hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝実質細胞と接着分子ICAM-1:その発現と肝障害における意義

従来、肝細胞におけるICAM-1の発現はサイトカインによって調節されると考えられてきた。我々は、ラット灌流肝や四塩化炭素投与肝における変性肝細胞にICAM-1抗原蛋白が発現することを観察した。in situ hybridazationによるmRNAのレベルにおける検討では、これらモデルにおいて肝細胞にICAM-1のシグナルは得られなかった。このことより、これらモデルにおけるICAM-1蛋白の発現は、de novoの合成ではなく、隣接細胞との膜接触解離による細胞膜上へ抗原エピトープの露呈によると推定された。変性肝細胞におけるICAM-1抗原蛋白の発現機序をさらに検討する目的で、ICAM-1分子の細胞外各ドメインを認識する特異的抗体を作製すべく、ICAM-1の細胞外蛋白を分離、精製し、モノクローナル抗体の作製を試みたが、特異抗体は得られなかった。マクロファージおよびKupffer細胞の活性状態が異なる種々のラット病態肝モデルを用いて、肝における接着分子の発現とこれら細胞の活性状態との関連を検討した。その結果、肝マクロファージにおけるLFA-1は刺激により得られた機能を、類洞内皮細胞におけるICAM-1は肝マクロファージの活性段階とexcitationを、それぞれ反映して発現した。また、ラットに塩化ガドリニウムまたはgum arabicを前投与しマクロファージ活性化を抑制すると、それらの発現はいずれの病態肝でも低下した。このことから、両接着分子の発現調節に肝マクロファージの活性状態が直接的に関与すると推定された。我々は、灌流肝や四塩化炭素投与肝における変性肝細胞にICAM-1抗原蛋白が発現することを観察し、これはサイトカイン調節を介した新生ではなく、隣接肝細胞との膜接触が解離したことによる抗原エピトープの露呈に基づくと想定した。今回、その仮説をin situ hybridazationによってmRNAのレベルで検討した。ラットを用い、肝細胞の変性を生じるモデルとして、四塩化炭素または、死菌およびエンドトキシン、ガラクトサミン投与による障害肝と、隣接細胞との接着解離を生じるモデルとして、灌流肝モデルを作製した。組織学的検討のため、凍結組織標本以外にパラホルムアルデヒド、エタノール、PLP固定液にて灌流固定した肝組織標本を作製した。四塩化炭素投与24時間後の類洞内皮細胞にはICAM-1mRNAのシグナルが認められたが、変性肝細胞には無かった。また灌流肝においても、灌流10分、および15分後の肝細胞にシグナルは得られなかった。このことより、これらモデルにおけるICAM-1蛋白の発現は、de novoの合成ではないと推定された。現在、変性肝細胞におけるICAM-1抗原蛋白の発現機序を検討する目的で、ICAM-1分子の細胞外各ドメインを認識する特異的抗体を作製すべく、ICAM-1の細胞外蛋白を分離、精製することを試みている。我々は、灌流肝や四塩化炭素投与肝における変性肝細胞にICAM-1抗原蛋白が発現することを観察した。in situ hybridazationによるmRNAレベルにおける検討では、灌流肝において肝細胞にシグナルは得られなかった。変性肝細胞におけるICAM-1抗原蛋白の発現機序をさらに検討する目的で、ICAM-1分子の細胞外各ドメインを認識する特異的抗体を作製すべく、ICAM-1の細胞外蛋白を分離、精製し、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体の作製を試みたが、特異抗体は得られなかった。マクロファージおよびKupffer細胞の活性状態が異なる種々のラット病態肝モデルを用いた検討では、マクロファージにおけるLFA-1および類洞内皮細胞におけるICAM1の発現は、マクロファージの活性状態に密接に関連した。ラットに塩化ガドリニウムまたはgum arabicを前投与しマクロファージ活性を抑制すると、それらの発現はいずれの病態肝でも低下した。
マイクロ流路デバイスを用いた伝播性α-シヌクレインの同定と伝播阻害システムの構築

α-Synuclein(αSyn)を主要構成分子とする細胞内凝集体「レビー小体」はパーキンソン病に特徴的な病理学的所見である。レビー小体の形成領域はパーキンソン病の最初期には嗅球において観察されると共に、病気の進行に伴って下部脳幹から大脳皮質に向かって上行性に広がって行く。近年、神経細胞に障害を引き起こす過程において、高分子化したαSynが細胞間を伝播し、近傍の神経細胞内へ取り込まれることが重要であるとの報告が相次いだ。この細胞間伝播は「プリオン様伝播仮説」と呼ばれ、脳内で病変が伝播・拡大する分子メカニズムとして注目されている。我々はこれまでに、レビー小体様凝集体を再現した病的培養神経細胞を一定期間培養した培地(conditioned medium)から高分子化したαSynの分離を行った。培地を濃縮後、ショ糖密度勾配遠心によって細分画を行い、Native-PAGE及びSDS-PAGEによって培地中に存在する高分子化αSynの分子量を算定すると共に、その凝集形成能についても検定を行った。その結果、病的神経細胞を培養した培地中には、ある特定の分子量を持つ、明瞭な高分子化αSynバンドを検出できることが明らかとなった。更に、この高分子化αSynを含む培地で健康な神経細胞を培養するとレビー小体様凝集体の形成を誘導することができた。現在、本研究の主軸であるマイクロ流路デバイスを用い、病的神経細胞が分泌する細胞間伝播性αSyn-seedを高精度で分離、その生化学的解析を進めると共に、マウス脳内に投与することで、そのin vivoでの細胞間伝播能と細胞毒性についての検討を進めている。今後は我々が見出した細胞間伝播性分子に注目し、細胞間の伝播を効率的に抑制するストラテジーの開発を視野に進めて行く予定である。マイクロ流路デバイスを用いることにより、細胞間伝播性αSyn-seed分子をより高精度で(人工的Fibril分子の影響を除いて)分離し、またこれを生化学的に検出する実験系を確立した。これにより当該Seed分子について、過去に報告されているProtease K(PK)assayや分子間力顕微鏡による分子形態の解析が可能となった。PK assayの実施により、本分子の構造的性質を知ることができたと共に、今後は電子顕微鏡による詳細な分子構造の解析を実施する予定である。更に現在、回収したαSyn-seed分子のタンパク量及びその実効濃度を高め、in vivoにおける細胞間伝播能を解析するため、当該分子をマウス脳内に投与し、一定期間飼育した後に免疫組織化学による凝集体の形成とその脳内伝播の検出を進めている。本研究によって我々が見出したαSyn-seed分子の有する細胞毒性を明らかにすることができるのみならず、生きた病的神経細胞が自ら産生する細胞間伝播性Seedの同定に繋がるものと期待される。今後は得られた情報を基に、神経保護ストラテジーの開発を目標として進めて行く予定である。今後の研究は、回収したαSyn-seed分子の性質について解析を進めると共に、神経保護ストラテジーの開発を目指す。1)原子間力顕微鏡(AFM)及び電子顕微鏡による分子形態の解析について、当該Seed画分をAFMのみならず、電顕を用いて観察し、Seed分子の形態を明らかにする。これまでの報告を踏まえ、特徴的な分子構造が存在するか、構造フィッティング解析を実施する。2)レビー小体様凝集体の形成能について、一次病態神経の作製に用いたαSyn-Fibrilやこれまでに我々が調製したSeed画分の凝集形成能を比較し、その病原性を定量的にin vivoで評価する。3) Seed分子に対する構造特異抗体の作製について、微量の抗原でも免疫可能な「試験管内免疫法」により、得られたSeed画分を用いてマウス脾臓細胞を免疫する。試験管内免疫の後、脾臓細胞はミエローマと細胞融合させ、ハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中から、dot blot assayとELISAによって単量体やFibrilには反応せず、標的のSeed構造にのみ反応する構造特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。4)構造特異抗体による細胞間伝播の阻害効果の検証を行う。レビー小体in vivo再現モデルを用いて、同定したSeed分子に対する構造特異抗体が細胞間伝播を阻害し、神経変性を防ぐことができるか、検証する。構造特異抗体の投与は、マウス線条体にFibrilを注入すると共に、大脳皮質内へ構造特異抗体(あるいは対照として正常マウス由来精製IgG画分)をosmotic pumpを用いて持続投与する。脳内注入後、30日目に灌流固定を行い、大脳皮質におけるレビー小体様凝集体の形成効率を抗リン酸化αSyn抗体を用いた免疫染色によって評価する。

