hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多面的自律神経モニタリングを用いたてんかん発作惹起の機序解明

昨年度に引き続き頭皮脳波と自律神経モニタリングの同時記録を試みた。ビデオ脳波モニタリング時に心拍・呼吸に加え、消化機能をモニターするシステム、すなわち脳波、心電図・酸素飽和度に加え、胃電図を長時間記録・解析するシステムを用いて、患者データの集積に努めた。今年度も、胃電図の同時記録中に発作を捉えることはできなかった。心電図に関しては、発作間欠時の心拍変動解析を継続して行い、興味深いデータが得られた。睡眠段階に着目し、覚醒時、ノンレム睡眠時、レム睡眠時における心拍変動データを区別して解析したところ、二次性全般化発作後に発作後全般性脳波抑制(postictal generalized EEG suppression: PGES)がみられる患者ではノンレム睡眠時の心拍変動に異常がみられることが分かった。この結果は第52回日本てんかん学会学術集会(横浜)、第13回ヨーロッパてんかん会議(ウィーン)で発表した。また、発作後の心拍変化に関して、発作後心静止を認めた多発奇形・発達障害を伴う右側頭葉てんかんの1例を経験し、第12回日本てんかん学会東北地方会(秋田)で発表した。発作間欠時の心拍変動異常および発作後心静止は、てんかん患者にみられる原因不明の突然死(sudden unexpected death in epilepsy: SUDEP)との関連が示唆される興味深いデータである。SUDEPに関しては、東京都監察医務院との共同研究でてんかん患者の浴槽内死亡例を論文にまとめてSUDEP in thebathtubと題して報告した。さらに、第59回日本神経学会学術大会(札幌)、日本睡眠学会第43回定期学術集会(札幌)、第10回日本臨床睡眠医学会学術集会(淡路島)、第48回日本臨床神経生理学会学術大会(東京)に参加し、てんかんと自律神経の関連について、国内外の研究者と議論する機会を得た。今年度は予定通り、頭皮脳波と自律神経モニタリングの同時記録を試みた。ビデオ脳波モニタリング時に心拍・呼吸に加え、消化機能をモニターするシステムの確立を目指し、脳波、心電図、酸素飽和度に加え、胃電図を長時間記録・解析するシステムを構築することができた。患者データも数例で記録することに成功したが、今のところ、発作時の記録を得ることができていない。なお、期間中、心拍に関しては、発作間欠時の心拍変動解析を継続して行い、データが蓄積されている。特に睡眠段階の違いに着目して、覚醒時、ノンレム睡眠時、レム睡眠時における心拍変動データを各々、区別して解析しており、興味深い結果が得られつつある。また、発作時記録として、発作時不整脈、特に発作時心静止および発作後心静止を記録することができた。貴重な記録であり、今後、学会にて発表する予定である。酸素飽和度についても、発作時記録が得られており、発作時中枢性無呼吸に関する知見をまとめたいと考えている。また、第50回日本てんかん学会(静岡)および全国てんかんセンター協議会総会(奈良)に参加し、てんかんと自律神経の関連について国内他施設の研究者と議論する機会を得た。特にてんかん患者にみられる原因不明の突然死(sudden unexpected death in epilepsy: SUDEP)に関して、我が国の現状と問題点を整理することができた。本領域における最新の知見を得ることができ、今後、本研究を展開する意義を再確認できた。胃電図同時記録の検査体制の確立はほぼ計画通りに進んだが、データ収集は予定通りには進んでおらず、遅れている。特に発作時の記録がまだ得られていない。昨年度確立したビデオ脳波モニタリング時に心拍・呼吸に加え、消化機能をモニターするシステム、すなわち脳波、心電図・酸素飽和度に加え、胃電図を長時間記録・解析するシステムを用いて、患者データの集積に努めた。残念ながら、胃電図の同時記録中に発作記録を捉えることはできなかったが、心電図に関しては、発作間欠時の心拍変動解析を継続して行い、興味深いデータが得られた。睡眠段階に着目し、覚醒時、ノンレム睡眠時、レム睡眠時における心拍変動データを各々、区別して解析したところ、全般てんかんと局在関連てんかんでは睡眠時の心拍変動パターンが異なることが明らかになった。この結果は第51回日本てんかん学会(京都)にて発表した。また、二次性全般化発作後に発作後全般性脳波抑制(postictal generalized EEG suppression: PGES)がみられる患者では睡眠時の心拍変動に異常がみられることが分かった。この結果は第9回日本臨床睡眠医学会(金沢)にて発表した。酸素飽和度に関しては、中枢性無呼吸が二次性全般化発作を誘発したと思われる興味深い一例の発作時記録が得られ、第9回日本臨床睡眠医学会(金沢)にて発表した。さらに、XXIII World Congress of Neurology(京都)、第35回日本神経治療学会(さいたま)、第47回日本臨床神経生理学会(横浜)、第5回全国てんかんセンター協議会(新潟)に参加し、てんかんと自律神経の関連について、国内外の研究者と議論する機会を得た。特にてんかん患者にみられる原因不明の突然死(sudden unexpected death in epilepsy: SUDEP)に関する最新の知見を得ることができ、本研究をさらに発展させる必要性を再確認した。胃電図同時記録中の発作記録が得られていない。しかし、心電図・酸素飽和度については興味深いデータが得られ、学会発表も行った。

