hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食事誘発性インスリン低抗性ラット骨格筋微小循環障害と酸素消費供給関係の解明

4.HE染色およびアルカリフォスファターゼ染色の結果、ヒラメ筋の筋線維横断面積は16週でOLETFで有意に増大、腓腹筋は逆に減少を示した。毛細血管/筋線維比(C/F ratio)はヒラメ筋では有意の変化を示さなかったが、腓腹筋で有意に増大した。今後ミオシン重鎖のアイソザイムの変化、HSPの変化の検討を行う。1.私たちは毛細血管のリモデリングを介する構造変化により血流障害をもたらすという仮説を検証するため、自然糖尿病発症モデル動物OLETFおよびその対照動物LETOを用いてペンシル型生体顕微鏡での微小循環の観察および共焦点顕微鏡による三次元毛細血管ネットワーク構造を明らかにした。HE染色およびアルカリフォスファターゼ染色により後脚筋のヒラメ筋はOLETFで筋肥大を示したが、40週では逆に筋萎縮を示したが、毛細血管・筋線維比は有意の変化を示さなかった。2.毛細血管ネットワーク構造は16週でOLETFのヒラメ筋の縦走方向毛細血管および吻合路の径は有意に減少した。吻合路の数は有意に増大した。毛細血管の容積はOLETFで有意に減少した。3.16週および26週でOLETFおよびLETOのヒラメ筋および腓腹筋の毛細血管赤血球速度の測定をペンシル型生体顕微鏡により行った。ヒラメ筋の毛細血管赤血球速度はOLETFで有意に増大を示した。40週において赤血球速度はOLETF、LETOで差を認めなかったが、26週に比較して速度が低下した。4.VEGFの筋組織中のタンパク量を測定するためELISA法により測定を行った。16週でVEGFはOLETFで有意に増大していることが判明した。VEGFとその受容体、アンギオポイエチンとその受容体のmRNAsの発現量をリアルタイムPCR法により相対定量を行った、16週では血管新生にかかわる因子が全体として増加していることが判明した。ヒラメ筋のHSP70の変化を検討するためウエスタンブロットを行った。16週ではHSP70が変化しなかったが、40週でOLETFはLETOに比較して有意の低下を示した。5.径の細い新生毛細血管増大は微小循環でのplasma skimmingを来たし赤血球速度増大を引き起こしたと考えられる。
関節軟骨代謝における老化制御因子SIRT1の機能解析

変形性関節症の発症において、加齢は重要な要素であるが、加齢と軟骨変性を結びつける分子メカニズムは不明な点が多い。本研究では軟骨代謝における、老化制御因子SIRT1の機能を検証している。本年度は四肢特異的Sirt1欠損マウスを作出しその表現型を解析するとともに、Sirt1の相同遺伝子であるSirt6欠損マウスの骨格の表現型を解析した。出生直後においてSirt6-/-マウスは、四肢長管骨が野生型よりも短縮していた。パターニングには明らかな異常は認められなかった。成長とともに四肢の短縮は明らかとなり、骨端部においては、二次骨化中心の成熟が遅延した。生後2週の脛骨成長板軟骨ではSirt6-/-マウスにおいて増殖層が短縮し、増殖マーカーPCNA陽性細胞が著明に減少していた。また一次骨梁の形成は著明に減少していた。一方、TUNEL法ではアポトーシス陽性細胞数に明らかな差は認められなかった。生後1週のSirt6-/-マウスから採取した初代軟骨細胞では、軟骨分化マーカーCol2a1, Col10a1の発現が野生型よりも低下していた。ATDC5および野生型初代軟骨細胞にてSirt6をノックダウンすると、Col 2a1, Col10a1およびCyclinD1、CyclinD2の発現が低下した。一方、培養軟骨細胞におけるIGF-1の発現はSirt6ノックダウンの影響を受けなかった。現在論文投稿中である。本年度は、ヒト関節軟骨、マウス関節軟骨においてSIRT1が高発現することをPCR法によって確認した。また、軟骨分化におけるSirt1の標的を特定するために、マウス軟骨細胞様細胞ATDC5およびマウス未分化間葉系細胞株C3H10T1/2にsiSirt1を作用させ、マイクロアレイ法を用いて、網羅的に変動遺伝子を同定し、更に、PCR法を用いて、遺伝子発現変動の確認を行った。現在、統計学的手法を用いて、影響された細胞内シグナルパスウエイの候補を絞る作業を行っている。また、Sirt1の生体における作用を検証するために、Sirt1-floxマウスを購入、飼育し、Sirt1の部位特異的ノックアウトマウスを作成している。本年度は、軟骨分化におけるSirt1の標的を特定するために、マウス軟骨細胞様細胞ATDC5にSirt1のsiRNAを作用させること、およびSirt1ノックアウトマウスの軟骨細胞を採取し、マイクロアレイ法を用いて、Sirt1遺伝子欠損によって変動する遺伝子検索を行った。現在、統計学的手法を用いて、影響された細胞内シグナルパスウエイの候補を絞る作業を行い、なおかつ、軟骨細胞などを用いて機能解析を進めている。また、Sirt1の生体における作用を検証するために、Sirt1-floxマウスを購入、飼育し、Sirt1の部位特異的ノックアウトマウスを作成してその軟骨組織、骨組織の表現型を解析している。

成長とともに四肢の短縮は明らかとなり、骨端部においては、二次骨化中心の成熟が遅延した。生後2週の脛骨成長板軟骨ではSirt6-/-マウスにおいて増殖層が短縮し、増殖マーカーPCNA陽性細胞が著明に減少していた。また一次骨梁の形成は著明に減少していた。一方、TUNEL法ではアポトーシス陽性細胞数に明らかな差は認められなかった。生後1週のSirt6-/-マウスから採取した初代軟骨細胞では、軟骨分化マーカーCol2a1,Col10a1の発現が野生型よりも低下していた。ATDC5および野生型初代軟骨細胞にてSirt6をノックダウンすると、Col2a1,Col10a1およびCyclinD1、CyclinD2の発現が低下した。一方、培養軟骨細胞におけるIGF-1の発現はSirt6ノックダウンの影響を受けなかった。現在論文投稿中である。
ミトコンドリア- 小胞体間のタンパク質の飛び移り