培地を濃縮後、ショ糖密度勾配遠心によって細分画を行い、Native-PAGE及びSDS-PAGEによって培地中に存在する高分子化αSynの分子量を算定すると共に、その凝集形成能についても検定を行った。その結果、病的神経細胞を培養した培地中には、ある特定の分子量を持つ、明瞭な高分子化αSynバンドを検出できることが明らかとなった。更に、この高分子化αSynを含む培地で健康な神経細胞を培養するとレビー小体様凝集体の形成を誘導することができた。現在、本研究の主軸であるマイクロ流路デバイスを用い、病的神経細胞が分泌する細胞間伝播性αSyn-seedを高精度で分離、その生化学的解析を進めると共に、マウス脳内に投与することで、そのin vivoでの細胞間伝播能と細胞毒性についての検討を進めている。今後は我々が見出した細胞間伝播性分子に注目し、細胞間の伝播を効率的に抑制するストラテジーの開発を視野に進めて行く予定である。マイクロ流路デバイスを用いることにより、細胞間伝播性αSyn-seed分子をより高精度で(人工的Fibril分子の影響を除いて)分離し、またこれを生化学的に検出する実験系を確立した。これにより当該Seed分子について、過去に報告されているProtease K(PK)assayや分子間力顕微鏡による分子形態の解析が可能となった。PK assayの実施により、本分子の構造的性質を知ることができたと共に、今後は電子顕微鏡による詳細な分子構造の解析を実施する予定である。更に現在、回収したαSyn-seed分子のタンパク量及びその実効濃度を高め、in vivoにおける細胞間伝播能を解析するため、当該分子をマウス脳内に投与し、一定期間飼育した後に免疫組織化学による凝集体の形成とその脳内伝播の検出を進めている。本研究によって我々が見出したαSyn-seed分子の有する細胞毒性を明らかにすることができるのみならず、生きた病的神経細胞が自ら産生する細胞間伝播性Seedの同定に繋がるものと期待される。今後は得られた情報を基に、神経保護ストラテジーの開発を目標として進めて行く予定である。今後の研究は、回収したαSyn-seed分子の性質について解析を進めると共に、神経保護ストラテジーの開発を目指す。1)原子間力顕微鏡(AFM)及び電子顕微鏡による分子形態の解析について、当該Seed画分をAFMのみならず、電顕を用いて観察し、Seed分子の形態を明らかにする。これまでの報告を踏まえ、特徴的な分子構造が存在するか、構造フィッティング解析を実施する。2)レビー小体様凝集体の形成能について、一次病態神経の作製に用いたαSyn-Fibrilやこれまでに我々が調製したSeed画分の凝集形成能を比較し、その病原性を定量的にin vivoで評価する。3) Seed分子に対する構造特異抗体の作製について、微量の抗原でも免疫可能な「試験管内免疫法」により、得られたSeed画分を用いてマウス脾臓細胞を免疫する。試験管内免疫の後、脾臓細胞はミエローマと細胞融合させ、ハイブリドーマを作製する。
簡約型実球等質空間に対するカルタン分解と制限ルートおよび不変測度の研究

対称空間に対するカルタン分解や制限ルート系の理論によって代数的手法により対称空間上の非可換調和解析や幾何の研究が進展した.一方で,対称ではない等質空間上の調和解析が未発展である理由の1つに,カルタン分解のような分解定理が知られておらずルート系の理論が未整備であることが挙げられる.本研究課題では,対称空間を含む簡約型実球等質空間に対して,カルタン分解を具体的に与え,制限ルートの集合の構造を明らかにする.また,本研究の調和解析への応用として,簡約型実球等質空間の不変測度を制限ルートによって明示的に与えることを目指す.対称空間に対するカルタン分解や制限ルート系の理論によって代数的手法により対称空間上の非可換調和解析や幾何の研究が進展した.一方で,対称ではない等質空間上の調和解析が未発展である理由の1つに,カルタン分解のような分解定理が知られておらずルート系の理論が未整備であることが挙げられる.本研究課題では,対称空間を含む簡約型実球等質空間に対して,カルタン分解を具体的に与え,制限ルートの集合の構造を明らかにする.また,本研究の調和解析への応用として,簡約型実球等質空間の不変測度を制限ルートによって明示的に与えることを目指す.
比較ゲノム解析による軸決定進化プロセスの解明

