hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラボン誘導体Factor-Xの生物学的活性(抗腫瘍・抗ウイルス効果)の検討

Factor-Xはクマザサ抽出液から分離・同定された分子量330のフラボン誘導体である。従来クマザサには多くの薬理作用があることが報告されているが、その中で、岐阜大学の共同研究者チームにより、有効成分を含むFractionからFactor-Xが分離・同定されたが、その後の解析により、Factor-XはTricin(4′, 5, 7-trihydroxy-3′, 5′-dimethoxyflavone)であることが同定され、その合成にも成功した。我々の予備的実験において、tricinは単純ヘルペスウイルス(HSV)への抗ウイルス効果、また、各種癌細胞株に対する増殖抑制効果・アポトーシス増強能を持つことが示唆された。本研究では更にtricinの効果を検討するため、肝硬変肝癌の病理に重要な役割を果たすHuman Hepatic Stellate cellに対する効果について検討を進め、tricinがstellate cellのPDGF依存性増殖を抑制することを見出し、そのメカニズムについて論文にて報告した。従来クマザサには多くの薬理作用があることが報告されているが、近年我々はクマザサ抽出液の持つ抗ウイルス効果および抗腫瘍効果に注目し検討を行ってきた。その中で、我々の共同研究者である岐阜大学生命科学研究支援センターのチームにより、有効成分を含むFractionからFactor-Xが分離・同定された。本研究では、現在解析をすすめているFactor-Xの持つ生物学的活性のメカニズムをin vitro、さらにはin vivoにおいて明らかにすることを目的とする。同成分を用いた我々の予備的実験において、Factor-Xは単純ヘルペスウイルス(HSV)への抗ウイルス効果、更に各種癌細胞株に対する増殖抑制効果・アポトーシス増強能を持つことが示唆された。特に初年度はプライマリー正常細胞への影響、更に間質細胞へのFactor-Xの効果を検討するため、肝硬変肝癌の病理に重要な役割を果たすHuman Hepatic Stellate cellに対する効果について検討を進め、Factor-Xの持つ生物学的活性のメカニズムを継続して解析中である。さらにはin vivo投与モデルのためのマウスによる予備的実験を行った。今後vivoにおける血中移行性を上昇さるため、Factor-X改変体についての検討を考慮中である。本年度は初年度に引き続き、プライマリー正常細胞への影響、更に間質細胞へのFactor-Xの効果を検討するため、肝硬変肝癌の病理に重要な役割を果たすHuman Hepatic Stellate cellに対する効果について検討を進め、Factor-Xがstellate cellのPDGF依存性増殖を抑制することを見出した。更にFactor-XのPDGFレセプターを介したシグナルにおける作用についての検討を行っており、引き続き本生物学的活性のメカニズムの解析を予定している。その中で、我々の共同研究者である岐阜大学生命科学研究支援センターのチームにより、有効成分を含むFractionからFactor-Xが分離・同定されたが、その後の解析により、Factor-XはTricin(4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavone)であることが同定され、その合成にも成功した。本研究では、現在解析をすすめているFactor-X=tricinの持つ生物学的活性のメカニズムをinvitro、さらにはin vivoにおいて明らかにすることを目的とする。同成分を用いた我々の予備的実験において、tricinは単純ヘルペスウイルス(HSV)への抗ウイルス効果、更に各種癌細胞株に対する増殖抑制効果・アポトーシス増強能を持つことが示唆された。

更に、プライマリー正常細胞への影響、更に間質細胞へのtricinの効果を検討するため、肝硬変肝癌の病理に重要な役割を果たすHuman Hepatic Stellate cellに対する効果について検討を進め、tricinがstellate cellのPDGF依存性増殖を抑制することを見出した。本年度は引き続き、同効果のメカニズム解析を行い、TricinのPDGFレセプターからのシグナル抑制作用について論文にて報告した。今後はtricin改変体を用いたin vivo実験、他の薬理作用についての解析を引き続き予定している。
リン酸化とアセチル化によるp53の活性調節

p53のN末端に近いThr18からLeu26の領域はp53をネガティブに制御する蛋白質Mdm2が結合する領域である。Carol Prives教授との共同研究で、われわれはその領域内にあるSer20がin vivoでもリン酸化される部位でありことをすでに見つけていたが、今回、それをリン酸化する酵素の精製を進めて同定したところ、Chk2とChk1であることがわかった。この両キナーゼはDNAがダメージを受けた時や、DNA複製異常が生じた時にチェックポイントコントロールのために働くことが酵母で最初に示され、ヒトでも同様な働きをすることが示されていたものである。しかし、p53を直接にリン酸化するとは思われていなかった。つい最近、米国のグループによって、癌患者が頻発するLi-Fraumeni症候群のうちp53に異常が無いものではChk2遺伝子に異常があることが見つけられた。これはわれわれの発見によってよく説明できる。p53はガンマ線照射後のG1あるいはG2停止に必要であるが、DNA複製阻害はp53非依存性のS期停止を引き起こす。われわれは、DNA複製がヒドロキシウレアかアフィディコリンで阻害された時、あるいは、ガンマ線でDNAがダメージを受けた時のp53への応答を解析した。その結果、阻止されたDNA複製フォークはp53を修飾して安定化させるキナーゼ類を活性化はするにもかかわらず、ATMの下流でp53の転写活性化をそこなうと考えられる結果が得られた。Carol Prives教授との共同研究で、われわれはその領域内にあるSer20がin vivoでもリン酸化される部位であることを昨年見つけていたが、今回、それをリン酸化する酵素の精製を進めて同定したところ、Chk2とChk1であることがわかった。また、Thr18をリン酸化するキナーゼの活性も見いだし、現在、精製と同定を進めている。ガンマ線の場合と同様、DNA複製阻害はリン酸化された核内p53量を高いレベルに増加させた。驚くべきことに、ガンマ線照射の場合にp53による転写誘導のターゲットとなるいくつかの(全部ではなくとも)ものは、DNA複製阻害では弱くか全く誘導されなかった。さらに、ガンマ線に対するp53の応答は細胞をヒドロキシウレアかアフィディコリンで処理することによって阻害された。これはDNA複製阻害がp53が活性な転写因子になるのを阻害することを意味する。ヒドロキシウレアで誘導されるp53安定化はATMを必要としない。したがって、阻止されたDNA複製フォークはp53を修飾して安定化させるキナーゼ類を活性化はするにもかかわらず、ATMの下流でp53の転写活性化をそこなうと考えられる。
中南米の寄生吸虫症、特にヴェネズエラにおける肺吸虫症の病態生理学的研究

