hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バレエの運動技能レベルが着地時の衝撃緩衝動作に与える影響

グランジュッテはクラシックバレエの基本的な跳躍動作の一つとして知られている.グランジュッテの最後には片脚での着地が必要となる.しかし,グランジュッテはこれまでバイオメカニクスの研究対象にはなってこなかった.本研究は着地動作におけるダンス技能を考察するために研究計画を立てた.そして,運動学と運動力学のデータを解析に使用した.グランジュッテのダンス技能は着地後にブレーキ力を制御する方略に現れることが明らかとなった.グランジュッテはクラシックバレエの基本的な跳躍動作の一つとして知られている.グランジュッテの最後には片脚での着地が必要となる.しかし,グランジュッテはこれまでバイオメカニクスの研究対象にはなってこなかった.本研究は着地動作におけるダンス技能を考察するために研究計画を立てた.そして,運動学と運動力学のデータを解析に使用した.グランジュッテのダンス技能は着地後にブレーキ力を制御する方略に現れることが明らかとなった.本年度は主としてグランジュッテやライズアップ等のバレエの基本動作を計測し,キネマティクスとキネティクスの解析をおこなった.そして,一部は継続して解析中である,トウシューズ着用時に足関節のみを底屈・背屈させるライズアップ動作をおこなった.被験者はクラシックバレエ経験者(ポワント群)とトウシューズ着用経験のないモダンダンスやタップダンス等の経験者群(非ポワント群)であった,実験機材としてデジタルビデオカメラ2台とフォースプレート1台を使用した.被験者はフォースプレート上でライズアップ動作をおこなった.画像データから関節の位置座標を算出し足関節角度を求めた.フォースプレートにより得られた地面反力のデータは被験者の体重により正規化した.最大底屈角度に両群に有意差はなかった.最大鉛直地面反力は上昇局面においてのみ有意に非ポワント群が大きかった.これは足部を制御するスキルが影響したものと考えられる.また,本年度はモーションキャプチャシステムを使用し,クラシックバレエ経験のある学生の計測もおこなった.被験者は全身に反射マーカーを装着し,跳躍からの着地動作が含まれるグランジュッテやグランパディシャを主としたバレエの基本動作をおこなった.動作はバレエシューズとトウシューズの両方でおこなった.得られたデータは動作解析ソフトで処理中である.国内のバレエダンサーに関するデータは蓄積が殆どないため計測をおこなっただけでも価値があると考えられる.本年度はプロのクラシックバレエダンサーの動作を計測した.そして,昨年度のクラシックバレエ経験のある学生バレエダンサーのデータ解析もおこなった.被験者は国内で活動しているプロの日本人女性バレエダンサーであった.バレエダンサーの動作を計測するために実験機材としてモーションキャプチャシステムとフォースプレートを使用した.被験者は全身に反射マーカーを装着しバレエの基本的な跳躍動作であるグランジュッテやグランパディシャを主としておこなった.また,動作はバレエシューズとトウシューズの両方でおこなった.国内においてプロのバレエダンサーの動作に関するデータは殆どないため計測をおこなっただけでも価値があると考えられる昨年度に計測したクラシックバレエ経験のある学生バレエダンサーのグランジュッテの着地動作の解析もおこなった.被験者8名中2名が体重の4倍を超える最大地面反力を示した.そして地面反力のパターンも他の被験者と異なっていた.この2名の地面反力は被験者が着地後に地面に留まろうとしたことが原因と考えられる.一方,他の6名は着地後に走り抜けようとしたと考えられる.この6名の中で2名が国内のバレエコンクールで入賞経験があった.地面反力のパターンはスキルレベルを反映していると考えられる.また,クラシックバレエの経験年数と最大地面反力の間には有意な相関はみられなかった.このことから経験年数だけでスキルレベルを予測することは難しいと考えられる.計測したプロのクラシックバレエダンサーのグランジュッテの着地動作の解析をおこなった.また,その中にはバレエ団の主役である女性プリンシパルダンサー2名も含まれていた.そして,特にこのプリンシパルダンサーの動作の特徴を対照群12名と比較し明らかにした.動作を計測するためにカメラ8台から構成されているモーションキャプチャプチャシステムを250Hzで使用した.また,地面反力を計測するためにフォースプレート1台を1000Hzで使用した.動作解析用ソフトを使用してデータ処理をおこなった.骨盤,そして左右の大腿部,下腿部,足部のモデル化をおこない下肢三関節の角度を求めた.空中でのパフォーマンスはプリンシパルダンサーと対照群で差はみられなかったが,着地した瞬間の姿勢はプリンシパルダンサーと対照群の間で顕著に異なっていた.また膝関節と足関節の最大屈曲・背屈角度がほぼ等しかった.これらのことから着地中の関節の制御は異なっていたと考えられる.そして,鉛直地面反力において両プリンシパルダンサーともに着地後に地面反力は急激に上昇し,幾つかの小さなピークを出現させながら80ms付近で最大値に達していた.また,両者ともに最大値は体重の4倍以下であった.しかし,対照群の一部の試技の最大値は体重の4倍以上であった.衝撃力はダンサーの質量と負の加速度の積である.結果的に減速が大きくなると地面反力も増加していくことになる.つまり,プリンシパルダンサーは一部の対照群よりも強いブレーキ力を作用させていないと考えられる.プロのバレエダンサーは多忙のため実験の日程調整に時間がかかった.しかし,予定していた被験者数に達し,必要だったデータの取得ができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。データの処理を進め,学生とプロのバレエダンサーの動作の比較をしていく.そして学会発表や論文を投稿していく予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ｆ２電子配置を持つ重い電子系の超伝導発現機構の解明

