hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜鉛イオンとERp44の連携による分泌経路の新たなタンパク質品質管理機構

すでに、ZnT7を安定発現するためのヒト培養細胞を作製し、1リットルの細胞培養液から約0.3 mgの精製ZnT7を得ることに成功した。さらにZnT7をナノディスクと呼ばれる脂質二重層に再構成することに成功しており、そのネガティブ染色電顕画像を取得した結果、今後のクライオ電子顕微鏡による構造解析が十分期待できる結果であった。ZnT7の構造決定が一日も早く達成できるよう、引き続き精力的に実験を進める。研究実績の欄にも記したように、投稿中であった亜鉛イオンによるERp44の構造機能制御に関する論文について、平成31年2月にNature Communicationsに掲載された。またERp44の機能制御に関わる亜鉛トランスポーターの同定についても系統的ノックダウン実験により、非常にクリアな結果が得られ、ZnT7が主たる因子であることを突き止めた。亜鉛トランスポーターの構造解析について、最大のボトルネックは構造解析に足る量の精製タンパク質を安定に得ることと考えていたが、それについてもZnT7の安定発現細胞株を構築し、またナノディスクに再構成することでZnT7の安定化を図り、ゲルろ過カラムによる精製が可能となった。さらにナノディスクに再構成したZnTについてネガティブ染色を行い、今後のクライオ電子顕微鏡による単粒子解析が可能と思われる結果が得られた。このように、国際一流雑誌に論文を発表し、また平成30年度に掲げた二つの研究課題いずれもが予定通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。ERp44の機能制御を担う主たる因子がZnT7であることを突き止めたが、一方でZnT7によるERp44制御のメカニズムについては未だ解明できていない。一つの可能性として、ZnTファミリーによって分泌経路における局在が定められており、どのZnTがどの区画にどの程度亜鉛イオンを取り込むか厳密に制御されていることが考えられる。このことを詳細に解析するには、各区画において亜鉛濃度を正確に定量するための亜鉛特異的な高感度プローブの開発と、超解像度顕微鏡による細胞イメージングが必要である。実際、高感度亜鉛プローブを東北大学多元物質科学研究所の水上進教授との共同研究ですでに開発に至り、各ZnTノックダウン条件下での各区画における亜鉛濃度を超解像顕微鏡により解析を進めている。その結果、多くの興味深い知見が得られつつあり、ZnT7によるERp44の機能制御機構についても解明されつつある。またZnT7の構造解析について、X線結晶構造解析のみならず、クライオ電子顕微鏡による解析にも本格的に着手しつつある。すでにヒト細胞を用いた発現精製系を構築し、ナノディスクに再構成することにより安定な素性のZnT7の調製に成功している。今後、クライオ電子顕微鏡観察のためのグリッド調製条件や測定条件を詳細に検討することにより、構造解析が達成できると考えている。また、多くの膜タンパク質で成功例のあるlipid cubic phase法を用い、ZnT7の結晶構造解析にも挑戦する。我々はすでにヒト由来カルシウムポンプの結晶構造解析を同方法で成功しており、そのノウハウを有している。
東方領土問題と戦後ドイツのナショナル・アイデンティティ

第二次大戦の敗戦によって、ドイツはオーデル=ナイセ線以東に広がる旧ドイツ領の四分の一に及ぶ領土(これを「東方領土」と呼ぶ)を失い、その領土を含めた東ヨーロッパ一帯から大量のドイツ人が強制移住(これを「追放」と呼ぶ)させられた。本研究では、第二次大戦直後から現代に至るまで、ドイツ連邦共和国の公共的言論の場においてドイツの東方領土をめぐっていかなる議論が行われてきたのかを検討した。1960年代の初頭まで、連邦共和国政府、主要政党、国民世論の圧倒的多数がオーデル=ナイセ線を国境として承認せず、東方領土の回復を主張・支持していた。しかしそのような状況は1960年代に大きく変化し、1970年ブラント政権の下で、暫定的ながらオーデル=ナイセ線を承認することになる。しかし国境承認を拒否する勢力はその後も法的原則論に依拠して東方領土に対するドイツ人の諸権利を主張し続けた。連邦共和国がオーデル=ナイセ線を最終的に承認するのは、1990年の統一の直後であった。それまでの間、連邦共和国の国内では、主流である国境承認派と、非主流の非承認派が対峙し続けた。本研究では、東方領土への領有権の主張する言論と東方領土の「放棄」を進める言論の双方において、ナショナル・アイデンティティの概念がいかなる役割を果たしてきたのかを分析し、連邦共和国における東方領土に対するスタンスの大きな変化は、ナショナル・アイデンティティの布置状況の変化に連動していると分析している。ナチス以前の「1937年のドイツ帝国」の存続という前提に基づいて「ドイツ」を理解する「帝国アイデンティティ」が連邦共和国建国当初は支配的であったが、1960年代頃から、ナチス犯罪という過去を「克服」することをドイツ人の「使命」ととらえる「ホロコースト・アイデンティティ」が優勢になっていく。後者のアイデンティティは東方領土を「放棄」することを正当化する際の妥当性根拠となった。国境を最終的に確定した後の現在においても、二つのアイデンティティは、ドイツの「過去」に対して異なって観点(片やナチス犯罪を戦後ドイツの出発点と見なし、片や「追放」の歴史を復権させることでそれに対抗する)を提起することによって対立を続けている。本研究は、第二次大戦で失ったドイツの東方領土(シュレージェン、東西プロイセン、ポンメルンなどを含む領域で、現在ポーランドおよびロシアの領内にある)が、戦後成立したドイツ連邦共和国がいかに認識し、いかにその領士の放棄をおこなっていったのかということに関する分析である。すでに、1972年の東方諸条約締結までの経過については分析を終わっており(これに関しては、平成13、14年度の科研費奨励研究の補助を受けた)、今年度の分析は1973年ころから1982年の政権交代(社会民主党・自由民主党の連立政権から、キリスト教同盟・自由民主党の連立政権への移行)までの時代をあつかっている。問題は、1972年にオーデル=ナイセ線を承認してしまった連邦共和国の公的言論が、「一九三七年のドイツ帝国」というドイツ概念を、そのごいかに維持していったのかという点であった。この点に関しては二つのことが指摘できる。一つは法的な継続性である。連邦憲法裁判所による何度かの判決では、東方諸条約によっては「ドイツ帝国」の領土の継続性は否定されないということになった。政府への批判勢力は、常にこの判決をよりどころにしたが、ポーランド側からはこれが「復讐主義」として批判された。

