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多変数保型形式の算術的構造と跡公式の明示的研究

整数論において、保型形式と呼ばれる関数とそのL関数は種々の算術的性質を記述する重要な対象であり、本研究ではこれらに関し多岐にわたる成果を得た。たとえばいくつかの保型形式の構造定理や次元公式の証明を与え、それを根拠に、定義や出自が全く異なる保型形式の空間が本質的に同じ算術的構造をもつという3種類の新予想、またその一部が他のもっと易しい保型形式の空間から来るという3種類のリフティング予想等を提出した。また我々の開発した微分作用素の特殊関数論を利用し、あるL関数の特殊値を初めて明示的に計算し1976年のザギエ予想の証明や数論的応用を得た。他の新結果とも合わせ理論の総合的な発展に寄与した。研究代表者は、1.領域の制限に関してよい振る舞いをするジーゲル保型形式上の微分作用素とそれを特徴付ける球関数、球多項式の研究(D. Zagierと共同)、2.関連するホロノミー系微分方程式の研究(落合啓之、葛巻孝子と共同)、3.レベルが平方因子を持たないヘッケ型離散群に関する低いウェイトの2次ジーゲル保型形式での、佐武コンパクト化の境界への一般ジーゲルファイ作用素の全射性の証明(S. Boechererとの共同)、4. 3次元主偏極超特異アーベル多様体のモジュライの既約成分の交差の状況の4元数的エルミート群のアデール群の算術による特徴づけ(F. Oortと共同)、5.ジーゲルモジュラー群などの離散群におけるVII型などのいくっかの共役類の大域局所理論とジーゲル保型形式の跡公式への寄与の明示的計算(若槻聡と共同)、6.次数2で指数2のヤコービ形式の加群の明示的構造定理、7.指数1のときのWitt作用素の全射性、などについての部分的ないしは最終的な定理を得た。また、岩堀部分群に関するジーゲル保型形式のフーリエ係数に関する共同研究をC. Poorと開始した。これらの研究のため、延べ5回の外国訪問、9回の国内出張を通じて成果発表、研究討論などを行った。また、これまでの研究のいくつかをとりまとめ、論文投稿を行った。研究分担者も業績リストのごとく、当課題について、しかるべき研究を進展させた。連携研究者落合理等が主催する第17回整数論サマースクール「1進ガロア表現とガロア変形の整数論」の会場費および旅費の一部等を負担して、この分野の研究のとりまとめに寄与したほか、国際研究集会等に外国人を4名招聘し、連携研究者もあわせて、広く研究討論した。今年度の最大の研究成果は、ラマヌジャンデルタ関数の3次対称L関数の5つの臨界特殊値を具体的な有理数とジーゲル保型形式の内積により明示的に表示したことである(桂田との共同研究)。各臨界点での特殊値は、Zagierにより30年以上も前に予想されていたが、その後全く進展はなかった。Zagierのラマヌジャンデルタ自身の内積を用いた予想値は、我々め結果と形は若干違うが、値は我々の結果と完全に比例しており、基本的には予想を解いたと言える。これ以外にジーゲル保型形式の跡公式、超特異アーベル多様体のモジュライの不変量と4元数的エルミート群の算術的不変量、保型形式上の微分作用素と特殊多項式系等の従来の研究を継続するとともに、C.Poor, D.Yuenとパラモジュラー形式のフーリエヤコービ展開による特徴づけの研究を開始しレベル4まで完成させた。従来の研究成果の一部を4つの英文論文として投稿した。内容は一般レベルの齋藤・黒川リフト、保型形式上の微分作用素とホロノミー系(落合、葛巻と共著)ジーゲル保型形式のAtkin-Lehner理論(桂田と共著)、ジーゲルファイ作用素の全射性(Boechererと共著)であり、このうち後者2つはすでに掲載決定された。本研究プロジェクトの成果発表や研究打ち合わせのために、延べ3回の外国出張、9回の国内出張をおこない、研究分担者若槻聡等が主催した第18回整数論サマースクール「セルバーグ・アーサー跡公式入門」の旅費の一部および報告集の費用を負担し、連携研究者池田保が主催した整数論オータムワークショップの旅費の費用の一部を負担して、この分野のとりまとめに寄与したほか、外国人研究者を2名招聘して、連携研究者も合わせて広く討論した。平成23年10月31日から11月5日まで第14回整数論オータムワークショップ「簡約理論とその応用」を研究協力者、渡部隆夫とともに主催し、ドイツ、フランス、アメリカの研究者4名を含む専門家31人の研究討論を行った。研究代表者は一般の対称管状領域における保型形式の消滅のフーリエ係数による特徴づけについて、一般的な定理を発表した。

集会では、保型形式理論における古典的な基本領域ないし、ボレル・ハリシュ・チャンドラの理論を具体的に記述することの重要性について共通認識を持つことができ、今後の研究の進展が期待される。また、オマーン王国での研究集会に科学委員会メンバーとして参画し、日独オマーンの数学研究交換に寄与した。個別の研究では2次シンプレクティック群のジーゲル保型形式とそのコンパクト実形上の保型形式の間の対応について、中間パラホリック群での記述が30年近く懸案であったが、このほど数値実験と次元比較による正確な予想を与えることができ、伊原康隆のコンパクト実形で固有値の重複度が2になるらしいという1963年の実験結果の意味を初めて明快に説明した。その他、レベルが平方因子をもたないパラモジュラー群のカスプ形式に対してもコンパクト実形などとの比較予想(北山と共同)、トリプルL関数に関する特殊値の明示式と3次ジーゲル保型形式の合同(桂田、Poor, Yuenと共同)、ジーゲル保型形式上の微分作用素の明示的公式(兵庫と共同)、対角成分への制限で保型性を保つ微分作用素の決める母関数の代数性の拡張などを行った。以上に関連して代表者は5編の論文を出版し、リュミニー、ボン、オマーンなどの国際会議での招待講演などを行い、外国人研究者6名を招聘し、幅広い領域について、研究を進展させた。各分担者も業績表に見るごとく、多様に研究を発展させた。本年は整数ウェイトのジーゲル保型形式の合同に関するHarder予想を解く実際的な方策を与えることに成功した。詳しくは次の通り。(1)半整数ウェイトの2次ジーゲル保型形式のうち、いわゆるHaupt typeの空間はNeben typeの空間とリフトで得られる空間の直和と、ヘッケ代数加群として同型との予想を与えた。これにより、半整数ウェイトと整数ウェイトの志村型対応についてHaupt type版を提案した。(2)以上によりHarder予想は同じ群に属する半整数ウェイトカスプ形式とKlingen型Eisenstein級数の合同に帰着された。(3)半整数ウェイトと本質的に同じである指数1の正則ベクトル値ヤコービ形式の構造定理と次元公式を得た。特に次元公式は対馬の提示していた予想の証明である。構造定理はヤコービ形式のTaylor展開係数に微分による修正項を追加すればベクトル値ジーゲル保型形式に帰着することなどの方法により、証明したものである。これはヤコービ形式を具体的に与える方法も与える。(4)本来、整数ウェイトについて述べられているHarder予想を、上記の志村対応予想で半整数ウェイトに移行することにより、初めてすべての素数に対するヘッケ作用素の固有値での合同が成立する実例を与えた。以上により、Harder予想は跡公式の比較とアイゼンシュタイン級数の引き戻し定理がわかれば証明できることが確定したと言ってよく、これは大きな前進であった。また保型形式上のある種の微分作用素のなす母関数の代数性をDon Zagierとともに従来わかっていた場合より高次の場合に証明した。上記の結果などについての成果発表および共同研究のため、研究代表者は5回海外渡航し、国内外の研究集会に参加して多数講演し、関連する外国人研究者を4名招聘して、討論をすすめた。中心的な課題のひとつの明示的跡公式は、多くの共役類についての個別の研究が必要であり、非常に複雑であって、全体的な解決には今なお時間がかかると思われる。
日本語文難易度推定と音声合成による「やさしい日本語」作成補助システムの研究開発

