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リアノジン受容体/カルシウム放出チャンネルの分子生物学的研究

本研究の目的はリアノジン受容体の生体レベルでの生理的機能の実体に迫ることであり、そのために変異モデル動物を作製し、その動物を様々な視野から解析を行うことを計画した。主な研究成果を以下に列挙する。まず、ショウジョウバエの系におけるリアノジン受容体遺伝子を解析しその変異株の検索を行ったが、現在まだ報告されていなかった(FEBS Lett. 337,81)。そこで、胎性幹細胞(ES cells)を用いた相同組み換えにより骨格筋型リアノジン受容体の欠損モデルマウスの作製を行い、骨格筋型リアノジン受容体は筋細胞の形態的成熟においても興奮収縮関連の形成においても必要不可欠な分子であることを示した(Nature,369,6481)。また、この変異マウス骨格筋の微細構造の観察から、本受容体は細胞表層膜と筋小胞体膜の近接部においてその両膜間の距離を規定する分子であるが、その形成には必須ではないことを明らかにした(Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 92,3381)。さらに、変異マウス骨格筋には脳型リアノジン受容体が存在することを証明し、それまで適当な実験材料がなく行うことが不可能であった機能的解析を行うことにより、そのイオンチャンネルとしての生理学的性質を明らかにした(EMBOJ. 14,2999)。これらの研究により、哺乳動物における骨格筋型リアノジン受容体の個体レベルでの機能をほぼ明らかにすることができ、リアノジン受容体サブタイプ間での生理機能の差異について初めて具体的な実験データに基づいて示すことができた。平成6年度の研究目的はリアノジン受容体の生理学的機能解析のための変異モデル実験動物系の検索又は作製であり、申請書に述べたように主に以下の2つの実験を遂行した。(i)多くの変異種が作製されているショウジョウバエにおいて、リアノジン受容体相同遺伝子を検索し単離した。その同定された染色体座における変異体は単離されたという報告は残念ながら無かったが、このリアノジン受容体相同物の推定一次構造を明らかにし、リアノジン受容体の分子進化についての考察を行った(FEBS Lett.337,81)。(ii)骨格筋型リアノジン受容体遺伝子における相同組み換え実験をマウス胎性幹細胞(ES cell)で行い、骨格筋型リアノジン受容体欠損マウスを樹立し、このマウス形態学と生理学的特徴を野生型のものと比較検討した。その解析の結果、骨格筋型リアノジン受容体は骨格筋の形態的成熟に必須の分子であることを明らかにするとともに、興奮-収縮連関の際のカルシウム放出チャンネルとして機能していることを証明した(Nature369,6481)。今後は、得られた変異マウスの筋組織により詳細な解析すなわち、電子顕微鏡による微細構造変化の解析や蛍光色素によるカルシウム動員機構の検討などを行うことによって、リアノジン受容体の生理的機能に迫る実験を予定している。本年度の研究目的は、昨年度に作製した骨格筋型リアノジン受容体欠損マウスの異常を詳細に検討することによりリアノジン受容体の生理的機能に迫ることであった。申請者らはこの変異マウス骨格筋の微細構造の観察から、本受容体は細胞表層膜と筋小胞体膜の近接部においてその両膜間の距離を規定する分子であるが、その形成には必須ではないことを明らかにした(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92,3381)。また、変異マウス骨格筋には脳型リアノジン受容体が存在することを証明し、それまで適当な実験材料がなく行うことが不可能であった機能的解析を行うことにより、そのイオンチャンネルとしての生理学的性質を明らかにした(EMBO J.14,2999)。

さらに、申請者らは心筋細胞のリアノジン受容体の存在形態(j.Cell Biol.129,659)や、cDNAを導入しリアノジン受容体を大量発現する培養細胞での膜系の形態観察(J.Muscle Res.Cell Motil.16,465)から、特にリアノジン受容体の細胞表層膜と小胞体膜の近接部における形態的機能について明らかにした。
東アジア方形城郭都市の造営技術史に関する学際的研究

平成30年度は北東アジア地域での方形城郭都市遺構の現地調査として、中国内蒙古自治区呼倫貝爾市(フルンボイル市)、通遼市、赤峰市および黒竜江省(省界)を訪問し、各遺構の踏査、博物館など文化財保存機関を見学した。事前の調査で、対象として、12-13世紀に造営・使用されていたと考える金界壕に付随する堡塁・堡城の構造と立地を確認することを目的としていた。現地で確認した限りでは、これらを方形城郭都市に含めることについては検討を要するが、その造営工法などは当該地域の方形城郭都市と共通する点がいくつかあることを確認することができた。また国内調査として、秋田、岩手、宮城の各県において、古代城柵遺跡の見学と関係施設の見学を行った。予定していたうち、胆沢城址に隣接する奥州市埋蔵文化財センターについては工事による閉館期間に当たり、見学することができなかったが、他については予定を達成することができた。すでに踏査・見学した北部九州および畿内の方形城郭都市遺構と異なり、防衛上の役割を歴史的に担っていた遺構であり、単純に時代・地域の異なる北東アジア地域として括ることは難しいが、立地条件や造営方法の上での共通点、相違点などを確認することができた。研究班の総括会議は3月および2019年度5月に開催した。2019年度が本科研班の最終年度に当たることから、年度末の報告書の内容および編集を含めた計画について検討を行い、方針案を決めることができた。外部への業績発信については、2017年度に行った口頭発表を投稿すると共に、付随する研究について、『アジア遊学』160号(勉誠出版)に発表した。平成30年度は新たに中国内蒙古自治区呼倫貝爾市(フルンボイル市)、通遼市において、金界壕および堡塁・堡城を踏査し、各地域の文物保存機関で新しい知見をえることができた。また国内調査では、東北地方の城柵遺構について、文献・写真などの資・史料に加え、現地で文化財保存機関の担当者から説明を受けることができた。一方、周辺環境要素の復元については、現地で得られる情報の性質や量が限られることから、リモートセンシングから得られる情報や知見とを結びつける方法について試行を続けている。2019年度については中国内蒙古自治区赤峰市において踏査を行い、当該地域の方形城郭都市遺跡についての確認事項を整理する予定である。また9月に年度末に刊行する報告書に関する編集会議を開き、各研究班員の研究について、相互に確認するとともに、修正・補足を行う予定である。研究成果の社会への還元に関連して、報告書の作成・発表と共に、市民向け講座での講演を9月に予定している。本研究の目的は唐朝成立以後に東アジア各地域に普及・展開した方形城郭都市に関する歴史的変容を先行研究からは抜け落ちていた周辺環境要素と造営技術を結びつける視点から解明することにある。平成28年度には比較的良好に城郭遺跡が残存する中国内蒙古自治区において現地踏査を行い、10世紀以降、契丹国(遼朝)時代に造営された遼上京址、遼中京址、12世紀に築かれた金代の界壕址、13世紀に造営された元上都址および応昌路城址について調査を行うことができた。これらの方形城郭都市遺跡のうち、本格的な発掘調査が未だ行われていない元代の応昌路城址についてはGISおよび空中写真を用いて遺跡の様相や造営技術などインフラの構成要素を検討した結果に、文献史料を用いた考察を加え、元上都と相似する構成要素を指摘した(雑誌論文として発表)。また契丹国(遼朝)時代の後半に外交上の首都として機能した遼中京については、先行研究に学びつつ、その都城機能の変遷を検討した。現地踏査で得られた知見に加え、空中写真から得られた情報を基に、城址西南部高地の造営方法を明らかにした。造営当時の方形城郭都市内部の景観に関する考察を加えて学会発表を行った。平成28年度の調整会議は平成29年度春に予定していた年度会議と集約して行い、研究費の節減に努めた。平成28年度秋に発表された大宰府外郭城址の一部と考えられる前畑遺跡(福岡県筑紫野市)の現地調査報告会および関連シンポジウムに事前に参加した上で、得られた知見を参考にしつつ、研究班全員で大宰府址、水城址、大野城址、基肄城址など外郭城関連遺跡を踏査した。平成28年度の調査においては中国の内蒙古自治区の方形城郭都市遺跡および日本の大宰府外郭城関連遺跡を踏査することができた。旅程の都合により割愛せざるを得なかった遺跡も存在したが、年度当初に予定していた遺跡はおおむね調査することができた。関連する国内外の報告、先行研究の収集、整理も順調に進み、空中写真および現地で撮影した写真を解析して、方形城郭都市の特徴を検討する作業を2つの方形城郭都市遺跡(遼中京址、元応路城址)について試み、研究報告として発表することができた。一方、衛星画像データおよびGISを用いた遺跡周辺の地文様相把握とデジタルマップの作成、現地で撮影したデータに画像処理を用いることで地形および周辺環境要素を抽出する作業など人文学と工学の手法を融合させる研究手法については、現地で撮影した画像データに存在する精粗のばらつきの処理や対象とする遺跡の選定に際しての基準作りなどの課題も確認することができた。

