hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大脳の局所回路ニューロンの機能

線条体投射細胞の膜電位は、一定した二つの膜電位の間を移り変わって(シフト)している。一つは、-80から-85mVの電位(Downstate)で、もう一つは、-60mVの電位(Up state)である。Up stateからのみスパイク発射が起きる。本研究では、基底核の機能を理解する上で重要と考えられる。投射細胞の膜電位のシフトの性質を調べ、その成因を考えた。ラットの線条体の細胞から細胞内記録を行った。記録している細胞の電位依存性電流を止めるために、電極内に次のような薬をいれた。(a)QX314(Naコンダクタンスを抑える)(b)D890(Caコンダクタンスを抑える)(c)セシウム(Kコンダクタンスを抑える)。最初に、脱分極がNaやCaによる電位依存性電流によるのかどうか調べた。QX314とD890を細胞内に入れ、NaコンダクタンスとCaコンダクタンスを抑えても、Up stateは影響を受けなかった。Up stateでは外向き整流が強く、Downstateでは内向き整流が強かった。細胞内にセシウムを入れて外向き整流Kコンダクタンスを止めると、Downstateはほとんど影響を受けなかったのに、Up stateは一定でなくなり、更に大きな脱分極が見えるようになった。次に、セシウム、QX314、D890を細胞内に入れ、K,Na,Caの電位依存性コンダクタンスを止め、Up stateの電位がどうなるかを調べた。その結果、Up stateは-10から-20mVになり、皮質からのEPSPの反転電位の値とほぼ同じになった。これらから、Up stateは、皮質由来のEPSPで作られており、その大きさは飽和しているが、Kによる外向き整流コンダクタンスによって、一定の電位にクランプされていると考えた。
肝細胞癌における腫瘍ワクチンおよびTRAILを用いた腫瘍特異的遺伝子治療

我々は、これまで肝癌細胞をモデルに腫瘍ワクチンおよびTRAILの開発をめざして、腫瘍細胞研究を以下の二点に注目して解析してきた。1)T細胞が認識する腫瘍抗原の同定。2)C型肝炎ウイルスの肝細胞障害作用。以上の二点についてこれまでの成果を述べる。2)肝細胞癌の主な原因の一つであるC型肝炎ウイルスの中に細胞障害を引き起こす領域を同定した。この領域には、アポトーシスを引き起こし肝細胞を死に至らしめる作用と核染色体異常をおこす作用がある事を見いだした。この領域をINES領域と名付けた。INES領域は、ロイシンとイソロイシンが多く含まれている特異な構造をとっていた。細胞内のRanとExportinに作用して、染色体構造を傷害している事が判明した。そして、肝細胞にアポトーシスを引き起こしていた。詳細なシグナル伝達系について検討を行っている。マウスのDC細胞に関しては、牌臓細胞、骨髄細胞より、RBCを除きnonT、nonBをGM-CSF/IL-4などを用いて分離採取を試みている。B7-1分子を発現させたtransfectant(Ll)とDC細胞との細胞融合を検討中である。
擬正則曲線とハミルトン力学系の周期軌道

シンプレクティック幾何における擬正則曲線の理論を応用してハミルトン力学系の周期軌道の研究を行い,以下の成果を得た:(1)境界付リーマン多様体の単位余接束のシンプレクティック容量をループ空間の幾何を用いて計算し,応用として最短周期ビリヤード軌道の長さのよい評価を得た.(2)ストリング・トポロジーの積構造を鎖複体レベルで定義(構成)した.これは,余接束のフレア・ホモロジー上の高次積と対応すると予想される.(3)埋込接触ホモロジーの理論を応用し,三次元レーブ流および二次元ハミルトン微分同相写像に対してC∞級の閉補題を証明した.1.周期ビリヤード軌道の研究:リーマン多様体の閉測地線を研究する最も基本的な手法は、ループ空間上の長さ汎関数に対してモース理論を使うことである。同様の手法をビリヤード周期軌道に適用する研究はBenci-Giannoniにより行われていた。私はこの研究を精密化(定量化)し、ビリヤード台の容量という概念を導入して、周期ビリヤード軌道の長さを捉えられることを示した。応用として、周期ビリヤード軌道の長さに関して以前得られていた私自身の結果の精密化・一般化を与え、同時に他の研究者により得られていた関連する結果にもこの方法による別証明を与えた。以上について論文"Periodic billiard trajectories and Morse theory on loop spaces"をまとめた(投稿中)。2.ストリングトポロジーの研究:Chas-Sullivanは、99年の論文で多様体のループ空間のホモロジー群の上に一種の交叉積を定義し、さらにそれがBatalin-Vilkovisky代数という構造にのびることを示した。これは余接バンドル上のフレア理論とも深い関係がある。この結果を精密化して、鎖レベルの構造を定義することは重要な課題であるが、まだ決定版の解答はないと思われる。一つの困難は、鎖レベルで交叉積を定義する際に不可避な横断正則性の問題である。これについて、de Rham理論に基づく新しいアプローチにより一定の成果を得たので、論文"Transversality problems in string topology and de Rham chains"にまとめてプレプリントとして公開した。ストリングトポロジー、特に鎖複体レベルの代数構造についての研究を継続した。昨年度は、その際の本質的な困難である横断正則性の問題に対する解決法としてde Rham鎖のアイデアを導入し、自由ループ空間の鎖複体のモデルを構成した。今年度はその鎖複体の上にBatalin-Vilkovisky(BV)構造を実現した。より詳しくのべると、サボテン・オペラッド(Voronovにより導入された、枠付き小円板オペラッドの変種)のセル分解から定まる次数付微分オペラッドの作用を定義し、ホモロジーレベルではChas-SullivanによるBV構造を再現することを示した。以上の成果についてプレプリントarxiv:1503.00403を発表した。また、これまでのストリングトポロジーの研究で得られた結果と、シンプレクティック幾何における擬正則曲線の理論の関係について考察を進めた。例えば、ループ括弧積の鎖複体レベルでの定義は昨年度の研究ですでに得られていたが、これからループ空間のホモロジー上にLie無限大代数の構造が定まる。これは余接束のフレアホモロジー上のLie無限大代数の構造と対応するはずであり、その対応を確立することは応用上も重要であるが、その証明に一定の見通しを得た。アイデアとしては、零切断(ラグランジュ部分多様体)に境界を持つ穴あき擬正則円板のモジュライ空間を用いる。実際の証明は、このモジュライ空間の解析を全て行う必要があるので、かなり大規模なものになると考えられる。今年度の特筆すべき成果として,三次元接触多様体上のレーブ流に対するC∞級の閉補題を証明したことが挙げられる(論文掲載済).閉補題は力学系における重要問題であり,また一般のハミルトン力学系においてはC∞級の閉補題が成立しない(M.ヘルマンによる)ことと比較すると,驚くべき結果である.証明には三次元接触多様体に対して定義されるフレアホモロジーの一種である埋込接触ホモロジー,特にそれに付随するスペクトル不変量(一種のミニマックス値)に関する最近の進展(M.ハッチングスとその共同研究者による)を用いる.さらにこの結果を応用して,浅岡正幸氏との共同研究において,閉曲面のハミルトン微分同相写像に対してもC∞級の閉補題が成立することを証明した(論文投稿中).証明には,上で述べた三次元レーブ流に対する閉補題とともに,ハミルトン力学系の古典的な知識(KAM理論やバーコフ標準形)を用いる.昨年度に引き続き,ストリングトポロジーに関する研究も継続した.昨年度までに,自由ループ空間のホモロジー群上のBV(バタリン・ヴィルコヴィスキー)構造を鎖複体レベルで実現することに成功していたが,これについて発表していた二編の論文を統合し改訂した(投稿中).また,この結果と余接束のフレアホモロジー上の代数構造との対応について考察を進めた.次の段階として,(1)余積などの複数の出力を持つ操作,(2)S1同変理論を扱う枠組みを作ることが必要となる.これについて考察し,いくつかの部分的な結果を得た.フレアホモロジーの一種である埋込接触ホモロジーの理論を応用して,三次元レーブ流に対するC∞級の閉補題を証明した.これは,必ずしも当初に計画していたものではないが,保存力学系の研究に新しい展開をもたらす結果であると考えている.(1):プレプリントとして発表していた論文``A Chainlevel Batalin-Vilkovisky structure in string

