hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱ショックタンパク質解析のための機械学習手法

タンパク質の各アミノ酸がタンパク質の表面にあるか内部にあるかを推定するために従来からcontact numberという指標が提案されていたが、最近、half-space exposure(HSE)という指標が提案された。しかしながら、HSEをアミノ酸配列だけから予測する手法がなかったため、本研究において、サポートベクターマシンとホモロジー検索や二次構造予測などの配列解析結果を組み合わせた予測手法を昨年度に引き続き開発し完成させた。開発した手法を計算機実験により評価したところ、相関係数にして0.72から0.68という良好な予測精度を達成することができた。その成果として、バイオインフォマティクス分野における中心的な専門誌であるBioinformatics誌に論文が掲載された。さらに、開発した手法に基づき予測サービスを行うWEBサーバを開発して公開した。似たアプローチを用いて、配列データからタンパク質の温度因子(タンパク質の立体構造で揺らぎの大きい部分と小さい部分を表すパラメータ)を予測する手法も開発し、良好な予測精度を得ることができた。また、タンパク質のフォールディング速度の予測について、立体構造をネットワークとして表現して特徴量を抽出し、さらに他の特徴量も加えて、サポートベクター回帰と組み合わせるという新たなアプローチに基づく方法を昨年度に引き続き開発し完成させた。この方法により、既存手法と同程度の予測精度を達成することができ、データの種類によっては既存手法を上回る予測精度を達成することができた。さらに、フォールディング速度予測については予測サーバを開発して公開した。本年度は主に以下の2種類の研究を行った。1、構造情報とネットワーク情報を用いたタンパク質のフォールデイング速度予測方式タンパク質フォールディング速度は熱ショックタンパク質を含むタンパク質の解析をおいて重要な指標となる。本研究では、二状態および多状態を経由するフォールデイング速度をタンパク質立体構造から予測するための新たな手法を開発した。開発した手法では、従来手法で用いられてきた構造上の特徴に加え、アミノ酸間を辺でつないだネットワークを考え、そのネットワークの特徴に関する指標を用いた点が特徴になっている。ネットワークを構造するにあたり、近接アミノ酸間の情報を主に考慮したPCN(Protein Contact Network)と長距離相互作用の反映したLIN(Long-range Interaction Network)の二種類を利用した。これら二種類のネットワークから抽出した指標とフォールデイング速度との相関を調べたところ、LINからの指標の方がより重要な役割を果たすことが判明した。また、計算機実験による評価を行ったところ、開発した手法は二状態を経由する場合については既存手法の予測精度を上回ることがわかった。2、タンパク質配列からの半球露出度予測プログラムHSEpredの開発タンパク質の構造予測および構造解析のために半球露出度(HSE,Hlaf-Sphere Exposure)という指標が最近、提案された。HSEは各アミノ酸から一定の距離にある球を考え、それを側鎖のある半球(HSE-up)とその反対側の半球(HSE-down)にわけ、それぞれの半球に入るアミノ酸の個数を指標としたものであり、従来のCN(Contact Number)という指標の拡張になっている。HSEはタンパク質立体構造が与えられれは計算できるが、HSEを配列から予測する手法はこれまでに開発されていなかった。そこで、サポートベクター回帰という機械学習手法をを用いてHSEを予測する手法を開発した。そして計算機実験による評価を行ったところ、良好な結果を得ることができた。
精祖細胞におけるアンドロゲンレセプター発現の役割

本研究では,精祖細胞に発現するアンドロゲンレセブター(AR)の役割をin vivo,in vitroの実験系を用いて解明することを目的とした。本年度は,in yitro実験系で利用する解析手段を確立し,マウス成体の精粗細胞におけるARの挙動を明らかにした(in vivo)。免疫組織化学的には,精祖細胞を含む精細管内の各細胞のAR発現変化を半定量的に解析する一方,in situ hybridization法を用い,各細胞のARmRNA発現を検出した。マウス精巣精細管の全載標本を用い,抗AR抗体(NH27)と反応,螢光標識(Cy3)し,同時にSYBR Green IおよびTOTO-3にて核を標識し細胞種の同定を行った。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて得た精細管上皮基底部の光学的切片像から,各則胞核のAR螢光強度を計測した。In situ hybridization法には,マウス精巣凍結切片を用い,AR mRNAに特異的なdigoxigenin標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。その結果,セルトリ細胞,精祖細胞,筋様細胞の核が精細管上皮周期を通じて常にAR陽性であり,セルトリ細胞と精祖細胞とでは,螢光強度変化は共にstage依存性であった。即ち,最も強いstageVII-Xには,最も弱いstageIIIVの2倍以上の螢光強度を示した。一方,筋様細胞では,精細管上皮周期に伴う顕著な変化は認められなかった。また,各stageにおいてB型精祖細胞はA型よりもAR螢光強度が弱かったが,A型精祖細胞間では幹細胞型と分化型とで有意な強度の差はなく,A型精祖細胞は一貫してAR陽性であった。以上のことから,精祖細胞およびセルトリ細胞では精細管上皮周期に対応して増減を繰り返し,また精祖細胞では精母細胞への分化に伴って失われることが示された。本研究では,精祖細胞に発現するアンドロゲンレセプター(AR)の役割をin vivo,in vitroの実験系を用いて解明することを目的とした。本年度は,その第1段階として,来年度実施予定のin vitro実験系で利用する解析手段を確立し,マウス成体の精祖細胞におけるARの挙動を明らかした(in vivo)。免疫組織化学的には,精祖細胞を含む精細管内の各細胞のAR発現変化を半定量的に解析する一方,in situ hybridization法を用い,各細胞のAR mRNA発現を検出した。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて得た精細管上皮基底部の光学的切片像から,各細胞核のAR螢光強度を計測した。その結果,セルトリ細胞,精祖細胞,筋様細胞の核が精細管上皮周期を通じて常にAR陽性であった。セルトリ細胞と精祖細胞とでは,螢光強度変化は共にstage依存性であった。即ち,最も強いstage VIIXには,最も弱いstageIIIVの2倍以上の螢光強度を示した。

また,各stageにおいてB型精祖細胞はA型よりもAR螢光強度が弱かったが,A型精祖細胞間では幹細胞型と分化型とで有意な強度の差はなく,A型精祖細胞は一貫してAR陽性であった。以上のことから,精祖細胞およびセルトリ細胞では精細管上皮周期に対応して増減を繰り返し,また精祖細胞では精母細胞への分化に伴って失われることが示された。
可解格子模型の転送行列が従う函数方程式の解の行列式表現とその代数構造

