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口腔・咽喉頭領域の術後嚥下障害における嚥下中枢の機能的役割の解析

本研究では、口腔癌に対する拡大手術後の嚥下障害における、求心性入力および遠心性出力の変化に対して、嚥下中枢がどのような機能的役割をしているのか解析することを目的とした(実験1)。また、平成16年度に開発した動物モデルから延髄の小細胞性網様体へのGABA作動性投射は嚥下の制御に関与していると考えられるため、GABAニューロンの起源の候補の一つである黒質網様部(SNr)との関係を解析した(実験2)。動物にはネコを用い、ハロセン麻酔下に中脳前縁で除脳を行い、実験中は嚥下を惹起させるために無麻酔で行った。実験1:咽喉頭粘膜から延髄への感覚入力である上喉頭神経(SLN)を両側切断し嚥下障害を引き起こした。嚥下中枢が存在すると考えられている延髄の小細胞性網様体(NRPv)に抑制性神経伝達物質であるGABAの受容体拮抗薬であるビククリンを微量注入し興奮性させ、嚥下パターンの変化を記録し、嚥下中枢との相互作用を解析した。実験2:基底核の出力核の一つであるSNrに微小電気刺激を加えSLNを刺激して誘発させた嚥下の変化を調べた。結果1:嚥下中枢へビククリンを微量注入することにより、SLN刺激により誘発した嚥下の回数が増加した。結果2:SNrの微小電気刺激はSLN刺激誘発嚥下の回数を減少させた。これらの結果から口腔癌の拡大手術により咽喉頭粘膜を摘出され嚥下中枢への感覚入力の低下による嚥下障害に対して、嚥下中枢に存在するGABAを変化させることによって嚥下を惹起させることができる可能性を示唆した。また、SNrからNRPvへのGABA作動性投射は筋活動抑制系の活動を調節することで、筋緊張の制御に関わっている可能性を示唆した。本研究では、拡大手術後の嚥下障害における、求心性入力および遠心性出力の変化に対して、嚥下中枢がどのような機能的役割をしているのか解析することを目的とした。平成16年度には嚥下における中枢の興奮性をシステマティックにコントロールできる動物モデルの開発を行い、平成17年度にはそのモデルを用いて、嚥下障害における末梢性の入出力の変化と嚥下中枢の相互作用の解析を行う。平成16年度1.動物モデルの開発口腔・咽頭領域の中枢の興奮性をシステマティックに変化させ、嚥下パターンがどのように変化するか解析できる動物モデルを開発した。嚥下は上喉頭神経に電気刺激を加え誘発させた。中枢の興奮性のシステマティックな変化は、神経薬理学的手法を用い抑制性神経伝達物質であるGABAの拮抗薬であるビククリンとGABA作動薬であるムシモールを微量注入し、その際の嚥下パターンの変化を神経生理学的に解析した。薬物はネコを脳定位固定装置に固定し、微小ガラス管を用い、嚥下中枢とその近傍に微量注入する。嚥下パターンの変化は、口腔・咽喉頭領域の嚥下に関与する筋群の筋電図を記録することにより解折した。結果は、嚥下中極が存在すると考えられている延髄の小細胞性網様体へビククリンを微量注入することにより、上喉頭神経刺激により誘発した嚥下の回数が増加した。また、咳を誘発する例もあった。同部位へのムシモールの微量注入は嚥下の回数を減少させた。嚥下の時間的パターンに変化はなかった。平成17年度2.嚥下障害における末梢性入出力を変化させたときの嚥下中枢の相互作用の解析嚥下障害を引き起こし、初年度に行った中枢の興奮性のシステマティックな変化を神経薬理学的手法を用いて行い、嚥下パターンの変化を記録し、嚥下中枢との相互作用を解析する。

結果2:SNrの微小電気刺激はSLN刺激誘発嚥下の回数を減少させた。これらの結果から口腔癌の拡大手術により咽喉頭粘膜を摘出され嚥下中枢への感覚入力の低下による嚥下障害に対して、嚥下中枢に存在するGABAを変化させることによって嚥下を惹起させることができる可能性を示唆した。また、SNrからNRPvへのGABA作動性投射は筋活動抑制系の活動を調節することで、筋緊張の制御に関わっている可能性を示唆した。
肺コレクチンが有する急性肺障害制御機能の臨床応用化への橋渡し

本研究は急性肺障害でのToll様受容体(TLRs)の役割を明確にし、肺コレクチン、SP-Aによる抑制効果を臨床薬に応用する基盤的研究である。ブレオマイシン(BLM)投与SP-Aノックアウトマウスは野生型よりも死亡率が高く、肺内炎症性サイトカイン産生が増強された。BLM刺激でラット肺胞マクロファージから炎症性サイトカインが誘導され、SP-A添加で有意に抑制された。sTLR2遺伝子導入HEK293細胞では、BLM刺激でNF-kBが誘導された。BLMはsTLR2と直接結合し、それはSP-Aで阻害された。以上より、BLM誘導シグナルはTLR2依存性で、肺コレクチンはその阻害効果をもつことが示された。急性肺障害、なかでも抗がん剤等で惹起される薬剤性肺障害は臨床上重要な有害事象である。本研究では急性肺障害の増強因子としてのToll-like receptor(TLRs)の関与を明らかにし、さらにTLRsの制御因子として知られる肺コレクチン投与による障害抑制効果について検討する。H23年度に肺コレクチンKOマウスを用いた薬剤性肺障害の作成と肺障害の評価を行い、SP-A(-/-)マウスにおいて薬剤投与後早期の炎症が増悪し、さらに引き続き後期の線維化においても肺障害が増強しているものと考えられた。H24年度はさらにその機序を解明するために、肺胞マクロファージ細胞と薬剤、肺コレクチンの関係についてin vitroで検討を行った。週齢8週のSDラットの肺胞洗浄液から肺胞マクロファージを分離し、薬剤(ブレオマイシン)で刺激したところ、TNF-α、IL-1βなどの炎症性サイトカインの産生を認めた。ブレオマイシンと共にrecombinant SP-Aを細胞上清に加えたところ、これらの炎症性サイトカイン産生は抑制された。また、Razonableらの報告によるとブレオマイシンによる炎症はTLR2を介するとされるため、HEK293細胞にTLR2を遺伝子導入し、ブレオマイシンで刺激したところ、濃度依存性に炎症性サイトカインの産生を認めた。これらの結果よりブレオマイシンによる炎症性サイトカインはTLR2依存性に肺胞マクロファージから産生され、SP-Aがその制御に関与していることが示唆された。次年度に肺コレクチンのTLRsとの結合性や更なる機序の解明を行いたい。最終年度に肺コレクチンとブレオマイシンや受容体との結合を検討した。ビアコア法を用いて分子間の結合を検討すると、ブレオマイシンはsTLR2と結合しうることが分かった。またブレオマイシンはSP-Aと強く結合した。ELISA法ではブレオマイシンはsTLR2と結合したが、SP-Aによりその結合は阻害された。肺コレクチンKO