「やさしい日本語」の文作成および音声アナウンス作成を高度化するため、やさしい日本語支援システム「やんしす」の高度化、およびそれに必要な調査研究を行った。調査内容としては、文難易度の自動推定、文の難易度、話速、ポーズおよび音響環境による音声劣化が文の聴き取りにどのように影響するかを調べた。これによって「やさしい日本語」音声として適切な話速が明らかになった。これを受けて、文難易度推定および音声合成機能を「やんしす」に実装した。今期は、次の研究を行った。(1)外国人にとっての書き言葉の難しさの調査。まず、さまざまな難易度の文を用意し、さまざまな言語背景を持つ外国人にそれらの文を読んでもらい、主観的な難しさを評価させる。(2)文の特徴と難易度の関係の調査。文の難易度に関係する特徴としては、文の長さや係り受けなどの文全体に関わる特徴、個々の単語の難しさ(例えば日本語能力検定の級)、文字種(漢字・ひらがな・カタカナ)などが考えられる。これらの特徴と、外国人が実際に感じた主観的な難しさの関係を調べ、どのような特徴が文の難易度推定に有効なのかを調査する。(3)日本語文を読み上げたときに、それが外国人にどの程度聞き取れて理解されるかのモデルを作成する。外国人による日本語の音声の聞き取りやすさには、言語的な難易度だけでなく、連続して発話する部分をどの程度の速度で読むか(話速)、単語や文節の間にどの程度の無音部分があるか(ポーズ長)などにも依存すると考えられる。そこで、これらの要因を変化させて聴取実験を行い、これらの要因と聞き取りやすさの関係を調べる。(1)(2)の結果、文の特徴からその難易度を推定するモデルを作成することができた。さらに、これを既存の「やんしす」に組み込み、文全体の難易度を見ながら「やさしい日本語」文の作成ができるシステムを作成した。(3)に関しては、20名前後の留学生を実験参加者として、さまざまな話速・ポーズの分に関する聴取実験を行い、聞き取りへの影響を調査した。その結果、文が十分やさしく構成されていれば、話速やポーズ位置・ポーズ長さは実際の聞き取りには影響しないことがわかった。同時に、音声の自然性や聞き取りやすさに関しては、360モーラ毎秒の話速で係り受け距離の大きいところのみにポーズを入れる条件がよかった。まず、日本語文の読み上げ速度と聞き取りやすさに関して、昨年度の研究では「読み上げ速度・ポーズ位置は外国人による主観的な聞きやすさには影響を与えるが、書き取りの正しさについては影響を与えない」という結論が得られた。話速が音声言語の理解度に影響しないということは直感的には考えにくいこと、また昨年度は文の難易度を低いところでそろえて実験を行ったことから、今年度は様々な難易度の文に関して同様の実験を行い、文の長さや難易度と話速がどう文の理解と関係するかを調査した。まず、以前の我々の研究成果である「文の難易度判定法」を使い、災害に関係する様々な文の難易度を求めた。そこから、様々な難易度を含み、平均難易度がほぼ同じになる8文のセットを6つ作成した。それぞれのセットに属する文を、320,360,400,440,480 (mora/min)の速度で音声合成し、テスト用音声を作成した。これを12名の被験者(中国語母語話者)に呈示し、聞いた内容を中国語で書きとらせた。その内容と元の日本語文を照合し、どの程度聞き取れたかを客観的に評価した。その結果、文の難易度は文の理解に影響するが、話速は影響を与えないという結果となり、昨年度の結果を補強することとなった。次に、「やさしい日本語」作成支援システム高度化のために、音声合成システムの作成を行った。やさしい日本語作成システムに既存の音声合成システムを組み合わせることは不可能ではないが、コンパクトでどのようなプラットフォームでも動くためには、音声合成システムがやさしい日本語作成支援システムと同じJava言語で記述されている必要がある。そこで、新たにJavaで記述された音声合成システムGyutanを開発した。このシステムは、オープンソースソフトウェアとして公開している。27年度はほぼ当初計画どおりに進行している。昨年度までに、「やんしす」に文難易度評価機能を追加し、また非日本語母語話者による日本語音声の聴き取りの良さと話速の関係について調査を行ってきた。その結果、話速と聴き取りの良さに直接的な関係はないが、主観的な聞き取りやすさは380モーラ/分程度の音声で良好であることが明らかになった。これまでの聴取実験は雑音などが全くない環境で行われていたが、実際のアナウンスは雑音や残響のある環境下で流される。そこで、雑音や残響がある環境下での音声の聴き取りが話速や音声劣化とどのように関連するかを調査した。音環境による音声劣化の指標としてSTI (Speech Transmission Index)を利用し、STIが0.4から1となる環境のインパルス応答を利用して、さまざまな劣化度合いの音声を作成した。難易度を75程度にそろえた防災文25文を用意し、320から480モーラ/分の話速で再生した。これを20名の外国人(中国人12名、韓国人4名、インドネシア人4名)が聞き取り、書き起こしおよび主観評価を行った。