1.付随するLie環がB型、C型の場合のT-systemにおいて、Young図形の深さを表す変数のとる値を負の整数にまで延長して、T-systemを格子型の離散戸田方程式とみなして、そのソリトン解の存在を検討した。これによって、T-systemが、可解格子模型の転送行列が従う非線形函数方程式を与えているだけでなく、任意のLie環の場合の戸田格子方程式の様々な離散化、およびその解の構成のための指針となりうることがわかった。2.T-systemのような有限系の戸田分子方程式において、与えられた境界条件のもとでの解の振舞いを、離散非線形可積分発展方程式における直接法の理論を用いて解析し、一般の場合に適当なgauge変換のもとで、解が多項式成分の行列式を用いて書き下せることを示した。これを応用して、逆に境界条件を適当に設定してやることによって、格子やtetherの運動を制御するための理論的、数値的解析を行った。3.離散Painleve方程式において、Miura変換、Schlesinger変換、双線形形式などの構成を行い、離散Painleve方程式を非対称に拡張することによって、独立変数および方程式中のparameterのなす空間における発展が、完全に自己双対な構造をもつことを発見した。4.非対称離散Painleve I方程式において環境条件を課した分子型の解を構成し、それが離散Airy函数を成分とする行列式で与えられることを示し、そのγ函数が、対数potentialをもつHermite ensembleの行列模型の分配関数そのものになっていることを証明した。
可逆光応答材料の設計

高効率で可逆的に何らかの情報やエネルギーを蓄積したり出力したりする材料を目指す。三木は高度の合成技術を駆使して多環芳香族に嵩高いt-ブチル基を多数導入し置換基環の立体反発で芳香間平面に歪みを生じさせて光異性化を効率良く起す手法を示した。斎藤は固体高分子中でのフォトクロミック分子の挙動、特に熱消色反応を動力学的に取扱い、1分子反応でありながら1次反応式に従わないことを示した。分散型過程の考えを導入してその解析を行った。熱消色速度は溶液<<ガラス<LB膜<結晶となることを見出した。材料化の基礎研究として重要な成果である。入江は高分子溶液および高分子混合系での光誘起相分離を検討している。田附は光誘起相変化をミセルやベシクル系で行い増幅効果を認めた。表面張力、光散乱強度、キラルな場における誘起円二色性スペクトルなど増幅読み出しができる物理量は数多くあり、増幅読み出しにより光反応量を低くすることができるため繰り返し使用安定性の改善も期待される。小門は電極と高分子の界面に可逆光応答性分子をおいてその光反応により電極からの注入電流を制御する増幅原理を示した。各種電極よりポリビニルカルバゾールへの注入電流がポリピロールを介在させた場合【10^2】も増す。LB膜に関して山崎はエネルギー準位の異なる色素を積層し、ピコ秒ケイ光測定の手法により段階的エネルギー移動を観測することに成功した。これはアンテナ色素の見事なモデルであり、今後、集光スステムの構築に役立つであろう。以上の如く、各自の得意分野での独自性を発揮しながら高効率化に向ってベクトルの揃ったプロジェクト研究が順調に進められている。
児童発達支援センター看護師の役割と小児在宅ケアでの多職種連携体制の構築

児童発達支援センターは、様々な障害をもつ就学前の子どもの通園事業施設である。看護師は各施設1ー2名配置されているが、その実践の現状は明らかではない。本研究の目的は、1.全国の児童発達支援センター施設管理者が捉える看護師の役割と多職種連携の実態を明らかにすること(質問紙調査)、2.児童発達支援センター看護師が実践する役割と専門性を見出し(面接調査)、小児在宅ケアでの多職種連携のコーディネーターとして参加できる体制の構築および提案を行うことである。本研究成果は、日本小児看護学会等で意見交換を行い、看護師を小児在宅ケアでの多職種連携のコーディネーターとして参加できる体制づくりの可能性を探りたい。
スケーラブル統合プログラミング言語モデルLMNtalの実用化

LMNtal(elementalと発音)は,多重集合や並行処理やモビリティなどの概念を持つさまざまな計算モデルを簡明な形で統合することを目的として,研究代表者と研究分担者が提案したプログラミング言語モデルである.本研究は,階層グラフ書換え型の計算モデルとして確立しつつあったLMNtalを実用プログラミング言語に成長させるために必要な言語機能を設計し,実装技術を確立し,実際に処理系を構築して広く公開することを目標に推進した.本研究によって得られた主要成果は以下の通りである.(a)プログラミング言語としてのLMNtalの確立-階層グラフ書換えモデルに対して,基本データ型と基本演算,モジュールシステム,他言語インタフェースなどの導入方法を検討設計し,それらを用いて多様なライブラリの構築を行った.(b)実装技法の確立と処理系の作成-LMNtal用中間言語へのコンパイラと,中間命令列を実行をつかさどる実行時処理系からなる処理系を構築した.特に,複数タスクを用いた非同期実行方式を設計・実装するとともに,逐次実行最適化機能や中間言語からJavaへのトランスレータも実装した.またグラフ自動整形機能をもつ実行可視化機能を設計・実装した.LMNtal(elementalと発音)は,多重集合や並行処理やモビリティなどの概念を持つさまざまな計算モデルを簡明な形で統合することを目的として,研究代表者と研究分担者が提案したプログラミング言語モデルである.本研究は,階層グラフ書換え型の計算モデルとして確立しつつあったLMNtalを実用プログラミング言語に成長させるために必要な言語機能を設計し,実装技術を確立し,実際に処理系を構築して広く公開することを目標に推進した.本研究によって得られた主要成果は以下の通りである.(a)プログラミング言語としてのLMNtalの確立-階層グラフ書換えモデルに対して,基本データ型と基本演算,モジュールシステム,他言語インタフェースなどの導入方法を検討設計し,それらを用いて多様なライブラリの構築を行った.(b)実装技法の確立と処理系の作成-LMNtal用中間言語へのコンパイラと,中間命令列を実行をつかさどる実行時処理系からなる処理系を構築した.特に,複数タスクを用いた非同期実行方式を設計・実装するとともに,逐次実行最適化機能や中間言語からJavaへのトランスレータも実装した.またグラフ自動整形機能をもつ実行可視化機能を設計・実装した.本年度は、並行言語モデルLMNtal実用化の基盤を固めるために下記の研究を遂行した。1.プラットフォーム処理系の整備拡充研究開発のプラットフォームとなるLMNtal逐次処理系をJavaで実装、公開し、バージョンアップを重ねてきた。分散処理系への拡張を念頭に置いて、膜ごとの計算を非同期に実行するための排他制御や協調動作の方式設計および実装を行った。また可視化機能や他言語インタフェース機能の拡充、プロセス文脈機能の強化、生成コードの改善などの各種改良も行った。2.言語設計の洗練LMNtalが分散計算を的確にモデル化する言語モデルとなるように、操作的意味論の一部を見直した。コネクタ(二つのグラフ構造を接続するための言語要素)に関して、どのような操作を構造合同(可逆)と見なし、どのような操作を遷移関係(非可逆)と見なすべきかを考察し、従来の言語仕様の問題点を発見し修正した。3.LMNtalプログラムに対する型体系の設計LMNtalプログラムが形成するプロセス構造を扱うための型体系を設計し、型安全性の証明を行った。この型体系は、膜に出現する可能性のあるアトム(グラフのノード)の種類やリンクのつながり方を定式化するものである。本研究を通じて、実用的な解析のためには、膜に名前を付けて膜の静的な役割を識別することが有効であるとの知見を得た。4.分散処理系および小規模制御系向け処理系膜に実行位置情報を付加する機能を導入し、通信・キャッシュ・ロック・終了処理等の機構を逐次処理系に付加することにより、LMNtal分散処理系の試作を行った。また、組込み応用に向けて、センサやアクチュエータをLMNtalのアトムとの対応づける方式を考案し、ロボットコントローラ実機上で動作するLMNtalサブセットの実行系を構築して自律移動ロボットの制御を実現した。本年度は階層グラフ書換えに基づく並行言語LMNtal処理系の機能を大幅に拡充すべく、以下の研究開発を遂行した。1.非同期実行アルゴリズムの確立LMNtalは細粒度の並行性を持つが、膜による階層化・ルール局所化機能とルールセット移送機能をもつことから、正しくかつ効率的な実装方式は自明でない。我々は、複数の非同期タスクで実行でき、並列分散実装への拡張が可能なスケジューリング方式と排他制御方式を設計・実装し、デッドロック不発生、漏れのないルール適用検査などの要件を満たすことを確認した。さらに、他言語によるインラインコードが作成するスレッドによるLMNtal内部データ構造の操作も可能にした。2.逐次実行の効率化細粒度並行言語においては各タスクの逐次実行の効率化も重要である。我々はLMNtal特有の最適化技術を検討し、多重集合マッチングのための中間命令列の並び替えとグループ化技術を提案・実装した。また、中間命令列をJavaに変換する機能を実装し、従来と比較して1桁近い性能向上を達成した。3.言語機能の強化組込みの型の概念を提供する「型付きプロセス文脈」機能を実装し、整数アトム、1価アトム、連結1価分子などの型概念やそれらの比較機能を提供した。また、同一対象に対して同一ルールが無限回適用されるのを防ぐためのuniqガード制約を設計・実装した。

