hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理学的応力環境での内皮細胞メカノセンシングと機能応答に関する研究

本研究では,生体の恒常性維持に関わる重要な指標の一つである血管内皮細胞の一酸化窒素(NO)産生能,ならびに細胞の酸素代謝能についてせん断応力負荷に対する応答変化を調べ,生理学的環境下での力学的刺激と細胞機能異変との関連について明らかにすることを目的とし,血管内皮細胞,もしくは血管細胞,血管組織に関して,次の3項目1)せん断応力刺激によるNO活性機構, 2)動脈壁内部の細胞でのLDL輸送機構, 3)頸動脈分岐部での酸素輸送機構,について調べた. 1.については,内皮細胞が二系統のせん断応力刺激による産生機構を有することを予想し実験を行った.その結果,遺伝子レベルで調節が行われるNO産生機構については,転写因子レベルでは活性が確認されたものの,蛋白レベルでは十分に確認できず,長時間の応力付加が必要であることが予想された.2.については,血管平滑筋細胞のLDL代謝機構のせん断応力依存性について調べた.その結果,内皮細胞が持つLDL代謝機構のせん断応力依存性と同程度の機能が平滑筋細胞にも実現されると仮定した場合,そうでない場合に比べ,動脈組織内での著しいLDL代謝の増進が予想された.これは内皮細胞層でのLDL透過率によっても多大な影響を受けることが考えられる. 3.については,若年層と老年層の頸動脈分岐部形状を模擬した動脈壁内部における酸素代謝のシミュレーションを行った.その結果,加齢と共に血行力学的な危険因子(低酸素,低せん断応力)が頸動脈分岐部で増大することが予想された.これは加齢と共に血管の形状や内皮細胞の状態が変化し,せん断応力刺激に対する細胞の機能応答が大きく変化するためであると考えられる.本研究では,生体の恒常性維持に関わる重要な指標の一つである血管内皮細胞の一酸化窒素(NO)産生能,ならびに細胞の酸素代謝能についてせん断応力負荷に対する応答変化を調べ,生理学的環境下での力学的刺激と細胞機能異変との関連について明らかにすることを目的とし,血管内皮細胞,もしくは血管細胞,血管組織に関して,次の3項目1)せん断応力刺激によるNO活性機構, 2)動脈壁内部の細胞でのLDL輸送機構, 3)頸動脈分岐部での酸素輸送機構,について調べた. 1.については,内皮細胞が二系統のせん断応力刺激による産生機構を有することを予想し実験を行った.その結果,遺伝子レベルで調節が行われるNO産生機構については,転写因子レベルでは活性が確認されたものの,蛋白レベルでは十分に確認できず,長時間の応力付加が必要であることが予想された.2.については,血管平滑筋細胞のLDL代謝機構のせん断応力依存性について調べた.その結果,内皮細胞が持つLDL代謝機構のせん断応力依存性と同程度の機能が平滑筋細胞にも実現されると仮定した場合,そうでない場合に比べ,動脈組織内での著しいLDL代謝の増進が予想された.これは内皮細胞層でのLDL透過率によっても多大な影響を受けることが考えられる. 3.については,若年層と老年層の頸動脈分岐部形状を模擬した動脈壁内部における酸素代謝のシミュレーションを行った.その結果,加齢と共に血行力学的な危険因子(低酸素,低せん断応力)が頸動脈分岐部で増大することが予想された.これは加齢と共に血管の形状や内皮細胞の状態が変化し,せん断応力刺激に対する細胞の機能応答が大きく変化するためであると考えられる.せん断応力・壁伸張といった『力学的刺激』と血管細胞・組織における『機能異変』との生理学的関係の解明を行うため、本年度はウシ内皮細胞に流体力学的せん断応力を負荷し、そのときに産生される一酸化窒素(NO)と細胞内カルシウムイオン濃度の変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いたバイオイメージング法により観察を行った。実験はまず、内皮細胞を培養した石英板サンプルを準備し、このサンプルに蛍光染料を負荷した後、せん断応力負荷装置にセットし、一定時間せん断応力を負荷後、イメージング観察を行った。同時にNO合成酵素(NOS)について、内皮細胞型(eNOS)と誘導型(iNOS)の発現機構のせん断応力依存性について詳細に調べるため、ウェスタンブロットとELISAを行った。内皮細胞のNO産生能については従来知られている通り、せん断応力負荷開始から数秒でNO産生がバイオイメージング法により確認された。カルシウムイオン濃度も同様に、せん断応力負荷後、早い時間で上昇が見られた。そのカルシウムイオンの由来を明確にするため、細胞表面のイオンチャネルをガドリニウムでブロックし、同様の実験を行ったところ、NO、カルシウムともに殆ど変化は見られなかったとことから、カルシウムは細胞内由来であると結論された。NOの由来についてはウェスタンブロット、ELISA法によりeNOS由来であることが確認されたが、iNOSについては数時間オーダーのせん断応力負荷が必要であることも、転写因子NF-kBの発現を調べる事により予想された。せん断応力・壁伸張といった『力学的刺激』と血管細胞・組織における『機能異変』との生理学的関係の解明を行うため、本年度は昨年度の実権装置を改良することで、ウシ内皮細胞に血流を模擬した拍動流による流体力学的せん断応力を負荷し、そのときに産生される一酸化窒素(NO)濃度変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いたバイオイメージング法により調べた。同時に、NO合成酵素(NOS)については、内皮細胞型NO合成酵素(eNOS)と誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現機構のせん断応力依存性について調べるため、ウェスタンブロット法とELISA法を行った。

