hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海の牧草スケレトネマの簡便で定量的な同定方法開発とそれを用いた生理生態特性の解明

珪藻Skeletonema属は,水中生態系の基礎生産者あるいはノリ有害藻の一つとして重要な植物プランクトンである。2005・2007年に分類同定法が提案され11種が確立されたが,これは画期的ではあったものの作業が煩雑で同定に日数を要し,高額なうえに定量的ではない。そこで,これら短所を凌駕すべく,リアルタイムPCR(qPCR)を用いた同定法の開発を試みた。各種についてrDNAプライマーを設計し,海水中の栄養細胞のみでなく堆積物中の休眠細胞について定量的に検討を行った結果,優占種に加え従来法では検出されなかった少量の種も同定され,リアルタイムPCR法の現場での汎用が見込まれた。コスモポリタンのSkeletonema costatumは、「海の牧草」として漁業生産を支える極めて重要な植物プランクトンである。しかし、2005・2007年に、Sarno et al.によってDNAを用いた系統発生解析と電顕を用いた微細形態解析により、本種は8種に細分化され、Skeletonema属には11種存在していることが報告された。これにより、新規同定基準に基づく種について、多くの研究の追試が必要となった。しかし、この同定法は定量的でなく同定に長期間を要し、高価な上、操作も煩雑で、とくに水産等現場の技術者などが日常的に用いることは容易ではない。そこで、これらの短所を改善した同定法の開発を試みることとした。そのような同定法には定量性の異なるマルチプレックスPCR法、リアルタイムPCR法およびFISH法の3方法が考えられる。これらの中で最も定量的とされるFISH法は、DNAとして細胞内での存在量が多いrDNAのみを用いる方法であるため、H26年度はSSU rDNAとLSU rDNAを用いて、種特異的なプライマー/プローブの開発と結合部分の増幅量の多いアニーリング温度の決定を試みた。その結果、Skeletonema costatum、Skeletonema dohrnii、Skeletonema japonium、Skeletonema pseudocostatumおよびSkeletonema tropicumの5種について、それらを決定することができた。さらに、得られた結果に基づき、リアルタイムPCR法でこれらの種のプライマー/プローブを用いて、S. dohrniiの検出を定量的に行えるか検証を試みたところ、本種のみのDNA増幅効率が極めて良好で、DNAの定量も可能であったことから、S. dohrniiについては定量的な同定を行えることが確認された。漁業生産の基礎生産者として多大な貢献をするため「海の牧草」と呼ばれるSkeletonema属について,DNAを用いた分子解析と微細形態解析の両方を併用する同定方法がSarno et al.により2005・2007年に報告された。この方法に従いSkeletonema属各種の同定を行うことは今後の水産研究を展開していく基礎となるが,この方法は高価・煩雑で定量的でないという短所を持っている。そこで,これらを凌駕する手法の開発を試みることとし,H26年度に行った研究をもとに,リアルタイムPCR法によるSkeletonema属各種の定量的評価を,遺伝子マーカーとしてrDNAを用いて行った。プライマーの開発はS.ardens, S. costatum, S. dohrnii, S. grevillei, S. japonicum, S. menzelii, S. pseudocostatum, S. tropicum, S. potamosの9種について,Sarno et al.(2005・2007)が分子解析に用いたSSU rDNAとLSU rDNA(D1-D3)を用いて行った。しかしその結果,これらの領域の塩基配列ではS. menzeliiについてはプライマーを設計できないことが確認されたことから,これら9種のITS,イントロン,および挿入部分の配列を除いたrDNAの全塩基配列(LSU rDNAはD1-D12)の解読を行わねばならないことが判明した。現在,32株のrDNAの全塩基配列の解読を完了し,S. menzeliiを含めたプライマー9種の種特異性をPCRで確認できたところである。なお,S. menzeliiは複数の隠蔽種を持つ種であるが,今回開発したプライマーは我が国沿岸域に出現する種を対象としている。H27年度当初は,用いる遺伝子マーカーとしてcox1 mtDNAを選定し,Skeletonema ardens, S. costatum +S. subsalsum, S. dohrni, S. grethae, S. grevillei, S. japonicum, S. menzelii, S. pseudocostatum, S. tropicum, S. potamos,およびS. sp. cf. pseudocostatumのSkeletonema属11種を対象として,定量的同定法をリアルタイムPCRを用いて検討を行っていた。cox1を選定した理由は,この遺伝子は母系遺伝するので系統関係の検討を行い易く,塩基変異速度が速いため短い進化的時間の中で生じたDNAの変異を効率よく測ることができ, rDNAではS. dohrniiとS. marinoiが別種と誤同定されるのに対しcox1では同種と同定され種の同定に際し精度が高いと判断されたためである。Cox1は,しかし,Skeletonema属の種毎のプライマーを設計して定量性を検討していく過程で,細胞当たりのDNA量が培養期間に応じた細胞活性に対応している可能性の高いことが確認された。今後この特性を活用した結果を汎用していくためには,詳細な研究が必要で,これには多大な時間を要するため限定された期間内で結果を得ることは困難であると判断した。