1、昨年度までに、カノニカルWntリガンドであるマウスWnt8Aとその拮抗因子であるDKK1を過剰に発現したマウス胚の表現型を解析した、DKK1遺伝子を過剰に発現させると前脳領域が拡大し、Wnt8Aを過剰に発現させると逆に前脳領域が縮小することを示してきた。DKK1過剰発現胚で観察された異常について、胚性8日目の細胞の性質を、形態レベルで詳細に解析したところ、前脳に隣接する表皮外胚葉が神経上皮細胞様の性質を持っことが分かった。特に、細胞分裂方向についても、詳細に解析したところ、本来表皮細胞様の単層上皮形態を維持するような分裂様式が、神経上皮様の重層又は、偽重層上皮様の形態を維持する分裂様式に変化していた。更に、どのようなシグナル経路を介して、Wntシグナルが前脳の大きさを制御しているのか明らかにするため、この時期の胚の前脳神経上皮と隣接する表皮外胚葉を用いて、mRNAを抽出しマイクロアレイ解析を行った。今後、Wntシグナルの標的分子候補や関連分子に絞って、詳細な発現解析を行う予定である。2、哺乳動物胚において、もっとも最初に前後軸決定がなされる組織は、臓側内胚葉と考えられている。現在までに、臟側内胚葉内の前後軸に沿ったWntシグナルの非対称性が、軸決定に重要な機能を果たしていることを明らかにしてきた。そこで、Wntシグナルの非対称な分布がどのような非コードゲノム機能の獲得で起こったのか解明するため、臓側内胚葉細胞の挙動を胚性5日目胚を用いてライブイメージングする系を樹立した。まず、緑色蛍光タンパク質によってCerl発現細胞を標識したトランスジェニック胚を用いて、移動中の細胞の挙動を追跡することに成功した。今後、WntやDkk1が、細胞移動に与える影響について、検討を進める。1、カノニカルWntリガンドであるマウスWnt8Aとその括抗因子であるDkk1を過剰に発現したマウス胚の表現型を解析した。これまでに、Dkk1遺伝子を過剰に発現させると前脳領域が拡大し、Wnt8Aを過剰を発現させると逆に前脳領域が縮小していた。実際どのような細胞レベルでの現象を介して、Wntシグナルが前脳の大きさを制御しているのか明らかにするため、より詳細な解析を行った。まず、連続組織切片を作製し、終脳の形成過程における外胚葉組織の形態を観察したところ、頭部の神経管が閉鎖する時点で既に、前脳の大きさに有意な差があることを見いだした。さらに、光学顕微鏡レベルの解析及び電子顕微鏡レベルの解析を行ったところ、表皮外胚葉と神経上皮の境界が曖味になり、表皮外胚葉の一部がより神経上皮に類似した形態を示していることが分かった。この結果は、Whtシグナルが、神経上皮と表皮外胚葉の運命決定に何らかの機能を果たしていることを強く示唆している。現在までに、臓側内腫葉内の前後軸に沿ったWntシグナルの非対称性が、軸決定に重要な機能を果たしていることを明らかにしてきた。そこで、Wntシグナルの非対称な分布がどのような非コードゲノム機能の獲得で起こったのか解明するため、キーとなっているマウスDkk1遺伝子の臓側内胚葉における発現制御機構の解析を行った。まず、Dkk1遺伝子の非コードゲノム領域約200kbをもつBACベクターを用いて、大腸菌内の相同組み換え法を用いて、Dkk1遺伝子産物と融合するようにレポーター遺伝子(蛍光タンパク質YFPの一種Venus)を挿入した。また、Dkk1遺伝子座全体を他の脊椎動物種の非コード領域と比較することで、10以上の高度に保存された非コード領域を見いだした。

まず、緑色蛍光タンパク質によってCerl発現細胞を標識したトランスジェニック胚を用いて、移動中の細胞の挙動を追跡することに成功した。今後、WntやDkk1が、細胞移動に与える影響について、検討を進める。
メラノーマの進展、および治療抵抗性におけるPIP3閾値モデルの検証

研究1年目となるH30年度は、以下の研究を行った。1メラノーマ・モデルマウス(BRAFV600E;Ptenー/ー)とInpp4b欠損マウスを交配し、Inpp4bをヘテロ欠損(BRAFV600E;Ptenー/ー;Inpp4b+/ー)、あるいはホモ欠損(BRAFV600E;Ptenー/ー;Inpp4bー/ー)で持つマウスを作製する。21で作製したメラノーマ・マウスのメラノーマの数、大きさ、腫瘍ができるまでの期間、生存率、転移の有無などを調べ、PIP3レベルとの関連を比較する。3切除したメラノーマの手術標本を用いて、PTENとINPP4Bの免疫組織化学染色を行い、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類する。1、2に関しては、順調に交配がすすみ、Pten、およびInpp4bの対立遺伝子数が異なるマウス、すなわち両者により産生されるPIP3レベルが異なるメラノーマ・マウスを作製することができた。また、PIP3レベルが上昇するにつれ、メラメラノーマの数、大きさが増え、腫瘍ができるまでの期間が短くなり、生存率も低下することがわかった。3に関しては、切除したメラノーマの手術標本を用いる代わりにまず、市販のメラノーマの組織アレイを用いて、PTEN、およびINPP4Bに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。その結果、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類されることがわかった。本研究では、PIP3レベルが異なるメラノーマ・マウスを作製することが、研究の進行度を決定することになる。そのためには、BRAFの活性化型変異(BRAFV600E)、Pten変異、Inpp4b変異に加え、色素細胞だけに変異を起こすためにタモキシフェン誘導性のTyr::CreERT遺伝子をもつマウスをスクリーニングする必要があった。これは、非常に時間と手間のかかる作業であったが、順調に交配が進み、発癌実験を行えるだけのマウスを手に入れることができた。また、組織アレイを用いてメラノーマにおけるPTEN、およびINPP4B発現レベルの傾向をつかむことができた。以上より、「おおむね順調に進展している」と判断した。2年目となるH31年度は以下の研究を行い、腫瘍のPIP3レベルが、腫瘍内の細胞障害性リンパ浸潤、免疫チェックポイント阻害薬感受性などにどのような影響を与えるかを調べる。そのために以下の研究を行う予定である。1腫瘍内PIP3レベルとメラノーマ・マウスのAKT-mTOR経路の活性化状態(ウェスタン・ブロット)、腫瘍浸潤性Tリンパ球の数(免疫組織染色)、腫瘍内のTリンパ球の浸潤に関わるサイトカインの発現(定量的PCR法)がどのように関連するかを解析する。2H30年度に作製したPIP3レベルの異なるメラノーマから細胞株を樹立する。32で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、増殖能、浸潤能、転移能とPIP3量との相関を解析する。42で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、BRAFキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬で処理し、PIP3レベルと治療抵抗性との相関関係を調べる。5当科で切除したメラノーマの手術標本を用いてPTENとINPP4Bの免疫組織化学染色を行い、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類し、BRAF変異の有無、臨床ステージ分類、免疫チェックポイント阻害薬に対する感受性との相関を調べる。

