hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
永久歯萌出に関わる歯導帯・歯小嚢相互作用と歯胚萌出異常に伴う歯根吸収機構の解明

本研究では、ヒトの前歯交換期の病理的状況の解明につながる生理的な永久歯萌出機構を明らかにすることを目的として、各発育段階におけるウシの乳歯・後継永久歯に関する各種形態学的検討を行った。その結果、代生歯永久歯歯胚による先行乳歯並びに隣接乳歯歯根の吸収が認められ、先行乳歯歯根の歯槽骨ソケットと代生永久歯歯胚を包む歯槽骨空間が連なった歯導帯と考えられる歯槽骨中の構造が観察された。また、先行乳歯歯根の吸収量、歯槽骨との結合、代生永久歯歯根形成量と歯の動揺度に相関が認められた。ヒトの前歯交換期の病理的状況の解明につながる生理的な永久歯萌出機構が明らかとなった。生理的な永久歯萌出機構を明らかにすることを目的とし、代生歯萌出時における歯導帯周囲の硬組織構造の解析、および歯導帯周囲の細胞や歯小嚢細胞、乳歯歯根膜細胞に発現する因子を解析するために必要な文献検索ならびに実験モデルの構築を終え、本実験を継続している。家兎の実験モデルでは今のところ明確な歯導帯が認められておらず、新たな実験モデル構築と並行して、検索を続けている。また、歯の形成ならびに萌出に伴う上皮間葉相互作用を検討するため、in vitroでのウシ歯小嚢組織と歯根膜細胞または上皮系細胞との象牙片上での共存培養系を継続して活用している。さらに代生歯萌出異常機構を検討するため、in vivoでの先行乳歯抜歯系、歯導帯破壊系、歯胚圧迫系の実験を継続して行っている。関連研究の論文報告としては、新たに設計した矯正歯科用オンプラントのバイオインテグレーション(生物学的骨結合)のための外科的埋入方法の開発について共同執筆し、学術雑誌に掲載された。本手技は、埋伏歯の開窓・牽引の際の矯正歯科治療にも有用になる可能性がある。また、咬合機能低下ラットの歯周組織の萎縮とVEGF/VEGFレセプターによる歯の移動の抑制に関する論文が掲載され、咬合機能低下歯の移動の際にVEGF/VEGFレセプターにより歯の移動が抑制することを初めて明らかにした。さらに、軟食飼育のラット海綿骨に及ぼす影響に関する論文が受理され、上顎骨に比べ下顎骨内部の海綿骨により大きな形態変化が生じることを明らかにした。本学動物実験センターが昨年7月より1年間程度の改修工事のため遅れている¥家兎の実験モデルでは今のところ明確な歯導帯が認められておらず、新たな実験モデル構築と並行して、検索を続けている。関連研究の論文報告としては、昨年度新たに設計した矯正歯科用オンプラントのバイオインテグレーション(生物学的骨結合)のための外科的埋入方法の開発について共同執筆し、学術雑誌に掲載された。生理的な永久歯萌出機構の検討するため、代生歯萌出時における歯導帯周囲の硬組織構造の解析、および歯導帯周囲の細胞や歯小嚢細胞、乳歯歯根膜細胞に発現する因子の解析するため、必要な文献検索ならびに実験モデルの構築を開始した。家兎の実験モデルでは今のところ明確な歯導帯が認められておらず、新たな実験モデル検索と並行して、検索を続けている。また、歯の形成ならびに萌出に伴う上皮間葉相互作用を検討するため、in vitroでのウシ歯小嚢組織と歯根膜細胞または上皮系細胞との象牙片上での共存培養系の開発に着手した。

さらに代生歯萌出異常機構を検討するため、in vivoでの先行乳歯抜歯実験系、歯導帯破壊実験系、歯胚圧迫実験系の開発を開始した。関連研究の論文報告としては、新たに設計した矯正歯科用オンプラントのバイオインテグレーション(生物学的骨結合)のための外科的埋入方法の開発について共同執筆し、投稿・修正・校正等を行った。2012年度中に学術雑誌に掲載される予定である。本手技は、埋伏歯の矯正治療にも有用になる可能性がある。また、咬合機能低下ラットで生じる歯槽骨減少に対する交感神経活動の影響に関する論文が掲載され、咬合機能低下の際の歯槽骨減少に対して交感神経活動が影響することを初めて明らかにした。さらに、成長期ラット下顎骨の間歇的後方位が下顎頭海綿骨に及ぼす影響に関する論文が掲載され、成長期下顎骨の間歇的後方位により下顎頭内部の海綿骨にも形態変化が生じること明らかにした。ラットの片側臼歯抜歯とエストロゲン欠乏によって引き起こされる歯槽骨の微細構造の変化に関する論文が掲載され、閉経後の咬合機能低下が歯槽骨微細構造に変化を起こす可能性が示唆された。ヒトの前歯交換期には、永久歯歯根吸収などの病理的問題が生じることがあるが、生理的な交換についても、永久歯歯胚と隣在歯歯根との3次元的大きさや位置関係の違いによる周囲への影響の相違について十分明らかにされているとはいえない。一方、正常な被験者では、倫理的な観点から被爆や組織採取を伴う研究を広範に行うことは難しい。そこで本研究では、各発育段階におけるウシの乳歯・後継永久歯・歯小嚢の大きさと乳歯歯根吸収の状況や永久歯萌出に伴うディスクレパンシー・動揺度等の状況を各種形態計測法等を用いて明らかにし、ヒトの前歯交換期の病理的状況の解明につながる生理的な永久歯萌出機構を明らかにすることを目的とする。月齢24-29月前後のウシ下顎前歯部の簡易規格X線写真撮影、写真撮影、CBCT撮影を行った。乳歯・永久歯の歯冠幅径、歯冠長、歯根長(吸収・形成程度の分類)、歯小嚢の幅径・長径・厚径、乳歯の動揺度の分類、ディスクレパンシーの計測、歯槽基底部の厚径、下顎骨体長等を実測もしくはX線写真、3次元画像解析ソフト等を用いて計測した。さらには乳歯抜歯を行い、乳歯歯根吸収部位・永久歯歯小嚢の形態・色彩・活性度等を記録・分類し、統計学的解析を行った。代生歯永久歯歯胚による先行乳歯並びに隣接乳歯歯根の吸収は認められたものの、隣接永久歯の吸収は認められなかった。3次元画像解析ソフトでは、先行乳歯歯根の歯槽骨ソケットと代生永久歯歯胚を包む歯槽骨空間が連なった歯導帯と考えられる歯槽骨中の構造が観察された。先行乳歯歯根の吸収量、歯槽骨との結合、代生永久歯歯根形成量と歯の動揺度に相関が認められた。歯科矯正学家兎における生理的な永久歯萌出機構の一部の検討で想定外の結果が生じたため、若干の遅延が生じたが、その他の生理的な永久歯萌出機構の検討、共存培養実験系での検討、代生歯萌出異常機構の検討では概ね順調に進行している。本学の動物実験センターが7月より1年間程度の改修工事で使えなくなるという、研究開始当初では想定できなかった状況による研究活動遅延が生じた。概ね順調に開始したが、海外での成果発表が行えなかった。また、想定外の結果や研究協力者の辞退が生じたため、若干の遅延が生じた。次年度に使用する助成金は、関連研究の国内発表を行ったが、旅費の請求手続きをできなかったこと、海外発表を行えなかったこと、想定外の状況による研究活動遅延のためなどで生じた。今年度は、当該研究費と次年度に請求する研究費により、次の検討を行う方策である。生理的な永久歯萌出機構を検討するため、代生歯萌出時における歯導帯周囲の硬組織構造の解析を継続する。
超音波画像を用いた伸張反射感受性の計測