第二に、旧東方領土からのドイツ人移民(アウスジードラー)の移動の自由、また旧東方領土に生活するドイツ人の権利問題などの、直接領土要求につながるものではなく、「属人化」された権利概念の中に「一九三七年のドイツ帝国」の概念を含有させる戦略があった。この問題は、1974年から始まる、ポーランドとの協定締結交渉において、ドイツ側からの主張の最大のポイントになっていた。政府への批判勢力、すなわち野党や被追放者諸団体は、この問題をついて、政府のポーランドとの「正常化」政策を妨害しようとしていった。しかしながら、ここでも政権与党の主張は議会を通過し、国民的世論の多くもこれを支持し、「ドイツ帝国」の保持を主張する勢力はますます周辺化していった。本年は、主として夏のポーランドおよびドイツでの調査を行った(2004年8月23日から9月15日)。ポーランドでは旧ドイツ東方領土の一部シュレージエンを中心に回り、昔のシュレージエンの中心地ヴロツラフ、現在でも多くのドイツ人マイノリティの住むオーポーレ、また第一次大戦後のドイツ人とポーランド人の民族対立の象徴的な場所であり、現在でもその対立の記憶が政治問題にもなったアンナベルクなどを視察した。またかつてのドイツ人の保養地であり、今でも多くの被追放者ドイツ人たちの訪れるリーゼンゲビルゲなどにも足を伸ばし、現在のこの地とドイツとの関係について観察した。その後のドイツでは、例年のようにベルリン州立図書館で資料収集にあたった。主として1990年代前後の連邦議会の議事録、そして被追放者同盟の機関紙Deutscher Ostdienstのバックナンバーを調べ、1980年代後半からドイツ統一(およびポーランド西側国境の最終承認)に至る過程での東方領土問題の扱われ方、そしてそこで示されている「ドイツ」の自己認識(ナショナル・アイデンティティ)の関連について調べた。領土問題の「属地的」側面と「属人的」側面の両面を分けてとらえ、ポーランド西側国境の承認は、「属地的」な領土主張を終わらせたが「属人的」側面をむしろ純化させる結果をもたらし、2000年代に入ってもこの側面での東方領土問題は依然としてドイツとポーランドの外交問題に影を落としていることがわかった。最近の「反追放センター」問題、また被追放者の旧財産権問題などがそのあらわれである。また今年は、「追放」関係の文献がドイツで少なからず出版されており、その購入にも研究費を用いた。現在集めた資料を分析中であり、今年度中には論文として発表する予定である。下記に表記した論文は、ここでの調査と直接関係しないが、その前提としての理論枠組みを構想している。1972年以後のドイツ東方領土問題を検討するというのが、本研究プロジェクトの目的だったが、今年度は第一に1990年のドイツ統一前後の東方領土問題を、オーデル=ナイセ線の承認、旧東方領土に残留するドイツ人マイノリティ、被追放者の「故郷権」、「追放」の歴史的記憶などのいくつかの争点の連関関係に注目しながら明らかにしていった。
蛋白質のエネルギー計算プログラムの妥当性・信頼性の検討

昭和61年4月に研究代表者は京都府立医科大学より愛知医科大学に移籍した。これに伴い、新任校の計算機システムの運用に習熟する要が生じ、また前任校で使用していた計算機上で開発したプログラム群を新システム上に移植する作業も生じた。特にグラフィックス関係は全面的な書き直しが必要となった。年度前半はこれらの作業に精力を傾注した。前年度に引き続き、蛋白質(牛膵臓トリプシン・インヒビタ:BPTI)の立体構造をfixed bond length,bond angleの拘束のもとで表現する努力を継続した(構造のrefinement)。今年度は特に、energy計算(ECEPP【II】)に基づく側鎖原子間の衝突の排除に努力した。これは、native構造のエネルギーが以降の諸計算の対照となる重要なものなので、省くことのできない重要なステップである。側鎖原子間に衝突のない、ほぼ満足できる構造を得ることに成功した。次のステップとして、天然アミノ酸配列に対して、random shufflingを行い、この配列に対してエネルギー極小構造の探索を行った。試みたアミノ酸配列は次の2種類である:親水性のアミノ酸同士,疎水性アミノ酸同士のshufflingを行ったもの、疎水性のアミノ酸の50%を親水性のアミノ酸と入れ換えたもの。これら2種類のアミノ酸配列を有する蛋白質のエネルギー極小構造を、天然配列の極小構造の近傍で探索した結果、天然構造のエネルギーよりはるかに大きなエネルギーを有する構造を得ることができた。天然構造より低いエネルギーを有する構造が無いことを積極的に示すことはできないが、エネルギー計算プログラムが、少なくともここで試みた程度の大きな配列変化に対しては妥当性のある結果を与えることを確認できた。エネルギー計算プログラムの信頼性を検討するには、より小さな配列変化に対する極小エネルギーの変動を調べる必要がある。
定量的アプローチを用いた経営学の「知の構造」研究

本研究の目的は、論文・書籍の引用データを用いた定量的アプローチを用いて、これまで実現しえなかった網羅的な学説史研究を展開する手法を確立することにある。既存のレビュー研究は、少数の重要な研究を深く探究する定性的アプローチで行われてきた。しかし、このアプローチには、取り上げる文献の客観性や網羅性という観点で不十分な点がある。本研究は、既存の定性的アプローチの弱点を、統計処理可能な引用データを用いた定量的なアプローチを新たに併用することで補うことを意図したものである。こういった方法が確立できれば、各国の主要雑誌のデータを用いた国際比較研究や、大規模な学説史研究につなげることもでき、今後の発展も大いに期待される研究だと考えられる。当該年度(2018年度)では、当初の予定を変更し、翌年度に向けてどの研究領域の知の構造を今後解き明かしていくかの探索を行った。当初の予定では、Tushman & Anderson(1986)をベースに「定性的アプローチと定量的アプローチでは、特定の論文を中心とした学問の発展プロセスの描き方にどのような差異が生まれるか」という問いを探究する研究を行う予定だったが、他の研究や学務上の都合によってまとまった研究時間を確保することができなかったため、研究方針を変更して当初2019年度に実施予定の研究内容の準備期間とすることとした。経営学分野のいくつかの研究領域に関して探索的な検討を行った結果、分析対象とする研究領域としては「ビジネス・エコシステム」と呼ばれる領域が有望なのではないかという結論に至った。その理由としては、当該領域に関しては近年注目が集まっていること、そうであるにもかかわらず今ひとつ学問領域としての全体像が把握されていないことなどが挙げられる。最大の理由は所属研究機関の組織上の「やむを得ない」理由から当初想定されていたエフォート量が確保できなかったことである。当該事由については2019年3月に解消されており、2019年度は当初予定されていたエフォート量が確保できる見込みであるので、当初の研究計画の遅れを取り戻すべく引き続き研究を進めていきたい。昨年度生じた研究計画の遅れについては、RA(リサーチアシスタント)を積極的に雇用することで解消に努めたい。本研究においては大量の文献データに関して、データベースを作成し、また引用文献のフォーマットの整えたり、論文執筆者の「名寄せ」を行う等の手間が非常に多く発生する。研究を進める上での最大のボトルネックとなりうるのはこの作業なので、この作業にRAを雇用し、研究作業の効率化に努めたいと考えている。前述のとおり、所属研究機関の組織上のやむを得ない事由により、当初予定されていたエフォート量を確保できなかったことから、予算執行額も少ないものとなっている。2019年度に関しては、前述のとおりRA等も積極的に雇用する予定なので、残額も含めて2019年度に全額執行予定である。
豆乳の乳酸菌発酵ろ液の活用による薄毛症状の改善に関する研究