局在軌道に電子が2つ配置された重い電子系(f2電子配置)は、非磁性の局在状態が基底になり得るという点で、電子が1つ配置された系とは本質的に異なる物性を示すことが知られている。しかし多軌道系を取り扱う必要があるために、格子モデルでの微視的な理論はほとんど行われてこなかった。そこで本研究は、スレーブボソン法を用いて多軌道周期アンダーソンモデルを解析し、特に非磁性一重項基底と準粒子状態の関連性について解析を行った。スレーブボソン法には近年、多軌道ハバード模型に適用できるよう拡張された、Rotationally Invariant Slave Boson (RISB)法を利用した。結果として、非磁性一重項基底には2種類の異なる振る舞いを示すものがあり、その振る舞いの違いは、局在軌道への電子占有の違いによることを明らかにした。Γ_1非磁性一重項基底では、最もエネルギーが低い軌道に2つの電子が占有され、結果として重い準粒子状態を形成しないことを明らかにした。この結果は従来のSlave Boson法であるKotliar-Ruckenstein法では議論できず、周期系では本研究で初めて示した。一方、六方晶で現れるΓ_4非磁性一重項基底では、2つのf軌道に電子が1つずつ占有され、各軌道ごとに近藤一重項状態を形成することで重い準粒子が形成されることをあきらかにした。この準粒子状態はΓ_4基底一重項状態と隣接しており、非磁性一重項基底と近藤一重項基底の競合領域であると考えられる。また、通常の重い準粒子状態とは違い磁気感受率が増強されないことを示した。この振る舞いはUPt_3で観測されている実験結果と矛盾しない。本研究はRISB法の鞍点近似の解析に終始しており、超伝導状態や非フェルミ液体について議論することができてない。今後の研究として、RISB法に揺らぎを取り入れる新たな手法の開発を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。UやPrなどの局在電子数の期待値がほぼ2個である(f2電子配置)重い電子系化合物で現れる準粒子状態について、多軌道周期アンダーソンモデルに結晶場効果を加えたモデルを用いて解析を行った。具体的には、f軌道の電子数が空占有状態から3重占有状態までを考慮したスレーブボソン法の平均場近似を行った。解析の結果として、f2電子配置での重い準粒子状態は結晶場基底状態に強く依存することを解析的に示した。一般に、f2電子配置での結晶場基底状態は複数のf軌道から構成されており、結晶場基底に関与しているf軌道は全て重い準粒子状態に関与することを明らかにした。すなわち、これらのf軌道の準粒子ピークがフェルミ面近傍に現れ、伝導電子との混成項が繰り込まれることを示した。先行研究によって、フェルミ準位近傍に現れる複数の準粒子ピークはある有限の幅に留まると予想されていたが、本研究ではこれらの準粒子ピークが現実的な電子相関の大きさで縮退していく傾向にあることを解析的に示した。準粒子ピーク間に縮退によって押しつぶされた非常にフラットな準粒子バンドがフェルミ準位にかかっており、現実的でない巨大な有効質量が現れることがわかった。この問題は、複数のf軌道が縮退する傾向から、f軌道間の直接的な飛び移りがフェルミ面の形状やエネルギー分散に反映されることが考えられる。すなわち、f2電子配置での重い準粒子状態を多軌道周期アンダーソンモデルから記述することができないことを示唆している。現在、f軌道間の飛び移りまでを考慮したモデルを用いた解析を進めている。また、この問題が本質的であるのかを調べるために、異なる手法を用いた解析を検討中である。

本研究はRISB法の鞍点近似の解析に終始しており、超伝導状態や非フェルミ液体について議論することができてない。今後の研究として、RISB法に揺らぎを取り入れる新たな手法の開発を目指す。一年目の時点で、準粒子間相互作用の導出までを予定していたが、3重占有状態までを考慮したスレーブボソン法の平均場近似の段階でモデルのさらなる拡張が必要であるということが明らかになったため。また現在、得られた結果が本質的であるかを確認するために別の手法を用いた解析も検討中であるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。f軌道間の飛び移り積分を考慮したモデルを構築し、平均場近似を行う。得られた結果にボソン演算子の揺らぎを導入し、準粒子間相互作用について議論する。また、得られた結果が本質的であるかを確認するために、多軌道周期アンダーソンモデルを動的平均場近似などの別の手法を用いた解析も検討中である。
終末期がん患者の生きる力を育むスピリチュアルケアの探求

本研究は、看護師の語りを通して、終末期がん患者に提供されるスピリチュアルケアを言語化し、そのケアの技とそれを成立させうる要因について探求しようとするものである。今年度は、昨年度に引き続き、参加観察とインタビューを実施した。研究協力者は、緩和ケア病棟に勤務し、プライマリーナースとして終末期にあるがん患者を受け持っている看護師6名であった。6名の看護師の緩和ケア病棟での経験年数は半年から5年、看護師としての経験年数はおよそ5年から15年であった。1名を除いた全員が自らの希望で緩和ケア病棟に就職していた。1名は病棟移動という形で管理者より勧められ、自分の意思で緩和ケア病棟に移動していた。また、全員がデータ収集時にプライマリーナースとして終末期にあるがん患者1名以上を担当し、ケアを行っていた。インタビューはできるだけケア場面の参加観察を実施した後にケア場面を想起しながら、話を進めるようにした。インタビューと参加観察は、一人の研究協力者につき、34回実施したが、最終のインタビューは担当していた患者が死亡した後に実施した。それぞれの看護師が患者を受け持っていた期間は、約1ヶ月から半年にわたっていた。インタビュー時に、研究協力者によって語られた「看護師自身の生と死の取り組み」は、個人の内面的な生と死への取り組みに留まらず、患者のケアそのものへ繋がる広がりのある内容であった。本研究において、現在までに明らかになったことは、以下の通りである。1.今回のインタビューで明らかになった看護師自身の生と死の取り組みには、【他者の死などを契機にして「死」を考える】、【人が生きることへの問いに何らかの答えを見出す】、【看護をする自分として日々を営む】という体験が含まれていた。2.看護師の語りを通して、改めてスピリチュアルケアとはどのようなものかを検討すると、それは単なるマニュアル的な技術として存在するものではなく看護師も生身の人間として「死」を自分自身のうちで先取って、存在の意味を問いつつ、ケアにあたり、さらにケアを通して成長していく過程であると考えられた。本研究は、看護師の語りを通じて、終末期がん患者に提供されるスピリチュアルケア(以後、SC)を言語化し、そのケアの技とそれを成立させうる要因について探求しようとするものである。今年度は、(1)国内外のSCに関する文献レビュー、(2)看護師に対するヒアリング調査を実施し、(3)緩和ケア病棟における参加観察とインタビューを開始した。文献レビューでは、まずSCの関連概念であるhopeの概念分析を行った。次にspirit-をkeywordとして、レビューを行った。その結果、スピリチュアリティという現象が非物質的で、多面的、文化的、文脈的であることにより、その定義は一つの確定したものがないこと、多数の関連概念の定義との重複があることがわかった。国内の文献レビューからは、わが国の宗教的・文化的背景の中で、欧米でスピリチュアリティの背景にあるような人間観・世界観が明確ではなく、SCの使われ方にも混乱が見られることがわかった。一方で、SCが輸入された概念であるという背景を持ちながらも、その重要性の認識から、自己や人間が生きるということに関わる根源的なものとして、わが国独自の定義の試みがいくつかあることも明らかになった。現在、臨床的にもスピリチュアリティという現象が捉えられるようになり、研究的に取り組まれる段階に至っていると考えられた。ヒアリング調査は、3名の看護師に実施し、終末期医療の場でSCという概念が定着しつつも、現場の看護師はSCが特別なケアであるという認識を持っており、個人によってSCの捉え方が多様であるため、SCが言語化される内容に差があることがわかった。そのため、参加観察を伴うインタビューがデータ収集法として不可欠であることが示唆された。現在、6名の看護師に参加観察とインタビューを開始しており、来年度に継続してデータを収集し、現象学的な方法論に基づいて記述を行っていく予定である。