伸張反射は,筋長センサ(筋紡錘)が伸張されるとそのインパルスが脊髄へ伝達され,無意識に筋収縮を生じるという定型的な応答を呈する.ところが,異なる筋間でこれらの伸張反射応答を比較する場合,たとえ同じ関節に同じ機能を有する筋でも,起始-停止位置が異なり,すなわち関節角度変化あたりの筋長(筋紡錘長)変化が異なり,単純に反射応答の大きさを比較できない.さらに,筋線維は筋の起始-停止方向に平行に収縮するのではなく,様々な形状で腱に筋収縮力を伝達している.したがって,その筋線維とほぼ同様に機能する筋紡錘の長さ変化は,たとえ同じ関節角度変化であっても与えられる刺激強度が筋によって異なるので,骨格筋間において伸張反射応答を直接比較することは困難である.そこで,本研究の目的は,筋線維長変化を非侵襲でin vivoに超音波画像を用いて解析し,伸張反射感受性の計測方法を確立するとともに,適切な伸張反射感受性計測システムを構築することである.平成14年度文部科学省研究設備整備費補助金申請で超音波画像診断装置が導入できたので,格段に超音波画像の解像度や画像取得サンプリングレートが130Hzに向上した.この装置を用いて,静的および動的な筋線維長変化を計測できる計測支援ソフトウェアを開発できた.その結果,二次元超音波画像から数十本の筋線維を自動的に同定し,動的に自動追尾することが可能となった.新たなアクチュエータとして,空圧モータの導入を計画したが,ダイレクトドライブ(DD)モータに比べて大きな角速度および角加速度を得ることができたが,速度制御が困難であることから,当初の通りDDモータを用いてシステム構築を行った.足関節,肘関節,手指関節用の反射誘発装置を開発することができ,上記の超音波画像計測支援ソフトウェアを用いて,伸張反射と筋線維動態の同時計測を可能にする伸張反射感受性計測システムを構築することができた.本研究の目的は,1)超音波画像を用いた伸張反射感受性の計測方法の確立,2)伸張反射刺激システムの構築である.目的別に研究実績について報告する.1.超音波画像を用いた伸張反射感受性の計測方法の確立申請者の研究グループで申請していた平成14年度文部科学省研究設備整備費補助金申請で,超音波画像診断装置が導入できたので,格段に超音波画像の解像度や画像取得サンプリングレートが向上した.平成14年度は,静的および動的な筋線維長変化を計測できる計測支援ソフトウェアの開発を行った.静的計測では,一つの筋全体の筋線維を同定することが目的であり,数十枚の超音波画像を張り合わせ,筋全体の画像を構築し,同定できる筋線維を自動計測できるソフトウェアの開発を行った.その結果,1つの筋全体の二次元超音波画像から35本以上の筋線維を自動的に同定することができた.今後はさらに多くの筋線維を自動抽出できるように改善する予定である.また,動的計測では,数本の筋線維を筋伸張時に自動追跡する支援ソフトを開発した.いくらか問題点があるものの,5本程度は自動追跡することができ,100deg/s程度の関節角速度にも対応可能であった.現在の超音波装置では,サンプリングレートが60Hzに制限されているが,平成15年5月には120Hz以上が可能となるので,実際に伸張刺激に近い角速度で実験可能となる予定である.2.伸張刺激システムの構築これまでのアクチュエータ(DDモータ)に問題があったため,新たなアクチュエータの選定を行った.その結果,空圧モータを用いた肘関節屈伸用試作機を開発した.DDモータに比べて大きな角速度および角加速度を得ることができたが,反応が遅く,動き出すまでに時間を要する点が問題となった.今後はこの空圧モータによる刺激装置の制御システムの改善と足関節や手関節などへの汎用デバイスを開発する.伸張反射は,筋長センサ(筋紡錘)が伸張されるとそのインパルスが脊髄へ伝達され,無意識に筋収縮を生じるという定型的な応答を呈する.ところが,異なる筋間でこれらの伸張反射応答を比較する場合,たとえ同じ関節に同じ機能を有する筋でも,起始-停止位置が異なり,すなわち関節角度変化あたりの筋長(筋紡錘長)変化が異なり,単純に反射応答の大きさを比較できない.さらに,筋線維は筋の起始-停止方向に平行に収縮するのではなく,様々な形状で腱に筋収縮力を伝達している.したがって,その筋線維とほぼ同様に機能する筋紡錘の長さ変化は,たとえ同じ関節角度変化であっても与えられる刺激強度が筋によって異なるので,骨格筋間において伸張反射応答を直接比較することは困難である.そこで,本研究の目的は,筋線維長変化を非侵襲でin vivoに超音波画像を用いて解析し,伸張反射感受性の計測方法を確立するとともに,適切な伸張反射感受性計測システムを構築することである.平成14年度文部科学省研究設備整備費補助金申請で超音波画像診断装置が導入できたので,格段に超音波画像の解像度や画像取得サンプリングレートが130Hzに向上した.この装置を用いて,静的および動的な筋線維長変化を計測できる計測支援ソフトウェアを開発できた.その結果,二次元超音波画像から数十本の筋線維を自動的に同定し,動的に自動追尾することが可能となった.新たなアクチュエータとして,空圧モータの導入を計画したが,ダイレクトドライブ(DD)モータに比べて大きな角速度および角加速度を得ることができたが,速度制御が困難であることから,当初の通りDDモータを用いてシステム構築を行った.

