hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中山間地域における土地基盤整備の効果評価に関する計算学的研究

研究第1年度(平成7年度)はこのうち(1)(2)を徹底して進め、同時に次年度(3)(4)の作業に向けて集中的実証地区(岐阜県飛騨東部地区、奈良県大和高原地区、奈良県五条吉野地区、福井県大野地区、岡山県津山地区、広島県中部高原地区など)に概要調査を精力的に実施した。地域農業の効果の研究はほとんど国外に依拠していて、わが国の農業・農村の特殊性が踏まえられていないこと、土地基盤整備事業の効果の研究は農水省に偏っていて、その「効果」の範囲はきわめて狭いことがわかった。中山間地域は食料基地、定住地域、農村文化・環境・国土保全地域、農村景観・休養・教育地域として安定持続を図らねばならない。しかし、これを担保するのは適正な地域農業と適正な地域農家の存続であり、このため農家の農業私的便益の持続的満足と土地基盤の整備促進が絶対に欠かせない。そこで、本研究はこのような土地基盤整備の促進に向けてその基礎研究を以下の3課題のもと、理論的・実証的に進めようとした。(1)中山間地域の地域農業の全部効果の現代的評価方法の解明・開発(公共経済学・社会会計学に依拠して)、(2)中山間地域の土地基盤整備業の全部効果の現代的評価方法の解明・開発、(3)中山間地域の土地基盤整備事業投資の負担方法の再検討(公共経済学に依拠して)。本研究は5作業過程からなる。(1)地域農業の全部効果の評価方法の先行研究の整理(公共経済学・社会会計学的接近を含む)、(2)土地基盤整備事業の全部効果の評価方法の先行研究の整理、(3)中山間地域の地域農業の全部効果の評価方法の解明・開発(公共経済学・社会会計学的接近を重視して)、(4)中山間地域の土地基盤整備事業の全部効果の評価方法の解明・開発、(5)中山間地域の土地基盤整備事業投資の負担方法の再検討。第1年度(平成7年度)は(1)(2)を中心的に進め、同時に7実証地区に概要調査を実施して実証的予備的情報を得た。そこで第2年度(平成8年度)は(3)(4)に中心的に取組んだ。すなわち、2集中調査地区(岐阜県飛騨東部地区、福井県大野市南六呂師地区)で関係機関・関係住民に対して詳細調査を重ねて実施し、それ自体が本研究の核心である「土地基盤整備の全部効果の評価方法を体系」を表わすことにもなる「中山間地域の土地基盤整備の効果に関する住民意識調査票」をほぼ完成した。中山間地域は食糧基地、定住地域、農村文化・環境・国土保全地域、農村景観・休養・教育地域としてその安定存続を図らねばならない。しかし、これを担保するのは適正な地域農業と適性な地域農家の存続であり、このため農家の農業私的便益の持続的満足と土地基盤の整備促進が絶対に欠かせない。本研究はこのような土地基盤整備の促進に向けてその基盤研究を以下の3課題のもと理論的・実証的に進めた。(1)中山間地域の地域農業の全部効果の現代的評価方法の解明・開発(公共経済学・社会会計学に依拠して)、(2)中山間地域の土地基盤整備事業の全部効果の現代的評価方法の解明・開発、(3)中山間地域の土地基盤整備事業投資の負担方法の検討(公共経済学に依拠して)。(1)地域農業の全部効果の評価方法の先行研究の整理(公共経済学・社会会計学的接近を重視して)、(2)土地基盤整備事業の効果の評価方法の先行研究の整理、(3)中山間地域の地域農業の全部効果の評価方法の解明・開発(公共経済学・社会会計学を重視して)、(4)中山間地域の土地基盤整備事業の全部効果の評価方法の解明・開発、
扁桃組織リンパ球由来蛋白分解酵素の病巣感染症における病因的意義

蛋白分解酵素の中でもplasminnogen activator(PA)を中心とする線溶系酵素が病巣感染症の発症と症状経過に重大な修飾を行うものであると推察されていた。そこで、これらの推察を実体論的に示すために、扁桃炎モデルを実兎に作製し、扁桃構成細胞の中でも細胞性免疫機能に重要な役割を演じるリンパ球のPAの存在を明らかにした。さらにはヒト扁桃病巣感染症の扁桃リンパ球にはurokinase活性促進物質とそれの抑制物質の存在が、リンパ球培養実験から明らかにされた。このような背景から、もし扁桃リンパ球由来PAおよび線溶系酵素が病巣感染症の発症や経過に重要な意義をもつならば、扁桃誘発試験に際して循環血中のPA活性に変動がみられるものと予想した。誘発陽性群ではtissue type PA(t-PA)量の高値の持続がみられたのに反し、誘発陰性群ではt-PA量の減少あるいは正常化の傾向がみられた。一方、最近t-PAを抑制する物質としてplasminogen activitor inhibitor(PAI)の存在が血液学的研究から明らかにされてきている。そこで扁桃病巣感染症の線溶液系酵素の関与を論じる場合には、t-pA活性とPAI活性の両者の相関性を検討する必要性が現れた。そこで今回は、Biopool社製のSpectrolyse TM/fibnin kitを用いて扁桃誘発試験前後の循環血中のt-PA,PAI活性を測定した。その結果、病巣感染症を疑われた10例の慢性扁桃炎患者では、誘発試験陽性例ではt-PA活性の減少がみられた。さらにPAI活性の変動では、誘発前に15Iu/ml以上が4例であった。6例は誘発前に既に0Iu/m1であった。誘発試験陰性例の中には誘発後にt-PA活性が減少し、PAI活性が上昇している例がみられた。このようなt-PA、PAI変動は生理学的に説明可能な変動であるが、陽性例ではなんらかの原因により、t-PA、PAIの相関性に破綻をきたしているものと推察した。
漂流物を考慮した実用的な津波シミュレーションシステムの開発

