hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
科学力の育成をめざす参加型教材ソフトウエアによる教育実践モデルの開発と評価

1.概要この研究プロジェクトでは,小中学校の理科授業において児童の科学概念の構成,特に科学的なモデルの構成を支援するソフトウエアの開発と,それを利用した教育実践モデルの開発と評価に取り組んだ。2.システムの開発理科授業で用いるための描画の機能と,描いた描画履歴を記録して,それを反復再生する機能を実装したWindowsソフトを開発し,「反復再生可能型描画システムPolka」と名付けた。これは,児童・生徒の反省的思考を促し,科学的な概念の構成を容易にする。ソフトウエアは,理科の観察対象を児童・生徒が単純なモデルとして認識することを促すため,簡単な図形の組み合わせによるドロー系ソフトとして設計した。このシステムについて,Webサイトや学会のワークショップにおいて普及につとめ,学校現場からの要望を取り入れた。3.教育実践モデルの開発小中学校教師の研究協力者に実際の理科授業で使用していただき,反復再生可能型描画システムPolkaを利用する理科授業の実践モデルの開発を行い,そのつど学会等に発表した。押し縮められた空気の働き,流れる水の働き,電流,光合成,など,いくつかの単元の実践モデルが得られた。4.課題教育実践を通して,現象の変化を表現する機能を持つシステムの必要が指摘され,アニメーション機能を含む新しいシステム開発の研究プロジェクト申請につながった。本年度は,開発と普及を行った。開発については,反復再生可能型描画システムPolkaの開発と,Polkaを用いた理科授業実践モデルの開発を平行して実施した。これは,授業実践を行うことによって,システムの機能改善に対する具体的な要求が授業の現場から発せられ,それを踏まえたシステム変更の評価を授業実践の場で行うという循環が必要だからである。普及は,学会,研究会での口頭発表だけでなく,ワークショップ,展示などを利用して詳しい説明を行い,Polkaユーザの拡大に努めた。これは,幅広い教師によってPolkaが利用されることによる教育実践モデルの拡充を目指すためである。具体的に実行した主な事項は以下の通りである。1.システム開発(1)描画の日付及び時刻表示機能を追加した(2)描画履歴分析用のソフトウエアを開発した2.理科授業実践モデル開発(1)中学2年生の「電流」単元での実践と分析を行った(2)小学6年生の「光合成」単元での実践と分析を行った(3)小学校4年生の「空気中の水の姿」単元での実践と分析を行ったこれらの実践は,いずれも「目に見えない対象のモデル化による現象の理解」に関する単元である。2005(平成17)年度は,1.システム開発,2.実践モデル開発,3.普及・フィードバックの3部門に取り組んだ。1.システム開発システム開発者と授業実践者による会議を踏まえて前年度までの懸案事項を整理し,「しおり」機能を優先的に開発することを決定してPolka1.4β2に実装した。現在は,機能の有効性と操作性を実践現場での利用によって評価中である。2.実践モデル開発前年度に引き続き,小学校B区分での授業を中心に実践モデル作りに取り組んだ。特に小学4年生の単元を中心に取り扱い,次のような内容での教育実践を実施して報告した。(1)小学4年生の「空気中の水」(水の凝結)(2)小学4年生の「物のあたたまり方」(熱の伝導と移動)(3)小学4年生の「空気や水をとじ込める」(空気の圧縮及び水との比較)これらは,いずれも「目に見えない対象のモデル化」に該当する内容である。Polkaを用いた描画によって,児童・生徒が現象の背後のメカニズムをモデル化する授業実践の基本的な流れを示すことが出来つつある。しかし,振り返り機能の生かし方と,「しおり」機能の生かし方については,課題が残っている。3.普及・フィードバックPolkaの操作や授業での利用方法について分かりにくいという声が実践現場から上がってきたため,利用マニュアルを全面的に改定し,「児童用」「生徒用」「教師用」を作成して,Webサイトからダウンロードできるようにした。さらに,Polkaの基本機能を説明するためのワークシートも作成し,教育実践現場への導入がスムーズに出来るようにした。さらに,学会におけるワークショップ開催,県の教員研修などを通して利用者を拡大し,学会の会期中に実践会議を行って実践現場からの具体的なフィードバックを得やすくした。現時点では,「しおり」機能の評価と具体的な実践モデルの開発が課題である。

2006(平成18)年度は,1.システム開発2.実践モデル開発,3.普及・フィードバックの3部門に取り組んだ。1.システム開発2006年の8月に,システム開発者と実践者が集まり,これまでの授業実践から出てきたシステム利用上の問題点を列挙し,今後の開発作業の手順を検討した。図形の回転や高速化などの課題が列挙され,まず図形の回転に関わるシステム改定に取り組んだ。その一部を電子通信学会技術報告に報告したが,まだ回転機能の実装までには至っておらず,継続して開発作業を行っている2.実践モデル開発主に次のような内容について実践モデル開発に取り組んだ。小3空気や水をとじこめると小5流れる水のはたらき小6もののあたたまり方これらのうち「空気や水をとじこめると」と「もののあたたまり方」についての実践を日本科学教育学会研究会に報告した。3.普及・フィードバック日本科学教育学会の年会におけるワークショップ開催,鳥取県教育センターでの研修講座での紹介などをとおして普及を図り,実際に利用する教師からの要望をより多く集めるようにした。最終年度では,これまでの要望にある可能の改訂作業と,授業実践での評価が課題である。平成19年度は,実践モデルの開発、研究発表,そして課題の点検・整理に取り組んだ。1.実践モデルの開発と分析可能な限り実践瀬モデルの開発に取り組み,小学校4年生「閉じこめた空気や水をおしてみよう」,小学校6年生「ものの溶け方」について,特に詳細な記録を取って,児童の概念変化分析や会話分析を行った。2.研究発表これまでのシステム開発の技術的な部分についてHCI International 2007で報告した。教育実践に関する部分では,実践モデルの開発に携わった研究協力者の中西英教諭を中心に日本科学教育学会で小学校4年生の「空気や水をとじこめると」の事例について発表した。3.課題の点検・整理教育実践モデルの開発に携わった小学校教師を交えてこれまでの教育実践から出てきた課題を出し合って検討した。その結果,児童がPolkaの再生機能を発展的に活用して,現象の変化をアニメーション的に表示し,それによって効果的な授業を行うことができるケースがあることが確認された。このことから,新しい研究開発プロジェクトとして,アニメーション機能を含むシステムの開発について検討する必要性か示唆された。
インプラントの新生骨が短期間で形成可能な生体骨アパタイトコーティング法の基礎研究

