hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南九州下の稍深発地震とサイスモテクトニクス

鹿児島大学や九州大学の高精度の地震データを用い,南九州下の稍深発地震活動・地震面の形状・発震機構について解析した.稍深発地震面はかなり複雑な形状であることが明らかになった.もっとも特徴的なことは,桜島を含む領域で地震面がずれていることである.すなわち,桜島の北北東側領域の地震面は,南南西側領域に比べ西北西方向におよそ10kmずれている.ずれは,深さ130kmでは水平距離50km程度の範囲で,深さ70kmでは80km程度の範囲で徐々に生じている.しかし,地震面の走向は,ずれの両側ともほぼ同じでN25°E-S25°W程度である.地震面の断面形状は,基本的には緩やかに曲率を変えながら深部に繋がっている.しかし,詳細に見ると,深さ65km前後で浅い方に,深さ50km付近と100km付近では深い方に凸の,波打ったような形状である.深さ80130kmの範囲での地震面の平均的な傾斜角は6065°であり,ずれの両側で差は認められない.深さ130km以深では,北北東側領域の傾斜角の方が大きくなっている.南九州の稍深発地震は,開聞岳下の深さ160km付近の活発な活動とその浅部の深さ70100km付近の低活動度で特徴づけられるが,この特徴的な活動が,地震面がずれている領域の近くに位置することは興味深い.南九州下に発生する稍深発地震の発震機構は,プレートの沈み込む方向の断面で見ると,張力軸は沈み込む方向に,圧縮軸はそれに直交する方向にほぼ揃っており,Down-Dip Extension型の様相を示す.しかし,水平面で見ると,圧縮軸がプレートの進行方向に揃っており,張力軸は沈み込む方向からずれている.すなわち,この領域の稍深発地震の発震機構は単純なDown-Dip Extension型とは言えない.以上のように,本研究によって,南九州下に沈み込むフィリピン海プレートには,単純な沈み込みに伴う力の他に,異なる力源が作用していると考えなければならないことが明かとなった.鹿児島大学や九州大学の高精度の地震データを用い,南九州下の稍深発地震活動・地震面の形状・発震機構について解析した.稍深発地震面はかなり複雑な形状であることが明らかになった.もっとも特徴的なことは,桜島を含む領域で地震面がずれていることである.すなわち,桜島の北北東側領域の地震面は,南南西側領域に比べ西北西方向におよそ10kmずれている.ずれは,深さ130kmでは水平距離50km程度の範囲で,深さ70kmでは80km程度の範囲で徐々に生じている.しかし,地震面の走向は,ずれの両側ともほぼ同じでN25°E-S25°W程度である.地震面の断面形状は,基本的には緩やかに曲率を変えながら深部に繋がっている.しかし,詳細に見ると,深さ65km前後で浅い方に,深さ50km付近と100km付近では深い方に凸の,波打ったような形状である.深さ80130kmの範囲での地震面の平均的な傾斜角は6065°であり,ずれの両側で差は認められない.深さ130km以深では,北北東側領域の傾斜角の方が大きくなっている.南九州の稍深発地震は,開聞岳下の深さ160km付近の活発な活動とその浅部の深さ70100km付近の低活動度で特徴づけられるが,この特徴的な活動が,地震面がずれている領域の近くに位置することは興味深い.南九州下に発生する稍深発地震の発震機構は,プレートの沈み込む方向の断面で見ると,張力軸は沈み込む方向に,圧縮軸はそれに直交する方向にほぼ揃っており,Down-Dip Extension型の様相を示す.しかし,水平面で見ると,圧縮軸がプレートの進行方向に揃っており,張力軸は沈み込む方向からずれている.すなわち,この領域の稍深発地震の発震機構は単純なDown-Dip Extension型とは言えない.以上のように,本研究によって,南九州下に沈み込むフィリピン海プレートには,単純な沈み込みに伴う力の他に,異なる力源が作用していると考えなければならないことが明かとなった.南九州下の稍深発地震は,日本中で最も急傾斜の面上で発生しており,また薩摩半島下の深さ160km付近の活動は日本で最も活発であるなど,特有の特徴を有している.しかしながら,この領域の地震観測網の整備は不十分であったため,活動の詳細は把握できていなかった.本研究は観測網の空白域である鹿児島県鹿児島郡竹島で臨時観測を行ない,そのデータと既設の観測点データを併合処理することにより,この領域に発生する稍深発地震活動の特徴を明らかにすることである.平成11年度は竹島に臨時地震観測点を設置し,観測を開始した.トリガ方式で現地観測機器に収録された観測データは,一般回線を用いた呼び出し方式で鹿児島大学に伝送している.現在は,観測データを蓄積している段階であり,まだ本格的な解析は始めていない.既設の観測点のデータについては,1998年以降に発生したものについて,地震波初動到達時間などの再検測を行っている.竹島観測点のデータがある程度揃った段階で震源再決定を行う予定である.

一方,既設の観測データを用いた稍深発地震のメカニズム解の解析は開始した.現在までに得られている結果では,南九州下の稍深発地震のメカニズム解は,他の島弧で多く見られるような単純なdown-dipcompression型あるいはdown-dip extension型とはならず,海洋プレートが島弧下に沈み込む方向以外の力がプレート内に作用しているものと推定される.今後の解析により,稍深発地震面(沈み込むフィリピン海プレート)の形状が明らかになるとともに,この領域のサイスモテクトニクスの理解が進むものと思われる.鹿児島大学や九州大学の高精度の地震データを用い,南九州下の稍深発地震活動・地震面の形状・発震機構について解析した.稍深発地震面は,かなり複雑な形状であることが明らかになった.もっとも特徴的なことは,桜島を含む領域で地震面がずれていることである.すなわち,桜島の北北西側領域の地震面は,南南西側領域に比べ西北西方向におよそ10kmずれている.ずれは,深さ130kmでは水平距離50km程度の範囲で,深さ70kmでは80km程度の範囲で徐々に生じている.しかし,地震面の走向は,ずれの両側ともほぼ同じで,N25゚E-S25゚W程度である.地震面の断面形状は,基本的には緩やかに曲率を変えながら深部に繋がっている.しかし,詳細に見ると,深さ65km前後で浅い方に,深さ50km付近と100km付近では深い方に凸の,波打ったような形状である.深さ80130kmの範囲での地震面の平均的な傾斜角は6065゚であり,ずれの両側で差は認められない.深さ130km以深では,北北東側領域の傾斜角の方が大きくなっている.南九州の稍深発地震は,開聞岳下の深さ160km付近の活発な活動とその浅部の深さ70100km付近の低活動度で特徴づけられるが,この特徴的な活動が,地震面がずれている領域の近くに位置することは興味深い.南九州下に発生する稍深発地震の発震機構は,プレートの沈み込む方向の断面で見ると,張力軸は沈み込む方向に,圧縮軸はそれに直交する方向にほぼ揃っており,Down-DipExtension型の様相を示す.しかし,水平面で見ると,圧縮軸がプレートの進行方向に揃っており,張力軸は沈み込む方向からずれている.すなわち,この領域の稍深発地震の発震機構は単純なDown-DipExtension型とは言えない.以上のように,本研究によって,南九州下に沈み込むフィリピン海プレートには,単純な沈み込みに伴う力の他に,異なる力源が作用していると考えなければならないことが明かとなった.
日本語の表記形態の標準化とその認知心理学的妥当性の研究