豆乳の乳酸菌発酵ろ液PS-B1の発毛促進効果について調べるため、背毛を除去した4週齢のC57BL/6雄性マウス(n=10)に対して、PS-B1(5%、15%、30%)、PBS(30%)、豆乳(30%)をそれぞれ含む20% EtOH溶液を塗布液として調製し、50μLを背部に1日1回全てのマウスの発毛が完了するまでの長期(8か月間)に渡り塗布を行った。塗布部の画像解析の結果、PS-B1は発毛個体出現及び発毛面積の増加に至る期間の短縮化において顕著な効果を示すことが明らかになった。さらに、PS-B1刺激した培養毛乳頭細胞のPCR分析の結果、毛髪関連遺伝子FGF-2及びKGFの発現増加が見出された。毛髪は、毛周期と呼ばれる成長期・退行期・休止期の3ステージを繰り返す毛の再生機構により、一定の量を保っている。薄毛症状は、毛髪の量の減少やミニチュア化などに基づき現れる。壮年性脱毛症における所見としては、毛周期における1休止期から成長期への移行の遅延(発毛抑制)、2成長期から退行期への移行期間の短縮(脱毛促進)等が挙げられ、これらの異常に基づいて総合的に薄毛症状が顕在化すると考えられる。従って、薄毛症状を改善させるための作用点としては、「休止期の短縮すなわち成長期への移行促進(発毛促進)」及び「成長期の維持・延長(脱毛抑制)」の2点が考えられ、これらの作用点に改善が図られた場合に発毛の促進が見られるようになる。本研究では、豆乳の乳酸菌発酵ろ液PS-B1が薄毛症状の改善に及ぼす影響について、発毛促進および脱毛抑制の2つの観点から検討することを計画しているが、平成26年度は発毛促進に及ぼす影響について調べた。成長期に入る時期(4週齢)のC57BL/6雄性マウスの背毛を除去した後、これらのマウスを(1) 5%豆乳、(2) 3% PS-B1、(3) 5% PS-B1、の各試料混合飼料摂取群及び(1)(3)の濃度になるように20% EtOHに溶解した各試料(50 μL)を背部に1回/日塗布した塗布群に分けた(n=3)。各群に決められた食餌摂取及び塗布を14週間行いマウスの背部の状態を画像として記録した。それぞれの群の対照群(通常飼料摂取群及び20% EtOH塗布群)の画像と比較し、PS-B1の摂取及び塗布が発毛に及ぼす影響を評価した。その結果、PS-B1の摂取及び塗布により、それぞれの対照群と比べ退行期・休止期が1週間程度短縮される傾向が見出され、PS-B1が発毛促進効果を有することが強く示唆された。一方、脱毛抑制作用については、明確な結果を得られなかったので再度検討する。本課題研究では、豆乳の乳酸菌発酵ろ液PS-B1の薄毛症状の改善に及ぼす影響について、発毛促進の観点に焦点を絞り研究を行ってきた。H26年度の研究では、少数のマウス群(n=3)を対象として次のパイロットテストを行った。すなわち、背毛を除去した成長期に入る時期(4週齢)のC57BL/6雄性マウスに対してPS-B1の発毛促進作用を見るため、20%エタノールにPS-B13%および5%含むものを塗布試料溶液として用い、各試料(50 μL)を1日1回塗布し発毛促進効果について調べた。対照としては、発酵ろ液のコントロールとして豆乳上清5%を含む20%エタノール溶液を用いた。その結果、PS-B1の塗布により、対照群と比べ休止期が1週間程度短縮される傾向が見出され、PS-B1が発毛促進効果を有することが示唆された。そこで、平成27年度には、n数を増やし、塗布するPS-B1濃度についても検討し、さらに、すべてのマウスの発毛が完全に終了するまでの長期(8か月間)にわたりPS-B1の影響について調べた。その結果、PS-B1は濃度依存的に発毛個体出現に至る期間の短縮化において顕著な効果を示すことが明らかになった。一方、発毛面積の増加促進に対する効果については、現在画像解析中である。本研究では、薄毛モデルマウスに対するPS-B1の摂食・塗布実験および皮膚等の回収試料を用いて機能解析実験を行い、発毛促進・脱毛抑制に及ぼすPS-B1の影響とその作用点を詳細に解析することを第一の目的としている。最終的には、PS-B1に含まれる薄毛改善作用を示す生理活性物質の単離・同定を目指すだけでなく、ヒトを対象とした臨床試験を実施することによって、PS-B1の塗布や食生活への導入を活用した、これまでに無い新しいタイプの「簡便・安価な毛髪ケア法」の提唱を図ることを目標に定めている。