タンパク質はオルガネラへと輸送されて定着し機能を発揮するが、近年、小胞体とミトコンドリアの間では生合成経路および定着後の生理環境の変化(飢餓等)において、膜タンパク質が2つのオルガネラ間を移動することが示唆されている(後者における例は、ミトコンドリア局在のシトクロムb5)。syntaxin 17(Stx17)は、富栄養条件下ではミトコンドリアおよび小胞体のミトコンドリア接触部位(MAM)上に存在するが、飢餓状態になるとオートファゴソーム膜上へと移行する。飢餓誘導と同時に、SERCA阻害剤処理して小胞体へのカルシウムの取り込みを阻害すると、Stx17はオートファゴソームへと移行せず、小胞体内に留まる。この現象は、ミトコンドリアに局在していたStx17が、一度小胞体へと飛び移った後にオートファゴソームへと移行している可能性を示している。この飛び移りに関与しているタンパク質を同定するために、栄養飢餓と、SERCA阻害剤処理によってStx17結合タンパク質が変化しているかを免疫沈降法によって調べた。その結果、飢餓およびSERCA阻害剤単独では顕著な結合タンパク質の変化がなかったが、両方の処理によって245 kDa以上のいくつかのタンパク質との結合が減少していた。一方、結合が増加しているタンパク質は明確には同定されなかった。オートファジーに関与するVMP1はSERCAと結合・活性化してカルシウムの小胞体への取り込みを促進することで、隔離膜の小胞体からの解離(閉じたオートファゴソームの形成)を促進していることがごく最近報告されている。VMP1の発現抑制はSERCAの失活を引き起こすので、SERCA阻害剤処理と同等と考えられる。それゆえ、Stx17やシトクロムb5のミトコンドリアからオートファゴソームへの移行にVMP1が関与するかどうかを現在調べている。ミトコンドリアの分裂やオートファジーに関与するsyntaxin 17(Stx17)は、栄養条件においてはミトコンドリアおよび小胞体ーミトコンドリア接触部位(MAM)の膜上に存在する。一方、飢餓状態になると、Stx17はオートファゴソーム膜上へと移行し、オートファゴソームとリソソームの融合を触媒する。飢餓誘導と同時に、タプシガルギン処理で小胞体からカルシウムを流出させると、Stx17はオートファゴソームへと移行できず、小胞体内でパッチ状に会合した局在を示す。この現象は、ミトコンドリアに局在していたStx17が、一度小胞体へと飛び移った後にオートファゴソームへと移行している可能性、すなわち膜タンパク質がオルガネラ間を飛び移っている可能性を示している。その可能性を検証するために本年度は以下の実験を行なった。先ず、シトクロムb5(Cb5)の局在を観察した。Cb5は、通常ミトコンドリアに局在しているが(おそらくMAMには局在していない)、飢餓誘導に伴いオートファゴソームに移行する。飢餓誘導とタプシガルギン処理を行うと、Cb5の一部はStx17と同様に小胞体内でパッチ状の構造として観察された。一方、ミトコンドリア外膜に局在するマーカータンパク質の局在には変化が見られなかった。次に、Cb5のオートファゴソームへの移行に、小胞体ーミトコンドリアの連結が必要かどうかをマイトフュージン2(Mfn2)の発現抑制を行って検証した(Mfn2は小胞体とミトコンドリアの繋留に関与)。Mfn2を発現抑制した細胞に飢餓誘導とタプシガルギン処理を行ったところ、コントロール細胞とは異なり、Stx17とCb5は小胞体上でパッチ状に会合せず、ミトコンドリアに留まった。この結果は、ミトコンドリアから小胞体へのタンパク質の飛び移りには両者の繋留が必要であることを示唆している。本年度は実験の調整等に問題があり、研究はやや遅れている。来年度は人的配置も含めて問題点を克服して研究を進める。

オートファジーに関与するVMP1はSERCAと結合・活性化してカルシウムの小胞体への取り込みを促進することで、隔離膜の小胞体からの解離(閉じたオートファゴソームの形成)を促進していることがごく最近報告されている。VMP1の発現抑制はSERCAの失活を引き起こすので、SERCA阻害剤処理と同等と考えられる。それゆえ、Stx17やシトクロムb5のミトコンドリアからオートファゴソームへの移行にVMP1が関与するかどうかを現在調べている。当初は以下の実験を計画していた。(1)Cb5の「飛び移り」の証明。(2)「飛び移り」に必要なCb5の膜アンカー構造の同定。(3)Cb5以外の「飛び移り」を起こしているミトコンドリアタンパク質の網羅的な同定。(4)ミトコンドリアと小胞体の近接の必要性。(5)「飛び移り中間体」の単離。(6)「飛び移り」のために必要な脂質組成の検討。今年度は(1)と(4)を達成できたので、残りの実験を進める。
ジベレリン酸シグナリングによる遺伝子稼働化を促す分子機構の解析

植物の発育に必須な成長ホルモンであるジベレリン酸(GA)に注目し、このホルモンが関わる生体ネットワークの詳細を調べることにより、植物の成長を支える分子基盤を明らかにすることを目的とした。GAによる穀物種子の発芽促進作用は、発芽の初期段階に発現する転写因子であるGAMybなどの、GA初期反応遺伝子の機能を起点とする多段階の遺伝子カスケードで制御される。GAによるリアルな遺伝子制御のしくみを知るため、GA初期反応遺伝子自体の発現制御機構を調べた。その結果、初期反応遺伝子が示すGA応答性は通常の遺伝子の様にプロモーター上流域には依存せず、転写開始点近傍の調節配列や、長大な第1イントロンに存在するエンハンサー様の活性で制御されていることが分かった。これらの特徴は、ArabidopsisのAGやFLCなどの既知のクロマチン制御を受ける遺伝子と類似していたので、クロマチン動態を決定する一つの要因であるDNAのメチル化状態を調べたところ、GAMybプロモーターの限られた領域に高度なメチル化部位を検出した。更に、そのメチル化状態は、GA応答に関わる組織特異性などに付随して、発芽種子内で様々に変化していることが分かった。これらの結果は、GA初期反応遺伝子の発現がクロマチン段階での制御を受けており、GAは標的遺伝子のクロマチンに作用してその発現を促す可能性を示唆するものであった。クロマチン制御は転写調節を越える高度な遺伝子調節様式である。普段は不活性な状態にある多様なGA初期反応遺伝子が、発生や成長に併せてクロマチン構成を変化して潜在化することによりGA情報伝達系との連携を生じて、植物の生活環を多面的に支えているのであろう。本研究は植物の成長に必須な植物ホルモンであるジベレリン酸(GA)の作用に注目し、イネ種子でのGAによる発芽促進効果に関わる生体ネットワークを調べることにより、GAの作用メカニズムの詳細を理解することを目的としている。穀物種子での発芽促進に関わる生理作用遺伝子の発現は、GAの作用により初発的に発現する転写調節因子などの、GA初期反応遺伝子の機能に支えられた二次的な反応であることが分かっている。そこでGAによる遺伝子制御のリアルなしくみを知るため、初期反応遺伝子自体の発現機構を調べた。初期反応遺伝子のGA応答性は、あまりプロモーター上流域に依存しておらず、様々な機能ドメインが遺伝子領域全体に存在していることが分かった。特に5'側非翻訳領域に存在するlarge intronにはenhancer活性を検出した。Intron enbancerに関する知見は少ないが、Arabidopsisの花成を制御する重要なHox geneであるAG、FLCで詳細な解析がなされている。いずれの遺伝子でもintron enhancerがその発現特性を決めるが、特筆すべきことにlarge intronには、遺伝子領域をクロマチン構造の中に押し込め、静的な状態に保つ情報が存在するらしい。これらを踏まえると、GAが作用して最初に起こる核内イベントとは、クロマチン領域に拘束されている初期反応遺伝子の可動であると推定された。特別なクロマチン構造の形成には様々な遺伝子修飾が必要なことは周知であるため、bisulfite sequencing法を用いてイネ発芽種子でのGA初期反応遺伝子のDNAメチル化状態の検出を試みた。その結果、初期反応遺伝子のプロモーター領域は、GAの非誘導組織では高度にメチル化されていることを確認した。これらの結果は、植物の生活史を通したGAの多面的な作用の1つの要因として、標的遺伝子のepigeneticな制御が重要であることを示唆するものであった。DELLA proteinはジベレリン(GA)情報伝達系で機能する抑制因子であり、GAはその抑制作用を解除することで必要とする遺伝子機能の発現を促す。DELLA proteinの機能は植物間で高度に保存されているが、その構成は植物ごとにまったく異なる。Arabidopsisでは、5種類のDELLA proteinが異なる発現様式で機能冗長しながら作用するが、イネではSLR1が単独で全てのGA作用を統括する。

