hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
美濃帯と秩父帯のジュラ紀砂質岩の岩石学的比較研究

昭和60年度および昭和61年度の両年度にわたって交付を受けた科学研究費補助金を補助条件通りに使用し研究を行った結果、以下の研究成果を得た。1.美濃帯各地の砂岩中のザクロ石の化学組成をEPMAを用いて数多く調べた結果、ザクロ石の多くはMgに富むアルマンディンで、MnやCaに乏しいことが明らかとなった。このようなザクロ石は、泥質砂質岩源のグラニュライト相の変成岩類から由来したと考えられる。2.秩父帯の砂岩中のザクロ石は、一般に、MnやCaに富みMgに乏しい。砕屑性ザクロ石の組成からみると、美濃帯と秩父帯の砂質岩の後背地には有意の差があったと考えられる。このような差異は今回の研究で初めて判ったことで、西南日本のテレーンアナリシスを行う上で大きな手がかりとなる。3.飛騨帯の手取層群の砂岩には、Mgに著しく富むザクロ石が含まれており美濃帯の砂岩との類似が指摘される。また、飛騨外緑帯のメンバーである上広瀬礫岩を再検討した結果、Caに富むザクロ石を含む片麻岩礫の存在が明らかとなった。4.岐阜県丹生川村の飛騨外緑帯の横尾礫岩から、二畳紀の放散虫化石を含むチャート礫が数多く見出された。このチャート礫は飛騨外緑帯と美濃帯の関係を考える上で重要な意味をもつ。5.美濃帯のジュラ紀砂岩と密接に伴って産する珪質頁岩やチャート中のマンガンノジュールについて、岩石学的ならびに化学的な検討を行った結果、ノジュール中より重晶石とlength-slow chalcedonyが見出された。美濃帯のマンガンノジュールは、組成的に、現在の海洋底のマンガンノジュールと全く異なっている。このことはマンガンノジュールを含む頁岩やチャートの堆積環境が、大陸から遠く離れた深海底ではなかったことを強く示唆している。
造血細胞における細胞接着・増殖・細胞死調節のシグナル伝達統合機構の解析

造血因子受容体から、アダプター因子CrkLやRasファミリーのGTP結合蛋白Krev1/Rap1を介して、インテグリンの活性化に至るシグナル伝達機構を、造血細胞において解析し以下の結果を得た。赤芽球系造血細胞の増殖と分化を調節するエリスロポエチン(Epo)の受容体は、CrkLおよびCrkLと結合するRasファミリーのGEFであるC3Gとを介して、Ras/MAPキナーゼ経路の活性化とともに、β1インテグリンを介して造血細胞の細胞接着の亢進をもたらすことを、私達はこれまでに示してきた。今回の研究では、C3Gにより活性化される事が知られているRap1に関して検討を行い、EpoやIL-3の刺激によりRap1が造血細胞内で一過性に活性化されることを見出した。サイトカインによるRap1の活性化は、CrkLやC3Gを誘導的に過剰発現することで増強され、これらの因子がサイトカイン受容体によるRap1活性化に関与していることが示唆された。また、Rap1はTPAやCa ionophoreによっても活性化され、一方PLCγの阻害剤により抑制されたことより、サイトカインによるPLCγの活性化も2次メッセンジャーを介してRap1の活性化に関与していることが示唆された。また、Rap1の活性化はβ1インテグリンを介した造血細胞の細胞接着と相関し、活性化型Rap1の発現によりβ1の活性化が認められた。以上の結果より、EpoやIL-3受容体はCrkL/C3GやPLCγを介してRap1を活性化することにより、β1インテグリンを介した細胞接着を誘導することが明らかにされた(Arai,A.et al.,JBiol Chem,in press)。
新癌診断法の開発:ポリアミン類の高電圧キャピラリー電気泳動法による測定と臨床応用

ポリアミン類の測定法として我々はキャピラリー電気泳動法を提案するものである.内径50μm,長さ70100cmのキャピラリー管を泳動管に用いた.注入は試科溶液をカラム先端につけ先端を一定時間持ち上げる方法にて行なった.検出はオンカラム検出を行なった.市販螢光検出器の光学系に工夫を加え高感度化した.試料の前処理およびフォレスカアミンによる前誘導化について諸条件を検討し最適な条件を見いだした.この試料をキャピラリー電気泳動法にかけ,フリーポリアミン類を15分で非常にきれいに完全分離した.ポリアミン各成分は内部標準(6ーアミノーNーカプロン酸)より定量した.検出感度は0,015μl注入して約50fmolの絶対感度が得られた.この方法を組織・尿・血液中のポリアミン類の定量に用いた.ポリアミンと癌,臨床,医学との関連についてはポリアミンのラジカル阻害効果が推察されるデーターが得られたこと,エンドトキシンショクにおけるポリアミン投与の効果が得られたこと,オルガンダメージにおけるポリアミンの挙動が分ったこと,またジアミンオキシダーゼの精製を行なったことなどがあげられ,医学とポリアミンとのかかわりは一層検討が進んだ.本研究は第三年度になるが本年度の研究により(1)多量の試料が採取できるときは従来法と同一の感度が得られる(2)微量試料については本法は他方より格段にすぐれている(3)絶対感度は50fmolと非常に高感度が得られた(4)装置のメインテナンスが安い,カラムが容易に洗浄できるなど実用面ですぐれている等の成果が得られた.ポリアミン類の測定法として我々はキャピラリー電気泳動法を提案するものである.内径50μm,長さ70100cmのキャピラリー管を泳動管に用いた.注入は試科溶液をカラム先端につけ先端を一定時間持ち上げる方法にて行なった.検出はオンカラム検出を行なった.市販螢光検出器の光学系に工夫を加え高感度化した.試料の前処理およびフォレスカアミンによる前誘導化について諸条件を検討し最適な条件を見いだした.この試料をキャピラリー電気泳動法にかけ,フリーポリアミン類を15分で非常にきれいに完全分離した.ポリアミン各成分は内部標準(6ーアミノーNーカプロン酸)より定量した.検出感度は0,015μl注入して約50fmolの絶対感度が得られた.この方法を組織・尿・血液中のポリアミン類の定量に用いた.ポリアミンと癌,臨床,医学との関連についてはポリアミンのラジカル阻害効果が推察されるデーターが得られたこと,エンドトキシンショクにおけるポリアミン投与の効果が得られたこと,オルガンダメージにおけるポリアミンの挙動が分ったこと,またジアミンオキシダーゼの精製を行なったことなどがあげられ,医学とポリアミンとのかかわりは一層検討が進んだ.本研究は第三年度になるが本年度の研究により(1)多量の試料が採取できるときは従来法と同一の感度が得られる(2)微量試料については本法は他方より格段にすぐれている(3)絶対感度は50fmolと非常に高感度が得られた(4)装置のメインテナンスが安い,カラムが容易に洗浄できるなど実用面ですぐれている等の成果が得られた.
新方式ECRアンテナによるプロセス用大面積均一プラズマの生成