平成26年度の研究では、まず、薄毛モデルマウスとして背毛を除去したC57BL/6雄性マウスを用いその毛周期を明らかにするため14週間にわたり詳細に調べた結果、第2毛周期の成長期開始が生後4週目、退行期開始が6週目、休止期開始が7週目、さらに第3毛周期開始が12週目であることを明らかとした。この毛周期に対して、PS-B1の塗布の影響を調べるパイロットスタディーを行った結果、発毛促進効果が示唆された。そこで、平成27年度は、このパイロットスタディーの規模を拡大し、発毛促進におけるPS-B1の有効濃度を明らかにするため、5%、15%、30%のPS-B1、および対照として豆乳上清30%を含む塗布用20%エタノール溶液を準備し、長期にわたる塗布実験を行った。発毛個体出現日数は、それぞれ塗布開始後19日(30%PS-B1)、22日(15%PS-B1)、36日(5%PS-B1)、43日(30%豆乳上清)であった。これらの結果は、PS-B1の塗布がマウスの背毛に対する発毛促進作用を示したことを示唆するものであり、その促進作用はPS-B1の濃度に依存することが明らかになった。本年度、これらのデータを裏付けるために、培養毛乳頭細胞を用いた系での実験を実施することなどにより、本研究の達成度をさらに上げたいと考えている。壮年性脱毛症における所見としては、毛周期における「休止期から成長期への移行の遅延(発毛抑制)」、「成長期から退行期への移行期間の短縮(脱毛促進)」等が挙げられ、これらの異常に基づいて総合的に薄毛症状が顕在化すると考えられている。本研究は、豆乳の乳酸菌発酵ろ液PS-B1の薄毛症状の改善に及ぼす影響について明らかにするために、発毛促進の観点に焦点を絞り行った。H26年度には、少数のマウス群(n=3)を対象として次のパイロットテストを行った。背毛を除去した成長期に入る時期(4週齢)のC57BL/6雄性マウスに対して、(1) 5%豆乳、(2) 3% PS-B1、(3) 5%PS-B1、の各試料混合飼料摂取群及び(1)(3)の濃度になるように20% EtOHに溶解した各試料(50 μL)を背部に1回/日塗布した塗布群に分けた。食餌摂取及び塗布を14週間行いマウスの背部の状態を画像として記録した。それぞれの群の対照群(通常飼料摂取群及び20% EtOH塗布群)の画像と比較した結果、PS-B1の摂取及び塗布により、それぞれの対照群と比べ休止期が1週間程度短縮される傾向が見出され、PS-B1が発毛促進効果を有することが示唆された。平成2728年度には、PS-B1の直接的効果(塗布)を詳細に評価するため、n数を増やし(n=10)、塗布するPS-B1濃度(5%、15%及び30% PS-B1含有塗布液を調製)についても検討し、さらに、全てのマウスの発毛が完全に終了するまでの長期(8か月間)に渡り、画像解析をもとに調べた。その結果、PS-B1は濃度依存的に発毛個体出現及び発毛面積の増加に至る期間の短縮化において顕著な効果を示すことが明らかになった。さらに、PS-B1を培養毛乳頭細胞に作用させPCR法にて解析した結果、毛髪関連遺伝子FGF及びKGF-2の発現増加が見出された。豆乳の乳酸菌発酵ろ液PS-B1の発毛促進効果について調べるため、背毛を除去した4週齢のC57BL/6雄性マウス(n=10)に対して、PS-B1(5%、15%、30%)、PBS(30%)、豆乳(30%)をそれぞれ含む20% EtOH溶液を塗布液として調製し、50μLを背部に1日1回全てのマウスの発毛が完了するまでの長期(8か月間)に渡り塗布を行った。塗布部の画像解析の結果、PS-B1は発毛個体出現及び発毛面積の増加に至る期間の短縮化において顕著な効果を示すことが明らかになった。さらに、PS-B1刺激した培養毛乳頭細胞のPCR分析の結果、毛髪関連遺伝子FGF-2及びKGFの発現増加が見出された。
マルチパス測定型水中音響多重通信に関する基礎研究

マルチパスやドップラー効果の影響が顕著な環境である浅海域で安定した音響通信を実現するために,これまで主に理論やシミュレーションで評価されてきた直交信号分割多重(OSDM)の性能を実験により確認するとともに,ドップラーシフトに対する対策を検討した.OSDMにドップラーシフト補償法を適用し,通信性能をシミュレーションならびに水槽実験で確認した結果,マルチパスとドップラースプレッドの影響が顕著な環境下でも安定した水中音響通信が実現可能な見通しを得た.マルチパスやドップラー効果の影響が顕著な環境である浅海域で安定した音響通信を実現するために,これまで主に理論やシミュレーションで評価されてきた直交信号分割多重(OSDM)の性能を実験により確認するとともに,ドップラーシフトに対する対策を検討した.OSDMにドップラーシフト補償法を適用し,通信性能をシミュレーションならびに水槽実験で確認した結果,マルチパスとドップラースプレッドの影響が顕著な環境下でも安定した水中音響通信が実現可能な見通しを得た.本研究はマルチパス測定型水中音響多重通信の実用化に向けた基礎的検討を行うことを目的としている.具体的には,実験水槽における通信実験,ならびにドップラーシフトに弱いというマルチパス測定型水中音響多重通信の問題点を克服するために,ドップラーシフト補償方式を適用し,その効果を検証することを目的としている.今年度はマルチパス測定型水中音響多重通信のドップラーシフト補償方式を提案し,その効果をシミュレーションベースで検討した.具体的には,ドップラーシフトが小さな環境において正しくデータ伝送が行うために,直交周波数分割多重方式で提案されているドップラーシフト補償方式をマルチパス測定型水中音響多重通信に適用した.次により大きなドップラーシフトに対応するために先のドップラーシフト補償方式を拡張した.その結果,実用上想定されるドップラーシフト環境で正しくデータ伝送が行えることが確認された.しかし,マルチパス環境ではフレーム同期が正しく行えないという問題が新たに明らかになった.そこで,この問題を解決するためにマルチパス測定型水中音響多重通信で用いるパイロットシグナルを指標としたフレーム同期法を提案し,先のドップラーシフト補償方式と組み合わせることで,ドップラーシフトに弱いというマルチパス測定型水中音響多重通信の問題点が解決できる見込みを得た.来年度は本年度の成果を実験において確認することを予定している.本研究はこれまで主に理論やシミュレーションで評価されてきた直交信号分割多重(OSDM)を用いる水中音響通信(マルチパス測定型水中音響多重通信)の性能を実験により確認するとともに,ドップラーシフトに対する対策を検討することを目的としている.平成22年度はドップラーシフトに対する対策を検討し,その効果をシミュレーションベースで検討した.具体的には,ドップラーシフトが小さな環境において正しくデータ伝送が行うために,直交周波数分割多重(OFDM)で提案されているドップラーシフト補償法をOSDMに適用した.その結果,実用上想定されるドップラーシフト環境で正しくデータ伝送が行えることが確認されている.これらの実績を踏まえ,平成23年度は前年度に検討されたドップラーシフト補償法をOSDMに適用し,水槽実験によりその効果を確認した.まず実験水槽内に送受波器を固定し,水中音響通信を行った.その結果,時間長にして10msを超える重いマルチパス環境においても正しくメッセージが伝送できることを確認した.次に送波器が移動させることで,マルチパスとドップラーシフトが混在する環境での水中音響通信を行った.その結果,前年度に検討したドップラーシフト補償法が有効に機能することを確認した.この実験では信号長を様々に変化させながら通信を行ったが,条件によっては伝送品質が劣化することが確認された.これは伝送路の時変動によるドップラースプレッドに起因する.従来のOSDMに関する研究は,その多くが通信路は静的であると仮定していることから,ドップラースプレッドの影響について検討を行った.ドップラースプレッドの大きさに対する通信品質の関係をシミュレーションと実験により確認した.そして,信号長を可能な限り短くすることで重いマルチパスとドップラースプレッドの影響が顕著な環境下でも,OSDMによる水中音響通信が実現可能な見通しを得た.
腎尿細菅細胞の脱分化・再生の過程におけるＤＮＡ修復、細胞周期、細胞死制御の解明