マウスを用いた薬剤性肺障害の作成と肺障害の評価を行った。週齢8週のSP-A(-/-)マウス及び野生種C57BL/6マウスに薬剤(ブレオマイシン)をマイクロポンプ使用下に皮下へ持続投与し肺障害モデルを作成した。ホルマリン固定肺組織をH-E及びE-V染色にて肺障害の程度を光顕観察した。薬剤投与21日目の肺組織において胸膜直下主体に線維化を認めた。さらに、気管支肺胞洗浄液(BALF)を細胞沈渣と上清に分離し、細胞数および細胞分画、TNF-α、TGF-βを定量した。薬剤投与7日目に好中球数の増加とTNF-αの増加を認め、SP-A(-/-)マウスでは有意に増強していた。薬剤投与14日目にSP-A(-/-)マウス群でTGF-βの増加を認めた。これらの結果はSP-A(-/-)マウスにおいて薬剤投与後早期の炎症が増悪し、さらに引き続き後期の線維化においても肺障害が増強しているものと考えられた。また、次年度に薬剤性肺障害を誘導した肺コレクチンKOマウスへの肺コレクチン投与実験を行うため、本年度においてはCHO細胞を用いてrecombinant SP-A、recombinant SP-Dを作成した。研究計画で推測した実験計画通りに実験結果が得られている。蛋白の合成など時間のかかる作業も医化学講座に提供していただくことで遅滞なく行えている。初年度、研究の基盤として最も重要な[肺コレクチンKOマウスを用いた薬剤性肺障害の作成と肺障害の評価]を行うことが出来たことで上記評価とした。薬剤性肺障害のモデルを作成する上で、ブレオマイシン、アミオダロン、ゲフィチニブなどを様々な濃度で経気道投与や皮下投与を行い、条件を設定するのに時間を要したが、最終的にブレオマイシンを用いたモデルで評価することができた。また、コレクチンの中でもSP-A(-/-)マウスで重要な知見を得ることが出来た。なかでも、薬剤投与早期のTNF-α産生増強はTLRの関与を示唆するものとして重要と考えられた。肺コレクチンKOマウスへの肺コレクチン投与実験も初年度に行う予定であったが、比較的多量の合成蛋白が必要であり、本年度は蛋白作成を行い、更なる解析は次年度に行うこととした。平成23年度、24年度に得られた結果を基にして、TLRsと薬剤や肺コレクチンの結合性について検討を進める。さらに、TLR2やTLR4のリガンドであるpeptidoglycanやlipopolysaccharideを用いてTLRsを介するTNF-αなどの炎症性サイトカイン産生に対する肺コレクチンの効果を検討する。週齢8週のSP-A(-/-)マウス、SP-D(-/-)マウス及び野生種C57BL/6マウスにSP-A、SP-Dをネブライザーにより投与し、肺障害の程度を評価する。平成23年度に得られた結果を基にして、薬剤刺激に関連したTLRs発現機序の解明を行う。薬剤投与後のSP-A(-/-)マウス、SP-D(-/-)マウス及び野生種C57BL/6マウスより回収したBALF中の肺胞マクロファージ及びマクロファージ系細胞株U937細胞(JCRB9021)におけるTLR2およびTLR4発現量を薬剤非投与マウスと比較分析する。週齢8週のSP-A(-/-)マウス、SP-D(-/-)
触媒的逐次不斉アルドール反応の開発

砂糖のような安価で安定な糖類類似の化合物群を活性化し、医薬品に頻出する1,3-ポリオール構造へと短工程で変換する反応の開発を行う。本研究の最大の課題点は、糖類の反応活性部位であるアルデヒドが分子内環化により保護されているため、これを活性化する必要がある点である。そこで私は、計算科学も用いた分子デザインにより、アミン部位を持つ新規ボロン酸誘導体が糖骨格の活性化に適することを見出した。現在は当研究室で開発済みの銅触媒不斉アルドール反応の適用を検討しており、本法の発展により従来は多段階合成の必要性から実質不可能であった1,3-ポリオール部位の構造活性相関研究が可能になると期待される。
楕円曲線に付随する岩澤加群の構造の研究

今年度も引き続き、楕円曲線の岩澤不変量の考察を行った。まず、楕円曲線の2進L関数に付随する不変量に関する木田の公式の類似を証明し、前年度までに得ていたp=2の場合のλ不変量のtwistによる変化公式の解析的版を与えた。これは岩澤主予想と両立しており、この公式を使って主予想が成立する多くの具体例も与えられる。なお、最近主予想の解決がSkinner氏とUrban氏によりアナウンスされたが、彼らの結果ではp=2の場合は扱われていない。これらの結果をまとめた論文は近々投稿予定である。続いてp=2の場合の楕円曲線のμ不変量の考察を行った。楕円曲線の2等分点がGalois加群として可約である場合の多くはGreenberg氏により考察されているが、既約である場合にはほとんど結果は知られていなかった。ここでは可約でGreenberg氏が扱ってない場合と既約の場合に、μ不変量がある代数体の一部分岐岩澤加群の構造と関連することを明らかにした。一部分岐岩澤加群は古典的な岩澤理論の研究対象となるべきものであるが、数年前に八森氏によってp=3の場合が考察されるまで、長らく扱われて来なかった。p=2の場合は実素点の影響もあり一層興味深い対象であると考えられるが、その構造についてはまだわからないことが多く残っている。それでも、2等分点が既約の場合にμ不変量を調べる手掛かりが得られたことは大きいと思われる。更にその後、p=7,13の場合にλ不変量が任意に大きな値を取り得る、という結果を証明した。pが5以下の場合には前年度までに結果を得ていたが、それとは別の方法(p等分点が可約な場合を利用)により結果を拡張できた。また、前年度の方法にFrey氏および堀江氏らの結果を追加して適用することでp=3,5の場合にはもう一段強い結果、λ不変量は任意の非負整数値を取り得る、を示すことができた。これらの結果をまとめた論文を現在執筆中である。以上により、当初計画した研究の大半は実行することができた。今年度は,まず小さい素数pに対する有理数体の円分的Z_p拡大の次数が小さい中間体で,Mordell-Weil群の階数が増えるような楕円曲線の無限族の構成に関して得られた結果を整理し,実例を具体的に与えた.更に類似の問題を有限体上の1変数有理関数体の拡大で考察し,その場合には任意のpに対して係数体のZ_p拡大の任意の中間拡大で階数が増えるような楕円曲線が構成できることを示した.代数体でも同様のことが成り立つと予想しているが,代数体と関数体の間には多くの類似があり,関数体での結果はその予想を支持する結果になっている.また,有理数体上の楕円曲線に付随するSelmer群の円分Z_p拡大でのλ,μ不変量が,楕円曲線の2次twistでどのように変化するかという問題の考察もはじめた.まずはp=2に対する不変量の変化を考察し,与えられた楕円曲線のμ不変量が0であれば,任意のtwistでもμ=0であり,更にλ不変量の変化もexplicitに記述できた.証明は2次体上でのλ,μ不変量の計算に帰着できるので,以前に八森氏との共同研究で与えた「木田の公式の楕円曲線類似」を使えば良いのであるが,もとの結果はp=2で有理数体上には適用できなかったので,その場合に適用できる形に一般化する必要があった.その証明はGalois群cohomology次元の結果が使えないため,スペクトル系列の議論を精密化するなどして行った.今年度は,Greenberg-Vatsalによる楕円曲線のSelmer群に付随する岩澤λ不変量に関する結果の類似を,素数pが2の場合に証明した.pでgood ordinary reductionを持つ有理数体Q上の楕円曲線Eに対し,円分Z_p拡大Q_∞/QでのEのSelmer群の岩澤λ,μ不変量をλ_<E,p>,μ_<E,p>と書く.そのときGreenbergとVatsalは,p【greater than or equal】3でμ_<E,p>=0という仮定の下,Galois加群としてE[p]〓E'[p]なる全ての楕円曲線E'に対してλ_<E',p>-λ_<E,p>の明示公式を与えた.(ただしE[p]はEのp等分点全体を表す.)今回得た結果はp=2の場合にも同じ公式が成り立つというものであるが,p>2の場合と異なりE[2]〓E'[2]という仮定だけでは足りず,その同型がある部分群を移しあうという条件も必要であることがわかった.(その条件が満たされない場合には公式は成り立たない.)この結果の系として,前年度に得ていた楕円曲線のtwistによるλ_<E,2>の変化を記述する公式の別証明も得られた.またp【less thanor equal】5の場合に,楕円曲線Eを動かすことでλ_<E,p>が任意に大きな値を取り得ることを具体例を構成することで示した.任意のpでそのような結果が成り立つことは,不変量μ_<E,p>に関するある予想の下でGreenbergにより示されていたが,上記のGreenberg-Vatsalの公式やtwist変化の公式を使うことで,予想を仮定することなく実例を与えることができた.更にp=2の場合にはλ_<E,2>が任意の非負整数を取り得ることもわかった.今年度も引き続き、楕円曲線の岩澤不変量の考察を行った。

