hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国雲南イネ品種が有する穂ばらみ期耐冷性の解析～強度耐冷性遺伝子の単離～

中国雲南地方の在来品種である「麗江新団黒谷」は、「コシヒカリ」や「ひとめぼれ」などの日本の強度耐冷性品種を上回る極強の耐冷性を有することが知られている(。申請者らはこれまでに「麗江新団黒谷」と「ひとめぼれ」の交配後代系統を用いてQTL解析を行ってきており、2年間の反復をとった耐冷性検定の結果から第3染色体長腕に「麗江新団黒谷」型の対立遺伝子の作用による耐冷性QTLを確認した。さらに染色体部分置換系統を作成し、候補領域内で組換えが生じている系統10系統を選抜して、2008年度および2009年度の2年間の反復をとった耐冷性検定の結果から候補領域を約1.2Mbの領域に絞り込んだ。この領域について「麗江新団黒谷」の塩基配列を決定して「日本晴」と比較したところ、ミスセシス変異を起こすSNPが6遺伝子に生じていた。これらのSNPについて、dot-blot-SNPマーカー化し、「麗江新団黒谷」と「ひとめぼれ」の遺伝子型を調べてところ、「ひとめぼれ」は全て「日本晴」型であった。また、推定遺伝子領域の上流5kb以内にSNPが存在る遺伝子について、「ひとめぼれ」及び準同質遺伝子系統の穂ばらみ期穎花からRNAを抽出して発現解析を行ったところ、両者で発現量に大きな差が見られるのはなかった。本研究では、「麗江新団黒谷」に由来する強度耐冷性の候補遺伝子を6遺伝子に絞り込むことができた。今後これらについて相補性試験等を進めることで、耐冷性遺伝子を単離できる可能性が高い。また、研究の過程で作成した準同質遺伝子系統は、実際に「ひとめぼれ」に比べて耐冷性程度が向上していることを確認しており、耐冷性育種にも貢献できると期待される。これまでに、中国雲南のイネ品種「麗江新団黒谷」に由来する強度穂はらみ期耐冷性QTLを検出しており、この領域の遺伝子型がヘテロ型であり、遺伝背景がほぼ「ひとめぼれ」に置換された準同質遺伝子系統を5タイプ得ている。このような系統の自殖後代であるF2世代の5集団を用い、耐冷性検定圃場(東北農業研究センター、秋田県大仙市)において、水温18.4°C、水深25cmの条件で6月下旬から9月上旬までの約2ケ月間冷水処理を行い、低温条件下での稔実率を測定した。また、同様の個体について遺伝子型を調査した結果と合わせ、QTL解析を行った。その結果、複数の系統で候補領域にQTLを検出する事ができ、この領域にQTLが座上していることを確認できた。しかし、QTLが検出された領域は系統の遺伝子型タイプによって差異があり、領域を絞り込むには至らなかった。この結果は、遺伝背景が完全に「ひとめぼれ」に置換されていないことによる影響、および個体として稔実率を調査しているために環境の影響を受けて値にぶれが生じやすいことが考えられた。この点を改善して候補領域を絞り込むため、遺伝背景の固定化を進めるためのマーカー作成、および準同質遺伝子系統に対してさらに戻し交配を行った系統群を作成し、個体ではなく系統として評価するための材料育成を行った。染色体全領域に対して網羅的なマーカー作成を行うため、454シーケンサーを用いて「麗江新団黒谷」の染色体領域を合計約2Mb解析し、「日本晴」に対するSNP情報を約2000個得て、順次SSCPマーカーへの変換を行っている。また、BC3F3世代の集団1204個体について遺伝子型選抜を行い、組換え系統を12タイプ合計148個体得、これらについて自殖したBC3F4系統を得た。ドットブロット分析は大量検体の遺伝子型を簡易に判定できる方法であるが、この方法をさらに安価かつ簡易に行うことができるように技術改良を行った。さらに大量個体のDNA抽出過程を簡略化する簡易DNA調整法を開発した。中国雲南イネ品種「麗江新団黒谷」に由来する強度穂ばらみ期耐冷性遺伝子の単離を目指し、「ひとめぼれ」との交配後代を用いた解析から、第3染色体長腕にQTLを検出している。このQTL候補領域の絞込みを行うため、候補領域内の組換え系統を12タイプ選抜しており、これらの系統の耐冷性を評価した。耐冷性検定は東北農業研究センター(秋田県大仙市)の冷水田(水温18.5度、水深20cm)で六月末から九月上旬までの約2ヶ月間冷水処理をし、全籾数に対する稔実籾数の数を稔実率として評価した。耐冷性検定の結果、「ひとめぼれ」と比べて稔実率が有意に高い系統が複数得られ、候補領域を約1.2Mbの領域に絞り込むことができた。今後、これらの系統の再評価を行うとともに、さらに内部で組換えが起こっている系統を選抜し、耐冷性の評価とあわせて候補領域の絞込みを行う。QTL解析を行う際や組換え系統をマーカー選抜により選定するとき、遺伝子型を判定するためには各個体からDNAを抽出し、PCRを行う場合が多い。大規模な集団になればなるほど、DNA抽出には多大な労力がかかる。この点を改良し、今後のQTL解析や組換え系統の選抜を効率的に行うため、DNA抽出を省略し、葉そのものを直接PCRのテンプレートにする、リーフパンチ法を開発した。

直径1mm程度のミニコルクボーラーを用いて葉を切り取り、これを用いてPCRを行うと、300bp以下の短い断片で100%近い増幅効率を得ることができた。中国雲南地方の在来品種である「麗江新団黒谷」は、「コシヒカリ」や「ひとめぼれ」などの日本の強度耐冷性品種を上回る極強の耐冷性を有することが知られている(。申請者らはこれまでに「麗江新団黒谷」と「ひとめぼれ」の交配後代系統を用いてQTL解析を行ってきており、2年間の反復をとった耐冷性検定の結果から第3染色体長腕に「麗江新団黒谷」型の対立遺伝子の作用による耐冷性QTLを確認した。さらに染色体部分置換系統を作成し、候補領域内で組換えが生じている系統10系統を選抜して、2008年度および2009年度の2年間の反復をとった耐冷性検定の結果から候補領域を約1.2Mbの領域に絞り込んだ。この領域について「麗江新団黒谷」の塩基配列を決定して「日本晴」と比較したところ、ミスセシス変異を起こすSNPが6遺伝子に生じていた。これらのSNPについて、dot-blot-SNPマーカー化し、「麗江新団黒谷」と「ひとめぼれ」の遺伝子型を調べてところ、「ひとめぼれ」は全て「日本晴」型であった。また、推定遺伝子領域の上流5kb以内にSNPが存在る遺伝子について、「ひとめぼれ」及び準同質遺伝子系統の穂ばらみ期穎花からRNAを抽出して発現解析を行ったところ、両者で発現量に大きな差が見られるのはなかった。本研究では、「麗江新団黒谷」に由来する強度耐冷性の候補遺伝子を6遺伝子に絞り込むことができた。今後これらについて相補性試験等を進めることで、耐冷性遺伝子を単離できる可能性が高い。また、研究の過程で作成した準同質遺伝子系統は、実際に「ひとめぼれ」に比べて耐冷性程度が向上していることを確認しており、耐冷性育種にも貢献できると期待される。
プラズマ照射高分子表面を利用した細胞固定化用機能性バイオインターフェイスの設計