歯科インプラント治療は歯の喪失により咀嚼機能の回復や審美性の改善に対して有効な治療法である。インプラントに関する研究はエッチング、コーティングおよびブラストの表面処理法による骨結合が多く報告されている。インプラント治療の術式である2回法は確実な骨結合を獲得する為に、埋入後3-6ヵ月の治癒期間を必要とする。また抜歯や骨移植が必要な場合には、さらに長期な治癒期間が必要となる。高本らはインプラント治療を経験する患者に対するアンケート調査で、76%の患者は長い治癒期間に不満があることを報告している。インプラント治療の成否は、インプラント体埋入後に形成される新生骨がインプラント周囲への結合により骨結合するか否かにより大きな影響を受ける。しかし、高齢者のインプラント治療または骨粗鬆症患者には十分な海綿骨の支持が得られず骨密度や骨質の低下からインプラント治療の適否を慎重に検討する必要性がある。よって、本研究はこれまで通常に使用されてきたβ-TCPや自化骨およびリン酸カルシウムに変わる新たな材料が必要と考える。そこで、本研究は生体微量金属元素のCO32-,Mg2+, Zn2+,F-をリン酸カルシウムに配合した生体骨アパタイト(Synthetic bone mineral: SBM)をインプラントにコーティングする表面処理法を開発し、埋入後に形成される早期な新生骨形成と骨質向上を明らかにする。実験は9週齡ラットに全身麻酔を行い、左側大腿骨遠位端から10mmの位置に剃毛と消毒後、切開を行い、骨膜を剥離し骨面を露出する。埋入窩は大腿骨に直径1.2mmの孔の形成し、インプラントを埋入する。ラットは埋入後2週および4週後に大腿骨を摘出する。摘出した骨はインプラント引き抜き試験、骨密度測定、Micro-CT撮影および組織学的観察によりSBMによる骨質向上の有用性を明らかにする。本研究は生体微量金属元素のCO32-,Mg2+, Zn2+,F-をリン酸カルシウムに配合した生体骨アパタイト(Synthetic bone mineral: SBM)をインプラントにコーティングする表面処理法を開発し、埋入後に形成される早期な新生骨形成と骨質向上を明らかにする。そこで、申請者は従来表面処理で使用するリン酸カルシウムと比較して生体骨アパタイトで早期な骨形成と骨質向上を解明する事を本研究の目的とする。本年度の進捗状況として、1)SBMの製作として、リン酸カルシウム: 100gと塩化マグネシウム: 10gおよび塩化亜鉛: 10gを1000mlの超純水(フッ化ナトリウム: 100gおよび炭酸水素カリウム: 100gを混和)を95°Cにて12時間混和させた後に加水分解により生成を行った。2)SBMコーティングとして、Tiディスク上へコーティング処置を行い、その状態を電子顕微鏡観察から結晶の存在について確認を行った。また、その結晶性についてはフーリエ変換赤外分光光度計(Fourier TransformInfrared Spectroscopy: FTIR)によりミネラルイオンのピークを確認することができた。よって、実際に動物実験を行うにあたりTiインプラントへSBMコーティング問題なく行えることを確認することができた。そこで、本研究は動物実験を遂行するにあたり、日本大学松戸歯学部動物実験委員会にて審査、学部長の承認を得られたので、日本大学動物実験運営内規等関連法規を遵守の上で令和元年6月より動物実験を開始する予定にしている。そのため埋入用Ti製インプラントの製造を業者に依頼し、完成後にTiインプラントを直径110μmのブラスト粉末による表面処理を行った後に、埋入用インプラントにSBMコーティングを5月中旬より開始し、6月より動物実験を行う予定にしている。本研究はインプラントに3種類の表面処理群(1表面処理無し群: 12頭、2リン酸カルシウムコーティング群: 12頭、3SBMコーティング群: 12頭に分けて実験を行う。インプラントのサイズは直径1.2mm、高さ4.0mmの円柱とし、上端から0.5mmの位置に引張試験用の通し穴を作成したものする。全てのインプラントは直径110μmのブラスト粉末によるブラスト処理と超音波洗浄を行った後に、オートクレーブで滅菌処理を行う。その中の12本はコントロール群とする。別の12本はリン酸カルシウムコーティング処理群とし、残りの12本はSBMコーティング群とする。実験方法として、実験動物は9週齢時に全身麻酔下(塩酸メデトミジン0.15mg/kg,ミダゾラム2.0 mg/kg,酒石酸ブトルファノール2.5mg/kgの混合麻酔薬;腹腔内投与)において、左側大腿骨遠位端から10mmの位置に、メスで皮膚を約10mm切開し、筋肉を鈍的に剥離し骨膜を剥離させ骨面を露出させる。インプラント体の埋入窩は、大腿骨の長軸に対し垂直に注水下で直径約1.2mm、深さ約4.0mmの埋入窩を直径1.2mmラウンドバーにて、左側大腿骨遠位端から10mmの位置に1カ所形成し、1本のインプラント体を埋入し縫合する。術後は消毒を行い、苦痛を排除するため鎮痛剤は術後3日間酒石酸ブトルファノール0.01mg/kgを筋注投与する。インプラント体埋入後2および4週後に各群6頭ずつ炭酸ガスを用いて安楽死させ、左側大腿骨を摘出し試料とする。