ビデオ脳波モニタリング時に心拍・呼吸に加え、消化機能をモニターするシステム、すなわち脳波、心電図・酸素飽和度に加え、胃電図を長時間記録・解析するシステムを用いて、患者データの集積に努めた。今年度も、胃電図の同時記録中に発作を捉えることはできなかった。心電図に関しては、発作間欠時の心拍変動解析を継続して行い、興味深いデータが得られた。睡眠段階に着目し、覚醒時、ノンレム睡眠時、レム睡眠時における心拍変動データを区別して解析したところ、二次性全般化発作後に発作後全般性脳波抑制(postictal generalized EEG suppression: PGES)がみられる患者ではノンレム睡眠時の心拍変動に異常がみられることが分かった。この結果は第52回日本てんかん学会学術集会(横浜)、第13回ヨーロッパてんかん会議(ウィーン)で発表した。また、発作後の心拍変化に関して、発作後心静止を認めた多発奇形・発達障害を伴う右側頭葉てんかんの1例を経験し、第12回日本てんかん学会東北地方会(秋田)で発表した。発作間欠時の心拍変動異常および発作後心静止は、てんかん患者にみられる原因不明の突然死(sudden unexpected death in epilepsy: SUDEP)との関連が示唆される興味深いデータである。SUDEPに関しては、東京都監察医務院との共同研究でてんかん患者の浴槽内死亡例を論文にまとめてSUDEP in thebathtubと題して報告した。さらに、第59回日本神経学会学術大会(札幌)、日本睡眠学会第43回定期学術集会(札幌)、第10回日本臨床睡眠医学会学術集会(淡路島)、第48回日本臨床神経生理学会学術大会(東京)に参加し、てんかんと自律神経の関連について、国内外の研究者と議論する機会を得た。発作時記録が得られるように、データ収集を進めていく。可能であれば、当初の予定通り、頭蓋内脳波と自律神経モニタリングの同時記録も行う。発作時記録が得られるよう、データ収集を継続する。頭蓋内脳波と自律神経モニタリングの同時記録も試みる。当初の予定より旅費がかからなかったため、次年度使用額が生じた。次年度にヨーロッパてんかん学会に参加するための旅費として使用する予定である。次年度にアメリカてんかん学会に参加するための旅費として使用する予定である。
燃料設計による低環境負荷型・噴霧燃焼法の開発

定容燃焼容器において,二成分混合燃料の組成,混合割合,雰囲気条件をパラメータとした着火実験を行った.その結果,高自着火性成分のセタン価がある値以上になると,低自着火性成分が支配的な混合割合であっても,その着火性は高自着火性成分に大きく依存し,それは高自着火性成分における低温酸化反応の発熱量によることがわかった.なお,本実験条件下では混合する両成分を室温・大気圧場において液体として存在する直鎖系炭化水素とした場合,高自着火性成分がn-デカンより高炭素数の燃料でそのような傾向が得られた.さらに,沸点が大幅に異なり,高自着火・高沸点成分に低自着火・低沸点成分を混合した燃料と沸点が比較的類似な高沸点の二成分を混合した際の低温酸化反応の開始時期および高温酸化反応の開始時期の二時期における反応開始位置を化学種発光画像から求めた.低温酸化反応開始時においては,沸点の近い二成分混合燃料の場合,噴霧液相長さとほぼ同位置から化学種の発光が確認できるのに対し,沸点の異なる混合燃料では液相長さから離れた噴霧先端で発光が開始された.これは低沸点・低自着火性成分が噴霧上流で早期に蒸発するため,その成分が高濃度な領域では高自着火性成分の反応を阻害し,高自着火性成分が支配的な濃度の領域から反応が開始されたためである.一方,高温酸化反応の開始時期では,沸点の離れた二成分がより上流部で反応を継続することがわかり,低沸点成分の混合に伴う二相領域の形成により高自着火性成分の蒸発が促進されていることも確認した.以上の結果から,二成分混合燃料では高い蒸発性と着火性の双方を有する燃料が作製可能である知見を得,本研究ではその基礎的データを構築した.ただし,二成分混合燃料の適用には両成分の空間的分布とそれらの化学反応特性を勘案した制御法の検討が肝要である.定容燃焼容器において,二成分混合燃料の組成,混合割合,雰囲気条件をパラメータとした着火実験を行った.その結果,高自着火性成分のセタン価がある値以上になると,低自着火性成分が支配的な混合割合であっても,その着火性は高自着火性成分に大きく依存し,それは高自着火性成分における低温酸化反応の発熱量によることがわかった.なお,本実験条件下では混合する両成分を室温・大気圧場において液体として存在する直鎖系炭化水素とした場合,高自着火性成分がn-デカンより高炭素数の燃料でそのような傾向が得られた.さらに,沸点が大幅に異なり,高自着火・高沸点成分に低自着火・低沸点成分を混合した燃料と沸点が比較的類似な高沸点の二成分を混合した際の低温酸化反応の開始時期および高温酸化反応の開始時期の二時期における反応開始位置を化学種発光画像から求めた.低温酸化反応開始時においては,沸点の近い二成分混合燃料の場合,噴霧液相長さとほぼ同位置から化学種の発光が確認できるのに対し,沸点の異なる混合燃料では液相長さから離れた噴霧先端で発光が開始された.これは低沸点・低自着火性成分が噴霧上流で早期に蒸発するため,その成分が高濃度な領域では高自着火性成分の反応を阻害し,高自着火性成分が支配的な濃度の領域から反応が開始されたためである.一方,高温酸化反応の開始時期では,沸点の離れた二成分がより上流部で反応を継続することがわかり,低沸点成分の混合に伴う二相領域の形成により高自着火性成分の蒸発が促進されていることも確認した.以上の結果から,二成分混合燃料では高い蒸発性と着火性の双方を有する燃料が作製可能である知見を得,本研究ではその基礎的データを構築した.ただし,二成分混合燃料の適用には両成分の空間的分布とそれらの化学反応特性を勘案した制御法の検討が肝要である.本研究では,低沸点,高沸点混合燃料による噴霧の混合気形成促進といった物理的制御法を駆使した燃焼特性の改善を試みる.そのため,急速圧縮膨張装置において,混合燃料噴霧の基礎的噴霧・燃焼特性を実験解析し,低沸点燃料の混合による蒸発特性の向上,それに伴なうすす生成の抑制が確認された.さらに,混合燃料の初期燃料温度を調節することにより減圧沸騰を生じさせ,ノズル内部からの気泡成長・崩壊が噴霧の微粒化・蒸気化を大幅に促進することを実証した.これらの結果から,低沸点・高沸点混合燃料を用いた人為的噴霧・燃焼制御法の可能性を示した.また,これらの効果が機関性能・排気特性に及ぼす影響を調べるため,混合燃料を実機関に適用した.この際,低沸点成分の混合割合および混合割合を一定とした条件の初期燃料温度をパラメータとした計測を行った.本実験から,低沸点・高沸点混合燃料では排出スモーク濃度を窒素化合物を同時低減することが可能であり,この傾向は低沸点燃料の混合割合を増すほど顕著となることを明らかにした.初期燃料温度を変更した場合,減圧沸騰現象における減圧度を調整することが可能となる.さらに,噴霧実験から,減圧度の増加により微粒化効果が加速度的に向上することが分かっている.実機関においても,初期燃料温度,すなわち減圧度の増大により,減圧沸騰噴霧は燃料消費率の改善,および大幅なスモーク排出濃度の低減を達成した.また,さらなる混合燃料の噴霧・燃焼現象における解析手法を確立するため,KIVA3Vコードを用いた数値解析を行った.

