hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PTCL-NOSモデルマウスによる腫瘍幹細胞探索・抗CCR4抗体治療モデルの確立

末梢性T細胞リンパ腫における病理組織診断マーカーの解析、腫瘍幹細胞の探索、治療モデルの確立のためにNOGマウスを使用し患者検体から末梢性T細胞リンパ腫である血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病のモデルマウスを作製した。作製したモデルマウスは、継代が可能であった。継代移植を行いマウス体内に形成された腫瘍は、患者のクローンと同一であることを確認した。NOGマウスに移植し形成された腫瘍は、患者検体と同様の条件で免疫組織染色を行うと染色精度が低くアーチファクトも強いことが確認できた。そのため今回作製したモデルマウスの腫瘍にてリンパ腫解析に必要と思われる、CD3、D20、CD4、CD8、CD25、CCR4、VEGF-A、CD31、α-SMA、PD-1等の代表的な抗体の染色至適条件を確立させた。我々の調査では、成人T細胞白血病患者のリンパ節生検標本にて血管内皮細胞増殖因子の発現を確認したところ23例中22例(96%)が陽性であった。また今回作製した成人T細胞白血病モデルマウスにおいては、移植もとである患者検体とマウスに形成された腫瘍の両者にて血管内皮細胞増殖因子が陽性であった。この結果を得て、血管内皮細胞増殖因子に対するモノクローナル抗体(ベバシズマブ)を用い、成人T細胞白血病の標準的な治療であるCHOP療法単独治療とCHOP療法にベバシズマブを加えた治療を比較検討した。CHOP療法にベバシズマブを加えた治療では、CHOP単独治療に比較し有意に生存期間が長いことが確認され、有効な新しい治療モデルであると考えられた。末梢性T細胞リンパ腫における病理組織診断マーカーの解析、腫瘍幹細胞の探索、治療モデルの確立のためにNOGマウスを使用し患者検体から末梢性T細胞リンパ腫である血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫のモデルマウスを作製した。そのため今回作製したモデルマウスの腫瘍にてリンパ腫解析に必要と思われるCD3、D20、CD4、CD8、CD25、CCR4、VEGF-A、CD31、α-SMA、PD-1等の代表的な抗体の染色至適条件を確立させた。我々の調査では、成人T細胞白血病/リンパ腫患者のリンパ節生検標本にて血管内皮細胞増殖因子の発現を確認したところ23例中22例が陽性であった。また今回作製した成人T細胞白血病/リンパ腫モデルマウスでは、移植もとである患者検体とマウスに形成された腫瘍の両者にて血管内皮細胞増殖因子が陽性であった。この結果を得て、血管内皮細胞増殖因子に対するモノクローナル抗体(ベバシズマブ)を用い、CHOP療法単独治療とCHOP療法にベバシズマブを加えた治療を比較検討した。末梢性T細胞リンパ腫である血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫のモデルマウスを作成した。末梢性T細胞リンパ腫非特定型モデルマウスにおいては、作成を試みるも腫瘍の生着が得られなかった。末梢性T細胞リンパ腫非特定型モデルマウスが確立出来ていないため、モデルを使用した病態解明、表面抗原の解析、遺伝子解析が進んでいない。引き続き臨床講座の協力を得て末梢性

T細胞リンパ腫非特定型の検体を用意し、NOGマウスへの移植を行いモデルマウスを確立していく。少ない腫瘍細胞でも生着できるよう腫瘍細胞の抽出や生着を阻害する細胞の分離の検討を行い精度を高めていく。今回作成した血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫のモデルマウスにおいて病態解明や表面抗原・遺伝子解析をする予定である。調達方法の工夫などにより、当初計画より経費の使用が節約できたことにより生じた未使用額。研究を進めていくなかで必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なってしまったが、研究計画には変更はなく前年度の研究費も含め、当初の予定通りの計画を進めていく予定である。
クエン酸代謝系遺伝子の多重組換えによる酸性土壌耐性植物の作出

クエン酸放出能力強化による酸性土壌耐性植物の分子育種を目的とした研究において、今年度以下2点の成果を得た。1.クエン酸の分解に関与しているNADP特異的イソクエン酸脱水素酵素(NADP-ICDH)の発現をRNAi法により抑制させたイネ組換え体を作製した。得られた2つのラインのNADP-ICDH活性は野生型の約30%に抑制されていた。これらの組換え体は野生型と比較して難溶性リン酸をリン給源とする培地における生育を改善させていた。このとき、組換え体は野生型と比較して多量のクエン酸を放出しており、このことによる難溶性リン酸の利用効率上昇が生育改善につながったと考えられる。これらのことは、NADP-ICDHを発現抑制することで植物のクエン酸放出能力を強化できることを示唆している。この成果に関して、和文誌に投稿済み(印刷中)であり、また英文誌への投稿準備中である。2.低リン酸耐性遺伝子群の獲得を目指して、クエン酸放出能力の極めて優れているニンジン変異細胞を材料としてcDNAサブトラクションを行った。これにより約500クローン(cDNA断片)を得たが、ディファレンシャルスクリーニング法により変異細胞において転写レベルが増加しているであろうcDNA断片を90にまで絞り込んだ。これらの中には転写調節タンパク質(転写因子)がいくつか含まれており、これまでに明らかにしてきたいくつかの低リン酸耐性遺伝子群の転写レベルの変動はこれらの転写因子が関与しているかもしれない。しかし、ほとんどは既報の配列とマッチしないものであった。現在、RACE法により未知領域を獲得しそれらの機能を予測するとともに、cDNAサブトラクションライブラリーの中から変異細胞のクエン酸放出レベルに影響を与える遺伝子の探索を行っている。なお、昨年度得たシロバナルーピンの研究成果に関して今年度英文誌に発表した。クエン酸放出能力強化による酸性土壌耐性植物の分子育種を目的とした研究の過程で、以下3点の成果を得た。1.クエン酸放出能力の極めて高いニンジン変異細胞において、まだ調べられていないクエン酸合成への基質供給過程について酵素活性レベルで解析した。その結果、解糖系の酵素の活性レベルには野生型細胞と変異細胞の間で差は認められなかった。しかし、ピルビン酸脱水素酵素複合体(PDC)の活性が変異細胞において高い値を示した。この高いPDC性はクエン酸合成力の向上に貢献すると予想される。しかし、これらの結果は予備的実験で得られたものであり、現在詳細な解析を行っている。2.リン酸欠乏条件下で旺盛なクエン酸放出を示すルーピンのプロテオイド根の代謝特性を明らかにするために、クエン酸代謝に関与する6つの酵素の活性を測定し、リン酸添加区(+P区)およびリン酸無添加区(-P区)の根端と比較した。その結果、クエン酸合成への基質供給に関与するホスホエノールピルビン酸ホスファターゼとホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性がプロテオイド根において有意に増加していた。さらに、クエン酸分解に関わるNADP特異的イソクエン酸脱水素酵素(NADP-ICDH)の活性がプロテオイド根において他よりも低かった。NADP-ICDH活性の低下はニンジン変異細胞においても観察されることから、NADP-ICDHはクエン酸蓄積における鍵酵素であると考えられる。3.クエン酸放出能力強化に貢献すると考えられる2つの酵素、クエン酸合成酵素(CS)とNADP-ICDHの遺伝子をイネに導入するためのベクターを作成した。植物発現ベクターであるpIG121-HmのGUSカセット領域にニンジンCSカセットとイネNADP-ICDH RNAi(発現抑制手法)カセットを組み込んだ。現在、イネへの組換えを実施している。
超原子価ラジカルの化学の新展開:気相からのアプローチ

