hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物分子モーターの構造・機能の1分子動態解析研究

(1)アクトミオシンモーターの化学・力学カップリング基板に固定されたへビーメロミオシン(HMM)上をアクチンフィラメントは滑り運動をする。HMMのATPase反応で獲得された化学エネルギーが力学エネルギーに変換されて、この運動が起こる。滑り速度、滑り運動中にHMMが発生している力が、このATPase反応とどのようにカップルしているかを現象論的に調べた。数種類のMgNTP、種々の二価金属イオンと結合したATPを基質とした場合、イオン強度を変えた場合について、同一条件下でNTPase反応のキネティクス、滑り速度、力を測定した。その結果、滑り速度は√<V_<max>K^A_m>に比例し、力は√<V_<max>/K^A_m>に比例するという実験結果を得た。アクトミオシンATPase反応では、アクチン・ミオシンは多くの時間弱い結合状態にあり、弱い結合状態から強い結合状態への遷移で力発生が起こると考えられる。弱い結合状態では負荷を発生し、この負荷と力が釣り合うことで滑り速度が決まるというモデルを基礎として理論的解析を行った。その結果上記実験結果をきれいに説明できた。過去の多くの実験結果もこの関係を満たすことが確認された。(2)ミオシンVのプロセッシブ運動の直接観察ミオシンVはその生化学的性質、細胞内での機能から、プロセッシブモーターであることが示唆されているが、実験的直接証明はなされていない。カルモジュリンを蛍光性カルモジュリンで置換することで、ミオシンV1分子の可視化に成功した。また、アクチンフィラメントの基板への固定方法に工夫を加えた。その結果、個々のミオシンVがアクチンフィラメント上をプロセッシブに運動し、B端まで達する様子が多数観察された。B端でもミオシンVは離れにくく、その結果、B端は時間とともに明るくなっていった。最大滑り速度は2μm/sec、最大ATPase活性は2/secであった。1ATPaseサイクルで500nmも滑ることになる。
南千島における絶滅危惧種・外来生物種の現状調査

研究期間2009-2012年の間に3回40日間程度、南千島での現地生物種調査を行った。上陸した島は色丹島、国後島、択捉島の3島で、主に維管束植物、哺乳類、魚類、貝類、キノコ類、海藻類の現状を調査した。維管束植物では在来生態系に影響を及ぼしかねない多くの外来種を確認したが、他の生物種では在来生態系に大きな影響を及ぼすような外来種は確認されなかった。5本の学術論文と1本の調査報告書を印刷公表した。ロシア側より出版されている『サハリン地域のRDB植物編』(2005)と、最新の『千島列島の維管束植物相』(Barkalov 2009)の和訳作業・DB化作業を進めている。これにより植物についてはロシア側による絶滅危惧種や外来種の地理情報がほぼ整理された。それ以外の生物種については和訳作業・DB化作業は継続中である。現地調査については、21年度は10月18日29日の日程でおこなわれたビザなし交流の国後島訪問に同行することができ、古釜布からセオイ川、乳呑路等の自然林や海岸、市内などで植物調査を行うことができた。国後島の自然植生は概ねよく保存されているが、チャチャ岳南西の乳呑路周辺で、外来種のオオハンゴンソウの群生を確認した。本種は北海道においても自然植生を脅かす外来植物として警戒されている所だが、これまで自然度が高いとされていた国後島においても外来植物の脅威は例外ではない事を表している。本調査の意義をあらためて示していると思われ、短報を準備中である。プロジェクト初年度は、ビザなし交流枠での参加のためのさまざまな事務手続き等をクリアーすることを第一目標としたので、この点では初年度から実地調査ができたのは何よりであった。但し、今回は概ね該当年度のビザなし交流枠が既に決まった後からの調査であったため、植物研究の1名(プラス通訳1名)しか実地調査には参加できなかった。このため今年度は、サハリン植物園の研究者を日本に招聘するなどして、次年度以降のロシア側との共同調査の体制構築を万全にすることに意を払った。色丹島で8月22日から29日の8日間、植物、海藻、魚類、貝類についての現地調査を行い、併せて現地情報の聞き取り調査を行うことができた。外来種についてはシャコタン山山麓や登山道沿い、頂上付近廃墟跡でシロツメクサ、ムラサキツメクサ、エダウチチチコグサ、セイヨウタンポポなどが確認され、自然植生に対する悪影響を考慮すると今後モニタリングを継続する必要がある。島北側のアナマ村やシャコタン村ではアメリカオニアザミやオニツリフネソウなどが単発的に侵入してはいるが、道東で見られるオオアワダチソウやオオハンゴンソウなど群生して在来植生に大きな影響を与える外来植物種はまだ侵入していなかった。また、島の南西部にあたる松ヶ浜やマスバ山などにはほとんど外来植物が侵入しておらず、良好な在来植生が維持されている事が確認できた。北海道で問題になっているセイヨウオオマルハナバチ、ブラウントラウト、アライグマ、ミンク、ウチダザリガニ等の外来動物については地元の自然保護関係者から聞き取りを行ったが侵入しておらず、島全体としては良好な状態であることが確認できた。絶滅危惧種・希少種においては、グイマツを200300株確認したものの湿原の乾燥化が懸念され、今後の継続調査が必要である。またこの周辺から記録されている希少種カラフトムシトリスミレは発見できなかった。ウルップソウ、カタオカソウは大きな群落地を確認した。色丹島固有のシコタントロロコンブの生育も確認し、島南部の沿岸生態系は良好に維持されていると考える。さらに希少種昆虫ノサップマルハナバチを自生地で確認し、希少魚類オショロコマの生息情報を得た。以上のように色丹島の外来種、絶滅危惧種に関する多くの知見を得ることができた。これまで21年度に国後島予備調査、22年度に色丹島調査を行い、本年23年度は択捉島調査の予定であったが、残念ながら北方四島側の都合により、ビザなし交流枠内での今回の日本人による現状調査は中止となってしまった。このため期待されていた我々自身の現状調査によるデータ収集ができなかった。そこでロシア人研究協力者であるユジノサハリンスクのサハリン植物園スタッフによる現地調査を依頼した。これにより特に外来植物種を50種程度確認できたのは大きな成果だった。一方で、現地調査以外での千島列島産生物群調査も進めており、今年度はウラジオストクの生物土壌学研究所の植物標本庫を研究代表者と研究協力者2名の計3名で訪問し、千島列島産の水生植物、イネ科ノガリヤス属などについての標本調査を進めた。

