hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
H-MRI, P-MRSによる咬合の咀嚼筋に及ぼす影響の画像的評価

開閉口、噛みしめによる咬筋の変化をMRIおよびMRSにより評価した。拡散固有値は、筋の伸展、収縮の状態を反映し、深層、浅層といった各コンパートメントの変化を反映していた。また、T2値は噛みしめ時に減少し、その後一過性に増大し、徐々に元の値に回復した。圧による血流遮断、その後の一過性の血流増加、回復に相当していると考えられた。最後に31-PMRSでは、歯牙接触によるADPの指標であるPi/PCr比の変化を評価した。歯牙接触時は、増大したが、その直後より減少し、5分後には元の状態に回復した。長時間の歯牙の接触、ブラキシズムが咀嚼筋の疲労に与える影響は以前から指摘されており、疑いのない事実と思われる。しかしながら、咀嚼筋疲労の画像化に関しては、ほとんど報告がないのが現状である。その為、H21年度は、咬合が、咬筋に与える影響に関して実験を行った。taskとしては、最大咬合20秒とし、咬合前、咬合中、咬合後、10分間にわたり、MRIのdynamic撮影を行い、T1時間、T2時間を各々、20秒おき、7.6秒おきに算出した。T2時間に関しては、咬合中、著明な減少を示し、過去の文献などから、機械的圧縮による血流低下と関与すると考えられた。咬合後、T2値は、急激に増加し16.8±7.6s後にpeakとなり、その後、徐々に安静時の値に戻っていくことが明らかになった(半減期222±0.84min)。これは、反応性の血流増加および、その後の減少と強く関係するものと考えられた。T1時間に関しては、咬合中の変化は少なく、咬合直後は、一過性に増加し、その後徐々に減少する事が明らかになった(半減期4.77±3.40min)。SSFPをもたらす高速撮像法balanced fast field echo sequence(bFFE)の信号強度の変化は、T1時間、T2時間から予測される値と近似しており、やはり、血流変化と強く関与する事が示された。顎関節症などで、咬筋に筋痛を有する患者に同様のprotocolを適応すれば、健常者との各種パラメーターに差異を認め、血流分布の違いを比較する事が可能だと考えられる。また、あわせて、拡散テンソル解析より、咬筋の筋線維の描出方法の確立を行ってきた。現在までに、咬筋線維の描出の適正化を行い、深層、浅層の分離が可能なまでになっている。この結果は、今後の咬合がおよぼす咬筋内の各層における変化の解析に有用でると考えている。筋肉の見かけの拡散係数(ADC)は、筋疲労、筋損傷などにより変化する事が、明らかになってきた。しかし、安静時と負荷時においての拡散係数は、筋変形により変動する事が考えられる。また、筋肉は紡錘形の形態より、方向による拡散のしやすさが異なり、拡散異方性をもつと考えられている。我々は、開閉口が咬筋の拡散異方性による変化を検討した。15方向の傾斜磁場をかけた拡散テンソル画像を採取し、筋肉内における、拡散テンソルの固有値、固有ベクトルの検討を行った。なお、高精細の解剖画像を重ね合わせることにより、下顎切痕、下顎孔、下顎臼歯根尖部の、拡散テンソルの固有値(λ1、λ2、λ3)を求めた。λ1は、筋線維にそった拡散を、λ2は、筋周膜間の拡散を、λ3は、筋線維に垂直(筋線維内)の拡散を表すとされる。開口により、λ3は、上方の下顎切痕、下顎孔部では、有意に減少した。しかし、この変化は、筋肉の下方(下顎臼歯部混線部)ではみとめなかった。λ3の増加は、筋線維の伸展による径の短縮によるものと思われ、この変化が、上方に著明に見られたのは、咬筋の中の特に深葉(比較的上方に存在する)の変化をとらえているものと思われた。一方、閉口により、λ1、λ2は、筋肉の上方から下方の全体で観察された。特にλ2の変化が、λ1に比較して大きく、筋変形による筋線維間のスペースの増大などが起因と考えられた。このように、拡散固有値は、開閉口などの筋の伸展、収縮の状態を反映し、さらに、深層、浅層といった各コンパートメントの変化を反映しているものと考えられた。筋線維走行を描出するトラクトグラフィーでは、安静時、閉口時では、容易に線維走行が追跡可能であったが、開口時では、中央面ちかくで、線維の追跡が不可能になるケースが多かった。筋変形による筋走行のねじれなどにより、拡散異方性の低下をもたらしたためと考えられた。

第一に開閉口が咬筋の拡散異方性による変化を検討した。11名のボランティアを対象に拡散テンソル画像を撮像した。画像データより、決定論的方法をもちいて、筋線維の描出を評価した。安静時、開口時は、描出が良好であったが、咬合時には、ほぼ全症例において、途中で連続性が失われていた。次に、拡散の偏りの大きさ(fractional anisotropy ; FA)の閾値を0.15から0.24の範囲で変化させ、当てはまる領域の割合を検討した。下顎孔レベルでは、開口時、FA0.15の時、97%であり、閾値を上げても、領域は減少するものの、FA0.24でも、85%の領域が、抽出された。安静時では、FA0.24の時、70%であり、閉口時では、FA0.24の時、59%と非常に低い値となった。閉口時では、閾値以下のFAの領域が、ハスの断面のように広がった。咬筋が複数の層からなることを考えると、閉口、噛みしめによる局所における筋束の複雑な走行変化が、FAの低下をもたらし、決定論的方法による筋線維描出を困難にしている事が明らかになった。第二に、7名のボランティアに対して、左側咬筋の閉口(上下顎のかるい接触5分間)による影響を32-P-MRスペクトロスコピィー(MRS)を用いて行った。撮像は、Single volumeで、関心領域の選択は、ISIS法を用いた。ADP濃度の指標とされるPi/PCr比を検討した。安静時は、0.15±0.05であったが、閉口時は、0.40±0.28と上昇した。その直後は、0.22±0.16と減少し、5分後には、安静時の値に戻った。この事は、かるい閉口では、task時にはわずかにADPの蓄積を認めるものの、比較的早期に元に回復する事が明らかになった。このことは、本年までに解明した閉口(噛みしめ)後の血流回復、一過性の血流増大と関係する可能性が示唆された。
形成後まもない恒星の高精度偏光測光観測

