hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい生物活性物質の有機化学的探索, 合成と反応, 及び活性評価

(2)先ず定説になっている活性型ビタミンDのA環の立体配座とVDR親和性[α-form【double arrow】β-form(活性型)]を指標とする様々な生理活性との関連を明らかにするためA環の2-位及び4-位にMe基を導入した1,25-dihydroxyvitamin D_3の各8種の全ジアステレオマーを合成した。又、現在注目を集めている前者の20-epi体も全8種合成した。合成はTrost法を採用し、A環前駆体enyneを汎用性の高い独自の方法を開発し合成した。2-メチルseriesのVDR結合能は、A環置換基の立体配置の違いで大きな差を生じた(10^5幅)。水酸基は天然型配置が活性が強く、特に2α-Me体のVDR結合能は1α,25-(OH)_2D_3(基準とする)の4倍、HL-60分化誘導能は2倍、Ca代謝調節能は4倍と増強した。A環修飾活性型ビタミンD誘導体で1α,25-(OH)_2D_3より強いVDR結合能を有するものとして史上初めての例である。更にその20-epi体はそれぞれ12倍、590倍、6.5倍という高活性を示した。一方、4-メチルseriesのVDR結合能は水酸基が天然型でも10^<-2>で、殆ど10^<-3>以下であり親和性がなかった。更に、D欠乏状態でのCa代謝調節能、各種の転写活性、アポトーシス制御能が調べられている。配座解析は[1α,2α-Me,β]体のX線結晶解析では1位OH基がequatorialのβ-formで存在するが、溶液中ではaxialであるα-form(/β-formは約2/1)が優先した。[1α,2β-Me,3β]体ではMe基がequatorialに近いハーフボートのβ-formが優先するようである。Me以外の2-置換誘導体、A環・側鎖同時修飾ハイブリッド、配座固定誘導体の合成が展開中である。(3) (1),(2)の研究展開が目覚ましく(3)は一時中断した。[文中(1),(2),(3)は科学研究費申請実施計画に対応する](2)先ず定説になっている活性型ビタミンDのA環の立体配座とVDR親和性[α-form【double arrow】β-form(活性型)]を指標とする様々な生理活性との関連を明らかにするためA環の2-位及び4-位にMe基を導入した1,25-dihydroxyvitamin D_3の各8種の全ジアステレオマーを合成した。[文中(1),(2),(3)は科学研究費申請実施計画に対応する]先に提出した科学研究費補助金交付申請書の平成9年度研究実施計画の各項目に対応して述べる。本課題研究は3部から成り立っている。(1)本年度は狩蜂の採集は行はず、昨年度までに採集した各種日本産独居性狩蜂についてその毒嚢成分の構造決定に全力挙げた。先ずオオフタオビドロバチの毒嚢を摘出し、イセエビ歩脚神経筋の神経伝達を阻害する抽出分画を、逆相HPLCにて丁寧に分離精製し2種のオリゴペプチドを得た。構造はEdman分解及びマススペクトロメトリー(FAB-MS/MSとMALDI-TOF-CID)より推定し、別途合成により決定した。マストパラン様活性を示した(第1回国際ペプチド討論会、Dec1997,Kyoto)。他方、ベッコウバチからも同様の手法によりオリゴペプチドの単離に成功しており(第39回天然有機化合物討論会、1997.8、札幌)、その神経作用が注目される[論文1参照]。

(2)活性型ビタミンD_3がレセプター(VDR)と結合し作用発現するとき、A環部の立体配座がどのようになっているかを解明のが究極目的である。A環のコンフォメーションが微妙に異なる2-methyl-1,25-(OH)_2D_3の8種のジアステレオマ-総てを合成した。合成法はTrost法を基盤としA環前駆体(enyne)合成に工夫をこらした。ここに得られた全8種のVDR結合能、DBP親和性、Ca代謝調節作用、HL-60分化誘導作用を測定し(共同研究者)、2α-methyl-1α,25-(OH)_2D_3が活性型ビタミンD_3より高い活性を有することを見い出した[論文2参照]。更に、これら化合物の20-エピ体すべてを合成し、2α-methyl-20-epi-1α,25-(OH)_2D_3のVDR結合能は10倍、HL-60分化誘導作用能は600倍と高い活性を有することを発見した(第17回メデイシナルケミストリーシンポジウム、1997.11,筑波)。基礎研究としては、25-位水酸化のbiomimetic酸化として電解酸化を開発した[論文3参照]。(3)ピロール部に置換基を導入したピロール縮環スルホレンを合成し、分子間Diels-Alder反応を検討しアルカロイド合成の可能性を探った[論文4参照]。また、アシル置換フラン縮環スルホレンから分子内、分子間D-A反応を用いて多官能基化多環化合物の合成に成功した[論文5参照]。(1)相模湖周辺、茨城県、京都市で捕獲した雌狩蜂を種別し、毒嚢を抽出し、逆相HPLCにてイセエビ神経筋標本による活性分画を集め、精製をくり返して単離し、構造は主として現在の質量分析の最先端であるMALDI-TOF-CID法を用いて推定し、Fmoc-L-アミノ酸を用いた固相法で別途合成して決定した。昨年度はオオフタオビドロバチ(eumenine科)からeumnenine mastparan-AF[Ile-Asn-Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Lys-Gly-Ile-Ile-Lys-Ser-Leu-NH_2]を単離し、スズメ蜂毒成分マストパラン様活性に酷似していることを証明し、肥満細胞を用いたヒスタミン遊離作用など更に詳細な生理作用を検討している。今年度は、オオモンクロベッコウ、及び更に捕獲数の少ないモンベッコウ(Pompilidae科)から毒嚢を抽出し、同様な精製をくり返して単離し、質量分析も酵素を用いたMALDI-TOF-Ladder Sequence法を加えて超超微量の毒成分がArg-Ile-Lys-Ile-Gly-Leu-Phe-Asp-Lys-Leu-Ser-Lys(β-はArg)-Leu-NH_2なる構造を有することを突き止め、合成で決定し、α-及びβ-pompilidotoxinと名付けた。このペプチドの神経作用は今まで類例を見ないもので神経生理学者の注目を集めている。作用機構や類縁体の合成を展開する予定である。(2)昨年度は2-Me-1,25-(OH)_<2->D_3のA環の立体配置の異なる全8種のジアステレオマーを合成し、VDR結合能が、A環置換基の立体配置の違いで大きな差を生じること(10^5幅)、水酸基は天然型配置が活性が強く、特に2α-Me体のVDR結合能は1α,25-(OH)_<2->D_3(基準とする)の4倍、HL-60分化誘導能は2倍、Ca代謝調節能は4倍と増強した。本年度は更にそれらの20-epi体を合成し、その生物活性を調べたところ、2α-Me-1α,25-(OH)_<2->D_3はそれぞれ12倍、590倍、6,5倍という高活性を示した。一方、4-Me-1,25-(OH)_<2->
Pー糖蛋白質の構造と機能の研究