そのためには、BRAFの活性化型変異(BRAFV600E)、Pten変異、Inpp4b変異に加え、色素細胞だけに変異を起こすためにタモキシフェン誘導性のTyr::CreERT遺伝子をもつマウスをスクリーニングする必要があった。これは、非常に時間と手間のかかる作業であったが、順調に交配が進み、発癌実験を行えるだけのマウスを手に入れることができた。また、組織アレイを用いてメラノーマにおけるPTEN、およびINPP4B発現レベルの傾向をつかむことができた。以上より、「おおむね順調に進展している」と判断した。2年目となるH31年度は以下の研究を行い、腫瘍のPIP3レベルが、腫瘍内の細胞障害性リンパ浸潤、免疫チェックポイント阻害薬感受性などにどのような影響を与えるかを調べる。そのために以下の研究を行う予定である。1腫瘍内PIP3レベルとメラノーマ・マウスのAKT-mTOR経路の活性化状態(ウェスタン・ブロット)、腫瘍浸潤性Tリンパ球の数(免疫組織染色)、腫瘍内のTリンパ球の浸潤に関わるサイトカインの発現(定量的PCR法)がどのように関連するかを解析する。2H30年度に作製したPIP3レベルの異なるメラノーマから細胞株を樹立する。32で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、増殖能、浸潤能、転移能とPIP3量との相関を解析する。42で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、BRAFキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬で処理し、PIP3レベルと治療抵抗性との相関関係を調べる。5当科で切除したメラノーマの手術標本を用いてPTENとINPP4Bの免疫組織化学染色を行い、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類し、BRAF変異の有無、臨床ステージ分類、免疫チェックポイント阻害薬に対する感受性との相関を調べる。年度末に抗体を注文したが、納品が年度内に間に合わなかった。
複雑ネットワークの優先的成長モデルとその臨界現象への応用

本研究では,複雑ネットワーク上で起こる現象を観測し,複雑ネットワークの成長モデルにその現象を取り入れて,現象そのものを数理的に理解することを目的としている.日本企業約100万社のデータを用いて,企業間の商取引によるお金の流れをリンクとする,企業間取引ネットワークを研究の対象とする.平成25年度には,企業間取引ネットワーク上で,様々な業種の優先的接続の強さの推定を行なった,優先的接続とは,多くリンクを持つノードほど新たにリンクを獲得する確率が高いという概念であり,その確率はリンク数に比例する.また優先的接続の強さは,リンク数の何乗に比例するかという,指数の値で決まる.申請者は業種によって,この優先的接続の強さを表す指数が異なることを明らかにし,特に値が1より大きい場合には,1)ネットワークに独占的な企業が現れる場合2)スケールフリーネットワークになる場合という2つの状態が存在することを見出した.申請者はこの現象を,既存の凝集現象の分野で知られている,ゾル-ゲル転移という現象と関連付けて研究を行なった.優先的接続の指数を複雑ネットワークの成長モデルに組み込み,この指数の値を変化させることで,ネットワークの状態がスケールフリーから独占的ノードが出現する状態に変化することを,シミュレーションから明らかにした.また成長モデルの時間変化を表す微分方程式を解くことで,転移点でネットワークがスケールフリーになり,そのベキ指数が優先的接続の強さによって決まることを明らかにした.(抄録なし)本研究では,複雑ネットワーク上で起こる現象を観測し,複雑ネットワークの成長モデルにその現象を取り入れて,現象そのものを数理的に理解することを目的としている.日本企業約100万社のデータを用いて,企業間の商取引によるお金の流れをリンクとする,企業間取引ネットワークを研究の対象とする.平成25年度には,企業間取引ネットワーク上で,様々な業種の優先的接続の強さの推定を行なった,優先的接続とは,多くリンクを持つノードほど新たにリンクを獲得する確率が高いという概念であり,その確率はリンク数に比例する.また優先的接続の強さは,リンク数の何乗に比例するかという,指数の値で決まる.申請者は業種によって,この優先的接続の強さを表す指数が異なることを明らかにし,特に値が1より大きい場合には,1)ネットワークに独占的な企業が現れる場合2)スケールフリーネットワークになる場合という2つの状態が存在することを見出した.申請者はこの現象を,既存の凝集現象の分野で知られている,ゾル-ゲル転移という現象と関連付けて研究を行なった.優先的接続の指数を複雑ネットワークの成長モデルに組み込み,この指数の値を変化させることで,ネットワークの状態がスケールフリーから独占的ノードが出現する状態に変化することを,シミュレーションから明らかにした.また成長モデルの時間変化を表す微分方程式を解くことで,転移点でネットワークがスケールフリーになり,そのベキ指数が優先的接続の強さによって決まることを明らかにした.(抄録なし)
錯体を前駆体とする希土アルミネートの合成と結晶化学

フラックス法、反応燒結法、アークメルト法を用いて希土類オルソアルミネート;RA1O_3(R=La-Lu)化合物の単結晶と多結晶の合成を試みた。フラックス合成法では溶質調整に際し、一部、アルコキシドを出発物質を用いる方法を試みた。KFをフラックスとし、R=LaLu全てで単結晶を得た。単結晶はみな立体的に近い形である。そして、例えばErA1O_3の場合にはピンクといったようにR^<3+>に特有の色を呈す。サイズは一つの辺の長さが約3060μmである。ところでNdの場合には一桁大きい300600μmのサイズを示す。この場合、溶質調整の原料をアルコレートにしたために、KFに対して溶媒和しやすい溶質が得られたものと解釈される。溶質の未溶に起因する多核発生が避けられ、結果的に得られる個々の単結晶が大きくなったと考えられる。フラックス法による単結晶合成に際し、溶質の原料をアルコレートに求めることの有用性を確認した。R=La、Pr、Ndは三方晶系(空間群;R3c)に属する。CeAlO_3については三方晶系とする論文が圧倒的に多いが我々が得た単結晶についての解析データが正方晶(空間群;P4/mmm)である。R=SmLuは全て斜方晶系(空間群;Pbnm)である。RA1O_3では特に重希土類において化合物形成が大変困難とされ、これまで高圧合成法が用いられてきている。今回、重希土類についても常圧下で単結晶が得られたのは注目される。一方、反応燒結法ではR=La-Tmの範囲で単相で多結晶化合物が得られる。R=Yb,Luにおいては今のところ目的化合物の単相化が達成されない。特にLuA1O_3の安定な温度の上限は低く、従って、合成温度を他より低く押さえる必要がある。アークメルト法ではR=La-Tmまで単相の多結晶化合物を得ることができる。しかしながら、この手法によればR=Yb、Luにおいてはオルソアルミネートは得られない。
肺がん長期生存症例のネオアンチゲンに対する免疫応答の検討