足関節,肘関節,手指関節用の反射誘発装置を開発することができ,上記の超音波画像計測支援ソフトウェアを用いて,伸張反射と筋線維動態の同時計測を可能にする伸張反射感受性計測システムを構築することができた.
近赤外分光法による急性低圧低酸素環境下の運動時局所筋酸素動態と高所身体適性

本研究では、まず、低圧低酸素研究の歴史的背景について(1)外国、および(2)日本についての文献的研究を行い、その歴史的背景について検討を行った。さらに、本研究の目的である急性低圧低酸素環境下における安静時および最大運動時の筋酸素動態を近赤外分光法を用いて明らかにすると共に、高所身体適性との関連性を検討するために以下の個別研究を行った。個別研究の実験Iとして、まず、常圧下における最大運動時筋内酸素動態の検討を行うために日常的に運動を行っている者7人(鍛錬者群)と日常的に運動を行っていない者7人(非鍛錬者)にランプ負荷による最大運動を行わせ、その時の筋内酸素動態を近赤外分光法により測定を行った。さらに個別研究実験IIとして、急性低圧低酸素環境下における最大運動時筋内酸素動態の検討のために被検者6人について常圧下、2000mおよび4000m相当高度の3高度条件で最大運動を行わせ、運動時筋組織酸素動態を近赤外分光法により検討を行うと共に高所身体パフォーマンスとの関連性について検討を行った。これらの結果より、運動時組織酸素飽和度動態は、鍛錬者群の方が非鍛錬者群よりも有意に低値を示し、鍛錬者群の高いO2 extraction能を反映していることが推察された。また、動静脈酸素較差を反映していると考えられる(SaO2-StO2)値は、常圧下の運動時では鍛錬者群の方が非鍛錬者群よりも高値を示し、組織への酸素供給が鍛錬者群で大であることが認められた。また、(SaO2-StO2)値は、4000m相当高度下の運動時では顕著な低下を示し組織への酸素供給が制限されうることを示唆された。これらの結果から、望ましい高所身体適性として、低圧低酸素環境下において高い動脈血酸素飽和度を有し、また、O2 extraction能が高く、(SaO2-StO2)値の高いことが重要な因子となることが示唆された。本研究課題である『近赤外分光法による急性低圧低酸素環境下の運動時局所筋酸素動態と高所身体適性』の遂行のため、まず、3波長2受光方式を採用している近赤外分光法による組織S02・Hb量モニター測定装置を選定・購入した。また、近赤外分光測定装置からのアナログデータ(組織酸素飽和度および総ヘモグロビン量)をデジタル変換し、パソコンに直接リアルタイムで取り込むことが可能なアナログ・デジタルデータ変換記録装置(マック・ラブ)も購入した。この装置を介して前述の2データとパルスオキシメーターによる動脈血酸素飽和度・心拍数および低圧シミュレーター装置による高度変化の計5データを連続的に記録・収集可能なシステムを構築した。ところで、低酸素環境下においては、最大酸素摂取量の大小よりも局所筋活動部位の酸素動態の方がより重要性が高いことを示唆されているが、その詳細なメカニズムについては未解明である。そこで、本研究課題の初年度に当たる本年度は、まず、一般健常成人男性5人における常圧下の安静時及び運動時局所筋酸素動態について検討を行った。また、一流登山家2人については、急性低圧低酸素環境下(3500m6000m相当高度)における安静および運動時局所筋酸素動態について検討を行った。また、全員について漸増負荷法により安静時から最大運動時までの酸素摂取量および外側広筋上に装着した近赤外分光測定装置のセンサーから得られる組織血液酸素飽和度、総ヘモグロビン量、動脈血酸素飽和度も連続記録した。

以上の実験結果から、常圧下および急性低圧低酸素環境下における局所筋活動部位の酸素動態には、個人差が大きいことが認められた。また、急性低圧低酸素環境下における局所筋酸素動態は、高度の上昇に伴う組織酸素飽和度の低下が大であり、さらに、組織酸素飽和度と動脈血酸素飽和度の低下度が高所身体適性と関連性のあることが示唆された。本研究課題である『近赤外分光法による急性低圧低酸素環境下の運動時局所筋酸素動態と高所身体適性』の遂行のため、本年度は、まず実験1として、鍛錬度の違いが運動時局所筋酸素動態に及ぼす影響を検討した。一般健常男子7人および鍛錬者7人を用い、常圧下において漸増負荷法により安静時から最大運動時までの酸素摂取量および外側広筋上に装着した近赤外分光測定装置のセンサーから得られる組織血液酸素飽和度、総ヘモグロビン量、動脈血酸素飽和度も連続記録し、その時の局所筋酸素動態を比較検討した。また、併せて、運動の2分ごとに血中乳酸を測定し、局所筋酸素動態との関連性についても検討を加えた。さらに、実験2として、一般健常男子5人を用いて、常圧下、2000mおよび4000m相当高度下の急性低圧低酸素環境下において実験1と同様に最大運動を行わせ、その時の局所筋酸素動態に関する測定を行い、高度の影響を比較検討した。実験1の結果から、鍛錬群では局所筋酸素飽和度が非鍛錬群よりも有意に低く、また、(酸素飽和度-筋酸素胞和度)が有意に高いことから、鍛錬者群の方がより筋内の酸素の抜き取りが高いものと推察され、このことが同一運動負荷時における血中乳酸の低値と関連しているものと考えられた。また、実験2の結果から、低酸素環境下における局所筋酸素動態は、酸素分圧の低下に応じて組織酸素飽和度も低下すること、血中乳酸蓄積開始点も高度の上昇に伴い短縮し、運動時血中乳酸動態も酸素分圧の低下に依存していることが認められた。以上の結果から、急性低圧低酸素環境下における局所筋酸素動態は、高度の上昇に伴う組織酸素飽和度の低下が大であり、さらに、組織酸素飽和度と動脈血酸素飽和度の低下度が高所身体適性と関連性のあることが示唆された。本研究課題である『近赤外分光法による急性低圧低酸素環境下の運動時局所筋酸素動態と高所身体適性』の遂行のため、一般健常男子学生8人を被検者として常圧下(760mmHg)および4000m(462mmHg)相当高度下において、漸増負荷法を用い最大運動負荷テストを行った。安静時から最大運動時まで、酸素摂取量および外側広筋上に装着した近赤外分光測定装置のセンサーから得られる組織血液酸素飽和度、総ヘモグロビン量、動脈血酸素飽和度を連続記録し、その時の局所筋酸素動態を比較検討した。また、併せて、運動の2分ごとに血中乳酸および運動開始前および終了直後に血液ガス関連項目についても測定し、局所筋酸素動態との関連性についても検討を加えた。これらの結果、動脈血酸素飽和度は常圧下安静時の平均約98%から4000m相当高度下安静時では平均76%と、約22%の低下を示した。4000m相当高度下では運動強度の上昇に伴いさらに低下した。4000m相当高度下における筋組織酸素飽和度は常圧下に比し低値を示し、運動強度の上昇に伴い漸減する傾向が認められた。また、動静脈酸素較差を示すと考えられる(酸素飽和度-筋酸素飽和度)は有意に低圧低酸素環境下で低く筋組織への酸素の取り込み能の低下を示唆しているものと推察された。また、4000m相当高度下における安静時および運動時の血液酸性度(pH)は常圧下と比較し有意に高値を示したが、血中二酸化炭素分圧は逆に常圧下の方が高値を示した。
非癌部肝組織におけるDNAメチル化異常の網羅的解析による肝発癌予測法の開発