この折に、ロシア人研究者との情報交換を行い、択捉島における調査方法についての議論を行うことができたので来年度以降の調査に生かしたいと思っている。さらに日本に保管されている戦前採集の千島列島産標本の整理も進めており、また最近ロシア側から出版された千島列島の植物図鑑の翻訳作業も継続して行っている。これらにより千島列島の生物インベントリー事業が着実に進んでいる。23年度調査全体としては、当初計画したほどの現地調査成果は得られなかったものの、これまでの調査の蓄積により、さまざまな生物群における希少種・外来種に関する報告をまとめることができた。たとえば、Sato, Y., et al.(2011)により、南千島で見られる稀少個体群「白いヒグマ」についてのレビューがまとめられた。また2011年3月には近藤ら(2011)により哺乳類コウモリ類のモモジロコウモリの白化型の報告、また河合ら(2011)によりコウモリ相の報告がなされた。本年度は現地調査として、国後島において8月17日より10日間、択捉島において8月25日より15日間程度行った。維管束植物、菌類、海藻、魚類などを対象として、希少種や外来種、生物相の現状調査を行った。植物の希少種としては、ロシアのレッドデータブックに掲載されているホオノキ、カシワ、ハリギリ、ウドなどを確認した。ウドは国後島、択捉島を通じて非常に多く見られた。植物では、国後島のフルカマップや択捉島の紗那市街には多くの外来種が侵入しており、Barkalov (2009)で確認されていない種類も多数確認した。特に、オオアワダチソウ類似種の小集団が紗那郊外に点在しており今後の注意が必要と思われる。また国後島や択捉島数か所の海岸の砂浜で、オニハマダイコンの群落を確認した。今後、在来の海岸植生を大きく変えていく可能性がある。菌類調査はハラタケ目を中心におこなった。北方四島を含む日本からの初記録として国後島でクナシリトマヤタケ(和名新称)を確認し、択捉島ではコウタクトマヤタケや、スイスから新種記載されたカワイトマヤタケ(和名新称)を確認した。また択捉島で確認されたユウバリトマヤタケは日本では夕張岳でしか採集されていない希少種である。海藻相としては、国後島では知床半島と同様にオニコンブが中心であるのに対し、択捉島ではエダネスジコンブとチシマネコアシコンブを中心としており、北海道本島以南とは全く異なる海藻植生だった。国後島北部から択捉島南部にかけて、海藻植生の移行が漸進的なのか断続的なのか興味がもたれる。魚類については約30種が確認され、希少種として北海道東部から新種報告されていたカンムリフサカジカを択捉島で確認した。南千島における植物外来種の現状については、2012年9月23ー27日にウラジオストクで開かれた、東アジアフロラに関するシンポジウムで口頭発表した。平成23年度においては、北方四島側の都合により、択捉島での日本人による現地調査ができなかった。このためロシア側の研究協力者による調査を依頼したが、これは植物のみが調査対象だった。千島列島標本の多いウラジオストク生物土壌学研究所での標本調査をおこなったり、ロシア側文献の翻訳をおこない、不足を補う努力をおこなった。しかしながら、実際に現地調査ができなかった影響により。当初計画よりも若干遅れていると言わざるを得ない。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年平成24年度は、択捉島での現地調査を成功させるこめ、関係諸機関と協議を進めているところである。また国後島での調査案も同時並行で協議中である。さらに、千島列島標本の多いサハリンの研究機関への調査も計画する。これにより、若干遅れている調査計画をなんとか達成したいと考えている。
へき地等における退院支援・調整に関する教育プログラムの開発

2018年度は、退院支援・調整に関わる多職種を対象としたフォーカス・グループ・インタビュー(以下、FGI)によって、患者・家族の希望に沿った在宅療養につながった、退院支援・調整の事例における、各職種の関わり、成果につながった要因、および課題を明らかにすることが目的であった。第1回専門家会議を開催し調査対象、調査方法等について検討した。その結果、1へき地といっても多様性があることから対象地域の焦点化、2へき地におけるFGIは実施困難、退院支援の実際(課題)をとらえる「視点」が必要であることから、調査デザインの再考、3へき地では入院に向けて送り出す支援から、退院に向けて受け入れる支援・地域づくりも含めた活動がなされていることから、本研究課題が対象とする退院支援の範囲を明確にする必要性等が指摘された。これを受け2018年度の活動計画を変更し、1)実際にへき地等で退院支援に関わっている看護職への訪問調査と、2)研究者らがへき地等看護職を対象に開講している退院支援・調整のe-learning科目受講生間の発言分析を実施した。1)訪問調査:連携研究者から紹介をうけた沖縄県離島の診療所勤務および小規模多機能居宅介護支援事業所勤務の看護職2名を対象に、離島における退院支援についてヒアリングを実施した。2)発言分析:へき地診療所、へき地医療拠点病院に勤務する看護職15名が自施設における退院支援について自由に語った発言(既存データ)から、どのような実践上の課題を抱えているかを分析、比較した。教育プログラム開発の素材となる退院支援の実際をデータ収集することを目指していたが、専門家会議を通して当初の調査デザインでは、データ収集が十分できないことが明らかになり、再考した点が大きい。2019年度は前年度完了できなかった計画を遂行する。前年度実施した訪問調査および発言分析の結果を踏まえ、調査デザインを再考、倫理審査の受審、調査実施および教育プログラムに含めるべき学習項目を抽出する。第2回専門家会議を開催し教育プログラム開発に向けて検討する。前年度実施した訪問調査および発言分析の結果を踏まえ、データ収集を実施する。一堂に会するグループインタビューとはせず、様々な立場で退院支援に関わっている複数の関係者を対象に個別面接調査を実施する。調査地は沖縄県離島とし、研究分担者を含めて複数体制で、一定期間滞在するため、グループインタビューよりも交通費おおび滞在費を要すると思われる。
アクチンフィラメントの構造多型と機能分化

