hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宿主特異的毒素ビクトリンのレセプタータンパク質の単離と機能解析

宿主特異的毒素Victorinが標的とする宿主因子を同定するために、イネ品種日本晴より抽出した細胞壁タンパク質をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより細分画した後、各フラクションをBiacoreに供試し、Victorinとの相互作用の有無を確認した。ビオチン化Victorin(VicBio)を作成し、相互作用が認められたサンプルにVicBioを反応させ、pull-downアッセイを行った結果、15 kDa付近にVicBio特異的なタンパク質が検出された。検出されたタンパク質を質量分析計により解析を行った結果、還元酵素であるチオレドキシンが同定された。植物病原菌は宿主植物の免疫応答を打破するべく宿主特異的毒素(HST)に代表される感染決定因子を分泌する。エンバクビクトリア葉枯病菌が産出するビクトリンは、同菌感受性遺伝子であるVb保有エンバク品種にのみ毒性を発揮する。現在までVb遺伝子は単離されていないが、ビクトリンはミトコンドリア局在性のグリシン脱炭酸酵素複合体(GDC)を作用点とすることが報告されている。しかし、GDCはビクトリン非感受性エンバク品種においても保存されており、毒素の選択性については十分説明できない。本研究では、応募者らによる細胞表面におけるビクトリン認識機構に関する実験的証明を背景に、新規ビクトリン結合タンパク質をまず単離し、さらにVBCPと複合化し、シグナル伝達に関与する膜タンパク質群を同定して、同菌感受性誘導に係る特異的毒素認識機構を明らかにする。本年度は、ビクトリンを大量精製し、NHS-LC-LC-biotinによりビクトリンの有するアミノ基を修飾した(vicBio)。vicBioは、ビクトリンに比べ毒素活性は約三分の一と弱いが、毒素特異性は保存されており、感受性品種であるIowa X469のみに細胞死を誘導した。そこで、Iowa X469植物の細胞壁からタンパク質を抽出し、vicBio結合性タンパク質の同定を試みた。その結果、vicBio添加区でのみ特異的にストレプトアビジンでpull-downされる、約15kDaのタンパク質を検出することに成功した。以前のゲル濾過カラムを用いた研究から、ビクトリン結合タンパク質の分子量は20kDa以下であることが想定されており、今回得られた結果はこれらと矛盾しない。これまでの報告により、Victorinは細胞表面で認識されることが強く示唆されており、さらに、分子相互作用を検出するBiacoreを用いた解析の結果、Victorinは細胞壁タンパク質と相互作用することが明らかにされている。この相互作用は感受性エンバク品種だけでなく、非感受性エンバク品種さらには、他のイネ科植物においても認められた。Victorinが標的とする因子を同定するために、ビオチン化Victorin(VicBio)を作成し、ゲノム解読が終了しているイネ品種日本晴より抽出した細胞壁タンパク質を用いて、プルダウンアッセイを行った。その結果、15 kDa付近にVicBio処理区特異的なバンドが検出された。さらに、日本晴より抽出した細胞壁タンパク質をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより細分画した後、各フラクションをBiacoreに供試し、Victorinとの相互作用の有無を確認した。Victorinと顕著な相互作用を示したフラクションを用いて、プルダウンアッセイを行ったところ、先述と同様の結果が得られた。この結果から、Victorinはチオレドキシンを標的とし、間接的に感受性決定因子であるVb/Pc-2を活性化することにより、細胞死を誘導することが考えられ、エンバク葉枯病菌が宿主免疫系を利用し、感染を成立させることを示唆するものと考えている。エンバク葉枯病菌が生成する宿主特異的毒素ビクトリンはVb遺伝子保有エンバク品種に対し特異的に毒性を発揮する。これまで、ビクトリンの初期作用点はミトコンドリア内グリシン脱炭酸酵素複合体であると考えられていたが、我々は細胞壁タンパク質が同毒素の初期認識及びその機能発現に関与する可能性を示した。本年度は、細胞壁由来の新奇ビクトリン結合タンパク質(VBP)の単離を試みた。まず、精製ビクトリン標品とNHS-LC-LC-Biotinを反応させ、ビオチン化ビクトリン(VicBio)を作成した。VicBioの毒素活性は200倍まで低下しているが、明確な宿主特異的細胞死誘導能を保持していた。そこで、感受性エンバク品種由来の細胞壁タンパク質とビオチン化ビクトリンを反応させた後、VBPをストレプトアビジンビーズで回収した結果、約15 kDaのタンパク質を検出した。本VBPの品種特異性を検討するために、Vb非保有エンバク品種から細胞壁タンパク質を抽出して相互作用解析を行った結果、感受性品種と同様にVBPが検出された。

また、VBPとビクトリンの結合解析を、Biacoreを用いて行った結果、カルシウムキレート剤であるEGTAやEDTA添加により両者の相互作用能は著しく低下した。カルシウムはビクトリンのVBP結合に対し競合的に作用することが明らかになった。以上の結果より、ビクトリンはカルシウムを介してVBPと相互作用することが示唆された。本年度、予定通りビクトリン結合タンパク質を細胞壁画分から同定することに精製した。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、ビクトリンと相互作用する新奇VBPをエンバク細胞壁画分に同定することができた。現在は、予定通りVBPの同定を質量分析計により進めている。また、VBPとビクトリンの相互作用においてカルシウムが必須であることを明らかにし、以前報告されていたビクトリンの毒性発揮におけるカルシウムイオンの役割を示した。今後は、ビクトリン結合15kDaタンパク質の内部配列を質量分析計を用いて解析する。エンバク植物は、ゲノム解析が十分行われていないので、配列情報の獲得が困難な場合は、ビクトリン結合タンパク質が同様に検出されたイネ植物を用いる。ビクトリン結合タンパク質のcDNAから同組換えタンパク質を合成し、ビクトリンと結合するかを検討し、結合定数等の生化学的情報を得る予定である。また、以前の解析から、ビクトリン結合タンパク質はカルシウムイオン依存的にビクトリンと結合することが示唆されているので、同タンパク質のカルシウム結合能についても調査する。エンバク細胞壁より同定した15 KDaのビクトリン結合タンパク質を、質量分析計を用いて同定する。栽培エンバク品種は6倍体でありゲノム解析が終了していないため、質量分析計による同定が困難な場合は、大容量の細胞壁タンパク質を用いてpull-downし、VBPのN末端シークエンスを同定する。また、細胞壁タンパク質と相互作用するVbタンパク質を酵母two-hybridシステムを用いて検出する。
喘息の感受性遺伝子多型の複数同時解析