1.日本語の3表記形態(漢字・ひらがな・カタカナ)の主観的表記頻度の標準的資料作成のための調査を行なった。材料は750語の名詞と代名詞。各語を漢字、ひらがな、カタカナで表記し、各表記を日常生活で目にする度合を3段階で、大学生に評定させた。この際、評定の信頼性を調べる手続も導入した。よく見るという段階の評定について集計したところ、(1)評定に信頼性のあることが分かった。(2)主観的表記頻度に従って、各語を漢字型・ひらがな型・カタカナ型等、10種類に分類することができた。(3)語としての出現頻度の高い語には、漢字で表記されやすい語(漢字型、漢字優位型等)の多いことが分かった。2.主観的表記頻度の認知的妥当性を見るため、以下の研究を行なった。(1)表記型が単語の音読潜時と再認記憶に及ぼす影響を大学生を用いて調べたところ、(1)音読潜時は、ひらがな表記では表記型間に差はなかったが、漢字型、漢字・ひらがな型では、漢字表記でも、ひらがな表記と同じレベルであった。(2)偶発再認記憶は、一般に漢字表記で提示した場合、ひらがな提示よりも成績がよかった。(2)表記型がアナグラム解決課題に及ぼす効果をみるため、漢字型、ひらがな型、カタカナ型の語を、それぞれ、ひらがな表記とカタカナ表記してアナグラムを作成し、大学生に解決させたところ、(1)漢字型は他の二つの型よりも解決しにくかった。(2)ひらがな型はひらがな表記の場合に、カタカナ型はカタカナ表記の場合に、それぞれ、その逆の場合よりも解決しやすかった。(3)俳句の季語の部分を3種の表記で提示し、俳句全体の印象をSD法で大学生に評価させたところ、ひらがな表記の場合、漢字やカタカナ表記の場合にくらべて、異なった評価をしていることが分かった。目的:1、日本語の表記形態(漢字・ひらがな・カタカナ)の主観的出現頻度の標準的資料作成のため、以前の予備調査を参考にして、調査を行う。2、表記形態の主観的出現頻度の妥当性を、認知心理学的方法を用いて調べる。3、表記形態が文学作品の評価に及ぼす効果をみる。表記形態の主観的出現頻度調査:動物や家具等30のカテゴリに属する語から計750語を選択、これを4群に分け、一つの語を漢字、ひらがな、カタカナで表記し、各表記を目にする度合いを「よくみる」「みることもある」「みることはない」の基準で、大学生に評定してもらった。なお、評定の信頼性をみるため、共通の30語を各群に挿入した。最終的には各群200名のデータを収集の予定であるが、本年度は各群約70名分を収集した。従って、結果はまだ報告できる段階にない。表記形態の主観的出現頻度の認知的妥当性の研究:予備調査の資料より、漢字型、ひらがな型、漢字・ひらがな型の語各8語を選択、半数づつ漢字表記とひらがな表記で大学生に提示し、1、音読反応時間を測定した。その結果、反応時間は、(1)ひらがな表記では、三つの型とも差はなかったが、(2)漢字表記では、ひらがな型が他の二つの型よりも遅かった。2、音読に続いて音読した語の偶発再認を求めた。ターゲット語は音読時と同表記、異表記半数づつとした。

その結果、再認成績は、(1)三つの型とも、音読時漢字表記の語はひらがな表記の語よりも優れ、(2)漢字型において、再認時漢字表記の語はひらがな表記の語よりもまさった。なお、認知的の妥当性の考察は次年度の研究結果を待って報告の予定。表記形態が俳句の評価に及ぼす効果:俳句の季語の部分を、漢字、ひらがな、カタカナに変えて提示し、俳句全体の印象をSD法で大学生に評価させたところ、ひらがな表記の場合、漢字やカタカナ表記の場合に比べて、よい評価をしていることが分った。1.日本語の3表記形態(漢字・ひらがな・カタカナ)の主観的表記頻度の標準的資料作成のための調査を完了した。材料は29のカテゴリに属する750語の名詞と代名詞(予備調査の119語を含む)。これを4群に分け、各語を漢字、ひらがな、カタカナで表記し、各表記を「よくみる」「みることもある」「みることはない」の基準で各群約200名の大学生に評定させた。評定の信頼度をみるため共通の30語を各群に挿入。従って、各群210語の評定となった。その結果、「よくみる」という評定について集計したところ(1)4群相互間の相関はr>0.9で、予備調査と共通の119語との相関もr>0.9となり、評定の信頼性の高いことが分かった。(2)結果を漢字型、ひらがな型、カタカナ型等、10種類に分類した。(3)表記の型と語としての出現頻度との関係を調べたところ、高頻度出現語には、漢字型や漢字優位型等、漢字で表記されるものの多いことが分かった。(4)今後、表記と語としての熱知性の関係の分析や、中高年者を対象に調査を行なうことを計画している。2.主観的表記頻度の認知的妥当性をみるため、表記型がアナグラム解決課題に及ぼす効果を調べた。高頻度語は、ひとまとまりのユニットとして知覚されやすいので、この種の語を構成する文字の順序をかえた配列を復元するアナグラム課題の解決は、低表記頻度語よりも容易であるという仮説の検証である。材料は、上記資料より、漢字型、ひらがな型、カタカナ型各14語を選び、アナグラムを作成、それぞれ、ひらがなとカタカナで表記し、各表記群16名の大学生にこれを解決させ、解決までの反応時間と難易度を調べた。その結果、反応時間も難易度も、漢字型は、両表記とも、ひらがな型、カタカナ型よりも劣り、ひらがな型はひらがな表記の場合、カタカナ型はカタカナ型の場合に、いずれも、その逆の場合よりも優れていた。かくて、仮説は立証された。
ハイブリッドモデルによる英語学習者のプロソディの知覚に関する研究

