hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織発生過程におけるGARP complexの役割

GARP complexの既知構成因子ならびに我々が新規に同定した因子の機能欠損マウスを用いて表現型解析を行ったところ、これら遺伝子が機能的に3つのグループに分類されることがわかった。これはGARP complexが発生過程において構成因子を取り替えることで様々な役割を果たすことを示す新たな発見である。さらに、GARP complexの組織発生過程における役割を解明するモデルとして、肝臓特異的Vps52欠損解析を行ったところ、オートファジー関連遺伝子の肝臓特異的欠損胚と同様の表現型を呈することを突き止めた。これはGARP complexがオートファジーと関連があることを示す重要な証拠と言える。VPS52と複合体を形成するタンパク質としてVPS53, VPS54が知られている。Vps52を欠損するマウス胚は着床直後に胚体組織の分化不全により致死となるが、Vps53欠損胚もVps52欠損胚と同時期に致死となることがわかった。一方、Vps54変異胚は発生中期まで生存し、神経系の発育不全と心血管系の形成不全により致死となる。致死直前のVps54変異胚を調べたところ、胚体外膜の一つである卵黄嚢の血管が貧弱であり、さらに全身の血流の低下もしくは造血不全と思われる表現型が新に確認された。今後これら変異マウス胚の表現型をさらに詳細に解析することで、初期発生過程におけるVPS52, VPS53, VPS54の機能的役割の解明に加え、血管新生・造血組織の発生のメカニズムを理解する上での重要な情報が得られると期待される。マウスEpiSC(エピブラストステムセル)は、naive型多能性幹細胞であるマウスES細胞に対して、primed型多能性幹細胞と呼ばれており、マウスES細胞よりわずかに分化した状態にあることが知られている。受精後3.5日胚よりVps52欠損ES細胞の樹立を試みたが正常核型のVps52欠損ES細胞を得ることが出来なかった。一方、EpiSCはさらに発生の進んだ受精後5.5日胚・6.5日胚より樹立されるのだが、Vps52欠損胚からEpiSCの樹立を試みたところ、正常胚と同程度の効率でVps52欠損EpiSCを樹立できることが確認された。Vps52欠損ES細胞自体は維持培養できることから、着床前胚からES細胞へと転換する際にはVPS52の働きが必須である一方、着床後胚からEpiSCへ転換する際にVPS52は不要であることが示唆される。初期胚性致死変異マウスより同定したVps52遺伝子の哺乳類発生過程における役割を明らかにするために、Vps52およびその関連遺伝子の変異マウス系統の表現型解析を行った。Vps52欠損胚およびVps53欠損胚はほぼ同様の表現型を示すのに対しVps54欠損胚は発生中期まで生存することから、Vps52/53/54は常に協調的に機能すると考えられていたこれまでの通説が覆される可能性が示唆される。Vps52欠損ES細胞の樹立を試みたが、数百個の着床前胚から1株も樹立することが出来なかった。しかし、Vps52欠損胚は着床直後まで生存していることから着床直後胚より樹立される多能性幹細胞“EpiSC"の樹立を試みた。それに先立ち、高品質のEpiSCを高効率で樹立する手法の開発を行い、75-95%の効率でEpiSCを樹立する技術を確立した。この技術を用いてVps52欠損EpiSCの樹立を試みたところ、まだ予備実験の段階だがVps52欠損EpiSCが樹立できることがわかった。この成果は、着床前胚に存在する多能性幹細胞から培養条件下でES細胞へ転換するためにはVps52が必要だが、着床直後胚の多能性幹細胞からEpiSCへの転換にはVps52は必須ではないことを意味している。この結果は同時に、着床前胚内の多能性幹細胞とES細胞は質的に異なっているのに対し、着床直後胚内の多能性幹細胞とEpiSCは質的に類似していることを示唆している。初期胚性致死変異マウスより同定したVps52遺伝子がコードするVPS52タンパク質を含むGARP complexの、哺乳類発生過程における役割を明らかにするために、Vps52およびその関連遺伝子の変異マウス系統の表現型解析を行った。GARP complexの構成因子としてVPS52の他にVPS51、VPS53、VPS54が知られている。VPS53およびVPS54のノックアウトマウスはすでに存在しており表現型解析は昨年度に行ったが、VPS51のノックアウトマウスは作製されていなかったため、CRISPR/Cas9systemを利用してノックアウトマウスを作製した。加えて、VPS52と結合するタンパク質として新たに同定したCCDC132およびTSSC1のノックアウトマウスも同様に作製した。これらの表現型の確認は現在進めているところであるが、予備実験の段階においてVps52ノックアウトマウスで認められる初期胚致死と同様の表現型が確認された。上記の6遺伝子のうちVps54を欠損させた時のみ表現型が異なっていることから、VPS54は哺乳類発生初期においてはVPS52を含むタンパク複合体の機能には必須ではなく、GARP complexを構成する因子は発生過程において必要に応じ入れ替わっていることが示唆される。Vps52の組織発生過程における役割を解明するため、各種組織特異的Cre発現マウスを用いて解析を進めてきた。肝臓特異的Aflp-Creならびに膵臓特異的Ptf1a-Creが極めて組織特異的かつ効果的にノックアウト解析を行えることを確認した。

