hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄損傷時のオピオイドによる神経毒性

胸髄損傷後の脊髄くも膜下モルヒネ単回投与による歩行障害増悪は、下肢の筋緊張を伴っており、脊髄μ-オピオイド受容体を介する反応であることを示した。脊髄くも膜下モルヒネの持続投与は、脊髄μ-オピオイド受容体活性化以外の機序により歩行障害を悪化するだけでなく、機能回復を遅延させた。モルヒネ持続投与による歩行機能の悪化の機序は、単回投与によるそれとは異なる。脊髄損傷急性期における鎮痛目的の持続的モルヒネ投与は、機能障害を遷延する可能性がある。BBBスコアが8-12となるように、中等度の胸髄挫傷によるSCIを作製する。2時間後にモルヒネ(30μg)を腰部くも膜下投与し、BBBスコアの変化を検討する。次いで、オピオイドの神経毒性がオピオイドレセプタ以外のレセプタを介した可能性があるため(Hauser et al., Frontiers in Biosci, 2005 ; 10 : 216-235)、μアゴニスト、κアゴニスト、δアゴニストの脊髄投与がSCIによる運動障害におよぼす影響を検討した。さらにこれら各レセプタのアゴニストをSCI後3日間持続投与し,腰髄(L4)の運動ニューロンや介在ニューロンの損傷程度を形態上解析し,運動障害の悪化が運動ニューロンの損傷によるか,介在ニューロンの損傷によるか,あるいは両者によるかを解明した。SCI作製2時間後にモルヒネを投与すると、運動麻痺は増悪し、この増悪はナロキソンで拮抗された。ついで3日間持続くも膜下投与すると(30μgbolus+3μg/hr),投与中止後も長時間運動麻痺の悪化が持続した。次いでSCI後,3日間モルヒネを持続くも膜下投与したラット腰髄(L4)をKluver-Barrera染色したが、モルヒネ投与群(Group M)で,sham群(Group Sh)やSCI+生食群(Group C)に比べ,傷害された運動ニューロンの割合には有意な差はなかった。脊髄損傷後には運動機能麻痺だけでなく疼痛が生じる。この痛みを緩和する目的で、しばしばオピオイドが投与される。しかしながら、オピオイド投与により、脊髄損傷後の下肢運動麻痺が増悪する可能性がある。本研究の目的は、脊髄損傷時に投与されたオピオイドの下肢運動麻痺に与える影響と、その増悪の機序を明らかにすることにある。以下の研究成果が得られた。1、オピオイド単回投与によるμ受容体を介した下肢運動麻痺の増悪鎮痛量のオピオイドμ受容体作動薬により下肢麻痺が一過性に増悪し、その増悪はオピオイド受容体拮抗薬により拮抗された。これらの結果から、脊髄損傷後のオピオイド単回脊髄投与による下肢麻痺の増悪は、オピオイドμ受容体を介したものであることが示唆される。2、オピオイド持続投与によるオピオイド受容体以外の機序の関与脊髄損傷ラットに、髄腔内に留置したカテーテルから3日間オピオイドを持続投与すると、下肢運動麻痺の回復が遅延した。この下肢運動麻痺はオピオイド受容体拮抗薬で拮抗されない。これらの結果から、オピオイド持続投与後の下肢運動麻痺増悪は、オピオイド受容体を介する機序だけでなく、その他の機序が関与している可能性がある。3、運動ニューロンに対する影響下肢の筋は腰髄運動ニューロンによってコントロールされる。組織学的検討では、オピオイド投与による腰髄運動ニューロンの有意な減少はみられなかった。これらの結果から、オピオイドによる下肢運動麻痺は、運動神経細胞の減少に由来するものではないことが示唆される。本研究の目的は,挫傷による脊髄損傷(Spinal cordcontusion injury : SCI)の時に,損傷部位(胸髄)からの遠隔部位(腰髄)へ投与されたオピオイドが神経毒性,(neurotoxicity)を有することを証明し,そのメカニズムを解明するものである.具体的には,(1)ラットの中部胸髄のSCIモデルを作成し,腰部くも膜下投与後に運動麻痺が悪化するモルヒネの量は9μgであった,これはラットでは,鎮痛のための用量(5μg以上)に近似する。(2)各種アゴニストを同様に投与した結果,この運動麻痺に関与するオピオイドレセプタは,μおよびδアゴニストであった.(3)神経毒性による運動麻痺は弛緩性でなく痙性であった.(4)SCIラットのくも膜下にモルヒネを3日間投与すると、ナロキソンで拮抗できない痙性麻痺が生じた.これは非オピオイド性の毒性と考えられた.(5)SCI後、モルヒネまたは生理食塩水を3日間クモ膜下に持続投与し,腰髄(L4)を形態上解析したが,運動ニューロンに差はなかった.

この実験の意義は,あるニューロンへのシナプス入力が傷害あるいは破壊された場合,本来神経毒性を持たない薬剤(オピオイド)が,このニューロンに対して通常投与量でも,神経毒性を有するようになる現象を提示したことである.これは新たな概念による神経毒性であり,脳のどの部位の損傷でも起こりうる.現在,麻酔薬の発がん性や、麻酔薬による胎児・小児の神経細胞分化の障害作用が報告され始めている.この麻酔薬・麻酔薬関連の神経毒性による研究は,新たな研究分野に発展する可能性があるだけでなく,麻酔の安全性を確立する見地から,重要性が高いと考えられる
骨関節の老化変性機序と,細胞寿命延長能を付加したバイオマテリアルによる関節再生法

