hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスサイレチンの単量体補足を基盤とする革新的抗アミロイドーシス薬の開発

トランスサイレチン(TTR)単量体に結合して、四量体会合を阻害する低分子化合物をイン・シリコスクリーニング(ドッキング・シミューレーション)および化合物ライブラリによるスクリーニングを行い、ジアセレインがTTR単量体に結合する可能性を示唆された。最終年度はジアセレインのTTRアミロイド線維化の仕組みを明らかにするために、1蛍光色素チオフラビンTを用いたアミロイド線維抑制実験、2グルタルアルデヒドを用いた化学架橋実験、3等温滴定型カロリーメトリー、4X線結晶構造解析を行った。その結果、1ジアセレインはTTR既存薬であるジフルニサルと同等の阻害活性を有する、2ジアセレインはTTR四量体よりもむしろTTR二量体・TTR単量体を安定化する、3ジアセレインは四量体TTR(野生型TTR)に解離定数6 &micro;Mで結合するが、二量体TTR(S112I変異体TTR)には結合しない。4ジアセレインは四量体TTRのT4結合部位に結合する。1と2の結果から、ジアセレインはTTR二量体または単量体を安定化することでTTRアミロイド線維化を阻害することが明らかにした。これは既存のTTR阻害薬とは異なるメカニズムである。一方で、比較的低い親和性で四量体に結合し、その立体構造を安定化することも明らかになった。等温滴定型カロリーメトリー実験で二量体TTRに結合しなかったという結果は、他の実験と矛盾しているが、比較的高いタンパク質濃度(50 μM)での実験であるため、この濃度におけるオリゴマー形成を検証する必要がある。また、ジアセレインの結合がエントロピー駆動型である場合、その結合を等温滴定型カロリーメトリーで検出するのは非常に困難なものになるため、小さい熱量変化を検出できるように実験条件を工夫する必要があるかもしれない。本研究はトランスサイレチン(TTR)単量体に結合することで、四量体会合を阻害する化合物の開発を目的としている。TTRの四量体形成を阻害する化合物は、TTRを小胞体関連分解へ導き、TTRのアミロイド線維形成を阻害すると期待している。初年度の目標は、(i)水銀化合物ラベル導入のための変異体TTRの作成、(ii)TTR単量体のX線結晶構造解析、(iii)仮想スクリーニング(ドッキングシミュレーション)の開始、である。まず、水銀化合物ラベル導入のためのS112C変異体TTRを大腸菌発現システムを利用して作成した。遺伝子組み換え大腸菌の大量培養および精製の結果、高純度のS112C変異体TTRを得た。S112CーTTR四量体のX線結晶構造解析を行い、変異導入部位のオミット差フーリエ図のピークの高さからS112C変異が正しく導入されていることを確認した。一方で、2016年に他のグループがTTR単量体の立体構造がNMRによって決定した(PDB ID: 2NBO)。研究の目的はあくまで阻害剤の開発であることを鑑み、研究を先に進めることを優先させ、この立体構造データを用いてインシリコスクリーニングを開始することにした。使用する仮想化合物ライブラリはカリフォルニア・サンフランシスコ大学が運営するZINCから約200万の立体構造データを取得した。現在、これらの化合物に対してAutoDock VINAを用いたドッキング計算を行っている。ドッキングシミュレーションに用いるTTR単量体の立体構造データはProtein Data Bankに登録されているものを使用するなど、多少の実験方法に変更はあったが、本年度の計画である仮想化合物スクリーニングを実行することができた。したがって、研究の進捗はおおむね順調としている。昨年度までに、システインを導入したTTRの調製に成功し、X線結晶構造解析に成功した。しかし、単量体TTRの立体構造が公開されたことを受け、研究推進を優先するために、この立体構造モデルを用いてドッキングシミュレーションを行った。今年度はその結果の解釈およびアミロイド線維形成阻害実験を行った。その結果、いくつかの化合物がTTR単量体に結合することが示唆された。また、独自の研究室内化合物ライブラリを用いて、TTRに結合する化合物もいくつか同定することができた。天然物であるゴシポールやロットレリンやFDA承認薬であるジアセレインがTTRのアミロイド繊維化の形成を阻害することを明らかにした。ゴシポールとロットレリンはアミロイド繊維を直接分解するアミロイド線維溶解作用と、TTR四量体に結合することでアミロイド線維形成を阻害するTTR四量体安定化作用を示し、目的とするTTR単量体に結合する化合物ではなかった。一方でジアセレインは化学架橋実験の結果から、TTR単量体もしくは二量体を安定化する結果が得られた。このことは、ジアセレインがTTRの単量体あるいは二量体に結合して、アミロイド繊維形成を阻害している可能性を示唆している。インシリコドッキングシミュレーションと研究室内化合物ライブラリおよび線維形成阻害作用試験によって、いくつかのTTRアミロイド線維形成阻害剤を発見した。その化合物の一つであるジアセレインは、単量体もしくは二量体に結合していることが、化学架橋実験の結果から示唆されており、目的とする候補化合物が得られた。そのため、順調に進展していると評価している。

トランスサイレチン(TTR)単量体に結合して、四量体会合を阻害する低分子化合物をイン・シリコスクリーニング(ドッキング・シミューレーション)および化合物ライブラリによるスクリーニングを行い、ジアセレインがTTR単量体に結合する可能性を示唆された。最終年度はジアセレインのTTRアミロイド線維化の仕組みを明らかにするために、1蛍光色素チオフラビンTを用いたアミロイド線維抑制実験、2グルタルアルデヒドを用いた化学架橋実験、3等温滴定型カロリーメトリー、4X線結晶構造解析を行った。その結果、1ジアセレインはTTR既存薬であるジフルニサルと同等の阻害活性を有する、2ジアセレインはTTR四量体よりもむしろTTR二量体・TTR単量体を安定化する、3ジアセレインは四量体TTR(野生型TTR)に解離定数6 &micro;Mで結合するが、二量体TTR(S112I変異体TTR)には結合しない。4ジアセレインは四量体TTRのT4結合部位に結合する。1と2の結果から、ジアセレインはTTR二量体または単量体を安定化することでTTRアミロイド線維化を阻害することが明らかにした。これは既存のTTR阻害薬とは異なるメカニズムである。一方で、比較的低い親和性で四量体に結合し、その立体構造を安定化することも明らかになった。等温滴定型カロリーメトリー実験で二量体TTRに結合しなかったという結果は、他の実験と矛盾しているが、比較的高いタンパク質濃度(50 μM)での実験であるため、この濃度におけるオリゴマー形成を検証する必要がある。また、ジアセレインの結合がエントロピー駆動型である場合、その結合を等温滴定型カロリーメトリーで検出するのは非常に困難なものになるため、小さい熱量変化を検出できるように実験条件を工夫する必要があるかもしれない。研究は予定通りに進展しているため、次年度も計画書通りに実施する。研究は予定通りに進展しているため、計画書通りに、線維形成阻害化合物とTTRの結合分析を実施する。研究計画の変更はない。試薬や旅費等の申請書作成時の見積もりと実際の費用の誤差によるものである。【理由】試薬や旅費等の申請書作成時の見積りと実際の費用の誤差によるものである。【使用計画】結合分析に必要な試薬を購入するために使用する。インシリコスクリーニングで得た候補化合物の中で、実際に購入する化合物を増やすために使用する。
レジャーの概念を規定する主観的要因の検討:経験抽出法適要による現象学的アプローチ

