hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子医薬品の体内動態および細胞取り込み機構の解明に基づくデリバリー戦略の確立

近年、遺伝子治療やDNAワクチンのアプローチにおいて、直接患者に投与するin vivo法の確立が望まれており、なかでも非ウイルスベクターであるプラスミドDNAを用いる方法は有用かつ安全な手段として期待されている。しかしながら、生体に投与されたプラスミドDNAの体内動態に関する情報は極めて乏しく、細胞取り込み機構に関してもほとんど知られていないのが現状である。一方、プラスミドDNAが、マクロファージ等の免疫担当細胞を活性化し、炎症性サイトカインが誘導されることが報告され、安全性の観点からもプラスミドDNAの体内動態や細胞取り込み機構を解明することが重要と考えられている。そこで本研究では、体内動態を支配する細胞として重要な役割を果たしていることが示されているマクロファージに焦点を当て、取り込み機構および取り込み後に起こる活性化について検討した。スカベンジャー受容体発現CHO細胞およびスカベンジャー受容体ノックアウトマウスより採取したマクロファージを用いた取り込み実験を行った結果、プラスミドDNAの取り込みにはポリアニオンの立体構造を特異的に認識する機構の関与が明らかとなった。一方、プラスミドDNAにはメチル化を受けていないCpGモチーフと呼ばれる配列が存在し、炎症性サイトカインを誘導することが知られている。そこでプラスミドDNAとリポソームとの複合体によって起こる免疫活性化を検討した結果、腫瘍壊死因子やインターロイキン-6などの炎症性サイトカインの顕著な産生が認められた。しかしながら、同様の現象はメチル化したプラスミドDNAおよびCpGモチーフを持たない哺乳類由来の牛胸腺DNAの場合にも認められ、CpGモチーフ非依存的な活性化が起こることが明らかとなった。以上、遺伝子治療やDNAワクチンのアプローチにおけるプラスミドDNAの最適化を実現するための有用な基礎情報が得られた。近年、遺伝子治療において、遺伝子を通常の医薬品と同様、直接患者に投与するin vivo法の確立が望まれており、なかでも非ウイルスベクターであるプラスミドDNAを用いるアプローチは、有用かつ安全な手段として期待されている。しかしながら、生体に投与されたプラスミドDNAの体内動態に関する情報は極めて乏しく、また標的細胞やそれ以外の細胞における取り込み機構もほとんど知られていない。一方、プラスミドDNAがマクロファージ等の免疫担当細胞を活性化し、炎症性サイトカインを誘導することが最近報告され、安全性の観点からもプラスミドDNAの動態解明が重要と考えられている。そこで本研究では、遺伝子治療およびDNAワクチンの試みにおけるプラスミドDNAの投与の最適化を最終目的に、プラスミドDNAを全身あるいは局所投与した際に体内動態に関連する細胞での取り込み機構の解明を試みた。これまでの検討により、マクロファージが重要な役割を演じていること並びにスカベンジャー受容体様の機構の関与が示唆されている。そこで、スカベンジャー受容体発現CHO細胞およびスカベンジャー受容体ノックアウトマウスより採取したマクロファージを用いた取り込み実験を行った。その結果、プラスミドDNAの取り込みにはポリアニオの立体構造を特異的に認識するスカベンジャー受容体の特性に極めて類似している別の受容体が関与することが明らかとなった。また、取り込み機構と取り込み後に起こる遺伝子発現や活性化による腫瘍壊死因子の分泌など生物学的作用との関連についても有用な情報が得られた。近年、遺伝子治療やDNAワクチンのアプローチにおいて、遺伝子を通常の医薬品と同様、直接患者に投与するin vivo法の確立が望まれており、なかでも非ウイルスベクターであるプラスミドDNAを用いる方法は有用かつ安全な手段として期待されている。しかしながら、生体に投与されたプラスミドDNAの体内動態に関する情報は極めて乏しく、標的細胞やそれ以外の細胞における取り込み機構に関してもほとんど知られていないのが現状である。一方、最近プラスミドDNAが、マクロファージ等の免疫担当細胞を活性化し、炎症性サイトカインが誘導されることが報告され、安全性の観点からもプラスミドDNAの体内動態や細胞取り込み機構を解明することが重要と考えられている。

昨年度は、マクロファージにおける取り込み機構に焦点を当てスカベンジャー受容体の特性に極めて類似した機構の関与などを明らかにした。そこで本年度は、取り込み後に起こる活性化について検討した。プラスミドDNAなど細菌DNAにはメチル化を受けていないCpGモチーフと呼ばれる配列が存在し、これを認識することで、炎症性サイトカインを誘導することが知られている。我々はプラスミドDNAとリポソームとの複合体によって起こる免疫活性化をマクロファージのin vitro培養系で検討した。プラスミドDNAとカチオン性リポソーム複合体をマクロファージに取り込ませた結果、腫瘍壊死因子やインターロイキン-6などの炎症性サイトカインの顕著な産生が認められた。しかしながら、同様の現象はメチル化したプラスミドDNAおよびCpGモチーフを持たない哺乳類由来の牛胸腺DNAの場合にも認められ、DNA・リポソーム複合体がマクロファージに取り込まれた場合にはCpGモチーフ非依存的な活性化が起こることが明らかとなった。
糖含有複合脂質膜を用いるがん細胞膜インターフェイスの制御とがん抑制効果