その結果、書き起こしの精度(聞き取りの客観的な良さ)はSTIの影響を受けないことがわかった。これは聴き取りと話速の間に影響がないとするこれまでの結果と整合する。また、STIが劣化すると聴き取りの精度は低下した。次に、これまで作成した「やんしす」に音声合成機能を追加し、やさしい日本語でアナウンス音声が作成できるシステムを作成した。このシステムはWindows, MacOS, Android, iOSで稼働する。作成システムはオープンソースソフトウェアとしてGitHubで公開しているほか、Windows版とMacOS版はプロジェクトのホームページで公開した。また、Android版はGoogle Play上で公開した。iOS版の公開は今後行っていく予定である。「やさしい日本語」の文作成および音声アナウンス作成を高度化するため、やさしい日本語支援システム「やんしす」の高度化、およびそれに必要な調査研究を行った。調査内容としては、文難易度の自動推定、文の難易度、話速、ポーズおよび音響環境による音声劣化が文の聴き取りにどのように影響するかを調べた。これによって「やさしい日本語」音声として適切な話速が明らかになった。これを受けて、文難易度推定および音声合成機能を「やんしす」に実装した。実績の概要に記したとおり、当初計画に挙げた平成26年度分の研究計画はほぼ完了した。また、27年度以降の計画である「やんしす」の多種類プラットフォーム対応(Windows, Android, iOS)も一部完了しており、27年度も順調な研究遂行が見込まれる。今年度もほぼ計画通りである。28年度が最終年度であるため、記入しない。音声情報処理研究はおおむね研究計画通りに推移しているため、当初計画通りに研究を遂行する。27年度は、「やんしす」の各種プラットフォームへの移植を行うとともに、音声合成機能の搭載に向けて、各種音声合成手法の検討を行う予定である。研究発表回数が当初の予定より少なくなったこと、研究に使用する計算機等を今年度は更新せずに既存のものを利用したことによる。26年度に雇用した研究員の雇用時間が予定より少なかったために余剰が生じた。研究遂行とともに適切な研究発表の計画を立て、費用が適切に使用されるようにする。27年度は研究員をフルタイムで雇用するため、27年度予算と上記の次年度使用額を含めてほぼ全額を当初予定した物品費・旅費・人件費に利用する予定である。
神経細胞におけるカルモデュリンキナーゼカスケードの解明

Ca^<2+>/カルモデュリ依存性プロテインキナーゼII(キナーゼII)をはじめ、いくつかのカルモデュリンキナーゼによるCa^<2+>シグナル伝達カスケードの存在が示唆されたことから、カルモデュリンキナーゼを介する情報伝達機構を明かにすることは、中枢神経機能の制御を解明する上で極めて重要であると考えられる。本研究では、(i)キナーゼIIの神経特異的アイソフォームであるαとβアイソフォームのcDNAをNb2a細胞に導入し、酵素を安定に発現するいくつかのクローンを単離した。cDNA導入し酵素を過剰に発現する細胞では、導入しない細胞にくらべて神経突起をもつ細胞が増加し、突起も長くなるという形態変化が引き起されることが見い出された。(ii)突起伸長作用はαよりβアイソフォームを発現する細胞のほうが大きく、両アイソフォームで作用の違いが見い出された。キナーゼIIのαとβアイソフォームの作用の違いが、この実験ではじめて明らかにされた。(iii)キナーゼIIの突起伸長作用はC-キナーゼの阻害剤によって増強されることも明らかとなった。C-キナーゼの阻害剤は細胞の増殖を抑制することにより、キナーゼIIの突起伸長作用が増強されると考えられる。このことは、増殖と分化がキナーゼIIとC-キナーゼ活性によって調節されることを示唆している。(iv)神経突起伸長にともないキナーゼIIの約15種類以上の基質のリン酸化が増大することが明らかとなった。リン酸化されるタンパク質を同定しリン酸化による機能変化を解析することによりキナーゼIIのシグナル伝達経路を明らかにできると考えられる。本研究では、多機能性のキナーゼIIのcDNAを培養神経芽細胞や初代神経培養細胞に導入し、種々の条件で細胞を刺激することにより、神経突起形成、伝達物質の合成と分泌、受容体機能、核への情報伝達など、神経細胞におけるリン酸化による調節の基本的な分子機構を解明する。本年度はキナーゼIIの神経特異的アイソフォームであるαとβアイソフォームのcDNAをNb2a細胞に導入し、酵素を安定に発現するいくつかのクローンを単離し、この細胞を使用してキナーゼIIの役割およびアイソフォームの作用の違いをを解析した。その結果、cDNA導入し酵素を過剰に発現する細胞では、導入しない細胞にくらべて神経突起をもつ細胞が増加し、突起も長くなるという形態変化を引き起されることが見い出された。突起伸長作用はαよりβアイソフォームを発現する細胞のほうが大きく、両アイソフォームで作用の違いが見い出された。キナーゼIIの突起伸長作用はC-キナーゼの阻害剤によって増強されることも明らかとなった。神経突起伸長にともないキナーゼIIの約15種類以上の基質のリン酸化が増大することが明らかとなった。

本研究では、カルモデュリンキナーゼを介する情報伝達を明らかにするために、多機能性のCa^<2+>/カルモデュリ依存性プロテインキナーゼII(キナーゼII)の作用を中心に解析する。そのために、これらのキナーゼのcDNAを培養神経芽細胞や初代神経培養細胞に導入し、種々の条件で細胞を刺激することにより、神経突起形成、伝達物質の合成と分泌、受容体機能、核への情報伝達など、神経細胞におけるリン酸化による調節の基本的な分子機構を解明する。さらに、キナーゼIIと相互作用する基質やタンパク質をクローニングし、得られたタンパク質の構造と機能を解析し、次のような結果を得た。(1)キナーゼIIのcDNAを培養神経細胞に導入し、これらのキナーゼを発現する細胞を得た。この細胞は、コントロール細胞にくらべ突起伸展能が亢進していた。(2)得られた細胞はプロテインキナーゼC阻害剤で処理することにより、細胞の増殖が抑制され、神経突起の形成が著しく促進され、突起の運動性が亢進することが明らかになった。このことは、キナーゼIIとプロテインキナーゼCの作用により突起伸展と細胞の増殖が制御されることを示している。(3)キナーゼIIのαとβアイソフォーム発現細胞では、突起の伸展能に違いが現れ、βの方が長い突起をもち、突起を持つ細胞の割合も高かった。(4)突起伸展にともないキナーゼIIの多くの基質タンパクがリン酸化されることが明らかとなった。現在、突起伸展に関わる基質を同定するため解析している。
ARを介したビタミンD3の前立腺癌抑制作用の分子機序の解明