まず、楕円曲線の2進L関数に付随する不変量に関する木田の公式の類似を証明し、前年度までに得ていたp=2の場合のλ不変量のtwistによる変化公式の解析的版を与えた。これは岩澤主予想と両立しており、この公式を使って主予想が成立する多くの具体例も与えられる。なお、最近主予想の解決がSkinner氏とUrban氏によりアナウンスされたが、彼らの結果ではp=2の場合は扱われていない。これらの結果をまとめた論文は近々投稿予定である。続いてp=2の場合の楕円曲線のμ不変量の考察を行った。楕円曲線の2等分点がGalois加群として可約である場合の多くはGreenberg氏により考察されているが、既約である場合にはほとんど結果は知られていなかった。ここでは可約でGreenberg氏が扱ってない場合と既約の場合に、μ不変量がある代数体の一部分岐岩澤加群の構造と関連することを明らかにした。一部分岐岩澤加群は古典的な岩澤理論の研究対象となるべきものであるが、数年前に八森氏によってp=3の場合が考察されるまで、長らく扱われて来なかった。p=2の場合は実素点の影響もあり一層興味深い対象であると考えられるが、その構造についてはまだわからないことが多く残っている。それでも、2等分点が既約の場合にμ不変量を調べる手掛かりが得られたことは大きいと思われる。更にその後、p=7,13の場合にλ不変量が任意に大きな値を取り得る、という結果を証明した。pが5以下の場合には前年度までに結果を得ていたが、それとは別の方法(p等分点が可約な場合を利用)により結果を拡張できた。また、前年度の方法にFrey氏および堀江氏らの結果を追加して適用することでp=3,5の場合にはもう一段強い結果、λ不変量は任意の非負整数値を取り得る、を示すことができた。これらの結果をまとめた論文を現在執筆中である。以上により、当初計画した研究の大半は実行することができた。
多形核白血球及び甲状腺細胞におけるス-パ-オキシドアニオン生成系の精製と分子機構

1.好中球のO_2生成系まずO_2生生糸(NADPH酸化酵素)の活性化機構、O_2生成機構等の分子機構を解析するための無細胞実験系を開発した。この系において、従来用いられてきたシス不飽和脂肪酸以外にトランフ不飽和脂肪酸や飽和脂肪酸も活性化に有効であること、そのいずれの場合にも細胞質画分中のタンパク因子(細胞質因子)が活性化に必要であることを見い出した。そしてこの活性化過程は可逆的であり、脂肪酸の持続的存在によって細胞質因子の作用が継続し本酸素の活性化状態が維続される機構を明らかにした(以上J.B.C.263巻に報告した)。次に細胞質因子の精製を試みた。この因子が共存の必要な複数の成分から成ることを見い出し、うち一成分をほぼ均一に精製した。同成分は分子量約6万のサブユニットから成る分子量的17万のタンパクで、ヘムやフラビンを含まず、O_2生成系の電子伝達系成分とは考えにくい性質を示した。さらに同成分は無傷好中球をある特定の刺激(モノ不飽和脂肪酸など)で活性化した際に膜画分へ移行し、刺激剤の違いにより活性化機構が異なることが示唆された。他のO_2生成系成分や細胞質因子について現在精製を進めている。2.甲状腺のO_2生成系本研究では我々が開発した新しい活性酸素定量法を用いて、甲状腺炉胞細胞の過酸化水素供給系が実はO_2を初生成物とするO_2生成酵素であることを初めて明らかにした。さらに無傷細胞ではO_2ではなく過酸化水素が放出されること、瀘胞細胞は好中球より著しく高くス-パ-オキシドディスムタ-ゼ活性を持つことを明らかにし、初生成されたO_2が速やかに過酸化水素に変換された後生理的に利用されるという機構を見い出した。現在このO_2生成系の精製を試みている。1)多形核白血球のO^-_2生成系の部分精製と性質の解明。ブタ好中球より無細胞系の調整に成功し,その解析を行った。即ち、好中球のO^-_2生成(NADPHオキシダーゼ)系はこれまで無傷細胞系においてのみ活性化が可能であり、無細胞系では賦活出来なかったためその精製と解析が阻まれていた。我々はブタ好中球に種々の活性化剤を適用して無細胞系における賦活化を検討し、C_<12>C_<18>の飽和およびモノ不飽和直鎖脂肪酸が無細胞標品(ホモジネート)中のO^-_2生成系を可逆的に活性化することを見出しこれを記載した(J.Biol.chem.263)。さらにその活性化機構を追究したところ、脂肪酸と形質膜画分に加えて可溶性画分に含まれるタンパク性の因子が必要であり、且つ一回の活性化過程でその活性が消失することから、この因子は膜画分に移行するかあるいは消費されることを推論した。従来、脂肪酸による多形核白血球O^-_2生成系の活性化はcis-ポリ不飽和脂肪酸にのみに限られるとされており、cis-不飽和脂肪酸の挿入による膜の流動化に帰せられていたが今回の我々の知見はこれとは異なる視点を要求する。このタンパク性因子を精製したところ、さらに二つの成分にわかれ、膜標品の脂肪酸による活性化には両成分とも必須であった。2)甲状腺細胞におけるO^-_2生成系について。ブタ甲状腺より濾胞膜標品を調整しそのO^-_2生成系を解析したところ、好中球と同じくNADPHを電子供与体とし、さらにカルシウムおよびATPを要求するユニークな系であることが判明した。