弱電離気体を利用するプラズマ技術を基盤とした手法により、細胞培養器材に汎用されているポリスチレン(PS)基板表面へ細胞接着を制御するインターフェイスを設計および構築した。プラズマ技術を利用して化学的に不活性なPS表面にカルボキシル基を導入し、そのカルボキシル基を介して細胞接着性ペプチドの固定化することで、PS表面の細胞接着性を飛躍的に改善し、かつ細胞増殖を有為に促進させることができた。足場依存性細胞の生存や活動に接着は不可欠であり、本研究成果は培養細胞の有効利用に有益なものと考えられる。動物細胞の大部分を占める足場依存性細胞は,その生存や増殖のために何らかの器壁へ接着しなければならない。細胞培養容器に広く用いられているポリスチレン(PS)は,疎水性であり細胞接着性が極めて悪いため,適度に親水性基が表面に導入されたPS製品が細胞培養に使用されている。しかし,そのような容器を用いても培養困難な細胞は多く存在する。本研究の目的は,培養細胞の有効活用のため,プラズマ技術を利用し,化学的に不活性なPS表面にカルボキシル基あるいはヒドロキシル基を高密度で導入し,それら酸素含有官能基を介して,細胞との接着を制御するインターフェイスを構築することである。ところで,PSヘアルゴンプラズマを照射すると,その表面には多量のラジカルが生成し,同時にその再結合反応により,高度な架橋層が形成される(プラズマ架橋反応)。今年度は,ビニルメチルエーテル-無水マレイン酸共重合体(VEMA)を含浸させたPS表面にアルゴンプラズマ照射を行い,プラズマ架橋反応によりPS表面にVEMAを固定化し,その後,VEMAの無水マレイン酸部位を加水分解することによるPS表面への高密度カルボキシル基導入法を確立した。このカルボキシル基含有PS(PS/VEMAC)表面においてLNCap細胞を培養したところ,未処理のPSシャーレを用いた場合と比較して,細胞接着性および増殖性が有意に改善された。以上の結果より,PS/VEMACは,細胞親和性が良好であり,その表面カルボキシル基を介して更なる機能化も可能であることから,細胞固定化用機能性インターフェイス構築のための優れた基板としての利用が期待できる。プラズマ表面処理を利用したポリスチレン(PS)表面への細胞接着性インターフェイスの導入について検討した。前年度までに調製したビニルメチルエーテルーマレイン酸共重合体固定化PS(PS/VEMAC)表面のカルボキシル基を介して、フィブロネクチンの細胞接着ドメインにおけるアミノ酸配列RGDを含むペプチドGRGDSを固定化した。その表面におけるモデル細胞PC12の接着性及び増殖性はPS/VEMAC表面と比較して顕著に増大した。また、プラズマ照射条件等のPS/VEMAC調製条件の最適化により、ペプチド固定化PS/VEMAC表面における細胞接着性・増殖性を、細胞外器質(ECM)タンパクがコーティングされた器材表面と同程度まで増大させることができた。この結果は、ペプチド固定化PS/VEMAC表面が人工的なECMとして機能していることを示唆するものである。また、更なる高密度のペプチド集積化を目指し、PS器材表面におけるポリアクリル酸(PAAc)グラフト層の構築を試み、プラズマ照射PS表面に生成するラジカルの酸化によって導入されるヒドロキシル基を介して、原子移動ラジカル重合法(ATRP)により鎖長の整ったPAAcのグラフト層を構築することができた。カルボキシル基と複合体を形成するトルイジンブルー0を用いて表面カルボキシル基密度を測定した結果、PAAcをグラフトした表面では、PS/VEMAC表面の約5倍のカルボキシル基密度が検出され、その表面にGRGDSを固定化した基板では、GRGDS固定化PS/VEMAC表面よりも有意な細胞増殖が認められた。このPAAcグラフト層の密度と鎖長はプラズマ照射条件とATRP条件によって制御できると考えられ、それらの最適化により高い活性を有するインターフェイスの構築も可能になると期待できる。
体液・循環調節に関与するペプチドホルモン受容体に関する比較分子生物学的研究(塩類細胞の分子解剖と分化誘導機構の解明)

ナトリウム利尿ペプチド(NP)系に関する比較分子生物学的な研究から,NP系の起源に迫るとともに,淡水と海水の間を往き来できる広塩性魚類の浸透圧適応にNP系が重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに,浸透圧調節に欠くことのできない塩類細胞が酸性適応や尿素代謝にも中心的な役割を果たしていることを明らかにした。細胞生物学分野で古くから探し求められていたチャネル分子の有力候補の同定にも成功した。具体的成果は以下のとおり。(1)魚類の浸透圧調節に関与するペプチドホルモンについてはまだよくわかっていなかったが,私たちはNP系が魚類の広塩性を支配する重要な内分泌系であることをリガンドと受容体の両面から明らかにした。これら即効性のホルモンは,既に存在するイオンや水の輸送体の活性を変化させることにより,急激な環境浸透圧の変化に対応する。NPファミリーは,さらに遅効性ホルモンであるコルチゾルや成長ホルモンの分泌を促進して,長期にわたり新しい浸透圧環境に適応できる体づくりをうながす。さらに,ユニークな浸透圧調節をおこなうサメやメクラウナギなどからNPファミリーを同定して,分子進化を明らかにした。(2)pH3.5という驚異的な酸性環境に適応している恐山ウグイの解析から,酸性適応時に誘導のかかる分子群を同定し,それらの大部分が塩類細胞に含まれることを明らかにした。(3)イオン輸送に必要な駆動力を供給するために,塩類細胞にはNa,K-ATPaseが豊富に存在する。この性質を利用し,Na,K-ATPaseと共役すると推定されるKチャネルを同定することに成功した。このKチャネルは生理学上極めて重要で長らく探し求められていたものである。(4)ウナギのエラにおけるNP受容体の局在部位の研究から,骨代謝とNP系の密接な関係を明らかにし,哺乳類を含めた骨形成研究に新分野を開いた。循環系の恒常性維持機構をよりよく理解するために,比較分子生物学的なアプローチを試み,以下の成果を得た。(1)ウナギで見つけた新型受容体の機能解明:私たちが見つけた新型受容体(D型)はRNase Protection Assayの結果から脳に多いことがわかっていたので,さらに脳のどの部分に多いかを抗体染色で調べ,視索上核のバソトシンニューロンと小脳のプルキンエ細胞に多く発現していることを明らかにした。(2)海水適応に重要なKチャンネルの発見と性質の解明:ウナギを淡水から海水に移したときに誘導されてくる分子の1つとしてKチャネルを同定し,それが新型の内向き整流性Kチャネルであること明らかにした。全一次構造も決定した。ついで,哺乳類のホモログの探索を試み,ラットでは苦戦をしいられているが,ヒトでは成功しそうなところまでこぎつけている。(3)ウナギのA型ナトリウム利尿ペプチド受容体(NPR-A)と海水適応:これまで未クローニングであったウナギのNPR-Aをクローニングし構造を決めた。NPR-Aが海水適応時のNaの排泄に重要な働きをしていることも生理学的な測定から明らかにした。(4)先祖型としてのCNPから受容体の先祖型を探る:サメにはCNPのみしか存在せず,従って,CNPがナトリウム利尿ペプチドファミリーの祖先型であることを示した。従って,サメの受容体を解析すれば,受容体(NPR)の祖先型に関する情報が得られることになる。そこで,まずリガンド結合実験により受容体の性質を明らかにして,現在受容体のcDNAのクローニングを行っている。(5)酸性適応機構解明の糸口:酸性適応能を有するウグイを材料に,Differential Displayにより候補分子を数種類単離した。