本研究テーマで用いた複合脂質膜(ハイブリッドリポソーム)は、ベシクル分子とミセル分子を緩衝水溶液中で超音波照射するだけで得られ、さらに、素材や組成比の選択によりサイズ、相転移温度、膜流動性や疎水性などの物性のコントロールが可能な機能性新素材である。本研究では、糖含有HLのがん治療に関する以下の興味深い知見が得られた。(A)ラクトース骨格を有する界面活性剤(LactC_<10>)は、β-lactoseoctaacetate(Ac-Lact)のグリコシル化と脱アセチルによって得られたdecyl-β-lactoheptaacetate (Ac-LactC_<10>)からの効率的な合成に成功した。(B)ラクトース骨格を有するLactC_<10>含有三成分HL (HL/LactC_<10>)のヒト肝臓がん細胞(Hep-G2、Huh-7)に対する制がん効果について検討したところ、二成分HLのIC50より小さかった。(C)HL/LactC_<10>の固定水層(TFAL)は、二成分HLの約2倍であり、HL/LactC_<10>の抑制性作用が、がん細胞における水和と関連がある可能性が明らかになった。適切な固定水層の厚さを持つLactC_<10>含有三成分HL(HL/LactC_<10>)のヒト肝臓がん細胞に対する増殖抑制効果と水和との関係の重要性を初めて実証した。ラクトース骨格を有する界面活性剤(LactC_<10>)を合成し,ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)を構成成分とするハイブリッドリポソーム(HL)にLactC_<10>を組込み、三成分系ハイブリッドリポソーム(THL)を創製した。THLの物性およびヒト肝臓がん細胞(Hep-G2, Huh-7)に対する制がん効果について検討したところ、次のような興味ある知見が得られた。(1)NMR、IR測定、元素分析などから、LactC_<10>が高純度で合成できた。(2)Hep-G2およびHuh-7に対するIC_<50>値はHLに比べて小さく、THLによる増殖抑制効果の向上が明らかになった。(3)THLはHep-G2およびHuh-7に対してアポトーシスを誘導し、正常肝細胞に毒性がないことを確認した。THLは、がん細胞のみに制がん効果を示し、アポトーシスを誘導することから、副作用のない新しい制がん剤としての臨床応用が期待できる。(高分子論文集,65 (1), 90-97 (2008))多価不飽和脂肪酸(PUFA)の制がん効果に注目し、リン脂質(DMPC)と非イオン性ミセル界面活性剤(Tween 80)からなるハイブリッドリポソーム(HL)にPUFAを含有させ、肺腺がん細胞、大腸がん細胞および胃がん細胞に対する増殖抑制効果を検討した。PUFA含有HLは、すべてのがん細胞に対して増殖抑制効果を示したが、n-6系のリノール酸は脂質過酸化反応による細胞傷害でネクローシスを誘導し、n-3系のドコサヘキサエン酸では細胞のプログラム死であるアポトーシスを誘導していることが明らかになった。HLに多価不飽和脂肪酸を含有させることで、がん細胞に対して異なる細胞死(ネクローシスとアポトーシス)を誘導できることをはじめて明らかにした。(Bioorganlc & Medicinal Chemistry Letters,18,1880(2008).)カチオン性脂質を含有する三成分系HLを新たに創製し、ヒト腎臓がん細胞に対するin vitroおよびin vivoでの制がん効果を検討したところ、次のような興味深い知見が得られた。in vitroにおいて、(1)腎臓がん細胞に対する高い増殖抑制効果が明らかになった。(2)正常ヒト腎臓細胞に対しては、低毒性であった。

(3)腎臓がん細胞に対してカスペースの活性化およびミトコンドリアを経由してアポトーシスを誘導することが明確になった。in vivoにおいて、(4)腎臓がん同所移植モデルマウスに対する治療実験から、アポトーシス誘導による顕著な治療効果が明らかになった。(5)正常マウスに対する安全性試験および溶血試験において、毒性はなく安全であることが確認できた。以上のことから、カチオン性脂質を含有する三成分系HLの腎臓がん治療薬としての可能性が初めて明らかになった。(Anticancer Research,30,327(2009).)大腸がんの肝転移マウスモデルに対するハイブリッドリポソーム(HL)の治療効果を肝臓組織切片の組織学的分析により検討したところ、次のような興味深い知見が得られた。(1)大腸がんの肝転移モデルマウスに対してHLを尾静脈投与し、治療後に肝臓を取り出し、肝臓重量、ヘマトキシリン-エオシン染色、マッソントリクローム染色および大腸がんの腫瘍マーカーであるCEAでの免疫染色法により治療効果を検討した。未治療群の肝臓においては、大腸がんの肝転移によるさまざまな異常所見が見られたが、HL治療群では、がん細胞を移植していないノーマルマウスの肝臓とほぼ変わらず、顕著な治療効果が確認された。(2)肝転移モデルマウスに対してHLを尾静脈投与し安全性を検討したところ、毒性は認められず、HLの高い安全性が確認された。大腸がんの肝転移に関して、薬物を含まないHLのみによる副作用のない顕著な治療効果が動物レベルでの組織学的分析により確認されたことは、非常に興味深い。(Int.J.Pharm.,394,174(2010))HLのコトンラット胃がん(CoRa622 G6)細胞に対する制がんメカニズムおよびin vivoにおける胃がんの腹膜播種モデルマウスに対する治療効果を検討したところ、以下のような興味深い知見が得られた。(1)HLは、1ヵ月以上、直径100ナノメートル以下の安定な膜を形成した。(2)ミトコンドリアの膜電位の減少とカスパーゼ-8、-9と-3の活性化が認められ、HLによるアポトーシスのシグナルがミトコンドリアおよびカスパーゼを経由することが明らかになった。(3)胃がんの腹膜播種モデルマウスに対してHLは、アポトーシス誘導により顕著な延命効果を示す事が明らかになった。本研究の結果は、胃がん患者に対する臨床応用が期待される。(Anticancer Res.,30,2011(2010))
光ファイバーによる周波数掃引光を用いたフェムト秒時間分解能非線型分光の実験的研究

スペクトル幅(^υ)の広い周波数掃引光が、その相関時間τc(^【υ^(-1)】)程度の超高時間分解能をもたらす分光光源として有用なことを示すのが本研究の目的である。フェムト秒(fs)領域のτcをもつ上記の光を発生する基本光源として、まず、連続動作モード同期YAGレーザーの第2高調波で励起された連続動作ピコ秒色素レーザーの開発を行った。所要の非線形効果を起すのに充分な強度の光パルスを高繰返しで得るため、連続動作QスイッチYAG再生増幅器を開発し、その出力の第2高調波によって更に色素増幅器を励起する方式を実現した。こうして、現在迄に1KHzの繰返しの0.51ピコ秒(ps)パルスが約1MWのピーク出力で得られるようになった。このパルス光を光ファイバーと回折格子の組合せによって圧縮し、80fsの幅を得た。これを更に別の光ファイバーに通し、その自己位相変調によって1020fs程度のτcをもつ周波数掃引光を得る予定である。一方、周波数掃引光の分光光源としての効果を示す目的で、他の光源による予備実験も行った。モード同期Arレーザーで同期励起された色素レーザー光を光ファイバーに通すと、パルス幅8ps,τc0.1psの周波数掃引光が得られる。これを光源として色素溶液における2入射光縮退4光波混合の実験を行ったところ、相関波形のピーク値が約30fsシフトする測定結果が得られた。これは色素分子(DODCI)における位相緩和の情報を与えるもので、周波数掃引光が幅τcの超短パルス光と同等の役割を果たすことを示すものである。前記光源の利用によって更に短時間領域での測定が可能になることが期待される。短いτcをもつ光として、他にインコヒーレント光があり、周波数掃引光との比較が重要である。このため、インコヒーレント光を用いた3入射光又は2入射光縮退4光波混合による色素分子のエネルギー緩和時間や、半導体ドープガラスにおける位相緩和時間の測定も行った。
エピタキシャル薄膜によるリチウム電池材料の界面構造制御と電極特性