さらに本年度は血管細胞における酸素代謝についても力学的刺激依存性を調べるため、まず研究の第一段階として、血流による酸素輸送に関する数値シミュレーションを行った内皮細胞のNO産生能については従来知られている通り、せん断応力負荷開始から数秒でNO産生がバイオイメージング法により確認された。拍動流と定常流との違いによるNO産生量の変化については、有意の差を認めることが出来なかった。細胞が実験開始から30分程度で剥離してくる点からも、蛍光染料の選定や負荷条件の見直しが必要であると考えられる。また、産生されたNOの由来についてはウェスタンブロット法とELISA法により、eNOS由来であることが確認されたが、iNOSについては昨年度同様、数時間オーダーのせん断応力負荷が必要であることも、転写因子NF-kBの発現を調べる事により判明した。現行の装置では2時間で細胞がコンタミネーションされてしまうため、力学的刺激の負荷装置の改善が必要と考えられる。せん断応力・壁伸張といった『力学的刺激』と血管細胞・組織における『機能異変』との生理学的関係の解明を行うため、本年度は内皮細胞の機能発現と密接に関係のある、血管壁内部に位置する平滑筋細胞が浸透流によるせん断応力を受ける場合の低比重リボ蛋白(LDL)物質輸送に関する数値シミュレーションを行った。本研究では、血管平滑筋細胞に作用するせん断応力の大きさ・分布状態が細胞の生理学的機能に及ぼす影響を数値解析的に解明することを目的としている。計算は複雑な幾何形状を持つ血管組織内部のモデリングを行う為、解適合座標系を用いて流れと物質輸送の基礎方程式を離散化し、血管平滑筋細胞周囲のLDLの流れ・反応・濃度場の数値解析を行った。計算対象となる生化学物質であるLDLは動脈硬化のイニシエーションと密接な関係を持つ、平滑筋細胞の内膜遊走・増殖を促進する作用を持つ。このLDLが血管壁内の内弾性板を経て血管内腔から浸透するという状況を想定した。また、平滑筋細胞でのLDL消費が、血管壁内部の浸透流により細胞表面で誘起されるせん断応力の「勾配」の大きさに依存する、という仮説を立て、この仮説を元にモデルを構築してシミュレーションを行った。その結果、平滑筋細胞表面でのLDLの輸送機構の詳細が明らかになった。特にLDLが平滑筋細胞表面で受容体を介して細胞内部に取りこまれる過程においては、内弾性板の「障害物」の存在等が重要となること、平滑筋細胞でのLDL消費率はせん断応力の勾配の大きさに強く依存すること、などが明らかになった。その一方で、本研究の最終目的である細胞内シグナル伝達とせん断応力との関係を明らかにする上で必要な、より詳細な現象論的モデルの構築も必要であることが判明した。新たな課題として、このモデルの構築に向けた詳細な数値解析と実験の遂行が浮かび上がった。
計量的観点に基づく近世後期口語資料の分析と評価

本研究は、これまで口語資料でありながら、その言語の位置づけの難しかった近世後期口語資料(心学道話や『古今和歌集遠鏡』、漢籍国字解等)について、コーパスを構築し、国立国語研究所で構築中の『日本語歴史コーパス江戸時代編I洒落本』にみられる近世後期洒落本の江戸語・上方語の話し言葉等と、計量的な観点から比較・対照することを目的としている。本年度は、上記の目的のもとに、以下の項目を行った。1.本課題に関する資料収集本課題の対象となる資料や本課題に関連する資料の版本や翻刻本の入手、本課題に関連する研究文献の収集につとめた。2.テキストデータ入力『古今和歌集遠鏡』、『鳩翁道話』『道二翁道話』などの心学道話等、本課題の対象となる資料について、テキストの取捨選択、入力順の確定、必要情報や想定される文書構造等の検討を行い、XML構造化を前提としたテキストデータの作成を行った。3.テキストのXML構造化上記のうち、『古今和歌集遠鏡』に関して、学生の協力を得て、テキストの分別や文・文字情報のアノテーションを行い、XML構造化を進めた。4.既存データの見直し本課題でコーパス構築を進めている資料群との比較対象とする予定である、国立国語研究所『日本語歴史コーパス江戸時代編I洒落本』について、話者データ・本文データの見直し作業を進め、国立国語研究所より最新データをリリースするとともに、コーパス作成に関する研究発表を行った。当初の予定におおむね即したスケジュールで、必要な資料のうち多くのものに関してテキストデータを作成することができた。また、洒落本コーパスの見直しについても、ほぼ予定通りに進めることができた。本課題の作業を依頼する人材を確保しつつ、着実にデータ構築を進め、適宜成果発表につとめたい。適切な技能を持つ協力者の確保に難があり、代替として学部生に部分的な協力を依頼することとなった。次年度以降も人材の確保につとめ、適材適所の分担をはかりたい。
ソフトウェアセキュリティのための量を扱う計算モデルの提案

ソフトウェアのセキュリティやプライバシーの尺度として,量的情報流,差分プライバシー等が提案され種々議論されている.本研究課題では主に量的情報流を中心にいくつかの定量的尺度について,それを計算するアルゴリズムや,そのような尺度に基づくソフトウェアの安全性検証手法の開発に取り組んだ.具体的に,復号アルゴリズムの時間攻撃による漏洩量の計算法,XMLデータベースにおけるk-安全性の検査法,#SMTソルバーを用いた量的情報流の計算手法,および文字列データの量的情報流解析の基礎となる認識可能級数および代数的級数に対する計数アルゴリズムの開発と,シミュレーションまたは実装ツールに基づく評価実験を行った.本年度は新たな定量的尺度について考察する基礎作りとして,以下の二つのケーススタディを実施した.一つ目は,隠れマルコフモデルにおけるパラメータ推定アルゴリズムの差分プライバシー化である.k-mean法や決定木構成アルゴリズム等,機械学習やデータマイニングのためのいくつかのアルゴリズムがε-差分プライバシーを満たすように改良されている.しかし,状態空間をもつモデルの学習アルゴリズムの差分プライバシー化はあまり検討されていなかった.そこで本研究では,隠れマルコフモデル(HMM)におけるパラメータ推定アルゴリズムの差分プライバシー化を行った.二つ目は,暗号システムへのタイミング攻撃に対する耐性の定量化である.この攻撃では,攻撃者がシステムの実行時間を観測し分析することで,内部で使用されている鍵の情報を推測する攻撃手法である.タイミング攻撃に対するシステムの耐性を定量的に評価するため,情報理論的手法を活用することが検討されている.情報理論的な見地からは,暗号システムを,未知の鍵を入力とし実行時間を出力とする通信路であると解釈することができる.通信路の出力(実行時間)から入力(鍵)を推測する行為がタイミング攻撃に相当するが,攻撃者が得ることのできる情報量は,通信路入出力間の相互情報量(量的情報流)を超えることはない.本研究では,暗号システムとしてRSA暗号の復号アルゴリズムを想定し,上記のように定義される通信路の量的情報流を精密に算出した.データベース内の機密情報の漏洩を防ぐ一般的な手法としてアクセス制御がある.アクセス制御とは,データベースに対し,機密情報が得られるような問合せの実行をアクセス権のあるユーザのみに許可するというものである.以下では,問合せを許可問合せと禁止問合せに分類することによりアクセス制御を行うと仮定する.このようにユーザごとに許可問合せ,禁止問合せが適切に指定されていれば機密情報の漏えいは直接的には生じない.しかし,ユーザがデータベースに対して許可問合せ,データベーススキーマ,問合せのコード(意味)等の公開情報を組み合わせることで,禁止問合せの結果を推論できることがある.このようなユーザの行為を推論攻撃という.推論攻撃によって禁止問合せの結果がk個未満に絞りこめないとき,データベースインスタンスは(これらの問合せとスキーマに対して)k-安全であるという.本研究ではXMLデータベーススキーマ,問合せ,インスタンスが与えられたとき,これらを命題論理式のモデル計数問題に帰着してk-安全性を検査する手法の提案を行った.この手法では,スキーマの適合性や問合せの入出力関係を充足可能性問題に帰着し,命題論理式のモデル(命題論理式を充足するような,論理変数への真偽値割り当て)を数えることによりk-安全性を判定する.入力を制約式に変換するツールを実装し,既存のSugar(順序符号化を行うツール)やsharpCDCL(射影を指定可能なモデル計数ツール)といったツールを用いて提案するk-安全性検査法に基づいた検査システムを実装し,性能評価のための実験を行った.また,提案する手法では候補データベースのサイズに上限をおいているという点で十分条件を判定しているといえる.そこで禁止問合せがない場合について,提案する手法で判定可能なk-安全性の必要十分条件を与えた.本研究で提案する具体的な検証手順は以下の通りである.まず,与えられた適合性制約,禁止問合せの入出力関係制約,許可問合せの入出力関係制約を制約式(範囲付整数を含んだ命題論理式)として表現する.次に制約式を順序符号化を用いて連言標準形命題論理式(CNF式)に変換し,最後に,このCNF式を禁止問合せの結果を表す変数に射影した論理式に対してモデル(論理式を真とするような,論理変数への真偽値割り当て)の計数を行い,得られたモデル数(禁止問合せの結果の候補数)を参照することでk-安全性であるかどうかを判定する.つまり入力を命題論理式のモデル計数問題に帰着することでk-安全性の検査を行う.しかし上記の検証法では生成される命題論理式のサイズが膨大となり検査に大きな時間を要したため,スキーマや問合せの情報を積極的に利用することで生成される命題論理式のサイズを小さくすることで高速化を行う手法も提案した.

