hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低～高分子までの生理活性化合物の精密合成を実現する水中反応の開発

水中におけるベンジリック位水酸基の脱離を促進することを期待し、ボロン酸など種々のルイス酸を添加剤に用いて反応を検討したが、目的の水中反応は進行しなかった。一方、塩酸などの酸性度の高いブレンステッド酸を添加すると、目的のベンジリック位チオール化反応が、一部の基質の組み合わせにおいては進行することが分かった。しかし、強酸性条件では不安定なタンパク質などの生体高分子に反応を適用することは難しく、より穏和な弱酸性条件(pH 4.5ー6.4)で進行する基質の設計を行った。その結果、種々の3ーインドリル(ヒドロキシ)アセテート誘導体(1)が、pH 5.4のリン酸緩衝水溶液中でチオールを含むペプチドやタンパク質と良好に反応することが分かった。基質1はチオール非存在下においても、アミノ基、イミダゾール基、水酸基、カルボキシ基やリン酸アニオンとは反応せず、チオール選択的な生体共役反応のプラットフォーム分子として利用できることが分かった。また、種々の基質1の構造と反応性との相関、反応次数などの速度論的解析、及び計算化学を用いた反応中間体の予測などについて検討を行い、より穏和な条件で進行する反応性に優れた基質設計の為の今後の指針を得ることができた。本研究の基礎的な成果について論文発表を行うことができた。弱酸性条件(pH 4.5ー6.4)においてチオール選択的に進行する生体共役反応の開発に成功した。本反応は従来のチオールを標的とするハロアルカンのSN2求核置換反応(反応条件, pH 7.5ー9.0)やマイケル付加反応(反応条件, pH 6.5ー7.4)などといった生体共役反応と比べて反応の至適pHが異なる。弱酸性pHで反応を行う利点は、1)チオールのジスルフィドへの空気酸化が起こらない点や、2)アミンやイミダゾールなどの他の求核剤との競合が起こらない点が挙げられる。また、本反応を用いて、インスリンやトリプシンなど中性や塩基性pHでは不溶または自己加水分解により不安定なタンパク質の弱酸性条件での修飾にも成功した。有機溶媒中で進行するベンジリック位置換反応は通常、カルボカチオン中間体の生成が律速となりSN1型の1次反応を示す。興味深いことに、本反応について速度論的解析を行った所、基質(ベンジリックアルコール)とチオールの両方に1次の反応次数が観測された(計:2次反応)。本反応はベンジリックアルコール側も反応次数を持つ点が、従来の系とは対照的であった。一方、基質の構造と反応性との相関を検討した結果、より安定なカルボカチオン(イミニウムカチオン)を生成する基質ほど反応性が高いことが分かった。カチオン中間体と水溶液中に大過剰に存在する水分子との平衡がこのような反応次数や反応機構に影響を及ぼすことが推測されるが、明確な機構については不明な点が残っている。2018年度で3年度目となる本研究課題では、タンパク質やペプチドなどの生体高分子の効率的な化学修飾技術の開発を目指した研究を進めている。前年度、インドール部位を含むアルコール化合物が、弱酸性緩衝水溶液中においてタンパク質やペプチドのシステイン残基(Cys)に含まれるチオール基と脱水酸基を伴いながら特異的に結合することを報告済みである(Chem. Eur. J. 2018, 24, 3959-3964)。
ゼブラフィッシュ成魚で確立したライブイメージング法による創傷時血管新生機構の解明

平成30年度は、3つの目的・計画を達成した。1の創傷治癒時の血管新生全過程の解明では、血管1本の創傷、真皮までの浅い創傷、筋肉層までの深い創傷における血管新生の解析を繰り返し、どの場合でも、残存した損傷血管からの活発な伸長と側枝の出芽・伸長が創傷部を覆い、伸長吻合後1-2週間程度、内皮細胞とペリサイトの過増殖が起こり、その後1-3ヶ月かけて両者とも創傷前の血管と同じぐらいの数に減少することを示した。さらに、ゼブラフィッシュ成魚の血管網へのペリサイトの被覆の全容も明らかにした。特に、損傷血管の再生時にペリサイトも内皮細胞に対して6-12時間程度の遅れだけで遊走・増殖することを見出したことは、これまで血管の伸長はペリサイトの血管壁からの剥離によって起こるとされてきた概念を覆す発見であった。2の血管修復と組織修復の相互作用の解明では、損傷した組織が虚血に陥って産生する血管内皮増殖因子Vegfの血管修復への影響を明らかにした。創傷皮膚にVegfシグナルの阻害剤を投与したところ、損傷血管の伸長再生は抑制された。この時、損傷血管の血流に対して上流側・下流側ともに伸長が抑制された。すなわち、上流側と下流側の伸長の違いは、Vegfではなく内腔圧による可能性がますます高くなり、3の研究の重要性が増した。3の損傷血管の上流側と下流側の伸長の違いと内腔圧の関連の解明では、当初の目的・計画以上に進み、内腔圧がかかる上流側では、先端が伸展されて、伸展刺激が、アクチンを減少させ、その結果内皮細胞の伸長を誘導するラメリポディアの形成が阻害されることにより、血管の伸長が起こりにくいことを明らかにした。さらに、伸展刺激やラメリポディア形成に関与する遺伝子を複数同定し、それらの機能を調べ始め、次の研究の基盤を築いた。平成29年度は、平成30年度分も含めた3つの目的・計画全てに取り組んだ。1の創傷治癒時の血管新生全過程の解明では、(1)血管1本の創傷、(2)表皮真皮の「浅い創傷」、(3)筋肉層まで達する「深い創傷」の3つを解析した。(1)と(2)では、残存した損傷血管からの活発な伸長と側枝の出芽・伸長が創傷部を覆い、伸長吻合後1週間程度、内皮細胞とペリサイトの過増殖が起こり、その後1-3ヶ月かけて両者とも創傷前の血管と同じぐらいの数に減少することを発見した。(3)では、前述の現象に加え、筋肉層から真皮への血管網の活発な移動を見い出した。2の血管修復と組織修復の相互作用の解明では、まずゼブラフィッシュ皮膚組織片のwhole-mount免疫染色法を独自に確立し、同手法により虚血組織同定を行ない、次に血管内皮増殖因子Vegfシグナルの阻害実験を行ない、損傷血管の血流に対して上流側と下流側では周辺組織の虚血の程度に顕著な違いが観られず、ともにVegfシグナルを受けることを示した。すなわち、前実験で同定した「損傷血管は下流側が活発に伸長するが上流側は伸長しにくい」原因は他にある可能性を示唆した。さらに、皮膚表皮を可視化したトランスジェニックゼブラフィッシュを樹立し、周辺組織の修復も解析できるようにした。3の損傷血管の上流側と下流側の伸長の違いと内腔圧の関連の解明では、上流側の内腔圧を消失させると上流側も下流側と同様に伸長すること、さらに内腔圧が負荷した損傷血管の先端では、アクチンが減少し、内皮細胞が前後極性を持ちにくくなり、その過程で先端を膨張させる伸展刺激が負荷されている可能性を示し、それを検証するためにin vitroで内皮細胞に伸展刺激を与える実験系を確立した。以上より、新たな実験系を3つ確立するとともに、創傷時の血管新生の過程と制御機構の両方で新しい発見をもたらすことができた。本研究で設定した3つの目的・計画において、1と3は8割以上、2は半分以上達成できており、全体としては順調に進んでいる。13どれも経過観察・解析とそれらの繰返しが重要な研究であるため、研究の効率化のために13を同時に遂行してきている。1では、内皮細胞だけでなくペリサイトも過増殖・その後の減少が起こることが分かったため、両者を研究していく必要があるが、それでも予定通りに進めることができている。2では、虚血組織を同定したこと、Vegfシグナルの関与を示したこと、さらに皮膚表皮を可視化したトランスジェニックゼブラフィッシュの樹立に成功したことでかなりの進展を得た。Vegfのin situ hybridization、免疫組織化学染色は実験系の確立で難航しており、虚血やVegfシグナルの創傷時血管新生への関与の詳細、血管と周辺皮膚の同時解析は取組み中である。3では、損傷血管の先端が内腔圧による影響を受けることを示したが、その過程で、アクチンの減少、内皮細胞の前後極性の消失などを発見し、さらに内腔圧が先端を膨張させる、すなわち損傷血管の先端に伸展刺激を与える可能性を見出し、当初の見込みよりも多くの新しい制御機構を明らかにできつつあり、研究すべきことが増えてきているが、それでも予定にしたがって進めることができている。今後は、創傷時血管新生の制御機構をできるだけ詳細に解明することに力を入れたい。