私達は網羅的に疾患発症に関する遺伝子多型の相乗作用の有無を検討するため、数十個の候補遺伝子の集合から、2つの遺伝子多型を取り上げ、1つの遺伝子多型で層化した後、他方の遺伝子多型と疾患の相関の検定と、遺伝子多型での層化前後の遺伝子多型対疾患の相関テーブルの適合度の2つの統計量を計算し、これを全ての可能な遺伝子多型ペアについて自動的に行うプログラムを開発し、遺伝子多型間の相互作用の検出を試みた。この方法によって、日本人喘息では、補体C3とロイコトリエン受容体CysLT2の遺伝子内での多型の相互作用(リスクハプロタイプの存在)が見出された。また、日本人小児喘息で、補体C5とInducible Tcell kinaseの遺伝子間相互作用が見つかった。次に喘息との相関を単独で示す候補遺伝子の遺伝子多型と遺伝子相互作用を加えてロジェスティック回帰式を作り、疾患の発症をどの程度説明できるかを検討した。イギリス人成人喘息では、4つの単独遺伝子と5遺伝子多型相互作用の回帰式によって、個人ごとの疾患の予測値を計算し、その大小によって、10グループに分けて、実際の患者、コントロールの人数を分けて検討した。最も予測値の高いグループ(グループ10)では、90%の者が実際に患者であるのに対し、最も予測値の低いグループ(グループ1)では、90%が正常であった。予測値が0.5付近のグループでは、ほぼ半数が患者となっていた。すなわち、疾患発症予測値の大小と実際の疾患の発生率は良い相関を示していた。日本人小児喘息では、4遺伝子と1相互作用、成人喘息では2遺伝子が回帰式に用いられ。日本人では、補体のハプロタイプが大きく疾患の有無に関与しているため、イギリス人より少ない遺伝子数でイギリス人での成績と同等な結果が得られた。以上の事から、ロジェスティック回帰を用いた多遺伝子の同時解析で、疾患発症のリスクの大小を表現可能であることが示唆された。
MIMO-OFDMAのリソース割り当てとパケットスケジューリングに関する研究

MIMO-OFDMAのスループット特性と誤り率特性の改善、およびユーザの公平性を得るために、リソース割り当てとパケットスケジューリングに関する研究を行う。まず、OFDMAにおける各トラヒックのQoS(Quality-of-Service)要求を考慮したパケットスケジューリング及びサブチャネル割り当て法を検討する。また、OFDMA-CDMにおけるRate Adaptationを用いたサブチャネルとOVSF符号割り当て法、および、MIMO-OFDMAにおけるサブキャリアおよび電力割り当て法を考える。そして、計算機シミュレーションにより、提案方式の有効性を明らかにする。1.適応チャネルを用いたOFDMAシステムにおいて、ユーザフィードバック量を低減するために、次タイムスロットにおいてスケジューリングされるユーザをモビリティに応じて選択し、選択されたユーザの使用可能なサブチャネルのチャネル状態情報のみをフィードバックする方式を検討した。提案方式では、パケットサイズおよびスケジューリング間隔を固定し、かつ、パケットサイズを最大変調方式で送信する場合に、スケジューリング時間内で送信できる大きさとする。これにより、各変調方式における1パケットの送信時間が算出でき、各スケジューリングにおいて開放されるサブチャネルを基地局で把握することが可能となる。計算機シミュレーションにより、提案方式は、無線リソースの有効利用を図ることができることを示した。2.複数の基地局の協調によるOFDMAサブキャリア割り当て方法を提案した。各ユーザのサブキャリア受信特性を考慮しつつ、各ユーザのサブキャリアの受信特性を複数の評価尺度を用いて、複数の基地局が協調して各ユーザにOFDMAのサブキャリアを割り当てることにより、さらに柔軟なサブキャリアを割り当てができることを、計算機シミュレーションにより明らかにした。3.マルチセル環境下でのOFDMAにおけるリソース割り当てにおいては、セルエッジ付近のユーザは、他セルからの同一サブチャネル干渉の影響を受けやすくため、割り当てビット数が減少し、ユーザの要求レートを満足しにくくなる。そこで、ビーコン信号を用いて中央制御の負荷を軽減しつつ、複数のセルの通信状態を管理し、全体のスループット特性およびOutage Probabilityの改善を可能とする方式を検討し、計算機シミュレーションにより、その有効性を明らかにした。1.従来,チャネル推定にはカルマンフィルタを用いた方法が用いられることか多いが,サンプルごとにフィルタを適用する必要があるため計算量が多くなる欠点があった.そこで定常状態のカルマンゲインを用いてチャネル推定を行うことで計算負荷を大幅に削減することを試みた.カルマンフィルタは理想的には定常状態で用いることが必要であるため,定常状態のカルマンゲインを用いることにより,フィルタの収束性の影響を受ける従来法よりも良い特性を示すことを計算機シミュレーションによって示した.2.OFDMA-CDMにおいて,チャネル状況やQoSに応じて送信レートを変化させる技術として,rate adaptationがある.これは,拡散符号の多重比率を変化させることで送信レートを柔軟に変化させるため,多重比率を小さくすることにより,付加的な周波数ダイバーシチ効果を獲得することができる.しかし,OFDMA特有のマルチユーザダイバーシチ効果を獲得するサブチャネル割り当て法は提案されてなく,rate adaptationの効果を十分に獲得してない.本研究では,CQIに基づくサブチャネル割り当て法及びOVSF符号割り当て法を提案し,計算機シミュレーションにより,rate adaptationを用いたOFDMA-CDMにおいて,提案のサブチャネル割り当て及びOVSIF符号割り当て法がフェージングの影響を低減できることを示した.3.QoSベースのMIMOシステムにおいて,変調方式と偏波面を適応的に制御して,システムスループットを最大にする方法を提案した.この方法ではチャネル行列を特異値分解した結果を基に通信に使用する偏波を決定し,併せてビット割り当てを行う.計算機シミュレーションにより特性を評価した結果,提案方式が,BERと送信電力に関する一定の条件の下,スループットが向上することを示した.周波数選択性フェージングに強く高速伝送が可能なOFDM変調方式やOFDMAアクセス方式、および、複数の送受信アンテナを用いることにより高品質かつ高速な伝送を実現するMIMOが基盤技術として注目され、これらを組み合わせた研究開発が盛んに行われている。本研究では、MIMO-OFDMAのスループット特性と誤り率特性の改善、およびユーザの公平性を得るために、リソース割り当てとパケットスケジューリングに関する研究を行う。本年度は、OFDMAにおける各トラピックのQoS要求を考慮したリソース割り当てに、適応編波制御を用いる方式と、ブロードキャスト時における効率的な周波数利用とQoSを提供するキューイング方式について研究を行い、以下のような成果をあげた。1.MOMOチャネルにおける特異値分解を用いた適応偏波制御法QoSベースのMIMOシステムにおいて、変調方式と偏波面を適応的に制御して、システムスループットを最大にする方法を提案した。この方法ではチャネル行列を特異値分解した結果を基に通信に使用する偏波を決定し、併せてビット割り当てを行う。計算機シミュレーションにより特性を評価した結果、提案方式は誤り率特性と送信電力に関する一定の条件下において、スループット特性を改善できることを示した。2.OFDMAシステムにおけるブロードキャストに関する研究マルチパス伝搬路での高速伝送に適したOFDMAを用いたシステムにおけるブロードキャスト時のキューイングモデルに焦点を当て、高い周波数利用効率と良好なQoSを提供できるキューイング方式を提案し、提案方式の有効性を明らかにした。
シロイヌナズナにおけるサーモスペルミンによる茎伸長制御機構の解明