ベンチマークを用いた実験では,上記の工夫を行うことにより,生成された論理式の論理変数および節の数が100分の1以下に減少し,検証に要するCPU時間も20分の1以下に減少した.これらにより,提案手法は十分有効であり,研究はおおむね順調に進んでいるといえる.プログラムに入力された機密情報が出力に流出するかどうかを解析することは,情報漏えい対策やプライバシ保護において重要である.このような解析における定量的な尺度として,量的情報流が注目されている.プログラムの量的情報流とは,プログラムfの出力変数Yの値を観測したときに入力変数Xの値についてどの程度の情報が得られるかを表す値であり,XとYの相互情報量で定義される.量的情報流を解析する手法の一つとして,量的情報流の計算を背景理論付き論理式のモデル計数問題(#SMT)に帰着する手法が提案されており,背景理論付き論理式の充足可能性判定ツール(SMTソルバ)を用いた#SMTの解を求めるツール(#SMTツール)が実装されている.本年度は,量的情報流解析に用いられる#SMTツールの計算効率の向上を以下の手順で行った.はじめに,#SMTツールにおいて充足不能コアとモデルのキャッシュを利用する改良を試みた.その改良を前提とし,出力変数値の探索順が計算効率に与える影響をベンチマークプログラムを用いて調査した.次に,SMTツールを利用して得られるモデルから出力変数のサンプル値を取得し,そこから計算効率の向上が確率的に期待できる探索順を求める手法を提案した.また,論理式のレベルで簡単な充足可能性判定を前処理として行うことで探索空間を小さくする手法を提案した.最後に,解析対象プログラムの抽象解釈による静的解析を利用して出力変数値に関するビットレベルの解析を行い,その結果を利用して効率のよい探索順を得る手法を提案した.提案手法を実装したツールを用いて評価実験を行ったところ,モデル数が多いベンチマークについて実行時間を小さくすることができた.また,論理式のレベルでの前処理や静的解析による前処理によって効率の良い探索順を得られることが確認でき,提案手法の有効性を示した.量的情報流を解析する手法として,量的情報流の計算を背景理論付き論理式のモデル計数問題(#SMT)に帰着する手法の高速化については当初の目的を達成することができた.最終段階で文字列データを扱うプログラムの量的情報流解析に取り組んだ.計数法の効果の検討を行った結果,動的計画法を用いることにより改良が可能であることが分かり,理論的考察までを行った.提案手法の評価のため,補助事業期間の延長を申請し承認されたところである.最終年度:形式級数Sと自然数dに対し,CC(S,d)によって長さdの語のSにおける係数の総和を表し,SC(S,d)によって長さdの語でSにおける係数が非ゼロである個数を表す.本研究では,認識可能級数Sと自然数に対し,CC(S,d)をO(log d)時間で計算するアルゴリズム,代数的級数Sに対してCC(S,d)をdの2乗オーダの時間で計算するアルゴリズム等を提案した.代数的級数に対する提案アルゴリズムは既存の計数ツールABCよりも多くの場合でより正確な計数を行えることを示した.研究期間全体:暗号システムを,未知の鍵を入力とし実行時間を出力とする通信路であると解釈すると,攻撃者が得られる情報量は通信路の相互情報量(量的情報流)を超えない.本研究ではRSA暗号の復号アルゴリズムを想定しその量的情報流を精密に算出した.データベースにおける許可問合せ,スキーマ,問合せの意味等の公開情報を組み合わせて禁止問合せの結果を推論する攻撃によって秘匿問合せの結果がk個未満に絞りこめないときデータベースはk-安全であるという.本研究では命題論理式のモデル計数問題に帰着してk-安全性を検査する手法を開発し,k-安全性検査システムを実装して有効性を確認した.量的情報流解析を,背景理論付き論理式のモデル計数問題(#SMT)に帰着する手法がある.
医薬品創製を指向する新反応モードの開発研究

われわれは、医薬品創製に有用な新規なシ-ド及びリ-ド化合物の合成開発を意識した新反応モードの開発戦略として“潜在的活性種"の有効利用という概念に従って研究を展開している。本科学研究費支援のもとでは、各種医薬品候補化合物、リ-ド化合物、有用新反応の開発を実施展開した。即ち、“潜在的脱水能"を発揮する3,3′-フェニルホスホリル-ビス(1,3-チアゾリジン-2-チオン)を活用してβ-ラクタム環形成反応を開発し、モノバクタム抗生物質合成に応用可能であることを実証した。次いで、チエナマイシンとモノバクタム系抗生物質のハイブリッドとしてチエナモノバクタムをデザインし、ジケテン-イミンによる“潜在的[2+2]環化反応"を活用してβ-ラクタマーゼ阻害剤の合成開発を達成した。更に、“潜在的連続性化種"ピラゾリジンとエチルホルムイミデ-トとによるトリアゾール環形成反応を利用して強力な1β-メチルカルバペネム抗生物質、ビアペネムのペンダント分子の実用的合成法を達成した。また、“潜在的環内窒素原子活性化能"を有するトリフルオロアセタミド-1,3,4-チアジアゾールを用いて新規なアシルイミノチアジアゾリン骨格を有する新規なアンジオテンシンII受容体拮抗作用化合物の合成開発を達成した。一連の研究過程で分子内非結合性S・・・O相互作用をX線結晶解析やab initio MO計算によって実証した。上述の各種新反応モードの他に、化学選択的なDieckmann型環化反応を活用するユニークなenantiodivergentなキラル分子の合成開発、高選択的なアリールアルキルケトン類のHWE反応の確立、共役アレニルケトン活性種のエンドモード環化反応を基盤とする高歪みメタシクロファン類の合成開発等にも成功している。以前われわれはジエチルα-アルキニルマロン酸ジエステル(DAM)体を1NKOHと処理することにより加水分解・脱炭酸反応が進行しカテプシンB、Lの酵素反応を阻害する共役アレニルエステル体が構築されるユニークなカスケード反応について報告している。今回、酵素認識部位としてジペプチドL-IIe-L-Proを有するDAM誘導体を合成し1NKOHと処理したところ期待通りのカスケード反応が進行しα,β-不飽和γ-ラクタムである新規なピロリノン誘導体の合成に成功した。本化合物はカテプシンBを特異的に阻害することが明らかとなり、免疫抑制を基盤とする抗炎症剤合成開発のシ-ド化合物として期待している。次いで、潜在的活性種共役アレニルケトンを経由する新しい5→7環拡大反応を基盤として、ヒドロキシプロパルジルイソインドリノン類のベンゾアゼピン誘導体への変換を行った。フェニル置換共役エンジインのモノリチウムアセチリド体とケトマロン酸ジエチルエステルを反応させて得た生成物の三級水酸基をメチル化後含水エタノール中触媒量のKOH水溶液と処理したところ、マイヤース型ビラジカル反応が進行しアンジオテンシンII受容体アンタゴニスト用のビフェニル誘導体の構築に成功した。更に、アミノチアジアゾール誘導体のアミノ基を選択的にトリフルオロアセチル化した後、ビフェニルメチル化すると選択的にチアジアゾール環内のN原子と反応することを見出した。本反応は血圧降下剤として有望な新規なアンジオテンシンII受容体アンタゴニストの開発に寄与した。平成9年度は次のような研究成果を得ることができた。