本研究の目的は唐朝成立以後に東アジア各地域に普及・展開した方形城郭都市に関する歴史的変容を先行研究を参照しつつ、周辺環境要素と造営技術を結びつける視点から解明することにある。平成29年度は8月に中国河北省から山西省にかけて、現地踏査を行い、10世紀以降、華北に存在した契丹国(遼朝)、金朝、元朝時代の文化財(城址、建造物、出土遺物)について観察・記録した。9月には北京市(契丹国(遼朝)の南京、金朝の中都、元朝の大都の各都城址に位置する)においても文化財(城址、建造物、出土遺物)について観察・記録する機会を得た(雑誌論文として発表)。また平成28年3月に国内の学会での成果発表に続けて、平成29年度9月に北京市で開催された国際学会で発表の機会を得た。研究代表者、研究分担者、研究協力者のうち1名の計3名が各々研究成果を発表した。3月に行った平成29年度の調整会議は神戸市に研究班メンバーが集まり、研究期間の折り返し地点として、各々の分担について報告を行った。と同時に今後の研究に関する方針を策定する機会とした。結果、当初調査対象地域としていた朝鮮半島(韓国)の方形城郭都市遺跡については、予算および訪問する時間的余裕が無いことから研究対象から割愛することにした。また国内の調査地域としては平成29年度に踏査した福岡県、佐賀県の大宰府および外郭城と共に、実際に防御施設としても用いられた多賀城、胆沢城などについて調査対象に含めることとした。研究班内部での研究分担をリモートセンシングを利用した周辺環境要素の復元、現況の都城址の画像処理に関する新しい手法の検討、画像データを利用した城壁築造技術の解析、同時代に近接する都城址相互の相関の研究と定め、今後2年間の研究方針を取りまとめた。平成29年度の国外調査では新たに山西省、河北省北部、北京市において方形城郭都市遺跡および関連文化財の調査を行うことができた。特に地方の文化財保管施設(博物館など)において新しい知見を得ることができた。一方、現地踏査の結果、予想されていたことではあるが、草原地帯の方形城郭都市遺跡と同じアプローチが難しいことも確認することができた。得られた文化財に関する画像データを整理、処理する方法について改めて検討する必要性が明らかになった。研究の成果については研究班全体で国際学会での研究発表3件、研究紀要への論文投稿2件を得た。平成30年度は北東アジア地域での方形城郭都市遺構の現地調査として、中国内蒙古自治区呼倫貝爾市(フルンボイル市)、通遼市、赤峰市および黒竜江省(省界)を訪問し、各遺構の踏査、博物館など文化財保存機関を見学した。事前の調査で、対象として、12-13世紀に造営・使用されていたと考える金界壕に付随する堡塁・堡城の構造と立地を確認することを目的としていた。現地で確認した限りでは、これらを方形城郭都市に含めることについては検討を要するが、その造営工法などは当該地域の方形城郭都市と共通する点がいくつかあることを確認することができた。また国内調査として、秋田、岩手、宮城の各県において、古代城柵遺跡の見学と関係施設の見学を行った。予定していたうち、胆沢城址に隣接する奥州市埋蔵文化財センターについては工事による閉館期間に当たり、見学することができなかったが、他については予定を達成することができた。すでに踏査・見学した北部九州および畿内の方形城郭都市遺構と異なり、防衛上の役割を歴史的に担っていた遺構であり、単純に時代・地域の異なる北東アジア地域として括ることは難しいが、立地条件や造営方法の上での共通点、相違点などを確認することができた。研究班の総括会議は3月および2019年度5月に開催した。
小児1型糖尿病の発症感受性遺伝子の検討-発症リスクを予測し、早期介入は可能か?-