さらに、与えられた初期プロセスとルール集合を用いて可能なすべての簡約経路を求める非決定的実行機能を設計・実装し、LMNtalの探索や検証への応用への道を開いた。本年度は、階層構造と接続構造の両方をもつ対象を簡明にモデル化することを目的とした並行言語モデルLMNtalの処理系について、下記の項目の研究開発を行った。(1)新たなコンパイラ最適化機能を設計・実装した。複数ルールの共通部分の編み上げ、システムルールセットのインライン展開、マッチングコスト見積もりによるグループ単位でのルール左辺の並び替えなどによって、プログラムによっては10倍から15倍程度の高速化を実現した。(2)統一されたインタフェースでLMNtalからJavaオブジェクトを利用できる仕組みを作り、Java標準のクラスライブラリのほとんどをLMNtalから利用できるようにした。(3)並列処理ライブラリの拡充・最適化を行った。以前のライブラリは中間コードの解釈実行処理のみの対応であったが、Javaソースコードへの翻訳処理にも対応させるとともに実行オーバーヘッドの削減を行った。(4)データの流れとプロセスの規模を同時に扱う静的型体系を構築し、これに基づいて型検査・型推論を行うアルゴリズムを設計・実装した。(5)実行可視化機能を再設計、再実装して、グラフ自動整形機能をはじめとする機能拡充および性能向上を実現した。(6)宣言的グラフィクス・GUI機能の再実装を行い、例題記述実験を通じて当応用分野への有効性を確認した。またLMNtalと他の計算モデルとの関連付けを一層進めるべく、新たに同期式π計算、Ambient計算、純粋λ計算のエンコード法を設計して処理系上で稼動させた。処理系および例題プログラムをwebから公開するとともに、これらの一連の成果を、LMNtalの実用言語機能およびLMNtal処理系に関する2編の総合報告論文にまとめた(うち1編は採録済)。
鶏の主要組織適合遺伝子に関する分子遺伝学的研究

鶏の主要組織適合複合体であるB座位を構成するF,L,Gの3領域の遺伝子について、その構造をDNAレベルで分析し、免疫能力並びに抗病性との関連性について検討した。試料のDNAは赤血球から抽出し、制限酵素で切断したのち、今回購入したミニチラーで冷却しながら電気泳動し、サザンハイブリダイゼーションにより、RFLP分析を行なった。以下に結果をまとめると:1.G領域に対するRFLPの標準パターンの作成。(1)制限酵素として、EcoRI,PvuII,HindIIIを使用するこにより血清学的にB座位がホモである12系統から得た8種のハプロタイプを織別することが出来た。(2)上記の他にB座位がヘテロである7種のハプロタイプを混合してRFLP分析するこにより、合計21本のバンドが検出され、各バンドの大きさを推定することにより、血清学的に同定されたハプロタイプに対する標準パターンを作成した。2.G領域が同一でF領域のRFLPパターンの異なる個体を用いた免疫能力並びに抗病性との関連性。(1)G領域がB^<21>ホモでF領域のRFLPパターンの異なる個体をもちいた場合、抗体産生能及び植片対宿主反応能とF領域のRFLPパターンの関連性については例数が少なく一定の傾向が見られなかった。今後は、例数を増やして検討する必要がある。(2)抗病性との関連性については、マレック病ウイルス接種試験により、発症した個体と末発症の個体のDNAをEcoRI,とHindIIIを用いて消化したRFLPパターンを比較した結果、特定のバンドの出現頻度に差が見られF領域との関連性が示唆されたが、今回の結果ではG領域が同一の例数が少なかったため、今回の結果でF領域が明らかになった系統を用いて更に検討する必要がある。
ネコの体幹筋神経機構における脊髄内入力応答特性