本研究の課題は、(1)ESM調査によって個人の日常生活における具体的経験のデータを収集し、その経験に即して現象学的にレジャーの概念を定義することであり、(2)この操作的定義により、レジャーの量的、質的充実度を数量的に把握して、“レジャー生活の充実と生活全般の質的充実の関連性"について検討することであった。前年度に引き続き、同一内容のESM調査を実施したが、本年度は特に主婦層におけるデータの蓄積に力点を置き、生活構造の異なる専業主婦、有職主婦、大学生間でレジャーの捉え方に差はあるのか等、新たな分析視点を加え検討を行った。主婦66名、学生30名、6000件余の経験データの分析から、以下が明らかになった。1.レジャー概念を特徴づける主観的・経娠的要素は何か、相関、重回帰分析など統計的手法によって検討した。“レジャーである"との状況判断(レジャー性の知覚)と最も強い繋りがあるのは、サンプル全体では、「楽しさ」や「興味」の観点であり、続いて「決定の自由」の影響力が強く、「肯定的感情」「リラックス感」がこれに続く。フロー理論等で重視される集中(没入)や能力と挑戦の均衡、達成・有能感等の体験はレジャーとの意味関連を殆ど持っていなかった。また、専業主婦、有職主婦、学生のグループ毎で分析を進めたところ、結果はほぼ同様であり、異なる集団においてもレジャーの捉え方をめぐる基本図式は等しく共有されていることが示された。2.レジャーの量的・質的充実が生活全般の充実に与える影響については、ESMデータより算定されたレジャー享受レベルと、同データによる全般的生活充足感には強い関連性が認められたが、質問紙調査(Leisure Bore-dom Scale,Purpose in Life Testなど)によるQOLレベルとの関連性については、意味ある知見は得られなかった。今後、ESM調査と質問紙調査の間の測定内容・次元のずれを少しでも解消していくことが課題である。本研究の課題は、(1)ESM調査によって個人の日常生活における具体的経験のデータを収集し、その経験に即して現象学的にレジャーの概念を定義することであり、(2)この操作的定義に拠り、レジャーの量的、質的充実度を数量的に把握して、“レジャー生活の充実と生活全般の質的充実の関連性"について検討することであった。このため、女子大学生と主婦を対象にESM調査を実施し、加えて、QOLレベルやレジャーの質的充実の把握を目的としてPurpose in lifeテストやLeisure Boredome Scale等によりなる一般的な質問紙調査も併せ行った。1.客観的状況要因(活動内容)とレジャーである/ないを段階的に評定するレジャー・ラベリング尺度の一致・対応についてみると、レジャー性の知覚は「マスメディア接触」を中心とした消極的レジャー活動で最も高く、「スポーツ」「教養・創作活動」など積極的レジャー活動に対するレジャー性の評価は相対的に低いものであった。2.レジャー/非レジャーの判別に寄与する感情、知覚を探り、相対的重要性を検討したところ、レジャーの定義づけにおいて最も有力であるのは、「楽しさ」であり、次に「選択・決定の自由」の知覚であった。気分・感情要素の「肯定的感情」と「リラクセーション」はそれについで有力であった。レジャーの経験は、楽しさ、自身が自由に決定したという自己決定感、くつろぎ感、幸せな明るい気分で表される。これまで重視されてきた、高度な能力の行使に伴う集中(没入)、達成や有能感といった体験は、レジャー性の知覚に寄与するものではなかった。3.レジャーの量的、質的充実が生活全般の質的充実に与える影響について、PILテストによるQOL得点とESMデータの相関分析を行ったところ、量的な面では、レジャーの生起頻度(%)と全般のQOLレベルには殆ど関連性はなく(r<0.1)、また、レジャーの質的充実とQOLの相関も弱いものであった。

2.レジャーの量的・質的充実が生活全般の充実に与える影響については、ESMデータより算定されたレジャー享受レベルと、同データによる全般的生活充足感には強い関連性が認められたが、質問紙調査(Leisure Bore-dom Scale,Purpose in Life Testなど)によるQOLレベルとの関連性については、意味ある知見は得られなかった。今後、ESM調査と質問紙調査の間の測定内容・次元のずれを少しでも解消していくことが課題である。
電極触媒スーパーアーキテクチャーの創製による電極反応選択性の深化