[目的]小児1型糖尿病(TIDM)患者の家族内検索を行い、発症感受性遺伝子の同定と、その父性ないし母性由来の遺伝子伝達不均衡を検討。[対象と方法]日本人のT1DM患者38人で、(1)15歳以下の急性発症、(2)第1度近親者に糖尿病の家族歴がない、(3)発症時以降の抗GAD抗体あるいは抗障島抗体が陽性を満たす患者とその両親、ならびに非罹患同胞27名を対象。平均発症年齢6.56±3.80歳(mean±SD;315歳)、男女比17:21. HLA-DR、DQ遺伝子は、PCR-SBT法でダイレクトシークエンスによりタイピングし、IDDM2は、ABI Gene Scanで繰り返し回数を決定。統計解析は患者対照相関解析を施行。TDT(transmission disequilibrium test)で父性、母性由来の相違を検討。P値は有意水準α<0.05とし、アリルまたはハプロタイプの数で補正したPc値で検討。なお医学部・病院倫理委員会の承認を得ている。(B倫99-05号)[結果](1)HLADRB1*0901-DAQ1*0301-DQB1*0303が、T1DM患者と同胞で対照群に比し父親由来に有意に多く認めた(Pc = 0.0336, 0.0198)。TDT解析で、同様の結果を得た。(2)HLADRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を有する同胞では、対立遺伝子に発症抵抗性遺伝子のDRB1*0101-DQA1*0101-DQB1*0501や、DRB1*15021-DQA1*0103-DQB1*0601等が母親から多く伝達される傾向を認めた。(3)IDDM2の繰り返し回数3033回のクラスIは、対照群に比しT1DM患者に多い傾向があった(Pc=0.0509)。(4)クラスIを有する同胞は、対立遺伝子に母親由来に4045回の配列を多く認めた。[考察]T1DM患者同様、同胞もHLA DRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を父親由来に有意に多く有する結果は、同胞でのT1DMの発症率が、一般人口に比して高いという疫学的事実を支持すると考える。また同じHLA DRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を有しても、発症感受性遺伝子を母親から受け継がない、あるいは発症抵抗性遺伝子を母親から伝達されることで発症が抑制される可能性が示唆された。IDDM2クラスIは、T1DM患者に多く認められる傾向があり、動物実験のIDDM2遺伝子とメチル化の関連性の報告から、発症感受性遺伝子の親由来の伝達不均衡の機序に関与している可能性が考えられた。諸外国の介入研究のように、ハイリスク児への予防的介入の際、日本人独自の遺伝情報の蓄積が重要と考える。IDDM1 HLAクラスII領域のDRとDQ遺伝子の候補遺伝子多型解析では、より若年発症、特に5歳未満発症でDR9のホモ接合体(DRBI*0901-DQA1*0301-DQB1*0303)が対照群に比し有意に多く(Pc=0.0363)、高学年や成人発症ではDR4が多いとする既報との相違点として結果を得た。また伝達不均衡テスト(Transmission diseqilibrium test; TDT)を用いた検討では、DR9のハプロタイプを有する父親から、有意に多く患者群に疾患感受性遺伝子が伝搬される結果を得(Pc=0.0001)、発症には父性由来が関与する可能性が考えられた。逆に母親からは、疾患抵抗性の可能性を有する遺伝子が非罹患群の同胞に多く伝搬されていたが、サンプル数の問題から有意差を得るまでには至らなかった。さらに症例を増やして検討中である。両親から患児への伝達不均衡のメカニズムについて、諸外国の知見ではMargaritte-Jeanninらカミ、フランス人の1型糖尿病の感受性遺伝子としてDR3/4が多く、DR3は母親から、DR4は父親から有意に伝搬すると報告し、この伝搬不均衡の原因として両親の疾患感受性遺伝子のインプリンティング効果によると推察した。NODマウスの実験から、IDDM2遺伝子とメチル化の関連性が報告され、IDDM2遺伝子の解析を施行した。短い繰り返し配列のクラスIは、患者対照相関解析で有意差は得られないものの、対照群に比し患者群に多く認められ、さらに父性由来が多い傾向を認めた。現在メチレーションPCR法を用い、インプリンティング効果について検討中である。なお患者群、非罹患群の同胞と対照群が、それぞれHardy-Weinbergの法則を満たす事を確認した。また少ないサンプル数でみかけ上の有意差が生じる可能性を減らすため、P値はアリルの数で補正しPc値で表記した。

平均発症年齢6.56±3.80歳(mean±SD;315歳)、男女比17:21. HLA-DR、DQ遺伝子は、PCR-SBT法でダイレクトシークエンスによりタイピングし、IDDM2は、ABI Gene Scanで繰り返し回数を決定。統計解析は患者対照相関解析を施行。TDT(transmission disequilibrium test)で父性、母性由来の相違を検討。P値は有意水準α<0.05とし、アリルまたはハプロタイプの数で補正したPc値で検討。なお医学部・病院倫理委員会の承認を得ている。(B倫99-05号)[結果](1)HLADRB1*0901-DAQ1*0301-DQB1*0303が、T1DM患者と同胞で対照群に比し父親由来に有意に多く認めた(Pc = 0.0336, 0.0198)。TDT解析で、同様の結果を得た。(2)HLADRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を有する同胞では、対立遺伝子に発症抵抗性遺伝子のDRB1*0101-DQA1*0101-DQB1*0501や、DRB1*15021-DQA1*0103-DQB1*0601等が母親から多く伝達される傾向を認めた。(3)IDDM2の繰り返し回数3033回のクラスIは、対照群に比しT1DM患者に多い傾向があった(Pc=0.0509)。(4)クラスIを有する同胞は、対立遺伝子に母親由来に4045回の配列を多く認めた。[考察]T1DM患者同様、同胞もHLA DRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を父親由来に有意に多く有する結果は、同胞でのT1DMの発症率が、一般人口に比して高いという疫学的事実を支持すると考える。また同じHLA DRB1*0901-DQA1*0301-DQB1*0303を有しても、発症感受性遺伝子を母親から受け継がない、あるいは発症抵抗性遺伝子を母親から伝達されることで発症が抑制される可能性が示唆された。IDDM2クラスIは、T1DM患者に多く認められる傾向があり、動物実験のIDDM2遺伝子とメチル化の関連性の報告から、発症感受性遺伝子の親由来の伝達不均衡の機序に関与している可能性が考えられた。諸外国の介入研究のように、ハイリスク児への予防的介入の際、日本人独自の遺伝情報の蓄積が重要と考える。
筋萎縮性側索硬化症の神経病理学的，分子遺伝学的検討