試料はインプラント体の引張試験、CT撮像および病理組織学的観察によりオッセオインテグレーションの評価を行う。なお、安楽死1週前にCalcein 20 mg/kg、3日前にカルセインブルー30mg/kgを腹腔内投与し、インプラント体周囲の新生骨において蛍光生体染色での評価を行う。歯科インプラント治療は歯の喪失により咀嚼機能の回復や審美性の改善に対して有効な治療法である。インプラントに関する研究はエッチング、コーティングおよびブラストの表面処理法による骨結合が多く報告されている。インプラント治療の術式である2回法は確実な骨結合を獲得する為に、埋入後3-6ヵ月の治癒期間を必要とする。また抜歯や骨移植が必要な場合には、さらに長期な治癒期間が必要となる。高本らはインプラント治療を経験する患者に対するアンケート調査で、76%の患者は長い治癒期間に不満があることを報告している。インプラント治療の成否は、インプラント体埋入後に形成される新生骨がインプラント周囲への結合により骨結合するか否かにより大きな影響を受ける。しかし、高齢者のインプラント治療または骨粗鬆症患者には十分な海綿骨の支持が得られず骨密度や骨質の低下からインプラント治療の適否を慎重に検討する必要性がある。よって、本研究はこれまで通常に使用されてきたβ-TCPや自化骨およびリン酸カルシウムに変わる新たな材料が必要と考える。そこで、本研究は生体微量金属元素のCO32-,Mg2+, Zn2+,F-をリン酸カルシウムに配合した生体骨アパタイト(Synthetic bone mineral: SBM)をインプラントにコーティングする表面処理法を開発し、埋入後に形成される早期な新生骨形成と骨質向上を明らかにする。実験は9週齡ラットに全身麻酔を行い、左側大腿骨遠位端から10mmの位置に剃毛と消毒後、切開を行い、骨膜を剥離し骨面を露出する。埋入窩は大腿骨に直径1.2mmの孔の形成し、インプラントを埋入する。ラットは埋入後2週および4週後に大腿骨を摘出する。摘出した骨はインプラント引き抜き試験、骨密度測定、Micro-CT撮影および組織学的観察によりSBMによる骨質向上の有用性を明らかにする。本研究は生体微量金属元素のCO32-,Mg2+, Zn2+,F-をリン酸カルシウムに配合した生体骨アパタイト(Synthetic bone mineral: SBM)をインプラントにコーティングする表面処理法を開発し、埋入後に形成される早期な新生骨形成と骨質向上を明らかにする。そこで、申請者は従来表面処理で使用するリン酸カルシウムと比較して生体骨アパタイトで早期な骨形成と骨質向上を解明する事を本研究の目的とする。本年度の進捗状況として、1)SBMの製作として、リン酸カルシウム: 100gと塩化マグネシウム: 10gおよび塩化亜鉛: 10gを1000mlの超純水(フッ化ナトリウム: 100gおよび炭酸水素カリウム: 100gを混和)を95°Cにて12時間混和させた後に加水分解により生成を行った。2)SBMコーティングとして、Tiディスク上へコーティング処置を行い、その状態を電子顕微鏡観察から結晶の存在について確認を行った。また、その結晶性についてはフーリエ変換赤外分光光度計(Fourier TransformInfrared Spectroscopy: FTIR)によりミネラルイオンのピークを確認することができた。
ウズラ由来H7亜型鳥インフルエンザウイルスの鶏への病原性に寄与するアミノ酸の同定

国内のウズラから分離されたH7亜型鳥インフルエンザウイルスは、ウズラにも鶏にも致死性を示さない低病原性株であった。本研究で、この株をウズラや鶏に接種して感染を繰り返すことで、鶏に対して非病原性であったウイルスが高病原性に変異した。HA開裂部位やM2蛋白質の変異によってウイルスの増殖性が、またHA蛋白質の複数箇所の変異によって鶏に対する感染性が上がることで病原性を獲得したと考えられた。本研究は、H7亜型鳥インフルエンザウイルスの強毒化メカニズム解明を最終目標とし、日本国内で分離されたウズラ由来H7N6亜型低病原性ウイルスの鶏への病原性獲得とそれに寄与するアミノ酸変異の同定を目的とする。以前にウズラ脳16代ニワトリ脳4代継代した株は、HA開裂部位が強毒型の配列に変異したが、静脈内接種試験で4週齢ニワトリに致死性を示さなかった。本研究では、この継代株を出発材料に、24週齢ニワトリの脳でさらに4代の継代を行った。得られた継代株は、静脈内接種試験で4週齢ニワトリに致死性を示し、これにより宿主動物(鳥)を用いた継代によってH7亜型ウイルスがニワトリに対して強毒化しうることが証明された。また、HA開裂部位への塩基性アミノ酸挿入およびM2蛋白質の1アミノ酸置換に加えて、追加して行った4継代によって新たにHA、NA、NS1遺伝子に非同義置換が認められた。これまでに得られた各継代株の、培養細胞における増殖性を評価するため、鶏胚線維芽細胞を用いトリプシン非存在下でプラーク形成試験を行った。M2蛋白質44位アスパラギン酸がアスパラギンに置換した後の継代株ではプラークサイズが有意に増加し、M2蛋白質44位アミノ酸がウイルスの増殖性に関与することが示唆された。一方で、HA、NA、NS1遺伝子に導入された非同義置換の意義は現時点では不明である。最終継代株をもとに、呼吸器感染によっても致死性を示す株を作出するため、引き続き、ニワトリを用いた肺継代を実施している。静脈内接種で4週齢鶏に対して致死性を示さなかったウズラ脳16代鶏脳4代継代株(Qb16Cb4)を脳継代4代追加してQb16Cb8株を得た。Qb16Cb8株は、静脈内接種で4週齢鶏に100%の致死性を示したが、経鼻接種では25%致死率にとどまった。そこで、Qb16Cb8株を34週齢鶏に経鼻接種し、肺継代を行ったところ、肺継代3代目の鶏の肉冠や脚部に、高病原性ウイルス感染鶏に特徴的なチアノーゼが認められ、当初目的とした呼吸器感染で致死性を示す強毒化株の作出が推察された。この肺継代により得られたQb16Cb8CL3株ではPAおよびHA蛋白に新たなアミノ酸変異が追加された。Qb16Cb8CL3株のニワトリおよびウズラでの病原性試験を、H26年度後半に実施する予定であったが、野鳥および家禽でのHPAIV感染発生への対応のためP3実験室の使用に制限が生じたため、平成27年度に実施することとし、代わりに、ニワトリでの増殖性をex vivoにて解析する目的で、鶏胚気管リング培養法を用い、変異段階の異なる継代株(Qb0、Qb16およびQb16Cb4)の鶏気管上皮による増殖性を評価した。Qb0株に比べて、Qb16株およびQb16Cb4株の増殖性の増加が示唆された。Qb16Cb8株およびQb16Cb8CL3株についても実施予定である。これまでに、ウズラから分離された低病原性H7亜型インフルエンザウイルスを、ウズラ脳で16代、ニワトリ脳で8代継代した結果、HA開裂部位が強毒型に変異し、4週齢ニワトリへの静脈内接種によって100%の致死性を示す継代変異株を得た。しかし、この継代変異株をニワトリに経鼻接種(呼吸器感染)しても、感染効率が低いままであったことから、さらにニワトリの肺で3継代したところ、高病原性ウイルス感染鶏でよく見られる肉冠や脚部のチアノーゼが確認された。このことから、本研究で目的とした呼吸器感染でニワトリに致死性を示す強毒化株の作出が推察された。また、この肺継代によりPAおよびHA蛋白に新たなアミノ酸変異が追加された。今後、ニワトリおよびウズラを対象に最終継代株(Qb16Cb8CL3)の病原性について評価するととともに、導入された変異の意義について検討する。当初計画の鶏に対する病原性株作出を目的としたウズラ由来H7