本研究において、形成後間もない恒星の一つであるR Monの偏光・測光・撮像観測と、そのデータ解析を行った。この天体の偏光と測光の諸量には、時間変動性があることが従来より知られている。これは、星周の塵雲の変動によると解釈されているが、その詳細は明らかにされていない。本研究では、観測方法と解析方法を改良し、従来よりも高い精度のデータを用いてR Monの変動性を調べた。得られたデータの精度は、測光に関して0.02等、直線偏光度において0.3%,直線偏光の位置角において1度程度であり(いずれもVバンドにおける精度)、所期の目標をほぼ達成できた。この結果、R Monに関して次のような知見を得た。1.直線偏光度の変動とフラックスの変動には、大変強い相関がある。相関係数は、0.8以上である。2.直線偏光の位置角は、1993年に急激に約5度変化した。3.星自体のフラックスと、星周辺の反射星雲の輝度の変化にも、強い相関がある。我々の結果は、R Monの極近傍の塵雲による減光の効果が、観測量の変動に影響を及ぼしていると解釈できる。このことは、R Mon周囲の空間では、物質は一様に分布しているのではなく、ラクンピーに分王していることを意味する。一般に、恒星の形成と同時に、惑星・彗星などの恒星系内天体が形成されたと考えられているが、我々の観測結果と、恒星系内天体の形成の関連性については、今後の課題である。
微生物による岩石風化とその地球物質循環への影響

桜島および北松浦溶岩の新鮮部分から風化殻までの系統的な岩石および微生物試料採取を行った。岩石の化学・同位体分析、および微生物の群集解析・ゲノム解析を行い、風化とともにどのような変化が起こっているかを観察した。いずれの溶岩も酸化した風化殻に向かって系統的化学組成変化がみられたが、同位体組成は、余り大きな変化が認められなかった。桜島溶岩の新鮮な部分には、鉄の酸化還元に関わる微生物および硝化微生物などの酸生成微生物系統群が見いだされたが、噴出年代の古い北松浦溶岩からは硝化微生物系統群のみが検出された。溶岩風化の初期過程には鉄の酸化還元微生物が重要な役割を果たしている可能性が示唆される。H25年度は、初年度に採取した試料のうち、桜島の安山岩質溶岩について、全岩化学および同位体分析(Sr,Nd,Pbの5同位体比測定)を行うと同時に、微生物群集解析を行った。桜島溶岩のうち、昭和溶岩(1946年)、大正溶岩(1914年)、安永溶岩(1779年の東部溶岩)、文明溶岩(1471年の東部溶岩、および14751476年の南西部溶岩)について、それぞれ1.新鮮で比較的緻密な溶岩部、2. 1より溶岩表面に近く、組織や色においても表面の土壌様風化部分への遷移にあたる部分(遷移部)、3.表面の土壌用風化部、の空間的にも隣接する(およそ20cm以内)3種類の試料を採取し、分析を行った。その結果、いずれの4つの溶岩においても、1⇒3に至るに従て、主成分や微量元素組成は、溶脱を示すと考えられる変化が認められる一方、同位体はほぼ一定もしくはごくわずかな変化を示した。また、微生物は、3では、植物やその根に関わる微生物群が卓越する一方、電流発生菌として知られるシュワネラ(Shewanella)などの嫌気性の鉄還元菌は、1のみで認められ、新鮮な溶岩中の2価鉄の存在に対応していることが示唆される。すなわち、微生物群集の特徴と、風化の度合いには関係性が存在するといえる。さらに北九州の東松浦地域から採取した平均およそ800万年前の玄武岩質溶岩については、主成分元素および微量元素組成の測定と、その中から選ばれた3試料についてのSr,Nd,Pb5同位体比測定を行った。比較的若い桜島溶岩に比べて、より大きな組成および同位体組成比変化が認められ、噴出年代が古いとより元素や同位体の風化による移動が大きいことが示唆される。本年度は、まず火山岩の調査・試料採取を行った。選定した火山は、第三紀の東松浦玄武岩溶岩、および現在活動中の桜島火山の歴史溶岩である。東松浦玄武岩については、4箇所の溶岩流について、赤色風化新鮮な溶岩流コアにいたるまでをそれぞれ数試料サンプリングを行った。同時に、同じ試料に対して、微生物分析用として、採取現場で無菌パックにシールし、冷蔵保管した。桜島火山については、昭和溶岩、大正溶岩、文明溶岩、安永溶岩のいずれについてもやや土壌化した風化殻が認められたため、風化部分から新鮮な溶岩コア部分まで、複数試料をサンプリングした。東松浦玄武岩と同様、全試料について微生物分析用として、採取現場で無菌パックにシールし、冷蔵保管した。これらの試料の主成分について、XRF分析を行い、現在結果を解析中である。同時に、微量元素、同位体分析用の分析方法のため、前者についてはレーザーアブレーションを用いたICP-MS分析、後者については、溶液による対象元素カラム分離後の表面電離型質量分析の準備を進めている。また、微生物数確認のための蛍光顕微鏡観察を行い、現在結果を解析中である。初年度に採取した桜島安山岩質溶岩および北松浦玄武岩質溶岩試料について、岩石内部に存在する微生物に対応するために、従来のビーズ法に加えて、アルカリ法によるDNA抽出を行い、両者の群集構造を次世代シーケンサーMiSeqによる16S rRNA遺伝子解析により比較した。その結果、DNA抽出法による群集組成の違いはサンプル間の群集組成の違いに比べ遥かに小さいことが示され、岩石粒子に閉じ込めれた細胞はほぼ無視できるといえる。また、昨年度実施した群集解析の結果(微生物群とその個々の検出数)を統計解析した。主成分分析により、26の溶岩試料から得た825の微生物群から、34の主要微生物群の組み合わせとその強度を得た。34の固有ベクトルは合計68.1%の分散を説明し、そのうち、2%を超えるベクトルは11個あった。この構造は、微生物群の多様性が大きいことも示していると同時に、ある程度、主要な微生物群集が溶岩と微生物の関係を支配していることを示す。