topology via de Rham chains''の改訂を行い,Int. Math. Res. Notices誌から(オンライン上で)出版した。改訂の際に,オペラッドの代数的な理論に関わる部分を大きく簡易化することができた。この論文は,ストリング・トポロジーの鎖複体レベルでの厳密な構成を与えるもので,今後予定している研究の基礎となるものであり,きちんとした形で出版できたことの価値は大きい。(2):(1)の論文の手法と,ラグランジュ部分多様体に境界を持つ擬正則円盤のモジュライ空間上の倉西構造の理論をあわせることで,ラグランジュ部分多様体上の(鎖複体レベル)ループ括弧積のモーラー・カルタン元を構成する研究を行った(論文準備中)。この研究は,ラグランジュ部分多様体の分類問題に顕著な応用がある。また,余接束のフレア理論とストリングトポロジーを関係づけるチリバック・ラチェフのプログラムを実現するうえでの重要な一歩になるものである。(3):昨年度プレプリントとして発表した,閉曲面のハミルトン微分同相写像に対するC∞級の閉補題を証明した論文の軽微な改訂を行い,Geom. Funct. Anal誌から出版した。(4):閉曲面の単位余接束の埋込接触ホモロジーと,閉曲面上のストリング・トポロジーとの関係について考察を進めた。シンプレクティック幾何における擬正則曲線の理論を応用してハミルトン力学系の周期軌道の研究を行い,以下の成果を得た:(1)境界付リーマン多様体の単位余接束のシンプレクティック容量をループ空間の幾何を用いて計算し,応用として最短周期ビリヤード軌道の長さのよい評価を得た.(2)ストリング・トポロジーの積構造を鎖複体レベルで定義(構成)した.これは,余接束のフレア・ホモロジー上の高次積と対応すると予想される.(3)埋込接触ホモロジーの理論を応用し,三次元レーブ流および二次元ハミルトン微分同相写像に対してC∞級の閉補題を証明した.本年度の成果は、ストリングトポロジーにおける鎖複体レベルのBV構造をオペラッドの言葉を用いて記述したことである。これは昨年度より目標としていたことで、ほぼ理想的な形で示すことができた。また、シンプレクティック幾何における擬正則曲線の理論との関係について、昨年度よりもかなり精密な理解を得た。昨年度より継続している(鎖複体レベルの)ストリングトポロジーの研究について,目下の課題は(1)余積などの複数の出力を持つ操作,(2)S1同変理論,を扱う枠組みを作ることである.本年度にいくつかの部分結果を得たので,それをもとに論文にまとめる作業を行う予定である.また,埋込接触ホモロジーの低次元保存力学系への応用に関して,次に取り組むべき面白い問題が複数あるので,それらも検討していく予定である.シンプレクティック幾何学
低分子量G蛋白質Rhoの活性化機構と作用機構

本研究では、Rho低分子量G蛋白質の作用機構と活性化機構について検討した。HGFやCキナーゼを活性化するTPAにより、KB細胞では細胞膜のラッフリングが、ケラチノサイト308細胞では細胞運動がそれぞれ惹起される。この際、Rhoの活性化を阻害するRho GDIや、Rhoの機能を阻害するC3をマイクロインジェクションすることによって、RhoがHGFやTPAの下流でこれらの機能を制御していることを明らかにした。一方、MDCK細胞におけるRhoの細胞内の局在を検討したところ、静止時には、Rhoは細胞質に存在していたが、HGFやTPAを作用させると、細胞膜ラッフリングが引き起こされ、Rhoは細胞質から細胞膜ラッフリング領域へトランスロケーションした。また、細胞外Ca^<2+>を上昇させると細胞間接着が引き起こされ、Rhoは細胞間接着部位にトランスロケーションした。Swiss3T3細胞では、細胞質分裂時にRhoは収縮環にトランスロケーションした。さらに、これらの部位には、アクチンと細胞膜との結合を制御すると考えられているERMファミリー(Ezrin,Radixin,Moesin)とCD44がRhoと共に存在していることを明らかにした。したがって、RhoはERMとCD44によるアクチンと細胞膜との接着部位にトランスロケーションし、そこでERM-CD44系を介してアクチン細胞骨格の再編成に関与していると考えられる。さらに、Db1発がん遺伝子産物がRhoのGDP解離促進蛋白質としての活性を有することを明らかにし、Db1が細胞内でRhoを活性化している可能性を示した。以上、Rhoの作用機構と活性化機構の詳細がかなり明らかになり、当初の研究目的はほぼ達成することができた。
経皮的血管形成術後の再狭窄に対する局所薬物注入によるアポトーシスの誘導の効果

