hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
せん断流れ場と歪曲電場を援用した特定単細胞連続選別法の開発

生体単細胞の赤血球(RBC)に注目し,マイクロ流路内せん断流れ中でのRBCに誘電泳動力(DEP)を作用させて高速かつ連続的に選別する方法を開発する研究を行った.RBCにDEPを適切に作用させるため流路内に設置した直線型あるいは半円型形状の薄膜電極によって発生する歪曲電場を数値予測し,球状ポリスチレン粒子を用いた可視化実験結果と良好な一致を示したことからRBCの分離・選別に応用できることが分かった.生体の単細胞に注目し,微量血液サンプル中で特定の単細胞だけを,マイクロ流体デバイスの流路内で電気的な力を利用して高速かつ連続的に選別する方法を新規に開発する研究を実施した.初年度は単細胞の代わりに同程度の大きさで取り扱いの容易な球状ポリスチレン粒子を選別対象とし,マイクロ流路中に歪曲電場を発生させて粒子に電気泳動力を作用させるような薄膜電極を設計・製作して,実際に粒子が捕捉,誘導できるかどうか実験的に確認した.電極についてはその形状と配置が粒子に作用する誘電泳動力の大きさと方向に強い影響を及ぼすため,電場強度分布とそれに対応する誘電泳動力について詳細な3次元数値解析を行った.また,粒子の移動経路に関する数値予測が可視化画像解析の結果と良好に一致したことから,本数値解析手法ならびに実験系の妥当性が確認できた.さらに,粒子の電極部への高精度な供給が可能となるように給液流量の変動を極力抑える小型加圧式ポンプの設計,製作も別途行った.この成果を基にして,最終年度には初年度に開発した流体デバイスに単細胞そのものを流し,粒子の場合と同じように捕捉・誘導できるかどうか調べた.一方で初年度に妥当であることが確認できた数値解析手法を用いて,単細胞を捕捉・誘導するための性能向上が見込める電極形状を決定した.具体的な形状として細棒の電極と半月形のグラウンド電極の組み合わせた櫛型電極,2本あるいは3本の平行線配置のレール型電極等を設計,製作して性能評価を行い,充分な捕捉,誘導,選別の行える事を確認した.ただし,この流体デバイスは上流部での細胞センシングの結果に基づくアクティブな選別,分取の性能を未だ有しない.今後,センサー部と連動した分取機能の開発が必須である.また,臨床現場等で要求される分取性能を実現するためには更なる性能向上が望まれる.生体単細胞の赤血球(RBC)に注目し,マイクロ流路内せん断流れ中でのRBCに誘電泳動力(DEP)を作用させて高速かつ連続的に選別する方法を開発する研究を行った.RBCにDEPを適切に作用させるため流路内に設置した直線型あるいは半円型形状の薄膜電極によって発生する歪曲電場を数値予測し,球状ポリスチレン粒子を用いた可視化実験結果と良好な一致を示したことからRBCの分離・選別に応用できることが分かった.生体の単細胞とくに赤血球(RBC)に注目して,微量血液サンプル中で特定のRBCだけを高速かつ連続的に選別する方法を新規に開発することを目的に,研究開始の今年度はRBCに代えて取り扱いの容易な球状ポリスチレン粒子を選別対象とし,マイクロ流体デバイスの初期設計・製作を行ってその性能を実験的,数値的に評価した.とくにサンプル粒子の移動経路に関する数値予測と可視化画像処理の結果は良好に一致し,本数値解析手法ならびに実験系の妥当性を確認することができた.この成果を次年度に向けて発展させ,より高性能な流体デバイスが構築できれば,極微量の単細胞サンプルから正常な単細胞の特徴を有しない単細胞だけを連続的に,高速に検出・選別する確固たる方策が提案できる.今後の更なる高齢化に伴う病気治療頻度の増大や地球温暖化に伴う伝染病の蔓延等に備えた初期診断には迅速,簡便,正確,低コスト,省スペースであることが要求されるが,現状ではこれらの要求にそぐわない試験管規模の容量の血液を要するバッチ処理測定あるいは手間隙の掛かる個別RBC標本採取の多数回繰り返し測定が行われている.この現状を打破し,要求に沿うものを実現するためには,単細胞選別性能をさらに向上させる必要がある.また,現在,選別対象としているポリスチレン粒子から本来のRBC等の単細胞に代えても本流体デバイスが思い通りに駆動するかどうかを早急に調べる必要もある.しかし,今年度に得られた結果の示すところから研究方針・方策は妥当であり,構築した数値解析手法,実験系を駆使して電極性能向上のための形状,配置の詳細な検討が行える目処は立ち,速度場を整えた流路に微量サンプルを流して特定の単細胞だけを非対称に歪曲させた電場でシームレスに分離・選別すること学術的にも極めて意義深い内容となっている.今年度はマイクロ流体デバイスの初期設計・製作を行い,その性能を実験的,数値的に評価することができた.選別対象はRBCではなく,それと同程度の寸法の球状ポリスチレン粒子を用いたが,これは対象を扱いやすいもので代用し,単細胞選別のためのマイクロ流体デバイスの早期製作を図ったためである.また,3分枝合流可能なセクションを有するマイクロ流路ならびに各分枝からの供給溶液流量の変動を極力抑えるための小型加圧式ポンプを設計,製作した.薄膜電極についてはその形状と配置が,粒子に作用する誘電泳動力の大きさと方向に多大な影響を及ぼすため,電場強度分布とそれに対応する誘電泳動力についての詳細な3次元数値解析を行った上で慎重に設計,製作した.