新規なアンジオテンシンII(AII)受容体拮抗作用物質として、既存のロサルタン(デュポン社)のイミダゾール環の代わりにアシルイミノチアジアゾリン骨格を有する新規化合物群に注目し、“潜在的環内窒素原子活性化能"を有するトリフルオロアセタミド-1,3,4-チアジアゾールを用いて多数の誘導体の効率的な合成を達成した。高活性を示したKRH-594ならびに関連化合物をX線結晶解析に供したところ全ての化合物においてチアジアゾリン環の硫黄原子とイミドカルボニルの酸素原子との間に分子内非結合性相互作用が観察された.この1,5-タイプの分子内非結合性S・・・O相互作用(close contact)の物理化学的様相を明らかにするために簡単なモデル化合物を合成しX線結晶解析ならびに分子軌道(MO)計算を試みた。その結果、分子内非結合性S・・・O相互作用が認められ、それらのMO計算から非結合性相互作用を基盤とする当該分子の安定性を考察することができた。この様な分子内非結合性S・・・O相互作用は、非天然型β-ラクタム系抗生物質ビアペネムを始め既存の多くの医薬品分子内に存在することが確認され、高い薬物活性に重要な役割を演じていることが示唆された。その他に医薬創製や合成に有用な新反応の開発も実施展開した。即ち、“潜在的優先エノール化"及び“潜在的優先脱離能"を有するキラルなモノチオールジエステル体を用いてユニークなDieckmann型環化反応を活用するenantiodivergentなプロセスを確立した。次いで、スズ(II)トリフレートと3級アミンの存在下において生成する“潜在的スズエノレート活性種"を活用し高いZ選択性で目的のHWE反応が進行することを見出した。
身体機能老化プロセスにおける心理的自律性のメカニズム：高齢者の精神的健康との関連

本研究は,老化の過程において精神的健康を保つための心理的要因を抽出し,その心理的要因を測定する方法について検討した。その結果,1)身体的な健康が維持された前期高齢者においては老いを受容するよりも心理的自立を実感することが精神的健康の維持に役立つこと,2)高齢者への投映法検査は有用であるが,認知機能の低下の影響を考慮する必要があることが明らかになった。交付申請書では縦断的調査の1回目を実施する予定だったが,研究代表者の所属機関が変わったため,縦断的調査のためのフィールド開拓が必要となった。また,確実に縦断調査を行うために,本フィールドにおいて匿名による横断的調査を実施し,調査フィールドの特徴を把握することとした。そこで2014年度は倫理審査委員会への申請,調査フィールドの開拓,当該フィールドでの質問紙調査,およびそのデータ解析を行った。まず,高齢者を対象に匿名で質問紙調査を実施するため,北里大学医療衛生学部倫理審査委員会に申請し,承認を得た。次に,高齢者が利用する公共の通所型施設,教養講座等に研究の趣旨を説明し,協力を依頼した。その結果,1施設において研究協力の了承を得た。その他今後の研究で協力を仰げる2施設も確保した。2014年11月に研究協力の了承を得た1施設において,施設を利用する高齢者を対象に身体機能,主観的幸福感,心理的自律性等に関する調査を実施した。400部を配布し,300名以上の高齢者から回答を得た。この調査の実施から,本施設を利用する高齢者を対象に,将来的には縦断的調査が可能であることを確認した。調査結果は,データ入力が完了し現在解析中であるが,研究代表者がこれまでに行った調査で得たデータとあわせると,回答者数も多く,貴重な知見が得られると考えられる。本フィールドでは今後,縦断調査を実施予定である,交付申請書から調査の進捗・内容について若干の修正が必要であったが,縦断調査を実行するという研究の核心はこの修正よって,より強化されたものと考える。平成27年度は,次のとおり研究を進めた。1高齢者を対象とした縦断研究の倫理申請:「加齢による身体・社会・心理的変化が精神的健康に与える影響」という課題名で,北里大学医療衛生学部研究倫理審査委員会に申請し,承認を得た。2研究協力者である高齢者の募集:高齢者関連の機関に協力をあおぎ,研究協力者として60名程度を確保した。3高齢者を対象とした縦断研究の第1回調査の実施:2で募集した研究協力者を対象に,「加齢による身体・社会・心理的変化が精神的健康に与える影響」という研究課題の第1回調査を実施した。4主な結果:本研究の独自性の一つである高齢者の心理状態をTAT(主題統覚検査)で測定することについて,次の示唆が得られた。図版3BMに,身体的苦痛のみを物語る対象者は,悩みや悲哀を含めて物語る対象者よりも不安・心理的動揺・情緒不安定性が高いことが示された。図版3BMの画中の人物から何らかの悲嘆や苦悩を感じ取らないこと,あるいはそれらを述べないことは,感情の統制の過剰傾向や感情生活の貧困化が示唆されており,本研究の結果もこれを支持するものと考えられる。しかしその他の指標では,天井効果が認められたり,群間での有意差が認められなかった。本研究は同一の被験者に対しての5年間の縦断研究を予定しており,引き続き検討を行う必要がある。5成果発表:本研究および前年に実施した横断研究で得られた成果を,国内外の学術論文および学会発表で発表した。6対照群となる大学生を対象とした縦断研究の倫理申請:高齢者を対象にした調査で得られた測定値と比較するため,同様の調査を大学生対象で実施するため,「大学生の身体・社会・心理的変化が精神的健康に与える影響」という課題名で,北里大学医療衛生学部研究倫理審査委員会に申請した。当初,高齢者を対象とした研究のみを実施する予定だったが,第1回の調査で得られた測定値が,成人を対象とした先行研究で指摘されている心理メカニズムと類似しており,本研究で得られた成果が高齢者に特有のものか,あるいは年齢によらない一般的なものかを判断する必要が生じた。そのため,大学生を対象とした調査を追加したため,最終的な成果のまとめは遅延が予測されるが,研究の妥当性は高まると考えられる。本研究は,肉体的老化の過程において精神的健康を保つための心理的要因を明らかにすることを目的に1心理的自律性に着目し,これを測定する質問紙法を開発し,2投映法検査の有効性の検証を行った。1心理的自律性は老いの受容と心理的自立の2下位尺度とした。地域在住高齢者に調査を実施した結果,前期高齢者においては,精神的健康と老いの受容は負の関連を示した。先行研究では,老いを受容することは条件なしに精神的健康に寄与すると示唆されていたが,本研究の結果は,長寿国であるわが国において,特に前期高齢者は「肉体的老化が進んだ高齢者」とはいえないため,老いを受容するよりも,心理的自立を維持することが精神的健康の維持につながることを示した初めての知見であった。ただし,肉体的な老化が顕著な高齢者については十分に検討できなかった。2肉体的な老化のプロセスにおける心理的要因の働きを明らかにするため,縦断調査に着手した。