われわれは、アクチンフィラメントが様々な異なった原子構造をとることにより異なったアクチン結合タンパク質と相互作用し、異なった機能を果たすことができるという仮説の検証を試みた。その結果、張力によりらせんピッチが伸びたアクチンフィラメントはミオシンIIと相互作用しやすいこと、および、ミオシンIIとコフィリンという異なるアクチン結合タンパク質をアクチンフィラメントと共存させると、結合部位が競合しないにもかかわらず、両者はそれぞれ相互排他的にアクチンフィラメントと結合することを見出した。これらはいずれも上記仮説を支持する結果である。アクチンは真核細胞でもっとも高度に保存されたタンパク質の一つであり、その重合体であるアクチンフィラメントは、細胞運動や細胞内物質輸送等のさまざまな現象で非常に重要な機能を果たしている。われわれは、細胞内アクチンフィラメントのこうした機能分化には、アクチンフィラメントの構造変化、とくに外力による変形や特異的アクチン結合タンパク質による構造変化が重要な機能を果たしているのではないかという仮説を提唱した。本研究は、この仮説の検証を目的としている。21年度は大別して下記の三つのアプローチに取り組んだ。(1)本仮説によれば、異なるアクチン結合タンパク質が共存する場合、アクチンフィラメントと排他的または相加的に協同的に結合すると予想される。そこで蛍光標識したミオシン断片とコフィリンを調製し、アクチンフィラメントとの結合を蛍光顕微鏡観察している。その結果、ミオシンII断片のみならず、コフィリンもアクチンフィラメントと長距離の協同的結合することを発見した。現状ではコフィリンのアクチンフィラメント切断活性などへの対処に手間取り、両者が共存する場合の挙動を確定するには至っていない。そこでこの困難を回避する一手段として、蛍光標識したアクチニンやフィラミンなど他のアクチン結合タンパク質の調製にも着手した。(2)細胞内でのアクチン結合タンパク質、とくに蛍光標識したミオシン断片の挙動を解析した。その結果、ミオシンII断片は張力のかかったアクチンフィラメントに局在していたが、ミオシンIの断片にはそうした傾向は認められなかった。これは本仮説と合致する結果である。(3)以前の科研費基盤研究「優性変異アクチンを用いたアクチンフィラメントの機能解明」で単離した変異(G146V)アクチンが、アクチンフィラメントの協同的構造変化に大きな影響を与えることを発見し、これに関する解析にも着手した。アクチンフィラメントは、細胞運動や細胞内物質輸送等のさまざまな現象で非常に重要な機能を果たしている。われわれは、細胞内アクチンフィラメントのこうした機能分化には、アクチンフィラメントの構造変化、とくに外力による変形や特異的アクチン結合タンパク質による構造変化が重要な機能を果たしているのではないかという仮説の検証に取り組み、今年度は以下の成果を上げた。1.昨年度までに、蛍光標識したミオシンIIのモーター領域断片とコフィリンを調製がそれぞれ個別にアクチンフィラメントと長距離の協同的結合することを発見していた。今年度は、ミオシンIIモーター領域断片、コフィリンおよび過剰量のアクチンフィラメント三者が共存する場合に、ミオシンIIモーター領域断片とコフィリンが相互排他的にアクチンフィラメントと結合する条件を見出すことができた。来年度にさらなる条件検討が必要になるが、これにより本研究の重要な目標達成にめどが立ったといえる。2.蛍光標識したミオシンIIモーター領域断片が、細胞内で張力のかかったアクチンフィラメントに局在することを昨年度までに観察していたが、今年度は、ミオシンIIフィラメントの細胞内局在に影響すると言われている変異体においても、ミオシンIIモーター領域断片は張力のかかったアクチンフィラメントに局在することを見出した。この結果により、オシンIIモーター領域断片が張力のかかったアクチンフィラメントに局在するという性質はアクチンフィラメントの本来的性質であることが示唆され、本研究の仮説がさらに支持された。3.ミオシンIIモーター領域断片がアクチンフィラメントに及ぼす影響を構造的に解明するため、アクチンの分子内FRET解析を行い、ミオシンIIモーター領域断片がATP依存的にFRETシグナルに影響を与えることを見出した。われわれは、細胞内アクチンフィラメントのこうした機能分化には、外力や特異的アクチン結合タンパク質によるフィラメントの構造変化が重要な機能を果たしているのではないかという仮説の検証に取り組んだ。1.昨年度までに、蛍光標識したHMM(ミオシンIIのモーター領域断片)とコフィリンが互いに排他的にアクチンフィラメントと協同的結合することを発見していた。しかしこの実験では、HMMとコフィリンがアクチン上の結合サイトを競合している可能性を否定できなかった。そこで今年度は、アクチン-S1融合タンパク質とコフィリン-アクチン融合タンパク質をそれぞれ正常アクチンと共重合させ、融合タンパク質が近傍の正常アクチンに及ぼす影響を共沈実験により調べた。

その結果、アクチン-S1融合タンパク質は、近傍の正常アクチンとコフィリンの結合を阻害する一方、HMMとの結合を促進すること、逆にコフィリン-アクチン融合タンパク質は、近傍の正常アクチンとコフィリンの結合を促進することを見出した。これらの実験においては、融合タンパク質と正常アクチンの共重合体フィラメントにおける正常アクチンとHMMあるいはコフィリンの結合をみており、結合部位の競合による影響を考慮する必要はない。したがって、昨年度までの蛍光顕微鏡観察とあわせ、ミオシンIIモーター領域やコフィリンとアクチンフィラメントの結合は、フィラメントの協同的な構造変化をひきおこし、ミオシンモーター領域やコフィリンとの親和性が正または負に制御されることが示された。これにより、本研究の主要目的の一つが達成されたことになる。2.蛍光標識したミオシンIIモーター領域が、細胞内で張力のかかったアクチンフィラメントに局在することについて、必要な補充実験を行い、論文発表した。
イカ肉の透明度を保持する科学的知見は九州特産アオリイカのブランド化を実現するか