本研究は、英語の自然発話の音調(プロソディ)を、日本語を母語とする英語学習者(以下JEFLと略す)がどのように知覚しているのか、母語話者との知覚とはどのような違いがあるのかを知覚実験によって検証するものである。実施した知覚実験は、英語の自然発話を聞いて、「発話のまとまり(以下IPと略す)」と意味上大切な「音調核」を知覚するものであるが、JEFLの実験結果は、学習中級者と上級者では異なっているが、予測に反して音調核のほうがIPよりも認識され易いという結果を得た。本研究はじデザインに基づいた母語話者の知覚実験の結果と比較して、人間の言語音声知覚のメカニズムの解明に発展性がある。研究目的:英語のプロソディ(つまりアクセントやイントネーション)知覚が、母語話者と日本語を母語とする英語学習者(以下「L2学習者」と呼ぶ)で、異なるのか否か、を同一の自然発話コーパスを用いて聴覚実験を検証することである。研究実施計画:1年目に引き続き、2年目もL2学習者の大規模な実験を行い、データを収集し分析することを計画し、遂行した。1年目にも同様の聴覚実験を実施したが、実験用のコーパス素材が米国オハイオ大学の自然発話コーパスを用いたものではあったが、L2学習者と母語話者の間で異なっていた。今年度は、完全に同一の実験素材を用いての実験である。今年度の実験は2大学から100名を超える被験者を集めてることができ順調に行われた。その後データを解析せきるように処理し、統計分析を行い、L2学習者のデータは解析が終わった。その結果を共同研究者である米国イリノイ大学のコール教授の専攻研究の母語話者のデータを比較し、分析を進めている最中である。現在のところ分かっていることは、英語の自然発話であっても、L2話者と母語話者では、発話のまとまりの知覚に関してはほとんど違いがない。また発話の中での重要な内容であることを示す音声特性の把握に関しても、統計的にはL2学習者が母語話者より数値が低いものの、音声特性知覚の傾向は類似している。つまり、母語話者もL2学習者も、自然発話を処理する能力はあまり違わない、という予測とは異なったおもしろい結果がでている。また共同研究者のイリノイ大学のコール教授と本研究のL2母語話者のデータを共有し、分析に助言をもらっている。研究実績:今年度の業績は、論文1(国内専門誌、英語論文)と口頭発表1(国内での開催学会、英語での発表)である。本研究の目的は、日本語を母語とする英語学習者が、英語プロソディの音韻的特質を知覚出来るか否かを、ハイブリッドモデル(Cole et al. 2008参照)に基づいて検証することにある。本年度は、Cole et al. 2008と同じ音源を使い、日本語を母語とする英語学習者を被験者として、プロソディの知覚を調査する計画であった。H24年度は、この研究計画に基づき、Cole et al. 2008と同じ音源を入手し、それを日本語の英語学習者の知覚実験ができるようにまず加工した。Cole et al. 2008の音源はアメリカのオハイオ大学が提供しているのBucheye corpusというアメリカ人の日常会話を録音したコーパスであるので、学習者には難しすぎるからである。母語話者の知覚データと比較する必要上、加工には工夫が必要であったが、ほぼ半分の長さにして、被験者の心的ならびに物理的な負担が過度にならないように注意をした。その上で、日本語の英語学習者である100名の被験者を使って知覚実験を実施した。実験はプロミネンスとチャンキング知覚の二種類で、得られたデータは統計処理をして分析をした。結果は、母語話者と日本語を母語とする英語学習者では、プロミネンスとチャンキングの両方で大きく異なる、というものであった。チャンキング(どこで発話のまとまりを感じるか)では統語情報が大きく影響すると言われているが、母語話者がS(文)単位で英語発話のかたまりを知覚しているのに対し、日本語を母語とする英語学習者は、NP(名詞句)やVP(動詞句)という小さなかたまりで知覚をしている、という統計的に優位な結果がでた。またチャンキング(どこが目立って聞こえるか)に関しては、日本語を母語とする学習者は被験者間でばらつきが大きく、母語話者間でばらつきが小さいのとは大変対照的である、という結論を得た。

本研究は、アメリカオハイオ州立大学のBuckeyeコーパスに収められている英語の自然発話を用いて、英語母語話者(NS)、日本語を母語とする英語学習者(中級Int)と同(上級Adv)がどのように英語のプロソディを知覚するのか、を同じデザインの知覚実験を用いて調査、検証するものである。具体的には英語の10秒から20秒程度の発話の境界(バウンダリー)と意味上顕著に聞こえるプロミネンスをマークするRTP実験と呼ばれている実験方式を採用している。最終年度はAdv20名に知覚実験を行い、これまでのInt108名の実験データとあわせて、音声面と統語面から総合考察を行った。1研究成果:本研究は日本語を母語とする英語学習者を被験者として知覚実験を行っており、母語話者のデータはRPT実験を発案したアメリカイリノイ大学のJennifer Cole教授の研究を許諾を得て使用している。実験の結果は、まず第一に被験者間の知覚の合致度はいずれの3群でもバウンダリーの方がプロミネンスよりも有意に高い、という結果を得た。第二にバウンダリーにおいてもプロミネンス知覚においても、NS>Adv>Intの順で被験者間合致度が有意に高いという結果であった。本研究では、プロミネンス知覚を音声面と統語面からさらに解析を行った。バウンダリー知覚に関しては、NSが反応するが学習者が全く反応しない統語範疇があることが分かった。音声面ではNSも学習者も時間長とポーズに反応する点は同じである。2意義と重要性:英語のプロミネンスは解明が困難とされている分野である。また数が決して多くはないプロミネンス研究は、産出の研究のみであり、プロミネンス知覚の研究は本研究がはじめてである。加えてプロミネンスの先行研究は音声面からの研究が主であるが、本研究は統語面からも考察している点に意義がある。言語学聴覚実験は計画通り進行している。分析に関しては、L2学習者と母語話者のデータを同じ分析方法で統計をかけるための前処理に時間がかかった。分析はおおむね終わっているが、まだ検討したい項目が残っているので、完了するにはもう少し時間が必要である。当初の初年度の計画としては、プロソディの聴覚実験をする環境の整備をする予定であった。しかし実際には、書年度から知覚実験のための環境整備だけではなく、実際に実験を大規模にできたことは計画以上である。また実験結果を分析できたばかりではなく、初年度にもかかわらず研究成果を国際会議に応募し、受理され、ポスター発表ができたことは喜びである。さらに実験音源を提供していただきたイリノイ大学のコール教授をアメリカ合衆国まで訪ね、実験結果、分析を発表する機会を得、またデータに関して、また今後の実験計画について建設的な打ち合わせができ、H25年度の研究方針が発展的に決定できた。以上の理由から、当初の計画以上に本研究が進展していると言える。3年目には、留学経験のある上級のL2学習者を被験者として、3回目の英語自然発話音声の聴覚実験を続け、被験者の英語能力によって英語の自然発話の知覚能力に違いがあるか否かを検討する。また、研究成果は国内外の学会で発表し、論文も執筆する予定である。H24年度の実験を踏まえて、さらに発展的実験を行う。具体的には、実験群をH24年度以上に細かく設定し、大規模知覚実験を行う。H24年度では英語の能力別の観点から実験群を作ることができなかったので、H25年度は日本語を母語とする英語学習者を英語の能力別に分けて実験群を設定する。知覚実験素材については、H25年度は母語話者の知覚実験を加工することなく全く同じデータを使える環境を整え、パラレルな比較が可能になるように腐心し、H24年度よりも、厳密な実験をめざす。
免疫親和性を利用したタンパク質アシル化の網羅的解析法の開発