そこで,検討に用いる遺伝子マーカーとしてcox1の利用を断念するに至った。一方,rDNAは,培養期間に関係なく細胞の数のみに対応している可能性の高いことを,予備実験で確認している。そこで,rDNAを遺伝子マーカーに選定して研究を展開し,得られた成果は「研究実績の概要」で報告したとおりである。海産珪藻類Skeletonema属は,基礎生産者として海洋生態系を支る重要な植物プランクトンである。このSkeletonema属は2005・'07年にSarno et al.によって微細形態観察とrDNA解析を用いた分類基準が報告されたが,この方法は同定前に細胞を単離培養する手間がかかり,さらに同定に当たっては高額な試薬や機器を使用し,定量的ではない。このため,これらの課題を解決する方法として,Real-time PCRを利用したSkeletonema属各種同定法の開発を試みた。Real-time PCRはRoche社のLight Cycler 480を用い,定量には蛍光物質としてSYBR GreenIを用いるインターカレーション法を採用した。プライマーは,日本では出現記録のない2種を除いたSkeletonema属9種についてrDNAのLSUやSSUの塩基配列を特異的に増幅させるプライマーペアを設計し使用した。Real-time PCRでは絶対定量法を用い,同定されたSkeletonema属各種のDNA量の割合を求め,光学顕微鏡観察から得たサンプル中のSkeletonema属総細胞密度とこれらの割合から各種の細胞密度を算出した。海水サンプルはWhatman Nuclepore2.0μmで濾過を行い,このフィルター上の残渣からExtraction Bufferを用いてDNAを抽出した。底泥サンプルでは,ISOIL for Beads Beating (NIPPON GENE)を用いてDNAを抽出した。有明海と筑後川河口域の海水と底泥サンプルを用いて両方法を比較検討した結果,Real-time PCR法では優占種に加え単離培養法では確認できなかった種類も同定できた。Skeletonema属の同定法として,Real-time PCR法は,汎用されることが今後に見込れる。珪藻Skeletonema属は,水中生態系の基礎生産者あるいはノリ有害藻の一つとして重要な植物プランクトンである。2005・2007年に分類同定法が提案され11種が確立されたが,これは画期的ではあったものの作業が煩雑で同定に日数を要し,高額なうえに定量的ではない。そこで,これら短所を凌駕すべく,リアルタイムPCR(qPCR)を用いた同定法の開発を試みた。各種についてrDNAプライマーを設計し,海水中の栄養細胞のみでなく堆積物中の休眠細胞について定量的に検討を行った結果,優占種に加え従来法では検出されなかった少量の種も同定され,リアルタイムPCR法の現場での汎用が見込まれた。定量的かつ簡便なSkeletonema属各種の同定法を確立するには、前提として、我が国沿岸域に出現するSkeletonema属全種についての正確な情報の把握が必要である。
圧力軸における蛋白質フォールディングの物理化学的研究

フォールディングとアミロイド線維は蛋白質の二つの安定形である。フォールディングについてはキネティックスの研究がこれまで盛んに行われてきたが、アミロイド形成についてのキネティックス研究はほとんど手付かずの状態である。本研究は、アミロイド線維形成の前駆体と考えられるプロトフィブリルの解離反応について、そのキネティックスを詳しく解析した最初の研究である。対象となるプロトフィブリルは、自然に変性状態にあるニワトリリゾチームのS-S欠損変異体で、圧力により加速される解離反応をトリプトファンの蛍光によりモニターした。蛍光の時間変化の解析とプロトフィブリルの線維長分布の解析から、プロトフィブリルの成長と消滅は、線維の端にモノマーが付加するのと線維の端からモノマーが解離するのとよりなるlinear polymerization mechanismにより進行することを明らかにした。また、解離速度の圧力依存性の解析から、解離の活性化体積が負(?V^<o‡>=-50.5?1.60ml mol^<-1>)で、活性化圧縮率も負であることが明らかになった。一方、高圧NMR実験から、平衡状態では、プロトフィブリルの解離に伴う体積変化が、およそ?V^o=-100ml mol^<-1>である。プロトフィブリルの体積パラメータが詳しく測定されたのはこれが初めてである。これらの一連の体積パラメータから、プロトフィブリルはもともと空隙を伴う比較的高い体積状態にあり、揺らぎによってかなりの水和が進行する活性化状態に達し、さらにより完全に水和した低体積のモノマーに解離する、と予想される。この成果はアミロイドプロトフィブリル及びその解離に関して初めての体積パラメータからの解析であり、その実験方法とともに、今後のアミロイド線維機構の解析について、貴重な示唆を与える研究成果であるといえる。プロトフィブリルの形成はアミロイド線維形成の重要なステップである。本研究では、自然に変性しているジスルフィド結合欠損にわとりリゾチームから生じた成熟プロトフィブリルについて、その圧力解離のキィネティックスを、トリプトファン蛍光を用いて研究した。25°Cで30から4000気圧まで加圧すると、蛍光強度が約半分に低下し、蛍光強度最大波長が340nmから348nmへと変化した。この事実は、プロトフィブリルが加圧により完全に解離し、埋もれていたトリプトファンが溶媒に露出することを示す。さまざまな圧力で蛍光強度の時間変化を測定することにより、解離測度を圧力の関数として測定したところ、解離測度が加圧により、著しく速くなることが明らかになった。特に2000気圧付近まで解離測度は直線的に増加し、その勾配から、負の活性化体積ΔV^<o<+^^+>>=-50.5±1.60ml mol^<-1>を決定した。また2000気圧以上では、解離測度の増加が鈍り、4000気圧でほぼ一定値となった。この事実から活性化圧縮率(プロトフィブリルから遷移状態に到る場合の圧縮率の変化)はΔk^<+^^+>=-0.013±0.001 ml.mol^<-1>.bar^<-1>)と決定された。以上の事実から、プロトフィブリル状態は遷移状態に比べ、部分モル体積と圧縮率の比較的大きな状態であることがわかる。このことは、プロトフィブリル状態が恐らくキャビティーなどを有する比較的緩い構造をもつが、遷移状態では水和が進行し、構造がやや堅くなることを示唆している。一方、解離測度の温度依存性(1000barで測定)から、活性化エンタルピーΔH^<+^^+>=9.1 kcal.mol^<-1>と活性化エントロピーΔS^<+^^+>=-44.9±1.6 cal.mol^<-1> K^<-1>(298.15 K)が決定された。

これらの一連の体積パラメータから、プロトフィブリルはもともと空隙を伴う比較的高い体積状態にあり、揺らぎによってかなりの水和が進行する活性化状態に達し、さらにより完全に水和した低体積のモノマーに解離する、と予想される。この成果はアミロイドプロトフィブリル及びその解離に関して初めての体積パラメータからの解析であり、その実験方法とともに、今後のアミロイド線維機構の解析について、貴重な示唆を与える研究成果であるといえる。
カドミウムおよびマンガンの標的臓器における金属輸送機構の解析