本研究では超原子価ラジカルの反応特性を系統的に調べ、生体反応を含む広範な化学反応に果たすラジカルの役割を解明することを目的とした。NH_4とCH_3OH_2に注目し、反応中間体としての生成過程と安定性を調べ、また関連するペプチドイオンの電子状態と光解離過程について以下の研究を遂行した1.NH_4はアルカリ原子と等電子構造を持ち、クラスター内で自発的にイオン化することが予測される。この特性の理解を深め、溶媒和電子生成と関連して水クラスター内での金属クラスターの安定性を調べるために、[Na_2(H_2O)_n]の光電子分光実験と理論計算を行った。この結果、水分子3個以上が付加するとNa_2から水への電子の移動が起こるとともに、Na原子間に水分子が挿入した構造が安定になり、二量体の溶解過程が始まることを明らかにした。2.極性溶媒中でのNH_4の安定性:H_2OやCH_3OH中でのNH_4の生成と緩和過程のダイナミックス、及びオキソニウムラジカルCH_3OH_2の安定性を調べるために、(NH_3)_n(Ch_3OH)_m@Hのイオン化エネルギーの測定とフェムト秒レーザー分光実験を行った。H_2OやCH_3OHクラスター中では、(NH_3)_n中と異なり、より強い水素結合で構造が決まるとともに、NH_4の生成が遅くなることが明らかになった。またH原子はNH_3に優先的に付加してNH_4を生成し、CH_3OH_2は生成しないという結果が得られた。3.タンパク質イオンの質量解析では、ペプチド類のN末端の-NH_3^+の電子再結合で生成するラジカルの解離反応が広く利用されている。この反応の基礎的理解を得るとともに、ペプチドの電子状態に与える影響を調べるために、ジペプチドイオンの赤外と紫外光解離分光実験を行った。この結果、構造および電子状態について新しい知見を得た。超原子価ラジカルは、広範な気相や溶液反応で反応中間体として重要な役割を果たしていることが、次第に認識されつつある。本研究では超原子価ラジカルの反応特性を系統的に調べ、生体反応を含む広範な化学反応に果たすラジカルの役割を解明することを目的としている。この目的を達成するために、初年度はNH_4に注目し、反応中間体としての重要性を検討するために、以下の研究を遂行した1.NH_4+錯体イオンの生成と構造:レーザー光イオン化で生成したNH_4+とベンゼン蒸気を混合して真空中に噴出させ、生成した錯体イオンを断熱膨張で冷却しうる新しいクラスター源を試作し、ベンゼンとの錯体の安定性について調べた。その結果、NH_4+・ベンゼン錯体は、アンモニアクラスター内で安定に存在することが分かった。現在、錯体の電子励起状態でのNH4イオン濃度の向上を計るとともに、錯体の光解離スペクトルの測定を進めている。また錯体の構造を調べるため,光パラメトリック型の赤外波長延長システムを導入し,赤外スペクトル測定の準備を進めている。また、構造情報のより的確に得られることが予測される核磁気共鳴の導入を計るため,気体NMR法の検討を行った。2.オキソニウムラジカルの安定性:CH_3OH_2ラジカルの安定性を調べるために、(NH_3)n(Ch_3OH)m@Hを分子線中に生成し、H原子がNH_3とCH_3OHの何れに付加するかを検討している。

ここではNH_3とメタノールの混合気体を真空中に噴出し、レーザー光解離法によりラジカルクラスターを生成している。現在、フェムト秒レーザー分光法と光イオン化法によりクラスターの電子状態を調べ、超原子価ラジカルの特性の検討を進めている。今後、赤外スペクトルの測定により、H原子の存在状態を明らかにする計画である。3.NH_4はアルカリ原子と等電子構造を持ち、クラスター内で自発的にイオン化することが予測される。この特性の理解を深めるため、Na_2の水クラスター内でのイオン化過程を、光電子分光を用いて検討した。超原子価ラジカルは、気相や溶液反応で反応中間体として重要な役割を果たしていることが、次第に認識されつつある。本研究では超原子価ラジカルの反応特性を系統的に調べ、生体反応を含む広範な化学反応に果たすラジカルの役割を解明することを目的とした。19年度はNH_4とCH_3OH_2に注目し、反応中間体としての生成過程と安定性を調べ、また関連するペプチドイオンの電子状態と光解離過程について以下の研究を遂行した1.NH_4はアルカリ原子と等電子構造を持ち、クラスター内で自発的にイオン化することが予測される。この特性の理解を深め、溶媒和電子生成と関連して水クラスター内での金属クラスターの安定性を調べるために、[Na_2-(H_2O)_n]の光電子分光実験と理論計算を行った。この結果、水分子3個以上が付加するとNa_2-から水への電子の移動が起こるとともに、Na原子間に水分子が挿入した構造が安定になり、二量体の溶解過程が始まることを明らかにした。2.極性溶媒中でのNH_4の安定性:H_2OやCH_3OH中でのNH_4の生成と緩和過程のダイナミックス、及びオキソニウムラジカルCH_3OH_2の安定性を調べるために、(NH_3)_n(Ch_3OH)_m@Hのイオン化エネルギーの測定とフェムト秒レーザー分光実験を行った。H_2OやCH_3OHクラスター中では、(NH_3)_n中と異なり、より強い水素結合で構造が決まるとともに、NH_4の生成が遅くなることが明らかになった。またH原子はNH_3に優先的に付加してNH_4を生成し、CH_3OH_2は生成しないという結果が得られた。3.タンパク質イオンの質量解析では、ペプチド類のN末端の-NH_3+の電子再結合で生成するラジカルの解離反応が広く利用されている。この反応の基礎的理解を得るとともに、ペプチドの電子状態に与える影響を調べるために、ジペプチドイオンの赤外および紫外光解離分光実験を行った。この結果、構造および電子状態について新しい知見を得た。また、構造情報のより的確に得られることが予測される核磁気共鳴の導入を計るため,気体NMR法の検討を行った。
カルネキシンスプライシングアイソフォームが新生蛋白質の品質管理機能に及ぼす影響