49頭のネコをペントバルビタール麻酔下あるいはハロセン麻酔下で脊髄ネコとし、第1腰髄節に入る左右の5種類の筋神経(多裂筋、最長筋、腸肋筋、外腹斜筋、腹直筋の神経)と2種類の皮膚神経(背側皮膚神経、腹側皮膚神経)をそれぞれ電気刺激し、その結果生ずる体幹筋(多裂筋、最長筋、腸肋筋、外腹斜筋、腹直筋)の運動ニューロンの反応を細胞内記録により調べた。この結果、脊髄ネコの髄節内シナプス応答では、背側筋(多裂筋、最長筋、腸肋筋)および腹側筋(外腹斜筋、腹直筋)のα運動ニューロンはすべての背側筋、腹側筋および皮膚の神経から両側性に興奮性効果を受けており、求心性線維から運動ニューロンまで3個以上のシナプスを介する反応が最も多かった。また、相反性神経支配は存在せず、同側の背側筋と腹側筋の間には2シナプス性抑制効果が少数例認められたが、多シナプス性興奮性効果が優性であった。このことは、同側の背側筋と腹側筋、左右の背側筋、左右の腹側筋、対角線上の背側筋と腹側筋はいずれも協同筋として働くことを意味している。同側の多裂筋と最長筋の筋神経とそれぞれのα運動ニューロン間、最長筋と腸肋筋の筋神経とそれぞれのα運動ニューロン間には単シナプス性興奮性経路が存在したので、これら解剖学的に隣接する筋間の関係はより密接であることが明らかとなった。αクロラロース麻酔下のネコの髄節内シナプス応答では、脊髄ネコの場合とは異なり、複雑な反応結果が得られた。ほとんどの経路で、多シナプス性興奮経路が優勢であったものの、脊髄ネコの場合と比較すると多シナプス性抑制反応が多く観察され、同側の、外腹斜筋神経から多裂筋運動ニューロン、多裂筋神経から最長筋運動ニューロンに至る経路、および対側の、外腹斜筋神経と腸肋筋神経から最長筋運動ニューロン、腹直筋神経から腸肋筋神経に至る経路では、多シナプス性抑制反応が優勢となった。外腹斜筋と腹直筋の運動ニューロンでは、刺激神経の刺激強度を増加しても無反応を示す例が増加した。αクロラロース麻酔ネコと脊髄ネコの相違は、αクロラロース麻酔ネコでは脳および脊髄上部からの下行性入力が存在しているということである。αクロラロース麻酔ネコの体幹筋運動ニューロンでは、脊髄ネコのそれと比べて、多シナプス性抑制反応や無反応が増加したということは、脳からの下行性経路は髄節内の反応を抑制する傾向が強いということを示唆している。猫の体幹筋運動ニュ-ロンの第1腰髄節内ないし第3腰髄節内における髄節内シナプス応答を調べた。

37頭の成猫を用い、左右の軸上筋(腰多裂筋、腰最長筋、腰腸肋筋)と軸下筋(外腹斜筋、腹直筋)の筋神経、2種類の皮膚神経の計12種類の末梢神経の分離、ラミネクトミ-、除脳はネンダ-ル麻酔下で行い、除脳後はネンブタ-ルの追加投与は中止し、筋弛緩剤(臭化パンクロニウム)投与を行い、人工呼吸で細胞内記録を実施した。実験中、血圧(80mmHg以上)、CO_2濃度(4%前後)、体温(38C後前)は常にモニタ-した。体幹筋運動ニュ-ロンの細胞内記録では、それぞれの末梢神経を閾値の倍数(1.2,1.5,2,5,10,20)で電気刺激し、その反応を直接、ないし20回平均加算して調べた。腰多裂筋運動ニュ-ロンは、同側の軸上筋である腰最長筋と腰腸肋節の末梢神経からの入力に対しては促通性反応(100%と84.6%)を示した。反対側の腰最長筋、腰腸肋節の末梢神経からの入力に対しては促通性反応しか認められなかったが、反対側の腰多裂筋末梢神経からは促通性反応が66.7%、抑制性反応が22.2%、無反応が11.1%と、同じ軸上筋ながら、腰最長筋、腰腸肋筋からの入力とは異なる反応を示した。同側の軸下筋である外腹斜筋末梢神経からの入力に対しては、促通性反応、抑制性反応、無反応が、それぞれ、36.4%,9.1%,54.5%,腹直筋末梢神経からの入力に対しては、それらが16.7%,33.3%,50.0%であり、抑制性反応の認められたのが特徴であった。しかし、腰多裂筋以外の軸上筋(腰最長筋、腰腸肋筋)と軸下筋(外腹斜筋、腹直筋)の運動ニュ-ロンは、それぞれの筋神経からの入力に対して、促通性反応を示す比率が圧倒的に多く、猫の髄筋内シナプス結合様式は、後肢や前肢の運動ニュ-ロンに比べて、抑制性反応の少ないのが特徴であった。1.軸上体幹筋と軸下体幹筋の運動ニューロンの間に四肢の伸筋と屈筋の間に認められるような相反性神経支配はほとんど存在しなかった。2.3種類の軸上筋のなかで、多裂筋運動ニューロンのシナプス応答は最長筋と腸肋筋の運動ニューロンのそれとは異なる反応を示した。3.外腹斜筋運動ニューロンは呼吸と同期して発火するものが存在したが、腹直筋運動にはそのような特徴は存在しなかった。4.左右の軸上筋運動ニューロンの間には交叉性IaIPSPの存在しないことを追認できたが、左右の軸下筋運動ニューロンの間にも交叉性IaIPSPの存在しないことを明らかにすることができた。5.背側ならびに腹側の皮膚神経からの入力は、いずれの運動ニューロンに対してもEPSP反応が圧倒的に多かった。6.HRP染色法により、体幹筋運動ニューロンは第一脊髄節内に広く分布していることが明らかになった。軸上筋運動ニューロンは軸下筋運動ニューロンよりも腹側部に存在し、腰多裂筋運動ニューロンはもっとも内側に存在した。また、運動ニューロン細胞体の大きさの分布を調べた結果、肢の運動ニューロンに認められるα運動ニューロンとγ運動ニューロンの分離は、体幹筋運動ニューロンでは認められなかった。7.第2腰髄節に入る左右の筋神経(腰多裂筋、腰最長筋、腰腸肋筋)と左右の皮膚神経(背側皮膚神経、腰側皮膚神経)を電気刺激した結果、第1腰髄節の体幹筋運動ニューロンに対する、これら末梢神経のシナプス応答は、EPSP反応が優勢であった。27頭のネコをαクロラロース麻酔下で、第1腰髄節に入る左右の5種類の筋神経(多裂筋、最長筋、腸肋筋、外腹斜筋、腹直筋の神経)と2種類の皮膚神経(背側皮膚神経、腹側皮膚神経)をそれぞれ電気刺激し、その結果生ずる体幹筋(多裂筋、最長筋、腸肋筋、外腹斜筋、腹直筋)の運動ニューロンの反応を細胞内記録により調べた。この結果、同側の、多裂筋神経と最長筋運動ニューロン、最長筋神経と腸肋筋運動ニューロン、外腹斜筋神経と腹直筋運動ニューロンの間には単シナプス性興奮経路が存在した。これらは解剖学的に隣接する筋同志であり、体幹筋では隣接する筋と筋の間に単シナプス経路が存在するという特異なパターンが認められたことになる。αクロラロース麻酔ネコの髄節内
血小板と巨核球に発現してるチャネル直結型ADP受容体と分泌現象の新しい解析法