現在これらマウスを用いて肝臓特異的Vps52ノックアウト、膵臓特異的Vps52ノックアウトの解析を進めている。肝臓特異的ノックアウトでは、オートファジー関連遺伝子Beclin1の肝臓特異的ノックアウトと極めてよく似た表現型が確認された。このことは、GARP complexがオートファジー制御に何らかの形で関わっている可能性を示唆している。新たに同定したタンパク質も含めGARP complexを構成する因子のノックアウトマウスを作製し、発生過程における表現型解析を進めることができた。GARP complex構成因子が発生過程で動的に変換されることを強く示唆する結果が得られており、これまでの知見を覆す新たな成果である。また、肝臓特異的Vps52ノックアウト解析から、GARP complexがオートファジー制御と関わりを持っていることを示唆する結果が得られた。当初予期していなかった結果であるが、GARP complexがオートファジー制御に関わる因子として新たに付け加えられる可能性が出てきた。VPS51, VPS52, VPS53, VPS54は一分子ずつ結合してGARP complexを形成する。そのため、これら遺伝子を欠損すると同様の表現型が現れると予想され、確かにVps51、Vps53それぞれの欠損胚はVps52欠損胚と同様に着床直後に致死となることを突き止めた。一方、Vps54欠損胚は発生中期まで生存し、その過程で卵黄嚢の血管形成に著しい異常が現れることから、Vps54は血管形成に重要な役割を担っていることが新たに判明した。さらに、GARP complexを構成する因子として新たに同定したCCDC132ならびにTSSC1を欠損させたマウス系統も新規に作出し、表現型解析を行ったところ、これら2遺伝子の欠損胚はお互いに同様の表現型を示し、受精後8.0日頃に発生が停止することがわかった。欠損胚では臓側内胚葉に胞状の小突起が生じていることが確認された。これは、変異によって胚体外胚葉ならびに胚体外外胚葉の発達が著しく阻害されている状況において臓側内胚葉は増殖を続けたことが原因で細胞層が突出したためと考えられる。このように、GARP complexの構成因子それぞれを欠損させたときの表現型が幾つかのグループに分類されることから、GARP complexは発生過程において、組織特異的、時期特異的に必要とする構成因子を使い分けることで様々な生命現象に関わっている可能性が示唆される。Vps52が発現している組織の一つである肝臓で特異的にVps52を欠損させたところ、オートファジー関連遺伝子Beclin1を肝臓特異的に欠損させたときと極めて類似した表現型を示した。このことから、GARP complexがオートファジーの制御に直接あるいは間接的に関与している可能性が示唆される。Vps52欠損細胞を用いてプロテオーム解析を行ったところ、オートファジーと関連のあるタンパク質が同定された。これらの結果からも、GARP complexとオートファジーとの強い関連性が示唆される。GARP complexの既知構成因子ならびに我々が新規に同定した因子の機能欠損マウスを用いて表現型解析を行ったところ、これら遺伝子が機能的に3つのグループに分類されることがわかった。
原爆・被爆体験の継承における「普遍的平和」の概念：言説変遷と国際的影響の実証研究

本実証研究は、原爆・被爆体験の継承における「普遍的平和」の概念に焦点を当て、被爆という負の個人記憶が、世界の恒久的平和を希求する国際的集合記憶へと昇華されたプロセスを解明する。被爆直後から、都市復興とコミュニティ再構築を経て現在に至るまでに、被爆者や非被爆者が、「恒久的平和に向けて行動する市民」の「当事者性」をどう形成してきたのか、その過程と条件を探る。記憶継承において、平和への「責任感」や「国際的な使命・役割」ほか社会参画の概念と「居場所」獲得の概念とが、普遍的な平和希求の概念構築にどう関与したか解明する。更に、「当事者」言説の共有が、欧州の非核・平和言説の発展に関与する実態を解明する。
放電光定量化計測による雷雲内放電誘発に関する基礎研究

本研究課題では、雷雲中での消雷を想定したレーザ光生成プラズマの諸特性を明らかにすることを目的としているが、以下のような研究成果が得られた。プラズマ生成実験は、微水滴を標的として行った。この条件下では、プラズマ生成に必要なレーザ光エネルギーのしきい値は、約1/3に低下する。イメージコンバータカメラとCCDカメラよりなる放電光定量化測定装置を用いて、プラズマの発光の空間分布について、その時間変化を測定することに成功した。この実験データを解析するプログラム群をパーソナルコンピュータとワークステーション上で新たに開発し、これによる解析結果を用いて、プラズマの成長および減衰過程を定量的に評価することができた。一方でこの現象の物理機構を明らかにするべく、点爆発より生じる衝撃波についての数値計算を行った。実験結果とよく適合する計算結果が得られ、レーザエネルギー注入後のプラズマの振る舞いは、衝撃波の伝搬特性で記述できることが判明した。さらに、放射光のスペクトル解析実験を行った。放射光の絶対強度を時間および波長の二次元空間内で測定した。事前に、空気中およびSF_6ガス中での短ギャップ放電を対象として、システムの較正実験を行い、その有効性を確認した。測定法をレーザ光生成プラズマへ適用し、密度と温度の推定を行ったところ、他のグループの報告に近い値が得られた。当研究グループでは、実験をさらに弱電界印加時の誘導電流測定へと発展させている。この結果を本研究課題の成果と合わせることにより、より詳細かつ信頼性のある知見が得られると期待される。雷雲内放電誘発に向けての基礎実験を行うべく、既設炭酸ガスレーザ装置、イメージコンバータカメラ、CCDカメラ、および超音波加湿器よりなるレーザ光生成プラズマの発光定量化計測システムの構築を行った。超音波加湿器の発生する蒸気を、レーザ光集光用レンズの焦点付近にフレキシブルホースで導き、これを標的としてレーザ光を照射し、プラズマを生成した。プラズマの発生は、照射レーザ光のエネルギーが0.30.5Jを敷居値として起こるが、この値は蒸気がない場合の1/3以下である。またこの値は、水滴の大きさと流量より見積もった水滴存在の密度を考慮すると、集光したレーザ光が、水滴の絶縁破壊エネルギー密度を形成する体積空間内に水滴が存在するか否かに対応するといえる。レーザ発振とカメラ系を同期することにより、生成プラズマの発光の経時変化を駒撮り撮影した。イメコンの像はCCDカメラによりディジタル化し、各駒ごとに計算機で解析・処理した。発光強度の経時変化から、弱いレーザ光照射が続くプラズマ発生後の数マイクロ秒の間、プラズマが成長していることが確認でき、また発光強度の空間積分値の時間変化が、同時測定の光電管出力波形と一致することもこれを裏付けている。一方、発光の空間分布の経時変化については、微小点の爆発より発生する衝撃波の発展を相似則により解析したものと比較した結果、第一近似での一致をみた。他に、生成プラズマに弱電界を印加し、印加電極に誘起される誘導電流の測定を行った。プラズマの発生がレーザ光や発光に依存するモデルをもとにした数値計算との照合から、現在解析を進めつつある。次年度は誘導電流の解析と、より高精度の衝撃波の解析を継続し、紫外線の重畳照射の効果についての実験に加えて、実際の放電誘発へ向けての基礎実験を遂行して行く予定である。

この実験データを解析するプログラム群をパーソナルコンピュータとワークステーション上で新たに開発し、これによる解析結果を用いて、プラズマの成長および減衰過程を定量的に評価することができた。一方でこの現象の物理機構を明らかにするべく、点爆発より生じる衝撃波についての数値計算を行った。実験結果とよく適合する計算結果が得られ、レーザエネルギー注入後のプラズマの振る舞いは、衝撃波の伝搬特性で記述できることが判明した。さらに、放射光のスペクトル解析実験を行った。放射光の絶対強度を時間および波長の二次元空間内で測定した。事前に、空気中およびSF_6ガス中での短ギャップ放電を対象として、システムの較正実験を行い、その有効性を確認した。測定法をレーザ光生成プラズマへ適用し、密度と温度の推定を行ったところ、他のグループの報告に近い値が得られた。当研究グループでは、実験をさらに弱電界印加時の誘導電流測定へと発展させている。この結果を本研究課題の成果と合わせることにより、より詳細かつ信頼性のある知見が得られると期待される。
高親和性糖輸送担体の発現抑制による細胞増殖抑制作用に関する研究