1.ウシ副腎のPー糖蛋白質の機能の解析ウシ副腎のPー糖蛋白質の薬剤結合部位について解析するため、ウシ副腎から膜画分を分離し、[ ^3H]アジドピンでフォトアフィニティ-ラベルを行った。130KDaの分子がフォトラベルされ、この分子はPー糖給白質にする単クロ-ン抗体、Cー219で免疫沈降した。このことはウシ副腎のPー糖蛋白質が、アジドピンとの結合部位を有し、その分子量はヒト癌KB細胞のPー糖蛋白質より10KDa以上小さいことを示している。[ ^3H]アジドピンによるフォトラベルは、抗癌剤ビンブラスチンや耐性克服薬剤、レセルピン、ベラパミ-ルで阻害された。ウシ副腎Pー糖蛋白質は、ヒト癌KB細胞のPー糖蛋白質の薬剤結合部位とよく似た薬剤結合部位を持つことが判明した。2.ウシ副腎中より、Pー糖蛋白質の輸送基質となる物質の抽出について。ウシ副腎をホモジェナイズし、100%メタノ-ルで抽出した。これをヘキサンで分配し、ヘキサン層を除去したあと、酢酸エチルで分配し酢酸エチル層を濃縮乾固した。クロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムに注入して1%酢酸、2%メタノ-ル、97%クロロホルムで溶出し、多剤耐性細胞への抗癌剤の蓄積を高める活性を各画分で測定した。活性部分を薄層クロマトグラフィ-で展開し、活性部分を採取して、順相HPLC、逆相HPLCにて精製を試みた。最後のODSー2カラムで、16分附近に活性のあるピ-クが認められたので、この物質の精製を進め、構造決定を行う予定である。
インターナル・マーケティングの促進要件に関する研究

今後の分析枠組みの設定を目的に顧客の満足度指標とその企業の成果指標の関係性を明らかにしようと試みた。顧客の満足度を測定するための指標として米国企業の売上上位500社(Fortune 500)の35%が利用しているNet Promoter Scoreを用いた。今回の目的はその評価値と企業の成果指標の関係性を実証的に確認することと、さらには日本独自の顧客推奨指標を仮説的に策定することにある。背景にはライクヘルドらが開発したNPSは日本企業の多くで近年採用され、それらの企業の戦略的意思決定のための情報として用いられることが急速に増加している一方で、日本人消費者には指標の適合度が低いのではないかとの批判が多く見受けられることがある。これらを理論的背景に顧客推奨度と業績を実証的に測定する独自調査を行った。対象は化粧品会社(回答数7,538人)、日用品会社(同6,403人)、食品宅配企業(同1,243人)、ファッションECサイト(同9,450人)である。結果を元にNPSを修正した日本版の独自モデルを開発し2018年9月の国際学会にて報告を行った。顧客推奨度と業績を実証的に測定する独自調査を行った。分析結果を元に、NPSを修正した日本版の独自モデルを開発し2018年9月の国際学会にて報告を行った。本パートはサッサー、ヘスケットらが提唱したService Profit Chainの後半部分のプロセスをもとにした実証分析である。サッサー、ヘスケットらが提唱したService Profit Chainの前半部分のプロセスである従業員満足がどのように顧客満足(顧客の推奨)に結びつくかを協力企業を対象にした実証調査により明らかにしていく。さらに最終的は当該企業の業績評価にどうつながるか、スタート時点である従業員に関してインターナル・マーケティングの諸要素がどのように働いたのかそれら因果関係の解明を行う。
芝性植物の畦畔における低コスト栽培法の研究

【研究目的】水田畦畔の草刈に要する労力・時間・燃料等の費用は毎年の事ゆえ莫大なものがある。そこで筆者は水田畦畔に芝性植物を植え付け被覆させることができれば,畦畔に自然発生する様々な雑草を相当程度排除することができ,その結果,草刈に要する労力等は大幅に軽減されるものと以前より考えている。ついては,様々な水田畦畔に応じ,芝性植物をどのような肥培管理をすることで,より低コスト且つ省力的に栽培できるかを解明しようとした【研究方法】予め芝性植物(センチピードグラスティフブレア)の種を播種し,56cmまで育てた。その間に畦畔を12区画に分け,EC/PHメーター等によって土壌診断を行った。6月に必要最小限の除草作業を行った後,育てておいたピット苗を水田畦畔に定植した。なおその際には窒素・燐酸・加里の単肥肥料や有機肥料の配合割合を色々変え,また施肥時期をずらし,様々に変更した条件下で実施した。その後半年余りの比較栽培期間中,生育状況の比較・作業時間の計測そして最重要要素である経費の比較実験を行った。【研究成果】今夏想定以上の高温障害・水分不足により一部は枯れ消滅した(省力化・低コストが目的のため枯死することは織り込み済)が,12月の降雪前までには程度の差はあれ,ほふく茎は伸びている。降雪前までの定着の比較では,費用対効果からは化成肥料は生育が一番良いが,費用も一番高額となってしまった。単肥の窒素肥料はその次である。牛糞肥料は生育が緩慢で期待はずれといっても良い。鶏糞がコスト面及び時間では最も有利となった。土壌診断の結果は,当地域は黒ボク土の畦畔のためか,どの区画も記載すべき傾向は見られなかった。なお3月末までという研究期間の制約により,現在も畦には多くの雪が残っており雪解け後の生育状況は,現時点では判明し難い。よって次年度に期待したい。
CD26/DPPⅣのHMGB1阻害による慢性GVHD発症防止のメカニズムの解明