元来,KIVA3Vオリジナルコードは単成分燃料のみを対象としているため混合燃料の詳細な解析は困難である.そこで本研究では化学熱力学推算を組み込んだ多成分噴霧モデルを構築し,その計算結果が上記実験結果と同様な傾向を示すことを確認した.本研究では,燃料設計手法を用いた,ディーゼル機関における高効率・低エミッション燃焼法の構築を目的としている.特に,本年度は早期燃料噴射を用いた予混合圧縮自着火燃焼方式に着目し,燃料設計手法による噴霧燃焼制御の第一段階として,早期噴射時の二成分混合燃料噴霧の基礎的特性を調べた.まず,室温雰囲気場における混合燃料の噴霧観察を行なった.ここで,低沸点・高沸点成分の混合組成は,圧力-温度線図上に気液の混在する二相領域を形成し,低沸点成分の割合が増すことで,二相領域はより低温・高圧側に移行する.そのため,ノズル内部流れのような局所的に圧力が降下する領域では,燃料の条件が二相領域内,あるいはそれ以下に至り,キャビテーション気泡の生成・成長が助長される.そのため,本研究においても,低沸点成分を含む混合燃料を用いた場合,高沸点成分単体に比して,低針弁リフト時の噴霧円錐角が増大することが分かった.さらに,ノズルのごく近傍における拡がりに燃料間の差異がない高針弁リフト時においても,比較的下流部では,キャビテーションの生成に起因すると考えられる拡がりが確認でき,蒸発の影響が少ない雰囲気条件下においても,低沸点成分の混合は,噴霧の半径方向への拡がりを促進することを明らかにした.加えて,実機関における早期噴射を想定した温度・雰囲気密度場において,噴霧内部に存在する燃料過濃領域をレーザシート光撮影により測定し,混合燃料の蒸発特性を調べた.その結果,燃料噴霧の条件が先述の二相領域に到達することで,活発な蒸発を生じることを確認した.以上の結果より,二成分混合燃料の飽和蒸気圧を考慮することで,早期噴射時においても,混合気形成過程を制御可能であることが分かった.本研究ではディーゼル機関の高効率・低エミッション化を目的とし,燃料の最適化といった観点から噴霧燃焼過程の改善を図っている.本年度は従来型ディーゼル噴霧燃焼および超低エミッション燃焼法として期待されている予混合圧縮自着火(HCCI)燃焼を対象に,燃焼過程の創始であり,且つその後の機関性能・排気特性を大きく左右する着火過程に注目し,燃料性状による着火・燃焼制御の可能性について検討を行なった.ここで,本研究ではこれまでディーゼル機関に用いられてきた軽油や重油などの高沸点成分に低沸点成分を混合することで噴霧特性が改善され,さらに高沸点成分の蒸発が促進されることを明らかにしてきた.ところが低沸点成分は基本的には炭素数の少ない成分であるため着火性が低く,この燃料を軽油などの高自着火性成分に混合したときの着火特性を調べることにした.これらの各成分を混合した場合の結果は以下のとおりである.(1)混合燃料の着火は高自着火性成分の着火特性が支配的である.(2)その過程には高自着火性成分の低温酸化反応が重要な役割を担う.(3)高自着火性成分がn-ヘプタン程度ではそれ以上の炭素数の燃料に比べ着火促進効果が弱い.以上の結果を受け,低沸点成分の混合による噴霧制御に加えディーゼル燃焼を成立するには,高自着火性成分の着火性を高める,あるいは低温酸化反応を活性化することが必要であり,後者は二段燃料噴射により実現可能と考えられる.また,このことは早期燃料噴射の希薄均一燃焼を実現するHCCI燃焼についても同様であり,ガソリン系燃料のような低自着火性成分を用いた場合により効果的であると予想できる.そこで,本研究ではガソリン系燃料を用いたHCCI燃焼の模擬実験により,一段目に噴射される燃料量などを最適化し,その酸化反応過程を用いることで均一希薄な二段の燃焼が実現できることを確認した.
一次水和水の直接観測システムの構築と固体高分子中の水の相転移解析への応用

固体高分子中の一次水和水の相転移挙動を,温度可変赤外分光法により調査し、当該材料表面への繊維芽細胞の付着特性との相関を評価した.固体高分子中の一次水和水は,これまでに考えられていたような不凍水のみだけではなく,様々な過程を経た相転移を起こすことが明らかになった.繊維芽細胞の吸着特性は,高分子材料のガラス転移温度や含水率との間にも何ら相関がないのと同様に,一次水和水の相転移挙動から説明することはできなかった.固体高分子中の一次水和水の相転移挙動を,温度可変赤外分光法により調査し、当該材料表面への繊維芽細胞の付着特性との相関を評価した.固体高分子中の一次水和水は,これまでに考えられていたような不凍水のみだけではなく,様々な過程を経た相転移を起こすことが明らかになった.繊維芽細胞の吸着特性は,高分子材料のガラス転移温度や含水率との間にも何ら相関がないのと同様に,一次水和水の相転移挙動から説明することはできなかった.本研究は,赤外ポンプーラマンプローブ分光装置からなる一次水和水の直接観測システムを構築し,一次水和水の動態と固体高分子中の水の相転移挙動との関係を明らかにすることを目的とする.モデル高分子材料として,ポリスチレンおよびポリ-2-メトキシエチルアクリレートを用いた.各高分子材料中の一次水和水の相転移挙動を,温度可変赤外分光法により評価した結果,一般的解釈である「一次水和水=不凍水」は,必ずしも正しくないことが判明した.具体的には,不透水のみ存在すると考えられてきた含水領域においても,ポリスチレンにおいては,凝縮凍結,融解,気化の,ポリ-2-メトキシエチルアクリレートにおいては,蒸着様,昇華様の相転移を起こすことが,明らかになった.ポリスチレンにおいて特徴的な現象として,冷却過程において,凍結後,蒸着様過程により結晶成長が生じ,また,昇温過程では,昇華様に結晶が縮小することが,確認された.さらに,冷却速度が高い場合,昇温過程においても,蒸着様の過程を経て,結晶成長が生じることが判明した.この現象は,本研究によって初めて報告されたものである,一方,ポリ-2-メトキシエチルアクリレートで特徴的な現象としては,昇温過程における結晶成長および冷却過程における結晶の生成が凝縮相(液体水あるいはアモルファス氷)を経ずに,氷⇔単分子水(一次水和水)の相転移により生じていることが確認された.この観測結果は,これまでに熱量測定により捉えられる相転移が,必ずしもアモルファス氷あるいは液体水から氷への相転移ではないことを明示しており,これまでの熱量測定の解釈に一石を投じるものである.昨年度までに,ポリスチレンおよびポリ-2-メトキシエチルアクリレート膜中の一次水和水の相転移挙動を評価し,一般的解釈である「一次水和水=不凍水」は,必ずしも正しくなく,不凍水のみ存在すると考えられてきた含水領域においても,ポリスチレンにおいては,凝縮/凍結/蒸着,および昇華/融解/気化の,ポリ-2-メトキシエチルアクリレートにおいては,蒸着様,昇華様の相転移を起こすことを明らかにした.本年度に実施した研究では,昨年度見出された固体高分子中の水の凝縮,蒸着,昇華,気化の4つの相転移は,広く水構造の解析に用いられている熱量測定では,検出不可能であることを明らかにした.具体的には,ポリ-n-ブチルアクリレート中の一次水和水の相転移挙動を分光学的に解析したところ,ポリスチレンと同様に,一次水和水の凝縮/凍結/蒸着および昇華/融解/気化が確認されたが,熱量測定においては,凝縮,蒸着,あるいは昇華,気化を明確に示すシグナルを得ることができなかった.この結果の差異は,それぞれの測定手法の水に対する感度の違いではなく,検出対象が異なる,という原理的な問題であることが判明した.熱量測定は,系の熱流束をともなう転移(変化)を検出するが,固体高分子中の一次水和水の凝縮,蒸着,あるいは昇華,気化は,それぞれの転移と同時に,高分子マトリックスからの脱着あるいはマトリックス中への収着を伴い,その脱/収着熱が,水の相転移熱と逆符号でほぼ等しく,互いの熱流束が打ち消され,熱量測定では検出できないと考えると,上記の結果を説明できる.これらの知見は,これまでに多くなされてきた熱量分析に基づく水一高分子系の水構造の解析結果,解釈に再考を求める.
