hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）に注目した下部尿路機能障害治療への基盤研究

加齢性筋肉減弱症(サルコペニア)は、高齢者が要介護状態に陥る重要な因子であり、下部尿路機能の分野では尿失禁との因果関係が疫学的に言及されている。サルコペニアでは慢性炎症や慢性虚血が筋肉および周辺臓器で発生していることが予測される。サルコペニアモデルがどのような下部尿路機能障害の発症に関与し、またサルコペニアに伴う慢性炎症や慢性虚血によって膀胱尿道の収縮反応の障害を受けるかを明らかにする。さらに筋肉回復を図ることでこれら機能障害が回復するかを検証する。本研究成果は、さらなる進行が確実視される超高齢化社会における下部尿路機能障害の病態解明および治療方法を開発するための礎となることが期待される。
陸起源物質のオ-シャンフラックスへの寄与

化学物質をトレ-サ-として、陸起源物質の海洋への輸送経路とその量が、オ-シャンフラックスに与える影響を評価することを目的として1).陸上定点における大気の連続観測.2)船舶を用いた洋上エ-ロゾルの採取研究、および3)研究船等による海水、粒状物、堆積物の採取と研究、を行った。ウラジオストックと札幌で毎週一回エ-ロゾル試料を採取分折した結果は、大気中のAl濃度がウラジオストックで平均2.8mg/m^3、札幌で0.94mg/m^3であり、前者が約3倍高いことがわかった。また、35月の春先に日本で高濃度を示したが、ウラジオストックでもこの現象は見られた。赤道太平洋上で採取したエ-ロゾル試料のガスクロマトグラフィ-を行ったところ、シュウ酸、マロン酸を主成分とした直鎖・飽和ジアルホン酸が除去されたが、同時に数多くの未知のピ-クが認められた。そこで更に質量スペクトルの分折を行ったところ、リンゴ酸と4ーオキソピメリン酸の存在が明らかとなった。大気中で2次的に生成されたものか大陸に起源をもつものかの解明は今後の課題である。河川、沿岸由来の^<228>Raと大気圏由来の^<210>Pbの分折結果は、^<228>Ra濃度がベンガル湾や南シナ海の表層で著しく高いことを示し、陸棚や河川の影響が大きいことが示唆された。また地中海や紅海では、大西洋と比較してもあまり変わらない。また、太平洋での^<210>Poの除去速度定数はクロロフィルa濃度と相関していて、生物生産による粒子のフラックスとの関連が示唆された。また赤道海域の海底附近で異常に高濃度のPuが検出された。仏核実験など、その起源についての研究が急務であることがわかった。さらに海水中のSe濃度と赤潮との関連についても知見が得られた。
リアノジン受容体の機能サブドメインを介する筋小胞体Ca2+遊離の制御機構の解明

本研究は、心筋細胞の収縮に必須な筋小胞体からCa2+を遊離させるリアノジン受容体RyR分子に着目し、その細胞質ドメイン内に存在するリガンド結合部位の構造機能相関的解明を目指している。今回、野生型および変異体のRyR組み替え体をHEK293細胞に蛋白発現させ、RyR分子から単一チャネル電流を測定する実験手法を確立することが出来た。Ca2+、ポリアミン、カルモジュリンなどのリガンド結合部位の責任アミノ酸領域が特定されつつある。リアノジン受容体RyRは、心筋や骨格筋の興奮収縮連関の一過程として収縮に必須なCa^<2+>を小胞体から細胞質に遊離させる。RyR分子は、数多くのリガンド結合部位即ち機能サブドメイン群からなる全チャネル最大の細胞質ドメインをもつ。各サブドメインは、RyRチャネル活性を修飾することにより、筋肉細胞のCa^<2+>遊離を巧妙に調節する重要な機能単位である。然しながら、RyRのサブ機能ドメインに関する構造機能連関研究は立ち遅れている。本研究では、機能サブドメインの特定と構造機能連関の解明を目指す。22年度では、心筋型RyRを主な実験対象にして、RyR分子の細胞質内ドメイン内のリガンド結合部位のうちCa^<2+>結合部位に焦点を当てて調べた。RyRの全長cDNAの塩基配列の中からCa^<2+>を結合しうる領域群を選び、点変異コンストラクトを系統的に作成した。更に、作成された変異コンストラクトごとに、チャネル機能解析を加えた。その結果、RyR2分子においてCa^<2+>が結合する可能性がかなり高いアミノ酸責任領域をいくつか見出した。残念ながら、L型Ca^<2+>チャネルからの流入Ca^<2+>の結合部位すなわち心筋の興奮収縮連関の要であるCa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離=CICR機構を担うCa^<2+>結合部位がそのうちの何れであるかは、現在まだ不明である。23年度以降も続けて、CICRを担うCa^<2+>結合部位の特定作業を行い、より詳細なCa^<2+>感受性の分子機構を明らかにしたい。我々は、細胞内生理活性物質リガンドに対する受容体であるRyR分子の細胞質内ドメイン内結合部位を見出し、生物物物理学的手法により、その構造機能相関的評価を加える仕事に長年従事している。その一貫として23年度は、細胞内に数mMの濃度で存在するポリアミン(スパーミン)という生理活性物質の結合部位を選び、その分子生物学的特定作業を行った。筆者らは以前、生物物理学的手法を用いてポリアミンのリアノジン受容体における結合部位の存在を示唆し、チャネル活性の阻害作用を報告した。ポリアミンは陽イオン電荷を持つので、酸性アミノ酸が特徴的にたくさん並ぶ部位を中心に変異体を作成し機能評価を加えた。全長のうち一箇所の特定アミノ酸領域における変異体のみに、ポリアミンの阻害効果を消失していた。このことから、ポリアミン結合部位の構成アミノ酸領域は特定されたと考えている。リアノジン受容体は、心筋細胞が興奮収縮するために必須なCa^<2+>を小胞体から細胞質方向への一方向に遊離させるCa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離を担う実体分子である。細胞質内のスパーミン結合部位が特定されたことから、細胞質側から小胞体内腔へのCa^<2+>が逆流することが細胞質スパーミンにより阻まれるという私の作業仮説が、今回実証されたものと考えられる。このように、生理学的活性物質のリアノジン受容体機能ドメインのアミノ酸領域が特定され、その分子間相互作用に関する構造機能連関の新知見が得られると、筋興奮収縮連関における筋小胞体レベルのCa^<2+>遊離制御の分子機構に関する新たな理解に繋がる。現在調べている他の生理活性リガンド物質の結合部位の解析結果を併せれば、リアノジン受容体の複数の機能サブドメイン群によるチャネル活性制御機構の総合的理解も進むと期待される。リアノジン受容体RyRは、心筋や骨格筋の興奮収縮連関の一過程として収縮に必須なCa2+を心筋細胞の小胞体から細胞質に遊離させる。各サブドメインは、チャネル活性修飾を介しCa2+遊離を巧妙に調節する重要な機能単位であるが、その構造機能連関研究は遅れている。本研究は、各機能サブドメインに関する特定と構造機能連関解明を目指したものである。主な機能解析法として、リコンビナントRyR変異体群に人工脂質平面膜法を適用し、単一チャネル電流を記録した。本計画の初年度は、心筋型リアノジン受容体RyR2分子の細胞質内ドメイン内の結合部位として、筆者が以前に生物物理学的に存在を示唆していたポリアミン結合部位に焦点を当てた。