1の創傷治癒時の血管新生全過程の解明では、血管1本の創傷、真皮までの浅い創傷、筋肉層までの深い創傷における血管新生の解析を繰り返し、どの場合でも、残存した損傷血管からの活発な伸長と側枝の出芽・伸長が創傷部を覆い、伸長吻合後1-2週間程度、内皮細胞とペリサイトの過増殖が起こり、その後1-3ヶ月かけて両者とも創傷前の血管と同じぐらいの数に減少することを示した。さらに、ゼブラフィッシュ成魚の血管網へのペリサイトの被覆の全容も明らかにした。特に、損傷血管の再生時にペリサイトも内皮細胞に対して6-12時間程度の遅れだけで遊走・増殖することを見出したことは、これまで血管の伸長はペリサイトの血管壁からの剥離によって起こるとされてきた概念を覆す発見であった。2の血管修復と組織修復の相互作用の解明では、損傷した組織が虚血に陥って産生する血管内皮増殖因子Vegfの血管修復への影響を明らかにした。創傷皮膚にVegfシグナルの阻害剤を投与したところ、損傷血管の伸長再生は抑制された。この時、損傷血管の血流に対して上流側・下流側ともに伸長が抑制された。すなわち、上流側と下流側の伸長の違いは、Vegfではなく内腔圧による可能性がますます高くなり、3の研究の重要性が増した。3の損傷血管の上流側と下流側の伸長の違いと内腔圧の関連の解明では、当初の目的・計画以上に進み、内腔圧がかかる上流側では、先端が伸展されて、伸展刺激が、アクチンを減少させ、その結果内皮細胞の伸長を誘導するラメリポディアの形成が阻害されることにより、血管の伸長が起こりにくいことを明らかにした。さらに、伸展刺激やラメリポディア形成に関与する遺伝子を複数同定し、それらの機能を調べ始め、次の研究の基盤を築いた。本研究で設定した3つの目的・計画で、当初の見込みよりも多くの新しい現象と新しい血管新生制御機構の可能性を発見し、さらに新しい手法を少なくとも3つ確立したため、研究の可能性と展望が当初の予定よりも広がった。今後は以下の点に力を入れて研究していきたい。目的1では、内皮細胞だけでなくペリサイトも過増殖・その後の減少が起こるため、損傷血管の伸長修復時において内皮細胞とペリサイトの両方を解析する。目的2では、ゼブラフィッシュ皮膚組織片のwhole-mount免疫組織化学染色法を独自に確立したため、同手法により、虚血組織やまだ抗体を得られていない血管内皮増殖因子Vegfの産生部位に限らず、他のさまざな液性因子の産生も調べていける可能性を得た。時間の許す限りいろいろな液性因子の関連も調べていきたい。いっぽう、皮膚表皮を可視化したトランスジェニックゼブラフィッシュは、従来用いてきた蛍光タンパク質のEGFPやmCherryではなくiRFP670(赤外蛍光)での樹立に成功したため、3色以上の蛍光タンパク質を用いたイメージングが可能になった。たとえば血管をEGFP、ペリサイトをmCherry、周囲の表皮細胞をiRFP670で同時に解析することも可能にした。血管だけでなく組織も調べられると、血管に限定しない創傷治癒全体をライブイメージングで研究できるようになるため、本研究に続く次の研究の樹立にもつながると考える。目的3では、現在、内腔圧が損傷血管の先端を膨張させ伸展刺激を与え、その結果、先端のアクチンが減少し、アクチンによる葉状仮足形成などが阻害されて、内皮細胞が前後極性を持てなくなる可能性を示唆しており、新たに内皮細胞への伸展刺激、アクチン、内皮細胞の極性に注目して研究を進めていく。さらに時間の許す限りこれらの制御過程に関わる分子の探索も行なっていきたい。
ペンタクロロフェノールによる細胞膜障害機構とその抑制

ペンタクロロフェノール(PCP)は、洗浄したヒト赤血球を溶血させた。この時、反応液中のグルコースの有無は、溶血に影響しなかった。このことは、溶血が、赤血球の代謝障害を介したものではない可能性を示唆している。更に、赤血球膜標品とPCPを反応させ、膜を遠心分離すると、膜量に応じて、上清中のPCPは減少し、PCPが赤血球膜に結合することが考えられた(Brit.J.Indust.Med.50:378-9,1993)。これらから、PCPによる溶血は、赤血球膜への直接的作用による可能性が大きいと思われた。一方、ヒト赤血球膜で特に活性が高く、膜外面に存在することが確立されているアセチルコリンエステラーゼ(AchE)活性へのPCPの影響をみたところ、協同性の高い(Hill係数45)抑制効果をもつことが明らかとなった。この協同性は、S-S結合を断裂させることによりさらに増加した(Biochem.Pharmacol.46:175-7,1993)。したがって、PCPによるAchE活性抑制は、その立体構造の変化を反映しうるものと考えられた。我々の調べえた範囲では、AchEに対しこのような効果を示す物質は今まで知られておらず、PCPが、本酵素研究に有用である可能性が考えられた。さらに、PCPの効果は、アルブミンにより強力に抑制された。限外漉過の結果、アルブミンがPCPを結合することが考えられ、これが、実際のPCP中毒とin vitroでの効果の差異の原因と思われた。この点については、内因性の「毒」性物質であるサイコシンの効果と対比させつつ、考察をおこなった(産業医科大学雑誌15:217-25,1993)。なお、このことは、PCP中毒の診断・予防等にも重要な意義をもちうるものと考えられるので、さらに詳細な分析を続けている。
リテラシーの涵養とＰＢＬを主眼とする双方向実験ノートを用いた実験指導に関する研究