ウイルスの鶏継代について、平成27年度に予定した最終継代株の病原性を確認するための感染実験以下の計画が、平成26年27年にかけて国内で発生した高病原性鳥インフルエンザに関連した検査業務と実験施設の使用状況から実施困難となり、平成28年度に実施することとなった。感染細胞内ウイルスRNA定量法の構築も実用化には至っておらず、計画より遅れている。本研究は、H7亜型鳥インフルエンザウイルスの強毒化メカニズム解明を目標に、H7N6亜型低病原性ウイルス国内分離株の鶏への病原性獲得とそれに寄与するアミノ酸変異の同定を目的とする。これまでに、ウズラ由来H7N6亜型低病原性ウイルスを、ウズラ脳で16代、鶏脳で8代継代し、HA開裂部位が強毒型に変異し、鶏への静脈内接種では5ー8日間で死亡するが、呼吸器感染では病原性の弱い継代変異株を得た。この継代変異株を鶏への経鼻接種で3代継いだところ、高病原性鳥インフルエンザでよく見られる臨床徴候が確認された。最終年度において、この継代株の病原性を確定するため、6週齢鶏を対象に静脈内接種病原性試験を実施したところ、鶏は1ー4日で全羽死亡し、高病原性が確定した。脳継代株に較べて生存期間が短縮していたことから、肺継代によって鶏への病原性がより強くなったことが推察された。この鶏肺での3継代により、HAタンパク質には3箇所のアミノ酸置換(Glu89Asp、Thr169Asn、Glu403Lys)が認められた他、脳継代中に導入されたアミノ酸置換のうち、Asn493Aspが維持された一方でLeu88Argは肺継代により元のアミノ酸に復帰したことから、病原性への寄与は低かったと考えられた。本研究では、低病原性H7亜型ウイルスが家禽で継代されることで、強毒化することを初めて実験的に証明した。最終的に、継代開始前の低病原性株と、家禽での継代により作出した高病原性株を較べると、HAタンパク質では、開裂部位への塩基性アミノ酸挿入に加えて、上記4箇所のアミノ酸が異なるのみであった。HA以外のタンパク質では、PAタンパク質(Arg490Lys)とM2タンパク質(Asp44Asn)にそれぞれ1アミノ酸置換が維持されており、これらが鶏への病原性獲得に寄与した可能性が高い。国内のウズラから分離されたH7亜型鳥インフルエンザウイルスは、ウズラにも鶏にも致死性を示さない低病原性株であった。本研究で、この株をウズラや鶏に接種して感染を繰り返すことで、鶏に対して非病原性であったウイルスが高病原性に変異した。HA開裂部位やM2蛋白質の変異によってウイルスの増殖性が、またHA蛋白質の複数箇所の変異によって鶏に対する感染性が上がることで病原性を獲得したと考えられた。平成26年度に予定した計画のうち、「1.鶏に対する病原性株作出を目的としたウズラ由来H7ウイルスの鶏継代」について、ウズラ脳16代、鶏脳8継代の段階から、さらに鶏肺継代を追加実施した。その過程で、経鼻接種した34週齢鶏がチアノーゼなどHPAIVに特徴的な症状を示し、呼吸器感染により致死的感染を起こす株が得られたことが推察された。アミノ酸変異については解析済みであるが、「2、鶏に対する病原性評価のためのH7ウイルス継代株接種試験」について、最終継代株の病原性を確認するための感染試験が未実施である。「3、ウズラ接種試験等に用いるための『継代株のプラーククローニング』については、段階的に異なる変異をもつ5継代株(Qb0、Qb9、Qb16、Qb16Cb1およびQb16Cb4)のプラーククローニングを完了、さらなる継代株(Qb16Cb8およびQb16Cb8CL3)についてもクローニングウイルスを作出する。「4.アミノ酸変異のウイルス性状への影響のin vitro解析」について、ヘモリシスアッセイによる細胞融合時の至適pHの決定、レポーターアッセイによるポリメラーゼ活性の測定、感染細胞内ウイルスRNA定量法の構築が実用化に至っておらず、計画より遅れている。
共焦点レーザー顕微鏡による唾液腺水分泌機構の動的解析

唾液腺水分泌機構を解明するため、ラットおよびヒト唾液腺の組織片あるいは単離腺房を蛍光色素を含有した培養液でかん流し、分泌刺激を与え、共焦点レーザー顕微鏡で観察して以下の結果を得た。1)水分泌時に膜動態:カルバコール刺激で水分泌を誘導すると、ただちに開口分泌が生じ、オメガ型の蛍光の凹みが観察された。融合膜は次第に拡大していき、30分以降にエンドサイトーシスによって細胞内にとりこまれた。対照としてイソプロテレノール刺激したものでは、融合膜は一個一個、数分以内に消失した。走査・透過電顕観察によりイソプロテレノール刺激では融合膜に被覆小胞がみられたが、カルバコール刺激ではほとんど観察されなかった。以上から、融合膜の処理機構が分泌刺激によって異なり、これが水分泌になんらかの影響を与えるものと推定された。2)水分泌時にタイトジャンクション:培養液に膜染色剤であるFM1-43と蛍光ラベルしたデキストランと共存させ観察した。分泌刺激後、デキストランは分子量10万まで管腔内に検知できたが、FM1-43は側基底形質膜のみ染色し管腔形質膜を染色しなかった。水分泌時に、タイトジャンクションは細胞膜局所分化のフェンス機能は保持したまま、paracellular pathwayのバリヤ-機能を開くものと推定された。3)IP3レセプターの局在とカルシウム動態:ラット顎下腺導管を単離し、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡でカルシウム動態を観察した。分泌刺激により一部の導管細胞頂上部からカルシウム濃度の上昇がすみやかに(1秒以内)観察された。IP3レセプターの免疫組織化学を光顕・電顕でおこない、dark cellやlight cellの頂上部に存在する小胞が反応陽性を示すことを確認した。これらの小胞は新しく同定されたIP3レセプターサイトで、カルシウムシグナリングにかかわる重要な構造物と思われた。本年度は2つの共同研究があったため、計画の一部を変更した。ひとつは、ヒト唾液腺を材料にした水分泌機構の解析(イタリア・リバ研究室)、もうひとつは、IP3レセプターの細胞内局在とカルシウム動態の解析(東大・医科研・御子柴研究室)である。これらにより、研究に大きな展開がもたらされた。唾液腺は大量の水を分泌する器官で、水分はイオンや血清蛋白の一部とともに血液から経上皮的に輸送される。これらの分子がtranscellular pathwayあるいはparacellular pathwayのいずれを通るのか、またその調節機構の実態などについての直接的証明はなされていない。本研究では、ラットやヒト唾液腺を材料に、共焦点レーザー顕微鏡と蛍光トレーサーを用いて、生きた唾液腺細胞の水分泌機構、特にtranscellular pathwayやparacellular pathwayの解析を行った。唾液腺水分泌時の特徴的形態変化として、ゴルジ装置の膨化による腺房細胞の空砲形成が知られていた。しかしムスカリン刺激で水分泌を誘発し、共焦点レーザー顕微鏡で直視したところ、空砲はゴルジ装置由来ではなく、開口分泌した分泌顆粒膜が融合・合一して拡大した管腔形質膜であることが判明した。開口分泌した顆粒膜は30分以上管腔形質膜にとどまり、ついで細胞内にとりこまれた。分泌顆粒膜には、さまざまなイオンチャネルやポンプが存在することが知られており、比較的長い時間分泌顆粒膜が管腔形質膜にとどまることが、transcellular pathwayを介する水分泌機構と関係するのではないかと考えられた。この結果は、ヒトでも同じであった。さまざまな分子量のトレーサーを用いた解析から、ムスカリン刺激時には分子量1万までの巨大分子がタイトジャンクションを通過することが明らかとなり、paracellular pathwayの調節を介して、水分泌の流量や透過分子を決定する機構が示唆された。