部位特異的変異法を用いて調べた結果、ポリアミン結合部位をアミノ酸レベルで特定することが出来た。その結果を踏まえて、最終年度は、ポリアミン結合部位とそのリガンドであるスパーミンとの相互作用機構を調べ、同結合部位の構造機能連関を明らかにした。また、本計画2年目と3年目では、細胞膜に発現するL型Ca2+チャネルからのCa2+流入Ca2+誘発性Ca2+遊離を担うRyR2のCa2+結合部位に焦点を当て、同上の実験を行った。最も大きなCa2+感受性の低下を示す変異体を探すことにより、Ca2+結合部位のアミノ酸領域をほぼ決定することが出来た。これらの結果を論文発表すべく、現在まとめている最中である。リアノジン受容体の遺伝子の分子サイズが、数k Bpの他のイオンチャネル蛋白と較べると、15k Bpと極端に大きい。また、リアノジン受容体は、細胞内へCa動員するなので形質転換や液体培養時に脱落する傾向が強い。この2点が、本課題におけるリアノジン受容体の分子生物学的なミュータント標本作成を手間取らせる結果につながる。今回、達成度として(3)のやや遅れていると自己評価はしているが、本研究は着実に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の今後の推進方策として、形質転換効率や液体培養後の遺伝子プラスミドの回収率を少しでも高めたい。更に、アルバイトを雇い、仕事のペースアップを計る。
細胞老化のリアルタイム解析法の確立とその応用による老化シグナルの解析

増殖因子の過多、増殖因子受容体の過剰な活性化あるいは癌遺伝子の変異・増幅などのイベントは、正常細胞を過剰に増殖させるシグナルとして働く。このような過剰な増殖シグナルは細胞の急速な増殖を励起すると同時に、細胞死(apoptosis)あるいは細胞の老化(senescence)のシグナルを誘導し、不必要な増殖やそれに伴って引き起こされる細胞の悪性化を防いでいると考えられている。現実に細胞死あるいは老化に関わる分子を不活化した細胞やマウスでは、活性型の癌遺伝子産物を発現することで癌化を引き起こすことが可能であり、細胞死および老化のシグナルが腫瘍形成を抑制する重要な砦として働いていることが分かってきている。近年、老化細胞ではsenescence-associated heterochromatin foci(SAHF)と呼ばれるクロマチンの凝集体が核内に出現することが見出され、その構成成分としてmacroH2Aやheterochromatin protein 1(HP1)が含まれることが明らかになった。本研究はこれらSAHFの構成分子を緑色蛍光タンパク質(GFP)と融合タンパクの形で細胞内に発現し、癌遺伝子の過剰発現や薬剤処理によって誘導される細胞老化を、SAHFの形成をリアルタイムでモニターすることによって、動的に評価するシステムを構築することを目的として実施した。その結果、HP1とGFPを融合したベクターを導入した細胞では、生きた細胞でSAHFと考えられるクロマチンの凝集体を検出することが可能となり、とくに抗がん剤などでDNA損傷を与えたときにその発現が上昇することが分かった。現在このシステムを用いて老化誘導化合物、あるいは老化誘導siRNAのスクリーニングを行っている。
新たに見つかった活動銀河核種族から暴く銀河と中心ブラックホールの共進化

本年度は、3つの研究を行った。1つめは、「超巨大ブラックホールには質量の上限があるのか?」という問いに対する観測的研究である。超巨大ブラックホール(supermassive black holes; SMBHs)は活動銀河核(active galactic nuclei; AGN)という非常に明るく輝く天体として観測されるが、SMBHの最大質量は概ね10^10太陽質量を超えたあたりであることがわかっている。つまり、SMBHはいったん10^10太陽質量になってしまったら、何かしらの理由でそれ以上太れなくなってしまうようである。理論研究によると、ガスはブラックホールまで落ちることなく、ほとんどの質量はoutflow/jetで外に放り出されてしまう。そこで、研究代表者はSDSSクエーサーカタログを用いて、ブラックホール質量ごとのジェットを出しているAGNの割合を求めてみたところ、10^9.3太陽質量を超えたあたりから、急激にジェットをもつAGNの割合が増えることを発見した。これは、上記の理論予測をサポートする初めての観測的結果となり、研究代表者が筆頭著者として、ApJに論文が出版された。また、2つ目の研究は、死につつあるAGNのダストトーラスの観測可能な期間についての結果がまとまり、研究代表者が筆頭著者としてApJに論文が出版された。また、研究代表者が昨年度取り組んだ、X線選択された活動銀河核の赤外線カタログを用いて、得られた赤外線光度から活動銀河核まわりのダスト立体角の見積もりを行った。また、その値をX線から示唆された立体角と比較したところ、X線から得られた立体角の方が平均的には必ず大きくなるという結果を得ることが出来た。X線から得られた立体角はダストとガスのいずれかをトレースする。そのため、活動銀河核の周辺には、ダストは存在しないものの、ガスで覆われた領域が存在することが示唆された。これらの結果は研究代表者が筆頭著者として、ApJに投稿を行った。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成28年度はX線サーベイによって観測された活動銀河核(Active Galactic Nuclei; AGN)のほぼコンプリートな赤外線対応カタログの作成を行った。それに伴い母銀河の活動が非常に弱いAGNの発見や、赤外線だけに頼ったAGN選択法は低光度AGNを見落としてしまうことがわかったため、その結果を論文としてまとめた(Ichikawa et al. 2017)。また、スペインにある口径10mの望遠鏡GTCに設置された赤外線観測装置CanariCamを用いて観測された近傍AGNに関して、その高空間分解能観測を活かしたダストトーラスの研究も精力的に行なった。その結果、ダストトーラスの起源や形状についてなど、4本の論文が共著として出版された(Martinez-Paredez et al. 2016, Alonso-Herrero et al. 2016,Lopez-Rodriguez et al. 2017, and Garcia-Bernete et al. 2017)。それだけでなく、テキサス大学の学生と共同で、飛行機に搭載した赤外線望遠鏡SOFIA/FORCASTを用いて、今まで地上からの観測では非常に難しかった30um波長帯でのトーラス観測により、トーラスは今まで思われていたよりも冷たい可能性があることを論文にまとめた(Fuller et al. 2016)。また、当初の計画通り、新たにテキサス大学およびコロンビア大学にて、新たにダストトーラス、およびAGN活動の最期に関する研究もスタートさせ、結果は現在論文としてまとめているところである。平成28年度にはX線選択された活動銀河核(AGN)の赤外線対応カタログの作成を行い、それに伴い母銀河の活動が非常に弱いAGNの発見や、赤外線だけに頼ったAGN選択法だけでは低光度AGNを見落としてしまうことなどをまとめ、その結果は主著論文として出版することができた。また、赤外線望遠鏡で観測された近傍AGNのダストトーラスの研究も精力的に行われ、ダストトーラスの起源や形状についてなど、合計で5本の論文を共著者として出版することができた。また、当初の計画通り、新たにテキサス大学およびコロンビア大学にて、新たにダストトーラスの共同研究もスタートさせることができたため、おおむね順当に研究が進展していると判断した。

