hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パルス放射光励起による光脱離の動的過程

また、さらに強度を上げた測定を行うために、アンジュレーターからの準単色化された放射光を用いた。これらは、申請者らの属するシンクロトロン放射光設備(UVSOR)を利用して実現可能となった。3)試料表面の清浄化のためのLEED装置として、オミクロン社のSPEC4型を購入し、現在の真空槽に取り付け、試料表面の構造を知る方法を備えた。これによって、現有の光電子分光などの表面分析装置ならびに真空へきかい装置との組合せが出来た。4)放射光の単バンチ運転を利用して、励起ナトリウム原紙の光脱離の時間応答性の測定を、現有のTAC(単一光子計数法)システムを用いて行い、脱離気宇にはナノ秒の早い機構とサブマイクロからミリ秒の遅い機構の2種類があることが明らかになった。5)これらの結果は、従来の脱離モデルでは予想出来なかった結果であり、第7回絶縁物における照射効果国際会議、ならびにPhysical Review Bに発表し、国内外の理論家との間の議論が呼んだ。平成6年度は以下の計画に基ずいて研究を行った。1)前年度に行った測定システムの完成度の確認ならびに点検を行うと共に、物質をひろげて、KClやLiFからのアルカリ原子の光脱離についての測定を行う。特に、光脱離の励起光エネルギー依存性や単バンチ運転利用の時間応答性の実験を行うことによって、励起アルカリ原子の光脱離の動的過程を明かにする。2)UVSORの実験ビームラインBL6A2において、光脱離と光電子分光実験を同一条件で行い、表面状態を確認しながら、光脱離の測定を行う。これによって、表面上の吸着アルカリの光脱離に対する影響を調べる。3)既存の半導体レーザーを用いてLIF法による高感度検出システムを構成し、それを用いて、基底原子の放出を測定する。その結果、(1)については、励起エネルギー依存性の測定を行うことが出来、現在論文作成中である。また、時間応答性については、世界で初めてナノ秒の動的過程を実験的に明らかにし、既に論文として報告した。(2)については、表面に金属アルカリが増えることを見いだし、それが光脱離を阻害することが明かとなった。現在、得られた実験結果の解析を進行中である。(3)については、実験システムを構成中で、いくつかの試行錯誤を行っているところであり、残念ながらまだ成果は得られていない。平成7年度は以下の計画に基ずいて研究を行った。1)いままでの本研究により、励起状態の検出ができるようになり、アルカリハライドからの励起アルカリ原子は、ナノ秒の早い脱離とミリからマイクロ秒の遅い脱離があることが分かったが、その一方では、基底アルカリ原子はミリからマイクロ秒の脱離しか報告されていない。そこで、半導体レーザーを用いてLIF法による基底原子の高感度検出システムを構成し、それを用いて、基底アルカリ原子の放出を測定する。また、アルカリハライド薄膜やガスを吸着させた系(COなど)についても光脱離の動的過程を調べる。その結果、(1)については、KBrとKClにおいて、基底カリウム原子の検出に成功した。
ヒト不死化神経幹細胞の低酸素性・虚血性脳障害モデル動物脳への細胞移植に関する研究

(1)神経幹細胞の樹立と分化:ブリティッシュ・コロンビア大学(カナダ)神経部門にてヒト中絶胎児脳を用い、レトロウイルスに組み込ませたv-myc oncogeneにより、高い増殖能を有し、自己複製能と多分化能をもったヒト由来不死化神経幹細胞株(HB1/C4)を樹立した。また、ヒト中絶胎児の後根神経節を用い、v-myc oncogeneにより高い増殖能を有し、自己複製能と多分化能をもつ不死化神経堤幹細胞(HNC10/C2)を樹立した。また、ヒト骨髄幹細胞由来の不死化細胞株を島根医大神経内科長井篤氏が樹立した。この細胞株を譲り受け、現在、骨髄細胞の分化誘導、増殖に及ぼす影響、細胞株自身の分化能の解明、神経幹細胞移植への応用に注目して研究を進行中である。この細胞株自身の分化動態を解明することで、他系統細胞への分化誘導が可能となる可能性がある。神経疾患における骨髄間葉系幹細胞株移植および静脈内投与の可能性を検討中である。(2)虚血性脳障害のモデル動物作成:興奮性アミノ酸であるカイニン酸をラット腹腔内に投与し、けいれん重積状態を惹起することで低酸素性・虚血性モデルラットを作成した。モデルラット脳を灌流固定し、海馬の錐体細胞層を免疫組織化学的方法で検討したところ、錐体細胞層のCA1,CA3,門部の神経細胞の脱落を確認できた。さらに、てんかん原性が獲得される初期の過程で海馬歯状回の神経前駆(幹)細胞から顆粒細胞への分裂増殖の促進現象が認められることを明らかにし、新しく分裂増殖した顆粒細胞が、苔状線維の発芽現象や、海馬の神経回路の再構築に何らかの影響を与えている可能性を見出した。(3)神経幹細胞移植:ヒト神経幹細胞と神経堤幹細胞を難治性てんかんモデル動物脳に移植し、移植後の行動変化を分析検討している。神経幹細胞を移植したモデルラット脳を灌流固定し、免疫組織化学的方法により神経回路網の再構築について検討を加えているところである。本研究の目的は、低酸素性・虚血性脳障害における重度の脳障害やてんかんの発生を予防するための治療法のひとつとして、ヒト由来の不死化神経幹細胞・神経堤幹細胞を用いて低酸素性・虚血性脳障害モデル動物脳に神経幹細胞移植を行うことである。平成13年度の研究実績(1)神経幹細胞の樹立と分化:ヒト中絶胎児脳を用い、レトロウイルスに組み込ませたv-myc oncogeneにより、高い増殖能を有し、自己複製能と多分化能をもったヒト由来不死化神経幹細胞株(HB1/C4)を樹立した。HB1/C4を、血清(5%FBS、5%HS)を含む培養条件で分化・誘導したところ、神経細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイトへの分化が認められた。HNC10/C2を、血清(5%FBS、5%HS)を含む培養条件で分化・誘導したところ、神経細胞、シュワン細胞、クロマフィン細胞、骨格筋細胞への分化が認められた。(2)虚血性脳障害のモデル動物作成:興奮性アミノ酸であるカイニン酸をラット腹腔内に投与し、けいれん重積状態を惹起することで海馬の虚血性脳障害モデルラットを作成した。

