hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3軸楕円粒子法シミュレーションの開発と重力流中の多体衝突ダイナミクスの解明

この研究の目的は重力流の内部に働く堆積物粒子の動きを計算機シミュレーションと実験によって明らかにするものである.自然界にみられる重力流は,時間的・空間的に流速が変動する複雑な流れである.このような流れをシミュレートし,流れ内部における堆積物の輸送および堆積作用を明らかにするため,昨年度に新たに開発した実験水路を,今年度さらに改良した.この水路は円筒形の循環型であり,上部のパドルの回転によって流れを発生させるものである.回転パドルの制御により様々な流れを模擬することが可能である.改良点はパドル数を増やすことでパドル間隔を減少させたことである.これにより流れの均質性が大幅に高まると共に,パドルによる渦の発生も低減させることに成功した.改良した実験水路を用いて,重力流に関係した流れによって輸送された堆積物粒子が形成する様々なベッドフォームや堆積構造を,実験的に作り出し,その構造と水理条件の関係を明らかにした.特に今年度は重力流のような一方向流と波浪による振動流が合成した複合流における堆積物粒子の運搬作用や形成される平衡・非平衡ベッドフォームを精力的に調べこれまで知られていなかった条件領域でハンモック状のベッドフォームが形成されることを明らかにした.このベッドフォームに関連した構造はハンモック状斜交層理と呼ばれ,地質学の分野で重要視されている構造である.様々な条件で複合流実験を行い,堆積物粒子の動きやベッドフォームを観察し,それをもとにして粒子の動きやベッドフォームをシミュレートすることで,ハンモック状斜交層理の形成条件を推定した.これは地層から過去の水理条件や古環境を推定する際の重要な指標となると期待される.ハンモック状斜交層理の形成実験に関しては今年度学術雑誌に報告した.本研究の目的は,堆積物重力流における多体衝突現象の理解,および堆積物からそれを形成した流れの性質を推定する方法を確立することである.第一の目的に向けて,本年度はまず,粒子法によるシミュレーション手法の改良を行った.具体的には,これまで用いてきた球粒子を連結し,異方性のある粒子の運動も調べることができるようにした.これにより,堆積学的に重要な粒子の方向性と流れの関係を調べることが可能になった.この手法を用いて行った重力流のシミュレーションと,高速度ビデオ撮影による実験的な重力流の粒子運動の解析により,流れ内部の粒子の配列が,局所的な粒子の連なり(連鎖構造)に強く規制されていることを明らかにした.また,第二の目的に向けて,これまでの流れのメカニズムの解析に加え,新たに堆積物の停止・保存過程に注目した数値モデルを提案した.これは,これまで提案されてきた堆積物重力流の下部における粒子の分別作用と堆積作用をモデル化したものである.モデル計算の解析から,自然界に見られる粒度変化のパターンが,従来とは異なる,よりシンプルなメカニズムで説明可能であることが示された.また,この解析によって,これまで提案されてきた堆積作用とその結果としてできる堆積物の粒度変化パターンとの対応関係が崩れる場合があることもわかった.その多くは比較的時間スケールの長い持続的な現象と関係していることがこれまでに明らかになっている.今後はこのような現象を実験的に調べ,自然界に見られるパターンなどと比較しながら現象の理解を進める予定である.自然界に見られる重力流は,時間的・空間的に流速が変動する複雑な流れである.このような流れをシミュレートし,流れ内部における堆積物の輸送および堆積作用を明らかにするため,新たに実験水路を開発した.この水路は円筒形の循環型であり,上部のパドルの回転によって流れを発生させるものである.回転パドルの制御により様々な流れを模擬することが可能である.この装置を用いて,重力流に関係した流れによって輸送された堆積物粒子が形成する様々なベッドフォームや堆積構造を,実験的に作り出すことに成功した.特にハンモック状斜交層理を実験的に作り出し,その堆積過程を明らかにしたことは重要な成果である.この構造は,過去の地層からは多数発見されるものの,これまでは実験で作り出すことができず,その堆積過程については未解明の部分が多かった.本研究の実験結果から,この構造が堆積速度に依存して大きく変化することが明らかになった.これは,ベッドフォームの解析やシミュレーションを通じて過去の地質構造から堆積速度を見積もる新しい手段となりうる重要な発見である.堆積速度の推定により,過去の重力流やそれと関連する自然界の流れと,それに伴う堆積物の輸送・堆積過程をより詳細に明らかにすることが可能となる.実験と平行してフィールド調査も行い,大分県杵築市の火砕流堆積物や,和歌山県の中新統田辺層群白浜累層,福岡県漸新統芦屋層群脇田累層,千葉県下部白亜系銚子層群犬吠埼累層などで,重力流やそれに関係した流れで形成された堆積物の構造を観察し,記載および試料採取を行った.また,ネパールのカトマンズ盆地において湖成段丘堆積物のなかから過去に湖の水位が急激に低下したことを示す重力流堆積物を見出し,学術雑誌に報告した.この研究の目的は重力流の内部に働く堆積物粒子の動きを計算機シミュレーションと実験によって明らかにするものである.自然界にみられる重力流は,時間的・空間的に流速が変動する複雑な流れである.このような流れをシミュレートし,流れ内部における堆積物の輸送および堆積作用を明らかにするため,昨年度に新たに開発した実験水路を,今年度さらに改良した.

この水路は円筒形の循環型であり,上部のパドルの回転によって流れを発生させるものである.回転パドルの制御により様々な流れを模擬することが可能である.改良点はパドル数を増やすことでパドル間隔を減少させたことである.これにより流れの均質性が大幅に高まると共に,パドルによる渦の発生も低減させることに成功した.改良した実験水路を用いて,重力流に関係した流れによって輸送された堆積物粒子が形成する様々なベッドフォームや堆積構造を,実験的に作り出し,その構造と水理条件の関係を明らかにした.特に今年度は重力流のような一方向流と波浪による振動流が合成した複合流における堆積物粒子の運搬作用や形成される平衡・非平衡ベッドフォームを精力的に調べこれまで知られていなかった条件領域でハンモック状のベッドフォームが形成されることを明らかにした.このベッドフォームに関連した構造はハンモック状斜交層理と呼ばれ,地質学の分野で重要視されている構造である.様々な条件で複合流実験を行い,堆積物粒子の動きやベッドフォームを観察し,それをもとにして粒子の動きやベッドフォームをシミュレートすることで,ハンモック状斜交層理の形成条件を推定した.これは地層から過去の水理条件や古環境を推定する際の重要な指標となると期待される.ハンモック状斜交層理の形成実験に関しては今年度学術雑誌に報告した.
循環血中腫瘍細胞を用いたがん抗原の網羅的解析法の開発