筋萎縮性側索硬化症(ALS)におけるTDP-43とFUSの関連について検討した。その結果、通常の弧発生ALSにおいてTDP-43はFUSの局在に影響を及ぼしているが、FUS陽性封入体を有するALSではFUSはTDP-43とは独立して病因になる可能性が考えられた。また、ALSの新たな病因となる蛋白としてElongator protein3 (ELP3)に注目した。ALSの前角細胞内にはELP3抗体陽性の封入体が存在し、TDP-43と共存していたが、それは非運動ニューロンでは認められなかった。ELP3の更なる研究はALSで運動ニューロン特異的に変性を起こす機序の解明に役立つ可能性があると考えた。筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病因としてRNAの異常が注目されている。Elongator complex protein 3 (ELP3)はトランスファーRNAの転写後のプロセシングに関与するとされ、さらにELP3遺伝子多型が孤発性ALSと関係していることが報告されている。これらのことから、本年度我々はELP3のALSにおける関与について神経病理学的研究を行った。その結果、TDP-43陽性封入体を有するALS (ALS-TDP)とFUS陽性封入体を有するALS (ALS-FUS)の両者でそれぞれみられる封入体がELP3と共存していることを見いだした。一方で、ALS-TDPおよびALS-FUSでみられるグリア細胞内封入体と海馬歯状回顆粒細胞など非運動ニューロンでみられるTDP-43陽性封入体はELP3抗体では染色されなかった。この所見はELP3のC末端を認識する抗体でのみ認められており、N末を認識する抗体では認められなかった。これらのことはALSの神経細胞内封入体形成にELP3の関与があること、ALSで認められる運動神経細胞内封入体と非運動神経細胞およびグリア細胞内封入体の形成過程には違いがあることが示された。また、ELPのC末は微小管のαーtubulinのアセチル化を担う部分であることからALSの病態にRNAの異常が関与するともに微小管の異常が関与する所見と考えた。1.筋萎縮性側索硬化症でみられる神経細胞内封入体の主要構成蛋白として2006年にTDP-43が同定された.さらに2009年にはFUSが家族性ALSの原因遺伝子の1つであることが同定された.FUSとTDP-43は両者ともRNA関連蛋白であり,ALSの病態にRNAが深く関与していると考えられているが,その詳細は明らかではない.今年度我々はTDP-43とFUSのALS患者の神経細胞内での関連を明らかにすることを目的とした.方法:TDP-43陽性封入体を有する通常の孤発性ALS(ALS-TDP)とFUS陽性封入体を有するALS(ALS-FUS)の脊髄パラフィン包埋切片を用いて,封入体を有する神経細胞でのTDP-43およびFUSの局在について免疫組織学的に検討した.結果:ALS-TDPでは多数のTDP-43陽性封入体が前角細胞内に認められたが,その細胞においてはFUSの核への局在が低下している神経細胞が多かった.TDP-43とFUSが共存していたのは1つの封入体のみであったが,TDP-43の凝集がFUSに何らかの影響を与えていることが示唆された.一方でALS-FUSではFUS陽性封入体を有している神経細胞の全てでTDP-43はコントロールと同様に核に染色性がみられ,ALS-FUSはALS-TDPとは独立した疾患の可能性があると考えた.2.BTBD10はAkt3の結合因子として同定され,BTBD10の高発現によりSOD1変異体が持つ神経細胞への毒性を抑制することが報告されているが,今年度我々はBTBD10の発現が低下した神経細胞ではTDP-43の局在に異常を来すことを孤発性ALSにおいて確認した.Elongator complex protein (ELP)はRNA polymerase IIによる転写を促進する蛋白として発見された。その6個のsubunitのうちの1つであるELP3は微小管のαチューブリンのアセチル化の促進やトランスファーRNAの転写後のプロセシングに関与するとされる。さらに近年、ELP3遺伝子多型が孤発性ALS (SALS)と関係していることが報告されていることから、我々はSALS例の脊髄切片に対して抗ELP3抗体を用いた検討を行った。その結果ALSの脊髄前角細胞内にはELP3抗体陽性の様々な形態を示す封入体が存在しており、これらはTDP-43と共存していることを見いだした。ELP3は微小管のα-tubulinのアセチル化を促進することで微小管の安定と細胞内物質輸送を制御することから、この異常により様々な蛋白やオルガネラの輸送に障害が生じ、運動ニューロン死につながる可能性が考えられた。

さらに本年度SALS例の非運動神経細胞についてELP3抗体を用いて検討した結果、下オリーブ核、黒質、海馬歯状回顆粒細胞のTDP-43陽性封入体は抗ELP3抗体では染色されないことを確認した。この研究を通じてALSの病因としてのRNAの異常があることを強く示唆するとともに、ELP3がALSにおいて運動神経細胞特異的にその変性に関与する可能性があると考えられ、ELP3の更なる研究はALSの病態解明に役立つものであると考えられた。神経病理学ELP3の病理学的異常についてさらに詳細に検討ができたと考えており、ELP3の遺伝子に関しても数例で既に検討されている。さらにこの検討の中ではALSにおけるTDP-43とFUSの関連についてもあわせて検討ができている。1.TDP-43とFUSの関連については神経病理学的手法を用いて明らかにしており,現在論文投稿中である.2.ELP3の病理学的異常については明らかに出来ているが,遺伝子の異常については不十分である.3.顔面神経引き抜き損傷ラットにおける検討は抗体の至適濃度等について検討中である.ELP3遺伝子について症例数を増やして検索していく引き抜き損傷ラットの検討については各種抗体の至適濃度などの確認がすみ、検討に入る予定である。1.TDP-43とFUSの関連については免疫電顕による手法を加えて検討する予定としている.2.ELP3の孤発性ALSにおける異常については免疫組織学的検討に加えて1.と同様に免疫電顕による検討を加える予定である.3.顔面神経引き抜き損傷ラットにおけるTDP-43の異常について,時間的経過を追って検討する.初年度購入の抗体が残っておりこれから使用したために本年度は残高が生じた。認識部位の異なるELP3抗体、電顕資料作成のための物品購入する。ELP3遺伝子検査の件数も増やす予定でありそのための費用にも充てる予定である。抗体の購入,免疫電顕に用いる試薬,器具の購入,成果発表のための投稿費,旅費にあてる.
極限地震動対応型アダプティブ構造と制御法に関する研究