2018年度は、前年度に解析を行った、C型肝炎ウイルスに起因する慢性障害肝を背景に発症した肝細胞癌組織の非癌部肝組織から採取したDNAを用いて、Methylation 450-BeadChipにてCpGメチル化サイトのDNAメチル化レベルを評価し、術後5年以上無再発症例群22例と術後2年以内に多中心性再発をきたした26例肝でのCpGメチル化サイトのDNAメチル化レベルを一般化線形モデル(GLM)により比較してDNAメチル化レベルに有意差(p<0.001)を認めたCpGサイト22か所を詳細に解析した。DNAメチル化レベルに有意差を認めた22か所のCpGサイトは、クロモソーム1,2,3,5,7,8,10,11,12,14,16,19,20に存在し、このうちConsistencyが認められた10か所のうち9か所は、早期再発群で低メチル化であり、これらの中で8個の遺伝子は、クロモソーム2のTRIM54,クロモソーム6のTENM2,クロモソーム10のAPBB1IP,クロモソーム14のSNX19,クロモソーム15のCLSTN13,クロモソーム17のOAS1,クロモソーム20のIRX5,クロモソーム22のSOX12であり、このうちTRIM54は細胞臭気や分化に関与、SNX19はインスリン分泌に関与、IRX5はTGF betaの作用抑制、SOX12は肝細胞癌の悪性化に関与しており、早期再発群で低メチル化である遺伝子8個のうち4個は発がんに関連した機能を有していた。一方、Consistencyが認められた10か所のうちわずかにクロモソーム10の1か所だけが早期再発群で高メチル化であった。一方、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からの肝発がんモデルに関しては、STAMマウスと再度行ったコリン欠乏アミノ酸食モデルともに十分な炎症や線維化を作成できなかった。平成28年度は、まず外科的切除にて採取したC型肝炎ウイルスに起因する肝細胞癌症例の非癌部肝組織と肝細胞癌組織からDNAを採取し各々の組織における染色体異常、変異、を解析し、末梢血単核球のDNAを正常ゲノムとして比較した。その結果、SNP-CGH arrayでは、非癌部肝組織の染色体の異常は認められなかった。次に非癌部肝組織21サンプルを切除後2年以内に再発した群(早期再発群)と5年以上再発しなかった群(無再発群)に分け、DNAのメチル化異常をBeadChip arrayで360,343のDNAのメチル化サイトを早期再発群と無再発群で評価した。その結果、42のDNAのメチル化サイトにおいて早期再発群と無再発群肝でメチル化のレベルに違いがあった。さらに、Principal component analysisにおいて、42のメチル化サイトのうち上位25の部位において早期再発群と無再発群でメチル化レベルに有意な違いがみられた。非アルコール性脂肪性肝炎からの肝発がんモデルの作成に関しては、現在コリン欠乏アミノ酸食投与モデル哉nSREBP-1c+cyclin D1のダブルノックアウトモデルが当初予定していたほどの肝発がん作用および非癌部肝組織の炎症が乏しかったために、別の方法で作成中である。ヒト肝細胞癌切除症例の癌部、非癌部肝組織を用いた遺伝子異常、DNAメチル化異常による検討はおおよそ当初の予定通りに進行している。今後はさらに症例を追加して同様の検討を行い、DNAメチル化異常を期待しているサイトを絞り込み可能であれば肝細胞癌の多中心性再発の原因となるメチル化異常の部位を同定したい。非アルコール性脂肪性肝炎からの肝発がんモデルの作成に関しては、現在コリン欠乏アミノ酸食投与モデル哉nSREBP-1c+cyclin D1のダブルノックアウトモデルが当初予定していたほどの肝発がん作用および非癌部肝組織の炎症が乏しかったために、現在新たな方法でモデルマウスを飼育中である。平成29年度は、2008年から2012年で当院にて背景をC型肝炎として発癌し、根治的肝切除術を施行した肝細胞癌203症例から術後5年以上無再発症例群:第1セット9例、第2セット13例と術後2年以内に多中心性発生様の再発を来した症例群(早期再発群):第1セット9例、第2セット17例の非癌部肝組織からDNAを抽出後、Methylation 450-BeadChipを用いて、常染色体上に位置する約47万箇所のCpGメチル化サイトのDNAメチル化レベルを取得した。一塩基多型に関連したCpGサイトならびにデータ取得率の悪いサイトを除いた計401,282箇所について、無再発群と早期再発群のDNAメチル化レベルの差を一般化線形モデル(GLM)により検定した。その結果、二つの解析セットに共通してp<.001を示したCpGサイトを8遺伝子領域10箇所に同定した。このうち9箇所は早期再発群において低メチレーションレベルを示していた。またこれら10サイトのメチレーションレベルを用いた主成分分析により、無再発群と早期再発群を識別することが可能であった。さらに、8遺伝子には転写因子、シグナル伝達分子、細胞増殖関連分子などが含まれていた。以上から、本研究で同定した非癌部肝組織のDNAメチル化領域のメチル化レベルは肝細胞癌の根治切除後の多中心性発生を予測する有用なマーカーになり得ること、さらにその領域に位置する遺伝子群は、多中心性発生の原因となる遺伝子候補となり得ることが示唆された。