モデルラット脳を灌流固定し、海馬の錐体細胞層を免疫組織化学的方法で検討したところ、錐体細胞層のCA1,CA3,門部の神経細胞の脱落を確認できた。(3)神経幹細胞移植:現在、ヒト神経幹細胞と神経堤幹細胞を虚血性脳障害モデル動物脳に移植し、移植後の行動変化を分析検討している。神経幹細胞を移植したモデルラット脳を灌流固定し、免疫組織化学的方法により神経回路網の再構築について検討を加えているところである。(1)神経幹細胞の樹立と分化:ブリティッシュ・コロンビア大学(カナダ)神経部門にてヒト中絶胎児脳を用い、レトロウイルスに組み込ませたv-myc oncogeneにより、高い増殖能を有し、自己複製能と多分化能をもったヒト由来不死化神経幹細胞株(HB1/C4)を樹立した。また、ヒト中絶胎児の後根神経節を用い、v-myc oncogeneにより高い増殖能を有し、自己複製能と多分化能をもつ不死化神経堤幹細胞(HNC10/C2)を樹立した。(2)虚血性脳障害のモデル動物作成:興奮性アミノ酸であるカイニン酸をラット腹腔内に投与し、けいれん重積状態を惹起することで海馬の虚血性脳障害モデルラットを作成した。(3)神経幹細胞移植:昨年度に引き続き、ヒト神経幹細胞と神経堤幹細胞を虚血性脳障害モデル動物脳に移植し、移植後の行動変化を分析検討している。(4)骨髄幹細胞由来の不死化細胞株による移植:ブリティッシュ・コロンビア大学(カナダ)神経部門にてヒト骨髄幹細胞由来の不死化細胞株を島根医大神経内科長井篤氏が樹立した。この骨髄幹細胞は間葉系であることが確認された。この細胞株を譲り受け、現在、骨髄細胞の分化誘導、増殖に及ぼす影響、細胞株自身の分化能の解明、神経幹細胞移植への応用に注目して研究を進行中である。この細胞株自身の分化動態を解明することで、他系統細胞への分化誘導が可能となる可能性がある。神経疾患における骨髄間葉系幹細胞株移植および静脈内投与の可能性を検討中である。また、ヒト骨髄幹細胞由来の不死化細胞株を島根医大神経内科長井篤氏が樹立した。この細胞株を護り受け、現在、骨髄細胞の分化誘導、増殖に及ぼす影響、細胞株自身の分化能の解明、神経幹細胞移植への応用に注目して研究を進行中である。(2)虚血性脳障害のモデル動物作成:興奮性アミノ酸であるカイニン酸をラット腹腔内に投与し、けいれん重積状態を惹起することで難治性てんかんモデルラットを作成した。
高磁気異方性を有するハーフメタル薄膜の創製と室温高スピン分極率の実現

高いスピン偏極率と大きな磁気異方性を併せ持つ強磁性材料を開発することは、スピントロニクスデバイスの性能向上と高集積化・小型化のための必須課題である。本研究ではハーフメタル材料Co_2MnSiをL1_0規則合金FePt, CoPt上に積層させた構造を作製することによって、極薄膜化したCo_2MnSiに高い磁気異方性を付加することに成功した。これを用いた強磁性トンネル接合においてトンネル磁気抵抗効果を明瞭に観測した。強磁性トンネル接合用電極としてCoPt垂直磁化膜上に極薄(<5nm)のCo_2MnSi電極を成膜し、その構造,磁気特性及び表面平坦性を評価した。面内のX線回折法によって極薄のCo_2MnSiの構造解析を行った結果、Co_2MnSiが1nmと非常に薄い領域においてもB2構造以上の高い規則状態を維持していることを確認した。Co_2MnSiが高いスピン分極率を持つためにはB2以上の規則度が必要であることが理論的に予言されており、本結果は極薄のCo_2MnSiにおいてもハーフメタル性が得られる可能性を示す非常に重要な成果である。また高輝度放射光施設SPring-8において、X線磁気円二色性を測定することによってCo, Mnの元素選択ヒステリシスを観測し、Co_2MnSiの磁化過程を直接的に評価した。その結果, Co_2MnSiの膜厚が3nm以下の場合においては, CoPtの高い磁気異方性の影響から、Co_2MnSiの磁化が面直方向に向いていることを明瞭に確認した。さらに、原子間力顕微鏡による表面像観察の結果、これらの膜の平均表面ラフネスは0.3nm前後と極めて小さいことを確認し、トンネル接合の下部電極として十分な平坦性を有していることが分かった。また、これらを下部電極とし強磁性トンネル接合を作製した結果、暫定的な結果として、室温で9%のTMR比を得た。これはCoPt単体を用いた場合よりも大きなTMR比である。FePt垂直磁化膜上に極薄(<5nm)のCo_2MnSi電極を成膜し、その構造,磁気特性及び表面平坦性を評価した。また高輝度放射光施設SPring-8において、X線磁気円二色性を測定することによってCo,Mnの元素選択ヒステリシスを観測し、Co_2MnSiの磁化過程を直接的に評価した。その結果,Co_2MnSiの膜厚が4nm以下の場合においてCo_2MnSiが垂直方向に磁化容易軸を取り、更にMCDのsum rule解析による磁気モーメントの大きさはCoPt上に成膜した場合に比べ1桁近く大きくなった。これらを下部電極とし上下ともに強磁性トンネル接合を作製した結果、室温で15%程度のTMR比を得た。また、トンネルコンダクタンスのバイアス電圧依存性を評価した結果、極低バイアス電圧付近で生じるコンダクタンスの急峻な立ち上がりが抑制される傾向が見られた。これは垂直磁気異方性が加わったことによって、Co_2MnSiとトンネル障壁層界面で生じるマグノンの分散に変化生じたためではないかと考えられる。
雄性不妊及び発がん過程のクロマチン動態解析