燃料電池の実用運転においては,燃料と酸素の混合が一部不可避的に生ずる。この問題を解決する有力技術は反応選択性を有する電極触媒の開発であり,本研究では提案者らが開発した技術を巧妙に組み合わせて電極触媒スーパーアーキテクチャーを創製し,電極反応の選択性を深化させることを目的とした。具体的には,(1)ナノインデンテーション法による微小触媒の形成と電気化学的評価,(2)反応選択性ナノ粒子触媒の評価,(3)Pt-Ru-C同時スパッタ法による反応選択性電極の作製とキャラクタリゼーション,(4)ナノ電極をプローブとした電極反応計測,(5)燃料電池用膜電極接合体の電極反応について研究を行った。本研究の目的は,マイクロ・ナノ電極と材料技術を巧妙に組み合わせて電極触媒アーキテクチャーを創製し,電極反応の選択性を格段に深化させることにある。学術的には,経験的である電極触媒の設計指針を明確化する点に特色を持つ。また,本研究を通して開発予定の反応選択性を示す電極を用いる直接メタノール燃料電池は,燃料電池本体の重量低減を可能とする新技術として応用が待たれる。また,電極触媒が関わる膜電極接合体(MEA)ならびに燃料電池セルに関係する研究も推し進める。本年度の主要な成果は以下の通りである。まず,平滑なグラッシーカーボン(GC)基体に,マスクファブリケーション法を用いてPtめっきを行った。この手法は,GC上に絶縁性高分子薄膜を設け,走査型プローブ顕微鏡のカンチレバーでスクラッチするもので,スクラッチサイズと個数を変えてGC露出面積を変化させた基体とそれへのPtめっき電極を得た。これを酸素還元極に使用して,副生する過酸化水素の量を走査型電気化学顕微鏡(SECM)を用いて,Pt有効面積と過酸化水素生成量の関係から評価した。次に,多孔質マイクロ電極に各種Pt担持カーボン(Pt/C)粉体触媒を充填して,メタノール酸化と酸素還元の反応選択性について調べた。その結果,白金表面の面指数の優位性が反応選択性への寄与率が高いと考えられた。さらに,Pt-Ru-C三元スパッタ電極を作製し,メタノール選択酸化反応に対する最適組成を検討した。結果として,カーボン数%を含むPt-Ru合金が期待する性能を発現することが見出された。この組成のPt-Ru-CをMEAのアノードに用いて直接メタノール燃料電池を作製し,単セル内でのメタノール酸化選択性についても,その性能が維持されることを確認した。以上,本研究の遂行により,電極触媒の構成に関する研究と燃料電池応用を前提とした反応選択性の研究が進展している。本研究で開発予定の反応選択性を示す電極を用いる直接メタノール燃料電池(DMFC)は,燃料電池本体の重量低減を可能とする新技術として期待される。さらに,電極触媒が関わる燃料電池に関係する研究も推し進める。まず,前年度に得たメタノール酸化反応選択性を示すPt-Ru-C三元スパッタ電極を,DMFCの燃料極に使用して,発電特性を評価した。その結果,メタノール燃料が酸素の共存によっても発電性能が低下しないDMFC用反応選択性電極触媒を得た。次に,平滑なグラッシーカーボン(GC)基体に,前年度に開発したマスクファブリケーション法を用いてPtめっきを行った。基体にランドマークを設けることで,劣化前後のPtをAFMおよびSEMで直接観測できるようにした。これより,H2O2に代表されるPt劣化加速因子の関与についてPtモルフォロジー観察より検討を行った。加えて,Pt溶解加速因子であるH2O2の作用を,新規導入した蛍光高度計を使用してOHラジカルであると特徴づけた。さらに,電極触媒の劣化因子となるH2O2の発生を調べるため,Ptマイクロ電極にNafionイオノマーを塗布して走査型電気化学顕微鏡(SECM)の発生極とした。酸素還元の際に検出極で観測されるH2O2の量は,Nafion膜厚とともに増加するが,さらに膜厚が増加すると減少した。これは,H2O2発生サイト数の変化とNafion膜中のH2O2拡散係数により説明された。また,DMFCのコンディショニングを最適化して,実用化に資する研究を行った。以上,本研究の遂行により,電極触媒の構成に関する研究と燃料電池応用を前提とした電極触媒反応選択性の研究が進展している。本研究の目的は,マイクロ・ナノ電極と材料技術を巧みに組み合わせて新しい電極触媒構造体を作製し,電極反応の選択性を格段に深化させることにある。

また,本研究で開発される反応選択性を示す電極触媒を用いる直接メタノール形燃料電池(DMFC)は,燃料電池本体の重量低減を可能とする新技術として応用が待たれる。さらに,電極触媒が関わる固体高分子形燃料電池(PEFC)に関係する研究も推し進める。本年度の主な成果は以下の通りである。まず,メタノールと酸素が共存した状態で、DMFCに使用するPt電極触媒の反応選択性を調べた。平滑な導電基板上にPt-C二元ナノ電極触媒をスパッタ成膜し,ポストアニール温度に対するメタノール酸化選択性とXPSスペクトルPt4fの結合エネルギーシフトとの関係を研究した。その結果,メタノール酸化選択性とPt4f結合エネルギーに相関性が認められた。次いで,作製条件が異なる7種類のPt担持カーボン(Pt/C)触媒を多孔質マイクロ電極により,メタノール酸化/酸素還元選択性について調べ,Pt-Cと同様な結果を得た。これらから,Pt4f結合エネルギーと生成物吸着との関係が反応選択性の程度を支配すると考えられた。一方,PEFC中でPt/Cを劣化させた場合の水素酸化測定を行い,多孔質マイクロ電極にPt/C劣化を強制的に組み込んだ電極の水素酸化測定結果と比較した。後者の電極を用いて測定した電気化学インピーダンススペクトル(EIS)は,モデル的なPt/C劣化を水素酸化の各プロセスの違いにより説明できた。これをPEFCのEIS結果に適用してPt/C触媒活性の劣化モードを非破壊検査できる可能性を見出した。以上のように,本研究の遂行により電極触媒の反応選択性の研究と電極触媒の構造変化に関する研究が進展した。26年度が最終年度であるため、記入しない。電気化学26年度が最終年度であるため、記入しない。白金のめっき部位への析出と,その酸素還元電極触媒性能を評価した。また,各種粉体電極触媒の反応選択性の評価を通して,反応選択性の支配因子について検討を加えた。さらに,メタノール酸化選択性を示すPt-Ru-Cの最適組成を特定できた。このように当初の計画どおりに研究を遂行している。Pt-Ru-C反応選択性触媒を直接メタノール燃料電池(DMFC)に組み込むことで,空気中の酸素が混入しても発電性能が低下しない燃料電池を作れることが証明された。白金電極触媒の劣化機構および劣化の加速因子となるH2O2の作用を可視化観測と反応活性種の特定から研究した。さらに,DMFC実用化の観点から,コンディショニングの最適化を検討した。(1)電極触媒形成サイトの研究,(2)反応選択性触媒の粉体化の研究,(3)ナノ電極をプローブに用いる酸素還元時に副生する過酸化水素の研究を行う。(1)電極触媒の反応選択性の発現に関する電極反応メカニズム研究,(2)反応選択性触媒の粉体化およびそれを用いる直接メタノール燃料電池(DMFC)の作製,(3)多孔質マイクロ電極を用いる白金ナノ粒子電極触媒の劣化メカニズムの研究を,走査型電気化学顕微鏡(SECM)を用いて解析する。
抗炎症剤による抗アルツハイマー病作用機序の検討