次にこれらのマイクロ流路,ポンプ,薄膜電極を組み合わせて実験系を構築し,ポリスチレン粒子の流れる様子を顕微鏡,高速度ビデオカメラで可視化した.光源の明るさや視野倍率の関係で数mm/sの速さで顕微鏡視野内を移動する10μm程度の粒子を可視化することに手間取ったが,粒子を追跡して,その経路が選別用薄膜電極の設置位置まで滑らかに,思い通りに誘導できていることを確認した.一方で,流体の速度場ならびに薄膜電極によって発生する歪曲電場を連成解析し,固体粒子の移動経路を数値的に予測した.その結果,数値予測された粒子の移動経路は可視化画像から得られたものと良好に一致しており,実験系および計算手法の妥当性が確認された.そこで,高い粒子選別性能を得るために様々なデザインの電極形状,寸法,配置を試すのに電極製作は取り止め,本数値解法を駆使して粒子移動経路を算定し,最適な電極を選定することにした.現在,有力候補としては細棒の電極と半月形のグラウンド電極の組み合わせに絞り込みを行っている最中で,それに対する実験系の構築を進めている段階である.今年度の結果として得られた粒子移動経路の可視化画像処理結果と数値解析結果との間の良好な一致は,実験系および計算手法の妥当性を示している.そこで本計算手法を駆使して現在,有力な電極構造の候補として細い棒状の電極と半月形状のグラウンド電極の組み合わせに絞り込みを行っており,次年度前半において高性能粒子選別可能な電極形状,寸法,配置の算定を早急に終え,それに基づくマイクロ流体デバイスの設計・製作を新たに行う.デバイス自体はこれまでと違い自作をせず,外注することで各部寸法,形状の精度を高めたものを製作することにする.予算的には本年度後半が数値解析による最適電極算定が主体であったため,薄膜電極付設の流体デバイス外注,新たな実験系構築は本年度配分研究費の一部を取り置くことができており,それを次年度に繰り越して研究推進に充てる.新たなデバイスについての選別性能の確認,向上が確認されれば,単細胞に対する誘電泳動力を望みのタイミングで発現できる連携システムや流体温度モニタのための回路設計,製作も行い,単細胞の接着・離脱制御が可能となる.可能ならRBC以外に白血球等その他の単細胞に本手法を応用展開し,年度末に本研究を総括する.上述のとおり,現在において最有力と考えられる電極構造の候補として細い棒状の電極と半月形状のグラウンド電極の組み合わせについて早急に検討を加えて,最終案に基づき本年度の繰越研究費を充当して薄膜電極付設のマイクロ流路の製造を外部業者に依頼する.一方で,選別された単細胞を特定のチャネルセクションに収集し,何らかの処理を施した後にはそこから単細胞を離脱させる方策も検討する必要のあることに思い至った.それゆえ,研究費繰越と外注によって加速可能と思われる単細胞選別法の研究の一環として離脱方法も追加し,数値計算,実験の両面から模索することとした.この他の研究費使用計画は当初のとおり執行する予定である.
高難度高選択的物質変換反応の理論的設計

研究代表者らは、研究期間内で、金属触媒による分子変換反応のメカニズムを、量子化学計算を用いて検討した。メントール不斉合成のキーステップであるRh(BINAP)+錯体とN, N,3-trimethylbut-2-en-1-amineの反応経路の探索を、反応物を人工的に押しつけることにより遷移状態を予測し反応経路を見つけるAFIR(人工力誘起反応)法とONIOM法を組み合わせて行った。さらに、得られた複雑な反応経路ネットワークから、Primの決定論的アルゴリズムを用いて、そのグラフを抽出し最小全域木(minimal span tree)を求めた。各経路のエネルギーを比較したところ、会合機構に比べて解離機構が有利であることがわかった。(2)Ni触媒によるC-O結合活性化反応の経路探索Ni触媒によるメトキシナフタレンとフェニルボロン酸エステルとのC-O結合活性化を伴うクロスカップリング反応を開発し2008年に報告された。PCy3を配位子として加えたときの反応ではCsFが必須である。ただし、カルベン配位子ICyを用いたときには、CsFは不要である。DFT計算(BP86-D3汎関数)を行い反応機構の検討を行った。C-O結合の配位子の電子的効果を検討した。(3)ほかにも、インドール置換のサレンCu(II)錯体の1電子酸化体の電子状態および、Cu(I)ープロリノール協同触媒存在下C-H結合活性化反応におけるエナンチオ選択性における弱い非共有結合(分散相互作用)の重要性について成果を出した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、以下の検討を行った。(1)工業的にもメントール合成で重要なRh(I)-BINAP触媒によるアリルアミンの水素異性化の反応経路を人工力誘起反応(AFIR)法により探索すると、複雑な反応経路ネットワークが見つかった。さらにこの複雑な反応経路ネットワークから有力な反応経路に絞る際に、グラフ理論に基づいたPrimアルゴリズムが有効であることを示した。この論文は学術誌論文Chemical ScienceへのEdge Articleとしての掲載を許可された。本研究は同じ新学術領域の計画班員との共同研究の成果である。(2) Ni触媒によるメトキシナフタレンとフェニルボロン酸のクロスカップリング反応のメカニズムの解明を行い、添加物としてのCsFの効果、配位子の効果、とくにカルベン配位子を用いることによる反応の加速効果に関して、分散力を含んだ密度汎関数法計算を用いて解明し、論文投稿に近い段階まで進んだ。本研究は同じ新学術領域の公募班員との共同研究の成果であり、塩を含まないカルベン配位子を用いた場合の反応の検討など、追加実験も行った。(3)次亜ヨウ素酸四級アンモニウムの酸化反応を用いたケトフェノール類の分子内シクロエーテル化反応について、Me4N+をモデルとして用い、量子化学計算を用いて現在反応機構を検討中である。Rh触媒の反応メカニズムを探索しただけでなく、グラフ理論に基づくアルゴリズムを組み合わせたということで、独創性が高く、論文掲載まで至った。これらに関する研究の進捗状況は順調である。一方、次亜ヨウ素酸塩の酸化反応を用いたケトフェノール類の分子内環化反応については、四級アンモニウム塩の単純なモデルを用いて求まった反応経路では実験的エナンチオ選択性を説明できないことがわかり、今後の対策を考える。今後も、共同研究による領域の発展に寄与したい。今後も、金属触媒反応に関する研究を行うほか、人工酵素の設計を見据えて、酵素反応機構も本課題で推進する。今後、高性能機能性分子の設計のため、理論と実験を融合した国際共同研究を行う。領域間共同研究の場合、今後は大学院生の受け入れが必要になる。
機能水を用いた義歯洗浄・消毒と義歯装着者の口臭抑制・義歯臭除去システムの開発研究