本研究により、水分泌が開口分泌を伴うこと、分泌時には想像以上に巨大な分子がタイトジャンクションを通過するらしいことが判明した。ヒトでもこの結果が追認され、単に基礎研究だけでなく、さまざまな唾液腺疾患の細胞レベルでの病因究明の期待がもたれた。なお、IP3レセプターは主に顎下腺導管に発現しており、カルシウムによる調節機構に新たな局面が開かれた。唾液腺水分泌機構を解明するため、ラットおよびヒト唾液腺の組織片あるいは単離腺房を蛍光色素を含有した培養液でかん流し、分泌刺激を与え、共焦点レーザー顕微鏡で観察して以下の結果を得た。1)水分泌時の膜動態:カルバコール刺激で水分泌を誘導すると、ただちに開口分泌が生じ、オメガ型の蛍光の凹みが観察された。融合膜は次第に拡大していき、30分以降にエンドサイトーシスによって細胞内にとりこまれた。対照としてイソプロテレノール刺激したものでは、融合膜は一個一個、数分以内に消失した。走査・透過電顕観察によりイソプロテレノール刺激では融合膜に被膜小胞がみられたが、カルバコール刺激ではほとんど観察されなかった。以上から、融合膜の処理機構が分泌刺激によって異なり、これが水分泌になんらかの影響を与えるものと推定された。2)水分泌時のタイトジャンクション:培養液に膜染色剤であるFM1-43と蛍光ラベルしたデキストランと共存させ観察した。分泌刺激後、デキストランは分子量10万まで管腔内に検知できたが、FM1-43は側基底形質膜のみ染色し管腔形質膜を染色しなかった。水分泌時に、タイトジャンクションは細胞膜局所分化のフェンス機能は保持したまま、paracellular pathwayのバリヤ-機能を開くものと推定された。3)IP3レセプターの局在とカルシウム動態:ラット顎下腺導管を単離し、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡でカルシウム動態を観察した。分泌刺激により一部の導管細胞頂上部からカルシウム濃度の上昇がすみやかに(1秒以内)観察された。IP3レセプターの免疫組織化学を光顕・電顕でおこない、dark cellやlight cellの頂上部に存在する小胞が反応陽性を示すことを確認した。これらの小胞は新しく同定されたIP3レセプターサイトで、カルシウムシグナリングにかかわる重要な構造物と思われた。
高親電子活性種の創出と不斉C-Hアミノ化反応の開発

ナイトレノイドとオレフィンの反応ではC-Hアミノ化とアジリジン化が競争的に起こるが、ナイトレノイドの求電子性が強まるとともにC-Hアミノ化が起こりやすくなることが知られている。申請者らは最近(ニトロシル)サレン錯体がアジド化合物をナイトレン先駆体とするナイトレン移動反応を高エナンチオ選択的に触媒すること、オレフィンの構造に依存してアジリジン化あるいはC-Hアミノ化が進行することを見出した。上記の従来の知見に照らして、サレン配位子の側鎖に電子吸引性基を導入することができれば、C-Hアミノ化がより促進され、また触媒の耐久性も向上するものと期待し、C2'位のフェニル基をフッ素および塩素で置換した(ニトロシル)サレン錯体を合成した。これらのサレン錯体を用いて各種オレフィンへのナイトレン移動反応を試みたところ、予期に反して専らアジリジン化が進行した。しかし、触媒の耐久性は著しく改善された。例えば、当初の錯体の触媒回転数はトルエンスルホニルアジドを用いたスチレンのアジリジン化で36回であったが、塩素を導入した第二世代のサレン錯体を用いると980回と大きく改善された。この結果、反応性の低いアジド化合物をナイトレン先駆体として利用することが可能となった。特に、β-トリメチルシリルエタンスルホニルアジドを用いたアジリジン化が高エナンチオ選択的に進行することを見出した。一般にアミノ基上のアリールスルホニル基の脱保護は厳しい条件を必要とするが、β-トリメチルシリルエタンスルホニル基は温和な条件で脱保護されるので、β-トリメチルシリルエタンスルホニルアジドを用いるアジリジン化は各種アジリジンおよびアミノ化合物の不斉合成のための有用な手法となるものと期待される。現在、サレン配位子の構造を変更しC-Hアミノ化を検討中である。
ウェルシュ菌・theta-毒素遺伝子発現調節機構の分子生物学的解析