我々は最近前立腺癌においてD3がARを介した転写制御を行うという知見を得た。前立腺癌においてD3は増殖抑制作用を持ち、またその作用がアンドロゲン依存的であるとも報告されていることから、アンドロゲンとのクロストークを含めたD3が有する抗腫瘍作用に興味が持たれる。そこで、本研究では、LNCaP細胞におけるDHTとD3間のクロストークの実態の解明を試みた。ホルモンを投与したLNCaP細胞の発現遺伝子をマイクロアレイで網羅的に解析した。その結果、複数のmetallothionein (MT)のファミリー遺伝子とHOXC9を中心としたファミリー遺伝子を共通の標的遺伝子として同定した。MT遺伝子群は全てDHTとD3に共通して抑制的に制御され、HOXC遺伝子群はDHTに抑制、D3に促進的に制御されていた。MT遺伝子群の制御は、種々の実験による解析から両ホルモンに共通してARを介していることが明らかとなった。MT遺伝子群がアンドロゲン系へのクロストークを介したD3の標的遺伝子であることを示している。MTは前立腺癌の増殖に関与するとも報告されていることから、D3がこれらの遺伝子発現を抑制することは癌抑制作用としても興味深い。今後、クロストークを介したD3によるMT遺伝子群の転写制御機構を解析し、癌抑制作用の実態に迫りたい。MT遺伝子群とHOXC遺伝子群は共にクラスターを形成してゲノム上に存在しているが、DHTによる転写抑制はこれらのクラスターを対象に生じており、DNAのメチル化酵素の阻害剤である5-アザシチジン処理で解除されたことからDNAのメチル化を介した転写制御機構であると考えられた。本研究で観察されたD3によりARが制御機構に関与するクロストークにもこのDNAのメチル化を介した制御機構の関与が考えられ、今後の更なる解析が求められる。本年度は前立腺癌細胞のLNCaP細胞でのD3-ARシグナル経路とその制御遺伝子群の同定を行った。まず最初に試みたのが、ゲノム編集による野生型AR発現LNCaP細胞の作製である。LNCaP細胞のARはリガンド結合ドメインにThr-Ala877の変異を有しており、この変異はD3と物理的に交差しないと報告されているものの、変異に依存した現象を完全に否定するのは難しい。このような実験的な問題を含む背景を排除するために、ゲノム編集にssDNAやターゲティングベクターを併用した、相同組換えによる内因性の変異型ARを野生型ARに変換するLNCaP細胞の作出を試みた。組換え候補細胞を約100株選別したが、しかし、相同組換え細胞を得ることは出来なかった。組換え細胞の作製と並行して、通常のLNCaP細胞を用いたD3による制御経路とその制御遺伝子群の系統的理解の解析を進めた。簡潔に記載すると、siRNAによる各核内受容体(ARとVDR)をノックダウンしたLNCaP細胞に種々のホルモン処理を行い、発現変動遺伝子をマイクロアレイで選別することでそれらの制御経路と制御遺伝子群を同定した。その結果から、LNCaPの変異型ARはD3を変異に依存して直接的なリガンドとして応答していないことを確認することが出来、本研究にはゲノム編集細胞の作製が必須でないことも示された。そして、癌の進行に伴って発現が上昇すると報告される遺伝子群の発現がDHTやD3に抑制されており、またそれらによる抑制はARが主に仲介していることを明らかにした。同定した標的遺伝子群の近傍の領域にARやVDRの結合領域が存在することもChIPアッセイで確かめている。今後、前立腺癌におけるそれら遺伝子の機能解析や、DHTやD3による発現制御の意義と伴に、D3-ARというクロストーク制御機構の解明を行っていく予定である。「研究実績の概要」にも記載した通り、平成28年度では、1ゲノム編集による野生型AR発現LNCaP細胞の作製2D3による制御経路とその制御遺伝子群の系統的理解の2つの研究を計画した。その進捗状況を次に記載する。1の研究では、TALEN発現ベクターや、相同組換えに使用するssDNAやターゲティングベクターを作製し、EGFP発現ベクターと供にLNCaP細胞に遺伝子導入を行った。EGFPの発現を指標に遺伝子導入細胞のみをFACSセルソーターで分取し、限界希釈培養で約100クローンを株化してジェノタイピングを行ったが、組換え細胞を入手するには至らなかった。組換え効率の低さが原因と思われ、より効率の良い実験方法の導入が必要と考えられる。2の研究では、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現の解析から、LNCaPが発現する変異型ARはD3に直接的に交差しないことを予想させる結果を得ることが出来たことより、ゲノム編集細胞の作製を待つことなく研究を進めた。その結果、当初から予想していたD3のシグナルをARが仲介するというクロストークをの存在と興味深い標的遺伝子群を同定することが出来た。今後、その標的遺伝子のDHTやD3による発現制御の意義と伴に、D3-ARというクロストーク制御機構の解明を行っていく予定である。我々は最近、前立腺癌や乳癌細胞においてエストロゲンがARを活性化するという奇妙な分子機構の存在を報告し、その解析過程でD3もARを介した転写制御を行うという知見を得た。

ホルモンを投与したLNCaP細胞の発現遺伝子をマイクロアレイで網羅的に解析した。その結果、共通して制御される23遺伝子が特定され、興味深いことにその内の8遺伝子がmetallothionein (MT)のファミリー遺伝子であった。MT遺伝子群は全てDHTとD3に共通して抑制的に制御され、各種の核内受容体をsiRNAでノックダウンしたところ、両ホルモンは共通してARを介した転写抑制であることが明らかとなった。このクロストークは、MT2AとMT1Xの遺伝子上流域に存在するAR結合領域を標的としたChIPアッセイによっても、D3に応答してARがこれらの領域に結合することが確かめられた。これらの結果は、MT遺伝子群がアンドロゲン系へのクロストークを介したD3の標的遺伝子であることを示している。MTは前立腺癌の増殖に関与するとも報告されていることから、D3がこれらの遺伝子発現を抑制することは癌抑制作用としても興味深い。今後、クロストークを介したD3によるMT遺伝子群の転写制御機構を解析し、癌抑制作用の実態に迫りたい。本研究の諸端として、LNCaP細胞で発現する変異型ARを野生型ARにゲノム編集によって置換した細胞を作出することを計画したが、いまだ作出することが出来ていない。この原因として、高効率にゲノム編集因子を細胞に導入できるエレクトロポレーション機器の導入が遅れたことが挙げられる。H30年度始めに導入される見通しである。また、LNCaP細胞でのD3とDHTの標的遺伝子をマイクロアレイ解析によって解析し、クロストークを介した制御を受ける遺伝子群を同定した。研究計画では、発現解析だけでなくARやVDRの結合部位をChIP-seqで網羅的に解析することを計画していたが、現時点ではqPCR解析での限られたDNA領域でしかARやVDRの結合部位を解析できていない。これらの理由から、本研究はH30年度に延長して継続して研究を進める予定である。我々は最近前立腺癌においてD3がARを介した転写制御を行うという知見を得た。前立腺癌においてD3は増殖抑制作用を持ち、またその作用がアンドロゲン依存的であるとも報告されていることから、アンドロゲンとのクロストークを含めたD3が有する抗腫瘍作用に興味が持たれる。そこで、本研究では、LNCaP細胞におけるDHTとD3間のクロストークの実態の解明を試みた。その結果、複数のmetallothionein (MT)のファミリー遺伝子とHOXC9を中心としたファミリー遺伝子を共通の標的遺伝子として同定した。MT遺伝子群は全てDHTとD3に共通して抑制的に制御され、HOXC遺伝子群はDHTに抑制、D3に促進的に制御されていた。MT遺伝子群の制御は、種々の実験による解析から両ホルモンに共通してARを介していることが明らかとなった。MT遺伝子群がアンドロゲン系へのクロストークを介したD3の標的遺伝子であることを示している。
ユビキチンシステムによる核内レセプター不活性化機構の解析