本研究課題では,リチウム電池の高性能化・高機能化の鍵を握る電極/電解質界面の反応解析を行った.特に電極界面構造変化に焦点を当て,エピタキシャル理想界面電極と表面X線散乱測定を駆使して電池反応中の界面構造変化を直接観測することに成功した.電極最表面では電池作製時に原子配列が乱れ,初期充電過程に再構成されることを見出した.さらに,材料,結晶面,表面形態により再構成構造が異なり,特に電極安定性に大きく影響することが分かった.ブラックボックスである実用電池電気化学界面の解明に向けた理論・実験的基盤を構築することに成功した.本研究課題では,リチウム電池の高性能化・高機能化の鍵を握る電極/電解質界面の反応解析を行った.特に電極界面構造変化に焦点を当て,エピタキシャル理想界面電極と表面X線散乱測定を駆使して電池反応中の界面構造変化を直接観測することに成功した.電極最表面では電池作製時に原子配列が乱れ,初期充電過程に再構成されることを見出した.さらに,材料,結晶面,表面形態により再構成構造が異なり,特に電極安定性に大きく影響することが分かった.ブラックボックスである実用電池電気化学界面の解明に向けた理論・実験的基盤を構築することに成功した.次世代のエネルギー変換・貯蔵デバイス開発の鍵は電極材料の改善にある.電極材料の改善には充放電反応機構に基づき,高容量,高出力,長寿命を実現可能な電極構造を見出すことが必要である.電極/電解質界面は電池反応の開始点であるが,様々な因子が関与する複雑系であり,既存の手法では界面構造,反応機構ともに詳細な解析が困難である.本研究では,リチウム電池電極材料の界面構造変化をその場観測し,界面構造と電極特性の関連を明らかにするため以下の課題を実施している.1)界面反応解析に適した反応系の構築:単一配向かつオングストローム単位で表面形態を制御した薄膜電極による電極反応因子の分離,2)各因子が与える電池特性への影響の評価:材料,反応面,表面形態が異なる電極を用いた電気化学測定,3)表面結晶構造のその場解析手法の確立:in situ放射光X線表面回折,表面XAFS測定による表面構造の追跡.結果として,Nb:SrTiO_3単結晶基板上に成長させた層状岩塩型LiMO_2(M= Mn, Co, Ni)で,初期充放電中における電気化学活性,表面皮膜形成過程が結晶面により変化することを見出した.さらに表面回折より,電極表面構造は電極内部と異なり初期過程で原子配列が乱れ,後に再配列し,一定となることを明らかにした.このことは変化後の表面構造が電池特性に影響する可能性を示唆し,新しい材料合成の指針として重要な知見が得られた.現在は,より詳細な解析を目指して表面XAFS,中性子反射率測定から電子状態,リチウム挙動の解析を試みている.昨年度までにリチウム電池正極材料のエピタキシャル薄膜をモデル電極として,放射光X線表面回折測定から,電池作製時に電極表面の原子配列が乱れること,初期充放電中に再配列することを見出した.このことは優れた特性を示す電極電解質界面を構築するためには再構成構造制御が鍵であることを示唆している.本年度は,より詳細に界面反応機構の解析を行った.課題の詳細と成果を以下に挙げる.1)単一配向かつオングストローム単位で表面形態を制御したLi_4Ti_5O_<12>エピタキシャル薄膜をパルスレーザー堆積法で作製した.さらに電極表面に固体電解質Li_3PO_4を修飾したLi_4Ti_5O_<12>エピタキシャル薄膜を作製し,充放電特性を比較した.その結果,固体電解質Li_3PO_4を修飾した薄膜電極は優れたサイクル特性を示すことを明らかにした.2)in situ放射光X線表面回折でLi_4Ti_5O_<12>薄膜/液体電解質界面とLi_4Ti_5O_<12>薄膜/Li_3PO_4固体電解質界面におけるLi_4Ti_5O_<12>結晶構造変化を追跡した.Li_4Ti_5O_<12>薄膜/液体電解質界面では初期過程に岩塩型へ再構成が観測されたのに対し,Li_4Ti_5O_<12>薄膜/Li_3PO_4固体電解質界面では再構成後もスピネル構造を維持した.以上の結果より,表面修飾により再構成構造が変化し,電極安定性を制御できることを明らかにした.3)Li_4Ti_5O_<12>薄膜電極にin situ中性子反射率法を適用することで,充放電反応中における電極から電解液側に渡るLiの濃度勾配を解析し,電解質側において電極から数10nmほど濃度勾配が存在することを明らかにした.以上より,高速かつ優れた安定性を示す次世代電池の開発には,電気化学反応場における電極表面構造・電解質構造を制御することが必要である.
一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いた下気道線毛運動機序の解明