理工系の教育現場では多くの実験実習がなされその評価は「レポート」の評価による。他方、実験ノート指導は重要視されていなかったが、リテラシー涵養の見地からSTAP問題を契機にその重要性が再認識された。本研究ではノートを核とする指導を異なる学年の実験科目に対して行いその効果を検証した。主たる取り組みは、1)記入式基礎情報シールの運用や「実験ノウハウ等引き継ぎメモ」によるチーム間での情報の共用2)ノートの自己及び相互評価3)事前に想定される注意点や対策等抽出しチームで共有化、4)実験室内SNSによる情報の共有化等のIT化。その結果、受動的性質の学生実験を能動的プロジェクトに昇華させることができた。大学等での学生実験実習において学生の評価は主として「実験レポート」の評価より行われているが、科学技術者の実践を通した育成という観点からはリテラシー教育の一環として、学生の記す「実験ノート」の指導は重要である。また科学技術の分野では、STAP騒動時に「実験ノートの重要性」が再認識され、「個人の備忘録的側面」を超え「実験者以外でも実験を再現できる客観的実験情報記載としてのノートのあり方」や「思考ツールとしてのノートのあり方」に関心が集まっている。一方指導の立場からは、その重要性は認識していても、指導にかかる手間の多さや「ではどのように実験ノートの指導をしたら良いかのハード・ソフト両面のノウハウ不足」は否めない。本研究はこのような実験ノート指導に着目し、それを核とする実験科目指導法の実践的萌芽研究である。今回は本校電気電子工学科での大型電気機器を扱う「機器実験」にて実験ノート指導手法の開発を試みた。得られた結果は(1)回路を回路図で示すだけでなく、実体配線図を手書きで記させることにより、再実験や第三者の回路再現等が容易に行えたほか、具体的な回路接続の理解に大いに役立った。(2)実験基礎データーを記す実験諸元テンプレートシールを開発し、実験毎に配布することにより、「冊子としてのノート」と「(プリント的な)定型フォーマットの配布」という相容れない二面の融合が可能となった。また実験は各班がローテーションで行うが「次の実験班に今回の実験内容やノウハウ、特に安全に関する留意事項を引き継ぐ『引き継ぎノート』を開発」したことにより、与えられた課題をこなすだけの受動的側面を持つ実験を、学生自らが問題意識を持って取り組むPBL的側面を持つ能動的取り組みに変えることができた。また、そのノートを自己評価させることでノート記述に関するPDCAサイクルを形成でき、ノート記載技法の向上に供することができた。今年度の当研究においては、当研究の前段階の研究テーマである『平成25年度科研費挑戦的萌芽研究:多様な双方向性及びPBL観点を主眼にした実験ノートを核とする実験指導に関する研究(課題番号:25560096)』の期間延長時期と重複してしまったため、本研究独自の取り組みとしてはやや遅れた状況になった。ただし今年度得られたノウハウ、特にPDCAサイクルののCに相当する『評価/チェック』に関係する部分は、今までの(レポートも含めた)実験指導には見られない視点であり、後述のように次年度以降、IT化も含めて本研究の主たるテーマとして取り扱う予定である。高専や大学等の学生実験実習での学生の成績評価は「実験レポート」の評価が主である。しかし科学技術者の実践力育成の観点では、リテラシー教育の一環としての「実験ノート記載技法」の指導は重要である。さらにSTAP問題時に「実験ノート」の重要性が社会の共通認識として提起・再認識された。そして「研究者個人の備忘録的側面」を超え、「実験の当事者以外でもノート記載をトレースすることにより実験を再現可能な実験情報の記載」や、「思考ツールとしての実験ノート」のあり方に関心が集まった。一方指導者からすると「実験ノートの重要性」を理解していても、かかる手間の多さや「具体的にどのような指導したら良いかのノウハウ不足」は否めない。そこで本研究は実験ノートを核とする学生実験指導法に関し様々な角度からのノウハウや問題点の蓄積を試みた実践的萌芽研究である。今年度は昨年度と同様、本学科4年次の大型電気機器を扱う「機器実験」科目において実験ノートを核とした指導を行った。主たる取り組みとしては前年度と同様、1)基礎情報シールの活用、2)回路の結線を結線図ではなく実体結線図を手書きにすることによる具体的な理解と回路図を読めないものでも回路を復元できる仕組み作り3)「実験ノウハウ及び注意事項引き継ぎメモ」により実験グループ間のノウハウの共用(紙ベースでのノウハウのクラウド化)等を試みた。さらに今年度は本学科3年生が行う「応用物理実験」においても同様な取り組みを行い、学年進行に伴う学生の習熟度に対しての比較検討を行った。さらに新たな着眼点として「ノートの自己及び相互評価」の観点を取り入れた。特に相互評価は今までは「実験ノートは個人に帰属する物」という既成概念があり、他者のノートから記述のノウハウを得るという体験は学生には新鮮な体験であり、学生からのアンケート結果からもその試みは役に立ったという意見が多く得られた。今年度は、実験ノート指導に関し、学生の行う取り組みとして、新たに「学生が記載した実験ノートの自己評価及び学生が各々記述した実験ノートの相互評価を行いそれを次回のノート記述に反映させる」といういわゆるPDCAサイクルにおける"C"と"A"に相当するアクションを実験ノート記述に採用するという新たな切り口を着想した。この着眼点は今までの実験指導には無い斬新な切り口であり、学生からのアンケート調査でも高評価であった。