本研究は漂流物を考慮した津波シミュレーションシステムの構築を目的とした。津波が遡上し街が呑み込まれる範囲を想定し、大規模な街モデルと漂流物の移動を対象としている。開発した解析システムはナビエ-ストークス方程式をSPH法(Smooth Particles Hydrodynamics)の手法で解くという構成になっている。最新の超並列計算技術(GPGPU)を導入したことによって、本来のCPU計算より10倍ほどの計算時間を短縮ことが確認できた。この手法により流体(津波)と個体(漂流物)を同時にシミュレーションすることが可能になり、流体しか考慮できない従来の津波解析より新たな被害を想定が想定し易くなる。開発した解析システムはナビエ-ストークス方程式をSPH法(Smooth Particles Hydrodynamics,粒子法の一種)の手法で解くという構成になっている。従来の津波シミュレーションに用いる計算手法(差分方や有限要素方)と比べて、流体(津波)と固体(漂流物)を表現する計算要素(粒子)の数は膨大のため、スーパーコンピュータークラスの計算機を用いた場合でも街規模のスケールを細部まで再現するシミュレーションは困難なことが分かった。但し、以下の活用方法は検討かのな範囲と思われる。街規模の計算は粗い解像度の粒子を用いて全体の津波の流れと大きい漂流物(家屋や船舶)を把握する。細部のエリアの検討が必要な場合、エリア全体の粗いシミュレーション結果を初期条件として対象をした小規模エリアを細かい解像度の粒子で計算を行う。この場合の漂流物対象物は車より小さいものを検討することが可能になる。本シミュレーションは高知県が半地下津波非難シェルターの地上構造物の形状を検討することにも活用でき、建物の形状は流れの速度に影響を及ぼすことが確認できた。丸みのある形状の建物の方は流れを回避する力が高いが、四角い形状より周辺の流れが速く、漂流物に衝突された場合に大きな衝撃力が発生することが分かった。本研究の初年度は基本津波シミュレーションシステムの構築を目的とした。津波が遡上し街が呑み込まれる範囲を想定した。大規模な街モデルと漂流物の移動を対象としている。開発した基本解析システムはNavier-Stokes方程式をSPH法(Smooth Particles Hydrodynamics,粒子法の一種)の手法で解くという構成になっている。最新のスパコン系計算技術に注目度が急上昇するGPU並列計算手法を導入し通常のCPU計算機より10倍ほどの計算時間を短縮ことが確認できた。初年度は本システムを利用し、仮想の小規模街モデル上に流体と漂流物を置き、津波の流れに伴う漂流物移動の挙動を検討した。津波高を5メートルから30メートルまで変動させ、漂流物を20トン船舶をはじめ小型ボート等で検討を行った。駐車場にとめあった複数の乗用車が津波に呑み込まれ、流れ着いた場所に留まって流れを変更することを想定し検討した。建物の形状は流れの速度に影響を及ぼすことが確認できた。ただし、丸みのある形状の建物の方は流れを回避する力が高いが、四角い形状より周辺の流れが速く、漂流物に衝突された場合に大きな衝撃力が発生することが分かった。計画通りに研究を進めている。初年度で行った検討解析を通じて、小規模での解析はGPUのメモリが限界に達したことが分かり、メモリ利用率を下げる工夫が大規模計算へのカギになると感じた。大規模計算は計算機ハードウェアとソフトウェアの限界が決めてと言うことが分かった。次年度の研究の推進方策は引き続き計画通りに行う予定である。(B-A)が600円程度であり、次年度に雑費として利用する予定である。
早期発症型歯周炎患者における骨代謝系遺伝子変異

歯周炎は遺伝的素因と環境要因が複雑に関与することによって発症する疾患である。なかでも早期発症型歯周炎はその家族歴等から何らかの遺伝的素因が関与していることが強く示唆されているが、その遺伝的素因は未だ不明である。早期発症型歯周炎における臨床症状の特徴である急速な歯槽骨吸収は、骨代謝系において骨形成と骨吸収のバランスが崩れ骨吸収に破綻しやすいという遺伝的素因の関連が強く疑われる。従って、骨代謝系の特徴を遺伝子レベルで明らかにすることは早期発症型歯周炎の病態解明に繋がる。骨代謝系の疾患のひとつである骨粗鬆症については発症ハイリスク者には骨形成に重要であるビタミンD3レセプター、エストロゲンレセプター遺伝子に変異が認められ、それらは現在、骨粗鬆症遺伝子診断のマーカーの一つとなっている。本研究では早期発症型歯周炎患者におけるビタミンD3レセプター、エストロゲンレセプター遺伝子変異と早期発症型歯周炎患者の臨床所見との相関を調べ、これらの遺伝子変異が早期発症型歯周炎の発症と進行における遺伝的素因であるかどうかを調べた。その結果、重度に骨吸収の進んだ早期発症型歯周炎患者の中にビタミンD3レセプター、エストロゲンレセプター遺伝子の特徴的な型を持つ者が存在することがわかった。これらの遺伝子多型はビタミンD3レセプター遺伝子ではエクソン2の翻訳開始点およびイントロン8に見られ、エストロゲンレセプター遺伝子ではイントロン1とエクソン2の間に見られた。これらのことから早期発症型歯周炎患者の中には骨代謝に関わるホルモンに対するレセプターであるビタミンD3レセプター、エストロゲンレセプター遺伝子に特徴的型を持ち、この遺伝子変異が早期発症型歯周炎の発症と進行における遺伝的素因の一つである可能性が示唆された。
霊長類視床痛モデルによる難治性疼痛の脳内機序解明と新たな治療法の開発

脳卒中後疼痛のメカニズム解明のため、動物視床痛モデル作成を試みたが、結果としてはラット、霊長類ともに作成ができなかった。脳卒中後疼痛患者の視床、被殻病変でのMRIのDiffusion tensor imageでは患側の描出率と経頭蓋磁気刺激療法による一次運動野刺激による除痛率との相関を検討したところ、運動線維および感覚線維の両者の描出率と相関が得られたが、感覚線維の描出率とより相関が得られた。この結果は病巣の主座が被殻であっても感覚中継核である視床腹外側核およびその線維連絡の保持が経頭蓋磁気刺激による一次運動野刺激による除痛効果とよく相関することが示されたと解釈された脳卒中後疼痛のメカニズム解明のため、動物視床痛モデル作成を試みたが、結果としてはラット、霊長類ともに作成ができなかった。この結果は病巣の主座が被殻であっても感覚中継核である視床腹外側核およびその線維連絡の保持が経頭蓋磁気刺激による一次運動野刺激による除痛効果とよく相関することが示されたと解釈されたアカゲザル視床に自己血注入する前段階の研究を行った。(1)視床痛の患者における運動線維と感覚線維をMRIのDiffusion tensor imageで描出し、どこで線維連絡が途切れるのかを評価した。比較的、運動機能、感覚機能の保たれた患者を選んだこともあり、71%の患者で神経線維が描出された。ヒトでは視床に限らず被核出血でも主に下肢痛になる患者がいることが知られており、これらの患者では視床に出血が及んでいないが、線維の一部が途切れていて、疼痛の原因となるようである。本研究では、ヒトの視床出血例のみの実験を行うこととして、視床の出血病巣の部位と大きさの評価を行った。出血のサイズとしては小型のものが多く、大型の出血では視床痛にならない。部位としては中心が腹外側核のもの、内包を中心として、腹外側核に及ぶタイプが多く。内側核に中心を持つようなタイプは非常に少ない。(2)アカゲザルの脳マップと上記所見を比較して、注入部位と注入量を検討しているが、注入部位としては視床腹外側核を想定している。注入量としては、少量注入を繰り返していくしかないと思われる。しかし、その少量とはいえ、どれだけを注入するかは難しい問題であるため、下記の予備実験を施行した。(3)予備実験として、ラットを用いて、視床出血モデル実験作成を行った。コラゲナーゼ(200-50U/ml)を1.0-3.0μl、定位的に注入を行い、数日後に還流固定による処分を行い、脳の連続切片を作成して、出血病巣のサイズ、広がりを検討した。しかし、現在のところ、モデルとして、適当な注入コラゲナーゼの濃度、注入量を正確に決定できなかった。(1)20例の視床または被殻病変の中枢性脳卒中後疼痛患者において運動線維と感覚線維をMRIのDiffusion tensor imageで描出して、線維の描出率を健常側に対する患側の比で表現した。症例によってはまったく描出できないこともあった。患側の描出率と経頭蓋磁気刺激療法による一次運動野刺激による除痛率との相関を検討したところ、運動線維および感覚線維の両者の描出率と相関が得られたが、感覚線維の描出率とより相関が得られた(Goto T, Saitoh Yet al, Pain,2008)。この結果は病巣の主座が被殻であっても感覚中継核である視床腹外側核およびその線維連絡の保持が経頭蓋磁気刺激による一次運動野刺激による除痛効果とよく相関することが示されたことになる。(3)予備実験として、ラットを用いて、視床出血モデルの作成を行った。コラゲナーゼ(200-50U/m1)を1.0-3.0・1、定位的に注入を行い、数日後に還流固定による処分を行い、脳の連続切片を作成して、出血病巣のサイズ、広がりを検討した。ラットでは病巣を作成することができても、痛み行動を評価することは困難であることが示唆された。
婦人科癌の抗癌剤耐性における細胞表面ペプチダーゼの機能解析と臨床応用