これらの結果を踏まえ、それぞれの試料における微生物群集の特徴として、比較的若く、かつ土壌化していない桜島の溶岩内部からは、鉄の酸化還元に関わる微生物および硝化微生物などの酸生成微生物系統群が見出されたが、噴出年代の古い北松浦溶岩試料からは硝化微生物系統群のみが検出された。さらに、これらの微生物系統群による金属の酸化還元や酸生成による岩石の溶解に関わる遺伝子探索の目的で、酸化還元微生物が検出された試料と酸生成微生物が検出された試料4試料について全ゲノムデータを取得した。地質学、地球化学、地球物理学当初予定していた元素組成および同位体組成が、玄武岩と安山岩質溶岩について求められ、それらの相関関係をより定量的に議論できるデータがそろったといえるが、安山岩試料の同位体比分別が予想よりも小さく、採取試料の種類を増やすあるいは変更するなどの見直しが必要となったため。予定していた九州地方での調査・サンプリングを行い、風化部分から新鮮な溶岩コアに至る連続試料を、複数の溶岩について得ることができた。これらの岩石化学的基礎データを得つつあり、概ね予定通りに進行している。今後は、花崗岩質岩石あるいは、より詳細な玄武岩質・安山岩質溶岩についてのデータを産出し、相関を独立成分分析(Independent Component Analysis)と呼ばれる多変量統計解析を用いて定量的に捉え、岩石の風化過程と微生物活動の関連性を議論する予定である。岩石化学については、九州の溶岩試料について、微量元素・同位体比分析をすすめると同時に、微生物群衆の観察・解析を進め、岩石化学データと照合を進める。同時に、気候の異なる東北地方の玄武岩および岩石組成の異なる西南日本の花崗岩についても調査・試料採取をすすめる。試料の化学・同位体分析がや遅れ気味であること、および予想よりも同位体分別が小さいことがわかり、採取試料の種類を増やすあるいは変更するなどの見直しを行う必要性が生じたため。試料の化学・同位体分析を効率良く進めるために分析補助員を雇用すると同時に、試料の種類を増やすあるいは変更するための野外調査と試料採取を行う。また、採取試料の微生物群集解析(DNA解析を含む)を行う計画である。岩石化学分析用の試薬、消耗品(20万円)、微生物解析用の消耗品やDNA分析費(40万円)、および調査・サンプリングのための旅費(3名x4日x2地域、30万円)の使用を予定している。
日本・中国・台湾の研究者による中国民衆運動の史実集積と動態分析

本研究は、日本・中国・台湾の三世代にわたる20数名による共同研究であり、文献調査・実地調査に基礎を置き、帝政期の全体をとって、一つの地域社会(府・州・県、図・都・里・甲等)に残る民衆運動の情報を網羅的に集積した。この分析をもとに、中国史の特質に関わって、民衆運動が多発する特定地区、省境に代表される"境界"が王朝交替に果たす役割、水運従事者等の非農業民を含む"民衆"の多様な内実、および今後期待される実地調査の意義(過去の諸情報が伝承されてきた過程の検証)等を提示した。(1)本研究は、過去中国民衆運動史研究に関わった日本のいわば三世代にわたる研究者、加えて中国・台湾における関係の研究者が参集し、それぞれの研究業績をふまえて秦末清末にかけての中国民衆運動の地方史実を集積し、最終的に一体的なデータベース(以下「DB」と略称)を構築するものである。(2)この作業を通して、日・中・台の研究の中で中国民衆運動の史実がどれほど掌握できているかを具体的に確認するとともに、集積された史実群をもとに中国民衆運動の歴史的動態のもつ特徴について実証的に解明し、さらには、日・中・台で共有できる新たな分析視点を見出そうとするものである。Iデータベース「中国民衆運動史実」(以下DBと略称)の構築:(各運動に関する1地点/時系列の)主要な文字データと画像データ、関係する二次史料、史跡等の調査結果・全画像データ、先行研究の一覧から成るDBを試作。高知大学総合研究棟内研究室にサーバーを設置し、研究分担者、海外の連携研究者がWEB上で史実を入力する環境を作りあげた。かかるDBの構築と国際的取り組みは日本、中国の学界でも始めての試みである。とくに中国、台湾の連携研究者には直接訪問して操作方法等を説明した。(DBは2009年4月現在なお史実集積中につき公開していない)II文字データの入力:本年度当研究班では、先ず唐末までの民衆運動について正史の記述等(各『農民戦争史史料』中華書局刊所載)1000件近くを入力した(龍谷大学)。明代以降では、史料の数の多さから、国内外の所蔵機関に」おいて入力すべき史料を選定する作業を行った。III現地調査と画像データの収集:唐末以前を担当するメンバーが先がけをなし、08年3月山東省南部江蘇省北部にかけて陳渉・呉広、劉邦、赤眉、黄巾、孫恩、黄巣等各反乱に関係する地点(大沢郷渉故台、沛県大風台、〓寧県古〓鎮、雲台山、柳阜鎮黄巣村等)を踏査した。09年03月には繰越分の計画、黄巾の乱・大乗の乱に関する河北省鉅鹿および糞州周辺における探索も完了した。こうした踏査は日本の学界で前例がなく、その過程で多数の貴重な画像データを得た。IV先行研究の掌握:唐五代、宋代、明清の抗租・抗糧・搶米・民変の先行研究の目録化を進めた(一部公表)。V国内外の学界に対する本研究のアピール:日本の「明清史夏合宿」の「抗租」シンポジウムを共催した外、中国の全国・国際級学会(明史国際学術研討会)ならびに地域文化に特化した学会(淮河文化研討会)において具体的問題をもとに本研究の主旨(史実の電子化による中国民衆運動の歴史動態の分析)を発表し、反響を得た。I史実の集積(データペースへの文字・画像データの入力)文字データは国内・外の各大学からインターネットを介して入力し、画像データはシステムの都合上高知大学のサーバーから入力した。代表者・分担者、海外研究協力者には、データ整理の面で改善を加えたデータベース「中国民衆運動史実wer.2」を提供した。集積した文字総数は約500,000。(内訳)(1)唐末五代まで:文字データの入力は、前年度同様龍谷大学で一括的に進め、史跡等の画像データについては、河北・山東の仏教・道教系反乱の調査、および洛陽・成都・漢中・襄樊(南陽)等の調査の結果を高知大学のサーバーに集積した。史実の共同分析の成果は、唐代以前総括担当・葭森健介編集の報告書としてまとめた。(2)宋代以降については、文字データを国内・外の分担者・研究協力者の下でデジタル化し入力した:宋代の三大農民戦争に関しては文字データを入力し、方臘の乱に関する史跡調査を行った。