茎伸長の欠損を示すacl5変異のサプレッサー変異sacを用いたこれまでの研究により、SAC51遺伝子のupstream ORF (uORF)を介した翻訳制御が、茎の伸長において重要な働きを担うと推測されている。本年度はサーモスペルミンと茎の伸長との因果関係を調べるため、以下の実験を行った。ナンセンス変異依存的mRNA分解機構(NMD)はナンセンス変異が起こった異常mRNAを選択的に分解するmRNA監査機構のひとつであり、uORFを持つSAC51mRNAはその標的となる可能性が示唆された。そこで、NMDの必須因子であるUPF1とUPF3の変異株を調べた結果、SAC51mRNAが過剰に蓄積し、SAC51がNMDの標的遺伝子であることが確認された。さらに、転写阻害剤のコルディセピンを植物に処理してSAC51mRNAの安定性を調べた結果、サーモスペルミンを合成しないacl5変異株において、SAC51mRNAは野生型と比較して不安定であることがわかった。この不安定化は外的なサーモスペルミンの処理によって解消されることから、サーモスペルミンはSAC51mRNAのuORFが翻訳されることによって誘導されるNMDを回避し、mRNAを安定化していることが示唆された。さらに、リボソームタンパク質の変異であるsac52-d及びsac56-d変異株において、サーモスペルミン非存在下でSAC51mRNAの安定化がみられ、sac53-d変異株においても弱い安定化の効果が認められた。以上の結果から、SAC51遺伝子は転写された後、サーモスペルミンによるuORFを介した翻訳調節とmRNA分解機構によって二重に制御されていることが明らかになった。SAC51 mRNAの安定性の解析はおおむね順調に進展し、研究成果を学会等に発表することができた。現在、これらの実験で得られた結果をまとめ、学術誌に投稿準備中である。これまでの研究により、NMDによるmRNA監査機構がSAC51の発現制御に関与する可能性が見出された。今後はNMDをはじめとするmRNA監査機構に関与する因子を欠失したシロイヌナズナにおけるSAC51 mRNAの安定性を調べることで、SAC51mRNAの遺伝子発現の詳細な制御機構を解明したいと考えている。茎伸長の欠損を示すac15変異のサプレッサー変異sacを用いたこれまでの研究により、SAC51遺伝子のupstream ORF (uORF)を介した翻訳制御が、茎の伸長において重要な働きを担うと推測されている。1.ac15-1サプレッサー変異(sac)の解析新たなsac変異を複数単離した。原因遺伝子の同定により、サーモスペルミンを介した茎の伸長機構についてさらなる知見をもたらす可能性がある。2.SAC51翻訳制御に関与するサーモスペルミンの構造サーモスペルミンと同様の炭素の並び方(C3C3構造)を持つノルスペルミンがサーモスペルミンの効果を代替することを示した(Kakehi et al. 2010)。そこで、このC3C3構造をもつマイナーポリアミンをac15変異株へ処理し、サーモスペルミンの効果を代替するポリアミンの探索を行った。その結果、C3C3構造を持つテトラミン(C3C3C2、C3C3C5)がサーモスペルミンと同様の生理活性があることがわかった。また、C3C3C3C4が部分的な代替効果をもつ一方で、C4C3C3C4に代替効果がみられないことから、サーモスペルミンを代替する条件は、4つ以上のアミノ基をもつこと、C3C3構造を分子構造の末端にもつことであると示唆された。3.ヒメツリガネゴケACL5遺伝子の機能解析ヒメツリガネゴケゲノムにある3つACL5推定オーソログ(PpACL5A,B,C)のをシロイヌナズナac15変異へ導入し、過剰発現させたところ、PpACL5B遺伝子とPpACL5C遺伝子を誘導した植物でのみ茎の伸長回復がみられた。さらに、ヒメツリガネゴケにおいて維管束植物の茎と葉に似た器官、茎葉体からサーモスペルミンを検出することに成功した。シロイヌナズナac15変異株は維管束において著しい道管組織の分化を起こす。維管束を持たないヒメツリガネゴケがサーモスペルミンを合成するという事実は、茎の進化とサーモスペルミンを結びつける上で重要な手がかりをもたらすと考えられる。茎伸長の欠損を示すac15変異のサプレッサー変異sacを用いたこれまでの研究により、SAC51遺伝子のupstream ORF(uORF)を介した翻訳制御が、茎の伸長において重要な働きを担うと推測されている。本年度はサーモスペルミンと茎の伸長との因果関係を明らかにするため、以下の実験を行った。(1)ac15-1サプレッサー変異(sac)の解析これまでの研究により、sac52-d及びsac56-dはSAC51 mRNAのuORFを介した翻訳制御に関わることが示唆されている。しかし、sac53-dについてはuORFに対して明確な翻訳促進効果がみられず、ac15変異を抑圧する仕組みについて不明な点が多い。リアルタイム定量PCRの解析から、サーモスペルミンの存在しないac15-1変異株では野生株と比べSAC51 mRNAが不安定化することがわかっている。sac52-