1.前年度の研究でGVHDマウスモデルの臓器で移植後早期に細胞の核からHMGB1が放出されていることを確認したことを踏まえ、GVHDの発症経過について臓器の組織学的所見を解析したところday20の時点で好中球の浸潤が認められることを確認した。GVHDのエフェクター細胞はT細胞であるが、GVHDの初期の病態形成には自然免疫細胞である好中球が関与している可能性が示された。移植後のどの時点で好中球の浸潤が起こるのかについて引き続いて検討を行う予定である。2.GVHDの発症にHMGB1が関与していることをin vivoで検討するために、移植前処置後に抗HMGB1抗体を投与してHMGB1の作用を阻害する実験を行った。移植後のマウスの体重変化には個体ごとのばらつきはあるものの、移植前処置後に抗HMGB1抗体を投与したマウスにおいて体重減少が少ない傾向が認められた。前処置後にレシピエント臓器細胞の核から放出されるHMGB1を移植後のどの時点で阻害することで前処置後に生じる炎症反応を制御できるのかはまだ明らかでないため、抗HMGB1抗体の投与時期を変えてみてGVHDマウスの臓器の病理組織所見と対比しながら引き続き検討を行う予定である。GVHDの発症におけるHMGB1の作用を検討する中で、病理組織学的に好中球の臓器浸潤を確認することができた。これはGVHDの初期病態形成における極めて興味深い知見であり、追加実験を検討していたが、研究棟の移転のために動物実験施設が使用できない状況となり、やむをえず研究を中断せざるを得なかった。そのために研究の進行が遅れることとなった。そのため期間延長を申請した。炎症メディエーターであるHMGB1のGVHD発症における作用を検討する中で自然免疫系細胞がGVHDの発症早期に関与していることを示唆する病理組織的所見が得られたことは極めて重要な知見であると考えている。自然免疫細胞である好中球がGVHDの発症早期に誘導されることが、その後のGVHDの病態形成にどのように作用するのかを今後検討する予定である。1. HMGB1の炎症惹起作用と作用発現に要する時間を検討するために単球系細胞株U937をHMGB1を添加して培養し、炎症性サイトカインTNF-αの産生量を測定した。培養開始3時間後にTNF-α量はピークを示し、HMGB1濃度に依存性であった。3.GVHD経過中のCD26/DPP4とHMGB1の相関を検討するためにGVHDマウス血中の可溶性CD26濃度を測定した。可溶性CD26の濃度はday1から徐々に低下してday6に最低値となり、day27から上昇することが明らかとなった。初年度の研究課題の進捗状況については、HMGB1の炎症惹起作用と免疫細胞活性化作用を確認し、骨髄移植後GVHDマウスモデルにおけるHMGB1の経時的変化の解析もほぼ予定通りに実施するができた。HMGB1は敗血症マウスモデルでの検討で炎症のlate phaseに作用する因子であることが知られているのでGVHDマウスモデルにおいてday6にHMGB1濃度が上昇することは予想通りであったが、HMGB1濃度がday0に高値を呈する二相性の変化を示すことは予期していない結果であった。この結果については2年目にGVHDにおけるHMGB1の由来臓器を明らかにすることで解析を進める準備をしている。2年目以降にCD26/DPP4によるHMGB1の作用阻害を解析する実験を行う準備として、HMGB1の炎症性サイトカイン活性をCD26が抑制することを評価するためのin vitroの測定系の実験の設定を進めて、HMGB1とCD26の濃度の条件設定を色々と変更して何度か試みたが、予備実験の段階でHMGB1とCD26の相互作用に関してデータのばらつきが大きく安定したデータを得ることができなかった。そのためHMGB1が炎症を惹起する作用をCD26が阻害することを示すための新たな活性測定系を模索しているため当初の予定よりも計画の進行がやや遅れている。1.前年度の研究でGVHDマウスモデルにおけるHMGB1の経時変化を明らかにしたことを踏まえHMGB1がどの臓器に由来するのかについて検討を行った。GVHDマウスモデルの臓器(肺、消化管、肝臓、脾臓)を使って移植前後の経過におけるHMGB1のmRNA発現量をreal time PCRで測定した。消化管や脾臓に比べて肺と肝臓でHMGB1のmRNAの発現量が増加することが明らかになった。2.GVHDマウスモデルの臓器(肺、消化管、肝臓、皮膚)で抗HMGB1抗体による免疫組織染色を行い、移植前処置後のHMGB1の発現を組織学的に解析したところ、前処置前は細胞核内にHMGB1が存在しているが、移植前処置後の早い時点でHMGB1が細胞核から放出されて細胞質に認められることが明らかとなった。特に臓器の中では肝細胞の核からHMGB1が多く放出されていることが判明した。しかし、GVHDマウスモデルでHMGB1が高値を呈するのは移植後6日目頃であり、移植早期に前処置で傷害を受けた臓器の細胞核からHMGB1が放出されていることとは時間差がある。これは核から放出されたHMGB1が細胞質内にとどまり細胞外へ放出されていないことが原因の可能性がある。

この点についてはGVHDの発症におけるHMGB1の動態をさらに検討する必要があり、DPP4/CD26がどの時点でHMGB1に対して作用するのかを考える上でも重要な検討事項と考えられる。本研究の2年目の進捗状況については、GVHDマウスモデルを用いて移植前処置後のHMGB1のmRNAの発現量を解析することでHMGB1がどの臓器に由来するのかを明らかにすることができた。また、GVHDマウスモデルの臓器を使ってHMGB1の免疫組織染色を行うことで移植前処置後のHMGB1の局在、およびGVHDの標的臓器とHMGB1の発現量との関連についてほぼ予定通りに解析を行うことができた。特に研究前の予想とは異なり、移植前処置を受けたGVHDマウスモデルの臓器ではHMGB1が細胞外に放出されるのではなく細胞質への放出に留まっていることなど新たな知見が得られた。一方、CD26/DPP4がHMGB1の作用を阻害してGVHDの発症を抑制することに関しては様々な条件検討を行っているが、まだデータが得られていない。移植前処置後の様々な段階を経た後にHMGB1が炎症性サイトカインとしてGVHD発症に作用していると考えられるが、D26/DPP4が移植前処置後のどの段階のHMGB1に作用しているのかをまだ明らかにできていない点で研究の進行が遅れている。1.前年度の研究でGVHDマウスモデルの臓器で移植後早期に細胞の核からHMGB1が放出されていることを確認したことを踏まえ、GVHDの発症経過について臓器の組織学的所見を解析したところday20の時点で好中球の浸潤が認められることを確認した。GVHDのエフェクター細胞はT細胞であるが、GVHDの初期の病態形成には自然免疫細胞である好中球が関与している可能性が示された。移植後のどの時点で好中球の浸潤が起こるのかについて引き続いて検討を行う予定である。2.GVHDの発症にHMGB1が関与していることをin vivoで検討するために、移植前処置後に抗HMGB1抗体を投与してHMGB1の作用を阻害する実験を行った。移植後のマウスの体重変化には個体ごとのばらつきはあるものの、移植前処置後に抗HMGB1抗体を投与したマウスにおいて体重減少が少ない傾向が認められた。前処置後にレシピエント臓器細胞の核から放出されるHMGB1を移植後のどの時点で阻害することで前処置後に生じる炎症反応を制御できるのかはまだ明らかでないため、抗HMGB1抗体の投与時期を変えてみてGVHDマウスの臓器の病理組織所見と対比しながら引き続き検討を行う予定である。GVHDの発症におけるHMGB1の作用を検討する中で、病理組織学的に好中球の臓器浸潤を確認することができた。これはGVHDの初期病態形成における極めて興味深い知見であり、追加実験を検討していたが、研究棟の移転のために動物実験施設が使用できない状況となり、やむをえず研究を中断せざるを得なかった。そのために研究の進行が遅れることとなった。そのため期間延長を申請した。初年度の研究で明らかになったGVHDにおけるHMGB1の経時変化の結果を基に、今後の研究ではHMGB1の由来臓器や標的細胞の解析を進めてGVHD発症におけるHMGB1の作用を明らかにしていく。また、GVHDにおける可溶性CD26の経時変化の結果を踏まえて、GVHDの病態進展においてCD26がHMGB1に対してどのように作用するのかを明らかにしていく予定である。また、HMGB1の炎症性サイトカインとしての機能に対するCD26の阻害効果の評価方法についても濃度設定や測定条件を変更して安定したデータを得るための実験の設定を進める。
浮遊微粒子で覆われた惑星大気大循環と物質循環の力学