平成10年度:1.ヒトの巨核球系細胞での解析:血液系細胞はヒトと実験動物とで,刺激に対する反応や基本機能が微妙に異なることが有りうる。前年度に明らかになったプリン2X型受容体の存在やセロトニンとADPの放出をヒト由来巨核球系cell lineを用いて調べた。調べたcell lineのうち白血病患者から樹立された、cell line(Meg-01)において血小板特異受容体(P2x-R)の存在が確認された。RPM1640培地(10%FCS添加)に生理的な分化因子であるトロンボポエチン(thrombopoietin)を加えると約3倍のADPへの反応が誘発された。実験的な分化促進因子であるphorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)を加えた場合は無添加の場合に比べて約2倍のADPへの反応が誘発された。巨核球の分化・成熟に伴いこれらの受容体が発現し、血小板に組み込まれることがマウスおよびヒトの巨核球系細胞で明確に示された。2.カーボン・ファイバー電極法の改良と放出物質制御機構の解析:巨核球や血小板の細胞質にある濃染顆粒(セロトニンやADPを含む顆粒)は、生理的刺激により放出される。骨髄から分離した巨核球をwhole-cell法にて記録すると、スパイク状の膜電流が頻繁に発生する事が観察された。ADPやトロンビン(生理的刺激物質)ないしフォルボールエステル(実験的刺激物質)を巨核球に与えると、膜電流応答の出現頻度は増し、これら放出された物質は改良したカーボン・ファイバー電極(先端経5um)によりスパイク状の酸化反応電流として存在が確認された。平成9年度:カーボン・ファイバー電極法を試作して活性物質の放出反応動態を明確にするとともに、モデル標本を開発しADP受容体の特性を解明した。1.放出物質の同定および放出機序の解明とカーボン・ファイバー電極法の試作:巨核球や血小板の細胞質にはセロトニンやADPを含む顆粒(濃染顆粒)があり、刺激により放出されている。マウス巨核球をwhole-cell法にて記録すると、自発シナプス電流の如き膜電流が観察された。トロンビンやフォルボールエステルを巨核球に与えると、膜電流応答の出現頻度は著増し、放出物質の一部はカーボン・ファイバー電極により酸化反応電流としてreal-timeに検出された。2.モデルとしての株化細胞の開発およびADP応答の解析:ヒトの血小板系細胞における血小板特異受容体(P2x-R)の動態を解明するため、白血病患者から樹立された、巨核球系cell line(Meg-01)を用いて調べた。40uMADPをMeg-01細胞にY-チューブより投与し、whole-cellの誘発電流をpatch電極にて記録した。培地(10%FCS添加のRPM1640)にPMA(phorbol 12-myristate 13-acetate;10nM)を加えて分化を誘導した場合は無添加の場合に比べて約2倍の内向き電流が誘発され、トロンボポエチン(thrombopoietin;100ng/ml)で分化を誘導した場合は約3倍の内向き電流が誘発された。両者を同時添加すると約6倍の大きさになった。ヒトの造血系においても、巨核球の分化・成熟に伴いこれらの受容体が発現し、血小板に組み込まれると考えられる。
MRダンパーによる建築物の耐震性向上に関する実験的研究

初年度(平成13年度)本研究プロジェクト研究の事前に試作した20kNMRダンパーによる実験で得た知見を踏まえて、本課題で実施予定の振動台実験で用いる大ストロークの免震建物用40kNダンパーを設計・製作した。各種の動加力実験による性能検証結果を踏まえてデティルの変更を行い、安定した性能の得られるMRダンパーを利用できることと、MRダンパーの力学モデルをダッシュポットとクーロンスライダーの並列結合とするBinghamモデルにより代表できることを確認した。引き続き、約10tfの鋼製重量をローラーベアリングで支える簡易免震建物モデルに上記のMRダンパーを設置して、参加研究者がそれぞれに考案するセミアクティブ制御アルゴリズムの策定を行った。次年度(平成14年度)初年度に実施した小型免震建物モデルによる振動台実験の成果を踏まえて、さらに実建物に近い大きさ(約2/3)の建物モデルによる振動台実験を実施した。総重量約20.0tfの3層鉄骨造フレームモデルをその1階床の四隅においてベアリング式のローラーベアリングにより支える免震システムとし、固有周期を約3秒に設定するために天然積層ゴムを水平ばねとして設置した。積層ゴムは建物重量を支えていない。ダンパーとしてセミアクティブ可変制御が可能なMRダンパーを用いることが本実験の大きな特徴である。研究参加者それぞれによるオリジナルなセミアクティブ制御の何れも有効であることを確認した。免震構造に対する既往パッシブダンパーの利用に対する優位性を持つためには、「変形の増加を招くことなく加速度応答の低減を実現する」事が必要であるが、(1)最適制御、(2)スカイフック制御、(3)原点復帰型履歴制御の何れにおいても目標がよく達成できることを確認した。初年度に実施したMRダンパー単体に対する模擬制御実験で確認されていた、制御信号に対する制御力に遅れが生じることも、免震建物のように比較的周期の長い建物においては問題が無かった。また、何れの制御実験においても、実験結果と解析結果との対応は極めて良好であった。本課題に着手する以前に検討を進めていた最大仕様荷重が20kNのダンパーを原型として各種の流体、最大荷重、最大ストローク、磁気コイルのインダクタンスの違いを検討するためのダンパーを設計・製作し、それぞれの履歴の安定性、力学モデル用パラメータ、反応速度等に及ぼす影響を中心にして今年度の研究を進めた。流体の違いは長期間静置された場合の対沈殿安定性において大きな問題であり、最新の流体ではダンパー実用化が可能な程度に改善されていることを確認した。コイルのインダクタンスをの大小に拠らず印加電流を調整することにより所定の抵抗力は発揮され、なおかつ印加電流に対する抵抗力の反応性も向上する利点がある。しかしながら、本ダンパーを建物の構造制御に応用する場合には、アクティブ制御と比べて大きな利点となるべき省電力性と背反するため、設計に関する今後の課題である。電流の印加に対して発揮されるダンパーの抵抗力の変化の早さは、本ダンパーを構造物のセミアクティブ制御へ応用する場合に極めて重要なポイントであり、今回はダンパーの構造、容量、流体種、コイルのインダクタンス、荷重条件等々の違いの及ぼす影響を体系的な動加力試験により検討したところ、振動数の高い振動モードを制御する必要性の高い制振構造制御には未だ困難が伴うものの、比較的周期の長い免震建物に対しては十分に応用可能であることを確認した。小型、および実大の免震建物モデルによる振動台実験を実施し、意図するセミアクティブ制御により変形、加速度の応答低減が可能であることと、実験結果が解析的にもシミュレートされることを確認した。