質量分析計を用いたプロテオミクス的手法に免疫沈降法を組み合わせることにより,T. thermophilus HB8のリシン残基のアシル化プロテオーム解析を行った。その結果,アセチル化部位197箇所(128個の蛋白質),プロピオニル化部位361箇所(183個の蛋白質),スクシニル化部位18箇所(14個の蛋白質)を同定した。特に,プロピオニル化が広範に存在することをはじめて明らかにした。さらに,増殖相や栄養源によってアシル化の種類や数が変動することが分かった。さらに他4種の細菌についてもアシル化プロテオーム解析を行い,アシル化の多寡が生物種ごとに異なることを明らかにした。本年度は,アシル化リシンのうち,アセチルリシンを対象にした研究を行った。まず過剰量の無水酢酸と反応させたウシ血清アルブミンをプロテアーゼで断片化し,得られたアセチルリシン含有ペプチドの混合物を抗原として,抗アセチルリシン抗体を作製した。この抗体(抗血清)を固定化したビーズを,高度好熱菌Thermus thermophilus HB8の細胞破砕液から調製したトリプシン消化物と混合し,中性緩衝液で洗浄した後,ビーズに吸着したペプチドを溶出した。この画分を脱塩,濃縮したのち,nano-LCと接続したESI-Q-TOF型質量分析装置によってタンデムMS解析を行い,アセチル化部位を同定した。その結果,128個の蛋白質について197箇所のリシン残基のアセチル化と4箇所のN末端アミノ基のアセチル化を同定した。同定したアセチル化蛋白質は,代謝や翻訳などに関するものが多く見られた。アセチル化部位は規則的二次構造中に多く見られ,また近傍には負電荷をもつグルタミン酸残基が多い傾向が見られた。さらにアセチル化部位を立体構造上にマッピングしたところ,蛋白質分子表面で静電的相互作用や水素結合を形成していたため,アセチル化はこれらの相互作用を破壊することが示唆された。さらに,蛋白質の働きにとって重要な部位にあるリシン残基がアセチル化されているケースも22例あり,この場合はアセチル化が蛋白質の活性を直接制御する可能性が示唆された。次に,対数増殖期と定常期にある高度好熱菌の細胞についてアセチル化部位の同定を行ったところ,アセチル化は定常期でより多く見られることが分かった。さらに,抗アセチルリシン抗体を用いた解析でもいくつかのプロピオニル化リシンが同定した。そこで,抗プロピオニルリシン抗体を作製し,同様の解析を行ったところ,アセチルリシンに匹敵する数のプロピオニルリシンを同定した。本年度は,アシル化リシンのうち,プロピオニル化リシンを対象にした研究を行った。まず過剰量の無水プロピオン酸と反応させたウシ血清アルブミンをプロテアーゼで断片化し,得られたプロピオニル化リシン含有ペプチドの混合物を抗原として,抗プロピオニル化リシン抗体を作製した。その結果,183個のタンパク質について361箇所のリシン残基のプロピオニル化を同定した。プロテオームレベルでこれほど多くのプロピオニル化が同定されたのは,本研究が初めてである。いくつかのペプチドについては,同じ配列をもつプロピオニル化ペプチドを合成し,同じMS/MSスペクトルが得られることを検証した。同定したプロピオニル化タンパク質の約60%は,エネルギー産生や広く代謝に関わるものであり,特に解糖経路やTCA回路で働く酵素の多くがプロピオニル化されていた。対数増殖期(80個のタンパク質,121箇所)と比べると,定常期(163個のタンパク質,323箇所)でより多くのプロピオニル化が同定され,全体の約60%は各増殖相に特有であった。代謝に関わるタンパク質のプロピオニル化は,定常期になると増加する傾向が見られた。また,アセチル化部位と重複していたのは,プロピオニル化部位全体の約20%であった。これらの結果から,アセチル化とプロピオニル化は細胞内で別々の制御を受けて異なる働きをしており,特に細胞増殖の調節に関与していることが示唆された。最終年度では,グラム陰性菌3種(うち好熱菌2種),グラム陽性菌2種(うち好熱菌1種)の計5種のバクテリアについて,蛋白質リシン残基のプロピオニル化とスクシニル化の解析を行った。まずプロピオニル化はThermus thermophilus (129箇所),Geobacillus kaustophilus (83箇所)で多く見られたのに対し,Bacilllus subtilis (7箇所),Escherichia coli (10箇所),Rhodothermus marinus (2箇所)では少なかった。この研究により,プロピオニル化がバクテリアに広く存在する翻訳後修飾であることが初めて示された。また,プロピオニル化の多寡と系統関係や生育温度との間には直接的なつながりはなく,近縁種でも異なる分布パターンを示した。次にスクシニル化は,G. kaustophilus (65箇所),B. subtilis (84箇所),E. coli (123箇所)に多く見られた。