さらに、明清代中葉の劉六・劉七の乱、明代河南の土賊(年度繰越が承認され2009年10月入力指導を実施)、〓茂七の乱、広東・福建・江西・湖南等の山寇・土賊、李自成の乱、江浙地区の搶米・民変・抗租、広東・広西省のヤオ族・チュアン族等の少数民族の反乱、台湾海峡を中心とする華南沿海・台湾等の海賊、太平天国および同時期の華南を中心とする抗糧運動等地方反乱、王倫反乱・天理教反乱・義和団運動(年度繰越が承認され2009年8月河北・山東・安徽の史跡も調査)等、および民国期の秘密結社を母体とする民衆運動。II作業経過の確認と討議2009年2月名古屋において本研究推進者(代表者・分担者・研究協力者・顧問)がデータペースにおける集積状況を確認するとともに、それらをふまえて次年度は関係史跡の実地調査とそれによる画像データの集積に重点を置くことを決定した。Iデータベース改良の試み本年度重点化した下記「II」の調査に対応し、画像データの大量集積を可能にするデータベース「中国民衆運動史実ver.3β」を試作した。ただし、画像データを自動的に圧縮するプログラムになお課題があり、現時点では全画像データをこれに集積するまでには至っていない。II文字データの入力・集積(集積したテキストデータは約1,327,000字。内、797,000字分は入力を終え、その中の170,000字が海外からの入力)(1)秦末唐末五代の文字データの入力は龍谷大学で一括的に進め、項目的整理を行なった。(2)宋代以降については、国内・外の研究分担者・協力者によって、王小波・李順の乱、河南省の土賊等の地方反乱、福建・江西省等の民変、広東・福建・江西・湖南省等の山寇等、李自成の乱、奴変、江浙地区の搶米・民変・抗租、広東・広西省の少数民族等の反乱、太平天国および同時期の西南の少数民族反乱、魯西白蓮教反乱、山東・河北・安徽省の義和団運動、民国期の主要な秘密結社、および台湾等の海賊について進めた。加えて、元末明初の反乱の史実の集積も開始した。III主な現地調査とそれによる画像データの集積(1)秦末唐末五代に関しては、安徽省・六安、寿春、合肥等から浙江省湖州、杭州、紹興、寧波、舟山等にかけて踏査した。この調査には南京師範大学等の協力を得た。別に大乗教の乱他仏教反乱について山東省を調査した。(2)宋代の王小波・李順の乱に関する調査のほか、明末清初の黄通の乱に関する福建省寧化県の調査、同時期奴変に関する江蘇省宜興県の予備調査、清代の堡寨に関する河南省博愛県の調査、太平天国に関する江西省桂平市等の調査を、厦門大学、南京大学、河南大学等の協力を得て行った。IV中間報告会「中国民衆反乱史の地域と景観」の開催(公開)2009年12月19-20日高知大学において実地調査の成果を中心に公開報告会を開催し、今後の課題等を確認した。1テキストデータの入力(平成22年4月-23年3月)(1)秦末唐末五代:龍谷大学で一括的して実施(都築晶子統括)。(2)宋代以降:国内外の分担者・研究協力者から送られてきたデータを高知大学(吉尾)で実施。(3)これらを民衆運動ごとに整理して「中国民衆運動史実」(試作版)に随時集積した。平成23年3月現在、2テキスト・画像データ追補のための現地調査(22年9月)○明末清初の黄通の乱に関する福建省寧化県の調査(顧問=森正夫団長)3主要事業:国際シンポジウム「中国民衆運動の史実集積と動態分析」の開催(22年11月27-28日於龍谷大学)(1)(概況)本研究に関わる日本・中国・台湾20余名の研究者が報告し、参加者は延べ50名(2)とりあげられた民衆運動および主体:陳勝・呉広、方臘、六朝水上交通者、同仏教徒、劉六・劉七、徐鴻儒(白蓮教徒)、黄通、堡寨、土豪、槍米、少数民族、義和団、近現代台湾の民衆運動、「江南」の土地改革を推進した中国共産党、現在の土地収用問題と維権農民
超高温領域における無機絶縁材料沿面での高電圧現象の解明

新エネルギー技術への適用または電気機器の高効率化などの革新が期待される高温域での高電圧絶縁技術に関して、基本となる沿面において特に長期特性に影響を及ぼすと予想される部分放電の発生現象ならびにそのメカニズムを実験的に調べた。研究着手段階として、材料種類、雰囲気、表面物性が温度上昇とともに部分放電発現にどのような関与があるか解明することを試み、以下の主要な成果を得た。1.概ね部分放電電荷量は温度上昇にしたがって増加するが、あまり高くなると減少する。同じ条件での放電電荷量分布および減少に転じる温度は材料種類によって異なり、特にtanδとの相関が強いことが示された。2.部分放電の発生は雰囲気ガス種の影響も受け、400°C以下では酸素濃度が高いほど放電電荷量が小さい。しかし、それ以上の温度では顕著な影響が見られなくなることが確認された。3.同じ性状の試料でもその表面におけるコンダクタンスが増加(絶縁抵抗が低下)すると放電電荷量が減少する。これは放電が単なる導通現象に移行することによって起きていることが推察された。また、誘電率の増加はむしろ部分放電を抑制することが示唆された。4.部分放電が発生すると絶縁材料自体の劣化というよりも、電極物質が絶縁沿面に飛散することで絶縁性能を低下させる可能性が高い。セラミックス等無機絶縁材料の高温領域での高電圧絶縁現象の解明を目的に,主に様々な試料に対して沿面における部分放電特性および各種絶縁特性を計測した。この結果,蒸着電極によって測定の安定が確保されるとともに,次に列挙する成果を得た。(1)沿面部分放電特性は試料の材質によって異なることを確認した。特に高温領域においては材料に依存する特性の違いが明確に現れることがわかった。(2)部分放電電荷量の温度上昇にともなう増加は,コンダクタンスの増加(絶縁抵抗の減少)が主に影響する。高温領域では誘電率の増加によっては電界緩和による放電の抑制が示唆された。200600°Cにわたる広い温度領域では,放電電荷量は両者の特性を包括したtanδとの相関が強く,tanδが大きいほど放電電荷量が増加する。(3)ある程度以下に絶縁抵抗が低下すると,放電電荷量が減少する現象が認められた。これは絶縁抵抗の低下により,本質的に絶縁の機能が薄れ抵抗体へ変化していることの現れと推測される。
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による薬疹の病態解明