13年度に実施した小型免震建物モデルによる振動台実験の成果を踏まえて、さらに実建物に近い大きさ(約2/3)の建物モデルによる振動台実験を実施した。総重量約20.0トンの3層鉄骨造フレームモデルをその1階床の四隅においてベアリング式のローラーベアリングにより支える免震システムとし、固有周期を約3秒に設定するために天然積層ゴムを水平ばねとして設置した。積層ゴムは建物重量を支えていない。は独立行政法人科学技術庁防災科学技術センターの振動台を利用した。本免震システムのダンパーとしてセミアクティブ可変制御が可能なMRダンパーを用いることが本実験の大きな特徴である。本研究プロジェクトの研究代表者、共同研究者のそれぞれがオリジナルなセミアクティブ制御側を考案し、実際の振動台実験によりこの制御の有効性を確認した。何れの制御則を採用するかに関わらず、既往のパッシブ制御に対する優位性を持つための制約条件として、免震構造としての特性を考慮し、「変形の増加を招くことなく加速度応答の低減を実現する」事としたが、(1)最適制御、(2)スカイフック制御、(3)原点復帰型履歴制御の何れにおいても目標がよく達成できることを確認した。前年度に実施したMRダンパー単体に対する模擬制御実験で確認されていた、制御信号に対する制御力の反応遅れの存在も、免震建物のように比較的周期の長い建物においては問題が無かった。また、何れの制御実験においても、実験結果と解析結果との対応は極めて良好であった。これは、MRダンパーの力学モデルをダッシュポットとクーロンスライダーの並列結合とするBinghamモデルの採用の妥当性を確認したことになり、今後のシミュレーション手法による適用範囲の拡大の検討に極めて有効な結果である。
柔軟構造系上に搭載された柔軟マニピュレータの運動と振動の同時適応制御(姿勢変動に対するフィードバック補償器のロバストゲインスケジュール)

当該研究では,柔軟構造系上に腰回り方向に自由度を有し,回転自由な振子が取り付けられたマニピュレータを搭載したタワークレーン形状の実験モデルを制御対象とし,マニピュレータの腰回り方向のテンドン制御により,柔軟マニピュレータの位置決め制御を行うと同時に柔軟構造系に生じる並進振動と振子の振れの制御を行った.特にマニピュレータの姿勢変動および振子長さ変動に適応したフィードバック補償器の最適なゲインスケジュールを設計しロバスト制御性能を向上させることを目的とし,まず,非線形性を考慮した厳密なモデリングを行った.柔軟構造系の振動特性は有限要素モデルを用いて解析し,運動方程式を導出し,この数学モデルに対して,制御系設計のためのモデルの線形化および低次元化を施した.さらにマニピュレータの姿勢変動および振子長さ変動に適応したゲインスケジュールの最適設計を線形行列不等式に基づくH_∞制御により行い,モデルの非線形性を考慮した数値シミュレーションによって本制御手法の妥当性を確認するとともに,モータの制御トルクが制御実験に用いるACサーボモータに対して妥当な数値となっていることを確認した.つぎに,実験モデルの設計・製作を行い,製作された実験モデルを実験モード解析することによりモデリングの妥当性を検証した.制御実験ではDSP(Digital Signal Processor)内に数値計算によって設計されたゲインスケジュール制御器を実装し,まず,固定制御器で柔軟構造系の振動制御と柔軟マニピュレータの位置決め制御,振子の振れ止め制御が同時に行われることを確認し,さらに振子長さ変動に対するゲインスケジュール制御器による有効性およびロバスト性を検証した.今後は,マニピュレータに腰回り方向の回転自由度を与え,さらに,マニピュレータの多リンク化を行い,3次元空間でのゲインスケジュール位置決め・振動の同時制御および2自由度制御系設計を行う予定である.当該研究では,柔軟構造系上に腰回り方向に自由度を有し,回転自由な振子が取り付けられたマニピュレータを搭載したタワークレーン形状の実験モデルを制御対象とし,マニピュレータの腰回り方向のテンドン制御により,柔軟マニピュレータの位置決め制御を行うと同時に柔軟構造系に生じる並進振動と振子の振れの制御を行った.特にマニピュレータの姿勢変動および振子長さ変動に適応したフィードバック補償器の最適なゲインスケジュールを設計しロバスト制御性能を向上させることを目的とし,まず,非線形性を考慮した厳密なモデリングを行った.柔軟構造系の振動特性は有限要素モデルを用いて解析し,運動方程式を導出し,この数学モデルに対して,制御系設計のためのモデルの線形化および低次元化を施した.さらにマニピュレータの姿勢変動および振子長さ変動に適応したゲインスケジュールの最適設計を線形行列不等式に基づくH_∞制御により行い,モデルの非線形性を考慮した数値シミュレーションによって本制御手法の妥当性を確認するとともに,モータの制御トルクが制御実験に用いるACサーボモータに対して妥当な数値となっていることを確認した.つぎに,実験モデルの設計・製作を行い,製作された実験モデルを実験モード解析することによりモデリングの妥当性を検証した.制御実験ではDSP(Digital Signal Processor)内に数値計算によって設計されたゲインスケジュール制御器を実装し,まず,固定制御器で柔軟構造系の振動制御と柔軟マニピュレータの位置決め制御,振子の振れ止め制御が同時に行われることを確認し,さらに振子長さ変動に対するゲインスケジュール制御器による有効性およびロバスト性を検証した.今後は,マニピュレータに腰回り方向の回転自由度を与え,さらに,マニピュレータの多リンク化を行い,3次元空間でのゲインスケジュール位置決め・振動の同時制御および2自由度制御系設計を行う予定である.
薬物の胎盤透過に関与するヌクレオシドトランスポーターの同定および機能評価