子牛神経疾患の生前診断と予後判定を目指した神経障害マーカーの網羅的検索

(1)高度医療機器の利用が困難な牛の神経疾患の診断において、脳脊髄液(CSF)中の中枢神経傷害マーカーに着目している。これまでS100B、Neuron-specific enolaseなど既知マーカーの診断的有用性を検討したが、30年度は牛CSF中の新規中枢神経傷害マーカーを網羅的に検索するため、炎症性脳疾患に罹患した牛のCSFを材料に二次元電気泳動を用いてCSFタンパク質を解析した。神経症状を主訴に帯畜大に搬入された牛のうち、病理学的検索により炎症性脳疾患と診断された7症例の生前に採取したCSFを用いた。7症例の内訳は伝染性血栓塞栓性髄膜脳炎2症例、髄膜炎2症例および脳幹部に限局した脳炎3症例であった。また、健常子牛4頭のCSFを対照とした。CSFは二次元電気泳動後に、銀染色を用いてスポットを検出し、疾患ごとにその分布を比較検討した。炎症性脳疾患牛7症例に共通して、pI 6-7、MW25-75 kDaの領域に健常子牛のCSFには認められないスポットが複数認められた。また、伝染性血栓塞栓性髄膜脳炎ではpI 5-9、MW25-75 kDaの領域、髄膜炎ではpI 3-8、MW25-75 kDaの領域、脳幹部に限局した脳炎ではpI 3-4およびpI 6-7、MW25-50 kDaの領域に、それぞれの疾患に特異的なスポットが複数存在した。これらは、中枢神経傷害によりCSF中に遊出したタンパク質であり、炎症性脳疾患の鑑別や傷害部位の特定に有用なマーカーになりうると思われた。(2)牛の神経疾患症例報告:本研究の一貫として神経症状を呈する牛の症例を大学に搬入し病性鑑定を実施しているが、その過程において、肝性脳症、脊椎周囲膿瘍、脳膿瘍、等の比較的希な症例に遭遇したため、その概要を学会及び論文にて報告した。(1)平成30年9月6日に発生した北海道胆振東部地震の影響で、北海道全体が停電となり、帯広市も約2日間停電となった。このため冷凍庫が機能せず、遺伝子発現解析用のサンプルの一部を破棄せざるを得ず、遺伝子発現解析については実施準備までとなった。(2)新規マーカーを網羅的に検索するために脳脊髄液(CSF)のプロテオーム解析を実施した。炎症性脳疾患に罹患した牛のCSFを材料に二次元電気泳動を用いてCSFタンパク質を解析した。神経症状を主訴に帯畜大に搬入された牛のうち、病理学的検索により炎症性脳疾患と診断された7症例-伝染性血栓塞栓性髄膜脳炎2症例、髄膜炎2症例および脳幹部に限局した脳炎3症例から、生前に採取したCSFを用いた。健常子牛4頭のCSFを対照とした。炎症性脳疾患牛特異的スポット、伝染性血栓塞栓性髄膜脳炎特異的スポット、および髄膜炎特異的スポットが複数確認され、これらは中枢神経傷害によりCSF中に遊出する疾患特異的マーカーになりうると思われた。しかしながら、各スポットは小さく、質量分析を行うには不足する量であった。このため、本来であれば実施する予定であった質量分析による蛋白質の同定に至らなかった。(3)神経症状症例は順調に収集が進んでおり、たいへん希な症例にも多く遭遇し、症例報告を行うことができた。1)31年度も継続して、臨床獣医師と共同して牛の各種神経疾患の自然発症例を収集し、血清および脳脊髄液サンプル採取を継続する。病理解剖により診断が確定された症例については、血清および脳脊髄液の生化学性状解析を行うとともに、症例報告としてその知見を積極的に公表する。2)質量分析による新規蛋白マーカーの同定と定量:30年度に二次元電気泳動による解析で、脳炎特異的と推測される蛋白質を複数見出した。31年度はこれら蛋白質スポットの質量分析を行い、診断に有用な蛋白質性状を同定する。さらに同定された蛋白質について、血清またはCSF中の含量を定量できるよう、ELISAの確立を目指す。4)31年度は研究最終年度のため、積極的に学会及び論文発表を目指す。平成28年度は、神経疾患症例収集と材料採取、および既知神経障害マーカーの測定と感度・特異性の検討を中心に研究を進めた。1)20052016年度の間に確定診断を得た神経疾患症例146検体の血清S100BをELISA法により測定し、既に報告している脳脊髄液S100B測定値と比較検討した結果、血清S100Bは脳脊髄液S100Bよりも相当な低値を示した。また、神経疾患牛の血清S100B値は健常牛に比べて有意に高かったが、非神経疾患牛と比較すると有意差がみられず、血清S100Bの測定は神経疾患に対する特異性が高くないものと思われた。しかし、脳腫瘍、小脳変性症、水頭症症例の血清S100Bは非神経疾患牛に比較して高値を示し、血清S100B測定が神経疾患の診断に利用可能であることが示唆された。

2)後躯麻痺を呈し、病理組織学的に脊髄神経変性が確認された子牛の症例において、脳脊髄液中neuron soecific enolase (NSE)をELISAにより測定したところ、複数の健常牛の脳脊髄液NSEに比べて高値が認められ、脳脊髄液中NSEの測定が子牛の神経疾患の臨床診断上応用できる可能性が考えられた。3)子牛の先天性ネオスポラ感染症による後躯麻痺症例に遭遇し、血清および脳脊髄液中の抗ネオスポラ抗体を測定したところ、著しい高値が認められた。臨床診断が困難であった先天性ネオスポラ症による子牛の神経疾患の診断に抗体価測定が有用であると考えられた。このため、新たな研究項目としてネオスポラ抗体測定の臨床的意義の検討を追加で開始した。平成28年度は当初計画に従い、神経疾患症例収集と材料採取、および既知神経障害マーカーの測定と感度・特異性の検討を主に研究を行い、次のような結果が得られた。1)神経疾患については20052016年度に病理解剖により確定診断を得た症例146症例の血清および一部の脳脊髄液サンプルを整理するとともに、新たに得られた神経疾患症例の症例報告を行った。これらサンプルについて、既知神経障害マーカーとして血清S100BをELISA法により測定し、既に報告している脳脊髄液S100B測定値と比較検討した結果、血清S100Bは脳脊髄液中のS100Bよりも低値を示した。2)神経疾患牛の血清S100B値は、健常牛の血清S100Bに比べて有意に高かったが、非神経疾患牛の血清S100Bと比較して有意差がみられず、血清S100Bの測定は神経疾患に対する特異性が高くないものと思われたが、脳腫瘍、小脳変性症、水頭症症例の血清S100Bは高値を示すものが多く、血清S100B測定が神経疾患の診断に利用可能であることが示唆された。3)脊髄神経変性を認める子牛の後躯麻痺症例において、脳脊髄液中NSEを測定したところ、健常牛に比べて有意に高値が認められ、脳脊髄液中NSEの測定が臨床診断上応用できる可能性が考えられた。4)自然発症神経疾患症例のネオスポラ感染症に遭遇したため、新たな研究項目として、血清および脳脊髄液中ネオスポラ抗体の診断的意義の検討を開始した。