本研究により、イカ筋肉が死後に白濁する現象を培養実験系で評価する方法が確立された。すなわち、イカ筋組織を培養し、顕微鏡下の筋組織透明度(可視光線透過率)をデジタルスチルカメラ像と画像処理ソフトを用いた画像解析から評価する方法を開発した。一方、培養系実験において、細胞のバイアビリティーを向上させてイカ筋肉の光学的透明度を維持延長する効果的な方法を見出すにはさらなる検討が必要であることが判明した。我々はイカ筋肉が死後に白濁するメカニズムを主に組織学的アプローチによって解明しようとしている。申請研究では、死後の筋組織に生じる白濁化現象を培養実験系で評価する方法を確立すること、また、培養実験系における評価方法を用いて死後白濁化を抑止する効果を持った物質を見出すために生理活性物質の作用を検索するとともに、白濁化抑制効果を有する物質が見出せたならば地元特産のアオリイカ輸送に活用することで活魚のブランド化に応用できる可能性について検討することとした。研究期間全体を通じて実施した研究の成果としては、地元長崎において飼育不可能と考えたれているアオリイカ個体を実験室内において成長をともなう長期の畜養方法を見出し、イカ筋組織の培養実験系の確立に必要となる筋組織試料の安定供給方法を準備することに成功した。また、イカ筋組織の切片を切り出し、これを培養するに適当な組成を見出すとともに、イカ筋組織の培養実験系において顕微鏡下の筋組織透明度(可視光線透過率)をデジタルスチルカメラ像と画像処理ソフトを用いて画像解析から評価する方法を確立した。これら開発した技術を用いて、最終年度に実施した研究では、細胞・組織のバイアビリティーをATP量から推定する方法の確立、および細胞のバイアビリティーと筋組織の光学的特性(透明度)の評価を基にした筋組織白濁化の顕微下評価の実施と白濁変化を抑制する方法の可能性を探った。その結果、予想に反して細胞のバイアビリティー向上に資すると予想された外部から培養筋組織へのATP添加は筋収縮を促進することでむしろ細胞死を早め、光学的透明度の早期消失を誘導することが示唆された。すなわち、筋組織の死後白濁化を抑制するためには細胞のバイアビリティーを低下させ、細胞活動を抑える方法が有効であり、本申請計画で対象とした披検査物質の選定方法にさらなる検討が必要であることが判明した。生体内生理物質が死後の筋組織に及ぼす作用を培養系実験での光学的組織特性によって検索するために、まず、活きイカの筋肉組織を長時間培養する実験環境を整えた。すなわち、今回新たに制作した水槽内で畜養された活きイカの筋肉細胞を適宜採取し、活きイカの筋肉組織を長時間培養する実験装置の製作を完了した。そして、アオリイカ筋組織の培養に適した条件はとくに知られていないため、実用的培養条件を網羅的に探るために、当初はD-MEM (High Glucose)、D-MEM (Low Glucose)、E-MEM、G-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham's F-12、Ham's F-12K (Kaighn's Modification)、D-MEM/Ham's F-12などを網羅的に検索したところ、概ね、イカ筋組織に好適と思われる基本培地を設定することができた。また、添加物質の検討および培養液浸透圧の調整を終えたことから、今回の研究で必要な細胞活性を保つ細胞培養条件を決定することができた。一方で、培養液中のアオリイカ筋組織像の透明度を画像解析するための顕微鏡デジタル画像-PC解析連携システムを整備し、培養アオリイカ筋組織像の透明度パラメータの測定方法を確立した。また、培養筋組織の透過電子顕微鏡像を観察するための筋組織処理方法を予備検討によってあきらかにすることにも成功した。これまでの研究成果によって、アオリイカ筋組織の光学的・組織学的死後経時変化を培養下に検索する技術が概ね確立した。研究費の減額措置が本研究推進に影響することがないように、測定システムのほとんどをハンドメイドに切り替えたことから製作に多大な時間を要した関係で、いくつかの検討項目について若干遅れているものもあるが、概ね当初計画していた研究の進捗状況にある。今後の研究推進に関しては、あくまで現在の状況においてであるが、とくに大きな変更を行う予定はない。若干遅れている検討項目の進捗を早めること以外は、基本的に申請した研究計画に従って以下のように今後の研究を進める予定である。すなわち、培養筋組織の顕微的透明度測定方法による死後変化の経過を対照として、生体内の高エネルギー物質の存在量が死後変化にどのような影響を及ぼすのかについて、付加・除去実験により検索する。検索の対象として考えるものは主に個体死の後に細胞死が進む過程において細胞の生存に重要な影響を及ぼすと予想され、多くの議論の対象となっているATP関連化合物の挙動である。ATP存在量の多寡が細胞死と筋組織の死後変化、およびそれらと関係する筋組織の光学的透明度の低下にどのような関係を持っているのかを検証する。

また、個体レベルでの死に至る条件(イカを漁獲して即殺するか、放血死か、あるいは何度で保存流通させるのか)が筋組織レベルの死後ATP関連化合物の挙動に如何なる影響を及ぼすのか、そして、個体レベルでの死に至る条件をコントロールすることでイカ筋組織の死後透明度低下を遅延させ得る方法があるのかについても検索する。さらに、顕微下で培養筋組織の細胞死および筋組織透明度の低下を遅延し得る食品添加物質の存在の有無を検索し、もしその効果を有する候補物質が有った場合には、in vivoにて高鮮度イカ肉の保持に対する有用性についても検索する。そして、アオリイカの鮮度保持に有効な知見、言い換えると地場海産物アオリイカのブランド化に結びつく新たな知見を得ることを目指す。研究費の使用計画は以下のようである。すなわち、物品費として、試料であるアオリイカの購入費、試薬費、画像処理メディアなど消耗品におよそ25万円ほどを充てることを計画している。旅費として、研究成果の学会発表におよそ10万円ほどを充てることを計画している。人件費・謝金として、画像解析処理および研究結果の論文発表に関する経費におよそ15万円ほどを充てることを計画している。
食物アレルギー発症機序に関する形態学的研究

(目的)食物アレルギー発症機序について本研究では、ラット小腸吸収上皮細胞における高分子物質及び食物性抗原の粘膜凝固有層への侵入経路を解明する目的で実験を行った。(材料・方法)乳飲ラット(生後14日目)を用い、空腸及び回腸内腔へ種々のトレーサー(HRP,コロイダルゴールド,カチオナイズドゴールド)を投与後、空腸及び回腸を採取し、電子顕微鏡を用いて侵入経路の検索を行った。さらに、乳飲ラットを用いて空腸及び回腸内腔へ食物性抗原(オボアルブミン,オボムコイド)を投与し、免疫細胞化学的に食物性抗原の侵入経路の探索を行った。(結果)HRP,コロイダルゴールド,カチオナイズドゴールド,オボアルブミン,オボムコイド,及びビオチンをラベルしたオボアルブミン投与群において、時間の経過とともに空腸及び回腸吸収上皮細胞内にトレーサーが観察された。さらに空腸においては、細胞間隔、粘膜固有層にトレーサーが認められた。(考察)乳飲期ラットでは、母乳の抗体(IgG)が空腸吸収上皮細胞より取り込まれLysosome系に関与せず、細胞壁側から細胞間隔へ放出されるといわれている。本実験結果より乳飲ラット上部空腸吸収上皮細胞において、非特異的高分子物質が細胞頂部の微絨毛細胞膜の被覆陥入部から吸収され、トランスサイトーシスによって基底-側部の細胞膜より細胞間隙へ放出され、粘膜固有層へ輸送されることが明らかとなった。さらに食物性抗原においても乳飲ラット空腸吸収上皮細胞内をトランスサイトーシスによって通過し、粘膜固有層へ侵入すると認められた。以上の事より乳飲期の空腸において、母乳の抗体が吸収上皮細胞内に取り込まれる機構と関連して、食物性抗原が細胞内に侵入し、細胞間隙へ放出されることが確認された。このことは、食物アレルギーの発生要因の一つであることを示唆している。
移植心冠動脈硬化の分子機構の解明と遺伝子治療