カドミウム(Cd)の標的組織である腎臓近位尿細管の領域特異的由来細胞(S1, S2, S3)を用いた検討によりS1, S2, S3領域ごとに管腔側および血管側からのCdの取り込みおよび排泄を解析した結果、尿細管の部位によってCdイオンの取り込みおよび排泄が異なることを見出した。神経細胞におけるMn取り込みには、DMT1のみならずZIP14が関与し、脳疾患の病変での上昇が報告される炎症性サイトカインによってMnの取り込みおよび排泄が変化し、神経細胞へのMn蓄積が増加する可能性を明らかにした。今年度はCdの毒性の標的組織である腎臓におけるCd輸送機構と、Mnの毒性の標的組織である神経細胞における2価のMnの輸送について解析を行った。腎臓については、入手したマウス腎臓近位尿細管のS1, S2, S3領域特異的な細胞(S1, S2, S3細胞)が極性細胞であり、カップ培養可能であることを確認した。また、Cd輸送に関与することが報告されているZIP8はS2, S3細胞において多く発現していた。次に、カップ培養系を用いてS1, S2, S3細胞で管腔側からのCdおよびMnの取り込みを調べた結果、S1, S2, S3のすべての細胞で管腔側からのCdの取り込みをMn, Znが阻害し、Mnの取り込みをCd, Znが阻害した。よってS1, S2, S3のどの領域においても、金属イオンの輸送が行われていることが示唆され、S1, S2, S3細胞は近位尿細管の部位特異的な金属輸送機構を検討する上で有用な細胞であることがわかった。神経細胞におけるMn輸送については、昨年までに神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞で発現が確認できたDMT1, ZIP8, ZIP14の発現抑制を行い、その金属輸送への影響を調べた。DMT1を発現抑制すると、Mn取り込み効率はcontrol siRNA導入細胞に比べて顕著に低下した。一方、ZIP14の発現を抑制すると、MnおよびCd取り込み効率はコントロールの半分以下にまで低下した。この結果より、脳神経系の細胞では、2価Fe輸送体のDMT1のみならず、亜鉛輸送体のZIP14もMn輸送に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。次に、神経細胞におけるMn輸送に対するIL-6の影響を解析した。SH-SY5Y細胞をIL-6に曝露すると、Mn蓄積が約2.5倍に上昇した。また、ZIP14およびZIP8の発現がIL-6によって上昇した。以上の結果より、SH-SY5Y細胞をIL-6に曝露することによって起こるMn蓄積の上昇は、ZIP8およびZIP14の発現上昇によるMn取り込みの上昇が関与する可能性を見出した。今年度、ラットおよびマウスから腎臓の尿細管を摘出し、近位尿細管のS1, S2, S3領域それぞれからの細胞の単離・樹立に挑戦したが、現在のところ細胞の単離には至っていない。腎臓に関しては、マウス由来の細胞を入手できたため、今後はS1, S2, S3領域由来細胞を用いて解析を進めていく。Cd毒性の標的臓器である消化管由来する細胞におけるCd輸送機構の解析も実施した。消化管モデル細胞としてCaco-2細胞を使用し、カップ培養システムを用いて管腔側と血管側のそれぞれの取り込みを調べた。これまで消化管におけるCdの吸収にはDMT1が重要であることが報告されている。しかし、それ以外の輸送体の検討はほとんど行われていなかった。そこで、Caco-2細胞においてZIP14の発現を抑制した結果、0.1, 1μMのCd取り込みがそれぞれ対照群の70%, 54%に低下した。一方、DMT1を発現抑制すると5μMのCd取り込みが対照群の約80%にまで低下したが、0.1, 1μMのCdの取り込みは変化しなかった。また、ZIP8を発現抑制すると、0.1μMのCdの取り込みはわずかに低下したが、1, 5μMの取り込みは変化しなかった。以上の結果より、消化管におけるCd吸収において、特に低濃度のCdの吸収については、DMT1以外にZIP14が重要な役割を果たす可能性を見出した。Mn毒性の標的組織である脳におけるMn動態を明らかにするため、本年度はヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞を使用して解析を行った。SH-SY5Y細胞では亜鉛輸送体のZIP8およびZIP14, DMT1が確かに発現していることを確認した。また培地に重炭酸を添加するとZIP8およびZIP14を介したMnの取り込みが上昇することが報告されているが、SH-SY5Y細胞においても重炭酸添加によりMn取り込み効率が約5倍増加した。腎臓については、マウス近位尿細管の部位(S1、S2、S3)特異的な不死化細胞株を入手し、Cd輸送の基礎的解析を開始した。

カップ培養系を用いてS1, S2, S3細胞を培養する系を確立し、管腔(原尿)側および血管側からのCdの取り込み効率を測定した。その結果、S1, S2細胞に比べてS3細胞へのCd2+取り込み効率が高いことが分かった。一方、Cdの排泄効率も調べた結果、S1, S2細胞では血管側に比べて管腔側への排泄効率が高かった。S3細胞は管腔(原尿)側および血管側への排泄効率は差がなく、S1, S2細胞よりも血管側への排泄効率が高かった。また、recombinantマウスメタロチオネイン(MT)タンパク質を大腸菌で作製する系を立ち上げた。研究期間中に、Cd-MTをカップ培養系に添加してS1, S2, S3細胞への取り込みおよび排泄実験を実施することは達成できなかったため、本研究の成果から今後の研究に活用していきたい。環境分子生物学今年、腎臓については、マウス腎臓近位尿細管のS1, S2, S3領域特異的な細胞(S1, S2, S3細胞)を用いて解析を開始した。S1, S2, S3細胞は極性細胞として機能し、カップ培養系を使用してCdの取り込みが測定可能であることがわかった。今後、この細胞を用いて、腎臓のより詳細な金属輸送機構について解析していく。神経細胞ではどのようにしてMnが細胞内に取り込まれるのか、DMT1以外の輸送体の検討が行われていなかったため、Mn輸送に関与する亜鉛輸送体のZIP8およびZIP14がSH-SY5Y細胞でMn輸送に関与するかどうか検討した。Mn輸送に関わる3つの輸送体(DMT1, ZIP8, ZIP14)の発現抑制に成功した。その結果、神経細胞において新たにMnの輸送に亜鉛輸送体のZIP14が関与している可能性を見出した。また、神経細胞におけるMn輸送へのサイトカインの影響についても解析を開始した。SH-SY5Y細胞において、サイトカインのうち今年度はまず、IL-6の影響を調べた結果、IL-6がMnの取り込み輸送体の発現を増加させ、Mn蓄積を上昇させる可能性を明らかにした。この発見により、サイトカインが金属代謝に影響を与えることがわかり、パーキンソン病などの脳変性疾患において脳内での増加が報告されているサイトカインが、Mn代謝に影響を与え、脳疾患の増悪因子となっている可能性があることを見出した。今後、そのメカニズムについて詳細な検討が必要となることがわかった。Cdの毒性の標的組織として腎臓、消化管、Mnの毒性の標的組織として神経細胞におけるそれぞれの金属の輸送機構の解析に着手した。近位尿細管由来の部位特異的細胞の樹立には成功していないが、すでに樹立された細胞を入手できたため、来年度以降はこの細胞を使用して解析を進めていく予定である。当初、マウスおよびラットから腎臓近位尿細管の部位特異的な細胞を単離し、不死化して得ようとしたが、尿細管の各部位を特定し単離したがそこから十分な細胞が得られず、不死化するまでに至らなかった。そこで、マウス腎臓近位尿細管のS1, S2, S3領域由来の不死化細胞を入手した。本年度はこれらの細胞が部位特異的な細胞であることを確認し、解析に使用可能な細胞であることを確認し、様々な実験を開始した。この細胞を今後の研究に活用し、イオン型でのCdの取り込みにどの輸送体が関与するのか、またそれは、尿細管の部位によって異なるのかを解析し明らかにする。また、近位尿細管では、Cdはメタロチオネイン(MT)と結合したCd-MTの型で取り込まれることが知られている。
アトピー性皮膚炎患者皮膚のスフィンゴミエリンアシラーゼによる水解生成物の解析