反応産物としてはO^-_2のみを生じ、H_2O_2の直接生成は見られなかった(J.Biol.chem.264in press)。この事実は形質膜表面におけるO^-_2の積極的生成が多形核白血球に限られた現象ではなく、従来考えられたよりは普遍的な細胞属性であることを示唆する。好中球のO^-_2生成系については、その活性化に必須な因子である細胞質因子の精製を行った。塩濃度47mMに調製したDEAEセルロ-スにより、同因子を活性化のためには共存の必要な最低2つの成分に分離できることを見い出した。そこでまず同セルロ-スに吸着する因子について精製を試みた。高速陰イオン交換クロマドグラフィなどにより精製した本因子は、SDS電気泳動上分子量約6万、ゲル濾過クロマトグラフィ上では同じく約17万を示し、オリゴマ-構造であると考えられた。また、精製標品にはヘムやフラビンは検出されなかった。この精製細胞質因子に対する抗体を作製し、イムノブロット法により活性化過程における同因子の挙動を解析した。活性化の前後において本因子の分子量は変化しなかったが、ある特定の刺激剤により好中球を刺激した際に本因子の膜画分への移行が顕著に認められた。この現象について現在詳細な検討を進めている。一方、塩濃度47mMにおいてDEAEセルロ-スに吸着しない細胞質因子については、高速陽イオン交換クロマトグラフィなどにより部分精製標品を得ているが、分子量等を特定できる段階にはまだ至っていない。甲状腺のO^-_2生成系については、本年度は無傷濾胞細胞の解析を行った。細胞をカルシウムイオノフォアやATP等により刺激した際に細胞外に放出される活性酸素種を同定したところ、全て過酸化水素であった。同細胞のス-パ-オキシドディスムタ-ゼ(SOD)活性は好中球の十倍以上の高値であることから、本系の初生成物として産生されたO^-_2がSODの作用により速やかに過酸化水素に不均化され、濾胞腔内での甲状腺ホルモンの生合成過程に利用されることが考えられた。現在このO^-_2生成系の精製と、細胞レベルにおける活性調節機構を解析中である。
中世宋様式の導入と伝播に関する研究 〜北京律僧の活動を中心として〜

超果寺の立地俊〓が8年間寄寓した超果寺(超果教院)跡は、上海市松江県の松江第一中学校の敷地となっており、仏寺の痕跡をまったく留めていないことを確認した。現地の古老によれば、破壊前の超果寺には、巨大な仏殿が2、3棟あって巨大な仏像が祀られていたという。超果寺は運河が巡らされた平野部に立地し、十六観堂のような池を備えた庭園を造るのに適している。旧超果寺寺地の西方には、17世紀に造られた酔白池という庭園があるが、あるいは超果寺内の庭園を再開削したものではなかろうか。このような立地は、南宋五山に列せられた霊隠寺、天童寺などが、山間部の谷地形を利用しながら池を穿つ構成とはまったく異なる。超果寺と同じ天台教院である上・中・下の各天竺寺も同様に谷地形を利用した立地で、十六観堂があった上天竺寺も、広い庭園を造るのに適した立地とは言い難い。したがって天台教院が必ずしも平野部に立地するとは言えない。大伽藍を平野部の水郷地帯に造る超果寺のような立地条件は、日本では得がたく、寺院の敷地や庭園を含めた宋様式の伝播については、今後、さらなる追究が必要である。宋様式の伝播・導入の様相現存遺構からみて、当時の入宋僧は、石塔や磚身木檐塔を含む塔を比較的よく目にしたはずである。これらの塔は上層に登る構造をもつが、このような技術は日本に伝播しなかった。ここから宋様式の伝播・導入は全般として選択的におこなわれたことは間違いない。個々の建築様式でも、室生寺御影堂の木製礎盤や同寺本堂(灌頂堂)は軒反りなどは選択的な導入であり、室生寺再興の経過からその根本は北京律僧に由来するとみられる。したがって、宋様式の伝播・導入は、入宋僧や来朝僧・技術者の活発な往来のなかで、比較的多様な様式・技法がもたらされ、そのなかで選択的に採り入れられたと考えられる。大仏様はその一典型であり、北京律僧は、現在、禅宗様とよんでいる様式の伝播・導入に関与していたのである。泉涌寺長老と北京律僧入宋を果たした北京律僧には、泉涌寺開山の俊〓をはじめ、戒光寺開山の浄業、仏牙舎利を請来した湛海、泉涌寺第4世長老の智鏡らがいる。重源や栄西に代表されるように、鎌倉時代初期の入宋僧は教団を形成することがほとんどない。そのなかで、北京律僧が泉涌寺や戒光寺を中心とし、入宋僧集団ともいうべきまとまりを形成していたことは改めて注目される。泉涌寺第3世の定舜は、南都海竜王寺に招かれて泉涌寺の規式による講義をおこなっており、泉涌寺僧が南都教学の指導的な立場にあったことが知れるが、西大寺叡尊の『感身学生記』によれば、これは宋風の強いものであった。このように、入宋僧を抱える北京律教団は、宋文化を移入させ、また指導的な立場にあったことで、国内の宋様式の伝播にも多大な影響力をもったと推定される。泉涌寺伽藍の特徴泉涌寺の中心伽藍は俊〓の残した勧進疏などにより、宋様式の強いことが知られている。これまで中央伽藍のみ注目されてきた感があるが、俊〓の目指した伽藍は、『造泉涌寺勧進疏』の「観堂教庠前後分措」という語から読み取れるように、十六観堂と中心伽藍の2つを並立させるものであった。その具体的な建築については、『東林十六観堂勧進疏』と『泉涌寺殿堂房寮色目』に記している。この十六観堂をもつ点が泉涌寺伽藍の特徴の一つだろう。泉涌寺古図の建築室町時代に描かれた泉涌寺古図を検証できる史料が、金沢文庫に残る元亨4年の泉涌寺真言院の指図である。指図によれば、真言院は南北棟で「シトミ」、「ツマト」などの書き込みが見え、住宅風の建築だったようだが、これはおおむね泉涌寺古図に描かれた真言院と一致する。したがって泉涌寺古図にみえる伽藍建築は、少なくとも鎌倉末期の様相を残していると解釈することも不可能でないことが判明した。宋における入宋僧の活動入宋僧が訪れたのは、南宋五山などで当時盛んだった禅宗の寺が多く、それらが多数存在した西湖周辺の臨安府(杭州)や四明(寧波)であった。北京律僧の俊〓が12ヶ年の入宋中8年を過ごしたのは、これらより北に位置する松江府(現上海市松江県)の超果教院である。超果教院は天台教学の専門寺院であり、このような天台教院では、四明の延慶寺で11世紀末に創建された十六観堂の信仰が深まっていた。北京律僧の湛海が門廊殿閣を再建したという白蓮教寺とは、延慶寺であった可能性が大きく、湛海が将来したと伝えられ、現在の泉涌寺でも信仰の篤い仏牙舎利は、延慶寺が所蔵していた仏舌舎利と呼ばれるものだったとみられる。宋における寺院と建築の様相俊〓が滞在した超果教院は、俊〓の遺文にもあるように超果寺天台教院という。