しかしその実践はその手法も含めて試行錯誤の段階であり、更なる改良をすることにより更なる大きな成果が期待できる。この取り組みにおいてはその実践方法も含めて教員の負担軽減の観点も伴いながら更なる改良に着手したい。またICT機器等の活用においてもプログラミング等の技術習得等の困難さがあり進捗が遅れている。今年度はその点も集中して取り組む予定である。高専や大学等の科学技術育成の現場では多くの実験実習がなされ、その主目的は法則理解や技法習得で、その評価は「実験レポート」の評価より行われる。他方基盤となる「実験ノート」の位置づけはメモや備忘録の範疇であった。が、実験ノートの正確な記述とその指導はリテラシー教育の見地からも必須であり、その重要性は最近STAP問題を契機に、社会の共通認識として提起再認識された。本研究は実験ノートの重要性に着目し、実習科目での実践を通して効果的指導法開発や成果を検証する実践的萌芽研究である。本研究では本学科4年の「機器実験」科目でノートを配布し記録と思考を核とする指導手法の構成を提案実践した。主たる取り組みは、1)記入式実験基礎情報シールの活用、2)実体結線図を手書きで書かせる事による具体的な理解と簡単に回路を再現できる仕組み作り3)「実験ノウハウ等引き継ぎメモ」運用による実験グループ間のノウハウの共用(紙ベースでのノウハウのクラウド化)4)ノートの自己及び相互評価等である。今年度はさらに以下の取り組みを行った。5)実験前に予め実験内容を理解し、想定される(特に安全上の)留意点等のノート記載とチームでの共有化及び実験後の総括という、"プロジェクト遂行訓練としての実験"への昇華、6)デジタル的手法の加味。ノートやレポートに評価者の評価等を記したマークシートや整理用バーコードを貼付しデジタル処理を可能とした。またタブレット端末等により実験室内専用SNSを構築、実験時の疑問点や実際の進行状況を教員や学生が共有しリアルタイムな双方向的指導が可能となった。このように、本研究において、実験ノートを核にアナログとデジタルの特性を相補的に活かす事により、従来、学生にとっては義務的で受動的取り組みであった学生実験をアクティブラーニングやPBL要素を取り込んだ能動的プロジェクトに昇華させることができた。理工系の教育現場では多くの実験実習がなされその評価は「レポート」の評価による。他方、実験ノート指導は重要視されていなかったが、リテラシー涵養の見地からSTAP問題を契機にその重要性が再認識された。本研究ではノートを核とする指導を異なる学年の実験科目に対して行いその効果を検証した。主たる取り組みは、1)記入式基礎情報シールの運用や「実験ノウハウ等引き継ぎメモ」によるチーム間での情報の共用2)ノートの自己及び相互評価3)事前に想定される注意点や対策等抽出しチームで共有化、4)実験室内SNSによる情報の共有化等のIT化。その結果、受動的性質の学生実験を能動的プロジェクトに昇華させることができた。今後の主たる推進方策として以下の5点を挙げる。
消化管の吸収・排泄機能による恒常性維持機構の解析

ショウジョウバエのマルピーギ管は哺乳類の腎臓に相当する器官であり,体液中の老廃物を体外に排出して適切なイオンバランスを保っている.ショウジョウバエのホメオドメイン型転写制御因子Defective proventriculus (Dve)は,マルピーギ管細胞の機能分化,高塩分食などのストレスに対する応答に重要な役割を果たしていることを明らかにした.ショウジョウバエのマルピーギ管は哺乳類の腎臓に相当する器官であり,体液中の老廃物を尿酸結晶として排出する.マルピーギ管は先端から4つの領域(initial, transitional, main, proximal)に分けられ,2種類の細胞,主細胞と星状細胞によって構成される.主細胞は外胚葉由来で核が大きく特異的に転写制御因子Cutを発現する.それに対し,星状細胞は中胚葉由来で核が小さく特異的に転写制御因子Teashirt (Tsh)を発現する.ショウジョウバエのホメオドメイン型転写制御因子Defective proventriculus (Dve)には2種類のアイソフォーム(Dve-A, Dve-B)が存在する.マルピーギ管におけるDve-Aの発現は,3齢幼虫期以降の全ての領域で検出され,星状細胞よりも主細胞での発現が強い.Dve-Bはtransitional, main segmentの主細胞で強く発現し,星状細胞では発現していない.Dveを強制発現した星状細胞の核は一回り大きくなり,主細胞特異的に発現するCutの発現が誘導された.一方,Dveの発現が完全に消失した主細胞の核は有意に小さくなり, Cutの発現も消失した.また,主細胞で発現するプロトンポンプV-ATPaseの発現も低下していることが明らかとなり,主細胞の形質維持にDveの機能が非常に重要であることが示された.そこで,マルピーギ管特異的にdveノックダウンを行ったところ,寿命の短縮や塩ストレス耐性の低下が観察され,体液恒常性の維持におけるDveの重要性が明らかとなった.ショウジョウバエのマルピーギ管は哺乳類の腎臓に相当する器官であり,体液中の老廃物を尿酸結晶として排出する.ショウジョウバエのホメオドメイン型転写制御因子Defective proventriculus (Dve)には2種類のアイソフォーム(Dve-A, Dve-B)が存在する.マルピーギ管におけるDve-Aの発現は,3齢幼虫期以降の全ての領域で検出され,星状細胞よりも主細胞での発現が強い.Dve-Bはtransitional, main segmentの主細胞で強く発現し,星状細胞では発現していない.dve変異細胞は主細胞の形質を失い,Dveを強制発現した星状細胞の核は一回り大きくなり,主細胞特異的に発現するCutの発現が誘導された.このようなDve強制発現星状細胞では,星状細胞形質(水輸送チャンネルDripの発現)が抑制されていることが予想されたが,Dripの発現はむしろ上昇していた.この興味深い現象は,Dveによって発現量あるいは安定性が増加したセプテートジャンクション構成因子によってDripが安定化した結果であるという知見を得た.機能獲得のためにDve活性を必要とする中腸細胞においても,セプテートジャンクション構成因子が機能分化を制御していることから,セプテートジャンクションを介した制御が細胞機能分化に重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された.また,マルピーギ管特異的なdveノックダウン個体は,通常飼育条件下での寿命には影響を与えないものの,塩ストレス条件下では有意に寿命が短縮することが明らかとなり,ストレス応答による体液恒常性の維持にDveの機能が重要であることが明らかとなった.ショウジョウバエのマルピーギ管は哺乳類の腎臓に相当する器官であり,体液中の老廃物を体外に排出して適切なイオンバランスを保っている.ショウジョウバエのホメオドメイン型転写制御因子Defective proventriculus (Dve)は,マルピーギ管細胞の機能分化,高塩分食などのストレスに対する応答に重要な役割を果たしていることを明らかにした.ショウジョウバエのマルピーギ管は哺乳類の腎臓に相当する器官であり,体液中の老廃物を尿酸結晶として排出する.マルピーギ管は先端から4つの領域(initial, transitional, main, proximal)に分けられ,2種類の細胞,主細胞と星状細胞によって構成される.主細胞は外胚葉由来で核が大きく特異的に転写制御因子Cutを発現する.それに対し,星状細胞は中胚葉由来で核が小さく特異的に転写制御因子Teashirt (Tsh)を発現する.ショウジョウバエのホメオドメイン型転写制御因子Defective proventriculus (Dve)には2種類のアイソフォーム(Dve-A, Dve-B)が存在する.マルピーギ管におけるDveの発現を各発生段階で調べた結果, Dve-Aは3齢幼虫期以降の全ての領域で発現しており,星状細胞よりも主細胞での発現が強いこと,そしてDve-Bはtransitional, main segmentの主細胞で強く発現し,星状細胞では発現していないことが明らかとなった.Dveを強制発現した星状細胞の核は一回り大きくなり,主細胞特異的に発現するCutの発現が誘導された.興味深いことに, Dveの発現が増加した星状細胞の細胞境界において,セプテートジャンクション構成因子Discs large (Dlg), Coracle (Cor)の発現が増強していることも観察された.一方,Dveの発現が完全に消失した主細胞の核は有意に小さくなり, Cutの発現も消失した.またDlg, Corの発現も消失していた.