DELLA proteinの具体的な作用様式は未だに不明であり、唯一のSLR1がどうやってイネの成長を統御するのかという問題は、植物の生活環を支えるGAの多面的作用を理解する上で重要な課題となる。本研究では、GAの発芽促進効果に注目して、そこで機能する制御遺伝子の発現機構を調べることにより、GA作用の詳細を理解することを目的とした。GAが初動的に発現を促すGAMybなどの、発芽制御遺伝子の発現には、転写開始点近傍の調節配列や、長大なイントロンにあるエンハンサー様活性が必要であることが分かった。これらの特徴は、既知のクロマチン制御を受ける遺伝子と似ていたので、クロマチン動態の一要因であるDNAのメチル化状態を調べてみると、GA作用により有意に変動する修飾部位をGAMybのプロモーター領域に検出した。また同じ遺伝子領域が、非誘導組織ではより高度にメチル化されていることが分かった。一般的にDNAのメチル化は遺伝子の発現を抑制する。GAの標的遺伝子は、発生や成長に併せてクロマチンの動態を変化させることにより、GA情報伝達系との連携を柔軟に変化させて、必要な遺伝子機能を発現するのであろう。また、このことは、DELLA proteinが遺伝子の遷移状態の変化に関わるクロマチン制御因子である可能性を示唆するものであった。今後は、これらの機能を支える分子装置の実体を探ることが必要となる。
外国人研修生・実習生の受入動向から見る国内農業構造の将来展望の検討

本研究では、国内農業における外国人労働者の雇用状況の分析という切り口から、歴史的転換点に立つ国内農業が、今後どのような変貌経緯を辿りうるか検討した。具体的には、近年急激に外国人労働者の拡大を遂げている長野県川上村の高原野菜産地、および、茨城県鹿行地域の都市需要対応型の大型園芸作産地を主たる対象として、当該地域の外国人労働者急増の背景やその経営展開論理、さらに外国人労働者の急増がもたらす、経営倫理の変容過程を分析した。本年度は、外国人研修生・実習生受入にかかわる諸関係機関として、全国及び各県の、JITCO・農業会議所・中小企業団体中央会・労働基準局、および茨城県を中心に外国人研修生・実習生1次受入機関となっている各単協、民間型事業協同組合等を広く取材し、論点発掘型の聞き取り調査を実施した。外国人研修生・実習生の受入は、安易な労働搾取型経営展開、固定費用圧縮型の経営展開の典型のようにマスコミ等で問題視され報道される場合が多いが、茨城等の近郊型野菜産地で進行しているのは、全く逆の動向であった。すなわち、従来取られてきた農繁期の日本人臨時雇用という流動費型労力対応が近年急速に困難化しているにもかかわらず、地域の担い手層二極化はますます鮮明になり、中核農家層は家族対応が不可能な規模の農地引受を迫られるようになってきている。結果、年間一人当たり200万円超もの固定的支出を伴うにも関わらず、中核農家層は外国人研修生・実習生の受入に経営存続の活路を見いださざるを得なくなっている。しかし、わずか一名の研修生受入でも、流動比率50%と仮定して損益分岐点で最低400万円超の売上増加を必要とする。ここに固定費増大と事業規模拡大のネズミ車的連鎖ともいえる経営構造変貌が強いられることになる。さらに、従来は労働基準法の適応除外に近い扱いであった農業分野でも、こと外国人受入については、さまざまな社会的・国際的摩擦への懸念から、製造業に準じた雇用契約関係の成文化や労働時間規制等が求められている。これが従来の家族経営的労働規範や小経営故の自己搾取型労働強化対応とさまざまな面で齪齬を生じる。食糧供給に責任を持ち続けようと努力する大規模経営者層や地域農協組織は、増加する事業規模と社会的責任のもと、苦悩を深めている現状にある。本研究課題に直接的にかかわる制度的前提である入国管理法が、平成21年7月に国会において改正され、本年7月から新制度が施行されることとなった。さらに、制度改正の具体的内容である各種の省令等は、平成21年秋のパブリックコメント募集を経て、平成21年12月末にようやく一般に公開され、平成22年春にかけて全国各地で説明会等が開催されてきた。以上のような経緯から、平成21年度夏以降、外国人研修生・実習生を受け入れている国内の生産現場や1次受入元となる各種事業協同組合等では、今後の研修・実習事業をどのように遂行すべきかを、あらためて根本的に考え直し、取り組みの仕切り直しを現在迫られている状況にある。本年度はこのような制度の大幅な変更にともなう混乱の中での調査となったために、昨年度春段階で計画していた調査研究の変更を余儀なくされた。一方で、制度変更にかかわる各種の説明会や公聴会に積極的に参加するなかで、これまで聞き取り調査が難しかった異業種型あるいは広域型の事業協同組合からも聞き取りを実施することができたし、また、表向きの建前とは別な、外国人研修・実習制度に対するさまざまな本音からの利害関心意向にも、触れることができた。外国人研修生・実習生の受入は、海外農村部等との賃金水準格差をテコとして、1.研修・実習生本人、2.海外の送り出し機関、3.日本側の一次受け入れ機関、4.国内の受入農家等、5各種ブローカ等、関係者全体のwin-win関係構築を構想したものであったのかもしれないが、国境や各種の制度をまたぐ異質な当事者が、互いの本音理解の不可能を前提として、それぞれの思惑から私的利害追求を行ってしまうために、極端な力関係のひずみが、特定の当事者に集中して発生するという構造を抱えている。本年度の調査の中ではその調整の、本質的な困難さをつよく認識する結果となった。本研究では、国内農業における外国人労働者の雇用状況の分析という切り口から、歴史的転換点に立つ国内農業が、今後どのような変貌経緯を辿りうるか検討を続けてきた。当初、作業仮説の一つとして、今時の農業粗生産額の減少という与件のもとで、農業者たちは、典型的な"固定費"ともいえる人件費の圧縮を意図していると考えていたが、調査結果からこの認識は誤りであることが確認できた。現場はけっして人件費の圧縮を意図しているのではなく、高賃金を払っても、信頼の置ける労働の質と量の確保を切実に求めていた。