ヒト絨毛腺癌由来のBeWo細胞を用いた検討により,抗ウイルス薬であるリバビリンがhCNT3とhENT1によって輸送されることが示唆された.そこで,現在同定されている6種のNTサブタイプのcDNAをクローニングし,発現系を用いた機能解析により,それぞれのサブタイプの寄与を検討した.その結果,リバビリンはナトリウムイオン共輸送系(CNT)には高親和性であり(Km=20μM),一方,促進拡散系(ENT)には低親和性である(Km=数mM)ことが明らかとなった.また,胎盤の上皮細胞においては,刷子縁膜にCNT, ENT両方が発現していることが報告されていることから,ヒトCNT3およびヒトENT1のクローンを用いて共発現細胞(Xenopus Oocytes)を作製し,リバビリンの取り込みをみたところ,CNT3によって取り込まれた薬物はENT1によって排出されて細胞内の濃度が維持されていることを示唆する結果が得られた.したがって,胎盤透過においては,リバビリンの輸送に胎児側に濃縮的に働く方向性が無い可能性が示唆された.一方,刷子縁膜にCNTが,基底膜にENTが発現していることが明らかにされている小腸においても,リバビリンの吸収にこれらのトランスポーターが寄与しており,刷子縁膜側で濃縮的に吸収細胞に取り込まれたリバビリンは基底膜側では促進拡散により血液中に輸送されることが示唆されたことから,各臓器の細胞における各トランスポーターの発現状態(局在性)の違いにより,薬物輸送特性が異なるものと考えられた.ヒト絨毛腺癌由来のBeWo細胞を用いた検討により,抗ウイルス薬であるリバビリンがhCNT3とhENT1によって輸送されることが示唆された.そこで,現在同定されている6種のNTサブタイプのcDNAをクローニングし,発現系を用いた機能解析により,それぞれのサブタイプの寄与を検討した.その結果,リバビリンはナトリウムイオン共輸送系(CNT)には高親和性であり(Km=20μM),一方,促進拡散系(ENT)には低親和性である(Km=数mM)ことが明らかとなった.また,胎盤の上皮細胞においては,刷子縁膜にCNT, ENT両方が発現していることが報告されていることから,ヒトCNT3およびヒトENT1のクローンを用いて共発現細胞(Xenopus Oocytes)を作製し,リバビリンの取り込みをみたところ,CNT3によって取り込まれた薬物はENT1によって排出されて細胞内の濃度が維持されていることを示唆する結果が得られた.したがって,胎盤透過においては,リバビリンの輸送に胎児側に濃縮的に働く方向性が無い可能性が示唆された.一方,刷子縁膜にCNTが,基底膜にENTが発現していることが明らかにされている小腸においても,リバビリンの吸収にこれらのトランスポーターが寄与しており,刷子縁膜側で濃縮的に吸収細胞に取り込まれたリバビリンは基底膜側では促進拡散により血液中に輸送されることが示唆されたことから,各臓器の細胞における各トランスポーターの発現状態(局在性)の違いにより,薬物輸送特性が異なるものと考えられた.ヒト絨毛腺癌由来のBeWo細胞を用いた以前の検討により,抗ウイルス薬であるリバビリンがhCNT3とhENT1によって輸送されることが示唆された.しかし,hENT1によるリバビリン取り込みのKm値:11.7mMが赤血球を用いて算出された文献値420μMと大きく異なった.そこで,hCNT3およびhENT1のクローンを用いてリバビリン輸送に関する詳細な検討を行った.hCNT3安定発現細胞を用いて算出されたhCNT3によるリバビリン輸送のKm値は22.9μMとなり,BeWo細胞での取り込み実験から得られた16.7μMとほぼ一致した.一方,hENT1を発現させたXenopus Oocyteを用いてリバビリンの取り込み実験を行った結果,取り込みの濃度依存性より得られたKm値は3.35mMとなり,hENT1はリバビリンに対して親和性が低く,BeWo細胞での実験結果を裏付ける結果となった.リバビリンを輸送すると予想されるNTとして他にhCNT2,hENT2があげられる.そこでこれらのNTに関して輸送活性の検討を行った.その結果,hENT2はhENT1と同程度の輸送活性であったのに対し,hCNT2はENTに比べて輸送活性が高かった.そこでhCNT2を介する輸送の濃度依存性を検討した結果,リバビリン取り込みのKm値は17.2μMと算出された.常用量経口投与後のリバビリンの血中濃度は約10μMであるため,リバビリンの標的臓器である肝臓をはじめとする臓器移行にはENTよりもCNTを介した輸送が優位である可能性が示唆された.昨年度までの検討で,抗ウイルス薬リバビリンの胎盤透過にはヌクレオシドトランスポーター(NT)が関与していることが明らかとなった.そこで,現在同定されている6種のNTサブタイプのcDNAをクローニングし,発現系を用いた機能解析により,それぞれのサブタイプの寄与を検討した.その結果,リバビリンはナトリウムイオン共輸送系(CNT)には高親和性であり(Km=20μM),一方,促進拡散系(ENT)には低親和性である(Km=数mM)ことが明らかとなった.

また,胎盤の上皮細胞においては,刷子縁膜にCNT,ENT両方が発現していることが報告されていることから,ヒトCNT3およびヒトENT1のクローンを用いて共発現細胞(Xenopus Oocytes)を作製し,リバビリンの取り込みをみたところ,CNT3によって取り込まれた薬物はENT1によって排出されて細胞内の濃度が維持されていることを示唆する結果が得られた.したがって,胎盤透過においては,リバビリンの輸送に胎児側に濃縮的に働く方向性が無い可能性が示唆された.一方,刷子縁膜にCNTが,基底膜にENTが発現していることが明らかにされている小腸においても,リバビリンの吸収にこれらのトランスポーターが寄与しており,刷子縁膜側で濃縮的に吸収細胞に取り込まれたリバビリンは基底膜側では促進拡散により血液中に輸送されることが示唆されたことから,各臓器の細胞における各トランスポーターも発現状態(局在性)の違いにより,薬物輸送特性が異なるものと考えられた.
超微粒子およびMA法を使ったナノクリスタル材料の作製法と開発とその物性評価