急性拒絶と並んで、慢性拒絶は臓器移植後の深刻な合併症である。心臓移植においては、移植心冠動脈内膜肥厚がその主体であり、長期予後を決定する重要な要素である。病態には不明な点が多く予防法はない。一方、急性・慢性拒絶反応を予防する新たな手段として移植臓器への遺伝子導入が注目されている。本研究では心移植後慢性拒絶の分子病態を解明するとともに、将来の臓器移植における遺伝子治療の戦略確立のために、移植臓器への遺伝子導入の有効性と安全性を動物実験において検討した。マウスおよびサルの移植心で30-60日後に臨床例と類似の冠動脈内膜肥厚が確認された。肥厚内膜の主体は形質変換した血管平滑筋細胞で、ICAM-1、VCAM-1など接着分子、MCP-1などの白血球走化因子、PDGFなどの増殖因子、エンドセリン、細胞周期調節遺伝子、MMPの発現亢進やTIMPの発現低下が認められた。本疾患の病態にはバルーン障害と同様、炎症機転が深く関わっていることが示された。HVJリポソーム法により移植心にアンチセンスcdk2 kinaseを導入した。導入遺伝子は少なくとも2週間血管及び心筋に広範に発現していることが確認された。遺伝子導入群では30日後の内膜肥厚は著明に抑制されていた。E2Fdecoy遺伝子導入ではより長期にわたる抑制効果があった。サルにおいても移植心へのE2Fdecoy遺伝子導入が可能であり、28日目に内膜肥厚の抑制効果が確認された。サルで行ったHVJリポソーム法の安全性試験では、大量静注投与によっても毒性を認めなかった。慢性拒絶反応の病態における炎症機転の関与が示され、遺伝子治療の有用性が小動物・大動物の実験で示された。標的とすべき遺伝子、導入方法、安全性、長期的効果などに関して、さらに詳細な検討が必要である。HVJリポソーム法は導入効率と安全性の高い遺伝子導入法と考えられ、臓器移植への臨床応用が期待される。
土木構造材料としての繊維強化型複合材料の力学的特性に関する研究

本研究の目的は、繊維強化型複合材料の一次土木構造材料としての適用性を調べるために、その力学的挙動を把握することにある。本年度は本研究代表者らが提案する離散的近似解法を用い、平面板にわずかに曲率をつけた偏平シェル構造にも扱える解析プログラムを作成し、曲面形状の変化などによる積層偏平シェルの弾塑性曲げ挙動特性を明らかにした。さらに、自由振動問題に関しては、離散的近似解法を用いた自由振動解析プログラムを作成し、一方向炭素繊維強化材を重ねたCFRPとガラスクロス強化材によるGFRPから成る試験片を用いて、レーザホログラフィを利用した実験結果と振動モードを比較することにより、積層構造の自由振動特性を明らかにした。得られた結果は、以下に示すとおりである。1.まず、積層偏平シェルの弾塑性曲げ解析においては、有限要素法により求めた弾塑性曲げ挙動と同様な結果を示したことから、本解析法の有効性を確認した。2.曲面形状の変化による弾塑性曲げ挙動は、単純支持(ピン支持)としたため、E.P,シェルとH.P.シェルは同様な挙動を示し、ガウス曲率がゼロのC.シェルの剛性が最も低い結果となった。また、対称、逆対称などの積層順序の違いによる弾塑性挙動についてはあまり差異が見られなかったが、カップリング剛性の有無により、塑性域の進行状況に違いが現れた。3.次に、積層板の自由振動解析においては、本解析法による結果は、レーザホログラフィを利用した実験結果と振動モードを比較すると、一方向強化材を重ねたCFRPおよびクロス強化材によるGFRPから成る試験片とも、実験結果とほぼ一致した結果が得られた。4.また、積層順序を変化させたクロスプライ積層板の解析では、対称積層、逆対称積層により振動モードの出現順序が違ってくる結果が出ており、実験においても同様の傾向を得た。本年度は本研究代表者らが提案する離散的近似解法を用い、積層理論に基づいた積層構造の弾塑性曲げ解析プログラムを改良し、種々の降伏条件を扱える解析プログラムを作成し、降伏条件の違いなどによる積層板の弾塑性曲げ挙動特性を明らかにした。さらに、自由振動問題に関しては、離散的近似解法を用いた自由振動解析プログラムを作成し、レーザホログラフィを利用した実験結果と振動モードを比較することにより、積層構造の自由振動特性を明らかにした。1.まず、積層板の弾塑性曲げ解析においては、Huber-MisesやHillの降伏条件を扱えるプログラムを作成した。本解析結果は、有限要素法により求めた弾塑性曲げ挙動と同様な結果を示したことから、本解析法の有効性を確認した。降伏条件の違いによる弾塑性曲げ挙動は、初期降伏後に多少の差が出てくる程度であった。2.次に、積層板の自由振動解析においては、本解析法による結果は、レーザホログラフィを利用した実験結果と振動モードを比較すると、低次の振動数には多少の差が出たものの、高次の振動数では、ほぼ実験結果と一致した結果が得られた。また、積層順序を変化させたクロスプライ積層板の解析では、振動モードの出現順序が違ってくる結果が出ており、実験においても同様の傾向を得た。この結果は、配向角を変化させたアングルプライ積層板の解析ではさらに顕著に現われており、繊維方向とノーダルラインが一致する波形が現われ易いという結果が得られた。以上の結果を踏まえて、今後、繊維強化型複合材積層板の配向角を変化させた振動実験を行い、その特性を明らかにするとともに、一次土木構造材料としての適用可能性を検討する。
放射線増感剤金ナノ粒子が及ぼす線量増幅効果の定量化の研究