(1)直径45cm程度の大面積均一プラズマの生成にスロット直径15cm程度のアンテナで対応でき、必ずしも大口径アンテナが必要でないことが分かり、実用上大きな利点がある。(2)入射マイクロ波電力にほぼ比例してプラズマ密度は増加していき、水冷構造をもつアンテナを用いることにより、1kW以下のアンテナの耐久性が確認された。500W以上では冷却の必要性が指摘された。さらに大電力化のために、大気側に設置できる高密度化のためのアンテナ構造の検討が詳細に行われた。(3)Ar等の不活性ガスのみならず、O2、SF6、N2などの多原子ガス、反応ガスを用いてもプラズマパラメータの大面積均一性に関しては同等な値が得られた。プラズマの大面積均一性にとって、アンテナに内蔵されている永久磁石による磁力線構造が極めて重要であることが分かった。(4)O2プラズマによるフォトレジストアッシング、またSF6によるポリシリコンエッチングにより、CF4によるシリコン酸化膜及びシリコン膜のエッチングにより、プロセスの一様性がほぼ45cmの直径にわたって均一度±5%以内になることが分かり、実用化の見通しがついた。(6)ラジカル制御やイオンアシスト制御など将来の高精度プラズマプロセスのために、平面ECRアンテナによる独自の電子及びイオンのエネルギー分布制御法を開発した。これらにより、基板前面の電子温度及びイオン温度をそれぞれ独立に1桁程度制御できることを明らかにした。これまでに製作された直径26cmの小型平面ECRアンテナを用いて、以下の成果が得られた。1)アンテナインピーダンスの測定を行い、本実験で用いたアンテナが効率的なマイクロ波整合及び放射特性をもっていることが明らかにされ、効率よいアンテナ設計のため基礎データを得ることができた。また、電磁界放射についての理論的解析を行なった。2)小型の平面ECRアンテナでプラズマ発生の空間分布を調べ、直径約25cm(約10インチ)均一度±3%程度のプラズマの生成に成功し、アンテナ近傍の磁力線分布及び真空容器内面のプラズマ閉じ込め用マルチポール磁場の重要性を確認した。3)O_2、SF_6、N_2などの多原子ガス、反応ガスを使用し、アルゴンガスで得られたプラズマ密度や均一性が使用するガスの種類にどう依存するかを調べた結果、密度に対しては電離断面積の違いによる差異は認められたが、大面積均一性に関しては同等な値が得られた。4)酸素プラズマによるフォトレジストのエッチング実験を実際に行い、エッチング速度の一様性について調べた結果、プローブ測定で得られた密度分布に対応する均一性が得られた。以上により、さらに大口径化の基礎データを得ることができた。内蔵した磁石の電子サイクロトロン共鳴(ECR)を利用した平面スロットアンテナを用い、本年度はプラズマ生成の大面積・均一化を計ることを目的として研究を進めて来た。その結果、次の成果を得た。1)整合特性の良い大口径アンテナの製作のために、最適なスロットの位置を解析し、ネットワークアナライザーによる電磁波の入反射特性の測定結果と比較し、電磁波のラジアルモードに対応したスロット位置で放射効率が最大となることが明らかになった。また、その時プラズマが効率的に生成されることが明らかにされた。2)アンテナ部の永久磁石リングが奇数列か偶数列かによって、形成される磁場分布が発散型及び閉じ込め型の2通りに変化することが分かり、後者では生成されるプラズマ密度が前者に比べて高く、電子温度は低くなることが分かった。どちらの場合もプラズマ密度は±3%の範囲でおよそ直径4045cmにわたって均一になることが明らかになり、ECRプラズマで初めて大口径化が達成された。3)反応性ガスを用いたエッチング実験の結果、上記の直径の範囲でプロセス速度の均一性が確認された。4)プラズマの高密度化の実現のため、大電力マイクロ波入力に耐えられるマイクロ波導入回路部の改良及びアンテナ部の水冷構造化を行い、マイクロ波の導入試験を行った結果、1kWまでの入力が確認され、プラズマ密度もマイクロ波入力に対して直線的に増加していくことが明らかにされた。(1)本方式による大面積プロセス特性とプラズマパラメータとの関係を、アッシング及びエッチングの結果を通して明らかにした。

プロセスの均一性を詳細に調べた結果、いずれの場合も、直径45cmの範囲で均一性±(2-5)%の大面積プロセスが実証された。(3)ECRアンテナ部の永久磁石列が偶数列か奇数列化によるプロセス特性の変化について実験が行われた。その結果、大面積均一化にとっては両者に特に著しい差異は認められないことが分かった。(4)基板に高周波電力を印加し、印加パワーに対するプラズマパラメーターの変化について明らかにした。また、エッチング速度に対する効果も調べられ、入射パワーに対してエッチング速度の上昇が確認された。(5)アンテナを真空容器外部に設置した場合のマイクロ波導入方法、及び水冷構造を取り入れた大面積プラズマ発生用永久磁石内臓型平面ECRアンテナの検討が行われた。(6)ラジカル制御やイオンアシスト制御など将来の高精度プラズマプロセスのために、電子及びイオンのエネルギー制御法を開発した。基板前面の電子温度及びイオン温度をそれぞれ独立に1桁程度制御できた。
新しく発見された古細菌型ロドプシンの赤外分光