線毛運動における一酸化窒素(nitric oxide; NO)、NO合成酵素(NO synthase; NOS)の役割は不明な点が多い。本研究ではNOSs完全欠損マウスを用い、NO及びNOSを介した線毛運動機序の解明を行うことを目的とした。リポ多糖(LPS)腹腔内投与後の線毛運動振幅頻度(CBF)は、野生型マウスに比しNOSs完全欠損マウスではCBFは低下しており、NO donorであるisosorbide dinitrateの前投与を行うと、NOSs完全欠損マウスのCBFの低下は改善した。以上よりNO/NOSsが線毛機能において重要な保護的な役割を果たしていることが示唆された。慢性下気道疾患における線毛運動異常については、病態は不明な点が多く、また治療法は確立されていない。原発性線毛運動異常症においては、呼気一酸化窒素(nitric oxide; NO)の低下と線毛運動の低下が相関していると報告されるなど、線毛運動においてNOが重要な役割を果たしている可能性が高い。連携協力者の筒井らは世界で初めてNOの完全欠損マウスの作成に成功した。我々はこのNO完全欠損マウスを用いて線毛運動との関連を調べている。特別に作成した箱型のメディウム入りプレパラート上で約1mm厚に切り出した気管輪の線毛運動を、顕微鏡下(倍率1000倍)にデジタルハイスピードカメラ(Ditect社、HAS-L1、最大1秒間3000コマまで撮影可能)で撮影し、線毛運動数を定量した。1秒当たりの線毛運動数はコントロールマウス(C57BL6J、雄、8-12終齢、N=10)では15.78 ±3.14に対して、NO完全欠損マウスでは15.78 ±3.14に対して、NO完全欠損マウス(雄、8-12終齢、N=6)では14.13 ±2.19と低下傾向ではあるもの有意な差は認めなった。原因としては、なんらからの代償反応が働いている可能性が考えられ、何らかの刺激を加えて差をみる必要があると考えられる。そこで、あらたにLPSの曝露(100ug/body、腹腔内投与)を行い、4時間後に測定を行研究を開始した。現在、曝露、ビデオ撮影は終了したが、まだ測定、解析までは行えていないという状態である。また、NOの欠損が線毛構造に影響を与える可能性もあり、電子顕微鏡による解析を開始した。線毛運動における一酸化窒素(nitric oxide; NO)、NO合成酵素(NO synthase; NOS)の役割も不明な点が多いが、これまでの報告からは重要な役割を果たしている可能性が高い事が示唆されている。本研究は、研究協力者の筒井らが世界で初めて作成したNOS完全欠損マウスと3種類(n, i, e)のNOSシングルノックアウトマウスを用い、線毛運動能の評価とNO及びNOSを介した線毛運動機序の解明を行うことにより、原発性線毛運動機能不全症(Primary ciliary dyskinesia; PCD)をはじめとした慢性下気道疾患における線毛運動異常の病態解明と治療戦略を検討する事を目的とする。我々は、8-12週齢の雄のC57BL6Jマウス(野生型)と各NOSのシングルノックアウトマウス、NOS完全欠損マウスを実験に使用し、まずは非曝露の状態で評価し、次にリポ多糖(LPS)腹腔内投与前および投与24時間後に実験を行った。気管の線毛運動振幅数/秒(CBF)を顕微鏡下に高速ビデオカメラを用いて、線毛構造を電子顕微鏡を用いて評価した。非曝露の状態では、CBFは野生型マウスと、各NOSシングルノックアウトマウス、NOS完全欠損マウスの間で差は認めなかった。しかし、LPS投与24時間後には、CBFは野生型においれ有意に低下した。さらに重要なことに、その低下の程度は、野生型マウスに比しNOS完全欠損マウスではさらに有意に大きかった。NO donorを投与すると、LPS腹腔内投与後のNOS完全欠損マウスにおける線毛運動機能低下は改善した。各NOSシングルノックアウトと野生型のマウスではLPS曝露による有意な差はCBFにおいて見られなかった。電子顕微鏡で評価した線毛構造異常は、野生型とNOS完全欠損マウスで明らかな差は認めなかった。【目的】線毛機能におけるNO/NOSsの役割を明らかにする。【方法】8-12週齢の雄のC57BL6Jマウス(野生型)とNOSs完全欠損マウスを実験に使用し、リポ多糖(LPS)腹腔内投与前および投与4時間、24時間後に実験を行った。気管のCBFを顕微鏡下に高速ビデオカメラを用いて評価した。また、線毛の超微細構造を電子顕微鏡を用いて評価した。【結果】電子顕微鏡で評価した線毛の超微細構造は、両マウス間で中心微小管、周辺微小管やdynein arm等の数や構造異常については明らかな差は認めなかった。LPS投与前及び投与4時間後のCBFは、野生型マウスとNOSs完全欠損マウスの間で差は認めなかったが、LPS投与24時間後にはCBFは両マウスで有意に低下した。

野生型ではLPS投与群では生理食塩水投与群に比べてCBFは79.4%に低下したが、野生型マウスに比しNOSs完全欠損マウスではCBFはさらに低下した(野生型のLPS投与群に対して76.9%)。NO donorであるisosorbide dinitrateの前投与を行うと、NOSs完全欠損マウスのCBFの低下は改善した(野生型のLPS投与群に対して93.5%)。e/n/i各NOSの気管における発現は野生型マウスにLPSを曝露したものでは発現亢進が認められたが、NOSs完全欠損ではLPSを曝露してもほとんど発現は認められなかった。血中NOx濃度も野生型にLPS曝露したものではほとんど発現亢進が認められたが、NOSs完全欠損ではLPSを曝露してもほとんど発現は認められなかった。さらに詳細な機序解明のため、cAMPやcGMPの検出などを行っているが、検出が困難で苦労している。また、1時的にマウスの育成が中止となった時期があり、やや遅れている。8-12週齢の雄の野生型マウスとNOSs完全欠損マウスを実験に使用し、リポ多糖(LPS)腹腔内投与前および投与4時間、24時間後に実験を行った。気管の線毛振幅数(CBF)を顕微鏡下に高速ビデオカメラを用いて評価した。また、線毛の超微細構造を電子顕微鏡を用いて評価した。電子顕微鏡で評価した線毛の超微細構造は、両マウス間で中心微小管、周辺微小管やdynein arm等の数や構造異常については明らかな差は認めなかった。LPS投与前及び投与4時間後のCBFは、野生型マウスとNOSs完全欠損マウスの間で差は認めなかったが、LPS投与24時間後にはCBFは両マウスで有意に低下した。血中NOx濃度も野生型にLPS曝露したものではほとんど発現亢進がみとめれたが、NOSs完全欠損ではLPSを曝露してもほとんど発現は認められなかった。線毛運動における一酸化窒素(nitric oxide; NO)、NO合成酵素(NO synthase; NOS)の役割は不明な点が多い。本研究ではNOSs完全欠損マウスを用い、NO及びNOSを介した線毛運動機序の解明を行うことを目的とした。リポ多糖(LPS)腹腔内投与後の線毛運動振幅頻度(CBF)は、野生型マウスに比しNOSs完全欠損マウスではCBFは低下しており、NO donorであるisosorbide dinitrateの前投与を行うと、NOSs完全欠損マウスのCBFの低下は改善した。以上よりNO/NOSsが線毛機能において重要な保護的な役割を果たしていることが示唆された。NOSシングルノックアウトマウス及びNO完全欠損マウスが感染を起こしたことより、約半年間程度マウスの産生が中止され、約半年間程度の研究の遅れを生じている。また、マウスの出産状況もやや不安定な状況である。cAMPやcGMPの検出などさらに詳細な機序の検討とLPSやPM2.5などの腹腔内ではなく気道曝露モデルでの検討。呼吸器内科上述のようにLPSの腹腔内投与による各NOSシングルノックアウトマウス、NOS完全欠損マウスへのCBFの評価は終了した。
過酸化水素から見えてくる口腔レンサ球菌の隠れた病原性