ハイブリッド犬を、thiopental sodiumで麻酔導入後、輸液ポンプを用いて維持麻酔を行った。気管内送管後、呼吸管理を行い、無菌的に左内頚動脈を剥離し、ヘパリン5000IUを静注した。同部より、8F右冠動脈用ガイドカテーテルをガイドワイヤーとともに透視下に、右または左大腿動脈へ進め留置した。大腿動脈の血管撮影を施行し、膝窩から鼠徑部の血管径の1.31.5倍径をもつ冠動脈形成術(PTCA)用のバルーンカテーテルを選択し、デリバリーカテーテルを装着した状態で大腿動脈内に挿入した。まず、一側の大腿動脈を対照とし、PTCA用バルーンを8気圧で30秒間膨隆させ、一分間隔で3回繰り返した。同様の操作を同側大腿動脈近位部で繰り返した(C群n=14)。その後、反対側の大腿動脈で、同様の操作を行った後、デリバリーバルーンカテーテルをPTCA用バルーン上にかぶせ、同位置で2気圧で膨隆し、ONO-40070.05mg/ml(LD群n=3)または0.5mg/ml(HD群n=11)を計5ml、2気圧の注入圧で局所に注入した。カテーテル類を抜去後、頚動脈を縫合修復し麻酔より覚醒させた。2週後または一ヶ月後に、大腿動脈を摘出しホルマリン固定を行った。摘出組織をHE染色し、短軸断面像をコンピュータplanimetryにより総血管面積(VA)に対する中膜面積比(M/V)、内皮面積(%I)および最大内皮肥厚径(maxI)を測定した。VA、M/Nは各群にて差を認めなかった。%Iは、HD群で2.75±1.06%とC群(6.42±3.42%)より有意に減少していた。また、maxIはC群の128±104μmに比してLD群で65.5±61.4μm(p<0.05)、HD群で50.5±21.5μm(p<0.01)と有意に減少していた。新生内皮内におけるTunel陽性細胞数は治療群で71.4±14.1でありC群の12.9±5.3に比して有為に増加していた。これらの結果から血管損傷局所へのONO-4007注入によるアポトーシスの誘導はその後の内皮の増殖に拮抗的に働き経皮的血管形成術後の再狭窄を予防する可能性が示唆された。当初、家兎を用いて実験計画を作成したが、巨大兎も含め6羽で実験を施行した結果、デリバリーバルーンを含めたカテーテルシステムの頚動脈からの挿入に困難を認めたため、対象動物を約15kgのハイブリッド犬に変更して実験を行った。ハイブリッド大を、thiopental sodium 20mg/kgで麻酔導入後、輸液ポンプを用いて維持麻酔を行った。

気管内送管後、人工呼吸器で呼吸管理を行い、頚部を悌毛後Isodineで消毒し、以後無菌的操作を行った。頚部切開後、左内頚動脈を剥離し、カットダウン法で8Fシースイントロヂューサーを挿入し、ヘパリン5000IUを静注した。同部より、8F右冠動脈用ガイドカテーテルをガイドワイヤーとともに透視下に、右または左大腿動脈へ進め留置した。大腿動脈の血管撮影を施行し、膝窩から鼠徑部の血管径を測定し、その1.31.5倍の径をもつ冠動脈形成術用のバルーンカテーテルを選択し、デリバリーカテーテルをマウントした状態で血管形成術用ガイドワイヤーを用いて大腿動脈内に挿入した。まず、一側の大腿動脈を対照とし、血管形成用バルーンを68気圧(血管径によって)で30秒間膨隆させ、一分間隔で3回繰り返した。同様の操作を同側大腿動脈近位部で繰り返した。その後、反対側の大腿動脈で、同様の操作を行った後、デリバリーバルーンカテーテルを血管形成術用バルーン上にかぶせ、同じ位置で2気圧で膨隆し、ONO-4007 0.01mg/1mlを計5ml、2気圧の注入圧で約12分かけて局所に注入した。カテーテル類を抜去後頚動脈を縫合修復し、麻酔より覚醒させた。後日、大腿動脈を摘出しホルマリン固定を行った。現時点で、血管損傷作成後6時間で摘出した標本2個および、4週間後の標本2個が固定中であり、3週生存犬1頭、2週生存犬1頭、1週生存犬1頭の作成を完了しているが、病理学的検索は平成11年度に行う予定である。また、各週でそれぞれ、平均4頭となるよう実験を進めていく。ハイブリッド犬を、thiopental sodiumで麻酔導入後、輸液ポンプを用いて維持麻酔を行った。気管内送管後、呼吸管理を行い、頚部を悌毛後Isodineで消毒し、以後無菌的操作を行った。左内頚動脈を剥離し、ヘパリン5000IUを静注した。大腿動脈の血管撮影を施行し、膝窩から鼠徑部の血管径の1.31.5倍径をもつ冠動脈形成術用のバルーンカテーテルを選択し、デリバリーカテーテルを装着した状態で大腿動脈内に挿入した。まず、一側の大腿動脈を対照とし、血管形成用バルーンを8気圧で30秒間膨隆させ、一分間隔で3回繰り返した。同様の操作を同側大腿動脈近位部で繰り返した(C群)。その後、反対側の大腿動脈で、同様の操作を行った後、デリバリーバルーンカテーテルを血管形成術用バルーン上にかぶせ、同位置で2気圧で膨隆し、ONO-4007 0.05mg/ml(LD群)または0.5mg/ml(HD群)を計5ml、2気圧の注入圧で局所に注入した。カテーテル類を抜去後、頚動脈を縫合修復し麻酔より覚醒させた。一ヶ月後、大腿動脈を摘出しホルマリン固定を行った。摘出組織をHE染色し、短軸断面像をコンピュータplanimetryにより総血管面積に対する内皮面積(%I)および最大内皮肥厚径(max I)を測定した。%Iは、HD群で2.8±1.3%とLD群(3.3±2.8%)、C群(6.2±3.2%)より有意に減少していた。また、max IはC群の111.5±66.2μmに比してLD群で65.5±61.4μm(p<0.05)、HD群で54.0±27.8μm(p<0.0l)と有意に減少していた。現在、血管損傷後1週間、2週間のモデルを作成しアポトーシス発現の有無を検討するためTunnel染色法で組織を検討中である。
酵素を応用した少糖類の大量調製・分離法の確立と少糖類の利用に関する研究