d変異はSAC51 mRNAを安定化し、同様の効果はsac53-d変異でもみられた。以上の結果から、sac53-dはSAC51 mRNAの安定化に寄与する可能性がある。今後sac56-d変異についても同様の解析を行うことを予定している。(2)ヒメツリガネゴケACL5遺伝子の機能解析ヒメツリガネゴケのゲノム上には3つACL5推定オーソログ(PpACL5A,B,C)が存在する,これらのACL5類似遺伝子がサーモスペルミンの合成能を有するかどうかを調べるため、大腸菌のタンパク質発現系を用いて酵素活性を調べた。茎を持たないコケ植物のヒメツリガネゴケでサーモスペルミンがどのように作用するか調べるため、サーモスペルミン合成欠損ヒメツリガネゴケの作出を試みている。現在、PpACL5A遺伝子ノックアウト株、PpACL5B遺伝子ノックアウト株を得ており、今後、3つのACL5類似遺伝子すべてを破壊した形質転換体の作出を行う。茎伸長の欠損を示すacl5変異のサプレッサー変異sacを用いたこれまでの研究により、SAC51遺伝子のupstream ORF (uORF)を介した翻訳制御が、茎の伸長において重要な働きを担うと推測されている。本年度はサーモスペルミンと茎の伸長との因果関係を調べるため、以下の実験を行った。ナンセンス変異依存的mRNA分解機構(NMD)はナンセンス変異が起こった異常mRNAを選択的に分解するmRNA監査機構のひとつであり、uORFを持つSAC51mRNAはその標的となる可能性が示唆された。そこで、NMDの必須因子であるUPF1とUPF3の変異株を調べた結果、SAC51mRNAが過剰に蓄積し、SAC51がNMDの標的遺伝子であることが確認された。さらに、転写阻害剤のコルディセピンを植物に処理してSAC51mRNAの安定性を調べた結果、サーモスペルミンを合成しないacl5変異株において、SAC51mRNAは野生型と比較して不安定であることがわかった。この不安定化は外的なサーモスペルミンの処理によって解消されることから、サーモスペルミンはSAC51mRNAのuORFが翻訳されることによって誘導されるNMDを回避し、mRNAを安定化していることが示唆された。さらに、リボソームタンパク質の変異であるsac52-d及びsac56-d変異株において、サーモスペルミン非存在下でSAC51mRNAの安定化がみられ、sac53-d変異株においても弱い安定化の効果が認められた。以上の結果から、SAC51遺伝子は転写された後、サーモスペルミンによるuORFを介した翻訳調節とmRNA分解機構によって二重に制御されていることが明らかになった。sac53-d,sac56-dに関する成果をまとめた論文の投稿が遅れているが、sac53-dの機能解析は予定通り概ね順調に進展している。ヒメツリガネゴケの実験に関しては、遺伝子欠損株も得られ、順調に進展している。SAC51 mRNAの安定性の解析はおおむね順調に進展し、研究成果を学会等に発表することができた。現在、これらの実験で得られた結果をまとめ、学術誌に投稿準備中である。sac53-d,sac56-dの成果をまとめた論文を早急に投稿する。新規sac変異の探索も行い、リボソームタンパク質とuORFを介した翻訳制御機構に関する新たな知見を得たいと考えている。ヒメツリガネゴケの研究に関しては、形質転換体の解析を進め、サーモスペルミン欠損状態における表現型への影響を調べる。
ポリグルタミン病の可逆性神経機能障害関連遺伝子のDNAチップによるスクリーニッグ

ポリグルタミン(PolyQ)病は種々の脊髄小脳変性症、ハンチントン病などの神経変性疾患の総称で、異常伸長PolyQ鎖(>40)を持つ原因蛋白質が神経細胞内に封入体として蓄積し、神経機能障害を来たして最終的に細胞死を引き起こすと考えられている。近年、PolyQ病では著明な細胞死が観察される前から神経症状が出現し、さらにそれが可逆的であることから、神経機能障害により発症することが示唆されているが、その詳細な分子機構は未解明である。本研究ではPolyQ病の可逆性神経機能障害の分子機構を解明するために、培養神経細胞での神経機能障害の出現過程、およびその回復過程における遺伝子発現の変化を解析する。本年度は、昨年度に樹立したテトラサイクリン誘導性に異常伸長PolyQ蛋白質Q81-YFPあるいは正常PolyQ蛋白質Ql9-YFPを発現するPC12細胞株PCl2/Tet-Q81、PCl2/Tet-Ql9について、表現型の解析を行った。その結果、PCl2/Tet-Q19ではQ19-YFPは細胞体にディフーズに分布し、有意な細胞毒性は認めなかったが、PC12/Tet-Q81では発現誘導約2日後からQ81-YFPが封入体として蓄積し始め、約1週間で顕著な細胞毒性を認めた。さらに発現誘導約2日後に再び発現を遮断すると、Q81-YFPの封入体が徐々にクリアランスされ、細胞死から免れることを明らかにした。以上の結果から、PolyQ病培養神経細胞モデルにおいて可逆性神経機能障害が存在する可能性が示された。ポリグルタミン(PolyQ)病は種々の脊髄小脳変性症、ハンチントン病などを含む一群の難治性神経変性疾患の総称で、異常伸長PolyQ鎖を持つ原因蛋白質のミスフォールディングが生じ、その結果難溶性の凝集体を形成して神経細胞内に封入体として蓄積し、神経機能障害を来たして最終的に細胞死を引き起こすと考えられている。近年、PolyQ病では著明な細胞死が観察される前から神経症状が出現し、さらにそれが可逆的であることから、神経機能障害により発症することが示唆されているが、その詳細な分子機構は解明されていない。本研究ではPolyQ病の可逆性神経機能障害の分子機構を解明するために、培養神経細胞での異常伸長PolyQ蛋白質の発現誘導による神経機能障害の出現過程、および異常伸長PolyQ蛋白質の発現遮断による神経機能障害からの回復過程における遺伝子発現の変化を、DNAチップを用いて網羅的に解析する。本年度は、まず培地中のテトラサイクリン除去により異常鎖長のPolyQ蛋白質Q81-YFPあるいは正常鎖長のPolyQ蛋白質Q19-YFPが発現誘導されるPC12細胞株PC12/Tet-Q81、PC12/Tet-Ql9を樹立し、それぞれのPolyQ蛋白質の発現誘導による表現型の解析を行った。その結果、PC12/Tet-Q19では発現誘導によりQ19-YFPは細胞体にディフーズに分布し、明らかな細胞毒性は認めなかったが、PC12/Tet-Q81では発現誘導約2日後からQ81-YFPが主に細胞質に封入体として蓄積し始め、約1週間で顕著な細胞毒性を認めた。さらに発現誘導約2日後に培地中にテトラサイクリンを再び添加して発現を遮断すると、Q81-YFPの封入体が徐々にクリアランスされ、細胞死から免れることを明らかにした。次年度にはその過程での遺伝子発現の変化を、DNAチップを用いて網羅的に解析する予定である。
内分泌撹乱物質による野生動物の生殖異常の解明とバイオマーカーの開発