本研究では近年、新たに発見された古細菌型ロドプシンに対して系統的な赤外分光を行い、光がどのようにエネルギーや情報へと変換されるのか、そのメカニズムを明らかにすることを目指した。既知の古細菌ロドプシンとの比較を徹底的に行った結果、プロトンポンプ活性のあるロドプシンには強い水素結合を形成した水分子が必ず存在するという構造と機能を結ぶきわめて重要な結論を得ることができた。わずか1個の水分子がプロトンポンプ機能を決定する可能性を見出したのである。本研究では近年,新たに発見された古細菌型ロドプシンに対して系統的な赤外分光を行い,光がどのようにエネルギーや情報へと変換されるのか,そのメカニズムを明らかにすることを目指している。特に,我々が世界をリードしてきた既知の古細菌ロドプシン(ポンプのバクテリオロドプシン,ハロロドプシン,センサーのフォボロドプシンなど)の赤外分光との比較を徹底的に行い,ロドプシンが機能する際の構造変化について統一的な原理を見出すことを目指す。具体的な測定対象としては,真正細菌や真核生物に見出されたロドプシンを考えているが,本年度はProteorhodopsin(PR),Anabaena Sensory Rhodopsin(ASR)などに対して以下の成果を得た。海洋性バクテリアのプロトンポンプ蛋白質であるPRに対して赤外分光解析を行ったところ,特異的な水素結合構造が機能発現に重要な役割を担っていることを明らかにした。一方、光駆動ポンプとしてエネルギー変換を実現する古細菌型のロドプシンだけでなく,光情報変換を担うASRの光反応を低温可視分光法により検討した。その結果,100%のフォトクロミズム反応が実現していることを明らかにした。プロトンポンプを行うロドプシンは100%の光サイクル反応,フォトクロミックセンサーであるロドプシンには100%のフォトクロミズム反応が起こっており,構造は類似しているにも関わらず,機能のため光反応が最適化されていることがわかった。古細菌型ロドプシンやその他の光受容蛋白質に対する成果も含め,2007年に11編の原著論文を世に出すことができた。また,平成19年度には15件の招待講演を含む46件の学会発表を行った。本研究では近年、新たに発見された古細菌型ロドプシンに対して系統的な赤外分光を行い、光がどのようにエネルギーや情報へと変換されるのか、そのメカニズムを明らかにすることを目指している。特に、我々が世界をリードしてきた既知の古細菌ロドプシン(ポンプのバクテリオロドプシン、ハロロドプシン、センサーのフォボロドプシンなど)の赤外分光との比較を徹底的に行い、ロドプシンが機能する際の構造変化について統一的な原理を見出すことを目指す。具体的な測定対象としては、真正細菌や真核生物に見出されたロドプシンを考えているが、本年度はProteorhodopsin (PR), Anabaena Sensory Rhodopsin (ASR)などに対して以下の成果を得た。海洋性バクテリアには千種類ものPRが存在し、プロトンポンプとして光エネルギー変換を行うと考えられている。このようなさまざまなPRは環境に応じて吸収する光の波長を最適化しているはずだが、我々はレチナールから遠隔部位のアミノ酸変異が色を変えるというこれまでの常識に完全に反した現象を発見した。一方、光駆動ポンプとしてエネルギー変換を実現する古細菌型のロドプシンだけでなく、光情報変換を担うASRの光反応を低温赤外分光法により検討したところ、細胞質側に特異な水素結合構造を見出した。一方、古細菌型ロドプシンの測定としてはバクテリオロドプシンの時間分解赤外分光やセンサリーロドプシンIおよびIIの低温赤外分光解析を発表することができた。それ以外の成果も含め、2008年に14編の原著論文を世に出すことができた。また、平成20年度には13件の招待講演を含む51件の学会発表を行った。具体的な測定対象としては、真正細菌や真核生物に見出されたロドプシンを考えているが、本年度はProteorhodopsin(PR), Anabaena Sensory Rhodopsin(ASR)などに対して以下の成果を得た。

海洋性バクテリアに千種類以上も存在するPRについては、レチナールから遠隔部位のアミノ酸変異が色を変えるというこれまでの常識に完全に反した現象を昨年度、発見したが、本年度はこの研究をさらに進め、これがPRに特有であること、さらに部位特異的であることを見出した。フォトクロミズムセンサーとして機能するASRにはプロトンポンプ活性がないとされていたが、我々は1アミノ酸の変異により、内向きのプロトン輸送を実現することに成功した。一方、古細菌型ロドプシンの測定としてはバクテリオロドプシンやセンサリーロドプシンの研究を発表することができた。それ以外の成果も含め、11編の原著論文を世に出すことができた。また、8件の招待講演を含む43件の学会発表を行った。
熱ストレスと氷温の最適制御による貯蔵果実の高品質化

本研究は、果実の貯蔵において、鮮度維持や品質改善の観点から、低温(-2°Cの氷温域)だけでなく、高温(40°C)にも注目し、温度に対する果実応答(水損失速度と呼吸速度)を連続計測し、それらの動的な関係を解析、モデル化し、どのような温度操作パターン(低温と高温の組合せ)が果実の鮮度維持に有効であるのか、すなわち果実応答を最小にさせるのかをシステム科学的に究明し、その方法論の実用化を検討した。実験材料はトマトとミカンである。1.氷温から高温に至る温度変化(-240°C)に対する果実応答を計測し、それらの動的な挙動を調べた。果実の水損失速度や呼吸速度は、低温であればあるほど低下したが、低温一定ではそれ以上の低下はなかった。しかし一旦(12時間ほど)高温にし(熱ストレスを与え)、その後低温にする(熱ストレス解除する)と、さらに低下した。2.ニューラルネットワークを用いて、温度変化に対する果実応答の時系列をモデル化し、動的モデルを構築した。,最適なモデルパラメータ値を選ぶことで高精度のモデルができた。3.このモデルのシミュレーションから、水損失速度や呼吸速度の値を最小にする温度操作を遺伝的アルゴリズムを用いて求めた。最適値は、収穫後直ちに40°Cの熱ストレスを12時間ほど与え、その後急激にもとの温度(低温)に戻すパターンであり、これは最高温度(40°C)と最低温度(-2°C)の適切な組合せであった。4.最適な熱ストレス(40°C、1224時間)を与えた果実(とくにトマト)は、高温に対して抵抗性(耐性)がある(水損失や呼吸が抑制される)ばかりでなく、低温に対しても抵抗性があり、低温障害をかなり回避できた。この結果は、熱ストレスを与えることで低温耐性が強くなり、氷温(-2°C)よりもっと低温にした貯蔵が可能となり、従来の氷温貯蔵法より鮮度をもっと維持できた。5.実用化の観点から、簡易で低コストな熱ストレス負荷の方法を検討し、氷温域との最適な組み合わせで、愛媛県の特産である柑橘類(伊予柑)の貯蔵に応用し、良好な結果を得た。果実の貯蔵において、低温(-20°Cの氷温域)と高温(4050°C)が注目されている。本研究は、低温から高温の範囲内(-250°C)において、温度に対する果実の生理生態的な応答(果実応答)を調べ、それらの同定(モデル化)を行い、モデルのシミュレーションから、どのような温度操作が果実の鮮度維持および品質改善に有効なのかをシステム科学的に究明する。研究成果は以下のようである。実験用果実としてはトマトと温州ミカンを用いた。(1)温湿度が厳密にコンピュータ制御できる恒温恒湿器を用いて、氷温域から高温域に至るいろいろな温度変化(-250°C)に対する果実応答(果実の水損失速度、呼吸速度、糖度など)を非破壊・連続計測し、それらの動的な挙動を調べた。(2)次に、得られた計測データを基に、3層の階層型のニューラルネットワークを用いて、温度変化に対する各種の果実応答を同定(モデル化)し、それらの動的モデルを構築した。最適なシステムパラメータ数、中間層ニューロン数、学習回数などを用いて各時系列データを学習することにより、精度の高い動的モデルが構築できた。