循環系の恒常性維持機構をよりよく理解するために,比較分子生物学的なアプローチを試み,以下の成果を得た。1)ウナギの海水適応に重要な分子として同定したKチャネルが塩類細胞の微細管系に局在することを免疫電子顕微鏡法で明らかにすると共に,この研究を哺乳類にまで拡げ,ラットから新型Kチャネルをクローニングすることに成功した。2)pH3.5という硫酸酸性湖である恐山湖にすむウグイを材料に酸性適応に重要な分子の一つとして,V-ATPaseをウグイのエラよりクローニングし,ノーザン分析や抗体を用いるウエスタン分析により,酸性下ではその発現が塩類細胞で昂進することを明らかにした。このほかにも,イオン輸送や水輸送に重要なトランスポーターやチャネルも候補分子として同定している。3)血圧に影響を与えない微量濃度で心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)がウナギの飲水の抑制と血漿アンギオテンシン濃度の低下を引き起こすという興味深い現象を見いだした。さらにANPによる飲水の抑制が,飲水誘起ホルモンであるアンギオテンシンの低下を介する間接作用ではなく,直接作用であることも明らかにした。4)塩類細胞は,魚類において淡水中での塩の摂取や海水中でのNaClの排出に主要な役割を果たしているが,Clチャンネルの局在,すなわち外界側にあるか血液側にあるかにより輸送の方向が決められる。ティラピアは淡水と海水双方によく適応する広塩性魚であるが,ティラピアの鰓のcDNAライブラリーから2種のCLC型のClチャンネルをクローン化した。そのうち,補乳類のCLC-5に相同なチャンネルは浸透圧調節器官である鰓,腸,腎臓などに多く発現しており,鰓では塩類細胞に局在して発現していることを明らかにした。現在,電顕レベルの免疫細胞化学法を用いて,塩類細胞における局在部位を明らかにしつつある。循環系の恒常性維持機構の解明に新視点を導入するべく,比較分子生物学的なアプローチを試みつつある。本年度は,淡水・海水の両方に適応できるウナギと高度な酸性適応能を有する恐山ウグイの系を中心に以下の成果を得た。1)ウナギで発見した新規Kチャネルの哺乳類型(Kir7.1)の生理機能:Kir7.1の組織分布及び細胞内分布の極性(apical vs basolateral)がNa,K-ATPaseのものとよく一致することから,Kir7.1が生理学上極めて重要で,古くから探し求められていたNa,K-ATPaseのパートナー分子である可能性が強いことを示唆した。2)pH3.5という強酸性下で生きている恐山ウグイの耐酸性機構を分子レベルである程度説明できるようにした。すなわちNa/Hexchangerをクローニングし,その発現が酸性下で顕著に高まり,かつ塩類細胞のapical膜に局在することを抗体染色によって示した。3)塩類細胞の分化誘導に関わると期待されるRBCCタンパク質を同定することに成功した。4)密度勾配遠心法を用いて塩類細胞を50%以上に濃縮する技術を確立した。その結果,細胞レベルでイオンや細胞内情報伝達系の変化をリアルタイムで調べられるようになった。5)^<22>
２８日間宇宙環境に暴露された細胞は細胞死に対し抵抗性を獲得するか？

宇宙放射線から戻ってきた細胞を用い、放射線抵抗性獲得の有無、その機序解明を行った。宇宙細胞では、明らかな細胞増殖速度の増大、活性酸素発生の増大および、ミトコンドリアに局在する活性酸素除去酵素MnSODの増大が認められた。宇宙細胞ではMnSODはSurvivinの発現を促進し、Beclin1の発現を抑制することで、オートファジーの発現を減少させていることが示唆された。またMnSODがアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2の発現を誘導し、それによって細胞死を抑制させ、放射線抵抗性を獲得することが示唆された。我々はこれまで、ヒト神経芽細胞腫であるSKーN-SH細胞を用い、「宇宙放射線と微小重力の哺乳類細胞への影響(NeuroRad)というテーマで宇宙実験を行った。この細胞は宇宙放射線をあび、放射線抵抗性が高くなっている可能性が考えられ、放射線抵抗性獲得の有無、その機序を解明する。平成23年度で宇宙細胞では、明らかな細胞増殖速度の増大、活性酸素発生の増大および、ミトコンドリア局在MnSODの増大が認められた。次に、照射後の細胞において、アポトーシスには変化が認められず、オートファジーの減少が認められることが明らかとなった。これらの結果からMnSOD活性とオートファジーとの関連性が浮かび上がってきた。従って、H24年度では、オートファジー関連遺伝子発現について検討した。コントロール細胞と宇宙細胞を用い、オートファジー関連遺伝子Bcl-2の発現について、はコントロール細胞に比べて宇宙細胞では明らかに発現は増大していたが、Beclin1の発現についてはほとんど差が見られなかった。またびSurvivinの発現についても有為な差が認められなかった。24年度では活性酸素消去酵素であるMnSOD遺伝子およびその発現を抑えるsiRNAを作成しトランスフェクトして、MnSOD活性とオートファジーとの関連性を検討する予定であったが、トランスフェクションがうまくいかず、ステーブルクローンを作成することができず、現在作成中である。これまでヒト神経芽細胞腫であるSK-N-SH細胞を用い、「宇宙放射線と微小重力の哺乳類細胞への影響(NeuroRad)」というテーマで宇宙実験を行った。この細胞は宇宙放射線を浴び、放射線抵抗性が高くなっていると考えられ、放射線抵抗性の獲得の有無について研究を進めてきた。宇宙細胞では、細胞増殖速度の亢進、明らかな活性酸素増大、抗酸化酵素であるMnSODの活性の上昇が見られた。宇宙放射線をあびた細胞(宇宙細胞)ではX線照射後においてアポトーシスの変化は認められず、オートファジーの減少が認められた。またオートファジー関連遺伝子であるbeclin1では変化は見られなかったが、オートファジー抑制遺伝子bcl-2の発現は宇宙細胞において有意に上昇が見られた。MnSODとオートファジーの関連性が示唆され、平成24年度MnSOD遺伝子および、その発現を抑制するsiRNAを作成し,トランスフェクトしてMnSOD活性をオートファジーの関連性を調べる予定であったが、トランスフェクションがうまくいかず、また平成25年度5月より海外留学に行ったため、現在研究が遅れている。我々はこれまで、ヒト神経芽細胞腫であるSKーN-SH細胞を用い、「宇宙放射線と微小重力の哺乳類細胞への影響(NeuroRad)というテーマで宇宙実験をおこなった。平成23年度では、まず、宇宙から戻ってきたSKーN-SH細胞(以下宇宙細胞)と地上コントール細胞の比較を行なった。細胞はセルバンカーにて凍結された状態で地上にもどり、その細胞を1ヶ月間増殖、凍結保存を行ない、再融解した細胞を用いた。継代数はp5であった。まず、顕微鏡下にて細胞の形態を観察したが、大きな差異は認められなかった。次に、レーザー共焦点顕微鏡にて、細胞発生活性酸素の量を調べた。我々の開発したHPF蛍光試薬を用いた(Setsukinai et al., JBC, 2003)。宇宙細胞では、コントロール細胞と比較して、まず、増殖速度の明らかな増大が見られ、細胞発生活性酸素量の明らかな増大が認められた。また、ミトコンドリアに局在し、スーパーオキシドを消去するMnSODの活性を調べたところ増大して認められた。次に、宇宙細胞にX-rayを10 Gy照射し、アポトーシスおよびオートファジーの検出を行った。アポトーシスの検出にはHoechst33342を用い、オートファジーの検出には検出抗体としてLC3抗体を使用した。その結果、宇宙細胞では、コントロール細胞と比較して、1)アポトーシスの明らかな増大は認められなかった。しかし、2)オートファジーの明らかな減少が認められた。