ロスビー数を変える実験を解析する前に、金星を模した雲層加熱により駆動する惑星大気大循環の水平解像度依存性と多重平衡について調査した。高緯度ジェットで形成される極域間接循環は、雲層のGierasch-Rossow-Williamsのメカニズムを弱める方向に働くため、雲層のスーパーローテーションを弱化させる。間接循環が解像できない低解像実験では、下層大気への角運動量輸送効率が下がり、初期に与えたスーパーローテーションの角運動量が雲層に残りやすい。それゆえ、初期にスーパーローテーションを与えた実験では、初期値を静止状態にした実験よりも、雲層で高速のスーパーローテーションが形成される。このように、低解像度実験では,多重平衡解が出現しやすい結果が得られた。赤道ケルビン波を下端から強制した金星中層大気大循環モデル実験を行い、「東西風最大値UMAX,子午面風最大値VMAX,南北温度差最大値dTMAXの時系列データの3変数空間の振る舞い」と「数年スケールの帯状流年々変動」についてまとめた。UMAXとVMAXとdTMAXの時系列データの散布点は、解析的手法から得られる推定曲線の周辺にプロットされる.また,赤道ケルビンの強制が弱いと、その散布分布は線状になるが、強制が強いと、その散布分布は小さい点状になる.前者の分布は、高緯度ジェットの盛衰に伴う年々変動を反映して線上構造になる。この数値実験の解析により、極域ロスビー波と高緯度ジェットの盛衰に伴うスーパーローテーションの年々変動プロセスを新たに提案した。対数正規モーメント法を用いた浮遊微粒子のパラメタリゼーションは、臨界半径を導入し、バイモーダルに拡張した定式化を行った。臨界半径を導入することで凝集過程のモーメント方程式が煩雑になった。また、放射コードを組み込んだ大循環モデル実験も行った。大気大循環モデルの計算結果を解析し、雲で覆われた惑星の大気大循環構造を明らかにする。「帯状流および大気大循環構造の相似性」を調査するために、無次元パラメーターを用いて数値実験結果を整理する。引き続き、数値実験を行い、極域の間接循環が存在するパラメーター域で、角運動量輸送収支や波動の解析を行う。また、循環構造のみならず波動についても、無次元パラメーターを用いて整理する。力学研究と併行して、「対数正規モーメント法を用いた浮遊微粒子のパラメタリゼーション」では、臨界粒径を導入したモーメント法の計算コスト改善をおこなう。今年度は、解析作業用サーバーを購入して、データ解析とモデル開発を効率よく行えるようにする。上記の途中経過や成果は学会発表および論文にまとめる。
補体研究の新展開-免疫細胞の機能調節と不要自己細胞認識の分子機構

I.好中球の補体レセプターCR3を介した貪食応答;スルファチドによる亢進L-セレクチンのリガンドの一つであるスルファチドで好中球を刺激すると、CR3-依存的な貪食応答がスルファチドの濃度依存的に亢進した。さらに、ヒト好中球をキモトリプシン処理してL-セレクチンを膜表面から脱落させても、セレブロシド刺激によるCR3-依存性貪食応答が観察された。これは、ヒト好中球には、L-セレクチン以外のセレブロシド受容分子が存在し、CR3の機能を増強する可能性を示唆する。II.不要細胞処理に働く同種補体活性化分子;M161抗原とポリペプチド鎖延長因子(EF-1α)a:ヒト癌細胞の同種補体活性化分子.ヒト癌細胞に同種補体活性化を誘導する分子を発見し、M161抗原と命名した。そのcDNA解析からマイコプラスマ感染刺激により産生誘導されたリポ蛋白質と判明した。b:ヒトTリンパ球の同種補体活性化分子.アポトーシス死したTリンパ球に観察される同種補体活性化分子は、アミノ酸配列分析からポリペプチド鎖延長因子EF-1αと判明した。EF-1αは正常細胞では細胞内に存在するが、アポトーシス死を起こすと膜表面に移動し補体を活性化する。iC3b標識により貪食処理が促進することから、補体系は不要自己細胞のクリアランスにも関わる免疫機構でもある。III.補体制御分子,MCP,の機能部位の解析MCPは麻疹ウイルスのレセプターでもある。新世界ザルのマーモセット細胞のMCPはヒトMCPと相同構造をしているが、麻疹ウイルス感染性を示さない。マーモセットそれ自体は麻疹感染性の霊長類であることから、MCP以外の麻疹ウイルス受容体が存在する可能性が高い。本年度の主な研究成果は、1;アポトーシス細胞の自己補体活性化分子の解析アポトーシス死したヒトTリンパ球(Jurkat細胞)のNP40可溶化画分をSDS-PAGEし、PVDF膜に転写してからヒト血清で処理すると、50kDaの蛋白質に袖体C3が結合する事が見いだされた。これは、50kDaの分子力が自己補体を活性し、C3がその分子表面に結合したことを意味する。この50kDa分子をクロマトグラフィーで精製し、その末端分析を行ったところ、転写開始因子、INFであることが判明した。INFに対する抗体を用いたウエスタンプロットからも、50kDa分子がINFであることが確認された。同種補体を活性化しないヒト好中球では、抗INF抗体を用いたウエスタンブロットが陰性であり、INFが自己補体活性化分子である可能性を強く示唆する。2;新助界サルのMCPMCPは補体制御因子であるほかに麻疹ウイルスレセプターでもある。麻疹は霊長類に感染するが、サルMCPの分子的な特徴は明らかでなかった。ヒトに近い旧世界サルに属するアフリカミドリサルの培養細胞Vero細胞ならびに新世界サルに属するマーモセットの培養細胞B95aかMCP遺伝子をクローニングし、ヒトMCPとの構造的な比較を行った。ヒトと近縁のVero細胞のMCPはヒトMCPと高い相同性を示し、麻疹ウイルス感受性も高いが、B95a細胞のMCPは麻疹感受性を示さなかった。B95a自体は麻疹疹ウイルス感受性を示すところから、MCP以外のウイルス受容体の存在する可能性を示唆する。1;アポトーシス細胞の自己補体活性化分子の解析アポトーシス死したヒトTリンパ球(Jurkat細胞)のNP40