研究の目的は、我々が最近見い出したcalnexin(CNX)のスプライシングアイソフォーム(iCNX,未発表)がdeltaF508CFTRの小胞体からの解離を促し,遺伝性嚢胞性線維症を改善するという新規の治療手段の可能性について検討することである。この新規蛋白は、CNXと異なり、膜貫通ドメインを持たず、また、レクチン活性およびカルシウム依存性活性に関わるリピート部分を持っていないという特徴をもつ。難治性遺伝性疾患である嚢胞性線維症(cystic fibrosis:CF)は、白色人種の間で最も頻度の高い,重篤な遺伝性疾患(常染色体劣性)である.CF患者の変異CFTRがprotein foldingの異常によりERに長期保持され分解された結果、細胞表面のCl^-透過不全に由来する易感染性により死に至るという。本研究は,delta F508 CFTRにはCNXが相互作用するという知見、および化学シャペロン(DMSO)が変異CFTRのER保持を解除し、機能的なCl^-チャネルを膜表面に発現させるという知見を基に,小胞体をターゲットにした新規治療法を提起することを究極的な目的としている.もし,この考え方の妥当性が証明されると,iCNXの機能最小単位(数十ペプチドレベル)を明らかにし,CFTRに対する選択性を高めた後,ペプチドのX線構造解析のデータがら有機化合物の創製が可能であり,CFの治療薬も夢ではなくなる.また,この治療薬は小胞体またはシャペロンターゲティングという新規の発想の新薬開発にも貢献しうる.現在まで,iCNXに対するモノクローナル抗体を作製し,内因性にこの蛋白が発現していることがわかった.また,iCNXをadenovirus vectorにサブクローニングし,その作用を調べているところである.さらに,札幌医科大学の和田教授との共同研究でiCNXとCNXの相互作用について調べている.研究の目的は、我々が最近見い出したcalnexin(CNX)のスプライシングアイソフォーム(iCNX,未発表)がdeltaF508CFTRの小胞体からの解離を促し,遺伝性嚢胞性線維症を改善するという新規の治療手段の可能性について検討することである。本研究は,delta F508 CFTRにはCNXが相互作用するという知見、および化学シャペロン(DMSO)が変異CFTRのER保持を解除し、機能的なCl^-チャネルを膜表面に発現させるという知見を基に,小胞体をターゲットにした新規治療法を提起することを究極的な目的としている.もし,この考え方の妥当性が証明されると,iCNXの機能最小単位(数十ペプチドレベル)を明らかにし,CFTRに対する選択性を高めた後,ペプチドのX線構造解析のデータがら有機化合物の創製が可能であり,CFの治療薬も夢ではなくなる.また,この治療薬は小胞体またはシャペロンターゲティングという新規の発想の新薬開発にも貢献しうる.現在まで,iCNXに対するモノクローナル抗体を作製し,内因性にこの蛋白が発現していることがわかった.また,iCNXをadenovirus vectorにサブクローニングし,その作用を調べているところである.さらに,札幌医科大学の和田教授との共同研究でiCNXとCNXの相互作用について調べている.
内蒙古東部における青銅器文化関係資料の調査に基づく先秦時代北方民族の研究

ユーラシア東部の歴史的推移は中国本土の農耕民とモンゴリアの遊牧民の対立が一つの基軸をなす。中国先秦時代(前3世紀)はこの農耕・遊牧対立の図式が形成される時期に当たる。本研究は、内蒙古東南部地区の青銅器文化、とくに夏家店上層文化およびそれに後続する諸文化に関わる考古学的資料の現地調査を踏まえ、文献史学・古文字学・考古学といった多面的な研究方法によって、この時期の内蒙古東南部における北方民族の実態を包括的に解明するものである。2006年6月13日付で共同研究項目について敖漢旗博物館に提示し、田彦国館長の快諾を得た。8月612日、研究代表者・共同研究者両名にて、内蒙古東部地区の現地調査におもむき、敖漢旗博物館の夏家店上層文化を中心とする青銅器文化関係文物の資料調査を行い、あわせて田彦国館長・邱国彬副館長と懇談し、夏家店上層文化に関する現地発掘担当者としての所見を聴取した。さらに同館の館蔵文物の撮影を行い、館員の案内で、燕北長城附属の方城遺址(斉大窩鋪戦国城址)を参観し、陶片を収集した。また同館刊行の資料を恵贈いただいた。同調査期間に、赤峰市博物館・寧城県博物館(遼中京博物館)・翁牛特旗博物館にもおもむき、館長・副館長と懇談するとともに可能なものについては撮影を行った。9月2023日、大連民族学院において開催された「首届中国満学高峰会議」に参加し、研究発表を行うとともに、中国東北地区各地の研究者と懇談した。会期中、大連大学を訪問し、王禹浪教授と懇談するとともに、附属博物館を参観し、資料の写真撮影を行った。これらの機会に撮影した写真については全てデジタル化した。敖漢旗博物館などにおける現地調査の結果として、(1)学術雑誌などに公表されていない資料がなお大量に存在する、(2)内蒙古東部地区の青銅器文化の類型・編年につき、赤峰市区の博物館の間においてさえ見解の相違がある、(3)夏家店下層文化と夏家店上層文化の間には一般的に文化的空白が報告されているが、敖漢旗博物館ではこの空白期に相当する遺物を発見し、「柳南類型」と命名している、(4)『中国文物地図集・内蒙古分冊』は公刊された調査資料としてはもっとも包括的だが、それでも主要な遺跡しか掲載していない。また採用された公式の地名と現地の通称の間には齟齬があり、そのことが報告書にも反映されている、などの重要な所見を得た。(1)昨年度の協定に基づき、敖漢旗博物館においては、夏家店上層文化を中心とする館蔵文物の整理、写真撮影、解説執筆を進めていたが、2007年9月にこの作業を基本的に完成し、およそ100件の画像および解説が、田彦国館長より研究代表者に送付された。従来未公開の資料群であり、『敖漢旗文物精華』に発表済みの資料とあわせて、DBのかたちに編集した。まずは冊子体の形態で、最終年度の研究報告書に掲載する予定である。(2)昨年度に引き続き、敖漢旗を中心とする内蒙古東部地区の考古学諸文化について、夏家店上層文化を中心に整理を進めた。本年度はとくに、「農牧交錯地帯」における新石器初期鉄器時代の環境変化に対する研究状況に重点を置いた。このため、研究分担者1名にて2007年5月29日6月4日および8月20日9月7日の2回にわたって、中国農業大学(北京市)・内蒙古自治区博物館(フフホト市)・赤峰市博物館(赤峰市)・遼寧省博物館(瀋陽市)などにおいて関連資料の収集を行った。(3)夏家店上層文化を文献に見える民族集団に比定する従来の諸研究を検討した。昨年度公刊した「史記匈奴列傳疏証」において、夏家店上層文化を山戎に比定すべきことを確認したが、本年度は東胡・貊について検討を進めた。東胡はかつて夏家店上層文化の担い手に比定されたことがあり、貊は十二台営子文化や夏家店上層文化の衰退後に敖漢旗地域に出現した鉄匠溝遺跡の担い手に比定されている。これらの説の根拠となる文献資料に対する包括的検討を進め、確実な知見の構築に務めた。平成20年度においては、研究成果報告書を作成した。報告書は研究篇・資料篇の二部構成を採る。研究篇には、以下の6篇の論文を収めた。(1)夏家店上層文化研究の現況-近年の環境考古学的研究に寄せて-(吉本道雅)、(2)内蒙古東南部出土中原有銘青銅器札記(吉本道雅)、(3)先秦