上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)は増殖シグナル伝達因子であり、非小細胞性肺癌などの多数の癌の病因に深く関与している。ゲフィチニブはEGFR-TK阻害薬で、非小細胞性肺癌の治療薬である。ところが、ゲフィチニブはしばしば薬疹を含めた副作用を来す。この薬疹の分子機構は未解明のままであるが、表皮あるいは付属器の細胞の(EGFR-TK)シグナルの阻害によって引き起こされると考えられている。本研究では、ゲフィチニブによる薬疹ではIL-1R2が低下するため、IL-1を介したシグナルが増強し、CCL2とCCL5が上昇していることが示唆された。非小細胞性肺癌等の上皮系腫瘍の治療薬である,上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor:EGFR-TKI)は6098%の確率でざ瘡様丘疹をはじめとしたさまざまな薬疹を引き起こすが,その発症機序は未解明のままである。この薬疹はEGFR-TKIに対するアレルギーが関与するのでなく,表皮基底層と外毛根鞘のケラチノサイト(KC)にEGFRが多く発現することから,EGFR-TKIのKCに対する直接作用が関与していると予測されている。しかし,EGFRシグナルを阻害するとどのようなシグナル伝達がKCにもたらされるかといった分子レベルの研究報告は今までにない。本研究はこの薬疹の病態を明らかにすることにある。本年度得られた結果を述べる。I.EGFR-TKI (PD153035)により表皮角化細胞は小胞体ストレス応答が引き起こされることを観察した。I-i.遺伝子レベルでの確認。NHEKとHSC-1それぞれの細胞について,PD153035により小胞体ストレス応答のマーカーであるGRP78, CHOP, PDI遺伝子が薬剤の濃度依存的に上昇することをリアルタイムPCR法で確認した。I-ii.タンパク質レベルでの確認。PD153035によりUPRのマーカーであるGRP78, CHOP, PDI蛋白質がこの阻害薬の濃度依存的に上昇することをウエスタンブロットで確認した。II. NHEKとHSC-1ではEGFR-TKIによりUPRを介してCCL2とCCL5が分泌されるかを検討した。II-i.遺伝子レベルでの確認PD153035によりCCL2とCCL5遺伝子が上昇することをリアルタイムPCR法で確認した。II-ii.たんぱく質レベルでもELISA法にて確認した。非小細胞性肺癌等の上皮系腫瘍の治療薬である,上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬(epidemal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor : EGFR-TKI)は6098%の確率でざ瘡様丘疹をはじめとしたさまざまな薬疹を引き起こすが,その発症機序は未解明のままである。I.NHEKとHSC-1とHaCaTではEGFR-TKIによりIL-1R2が低下してCCL2とCCL5が分泌されることを遺伝子レベル、タンパク質レベルで確認した。さらに、CCL2とCCL5の分泌はIL-1添加により増強されることを確認した。II.免疫組織化学法にて本薬疹部の表皮において、CCL2とCCL5が上昇していることを確認した。本薬疹の特徴的病理所見の1つに好中球の浸潤がある。無菌性の好中球浸潤はIL-1シグナルが重要であることが知られている。本研究にて得られた知見の重要性は、IL-1シグナルを抑制することが本薬疹の治療標的となりうることをはじめて明らかにしたことにある。

本研究はこの薬疹の病態を明らかにすることにある。本年度得られた結果を述べる。I. NHEKとHSC-1とHaCaTではEGFR-TKIによりIL-1R2が低下してCCL2とCCL5が分泌されることを遺伝子レベル、タンパク質レベルで確認した。さらに、CCL2とCCL5の分泌はIL-1添加により増強されることを確認した。II.免疫組織化学法にて本薬疹部の表皮において、CCL2とCCL5が上昇していることを確認した。本薬疹の特徴的病理所見の1つに好中球の浸潤がある。無菌性の好中球浸潤はIL-1シグナルが重要であることが知られている。本研究にて得られた知見の重要性は、IL-1シグナルを抑制することが本薬疹の治療標的となりうることをはじめて明らかにしたことにある。
低侵襲な卵胞活性化療法の開発による高齢不妊治療の革新

卵巣機能不全患者では、卵胞が発育せず自己卵子を用いた妊娠は非常に困難である。我々は、卵胞活性化療法(IVA: In Vitro Activation)を開発し、摘出した卵巣を卵胞活性化培養した後に自家移植することで、早発閉経患者の妊娠・出産に成功した。本研究は、現行のIVAよりも低侵襲な治療法の開発を行い、卵巣自家移植後の卵胞発育誘導に最適な卵巣刺激方法の創出によりIVAの臨床成績を向上を目指す。
Dirichlet L-関数の解析的性質および素数分布

当研究では、リーマンゼータ関数やディリクレL-関数をはじめとする、数論的な概念に関連する各種L-関数の解析的性質の解明を目的とした。これらのL-関数の零点の分布や大きさを調べることは、素数分布などの整数論の基礎的な問題に結びつく重要な課題である。研究期間3年のうち、最初の2年は主にリーマンゼータ関数の自明でない零点の分布を研究した。自明でない零点全体のうち、どの程度の割合の零点が関数等式の中心線Re(s)=1/2上にあるのかを評価し、論文にまとめて出版した。また、デデキントゼータ関数の絶対値の冪の中心線上における積分の下からの評価を行い、有理数乗の場合の既存の結果が実数乗の場合でも同様に成り立つことを示した。この結果も論文にまとめ、海外のジャーナルに掲載された。更に、ディリクレL-関数と保型L-関数のディリクレツイストがある領域で同時に非消滅になるような指標の存在について研究を行い、この結果も論文にまとめ、海外のジャーナルに掲載が確定した。最終年度は、L-関数の中心点における非消滅を証明するための第一段階として、2次指標に付随するL-関数の中心点における2乗平均の漸近的振る舞いについて研究した。主にYoungが1乗平均と3乗平均の漸近公式を導く際に用いた手法を援用し、2乗平均の漸近公式で誤差項が十分に小さいものを導出した。この結果についても論文にまとめ、現在は海外のジャーナルに投稿中である。また、それぞれの研究成果に関しては、京都大学、上智大学、大阪大学、愛媛大学など全国各地の大学で研究発表を行った。本年度の前半は、昨年度から研究していた素数および概素数の分布に関する研究を完成させた。双子素数予想やゴールドバッハ予想のような加法的整数論の問題に対する有力な道具として、「篩法」とよばれる手法が挙げられる。特に隣接する素数の差を問題にする場合はGPY(Goldston, Pintz, Yildirim)の篩という篩法が有効であることが知られていた。2013年、MaynardはこのGPYの篩を拡張することにより、隣接する素数の組で差が600以下のものが無限に存在することを示した。私の研究では、Maynardの篩を概素数と呼ばれる、2つの素数の積で表される整数の集合に適用し、隣接する概素数の差に関する新しい結果を証明した。特に、隣接するn個の概素数の組で、最小のものと最大のものの差が十分小さくなるものが無限に存在することを示した。これらの結果を論文にまとめ、専門誌に投稿した。後半は、リーマンゼータ関数の零点の研究を行った。リーマンゼータ関数とはある範囲で簡単な級数で定義される関数であるが、素数分布と密接に関連していることが知られており、その解析的性質を解明することは整数論における重要な課題である。特に、実部が0と1の間での挙動が重要であり、この範囲における零点はすべて実部が1/2であると予想されている(リーマン予想)。この予想に対するアプローチの1つとして、実部が1/2である零点の割合を下から評価する方針が挙げられる。なかでも、mollifierとよばれる関数を用いた計算が非常に有力である。私の研究では、リーマンゼータ関数に対する新しいmollifierを考案し、それを含む積分の評価を行うことで、リーマンゼータ関数の零点のうち少なくとも41.05821%が実部が1/2であることを示した。また、単純零点の割合の評価についても一定の改善ができた。当初計画していた素数分布の研究とL-関数(リーマンゼータ関数を含む)の解析的性質の研究の双方において一定の成果が得られたため。2017年度の前半はガロア拡大体に付随するDedekindゼータ関数の積分モーメントの評価を行った。数論的な意味を持つL関数の、関東等式の中心線上の積分の大きさの評価は数論において非常に重要な研究テーマである。現在のところ、Dedekindゼータ関数の絶対値の有理数乗のモーメントの下からの評価は何人かの数学者の研究によって知られていたが、冪が無理数の場合に同様の評価ができるかどうかに関しては未解決であった。私は、Sylvester数列を用いた有理数による近似を導入することで、冪が無理数の場合にも有理数の時と同様の下からの評価が一切の仮定なく得られることを示した。この研究は海外の雑誌(Journal of Number Theory)に投稿し、掲載が確定している。また、年度の後半はGL(2)の保形L-関数のDirichletツイストのnon-vanishingの問題を中心に研究を行った。数論的なL関数が関数等式の中心点において零になるか、ならないかという問題は、整数論における最も重要な問題の1つであると考えられている。GL(2)の保形形式のDirichletツイストの場合には、L関数が1/2で零にならないものが無限に存在することが近年の研究によって知られている。私はこの問題を関数等式の帯領域上の任意の点に拡張し、与えられた任意の点に対し、L-関数の指標に関する平均を計算することで、その点で非零になるようなDirichlet指標が無限に存在することを証明した。この結果は論文にまとめて現在投稿中である。研究課題としてきたL関数の解析的な性質に関して様々な側面から考察を行い、複数の論文を執筆し、そのうち少なくとも1つは専門誌に掲載が確定している。