中南米における肺吸虫に関する研究は多くの現地の研究者らによってなされ、メキシコ、コロンビア、エクアドル、ペル-、コスタリカなどでそれぞれ新種として発表され、またヴェネズエラでは最近人体肺吸虫症の存在が明らかにされ、メキシコ肺吸虫とは異なるとの報告がなされている。これまでの調査研究の結果からペル-、エクアドル、メキシコ、コスタリカの肺吸虫はメキシコ肺吸虫と同一種との確信を得ているが、ヴェネズエラの肺吸虫についての検討が未だなされていないので、他の中南米種との異同を形態学的、生態学的、疫学的に比較検討を試みた。得られた成績は以下のごとくである。1.疫学調査.1989年1月から2月にかけてヴェネズエラのス-クル県エルアルガロボ地区とマナカル地区で免疫血清学的手法と糞便および喀痰検査を用いて肺吸虫症に関する疫学調査を行った。(1)メキシコ肺吸虫抗原による皮内反応では一般住民292名について実施し、陽性および疑陽性を呈した者が13名(4.5%)であった。(2)皮内反応陽性および疑陽性者13名と血痰を喀出している者1名の計14名について採血し、その血清についてはメキシコ肺吸虫抗原を用いて血清反応を実施した。その結果、酵素抗体法で陽性をしめした者は7名、ラテックス凝集反応で陽性を示した者は4名であった。その内2名は両反応とも陽性であり、抗体価も2名とも酵素抗体法で320倍、ラテックス凝集反応で512倍と高値を示していた。(3)糞便検査は、全受診者の内糞便を提出した211検体について厚層塗抹法とホルマリン・エ-テル法を実施した。その結果、肺吸虫卵陽性者は見いだされなかったが、腸管寄生虫陽性者は205名(97.2%)と多く、殊に蠕虫類では蛔虫が149名(70.6%)、鞭虫が193名(91.5%)、鈎虫が157名(74.4%)と高率であった。また原虫類で赤痢アメ-バが15名(7.1%)、大腸アメ-バが31名(14.7%)、小形アメ-バが2名(0.9%)、ランブル鞭毛虫が2名(0.9%)の陽性であって、中南米の他国に比較して低率であった。地区別にみるとエルアルガロボは101名中腸管寄生虫陽性者は100名(99.0%)、マナカルは110名中105名(95.5%)で、鈎虫陽性者のみがエルアルガロボで83.2%とマナカルの66.4%に比べて高率であった。(4)喀痰検査は皮内反応陽性者および疑陽性者と呼吸器症状を有する者20名について行ったが、肺吸虫卵は全例が陰性であった。2.中間宿主および自然保虫宿主調査(1)第一中間宿主の淡水産貝アロアピルグス1,500個を採集して破砕法により検査した結果、3個(0.2%)の貝から肺吸虫のセルカリアが検出された。また他種セルカリアも11個体の貝から見いだされた。(2)第二中間宿主である淡水産カニ74匹を採集して検査した結果、エルアルガロボ地区のカニ2匹(2.7%)から肺吸虫メタセルカリアが検出され、265個のメタセルカリアが採取された。そのうち100メタセルカリアをヴェネズエラで猫に感染させ、残りの165個は形態観察用の標本とした。(3)自然保虫宿主の調査としてネズミ12頭とオポッサム8頭を捕獲し検査した結果、ネズミはすべて陰性であったが、2頭のオポッサムから62虫の肺吸虫成虫が得られた。3.肺吸虫の成虫、幼虫および虫卵の形態学的観察(1)成虫の観察の結果、口吸盤は腹吸盤よりもやや大きく、体表の皮棘は単生で、卵巣は6ー9葉で中央に位置し、睾丸は3ー6葉で複雑分岐は認められなかった。(2)セルカリアは平均221X67μm大で7対の侵入腺細胞と棒状の排泄嚢を有する。(3)メタセルカリアは平均822X334μm大で腸管分岐点にまで達する排泄嚢があり60の炎細胞が認められた。体表には単生の皮棘が密生している。腹吸盤の内乳頭は6個、外乳頭は不明瞭であるが約10ー20個である。(4)虫卵は84X49μmで卵殻は薄く無蓋端は肥厚しており、表面には無数のピットがみられた。以上の所見からヴェネズエラの肺吸虫はこれまで調査した中南米の他の国の肺吸虫とは異なっており、その種の同定にはさらにカリ肺吸虫のセルカリアなどとの比較を行って慎重に決めることが必要である。

これまでの調査研究の結果からペル-、エクアドル、メキシコ、コスタリカの肺吸虫はメキシコ肺吸虫と同一種との確信を得ているが、ヴェネズエラの肺吸虫についての検討が未だなされていないので、他の中南米種との異同を形態学的、生態学的、疫学的に比較検討を試みた。得られた成績は以下のごとくである。1.疫学調査.1989年1月から2月にかけてヴェネズエラのス-クル県エルアルガロボ地区とマナカル地区で免疫血清学的手法と糞便および喀痰検査を用いて肺吸虫症に関する疫学調査を行った。(1)メキシコ肺吸虫抗原による皮内反応では一般住民292名について実施し、陽性および疑陽性を呈した者が13名(4.5%)であった。(2)皮内反応陽性および疑陽性者13名と血痰を喀出している者1名の計14名について採血し、その血清についてはメキシコ肺吸虫抗原を用いて血清反応を実施した。その結果、酵素抗体法で陽性をしめした者は7名、ラテックス凝集反応で陽性を示した者は4名であった。その内2名は両反応とも陽性であり、抗体価も2名とも酵素抗体法で320倍、ラテックス凝集反応で512倍と高値を示していた。(3)糞便検査は、全受診者の内糞便を提出した211検体について厚層塗抹法とホルマリン・エ-テル法を実施した。その結果、肺吸虫卵陽性者は見いだされなかったが、腸管寄生虫陽性者は205名(97.2%)と多く、殊に蠕虫類では蛔虫が149名(70.6%)、鞭虫が193名(91.5%)、鈎虫が157名(74.4%)と高率であった。また原虫類で赤痢アメ-バが15名(7.1%)、大腸アメ-バが31名(14.7%)、小形アメ-バが2名(0.9%)、ランブル鞭毛虫が2名(0.9%)の陽性であって、中南米の他国に比較して低率であった。地区別にみるとエルアルガロボは101名中腸管寄生虫陽性者は100名(99.0%)、マナカルは110名中105名(95.5%)で、鈎虫陽性者のみがエルアルガロボで83.2%とマナカルの66.4%に比べて高率であった。(4)喀痰検査は皮内反応陽性者および疑陽性者と呼吸器症状を有する者20名について行ったが、肺吸虫卵は全例が陰性であった。2.中間宿主および自然保虫宿主調査(1)第一中間宿主の淡水産貝アロアピルグス1,500個を採集して破砕法により検査した結果、3個(0.2%)の貝から肺吸虫のセルカリアが検出された。また他種セルカリアも11個体の貝から見いだされた。(2)第二中間宿主である淡水産カニ74匹を採集して検査した結果、エルアルガロボ地区のカニ2匹(2.7%)から肺吸虫メタセルカリアが検出され、265個のメタセルカリアが採取された。そのうち100メタセルカリアをヴェネズエラで猫に感染させ、残りの165個は形態観察用の標本とした。(3)自然保虫宿主の調査としてネズミ12頭とオポッサム8頭を捕獲し検査した結果、ネズミはすべて陰性であったが、2頭のオポッサムから62虫の肺吸虫成虫が得られた。3.肺吸虫の成虫、幼虫および虫卵の形態学的観察(1)成虫の観察の結果、口吸盤は腹吸盤よりもやや大きく、体表の皮棘は単生で、卵巣は6ー9葉で中央に位置し、睾丸は3ー6葉で複雑分岐は認められなかった。(2)セルカリアは平均221X67μm大で7対の侵入腺細胞と棒状の排泄嚢を有する。(3)メタセルカリアは平均822X334μm大で腸管分岐点にまで達する排泄嚢があり60の炎細胞が認められた。体表には単生の皮棘が密生している。腹吸盤の内乳頭は6個、外乳頭は不明瞭であるが約10ー20個である。(4)虫卵は84X49μmで卵殻は薄く無蓋端は肥厚しており、表面には無数のピットがみられた。以上の所見からヴェネズエラの肺吸虫はこれまで調査した中南米の他の国の肺吸虫とは異なっており、その種の同定にはさらにカリ肺吸虫のセルカリアなどとの比較を行って慎重に決めることが必要である。
腫瘍細胞の薬剤低感受性機構の解析とその克服に関する研究