中国の史料『至元嘉禾志』(1284年成)によれば、超果寺は唐代に則天武后が建てた長寿寺の後身であり、詩に詠まれる見遠亭という建物があった。また、遺文から超然閣という建物が存在したことが知れ、時代がやや下るが、『江南通史』(1737改訂)によれば、鴛鴦殿、一覧楼、両花堂、見遠亭、西来堂などの建物があり、さらに瑞光井や石假山がある風光明媚な寺だったらしい。超果寺には十六観堂はなかったようだが、『至元嘉禾志』によれば、超果寺の近辺には、延慶教院や真如教院という十六観堂をもつ寺院があった。俊〓が立ち寄った下天竺寺に近い上天竺寺にも十六観堂があり(『宝慶四明志』)、泉涌寺の伽藍は、当時盛んだった禅寺と十六観堂の気風を全面に取り入れたものだったと理解できる。なお、『松江縣志』によると、超果寺は1949年頃まで存在したらしいが、現状では寺院の建物はほとんど失われたようだ。諸々の理由から、渡航による現地調査は中止せざるをえなかった。超果寺の立地俊〓が8年間寄寓した超果寺(超果教院)跡は、上海市松江県の松江第一中学校の敷地となっており、仏寺の痕跡をまったく留めていないことを確認した。現地の古老によれば、破壊前の超果寺には、巨大な仏殿が2、3棟あって巨大な仏像が祀られていたという。超果寺は運河が巡らされた平野部に立地し、十六観堂のような池を備えた庭園を造るのに適している。旧超果寺寺地の西方には、17世紀に造られた酔白池という庭園があるが、あるいは超果寺内の庭園を再開削したものではなかろうか。このような立地は、南宋五山に列せられた霊隠寺、天童寺などが、山間部の谷地形を利用しながら池を穿つ構成とはまったく異なる。超果寺と同じ天台教院である上・中・下の各天竺寺も同様に谷地形を利用した立地で、十六観堂があった上天竺寺も、広い庭園を造るのに適した立地とは言い難い。したがって天台教院が必ずしも平野部に立地するとは言えない。大伽藍を平野部の水郷地帯に造る超果寺のような立地条件は、日本では得がたく、寺院の敷地や庭園を含めた宋様式の伝播については、今後、さらなる追究が必要である。宋様式の伝播・導入の様相現存遺構からみて、当時の入宋僧は、石塔や磚身木檐塔を含む塔を比較的よく目にしたはずである。これらの塔は上層に登る構造をもつが、このような技術は日本に伝播しなかった。ここから宋様式の伝播・導入は全般として選択的におこなわれたことは間違いない。個々の建築様式でも、室生寺御影堂の木製礎盤や同寺本堂(灌頂堂)は軒反りなどは選択的な導入であり、室生寺再興の経過からその根本は北京律僧に由来するとみられる。したがって、宋様式の伝播・導入は、入宋僧や来朝僧・技術者の活発な往来のなかで、比較的多様な様式・技法がもたらされ、そのなかで選択的に採り入れられたと考えられる。大仏様はその一典型であり、北京律僧は、現在、禅宗様とよんでいる様式の伝播・導入に関与していたのである。
実験・演習科目に特化した外国人留学生のための学習支援システムに関する研究

日本語能力が高くない留学生に,大学での学習を継続するために必要な知識を獲得したり,経験を積むことができるような支援システムの開発を行った.まず,技術用語の検索システムとそれを簡便に利用するためのシステム開発を行った.次に,コンピュータでリアルタイムに生成したグラフィックスなどを、Webカメラで取得した動画像の上に重畳することができる,学習コンテンツの開発を行った.また,オーサリングツールと連携して動作する,ホワイトボードなどの周辺ツールの開発を行った.昨年度の検討と試作の結果に基づき、電子工学系の演習・実験科目用コンテンツの開発とその改良を行った。Webブラウザ内でリアルタイムに生成するグラフィックスの重畳だけでなく、音声や動画のマルチメディア情報を指定した位置に重畳できるようにすることで、コンテンツの更なる教育効果の向上を図った。一方で、処理速度の低下が一部に見られたため、座標変換処理ルーティンの見直しや再計算の対象領域の判定を加えることで、5年前に発売されたノートPCのような、現在では低スペックとなったコンピュータであっても十分実用的な処理速度を確保することができた。これと並行して、これまではXML形式での記述が必要だったオブジェクトの重畳位置の指定をGUIで実現することでコンテンツの作成時間を軽減するオーサリングツールの試作も行った。このオーサリングツールはHTML5とJavaScriptで開発中であり、WebブラウザとWebカメラ(リモートに設置したものでも利用可能)があれば、使用する機種やOSを問わず、コンテンツの開発や修正を行う事が出来る。これらの成果は、随時日本教育工学会第27回全国大会(長崎大学)や教育システム情報学会学生研究発表会(琉球大学)等で報告を行った。また、オーサリングツールの開発や日本語を母国語としない学習者に対する日本語表記の方法について、国際会議(ED-Media 2012など)で報告し諸外国の研究者らと議論を行った。昨年度より行ってきた、HTML5を利用したオーサリングツールの開発を行った。Google Driveに対応させることで、作成したコンテンツの共有や再利用を容易にすると共に、Web RTC(Real-Time Communication)を利用して、遠隔地の静止画像や動画像取り込みを可能にすることで、場所を選ばずにコンテンツ開発ができるようになった。この他にも、プロトタイプでのコンテンツ作成実験を繰り返し、利用者からの様々な意見を得て、ユーザインタフェースの大規模な変更や、タッチスクリーンでの操作が中心となるスマートディバイスでの利用を前提とした、インタフェースの改良を行った。さらに、複数のコンテンツ作成者による共同作業を円滑にするよう、オーサリングツールと連係して動作するホワイトボードを中心とした、コミュニケーションツールの開発を行った。これらの成果は、日本教育工学会の全国大会等で報告を行っている。また、ベトナムハノイにあるベトナム国家大学ハノイ校(Vietnam National University, Hanoi)のハノイ工科大学(Vietnam National University Hanoi College of Technology)の協力を得て、作成したオーサリングツールの試用と実践に向けた準備を行うと共に、国外留学の経験がある現地スタッフからベトナムにおける技術教育の現状や、留学先での技術習得での問題点などのヒアリングを行った。なお、これらの成果は、今後行われる関連学会の研究会や大会等で報告する予定である。日本語能力が高くない留学生に,大学での学習を継続するために必要な知識を獲得したり,経験を積むことができるような支援システムの開発を行った.まず,技術用語の検索システムとそれを簡便に利用するためのシステム開発を行った.次に,コンピュータでリアルタイムに生成したグラフィックスなどを、Webカメラで取得した動画像の上に重畳することができる,学習コンテンツの開発を行った.また,オーサリングツールと連携して動作する,ホワイトボードなどの周辺ツールの開発を行った.本年度は電子工学系の初年度教育にフォーカスを当て、オシロスコープやファンクションジェネレータなどの機器を使用する実験科目でのコンテンツ開発の検討を行った。具体的には、電子工学実験等の実験科目での実験環境や指導の現状を調査、分析することで、実験教室内でのe-Learningコンテンツの活用方法について検討すると共に、それに基づいたコンテンツの試作を行った。このコンテンツ作成の試みとして、Webカメラと画像処理技術を利用したeラーニングコンテンツを作成した。このコンテンツによって、コンテンツ内にWebカメラから取り込んだ学生が実際に操作を行う各機器上に、ヒントや操作説明などの教授内容を重畳して提示することができるようになった。また、マイクロブログとして有名なtwitterを用いた、学生の状況把握を行うためのツールの開発にも着手した。まだ試作の開発を行っている段階ではあるが、上述のコンテンツを利用して、学生の操作状況や記述内容の参照状況等のデータを収集し、そこから学生が躓いたり停滞したりしているか、あるいは完了して時間をもてあましているかどうかを自動的に判断し、その状況をtwitterで教員やTAに知らせるものである。これらの研究成果は国内外の教育工学に関する国際会議(EISTA2011, ICCE2011など)、研究会(電子情報通信学会教育工学研究会など)、全国大会(日本教育工学会、教育システム情報学会など)で報告をした。オブジェクトの重畳処理の高速化やオーサリングツールの試作版開発が進み、試用に基づく評価を早い段階で行う事が出来た。それによって、国際会議での発表が可能となり、海外の研究者らとの意見交換やアドバイスを頂戴する事が出来たため、より一層研究を進展させることができた。コンテンツの試作を行ったものの、学生への影響や授業への影響等々の問題もあり、開発したコンテンツの実践評価が行えない状況にある。予備実験を重ね、コンテンツの信頼性を高める努力をしているが、実践の場の確保が非常に難しく、海外にも範囲を広げ協力先を求めている段階である。