可溶化画分をSDS-PAGEし、PVDF膜に転写してからヒト血清で処理すると、50kDaの蛋白質に補体C3が結合する事を見いだした。これは、50kDaの分子が自己補体を活性し、C3がその分子表面に結合したことを意味する。この自己補体活性化分子は、アポトーシスにより誘導されるのではなく、正常な細胞にも存在することが明らかになった。この50kDa分子を部分精製し、そのアミノ酸配列分析から、ポリペプチド鎖延長因子(EF-1a)と推定された。さらにEF-1αに対する抗体を用いた免疫染色法によりこの50kDa分子がEF-1αであることが確認された。この自己補体活性化能のある50kDa分子は、末梢血から採取した単球画分でも観察されたが、好中球では観察されなかった。EF-1αも単球画分に確認されたが、好中球には確認出来なかった。この結果も、50kDa分子がEF-1αであることを支持している。正常なJurkat細胞はEF-1α抗体と反応しないが、アポトーシスに伴って反応することが確認された。これは、アポトーシスに伴う細胞膜構造の変化により、細胞質成分のEF-1αが細胞表面へ移行することを示唆する。2:スフィンゴ脂質による食細胞の貪食活性の亢進スフィンゴ脂質は細胞膜の主要な構成因子である。スフィンゴ脂質の硫酸化誘導体であるスルファチドで食細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達系のチロシンキナーゼがリン酸化されることや貪食機能が亢進することを見いだした。また、細胞表面のスルファチド受容体を探索したところ、ラクトフェリンであることを明らかにした。I.好中球のFcR-CR3依存性食作用に対するセレブロシドの影響L-セレクチンのリガンドの一つであるスルファチドが、ヒト好中球の細胞内シグナル伝達を惹起する事は良く知られているが、スルファチド刺激により貪食応答が亢進されるかに付いては明らかでなかった。本研究では、FcRやCR3を介した貪食応答がスルファチド刺激により亢進するかを調べた。その結果、FcR-依存的な貪食応答は亢進しなかったが、CR3-依存的な貪食応答がセレブロシドの濃度依存的に亢進した。これは、セレブロシドを介したシグナルがCR3を介したシグナルにより増強される事を示唆する知見である。さらに、ヒト好中球をキモトリプシン処理してL-セレクチンを膜表面から脱落させても、セレブロシド刺激によるCR3-依存性貪食応答が観察された。これは、ヒト好中球には、L-セレクチン以外のセレブロシド受容分子が存在する可能性を示唆する興味深い知見である。II.ヒトTリンパ球の自己補体活性化分子ヒトTリンパ球(Jurkat細胞)のNP40可溶化画分から50kDaの自己補体活性化分子を精製し、アミノ酸配列分析から、ポリペプチド鎖延長因子EF-1αと推定された。この自己補体活性化能がEF-1αに対する抗体処理により活性が消失することやEF-1αの存在しないヒト好中球にはこの活性化分子も検出されないことからも支持された。正常なT-リンパ球には抗EF-1α抗体は結合しないが、アポトーシスを起こすと抗体の結合が観察される。これは、EF-1αがアポトーシスに伴う細胞膜構造の変化により細胞質から膜表面へ移行し、自己補体活性化を誘導する可能性を示唆する。
運動性筋損傷後の再生に働く筋衛生細胞のバイオイメージング

筋衛星細胞(サテライトセル)は筋線維の基底膜と形質膜の間に局在する幹細胞の一種であり,骨格筋の再生や発育に重要な役割を担っている.しかし,今まで生体内の骨格筋内に局在するサテライトセルを直接可視化することは技術的に困難であった.本研究において発育や再生時の骨格筋のサテライトセルの移動を観察することができ,生体の骨格筋内のサテライトセル移動の制御メカニズムをリアルタイムで検討する上で有効な研究モデルを得ることができた.筋衛星細胞(サテライトセル)は筋線維の基底膜と形質膜の間に局在する幹細胞の一種であり,骨格筋の再生や発育に重要な役割を担っている.しかし,今まで生体内の骨格筋内に局在するサテライトセルを直接可視化することは技術的に困難であった.本研究において発育や再生時の骨格筋のサテライトセルの移動を観察することができ,生体の骨格筋内のサテライトセル移動の制御メカニズムをリアルタイムで検討する上で有効な研究モデルを得ることができた.運動性筋損傷にともなう線維長軸の一部の構造破壊は,近傍の筋衛星細胞(SC)を活性化させ,増殖,分化,融合といった一連の再構築過程を進めると考えられているが,その実態を示した報告はない.そこでF344系ラットの長指伸筋の挫滅による筋損傷を惹起し,損傷1,2,3,5日後に筋を摘出し,単一筋線維を取り出,細胞周期,分化の決定マーカーとSCのマーカー(M-cadherin)とにより免疫化学染色を施し再生に関わるSCの動態を検討した.損傷3日までに増殖と細胞周期停止を示すSCが,損傷部2600μm以内に5倍以上に増加した.損傷5日まで増殖したSCの中で壊死は観察されず,ミオシンの新生は損傷近端800μm以内で起きていた.再生筋においてSCが増えないことから,遠位で増えたSCの損傷部への積極的遊走の可能性が考えられた.この移動性を町田(東海大)により初代培養筋で確かめた.摘出したSCをコラーゲンコーティングしたCultureSlideに播種し,固定後に種々濃度のHGFを含む培地に交換しSCの遊走性を確認した.また,竹倉(鹿屋体育大)により,筋疲労時の興奮収縮連関の機能低下と内膜系の形態変化を調べた。Wistar系ラットの下肢筋線維束を摘出し,Ringer液(5mM、10mM、25mMの乳酸)に浸漬処理した後の筋細胞内膜系を電子顕微鏡により観察した。乳酸濃度に依存しT管が細くなり走行形態にも乱れが生じた。形態変化は可逆性の変化であり,筋疲労に伴う興奮収縮連関の機能低下は、筋内膜系の形態変化による可能性が示唆された。再生筋における筋衛星細胞(サテライトセル)の挙動を生体上で観察する目的で実験を行った.ネンブタール麻酔科において露出したひらめ筋の遠位1/4部をピンセット先端にて1秒間強く挟み,挫滅損傷を与えた.挫滅3日後に吸引麻酔下にあるラットの下肢の損傷筋(ひらめ筋),をM-cadherin-Qdot複合体/0.1M PBSにてincubationを行いin vivoにて観察した.その結果,生体上においてもQdotが導入されることが確認され,サテライトセルのin vivo real-time imagingが可能となった.損傷を与えていないコントロール筋に対してM-cadherin-Qdot複合体でincubationを行い,15分毎120分間の観察を行ったが,筋衛星細胞の移動は起きていなかった.一方,損傷3日後の筋に対してM-cadherin-Qdot複合体でincubationを行いin vivoにて観察した結果,経時的に移動する,M-cadherin陽性の核(サテライトセル)を確認することが出来た.intactな筋上にあるサテライトセルは,空間移動せず静態しているが,骨格筋が損傷することにより,サテライトセルは活性化し移動を開始するものと考えられた.昨年度に行った免疫組織化学で得られたデーターでは,挫滅3日後に2損傷部から2600μm離れた件繊維状に細胞周期を終了したサテライトセルが見られ,さらに5日後には損傷部に移動し,分化・融合してミオシンを発現するという結果が得られており,その移動速度は,900nm/minであった.Qdot観察結果と矛盾しないものであった.今回,生体時用での観察結果では,15分間の移動距離は13μmであり,平均移動速度は840nm/minであった.この数値は,組織学的横断的観察と比較して矛盾しないものであった.昨年度末の段階で,本研究テーマの重要部を占める,再生筋における筋衛星細胞(サテライトセル)の挙動を生体上で観察することに成功した.こ.の実験は,Fischer344系ラットのヒラメ筋によりおこなった.実験3日前の段階で,ヒラメ筋の遠位1/4部に挫滅損傷を与えておき,実験時には吸引麻酔下にあるラジトの下肢の損傷筋(ひらめ筋)をM-cadherin-Qdot複合体/0.1MPBSにて4時間incubationを行った後に,そのまま吸引麻酔を維持し,ラットを顕微鏡下にセットし,筋上のサテライトセルをin vivo real-time imagingすることを可能にした者である。この実験では,損傷方向に移動するの平均移動速度は840nm/1脚であった.損傷を与えていない成熟筋においては,サテライトセルの移動は起きていなかった.