1)牛の神経疾患症例の収集および脳脊髄液(CSF)と血清の採取、およびneuron specific enolase (NSE)の測定と感度・特異性の検討を行った。神経症状を呈した75頭(Neu群)の血清59検体とCSF75検体,神経症状のない45頭(non-Neu群)の血清35検体とCSF44検体,健常子牛9頭(C群)から血清9検体とCSF9検体について、ELISA法によりNSE濃度を測定した。C群のNSE濃度からカットオフ値を1.35ng/mlと3.58ng/mlと定めたところ、高値を示した検体は,Neu群血清で59検体中15検体(25%),non-Neu群血清で35検体中11検体(31%),Neu群CSFで75検体中19検体(25%),non-Neu群CSFで44検体中2検体(5%)であった。血清NSE濃度はNeu群とnon-Neu群で有意差はなく,また炎症性疾患を伴う症例は高値を示す傾向があり,神経損傷への特異性は低いと考えられた。いっぽうCSF-NSE濃度はNeu群でnon-Neu群より有意に高値を示した。NSE濃度が高値の症例は神経に組織学的変化を有する傾向があった。牛のCSF-NSE濃度は神経損傷の指標となり,神経疾患マーカーとなる可能性が示唆された。2)牛の脳脊髄液性状を解析した。健常対照群のCK及びLDH活性の平均±2SDはそれぞれ10±18 IU/L及び15±12 IU/Lに対し、髄膜脳炎症例ではCKは59 IU/L,LDHは425 IU/Lと高値を示した。また,CSFの二次元電気泳動解析を実施したところ、髄膜脳炎症例では対照にみられない19カ所のスポットが認められた。
顎関節滑膜線維芽細胞の細胞生物学的機能の検索(機械的刺激とサイトカインの影響)

顎関節症は、病態生理学的因子、社会心理学的因子、咬合因子、悪習癖因子等多因子が関与しているといわれているが、その発症および進展メカニズムについては不明な点が多い。本申請では、顎関節部の恒常性および病態生理に深く関与していると示唆される滑膜細胞の培養系を確立すると共に、その細胞学的諸性質について検討を行った。<方法>インフォームド・コンセントを行った顎関節症あるいは顎関節強直症患者の観血的手術時に顎関節滑膜を採取し、out growth法にて滑膜細胞を得た。初代培養は20%FCSを含むHamF12にて、継代培養は10%FCSを含むHamF12にて行い、継代数6-8代のものを実験に供した。得られた細胞の表層抗原は免疫染色法により検索した。次に、confluent stageの細胞に顎関節症患者の滑液中で上昇しているIL-1βあるいはTNF-αを作用させて、培養上清を採取し、培養上清中のplasminogen activator(PA)活性は合成基質を用いて、IL-6、IL-8、monocyte attractant protein(MCP)-1はELISA法にて測定した。<結果>out growth法にて得られた顎関節滑膜細胞は、紡鍾形を呈する細胞と多角形を示す細胞が認められた。線維芽細胞マーカーおよびビメンチン抗体に陽性で、マクロファージマーカー、HLA class II、樹状細胞マーカー抗体には陰性であった。培養上清中のPA活性は、作用させたIL-1β濃度依存的に上昇した。IL-6量はIL-1βの作用時間および作用濃度に応じて上昇し、mRNA量もIL-1β作用にて増加した。IL-8量とMCP-1量は、IL-1βあるいはTNF-αの作用時間および作用濃度に応じて上昇し、mRNA量もこれらサイトカイン刺激にて増加した。また、IL-1βあるいはTNF-αを作用させた系作用させない系について、IL-6,1L-8,MCP-1について免疫染色を行ったところ、作用した系ではIL-6,IL-8,MCP-1抗体いずれについても染色陽性細胞と陰性細胞が混在していた。作用させない系ではIL-6,1L-8,MCP-1抗体で染色陽性細胞は認められなかった。<考察>顎関節滑液中IL-1βやTNF-αが増加すると、滑膜細胞を刺激し、PA活性、IL-6やchemokineであるIL-8,MCP-1が増加し、炎症の進展や細胞外基質分解が更新することが示唆された。また、免疫染色の結果から、得られた滑膜細胞は線維芽細胞様細胞であるものの、機能的にheterogenousであること示唆された。顎関節症は多様な因子が関与していると考えられ、多方面からの研究が行われているが、細胞学的レベルでの研究は進んでいない。

本申請では、顎関節の恒常性維持や病態生理において重要な役割を担っている顎関節滑膜細胞の細胞学的、生化学的諸性質を検索することを目的とした。<方法>顎関節強直症でインフォームド・コンセントを行った患者の顎関節開放手術時に採取した滑膜をPBS(-)で洗浄後、細分する。20%FCSを加えたHam F12培地を用い、out growth法にてヒト顎関節滑膜細胞を得た。得られた細胞は10%FCSを添加Ham F12にて継代培養を行った。次に、confluent stageの細胞にIL-1βを作用させ、培養上清を採取した。合成基質を用いてplasminogen activator(PA)活性およびELISA法にてIL-6量をそれぞれ測定した。実験にはpassage6-8代のものを使用した。<結果及び考察>顎関節滑膜培養後、約2週間で滑膜片より細胞がout growthしてくるのが観察された。得られた細胞を低濃度で藩種した時はマクロファージ様細胞と線維芽細胞様細胞の2種類の形態の細胞が顕微鏡下で観察された。Confluentになると線維芽細胞様となり、over confluentになると敷石状となった。再び、低濃度で藩種するとマクロファアージ様細胞と線維芽細胞様細胞の2種類が見られた。次に、ヒト顎関節滑膜細胞にIL-1βを作用させ、培養上清中のPA活性を測定したところ、IL-1β作用濃度および作用時間に応じてPA活性は有意に上昇した。培養上清中のIL-6量もIL-1β作用濃度および作用時間に応じて有意に上昇した。以上の結果から、変形性顎関節症における炎症の進展や細胞外基質の破壊に滑膜細胞が深く関与していることが示唆された。また、out growth法にて得られたヒト顎関節滑膜細胞はheterogenousであると考えられ、今後cloning等を行うことにより、ヒト顎関節滑膜細胞の諸性質を検討していく。顎関節滑膜細胞は顎関節の恒常性維持や病態生理において重要な役割を担っており、細胞学的諸性質を検索する事は顎関節症の発症・進展を研究する上で有意義であると考えられる。一方、近年、関節滑液解析が行われ、顎関節症患者ではinterleukin(IL)-1β,IL-6等の炎症性cytokineが上昇していることが報告されている。本年度申請ではヒト顎関節滑膜細胞にIL-1βを作用させて、chemokineであるIL-8,macrophage chemoattractant protein-1(MCP-1)の産生を調べた。<結果及び考察>ヒト顎関節滑膜細胞にIL-1βを作用させ、培養上清中のIL-8,MCP-1を測定したところ、IL-1β作用濃度および作用時間に応じてIL-8およびMCP-1産生は有意に上昇し、mRNA量はcontrolに比べて増加した。免疫染色法を行ったところ、IL-1β刺激を行った細胞では、IL-8,MCP-1が強く染色される細胞が認められたが、controlではいずれのcytokineも染色されなかった。さらに、初年度の成果で報告したIL-6についても染色を行ったところ、IL-1β刺激細胞では強く染色されたが、controlでは染色されなかった。