本研究は機能水を義歯装着患者の口臭の脱臭剤・義歯臭の除去剤として用いて,応用可能であるかについて比較検討を行った.実験1.全身疾患を有していない可撤性補綴物を装着していない患者を選択し,試験液(電解酸性機能水,50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液,コントロールとして蒸留水の3種類)20mlを用いて30秒間洗口を行った.その洗口前後の口臭を測定した結果,電解酸性機能水および50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液は洗口前と洗口後の測定値間に有意な減少が認められた.しかし蒸留水は洗口前と洗口後の測定値間に有意な減少が認めらなかった.また電解酸性機能水および50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液は蒸留水と比較して,洗口後の測定値が有意に減少した.電解酸性機能水は洗口前後で50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液と同等の減少を示した.実験2.全身疾患を有していない可撤性補綴物を装着している患者を選択し,始めに来院時,義歯を装着している状態で測定1として測定,次いで義歯をはずして測定2として測定,続いて義歯を試験液(電解酸性機能水,ピカ青錠を50°Cの温水に溶解したもの,コントロールとして蒸留水の3種類)100mlに5分間浸漬洗浄した後,再び義歯を装着して測定3として測定,その後義歯をはずして,試験液(電解酸性機能水,コントロールとして蒸留水の2種類)20mlで30秒間洗口した後に測定4として測定,最後に洗浄した義歯を再び装着して測定5として測定した.その結果、測定2,測定1,測定3,測定5,測定4の順に測定値が減少した.来院時から電解酸性機能水による義歯洗浄後,義歯洗浄および洗口後の順にコントロールと比較して有意な減少が認められた.また電解酸性機能水による義歯洗浄は測定値の減少が認められ、さらに電解酸性機能水による義歯洗浄および洗口はより大きな減少が認められた.本研究は機能水(オゾン機能水,電解酸性機能水,電解アルカリ性機能水の3種類)を義歯の洗浄・消毒剤として用いて,応用可能かどうかについて細菌学的に比較検討を行った.S.mutans,S.aureus,MRSA,C.albicansを約3.0×108CFU/mlに調整した菌液中に義歯床用レジンの試験片を浸漬,汚染し,各機能水にて各洗浄条件(条件1:オゾン機能水による前洗浄30秒間,後洗浄30秒間.条件2:オゾン機能水による前洗浄30秒間,後洗浄60秒間.条件3:電解アルカリ性機能水による前洗浄30秒間,電解酸性機能水による後洗浄30秒間.条件4:電解アルカリ性機能水による前洗浄30秒間,電解酸性機能水による後洗浄60秒間.条件5:電解アルカリ性機能水による前洗浄30秒間,滅菌蒸留水による後洗浄30秒間.条件6:電解アルカリ性機能水による前洗浄30秒間,滅菌蒸留水による後洗浄60秒間.条件7:滅菌蒸留水による前洗浄30秒間,電解酸性機能水による後洗浄30秒間.条件8:滅菌蒸留水による前洗浄30秒間,電解酸性機能水による後洗浄60秒間.条件9:滅菌蒸留水による前洗浄30秒間,滅菌蒸留水による後洗浄30秒間.条件10:滅菌蒸留水による前洗浄30秒間.滅菌蒸留水による後洗浄60秒間.)に従って洗浄後,検出された生菌数を測定した結果,条件1,2,3,4,5,6,7,8はすべての菌株においてコントロールである条件9,10と比較して生菌数の減少が有意に認められた,条件2,3,4,8はすべての菌株において検出限界(1.0×102CFU/ml)未満の生菌数の減少が認められた.条件1,5,6,7はすべての菌株において生菌数の減少が認められたが,検出限界以下ではなかった.最も短時間で生菌数の減少が認められたのは条件3であった.本研究は機能水を義歯装着患者の口臭の脱臭剤・義歯臭の除去剤として用いて,応用可能であるかについて比較検討を行った.実験1.全身疾患を有していない可撤性補綴物を装着していない患者を選択し,試験液(電解酸性機能水,50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液,コントロールとして蒸留水の3種類)20mlを用いて30秒間洗口を行った.その洗口前後の口臭を測定した結果,電解酸性機能水および50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液は洗口前と洗口後の測定値間に有意な減少が認められた.しかし蒸留水は洗口前と洗口後の測定値間に有意な減少が認めらなかった.また電解酸性機能水および50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液は蒸留水と比較して,洗口後の測定値が有意に減少した.電解酸性機能水は洗口前後で50倍希釈のネオステリンRグリーン水溶液と同等の減少を示した.実験2.全身疾患を有していない可撤性補綴物を装着している患者を選択し,始めに来院時,義歯を装着している状態で測定1として測定,次いで義歯をはずして測定2として測定,続いて義歯を試験液(電解酸性機能水,ピカ青錠を50°Cの温水に溶解したもの,コントロールとして蒸留水の3種類)

100mlに5分間浸漬洗浄した後,再び義歯を装着して測定3として測定,その後義歯をはずして,試験液(電解酸性機能水,コントロールとして蒸留水の2種類)20mlで30秒間洗口した後に測定4として測定,最後に洗浄した義歯を再び装着して測定5として測定した.その結果、測定2,測定1,測定3,測定5,測定4の順に測定値が減少した.来院時から電解酸性機能水による義歯洗浄後,義歯洗浄および洗口後の順にコントロールと比較して有意な減少が認められた.また電解酸性機能水による義歯洗浄は測定値の減少が認められ、さらに電解酸性機能水による義歯洗浄および洗口はより大きな減少が認められた.
血球細胞の増殖と分化に関する基礎的臨床的研究

血液細胞の増殖と分化に関する分野の研究は各種血液疾患の病態の解明や適切な治療法の確立のためにきわめて重要な位置を占めている。本研究班では、「重点領域研究」として「造血幹細胞の分化増殖の分子生物学的解析」が平成2年度より開始することを踏まえて、全国の血液学の専門家の間で討議を行ない、準備を行なった。1.基礎的分野では、インタ-ロイキン6などのサイトカインの作用と血液疾患の病態について検討が行なわれた。とくに、インタ-ロイキン6と多発性骨髄腫の病態との関連について広島大学蔵本淳班員より報告がなされ活発な議論が行われた。2.血球細胞の分化についてはサイトカインの作用とそのメカニズムについて検討が行われた。とくに、好塩基球の分化について変異マウスを用いた研究が大阪大学北村幸彦班員より報告され、がん遺伝子Kitとこれを調節する液性因子のもつ役割について詳細なデ-タが紹介され、議論が行われた。3.臨床分野では、顆粒球コロニ-刺激因子(GーCSF)やエリスロポエチンなどの造血因子の各種疾患に対する有効性が検討された。とくに、GーCSFの化学療法後の好中球減少症や骨髄移植後の投与、白血病治療後の好中球減少症に対する応用、AIDSにおける感染症に対する投与、再生不良性貧血や不応性貧血などに対する応用などが班長らによって報告された。さらに、GMーCSFやインタ-ロイキン1などのサイトカインの臨床応用についても討議が行なわれた。
歯周炎をインスリン抵抗性症候群に包括するための研究