腫瘍細胞のMHC class I分子上に提示されるがん抗原ペプチドを網羅的に解析する方法として、MHC class I分子上のペプチドを酸解離法により溶出し、溶液中のペプチドを質量分析計(2DICAL)により解析する方法を考案した。HLA-A24との結合が予測されるGlypican3由来ペプチドを合成し、HLA-A24発現細胞に会合させて提示させた後、酸解離-2DICALによるペプチド同定を行ったところ、HLA-A24と最も結合性が高いペプチドのみが検出された。将来的には本方法を循環血中腫瘍細胞に応用し、がん細胞上に実際に提示されているがん抗原ペプチドを探索することが可能になると考えられた。同一のがん種においても患者ごとにMHC上に提示されるがん抗原は異なっているおり、個別化がん免疫療法を実現するためには、患者ごとにがん抗原を同定することが理想である。しかし腫瘍細胞において、提示されているがん抗原を網羅的に効率よく解析する方法は確立されていない。そこで本研究では、循環血中腫瘍細胞(CTC)の利点を生かしてMHC classI分子上のペプチドを酸解離法により溶出し、質量分析法によりペプチドを網羅的に解析することを目的としている。平成25年度は研究計画に基づき、がん細胞株を用いて細胞株のMHC classI上に提示されるペプチドについて解析を行った。まず、日本人に最も多い遺伝子多型であるHLA-A24を保有し、さらに腫瘍抗原としてMAGE-1由来ペプチドが細胞傷害性T細胞の標的となることが報告されているTE-11細胞(ヒト由来中分化型食道扁平上皮癌細胞株)に対して酸解離法を用い、ペプチド溶出を行った。9個のアミノ酸配列を同定するために、2DICAL(2 dimensional image converted analysis of LCMS)の手法によりアミノ酸配列決定を行った。その結果、TE-11細胞株より13596個の9アミノ酸からなるペプチド断片が得られた。これらのペプチドのうちHLA-A24上に提示されやすいと思われるものをBIMASにて予測したところ、BIMAS score高値であり、HLA-A24上に提示されているものと推定されるペプチド、およびその由来タンパク質を24個同定することができた。この操作に対して必要となった細胞数は3×108であった。今後CTCに対して応用するにはより少ない細胞数でも同様の操作ができることが必要であり、引き続き条件検討を進める。がん患者ごとにMHC class I分子上のがん抗原は異なっており、提示されているがん抗原を網羅的に効率よく解析する方法は確立されていない。本研究ではMHC class I分子上のペプチドを酸解離により溶出し、質量分析計により網羅的に解析することを目的とした。肝細胞がんペプチドワクチン療法の臨床試験が進行中であるGlypican-3タンパク由来のペプチドのうち、HLA-A24と結合すると予想されるものをアルゴリズムにより予測し、上位5つのペプチドを合成した(GlypA /GlypB /GlypC /GlypD /GlypE)。この新たに予測したペプチドのHLA-A24結合能を測定したところ、臨床応用されているペプチド(Clinical;親和性定数LogKa=5.346)に対し、GlypA/ GlypCは同等、またGlypBは臨床ペプチド以上のHLA-A24分子への結合を認めた(LogKa=6.307)。次に、HLA-A24上のペプチドを除去した細胞にこれらのペプチドを会合させ、会合したペプチドを酸解離により解析した。酸解離液を限外濾過し、通過した溶液中に含まれるペプチドを2DICALにて同定したところ、結合が最も強いGlypBのみ、ペプチドとして検出できた。限外濾過にて余分なタンパク質を除去することで、細胞の酸解離液を用いてMHC class I分子に結合するペプチドを2DICALにより網羅的に解析できた。今後循環血中腫瘍細胞をその表現型を変えずに増殖させる技術革新があれば、本方法を循環血中腫瘍細胞に応用し、経時的にがん抗原を探索することが可能と考えられた。腫瘍免疫研究計画に基づき、腫瘍細胞株から酸解離法を用いてペプチド溶出が可能であること、また溶出したペプチドから9個のアミノ酸からなるペプチドのアミノ酸配列決定が2DICALの手法により解析可能であることを明らかとした。この実験より、腫瘍細胞として3x108程度の細胞数があれば本手法による解析が可能であることが分かった。今後CTCに対して応用することを考えるにあたり、より少ない細胞数でのペプチド溶出が必要となることから、どこまで細胞数を減らしてもペプチドを検出しうるかについて、さらなる検討が必要である。一方、検出されるペプチドを検討すると、想定以上に細胞内タンパク質のペプチド断片が多く検出されることが分かった。

実験の過程において細胞破壊的な操作は行っていないが、今回用いた108という大量の細胞において操作を行うと、細胞剥離洗浄や酸解離の段階において、非特異的な細胞破壊が起こり、細胞内タンパク質が溶媒中に放出されていると考えられる。現在問題となっているこのタンパク質は高濃度ではないものの、我々が本来検出したいMHC classI上のペプチドを検討する上で阻害要因となる可能性がある。そのため、当初の予定にはなかったが、これらのタンパク質を2DICALによる解析前に除去するという工程を追加する必要があることが判明した。まず早急に解決すべき問題として、酸解離非特異的に遊離するタンパク質・ペプチドによるアーチファクトがある。これを除去する方法の開発利用が急務であり、解決方法として、電気泳動移動度の差をもって高分子量タンパク質を除去することを検討する。問題が解決できれば、CTCを用いた解析へ応用するために、より少ない細胞数でペプチド同定が可能かどうかの検討を行う。ヒト膵がん細胞株(AsPC-1、Panc-1、BxPC-3など)を用いて酸解離法を施行し、遊離上清中に含まれているタンパク・ペプチドについて2DICALを用いてペプチド配列決定を行う。対照となる正常膵管上皮細胞株としては、正常ヒト膵管上皮を不死化した細胞株HPDEを使用する。細胞数がCTCへの応用可能なレベルまで減少させることができれば、健常人の血液内に少数のがん細胞株を混入し、CTCに見立てて細胞を回収し、血球系のその他の細胞由来のペプチドがどの程度測定に影響を与えるか検討する。これらの後、実際にヒト膵臓がん患者検体よりCTCを回収し、CTC細胞表面のMHC classI分子上に提示されているペプチドを遊離し、質量分析技術を駆使してアミノ酸配列決定から標的タンパクの決定を行う。続いてこの得られたペプチドが実際に細胞傷害性T細胞を誘導できるかどうかをin vitroで検討する。同時にCTC上に提示されるがん抗原が膵がん原発巣において発現しているかどうかを定量的RT-PCR法や免疫組織染色などにより検討し、原発巣とCTC上のがん抗原の関連性について明らかとする。
足底への振動刺激に対する姿勢応答の刺激部位による違い