本研究では「病態進行過程におけるクロマチン構造の動態変化」をキーワードに、二つのテーマを推進した。一つ目のテーマでは、マウスの精巣特異的ヒストンH3バリアントであるH3tに着目し、クロマチン構造が大規模に変動する精子形成過程においてH3tがどのような役割を担っているのかを明らかにすることを目的として行った。本領域に参画期間中に行った解析から、H3tは幹細胞の維持には必要ないが、精原細胞が分化し、減数分裂に移行するために必要であることを明らかにした。また、領域代表の胡桃坂仁志教授のグループの解析によって、H3tを組み込んだヌクレオソームはcanonicalなH3であるH3.1を組み込んだヌクレオソームに比べて開いた構造を取っていることが結晶構造並びに生化学的解析によって明らかとなった。さらに、この構造の違いがヌクレオソームのentry/exit部位に位置するH3tの42番目のヒスチジン残基(canonicalなH3では42番目がアルギニン残基)に由来することも点変異の実験によって突き止めた。これらの結果は論文として発表し(Ueda, J., et al., Cell Reports, 2017)、現在はこの仕事の続きとして、H3tの42番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換したマウスの作製に取り組んでいる。二つ目のテーマでは、メチル化DNAを可視化したレポーターマウス「メチロー」を用いて、腫瘍形成過程にメチル化DNA及びヘテロクロマチン構造がどのように変動するかを解析した。メチローマウスと発がんモデルマウスを用いた解析から、非腫瘍と腫瘍を区別する特徴量として使えそうな候補指標がいくつかあることが明らかとなった。また、中部大学の岩本隆司教授(連携研究者)、岩堀祐之教授との共同研究によって、腫瘍切片のヘマトキシリン・エオシン染色(明視野)画像から細胞核を抽出する方法の開発を行った(Tsukada, Y., et al., Procedia Computer Science, 2017)。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では「病態進行過程におけるクロマチン構造の動態変化」をキーワードに、二つのテーマを推進している。一つ目のテーマでは、マウスの精巣特異的ヒストンH3バリアントであるH3tに着目し、クロマチン構造が大規模に変動する精子形成過程においてH3tがどのような役割を担っているのかを明らかにすることを目的としている。これまでの解析から、H3tは未分化型精原細胞や精子幹細胞の維持には必要ないが、精原細胞が分化し、減数分裂に移行するために必要であることを明らかにした。また、早稲田大学の胡桃坂仁志教授のグループの解析によって、H3tを組み込んだヌクレオソームはcanonicalなH3であるH3.1を組み込んだヌクレオソームに比べて開いた構造を取っていることが結晶構造並びに生化学的解析によって明らかとなった。これらの結果は論文として発表した(Ueda, J., et al., Cell Reports, 2017)。現在はこの続きの仕事として、九州大学の大川恭行教授のグループとの共同研究によって、「精子幹細胞の分化誘導実験系を用いたヒストンH3バリアントのChIP-seq解析」を行っている。二つ目のテーマでは、メチル化DNAを可視化したレポーターマウス「メチロー」を用いて、腫瘍形成過程にメチル化DNA及びヘテロクロマチン構造がどのように変動するかを解析している。メチローマウスと発がんモデルマウスを用いた解析から、特徴量として使えそうな候補指標がいくつかあることが明らかとなった。平成28年度は、中部大学の岩本隆司教授、岩堀祐之教授との共同研究によって、腫瘍切片のヘマトキシリン・エオシン染色(明視野)画像から細胞核を抽出する方法の開発を行った(Tsukada, Y., et al., Submitted)。H3tの機能解明までは到達していないが、途中経過として論文発表を行うことができた。また、機能解明に繋がりそうな共同研究が始まっていることから、このような自己評価とした。

二つ目のテーマでは、メチル化DNAを可視化したレポーターマウス「メチロー」を用いて、腫瘍形成過程にメチル化DNA及びヘテロクロマチン構造がどのように変動するかを解析した。メチローマウスと発がんモデルマウスを用いた解析から、非腫瘍と腫瘍を区別する特徴量として使えそうな候補指標がいくつかあることが明らかとなった。また、中部大学の岩本隆司教授(連携研究者)、岩堀祐之教授との共同研究によって、腫瘍切片のヘマトキシリン・エオシン染色(明視野)画像から細胞核を抽出する方法の開発を行った(Tsukada, Y., et al., Procedia Computer Science, 2017)。【テーマ1.精巣特異的ヒストンH3バリアント、H3tの精子形成過程での役割の解明】平成29年度は、九州大学の大川恭行教授のグループとの共同研究によって、「精子幹細胞の分化誘導実験系を用いたヒストンH3バリアントのChIP-seq解析」を継続して行う。H3tの論文発表後、海外から共同研究の依頼があり、共同研究をスタートした。今後はH3t特異的なヒストン・コードが存在するか否かを明らかにしていくことで、H3tが精子形成過程においてどのような役割を果たしているかを明らかにしていきたいと考えている。このことを実現するために、精巣組織からH3tをプルダウンした後にプロテオーム解析を行うことを計画している。精巣組織からのH3t複合体の精製及びプロテオーム解析については、基礎生物学研究所の中山潤一教授のグループと共同で進めることを予定している。最終的に、H3tがどのように精子形成過程に寄与しているのか、その分子メカニズムを明らかにしたいと考えている。【テーマ2.メチローマウスを用いた発がん過程でのヘテロクロマチン構造変化の動態解析】平成28年度は、中部大学の岩本隆司教授、岩堀祐之教授との共同研究によって、腫瘍切片のヘマトキシリン・エオシン染色(明視野)画像から細胞核を抽出する方法の開発を行った(Tsukada, Y., et al., Submitted)。今後は、明視野画像から抽出した細胞核からがん細胞に特有の核内構造の特徴量を抽出し、非腫瘍と腫瘍を区別するための方法(診断法)を開発することを計画している。また、メチローマウスと発がんモデルマウスを用いた解析から、特徴量として使えそうな候補指標がいくつか見付かったので、それらが明視野画像でも有効であるかを検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
各種の脂質メディエーターによるプロテインキナーゼC活性調節と細胞応答

イノシトールリン脂質の加水分解反応が、細胞の情報伝達に果たす役割は、すでに確立されているが、細胞内では同時にコリンリン脂質(PC)も分解される。そこで、コリンリン脂質の加水分解反応が細胞内情報伝達に関与する可能性を検討した。その結果、ホスホリパーゼA2(PLA2)によって切り出される不飽和脂肪酸とリゾコリンリン脂質(リゾPC)の両者が共に、ジグリセリドと協調してプロテインキナーゼC(PKC)の活性を促進させ、細胞応答を増強させることが判明した。そこで、種々の不飽和脂肪酸を切り出すPLA2の受容体との共役機序について解析した。その結果、この種のPLA2はCa^<2+>非要求性であり、その活性調節にはチロジンのリン酸化反応、PKCによるセリン・トレオニンのリン酸化反応が関与していることが示唆された。この際、GTP-γSの作用もうけるため、G-蛋白質と共役した受容体からの調節の可能性も示唆される。現在、このCa^<2+>非要求性PLA2を種々の組織、細胞より精製し、その活性調製機構の解析を進めている。
脳磁図のガンマ帯域活動解析による統合失調症の脳部位間ネットワーク異常の検討