抗炎症剤であるibuprofenがアルツハイマー病モデル動物であるAPPトランスジェニッグマウスのアミロイド病理を抑制する。研究者らはこれまでこのメカニズムを明らかにして論文発表してきた(T Morihara J Neurochem.2002、T MoriharaNeuropsychopharmacology2005など)。本研究ではibuproofenの抗炎症作用が、マイクログリアの好ましい作用までも阻害していないか調べた。活性型マイクログリアはアミロイドの除去を行っている。In vivo(APPトランスジェニックマウス)では、抗炎症作用が出現すると想定される濃度以上の抗炎症剤でもマイクログリアの活性マーカー(CD68,CD11b、CD11c)は抑制されていなかった。In vitroでも抗炎症剤はマイクログリア初代培養細胞の活性マーカーを抑制することなく、PGE2産生を抑制することで抗炎症作用を発揮していた。以上より抗炎症剤ibuprofenはマイクログリアのアミロイドクリアランスという好ましい作用を阻害することなく、有害な抗炎症作用やアミロイド促進因子である炎症関連分子al-antichymotrypsinを抑制が可能であることが支持された。この知見は、高価なアルツハイマー病治療薬としての抗炎症剤の臨床治験を合理的にデザインする上で有用である。また別の新規治療法として開発中のワクチン療法と抗炎症剤の併用が可能であることも支持する。NSAIDsについてはin vivoでみられた貪食に関連するマイクログリアマーカーが抑制されなかったことを、in vitroでも確認できた。プライマリーマイクログリア細胞とibuprofenで10100uM処理したところCD11bは抑制されたが、貪食に関連が強いCD68は変化しなかった。以上の結果からibuprofenはアミロイド病理を抑制し、このとき抗炎症作用も発揮するが、アミロイドを除去するマイクログリアの貪食を阻害しないことがin vivoでもin vitroでも強く示唆された。このことは臨床応用が近い2つの療法であるNSAID療法とアミロイドワクチン療法の作用がお互い阻害することなく、合わせて使うこともできることを示す。Curcuminについてもin vivoでみられたBACEの抑制をin vitroでも確認できた。初代神経培養細胞を0.532uMのcurcuminで処理した。BACE mRNAが容量依存的に最大35%抑制された。このときLDH assayでみた細胞毒性は認められなかった。Abetaの産生をメディウム中のAbetaをELISAで測定したところ、容量依存的に最大10%抑制された。このときAbeta42と40の比率は有意に変化しなかった。以上の結果から、脳内に達成可能な濃度のcurcuminはBACE発現を抑制しAbeta産生を抑制することがin vivoでもin vitroでも強く示唆された。これはアルツハイマー病の中心病理を抑制できることをしめす。抗炎症剤であるibuprofenがアルツハイマー病モデル動物であるAPPトランスジェニックマウスのアミロイド病理を抑制する。研究者らはこれまでこのメカニズムを明らかにして論文発表してきた(T Morihara J Neurochem. 2002、T MoriharaNeuropsychopharmacology2005など)。本研究ではibuprofenの抗炎症作用が、マイクログリアの好ましい作用までも阻害していないか調べた。以上より抗炎症剤ibuprofenはマイクログリアのアミロイドクリアランスという好ましい作用を阻害することなく、有害な抗炎症作用やアミロイド促進因子である炎症関連分子a1-antichymotrypsinを抑制が可能であることが支持された。
寄生虫由来免疫抑制因子の機能解析と関節リウマチモデルへの医学応用研究

マンソン裂頭条虫擬充尾虫(幼虫)由来の免疫抑制因子(ES90)のN末端と内部のアミノ酸配列に基づいてRT-PCR法でcDNAが増幅でき、クローニングの基礎試料が得られた。また、同じ幼虫由来の130kDaの免疫抑制因子(ES130)を精製した。ES130は活性化マクロファージが産生する3つのケモカイン(RANTES, MIP-2, IP-10)の遺伝子発現を抑制し、炎症や免疫応答の抑制への関与が推察された。寄生現象成立のために、寄生虫は宿主免疫からの回避機序を獲得していると考えられている。我々は、マンソン裂頭条虫擬充尾虫(幼虫)の排泄・分泌物質(ES物質)がLPS刺激による活性化マクロファージの一酸化窒素合成酵素(iNOS)やTNF-α、IL-1βなどのサイトカインの遺伝子発現を抑制することを見いだし、精製した分子量90kDaの免疫抑制因子ES90を得た。このアミノ酸情報に基づいて遺伝子をクローニングするため、RT-PCR法によってDNA断片を得るよう検討中である。また、今回ES物質中の130kDaの免疫抑制因子ES130を精製した。そして、ES130および未精製のES物質(crude ES)が活性化マウス腹腔マクロファージとRAW264.7細胞のRANTES(CCケモカイン)、MIP-2、IP-10(CXCケモカイン)の遺伝子発現に及ぼす影響についてsemi-quantitative RT-PCRを用いて検討した。ES130またはcrude ESの前添加によってLPS刺激3時間後のRANTES、MIP-2、IP-10の遺伝子発現を抑制した。LPS刺激8時間のRANTESの遺伝子発現は抑制していなかったが、24時間後のELISAによる測定では、産生抑制が認められた。また、LPS刺激8時間後のMIP-2、IP-10の遺伝子発現もLPS刺激24時間後の培養液中のMIP-2、IP-10の産生も抑制されており、幼虫分泌因子によって寄生虫の周囲への好酸球、好中球、単球やTh1細胞の遊走が抑制されていると推察された。我々は、これまでにマンソン裂頭条虫のプレロセルコイド(幼虫)の分泌物質中の免疫抑制因子(ES90)を精製し、この因子がToll-like receptor(TLR)4のリガンドであるlipopolysaccharide(LPS)活性化マクロファージの遺伝子発現および破骨細胞形成を抑制することを見い出した。そして、ES90のN末端と内部のアミノ酸配列の一部を決定した。そして、このアミノ酸配列を基にしたdegeneratePCRプライマーを作成し、幼虫由来のmRNAからRT-PCR法によってcDNA断片が得られた。このcDNAの塩基配列は、374bpで、プライマーのアミノ酸配列と一致した。このcDNAの塩基配列の解析結果から、2種類の塩基配列のパターンが確認された。アミノ酸に変換すると124アミノ酸中15アミノ酸で変異がみられ、2つのisoformの存在が示唆された。そして、これらのDNA情報、アミノ酸情報について検索したが、相同性の高いものはいずれも報告されておらず、新規の免疫抑制因子と推察された。最近得られた2種類のisoformの免疫抑制因子ES90のcDNA情報を基にして、3'RACE法および5'RACE法を用いて全長のcDNAの塩基配列を決定し、クローニングと遺伝子組換えタンパク作製の準備ができた。また、マンソン裂頭条虫の幼虫の分泌因子中から精製していた免疫抑制因子ES130によるLPS活性化マクロファージのRANTES(CCL5),MIP-2(CXCL2),IP-10(CXCL10)ケモカインの遺伝子発現抑制および産生抑制について論文にまとめて発表した。これらの3つのケモカインは、ES130によって異なる機序で産生が抑制されていることが推察された。
翻訳と共役した無細胞蛋白質成熟システムの構築