健常成人を対象に、足底前足部に振動刺激(振幅0.5mm、周波数60Hz)を負荷し、姿勢応答を評価した。刺激部位(直径12mm)は、両足の(1)立位における中足骨骨頭部下の最大加圧部位、(2)その前方部位、(3)後方部位とした。これらの部位は、各被験者の立位時の中足骨骨頭部下の圧分布と足底接地範囲に基づいて決定した。最大加圧部位への振動刺激は、その前後の部位への刺激と比べて、高い割合で身体の後方傾斜(補償応答)を生じさせた。このことから、安静立位時の立位位置の知覚において、最大加圧部位が重要な役割を担うことが示唆された。足底からの感覚情報は立位位置の知覚において重要な役割を担う。これは、足底中足骨骨頭部あるいは踵部への振動刺激に対して、それぞれ後傾応答、前傾応答が認められることから示唆されてきた。足底に存在する機械受容器の分布や、立位姿勢における実際の足底圧分布に関する先行研究から、中足骨骨頭部内においても、部位によって立位位置の知覚における役割が異なることが予想される。しかし、これまで立位位置知覚における中足骨骨頭部下の足底感覚の意味づけの、部位による違いを詳細に検討した研究はほとんどない。平成25年度は、ピドスコープ(平沢,1961)を参考とした測定システムを用いて、安静立位時、および足圧中心を踵から足長の60%まで移動させたときの足底接地面の変化をとらえた。これに加え、中足骨骨頭部の骨格構造を把握するために、上面から足背の中足骨骨頭部を同時に撮影した。また、参考として、足底圧分布測定装置を用いて、同じ条件での足底圧分布を測定した。第1第3、第5中足骨骨頭部前方の足底接地面前縁は、前傾に伴って有意に前方へ移動した(第1:1.0±1.4 mm;第2:0.9±0.6 mm;第3:0.9±1.1 mm;第5:0.9±1.3 mm)。これに対して中足骨骨頭部は、前傾に伴い、第13中足骨は有意に前方へ(第1:1.8±1.5 mm;第2:1.7±1.5 mm;第3:1.1±1.3 mm)、第4,5中足骨は内側へ(第4:0.2±0.5 mm;第5:0.3±0.3 mm)移動した。中足骨骨頭部下の足底圧分布の中心は、前傾に伴って有意に前方(0.9±1.6 mm)、内側(0.7±4.5 mm)へ移動した。身体前傾時の中足骨の前方移動は接地面の変化よりも大きく、これは第13中足骨骨頭部が皮膚に対して前方に移動していることを示唆していると推察される。足底中足骨骨頭部からの感覚情報は立位位置の知覚において重要な役割を担う。閉眼立位において、足底中足骨骨頭部へ高い周波数(20-100Hz)の振動刺激は身体の後方傾斜を生じさせる。この姿勢応答は、身体が前方へ傾斜したという錯覚に対する補償応答であると考えられている。平成26年度には、中足骨骨頭部の最大加圧部位への振動刺激において、比較的低い周波数(10Hz以下)では、補償応答とは逆の前傾応答が生じることを報告した(Naka, Fujiwara, Kiyota, 2015)。この結果は、立位姿勢制御における感覚情報の統合・処理が、その感覚情報の強度によって異なる可能性を示唆する。加えて、平成26年度は、感覚情報の立位位置の知覚における役割の足底部位よる違いを検討した。平成25年度に確認した中足骨骨頭部下の圧分布と足底接地面に基づき、刺激部位による姿勢応答の違いを、中足骨骨頭部下の最大加圧部位とその前後で比較した。振動子の直径は1.2cm、周波数は60Hzとした。各部位5試行ずつ負荷し、応答の割合を算出した。健常成人(平均24.1±5.6歳)17名が実験に参加した。足底中足骨骨頭部への振動刺激に対して姿勢応答を示した被験者数は15名であった。残りの2名は、いずれの部位への刺激に対しても応答を示さなかった。以下に15名の結果を示す。最大加圧部位では、後傾応答、前傾応答、応答なしの試行の割合が、それぞれ88.0%、2.7%、9.3%であった。最大加圧部位の1.2cm前方ではそれぞれ66.7%、13.3%、20.0%、1.2cm後方では50.7%、20.0%、29.3%であった。

中足骨骨頭部下の最大加圧部位は、その前後の部位と比べて、振動刺激に対して補償応答が生じる割合が高かった。このことから、立位位置知覚において、最大加圧部位が重要な役割を担うことが示唆された。理学療法学本年度は、足底接地面と中足骨骨頭部を同時に撮影する方法、およびその分析方法を定めた。さらに、撮影をした16名のうち、10名は第1中足骨骨頭部下への振動刺激に対して先行研究と同様の姿勢応答を示すことが確認できている。彼らを被験者として、平成26年度の実験を遂行する。平成26年度は、平成25年度の方法で足底接地面および中足骨骨頭部の撮影を行った被験者を対象に、足底接地面の各部位に対して直径12 mmの振動子で刺激を負荷し、刺激部位と認められる姿勢応答との関係を検討する。3つのロードセルで構成された床反力計に振動刺激装置を組み込む。この装置は、円柱型(直径12 mm)の振動部が、信号発生器からの正弦波状の電位変化に同調して振動する。振動部は常に最下方位置から駆動し、その振動開始位置は床面の高さとする。振動のpeak to peak振幅は0.5 mmとする。振動部の位置は、各被験者の足底の形状に合わせて床反力計上を任意に移動させることができる。第15中足骨骨頭部を通る足部内側面と平行な線を基準に、刺激部位を設定する。様々な部位への振動刺激に対する姿勢応答と、足底接地面および皮膚に対する中足骨骨頭部の位置の変化との関係から、立位位置知覚における足底中足骨骨頭部からの感覚情報の役割を考察する。国際学会参加のための旅費として30万円を計上していたが、早期に飛行機を予約する等の工夫により、実際には約20万円の旅費で可能となった。また、電話連絡を頻回に行うことにより、金沢大学の藤原勝夫教授との打ち合わせが効率的となり、金沢大学への移動回数を減らすことができた。加えて、機材の工夫により実験の所要時間を短くすることができ、一日に複数被験者のデータを収集することが可能となったことも、移動回数の減少につながった。本年度中に実施した予備実験から、平成26年度に予定している実験の結果には個人差が存在することが予想される。したがって、予定より多くの被験者のデータを収集する必要があるため、その被験者謝金として使用する。また、その実験時間は平成25年度よりも長くかかることから(約5時間6時間)、一日に1人の被験者のデータを収集することしかできない。これにより、移動回数が増えることが予想されるため、その旅費として使用する。
植物の防御機構に関与するステロイドの骨格部生合成機構の解明