子宮体癌の術後補助療法として化学療法が広く行われるが、その適応については一定でない。今回の研究で我々はペプチダーゼの中でもP-LAP/IRAPに着目して、その発現による子宮体癌化学療法の個別化と抗癌剤耐性作用のメカニズムについて検討した。これまでの研究においてP-LAP/IRAPは抗癌剤によるミトコンドリアを介するアポトーシスを抑制し抗癌剤耐性に関与することを示した。また、さらなる検討によってP-LAP/IRAP発現によってグルコースの取り込みが増加し、抗アポトーシスに働くことを証明した。さらに、我々はペプチダーゼの中でP-LAP/IRAPに相同性の高い、Aminopeptidase N(APN/CD13)に着目し、APN/CD13の発現と卵巣癌細胞のタキソール感受性との関連について検討したところ、APN/CD13発現とタキソールのIC50は相関を示し、APN/CD13がタキソール耐性に関与することが示唆された。そこで、APN/CD13阻害剤のベスタチン、APN/CD13に対するsiRNAとタキソールの併用によってin vitroにおける卵巣癌細胞株ES-2のタキソール感受性増強とアポトーシス促進が確認された。さらに、ヌードマウスを用いた、in vivoの検討においてベスタチン、APN/CD13に対するsiRNAをタキソールと併用し、腹腔内投与すると、卵巣癌細胞株ES-2の腹膜播腫抑制効果を見出した。今回の研究ではアミノペプチダーゼの中でもP-LAP/IRAPに着目して、その発現による子宮体癌化学療法の個別化と抗癌剤耐性作用のメカニズムについて検討した。1)インフォームドコンセント後検体提供を受けた術後評価可能病変を有するIII、IV期子宮体癌18例のP-LAP/IRAPを免疫組織染色し、発現強度と抗癌剤臨床効果との関係を検討した。2)子宮体癌細胞株にP-LAP/IRAPを遺伝子導入し、抗癌剤感受性の変化を親株と比較した。P-LAP/IRAP発現をsiRNAにて抑制し感受性の変化を観察した。3)P-LAP/IRAP遺伝子導入後抗癌剤によるアポトーシスの変化を観察し、アポトーシス関連蛋白の発現を検討した。結果は、1)18例中1例が陰性、6例が弱陽性、11例が強陽性であった。陰性、弱陽性7例の奏効率は100%であったのに対して、強陽性11例の奏効率は18.2%でありP-LAP/IRAP発現が抗癌剤耐性に関与することが示唆された。2)P-LAP/IRAP遺伝子導入により、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセルに対するIC50値は親株の2.0倍、2.5倍、1.5倍に増加した。そこで、P-LAP/IRAP発現をsiRNAにて抑制するとIC50値はそれぞれ45%、50%、40%減少した。3)P-LAP/IRAP強制発現株は抗癌剤によるアポトーシスが著明に抑制され、Caspaseの発現及びPARPの分解が完全に抑制され、生存シグナル蛋白の発現は亢進した。今回の研究成果から、P-LAP/IRAPは抗癌剤によるアポトーシスを抑制し耐性に関与しており、子宮体癌に対する化学療法の個別化に応用可能であり分子標的治療のターゲットになり得ることが示唆された。旨これまでの研究においてP-LAP/IRAPは抗癌剤によるミトコンドリアを介するアポトーシスを抑制することにより耐性に関与することを示した。そこでさらに、P-LAP/IRAPによるアポトーシス抑制機序の解明を目指して研究を行った。P-LAP/IRAP遺伝子導入細胞株とmock導入株におけるGlucose

transporter4(GLUT4)の発現を蛋白レベルで検討したところ、P-LAP/IRAP遺伝子導入細胞株で有意に発現が亢進していた。次に、インスリン刺激による細胞増殖能を検討したところ、P-LAP/IRAP遺伝子導入細胞株では有意に72時間後の増殖能が亢進しており、さらに、細胞内へのグルコースの取り込みを検討したところ同様に有意に取り込みの増加を認めた。インスリン刺激による細胞内シグナル伝達系の検討を行った結果、P-LAP/IRAP遺伝子導入細胞株はmock導入株に比べPI3KおよびAKTのリン酸化が亢進していた。以上の結果からP-LAP/IRAPはGLUT4の発現の亢進を介して細胞内へのグルコースの取り込み亢進に関与しており、さらに細胞増殖能亢進、抗アポトーシスに働くことが示された。この結果はP-LAP/IRAPによる抗癌剤耐性機序の解明につながるものと考えられた。子宮体癌の術後補助療法として化学療法が広く行われるが、その適応については一定でない。今回の研究で我々はペプチダーゼの中でもP-LAP/IRAPに着目して、その発現による子宮体癌化学療法の個別化と抗癌剤耐性作用のメカニズムについて検討した。これまでの研究においてP-LAP/IRAPは抗癌剤によるミトコンドリアを介するアポトーシスを抑制し抗癌剤耐性に関与することを示した。また、さらなる検討によってP-LAP/IRAP発現によってグルコースの取り込みが増加し、抗アポトーシスに働くことを証明した。さらに、我々はペプチダーゼの中でP-LAP/IRAPに相同性の高い、Aminopeptidase N (APN/CD13)に着目し、APN/CD13の発現と卵巣癌細胞のタキソール感受性との関連について検討したところ、APN/CD13発現とタキソールのIC50は相関を示し、APN/CD13がタキソール耐性に関与することが示唆された。そこで、APN/CD13阻害剤のベスタチン、APN/CD13に対するsiRNAとタキソールの併用によってin vitroにおける卵巣癌細胞株ES-2のタキソール感受性増強とアポトーシス促進が確認された。さらに、ヌードマウスを用いた、in vivoの検討においてベスタチン、APN/CD13に対するsiRNAをタキソールと併用し、腹腔内投与すると、卵巣癌細胞株ES-2の腹膜播腫抑制効果を見出した。以上の結果からP-LAP/IRAP、APN/CD13は婦人科癌化学療法における、抗癌剤耐性の分子標的治療のターゲットになり得ることが示唆された。
発達脳における局所神経回路成熟に伴うシナプス除去のメカニズム解析