調査項目は,質問紙法に加えて,面接法,投映法,体力測定など,多面的・客観的な指標を採用した。投映法は,現実の対人関係や心理的葛藤が投映されやすいとされるTATを用いた。地域在住高齢者を対象に1回目の調査を実施した結果,投映法においてこれまでに指摘されていない反応が得られた。一方,対照群である大学生を対象とした調査では一般的な反応が得られた。精査の結果,高齢者に特徴的な反応のうちいくつかは心理的状態とはかかわりがなく,むしろ認知機能の正常な老化との関連が示された。また,大学生や先行研究で指摘された心理的状態を現す指標も有効であることが示された。本年度は最終年度であったため,以上の知見についてInternational Congress of Psychology,日本老年社会科学大会自主企画フォーラムなど国内外の学会で積極的に発表し,地域在住高齢者を対象とした講演会で広く周知した。本研究は,老化の過程において精神的健康を保つための心理的要因を抽出し,その心理的要因を測定する方法について検討した。その結果,1)身体的な健康が維持された前期高齢者においては老いを受容するよりも心理的自立を実感することが精神的健康の維持に役立つこと,2)高齢者への投映法検査は有用であるが,認知機能の低下の影響を考慮する必要があることが明らかになった。高齢者を対象とした研究において調査フィールドの確保は困難である。2014年度に開拓したフィールド(高齢者が利用する通所型の施設)は,施設長が研究代表者の研究に十分理解があり,長期的な研究協力が見込めるため,より確実に縦断的調査を遂行するために適した機関であった。ただし,当初は縦断研究を実施する予定であったため,1年繰り越していることとなった。平成28年度は,以下のように研究を進める予定である。1対照群となる大学生を対象とした縦断研究の倫理申請の承認を得る。2大学生を対象とした縦断研究の第1回調査を実施する。3高齢者を対象とした縦断研究の第2回調査を実施する。4国内外の学術雑誌および学会発表で成果を報告する。5本科研は28年度が最終年度であるため,2つの調査にかかる資金の確保として,あらたに科研費の申請を行う。臨床心理学2015年度は本フィールドで第1回目の縦断研究を実施予定である。面接・実技・質問紙・生理指標によってストレスチェック,パーソナリティ,心理的自律性,身体機能等を評価する。28年度に,予定していなかった調査(大学生を対象)を行うため,その謝金等にあてるために資金を残した。縦断調査の第1回調査を予定していたため機材等の費用を計上していたが,代表者の所属機関変更に伴い予備調査に該当する匿名の横断調査のみの実施とした。したがって機材等の費用が次年度に持ち越した。1大学生対象の調査における研究対象者および研究補助者への謝金,2高齢者対象の調査における研究対象者および研究補助者への謝金,33件の国内学会を予定しており,その旅費,4海外論文投稿にかかわる費用2015年度に縦断調査の第1回調査を実施するため,初年度に購入予定だった下肢筋力の測定具,細胞組織の採取機材等を購入する。
日本人英語学習者の作文プロセスとプロダクトの発達:「診断テスト」の開発と配信

2008年度は,作文熟達度の異なる学習者の英作文プロセスとプロダクトには,どのような差異があるか明らかにした。また,それぞれの学習者に対する明示的な指導方法を模索した。2009年度は,得られた指導法を学習者に実施し,学習者の作文熟達度の向上を図った。そして,どのような変容があったかを明らかにした。加えて,学習者の作文プロセス・プロダクトの発達に関する知見を整理し,診断テストの配信準備を行った。平成20年度は,日本人英語学習者を研究対象として,「作文熟達度の異なる学習者の英作文プロセスとプロダクトには,どのような差異があるか明らかにし,明示的な指導方法を模索する」という事柄を調査した。具体的には,英作文のプロセスを測定するための暫定版の質問紙を質的・量的な方法を組み合わせることで作成した(Yamanishi, in press)。加えて,その質問紙を使用した際の結果を踏まえて,質問紙のさらなる精緻化を行った(Yamanishi, 2009)。精緻化のプロセスでは, (a)質問紙項目の普遍化, (b)項目数の削減, (c)項目のカテゴリー化, (d)回答方法の簡易化どいった作業が行われた。Yamahishi(2009)では,その改善された質間紙を用いて,日本人英語学習者の英作文プロセスの調査を行った。この研究では,客観的な標準テストであるGTEC for STUDENTSのライティング・パートの結果を用い,学習者を3つの熟達度レベルに分けた上で,プロセスの差異を検討した。そして,それぞれの熟達度の学習者の英作文プロセスの傾向差を議論し,教育的な示唆を得た。なお,作文熟達度の異なる学習者の英作文のプロセスに対する分析は書かれた作文量などの計測とともにコーパス用ソフトウェアを用いた分析を行い,正確さ(accuracy)と流暢さ(fluency)の面からの考察存行った。現在,その結果をまとめ,学術雑誌に投稿する準備中である。平成21年度は,「平成20年度の研究で得られた指導法を学習者に実施し,学習者の作文熟達度の向上を図り,その際に個内にどのような変容があったがを明ちかにする」という研究計画の第2段階の事柄と「学習者の作文プロセス・プロダクトの発達に関する知見を整理し,オンラインで利用可能な診断テストの配信準備を行う」という第3段階の事柄が実施された。第2段階の研究では,まず,学習者のライティングの熟達度が向上するにつれ,彼らの作文のプロセスが意識的になり,またプロダクトの複雑さ(質)や書かれる量が増加することを,データを分析することで確認した(山西,2009)。その結果を踏まえて,実際に1学期のライティング指導を実施した。授業を行った学期の開始時に学習者に作文を書かせ,その直後に20年度の研究成果であるプロセス測定の質問紙調査を実施した。その結果とTOEFL等客観テスト結果およびプロダクトに対する質的・量的な指標による分析結果をあわせて,学習者の特性によるグループ分けを行った。その特性に応じグループに対して,20年度の研究において示した指導を明示的に行った。また,学期の終わりに再び作文を書かせ,プロセスの質問紙調査とプロダクトに対する分析を行い,その変容を調査した(これらの成果は学術論文として執筆し,現在投稿中である)。第3段階の研究のにめに,現在,上記の調査に基づいた知見をもとに,学習者の特性に応じた適切なフィードバックを与えるための(フローチャート式)モデルの構築を行っている。同時に,実際にオンラインで作文を書き,プロセスの質問項目に回答することで,学習者の特性を診断し,適切なフィードバックを与えるためのシステムを構築するための準備を行つている。このオンフイン「診断テスト」システムは,次年度以降の授業でテスト運用を行い,多くのデータを得て精度を高めた上での公開を目指している。
脳の老化および神経変性疾患におけるAPP神経特異的リン酸化の機能