トマトの実生を5μMのMJで処理し、トマトステロイド(トマチン)の内生量を調べた。未処理のトマトに比べて、3日後にはトマチン含量が4倍に増加した。一方、トマチン前駆体のコレステロールは12時間後に未処理のトマトを比較して1. 5倍に増加し、24時間後以降、同程度に回復することがわかった。次に、MJ添加したトマト実生を用いて[ 6-^<13>C_3]メバロン酸のトレーサー実験を行い、培養7日後のトマチンならびにコレステロールの骨格部生合成について調べた。その結果、未処理のトマトではトマチンはシクロアルテノール経路で主に生合成されるのに対し、MJ処理トマトではラノステロール経路がシクロアルテノール経路と比較して3%にまで上昇することがわかった。一方、コレステロールは未処理、MJ処理時共にシクロアルテノール経路で生合成されていることがわかった。これらの結果から、病傷害時にトマトが増産するトマチンは、細胞膜ステロールとして存在するコレステロールを前駆体として生合成されるのではなく、増産されるコレステロールは全てトマチンへと代謝されており、一次代謝物と二次代謝物が切り離されて生合成されることが示唆された。ナス科植物には炭素数27の骨格を有する6環性ステロイドサポニンが含まれている。これら化合物は植物の防御機構に関与すると考えられているが、防御応答に対するこれら含有量の増減や生合成の変化については明らかにされていない。申請者がシロイヌナズナから同定したラノステロール合成酵素遺伝子はメチルジャスモン酸(MJ)処理により発現量が増加することが明らかになっている。さらにシロイヌナズナにはシクロアルテノールを経由する経路とともにラノステロールを経由するステロール生合成経路が存在することを明らかにしている。本申請課題ではラノステロール合成酵素遺伝子が単離されているナス科植物トマトを用いて、2つのステロイド骨格生合成経路のフローを定量化することにより、外部からの刺激に対して植物が2つの経路をどのように使い分け変化させるか明らかにする。これにより、植物ステロイド生合成制御に関する新たな知見を加えるとともに、これら経路の人為的制御による効率的物質生産、抵抗性付与に繋げることが期待できる。トマトの実生を浸透培養により育て、5μMのMJで処理しトマトに含まれるステロイドであるトマチンの内生量の変化を測定した。その結果、24時間には未処理のトマトに比べて2倍に増加し、7日後には4倍程度に増加することが明らかになった。さらに、MJを添加したトマト実生を用いて、[6-13CD3]メバロン酸のトレーサー実験を行い、トマチンの骨格部生合成について調べた。その結果、未処理のトマトではトマチンはシクロアルテノールを経由する経路が主経路であるのに対し、MJ処理したトマトではラノステロールを経由する経路がシクロアルテノール経路と比較して約3%にまで上昇することが明らかになった。ナス科植物に含まれるステロイドサポニンは、防御物質と考えられているが、防御応答に対する含量の増減や生合成の変化は不明である。申請者がシロイヌナズナから同定したラノステロール合成酵素遺伝子(LAS)は、メチルジャスモン酸(MJ)処理により発現量が増加することが明らかになっている。本課題ではLASが単離されているナス科トマトを用いて、2つのステロイド骨格生合成経路のフローを定量化し、外部からの刺激に対する2つの経路の変化を明らかにすることを目的とした。一方、トマチン前駆体のコレステロールは12時間後に未処理のトマトを比較して1.5倍に増加し、24時間後以降、同程度に回復することがわかった。次に、MJ添加したトマト実生を用いて[6-^<13>CD_3]メバロン酸のトレーサー実験を行い、培養7日後のトマチンならびにコレステロールの骨格部生合成について調べた。

一方、コレステロールは未処理、MJ処理時共にシクロアルテノール経路で生合成されていることがわかった。これらの結果から、病傷害時にトマトが増産するトマチンは、細胞膜ステロールとして存在するコレステロールを前駆体として生合成されるのではなく、増産されるコレステロールは全てトマチンへと代謝されており、一次代謝物と二次代謝物が切り離されて生合成されることが示唆された。
グリア細胞系による消化管粘膜免疫の調節

消化管粘膜免疫に及ぼす神経系の役割を評価することを目的に研究遂行中である。腸管グリア細胞に化学的な"ablation"を施し、機能を失活させた状態で、消化管免疫担当細胞の構成、機能がどのように変化をするか明らにすることを試みている。中枢神経形のグリア細胞と同様に、腸管グリア細胞が化学的な"ablation"を受けることの証明と、そうした腸管グリア細胞の"ablation"が、腸管粘膜に炎症を来たす事を確認、並びに、粘膜炎症の発症機序が局所の免疫細胞系を介したものであるか否かを明らかにするという目標を設定している。更には、粘膜の炎症がグリア細胞の構成に及ぼす影響と、グリア細胞-リンパ球間の接合を明らかにする。本年度は継続して腸管グリアの化学的な"ablation"とグリア細胞の変性形態のイメージング可視化の為の準備実験を行っている。また本年度は、派生的実験として、腸管IELの機能に関し、カテコラミン作動性調節を定量的に測定する技術を確立した。また、スタチン系薬剤の粘膜免疫並びに腸管神経に関する作用の検討を行っている。スタチン系薬剤は、ex vivo状態のIELにおいて、サイトカイン産生を抑制する可能性が示された。In vivoにおける有神経系状態での検討につき、準備を重ねている。これらの知見は、腸管免疫が、神経系或いはHMG-CoA作動系等のこれまで知られていない調節系の制御を受けているこを明らかにしつつあるもので、今後炎症性腸疾患や過敏性腸症候群等の治療への応用が期待される。消化管固有の粘膜免疫系に及ぼす神経系の関与を、グリア細胞の観点で評価する。腸管グリア細胞に化学的な"ablation"を施し、機能を失活させた状態で、消化管免疫担当細胞の構成、機能がどのように変化をするか明らかにする。具体的には、以下の目的を掲げ研究遂行中である。第一に、中枢神経形のグリア細胞と同様に、腸管グリア細胞が化学的な"ablation"を受けることを証明する。第二に、そうした腸管グリア細胞の"ablation"が、腸管粘膜に炎症を来たす事を確認する。第三に、粘膜炎症の発症機序が局所の免疫細胞系を介したものであるか否かを明らかにする。前三項の検証を踏まえ、第四には、粘膜の炎症がグリア細胞の構成に及ぼす影響と、グリア細胞-リンパ球間の接合を明らかにする。本年度は、腸管グリアの化学的な"ablation":を企図し、グリア細胞の変性形態のイメージング可視化の為の準備実験を行っている。消化管固有の粘膜免疫系に及ぼす神経系の役割を、グリア細胞の観点で評価することを目的に研究遂行中である。本年度は、派生的実験として、腸管IELの機能に関し、特にスタチン系薬剤の効果検討の論文上梓を得た。
正しい心筋梗塞評価法の確立