(3)簡易な方法で、非接触計測できる3次元画像計測装置を試作し、画像処理による形状計測から、貯蔵プロセスにおける植物体(葉、茎、果実など)の品質劣化の状態を調べた。(4)これらの研究成果を、2004年9月にベルギーのルーバンで開催されたヨーロッパ農業工学会および10月に中国の北京で開催されたCIGR(国際農業工学会)で発表した。果実の貯蔵において、できるだけ低温(-20°Cの氷温域)にすることは鮮度維持の観点から重要であるが、高温(4050°C)もまた注目されている。本研究は、低温から高温の範囲内(-250°C)において、温度に対する果実の生理生態的な応答(果実応答)を調べ、それらの同定(モデル化)を行い、モデルのシミュレーションから、どのような温度操作が果実の鮮度維持および品質改善に有効なのかをシステム科学的に究明し、その方法論の実用化を検討した。研究成果は以下のようである。実験用果実としてはトマトと温州ミカンを用いた。1.最適な熱ストレス(40°C、1224時間)を与えた果実(とくにトマト)は、高温に対して抵抗性(耐性)がある(水損失や呼吸が抑制される)ばかりでなく、低温に対しても抵抗性があり、低温障害をかなり回避できた。この結果は、熱ストレスを与えることで低温耐性が強くなり、氷温(-2°C)よりもっと低温にした貯蔵が可能となり、従来の氷温貯蔵法より鮮度をもっと維持できた。2.実用化の観点から、簡易で低コストな熱ストレス負荷の方法(気温を高める、温水につける、温水を吹き付ける方法など)を検討し、氷温域との最適な組み合わせで、愛媛県の特産である柑橘類(伊予柑)の貯蔵に応用し、良好な結果を得た。
切断型コレクトリンを用いた膵ホルモン分泌能評価のための新たなバイオマーカーの確立

研究代表者は転写因子であるHNF-1α遺伝子異常によりインスリン分泌不全型糖尿病が発症すること、コレクトリンがHNF-1αの標的遺伝子であり、インスリン分泌促進作用を有していることを見出した(Nature 1996, Cell Metabolism 2005)。本研究の結果、コレクトリンは膜貫通領域の近傍で切断されてそのN末が細胞外へ放出されることが判明した。分泌型コレクトリンの抗体がインスリン分泌のマーカーになりえるものと考えられた。研究代表者は転写因子であるHNF-1αの遺伝子異常によりインスリン分泌不全を伴う糖尿病が発症することを明らかにした(Nature 1996)。HNF-1αによるインスリン分泌制御の分子機構を検討する過程で代表者らはHNF-1αの標的遺伝子としてACE2に相同性のある新規分子コレクトリンのクローニングに成功した(Cell Metabolism 2005)。コレクトリンはインスリン顆粒の開口放出を促進することでインスリン分泌を制御していた。膵β細胞におけるコレクトリンの働きの詳細を理解するために、コレクトリンのC末を特異的に認識する抗体を作成し、β細胞株を用いてウエスタンブロットを行なったところ、特異的なバンドが2本検出され、β細胞内においてコレクトリンは切断されている可能性が考えられた。N側にmyc配列を導入したコレクトリン発現ベクターをβ細胞株に導入し、抗myc抗体を用いてウエスタンブロットを行なったところ、細胞培養上清中にバンドが検出され、コレクトリンのN側がβ細胞で切断され細胞外に放出されていることが判明した。コレクトリンはインスリン分泌促進作用を有することから、細胞外に放出された切断型コレクトリンの血中濃度を測定することでインスリン分泌を評価するための新たなバイオマーカーが得られるものと期待できる。そこで現在、2次元電気泳動による分離後に、切断型コレクトリンのスポットを回収し、そのアミノ酸配列の決定を試みている。切断部位が同定できれば、GST融合タンパク質を作成し切断型コレクトリン特異的モノクローナル抗体を作成する予定である。研究代表者は転写因子であるHNF-1αの遺伝子異常によりインスリン分泌不全型の糖尿病が発症することを明らかにした(Nature1996)。HNF-1α異常によるインスリン分泌不全の分子機構を探索する過程で、研究代表者はコレクトリンがHNF-1αの標的遺伝子であり、インスリン分泌促進作用を有していることを見出した(Cell Metabolism2005)。コレクトリンの発現制御機構の解明は膵β細胞におけるコレクトリンの働きを理解する上で重要であることから、種々の因子によるコレクトリンの発現調節について検討を行った。膵β細胞株(MIN6)を高グルコースと低グルコース状況下において培養し、コレクトリンの発現について検討したところ、コレクトリンの発現は高グルコースの存在下で菩しく増加していることが判明した。一方、マニトールやインスリンはコレクトリンの登現に影響を及ぼさなかったことから、浸透圧やグルコースにより分泌されるインスリンではなく、高グルコースそのものがコレクトリンの発現に影響をおよぼしているものと考えられた。グルコースによるコレクトリンmRNAの発現量について検討を行ったところ、mRNA発現量について変化は認められず、高グルコースによるロレクトリンの発現はタンパク翻訳レベルで制御されているものと考えられた。また、コレクトリンは膜貫通領域の近傍で切断されてそのN末が細胞外へ放出されることが判明した。そこでコレクトリンのN側とGSTの融合タンパク発現ベクターを作成した。今後、融合タンパクを用いて分泌型コレクトリンのモノクローナル抗体を作成し、インスリン分泌との関連について検討する予定である。
非抗菌薬を用いた持続感染細胞の駆逐を目指したMRSAバイオフィルムの制御