1.α-グルコシダーゼの糖転移反応による少糖調製に利用するため、ソバ、酵母、ミツバチ、Asp.niger,Asp.oryzae等の各種の材料からα-グルコシダーゼを結晶化あるいはディスク電気泳動的に均一な蛋白標品にまで精製した。2.固定化ソバα-グルコシダーゼの糖転移反応により新しい三糖類、【3^G】-α-グルコシル-シュクロースの調製を行なった。3.Asp.niger α-グルコシダーゼの結晶酵素を用いることにより、イソマルトースやパノースを調製し、これら二糖類、三糖類を活性炭カラムクロマトグラフィーにより分離調製した。4.ソバα-グルコシダーゼは特異的にニゲロースやコジビオースを生成するが、反応液中のこれら二糖類の混合物をそれぞれ定量する方法は確立されていなかった。本研究においてガスクロマトグラフィーとペーパークロマトグラフィーを組合せた手法を用いることによって、はじめてその定量法を確立した。この方法によって反応液中の各種二糖類の生成量を経時的に定量し、ニゲロースないしコジビオースの生成最適反応条件を設定することによりこれら二糖類の大量調製を行なった。5.ニゲロースとマルトースを相互分離することは通常極めて困難であるが、本研究においてはニゲロースをほとんど分解することのできないミツバチα-グルコシダーを用いて、マルトースを特異的に分解することにより高純度のニゲロースを分離する方法を確立した。6.一連のセロオリゴ糖の調製法を検討するためにエンド型のセルラーゼ(A.niger)を均一な蛋白に精製した。7.イソマルトースの調製に利用するため、デキストランからイソマルトースのみを特異的に生成するイソマルトデキストラナーゼを均一な蛋白標品にまで精製した。1.α-グルコシダーゼの糖転移反応による少糖類調製に利用するため、ソバ、酵母、ミツバチ、Asp.niger,Asp.oryzae等の各種の材料からα-グルコシダーゼを結晶あるいはデイスク電気泳動的に均一な蛋白標品にまで精製した。2.イソマルトースの調製に利用するため、デキストランからイソマルトースのみを特異的に生成するイソマルトデキストラナーゼを均一な蛋白標品にまで精製した。3.一連のセロオリゴ糖(β-1,4-グルコシド結合)の調製法を検討するためにエンド型のセルラーゼ(A.niger)を均一な蛋白に精製した。5.ニゲロースとマルトースを相互分離することは通常極めて困難であるが、本研究においてはニゲロースをほとんど分解することのできないミツバチα-グルコシダーゼを用いて、マルトースを特異的に分解することにより高純度のニゲロースを分離する方法を確立した。6.A.niger α-グルコシダーゼの縮合反応を応用した少糖類の合成法を検討し、この反応によりイソマルトースの調製が可能であることを確認した。7.A.niger α-グルコシダーゼを用いてパノースの調製とその分離を行なった。
社会体育領域における障害者のスポーツ活動に対するボランティアに関する国際比較研究-日米のスポーツボランティアのボランティア観及び継続規定要因の比較研究-

本研究の目的は、日本とアメリカの障害者に対するスポーツボランティア活動(障害者のスポーツ活動に参与しているボランティア活動)の実態を明らかにして、ボランティアの価値意識、継続意欲、ボランティア観、社会的背景などの比較を行い、両国のボランティア活動の継続規定要因を明らかにしていくことを目的とした。研究対象は、関東近郊のスポーツボランティア(車椅子バスケットボールのボランティア、障害児キャンプのボランティア、チアスキー教室のボランティア)123名及びアメリカの登録ボランティアのうちスポーツボランティアを行ったことのあるボランティア78名を対象として、郵送法及び直接インタビュー法による質問紙調査を行った後、両国より各5名を有意に抽出して直接ヒアリング調査を行った。調査項目は、価値意識、ボランティア観、活動に際しての阻害要因等であった。主な結果として、以下のことが明らかになった。1)属性は、日本が学生の割合が8割を占めているのに対して、米国では学生が約5割で社会人が3割を占めていた。活動は、日本が個人での活動が多く、アメリカでは、地域、教会、関係ボランティア団体等の集団で活動を行っているケースが多かった。2)「活動の価値意識」及び「ボランティア観」では、日本ボランティアは「社会的価値」を重視しており、アメリカのボランティアは「個人的価値」を重視している傾向があった。3)「ボランティア活動の阻害要因」では、日本のボランティアは、「時間の不足」「所属の理解の無さ」を上位に挙げており、アメリカのボランティアは、「活動上の価値観の違い」「経済的な援助」を上位に挙げていた。これらの結果より、アメリカのボランティアは、宗教より活動に関わっているケースが多く、活動の本質によって活動の継続が規定されており、日本のボランティアの場合、活動する上での実質的な問題が活動継続に影響していることが窺われる。
リン酸化修飾によるミトコンドリア機能と品質管理の制御機構

ミトコンドリアは様々な細胞機能に重要な役割を果たしているため,その活性は細胞により調節されている。特に,オートファジーを介した障害を受けたミトコンドリアの排斥は,ミトコンドリア品質管理として,近年,その詳細な分子メカニズムが明らかになってきた。私達は,PINK1とParkinにより制御されるミトコンドリアの品質管理が,cAMP/PKA経路を介したMIC60/MIC19のリン酸化修飾により調節されていることを明らかにした。しかし,ミトコンドリアでのリン酸化による調節機構には,まだ不明な点が多く残されている。本研究では,MIC60/MIC19,そしてDNAJC11のリン酸化修飾に着目して,そのリン酸化を介したミトコンドリア機能の調節機構の分子メカニズムを明らかにする事を目指している。平成30年度は,次の3点について研究を進めた。1.MIC60相互作用因子SLC25A46の発現抑制で,Parkinのミトコンドリア標的化に阻害効果が観察されたため,異なるsiRNAを用いてその効果を検討したが,2次的な影響であると推察された。2.MIC60/MIC19のPKAによるリン酸化反応が細胞質またはミトコンドリアのどちらで起こるかは,調節機構を理解する上で重要なポイントとなる。そこで,新規合成後に翻訳後修飾によりリン酸化されたMIC60がミトコンドリアへの輸送出来るかを検討するため,ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系で合成したMIC60を,細胞抽出液中に内在するPKAにより合成と同時に修飾する方法を確立した。3.PKAによる直接的なDNAJC11のリン酸化は,これまで確認できていないが,DNAJC11はMIC60/MIC19とMIBと呼ばれるタンパク質超複合体を形成することから,ミトコンドリア品質管理に寄与することが推定される。そこで,DNAJC11の機能ドメインを欠損変異体を用いて解析したところ,C末端にミトコンドリア局在化に必須な4アミノ酸残基から成る配列を見出した。1.MIC60相互作用因子SLC25A46の発現抑制で,Parkinのミトコンドリア標的化に影響が観察されたが,その効果は弱く,二次的な影響と推察された。そこで,同じ外膜タンパク質のPINK1の安定性を介してSLC25A46がParkin標的化に影響している可能性を検討している。2.大きな負の電荷を持つリン酸基を付加された新生タンパク質が,ミトコンドリアの膜透過装置を通過できるかは不明である。そこで,ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系でMIC60を合成と同時にPKAによるリン酸化修飾を行い,ミトコンドリア輸送系のモニタリング基質を作成した。3.DNAJC11のPKAを介したリン酸化反応は未同定であるが,ミトコンドリア局在化に必須なアミノ酸配列を,そのC末端領域に見出した。この部分は,神経筋疾患モデルのspc変異マウスにおいて欠損している領域に位置していた。1)MIC60/MIC19のリン酸化による品質管理の調節を解析するため, MIC60相互作用因子SLC25A46を発現抑制したがParkin標的化への影響は小さく間接的な効果であると考えられたため,次にPINK1の分解への役割を解析する。SLC25A46の野生型と変異体の安定発現細胞を樹立したので,ヒトで見つかったSLC25A46変異の影響についても検討する。2)PKAによりリン酸化されたミトコンドリアタンパク質のミトコンドリア内への輸送機構を解明するため,無細胞系で合成したリン酸化MIC60の輸送活性をin vitroミトコンドリア輸送系を用いて検討し,様々な輸送因子の要求性を明らかにする。3)ミトコンドリアタンパク質DNAJC11の生理的役割を明らかにするため,ミトコンドリアでの膜配向性と輸送に必須なシス領域を決定する。ミトコンドリアは多彩な細胞機能を担っており,その活性は細胞により様々な調節を受けている。特に,障害を受け膜電位が低下したミトコンドリアのオートファジーによる排斥は,ミトコンドリア品質管理として,近年,その詳細な分子メカニズムが明らかになってきた。私達は,PINK1とParkinにより制御されるミトコンドリアの品質管理が,cAMP/PKA経路を介したMIC60/19のリン酸化修飾により調節されていることを明らかにした。本研究では,MIC60, MIC19, SAM50そしてDNAJC11のリン酸化修飾に着目して,そのリン酸化を介したミトコンドリア機能の調節機構の分子メカニズムを明らかにする事を目指している。平成29年度は,次の3点について研究を進めた。1.MIC60相互作用因子SLC25A46の発現抑制で,Parkinのミトコンドリア標的化に阻害効果が観察された。今後は,SLC25A46のPINK1機能への役割の解析を進める。2.Hexokinaseの発現抑制により, Parkinのミトコンドリア標的化は顕著に阻害され,Hexokinaseの異所発現により回復した。繰り返し構造で2つの活性部位を持つHexokinaseのうち,活性部位を1つだけ持つユニットでもParkinの標的化阻害を回復できることから,Hexokinase全構造は必要ないことが明らかとなった。3.DNAJC11の推定リン酸化部位に特異的な抗体を作成したが,forskolin処理による優位な変化は検出できなかった。