我々はすでにヒトGLUT1遺伝子を単離し、転写開始部位および、5'-上流域の塩基配列を決定し報告した。さらに消化器癌や脳腫瘍でGLUT1の発現が著しく亢進し、癌細胞における細胞増殖に寄与する可能性を示した。本年度の研究において、この転写調節領域のDNA断片を制限酵素により処理し、数種類のdeletion mutantを作製してルシフェラーゼ発現プラスミドに組み込み、リン酸カルシウム法によりヒト肝癌細胞株HepG2に導入し、transient expressionの系でdeletionによる転写活性の変化を検討した。-317+181のDNA断片に対する5'-側からのdelectionでは、上流約200塩基を欠失させた-102+181のDNA断片までがきわめて強い転写活性を示し、さらに60塩基を欠失させた-40+181のDNA断片では活性が1/10まで低下し、このDNA断片から3'-側を欠失させた-40+55のDNA断片ではさらに活性が1/4となった。以上の知見より、ヒトGLUT1遺伝子の転写調節には転写開始点の上流-102塩基から下流+181塩基が特に重要であることが明らかとなった。引続き、培養したHepG2細胞より核抽出物を精製し、上記の-317+181のDNA断片を制限酵素処理して得た-312-168、-226-55、-102+74、-13+181の4種類のDNA断片を^<32>Pによって末端標識したプローブを用いてゲルシフト・アッセイを施工した。使用した4種類のプローブのいずれにも核蛋白が用量依存的に結合した。核蛋白の結合部位を特定するために行ったDNase Iフット・プリントでは、数カ所に核蛋白の結合によると考えられるラダーの変化が認められ、CCAAT配列、TATAA配列の他に、4カ所のTPA response element(TRE:TGACTACA)類似の配列を中心とする部分がDNase Iによる影響を受けにくくなっていた。先のdelection analysisの結果と合わせると、4か所のTRE類似配列のうち、-65付近と+60付近の配列がヒトGLUT1遺伝子の発現に深く関与していると予想されるため、今後、site directed mutagenesisなどの方法で変異を導入して転写活性の変化を検討する予定である。
インドネシアにおけるマラリア薬剤耐性の起源と現状

インドネシアは群島国であり,島によって住む民族が異なるようにマラリア流行様式も島によって異なるだけでなく,1つの島の中でも地域によって異なる。この多様性を生み出しているのは媒介蚊の種を決定する自然環境であり,人間側の生活習慣,貧困であった。しかし現在の社会経済の発達は流行地図,様式を大きく変動させている。都市化はこの地域でのマラリアを撲滅へと導いている。この典型がジャワ島やバリ島であり,私達が調査を行なったロンボク・スンバワ島においても,これまで重要な流行をもたらしていた沿岸マラリアは,経済発達のためロンボク島では一部の未開発地域を残して減少,消滅へと向かっている。ところが人口増加,社会経済活動の変化は,海岸のすぐ背後に控える森林丘陵地帯へと人々の生活圏を拡大させた。ロンボク調査地では今やマラリア流行は森林部でこれらの人々の間で起きていることが判明した。同じようなことがスンバワ島南部の新しい入植地で起きていた。どのような条件が入植地でのマラリア流行を引き起こしたのかは現在調査中であるが,旧村落から遠く離れた三つの入植地で高いマラリア流行が起きていることが発見された。すべてに共通して言えることは,マラリア流行地は医療の手の及ばないところに発生することである。興味あることは,これまでマラリア免疫は高度流行地での繰り返し感染によってのみ獲得されるという教科書的考えがここではあてはまらないことである。ロンボク森林丘陵部のマラリア流行は中等度であるにかかわらず,10才を超えるとマラリアに抵抗できる免疫を獲得すること,新しい入植地でも入植後78年を経た村では15才以上の成人には抗マラリア免疫があることが明らかになってきた。いずれの地域でも熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性関連遺伝子のひとつpfcrtは100%の耐性変異,もうひとつのpfmdr-1は50%を越す耐性変異を示した。インドネシアでは1970年代始めにイリヤンジャヤとカリマンタンで最初の熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性が発見され,その後全国に広がっているが,現在でもマラリア治療薬の第一選択薬はクロロキンで第二の選択薬はSP合剤である。クロロキン耐性変異の全容は明らかでないが,Plasmodium falciparum chloroquineresistance transporter gene(Pf CRT遺伝子)のアミノ酸配列72-76までの耐性変異配列がアジア,アフリカ型とパプアニューギニア,南米型に分類されることが知られていた。しかし近年各地域からの変異データが集められてくると,2つの起源だけでは説明できないものがある。とくにインドネシアではいったいどのように発生して広がってきたのかよくわかっていない。パプアでは近年パプアニューギニア型の他に多数のアジア型が認められることが示された。私達の調べたバリ島東側のロンボク島では,大部分のパプアニューギニア型に混じって少数のアジア型が認められた。多様性マーカー遺伝子(Glurp)からみると,少数アジア型については単一クローンが拡大したものであった。すなわちこの地では古くからパプアニューギニア型が入り込んだか,この地で独自に発生した状況のもとに,最近アジア型が移入されたことになる。同じ現象についてカリマンタン,ジャワ島で調査が進められている。インドネシアにおける従来の抗マラリア剤(クロロキン,SP合剤)は,多くの治療失敗例を生み出し,熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性は全土に広がっていると考えられる。インドネシア政府もこれに対し,マラリア治療方針をアルテスネート・アモディアキンの併用療法へと切り替えつつある。

私達はロンボク・スンバワ島の2ヶ所から採取した熱帯熱マラリア原虫が,クロロキン耐性関連遺伝子についてはPfcrtについてはほぼ100%,pfmdr1については約50%の変異を認めている。この結果に基づき両島においてアルテスネート・アモディアキン併用療法の効果試験を行った。方法は治療後28日間の追跡調査によった。どちらの島においても併用療法は全例に奏効し,みるべき副作用も示さなかった。クロロキンなどと同様成熟ガメトサイトに対する殺滅作用は認めなかった。ガメトサイト形成阻止作用は認められた。例数が少ないので何とも言えないが,治療後1週間目のPCR陽性患者(半数はガメトサイト陽性)のうちpfmdr-1の変異型86Yより野生型N86が大部分を占めたことは何かの意味をもつのだろうか。インドネシア全体の耐性遺伝子変異の多様性を調べるために,上記両島以外にジャワ島東部パチタン地域,東カリマンタン,スパク地域,スマトラ島リアウ州タンビラハン地域において熱帯熱マラリア原虫材料が収集された。ロンボク島ではパプアニューギニアタイプと呼ばれるPfcrt変異が42/48(87.5%),スンバワ島では21/21(100%)で,変異の多様性は少ない。これまで分析された中では東カリマンタンにおける多様性が大きく,インドネシアの最初のクロロキン耐性出現報告が東カリマンタンとイリヤンジャヤ(現パプア)島であることから,両地域では,多くのクロロキン耐性を生じさせる風土があり,そのうちの一部が他地域へと移動したのであろうか。
食物網が担う「第二の生物ポンプ」-琵琶湖で解く地球環境変化の謎-