低スペックのPCで、十分な応答速度が得られることが試験運用より確認できたため、今後発展途上国での普及が見込まれているFirefox OS上で動作するよう、改良を行っていく。さらに、Firefox OSを含めいわゆるスマートディバイスやPCなど様々な端末からの利用に柔軟に対応できるよう、システムの改良を重ねていく。その過程で、リアルタイムで学習者の作業をカメラで把握できる、という特長を活かし、遠隔地にいる教授者の指示をここの学習者に送信する仕組みを検討・実現する予定である。試作したコンテンツの評価を行い、その結果を反映させたコンテンツの開発を行う。その一方で、現在のコンテンツ開発には多くの手間やある程度の専門知識を必要とするので、コンテンツの作成を支援するオーサリングツールの開発を行う。また、日本語が得意ではない留学生に対して、コンテンツ内の説明を補足するためのシステムを組み入れた、より新しいコンテンツの開発に取り組む。さらに、これまではPCでの利用を前提としていたが、昨今のタブレットPC等の普及を鑑み、タブレット上で動作するコンテンツの試作を行う。遠隔地からの技術指導を行うために、中継サーバを1台ないし2台を購入する予定である。また、システム開発や運用試験に伴って謝金を使用する予定である。この他、成果発表などのために国内外の研究会や大会等に参加する予定であり、随時旅費を使用する。授業内での実践にはWebカメラが履修者分必要となる。また、コンテンツを配備するサーバが必要であるため、実践を行う目処が立った時点で、速やかにこれらを物品費から購入する予定である。実践のための補助やシステムのチューニングなどで、謝金も使用する予定である。また、成果発表や情報・意見交換のために、国内外の研究会、大会、国際会議などに出席する予定であり、随時旅費を使用する。
運動神経細胞における運動時の神経栄養因子シグナル伝達に及ぼす支配筋特異性の影響

本研究では,特定の筋を支配する運動神経細胞を逆行性に同定することによって,運動による神経栄養因子のシグナル伝達経路を単一運動神経細胞レベルで検討するとともに,支配筋によってシグナル伝達に相違が認められるかどうかについて検討することを目的とする.19年度は,運動条件の相違によって両筋でリン酸化の程度が異なるかどうかを支配筋別に確認することを目的とした.成熟したWistar系雄性ラットの左脚ヒラメ筋と右脚足底筋に逆行性神経標識物質であるNuclear Yellow(2%濃度)を1020μl注入し,約24時間後に乳酸性作業閾値以下のスピード(10m/min)と乳酸性作業閾値以上のスピード(25m/min)でランニングを30分間実施した.終了後に断頭屠殺し,脊髄を摘出後,厚さ12μmの連続凍結切片を作製し,蛍光顕微鏡により運動神経細胞を同定した.切片にはTrkB,p-Trk抗体による免疫染色を施した.その結果、ヒラメ筋,足底筋の支配運動神経細胞ともにTrkB,p-Trkの染色反応が認められ,運動によるTrkBのリン酸化が確認された.また,ヒラメ筋支配運動神経細胞では運動強度による染色反応の相違がほとんど認められず,一方,足底筋支配運動神経細胞では運動強度の増加とともに染色反応が増加する傾向にあった.これらの結果から,両筋でリン酸化の程度が異なるとともに,さらにリン酸化の程度が運動強度に影響されることが示唆された.一過性の運動時に、脊髄において受容体と結合した神経栄養因子の増加と受容体のリン酸化が生じる。しかし、脊髄内には運動神経細胞だけではなく、他の細胞が多数存在しており、脊髄における受容体のリン酸化が運動神経細胞で生じているかどうかは明らかではない。また、脊髄内には支配筋の異なる運動神経細胞が点在しており、支配筋による影響も明らかではない。本研究では、特定の筋を支配する運動神経細胞を逆行性に同定することによって、運動による神経栄養因子のシグナル伝達経路を単一運動神経細胞レベルで詳細に検討するとともに、支配筋によってシグナル伝達に相違が認められるかどうかについて検討することを目的とする。平成17年度の研究目的は、特定の筋を支配する運動神経細胞を同定し、それらの細胞における神経栄養因子の発現を確認することにあった。6ヶ月齢のWistar系雌性ラットの左脚ヒラメ筋に逆行性神経標識物質であるNuclear Yellow(2%濃度)を15μl注入した。約24時間後に断頭屠殺し、脊髄を摘出後、クリオスタットを用いて厚さ15μmの凍結切片を作製した。奇数切片は蛍光顕微鏡によりヒラメ筋の運動神経細胞の同定に、偶数切片は脳由来神経栄養因子(BDNF)抗体を用いた免疫染色に使用した。その結果、ヒラメ筋を支配するすべての運動神経細胞の細胞体に強いBDNFの染色反応が認められた。さらに、その染色反応を半定量化したところ、細胞体の大きさと染色濃度は負の相関関係を示す傾向にあったが、有意なものではなかった。今後、この方法を用いて、さらに詳細な検討を実施する予定である。一過性の運動時に,脊髄において受容体と結合した神経栄養因子の増加と受容体のリン酸化が生じる.しかし,脊髄内には運動神経細胞だけではなく,他の細胞が多数存在しており,脊髄における受容体のリン酸化が運動神経細胞で生じているかどうかは明らかではない.また,脊髄内には支配筋の異なる運動神経細胞が点在しており,支配筋による影響も明らかではない.本研究では,特定の筋を支配する運動神経細胞を逆行性に同定することによって,運動による神経栄養因子のシグナル伝達経路を単一運動神経細胞レベルで詳細に検討するとともに,支配筋によってシグナル伝達に相違が認められるかどうかについて検討することを目的とする.平成18年度は,ヒラメ筋と足底筋を支配する運動神経細胞において,一過性の運動により,BDNFの受容体であるTrkBのリン酸化が生じるかどうかを確認した.成熟したWistar系雄性ラットの左脚ヒラメ筋と右脚足底筋に逆行性神経標識物質であるNuclear Yellow(2%濃度)を1020μ9注入し,約24時間後に乳酸性作業閾値のスピードでランニングを60分間実施した.終了後に断頭屠殺し,脊髄を摘出後,厚さ12μmの連続凍結切片を作製し,蛍光顕微鏡により運動神経細胞を同定した.切片にはTrkB, p-Trk抗体による免疫染色を施した.その結果、ヒラメ筋,足底筋の支配運動神経細胞ともにTrkB, p-Trkの染色反応が認められ,運動によるTrkBのリン酸化が確認された.また,ヒラメ筋支配運動神経細胞よりも足底筋支配運動神経細胞の染色反応が強い傾向にあり,両筋でリン酸化の程度が異なる可能性が示唆された.今後,さらに運動条件の相違や下流のシグナル伝達経路について検討を実施する予定である.