本年度の研究では,アダプティブ構造の一形態としてバリアブルダンパーの適用について検討を行った.昨年度の研究では,見かけ上負の剛性と正のエネルギー吸収性能をもったデバイスとしてバリアブルダンパーのセミアクティブ制御を行うことにより,長大橋の耐震補強による改善に適用する検討を行ってきたが,本年度はこの擬似負剛性セミアクティブ制御手法が高架道路橋の地震時応答を低減する手法としても有効であることを明らかにするための解析的検討を実施した.従来法として,粘性ダンパーによるパッシブ制御や免震支承を適用したものとの地震時応答の比較を行い,擬似負剛性セミアクティブ制御は構造物の見かけの固有周期を長くすることが可能であり,最大加速度応答の低減に効果的であること,既設のゴム支承の剛性を低くして,橋梁全体系を長周期化することで,擬似負剛性ダンパーの適用による地震時応答低減効果が向上することなどが明らかとなった.また本制御法を免震支持された液体貯蔵タンクの制震デバイスとして適用した検討も実施している.負剛性セミアクティブ制御手法をMRダンパーを用いて実現する方法についても検討し,その効果をリアルタイムハイブリッド試験により構造物に適用した場合の応答低減効果を実験的に検証した.その結果,MRダンパーにより構成した制御システムは,ほぼ想定された復元力特性を発揮できることを確認した.また免震支承に求められる常時と地震時の性能を分離して設計できる機能分離型免震システムを採用した際に問題となる軸力変動の影響を検討するために,床組の振動台実験を実施した.その結果,軸力変動が生じる場合でも既往の地震記録レベルでは応答値およびエネルギー吸収性能にはほとんど影響がないことを確認した.地震荷重は継続時間の短い動的な現象であることから、常時と地震時とで構造形態自体を変化させるというアダプティブ構造が有効であると考えられ、これに適した構造形態について検討した。まず港湾施設での荷役機械であるコンテナクレーンについて、免震機構として水平剛性を低くすることを大地震対策として考えると同時に、常時の荷役作業時における使用性の問題を解決するために常時において免震装置を固定する常時シアーピン付き免震装置について検討し、免震装置模型を対象としたサブストラクチャー仮動的実験を行った。その結果、シアーピンの破断に伴う免震装置の作動、固有周期のシフトおよび免震時応答を確認し、またシアーピンの設計破断強度がコンテナクレーンの応答に及ぼす影響について検討した。この際、シアーピンの破断に際して発生する衝撃的荷重が高次モード応答を発生させることを確認し、その対策として免震装置に粘性ダンパーを付加するなどの対策を講じることで緩和できることを示した。また、アダプティブ構造の一形態としてバリアブルダンパーの適用について検討を行い、見かけ上負の剛性と正のエネルギー吸収性能をもつたデバイスとしてバリアブルダンパーのセミアクティブ制御を行うことにより、構造物の地震時応答の低減と構造設計の合理化が可能であることを明らかにした。この考え方を長大橋の耐震補強による改善に適用したケーススタディを行い、意図された効果が得られることを数値計算により示した。本年度の研究では,アダプティブ構造の一形態としてバリアブルダンパーの適用について検討を行った.昨年度の研究では,見かけ上負の剛性と正のエネルギー吸収性能をもったデバイスとしてバリアブルダンパーのセミアクティブ制御を行うことにより,長大橋の耐震補強による改善に適用する検討を行ってきたが,本年度はこの擬似負剛性セミアクティブ制御手法が高架道路橋の地震時応答を低減する手法としても有効であることを明らかにするための解析的検討を実施した.従来法として,粘性ダンパーによるパッシブ制御や免震支承を適用したものとの地震時応答の比較を行い,擬似負剛性セミアクティブ制御は構造物の見かけの固有周期を長くすることが可能であり,最大加速度応答の低減に効果的であること,既設のゴム支承の剛性を低くして,橋梁全体系を長周期化することで,擬似負剛性ダンパーの適用による地震時応答低減効果が向上することなどが明らかとなった.また本制御法を免震支持された液体貯蔵タンクの制震デバイスとして適用した検討も実施している.負剛性セミアクティブ制御手法をMRダンパーを用いて実現する方法についても検討し,その効果をリアルタイムハイブリッド試験により構造物に適用した場合の応答低減効果を実験的に検証した.その結果,MRダンパーにより構成した制御システムは,ほぼ想定された復元力特性を発揮できることを確認した.また免震支承に求められる常時と地震時の性能を分離して設計できる機能分離型免震システムを採用した際に問題となる軸力変動の影響を検討するために,床組の振動台実験を実施した.その結果,軸力変動が生じる場合でも既往の地震記録レベルでは応答値およびエネルギー吸収性能にはほとんど影響がないことを確認した.
持続可能なワークライフ・バランスのあり方に関する研究

企業と労働者の双方の視点からみたワークライフ・バランス(WLB)の望ましいあり方に焦点を当て、「企業からみたWLBの費用対効果」、「企業と労働者の希望労働時間の乖離」、「WLBと雇用の伸縮性を両立する非正規雇用の可能性」の3つの研究を主として実施した。具体的には、WLB施策が企業の生産性を高める可能性があること、日本人の長時間労働の背後には企業の合理的な行動がある一方で、非効率性も検出されること、非正規雇用の就業条件が悪化している可能性があること、東日本大震災直後にはボランティアの労働供給行動が変化した可能性があることなどを実証的に示した。本研究は、企業と労働者の双方の視点からみたワークライフ・バランス(WLB)の望ましいあり方を多角的に検証することを目的とし、1.企業からみたWLBの費用対効果、2.企業と労働者の希望労働時間の乖離、3.WLBと雇用の伸縮性を両立する非正規雇用の可能性の3つの研究を主として実施する。2年目にあたる平成24年度は、計画通り、本格的な分析の実施、初稿の作成、中間発表等を進めた。まず、1については、企業調査の個票データを用いることで、低賃金という形で労働者が費用負担することによって企業のWLB施策の導入がなされる可能性を検証した。WLB施策の導入費用を労働者が負担することは補償賃金仮説として説明できるが、WLB施策に関して行動経済学や伝統的な労働経済学を用いて検証することは、これまでにはない試みといえる。さらに、前年度実施したWLB施策が企業の全要素生産性に与える検証を論文にまとめ、学術雑誌への投稿を行い、査読結果に基づくリバイスを行った。次に、2については、労働者へのアンケートデータをもとに、希望労働時間が賃金によってどの程度変化しうるのかという労働供給弾性値を仮想的に推定する研究論文をまとめ、学術雑誌への掲載許可をもらった。希望労働時間を切り口にした労働供給弾性値の推定も、これまでに例の少ない新しい取り組みといえる。このほか、前年度までに進めた労働時間への企業の需要制約と労働供給に関する研究論文のリバイスを進め、学術雑誌への掲載を果たした。一方、3については、非正規雇用者の賃金が地域寡占の影響を受けて低く抑えられているかを家計パネルデータを用いて検証した。このほか、1と2に関連し、より広い観点から日本人のワークライフ・バランスについて考察する研究として、東日本大震災後の災害ボランティアへの参加メカニズムに関する研究を行い、学術雑誌への掲載を果たした。本研究の目的は、企業と労働者の双方の視点からみたワークライフ・バランス(WLB)の望ましいあり方を多角的に検証することを目的とし、1.企業からみたWLBの費用対効果、2.企業と労働者の希望労働時間の乖離、3.WLBと雇用の伸縮性を両立する非正規雇用の可能性の3つの研究を主として実施することにある。最終年にあたる平成25年度は、計画通り、昨年度まで進めてきた研究をリバイスを実施するとともに、研究の総括と政策含意の導出を試みた。まず、1についてはWLB施策が全要素生産性に与える影響を検証した論文のリバイスを進めたほか、企業と労働者のWLB施策に対する主観的な費用のギャップを明らかにする検証を論文にまとめ、いずれも英文学術雑誌に掲載した。次に、2についても、企業の労働時間需要がどのような要因によって高まるかを明らかにした論文、労働者供給弾性値の国際比較を行った論文、働き方や労働時間が周囲の環境にどの程度影響を受けやすいかを検証した論文の執筆を行い、それぞれ英文あるいは和文学術雑誌に掲載した。さらに、3の関連として、非正規雇用の増減によって企業の人件費や賃金にどの程度の伸縮性が生じ、その結果としてデフレをもたらしたかを検証した研究を実施し、英文学術雑誌に掲載した。このほか、ワークライフバランスと労働時間に関する研究成果をまとめるとともに、研究の総括や政策含意の導出を行い、1冊の学術和書を作成し、刊行を決めた。以上、本年度は最終年度ということもあり、本研究プロジェクトの総括を兼ねて、13のテーマにおいて合計で6本の査読付論文を学術雑誌に刊行するとともに、1冊の学術和書の作成を行った。本研究は、企業と労働者の双方の視点からみたワークライフ・バランス(WLB)の望ましいあり方を多角的に検証することを目的とし、研究期間内に(1)企業からみたWLBの費用対効果、(2)企業と労働者の希望労働時間の乖離、(3)WLBと雇用の伸縮性を両立する非正規雇用の可能性の3つの研究を主として実施する。初年度は、計画通り、先行研究のサーベイや理論的・実証的フレームワークの構築、データセットの整備等を進め、3つの研究を以下のように進めた。(1)の「企業からみたWLBの費用対効果」については、各種の企業データを組み合わせることで、WLB施策が企業の全要素生産性(TFP)に中長期的にどのような影響を与えるかを検証した。