本研究は超微粒子またはメカニカルアロイング法により作製した粉末を焼結することにより、ナノクリスタル材料を作製することおよびそれを利用した機能材料の開発を目的として行った。得られた主な結果は以下のようである。1.プラズマパウダ-法により作製される超微粒子の粒径はチャンバ-内圧を下げる程また粉末送給量を少なくする程小さくなった。2.超微粒子を低温高加圧で焼結することにより、50nm程度の結晶粒径をもったバルク体の作製が可能であった。このようなバルク体は通常材の46倍の硬度を示した。しかし、純金属超粒子のみを焼結する場合は低温から粒成長が始まり、熱的に不安定であった。3.CuとAlNの超微粉を混合し焼結すると、定常粒径が0.4μmの熱的に安定な超微細結晶粒材料が作製できた。超微細組織を安定化する方法としてマトリックスに溶解しない第二相のピン止め効果の有効性が明らかとなった。4.AlーNiーTi系の2元および3元系合金をMAしたところ組成によりアモルファス相、過飽和固溶体、金属間化合物の相が生成した。5.MAした粉末の焼結においては焼結過程での発熱量が多いもの程焼結は良好で、焼結体の結晶粒径は、一般に0.1μm程度で極めて微細であった。6.MAによる結晶粒の微細化を応用してSm_2Fe_<17>とNdMo_2Fe_<10>の窒化物を作製した。上記粒末の結晶粒径は50nm程度と非常に微細でほぼ単磁区構造になっていると考えられる。上記粉末は溶解法や急冷凝固法では得られない高い保磁力を示した。本研究は粒径が0.1ミクロンから数ナノメ-タ-の大きさの材料を超微粒子およびメカニカルアロイング法により作製し、その物性を評価しようとするものである。初年度である本年度は本科研費で購入した粉末送給装置を超微粒子製造装置に直結させ、チャンバ-内圧と粉末送給速度と超微粒子のサイズの関係を調べた。次に作製した超微粒子からホットプレスおよびパイプ圧延によりバルク体を作製し、結晶粒径と成形条件の関係を調べた。さらにCu超微粒子にAlN超微粒子を混合し、焼結させ、粒成長に対するAlN混合の効果を調べた。得られた主な結果は次の通りである。1)チャンバ-内圧を下げる程又粉末供給量を少なくする程得られる超微粒子のサイズは小さくなった。2)Cu超微粒子をホットプレスにより加圧焼結すると、密度は加圧力の増加および焼結温度の上昇と共に増加した。3)Cu超微粒子焼結体の結晶粒は焼結温度が150°C以上では焼結温度の上昇と共に増大し、それに伴って焼結体の硬度は減少した。4)パイプ圧延により作製したバルク材は密度が95%以上あり、超微粒子の一部は塑性変形していた。5)Cu超微粒子にAlN超微粒子を混合させると高温での粒成長が抑制され、1000°Cにおいても粒径は0.3μmと極めて微細であった。6)ボ-ルミルによるメカニカルアロイングで作製したTiーAl粉末の焼結体は0.1μm程度の非常に微細な結晶粒であった。本研究は粒径が0.1ミクロンから数ナノメ-タ-の大きさの材料を超微粒子およびメカニズムアロイング法により作製し、その物性を評価しようとするものである。本年の研究成果は、以下のようである。

1.MAと熱処理(加熱と窒化)により作製したSm_2Fe_<17>N_×およびNdMo_2Fe_<10>N_y化合物は、溶解法や急冷凝固法では達成し得なかった高い保磁力を示した。この原因は結晶粒が微細化し、単磁区構造に近くなったものと考えられる。2.NiーTi系合金をMAすると、Ni_<75>Ti_<25>組成ではNi固溶体が、Ni_<50>Ti_<50>およびNi_<33>Ti_<67>組成ではアモルファス相が生成した。これらMA粉末を焼結すると、それぞれNi_3Ti、NiTi_2の化合物となった。焼結体のTEM観察の結果、それらの結晶粒径は0.1μmと非常に微細であった。3.MAにより作製したNi_<50>Ti_<50>組成のアモルファス粉は、800Kへの加熱でB2相のNiTi化合物となり、さらに800K以上に加熱すると、B2相からNiTi_2とNi_3Ti相が析出した。これはMA粉の焼結により作製したNiTi化合物の格子欠陥密度が高いこと、および結晶粒が超微細であるため、析出が加速されたためと考えられる。以上のことは低温での相安定の加速実験に対して、MA法が有効であることを示している。4.Cu超微粉にAIN超微粉を混合し焼結した材料は、高温長時間の加熱で粒径の変化しない定常粒径を示した。その粒径はAINの粒径に比例し、AINの体積率に反比例する。54nmのAINを12.6vo1%混合した場合には、定常粒径として0.4μmのものが得られた。
ヒトCD34陰性造血幹細胞のin vitro解析

研究実績の概要最近CD34陰性のより未分化な細胞の存在がヒトを含む哺乳類で報告されており新たなクラスの造血幹細胞として注目されている。CD34陰性幹細胞はコロニー形成能やLTC-IC活性をほとんど持たずSRC活性も低い。さらにCD34陰性幹細胞の存在頻度が低いことと培養が困難であることより細胞生物学的、分子生物学的解析が困難であった。われわれは最近マウス骨髄ストローマ細胞を利用することによりこれらの細胞を培養しCD34陽性幹細胞を誘導することに成功した。しかしながらわれわれの分画した分化マーカー陰性CD34陰性(Lin-CD34-)細胞集団もまだ十分に幹細胞を純化しているとは言い難く細胞生物学的、分子生物学的解析のためにはCD34陰性幹細胞陽性マーカーを同定することを目的に本実験計画を設定した。1 CD34陰性造血幹細胞純化法の検討筆者らは赤血球除去フィルターを利用してヒト臍帯血よりlineageマーカー陰性CD34陰性細胞を100倍濃縮することに成功した。さらに免疫磁気ビーズ法、FACSを組み合わせることにより99%以上の純度でこれらの細胞を回収することが可能とした。さらに本年度はこれらの細胞をVEGFR,Tie-1,Tie-2,TPO-Rなど既存のモノクローナル抗体を利用して細分化することに成功した。2造血活性の検討以上によりTPO-RがCD34陰性細胞の表面マーカーである可能性が示されたので、さらにコロニー形成能を検討した。現在NOD/SCIDマウスに移植することにより長期造血再構築能および多分可能を検討し、造血幹細胞であることを確認中である。
赤芽球系細胞の増殖分化におけるp53がん抑制遺伝子の機能の解析

種々のヒト培養白血病細胞より抽出したポリA(+)RNAを対象に、p53 cDNAをプロ-ベとしてノ-ザンブロット解析を行った結果、リンパ性白血病細胞では全てに高い発現を認めたが、骨髄系細胞株ではJK1とKu812 2つの赤芽球系細胞株においてのみ高い発現を認め、他の細胞株では発現は極めて低いか認められなかった。また、骨髄系細胞株についてはp53遺伝子のサザンブロット解析を行ったが、JK1およびKu812を含めた全例で遺伝子増幅、再構成などの変化は検出できなかった。さらに上記2株については、細胞を^<35>Sメチオニンで標識後可溶化し、抗p53モノクロ-ナル抗体で免疫沈降したものをSDSーPAGEで解析した。その結果、両株において分子量約53KDの蛋白即ちp53を同定することができた。他、Ku812細胞においては分子量約75KDおよび180KDの蛋白質が共に免疫沈降されることを見出した。これらの蛋白質は細胞内においてp53と複合体を形成している可能性が示唆された。われわれはまた、哺乳動物細胞ベクタ-にp53cDNAをセンス方向に挿入し、p53陰性のHEL細胞に導入し安定形質転換体を得ることができた。しかしながら、この形質転換体は形態、増殖能、分化誘導能などの点で親株と比較し著明な変化を示さなかった。なお、p53cDNAをアンチセンス方向に挿入したものを同様にKu812細胞へ導入したが、有意な発現レベルの低下は得られなかった。今回実験に用いたp53cDNAは点突然変異を有するミュ-タントであることが途中で判明したため、いずれにせよ形質転換体を用いて赤芽球系細胞の増殖分化におけるp53の役割を検討することは今後に残された。