私は、これまで成獣孤束核において、ニューロンの形態とシナプス結合様式の明瞭な分化傾向の存在を明らかにしてきた。このニューロン結合様式の分化は、生後1週を境界に急激に完成されることを最近見出した。そこで、グルタミン酸性およびGABA性シナプス結合様式の変化の実態を機能形態解析することを研究の目的とした。このシナプス結合様式の生後変化は特定のニューロンにおいてグルタミン酸性シナプスおよびGABA性シナプスの形成と消失が起こっていることを示唆しており、シナプス前要素側での軸索側枝の形成および退縮、シナプス後要素側でのグルタミン酸受容体およびGABA受容体のサブユニット構成変化等の可能性を調べた。これまで特定のニューロンにおいて生後1週を境にGABA性シナプス活動が消失することを示してきたが、このGABA性シナプス応答はその特異的阻害剤実験からA型GABAタイプの受容体を介することを明らかとした。この現象の分子的機序として、A型GABA受容体のサブユニット構成のシナプス後要素ニューロン細胞膜上の発現変化について、in situ hybridization組織化学法と免疫電顕法の2つの手法を用いて検討した。また、GABAシナプス後電流の薬理学的特性の生後変化についても検討した。A型GABA受容体は、主にα1-6、β1-3、γ1-3のサブユニットの内から脳内において部位特異的に数個のサブユニット構成でチャネルを形成している。このうち、γサブユニットはこれらのチャネルをシナプス後膜に繋ぎ止めておくのに重要な役割を果たしていることが報告されている。そこで、γサブユニットに注目し、生直後の特定のニューロンにおいてこれらの遺伝子の発現変化が起こっているのかどうかを、in situ hybridization組織化学法によって確認した。その結果、小型ニューロンにおいて、生後6日を境に、GABA性シナプス活動の特異的消失に伴って、γ1サブユニットの発現が完全に停止することがわかった。また軸索・細胞体シナプスの劇的減少がこの時期に一致して確認された。GABA電流のベンソチアゼピン感受性がこの時期を境に大きく変化することもわかった。

A型GABA受容体は、主にα1-6、β1-3、γ1-3のサブユニットの内から脳内において部位特異的に数個のサブユニット構成でチャネルを形成している。このうち、γサブユニットはこれらのチャネルをシナプス後膜に繋ぎ止めておくのに重要な役割を果たしていることが報告されている。そこで、γサブユニットに注目し、生直後の特定のニューロンにおいてこれらの遺伝子の発現変化が起こっているのかどうかを、in situ hybridization組織化学法によって確認した。その結果、小型ニューロンにおいて、生後6日を境に、GABA性シナプス活動の特異的消失に伴って、γ1サブユニットの発現が完全に停止することがわかった。また軸索・細胞体シナプスの劇的減少がこの時期に一致して確認された。GABA電流のベンゾヂアゼピン感受性がこの時期を境に大きく変化することもわかった。私は、これまで成獣孤束核において、ニューロンの形態とシナプス結合様式の明瞭な分化傾向の存在を明らかにしてきた。このニューロン結合様式の分化は、生後1週を境界に急激に完成されることを最近見出した。そこで、グルタミン酸性およびGABA性シナプス結合様式の変化の実態を機能形態解析することを研究の目的とした。このシナプス結合様式の生後変化は特定のニューロンにおいてグルタミン酸性シナプスおよびGABA性シナプスの形成と消失が起こっていることを示唆しており、シナプス前要素側での軸索側枝の形成および退縮、シナプス後要素側でのグルタミン酸受容体およびGABA受容体のサブユニット構成変化等の可能性を調べた。これまで特定のニューロンにおいて生後1週を境にGABA性シナプス活動が消失することを示してきたが、このGABA性シナプズ応答はその特異的阻害剤実験からA型GABAタイプの受容体を介することを明らかとした。この現象の分子的機序として、A型GABA受容体のサブユニット構成のシナプス後要素ニューロン細胞膜上の発現変化について、in situ hybridization組織化学法と免疫電顕法の2つの手法を用いて検討した。また、GABAシナプス後電流の薬理学的特性の生後変化についても検討した。
半導体ナノ粒子の化学調製法の開発と光誘起エレクトロオプティクス特性の研究

Nouneh氏の来日が9月であったため、本年度の研究期間は7ヶ月と短期間であったが、重点的に研究を遂行した。まず、ITO基板に金属または半導体ナノ粒子を固定する化学調製法として、これまで本研究室で行ってきた種核成長法について、その習得から始め、種々の改良法について検討し、固定する金属ナノ粒子の修飾密度や大きさの制御を可能にした。具体的には、銀ナノ粒子に関しては、核となるナノ粒子を基板に固定する方法として新しくin situ還元法を適用して、成長時間の制御によって密度制御を可能にした。また、金ナノ粒子に関しては核となるナノ粒子の固定化を繰り返し行うことにより、大きさの揃った金ナノ粒子の高密度修飾表面が作成できることを明らかにした。これらの単一金属ナノ粒子に関する成果は、技術取得過程で得られた副次的なものであるが、目的である半導体ナノ粒子の研究にこの方法を発展させる過程として、二種類の金属イオンを共存させ構造成長させる方法についても検討した。その結果、金・銀イオンの共存系やニッケル・銀イオンの共存系において、単一金属イオンの場合に比べて多くのナノ粒子がITO基板表面に固定できることがわかった。この現象に関しては、その原理や応用に関してさらに検討を進めている。さらに、光誘起反応への応用に関する検討の端緒として、YAGレーザーを照射した場合のナノ粒子の構造変化についても検討をはじめた。その結果、単一パルスのレーザー照射において、金属ナノ粒子のナノ構造の変化や照射領域での色調変化が観測された。
シミュレーション型動画像解析のためのモンテカルロモデリング法の構築