ワーキングメモリ課題を用いて誘発される脳磁場活動を測定した。時系列解析を用いてガンマ帯域活動(γBA)を抽出し、空間フィルタ法を用いて活動源の推定を行った。その結果、高周波帯域である50-80Hzの帯域においては,encoding区間でSCZ群はHC群に比し上頭頂小葉にて有意なERSの低下が認められ,retention区間では後頭葉および左背外側前頭前野にてSCZ群ではERDが,HC群ではERSが認められ,両群で有意差が認められた.作業記憶に関連するとされる左背外側前頭前野での記憶の保持に関してHC群で神経活動が増強し,SCH群では減弱していることが示唆された.ワーキングメモリ課題を用いて誘発される脳磁場活動を測定した。その結果、高周波帯域である50-80Hzの帯域においては,encoding区間でSCZ群はHC群に比し上頭頂小葉にて有意なERSの低下が認められ,retention区間では後頭葉および左背外側前頭前野にてSCZ群ではERDが,HC群ではERSが認められ,両群で有意差が認められた.作業記憶に関連するとされる左背外側前頭前野での記憶の保持に関してHC群で神経活動が増強し,SCH群では減弱していることが示唆された.平成20年度は、統合失調症患者20名、健常被験者20名に対して、64チャンネル全頭型脳磁計を用いて、様々な認知課題を呈示し、誘発される脳磁場活動を測定した。ガンマ帯域活動(γBA)の解析では、FFT、ウェーブレット、ICAといった基本的な時系列解析を用いてγBAを抽出し、空間フィルタ法を用いて活動源の推定を行った。その結果、P300ではγBAが健常被験者においても誘発されず、γBAをみるための課題としては適切ではないことが判明した。この結果はClinical Neurophysiology誌(2008年インパクトファクター値:2.972)に受理され、すでに出版されている。また最も効率よくγBAを誘発し、健常被験者群と統合失調症群との間でγBAの差を見出しうる課題として、ワーキングメモリ課題の一種であるSternberg's Memory Taskが最適であることが判明した。また統合失調症群60名と健常者群60名に対して、5種類の前頭葉機能課題を施行中に近赤外分光法による前頭前野の酸素化ヘモグロビン濃度変化を測定し、統合失調症と健常者と判別可能かどうか判別分析をおこなった。課題成績と酸素化ヘモグロビン濃度変化の両者を従属変数とした場合、第1群では88%、第2群では75%の正判別率を得た。その際、判別に有用な変数は、言語流暢性課題成績(文字バージョン、カテゴリーバージョン)、ハノイの塔課題成績、言語流暢性課題文字バージョンの酸素化ヘモグロビン濃度変化の4つであった。このことは統合失調症と健常者の判別には認知課題成績と近赤外分光法による血流変化の両者を考慮に入れた方がより再現性の高い結果が得られることを示唆している。この結果はSchizophrenia Research誌(2008年インパクトファクター値:4.174)に受理され、すでに出版されている。平成22年度は、昨年度に最も効率よくγBAを誘発し、健常被験者(HC)群と統合失調症(SCH)群との間でγBAの差を見出しうる課題であることが判明したワーキングメモリ課題の一種であるSternberg's Memory Taskを用いて、患者21名、健常被験者20名に対して、64チャンネル全頭型脳磁計を用いて、誘発される脳磁場活動を測定した。その結果、課題成績では,SCZ群(54.3±7.3)はHC群(58.3±1.4)に比し有意に低下した(両側t検定p<0.05).脳磁図の結果では,30-80Hzの帯域におけるERS/ERDの脳内分布について,encoding区間,retention区間とも両群に有意差は認められなかった.しかしながら,より高周波帯域である50-80Hzの帯域においては,encoding区間でSCZ群はHC群に比し上頭頂小葉にて有意なERSの低下が認められ,retention区間では後頭葉および左背外側前頭前野にてSCZ群ではERDが,HC群ではERSが認められ,両群で有意差が認められた.これはSCH群ではHC群に比べ作業記憶に関する神経活動がより増強していることを示唆しており,難易度が低い作業記憶課題においては,SCH群はHC群よりもGBAが増強したという過去の報告と一致している.神経活動について,ERSでは増強,ERDでは減弱していると考えられているため,作業記憶に関連するとされる左背外側前頭前野での記憶の保持に関してHC群で神経活動が増強し,SCH群では減弱していることが示唆された.平成23年度は、一昨年度に最も効率よくγBAを誘発し、健常被験者(HC)群と統合失調症(SCH)群との間でγBAの差を見出しうる課題であることが判明したワーキングメモリ課題の一種であるSternberg's Memory Taskを用いて、さらに被験者数を増やして患者30名、健常被験者30名に対して、64チャンネル全頭型脳磁計を用いて、誘発される脳磁場活動を測定した。

ガンマ帯域活動(γBA)の解析では、FFT、ウェーブレット、ICAといった基本的な時系列解析を用いてγBAを抽出し、空間フィルタ法を用いて活動源の推定を行った。その結果、課題成績では,SCZ群(54.3±7.3)はHC群(58.3±1.4)に比し有意に低下した(両側t検定,p<0.05).脳磁図の結果では,30-80Hzの帯域におけるERS/ERDの脳内分布について,encoding区間,retention区間とも両群に有意差は認められなかった.しかしながら,より高周波帯域である50-80Hzの帯域においては,encoding区間でSCZ群はHC群に比し上頭頂小葉にて有意なERSの低下が認められ,retention区間では後頭葉および左背外側前頭前野にてSCZ群ではERDが,HC群ではERSが認められ,両群で有意差が認められた.これはSCH群ではHC群に比べ作業記憶に関する神経活動がより増強していることを示唆しており,難易度が低い作業記憶課題においては,SCH群はHC群よりもGBAが増強したという過去の報告と一致している.神経活動について,ERSでは増強,ERDでは減弱していると考えられているため,作業記憶に関連するとされる左背外側前頭前野での記憶の保持に関してHC群で神経活動が増強し,SCH群では減弱していることが示唆された.平成24年度は、一昨年度に最も効率よくγBAを誘発し、健常被験者(HC)群と統合失調症(SCH)群との間でγBAの差を見出しうる課題であることが判明したワーキングメモリ課題の一種であるSternberg's Memory Taskを用いて、さらに被験者数を増やして患者50名、健常被験者50名に対して、64チャンネル全頭型脳磁計を用いて、誘発される脳磁場活動を測定した。その結果、課題成績では, SCZ群(54.3±7.3)はHC群(58.3±1.4)に比し有意に低下した(両側t検定, p<0.05).脳磁図の結果では, 30-80Hzの帯域におけるERS/ERDの脳内分布について, encoding区間, retention区間とも両群に有意差は認められなかった.しかしながら,より高周波帯域である50-80Hzの帯域においては, encoding区間でSCZ群はHC群に比し上頭頂小葉にて有意なERSの低下が認められ, retention区間では後頭葉および左背外側前頭前野にてSCZ群ではERDが, HC群ではERSが認められ,両群で有意差が認められた.これはSCH群ではHC群に比べ作業記憶に関する神経活動がより増強していることを示唆しており,難易度が低い作業記憶課題においては, SCH群はHC群よりもGBAが増強したという過去の報告と一致している.神経活動について, ERSでは増強, ERDでは減弱していると考えられているため,作業記憶に関連するとされる左背外側前頭前野での記憶の保持に関してHC群で神経活動が増強し, SCH群では減弱していることが示唆された.現在までに、ワーキングメモリ課題の一種であるSternberg's Memory Taskが、最も効率よくγBAを誘発し、健常被験者(HC)群と統合失調症(SCH)群との間でγBAの差を見出しうる課題であることが判明している。
聴覚障害児による乗法九九の記憶コードに関する研究