アトピー性皮膚炎は乾燥性皮膚(atopic skin)がその発生基盤となり慢性の湿疹病変が形成されると考えられるが、この乾燥性皮膚においては、皮膚のバリアー機能が障害されていることがわかっている。われわれは角質細胞間脂質、ことにセラミドの減少がアトピー性皮膚炎のバリアー機能障害に関与していることを明らかにしてきた。セラミドの代謝はその合成酵素であるスフィンゴミエリナーゼ(SMase)、β-グルコセレブロシダーゼ(BGCase)と分解酵素であるセラミダーゼ(CDase)の酵素活性バランスにより調節されており、すでにBGCaseとCDaseの酵素活性は健常人との間に有意差が認められないことは明らかにしている。AD,健常人の前腕屈側よりテープストリッピングにより採取した各層、およびAD,健常人の皮膚生検から得た表皮を材料として、酵素蛋白を抽出しコリンのメチル基がC^<14>で標識されたスフィンゴミエリンを基質として用い、スフィンゴミエリン水解活性を測定し、ラジオアイソトープ薄層クロマトグラフィー(TLC)で解析した。また、C^<14>で標識されたスフィンゴミエリンに市販のアシラーゼを反応させTLCで解析し、さらにHigh-performance liquid chromatography-mass spectometryを用い検討した。今回の検討で、AD患者ではスフィンゴミエリン水解活性は著しい亢進を示し、その反応生成物の解析から、本来のセラミド合成酵素であるSMaseに替わり、スフィンゴミエリンアシラーゼ活性をもつ酵素が誘導され、その結果セラミドにかわりスフィンゴミエリンホスホリルコリンが生成され、セラミド量の減少を来していることが示唆された。今後はさらに市販のアシラーゼ、スフィンゴシルホスホリルコリンを抗原として作製したモノクロナル抗体を用いて、免疫組織化学的手法により、生検した患者皮膚においてその局在を検討したい。
説話史料を活用した仏教版画の像内納入に関する研究

本研究では、中国と日本の仏教説話を参照しながら、仏像の像内に印仏が納入された信仰的背景を考察した。特に地蔵菩薩彫像への印仏の納入に注目し、大量の地蔵菩薩画像の像内納入を記す早期の史料である北宋代の『地蔵菩薩応験記』の記載を検証した。同時に、その画像が日本では版画と認識された可能性を考察し、平安鎌倉時代の印仏納入の思想的源泉を北宋代の信仰に求めた。さらに、彫像による千体地蔵の諸作例や経典の記載を視野におさめることで、印仏を納入した地蔵菩薩彫像は多数の分身を伴う姿を表した作例であるとの見通しを立てることができた。25年度は、印仏・摺仏を像内納入する仏像と密接な関係を持つと考えられる、京都・寂光院地蔵菩薩像の像内納入品、および奈良・福智院地蔵菩薩像の実見をおこなった。これらはいずれも「千体地蔵」として造立されたとみなされる作例である。寂光院像は多岐にわたる納入品で知られ、特に膨大な地蔵菩薩の小像の存在は際立っており、鎌倉時代における多数尊の造像およびその像内納入という信仰形態の好例である。また、福地院像は多数の地蔵菩薩の小像を光背に多数取り付けており、本体と光背の総体で千体地蔵であることをあらわす。寂光院像のように多数尊を像内納入するのではないが、制作年代の判明する基準的作例であり、地蔵信仰の中心地である奈良に所在することからも重要性が認められ、鎌倉時代における地蔵菩薩の大量造像という問題を考察するうえでは看過できない。このほか、神奈川・元箱根地蔵菩薩像を中心とする摩崖仏群を実見し、地蔵信仰と「場」の関連性を考察する準備をおこなった。26年度は、印仏を納入する地蔵菩薩像の実査を進め、造形的特徴とともに造立時の願文の内容にも検討を加えることで、制作背景をより具体的に捉え直してゆきたい。史料研究では、金沢県立金沢文庫において『漢家類聚往生伝』の影印本の調査をおこなった。同書は遼代説話をベースとする鎌倉時代の往生伝で、仏教版画の制作の場について語る説話を含む。今回は翻刻本と影印本を対照し、特に版画制作に関する「摸」「摺」といった語の使用箇所に注目しながら字句を確認した。26年度は、まだ未見の説話集にも視野を広げ、印仏・摺仏の制作と仏像への納入を語る説話を収集して内容の検証を進め、実作例を対象とする研究の成果と合わせて得られた知見を公表したいと考えている。前年度に引き続き、印仏・摺仏の制作と関連の深い、大量造像の代表的な彫刻作例である千体地蔵像に注目し、京都・報恩寺地蔵菩薩像の造形的特質を検証した。本像は岩山の中央に地蔵菩薩像1躯を配し、その周囲に大量の微細な地蔵菩薩像が立ち並ぶさまを表現した作例で、岩山は地蔵の住処とされる■(キャ)羅陀山をあらわす。岩座上に坐す地蔵菩薩像をあらわした版画作例には、京都・六波羅蜜寺地蔵菩薩坐像の納入品である地蔵菩薩坐像印仏がある。こうした作例の存在を念頭に置くことで、大量の地蔵印仏を納入する地蔵彫像は■(キャ)羅陀山に出現する千体地蔵を意味するとの見通しが立てられた。今後は、小地蔵像を彫像として中尊の周囲に配する場合と、印仏として彫像内に納入する場合の信仰上の相違をあきらかにしてゆきたい。文献史料研究では、往生伝や霊験記の類のほか『楞厳院二十五三昧結衆過去帳』などにも注目し、「印仏」の語の用例を収集した。その結果、1011世紀には用例が増えてくることが確認され、印仏の像内納入の前提となる信仰が浸透しつつあった状況が推察された。ただし、史料上に見える「印仏」はほとけの姿を観想するのみで版画を制作しない場合もありうるので、今後も慎重に検証してゆく所存である。また、『小記目録』や「比丘尼法薬埋納作善供養目録」などには、木版印刷を意味する「摸」の用例を見出すことができた。これらは仏教版画制作の問題と密接に関わるので、用例の収集および検証を継続したい。像内納入に関しては、『仏説文殊師利般涅槃経』に「身内心処に真金像あり」との記述を見出した。この記述は仏像の像内に小像を納入する信仰の根拠のひとつと目されるため、類似の記述を他の経典にも広く求めながら、造像との関わりをより深く考察してゆきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。