非抗菌薬として界面活性剤に抗菌活性があることは以前から知られているが、各種界面活性剤を用い、MRSAバイオフィルムに対する効果と安全性を検討した。研究方法として高バイオフィルム形成能を有するMRSA臨床株(ATCC BAA-2856)を用いて、少量の菌とともに各種界面活性剤(陽イオン系、陰イオン系、両性イオン系、非イオン系)を添加(0.0005%0.5%)し、37 °C、24時間培養後、生菌数のカウント、クリスタルバイオレット染色法により定量化した。バイオフィルム産生の基質はプラスチック、マウス皮膚切片(ダーマルチップ)、シリコン、ステンレスを用いた。3T3繊維芽細胞はMTSアッセイを用い、細胞生存率を算出した。結果、非イオン系であるPS80以外の界面活性剤は、培養線維芽細胞に対し急激な毒性を示したが、PS80では最高濃度でも50%程度にとどまり、細胞障害性発現は緩徐だった。4種の界面活性剤は全てMRSAバイオフィルム形成を抑制したが、陽イオン系と陰イオン系では細胞毒性の発現が顕著であった。PS80には細胞毒性は認めなかったものの、バイオフィルム形成を特異的に抑制した。その効果は基質への菌の接着抑制だった。様々なバイオフィルム形成基質を用い、PS80の効果を検討した。ステンレスへのBF形成は抑制できなかったものの、ダーマルチップやシリコンではBF形成を抑制した。MRSAバイオフィルム形成は菌の基質への付着から始まるものの、PS80はその付着を抑制し、MRSAによるBF形成を効果的に抑制した。バイオフィルム形成が危惧される皮膚組織やプラスチック、シリコン素材の医療器具をPS80で前処理することで、菌の付着およびバイオフィルム形成を阻止でき、異物感染が原因となる難治性感染症への移行を予防できる可能性が示された。実験を遂行するマンパワーと時間の確保に依然困難を伴った。但し、当初の実験計画の対象として考えていた非抗菌薬について、界面活性剤まで拡げた結果、一定の研究業績を得ることができた。MRSA菌血症から分離された血液分離株について、バイオフィルム関連遺伝子およびバイオフィルム産生能、各種病原遺伝子について系統的な解析を加え、臨床像との関連について解析を加える。また、バイオフィルム産生能の高い株について抗バイオフィルム効果を認める界面活性剤をはじめとする非抗菌薬の効果を検討する予定である。I.MRSA臨床分離株のバイオフィルム関連遺伝子とin vitroにおけるバイオフィルム発現への影響の評価およびバンコマイシン感受性や臨床像との関連の解析2002年以降に分離されたMRSA血液分離株を用いPCR法を用いたバイオフィルム関連遺伝子の探索を行った。さらに、ポリスチレン製の96穴プレート上で発育させ、crystal violet染色後、分光光度度計によりバイオフィルム産生の定量スクリーニングを行った。バイオフィルム産生能は血清添加の有無で大きく異なる為、添加する場合と添加しない場合の両者で検討した。さらに各分離株のバンコマイシン低感受性の表現型であるヘテロVISA耐性やslow VISA耐性の特徴の有無についても解析を行った。これらバイオフィルム関連遺伝子とバイオフィルム発現能およびバンコマイシン感受性および各分離株が分離された例の臨床像との関連を解析した。これらの株のうち、病院感染型株、市中感染型株からバイオフィルム産生能の高い株を各々選択し、以下の実験に使用した。これまでに抗バイオフィルム効果が報告されている非抗菌薬を単剤で添加し、抗バイオフィルム効果の評価を行った。さらに非抗菌薬添加の有無による各菌株の増殖曲線を測定した。コントロールとして過去のバイオフィルム解析研究で使用されたバイオフィルム形成能の高いATCC登録株を用いた。実験を遂行するマンパワーと時間の確保に難渋し、当初予定実験の約半分の実行量にとどまった。

バイオフィルム形成が危惧される皮膚組織やプラスチック、シリコン素材の医療器具をPS80で前処理することで、菌の付着およびバイオフィルム形成を阻止でき、異物感染が原因となる難治性感染症への移行を予防できる可能性が示された。実験を遂行するマンパワーと時間の確保に依然困難を伴った。但し、当初の実験計画の対象として考えていた非抗菌薬について、界面活性剤まで拡げた結果、一定の研究業績を得ることができた。実験遂行の補助を行うマンパワーの確保に目途がついたため、当初の実験計画の遅れ部分にも着手の予定である。尚、初年度の結果でバイオフィルムとバンコマイシン低感受性および臨床像との関連について、興味深い知見が得られており、それに関する実験も新たに遂行予定である。MRSA菌血症から分離された血液分離株について、バイオフィルム関連遺伝子およびバイオフィルム産生能、各種病原遺伝子について系統的な解析を加え、臨床像との関連について解析を加える。また、バイオフィルム産生能の高い株について抗バイオフィルム効果を認める界面活性剤をはじめとする非抗菌薬の効果を検討する予定である。初年度は解析を行った対象菌株数が当初の予定より少ない株数しか行えなかったが、次年度は解析菌株数を増やし検討する。さらにバイオフィルム発現関連遺伝子のより詳細な解析も行う予定である。当初計画していた、非抗菌薬の抗バイオフィルム効果に関するより詳細な解析やin vivoでの効果の解析等にも使用する予定である。今回行った界面活性剤に関する実験は既存の物品で行える内容のものが多く予定程の物品消費が無かった。次年度は解析菌株数を増やし、関連遺伝子解析や非抗菌薬の効果に関する解析を行うために使用予定である。
低酸化数ホウ素化合物の合成と応用

本研究では、通常求電子剤として働くホウ素化合物とは異なる反応性を示す低酸化数ホウ素化合物を合成・単離し、これらを用いて新規反応の開発を目指した。具体的にはボリルリチウムによる小分子の活性化反応、および塩基安定化ボリレン、塩基安定化ボリルラジカルの合成法の開発及びその反応性を探求し、最終的には新規ホウ素置換基導入反応の開発を目指した。本年度は前年度の研究成果により見出したボリルリチウムと水素分子の反応機構を密度汎関数法(DFT)および自然結合軌道(NBO)解析を用いた理論計算により明らかにした。DFT計算によると、この反応の活性化ギブス自由エネルギーが室温で反応が進行しうる程度に低い活性化エネルギーをもつことが明らかになった。またNBO解析により、この反応機構がホウ素アニオンによる水素一水素結合の反結合性軌道に対する求核攻撃であることが明らかになった。これはホウ素アニオンが炭素アニオンと比べて高い求核性を示すことを示すことを表しており、ホウ素アニオンの高い求核性を実験、理論の両面から明らかにした成果であり、未だにまだ理解が十分に進んでいないホウ素アニオンの特性を理解する上で基礎化学的に非常に重要な知見の一つとなった。(抄録なし)当研究室ですでに合成が報告されているボリルアニオン等価体であるボリルリチウム、ボリルマグネシウムプロミド、ボリルブロモキュプラートと水素との反応を検討した結果、ボリルリチウムとボリルブロモキュプラートは水素と反応した。生成物はボリルリチウムは骨格由来の対応するジアミノボランと水素化リチウムを与え、ボリルブロモキュプラートはジアミノボランと0価の銅が生成した。これはボリルアニオンが求核剤としてのみではなく一電子移動還元剤としても働くことを示しており、グリニャール試薬などのカルボアニオンと同様の性質を示すことを示唆しており、ボリルアニオン種の性質に関して新しい知見が得られた。塩基安定化ボリレンの合成に関しては前駆体の候補であるプロモボレニウムカチオンの合成に成功した。ボレニウムカチオンを種々の一電子還元剤により還元することで目的とする塩基安定化ボリレンの合成を検討したところ、混合物ではあるものの塩基安定化ボリレンと思われる化合物のシグナルを11BMRにより観測した。これは塩基安定化ボリレンの単離に向けて期待の持てる予備的検討であり、今後は反応温度、溶媒、還元剤などの条件を最適化していくことで目標を達成できると考えている。塩基安定化ボリルラジカルの合成に関しては、β-ジイミナート配位子を持つジフルオロボランを合成し、それを一電子還元することで塩基安定化ボリルラジカルを極限構造の一つとして持つ含ホウ素複素環ラジカルを合成した。このラジカルは過酸化ベンゾイルといった含酸素化合物反応しとB-0結合生成を伴う生成物を与え、ボリルラジカルとして反応したと考えられる。これまで単離例のなかった二重項塩基安定化ボリルラジカルの反応性を解明して行く上でさきがけとなる重要な成果の一つだと考えられる。ボリルアニオンと塩基安定化ボリルラジカルの系については計画通り順調に進行し、研究としてほぼ完成の段階にまで達している。塩基安定化ボリレンは前駆体の合成に手間取ったために当初の計画よりやや遅れてはいるものの順調に進んでいる。今年度は塩基安定化ボリレンの合成に注力する。前駆体であるボレニウムカチオンの還元条件および配位子上の置換基の検討を行う。また単離そのものが困難であると判断された場合は系中で発生した塩基安定化ボリルに対して一価の金などの遷移金属錯体を添加することで塩基安定化ボリレン錯体としての単離を試みる。(抄録なし)
血清中血管内皮リパーゼ酵素活性の測定法確立と血清HDL値の関連の解明