長期生存肺がん患者と早期再発肺がん症例の手術(生検)時の腫瘍におけるネオアンチゲンの多寡や特徴、免疫関連遺伝子発現、腫瘍浸潤リンパ球の病理学的所見を比較検討することで、長期生存肺がん患者の抗腫瘍免疫応答の全容をつかむ。また、手術(生検)時の腫瘍で発現していたネオアンチゲンに対する特異的T細胞が、患者末梢血に長期生存メモリーT細胞として存在している直接の証拠を、マルチマー解析を含むフローサイトメトリーによる解析、IFN ELISA、TCRレパトア解析等を駆使して掴む。これらのデータは今後のネオアンチゲンワクチンの治療適応選択、ネオアンチゲンペプチド候補選択に役立てることが可能になる。
MRIを用いた骨質評価法の開発　ー骨質を画像化するー

ストレプトゾトシン(STZ)投与による糖尿病(DM)ラットにおける皮質骨の変化をSWIFTで評価した.STZ投与後2,4,8週の時点で脛骨を摘出し, CTとMRIの撮像および骨形態計測を行った.MRIでは動物用7.04TMRI装置を用いてSWIFTと従来の撮像法であるプロトン密度強調画像(PDWI)を撮像した.それぞれの条件下で脛腓骨癒合部から2mm近位の横断面の皮質骨に関心領域(ROI)を設定した.CTではROI内の骨密度を計測した.MRIではROI内の信号強度から信号雑音比(SNR)を算出した.骨形態計測ではvillanueva bone染色を施した標本を作製し,蛍光下に骨形成速度(BFR/BS)を計測した.また,動物モデルの妥当性を示すために血液検査と脛骨の力学試験を行った.えられたそれぞれの結果について,DM群と対照群を比較した.血液検査では空腹時血糖値はすべての時点で,DM群で高値であった.力学試験では最大破断強度などがDM群ですべての時点で低下していた.CTで計測した皮質骨骨密度は投与後8週になりDM群で低値となった.皮質骨のSNRは,PDWIではいずれの時点においても有意な差はなかったが,SWIFTでは投与後2週からDM群で有意に低値となった.BFR/BSはすべての時点においてDM群で有意に低値となった.CTや従来のMRI撮像法ではとらえられないDMにおける皮質骨の変化をSWIFTではとらえることができた.骨密度以外の部分,すなわち骨質の変化をとらえることができたと考える.SWIFTはDMにおける皮質骨の骨質の変化をとらえることができ, DM患者における骨粗鬆症の診断において有用なツールとなりうることが明らかにされた.骨粗鬆症患者において,骨密度が基準値以上であるにもかかわらず,骨折を生じるやすくなることがある.とくに糖尿病患者では正常高値の骨密度を呈するにもかかわらず,骨折のリスクが増加する.糖尿病患者では,骨質が低下することにより骨強度の低下を来たしている可能性がある.MRIは非侵襲的に組織の変化をとらえることができる検査法である.近年,いくつかの研究において,MRIによる骨質の評価が行われている.骨強度の維持に中心的な役割を果たす皮質骨は,内部の水分子のうち結合水の割合が高く,T2値が低値である.MRIの撮像法のひとつであるUTEやSWIFT法は,このようなT2減衰時間が短時間である組織を撮像するのに用いられている.われわれのグループは卵巣摘除によるラット骨粗鬆症モデルを用いて,SWIFT法が従来のMR画像よりも鋭敏に骨粗鬆症における骨皮質の変化をとらえられることを明らかにしてきた.今回,動物用高磁場MRI装置を用いて糖尿病モデルラットの脛骨のSWIFT像を撮像し,骨質の評価方法としての有用性を検討することを目的として研究を開始した.平成28年度は糖尿病モデルラットの作製,力学試験の方法の確立を行った.糖尿病モデルラットとして,まずはストレプトゾトシン投与による1型糖尿病誘発モデルを用いて,研究を行った.空腹時血糖値,HbA1cはどちらも正常群と比較し,有意に高く,糖尿病モデルとして妥当であった.力学試験として,3点曲げ試験を行った.力学試験として3点曲げ試験を行ったが,ラット脛骨の形状は弯曲しており,安定した方向,強さの負荷を加える方法の確立に苦慮したため.ストレプトゾトシン投与による糖尿病ラットにおける皮質骨の変化をSWIFTで評価した.投与後2,4,8週の時点で脛骨を摘出し, CTとMRIの撮像および骨形態計測を行った.MRIでは動物用7.04TMRI装置を用いてSWIFTと従来の撮像法であるプロトン密度強調画像(PDWI)を撮像した.それぞれの条件下で脛腓骨癒合部から2mm近位の横断面の皮質骨に関心領域(ROI)を設定した.CTではROI内の骨密度を計測した.MRIではROI内の信号強度から信号雑音比(SNR)を算出した.骨形態計測ではvillanueva bone染色を施した標本を作製し,蛍光下に骨形成速度(BFR/BS)を計測した.えられたそれぞれの結果について,DM群と対照群を比較した.皮質骨骨密度は投与後8週になりDM群で低値となった.皮質骨のSNRは,PDWIではいずれの時点においても有意な差はなかったが,SWIFTでは投与後2週からDM群で有意に低値となった.BFR/BSはすべての時点においてDM群で有意に低値となった.CTや従来のMRI撮像法ではとらえられないDMにおける皮質骨の変化をSWIFTではとらえることができた.骨密度以外の部分,すなわち骨質の変化をとらえることができたと考える.SWIFTはDMにおける皮質骨の骨質の変化をとらえることができ,DM患者における骨粗鬆症の診断において有用なツールとなりうることが明らかにされた.ストレプトゾトシン投与による糖尿病ラットモデルにおいて皮質骨の変化をSWIFTによって明らかにできたため.ストレプトゾトシン(STZ)投与による糖尿病(DM)ラットにおける皮質骨の変化をSWIFTで評価した.STZ投与後2,4,8週の時点で脛骨を摘出し, CTとMRIの撮像および骨形態計測を行った.MRIでは動物用7.04TMRI