日本仏教美術史26年度が最終年度であるため、記入しない。複数の研究プロジェクトや調査を並行して進めたため、本研究に割ける時間が減少した。研究計画を見直し、未見の彫刻作品の調査を速やかにおこなうとともに、説話の収集と検証を進めたい。
ジーンターゲッティングを用いたマラリア原虫ロプトリー蛋白の機能解析

マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部には侵入に重要な役割を果たすと考えられている小器官が局在している。その中で最も大型の小器官であるロプトリーに含まれる蛋白(140kDaおよび100kDa)の機能解析を、ジーンターゲッティングの手法を用いて解析することを目的として本研究を開始した。遺伝子の破壊を試みたネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiにおいては、遺伝子導入方法が確立していないため、近縁種のP. bergheiで確立されている方法を基に、1)実験に使用するマウス体内における原虫のピリメサミン感受性の確認、および、2)ピリメサミン耐性遺伝子の遺伝子導入による薬剤耐性能の獲得の確認とピリメサミンの有効濃度の確認などの予備実験を行った。その結果、P. bergheiで行われている方法に改良を加えることで、P. yoeliiでも遺伝子導入が可能であることが示唆された。そこで100kDaまたは140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターを構築するために、PCR法によりP. yoeliiから100kDaまたは140kDaロプトリー蛋白をコードする遺伝子断片を増幅し、ピリメサミン耐性遺伝子を運ぶベクターpMD204に組み込んだ。次に、直鎖状にしたこれらのロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターをP. yoeliiに電気穿孔法により遺伝子導入し、ピリメサミンの選択圧の下で培養して、ロプトリー蛋白遺伝子座が破壊された原虫の選択を試みた。現在までのところロプトリー蛋白遺伝子座破壊クローンの樹立には至っていないため、遺伝子破壊ベクターの改良を行い、ロプトリー蛋白遺伝子座破壊マラリア原虫の作成を継続して実施している。本研究は、マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部に局在し、侵入に重要な役割を果たすと考えられているロプトリー蛋白(140kDaおよび100kDa)の機能解析を、ジーンターゲティングの手法を用いて解析することを目的として実施している。今年度は、これらの遺伝子座を破壊したノックアウト原虫を作成することを試みた。140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターを構築するために、PCR法によりネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiから140kDaロプトリー蛋白をコードする遺伝子断片を増幅し、ピリメサミン耐性遺伝子を運ぶベクターpMD204に組み込んだ。遺伝子断片を組み込んだベクターの塩基配列を解析し、予定していたベクターが構築されていることを確認した。ネズミマラリア原虫P.yoeliiの100-kDaロプトリー蛋白についても、同様の操作を行った。遺伝子の破壊を予定しているネズミマラリア原虫P.yoeliiにおいては、現在のところ、遺伝子導入方法が確立していないため、近縁種のP.bergheiで確立されている方法を基に、1)実験に使用するマウス体内における原虫のピリメサミン感受性の確認、および、2)ピリメサミン耐性遺伝子の遺伝子導入による薬剤耐性能の獲得の確認とピリメサミンの有効濃度の確認などの予備実験を行った。その結果、P.yoeliiでもP.bergheiと同様の方法で遺伝子導入が可能であることが示唆された。現在、直鎖状にした140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターをP.yoeliiに電気穿孔法により遺伝子導入し、ピリメサミンの選択圧の下で培養して、ロプトリー蛋白遺伝子座が破壊された原虫の選択を試みている。

その中で最も大型の小器官であるロプトリーに含まれる蛋白(140kDaおよび100kDa)の機能解析を、ジーンターゲッティングの手法を用いて解析することを目的として本研究を開始した。遺伝子の破壊を試みたネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiにおいては、遺伝子導入方法が確立していないため、近縁種のP. bergheiで確立されている方法を基に、1)実験に使用するマウス体内における原虫のピリメサミン感受性の確認、および、2)ピリメサミン耐性遺伝子の遺伝子導入による薬剤耐性能の獲得の確認とピリメサミンの有効濃度の確認などの予備実験を行った。その結果、P. bergheiで行われている方法に改良を加えることで、P. yoeliiでも遺伝子導入が可能であることが示唆された。そこで本年度は、昨年に引き続いて140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターを構築するために、PCR法によりP. yoeliiから100kDaまたは140kDaロプトリー蛋白をコードする種々の遺伝子断片を増幅し、ピリメサミン耐性遺伝子を運ぶベクターpMD204に組み込んだ。そして、直鎖状にしたこれらのロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターをP. yoeliiに電気穿孔法により遺伝子導入し、ピリメサミンの選択圧の下で培養して、ロプトリー蛋白遺伝子座が破壊された原虫の選択を行った。現在までのところロプトリー蛋白遺伝子座破壊クローンの樹立には至っていないため、さらに遺伝子破壊ベクターの改良を行い、マラリア原虫の遺伝子破壊を継続して実施している。
動物の肝機能評価に有望なparaoxonaseの基礎及び臨床応用に関する研究