肥満が危険因子となって発症する高血圧、高脂血症、2型糖尿病等の一連の生活習慣病は、仮に個々の疾患の程度が軽度であっても複数個合併することで動脈硬化を経て虚血性心疾患で命を落とす危険性が極めて高まることから、危険因子重積症候群あるいはインスリン抵抗性症候群として一括されている。近年、この虚血性心疾患の発症にsub-clinical rangeの慢性炎症が関与すること、従ってこういった慢性炎症はインスリン抵抗性症候群の一つに位置づける必要性があることが指摘されている。とくに、従来健常域とされているc-反応性蛋白(CRP)の範囲内であっても高めの値を示す者ほど将来的に心筋梗塞を起こす危険性が高まることが示され、CRP値の上昇は虚血性心疾患の発症を予測するうえで有用なマーカーとして捉えられるようになった。申請者らは昨年、歯周病感染の程度を示す歯周病菌に対する血清抗体価の上昇と高感度CRP値が有意に相関すること、すなわち歯周病菌に感染すればするほどCRP値が上昇することを示した。しかしながら歯周病によってCRP値が上昇するという概念を説得力を持って確立するには、上昇したCRP値が歯周治療によって低下することを証明しなければならない。そこで虚血性心疾患に対するハイ・リスク患者で重度の歯周炎を合併している患者に対して歯周治療を施し、治療前後におけるCRP値を比較検討した。その結果、歯周治療によってCRP値は有意に低下することを明らかにした。過去の報告を参考に考察した場合、この低下は虚血性心疾患に対する相対危険度を5060%低下させるに匹敵するものであった。肥満や2型糖尿病は歯周炎の危険因子と捉えられている。こうして発症した歯周炎が逆に虚血性心疾患のリスクを亢進することは、この種の患者の歯周炎もまたインスリン抵抗性症候群に包括する必要性があることを示すものと考えられた。肥満が危険因子となって発症する一連の疾患群(2型糖尿病、高血圧、動脈硬化症、高脂血症、上半身肥満等)は仮に個々の疾患の程度が軽度であっても複数個合併することで最終的に虚血性心疾患で死亡する危険性が極めて高いことから危険因子重積症候群あるいはインスリン抵抗性症候群と総称されている。近年、これらのうち2型糖尿病の発症や動脈硬化症の進展にsub-clinical rangeの慢性炎症が深く関わると考えられるようになった。その代表が肥満症である。肥満者では急性炎症マーカーであるc-反応性蛋白(CRP)のレベルが従来健常域とされた範囲のなかであっても高めの値を維持すること、体重減少によって低下することが明らかにされている。また、CRP値の上昇は将来の虚血性心疾患を予測するうえで極めて有効なマーカーであると考えられている。肥満者におけるCRP値の上昇は、脂肪細胞から産生されるインターロイキン-6が肝細胞からのCRP産生を促進することに由来すると考えられている。歯周炎も生体にとってはsub-clinical rangeの慢性炎症と捉えることができる。そこで肥満の影響を排除して歯周感染とCRP値の相関関係を調べた。その結果、非肥満糖尿病患者では歯周病菌Porphytomonas gingivalisに対する血清IgG抗体値と高感度CRP値が有意に相関することを見出した。すなわち、歯周病に伴う感染によってCRP値が上昇し全身の免疫応答が惹起されることを明らかにした。以上の結果から、慢性歯周炎の存在は肥満類似の機序で全身の炎症反応を持続させ、動脈硬化の進展に関与する可能性を示した。最終年度(平成15年度)は、歯周治療によってCRP値が減少するかどうかを調べる予定にしている。

こうして発症した歯周炎が逆に虚血性心疾患のリスクを亢進することは、この種の患者の歯周炎もまたインスリン抵抗性症候群に包括する必要性があることを示すものと考えられた。
掻痒メカニズムの解明と新規止痒剤の開発

化合物スクリーニングおよびPAR2阻害剤の評価を行い、使用可能なPAR2阻害剤の、接触皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症効果、またアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症効果と皮膚バリア機能改善効果を明らかにした。さらに、現在実施しているMC903モデルでは、ILC2がその病態形成に重要な役割を果たしていることから、ILC2について詳細に検討した。その中で、皮膚とその所属リンパ節に存在するILC2sにPAR-2が発現していることを見いだし、その機能の解明を試みた。具体的には、In vitroでマウスのリンパ節をPAR-2アゴニストで刺激し、ILC2sから産生されるサイトカインをフローサイトメトリーにて解析することにより、ILC2sが直接PAR-2に刺激され、IL-5を産生することを見出した。申請者はこの1年間、申請内容である掻痒メカニズムの解明と新規止痒剤の開発について研究を進めました。申請者は、化合物スクリーニングおよびPAR2阻害剤の評価を行い、使用可能なPAR2阻害剤の、接触皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症効果、またアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症効果と皮膚バリア機能改善効果を明らかにしました。現在はその分子メカニズムについて検討を行っています。当初期待されていた掻痒に対する効果については、アトピー性皮膚炎モデルマウスの1つであるMC903塗布モデルマウスにてスクラバリアル等を用いて検討を行いましたが明らかにはできませんでした。掻痒については今後、さらに掻痒の強いモデルの使用や、スクラバリアル以外の手法を用いて検討するため準備を進めています。以上より、ある程度の進展はありますが、当初の期待よりやや遅れていると評価しました。皮膚末梢神経の動態評価について、末梢神経特異的Creマウス(Peripherin-Creマウス)と、GFPを用いた蛍光カルシウムプローブであるGCaMPマウスを交配し、Peripherin陽性の末梢神経のみ緑色に発色するマウスを作成した。作成したマウスを用いて二光子励起顕微鏡を用いて末梢神経の動態評価を試みた。マウスの耳介に1%クロトンオイルと、カプサイシンを塗布し、末梢神経の発火の観察を試みたところ、マウス皮膚内のメラノサイトでも神経と同様に発火が観察された。末梢神経における発火のみを観察するためにマウスのアルビノ化をすすめ、また、掻痒に関連する神経としてPeripherinよりも多くの神経で発現を認めるNAV1.8-Creマウスを導入した。また、発火時のみならず定常時も末梢神経の観察をより明確にするため、NAV1.8-Creマウスに、GCaMPマウスに加え、dTomato(dimeric Tomato)遺伝子2つをタンデムにつなぎ合わせ、タンデム2量体を形成するよう設計されていることにより非常に明るい蛍光シグナルをもつtdTomatoマウスを交配して、NAV1.8-Cre×GCaMP×tdTomatoマウスを作成した。現在はこのマウスを使用し、掻痒に関連する末梢神経の動態評価を進めている。また、PAR-2は神経細胞にも発現しており、掻痒への影響も示唆されていることから、PAR-2阻害剤がADモデルマウスの掻爬行動にも効果が認められるかを検討するため、MC903モデルにおいて、スクラバリアルを用いて掻爬行動の観察を行ったが、PAR-2阻害剤投与による掻爬行動の回数の有意な減少は認めなかった。これについては、今後MC903モデル以外のADモデルマウスでも検討する予定である。マウスの耳介に1%

クロトンオイルと、カプサイシンを塗布し、末梢神経の発火の観察を試みたところ、マウス皮膚内のメラノサイトでも神経と同様に発火が観察された。末梢神経における発火のみを観察するためにマウスのアルビノ化をすすめ、また、掻痒に関連する神経としてPeripherinよりも多くの神経で発現を認めるNAV1.8-Creマウスを導入した。また、発火時のみならず定常時も末梢神経の観察をより明確にするため、NAV1.8-Creマウスに、GCaMPマウスに加え、dTomato(dimeric Tomato)遺伝子2つをタンデムにつなぎ合わせ、タンデム2量体を形成するよう設計されていることにより非常に明るい蛍光シグナルをもつtdTomatoマウスを交配して、NAV1.8-Cre×GCaMP×tdTomatoマウスを作成した。現在はこのマウスを使用し、掻痒に関連する末梢神経の動態評価を進めている。また、PAR-2は神経細胞にも発現しており、掻痒への影響も示唆されていることから、PAR-2阻害剤がADモデルマウスの掻爬行動にも効果が認められるかを検討するため、MC903モデルにおいて、スクラバリアルを用いて掻爬行動の観察を行ったが、PAR-2阻害剤投与による掻爬行動の回数の有意な減少は認めなかった。これについては、今後MC903モデル以外のADモデルマウスでも検討する予定である。
反射率差分光によるワイドギャップ半導体ヘテロ構造の評価