これまでに内分泌撹乱化学物質(EDs)が猛禽類に何らかの影響を与えているとする報告が数多くみられる。PCB類はハクトウワシにおいて生殖低下と関連付けられ、DDEはハヤブサやチョウゲンボウにおいて卵殻薄化との関連が示唆されている。わが国でも猛禽類の個体数減少及び繁殖状況の悪化が報じられている。その主たる要因は生息環境の悪化にあると思われるが、EDsも何らかの影響を与えていると推測されている。そこで本研究では、猛禽類において影響が大きいと考えられるダイオキシン類、PCB類およびDDT類の蓄積濃度とその影響を調べた。また、EDsの繁殖学的影響を明らかにするにあたり、猛禽類の繁殖生理解明の端緒としてトビの精巣の形態学的観察を行った。その結果、ダイオキシン類とP, P'-DDEに関して、何らかの影響が及んでいる可能性を否定できない蓄積が多くの猛禽類に認められた。繁殖期成鳥の検体が少なく、配偶子形成に関して十分な情報を得られなかったが、性腺に組織学的異常は認められず、これらの物質が発生学的影響を与えている可能性は低いと思われた。ダイオキシン類の蓄積傾向は種や生息地による食性の違いを反映していることが示唆され、今後食性を把握することにより猛禽類が地域の汚染状況のモニター生物として有用になり得ることが考えられた。しかし、影響や蓄積傾向を明らかにするには、食性や薬物代謝能、対象物質に対する感受性など、猛禽類に関するより詳細な研究が必要と思われる。トビ成鳥の精巣が季節により形態学的に大きな変化を遂げることが示された。更に詳細を知るには、より多くの、年齢の判明している個体に関し調べる必要がある。
老化に関わる難治性疾患の予防・改善を目指した天然薬物の研究

白桃花から分離したアロマデンドリンは、脂肪細胞のアディポネクチン発現量を上昇させるため、類似化合物を合成して神経細胞に対して試験を行い、神経細胞を保護する可能性が認められた。ベンケイソウ科植物Rhodiola sacraからマクロファージの活性化を抑制する2-phenylethyl gallateを明らかにし、類似化合物を合成し慢性炎症に有効である可能性が示唆された。アルツハイマー疾患などで問題となる神経疾患を保護する化合物を探索する目的でLicopodium serratum var. longipetiolatumの成分研究を行い新規アルカロイドeffususol Aを単離した。筋委縮性側索硬化症(ALS)に対する有効な天然薬物としてレイシ(霊芝)がスクリーニングの結果挙げられた。抽出後、クロマトグラフィーにより分画し、抗酸化活性及びODAAP-EA毒性軽減活性を持つ画分から、レイシに見られる特異な8種のトリテルペンを単離し構造解析を行った。4種の化合物については、抗酸化活性を認めており、ODAAP-EA毒性軽減活性について検討中である。中国産ベンケイソウ科植物Rhodiola sacra S. H. Fuからこれまでにマクロファージの活性化を抑制(NO産生抑制)する化合物として2-phenylethyl gallateを報告しているが、これをリード化合物としてベンジルアルコール部のメチレン部を2から5に延長した4種の化合物を合成し活性評価を行った。その結果、今回、25種のアナログ化合物を合成し、NO産生抑制活性を評価した。その結果メチレン4個化合物に最も強い活性が認められた。現在gallic acid部位の水酸基の置換様式を変えた化合物の合成を進めている。ヒカゲノカズラ科Licopodium属植物は、神経変性を特徴とする疾患、特にアルツハイマー病に対する有望な治療薬として研究が進められているが、台湾産のLicopodium serratum var. longipetiolatumについて成分探索を行い新規アルカロイドserralongamine Aを構造決定したが、アセチルコリンエステラーゼの阻害活性は認められなかった。他の成分について探索中である。白桃花からフラバノノール誘導体であるaromadenndrnを抽出分離を行い、NMR,MSより本物質の同定した。また、本物質の量を確保するため、2,4,6-trihydroxyacetophenoneと3-methoxymethoxy benzaldehydeを出発原料として2',4',6',4-Tera(methoxymethoxy)chalconeを作り、2',4',6'-Tris(methoxymethoxy)phenyl(3-(4-methoxymethoxy phenyl) oxiran-2-yl)methanoneを経たのち、(2R,3R)-(+)-Aromadendrin及び(2S,3S)-(-)-aromadendrinの混合物を得た。これらのエナンチオマーの混合物についてキラルカラムで分離を試み、それぞれ2R,3R)-(+)-Aromadendrin及び(2S,3S)-(-)-aromadendrinを得ることに成功した。白桃花より得た天然型のaromadenndrnについて前駆脂肪細胞3T3-L1を用いてアディポカインについて検討を行った。3, 10, 30mMの濃度でadiponectinの発現量について検討したところ用量依存的な上昇をみとめた。一方、resistin発現量について影響を検討したところ、コントロールに比べ有意な変動は観察されなかった。この結果aromadenndrnはadiponectinの発現量の発現を特異的に増加させることが認められた。その他、オノエヤナギからampelopsinの単離、スナジヒゴタイからマクロファージ活性化抑制成分を明らかにした。、医歯薬学筋委縮性側索硬化症、老化と関わりを持つアルツハイマー病の神経疾患に関わる生薬成分について予定通り進められている。また、慢性炎症疾患と関わりが深いマクロファージのNO産生抑制活性を持つ化合物についてRhodiola sacraから得た2-phenylethyl gallateをリード化合物としてアナログを合成し、メチレン鎖の長さによる構造活性相関を明らかにした。数種の生薬について成分分離が進んでおり、ある程度順調に進んでいると考えている。またからフラバノノール誘導体の合成とエナンチオマーの分離法について解決できたと考えている。線虫を用いた寿命延長試験とリガンデバインディングアッセイについては次年度に行うことを考えている。生薬からの成分分離と生物活性評価を引き続き継続するが、これまで生物活性評価が、in vitroによる試験が主体であったが、これまでの試験を継続すると共にin vivo試験を行う。すなわち寿命に関しては、レイシや及びハクトウカから得た単離成分についてセンチュウを用いた寿命延長試験、脂肪細胞分化促進成分についてはマウスを用いてアディポネクチンに及ぼす影響について検討する。そのためには充分な試験サンプル量を確保するために、生薬からの成分分離と共に化学合成が可能な化合物は合成を行い進める予定である。

脂肪細胞の分化促進、PPARγアゴニストを目的としたリガンドバインディングアッセイ法により活性成分を評価し、構造活性相関を視野に入れて生薬中の活性成分探索と化合物の合成を進めたいと考えている。最終的には糖尿病モデル動物を用いたin vivo試験により評価し医薬品となりうるリード化合物の創製を目指す。残額が2万円を切りカラム購入に満たなかったため、次年度繰越とした。カラム機材を購入する。生薬から活性成分を分離・構造決定するために、クロマトグラフィー(HPLCを含む)の担体、溶媒、分析料金にしようする。また、合成を行うための試薬代といて使用する。生物活性評価のための細胞、培地、プラスチック類に研究費をあてる予定である。
選挙制度の変化が政治変動に及ぼすインパクトに関する日米共同研究:小選挙区制による変化の日本的特性