植物プランクトンによって生産される有機物は食物網に取り込まれ、一部は高次生産へ、一部は分解され、他は湖底へ沈降する。したがって、有機物の湖底への輸送、すなわち沈降粒子束は湖沼の生物過程を反映するものと考えられる。本研究は、地球環境変動に対する水界生態系の応答を理解するため、琵琶湖において生物生産と分解過程における律速要因を解明するとともに、沈降粒子束と食物連鎖との関係を明らかにすることを目的として行った。得られた結果は下記の通りである。1)基礎生産は5m以浅ではリンに、それ以深では光に律速される。2)細菌による有機物分解は表水層ではリンに、深水層では温度に律速される。3)沈降粒子束は基礎生産の12%程度であり、内生性有機物の殆どは有光層内で動物プランクトンや細菌に消費される。4)沈降粒子束の2030%は底生生物(ヨコエビ)の純生産として利用される。5)ただし、沈降粒子束は季節により異なり、そのピークは外部由来の物質による場合と内部生産物質による場合がある。前者は降雨が多い時、後者は動物プランクトンが少なくケイ藻などの大型植物プランクトンが増殖したときに見られる。以上のように、琵琶湖の生物生産・分解速度と沈降粒子束は光-温度などの物理環境や食物網構造に影響されると同時に、集水域から運ばれる栄養物質(栄養塩・有機物)にも共役的に強く依存していることが明らかとなった。これらの結果は、降雨量や光環境を支配する気候変化によって生産・分解速度や湖底への物質輸送量が大きく変化することを示している。1996年7月より1997年3月にかけて琵琶湖北湖に設定した2定点おいて、有機物生産と分解・鉛直輸送についての集中的な観測を行うと共に、それら生物過程において鍵となる化学物質、特に脂肪酸類の消長について検討を行った。およそ月1回の間隔で行った集中観測により、琵琶湖の基礎生産はリン供給量に律速され、その律速強度は降雨と動物プランクトンによるリン回帰速度に依存していることが明らかとなった。鉛直輸送効率(沈降速度/基礎生産速度)は卓越する動物プランクトンにともなって変化することが示され、動物プランクトンの「生物ポンプ」としての役割は、動物プランクトンの種構成によって異なることが明らかとなった。さらに、バクテリアによる有機物の分解過程においてもリンは重要であり、リン供給量が少ないと沈降過程における懸濁態炭素の無機化速度は低下することが示された。以上の結果から、琵琶湖では湖外から供給されるリン量と動物プランクトン種構成が、有機物生産と湖底への炭素鉛直輸送を支配していることが示唆された。また、動植物プランクトン及び沈降物質の脂肪酸組成を分析したところ、脂肪酸組成はこれらの間で大きく異なり、表層で生産された炭素有機物は摂食及び沈降分解過程により著しく変質してゆくことが示唆された。植物プランクトンによって生産される有機物は植物網に取り込まれ、一部は高次生産へ、一部は分解され、他は湖底へ沈降する。

4)沈降粒子束の2030%は底生生物(ヨコエビ)の純生産として利用される。5)ただし、沈降粒子束は季節により異なり、そのピークは外部由来の物質による場合と内部生産物質による場合がある。前者は降雨が多い時、後者は動物プランクトンが少なくケイ藻などの大型植物プランクトンが増殖したときに見られる。以上のように、琵琶湖の生物生産・分解速度と沈降粒子束は光-温度などの物理環境や食物網構造に影響されると同時に、集水域から運ばれる栄養物質(栄養塩・有機物)にも共役的に強く依存していることが明らかとなった。これらの結果は、降雨量や光環境を支配する気候変化によって生産・分解速度や湖底への物質輸送量が大きく変化することを示している。
閾値を有する確率分布の非正則性問題の解決を考慮した推定法の確立

閾値を有する確率分布における推定法の確立を目的とし、信頼性及び品質管理分野において重要とされている寿命分布(ワイブル分布、ガンマ分布、対数正規分布、逆正規分布)において、非正則問題を回避する推定法を開発し、評価を行った。閾値を有する確率分布は、統計学分野をはじめ、信頼性、品質管理学、医学、薬学、生物学、情報学等極めて広範囲の分野で用いられる確率分布である。閾値を未知パラメータとし、他のパラメータと共に同時パラメータ推定を行おうとすると、Cramerの正則条件が破綻し、最尤推定量の導出や漸近理論の構築ができないという統計学的問題が生じる。この非正則問題のために、閾値を有する確率分布の区間推定法や仮説検定法の研究、開発も遅れている。本研究は、閾値を有する確率分布の非正則性問題の解決を考慮した推定法の確立を目的とする。本年度は、閾値を持つ確率分布として、主に3パラメータワイブル分布及び3パラメータガンマ分布に焦点を当て、完全データにおけるパラメータ推定法の開発に取り組んだ。開発した推定法では、全てのパラメータの値において推定量が一致性を持ち、全てのパラメータの値と全てのサンプルサイズにおいて推定値が一意に存在することが証明され、非正則問題の一部が解決されていることが確認された。IEEE Reliability Society Japan Chapter Awards受賞記念講演会をはじめ、国内外会議にて成果発表を行った。平成21年度に引き続き、閾値を持つ確率分布における非正則性の問題を回避した推定法の開発と理論構築を進めた。申請者はこれまでの研究において、ある変数変換(この変換をW変換と呼ぶ(申請者が命名))を用いて標本から閾値及び尺度情報を取り除いて推定を行うと、非正則性の問題が回避されるとの知見を得ており、平成21年度のワイブル分布に引き続き、対象モデルを対数正規分布、ガンマ分布、逆正規分布まで拡張し、以下のことに取り組み、論文投稿及び国内外会議にて成果発表を行った。1.W変換後の標本に対する尤度関数の厳密な導出と形状母数の最尤推定量の導出及びその定理化。2.形状母数の推定量が、確率1で一意に必ず存在することの証明とその定理化。3.形状母数の推定量が、一致性を持つことの証明とその定理化。4。位置母数及び尺度母数について、確率1で一意に必ず存在し、さらに一致性を持つ推定量の導出。この内、2.の証明過程において誤りがあることが、投稿中の論文のReviewerの指摘により判明した。この定理の証明の数理的難易度は高く、平成22年度中の解決には至らなかった。平成23年度中の解決を目指す。また、本研究代表者は、2010年9月10日9月26日までMcMaster Universityに滞在し、本研究の共同研究者であるN.Balakrishnan教授と共同研究を進め、非正則性を回避するための変数変換の新たな知見や対象モデルに関する新たな知見等を得ることができた。また、現地にて、複数の論文投稿を行うことができた。平成22年度に引き続き、閾値を持つ確率分布における非正則性の問題を回避した推定法の開発と理論構築を進めた。平成22年度に、ワイブル分布、対数正規分布、ガンマ分布、逆正規分布を対象とし、以下のことに取り組み、論文投稿及び国内外会議にて成果発表を行ったところ、2における証明において誤りがあることが、投稿中の論文のReviewerの指摘により判明した。4.位置母数及び尺度母数について、確率1で一意に必ず存在し、さらに一致性を持つ推定量の導出。平成23年度の前半は、証明の誤りの解決に注力し、解決することができた。平成23年度の後半は、これまでの提案法が持つ、以下の2つの問題の改善に取り組んだ。1,W変換により、2つの確率変数が退化する。尤度関数が非有界となるのを防ぐには、1つの確率変数の退化でよい。2,逐次推定を行っているため、同時推定が必要なケース(例えば、分位数を推定するケース)では、よいパフォーマンスが得られない場合がある。また、本研究代表者は、2011年8月28日10月1日まで、客員研究員としてMcMaster University (Canada)に滞在し、本研究の共同研究者であるN. Balakrishnan教授との議論を行い、本研究に関する新たな知見を得ることができた。
14-3-3タンパク質によるリン酸化シグナル経路の熱力学的・構造生物学的基盤