本研究では反射率差分光(RDS)装置を用いて窒化物半導体などワイドギャップ半導体ヘテロ構造材料についてヘテロ界面の局在電子状態を調べ、結晶欠陥特有のスペクトル構造やヘテロバレントな系や異結晶形なヘテロ構造について見られる多用な局在電子状態についてスペクトル上の特徴を解明した。また、線型光学効果を介して界面電界を調べる手法を確立した。以上の研究で得られた成果をデーターベースにしてIII-V族窒化物半導体に注目して結晶成長その場でヘテロ界面構造の電子状態とその形成過程を明らかにした。具体的な成果を以下に示す。(1)ワイドギャップ半導体ヘテロ構造のRDS分光ヘテロバレントな系(GaN/GaAs)に見られる多用な局在電子状態についてスペクトル上の特徴を解明した。平成12年度備品のRFプラズマセルを使って分子線エピタキシー過程でGaAs表面の窒化を行い、窒化その場で多波長同時のRDS測定を行い高測定精度な実験を実現し、窒化初期過程における界面形成過程を明らかにした。(2)ワイドギャップ半導体ヘテロ構造によるRDSスペクトルの特徴GaN/GaAsの系ではGaNのバンドギャップが約3.5eVと大きく、それによってヘテロ界面形成と同時にRDS信号強度の増大が確認でき、その場観察として利用できることを突き止めた。(3)InGaN結晶成長過程のRDS分光InGaN/GaAs(001)界面における局在電子状態の形成について明らかにした。また、結晶成長条件と界面電子構造との関係を解明し界面制御方法を構築した。(4)多波長同時のRDS測光による界面電子構造のダイナミックス本研究では同時分光が可能であるので結晶成長中に成長を中断することなく同時にRDS測定を行うことができる。これによりRHEEDとRDSの同時観測から原子レベルでの成長ダイナミックスモデルを構築した。本研究では現有の反射率差分光(RDS)装置を用いてさまざまなワイドギャップ半導体ヘテロ構造材料についてヘテロ界面の局在電子状態を調べ、結晶欠陥特有のスペクトル構造やヘテロバレントな系や異結晶形なヘテロ構造について見られる多用な局在電子状態についてスペクトル上の特徴を解明した。(1)ワイドギャップ半導体ヘテロ構造のRDS分光ヘテロバレントな系(GaN/GaAs)や異結晶形なヘテロ構造(GaN/サファイア)について見られる多用な局在電子状態についてスペクトル上の特徴を解明した。平成12年度備品のRFプラズマセルを使って分子線エピタキシー過程でGaAs表面の窒化を行い、窒化その場で多波長同時のRDS測定を行い測定精度をあげた実験を実現した。その結果、窒化初期過程における界面形成過程を明らかにした。本研究では反射率差分光(RDS)装置を用いて窒化物半導体などワイドギャップ半導体ヘテロ界面原子の配置の仕方や結晶欠陥の発生による局在電子状態や界面built-in電界による線型電気光学効果を明らかにすることを目的にしている。半導体ヘテロ界面では格子定数の不一致によって発生する転移、異なる半導体同士を接合したときのヘテロバレントな界面の発生などによって多様な電子状態が界面に局在して存在する。これらの詳細な評価は高品質な結晶成長をする上で欠かせない。これら目的を実現するため(a)成長過程での原子の配置による電子構造の解明、(b)熱処理による界面変化に関わるダイナミックスの解明に着目した研究を行い、下記の点を明らかにできた。

(1)InGaN結晶成長過程のRDS分光RF窒素プラズマソースをい用いてInGaNをGaAs(001)基板に成長した。結晶成長その場のRDS分光を行い、これまでに得られた研究成果と比較しながら界面における局在電子状態の形成について明らかにした。また、結晶成長条件と界面電子構造との関係を解明し界面制御方法を構築した。(2)多波長同時のRDS測光による界面電子構造のダイナミックス本研究では同時分光が可能であ多ので結晶成長中に成長を中断することなく同時にRDS測定を行うことができる。これによりRHEEDとRDSの同時観測から転移の貫通による電子構造に及ぼす影響を明らかにできたとともに界面電界の発生について調べ上げ、原子レベルでの成長ダイナミックスモデルを構築した。
栄養の概日リズム調節特性を利用した光栄養療法の開発