しかし,骨格筋は発生過程における形態形成ばかりでなく,生後の筋細胞の成長(伸長肥大)にともなう筋核の増加などは,骨格筋内に局在するサテライトセルの増殖に頼っている.新たな筋節が線維端に形成されながら細長く成長する筋線維において,長軸構造内の均等配置を保った筋核数の増加は,筋線維上に分布は筋衛星細胞の増殖・遊走(細胞運動)・分化によっていると考えられる.増殖・分化は筋形成制御因子の発現などで確認されているが,発育筋における筋衛星細胞の細胞運動について確認されていない.そこで2011度は1発育初期にある生後1から3週齢のFischer系ラジトを用い,筋の長育を支える筋衛星細胞の動態をin vivo imgingし,その遊走特性を検討する目的で実験を行った.実験手法としては昨年確立された方法と同様とした.生後14日齢のヒラメ筋に対してM-cadherin-Qdot複合体でincubationを行いin vivoにて80分間の連続観察した結果,経時的に移動するゴM-cadherin^+筋衛星細胞を確認することが出来た.遊走は筋線維中央側から筋端方向に起きていた.発育期の筋線維端で盛んに起きる筋節構造の新設に対して筋核の供給がどのように行われているかについては不明瞭であったが,本成果から,発育の筋線維では,筋線維上既存部にある筋衛星細胞が活性化・増殖し,筋線維端に移動し筋端で融合することで筋形成・筋節構造の新設に働くことが明らかとなった,観察できた筋衛星細胞の平均移動速度は105nm/minであった.本研究の最大テーマである再生筋における筋衛星細胞(SC)の挙動を生体上で観察することに成功した.この実験は,F344系ラットのヒラメ筋の遠位1/4部に挫滅損傷を与えて,再生が最も盛んな損傷3日後に,M-cadherin-Qdot複合体でラベルしたSCの動態を吸引麻酔下のラット下腿上から観察したものであり,筋表層のSCが損傷方向に移動することを観察可能にしたものである.次の実験では,発育期の筋におけるSCに着目した.筋細胞の成長は新たな筋節が線維端に形成されながら細長く伸長するが、その筋線維端筋核の増加はSCによると考えられる.そこで,発育初期(生後1から3週齢)のラットを用い,筋の長育を支えるSCの動態を観察した結果,経時的に筋線維中央側から筋端方向に移動(平均移動速度は105nm/min)する,M-cadherin+ SCを確認することが出来た.発育の筋線維では,筋線維上既存部にあるSCが活性化・増殖し,筋線維端に移動し筋端で融合することで筋形成・筋節構造の新設に働くことが明らかとなった.このようなSC移動の制御メカニズムが不明のままであるが,培養実験において筋芽細胞移動を誘発する主な因子として肝細胞増殖因子(HGF)があることが知られている.そこで,外因性HGFを用い筋衛星細胞移動の誘因性を検討した.麻酔下のラット下腿を露出させ、HGF溶液にて3時間インキュベーションされた結果、濃度依存性のある移動速度を示す細胞が生体上で観察された. HGFインキュベーションにより,SCにおいてMyoDの発現が引き起こされており,移動した細胞がSCである可能性が示めされた.生体の骨格筋内の筋衛星細胞移動の制御メカニズムをリアルタイムで検討する上で有効な研究モデルを得ることができた.本研究では,世界で初めて生体上での筋衛星細胞(サテライトセル)の動きを捉えることに成功した.
構造化されたエリシテーションの開発と意味研究への応用

従来から、言語の統語論的・意味論的分析のためには研究者あるいは研究協力者の内省・直感が用いられてきた。このような研究手法を再検討するため、母語によって異なる事象の捉え方、顕在的態度とは異なる潜在的態度の存在に注目しつつ、特にヴォイス現象とダイクシス現象について従来の研究データを詳細に分析した。その結果に基づき、構造化されたエリシテーションの手法の概要を定め、試行のための準備をおこなった。昨年度と同様、構造化エリシテーションの手法を開発するための方法論的検討と併行して、具体的データを使っての検討およびその予備的分析をおこなった。まず方法論の検討としては、研究代表者と研究分担者全員がひき続き定期的に会合を持ちながら、各自が国内外から集めた資料を持ち寄り、これまでの言語研究において当然のごとくおこなわれてきたエリシテーションの手法について、それが暗黙に依存している前提を解明するための方法論的検討をおこなった。その結果、従来のエリシテーションにおいては、(1)母語話者間の相違は無視できること、(2)母語話者の適格性判断の尺度が常に一定であること、(3)母語話者の判断の揺れも言語データとして利用できること、(4)質問同士の影響(先行する質問や回答からの後続する質問への回答に対する影響)はないこと、(5)エリシテーションによって得られたデータの信頼性は、分析結果が規則性を示せば示すほど高まること、などが想定された上で実施されていることが明らかになってきた。次に具体的データを使っての検討としては、前年度同様、日本語の指示詞を対象に実験データの収集をおこなった。前年度に24名の参加を得ておこなった実験を、さらに12名に対しておこなった(ただし、うち1組2名のデータについては、音声を十分に拾うことができず、利用を諦めざるを得なかった)。すべての一次データ(映像・音声)の整理が終わり、一部のアノテーションが終わった。現在は、その結果を使い、エリシテーションによる結果との比較を試みているところである。なお、研究分担者のひとりが平成25年度から副研究科長に就任したため、当初予定していた研究費の一部しか執行できなかった。計画を立てる段階で予期していなかった事態であり、研究協力者を募るなどして、来年度、当初計画を達成できるよう、様々な方策を検討する予定である。構造化エリシテーションの手法を開発するための理論的検討と、そのための具体的データを集めるための実験をおこなった。まず理論的検討については、研究代表者と研究分担者全員が定期的に集まり、これまでの言語研究、特にフィールド言語学がおこなってきた、エリシテーションというデータ収集の方法を検討するとともに、海外での研究動向についても広くサーベイした。その結果、わずかではあるが、海外でも同様の問題意識が持たれ始められていることを確認した。次に実験については、平成24年度は日本語の指示詞を対象に実験をおこなった。テーマとして指示詞を選んだのは、同定が容易な言語形式であるにもかかわらず、その機能・用法を説明することが、一般の話者にとってだけでなく、言語研究者にとっても、きわめて困難であると考えられるからである。24名(うち2名は日本語非母語話者)の参加を得て、対話者の配置(2名の実験参加者が向き合って座るか、あるいは、同じ方向を見て座るか)、指示対象が既知か否か、指示対象が固有の特徴を持っているか否か、などの条件が指示詞の分布にどのように影響するかを観察した。また、調査者の母語と調査対象言語とが同じ場合と異なる場合とでエリシテーションへの影響があるかないかを知るため、同様の実験をトルコ語と日本手話の母語話者を対象としても実施した。現在、録音・録画されたやりとりの書きおこし、およびアノテーション作業が進行中である。なお、当初平成24年度に予定していた研究費の一部しか執行できなかった理由としては、すでに述べたように、海外でも同種の問題意識を持つ研究者がおり、その見解の確認に時間がかかったこと、および、実験のデザインと準備に想定以上の時間がかかったことがあげられる。構造化エリシテーションの手法を開発するために、理論的な検討と並行して、具体的なデータを用いて、これまでの言語研究で用いられているデータと、実際の母語話者の判断との間の関係に焦点を当てた研究をおこなった。具体的には、ヴォイス現象として日本語の受け身文を取り上げ、主な先行研究における言語研究者の適格性判断の検討をおこなった後に、一般の日本語話者の判断とそれを比較するため、別途アンケートを準備し、アンケート調査を実施する予定であったが、後者については、準備が間に合わず、実施することができなかった。このように、当初予定した日程を十分に消化することはできなかったが、これまで研究において取り上げられてきた例文における、日本語受け身文のタイプ、含まれる語彙項目などには、相当の偏りがあること、また、対応する非受け身文との比較が十分検討されていないこと、さらに、専門の研究者といえども、例文の適格性の判断は、彼らの間で必ずしも一致しないことが明らかとなった。また、日本語の受け身文に関するこうした研究データを、予備的ではあるが、中国語など、他の言語の研究データと比較した。本年度は、日本語の受動構文に焦点を当て、言語研究者の適格性判断を含む言語データを、一般の日本語母語話者の観点から再検討した。そのため、日本語の受動構文に関する研究をサーベイし、特に重要な貢献をもたらした研究の中から、共通のテーマを扱っていると見なせる11本の著作・論文について、それに含まれる全例文のデータベースを作成した。