北族関係文献の研究-夏家店上層文化の族属をめぐって-(吉本道雅)、(4)契丹小字『金代博州防禦使墓誌銘』墓主非移刺斡里朶-兼論金朝初期無「女真國」國號-(愛新覚羅烏拉煕春)、(5)金代契丹人習撚鎮國墓所出帛書考(愛新覚羅烏拉煕春)、(6)〓思涅烈家族與東丹國世選制(愛新覚羅烏拉煕春)。(1)(3)は夏家店上層文化およびそれに後続する諸文化に関わる考察である。(1)は考古資料、(2)は出土文字資料、(3)は文献に基づき、夏家店上層文化の族属に関わる問題を多面的かつ包括的に考察している。(1)では近年の環境考古学の発展をふまえ、中国北彊への遊牧民の南下を展望し、(2)では西周金文断代の修正案を附記し、(3)は<第一章戎秋><第二章貊><第三章東胡>の構成をとって、中国北疆に出現する異族の実態につき、その出現の順番に検討を加えた。(4)(6)は、本研究の調査対象である敖漢旗出土の遼金時代文物をあつかった専論である。資料篇は、「内蒙古自治区敖漢旗博物館館蔵資料図録」と題して、敖漢旗博物館提供の夏家店下層文化戦国期の関係資料のカラー図版ならびに解説を掲載したものである。『敖漢旗文物精華』に既発表のもののほか、従来未公開のものを含め、合計110点の文物を紹介するものであり、関連研究に重厚な基礎資料を提供するものである。
植物オルガネラ遺伝情報を維持・制御するＰＰＲ蛋白質のＲＮＡ認識コードの網羅的解析

本研究の遂行により、PPRモチーフのRNA結合様式をほぼ解明することができた。すなわち、PPR蛋白質を構成する連続した、複数のPPRモチーフが一対一の対応関係でRNAと結合し、かつモチーフ中の3アミノ酸(1、4、ii番)の組み合わせが暗号となって(PPRコード)、結合塩基が決定する。この知見により、植物にのみ非常に多く含まれるPPR蛋白質のミトコンドリア、葉緑体遺伝情報の管理について著しい進歩が期待出来る。また、上記のPPR蛋白質の性質は、蛋白質工学的な利用に最適であり、現在、PPR蛋白質を利用したカスタムRNA結合蛋白質の構築にも着手している。高等植物のみで大きなファミリーを形成するPPR蛋白質は、ミトコンドリア、葉緑体のゲノム情報をRNAレベルで配列特異的に維持・管理している。本研究はPPR蛋白質のRNA結合特性を明らかにすることで、PPR蛋白質による植物のオルガネラ遺伝情報維持機構に新たな知見を得ることを目的としている。本年度は、既に予備的な知見を得ていたPPRモチーフ中のRNA結合に関わるアミノ酸群の詳細な解析を行った。様々な天然型および変異導入PPRモチーフを用いて解析を行った結果、塩基認識、親和性にそれぞれ寄与するアミノ酸群を同定した。当該アミノ酸について、約5000個のPPRモチーフを用いて統計解析を行い、当該アミノ酸群の連続性、および協調的な働きについて知見を得た。また、異種植物間での相同遺伝子のアミノ酸多型を解析することで、同義の働きをするアミノ酸群について知見を得ることが出来たため、PPRモチーフのRNA認識コードについてある程度単純化した分類分けを行った。平行して、RNA結合特性を解析する手法として、新たにSELEX法の構築を行った。シロイヌナズナHCF152蛋白質を用いたところ、過去に部分欠失RNAを用いて同定した結合RNA領域20b中の約10bとほぼ一致するRNA配列をSELEX法によって得ることが出来た。生化学的な解析結果と合わせて、さらに考察を進めている。また、PPR蛋白質のRNA結合特性解析手法として、試験的にPhage Display法の導入を試みた。いくつかのPPRモチーフをライブラリーに組み込んで実験したところ、ligandに用いるRNAに応じて特定のアミノ酸を持つPPRモチーフが選択的に濃縮されることがわかったため、ライブラリーに含まれるPPRモチーフを増やして新たな実験系の構築を進めている。本研究はPPR蛋白質のRNA結合特性を明らかにすることで、PPR蛋白質による植物のオルガネラ遺伝情報維持機構に新たな知見を得るこどを目的としている。本年度は、昨年度より行っているHCF152蛋白質をモデル分子として用いたPPRモチーフのRNA結合能の確認実験、および論文発表を行った。また、RNA編集に関わる既知のPPR蛋白質と標的RNA配列、約30種、の組み合わせを材料に、計算科学および統計学的手法で、PPRモチーフのRNA認識コード、PPRコード、を明らかにした。その結果、PPRモチーフのRNA結合能は、PPRモチーフを構成する35アミノ酸の中でも、ほんの数個所のアミノ酸で決定することがわかった。さらに、当該アミノ酸の種類および組み合わせに含まれる結合RNA塩基の情報を用いることで、生体内の標的RNA分子が予測できることが明らかになった。本成果に関しては、特許申請を行うとともに、論文発表の準備を進めている。上記に記したPPRコードの正確性を試験管内、および生体内で検証・利用する実験系の確立に着手した。同時に、PPR蛋白質の結合RNA配列予測プログラムの試用版を構築した。このプログラムを用いて、シロイヌナズナに含まれる機能未知PPR蛋白質いくつかのの標的予測を行った。現在、該当遺伝子を欠損したシロイヌナズナを入手し、予測の正確性を検証している。また、PPRモチーフのRNA結合特性を大量かつ高速にアッセイするためのPhageDisplay法の導入を継続して行った。天然型PPRモチーフ500種、または上記のPPRコードを担うアミノ酸群にアミノ酸置換を施した合成PPRモチーフ、ふたつのライブラリーを構築した。特定のRNA配列に結合するPPRモチーフの選抜を行っている。本年度は、昨年度に明らかにしたPPRモチーフノRNA認識コード、PPRコード、の試験管内での動作検証を行った。PPRコードに準じて、タンパク質にアミノ酸置換を導入したところ、そのRNA結合選択性において、予測通りの結果を得ることができた。

また、PPRコードを利用して、いくつかの未解析PPR蛋白質の標的RNA予測を行い、当該遺伝子欠損株(シロイヌナズナ)を解析した。その結果、予測通りの結果を得ることができた。以上の実験から、本研究で得られたPPRコードの正確性を実証した。結合配列予測プログラムの構築と検証を行っている間に、RNA塩基識別に働く3つのアミノ酸(1番、4番、-2番)の効力が他の箇所のアミノ酸の影響を受けるという新たな知見を得た。追加検証実験を行い、得られた結果を基に、予測プログラムを改良を試みた。本年度の研究により、PPRモチーフの選択的なRNA配列の認識機構、の原理をほぼ解明することが出来たため。25年度が最終年度であるため、記入しない。予定通りに研究を進めるとともに、応用展開にいち早く着手するべきだと考える。
多機能タンパク質プラスチン分子群の細菌感染における機能の解明