今後は,内在性DNAJC11の免疫沈降産物でのリン酸化修飾の検出を試みる。1.MIC60相互作用因子SLC25A46の発現抑制で,Parkinのミトコンドリア標的化に影響が観察されたが,その効果は弱く,二次的な影響も懸念された。現在は,SLC25A46の異所発現による発現抑制の相補効果を検証している。2.Hexokinaseの発現抑制は,顕著にParkinのミトコンドリア標的化を阻害した。この標的化の阻害は,Hexokinaseの異所発現により回復した。Hexokinaseは活性部位を2ヶ所持つ繰り返し構造をとっているが,活性部位を1つだけ持つユニットでもParkinの標的化阻害を回復できることから,Hexokinase全構造は必要ないことが明らかとなった。今後は,Hexokinase活性のParkinの標的化への影響を検討する。今後は,低ブドウ糖培養条件でのHexokinaseの細胞内局在を検討する。3.DNAJC11はPKAによる推定リン酸化部位を持つため,特異的リン酸化部位抗体を作成し,forskolin処理によるリン酸化の検出を試みたが,優位な変化は検出できなかった。今後は,内在性DNAJC11のリン酸化を免疫沈降と組わせて検討する。ミトコンドリアは様々な細胞機能に重要な役割を果たしているため,その活性は細胞により調節されている。特に,オートファジーを介した障害を受けたミトコンドリアの排斥は,ミトコンドリア品質管理として,近年,その詳細な分子メカニズムが明らかになってきた。私達は,PINK1とParkinにより制御されるミトコンドリアの品質管理が,cAMP/PKA経路を介したMIC60/MIC19のリン酸化修飾により調節されていることを明らかにした。しかし,ミトコンドリアでのリン酸化による調節機構には,まだ不明な点が多く残されている。本研究では,MIC60/MIC19,そしてDNAJC11のリン酸化修飾に着目して,そのリン酸化を介したミトコンドリア機能の調節機構の分子メカニズムを明らかにする事を目指している。平成30年度は,次の3点について研究を進めた。1.MIC60相互作用因子SLC25A46の発現抑制で,Parkinのミトコンドリア標的化に阻害効果が観察されたため,異なるsiRNAを用いてその効果を検討したが,2次的な影響であると推察された。2.MIC60/MIC19のPKAによるリン酸化反応が細胞質またはミトコンドリアのどちらで起こるかは,調節機構を理解する上で重要なポイントとなる。そこで,新規合成後に翻訳後修飾によりリン酸化されたMIC60がミトコンドリアへの輸送出来るかを検討するため,ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系で合成したMIC60を,細胞抽出液中に内在するPKAにより合成と同時に修飾する方法を確立した。3.PKAによる直接的なDNAJC11のリン酸化は,これまで確認できていないが,DNAJC11はMIC60/MIC19とMIBと呼ばれるタンパク質超複合体を形成することから,ミトコンドリア品質管理に寄与することが推定される。
古代ロシア文語成立の萌芽期におけるブルガリア写本テクストの影響について

『ヴァチカン・パリンプセスト・キリル・アプラコス』と『サバの書』を主対象に上記テーマで研究を行った。『サバの書』本体のみではなく、やや後のロシアやブルガリアの写本をも包含する「とり合わせ本」として1冊のアプラコスをなすコーデクスNo14を研究対象とするなど新たな試みも行った。また、『サバの書』を中心に『オストロミール福音書』、『アルハンゲリスク福音書』、『ムスチスラフ福音書』のそれぞれを四福音書での章節順に並べ替えた電子的平行テクストも作製した。最後に報告書(iii+173ページ)を刊行して各位に配布した。「オストロミール福音書」(Ostr)については、分かち書き化の後Vostokov・Kozlovskij・Rep・版の諸補訂によりチェックを終えたテクストを、119va迄電子化した。すでに電子化してある「ムスチスラフ福音表」(Mst)・「アルハンゲリスク福音書」(Arch)の両テクストを四福音書順に置換する作業は終了した。この間岩井は、「サバの書」(Sar)とOstrとの密接な関連性から、カノンテクストに準するブルガリアの「バチカン・パリンプセスト・キリル・アプラコス」(VP)に注目し、そのmenologionを検討した。結果、1)Menologionにおいて81のカレンダー項目を、<12の副音>において8つの項目を確認した。2)Ostrとの間に差異が存することを確認した。3)カレンダー部分の日付け・視察対象・Imeの型・アンモニオス番号・ペリコペー等を詳細に見ると、VPのmenologionには少数の誤認がありさらに記事に不統一性が認められる。これは即ちにVPのmenologionがブルガリアないしマケドニアにおけるmenologion編集の完成への流れにあって、整理・改新をも含めて、その途上の作品であった可能性を推察せしめる。4)細部の点でDogramadzijeva、2010の記述と少数意見をことにした、等々の知見を得た。服部は、ロシアのOstr・Arch・Mstの3アプラコスとOCSの諸カノンや東ブルガリアのテトラ系写本との間で、これ迄の研究をふまえた上で改めて比較対照を行なった。これによりロシアのアプラコスの共通特徴さらに独自の個性的特徴を明確にせんとした。例えば次のような動詞形にその事例をみる。OCSカノンテクストKljucitz(Mt26.35)に対しロシアのアプラコスArchはlucitz、その平行箇所Mc14.31では「ゾグラフォス写本」(Zog)はlucitz、Ostrはpri-lucitz、Mst sz-lucitz、東ブルガリアのテトラ「バニシコ福音書」(Ban)sb-kljucitzと、語彙の異なり・接頭辞の有無と接頭辞の異なり等の諸状況が存在している。岩井の許においては、「オストロミール福音書」(Ostr)のテクスト111葉から電子化を続行し、一次的作業を終えて紙に印刷し、Ostrのファクシミリ版との対校作業を208葉迄終了した。又、「サバの本」(Sav)のテクストについては一次的作業を終えて紙に印刷し、Knjazevskajaらの刊本テクストおよび写真との校正を終了した。今後は誤植・変更箇所を電子テクストに反映する作業に入る。岩井はSavと他のOCSテクストの文献学的研究を当初の課題としていたが、「ヴァチカン・パリンプセスト・キリル・アプラコス」(VP)とSavおよびOstrとの関係性を重視し、前年の研究を踏まえてVPのsynaxarionにつきOstrと比較しつつ精査・検討を行ない、次の結果を得た。1)VPの底本はグラゴル文字で書かれた複数のaprakosである可能性あり。2)VPのsynaxarionはその構成上、スラブでのaprakos編集史上、創草期に位置すると考えうる。3)VPに元来存在しなかった項目が存する。4)VPインキピット(Inc)、に特異な例が存する。5)工ncに関し、VPはタイプIが主であるのに対し、OstrはタイプIからIaにドミナントが移行する。6)工ncとペリコペーとの間に、この間をつなぐテクストが挿入されるケースがみられる。7)VP同様、Ostrにも数字表記に関し、グラゴル・キリル両文字の誤認・混同が存する。これらは祖本に辿る可能がある。服部は、これ迄の研究を踏まえて、11世紀12世紀頃のルーシの言語における過去時制に関し、「アルハンゲリスク福音書」(Arch)に見られる興味深い諸例を手掛かりとして、《文法化》という視点から考察を加え、当時の非標準語である日用語(zhivajarech')の姿に追った。