この例文データベースを利用して、異なる主張ごとに例文データを整理した結果、扱われているテーマが類似しているにもかかわらず、依拠する例文について、著者の間にかなりの違いがあることが明らかとなった。例えば、今回作成したデータベースは受け身文と非受け身文の双方を含むが、その中から受け身文(計736例)に使われている動詞の種類を見てみると、もっとも出現頻度の高かった「殺す」(計31例)の場合、黒田(1979)に21例、久野(1983)に2例、柴谷(2000)に2例、寺村(1982)に5例、Jacobsen (1991)に1例と、著書・論文による大きな偏りが見られた。さらに、以上の知見を利用しつつ、研究者に由来する偏りを避けながら、研究者にとって関与的なデータが効率よく集められるような質問群を生成する手法を検討した。その結果を「構造化されたエリシテーション」として具体化した。当初予定していた、構造化されたエリシテーションの手法を利用したアンケート調査に代わり、少人数の母語話者へのインタビューを行うことができ、それによって構造化されたエリシテーションの手法の将来性について、一定の見通しが得られた。また、日本語以外の言語についても、試作をおこなっており、この点では当初の予定以上の成果をあげることができた。従来から、言語の統語論的・意味論的分析のためには研究者あるいは研究協力者の内省・直感が用いられてきた。このような研究手法を再検討するため、母語によって異なる事象の捉え方、顕在的態度とは異なる潜在的態度の存在に注目しつつ、特にヴォイス現象とダイクシス現象について従来の研究データを詳細に分析した。その結果に基づき、構造化されたエリシテーションの手法の概要を定め、試行のための準備をおこなった。適格性に関して、言語研究者間の揺れが予想以上に大きかった上に、言語データ自体に大きな偏りがあったことにより、非言語研究者を対象にしたアンケート調査の準備に手間取り、当初予定していた平成26年度までに、研究を終了することができなかった。特に、平成25年度に研究分担者のひとりが所属する部局の副研究科長・副学部長となり、平成26年度も、引き続き本研究課題へのエフォートを減じなければならない状況に直面したことに加え、平成26年度からは、別の研究分担者1名が、やはり副研究科長を命じられ、同様に、本研究課題へのエフォートを減じなければならないこととなった。このため、研究の進捗に大きな影響が生じ、平成27年度まで研究期間を延長することとなった。言語学研究分担者1名は、昨年度で副研究科長の任期が終了し、研究活動に対し、より多くのエフォートを割ける状況となったが、引き続き部局内で重要な責務を負っており、楽観はできない。また、別の研究分担者1名は、本年度も引き続き副研究科長のままであり、本研究課題の実施に関しては、引き続き大きな障害となる懸念がある。
水疱性類天疱瘡における制御性Ｔ細胞の解析および細胞療法への応用