腎不全から透析に至る患者の増加は社会問題となっており、腎障害および障害の修復、再生の分子メカニズムを解析することにより、急性腎不全/慢性腎不全の予防的治療への方策を検討している。腎尿細管細胞株を利用し、細胞周期(細胞分裂に至る過程)、細胞増殖、細胞死について検討を行い、細胞が障害を受けると、尿細管になる前段階の細胞に近づく現象(脱分化)および、尿細管を形成する様子が観察された。今後、さらなる解析を行う予定である。当初の研究目的として、1)腎尿細管脱分化細胞の同定、2)尿細管細胞死におけるDNA修復の重要性の解明、を目的として実験計画を立案した。これらにおいて、尿細管の細胞増殖、再生に関しての基礎的研究は重要であり、共同研究者の寺田と共に研究を行っていた。当初の研究計画では、細胞周期を蛍光標識した蛋白によりin vivoでモニターできるFUCCIマウスを使用し、急性腎障害後の細胞周期および細胞増殖の解析を行う予定だったが、主に2つの理由で断念せざるを得なかった。1)当研究室でマウスの維持管理を行う人員不足および実験に携わる人員の不足、2)当方所属病院での臨床業務が近年の医師不足により多忙を極め、自らがマウスを扱って維持管理が出来る状況には無かったこと、により本年度は当初のin vivoによる実験系の構築も出来なかった。以上の理由により当初の計画は全くの未達である。予備実験のデータとして、虚血再灌流によるFUCCIマウスにて障害後の細胞周期がG0期からG1期へ進行していることは確認できているが、その再現性に問題があり、これは虚血再灌流の条件設定の問題および、虚血再灌流による全身性変化(炎症性サイトカインの放出など)が関わっていると考えられる。上記のようにマウスを使った実験系を動かすことが当方ではほとんど不可能な状況であり、細胞系での実験を予定している。具体的には、FUCCI発現vectorを腎尿細管細胞に恒常的に発現する細胞株を樹立し、各種障害により細胞周期の進展を解析する事により、急性腎障害に対する腎尿細管の反応を見ることとする。当初の研究計画では、細胞周期を蛍光標識した蛋白によりin vivoでモニターできるFUCCIマウスを使用し、急性腎障害後の細胞周期および細胞増殖の解析を行う予定だった。しかし当研究室における人員不足があり、マウスを使用したin vivoによる急性腎障害後の尿細管再生(脱分化、細胞周期進展、再構築)の解析が難しい現状があり、本年は細胞系での実験系構築を目指した。具体的には、腎尿細管細胞、および尿細管と同様に幹細胞(未分化状態の細胞)において増殖し、その後に分化すると考えられる骨格筋細胞をモデルとして、細胞周期マーカーとしてFUCCI vectorを細胞内に導入して、蛍光標識により細胞周期が確認できる細胞株を樹立し、薬剤による障害を与えることにより、細胞周期の進展を確認することを第一の目標とした。骨格筋細胞株(分化誘導が可能)をコントロールとして使用することにより、分化と細胞増殖の過程を区別できるのではないかと考え、細胞株樹立を目指している。現在のところ残念ながら細胞株の樹立は成功していない。樹立後、細胞傷害後の細胞周期の進展を解析すると共に、分化および脱分化の過程をin vitroの系で再現することを目標としている。当初1)腎尿細管脱分化細胞の同定、2)尿細管細胞死におけるDNA修復の重要性の解明、を目的として実験計画を立案した。これらにおいて、尿細管の細胞増殖、再生に関しての基礎的研究は重要であり、共同研究者の寺田と共に研究を行った。Six2-GDNF経路は腎臓の発生に必要な経路であるが、急性腎障害後の腎尿細管の増殖及び再生に寄与しているかは明らかではなかった。我々は、ラット腎における虚血再灌流実験により以下のことを明らかにした。1)Six2およびGDNFは虚血再灌流により腎尿細管で発現が亢進した。2)NRK細胞において、HGFやEGF等の細胞増殖因子はSix2およびGDNFの発現を増加させた。3)3D-Gelにおいて、Six2は尿細管細胞の管腔形成を促進した。以上より、Six2-GDNF経路は急性腎障害後の尿細管細胞増殖及び再生に寄与していると考えられた。しかし、当方およびテクニシャンによるマウスによる腎臓虚血再灌流モデルの再現性および実験結果の一貫性に問題があり、信頼に足るデータが出ていない。また、当方の病院での臨床業務が近年の地方における医師不足により多忙を極め、自らが時系列でのマウス実験を遂行できなかった。

以上の理由により当初の計画は全くの未達である。1)当研究室でマウスの維持管理を行う人員不足および実験に携わる人員の不足、2)当方所属病院での臨床業務が近年の医師不足により多忙を極め、自らがマウスを扱って維持管理が出来る状況には無かったこと、主に以上の2つの理由により本年度は当初のin vivoによる実験系の構築も出来なかった。予備実験のデータとして、虚血再灌流によるFUCCIマウスにて障害後の細胞周期がG0期からG1期へ進行していることは確認できているが、その再現性に問題があり、これは虚血再灌流の条件設定の問題および、虚血再灌流による全身性変化(炎症性サイトカインの放出など)が関わっていると考えられる。現在虚血再灌流実験ができるテクニシャンが産休に入っており、同実験の進展が期待できない状態である。また、腎臓というin vivoを中心とした系を使用しているので、in vitro系に置き換えることが難しく、現在どのように実験を進展させるかを思案中である。上記のようにマウスを使った実験系を動かすことが当方ではほとんど不可能な状況であり、細胞系での実験を予定している。具体的には、FUCCI発現vectorを腎尿細管細胞に恒常的に発現する細胞株を樹立し、各種障害により細胞周期の進展を解析する事により、急性腎障害に対する腎尿細管の反応を見ることとする。1.FUCCIマウスと同様の細胞周期FUCCI2-HeLa細胞を使用し、G0/G1→S期進行に対する基礎的実験を組み立てる。細胞のoriginは異なるが、障害後の細胞周期の進展に関しては同様であり、preliminaryなデータを蓄積する必要がある。具体的には、DNA障害薬剤に対する感受性及び障害後の細胞周期の変化、DNA修復/アポトーシスの解析、各種細胞増殖因子による細胞増殖及びDNA修復能の検討を行う。2.腎尿細管細胞株にFUCCIシステムを導入し、腎尿細管障害に対する反応をin vitroで観察する。1)で得られた知見を元に、腎尿細管細胞で同様の観察が可能か確認し、スクラッチアッセイによる尿細管細胞再生とDNA修復/細胞周期/細胞増殖に関して検討を行う。3.マウス虚血再灌流の実験系の再構築を行う。最終的には本年度中にマウス実験系の可否を判断する。細胞実験系の構築および培養、FACS機器その他に使用する試薬類の購入を行う。以上のように研究費使用に関しては十分ではなかったため、本年は上記1)-3)に対して、試薬、抗体、FUCCIマウスの購入などを行う予定である。また、実験の進行度合いにより、G0/G1/S期の細胞のFACSによるソーティングおよびその発現解析を行うためにアレイなどに研究費を使う予定である。
幼弱脳における麻酔薬の神経毒性に関する研究