その成果は別項に示した国際シンポジウム(2011.11.13,北海道大学)において講演発表された。なお、2010年の服部の研究と今回の岩井の研究により、ロシアにおける拡張型aprakosの成立・発達に関するZhukovskajaの主張は、VPの存在とその構成から、再考されなければならないことが明確化した。これは大きな収穫である。岩井の許において、『サバの書』(Sav)を中心として、『オストロミール福音書』(Ostr)、『アルハンゲリスク福音書』(Arch)、『ムスチスラフ福音書』(Mst)のそれぞれを四福音書での章節順に並べ替えた、平行テクストの作製を開始した。7月にはまずマタイ伝を紙に印刷し(A4版全391ページ)、試作品として種々の検討を行った。年度末までにマルコ伝、ルカ伝、ヨハネ伝についても完成させた。岩井はさらに、(前年度に文献学的な分析の対象とした)Savのsynaxarionの研究に対応させるべく、同書のmenologionについても文献学的な分析と検討を行った。今年度の研究の特徴は、従前のように古代教会スラブ語のカノンであるSav本体のみではなく、やや後のロシアやブルガリアで作られた写本をも包含する「とり合わせ本」として全体で1冊のアプラコスをなすコーデクスNo.14を研究対象とする点にあった。得られた結論は次の4点である。1)Kniazevskaiaらの刊本で列挙されるmenologionに認められる日付に関して漏れや誤りが有ることを確認した。2)前年度のsynaxarionの研究で「ペンテコステ後第17土曜・日曜」は設定されていなかったと結論付けたが、設定されていたと考えうる。3)「主日の早課十一の福音」は『アッセマーニ写本』、Arch、Mstと同様にmenologionの後に配されている。これに対してOstrでは、synaxarionとmenologionの中間に配される。4)コーデクスNo.14では、さらに写本末尾にアポストルの聖務日課とみられるHeb 3.1-4を含む半葉が付加されており、きわめて興味深い(この葉は11世紀ブルガリア制作にかかる)。一方、服部は、Ostr、Arch、Mstのアプラコスとしての構成に注目しつつ、今次の研究の総括を試みた。その結果、三写本の中で成立年代が最も古いOstrが、当時の最新のブルガリアのアプラコスにならうことで、革新的であることを示し、その成果を国際学会において発表した。岩井の許では,Ostrの電子化した本文とファクシミリ版との対校作業を終え,verse順に並べ終えた。Savは電子化をほぼ終了し,並べ換えに着手した。この間,岩井はSavの基礎研究として1999年Knjazevskajaらの刊本によりsynaxarionの構成を調査・検討し次の結果を得た。1)第2サイクルはペンテコステ後第16週のみ設定。これに対しVat PalとArchは第17週迄設定。2)IncはI ́が多い。ArchはIa。3)アンモニオス番号に誤りが多い。原因としてVat Palとは別理由が考えうる。4)Arch全体のsynaxarionの構成はSavに近似。ただし少なからぬ同異点が存し,1)に関連づけられる。「オストロミール福音書」のファクシミリ版と印刷本において細々とした文字・記号の問題があり、予想外であったが、おおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。
臓器移植希望者（レシピエント）に対する心理社会的評価のためのガイドラインの作成