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からの肝発がんに関する検討においては、新たに肝の炎症、線維化、発癌をきたすモデルを作成中である。ヒト肝細胞癌切除例におけるDNAメチル化異常に関する検討に関しては、昨年度から症例の蓄積が新たに行われ、早期再発群で17例、無再発群で13例の症例が追加解析された。よって、ヒト肝細胞癌切除例におけるDNAメチル化異常に関する検討に関しては、おおむね当初の予定に沿って研究が行えている。一方、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からの肝発がんに関する検討では、モデルの作成に関し昨年度以来取り組んでいるがなかなか線維化の進展と肝発がん率が解析に適したモデルの作成がうまく行かず苦慮している。平成30年度も引き続きNASHモデルの作成を継続する予定である。2018年度は、前年度に解析を行った、C型肝炎ウイルスに起因する慢性障害肝を背景に発症した肝細胞癌組織の非癌部肝組織から採取したDNAを用いて、Methylation 450-BeadChipにてCpGメチル化サイトのDNAメチル化レベルを評価し、術後5年以上無再発症例群22例と術後2年以内に多中心性再発をきたした26例肝でのCpGメチル化サイトのDNAメチル化レベルを一般化線形モデル(GLM)により比較してDNAメチル化レベルに有意差(p<0.001)を認めたCpGサイト22か所を詳細に解析した。DNAメチル化レベルに有意差を認めた22か所のCpGサイトは、クロモソーム1,2,3,5,7,8,10,11,12,14,16,19,20に存在し、このうちConsistencyが認められた10か所のうち9か所は、早期再発群で低メチル化であり、これらの中で8個の遺伝子は、クロモソーム2のTRIM54,クロモソーム6のTENM2,クロモソーム10のAPBB1IP,クロモソーム14のSNX19,クロモソーム15のCLSTN13,クロモソーム17のOAS1,クロモソーム20のIRX5,クロモソーム22のSOX12であり、このうちTRIM54は細胞臭気や分化に関与、SNX19はインスリン分泌に関与、IRX5はTGF betaの作用抑制、SOX12は肝細胞癌の悪性化に関与しており、早期再発群で低メチル化である遺伝子8個のうち4個は発がんに関連した機能を有していた。一方、Consistencyが認められた10か所のうちわずかにクロモソーム10の1か所だけが早期再発群で高メチル化であった。一方、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からの肝発がんモデルに関しては、STAMマウスと再度行ったコリン欠乏アミノ酸食モデルともに十分な炎症や線維化を作成できなかった。ヒト肝細胞癌切除症例の癌部、非癌部肝組織を用いた遺伝子異常、DNAメチル化異常による検討は、今後症例を蓄積していきDNAメチル化異常をきたすサイトのうち肝細胞癌の多中心性再発に最も関連するものを同定できるよう絞り込んでいく予定である。非アルコール性脂肪性肝炎からの肝発がんモデルの作成に関しては、現在新たな方法でモデルマウスを飼育中である。ヒト肝細胞癌切除例におけるDNAメチル化異常に関する検討に関しては、平成29年度まででDNAメチル化レベルの早期再発群と無再発群間での比較に関するMethylation 450-BeadChipによる解析とその結果をもとにした一般化線形モデル(GLM)による検定は終了した。平成30年度は早期再発群と無再発群間で差を認めるDNAメチル化サイトがコードする遺伝子をより詳細に解析する予定としている。
地表地震断層の有無で震源近傍域強震動をどう評価するか？実態把握と予測の高度化

地表地震断層を伴わない地震の地震動が既往観測記録を統計解析した平均よりも有意に大きい一方で,地表地震断層を伴う場合は平均よりも有意に小さいとの既往研究がある。また,地表地震断層ごく近傍で断層変位による構造物被害が見られる場合も地震動による被害が小さい事例が散見される。本研究では,地表地震断層の有無を指標に,震源近傍の強震動を生じる断層破壊過程,観測点および被害地点の地盤条件を精査し,(1)地表地震断層ごく近傍で地震動が小さいことの検証とその要因,(2)地表地震断層を伴わない場合の地震動が大きい要因,を網羅的に分析し,得られた知見からその再現を試みる。
日本語話者のrとlの弁別能力測定方法の確立及びこれを用いた学習効果の測定

昨年度に学習実験に参加してもらった被験者に、再度rとlの聞き分けのテストを行い、学習によって得られた成果が、約一年後にどれほど保持されているかを、検証した。4名の被験者の内、1名は多少の弁別能力の低下が見られたが、学習開始前のそれよりは格段に良かった。残りの3名では学習実験終了時と同様の弁別能力が観察された。これまで弁別能力の測定には主に刺激を一つずつ呈示し、それがrかlかを答えさせる方法を用いてきたが(one-interval identification task)、3つの刺激をその中の1つが常に他の2つと異なるように呈示し、被験者に何番目の刺激が他の2つと異なるかを答えさせる方法(oddity discrimination task)を被験者に与えて見たところ、刺激の間の時間(Inter Stimulus Interval,discrimination task)を被験者に与えて見たところ、刺激の間の時間(Inter Stimulus Interval,ISI)が短いと正答率が極端に悪くなることが判明した。学習実験の結果、語頭のrとlをほぼ100%の正確さで聞き分けられるようになった被験者でも、67%の正答率にしか達しなかった。英語を母語とするコントロール群の実験にまではいたっていないので、これがタスクそのものの困難さを表すのか、それとも日本人であるがための差なのかは、現時点では明確でない。しかし日本語にある子音なら、例えば「ただた」と一息に言われても、確実に繰り返すことが可能で、従って真ん中の「だ」が他の2つの「た」と違うと報告できるであろうことを考えると、このタスクが真にメイティブスピーカーと同様のrとlを獲得したか否かを判別する道具として有効である可能性が高いと思われる。10名の英語話者による100のrと100の1の刺激を一つづつランダムに呈示し、それがrか1かを2段階の確度とともに答えるタスク(one-interval identification task with confidence ratings)を用い、信号検出理論(signal detection theory)に基づいて日本語話者のrとlの弁別能力を測る方法の妥当性・信頼性・一般性を、語頭のrとl(例right-light)及び語頭の子音結合中のrとl(例play-pray)に関しておのおの2組の刺激セット(別の話者による)を、10名づつの日本人被験者に聞かせて検証した結果、語頭のrとlに対して例外的に高い弁別能力を示した1名の被験者を除いて、信号検出理論の予想通りのデータが得られた(妥当性)。同じ刺激セットに対する2度の応答を比べても慣れによる弁別能力の向上は見られなかった。(信頼性)。しかし同一被験者の2つの刺激セットへの応答のデータを比較した結果両者には違いが見られ、一般性は無いことが判明した。すなわち10名が録音した200の刺激で得られた弁別能力の指標は、また別の10名の録音した200の刺激で得られる指標と異なる場合があった。これは刺激と観察者の強い相互干渉を示している。しかし弁別訓練の成果を測るには最後の一般性の欠如は大きな問題とならない。なぜなら真にrとlの聞き分け能力が向上したなら、どんな刺激に対しても学習の前と後で成果が表れるはずだからである。これまで用いられてきた正答率は応答のバイアスと弁別能力とを個別に測れない欠点を持っていたが、今回のタスクを用いて学習の成果を測るパイロット研究(被験者2名)では、学習によって弁別能力が向上することが明らかになった。当初は合成音も使用して学習効果を測定する予定だったが、これでは簡単すぎてシーリングエフェクトがでそうなので、英語話者が実際に発話した刺激のみを使い、長期(15回)にわたるrとlの聞き分け訓練が、2つの子音の弁別能力をどのように向上させるかを、信号検出モデルに基づいた指標を用いて検証した。全部で8名の被験者に実験を行ない、始めの4人のデータは、電子情報通信学会にて発表した。rとlの弁別能力は大部分の被験者で訓練による上昇が認められたが、その程度には個人差があった。応答のバイアスについても同様のことが言え、訓練を終えてもrにバイアスがかかる者と、lにバイアスがかかる者とに別れた。しかし長期の訓練を経ても、全ての被験者にとって、rなのに100%lのように全く逆の音と信じて疑わない刺激が存在することが判明した。英語話者が物理的ノイズの存在する状況のもとでrとlを聞き分けているのと同じような困難を、日本語話者が覚えているとするなら、このように常に逆の音と判断される刺激は存在しないはずである。このことは、長期の訓練を経た後も、日本語話者のrとlの聞き分けのメカニズムが、英語話者のそれと本質的に異なっている可能性を示唆している。