また、2つ目の研究は、死につつあるAGNのダストトーラスの観測可能な期間についての結果がまとまり、研究代表者が筆頭著者としてApJに論文が出版された。また、研究代表者が昨年度取り組んだ、X線選択された活動銀河核の赤外線カタログを用いて、得られた赤外線光度から活動銀河核まわりのダスト立体角の見積もりを行った。また、その値をX線から示唆された立体角と比較したところ、X線から得られた立体角の方が平均的には必ず大きくなるという結果を得ることが出来た。X線から得られた立体角はダストとガスのいずれかをトレースする。そのため、活動銀河核の周辺には、ダストは存在しないものの、ガスで覆われた領域が存在することが示唆された。これらの結果は研究代表者が筆頭著者として、ApJに投稿を行った。今回作成された赤外線カタログを用いて赤外線のSEDを作成する。近傍宇宙に存在するAGNのトーラス成分と母銀河成分の分離を、SEDの特徴を用いて行う予定である。これにより、幅広いX線光度での、トーラスおよび母銀河の性質の理解を目指す。また、新たにスタートしたAGNトーラスおよびAGNの最期の研究を進める。観測は現在ほぼ終了しているため、データ解析および議論、論文執筆に時間を用いる予定である。また、この研究の一部については、理論研究から予想されているAGNの特徴をすでに存在している大規模な観測データを用いて行う予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
風疹ウイルス感染並びに風疹発症を許容する宿主免疫についての解析

1風疹輸入症例から検出された風疹ウイルス(RV)の遺伝子型を調査し、2017年のインドネシアでの流行株を「逆探知」した。インドネシアは世界で最も風疹が流行している国の一つであり、近隣諸国の風疹流行や排除状態の維持に大きな影響を与えている。しかし、サーベイランス体制が十分構築されていないため、流行株についての情報は殆ど明らかにされていなかった。世界各国が風疹排除を進める上で、重要な情報を提供できた(Kanbayashi et al., Emerg Infect Dis. 2018)。RV株のB細胞エピトープの同定と中和反応に対する寄与度を明確化する為、ワクチン株を遺伝的背景に持つRV構造タンパク質発現ベクターpcDNA3.1(+)/HS-CE2E1を構築した。これまでの解析で明確化した中和抗体の反応性低下に寄与する可能性がある変異(Kanbayashi et al., J Virol Methods. 2018)を順次導入し、中和活性低下と変異の関係性を明らかにする。32017年の大阪市内における手足口病流行について解析し、コクサッキーウイルスA6(CV-A6)が主要な原因ウイルスであることを明らかにした。手足口病は、風疹と同様に発疹性疾患である。1982年の調査開始以来、大阪市内において2番目に大きい規模で手足口病が流行した。主要な原因ウイルスはCV-A6であった。検出されたCV-A6のVP1全長(915nt)を用いた系統樹解析から、検出されたCV-A6は、genetic group A3とA4に分類された。抗原性変化や感受性集団の蓄積が流行に関与している可能性が示唆された(Kanbayashi et al., Jpn J Infect Dis. 2019)。研究実施計画書に記載した事項について、おおむね計画通り研究を進めることができた。それに加えて当初予定していなかったが、ワクチン接種者から網羅的にヒトモノクローナル抗体を作製する研究実施に向けて準備を進めることが出来た。当該解析の実施により、風疹ワクチンが誘導する免疫並びに風疹ウイルスの理解の深化、治療・発症予防薬の開発、サブユニットワクチンの開発など、当初の計画以上にウイルス学の発展や社会に貢献出来る知見が得られると考えられる。【風疹ワクチンによって誘導される抗体のパネル化とエピトープの決定】ヒト血液から網羅的に抗原に反応する抗体を作製しパネル化する。その中から、中和活性等を持つ機能性抗体を探索する。ワクチンが効果を発揮できない免疫学的弱者における感染防御や妊婦の予防的並びに急性感染の治療に使用できる抗体医薬品の開発に繋がる知見を得る。また、中和活性の強い抗体が認識する部位(エピトープ)を決定し、妊婦にも使用できるサブユニットワクチンの開発など、より効果的なワクチンの創生に貢献できる基盤情報を蓄積し公衆衛生の向上に貢献する。当該研究は、B細胞1個から抗体遺伝子を増幅し、無細胞タンパク質合成系で抗体を発現させる技術を持つ外部機関との共同研究で行う予定である。【遺伝子型2B RV株のB細胞エピトープの同定と中和反応に対する寄与度の明確化】野生型RVLPと変異型RVLPを抗原として中和抗体価を測定する。中和抗体の反応性低下に寄与した変異を同定し、同定された各アミノ酸変異の液性免疫回避に対する寄与度を明確にする。【風疹ウイルス複製制御因子IFNλの胎盤低応答性の分子メカニズムの解明】ヒト胎盤由来細胞株について、複製制御因子IFNλの胎盤低応答性の分子メカニズムを明らかにする。【風疹の臨床症状と相関する免疫因子(immune correlate)の同定】当所が収集した風疹患者血清パネルや患者の末梢血単核球(PBMC)を使用し、血清生化学的検査所見およびサイトカイン類の誘導量を蛋白質・mRNAの発現プロファイリングにて評価する。患者の臨床症状と採取した血液・尿・咽頭ぬぐい等の患者検体に含まれるRVコピー数との相関を解析し、風疹症状の程度と相関が認められる因子を同定する。生物活性物質である場合には、in vitro感染モデルでRV複製に与える影響を評価する。【2018年から2019年の風疹流行要因の解明】1風疹輸入症例から検出された風疹ウイルス(RV)の遺伝子型を調査し、2017年のインドネシアでの流行株を「逆探知」した。