臓器移植希望者(レシピエント)に対する心理社会的評価のためのガイドラインを作成するための予備調査として、国内における現行の心理社会的評価法を整理し、問題の所在を明らかにすることを目的に、国内の主要な移植施設において実施されている心理社会的評価方法と、そこで生じている問題についてフォーカスグループインタビューを実施した。インタビューの内容は、各施設における評価者・評価時期・評価項目・評価方法(各施設で使用している評価ツールを含む)・評価者が感じている評価上の問題点等である。対象は国内における主だった臓器移植施設においてレシピエントの心理社会的評価に3年以上関与している医療従事者(精神科医、臨床心理士、レシピエント移植コーディネーター、ソーシャルワーカー)である。2018年度末までに、目標施設数を超える心臓移植9施設、腎臓移植14施設、膵臓移植5施設、肝臓移植9施設を対象に実施できた。現在、インタビュー結果を集約中である。このインタビュー結果によって、移植先進諸外国での知見と対比するかたちで、メンタリティや移植事情の異なるわが国独自の課題をあぶりだすことができるため、わが国の事情に即したガイドライン作成のための有益な資料となった。本ガイドラインによって1施設を超えて一定のコンセンサスを得た評価を行うことが出来る、2移植適応基準における心理社会的・精神医学的評価の信頼性を担保できる、3予後に悪影響を及ぼす要因を特定し、介入に繋ぐことが出来るため、移植患者の予後の改善、QOLの向上に寄与できる、4脳死・心臓死下臓器提供への国民の理解促進にも寄与しうる等が期待できる。参加者の日程調整に難航し、上記インタビューの目標施設数の達成に時間がかかったため。インタビューによって得られた課題について、外部識者(医療倫理の専門家)、移植医、移植経験者、移植に携わっていない精神科医などを含めたワーキンググループメンバーで対応策を検討する。この検討会を今年度の前半に複数回行い、今年度中にガイドラインを策定する。1.移植先進諸外国のレシピエントの心理社会的評価の系統的レビュー移植先進諸外国における臓器移植レシピエント候補者に対する心理社会的評価に関する文献・ガイドラインをドナー種別(生体・死体)、臓器(心臓・腎臓・肝臓)の別を問わず、収集した。評価者・評価時期・評価項目・評価方法・予後予測・事後評価について整理し、同時に臓器横断的な共通要素と、臓器特異的要素の有無を整理した。現在、この成果をまとめ、論文化している。2.国内におけるレシピエントの心理社会的評価の整理と問題点の抽出国内における現行の心理社会的評価法を整理し、問題の所在を明らかにすることを目的に、国内移植実施施設において実施されている心理社会的評価方法(各施設で使用している評価ツールを含む)と、そこで生じている問題についてのヒアリングを実施するために準備中である。対象施設は2013年実施の全移植施設(心臓9施設、肝臓22施設、腎臓126施設)のうち、研究代表者が委員長を務める、日本総合病院精神医学会の臓器移植関連委員会のワーキンググループに所属する全国17移植施設の精神科医・レシピエント移植コーディネーター・臨床心理士等のメンバーが所属する心臓5施設、肝臓10施設、腎臓12施設程度を予定している。施設ごとあるいは職種ごとにフォーカスグループインタビューを行い、評価者・評価時期・評価項目・評価方法・予後予測・事後評価・評価者が感じている問題点について整理する予定である。特に先行研究において指摘されている以下のアドヒアランス不良のリスク要因に留意する:若年者、ソーシャルサポートの不足(家族の脆弱性)、不十分な理解力・意思決定能力、過去のアドヒアランス不良歴、精神障害、パーソナリティ障害の既往、現在症(アルコール・物質使用障害を含む)。おおむね順調に進展している。【課題1】移植先進諸外国のレシピエントの心理社会的評価の系統的レビュー移植先進諸外国における臓器移植レシピエント候補者に対する心理社会的評価に関する文献・ガイドラインをドナー種別(生体・死体)、臓器(心臓・腎臓・肝臓)の別を問わず収集した。【課題2】国内におけるレシピエントの心理社会的評価の整理と問題点の抽出国内における現行の心理社会的評価法を整理し、問題の所在を明らかにすることを目的に、国内移植実施施設において実施されている心理社会的評価方法(各施設で使用している評価ツールを含む)と、そこで生じている問題についてのヒアリングを開始した。29年度末までに、全17施設19名(精神科医6名、レシピエント移植コーディネーター13名;心臓移植施設3、腎臓移植施設11、膵臓移植施設4、肝臓移植施設6)に対するフォーカスグループインタビューを行い、各施設におけるレシピエントに対する心理社会的評価に関して、評価者・評価時期・評価項目・評価方法・評価者が感じている評価上の問題点等についてヒアリングした。課題1の論文化が遅れているが、課題全体の進捗としては概ね順調である。

臓器移植希望者(レシピエント)に対する心理社会的評価のためのガイドラインを作成するための予備調査として、国内における現行の心理社会的評価法を整理し、問題の所在を明らかにすることを目的に、国内の主要な移植施設において実施されている心理社会的評価方法と、そこで生じている問題についてフォーカスグループインタビューを実施した。インタビューの内容は、各施設における評価者・評価時期・評価項目・評価方法(各施設で使用している評価ツールを含む)・評価者が感じている評価上の問題点等である。対象は国内における主だった臓器移植施設においてレシピエントの心理社会的評価に3年以上関与している医療従事者(精神科医、臨床心理士、レシピエント移植コーディネーター、ソーシャルワーカー)である。2018年度末までに、目標施設数を超える心臓移植9施設、腎臓移植14施設、膵臓移植5施設、肝臓移植9施設を対象に実施できた。現在、インタビュー結果を集約中である。このインタビュー結果によって、移植先進諸外国での知見と対比するかたちで、メンタリティや移植事情の異なるわが国独自の課題をあぶりだすことができるため、わが国の事情に即したガイドライン作成のための有益な資料となった。本ガイドラインによって1施設を超えて一定のコンセンサスを得た評価を行うことが出来る、2移植適応基準における心理社会的・精神医学的評価の信頼性を担保できる、3予後に悪影響を及ぼす要因を特定し、介入に繋ぐことが出来るため、移植患者の予後の改善、QOLの向上に寄与できる、4脳死・心臓死下臓器提供への国民の理解促進にも寄与しうる等が期待できる。参加者の日程調整に難航し、上記インタビューの目標施設数の達成に時間がかかったため。2つ目の課題である「国内におけるレシピエントの心理社会的評価の整理と問題点の抽出」に関して、対象施設を増やすために、上記ワーキンググループ以外の施設にも打診している。課題1の論文化を進める。課題2については順調に進んでいる。インタビューによって得られた課題について、外部識者(医療倫理の専門家)、移植医、移植経験者、移植に携わっていない精神科医などを含めたワーキンググループメンバーで対応策を検討する。この検討会を今年度の前半に複数回行い、今年度中にガイドラインを策定する。すでに20万円の前倒し支払い請求をしていたが、人件費・謝金が予定より少ない額にとどまったため、次年度使用額が生じた。課題2のインタビューのための必要経費として次年度に使用する。インタビュー調査の実施回数を参加者の日程調整により節約できたため。次年度の会議実施のために使用する。次年度の人件費・謝金に充てる予定である。
皮膚悪性リンパ腫におけるT細胞受容体(γ鎖)遺伝子再構成に関する分子生物学的研究