逆に言えば、今日の日本国内の労働市場内部では、農業という現場で雇用就業しようとする人材を見出し得なくなっている状況が、年々進行している状況にあった。これは第二の作業仮説、"これまで小経営的規範意識を共有することで営まれてきた肉体的過重農業労働が、その枠組みを取り払われ、純粋にカネ勘定のみで取捨選択されるようになったとき、果たして国内の労働市場にその積極的な担い手を見い出し得るのか?"という論点への返答でもあった。すなわち、他の3K等と呼ばれる国内の低賃金過重労働の現場と同様、商業ベースでの国内農業は、機械化による代替と、外国人労働者への依存にしか打開策を見いだせない状況にますます歩みを進めていきつつあった。さらに、本調査を通じて、日本農業を支え続けてきた、相互の立場を同一の基盤において認めあう家族的人間関係の規範性のなかに、"外国人"という種差を納得の足場として、雇用者と被雇用者のあいだの質的分離を前提として組み立てられる労働規範性が広がり、営農の倫理観を揺さぶりつつあることも確認できた。この最後の論点は、当初は強く意識しなかったものであるが、農という営みの根幹にかかわる問題として、その帰趨を注視すべきであると痛感させられた。
マウス・ヒト受精卵における脂肪滴の解析と脂肪酸組成の最適化による新規培養液の作成

体外受精においてより高い妊娠率を得るためには、よりよい胚を見極めること、よい培養液を作成することが重要となります。今回私たちは1ヒト受精卵のタイムラプス画像における脂肪滴の動態の解析を行うことにより、侵襲のない新しい体外受精における受精卵の品質評価法を作成すること、2私たちが開発した、オートファジーを強制的に誘導して脂肪滴を分解する手法を用いて、マウス胚に含まれる脂肪酸を分析することで、より受精卵内の状態を反映した質の高い培養液の作成を目指します。
超伝導検出器を用いたテラヘルツ分光カメラの開発

近年テラヘルツ波は天文学やバイオなどの基礎研究分野だけでなく、医療・セキュリティ・非破壊検査などの産業分野でも注目を集めている。特に天文学などの基礎科学の分野では高感度なテラヘルツ波センサの開発が待たれているが、電波領域の技術の応用では周波数が高いため損失が大きくなること、光子のエネルギーが光赤外領域と比べて小さく半導体技術では十分な感度が得られないことが問題となっている。そこで本研究の目的は、超伝導体を用いたテラヘルツ波帯高感度分光カメラを開発することである。検出器の動作温度はこれまでMKIDを動作させている1 K以下の極低温ではなく、機械式冷凍機で容易に持続可能な4 Kとしたい。そこで、バルクの超伝導転移温度が約16 Kと高く、また高感度化に必要な高品質膜が作製しやすい窒化ニオブ(NbN)を超伝導材料に採用した。H24年度は超伝導転移温度の高いNbN膜を作成するため、多元マグネトロンスパッタ装置を用いて、放電電力、ガス圧、ArとN2流量比の3つの成膜条件を変化させながら成膜し、諸条件と超伝導転移温度の関係性を調べた。その結果、放電電力dc: 150 W、ガス圧0.225 Pa、ArとN2の流量比10%で最も高い超伝導転移温度TC=15.7 Kを得た。このNbN膜を用いてMKIDを作成し、0.1 k-3.7 Kでの動作確認し、実用可能なことを示した。また、位置分解能を下げる要因となるセンサ間のクロストークの原因がマイクロ波によるものであることを明らかにし、マイクロ波クロストークを低減できる構造を提案した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
脳細胞で高発現している新規なFGFの生理的意義の解明

FGF(fibroblast growth factor)は細胞増殖作用、神経栄養作用、血管新生作用などの多様な生理作用を示す細胞間シグナル分子である。その構造の類似性から、9種類のFGFが見い出されていた。我々は、FGFの構造上の類似性を利用したhomology-basedPCR法により、新規なFGFを同定し、それをFGF-10と命名した。FGF-10の発現を調べたところ、主要な組織では、白色脂肪組織に特異的に高発現していることを明らかにした。さらに、FGF-10は脂肪組織の前駆脂肪細胞に発現した。また、その発現は、脂肪組織の発達とともに増加することを明らかにした。一方、初代培養脂肪細胞においてもFGF-10も発現を調べたところ、FGF-10は分化初期段階で一過性に高発現し、その発現は分化とともに減少していった。FGF-10の組換えタンパク質を作成し、その活性も調べた。FGF-10は前駆脂肪細胞に対して細胞増殖活性をもつことが明らかになった。以上の結果から、FGF-10は前駆脂肪細胞増殖因子として、脂肪組織の発達に重要な役割を果たしていると期待された。このことを、直接的に証明するために、FGF-10 KOマウスを作成し、その表現形質を解析した。FGF-10は肺の形成不全により、出生後、死亡した。FGF-10 KOマウスの脂肪組織を調べたところ、脂肪組織の形成不全が観察された。従って、FGF-10は前駆脂肪細胞で特異的に高発現し、前駆脂肪細胞の増殖あるいは分化に重要な役割を果している因子であることが明らかになった。FGF(fibroblast growth factor)はペプチド性の細胞間シグナル分子で,その構造上の類似性から,FGF-1FGF-9の9種類が見い出されていた。FGFファミリーのうち,aFGF,bFGF以外の7種類のFGFは別の研究目的で単離されたもので,その構造上の類似性からFGFファミリーに分類されている。しかし,申請者らは新規なFGFを単離する目的で,その構造上の類似性を指標にして,簡便に遺伝子検索ができる手法を独自に開発し,遺伝子検索を行い,6種類の新規なFGF関連遺伝子を単離した。これらの新規なFGFの発現を調べたところ,FGF-10とFGF-16が,それぞれ,白色脂肪組織と褐色脂肪組織に特異的に発現していることを明らかにした。本研究では,これらのFGFの脂肪組織における発現の発達段階特異性を調べたところ,FGF-10は生後とともに発現量が増大し,成熟とともに発現量が一定になることを明らかにした。一方,FGF-16は胎児に高発現し,出生後,その発現が急速に低下することを明らかにした。さらに,FGF-10とFGF-16を大腸菌で発現させ,その生物活性を白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞の初代培養系で調べたところ,FGF-10は白色脂肪細胞に,FGF-16は褐色脂肪細胞に対して細胞増殖活性をもつことが明らかになった。従って,FGF-10は主として,生後の白色脂肪組織の増大に,FGF-16は胎児期における褐色脂肪組織の増大に関与していることを明らかにした。FGF-10の成体における発現を調べたところ,白色脂肪組織で高発現していた。さらに,白色脂肪組織を成熟脂肪細胞と前駆脂肪細胞に,遠心分離法で分画して,FGF-10の発現を調べたところ,FGF-10は前駆脂肪細胞に特異的に高発現していた。さらに,前駆脂肪細胞の初代培養系を用いて,前駆脂肪細胞の分化過程におけるFGF-10の発現量の変化を調べた。前駆脂肪細胞は分化誘導開始後,2日目から,分化誘導のmaster regulatorであるPPARγを発現し,成熟脂肪細胞に分化していく。