その結果、WLB施策が企業のTFPを無条件に高めることはないものの、労働の固定費用の大きい企業や中堅大企業など、特定の条件の整った企業では、WLB施策をとることでその後のTFPが大きく上昇することなどがわかった。(2)の「企業と労働者の希望労働時間の乖離」については、日本人労働者の長時間労働の原因が労働供給とともに労働需要に存在する可能性を検証した。その結果、企業特殊的な人的資本の蓄積されている労働者ほど、企業は長い労働時間を要請する傾向があることがわかった。さらに、(2)の関連研究として、労働時間規制が労働時間に与える影響を検証した従来の研究を拡張し、労働時間規制の適用除外者が本人の希望を超えて長く設定される傾向があることなども明らかにした。(3)の「WLBと雇用の伸縮性を両立する非正規雇用の可能性」については、労働者のパネルデータを用いて、同じ非正規雇用であっても、自ら選択したかどうかでその特性が大きく異なり、不本意で就いている不本意型の非正規雇用者は、主観的厚生水準が他の就業形態よりも低いものの、自ら選択して就いている場合は他と変わらないことなどがわかった。研究計画通りに研究を進めており、本格的な分析の実施、初稿の作成、研究成果の中間発表等を進めている。さらに、研究計画では必ずしも予定しなかった関連研究(ワークライフバランスを実現する1つの可能性としてのボランティアのあり方に関する研究)についても、東日本大震災に関するアンケート調査データを用いた検証を行うなど、研究の幅を拡げている。また、研究計画の2年目が終了した時点で、すでに以下の3本の論文が査読付き学術雑誌への掲載を許可されており、当初計画以上の進展を遂げているといえる。3.黒田祥子・山本勲「希望労働時間の国際比較:仮想質問による労働供給弾性値の計測」『日本経済研究』(近刊)研究計画通りに研究を進めており、先行研究のレビューやデータの整備、分析フレームの策定、予備的分析、統計的な検証作業を順次実施している。研究の最終年度にあたる平成25年度は、国内外の学術会議やワークショップ、セミナー等で研究成果の報告を積極的に行うことで、内外の研究社からコメントや意見を広くもらい、これまで着手した研究の改良を行ったのち、研究論文の学術雑誌への掲載に向けた取り組みを進める。特に、前年度に研究を進めたワークライフ・バランスと賃金プレミアムの関係に関する実証研究のリバイスに注力するほか、女性の活用と企業業績の関係に関する企業や労働者のデータを用いた検証を進め、ワークライフ・バランスとともに、ダイバーシティについての研究を進める。今後は、23年度に整備した分析用のデータや新たなデータセットの整備を進めるとともに、実証研究の内容をより精査し、初稿の完成を目指す。また、完成した初稿をもとに国内外の学術会議やワークショップ、セミナー等で研究報告を行うことで、内外の研究者からコメントや意見を広くもらい、研究内容の改良を進める。さらに、23年度に分析・検証を進める過程で、関連する研究を実施する必要性が高まったため、以下の研究も実施する。1つは、女性の活用と企業業績の関係についてであり、ワークライフ・バランスを企業・個人の双方から考える際には、女性雇用のあり方を研究することは避けて通れない。このため、個別企業の財務データやアンケートデータ等を用いて、女性雇用と企業業績の関係性について検証を進める。
自己組織化を利用したオンチップ血管モデルの開発―血管生理・病態の再現と理解

本研究課題において、微小流体デバイス上で長期灌流可能な血管網を血管新生を通じて構築する基盤技術を開発した。ヒト培養細胞と単離したマウス細胞のどちらを用いても、壁細胞が内皮細胞の構造体を取り囲み内腔に管腔を持つ、生体内を模す血管網を再構築することに成功した。また、毛細血管流相当の流速で培地を1週間に渡り灌流することが可能になった。さらに、血管新生時の細胞動態を定量評価するための技術基盤も整ってきた。最後に、同解析系を用いることで、内腔圧は内皮細胞による血管伸長現象を抑制的に制御していることを見出した。本研究課題では、微小流体デバイス上で長期灌流可能な血管網を構築する基盤技術を開発する。さらに、そのシステムを用いてより生体内の状態を模した血管新生現象を再現し、1)その分子細胞メカニズムの包括的理解、また、2)動脈分化等の血管成熟過程を理解することを目標としている。平成26年度においては、上記目標を達成するための基盤技術の確立を行った。これまでに、ヒト培養血管内皮細胞をヒト肺線維芽細胞と供培養することで、血管新生を通してデバイス上に管腔構造を持つ血管網を構築することができた。特に、細胞外基質と培地の条件を整えることで、目的にそった血管網を効率よく再構築する条件を確定させることができた。また、ヒト培養周皮細胞を内皮細胞とあわせて導入することにより、血管内皮細胞による血管構造の周りに周皮細胞がとりまく生体内をより模した血管網を再現することが可能となった。このことから、血管内皮細胞からなる血管網構造をより長期に持続さするためには周皮細胞の存在が重要であることがわかってきた。また、あらかじめ内皮細胞の細胞質を2色以上の色素で色分けし、それらの細胞を用いて上述の実験を行うことで(モザイク解析)、血管新生を行う際の一細胞動態を捉えることが可能となってきた。さらに、同時に、マウス大動脈から内皮細胞を酵素処理により粗単離し、培養増幅後、磁気分離装置を用いてCD31陽性細胞へと純化することが可能となってきた。これまでに、粗単離した内皮細胞を用いて、前述と同様、微小流体デバイス上で管腔構造をもつ血管網を再構築できることを確認している。以上の様に、次年度の研究に必要な基盤技術は確立できてきている。本研究課題では、微小流体デバイス上で長期灌流可能な血管網を構築する基盤技術を開発し、血流依存的な血管新生メカニズムと動脈分化などの血管成熟化メカニズムの解明に繋げることを目標とした。平成27年度には、前年度に構築可能とした微小流体デバイス上の血管網内腔に培地を灌流する技術開発を行った。微量流量で送液制御可能なシリンジポンプを用いることで、構築した血管網にヒト毛細血管血流に相当する0.5-1mm/sの流速で、約1週間にわたり培地を灌流することが可能となった。新生血管内腔(血管先端は盲端)という限られた空間を灌流する場合、せん断応力に加えて、血管内腔圧が上昇し垂直抗力や伸展張力などの物理的力が加わる。したがって、灌流による物理的刺激が与える影響を明確化するために、さらに、血管内腔に静水圧を加え垂直抗力(+伸展張力)のみを変化させ得る解析系を構築した。これまでに、垂直抗力を増加させることで血管新生プロセスにより形成される血管形態の異常が観られる興味深い知見が得られている。以上の様に、微小流体デバイスに血管新生プロセスを通して血管網を構築し、血流刺激を与えうる解析系が確立できた。現在、血管新生における血流の影響や血流刺激を用いた血管分化誘導などの解析を進めている。今年度の大きな目標であった、ヒト培養細胞を用いた微小流体デバイス上での灌流可能な血管網の構築技術、並びにマウス大動脈組織から機能性を保持した質の良い血管構成細胞の単離(特に血管内皮細胞)技術の確立がほぼできたので、おおむね順調に進展していると自己評価した。血管生物医学平成27年度においては、微小流体デバイス上に作製した血管網を長期維持するための一つのキーテクノロジーであるマイクロ流体デバイス上の灌流技術の確立に注力する。それにより、血管網の長期維持のみならず、血管内腔の灌流による剪断応力や垂直抗力が血管形成過程、リモデリングおよび血管形態保持過程にどのような影響を及ぼしているかを検討する。物品費および旅費使用にて小額の端数が生じた。次年度の計上予算にあわせて、物品費として使用する計画である。
細胞遊走活性を有する新規生理活性物質とその受容体の探索