当該年度では、放射線増感剤である金ナノ粒子がクラスターを形成した場合の線量増加をモンテカルロシミュレーションにより計算し、クラスター形成を考慮しなかった場合と比較した。本研究について論文を国際雑誌に投稿し、当該年度に受理された。また、米国ハーバード大学医学部に1年4ヶ月間滞在し、金ナノ粒子の血管破壊剤利用について以下の研究を行った(2017年12月2019年3月)。まず、超音波撮像法であるAcoustic Angiographyを用いて腫瘍の微細血管を非侵襲的に撮影し、金ナノ粒子と放射線治療を組み合わせたときにマウス腫瘍に起こる血管破壊効果を評価した。特に、マウス腫瘍血管の3次元空間分布を定量的に把握する手法を確立した。さらに、治療前のAcoustic Angiography画像から微細血管の特徴量を抽出すると、腫瘍の長期的な成長度を予測できる可能性が示唆された。本研究についてThe AAPM 60th Annual Meetingにおいて口頭発表を行った。この演題を基に論文を執筆し、国際雑誌に投稿した。この論文は現在Major Revisionの段階にある。腫瘍の血管破壊治療後には、腫瘍内部に低酸素領域が発生することが予想される。そこで次に、マウス腫瘍の低酸素領域をMRIによる低酸素領域イメージング手法である、Blood Oxygen Level Dependent (BOLD)法を用いて定量化する研究を行った。研究の初期段階として最適な撮像条件や腫瘍モデルを探索していく中で、マウスの体動の影響を受けにくいGlioblastomaがBOLD法に適した腫瘍モデルであることが分かった。未治療のマウスGlioblastomaを用いた実験の結果、腫瘍領域は正常組織と比較して比較的低酸素状態にあることが確かめられた。クラスター形成時の金ナノ粒子による線量増加を推定した論文が、国際雑誌に受理されたため。また、ハーバード大学医学部の研究室との共同研究により、ナノ粒子の血管破壊剤としての利用へと研究が発展し、超音波・MRIを用いた腫瘍の機能評価手法を確立したため。次年度は、所属機関にて引き続き研究を遂行する。具体的には、マウス腫瘍に対し血管破壊治療を施し、低酸素領域をBOLD法により定量化する。さらに、低酸素領域を放射線治療のみの場合と比較する。留学先であったハーバード大学の研究室とは共同研究を継続し、定期的に遠隔でのミーティングを行う。当該年度では、モンテカルロシミュレーションによって金ナノ粒子が及ぼす放射線量の増加効果の推定を行った。放射線増感剤として研究されている金ナノ粒子は、細胞内ではクラスターを形成して分布することが実験的に確認されている。しかし、金ナノ粒子が及ぼす放射線量の増加を推定した先行研究の多くは、このクラスター形成による影響を考慮してこなかった。そこで、既に報告されている金ナノ粒子クラスターの実測パラメータを用いて、クラスターをシミュレーション上で再現することで、クラスター形成が線量増加に及ぼす影響の推定を試みた。その結果、クラスター形成を考慮しないシミュレーションでは、実際の線量増加を過大評価しており、特に等重量濃度下では小さい金ナノ粒子ほど過大評価されるおそれがあることを明らかにした。一方で最新の研究では、金ナノ粒子を血管破壊剤として用いることで、放射線増感剤よりも高い効果が得られるという報告があることに着目し、当研究領域で最先端である米国ハーバード大学医学部にて共同研究を開始した。まず血管破壊効果を推定するにあたり、様々なパラメータ(金ナノ粒子の濃度、サイズ、空間分布、X線照射方向、薬剤注入後経過時間等)が血管への放射線量の増加効果にどのように影響するかを計算した。その結果、特に(1) X線の血管への入射方向が血管破壊効果の空間的な分布に影響を及ぼし、入射方向の違いにより、血管破壊効果に最大で約14%の差が生じる。(2)小さい金ナノ粒子(直径20 nm)ほど短時間で血管から拡散するため、時間が経つにつれ、大きい金ナノ粒子(直径100 nm)の方が小さい金ナノ粒子より高い効果を示すようになることが明らかとなった。これは金ナノ粒子を用いた血管破壊治療時の誤差を低減するため有用な知見である。さらに、より非侵襲的な治療をするための、最適なパラメータの選択を可能とするといえる。クラスターを形成した金ナノ粒子が及ぼす放射線量の増加をシミュレーションによって推定したため。また、金ナノ粒子の血管破壊剤利用時の、有用なパラメータを選定したため。

そこで次に、マウス腫瘍の低酸素領域をMRIによる低酸素領域イメージング手法である、Blood Oxygen Level Dependent (BOLD)法を用いて定量化する研究を行った。研究の初期段階として最適な撮像条件や腫瘍モデルを探索していく中で、マウスの体動の影響を受けにくいGlioblastomaがBOLD法に適した腫瘍モデルであることが分かった。未治療のマウスGlioblastomaを用いた実験の結果、腫瘍領域は正常組織と比較して比較的低酸素状態にあることが確かめられた。クラスター形成時の金ナノ粒子による線量増加を推定した論文が、国際雑誌に受理されたため。また、ハーバード大学医学部の研究室との共同研究により、ナノ粒子の血管破壊剤としての利用へと研究が発展し、超音波・MRIを用いた腫瘍の機能評価手法を確立したため。次年度は、シミュレーションで選定されたパラメータを活用し、マウスモデルに対してナノ粒子を用いた血管破壊治療を行う。治療前後の超音波・MRI画像から血管破壊の程度の定量化を行い、治療効果の推定を試みる。次年度は、所属機関にて引き続き研究を遂行する。具体的には、マウス腫瘍に対し血管破壊治療を施し、低酸素領域をBOLD法により定量化する。さらに、低酸素領域を放射線治療のみの場合と比較する。留学先であったハーバード大学の研究室とは共同研究を継続し、定期的に遠隔でのミーティングを行う。
消化管運動機能障害におけるペースメーカー細胞の可塑性と機能異常の解明とその再建