モーター・レール系運動制御の高分解能構造解析

ダイニン・微小管複合体の電子顕微鏡構造研究を行い、従来のモデルに反して、力発生の前後に対応する状態でストークの角度が変化しないことを示し、新たなモデルを提唱した。キネシンファミリー分子Kar3と微小管の複合体の立体構造を約12Åの分解能で解き、ヌクレオチド状態に依存した構造変化を明らかにした。骨格筋ミオシンとアクチンの硬直複合体構造を1nmを超える分解能で得た。また、高速ミオシンのアクチン結合での構造変化を見出したダイニン・微小管複合体の電子顕微鏡構造研究を行い、従来のモデルに反して、力発生の前後に対応する状態でストークの角度が変化しないことを示し、新たなモデルを提唱した。また、高速ミオシンのアクチン結合での構造変化を見出した微小管と、分子モーターやその働きを制御する分子の複合体の3次元構造を高分解能で得るためにはまず、規則性の高い安定な微小管を用いることが肝要である。このため微小管の重合条件を再検討したが、この過程でこれまで用いていた微小管が高濃度のヌクレオチド存在下で不安定であることが判明した。そこでまず、チューブリンの精製方法を再検討し、得られたチューブリンをもちいて重合した微小管を様々な条件下で電子顕微鏡観察した。また、これまでに得たキネシン・微小管複合体において、キネシン結合に伴うチューブリンの構造変化が観察されたため、結晶構造をいくつかのドメインに分けてフィッティングを行った。この結果、チューブリン分子の特定のドメインがキネシン結合にともなって回転することがわかった。キネシン・微小管複合体の構造変化に関する結果は、2004年生物物理学会年会にて報告するとともに、アメリカ細胞生物学会のシンポジウムで依頼講演を行った。安永は、2004年度は、主として、画像解析法の開発とモータータンパク質の単粒子三次元再構成を行った。高分解能3次元構造を得るために、数多くの画像を取得し、平均化することが重要である。そこで、電子顕微鏡による粒子画像の自動取得を目的とした新しい手法を開発し、査読付国際会議で発表した。また、三次元画像再構成のための新規アルゴリズムを開発し、日本生物物理学会年会において報告した。この手法を用いて、ミオシンVI、ダイニン、シトクロム酸化酵素の三次元再構成を行った。さらに、画像分類・統計処理法を用いて、シャペロニン構造の基質結合により誘導された構造変化を捉え、Protein Science誌に報告した。この手法は、モータータンパク質の高分解能構造の妥当性を検討する上でも重要である。また、ナノメータ分解能の電子顕微鏡三次元画像から原子モデルを構築するためのアルゴリズムを開発した。これらは、2004年生物物理学会年会にて報告した。キネシン分子モーター・微小管システムに関する研究では、昨年度までに得られたキネシンファミリー分子Kar3と微小管の複合体の立体構造の解析を進め、ヌクレオチドの有無で、ミオシンのそれと共通した構造変化があることを見いだし、論文を投稿した。微小管の構造変化の研究においては、GMPCPP存在下での微小管重合条件を検討し、このクライオ電子顕微鏡像の集積を開始した。また、ダイニン分子モーター・微小管システムでは、数種のダイニンをもちいて、ダイニン・微小管複合体の構造研究に適した系を開発するための研究をおこなった。東京大学助教授・真行寺千佳子(研究項目A02計画研究代表者)らと協力し、ウニ精子から抽出したダイニンをもちいたところ、2本の微小管の間にダイニンが規則的に並んで結合する条件を見いだすことができた。分担者安永は、電子顕微鏡像の解析方法の開発を進めた。三次元構造の原子モデリングのための新しいアルゴリズムを開発し、J.Plasma.Phys.に印刷中である。電子顕微鏡像の自動抽出のためにSVMを用いた新規のアルゴリズムを開発し、Wseas Trans.Biol.Biomed.に報告した。筋肉の細いフィラメント内部のトロポニンIのC末端サブドメインの位置を電子顕微鏡法で同定し、NMR観察とともにJ.Mol.Biol.に報告した。鞭毛内部での軸糸内椀ダイニンcの配置を画像処理法を用いて同定し、J.Biol.Chem.に報告した。現在、単粒子解析三次元再構成法のためのアルゴリズムを開発しており、特徴量抽出法をもちいた角度決定法を開発し、雑音に強いということがわかった。さらに広瀬と安永は、日本生物物理学会年会において、「分子モーターシステム:その構造情報の流れと分子メカニズム」と題したシンポジウムをオーガナイズした。キネシン分子モーター・微小管システムに関する研究では、昨年度までに得られたキネシンファミリー分子Kar3と微小管の複合体の立体構造の解析をさらに進め、複合体におけるKar3の構造に、ヌクレオチドの有無で大きな構造変化があることを見いだし、論文発表した。ダイニン・微小管複合体の構造解析では、昨年度ウニの精子軸糸外腕ダイニンが微小管を規則的に架橋した系を開発したが、今年度はこの系をもちいて、まずヌクレオチド非存在下でのクライオ電子顕微鏡画像を収集した。得られた分子の構造は一様でなかったため、分担者安永の協力のもと、コンピュータ画像解析による画像の分類を開始した。