本実験では、幼若期における全身麻酔薬投与が成長後の海馬機能に与える影響をin vivoで調査した。生後7日目のラットにPentobarbita1(以下Pento,10 mg/kg and 20 mg/kg)を腹腔内投与し、成長後(生後10-12週)の海馬機能を電気生理学的ならびに行動学的(Open-fieldtest;以下OFT)に測定した。電気生理学的検討では、麻酔下ラットの海馬に経頭蓋的に電極を挿入し、Schaffer側枝の刺激によるCA1領域における集合スパイク電位を測定した。高頻度刺激による集合スパイク電位の増加はシナプス長期増強(Long-term potentiation;以下LTP)と呼ばれ、記憶・学習の電気生理学的基盤とされている。本実験では、海馬CA1領域におけるLTP形成は、幼若期Pento投与により著明に抑制された。またOFTでは、ボックスにラットを放ち、水平移動量と垂直移動量とを測定した。これらの値はそれぞれ総運動量と探索行動量の指標とされており、特に探索行動量(垂直移動量)は海馬機能と関連すると報告されている。幼若期Pento投与により、OFTにおいて総運動量に変化は認められなかったが、探索行動量は減少する傾向が示された。以上の結果より、幼若期Pento投与により、成長後の海馬機能が低下している可能性が示唆された。一方で、幼若ラットへのPentoの腹腔内投与は著明な呼吸抑制をまねき、数時間に及ぶ著明な低酸素血症ならびに全身性アシドーシスをきたした(Control;Pa02 113.4±6.0mmHg,pH7.43±0.01,Pento20mg/kg;Pa02 65.3±10.6mmHg,pH7.11±0.09,p<0.01)。幼若ラットへの全身麻酔による成長後の神経学的異常を検討する際には、呼吸抑制作用による低酸素等の影響を加味する必要があると考えられた。幼弱ラットが麻酔薬に暴露されると、脳の広範囲の部位に神経細胞死が起こることが、2003年に報告された(Journal of Neuroscience 2003;23:876)。ある種の麻酔薬の組み合わせで、NMDAレセプタの遮断とGABAレセプタの賦活が同時に生じると神経細胞の活動が異常に抑制され、その結果アポトーシスのカスケードに信号が入るという機序が推測されている。しかし、この知見に関しては、依然確立しておらず、議論が多い。平成18年度は1脳に障害が生じる時期は、生後何日後というようなtime windowが存在するか2どのような麻酔薬の組む合わせで障害が生じやすいかを行った。1については、生後4,7、14日のラットにミダゾラムを腹腔内投与後、イソフルラン、笑気/酸素を通気したチャンバー内で6時間観察し、24時間後ラット脳を段頭後、deOlmos silver染色で組織学的評価を行った。しかし、明らかな神経障害は認めず、time windowは存在しなかった。2については、NMDA拮抗薬としてケタミン、笑気、イソフルラン、セボフルランGABA作動薬としてバルビタール、プロポフォールなどを用いたが、どの組み合わせでも明らかな神経障害は認めなかった。以上より、暴露後24時間後の短期予後では、麻酔薬の神経毒性は認めなかった。平成19年度は、生後1ヶ月以上の長期予後の検討を中心に研究を進める予定である。

本実験では、幼若期における全身麻酔薬投与が成長後の海馬機能に与える影響をin vivoで調査した。生後7日目のラットにPentobarbital(似下Pento, 10mg/kg and 20mg/kg)を腹腔内投与し、成長後(生後10-12週)の海馬機能を電気生理学的ならびに行動学的(Open-fieldtest;以下OFT)に測定した。電気生理学的検討では、麻酔下ラットの海馬に経頭蓋的に電極を挿入し、Schaffer側枝の刺激によるCA1領域における集合スパイク電位を測定した。高頻度刺激による集合スパイク電位の増加はシナプス長期増強(Long-term potentiation;以下LTP)と呼ばれ、記憶・学習の電気生理学的基盤とされている。本実験では、海馬CA1領域におけるLTP形成は、幼若期Pento投与により著明に抑制された。またOFTでは、ボックスにラットを放ち、水平移動量と垂直移動量とを測定した。これらの値はそれぞれ総運動量と探索行動量の指標とされており、特に探索行動量(垂直移動量)は海馬機能と関連すると報告されている。幼若期Pento投与により、OFTにおいて総運動量に変化は認められなかったが、探索行動量は減少する傾向が示された。以上の結果より、幼若期Pento投与により、成長後の海馬機能が低下している可能性が示唆された。一方で、幼若ラットへのPentoの腹腔内投与は著明な呼吸抑制をまねき、数時間に及ぶ著明な低酸素血症ならびに全身性アシドーシスをきたした(Control; Pa02 113.4±6.0mmHg, pH7.43±0.01,Pento20mg/kg;Pa02 65.3±10.6mmHg,pH7.11±0.09,p<0.01)。幼若ラットへの全身麻酔による成長後の神経学的異常を検討する際には、呼吸抑制作用による低酸素等の影響を加味する必要があると考えられた。
電子常磁性共鳴法を用いる複数分子同時イメージング法の開発