1.今回のインタビューで明らかになった看護師自身の生と死の取り組みには、【他者の死などを契機にして「死」を考える】、【人が生きることへの問いに何らかの答えを見出す】、【看護をする自分として日々を営む】という体験が含まれていた。2.看護師の語りを通して、改めてスピリチュアルケアとはどのようなものかを検討すると、それは単なるマニュアル的な技術として存在するものではなく看護師も生身の人間として「死」を自分自身のうちで先取って、存在の意味を問いつつ、ケアにあたり、さらにケアを通して成長していく過程であると考えられた。
拡大内視鏡観察により視覚化された腫瘍血管形態の客観化と癌自動診断システムの構築

胃拡大内視鏡で捉えられる早期胃癌に特徴的な微小血管像を指標に用い,客観的な診断法を開発した.微小血管像を抽出するコンピュータの画像解析ソフトを開発した,再現性も求めるために多施設共同研究を行い,拡大内視鏡で捉えられる微小血管像を指標にした診断能を求めた結果,生検に代わりうる高い診断能を有していることが明らかになった.さらに,研究の過程で胃腫瘍が脂肪吸収能を有しているという現象を発見した.そしてこの現象を応用し,新しい早期胃癌の内視鏡による発見法を開発した.胃拡大内視鏡で捉えられる早期胃癌に特徴的な微小血管像を指標に用い,客観的な診断法を開発した.微小血管像を抽出するコンピュータの画像解析ソフトを開発した,再現性も求めるために多施設共同研究を行い,拡大内視鏡で捉えられる微小血管像を指標にした診断能を求めた結果,生検に代わりうる高い診断能を有していることが明らかになった.さらに,研究の過程で胃腫瘍が脂肪吸収能を有しているという現象を発見した.そしてこの現象を応用し,新しい早期胃癌の内視鏡による発見法を開発した.【研究1】本研究の初年度である平成21年度は,画像解析ソフトを用い,主に拡大内視鏡画像の血管を抽出すためには,どのアルゴリズムが適しているかを検討した.ある一定の精度で検出できるようになったが,血管の一定の形状(閉鎖性ループ状血管)については,現時点でのアルゴリズムでは抽出に限界があることが判明した.現在,血管を抽出するアルゴリズムを改良中であり,血管の抽出が安定してできるようになった時点で,がんと非がんの特徴量を求める予定とした.血管の解析と同時に,胃拡大内視鏡像を詳細に検討すると,粘膜上皮下の血管を不透明にする上皮内の白色物質white opaque substance(WOS)が存在することを発見した.本物質は,胃病変の良悪性を鑑別診断する上で,臨床的に有用な指標となり得ることが判明した.本知見については,世界に先駆けて,学会や論文で報告し,血管に加えて,WOSも画像解析による定量的解析のターゲットにすることを研究計画に加えた.【研究2】現在,一次抗体に,CD34,MUC5AC,HGM,MUC6,MUC2,CDX2,CD10を用い,腫瘍と非腫瘍の粘膜を染色し,拡大内視鏡で視覚化された血管の密度・形態と粘膜上皮下の血管の密度・形態や癌の粘液形質の基礎的な関連を検索した.その結果,研究1にも関連するが,上皮下に血管が存在しているにも拘わらず,腸型の形質(MUC2/CDX2/CD10)を腫瘍が有する場合は,上皮直下の血管が視覚化されていないことが判明した.本知見も従来報告がされていないので,まず,国際学会で発表し,オリジナリティーを証明するとともに,来年度に,腸型の形質を有する腫瘍で,上皮下の血管が視覚化されにくく,胃型の形質を有する腫瘍で,上皮下の血管が視覚化されやすいかの機序を検討することとした.研究の過程で,慢性胃炎粘膜と胃腫瘍双方において,粘膜上皮内に沈着した物質により,上皮下の血管が視覚化されていない現象が一定の頻度で存在していることを発見し,本物質を白色不透明物質white opaque substance (WOS)と命名し,学術集会や論文ですでに報告した.本物質の存在のために血管が視覚化されていない場合があり,上皮下の血管の解析より前に,そしてオリジナリティーの点から,本物質の臨床的意義と本物質の本体の解明を優先すべきと考え,集中的に研究を行い以下の結果が明らかになった.本物質の形態学的特徴を解析したところ,血管が視覚化されていない場合は,癌と非癌の鑑別診断に有用であることが判明した.粘膜を不透明にする物質は,上皮内で光を強散乱させている物質であると仮定し,病理組織学的に本物質の正体について,様々な方向からアプローチした.細胞の核や細胞質の粘液との相関について調べたところ,関係がないことが判明した.しかしながら,十二指腸において,吸収された脂肪滴が上皮内に集積し停滞すると,白色に観察されるという報告があり,胃の背景粘膜や腫瘍から採取した生検標本の凍結切片を作成し,脂肪染色を行ったところ,非腫瘍や腫瘍のWOSは,吸収された微小な脂肪滴が沈着している現象である可能性が判明した.胃の腫瘍が脂肪の吸収能を獲得したという報告はこれまでになく,もし脂肪を負荷すれば,胃腫瘍の内視鏡診断の診断能を上げうる可能性や試薬開発の可能性があり,米国へ仮特許を申請した.その後,海外の学術集会で報告した.この知見は,本来は粘液や胃酸を分泌する臓器である胃が,腫瘍になって脂肪の吸収能を獲得したという従来にない新しい知見の可能性があり,血管を不可視化すること,生物学的に腫瘍の発生や分化を研究する上で重要な知見となりうること,将来の癌を診断する新しい試薬の開発につながる可能性があると考えられた.【研究1】拡大内視鏡で観察される胃腫瘍上皮下の血管を不明瞭化する白色不透明物質(white opaque substance,WOS)の有無と組織学的に検出される上皮内の脂肪滴の有無との相関を求めたところ,WOSの存在は,腫瘍上皮内に集積した脂肪滴の存在に依存していたことが判明した.本知見は,胃上皮性腫瘍に脂肪が集積することを証明した世界で初めての報告である.【研究2】