多くのがん細胞においては、Rasタンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する、というリン酸化シグナルが亢進している。そのシグナルを持続させる機能をもつタンパク質が14-3-3タンパク質である。本研究では、この14-3-3タンパク質がいかにしてリン酸化シグナルを持続させるのかを定量的に、かつ、タンパク質の立体構造の観点より解明することにより、この過程を数理モデル化して理解することを目的としている。このメカニズムが解明できれば、リン酸化シグナルを抑制する革新的な制がん剤の創製につながると考えている。
陽子・反陽子・パイ中間子,及び軽イオンと原子核の相互作用の研究

陽子-原子核反応:陽子を原子核に衝突させると核は励起する。その際の相互作用は自由空間のものとは異なる。パウリ効果を取り込む為にG行列計算を行い有効相互作用を導出し、さらには実際に反応の断面積を計算した。ロスアラモスで得られたスピン応答関数の計算をいろんな効果(核表面効果,アイソスピン混合,縦横スピン相互作用の混り)を取り込んで行った。それらの効果により実験結果が説明出来る事を示した。反陽子-原子核反応:50MeVの反陽子の光学ポテンシャルを実験データから導出した。非常に強い虚数ポテンシャルが得られた。さらに(【p!】,【n!】)反応をカスケードモデルを使って計算した。前方の角分布には実験と理論に食い違いがある事を示した。パイ中間子-原子核反応:パイ中間子吸収において△アイソバーエネルギー領域では二体に加えて三体の過程が重要である事を示した。さらに四体過程も計算しその大きさは小さい事を示した。(【π^+】【π^-】)荷電交換反応をデルタアイソバー過程を通して計算した。DINT及びDSEQ過程だけではデータが再現されない事を示した。次の次数のものを考慮する必要性がある事を指摘した。重イオン-原子核反応:パイ中間子放出核融合反応をクラスターモデルを使って計算した。実験の傾向を再現する事を示した。その際クラスター効果は非常に重要である事を強調した。高いエネルギーでの原子核反応をカスケードモデルで計算した。パイオン多重度の問題、Sidewavd flowの問題なのがこのモデルで計算すると自然に説明出来る事が分かった。さらに難度を上げてやるべき実験の指摘を行った。核子の構造:核子のモデルとしてカイラルバックとスキルミオンの複合モデルを構築した。スピン-アイソスピンの射影法として集団座標につけ加えて生成座標の方法を提案した。
薬剤耐性水痘・帯状疱疹ウイルスの迅速な診断系の開発

2種類のアプローチにより、水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子変異に起因するアシクロビル(ACV)耐性VZVの迅速な診断系の開発を目指した。1つ目は、in vitroでVZV TKによるACVリン酸化能の定量可能な系を作出し、ACVリン酸化能を測定することでACV感受性が決定可能な系を作出する。2つ目は、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)についてそのTK遺伝子を欠損し、代わりにVZV TK遺伝子を搭載したウイルスをACV存在下で培養することで、ACV耐性変異を誘導し、責任変異についてのマッピングを行った。放射線同位体を用いないアシクロビルリン酸化能定量法の確立をめざし、以下の検討を行った。1単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)チミジンキナーゼ(TK)および水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV) TKを特異的に増幅するプライマーを設計した。2Rabbit Reticulocyteを用いたHSV-1 TKタンパク発現系を確立し、その発現をウェスタンブロット法により確認した。また、BAC systemを用いて、HSV-1のTK遺伝子を欠損し、更にVZV TK遺伝子を搭載したキメラウイルスを作製した。Rabbit Reticulocyteを用いて発現させたTKタンパクの精製ができず、次の段階へ進めずにいる。現在タンパク精製法の条件検討を行っている。外部機関よりBAC systemを導入するのに手間取ってしまったが、導入後は順調に組換えウイルスを作製できているため、その後の作業はおおむね順調である。VZV TK遺伝子変異による薬剤耐性の獲得はそのACVリン酸化能消失に起因するため、迅速かつ簡便にACVリン酸化能を定量化し、これを指標とすることで迅速に薬剤耐性の診断可能な系をの確立を目指した。今年度はin vitroにおいて発現させたVZV TKを用いて、ACVリン酸化能の定量系を開発するための至適条件の検討を行った。現在作製した系を用いて、薬剤感受性レベルとACVリン酸化能の相関性について検証を行っている。また、薬剤耐性責任変異をデータベース化することで薬剤耐性VZVの迅速な診断系の確立を目指した。昨年度作製したHSV-1 TKを欠損し、代わりにVZV TKを搭載したキメラウイルスについて、まずACVによる阻害効果レベルを確認した。結果、HSV-1よりも本キメラウイルスはIC50値が510倍上昇しており、VZVのIC50値と同レベルであった。そこで本キメラウイルスをACV存在下で培養することで、ACV耐性ウイルスを得、これについて遺伝子解析を行い、ACV耐性責任変異についてのマッピングを行った。結果、残念ながらVZV TK遺伝子上には薬剤耐性変異が得られなかったが、VZV TK遺伝子同様薬剤耐性責任変異についてのデータが乏しいHSV-1 DNA上に薬剤耐性責任変異が得られ、この中で5つについてはこれまでに報告のない新規の変異であった。このように、キメラウイルスを用いた系でVZV TK遺伝子上の薬剤耐性責任変異のマッピングをすることができなかったため、現在Error-prone PCR法を用いてVZV TK遺伝子にランダムに変異を導入し、薬剤耐性責任変異および自然多型のマッピングを行っている。引き続き放射線同位体を用いないアシクロビルリン酸化能測定法の確立をめざし、実際に精製したTKを用いて試験管内でのアシクロビルのリン酸化反応を行い、その定量法確立のための条件検討を行う。また、作製したキメラウイルスの増殖性、HSV-1およびVZV TKの発現、ACVリン酸化能を野生株と比較して著しく変化がないことを確認する。更に、本キメラウイルスをアシクロビル存在下で増殖させることで薬剤耐性ウイルスを分離し、その責任変異のマッピングを行う。ウイルス学年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成27年度分についてはほぼ使用済みである。上記のとおり。
コヒーシンモデルを導入した薬物トランスポーター遺伝子発現メカニズムの解明

