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非平衡プラズマ物理学のための乱流計測シミュレータ研究

この研究では、磁化不均一高温プラズマを対象に、乱流計測シミュレータ(大域的乱流シミュレーションの時間・空間4次元データ全体を蓄え、多元の乱流場を高次相関解析し、諸現象の因果関係を検定するシステム)を活用し研究を推進した。広域高次相関解析等の先進データ解析法を考案した。輸送障壁の形成機構の検証、勾配ー流束関係に現れるヒステリシスの発見、位相空間に働く新しい乱流駆動力の提唱、スケール混合にもとづく空間構造や時間的突発性の発生の研究など、多くの成果をもたらした。非平衡プラズマの大域的非線形機構の理解に大きな進歩をもたらした。平成23年度には、まず研究の全体設計を行った。(i)研究の体系的構想、(ii)研究者チームの役割分担、(iii)全体年次計画を確認する。この全体計画は、(a)大域的な非平衡ダイナミックス(プラズマ中の様々な領域が多スケールの揺動を介在として結びつき全体の構造を作り出す過程)の理論研究、(b)乱流計測シミュレータを活用した大域的因果関係の観測、(c)実空間の輸送界面や速度空間構造と乱流の相互作用の理論・シミュレーションによる研究、(d)得られる予言の実験での検証法の研究、等の個別ステップから構成される。この多元的研究展開を実現し、研究方法論として乱流計測シミュレータが大域的非線形ダイナミクスの本質的な過程を見いだしうる事を実証する。非平衡プラズマの物理学の新展開の典型例を形作る。具体的な研究として、次の研究に着手した。大域的な非平衡ダイナミックスの理論研究では、代表者によるSeesaw wmechanismのように、空間的にはなれた位置での相反する輸送応答をもたらす機構について研究に着手し、非拡散型の輸送をもたらす乱流の研究を進めた。乱流計測シミュレータについては、試作機をもとに、乱流場生成やデータ解析のおけるシミュレーションや解析プロセスの並列化に着手した。それによって、順次乱流計測シミュレータの物理解析面での高度化を図った。輸送界面のダイナミクスや、速度分布関数と輸送構造の関係の研究を進め、研究成果を投稿した。先進データ解析法と実験検証では、ウエーブレット解析による先進法を考案し輸送伝播研究での高精度化を実現したので、それを活用し、輸送界面探査法や、界面での乱流ダイナミックスの探査法を提示した。本研究の全体計画は、個別ステップ(a)大域的な非平衡ダイナミックス(プラズマ中の様々な領域が多スケールの揺動を介在として結びつき全体の構造を作り出す過程)の理論研究、(b)乱流計測シミュレータによる大域的因果関係の観測、(c)実空間の輸送界面や速度空間構造と乱流の相互作用に関する理論・シミュレーションによる研究、(d)得られる予言の実験での検証、から構成される。乱流計測シミュレータが、大域的非線形ダイナミクスの本質的な過程を見いだすための研究方法論となる事を実証し、非平衡プラズマの物理に新しい進展をもたらすことを目指す。平成24年度には、上記(a)-(d)の観点から次のような進展を得た。(a)大域的な非平衡ダイナミックスの理論研究では、空間的にはなれた位置での相反する輸送応答の具体的研究を進めた。非拡散型輸送現象との関連を解析した。(b)乱流計測シミュレータの研究では、前年度までのシステム高度化に立脚し、乱流計測シミュレータを用いた解析を進めた。乱流の塊の間欠的移送に対し統計的解析を行った結果、その運動のダイナミックな相関長を評価することに成功し、移動速度の理論的評価を検証することが出来た。ダイナミック輸送現象の実験観測への具体的応用を開始した。(c)輸送界面や速度空間構造と乱流輸送の相互作用の理論・シミュレーション研究は、代表者や分担者(登田)による内部輸送界面研究を進めるとともに、分担者(村上)が開拓した高精度ICRF加熱解析コードを活用し、イオンのエネルギー分布関数の構造と駆動流を介在とした乱流揺動構造の結びつきを研究に成果を得た。(d)先進データ解析法と実験検証では、輸送界面探査法や、広域相関探査法を展開し、実験データ解析に適用開始する。LHDやHL-2A装置を用いた実験に適用を進め成果を得た。揺動解析国際共同作業ワークショップを開催し成果を得た。平成25年度には次のように大きな成果が得られた。(a)大域的な非平衡ダイナミックスの理論研究について、乱流の塊の間欠的移送機構を定式化するため輸送量の変動に関するラグランジュ相関を用いる方法を示した。(b)乱流計測シミュレータの研究では、分担者(糟谷)を中心に研究協力者とともに動的輸送応答実験の解析を推進した。非拡散な輸送応答に伴い、非局所的な揺動の非線形結合が起きている事を示した。非拡散な輸送現象の観測法への具体像を提示し、実験家に提供した。(c)輸送界面や速度空間構造と乱流輸送の相互作用の研究は、代表者らによって提唱された位相空間乱流効果[Sci. Rep. 2 (2102) 860]の研究を進め、分担者や協力者とともに、イオンのエネルギー分布関数の構造と駆動流を介在とした乱流揺動構造の結びつきの具体的検証法の研究を進めた。(d)先進データ解析法と実験検証では、輸送界面探査法や広域相関探査法をトカマクの乱流データに適用し、大きな成果を得た。例えば、HL-2Aでの多チャンネルプローブシステムのデータに着目し、JFT-2MではL-H遷移が起きる状況での詳細な観測データを活用した。そこでの広域相関探査法応用によってトカマクでの大域