1982年の調査開始以来、大阪市内において2番目に大きい規模で手足口病が流行した。主要な原因ウイルスはCV-A6であった。検出されたCV-A6のVP1全長(915nt)を用いた系統樹解析から、検出されたCV-A6は、genetic group A3とA4に分類された。抗原性変化や感受性集団の蓄積が流行に関与している可能性が示唆された(Kanbayashi et al., Jpn J Infect Dis. 2019)。研究実施計画書に記載した事項について、おおむね計画通り研究を進めることができた。それに加えて当初予定していなかったが、ワクチン接種者から網羅的にヒトモノクローナル抗体を作製する研究実施に向けて準備を進めることが出来た。当該解析の実施により、風疹ワクチンが誘導する免疫並びに風疹ウイルスの理解の深化、治療・発症予防薬の開発、サブユニットワクチンの開発など、当初の計画以上にウイルス学の発展や社会に貢献出来る知見が得られると考えられる。【風疹ワクチンによって誘導される抗体のパネル化とエピトープの決定】ヒト血液から網羅的に抗原に反応する抗体を作製しパネル化する。その中から、中和活性等を持つ機能性抗体を探索する。ワクチンが効果を発揮できない免疫学的弱者における感染防御や妊婦の予防的並びに急性感染の治療に使用できる抗体医薬品の開発に繋がる知見を得る。また、中和活性の強い抗体が認識する部位(エピトープ)を決定し、妊婦にも使用できるサブユニットワクチンの開発など、より効果的なワクチンの創生に貢献できる基盤情報を蓄積し公衆衛生の向上に貢献する。当該研究は、B細胞1個から抗体遺伝子を増幅し、無細胞タンパク質合成系で抗体を発現させる技術を持つ外部機関との共同研究で行う予定である。【遺伝子型2B RV株のB細胞エピトープの同定と中和反応に対する寄与度の明確化】野生型RVLPと変異型RVLPを抗原として中和抗体価を測定する。中和抗体の反応性低下に寄与した変異を同定し、同定された各アミノ酸変異の液性免疫回避に対する寄与度を明確にする。【風疹ウイルス複製制御因子IFNλの胎盤低応答性の分子メカニズムの解明】ヒト胎盤由来細胞株について、複製制御因子IFNλの胎盤低応答性の分子メカニズムを明らかにする。【風疹の臨床症状と相関する免疫因子(immune correlate)の同定】当所が収集した風疹患者血清パネルや患者の末梢血単核球(PBMC)を使用し、血清生化学的検査所見およびサイトカイン類の誘導量を蛋白質・mRNAの発現プロファイリングにて評価する。患者の臨床症状と採取した血液・尿・咽頭ぬぐい等の患者検体に含まれるRVコピー数との相関を解析し、風疹症状の程度と相関が認められる因子を同定する。生物活性物質である場合には、in vitro感染モデルでRV複製に与える影響を評価する。【2018年から2019年の風疹流行要因の解明】令和元年度以降、ヒトモノクローナル抗体のパネル化、エピトープ決定に多額の費用を要することとなった。その為、初年度は、これまで獲得した研究費で購入した試薬の残余分を使用し実験を行った。
糖化ストレス分子メチルグリオキサールによる骨質劣化機序の解明とその改善方法の開発

糖尿病は代表的な糖代謝異常疾患であるが、近年、糖尿病の新たな合併症として骨粗鬆症が注目されている。インスリン依存性の1型糖尿病では骨芽細胞のインスリンシグナルが不足する事により骨形成が低下する事が知られている。一方、インスリン非依存性の2型糖尿病では『骨量は減少しないが、骨折リスクは上昇する』という特徴がある。その理由として、骨基質が終末糖化産物(AGEs)によって糖化変性し、劣化することで『硬くて脆い』骨になり脆弱性を示すと考えられているが、高骨密度が維持される機序については不明である。これまでに我々は、2型糖尿病で血中濃度が増加するAGEsの一つであるメチルグリオキサール(MG)を培養系に添加すると、骨芽細胞株MC3T3-E1細胞の石灰化が亢進し、形成した石灰化物の性状が対照と比べて硬さが増し、粘弾性が低下することを報告した。MGによるタンパク質の糖化変性は、カルボニル基の求電子反応によるものと考えられるため、その求電子反応を抑制する求核物質の一つとして、我々は活性イオウ分子種(RSS)に着目した。活性イオウ分子種はチオール基に過剰にイオウが結合したポリスルフィド構造を持つ物質で、様々な生体反応に関与することが近年明らかになっている。本年度は、この活性イオウ分子種がMGによる石灰化亢進作用に及ぼす影響について解析を行った。RSSとしてNaSH、Na2S2、Na2S3、Na2S4を用いた。MC3T3-E1を石灰化誘導培地で培養し、培地中にMGおよび各種RSSを添加して培養した。その結果、RSSの添加はMGによる石灰化亢進作用を抑制することが明らかとなった。また、その作用はSの原子数が多いほど大きかった。以上より、RSSはMGによる糖化ストレスを抑制する可能性が示唆された。MGによる糖化ストレス抑制分子の候補の一つとしてRSSを同定した。具体的には、MC3T3-E1細胞を石灰化誘導培地で培養する実験系において、MGの添加で上昇するアルカリホスファターゼ活性、石灰化物形成をRSSの添加が抑制することを発見した。さらにその作用はS原子を多く持つRSSほど強い抑制作用を示すことも明らかにした。RSSの代謝はミトコンドリアで行われるが、その産生と分解に関わる酵素としてシステインtRNA合成酵素(Cars2)および硫化物キノンオキシドレダクターゼ(SQR)が報告されている。今後はこれらの酵素をsiRNAでノックダウンし、MGによる石灰化物形成促進作用およびナノインデンテーション法を用いた物性解析を行う予定である。今年度は種々のRSSを用いて、MGによるMC3T3-E1細胞の石灰化物形成促進作用に及ぼす影響について解析した。

本来はRSS添加時に形成された石灰化物の物性解析を予定していたが、研究を進める途中でRSS合成酵素であるCars2および分解酵素であるSQRの重要性が明らかとなり、Cars2およびSQRの遺伝子ノックダウンを行った上で石灰化物の物性解析を実施することにした。そのため、石灰化物の物性解析に関わる費用を次年度使用する。
「触感温度」評価式の実験的検証と実用製品への応用