本年度の研究によって得られた成果は以下のとおりであった。1.ウェルシュ菌内でのtheta-毒素遺伝子(pfoA)の発現に成功した。ウェルシュ菌で複製できるプラスミド(pJIR418)へ毒素遺伝子(pfoA)断片を挿入し、これをウェルシュ菌へ電気穿孔法(electroporation)によって導入し、プラスミド上のpfoA遺伝子の発現を調べた。このプラスミドを形質転換したウェルシュ菌では溶血活性が上昇し、外来のtheta毒素遺伝子が効率よく発現されたと考えられた。2.ウェルシュ菌でpfoR遺伝子以外のtheta-毒素遺伝子発現調節遺伝子がクローニングされた。ウェルシュ菌のさまざまなtheta-毒素産生変異株におけるtheta毒素遺伝子の発現を解析した結果、pfoR遺伝子以外にもtheta-毒素遺伝子の発現を調節している遺伝子が存在することが明らかとなり、この新たな調節遺伝子を直接ウェルシュ菌にてクローニングした。この遺伝子(virR)は、細菌の二成分調節系におけるresponse regulatorと相同性が高く、ウェルシュ菌でも他にコラゲナーゼ、血球凝集素の発現を調節していた。このことからvirR遺伝子はウェルシュ菌における病原因子のグローバルな調節遺伝子と考えられた。3.ウェルシュ菌のvirR遺伝子の変異株の作製に成功した。virR遺伝子の変異株をhomologous recombinationにて作製した。得られた変異株では、pfoA遺伝子、コラゲナーゼ、血球凝集素の発現が消失していた。また、これらの毒素の発現は正常なvirR遺伝子を形質転換することで相補された。
アジアイネとアフリカイネにおける脱粒性遺伝子SH3の分化

イネ種子脱粒性は栽培化に関わる重要形質である。AAゲノム野生種は、myb-likeドメインをもつ転写因子をコードする脱粒性遺伝子SH3を普遍的に保有しているが、Oryza sativaではmyb-likeドメイン内に生じたSNP (G>T変異)により劣性の非脱粒性アリルとなったことが明らかになっている。一方、西アフリカの栽培イネO. glaberrimaは、一年生野生イネO. barthiiより栽培化されたが、G>T変異は保有しておらず、O. glaberrimaの非脱粒性の原因変異は不明であった。本研究は、O. glaberrimaの非脱粒性に関する遺伝的変異の同定とその分子的基盤の解明を目的として解析を行った。本研究では、遺伝子単離を行った結果、O. glaberrimaのもつ非脱粒性の原因遺伝子はSH3であることを明らかにした。さらに多様性解析により、O. glaberrimaの非脱粒性遺伝子の原因変異はsativaのG>T変異とは異なることを示した。この結果は、アジア大陸とアフリカ大陸において、人類はSH3に起こった異なる変異を独自に選んだ結果、O. sativaとO. glaberrimaを栽培化したことを意味する。O. glaberrimaとO.barhii系統の配列解析から、SH3領域に選択一掃(selective sweep)が見られ、SH3の非脱粒性アリルが正の選択を受けている事が明らかとなった。また、非脱粒性アリルであるsativa型SH3アリル(SH3-sativa)とglaberrima型SH3 (SH3-gla)アリルのヘテロ接合体は顕著な脱粒性を示す事を明らかにした。これは、ヘテロ接合体において、SH3-sativaタンパク質とSH3-glaタンパク質が相互にドメインの機能を相補することで起こることが示唆された。以上の内容を論文にまとめ、論文投稿を行った。(抄録なし)(抄録なし)イネ種子脱粒性は収量に直結する重要形質である。AAゲノム野生種は、myb-likeドメインを保有する転写因子をコードする脱粒性遺伝子SH3を普遍的に保有しているが、Oryza sativaではmyb-likeドメイン内に生じたSNPにより劣性の非脱粒性アリルとなった事が明らかになっている。申請者らはO. sativa遺伝的背景に非脱粒栽培イネO. glaberrimaに由来するSH3を導入した系統(SH3-gla NIL)は非脱粒性を示すが、O. sativaとの交F_1は脱粒性を示すことを見出しており、この現象を説明するため、SN3に緊密に連鎖する抑制因子iSH3を仮定する二遺伝子座モデルと、アリル間の対立間相補性を仮定する一遺伝子座モデルを提唱している。これらの現象を司る遺伝的変異の同定と、分子的基盤の解明するため、本申請の外国人特別研究員Win氏は、iSH3単離を行うため、候補領域のBACクローンを選抜し、当該領域の解読を進めた。申請者らが用いたO. glaberrima系統は、O. glaberrimaゲノム配列プロジェクトにて用いられている系統と同じ系統であるので、データベースにて公開されているデータを補助的に用いて、申請者らのデータとの統合化を図り、解読を推進した。また、形質転換実験によるgain-of-function解析を行うため、日本晴BACクローンとglaberrima BACクローン由来の制限酵素断片をバイナリーベクターに導入する実験にも着手した。また、glaberrima由来cDNAをクローン化するため、glaberrimaの開花前離層部位をサンプリングし、RNA抽出の準備を整えた。イネ種子脱粒性は収量に直結する重要形質である。申請者らはO.sativa遺伝的背景に非脱粒栽培イネO.glaberrimaに由来するSH3を導入した系統(SH3-gla NIL)は非脱粒性を示すが、Osativaとの交雑Flは脱粒性を示すことを見出しており、これらの現象を司る遺伝的変異の同定と分子的基盤の解明するため、本申請の外国人特別研究員Win氏は、候補領域の日本晴およびOglaberrima由来BACクローンを選抜し、候補遺伝子を含むゲノム制限酵素断片をバイナリーベクターにクローニングし、T65号およびSH3-glaNILに形質転換を行った。T_0個体の表現型を解析した結果、あるT_0個体にて強い脱粒性を示す個体が出現した事から、原因遺伝子を特定することができた(未発表)。AAゲノム種原因遺伝子のコード領域について、AAゲノム種由来SH3の多様性を解析したところ、台中65号対立遺伝子とO.glaberrima対立遺伝子間に見られる多型のうち3カ所が、脱粒性/非脱粒性の原因変異の候補として絞り込まれた。その3カ所のうち1カ所ずつ変異を導入した変異遺伝子とYFP/CFPとの融合コンストラクトを作成し、各対立遺伝子産物の相互作用実験を開始した。O.barthiiからO.glaberrimaへの栽培化される過程において、SH3の寄与を推測するため、O.barlhii/O.glaberrima交雑F_1を作成し、F_2種子を得た。現在休眠打破を行い、F_2植物体の栽培を開始した。