これまで弁別能力の測定には主に刺激を一つずつ呈示し、それがrかlかを答えさせる方法を用いてきたが(one-interval identification task)、3つの刺激をその中の1つが常に他の2つと異なるように呈示し、被験者に何番目の刺激が他の2つと異なるかを答えさせる方法(oddity discrimination task)を被験者に与えて見たところ、刺激の間の時間(Inter Stimulus Interval,discrimination task)を被験者に与えて見たところ、刺激の間の時間(Inter Stimulus Interval,ISI)が短いと正答率が極端に悪くなることが判明した。学習実験の結果、語頭のrとlをほぼ100%の正確さで聞き分けられるようになった被験者でも、67%の正答率にしか達しなかった。英語を母語とするコントロール群の実験にまではいたっていないので、これがタスクそのものの困難さを表すのか、それとも日本人であるがための差なのかは、現時点では明確でない。しかし日本語にある子音なら、例えば「ただた」と一息に言われても、確実に繰り返すことが可能で、従って真ん中の「だ」が他の2つの「た」と違うと報告できるであろうことを考えると、このタスクが真にメイティブスピーカーと同様のrとlを獲得したか否かを判別する道具として有効である可能性が高いと思われる。
新規ケージドNO化合物等の反応性拡張と生体応用

一酸化窒素(NO)は重要な生体因子であるが、反応性が比較的高く且つ常温常圧でガス状という扱いにくい性質を有する。近年、この様な短寿命ガス状低分子化合物のいくつかが重要な生理・薬理作用を有することが報告され、「ガス状メディエーター」として注目を集めている。これらは安定性・安全性から試薬として保管したり直接投与したりすることが難しい。そのため系中で目的のメディエーターを発生する「供与化合物」が開発され、現在ガス状メディエーター研究では供与化合物が不可欠となっている。我々はケージドガス状メディエーターの有用性に着目し、いくつかの化合物を世界に先駆けて開発してきた。本研究では、これまでの我々の成果に基づき、in vivo応用に適したNO、H2Sのケージド化合物を開発することを目的とした。近赤外ケージド化合物を中心的に開発した。これまでに開発したN-ニトロアミノフェノール型ケージドNOの色素をローダミンに置換した化合物NO-Rosa5を開発し、黄緑色光の照射により効率的にNOを放出することを見出した。さらに、フェノール部にα-グルコースを導入しα-グルコシダーゼ存在下に光照射することで初めてNO放出が起こる仕組みを開発した。NO-Rosa5は培養細胞系にも適用可能であり、ラット大動脈切片を用いたマグヌス試験において光依存的な血管弛緩応答を誘導した。また、これまで開発したN-ニトロソアミノフェノール型ケージドNOをポリマー製ナノ粒子に封入し、ケージドNOのナノ粒子化に成功した。さらに、イリジウム錯体とN-ニトロソアミノフェノール誘導体を封入し、イリジウム錯体を励起することでNO放出を示す新しい仕組みのケージドNOナノ粒子を開発した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。一酸化窒素(NO)、硫化水素(H2S)などガス状メディエーターは重要な生理活性分子として注目されているが、化学的に不安定であり取扱いが難しい。我々はこれら短寿命生理活性分子のケージド化合物の開発を進め、これまでに複数のケージド化合物開発とex vivo系への応用に成功した。本研究では、この成果に基づき、生体深部での利用を想定した超音波ケージド化合物、放射線治療の増感作用を想定したX線ケージド化合物開発に着手し、総合的に開発を進めることとした。これらの化合物開発と応用を行うことで、疾患の原因解明に貢献できるようになるとともに光線力学療法・超音波力学療法の新たな領域が開拓できると考えられる。本年度は、これまでに開発したケージドNOであるBhc-DNBおよびNOBL-1を基に、より長波長の光で制御可能なケージドNO化合物の開発を目指して研究を行った。その結果、NOBL-1のBODIPY構造部を、より長波長吸収色素であるロサミン骨格に置換することで黄緑色光(560 nm付近)の光を照射することでNO放出を起こす新たなケージドNO化合物NO-Rosaの開発に成功した。NO-Rosaは培養細胞系で黄緑色光照射依存的にNO放出を起こすことが確認され、またラット大動脈切片を用いたマグヌス試験において黄緑色光依存的に血管弛緩応答を誘導できることが示された。また、本年度はすでに開発済みのNOBL-1を用いて、ポリマーナノ粒子形成の検討を行った。PVKポリマーおよびPEGポリマーを用いて、拡散法によりNOBL-1とともにIr錯体含有ポリマーナノ粒子形成を行ったところ、NOBL-1を内包したIr錯体含有ポリマードット作成に成功し、ナノ粒子封入型ケージドNO開発の基礎的知見が得られた。本年度は、既開発のケージドNOであるBhc-DNBおよびNOBL-1を基に、より長波長の光で制御可能なケージドNO化合物の開発を目指して研究を行った。NO-Rosaは培養細胞系で黄緑色光照射依存的にNO放出を起こすことが確認され、またラット大動脈切片を用いたマグヌス試験において黄緑色光依存的に血管弛緩応答を誘導できることが示され、生物実験系への応用可能な新規化合物の取得に成功し、また目標である近赤外線吸収化合物への展開の基礎データも得られたため、順調な進展であるといえる。また、開発済みのNOBL-1を用いて、Ir錯体含有ポリマーナノ粒子形成の検討を行いNOBL-1を内包したIr錯体含有ポリマードット作成に成功し、ナノ粒子封入型ケージドNO開発の基礎的知見が得られたことも、順調な進展がみられたといえる。一酸化窒素(NO)などガス状メディエーターは重要な生理活性分子として注目されているが、化学的に不安定であり取扱いが難しい。本研究では、この成果に基づき、生体深部での利用を想定した化合物を総合的に開発することとした。これまでに開発したケージドNO化合物群であるRol-DNB、NOBL-1、NO-Rosaで得られた化学特性や光応答性などの情報を基に、近赤外光に応答してNOを放出する新たなケージドNO化合物の開発を進めた。NOBL-1の色素部分の構造は置換可能であることをNO-Rosaの開発により示した。