肝細胞由来酵素活性は多くの肝臓疾患で減少する。旋毛虫感染ラットでは、初期よりPON1活性が減少を続けた。その他の酵素活性も減少した。血清中の炎症性サイトカインは寄生虫の腸管内寄生期において顕著に上昇した。抗炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10の上昇もみられた。肝臓内では炎症性細胞の浸潤や肝細胞の変性も亢進していた。肝臓内での各酵素のmRNA発現も著しく抑制されていた。旋毛虫感染はラット肝臓で炎症を誘導し、血清中の肝細胞由来酵素活性を低下させることが明らかになった。一方、マウスで同様の感染実験を行うと、ラットと異なり抗炎症性サイトカインが感染初期から増加し、肝臓での障害が軽減された。平成26年度の研究計画のうち、課題1の寄生虫感染時のPON1、PON2、PON3活性の変化と課題2の寄生虫感染によるPON1、PON2、PON3の変化が脂質の酸化や動脈硬化に及ぼす影響については、予定以上の成果が得られ以下のように纏めことが出来た。一方、課題3と課題4については症例を網羅できるだけのサンプル収集に時間がかかり、一部の症例の測定に留まっている。平成27年度の研究計画のうち、課題1の寄生虫感染時のPON1、PON2、PON3活性の変化と課題2の寄生虫感染によるPON1、PON2、PON3の変化が脂質の酸化や動脈硬化に及ぼす影響については、26年度の成果を補強した。一方、課題3と課題4については研究協力農場の状況が変化し、症例を網羅できるだけのサンプル収集ができていないため一部の症例の測定に留まっている。平成27年度の研究計画のうち、課題1と課題2については、Trichinella spiralisを用いた実験では論文投稿中である。また、Nippostrongylus brasiliensisに関する実験も投稿準備中である。平成28年度は、27年度研究課題1「寄生虫感染時のPON1、PON2、PON3活性の変化と課題2の寄生虫感染によるPON1、PON2、PON3の変化が脂質の酸化や動脈硬化に及ぼす影響」については、国際誌に投稿中であったが、追加実験や修正を重ねたのち、採択された。【本年度の成果の纏め】Paraoxonase-1 (PON1)活性は様々な肝臓疾患で減少するが、慢性の人獣共通寄生虫症である旋毛虫(Trichinella spiralis)が肝臓で炎症を引き起こし、肝細胞や肝機能に及ぼす影響、特にPON1活性への影響についてはほとんど分かっていなかった。旋毛虫とラットを用いた研究により確認できた以下の結果を公刊した。(研究概要)旋毛虫感染ラットは感染後2日目よりPON1活性が減少し始め7週目まで持続した。同様に血清中のbutyrylcholinesterase (BuChE)活性も4日目より減少し始め2週目まで持続した。血清中の炎症性サイトカインであるIL-1、IL-6、TNF-αとマクロファージ活性化にかかわるMCP-1やMIP-1αは寄生虫の腸管内寄生期において顕著に上昇した。これに伴って抗炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10の上昇が同時期および旋毛虫幼虫の筋肉内寄生期においてもみられた。肝臓内では炎症性細胞の浸潤や肝細胞のアポトーシスも亢進していた。時期を同じくして肝臓内のPON1およびBuChEのmRNA発現も著しく抑制されていた。ラットにおける旋毛虫感染は肝臓での炎症を誘導し、その結果血清中のPON1およびBuChEの活性を低下させることが明らかになった。成果論文:Europ. J. Clin. Invest. 2017, 47 (3): 250-261.平成28年度の研究計画のうち、Trichinella spiralisを用いた実験では、投稿中の論文が採択され、公刊された。またNippostrongylus brasiliensisに関するマウスの実験結果も投稿準備中である。一方、課題3と課題4については症例を網羅できるだけの十分なサンプル収集ができなかったため、論文作成に至っていない。最終年度は、マウスの結果を公刊することを目標にしたが採択に至らず、修正版を再投稿中である。研究全体を通じては、以下の成果が得られた。Paraoxonase-1 (PON1)活性は様々な肝臓疾患で減少することが知られているが、慢性の人獣共通寄生虫症である旋毛虫(Trichinella spiralis)が肝臓での炎症を引き起こし、それらの肝臓への影響ついてはほとんど解析されていない。旋毛虫感染ラットは感染2日後よりPON1活性が減少し始め7週目まで持続した。同様に血清中のbutyrylcholinesterase (BuChE)活性も4日目より減少し2週目まで持続した。反対に血清中の炎症性サイトカインであるIL-1、IL-6、TNF-αとマクロファージ活性化にかかわるMCP-1やMIP-1αの上昇が寄生虫の腸管内寄生期において顕著に上昇した。また、これに伴って抗炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10の上昇が同時期および旋毛虫幼虫の筋肉内寄生期においてもみられた。肝臓内のPON1およびBuChEのmRNA発現も著しく抑制されていた。