この細胞は宇宙放射線を浴び、放射線抵抗性が高くなっている可能性が考えられ、放射線抵抗性獲得の有無、その機序を解明する。宇宙細胞では、明らかな細胞増殖速度の増大、活性酸素発生の増大および、ミトコンドリア局在MnSODの増大が認められた。コントロール細胞と宇宙細胞を用い、オートファジー関連遺伝子Bcl-2の発現についてはコントロール細胞に比べて宇宙細胞では明らかに発現は増大していたが、Beclin1の発現についてはほとんど差が見られなかった。またSurvivinの発現についても有為な差が認められなかった。次に、X線10Gy照射後の細胞において、アポトーシスには変化が認められず、オートファジーの減少が認められることが明らかとなった。これらの結果からMnSOD活性とオートファジーとの関連性が浮かび上がってきた。従って、オートファジー関連遺伝子発現について検討した。MnSODを過剰発現した細胞に、X線10Gyを照射したときBcl-2の発現についてはコントロール細胞に比べて細胞では明らかに発現は増大していたが、Beclin1の発現は有意に減少していた。またSurvivinの発現は有意に増加していた。一方オートファジーはMnSODを過剰発現した細胞では10GY照射後、発現が低下していた。以上の結果から、宇宙細胞ではMnSODはSurvivinの発現を促進し、Beclin1の発現を抑制することで、オートファジーの発現を減少させていることが示唆された。またMnSODがアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2の発現を誘導し、それによってアポトーシスが抑制させているから、放射線抵抗性を獲得することが示唆された。放射線生物学MnSOD遺伝子およびその発現を抑えるsiRNAを作成しトランスフェクトして、MnSOD活性とオートファジーとの関連性を検討する予定であったが、トランスフェクションがうまくいかず、ステーブルクローンを作成することができず、研究の進行がやや遅れている状態である。25.5より海外留学にいったため、少し研究が遅れている。宇宙細胞では、細胞増殖速度の増大、活性酸素発生の増大およびMnSODの増大が認められた。また照射後の細胞においては、アポトーシスには変化が認められず、オートファジーの減少が認められることが明らかとなった。これらの結果からMnSOD活性とオートファジーとの関連性が浮かび上がってきたため、当初、Suvivin遺伝子およびその発現を抑えるsiRNAを作成しトランスフェクトする予定であったが、MnSOD遺伝子およびその発現を抑えるsiRNAを作成しトランスフェクトしてオートファジーとの関連性を調べる方向で研究を進めることにする。survivinのオートファジー抑制効果がないようなので、25年度はオートファジー関連遺伝子Beclin1とアポトーシス抑制タンパク質Bcl-2の相互作用について検討する。1)オートファジー関連遺伝子であるbeclin 1に結合するBcl-2のcDNAを過剰発現する細胞株をG418 selectionにより確立する。
集積量子フォトニックデバイスの研究

将来の光子を用いた量子情報通信などの分野に必要となる新規な量子光学機能デバイスの実現可能性を開拓することを目的として研究を行い、以下の結果を得た。1.擬似位相整合非線形光学導波路における第2高調波発生、和・差周波数発生、パラメトリック蛍光などの2次非線形光学相互作用を量子論的に理論解析した。出力光の量子雑音や光子相関を計算し、基礎特性を解明しデバイス設計法を確立した。2.分布ブラッグ反射型半導体レーザの量子光学特性解析を行い、量子雑音抑制の条件とスクイジング量を明らかにし、量子フォトニックデバイス設計の基礎データを得た。3.擬似位相整合LiNbO_3光導波路の作製技術の確立を行った。擬似位相整合用分極反転構造形成における損傷抑圧条件や、光損傷回避のためのMgO添加LiNbO_3結晶においてフォトマスクと光導電膜を用いて紫外光照射と電圧印加を行う新手法を見出した。4.基本デバイスとしてLiNbO_3導波路SHG、DFGおよびPFデバイスを設計・作製した。効率改善のため、導波路を逆プロトン交換技術で埋込んで異波長モード間の重なりを高めた。SHG/DFGデバイスの特性を測定し理論予測に近い波長帯域と1400%/Wの高い規格化変換効率を達成した。5.平行偏波光子対発生および直交偏波光子対発生のための2種類のLiNbO_3導波路擬似位相整合非線形光学デバイスを設計・作製して理論設計に近い性能を確認し、相関光子対の高効率発生を検証した。6.スクイズド光発生用DBRレーザを設計・試作した。量子効率を高めて70%以上の効率を達成し、標準量子限界以下0.8dBの振幅スクイズド光発生を実証した。7.超低雑音高効率DBRレーザによる量子相関ツイン光ビーム発生の可能性を実験的に検討し、その可能性を示す実験結果を得た。本年度は量子光学機能の理論解析、および擬似位相整合(QPM)非線形光学導波路と集積半導体レーザの基本構造の作製技術確立と改善に重点を置いて研究を行い、以下の成果を得た。1.QPM導波路における第2高調波発生(SHG)、和周波数発生(SFG)、パラメトリック蛍光(PF)、パラメトリック光増幅(OPA)、縮退パラメトリック増幅(DOPA)、差周波数発生(DFG)などの相互作用を量子論的に理論解析した。揺らぎ伝搬マトリクス法を拡張し、出力光の量子雑音や光子相関を計算し、量子光学機能実現の基礎特性を明らかにし、デバイス設計手法を確立した。2.分布ブラッグ反射型(DBR)半導体レーザの量子光学特性解析を行った。量子揺らぎ項付加レート方程式解析により、量子雑音抑制の条件と、予想されるスクイジング量を明らかにし、半導体量子フォトニックデバイス設計のための基礎データを得た。3.量子フォトニックデバイスのためのQPM導波路を設計・作製した。自動制御電圧パルス印加法によるQPM用周期的分極反転構造形成時の損傷抑圧や、埋込み型導波路やリッジ導波路採用による光波閉じ込め強化、MgOドープによる光損傷回避などの改善策について検討を行った。実際に埋込み型導波路を採用することにより1400%/Wの非常に高い規格化変換効率を達成した。4.QPM導波路パラメトリック蛍光(PF)デバイスのプロトタイプを設計・作製した。同偏光および異偏光の光子対発生の基礎特性について実験的結果を得た。