我々は生菌やLPSの刺激で強くリン酸化されるマクロファージ内タンパク質p65/L-Plastin (p65)を同定した。p65は免疫系細胞に特異的に発現され,Ca, calmodulin,β-actin結合ドメインを有する多機能タンパク質であり,細菌の細胞内侵入や防御系細胞の遊走・接着など,病原体と防御系の攻防の両面で重要な機能を担っていることが明らかになりつつある。今回,我々は,recombinant p65(rp65)を免疫原として高力価抗体および単クローン抗体(mAb)を調製し,菌体刺激に伴うp65の細胞内動態について検討した。rp65はpETvectorおよびBL21大腸菌株を用いて調製した。充分量のrp65でウサギを免疫し高力価抗rp65抗体を得た。この抗体はマクロファージ・リンパ球のnative rp65をシングルバンドとして検出した。また,rp65を抗原とするELISAを確立しmAbを得た。これらにより細胞内p65の検出が可能となった。我々は菌体やLPS刺激でマクロファージの形態が変化し接着性が著明に亢進することを報告した。また,最近Brown EJらはp65のリン酸化がintegrinを介した細胞接着性を制御することを報告した。そこで細胞内p65の免疫組臓学的解析を実施した。接着性が亢進したマクロファージは接着面に対して著明に伸張し紡錘状の形態を示した。共焦点レーザー顕微鏡でp65の三次元的局在を解析すると,伸張部ではp65を含む触手状の構造物が観察された。β-actinと特異的に結合するphalloidinを用いて二重染色すると,細胞の伸張部では樹状のβ-actinファイバーが存在し,それに一致してp65が局在することが明らかにされた。p65のリン酸化を阻害するH-89存在下では接着性の亢進は抑制され,β-actin-p65の触手状構造物の伸張も抑制された。これらのことからp65が細胞接着をin situで動的に制御していること,およびp65を含む細胞骨格の再構成が感染防御上重要なであることが強く示唆された。我々は生菌やLPSの刺激で強くリン酸化されるマクロファージ内タンパク質p65/L-plastin (p65)を同定した。p65は免疫系細胞に特異的に発現され,Ca, calmodulin, β-actin結合ドメインを有する多機能タンパク質であり,細菌の細胞内侵入や防御系細胞の遊走・接着など,病原体と防御系の攻防の両面で重要な機能を担っていることが明らかになりつつある。今回,我々は,recombinant p65 (rp65)を免疫原として高力価抗体および単クローン抗体(mAb)を調製し,菌体刺激に伴うp65の細胞内動態について検討した。

この抗体はマクロファージ・リンパ球のnative p65をシングルバンドとして検出した。また,rp65を抗原とするELISAを確立しmAbを得た。これらにより細胞内p65の検出が可能となった。我々は菌体やLPS刺激でマクロファージの形態が変化し接着性が著明に亢進することを報告した。また,最近Brown EJらはp65のリン酸化がintegrinを介した細胞接着性を制御することを報告した。そこで細胞内p65の免疫組織学的解析を実施した。接着性が亢進したマクロファージは接着面に対して著明に伸張し紡錘状の形態を示した。共焦点レーザー顕微鏡でp65の三次元的局在を解析すると,伸張部ではp65を含む触手状の構造物が観察された。b-actinと特異的に結合するphalloidinを用いて二重染色すると,細胞の伸張部では樹状のβ-actinファイバーが存在し,それに一致してp65が局在することが明らかにされた。p65のリン酸化を阻害するH-89存在下では接着性の亢進は抑制され,β-actin-P65の触手状構造物の伸張も抑制された。これらのことからp65が細胞接着をin situで動的に制御していることが強く示唆された。我々は生菌やLPSの刺激で強くリン酸化されるマクロファージ内タンパク質p65/L-plastin(p65)を同定した。p65は免疫系細胞に特異的に発現され、Ca、calmodulin、b-actin結合ドメインを有する多機能タンパク質であり、細菌の細胞内侵入や防御系細胞の遊走・接着など、病原体と防御系の攻防の両面で重要な機能を担っていることが明らかになりつつある。今回、我々は、recombinant p65(rp65)を免疫原として高力価抗体および単クローン抗体(mAb)を調製し、菌体刺激に伴うp65の細胞内動態について検討した。rp65はpETvectorおよびBL21大腸菌株を用いて調製した。充分量のrp65でウサギを免疫し高力価抗rp65抗体を得た。また、rp65を抗原とするELISAを確立しmAbを得た。また、最近Brown EJらはp65のリン酸化がintegrinを介した細胞接着性を制御することを報告した。共焦点レーザー顕微鏡でp65の三次元的局在を解析すると、伸張部ではp65を含む触手状の構造物が観察された。β-actinと特異灼に結合するphalloidinを用いて二重染色すると、細胞の伸張部では樹状のβ-actinファイバーが存在し、それに一致してp65が局在することが明らかにされた。p65のリン酸化を阻害するH-89存在下では接着性の亢進は抑制され、β-actin-p65の触手状構造物の伸張も抑制された。
頸椎捻挫後調節障害の病態解明

頸椎捻挫後視力障害を訴える患者20名に対してMRIを施行し、中脳Edinger-Westphal(EW)核近傍での出血の既往を検索した。これら20名の患者うち4名で同部位での出血を疑う所見を認めた。調節障害に関しては、この4名以外の患者でも認められており、EW核近傍での出血と調節障害の相関性は低いと考えられた。しかし、この4名の患者全てで矯正視力の低下を認めており、残りの16名の患者うち矯正視力の低下を認めた者が1名のみであることから、EW核近傍での出血と矯正視力の相関性が疑われた。頸椎捻挫後視力障害を訴える患者12名に対してMRIを施行し、中脳Edinger-Westphal(EW)核近傍での出血の既往を検索したところ、12名中4名で同部位での出血を疑う所見を認めた。調節障害に関しては、これら4名全てで認められた訳ではなく、またこの4名以外の患者でも調節障害は認められており、EW核近傍での出血と調節障害の相関性は低いと考えられた。しかし、この4名の患者全てで矯正視力の低下を認めており、残りの8名のうち矯正視力の低下を認めた者が1名のみであることから、EW核近傍での出血と矯正視力の相関性が疑われた。視力検査は自覚的検査であり詐病との鑑別が必要であるため、現在この5名に対して他覚的検査である視覚誘発電位図および詐病の鑑別の一助となる動的視野検査などを施行中である。EW核における出血が視力に及ぼす影響は現時点では不明だが、これらの関連性が明らかになれば頸椎捻挫後の視力低下を他覚的検査で類推することが可能となる。先にも述べた様に視力検査は自覚的検査であり、心的ストレス、或いは詐病の場合でも低下し得る。他覚的検査であるMRIによって視力低下を示すことができれば非常に有意義であると考える。また、頸椎捻挫後視力障害を訴える患者12名のうち女性が10名、男性が2名と明らかな男女差を認めている。血中エストロゲン濃度、或いはエストロゲン受容体発現の差異からくるストレス応答の違いが関与している可能性もあり、これらについても現在検討中である。昨年度は頸椎捻挫後視力障害を訴える患者12名に対してMRIを施行したが、今年度は更に8名の患者に対してMRIを施行し、中脳Edinger-Westphal(EW)核近傍での出血の既往を検索した。視力検査は自覚的検査であり、心的ストレス、或いは詐病の場合でも低下し得る。また頸椎捻挫後視力障害を訴える患者20名のうち女性が18名、男性が2名と明らかな男女差を認めている。血中エストロゲン濃度、或いはエストロゲン受容体発現の差異からくるストレス応答の違いが関与している可能性もあり、血中エストロゲン濃度を5例で測定したが、年齢にばらつきがあり一定の見解は得られていない。今後症例数を増やす必要がある。また、エストロゲンに関しては、サルの中脳組織を使ってエストロゲンレセプターの発現部位、発現細胞を検討中である。
NOTCH1の扁平上皮がんにおける二面性の分子基盤