細胞寿命延長操作をした細胞と高機能マトリックスを組み合わせた階層的ハイブリッドバイオマテリアルの組織再生効果これまでに得られた知見・培養技術を用いて、細胞寿命を延長させる操作を行った骨軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞をバイオ.マトリックスを足場として複合的に階層化構築させる技術を開発し、in vitroで培養した研究を前年度に引き続き継続して、データーの精度を高めた。ハイブリッドバイオマテリアルを用いて再生した骨軟骨組織の機能・安定性評価ハイブリッドバイオマテリアルを用いて再生した骨軟骨組織の対メカニカルストレス(対荷重性)、炎症性サイトカイン反応性など、再生組織の強度、耐用性を検討した。特に、静水圧荷重下や異なる酸素分圧下に細胞や組織を培養した場合のバイオマテリアルの変化については、今後の医療用素材開発に資する重要な知見が得られた。これらの結果は、1)関節構成細胞の細胞寿命・老化の制御機構と関節変性老化との関連、2)骨軟骨細胞および組織幹細胞(間葉系骨髄幹細胞)の細胞寿命(老化)克服のための新技術の開発、3)組織幹細胞の分化誘導、細胞寿命延長を誘導する高機能バイオマテリアルの開発を行なう上で最重要な基礎的知見である。これらの知見を研究成果としてまず知的財産として特許にしたのちに、発表のため論文を投稿中である。これらの知見の一部を2006年に特許に出願した。関節構成細胞のテロメア長,細胞寿命関連遺伝子と臨床的背景ならびに組織像との関連骨・関節などの運動器は、加齢に伴い様々な老化表現型をとり、変性疾患や日常生活動作障害の原因となる。臓器・組織の加齢に伴う老化現象は、その多様な現れから、寿命・老化に導く共通の必須因子が何かは未だ不明である。本年度は、運動器の老化変性、特に関節老化の発生機序を構成細胞、特に軟骨細胞の細胞老化の発生機序と関節変性老化との関連を検討し、下記の知見を得た。インフォームドコンセントを得て患者由来の軟骨細胞のテロメア長,テロメラーゼ活性及び各種の細胞寿命関連遺伝子発現度と疾患活動性や軟骨変性度(組織学的所見)などの臨床的背景との関連を分析し、軟骨細胞の分裂寿命・細胞老化が関節老化の病態形成に密接に関連することを明らかにした。さらに、軟骨細胞老化が、軟骨変性を誘導する因子として公知である炎症性サイトカインや酸化ストレスによって惹起されることをはじめて確認した。さらに、各細胞寿命関連因子の相互関連、特にモータリン1,2の発現とテロメラーゼを構成する3遺伝子(hTR, hTERT, TP1)ならびにテロメラーゼ活性の相互関連について着目し、軟骨細胞を用いて、細胞老化の過程での動態を観察した。これらの知見の一部は学会ならびに学術論文として報告した。細胞寿命延長操作をした細胞と高機能マトリックスを組み合わせたハイブリッドバイオマテリアルのin vitroにおける組織再生効果これまでに得られた知見・培養技術を用いて、細胞寿命を延長させる操作を行った骨軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞をバイオマトリックスをscafolldとしてin vitroで培養した。ハイブリッドバイオマテリアル移植マウスを用いた骨軟骨再生組織の検討In vivoにおいて、上記ハイブリッドバイオマテリアルの関節再生能を評価するためマウスを用いた。このモデルマウスに、OAやRAの関節組織を軟骨を含めて移植し、かつ生着後に滑膜増殖、サイトカイン産生を確認した。また、RAやOA関節と同様の病理学的変化を観察した。本年度は、1)細胞寿命延長を誘導した骨芽細胞と軟骨細胞をヒト骨軟骨組織とともにマトリゲル中に封入培養し、マウス皮下に移植した。2)ハイブリッドバイオマテリアルを同様にマウスに移植し、経時的に再生骨軟骨組織の変化を組織学的に分析した。これにより、細胞寿命を延長させた関節構成細胞の有用性と、ハイブリッドバイオマテリアルの関節(骨軟骨)組織再生能をin vivoで評価した。これらの知見を研究成果として発表するため、論文を作成中である。細胞寿命延長操作をした細胞と高機能マトリックスを組み合わせたハイブリッドバイオマテリアルのin vitroにおける組織再生効果これまでに得られた知見・培養技術を用いて、細胞寿命を延長させる操作を行った骨軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞をバイオマトリックスをscafolldとしてin vitroで培養した研究を前年度に引き続き継続して、データーの精度を高めた。

ハイブリッドバイオマテリアルを用いて再生した骨軟骨組織の機能・安定性評価ハイブリッドマテリアルを用いて再生した骨軟骨組織の対メカニカルストレス(対荷重性)、炎症性サイトカイン反応性など、再生組織の強度、耐用性を検討した。特に、静水圧荷重下や異なる酸素分圧下に細胞や組織を培養した場合のバイオマテリアルの変化については、今後の医療用素材開発に資する重要な知見が得られた。これらの結果は、1)関節構成細胞の細胞寿命・老化の制御機構と関節変性老化との関連、2)骨軟骨細胞および組織幹細胞(間葉系骨髄幹細胞)の細胞寿命(老化)克服のための新技術の開発、3)組織幹細胞の分化誘導、細胞寿命延長を誘導する高機能バイオマテリアルの開発を行なう上で最重要な基礎的知見である。上記の高機能細胞とバイオマテリアルをScaffoldに用いた関節組織再生の基礎的検討や細胞老化変性の発生機序とその克服、細胞寿命の延長に関する研究は、最近クローニングされた遺伝子等の知見をもとに展開されているもので、これらの誘導因子を骨関節細胞に発現させる担体として人工マトリックスを開発し、これにより関節再生を現実のものとしたいと考えているこれらの知見を研究成果として発表するため、論文を作成中である。
長時間のジェットラグと機体振動が機内作業者の身体に与える影響

旅客機の客室乗務員は時差による影響に加え、機内作業及び作業環境の影響を受けて作業している。口腔内温度の変化をみると東行便(北米航路)の乗務帰国後は体温の頂点時間が23時間前方へ移動し、西行便(欧州航路)では46時間後方へ移動する。東行便では頂点は帰国後34日で回復するが、西行便では4日後にも回復しない例がみられた。症状としては全身の疲れ、目の疲れ、首肩の凝り、頭重、皮膚乾燥が70%を超える。身体活動量からみると、身体活動時間は東行便が長く、西行便が短い。心拍変化は活動量に応じて増減した。客室内の環境は50Hz以下の低周波騒音が93dBを超え、床振動も102dBの大きさを有していた。室温は2426°Cの間にあったが、気温は次第に低下し、約1時間では20%以下になり、12%まで低下した。身体活動量の増加とともに、体表面温度は上昇し、筋電図の積分値が増加した。東行便は昼出発する便が多いので、西行便よりも活動時間帯が長い。一般には時差による身体リズムの変調は東行便では現地のリズムに同期しやすく、西行便では同期しにくく辛いといわれるが、機内作業者では作業時間の長さ、作業時間帯が影響を与えているようであった。床振動は30125Hzに主成分を持つ振動がみられる。3040Hzはエンジンのタービンの回転により発生していた。筋活動は主として行動によって生じるが、床の揺れに応じても大きくなっていた。客室乗務員を対象として東行便(米国航路)と西行便(欧州航路)の機乗時の活動量と心拍数を各便2名についてアクティブトレーサーにより10分毎に継続的に記録し、帰国後は東行便35名、西行便40名の口腔内温度、及び自覚症状の変化を4日間に渡り観察した。併せて機乗時の作業環境としてジャンボ機B747の客室内の50Hz以下の低周波騒音、床振動、温度、湿度を継続的に記録した。口腔内温度からみられる機乗終了後の体温変化は一般地上職に比べて体温の頂期位相が23時間前方に移動し西行便では後方に移動する。東行便では帰国後34日で1516時に復するが西行便では4日目でも1618時までしか戻らなかった。症状としては全身の疲れ、目の疲れ、首肩の凝り、頭重、皮膚乾燥が70%を越える訴え率であった。身体活動量からみると東行便は活動状態が悪く、西行便では活動時間が少い。心拍変化は活動量に応じて増減を繰り返した。機内休憩時の心拍帰国後の安静時心拍のCV値((変動分散値)/(平均値))をみると機内休憩時は小さく帰国後大きくなる傾向がみられ自律神経緊張の亢進が示唆された。客室内の環境をみると50Hz以下の低周波騒音が常時93bBを超え、振動も約102dBの大きさを有していた。ちなみに高速バスでは低周波騒音は約100dB新幹線では低周波騒音98dB振動約90dBの大きさである。気温は2426°Cの間に保たれているが、湿度は機乗前約50%であったのが機体上昇後降下し始め約1時間で20%以下となりその状態が継続し最低で12%まで低下した。ジェットラグと作業状態、作業環境は体温シフトが発表し東行便では前方へ西行便では後方へ頂点位相が移動し活動量では昼行便の東行便が夜行便の西行便より多い。共通の問題としては低周波騒音、機内の床振動、機内の乾燥が大きな問題を有しているようであった。