Lipid Yの構造を同定するため、前年度に引き続いてまずはlipid YをHPLCで精製することを試みた。Lipid Yを分泌するHT29細胞の培養上清をHPLCで分画しMSなどの検出器により構造を同定しようと考え、まずはHPLCにかける条件を決める目的で簡便な固相抽出カラム(ODS)を用いた逆相分画を試してみてLipid Yがどのような画分にくるか、すなわちどの画分にA2058遊走活性が見られるかを検討した。その結果、Lipid Yは中性脂質であるというこれまでの結果を裏付けるように、ODSカラムではアセトニトリル濃度が80%以上のフラクションに対しA2058細胞は遊走すること、すなわちLipid Yが溶出することが分かった。実際に培養上清抽出脂質をC18カラムにローディングしHPLCで分画したところ、アセトニトリルのグラシエンド(50%-100%)中にはLipid Yは溶出されず、活性はアセトニトリル100%のwash画分に検出された。この活性画分に含まれる物質のピークの検出をUVまたは蒸発光散乱検出計で試みたが、wash画分には全くピークは見られなかった。また、この活性画分を、細胞遊走活性のないA2058細胞の培養上清から抽出した脂質を同様にHPLCにかけて得られた画分と比較した(HPLC,MS)が、大きな違いを見いだすことはできなかった。おそらく培養上清中に含まれるLipid Yはとても微量であり、HPLCで精製する際には多量の培養上清から抽出した脂質を持ち込む必要があると考えられる。Lipid Yの受容体を同定するために既知のケモカイン・脂質メディエーター受容体を中心にスクリーニングを続行したが、残念ながらめぼしい受容体は引っかかってこなかった。GPCRスクリーニングの系に関しては、G16よりもGiに強いGq-GiのキメラGタンパク質を用いた系を導入するなどの工夫が必要である。Lipid Yの受容体を探索する目的で、作製したオーファンGPCRライブラリー(90種類)のスクリーニングを行った。方法としては、すでに確立している、ルシフェラーゼをレポーターとしたレポータージーンアッセイとオーファン受容体の発現系を組み合わせたオーファン受容体スクリーニング系を用いた。この系ではどのようなGPCRとでもカップリングが可能なGタンパク質であるG_<16>,を用いており、強制発現させたオーファンGPCRにやはり強制発現させたG_<16>がカップリングするため、リガンドがGPCRに結合するとどのようなGPCRでもG_<16>からのシグナルが細胞内に伝えられ、最終的にコトランスフェクションしたルシフェラーゼの発現が誘導される仕組みとなっている。スクリーニングに用いるリガンドとしては、Lipid Yがヒト大腸癌由来細胞であるHT29細胞の培養上清に豊富に含まれていることから、1段階目にHT29細胞の培養上清から抽出した脂質、さらに1段階目に反応の見られたものに対して2段階目に抽出脂質を固相抽出法により分画した中性脂質画分を用いた。その結果、1段階目のスクリーニングで再現性よく応答したオーファンGPCRは3つあり、そのうち1つが2段階目のスクリーニングでも反応が見られた。最終的に残った受容体はTGR5であり、近年胆汁酸をリガンドとするGPCRとして報告されている。このTGR5が、Lipid Yに反応し遊走する細胞であるA2058細胞(ヒトメラノーマ由来)に実際に発現しているかどうか、また、A2058細胞が胆汁酸に対し遊走能を示すかどうかは現在調査中である。Lipid Yの受容体を同定するために前年度に行ったオーファンGPCRライブラリー(約90種)のスクリーニングの結果、受容体の候補とした胆汁酸受容体として近年報告されたTGR5が上がってきた。そこで、Lipid Yが胆汁酸の一種であるかどうかを検証するために、(1)Lipid Yに対し遊走する細胞であるA2058細胞が、TGR5の最も強力なリガンドであるDeoxycholic acid(DCA)に対して遊走するかどうかを検証し、(2)TGR5に対するLipid YとDCAのIuciferase assayにおけるdose-responseの比較を行った。その結果、(1)ではDCAのA2058遊走活性は高濃度(100μM)にすれば見られるもののLipid Yに比して著しく弱いことが分かった。また、(2)ではLipid YがA2058の遊走を最も引き起こす濃度でも、1μMのDCAに及ばないことがわかった。以上の結果よりLipid Yの受容体は残念ながらTGR5ではないことが強く示唆された。今後は既知のケモカイン受容体や脂質受容体、fMLP受容体もスクリーニングする予定である。Lipid Y受容体の探索と平行してLipid Yの構造を解明するための実験も行っている。HPLCで分画し、MSなどの検出器により構造を同定しようと考えているが、まずはHPLCにかける条件を決める目的で固相抽出カラムを用いた逆相分画(ODSカラム,アセトニトリル-水系)をしてみてLipid Yがどのような画分にくるか、すなわちどの画分にA2058遊走活性が見られるかを検討した。その結果、Lipid Yは中性脂質であるというこれまでの結果を裏付けるようにアセトニトリル濃度が高くなるに連れてLipid Yは溶出することが分かった。現在はこの条件をもとにHPLCでの分画を試している。