APPはアルツハイマー病患者の脳に検出される老人斑の主成分β-アミロイドの前駆体タンパク質である。APPは、あらゆる組織で発現しているタンパク質であるので、脳・神経系に特有の代謝機構を解明することが、Aβの生成機構とAPPの生理機能を理解する上で重要である。本研究では、APPの神経特異的な代謝機構を解明する目的で、APPの神経特異的リン酸化に着目して解析を行った。この結果、以下のことが明らかになった。APPの細胞質ドメインは神経特異的なリン酸化酵素Cdk5によって、リン酸化を受ける事を明らかにした。リン酸化を受けるAPPは、後期ゴルジ体以降の分泌過程と細胞膜上に存在する成熟したAPPである。リン酸化の生理機能およびAβ生成に係わる機能を解明する目的で、リン酸化サイトをノツクインしたマウスを作成した。このマウスは、従来の129系統のマウス由来のES細胞を相同組み換えしたものではなく、BL/6マウス由来のゲノムをターゲティングベクターとしてBL/6マウスのES細胞に相同組み換えを行い作成した。このため、遺伝的背景が均質であるので、神経機能解析やGeneChip解析でより正確な測定が可能となった。リン酸化サイトThr668(APP695 isoform)をAla,Aspにそれぞれ置換した変異マウスを2系統作成した。Affymetrix社のGeneChipを用いて、野生型に対して発現が変動している遺伝子の測定を行い、APPリン酸化の下流で機能する遺伝子の探索を行った。約13000の遺伝子のうち99%は有為な変動を示さなかった。これは、このマウスの遺伝的背景の均質さを示すものである。約1%の発現変動した遺伝子のうち、発現低下が認められた遺伝子には神経活動に係わる遺伝子群が含まれている事を明らかにした。今後、これら遺伝子の発現変動が老化によって変化するのか、人の病態では変化しているのかを明らかにする予定である。また、変異マウスの老化に伴うAβの生成量の変化を定量すると共に、形態学的な病変の有無に関して検討を行う。
c-Mycの異常発現によるエピジェネティクス変化が染色体転座に与える影響

c-Mycを強制発現とその状態でのChIP-sequenceを行いながら、microRNA, cDNA arrayによるデータの解析・検証も実施した。染色体不安定性の有無に関して、DNA ploidy法およびarray CGH法にてゲノム分画とDNAコピー数の異常を検出し並行してmiRNAおよびcDNA arrayのdataを用いてmiRNAの異常が-c-Mycおよび染色体不安定性に関与していないか、検討をおこなった。c-myc導入線維芽細胞におけるI-ScelによるHR活性測定法、およびNHEJ assayであるrandom plasmid integration法により判別した。我々の施設ではこれまでに様々な種類の肉腫細胞株、血液系腫瘍細胞株、さらに癌腫細胞株を用いてmessenger RNA (mRNA)遺伝子発現を全ゲノムcDNA array法にて網羅的に解析した。その結果、転座を有する細胞株では共通してc-myc発現の異常高値を認めたが、これは多段階に遺伝子変異が蓄積し発がんする癌腫とは大きく異なるものであった。ヒストン脱メチル化や脱アセチル化の阻害はDNA二本鎖切断double strand breaks (DSB)の頻度を増加させ、さらにはDBS修復をも阻害する、という結果も報告されている。これらの観察結果から、エピジェネティクス変化が染色体不安定性に関与していることが強く示唆されている。線維芽細胞にレンチウイルスベクターを用いてc-Mycを強制発現させた。ChIP-sequence法にて1)53BP1のタンパク発現をWestern blotにて比較・検討したが現在のところc-Myc導入の有無による明らかな差は認めていない。現在は、染色体不安定性の有無に関して、DNA ploidy法およびarray CGH法にてゲノム分画とDNAコピー数の異常を検出しようと試みている段階である。並行して我々はmicroRNAおよびcDNA arrayのdataを用いてmicroRNAの異常が-c-Mycおよび染色体不安定性に関与していないか、検討をおこなっている。また我々の予想ではhomologous recombination, non-homologous end joiningのどちらのDSB修復系がより機能不全に陥っていると考えており、c-myc導入線維芽細胞におけるI-ScelによるHR活性測定法、およびNHEJ assayであるrandom plasmid integration法により判別している。上記のようにc-Mycを強制発現とその状態でのChIP-sequenceを行いながら、microRNA, cDNA arrayによるデータの解析・検証も実施してきた。特にc-MycのmRNAが高発現であることに上流の因子であるmicroRNAの発現異常が関与している可能性もあると考えた。現在のところlet-7a, miR-16, miR-29b, miR-1294, miR-2682が関与している可能性が高い。とくにmiR-1294, miR-2682はc-Mycの上流に位置しておりこれが低発現であるためにc-Mycの発現が高いと予想した。この2因子をtransfectionするとc-MycのmRNAとタンパク発現は抑制され、さらに細胞周期の進行が抑制されることは証明できた。悪性腫瘍計画書に記載した通り、まずはChIP-sequenceで再現性のあるdataを得ることを前提とし、以下の実験を行う。1)c-myc導入線維芽細胞においてSET8/PR-Set、SUV-20H1/2発現レベルが変化しているか否かをWestern blot法にて確認すると同時に、ChIP-sequence法でH4K20のメチル化レベルが変化しモノメチル化の割合が上昇しているかを検討する。2)c-myc導入線維芽

細胞におけるMDC1とそのパートナーであるRNF8が複合体、histone methyltransferaseであるMMSETの発現変化についてもWestern blotにて示す。3)c-myc導入線維芽細胞とコントロール細胞間でSIRT1, SIRT6のタンパク発現をWestern blot法にて定量する。4)c-myc導入後、線維芽細胞のHDAC1,HDAC2の発現が変化するかどうか、抗HDAC1およびHDAC2抗体を使用しWestern blotによって確認する。予定していた実験方針を一部変更した。具体的には実験器具が購入できなかったため消耗品を購入した。引き続き実験消耗品を中心に購入する。当施設での共通機器を使用することで計画に変更はない。
熱ショック転写因子は血管再生治療の新規標的分子になり得るか?