乱流構造を観測し、L-H遷移近傍での自律的振動の物理を解明した。揺動塊の大域的変動の観測に成功した。成果をH-mode workshopなどの国際会議で発表しレビュー論文を刊行した。また、リアルタイムディジタルオシロスコープのデータ解析により密度分布の統計的把握が実現するという、当初予想されなかった、乱流計測シミュレータの進展が得られた。この革新的成果を新たに取り入れる乱流計測シミュレータの増強は、当該研究の十全な達成に必須である。平成25年度末に得られる実験データ確認後増強を完了する事とした。平成26年度には次のような研究実績を上げた。乱流計測シミュレータの研究では、乱流計測シミュレータの物理解析面での高度化を図った。それを活かし、動的輸送応答実験観測への具体像を提示し論文として発表した。速度空間を捨象した、実空間の乱流の大域的発展を研究し、それに伴う輸送の動的応答を解析した。その結果、勾配ー流束関係にヒステリシスがある事は再現出来たが、ヒステリシスの上を動く向きが、実験とは逆である事を確認した。これは、初期的な結果ではあるが、流体モデルでの不十分さを示唆しており、代表者らによって提唱された位相空間乱流効果[Nucl. Fusion 53 (2013) 073035]の重要性を支持している。輸送界面や速度空間構造と乱流輸送の相互作用の研究を進め、輸送障壁の構造に係る定性的なスケーリング則を導いた。先進データ解析法と実験検証では、マイクロ波コムを活用し分布の統計的変動を観測する理論手法を考案した。JFT-2MではL-H遷移が起きる状況での詳細な観測データが存在する。乱流計測シミュレータの考え方から、乱流の塊の間欠的移送が観測出来る事を予測した。広域相関探査法応用によってトカマクでの大域乱流構造を観測し、乱流の塊の間欠的移送機構を実測した。国際的にも中国西南物理学研究所にて揺動解析国際共同作業ワークショップを開催した。これらの成果を論文として投稿した他、国内外で発表した。本研究では、乱流計測シミュレータが、大域的非線形ダイナミクスの本質的な過程を見いだすための研究方法論となる事を実証し、非平衡プラズマの物理に新しい進展をもたらすことを目指している。平成27年度は最終年度であり、全体計画に沿って研究をとりまとめた。乱流計測シミュレータによる動的輸送応答実験観測への寄与を取りまとめ、実験観測に具体的に適用した。位相イメージコントラスト法と呼ばれる乱流計測法について検討した。通常、視線積分のデータをもとに実空間分布が推定されているが、推定の誤差(曖昧さ)が通常信じられているより大きいことを示し、乱流の解釈に基軸を示した。また、プラズマの大域的な非平衡ダイナミックスについて考察を深め、通常はミクロ・メゾ・マクロと分離されて議論されている物理過程が、スケールの差を超えて直接相互作用するクロススケールの考え方も示した。この成果を、輸送界面や速度空間構造と乱流輸送の相互作用の研究へと統合し、その結果、通常は滑らかと仮定されている分布に細かな凹凸が自律的に生まれ、それが大域的な輸送現象に大きな影響を与えることを示した。さらに、H-モード輸送障壁のスケーリング則を導いている。
頭蓋外短持続電気刺激に対する前庭神経ニューロンの反応に関する生理学的研究

短持続電気刺激を頭蓋外からあたえたときの前庭神経の反応について、モルモットにおける電気生理学的研究とヒトにおける誘発筋電位による臨床神経生理学的研究を行った。モルモットにおいては、中耳腔と前頭部間に電気刺激を与えた。今回の研究で、頭蓋外からの短持続電気刺激は、前庭神経を刺激し得ることが明らかになった.すなわち、モルモットにおいては、頭蓋外からの短持続電気刺激に対して、短い潜時で応じる前庭神経ニューロンの存在することが認められた。また、ヒトにおいて、乳突部-前頭部間を電気刺激し、胸鎖乳突筋における誘発筋電位を記録すると、潜時10-20msecで2相性の反応が記録された(p33g-n23g)。健常成人における反応閾値は2.5mAであった。最適の刺激頻度は5Hzと考えられた。さらに、前庭機能障害症例における検討からは、臨床検査としても応用可能なことが明らかとなった。すなわち、末梢前庭障害のうち神経障害(聴神経腫瘍など)では、電気刺激に対し無反応であるが、受容器障害(メニエール病など)では、電気刺激に対して反応のあることが明らかになった。短持続頭蓋外電気刺激法と従来から用いられている音響刺激法を併用して、末梢前庭障害を神経障害と受容器障害に分類することが可能となった。この方法を前庭神経炎症例に応用したところ、臨床的な前庭神経炎のうち、70%は、神経障害であるが、30%は、受容器障害であることが示唆された。(1)誘発電位による動物実験ネンブタールによる全身麻酔モルモットを用い、頭頂部-鼓室間あるいは、鼓室-鼓室間の短潜時電気刺激によって脊髄に誘発される誘発電位の記録を行った。この方法によって誘発電位の記録は可能であったが、電気的アーチファクトが大きく、反応の判定が容易ではなかった。このため、電気刺激法を改良し、鼓室内に挿入した、双極性の刺激電極についてその試用を開始したところである。本法による動物実験が来年度の課題の一つである。(2)ヒトにおける臨床研究ヒトにおける臨床研究においては、大きな成果が得られた。まず、健常被検者における記録で、前頭部-乳突部刺激によ'って潜時10msec付近に最初のピークを持つ2相性の電位が胸鎖乳突筋から記録された。3mA(1msec)の刺激で、健常被検者においては全例反応を認めた。反応閾値は、平均で2.5mAであった。反応には年齢の影響は認められなかった。また、メニエール病および聴神経腫瘍の症例における検討では、本反応が、迷路病変と後迷路病変の鑑別に有用である結果が得られた。すなわち、音響刺激によるVEMPが消失している上記2疾患において、メニエール病症例においては反応が認められ、一方、聴神経腫瘍症例においては反応が消失あるいは減弱していた。このような臨床応用についてはさらに検討をすすめる予定である。なお、第1報は2002年内にClinical Neurophysiology誌に掲載予定である。(1)誘発電位による動物実験ネンブタールによる全身麻酔モルモットを用い、頚筋上においた電極から誘発電位を記録する実験を行った。この部位で陰性電位が記録されることは明らかであったが、本年度は、外科的に前庭神経を切断した動物でこの電位が消失することを明らかにし、この反応が前庭由来であることが確実となった。電気刺激法については、改良を施し、鼓室内に挿入した双極性の刺激電極によって電位の測定を開始した。本法による動物実験を来年度も継続して行う。(2)ヒトにおける臨床研究ヒトにおける臨床研究においては、次のような成果が得られた。平成13年度の研究から、短持続電気刺激による頚筋反応が、迷路病変と後迷路病変の鑑別に有用である結果が得られたことから、この反応を前庭神経炎の障害部位診断に応用した。

前庭神経炎の場合約80%の症例では本反応も消失しており、障害部位は前庭神経にあると考えられたが、約20%の症例では、音響刺激によるVEMPが消失している症例においても本反応が認められ、障害部位は内耳と考えられた。このように、本反応の応用によって、臨床的に前庭神経炎と診断される症例のなかには、迷路障害型と神経障害型の二種類に分類されることが明らかとなった。この成果については、2002年に国際平衡神経学会であるBarany Society Meetingで発表した。また、同様の電気刺激で下肢筋からも誘発電位が記録されることが明らかとなった。動物実験ネンブタールによる全身麻酔モルモットを用い、頚筋上においた電極から誘発電位を記録する実験を行った。この部位で陰性電位が記録されることは明らかであったが、本年度は、薬理学的に内耳(前庭系)を破壊した動物でこの電位が消失することを明らかにした。電気刺激と免疫組織化学的手法の組み合わせによってもこの刺激が前庭系を刺激していることが示唆された。ヒトにおける臨床研究ヒトにおける臨床研究においては、次のような成果が得られた。短持続電気刺激による頚筋反応が、迷路病変と後迷路病変の鑑別に有用である結果が得られたことから、この反応を前庭神経炎の障害部位診断に応用した。この成果は、Neurology誌で発表された。また、この短持続電気刺激による刺激部位は、比較的長い持続の電気刺激を用いるgalvanic body swaytestにおける刺激部位と同一部位であることがわかった。この成果はClinical Neurophysiology誌で発表予定である。前年度に引き続き、短持続電気刺激を頭蓋外からあたえたときの前庭神経の反応について、モルモットにおける電気生理学的研究とヒトにおける誘発筋電位による臨床神経生理学的研究を行った。前年度までで確立された方法を用い、すなわち、モルモットにおいては、中耳腔と前頭部間に電気刺激を与えた、また、ヒトにおいては乳突部-前頭部間を電気刺激し、胸鎖乳突筋における誘発筋電位を記録した。前年度までの結果とあわせて、頭蓋外からの短持続電気刺激は、前庭神経を刺激し得ることが明らかになった。すなわち、モルモットにおいては、頭蓋外からの短持続電気刺激に対して、短い潜時で応じる前庭神経ニューロンの存在することが認められた。また、ヒトにおいて、乳突部-前頭部間を電気刺激し、胸鎖乳突筋における誘発筋電位を記録すると、潜時10-20msecで2相性の反応が記録された(p33g-n23g)。健常成人における反応閾値は2.5mAであった。最適の刺激頻度は5Hzと考えられた。さらに、前庭機能障害症例における検討を行った結果からは、臨床検査としても応用可能なことが明らかとなった。すなわち、末梢前庭障害のうち神経障害(聴神経腫瘍など)では、電気刺激に対し無反応であるが、受容器障害(メニエール病など)では、電気刺激に対して反応のあることが明らかになった。短持続頭蓋外電気刺激法と従来から用いられている音響刺激法を併用して、末梢前庭障害を神経障害と受容器障害に分類することが可能となった。
遷移金属合金の耐食機能における不働態皮膜の電子構造の役割