核内レセプターは、ビタミンA, D,ステロイドホルモン、脂質、コレステロール代謝物などの脂溶性物質をリガンドとする転写因子である。近年、レセプターのユビキチン化とプロテアソームでの分解が、転写活性化に重要であることが示唆され、注目を集めている。本研究では、核内レセプターの一つであるエストロゲンレセプターに着目し、その分解機構を分子レベルで解析した。エストロゲンレセプターは女性ホルモンであるエストロゲンを受容するレセプターであり、α、βの2つのサブタイプ(ERα、β)が存在する。本研究では、ERαがエストロゲン存在下でも非存在下でも、ユビキチン・プロテアソーム系によって分解を受けることを明らかにした。エストロゲン非存在下では、ERαはCHIPと呼ばれる蛋白質によってユビキチン化を受け、分解されることが示された。CHIPはhsp70/hsp90/hsp40などのシャペロン蛋白質と複合体を形成し、フォールディングに異常のあるレセプターを選択的にユビキチン化し、分解へと導くことにより、レセプターの品質を向上する役割を担っていることが明らかとなった(EMBO J.Y.Tateishi et al.,2004)。一方、ERβは、ERαと同じくエストロゲン依存的分解を示すものの、その分子機構はERαと異なることが判明した。ERβの分解には、N末端に存在する領域が必須であり、この領域を持たないERβ変異体は、エストロゲン依存的な分解を示さなくなる。本研究者らは、すでにこの領域を認識して結合するユビキチン・リガーゼの単離に成功しており、解析を進めている。また、エストロゲン依存的な分解を示さないERβ変異体も転写活性を示すことから、レセプターの転写活性に分解は必要でないことが示唆された。核内レセプターは、脂溶性ビタミン・ステロイドホルモン・脂質・コレステロール代謝物などをリガンドとするリガンド誘導性転写因子である。核内レセプターは、構造上、機能上の相同性から遺伝子スーパーファミリーを形成していることが知らており、ヒトで50種類弱存在する。近年、これらの核内レセプターがユビキチン・プロテアソーム系で分解を受けることが示された。しかしながら、その分子機構、生物学的重要性については未だに不明である。わたしたちは、リガンド誘導性転写因子である核内レセプター、特にエストロゲンレセプターを材料とし、転写因子のユビキチン化と転写不活性化機構の関連について研究を進めている。エストロゲンレセプター(ER)は女性ホルモンであるエストロゲンを受容し、DNAの特異的配列に結合して、下流に存在する標的遺伝子群の転写を制御する。わたしたちはERがエストロゲン存在下、非存在下においてそれぞれ異なったユビキチンリガーゼによってユビキチン化を受け、分解されることを見出した。エストロゲンの結合していないERはHsc70を含むシャペロン複合体によってCHIPと呼ばれるユビキチンリガーゼと結合し、分解される。CHIPは変異型のERを選択的にユビキチン化することから、ERの品質管理に関与しているものと考えられる。一方、エストロゲンの結合したERは新規ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されることが明らかとなった。このユビキチンリガーゼはエストロゲン依存的にERと結合し、ユビキチン化することによって分解へと導く。現在、このユビキチンリガーゼの機能を探るため、遺伝子欠損マウスの作成を進めている。

近年、レセプターのユビキチン化とプロテアソームでの分解が、転写活性化に重要であることが示唆され、注目を集めている。本研究では、核内レセプターの一つであるエストロゲンレセプターに着目し、その分解機構を分子レベルで解析した。エストロゲンレセプターは女性ホルモンであるエストロゲンを受容するレセプターであり、α、βの2つのサブタイプ(ERα、β)が存在する。本研究では、ERαがエストロゲン存在下でも非存在下でも、ユビキチン・プロテアソーム系によって分解を受けることを明らかにした。エストロゲン非存在下では、ERαはCHIPと呼ばれる蛋白質によってユビキチン化を受け、分解されることが示された。CHIPはhsp70/hsp90/hsp40などのシャペロン蛋白質と複合体を形成し、フォールディングに異常のあるレセプターを選択的にユビキチン化し、分解へと導くことにより、レセプターの品質を向上する役割を担っていることが明らかとなった(EMBO J. Y. Tateishi et al.,2004)。一方、ERβは、ERαと同じくエストロゲン依存的分解を示すものの、その分子機構はERαと異なることが判明した。ERβの分解には、N末端に存在する領域が必須であり、この領域を持たないERβ変異体は、エストロゲン依存的な分解を示さなくなる。本研究者らは、すでにこの領域を認識して結合するユビキチン・リガーゼの単離に成功しており、解析を進めている。また、エストロゲン依存的な分解を示さないERβ変異体も転写活性を示すことから、レセプターの転写活性に分解は必要でないことが示唆された。
理科の中等教育における探究活動や課題研究における学習プログラム及び評価方法の考案