このため、現在のところ研究はおおむね順調に進展しているとみなせる。当研究では、リーマンゼータ関数やディリクレL-関数をはじめとする、数論的な概念に関連する各種L-関数の解析的性質の解明を目的とした。これらのL-関数の零点の分布や大きさを調べることは、素数分布などの整数論の基礎的な問題に結びつく重要な課題である。研究期間3年のうち、最初の2年は主にリーマンゼータ関数の自明でない零点の分布を研究した。自明でない零点全体のうち、どの程度の割合の零点が関数等式の中心線Re(s)=1/2上にあるのかを評価し、論文にまとめて出版した。また、デデキントゼータ関数の絶対値の冪の中心線上における積分の下からの評価を行い、有理数乗の場合の既存の結果が実数乗の場合でも同様に成り立つことを示した。この結果も論文にまとめ、海外のジャーナルに掲載された。更に、ディリクレL-関数と保型L-関数のディリクレツイストがある領域で同時に非消滅になるような指標の存在について研究を行い、この結果も論文にまとめ、海外のジャーナルに掲載が確定した。最終年度は、L-関数の中心点における非消滅を証明するための第一段階として、2次指標に付随するL-関数の中心点における2乗平均の漸近的振る舞いについて研究した。主にYoungが1乗平均と3乗平均の漸近公式を導く際に用いた手法を援用し、2乗平均の漸近公式で誤差項が十分に小さいものを導出した。この結果についても論文にまとめ、現在は海外のジャーナルに投稿中である。また、それぞれの研究成果に関しては、京都大学、上智大学、大阪大学、愛媛大学など全国各地の大学で研究発表を行った。今後はしばらくリーマンゼータ関数をはじめとするL-関数の解析的性質の研究を続行する予定である。この分野の研究は現在急速に進展しており、関数論のみならず確率論、エルゴード理論などを応用した様々な新しい手法が開発されている。これらの手法を習得し、同時に自身の新しいアイデアを付け加えることで、ゼータ関数の零点分布などの古典的問題に対してこれまでにない優れた成果が挙げられるのではないかと期待できる。引き続きL関数のモーメントとnon-vanishingの問題について研究を行う。これらの研究に関しては様々な手法が次々と生み出されており、研究集会などで国内外の研究者と議論を重ねることでこれらの技術を学び、今後の研究に大いに役立てたい。本年度は学内業務などの都合により予定よりも出張に行く回数が少なくなったため、そのぶん使用額が予定よりも下回った。授業の関係などで予定よりも研究集会に出向く回数が少なくなったため、経費が余る結果となった。今年度はより多くの研究集会に参加することに経費を使用したい。次年度以降、興味のある学会や研究集会になるべく多く参加することで旅費として使用する予定である。
電気生理学的アプローチによる微小循環系に対する吸入麻酔薬の作用機序解明

本研究は、ラット腸間膜動・静脈の膜電位およびカルシウム電流に対する3種類の吸入麻酔薬の影響について、その作用機序を細胞レベルで明らかにすることを目的とした。血管平滑筋の膜電位は、生理的範囲において血管壁にかかる張力と比例関係にある。0.5および1.0MACのハロセン、イソフルレン、セボフルレンがin situにおいてラットの抵抗血管および容量血管である腸間膜動・静脈の膜電位を深くした。その程度は、高濃度ほど(0.5<1.0MAC)また麻酔薬の種類ではイソフルレン<セボフルレン<ハロセンの順に膜電位を深くした。交感神経を6-hydoroxydopamine等により遮断すると膜電位は深くなるが、吸入麻酔薬を高濃度(1.0MAC)適用させると、膜電位がさらに深くなった。すなわち、0.5MACでは交感神経を介さない血管平滑筋に対する直接抑制作用が認められ、1.0MACでは直接作用のみならず交感神経を介する抑制作用も認められた。また、血管平滑筋に対する直接抑制作用を調べる目的にて、パッチクランプ法をもちいて腸間膜動・静脈のカルシウム電流に及ぼすこれら吸入麻酔薬の影響を調べた。そしてこれら吸入麻酔薬が濃度依存性にカルシウム電流を抑制することを発見した(未発表データ)。これらの成績は、今後、学会での発表(一部は、1996 FASEB annual meetingおよびASA annual meetingにて発表済み)を経て、雑誌(Anesthesiologyへ投稿中)への掲載を行っていく予定である。
心肺バイパスのための準自動循環制御システムの研究開発