本研究は、遷移金属合金の耐食性に大きく関与する不働態皮膜の電子状態を、光照射を利用した電気化学的手法により調べ、実際の耐食機能との比較から、合金の耐食機能の本質と皮膜の電子構造との関連を明らかにすることを目的とした。具体的には代表的な遷移金属であるチタン合金に注目し、純チタンおよび周期律表の3d(V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu)、4d(NbおよびMo)5d(Ta)遷移金属元素をそれぞれ5at%添加した合金に生成する不働態皮膜の電子状態の変化を実験的に調べた。また、分子軌道計算により、皮膜の電子構造計算を行い、実験との比較検討を行った。Ti合金の不働体態皮膜に光を照肘すると、すべて正の光電流を生じる。すなわち、皮膜自体がn型の半導体特性を持っており、この基本的特性は添加元素によって変化しない。照射する光の波長を変化させて求めた光電流スペクトルの形状は、純Tiで得られるものと比べてそれほど大きな変化はなく、そこから得られる皮膜のバンドギャップは4.0eV付近であった。これに対して、表面皮膜のバンド構造の曲がりの大きさを表すフラットバンド電位は添加元素によって大きく変化した。Co,Cu,NbおよびTaを添加した場分は卑に、FeやMoを添加した場合には貴になる。フラットバンド電位の変化と皮膜の安定性の目安となる不働態保持電流密度との間には相関関係が認められた。電位の卑なものほど不働態保持電流密度は低く本電位が皮膜の安定性の目安になることが明らかとなった。皮膜の電子構造計算から求めたバンドギャップは実験値に近い値が得られたが、バンドの曲がりの大きさの原因となるフェルミ準位とフラットバンド電位の間には明瞭な関係は見いだせなかった。実験と理論計算との対応については今後もう少し詳細な検討が必要である。本研究は、遷移金属合金の耐食性に大きく関与する不働態皮膜の電子状態を、光照射を利用した電気化学的手法およびX線光電子分光などにより調べ、実際の耐食機能との比較から、合金の耐食機能の本質を明らかにすることを目的としている。本研究では、代表的な遷移金属であるチタン合金に注目している。本年度は、純チタンおよび、周期律表の4d(Zr,NbおよびMo)5d(Hf,TaおよびW)遷移金属元素をそれぞれ5at%づつ添加した合金を、トリアーク炉により溶製した。作製した合金試料について、0.5mol硫酸水溶液中でアノード分極測定ならびに、単色化したキセノンランプの光を照射し、光電流の測定を行った。現在までのところ、以下の様な結果が得られている。Ti合金のアノード分極測定により求めた不働態皮膜の安定性と関連する不働態保持電流密度は、添加した合金元素の種類によって大きく変化する。また、Ti合金の不働態皮膜に光を照射すると、正の光電流を生じる。すなわち、皮膜自体がn型の半導体特性を持っているが、合金元素の添加によってこの基本的特性には変化は生じない。照射する光の波長を変化させて求めた光電流スペクトルの形状は、純Tiで得られるものと比べてそれほど大きな変化はなく、皮膜のバンドギャップは4.4eV付近である。ただし、Moを添加した場合には、4.1eV付近にまで低下する。光電流を打ち消すのに必要なフラットバンド電位も添加元素によって大きく変化する。NbやTaを添加した場合は卑に、Moを添加した場合には貴になる。フラットバンド電位の変化と不働態保持電流密度との間には相関関係が認められ、電位の卑なものほど不働態保持電流密度は低く、安定な皮膜が形成されていることを示している。

現在、これら合金試料について、硫酸水溶液での浸漬腐食試験が継続中である。本研究は、遷移金属合金の耐食性に大きく関与する不働態皮膜の電子状態を、光照射を利用した電気化学的手法により調べ、実際の耐食機能との比較から、合金の耐食機能の本質と皮膜の電子構造との関連を明らかにすることを目的とした。具体的には代表的な遷移金属であるチタン合金に注目し、純チタンおよび周期律表の3d(V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu)、4d(NbおよびMo)5d(Ta)遷移金属元素をそれぞれ5at%添加した合金に生成する不働態皮膜の電子状態の変化を実験的に調べた。また、分子軌道計算により、皮膜の電子構造計算を行い、実験との比較検討を行った。Ti合金の不働態皮膜に光を照射すると、すべて正の光電流を生じる。すなわち、皮膜自体がn型の半導体特性を持っており、この基本的特性は添加元素によって変化しない。照射する光の波長を変化させて求めた光電流スペクトルの形状は、純Tiで得られるものと比べてそれほど大きな変化はなく、そこから得られる皮膜のバンドギャップは4.0eV付近であった。これに対して、表面皮膜のバンド構造の曲がりの大きさを表すフラットバンド電位は添加元素によって大きく変化した。Co,Cu,NbおよびTaを添加した場合は卑に、FeやMoを添加した場合には貴になる。フラットバンド電位の変化と皮膜の安定性の目安となる不働態保持電流密度との間には相関関係が認められた。電位の卑なものほど不働態保持電流密度は低く本電位が皮膜の安定性の目安になることが明らかとなった。皮膜の電子構造計算から求めたバンドギャップは実験値に近い値が得られたが、バンドの曲がりの大きさの原因となるフェルミ準位とフラットバンド電位の間には明瞭な関係は見いだせなかった。実験と理論計算との対応については今後もう少し詳細な検討が必要である。
海馬苔状線維の神経回路形成における神経細胞接着分子および神経活動の役割