本研究は消化管運動におけるペースメーカー細胞であるinterstitial cells of Cajal(ICC)における炎症性シグナルに対するICC可塑性とペースメーカー機能変化を解明することを目的としている。前年度までにin vitro実験系において、Th1型炎症刺激が一酸化窒素(NO)を介した酸化ストレスによりICCの障害を発生させることを明らかにした。本年度は消化管筋層における炎症を主因とする術後イレウスのマウスモデルを用いた、生体レベルにおけるICCの機能障害発生とその分子機構の解明を実施した。回腸遠位部の操作(intestinal manipulation;IM)の24時間後に筋層におけるマクロファージおよび好中球の浸潤が認められた。このとき、ICCマーカーであるc-KitによりICCネットワークを評価した結果、c-Kit陽性ICCが有意に減少していた。一方、IMの48時間後には炎症細胞が減少しており、同様にc-Kit陽性ICCは対照群と同レベルまで回復していた。また、微小電極アレイを用いたICCのペースメーカー電位の発生とその伝搬を検討した結果、IM24時間後の筋層において、ペースメーカー電位の消失、不整な発生および伝搬の異常が認められた。一方、IMの48時間後にはペースメーカー電位の異常は改善していた。定量的PCRにより誘導型NO合成酵素(iNOS)のmRNA発現を検討した結果、IMの24時間後にはiNOSの発現が顕著に増加し、IMの48時間後には対照群と同レベルまで減少していた。IM処置の30分前および240分後にiNOS阻害剤であるアミノグアニジンを投与することでc-Kit陽性ICCの減少が抑制されたことから、IMによるICC障害においてもNOが関与することが明らかとなった。in vitro、in vivoの検討結果よりTh1型炎症におけるICC機能障害の発生にはNOが大きく関与していることが明らかとなった。これらの成果は現在、学術雑誌へ投稿中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は腸管のペースメーカー細胞であるInterstitial cells of cajal (ICC)における炎症性あるいは代謝異常シグナルに対するICC可塑性とペースメーカー機能変化を解明することを目的とする。本年度はマウス小腸筋層をコラゲナーゼ処理することで得たcell clusterを用いて、様々な炎症性メディエーターのICCペースメーカー機能に及ぼす影響を検討した。まず、cell clusterを構成する細胞群を確認するため、免疫染色学的解析を行った。その結果、cell clusterは平滑筋、ICC、神経、マクロファージを含んでいることが明らかとなった。これはcell clusterが腸管筋層の細胞間ネットワークを維持していることを示唆し、ICC機能を評価する上で有用な実験モデルであると考えられた。次に様々な炎症性メディエーターのICCペースメーカー機能に及ぼす影響を検討するため、cell clusterに炎症性メディエーターを24時間処置した後にfluo-3を用いてカルシウムイメージングを実施した。Th1サイトカインであるIL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、Th2サイトカインであるIL-4、Th17サイトカインであるIL-17(各25ng/mL)はICCペースメーカー機能に影響を与えなかった。また、LPS (10μg/mL)もICCペースメーカー機能に影響を与えなかった。しかしながら、IFN-γとLPSの併用処置(IFN-γ/LPS)はカルシウムオシレーションの振幅および頻度を有意に減少し、ICCペースメーカー機能を著しく障害した。以上の成績からICCペースメーカー機能は多くの炎症性サイトカインに抵抗性を持つ一方で、IFN-γ/LPSにより有意に抑制され、このことはICCが感染による炎症反応に感受性が高いことを示唆する。本研究は消化管運動におけるペースメーカー細胞であるInterstitial cells of Cajal(ICC)における炎症性あるいは代謝異常シグナルに対するICC可塑性とペースメーカー機能変化を解明することを目的とする。前年度までにマウス筋層より得た小細胞塊(cell cluster)を用いたICC機能評価系によりIFN-γ+LPS刺激がICC機能を著しく障害することを見出しており、本年度はその更なる詳細なメカニズムを明らかにするため実験を行った。まず、IFN-γ+LPS刺激によるcell clusterにおける一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現を確認した。その結果、iNOS発現細胞はcluster構成細胞の中でも平滑筋および常在性マクロファージに限られており、ICCには発現がないことが明らかとなった。次に、このiNOSにより産生されたNOがICC機能に及ぼす影響を確認するために、NOS阻害剤(L-NAME)を用いた検討を実施した。NOS阻害剤の前処置はIFN-γ+LPSによるICC機能の障害を有意に抑制した。以上の検討によりIFN-γ+LPS刺激によるICC機能障害の発生にはICC周囲に存在する平滑筋やマクロファージのiNOSにより産生されたNOが関与していることが明らかとなった。NOの下流シグナルは大きく分けて1)cGMP/PKCシグナル、2)Sーニトロシル化、3)酸化ストレスが挙げられる。そこで次にIFN-γ+LPS刺激によって発生したNOによるICC機能障害がどのようなメカニズムで発生しているかを詳細に検討するために、これらの下流シグナルに関して実験を行った。その結果、IFN-γ+LPSによるICC機能障害はcGMP/PKCシグナルおよび酸化ストレスを介して発生することが明らかとなった。以上の成績から炎症時におけるICC機能障害発生のメカニズムが示唆された。

本研究は消化管運動におけるペースメーカー細胞であるinterstitial cells of Cajal(ICC)における炎症性シグナルに対するICC可塑性とペースメーカー機能変化を解明することを目的としている。前年度までにin vitro実験系において、Th1型炎症刺激が一酸化窒素(NO)を介した酸化ストレスによりICCの障害を発生させることを明らかにした。本年度は消化管筋層における炎症を主因とする術後イレウスのマウスモデルを用いた、生体レベルにおけるICCの機能障害発生とその分子機構の解明を実施した。回腸遠位部の操作(intestinal manipulation;IM)の24時間後に筋層におけるマクロファージおよび好中球の浸潤が認められた。このとき、ICCマーカーであるc-KitによりICCネットワークを評価した結果、c-Kit陽性ICCが有意に減少していた。一方、IMの48時間後には炎症細胞が減少しており、同様にc-Kit陽性ICCは対照群と同レベルまで回復していた。また、微小電極アレイを用いたICCのペースメーカー電位の発生とその伝搬を検討した結果、IM24時間後の筋層において、ペースメーカー電位の消失、不整な発生および伝搬の異常が認められた。一方、IMの48時間後にはペースメーカー電位の異常は改善していた。定量的PCRにより誘導型NO合成酵素(iNOS)のmRNA発現を検討した結果、IMの24時間後にはiNOSの発現が顕著に増加し、IMの48時間後には対照群と同レベルまで減少していた。IM処置の30分前および240分後にiNOS阻害剤であるアミノグアニジンを投与することでc-Kit陽性ICCの減少が抑制されたことから、IMによるICC障害においてもNOが関与することが明らかとなった。in vitro、in vivoの検討結果よりTh1型炎症におけるICC機能障害の発生にはNOが大きく関与していることが明らかとなった。これらの成果は現在、学術雑誌へ投稿中である。本年度の実験計画として当初予定していたIFN-γ+LPSによるICC機能障害発生の詳細なメカニズムを明らかにすることができた。また、これらの結果からICCが酸化ストレスに感受性が高いことが示唆され、消化管の炎症性または代謝性疾患におけるICC障害発生のメカニズムを検討する上で重要な知見を得ることができた。一方で、in vivoの実験系を用いた検討は十分に行えていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は、26年度で得た結果をさらに精査するとともに、これまでのin vitorでの結果を基にin vivoにおけるICCの炎症病態変化について検討していく。具体的な項目を以下に挙げる。3In vivoの検討として各種腸炎モデル(DSS誘発性腸炎、TNBS誘発性腸炎、術後イレウスモデル)
大型サイロの耐震性に関する研究