近年、24時間営業や交替制勤務等の増加により、人々を取り巻く明暗周期が不規則化している。不規則な照明条件は内因性の概日時計を撹乱させ、睡眠障害や肥満、糖尿病、高血圧、がんなどの発症リスクを高めることが明らかになりつつある。本研究では、マウスを用いて、活動リズムや時計遺伝子発現を調節できる幾つかのアミノ酸を同定し、概日時計に関連する疾病モデルマウスにおける改善効果を明らかにした。本研究により、概日時計の乱れをアミノ酸栄養により予防改善する道が開かれた。近年、24時間営業や交替制勤務などの増加により、人々を取り巻く明暗サイクルが不規則化している。不規則な照明条件は内因性の概日時計を撹乱させ、睡眠障害やがんなどの発症リスクを上昇させる。本研究では、概日時計を調節できるアミノ酸栄養を同定するため、マウスの活動リズムや時計遺伝子発現を指標としてスクリーニングを行った。20種類のアミノ酸をそれぞれCBA/Nマウスに経口投与し、各種指標を解析した結果、回転輪活動リズムの位相を変化させるアミノ酸が2種類、同活動リズムの光リセットを増強させるアミノ酸が1種類、また肝臓の時計遺伝子発現を変化させるアミノ酸が12種類同定された。また、アミノ酸の投与時刻によりホルモン分泌の調節作用が異なることが解明された。これらの結果から、適切なアミノ酸を適切な時刻に摂取することで、概日時計の乱れに起因する疾病を改善予防できる可能性が考えられる。同定したアミノ酸の機能性を評価するため、概日時計の乱れを伴うと知られる冬季うつ病モデルマウスにおいて、光リセット増強アミノ酸を投与後に高照度光照射を行ったところ、高照度光による抗うつ様効果が有意に強められた。また、縫線核の小領域におけるセロトニン免疫陽性細胞数や神経活性が光により増加すること、その増加が同アミノ酸の投与により部分的に強められることを見出した。次に、光条件を人為的に乱した慢性的時差ぼけモデルマウスを作製し、肝臓における時計遺伝子や細胞周期関連遺伝子、またホルモン受容体遺伝子の発現異常を見出した。同マウスにおいて、肝臓の時計遺伝子発現の調節機能をもつ幾つかのアミノ酸を投与すると、上記遺伝子発現の異常が部分的に改善された。本研究により、概日時計の乱れに起因する疾病をアミノ酸栄養により予防改善する道が開かれた。近年、夜間連続照明や交替制勤務などによる概日時計の乱れとそれに起因する疾病リスクの上昇が問題視されている。本研究では概日時計を制御できる機能性アミノ酸を同定するため、マウスの活動リズムや時計遺伝子発現を指標としてスクリーニングを行った。恒暗条件において20種類のアミノ酸をそれぞれ経口投与し、回転輪活動リズムの位相変化を測定したところ、位相を有意に後退させるアミノ酸が2種類同定された。また12時間明期12時間暗期の明期において各アミノ酸を投与し、1.5時間後における肝臓の時計遺伝子発現を解析したところ、12種類のアミノ酸が様々な時計遺伝子の発現を増減させた。アミノ酸により発現が調節される時計遺伝子の種類や誘導・抑制の方向が異なっていたが、構造や代謝経路が似たアミノ酸では類似の反応性を示す傾向が見られた。これらの結果は、アミノ酸栄養により中枢や末梢の概日時計を制御できることを示唆する。また、アミノ酸の投与時刻により概日時計やホルモン分泌の調節作用が異なることが解明された。これらの結果から、アミノ酸の種類のみでなく摂取時刻も生体リズム調節に重要であることが示唆された。本研究では今後、スクリーニングされたアミノ酸が概日時計の攪乱に起因する疾病に効果があるかを検討する予定である。そのための動物モデルとして、頻繁に光条件を前進させて作出した慢性的時差ぼけモデルマウスにおける概日時計の特性を解析したところ、肝臓における時計遺伝子や癌関連遺伝子の乱れが確認された。また、概日時計の乱れを伴うと知られる定型うつ病や冬季うつ病のモデル動物についても解析を行い、アミノ酸の機能性を検証する基盤が築かれた。予定していた実験は全て終了し、順調に結果が出ている。活動リズムや末梢概日時計の時計遺伝子発現を調節できるアミノ酸がスクリーニングされ、それぞれの機能性を深く追求するための基礎が出来ている。さらに、次年度で効果を確認するための慢性的時差ぼけモデルマウスやうつ病モデル動物の解析も終わっており、目的の病態を示すことを確認しているため、次年度の解析がスムーズに進むと期待できる。今年度スクリーニングされたアミノ酸を用いて、概日時計に関連した2つの疾病モデルマウス(慢性的時差ぼけマウスおよび冬季うつ病マウス)に対する改善効果を検討する。慢性的時差ぼけマウスは、新規光条件への反応の遅さと肝臓における時計遺伝子および癌関連遺伝子(c-Myc, p53)の発現異常を特徴とする。まずアミノ酸栄養の効果検証のための最適条件を探るため、慢性的時差ぼけ処理期間において経時的に肝臓の上記遺伝子発現を解析する。同定された最適条件において、活動リズムを調節するアミノ酸や肝臓の時計を調節するアミノ酸をそれぞれ投与し、上記遺伝子発現の異常を改善させるものを同定する。

また、アミノ酸の概日時計調節メカニズムについて、アミノ酸投与後の脳内アミノ酸含量の変化や関連遺伝子発現を解析することにより追求する。冬季うつ病は概日時計の乱れが一因と知られているため、アミノ酸栄養により改善できる可能性が考えられる。そこで我々が既に確立しつつある冬季うつ病様マウスにアミノ酸投与を行い、うつ様行動やそれに関連する脳内セロトニン神経系に見られる効果を解析する。また治療に最適な投与時刻や光条件との相互作用についても解析する。今年度は15,862円の残金が生じているが、次年度に代表者の物品費(遺伝子発現解析試薬)として使用予定である。次年度のその他の使用内訳に変更はない。
デスモヨーキン(AHNAK蛋白)ノックアウトマウスの作成とその機能の解析

表皮細胞間接着にはデスモソームが最も重要な役割を果たしている。その異常により多くの難治性皮膚疾患を生ずることが明らかとなってきた。デスモソームは種々の構成蛋白からなり、デスモプラキン、ブラコグロビン、デスモグレイン、デスモコリンなどほとんどのデスモソーム構成蛋白のcDNAが単離されている。私どもはそのcDNAを単離し解析した結果、デスモヨーキンは非常に特異な構造を有する蛋白で、ヒト癌抑制遺伝子AHNAK遺伝子産物と同一であることを証明したが、その真の機能はまだ不明である。今回の研究では、デスモヨーキン(AHNAK)の機能を明らかとするために遺伝子ターゲッティング法によるデスモヨーキンのノックアウトマウスを作成した。マウスのゲノムDNAライブラリーからデスモヨーキンのマウスゲノムDNAを単離し、マウスゲノムDNA、neo耐性遺伝子とHSV-tk minigeneを有する遺伝子ターゲッティングベクターを作成した。ES細胞に直線化した上記のターゲッティングベクターを挿入し、相同組換え体をスクリーニングし、その相同組換え体ES細胞を用いてヘテロ変異マウスそしてホモ体作成した。このマウスが実際にデスモヨーキンを欠損していることを遺伝しレベルならびに抗体を用いた蛋白レベルで確認した。同時に、デスモヨーキンの細胞レベルでの機能の研究のためにデスモヨーキンのノックアウトES細胞を樹立した。これらのノックアウトマウスおよびノックアウトES細胞を用いて、現在、各種の検索を施行中である。これらの解析から表皮の細胞接着、分化・増殖に対するデスモヨーキンの真の機能が明らかになることが期待される。特に、その表皮の細胞接着の変化を各種の手法を用いて検討している。なお、胎児死亡でないことが明らかとなり、表皮でのみその発現を欠失させるコンディショナルノックアウトマウスの作成は中止した。まず、デスモヨーキン(AHNAK蛋白)ノックアウトマウスの作成のための予備研究として、さらに、この蛋白の蛋白レベルでの機能の解析を進めた。デスモヨーキンのN末端・中央部・C末端部のcDNAを組み込んだ有核細胞発現系ベクターを用いた研究で、デスモヨーキンのN末端および中央部は細胞質内に分布し細胞膜および核内への移行は見られなかったが、C末端部には核内および細胞膜部両方への移行が見られた。この反応をtransfection効率をさらに高率にすることにより確認し、さらに、Laser con-focal microscopeを用いた詳細な検討でその分布の変化を明確にした。さらにこのC末端部の細胞内移行反応がカルシウムおよびTPAにより誘導されたことから、この移行にprotein kinase Cを中心とした細胞内情報伝達が重要であることが示唆された。次いで、デスモヨーキンノックアウトマウスのためのtargeting vectorを作成するためにまず、マウスゲノムDNAライブラリーをマウスデスモヨーキンcDNAによるhybridizationscreeningを行った。すなわち、以前クローニングしたマウスデスモヨーキンの中央部をコードするcDNAをpBluescript vectorから切り出し、ジゴキシゲニンでラベルした。マウスゲノムDNA Lambda FIXライブラリーと大腸菌XL1Buleで作製したプラークをナイロンメンブランに転写し、DNAハイブリダイゼイションならびに化学発光法により、陽性クローンを得、数回の再スクリーニングで単離した。現在、PCR法、DNA sequencingにより、そのゲノムDNAクローンのintron-exon organizationの解析中である。来年度は、このDNAを用いてTargeting vectorを作成し、ES細胞に導入する予定である。デスモヨーキン(AHNAK遺伝子産物)の機能は長い間不明であったが、私共は、ノックアウトマウス実験と平行して細胞生物学的研究も進め、デスモヨーキンの各部位特異的cDNAを有核細胞に発現させ、そのC末端が細胞膜と核への移行に重要であり、この蛋白が細胞内情報伝達に重要であることを示した。