この研究の主目的は、聴覚障害児がどのようなコードを用いて、乗法九九を記憶しているか、そのようなコードが聴覚障害児の言語能力(特に、文法能力)とどのように関係しているのかを明らかにすることであった。4校の聾学校に在席している小学部4年生6年生の児童44人に、乗法九九のテストと文法能力テストを実施した。乗法九九のテストは次の5種類のモードから成っていた。【.encircledB.】数読みモード:よん×はち=〓【.encircledC.】読下しモード:よんかけはちは〓【.encircledD.】暗唱モード:しわ〓これらのテスト成績から平均正答率、平均正答スピード、誤答傾向を求めるとともに、文法能力との関係を調べた結果、次のようなことが明らかになった。
形態化連合過程における海馬の時間符号化を形成する多領野間ネットワークメカニズム

海馬のシータ波は10Hz程度の周期性を持った脳波であり、動物が実際に走行した順番通りに場所細胞群を発火させることが分かっていた(時間符号化)。これまで、海馬の時間符号化が、形態化連合記憶に関わる前頭前皮質や膨大後部皮質などの皮質領域とどのような関係があるのか不明であった。研究者代表は、ラットが形態化連合記憶課題を遂行中にシリコンプローブ電極を用いた大規模細胞外記録を実施することで、海馬のシータ波は海馬と皮質にわたる特定の細胞集団を同期発火させる役割を果たし、海馬の時間符号化が海馬ー皮質間という広範囲の神経ネットワーク内の細胞集団活動であることを示した。連合過程は、記憶や認知などあらゆる心的機能の基礎を成す過程である。本研究はその中でも、要素間の連合により要素単体が持ち得なかった情報が新たなに現れるという形態化連合過程に焦点を当て、その神経メカニズムを海馬、前頭前皮質、膨大後部皮質における相互作用の観点から明らかにしていく。応募者のこれまでの研究成果にから、要素の関連づけから情報の創発までの一連の過程が、海馬の時間符合化により表現されることが分かっていた。しかしながら、海馬の時間符号化は前頭前皮質や膨大後部皮質の影響を受けない独立した情報処理ではなく、むしろこれらの部位との相互作用によって実現するものである。本研究は、前頭前皮質と膨大後部皮質が海馬の時間符合化にどのような影響を与えるのかを検討することで、海馬の時間符合化による形態化連合過程の脳内表現をネットワークレベルで捉えることを目的とした。本年度において、形態化連合過程における海馬-膨大皮質-前頭前皮質ネットワークのダイナミクスを大規模細胞外記録により計測することに成功した。これにより、まず、各領野から本行動課題の遂行に必要な、音、匂い、組み合わせ、選択行動といったそれぞれの情報に反応する細胞が多数観察された。領野ごとにそれらの割合が異なることが分かり、各領野がそれぞれ異なる役割を果たすことが示唆された。さらに、各領野間の相互作用を検討するために、局所場電位間のコヒーレンスを解析したところ、領野間の同期活動が情報処理プロセスに応じて、ダイナミックスに変移していることが分かった。以上のことから、異なる機能を持つ各領野が相互に影響を与えることで、形態化連合を実現することが示唆された。今後はさらなる解析を加えて、各領野の機能と相互作用を明らかにしていく。非常に難易度の高い三つの脳部位からの同時記録に成功して、非常に興味深いデータを取得するに至ったことが理由である。本研究における行動実験と電気生理学実験は極めて難易度高い。本研究以外に、これらの難易度の高い両実験を組み合わせたものはないことから、本研究は非常に独創的でインパクトの強い研究であったと言える。研究者代表は海馬で発生するシータ波が海馬ー皮質間の細胞集団活動の形成に関わると仮説立てた。海馬のシータ波は10Hz程度の周期性を持った脳波であり、一周期(100ミリ秒)のオーダーで、動物が実際に走行した順番通りに場所細胞群を発火させることが分かっている(時間符号化)。これまで、海馬の時間符号化が、形態化連合記憶に関わる前頭前皮質(PFC)や膨大後部皮質(RSC)などの皮質領域とどのような関係があるのか不明であった。本研究は、ラットが形態化連合記憶課題を遂行中にシリコンプローブ電極を用いた大規模細胞外記録を実施することで、海馬CA1、PFC、RSCの個々の細胞の発火活動と海馬シータ波との関係を詳細に調べた。本記憶課題は、音と匂いの組み合わせを弁別して左右どちらかのレバーを引くことが求められる。これらの脳領域には本記憶課題に関連する情報(音、匂い、組み合わせ、選択行動)に反応して発火活動を強める“出来事細胞"が存在することを前年度に報告した。本年度において、これらの細胞群を多数同時に記録することに成功し、これらの細胞群のネットワークレベルでの相互作用を詳細に調べた。まず、PFCやRSCの出来事細胞には海馬シータ波に発火タイミングを同期させている集団が確認された。さらに相互相関解析によって、海馬とRSCの出来事細胞は海馬シータ波の一周期のオーダーで同期発火していることが明らかになった。これらの結果は、海馬のシータ波は海馬と皮質領域にわたる特定の細胞集団を同期発火させる機能を果たし、海馬の時間符号化が海馬内だけでなく海馬ー皮質間という広範囲の神経ネットワーク内の細胞集団活動であることを示唆している。さらなる解析を加えることで、形態化連合過程における海馬、PFC、RSCの相互作用の重要性と海馬の時間符号化への影響を明らかにする。

これらの結果を用いることで、海馬を用いた既存の記憶モデルを局所回路演算的なものから包括的回路演算のモデルに拡張させることができ、これらの神経メカニズムの全容解明に大きく貢献することを目指す。神経科学29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
接着分子ネクチン/アファディン系による新規細胞選別に基づく形態形成機構の解析