本研究ではFRP製サイロの耐震性に集中し、以下の結果を得た。1.(a)FRP製サイロは復元力が強く、鉛直方向の軸力を増加しても、水平力に対する水平変位は、座屈後でも一定の値に達しないと破壊に至らない。(b)粉体、軸力の有無、変位の大小にかかわらず、力-変位関係は原点近傍を通り、FRP製サイロは金属製に比べ残留歪が小さいことがわかった。(c)粉体はサイロが座屈した後もサイロを安定な状態に保つ役目をする。2.金属製サイロの座屈パターンは水平力を取り除いても消えないが、FRPサイロでは、かなりの変位に対して、座屈パターンは現われ、水平力を0にすると又、消失する特徴を示した。3.牧草の質量の経時変化を実験的に調べ、安全側に減少ることがわかった。4.(a)FRP製サイロの履歴面積は座屈までは0と考え、骨曲線を直線とすることが出来るが、座屈点を越えると面積は大きく増加する傾向にある。(b)和曲線については、βの関数化により、実験値に近い値を連続的に得ることが出来たために、以後の応答解析はより現実に近いものと考えられる。5.(a)解析手法については、金属製サイロの解析手法を1部適用することが出来た。FRPサイロは特に残留変位の小さな原点指向型なので、今回は新たに等価履歴系(ER)の手法を用い、良く対応することが出来た。(b)地震応答解析の結果、軸力比0.3で、EL-CENTRO400Gal入力に対しても安定な応答変位を示し、破壊には至らなかった。以上の結果は、サイロのみにとどまらず、他のタンク、容器類の耐震設計にも応用可能で、今後、どのように設計規準に反映させるかが重要な点となる。
抗体修飾型相変化ナノ液滴と超音波を用いた細胞選択的診断治療の開発

細胞の中での気泡化と細胞の外での気泡化による傷害作用を比較することにより,細胞内に相変化ナノ液滴を導入する利点を示した.具体的には気泡化に伴う傷害作用を引き起こす超音波の音圧値が低下することを示した.さらに細胞内気泡化により傷害した細胞の免疫原性を評価し,本手法によって引き起こされる細胞死の免疫原性が高いことを示した.下記に具体的な内容について示す.抗体修飾された相変化ナノ液滴(9E5修飾PCND)を抗体抗原反応により細胞内に選択的に導入することで液滴同士の凝集が共焦点顕微鏡観察により確認された.9E5修飾PCNDをDLD1細胞(抗原発現がん細胞)に作用させてから1hでは,細胞内における9E5修飾PCND由来の蛍光シグナルは検出されなかったが,細胞膜に介入している9E5修飾PCNDが観察された.9E5修飾PCNDを細胞に作用させてから3hでは,細胞内に移行している9E5修飾PCNDが観察され,6hでは,細胞内移行が顕著であった.24h経過すると,細胞内の数か所で9E5修飾PCNDからの高い蛍光輝度値が検出された.PCNDの細胞内凝集を引き起こした状態とそうでない状態において,超音波照射を行い,生存率測定を行うと,凝集を引き起こした状態において,細胞を傷害するために要する超音波強度が低かった.このことから細胞内に相変化ナノ液滴を導入することで,気泡化による傷害閾値を低下できることを示した.また,細胞内気泡化により引き起こされた細胞死において,ATPとHMGB1の細胞外への放出が確認された.これらの物質はDAMPs(damage associated molecular patterns)として知られ,免疫原性を有する.このことから,本手法によって引き起こされる細胞死の免疫原性が高いことが示された.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,抗体修飾相変化型ナノ液滴と超音波による細胞選択的がん治療の実現であり,以下の検討を行う事を目標とした:(i)殺傷効果の評価,(ii)殺傷効果の作用機序解明,(iii)細胞内気泡化が周囲細胞に与える影響の検討.In vitro系において殺傷効果が検証可能な系およびメカニズム解明のための高速度撮影系を構築し,ターゲティング性能および抗腫瘍効果が定量解析可能となった.抗体修飾相変化型ナノ液滴が高い抗腫瘍効果を有することを明らかにした.また,生体内において自己免疫活性を誘発させることを示した.以上の結果をまとめた投稿論文(Scientific reports)がアクセプトされた.また,抗体修飾相変化型ナノ液滴の細胞への作用時間が殺傷効果に大きな影響を与えることを確認した.さらに,単一細胞の気泡化が周囲細胞にダメージを与えることが明らかになった.同大学の長棟研究室と共同で,細胞をガラス基板上に光活性化PEG脂質を用いて,細胞をパターニングし,細胞の空間分布を制御することによって,細胞内気泡化が周囲細胞に与える影響を再現性良く,定量的に解析可能な系を作成した.In vivo系においては,マウスに対してパルス超音波が照射可能な系を構築した.マウス腫瘍内に局所注射した抗体修飾相変化型ナノ液滴が超音波パルス波によって気泡化可能なことを超音波イメージングによって確認した.また,抗体修飾相変化型ナノ液滴をマウス腫瘍内に局所投与し,その滞留性を蛍光イメージング装置を用いて評価した.抗体を修飾していない場合と比較して,腫瘍に長い時間留まることを確認した.In vitroにおいて抗体修飾相変化型ナノ液滴のがん細胞に対する選択的殺傷能力の定量的な評価に成功し,今年度において国際誌採択に至るまでの成果をあげた.具体的に,抗体修飾型相変化ナノ液滴の標的率が90%以上であり,細胞内に相変化型ナノ液滴が局在していることを共焦点顕微鏡観察によって確認した.その状態で超音波照射することによって約60%の細胞を殺傷させることに成功した.また,細胞内気泡化の高速度観察を通して,細胞殺傷のメカニズムを明らかにした.加えて,細胞をパターニングし,細胞の空間分布を制御することによって,細胞内気泡化が周囲細胞に与える影響を再現性良く,定量的に解析可能な系を作成した.実際に超音波を照射し,殺傷範囲が定量的評価ができることが示された.In vivoでの評価に向けた準備を計画通り順調に行った.予備的検討において,相変化型ナノ液滴をマウス腫瘍内に局所投与し,気泡化用超音波を照射したところ,バブルが生成したことを超音波イメージングによって確認でき,さらには腫瘍サイズの縮小を観察した.しかしながら皮膚にダメージの痕跡が確認された.これは正常組織へのダメージが生じていることを示唆されている.超音波パラメータの調整によってダメージが削減できると考えられる.細胞の中での気泡化と細胞の外での気泡化による傷害作用を比較することにより,細胞内に相変化ナノ液滴を導入する利点を示した.具体的には気泡化に伴う傷害作用を引き起こす超音波の音圧値が低下することを示した.さらに細胞内気泡化により傷害した細胞の免疫原性を評価し,本手法によって引き起こされる細胞死の免疫原性が高いことを示した.下記に具体的な内容について示す.抗体修飾された相変化ナノ液滴(9E5修飾PCND)を抗体抗原反応により細胞内に選択的に導入することで液滴同士の凝集が共焦点顕微鏡観察により確認された.