我々はHSF1が骨髄由来幹細胞の動員や集積による虚血誘導性の血管新生に貢献しているか否かをHSF1ノックアウトマウス(HSF1-KOマウス)を用いて解析した。WTマウスと比較してHSF1-KOマウスの虚血下肢において血流量の回復率と毛細血管密度が有意に減少していた。さらに骨髄由来幹細胞の虚血部位への集積、遊走能、接着能、生存率も有意に減少していた。以上の結果より、HSF1は骨髄幹細胞の動態制御を介して虚血誘導性の血管新生に寄与していることが示唆された。本年度は、熱ショック転写因子(HSF1)欠損(KO)およびWild type(WT)マウスの下肢虚血モデルを作製して、両者を比較・検討した。WTマウスと比較して、KOマウスの虚血下肢では血流量回復の低下と毛細血管密度の減少が認められ、虚血組織での血管新生が低下することが分かった。次に、FACS解析にて虚血3日後の末梢血中のSca-1陽性幹細胞を定量することで、骨髄幹細胞の動員を評価した。虚血前と比べてWTマウスでは幹細胞の動員が認められたが、KOマウスでは認められなかった。また、虚血1日後に骨髄細胞(CFSE蛍光標識)を経静脈的に投与し、虚血組織中のCFSE陽性細胞を組織学的に解析することで、集積を評価した。KOマウスの骨髄細胞を投与した際には、WTマウスの場合と比較して、集積細胞数が減少していた。最後に、骨髄キメラマウス作製後に虚血組織での血管新生を評価した。骨髄がWTマウスの場合と比較して、KOマウスの骨髄に置換したWTマウスでは血流量の回復が低下していた。一方で、骨髄がKOマウスの場合と比較して、WTマウスの骨髄に置換したKOマウスでは血流量の回復が増強した。以上から、HSF1-KOマウスでは骨髄幹細胞の末梢血への動員や虚血組織への集積が抑制され、虚血組織での血管新生が低下することが示された。以上の結果より、HSF1は骨髄幹細胞の動態制御を介して、虚血組織における血管新生に寄与することが示唆された。虚血性疾患が増加している現代において、血管再生治療の標的分子を同定することが治療戦略の構築に有用と考えられる。一方で、虚血応答の制御因子として熱ショック転写因子heat shock factor 1(HSF1)が知られている。そこで、我々はこれまで血管再生や血管生物学の領域では着目されていなかったHSF1が血管再生に関与するか否かについて、虚血組織での局所環境および骨髄幹細胞の機能・動態の観点から検証することを目的とした。本年度は、HSF1ノックアウトマウス(KOマウス)および野生型マウス(WTマウス)の下肢虚血モデルを用いて比較検討した。次に、虚血組織での血管再生因子(VEGF、SDF-1)の産生について調べたが、KOマウスにおいてVEGF、SDF-1産生の低下は認められなかった。また、骨髄から動員された幹細胞が虚血部位に集積して血管新生に関与することが知られているので、骨髄幹細胞の動員や集積といった動態について検討した。FACS解析にて虚血3日後の末梢血中のSca-1、c-kit陽性幹細胞を定量することで、骨髄幹細胞の動員を評価した。さらに、虚血1日後に骨髄細胞(CFSE蛍光標識)を経静脈的に投与し、虚血組織中のCFSE陽性細胞を組織学的に解析することで、集積を評価した。以上の結果から、HSF1-KOマウスでは虚血組織での血管再生が低下することが示された。また、骨髄幹細胞の末梢血への動員や虚血組織への集積が抑制されていることが、その要因として考えられた。当初の研究計画を実施できており、HSF-KOマウスを用いた検証が順調に進捗している。平成23年度に引き続いて、HSF1-KOマウスを用いて虚血組織での血管再生におけるHSF1の役割を明らかにする。HSF1-KOまたはWTマウスにX線全身照射後、HSF1-KOまたはWTマウス由来の骨髄細胞を経静脈的に投与して骨髄細胞のみ置換したキメラマウスを作製する(4通りの組み合わせ)。骨髄移植5週間後に下肢虚血モデルを作製し、虚血下肢の壊死状態および血流量の変化を評価する。また、HSF1-KOまたはWTマウス由来の骨髄細胞の細胞機能(生存、接着、遊走など)についても検証する。

上記の研究の推進方策に基づいて、研究費(キメラマウス作製費、免疫染色、ウェスタンブロッティング用の抗体購入費)を使用する。平成23年度は、HSF1-KOまたはWTマウスにX線全身照射後、HSF1-KOまたはWTマウス由来の骨髄細胞を経静脈的に投与して骨髄細胞のみ置換したキメラマウス(4通りの組み合わせ)を用いて下肢虚血モデルを作製し、虚血下肢の壊死状態および血流量の変化を評価する予定であったが、行わなかったため、未使用額が生じた。尚、未使用額については上記の研究費(キメラマウス作製費、免疫染色、ウェスタンブロッティング用の抗体購入費)に加えて使用する。
口腔癌のBRAF変異スクリーニングに基づくセツキシマブ・BRAF阻害療法の開発