腫瘍細胞の低感受性機構を解明して臨床レベルで,癌治療成績の向上を目ざすことを目的として以下の研究成績を得た。1ヒト造血器腫瘍細胞の低感受性機構の遺伝子レベルでの解析ではdihydrofolate reductase(DHFR)遺伝子の定量化をおこなうことにより、臨床耐性現象を、実際の患者腫瘍細胞レベルで客観的に把握することが可能となった。2・制癌剤に対するsrc遺伝子発現及び非発現細胞間の感受性の差-その機構と応用-の面では、癌遺伝子産物を標的とする抗生物質ハービマイシンの開発に成功し、従来の概念を越えた形での低感受性機構克服のための方策を見いだした。3・ペプロマイシンに対する自然低抗性細胞の低抗性のメカニズムの遺伝生化学的研究においては、実験腫瘍細胞チャイニーズハムスター由来のCHO/V79各細胞系を利用して、自然耐性機構が、BLM不活化の上昇と同時に薬剤細胞内取り込みの低下の機構によることが判明した。こうした複数の機構に基づく耐性機序の解明は、自然耐性克服に有用なモデルである。4・薬理生化学機序からの耐性克服の方策として制癌活性のないアントラサイクリンのアナローグのみならず、多くのvinca alkaloidも耐性細胞による薬剤のeffluxを抑制して、制癌剤に対する感受性を回復させることを見出した。制癌剤との併用療法により生体内での抗癌作用の亢進の可能性を認めた。5・腫瘍細胞由来の血管新生因子の検索は、耐性細胞の新しい視点での克服方策になりうる手がかりを与えた。6・実際の臨床面での対応はhigh-dose Ara-Cとmitoxantroneの併用療法により好成績を得ており、今後、症例の蓄積のなかで、確立されうる治療法と思われる。以上の如く、本研究班での低感受性腫瘍に対する、基礎的及び臨床的研究は着実な実績を示しつつある。
魚類下垂体におけるゴナドトロピン産生活性の動態

近年、シロサケ下垂体から化学的に異なる2種類のGTH(GTH I & GTH II)が精製され、魚類の生殖腺の発達も2種類のGTHの調節を受けていることが示唆された。アミノ酸配列や生理的機能の点でGTH IIは従来からの成熟・排卵に関与するホルモンであることが確認されているが、GTH Iの機能についてはいまだ明らかではない。β-subunitの抗体を用いた免疫細胞化学によりGTH I、GTH II陽性細胞の染分けができること、GTH I細胞は卵黄形成期初期にGTH II細胞に先立って下垂体に出現すること、更に、GTH Iの下垂体および血清中での値は卵黄形成期に高いことなどが現在までに分っている。しかし、新しいホルモンであるGTH Iの生理的機能を解明するためにはホルモンそのものの産生と分泌の動態を把握する必要がある。そこで、本研究ではニジマス(♀)を用い、生殖周期におけるGTH I、GTH IIのmRNAの転写活性をin situ hybridization法により検索し、GTH I、GTH IIの産生動態を検索した。生殖周期におけるニジマス(♀)下垂体のGTH産生状況(mRNAの発現状況)はGTH IとGTH IIとではその産生時期に明らかな違いがある。GTH II mRNAは卵黄形成期中期から卵成熟・排卵期直前にかけて急激に増加する。一方、GTH I mRNAの活性は卵黄形成期初期から出現し、中期にかけて急激な増加を見せ、卵成熟・排卵期には減少している。これらの結果はGTH Iが常にGTH IIに先立って産生され、特に卵黄形成期にはその産生活性が高いことを明らかにしており、GTH Iの生理的機能を解明する上で重要な鍵となると考えられる。加えて、GTH I、GTH IIの生理的機能が相互に関連している可能性も示唆しており、GTH IIの機能発現にGTH Iの存在が必要であるか等について今後の検討が必要である。硬骨魚類シロサケの下垂体から2種類の化学的に異なるゴナドトロピン(GTH I,GTH II)が単離され、一次構造およびcDNAの塩基配列が決定された。GTH IIは卵成熟・排卵に関与するホルモンであり、GTH Iは新しい物質であるが、ホルモンとしての機能はわかっていない。これらに基づき本研究では、生殖周期に伴なうGTH I、GTH II産生細胞の形態および、産生活性の動態を免疫細胞化学およびin situ hybridizationの手法を用いて検討することを目的とした。本年度は主として、電顕レベルの免疫細胞化学によりGTH I細胞、GTH II細胞の微細形態の比較検討とin situ hybridization用のプローブおよび器具類の準備をおこなった。GTH IおよびGTH IIの各βサブユニットの抗体を用い、アマゴ下垂体におけるGTH I、GTH II各陽性細胞の微細形態を検討した。排卵直後の下垂体では、GTH II陽性細胞の免疫反応は小果粒(200ー400nm)と大果粒(500ー2000nm)の双方に検出され、一方、GTH I陽性細胞では大果粒に相当する構造が存在せず、陽性反応は小果粒(100ー400nm)のみに観察された。また、卵黄形成期の下垂体では、排卵期に比べ両細胞とも著しく数が少ないことに加え、それらの免疫陽性果粒のサイズもともに小型化(100ー300nm)していることが確かめられた。これらの結果から、GTH I、GTH II細胞は相互に極めて類似しており、免疫染色を用いてはじめて識別可能であることが明らかになった。