高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-C)は、動脈硬化の負の危険因子である。しかし、血清HDL-C値の制御機構は十分に明らにされていない。近年同定された新規の脂質代謝酵素である血管内皮リパーゼ(Endothelial lipase ; EL)は血清HDL値の主要な規定因子である。本研究は、血清EL活性.蛋白量と血清HDL値との関係を明らかにすること、また冠動脈疾患の発症におけるHDL値とELとの関係を解析することを目指した。我々は、これまでヒト血清EL蛋白濃度を測定するELISAを用いて血清EL濃度と血清HDL. C濃度との関係を検討してきた。本課題研究では、新規の抗ELモノクロナル抗体を作製し、血清中EL蛋白量を定量するためのELISAをさらに改良した。新規のELISAではヒトEL血中濃度は319. 9±9. 0(74. 6.1193. 7) pg/mLと既報より2桁低値を示した。ヒト血清EL濃度と血清HDL-C値との関係を検討したところ、血清EL濃度は血清HDL-C値と有意な逆相関関係を示したが、血清LDL-C濃度や中性脂肪濃度とは関連がなかった。また、冠動脈疾患患者は、非冠動脈疾患患者と比較して血清EL濃度が上昇しており、血清HDL-C値が低値であった。さらに、ヘパリン投与前後でELの蛋白量に変化はなかった。ELは血管内皮細胞から分泌された後、血管内宮側にヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して係留していると推察されてきたが、ELとプロテオグリカンの相互作用やヘパリンによる遊離の有無については、再検討が必要であると考えられた。また、新規に作成した抗EL抗体で血清を免疫沈降した後に、その活性を蛍光標識した合成リン脂質Bis-BODIPY FL C11-PCを基質として測定する系を独自に開発した。ヒト血中EL活性と血清HDL-C値との関係を検討したところ、EL活性は血清HDL-C値と有意な逆相関関係を示したが、血清LDL-C濃度や中性脂肪濃度とは関連がなかった。また、冠動脈疾患患者は、非冠動脈疾患患者と比較して血清EL活性が上昇しているとともに高感度CRPが高値で、血清HDL-C値が低値であった。血清EL活性は冠危険因子と正の相関を示した。ただし、EL蛋白量と活性は有意な相関は示さず、これは血清中のELには不活性型が多いのかなどを含めて更なる検討が必要であると考えられた。結論として、我々はヒト血清EL蛋白濃度および活性の測定系を独自に確立した。ヒト血中EL濃度および活性は、血清HDL-C値の制御因子であるとともに、冠動脈硬化のマーカーであることが明らかとなった。

ヒト血中EL濃度および活性は、血清HDL-C値の制御因子であるとともに、冠動脈硬化のマーカーであることが明らかとなった。血管内皮リパーゼ(Endothelial lipase ; EL)はホスホリパーゼA1活性を有し、HDL中のリン脂質を選択的に分解してHDL代謝を促進する。EL発現は種々の動脈硬化惹起性刺激によって増加し、動脈硬化、高血圧、高インスリン血症などの動物モデルにおいてはEL発現が亢進し低HDL血症の原因となる。マウスでELを不活性化すると、血清HDL-C値が上昇し動脈硬化巣へのマクロファージの浸潤やコレステロールの取込みが減少し動脈硬化が抑制される。そこで、本研究ではヒト血清中のEL濃度と活性の測定法を確立し、血清HDL-C濃度との関係を明らかにすること目的とする。ヒト血中EL濃度の測定用ELISAを確立し、血清EL濃度と血清HDL-C値との関係を検討したところ、EL濃度は血清HDL-C値と有意な逆相関関係を示したが、血清LDL-C濃度や中性脂肪濃度とは関連がなかった。また、高脂血症治療薬であるピタバスタチンは血清HDL-C値を10-12%増加させるが、血清EL濃度を減少させることが明らかとなった。すなわち、ヒトにおいてもELが血清HDL-C値の規定因子であり、スタチンのHDL上昇作用にELが関与することを示した。ELは血清中で酵素的に切断不活性化されることが知られている。そこで活性型ELと血清HDL-C値との関係を検討するために、血清を抗EL抗体で免疫沈降した後に、その活性を蛍光標識した合成リン脂質Bis-BODIPY FL C11-PCを基質として測定する系を開発した。ヒト血中EL活性と血清HDL-C値との関係を検討したところ、EL濃度は血清HDL-C値と有意な逆相関関係を示したが、血清LDL-C濃度や中性脂肪濃度とは関連がなかった。以上より、EL活性は血清HDL-C値の規定因子であることを示した。高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-C)は、動脈硬化の負の危険因子である。しかし、血清HDL値の制御機構は十分に明らにされていない。血管内皮リパーゼ(Endothelial lipase;EL)は血清HDL値の主要な規定因子である。ELは血清中で酵素的に切断不活性化される。そこで我々は、血清を抗EL抗体で免疫沈降した後に、その活性を蛍光標識した合成リン脂質Bis-BODIPY FL C11-PCを基質として測定する系を開発した。本研究は、血清EL活性を測定し、血清HDL値との関係を明らかにすること、また冠動脈疾患の発症におけるHDL値とDLとの関係を解析することを試みた。本年度は、前年度より継続してヒト血中EL活性と血清HDL-C値との関係を、症例を増やして検討した。EL活性は血清HDL-C値と有意な逆相関関係を示したが、血清LDL-C濃度や中性脂肪濃度とは関連がなかった。さらに、冠動脈疾患患者は、非冠動脈疾患患者と比較して血清EL活性が上昇しているとともに血清HDL-C値が低値であった。また、喫煙患者では血清EL活性が上昇し、血清HDL-C値が低値であった。さらに血清EL活性はフラミンガムリスクスコアと正の相関を示した。さらに、運動習慣は血清EL活性を低下させた。したがって、ELが血清HDL-C値の規定因子のみならず、冠動脈疾患の発症に関与することが示された。家兎は、CETPを有するとともに、VLDL、LdL、HDLなどのヒトと同じリポ蛋白分画を有し、高脂肪食負荷により高脂血症と動脈硬化が惹起されるという点で、ヒトに近い脂質代謝をもつ動物モデルである。
生物学的製剤抵抗機序におけるヒト腸内細菌フローラパターンの経時的変化