海馬では、成体になっても例外的にニューロン(顆粒細胞)の新生が続いている。したがって,この新生した顆粒細胞が,軸索(苔状線維)を発達させ,標的(錐体細胞)の樹状突起とシナプスを形成し、成体の海馬に新しい神経回路を付加していると考えられる。私は,以前に行った神経細胞接着分子(NCAM)のノックアウトマウスの解析結果から、このような苔状線維と錐体細胞のシナプス形成時には、神経一筋で見られるような,神経支配の再構成が起こる、との仮説を立てた。本研究では,この仮説を証明する目的で、まず,正常マウス・ラットとMCAMノックアウトマウスの苔状線維の発達を,蛍光色素DiIと共焦点レーザー顕微鏡・電子顕微鏡を用いて観察した。その結果、正常な動物では,生後645日目に、錐体細胞層内に多数の苔状線維側枝が見られたが,1・2ヶ月令では,ごく少数の側枝しか見られなかった。また,側枝に存在する大小のボタンにはシナプスが見られた。これに対し,MCAMノックアウトマウスでは,2ヶ月令でも,錐体細胞層内に側枝が残存し,シナプスボタンが錐体細胞の細胞体と非シナプス性の細胞接着構造を形成していた。つぎに,生きている状態で,苔状線維側枝を観察する目的で,海馬切片培養法を用いて,苔状線維側枝を観察した。その結果,錐体細胞層側に伸びた苔状線維側枝が,伸長又は退縮する様子を観察できた。この場合,側枝上に存在するボタンが移動することも明らかになった。以上の観察結果から次のようなことが推測される。苔状線維の発達時期には,時的に側枝が錐体細胞層に侵入し,シナプスボタンを形成する。しかしそのシナプスボタンの結合は永久的なものではなく,おそらくある程度変化する。その後,苔状線維側枝は退縮するが,この時にはシナプスボタンも消失する。また,このような苔状練維の退縮過程には,NCAMが関与することが考えられる。海馬では成体でも顆粒細胞の新生が続いている.したがって,海馬では,一生の間ニューロンの新生によって,神経回路が付加され続けていると考えられる.この発達中の顆粒細胞の軸索(苔状線維)には、長鎖のポリシアル酸(PSA)が結合した神経細胞接着分子(PSA-NCAM)が特異的に発現している。このことは、PSA-NCAMが苔状線維の発達に重要であることを示唆している。発達中の苔状線維から酵素(endoN)によってPSAを除去すると、異所性シナプスが錐体細胞層内に多数形成される。本研究では、この異所性シナプスの形成機構を調べることを目的としている。生後ラット又はマウスの脳を4%パラフォルムアルデヒドで固定し、海馬スライスを作製する。このスライスの歯状回門付近に蛍光色素DiIを付着させることにより苔状線維を標識した。スライスからビブラトーム切片を作製後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、さらに蛍光標識した苔状線維をphotoconversion法により、DAB(ジアミノベンチジン)反応に置換し、電子顕微鏡で観察した.その結果,正常な動物及びendoN処理群の両者で,生後2週間頃に、多数の苔状線維側枝が錐体細胞層内に侵入することが明らかになった.この側枝には、大小さまざまなボタンが観察された。生後1カ月の動物では,その側枝の数が減少した。

この一時的な側枝を電子顕微鏡で観察した結果、この側枝が錐体細胞とシナプス及び非シナプス様の細胞結合を形成することを見いだした.このことは,endoNの投与によって形成された異所性のシナプスは、この一時的に侵入する側枝が退縮せずに錐体細胞層内にシナプスを形成した結果であることを示唆している.海馬歯状回では、成体になってもニューロン(顆粒細胞)の新生が続いている。このようなニューロンの新生に伴って、新生したニューロンの軸索(苔状線維)も常に発達し続け、海馬に新しい神経回路が付加され続けていると考えられる。今までの実験から、生後の苔状線維-CA3錐体細胞間のシナプス形成には、神経-筋・小脳登上線維-プルキンエ細胞で見られるような神経支配の再構成が起こる、との仮説を立てた。今年度は、この仮説を証明する目的で、正常発生における苔状線維側枝について検討した。生後6日から2カ月のマウス及びラットの苔状線維をDiIでラベルし、共焦点レーザー顕微鏡・電子顕微鏡で観察した。その結果、生後15日目では、錐体細胞層内に多数の側枝と様々な大きさのボタンが侵入していた。そこで、つぎに海馬切片培養法(静置界面培養法)を用いて、苔状線維側枝を観察する実験始めた。生後5日目のラットから350μmの海馬切片を切り出し、フィルター(MILLICELL-CM)上で16日間培養した。苔状線維を蛍光色素DiIによりラベルし、錐体細胞層内に侵入する側枝を共焦点レーザー顕微鏡によって観察しところ、in vivoと同様に、錐体細胞層内に侵入する側枝が観察できた。よって、海馬でも苔状線維の発達中に一時的な神経支配が起こることが考えられる。海馬における記憶・学習の基盤は、神経活動に依存的な海馬の可塑性にあると考えられている。本研究では、海馬神経回路のうち、顆粒細胞の軸索(苔状線維)と錐体細胞の樹状突起との間に形成されるシナプス結合に着目し、その形成過程で起こる可塑的な現象を解明することを目的としている。今までの研究で、苔状線維の発達期には、一時的に苔状線維の側枝が,錐体細胞層内に侵入することを示唆する結果を得た。本年度の研究では、この側枝が実際に錐体細胞層に侵入し、退縮する様子を共焦点顕微鏡と培養装置を組み合わせて、経時的に観察した。生後5-7日目のラットから海馬を取り出し350μmの切片を作成した。培養には,35mmプラスチックdishの底に穴をあけ,カバーガラスを張り付けたものを用いた。このカバーグラス上に海馬切片を載せ,完全無血清培地であるNeurobasal+B27を少量加えた。その後,海馬切片上の苔状線維をDiIによってラベルし,一晩培養した。翌日,温度と炭酸ガス濃度をコントロールできるチェンバーを共焦点レーザー顕微鏡のステージに設置し、その中に培養海馬切片を置いた。このような状態で少なくとも2-3時間の観察が可能であった。その結果,錐体細胞層側に伸びた苔状線維側枝が,伸長又は退縮する様子を観察できた。この場合,側枝上に存在するボタンが移動することも明らかになった。以上の観察結果は,苔状線維の発達時期に,一時的に側枝が錐体細胞層に侵入し,その後退縮するとの考えを支持する。また,その過程で,側枝上に存在するシナプスボタンに変化が起こることも示唆された。
スギヒラタケの毒性解明と特異な基質開裂特性を有する新規酵素の創出