カルシウム依存的プロテアーゼであるカルパインが心筋細胞のミトコンドリアにも存在し、虚血再灌流時に活性化することを見出した。活性化したミトコンドリアのカルパインはミトコンドリア呼吸鎖のComplex Iのサブユニットを限定分解し、Complex Iを不活性化することにより、mitochondria permeability transition pore(mPTP)を開口し、心筋梗塞進展に重要な役割を果たしていることを明らかにした。昨年度、私達は心筋のmitochondria(Mt)にもCa2+依存的proteaseであるcalpainが存在し、虚血再灌流時に活性化することを見出した。そこで本年度はMt-calpainが関与した新しい心筋梗塞進展の分子機序を明らかにすることを目的に実験を行った。その結果、心筋Mtのmatrix画分にm-calpainが存在することを証明し、MtのCa2+過負荷や虚血再灌流によって活性化されることを確認した。活性化したMt-calpainはミトコンドリア呼吸鎖のComplex IのサブユニットであるND6を限定分解し、Complex Iを不活性化することにより、mitochondria permeability transition pore(mPTP)を開口し心筋梗塞進展に関与することを、calpain阻害剤を用いて明らかにした。これらの結果は細胞質calpainのみならずMt-calpainも心筋梗塞進展に重要な役割を果たしていることを示唆しており、心筋梗塞を評価する上で考慮すべき分子であることを意味している。心筋梗塞は心筋細胞の膜破綻によるnecrosisと考えられ、心筋の過収縮(収縮帯)が膜破綻の原因と信じられてきた。しかし、私達はラット左冠状動脈結紮による虚血再灌流モデルを用い、抗phospholamban(PLN)抗体導入による筋小胞体のカルシウム(Ca2+)取り込み促進処置により再灌流時の細胞質Ca2+過剰を抑制すると収縮帯領域が狭小化するが、梗塞領域はむしろ拡大することを見出した。この知見は心筋の過収縮によって生起された収縮帯が心筋梗塞に進展するという既成概念を否定するものであることから、本年度はこの抗PLN抗体導入した心臓の虚血再灌流モデルを利用して、筋小胞体Ca2+取り込み促進が梗塞進展を促進する機序について検討した。その結果、筋小胞体に取り込まれたCa2+がユニポーターを介してミトコンドリア(Mt)に移行し、Mt内Ca2+過剰を引き起こす結果、Mt内膜に存在するmitochondria permeability transition pore(mPTP)が開口し、心筋梗塞進展を加速させることを解明した。再灌流時の細胞質Ca2+過剰は、細胞質に存在するCa2+依存性プロテアーゼであるcalpainを活性化し細胞骨格タンパク質を分解することでnecrosisに寄与する。実際、calpain阻害剤の梗塞サイズ抑制効果はよく知られている。しかし、抗PLN抗体導入は細胞質calpainの活性化を抑制したが、梗塞領域は拡大した。この原因として私達は、最近肝細胞などで存在が明らかにされたMtのcalpainに着目した。その結果、心筋細胞にもMt-calpainが存在することを確認し、再灌流時に活性化してmPTPを開口させることを見出した。これらの結果は、細胞質calpainのみならずMt-calpainも心筋梗塞進展に重要な役割を果していることを示唆している。本研究の目的は心筋梗塞がミトコンドリア障害と膜破綻のいずれに起因するのか、過収縮(収縮帯)が膜破綻や梗塞進展に寄与するのか等、心筋梗塞の診断・評価・研究に用いられてきた方法・定義・概念を再検討することにある。本年度中に私達は収縮帯の形成が心筋梗塞進展の必要条件ではないことを抗PLN抗体導入による細胞質Ca2+の筋小胞体取り込み促進モデルを用いて証明した。さらにその機序として、筋小胞体からミトコンドリアへ移行した過剰なCa2+がmPTPを開口させることを見出し、循環器学分野の一流誌に発表した。本年度の研究は概ね当初の計画通りに進行し、論文発表等の研究成果を出し、最終年度である次年度に向けて集成に入っていることから、「(2)おおむね順調に進展している。」と評価した。虚血再灌流時の細胞質calpainの活性化は心筋梗塞進展の必要条件ではなく、Mt-calpainによるmPTP開口が重要であることを見出したので、次年度はMt-calpainが寄与する梗塞進展の分子機序を明らかにする。具体的には、Mt-calpainによって分解される基質タンパク質をプロテオーム解析等を用いて検索し、候補となった基質タンパク質のmPTP開口への関与を遺伝子改変技術等を用いて候補タンパク質のノックダウンにより解析する。最終的には、それらタンパク質の心筋梗塞の診断・評価・研究への有用性を検討する。プロテオーム解析費用:業者に委託する抗体作製費用:Mt-calpain基質の候補タンパク質に対する抗体が市販されていなかった場合、業者に委託して作製する。ベクター作製費用:Mt-calpain基質の候補タンパク質のノックダウンに用いるため必要。その他消耗品:ウェスタンブロッティング、細胞培養等に用いる試薬や器具の購入
診断に検討課題が残る欧米発ゲノムワイド関連解析結果への日本人症例解析での理解深化