5.量子機能実現の観点からInGaAs曲線DBRレーザの高性能化を行った。3次DBRを1次DBRに置き換えて反射率と波長選択性を高めるとともにリッジ構造改善により、低閾値(7.8mA)・高微分量子効率(80.2%)および高いサイドモード抑圧比(50dB以上)を達成でき、スクイズド光発生の兆候を観測できた。昨年度に引き続き基本デバイスの作製・性能改善と量子光学機能確認に重点を置いて研究した。主な成果は以下のとおりである。1.具体的な量子機能LiNbO_3導波路非線形光学デバイスとしてSHGデバイス、DFGデバイスおよび光子対発生(パラメトリックフロレッセンス)デバイスを設計・作製した。効率改善のため、導波路を逆プロトン交換技術で埋込んで異波長モード間の重なりを高めた。SHG/DFGデバイスの特性を測定し理論予測に近い波長帯域と1400%/Wの高い規格化変換効率を達成した。またパラメトリックフロレッセンス発生の特性を光スペクトル分析等で測定し、理論設計に近い性能を得るとともに、単一光子検出と相関解析により相関光子対の高効率発生を検証した。2.DBRレーザに選択的量子井戸無秩序化による受動導波路損失低減と端面反射率最適化の改善を加え、量子効率をさらに70%以上に高めることができた。このレーザをインダクタ直列挿入による広帯域定電流駆動で作動させ、標準量子限界を基準とする量子雑音測定を行い、標準量子限界以下0.8dBの振幅スクイズド光発生を実証できた。3.上記の高性能DBRレーザレーザ2個を直列接続してツインレーザを構成し、定電圧駆動することにより量子相関ツイン光ビーム発生の可能性を実験的に検討した。ツインビームの量子相関を平衡光検出と高周波スペクトル分析により解析し、理論予測に定性的に一致する予備的実験結果を得た。4.タイプII擬似位相整合パラメトリックフロレッセンスによる直交偏光光子対発生デバイスの理論設計と作製を行い、光スペクトル分析により理論予測どおりの光子対発生性能を得た。現在このデバイスの量子エンタングル光子発生への応用の検討を行っている。昨年度に引き続き集積量子フォトニックデバイスの作製・性能改善を行い、量子光学機能の実証を行った。1.擬似位相整合非線形光学導波路における光子対発生について、振幅演算子と状態ベクトルのユニタリ変換に基づく多モードモデルによる量子論的解析を拡張し、損失が光子対発生特性に与える影響を初めて明らかにし、多くの設計・特性予測データを得た。2.量子フォトニックデバイスのための擬似位相整合LiNbO_3非線形光学導波路の作製技術の確立と改善を行った。光損傷回避のためMgOを添加したLiNbO_3結晶における擬似位相整合用周期分極反転構造形成の新しい手法として、絶縁膜を装荷して加熱電圧印加を行う方法を見出した。3.光通信波長(1.5μm)帯直交偏波光子対発生のためのLiNbO_3導波路TypeII擬似位相整合非線形光学デバイスを設計・作製した。出力光子対ビームを光スペクトル分析等で測定し、理論設計に近い性能を確認した。また単一光子検出と光子相関解析の実験を行い、光子相関を検証した。さらにこのデバイスによる偏波エンタングル光子対発生の実験を行い、基礎的知見を得た。4.本研究で開発した超低雑音高効率DBRレーザ
古細菌の進化的位置と真核生物の起源

前年度までの研究で,メタン細菌,好塩菌,エオサイトなどの古細菌が,真正細菌によりは真核生物に近縁であることが確かめられたが,これら3つの古細菌のグループと真核生物との関係は不明であった.今年度は,ペプチド鎖伸長因子のアミノ酸配列データを,われわれが開発した最犬法にもとづいて解析した結果,これらの古細菌がすべて系統的に一つのグループとしてまとまるという可能性のほかに,エオサイトが特に真核生物に近いという可能性も浮上した.ミトコンドリアなどのオルガネラをもたない真核原生生物の系統学的な位置づけは,真核生物の初期進化をさぐる上で極めて重要である.従来この問題は,リボソームRNAの配列データにもとづいて研究されてきたが,われわれはリボソームRNA分子系統樹の問題点を指摘した.最大の問題は,近縁な生物の間ででも,塩基組成が大きく異なることがあり,このことが間違った系統樹を導くことがあるということである。われわれは,ペプチド鎖伸長因子やRNA合成酵素などといった保存的なたんぱく質のアミノ酸配列データを解析し,塩基組成が大きく違っているような場合でも,たんぱく質のアミノ酸配列はその影響を受けず,そのようなデータからえられる分子系統樹の信頼性が高いことを示した。ミトコンドリアをもたない真核原生生物の一種であるギアルディアのペプチド鎖伸長因子EF-1αの遺伝子の塩基配列を決定し,この原生生物が真核生物の祖先型生物に近い可能性のあることを示した.前年度までの研究で,メタン細菌,好塩菌,エオサイトなどの古細菌が,真正細菌によりは真核生物に近縁であることが確かめられたが,これら3つの古細菌のグループと真核生物との関係は不明であった.今年度は,ペプチド鎖伸長因子のアミノ酸配列データを,われわれが開発した最犬法にもとづいて解析した結果,これらの古細菌がすべて系統的に一つのグループとしてまとまるという可能性のほかに,エオサイトが特に真核生物に近いという可能性も浮上した.ミトコンドリアなどのオルガネラをもたない真核原生生物の系統学的な位置づけは,真核生物の初期進化をさぐる上で極めて重要である.従来この問題は,リボソームRNAの配列データにもとづいて研究されてきたが,われわれはリボソームRNA分子系統樹の問題点を指摘した.最大の問題は,近縁な生物の間ででも,塩基組成が大きく異なることがあり,このことが間違った系統樹を導くことがあるということである。ミトコンドリアをもたない真核原生生物の一種であるギアルディアのペプチド鎖伸長因子EF-1αの遺伝子の塩基配列を決定し,この原生生物が真核生物の祖先型生物に近い可能性のあることを示した.ATPア-ゼ,伸長因子などの重複遺伝子を含む複合系統樹を,われわれの開発した最尤法によって解析した結果,ほとんど100%に近い確実さで古細菌が真正細菌よりも真核生物に近縁であることが明らかになった。ただし,古細菌がはたして単系統のグル-プかという問題については,単系統である可能性が最も高いが,他の可能性を完全に否定するには,まだデ-タが不足していることがわかった.最近,ミトコンドリアなどオルガネラをもたない真核正物である“ア-ケゾア"が,真核生物の起原の問題とも関連して注目を集めている.これまでに行なわれたア-ケゾアの系統的位置に関する研究は,いずれもSrRNAのデ-タに基づいたものであったが,それらは塩基組成(G+C量)が2倍以上も異なるものを一緒にして解析したものであり,信頼性に乏しい.われわれは,はじめて,延長因子のアミノ酸配列デ-タを用いて,ア-ケゾアの一種であるエントアメ-バ・ヒストリチカが真核生物の進化の初期に他から分岐したことを示した.このことは,エントアメ-バが,ミトコンドリアが共生する以前の真核生物の祖先型の生物であることを示している.たんぱく質のアミノ酸配列デ-タを最尤法に基づいて解析するという新しい分子系統学的方法によって,古細菌の進化的位置と真核生物の起源という問題を追求してきたが,そのための方法論の整備も行なった.この方法は,従来この分野で広く用いられてきた最大節約法よりも,いろいろな情況下ではるかに効率が良いことが示された.前年度までの研究で,メタン細菌,ハロバクテリウム,エオサイトなどの古細菌が,真性細菌によりは真核生物に近縁であることが確められたが,これら3つの古細菌の系統と真核生物との関係は不明であった。今年度は,伸長因子のアミノ酸配列データを解析した結果,これら3つの古細菌のグループが単系統であるという可能性のほかに,エオサイトが特に真核生物に近いという可能性も浮上した。ミトコンドリアなどのオルガネラをもたない真核生物の系統学的な位置づけは,真核生物の初期進化を明らかにする上で重要な問題である。従来この問題は,リボソームRNAの配列データにもとづいて研究されてきたが,われわれはリボソームRNA分子系統樹の問題点を指摘した。リボソームRNAの最大の問題は,近縁な生物の間でも塩基組成が大きく異なることがあり,このことが間違った系統樹を与えることがあるということである。