スギヒラタケレクチンと相互作用のある蛋白質の探索を行い、候補タンパク質の1つが、rPPLと混合するとプロテアーゼ活性を有することを見出した。PPL単独でもプロテアーゼ活性を示すことがあり、その時のMSの解析結果ではm/z 13,000付近にピークが確認される。そこで、このタンパク質の精製を行った結果、精製および部分一次アミノ酸配列の取得に成功した。担子菌Phanerochaetesordida YK-624株を用い, rPPLの異種発現系の構築を行った。スギヒラタケのゲノム及びトランスクリプトームのデータを用いて、データベースの構築を行った。酵母two-hybrid法を用いたスギヒラタケレクチン(PPL)と相互作用のある蛋白質の探索を行い、得られた候補タンパク質の酵母を用いた異種発現を順次行なった。その結果、候補タンパク質の1つが、担子菌で異種発現させたrPPLと混合するとプロテアーゼ活性を有することを見出した。このことから本プロテアーゼ活性は、スギヒラタケ中に存在する微量のプロテアーゼのコンタミネーションの可能性ではないことが証明された。また、プロテアーゼ活性試験を行っていくと、PPL単独でもプロテアーゼ活性を示すことがあり、その時のMALDI-TOF-MSの解析結果ではm/z 13,000付近に夾雑タンパク質のピークが確認される。そのため、このタンパク質(PP-13000)がプロテアーゼ活性に関与している可能性が示唆された。そこでPP-13000の精製方法の確立と構造解析を行うこととした。精製にはSuper Octylを用いた逆相クロマトグラフィーを用いた。その結果PP-13000の単離に成功した。また単離したPP-13000を担子菌にて発現させたrPPLと混合し、insulinを基質としたプロテアーゼ活性試験を行った結果、基質をN末端、C末端の両方から切断する活性を示した。現在、精製したPP-13000の一次アミノ酸配列の決定・遺伝子クローニングを試みている。スギヒラタケレクチンの抗体作成のため、PPLとマンガンペルオキシダーゼ(MnP)を融合させ担子菌(Phanerochaete sordida)を用いた細胞外分泌異種発現系の構築を行うことで、スギヒラタケレクチンの大量発現系の構築を試みている。その他、スギヒラタケのゲノム及びトランスクリプトームのデータを用いて、ユーザーが利用しやすいBLAST検索・キーワード検索・Gene ontology tree等を実装したデータベースの構築も行った。酵母two-hybrid法を用いたスギヒラタケレクチン(PPL)と相互作用のある蛋白質の探索を行い、得られた候補タンパク質の酵母・担子菌を用いた異種発現を順次行なった。また、プロテアーゼ活性試験を行っていくと、PPL単独でもプロテアーゼ活性を示すことがあり、その時のMALDI-TOF-MSの解析結果ではm/z13,000付近に夾雑タンパク質のピークが確認される。精製にはSuperOctylを用いた逆相クロマトグラフィーを用いた。また単離したPP-13000を担子菌にて発発現させたrPPLと混合し、insulinを基質としたプロテアーゼ活性試験を行った結果、基質をN末端、C末端の両方から切断する活性を示した。更に、精製したPP-13000の部分一次アミノ酸配列の決定に成功し、現在遺伝子クローニングを試みている。酵母two-hybrid法によるスギヒラタケレクチン(PPL)と相互作用のある蛋白質の探索の結果、rPPLと候補蛋白質を混合することでのプロテアーゼ活性が確認された。この結果から、本プロテアーゼ活性はスギヒラタケ中に含まれる他のプロテアーゼの微量なコンタミネーションの可能性ではないことが証明され、非常に大きな進歩であったと考える。しかし、そのプロテアーゼ活性は基質をN末端側から切断する活性しか確認できていない。現在、本候補蛋白質は酵母で異種発現させており、タンパク質のコンフォメーション・糖鎖修飾が異なるためと考えており、今後PPLと同様に担子菌での発現を試み必要がある。またもう一つのアプローチである、PP-13000の精製方法の確立にも成功しており、その一次アミノ酸配列の解明のために今後有効に活用できる。

また、別途遺伝子情報に関してはデータベースの整備も行ったため、上記の研究で得られたアミノ酸配列から、遺伝子情報・アノテーション・発現プロファイルを検索することが可能となった。上記結果から、プロテアーゼ活性の再現に関しては進展しており、データベースの構築等の作業も進展していることから、概ね順調に進展していると考える。木質科学酵母two-hybrid法によるスギヒラタケレクチン(PPL)と相互作用のある蛋白質の探索で得られた候補蛋白質は、担子菌を用いた異種発現系の構築を試み、プロテアーゼ活性の再現を試みる。またPP-13000は、一次アミノ酸配列及び遺伝子クローニングを試みる。また,その蛋白質分解活性の基質特異性について、様々な蛋白質、ペプチドの分解をMALDI-TOF-MSあるいはESI-TOF-MSを用いて解析する。また、発現した致死性毒物質とレクチンのアミノ酸変異を行い、構造と活性の相関を検討する。PPLの抗体に関してはPPLの大量発現系の構築を行う。また同時にNative PPLの大量精製も行うことで、抗体の作成を試みる。PPL抗体を作成後は、複合体の投与検体において、BBB表面にレクチンが存在するか否かを免疫染色によって確認する。更なるメカニズム解明のため、致死性毒物質とレクチン複合体がBBB以外のどの器官に作用しているか、また実際のスギヒラタケの生体内ではどの組織細胞に局在しているかを調べる。
硝酸希土類結晶の疑似安定状態における非線形性

硝酸希土類結晶は10°Cから-45°Cの温度領域に本質的な非線形性を有する疑似安定な結晶相を持ち,10^<-3>sec程度の長い緩和時間を有し,低周波数領域でのAC伝導率の周波数特性はガラス或いはアモルファス半導体に類似する特性を示す。本研究の目的は,この特異な非線形物性現象を実験的に解明する事である。配分された補助金(消耗品)によりランタンLa(57)からルテチュムLu(71)まで希土類の硝酸化合物の単結晶育成を行い,測定に耐え得る単結晶を得た。備品費により得た冷却装置,制御用コンピューター等の備品に基づき,室温から-80°Cまでの各温度においてACインピダンスの時系列データの計測システムを製作した。作製した測定システムは1ヶ月以上の長期計測に耐え得るものであり,従来の測定システムよりその測定能力は向上している。実験の結果より,物性が未定であった硝酸ツリウム結晶において,疑似安定相が存在する事が分かり,硝酸テルビウムにおいては顕著な経時変化が発見された。硝酸サマリウムは,疑似安定領域における,繰り込み次元に対してフラクタル次元が飽和し,この領域がカオス的或いは決定論的な特性を示す事が判明した。合わせて,1/fノイズの存在が見いだされた。現在,その結果をPhysicaに投稿中である。また硝酸ネオジム結晶における時系列データの温度変化測定より,そのスペクトルが不安定と安定領域の転移において変化することが解った。硝酸サマリウムと同様に1/fノイズの存在を示唆する結果を得た。以下の学会に研究結果は公表されている。平成5年9月岡山大の日本物理学会て1件,北大にて開かれた第29回応用物理学会北海道支部会にて3件また福岡工大にて平成6年3月に開催された日本物理学会にて1件で,合計5件の講演発表を行った。現在論文投稿中としては,Physicaへの投稿を含めて,3編程度ある。
血小板依存的な骨軟部肉腫の増殖・転移機構の解明と新規治療法の開発