身体の一部がものに触れた瞬間に、そのものをどのように感じるかを評価することは、物質評価においてたいへん重要である。これまで半無限固体の非定常熱伝導モデルから新しい触感温度評価式を提唱しているが、身の回りには異質材表層で覆われた材料が多く、本研究では初めにそれら異質材表層の触感温度に及ぼす影響を数値解法から検討した。材料と皮膚内の温度分布の最終浸透深さを考慮して、皮膚、表層、材料の各領域における要素分割の個数と刻みを適宜決め、それぞれの温度分布から触感温度に及ぼす表層の厚さの影響を検討した。その結果、触感温度の物体温度からの偏差は、皮膚と表層・母材間の温度差、これらの熱物性値、および表層の厚さと温度受容器の深さから定まること、触感温度に及ぼす表層厚さと熱浸透率比の影響は、表層厚さの減少に伴い急激に顕著になることがわかった。また、異質材表層が物体表面に存在するときの、皮膚と物体の接触面温度や接触温冷感への影響を被験者実験により検討した。アルミニウム板に塩化ビニリデンフィルムを異なる枚数、貼付することにより貼付枚数の多いものほど接触面温度の低下が少ないことが実測された。さらに、温度を可変できるシリコンラバーヒータを用いた温感測定器を2台作製し、測定センサの位置や充填材の影響、熱電対の種類などを考慮して測定精度を高め、ポリプロピレンフィルムを用いた接触温冷感の比較実験を行い、異質材表層の影響を検討した。表層材としてポリプロピレンフィルムを用いた実験では、フィルムの存在により設定温度の知覚が緩和される、すなわち皮膚温により近く感じられることが確認された。その効果は物質の温度と体温との差が大きいときほど、異質材表層の影響が大きいことがわかった。身体の一部が物に触れた瞬間に、その物をどのように感じるかを評価することは、物質評価の重要な関心事であり、これまで身体が物に触れた直後に感じる温度を「触感温度」と呼び、単一の数値で表す測度として触感温度評価式を提唱した。しかし、日常触れる物体の表面にはその製品の付加価値を高めるために、塗料や保護膜などさまざまな加工が施されている。これらの表層材が非常に薄い場合は接触熱抵抗として取り扱うことができ、非常に厚い場合は皮膚と表層材だけの完全接触として取り扱うことができる。しかし、触感温度を感じる皮膚内の温度受容器の位置する深さに比べて表層の厚さが同程度になると、接触熱抵抗モデルによる近似はもはや成り立たず、厳密な解析解を導き出すことが困難になる。そこで本研究では数値解法を用いてこの問題を取り扱った。その結果を発表しているが、現在、触感温度に及ぼす表層材の厚さの影響がどの程薄くなると顕著に現れるかを検討中である。また人の知覚による表層材の影響を検討するために、温度を可変できる触感温度測定装置を作製し、被験者実験を行った。装置表面の接触面には熱伝導率が高くて温度むらができにくいアルミニウム板を、加熱部には鉄板に密着し容易に均等な加熱ができるマグネット付のシリコンラバーヒータを用いた。この装置を二つ作成し、一方には表層材としてポリ塩化ビニルを貼り付けた。表面の温度測定にはアルメル-クロメル熱電対を使用した。実験は一方の装置の温度を固定し、他方の温度をそれより低い温度から少しずつ上昇させ、どちらが熱いかを選択してもらう方法とした。その結果、物質の表面に薄膜を貼ることにより人が感じる熱を緩和する効果が生じることが確認できた。また、物質の温度と体温との差が大きいほど薄膜を貼る効果が大きいことも確認でき、さらに装置を改良して表層材の影響を検討する予定である。

身体のー部がものに触れた瞬間に、そのものをどのように感じるかを評価することは、物質評価においてたいへん重要である。ものに触れた直後に感じる温度を、単一の数値で表すことができれば接触温冷感を予測でき、製品開発にも結ぴつくといえる。これまで半無限固体の非定常熱伝導モデルから新しい触感温度評価式を提唱した。身の回りには異質材表層で覆われた材料が多く、本研究では初めにそれら異質材表層の触感温度に及ぼす影響を数値解法から検討した。薄い異質材表層で覆われた材料の触感温度は、皮膚内の温度受容器の位置する深さに比べて表層の厚さが同程度になると、接触熱抵抗による近似はもはや成り立たず、そのため厳密な解析解を導き出すことが困難になる。そこで材料と皮膚内の温度分布の最終浸透深さを考慮して、皮膚、表層、材料の各領域における要素分割の個数と刻みを適宜決め、それぞれの温度分布から触感温度に及ぼす表層の厚さの影響を検討した。本研究より、触感温度の物体温度からの偏差は、皮膚と表層・母材間の温度差、これらの熱物性値、および表層の厚さと温度受容器の深さから定まること、触感温度に及ぼす表層厚さとσ_m/σ_sの影響は(κ_s/κ_f)^<1/2>ε/δが約1以下になってはじめて現れ、表層厚さの減少に伴い急激に顕著になるごとがわかった。また、実験的検証により触感温度評価式の有用性を明らかにすることを目的として、異質材表層が物体表面に存在するとき、皮膚と物体の接触面温度や接触温冷感への影響を検討した。アルミニウム板にサランラップを異なる枚数、貼付することにより接触面温度の実測検討の結果、貼付枚数の多いものほど接触面温度の低下が少ないことが確認された。また、温度を可変できるシリコンラバー式温感測定器を作製し、表示温度の分布精度を高めた上で、接触温冷感の比較測定を行った。その結果、異質材表層がある場合は触感温度を緩和する効果が生じ、物質の温度と体温との差が大きいほど、異質材表層の影響が大きいことが確認された。
カンジダ酵母における網羅的発現制御株の構築と応用-病原性ゲノム機能学-

カンジダグラブラータは、パン酵母の近縁種であるが、人体内に常在する真菌である。健常者にとっては大きな問題とはならないが、エイズや免疫抑制剤の投与によって免疫力の低下した患者に対しては重篤な日和見深在性感染症を起こすため問題となっている。我々は、カンジダの病原性解明と優れた抗真菌薬の開発を目指し、ゲノム機能解析を進めている。まず、真菌類およびヒトゲノムのデータベースを用いて、真菌類に高く保存され,人には類似性の低い遺伝子をカンジダグラブラータのゲノムから抽出した。次にパン酵母では生育必須遺伝子が同定されており、我々は前述の遺伝子の中からパン酵母の必須遺伝子のオーソログ遺伝子を184遺伝子抽出し、このうち180遺伝子についてい誘導型プロモーターを導入した株(Tet株)を体系的に構築した。これらの株を用いてin vitroでの生育実験を行い、各遺伝子のカンジダの生育に対する影響を、定量的に測定した。今後、in vitroでの生育実験を行い、これらの結果を基に抗真菌薬の標的として適性度の順位を決めていく。カンジダグラブラータではパン酵母と比較して相同組み換え効率の低いことが問題であり、遺伝子組換え操作をより効率的に進めるために新しい組換え実験系を構築する必要があった。そこで、我々はKU80のノックダウンシステムを構築し、このシステムにおいて菌株のゲノムや生育の安定性について詳細に検証を行い、生育速度、突然変異率などに影響が無い事を確認した。平成19年度はKU80ノックダウンシステムを用いて、約600のTet株を構築した。今後、組換え株の作製には、KU80ノックダウンシステムを用いる。
e-Learning環境での協調学習支援のためのメタデータ化と知識共有の研究