我々は厳密に診断した日本人集団の緑内障群と正常対照群について、高密度チップによる2段階の緑内障ゲノムワイド関連解析を実施した。広義の原発性開放隅角緑内障(広義POAG:正常眼圧緑内障normal pressure glaucoma;NPG +狭義原発性開放隅角緑内障Primaryopen-angle glaucoma; POAG)833例・対照686例を源泉し、厳格なフィルターにより抽出した653,519個の高精度なジェノタイプデータを用いて相関解析を実施した。さらに眼圧値で症例群をNPGとPOAGに細分類した解析の結果、NPGに特異的なCDKN2B-AS1遺伝子を同定した(PLoS ONE:7: e33389, 2012)。その結果を用いてネガコンの一般集団と正常対照群の差を計算した。また落屑緑内障に関しては疾患190例・対照660例の解析を実施し有意な遺伝子を同定した。現在再現性を検討中である。1.サンプルの収集:2010年に欧米のグループが発表した原発開放隅角緑内障の大規模ゲノムワイド関連解析には、落屑緑内障のマーカーとして既に同定されていたLOXL1が含まれていた。このことは、ケースコントコール解析における「症例群」のサンプル中に、原発開放隅角緑内障と鑑別判断が難しい落屑緑内障が20%程度混入していると強く疑われた。落屑緑内障は瞳孔縁、水晶体表面に特徴的な偽落屑物質が認められる偽落屑症候群によって発症する続発性の緑内障で、70歳以上に多発し、高齢者の失明原因として重要な疾患である。本学緑内障専門外来では視野異常をきたしている緑内障症例のうち、瞳孔縁、水晶体嚢に付着する落屑物質を生体顕微鏡で確認し、さらに隅角検査の色素高位付着を参考に、熟練した緑内障専門医が厳密に診断を行った。落屑緑内障患者から研究協力の書面による同意を得て血液を採取した。すべての検体は匿名化後、DNAを抽出した。正常対照は2000人以上の協力者から研究協力の書面による同意を得て、緑内障患者と全く同じ精密検査を実施し、緑内障専門医が診察を行った上で、複数の緑内障専門医が「緑内障でない」と判定したものを正常対照群とした。さらにこの中から、問診上の緑内障家族歴のあるものを除外した。症例群同様すべての血液検体は匿名化後、DNAを抽出した。2. 1000KチップによるSNPジェノタイプの情報の取得:落屑緑内障症例200例、正常対照群800例のジェノタイピングを実施した。ジェノタイピングはアフィメトリックス社のGenome-Wide Human Array 6.0システムを用いて、ヒト全ゲノムにわたる90万個以上のSNPジェノタイピングを実施した。これらの膨大なジェノタイプデータを独自の解析サーバーによりχ二乗検定を行い、LOXL1以外に落屑緑内障のマーカーと期待される新規遺伝子を同定した。1.サンプルの収集:欧米のグループが発表した原発開放隅角緑内障の大規模ゲノムワイド関連解析には落屑緑内障のマーカーとして同定済みのLOXL1が含まれ、症例群に鑑別診断が難しい落屑緑内障が20%程度混入していると強く疑われる。落屑緑内障は瞳孔縁、水晶体表面に特徴的な偽落屑物質が見られる偽落屑症候群によって生じる続発性の緑内障で、70歳以上に多発し高齢者の失明原因として重要な疾患である。本学緑内障専門外来では、視野異常を来している緑内障症例で、瞳孔縁や水晶体嚢に付着する落屑物質を生体顕微鏡で確認し、さらに隅角検査での色素高位付着を参考に熟練した緑内障専門医が厳密な落屑緑内障の診断を行っている。落屑緑内障と診断された患者のうち250人から研究協力の同意を得て、血液を採取し匿名化した上でゲノムDNAを抽出した。正常対照は研究協力の同意を得て、緑内障精密検査を実施した中から厳密に選別した。具体的には、視野(FDT、ハンフリー静的視野)、眼底写真、HRT、GDx、ペンタカム、ビサンテ、3D-OCTによる網膜神経繊維層厚解析等を実施し緑内障専門医が診察を行ったうえで、複数の緑内障専門医が緑内障でないと判定した。この中から問診上の緑内障家族歴のあるものを除き厳正に選別した。

症例群と同様に血液を採取し匿名化した上でゲノムDNAを抽出した。2. 1000KチップによるSNPジェノタイピング情報の取得本年度は現有している検体のジェノタイプの取得に着手した。匿名化された血液検体からゲノムDNAを抽出し、アフィメトリックス社のGenome-Wide Human Array 6.0システムを用いてヒト全ゲノムにわたる900,000個以上のSNPジェノタイピングを実施した。現在はマイクロアレイをスキャンして得られた膨大な生データを専用ソフトウェアによりジェノタイプ情報に変換しているところである。平成23年度の計画は、検体収集と1000Kチップによるジェノタイピング情報の取得であった。厳密に診断された落屑緑内障の症例収集は計画どおり落屑緑内障250例を達成した。正常対照群は疾患対象年齢より若い参加者が多いという点を改善すべく、できるだけ高齢者への参加の呼びかけをして症例群との年齢に開きがないよう心がけた結果、70代前後の正常対照群が増えた。ジェノタイプデータについては、現有している落屑緑内障症例を用いたマイクロアレイ実験を開始し、ヒト全ゲノムにわたる900,000個以上の生データの取得を終え、現在はジェノタイプデータに変換中である。マイクロアレイ実験からジェノタイプ情報の取得に至る一連のプロセスは、現有のサーバーシステムにより順調に稼働している。次年度のケースコントロール相関解析、混入程度推定、欧米人データとの比較・統合解析に向けて順調に推移していると思われる。1,ケースコントロール相関解析:現在計算中のジェノタイデータからアレル頻度に基づくχ二乗検定によりP値を算出し、ケース群で有意なSNPを同定する。あらゆるフィルターをクリアしたSNPについては、そのSNP周辺の染色体情報(遺伝子の有無や連鎖不平衡ブロック)をUSCSのゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)を用いて解析する。2.仮想検体群作製によるアイスランド診断への混入程度推定:今回取得した日本人落屑緑内障症例250例の1000Kチップデータと他プトジェクト・他予算で取得中の原発開放性偶角緑内障1000例と両疾患について精密検査によって緑内障でないと診断された対照群700例の1000Kチップデータを用いて、ランダム抽出の手法により、落屑緑内障の原発開放性偶角緑内障群への様々な比率での混入群を作製し、アイスランドdeCODE社から発表したLOXL1のSNP rs4236601のP値5.0×10-10、オッズ比1.36に近似する混入比率を割り出す。また、対照群に原発開放性偶角緑内障群をランダム抽出の手法により落屑緑内障症例を混入することで仮想検体群を作製し、アイスランドの対照群に緑内障症例が混入している割合の近似値を推定する。3.欧米人データとの比較および統合解析:LOXL1を同定した欧米グループが取得したイルミナ社のチップを用いた約300,000SNPについてのジェノタイピングデータをデータベースからダウンロードし、我々と同一の検定方法により再検定した結果をside-by-sideで多角的に比較する。加えて、我々の取得したデータとの統合解析を試みることで、統計学的な検出力を上げ、日本人と欧米人とで共通するLOXL1以外のSNPの同定も試みる。引き続き行う落屑緑内障症例群および正常対照群のゲノムデータ取得のための、試薬などの消耗品について20万円要する。またデータ解析に必要な補助要員の謝金な70万円を要する。この補助要員についての内訳は、緑内障病型診断などに必要な緑内障精密検査にあたる検査員雇用費用40万円、ゲノムデータ解析のデータ整理にあたる事務補助要員雇用費用30万円を想定している。
心筋脂肪酸結合蛋白FABPを用いた急性冠症候群の診断とリスク層別化