計算機シミュレーションは,計算機内で実世界の現象を模擬する技術であり,とくにシミュレーションに確率的な要素を組み込んで,試行のたびに異なる結果を出力するようにしたものをモンテカルロシミュレーションと呼ぶ.本研究では,この方法を活用して,実世界を映した動画像とそれを模擬するシミュレーションモデルを比較する手法について研究し,物体トラッキング,カメラ運動の推定,および人の行動解析などに応用した.計算機シミュレーションは,計算機内で実世界の現象を模擬する技術であり,とくにシミュレーションに確率的な要素を組み込んで,試行のたびに異なる結果を出力するようにしたものをモンテカルロシミュレーションと呼ぶ.本研究では,この方法を活用して,実世界を映した動画像とそれを模擬するシミュレーションモデルを比較する手法について研究し,物体トラッキング,カメラ運動の推定,および人の行動解析などに応用した.シミュレーション型動画像解析のためのモンテカルロモデリング法の基礎技術の一つとして,動画像中の物体の挙動を追跡するための統計的運動モデルを提案し,関連するソフトウェア群を開発・実装した.このモデルは,画像中の局所的な特徴量から局所的な運動を推定し,それに基づいて大局的な運動推定を行うものである.局所的な画像特徴量を利用することで,統計的運動モデルを適応的に変化させることができる.この運動モデルをシミュレーション型時系列フィルタリングの手法に基づいてアルゴリズムを構築した.広く利用されている従来モデルのいくつかと比較検証し,高精度かつ追従性が高いことを実証した.さらに,局所的な画像特徴量の計算コストは高くないため,アルゴリズム全体としても高速に動作する利点もある.標準的なパーソナルコンピュータでの処理時間は,100×100画素程度の大きさの物体に対して,15ミリ秒/フレーム程度であり,ビデオレート以内の処理を達成している.この運動モデルは,動画像中の物体位置の時間的変化を記述する.本研究課題では,このモデルにさらにさまざまなモデルを追加していき,モンテカルロモデリング法を発展させていく.すなわち,本年度の研究成果は,次年度以降の研究を展開していくうえでの基盤となるものである.以上を要するに,本研究の基盤となる手法を提案し,その検証を行っていることから当初の目標を十分に達成している.シミュレーション型動画像解析のためのシミュレーションモデルを実動画像から推定する手法について3つの個別課題を取り上げて研究を実施した.最初の課題は,低解像度画像から高解像度画像を復元する超解像画像処理である.まず定式化のために階層ベイズモデルを導入し,さらに事前分布と尤度関数のバランスを取る重みをベイズ情報量基準に基づいて自動決定する方法を提案した.さらに,このベイズ情報量基準の計算で現れる高次元の複雑な積分を2次近似で計算する方法も導入している.これにより,従来法の多くが重みを経験的に手動で決めているのに対し,データから客観的にパラメータを決めることができるようになった.次の課題は,動画像での物体追跡である.すでに多くの手法が存在しているが,特に物体の特徴点の動きを支配する超パラメータを入れた階層ベイズモデルを導入した点に特徴がある.最後の課題として,動画像計測からの歩行者の運動予測を取り上げた.これは,動画像で複数歩行者の位置を検出・追跡しながら,彼らが将来どのように動くかを予測する技術であり,行動認識やインタラクションなどへの応用が考えられる.このために,まず,歩行者の運動を模擬する数値シミュレーションを計算機内に構築した.そして,このシミュレーションに基づくモンテカルロサンプルを多数生成し,それらを動画像での計測結果と照らし合わせて,現実世界をよく説明するシミュレーションサンプルだけを残すようにする.これにより,計算機内の仮想世界と現実世界を融合することができるようになる.前年度までに得られた成果として,階層ベイズに基づくモデリング法および数値シミュレーションと画像計測の融合技術の提案とその基本アルゴリズムの実装があげられる.今年度では,これらの技術をより実用的なものにするために高速化・大規模化および実データによる検証を実施した.まず,階層ベイズモデルの超パラメータ推定に現れる大規模な連立線形方程式を解くために,勾配探索型のアルゴリズムを導入し,従来よりも変数の数が大きな連立線形方程式を解けるようになり,さらに高速化も達成している.次に,数値シミュレーションと画像計測の融合技術の高速化として,動的に変化しないと見なせる静的なパラメータをオフラインで事前に訓練動画像データから推定しておき,オンライン推定からそれらのパラメータを外す戦略を採用した.さらに,この方法を歩行者間に働く相互作用のオンライン推定へ応用し,実動画像データにおいて検証を行った.実験検証では,ある歩行者の行動が他の歩行者からどのように影響を受けるかを検証し,オンライン推定した相互作用の力係数から,歩行者行動がいくつかの行動パターンに分類できることを示した.最後に,新たな研究課題として,風景を撮影した手持ちカメラ動画像から,そのカメラ運動をオンラインで推定する逐次モンテカルロアルゴリズムを提案した.複数のカメラ運動モデルを用意しておき,それらのモデル間を遷移する離散的なラベルを導入し,逐次モンテカルロ法でモデル間を確率的に遷移させながら,運動パラメータをオンライン推定できるようになった.
細胞骨格の動態変化とニュ-ロンの老化・細胞死ー合成,輸送,分解バランスの乱れー

ラットの脊髄後根神経細胞座骨神経知覚繊維及び脊髄前角細胞運動繊維の実験系を用いて,軸索内細胞骨格蛋白の輸送と重合・脱重合動態の解析をこない。以下のような結果を得た。1)軸索内の細胞骨格蛋白は全て遅い軸索内輸送によって細胞体から供給され,軸索それ自身によって合成されることはない。その輸送速度は週齢が進むに従って遅くなる。2)軸索内の細胞骨格蛋白は従来考えられてきたような硬い構造物ではなく,常に重合・脱重合をくり返しているダイナミツクな状態にあり,軸索の生理的変化には素早く対応した変化をしめす。3)軸索内の細胞骨格蛋白の重合型には,各種の脱重合剤に対して抵抗性をしめす安定重合型と,これらに感受性をもつダイナミック型が区別され,これら相互間及び脱重合型であるそれらのサブユニットとの間には動的な平衡関係が成立している。4)細胞骨格蛋白の軸索内輸送はこれ迄考えられてきたような重合した状態で運ばれるのではなく,脱重合した状態が輸送型と推定される。5)軸索が傷害を受けるとその遠位側は変性をおこすが,近位側は直ちにダイナミック型の割合を増加させて,修復を開始する。6)週齢が進むに従って安定重合型の割合が増加し,ダイナミツク型が減少する。これに対応して輸送速度の減少が見られる。しかしある週齢をすぎた老齢ラットでは重合・脱重合変換,或はダイナミック型と安定重合型との変換がうまく機能せず,あたかも軸索の起始部でせきとめられたような細胞骨格蛋白の通過傷害が認められる。7)細胞骨格蛋白の軸索内輸送に影響を与える薬物としてコルヒチン,β,β^x-イミノジプロピオニトリル(IDPN),タクソ-ル,2,5-ヘキサンジオン,二硫化炭素等が見出された。
肺癌の喀痰細胞診における分子疫学的手技の導入