つまり,一度決定されたマルピーギ管細胞の運命は,Dveの発現レベルに応答して正しく維持されるという可能性が強く示唆された.各細胞種に特異的なトランスポーターの発現変化を調べ,主細胞形質の維持におけるDveの重要性を裏付ける結果を得た.また,高イオン濃度負荷に対する影響や寿命に及ぼす効果についても同様に結果を得たため,観察個体数を増やして,再現性の確認に努めている.dve変異体において観察されていた前部マルピーギ管における異所的な尿酸結晶生成は,遺伝的背景に依存したものであり,dve RNAiの誘導によっても異所的な尿酸結晶は生成されなかった。その他に関しては,順調に推移している。マルピーギ管におけるDveアイソフォームの機能分担について検討を行うとともに,dveと遺伝的相互作用を示す因子がマルピーギ管の機能分化に果たす役割について検討する.マルピーギ管におけるdve変異体の生理的な表現型を明確に示すことができていないので,各細胞種に特異的トランスポーターのマーカー等を用いて,発現変化を調べる。また,高イオン濃度負荷に対する影響や寿命に及ぼす効果についても検討を行う。平成25年度は,消耗品800,000円,旅費250,000円,謝金100,000円,その他(印刷費等)50,000円,計1,200, 000円を予定している.平成24年度は,消耗品1,200,000円,旅費300,000円,その他(印刷費等) 100,000円,計1,600,000円を予定している。
撥水性評価技術の革新によるシリコーンゴムがいし材料の非接触劣化診断技術の開発

大震災後特に注目されているポリマーがいし材料であるシリコーンゴムは、撥水性とその自己回復能力を有している。軽量で重汚損環境でも優れた絶縁性能を発揮するなど、世界各国で使用実績を高めつつある。一方、磁器とは異なり高分子材料であるため、その経年劣化や撥水性能の低下が問題となることが指摘されてきた。本研究では、材料表面の撥水性を定量的に解析し、その劣化診断や性能向上へ向けた計測手法を開発し、評価指標を得ることを目的とした。具体的には、撥水性は試料温度や表面粗さ、試料の吸水状態など、多くのパラメータによりその発現状態を変化させるが、各パラメータ変化時の撥水性評価値の変化を計測指標として用いれば、より正確な撥水性診断が定量的に可能となることを明らかとしてきた。例えば計測温度の低下は、表面自由エネルギーの温度依存性により、液体の表面張力と固体面の表面自由エネルギーを増加させる。前者は撥水性の向上に寄与し後者は撥水性の低下に寄与するので、これら両方が同時に発現されることとなる。本研究により、低温側では撥水性は低下して高温側では改善して観測される傾向を実験的に明らかとした。一年間の延長期間を用いて、本研究の成果である材料面に非接触で撥水性を測定する手法を国際的に検討されている、撥水性維持能力試験法に適用した結果を報告した。また、コンクリート表面の劣化診断へもこの撥水性計測手法が適用可能であることを報告した。特に材料の劣化は前進および後退接触角の差として現れることを各種撥水指標により明らかとした。本研究成果の基礎は、電気学会調査専門委員会による技術報告や論文および学会発表として広報した。更には研究成果の応用として、コンクリート材料表面に形成される撥水層の評価や、国際大電力会議(CIGRE)の新試験法に関する日本代表委員とも連携し、国際共同研究としても研究成果の活用と応用に携わった。本年度は、撥水状態の立体的な計測を非接触で行うために、光源とカメラの位置関係を色々制御して、水滴に写り込む光源の位値や大きさ、光源による水滴の陰の長さから、水滴の立体形状を評価した。その結果、接触角が90度以上の撥水性が良好な場合についても、カメラ位置を斜めにするか、カメラ位置は試料面に鉛直方向でも、光源を斜めに入射させて水滴の陰の長さを計測することで、接触角の非接触計測が可能であることが確認できた。本手法は、幾何学的な光源や陰の位置関係を計測するため、接触角の大きさの範囲ごとに適した光源とカメラの位置関係など、接触角の変化の状況により、複数の計測手法を活用することが必用である。しかしながら、非接触での接触角評価が可能となったので、凹面内の撥水状態など、従来は計測不可能であった箇所の水滴の接触角も計測可能である。次に、撥水状態の形成過程が、固体面の粗さや表面温度により、どの程度影響されるのかを定量的に計測した。本年度は接触角の測定を水滴体積増加時と減少時に連続的に動的接触角として「ヒステリシス測定」し、それらの影響を5種類の電気学会調査専門委員会共通試料で確認した。その結果、試料の状態変化は、試料面温度を変化させて、前進及び後退接触角のヒステリシス測定を上記手法で行う事で、非常に良い撥水状態診断指標が得られることが確認できた。これらは、材料表面の劣化が動的接触角のヒステリシスに顕著に表れることを示唆しており、接触角の大きさの変化以上に重要な劣化診断指標となる事が確認できた。次年度はスプレー法やDDT方など、接触角以外の測定手法ごとに、各試料の撥水状態が異なって観測されてしまう原因に、上記撥水状態の形成過程が影響することが示唆されたので、この計測手法ごとの特徴について、更に検討し、より良い評価指標を得るための計測技術へと改善していく。本年度は前年度に有効性が確認された,微小水滴の体積を増加及び減少させ,前進接触角と後退接触角の変化を動的に計測していく手法について,ポリマーがいし材料の表面温度と表面粗さの影響を実験的に検証した。測定には接触角計を用いて,水滴の体積変化と動的な接触角の変化の試料および試験条件による違いを検証した。その結果,1.試料乾燥状態においては,動的接触角の振る舞いの違いで,電気学会調査専門委員会の5種類の試料を見分けることができることが示唆された。2.試料温度を低下させて観測すると,動的接触角の変化が大きくなり,試料の違いがより顕著となった。3.表面粗さと垂直な方向の動的接触角の変化は大きく,平行な方向の変化は少ない。4.試料の吸水状態が変化すると,接触角の違いが吸水に伴う撥水性の低下で見かけ上,区別がつきにくくなり,全体的に撥水性が低下してしまう。この場合,撥水性の時間的変化を水滴体積増減法による動的接触角測定のヒステリシスを繰り返し観測することで,試料の違いや劣化状態の変化を評価可能となることが示唆された。次に,接触角の望遠観測の検討については,1mの距離から接触角を非接触で望遠計測することが可能であることを確認できた。しかしながら,接触角が90度以上の撥水性の良好な状態については,水滴の半径と焦点距離の分解能の関係で,傾斜観測法を用いても測定精度に問題があり,更なる検討が必要である事が示唆された。