一方,FGF-10の発現は分化誘導開始1日目から見られ,PPARγが誘導される2日目には,その発現が低下した。さらに,前駆脂肪細胞の初代培養系で,FGF-10の生物活性を調べたところ,FGF-10は前駆脂肪細胞に対して増殖活性を示したが,分化誘導には影響を示さなかった。これらのことは,FGF-10は前駆脂肪細胞に対する増殖因子として,白色脂肪組織の形成に関与しているとことを示唆している。FGF-10の白色脂肪組織の形成における役割を明らかにするため,我々はFGF-10ノックアウトマウスを作成し,その表現形質を解析した。FGF-10ノックアウトマウスは胎生致死ではなかったが,出生直後に死亡した。FGF-10ノックアウトマウスは四肢と肺が完全に欠損していた。出生直後のFGF-10ノックアウトマウスと正常マウスの皮下組織をOil Redで染色し,白色脂肪組織を調べた。正常マウスでは,皮下の白色脂肪組織が形成され,脂肪細胞には脂肪滴の蓄積が見られた。一方,FGF-10ノックアウトマウスの皮下組織の脂肪組織は未発達で,脂肪滴の蓄積は見られなかった。これらの結果より,FGF-10は白色脂肪組織形成に重要な役割を果していることが明らかになった。
マダケ属の一斉開花関連遺伝子群の新規ベクター系による未開花個体への導入と発現解析

1.モウハイチクおよびトウオカメザサの生活史における年次変化での様々な器官の花成促進遺伝子FTおよび花成抑制遺伝子TFL1/CEN相同遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCR法によって解析した。FT相同遺伝子の単独での高い発現量は葉においてのみ検出され、稈、根、地下茎では検出されなかった。この結果は、シロイヌナズナやイネで解明された知見、すなわちFT遺伝子が葉で発現し、生産されたFTタンパク質が茎頂分裂組織へ移動して花成を促進するということと一致することを示唆した。一方、TFL1/CEN相同遺伝子の発現は実生の茎、腋芽、タケノコといった初期の栄養繁殖器官にのみ検出された。また、年次的な発現パターンの結果は、モウハイチクが一斉繁殖型の生活史を、トウオカメサザが多回繁殖型の生活史を持つことを裏付けている。また、花序におけるFTとTFL1/CEN相同遺伝子の発現量のバランスによって、有限・無限という花序形態の基本構造が決定されることが示唆された。2.これまで全く報告例の無い、タケ類の葉よりプロトプラストを単離するための確実で簡便な方法を開発した。次に、モウハイチクのプロトプラストにエレクトロポレーション法によってGFPベクターおよびGFP-PmFT融合ベクターを導入した。これらの遺伝子発現をRT-PCR法によって確認した。3.タケは巨大なクローンを形成する植物であるため、接種したFT相同遺伝子をクローン内の隅々にまで行き渡らせるには、自己増殖能力を持つ無害なウイルスをベクターとして改変・活用するのが最も有効であると判断した。リョクチクBambusa oldhamii葉からBaMVを単離し、6,365塩基の全配列を決定し、遺伝子ベクターとして使用するために、BaMV完全長cDNAクローンを構築した。その後、パーティクルガン法によるタバコ葉への接種実験により、クローンの感染性を確認した。1.モウハイチクおよびトウオカメザサの一斉開花の各時期・各器官における花成促進遺伝子FTおよび花成抑制遺伝子CEN相同遺伝子の発現を解析した。FT相同遺伝子の発現は花序よりも葉で高い値を示し、一方CEN相同遺伝子は葉よりも花序、特に無限花序で高い発現を検出した。この結果は、シロイヌナズナやイネにおける、FT遺伝子によって葉で生産されたFTタンパク質が師部を通って茎頂分裂組織へ移動し花成を促進するという報告やCEN遺伝子が花序を無限化し花成を遅らせるという知見と一致し、タケ類においてもFTとCEN相同遺伝子が花成や花序形成に関与することが示唆された。同時に、実生や幼若個体においてCENのみが高い発現を示したことは、今後幼若未開花個体の強制開花を実現するには、単にFT相同遺伝子を導入するのみならずCEN相同遺伝子の発現を抑制する必要のあることを示唆した。2.これまでタケ類におけるCaMV35Sプロモーターの発現の報告は無いため、GFP発現ベクターを使用し、草本性タケ類リサクネの葉から分離したプロトプラスト内でのGFP発現の確認を行っている。リサクネの葉からエレクトロポレーション法による遺伝子の導入に必要な10^6細胞/ml培地のプロトプラストがほぼ調整可能となった。3.タケは巨大なクローンを形成する植物であるため、接種したFT相同遺伝子をクローン内の隅々にまで蔓延するには、自己増殖能力を持つ無害なウイルスをベクターとして改変・活用するのが最も有効であると判断した。そこで、台湾でタケモザイクウイルスBaMVに感染したタケ類を採取し、リョクチクBambusa oldhami葉から単離したBaMVをRT-PCR法によってcDNAを合成し、クローニングして6365塩基の全配列を決定した。その後、発現ベクターp35SIV(19)を使用し、完全長cDNAクローンを構築中である。

リョクチクBambusa oldhamii葉からBaMVを単離し、6,365塩基の全配列を決定し、遺伝子ベクターとして使用するために、BaMV完全長cDNAクローンを構築した。その後、パーティクルガン法によるタバコ葉への接種実験により、クローンの感染性を確認した。
重症喘息におけるIL-23産生樹状細胞誘導機構の解明