生物をそのままの状態で画像化する非侵襲分子イメージング法は、生命現象を分子の動きからダイナミックに観測することができ、生命活動の解明への貢献はもとより、病因の解明、早期診断、治療薬の開発への貢献など、期待が膨らんでいる。本課題では、生体機能・生命機能と関連する生体内複数分子を非侵襲的に画像化をめざしており、近年開発した電子常磁性共鳴イメージング(Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI))法を利用して、生命現象の解明を試みる。本年度(平成24年度)の研究としては、「複数分子同時イメージング法による生体機能の画像化」研究を実施した。1プローベの開発:H24年度の研究では、まず生体機能画像化を目指したナイトロオキシドレポーター分子の合成を行い、ファントムでの原理実証研究を実施した。生体機能を画像化するプローベ合成については、研究助言を頂いているオハイオ州立大学Khramtsov教授の指導の下でプローベの合成を実施した。同時画像化を目指す生体機能としては体内pHで、体内のpHをEPR法で測定可能なプローベを数種類合成した。生体内毒性を考えて利用可能かどうか、また、候補プローベの画像化の可能性とその課題点について、現在検討を進めているところである。2動物実験での実証研究について:ファントムによる試験を通過したプローベをマウスに投与し、複数の生体機能同時イメージング実証試験を実施した。pH感受性プローベとしては5種類合成を試みた。全てマウス頭部でのEPR信号を観測するところまでは到達した。検討したプローベ5種類のうち4種類は細胞内移行が見られなかった。マウス頭部MRI画像、脳内移行可能ナイトロオキシドと移行できないプローベを用いたEPRイメージング画像を撮像した。申請者の開発した“高速EPRイメージング手法"を駆逐し、脳内外でのpH・酸素濃度の計測を同一個体で行い、それぞれの情報を視覚化する試みを実施した。pH情報と酸素濃度pO2情報を取得出来る段階に達した。病態モデル動物として炎症モデル動物を利用した。組織内pHおよび脳内酸素濃度が正常マウスと比較検討しており、抗炎症剤の投与での治癒効果視覚化が可能だというデータを得ている。更なる検討を目指している。電子常磁性共鳴(EPR)イメージング法は、フリーラジカル等により起こる生体機能情報を非侵襲的に3次元で視覚化できる分子イメージング法の一手法である。本申請では、複数の常磁性プローベ分子を個別に識別し、複数分子の存在状態や体内動態をそれぞれ同時に非侵襲的に視覚化する、全く新しい"複数分子同時イメージング法の開発"に挑戦するものである。この分子イメージング手法を病態モデル動物に適応すると、複数の生体機能情報(例えば、酸素分圧やpH、薬物効果など)を一個の動物個体から同時に画像情報として取得することが可能となる。このような複数分子同時イメージング手法を開発することによって非侵襲的に得られる生体機能情報は、病因の解明や治療薬の開発など幅広い分野での活用が期待されるものである。平成23年度の研究に於いては、「2分子同時イメージングの動物実験での検証」研究を実施した。我々の研究室では、過去及び現在継続中の基盤研究において、高速電子常磁性共鳴イメージング(EPRI)システムの開発を行っており、現在、小動物用高速イメージングシステムが稼働している。本システムを利用して、動物体内に投与された2種類のラジカルプローベを、同一の個体で同時に視覚化させる画像化手法の確立を目指した。(1)2種類の分子を同時に画像化する手法について:2種類の安定フリーラジカル分子をスペクトルから識別する手法を採用した。このアイディアが原理的に実現可能なことはファントムを用いることで、個別画像化の実証を行った。(2)動物実験での実証での実証について:二種類のフリーラジカル化合物をマウスへ投与し、マウス頭部でのEPRイメージング画像を撮像し、画像化を進めている。藤井の研究室では、過去および現在において継続中の基盤研究において、高速電子常磁性共鳴イメージングシステム(EPRI)の開発を実施しており、現在、小動物用(マウスなど)高速イメージングシステムが稼働している。本EPRイメージングシステムを利用して、動物体内に投与された2種類のフリーラジカルプローベを、同一の個体で同時に視覚化させる画像化手法の確立を目指した。H23年度は2種類のフリーラジカル分子を同時に画像化する手法について検討を実施した。1本のシグナルであるフリーラジカルと、2本線からのスペクトルを呈するナイトロオキシドの2種類の安定フリーラジカル分子をスペクトルから識別する手法について検討を行った。このアイディアが原理的に実現可能なことはファントムを用いて検証することが出来た。現在、マウスを用いた動物実験レベルでの実証試験を実施している。1本線ラジカルによる酸素濃度測定は可能となっており、また、2本線からのラジカルによる画像化実証については進行している。

以上の研究結果から、当初予定に従った順調な進展を見せていると思われる。【平成24年度】平成24年度では、プロジェクト2での「複数分子同時イメージング法による生体機能の画像化」研究を実施する。(1)プローベの開発:H24年度の研究では、まず生体機能画像化を目指したナイトロオキシドレポーター分子の合成を行い、ファントムでの原理実証研究を行う。プローベの合成については、Khramtsov教授の指示で実施する計画である。同時画像化を目指す生体機能、利用予定のプローベ、そして画像化の可能性とその課題点について、現在検討を進めているところである。(2)動物実験での実証研究:ファントムによる試験を通過したプローベをマウスに投与し、複数の生体機能同時イメージング実証試験を実施する。マウス頭部MRI画像、脳内移行可能ナイトロオキシドと移行できないプローベを用いたEPRイメージング画像を撮像する。申請者の開発した"高速EPRイメージング手法"を駆逐し、脳内外でのpH・酸素濃度の計測を同一個体で行い、それぞれの情報を視覚化する試みを実施する。炎症モデル動物の利用:組織内pHや脳内酸素濃度が正常マウスと異なる例として、炎症モデル動物を用いた実験も計画する。炎症組織への薬物集積状態の可視化研究も目指している。【平成24年度】平成24年度に実施するプロジェクト2での「複数分子同時イメージング法による生体機能の画像化」研究を実施するに当たっての研究費の使用計画を以下にまとめた。(1)プローベの開発用の経費:生体機能画像化を目指したナイトロオキシドレポーター分子の合成を行うので、試薬購入費を消耗品支出として計上している。(2)イメージングプログラムの開発経費:多分子動時イメージング用には、目的に特化したEPRイメージング用のプログラムが必要である。現在、MatlabおよびLabVIEWを利用したプログラムの開発を進めている。本プログラムの開発費を新しく計上することにした。(3)動物実験での実証研究経費:ファントムによる試験を通過したプローベをマウスに投与し、複数の生体機能同時イメージング実証試験を実施する。実験小動物として、マウス(C57およびBALB/c)での実験を計画しており、動物購入費を計上する。(4)学会参加旅費:平成23年度の成果について、オーストラリアで開催されるISMRM国際学会で発表する。その為の旅費を計上する。
人工酸素運搬体を併用した化学療法,放射線療法の抗腫瘍効果増強について