本研究では、活動期炎症性腸疾患の腸内細菌叢を解析したところ、Clostrida目の細菌の減少を認めた。生物学的製剤および他治療法によって寛解導入された患者では、このClostridia目の細菌は増加を認める一方で、寛解導入できなかった患者では増減を認めず腸炎の病態への関与が考えられた。さらにこのClostridia目の細菌の死菌体は、ヒト潰瘍性大腸炎患者や各種腸炎マウス及びの腸管の免疫担当細胞から抗炎症性サイトカインであるIL-10産生を亢進させた。以上から、Clostrida目の細菌がIBD患者において抗炎症効果を有し、更には治療に応用できる可能性があるといえる。炎症性腸疾患(IBD)は原因不明の慢性腸管炎症性疾患である。近年、Tumor necrosis factor (TNF)-αに対する生物学的製剤をはじめとした宿主の免疫応答を調整する薬剤の有効性より、免疫異常の関与は明らかである。さらに、近年、ヒトやマウスモデルに於いて腸内細菌叢がIBDに限らず、他の自己免疫疾患、糖尿病、NASHなど幅広い疾患との関連が示唆され、その原因として腸内細菌叢が宿主の異常な免疫応答が惹起されることが想定されているが詳細な検討は未だなされていない。我々は、前年度より引き続き高感度16S-rRNA RT-PCR法を用いて、新規腸内細菌叢ライブラリの作成、疾患関連細菌叢の探索、probioticsの候補を検討してきた。我々は、これらの炎症時に減少し、治療後に増加している菌のうち特にClostridium coccoides groupに着目し新規Probioticsの候補が存在すると仮説した。これらのClostridaのうち、培養に成功した菌を用いてデキストラン硫酸(DSS)誘因大腸炎モデルの病態修飾効果を検討したところ、Clostridium coccoidesの死菌体投与により腸炎は有意に改善した。これらのことから、Clostridium coccoidesに新規Probioticsの候補が存在する可能性が示唆された。近年、Tumor necrosis factor (TNF)-αに対する生物学的製剤をはじめとした宿主の免疫応答を調整する薬剤の有効性により、免疫異常の関与は明らかである。さらに、近年、ヒトやマウスモデルに於いての腸内細菌叢がIBDに限らず、他の自己免疫疾患、糖尿病、NASH、自閉症など幅広い疾患との関連が示唆され、その原因として腸内細菌叢が宿主の異常な免疫応答を惹起していることが想定されているが、詳細な検討はいまだなされていない。活動期潰瘍性大腸炎患者15名、クローン病患者11名で治療前後(infliximab, FK506, Corticosteroid)での糞便解析から、潰瘍性大腸炎患者において、治療により寛解導入された患者では有意に腸内細菌数が増加していることが明らかとなった。一方で、寛解導入されなかった群では腸内細菌数の増加を認めなかった。我々は、これらの活動期に減少し、治療後に増加している細菌のうち、特にClostridium coccoides groupに着目し新規probioticsの候補が存在すると仮設した。これらのClostridiaのうち、培養に成功した菌を用いて、デキストラン硫酸(DSS)誘発大腸炎モデルの病態修飾効果を検討したところ、Clostridium coccoidesの死菌体投与により腸炎は有意に改善した。さらにマウスモデルにおける腸炎抑制効果について検討したところ、Clostridiaの死菌体との共培養が、大腸粘膜固有層よりIL-10の産生を増強していることが明らかとなった。さらに、ヒト大腸検体でも、同様にIL-10の産生増強を認めた。これらのことから、Clostridiaに新規probioticsの候補が存在する可能性が示唆された。炎症性腸疾患(IBD)は原因不明で慢性かつ難治性であるが、近年その病態の解明が進み、従来の治療と生物学的製剤を組み合わせて、多くの症例が緩解に至ることが可能になった。しかし、生物学的製剤に抵抗性を有する例が確実に存在しており、現在までその原因は全く解明されていない。一方、IBD患者では過剰な免疫反応を抑制的に制御する機構が崩れ、腸内細菌が炎症を惹起する免疫反応を誘導しているとされる。以上より腸内細菌フローラのパターンが生物学的製剤の薬剤抵抗性と密接に関連することが予想された。これまでの腸内細菌研究はほんの一部の腸内細菌のみの検出しか達成できない培養法が主体であったが、我々は新規の糞便腸内細菌フローラライブラリーの検出、定量化をRT-qPCR法によって解決してきた。

今回、同意取得できた潰瘍性大腸炎、クローン病患者より、治療前及び治療後(infliximabは0週、2週、6週の投与直前、FK506、ステロイドは投与前、2週間後)に糞便を採取した。定量的RT-qPCR法による潰瘍性大腸炎9名の解析では、糞便1g中に含まれる細菌数の合計は治療前後で有意に上昇していた。Clostridium Coccoides groupについては治療前後で有意な菌の上昇を認めた。9名中1名は治療抵抗性であり他の治療に切り替えられたが、治療前後でClostridium Coccoides groupの減少を認めた。治療前後でのClostridium増加の割合についても、若年者の方が顕著であった。Clostridium coccoidesは潰瘍性大腸炎若年者治療介入後に多いこと、治療介入前には菌数が減少しているということからClostridium coccoidesの中に炎症を抑制するProbioticsが存在する可能性が示された。当初、当該年度に於いては、活動性クローン病患者のうち、生物学的製剤(レミケード)による暖解導入療法患者(推定60例)の治療前後の糞便腸内細菌フローラ角斬をRT-qPCR法によって腸内細菌ライブラリの作成予定であった。現在、登録患者数を拡充二次性のレミケード治療抵抗例の腸内細菌の経過中の変化を解析し、二次性のレミケード治療抵抗例を予測する腸内細菌叢を検討中である。さらに、平成25年度実施予定であった、上記のライブラリからのIBD治療応用可能な新規Probioticsの候補として未知のClostridium coccoidesを数種類分離培養に成功し、動物実験レベルで腸炎抑制効果を示すことに成功している。平成24年度にはIBD患者の腸内細菌叢ライブラリの拡充を行うと共に、現時点で単菌分離培養できる菌数を増加し、新規Probioticsの候補細菌を同定、その作用メカニズムを詳細に検討していきたい。当初、当該年度においては、活動性クローン病、活動性潰瘍性大腸炎、健常コントロールの糞便腸内細菌フローラ解析をRT-qPCR法によって行い、腸内細菌ライブラリーを作成し、その際、IBD特異的腸内細菌の同定を行い、平成24年度に治療介入前後の腸内細菌フローラ解析を行う予定であった。現在までに、IBD患者の腸内細菌ライブラリーの作成と並行して、すでに前倒しで同一患者治療介入前後の腸内細菌フローラ解析も行なっているが、予定より下回る例数しか施行できていない。今後、例数を増やすとともに、Clostridiumの亜群解析も含め解析を急ぎたいと考えている。今回活動期潰瘍性大腸炎患者17名、クローン病患者11名で同一患者の治療前後での糞便の解析から、潰瘍性大腸炎患者に於いて治療前後で増加しているClostridium coccoides groupの中で数種類の単菌分離培養に成功した。これらの新規Probioticsの候補としての免疫調整能を検討するために、DSS誘因大腸炎モデルの病態修飾効果を検討した。今回の検討より、Clostridium coccoides groupの死菌投与は腸炎の改善、即ち、体重減少、腸管短縮、下痢・血便など腸炎の重症度を改善した。
生体機能を制御する活性イオウ分子種のシグナル伝達機構