蛋白質の成熟過程のメカニズム解明することを目標として、再構築した蛋白質合成系PUREsystemによって大腸菌ゲノム上の全蛋白質(4132個)の合成を行い、各蛋白質の凝集特性を遠心分離により可溶性を評価した。PUREsystemにより合成可能また電気泳動可能であった7割についての評価したところ、凝集しやすさは二峰性を示すことが示された。分子量が小さい蛋白質、等電点が低い蛋白質は可溶性が高いことが示された。また、細胞質の凝集傾向のある蛋白質792個について、シャペロン存在下のPURE systemで合成を行い、その可溶性の向上から、シャペロン依存性を評価した。以上の解析結果をe-Solデータベースとして公開した(http://tp-esol.genes.nig.ac.jp/)。私たちは、近年、翻訳過程に必須な因子のみ構成された試験管内遺伝子発現系PURE systemを再構築し、蛋白質の誕生プロセスを無細胞化した。このシステムの発展型として蛋白質成熟プロセスに関与する因子群をPURE systemに共存させた複合型無細胞システムを開発し、蛋白質の成熟過程のメカニズム解明することを本研究の目標としている。まず、新生蛋白質のフォールディングにおける分子シャペロンの役割、および翻訳と共役したフォールディングプロセスを解析するために、フォールディングに関与するシャペロンの共存させたPUREsystemを構築した。従来のシャペロンのフォールディングヘの関与に関する仮説を検証することを目的として、このシステムを用いた解析を進めている。単鎖抗体(scFv)を用いた実験では、DnaKシステム(DnaK-J/GrpE)とトリガーファクターは、新生蛋白質の可溶化率とその抗原結合活性の向上に著しく効果があり、合成されたscFvの正確な折り畳みを促進することが示された。また、トリガーファクターとDnaKシステムがco-translationalおよびpost-translationalの両プロセスで新生蛋白質の凝集を抑えることが明らかとなった。また、これらのシャペロンの基質となる蛋白質を、大腸菌遺伝子から検索し、シャペロンニン(GroEL/ES)に依存してフォールディングする基質蛋白質-stringent substrate-を見いだした。その中で、GroELの基質であるMetK遺伝子をGroEL/ES-dependentフォールディングプロセスをin vitroで解析したところ、今まで言われたpost-translationalプロセスではなく、新生ポリペプチド-リボソーム-mRNA複合体に結合し、co-translationalなプロセスでフォールディングに寄与する可能性が高いことが示された。また、このプロセスで、GroESは翻訳後終了後にGroELに結合しフォールディングを促進することが、single-ringのGroEL変異体による実験から、明らかとなった。私たちは,近年,翻訳過程に必須な因子のみ構成された試験管内遺伝子発現系PURE systemを再構築し,蛋白質の誕生プロセスを無細胞化した。このシステムの発展型として蛋白質成熟プロセスに関与する因子群をPURE systemに共存させた複合型無細胞システムを開発し,蛋白質の成熟過程のメカニズム解明することを本研究の目標としている。まず,新生蛋白質のフォールディングにおける分子シャペロンの役割,および翻訳と共役したフォールディングプロセスを解析するために,フォールディングに関与するシャペロンの共存させたPUREsystemを構築した。従来のシャペロンのフォールディングへの関与に関する仮説を検証することを目的として,このシステムを用いた解析を進めている。PUREsystemを用いてシャペロンの基質となる蛋白質を,大腸菌遺伝子から検索し,シャペロンニン(GroEL/ES)に依存してフォールディングする基質蛋白質-stringent substrate-を見いだした。その中で,GroELの基質であるMetK遺伝子をGroEL/ES-dependentフォールディングプロセスをIn vitroで解析したところ,今まで言われたpost-translationalプロセスではなく,新生ポリペプチドーリボソーム-mRNA複合体に結合し,co-translationalなプロセスでフォールディングに寄与する可能性が高いことが示された。また,大腸菌の蛋白質遺伝子をすべてカバーするライブラリーをPURE systemで合成し,その可溶性から各々の蛋白質のシャペロン依存性を評価した。私たちは、翻訳過程に必須な因子のみ構成された試験管内遺伝子発現系PUREsystemを再構築し、蛋白質の誕生プロセスを無細胞化した。まず、PUREsystemによって大腸菌ゲノム上の全蛋白質(4132個)の合成を行い、各蛋白質の凝集特性を遠心分離により可溶性を評価した。PUREsystemにより合成可能

また電気泳動可能であった7割についての評価したところ、凝集しやすさは二峰性を示すことが示された。分子量が小さい蛋白質、等電点が低い蛋白質は可溶性が高いことが示された。立体構造と凝集特性の相関を解析したところ、SCOPデータベースのfoldの階層で、相関が認められた。例えば、c94というfoldでは8割以上が凝集するが、c47のfoldでは7割以上が可溶性であった。また、細胞質の凝集傾向のある蛋白質792個について、シャペロン存在下のPURE systemで合成を行い、その可溶性の向上から、シャペロン依存性を評価した。Trigger factorは単独での凝集抑制効果は低いこと、GroEL/ESは分子量20-50kDaに対して効果があること、DnaK/DnaJ/GrpEでは高分子のものに効果があることが示された。また塩基性蛋白質には、DnaK/DnaJ/GrpEが効果のあることが示された。この結果は、ポリペプチド固有の特性を初めてゲノムワイドに明らかにしたものである。また以上の解析結果をe-Solデータベースとして公開した(http://tp-esol.genes.nig.ac.jp/)。
下肢関節疾患患者への運動介入プログラムとその評価法の開発