Lipid Yの構造を同定するため、前年度に引き続いてまずはlipid YをHPLCで精製することを試みた。Lipid Yを分泌するHT29細胞の培養上清をHPLCで分画しMSなどの検出器により構造を同定しようと考え、まずはHPLCにかける条件を決める目的で簡便な固相抽出カラム(ODS)を用いた逆相分画を試してみてLipid Yがどのような画分にくるか、すなわちどの画分にA2058遊走活性が見られるかを検討した。その結果、Lipid Yは中性脂質であるというこれまでの結果を裏付けるように、ODSカラムではアセトニトリル濃度が80%以上のフラクションに対しA2058細胞は遊走すること、すなわちLipid Yが溶出することが分かった。実際に培養上清抽出脂質をC18カラムにローディングしHPLCで分画したところ、アセトニトリルのグラシエンド(50%-100%)中にはLipid Yは溶出されず、活性はアセトニトリル100%のwash画分に検出された。この活性画分に含まれる物質のピークの検出をUVまたは蒸発光散乱検出計で試みたが、wash画分には全くピークは見られなかった。また、この活性画分を、細胞遊走活性のないA2058細胞の培養上清から抽出した脂質を同様にHPLCにかけて得られた画分と比較した(HPLC,MS)が、大きな違いを見いだすことはできなかった。おそらく培養上清中に含まれるLipid Yはとても微量であり、HPLCで精製する際には多量の培養上清から抽出した脂質を持ち込む必要があると考えられる。Lipid Yの受容体を同定するために既知のケモカイン・脂質メディエーター受容体を中心にスクリーニングを続行したが、残念ながらめぼしい受容体は引っかかってこなかった。GPCRスクリーニングの系に関しては、G16よりもGiに強いGq-GiのキメラGタンパク質を用いた系を導入するなどの工夫が必要である。
「疎水性ナノ反応場」の原理に基づいたフラグメント核酸合成システムの研究

本研究では、核酸オリゴマーを有機溶媒中に可溶化することができる疎水性支持体を新たに開発し、これらの分子挙動を制御することによって、これまで合成困難であった核酸配列を効率的に合成することができる、新たな反応システムを確立することに成功した。本システムで用いられる疎水性支持体は、ナノ領域で安定に分散させることが可能であるとともに、反応性が著しく向上することが明らかになった。核酸オリゴマーは、核酸医薬品、ナノ電子ワイヤー、DNA折り紙、DNAテンプレート合成など、革新的な機能とその利用によって、近年、大きな注目を集めている。一方、これらの合成技術は、ホスホロアミダイト試薬を用いた固相法が広く利用されている。当該技術は、不溶性のポリスチレン樹脂やガラスビーズを支持基盤として核酸モノマーを逐次伸長していく方法であり、現在では多様な自動合成機が市販され、医薬品や機能性素材の探索において極めて重要な役割を果たしている。しかし、固相合成法は殆どが少量のプライマー用途に限定されており、近年進展が目覚ましい研究領域においては合成困難な配列が顕著に増加している。とりわけ、各種固相基盤の改善やポリエチレングリコールなどを用いた方法が提案されているものの実践的ではなく、難シークエンスの核酸オリゴマーを確実に合成できる新たな方法論を確立することが急務となっている。本研究では、従来の合成法では困難な核酸オリゴマーについて、新規核酸合成システムを構築することによって、実践的で波及効果の高い合成プロセスの確立を目指している。申請者がこれまでに見出した、「疎水性ナノ反応場」の原理に基づく多段階液相合成プロセスを用いることにより、従来合成が困難であったRNAオリゴマーの効率的な合成方法を確立した。本システムは、有機溶媒に可溶な液相支持体を利用することで、反応溶媒において高い反応性を示すと共に、極性溶媒の選別によって目的物質のみを簡便に析出させることを可能にする。これより、固相法に比べカップリング効率が飛躍的に向上するとともに、煩雑な分離操作を著しく簡易化することを可能になった。さらに、本液相支持体は、サブミクロン以下の微細な凝集構造を安定に形成するため、反応促進場として機能し、試薬当量数の大幅な削減や量産化について寄与することを見出した。核酸オリゴマーは広範な研究領域で重要な役割を果たしている一方で、現在、合成することが困難な配列が顕著に増加している。これは、反応性の低い固相支持基盤を用い、核酸モノマーを順次伸長していくことが要因であり、新たな現象の解明や機能探索において大きなボトルネックになっている。本研究は、「疎水性ナノ反応場」の原理に基づいたフラグメント合成システムを構築することによって、従来困難であった核酸オリゴマーを実践的かつ効率的に合成し、広範な学術領域の発展に広く貢献するものである。本システムを確立するためには、新規リンカー分子を設計し、液相支持体に導入する必要がある。ホスホロアミダイト試薬由来のフラグメント鎖は、酸や熱、塩基、還元に対して不安定な保護基を有する上に、伸長過程に亜リン酸エステルをリン酸エステルに変換する酸化反応が含まれるため、これらの条件を切断反応に適用することは現実的に回避されるべきである。このことを踏まえ液相支持体分子を新たに合成し、ターゲット難シークエンスに必要な合成用核酸フラグメント鎖について、その合成ルートを確立し、新規リンカー分子の最適切断条件を探索することを計画した。本年度は新たに疎水性液相担体を8種類合成した。いずれの化合物についても、簡便かつ低コスト、さらには100グラム以上のスケールを持って合成することが可能になった。さらにこれらの担体は、リンカー分子の構造によって溶解度が著しく変化することが明らかとなった。このことは有機溶媒中においても液相担体が疎水総合作用や水素結合によって非常に弱い会合状態を形成していることを意味している。同時に、平均粒径が30nmと高い均一性を持って分散していることから、核酸伸長反応において高い等価性と反応性を有する合成システムになることが期待される。液相合成反応における可溶性担体の分散状態は、適用する反応を確実に再現するうえで極めて重要な役割を果たしている。つまり、可溶性担体を用いた液相合成は、均一に担体が分散している状態においても、反応の不均一性を発現することが従来の問題点であり、欠損配列の生成等、純度の低下につながっていた。当該年度の研究においては、これら液相反応に関わる課題を克服する重要な知見が得られたと同時に、液相反応に期待される反応性を最大限引き出すことが可能であることから、当初の計画通り進捗していると考えている。また、反応に用いられる疎水性液相担体を100グラム以上のスケールで容易に合成可能なルートが確立できたことから、今後の研究を大きく推進することが期待されるため。当該研究で合成した液相担体を用いて、Gカルッテット領域を含む、G,C含量の高いRNA鎖を順次ブロック伸長を実施していく。最終的に以下に示す反応実績の実現を目指す。