イネ種子脱粒性は栽培化に関わる重要形質である。AAゲノム野生種は、myb-likeドメインをもつ転写因子をコードする脱粒性遺伝子SH3を普遍的に保有しているが、Oryza sativaではmyb-likeドメイン内に生じたSNP (G>T変異)により劣性の非脱粒性アリルとなったことが明らかになっている。一方、西アフリカの栽培イネO. glaberrimaは、一年生野生イネO. barthiiより栽培化されたが、G>T変異は保有しておらず、O. glaberrimaの非脱粒性の原因変異は不明であった。本研究は、O. glaberrimaの非脱粒性に関する遺伝的変異の同定とその分子的基盤の解明を目的として解析を行った。本研究では、遺伝子単離を行った結果、O. glaberrimaのもつ非脱粒性の原因遺伝子はSH3であることを明らかにした。さらに多様性解析により、O. glaberrimaの非脱粒性遺伝子の原因変異はsativaのG>T変異とは異なることを示した。この結果は、アジア大陸とアフリカ大陸において、人類はSH3に起こった異なる変異を独自に選んだ結果、O. sativaとO. glaberrimaを栽培化したことを意味する。O. glaberrimaとO.barhii系統の配列解析から、SH3領域に選択一掃(selective sweep)が見られ、SH3の非脱粒性アリルが正の選択を受けている事が明らかとなった。また、非脱粒性アリルであるsativa型SH3アリル(SH3-sativa)とglaberrima型SH3 (SH3-gla)アリルのヘテロ接合体は顕著な脱粒性を示す事を明らかにした。これは、ヘテロ接合体において、SH3-sativaタンパク質とSH3-glaタンパク質が相互にドメインの機能を相補することで起こることが示唆された。以上の内容を論文にまとめ、論文投稿を行った。当初実験計画では、平成23年度終了までにO. glaberrima BACクローンの準備と解読を行い、形質転換実験に着手する事を予定していた。Khin Thanda Win氏は2012年11月22日に来日し、四ヶ月の間に先行研究の概要および実験計画の詳細を理解し、O. glaberrimaゲノム解読の概要を明らかにし、形質転換実験に着手することができたため、おおむね順調に進展していると考えた。形質転換用のコンストラクションにおいて、作成困難なコンストラクトが一部存在するが、それ以外には形質転換実験は順調に進捗している。原因遺伝子も同定することができ、進捗は順調であると考えている。(抄録なし)site-directed mutagenesisなどがうまく行かず、当初予定していたコンストラクトが作製できない可能性があるが、形質転換実験のみに依存した実験系だけではなく、近縁種や種内変異を利用した多様性解析などを行う事で、原因変異の証明をしていく予定である。現在配列解析を進めており、QTL解析などの表現型データを伴う実験データと統合していく事で、それらの問題点は補われるものと考えている。(抄録なし)
口腔領域硬組織疾患克服に向けた小胞体品質モニタリングプローブの新規開発

小胞体の健康状態が低下した際には、小胞体内に不良タンパク質が蓄積する。このことを利用して、小胞体内腔に蛍光タンパク質GFPを発現させ、その蓄積量を経時的にモニターすることで、小胞体の品質管理を定量化することを目指した。そのための技術的ハードルとして、通常小胞体内は酸性のためシステイン間のジスルフィド結合を有するGFPは立体構造が緩み蛍光強度が下がる。この問題点を解決するため、システインを持たないGFP変異型[GFPCys(-)]の作成を行った。これによって得られるプローブを、各種細胞に遺伝子導入し小胞体の状態をモニターし、生細胞における小胞体ストレス状態の可視化に成功した。歯と骨の形成とその破綻による疾患のメカニズムを考える上で、骨基質など全ての分泌タンパク質が通過する小胞体(ER)の機能を理解することは不可避である。しかし、小胞体のみならず細胞内オルガネラが発信するシグナルに着目した硬組織研究は数少ない。本研究では、品質管理が保たれた「元気なERか?」機能不全に陥った「弱ったERか?」を可視化する新規の小胞体品質検出プローブ(ER quality control monitoring probe)を開発し、これまでにない視点での硬組織研究を目指す。技術的には、小胞体内(酸性)でも蛍光を発することが可能なGFP変異体を開発し、細胞・個体レベルに導入しその有用性を検証する。本研究成否は、プローブ開発に依存するが、様々な硬組織疾患マウスモデルに応用すればその波及効果は極めて大きいと期待される。そこで、本研究では、申請者がこれまで進めてきた小胞体品質管理機構に関する研究基盤をもとに、これまでにない新たな小胞体機能のバイオマーカーを作出する。さらにin vivoで小胞体の機能をモニターできるマウスを作出し、硬組織細胞における小胞体の状態を経時的に観察することを試みる。これにより、これまでほとんど研究がなされていなかった歯と骨における小胞体の機能と役割を明らかにするための研究基盤を開発する。平成25年度は下記の項目について検討した。・酸化条件下で蛍光を発するGFPCys(-)の作製、・小胞体内腔滞在型ER-GFPCys(-)の作製、・ER-GFPCys(-)の薬剤誘導性発現未分化骨芽細胞株の作製、・レンチウィルスによるER-GFPCys(-)の破骨細胞分化への導入、・Tet-ER-GFPCys(-)トランスジェニックマウスの作製硬組織形成に関わる様々なシグナル伝達経路が明らかにされてきたが、細胞内オルガネラが発信するシグナルに着目した研究は数少ない。骨形成過程では、I型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、骨形成因子(BMP)などの骨基質タンパク質やシグナルリガンドが大量に産生されており、その産生異常は硬組織形成異常を引き起こす。このような分泌タンパク質の全ては、小胞体内腔へ翻訳・輸送され、糖鎖付加・ジスルフィド結合などの修飾を受け高次構造を獲得し、ゴルジ装置を経由して細胞外に分泌される。多くの分泌タンパク質を産生する細胞では、小胞体の品質管理機構が充分に機能していなければならない。例えば膵臓のβ細胞では大量のインスリンを、形質細胞では大量の抗体を産生しており、それらの細胞内の小胞体機能異常はそれぞれ糖尿病、抗体産生異常を引き起こす。硬組織においても同様で、骨芽細胞・軟骨細胞での小胞体機能異常は、それぞれ骨・軟骨組織の形成異常を引き起こすことが知られている。一方、口腔がんは顎骨浸潤を伴うことが多く、重大な口腔機能障害をもたらす。その骨浸潤・骨吸収の過程では破骨細胞の機能が過剰亢進しており、その際にもやはり様々な分泌タンパク質が産生され、そのため小胞体機能が更新していることが予想された。従って、硬組織形成を担当する細胞群における小胞体品質管理機構を理解し、その制御方法を探索することは、様々な疾患の克服に繋がる。これまで進めてきた小胞体品質管理機構に関する研究基盤をもとに、これまでにない新たな小胞体機能のバイオマーカーの作出を試み、in vivoで小胞体の機能をモニターできるマウスを作出し、硬組織細胞における小胞体の状態を経時的に観察した。これにより、これまでほとんど研究がなされていなかった歯と骨における小胞体の機能と役割を明らかにするための研究基盤の開発を試みた。細胞生物学以下の点について具体的な進捗を得たため。GFPタンパク質は、細胞質内で図4の様なβバレル(樽型)構造をしており、このような高次構造を獲得することで450nm付近の吸収波長で励起され蛍光を発する。しかし、その一次アミノ酸配列内には一つの分子内ジスルフィド(S-S)結合が形成されるシステイン残基が存在する。