同一の手法を用いて種横断的に調べた結果,同じアシル化であってもその分布に大きな違いがあることが明らかとなった。同定されたアシル化部位は代謝や翻訳に関わる蛋白質に多く見られたが,立体構造上にマッピングした結果,機能的に重要な部位がアシル化されている例が多く見られた。プロピオニル化は酵素の活性部位に多く,スクシニル化は核酸の結合部位に多いという特徴が見られた。これらの結果は,プロピオニル化とスクシニル化が異なる制御を受けて独自の機能を持っていることを示唆した。さらに富栄養培地から栄養制限培地にすると,アシル化の種類や数が大きく変動することも判明した。本研究を通じて,アシル化リシン特異的な抗体を用いた蛋白質アシル化の網羅的解析法を確立し,アセチル化以外のリシンアシル化がバクテリア界に広く存在することを明らかにした。質量分析計を用いたプロテオミクス的手法に免疫沈降法を組み合わせることにより,T. thermophilus HB8のリシン残基のアシル化プロテオーム解析を行った。その結果,アセチル化部位197箇所(128個の蛋白質),プロピオニル化部位361箇所(183個の蛋白質),スクシニル化部位18箇所(14個の蛋白質)を同定した。特に,プロピオニル化が広範に存在することをはじめて明らかにした。さらに,増殖相や栄養源によってアシル化の種類や数が変動することが分かった。さらに他4種の細菌についてもアシル化プロテオーム解析を行い,アシル化の多寡が生物種ごとに異なることを明らかにした。「研究の目的」として上げた4点のうち,「1)キャリアータンパク質を化学的に修飾して,アシル化リシンを含むペプチドの混合物を調製し,それらに対する抗体を作製する」点については,化学的にアシル化したウシ血清アルブミンを用いて抗アセチルリシン抗体および抗プロピオニルリシン抗体を作製することに成功した。次に,「2)抗アシル化リシン抗体に対する免疫親和性を利用して,細菌細胞から各アシル化修飾を含むペプチドをアフィニティー精製により選択的に濃縮する方法を確立する」点についても,高度好熱菌の細胞破砕液からアセチル化ペプチドだけでなく,プロピオニル化ペプチドを選択的に濃縮する方法も確立した。さらに,「3)確立した方法を用いて,異なる培養条件の菌体やタンパク質のアセチル化に関与する酵素の遺伝子欠損株について,アシル化プロテオーム解析を行う」点については,nano-LCと接続したESI-Q-TOF型質量分析装置によってタンデムMS解析を行い,対数増殖期と定常期という異なる培養条件の菌体について,アセチル化部位とプロピオニル化部位を同定することに成功した。また,(脱)アセチル化酵素の遺伝子欠損株も作製したが,アシル化プロテオーム解析はまだ行っていない。最後に「4)アシル化によるタンパク質機能の影響を精製タンパク質を用いて解析する」点については,アシル化酵素と脱アセチル化酵素(2種類)の発現・精製に成功し,そのうち1つについては合成ペプチドに対する脱アセチル化活性を確認した。また,平行して,同定したアセチル化部位を立体構造上にマッピングすることにより,修飾による蛋白質機能への影響を評価した。以上のことから,初年度としては当初の目的の半分近くは達成しているものと判断した。
生体反応関連分子の遺伝子多型解析に基づく個別化治療確立に関する研究

日本人独自の遺伝子多型からみた重症救急患者に対する個別化治療を確立することを目的としている.多施設共同研究(計5施設)で遺伝子情報と臨床情報を収集した.IL1RA 2nd intronVNTRの臨床経過や転帰への影響について検討した.その結果,導出コホート(自施設症例;n=261)および検証コホート(多施設症例;n=793)両方において,IL1RA RN^*2 alleleの保有数が多くなるにつれてICU死亡率,重症敗血症罹患率ともに有意に上昇していた.日本人独自の遺伝子多型からみた重症救急患者に対する個別化治療を確立することを目的としている.多施設共同研究(計5施設)で遺伝子情報と臨床情報を収集した.IL1RA 2nd intronVNTRの臨床経過や転帰への影響について検討した.その結果,導出コホート(自施設症例;n=261)および検証コホート(多施設症例;n=793)両方において,IL1RA RN^*2 alleleの保有数が多くなるにつれてICU死亡率,重症敗血症罹患率ともに有意に上昇していた.近年、感染や外傷、熱傷などの侵襲に対する生体反応は、免疫-炎症反応に関連する各種分子の遺伝子多型によって左右されることが報告されている。この生体反応の個人差は、続発する臓器障害の発症頻度や転帰に大きく影響することが明らかになっている。また、これら遺伝子多型の頻度は人種差が大きく、欧米人と日本人では各種の治療に対する反応性の差となって現れる可能性がある。本研究では、これら遺伝子多型に関する情報をさらに多くの個体を対象として集積するとともに、転帰や治療経過との関連を研究することで、日本人独自の重症救急患者に対する個別化治療を確立することを目的としている。本研究では、これまでの自施設での研究を基盤に、多施設共同研究でより多くの固体の遺伝子情報と臨床情報を収集する。目標症例数は1000例とし、全国8つの施設でインフォームド・コンセントを得た上で検体採取と臨床データ収集を行う。また、ハイリスクと診断された症例のサイトカインプロファイルを、非ハイリスク患者と比較検討する。さらにハイリスク患者から採取した全血をエンドトキシン(LPS)で刺激し、血中サイトカインプロファイル、TLR発現、MIF、プロテインC濃度等を検討し表現型の違いを明らかにし、これらの反応を制御するための治療法の確立を図る。本年度は、協力を依頼した8施設のうち7施設において倫理審査の承認が得られ、検体採取とデータ収集が開始され、360症例が登録された。これら検体において我々が共同開発した高感度遺伝子検出バイオチップ(DNAアレイ)を用いて、サイトカイン、自然免疫、凝固系に関連した15種類の遺伝子多型を解析した。侵襲に対する生体反応は、免疫一炎症反応に関連する各種分子の遺伝子多型によって左右されることが報告されている。この個人差は、続発する臓器障害の発症頻度や転帰に大きく影響することが明らかになっている。また、これら遺伝子多型頻度の人種差が各種の治療に対する反応性の差となって現れる可能性もある。本研究では、これら遺伝子多型に関する情報をさらに多くの個体を対象として集積し、臨床経過との関連を研究することで、日本人独自の重症救急患者に対する個別化治療を確立することを目的とする。本研究では、自施設での過去の研究を基に、多施設共同研究でより多くの個体の遺伝子情報と臨床情報を収集する。全国5施設でインフォームド・コンセントを得た上で検体採取と臨床データ収集を行う。さらに患者全血をエンドトキシン(LPS)で刺激し、血中サイトカインプロファイル等から表現型の違いを明らかにし、これらの反応を制御するための治療法の確立を図る。本年度までに、協力施設5施設において検体採取が継続され、計677症例(目標1000症例)が登録された。現時点で,ICU患者重症化予測として有望な遺伝子多型としては,IL1RA VNTR(variable number of tandem repeat),TNF-308*G/A,IL1B-31*C/T,などが中間結果で挙がっている.そして,1μg/mLのLPS刺激により,IL-1ra,IL-1β,TNF等の産生量に関して,異なる遺伝子型間で表現型に差が生じるか否かにつき検討中である.現時点で,IL1RA VNTRのminor allele保有者で,IL-1β産生に比し,相対的にIL-1ra産生が少ない傾向が認められている.今後他のサイトカインおよびそれらのmRNA発現についても詳細に測定する方針である.侵襲に対する生体反応は,遺伝子多型によっても少なからず左右される.この個人差は,臓器障害の発症頻度や転帰に大きく影響することが示唆されている.本研究は,本邦の症例を対象として,遺伝子多型に関する情報と臨床経過との関連を研究することで,日本人独自の重症救急患者に対する個別化治療を確立することを目的としている.今年度は,多施設共同研究(計5施設)でより多くの症例の遺伝子情報と臨床情報を収集した.このうち,重症敗血症における遺伝子多型の関与を明らかにするために,IL-1 receptor antagonist遺伝子のvariable number of tandem repeat多型( IL1RA VNTR )を取り上げ,臨床経過や転帰への影響について検討した.検体採取時期から,導出コホート(自施設症例; n=261)と検証コホート(多施設症例; n=793)に分け,ICU患者の転帰とIL1RA VNTRとの関連を検討した.