【目的】近年、血中の傷害心筋マーカーとして開発された心筋脂肪酸結合蛋白(FABP)は、高い特異性を持ち、急性冠症候群発症後、極めて早期の診断が可能である。FABP迅速測定キットを用いて、急性冠症候群の鑑別診断、リスク層別化、および予後評価が可能かを明らかにし、胸痛患者の救急外来におけるトリアージの確立を試みた。【方法】胸痛を主訴に救急外来を訪れ、症状、病歴、身体所見、心電図所見から、急性冠症候群もしくは急性心筋梗塞またはその疑いと診断された症例を対象に病歴聴取、FABP定性(迅速判定)、トロポニンT(TnT)定性(迅速判定)を測定。初回受診時から1ヶ月以内および1年後を予後追跡期間とした。【結果】北海道内7施設より208症例が登録された。全ての症例において同意を取得。119症例において急性冠症候群の診断を受け、その内訳は急性心筋梗塞78例、新規発症型狭心症3例、増悪型狭心症30例、冠攣縮性狭心症8例で、うちFABP定性検査陽性は86例、TnT定性検査陽性は65例であった。FABP陽性およびTnT陽性所見の急性冠症候群診断に対する感度はそれぞれ67%、53%、特異度は93%、98%、そして急性心筋梗塞診断に対する感度79%、67%、'特異度82%、91%であった。1ヶ月以内の心事故は12例(全症例の5.8%)で再梗塞1例、狭心症再発5例、心不全1例、冠動脈バイパス術3例、心不全死1例、心臓突然死1例であり、FABPの陽性予測値は10.5%、陰性予測値は97.5%であった。1年後予後追跡を行い得た191例における心事故は27例(14.1%)で、再梗塞1例、狭心症再発16例、心不全2例、冠動脈バイパス術4例、心不全死2例、心臓突然死2例であり、FABPの陽性予測値は22.5%、陰性予測値は92.0%であった。【結語】FABP迅速定性検査は急性冠症候群の鑑別診断、予後評価に有用であり、リスクに応じた診断、治療方針の決定に貢献できる。特にハイリスク症例への積極的な治療による予後改善が図られると同時に、不適切な侵襲検査、入院、治療が回避でき、医療経済的にも寄与できる。1.登録患者の現況平成14年3月1日現在、北海道内7施設より急性冠症候群もしくは急性心筋梗塞またはその疑いと診断された88症例が登録された。全ての症例において同意を取得した。うち、心筋脂肪酸結合蛋白H-FABP(迅速法)定性検査陽性は40例、トロポニンT(迅速法)定性検査陽性は33例、CK-MB活性陽性53例であった。一方、43症例において急性冠症候群の診断を受けた。急性冠症候群43症例中、H-FABP陽性と診断されたのは28例で、H-FABP陽性所見の急性冠症候群診断に対する感度は65%、特異度は100%であった。その内訳は急性心筋梗塞21例、不安定狭心症15例、冠攣縮性狭心症2例、安定狭心症2例であった。残り3例の診断は胸痛症候群2例、肥大型心筋症1例であった。2.予後追跡登録88症例のうち、1ケ月以内の予後追跡は現時点で29例において行い得た。入院が必要とされた症例は26例(うち再入院3例)、緊急冠血管インターベンシヨン施行例16例(うち成功例15例、不成功例1例)、心不全2例、CCU/ICUへの入院2例であった。1ケ月以内入院に対するH-FABP陽性所見の感度は50%、特異度100%であった。心事故を胸痛再発、入院治療、急性心筋梗塞、狭心症、心不全発症、致死性不整脈出現、カテーテル治療、IABP/PCPS治療、外科手術、心臓死と定義した。1ケ月後心事故発生に対する来院時H-FABP陽性所見の感度は58%、特異度100%であった。以上より、心筋脂肪酸結合蛋白H-FABP(迅速法)定性検査は急性冠症候群の鑑別診断、リスク層別化、予後評価に有用であることが推察された。今後、1年後、2年後予後追跡調査を継続し、長期予後判定に関する有用性も検討予定である。

119症例において急性冠症候群の診断を受け、その内訳は急性心筋梗塞78例、新規発症型狭心症3例、増悪型狭心症30例、冠攣縮性狭心症8例で、うちFABP定性検査陽性は86例、TnT定性検査陽性は65例であった。FABP陽性およびTnT陽性所見の急性冠症候群診断に対する感度はそれぞれ67%、53%、特異度は93%、98%、そして急性心筋梗塞診断に対する感度79%、67%、'特異度82%、91%であった。1ヶ月以内の心事故は12例(全症例の5.8%)で再梗塞1例、狭心症再発5例、心不全1例、冠動脈バイパス術3例、心不全死1例、心臓突然死1例であり、FABPの陽性予測値は10.5%、陰性予測値は97.5%であった。1年後予後追跡を行い得た191例における心事故は27例(14.1%)で、再梗塞1例、狭心症再発16例、心不全2例、冠動脈バイパス術4例、心不全死2例、心臓突然死2例であり、FABPの陽性予測値は22.5%、陰性予測値は92.0%であった。【結語】FABP迅速定性検査は急性冠症候群の鑑別診断、予後評価に有用であり、リスクに応じた診断、治療方針の決定に貢献できる。特にハイリスク症例への積極的な治療による予後改善が図られると同時に、不適切な侵襲検査、入院、治療が回避でき、医療経済的にも寄与できる。
銀河系最外縁における星生成と銀河回転曲線の研究