腫瘍細胞が体を蝕み、死に至らしめる最大の要因は、転移能を獲得し悪性化することにあります。その悪性化の分子機構を突き止めることは、がんの本態を解明する上で極めて重要です。私の研究は、扁平上皮がんを対象に、子宮頸部や皮膚等の重層扁平上皮組織の分化に関わるNOTCH1という因子が、正常組織では細胞分化を誘導し、がん抑制に働く一方、悪性化した腫瘍細胞においては運動や浸潤能を促進するドライバーとして働きを変える仕組みを明らかにしました。このことは、がんの分子標的薬としてNOTCH1を標的とする場合、その対象を見極めるための科学的根拠を提示するものです。p63は重層扁平上皮組織の発生・分化におけるマスター制御因子であり、組織幹細胞性の維持に必須の役割を果たしている。p63の高発現は皮膚・子宮頸部・肺・頭頸部などの扁平上皮がんの50%以上の症例、中でも高分化扁平上皮がんで多く認められており、がん遺伝子としての機能が示唆されている。一方、p63の発現低下とがん進展との相関が報告されているが、その背景となる分子機構と意義は未解明である。NOTCH1は多くのがんにおいてがん遺伝子として働くが、重層扁平上皮組織においてはがん抑制遺伝子として機能する。しかしながら、扁平上皮がんの後期にはがん遺伝子として機能する可能性が示唆されており、NOTCH1のがんにおける二面性は謎である。これまでに研究代表者らはp63がNOTCH1遺伝子の転写抑制因子として機能し、正常角化細胞の自己複製能維持に働くことを見出している。また新規NOTCH1-ROCK1経路を同定し、これがヒト正常角化細胞の分化誘導と運動能亢進に働く主要経路であることを報告した。本研究では、NOTCH1-ROCK1経路がNOTCH1のがんにおける二面性を説明する分子基盤となる可能性を検討し、扁平上皮がんの悪性転換に関わるスイッチ機構を解明することを目的とした。正常角化細胞やp63を高発現する複数の子宮頸がん細胞株においてp63をノックダウンするとNOTCH1の発現誘導を介して強力な細胞増殖抑制が起こる。正常角化細胞においてMYCの発現導入がこのp63ノックダウンによる細胞増殖能の喪失を完全にレスキューしたこと、MYCの発現誘導によってp63の発現低下が認められたこと、並びにp63の発現低下によってNOTCH1-ROCK1経路の活性化が起きることを明らかにした。また、子宮頸がんモデル細胞の三次元培養系における浸潤能がNOTCHあるいはROCK阻害剤によって抑制されることを見出した。p63はがん遺伝子として機能する一方で、その発現低下とがん進展との相関が報告されている。しかしながら、扁平上皮がんの後期にはがん遺伝子として機能する可能性が示唆されており、p63と同様にNOTCH1のがんにおける二面性は謎である。また新規NOTCH1-ROCK1経路を同定し、これがヒト正常角化細胞の分化誘導と運動能亢進に働く主要経路であることを報告している。本研究では、p63の下流に位置するNOTCH1-ROCK1経路がNOTCH1のがんにおける二面性を説明する分子基盤となる可能性を検討し、扁平上皮がんの悪性化に関わるスイッチ機構を解明することを目的とした。MYCの過剰発現によりp63ノックダウンによる細胞増殖能の喪失は完全にレスキューされ、この時NOTCH1-ROCK1経路の活性化が起きることを明らかにした。既に樹立した子宮頸がん多段階発がんモデルを用いて、この三次元培養系における浸潤能がNOTCH-ROCK経路に依存していることを見出した。従って、MYCの過剰発現がp63の機能喪失を許容し、NOTCHのがんにおける二面性を説明する鍵となる可能性が示唆された。平成27年度の研究実施計画として細胞分化能の有無におけるNOTCH1-ROCK1経路の生物学的効果の違いを明らかにすることと、扁平上皮がん臨床検体におけるp63,NOTCH1,MYCのステータスと悪性度との相関解析を掲げた。既に樹立したヒト子宮頸がんの多段階発がんモデルの三次元培養系を用いて、MYC高発現による浸潤能の亢進がNOTCH1-ROCK1経路の活性化を介していることを明らかにした。また、当初の計画には無かったが、p63の発現低下を認め浸潤能が亢進したモデル細胞にp63を過剰発現させることで浸潤能が失われるか否かの検討を開始した。このためp63とエストロゲン受容体との融合蛋白を作成し、タモキシフェン(4OHT)投与によってコンディショナルにp63の発現誘導が可能な系を樹立した。次年度以降、p63の発現誘導によりNOTCH-ROCK経路の活性化が抑制され、浸潤能が阻害されるか否かを明らかにする予定である。また口腔がんの臨床検体を用いた解析から、p63の発現低下が認められる腫瘍において活性化型NOTCH1とMYCの発現亢進が認められるという予備的結果を得た。