装置を用いてSWIFTと従来の撮像法であるプロトン密度強調画像(PDWI)を撮像した.それぞれの条件下で脛腓骨癒合部から2mm近位の横断面の皮質骨に関心領域(ROI)を設定した.CTではROI内の骨密度を計測した.MRIではROI内の信号強度から信号雑音比(SNR)を算出した.骨形態計測ではvillanueva bone染色を施した標本を作製し,蛍光下に骨形成速度(BFR/BS)を計測した.また,動物モデルの妥当性を示すために血液検査と脛骨の力学試験を行った.えられたそれぞれの結果について,DM群と対照群を比較した.血液検査では空腹時血糖値はすべての時点で,DM群で高値であった.力学試験では最大破断強度などがDM群ですべての時点で低下していた.CTで計測した皮質骨骨密度は投与後8週になりDM群で低値となった.皮質骨のSNRは,PDWIではいずれの時点においても有意な差はなかったが,SWIFTでは投与後2週からDM群で有意に低値となった.BFR/BSはすべての時点においてDM群で有意に低値となった.CTや従来のMRI撮像法ではとらえられないDMにおける皮質骨の変化をSWIFTではとらえることができた.骨密度以外の部分,すなわち骨質の変化をとらえることができたと考える.SWIFTはDMにおける皮質骨の骨質の変化をとらえることができ, DM患者における骨粗鬆症の診断において有用なツールとなりうることが明らかにされた.力学試験については,支点の形状を工夫することで解決した.平成28年度に確立した動物モデルを用いて,力学試験とともに,SWIFT法によるMR画像の撮像を行っていく.同様の手法を用いて,別の動物モデルにも応用することで,これまでの結果を強固なものにすると同時に,より臨床での使用へと近づける予定である.力学試験の方法を確立することに苦慮したため.MR画像の撮像を開始することが遅れたため.平成28年度の繰り越し金が多かったため,次年度使用額が生じた.平成29年度分については,研究が予定通りもしくはそれ以上に進展し,それに伴い予定額以上の金額を使用した.平成30年度にこれまでと異なる動物モデルを用いた実験を行うとともに,これまでの研究成果についての学会発表や論文作成を行い,予定通りの経費を使用する予定である.力学試験については,支点の形状を工夫することで解決した.平成28年度に確立した動物モデルを平成29年度中に繰り越して購入し,MR画像の撮像を行う予定である.
古代官衙の造営技術に関する考古学的研究

本研究では、古代(710世紀)地方官衙遺跡の掘立柱建物遺構を主たる分析対象として、基部構造、柱穴の形状・規模、建物の平面形式や規模等の諸属性を抽出・分類し、属性ごとのデータを収集し、データベースを作成して公開した。そして、各属性データの統計的分析をおこない、豪族居宅や集落の建物と比較しながら、官衙建物の造営技術の特性や在来技術との関係について追究し、官衙造営方式のあり方にっいて検討を加えた。その結果、礎石建物官舎の採用には官衙の等級差による規制がうかがえること、総地業を伴う礎石建物正倉の普及がする関東以北では、蝦夷征討などに備えた穀稲の永年貯積がとくに重視された地方的特質や技術のネットワークの存在を推測することができた。また、官衙の掘立柱建物では、居宅や集落に比べて、柱掘方が方形で棟方に直行する建物、大型の柱掘方を伴う建物の割合が高く、縄張りなどに合わせて柱掘方を機械的に掘削する方式が大規模な官衙建物造営と強く結びついていたことが知られた。また、官衙では柱筋の通りがよく、柱間は完数尺や等間の例が多い。それは、規格化された設計と良材を選び精度の高い部材加工を施す建築方式の存在を示している。また、建物の平面規模でも総体として大型の例が多く、柱掘方も深い例が多く、その深さと柱間寸法とには相関性が認められ、広い柱間を伴う建物の側柱高が高かったこともうかがえる。こうした官衙建物にみられる特徴は、その背後に豊富な資材調達と工人や役夫の労役編成があり、それらが造営指揮者によって統括されるという官衙造営システムが存在していたことことを物語るものであろう。このような造営方式は10世紀代までは維持されていたことも明らかになり、官衙造営技術のあり方も官衙の変遷を探る重要な糸口となることも判明した。本年度は、掘立柱建物・礎石建物遺構の基本的属性について検討し、基準となる項目(データ項目)を抽出・作成した。その項目としては、基部構造、桁行・梁行の規模、平面構造、平面形式、柱筋、対向側柱位置、妻柱位置、柱掘りかた形状・規模、礎石形状・規模、基壇形状・規模、外周柱穴列(縁・足場穴等)の有無と形状・配置、雨落ち溝、階段など約120項目を抽出した。そして、各項目ごとに、既往の研究成果を収集・整理し、暫定的な型式分類をおこなった。これらの各建物属性の項目や各項目ごとの分類内容については、資料収集作業や資料分析によって順次改訂しながら、完成度の高いものにしていく予定である。そして、これらの建物遺構の属性項目について、データベース化の相関図を作成し、旧来の遺跡データベース構造を見直し、新たなデータベース構造を作成した。本年度は、上記のデータベース項目にしたがって、主に関東以北の国府・郡衙・城柵遺跡・豪族居宅などの発掘調査成果を中心として建物遺構の資料収集をおこない、約2000レコードのデータベース化をおこなった。その資料収集によって、東北城柵地域には特異な建築基部構造や平面構造を採用している建物例が少なくないことが判明しており、東北地域における在地の建築技術の導入如何や環境との関わりなどが問題として浮上してきている。また、東北地域については、城柵にみられる櫓の造営技術に関する検討にも着手した。