本研究は、日本の選挙制度・および投票行動の変化が政治変動に及ぼすインパクトを継続的に研究している日米の研究者チームが、1996年度に取得した衆議院選挙全国パネルデータの分析・研究を発展させ、98年、2000年にも多角的かつ補足的な調査を行うことによって、90年代後半の日本の政治変動を、有権者のレベル、政治文化のレベル、制度のレベルの3つの視点から説明する、理論的・実証的成果を得ることを目的としていた。まず1996-8度の衆院選全国パネル調査データを核として制度の影響の2モデルの比較検討を行い、日本の政治過程における政治文化的な影響力の検討を通じて、有権者から見た政治制度や政党再編過程に対する日本的な適応と不適応とを検討してきた。この調査データセットの英文化を進め、これを東京大学社会科学研究所のデータベース公開サイト(SSJDA)から広く内外の研究者に公表した。日本語が読めずとも日本のデータが分析できることになる。このことによって、データベースのブラックホールと呼ばれる日本の社会調査データに政治行動データの面で、大きく寄与したと考える。2000年度には日本の政治文化の形成に関するスノーボールデータを取得し、近年議論が盛んなソーシャル・キャピタル論と、本チームが一つの主眼としている社会的ネットワークめ政治意識に対する規定力の測定との間の概念的・実証的橋渡しを念頭に置いた調査・分析を実施した。本研究は、日本の選挙制度・および投票行動の変化が政治変動に及ぼすインパクトを継続的に研究している日米の研究者チームが、平成8年度に取得した衆議院選挙全国パネルデータの分析・研究を発展させ、90年代後半の日本の政治変動を有権者のレベル、政治文化のレベル、制度のレベルの3つの視点から説明する理論的・実証的成果を得ることを目的とした。衆院選全国パネル調査データでは日本の政治過程における政治文化的な影響力の検討を通じて、有権者から見た政治制度や政党再編過程に対する日本的な適応と不適応とを検討した。また平成10年の参議院議員選挙でも同一の回答者の追跡パネル調査を実施し、時間の変化を含んだ影響過程の分析を可能にした。調査対象者は96年選挙時の前後調査に回答した1,244人とし、参議院選挙前の調査(郵送調査で回収数916、96年の回答者1244に対し73,6%)、後調査(電話調査で回収数634、51.0%)が行われた。調査内容は日米の研究分担者が共同で設計し実施したもので、政党スキーマ、争点、政党支持、無党派層、政治的アパシーから政治文化までを含んだ。この調査実施態勢は平成11年度にも継続される。また、平成8年度の衆議院選挙のデータは、東京大字社会科学研究所のデータベース(http://www.iss.u-tokyo.ac.jp/pages/ssjda-e/)を通じて日本語版が既に公開されており、関心ある研究者に利用可能となっている。現在このデータファイルの英文化を進めており、広く世界に日本の投票行動データを公開することで、日本研究の発展に寄与することを狙っている。平成11年度の本研究では、まず、平成8年度から継続中の衆議院パネル調査データセットの英文化を進め、これを東京大学社会科学研究所のデータベース公開サイト(SSJDA)から広く内外の研究者に公表した。また、このデータを用いて、いくつかの研究発表を行っている。選挙学会での発表などとともに、雑誌・書籍に論文が掲載される。また、その後の政治変動と有権者の政治意識の変化とをトレースするために改めてオムニバス形式の全国調査を実施し、平成12年度中に実施される次の衆議院議員選挙に向けての変化を測定している。特に近年議論が盛んなソーシャル・キャピタル論と、本チームが一つの主眼としている社会的ネットワークの政治意識に対する規定力の測定との間の概念的・実証的橋渡しを念頭に置いた調査を行っている。

本研究は、日本の選挙制度・および投票行動の変化が政治変動に及ぼすインパクトを継続的に研究している日米の研究者チームが、1996年度に取得した衆議院選挙全国パネルデータの分析・研究を発展させ、98年、2000年にも多角的かつ補足的な調査を行うことによって、90年代後半の日本の政治変動を、有権者のレベル、政治文化のレベル、制度のレベルの3つの視点から説明する、理論的・実証的成果を得ることを目的としていた。まず1996-8度の衆院選全国パネル調査データを核として制度の影響の2モデルの比較検討を行い、日本の政治過程における政治文化的な影響力の検討を通じて、有権者から見た政治制度や政党再編過程に対する日本的な適応と不適応とを検討してきた。この調査データセットの英文化を進め、これを東京大学社会科学研究所のデータベース公開サイト(SSJDA)から広く内外の研究者に公表した。日本語が読めずとも日本のデータが分析できることになる。このことによって、データベースのブラックホールと呼ばれる日本の社会調査データに政治行動データの面で、大きく寄与したと考える。2000年度には日本の政治文化の形成に関するスノーボールデータを取得し、近年議論が盛んなソーシャル・キャピタル論と、本チームが一つの主眼としている社会的ネットワークの政治意識に対する規定力の測定との間の概念的・実証的橋渡しを念頭に置いた調査・分析を実施した。
日本人顎骨の内部構造に関する研究

顎骨の内部構造は、歯牙の有無、年齢、病変の存在により様々な変化が観察され、現在のところインプラントを植立させる内部構造が正確に把握されているとは言い難い。そこで有歯顎、無歯顎における下顎骨の緻密骨並びに海綿骨の骨粱形態の観察を行い、それぞれ比較検討した。試料は、東京歯科大学解剖学教室所蔵の成人屍対のうち有歯下顎骨5体、無歯下顎骨5体である。脱水処理を行いポリエステルレジン樹脂に包埋した後、硬組織薄片切断機にて下顎底面に垂直に厚さ500ミクロンの非脱灰連続切片を作成し、各切片の軟X線写真を撮影した。得られた軟X線写真を画像解折装置に入力し骨形態計測を行い、骨粱及び周囲の緻密骨の構造を解折した。1.緻密骨の幅上部舌側では切歯部で厚く、その厚みは、有歯顎よりも無歯顎で厚かった。唇側では有歯顎、無歯顎とも大臼歯部において最も厚いことが示された。中央部では前歯部、臼歯部とも無歯顎と比較して有歯顎で厚い結果となった。下顎底部では、有歯顎が無歯顎に比較して厚い結果となった。2.骨粱の割合骨粱幅上部の骨粱は有歯顎無歯顎とも切歯部で多く、小臼歯部では少ない結果となった。中央部では大きな差は認められなかった。下部では有歯顎は、切歯部から大臼歯部に向かい骨粱は減少した。無歯顎では切歯部で多い結果となった。骨粱幅は有歯顎無歯顎とも切歯部で太く、次いで大臼歯部、小臼歯部の順となった。今後例数を重ね、上顎骨の内部構造についても観察し検討する次第である。
生体膜の形態形成と恒常性の維持に関わる細胞内機構の解明