本研究は肺癌喀痰細胞診に対して分子疫学的手技を導入し、喀痰細胞中の癌遺伝子、癌抑制遺伝子の検索を行なったものである。今回は、山形市の喀痰細胞診において判定がC、D、Eであった喀痰を対象として検討を行った。喀痰細胞診でこれらの判定を受ける検体は少数であり、本研究においても回収し、検索し得た検体は12例にとどまった。また、癌遺伝子K-rasの突然変異はその部位が一定しているため、喀痰細胞における突然変異の検索は可能であったが、癌抑制遺伝子p53はその変異が広範な領域にわたっており、喀痰細胞における変異の検出は困難と断定し、今回の研究においてはK-rasのみを対象とした。上記の判定を受けた喀痰からDNAを抽出したのち、PCRにてK-ras領域を増幅させた。このPCR産物をベクターに挿入し、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、癌遺伝子K-rasコドン12の突然変異を検出した。今回得られた12例の検体においては、K-rasの突然変異は検出されなかった。このことから、喀痰細胞においてはK-rasの突然変異は存在しても低率で、喀痰細胞診に導入するには、更なる検討が必要であると考えられた。
イノシトールポリリン酸によるニューロトランスミッター放出の制御とその分子機構

シナプトタグミンのC2Bドメインはイノシトールポリリン酸(IP)結合部位である。また、IPをイカ巨大シナプス前部に注入するとシナプス連絡が完全に抑制される。これらの現象から我々はシナプトタグミンが神経伝達物質の放出に直接関わる機能分子であり、IPによるシナプス連絡の抑制における標的分子であると考察した。平成7年度はこの推論を証明するために、C2Bドメインに対する特異的なポリクローナル抗体(この抗体はIPの結合を阻害する)を作製し、これをイカ巨大シナプス前部に注入した場合にいかなる影響を与えるか調べた。その結果、IPとの同時注入ではIPによるシナプス連絡の抑制を完全に解除することが認められた。さらに、抗体のみを注入した後、シナプス前部の高頻度刺激を行なうとシナプス応答の急速な低下が見られ、電顕観察の結果、シナプス小胞の激減が認められた。これらの結果はシナプトタグミンがIPによるシナプス連絡抑制の標的分子であることを証明するとともに、C2Bドメインが神経伝達物質の放出のみならず、放出後のシナプス小胞のエンドサイトーシスにも関与していることを強く示唆している。平成8年度はイカ巨大シナプスを用いて得られたこれらの研究結果が哺乳類系の細胞を用いた場合でも観察されるか否かについての検討を加えた。材料として、ラット上頚部交感神経節細胞とウシクロマフィン細胞の初代培養系を用いて、電気生理学的観察及びカテコールアミンの遊離で調べた。その結果、いずれの場合もIPによるシナプス連絡及び伝達物質遊離の抑制効果とC2Bドメインに対する抗体による抑制の解除が認められた。以上の様に哺乳類系の細胞を用いた場合でも同様の結果が得られたことから、IPは種を越えた普遍的なメッセンジャーとして、神経終末においてシナプトタグミンの機能を調節していることが強く示唆された。シナプトタグミンのC2Bドメインはイノシトールポリリン酸結合部位である。また,イノシトールポリリン酸をイカ巨大シナプス前部に注入するとシナプス連絡が完全に抑制される。これらの現象から我々はシナプトタグミンが神経伝達物質の放出に直接関わる機能分子であり,また,イノシトールポリリン酸によるシナプス連絡の抑制における標的分子であると推論した。平成7年度はこの推論を証明すべくC2Bドメインに対する特異的なポリクローナル抗体(この抗体はイノシトールポリリン酸の結合を阻害する)を作成し,これをイカ巨大シナプス前部に注入した場合にシナプス連絡にいかなる影響を与えるか調べた。その結果,抗体のみの注入ではシナプス連絡に全く影響を与えなかったが,イノシトールポリリン酸を同時注入した場合にはイノシトールポリリン酸によるシナプス連絡の抑制を完全に解除した。さらに,抗体のみを注入した後,シナプス前部の高頻度刺激を行うとシナプス応答の急速な低下が観察された。これらの結果はシナプトタグミンがイノシトールポリリン酸の標的分子であることを証明するとともに,C2Bドメインが神経伝達物質の放出のみならず,放出後のシナプス小胞のエンドサイトーシスにも関与していることを強く示唆するものである。イノシトールポリリン酸によるシナプス連絡の抑制にシナプトタグミンが直接関与しているか否かは今後の研究を進める過程で最重要課題であったが,イカ巨大シナプスを用いた系では,ほぼ予測通りにシナプトタグミンがイノシトールポリリン酸による抑制の標的分子であると結論づけられた。今後は,哺乳類系の初代培養細胞においても,同様の現象が観察されるか調べる予定である。シナプトタグミンのC2Bドメインはイノシトールポリリン酸(IP)結合部位でありIPが結合することにより、シナプス連絡のブロックが生ずることをイカ巨大シナプスを用いた研究から明らかにした。また、電気生理学的結果より、このブロックがシナプス小胞の前シナプス膜への融合阻害にあることも明らかにした。

即ち融合過程にシナプトタグミンが直接関与する可能性を強く示している。さらに、C2Bドメインに対する特異抗体をイカ巨大シナプス前部に注入し、高頻度刺激を行なうと、シナプス小胞が激減するところから、C2Bドメインがシナプス小胞のエンドサイトーシスにも深く関わることを明らかにした。今年度はイカ巨大シナプスを用いて得られた研究結果が哺乳類系の細胞を用いた場合でも観察されるか否かについての検討を加えた。まず、ラットの上頚部交感神経節細胞の初代培養系を用いて同様の実験を行なった。その結果、IPあるいはC2Bドメインに対する抗体の注入により、アセチルコリン遊離がブロックされることを明らかにした。またIPによるブロックはC2Bドメインに対する抗体をあらかじめ注入することにより解除された。つぎに、ジキトニン処理により透過性を高めたウシクロマフィン細胞の初代培養系を用いて、外液にIPあるいはC2Bドメインに対する抗体を加えることにより、カテコールアミンの遊離にいかなる影響を及ぼすか調べた。その結果IPが分泌小胞の膜への融合をブロックすることにより、カテコールアミンの放出を抑制していることを明らかにした。さらに、カテコールアミンの放出の抑制はC2Bドメインに対する抗体の添加により解除された。以上の様に哺乳類系の細胞を用いた場合でも同様の結果が得られたことから、IPは種を越えた普遍的なメッセンジャーとして、神経終末においてシナプトタグミンの機能を調節していることが強く示唆される。
高安定紫外波長変換をめざした水晶結晶によるツイン制御光素子の提案