そこで、色素部を近赤外光を吸収する色素の1つであるSi-Rhodamineに置換した化合物を設計・合成した。その結果、630 nm付近の光照射によりNO放出を起こすNORD-1の開発に成功した。さらに、NO放出部の置換位置を検討することにより、高効率でNO放出する近赤外応答性化合物の取得に成功した。また、NOBL-1を内包したIr錯体含有ポリマードット作成を踏まえて、よりナノ粒子に包含されやすいNO放出剤として脂溶性を増加させたNOBL-2を開発し、これを用いてポリマードットを作成した。NOBL-2及びポリマーの比率を検討することにより高効率でNOBL-2を内包させることに成功した。これを用いて光照射及びX線照射によるNO放出効率の検証を行ったところ、光照射及びX線照射に応じたNO放出が見られた。しかし放出効率には改善の余地があり、封入比率などを精査する必要があることが判明した。本年度は、既開発のケージドNOであるNOBL-1及びNO-Rosaを基に、より長波長の光で制御可能なケージドNO化合物の開発を目指して研究を行った。その結果、NOBL-1のBODIPY構造部を、より近赤外吸収色素であるSi-Rhodamine骨格に置換することで近赤外光(630 nm付近)の光を照射することでNO放出を起こす新たなケージドNO化合物NORD-1の開発に成功したため、順調な進展であるといえる。また、Ir錯体含有ポリマーナノ粒子形成の検討においてより内包効率を高めるためNOBL-2を開発し内包率向上に成功しX線照射に応じたNO放出が見られたことも、順調な進展がみられたといえる。一酸化窒素(NO)は重要な生体因子であるが、反応性が比較的高く且つ常温常圧でガス状という扱いにくい性質を有する。近年、この様な短寿命ガス状低分子化合物のいくつかが重要な生理・薬理作用を有することが報告され、「ガス状メディエーター」として注目を集めている。これらは安定性・安全性から試薬として保管したり直接投与したりすることが難しい。そのため系中で目的のメディエーターを発生する「供与化合物」が開発され、現在ガス状メディエーター研究では供与化合物が不可欠となっている。我々はケージドガス状メディエーターの有用性に着目し、いくつかの化合物を世界に先駆けて開発してきた。本研究では、これまでの我々の成果に基づき、in vivo応用に適したNO、H2Sのケージド化合物を開発することを目的とした。近赤外ケージド化合物を中心的に開発した。これまでに開発したN-ニトロアミノフェノール型ケージドNOの色素をローダミンに置換した化合物NO-Rosa5を開発し、黄緑色光の照射により効率的にNOを放出することを見出した。さらに、フェノール部にα-グルコースを導入しα-グルコシダーゼ存在下に光照射することで初めてNO放出が起こる仕組みを開発した。NO-Rosa5は培養細胞系にも適用可能であり、ラット大動脈切片を用いたマグヌス試験において光依存的な血管弛緩応答を誘導した。また、これまで開発したN-ニトロソアミノフェノール型ケージドNOをポリマー製ナノ粒子に封入し、ケージドNOのナノ粒子化に成功した。
オオミノガヤドリバエの寄主利用戦略-なぜ高知でオオミノガが絶滅しないのか-

1995年頃に日本に侵入したオオミノガに特異的に寄生するオオミノガヤドリバエは日本各地でオオミノガをほとんど確認できないほどに個体群を絶滅状態に追い込んだ。高知県においてもオオミノガはかつてほど見られなくなったが,絶滅にまでは至らないまま今日に至っている。オオミノガヤドリバエの侵入から15年経過した段階で,高知県におけるオオミノガの生息状況を10年前の研究と比較し,オオミノガが絶滅しない要因を検討した。高知県高知市、南国市、室戸市で平成20年4-5月と10月及び平成21年3月にオオミノガのサンプリングを実施した。その結果いずれの地域でも、2-30個体のオオミノガのミノを採集することができた。ミノを解体して求めたオオミノガヤドリバエによる寄生率は20年4-5月と10月は約70%、21年3月は90%を越えていた。このように、高知県において、オオミノガは健在であるが、オオミノガヤドリバエによる寄生率も平成10-15年ごろとほとんど変わっていないことが明らかとなった。20年4-5月に南国市で採集した未寄生のオオミノガの飼育を試みたが、異常高温や少雨の影響で成虫の羽化時期がばらついて、交尾がうまく成立せず、室内実験用に必要な個体数を得ることができなかった。次年度は未寄生個体からの成虫雌雄の羽化時期を同調させるために、温度条件を変えた飼育の必要性があると思われた。平成20年4-5月に南国市で採集したオオミノガのミノ内にあったオオミノガヤドリバエの囲蛹から、数個体のキアシブトコバチが羽化してきた。その後オオミノガヤドリバエの未寄生囲蛹が獲られなかったので、キアシブトコバチによる寄生実験は行うことができなかったが、次年度に向けて、オオミノガだけでなく、近縁のチャミノガ(オオミノガヤドリバエは寄生しない)や、キアシブトコバチの寄主になるイエバエ、キンバエを室内増殖中であり、次年度へ向けたキアシブトコバチの寄生能力、寄主選択性を調査できる体制を整えた。平成21年度は高知県高知市、南国市、室戸市、四万十市、香美市、高岡郡大豊町の各地でオオミノガのサンプリングを実施した。その結果、大豊町以外の地域では、数個体のオオミノガのミノしか採集できなかった。それらはオオミノガヤドリバエによる被寄生個体と、未寄生個体が混在した。健全個体について、実験圃場のクヌギに放飼し、次世代を得ることを試みたが、初夏の異常な少雨乾燥のためか、成虫が全く羽化することができなかった。大豊町では平成22年3月に263個体のミノを採集することができた。ミノ内部の状態を調べたところ、健全個体39.9%、寄生バエによる被寄生個体13.3%、寄生蜂による被寄生個体4.2%、死亡個体(冬期の低温が原因と思われる)41.1%、空のミノ1.5%という結果が得られた。採集地は標高200m程度であり、これまでの高知県の平地でのオオミノガにおける寄生バエや寄生蜂による寄生率と全く異なる結果が得られたことは非常に興味深い。特にオオミノガヤドリバエによる被寄生率が低いだけでなく、ミノ一個あたりの寄生数もほとんどが1-3個体と、高知県の平地でのこれまでの調査結果より張るかに低い値であった。オオミノガが加害していた植物はウバメガシ、ツバキという常緑広葉樹であり、これらのオオミノガヤドリバエの産卵場所としての適合性について更に研究を進める予定である。また、健全なオオミノガは現在飼育継続中で、十分な個体数があるので次世代を得ることは可能と思われ、オオミノガーオオミノガヤドリバエー高次寄生蜂の三者系を確立し、22年度に向けた実験を実施する準備は整っている。2010年3月末に高知県長岡郡大豊町(標高約375m)のウバメガシ低木で採集した263個のオオミノガのミノ内の状態を同年4-5月に調べた結果、オオミノガ生存幼虫39.9%、原因不明の死亡・空のミノ42.6%、オオミノガヤドリバエによる寄生13.3%、ヒメバチ類による寄生4.2%であった。生存幼虫については研究室内で飼育を継続して成虫を羽化させた。そして人工交配により、2頭の雌から受精卵を得ることができた。6月末にそれらの卵から孵化した幼虫を高知大学農学部構内の無防除のクリの木に放飼した。その後9月5日から10月22日にかけてミノ210個を回収し内部の状態を調べた。その結果、生存幼虫9.0%、オオミノガヤドリバエによる寄生83.8%、原因不明の死亡・空のミノ7.2%であった。