共同研究者や研究協力者と共に,化学基礎,化学において探究の過程を踏まえた学習プログラム及び評価方法の考案を行った。佐賀県立A高等学校における実践は,アルコールと水を混合させると質量と体積はどうなるかを予想させその理由もあわせて書かせており,自然事象に対する気付きから仮説の設定までの探究の過程を重視した取組である。青森県立B高等学校における実践では,化学基礎の最後の授業で「安全な水を得るためには」と題して,身近な物質として「水」を取り上げ,今まで学習したこととの関連について想起させ,化学基礎で学習した内容が密接に結びついていることに気付かせるような学習プログラムを考案した。北海道立C高等学校の実践では,探究的な活動を取り入れた授業を導入するとき,「単元や章の導入段階に位置付けて実施することにより,単元全体の学習効果を高めることができるのではないか」という仮説のもとに単元の指導計画を構築した。茨城県立D高等学校の実践では,疑問をもつ場面を設定した学習展開により,生徒が主体的に取り組み,理解を促すことができたとしている。生徒が自ら「課題を設定」し,「検証計画の立案」をすることができれば,その後のプロセスにも主体的に取り組むようになることが考えられる。北海道立教育研究所附属理科教育センターにおける実践では,酸・塩基の基礎的・基本的な知識を活用し,未知資料の性質を調べる実験数をできるだけ少なくするような実験計画を立案し,その仮説にしたがって未知資料の同定に取り組む授業を構築した。様々な実践から,特に「課題の設定」から「検証計画の立案」へのプロセスにスポットをあて,そのプロセスに関する学習プログラム及び評価を考案することが特に重要であることが推測される。共同研究者や研究協力者と共に先行研究からの情報を基に,次期学習指導要領の「理数探究基礎」や「理数探究」に資する探究活動や課題研究について,学習プログラムや評価方法を構築するための要因を抽出し,幾つかの分野で試案を作成し実践してまとめた。具体的には,千葉県立A高等学校の授業を参観し,化学実験レポート「醤油に濃塩酸を加えるとなぜ塩化ナトリウムの結晶が析出したのか」についての相互評価に関して情報交換を行った。評価規準表を基にした自己評価や他者評価を通して生徒の記述内容が改善され生徒が自分の成長を認識できるような構成であった。国立大附属B校と適宜打ち合わせを実施し,バカロレアに関する学習プログラムの構築や評価についての情報交換を行った。単元計画全体を通して社会との結びつきを意識した構成であった。さらに,SSH校であるC中等教育学校においては,授業におけるルーブリック評価の実践に関する情報交換を行った。幅広い分野においてルーブリックを用いた評価の実践がなされていた。北海道立D高校における「酸・塩基に関わる未知資料の同定」の課題研究の実践においては,生徒個人で実験の方法を考案させた後,グループで検討改善させグループとして実験方法を再度考案させる構成であった。北海道の理科教員対象研修における取組でも実験計画をどうたてるかが指導のポイントになっていた。青森県E高校における探究活動のプロセスに焦点をあてた実践では,問題を見いだし課題をどう設定するかを中心に生徒の主体性をどう育むかを研究している。佐賀県立F高校における電気分解の授業実践では,自己評価において,今回の実験でわかったことを書かせて生徒の変容を把握する試みをしている。上記のような実践における情報交換や成果と課題の抽出を中心に研究を進めた。その他,研究会の実施やメール等を通して情報交換を適宜行い,成果や課題の共有に努めた。主に高等学校での探究活動や課題研究における先行研究から情報収集を行うとともに,SSH校やバカロレア校から優れた実践の要因を抽出することなども行った。それらを基に,主に高校化学においていくつかの分野で探究活動や課題研究の学習プログラムを試案し,その実践を持ち寄ってその成果と課題を検証した。その内容は「一般社団法人日本理科教育学会第67回全国大会」にて発表予定である。共同研究者や研究協力者と共に,問題解決過程を踏まえた化学基礎や化学における探究活動の学習プログラムや評価の考案に向けていくつかの単元において実践を行った。具体的には,茨城県立A高等学校においては,化学基礎におけるダニエル電池に関する授業を参観し研究協議を行った。中学校の学習やイオン化傾向の学習を踏まえ,生徒が自ら疑問をもち課題を設定して,主体的に実験に取り組めるような構成であった。新学習指導要領では,中学校でダニエル電池を取り上げることになっているので,中高の接続を考慮した授業を構成することは大切なことだと考える。佐賀県立B高等学校及び青森県立C高等学校では,化学基礎の最初の授業で今後の学びの展望をどう生徒につかませるかという視点で授業を構成して実践した。化学開きというべき最初の授業で,何をどのように展開し生徒の学びの意欲を喚起させるかを勘案して授業を構成した。B高等学校では,水とエタノールを混合するとどうなるかという問いに対して仮説を立てさせ実験を行い,その結果を分析して解釈することを通して生徒のなぜを引き出し,学ぶ意欲につなげる構成であった。C高等学校では,中学校での実験を想起させ,生徒自ら化学の特徴を考えさせる授業の構成であり,生徒の実態に応じて様々な工夫が見られた。北海道立D高等学校においては,酸と塩基に関する授業において,イオンに関しての生徒の疑問を引き出す授業構成を考えており今後実践する予定である。その他,研究会の実施やメール等により情報交換を適宜行うことにより,成果や課題を抽出し探究活動の学習プログラムや評価方法の考案につなげていきたい。高等学校の化学基礎や化学における様々な単元で探究活動における学習プログラム及び評価方法を考案して実践を行った。実践した内容における成果と課題は「一般社団法人日本理科教育学会第68回全国大会」岩手大会で発表予定である。

共同研究者や研究協力者と共に,化学基礎,化学において探究の過程を踏まえた学習プログラム及び評価方法の考案を行った。佐賀県立A高等学校における実践は,アルコールと水を混合させると質量と体積はどうなるかを予想させその理由もあわせて書かせており,自然事象に対する気付きから仮説の設定までの探究の過程を重視した取組である。青森県立B高等学校における実践では,化学基礎の最後の授業で「安全な水を得るためには」と題して,身近な物質として「水」を取り上げ,今まで学習したこととの関連について想起させ,化学基礎で学習した内容が密接に結びついていることに気付かせるような学習プログラムを考案した。北海道立C高等学校の実践では,探究的な活動を取り入れた授業を導入するとき,「単元や章の導入段階に位置付けて実施することにより,単元全体の学習効果を高めることができるのではないか」という仮説のもとに単元の指導計画を構築した。茨城県立D高等学校の実践では,疑問をもつ場面を設定した学習展開により,生徒が主体的に取り組み,理解を促すことができたとしている。生徒が自ら「課題を設定」し,「検証計画の立案」をすることができれば,その後のプロセスにも主体的に取り組むようになることが考えられる。北海道立教育研究所附属理科教育センターにおける実践では,酸・塩基の基礎的・基本的な知識を活用し,未知資料の性質を調べる実験数をできるだけ少なくするような実験計画を立案し,その仮説にしたがって未知資料の同定に取り組む授業を構築した。様々な実践から,特に「課題の設定」から「検証計画の立案」へのプロセスにスポットをあて,そのプロセスに関する学習プログラム及び評価を考案することが特に重要であることが推測される。「一般社団法人日本理科教育学会第67回全国大会」の研究発表に向けて情報の共有,成果と課題の検証を進める。その後,定期的に研究会等を開催し,探究活動や課題研究における具体的な学習プログラムや評価方法を考案する。考案した学習プログラムや評価方法に改良を加え実践をくりかえすとともに,得られた結果から成果と課題を分析し学会等で発表する予定である。「一般社団法人日本理科教育学会第68回全国大会」岩手大会の研究発表に向けて情報の共有,成果と課題の検証を進めるとともに,理科教育学会において幅広いご意見をいただくこととしている。今後も情報の共有,分析・解釈等を行い,成果と課題等を明らかにしていきたい。旅費が予定よりも低く抑えられたため(理由)旅費が予定よりも低く抑えらえたため(使用計画)研究会の実施や学会等に係る旅費研究会の実施や学会等の発表に係る旅費
改正行政不服審査法の運用実態の検証を通じた解釈論，立法論の展開