ホスファチジルエタノールアミン(PE)は真核生物の生体膜主要構成成分である。これまでにPE合成に関わる酵素は同定されているが、輸送機構については知見が乏しい。これは細胞内におけるリン脂質輸送を評価する実験系が構築されていないためである。そこで小胞体からミトコンドリアへのPE輸送について、昨年度までにこれを評価する系として、人工タンパク質mitopmtを利用した実験系を構築した。そこで本年度はこの実験系を用いて、実際に細胞内PE輸送の観測を試みた。しかしながら、出芽酵母の放射標識エタノールアミン取り込み効率がきわめて悪く、またコリンによってこの取り込みは強く阻害された。そこでin vivoでのPE輸送測定を断念し、精製膜画分やセミインタクト細胞を用いてPE輸送の再構築を試みた。種々の条件検討の結果、精製膜画分やセミインタクト細胞においてPEを標識することに成功した。ところがこれらの条件ではmitopmtの活性が観察されないことが分かった。これはpmtがin vivoにおいては著しく不安定なためと考えている。また昨年度までに.細胞内PE輸送に関わる因子の取得を目的とし、pdlΔ株の呼吸機能欠損に対するマルチコピーサプレッサーを取得していた。そこでこれら遺伝子産物の細胞内機能について検討するため、高発現による細胞内リン脂質組成への影響を調べた。その結果、これらのうち少なくとも1つのクローンにおいては、高発現によって細胞内PE量が有意に増加していることが確認された。この株においてはミトコンドリアPE量も増加していたことから、ミトコンドリアPE量の回復によって呼吸機能が改善されたものと考えられた。生体膜の形態形成と恒常性の維持に関わる膜脂質の細胞内代謝調節機構について調べるため、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて脂質滴の形成機構に関する解析を行った。脂質滴にはステロールエステル(SE)とトリアシルグリセロール(TAG)の2種類の中性脂質が含まれている。そこでまずそれらを区別するため、SE合成酵素Are1pとAre2pの二重欠失株、TAG合成酵素Dga1pとLro1pの二重欠失株を作製した。これらの株ではSEのみやTAGのみが貯蔵された脂質滴が形成される。これらの株を用いてSEとTAGのそれぞれについて、その脂質滴への輸送に関わる因子の探索を試みた。まずEUROSCARF破壊株コレクションとこれらの株を掛け合わせ、SE合成欠損・TAG合成欠損を背景にもつ5000株の破壊株コレクションを作製し、そのそれぞれについて脂質滴をナイルレッドで染色し、プレートリーダーによって簡便に定量することを計画した。またプレートリーダーから得られたデータについて細胞数による標準化を行うため、ヒストンH2BをコードするHTB2をCFPで標識し、その蛍光量を標準化に用いることにした。そこで、SE合成欠損株・TAG合成欠損株のそれぞれについて、HTB2のC末端側にCFPを導入した。プレートリーダーで中性脂質量を定量する条件について培養条件・染色条件・測定条件の検討を行ったが、野生型株と脂質滴欠失株との間で有意なナイルレッド蛍光量の差を検出できる条件を見出すには至らなかった。これまでにPE合成に関わる酵素は同定されているが、一方で輸送機構については知見が乏しい。これは細胞内におけるリン脂質輸送を評価する系が構築されていないためである。そこで小胞体からミトコンドリアへのPE輸送について、これを評価するために以下のような実験系の構築を試みた。まず出芽酵母内在性のPEメチル化酵素Pem1,Pem2を欠失しPEからホスファチジルコリン(PC)への変換を停止する。その上でミトコンドリアにPEメチル化酵素を局在させる。このような細胞に対して放射標識エタノールアミンを与えると、ケネディ経路で小胞体に作られた標識PEは、ミトコンドリアへと運び込まれた場合のみPCへと変換される。この手法を用いることで、標識PCの合成量を指標に小胞体からミトコンドリアへのPE輸送を評価することが可能となる。実験系構築のため、酢酸菌由来のPEメチル化酵素Pmtを利用することにした。PmtのN末側にPet100のシグナル配列および膜貫通領域を、C末側に3xHAを連結した融合蛋白質mitopmtは想定した通りミトコンドリアへと正しく局在した。さらにmitopmtは融合蛋白質となっても酵素活性を失わず、pem1Δpem2Δ株のコリン要求性を抑圧し、酵母細胞内でPEをPCへと変換する能力を有していた。そこで実際に標識エタノールアミンを細胞に取り込ませたところ、mitopmtによって標識PEから標識PCへと変換されている様子が観察された。以上の結果から、これまで不可能であった小胞体からミトコンドリアへのPE輸送を評価する実験系の構築に成功した。

そこでin vivoでのPE輸送測定を断念し、精製膜画分やセミインタクト細胞を用いてPE輸送の再構築を試みた。種々の条件検討の結果、精製膜画分やセミインタクト細胞においてPEを標識することに成功した。ところがこれらの条件ではmitopmtの活性が観察されないことが分かった。これはpmtがin vivoにおいては著しく不安定なためと考えている。また昨年度までに.細胞内PE輸送に関わる因子の取得を目的とし、pdlΔ株の呼吸機能欠損に対するマルチコピーサプレッサーを取得していた。そこでこれら遺伝子産物の細胞内機能について検討するため、高発現による細胞内リン脂質組成への影響を調べた。その結果、これらのうち少なくとも1つのクローンにおいては、高発現によって細胞内PE量が有意に増加していることが確認された。この株においてはミトコンドリアPE量も増加していたことから、ミトコンドリアPE量の回復によって呼吸機能が改善されたものと考えられた。
インドネシアにまん延する病原性腸管寄生原虫の遺伝的多型解析