さらに,健常者80名を対象に,in vitroでLPSにて刺激した全血の血清中IL-6,IL-1ra濃度を測定し, IL1RA mRNA発現量を測定した.その結果,導出コホートおよび検証コホート両方において,RN*2 alleleの保有数が多くなるにつれてICU死亡率,重症敗血症罹患率ともに有意に上昇していた(P adj=.002). LPS刺激下で,培養血中IL1RA mRNAを測定したところ,RN*1.2症例では1.1症例に比しその発現が有意に抑制されていた.したがって,RN*2 alleleが抗炎症性サイトカインの発現低下を介して重症敗血症患者の転帰を悪化させている可能性が示唆された.本邦において集中治療室における高サイトカイン血症対策を中心とした重症敗血症個別化対策への応用が期待される.サンプルの収集,患者データの集積,ex vivoassayは概ね順調であったが,遺伝子多型解析の手法として,当初導入していた遺伝子検出バイオチップ(DNAアレイ)の精度が不安定となり,原因検索を行ってきたが結局,別の手法に切り替えざるを得なくなったため.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
変異ウイルスに対して有効な液性免疫記憶形成機序

ウイルス一次感染時、メモリーB細胞は、高親和性IgG抗体を有する細胞が選択されると考えられていた。このモデルでは、2度目にドラスチックな変異が入ったウイルスが感染した時には、高親和性IgG抗体メモリーB細胞は、反応できず、にもかかわらず、なぜ免疫記憶反応が成立するヒトが存在するのかが謎であった。申請者らは、メモリーB細胞集団は、広汎な親和性を有する細胞が選択されており、それ故、変異ウイルス2次感染時、免疫記憶反応を誘導できる、という仮説提唱に至った。本研究では、先ず、この仮説検定をおこない、このメモリーB細胞の生成・活性化を支えるメカニズムを明らかにする。本研究は、「メモリーB細胞集団には、抗体レパトアが広汎かつ低・中親和性を示すものが存在し、変異ウイルス感染時に迅速な免疫記憶反応を誘導できる基盤となっている」という研究代表者の仮説をインフルエンザウイルスを対象として検証すること、またメモリーB細胞の生成・活性化機構を解明することを目的としている。本研究は、新規メモリーB細胞集団の役割を解明してワクチン効果の分子機構そのものを明らかにする研究といえ、学術的にも臨床的にも極めて重要な課題を担っている。本研究により、メモリーB細胞の生成・活性化機構が解明され、結果、感染症予防にとって有益なワクチン開発への情報が提供されることが期待される。
清浄金属ナノ粒子形成のためのカーボンナノチューブチュービング法の確立

金属内包カーボンナノチューブ(CNT)の内包金属の低温溶出現象を利用した、金属ナノ粒子の新しい形成法を研究した。銅内包CNTと樹脂との複合フィルムは、590 nm付近に内包銅による特異な光吸収があることを見出した。さらに、加熱処理した試料では処理前と比較して、約5 nm短波長へシフトした。これは内包銅が溶出し、CNTの外側に銅ナノ粒子を形成する温度領域と一致していることを明らかにした。また銅とゲルマニウムならびに銅とチタンの合金内包CNTを従来の銅内包CNTに匹敵する収率、充填率で作製することに成功した。これらは銅内包CNTより、さらに約200°C低い温度で溶出することがわかった。アーク放電法で作製可能な高充填率の銅内包カーボンナノチューブ(CNT)と紫外線硬化樹脂とのコンポジットフィルムを作製し、可視光吸収スペクトルによる評価を行った。その結果、590 nm付近に特異な吸収を観測することができた。これは紫外線硬化樹脂に埋め込まれた銅内包CNTの内包銅による吸収である。さらに、300-1100°Cの範囲で真空加熱処理した銅内包CNTの試料も同様に、紫外線硬化樹脂とのコンポジットフィルムを作製し、吸収スペクトルの測定を行った。900°C以上で加熱処理したものでは、銅による吸収ピークは観察できなかった。これは内包銅が完全に蒸発し、中空のCNTしか存在していないという電子顕微鏡観察の結果と一致している。興味深いのは300-800°Cの加熱温度領域である。詳細な最大吸収波長を調べたところ、熱処理前の試料では586.5 nmであったが、300°C以上で加熱した試料では581.5 nmとなっており、5 nmほどブルーシフトした。つまり、ちょうど内包銅が溶出し、CNTの外側に銅のナノ粒子を形成する温度領域と一致していることが明らかとなった。また並行して酸処理による内包銅の溶出挙動を調べる過程で、予想に反してCNT層数が増大しグラファイト性が向上することを見出した。銅内包CNTよりもさらに低温で溶出する金属を模索する過程で、銅とゲルマニウムの合金が、その可能性を有することを見出した。同様のアーク放電法により銅・ゲルマニウム内包CNTを従来の銅内包CNTに匹敵する収率、充填率で作製することに始めて成功した。さらに熱処理により200°C以上(銅内包CNTより100°C低下)で内包金属が溶出することがわかった。XRD解析により内包物はCu3Geであることが明らかとなった。また現在までに100%ゲルマニウム内包CNTや銅/チタン合金内包CNTなどの作製にも成功している。研究初年度には、アーク放電法で作製可能な高充填率の銅内包カーボンナノチューブ(Cu@CNT)と紫外線硬化樹脂とのコンポジットフィルムを作製し、可視光吸収スペクトルによる評価を行った。その結果、590 nm付近に内包銅による特異な吸収を観測することができた。さらに、真空加熱処理したCu@CNTの試料でも同様に、紫外線硬化樹脂とのコンポジットフィルムを作製し、詳細な吸収スペクトルの測定を行った。その結果、熱処理前の試料と比較して、300°C以上で加熱した試料では約5 nmブルーシフトした。つまり、ちょうど内包銅が溶出し、CNTの外側に銅ナノ粒子を形成する温度領域と一致していることが明らかとなった。研究最終年度には、紫外領域も含めた吸収スペクトルによるCu@CNTの銅溶出現象の追跡を可能にするため、ポリビニルアルコールとのコンポジットフィルムを作製し、評価を行った。その結果、初年度には測定できなかったCNT構造由来の吸収と、大気中で操作した場合に自然酸化された酸化銅ナノ粒子由来の吸収を評価することができた。また、さらに低温で溶出する金属を模索する過程で、銅とゲルマニウムならびに銅とチタンの合金内包カーボンナノチューブ(Cu-Ge@CNTならびにCu-Ti@CNT)を従来のCu@CNTに匹敵する収率、充填率で作製することに成功した。これらはCu@CNTより約200°C低い温度で内包金属が溶出することがわかった。XRD解析によりCu-Ge@CNTの内包物はCu3Geであることが明らかとなった。一方Cu-Ti@CNTの場合はCu-Ti合金はCNTに内包しているときはアモルファスで、CNTから溶出すると結晶性のCu3Ti合金粒子に変化することが分かった。さらにXPS分析から、熱処理により溶出し形成されたCu3Ti合金粒子は表面がTiO2で覆われたコアシェル構造であることを明らかにした。