研究全体に関わる問題として,行政不服審査法の平成26年の全面改正に至る過程を回顧し,立法過程の各種資料,文献等を素材として包括的な検討を加え,全面改正の過程で大きな焦点となり検討過程でその方向性に変遷が見られた問題として,「不服申立ての基本構造」とその例外,公正性確保のための制度設計,救済態様の多様化に焦点を当てて,改正の意義と課題を整理した。運用面について,「認容裁決の際の措置」を中心に,「行政不服審査裁決・答申検索データベース」に掲載された答申,裁決を素材に,現状の把握とその課題の抽出を行った。また,昨年度同様,国・地方公共団体の行政不服審査制度の運用に関わる関係者(審査会委員,審理員,事務局等)が一堂に会して運用上の課題等について議論する会合(第3回行政不服審査交流会)において分科会のコーディネーターを努める機会を得て,参加者との意見交換を通して,手続の長期化の要因と迅速化のための方策,事実認定の充実のための取り組み等,審理員制度の運用において実際に生じている課題を認識,整理することができた。比較法研究においては,オーストリア法について,権利救済手続の裁判化と一元化という観点から検討を加え,行政不服審査制度についての取扱いの変遷とその背景,現状を明らかにした。また,ドイツ法について,申請拒否処分に対する異議審査請求の認容決定の構造分析し,わが国の「認容裁決の際の措置」との異同について検討を加えた。当初の研究計画に沿った形での研究を進めることができている。これまでの成果のうち論文等の形で公表できていない部分の公表に向けた作業を進めるとともに,最終年度における研究全体の取りまとめを行う。本研究課題に着手するに当たって,当初の実施計画通りに,(a)不当性審査,(b)認容裁決の際に行う「一定の処分」,(c)行政不服審査会等への諮問の要否の判断,の三点について,立案段階の資料,各種論考,改正前後の各種解説書等の精査を通じて,立案過程の再検証を行った。その作業と並行して,裁量審査(不当性審査)について,従来の学説について整理・検討を加えた。また,行政不服審査制度の運用に携わる関係者が一同に解する「行政不服審査交流会」に参加し,実務担当者などから改正法の運用状況についての情報を得た。さらに,総務省が実施した審理手続の運用実態に係るアンケート調査結果をもとに,運用方策について検討を加える研究会に参加する機会を得て,実際の運用実態に即して実務担当者と意見交換を行った。比較法的検討について,短期の出張を行い,不当性審査,行政不服審査会への諮問の要否についての検討に資する資料の収集を行い,その分析を進めている。答申,裁決について,「行政不服審査裁決・答申検索データベース」において公表されたものを確認し,地方公共団体の審査会の裁決を中心に,その特徴の整理を進めている。当初の実施計画に盛り込んでいた事項以外に,本研究課題に関連して,裁定的関与の問題について,改正の具体的な内容とその意義について検討を加えた。また,審査請求手続を中心に,従来の判例を踏まえて具体的な論点についての検討を行った。平成28年度の研究実施計画に盛り込んだ事項はほぼ実施したが,国の行政不服審査会の答申が年度末の時点で数件しか公表されていないことから,答申,裁決を分析する際の手法の確定には至っていない。今年度は,「行政不服審査裁決・答申検索データベース」に掲載された答申,裁決を素材に,(a)不当性審査,(b)認容裁決の際の措置,(c)行政不服審査会等への諮問の要否を中心に,運用上の問題点を抽出する作業を進めた。また,国・地方公共団体の行政不服審査制度の運用に関わる関係者(審査会委員,審理員,事務局等)が一堂に会して運用上の課題等について議論する会合(第2回行政不服審査交流会)において分科会のコーディネーターを努める機会を得て,参加者との意見交換を通じて,争点整理手続,弁明書・反論書の提出期限の設定等,審理手続の終結等,証拠書類の閲覧請求と審理員の職権による送付,事実認定における証拠による裏付け等,審理員制度の運用において実際に生じている運用上の課題を認識,整理することができた。比較法研究について,ドイツ法,オーストリア法双方について,出張等を通じて収集した資料に分析を加える作業を継続した。特に,オーストリア法について,論点ごとの検討の前提となる,権利救済制度の全体像を明らかにするための検討を加えた。当初の実施計画に盛り込んでいた事項以外に,本研究課題に関連して,昨年度に引き続き,裁定的関与の問題について,そのリーディングケースとされる事例(大阪市国保事件)とその現代的意義について詳細に検討を加えた。また,審理手続における職権探知主義について,判例解説を通じて,改正法の下での妥当性や運用上の留意点について検討を加えた。研究の成果を,引き続き順次論文等の形で公表していく予定である。

運用面について,「認容裁決の際の措置」を中心に,「行政不服審査裁決・答申検索データベース」に掲載された答申,裁決を素材に,現状の把握とその課題の抽出を行った。また,昨年度同様,国・地方公共団体の行政不服審査制度の運用に関わる関係者(審査会委員,審理員,事務局等)が一堂に会して運用上の課題等について議論する会合(第3回行政不服審査交流会)において分科会のコーディネーターを努める機会を得て,参加者との意見交換を通して,手続の長期化の要因と迅速化のための方策,事実認定の充実のための取り組み等,審理員制度の運用において実際に生じている課題を認識,整理することができた。比較法研究においては,オーストリア法について,権利救済手続の裁判化と一元化という観点から検討を加え,行政不服審査制度についての取扱いの変遷とその背景,現状を明らかにした。また,ドイツ法について,申請拒否処分に対する異議審査請求の認容決定の構造分析し,わが国の「認容裁決の際の措置」との異同について検討を加えた。当初の研究計画に沿った形での研究を進めることができている。国の行政不服審査会の答申が年度末の時点で数件しか公表されていないことから,答申,裁決を分析する際の手法の確定には至っていないため,ある程度答申が蓄積された段階で,改めてこの点について検討を加える。この点を除き,当初の研究実施計画に即して研究を推進していく予定である。引き続き,裁決・答申等の分析,実務担当者との意見交換等を進めて運用上の課題を明らかにする作業を進めるとともに,比較法的研究を同時に進め,運用上の課題を解決するための解釈論,立法論を構築していく。その過程で,関係者へのヒアリングなどを行い,解決策の実際上の妥当性をあわせて検証していく。これまでの成果のうち論文等の形で公表できていない部分の公表に向けた作業を進めるとともに,最終年度における研究全体の取りまとめを行う。必要な書籍等が想定よりも安価で入手できたため。書籍等について,当初の予定よりも安価で入手することができたために次年度使用額が生じた。次年度使用額については,より幅広い検討を行うための書籍等の追加購入に充てる予定である。平成29年度請求額とあわせて,書籍の購入等に充当する。
ジンクフィンガーモチーフを有する真核リボソーム蛋白質S29の構造と機能