下肢関節疾患患者を対象として、在宅で行える効果的な段階的運動プログラムD V Dを開発し、その効果を検証した。対象患者に配布し3か月後の追跡調査の結果、DVD介入を行った患者は、股関節疾患患者で、片脚立位時間、膝伸展筋力、膝関節疾患患者では歩行能力が有意に改善し、両患者とも精神面の向上が認められた。我々の開発した運動プログラムDVDの効果が示唆された。また、本研究評価のために必要である、膝関節疾患患者評価尺度Oxford knee score(OKS)の日本語版を開発し、人工膝関節手術患者に調査を行い、その信頼性・妥当性も確認した。本研究では、下肢変形性関節症を有する整形外科外来患者を対象として、在宅で行える効果的な運動プログラムを開発し、DVDおよびパンフレットを作成し、その効果を検証することを目的とした。先行研究および整形外科医らの意見をもとに運動内容を検討した。運動内容はSLRや膝屈曲、伸展、股関節屈曲、足関節屈曲などからなる6パターンとした。客観的評価としてBMIより体格、生体電気インピーダンス方式体組成計の測定結果より「全筋量」「患側の筋量」「患側の筋力」「患側のWBI」、膝伸展筋力センサーより「患側の膝伸展筋力」、TUAGより歩行能力を明らかとした。主観的評価としてアンケート調査のVASより「患側の痛み」、老研式活動能力指標より、患者の生活自立度、Oxford hip score、Oxford knee scoreより「痛みや日常生活動作」、和式生活項目より「深い屈曲を伴う動作」SF-8よりQOL、運動セルフ・エフィカシー尺度より「運動に対する信念」、一般性セルフ・エフィカシー尺度;General self efficacy scaleより「結果を生み出すための信念」を明らかとした。同意の得られた患者にDVDおよびパンフレットを渡し、3か月の追跡調査ができた対象者は、変形性膝関節症8名(男性3名、女性5名)、変形性股関節症9名(男性0名、女性9名)、平均年齢61.2歳であった。客観的指標として「患側の筋量」「患側の筋力」「患側のWBI」「患側の膝伸展筋力」はやや上昇していたが、有意差は認められなかった。TUAGは有意に改善していた(p<0.01)。主観的指標で有意な改善が認められたのは痛みについてのVAS、痛みと身体機能を表すOxford score、身体機能を表すSF-8のPCSであった(p<0.05)。また評価法の一つであるOxford knee score(OKS)の信頼性・妥当性の検証のため、術前のOKS調査を行っており、現在57名の患者より回答を得ている。今後術後調査を行うこととしている。本研究では、下肢変形性関節症を有する整形外科外来患者を対象として、在宅で行える効果的な運動プログラムとその評価法を開発することを目的としている。運動プログラムDVDは昨年度の試作版を経て本年度は精度の高いものを作成した。また評価法の開発として膝関節疾患患者尺度Oxford knee score (OKS)日本語版の信頼性、妥当性を確認した。OKS日本語版の質問項目は膝の痛みや階段を下りる、買い物、車の乗り降りなどの日常生活動作の困難さ、跛行、膝崩れなどを問うている。対象者は変形性膝関節症患者で人工膝関節置換術術前および治療中患者とし、OKS日本語版、健康関連QOL尺度SF-36v2を用いて調査を行った。データの解析は記述統計および信頼性の検証のためクロンバックα係数、妥当性の検証のためのSF-36v2との相関を求めた。有効回答103名(男性16名、女性87名、平均年齢70.8(SD=8.3)(4289))のデータが得られた。OKSは12点から60点の配点で、得点が低いほど身体機能が高く痛みが少ないことを示す。平均点はOKS29.4(SD=11.9)であった。SF-36v2は身体機能から心の健康までの8下位項目で各50点を国民標準値とし高いほうが良いが、最も低かったのは身体機能の25.1、次いで日常生活役割(身体)33.9、身体の痛みの38.7であった。OKSのクロンバックα係数は0.95、SF-36v2との相関ではすべての項目において有意な相関が認められ(p<0.01)相関係数が0.6を超えたのは身体機能(0.78)、日常生活役割(身体)(0.83)、身体の痛み(0.77)、日常生活役割(精神)(0.77)であった。原作者による先行研究のSF-36との相関係数(0.520.71)とも同様の相関であった。以上によりOKS日本語版は信頼性および妥当性が確認された。

本研究では、昨年度までの研究をもとに、下肢関節疾患患者を対象として、在宅で行える効果的な運動プログラムDVDを理学療法士や整形外科医師とともに開発し、その効果を検証することを目的とした。プログラムは股関節・膝関節患者用であり、OKC・CKC運動それぞれ3種類からなり、1日に約3040分、2週間ごとにステップアップし、3か月で6段階目まで到達できるものである。対象者は大学病院外来を受診している変形性股関節・膝関節症患者で運動を推奨される同意を得られた患者とした。コントロール群は従来の運動療法パンフレットを配布し、介入群には運動ブログラムDVDを説明の上配布した。効果の判定のために、主観的評価として、QOL尺度SF-8、一般セルフエフィカシー、加えて股関節患者にはJHEQ、oxford hip score、膝関節患者にはoxford knee scoreにて評価した。3か月後の得点変化を検証し、有意水準は5%未満とした。男性4名、女性70名の対象者から結果が得られた。股関節患者は介入群21名、(平均年齢50.1歳)、コントロール群33名(51.7歳)であった。膝関節患者は介入群6名、(平均年齢65.2歳)、コントロール群14名(67.4歳)であった。3か月後の追跡調査の結果、調査項目全体に改善傾向が認められた。介入群では股関節患者において、JHEQメンタル(介入前15.0、介入後23.6:高い方が良い)、Oxford hip score痛み(12.7から11.1:低い方が良い)、膝関節患者において、SF-8の精神的健康(44.3から48.6:高い方が良い)に有意な改善を示していた。コントロール群では股関節患者においてのみJHEQメンタル(14.8から23.3)に有意な改善を示していた。介入群に有意な改善が認められたことは、DVDによる運動療法効果と考える。股関節患者に有意な改善が認められた項目が多かったことは、患者の平均年齢が若く、運動への取組が高かったためではないかと推測された。身体面だけでなく、精神面にも有意な改善が認められたことは、患者が運動によって精神的な充足を得られたことが考えられた。
2DHGダイヤモンドNano-Fin構造における量子伝導機構の解明とFET応用

ダイヤモンドは、表面を水素結合(C-H)で終端させて負イオンが吸着することで、2次元正孔ガス(2DHG)層が表面近傍に形成される。2DHG層は浅いアクセプタ準位、高い表面キャリア密度を有しており、面方位に依らず誘起され、かつ広い温度領域で安定したp型伝導を発現する。一方、極微細化されたFin構造における伝導機構およびデバイス開発の報告はない。そこで本研究では、2DHGダイヤモンドNano-Fin構造の量子的な電気伝導機構の探索・解明を実施し、高電流密度・高移動度を有する2DHGダイヤモンドNano-FinFETを実現する。
微細加工カンチレバーを用いた近接場光学プローブによる機能性有機薄膜の評価

近接場走査光学顕微鏡(NSOM)における極微小開口プローブの製作技術、プローブ-試料間の間隙制御方式、微弱光検出に関わる装置構成については、現在も発展段階にあり、種々の異なる方法が提案されている。これらの中でも薄膜試料の背面から全反射条件を満たすように照明し、試料上に生じたエバネッセント場とプローブとの間で発生する散乱光を検出する方式のNSOMは、しばしばその製作が困難な微小開口を必要としないという大きな利点をもつ。我々はこれまでにNSOMプローブとして原子間力顕微鏡(AFM)の微細加工カンチレバーを用いることで、AFMの様々な動作モードで間隙制御を行うNSOMを試作してきた。本年度の研究では、圧電薄膜(PZT)カンチレバーを用いて新規NSOM/AFM装置を構成し、その基本特性の評価を行った。さらに、AFM動作をベースとして確立されてきた試料表面の局所物性量を検出・測定するさまざまなプローブ顕微鏡の手法が、NSOMにおいても同時測定の形で実現できることを示すため、有機分子薄膜試料(チオフェン5量体)の表面電位測定をNSOM観察可能なPZTカンチレバーを用いて行い、新規に開発した独自の位相同期ループ(PLL)回路を採用している周波数変調検出法(FM検出法)を用いることで、表面電位測定が可能であることを示した。これにより光電変換過程の直接観察などへの応用が今後期待される。また、光検出型微細加工カンチレバーを用い、強誘電体薄膜の局所的な光学的評価を行った。NSOM像は入射光の偏光方向に大きく依存し、試料薄膜の厚さによりそのコントラストが変化することが示された。
高感度の硬X線観測で探るブラックホールへの物質流入