本研究では気管支喘息の難治化機構の解明を目的に、樹状細胞によるIL-23産生を誘導する因子の同定、及びアレルギー性気道炎症における真菌成分αマンナンの受容体Dectin-2とNF-κB関連蛋白であるIκBNSの役割の解明を行った。その結果、1Dectin-2を発現するCD11b陽性樹状細胞はIL-23を発現しており、アレルギー性気道炎症を誘導すること、2血球系細胞に発現するIκBNSはアレルギー性気道炎症を抑制することを明らかにした。現在、樹状細胞にIL-23産生を誘導する気道上皮細胞由来分子の同定を目指し、研究を継続している。本研究者らは、アレルギー性気道炎症において、1気道上皮細胞がIL-25を産生しTh2型免疫応答を惹起すること、2樹状細胞がIL-23を産生し、Th17細胞依存的な好中球性炎症を誘導するとともに、Th2細胞依存的な好酸球性炎症を増強することを報告し、重症喘息における病態機序の可能性を示した。しかしどのような機序で樹状細胞からIL-23が産生されるのかは依然不明である。そこで本研究では、アレルギー性気道炎症におけるIL-23産生樹状細胞の誘導機構を明らかにすることを目的とした。真菌感染は重症喘息への関与が知られており、真菌のαマンナンの受容体であるDectin-2はTh17細胞分化を誘導することが報告されている。そこでH25年度の研究では、Dectin-2欠損マウスを用いて、ハウスダスト抽出物(HDM)を経気道的に投与することで、気管支喘息のモデルマウスを作成し解析した。その結果、Dectin2欠損マウスでは、アレルギー性気道炎症の減弱とともに、Th2細胞とTh17細胞の分化の減弱を認めた。さらにDectin-2を欠損した樹状細胞はproinflammatoryサイトカインや副刺激分子の発現も低下していることが明らかとなった。以上よりDectin2のシグナル伝達経路がIL-23産生樹状細胞の誘導に関与している可能性が考えられ候補因子を解析中である。本研究者らは、アレルギー性気道炎症において、1気道上皮細胞がIL-25を産生しTh2型免疫応答を惹起すること(J Allergy Clin Immunol 2006 Tamachi)、2樹状細胞がIL-23を産生し、Th17細胞依存的な好中球性炎症を誘導するとともに、Th2細胞依存的な好酸球性炎症を増強すること(AJRCCM 2008 Wakashin)を報告し、重症喘息における病態機序の可能性を示した。しかし樹状細胞からIL-23が産生される機序は依然不明である。今回、ハウスダスト抽出物(HDM)を用いた気管支喘息のモデルマウスの解析の結果、Dectin-2欠損マウスにおいて、アレルギー性気道炎症の減弱とともに、Th2細胞とTh17細胞の分化の減弱が認められた。(Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Norimoto)。以上よりDectin2のシグナル伝達経路がIL-23産生樹状細胞の誘導に関与している可能性が考えられ候補因子の解析を行っている。並行してマウスの気管から気道上皮細胞を単離して、Air-Liquid Interface Cultureを行い、骨髄由来樹状細胞(BMDC)と共培養する技術も確立した。それにより気道上皮細胞を存在下では、BMDCはCD80,CD86を高発現することが示された。現在IL-23を誘導する因子を同定するための解析を行っている。本研究者らは、樹状細胞がIL-23を産生しTh17細胞依存的な好中球性炎症を誘導するとともに、Th2細胞依存的な好酸球性炎症を増強すること(AJRCCM 2008 Wakashin)を報告し、重症喘息における新たな病態機序の可能性を示した。そこで本研究ではアレルギー性気道炎症におけるIL-23産生樹状細胞の誘導機構を明らかにすることを目的とした。今回、ハウスダスト抽出物(HDM)を用いた気管支喘息のモデルマウスの解析の結果、CD11b陽性樹状細胞にDectin-2の発現を認めた。Dectin-2欠損マウスでは、アレルギー性気道炎症の減弱とともに、Th2細胞とTh17細胞の分化の減弱がみられた。またDectin-2を欠損した樹状細胞においてIL-23の発現が低下することを示した(Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Norimoto)。さらに、アレルギー性気道炎症における樹状細胞のサブセット解析として、単球由来のinflammatory DCs (iDCs)が気道局所に集積してArginase1を発現していることを明らかにした(Int Immunol. 2014 Iwata)。

またHDMはNF-κBを誘導して炎症病態を惹起し、そのシグナル制御にはatypical IkBファミリー蛋白の一つであるIkBNSが重要な役割を果たすことが、樹状細胞においても知られている。今回、血球系細胞においてIkBNSを欠損するマウスにおいてアレルギー性気道炎症が増強することを明らかにした(投稿中)。以上の結果から本研究成果は、難治性喘息における樹状細胞を標的とした新たな治療戦略開発の基盤構築に寄与することが期待される。本研究では気管支喘息の難治化機構の解明を目的に、樹状細胞によるIL-23産生を誘導する因子の同定、及びアレルギー性気道炎症における真菌成分αマンナンの受容体Dectin-2とNF-κB関連蛋白であるIκBNSの役割の解明を行った。その結果、1Dectin-2を発現するCD11b陽性樹状細胞はIL-23を発現しており、アレルギー性気道炎症を誘導すること、2血球系細胞に発現するIκBNSはアレルギー性気道炎症を抑制することを明らかにした。現在、樹状細胞にIL-23産生を誘導する気道上皮細胞由来分子の同定を目指し、研究を継続している。既にアレルギー性気道炎症のモデルマウスの作成と解析が行える状況にあり、さらに樹状細胞と気道上皮細胞の単離も可能であり、Dectin-2欠損マウスの解析結果もふまえ、おおむね順調に進展している。当初の研究計画にある気道上皮細胞からのアプローチも、HDMを経気道投与した気道上皮細胞を単離してRNAシークエンスによる網羅的な遺伝子解析を行ない、候補遺伝子に着目した気道上皮特異的な強制発現マウスや欠損マウスの作成を進めている。さらに樹状細胞に関しても、アレルギー性気道炎症において単球由来のinflammatory DCs (iDCs)が気道局所に集積してArginase1を発現していることを明らかにしており、DCサブセットの解析は順調に進んでいる。これらの結果を総合的に判断し、本研究計画はおおむね順調に進展しているものと判断する。アレルギー学まず、Air-Liquid Interface Cultureにおける気道上皮細胞を骨髄由来樹状細胞(BMDC)の共培養の実験系において、BMDCにおけるIL-23p19の発現を定量的RT-PCR法により解析し、重症喘息モデルの気道上皮細胞がIL-23p19産生誘導能を示すか否か検討するさらにHDMを経気道投与した気道上皮細胞のRNAシークエンスの解析から絞った候補遺伝子について、気道上皮細胞株を用いてvitroでの解析をすすめるとともに、気道上皮特異的な強制発現マウスや欠損マウスの作成を進めており、そのマウスの喘息モデル解析を行う。また候補遺伝子の一つであるDectin2がどのようにIL-23産生樹状細胞の誘導に関与しているか解析を更に進める。あわせてIL-23産生のDCサブセットの同定もすすめる。当初の研究計画にある気道上皮細胞からのアプローチも、HDMを経気道投与した気道上皮細胞を単離してRNAシークエンスによる網羅的な遺伝子解析を行っている。候補遺伝子を気道上皮細胞株に発現させ、BMDCと共培養する系に関しては着手しているものの、まだ十分な結果が得られていはいない。
ポスト軍政期ミャンマーにおける宗教ＮＧＯの人類学的研究