1.研究目的我々はこれまでに、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのリボソーム蛋白質YS29が40Sサブユニット蛋白質群の中で最小(55アミノ酸からなる)であり、C4型ジンクフィンガーモチーフ(ZnFM)を持つ事、ラットリボソーム蛋白質S29および原核生物型S14の構造的相同蛋白質である事などを遺伝子の単離、解析により明らかにしてきた。YS29における構造と機能の関係をさらに追及する事を目的とし、以下の実験を行なった。2.研究方法および結果ハプロイドあたり2コピー存在するYS29遺伝子を2つとも同時に破壊した細胞は生育不能である事から、YS29はリボソームの機能に必須であると考えられた。ラットリボソーム蛋白質S29をコードするcDNAを、酵母GAPDH遺伝子のプロモーター下につないだ多コピープラスミドを予め導入した場合、上記遺伝子破壊による致死性が相補された事から、YS29とラットS29は機能的にも相同である事が示唆された。次に、site-directed mutagenesis法によりYS29のZnFMに種々の変異を導入し、細胞の生育への影響を調べた結果、(1)YS29に存在する4つのシステイン残基のうち、第2、第3番目は欠失可能である事、(2)進化的によく保存されている、第1番目のシステイン残基は他のアミノ酸に置換可能であり、機能発現に必須ではない事が明らかとなった。
哺乳類オートファジーに必須な巨大蛋白質FIP200の構造生物学的研究

オートファジーに関わるタンパク質群の多くは、出芽酵母からヒトに至る真核生物において広く保存されているものの、一部のタンパク質はヒトなどの高等真核生物に固有の因子であり、その一つがオートファジー始動複合体の足場タンパク質FIP200である。今回ヒト由来FIP200を用いて、試料調製に最適な領域を絞るとともに、得られた良質なサンプルを用いて結晶化と構造解析を行った。FIP200のC末端側の領域は平行なcoiled-coilダイマーを形成していた。このことから、複合体の足場として機能する巨大なタンパク質FIP200は平行な二量体構造をとることが示唆される。オートファジーは真核生物に広く保存された細胞内分解システムであり、細胞質やオルガネラをオートファゴソームと呼ばれる二重膜(隔離膜)で隔離した後、リソソーム/液胞と融合して内膜ごと分解する現象である。酵母を用いた遺伝学的な研究から約40種類におよぶオートファジー関連(Atg)蛋白質が同定されている。これらの多くは高等生物においても保存される一方で、高等生物に特有の因子や付加領域が存在し、酵母と高等生物とでオートファゴソーム形成過程が異なることが予想される。本研究では高等生物において必須かつ特有の因子であるFIP200および特有の付加領域(C末端側のWD40 repeatドメイン)を有するAtg16L1に着目して構造生物学的解析を行うことで、高等生物に固有のオートファゴソーム形成過程を明らかにすることを目的としている。FIP200はいくつかの領域に分けることで、良質なサンプルを得ることは可能であったため、結晶化スクリーニングを行った。C末端側の一部の領域は結晶が得られ、X線回折強度データを収集した。それ以外の領域については、分子の安定化、結晶化能の向上を期待して相互作用分子との複合体を得ることを目指し、結合領域の探索を行った。Atg16L1はWD40repeatドメインの結晶構造解析を行うため、発現系・発現領域の検討を行った。昆虫細胞発現系によりゲルろ過クロマトグラフィーで単一のピークとなるサンプルを得ることが可能となった。しかし、結晶化のための濃縮により沈殿が析出してしまう問題点がある。FIP200の結晶が得られた領域については、分解能3ÅのX線回折強度データを収集した。その他の領域は微結晶は得られるものの、再現よく結晶が得られない状況である。細長い分子であると予想され、接触面の少なさ、分子の揺らぎが一因となり、結晶が析出しにくいと考えられる。これらの問題を改善するため、相互作用分子(Atg13、ULK1)との複合体を得ることを進めた。相互作用分子のサンプル調製、FIP200との生化学的な解析から、FIP200のN末端側の領域がAtg13の天然変性領域、およびULK1のC末端側ドメインとの相互作用に関与することが明らかとなった。Atg16L1はC末端側WD40 repeat領域の大量調製は可能となっているが、濃縮時のサンプル状態不良、また既報の領域ではFIP200と直接相互作用しない、または相互作用が弱くて検出できないことがわかった。いずれものサンプルも高い精製度で調製することは可能であるが、その性質、結晶化能に問題があり、相互作用分子との複合体形成を目指す方針に転換したため、当初の計画からは若干遅れている。オートファジーは真核生物に広く保存された細胞内分解システムであり、細胞質やオルガネラをオートファゴソームと呼ばれる二重膜(隔離膜)で隔離した後、リソソーム/液胞にと融合して内膜ごと分解する現象である。酵母を用いた遺伝学的な実験から約40種類におよぶオートファジー関連(Atg)蛋白質が同定されている。本研究では高等生物おいて必須かつ特有の因子であるFIP200および特有の付加領域(C末端側のWD40 repeatドメイン)を有するAtg16L1に着目して構造生物学的解析を行うことで、高等生物に固有のオートファゴソーム形成過程を明らかにすることを目的としている。C末端側の一部の領域は結晶が得られ、高分解能のX線回折強度データを収集した。しかし、それらは再現性が悪く、位相決定のための結晶を調製することができなかった。そこで、当該領域のC末端にT4Lysozymeを融合してサンプル調製し結晶化を行うことで、X線回折強度データ収集が可能な結晶を得た。得られたデータに対して、T4Lysozymeの構造をサーチモデルに分子置換法を適用して構造を決定した。構造解析の結果、FIP200のC末端側領域は平行なcoiled-coilダイマー構造をとることが明らかとなった。また、これらの構造から巨大タンパク質FIP200が平行なダイマーとして存在することが示唆された。

FIP200のC末端側の領域は平行なcoiled-coilダイマーを形成していた。このことから、複合体の足場として機能する巨大なタンパク質FIP200は平行な二量体構造をとることが示唆される。FIP200のN末端側領域については、Atg13およびULK1との結合領域が明らかとなったため、3者の複合体を調製し、結晶化を試みる。C末端側領域は、すでにデータが取得できた領域についてはセレノメチオニン置換体の結晶を得て、異常分散法による位相の決定と構造解析を進める。その他の領域についてはサンプル精製条件、結晶化条件の最適化を行う。結晶析出の再現性をよくするため、T4Lysozymeを融合するなど、結晶化タグを活用する。結晶が得られたらX線回折強度データの収集、位相の決定、構造解析と進める。適当な結晶が得られなかった場合には、生物種を変えてみる。Atg16L1ついては、サンプルの状態を改善することが第一である。添加剤を加えることや、発現領域の再検討を行い、良質なサンプルを得て結晶化を行う。構造生物学発注していた物品の納期が遅れたため。タンパク質の発現、精製、結晶化に必要な試薬類(培地、結晶化試薬など)、ガラス器具、プラスチック類(チップ、結晶化プレート)、タンパク質精製カラムなどを購入予定である。微生物化学研究所