昨年度の研究により星生成の存在が明確になった、銀河最外縁の分子雲Cloud2について、すばる望遠鏡の近赤外線観測装置IRCS(Kobayashi et al.2000)を用いてフォローアップを行った。まず、昨年度の解析で見つかった南北それぞれの分子雲コアに付随した低質量星のクラスターのdeepimagingをJ(1.25μm)、H(1.65μm)、K(2.2μm)の3バンドで行い、さらに暗い天体を数多く検出した。この結果については、現在解析中であるが、銀河最外縁のように金属量が低いと考えられる領域での質量関数(mass-function)を明らかにできると期待される。また、とくに赤い5天体あまりの天体をKバンドにおいて分光観測し、実際に分子雲中で生まれているYSO(Young Stellar Objects)であるかを確認しようとしている(現在データ解析中)。また、このCloud2について、電波によるフォローアップをCenter for Astrophysics(Harvard-Smithsonian Institute)の斎藤氏と開始した。この3月に野辺山45m望遠鏡による分子雲の観測、8月にはマウナケア山頂のJCMTサブミリ波望遠鏡による分子解離領域(Photo Dissociation Region)の観測が予定されている。これらの観測により、このような銀河最外縁における分子雲や星生成メカニズムに大きなヒントが得られると期待している。一方、これら一連の銀河最外縁の星生成研究に関して、アメリカ・ワイオミング州で開催された国際会議「Galactic Structure,Stars,and Interstellar Medium(2000.6)」において一連のプロジェクトを発表した。ターゲットの8つの銀河最外縁の分子雲のうち、銀河中心からもっとも遠方に位置する考えられている「Cloud2」のハワイ大学60cm望遠鏡による近赤外広視野サーベイデータを解析し、7個の赤い近赤外線源を検出した。UKIRT3.8m望遠鏡を用いた1.8-2.4μmの分光観測の結果とあわせ、これら近赤外源がCloud2に付随する若い天体であることを示した。近赤外線源の分布を電波による分子雲の広がり/IRAS衛星による遠赤外線のマップ等と比較した結果、銀河系の光学ディスクの端に位置するCloud2において星生成活動性が存在することを示唆し、以上の結果を学術論文として公表した(Kobayashi and Tokunaga 2000, Astrophysical Journal, in press)。また、本科研費を用い高機能PCと独自ソフトを組み合わせた高速データ解析システムを構築し、ハワイ大学2.2m望遠鏡によるCloud2のより高感度/高分解能の近赤外サーベイデータを解析した。その結果、Cloud2に付随する多数の暗い近赤外線源を検出した。近赤外の色超過から、これらが若い天体であることを結論し、Cloud2での活動的星生成の存在を確定した(Kobayashi and Tokunaga 2000, in preparation)。Cloud2は、矮小銀河(dwarf galaxies)に典型的に存在する、重元素量の低い低密度ガス環境下での星生成のよい実験場となる。このような環境下での質量関数(IMF)を上記データより現在求めつつある。ハワイ大学60cm望遠鏡による残りの分子雲のサーベイデータを現在解析中であるが、次年度はそのまとめをもとに、銀河系最外縁でのグローバルな星生成を考察する予定である。また、検出した近赤外線源を、国立天文台「すばる」8m望遠鏡の近赤外分光器IRCSを用いてフォローアップする予定である。
紫外線の変異毒性を回避する生体皮膚表皮で発見された新たな応答機構の解明

我々は生体皮膚に対するUVBの突然変異誘発能の研究の中で、ある一定以上のUVB線量では表皮において突然変異誘発が強く抑えられることを発見した。本研究では、この皮膚表皮に備わるUVB突然変異誘発の抑制応答のメカニズムを解明することを研究目的とした。この変異誘発抑制応答の機序として、表皮細胞のapoptosisや炎症性免疫といった組織レベルの選択排除の機構によって一定以上の突然変異またはDNA損傷を受けた細胞が選択的に排除されるような反応を想定して研究を行い、以下の結果を得た。1.マウス皮膚におけるUVB照射後のapoptosisの出現の有無を、変異誘発抑制応答の見られる線量域500-1000J/m^2で、皮膚組織切片を作成して経時的に観察を試みたが、方法論的にうまく行かず明確な結果を得るには至らなかった。2.皮膚表皮におけるUVB突然変異誘発の抑制応答が最大どの程度のUVB線量まで観察されるか、これまでより更に高い3,4,5kJ/m^2の線量を突然変異検出用トランスジェニックマウスMutaに照射して検討したが、2kJ/m^2以上では誘発突然変異頻度のデータのばらつきが大きくなり結論を得られなかった。3.apoptosisに欠損があるとUVBに対する変異誘発抑制応答が見られなくなるかどうか調べるために、遺伝学的アプローチとしてapoptosis能に異常のあるp53欠損マウスにUVB照射実験を行い、変異誘発抑制応答の出現の様子を調べた。その結果、依然として野生型マウスと同じようなUVB線量から変異誘発抑制応答を示すことが明確に認められ、少なくともp53に依存するapoptosisはこの現象に関与していないことが明らかとなった。このことより、変異誘発抑制応答を誘導している機構としてはp53非依存性のapoptosis、または炎症性免疫反応が関与している可能性が高いことが示唆された。本研究では、この皮膚表皮に備わるUVB突然変異誘発の抑制応答のメカニズムを解明することを研究目的としている。1.マウス皮膚におけるUVB照射後のapoptosisの出現の有無を、変異誘発抑制応答の見られる線量域500-1000J/m^2で、皮膚組織切片を作成して経時的に観察を試みたが、方法論的にうまく行っておらず明確な結果を得るには至らなかった。2.皮膚表皮におけるUVB突然変異誘発の抑制応答が最大どの程度のUVB線量まで観察されるか、これまでより更に高い3,4,5kJ/ m^2の線量を突然変異検出用トランスジェニックマウスMutaに照射して検討したが、2kJ/ m^2以上では誘発突然変異頻度のデータのばらつきが大きくなり結論を得られなかった。3.apoptosisに欠損があるとUVBに対する変異誘発抑制応答が見られなくなるかどうか調べるために、遺伝学的アプローチとしてapoptosis能に異常のあるp53欠損マウスをMutaマウスと交配し、p53欠損Mutaマウスを作成した。現在UVB照射実験を行ったところである。

この変異誘発抑制応答の機序として、表皮細胞のapoptosisや炎症性免疫といった組織レベルの選択排除の機構によって一定以上の突然変異またはDNA損傷を受けた細胞が選択的に排除されるような反応を想定して研究を行い、以下の結果を得た。1.前年度に引き続き、マウス皮膚におけるUVB照射後のapoptosisの出現の有無を、変異誘発抑制応答の見られる線量域500-1000J/m^2で、皮膚組織切片を作成して経時的に観察を試みたが、方法論的にうまく行かず明確な結果を得るには至らなかった。2.apoptosisに欠損があるとUVBに対する変異誘発抑制応答が見られなくなるかどうか調べるために、遺伝学的アプローチとしてapoptosis能に異常のあるp53欠損マウスにUVB照射実験を行い、変異誘発抑制応答の出現の様子を調べた。その結果、依然として野生型マウスと同じようなUVB線量から変異誘発抑制応答を示すことが明確に認められ、少なくともp53に依存するapoptosisはこの現象に関与していないことが明らかとなった。このことより、変異誘発抑制応答を誘導している機構としてはp53非依存性のapoptosis、または炎症性免疫反応が関与している可能性が高いことが示唆された。