旅客機の機内作業者のジェットラグによるサーカデイアンリズムの頂点は東行便(北米行き)群では国内作業者の頂点(午後2時3時)より朝方へ移動し,西行便(欧州行き)群では夕方へ移動することが前年の研究で明らかになり、この状態は帰国後4日から7日かかって国内のリズムに戻ってゆく。本年度は機内作業者下肢と腰部の、体表温度、表面筋電図と機内の床の振動を測定観測して解析を行った。身体活動計による観測した活動量の増加とともに体表温度が上昇し、筋電図の積分値が増加した。但し、体表温度は仮眠休憩時の入眠時においても若干上昇する。上昇の見られない例は入眠が困難であった。機内湿度が815%と低いためか、下腿の体表温度は活動しているにもかかわらず低い状態が続いていた。東行便は昼出発する便が多いため、夜出発する西行便に比べ、旅客は機乗中の中央時間帯を仮眠で過ごし、離陸後、着陸前に覚醒時を過ごし、東行便の作業者では活動量が西行便群よりも多くなる。一般には機内活動の少ない旅客では東行便では現地のリズムに合いやすくて辛さが少なく、西行便では現地のリズムに合いにくいために辛いといわれるが、機内作業者ではリズムへの適合以外の作業時間帯の問題が存在する。床振動はB747について行ったが、30125Hzに主成分を持つ振動がみられ、特に3040Hzにみられる振動はタービンの回転によって発生する振動と考えられた。離陸上昇時は1015dB水平航行時よりも床振動が大きいが、水平航行時は安定していた。当初考えていた、0.810Hzの低周波振動はあまりみられず、却って比較のため測定した旅客鉄道の方が大きかった。国内便のB777はB747よりも床振動が5dB程度大きい。筋活動は床振動の大きさと関連が見られた。上空の気圧変動による機体の揺れが発生したときは筋電図上大きな筋活動として現れていた。
外交文書編纂と以酊庵輪番制-元禄竹島一件による外交折衝の変化と「外交機関」

(1)以酊庵輪番制に関わる史料・論文、(2)対馬藩士の手になる外交史料(『善隣通交』『善隣通書』ほか)、(3)(1)(2)と密接に関連すると思われる対馬藩政史料〔国元日記や江戸藩邸日記〕、(4)元禄竹島一件に関わる論文、史料、(5)近世日朝間における外交折衝の特色を分析・評価する上で参考となる近代日朝漂流史料、を収集した。収集史料のうち、いくつかを選んで翻刻作業を進め、分析を行った。以酊庵輪番制については、現時点で得られる先行研究の整理を行った上で問題点を整理した。既往の評価が一面的であることを明らかにすると共に、今後以酊庵輪番制研究を進めていうくえで解明すべき点を具体的に指摘することとなった。それら諸論点のうち、第86代輪番僧であった梅荘顕常の動向に関わっては口頭報告を行った。対馬藩士の手になる外交史料については、収集した諸本間の比較検討を行った。また、対馬藩における外交史料集の嚆矢ともいえる『善隣通書』『善隣通交』の成立と元禄竹島一件交渉との関わりを検討した。その作業を進める過程で、元禄竹島一件交渉について詳細な検討を行わざるをえず、これまで歴史具体的な分析の不足していた安龍福事件について詳細に明らかにし、口頭発表を行うとともに原稿化した。(1)以酊庵輪番制に関わる史料・論文、(2)対馬藩士の編纂になる外交史料(『善隣通交』など)、(3)元禄竹島一件の歴史的評価にかかわる史料・論文、を収集するとともに、(4)近世日朝間における外交折衝の特色を分析・評価するうえで必要と思われる近代日朝漂流関係史料をも収集した。収集した史料のうちいくつかを選んで翻刻作業を進めるとともに、とくに(3)について、元禄竹島一件が、当時どのように評価され、のちにどのように評価替えが進められてゆき今日に至るのか、との観点から分析を進めた。元禄竹島一件に際して日朝間で争われたのは、そもそもは竹島(欝陵島)海域における漁業権の問題であって、竹島(欝陵島)の領有権に関わるものではなかった.また、そこに往々にして松島(こんにちの竹島/独島)の領有権問題が議論されたかのごとく誤解されるが、当時の議論にそうした痕跡は存在しない。松島(竹島/独島)領有権問題が当時争われたと解される重要な論拠としての安龍福事件について、その解釈がいかに不当であるかを解明した(研究成果欄の『鳥取地域史研究』所収論文)。一方、漁業権問題が領有権問題にすり替わっていく経過に関わっては、地誌・古地図の分析を通じて、竹島(欝陵島)-隠岐諸島海域に対する領域認識の変化としてアウトラインを描いておいた(『史林』論文)。また、安龍福に対する過大な評価を「伝説」の形成としてとらえ、口頭発表をも行った(2006年10月26日・ソウル大学校師範大学、2007年1月14日・名古屋大学)。前年度にひきつづき、(1)以酊庵輪番制に関わる史料・論文、(2)対馬藩士の手になる外交史料(『善隣通交』『善隣通書』ほか)、(3)(1)(2)と密接に関連すると思われる対馬藩政史料〔国元日記や江戸藩邸日記〕、(4)元禄竹島一件に関わる論文、史料、を収集した。収集史料のうち、いくつかについて翻刻および分析作業を進めた。上記のうち(1)については、現時点で得られる先行研究の整理を行った上で、以酊庵輪番制研究の問題点を整理した。それらのうち、第86代輪番僧であった梅荘顕常の動向に関わって口頭報告を行い、参加者からの批判を仰いだ(2008年12月15日、九州国立博物館開館3周年記念国際シンポジウム第2セッション

〔九州国立博物館〕、同年12月25日、アジア的公共性を問い直す日韓研究プロジェクトシンポジウム〔名古屋大学〕)。(2)(3)については、研究成果報告書に成果を盛り込んだ。(4)については、二回の口頭報告(2008年6月23日、朝鮮史研究会関西部会〔河合塾大阪校舎〕、同年11月17日、朝鮮史研究会関東部会〔東京大学〕)を踏まえて原稿化した(研究発表欄の『鳥取地域史研究』論文)。
都市近郊地域における水田地域の特性解明にもとづく生態系保全型営農方法に関する研究