ダイニン複合体の画像分類に適するよう、ソフトウェアに改良を重ねた結果、ヌクレオチド非存在下でのダイニン頭部の構造、特にストークの微小管に対する向きについて新たな知見が得られた。安永は、クラミドモナスのダイニンミュータントの電子顕微鏡撮影像から、三つの重鎖の配置を決定した。また、ミオシン9に関して、クライオ電子顕微鏡法を用いて、ATP存在下、非在下での結合様式を明らかにし、ATP非依存的な結合が存在することを示した。ミオシン6に関しても、これまで同様に、ダイマー構造が観察できることを再確認した。他の研究との不一致を今後検討する必要がある。ミオシン2に関しては、ATP非結合状態での頭部の三次元像を単粒子解析法で決定し、レバーアームの揺らぎの可能性を示唆するデータを得ている。ミオシン頭部でも三次元像が再構成できる手法が分かったことから、今後、電子顕微鏡法によってさらに詳細な構造変化を追うことが可能となった。また、電子顕微鏡法による三次元像からの原子モデル構築のためのアルゴリズムに関して、論文発表した。アクチン類似蛋白質MreBの構造解析についても論文発表した。ダイニン・微小管系の研究では,18年度に行ったヌクレオチド非存在下での構造研究に加え,ADP・vanadate存在下での低温電子顕微鏡像を得ることに成功して画像データを集積し,分担者安永とともに画像解析を行った。これにより,現在広く信じられているモデルとは異なり,これらの2っの状態間でストークの角度は変わらないこと,頭部とストークの位置が尾部に対して変化することがわかった。キネシン・微小管系では,JSPS外国人特別研究員として来所したSindelar博士の協力のもと,単粒子法による立体構造解析のプログラムを設置,我々の試料に適合させるための改変を行い,以前の方法と比較して解析に要する時間を大幅に短縮できることを確認した。アクチン・ミオシン系ではミオシンVIの三次元構造をATPの有り無しのいずれの構造もとき,レバーアームの動きが存在することを示した。アクチン・ミオシン硬直複合体に関しては,らせん対称性による構造解析に単粒子解析を加えたシステムを構築し,次の構造解析を進めている。軸糸ダイニンに関して,原子モデルとフィッティングし,その鞭毛内での配置を検討した。トモグラフィーによる構造解析も傾斜によるデフォーカス補正を考慮して,3次元像を再構成できるソフトウェアを開発した。さらに,三次元再構成法も改良し,ミッシングエリアを考慮した三次元像を得ることに成功した。また,構造分類法を改良し,注目する領域のコントラストを挙げ,その領域で分類できるようなシステムを作成した。ダイニン・微小管系の研究では、代表者、分担者、および計画班「鞭毛の振動運動システムの制御メカニズム」代表者の真行寺千佳子の協力により、ダイニン・微小管複合体の構造解析を進め、これまで一般に信じられていたモデルとは異なり、これらの2つの状態間でストークの角度は変わらないことを示して、これに代わるモデルを提唱した。構造解析に用いた複合体については、運動活性測定も行い、複合体中1のダイニンが運動機能をもつことを確認した。これらの結果については、分子モーターに関するゴードン、会議(米国)の招待講演等で発表するとともに、PNAS誌に論文発表した。
ゲノム編集を用いた高度社会性動物である平原ハタネズミの社会行動制御基盤の解明

2017年度までに、ゲノム編集技術であるるCRISPR/Cas9システムを用いることで、オキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの作成に成功した。また、作製したオキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの基礎的な運動行動や繰り返し用行動、社会的行動などの行動を観察し、オスの平原ハタネズミが自閉症用行動を示すことを明らかにした。2018年度は、オキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの脳に対して、アイソトープでラベルしたリガンドを用いたリガンド結合実験を行い、オキシトシン受容体の発現が脳内で完全に欠損していることを示した。これらの結果をまとめ、社会行動やその制御機構に関する専門紙であるHormones and Behaviorに学術論文として出版し、本研究の成果を全世界に発表した。本研究は世界で初めて遺伝子組み換え平原ハタネズミの作製に成功し、平原ハタネズミの社会行動を制御するオキシトシン受容体システムの一端を明らかにした研究として、大きなインパクトを与えた。また、オキシトシン受容体を欠損したオスの平原ハタネズミが様々な向社会行動の低下を示すことを明らかにした。加えて、オキシトシン受容体を発現する神経回路を特異的に遺伝子操作可能な平原ハタネズミを用いて、平原ハタネズミのオキシトシン受容体発現神経細胞が形成する神経回路の探索を行った。オキシトシン受容体発現細胞は様々な脳領域に発現することを見出し、実験動物として広く用いられているマウスとは異なる神経回路を形成している可能性を見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2016年度は、ゲノム編集技術であるCRISPR/Casを用いて平原ハタネズミのオキシトシン受容体(Oxtr)を欠損させることを目的として研究を遂行した。CRISPR/Casを用いることで平原ハタネズミのOxtr遺伝子の編集に世界で初めて成功した。様々な遺伝子型を持つOxtr遺伝子編集平原ハタネズミの作製に成功したが、ナンセンス変異型の遺伝子型のみならず、数アミノ酸の欠損のみを引き起こすインフレーム型の変異型Oxtr遺伝子を持つことがわかった。それぞれの変異型Oxtr遺伝子の機能欠損を確認するために、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のシグナル活性を測定可能なTGF αshedding assayを用いて、in vitroでのそれぞれの変異型受容体の機能欠損を確認した。この評価系は、アルカリホスファターゼの活性ドメインを融合させたTGF alpha (AP-TGF alpha)と、評価したいGPCRをHEK293細胞に強制発現させることで行う実験系である。リガンドに結合したGPCRはGタンパク質シグナルを伝達し、HEK293細胞に内在するTACEを活性化し、AP-TGP alphaを培養上清に放出する。培養上清中のAP-TGF alphaの活性を測定することで、間接的にGPCRの活性を測定可能である。来年度は、変異型Oxtr遺伝子を持つ個体を、in vivoやex vivoで評価する。具体的には放射性同位元素を用いたリガンド結合実験や、パッチクランプ法などを用いた各脳領域における神経細胞の電気生理的な機能評価を行う。これらの実験によってOxtr遺伝子の機能欠損を証明し、Oxtr遺伝子が平原ハタネズミのパートナー形成や母性・父性行動に及ぼす影響を行動実験によって解析する。現在、行動実験の準備を進めている。2016年度の研究目的である、CRISPR/Casを用いたオキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの作製に成功したため、おおむね順調に進展しているという評価とした。昨年度は、ゲノム編集技術であるCRISPR/Casを用いて世界で初めてオキシトシン受容体を破壊した平原ハタネズミの作製に成功した。今年度はオキシトシン受容体を破壊した平原ハタネズミの行動解析を行った。