ヒヒト小腸においてCYP3A4とABCB1発現量には検体間で数十から数百倍の大きな個体間変動が存在するものの、両者の間には有意な正相関が認められた。このことから、両遺伝子の発現制御には共通の制御機構が関与している可能性を想定した。染色体上において両遺伝子が局在する領域の間に位置するCpG islandのメチル化状態は、一部のCG siteにおいて脱メチル化が生じていることが明らかとなった。これらの領域はCTCF結合領域と考えられることから、同CG siteの脱メチル化がコヒーシンモデルによるループ構造を惹起するという発現制御機構が予想された。CYP3A4とABCB1遺伝子発現に共通の機序の存在の可能性がある。遺伝子発現の個人差要因が未解明であるp-糖タンパク質をコードするMDR1遺伝子について、MDR1遺伝子上流約7 Mbpに位置するdifferentiallymethylation region (DMR)との空間的近接をchromosomeconformation capture(3C)法によりヒト肝を用いて3Cライブラリーを作成し解析した。その結果、MDR1発現量の低い検体ではDMRとMDR1転写開始点領域との間に空間的な近接を認めた一方で、MDR1発現量の高い検体では同領域間の近接は検出されなかった。同様の解析をMDR1 exon 1においても行ったが、いずれの検体においてもDMRとの空間的近接は認めなかった。このことから、DMRのMDR1転写開始点への空間的近接がMDR1転写を抑制しており、MDR1遺伝子発現の個人差要因となっている可能性が考えられる。興味深いことに今回解析したDMRはCYP3A4遺伝子から5 Mbp離れた領域に存在し、MDR1遺伝子とCYP3A4遺伝子の間に染色体上位置する。その一方で、MDR1遺伝子とは異なりCYP3A4発現の高い検体ではDMRとCYP3A4遺伝子2 kbp上流領域は高い立体的近接を示した。染色体上の非常に幅広い領域に立体的な近接をもたらすメカニズムとしてコヒーシンが知られている。コヒーシンを構成するRad21は今回解析した領域に複数結合することが予想されている。MDR1とCYP3A4の基質薬物の多くは重複していることから、これら遺伝子発現を効率良く調節するメカニズムとしてコヒーシンによるDMRを介した遺伝子発現調節機構が存在していることが推察される。何故、CYP3A4とMDR1は共通の医薬品を基質とするのか、何故、誘導や阻害にも共通の動態特性が存在するのか。これらの極めて重要な疑問を解決できる糸口が得られたと言える。研究計画では2年間で以下の4項目を達成することとなっている。1.3Cライブラリーの作成, 2.enhancer領域の探索, 3.luciferase assay, 4.多型探索、メチル化、アセチル化解析1.にて作成したライブラリーを用いた3C assayにより発現制御領域の候補としてDMR領域が見いだされ2.を達成した。1.と2.の終了により全計画のおおよそ半分は達成した。今後は残りの項目(3.と4.)に取り組むことでDMR領域がMDR1遺伝子発現制御を行う詳細なメカニズムを明らかにすることが出来ると考えられる。本研究を行う以前我々は、DMR領域がMDR1遺伝子の転写活性化に寄与することを想定していた。研究実績の概要の項目で記述したように得られた結果はDMR領域の近接は発現の抑制を示唆するものであった。このことからDMR領域がenhancerとして機能するのではなく、近接することによりむしろ他の転写促進因子を立体的に阻害している可能性が考えられる。DMR領域のMDR1遺伝子への近接が遺伝子発現に影響を与えるメカニズムを解明するためには、関連する転写因子群の同定やその結合状態、立体構造への影響等を総合的に解析する必要があると考えられる。当初の研究計画であるluciferase assay、多型探索、メチル化・アセチル化解析に加えDMR領域に関連したChip assayを行っていく予定である。
副腎中で発現しているMDRcDNAの単離とMDR蛋白の大腸菌中での生産

癌の多剤耐性に関係しているMDR1遺伝子は、ヒトの肝臓、腎臓、大腸、副腎などで発現している。MDR1遺伝子のコードするP-糖蛋白質は、本来食物中の有害物などを体外に排出していると考えられる。副腎においては、発現様式が他の器官と異なるため、それ以外の機能が考えられた。P-糖蛋白質の副腎における本来の機能を解明する事を目的に、本年は次の事を行った。1.ヒト正常副腎RNAを用いてcDNAライブラリーを作成し、4.2kbのMDR1cDNAを単離した。全塩基配列を決定した結果、副腎MDR1cDNAは、すでに多剤耐性細胞から単離していたcDNAと比べ9塩基の置換を持っており、185番目と893番目のアミノ酸が異なっていた。2.各器官及び培養細胞のRNAとDNAを検討した結果、185番目のアミノ酸置換は、コルヒチン選別多剤耐性細胞でのみ見いだされ、893番目のアミノ酸は、ヒトゲノム中で多型性を示すことが示唆された。3.2つのアミノ酸置換を種々組換えた4種のcDNAを発現ベクターにつなぎ、マウス培養細胞に導入した。いずれのcDNAも培養細胞を、コルヒチン、ビンブラスチン、アドリアマイシンに対して同時に耐性にした。さらに185番目のアミノ酸の違いが、これらの薬剤に対する相対耐性度を大きく変化させることが明らかになった。4.ヒトMDR1遺伝子を酵母内で誘導発現する系を確立した。発現させたPー糖蛋白質が、酵母細胞膜に正しい方向に挿入されていることが抗体によって確認できた。Pー糖蛋白質は、酵母細胞膜の数パーセントに達し、試験管内で薬剤結合活性を示した。以上の系を用い、副腎におけるステロイドホルモン輸送などへのPー糖蛋白質の関与などを、さらに解明したい。
転写因子による細胞系列の決定および維持の染色体制御機構