コンクリートに対する本研究手法の応用から,試料の吸水状態の変化が,撥水性計測を用いた劣化診断に大きな影響を及ぼすことが示唆された。この点については,数秒間から数分間の比較的短時間の撥水状態の時間依存生を計測することの有効性が示唆されたので,この撥水状態の時間依存生についても今後検討していく。試料表面温度や表面粗さを変化させ,撥水性評価指標の変化を観測することで,試料の違いや状態の違いを定量的に評価することが可能となった。また,撥水状態は試料の吸水状態により大きく変化するが,撥水性評価指標の時間的変化を追うことで有益な情報が得られることが確認できた。撥水性評価指標としては,水滴体積増減法を用いた動的接触角の測定が,新たな評価指標となり得ることを見いだした。撥水性の望遠計測に関しては,90度以下の接触角の評価には成功したが,撥水性の良好な状態での評価はうまくできなかった。撥水状態の計測方法について,引き続き改善・改良を進め,撥水性の望遠計測や非接触での接触角測定の精度と計測範囲の向上を引き続き研究する。これらにより,表面撥水性計測による材料評価・劣化診断技術のさらなる改善を目指すことの有益性が確認できた。本年度は、微小水滴の体積を増加及び減少させ、前進接触角と後退接触角を動的に計測していく撥水性計測手法と、新たに国際大電力システム会議(CIGRE)により撥水性維持能力評価手法として提案されたDynamic Drop Test(DDT)について検討した。試料としてはCIGREにより提供された、シリコーンゴムとEVAの共通試料を用いた。動的接触角計測により試料の撥水性発現を実験的に検証した結果、CIGRE試料についても、1.試料乾燥状態に於いては、動的接触角による撥水性はシリコーンゴムが優れていた。2.試料温度を上昇および低下させると、撥水性は両試料ともに向上および低下するが、動的接触角の変化形状には大きな違いは両試料とも観測されなかった。3.試料への表面粗さの付与に関しては、水滴の拡張方向に対して垂直な表面粗さの付与のみが、両試料の撥水性を大きく向上させた。4.試料が吸水すると、シリコーンゴムの接触角は大きく低下するが、EVAの場合は吸水に伴う撥水性の低下があまり無かった。5.3回の水滴体積増減による撥水性のヒステリシスは、全体的な低下は認められるが、上記1ー4の試料状態による変化に比べてヒステリシス形状の変化は少なかった。DDTについて検討した結果、シリコーンゴムでは177分、EVA試料では46分を8個の試料の平均値として得た。本研究の特色である「非接触での撥水性評価」の観点から、1m程度離れた位置からDDTの最大水滴長の変化を観測したところ、電極間隔の50mmの半分程度までの水滴長の伸展の後、急激な水滴長の伸展が観測された。DDTでは、電極間の電界によるクーロン力も水滴伸張に寄与し、撥水性維持性能への複雑な影響が含まれている可能性が示唆された。この試料撥水状態の変化を非接触で定量化できる手法の開発は極めて重要で有り、最終年度にこの手法の改善を進めていく予定である。試料の撥水状態は多くのパラメータで変化してしまう。しかしながら材料の劣化診断を考える場合、非破壊で場合によっては課電状態での診断を考慮すると、撥水状態は非接触でも観測可能であり、極めて有益な試料状態の定量化指標となり得る。本研究では、撥水状態の発現が、試料温度・表面粗さ・試料の吸水状態などの多くの依存性を有していることを逆に利用し、その各種パラメータによる変化率を計測することで、撥水性の計測を材料の劣化診断に適用することを目指している。今年度までの研究により、撥水状態の代表的評価指標である水滴
融液からの結晶成長機構における要素過程の光散乱による研究

(1)ハイパ-ラマン散乱システムの完成固相-融液相の間の領域においてposition sensitiveなスペクトルを観測することが当研究課題の最も重要なポイントである。実際に予備的実験をいくつか進め、また簡単なシミュレ-ションを併用することにより、この両相境界領域においては屈折率の差にともなう入射レ-ザ-光の弾性散乱が極めて強く存在し、その強度および分光スペクトルの重なりの程度は無視できない程大きいものであることがあきらかになった。そのため光散乱スペクトルのうち成長機構の要素過程を反映する低周波スペクトルを正確に観測するためには、通常の1光子過程による光散乱ではなく光子過程によるいわゆるハイパ-ラマン散乱が必要であることが結論された。当研究助成金により購入されたNd:YAGパルスレ-ザ-、パルス発生装置および遅延回路を用いて、この目的のためにハイパ-ラマン散乱システムが構成された。それにより微弱なH_2Oからのハイパ-ラマン散乱スペクトルを観測することができた。(2)要素過程のダイナミクスを反映するスペクトルの観測精密に温度制御がなされる光散乱セルがいくつか完成した。これらを上述の分光システムに組み合わせて要素過程スペクトルの測定が現在行なわれるようになった。この場合結晶相としては対称中心のあるものを用いると通常ハイパ-ラマンスペクトルに現われるSHG光が生じないので、低周波スペクトルを観測するには都合が良い。現在このような結晶系および対称中心を欠く系について研究が行なわれている。(3)研究結果以上のような本研究の遂行過程から次貢に示されるような、さまざまな研究成果が得られた。(1)現在までの進行状況当研究計画における主要な設備である連続励起型Nd:YAGレーザー、高速ゲートパルサー、デジタルオシロスコープ、デジタル遅延パルス発生器などは順調に納入され、それぞれの性能は設置実験室において確認された。本研究目標を達成するためには固相中の融液相の領域に近い部分のみのスペクトルをまず検出する必要がある。イオン結晶NaNO_3およびKNO_3を用いて温度調節器付光散乱セルにより融液領域直下におけるスペクトルを観測することに成功した。その結果極めて強い低周波成分(準弾性散乱)スペクトルがアニオンの運動の特徴を良く反映していること、およびすでに固相中に融液状態の特徴をもつスペクトルを生じる分子運動が励起されていることが明らかになった。この運動が結晶成長の要素過程に対してどのような寄与をなしているかは現在のとこめ明らかになっておらず、解析中である。現在までの進行状況における反省点としては、固ー液界面からの強い純弾性散乱光(準弾性散乱光ではなく)をいかに除去するかという点が、もう少し徹底しても良いのではないかと思われる。(2)来年度の計画境界面からの強い弾性散乱光をおさえるために、新型の光散乱セルを本年度の実験結果の検討をもとに試作し、それを用いて実際に結晶成長を起す固相ー融液相共存状態を実現して目的の要素過程を司さどる励起状態を見出してゆく。したがって論文出版は来年度以降になるので現在のところ出版予定のものばかりである。しかしながら強弾性散乱光の除去のため、今年度の研究過程で開発された新型空間フィルターは充分な効果を発輝するものと思われる。(1)ハイパ-ラマン散乱システムの完成回相-融液相の間の領域においてposition sensitiveなスペクトルを観測することが当研究課題の最も重要なポイントである。実際に予備的実験をいくつか進め、また簡単なシミュレ-ションを併用することにより、この両相境界領域においては屈折率の差にともなう入射レ-ザ-光の弾性散乱が極めて強く存在し、その強度および分光スペクトルへの重なりの程度は無視できない程大きいものであることが明らかになった。