さらに,免疫組織化学的染色を行いWOSの有無と腫瘍の組織学的形質の関連を検索したところ,腸型の形質を獲得した腫瘍のみがWOS陽性であった.従って,WOSは,本来は吸収能を有さない胃粘膜が腫瘍化することにより,脂肪吸収能を獲得した現象であることが推測される.本知見も未だかつて報告がなく世界初の知見である.【研究3】拡大内視鏡像の微小血管像とWOSを今まで開発した画像解析の手法を用い定量化を試みた.現在その精度については検討中であるが,今後,脂肪負荷試験に対する客観的評価法につながると考え,研究を継続している.以上の研究成果を要約すると,拡大内視鏡により観察される腫瘍の微小血管像の画像解析による定量的解析法の研究過程で発見された白色不透明物質の正体は,本来は脂質の吸収能を有さない胃粘膜が腫瘍化することにより,腸型の形質を獲得し,脂質吸収能を獲得し集積した微小な脂肪滴であることが判明した.胃は本来,粘液や胃酸などを分泌する臓器であるが,「胃粘膜が腫瘍化することで吸収という機能を獲得した」という現象を世界ではじめて証明したオリジナリティーに富む知見であったので,原著論文にまとめ英文学術誌に投稿し受理された.さらに,効率よく腫瘍に吸収される脂肪製剤を開発すれば内視鏡による新しい早期胃癌の診断法になる可能性があり,本年度に国際特許出願(PCT/JP2011/71389)を完了した.【研究1】内視鏡画像解析により拡大内視鏡の微小血管像を抽出し,特徴量を解析したところ,微小血管の形状不均一,分布の非対称性,配列の不規則性が癌の特徴的所見であった.コンピューターを用い完全に定量化を試みたが,現在のところ,血管の抽出は可能であるが,数量化までは至っていない.従って本研究から求めた癌の微小血管像の形態学的所見を指標にし,未知の症例を対象とし,全国の施設で前向き試験を行い,診断能を検証した.1094例の患者が対象に組み入れられ,癌20病変,非癌351病変が発見された.拡大内視鏡の正診率98.1%,感度85.7%,特異度99.4%であり,非常に高い診断能を有していることが判明した.また,本診断法の限界は,平坦な褪色調を示す未分化型癌であることが判明した.従って,拡大内視鏡による内視鏡診断の適応は,発赤・同色調病変であることが判明した.本成績は,現在英語論文にまとめ投稿中である.【研究2】内視鏡画像解析を行った際に上皮内に存在する血管を不可視化する物質(白色不透明物質white opaque substance, WOS)を発見した.さまざまな検討の結果,WOSの正体は,腫瘍上皮内に集積した脂肪滴であることがを証明し報告した.すなわち,本来は物質の吸収能を有さない胃粘膜上皮細胞が,腫瘍化することにより脂肪の吸収能を獲得したと考察した.本知見を応用し,経口的脂肪負荷試験を開発した.経口的に乳化脂肪を負荷すると胃上皮性腫瘍が白色化したことが,研究の結果明らかになった.経口的脂肪負荷試験は,腫瘍の早期発見や正確な内視鏡診断に寄与すると考え,臨床的有用性を証明するために臨床試験を開始した.研究の過程で発見した胃上皮性腫瘍の白色不透明物質の正体が,腸の形質を獲得した胃腫瘍により吸収された脂肪滴であるという現象を世界に先駆けて証明できたこと.24年度が最終年度であるため、記入しない。胃上皮性腫瘍(腺腫・癌)が脂肪を吸収するという現象を応用し,以下の研究を行う.(1)脂肪吸収能を獲得した腫瘍の変異遺伝子の解析;(2)早期胃癌を内視鏡でより発見しやすくするための脂肪負荷試験の開発;(3)脂肪負荷試験の効果を客観的に評価する内視鏡画像解析法の確立.24年度が最終年度であるため、記入しない。
沖縄トラフの中央地溝および熱水域の北方延長の探査・研究

平成4-5年度にわたり、沖縄トラフおよび周辺の海洋地質・地球物理探査を中心とした調査を行ってきた。その際設備備品として米Geometrix社製のプロトン磁力計一式を購入し、活用した。また、両年とも潜水船「しんかい2000」や「ドルフィン3K」をはじめとした潜水調査も行った。以上の成果をふまえて、これまでに得られた諸機関による地磁気および音探探査データの総合的解析を行うことができた。その結果、以下のような成果が得られた。1)沖縄トラフの中央地溝の北方延長部は、九州中央部に連続することがまず明らかとなった。2)沖縄トラフ中央地溝の形成時期が、およそ今から200万年前ということが、サンプリングにより、より明確となった。3)南奄西海丘の、従来より北方の地点およびより北方の沖縄硫黄島火山西方の海底で新熱水域発見の可能性を明らかにした。そこでは、伊是名海穴等で見られるようなバクテリア・マット(?)海水のゆらぎ、気泡および炭酸塩沈積物を発見することができた。4)潜水調査により、沖縄トラフ北部東縁にあたるトカラ・ギャップおよびケラマ・ギャップ海嶺上で、数十万年前に生成されたと推定される硫球石灰岩が侵食されてできた大露頭を確認、サンプル採取に成功した。それにより、沖縄トラフ東縁また、沖縄本島と宮古島沖縄トラフの新期の水没は(1)およそ150-100万年前と、(2)数万年以降の、2回が推定された。1992年4月に、長崎丸(長崎大学)および「かいよう|(海洋科学技術センター)による沖縄トラフ北部域の調査を行い、5月に「しんかい2000」による潜水調査を行った。11月にプロトン磁力計が入り、沖縄トラフ北半部の中央地溝に属する南奄西海丘付近の調査を「かいよう」で行った。当初は、記録にノイズが入ったが、その原因が他の電源にあることがわかり、とりのぞくことができた。記録については現在解析中である。これに、従来得られている地磁気データを加えて、沖縄トラフ中央地溝の北方延長を検討する。以下、これまでの得られた結果を報告する。1)従来はっきりしなかった沖縄トラフの北半部にも活動的な中央地溝が認められることがほぼ明らかになった。そして、一部を除いて中央地溝と火山域とみられる異常が良く一致することがわかった。しかし、北半部の南部の方で、地磁気異常が認められていないのに中央地溝の存在する所があり、これが熱水域と一致するかどうか今後の検討課題が残った。2)沖縄トラフ中央地溝の北方延長は九州中部の野母半島の東側へはむりなく追えることが見えてきた。この東北方延長に現在活動中の雲仙普賢岳があり、それとの検討がいよいよ残された。今後、地磁気異常との照合により、この点が解決される見通しがたってきた。3)沖縄トラフの北半部で火山域が広いのは、やはりなんといっても奄西海丘付近である。しかし、その北方の2つの中央地溝付近にも大きな火山岩域があることがかなり明らかになってきた。さらに、その北方の軸部についても、海底下に顕著な火成岩の貫入が予測される。また、小規模ではあっても点々と火成岩が海底に露出している様子がうかがえる。平成5年7月「かいよう」、11月「長崎丸」による沖縄トラフ域の精密地形・地磁気調査および試料採取を行った、平成5年5月、無人潜水船「ドルフィン3K」による、沖縄トラフ北部の中央地溝、特に南奄西海丘の熱水域の調査を行った。8-9月、同船と有す人潜水船「しんかい2000」による、沖縄トラフ北縁潜水調査を行った。