内耳の蝸牛管の聴覚感覚上皮では機械的刺激を受け取る感覚細胞と、それらを支える支持細胞が市松模様のように配置されている。そして、感覚細胞の頂端面にある感覚毛は聴覚能力に必須の構造である。接着分子ネクチン-3をノックアウト(KO)したマウスの感覚上皮では感覚細胞同士が接し、感覚細胞の頂端面に生えている感覚毛が正しく形成されていなかった。そこで、ネクチン-3が感覚毛の形態形成にかかわっているのか調べる目的で、ネクチン-3 KOマウスの感覚上皮を用いて解析を行った。まず、走査型電子顕微鏡を用いて感覚毛の形態を詳しく観察したところ、野生型ではV字型の感覚毛が同じ向きに揃って配列しているのに対し、ネクチン-3 KOマウスでは感覚毛の向きがばらついていた。感覚毛の向きの決定には平面内極性が必要であることが報告されている。そこで、ネクチン-3 KOマウスの感覚上皮における平面内細胞極性関連分子の局在を調べたが、KOによる影響は観察されなかった。また、感覚上皮を含む上皮組織の機能と形態形成には、平面内細胞極性の軸と直交する頂底軸方向の細胞極性も必要不可欠である。接着分子ネクチンを含むアドヘレンス(AJ)ジャンクションは細胞と細胞を繋ぐ役割だけでなく、頂底軸の細胞極性にもかかわっている。そこで、感覚毛の形態形成の異常に頂底軸方向の細胞極性が関わっているのか調べる目的で、感覚細胞の接着面でのAJジャンクション関連分子の局在を調べた。その結果、野生型では細胞間の頂端部側に局在していたシグナルが、KOマウスでは頂端部側から側面にもシグナルが認められた。この観察結果から、感覚毛の形態形成の異常に頂底軸方向の細胞極性が関わっていることが示唆された。しかし、頂底軸方向の接着分子の局在の異常が感覚毛の形態形成の異常を引き起こしているのかは明らかにできなかった。感覚毛の形態形成の異常を直接引き起こす分子メカニズムを明らかにすることが今後の課題である。これまでに、培養細胞においてネクチンのヘテロフィリックな相互作用によってモザイク様の細胞選別現象が生じることがわかっている。そこで、この新規の細胞選別現象を組織レベルで検証するため、内耳感覚上皮のモザイク様の細胞パターン形成をモデルに新規細胞選別の果たす役割を調べた。1)感覚上皮におけるネクチン発現細胞の特定感覚上皮では感覚細胞の間に支持細胞が入り込んで感覚細胞同士を接しないようにしてモザイク様の細胞パターンが形成されている。これまでの研究でこの感覚細胞と支持細胞の間にネクチン-1とネクチン-3が発現していることが分かっていたが、それぞれのネクチンは細胞間に濃縮している接着分子のため、感覚細胞と支持細胞のどちらから発現しているのか免疫染色法だけでは分からなかった。そこで、それぞれのネクチンを発現している細胞を特定するため、細胞内のmRNAを標識するin situ hybridization法を用いて調べた。その結果、感覚細胞でネクチン-1、支持細胞でネクチン-3がそれぞれ相補的に発現していることがわかった。2)ノックアウトマウスを用いた表現形解析感覚上皮の細胞パターン形成におけるネクチンのヘテロフィリックな相互作用の重要性を調べるために、各ネクチンのノックアウトマウスを用いて感覚上皮の細胞パターンへの影響を調べた。その結果、ネクチン-3ノックアウトマウスでは感覚上皮の正常なモザイク様の細胞パターンが形成されず、本来は決して接しない感覚細胞同士が接している現象が観察された。また、接した感覚細胞の接着面ではネクチン-1が濃縮していたことから、感覚細胞同士はネクチン-1のホモフィリックな相互作用によって細胞間接着をしていることがわかった。これらのことからネクチンのヘテロフィリックな相互作用が内耳感覚上皮のモザイクパターンの形成に重要であると結論した。音を感じ取る内耳の蝸牛管では感覚細胞と支持細胞の2種類の細胞が互い違いに並んでいますが、これまでの研究で私は細胞間接着分子ネクチン-3のノックアウトマウスではこの配列が乱れることを明らかにしました。このノックアウトマウスでは感覚細胞同士がくっついていました。この表現形は他に例がなく、「聴覚を得るためになぜ感覚細胞と支持細胞が互い違いに並んでいるのか」という謎に対する答えを現在調べています。そこで私は、聴覚獲得におけるネクチンの機能とその分子機構を明らかにする目的で以下の研究を行いました。1)ノックアウトマウスを用いた形態学的な解析音を感じるには感覚細胞の上に生えている感覚毛が重要です。私は走査型電子顕微鏡を用いてネクチンノックアウトマウスの感覚上皮を観察しました。すると、感覚毛の形態に異常があることが分かりました。このことから、ネクチンノックアウトマウスが難聴になっている可能性が示唆されたため、以下の実験を行いました。2)ノックアウトマウスを用いた機能解析機能面の解析では神戸大学付属病院の耳鼻咽喉科と共同研究を行っています。ネクチンノックアウトマウスを用いて聴力検査を行ったところ、難聴を示すことが分かりました。これらのことからネクチン-3は聴力獲得に必要であることが示唆されました。しかし、機能面ではネクチンが聴覚に必要であることが分かりましたが、難聴を示している原因である分子機構は分かっていません。これまでの研究では感覚毛の形態異常に関わる分子群が知られています。そこで、私はこれらの分子群とネクチンの関連について分子レベルで解析しています。内耳の蝸牛管の聴覚感覚

上皮では機械的刺激を受け取る感覚細胞と、それらを支える支持細胞が市松模様のように配置されている。そして、感覚細胞の頂端面にある感覚毛は聴覚能力に必須の構造である。接着分子ネクチン-3をノックアウト(KO)したマウスの感覚上皮では感覚細胞同士が接し、感覚細胞の頂端面に生えている感覚毛が正しく形成されていなかった。そこで、ネクチン-3が感覚毛の形態形成にかかわっているのか調べる目的で、ネクチン-3 KOマウスの感覚上皮を用いて解析を行った。まず、走査型電子顕微鏡を用いて感覚毛の形態を詳しく観察したところ、野生型ではV字型の感覚毛が同じ向きに揃って配列しているのに対し、ネクチン-3 KOマウスでは感覚毛の向きがばらついていた。感覚毛の向きの決定には平面内極性が必要であることが報告されている。そこで、ネクチン-3 KOマウスの感覚上皮における平面内細胞極性関連分子の局在を調べたが、KOによる影響は観察されなかった。また、感覚上皮を含む上皮組織の機能と形態形成には、平面内細胞極性の軸と直交する頂底軸方向の細胞極性も必要不可欠である。接着分子ネクチンを含むアドヘレンス(AJ)ジャンクションは細胞と細胞を繋ぐ役割だけでなく、頂底軸の細胞極性にもかかわっている。そこで、感覚毛の形態形成の異常に頂底軸方向の細胞極性が関わっているのか調べる目的で、感覚細胞の接着面でのAJジャンクション関連分子の局在を調べた。その結果、野生型では細胞間の頂端部側に局在していたシグナルが、KOマウスでは頂端部側から側面にもシグナルが認められた。この観察結果から、感覚毛の形態形成の異常に頂底軸方向の細胞極性が関わっていることが示唆された。しかし、頂底軸方向の接着分子の局在の異常が感覚毛の形態形成の異常を引き起こしているのかは明らかにできなかった。感覚毛の形態形成の異常を直接引き起こす分子メカニズムを明らかにすることが今後の課題である。当初の予定であった、組織培養を用いて細胞パターン形成過程におけるネクチンやアファディン分子の挙動を経時観察するという目的は達成されていません。しかし、ネクチン-3ノックアウトマウスの内耳における形態学的な解析から、ネクチンの聴覚における新たな役割を示す可能性が示唆されました。このことから、本研究は当初の計画以上に順調に進展していると考えられます。私が行った研究から、機能面ではネクチンが聴覚に必要であることが分かりましたが、難聴を示している原因である分子機構は分かっていません。これまでの研究では感覚毛の形態異常に関わる分子群が知られています。そこで、私はこれらの分子群とネクチンの関連について分子レベルで解析しています。
電荷移動型交互性の主鎖を有するπ共役系高分子の合成とナノスケールでの組織制御