セツキシマブは、頭頸部癌のEGFR標的抗癌剤である。申請者は、EGFR伝達経路のBRAF阻害によるセツキシマブの抗腫瘍増強効果を計画し、ヒト口腔癌由来細胞株9株を対象に、BRAF,KRAS,NRAS,PIK3CA遺伝子変異解析した。BRAF変異はなく、2株にてPIK3CA変異を認めた。PIK3CA変異を有し、PETにてEGFR著高発現株担癌マウスはセツキシマブ奏効しなかった。これはPIK3CA遺伝子E542K変異に由来すると考えられた。今回、口腔癌におけるセツキシマブ奏効を妨げるEGFR伝達経路としてPI3K/Akt経路を対象とすればセツキシマブ感受性増強を期待できることを示唆した。ヒト由来口腔癌細胞株6株(HSC4,HSC3,HSC2,SAS, Hep2,KB株)を予定していたが、細胞株を変更(不調であったKB株を除く)、さらにHSG、Ca9-22、H0-1-u-1、HSQ-89株を加え9株とした。それぞれにおけるBRAF遺伝子変異に加え、周辺遺伝子(KRAS,NRAS, PIK3CA)遺伝子の変異を検索した。ほとんどの株で各遺伝子変異を見つける事が出来なかったが、HSG、Ca9-22株において、変異を認めた。Ca9-22株においてPIK3CA遺伝子のH1047R変異、HSG株においてPIK3CA遺伝子のE542K変異を認めた。遺伝子変異検索にはファルコバイオシステムズ社のK-ras遺伝子解析(コドン12・13領域)ならびにMu-PACK遺伝子解析を用いた。さらに、昨年度はこれらの癌細胞株のアービタックス感受性を担癌BALB/Cヌードマウスを用いてBRAF関連遺伝子変異の有無と比較している。それぞれの細胞株におけるアービタックスによる抗腫瘍効果は現時点において検討中で、順調に進行中である。担癌マウスモデルの作製は9株中、6株程度での成功となった(500万個/背部皮下1ポイント)。全株での目標達成に至ることが出来なかったが、特にBRAF関連遺伝子変異(PIK3CA遺伝子のH1047R変異)を有するCa9-22株を播種した担癌マウスの作製が困難で、その条件設定(播種細胞数など)を今年度は行う予定である。また、アービタックスをプローブとして用いるEGFR-PETの撮像を目指すため、アービタックスのプローブ化を試み、標識核種の選定(Cu、Zr)を行った。前年度に引き続き、ヒト由来口腔癌細胞株9株(HSC4、HSC3、HSC2、SAS、Hep2、HSG、Ca9-22、H0-1-u-1、HSQ-89株)を対象として、検討を行った。当初、それぞれにおけるBRAF遺伝子に加え、周辺遺伝子(KRAS,NRAS, PIK3CA)遺伝子の変異を基にアービタックス感受性を比較検討する予定であったが、ほとんどの株で各遺伝子変異を見つける事が出来なかった為、PIK3CA遺伝子のH1047R変異を認めたCa9-22株と、PIK3CA遺伝子のE542K変異を認めたHSG株をテスト細胞とし、その他の細胞をコントロール群とした。前年度、BRAF関連遺伝子変異(PIK3CA遺伝子のH1047R変異)を有するCa9-22株を播種した担癌マウスの作製が困難で、その条件設定(播種細胞数など)を本年度行う事としていたが、検討の結果、前年同様細胞の生着率が低く、Ca9-22株は担癌BALB/Cヌードマウスモデルへの利用困難な細胞株であると判断し、今後のin vivo実験からは除外する事となった。また、アービタックスをプローブとして用いるEGFR-PETの撮像を目指すため、アービタックスのプローブ化を試み、標識核種の選定(Cu、Zr)を行っているが、Zr(ジルコニウム)を核種として、担癌BALB/CヌードマウスモデルについてPET撮影を行い、解析ソフトPMODを用いて画像解析を行った。その結果、アービタックスプローブ接種72時間後、144時間後まで腫瘍へのプローブ取り込みを認め、その信号の安定性、定量性などから、臨床応用可能なプローブとなりうる可能性を示唆できた。これは、Zrが長い放射線半減期を有する事によるものと考えられた。昨年度は、Zr(ジルコニウム)を核種として、アービタックスをプローブとして担癌BALB/CヌードマウスモデルについてPET撮影を行い、解析ソフトPMODを用いて画像解析を行った点で良好な結果を得ることが出来た。撮像時間やプローブ量の最適化も試み、アービタックスを用いたEGFR-PETの基礎的実験を検討、分子イメージングを取り入れた抗癌剤感受性試験への応用の第一歩とすることが出来た。また、それぞれの細胞株におけるアービタックスによる抗腫瘍効果は現時点においてin vitroにおいて検討中で、順調に進行中である。当初、それぞれにおけるBRAF遺伝子に加え、周辺遺伝子(KRAS,NRAS, PIK3CA)遺伝子の変異を基にアービタックス感受性を比較検討する予定であったが、ほとんどの株で各遺伝子変異を見つける事が出来なかった為、PIK3CA遺伝子のH1047

R変異を認めたCa9-22株と、PIK3CA遺伝子のE542K変異を認めたHSG株をテスト細胞とし、その他の細胞をコントロール群とした。前年度、BRAF関連遺伝子変異(PIK3CA遺伝子のH1047R変異)を有するCa9-22株を播種した担癌マウスの作製が困難であることから、今後のin vivo実験からは除外し、HSG株のみを担癌BALB/Cヌードマウス実験に供する事となった。口腔癌細胞株にはBRAF変異がないことからBRAF阻害薬を用いることは中止とし、その代用として、BRAF同様、EGFRシグナル経路であるRAS関連下流遺伝子であるPIK3CAについての阻害剤を購入、in vitroならびにin vivo実験を開始した。現在in vitroでのPIK3CA阻害剤投与濃度設定を行い、アービタックスとの併用投与による抗腫瘍効果をMTTアッセイにて検討中である。また、前年に引き続き、アービタックスをプローブとして用いるEGFR-PETの撮像に用いるアービタックスプローブの改良の一環として標識核種の選定(Cu、Zr)を行い、Zr(ジルコニウム)を核種として、ヒト由来口腔癌細胞株HSG株担癌BALB/CヌードマウスモデルについてPET撮影を行ったデータについて、解析ソフトPMODを用いて画像解析を引き続き行った。その結果、Zr標識型アービタックスプローブは、臨床応用可能なプローブとなりうる可能性を示唆でき、今後、アービタックス+PIK3CA阻害剤併用療法時の抗腫瘍効果評価に利用できる可能性を示唆できた。セツキシマブは、頭頸部癌のEGFR標的抗癌剤である。申請者は、EGFR伝達経路のBRAF阻害によるセツキシマブの抗腫瘍増強効果を計画し、ヒト口腔癌由来細胞株9株を対象に、BRAF,KRAS,NRAS,PIK3CA遺伝子変異解析した。BRAF変異はなく、2株にてPIK3CA変異を認めた。PIK3CA変異を有し、PETにてEGFR著高発現株担癌マウスはセツキシマブ奏効しなかった。これはPIK3CA遺伝子E542K変異に由来すると考えられた。今回、口腔癌におけるセツキシマブ奏効を妨げるEGFR伝達経路としてPI3K/Akt経路を対象とすればセツキシマブ感受性増強を期待できることを示唆した。昨年度は、ヒト口腔癌由来細胞株9株について、それぞれにおけるBRAF周辺遺伝子(KRAS,NRAS, BRAF, PIK3CA)遺伝子の変異を検索し、それぞれの細胞株をBALB/Cヌードマウスに播種して、マウスモデルを作製した。それぞれにおけるアービタックスによる抗腫瘍効果は現時点において検討中で、順調に進行中である。マウスモデル作製は6株程度での成功となり、全株での目標達成に至ることが出来なかった。今年度は不成功であった細胞株での担癌マウス作製を進めつつ、成功株での腫瘍形成の確実性を高める予定である。BRAF遺伝子本体の変異は少なく、BRAF関連遺伝子であるPIK3CA遺伝子の変異を有する細胞株を2株認めた。今後はこのPIK3CA遺伝子の変異をターゲットとして、近年その開発を知られるPIK3CA阻害剤による口腔癌への抗腫瘍効果についても検討し、アービタックスとの併用効果など追加検討したい。現在、PIK3CA阻害剤の選定中である。