平成6年2月、無人潜水船「スコーピオン」を用いての調査が行われた。以上の成果をふまえて、これまでに得られた諸機関による地磁気および音探探査データの総合的解析を行うことができた。その結果、以下のような成果が得られた。1)南奄西海丘の従来より北方の地点およびより北方の沖縄硫黄島火山西方の海底で新熱水域発見の可能性を明らかにした。そこでは、伊是名海穴等で見られるようなバクテリア・マット(?)海水のゆらぎ、気泡および炭酸塩沈積物が認められた。2)潜水調査により、沖縄トラフ北部東縁にあたるトカラ・ギヤップの水深1200mの海嶺上で、数万年前に生成されたと推定される琉球石灰岩の大露頭が確認された。これより、本域の最新期の水没は【.encircled1.】および150-100万年前と、【.encircled2.】数万年以降の、2回が推定された。3)沖縄トラフ中央地溝の形成時期が、およそ今から200万年前ということがより明確となった。4)沖縄トラフの中央地溝の北方延長部は、九州中央部に連続することがより明らかとなった。
卵巣癌のアポトーシス抑制機序の解析に基づく新しい遺伝子治療法の開発

本研究の目的は、卵巣癌細胞における外因性および内因性のアポトーシス抑制シグナルを解明し、これを解除するような新しい遺伝子治療を開発することにある。外因性機序として卵巣癌発生に重要な役割を果たすゴナドトロピンに着目した。卵巣癌細胞およびその組織発生起源である卵巣表層上皮細胞はゴナドトロピンであるLH/hCGの受容体を発現し、hCGはinsulin-like growthfactor-1(IGF-1)の発現亢進を誘導し、このIGF-1がシスプラチンによるアポトーシスを抑制することが明らかとなった。そこで、IGF-1アンチセンスRNA発現アデノウイルスを作成し、これをin vitroで添加するとhCGによるアポトーシス抑制を解除することができ、シスプラチン感受性が回復した。次に、内因性機序として、卵巣癌の半数に存在するp53遺伝子異常とp53の下流のアポトーシス促進因子Bax発現をみると、p53異常がBax発現の異常をきたし、シスプラチン抵抗性をもたらしていることが明らかとなった。そこで、Bax発現アデノウイルスを開発し、これをin vitro、in vivoで用いたところ、Bax発現およびアポトーシスを誘導することができ、シスプラチン耐性の卵巣癌細胞にも有効であった。また、Bax発現アデノウイルスはシスプラチンとの併用により相加効果が認められた。以上より、アポトーシス抑制に関与する遺伝子を標的とした遺伝子治療は制癌剤耐性の卵巣癌細胞に有効であることが示され、臨床応用の可能性が展望される。本研究の目的は、卵巣癌に対する制癌剤の効果を高めうる遺伝子治療法の開発を目的として、卵巣癌細胞のアポトーシス抑制シグナルを解明し、これを解除するような遺伝子治療を開発することにある。卵巣癌培養細胞のうち、OVCAR3細胞はゴナドトロピンである。LH/hCGの受容体を発現しており、hCGを添加すると、insulin-like growthfactor-1(IGF-1)の発現亢進を誘導し、このIGF-1がcisplatinによるアポトーシスを抑制することを、種々のアポトーシス測定、および、hCG,IGF-1 receptor中和抗体同時添加によるアポトーシス抑制解除により確認した。さらに、IGF-1によるアポトーシス抑制の細胞内シグナル伝達はIGF-1下流のphospahtidy1 inositol3-kinase(PI3-kinase),Aktの活性変化を伴っていることが示された。次に、アポトーシス促進因子であるBax発現に関与する細胞内シグナル伝達の解析を行った。卵巣癌組織においてアポトーシス関連蛋白およびp53の発現を免疫染色により解析すると、Bax,p53発現が臨床的な制癌剤感受性とよく相関していた。さらに、cisplatin感受性の異なる種々の卵巣癌培養細胞において、p53遺伝子異常とアポトーシス関連蛋白の発現、およびcisplatin感受性を検討すると、p53異常に基づいてBax発現が誘導されないことがcisplatin抵抗性と深く関連することが明らかとなり、Bax遺伝子の導入がこれを回復させうる可能性が示唆された。次に、内因性機序として、卵巣癌の半数に存在する

p53遺伝子異常とp53の下流のアポトーシス促進因子Bax発現をみると、p53異常がBax発現の異常をきたし、シスプラチン抵抗性をもたらしていることが明らかとなった。そこで、Bax発現アデノウイルスを開発し、これをin vitro、in vivoで用いたところ、Bax発現およびアポトーシスを誘導することができ、シスプラチン耐性の卵巣癌細胞にも有効であった。また、Bax発現アデノウイルスはシスプラチンとの併用により相加効果が認められた。以上より、アポトーシス抑制に関与する遺伝子を標的とした遺伝子治療は制癌剤耐性の卵巣癌細胞に有効であることが示され、臨床応用の可能性が展望される。
インスリンの時間変動による肝細胞の糖放出制御機構の解明:実験と数理モデルでの解析