近年,インターネットを利用した協調活動が日常的に行われるようになり,コンピュータを用いた協調学習の支援が期待されている.特に,教育・学習においては,インターネット上での協調学習(CSCL : Computer Supp orted Collaboration System)が新しい学習形態として注目を集めている.そして,協調学習を支援するための基盤システムや様々なツールが開発されている.また学校教育においても,協調学習を取り入れた授業が行われるようになっている.しかしながら,協調学習を取り入れた授業は,従来の集合的な授業と比較し,教育現場の教師に高度な授業設計能力を求める.そのため,協調学習による教育・学習の必要性や重要性が認知されながらも,実際の授業では,円滑に進める事が困難となっている.本科研の目的は,協調学習を意図したLearning Entityのメタデータ化(CLEM : Collaborative Learning Entity Metadata)とその参照モデルによる知識・共有の具体化になる.そして,メタデータ付けされた協調学習事例から構成される事例ベースシステムの構築・運用を通じて,教師の協調学習環境の設計や指導に関する教育的知識の抽出を試みる.CLEMに基づく協調学習事例ベースシステムは,事例管理のみならず,対話的事例検索の機能を提供する事によって,教師の協調学習の設計・実践・評価等に関する知識の共有と再利用を可能にする.(1)協調学習事例の収集,(2)協調学習事例ベースシステムの実装を行った.前者においては,各教育機関(特に,初等中等教育機関)に実地調査し,協調学習事例(サンプル)を収集した.そして,昨年度の研究成果であるCLEMに基づき協調学習事例を記述した.(2)においては,事例ベースシステムの基本モジュールとなる"事例登録","事例検索","事例修正","事例修復"の4つのモジュールを設計し,実装した.また,事例ベースシステムは,通常のデータベースシステムと異なる,事例の検索から解の導出(事例の提示)まで計算コストが高くなる.本科研では,事例ベースシステムを負荷分散する仕組みを提案し,導入した.本年度の成果は,次のように纏められる.・協調学習事例の収集とCLEMによる表現・協調学習事例ベースシステムの設計・実装・協調学習事例ベースシステムの運用近年,インターネットを利用した協調活動が日常的に行われるようになり,コンピュータを用いた協調学習の支援が期待されている.特に,教育・学習においては,インターネット上での協調学習(CSCL : Computer Supp orted Collaboration System)が新しい学習形態として注目を集めている.そして,協調学習を支援するための基盤システムや様々なツールが開発されている.また学校教育においても,協調学習を取り入れた授業が行われるようになっている.しかしながら,協調学習を取り入れた授業は,従来の集合的な授業と比較し,教育現場の教師に高度な授業設計能力を求める.そのため,協調学習による教育・学習の必要性や重要性が認知されながらも,実際の授業では,円滑に進める事が困難となっている.本科研の目的は,協調学習を意図したLearning Entityのメタデータ化(CLEM : Collaborative Learning Entity Metadata)とその参照モデルによる知識・共有の具体化になる.そして,メタデータ付けされた協調学習事例から構成される事例ベースシステムの構築・運用を通じて,教師の協調学習環境の設計や指導に関する教育的知識の抽出を試みる.CLEMに基づく協調学習事例ベースシステムは,事例管理のみならず,対話的事例検索の機能を提供する事によって,教師の協調学習の設計・実践・評価等に関する知識の共有と再利用を可能にする.(1)協調学習事例の収集,(2)協調学習事例ベースシステムの実装を行った.前者においては,各教育機関(特に,初等中等教育機関)に実地調査し,協調学習事例(サンプル)を収集した.そして,昨年度の研究成果であるCLEMに基づき協調学習事例を記述した.(2)においては,事例ベースシステムの基本モジュールとなる"事例登録","事例検索","事例修正","事例修復"の4つのモジュールを設計し,実装した.また,事例ベースシステムは,通常のデータベースシステムと異なる,事例の検索から解の導出(事例の提示)まで計算コストが高くなる.本科研では,事例ベースシステムを負荷分散する仕組みを提案し,導入した.本年度の成果は,次のように纏められる.・協調学習事例の収集とCLEMによる表現・協調学習事例ベースシステムの設計・実装・協調学習事例ベースシステムの運用現在,インターネットを利用した協調学習を支援するシステムが数多く開発され,教育の実践が展開されている.しかし,これらのシステムを活用したとしても,教育現場では,教師が自らの教育目的,意図,指導の方針に基づき,様々な学習環境をデザインしなければならない.また,協調学習と一口でいっても様々な形態・指導の方法があり,現実的な制約をふまえて,その実行可能な知識の共有化を行うことが大きな課題となっている.本科研の目的は,協調学習支援を意図したLearning Entityのメタデータ化(CLEM : Collaborative Learning Entity Metadata)とその参照モデルによる知識抽出・共有の具体化を行うことである.そして,メタデータ付けされた協調学習事例から構成される事例ベースの構築・運用を通じて,教師の協調学習環境の設計や指導に関する教育的知識の抽出を試みる. CLEMに基づく協調学習事例ベースは,事例管理のみならず,対話的事例検索の機能を提供することで,教師の協調学習の設計・実践・評価等に関する知識を共有・再利用することを可能にする.本科研では,この事例ベースの研究を通じて,教師の協調学習環境設計を支援することを意図するものである.今年度は,協調学習に関係する広範な研究成果の調査,および,教育現場での事例調査を行った.