次年度以降は検体数を増やし、且つ様々なグレードの腫瘍を解析対象とすることで、p63,NOTCH1,MYCのステータスと悪性度との相関を統計学的に調べ明らかにする。その上で、実際のヒト扁平上皮がんの進展において、その本態にp63とNOTCH1の二面性が関わる可能性を検討する。p63は重層扁平上皮組織の発生・分化におけるマスター制御因子であり、組織幹細胞性の維持に必須の役割を果たしている。その生理機能に合致し、p63の高発現が皮膚・子宮頸部・肺・頭頸部などの扁平上皮がんの50%以上の症例、中でも高分化扁平上皮がんで多く認められており、がん遺伝子としての機能が示唆されている。これと一見矛盾するように、p63の発現低下・機能消失とがん進展・予後不良との相関が報告されているが、その背景となる分子機構と意義はNOTCH1の二面性と同様に未解明のままである。これまでに研究代表者らはp63がNOTCH1遺伝子の転写抑制因子として機能し、正常角化細胞の自己複製能維持に働くことを見出している。またp63の下流抑制経路として新規にNOTCH1-ROCK1経路を同定し、これがヒト正常角化細胞の分化誘導と運動能亢進に働く主要経路であることを報告している。正常角化細胞やp63依存性の増殖を示す複数の子宮頸がん細胞株を用いて、p63ノックダウンによる細胞増殖能の喪失はMYCの過剰発現により完全にレスキューされることを明らかにした。また、樹立済みの子宮頸がんin vitro発がんモデルを用いて、MYC過剰発現下におけるp63ノックダウンは浸潤能を促進すること、その責任経路としてNOTCH1-ROCK1経路が機能することを見出した。更に、頭頸部がんのTCGA解析により、p63とMYCの発現は相互排他的な傾向にあることを確認している。従って、MYCの過剰発現がp63の機能喪失を許容し、扁平上皮がんの発生と進展におけるNOTCHの二面性を説明する鍵となる可能性が示唆された。平成28年度の研究実施計画としてMYC高発現下におけるp63-NOTCH1-ROCK1経路の制御破綻と悪性転換との機能的関連を調べることと、扁平上皮がん臨床検体におけるp63,NOTCH1,MYCのステータスと悪性度との相関解析を掲げた。樹立済みのヒト子宮頸がんのin vitro発がんモデルの三次元培養系を用いて、MYC高発現による浸潤能の亢進がNOTCH1-ROCK1経路の活性化を介していることを明らかにした。また、正常角化細胞を起点とした多段階発がんモデルの場合とは逆に、高転移能を有するがん細胞株においてp63過剰発現の効果を検討したところ、NOTCH1-ROCK1経路の不活化を伴って、有意に運動能が抑制されることを明らかにした。口腔がんの臨床検体を用いた解析から、p63の発現低下が認められる腫瘍において活性化型NOTCH1とMYCの発現亢進が認められるという予備的結果を得た。NOTCH1は多くのがんにおいてがん遺伝子として機能するが、重層扁平上皮組織においては角化細胞の分化決定因子であり、がん抑制遺伝子として機能する。
CuIを原料とするCuの選択形成

ヨウ化銅(CuI)を原料とした低圧化学気相堆積法を用いて薄膜の選択成長プロセスを実現し、ULSIでの簡易な配線技術の確立を目指すことを目的とし平成30年度は以下の研究を行った。実施計画1Cu堆積速度の高速化:平成29年度に引き続き原料であるCuIを面供給型で気化させ堆積表面への原料供給速度を増加させることでのCuの高速堆積に関する詳細検討を実施した。平成29年度では、Cuの堆積速度を<111>配向を維持したままで120nm/min程度まで大幅に増加することに成功したが、今年度の詳細検討の結果、成長初期段階でのRu上での堆積速度と堆積されたCu上での堆積速度の著しい差異による堆積速度の非線形性が確認された。実施計画2パターン形状へのCu堆積:平成29年度の結果より、パターン下地金属としてRuが有利であることが明らかとなったことから、今年度はRuを下地とするViaパターン付きウェハの作製を検討し外注作製した。Viaパターンは3μm厚TEOS-SiO2に開口直径3μmを中心サイズとし、マスク設計しRIE加工した。パターン形成中でTEOS-SiO2/Ru間での密着性の問題により数回の試作が必要となり、その結果厚さ7nm程度のTi密着層を挿入することに変更した。作製した加工パターンを用いて実施計画1での結果を基にCuの埋め込み実験を開始し、Ru上でのCuの選択形成が可能であることまでわかってきている。実施計画3分子軌道計算による選択成長機構の解明:Gaussian PackageによるDFT計算での基底関数をLANL2DZに変更することで実験値と良い相関がある結果が得られることがわかり、Ru上およびCu上でのCuI三量体の状態が推察できるようになった。但し、実施計画1で得られたCu堆積速度の非線形についてはさらに大規模な分子動力学計算が必要となるためにその準備を開始した。実施計画1Cu堆積速度の高速化については、当初の目標である100 nm/minの堆積速度を超える結果が得られているが、Ru上とCu上でのCuの堆積速度の大きな差異があることが新たにわかり、Cu堆積の制御性を高くするために新たな検討が必要となった。実施計画2下地金属をRuに変更したことによる微細パターン付きウェハ作製に遅れが生じた。問題点は、TEOS-SiO2/Ru間での密着性が乏しいことが当初不明であり、SiO2形成時に膜剥がれが生じ、これを回避するために前処理やPCVD-SiO2への変更などの検討を行ったための遅れである。結果としては、これらの回避方法は有効ではないことがわかり、やむを得ずTEOS-SiO2/Ru間に7nm程度の暑さでTi密着層を用いることにした。実施計画3分子軌道計算による選択成長機構の解明については、遷移金属に対応し得る基底関数に変更することで、実験結果との相関を高くすることができるようになってきたが、実施計画1で新たにわかったRu上とCu上での原料分解過程に著しい差異についてはこれまで実施してきた分子軌道計算では対応できず、新たに分子動力学計算を導入しこれらの分解過程の解明が必要となったため、当初の計画を修正することとなった。平成31年度の実施計画は、2パターン形状へのCu堆積と、3分子軌道計算による選択成長機構の解明からなる。特に、パターン形状へのCu堆積については、現在までの進捗状況に記載の理由により実施に遅れが生じていることから、特に注力して実施する。また、同時に形成したCu薄膜および下地との界面の組成分析と構造分析を実施する。分子軌道計算による選択成長機構の解明については、Ru上とCu上での原料の分解過程の解明に注力し、新たに共同研究者1名を加えて分子動力学計算による検討を行う。本研究課題では、ヨウ化銅(CuI)を原料とした低圧化学気相堆積法を用いて導体上へのCu薄膜の選択成長プロセスを実現し、ULSIでの簡易な配線技術の確立を目指すことを目的とし平成29年度は以下の研究を行った。実施計画1Cu堆積速度の高速化:原料粉末をペレット状に加工し、面供給型での原料気化に変更することで、より低温での原料供給を行い、かつ、堆積表面への原料供給速度を増加させることでCu堆積速度の高速化を試みた。その結果、これまで3 nm/min程度に留まっていたCuの堆積速度を[111]配向を維持したままで120 nm/min程度まで大幅に増加することに成功した。また、この原料供給源の改良により、Cuの成長核密度の増加を実現でき、抵抗率がバルクと同等のCu薄膜の形成を実現できた。実施計画2パターン形状へのCu堆積:上記1での研究を遂行する過程で下地が導体でもその材質によりCu形成温度が異なることが見出された。その結果、当初下地バリアメタルとして考えていたTiNに比べてRuが形成温度の低温化に非常に有利であることが明らかとなり、ウェハパターン設計の変更を行う必要が発生したため、実際のCu堆積はH30年度に実施することに変更した。実施計画3分子軌道計算による選択成長機構の解明:GaussianパッケージでのDFT計算によりCuI三量体がRu上とCu上に近接した際の構造と系のエネルギー計算を行い、分解過程のモデルの概要を明らかにした。更に、気相中でのCuI三量体と添加ガスとの相互作用による構造変化を計算し、より低温でのCu堆積に有効な添加ガス種の見当がついた。