本研究の目的は、骨肉腫ポドプラニン(Pod)と血小板CLEC-2の相互作用が増殖・転移における役割を解明し、それを治療につなげることである。1骨肉腫と血小板との凝集を確認した。この凝集は、ポドプラニン抗体、ないしCLEC-2ブロッキングペプチドで抑制された。2血小板と骨肉腫共培養により得られた上清は骨肉腫の遊走を誘導したが、EMTの誘導は部分的であった。3血小板CLEC-2抗体を投与すると肺転移が有意に抑制された。骨軟部肉腫領域での化学療法は、この20年間で特段の変化をみない。しかし肺転移が予後因子であるため、骨軟部肉腫の化学療法として、増殖と共に肺転移を抑制する新たな治療法の登場が望まれる。これまでに研究者らは、一部の扁平上皮癌等に発現する膜蛋白ポドプラニンは、血小板活性化受容体CLEC-2に結合して血小板凝集を惹起して、血行性転移を促進することを発見した。更に、ヒト骨肉腫細胞の高肺転移株ではポドプラニンが高発現し、また高肺転移株のみが血小板凝集を惹起することを見出した。H27年度は1)骨肉腫Podと血小板CLEC-2との凝集の有無の確認を行った。まず、1骨肉腫細胞株とそれ由来の高肺転移株を用いて、それらのPod発現をFACSで比較したがやはり高肺転移株の方がPod発現が高く、洗浄血小板との凝集も確認できた。また、高肺転移株のPod発現をsiRNAにて低下させた株では血小板凝集が見られなくなった。よって、骨肉腫細胞のPodは血小板凝集に重要な役割を担っている。2)血小板活性化による骨肉腫の増殖・遊走・EMTへの影響肉腫細胞Podによる血小板活性化の有無についての検討を行った。高肺転移株とヒト洗浄血小板を15分共培養ののち、遠心して得られた上清中に血小板活性の際に血小板顆粒中に含有するPlatelet Factor-4(PF-4)が特異的に放出されるので、そのPF-4の測定をELISAで測定した。その結果、PF-4の産生が確認された。また、SiRNAでPod発現を抑制した細胞株では産生が低下しており、血小板活性化にPodが必要であることが分かった。骨肉腫細胞Podの発現と血小板との凝集、活性化において、そのPodが機能的であることが証明された。今後はマウス血小板を使用し、CLEC-2抑制を行った血小板と、正常血小板と骨肉腫細胞間の凝集、活性化の有無を調べて、PodーCLEC-2の役割を更に明らかにしたい。これまでに研究代表者らは、一部の扁平上皮癌等に発現する膜蛋白ポドプラニンは、血小板活性化受容体CLECー2に結合して血小板凝集を惹起して、血行性転移を促進することを発見した(J Biol Chem. 285: 24494ー507, 2010)。本研究では、これらの成果を更に発展させ、肉腫ポドプラニンと血小板CLECー2を介した血小板活性化が肉腫の増殖・転移に果たす役割を解明し、それを治療へ発展させることが目的である。平成28年度の計画と研究実績血小板活性化による肉腫細胞の変化1)浸潤能への影響;Boyden Chamberアッセイを用いる。上層には無血清条件で1.骨肉腫細胞のみ2.骨肉腫細胞と血小板の共培養3.血小板のみのとし、下層には10%FCS入りの基本培地を置く。その結果、骨肉腫細胞と血小板との共培養で最も高い浸潤能が認められた。2)上皮間葉転換(EMT)への影響;プレートに骨肉腫細胞を播き、1日待機する。培地をFCSなしに変え、洗浄血小板を添加する。その結果、血小板と共培養した骨肉腫細胞では、Nカドヘリン、Snailなどの間葉系マーカーの発現が見られた。血小板と骨肉腫が凝集し、その結果、一つは浸潤能の獲得、もう一つはEMTの促進が認められた。本研究では、肉腫Podと血小板CLEC-2の相互作用がどのように肉腫の増殖・転移を誘導するかを解明し、それを治療につなげることを目的とする。肉腫として代表的な骨肉腫細胞を用いて実験を計画したが、この研究結果は骨軟部肉腫全体への応用が可能と考える。マウスモデルによるCLEC-2抗体の治療効果と臨床検体を検討することで、新規治療ターゲットとしての妥当性を明らかにする。1ルシフェラーゼ遺伝子を導入した143Bを脛骨に移植するモデルを使用する。治療としては、CLEC-2抗体群、IgG抗体群、未投与群の3群とする。

移植後6週間での肺転移を予備実験で確認しているので、2週、4週、6週の時間経過でルシフェラーゼアッセイにより治療効果判定を行う。また、治療中は血小板機能評価のため、2,4,6週で採血を行い、凝固能(PT,APTT)血小板数を測定する。副作用の有無に関しては毎週ごとに体重測定を行う。脛骨移植モデルでは、6週と経過がながく安定しなかったため、尾静脈注射を行い、肺転移の有無を調べた。また、原発については、皮下移植モデルを用いて効果判定を行った。尾静脈注射モデルでは、CLEC-2抗体投与群で、肺転移が抑制された。皮下移植モデルでは、3群で差は認められなかった。2当院で得られた骨肉腫患者サンプルを用いて、Podの発現を免疫組織学的に検討する。また、その発現強度と患者予後について関連性を検討する。現在、同一患者で、原発と肺転移の両方をマッチした症例で、Podの発現変化を見ている。肺転移症例でPod発現が高くなることが分かった。本研究の目的は、骨肉腫ポドプラニン(Pod)と血小板CLEC-2の相互作用が増殖・転移における役割を解明し、それを治療につなげることである。1骨肉腫と血小板との凝集を確認した。この凝集は、ポドプラニン抗体、ないしCLEC-2ブロッキングペプチドで抑制された。2血小板と骨肉腫共培養により得られた上清は骨肉腫の遊走を誘導したが、EMTの誘導は部分的であった。3血小板CLEC-2抗体を投与すると肺転移が有意に抑制された。おおむね計画どおり遂行されている。今後はマウス実験において、抗体の投与間隔などPreliminaryの実験が必要になると思われる。実験のまとめとして、マウスモデルへの抗体投与があるので、最終年度にそれを行う予定である。整形外科
ケロイドにおけるオートファジー現象の関与解析