しかし、小胞体内腔は比較的酸性状態にあるため、S-S結合が形成されず、そのため立体構造が崩れ蛍光が極めて減弱する。この問題点を解決するため、システインを他のアミノ酸に置換し、さらにS-S結合がない状態でもβバレル構造を維持できるよう、様々な部位にランダム変異を挿入し、酸性で蛍光を発する変異型GFP [GFPCys(-)]を作製した。また、スクリーニングによって得られるGFPCys(-)を小胞体内腔に発現させ、かつERADを介して素早く分解されるタンパク質を下記の配列を付加することで作製した。テトラサイクリン(Tet)投与によって目的タンパク質の発現on/offを制御できるシステムにより(図6)、骨芽細胞への分化誘導が可能なC2C12細胞、軟骨芽細胞への分化が可能な前駆軟骨細胞株ATDC5、間葉系幹細胞などを用いて、恒常的遺伝子導入細胞株を作製した。ウィルス発現システムを用いて、Lentivirus-Tet-ER-GFPCys(-)を作製した。[TRE(Tet responsive element)]-[CMV promoter]-[ER-GFPCys(-)]コンストラクトのトランスジェニック(Tg)マウスの作製を外部委託により開始した。平成25年度進捗に基づき、下記の点を中心に研究を進める。in virtoの実験系としては、骨芽細胞・破骨細胞分化におけるin cell発現系の解析を行う。
ヘリコバクターピロリの胃粘膜内線維芽細胞増殖,分化におよぼす影響の検討

筋線維芽細胞の増殖機転を明らかにする目的で,増殖因子の塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF),血小板由来増殖因子(PDGF),endothelinの結合部位を,autorodiography法およびin situ hybridization法により検討した。その結果,bFGF, PDGF-BB, endothelin-1に対する結合および対応する受容体が,筋線維芽細胞をはじめとした間葉系細胞上に分布するのを認めた。さらにHelicobacterpylon感染Mongolian gerbi1では,対照群に比し,筋線維芽細胞が増加したが,bFGFの酸に対する安定化体であるCS23-bFGFを腹腔内あるいは経口投与することにより,筋線維芽細胞のさらなる増加および受容体発現の増加を認めた。しかし,この検討を行っている際に,近年肥満などに関係することから注目されているホルモンであるレプチンが,この筋線維芽細胞の類縁細胞である伊東細胞あるいはfatstoringcellの増生に関与することが明らかになったことから,leptinのHelicobacter pylori感染時の分布の変化につき検討した結果,leptinは胃粘膜内では,微小循環系内皮細胞に主に分布するのに対し,感染時には筋線維芽細胞および未分化間葉系細胞にも分布するようになり,さらにその受容体がこれらの細胞に分布することがわかったことから,その増殖機転に関与することが示唆された。すなわち,増殖因子は細胞の増生に関与し,Leptinは,transdifferentictionに関係すると考えられた。胃潰瘍症例生検組織およびスナネズミのヘリコバクターピロリ(Hp)持続感染モデルにおいてこの筋線維芽細胞と微小循環系の変化を検討した。その結果、胃潰瘍症例においては、活動期胃潰瘍では、慢性胃炎症例では観察されない円形あるいは紡錘形のPR 2D3抗体およびrhodamine-phallodin陽性の筋線維芽細胞が潰瘍辺縁に多数出現し、治癒期、瘢痕期には筋線維芽細胞は、小型化し、その数も減少した。また、腸上皮化成部ではその数はさらに減少していた。cyclooxygenase II(COX II)免疫活性は、そのほとんどがこの筋線維芽細胞上に局在していた。一方、Hp持続感染スナネズミにおいては、感染1年後までの観察では、3ヶ月後をpeakとして筋線維芽細胞の増大が観察され、胃潰瘍症例と同様にCOX II免疫活性が認められた。また、第8因子およびCD34,36による内皮細胞、FITC-dextran加agarの経大動脈カテーテルからの注入による血管透過性の検討からは、粘膜先端部での微小循環系の拡張、増生および血管透過性の亢進が明らかとなり、上皮細胞にHpが接着することにより、筋線維芽細胞、微小循環系などの間葉系細胞が増加することが明らかとなった。そこで、この増加の機序を明らかにする目的で、この細胞における各種増殖因子(塩基性線維芽細胞増殖因子basicfibroblast growthfactor:bFGF,血小板由来増殖因子PDGF-AA,BB,transforming growthfactor β)およびendothelinに対する受容体の分布をin vitro autoradiography法により検討した。その結果、bFGF,PDGF-BB,endothelin-1が筋線維芽細胞および微小循環系内皮細胞に結合することが明らかとなり、これらの因子がその増殖に関与することが示唆された。また、vitaminA投与によりこの筋線維芽細胞に対する集積が認められたことから、この細胞は伊東細胞あるいはfat-storing cellに類縁した細胞であり、vitaminA投与がその増殖の抑制に関与することが示唆された。筋線維芽細胞の増殖機転を明らかにする目的で、増殖因子の塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF),血小板由来増殖因子(PDGF),endothelinの結合部位を、autoradiography法およびin situ hybridization法により検討した。その結果、bFGF, PDGF-BB, endothelin-1に対する結合および対応する受容体が、筋線維芽細胞をはじめとした間葉系細胞上に分布するのを認めた。さらに、Helicobacter pylori感染Mongolian

gerbilでは、対照群に比し、筋線維芽細胞が増加したが、bFGFの酸に対する安定化体であるCS23-bFGFをの腹腔内あるいは経口投与することにより、筋線維芽細胞のさらなる増加および受容体発現の増加を認めた。しかし、この検討を行っている際に未分化間葉系細胞の増減は観察されなかった。一方、この検討を行っている際に、近年肥満などに関係することから注目されているホルモンであるレプチンが、この筋線維芽細胞の類縁細胞である伊東細胞あるいはfat-storing cellの増生に関与することが明らかとなったことから、leptinのHelicobacter pylori感染時の分布の変化につき検討した結果、leptinは、胃粘膜内では、微小循環系内皮細胞に主に分布するのに対し、感染時には筋線維芽細胞および未分化間葉系細胞にも分布するようになり、さらにその受容体がこれらの細胞に分布することがわかったことから、その増殖機転に関与することが示唆された。すなわち、増殖因子は、細胞の増生に関与し、leptinは、transdifferentiationに関係すると考えられた。