そのため光散乱スペクトルのうち成長機構の要素過程を反映する低周波スペクトルを正確に観測するためには、通常の1光子過程による光散乱ではなく2光子過程によるいわゆるハイパ-ラマン散乱が必要であることが結論された。当研究助成金により購入されたNd:YAGパルスレ-ザ-、パルス発生装置および遅延回路を用いて、この目的のためにハイパ-ラマン散乱システムが構成された。それにより微弱なH_2Oからのハイパ-ラマン散乱スペクトルを観測することができた。(2)要素過程のダイナミクスを反映するスペクトルの観測精密に温度制御がなされる光散乱セルがいくつか完成した。これらを上述の分光システムに組み合わせて要素過程スペクトルの測定が現在行われるようになった。この場合結晶相としては対称中心のあるものを用いると通常ハイパ-ラマンスペクトルに現れるSHG光が生じないので、低周波スペクトルを観測するには都合が良い、現在このような結晶系および対称中心を欠く系について研究が行われている。(3)研究結果以上のような本研究の遂行過程から次頁に示されるような、さまざまな研究成果が得られた。
皮膚の創傷治癒過程における癌関連遺伝子の動態とその法医病理学的応用

皮膚創傷治癒過程は,炎症期,増殖期,成熟期と3つの時期に大別される生体防御反応である.この過程に関与する様々な細胞は,細胞表面分子を介した細胞間相互作用によって制御されている.細胞表面のガラクトース糖鎖は細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられているが,未だ詳細な検討はなされていない.本研究では,皮膚創傷治癒過程におけるガラクトース糖鎖の生物学的意義の解明を目的として,β-1,4-ガラクトース転移酵素(GalT)-I欠損(KO)マウス及びヘテロマウスの背部に皮膚欠損創を作製し,創傷治癒に関与する種々の因子についての経時的測定を行い,治癒の程度を比較検討した.ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスは創の閉鎖率,肉芽組織内における血管内皮細胞占有率,再上皮化が,各々有意に減少していた.さらに,損傷部におけるコラーゲン量が有意に減少しており,それらに関与する分子(TGF-β1,CTGF,COL1A1)並びに血管新生に関与するVEGFの発現が,各々有意に減少していた.損傷部における炎症の様態については,ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスでは,マクロファージ数及びケモカイン(MCP-1,MIP-1α,MIP-2)の発現が,各々有意に減少していた.以上から,コントロールマウスに比べGalT-I KOマウスは炎症反応の減弱が認められ,また,組織修復や血管新生に関与する遺伝子発現の減少が認められた.その結果として,GalT-I KOマウスでは皮膚創傷治癒が遅延したものと判断された.GalT-Iはセレクチンのリガンド糖鎖であるシアリルLexの生合成に関与していることから,GalT-I KOマウスでは創部へ白血球浸潤細胞数の減少が生じ,その結果,それら細胞群が分泌する増殖因子等の減少が生じたことで治癒が遅延したと考えられる.皮膚創傷治癒過程における癌関連遺伝子の局在を免疫組織化学的手法を用いて検索し,皮膚損傷の受傷後経過時間判定のための有用な指標となる物質であるか否かについて検討した.法医剖検例で受傷後経過時間が判明している皮膚損傷(刺創,切創,外科手術創及び挫裂創)を計50個採取し,10%PBS緩衝ホルマリンで固定後,パラフィン包埋切片(4μm厚)とした.一次抗体に抗c-fos及びc-Jun・ウサギポリクローナル抗体を用いて免疫染色を行った.染色結果について,各切片ごと任意で10視野選択し(200倍),1視野当たりの全細胞数に対するc-fos及びc-Jun陽性細胞数の割合を求め,その10視野の平均値をc-fos及びC-Jun発現量とした.結果及び考察:正常皮膚組織では表皮細胞や毛嚢細胞の核に陽性所見が観察された.一方,損傷皮膚試料で,受傷後1日未満では,主に好中球浸潤が観察され,一部の好中球の核にc-fos及びc-Jun陽性所見が認められた.受傷後1日以上では,好中球に替わってマクロファージの浸潤,さらには線維芽細胞の増殖が観察され,これらマクロファージや線維芽細胞の核に陽生所見が認められた.c-fos及びc-Jun陽性率は受傷後1日未満の損傷では低く,受傷後1日以上の損傷ではc-fos及びc-Junともに陽性率が10%を超えるものが多かった.これらの結果はc-Junが皮膚創傷治癒,特に細胞増殖と密接な関係のあることを示唆している.1.受傷後経過時間の異なるヒト皮膚損傷試料(I群:0-12時間,II群:1-4日,III群:7-14日,IV群:17-21日)について,IL-8,MCP-1及びMIP-1αの発現を免疫組織化学的に検討した.I群では主として好中球に各ケモカインの陽性所見が観察され,II-IV群ではマクロファージ及び線維芽細胞が陽性となった.全浸潤細胞に対する各ケモカイン陽性浸潤細胞の割合を求めたところ各々の陽性率の変化は類似パターンを示した.すなわち,I群ではいずれの陽性率も低く,II群で急激な上昇が認められ,その後減少傾向に転じた.法医病理学的にこれらのケモカインが皮膚損傷の受傷後経過時間判定のための有用な指標となるものと考えられ,IL-8陽性率が50%以上,MCP-1陽性率が30%以上,MIP-1α陽性率が40%以上であれば,受傷後1日以上の損傷であることを示すものと考えられた.(Kondo T et al., Int.J.Legal Med.(2002)116,87-91).2.ユビキチン(Ub)の皮膚損傷治癒過程における発現を免疫組織化学的に検索した.