計画の中で、マスターレギュレーターにより誘導された染色体構造の変化は、DNA複製をはじめとする細胞増殖サイクルに影響を与えるか、という問題について成果が得られた。哺乳動物などの高等多細胞生物では複製開始点について、共通配列が存在せず、エピジェネティカルな染色体構造が、その選択に重要であるという仮説が提示されている。ヘルパーT細胞サブセットの分化は、ピストン修飾やDNAメチル化などのエピジェネティカルな染色体構造変化をともなう。このようなエピジェネティカルな染色体構造と複製制御との関係を解析するため、まず複製開始点をIL-4/IL-13ローカスで探索した。その結果IL-13遺伝子下流に複製開始点oriIL-13を同定した。oriIL-13はTh1/Th2の両サブセットに存在し、H3ヒストンのアセチル化およびジメチル化の修飾による影響を受けないことが明らかとなった。さらにTh2特異的なサイトカインの発現に重要である、保存された遺伝子間領域CNS-1が、oriIL-13の選択に重要であること、またCNS-1の欠失が、ピストン修飾にも影響を与えないことから、ヒストン修飾を介さずに遺伝子発現量を制御すると考えられた。すなわち複製開始点の選択とTh2サイトカインIL-4およびIL-13の発現量の制御にCNS-1領域は重要であるが、共にヒストンの修飾(H3K9/K14のアセチル化とH3K4のジメチル化)を介さず、他のメカニズムを考える必要がある。この成果は現在投稿中である。In vitroで分化させたエフェクターT細胞をマウスに移入することで誘導されるメモリーTh2細胞において、IL-4産生能、またCNS-1欠失による発現量の減少は維持された。しかし、IFNγの産生活性も誘導される細胞群がかなり検出され、メモリー細胞誘導過程でIFNγ産生の抑制がかからなくなる可能性が示唆された。
理想的ではない断続動作特性が合成力学系に与える影響について

状態や時刻依存型の断続動作特性が「理想的でない」スイッチング動作によって切り替えられた場合、その断続動作が合成力学系にどのような影響を与えるのか?について検討し、数学的に性質を示した。また、回路実装によりその性質を再現した。一方、理想的でないスイッチング動作を有する合成力学系において,カオスアトラクタに内在する不安定周期軌道を安定化する手法についても考察し、アルゴリズムの提案、実験系を用いたその正当性の確認を行った。理想的ではない断続動作特性を有する合成力学系に関する基礎研究を行った.特に,分岐条件を解析的に導出可能な系を中心に研究を進めた.1.スイッチング動作に遅延が発生する系のモデル化および分岐解析スイッチング動作が理想的ではない簡素な合成力学系を提案し,ポアンカレ写像および特性乗数の導出法を示した.また,各々の系に生じる非線形現象についても考察し,分岐条件を導出した.2.遅延もしくは高周波振動が理想的な断続動作特性を有する力学系にあたえる影響上記の理想的ではないスイッチング動作は,不変区間を若干広くすることを数学的に示した.また,系の一部が二価関数で記述されることを示し,理想的な系には見られない解軌道の共存について検討した.一方,この影響が系に発生するカオスアトラクタの安定性に重要な役割を担っていることも明らかとなった.3.遅延及び高周波振動が発生する系の定性的な比較合成力学系から導かれた写像を観察した限りでは,2種類の理想的ではないスイッチング動作は合成力学系に等価な影響を与えているように見受けられた.そこで,広いパラメータ空間における二次元分岐図を導出し,これらの理想的ではないスイッチングが力学系に等価な影響を与えることを示した.工学・生態系への適用を念頭に基礎研究を行った.1.電気回路系における再現実験前年度の基礎的検討をふまえ,電気回路系において申請者が提案する簡素な合成力学系を再現し,解析結果の正当性を示した.2.理想的ではないスイッチング動作を有するコンバータ回路の解析本申請課題を行う基となった,高いスイッチング周波数で動作する電流制御型DC-DCコンバータ回路に発生する「理想的ではない」スイッチング動作が回路の振る舞いに大きな影響を及ぼしている,との実験的報告に基づき,前年度の解析手法をスパイクノイズの発生を仮定したBuck-Boostコンバータ回路に適用した。具体的には,まずリターンマップを定義し,その不変区間を示した.また,リアプノフ指数,1および2次元分岐図を導出し,スイッチングが理想的な揚合との比較検討を行った.さらに,新たに2次元離散系を提案し,若干の基礎研究を行った.3.他分野への本手法の適用を模索森林火災を模擬した2次元インパクトモデルに対して提案手法を応用したアルゴリズムを適用し,地中海森林およびサバンナにみられるモデルの定性的性質を検討した.その結果,周期倍分岐が特に重要な役割を担っていることがわかった.4.n次元で記述される理想的ではない断続動作特性を有する合成力学系に適用可能な分岐追跡アルゴリズムの提案前年度の基礎研究を踏まえ,一般的な固定点および周期点の追跡が可能となった.この結果を踏まえ,来年度は特性乗数および分岐パラメータの計算が可能なアルゴリズムを構築する.5.理想的ではないスイッチングをみられる不安定現象の安定化4.を応用し,解軌道の安定化をシミュレーションおよび実験の両面から試みた.以下を検討した:1.スパイクノイズを有するバックブーストコンバータ回路の解析上記回路を2次元離散系として解析するための手法を示した.また,その合成Jacobi行列を導出することで系の性質を詳細に解析した.その結果,スパイクノイズに伴う新たな領域の発生が,解の挙動,共存,不変区間の拡大に大きな影響を与えることを示した.2. PWM-1で制御される断続動作回路の実装,およびスイッチング動作が系に与える影響の解明これまで,電流制御型のコンバータ回路を念頭に理想的ではないスイッチングが合成力学系に与える影響を検討してきたが, PWM-1で制御される合成力学系に関しても基礎的検討を行った.その結果, 1.同様の力学的影響が見られた.また,その回路実装を行い,理論およびシミュレーション結果との一致を確認した.3.理想的ではないスイッチング動作を有する系に見られる不安定周期軌道安定化の実装前年度提案した手法を理想的ではないスイッチングを有する電気回路系に適用した.その結果,理想的なスイッチング動作を念頭において構成された制御器では制御不可能であった不安定周期軌道が,提案手法では安定化できることを確認した.4. n次元で記述される理想的ではない断続動作特性を有する合成力学系に適用可能な分岐追跡アルゴリズムの提案n次元で記述される系の1周期解に対し,固定点およびその特性乗数の計算手法を示した.また,分岐条件を連立させることにより,分岐曲線を連続的に追跡できるアルゴリズムを構築した.一方,これらの手法をC言語およびMATLAB上で実装し,その正当性を確認した.
DNA修復欠損マウスにおける突然変異の解析