その結果、オキシトシン受容体を破壊した平原ハタネズミでは、ビー玉埋めテストにおいて、ビー玉を埋める数が増加した。このことから、固執・脅迫様行動が増加することが示された。また、他個体に対する社会的な探索行動を測定した。その結果、オキシトシン受容体を欠損した平原ハタネズミは初めて出会う個体と、出会ったことのある個体を識別できないことが示された。現在、一夫一妻性行動について測定を行っている。また、オキシトシン受容体が存在する神経細胞のみを操作可能な遺伝子ノックイン平原ハタネズミの作製に世界で初めて成功した。この平原ハタネズミを用いることで、オキシトシン受容体を発現する神経細胞が、どのように脳内の神経回路を構成しているかが解明可能となる。この遺伝子ノックイン平原ハタネズミを用いることで、オキシトシン受容体が発現する神経回路を、世界で初めて明らかにすることに成功した。上記二つの遺伝子組み換え平原ハタネズミを用いることで、一夫一妻性行動とオキシトシン受容体の関係性がより詳細に解明されることが期待される。研究計画調書に記載した、オキシトシン受容体を破壊した平原ハタネズミに対する、次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析の準備を進めている。また、Oxtr遺伝子を組織特異的に欠損可能な平原ハタネズミの作製に取り掛かり、現在、解析を進めている。申請者は、オキシトシン受容体平原ハタネズミの作製と、その行動解析を行い、平原ハタネズミにおいてオキシトシン受容体が制御する行動を検出することに成功した。また、遺伝子挿入平原ハタネズミの作製に成功し、平原ハタネズミにおいてオキシトシン受容体が発現する神経回路の探索に、世界で初めて成功した。これらの理由より、概ね順調に進展していると評価した。

また、作製したオキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの基礎的な運動行動や繰り返し用行動、社会的行動などの行動を観察し、オスの平原ハタネズミが自閉症用行動を示すことを明らかにした。2018年度は、オキシトシン受容体欠損平原ハタネズミの脳に対して、アイソトープでラベルしたリガンドを用いたリガンド結合実験を行い、オキシトシン受容体の発現が脳内で完全に欠損していることを示した。これらの結果をまとめ、社会行動やその制御機構に関する専門紙であるHormones and Behaviorに学術論文として出版し、本研究の成果を全世界に発表した。本研究は世界で初めて遺伝子組み換え平原ハタネズミの作製に成功し、平原ハタネズミの社会行動を制御するオキシトシン受容体システムの一端を明らかにした研究として、大きなインパクトを与えた。また、オキシトシン受容体を欠損したオスの平原ハタネズミが様々な向社会行動の低下を示すことを明らかにした。加えて、オキシトシン受容体を発現する神経回路を特異的に遺伝子操作可能な平原ハタネズミを用いて、平原ハタネズミのオキシトシン受容体発現神経細胞が形成する神経回路の探索を行った。オキシトシン受容体発現細胞は様々な脳領域に発現することを見出し、実験動物として広く用いられているマウスとは異なる神経回路を形成している可能性を見出した。2016年度に作製したオキシトシン受容体欠損平原ハタネズミを用いてパートナー形成行動や母性・父性行動の解析を行い、オキシトシン受容体が制御する社会行動を評価する。行動試験後の活性化脳領域を評価し、平原ハタネズミの行動制御時にオキシトシン受容体が関連する脳領域を特定する。また、オキシトシン受容体のプロモーターの下流に蛍光タンパク質であるVenusを導入し、オキシトシン受容体を脳内で可視化可能なノックイン平原ハタネズミの作製を行い、平原ハタネズミ脳内でのオキシトシン受容体の分布を詳細に解析する。今後は、オキシトシン受容体を破壊した平原ハタネズミの一夫一妻行動を測定し、神経活性活性化領域の検出によってオキシトシン受容体が一夫一妻性行動を制御するメカニズムを探索する。また、オキシトシン受容体を脳領域特異的に欠損可能な遺伝子組み換え平原ハタネズミの作製を行、平原ハタネズミの社会行動の制御に重要な役割を果たすオキシトシン受容体発現領域を特定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
がん薬物療法にともなう中枢神経傷害の病態に関する研究

化学療法の発展に伴い長期的な予後が期待できるようになった一方、化学療法後に慢性的に中枢神経系有害事象(認知機能障害)が生じる可能性が指摘されるようになった。この認知機能障害はchemo-brainと総称される。しかし、認知機能障害と化学療法との関連性、その機序に関する検討は未だ途上である。そこでわれわれは、化学療法前後を通して、脳構造画像の変化を非侵襲的に評価する測定系を構築し、抗腫瘍薬と脳機能との関連性、療養生活の質(QOL)との関連の検討を開始した。症例の集積は予定通り進み、追跡調査が終了次第、解析を行う予定である。がん化学療法が進歩し生命予後が改善するに従って、がん化学療法による認知機能障害が出現し生活の質(QOL)が低下することが問題となっている。長期予後が期待できる反面、がんを抱えて生きる人(サバイバー)も増加し、2015年には500万人を越え、今後さらに増加すると見積もられる。がん化学療法が引き起こす認知機能障害を把握し対応することは緊急の課題である。がん化学療法が認知機能障害を引き起こす機序として、酸化ストレス反応や微小循環障害による中枢神経系の間接的な障害仮説が提唱されているものの、画像的にも生理学的にも検討した報告はない。そこで本研究では、がん化学療法が中枢神経系にどのような影響を与え、どのような認知機能障害を誘導するかを、磁気共鳴画像(MRI)を用いて形態画像および代謝変化をあわせて評価することを計画した。本研究は、がん化学療法が慢性的な中枢神経障害を引きおこすメカニズムを解明する初めての研究となる。また、同時に責任部位を同定することができ、病態機序を初めて検討できるようになる。本年度は、癌化学療法治療後1年を追跡して神経心理学的検査を施行し、認知障害の程度とその経過を縦断的に評価するMRI測定系の整備を進め、特にMRSによる代謝変化を測定し、化学療法による脳内代謝変化を非侵襲的に評価する測定系を構築した。同時に乳腺外科と協力し、乳がん患者の術前化学療法、ならびに術後化学療法(どちらもAC+Taxaneのレジメン)を対象とした調査計画をたて、施設内の倫理審査委員会に諮った。癌化学療法治療前、開始6ヶ月後、12ヶ月後を通して、神経心理学的検査を施行し、認知障害の程度とその経過を縦断的に評価するとともに形態変化および代謝変化(MRS)を測定し、その変化を統計学的に検討した。従来、認知機能検査で認められた障害を、画像評価を併用することにより定量的に評価が可能となる。