本研究はミャンマーのポスト軍政期における変化の様相のなかで、宗教的背景を持つローカルNGOの活動に着目し、現地調査を通じて、その実態を実証的に明らかにすることを目指すものである。宗教NGOに着目することにより、ミャンマーにおける民主化プロセスの動態を草の根レベルで追い、宗教の社会的布置の変容を解明するという目標を立て、計画を遂行中である。初年度に三つの目標(調査開始、研究課題の明確化、基礎的なデータベースの構築開始)を立て、順調に遂行した。二年度目もそれぞれの目標をさらに深化させた。第一に宗教NGOの本格的調査を開始した。引き続き、調査対象を1宗教マジョリティを核とするNGO(具体的には仏教NGO)2宗教マイノリティを核とするNGO(具体的にはムスリムNGO)3少数民族を核とするNGOという3つに分け、分担者によってそれぞれの担当を定めた。調査に際しては、分担者が対象とする組織を絞り、その組織的特徴と個々の参加者という2側面からとらえることを目標とした。加えて、他の宗教組織との比較の視点も持ち、宗教的側面と世俗的側面を意識化する作業も推進した。第二に国内研究会を通じて、こうした調査成果を共有しあい、相互に議論を深めた。現在のところ、集金・寄進システム、組織化、会員の参与といった共通テーマが挙がっており、伝統的宗教組織と本研究で対象としている宗教NGOの継続性と革新点を明らかにしていく必要性が認識された。第三に国内の宗教NGOやいわゆるNGOがどのように展開しているかといった全体像の把握も必要であるという認識に基づいて、昨年度に引き続き、ヤンゴンを核とするデータベース構築を続けた。理由は、もともと掲げている三つの目標が順調に進んでいることによる。第一に、宗教NGOの本格的調査を開始した。調査対象としては、上記の123の3つに分け、分担者がそれぞれの担当を定めた。また、グループのなかで取り上げる組織をいくつか絞って、集中的に調査しつつある。調査の際には、その組織的特徴と個々の参加者という二側面からとらえようとした。また他の宗教組織との比較の視点も持ち、宗教的側面と世俗的側面を意識化するといった目標のもとに調査を推進している。第二に、国内研究会で第一の成果を通じて、今後議論を展開する視点について絞った。その結果、集金・寄進システム、組織化、会員の参与といった共通テーマが挙がっている。こうした切り口から、従来の宗教組織との比較のうえに、近年結成され福祉活動を行っている宗教NGO、CBO(コミュニティ基盤組織)の特徴を把握する試みを続けているところである。ただ宗教NGOへの関心はまだ研究が始まったところともいえる。理論的貢献については今後も引き続き模索することが必要であり、次年度以降の課題でもある。第三に、より大きな見取り図を共有する目的で、昨年度に引き続き、ヤンゴンを核とするデータベース構築を続けたが、データが得られる箇所では郡レベルで登録されているNGOのデータベース化をほぼ終了させることができた。課題は残しつつも、当初立てた目標のうち、二年目に終了すべき点はそれぞれ達成されていることから、本研究は順調に進展していると考えている。今後も、この三つの目標をそれぞれ進めていく予定である。第一には調査の継続であり、次年度以降各分担者が対象とする組織について、組織的特徴と個々の参加者という二側面からとらえ、必要に応じて他のタイプの宗教組織や世俗組織との比較を行う。もちろん、宗教NGOの研究はその端緒についたばかりで、理論的深化は重要である。そのため、第二の成果とりまとめを含めた理論研究は重要となる。次年度はひとまずヤンゴン大学で現地人類学者などと国際合同セミナーを行う。ここで、相互の研究を報告し、ラウンドテーブルなどを通じて議論の交換を行い、新たな視点を構築することを試みる。この成果はプロシーディングズとして出版予定である。他方で、それぞれの分担者が調査結果を深めつつ、それをいかに分析するか、理論的支柱を見出すことが課題として残されている。国内研究会でそれぞれ議論を継続するほか、必要に応じて話者を招聘し、研究を進める。第三に、昨年度までに作成したヤンゴン管区のデータベースに、調査を行った組織を加え、データベースを通じて宗教NGOの全貌を把握する。最終的に、宗教NGOに着目することで得られる視点をとりまとめ、日本での書籍出版につなげる予定である。今年度は、本計画の初年度に当たり、以下3点の目標を立てた。第一は各メンバーの従来の調査経験・データを共有し、本研究に関わる研究課題を明確化すること、第二はそれに基づき、予備調査を開始すること、第三は現地の調査機関と連携し、基礎的なデータベースを構築することであった。第一と第二の目標に関しては、各メンバーが予備調査を行い、そこで得た問題意識を研究会を通じて共有した。具体的には、マイノリティを核とするNGO、マジョリティを核とするNGO(具体的には仏教NGO)、少数民族を核とするNGOという方向から調査を行った。マイノリティを母体とするNGOについては、その設立の経緯が極めて多様で、今後も個別の詳細な研究が必要であることが確認された。