前年度までに、インスリンのステップ刺激(一定刺激)に対し、糖代謝を制御する主要な代謝経路である解糖系、糖新生経路、グリコーゲン経路すべてが応答して、糖の放出(細胞外グルコース濃度)が抑制されることを見出した。さらに、同じインスリンのステップ刺激(一定刺激)であるにもかかわらず、各経路は異なる時間的な変動のパターン(時間パターン)を示すことが分かった。このことにより、インスリンの時間パターンによって各経路が選択的に制御されることが示唆された。本年度はこのメカニズムを詳細に解析するためにまずは数理モデルの構築に取り組み、実験とシミュレーションをフィードバックしながら、シンプルかつエッセンシャルなモデルの構築に成功した。モデル上の経路遮断などのシミュレーションにより、インスリン刺激に対する各経路の応答性の違いが、ネットワーク構造(制御構造)の違いによってもたらされていることが分かった。さらに、インスリンの時間パターン依存的な選択的制御機構について調べるために、インスリンのパルス刺激(急激な変動)とランプ刺激(ゆっくりとした変動)に対する各経路の応答性を検討した。その結果、それぞれの経路が持つネットワーク構造の違いによって、糖新生はステップ、パルス、ランプのすべての刺激パターンに応答することができる一方で、解糖系およびグリコーゲン合成は、急激な変動を含むステップとパルスの刺激にのみに応答できることが分かった。このことは、インスリンの時間パターンによって各経路が選択的に制御されうることを意味しており、長らく不明であった基礎分泌や追加分泌といった生体内におけるインスリンの時間パターンの生理学的な意義の解明に一石を投じる大変重要な示唆である。今後については、実際に生体内でこのような機構が存在しているかを確かめるために、初代培養肝細胞ならびにラットなどを用いたin vivoでの検討を行う必要がある。前年度に掲げた2つの目的である「インスリン刺激による糖の放出制御機構の解明」ならびに「インスリンの時間パターンによる糖代謝経路の選択的制御機構の解明」の2つについて本年度中に明らかにすることができたため、順調に進展したと考えている。上述の通り、当初か掲げた目的に対しては十分に取り組むことができた。その一方で、解糖系の中心的代謝物であるフルクトース1,6ビスリン酸(F16P)については、その測定の難しさから、シミュレーションのみによる検討でとどまっているという問題がある。実験的に検証するために、同じ解糖系に存在する付近の代謝物をF16Pの代理として測定したり、再度メタボローム解析によって様々な時間パターンを持つインスリン刺激に対する応答を調べるなどしたりする必要があると考えられる。また、本研究においては培養細胞を用いたが、in vivoのレベルでこのような機構が同様に存在しているか検討する必要がある。したがって、今後は、まずは初代培養肝臓細胞を用いて同様の検討を行うとともに、ラットなどを用いた動物実験を行い、実証する必要があると考えられる。本研究の大目的は「インスリンの時間変動による肝細胞の糖放出制御機構の解明」である。この命題に取り組むために、まずはインスリンの一定刺激に対する糖の放出量(細胞外グルコース濃度)ならびに細胞内代謝物の動的な挙動について調べることとした。前年度において培養肝臓細胞(Fao細胞)を用いて、インスリン刺激時の糖の放出を観測するための細胞刺激実験系・測定系を確立し、糖の放出がインスリン刺激後数十分以内に迅速に抑制されることを明らかにした。続いて本年度においては、メタボローム解析により、インスリン一定刺激に対する細胞内の糖代謝関連代謝物の動的挙動を調べた。その結果、糖代謝をつかさどる、解糖系、糖新生経路、グリコーゲン合成経路において、インスリン依存的な応答が観測され、これらの3つの経路すべてがインスリンに応答することで糖の放出が抑制されることが示唆された。これに加えて、同じインスリンの一定刺激であっても、各経路はそれぞれ異なる時間的な変動のパターン(時間パターン)を示すことが明らかとなった。このことは、インスリンの時間パターンの伝わり方が各経路において異なることを示唆しており、インスリンの時間パターンによって選択的に制御されうる可能性があることを見出した。これは、先述した当初の大目的に大きく近づく非常に重要な示唆である。現在のところ、このメカニズムについて詳細に解析するために実験データをもとに数理モデルの構築に取り組んでいる段階である。

このことは、インスリンの時間パターンによって各経路が選択的に制御されうることを意味しており、長らく不明であった基礎分泌や追加分泌といった生体内におけるインスリンの時間パターンの生理学的な意義の解明に一石を投じる大変重要な示唆である。今後については、実際に生体内でこのような機構が存在しているかを確かめるために、初代培養肝細胞ならびにラットなどを用いたin vivoでの検討を行う必要がある。本年度に実施したメタボローム解析によって、インスリン刺激時の細胞内の代謝物の動態がわかり、当初掲げていた「インスリン刺激による糖の放出制御機構の解明」という、大きなゴールに対して着実に近づいてている。また、経路によって応答の時間パターンが異なることがわかったことは、インスリンの時間パターンによる経路の選択的な制御が存在する可能性を示唆する非常に重要な新規知見である。現在構築中の数理モデルが完成すれば、モデル解析を行うことでこの機構のメカニズムの解明やこの機構が持つ生理学的意義の理解に一層近づくと考えられ、非常に重要な局面を迎えている。前年度に掲げた2つの目的である「インスリン刺激による糖の放出制御機構の解明」ならびに「インスリンの時間パターンによる糖代謝経路の選択的制御機構の解明」の2つについて本年度中に明らかにすることができたため、順調に進展したと考えている。今後については、ゴールとして次の2点を掲げている。第一に、当初の目的にあるように「インスリン刺激による糖の放出制御機構の解明」である。これに応えるために、まずは現在取り組み始めた数理モデルの構築を引き続き行う必要がある。構築したモデルを用いて、経路遮断などのシミュレーションを行うことで、インスリンがどのように糖代謝経路を制御しているかを明らかにする。また、第二の目的として、本年度の研究により示唆された「インスリン刺激による糖代謝経路の選択的制御」について調べることが挙げられる。構築したモデルを用いて、パラメータ感受性解析や、様々な時間パターンを持つインスリン刺激を与えるシミュレーションを行い、糖代謝経路がどのようにして選択的な制御をされるのか明らかにする予定である。考えられる問題点としては、妥当なモデルが構築できるかどうかである。もし現在取り組んでいる枠組みでうまくいかない場合には、新規経路を仮定したり、新たな実験データを学習させたりすることで、解決したいと考えている。上述の通り、当初か掲げた目的に対しては十分に取り組むことができた。その一方で、解糖系の中心的代謝物であるフルクトース1,6ビスリン酸(F16P)については、その測定の難しさから、シミュレーションのみによる検討でとどまっているという問題がある。
ASICによる超高速H_∞コントローラとそのフィールド開発環境

ソフトウエアによるコントローラは、H_∞制御など、高次になる場合は速度が低下するため、ハードウエアを採用することがある。この場合に回路、特に乗算器の規模の大きさが問題になる。そこで、これを縮小し、併せて回路の開発時間を短縮することがこの研究の主目的である。具体的には、コントローラの乗算は一般に定係数であるので、乗算k*xにおいてk,xの2つを入力とするのではなく、xのみを入力とした関数f(x)と考え、xからf(x)を得る回路を、入出力関係から論理合成することを基本原理とした。すなわち、合成した定係数器と加算器を組み合わせて、線形演算kl*x1+k2*x2...kn*xnを実現している。また、長い入力語長を2つに分割し、それぞれの出力を後で加算することにより、合成時間をさらに短縮した。これらの工夫の結果、合成時間が最低およそ1/5に、回路規模が最低およそ1/4に、どちらも減少すること、また次数の増加に対するこれらの増加は線形であることを確認した。f(x)は設計によって変わるので、実現にはプログラム可能なASIC(FPGA)を用いる。この特徴を活かし、ノート型PCを用いて、現場で使える開発システムのプロトタイプを構築し、サンプル周波数約300kHzのコントローラを作成できた。これは、DSPを用いるソフトウェアコントローラに比して約30倍速い。実験の次数は2であるが、20次になっても200kHzを下ることはない。以上により、ハードウェアによる高次コントローラを、小さな回路で短時間に開発する、という目的はほぼ達成されたと考えられる。今後の主な課題は、回路規模を小さくしながら目的の仕様を実現できるような、係数に制約をつけた設計法の検討である。ソフトウエアによるコントローラは、H_∞制御など、高次になる場合は速度が下がるため、ハードウエアを採用することがある。この場合、対象に合わせて設計パラメータが変わるので、通常はプログラム可能なASIC(FPGA)を用いる。ところがFPGAはゲート数が少ないため、演算回路の規模を縮小する必要があり、このための最適化に非常に時間がかかる。そこで、限られた計算資源で論理回路を最適化する技法に基づいて現場でハードコントローラを開発することにより、従来より2桁速いコントローラを実現する手法に関して研究を行った。具体的には、多倍長演算に基づいて回路を分割し、それを加算器でまとめる方法を用いる。その結果、最適化時間が最低およそ1/5に、回路規模が最低およそ1/4に、どちらも減少することを確認した。実際に、現場で使える開発システムのプロトタイプを構築し、サンプル周波数約300kHzのコントローラを作成できた。実験の次数は2であるが、サンプル時間を支配するのはA/D変換器であるため、20次になっても200kHzを下ることはない。今年度は、高次の場合は2次のための手法をツリー状に積み上げることで構成することにしたが、次年度へのテーマとして、ツリーの回路規模の問題が残った。高次になったときの回路規模をさらに小さくする手法を、「係数加算」という演算専用の論理最適化法の開発を中心に検討することが、来年度の主な課題である。そこで、これを縮小し、併せて回路の開発時間を短縮することにより、従来より2桁速いコントローラを実用的にすることがこの研究の主目的である。