そして,この調査結果に基づき,包括的協調学習モデルの構築と第一ステップとしてのCLEMの規定を行った.具体的には下記の項目について研究を行い,成果を得た.・協調学習の研究および実践の動向調査・協調学習における技術的,教育的課題の考察・協調学習のメタデータ化(CLEM)と共有すべき対象の考察・CLEMに基づく協調学習事例ベースの枠組みの提案近年,インターネットを利用した協調活動が日常的に行われるようになり,コンピュータを用いた協調学習の支援が期待されている.特に,教育・学習においては,インターネット上での協調学習(CSCL : Computer Supported Collaboration System)が新しい学習形態として注目を集めている.そして,協調学習を支援するための基盤システムや様々なツールが開発されている.また学校教育においても,協調学習を取り入れた授業が行われるようになっている.しかしながら,協調学習を取り入れた授業は,従来の集合的な授業と比較し,教育現場の教師に高度な授業設計能力を求める.そのため,協調学習による教育・学習の必要性や重要性が認知されながらも,実際の授業では,円滑に進める事が困難となっている.本科研の目的は,協調学習を意図したLearning Entityのメタデータ化(CLEM : Collaborative Learning Entity Metadata)とその参照モデルによる知識・共有の具体化になる.そして,メタデータ付けされた協調学習事例から構成される事例ベースシステムの構築・運用を通じて,教師の協調学習環境の設計や指導に関する教育的知識の抽出を試みる.CLEMに基づく協調学習事例ベースシステムは,事例管理のみならず,対話的事例検索の機能を提供する事によって,教師の協調学習の設計・実践・評価等に関する知識の共有と再利用を可能にする.今年度は,(1)協調学習事例の収集,(2)協調学習事例ベースシステムの実装を行った.前者においては,各教育機関(特に,初等中等教育機関)に実地調査し,協調学習事例(サンプル)を収集した.そして,昨年度の研究成果であるCLEMに基づき協調学習事例を記述した.(2)においては,事例ベースシステムの基本モジュールとなる"事例登録","事例検索","事例修正
自己組織的都市システムにおけるマクロ空間構造の法則性創発メカニズムに関する研究

本研究では、生産・消費・輸送における外部効果に基く集積の経済を考慮した都市・輸送システム理論の基礎モデルの構築・理論分析を行うとともに、基礎モデルを一般化した大規模シスオムの数値シミュレーション分析の基礎を作った。理論モデルにおいては、特に、輸送外部効果に基く輸送網の形成および産業集積のメカニズム、および、生産・消費外部効果と労働者間技術(人的資本)格差の相互作用に基く、産業集積と地域格差のメカニズムの、明示的な記述を行ったものは本研究による成果が初めてであり、既存研究に対しての貢献があった。さらに、基礎理論モデルを発展させ、並列計算機上で、大規模な都市・輸送システムの自己組織化分析を効率的に行う、シミュレーション手法の開発を進めてきた。特に、オブジェクト指向・並列プログラミングを適用することで、従来の手続型プログラミングによる場合に比べ、容易に一般的かつ複雑な経済システムを対象とするシミュレーション手法の開発が可能になった。本研究で開発した手法は、外部経済の下での大規模システムの自己組織化など、いわゆる複雑系の分析をする上で、非常に有用な分析手段を提供する。このことは、手続型プログラミングを用い、比較的単純なシステムを対象としてきた従来の計算経済学におけるものに対し、新たな可能性を示したと言える。本研究による成果の一部は、ディスカッションペーパーとしてまとめられ、国際雑誌に投稿中である。本年度は、都市システムの自己組織化分析に用いる理論モデルの構築、および、その理論モデルに基づく数値シミュレーションプログラムの整備を行った。1)都市システムの自己組織化を直接的に与える理論モデルを構築都市の人口規模・位置・数・産業構造が内生的に決定される一般均衡モデルを構築した。これにより、都市間貿易・人口および企業の移動を通して、ミクロ的基礎に基づく都市システムの自己組織化を表現することが可能になった。この理論モデルは、来年度に本格化する、都市システムの構造法則性の創発メカニズムに関する分析において、基本モデルとして用いる。モデル開発における各段階での結果は一部、雑誌等にて公表された(項目11参照)。2)構築した理論モデルのシミュレーションプログラムの作成および整備(1)において構築した理論モデルを用いて、都市システムの自己組織化過程を数値シミュレートすることを可能にするプログラムの作成を行い、数値シミュレーションの試行を繰り返すことによりプログラムの整備を完了した。
新生児仮死に対する軽度脳低温療法の基礎的検討

新生児へ安全かつ効果的に脳低温療法を行う際の基礎的データーを得ることを目的として、今年度は全身冷却法において局所脳血流(rCBF)の部位別変化を中枢神経系の発達がヒト新生児と比較的類似している正常新生仔豚を用いて詳しく検討した。さらに選択的頭部冷却法用のキャップを作成し、選択的頭部冷却における非侵襲的な脳温測定法や脳循環評価法の検討を行った。1.rCBFは大脳全体の血流は冷却前39°Cで79.0±11.2ml/100g/min、35°Cでは冷却前値の72%、32°Cで41%に減少した。これに対して脳幹部での血流は前値が116.6±18.3ml/100g/min、35°Cでは冷却前値の59%、32°Cで30.7%に減少し、他の視床、小脳、前頭葉、側頭葉、頭頂葉、後頭葉のどの部位より減少率が有意に高かった。2.血圧は全身冷却、選択的頭部冷却のいずれにおいても、冷却前後で有意な変動はなかったが、心拍数は33°C以下で有意に低下した。3.頭部冷却水の温度が5°Cである場合、深部体温計で測定した脳深部温、鼻腔内温より脳皮質温の方が、約2°C低くなり、脳表より2cm深い場所と、脳表で2°C以上の格差が生じることが判明した。4.近赤外分光装置による脳内ヘモグロビン酸素飽和度測定はいずれの冷却法においても低体温中の脳循環モニターとして有用であるが、選択的頭部冷却ではプローブ装着の工夫が必要であった。以上の成績より、中等度の低体温療法でも脳幹部の血流が最も低下しやすいので、脳幹部の血流低下の起こる全仮死に対しての低体温療法は危険性が高く、本療法の適用には十分な注意が必要である。また全身冷却による低体温中の非侵襲的脳温モニターとして有用であった鼻腔内温、深部体温計以外に脳表の脳皮質温を反映するモニター法の検討が必要である。新生児への脳低温療法を行う際の基礎的データを得ることを目的として、非侵襲的な脳温モニター部位の検討と脳循環代謝に及ぼす影響について検討した。今年度は、新生仔豚を用い全身冷却法において脳低温療法を行い、近赤外分光法による脳内ヘモグロビン酸素飽和度の測定およびカラードマイクロスフェレによる脳血流、脳の酸素およびグルコース消費量を測定した。1.全身冷却法の生理的パラメータに及ぼす影響:血圧は冷却前後で有意な変動はなかったが心拍数は33°C以下で有意に低下した。2.非侵襲的な脳温モニター部位の検討:脳皮質に挿入して直接測定した脳皮質温と頭部に装着した深部体温計および鼻咽頭に挿入した鼻咽頭温が、各々r=0.995、r=0.994と良好な相関を示した。3.大脳全体の血流(CBF)、脳酸素消費量、脳グルコース消費量は冷却前で各々79.0士11.2ml/l00g/min、5.3±1.2ml02/l00g/min、48±13μmol/l00g/minであった。35°Cでは冷却前値の72%、70%、72%、32°Cで41%、55%、50%に減少した。CBFがどの段階でも有意に減少するのに対して脳酸素消費量、脳グルコース消費量は35°C以下では有意な減少はなかった。4.近赤外分光法で測定した脳内ヘモグロビン酸素飽和度は低体温開始後一旦やや上昇し、その後35°C以下で有意に低下した。以上の成績より、全身冷却による低体温中の非侵襲的脳温モニターとして、鼻腔内温、深部体温計が、また非侵襲的脳循環モニターとして近赤外分光法による脳内ヘモグロビン酸素飽和度の測定が有用であると考えられた。また安全に全身冷却法で低体温療法を行うには35°Cまでが適当ではないかと思われた。次年度は、選択的脳低温療法用のキャップを作成し、選択的頭部冷却法における基礎的検討を今年度と同様にして行う。