オートファジーとは、自己の細胞成分をリソソームで分解する現象を指す。最近、ラット創傷治癒モデルにおいて、肉芽組織中の線維芽細胞においてLC3陽性顆粒数が増加すると報告された。このことは、これら線維芽細胞においてオートファジー-リソソーム系が影響を受けていることを示す。しかし創傷治癒過程では、細胞増殖、細胞外基質の産生とリモデリング、筋線維芽細胞への分化など、複数の現象が異なる部位で一過性に起きているため、個々の線維芽細胞においてオートファジーが亢進しているかどうかを結論できていない。本研究では、哺乳類線維芽細胞におけるLC3陽性顆粒数の増加の原因を探り、かつ細胞増殖因子、分化因子のオートファジーへの関与を精査する目的で、ラット線維芽細胞由来のNRK細胞を用い、bFGFおよびTGF-βの効果について、免疫蛍光法およびLC3の検出によるフラックスアッセイを用いて解析した。結果、bFGF投与によりLC3陽性顆粒数は増加せず、オートファジーによる分解も変化しなかった。また、TGF-β投与によりLC3陽性顆粒数は変化せず、オートファジーによる分解も変化しなかった。更に、bFGF投与により隔離膜マーカーであるAtg16Lが増加するが、TGF-β投与72時間によりAtg16Lは減少した。現時点で、bFGFやTGF-βがオートファジー分解系のどの段階に影響を与えているかを示すことができなかった。これは、LC3ないしAtg16L以外の抗体を使用して、オートファジー分解系の初期あるいは後期段階での動向の調査が必要であると考える。ケロイド組織内におけるオートファジー動態は、いまだ明らかにはされておらず、そのため、研究の方針も見出されていない。一方、ケロイドの病理組織学的形態は、線維芽細胞の異常増殖であることが示されている。従って、ケロイドの動態の研究は線維芽細胞の研究に言い換えることができる。また、トランスフォーミング増殖因子のひとつであるTGF-βは、細胞を線維芽細胞に変換させる作用が知られている。ケロイドの形成は、この、線維芽細胞への変換能が関与している可能性があると考え、ネズミ腎細胞(NRK)にたいしてTGF-βを投与してのオートファジー活性の研究ならびに、強力な細胞増殖因子である塩基性線維芽細胞成長因子、bFGFを投与してのオートファジー活性の研究を行った。その結果、従来よりTGF-βはオートファジー活性を更新させる作用があると報告されているが、時間経過とともに活性を抑制させている可能性、そして、オートファジー関連タンパク質であるLC3ならびにAtg16Lを凝集させる効果が見いだされた。この結果より、オートファジー経路における、最重要ともいえる構造物である、隔離膜の形成に、TGF-βは関与している可能性を考慮している。今後は、TGF-β投与後に、オートファジー経路の後半に形成される構造物、オートリソソームの構造に変化があるかの調査を行い、TGF-βがオートファジー経路に与える影響の精査を進めていく方針である。なお、本研究の経過の一部は、2017年10月19日、第26回日本形成外科学会基礎学術集会にて概要を発表した。ケロイドにおけるオートファジー関連抗体による免疫染色では、有意な所見が見いだされていないため、ケロイドと最も関連が深い構造物である、線維芽細胞におけるオートファジー活性の調査から進めている段階である。TGF-βにおける、オートファジー活性を精査することで、線維芽細胞、ひいてはケロイドの形成に関与があるか調査する方針である。初年度使用額の目標に沿って使用しましたが、少額の余りが出ました。
骨補填材の違いによる再生組織における炎症抵抗性の評価

本研究は、再生した組織に歯周炎を惹起させ、その炎症の波及について評価することを目的としている。平成28年度では、本研究モデルを確立するために必要な結紮糸誘導歯周炎を利用した予備実験を行なった。この予備実験に関連する内容を第81回日本口腔病学会学術大会で報告した。この内容は平成29年度に査読のある国際誌であるOdontologyに投稿・受理された。本実験ではビーグル6頭の下顎両側第1前臼歯と第3前臼歯を抜歯することで欠損スペースを作り、12週後に両側下顎の第2前臼歯遠心と第4前臼歯近心に3壁性の骨欠損を作製した。骨欠損には3種類の骨補填材を無作為に分けて補填した。そして12週後に絹糸を挿入した。歯周炎を惹起させてる間、著しい歯肉の腫脹・出血などの炎症所見を認めた。また経時的にデンタルX線写真を撮影することで軽度な骨吸収も確認した。一定期間炎症状態に置いた後に、抜糸を行った。そして急性症状が和らいだ後に標本を採取し、組織切片の作製を行った。平成30年度はmicroCT、および作製した組織切片から各種パラメータを計測し、統計処理を行なった。β-TCP群では、異種骨群や自家骨群よりも大きな骨吸収が認められたが、統計学的には歯周炎による組織破壊の材料による差は認められなかった。また、組織学的には、術後12週で自家骨とほとんどの人工骨は完全に吸収・置換されていたが、異種骨は全ての組織で残存していた。歯根周囲に残存した異種骨顆粒の間および周囲には結合組織が広範囲に入り込んでいる所見が得られた。この成果内容について秋季日本歯周病学会でポスター発表を行なった。現在国際誌への論文投稿の準備を行っている。我々の研究室では、筒状のβ-TCPを多数焼結させたブロック状の多孔質骨補填材が歯周組織再生、特に骨再生に有効であることを見出した。一般的に骨補填材などの人工材料は感染に弱いとされているが、感染の影響を報告した研究はほとんどない。再生した歯周組織をいかに持続させるかが、自身の歯を残す上で重要となってくる。無菌化できない口腔内環境で歯周炎が再発するリスクはゼロとは言えず、再生した歯周組織の変化やその予後は不明である。そこで再生した組織に歯周炎を惹起させ、その炎症の波及について評価することを目的とし研究を進めている。そして本実験ではビーグル6頭の抜歯を終え、4頭までの欠損作製と骨補填材填入が進んでおり、絹糸を挿入するまでの治癒を待っている。あらかじめ下顎両側第1前臼歯と第3前臼歯を抜歯することで欠損スペースを作り、抜歯から12週後に両側下顎の第2前臼歯遠心と第4前臼歯近心に3壁性の骨欠損を作製した。材料は3種類の骨補填材を無作為に振り分けて補填した。術後2週での抜糸時に創の離開などの異常所見は認められず、術後の経過は良好である。次年度は引き続き実験を進め標本採取を行い、組織学的な評価および得られたデータを分析していく予定である。平成28年度は、様々な骨補填材を利用して再生させた組織に歯周炎を惹起させることを目的とした。しかし大型動物の1度あたりの飼育数に上限があること、また他研究との兼ね合いから、本実験開始が冬季となった。そのため、平成28年度内にデータ採取まで進められなかった。しかしながら、予備実験により結紮糸による歯周炎惹起の術式・及び経時的な変化が把握できた。これに関連した結果を国内学会で発表した。本研究は、再生した組織に歯周炎を惹起させ、その炎症の波及について評価することを目的として実験を進めている。本年度は、昨年度に行った4頭の治癒待機および2頭の欠損作製・骨補填材填入を行う時点から開始した。欠損作製・骨補填材填入手術から12週後に絹糸を対象歯に結紮し歯肉溝に挿入することで、歯周炎を惹起させた。この期間、歯肉の腫脹、出血などの炎症所見を十分に認めた。まだ全頭分のデータが集まっていないため、解析は十分に進んではいないが、自家骨、異種骨、人工骨の違いで興味深い結果を得ることができた。組織学的には、術後12週で自家骨とほとんどの人工骨は完全に吸収・置換されていたが、異種骨は全ての組織で残存していた。また歯根周囲に残存した異種骨顆粒の間および周囲には結合組織が広範囲に入り込んでいる所見が得られた。また、予備実験で行った結紮糸誘導歯周炎を利用した実験の成果を、昨年度の学会発表に続き、国際誌であるOdontologyにに投稿し、受理された(epub ahead of print)。