制御性T細胞(Treg)は免疫自己寛容に重要な役割を果たすTリンパ球で、マスター転写因子はFoxp3である。Foxp3遺伝子変異によってTregが欠損すると、マウスではScurfyマウス、ヒトではIPEX症候群という重篤な全身性自己免疫疾患が生じる。本研究では、Tregが欠損することで、表皮基底膜部に対する自己抗体が産生されることが明らかとなった。また、その自己抗体は、ScurfyマウスおよびIPEX症候群患者いずれにおいても、水疱性類天疱瘡抗原であるBP230と17型コラーゲンを標的としていた。以上より、Treg欠損は水疱性類天疱瘡の発症誘因となっている可能性が示唆された。1)制御性T細胞(Treg)欠損マウス(Scurfyマウス)が産生する抗表皮基底膜部抗体の標的抗原の同定Scurfyマウスの皮膚炎の組織を観察したところ、表皮真皮境界部に著明な炎症細胞浸潤が見られたが、水疱形成は見られなかった。Scurfyマウスの皮膚を用いた蛍光抗体直接法と血清を用いた蛍光抗体間接法を行ったところ、Scurfyマウスは抗表皮基底膜部自己抗体を産生していることが明らかとなった。その自己抗体は1M食塩水剥離皮膚のroof sideに反応した。そのことから、Scurfyマウス自己抗体が認識する表皮基底膜部標的タンパクはCOL17とBP230の可能性が高いと推測した。それぞれのリコンビナントタンパクを用いてウエスタンブロット法を施行したところ、Scurfyマウス自己抗体はマウスCOL17全長タンパクとマウスBP230のC末端とrodドメインのリコンビナントタンパクには高率に反応した。以上より、遺伝子変異による制御性T細胞欠損によって、マウス体内には水疱性類天疱瘡抗原であるCOL17およびBP230に対する自己抗体が誘導されることが明らかとなった。2)アクティブBPマウスモデルにおけるTregの解析アクティブBPマウスモデルの作成にはRagKO/COL17ヒト化マウスが必要であるが、現在実験に必要な数のマウスが確保できていないため繁殖を進めている。最近ようやく量産体制に入ったため今後の研究の進展が期待できる。アクティブBPマウスモデルにおけるTregの継時的変化を解析し、末梢血および脾臓のTreg数(CD4+Foxp3+)数の推移を測定する。また、各種マーカーの発現(CTLA-4, GITR, GARP, CD39)、サイトカインの産生(IL-10)などを経時的に測定し、コントロールマウスのTregと比較する。1)Treg欠損マウス(Scurfyマウス)が産生する抗表皮基底膜部抗体の標的抗原の同定Scurfyマウスの皮膚を用いた蛍光抗体直接法と血清を用いた蛍光抗体間接法を行ったところ、Scurfyマウスは抗表皮基底膜部自己抗体を産生していることが明らかとなった。一方、病原性が高いと考えらえるマウスCOL17-NC14Aドメインタンパクには反応が見られなかったため、Scurfyマウス血清中の抗COL17抗体は病原性が低いと考えられた。また、BP230のN末端タンパクにも反応はほとんど見られなかった。2)アクティブBPマウスモデルにおけるTregの解析アクティブBPマウスモデルの作成にはRagKO/COL17ヒト化マウスが必要であるが、繁殖が難しい。特にRagKOマウスのメスは繁殖力が低いため、一度RagKO/COL17ヒト化マウスオスとCOL17ヒト化マウスメスを交配し、RagKOヘテロ/COL17ヒト化マウスを作成した。現在はRagKOヘテロ/COL17ヒト化マウスのオスとメスを交配し、RagKO/COL17ヒト化マウスの繁殖を進めている。以上より、上記2)は遅れているものの1)の進捗が予定以上であり、全体としては概ね計画通り進行していると考える。1)制御性T細胞(Treg)欠損マウス(Scurfyマウス)が産生する抗表皮基底膜部抗体の標的抗原の同定Scurfyマウス血清中の抗基底膜部自己抗体の標的抗原がCOL17およびBP230であることが同定できたため、次に制御性T細胞の欠損(Foxp3の遺伝子変異)によって生じるIPEX症候群患者血清中にCOL17およびBP230に対する自己抗体が存在するかどうか確認した。COL17NC16AELISAは陰性であったが、全長COL17 ELISAは5例中3例で陽性となった。BP230ELISAは全て陰性であった。次に、ScurfyマウスのCD4+T細胞を抽出し、TCR-beta/TCR-deltaダブルKOマウスに移入したところ、レシピエントマウスは抗基底膜部自己抗体を産生したため、Scurfyマウスにおける抗基底膜部自己抗体産生はCD4+T細胞依存性であることが明らかとなった。さらに、抗基底膜部自己抗体はIgMの沈着から始まり、IgGの沈着に推移していくことも明らかとなった。

以上より、Treg欠損によりマウスとヒトにおいて水疱性類天疱瘡自己抗体が産生されることが明らかとなった。また、マウスでは自己反応性CD4+T細胞がTreg欠損により活性化し、抗基底膜部自己抗体が誘導されていることが明らかとなった。2)アクティブBPマウスモデルにおけるTregの解析アクティブBPマウスモデルの作成にはRagKO/COL17ヒト化マウスが必要であるが、実験に必要な数のマウスが確保できていないため繁殖を進めていた。現在までに十分数のマウスが確保できておらず、今後マウスが確保でき次第、実験を行う予定である。制御性T細胞(Treg)は免疫自己寛容に重要な役割を果たすTリンパ球で、マスター転写因子はFoxp3である。Foxp3遺伝子変異によってTregが欠損すると、マウスではScurfyマウス、ヒトではIPEX症候群という重篤な全身性自己免疫疾患が生じる。本研究では、Tregが欠損することで、表皮基底膜部に対する自己抗体が産生されることが明らかとなった。また、その自己抗体は、ScurfyマウスおよびIPEX症候群患者いずれにおいても、水疱性類天疱瘡抗原であるBP230と17型コラーゲンを標的としていた。以上より、Treg欠損は水疱性類天疱瘡の発症誘因となっている可能性が示唆された。Scurfyマウス血清中の抗基底膜部自己抗体の標的抗原がCOL17およびBP230であることが同定できたため、次に制御性T細胞の欠損(Foxp3の遺伝子変異)によって生じるIPEX症候群患者血清中にCOL17およびBP230に対する自己抗体が存在するかどうか確認する。それを行うにあたり、IPEX症候群血清を解析する旨の自主臨床計画書を作成し、北海道大学病院の倫理委員会にて承認された。加えてアクティブBPマウスモデルにおけるTregの解析を実施する。アクティブBPマウスモデルの末梢血および脾臓のTreg数(CD4+Foxp3+)数の推移を測定する。また、各種マーカーの発現(CTLA-4, GITR, GARP, CD39)、サイトカインの産生(IL-10)などを経時的に測定し、コントロールマウスのTregと比較する。次に、アクティブBPマウスモデルを用いたTregの治療効果についての研究を実施する。野生型マウスあるいはCOL17ヒト化マウスの脾臓よりCD4+CD25+T細胞を抽出し、あらかじめ抗CD3/CD28抗体をコートしておいた24 well plate上でIL-2を含む培地で培養する。Day6-8で回収し、細胞数およびFoxp3発現を確認する。この方法でFoxp3陽性率が低い場合は、野生型マウスの代わりにFoxp3-GFPレポーターマウスを使用し、GFP陽性CD4+T細胞を抽出することで、より精製度の高いTregを得る。このPolyclonal activated TregをアクティブBPマウスモデルに投与し、血清中の抗ヒトCOL17IgG抗体価や皮疹の経時的変、血中および脾臓のTreg数の継時的変化などを行う。以上の実験で得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。皮膚科学前述の通り、アクティブBPマウスモデルの作成に必要なRagKO/COL17ヒト化マウスの繁殖に難渋したため、アクティブBPマウスモデルの解析が計画よりも遅れた。
フェルミ準位のコントロールによる燃料電池電極表面現象の改善

固体酸化物形燃料電池(SOFC)はクリーンで効率的なエネルギー変換が可能であるが、変換効率と耐久性向上によるコスト削減が必要である。本研究に於いて、SOFC用カソード電極の迅速な酸素取込み改善で性能理解と改善を試みた。モデル電極材料Sr(Ti,Fe)O3-xにLa(材料への電子供与性"ドナー"元素)を混入し、カソード電極の電子濃度増加が酸素表面交換率を向上するという仮説を検証した。実験より、本過程での電子発生量を示す「欠陥化学的モデル」を開発した。異なるLa濃度で緻密薄膜電極を作製し、濃度が効率に与えた影響を見る「光伝送緩和」等の新技術により、表面交換比率を究明した。化学機械的耐久性も調べた。