心臓大血管手術は新規な技術の開発が進むなど、生体への負荷を減らす新規技術の開発も目覚ましく、新たな技術やシステムが導入されるが、心奇形や一部の弁膜症など心拍動を停止させた直視下治療は必要であり、侵襲の高い術式であるが人工心肺システムを使用した術式は今後も継続して実施される。本研究課題では、体外循環「システム」を見直し開発を行い、心臓手術の安全施行を実現するべく研究開発を行うことを考えた。体外循環中の患者血液量は貯血槽内の血液量で調節される。「流入量」「流出量」を制御することができれば、人工心肺システムの制御は可能であると考えた。初年度は、準自動循環制御を行うためのシステム開発の第一段階として、流入出量の安定化システムを構築することを目標とした。予備実験により、流入量と流出量の安定化については作成済であったため、脱血圧を模擬した静脈圧発生のタンクを設け、タンク内液位を指定圧で維持するための機構を新たに追加するだけで済む。早い時期に大型の水槽を設け人工心肺システムから送り出された液体をシミュレータ本体へ戻さずに、生体内を模擬した実験用模擬回路を作成した。これにより、体外循環中の体内灌流状況を自由に作成でき、静脈灌流の減少を模擬することが可能になったことから、脱血状態を定量的に再現することができた。しかし、当初予定していた制御条件では、制御項目を増加させたことが要因となり、別システムの構築として最終年度にはローラーポンプを送脱血回路に各1機の計2機のローラーポンプを購入し検証実験を実施できた。システム構築の変更のため、同時にソフトウェアの見直しを実施することができた。準自動循環のための主要アルゴリズムを適宜修正し、年度内にすべての検証実験を終えた。作動流体(水)を使用した検証において、送脱血の準自動循環は可能であった。しかし、当初予定していた制御条件では、制御項目を増加させたことが要因となり、研究開始より適用したシステムでは対応できないことが判明した。準自動循環制御システムの構築には、制御項目は複数項必要である。これに対応するために、別システムの構築に初年度の後半、時間を費やした。ローラーポンプの電流制御により回転数を調整できる目処が立ったため、最終年度にはローラーポンプを送脱血回路に各1機および生体内を模擬するために1機の計3機のローラーポンプを制御項目の変化に連動して動作するための検証実験を行う予定である。準自動のための主要アルゴリズムは作成済である。安全性検証実験と併せて、操作性の検証実験を予定通り実施する。体外循環操作はシステム化できることを示す。当初の実施計画のうち、実験用模擬回路の作成および操作のための制御条件の確定については完了している。途中、制御条件の項目を複数としたことで、現システムでは対応ができなくなり、別プログラムの作成によりシステム変更を当該年度の後半に実施した。このため、同実験の再現検証実験が遅れている。

しかし、当初予定していた制御条件では、制御項目を増加させたことが要因となり、別システムの構築として最終年度にはローラーポンプを送脱血回路に各1機の計2機のローラーポンプを購入し検証実験を実施できた。システム構築の変更のため、同時にソフトウェアの見直しを実施することができた。準自動循環のための主要アルゴリズムを適宜修正し、年度内にすべての検証実験を終えた。作動流体(水)を使用した検証において、送脱血の準自動循環は可能であった。準自動循環制御システムの構築には、制御項目は複数項必要である。使用するポンプを遠心ポンプからローラポンプへ変更したが、ローラポンプの電流制御により回転数を調整できる目処が立ったため、最終年度にはローラーポンプを送脱血回路に各1機および生体内を模擬するために1機の計3機のローラーポンプを制御項目の変化に連動して動作するための検証実験を行う予定である。準自動のための主要アルゴリズムは作成済である。安全性検証実験と併せて、操作性の検証実験を予定通り実施する。体外循環操作はシステム化できることを示す。シミュレータ等から模擬患者情報として動脈血圧と中心静脈圧の信号をシステムに入力させる。各血圧を指定した圧にするための操作条件をシステムに組込み、循環状態だけでなく生体情報も考慮したシステムへ改良する。次年度には、シミュレータを使用して様々な環境(トラブル含む)を再現し、トレンドを記録する。自動循環操作中に人工心肺に関する重大な事故である「空気誤送」を起こすことのないシステムを目指す。制御条件の項目を複数としたことで、現システムでは対応ができなくなり、別プログラムの作成によりシステム変更したことで、当初必要とした材料の変更を実施した。また、使用するポンプの変更により、次年度は計画時の同等のローラーポンプを3機購入する予定である。モーター駆動のためのシステム設計が今年度末に完成できたため、3機駆動のための電子部品購入費用を計上する。体外循環を模擬するための各種チューブや構成要素(貯血槽(水実験のため未滅菌で可能)等)の購入が必要である。また、研究成果発表としては国内の関連学会で数件発表を行う予定である。より多くの研究者に知見を報告するためには国際誌への投稿は最も影響が高いため数本のエントリーを検討している。実験の遅れにより初年度英文校閲を見送る必要があった。次年度に変更し、本研究に関連する国際誌に複数の投稿を目指す。英文校閲等費は次年度に変更する。
分子シャペロンによる神経細胞変性の抑制に関する研究

本研究は、一群の熱ショック蛋白質に共通の転写因子を鍵として、熱ショック蛋白質群の神経細胞での高発現を導くことで神経変性疾患の治療の可能性を検討するのがねらいである。私たちは、これまでに活性型熱ショック転写因子HSF1を作成し、この因子のHeLa細胞への高発現により一群の熱ショック蛋白質の発現が亢進することを確認した。さらに、病的な長さのポリグルタミンを融合させた蛍光蛋白質GFP(Q81-GFP)を活性型HSF1高発現HeLa細胞へ発現させると細胞内凝集体の形成と細胞死が著明に抑制されることを示した。今回、遺伝子治療をめざして、活性型HSF1を発現するアデノウイルスベクター(Ad-HSF1)を作成してその効果を調べた。コントロールとしてLacZを発現するベクター(Ad-LacZ)を用いた。Ad-HSF1のHeLa細胞への感染により一群の熱ショック蛋白質の高発現を認めた。ウイルスを感染させて24時間後にQ81-GFPの発現ベクターを導入した。36時間後にGFPを発現しているすべての細胞と封入体を持つ細胞をカウントした。その結果、Ad-LacZを感染した細胞では約30%、Ad-HSF1感染細胞では約15%の封入体形成細胞が存在した。トランスフェクトするQ81-GFP発現ベクターの量を変えると封入体形成細胞の割合は変動するが、Ad-HSF1感染細胞での封入体形成率は、常にAd-LacZ感染細胞の率の約半分であった。驚いたことに、Q81-GFPベクターをトランスフェクトして48時間後にウイルスを感染しても、やはりAd-HSF1感染細胞で封入体の形成率が低下した。以上の結果より、ウイルスによる活性型HSF1の高発現はポリグルタミン病の治療に有効であることが示唆された。
公教育とイスラーム ヨーロッパの移民統合の破綻と異文化間教育の役割