1.魚類の水田の利用実態の解明2005・2006年に、多摩川中流域に位置する府中用水およびその受益水田(東京都国立市)を対象に、水田の水口・水尻にトラップを設置し、用排兼用型水路-未整備水田間の魚類の移動数調査を行った。その結果、落水時に最も多くの魚類が脱出すること、落水や農薬散布、降雨の有無によらず取水後20日から40日にかけて、ドジョウ、タモロコ、フナ属の稚魚(ヒレが完成する)が多数脱出した。よって、ヒレが完成して遊泳が活発になった個体が水田から脱出するものと考えられたが、水温や餌条件の変化などの脱出を促す主要な要因は課題として残された。また、水田からの脱出経路について見ると、ドジョウは水尻から、タモロコとフナ属は水口から圧倒的に多くの個体が脱出した。2.水田内部での生物の生息に落水が与える影響水田の落水時に水口と水尻にトラップを設置し、1時間ごとに水田から出てくる魚類の採捕と水田内部の水深の測定を行った。その結果、水田水深の低下に対し、タモロコやフナ属は早い段階で脱出するのに対してドジョウはもっと水深が低下してから脱出し始める傾向があり、その理由は、ドジョウはある程度乾燥に耐えることができるために、水深低下を危機と感じる度合いが他の魚種と比べて小さいためと考えられた。農工大実習田に設けた5aの区画を5cm湛水し、ドジョウ・メダカ各500個体、フナ属150個体を区画に均等に放流した後、1時間ごとに脱出してくる魚類の確認と区画の水深測定を行った。その結果、魚種によって脱出率が異なり、メダカは90%以上が脱出したのに対してドジョウは7.2%、フナ属は14.2%となり、水田に多くの魚類が取り残される可能性が示唆された。水田水域の魚類個体群の衰退が進んでいる場合には、個体の供給源としての水田の役割が重要となることから、水田内の魚類が水路へと脱出できる技術(水管理方法など)の必要性が認められた。3.水田における生物の生息に考慮した水田の構造および営農方法(落水、農薬散布)の提案流れに向かって湖上する性質が強い遊泳魚にとって、用水路系への脱出が容易であることから、用水路系の存在が魚類の水田における繁殖と分散に寄与していることが示された。よって、圃場整備事業において用排兼用型の潅漑システムを保全する区域を設けること、排水路堰上げ式水田魚道(端、2005)の採用を提案した。また、水田水域の魚類の保全に資する営農方法として、多くの当歳魚が水田から脱出する取水後40日まで農薬散布(特に殺虫剤)を差し控えること、農薬散布前に水深1cm程度まで落水して魚類を水田から脱出させた後に農薬散布を行うことを提案した。よって、圃場整備事業において用排兼用型の潅漑システムを保全する区域を設けること、排水路堰上げ式

水田魚道(端、2005)の採用を提案した。また、水田水域の魚類の保全に資する営農方法として、多くの当歳魚が水田から脱出する取水後40日まで農薬散布(特に殺虫剤)を差し控えること、農薬散布前に水深1cm程度まで落水して魚類を水田から脱出させた後に農薬散布を行うことを提案した。
技術の高度化と交通輸送システムの適応に関する研究

本研究では、在来の鉄道、リニアモーターカー、航空輸送及び物流について、技術開発とその適応の可能性を考察した。と同時に、交通システム全体について問題を孝察した。在来鉄道については、環境保全や安全性も考慮した新しい発想を取り入れる必要がある。また、鉄道と道路輸送技術との融合の可能性も検討されなければならない。リニアモーターカーは、時間短縮効果や沿線地域への機能分散効果等が期待される。しかし、それは在来型新幹線との比較により計画されるべきものである。ジェット化によって飛躍的に発展した航空は、ハイテク化の進展、超大型機や極超音速機の実用化等、一層の技術高度化の可能性が見込まれる。しかし、航空を社会に定着させるトータル・システムの構築が必要である。物流においては、システムの改善が進み、一般市民も広くその成果を利用できるようになった。しかし同時に交通渋帯、交通事故、環境汚染、労働力不足および石油資源の大量消費などの問題を生じた。その解決の技術開発が要請される。交通プロジェクトは対象地域との関連において把握されるべきであり、本研究では91年度に仙台都市圏の物流を、92年度には大阪都市圏の交通計画を調査した。東京都市圏と東北地方北4県への結節点である仙台都市圏の物流量は現在の技術で対応可能な規模であり、物流情報システムの導入も容易である。また、大阪都市圏では将来技術を織り込んだプロジェクトが推進されているが、実現までの過程の科学的な把握、経済動向とのギャップの解消、身近な交通問題の解決の必要性がある。
硝酸還元酵素系遺伝子群を協同的に転写制御するDNA結合 蛋白質:NarL・Fnr

嫌気的条件での大腸菌硝酸呼吸系遺伝子群(nark:硝酸輸送蛋白質をコ-ド)とnarCHJI(硝酸還元酵素複合体をコ-ド)の発現には,各プロモ-タ-上流にある制御領域にそれぞれ作用する二つの転写促進因子が必要である.一つは,分子状酸素センサ-であると同時に嫌気呼吸系遺伝子群の活性化因子であるFNR蛋白質である.他の一つは,硝酸イオンに対する二成分制御系:NarxーLでの制御因子としてのNarL蛋白質である.それら両制御蛋白質からなる二制御因子系(Two Regulator System)によるnarオペロンの転写制御機構の究明と,両制御蛋白質のそれぞれが認識するDNAの高次構造の決定とを目的とした本研究において,平成3年度には次のような研究成果を得た.1.平成2年度に確立していたNarLとFNRの大量発現系を利用して,それら両制御蛋白質の精製を検討した.FNRに対してはその精製法を確立するとともに,その家兎抗血清を作製した.一方,NarLの方は,最終精製段階におけるその蛋白質の大半が沈澱するという問題点を残しており,現在,その解決策を検討中である.2.精製FNRは,単独では,narオペロンへの特異的な結合を起こさなかったが,RNAポリメラ-ゼのホロ酵素およびコア酵素の存在下では結合するとともに,その酵素の結合能を増加させた。一方,シグマ因子との共存下では,FNRは結合しなかった.3.NarL非存在下でのin vitro転写実験において,narCHJI・narKの両プロモ-タ-からの転写は起こらなかった。しかし,narX(硝酸センサ-をコ-ド)のプロモ-タ-を含むそのnarKのフラグメントではnarXの方に対応した転写が観測され,その転写活性はFNRによって抑制されていた.4.現在,narオペロンに対する精製FNRと部分精製NarLとの協同的な転写制御のin vitro実験を進行中である(平成4年2月)嫌気的条件での大腸菌硝酸呼吸系遺伝子群(nark:硝酸輸送蛋白質をコ-ド)とnarCHJI(硝酸還元酵素複合体をコ-ド)の発現には,各プロモ-タ-上流にある制御領域にそれぞれ作用する二つの転写促進因子が必要である.一つは,分子状酸素センサ-であると同時に嫌気呼吸系遺伝子群の活性化因子であるFNR蛋白質である.他の一つは,硝酸イオンに対する二成分制御系:NarxーLでの制御因子としてのNarL蛋白質である.それら両制御蛋白質からなる二制御因子系(Two Regulator System)によるnarオペロンの転写制御機構の究明と,両制御蛋白質のそれぞれが認識するDNAの高次構造の決定とを目的とした本研究において,平成3年度には次のような研究成果を得た.1.平成2年度に確立していたNarLとFNRの大量発現系を利用して,それら両制御蛋白質の精製を検討した.FNRに対してはその精製法を確立するとともに,その家兎抗血清を作製した.一方,NarLの方は,最終精製段階におけるその蛋白質の大半が沈澱するという問題点を残しており,現在,その解決策を検討中である.2.精製FNRは,単独では,narオペロンへの特異的な結合を起こさなかったが,RNAポリメラ-ゼのホロ酵素およびコア酵素の存在下では結合するとともに,その酵素の結合能を増加させた。しかし,narX(硝酸センサ-をコ-ド)のプロモ-タ-を含むそのnarKのフラグメントではnarXの方に対応した転写が観測され,その転写活性はFNRによって抑制されていた.4.現在,narオペロンに対する精製FNRと部分精製NarLとの協同的な転写制御のin vitro実験を進行中である(平成4年2月)
出産時のトラウマ体験からの回復を支えるケアの開発