目的:腫瘍組織内の低酸素領域を改善させるために人工酸素運搬体を投与し,腫瘍組織内の低酸素状態,低血流状態を改善させ,各腫癌治療の抗腫瘍効果増強作用を検討する.結果:各群の動注前の腫瘍内酸素分圧,並びに腫瘍サイズに大きな差異はなく,また,FiO2 0.99人工呼吸器下における動注前の各群のラットの血液ガスデータも平均350 mmHg以上に維持できていた,毎回の測定終了後にカテーテルの位置が下行大動脈総腸骨動脈分岐部直上0-2.5mmの間に存在することを確認した.rHSA-FeP動注群の腫瘍内酸素分圧は,動注直後にはいったん減少するもののその後増加に転じ,150秒後から390秒後までの間は約3Torrにまで増加した.その後は徐々に減少傾向となり,870秒後にはほぼ初めの値に戻った.Hgb-V動注群の腫瘍内酸素分圧も.いったんは減少したのち増加に転じ,270秒後には最高2.5Torrにまで増加した.動注後の腫瘍内酸素分圧を動注前の酸素分圧(control)で除した増加率(Increase Ratio)は,rHSA-FeP動注群では投与前値の最高約2.5倍に(P=0.014),Hgb-V動注群では最高約1.8倍(P=0.048)に増加した.考察:酸素化した人工酸素運搬体の動注により腫瘍内酸素分圧が上昇することが明らかになった.腫瘍血流の安定性から、担癌モデルをSato Lung Cancer(以下SLC)のかわりに吉田肉腫LY-80に変更した。LY-80組織内酸素分圧(PTO2)の測定方法としてはOxyspot(パラジウムコプロポルフィリンをラット頚静脈から静注し、励起後の燐光の減衰消滅時間から腫瘍内酸素分圧を測定する装置.)を採用し、人工酸素運搬体を投与することによる腫瘍内酸素分圧の変化を測定した。【対象と方法】人工酸素運搬体は、アルブミンヘム、フルオロカーボン、Hgb-vesicleの3種類を移植ラットの尾静脈から投与した。コントロールとしてラクテック及び5%アルブミンを設定した。投与前と投与後の腫瘍内酸素分圧を経時的にPxyspotで測定した。【麻酔と測定条件】ハロセン吸入麻酔下自発呼吸、保温下及び血圧モニター下にて測定。【結果】個体によっては腫瘍酸素分圧の上昇が見られたものもあったが、全体としてはいずれの人工酸素運搬体においても著明な腫瘍酸素分圧の上昇は得られなかった。この原因としては、人工酸素運搬体投与により何らかのかたちで腫瘍血流が低下することが関与しているものと思われる。microsphere法によりこの腫瘍血流の動態を確認するのを急ぐとともに、腫瘍血管抵抗をある程度維持する物質との同時投与などを計画している。また今後は腫瘍の移植部位を足背に変更し、酸素で飽和した人工酸素運搬体の大腿動脈からの動注プロトコールを予定している。個体数を重ねて、さらには抗癌剤及び放射線と組み合わせた抗腫瘍効果増強について実験を重ねてゆく予定である。目的:腫瘍組織内の低酸素領域を改善させるために人工酸素運搬体を投与し,腫瘍組織内の低酸素状態,低血流状態を改善させ,各腫癌治療の抗腫瘍効果増強作用を検討する.結果:各群の動注前の腫瘍内酸素分圧,並びに腫瘍サイズに大きな差異はなく,また,FiO2 0.99人工呼吸器下における動注前の各群のラットの血液ガスデータも平均350 mmHg以上に維持できていた,毎回の測定終了後にカテーテルの位置が下行大動脈総腸骨動脈分岐部直上0-2.5mmの間に存在することを確認した.rHSA-FeP動注群の腫瘍内酸素分圧は,動注直後にはいったん減少するもののその後増加に転じ,150秒後から390秒後までの間は約3Torrにまで増加した.その後は徐々に減少傾向となり,870秒後にはほぼ初めの値に戻った.Hgb-V動注群の腫瘍内酸素分圧も.いったんは減少したのち増加に転じ,270秒後には最高2.5Torrにまで増加した.動注後の腫瘍内酸素分圧を動注前の酸素分圧(control)で除した増加率(Increase Ratio)は,rHSA-FeP動注群では投与前値の最高約2.5倍に(P=0.014),Hgb-V動注群では最高約1.8倍(P=0.048)に増加した.考察:酸素化した人工酸素運搬体の動注により腫瘍内酸素分圧が上昇することが明らかになった.
小胞体ストレス応答によるNKG2Dリガンド発現機構と腸炎への関与の解明

腸管上皮のXbp1欠損が小胞体(ER)ストレスを誘発し、マウスにおいて自然発症腸炎が生じることが知られている。本研究ではERストレスに伴って誘導されるCHOPが、NKG2DのマウスにおけるリガンドであるMULT1の発現を誘導することを証明した。また、この誘導がNKG2Dを介して、NK細胞の細胞傷害活性を亢進させることを証明した。ヒト大腸上皮細胞株を用いた実験から、ERストレスがNKG2DのヒトにおけるリガンドであるULBP1・5・6の発現を誘導することが明らかとなった。更に、クローン病患者小腸の免疫染色では、パネート細胞を中心とした腸管上皮でULBP5の発現が亢進している傾向を認めた。マウスの腸管上皮において、Xbp1欠損が小胞体(ER)ストレスを誘発しそれに伴って誘導されるCHOPがMULT1のプロモーター領域に結合することで、転写レベルでのMULT1発現の誘導につながることを証明した。また、Xbp1欠損によって誘導されるMULT1が、NKG2Dを介してNK細胞の細胞傷害活性を亢進させることを証明した。これらの結果からヒト炎症性腸疾患で疾患感受性遺伝子として同定されているXbp1の欠損が、MULT1-NKG2Dリガンドを介した自然免疫細胞の活性化をもたらし、炎症に関連することが示唆される。また、ヒト大腸上皮細胞株を用いた実験から、ERストレスがULBP1・5・6の発現を誘導することが明らかとなった。また、ULBP5発現については、ヒト炎症性腸疾患で発現亢進していることが示唆される予備実験結果を得た。前年度の実験結果で、ヒト大腸上皮細胞株においてERストレスがULBP1・5・6の発現を誘導するという結果が得られた。この現象が大腸上皮特異的反応なのか、他の細胞株においても同様の反応が起こりうるのかの確認の為に、食道、胃、肝臓癌細胞株、及びT細胞系細胞株やB細胞系細胞株で評価を行った。その結果、胃がん細胞株においておも、ULBP5とULBP6の発現がERストレス下で亢進することが明らかとなった。また肝細胞癌細胞株、B細胞系・T細胞系細胞株のいずれにおいてもULBP1・ULBP2・ULBP5の発現が亢進した。このことは、ERストレスによるNKG2Dリガンド、特にULBPの発現誘導はuniversalな現象であることが明らかとなった。前年度の実験結果で、マウス細胞においてCHOPがNKG2DリガンドであるMULT1発現に重要な核内転写因子であるという結果を得られた。同様のメカニズムがヒト細胞におけるULBP発現にもあてはまることが予測されたため、CHOPノックダウン下でのERストレス刺激実験を行ったが、CHOPを介した発現メカニズムを裏付ける結果は得られなかった。ULBP5発現については、潰瘍性大腸炎の粘膜PCRでmRNA発現が優位に亢進している結果が得られた。しかしながら免疫染色では裏付ける結果が得られなかった。一方で、クローン病の腸管上皮でULBP5の発現が亢進している傾向を認め、特に小胞体ストレスマーカーの発現が強いパネート細胞における発現が強い傾向にあった。この結果は、炎症性腸疾患の新たな治療標的の探索をすすめる上で重要な結果であったと考える。初年度計画していた、マウス腸管上皮細胞におけるMULT1発現機構については、Xbp1欠損上皮細胞とERストレス刺激下の上皮細胞を用いたin vitro実験で検証を行い、ある程度の結果を得られた。しかしながら、ヒト炎症性腸疾患患者サンプルを用いた検討では、まだ十分な症例数を集められておらず、現時点では疾患特異的なNKG2Dリガンド発現パターンの同定や病状との関連は得られていない状況である。27年度が最終年度であるため、記入しない。炎症性腸疾患ヒト炎症性腸疾患の症例数を増やし、ULBP5を含めたNKG2Dリガンド発現を免疫染色・real-time RT-PCR法などで解析し、疾患特異的発現パターンや病状との関連を検討していく予定である。また、NKG2D-NKG2Dリガンドを介した自然免疫細胞の活性化とそれに引き続く炎症が、マウス腸炎モデル・ヒト炎症性腸疾患の病態であるという仮説の証明のために、NKG2D阻害抗体を用いたin vivo実験など行い、ヒト炎症性腸疾患の新規治療ターゲットとしての可能性を検討する。