ミティス群口腔レンサ球菌は口腔内で最多数を占める常在細菌であるが,抜歯などの際に菌血症や心内膜炎を引き起こすことがある.本研究により,ミティス群口腔レンサ球菌が感染防御の最前線で働くマクロファージや好中球に細胞死を引き起こすことが明らかになった.その病原因子を探索したところ,菌が産生する過酸化水素が細胞死を誘導するという意外な事実が明らかになった。この細胞死は炎症応答とは異なるメカニズムで引き起こされ,細胞内小器官であるリソソームの傷害に関連していた.細菌由来の過酸化水素が細胞毒性を有することは,従来全く知られておらず,本研究の成果は口腔レンサ球菌の病原性の研究に一石を投じるものである.本申請研究は、ミテイス群口腔レンサ球菌感染によるマクロファージの細胞死には,菌が産生する過酸化水素が関与しているという意外な発見から始まっている。予備実験の結果を踏まえ、まず、初年度は、マクロファージ以外の細胞でも細胞死が誘導されるのかどうかを調べた。その結果、上皮細胞でも、ミテイス群口腔レンサ球菌の感染によって細胞死が誘導されることが見出され、この菌が様々な細胞に対して細胞死を誘導することが明らかになった。次に、ミテイス群口腔レンサ球菌の代表菌種としてS. oralisを選び、その親株から過酸化水素産生に関与する遺伝子spxBをノックアウトした変異株(spxB KO)を作成した。このspxB KO変異株ではマクロファージの細胞死がほとんど見られず、細胞死には菌が産生する過酸化水素が重要であることが明確になった。細胞核の蛍光染色やカスパーゼ3のウエスタンブロット解析などの結果は、この細胞死がアポトーシスとは異なるものであることを示唆していた。さらに、感染マクロファージは、IL-1bやTNF-aなどの炎症性サイトカインを産生することが判明した。加熱死菌では、これらのサイトカインはほとんど産生されなかった。これらの結果は、ミテイス群口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素によるマクロファージの細胞死は、炎症応答を伴うユニークな細胞死であることを強く示唆している。昨年度の研究成果を踏まえ、本年度は、口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素がどのようなメカニズムでマクロファージの細胞死を誘導するのかを調べた。まず、この細胞死がアポトーシスによるものかどうかを検討したが、細胞死に伴う細胞核の断片化などは明らかでなく、アポトーシスを誘導するカスパーゼ3や9の活性化も認められなかった。過酸化水素が炎症性サイトカインやATPの産生を誘導することからインフラマソームの活性化を調べたが、それに伴うカスパーゼ1の活性化なども見られなかった。アポトーシス誘導もインフラマソーム活性化も認められなかったため、細胞死の様相を顕微鏡下で詳細に観察したところ、細胞死に先だってミトコンドリアやリソソームなどの細胞内小器官の変化が起こっていることが認められた。ミトコンドリア膜特異的な蛍光試薬で調べると、口腔レンサ球菌の感染によってミトコンドリアの膜電位が消失することが分かった。また、LysoTracker蛍光試薬で染色した結果から、リソソーム内のpHが酸性から中性になることが判明した。さらに、リソソーム膜に特異的なマーカータンパク質LAMP-1を蛍光免疫染色法で検出すると、LAMP-1が減少し、リソソームが断片化する様子が観察された。過酸化水素を単独で作用させた場合も、同様にミトコンドリアやリソソームの傷害が起こっていた。これらの結果は、口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素が細胞内小器官にダメージを与えることを示唆している。リソソームのダメージがマクロファージの細胞死が誘導する可能性が考えられるが、その詳細は今後の研究課題である。口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素による細胞死がアポトーシスやインフラマソーム活性化によるものではなく、細胞内小器官の傷害によるものであることが判明した。これは予想外の新知見であり、代謝産物が細胞内小器官にダメージを与えるという点で、口腔レンサ球菌の病原性に新しい光を投げかけるものである。最終年度の研究成果としては,まず,ミティス群口腔レンサ球菌感染が好中球にNETosis (好中球細胞外トラップ:核内DNAを細胞外に放出することによって周囲の感染細菌を捕捉する)を誘導する事実を見出したことが挙げられる.NETosisは起こるものの,ミティス群レンサ球菌由来の過酸化水素により,好中球本来の貪食作用が抑制され,感染した菌の殺菌・排除はむしろ抑制されることが示唆された.また,マイクロアレイを用いた遺伝子発現変化の解析からは,ミティス群口腔レンサ球菌感染および過酸化水素処理は,マクロファージにストレス応答を誘導し,リポ多糖(LPS)刺激によるサイトカイン産生を抑制することが示された.これらの結果は,ミティス群レンサ球菌由来の過酸化水素が,好中球やマクロファージの貪食作用やサイトカイン産生を抑制することを通じて,菌の生存戦略に大きな貢献をしていることを示していると考えられる.3年間におよぶ本研究の成果から,ミティス群口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素がマクロファージなどの細胞に対して細胞傷害性を示すことが明らかになった.ミティス群レンサ球菌が産生する過酸化水素は数mM程度であるが, in vitroで細胞死を誘導するには十分な濃度であった.

従来,病原性が強いと言われながらもその正体がはっきりしなかったミティス群レンサ球菌の病原因子が,実は過酸化水素であることを示すことが出来たのが最大の成果であると考えている.ミティス群口腔レンサ球菌は口腔内で最多数を占める常在細菌であるが,抜歯などの際に菌血症や心内膜炎を引き起こすことがある.本研究により,ミティス群口腔レンサ球菌が感染防御の最前線で働くマクロファージや好中球に細胞死を引き起こすことが明らかになった.その病原因子を探索したところ,菌が産生する過酸化水素が細胞死を誘導するという意外な事実が明らかになった。この細胞死は炎症応答とは異なるメカニズムで引き起こされ,細胞内小器官であるリソソームの傷害に関連していた.細菌由来の過酸化水素が細胞毒性を有することは,従来全く知られておらず,本研究の成果は口腔レンサ球菌の病原性の研究に一石を投じるものである.本年度は、口腔レンサ球菌が産生する過酸化水素が、マクロファージだけでなく上皮細胞でも細胞死を誘導することを新たに見い出すことができた。また、マクロファージの細胞死が、従来報告のないユニークな細胞死であることが明らかになった。ミテイス群口腔レンサ球菌が、菌が産生する過酸化水素の作用によって、炎症性サイトカイン産生やATP遊離をともなう細胞死を誘導することは、このレンサ球菌の病原性を考える上で極めて重要な知見である。最終年度は、細胞内小器官に対する過酸化水素の作用機序を調べることがメインになる。また、本年度の研究過程で、過酸化水素が好中球に作用してNETosisを誘導することを新たに発見したため、NETosis誘導が口腔レンサ球菌の病原性に及ぼす影響も検討する予定である。口腔細菌学次年度は、S. oralis親株、spxB KO株、過酸化水素そのものを用いて、マクロファージ細胞においてどのような炎症応答が起こるのかを解析する予定である。IL-1b産生やATPの遊離はインフラマソームの関与を疑わせる材料であり、まずはインフラマソームの活性化を調べる必要があると考えている。本年度秋の時点で論文を投稿したため、掲載料相当分として約9万円を残した。残額は約2万円と少額であり、無理に年度内に支出する必要はないと判断した。上述の論文が受理されたら掲載料として支出する予定である。一般試薬の購入に充てる予定である。
ダイズの育種選抜のためのDNAマーカーの開発