最近1年間にデスモヨーキンに関して世界的に3種の研究成果が行われいずれも細胞内情報伝達における関与を示唆するもので、今後この分野の研究が重要になると思われ、ノックアウトマウス実験の必要性が高まっている。現在まで、私共はマウスのデスモヨーキンの全長ゲノムDNAの単離、解析を終了した。現在、エクソン-イントロンの解析を進めているが、ヒトゲノムと同様に単一イントロンの可能性が示唆されている。さらに、マウスのデスモヨーキンのリコンビナント蛋白を作製し兎に免疫して特異的抗体を作成中である。この抗体はノックアウトマウスの解析に重要である。現在、コンベンショナル法でデスモヨーキンの作製中である。すなわち、マウスゲノムDNA、neo耐性遺伝子およびHSV-tk minigeneを有する遺伝子ターゲッティングベクターを作成、ES細胞に挿入、サザンブロットによるスクリーニングして3種の相同組換体を得た。現在、常法に従って、全身のデスモヨーキン遺伝子のノックアウトマウスを作成中である。上述のようにマウスのデスモヨーキンのゲノムは単一イントロンの可能性があり、通常のCRE-loxP実験系を用いたコンディショナルノックアウトマウスの作製は困難である。そのため、現在作成中のコンベンショナルノックアウトマウスが胎児致死性であったときのために、単一イントロンに可能な遺伝子ターゲッティング法を検討中である。今回の研究から、表皮の細胞接着・分化・増殖に対するデスモヨーキンの真の機能が明らかになることが期待される。表皮細胞間接着にはデスモソームが最も重要な役割を果たしている。その異常により多くの難治性皮膚疾患を生ずることが明らかとなってきた。デスモソームは種々の構成蛋白からなり、デスモプラキン、プラコグロビン、デスモグレイン、デスモコリンなどほとんどのデスモソーム構成蛋自のcDNAが単離されている。私どもはそのcDNAを単離し解析した結果、デスモヨーキンは非常に特異な構造を有する蛋白で、ヒト癌抑制遺伝子AHNAK遺伝子産物と同一であることを証明したが、その真の機能はまだ不明である。今回の研究では、デスモヨーキン(AHNAK)の機能を明らかとするために遺伝子ターゲッティング法によるデスモヨーキンのノックアウトマウスを作成した。マウスのゲノムDNAライブラリーからデスモヨーキンのマウスゲノムDNAを単離し、マウスゲノムDNA、neo耐性遺伝子とHSV-tk minigeneを有する遺伝子ターゲッティングベクターを作成した。ES細胞に直線化した上記のターゲッティングベクターを挿入し、相同組換え体をスクリーニングし、その相同組換え体ES細胞を用いてヘテロ変異マウスそしてホモ体作成した。このマウスが実際にデスモヨーキンを欠損していることを遺伝しレベルならびに抗体を用いた蛋白レベルで確認した。
唾液腺癌の誘発・組織像・進展への内分泌撹乱物質の関与と性ホルモンレセプターの動態

1.実験的検索1)DMBA誘発ラット顎下腺癌の初期変化は腺房の変性・消失、導管の変化で、その後、小導管の増殖、導管の異型増殖を示して腺癌の発生をみる。腺癌には導管上皮や筋上皮の関与があり、それらの動態を排出導管結紮により検索した。結果:結紮後2-3日で導管にPCNA陽性細胞および細胞分裂像が出現して、導管細胞の細胞周期の短縮が生じ、3-4日では腺房の減少とTUNEL陽性細胞がみられ、7日に腺房はほとんど消失した。筋上皮細胞のPCNA陽性は結紮後2-3日にみられ、その後減少し、TUNEL陽性細胞(アポトーシス)は2日に出現し、5日に最大であった。2)ラットを用い、卵巣非摘出または卵巣摘出後に顎下腺にDMBAを投与、あるいはDMBA誘発腺癌発育後に卵巣摘出やtamoxifen投与行い病理組織学的に検索した。結果:腺癌は雌に多発し、エストロジェン分泌を阻害すると腺癌から扁平上皮癌への移行がみられ、移行像では導管細胞に形態変異を生じた。その際、腺癌構成エストロジェン・レセプター(ER)発現細胞にアポトーシスがみられ、移行した扁平上皮癌のER発現は殆ど消失するが、その後、扁平上皮癌の一部にER発現細胞が認められるようになる。これらの変化には性ホルモンとレセプターの動態の関与が示唆された。2.臨床病理学的検索粘表皮癌におけるER, PgR, cytokeratin (CK) 6,7,8,13,19 MIB-1、PCNAの発現動態を検索した。結果:粘表皮癌の53%にERが発現していた。類表皮細胞は中間細胞より、ERの発現率が高く、粘表皮細胞では発現細胞は僅かであった。ER発現はWHO分類の高分化型に多く、MIB-1は低分化型に高い傾向を示した。原発巣とリンパ節転移巣とでERとCKの発現様式が異なる症例もあった。ERは腫瘍細胞の分化に関連していることが示唆された。1.臨床的検索:粘表皮癌における主にエストロジェン・レセブター(ER)の発現動態と各腫瘍構成細胞の病理組織学的動態を免疫組織学的に検索した。対象は、本大学大学院口腔病態学講座において粘表皮癌と診断された19症例とした。ER,progesterone receptor(PgR),の発現様式、MIB-1による増殖活性、cytokeratin(CK)6,7,8,13,19の発現様式を病理組織学的に検索した。腫瘍構成細胞による相異は、類表皮細胞は中間細胞より、ERの発現率が高く、粘表皮細胞では発現細胞は僅かであった。ERの発現はWHO分類の高分化型に多く、MIB-1は低分化型に高い傾向を示した。CKの発現様式では、粘液産生細胞と導管様構造細胞に腺系マーカーのCK-7、8、19、が発現し、類表皮細胞では、CK-13が多く発現し、CK-7、8、19の散在的発現も認められた。CK-6は低分化型の中間細胞や類表皮細胞に多く発現した。