具体的には、コントローラの乗算は一般に定係数であるので、乗算k*xにおいてk,xの2つを入力とするのではなく、xのみを入力とした関数f(x)と考え、xからf(x)を得る回路を、入出力関係から論理合成することを基本原理とした。すなわち、合成した定係数器と加算器を組み合わせて、線形演算k1*x1+k2*x2+...kn*xnを実現している。また、長い入力語長を2つに分割し、それぞれの出力を後で加算することにより、合成時間をさらに短縮した。これらの工夫の結果、合成時間が最低およそ1/5に、回路規模が最低および1/4に、どちらも減少すること、また次数の増加に対するこれらの増加は線形であることを確認した。f(x)は設計によって変わるので、実現にはプログラム可能はASIC(FPGA)を用いる。この特徴を活かし、ノート型PCを用いて、現場で使えう開発システムのプロトタイプを構築し、サンプル周波数約300kHzのコントローラを作成できた。これは、DSPを用いるソフトウェアコントローラに比して約30倍速い。実験の次数は2であるが、20次になっても200kHzを下ることはない。以上により、ハードウェアによる高次コントローラを、小さな回路で短時間に開発する、という目的はほぼ達成されたと考えられる。今後の主な課題は、回路規模を小さくしながら目的の仕様を実現できるような、係数に制約をつけた設計法の検討である。
日本語学習者に対するプレースメントテストとしてのSPOT

SPOTとは外国人日本語学習者の日本語能力を簡単に測定するものとして我々が開発したものである。基本的には二レベルの難度の問題基準があり、それに応じたテストヴァージョンを作り続けている。これらのテストを学習者のプレースメントテストとして試用する日本語教育機関は国内(筑波大、北海道大学、名古屋大学、など)外(アメリカ、オーストラリア、韓国など)で数十校に増加した。また、第2言語としての日本語の習得研究の基準としてこのテストを利用した研究も出始めた。本年度も各問題項目の難易を決定する条件を得るため、別途作成の文法項目学習診断テストとSPOTの各バ-ジョンの両タイプを実施してデータ収集をおこなった。また、コンピュータによる自動テスト処理システムの試作が完成し、学習者にフィードバックできる方法に見通しがたった。パソコンヘの入力には労力を要したが、教師のための統計処理結果が自動的にでき、また、受験者に対しては点数、誤りの傾向を知らせるための結果シートを返却できた。分析の精度をあげるために、文法項目の分析、項目ラベルのデータベース作りをしたが、このラベルを他の基準テストにも付け、相関を見ることで、文法項目の知識とSPOTでの得点率を調べることが今後さらに必要と考える。一方、SPOTの言語テストとしての妥当性の研究のために、学習者のface validity調査も試みた。その結果、教師側にとっては便利であっても、受験者側の心理的な問題も浮かび上がってきた。時間的にも方法の上でも処理の簡単なテストは、受験者に自己の実力を納得させるには不満が残るようで、テストにはある程度の時間をかける必要もあるという心理的な側面の問題がわかった。最終年度であることから、8月には公開で研究発表会を開催した。使用機関の教師の労力削減に寄与していることは喜ばしいことであるが、精度をあげていくという今後の課題も大きい。1.本プロジェクト初年度の本年は、既存の筑波大学で実施済みのSPOTが海外でも同様の傾向を示すかどうか、まずテストを実施し、そのデータを検討することから始めた。実施検討事項は以下のとおりである。(1)オーストラリア、モナシュ大学において:日本語学習2年度末の学習者対象に試用、また同時にこのテストの学習者の受けとめ方(face-validity)のアンケート調査をおこない、その解析をおこなった。その結果、海外ではさらに低いレベルを識別する、より易しいテスト問題作成が必要であることがわかった。(2)アメリカ、カリフォルニア大学サンディエゴ校において:学年末の5月に試用し、その結果をもって、翌年度('95年9月)のクラス分けプレースメントテスト本テストとして実施、その結果の解析を当校の他のテスト結果との相関をみながら解析、また学習者のテストに対する反応を観察した。クラス分けは適切におこなわれ、当地の教師たちのクラス分けにかかる労働の短縮におおいに貢献したという報告をえた。また、来年度はこのテストを当地周辺の高校やコミュニティーカレッジにも実施する計画である。(3)韓国、全北大学校において:韓国語話者の音声的な弱点がどのようにSPOTの結果に影響しているのか解析をおこなった。その結果をさらに分析するために、どのような音声環境をもった問題を作ればいいのかの検討に入っている。2.筑波大学においては問題穴埋め箇所の位置による違いを解析した。3.12月には海外の分担者も含め全員を筑波大学に招聘し、本年度の成果報告及び、次年度に向けての討議のための研究会をおこなった。これを本年度の報告書として3月中にまとめる予定。外国人日本語学習者の日本語能力を短時間、かつ簡単に、測定できるテスト法としてSPOTを開発し、試用、分析を重ねてきている。