1.ダイズ品種「農林2号」の完全展開葉からcDNAライブラリーを作製し、無作為に選んだ約500のcDNAクローンを用いてRFLPマーカーを開発した。8種の6塩基認識酵素を用いて、6つの品種・ツルマメ系統の組み合わせでRFLPを解析した結果、多型頻度は34.469.0%であり、多型性は従来報告されている結果よりもはるかに高かった。2.ダイズ品種「農林2号」のゲノムDNAを用いて、ピペットによる物理的切断とDNaseI処理の後、電気泳動により300600bpの断片を回収して、T4DNA polymerase,T4polynucleotide kinaseを用いて、断片の平滑化、修復を行い、EcoRIアダプターを結合してLambda ZAPIIに導入してゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーから(CT)10、(GAA)6,(GTG)6をプローブにして陽性クローンを単離した。CTとGAAについての陽性クローンを中心に塩基配列を決定、プライマーの設計を行い、約70のSSRマーカーを作出した。3.「ミスズダイズ」と「秣食豆公503」を両親としたF2集団190個体を用いて、既知のマーカーと開発したcDNAクローンに基づくRFLPマーカー、SSRマーカーから成る連鎖地図を作製した。その結果503マーカー、21連鎖群、全長2,908.7cMの地図が得られ、主要連鎖群は染色体数20に一致した。4.上記のF2集団を用いて開花期のQTL解析を行ったところ、4つの遺伝子座FT1、FT2、FT3、FT4が同定され、これらの遺伝子座により、開花期のほとんどの分散が説明できた。従って、ここで得られた連鎖地図はダイズゲノムの大部分を網羅していると推定された。5.上記の集団の後代F8で156系統の組換え型近交系(recombinant inbred lines)を作製した。現在までにマーカー数232、連鎖群31の連鎖地図が得られ、F2で作製された地図と矛盾することはなかった。1.ダイズの緑葉由来のcDNAクローンをプロープとし、7品種のゲノムDNAを8種の6塩基認識酵素(BamHI,BglII,EcoRV,HindIII,ApaI,Dral,EcoRI,KpnI)で処理して、RFLPを解析した。198のクローンを解析して、ミミズダイズと秣食豆公503の間では、136クローン、タマホマレとPekingの間では、132クローン、ツルコガネとトヨコマチの間では、75クローンがRFLPを示した。2.ミミズダイズと秣食豆公503の間でRFLPを示したクローンのうち、無作為に選んだ30クローンの5'末端からの部分塩基配列を決定した。BLASTN,BLASTXプログラムを用いて既知の塩基配列、アミノ酸配列との相同性検索を行った結果、14クローンは既知のタンパク質をコードしており、16クローンは未知の遺伝子であることがわかった。3.(CT)10をプロープとして得られた23のゲノムDNAクローンの塩基配列を決定した結果、(CT)nのタイプのマイクロサテライト13個、(CT)nの3'側に(AT)nが直結したもの5個、(CT)nの配列が短い他の塩基配列に隔てられて複数連なったもの5個が得られた。これらはすべて互いに異なるマイクロサテライトであった。

4.マイクロサテライトに隣接した配列から設定したプライマーセットを用いて、PCR産物のサイズを比較してマイクロサテライトの多型を解析するために、プライマーの一方の5'末端をFITCで蛍光標識して変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後蛍光イメージアナライザーで検出する方法を確立した。多型検出感度は非常に高いが、簡便性を更に向上させる必要がある。5.北海道立中央農業試験場では、わいか病抵抗性のQTLに連鎖する3つのRAPDマーカーを見いだした。これをもとに、このRAPDマーカーに連鎖するRFLPマーカーを見いだすことができた。6.長野県中信農業試験場では、ダイズモザイクウイルス病抵抗性遺伝子に連鎖するRFLPマーカーを見いだしたが、1cM以下のマーカーはまだ得られなかった。1.ダイズの緑葉由来のcDNAクローンをプローブとし、12品種・系統のダイズ及びツルマメのゲノムDNAを8種の6塩基認識酵素(BamHI,BglII,EcoRV,HindIII,ApaI,DraI,EcoRI,KPnI)で処理して、RFLPを解析した。それらの中で、ミスズダイズ秣食豆公503、小糸在来/ツルマメ090010、タマホマレ/Pekingでは256クローンを解析して、各々63.3、69.1、63.3%のクローンでRFLPが認められた。他の組合わせでの解析数は62197クローンで35.538.7%がRFLPを示した。2.ミスズダイズと秣食豆公503の間でRFLPを示したcDNAクローン、単離された遺伝子、Public Soybean Probesを用いて、ミスズダイズ×秣食豆公503のF2個体のサザンハイブリダイゼーションを行い、RFLP連鎖地図を作製した。その結果、マーカー数320から成る31連鎖群、全長1911.1cMの地図が得られた。この地図上には緑葉由来の125のcDNAクローンが位置づけられた。3.連鎖地図上に位置づけられた緑葉由来の75のcDNAクローンについて5′末端から部分塩基配列を決定し、BLASTN検索を行ったところ、28クローンが既知のタンパク質をコードしていたが、残りは未知の遺伝子であった。4.単離した(CT)nをコアとするマイクロサテライトの中12種類について、40品種・系統のダイズ及びツルマメの多型を昨年度確立した方法で解析したところ、対立遺伝子の数は112であった。5.北海道立中央農業試験場で、ダイズのわい化病抵抗性遺伝子のQTL解析を行ったところ、第5連鎖群上に2つ以上の領域が存在することが示唆された。6.長野県中信農業試験場では蒸煮ダイズ硬度のQTL解析を行い、ひとつの効果の高い領域を同定した。1.(CT)10、(GAA)6、(GTG)6をプローブとして、物理的切断とDNase I処理により作製したDNlAライブラリーから各々326、291、357のマイクロサテライトを含むクローンを単離した。これらのクローンの一部の塩基配列を決定して新たに41のマイクロサテライトマーカーを開発した。2.新たに67のマイクサテライトマーカーをRFLP連鎖地図上に位置づけた。その結果、cDNAマーカー132、Shoemakerのマーカー174、単離された遺伝子20、RAPDマーカー1、質的形質マーカー4を含むマーカー数398、連鎖群25、全長2,684.3cMの連鎖地図が作製された。3.上記の連鎖地図を用いであらためて開花期のQTL解析を行ったところ、従来の3遺伝子座に加えて新たに作用力の小さい1遺伝子座を検出した。
ヘテロローガス・プライムブースト免疫法を用いた新規ワクチンプラットフォームの開発