3.頭部冷却水の温度が5°Cである場合、深部体温計で測定した脳深部温、鼻腔内温より脳皮質温の方が、約2°C低くなり、脳表より2cm深い場所と、脳表で2°C以上の格差が生じることが判明した。4.近赤外分光装置による脳内ヘモグロビン酸素飽和度測定はいずれの冷却法においても低体温中の脳循環モニターとして有用であるが、選択的頭部冷却ではプローブ装着の工夫が必要であった。以上の成績より、中等度の低体温療法でも脳幹部の血流が最も低下しやすいので、脳幹部の血流低下の起こる全仮死に対しての低体温療法は危険性が高く、本療法の適用には十分な注意が必要である。また全身冷却による低体温中の非侵襲的脳温モニターとして有用であった鼻腔内温、深部体温計以外に脳表の脳皮質温を反映するモニター法の検討が必要である。
シュードモナス細菌がつくるエチレン生成酵素の基質特異性のタンパク工学的改変

1.EFE中にある10コのヒスチジン残基(His)を部位特異的突然変異手法を用いて、グルタミンに変化させた。その結果、H-189とH-233をグルタミンに変えることにより、EFE活性が完全に消失した。このことはH-189とH-233がFe(II)結合部位と考えられた。一方、H-268は1.3%のEFE活性が残存したが、基質である2-オキソグルタル酸の結合部位と推定した。2.微生物と植物のEFEのハイドロパシープロットは、P.syringaeのEFE遺伝子から、疎水性アミノ酸領域(Pro93・Pro114)と親水性アミノ酸領域(Arg209-Ser226)を除くと植物由来のEFEのものとよく一致している。そこで、上記領域を欠失させたEFEを作成し、植物由来のEFE酵素へと構造変換できないか検討した。(1)PCR法を用いて欠失EFE遺伝子断片を調整した。(2)得られた疎水部欠失部EFE遺伝子のものと、親水部欠失EFE遺伝子断片をそれぞれpUC18にライゲーションした。(3)欠失EFE遺伝子断片を含むプラスミドによる大腸菌の形質転換体を作成した。(4)2つの領域をそれぞれ除去したEFE遺伝子を含む大腸菌は、in vivo,in vitroで測定したところ、2-オキソグルタル酸、ACCからのエチレン生成酵素活性を消失していた。(5)形質転換体での欠失EFE遺伝子の発現の確認をウエスタンブロッティングで行ったが、現在のところ確認できていない。Pseudomonassyringaeのエチレン生成酵素(EFE)のエチレン生成反応に必須な2価の鉄イオンの結合部位を蛋白質工学的手法を用いて解析することを目的として本実験は実施された。得られた結果は次のように要約される。本EFEと他の2-オキソグルタール酸依存性のジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を比較した結果、全てで保存されていたEFEのHis189とHis268をそれぞれGln残基に変異した変異型EFE遺伝子を作製し、E.coliで変異EFEを発現させた。両者を単離精製し、エチレン生成活性を測定した結果、H1890では活性が完全に消失していたが、H2680は比活性で1%程度のEFE活性が残存していた。つぎにEFE蛋白質中の全てのHis残基10個のうち、His189とHis268を除いた8個をそれぞれGln残基へ変異した変異型EFE遺伝子を作製し、E.coliで発現させた。その結果、H3050,H3350は野性型と同程度の活性を維持していたが、5種類の変異型酵素(H1160,H1680,H1690,H2840,H3090)では、約10%以下まで活性が低下していた。そして、H2330はH1890と同様に活性が完全に消失していた。1残基を置換しただけで活性が消失したこと、また2-オキソグルタール酸依存性のジオキシゲナーゼの保存領域に位置することから、H189とH233の2つのHis残基はEFEのエチレン生成反応において非常に重要なアミノ酸残基であることが判明した。おそらくこの2つのHis残基が2価の鉄イオンとの結合に関与していると推測した。各変異型酵素の熱安定性を測定した結果、H3050,H3090,H3350の熱安定性は親株とほぼ変わらなかった。また、各変異型酵素の熱安定性は、親株の熱安定性を上回るものはなかった。

また、微生物のEFEから植物型EFEへの変換の可能性を調べるため植物型EFE遺伝子にはない余分の塩基部分(280-342と625-678)を除いた欠失変異遺伝子を作成中である。Pseudomonas syringaepv. phaseolicolaPK2のエチレン生成酵素(EFE)と植物由来のEFE酵素は、活性部位と考えられるアミノ酸残基が保存されており、また、両者のハイドロパシープロットは、P. syringaeのEFE遺伝子から疎水性アミノ酸領域(Pro93-Pro114)と親水性アミノ酸領域(Arg209-Ser226)を除くと植物由来のエチレン生成酵素のものと良く一致している。そこで、上記領域を欠失させたEFEを作成し、植物由来のエチレン生成酵素へと構造変換できないか検討することを目的とした。1.PCR法を用いて欠失EFE遺伝子断片を調整した。この時用いたプライマーはKY6プライマー、KY9プライマー、N末端プライマー、C末端プライマー、KY7プライマーとKY10プライマーの6種類である。2.得られた疎水部欠失EFE遺伝子(1,000bp)のものと、親水性欠失EFE遺伝子(1,000bp)断片をそれぞれpUC18にライゲーションした。4.2つの領域をそれぞれ除去したEFE遺伝子を含有するE.coliJM109は、in vivo、in vitroで測定したところ、α-ケトグルタール酸からのエチレン生成酵素活性を消失していた。5.形質転換体での欠失EFE遺伝子の発現の確認をウエスタンブロッティングで行ったが、現在のところ確認できていない。今後、疎水部、親水部別々に作成したものから、両者を欠失した断片を作成し、EFEタンパク質の確認を行うとともに、植物EFE活性の測定を行って行きたい。