インドネシアにおける網羅的な原虫同定に分子分類を活用し、宿主特性との相関解析によって分子疫学的研究を実施した。成果は以下の通り。(1)アメーボゾア、フォルニカータ、パラバサリア、ストラメノパイルの調査地域における高度まん延を確認した。(2)学童の寄生原虫の感染率と年齢および性別との相関の可能性が種々の原虫について示唆された。(3)学年が進むにつれて低下するジアルジアの感染率は、主に遺伝子型Aの感染率の低下によって起こる。(4)腸トリコモナスは、特定株の人獣共通感染症として同地域にまん延している。網羅的なアプローチでの分子疫学は、途上国における寄生原虫のまん延実態の解明に極めて有用と考えられた。成果は以下の通り。途上国の寄生虫まん延地域には多様な病原性腸管寄生原虫が分布している。しかし、住民の日常的な寄生虫感染状況の詳細は一部の種を除いてはほとんど明らかにされていない。本研究では分子分類を用いた種同定と遺伝子型解析によって、インドネシアの寄生虫まん延地域に分布する各種腸管寄生原虫の種内多型を網羅的に解析し、種・遺伝子型の地理的分布、宿主特異性、感染ルートを明らかにすることで、各種・型の生態学的な特徴を考慮し、まん延に対抗しうる有効な寄生虫対策を構築する。本年度は、インドネシア、スンバ島農村部の小・中学校を拠点とした学校ベースの糞便回収と周辺地域での動物サンプル収集を、8月に約2週間のフィールドワークとして実施した。サンプル数は、ヒト便サンプル472、尿540サンプルを回収した他、同地域でヒトと密接に関係する動物からはブタ42、ネズミ23、ウシ13、ウマ14、水牛10、アヒル20、ロバ2、ヤギ6の糞便サンプルを収集した。また、ヒト糞便サンプルの顕微鏡検査では、回虫137(29.0%)、鞭虫69(14.6%)、鉤虫59(12.5%)などの蠕虫の陽性率をみた他、ジアルジア80(16,9%)、アメーバ類168(35.6%)と高率な原虫感染を検出し、またランダムに選択したヒト糞便195サンプルの培養検査では、ブラストシスチス31(15.9%)および腸トリコモナス14(7.2%)を検出した。現在、PCRおよびシークエンス解析による今年度採取サンプルの多型解析が進行中であり、詳細結果が得られ次第、家庭訪問によって得たGPS情報、インタービュー結果等との相関解析に供し、寄生虫の生態を明らかにしていく予定である。途上国における腸管寄生原虫の網羅的分子疫学調査を実施し、寄生虫蔓延の実態を明らかにすることを目的として、本年度は、2013年8月13日8月29日までインドネシアスンバ島ワインニャプ地域においてフィールドワークを実施した。1.学校検診により、715歳の年齢層における288サンプルの糞便および242サンプルの尿サンプルを収集した。また、ヒトと密接に関わり合っている野生動物やペット・家畜からは、野鼠(12)、イヌ(14)、ウシ(1)、ブタ(31)、ヤギ(3)、水牛(31)、ウマ(7)、ニワトリ(45)、アヒル(4)のそれぞれの糞便サンプルを収集した。2.現地において顕微鏡検査を終了したヒト由来の236サンプルに認められた代表的な腸管寄生虫の陽性数(率)は、回虫66(28.0%)、鞭虫30(12.7)、鉤虫11(4.7)、アメーバ類55(23.3)、ジアルジア24(10.2)と高い数値を示した。アメーバ類には、大腸アメーバ、ハルトマンアメーバ、さらに小型アメーバが含まれ、また、数は限られていたが、メニール鞭毛虫、ヨードアメーバ、二核アメーバ、さらに培養によってブラストシスチス、腸トリコモナス、大腸バランチジウムが検出された。3.腸管寄生原虫の網羅的検出を実現するためのリファレンスDNA解析を上記サンプルをターゲットとして進めており、各原虫の種内多型の詳細が明らかになりつつある。4.その他、同調査地域の学童の居住地をマッピングすることを目的としたGPSによる地理情報の収集は今年度も引き続き継続し、ほぼ現在の全校生徒について確定し、またジアルジア特異的尿中分泌型IgA抗体の評価については、培養ジアルジア粗抽出抗原を用いた予備的評価を実施し、次年度より開始する新たなプロジェクトのための基本プロトコルを確立した。(1)インドネシアの学校を拠点とした糞便回収と動物サンプル収集を継続し、ヒト便サンプル161、尿220サンプルを、また動物からはブタ61、齧歯類27、ウシ5、ウマ15、水牛19、鳥類96、ヤギ2の糞便サンプルを収集した。

(2)ヒト糞便サンプルの顕微鏡検査により、回虫64(37.9%)、鞭虫24(14.9)、鉤虫16(9.9)などの蠕虫の陽性率をみた他、ジアルジア34(21.1)、アメーバ類37(23.0)と高率な原虫感染を検出した。(3)分子解析では2011年度サンプルの解析が終了し、a.ジアルジアの詳細な陽性率:ヒト145/576(25.2%)、ブタ13/59(22.0)、野鼠11/43(25.6)、イヌ2/2(100)、ウシ2/17(11.8)、トリ2/36(5.6)、ウマ0/9(0)、ヤギ0/9(0)が判明した。c.分担研究者によるブラストシスチスの遺伝子型分布:ヒト78/200(39.0, Type 1, 2, 3)、ブタ11/53(20.8,Type 1, 4)、野鼠7/43(16.3,Type1, 4)、イヌ1/1(100)、ウシ0/14(0)、トリ1/34(3.0)、ウマ1/7(14.3)、ヤギ0/10(0)が判明した。分子寄生虫学詳細な遺伝子レベルでの解析は進行中だが、当初より目的としてきた網羅的な寄生原虫検出が実施可能であること、また量的にも十分な寄生虫サンプルが対象地域において実際に収集できることが確認された。また遺伝子解析についても実験室において順調に進行していることから、データの取得に問題はなく、研究初年度の達成度としてはおおむね順調と考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)2年目のフィールド調査においても、サンプル収集は予定通り実施され、解析のベースとしての材料が確保された。(2)遺伝子型等の解析結果が出始め、詳細なデータ解析が可能となり、これらの基礎データにもとづく調査対象の見直しを進めている。(3)アメーバ類の遺伝子レベルでの解析は未だ完了していないが、手法的な目処がたち、本格解析を既に開始した。(4)ジアルジア、トリコモナス、ブラストシスチスについては、すでにデータが出始めている。以上より、本研究の進展はおおむね順調と考えられる。リファレンスとなる各寄生原虫の各多型の収集・解析をさらに進めていくと同時に、同地域において寄生虫のまん延の原因となる基本要因の特定のために、水、食品、土壌等を含む環境要因の解析を今後実施予定である。また、寄生虫生存の基本要因が特定された場合には、寄生虫の生活環への人為的介入により、このような熱帯地域の寄生虫まん延状況を実際に軽減可能かどうかについて、無作為化比較対象試験を予定している。(1)定期的な調査地域における学校ベースのサンプル採取を継続し、長期にわたる寄生虫蔓延の推移を分子疫学的手法をベースにモニタリングしていく予定。(2)分子解析手法については、より簡便に、さらに多様な寄生虫を調査可能な方法の確立に努め、分子分類の見直しを含めた網羅的検出方法のさらなる発展をはかる。(3)GPS、インタビューを用いた基礎データの収集を予備的に進めてきたが、次年度からは分子疫学研究として、統計ベースの解析を本格的に実施する。(4)寄生虫蔓延に対する介入手法の検討を開始し、次年度より評価可能な形での介入を実施する。