ラットにおける旋毛虫感染は肝臓での炎症を誘導し、血清中のPON1およびBuChEの活性を低下させることが明らかになった。論文:Europ. J. Clin. Invest. 2017, 47 (3): 250-261.一方、マウスで同様の感染実験を行うと、ラットと異なりIL-4、IL-10などのサイトカインが感染初期から増加し、肝臓での障害が軽減された。PON1活性もラットとは異なり、減少は一過性であり、すぐに正常範囲に復帰した。マウスやラットは実験動物として汎用されるが、それぞれの特性を考慮して人の感染症モデルに用いることの重要性が示唆された。肝細胞由来酵素活性は多くの肝臓疾患で減少する。旋毛虫感染ラットでは、初期よりPON1活性が減少を続けた。その他の酵素活性も減少した。血清中の炎症性サイトカインは寄生虫の腸管内寄生期において顕著に上昇した。抗炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10の上昇もみられた。肝臓内では炎症性細胞の浸潤や肝細胞の変性も亢進していた。肝臓内での各酵素のmRNA発現も著しく抑制されていた。旋毛虫感染はラット肝臓で炎症を誘導し、血清中の肝細胞由来酵素活性を低下させることが明らかになった。一方、マウスで同様の感染実験を行うと、ラットと異なり抗炎症性サイトカインが感染初期から増加し、肝臓での障害が軽減された。平成26年度の研究計画のうち、課題1の寄生虫感染時のPON1、PON2、PON3活性の変化と課題2の寄生虫感染によるPON1、PON2、PON3の変化が脂質の酸化や動脈硬化に及ぼす影響については、Trichinella spiralisを用いた実験では論文作成まで完了し、現在投稿のための最終段階に有る。また、Nippostrongylus brasiliensisに関する実験も予備的実験が既に終了しており、追加実験に関するディスカッションの段階である。一方、課題3と課題4については症例を網羅できるだけのサンプル収集に時間がかかり、一部の症例の測定に留まっている。しかし、測定方法については簡便な方法が確定できた。平成28年度は最終年度であり、研究経費は論文投稿費用を主に計画している。今年度中に研究課題1,2の主となる論文を国際誌に公刊することを第1目標とする。課題3,4については材料採取は進める。本年度は、1年の研究期間延長を申請し、承認されたことから、Nippostrongylus brasiliensisに関するマウスの実験結果を論文にまとめて、投稿することを最優先にしたい。今年中に採択まで持っていきたい。農学平成27年度には、寄生虫感染症とその他の要因解析を進めるために、多くの農家とNOSAI獣医師の協力のもとに多数のサンプルの収集と測定を行なう。異なる条件下で飼育されている肉用和牛(繁殖用、肥育用)と乳用牛で、背景(寄生虫を含む感染症、その他の代謝性疾患などの臨床診断がなされた例)情報がはっきりしたものを、それぞれ50例ずつを目途に収集し、測定結果との関連を統計解析によって求める。また屠畜時の肝臓検査が一部可能なため、肝組織の変化とPON1の変化を比較検討できるため、より詳細な応用性が確認できる。
室内・数値衝突実験による氷天体衝突時のエネルギー分配・化学反応過程の解明

二段式水素ガス銃は衝突研究において理想的な加速器の一つである.これは標準状態(常圧,室温)にある巨視的(>0.1 mm)な飛翔体をおよそ9 km/sまで加速可能であることによる.ところが飛翔体加速ガスが計測部に侵入し,化学汚染を引き起こすことから衝突による蒸発,脱ガス量の計測や化学反応物を測定する目的では利用できなかった.今年度は二段式水素ガス銃を用いつつ,銃由来の化学汚染を極力抑える実験手法を確立し,衝突で発生するガス成分の気相化学分析を行う手順を確立した.新手法を火星上で実際に発見されている蒸発岩鉱物(岩塩,含水石膏)に適用し,衝突速度を系統的に変化させて蒸発,脱ガスを開始する衝突速度の閾値を計測した.その結果,火星における天体衝突条件で岩塩は蒸発,含水石膏は脱ガス(水蒸気放出)を起こすことがわかった.また火星への典型的な衝突速度程度の衝突であれば含水石膏からの大規模な硫黄ガス放出は起こらないことがわかった.この結果は火星表層の塩素分配には天体衝突が寄与し,岩塩が析出した古塩湖から塩素の水平輸送を促し得ることを意味している.火星の表層はそのバルク組成に対して塩素に富んでいることが知られており,古塩湖の分布はかつて液体の水が流れたとされる地域と一致する.近年火星表層で強い酸化剤である過塩素酸塩が全球的に存在していることが明らかとなっており,火星表層で有機物が見つからないことの理由として注目されている.古塩湖に岩塩として固定された塩素を全球に再分配し,過塩素酸塩に変化させるには何らかの塩素の水平輸送過程が必要になる.したがって本研究で得られた成果は天体衝突によって駆動される塩素の水平輸送が惑星表層の有機物量の進化に関連している可能性を指摘するものである.新しく確立した手法を適用する最初の標的として蒸発岩鉱物を用い,学術誌に投稿する成果を挙げることができた.しかし,一方で当初の予定であった氷標的への衝突実験は試料作製時の難度の高さから取り掛かることができていないため,「(3)やや遅れている」とした.今後は氷試料作製法の確立を目指す.今回開発した手法は現時点では世界的にも我々の研究グループの専売特許であり,地球惑星科学で興味ある様々な標的に適用し,惑星表層システムの揮発性元素挙動を理解するための基礎データを提供することができる.こういった方向転換も視野に入れながら研究を推進する.具体的にはK/Pg衝突事件の基盤岩だったことが知られている硬石膏,小惑星中に含まれる水のキャリアの一つである蛇紋岩,炭素質隕石と組成が同じになるように調製された模擬粉末試料をすでに手に入れてある.これらを標的に用い,衝突速度を系統的に変化させた実験も合わせて実施していく.二段式水素ガス銃は衝突研究において理想的な加速器の一つである.これは標準状態(常圧,室温)にある巨視的(>0.1 mm)な飛翔体をおよそ9 km/sまで加速可能であることによる.ところが飛翔体加速ガスが計測部に侵入し,化学汚染を引き起こすことから衝突による蒸発,脱ガス量の計測や化学反応物を測定する目的では利用できなかった.今年度は二段式水素ガス銃を用いつつ,銃由来の化学汚染を極力抑える実験手法を確立し,衝突で発生するガス成分の気相化学分析を行う手順を確立した.新手法を火星上で実際に発見されている蒸発岩鉱物(岩塩,含水石膏)に適用し,衝突速度を系統的に変化させて蒸発,脱ガスを開始する衝突速度の閾値を計測した.その結果,火星における天体衝突条件で岩塩は蒸発,含水石膏は脱ガス(水蒸気放出)を起こすことがわかった.また火星への典型的な衝突速度程度の衝突であれば含水石膏からの大規模な硫黄ガス放出は起こらないことがわかった.この結果は火星表層の塩素分配には天体衝突が寄与し,岩塩が析出した古塩湖から塩素の水平輸送を促し得ることを意味している.火星の表層はそのバルク組成に対して塩素に富んでいることが知られており,古塩湖の分布はかつて液体の水が流れたとされる地域と一致する.近年火星表層で強い酸化剤である過塩素酸塩が全球的に存在していることが明らかとなっており,火星表層で有機物が見つからないことの理由として注目されている.古塩湖に岩塩として固定された塩素を全球に再分配し,過塩素酸塩に変化させるには何らかの塩素の水平輸送過程が必要になる.したがって本研究で得られた成果は天体衝突によって駆動される塩素の水平輸送が惑星表層の有機物量の進化に関連している可能性を指摘するものである.新しく確立した手法を適用する最初の標的として蒸発岩鉱物を用い,学術誌に投稿する成果を挙げることができた.しかし,一方で当初の予定であった氷標的への衝突実験は試料作製時の難度の高さから取り掛かることができていないため,「(3)やや遅れている」とした.今後は氷試料作製法の確立を目指す.今回開発した手法は現時点では世界的にも我々の研究グループの専売特許であり,地球惑星科学で興味ある様々な標的に適用し,惑星表層システムの揮発性元素挙動を理解するための基礎データを提供することができる.こういった方向転換も視野に入れながら研究を推進する.具体的にはK/Pg衝突事件の基盤岩だったことが知られている硬石膏,小惑星中に含まれる水のキャリアの一つである蛇紋岩,炭素質隕石と組成が同じになるように調製された模擬粉末試料をすでに手に入れてある.
イネとマメ植物の体細胞融合による有用農業形質の確立