また、これまでの発掘調査ではあまり重視されることが少なかった柱掘りかたの深さの問題が、掘立柱建物における基壇の有無や整地との関係、柱材の調達や再利用との関係で重要な意味をもつことが改めて明らかになってきている。本年度は、昨年度抽出・作成した掘立柱建物・礎石建物遺構の基本的属性約120項目について、それぞれの型式分類作業などを通じて選択項目など一部補訂作業をおこなうとともに、岩手県・宮城県・秋田県・山形県・福島県の官衙遺跡・官衙関連遺跡・城柵跡等で検出されている建物遺構(竪穴建物を除く)について各属性ごとに資料を収集し、新たに構築したデータベース構造にしたがってデータベース入力作業を継続した。その結果、東北地方で2003年度以前に調査された当該遺跡のデータベースをほぼ完成させた。そのデータ件数は、遺跡数約220件、建物データ数約2800件、調査報告書・論文等文献数約2500件である。これらについては、一般公開の準備作業も合わせて進めている。この資料収集とデータベース化によって、隅柱の柱掘りかたが隅行き方向に掘られるなど特徴的な柱掘りかたを伴う掘立柱建物例が、とくに栃木県北部から福島県・宮城県で目に付く傾向がある。福島県中通り地方北部に所在する郡では、そうした土木技法を採用した各郡間の技術的な繋がりをうかがうことも可能になってきている。ただし、その特徴的な掘りかたが建築構造と結びついているのか、掘削作業上における約束事としておこなわれているのか、などは今後の課題である。また、柱抜取穴の掘られ方について、官衙遺跡では建物によって抜き取り方向が一定している例がみられ、宮城における土木作業に準じるような作業方式や労働力の編成のあり方が地方官衙においても採用されていたことが判明してきている。本年度にはまた、正倉院文書にみられる石山寺造営記事から、居宅建物の柱寸法や土工量などを分析する作業もおこない、官衙造営との比較作業も開始した。今年度は、近畿以西の官衙関係遺跡における建物遺構の資料収集作業を進めるとともに、隅柱堀方等、建物遺構の属性について一部補訂し、それに伴いデータベース構造に改良を加え、東日本の収集データに改訂を加えた。そして、関東以北の官衙遺跡について、その成果の一部を地方官衙関係遺跡データベースとして奈良文化財研究所ホームページ上に公開した。公開件数は遺跡数で485件、建物基本データで6600件を数える。このデータベースを活用し、廂の出について統計処理をおこない分析したところ、8世紀末以降に広廂が増加する傾向を見いだすことができた。また、かつて梁行3間の建物は古式のものとする意見もあったが、梁行間数について検討した結果、8世紀後半以降においても多用されていることが明らかとなり、時期的な特徴とはみなしがたいことも判明した。総柱高床倉庫遺構の柱穴規模の分析では、側柱堀方が束柱堀方より大型で、側通し柱構造の可能性が高いとみられる例は、全体の一割強で、桁行5間以上になるとその割合は内外柱穴規模が同じものに近い数となる。これは長大な倉には板倉が多かったことを示すと考えて良かろう。また、3×3間の倉は2×2間の倉に次いで多いことが明らかとなり、3×3間が正倉の典型例であるとしてきた従来の見解を検証することができた。隅柱が隅行き方向の柱堀方を伴う遺跡の分布は、北関東以北に集中するが、その中では現状ではいわき市根岸遺跡の例が7世紀代と最も古く、北関東ないしは陸奥国南部からこの土木工法が展開した可能性を考えうる。また、面取り状堀方は関東に多く、集落にも多く認められ、在地の技術が官衙造営にも導入されたことを示唆しているが、なお、建物構造との関連性などこれからの検討を進めていく予定である。今年度は、四国地方以西の官衙関係遺跡における建物遺構の資料収集作業を進めるとともに、平均柱間寸法や木割の属性を加え、それに伴いデータベース構造に改良を加え、近畿以東の収集データにも補訂を加えた。
口腔白板症の悪性化に関わる因子は何か?-HuRと細胞質移行タンパクの解析-

口腔の悪性腫瘍の大部分は扁平上皮がんが占めており、口腔がんの発症・進展は患者の咀嚼や発音などの機能障害だけでなく、審美障害を引き起こすため、その治療成績の改善は患者のQuolity of Life (QOL)の向上に密接な関係を有している。口腔は、可視化できる臓器であるため、これまで口腔扁平上皮がんの前がん病変として、所謂、白板症があることが知られている。我々は、これまで口腔扁平上皮がんの発生・進展に関わっている遺伝子/遺伝子産物の研究を行ってきた。アデノウイルスのがん遺伝子産物を研究する過程で、E4orf6がAU-rich element (ARE)に結合することでmRNAを安定化させるHuRと結合し、核から細胞質へ移行することで細胞がん化を導くことを明らかにした。口腔癌細胞株HSC3, Ca9.22を用いてHuRの発現をWestern blotおよび免疫染色で検索した。その結果、両細胞でHuRの発現は亢進し細胞質へ移行していることが明らかになった。HSC3の細胞増殖能はHuRの細胞質での発現がみられない歯肉線維芽細胞に比べ明らかに亢進していた。口腔がん細胞における駅EmRNAであるc-fos, c-myc mRNAの局在をin situ hybridization法で検討したところ正常細胞であるHGF(ヒト歯肉線維芽細胞)では核に局在していたが、口腔がん細胞では核および細胞質に存在し、ARE mRNAが核外輸送されていることが明らかになった。さらに定量RT-PCR法でARE mRNAの安定化について検索した。その結果、口腔がん細胞ではc-fos, c-mycが細胞質内に蓄積・安定化されていた。以上の結果は、口腔がん細胞ではHuRが核外へ輸送され、同時にARE mRNAも核外輸送・安定化されていることを示しており、HuRの細胞質への輸送局在を検討することにより、早期の細胞がん化を判定できる可能性が示された。口腔の悪性腫瘍の大部分は扁平上皮がんが占めており、口腔がんの発症・進展は患者の咀嚼や発音などの機能障害だけでなく、審美障害を引き起こすため、その治療成績の改善は患者のQuolity of Life(QOL)の向上に密接な関係を有している。アデノウイルスのがん遺伝子産物を研究する過程で、E4orf6がAU-rich element(ARE)に結合することでmRNAを安定化させるHuRと結合し、核から細胞質へ移行することで細胞がん化を導くことを明らかにした。口腔癌細胞株HSC3,Ca9.22を用いてHuRの発現をWestern blotおよび免疫染色で検索した。この際、AREmRNAであるc-fos mRNAは核から細胞質に移行しており、タンパク発現が認められた。現在、HuRに結合するタンパクの解析を行い、その相互作用について検討を行っている。さらに口腔白板症におけるHuRの局在変化を免疫染色を行い検討している。
インヒビンの作用機序に関する研究