材料化学銅内包カーボンナノチューブ(CNT)と紫外線硬化樹脂のコンポジットフィルムを作製し、その光吸収特性から、内包銅の溶出とナノ粒子形成との関係を見出した点、新しい合金内包CNTを作製し、その溶出温度の低温化に成功した点など、2年間の研究計画の内、現在までに計画に先んじて、いくつかテーマを遂行することができた。しかし、コンポジットフィルム内での内包金属の溶出によるナノ粒子形成や、ナノ粒子サイズ制御のための銅内包CNTの切断長制御などは達成できていない。計画通り、切断長のそろった銅内包カーボンナノチューブ(CNT)を用いた加熱型CNTチュービング法の確立を目指す。そのために超音波照射法による銅内包CNTの切断と遠心分離によるサイズ分離を試みる。また切断長制御の成否に関わらず、平行してコンポジットフィルム中での内包金属の溶出実験を試みる。そのためにフィルムとしてポリビニルアルコール(PVA)を選択し、コンポジットフィルムを作製した後、加圧による溶出試験を行う。得られたコンポジットフィルムの光学的特性を紫外・可視吸収や蛍光分光などにより評価する。最終的に、CNTチュービング法の確立と本方法で作製できるコンポジットフィルムの特性をまとめ、新しい素材として提案することを目指す。物品費による物品購入の際、当初予定価格より安価で購入でき、生じた残額をそのまま次年度へ繰り越した。次年度の物品費として使用する予定である。
ポリチア〔n〕フェロセノファン-遷移金属錯体の合成と金属-金属相互作用の研究

ポリチア〔n〕フェロセノファンと種々の遷移金属塩との反応を行ない、相当する錯体を多数合成し、フェロセンの鉄原子と遷移金属イオンとの間の相互作用を種々のスペクトルを用いて調べた。その結果、ある種の錯体については強い相互作用があることが見い出された。以下に具体的に述べる。テトラチア〔n〕フェロセノファンと銅(【I】),銀(【I】),水銀(【II】),パラジウム(【II】)との錯体を合成・単離した。その際、錯体の安定性がフェロセノファンの環の大きさに大きく影響されることがわかった。また、錯体のスペクトルを検討した結果、金属イオンとフェロセン核との相互作用は小さく、恐らく、その性格は硫黄原子の配位を介した誘起効果であろうと推測された。トリチア〔n〕フェロセノファンに対しても、上と同じ金属イオンとの錯体を合成・単離した。スペクトルデータから、パラジウム錯体以外はいずれの錯体もよく似た構造を持つことが推測された。また、いくつかの錯体においては、金属イオンとフェロセン核との間に何んらかの強い相互作用があることが推測された。トリチア〔n〕フェロセノファン(n=7,9)とパラジウム(【II】)フルオロボレートとの錯体を合成・単離した。この錯体のスペクトルデータは、上に述べたいずれの錯体とも大きく異なり、フェロセンの鉄原子とパラジウム原子との間に弱い配位結合が存在することが示唆された。また銅(【II】)フルオロボレートとの反応では、分子内酸化還元反応が起ったと考えられる興味深い2:1錯体が単離された。ポリチアフェロセノファンとの比較のために、ポリチア〔n〕ルテノセノファンと塩化パラジウム(【II】)との錯体の合成・単離および構造決定を行なった。ジチア〔4〕ルテノセノファンとテトラチア〔10〕ルテノセノファンでは配位様式が異なることがわかった。
2ループファインマン積分の数値積分法の研究

現在のところ2ループ積分を解析的に計算する方法は一般的には知られていない。このため大きく分けて次の2つの接近の仕方で計算が試みられている。一つは外線の運動量で2ループ積分を展開し、展開係数を数式処理によって求め、それを最後に数値化する方法と、2ループ積分を何らかの表示で数値積分を直接行なってしまう方法である。今年度の研究ではファインマンパラメータ積分を数値積分する方法の確立を行なった。ファインマン積分は超関数の積分であるため数値積分を行うことは困難であるとされ、1ループ積分では一般的な解析積分が行なわれてきた。しかし、モンラカルロ積分法の一手法である負関数をとる方法を拡張することにより超関数の積分を可能なものとした。この方法により2点関数及び平面型3点関数の2ループ積分の数値化に成功した。折しも世界的にも2ループ補正の重要性が認識され初め、今年度にはロシア,オランダ又ドイツでは2グループが標準理論における2ループ積分が手がけられるようになった。本研究は他のグループに先駆けて数値結果を示すことができたため、ドイツの2グループ及びロシアのグループのそれぞれから結果の照合の問い合わせを受け、いずれにおいても一致と見ている。特に先に書いた展開係数を求める方法を採るグループにとっては展開の正当性を保証するものとして今研究結果との照合は不可欠となっている。現在の課題は交叉型3点関数の積分の数値化であり、未だどのグループも成功するに至っておらず激しい競争となっている。
低速多価イオンによる二電子捕獲過程の衝突径数依存性

標的から電子を捕獲した後の低速多価イオンの励起状態の研究および多価イオンの標的からの電子捕獲過程の衝突径数依存性を研究するための準備を行った。1.低速多価イオン(O^<6->,Ne^<3->)を種々の標的ガスに衝突させ、標的からの二電子捕獲によりベリリウム様二電子励起状態を生成した。この励起状態のエネルギー準位を調べるために、Auger電子のエネルギーを零度電子分光法を用いて測定した。この結果、O^<4->(1s^23131^')の三重項状態のエネルギーを単回衝突の条件のもとで決められた。一般に、ヘリウムや水素分子標的を用いると二電子捕獲過程により一重項励起状態が生成され、多電子標的(窒素分子、ネオン、アルゴン等)を用いると一重項だけでなく三重項励起状態が生成される。多電子標的を用いた場合の一重項状態と三重項状態の生成される割合は衝突系(多価イオンと標的ガス)により大きく異なることがわかった。われわれの実験では、O^<6->をネオン標的に衝突させた場合に選択的にO^<4->(1s^23131^')の三重項励起状態が生成されている。これは、この衝突における二電子捕獲反応のリアクションウインドウの位置と二つの電子を引き抜かれた標的(Ne^<8->)に基底状態が三重項状態であることで定性的な説明がつけられる。2.リコイルイオン・散乱イオンの同時測定を行い衝突径数を決めるための測定系の準備を行った。本研究に必要な測定回路の一部を購入しCAMMACを利用した同時計測系をつくり回路系の動作試験を行い、来年度以降の実験の準備を行った。
中国語劇成立史研究-早期話劇を中心に