1.出産時のトラウマ体験の分析研究協力が得られた5ヶ所の助産院、2ヶ所の病院が保有する、女性が書いた出産体験の記録から出産時のトラウマ体験を抽出し、その体験の分析を行った。その体験の中で、多くの場合、援助者との関係性が原因となっていたことが明らかになった。また、トラウマ体験となった出産後の生活、特に夫婦関係や育児に対し大きな影響があることがわかった。第1子の出産がトラウマになった女性の第2子の出産は、トラウマを克服し自己の再統合を可能にしていたことが明らかになった。出産には、子どもの誕生という体験と同時に、女性自身が「再生する」または「生まれ変わる」という意味を持っていることがわかった。現在、第一子の出産体験がトラウマ体験でありながらも第2子を出産した女性に対してインタビューを行い、その結果の分析を行っている。2.出産時のトラウマ体験からの回復を支えるケアの試案上記5ヶ所の助産所に勤務する助産婦5名に対し、第一子の出産体験がトラウマ体験であった女性の出産時のケアについて、助産婦から見たその女性に出産体験についてをインタビューにて聞き取り調査を行った。その結果については現在分析中である。
癌関連スフィンゴ糖脂質と膜分子間の相互作用の時空間的動態と癌性形質増強機構の解析

本研究では癌関連糖脂質(GD3、GD2)と、主に正常細胞に発現する糖脂質(GM3、GM2、GM1)の機能的差異を検討し、癌細胞の接着、移動、浸潤・転移及びエクソソームにおける癌関連糖鎖の役割と作用機構を解明する。平成30年度は、酸性糖脂質のGM3のみを有するヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-28由来N1細胞に各種の糖鎖合成酵素遺伝子を導入して作製したGD3(+)細胞、GM2(+)細胞、GM1(+)細胞、GD2(+)細胞を用い、それらのシグナル分子の活性化を比較検討した。その結果、FCS刺激によりコントロール細胞(GM3(+)細胞)と比較してGD3(+)細胞ではp130Cas及びpaxillinのリン酸化が増強した。しかし、GD2(+)細胞はp130Cas及びpaxillinのリン酸化の増強は認められなかった。これらの分子の活性化の差異が、GD3(+)細胞では浸潤性や接着性が上昇するが、GD2(+)細胞では浸潤性及び接着初期の接着性が低いことの要因と推察された。また、蛍光ラベルGD3(ATTO594-GD3)、GM3(ATTO594-GM3)及び、GM1(ATTO594-GM1)をコントロール細胞に取り込ませ、タイムラプス観察を行なった。その結果、移動が顕著な細胞のリーディングエッジにGD3が集合し、GD3が細胞の移動方向を先導することが示唆された。GM3及びGM1では、GD3のような顕著な局在は認められなかったが、今後、再検討する。エクソソームの解析については、GD3またはGD2が発現しているヒトメラノーマ細胞株から超遠心法によりエクソソームを調製した。エクソソームのqualityはWestern blottingによりエクソソームのマーカータンパク(CD63, TSG101)を検出して検討した。これまでに各種の糖鎖リモデリング細胞を用いて、その形質の差異について解析してきた。その結果、癌関連糖脂質(GD3, GD2)発現細胞では、細胞増殖と接着性が増強した。しかし、GD2発現細胞は、接着初期では接着性が低く、接着後期で顕著に上昇した。また、浸潤性については、GD3発現細胞では亢進したが、GD2発現細胞は亢進が認められなかった。GD3発現細胞とGD2発現細胞におけるこのような差異は、p130Cas及びpaxillinのリン酸化の差異が要因となることが示唆され、これらの結果を「PLoS One 13:e0206881. doi: 10.131/journal.pone.0206881. eCollection, 2018」に報告した。タイムラプス観察による蛍光ラベル糖脂質の生細胞膜局在の解析については、GD3に加えて、GM3及びGM1についても開始した。エクソソームの解析については、超遠心法によりヒトメラノーマのエクソソームが回収でき、エクソソームのマーカータンパク質(CD63, TSG101)が確実に検出できた。よって、本実験における超遠心法によるエクソソームの調製法が確立できた。1SK-MEL-28 N1細胞のコントロール細胞に蛍光ラベルGD3(ATTO594-GD3)を取り込ませ、タイムラプスイメージングにより、CL-I上の細胞動態とGD3の細胞膜上の経時的局在変化を観察する。蛍光ラベルGM3及びGM1についても同様に解析し、比較検討する。また、蛍光強度の定量法を検討する。2細胞をCL-Iディッシュに播き、経時的に、糖脂質、インテグリン、FAK、paxillin及びF-アクチンを免疫染色後、共焦点レーザー顕微鏡による三次元イメージングを行い、糖脂質との局在を検討する。3各種のメラノーマ細胞株、及び糖鎖改変細胞由来のエクソソームの分泌量及びエクソソームに含まれる糖脂質についてTLC、Western blots及び質量分析等により解析し、比較検討する。また、エクソソームの調製法について、超遠心法とTim4ビーズによる調製法で比較検討する。