マウス皮膚損傷におけるUb発現細胞を観察すると,好中球,マクロファージ及び線維芽細胞の核にUb陽性所見が観察された.さらに受傷後経過時間の異なるヒト皮膚損傷試料(I群:0-12時間,II群:1-5日,III群:7-14日,IV群:17-21日)についてUb発現を免疫組織化学的に検討したところ,マウスと同様に好中球,マクロファージ及び線維芽細胞の核に陽性所見が観察された.全浸潤細胞に対するUb陽性浸潤細胞の割合をUb発現量としたところ,I群でUb陽性率が低かった.II及びIV群では全例で陽性率が10%以上,III群では20%以上であった.Ub発現量について,III群と他の3群の間には有意差が認められた.以上のことから,法医実務的にUbが皮膚損傷の受傷後経過時間判定に有用な指標となることを明らかにした.(Kondo T et al., Int.J.Legal Med. (2002)116,87-91).3.TNF-Rp55遺伝子欠損マウスと野生型マウスの比較検討により,マウス皮膚創傷治癒過程におけるTNF-TNF-Rp55シグナル伝達系の役割を調べた結果,血管新生及びコラーゲン産生には抑制的に働いており一方,創部への白血球浸潤,サイトカイン及びケモカイン産生には促進的に働いていることが明らかとなった.以上の結果と相まって,TNF-TNF-Rp55シグナル伝達系の役割は治癒を遅延する働きがあることが明らかとなった.よって,TNF-TNF-Rp55シグナル伝達系は皮膚創傷治療のターゲットとして応用できると考えられる.(Mori R et al.,FASFBJ. (2002)16,963-974)皮膚創傷治癒過程は,炎症期,増殖期,成熟期と3つの時期に大別される生体防御反応である.この過程に関与する様々な細胞は,細胞表面分子を介した細胞間相互作用によって制御されている.細胞表面のガラクトース糖鎖は細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられているが,未だ詳細な検討はなされていない.本研究では,皮膚創傷治癒過程におけるガラクトース糖鎖の生物学的意義の解明を目的として,β-1,4-ガラクトース転移酵素(GalT)-I欠損(KO)マウス及びヘテロマウスの背部に皮膚欠損創を作製し,創傷治癒に関与する種々の因子についての経時的測定を行い,治癒の程度を比較検討した.ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスは創の閉鎖率,肉芽組織内における血管内皮細胞占有率,再上皮化が,各々有意に減少していた.さらに,損傷部におけるコラーゲン量が有意に減少しており,それらに関与する分子(TGF-β1,CTGF,COL1A1)並びに血管新生に関与するVEGFの発現が,各々有意に減少していた.損傷部における炎症の様態については,ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスでは,マクロファージ数及びケモカイン(MCP-1,MIP-1α,MIP-2)の発現が,各々有意に減少していた.以上から,コントロールマウスに比べGalT-I KOマウスは炎症反応の減弱が認められ,また,組織修復や血管新生に関与する遺伝子発現の減少が認められた.その結果として,GalT-I KOマウスでは皮膚創傷治癒が遅延したものと判断された.GalT-Iはセレクチンのリガンド糖鎖であるシアリルLexの生合成に関与していることから,GalT-I KOマウスでは創部へ白血球浸潤細胞数の減少が生じ,その結果,それら細胞群が分泌する増殖因子等の減少が生じたことで治癒が遅延したと考えられる.
細胞融合法による高い木材腐朽能を持つ担子菌の育種に関する研究

本研究では、リグニン分解性担子菌、特にPhanerochaete chrysosporiumを対象の中心として、これらのリグニン分解能の増強や改良に細胞融合法を適用するための基礎的な知見を得ることを目的とした。まず、P.chrysosporiumの分生胞子を2日間前培養し、次いで新しい培地で20時間本培養して、得られた菌糸体をNovozyme234及びCellulase ONOZUKA RSの混合溶液を用いて処理することにより、プロトプラストを得た。プロトプラストの再生頻度は、約5%と算出された。本菌のプロトプラストの触合には従来のポリエチレングリコ-ル(PEG)法及び電気触合法が共に有効であり、後者の最適条件は、高周波電圧15v、印加時間20秒、パルス電圧300v、パルス幅50μ秒、パルス回数2目(1秒間隔)であった。本菌の栄養要求性変異株(3株)やパ-オシダ-ゼ欠損変異株を用いて、種々の組合せでプロトプラスト触合を行ったところ、栄養要求性の解除など両親株の形質を合わせ持つ触合株が取得された。これらの触合株は、数代の継代培養でも両親株の形質を比較的安定に維持した。本菌のプロトプラストはFITCやRITCにより蛍光染色され、これらは、蛍光顕微鏡下で識別可能であった。本菌のプロトプラストと、同じくリグニン分解担子菌であるCoriolus versicolorあるいはPleorotus ostreatusのプロトプラストをそれぞれFITC、RITCで染色して、PEG処理を行ったところ、異種間で触合するところが観察され、プロトプラストの蛍光染色が触合の指標として有効であること、また異種担子菌間での触合の可能性が示唆された。また、P.chrysosporiumとCoprinus aff ellisiiとの間でも電気触合により触合株選抜され、この触合株は、両親株各々に特有の、フェノ-ル酸化酵素(あるいはパ-オキシダ-ゼ、これらはリグニン分解に関与する)の生産性を示し、高リグニン分解能を有する可能性が示唆された。本年度はリグニン分解性担子菌Phanerochaetechrysosporiumを対象とし,遺伝的マーカーの付与,プロトプラストの調製・再生条件とプロトプラスト融合条件の設定,融合の確認法などについて検討を行い,次の成果を得た.まず遺伝的マーカーとして,本菌の分生子をUV照射することによりパーオキシダーゼ欠損株(POD^-)を誘導した他,ニコチン酸(Nic^-),ロイシン(Leu^-),メチオニン(Met^-)などの栄養要求株を用いた.次にこの菌のプロトプラスト化の条件を検討した.分生子の2日間培養後の菌体を磨砕により断片化し,これをグルコースーペプトン培地で20時間静置培養した菌糸について,ノボザイム234-セルラーゼオノヅカRS混合酵素を0.6M硫酸マグネシウム存在下で処理した場合に最も高いプロトプラストの生成が得られた.プロトプラストはガラス繊維ろ過および遠心分離により精製した.プロトプラストは再生培地に混じ, 28°Cに7日間保持することにより再生した.再生率は約5%であった.