本研究では、昨年に引続きπ共役高分子の中でも特に電荷移動型交互性の主鎖を有するπ共役高分子の合成及びポリチオフェン系、ポリチアゾール系π共役高分子の組織化について研究を行った。ニッケル、パラジウム錯体を用いた有機金属縮合法により、電荷移動型交互性の主鎖構造を有するπ共役高分子の合成を行った。電子供与性アリーレンユニット-Ar-と電子受容性アリーレンユニット-Ar′-で構成されたπ共役高分子-(Ar-Ar′)-は、主鎖に沿った電荷移動構造Ar^<δ+>-Ar′^<δ->を有しており、相当するホモポリマーよりも長波長側にUV-visible吸収及び蛍光を示すことがわかった。フェロセンと電子吸引性エチニル基で構成されたポリアリーレンエチニレンを上記の手法と同様に合成した。その電気化学的な性質を解析した結果、ポリマーのp型ド-ピングが、低分子化合物と比較して高酸化側にシフトし、エチニル基の電子的影響を受けていることがわかった。また、同様のことがメスバウアースペクトル法により確認された。regioregular型ポリアルキルチオフェン、ポリアルキルチアゾールはスタッキングによるπ-π相互作用により吸収の長波長側へのシフトを起こすことがわかった。
マイトマイシンCの細胞致死作用の温熱による増強に及ぼすp53遺伝子型の影響

【目的】我々はp53欠損ヒト肺癌H1299細胞に正常型・p53発現ベクターを導入したH1299/wtp53細胞、変異型p53発現ベクターを導入したH1299/mp53細胞および対照としてベクターのみを導入したH1299/neo細胞を用い、42°C加温とマイトマイシンC(MMC)との併用処理により、いずれの細胞においても顕著な温熱化学増感効果が認められることから、その温熱化学増感効果は癌抑制遺伝子p53非依存的に誘発されることを報告した。本研究は、これらの知見の普遍性について他の癌細胞株を用いて検討することを目的とした。【材料と方法】1.p53欠損ヒト肝癌Hep3B細胞を用いた。2.温熱単独処理は、フラスコを42°Cに設定した恒温槽に浸漬して行った。3.MMC単独処理は、最終濃度0.05μg/mlのMMCを培養液に添加し、37°Cで処理した。4.併用処理は、上記MMC処理を42°Cで行った。5.各処理の殺細胞効果はコロニー形成法により解析した。6.細胞死型の解析は、蛍光色素acridine orange/ethidium bromide二重染色蛍光顕微鏡観察法により行った。7.Hsp72の蓄積動態の解析は、抗Hsp72抗体を用いたWestern blotting法により行った。【結果と考察】1.この細胞の42°C単独加温におけるLD50は2時間であり、4時間以降に温熱耐性の誘導が認められた。この濃度のMMC単独処理ではほとんど殺細胞効果を示さなかった。また42°C加温とMMCとの併用処理では、殺細胞効果の増強がほとんど認められず、温熱耐性誘導の抑制も示されなかった。2.42°C加温単独およびMMCとの併用処理において、apoptosisの誘導はほとんど認められなかったが、顕著なnecrosisの誘導が認められた。42°C加温によるnecrosis誘導は、MMCの同時併用処理により増強されなかった。3.42°C加温によるHsp72の蓄積誘導はMMCの同時併用により抑制されなかった。今後、Hep3B細胞に正常型あるいは変異型p53遺伝子を導入し、MMCによる温熱増感効果のmechanismについて検討する。【目的】固形癌に対する化学療法単独の抗腫瘍効果は低いことから、従来より副作用を最小限にさせるために、集学的癌治療の一様式として制癌剤と温熱療法との併用(温熱化学療法)が広く用いられている。近年癌抑制遺伝子p53変異の有無と癌細胞の放射線感受性、制癌剤感受性あるいは温熱感受性との関連性について様々な報告がされている。本研究は温熱化学療法における制癌剤と温熱との相互作用とp53遺伝子型との関連性を解析し、温熱化学療法のメカニズムを明らかにすることを目的とした。【材料と方法】1.細胞:ヒトp53欠損肺癌H1299細胞に、正常型p53発現ベクターを導入したH1299/wtp53細胞、変異型p53発現ベクターを導入したH1299/mp53細胞及び対照としてベクターのみを導入したH1299/neo細胞を用いた。2.温熱化学増感効果の解析:制癌剤としてマイトマイシンC(MMC)を用いた。MMC単独処理、42°C温熱単独処理とそれらの同時併用処理を種々の処理時間で行って、コロニー形成実験より温熱化学増感効果を解析した。3.温熱化学増感効果のメカニズムの解析:メカニズムの解明をアポトーシス誘導頻度の評価(蛍光色素染色法)、細胞周期位相応答の変化(フローサイトメトリ)及びHsp72の細胞内蓄積動態(Western blot法)より行った。【結果と考察】1.ヒトp53欠損肺癌H1299細胞に、正常型p53発現ベクターを導入したH1299/wtp53細胞、変異型p53発現ベクターを導入したH1299/mp53細胞及び対照としてベクターのみを導入したH1299/neo細胞を用いて、42°C加温とMMCとの併用処理により、いずれの細胞においても顕著な増感効果が認められることから、その温熱化学増感効果は癌抑制遺伝子p53非依存的に誘発されることが示された。2.その温熱化学増感にアポトーシス誘導の促進及び細胞周期位相応答の調節が寄与していることが示唆された。3.p53遺伝子のstatusにかかわらず、いずれの細胞のおいても温熱によるHsp72の蓄積誘導はMMCの併用により抑制されなかった。

2.温熱単独処理は、フラスコを42°Cに設定した恒温槽に浸漬して行った。3.MMC単独処理は、最終濃度0.05μg/mlのMMCを培養液に添加し、37°Cで処理した。4.併用処理は、上記MMC処理を42°Cで行った。5.各処理の殺細胞効果はコロニー形成法により解析した。6.細胞死型の解析は、蛍光色素acridine orange/ethidium bromide二重染色蛍光顕微鏡観察法により行った。7.Hsp72の蓄積動態の解析は、抗Hsp72抗体を用いたWestern blotting法により行った。【結果と考察】1.この細胞の42°C単独加温におけるLD50は2時間であり、4時間以降に温熱耐性の誘導が認められた。この濃度のMMC単独処理ではほとんど殺細胞効果を示さなかった。また42°C加温とMMCとの併用処理では、殺細胞効果の増強がほとんど認められず、温熱耐性誘導の抑制も示されなかった。2.42°C加温単独およびMMCとの併用処理において、apoptosisの誘導はほとんど認められなかったが、顕著なnecrosisの誘導が認められた。42°C加温によるnecrosis誘導は、MMCの同時併用処理により増強されなかった。3.42°C加温によるHsp72の蓄積誘導はMMCの同時併用により抑制されなかった。今後、Hep3B細胞に正常型あるいは変異型p53遺伝子を導入し、MMCによる温熱増感効果のmechanismについて検討する。
p53によるアミノ酸代謝制御機構の解析