GTH Iα、GTH Iβ、GTH IIβの3種のcDNAを用い、^<35>Sで標識したプローブを作製した。現在、排卵期のニジマス下垂体におけるmRNAの検出を行ない、プローブの特異性、反応時間等の検討を進めている。昨年に引続き、サケ科魚類の下垂体におけるゴナドトロピン(GTHI、GTHII)の産生活性の動態をメッセンジャ-RNA(mRNA)の転写活性を指標として、in situ hybridization法(ISH法)により検索することを目的として、本年は、特に以下の3点について順次検討した。2)生殖周期におけるGTH産生活性の変動の検討:ニジマス(♀)を用い、卵黄形成期初期(7-8月)、中期(9-10月)、成熟・排卵期(11-12月)の3点で下垂体を採集し検討した。ISH法と免疫細胞化学法による結果を隣接切片で対応させ、下垂体の同一領域に混在しているGTHI、GTHII産生細胞を的確に識別し、ホルモンの産生状態と貯留状態とを比較検討した。現在までの結果、生殖周期におけるニジマス(♀)下垂体のGTHI、GTHII産生状況(mRNAの発現状況)には時期的なずれがみられ、GTHIIは卵成熟・排卵期直前に、一方、GTHIは卵黄形成期中期に各々産生活性の最盛期を示すことが確かめられた。これらの結果はGTHIが卵黄形成期に作用を持つホルモンであることを示唆しており、GTHIの生理的機能を解明する上で重要な鍵となると考えられる。
妊娠中の母親の脂質摂取と臍帯血IgE値、乳児期のアレルギー発症に関する研究

小児のアレルギー疾患増加への食生活の変化の関与を検討するため、妊娠中の母の脂質摂取と臍帯血IgE値、児のアレルギー疾患罹患との関連を前向き研究にて評価した。妊娠中の母のドコサヘキサエン酸、イコサペンタエン酸摂取と出生した児の3歳時の気管支喘息、5歳時の鼻アレルギーとの間に、負の関連を認めた。妊娠中の脂質摂取が児の幼児期のアレルギー発症に影響を及ぼす可能性を示唆した。小児のアレルギー発症には、妊娠中の母の免疫状態が関連し、妊娠中の食事や生活習慣が母だけでなく児の免疫にも影響する可能性がある。本研究では、妊娠中の食事の中で脂質に注目した。前向きデザインで、妊娠中の母の脂質摂取と臍帯血IgE値との関連、臍帯血IgE値と出生後児のアレルギー発症との関連、妊娠中の母の脂質摂取と出生後児のアレルギー発症との関連を評価する。研究代表者が所属する分野が行ったホルモンに関する疫学研究にて、数百人の女性が、妊娠中から現在も当研究に参加している。妊娠29週時に、5日間食事記録、生活習慣調査を、出産時に、臍帯血採取を行った。食事記録から脂質摂取量を推定し、コマーシャルラボに依頼し、臍帯血IgEを測定した。出産後経年的にアレルギーを含む児の状態を追跡している。平成21年度には女児についてデータの集計、解析を行った。女児についてのみの解析結果であるが、母の妊娠中脂質摂取推定量と臍帯血IgE値との間には有意な相関関係は認めなかった。乳児期のアレルギー疾患(喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎)を有する女児と有しない女児の臍帯血IgE値を共分散分析にて比較した。有意差は認めなかった。小児期のアレルギー疾患には、妊娠中の母の免疫状態が関連するという仮説がある。妊娠中の食事を含む生活習慣が児の免疫にも影響しその後のアレルギー発症に関連があるかもしれない。本研究では、妊娠中の食事の中で脂質に注目し、前向きデザインを用いて、妊娠中の母の脂質摂取と臍帯血IgE値との関連、臍帯血IgE値と出生後児のアレルギー発症との関連、妊娠中の母の脂質摂取と出生後児のアレルギー発症との関連を評価する。研究代表者が所属する分野が行ったホルモンに関する疫学研究にて、数百人の女性が妊娠中から現在も当研究に参加している。妊娠29週時に5日間食事記録と生活習慣調査を、出産時に臍帯血採取を行った。平成21年度から引き続き食事記録から脂質摂取量を推定した。また、平成21年度には女児の、平成22年度には男児の臍帯血IgEを測定した。出産後経年的にアレルギーを含む児の健康状態を追跡中である。平成22年度には男女合わせたデータの集計、解析を行った。母の妊娠中脂質摂取推定量を三分位化し、臍帯血IgE値を共分散分析にて比較したが、有意な関係は認めなかった。乳幼児期に各アレルギー疾患(喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎)を有する児と有しない児の臍帯血IgE値を共分散分析にて比較した。小児期のアレルギー疾患は、妊娠中の母の免疫状態と関連するという仮説がある。食事を含む妊娠中生活習慣が、児の免疫にも影響し、後の児のアレルギー発症に関連があるかもしれない。本研究では、妊娠期の食事で、脂質に注目し、前向きのデザインにて、1)妊娠中の母の脂質摂取と臍帯血IgEとの関連、2)臍帯血IgEと出生児のアレルギー発症との関連、3)妊娠中の母の脂質摂取と出生児のアレルギー発症との関連を評価した。既に、妊娠中の母の性ホルモンと出生時の児の発育との関連を評価する研究に参加した母子の中で、461組が追跡調査を遂行中である。妊娠29週時に母体情報として、5日間食事記録と生活習慣調査を、出産時に臍帯血を採取した。妊娠29週時の5日間食事記録から、五訂増補日本食品標準成分表を基に脂肪酸摂取量を推定した。成分表収載の脂肪酸5種類(飽和,一価不飽和,多価不飽和,N-3系,N-6系脂肪酸)に加え、さらに詳細な脂肪酸摂取量を推定した。出生した子については、1年に1回質問票を郵送し、アレルギーがあると医師に診断を受けたことがあるかどうか回答を得、生まれてから3歳及び5歳までのアレルギー罹患(喘息、アトピー性皮膚炎、鼻アレルギー、食物アレルギー)を定義した。1)妊娠中の母の脂質摂取と臍帯血IgEとの関連、2)臍帯血IgEと幼児期の児のアレルギー発症との関連については、前年度の報告のように、男女児ともに有意な関係は認められなかった。今年度は3)妊娠中の脂質摂取との児の3歳及び5歳時のアレルギーとの関連について解析を行った。

摂取量を3分位化後、摂取量の最少群を対照とし、それより多い群のアレルギー罹患のオッズ比を算出した。3歳時の検討で、ドコサヘキサエン酸(DHA)、イコサペンタエン酸(EPA)の最多群において気管支喘息のオッズ比が有意に低下していた。有意な傾向性は認めなかった。N3/N6比では、摂取最多群において鼻アレルギーのオッズ比が低下した。5歳時の検討では、妊娠中DHA、EPA摂取量は、鼻アレルギー罹患と有意な負の関連にあった。アトピー性皮膚炎、食物アレルギーでは、妊娠中脂質摂取との間に関連は認めなかった。当研究は、前向き研究であり、妊娠中の脂質摂取が出生後の児のアレルギー発症に影響することが示された。研究実績は、学会にて発表し、現在、投稿準備中である。
脊髄交叉性ニューロンの運動神経回路網における機能的役割の解明