1)正常マウスとXPAマウスの自然突然変異頻度: DNA除去修復欠損の体細胞自然突然変異への影響を調べる為、HITECマウスを用いて主要組織の突然変異出現頻度を調べた。脳、肝臓で最も高く(34×10-4)、腎臓、精巣、皮膚では中程度(12×10-4)、脾臓では最も低い(13×10-5)という結果を得た。しかし、正常・XPAマウス間で顕著な差はなかった。2) UV誘発突然変異と発癌:2000J/m2のUV線量を週3回照射することにより、20週からXPAマウスのみに皮膚癌が観察された。PCR・Direct Sequence法でp53遺伝子を調べた結果、40例中19例の皮膚癌に突然変異を認めた。これらの突然変異は1例を除いて全てピリミジン・ランに生じており、UV誘発変異と考えられる。突然変異部位のホットスポットは見られず、突然変異の約7割は転写鎖上のUV損傷に起因すると考えられた。これらのことは、XPA遺伝子欠損マウスのUV誘発突然変異は頻度ばかりでなく質的にも野生型マウスとは異なることを示唆する。一方、同じ処理を2、4、8週間施したHITECマウスを用いて突然変異体出現頻度を調べたところ、UV照射による上昇は観察されたが、全ての遺伝子型(XPA+/+, XPA+/-, XPA-/-)で同程度にみられ、UV発癌実験の結果とは一致しなかった。独立した実験間で得られる数値の変動が大きく、この系を用いてUVによる誘発突然変異頻度の解析を行うのは困難であると考えられた。3) XPAマウスにおける神経細胞死の有無:正常マウスとXPAマウスから脳の切片を作成し、抗p53抗体(CM-5)を用いて免疫染色を行った。小脳のPurkinje細胞の核以外、神経細胞には顕著な染色は見られなかった。Purkinje細胞核の染色は正常マウスでも観察された。更に、Tunel法を用いてアポトーシスの有無を調べたが、XPAマス中枢神経系神経細胞でアポトーシスが起きているという証拠は得られなかった。1)正常マウスとXPAマウスの自然突然変異頻度及び種類の比較:HITECマウスの系を用いるために各主要組織からのDNA調製法を検討し、比較的高品質なDNAを調製できる方法を確立した。この実験の課程で、低品質DNAを用いると、大腸菌への導入効率が下がるだけでなく、突然変異頻度が上昇することが解った。また、マウスから回収したpML4の大腸菌を検査できる条件を確立した。従来のHITECマウスの系では突然変異体の検出に形質転換効率の高い大腸菌への導入法を検討し、1回のDNA導入で総数2x10^5個の大腸菌RR-1(recA^+)を用いていたが、この方法により、大腸菌HB101(recA^-)を用いることが可能になった。大腸菌HB101を用いた場合、1回のDNA導入で検査できる大腸菌総数が1/31/2に減少するが、バックグランドとして出現する突然変異体数は1/201/10に減少し、全体として突然変異体の検出限界が下がり、従来の系よりも鋭敏な系を確立することができた。

現在、DNA除去修復欠損が加齢と共に体細胞の自然突然変異にどの様な影響を及ぼすかを調べるために、20、50週齢の各遺伝子型のマウスを得て、それらの主要組織から今回確立した方法によりDNAを調製し、自然突然変異頻度及び種類の決定を行っている。2)変異原による誘発突然変異と発癌との相関関係:2000J/m^2のUV線量を週3回照射することにより、XPAマウスのみにUV発癌が観察された。このUV線量で照射された部位は、UVは照射していない部位と比較して突然変異体の出現が23倍上昇することを認めた。しかし、この差は、全ての遺伝子型(XPA^<+/+>,XPA^<+/->,XPA^<-/->)でみられ、UV発癌実験の結果とは一致していないようにみえる。この実験では皮膚組織全体からDNAの抽出を行ったが、表皮細胞のみからDNAの抽出を行い、突然変異体出現頻度の比較検討を行っている。1)正常マウスとXPAマウスの自然突然変異頻度:DNA除去修復欠損の体細胞自然突然変異への影響を調べる為、HITECマウスを用いて主要組織の突然変異出現頻度を調べた。脳、肝臓で最も高く(34×10-4)、腎臓、精巣、皮膚では中程度(12×10-4)、脾臓では最も低い(13×10-5)という結果を得た。しかし、正常・XPAマウス間で顕著な差はなかった。2)UV誘発突然変異と発癌:2000J/m2のUV線量を週3回照射することにより、20週からXPAマウスのみに皮膚癌が観察された。PCR・Direct Sequence法でp53遺伝子を調べた結果、40例中19例の皮膚癌に突然変異を認めた。これらの突然変異は1例を除いて全てピリミジン・ランに生じており、UV誘発変異と考えられる。突然変異部位のホットスポットは見られず、突然変異の約7割は転写鎖上のUV損傷に起因すると考えられた。これらのことは、XPA遺伝子欠損マウスのUV誘発突然変異は頻度ばかりでなく質的にも野生型マウスとは異なることを示唆する。一方、同じ処理を2、4、8週間施したHITECマウスを用いて突然変異出現頻度を調べたところ、UV照射による上昇は観察されたが、全ての遺伝子型(XPA+/+,XPA+/-,XPA-/-)で同程度にみられ、UV発癌実験の結果とは一致しなかった。独立した実験間で得られる数値の変動が大きく、この系を用いてUVによる誘発突然変異頻度の解析を行うのは困難であると考えられた。3)XPAマウスにおける神経細胞死の有無:正常マウスとXPAマウスから脳の切片を作成し、抗p53抗体(CM-5)を用いて免疫染色を行った。小脳のPurkinje細胞の核以外、神経細胞には顕著な染色は見られなかった。Purkinje細胞核の染色は正常マウスでも観察された。更に、Tunel法を用いてアポトーシスの有無を調べたが、XPAマウスの中枢神経系神経細胞でアポトーシスが起きているという証拠は得られなかった。