われわれは,延長因子やRNA合成酵素など保存的なたんぱく質のアミノ酸配列を調べた結果,塩基組成が大きく違っている場合でも,たんぱく質のアミノ酸組成はその影響を受けず,そのようなデータからえられる系統樹の信頼性が高いことを示した。ミトコンドリアをもたない真核生物の一種であるギアルディアの延長因子遺伝子の塩基配列を決定し,この原生生物が真核生物の祖先型生物に近い可能性のあることを示した。
糖尿病性網膜症発症マウスの網脈絡膜循環障害の解析及びその薬物治療に関する研究

今回の研究のために、徳島大学医学部栄養学科臨床分子栄養学講座よりヒトアルドース還元酵素を発現する(hARcDNAを導入した)トランスジェニックマウスの提供を受ける道が開けた.また、私どもは独自の固定器を用いて手持ち眼底カメラ(コ-ワRC-2)による明瞭な家兎の眼底撮影を行うことに習熟していたが、今回家兎より著しく小さいマウスの眼底撮影には難渋した。しかし、マウス眼底撮影の固定器も新たに独自に考案しており、明瞭なマウスの眼底撮影が可能になると考えられる.現在トランスジェニックマウスの糖尿病性網膜症発症の過程を眼底撮影、蛍光眼底撮影にて観察検討中である。さらに、水素クリアランス法による網脈絡膜血流量の測定、網膜電図の記録は、現在、安定したデータを得るために様々な記録電極を試作して検討中である。平成8年度には実験マウスに対し、1.手持ち眼底カメラ(KOWA RC-2既存)により眼底及び蛍光眼底撮影を行い網膜症の病期の決定.2.矩形波光刺激によるERGの記録.3.網脈絡膜血流量を水素クリアランス式組織血流計(PHG-201型、既存)の測定を計画したが、最も困難と思われたマウスの明瞭な眼底撮影の成功により、糖尿病性網膜症の病期の解析が可能となった。しかし、安定したERGの記録法及び網脈絡膜血流量の測定法については現在検討中である。平成8年度は武井一夫氏の存外研究員としての渡米に伴い,研究代表者を変更し、研究を継続した。4月1日武井一夫氏の帰国により平成9年度に研究を継続する予定である。1.Calcitonin Gene-related Pepticle(CGRP)の硝子体内投与による網脈絡膜循環に及ぼす影響;水素クリアランス法を用いて家兎眼において実験を行った。その結果,網膜血管系の増加,網膜血流の増加が,CGRP投与後60分以降に認められることが明らかにされた。眼圧,血液ガス,血圧Kは影響はなかった。これらの結果については,論文として発表すべく準備中である。2.ラットにおける網膜血管径計測,網膜・脈絡膜組織血流の測定;ラット眼球は家兎眼に比し、著しく小さく,眼底撮影,網膜・脈絡膜組織血流の水素クリアランス法Kによる測定には,技術的困難があり,現在正常ラット眼において,精度の良い手枝について試行・検討中である。これらについて結論が得られ次第,トランスジェニックマウスを対象とする実験に着手できる予定である。その結果を踏まえて,血管作動物質の影響に関する実験が可能となる。
自己学習力を育てるオープンエンドな授業構成に関する研究

自己学習能力が生涯学習の時代において望ましい能力であり、その形成が重要であることは言うまでもない。しかし、自己学習能力の構成要素やその形成過程がいかなるものであるかについては明らかになっていないのが現状である。本研究では、自己学習能力を認知心理学的な知識論の観点から理論的に考察し、問題解決学習などの学習スタイルは自己学習能力形成に直結しないこと、むしろ知識の自己増殖的な発展過程が重要であるとの緒論を得た。また、オープンエンドな指導法とよばれるものには大別して2種あること、すなわち指導や思考の多様性と捉えられているものと、認識の進展に関するものがあることを見いだした。自己学習能力に関係するのは後者である。これらの結論をもとに、学習における知識の自己増殖過程がどのようなものであるかを理論的・実験的に考察し、有力な作業仮説として次のような考えを得た。すなわち、自己増殖的な活動のおこりやすい知識構造は、広範な適用範囲を持つべースとなる知識と、それぞれの事象に特有な条件に関する知識の両者で、各事象を捉え理解すべきであるということである。知識構造がこのような状態であれば、新たな事態に遭遇した際に柔軟な適用が可能になるのである。この作業仮説をもとに、学習指導過程の設計を実践的に検討して、妥当であるとの見通しを得た。そこで本研究の10年度では、自己学習能力を認知心理学的な知識論の観点から理論的に考察し、問題解決学習などの学習スタイルは自己学習能力形成に直結しないこと、むしろ知識の自己増殖的な発展過程が重要であるとの結論を得た。すなわち、自主的に活動できることが、知識を拡大し、新たな疑問を生み出し、その疑問を解消する過程で新たな学習を行わせることになるということである。したがって、自己学習能力の基礎として重要なのは、その領域に関する具体的な知識なのではないかと考えられる。調査によって、この過程の存在を確認した。そして、自己学習の結果としての思考の柔軟性は、学習者の持つ認知構造と大いに関係することも実験的に確かめた。また、指導形態に関する基礎的な先行研究のレビューを行い、オープンエンドな指導法が、一般的にややもすれば単なる指導や思考の多様性と捉えられていることを見いだした。それに対して、先の認知心理学的な知識論からの結論を加味して考えれば、知識の足がかりを与えそこからの自己展開を促すという結論になる。いくつかの良質な授業の観察も行い、そこに、この意味での自己学習能力、オープンエンドな学習指導形態の要素が見られそうなことを確認した。本研究では、すでに、自己学習能力を認知心理学的な知識論の観点から理論的に考察し、問題解決学習などの学習スタイルは自己学習能力形成に直結しないこと、むしろ知識の自己増殖的な発展過程が重要であるとの結論を得ている。また、指導形態に関する基礎的な先行研究のレビューを行って、オープンエンドな指導法が、一般的にややもすれば単なる指導や思考の多様性と捉えられていることを見い出している。11年度の研究においては、既に得られているこれらの結論をもとに、学習における知識の自己増殖過程がどのようなものであるかを理論的・実験的に考察し、有力な作業仮説として次のような考えを得た。すなわち、自己増殖的な活動のおこりやすい知識構造は、広範な適用範囲を持つベースとなる知識と、それぞれの事象に特有な条件に関する知識の両者で、各事象を捉え理解すべきであるということである。
言語・非言語情報統合によるマニュアルからの知識獲得と概念形成システム