その結果、移動が顕著な細胞のリーディングエッジにGD3が集合し、GD3が細胞の移動方向を先導することが示唆された。GM3及びGM1では、GD3のような顕著な局在は認められなかったが、今後、再検討する。エクソソームの解析については、GD3またはGD2が発現しているヒトメラノーマ細胞株から超遠心法によりエクソソームを調製した。エクソソームのqualityはWestern blottingによりエクソソームのマーカータンパク(CD63, TSG101)を検出して検討した。これまでに各種の糖鎖リモデリング細胞を用いて、その形質の差異について解析してきた。その結果、癌関連糖脂質(GD3, GD2)発現細胞では、細胞増殖と接着性が増強した。しかし、GD2発現細胞は、接着初期では接着性が低く、接着後期で顕著に上昇した。また、浸潤性については、GD3発現細胞では亢進したが、GD2発現細胞は亢進が認められなかった。GD3発現細胞とGD2発現細胞におけるこのような差異は、p130Cas及びpaxillinのリン酸化の差異が要因となることが示唆され、これらの結果を「PLoS One 13:e0206881. doi: 10.131/journal.pone.0206881. eCollection, 2018」に報告した。タイムラプス観察による蛍光ラベル糖脂質の生細胞膜局在の解析については、GD3に加えて、GM3及びGM1についても開始した。エクソソームの解析については、超遠心法によりヒトメラノーマのエクソソームが回収でき、エクソソームのマーカータンパク質(CD63, TSG101)が確実に検出できた。よって、本実験における超遠心法によるエクソソームの調製法が確立できた。1SK-MEL-28 N1細胞のコントロール細胞に蛍光ラベルGD3(ATTO594-GD3)を取り込ませ、タイムラプスイメージングにより、CL-I上の細胞動態とGD3の細胞膜上の経時的局在変化を観察する。蛍光ラベルGM3及びGM1についても同様に解析し、比較検討する。また、蛍光強度の定量法を検討する。2細胞をCL-Iディッシュに播き、経時的に、糖脂質、インテグリン、FAK、paxillin及びF-アクチンを免疫染色後、共焦点レーザー顕微鏡による三次元イメージングを行い、糖脂質との局在を検討する。3各種のメラノーマ細胞株、及び糖鎖改変細胞由来のエクソソームの分泌量及びエクソソームに含まれる糖脂質についてTLC、Western blots及び質量分析等により解析し、比較検討する。また、エクソソームの調製法について、超遠心法とTim4ビーズによる調製法で比較検討する。(理由)平成30年度は実験が順調に進み、消耗品の支出が予定よりも少額となった。具体的には、糖鎖リモデリング細胞における細胞形質とシグナル分子の解析が進み、論文として報告できた。また、本実験のためのエクソソームの調製法(超遠心法)も確立できた。(使用計画)1)酸性糖脂質と細胞膜分子との相互作用を解析するために、各種の抗体を購入する。2)エクソソームを回収、調製するためにTim4ビーズを購入する。
モデル櫛型高分子の粘弾性:メタロセン触媒系ポリオレフィンのための基礎的研究

近年さかんに製造・使用されているメタロセン触媒系ポリオレフィンについては,長時間緩和が少量の長鎖分岐に著しく影響されると推測されている.しかし,これまでの研究では,分子量分布の影響と分岐の影響が明瞭に分離されていなかった.このような状況下で,本研究では,従来得られなかった枝および幹部分に分子量分布のない櫛型モデルポリブタジエンを,ピリジン基の選択的反応性を利用した2段階アニオン・カップリング法で合成した.その粘弾性挙動を調べた結果,この櫛型高分子の終端緩和は幹部分の緩和であること,絡み合い系の挙動の記述によく用いられる管模型の枠内では,この幹緩和は束縛解放機構で進行することも明らかにした.現在の管模型では,管の運動は,束縛解放機構に対応した遅延Rouse型運動をもたらすのみでなく,管の動的膨張ももたらして鎖の緩和を誘起する.特に,分岐鎖については,管膨張過程が重要な緩和過程であると考えられてきた.しかし,束縛解放過程と管膨張過程を識別し,管膨張過程そのものを実験的に検証した例はない.上記の櫛型鎖の緩和をさらに精密に理解するため,より基本的な直鎖および星型鎖について管膨張過程を検証した.この検証においては,鎖骨格に平行な双極子を有する鎖の大規模運動は粘弾性量と誘電量に異なる形で平均化されていることに着目し,鎖の緩和過程で管が膨張する場合に成立する粘弾性緩和関数と誘電緩和関数の関係を導出した.直鎖単分散系についてはこの関係が成立し,管が実際に膨張していることを見い出した.一方,星型鎖単分散系および直鎖ブレンド系についてはこの関係は成立せず,管膨張が完了する以前に束縛解放機構によって鎖の終端緩和が起こることを明らかにした.この結果は,星型鎖の緩和が管膨張に支配されているとする従来の考え方に訂正をもたらす結果であり,上記の櫛型鎖が束縛解放機構で緩和すること良く対応した結果である.近年さかんに製造・使用されているメタロセン触媒系ポリオレフィンについては,長時間緩和が少量の長鎖分岐に著しく影響されると推測されている.しかし,これまでの研究では,分子量分布の影響と分岐の影響が明瞭に分離されていなかった.このような状況下で,本研究では,従来得られなかった枝および幹部分に分子量分布のない櫛型モデルポリブタジエンを,ピリジン基の選択的反応性を利用した2段階アニオン・カップリング法で合成した.その粘弾性挙動を調べた結果,この櫛型高分子の終端緩和は幹部分の緩和であること,絡み合い系の挙動の記述によく用いられる管模型の枠内では,この幹緩和は束縛解放機構で進行することも明らかにした.現在の管模型では,管の運動は,束縛解放機構に対応した遅延Rouse型運動をもたらすのみでなく,管の動的膨張ももたらして鎖の緩和を誘起する.特に,分岐鎖については,管膨張過程が重要な緩和過程であると考えられてきた.しかし,束縛解放過程と管膨張過程を識別し,管膨張過程そのものを実験的に検証した例はない.上記の櫛型鎖の緩和をさらに精密に理解するため,より基本的な直鎖および星型鎖について管膨張過程を検証した.この検証においては,鎖骨格に平行な双極子を有する鎖の大規模運動は粘弾性量と誘電量に異なる形で平均化されていることに着目し,鎖の緩和過程で管が膨張する場合に成立する粘弾性緩和関数と誘電緩和関数の関係を導出した.直鎖単分散系についてはこの関係が成立し,管が実際に膨張していることを見い出した.一方,星型鎖単分散系および直鎖ブレンド系についてはこの関係は成立せず,管膨張が完了する以前に束縛解放機構によって鎖の終端緩和が起こることを明らかにした.この結果は,星型鎖の緩和が管膨張に支配されているとする従来の考え方に訂正をもたらす結果であり,上記の櫛型鎖が束縛解放機構で緩和すること良く対応した結果である.近年、単分散の幹上に同一鎖長の枝が均等なスパンでグラフトされたモデル櫛型高分子の粘弾性に対する研究が望まれている。この高分子は、これまでに使用されてきた1段階カップリング反応では合成できない。本研究では、このモデル櫛型高分子の合成経路を確立し、そのレオロジー的性質の解明を行う。本年度は、この合成経路を見い出し、櫛型高分子の予備的合成と粘弾性測定を行った。その結果を以下にまとめる。合成:ポリブタジエン(PB)アニオンは、2,6-ビス(クロロメチル)ビリジン(BCMP)の2個のクロロメチル基に対してグラフト型の停止反応を行い、また、ビリジン環のo-位の炭素に対してはニトロアニオン形成を伴うグラフト反応を行う。さらに、ビリジン環のp-位の炭素に対しても、グラフト反応を行うことが出来る。一方、ジフェニルエチレン(DPE)で末端修飾したPB-DPEアニオンは、2個のクロロメチル基とのみ反応する。この反応選択性を利用して、まず、幹プレポリマーとなるDPE-PB-DPEパイアニオン(M=7.5万)をベンゼン中で重合し,所定量のBCMPでカップリングしてプレポリマーのunimer,dimer,trimerを得た。次に、幹となるunimer,dimer-を分別・単離し、枝PBアニオン(M=4.2万)とカップリングした。その粗生成物を分別して、目的とするモデル櫛型高分子を得た。