本研究では,特定の筋を支配する運動神経細胞を逆行性に同定することによって,運動による神経栄養因子のシグナル伝達経路を単一運動神経細胞レベルで検討するとともに,支配筋によってシグナル伝達に相違が認められるかどうかについて検討することを目的とする.19年度は,運動条件の相違によって両筋でリン酸化の程度が異なるかどうかを支配筋別に確認することを目的とした.成熟したWistar系雄性ラットの左脚ヒラメ筋と右脚足底筋に逆行性神経標識物質であるNuclear Yellow(2%濃度)を1020μl注入し,約24時間後に乳酸性作業閾値以下のスピード(10m/min)と乳酸性作業閾値以上のスピード(25m/min)でランニングを30分間実施した.終了後に断頭屠殺し,脊髄を摘出後,厚さ12μmの連続凍結切片を作製し,蛍光顕微鏡により運動神経細胞を同定した.切片にはTrkB,p-Trk抗体による免疫染色を施した.その結果、ヒラメ筋,足底筋の支配運動神経細胞ともにTrkB,p-Trkの染色反応が認められ,運動によるTrkBのリン酸化が確認された.また,ヒラメ筋支配運動神経細胞では運動強度による染色反応の相違がほとんど認められず,一方,足底筋支配運動神経細胞では運動強度の増加とともに染色反応が増加する傾向にあった.これらの結果から,両筋でリン酸化の程度が異なるとともに,さらにリン酸化の程度が運動強度に影響されることが示唆された.
線条体patchニューロンのネットワーク解析

パーキンソン病やハンチントン病の病変主座である大脳基底核の入力部位は線条体であり、ここにはパッチ・マトリックスという解剖学的なコンパートメントが存在することが知られている。しかし線条体の入出力に関してこのコンパートメントでどのような違いがあるのかは未だ明確にされていない。例えば、入力に関しては各コンパートメントに特異的に入力する大脳皮質領野はわかっているものの視床からの入力パターンの違いはわかっていない。また出力に関しては教科書的にも、直接路・間接路のニューロンともにパッチにもマトリックスにも約半々の割合で分布しており、しかしパッチからの出力は黒質緻密部のドーパミンニューロンであろうという曖昧な記述しかなされていない。この曖昧さの理由として、従来のトレーサー実験では入力元の全てをラベルすることが不可能なこと、また逆に一つのニューロンのみをラベルできずニューロン単位での出力先を追えなかったことが挙げられる。この問題を克服するため、我々はまず入力に関しては、大脳皮質-線条体投射系と視床-線条体投射系の全てを、2種類のシナプス小胞性グルタミン酸トランスポーター(VGluT1,VGluT2)で識別しうることを先行研究(Fujiyama et al., Eur, J.Neurosci., 2004)で明らかにした。このVGluTに対する抗体を用いた免疫組織化学と、パッチに特異的に強く発現するμ-opioid受容体との免疫組織化学(Kaneko et al., 1995)を組み合わせ共焦点顕微鏡および電子顕微鏡による解析を行った。これにより、大脳皮質終末はパッチおよびマトリックスニューロンの樹状突起のスパインにほぼ同程度入力するのに対し、視床終末はマトリックスに比べパッチへの入力が少なく、マトリックスでは樹状突起のシャフトに、パッチではスパインにとシナプスの相手をも替えていることがわかった(Fujiyama et al., submitted)。
筋幹細胞生物学を基盤とした筋線維型制御機構の先駆的理解と栄養機能学的調節