人間が知識を獲得する最も基本的な手段として,教科書や説明書からの知識獲得が考えられる.既にルーチン化された作業に関するマニュアルでは対象機器の形状等に関する情報は記号化(符号化)されているため,記号表現(自然言語文)のみで知識の伝達が可能である.しかしルーチン化されていない作業では,対象を記号化することは困難であり,説明文に出現する物体の説明図の参照が不可欠である.一般に非言語情報-特に図表等-を参照する必要がある場合には,図表のモデルが準備される.しかしシステムが未知の事柄を習得する際に,予め必要な対象のモデルが準備されているのは不自然であり,また参照される可能性のある対象のモデルを予め集積することは不可能である.図表の解釈は文の理解状況に応じてシステム自らが行うべきであるとの信念に基づいて,機械部品組立マニュアルの内容の理解を試みた.言語理解において,語や句の意味設定が対象分野の考慮の下に行われるように,画像理解では,機械部品を構成する部分図形-例えば楕円,平行線対,穴,穴に挿入される部分等-の抽出を行う手続きの集合を与えた.本研究では,言語中の単語や句が図中のどの部分に対応するかを決定することが重要であり,構文解析器が機械部品の指定に使用される特殊記号にわずらわされぬよう工夫した.組立指令の言語的特徴は参照図が与えられていることから,対象をその部品名で引用し,部品のどの穴や凸起が組立てに用いられるかを明示せぬ点である.また参照図は組立指令が実行される直前の時点における部品の詳細部の関係が図示されている.このため図示された穴と凸起の組立てが1ステップで実現されない場合,図の情報から組立手順を推測することは困難である.ここでは言語指示と図形の協調が活用されねばならない.本研究で対象とする組立説明図はテクニカルイラストレーション(TI)の一例であり,組合せられる2つの部品間には補助線が描かれている.しかし類似の組合せが2組以上ある場合には代表的な一例についてのみ言及されかつ補助線描画がされるのが一般的であるため,言語指令される組立操作がいくつ存在するかを知る必要がある.この問題は図形の相関を伴った言語・図形協調を導入することにより解決された.人間が知識を獲得する最も基本的な手段として,教科書や説明書からの知識獲得が考えられる.既にルーチン化された作業に関するマニュアルでは対象機器の形状等に関する情報は記号化(符号化)されているため,記号表現(自然言語文)のみで知識の伝達が可能である.しかしルーチン化されていない作業では,対象を記号化することは困難であり,説明文に出現する物体の説明図の参照が不可欠である.一般に非言語情報-特に図表等-を参照する必要がある場合には,図表のモデルが準備される.しかしシステムが未知の事柄を習得する際に,予め必要な対象のモデルが準備されているのは不自然であり,また参照される可能性のある対象のモデルを予め集積することは不可能である.図表の解釈は文の理解状況に応じてシステム自らが行うべきであるとの信念に基づいて,機械部品組立マニュアルの内容の理解を試みた.言語理解において,語や句の意味設定が対象分野の考慮の下に行われるように,画像理解では,機械部品を構成する部分図形-例えば楕円,平行線対,穴,穴に挿入される部分等-の抽出を行う手続きの集合を与えた.本研究では,言語中の単語や句が図中のどの部分に対応するかを決定することが重要であり,構文解析器が機械部品の指定に使用される特殊記号にわずらわされぬよう工夫した.組立指令の言語的特徴は参照図が与えられていることから,対象をその部品名で引用し,部品のどの穴や凸起が組立てに用いられるかを明示せぬ点である.また参照図は組立指令が実行される直前の時点における部品の詳細部の関係が図示されている.このため図示された穴と凸起の組立てが1ステップで実現されない場合,図の情報から組立手順を推測することは困難である.ここでは言語指示と図形の協調が活用されねばならない.本研究で対象とする組立説明図はテクニカルイラストレーション(TI)の一例であり,組合せられる2つの部品間には補助線が描かれている.しかし類似の組合せが2組以上ある場合には代表的な一例についてのみ言及されかつ補助線描画がされるのが一般的であるため,言語指令される組立操作がいくつ存在するかを知る必要がある.この問題は図形の相関を伴った言語・図形協調を導入することにより解決された.
損傷予見システムを用いた道路橋の健全度診断技術の高度化

予想をはるかに越える橋梁環境の変化によって、道路橋のいろいろな箇所に損傷が発生しているとの報告が近年とみに多くなってきており、維持管理の点からも最大の関心事となってきている。ところが従来、道路橋の点検や診断を実施し、その健全度を判定する際に、竣工時点ですべての橋梁が同一品質と考えるような、平均的な考察に終始しているために「損傷予測」という点では不備であった。A橋とB橋は「建設に至るまでの情報」が異なるのに、他の多くの橋梁との平均値的な見方でしか診断されていないのである。多くの場合、損傷は構造的な欠陥や施工上の問題、すなわち、建設時までに多くの原因があることが判ってきた。そこで、健全度診断時の情報として、環境情報のほかに、建設情報を積極的に利用し、より高度な診断ができるような支援システムの整備してきた。橋梁の竣工時点を人間の誕生時と考え、それ以前に伝達された遺伝情報とそれ以降に受けた環境情報とを、はっきりと区別し、制御可能な損傷発現因子を見出し、構造物の健全度診断と保全を合理的に進めるため、予見システムの完成と健全度診断支援システムの整備を行なってきた。(1)損傷評価と診断の支援システムの具体案を設計し、仕様を決めた。(2)建設情報伝達子データの収集と環境履歴情報伝達子システムの収集をした。(3)より高度な損傷予見システムによる健全度診断技術については開発中である。
中英語における迂言的助動詞GANの意味・用法に関する実証的研究