哺乳動物における歩行運動、特に左右の交代性のリズム活動のパターンの形成には左右の交叉性の脊髄介在ニューロンが深く関与していると考えられるが、その機能発達に関してはこれまでほとんど調べられていない。本研究ではこうした交叉性脊髄介在ニューロンの電気生理学的性質とその機能分化を調べることを目的とした。新生児ラット脊髄摘出標本においてセロトニン(5-HT)の灌流投与により左右の腰髄前根に交代性の歩行運動様のリズム活動が誘発される。このリズム活動を引き起こす神経回路は胎生期に機能分化するが、左右の前根でみられるリズムのパターンは、その発現初期(胎生14-15日)においては同期したリズムが見られ、生まれる直前(胎生18-20日)に交代性のパターンへと変化する。この二つの異なるパターンを示す時期のラット胎児から得た脊髄摘出標本を用いて正中部で灌流槽を二分し、片側のリズム形成回路網から対側運動ニューロン群への入力について調べた。同期したリズムが見られる胎生15.5日の標本において片側脊髄に5-HTを灌流投与したところ、投与側と同期したリズムが対側前根にも誘発された。さらに片側灌流槽へのカルシウムイオンを除去した状態での薬物投与により、個々の交叉性ニューロンを直接興奮させたところ、対側前根に5-HT投与時と同様のリズム活動が誘発された。これらの結果から、片側脊髄のリズム形成回路網は交叉性ニューロンを介して対側の連動ニューロンに興奮性に結合していることが示唆された。この対側のリズムは対側脊髄へのビククリン投与によって抑制されたことから、交叉性の興奮性シナプス入力は主にGABA_A受容体を介していることが示唆された。一方、左右交代性のパターンが見られる胎生20.5日の脊髄摘出標本においては、片側脊髄に5-HTを灌流投与してもその対側前根にはリズムが誘発されず、この時期、リズム形成回路網の交叉性入力の性質が抑制性へと変化したことが示唆された。本研究はラット及びマウスの胎児や新生児の脊髄摘出標本を用いて歩行リズムにおける左右の交互パターンの形成に関わっている脊髄介在ニューロンを同定し、その電気生理学的、形態学的性質とその胎生期における日齢に伴う変化を調べることを目的にしている。これまでに我々は、胎生ラット脊髄摘出標本において胎生15.5-16.5日には、腰髄前根における5-HT誘発リズムは左右で同期したパタンを示し、胎生20.5日までには左右交代性のパタンに変化することを明らかにした。本研究でまず我々はこれらの左右の神経回路網の結合は前交連を通る神経軸索によって伝えられていることを確認した。次にこれらの前交連に軸索を送る交叉性ニューロンを逆行性に標識し、脊髄内における位置とその日齢による変化を明らかにする目的で胎生15.5-16.5日及び胎生20.5日において摘出した腰髄の断面の片側に脂溶性標識色素Dilの結晶を挿入し、反対側から投射している交叉性ニューロンを標識してその細胞体の位置を確認した。この結果、どちらの日齢ともこうしたニューロンの多くは脊髄腹側3分の2に分布しており、特に内測に細胞体が位置するものが多く染色された。さらに、胎生ラット脊髄摘出標本において、カルシウム感受性色素のCalcium green-1AMを逆行性に交叉性ニューロンに取り込ませ、カルシウム・イメージング法を用いて細胞内カルシウム濃度の変化を観察した。この結果、多くの腹内側に位置する交叉性ニューロンに運動ニューロンのリズム活動と一致した細胞内カルシウム濃度の上昇が見られた。今後、マウスにおいても同様の実験を行ない、これらのニューロンを赤外線微分干渉法と蛍光観察を組み合わせて、単一ニューロンのホールセル記録を行なってそのリズム活動の際の膜電位変化について調べる予定である。

一方、左右交代性のパターンが見られる胎生20.5日の脊髄摘出標本においては、片側脊髄に5-HTを灌流投与してもその対側前根にはリズムが誘発されず、この時期、リズム形成回路網の交叉性入力の性質が抑制性へと変化したことが示唆された。
国際理解教育における難民問題と市民性形成―欧州の協働実践に学ぶ教材開発

前年度に引き続き、「きれいごと」「他人事」を乗り越えること、当事者性のある学び、身体性にねざす学びをキーワードに検討を継続した。その中で、「情念」や「情動」という教育学では扱いづらいキーワードにこそ着目した教材作りができないかということで検討を進めた。また、3名がポーランドで、1名がルワンダでNGO等の訪問調査を行った。内戦から20年が経ったルワンダ、あるいはホロコーストや第二次世界大戦の記憶の残るポーランドで、実際に使用されている教材について情報収集を行うことができた。例えばポーランドでは難民危機以来、NGO等は財政的にも困難な状況に置かれており、ヨーロッパの多くの国々同様、市民の間で分断が進んでいる。しかしだからこそ対話が必要ということで、教師用のマニュアルや教室内での対話のための工夫、またアートやドラマ、映画を媒介に市民の間の対話を促す実践などについて知見を得た。また、ポーランドにせよルワンダにせよ、こうした課題に取り組む人々は、過去の苦い経験をこれからの移民・難民との共生に生かしていきたいという使命感に動かされている。日本も同様に過去の経験から学ぶための教材の工夫が必要であることを痛感した。オープンな議論のために日本国際理解教育学会実践研究委員会の枠組みで5回の公開研究会を実施した。また研究経過報告としてはドラマワークとアートワークを用いた実践を、ネガティブ・ケイパビリティの必要性からまとめ、日本国際理解教育学会大会で報告した。また、中田豊一氏考案の対話技法であるメタ・ファシリテーションを用いたリフレクションの探求を軸に、その成果と課題をヴィゴツキーの情動理論と絡めて言語文化教育研究学会で報告した。最終年は日本国際理解教育学会大会でこれまでの成果を報告し、教材を公開する予定である。学校での実践のための調整に時間がかかったため。今年度も前半で2回の公開研究会を行うほか、メンバー内で研究会を数回持ち、成果のまとめに向けて研究を遂行する。初年度は、市民性教育や開発教育、社会科教育の分野などにおいて、これまで作成されてきた国内外の難民に関する教材を収集・分析するほか、教材開発に示唆を得るべく難民当事者を招いた研究会の開催、海外で多く出版されている難民をモチーフとする絵本に学ぶ活動、またそうした絵本を活用するドラマワークやアートワークの実践を検討するなどの活動を行なった。可能な限りオープンな形での教材開発を行うため、2017年度には、日本国際理解教育学会の研究実践委員会の枠組みで4回の公開研究会を実施したほか、日本国際理解教育学会研究大会の特定課題研究で報告を行った。本研究では「きれいごと」「他人事」に終始しがちな従来の理解・学びを越え、国際理解教育を「自分ごと」にして行くことを念頭に、「当事者性」「市民性」「社会参加」を改めて問うこととし、教材の開発においては知識理解を超え、感性や身体性を重視した行動や価値観の変容を促すきっかけとなるものを目指すために、「ライフストーリー」「アート」「絵本」「場・コミュニティづくり」、更には話し合い学・プロセスワーク・U理論などもキーワードにしながら進めている。2年目は2018年度日本国際理解教育学会研究大会の特定課題での報告・協議を行い、また継続して4ー5回の公開研究会を行う予定である。同時に、作成中の教材の試験的な実践、またアウトプットに向けて検討を開始する。開発中の教材は実践を重ねて内容の改善を行うべきところだが、学校での実践などをめぐり、調整に予定より時間がかかっている。学校での実践は整い次第実施する。また、公開研究会を昨年同様に5回程度実施するほか、メンバー間で教材の成果の出し方に向けた議論を行っていく。