線形粘弾性:これらの櫛形試料の20wt%n-テトラデカン溶液の線形粘弾性を調べ、幹の運動に対応する終端緩和を見い出した.その緩和時間およびコンブライアンスの検討から、絡み合った枝の運動で誘起されるRouse型の束縛解放機構によって、幹が運動・緩和することが明らかとなった。次年度計画:以上の知見をもとに、一連のモデル櫛形高分子の合成と粘弾性測定を行い、その緩和機構の詳細を解明する.近年さかんに製造・使用されているメタロセン触媒系ポリオレフィンについては,長時間緩和が少量の長鎖分岐に著しく影響されると推測されている.しかし,これまでの研究では,分子量分布の影響と分岐の影響が明瞭に分離されていなかった.このような状況下で,本研究では,従来得られなかった枝および幹部分に分子量分布のない櫛型モデルポリブタジエンを,ピリジン基の選択的反応性を利用した2段階アニオン・カップリング法で合成した.その粘弾性挙動を調べた結果,この櫛型高分子の終端緩和は幹部分の緩和であること,絡み合い系の挙動の記述によく用いられる管模型の枠内では,この幹緩和は束縛解放機構で進行することも明らかにした.現在の管模型では,管の運動は,束縛解放機構に対応した遅延Rouse型運動をもたらすのみでなく,管の動的膨脹ももたらして鎖の緩和を誘起する.特に,分岐鎖については,管膨張過程が重要な緩和過程であると考えられてきた.しかし,束縛解放過程と管膨張過程を識別し,管膨張過程そのものを実験的に検証した例はない.上記の櫛型鎖の緩和をさらに精密に理解するため,より基本的な直鎖および星型鎖について管膨張過程を検証した.この検証においては,鎖骨格に平行な双極子を有する鎖の大規模運動は粘弾性量と誘電量に異なる形で平均化されていることに着目し,鎖の緩和過程で管が膨張する場合に成立する粘弾性緩和関数と誘電緩和関数の関係を導出した.直鎖単分散系についてはこの関係が成立し,管が実際に膨張していることを見い出した.一方,星型鎖単分散系および直鎖ブレンド系についてはこの関係は成立せず,管膨張が完了する以前に束縛解放機構によって鎖の終端緩和が起こることを明らかにした.この結果は,星型鎖の緩和が管膨張に支配されているとする従来の考え方に訂正をもたらす結果であり,上記の櫛型鎖が束縛解放機構で緩和することと良く対応した結果である.
生体肝移植後の肝細胞癌再発に対するDNAワクチン療法の開発

インターロイキン12(以下、IL-12)と樹状細胞(以下、DC)を併用した免疫抑制下での抗腫瘍効果を検討した。MH134肝癌細胞によるマウス皮下腫瘍モデルを用い、IL-12/DCを腫瘍内導入し、治療8日目より免疫抑制状態として、無治療、DC単独、IL-12単独、IL-12/DC併用の4群で比較した。原発腫瘍に対する効果は、治療28日目の皮下腫瘍径で比較した。無治療/DC単独/IL-12単独/併用群で、7.6±0.2/4.8±0.1/2.1±0.1/1.7±0.1cm^3であり、併用群で有意に小さく、抗腫瘍効果を認めた。微少転移に対する効果は、治療28日目の肺及び肝における転移巣の個数、最大径で比較した。肺微小転移を、無治療/DC単独/IL-12単独/併用群で、100/100/63/0%に認め、肺左葉矢状断での転移巣個数並びに最大径は、37.3±7.9/13.8±0.8/3.29±1.55/0個、1.9±0.5/1.1±0.1/0.2±0.1/0mmであった。肝微少転移は、無治療/DC単独/IL-12単独/併用群で、100/100/75/0%に認め、肝中葉水平断での転移巣個数並びに最大径は、115.0±36.2/60.6±7.6/18.0±6.1/0個、0.7±0.0/0.6±0.0/0.4±0.1/0mmであった。併用群で、有意に転移抑制効果を認めた。さらに、治療14日目(免疫抑制下7日目)のMH134に対する特異的CTL assayでは、無治療/DC単独/IL-12単独/併用群で、0/4.9±2.7/11.0±1.4/22.8±4.2%で、免疫抑制下でも併用群では有意に抗腫瘍効果を認めた。以上より、IL-12/DC併用療法による免疫抑制下での抗腫瘍効果、転移抑制効果は効果的であり、肝癌に対する生体肝移植のNeoadjuvant immunotherapyの有効性が示唆された。免疫抑制状態での抗腫瘍効果を判定する為に、まず初めに免疫抑制状態の肝細胞癌マウスモデルに対して、樹状細胞とIL12による抗腫瘍効果の検討を行うこととした。ヒト肝癌細胞株であるMH134細胞をviabilityの良い状態で大量に保存し、その1つを用いて肝細胞癌マウスモデルの作製を行った。MH134細胞を2.5×10^5個/0.5mlにPBSを用いて調整し、C3Hマウスの皮下に慎重に打込んだ。肝細胞癌皮下腫瘍マウスモデルの良好な作製が可能となった。続いて、C3Hマウスの両側大腿骨・脛骨の骨髄を採取し、樹状細胞の採取を行った。採取した骨髄中の細胞を慎重に分離し、未成熟な樹状細胞のみを抽出した。

採取した未成熟な樹状細胞を培養し、同時にLPSにて活性させた。LPSによって活性され成熟した細胞をFACSにて解析したところ、MHC class I、CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD86の発現を認め、CD4、CD8、Gr1の発現は認めなかった。以上より良好な樹状細胞の精製を確認した。IL12遺伝子を組み込んだプラスミドを腫瘍内に打込み、局所でのIL12発現を可能とする為に、まず、IL12遺伝子を組み込んだプラスミドの作製を行った。当科にて以前用いて保存してあったプラスミドを、制限酵素を用いて電気泳動にかけて評価したところ、良好な保存状態ではなかった。再度、大腸菌に導入して良好な状態のプラスミドを抽出し、それを用いて大量に作製した。免疫抑制状態の指標とする為に、スキングラフトを用いることとした。C3Hマウスの皮膚のみを1cm^3程剥離し、同部位にBalb/Cマウスの皮膚を移植した。FK506の腹腔内投与を移植前日から行い、免疫抑制状態とした。移植した皮膚の良好な生着を認め、良好なスキングラフトモデルの作製が可能となった。免疫抑制状態での抗腫瘍効果を判定する為に、まず初めに免疫抑制状態の肝細胞癌マウスモデルに対して、樹状細胞とIL12による抗腫瘍効果の検討を行うこととした。前準備としての作業を現在行っているところである。ヒト肝癌細胞株であるMH134細胞を用いて、肝細胞癌皮下腫瘍マウスモデルの良好な作製が可能となった。また、C3Hマウスの両側大腿骨・脛骨の骨髄を採取し、樹状細胞の精製作業を修練し、良好な採取が可能となった。続いて、IL12遺伝子を組み込んだプラスミドの作成、精製を行い、保存を行った。免疫抑制状態の指標の為のBalb/Cマウスの皮膚を用いたスキングラフト作成も可能となった。最終的な目標は生体肝移植後の再発に対する免疫抑制状態での抗腫瘍効果の検討であり、今年度は、SD並びにWisterラットを用いたカフ法による全肝移植の手技の習得を中心に行った。ドナーの全肝採取の手技(右腎摘出、右副腎摘出、胆管ステント留置、総肝動脈結紫切離、幽門静脈並びに肺静脈結紫、グラフト採取)、冷ラクテックを用いたグラフトの還流、門脈カフ並びに静脈カフの作成、静脈形成等のバックテーブルの手技は早期の段階で習得可能であった。しかし、実際のレシピエントへの全肝移植の手技が困難であり、習得まで多大な時間を要した。耐術はするものの、術後1日生存に至らず、その原因として、静脈吻合から門脈再建に至る無肝期の時間が長いことが考えられた。多大な時間を要したものの、現在は手技の安定を認め、良好なカフ法を用いたラット全肝移植モデルの作成が可能となった。
魚類における免疫応答調節波性因子の産生と防御免疫における関与