主として中英語にしか見られない迂言的動詞GAN(現代英語の'did'に相当)の意味・用法に関する全容を解明すべく本年度は次のことを行った。1.数年来継続中の本研究に必要な中英語・中世スコットランド語文献(テキスト)及びganに関する研究文献(著書・論文等)の調査収集はほぼ終了した。今年度新たに入手したテキストは、我が国では比較的入手困難な中世スコットランド語の文献8点を含む25点、それに研究文献17点である。2.これまで入手した文献(テキスト)のうち本年度はほぼ50点の調査を完了した。とりわけ特異な用法の見られるスコットランド語関係の文献解読はほぼ終了した。3.最終目標は約150点の韻文及び散文テキストを調査することであるが、これで全計画の8割は終了したことになる。残りは今後継続する4.最終的な成果は2、3年後公刊予定の著書(モノグラフ)で発表するが、現時点でも数々興味深い事実が明らかになっている。例えば、この助動詞ganは1200年頃英語に登場するが、1600年頃にはほぼ完全に姿を消し、その役割は迂言的助動詞do didに取って代わられたこと、北部方言及びスコットランド方言では冒頭の[g]が[k]に音韻交替し、can或いはconの形で現れること、用法的には主として後続の不定詞を脚韻の位置に置くために使われたこと、などである。
腸の生理機能維持に働くプロスタグランジン代謝の機能解明

本年度は、(機能解析1)腸絨毛形成における機能解析と(機能解析2)腸管免疫における機能解析を行った。(機能解析1)では、シクロペンテノン型プロスタグランジンに加えエイコサノイドの過酸化代謝物の酵素学的な代謝解析とアポトーシス作用、代謝酵素による抗アポトーシス作用を解析した。初めに、酵素学的な解析の結果、4-ヒドロキシノネナール、4-オキソノネナール、マロンジアルデヒドが硫酸化を受けることが明らかとなった。さらに、ヒトの肝臓がん細胞株でも解析した結果、やはり硫酸化による代謝を受けていることが分かり、ヒトの酵素も代謝を担うことが示唆された。また、質量分析計を用いて代謝物を解析し、スルホン基の転移がなされていることを確認した。さらに、SULT7A1過剰発現細胞を用いた解析から、3種類のa,b-不飽和アルデヒドいずれも細胞内の代謝過程において硫酸化を受けることが想定された。そこで、シクロペンテノン型プロスタグランジンである15d-PGJ2に加え、3種類のa,b-不飽和アルデヒドによる細胞障害を検討した結果、4種類の中で4-オキソノネナールに最も強いアポトーシス作用があることが分かった。また、SULT7A1やGSTsを過剰発現させた細胞を用いた解析から、硫酸転移酵素やグルタチオン転移酵素には4-オキソノネナールによるアポトーシスから細胞を保護する機能を持っていることが想定された。(機能解析2)では、PGA2のグルタチオン体と硫酸体の受容体に対する作用解析を細胞を用いて行った。現在は、その作用が免疫細胞に与える影響を解析している。また、in vivoノックダウン実験に向け、SULT7A1安定発現株を作成し、SULT7A1発現を効率よくノックダウンするsiRNAを見出すことができた。また、動物実験計画の承認が得られ、動物実験の予備実験中である。(機能解析1)腸絨毛形成における機能解析実験で当初予定した計画以上の実験を遂行することができた。当初の予定通り、エイコサノイドの過酸化代謝体の中から、硫酸化による代謝を受ける化合物を見出すことができた。さらに、当初予定していなかった代謝物の構造も明らかにすることができた。エイコサノイドの過酸化代謝体の細胞内硫酸化による代謝も当初予定通り遂行できた。当初の予定にはなかったが、SULT7A1以外の酵素による硫酸化代謝を検討した結果、SULT7A1を発現していない細胞でも硫酸化による代謝が行われていたことは大きな発見であり、更なる解析を翌年度以降、継続することにした。エイコサノイドの過酸化代謝体のアポトーシス効果も当初の予定通りに解析することができた。抗アポトーシス実験に関しては、ノックダウン実験を行う予定であったがSULT7A1を発現する株化細胞を見出すことができなかったことから、過剰発現させた細胞を用いた解析に移行した。機能解析2)腸管免疫における機能解析では、少し計画に遅れが生じた。PGA2の代謝体の作用解析では、再試験の結果EP4に対する作用が確認されたため、その作用確認の追加実験を行った。また、in vivo-knock down実験は、実験室などの施設や動物実験計画の承認を得るのに時間がかかり、十分な試験を行うことができなかった。但し、その下準備としてノックダウンに利用するsiRNAの検討は行うことができた。以上のことを踏まえ、予定以上に実験計画を膨らまし行うことができた一方、動物実験が遅れていることを考慮し、進捗状況・達成度はやや遅れているとした。本年度は、(機能解析1)腸絨毛形成における機能解析と(機能解析2)腸管免疫における機能解析のin vitro培養細胞実験を行うとともに、in vivoノックダウン実験を行う。(機能1):腸絨毛形成における機能:エイコサノイドの過酸化代謝体であるa,b-不飽和カルボニル代謝のSULT7A1による酵素学的解析、特に反応速度論的解析を行う。また、ヒトSULT酵素による酵素学的解析(基質特異性と反応速度論的解析)を完了させる。(機能2):腸管免疫における機能:調製した15d-PGJ2硫酸体及びグルタチオン体、PGA2硫酸体及びグルタチオン体の作用を免疫細胞(RAW264.7やJurkat細胞等)を用いて解析する。具体的には、その免疫細胞に対する作用をサイトカインなどの遺伝子発現及びタンパク質発現レベルで評価する。また、作用を網羅的に評価するため、プロテオミクスを用いた解析も検討する。・ノックダウンマウス作製:SULT7A1特異的siRNAを用いたノックダウン条件(投与量、投与方法)の検討を行う。ノックダウン効率は、SULT7A1抗血清を用いたウエスタンブロッティング法による行う。遺伝子特異的siRNAによる標的遺伝子のノックダウン効率を確認後、腸柔毛細胞や腸上皮細胞の形態観察のほか、サイトカインなどの遺伝子発現やタンパク質発現に与える作用などを評価する。SULT7A1に加え、グルタチオン転移酵素(GSTA1やGSTP1)特異的なsiRNAを用いたノックダウン実験も同様に行い、各代謝酵素の個別遺伝子ノックダウンの作用を比較解析する。シクロペンテノン型プロスタグランジン代謝の機能解析として、本年度は、(機能解析1)腸絨毛形成における機能解析と(機能解析2)腸管免疫における機能解析を行った。(機能解析1)では、シクロペンテノン型プロスタグランジンによるアポトーシス作用を検討するとともに、グルタチオン転移酵素と硫酸転移酵素による抗アポトーシス作用を解析した。初めに、腸管発現グルタチオン転移酵素であるGSTA1,GSTM