基礎研究の進行具合から、海外調査を2年目に行うことにしたこと、また学校での教育実践の日程調整に時間がかかり、次年度での実戦となったことから、次年度に予算を送った。教材作成・報告書作成のための経費が当初見込んでいた額より必要であると判断したため。
TLRシグナルを介した新奇薬物相互作用によるマクロファージ細胞死の分子機構の解明

マクロファージを、グラム陰性菌外膜成分であるリポ多糖(LPS)によって刺激することでM1マクロファージへと誘導した。その際に、M1マクロファージにのみ特異的に細胞障害を誘導する化合物の探索を行った結果、広域型カスパーゼ阻害剤であるzVAD-fmkを候補化合物として見出した。zVAD-fmkによるM1マクロファージの細胞障害誘導機構を調べた結果、LPSによる刺激時間が長くなるにつれて、細胞障害は大きくなることが分かった。次に、ネクロプトーシス阻害剤であるnecrostatin-1やウェスタンブロッティングによる解析を行った結果、necrostatin-1によってzVAD-fmkによるM1マクロファージの細胞障害は抑制された。さらに、ネクロプトーシス実行因子であるmixed kineage kinase domain-like protein(MLKL)はLPSの刺激時間に依存して発現量が大きくなり、MLKLの活性化体であるリン酸化MLKLも同様の結果を示した。また、necrostati-1によってリン酸化MLKLは顕著に抑制されたことから、zVAD-fmkによる細胞障害はネクロプトーシスを介していることが明らかになった。また、各種阻害剤を用いた検討によって、活性酸素種ならびにp38 MAPキナーゼもネクロプトーシスに関与しており、活性酸素種はMLKLやp38 MAPキナーゼの上流に位置していることを明らかにした。現在、マクロファージ細胞死の新たな誘導機構ならびにその誘導に関与する因子の同定に成功しており、おおむね順調に進展していると思われる。今後、実臨床にて用いられている薬剤を用いて、薬物相互作用の検討を行っていく予定である。超高齢化社会への移行に伴い、多剤併用療法が標準化し、薬物相互作用による有害事象を回避することは、重要な課題である。申請者は、マクロファージ活性化経路の一つであるToll様受容体(TLR)シグナル経路に作用する薬物同士を併用にすることによって、急速に細胞死が誘導される現象を見いだした。本現象は、免疫系以外の細胞では見られないことから、免疫系に特異的な薬物相互作用を示唆している。これらの研究成果を踏まえ、本研究では、自然免疫系の機能低下をもたらす新奇薬物相互作用を起こしうる医薬品の同定とその分子機構の解明を行うことを目的とし、重篤な感染症の予防に向けた新たな治療手段の提供につながると考え、本申請研究を企画した。初年度は、マクロファージに細胞死を誘導する薬物相互作用を同定するために解析系(ルシフェラーゼレポーターアッセイ系)の確立に取り組んだ。レポーターアッセイのプラスミドは完成した。また、一般的にマクロファージ系の細胞は遺伝子導入効率が悪いという報告もあったが、様々な条件検討の末、最適な導入法の確立も成功したことから、現在は本解析系を用いた検討を進めるために、今までに見つかっている相互作用を示す化合物をマクロファージに作用させ、アッセイ系が適切に反応するかどうかについて調べている最中である。次に、細胞死誘導を起こしうる相互作用の探索を行った。その結果、マクロファージ活性化作用をもつ物質、カスパーゼ阻害作用を有する化合物において新たに細胞死(ネクロトーシス)が誘導されることを発見した。現在は、この分子機構の解明を行っているところである。当初目標としていた計画通りに概ね進展しており、新たな細胞死誘導機構も明らかになりつつあるため。本年度は、作製したレポーターアッセイ系を用いて、薬物相互作用の解析を進めていく予定である。さらに、細胞死誘導の分子機構を解明し、次年度の患者を対象とした副作用調査への準備へと入っていく予定である。計画した研究が順調にいったため、翌年度繰り越し分が生じた。実験の検討に時間がとられ、予算額よりも下回る使用額となった。
機能未知のＣ型レクチンが認識する結核菌由来脂質の同定とその機能の解明

申請者は、機能未知のC型レクチン受容体DCLRが結核菌を認識することを見出していたが、結核菌の様々な構成成分の中で、何がDCLRのリガンドなのかは不明であった。そこで、結核菌を有機溶媒にて処理し、細胞壁に含まれる脂質成分を抽出し、この脂質成分中からDCLRリガンドを単離した。脂質成分をオープンカラムクロマトグラフィーにて分取し、各分画に含まれる脂質成分を薄層クロマトグラフィーにて解析を行った。同時に、各分画のDCLRに対するリガンド活性をレポーター細胞を用いて検討し、活性のある分画を複数同定した。九州大学薬学研究院の宮本智文准教授との共同研究により、これらの分画に含まれる脂質が、結核菌に特有のphosphoglycolipidであることが明らかとなった。このことから、DCLRのリガンドは、結核菌に含まれるユニークな脂質であることを明らかにした。また、生体において、どのような細胞にDCLRが発現しているかを明らかにするため、DCLR欠損マウスに、DCLR安定発現細胞株を免疫し、モノクローナル抗体を樹立した。この抗体を用いて、DCLR発現細胞を解析し、腹腔や脾臓、肺などに存在する一部の細胞集団にDCLRが発現していることを見出した。現在、感染防御におけるDCLRの役割を明らかにするため、野生型及びDCLR欠損マウスを用いて、BCG感染実験を行っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、機能未知のC型レクチン受容体が結核菌を認識することを見出しているが、結核菌の様々な構成成分の中で、何がリガンドなのかは不明である。当該年度は、そのリガンド同定に注力して研究を行った。リガンド認識をGFPでモニターできるレポーター細胞を用いたこれまでの研究から、結核菌を有機溶媒にて処理し、細胞壁に含まれる脂質成分を除去した菌体では認識されなくなること、また、処理した有機溶媒中にはレポーター細胞を活性化する成分が含まれていることが明らかとなっている。そこで、この有機溶媒中に含まれるリガンドを単離するために、薄層クロマトグラフィー(TLC)を用いて解析を行った。結核菌から抽出した脂質成分をTLCによって展開した後、移動度毎に分画し、レポーター細胞を用いてこれらのサブフラクションのリガンド活性を検討した。その結果、レポーター細胞を活性化させたサブフラクションがいくつか得られた。これらのサブフラクションは、オルシノールによる糖染色や、モリブデンブルーによるリン酸染色によって染色されたことから、糖やリン酸を含む脂質である可能性が示唆された。現在、この脂質成分を大量に精製しており、今後、構造解析を行う予定である。新規結核菌受容体の結核菌に含まれるリガンドに関して、リガンドの単離方法を確立し、現在構造を行っている。TLCでの様々な解析結果から、このリガンドは糖脂質であることが示唆されているが、これまで得られているMSやNMR解析からも、このことを支持する結果が得られている。また、この新規結核菌受容体を特異的に認識するモノクローナル抗体の樹立にも成功し、実際にこの受容体が生体においてどのような細胞に発現しているかも明らかとなった。確立したリガンド単離方法によって、リガンドを大量に精製し、構造解析や生理活性検討用のサンプルを調製する。生理活性の検討は、野生型及び新規結核菌受容体欠損マウスから得た細胞を用いて行う。炎症性サイトカインの産生や細胞表面の活性化マーカーの発現を指標にこれらを検討し、必要であればマイクロアレイ解析を行う。また、野生型マウス及び新規結核菌受容体欠損マウスを用いて結核菌感染実験を行い、この受容体の結核感染における機能を明らかにする。
前期破水による早産の予防・管理に関する新方式の検討