サイトカインは動物の免疫応答調節因子として重要な役割を担っている。しかし魚類においては、それら免疫応答を調節するサイトカインの性状ならびに防御免疫における役割と意義はほとんど不明である。そこで今回、ニジマスを用いて血清中の造血幹細胞増殖刺激因子(主としてM-CSF)の存在を検討し、また、ニジマスマクロファージの性状を解析した。頭腎細胞をニジマス血清存在下で軟寒天中で培養すると、マクロファージからなる細胞のコロニーが形成された。LPS、フロインド完全アジュバント、あるいはMDPを接種した魚の血清を培養に加えると、コロニー形成は促進された。これらの結果より、ニジマスにおけるM-CSF様因子の存在が示された。一方、頭腎マクロファージをボツリヌスC_2毒素処理すると、アクチンのADPリボシル化が起こるとともに、マクロファージの食作用が阻害された。この結果より、他の脊椎動物同様、魚類の非筋肉性アクチンもボツリヌス毒素に感受性をもつことが示された。一方、血液中に存在するCRPその他の急性期蛋白質は、感染防御免疫および生理機能維持に重要な役割を担っている。しかし、宿主の免疫応答調節における役割は必ずしも明らかではないことから、ニジマス急性期蛋白質による免疫応答調節機構を検討した。ニジマス血清からCRPおよびSAPを分離し、アミノ酸配列を解析した。その結果、既知のCRPおよびSAPを相同性を有することが明らかとなった。また、電子顕微鏡による観察で、ペントラキシン類の5角形の結合構造が認められた。炎症を誘導したニジマスから得た血清の蛋白質成分の変動を解析した結果、CRPおよび43KDの中性蛋白質が増加した。哺乳類の骨髄細胞は増殖刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3など)により分化・増殖が刺激され、軟寒天中でマクロファージあるいは顆粒球からなるコロニーを形成する。今回、魚類における造血細胞増殖刺激因子の存在を知る目的で、ニジマス頭腎(魚類における骨髄相当器官)細胞の文化・増殖に対するニジマス血清の効果を検討した。頭腎細胞を1%メチルセルロースの中で培養(20%牛胎児血清(FCS)加alpha-MEM、20°C、8日間CO_2培養)すると、ニジマス血清(1.2510%)存在下で数10個の細胞からなるコロニーが形成された(平均30コロニー/2.5x10^5頭腎細胞)。コロニー形成はニジマス血清濃度および培養細胞数に比例した。リポポリサッカライド(LPS)、フロインド完全アジュバント(FCA)あるいはムラミルジペプチド(MDP)をニジマスに腹腔内接種して得た血清は、正常血清と比べ高いコロニー形成刺激作用をもち(最高150コロニー)、接種後24時間(LPS、FCA)、あるいは48時間(MDP)で最高となった。コロニー形成細胞は付着性で強いルミスフェア粒子貧食能を有し、非特異エステラーゼ弱陽性、パーオキシダーゼ陰性弱陽性であり、形態学的観察(大きな卵円形核、青染性で空胞を有する広い細胞質)とあわせマクロファージと同定された。一方、頭腎細胞をニジマス血清存在下で浮遊培養すると、多形核白血球(分葉核、難染性細胞質、貧食能弱陽性、パーオキシダーゼ陽性)の割合、数ともにFSCのみを加えた培養と比べ増加し、培養46日で最高となった。今回の実験から、ニジマス血清中にマクロファージおよび多形核白血球の文化・増殖を刺激する因子が存在し、LPS、FCAあるいはMDPは本因子産生を促進することが示唆された。

ニジマスサイトカイン(主としてマクロファージコロニー刺激因子(macrophage-colony stimulating factor:M-CSF)のマクロファージに対する作用を検討するための予備実験として、マクロファージに対するボツリヌスC_2毒素の作用機序を調べた。C_2毒素はcomponent IおよびIIよりなる蛋白毒素である。component Iとトリプシン処理したcomponent IIは、ニジマス頭腎マクロファージおよびマウス腹腔マクロファージの合成樹脂ビーズ(ルミスフェア)貧食を阻害した。細胞死を起こさない毒素量でもマクロファージの食作用を阻害したことから、これは毒素の直接的な細胞傷害によるものではなかった。マクロファージのアクチン(非筋肉性アクチン)はcomponent IによってADPリボシル化されることから、食作用の阻害はアクチンの不活化によるものと思われた。さらに、トリプシン処理したcomponent II単独でも食作用を阻害した。今回の結果は、魚類マクロファージも他の脊椎動物同様ポツリヌスC_2毒素に感受性があることを示している。さらに、component IIはマクロファージ細胞膜に結合してマクロファージ活性に影響を及ぼすものと考えられた。今後毒素処理したニジマスにおけるサイトカイン産生(主としてM-CSF)と、M-CSFのマクロファージ活性に対する影響を検討する計画である。
pi電子共役系 starburst 分子のガラス形成能と構造との相関

われわれは、室温以上で容易に透明で安定なガラスを形成する有機低分子の創出と、そのガラス状態における物性の解明を目的として、これまでにstarburst分子と名付けたいくつかの新規なpi電子共役系分子群を合成し、これらが容易に室温以上で透明で安定なガラスを形成することを見いだすとともに、ガラス状態における物性の検討を行っている。有機低分子のガラス形成能は、その分子構造と密接に関係していると考えられるため、ガラス形成能を有するstarburst分子の単結晶を育成し、そのX線結晶構造解析を行うことは、分子構造とガラス形成能との相関を理解する上で、重要な知見を与えると考えられる。TBAはその溶融状態を室温で放冷することにより容易に透明なガラスを形成した。示差走査熱量測定により、ガラス転移温度は室温よりはるかに高い76°Cであることがわかった。ベンゼンから再結晶を行って得たTBAの単結晶について、X線結晶構造解析を行った結果、TBA分子の中央のトリフェニルアミン骨格部分は、トリフェニルアミンと同様のプロペラ構造をとることがわかった。また、ビフェニルが結晶中で平面構造をとるのに対し、TBAの三つのビフェニル骨格部分はいずれもベンゼン同士をつなぐ単結合部分でねじれた非平面構造をとっており、このようなねじれ構造が結晶化を妨げ、ガラスを形成しやすくしていると考えられる。