インヒビンはTGFーβスーパーファミリーに属するホルモンであり、卵胞刺激ホルモン(FSH)の分泌を特異的に抑制することで哺乳類の排卵数を調節している。インヒビンはFSHβ鎖mRNAの3'末端非翻訳領域を介してFSHβmRNAの安定性を低下させることによりFSH分泌を抑制していることが示唆されるため、FSHβmRNAの3'非翻訳領域を欠失させた遺伝子改変マウスを作製し、現在その形質を解析中である。また、インヒビンの作用機序を解析するために必要となる組換え型ラットインヒビンをCHO細胞で作製した。インヒビンは哺乳類において下垂体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)分泌の抑制に主要な役割を占めており、その作用にはFSHβ鎖mRNAの3'末端比翻訳領域(3'UTR)が関与している可能性が考えられる。そのためFSHβmRNAの3'UTRを欠失したマウスでは、インヒビンのフィードバック作用が欠失するものと考えられる。このマウスを作製するため、マウスFshb遺伝子を含むBACクローン、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットおよびジフテリアトキシン発現カセットを用い、FSHベータ鎖mRNAの3'UTRをLHβ鎖mRNAの3'UTRで置き換え、その下流にネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを挿入したターゲティングベクターを構築した。また、ES細胞でのスクリーニング条件検討のためのコントロールベクターも作製し、PCR、サザンブロットなどの条件検討を済ませている。本研究では上述の遺伝子改変マウス下垂体に対するインヒビンの作用を検討する予定であるが、現在ではインヒビンが市販されていないため、ラットインヒビンαとβサブユニットを導入したCHO細胞を作製した。20株ほどの安定発現株の内、一株が比較的多量のインヒビンを分泌することをウエスタンブロットで確認し、その株を無血清培地で培養してその培養上清を500ml程回収した。インヒビンのFSHβ鎖mRNAに対する作用には内因性のsiRNAが関与していることが考えらる。内在性siRNAは、3'UTR部分をターゲットとすることが多いため、インヒビンが下垂体に作用することで、FSHβ鎖mRNA3'UTR部分のセンス鎖RNAに相補的な短鎖のRNAが増加するはずである。その短鎖RNAの検出をリボヌクレアーゼプロテクションアッセイで行うため、FSHβ鎖mRNA3'UTR部分全体をカバーするように200300bpの鋳型cDNAを、5種類作製した。インヒビンは下垂体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)の分泌を特異的に抑制するが、その作用はFSHβ鎖mRNAの3'末端非翻訳領域(3'UTR)を介して発揮されるのではないかとの仮説に基づき、FSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスの作製を試みた。作製法は通常のノックアウトマウスと同様、相同組換えを用いるものであるが、3'UTRのみを欠失させるという特殊なターゲティングベクターの構築が必要とされるためベクター作製に予定よりも時間がかかり、未だ変異マウスの作製には至っていない。現在相同組み換え用のロングアーム部分と、FSHβ鎖mRNAの3'UTRの代わりにLHβ鎖の3'UTRを挿入したDNAをつなぎ合わせたコンストラクトを作製し、そこにネオマイシン発現カセットを挿入した段階である。また、本研究ではインヒビンの作用を検討するために多量のインヒビンを必要とするが、商業的に入手可能なインヒビンが存在しないためCHO細胞での組換え型インヒビンの作製を試み、20クローンを選択した。現在インヒビンの入手が困難であるため、インヒビン高発現株が得られればその有用性は高い。さらにインヒビンと同様の作用を示すフォリスタチンについては高発現CHO細胞株の作製に成功し、簡便な精製法も確立した。また、CMVプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、さらにFSHβ鎖mRNAの3'UTRを連結したレポーターコンストラクトを作製し、これを下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞由来のαT3-1細胞にトランスフェクションしてインヒビンに対する反応性を検討した。その結果、インヒビンによるレポーター遺伝子発現への影響は観察されなかったが、FSHβ鎖mRNAの3'UTRの存在によりmRNAが不安定化することが示唆され、FSHβ鎖mRNAの3'UTRがFSH分泌調節に関与している可能性が示唆された。インヒビンは卵胞刺激ホルモン(FSH)分泌を特異的に抑制する因子として分離されたが、インヒビンが生物活性を発揮するメカニズムについては完全には解明されておらず、特にインヒビンがFSHβmRNA発現を抑制するメカニズムについては未解明の点が多く残されている。哺乳類のFSHβmRNAの3'非翻訳領域(3'UTR)には他の糖タンパク質ホルモンには見られない長い非翻訳領域が存在し、インヒビンの作用との関連が示唆されている。

本研究は、いまだ明らかにされていないインヒビンの作用機序、特にFSHβmRNA発現抑制のメカニズムを解明することことを目的とした。まずインヒビンによるFSHβmRNAの発現抑制とFSHβmRNAの3'UTRとの関連を明らかにするため、ES細胞を用いた相同組み換え法によりFSHβ遺伝子の3'UTR部位をLHβ遺伝子の3'UTR部位で置換した遺伝子改変マウスの作製を試み、目的とする変異をヘテロで持つマウスが複数得られた。また、FSHβmRNAの3'UTRをルシフェラーゼ遺伝子に接続することによりルシフェラーゼmRNAの安定性が低下することも示唆された。一方、インヒビンの作用機序を解明するにあたりインヒビンの精製品が必要とされるが、近年ではインヒビンの精製品は販売されていないことからCHO細胞でのラットリコンビナントインヒビンの作製を試み、インヒビンを高いレベルで分泌するCHO細胞株を得た。本研究では当初予定していた研究計画を期間内に達成することは出来なかったが、本研究で得られた変異マウス、ルシフェラーゼを用いたFSHβmRNA 3'UTRの作用機序解析手法、CHO細胞で作製したリコンビナントインヒビンは、インヒビンの作用機序解明に大きく役立つと考えられ、今後インヒビンによるFSH分泌抑制機構関する新たな知見が得られるものと期待できる。基礎獣医学大学内における本研究以外の業務が想定していた以上に増加し、本研究に予定していたエフォートを投入することが出来なかったため。インヒビンはFSHβ鎖mRNAの3'UTRに作用してその安定性を低下させてFSH分泌抑制作用を発揮しているのではないかとの仮説に基づきFSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスの作製を試みたが、通常のノックアウトマウス作製用ターゲティングベクターの構築と異なり、3'UTRのみを欠失させるというやや特殊なターゲティングベクターの構築が必要とされるため、その作製に予定よりも時間がかかり未だ変異マウスの作製には至っていない。現在、相同組み換え用のロングアーム部分と、FSHβ鎖mRNAの3'UTRの代わりにLHβ鎖の3'UTRを挿入したDNAをつなぎ合わせたコンストラクトを作製し、そこにネオマイシン発現カセットを挿入した段階であり、さらに相同組み換え用のショートアームとネガティブ選択用のジフテリアトキシン発現カセットを挿入する必要がある。作製したターゲティングベクターを用いてFSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した遺伝子改変マウスを作製する。このマウスについて、産仔数、春期発動、発情周期、排卵数、血中各種ホルモン濃度、下垂体のインヒビンに対する反応性などを調べ、遺伝子改変がマウスの生殖生理に与える影響を検討する。また、実験に必要なインヒビンを確保するため、抗インヒビン抗体を結合させたカラムを作製し、インヒビン発現CHO細胞株の培養上清からインヒビンを精製する。さらに、インヒビンが内在性siRNAを介して作用している可能性を検討するため、FSHβ鎖mRNAの3'UTRセンス鎖プローブを用いたリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを行い、FSHβ鎖mRNAの3'UTRに相補的な短鎖RNAのインヒビンによる増減を調べる。FSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスを作製するため、変異マウス作製用のターゲティングベクター構築を早急に行う。現在7割方ターゲティングベクターは完成しており、残る作業は通常のターゲティングベクター構築とさほど変わらないためターゲティングベクターを完成させるにはそれほど時間はかからないと予測される。