動物の出生後の筋成長過程での筋線維型制御に筋幹細胞(衛星細胞)合成・分泌因子semaphorin 3A (Sema3A)が関与しているかを直接的に調べるため、衛星細胞特異的Sema3A-cKOマウスの表現型解析を行った。前年度までの結果に基づき、筋の初期成長期にあたる1週齢でタモキシフェンを腹腔に投与しSema3A発現をcKOした後、成熟期の15週齢まで飼育した。対照区のSema3A-loxPマウスにもタモキシフェンを同様に投与した。両群から回収した後肢下腿部の筋(ヒフク筋、ヒラメ筋)を抗myosin重鎖アイソフォーム抗体で4重蛍光免疫染色し、筋線維型組成(遅筋型筋線維、速筋型(IIa, IIx, IIb型)筋線維の相対比)を測定した。タモキシフェン投与を開始した1週齢では、期待通り、いずれの筋においても両群間で筋線維型組成に有意な差は認められなかった。一方、15週齢でヒラメ筋(遅筋型筋線維が極めて優勢な筋)の筋線維型組成を比較したところ、Sema3A-cKO群で遅筋型筋線維の割合が劇的に低下し、速筋型(IIb型)筋線維が代替的に増加することが認められた。同筋肉組織のmyosin重鎖アイソフォームおよび筋線維型関連因子(myoglobin, porin, myogeninとMEF2D)のmRNA発現解析の結果は上記の結果を指示するものであった。以上の結果から、マウスの初期筋成長期において、衛星細胞が合成・分泌するSema3Aは遅筋型筋線維の形成を誘導する重要な因子であることが分かった。また、新たに作出した「衛星細胞の高純度初代培養系」を用いて、リンゴポリフェノール(種々のポリフェノールの混合物)からSema3A細胞膜受容体(neuropilin2-plexinA3複合体)のアゴニスト活性を有すると考えられる単一成分1種を見出した。「研究実績の概要」で前述した通り、衛星細胞特異的Sema3A-cKOマウスを用いたin vitroおよびin vivo実験により、筋幹細胞(衛星細胞)が合成・分泌するSema3Aは遅筋型筋線維の形成誘導に関わる鍵因子であることが明確になった。また、筋損傷・再生時と同様に筋の初期成長期においても、Sema3A依存的なシグナリング軸にmyogeninとMEF2Dが関与していることも推測された。更には、このSema3Aリガンドを受容する細胞膜受容体(neuropilin2-plexinA3複合体)のアゴ二スト活性を有すると考えられる食品成分として、リンゴ幼果皮由来のポリフェノールから単一成分1種を見出した。従って、予定した実験計画の主要な項目は概ね良好に実施されたと言える。学術的にインパクトのある大きな成果としてまとめるため、前年度に引き続き更に研究データを蓄積することが必要と認識している。前述の通り、後肢下腿部の代表的な筋であるヒフク筋およびヒラメ筋(遅筋型筋線維が優勢な筋)において、筋幹細胞(衛星細胞)合成・分泌因子semaphorin 3A (Sema3A)依存的シグナリング機構によって遅筋型筋線維の形成が誘導されることをほぼ実証することがきたので、この新奇分子機構を更にハイライトするための補強実験データを得るよう努める。また、食品機能学的成果をさらに発展させるため、アゴニスト活性を有する単一食品成分を更に検索する予定である。Sema3A-cKOマウスおよび野生型マウスを用いた給餌実験を行い、筋の初期成長期におけるSema3A依存的な遅筋型筋線維形成機構の食品機能学的制御に向けた基盤整備を行う予定である。筋成長期にあたる3週齢でタモキシフェンを腹腔に投与しSema3A発現をcKOした後、成熟期の15週齢まで飼育した。先ず、3週齢のマウスから衛星細胞を単離・培養し幼弱な筋線維を調製した後、筋線維型関連因子のmRNAおよびタンパク質の発現を比較した。Sema3A-cKOにより遅筋型myosin重鎖の発現が有意に低下する一方、速筋型myosin重鎖(IIb)の発現が増加することが認められた。また、Sema3A依存的シグナリング軸を構成すると予想したmyogeninとMEF2Dの発現は低下した。次に、15週齢で両群から回収した後肢下腿部の筋(ヒフク筋、足底筋、ヒラメ筋)を抗myosin重鎖アイソフォーム抗体で4重蛍光免疫染色し、筋線維型組成(遅筋型・速筋型筋線維(IIa, IIx, IIb)の相対比)を測定した。ヒフク筋の外側部および内側部(遅筋型筋線維が多く存在する領域)の筋線維型組成を比較したところ、Sema3A-cKO群で遅筋型筋線維の割合が有意に低下し、速筋型(IIb型)筋線維が代替的に増加することが認められた。以上の結果から、筋成長期において、衛星細胞が合成・分泌するSema3Aは遅筋型筋線維の形成を誘導する重要な因子であり、そのシグナリング軸にmyogeninとMEF2Dが関与していることが分かった。

一方、足底筋やヒラメ筋では、Sema3A-cKOによって筋線維型組成に有意な変化は観察されなかったことから、3週齢より前の時期でSema3Aがより強く機能していると予想された。「研究実績の概要」で前述した通り、衛星細胞特異的Sema3A-cKOマウスを用いたin vitroおよびin vivo実験により、筋幹細胞(衛星細胞)が合成・分泌するSema3Aは遅筋型筋線維の形成誘導に関わる鍵因子であることが明確になった。また、筋損傷・再生時と同様に筋成長期においても、Sema3A依存的なシグナリング軸にmyogeninとMEF2Dが関与していることも推測された。更には、このSema3Aリガンドを受容する細胞膜受容体としてneuropilin2-plexinA3複合体を同定した他、そのアゴ二スト活性を有する食品成分としてリンゴ果皮由来のポリフェノールを見出した。従って、初年度に予定した実験計画1, 2, 3の主要な項目は概ね良好に実施されたと言える。動物の出生後の筋成長過程での筋線維型制御に筋幹細胞(衛星細胞)合成・分泌因子semaphorin 3A (Sema3A)が関与しているかを直接的に調べるため、衛星細胞特異的Sema3A-cKOマウスの表現型解析を行った。前年度までの結果に基づき、筋の初期成長期にあたる1週齢でタモキシフェンを腹腔に投与しSema3A発現をcKOした後、成熟期の15週齢まで飼育した。対照区のSema3A-loxPマウスにもタモキシフェンを同様に投与した。両群から回収した後肢下腿部の筋(ヒフク筋、ヒラメ筋)を抗myosin重鎖アイソフォーム抗体で4重蛍光免疫染色し、筋線維型組成(遅筋型筋線維、速筋型(IIa, IIx, IIb型)筋線維の相対比)を測定した。タモキシフェン投与を開始した1週齢では、期待通り、いずれの筋においても両群間で筋線維型組成に有意な差は認められなかった。一方、15週齢でヒラメ筋(遅筋型筋線維が極めて優勢な筋)の筋線維型組成を比較したところ、Sema3A-cKO群で遅筋型筋線維の割合が劇的に低下し、速筋型(IIb型)筋線維が代替的に増加することが認められた。同筋肉組織のmyosin重鎖アイソフォームおよび筋線維型関連因子(myoglobin, porin, myogeninとMEF2D)のmRNA発現解析の結果は上記の結果を指示するものであった。以上の結果から、マウスの初期筋成長期において、衛星細胞が合成・分泌するSema3Aは遅筋型筋線維の形成を誘導する重要な因子であることが分かった。また、新たに作出した「衛星細胞の高純度初代培養系」を用いて、リンゴポリフェノール(種々のポリフェノールの混合物)からSema3A細胞膜受容体(neuropilin2-plexinA3複合体)のアゴニスト活性を有すると考えられる単一成分1種を見出した。また、筋損傷・再生時と同様に筋の初期成長期においても、Sema3A依存的なシグナリング軸にmyogeninとMEF2Dが関与していることも推測された。更には、このSema3Aリガンドを受容する細胞膜受容体(neuropilin2-plexinA3複合体)のアゴ二スト活性を有すると考えられる食品成分として、リンゴ幼果皮由来のポリフェノールから単一成分1種を見出した。