13年度には、12年度に導入した応力印加装置の改良を行い、外部ファンクションジェネレータによる電気的制御を可能にした。12年度では貫通するツインの大きさが1mm角でありこれをより精密に制御するためにパルス的応力印加を可能にした。この結果印加応力の立ち上がり時間は300ミリ秒まで短縮され、応力印加時間の短縮が可能になった。またツイン生成の際に高い核成長密度を得るために、最高温度400°Cであった装置を改良し、相転移点573°Cを上回る600°Cまでの加熱を可能にした。またこれに伴って応力印加用の高温ブロックの材質を見直し、600°Cにおいても十分な剛性と安定性を有し、研磨の可能な超硬合金を見いだした。これを用いて応力印加用の高温ブロックを改良した。また13年度には、ドライエッチング技術を用いて水晶基板を掘り込み、選択的に応力を印加する方法を採用した。反応性イオンエッチングにより周期2μm、高さ1.3μmの掘り込み構造を作製することに成功している。またこの構造において周期ツイン作製のための応力分布計算も行った。周期ツインのパターニングには応力の空間分布を制御する必要があり、十分な空間変調を得るために有限要素法を用いた計算機シュミレーションが有効であった。シュミレーション結果をもとに適切な水晶基板のエッチング深さ、エッチング部の周期に対する比、応力印加装置の周期溝の形状、など、実験による最適条件の探索を行っていく。他方シンクロトロン放射光を利用して水晶基板の深紫外光吸収特性も評価し、基板依存性も明らかにした。12年度には、ツイン制御のための応力印加装置の立ち上げ、および基礎データ取得を行った。応力によるツイン生成にはツイン間で符号の異なる弾性コンプライアンスS_<1123>を用い、応力下ではツイン間で熱力学的二次の弾性エネルギーが異なることを利用した。すなわち二次の弾性エネルギーがツイン生成の臨界エネルギー(ΔGc)を越えるとツインが生成する。ツイン生成に必要な臨界応力σcは基板方位に依存するがΔGcは依存しないため、ΔGcを測定することで任意方位におけるσc(θ,φ)を求めることができた(250-400°C)。ΔGcは温度に著しく依存しσcはα-β転移点(573°C)に近づくに連れ0に近づく。この関数をθ=60゚の基板方位を用いて測定し、二次相転移の基本式を用いてフィッティングすることで、ΔGcの温度依存性ΔGc(T)が求められた。これより各温度において任意基板方位における臨界応力が計算できた。今後波長変換素子に有利な基板方位にて、ツイン形成の実験を行っていく予定である。12年度には周期ツイン作成のための基板構造も検討も行った。周期ツインのパターニングには応力の空間分布もしくはツインの核成長領域を制御する必要があり、これにはフォトリソグラフィ技術を利用して基板を加工する方法、印加装置に周期構造をもたせる方法が考えられる。今年度はウェットエッチング技術を用いて水晶基板を掘り込み、選択的に効力を印加する方法を採用した。これにより1mm角の領域に選択的にツインを形成することに成功し、厚さ0.33mmの基板を貫通するツインが得られた。またパターニングに適切な応力分布を得るために、有限要素法を用いた応力分布のシミュレーターも検討した。これにより来年度は適切な水晶基板のエッチング深さ、エッチング部の周期に対する比、応力印加装置の周期溝の形状,などの実験的検討を行う。
有機超高スピン分子及び有機超常磁性体のCW及びパルスFT-ESRによる研究

我々のグループはπ共役系をもつ有機分子のトポロジー的対称性に着眼し、相互のスピン相関をもつ平行電子スピンの集合系(有機高スピン分子)を高分子化・高次元化・集積化するアプローチにより有機磁性体実現を最終目的として研究を進めてきた。この発想を用いた高分子化の研究では、すでに分子内に12個の平行電子スピンを有する二次元型の有機磁性体モデル分子ヘキサキスカルベンオリゴマー(スピン13重項)の合成・ESR検出に成功した。現在、ヘキサキスカルベンオリゴマー(S=6)よりもスピン多重度の大きい有機分子の合成・検出を目指し研究を進めている。当面の目標としているドデカキスカルベンオリゴマー(S=12)のジアゾ前駆体の合成は目下最終段階に入りつつあるが、なお単離上の困難除去に時間を要する見通しである。その他、有機超高スピンオリゴマー・有機超常磁性体を検出するための新しい手段として、フーリエ変換(FT)パルスESRを利用した方法論の確率を目指している。この方法は、測定系のスピン量子数(S)とスピン磁気量子数(M_S)に依存する過渡的量子スピン減衰運動をFTパルスESRにより検出するものである。この方法を利用すれば複数の常磁性種によりなる系から目的とする常磁性種を選択的に検出することが時間領域において可能となる。本研究では、科学的に安定な系(Mn^<2+>,DPPH)をモデル系としてとりあげ、この方法論が様々なスピン多重度を持った常磁性種の混在する系の中から目的とする成分だけを検出することが可能なことを明らかとした。今後、この方法論を零磁場分裂常数の大小vs.励起パルスマイクロ波の強度の関係を厳密に解く方法論に拡張して、本来の目的分子である二次元型有機強磁性体モデル分子であるドデカキスカルベンオリゴマー等の分子の検出に適用する予定である。
信頼と意図の意味空間における協調行動の発現

本研究は,人間の腕とロボット(以下H/R)が共存するシステムにおいて,H/R相互の動作の中から協調という意味に値する行動を発現させることを目的として,平成8年から2年間の計画で発足した.協調行動の実現性は,H/Rが互いに接近あるいは接触した局面において,ロボットが人間の教示意図をどの程度理解できるかに大きく依存しており,もし意図が理解できなければ,協調の意味が薄れて人間は不安全な状況に陥ることになる.そこで,本研究ではまず,ロボットが,人間の「安全性」をいかに確保しつつその「意図性」をどの程度理解できるかを評価するために,H/R相対運動パラメータ空間に「意味空間」を定める提案を行った.すなわち,意味空間は,安全性を定量化する「安全部分空間」と人間の「意図性」を定量的に表現するための「意図部分空間」で構成されるものと考えた.研究初年度は,H/R間の相対距離・相対速度を規範とする安全部分空間の構築を行い,H/R相互の不安全な干渉を回避するためにこの部分空間のパラメータに基づいてロボットの速度制御を行う戦略を示した.実験では,人間の前腕とロボット第2リンクの動きをモニタし,提案戦略に基づきロボットがH/Rの相対運動により加減速したときに,人間が恐怖心を覚えるか否かを多面的に調べた.その結果,従来,恐怖心を覚えるとして報告されてきた0.6m/sの速度でロボットが定型動作を行っている状況にあっても,自分に当たらないと分かると,やがて被験者は慣れて恐怖感を覚えなくなることが心理実験により判明した.そこで,ロボットが当たる可能性もあるとする状況に被験者が立ったときの恐怖感を覚える最低速度は0.27m/sに減少した.また,予測される衝突部位で恐怖の程度が瞬時的に決定されることなどの傾向が明らかになり,これらを評価できる本システムの有効性が認められた.本研究は,人間の腕とロボット(以下H/R)が共存するシステムにおいて,H/R相互の動作の中から協調という意味に値する行動を発現させることを目的として,平成8年から2年間の計画で発足した.協調行動の実現性は,H/Rが互いに接近あるいは接触した局面において,ロボットが人間の教示意図をどの程度理解できるかに大きく依存しており,もし意図が理解できなければ,協調の意味が薄れて人間は不安全な状況に陥ることになる.そこで,本研究ではまず,ロボットが,人間の「安全性」をいかに確保しつつその「意図性」をどの程度理解できるかを評価するために,H/R相対運動パラメータ空間に「意味空間」を定める提案を行った.すなわち,意味空間は,安全性を定量化する「安全部分空間」と人間の「意図性」を定量的に表現するための「意図部分空間」で構成されるものと考えた.研究初年度は,H/R間の相対距離・相対速度を規範とする安全部分空間の構築を行い,H/R相互の不安全な干渉を回避するためにこの部分空間のパラメータに基づいてロボットの速度制御を行う戦略を示した.実験では,人間の前腕とロボット第2リンクの動きをモニタし,提案戦略に基づきロボットがH/Rの相対運動により加減速したときに,人間が恐怖心を覚えるか否かを多面的に調べた.その結果,従来,恐怖心を覚えるとして報告されてきた0.6m/sの速度でロボットが定型動作を行っている状況にあっても,自分に当たらないと分かると,やがて被験者は慣れて恐怖感を覚えなくなることが心理実験により判明した.そこで,ロボットが当たる可能性もあるとする状況に被験者が立ったときの恐怖感を覚える最低速度は0.27m/sに減少した.また,予測される衝突部位で恐怖の程度が瞬時的に決定されることなどの傾向が明らかになり,これらを評価できる本システムの有効性が認められた.
遺伝子多型および発現特性による口腔癌細胞特性診断パネルの開発