実施計画1Cu堆積速度の高速化については、当初の目標である100 nm/minの堆積速度を超える結果が得られており、また、バルク抵抗率に匹敵する低抵抗Cu薄膜が得られていることから、当初の計画以上の成果が得られていると考えられる。実施計画3分子軌道計算による選択成長機構の解明についても、DFTによる構造最適化後に得られるエネルギーが実験結果と非常に良い一致を示し、原料分解過程のモデルが妥当であることを示しつつあり、更に、所望のガスを添加することでより低温でのCu堆積が示唆できていることから、当初の計画以上の成果が得られていると考えられる。実施計画2パターン形状へのCu堆積については、より低温でのCu形成を行うために、当初計画していた下地バリアメタルのTiNからRuに変更する必要が生じたことから当初の計画より若干の遅れを生じている。ヨウ化銅(CuI)を原料とした低圧化学気相堆積法を用いて薄膜の選択成長プロセスを実現し、ULSIでの簡易な配線技術の確立を目指すことを目的とし平成30年度は以下の研究を行った。実施計画1Cu堆積速度の高速化:平成29年度に引き続き原料であるCuIを面供給型で気化させ堆積表面への原料供給速度を増加させることでのCuの高速堆積に関する詳細検討を実施した。平成29年度では、Cuの堆積速度を<111>配向を維持したままで120nm/min程度まで大幅に増加することに成功したが、今年度の詳細検討の結果、成長初期段階でのRu上での堆積速度と堆積されたCu上での堆積速度の著しい差異による堆積速度の非線形性が確認された。実施計画2パターン形状へのCu堆積:平成29年度の結果より、パターン下地金属としてRuが有利であることが明らかとなったことから、今年度はRuを下地とするViaパターン付きウェハの作製を検討し外注作製した。Viaパターンは3μm厚TEOS-SiO2に開口直径3μmを中心サイズとし、マスク設計しRIE加工した。パターン形成中でTEOS-SiO2/Ru間での密着性の問題により数回の試作が必要となり、その結果厚さ7nm程度のTi密着層を挿入することに変更した。作製した加工パターンを用いて実施計画1での結果を基にCuの埋め込み実験を開始し、Ru上でのCuの選択形成が可能であることまでわかってきている。実施計画3分子軌道計算による選択成長機構の解明:Gaussian PackageによるDFT計算での基底関数をLANL2DZに変更することで実験値と良い相関がある結果が得られることがわかり、Ru上およびCu上でのCuI三量体の状態が推察できるようになった。但し、実施計画1で得られたCu堆積速度の非線形についてはさらに大規模な分子動力学計算が必要となるためにその準備を開始した。実施計画1Cu堆積速度の高速化については、当初の目標である100 nm/minの堆積速度を超える結果が得られているが、Ru上とCu上でのCuの堆積速度の大きな差異があることが新たにわかり、Cu堆積の制御性を高くするために新たな検討が必要となった。実施計画2下地金属をRuに変更したことによる微細パターン付きウェハ作製に遅れが生じた。問題点は、TEOS-SiO2/Ru間での密着性が乏しいことが当初不明であり、SiO2形成時に膜剥がれが生じ、これを回避するために前処理やPCVD-SiO2への変更などの検討を行ったための遅れである。結果としては、これらの回避方法は有効ではないことがわかり、やむを得ずTEOS-SiO2/Ru間に7nm程度の暑さでTi密着層を用いることにした。実施計画
遺伝子発現をリアルタイムで可視化する新規蛍光プローブの開発及びその応用

蛍光プローブとしてBODIPYは高い量子収率と低いpH依存性を有しており極めて有用である。しかしながら簡便な合成方法がないため、まず初めに合成方法の確立を行った。その結果、塩化クロライドとピロールを1,2-ジクロロエタン中で加熱還流し、フッ化ボロンを添加することにより、1段階でBODIPY骨格を合成する方法を確立することができた。特に電子供与性基を有する塩化クロライドを用いた場合、最大収率18%という高収率にてBODIPY骨格を有する化合物を得ることが出来た。この方法を用いることにより様々な位置に置換基を導入したBODIPYを合成することが可能になった。そこでp置換型ベンゾイルクロライドを1,2-ジクロロエタン中で加熱還流することにより、p置換フェニルを8位に導入したBODIPYの合成を行い、置換基による蛍光への影響について検討した。p置換フェニルを8位に導入したものを2種、脂肪族のものを2種合成し、これらの励起波長および蛍光波長を測定したところ、8位がメチル基の場合、励起波長490nm、蛍光波長500nm、t-ブチル基を導入した場合、励起波長495nm、蛍光波長515nmとなった。一方、8位がフェニル基の場合、励起波長505nm、蛍光波長510nmで、p-アセチルフェニルを導入したものでは、それぞれ500nm、510nmとなり、蛍光波長、ストークスシフトの大きさはともにほぼ変わらなかった。このことから8位のフェニル基のパラ位の置換基は蛍光波長に影響を与えないことが明らかとなった。これは原子模型等の結果からフェニル基がBODIPY骨格に対しほぼ垂直になっていることから、共鳴系が及ばないためであると考えられる。この結果から、BODIPY骨格の8位のフェニル基のp位にmRNA認識部位をつければ、蛍光特性を変化させることなく、蛍光プローブを作成できることが示された。前年度までに、得られた知見をもとにさらに新規のBODIPY類の合成に着手した。3位と5位にそれぞれp置換フェニル基を有するBODIPY骨格を合成することで、励起波長、蛍光波長が長波長にシフトする事が考えられたため、これら新規蛍光化合物の合成を行った。合成においては前年度に確立した方法を利用し、原料となるピロールの合成方法の確立を行ったところ、立体的な障害のため収率は低くなるものの、目的のピロール類を得ることに成功した。これをもとに新規蛍光化合物の合成を行い、これら化合物について物理的特性を求めた。まず初めにこれら蛍光化合物の溶媒による影響について調べたところ、水溶媒系においても蛍光強度はほぼ変わらなかった。またpHについても検討を行ったが、生理的pHでは蛍光強度に影響は見られず、生体への適用が十分可能であることが明らかとなった。次に、DNAの鋳型に結合させ、特定のmRNAに対してのみ蛍光シグナルを発するようにデザインを行った。蛍光化合物とDNAを直接結合させた蛍光プローブの合成を行ったところ、収率は低く、また単独での蛍光強度も低かった。理由の一つとして、蛍光団がDNAの塩基の芳香環と相互作用を起こし、消光してしまったものと考えられる。蛍光団とDNAの間にスペーサーを組み込んだ化合物を数種類合成することで、この問題を解決することが可能となった。一方、適応性についての基礎的な検討を行うため、皮膚の創傷治癒の解析、また発現タンパク質の検出について検討を行った。検討を重ねるうち、従来法では不十分な点が明らかになったため、これらの問題点を解決するための方法の開発に着手し、新規手法の確立に至った。