(A)マウスモデルによるワクチン効果の評価:ワクチン効果を評価するために必要なPfCSPならびにルシフェラーゼ共発現型遺伝子組換えネズミマラリア原虫Pb-Luc(ダブルトランスジェニック原虫)の作出に成功した。Pb-Luc原虫のスポロゾイトをマウス静脈内に投与したところ、24時間後に肝臓においてルシフェラーゼの発現をIn vivo imaging systemで確認することができた。今後の感染実験に必要とされるバキュロウイルス、アデノウイルスならびに組換えタンパクについて精製を行った。(B)ワクチンが誘導する免疫応答解析:種類の異なるワクチンの組み合わせならびにワクチン投与のタイミングが及ぼす免疫応答への影響について研究を進めている。初回免疫から追加免疫までの期間をあけることでワクチン効果が上昇することを確認した。バキュロウイルスを筋肉内に接種すると血中サイトカインレベル(特にインターフェロン)が発現上昇することが明らかとなった。マラリア原虫スポロゾイトはヒトに侵入が最初に肝臓に感染するが、DNAマイクロアレイ解析の結果、バキュロウイルスを接種したマウスの肝臓細胞においてインターフェロン応答性の種々の遺伝子発現が増強されることを見出した。(C)製造プロセスの検討と品質管理:イオン交換クロマトグラフィーを用いたバキュロウイルスの精製については条件検討の段階にある。品質管理の条件検討するために必要な長期間保存用のバキュロウイルスサンプルについて精製を行った。作出が困難と考えていたダブルトランスジェニック原虫の作出に成功し、ワクチン効果判定用の材料が準備できた。肝臓におけるDNAマイクロアレイ解析も順調に進展しており、ワクチンによる免疫応答のメカニズムにせまれる研究ができたと思われる。ワクチン免疫後のマウスについて、引き続き血清を採取して液性免疫応答の変動を調べる。初回免疫と追加免疫のそれぞれのワクチンの組み合わせとその感染防御効果について、チャレンジ感染実験を行い明らかにする。DNAマイクロアレイのデータをもとにバキュロウイルス免疫時に特異的に肝臓で誘導される遺伝子群の同定を行う。製造プロセスの検討についてはイオン交換クロマトグラフィーで精製後のサンプルについて電子顕微鏡で形態学的な検討を行う。
複素多様体の変形の研究

開複素多様体の局所変形を中心に、特異点の変形、CR構造の変形、正則写像の変形、解析空間の局所安定変形や特異多様体の特性類に関する研究を行なった。また、変形論を展開する基礎である調和解析に関して、特異積分作用素についての研究を行ない、変形論の形式的な部分と関連をもつ表現論に関して、有限変換半群についての研究を行なった。11月25、26日には、来日中のフランスCIRM所長のJ.P.Brasselet教授を招いて「交叉サイクルのモチーフ」と「代数的サイクルの持ち上げと交叉ホモロジーに付随した準同型写像」についての講演を依頼し、本研究の遂行にかんして討論に参加して貰った。また、今後の研究の発展に備えるため、変形論にかんする260件の文献情報をデータベース化した。本研究で得られた成果と今後の課題は次の通り:(1)孤立特異点の特異点解消として得られる開複素多様体の局所モジュライ空間を構成し、その開複素多様体の混合ホッジ構造に基づいてBogomolov-Tian-Todorovの定理のアナロジーが成り立つことを示した。更に、J.Bingener-S.Kosarewの予想に関して、4次元以上の強擬凸複素多様体の場合に肯定的解答を与えた。(2)depth〓3という条件の下で、孤立特異点の多様体部分の変形に関して局所モジュライ空間を構成した。孤立特異点の多様体部分の混合ホッジ構造は複雑で、この場合にBogomolov-Tian-Todorovの定理について、どのようなアナロジーが成り立つかは今後の課題として残された。(3)解析空間の局所安定変形のモジュライ空間を、正則写像の変形という観点から、構成した。(4)特異多様体上での、Riemann-Roch型の定理を2つ確立した。(5)特異積分作用素について、重み付きLpノルムに関する評価を確立した。(6)有限変換半群について、Fphilner数の評価を行なった。
公共意識が希薄化する状況下の社会基盤整備においてNPOが果たすベき機能とその限界

今回の研究では、(1)わが国のインフラ整備における国民からの信頼を回復するためにNPOが果たしうる役割の検討し、(2)東南アジアの社会基盤整備事業における環境影響緩和計画とその効果を評価した。(1)については、わが国のインフラ整備における行政官(以後、「官」と略する)と国民との信頼関係の分析と信頼回復にNPOが果たしうる役割を検討した。旧来の官と国民との関係は「公私二元論」で表される。官の「無私と全能」と国民の「お上意識と滅私奉公」によって、旧来のインフラ整備では社会的不確実性と機会コストが抑制されてきた。しかし近年は、官における私が顕在化し、個人の「多面的」主張・行動によって、社会的不確実性と機会コストの双方が増大する可能性がある。官と個人の「改革」課題として、それぞれの「信頼性」を向上し、社会的知性を発達させ、他者への信頼を醸成していくことが求められる。NPOが有するa)新たな主体としての資源の受入機能、b)私福の共福への「昇華」機能、c)官の監査機能は、官と個人の「改革」を促すと考えられる。しかしNPOの意義を過大評価してはならない。NPOの信頼性の源泉は利潤の非配分にあるが、これは組織の信頼性を表す一つの条件にすぎない。NPOの信頼性を如何に確保すべきか、それをどう評価すべきかが重要な課題になる。NPOの信頼性は、その使命の妥当性と達成度によって評価される必要がある。(2)について東南アジアの社会基盤整備事業では、国内外のNPO・NGOが住民を支援して事業への抗議活動が実施されることが多い。住民とNPOの目指すものが何故得られなかったのか、どのようにしたら住民・NPOと事業推進者の「公共性」に関する見解を統合できるのかを明らかにすることが必要である。今回は、東南アジアの二つのダム建設事業においてそれらの事業推進に伴う環境影響緩和計画とその効果を評価し、今後の課題を検討した。平成15年度は、(1)わが国のインフラ整備における国民からの信頼を回復するためにNPOが果たしうる役割の検討と(2)東南アジアの社会基盤整備事業における環境影響緩和計画とその効果の評価を行った。(1)については、今後のインフラ整備事業において「社会的不確実性」の発生は不可避であり、事業執行過程に伴う「機会コスト」も増加する可能性が高い。新しい整備事業執行過程の開発と実践が求められている。社会的不確実性と機会コストが大きい状況では、「高信頼者」が「低信頼者」よりも大きな利益を得る可能性が存在する。すなわち、国民は金銭や役務などインフラ整備への投資先として官以外の組織も主体的に選択することによって、大きな利益を得る可能性がある。NPOには超安心から高信頼に基づく整備事業執行形態への「橋渡し」を担うことが期待される。その主要意義は社会的不確実性の低減ではなく機会コストの抑制にある。インフラ整備関連のNPOの最重要課題は信頼性の確保にある。
Porphyromonas gingivalis Hgp44の付着ドメインの解明