イネとマメ科植物3種(ダイズ、バーズフット・トレフォイル、アルファルファ)の総組合わせ6種の細胞融合を実施した。主な結果は次の通りである。1.イネとバーズフット・トレフォイルの組合わせで、バーズフット・トレフォイルの核を持ち、バーズフット・トレフォイルの形状の細胞質雑種で、冬期の温室条件、すなわち低温、低日照条件に耐性を示す系統が得られた。2.バーズフット・トレフォイルとアルファルファの雑種カルスで主にバーズフット・トレフォイルの核を持つが、リボゾームDNA解析で両種間で相互転座が起きていることが明らかになった。3.バーズフット・トレフォイルとアルファルファの非対称融合カルスでバーズフット・トレフォイルの核を持ち、アルファルファの葉緑体ゲノムを持つカルスを得た。しかし、再分化固体は得られなかった。4.ダイズとアルファルファの細胞融合カルスにおいてAMPおよびPGDのアイソザイムパターンが両種の融合型ではなく、アルファルファ型のみを示したことから、これらアイソザイムが座乗する染色体に関して、アルファルファの染色体がダイズのそれと置換したものと推測された。5.イネとバーズフット・トレフォイルの雑種で、深根性による土壌浸蝕防止と黄花による美観を与えると考えられる多茎・多花のバーズフット・トレフォイル型個体が得られた。1.ダイズプロトプラストからの再分化系は成功していないが、他殖性のアルファルファの分化全能性の保持系統を確立した。その保持系統は個体毎の遺伝子型の違いに依存していた。2.イネとマメ科3植物種(ダイズ、アルファルファ、バーズフット・トレフォイル)の科間、属間6組合せのプロトプラストの融合を行っている。イネとX線照射したバーズフット・トレフォイルのプロトプラストおよびIOA処理したバーズフット・トレフォイルとX線照射したアルファルファのプロトプラスト融合を行い、現在雑種のコロニー形成に至っている。これはイネへのマメ科植物遺伝子の導入およびバーズフット・トレフォイルの初期成育の促進を目的に行った。3.従来から行っていた科間・属間雑種の対称融合のうち、アイソザイムおよびDNA解析が未だ行われていないダイズとアルファルファの雑種カルスで検討したところ、カルス初期ではアイソザイムで雑種性を示したが、後期ではダイズパターンのみへと変化した。核DNAのサザンブロット解析では後期カルスは全てダイズ型を示した。4.バーズフット・トレフォイルとアルファルファの雑種カルスではアルファルファの核ゲノムが消失することが明らかとなったが、リボゾームDNA解析で両種間で転座が起きていることが明らかとなった。5.雑種カルスからの再分化は分化全能性の高いバーズフット・トレフォイルの組合せのみに見られた。1.イネとマメ科3植物(ダイズ,アルファルファ、バーズフット・トレフォイル)の科間、属間6組合せのプロトプラスト融合によつて得られたカルスについて、核、ミトコンドリア、葉緑体ゲノムについて種々プローグを用いてサザンブロット解析を行なったところ、核ゲノムではバーズフット・トレフォイルとアルファルファ間で両染色体間で組換えが起こることが明らかになった。またミトコンドリアでは高頻度で組換えが起こることが明らかになった。葉緑体では全組合せで組換えは起こらなかった。2.またバーズフット・トレフォイルとアルファルファの対称融合では植物体の再分化は起きなかったが、バーズフット・トレフォイルにヨードアセトアミド処理し、アルファルファにX線照射を行なって融合を行なったところ雑種の再分化が可能であった。またこのカルスのアイソザイム解析により初期カルスでは雑種性を示したが、後期カルスではバーズフット・トレフォイルのみが残ることが明からになった。親植物と雑種植物の形質比較を現在行っている。3.イネとバーズフット・トレフォイルのプロトプラストの融合によって得られた雑種植物で、顕著に茎数が多く、ほふく型の固体が得られ、親固体のバーズフット・トレフォイルの花粉によって受精を行なったところ種子が得られ、現在その植物体を増殖中である。

このような草型の植物は土手などのエロ-ジョン防止効果が高く、また花数が多いので美観を高める効果があると思われる。イネとマメ科3植物(ダイズ、アルファルファ、バーズフット・トレフォイル)の科間、属間6組合せのプロトプラスト融合によって得られたカルスあるいは植物体についてアイソザイム分析あるいは核、ミトコンドリア、葉緑体ゲノムについてサザンブロット解析を行った。得られた結果は次の通りである。1.ダイズとアルファルファの細胞融合カルスにおいて、AMPおよびPGDアイソザイムバンドパターンは多くの系統はダイズ型を示すが、数系統において、ダイズとアルファルファの融合型のバンドパターンではなく、アルファルファ型のバンドパターンのみを示したことから、これらのアイソザイムが座乗する染色体に関して、アルファルファの染色体がダイズのそれと置換したものと推測された。2.アルファルファプロトプラストにX線処理し、バーズフット・トレフォイルプロトプラストにヨードアセトアミドを処理し、非対称融合を行い、そのカルスの葉緑体ゲノムについてサザンブロット解析を行ったところ、バーズフット・トレフォイルの核を持ち、アルファルファの葉緑体ゲノムを持つカルスが存在することが明らかになった。しかしこれらカルスからは再分化個体が得られなかった。3.イネとバーズフット・トレフォイルの雑種で、深根性による土壌浸蝕防止と黄花による美観を与えると考えられる多茎・多花のバーズフット・トレフォイル型個体の親系統への戻し交配後代で現在選抜を行っている。