昭和63年度からの2年間の本研究において、皮膚の悪性リンパ腫におけるT細胞受容体遺伝子再構成に関する分子生物学的研究をおこなった。4例の悪性リンパ腫(ATL1例を含む)のうち3例においてT細胞受容体β鎖cDNAを用いてDNAの再構成が認められ、T細胞由来の性格が明らかとなった。さらに1例においては免疫グロブリン産生遺伝子Jhの再構成が認められ、B細胞性リンパ腫であった。反応性リンパ節腫脹の1例では、Tβ、Jhとも陰性であった。本研究の当初の目的としてT細胞受容体γ鎖遺伝子の再構成をも検討したいと考えていたが平成元年度に新しい臨床検体が得られず、現在の段階では未施行である。Tγは一般に幼若な分化段階のT細胞に表現されていると考えられており、成熟型の腫瘍細胞からなることの多い皮膚悪性リンパ腫における発現は可能性が少いとも想像されるが、腫瘍性T細胞と密接な関係にあるランゲルハンス細胞類似の表皮樹枝状細胞に発現していることがマウスで証明されており、今後症例を重ねて検討して行きたい。さらにこれらのT細胞受容体遺伝子のin situ hybridizationも試みたが現段階では成功していない。組織切片においていかにノイズを減らし、シグナルを拾い上げるかが最も重要なポイントであり、よりよい標識法を選択することと同時に今後も検討を加えていく必要がある。本年度は、皮膚T細胞性リンパ腫におけるT細胞受容体γ鎖の検討の前段階として、(1)臨床検体からのDNAの摘出、(2)サザンブロッティングによるハイブリダイゼーション、(3)T細胞受容体γ鎖cDNAの作製、(4)非放射性(ビオチン標識)Tα鎖、Tβ鎖cDNAの作製を予定した。研究は順調に進行し、まず、臨床検体からのDNAの描出とサザンブロッティングによるハイブリダイゼーションに関しては、5例において検索された。その内訳は、ATL1例、小児のリンフォーマ3例、反応性リンパ節腫脹1例で、ATLと2例のリンフォーマでT細胞受容体β鎖cDNAを用いてDNAの再構成が認められ、T細胞由来の性格が明らかとなった。さらに1例の小児リンフォーマでは免疫グロブリン産生遺伝子Jhの再構成が認められ、B細胞性リンパ腫であった。反応性リンパ節腫脹の1例ではTβ,Jhとも陰性であった。T細胞受容体γ鎖cDNAは現在作製中である。プラスミドはpuc21を用い、VJcγ1領域を大腸菌HB101に挿入し、クローニング中である。in situ hybridizationのための非放射性(ビオチン標識)Tα鎖、Tβ鎖cDNAの作製に関してはこの方面のテクノロジーの進歩は目覚ましく、次々と改良された標識法が開発され、利用可能となってきているので、我々の目的に最も適した方法を選択して来年度に実行することにした。
抗腫瘍血管新生能を持つPECAMアンタゴニストの探索と解析

α2,6-シアル酸を欠損したST6Gal I KOマウスを用いて、そのKOマウスと野生型マウスに腫瘍細胞を移植し、その後の腫瘍のサイズや腫瘍内の血管新生について調べました。その結果、欠損マウスでは腫瘍の増殖が野生型マウスと比べて明らかに減退していることがわかりました。さらに両マウスの腫瘍組織において血管内皮マーカーとアポトーシスマーカーであるcleavef PARPの二重染色をおこなった結果、欠損マウスでは腫瘍内部の血管内皮細胞の多くが死んでいることが分かりました。本来PECAMは、α2,6-シアル酸に結合することで細胞同士を接着させると同時に、他の細胞膜上のシグナル分子であるVEGFFR2やインテグリンと機能的複合体を形成して生存シグナルを伝えています。しかし、α2,6-シアル酸が欠損するとPECAM同志のホフィリックな相互作用が失われる結果、細胞表面にとどまれず、結果的に複合体成分が異常なシグナルを伝えることで、血管内皮細胞が死にやすくなることが明らかになり、この結果は2018年のOncogeneに掲載されました。現在、α2,6-シアル酸を模倣した低分子化合物のスクリーニング中であり、将来的にPECAMの相互的結合を阻害するような選択的化合物を得られれば、新たな抗血管新生阻害剤の候補になると期待できます。私達は、血管内皮細胞の主要な接着分子PECAMがα2,6-シアリル化糖鎖を持つこと、そしてα2,6-シアリル化糖鎖に対するレクチン活性を持つこと(S. Kitazume et al. (2014)J. Biol. Chem. 289, 20606)を最近明らかにした。α2,6-シアル酸を欠損した血管内皮細胞でPECAMはホモフィリックな相互作用が出来なくなるために細胞表面に停留できず、エンドサイトーシスされてしまうために生存シグナルを細胞に送ることが出来なくなる結果、アポトーシス刺激に脆弱になることも分かった。今年度はPECAMが細胞表面に停留できなくなる結果、パートナー分子であるVEGFR2やintegrinβ3も細胞表面の発現量が低下し、細胞内に異常なシグナル伝達をする結果、腫瘍血管新生が減退する分子機構を明らかにしたため、現在論文としてまとめており、投稿間近である。また、α2,6-シアリル化糖鎖をミミックする化合物がPECAMアンタゴニストとして作用することで抗血管新生阻害剤になるのでないか、との期待の元にスクリーニングを行った。今年度はPECAMに結合する化合物を理研化合物アレイを用いて3万化合物のスクリーニングをした結果、11種類のヒット化合物を見出した。また独自にα2,6-シアリル化糖鎖をミミックするペプチドを共同研究者より分与して頂き、PECAM-PECAM相互作用のアッセイ系に添加したところ、予想外に相互作用を強める化合物を見つけた。この化合物は血管透過性を抑制する効果を持つことが期待できるため、さらに次年度は解析を進める計画である。本年度、3万種類の化合物を搭載する化合物アレイの中から、PECAMに結合するヒット化合物を複数同定することが出来たのは、大きな進展と言える。また、これとは別にα2,6-シアリル化糖鎖をミミックしたペプチドがPECAM-PECAM相互作用を増強する効果があることを偶然にも発見した。このことは、私達の構築したin vitroの実験系でPECAMのアンタゴニストとアゴニストの両方をスクリーニングできる可能性を示している。さらに、本年度はin vivoでのα2,6-シアル酸の欠損によって腫瘍血管新生が減退すること、その分子的背景を明らかにした論文をまとめることが出来たのも大きな収穫である。私達は最近、血管内皮細胞に特異的に発現する接着分子PECAMがα2,6-シアル酸特異的に結合するレクチン活性を持つこと、α2-6シアリル化糖鎖を添加するとPECAM同志の相互作用が失われて細胞表面に停留できなくなり、PECAM依存的な生存シグナルを細胞に伝達できなくなることを明らかにした(S. Kitazume et al J. Biol. Chem. 285, 6515, (2010)、S. Kitazume et al. J. Biol. Chem. 289, 27606 (2014))。2017年度は化合物ライブラリーを用いてα2-6シアリル化糖鎖をミミックするようなPECAMアンタゴニストとなる化合物探索を引き続き進め、複数の候補化合物を見出した。また、本研究の根幹となる発見は、α2-6シアリル化糖鎖を欠損させたなマウスにおいては腫瘍内の血管新生が特異的に減退し、その結果、腫瘍の壊死が亢進するというものであり、Oncogeneに投稿していたが、レビュアーからいくつかの追加実験を求められた。まず、ポリライゲーションアッセイによって、α2-6シアリル化糖鎖を欠損させた血管内皮細胞においては、PECAMと複合体を形成しているVEGFR2がPECAMと共にエンドサイトーシスされて細胞に過剰なシグナルを伝達することをみいだした。また、polyHEMAコートしたプレート上でα2-6シアリル化糖鎖を欠損させた血管内皮細胞を培養することで、インテグリン依存的なアノイキスが昂進していることが血管内皮細胞死につながっている可能性が高いことなどを明らかにした。これらの結果をまとめ、再投稿を行った結果、受理された。血管内皮細胞系を用いてpolyligation assayを行うことで、PECAM-VEGFR2 complexの可視化に成功した。