研究開始と同時に、まず中国語ワープロソフト、ハードディスク等のパソコン周辺設備を購入、大学研究室のパソコンの機能向上をはかった。あわせて清末民初の文学雑誌等を購入、そこにみられる演劇関係記事等の調査をおこなった。また平成四年八月より五年三月まで数回にわたって東京へ出張し、上海の新聞等を集中的に調査した。このような研究過程を経て、平成四年十一月二十一日開催の日本演劇学会秋季大会(於大阪大学)で研究の成果を話劇女優の誕生に焦点を絞って「中国話劇女優の誕生」という題目で報告した。また平成五年一月には話劇成立の指標とされる上海戯劇協社「若奥様の扇」上演の意義と内容を「上海戯劇協社『若奥様の扇』(《少〓〓的扇子》上演をめぐって」と題する論文にまとめ、日本中国学会報(日本中国学会)に投稿した。この論文は平成五年秋発行の同誌第四十五集に掲載されることがすでに決定している。以上を通して話劇の本質はリアリズム演劇であること、それは女優を必要とすること、話劇と清末民初・五四時代との関連などを考察した。また、これと平行してすでに作成した春柳社上演広告にデーターベース化をめざして業者に入力を委託した。さらにリアリズム演劇としての話劇の性格をより具体的に把握するために、リアリズム演劇の対立物として出現した日本「アングラ」演劇の初の訪中公演である新宿梁山泊「人魚伝説」上海公演の上演資料(劇評等現地の反響)を収集し、それを翻訳してパンフレットにまとめた。このパンフは平成五年五月に完成の予定である。
精巣内体細胞におけるDAX1の機能解析とアデノウィルスベクターを用いた臨床応用

(目的)DAX1の精子形成に果たす役割は未だ解明されていないためアデノウィルスベクターを用いたDAX1の精巣内遺伝子導入の効果を検討した。(方法)DAX1発現アデノウィルスベクターを作製し、ライディッヒ・セルトリ細胞株に遺伝子導入した。遺伝子発現をRT-PCRで比較した。ラットの精巣にベクターを投与し、免疫染色で検討した。(結果)セルトリ細胞ではScf遺伝子の発現が亢進していた。ラット精巣ではセルトリ細胞にDAX1の強発現を認めた。(考察)DAX1はセルトリ細胞からSCF/KITシグナル経路を介して精子形成を促進していると考えられた。私たちは、これまでに特発性造精機能障害患者の精巣内では転写因子DAX1の発現が低下していることを明らかにした。本研究では、精巣内体細胞における転写因子DAX1の機能解析とアデノウイルスベクターを用いた精巣内遺伝子治療への臨床応用を目指し以下の2つを行った。i. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製a).ベクターのコンストラクト作製:サブクローニングによりプラスミド内で遺伝子配列を作製した。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを使用した。DAX1とマーカータンパクeGFPを発現できるように、DAX1遺伝子の全長cDNAとeGFPのcDNAとの間にIRES (internal ribosomal entry site)配列を挿入した。作製した目的遺伝子配列を非増殖性アデノウイルスのゲノムDNA内に組み込みアデノウイルスベクターを作製した。コントロールベクターとしてeGFPのみを発現するベクターも作製した。b).アデノウイルスベクターの精製とタイター調整:HEK293細胞内で増殖したアデノウイルスを培養細胞ごと回収し凍結融解により細胞壁を破壊したあと、Adeno-X Maxi Purification kit (Clonetech社)のカラムクロマトグラフィーで精製した。さらに、Adeno-X Rapid Titer kitを用いてタイター測定しウイルス溶液を調整した。ii.培養細胞におけるDAX1機能解析セルトリ細胞として幼仔期由来のTM4細胞、ライディッヒ細胞として幼仔期由来のTM3細胞を用いた。アデノウイルスベクターによりDAX1の発現を亢進した際の遺伝子変化を定量RT-PCRで解析した。本研究では、精巣内体細胞であるセルトリ細胞とライディッヒ細胞における、転写因子DAX1の機能を解明すること。その後DAX1遺伝子をマウス・ラットの精巣内に遺伝子導入し、造精機能への影響を検討することを目指している。そのために以下の4つを計画している。1. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製、2.培養細胞(セルトリ細胞とライディッヒ細胞)における" in vitro "でのDAX1機能解析、3.ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討、4.ラット精巣における" in vivo "でのDAX1機能解析、である。現在までに1と2が終了し、3に取りかかっている。1. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製:サブクローニングによりプラスミド内で遺伝子配列を作製した。目的遺伝子を発現させるためのプロモーター、マウスDAX1遺伝子のcDNAとマーカータンパクeGFPのcDNAを非増殖型ヒト5型アデノウイルスゲノムDNAに組込んだ。その後は増殖に必要なE1領域を発現するHEK293細胞内では増殖させた。HEK293細胞内で増殖したアデノウイルスをカラムクロマトグラフィーで精製しタイター測定によりウイルス溶液を調製した。2.培養細胞における" in vitro "でのDAX1機能解析:セルトリ細胞とライディッヒ細胞を用いた。アデノウイルスベクターを用いてDAX1遺伝子を遺伝子導入しgain-of-function解析を行った。3.ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討:アデノウイルスベクター投与後のDAX1発現の局在と経時的な変化を解析し、適切なウイルスタイターを検討中である。1.DAX1発現アデノウイルスベクターの精製と培養細胞への投与コンストラクトを作製したアデノウイルスベクターをHEK293細胞内で増殖させ、Adeno-X MaxiPurification kit (Clonetech社)のカラムクロマトグラフィーで精製した。セルトリ細胞として幼仔期由来のTM4細胞、ライディッヒ細胞として幼仔期由来のTM3細胞を用いた。2.ラット精巣に対するアデノウイルスベクターの投与ラット精巣に様々なタイターのウイルス溶液を投与し、投与後1、4、7、14日目に精巣を採取した。精巣内投与法に関しては2種類の方法を用いた。精巣間質注入法ではライディッヒ細胞に特異的に遺伝子導入が可能であり、精細管内注入法ではセルトリ細胞に特異的に遺伝子導入が可能である。組織学的な変化(Johnsen scoreや精細管あたりの精原細胞数)とアポトーシスの有無を解析した。(目的)