これらの結果からERは腫瘍細胞の分化、に関連していることが示唆され、また、ERの役割に性差の存在の可能性が推察された。結果:腺癌の発生は雌に多発し、また、腺癌から扁平上皮癌への移行がみられ、腺癌から扁平上皮癌への移行像を示す扁平上皮様組織像を示す部分では、ER発現細胞は減少し、組織像の移行にはエストロジェンの関与が示唆された。結果:粘表皮癌のER発現は53%で、腫瘍構成細胞では、類表皮細胞は中間細胞より高く、粘表皮細胞では僅かであり、WHO分類の高分化型に多く、原発巣とリンパ節転移巣とで異なる症例もあった。CKの発現は、粘液産生細胞と導管様構造細胞に腺系マーカーが発現し、類表皮細胞ではCK-13が多く、腺系マーカーも散在的にみられ、CK-6は低分化方型の類表皮細胞、中間細胞に多く発現した。この結果、ERの腫瘍細胞の分化・増殖への関連が示唆され、また、性差の存在の可能性が推察された。腺様嚢胞癌のER発現は組織像で異なり、充実部で約45%、筋状部で53%、線管部で26%であった。各組織形態においてERとPCNAに相関した発現を認め、ER陽性率では筋状、線管状を示す組織が充実性に比べPCNA強陽性例で多く発現し、エストロジェン依存性増殖が高い可能性が示唆された。2.実験的検索:雌Wistarラットを用い、卵巣非摘出または卵巣摘出後にDMBA(9,10,-dimethyl-1-,2-benzanthracene)を投与、あるいはDMBA誘発腺癌発育後に卵巣摘出やtamoxifen投与行い、臨床的検索に準じて検索した。結果:腺癌は雌に多発し、腺癌から扁平上皮癌への移行がみられ、移行像を示す扁平上皮様組織像の部分では、腺癌のER発現細胞にアポトーシスがみられ、ER発現細胞は減少した。組織像の移行には性ホルモンとレセプターの動態の関与が示唆された。
皮膚再生機構の解析-新規幹細胞マーカーの確率と機能解析

表皮や毛器官の維持と再生にはニッチと呼ばれる真皮側の細胞やマトリックス構造と上皮系の幹細胞との相互作用が重要である。皮膚の幹細胞は表皮と毛包の立毛筋が付着する毛隆起に局在すると推測されているが、創傷時には表皮のみならず毛包の幹細胞も活性化され真皮マトリックス上を遊走し表皮を再生する。我々はCre-LoxPシステムにより角化細胞特異的にSTAT3を欠失させたマウスを作成し、皮膚創傷治癒と毛包の再生には毛乳頭細胞や繊維芽細胞の産生するHGFによる角化細胞におけるSTAT3の活性化が必須であることを明らかにした。そしてSTAT3-/-マウスの角化細胞はin vitroの角化細胞遊走実験でHGFによる遊走刺激に反応しないが、これは細胞が基質に接着するために機能するfocal adhesion分子の1つであるp130Casのチロジンが過剰にリン酸化されているため再構築ができないことによることを明らかにした。Lig-1はleucine-rich repeatsとimmunoglobulin like domainsを有する1型の膜貫通型糖タンパク質であり、マウスでは脳のグリア細胞に特異的に発現している。我々は脳以外での発現について詳細に検討し、皮膚特に毛包のバルジ領域に限定してmRNA発現を認めることを明らかにした。そこでノックアウトマウスを作成し、皮膚の表現型を調べたところ、尋常性乾癬の表皮に類似していた。さらに乾癬病変部皮膚ではLig-1の発現は低下していた、Lig-1は分子構造上細胞間接着や情報伝達に関与していることが想定されるため、皮膚の幹細胞に特異的に発現しその機能を制御している可能性が考えられた。皮膚の幹細胞は真皮乳頭に接する表皮基底層や毛包の立毛筋が付着する毛隆起に局在すると推測されており、創傷時には表皮のみならず毛包の幹細胞も活性化され真皮マトリックス上を遊走し表皮を再生する。我々はCre-LoxPシステムにより表皮細胞特異的にSTAT3を欠失させたマウスを作成し、皮膚創傷治癒と毛包の再生には繊維芽細胞の産生するHGFによる表皮細胞におけるSTAT3の活性化が必須であることを明らかにしてきた。そこでSTAT3シグナルによる遊走メカニズムを明らかにするため、表皮細胞の遊走に関わるintegrin, MMPやfocal adhesion分子の燐酸化状態に対するSTAT3の関与につき検討した。その結果、STAT3欠失マウスではfocal adhesionを構成する分子であるp130Casが特異的に過リン酸化されていおり、focal adhesionの再構成ができないために遊走障害にいたることが明らかとなった。この部位には毛包の幹細胞が局在することよりLig-1が皮膚の幹細胞に特異的に発現している可能性が考えられた。さらにLig-1のノックアウトマウスでは、神経学的な異常は認めなかったもの、顔面、尾部皮膚の肥厚と落屑を生じ、乾癬様の組織所見を示した。乾癬では幹細胞の過剰動員が知られており、Lig-1は皮膚幹細胞において抑制的な役割をすると推測された(第62回米国研究皮膚科学会、2001年、5月)。

我々はCre-LoxPシステムにより角化細胞特異的にSTAT3を欠失させたマウスを作成し、皮膚創傷治癒と毛包の再生には毛乳頭細胞や繊維芽細胞の産生するHGFによる角化細胞におけるSTAT3の活性化が必須であることを明らかにした。そしてSTAT3-/-マウスの角化細胞はin vitroの角化細胞遊走実験でHGFによる遊走刺激に反応しないが、これは細胞が基質に接着するために機能するfocal adhesion分子の1つであるp130Casのチロジンが過剰にリン酸化されているため再構築ができないことによることを明らかにした。Lig-1はleucine-rich repeatsとimmunoglobulin like domainsを有する1型の膜貫通型糖タンパク質であり、マウスでは脳のグリア細胞に特異的に発現している。我々は脳以外での発現について詳細に検討し、皮膚特に毛包のバルジ領域に限定してmRNA発現を認めることを明らかにした。そこでノックアウトマウスを作成し、皮膚の表現型を調べたところ、尋常性乾癬の表皮に類似していた。さらに乾癬病変部皮膚ではLig-1の発現は低下していた。Lig-1は分子構造上細胞間接着や情報伝達に関与していることが想定されるため、皮膚の幹細胞に特異的に発現しその機能を制御している可能性が考えられた。
菌類・藻類・細菌３者間相互作用　～菌類の陸上進出と爆発的多様性創出の要因を探る～

水中で生まれた菌類は如何にして陸上進出し、爆発的に多様化したのか?水中の藻類に寄生していた原始的な菌類は、上陸して菌糸体制を確立し、藻類や植物と地衣や菌根という共生関係を築いた。この共生には内生細菌も関わった可能性が高い。そこで菌類・藻類・細菌3者間の既知相互作用について分類群毎にデータベースを構築した上で、相互作用に関わる進化の鍵を握る分類群や藻類主体のバイオフィルムを構成する微生物群を広く自然界から探索する。各々の培養株を確立し、培養下で相互作用を再現し、関連する遺伝子や細胞の微細構造を分類群間で比較解析し、藻類・細菌との相互作用が菌類の多様化の強力な駆動力となったという仮説を検証する。