本研究で、我々はp53がアルギニノコハク酸合成酵素ASS1の発現制御を介して、アミノ酸の1つであるアルギニンの生合成経路を制御していることを見出しました。さらにp53によるASS1の発現制御は、がん遺伝子産物であるAktの活性レベルのコントロールに重要な役割を担っていることを明らかにしました。またがん細胞内のアルギニン生合成経路を制御することで、既存の抗がん剤の効果が増強される事が示されました。本研究はp53による代謝制御メカニズムの一端を紐解いたもので、がん細胞内の栄養状態の理解や有効ながん治療法の開発に向けた重要な一歩であると考えられています。1979年に発見されて以来、がん抑制遺伝子産物p53によって制御されている遺伝子ネットワークは複雑化の一途をたどっている。これは同時に、未だ多くのp53標的遺伝子が明らかにされていないことも意味している。そこで我々はp53の標的遺伝子を包括的に同定するために、がん細胞株を用いたIntegrated-multi OMICS analysis (transcriptome analysisとproteome analysisによる網羅的なp53標的遺伝子の探索)を行い、それぞれの解析で数十種類の新規p53標的遺伝子候補を同定した。現在、その中の一つであるArgininosuccinate synthase (ASS1)に着目し、解析を行っている。ASS1はアルギニン生合成経路における律速酵素である。我々はストレス存在下においてp53がASS1の発現誘導を介してアルギニン代謝を変化させることを見出した。さらにCRISPR-Cas9systemによってASS1 knockout cellsを樹立したところ、ストレス存在下においてASS1 knockout cellsではAktのリン酸化が有意に亢進することがわかった。我々はAktのリン酸化レベルがアルギニン欠乏条件下で亢進することを見出しており、ASS1 knockout cellsではストレス存在下に必要なアルギニンを合成できないために、このようなAktの活性化が起こっていると推測している。またASS1 knockout cellsはそのようなストレス存在下において細胞死が誘導されやすくなっていること、そしてこの細胞死の亢進はAktの活性化が一部要因となっていることを見出した。以上のことからp53はASS1の発現誘導を介してアルギニン代謝を制御することで、Aktの活性レベルをコントロールしていると考えられる。現段階でp53-ASS1経路の生理的意義の解明はin vitroの実験系ではほぼ終了している。具体的には、intergrated multi-OMICS analysisによって見出したASS1がp53によって直接的に発現誘導されていることを確認した。次にp53によるASS1の発現誘導の生理的意義を明らかにするためにCRISPR-Cas9 systemによってASS1 KO cellsを樹立した。その後、細胞内におけるアルギニン合成経路の活性レベルを測定したところ、p53によってASS1の発現が誘導されると、細胞内でのアルギニン合成経路が亢進することを見出した。アルギニン合成を促進する理由として、我々はAktの活性レベルの制御を見出した。実際細胞内でのAktの活性レベルはアルギニンレベルの低下によって増加するが、p53が活性化するような条件下ではASS1 KO cellsにおいてAktの活性レベルが著しく高くなっていた。またこのような条件下では細胞死が誘導されやすいことがわかった。以上のことからp53はASS1の発現誘導を介して細胞内のアルギニンレベルを増加させ、Aktの活性レベルの制御に関与していることがわかった。このようにp53-ASS1 pathwayの解明がおおよそ1年でここまで進んだことから、おおむね順調に研究は進展していると考えている。1979年に発見された転写因子p53は、最も高頻度に変異が見られるがん抑制遺伝子である。近年、アミノ酸などの代謝制御がp53によるがん抑制システムにおいて重要な役割を担っていることが明らかにされつつある。しかしp53による代謝制御メカニズムの全容は明らかにされていない。申請者らはp53による代謝制御メカニズムを解明することを目的として、transcriptomeおよびproteome解析を行い、p53によって制御される新規代謝関連遺伝子の同定を試みた。その結果、アルギニン合成経路の律速酵素であるArgininosuccinate synthase 1 (ASS1)がp53によって直接制御されていることを見出した。申請者らはp53-ASS1経路はgenotoxic stress存在下においてアルギニン合成を促進するために必要であり、この経路が抑制されるとgenotoxic stressに対する感受性が高くなることを細胞およびマウスの実験で明らかにした。この感受性の増加はアルギニン不足に起因するものであり、細胞外からのアルギニン供給と細胞内でのアルギニン合成能を独立したinputとして定義した場合、genotoxic stressに対する感受性は否定論理積(NAND gate)で表されることも明らかにしている。さらに申請者らはAktの活性レベルがアルギニン欠乏下で著しく上がること、さらにその活性レベルはASS1欠損細胞において相乗的に増加することから、p53によるASS1の発現誘導はAktの活性レベルを抑制するために重要であることを明らかにした。p53はこれまでにPTENやPHLDA3の発現誘導を介してAktの活性に対して抑制的に働くことが知られているが、今回申請者らはこれに加えASS1が三本目の矢としてAktの抑制に働くことを明らかにした。以上の結果から、本研究ではアルギニン代謝がp53によるがん抑制メカニズムにおいて重要である可能性を示唆している。

本研究で、我々はp53がアルギニノコハク酸合成酵素ASS1の発現制御を介して、アミノ酸の1つであるアルギニンの生合成経路を制御していることを見出しました。さらにp53によるASS1の発現制御は、がん遺伝子産物であるAktの活性レベルのコントロールに重要な役割を担っていることを明らかにしました。またがん細胞内のアルギニン生合成経路を制御することで、既存の抗がん剤の効果が増強される事が示されました。本研究はp53による代謝制御メカニズムの一端を紐解いたもので、がん細胞内の栄養状態の理解や有効ながん治療法の開発に向けた重要な一歩であると考えられています。今後はASS1+/-マウスを用いて、in vitroで観察された現象がin vivoでも観察されるかどうかを検討する。すでにASS1ヘテロマウスと野生型のマウスではX線照射後のサバイバルに差がでる傾向を見出している(ヘテロの方が生存率が低い)。またASS1野生型マウスの食事からアルギニンを抜くと、X線照射後の生存率が低下することを見出した。これらの結果はアルギニンがX線照射後の生存率に大きく影響を与えていることを示唆している。今後その確認および原因の究明を行う予定である。具体的には血中アミノ酸濃度を測定し、アルギニンなどのアミノ酸プロファイルがどのように変化しているのかを明らかにする。さらにX線照射後、各臓器におけるASS1の発現レベルを検討したり、組織学的にASS1ヘテロマウスと野生型のマウスで変化があるかどうかを観察する。分子生物学