癌胎児性フィブロネクチンのモノクローナル抗体(FDC-6)を利用した癌胎児性フィブロネクチン測定ELISAキット(PTD check,ADEZA社)を用いて膣分泌液から癌胎児性フィブロネクチンを検出した。11施設において採取した膣分泌液490検体を用いて検討した。本研究での正常妊婦とは年齢2039歳までの妊婦で、検査時に切迫早産徴候が認められず、治療を行っていない妊婦とし、切迫早産とは年齢2030歳までの妊婦で検査時臨床症状が認められたか、あるいはトコライシスなどの治療を行っており、破水を起こしていない症例とした。正常妊婦の妊娠622週未満までの癌胎児性フィブロネクチン陽性率は14.7%、22週以上37週未満までの陽性率は4.9%、37週以上での陽性率は19.4%であった。切迫流早産の妊婦622週未満までの陽性率は50%、22週以上37週未満までの陽性率は46.2%となり、いずれの群でも正常妊婦に比較して切迫早産群の癌胎児性フィブロネクチンの陽性率が高いことが認められた。切迫早産群のうち妊娠22週以上37週未満での切迫早産169例中、早産に至った症例は60例あり、その中本法陽性は43例、陰性は17例であり、本法の早産に対する感度は71.7%であった。また、正期産に至った症例は109例あり、その中本法陽性は35例、陰性は74例であり、本法の特異性は67.9%であった。また一致率は69.2%であり、x^2検定で有意差が認められた。以上のことから切迫早産群における早産の可能性や早産に至らない可能性を判断する際、臨床症状に加えて客観的な指標として本法のような生化学的な手段を加えることは、周産期管理上意義が高いと考えられる。(1)羊水中に多量含まれるとされる癌胎児性フィブロネリチン(OFFN)を子宮頸管分泌液中から検出することによって早産を予知できるかどうか検討してみた。妊娠22週以上37週未満の正常妊娠症例のOFFN陽性率は4.4%と低いことが認められた。一方、切迫早産群のうち早産に至った症例の71.4%がOFFN陽性であったことからOFFN陽性者では早産のリスクファクターが高いことが認められた。逆に、正常妊娠のOFFN陰性率は95.6%と極めて高く、また切迫早産群でもOFFN陰性例での正期産に至る率が80.4%と高率であったことから、OFFNが陰性であれば早産に至る危険性は少ないことが示唆された。(2)癌胎児性フィブロネクチンが子宮頸管分泌液中より検出されるのは、絨毛羊膜炎によって好中球から放出されるエラスターゼ等のプロテアーゼにより羊膜の脆弱化がおこるためと考えられる。そこで同上子宮頸管分泌中の、感染のマーカーと思われるIL-6,IL-8,G-CSFを測定し、OFFN検出との関連性について検討を行なった。IL-6値に関してはOFFN値との間に相関は認めなかった。G-CSFに関しては使用したELLISAキットではほとんど検出されなかった。しかしIL-8値はOFFN陰性例でも高値を示し、OFFNとの相関は明療ではないが、IL-8測定ELLISAの感度を調整することによって明らかとなろう。さらに多くの症例でのIL-8値を羊水液中、子宮頸管分泌液中での値を検討し、その臨床的意義について考察する必要があるとともに、OFFN値との関連性を明白にする。本研究での正常妊婦とは年齢2039歳までの妊婦で、検査時に切迫早産徴候が認められず、治療を行っていない妊婦とし、切迫流産とは年齢2030歳までの妊婦で検査時臨床症状が認められたか、あるいはトコライシスなどの治療を行っており、破水を起こしていない症例とした。切迫流早産の妊娠622週未満までの陽性率は50%、22週以上37週未満までの陽性率は46.2%となり、いずれの群でも正常妊婦に比較して切迫早産群の癌胎児性フィブロネクチンの陽性率が高いことが認められた。

以上のことから切迫早産群における早産の可能性や早産に至らない可能性を判断する際、臨床症状に加えて客観的な指標として本法のような生化学的な手段を加えることは、周産期管理上意義が高いと考えられる。癌胎児性フィブロネクチンのモノクローナル抗体(FDC-6)を利用した癌胎児性フィブロネクチン測定ELISAキット(PTD check,ADEZA社)を用いて膣分泌液から癌胎児性フィブロネクチンを検出した。11施設において採取した膣分泌液490検体を用いて検討した。本研究での正常妊婦とは年齢2039歳までの妊婦で、検査時に切迫早産徴候が認められず、治療を行っていない妊婦とし、切迫早産とは年齢2030歳までの妊婦で検査時臨床症状が認められたか、あるいはトコライシスなどの治療を行っており、破水を起こしていない症例とした。正常妊婦の妊娠622週未満までの癌胎児性フィブロネクチン陽性率は14.7%、22週以上37週未満までの陽性率は4.9%、37週以上での陽性率は19.4%であった。切迫流早産の妊婦622週未満までの陽性率は50%、22週以上37週未満までの陽性率は46.2%となり、いずれの群でも正常妊婦に比較して切迫早産群の癌胎児性フィブロネクチンの陽性率が高いことが認められた。切迫早産群のうち妊娠22週以上37週未満での切迫早産169例中、早産に至った症例は60例あり、その中本法陽性は43例、陰性は17例であり、本法の早産に対する感度は71.7%であった。また、正期産に至った症例は109例あり、その中本法陽性は35例、陰性は74例であり、本法の特異性は67.9%であった。また一致率は69.2%であり、x^2検定で有意差が認められた。
セメント芽細胞におけるカルシウム受容体の発現と活性化機構の解析