今後はmicroCT、および組織切片から得られたデータをより詳細に分析してまとめ、学会や論文投稿を通じて国内外に発表していく予定である。平成28年度は、学内施設での飼育数に上限があること、また他研究との兼ね合いから、本実験開始が冬季となった。そのため、実験開始が遅れ、平成29年度内は組織切片作製までしか進められず、データを分析してまとめることができなかった。しかしながら、予備実験により得られた結果を平成29年度に国際誌で発表した。本研究は、再生した組織に歯周炎を惹起させ、その炎症の波及について評価することを目的としている。平成28年度では、本研究モデルを確立するために必要な結紮糸誘導歯周炎を利用した予備実験を行なった。この予備実験に関連する内容を第81回日本口腔病学会学術大会で報告した。この内容は平成29年度に査読のある国際誌であるOdontologyに投稿・受理された。本実験ではビーグル6頭の下顎両側第1前臼歯と第3前臼歯を抜歯することで欠損スペースを作り、12週後に両側下顎の第2前臼歯遠心と第4前臼歯近心に3壁性の骨欠損を作製した。骨欠損には3種類の骨補填材を無作為に分けて補填した。そして12週後に絹糸を挿入した。歯周炎を惹起させてる間、著しい歯肉の腫脹・出血などの炎症所見を認めた。また経時的にデンタルX線写真を撮影することで軽度な骨吸収も確認した。一定期間炎症状態に置いた後に、抜糸を行った。そして急性症状が和らいだ後に標本を採取し、組織切片の作製を行った。平成30年度はmicroCT、および作製した組織切片から各種パラメータを計測し、統計処理を行なった。β-TCP群では、異種骨群や自家骨群よりも大きな骨吸収が認められたが、統計学的には歯周炎による組織破壊の材料による差は認められなかった。また、組織学的には、術後12週で自家骨とほとんどの人工骨は完全に吸収・置換されていたが、異種骨は全ての組織で残存していた。歯根周囲に残存した異種骨顆粒の間および周囲には結合組織が広範囲に入り込んでいる所見が得られた。この成果内容について秋季日本歯周病学会でポスター発表を行なった。現在国際誌への論文投稿の準備を行っている。現在は本実験の欠損作製・骨補填材填入手術まで進んでいる。次年度は追加で必要な実験材料を購入し、引き続き動物実験を進めていきデータを採取・分析していく予定である。また、平成28年度に得られた予備実験の結果に関しては論文投稿中である。大型動物の飼育数の制限により本実験開始が遅れた影響で、脱灰組織切片作製も遅れ、当初予定の年度内に解析を終えることができなかった。平成30年度ではデータを解析し、学会発表および論文投稿を進める予定である。大型動物の飼育数の制限により本実験開始が遅れた影響で、脱灰組織切片作製も遅れ、平成29年度内に解析を終えることが困難となった。そこで平成30年度にデータの解析、英文校正などの論文投稿関係の費用、学会発表にかかる費用が必要となった。
緑茶カテキンによる胃瘻チューブ内腔の細菌汚染予防効果

食酢洗浄法と比較して優位性/有効性はあるが統計学的には非劣性であった。微温湯とのクロスオーバー試験である本研究ではpseudomonous aeruginosaとacienotobactor baumauniiとで優位の差がみられ、院内感染においては予防効果があると考えられ、2本の論文発表予定である。胃瘻チューブ洗浄液にヘルシアという特定保健用食品である飲料水を使用する方法は研究期間中、健康障害や有害事象もみられなかったので、食酢を洗浄液とする従来の方法と比較して、間違えて酢酸を使用するような痛ましい医療事故を引き起こすことのない有用な洗浄液と考えられた。発表:佐々木晶世,永田茂樹,叶谷由佳:胃瘻増設患者における胃瘻留置チューブ内腔の細菌汚染状況,第26回日本健康学会総会(東京, 2016. 11 )先行研究として研究デザインを無作為割り付け比較試験とした臨床研究を実施した。栄養剤注入後に微温湯を注入する群を対照群とし、介入群では微温湯のあとチューブ内を満たす15mlの緑茶を注入しロックする。介入群と対照群が1:1になるよう封筒法を用いて割り付けを行った。緑茶はカテキン含有量540mg/350ml(GTP濃度0.15%)である花王ヘルシア緑茶を使用した。胃瘻造設7病日に昼食時の栄養剤注入前に検体採取を行った。胃瘻刺入部(ろう孔)の観察(発赤、腫脹、熱感の有無、浸出液や粘液の状態、栄養剤の漏れの有無)、消化器症状の観察(下痢、便秘、嘔吐)についても病棟の看護師により観察を行った。対象者は9名でうち、女性4名、男性5名であり、緑茶群に4名(うち女性1名)が、対照群に5名(うち女性3名)が割り付けられた。胃瘻刺入部の発赤、腫脹、熱感が7病日までにみられた患者はいなかった。7日目に浸出液と栄養剤漏れがみられた患者が1名であった。下痢や嘔吐が複数回継続するような消化器症状をもつ患者はいなかった。1名嘔吐後に発熱し誤嚥性肺炎であった。その過程で洗浄試験施行前の胃瘻留置チューブ内の細菌汚染が高度であったことが判明した。Klebsiella pneumoniae(肺炎桿菌)が検緑茶群と対照群各群2名、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)は緑茶群2名、対照群1名、腸内細菌のEnterobacter属は緑茶群3名、対照群1名から、多剤耐性菌で第5類感染症であるAcinetobacter baumanniiが対照群で1名から検出された。この結果はIF=1.215のAging Clinical and Experimental Researchに投稿中である。また、この結果をもとに本臨床研究のデザインの見直しをし、本年5月よりの実施予定で準備を整えている。先行研究として研究デザインを無作為割り付け比較試験とした臨床研究を実施したところKlebsiella pneumoniae(肺炎桿菌)が緑茶群と対照群各群2名、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)が緑茶群2名、対照群1名、腸内細菌のEnterobacter属は緑茶群3名、対照群1名より検出され、多剤耐性菌で第5類感染症であるAcinetobacter baumanniiが対照群で1名検出されたため、1.保健所などに届け、感染対策を行ったこと。2.洗浄試験施行前の胃瘻留置チューブ内の細菌汚染が高度であったことが判明したため、本臨床研究のデザインの見直しをしたこと。3.この結果をIF=1.215のAging Clinical and Experimental Researchに投稿することにしたこと。以上の3点で当初の予定より多少の遅れがが生じている。2.研究対象以外の入院患者からも同様の多剤耐性菌で第5類感染症であるAcinetobacter baumanniiが検出されるに至り、院内感染が確認された。3.厚生労働省関東信越厚生局よりの指導があり、感染対策を講じるも、多剤耐性菌で第5類感染症であるAcinetobacter baumanniiが再度検出されたため、解除されるまで6か月を要した。4.感染対策の徹底や研究方法の見直しをし、同意を得て、患者登録を開始するまで3か月かかった。以上より研究を中断せざるを得なくなった。1. 5類感染症である多剤耐性Acinetobactor baumanniiの院内感染が確認され、報告義務が解除されるまで研究を中止せざるを得なかった。2.再発防止のための院内感染対策の見直し、徹底をしたため、院内感染監視解除に時間がかかり、患者の登録と同意が再度必要になった。3.その後、登録、同意が順調に行われ、6か月で21名に対して培養結果結果が得られている。4.実施予定人数に達していないがすでに7名の同意が取れており、追加症例が見込まれるため、期間延長の申請をした。