SPOTはそれぞれには関連のない個別の1文を次々に読み上げ(音声テープで)、その文に含まれる文法項目のひらがな1文字分を同じ文を読みながら穴埋めディクテーションさせるという今までにない新しいテスト法である。過去、海外においては、オーストラリア、アメリカ、韓国、オランダ、ドイツ、エジプト、国内においても名古屋大学、九州大学、北海道大学などで試用の協力を得、筑波大学以外からのデータも集まり、このテストの特性も徐々に明らかになりつつある。また、実用性の高いことから、日本語教員の人員の少ない海外の日本語教育機関では実際にこれで効率的、かつ正確にプレースメントができたという報告を受けた。実際の使用が広がり始めたという現実の一方で、このテストに関する基礎的な研究も以下のような進展が見られた。1新しく問題を作成し、次のような条件の音声リソースを用意できた。(1)読み上げの速度(速い/遅い)(2)読み上げの調子(日常会話調/アナウンス調)(3)問題間隔(2秒/5秒)(4)読み上げの音声の質(男/女)(5)録音状況(ノイズ有/ノイズ無)以上の5つの条件の組み合わせにより32種類の音声テープが用意できた。これらの音声テープは今後の貴重な実験材料となる。2学習者特性と解答傾向の関係の分析を試みた。従来型の筆記による言語テストを外在規準として得点を比較すると、中国語話者は従来型の語彙、文法テストで得点しやすくSPOTでは得点が低くなりがちなこと、また、知識としてはあっても十分に習熟していない学習者は従来型では得点できてもSPOTでは得点できないことがわかった。3受験者の解答に至るプロセスの調査もパイロットスタディーとして行われた。4韓国語話者の場合については1の条件の違いを試み、今後の実験計画をたてた。5アメリカにおいては実際のクラス分けに利用した結果が学会で発表された。SPOTとは外国人日本語学習者の日本語能力を簡単に測定するものとして我々が開発したものである。基本的には二レベルの難度の問題基準があり、それに応じたテストヴァージョンを作り続けている。これらのテストを学習者のプレースメントテストとして試用する日本語教育機関は国内(筑波大、北海道大学、名古屋大学、など)外(アメリカ、オーストラリア、韓国など)で数十校に増加した。また、第2言語としての日本語の習得研究の基準としてこのテストを利用した研究も出始めた。本年度も各問題項目の難易を決定する条件を得るため、別途作成の文法項目学習診断テストとSPOTの各バ-ジョンの両タイプを実施してデータ収集をおこなった。また、コンピュータによる自動テスト処理システムの試作が完成し、学習者にフィードバックできる方法に見通しがたった。パソコンへの入力には労力を要したが、教師のための統計処理結果が自動的にでき、また、受験者に対しては点数、誤りの傾向を知らせるための結果シートを返却できた。
薬用植物の二次代謝物生合成遺伝子の遺伝子工学およびタンパク質工学

【目的】高等植物からのアミノ酸生合成などの物質代謝遺伝子の単離は、かならずしも容易ではなく、大量の酵素タンパク質の精製をおこなわない簡便なcDNAクローニング法の開発が必要である。今回演者らは、遺伝的相補性によるクローニング戦略を開発し、スイカ(Citrullus vulgaris)より硫黄同化経路の中心に位置するシステイン合成酵素(CSase)cDNAの単離に成功した。さらにこのCSase cDNAを大腸菌で大量発現させ、非タンパク性β-置換アラニン類の生合成に成功した。【方法・結果】スイカの黄化発芽体より発現型cDNAプラスミドライブラリーを構築し、遺伝的相補性を利用することにより、スイカからCSase cDNAの単離に成功した。1.5×10^5クローンからなるプラスミドライブラリーを、2個のシステイン合成酵素遺伝子座(cysK,cysM)が欠失しシステイン要求性となった大腸菌NK3に導入したところ、システイン要求性を機能的に相補する13個のクローンを単離した。これらのクローンは塩基配列の決定の結果、単一の遺伝子由来で325アミノ酸残基からなる分子量34、342のポリペプチドをコードしていることが示された。またゲノムDNAのサザン分析の結果、ゲムノ中に1コピー存在することが明らかになった。次に緑色及び黄化発芽体の子葉、胚軸、幼根より全RNAを調製しノーザン分析をおこなったところ、いずれの部位においても、構成的に発現していた。次にこのcDNAの大腸菌高発現系を作製し、ウリ科植物に特異的な非タンパク性アミノ酸であるβ-ピラゾールアラニンをはじめいくつかの二次代謝性アミノ酸のin vitroおよびin vivo合成に成功した。[目的]高等植物のシステイン合成酵素(CSase)は、自然界の硫黄サイクルにおいて重要な役割を果たし、また二次代謝性の非タンパク性アミノ酸生合成にも関与している。すでに演者らはホウレンソウ緑葉に存在するCSaseAのcDNAクローニングに成功している[PNAS,89,8078(1992)]。そこで、(] SY.encircled1. [)大腸菌での機能的大量発現、(] SY.encircled2. [)部位特異的変異による活性中心部位の検索、(] SY.encircled3. [)トランスジェニック植物での発現、を目的として研究を行った[方法と結果](1)大腸菌での機能的発現と大量発現cDNAクローンを大腸菌で機能的に発現するために、lacZプロモーターにつないだpKM1を構築し、CSase遺伝子座が欠損してCys-となったE.coli NK3に導入したところCys要求性を相補した。次に、大量発現のためT7プロモーターをもつpETベクターに導入した。その結果、T7RNAポリメラーゼを持つE. coli内で酵素活性をもつCSaseタンパクを大量発現することができた。(2)部位特異的変異導入による活性中心部位の検索CSaseはLys残基に結合したピリドキサールリン酸を補酵素とする酵素である。そこで、この活性中心部位のLys残基を同定するために、26個のLys残基のうちE.coli由来のCSaseと相同性のある12個について、Glyに改変した部位特異的変異体を得た。これらをE.coli NK3に導入し相補性を調べたところ、いくつかの変異体はCys要求性を相補できなかった。(3)トランスジェニック植物への導入、発現センス、アンチセンスcDNA、クロロプラストに輸送するトランジットペプチド配列を持ったキメラ遺伝子を構築し、トランスジェニックタバコを得て、発現を解析している。

1.5X10^5クローンからなるプラスミドライブラリーを、2個のシステイン合成酵素遺伝子座(cysK,cysM)が欠失しシステイン要求性となった大腸菌NK3に導入したところ、システイン要求性を機能的に相補する13個のクローンを単離した。これらのクローンは塩基配列の決定の結果、単一の遺伝子由来で325アミノ酸残基からなる分子量34,342のポリペプチドをコードしていることが示された。またゲノムDNAのサザン分析の結果、ゲノム中に1コピー存在することが明らかになった。次に緑色及び黄化発芽体の子葉、胚軸、幼根より全RNAを調製しノーザン分析をおこなったところ、いずれの部位においても、構成的に発現していた。次にこのcDNAの大腸菌高発現系を作製し、ウリ科植物に特異的な非タンパク性アミノ酸であるβ-ピラゾールアラニンをはじめいくつかの二次代謝性アミノ酸のin vitroおよびin vivo合成に成功した。