本研究では、申請者が光合成細菌から新規に同定した活性イオウ分子種(Reactive sulfur species; RSS)応答性転写因子SqrRのRSS応答機構および本細菌のRSS代謝系の解析を通じ、RSSシグナル伝達の分子機構を理解することを目指している。本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、および、2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定を行うことで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。SqrRはRSSによって2つの保存されたシステイン残基の間で分子内テトラスルフィド結合が形成され、標的遺伝子のオペレーター領域へのDNA結合親和性が低下することがわかっている。この修飾について、細胞内のメジャーなRSSであるグルタチオンパースルフィド(GSSH)とシステインパースルフィド(CysSSH)に着目して、in vitroおよびin vivoでの解析を行ったところ、CysSSHではなくGSSHによって安定的な修飾を受けることが示唆された。また、SqrRの修飾に関わるRSSの代謝について、また、SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、関与し得るRSS代謝酵素を同定した。本酵素はロダネース様タンパク質であり、少なくとも硫化水素イオンのイオウ原子の転移を触媒する活性を持つことがわかった。さらに、硫化水素の消費を促すことで、SqrRの修飾をフィードバック制御している可能性が示唆された。本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定の2つのアプローチによって進め、それらの成果を有機的に結びつけることで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。今年度の各研究の研究状況を以下に記す。1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:細胞内のメジャーなRSSであるGSSHとCysSSHに対するSqrRの感受性について調べるため、大腸菌から精製したリコンビナントSqrRタンパク質をGSSHあるいはCysSSHで処理したところ、GSSHによって強く安定した修飾を受けることがわかった。また、SqrRによって制御を受ける遺伝子のプロモーター活性を指標に、in vivoでの各RSSの影響を観察したところ、細胞を硫化水素だけで処理、あるいは硫化水素とシステインで同時処理したときに比べ、硫化水素と還元型グルタチオン(GSH)で同時処理したときの方が、SqrRの活性が抑制された。この結果は、in vivoでもGSSHによる修飾がメジャーであることを示唆する。2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定:SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、関与し得るRSS代謝酵素を同定した。本酵素はロダネース様タンパク質であり、生化学的な解析から、少なくとも硫化水素イオンのイオウ原子の転移を触媒する活性を持つことがわかった。また、本酵素遺伝子の欠損株の解析から、硫化水素の消費を促すことで、SqrRの修飾をフィードバック制御している可能性が示唆された。今後も、以下の研究を構成することで、異なるアプローチによる研究成果を効率良く、有機的に結びつけることで研究の推進を図る。1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:SqrRに対するGSSHおよびCysSSHの反応性について、定性的なデータしか得られていない。そこで、より定量的なデータを得るために、各種濃度のRSSで処理したときの修飾具合から、SqrRに対するGSSHおよびCysSSHのKd値を求める。また、in vitroではSqrRはRSSによってテトラスルフィド結合を形成することがわかっているが、細胞内での修飾は解析できていない。そこで、光合成細菌からFLAGタグを融合したSqrRをアフィニティー精製し、質量分析によって修飾の種類を同定する。2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定:同定したロダネース様タンパク質の酵素活性について、硫化水素由来のイオウ分子を渡す先のイオウ受容体はわかっていない。そこで、イオウ受容体となる分子の同定を試みる。また、RSS代謝の初期課程に関わる他の酵素についても、生化学的に酵素活性を測定し、RSS代謝への寄与を検証することで、より包括的なRSS代謝の理解を目指す。そのために、野生株とこれらRSS代謝関連遺伝子の欠損株について、質量分析を用いた網羅的RSS解析法によって細胞内RSSの定量を行うことで、細胞内のRSS代謝系の検証を試みる。

また、SqrRの修飾に関わるRSSの代謝について、また、SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、関与し得るRSS代謝酵素を同定した。本酵素はロダネース様タンパク質であり、少なくとも硫化水素イオンのイオウ原子の転移を触媒する活性を持つことがわかった。さらに、硫化水素の消費を促すことで、SqrRの修飾をフィードバック制御している可能性が示唆された。本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定の2つのアプローチによって進め、それらの成果を有機的に結びつけることで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。今年度の各研究の研究状況を以下に記す。1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:細胞内のメジャーなRSSであるGSSHとCysSSHに対するSqrRの感受性について調べるため、大腸菌から精製したリコンビナントSqrRタンパク質をGSSHあるいはCysSSHで処理したところ、GSSHによって強く安定した修飾を受けることがわかった。また、SqrRによって制御を受ける遺伝子のプロモーター活性を指標に、in vivoでの各RSSの影響を観察したところ、細胞を硫化水素だけで処理、あるいは硫化水素とシステインで同時処理したときに比べ、硫化水素と還元型グルタチオン(GSH)で同時処理したときの方が、SqrRの活性が抑制された。この結果は、in vivoでもGSSHによる修飾がメジャーであることを示唆する。2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定:SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、関与し得るRSS代謝酵素を同定した。本酵素はロダネース様タンパク質であり、生化学的な解析から、少なくとも硫化水素イオンのイオウ原子の転移を触媒する活性を持つことがわかった。また、本酵素遺伝子の欠損株の解析から、硫化水素の消費を促すことで、SqrRの修飾をフィードバック制御している可能性が示唆された。今後も、以下の研究を構成することで、異なるアプローチによる研究成果を効率良く、有機的に結びつけることで研究の推進を図る。1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:SqrRに対するGSSHおよびCysSSHの反応性について、定性的なデータしか得られていない。そこで、より定量的なデータを得るために、各種濃度のRSSで処理したときの修飾具合から、SqrRに対するGSSHおよびCysSSHのKd値を求める。また、in vitroではSqrRはRSSによってテトラスルフィド結合を形成することがわかっているが、細胞内での修飾は解析できていない。そこで、光合成細菌からFLAGタグを融合したSqrRをアフィニティー精製し、質量分析によって修飾の種類を同定する。