オオミノガヤドリバエに寄生されていたミノ176個中46個(26.1%)において、ヤドリバエに対するキアシブトコバチの寄生が認められた。2010年度の春から初夏にかけて、上記大豊町以外に高知市内、香美市内、室戸市内においてオオミノガのミノを採集することができたが、その数は地域ごとに110個程度と少なく、まとまった数を得ることはできなかった。またこれらのミノからはオオミノガヤドリバエの羽化済みの場合とオオミノガ幼虫が生存している場合の両方が認められた。以上のように、1999年頃に高知県にオオミノガヤドリバエが侵入したと考えられているが、10年あまり経過してもオオミノガは県内に広く分布し、一時的に多発生していることが分かった。また、オオミノガヤドリバエによる寄生率は10年経過しても高い状態で維持されているが、オオミノガなぜ詰め津する傾向は認められず、そこにはキアシブトコバチを初めとするヤドリバエに寄生する土着の寄生蜂の働きが大きいと考えられた。
組織培養による歯胚の形態形成と軟骨細胞の石灰化に関する研究

(1)下顎頭軟骨細胞の形質転換に関する研究:下顎頭軟骨細胞は軟骨性骨化の間に肥大軟骨細胞になって変性に陥ることが判明しているが、肥大軟骨細胞の一部は骨髄に達して活発な骨形成に参加するという報告もあり、下顎頭軟骨細胞の運命については不明のままであった。本研究では、マウス、ウサギの下顎頭軟骨細胞を用いて、器官培養、細胞培養における軟骨細胞の骨細胞への形質転換を免疫組織化学、電子顕微鏡、遺伝子発現等の観察から検討を行った。その結果、培養軟骨細胞は形態変化に伴って、type I、type Xコラーゲン、osteocalcin、mRNAsの遺伝子発現が観察され、骨細胞へ形質転換することが確かめられた。(2)歯胚の歯根形成に関する研究:我々が考案した培養法による歯根部の三次元培養を行ない、今回はInsulin like groth factor-I (IGF-I)の作用について検討した。切片標本ではIGF-I receptorはHertwig上皮鞘の外エナメル上皮に顕著に認められた。この歯胚を上記器官培養系を用いて、IGF-I, anti IGF-I antibodyを添加して培養を行った。無添加培養群(対照群)と比較するとIGF-I添加群では有意にHertwig上皮鞘の伸長が認められ、この伸長はanti IGF-I antibody添加により抑制された。また、IGF-I添加群ではHertwig上皮鞘の外エナメル上皮のDNA合成が特異的に促進された。これらの結果から、IGF-IはHertwig上皮鞘のDNA合成に、初期歯根形成に関与していることが明らかになった(3)軟骨細胞の脂肪細胞への形質転換に関する研究:胎生期メッケル軟骨培養実験中に仔牛血清からニワトリ血清に交換すると、メッケル軟骨が高頻度で脂肪細胞に形質転換することが判明した。本年度は歯髄細胞、皮下線維芽細胞、骨原性細胞3T3-E1を使用して形質転換に関する研究を行った。その結果、細胞の由来によって多少の差異はあるが、いずれも脂肪細胞に転換することが判明した。本態は不明であるが、ニワトリ血清には間葉細胞に共通する作用因子の存在することが明らかになった。(1)メッケル軟骨の中間部組織は蝶下顎靭帯として残存することが知られている.この靭帯形成のメカニズム解明のために、メッケル軟骨の増殖、分化、石灰化に及ぼす上皮増殖因子(EGF)の効果について検討した.その結果、EGFは軟骨細胞の分化を抑制し、線維芽細胞への形質転換を促進することが判明した.この結果はメッケル軟骨の中間部組織は未石灰化のままに残存し、線維芽細胞へと形質転換して靭帯を形成する可能性を示唆している.(2)メッケル軟骨の消失のメカニズムを解明するために熱処理による細胞死誘導の実験を行った.4045°Cの準致死的温度では細胞の形態的変化もなく、むしろDNA合成は促進され、アポトーシス細胞が高頻度に出現した.5060°Cの致死的温度では細胞の形態は崩れ、高頻度に細胞死が出現するが、この細胞死はネクローシスであった.準致死的温度で出現するアポトーシスはheat-shock protein 70の出現と相関し、誘導されたアポトーシスにheat-shock proteinの関与が示唆される.

(3)メッケル軟骨細胞の脂肪細胞へめ形質転換について:実験の過程の中でメッケル軟骨をニワトリ血清で培養すると軟骨細胞が脂肪細胞に形質転換することが判明してきた.現在、このメカニズム解明に向けて研究を続行中である.(1)下顎頭軟骨細胞の形質転換に関する研究下顎頭軟骨は発生学的には二次軟骨であり、関節軟骨としては特異な組織学的構築をなしていることで知られている。下顎頭軟骨細胞は軟骨性骨化の間に肥大軟骨細胞になって変性に陥ることが判明しているが、肥大軟骨細胞の一部は骨髄に達して活発な骨形成に参加するという報告もあり、下顎頭軟骨細胞の運命については不明のままであった。本研究では、マウス、ウサギの下顎頭軟骨細胞を用いて、器官培養、細胞培養における軟骨細胞の骨細胞への形質転換を免疫組織化学、電子顕微鏡、遺伝子発現等の観察から検討を行った。その結果、培養軟骨細胞は形態変化に伴って、type I、type Xコラーゲン、osteocalcinmRNAsの遺伝子発現が観察され、骨細胞へ形質転換することが確かめられた。(2)歯胚の歯根形成に関する研究生後5日のマウスを用いて、我々が考案した培養法による歯根部の三次元培養を行ない、今回はInsulin like groth factor-I(IGF-I)の作用について検討した。切片標本ではIGF-I receptorはHertwig上皮鞘の外エナメル上皮に顕著に認められた。この歯胚を上記器官培養系を用いて、IGF-I,anti IGF-I antibodyを添加して培養を行った。無添加培養群(対照群)と比較するとIGF-I添加群では有意にHertwig上皮鞘の伸長が認められ、この伸長はanti IGF-I antibody添加により抑制された。また、IGF-I添加群ではHertwig上皮鞘の外エナメル上皮のDNA合成が特異的に促進された。これらの結果から、IGF-IはHertwig上皮鞘のDNA合成に、初期歯根形成に関与していることが明らかになった(3)軟骨細胞の脂肪細胞への形質転換に関する研究。胎生期メッケル軟骨培養実験中に仔牛血清からニワトリ血清に交換すると、メッケル軟骨が高頻度で脂肪細胞に形質転換することが判明した。本年度は歯髄細胞、皮下線維芽細胞、骨原性細胞3T3-E1を使用して形質転換に関する研究を行った。その結果、細胞の由来によって多少の差異はあるが、いずれも脂肪細胞に転換することが判明した。本態は不明であるが、ニワトリ血清には間葉細胞に共通する作用因子の存在することが明らかになった。