本年度は、2005年7月に打ち上げられた「すざく」衛星を用いた観測的研究を中心に据え、以下のような研究を行った。これにより、本計画研究の目的を十分に達成することができた。1.昨年度に引き続き、「すざく」搭載硬X線検出器(HXD-II)の軌道上較正を進め、バックグラウンド数値モデルの精度を向上するとともに、時刻づけ精度などを検証した。2.「すざく」・CCDカメラで、近傍銀河の超大光度X線天体(ULX)のスペクトルを詳しく観測するとともに、HXD-IIでは世界で初めて、M82銀河にあるULXから10keV以上での硬X線信号の検出に成功した。これらの結果から、ULXが中質量ブラックホールである証拠を強めた。3.「すざく」HXD-IIを用い、ハード状態にある複数の銀河系内ブラックホール連星を比較観測した結果、降着円盤を見る角度の違いにより、コンプトン散乱の光学的厚みが系統的に異なることを発見した。これは30年来の謎だった、高温コンプトン雲の幾何形状に、重要な手掛かりを与える結果である。4.強く吸収された活動銀河核NGC 4945のHXD-IIスペクトルと時間変動を詳しく解析することで、この巨大ブラックホールに落ち込む物質は、これまで考えられていたような「太いトーラス」ではなく,薄くて歪んだ円盤の形状をもつという新しい可能性を突き止めた。5.理研の運用するHETE-2衛星や、アメリカのSwift衛星などと共同して、「すざく」HXD装置のシールド部を用いたガンマ線バーストの観測的研究を推進するとともに、光学望遠鏡を用いたバースト残光の探査を進めた。6.「すざく」の後継のNeXT衛星(2012年頃の打ち上げを想定して提案中)に向け、撮像型ガンマ線装置などの基礎開発を続行した。本研究の目的は、Astro-E2衛星(2005年度に打上げ予定)に搭載される世界最高の感度をもつ硬X線検出器HXD-II (Hard X-ray Detector)を開発すること、またそれを用いてブラックホールに物質が吸い込まれる際の統一的な理解を得ることである。本年度は鋭意、HXD-IIの製作を推進し、以下のような成果を達成した。1.HXD-IIのセンサー部(HXD-S)は、Well検出器と呼ばれる、16本の主検出器を擁する。本年度は購入した結晶シンチレータなどを用い、16本のWell検出器の大部分を製作し、それらの温度試験、振動試験、特性評価などを進めた。温度ひずみで結晶が破損するのを防ぐため、CFRP防振材の接着方法を改良した。2.Well検出器部の出力信号は、HXD-IIのアナログ信号処理部(HXD-AE)の中でWPUと呼ばれるモジュールで処理される。本年度はWPUの衛星搭載回路を最終設計するとともに、さまざまな予備試験を通じてその特性を確認した。また必要な高信頼性と放射線耐性をもつ電子部品の選定を進めた。3.HXD-IIのデジタル信号処理部(HXD-DE)の設計を進め、その搭載ソフトウェアのコーディングに着手した。4.衛星軌道上での検出器の放射化特性を定量化するため、阪大、理研などにおいて加速器ビーム照射実験を数回にわたって行い、貴重なデータを取得した。本研究の目的は、Astro-E2衛星(2005年1月に打上げ予定)に搭載される世界最高の感度をもつ硬X線検出器HXD-II(Hard X-ray Detector)を開発すること、またそれを用いてブラックホールに物質が吸い込まれる際の統一的な理解を得ることである。本年度は昨年度に引き続き、HXD-IIの製作を推進し、以下のような成果を達成した。2.7月から11月にかけ、これらのコンポーネントをいったん衛星に搭載し、機械的および電気的なインタフェースの確認試験(1次噛み合わせ)を行った。3.11月から2月にかけ、1次噛み合わせでの不具合に対処するとともに、単体環境試験の準備を進めた。4.衛星軌道上での検出器の放射化特性を定量化するため、昨年度の理研や阪大での実験に引き続き、放射線医学研究所において加速器ビーム照射実験を行い、とくに短時間成分に関するデータを取得した。5.HXD-IIでの観測の準備として、Chandra、XMM-Newton, HETE-2などの衛星のデータ解析を進めた。またHXD-IIによる観測および軌道上較正の立案を進めた。6.HXD-IIのさらなる改良を目ざし、フーリエ合成硬X線光学系、1次元の位置感度をもったCdTe検出器の開発、コンプトンカメラの概念設計などを進めた。本研究の目的は、Astro-E2衛星(2005年夏に打上げ予定)に搭載される世界最高の感度をもつ硬X線検出器HXD-II (Hard X-ray Detector)を開発すること、またそれを用いてブラックホールに物質が吸い込まれる際の統一的な理解を得ることである。本年度は以下のように、同衛星の打ち上げ準備を完了した。1.HXD-IIのセンサー部(HXD-S)、アナログ信号処理部(HXD-AE)、およびデジタル信号処理部(HXD-DE)のハードウェアを完成させ、7月に衛星に搭載し、打ち上げ前の「総合試験」に臨んだ。現在HXD-IIを含め、衛星はすべての試験項目をクリアし、宇宙航空研究開発機構による打ち上げ日程の決定を待っている。2.HXD-IIのデータ解析のためのソフトウェアを鋭意、作成しつつある。