申請者らはセメント芽細胞において、細胞外カルシウム刺激によりFibroblast growth factor 2(FGF-2)の発現が増強されることを見いだした。プロテインキナーゼA(PKA)阻害剤であるH89およびアデニル酸シクラーゼ阻害剤であるMDL-12330AによりFGF-2mRNAの発現増強は抑制され、プロテインキナーゼC(PKC)阻害剤であるGF-209203XおよびホスフォリパーゼC阻害剤であるU73122では発現増強に影響がないことから、細胞外カルシウムによるFGF-2発現増強はPKA依存性かつPKC非依存性のシグナル伝達経路によることが示唆された。Calcium-sensin recetorのようなGタンパク共役型受容はカルシウムの恒常性の維持に重要な役割を果たしている。これらの受容体は骨芽細胞の表面にも発現しており同細胞の分化に関与することが知られている。一方、細胞外Ca^<2+>に対するセメント芽細胞の反応に関してはあまり知られていない。セメント芽細胞は歯根の表面にあり、骨芽細胞と類似したタンパク質を細胞表面に表出している。セメント芽細胞はセメント質および歯根膜の分化、再生に中心的な役割を果たしていると考えられている。我々は、歯周組織の再生に関与する成長因子のmRNA発現について、マウスセメント芽細胞に対する細胞外Ca^<2+>の影響をin vitroにおいて解析した。マウスセメント芽細胞は、Somerman博士の研究室で樹立された不死化細胞株(OCCM-30)を実験に供した。2) Calcium-sensing receptorアゴニストであるSpermine, NeomycinやGadlinium刺激したところ、Gadlinium刺激でFGF-2 mRNA発現の誘導がみられた。3)高濃度細胞外Ca^<2+>(10mM)刺激によるMAPキナーゼのリン酸化についてウェスタンブロッティングを用いて解析したところ、ERK1/2のリン酸化が10分をピークとしてみられた。4) ERK1/2の阻害剤であるPD98059を用いてOCCM-30を前処理したところ、細胞外Ca^<2+>(によるFGF-2mRNAの発現の増強は抑制された。以上の結果から、マウスセメント芽細胞において、細胞外Ca^<2+>がMAPキナーゼを介してFGF-2 mRNA発現を増強することが分かった。今後受容体およびシグナル伝達機構を同定することにより、新しい歯周組織再生治療の確立に貢献することが期待できる。Calcium-sensing receptorのようなGタンパク共役型受容体はカルシウムの恒常性の維持に重要な役割を果たしている。これらの受容体は骨芽細胞の表面にも発現しており同細胞の令化に関与することが知られでいる。2)PKC阻害剤であるGF-109203X前処理ではFGF-2 mRNA発現の抑制はみられなかった。また、PMAによるPKC枯渇時においてもCaによるFGF-2 mRNA発現誘導に影響がみられなかった。3)PKA阻害剤であるMDL-12330AおよびH-89前処理ではFGF-2 mRNA発現誘導が抑制された。また、Ca刺激によってcAMP濃度の上昇が認められた4)免疫染色にてFGF-2タンパクの発現誘導を解析したところ、Ca刺激でFGF-2タンパクの発現誘導がみられた。5)カルシウムイオンチャンネル阻害剤であるNifedipineおよびCa Ionophore存在下でCa刺激したところ、FGF-2 mRNA発現の抑制はみられなかった。以上の結果から、セメント芽細胞において、細胞外Ca^<2+>がcAMP/PKA依存件にFGF-2 mRNA発現を増強することが分かった。この反応は陽イオンを認識するCalcium-sensing receptorに類似したGタンパク共役型受容体を介している可能性がある。これらの知見は、新しい歯周組織再生治療の確立に有用であると考えられる。
認知症の先制予防法開発の試み～口腔から全身を守る～

本研究では、高齢者を対象に、慢性炎症を引き起こす歯周病関連細菌、血液脳関門を弱めて微生物の脳への侵入を助けるカンジダと認知症についての関連性を検討し、口腔ケアなどの口腔微生物の制御が積極的な認知症予防となる可能性を模索することを目的とする。平成30年度は、本研究に同意の得られた88名を対象に会場検診を実施した。1認知機能検査:島根大学で開発され、妥当性と信頼性の検証も終了し、無料でダウンロードおよび利用が可能であるiPad用認知機能スクリーニング検査「CADi」を使用して行った。これまでに、平成29年のCADiスコアが6点未満の群は、平成28年時点のTreponema denticola数が有意に多かった。Spearmanの相関係数は、平成28年、29年のTreponema denticola数が平成29年CADiスコアと負の相関があり、平成29年の所要時間との間には正の相関が認められた。一般線形混合モデルでは、認知検査スコアにTreponema denticolaが負の影響を与え、認知機能検査所要時間には正の影響を与えている可能性が示唆された。また、3Dプリンタを応用したオーダーメイド歯ブラシ作製の準備として、口腔内スキャナを用いた光学印象採得を行った。現在、光学印象採得で得られたデータをもとにオーダーメイド歯ブラシの設計を模索している。平成30年度は会場検診によるサンプリングを実施したが、産前・産後休業および育児休業を取得したため、分析等にやや遅れが生じている。2019年度は、平成1020年度に8020健康調査の一環として実施された新潟高齢者研究の被験者を対象に、訪問調査を実施し、慢性炎症を引き起こす歯周病関連細菌、血液脳関門を弱めて微生物の脳への侵入を助けるカンジダと認知症についての関連性を検討し、口腔ケアなどの口腔微生物の制御が積極的な認知症予防となる可能性を模索し、口腔内スキャナを用いた光学印象採得で得られたデータをもとにオーダーメイド歯ブラシの設計を実施する予定である。本研究では、慢性炎症を引き起こす歯周病関連細菌、血液脳関門を弱めて微生物の脳への侵入を助けるカンジダと認知症についての関連性を検討し、口腔ケアなどの口腔微生物の制御が積極的な認知症予防となる可能性を模索することを目的とする。平成28年度は、本研究に同意の得られた81名(昭和2年生まれの男性45名、女性36名)を対象に訪問調査を実施し、1)認知機能と口腔微生物の関係性についての検討2)酸化ストレスと口腔微生物が高齢者の健康状態に与える影響の検討を行った。その結果、認知機能検査の所要時間が300秒以上の群は、P. intermedia、T. denticola、Candida数が多い傾向を示したが、有意差は認められなかった。また、P. intermediaとF. nucleatumが認知機能検査所要時間との間に弱い正の相関が認められた。平成28年度は、平成1020年度に「高齢者の口腔保健と全身的な健康状態の関係についての総合研究」一環として実施された新潟高齢者研究の被験者のうち、本研究に同意の得られた81名(昭和2年生まれの男性45名、女性36名)を対象に訪問調査を実施し、1)認知機能と口腔微生物の関係性についての検討2)酸化ストレスと口腔微生物が高齢者の健康状態に与える影響の検討のため、唾液サンプル採取、iPad用認知機能スクリーニング検査「Cadi2」、カンジダ検査を実施した。本結果は、第66回日本口腔衛生学会総会にて発表する予定である。平成29年度は、本研究に同意の得られた56名を対象に訪問調査を実施し、認知機能と口腔微生物の関係性についての検討を行った。2歯周病関連細菌とカンジダの菌数測定:唾液を検体としてリアルタイムPCRにより実施した。リアルタイムPCRは、今までに認知機能との関連が報告されたPrevotella intermedia, Treponema denticolaと脳血液関門バリアの抵抗性を弱めるとの報告があったカンジダ症関連真菌Candidaalbicansの菌数を測定した。その結果、平成29年のCADiスコアが6点未満の群は、平成28年時点のTreponema denticola数が有意に多かった。