平成19年度は、平成18年度で明らかにしたオランダ、ベルギー、フランスの公教育における宗教の構造的位置づけの違いと宗教的規範や宗教教育に対する処遇の違いを踏まえ、主に二つの課題に取り組んだ。第一の課題は、前年度に引き続き、各国の公教育の場でイスラームへの対応をめぐって生じている個別の問題や矛盾を国民・市民の育成と「普遍的」価値の伝達という近代公教育の機能の観点から捉え直すことにより、共通して表出している傾向を抽出することであった。一連の分析から、これらの国におけるムスリム移民の統合をめぐる共通した論点とその論点に含まれるイスラームフォビア的な思考様式を指摘した。これらの研究成果は主に平成19年度の前半に行った日本国内での研究活動を通じて公表した。第二の課題は、これまでの研究成果を踏まえて、個人の信仰や宗教的規範の違いを考慮に入れた公教育での異文化間教育のありかたを展望することであった。この課題は、ヨーロッパ社会の世俗化やムスリム以外の信徒の存在など、他の様々な諸要素をも考慮し多角的に考察すべき複雑な内容である。本課題に取り組むため、平成19年度後半からはフランス国立社会科学高等研究院のPD研究員として籍を置き、特に宗教学や宗教教育学の知見を深めることにより、本課題に関わる基礎的研究を進めることが可能となった。具体的には、宗教を基盤とした異文化間教育の質的条件(信仰をどのように、またどこまで扱うか)と、構造的条件(信仰をどのような場で扱うか)をめぐる萌芽的研究を行い、その成果を同研究院の研究会で報告し、宗教学研究者や教育学者などから輻広い意見やコメントを得ることができた。ヨーロッパにおける宗教の多様性を踏まえた異文化間教育の方途を探るため、フランス・オランダ・ベルギーを対象として、これら三カ国における公教育構造の限界と今後の展望を比較考察することを目的として研究を進めている。本年度は主に次の研究を進めた。まず、オランダにおける宗教の制度的位置取りを確認し、近年それがイスラーム的規範やイスラーム教育への対応をめぐって、いかなる変容の傾向を見せているのか検討した。この研究成果は、日本教育政策学会の年報に投稿論文として掲載された。また、共著『オランダ寛容の国の改革と模索』では、こうした議論が持つ意味や課題をオランダ社会全体のより大きな文脈に置いて論じた。並行して、フランス公教育における宗教の位置づけ、すなわちライシテ原理が、ムスリム女生徒のスカーフとの関連から生じている問題についても概括し、日本学習社会学会の課題研究論文として掲載された。5月下旬からベルギーで実施した調査では、大学図書館や関連諸機関の資料室において、ベルギーの公教育史にかかわる数々の史資料にあたった。また、実際の学校現場で生じている課題や、試行中の取り組みを明らかにするため、多文化地域における公立学校を訪問し、学校関係者へのインタビューや参与観察をおこなった。さらに、教育政策に携わる国会議員らに対して実施したインタビュー内容から、本課題をめぐる今後の見通しを分析した。秋以降はこれらの実証研究を発展させて研究論文としてまとめ上げ、2007年3月末に提出した。論文中では主に公教育構造に宗教的多元性が保持されているオランダとベルギーを対象としたが、両国の公教育とは対照的な制度を有するフランスについても若干の考察を加え、19年度に本格的に開始する研究の基礎的土台を築いた。また、この比較研究の基本的な枠組みは、共著『衝突と和解のヨーロッパユーロ・グローバリズムの挑戦』において提示した。
ヘプシジン関連創薬のためのＥＰＩＣシステムを応用した活性型ヘプシジン測定系の開発

ヘプシジン(Hpc)は細胞膜表面のフェロポルチン(Fpn)に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する。Hpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こし、一方、Hpc過剰産生は鉄欠乏状態を招く。このようなHpcに起因する病態に対する治療戦略として、Hpc agonists/antagonistsの開発が注目されている。そこで、Hpc活性測定システムとして、Fpn-GFPを安定発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。はじめに、クローニングしたFpn-GFP発現細胞株[A-3]のHpc isoforms; hep-20、hep-22、hep-25に対する反応性を、Flow cytometry法で評価した。結果、hpc-25を添加、培養したアッセイ系のみがhpc-25濃度依存的に蛍光減弱を示した。すなわち、今回樹立したFpn-GFP発現細胞株がcell-based bioassayとして利用可能な細胞であることを確認することができた。次に、High-throughput screeningシステムとして、細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達に伴う細胞骨格の変化や細胞内分子のトランスロケーションが引き起こされる動的な質量の再分布;Dynamicmass redistribution(DMR)を捉えることを可能としたEpicシステムの適応性を検討した。予め96ウェル・ラベルフリー測定用マイクロプレートに播種したA-3細胞株にHpc isoformsをそれぞれ添加し、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25を添加した系のみが動的な質量の再分布・変化を示した。このように、試料中のhpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムを構築することができた。ヘプシジン(Hpc)は細胞膜表面のフェロポルチン(Fpn)に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する因子である。Hpcの遺伝子異常や転写プロモーターへのシグナル不全などによるHpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こす。一方、炎症性サイトカインによるプロモーター活性増強やnegative regulatorであるTMPRSS6/MT-2の遺伝子異常などによるHpcの過剰産生は鉄欠乏状態を招く。そこで、Hpc活性の測定・評価システムとして、Fpn-GFP (Green Fluorescent Protein)を安定に発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。Fpn-GFP融合蛋白発現ベクターをHEK293細胞に遺伝子導入後、ソーティングおよび限界希釈法によりFpn-GFP低発現クローンを得た。Hpc活性は、Fpn-GFPのinternalization/degradationによる蛍光減弱をFlow Cytometryで評価した。さらに、Fpn-GFPのinternalization/degradationを動的な質量の再分布・変化として捉えるDynamic mass redistribution (DMR)評価方法を検討した。3種類のヘプシジン・アイソフォーム(Hpc-20、-22、-25)の活性を比較検討したところ、既報にてFpnとの結合が確認されているHpc-25を添加したアッセイ系のみが、蛍光減弱、DMR変化を示した。本システムは、試料中のHpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムであることが確認できた。Cell-based bioassay同時多検体測定システムにおける測定条件の最適化作業に向けて、光学ラベルフリー・システムを搭載したマルチモードプレートリーダー(EnSpire)の導入を行う。当該機器を用いることで、real-time response追跡が可能となることから、assayに影響を及ぼす測定時温度、測定時間などの各種パラメーターの最適化を詳細に検討することが可能となる。より短時間で信頼性の高いHpc活性測定システムを構築していく予定である。

クローニングしたFpn-GFP低発現細胞において、細胞表面でのFpn-GFP発現が不安定であることが明らかとなった。そこで、当該細胞株の状態を精査する目的で、Flow Cytometryを用いたHpc活性測定を中心に行ったことから、使用額が予定額より低くなった。次年度はマルチモードプレートリーダー(EnSpire)の導入によるcell-based bioassayを中心に研究を進め、Hpc活性測定のための同時多検体測定システム構築に繰越額を当てる予定である。