歯周病原細菌であるPorphyromonasgingivalisおよびTreponema denticolaは,慢性歯周炎において高頻度に検出される菌群`red complex'に分類される。P. gingivalisが産生するシステインプロテアーゼであるジンジパインの一部のRgpAは,プロテアーゼドメインおよび赤血球凝集/付着ドメインによって構成されている。この赤血球凝集/付着ドメインの一部であるHgp44がT. denticolaとの共凝集において重要な付着因子であると報告されており,P. gingivalis Hgp44のT. denticolaとの付着に主に関与する特定領域を解明することした。歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisおよびTreponema denticolaは,慢性歯周炎において高頻度に検出される菌群`red complex'に分類される。
NICU退院後の低出生体重児の早期療育に関する国際調査と身体教育プログラムの開発

本研究の国際調査結果から主に二つのことが明らかになった。1.低出生体重児は、退院後も発育・発達のみならずさまざまな問題を抱えやすいため、退院後の生活支援や地域連携も重要である。そのため、地域の病院、保健所、訪問看護ステーションとの連携、さらには教育機関との連携が不可欠である。2.低出生体重児は発達障害ハイリスク児であるため、発育・発達をフォローする発達相談、感覚運動指導に関する身体教育プログラムが必要である。3年間の研究で発達障害ハイリスク児の早期感覚運動指導に関する身体教育プログラムについて4か国で施設見学、インタビュー及び現地実態調査を行った。調査結果をまとめて国際シンポジウムを開催した。平成27年度の研究実施として、発達障害ハイリスク低出生体重児の身体教育プログラムに関する臨床的研究(発達アセスメント、実践現場の見学と現地実態調査)と基礎的研究(先行研究など)を行なった。平成27年度の研究期間内でイギリスとハンガリーの発達障害乳幼児に対する運動指導プログラムの実態について、実践現場の見学とインタビュー調査、現地実態調査を行なった。各国において発達障害ハイリスク低出生体重児に対して、現在どのような早期感覚運動指導に関する身体教育プログラムが取り入れられているか、その実態を明らかにした。平成27年度の国際調査研究実施国・地域及び移動経路1イギリスにおける発達障害乳幼児に対する療育実践に関して、実践現場の見学とインタビュー調査、現地実態調査を行った。地域、訪問先はHomerton大学病院NICU及びHackneyArk子ども療育センターであった。NICUで、発達障害ハイリスク低出生体重児のフォローアップアセスメント、地域サービスシステムの管理について、その実態を調査した。また、様々な病棟ユニット(NIC,PICなど)を見学し、プログラム説明会ならびに研究会議に参加した。2ハンガリーで開発された感覚統合療育のシステム、早期療育プログラム、発達障害向けの乳幼児期運動指導プログラムについて実践現場の見学とインタビュー調査、現地実態調査を行った。一つ目の現地調査は、ブタペストにあるBHRG財団で行なった。BHRGの身体教育プログラムの中で2つの早期介入指導が行われている(1.水中リハビリテーション(HRG)、2.PSMTトレーニング)。両プログラムにおける、早期身体教育の内容及び実践的な臨床活動の共通性や異なる点等について検討した。二つ目の現地調査は、ヨーロッパで最も早く創立されたブダペスト早期療育センターでの活動内容についての調査を行い、症例報告会にも参加した。平成27年でヨーロッパであったのテロの高リスクにより、海外現地調査の対象地域の不安要素が高まった。こういった現地の状況により、渡航が困難となった。よって、予定していた現地での調査の一部が不可能となり、平成27年度当初に予定していた研究計画の一部を延期せざるをえなくなった。平成27年11月、マンチェスターとロンドンで、HN Exam, Infant Motor Scale調査する予定だったが、現地研究協力者からロンドンの治安が悪く渡航を延期すべきとの指摘を受け、ロンドンでの調査を延期せざるを得なかった。研究遂行上、欧州と米国のNICUの比較調査が必要なため治安回復を見込み、平成28年9ー10月に現地調査を予定し情勢が回復しない場合は、イギリス他地域で代替調査を実施する。以上のようなやり取りがあり、テロリズム等による国際情勢の不安定さから、十分な調査日数が確保できないこともあり、現在のところ予定していた研究スケジュールよりもやや遅れてしまっているのが現状である。海外現地調査の見直しなどが必要となり、旅費の一部と現地コーディネートに係る人件費を翌年度に繰越した。平成27年度から平成28年度に変更になった、以下の現場見学と現地実態調査を行った。1イギリスにおける2回目の現地実態調査(見学とインタビュー)はWinchesterのLanterns幼稚園と療育センターであった。また、Lanternsで行なっている早期身体教育プログラムの説明会と症例検討会にも参加することができた。2イギリスにおける2回目の現地実態調査。ELTE大学付属特別支援幼稚園で開発された感覚運動プログラムと、BasicTherapy財団で開発された身体教育プログラムの現地実態調査を行った。3スロバキアにおける現地実態調査。平成28年度に計画していたアメリカにおける調査研究(BMCセンターが開発した乳児発達運動教育IDMEプログラム)をスロバキアに変更した。BMC理事長に調査研究への協力を依頼したところ、BMC理事長よりスロバキア在住のIDMEプログラム代表者2名に対する現地実態調査を行うようアドバイスがあり、変更することとなった。BratislavaでIDMEプログラムやComenius大学、早期発達支援K-CENTRUMを見学し、インタビュー調査と実態調査を行った。また、前年度に調査行ったハンガリーのBHRG財団の海外研究協力者Lakatos氏が亡くなったため、新しいリーダ一との研究会議を行った。4オーストラリアにおける現地実態調査。調査訪問先はSunshineCoast大学とHerveyBay特別支援学校、子ども療育センター、XavierCollegeであった。発達障害児に対する支援プログラム、フォローアップアセスメントなどについて調査した。さらに、地域サービスシステムの説明会と研究会議に参加することができた。その後、Melbourneで開催されたBMC乳幼児発達ワークショップに参加し、BMCセンター理事長のCohen氏に対するインタビュー調査を行った。アメリカのBMCセンターが開発した乳児発達運動教育(IDME)プログラムについては、BMC理事長のアドバイスによってUSからスロバキアに変更することとなった。スロバキアの研究者を紹介されたためであり、Bratislavaでプログラム調査を実施することとなった。