本研究は、口腔癌の特性と変異遺伝子との関係を理解し治療法を選択する基準を確立するために、遺伝子発現と多型のバリエーションを分析し、それぞれの細胞特性を明らかにすることを目的とした。なお、あらかじめ鶴見大学倫理審査委員会の承認を受け、被験者のインフォームドコンセントを得た上で行った。遺伝子多型を調べるSNP解析および発現多型を調べるDNAマイクロアレイ解析やプロテオーム解析を行った。すべての解析で共通のものはなかったが、少数の候補を絞ることができた。口腔癌の持つ特性と変異遺伝子との関係を理解し科学的根拠を検証した上で、最も効果の高い治療法を選択する基準を確立するために、本研究では遺伝子発現と多型のバリエーションを分析し、それぞれの細胞特性を明らかにすることを目的とした。以下に研究項目とその結果を示す。1.ヒト口腔癌培養細胞5株および正常上皮からRNAを抽出しcDNAを合成し、マイクロアレイを用いてアノテーション済みの遺伝子について、ゲノムワイドに遺伝子発現を網羅的に分析した。腫瘍部と正常部とで比較し有意に発現が上昇していたのは27遺伝子、逆に減少していたのは73遺伝子であった。それらのうち、平均値の差の大きいものから12遺伝子ずつリアルタイムPCRにより分析を行ったところ、発現上昇・低下の検証がなされた。したがって、少なくとも24遺伝子においてRNA発現に異常が見られることが示唆された。2.ヒト口腔癌47症例および健常者47名から末梢血を採取し、DNAを抽出しSNPs多型解析を行った。既に今回の分析対象と異なる集団での口腔癌のcase-control studyをセミゲノムワイド(6800SNPs)に行って有意に多型分布率に差の見られた55SNPsについてのアレル頻度と、それらのハプロタイプ頻度の解析を行った。その結果、有意にアレル頻度に差が認められたのは、7番染色体とX染色体上の3SNPsであった。また、ハプロタイプブロックでは7番染色体と13番染色体上のハプロタイプ頻度に有意差が認められた。以上の結果より、これらのRNA発現異常、多型頻度異常が口腔癌細胞特性にどのように反映されているか検証する必要があると考えられた。1.ヒト口腔癌培養細胞12株からタンパク質を抽出し、昨年度の研究成果からRNA発現に異常上昇が見られた候補遺伝子において、タンパク質レベルでの発現解析を行った(Western blotting法)。その結果、少なくとも2遺伝子のタンパク質発現が過剰であることが示され、バイオマーカーとしての可能性が示唆された。2.昨年度のSNPs解析により、正常群と腫瘍群でマイナーアレル頻度が異なる傾向にある第7、13、19およびX染色体上の単一SNPsおよびHaplo-type Blockの近傍のSNPs解析を行った。その結果、19およびX染色体上の近傍SNPsにsnoRNA(核小体低分子RNA)およびlincRNA(大型介在性非コードRNA)などのmicroRNAターゲット配列が含まれていることが明らかとなった。3. 2の結果よりmicroRNA発現が発症メカニズムに関連する可能性を検証する必要性が示されたので、microRNA発現解析を行う条件検討を行った。ボランティアから採取した血漿および唾液からmicroRNAを抽出し、キャピラリー電気泳動(BioAnalyzer^[○!R], Agilent社)で確認したところ、唾液サンプルの方が血漿サンプルに比べリボゾームRNAの混入が少なくより純度の高いmicroRNAの抽出に適していることが示された。さらに、直接バイオマーカーとしての有用性が示されるならば、より侵襲性の少ない患者サンプル採取による診断に結び付けられる可能性が期待される。したがって本研究では、口腔癌細胞の持つ遺伝子多型とそれに伴う発現特性を分析し、細胞生物学的検証に基づいてバイオインフォマティクス的解析により、診断・予後診断・治療法選択の基準とするための基礎研究を行うことを計画した。すなわち、各遺伝子の発現特性が個々の癌細胞に何をもたらしているのかを明らかにし、遺伝子多型に相関性を持つものを見いだすことで、診断のマーカーとしての有用性を検討するものである。1.昨年度の研究からヒト口腔癌培養細胞12株においてタンパク質の過剰発現が見られたり、SNPマイナーアレル頻度率が異なっていることが示唆されたバイオマーカー候補において、組織タンパク質レベルでの発現解析(Western blotting法)を行った。しかし感度と特異度が有意に高く、最終的にマーカーと判定されるには到らなかった。

2.唾液サンプルにおいて、バイオマーカー候補タンパク質の発現を腫瘍群と対照群との2群での比較を行ったが、サンプルの症例数が十分に得られなかった。そこで、個々の症例での治療前後で変動を示す候補タンパク質と代謝産物(メタボライト)について、プロテオーム解析およびメタボローム解析によるスクリーニングを行った。その結果、サイトカインや炎症に共通の代謝産物が候補物質として絞り込まれた。唾液は非侵襲性の検体として有用であると考えられる。以上の結果より、バイオマーカー候補として選択された物質について、今後有用性を判定し、癌細胞特性にどのように反映されているかをさらに検証する必要が示唆された。