また、仏教やイスラームなどの宗教NGOにおいては、その広がりに注目すると同時に、宗教内に存在する他者への排外性の可能性に留意する必要性などが再確認された。第三のデータベース構築については、主要NGOはヤンゴンに本部を置くことが多いという認識から、まずヤンゴン管区に絞ってデータを収集した。現在、ヤンゴン管区南部県、東部県などに関して、郡レベルで登録されているNGOのデータベース化が終了している。上記の通り、三つの目標を立て、いずれも順調に進んでいることから、順調に進展していると考えている。予備調査においては、それぞれが予定の方向性に従って、予備調査を行い、今後の調査の基盤を構築した。今年度さらにより踏み込んだ調査を行い、成果報告に向けてのいくつかの研究テーマを進展させていく予定である。また、データベース構築については、ヤンゴン管区に焦点を絞り、データベース化を順調に進めている。地方で展開するNGOの多くが、ヤンゴン管区に本部を置く可能性も高く、このデータベースが今後の調査の基盤となる可能性を多大に有している。その意味でも、初年度としては相応の成果を得られたと考えている。本研究はミャンマーのポスト軍政期における変化の様相のなかで、宗教的背景を持つローカルNGOの活動に着目し、現地調査を通じて、その実態を実証的に明らかにすることを目指すものである。宗教NGOに着目することにより、ミャンマーにおける民主化プロセスの動態を草の根レベルで追い、宗教の社会的布置の変容を解明するという目標を立て、計画を遂行中である。初年度に三つの目標(調査開始、研究課題の明確化、基礎的なデータベースの構築開始)を立て、順調に遂行した。二年度目もそれぞれの目標をさらに深化させた。第一に宗教NGOの本格的調査を開始した。引き続き、調査対象を1宗教マジョリティを核とするNGO(具体的には仏教NGO)2宗教マイノリティを核とするNGO(具体的にはムスリムNGO)3少数民族を核とするNGOという3つに分け、分担者によってそれぞれの担当を定めた。調査に際しては、分担者が対象とする組織を絞り、その組織的特徴と個々の参加者という2側面からとらえることを目標とした。加えて、他の宗教組織との比較の視点も持ち、宗教的側面と世俗的側面を意識化する作業も推進した。第二に国内研究会を通じて、こうした調査成果を共有しあい、相互に議論を深めた。現在のところ、集金・寄進システム、組織化、会員の参与といった共通テーマが挙がっており、伝統的宗教組織と本研究で対象としている宗教NGOの継続性と革新点を明らかにしていく必要性が認識された。第三に国内の宗教NGOやいわゆるNGOがどのように展開しているかといった全体像の把握も必要であるという認識に基づいて、昨年度に引き続き、ヤンゴンを核とするデータベース構築を続けた。理由は、もともと掲げている三つの目標が順調に進んでいることによる。第一に、宗教NGOの本格的調査を開始した。調査対象としては、上記の123の3つに分け、分担者がそれぞれの担当を定めた。
神経・筋接合に必須のレセプター蛋白LRP４の脳中枢神経系における役割

Lrp4 KOマウスは出生直後に横隔膜での神経・筋接合ができずに呼吸不全で死亡した。多くのKOに両方/片方の腎臓欠損が見られたが羊水過多が見られ卵膜、胎盤でのアクアポリン9、アクアポリン1の有為な発現低下が見られた。またLrp4 KO胎児では神経・筋接合シナプス形成不全により呼吸様運動、嚥下に障害があり、羊水の羊膜腔からの排出に異常を生じ、主たる羊水成分である胎児尿の分泌が無くても羊水過多になったと考えられ、羊水量の調節は羊水の取り込みが本質的な役割を果たしていると考えられた。ヒトでも稀だが両腎形成不全で尿生産が無いにもかかわらず脳脱や食道閉鎖による羊水過少症にならない例が報告されている。Lrp4KOマウスは出生直後に呼吸不全で死亡し合指・多指症を呈した。多くのKOマウスに両方(53匹/191匹)、片方(81匹/191匹)の腎臓の欠損が見られた。E17.5 KO胎児では1.30倍、E18.5 KO胎児では2.76倍の羊水過多が見られた。羊水は主として胎児腎臓で作られた尿が羊膜腔に排出されたものと考えられてきたが、E17.5, E18.5 KO胎児は腎臓の有無に拘らず羊水過多が見られた。またE18.5羊水の浸透圧はKO胎児において有為に低かった。そこでLrp4+/-♂と交配した妊娠Lrp4+/-♀19dpcの子宮に墨汁を注入し30分後に胎児を取り出し固定後、胎児の肺、胃腸を調べたところ、コントロールとなるLrp4+/+、Lrp4+/-胎児では墨汁の取り込みが見られたのに対しLrp4KO胎児では見られなかった。羊水中の肺サーファクタント蛋白Aは胎盤からも分泌されるが、その多くは胎児の呼吸様運動によって胎児の肺から羊水中に分泌される。そこでE18.5の羊水中の肺サーファクタント蛋白Aを調べると肺胞液の羊膜腔への分泌がないKO胎児羊水中の肺サーファクタント蛋白Aはコントロール胎児と比べて43%まで減少していた。また肺胞液中に比較的多く存在するClイオンの濃度はKO胎児では有為に低かった。KO胎児に消化管閉塞は見られなかった。これらの事からKO胎児は呼吸様運動・嚥下ができない事が解った。さらに羊膜腔からの水の取り込みに関与する卵膜上のaquaporin 9、胎盤上のaquaporin 1 mRNAを定量するとE17,5、E18.5ではKO胎児において有為な発現低下が見られた。以上の結果から羊水の羊膜腔からの排出(嚥下、卵膜からの吸収)に異常を生じ、腎臓が無いにもかかわらず羊水過多になったと考えられる。人においても稀なケースだが重症筋無力症の胎児で嚥下障害により羊水過多をおこす例が報告されている。Lrp4は神経筋接合に必須であり、ポストシナプス筋終板でMuSK(muscle-specific kinase)と複合体を形成し、MuSKを活性化してアセチルコリンレセプターのクラスター化とそれに続くシナプス形成に必須の蛋白である。また運動神経終末から分泌される糖蛋白アグリンと結合し、シナプス形成後のLrp4-MuSK結合を増強してシナプス形成を保持する為にも必須の蛋白である。Lrp4欠失マウス(Lrp4 KO)を作成した処、Lrp4 KOは出生直後に呼吸ができずに全て死亡した。その肺胞は膨らんでおらず、合指多指症を呈し、多くのKOに両方(77匹/ 295匹KOあるいは片方(126匹[左73右53] / 295匹KO)の腎臓の欠損が見られた。予期しなかった表現型としてLrp4 KOでは羊水過多が見られた。羊水は主として胎児腎臓で作られた尿が羊膜腔に排出されたものであり、胎児呼吸様運動で肺から排出される肺胞液も関与している。一方、羊水の羊膜腔からの排出には嚥下、卵膜や胎盤からの吸収が関与している。ところがLrp4 KOは両腎の欠損があっても羊水過多が見られた。そこで雄Lrp4+/-と交配した妊娠19日目の雌Lrp4+/-の羊膜腔に墨汁を注入し30分後に胎児を取り出し固定後、胎児の肺、胃腸を調べたところ、Lrp4 KO胎児では墨汁の取り込みが見られずKO胎児は呼吸様運動、嚥下に障害がある事が解った。またKO胎児羊水中の肺サーファクタント蛋白Aの減少も見られた。さらに羊膜腔からの水の取り込みに関与すると考えられる卵膜上のアクアポリン9 mRNA、胎盤上のアクアポリン1 mRNAの有為な発現低下がKO胎児で見られた。以上の結果からLrp4 KO胎児は、羊水の羊膜腔からの排出に異常を生じ、主たる羊水成分である胎児尿の分泌が無くても羊水過多になったと考えられ、羊水量の調節は羊水の取り込みが本質的な役割を果たしていると考えられる。当初の研究計画以外の進展としてKO胎児に羊水過多が見られた。KO胎児は呼吸用運動・嚥下が出来ない事が分かった。