3.HXD-IIを含め、Astro-E2に搭載される観測装置群を用いた、軌道上での較正観測および初期観測のプランを立案するとともに、公募研究の時間枠に向け、観測提案を行った。5.HXD-IIのさらなる性能向上を目ざし、Astro-E2の後継機となるNeXT衛星(提案中)に向け、撮像型ガンマ線装置の基礎開発をスタートした。本研究の中心となる硬X線検出器HXD-II(Hard X-ray Detector)を搭載したAstro-E2衛星は、2005年7月10日に無事に地球周回軌道に打ち上げられ、「すざく」と命名された。この大きな進展を軸に、本年度は本特定領域を構成する他のいくつかの計画研究と緊密に協力しつつ研究を行い、以下の成果を得た。1.7月末から8月半ばにかけて軌道上でHXD-IIの立ち上げを行ない、装置の各部が、ロケット打ち上げ時の振動などで破損することなく、正常に作動していることを確認した。2.私見観測データを用いて、HXD-IIの軌道上での微調、機能検証、較正などを進めた。その結果HXD-IIは、目的とする超低バックグラウンドを達成することができた。3.「すざく」HXD-IIおよびX線CCDカメラを用い、いくつかのブラックホール連星や10個以上の活動銀河核を観測し、明るい天体では300keVまで良好なスペクトルを得ることに成功した。4.HXD-IIのシールド部を利用し、ガンマ線バーストや太陽フレアの観測を開始した。ガンマ線バーストの観測では、理研の運用するHETE-2衛星などと協力体制を構築した。6.HXD-IIのさらなる性能向上を目ざし、「すざく」の後継機となるNeXT衛星(提案中)に向け、撮像型ガンマ線装置の基礎開発を続行した。本年度は、2005年7月に打ち上げられた「すざく」衛星を用いた観測的研究を中心に据え、以下のような研究を行った。これにより、本計画研究の目的を十分に達成することができた。1.昨年度に引き続き、「すざく」搭載硬X線検出器(HXD-II)の軌道上較正を進め、バックグラウンド数値モデルの精度を向上するとともに、時刻づけ精度などを検証した。2.「すざく」・CCDカメラで、近傍銀河の超大光度X線天体(ULX)のスペクトルを詳しく観測するとともに、HXD-IIでは世界で初めて、M82銀河にあるULXから10keV以上での硬X線信号の検出に成功した。これらの結果から、ULXが中質量ブラックホールである証拠を強めた。3.「すざく」HXD-IIを用い、ハード状態にある複数の銀河系内ブラックホール連星を比較観測した結果、降着円盤を見る角度の違いにより、コンプトン散乱の光学的厚みが系統的に異なることを発見した。これは30年来の謎だった、高温コンプトン雲の幾何形状に、重要な手掛かりを与える結果である。4.強く吸収された活動銀河核NGC 4945のHXD-IIスペクトルと時間変動を詳しく解析することで、この巨大ブラックホールに落ち込む物質は、これまで考えられていたような「太いトーラス」ではなく,薄くて歪んだ円盤の形状をもつという新しい可能性を突き止めた。5.理研の運用するHETE-2衛星や、アメリカのSwift衛星などと共同して、「すざく」HXD装置のシールド部を用いたガンマ線バーストの観測的研究を推進するとともに、光学望遠鏡を用いたバースト残光の探査を進めた。
汎発性強皮症患者におけるTGFβおよびTGFβレセプター発現に関する研究

我々は、汎発性強皮症患者皮膚線維芽細胞におけるTGFβレセプターI型、II型の発現量は2倍増加、I型コラーゲンは3倍上昇するのを明らかにし、TGFβレセプターがそのオートクライン制御を活性化させ、これを介してTGFβの働きが増強し、コラーゲン産生を刺激すると推測した。これをうけて、汎発性強皮症患者におけるin vivo系でのTGFβ及びTGFβレセプターの発現を検索した。様々な病期の強皮症患者より、前腕伸側の皮膚生検を採取した。加えて、皮膚内の石灰沈着が顕著な汎発性強皮症(CREST症候群)の患者皮膚や、真皮における異常膠原線維が表皮へ穿孔する病理組織像が特色であるReactive perforating collagenosisの皮疹部生検も併せて施行した。各標本はOCT包埋固定後、脱パラフィン、内因性ペルオキシダーゼ除去し、一次抗体としてTGFβ1、2、3及びTGFβレセプターI型、II型、二次抗体にビオチン標識抗ウサギIgGを使用したABC法で発色させる免疫組織化学染色を行い、その組織内発現を観察した。汎発性強皮症患者では発症3年以内の標本で、TGFβ1、3及びTGFβレセプターI型、II型が真皮線維芽細胞や増生する膠原線維に過剰発現した。これは強皮症の病因の一つであるコラーゲンの過剰産生、沈着が、TGFβシグナル伝達経路と深く関与する我々の報告と一致する所見である。また、CREST症候群では石灰沈着塊周囲に特にTGFβ3が増強を示した。これより、汎発性強皮症でときにみられる石灰沈着の機序に、TGFβ3が関連する可能性が示された。一方、Reactive perforating collagenosisでは真皮上層の特に穿孔する膠原線維束周囲で、TGFβ1、3が過剰発現した。この所見は、本症の病態にTGFβが関与することを示唆させる。他に、Bowen病、Paget病などの表皮内癌や汗孔角化症などの前癌状態の病変部標本でも免疫組織化学染色を試みたところ、癌細胞内にTGFβ1、3が増強する所見を認め、それぞれの発癌メカニズムと何らかの関連があることを伺わせた。次いで、in situ hybridization法にてTGFβ1、2、3及びTGFβレセプターI型、II型の染色性を施行し、皮膚癌発生機序にこれらのサイトカインが介入することを示した。現在、これらの標本を用いてin situ hybridization法にてTGFβ1、2、3及びTGFβレセプターI型、II型の染色性を検討中である。

様々な病期の強皮症患者より、前腕伸側の皮膚生検を採取した。加えて、皮膚内の石灰沈着が顕著な汎発性強皮症(CREST症候群)の患者皮膚や、真皮における異常膠原線維が表皮へ穿孔する病理組織像が特色であるReactive perforating collagenosisの皮疹部生検も併せて施行した。各標本はOCT包埋固定後、脱パラフィン、内因性ペルオキシダーゼ除去し、一次抗体としてTGFβ1、2、3及びTGFβレセプターI型、II型、二次抗体にビオチン標識抗ウサギIgGを使用したABC法で発色させる免疫組織化学染色を行い、その組織内発現を観察した。汎発性強皮症患者では発症3年以内の標本で、TGFβ1、3及びTGFβレセプターI型、II型が真皮線維芽細胞や増生する膠原線維に過剰発現した。これは強皮症の病因の一つであるコラーゲンの過剰産生、沈着が、TGFβシグナル伝達経路と深く関与する我々の報告と一致する所見である。また、CREST症候群では石灰沈着塊周囲に特にTGFβ3が増強を示した。これより、汎発性強皮症でときにみられる石灰沈着の機序に、TGFβ3が関連する可能性が示された。一方、Reactive perforating collagenosisでは真皮上層の特に穿孔する膠原線維束周囲で、TGFβ1、3が過剰発現した。この所見は、本症の病態にTGFβが関与することを示唆させる。他に、Bowen病、Paget病などの表皮内癌や汗孔角化症などの前癌状態の病変部標本でも免疫組織化学染色を試みたところ、癌細胞内にTGFβ1、3が増強する所見を認め、それぞれの発癌メカニズムと何らかの関連があることを伺わせた。次いで、in situ hybridization法にてTGFβ1、2、3及びTGFβレセプターI型、II型の染色性を施行し、皮膚癌発生機序にこれらのサイトカインが介入することを示した。