hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
青果物のエチレン生成誘導機構の電気生理学的解析

青果物のエチレン生成の誘導機構を電気生理学的手法を用いて調べた。1.これまでに開発した通電によるエチレン生成の誘導方法には、電極表面での電気分解による組織崩壊があり、傷害エチレンが含まれている懸念があった。そこで、寒天橋を用いて電極が直接組織に触れないように通電方法を改良した。改めて通電によるエチレン生成の誘導様相を確認したところ、キュウリ、トマトおよちカボチャで、通電刺激に反応した急速なエチレン生成の誘導がみられた。このエチレンは、ACC含量の蓄積とACC synthaseおよびACC oxidaseの活性化を伴っており、青果物自体の生理反応に基づくものであることを再確認した。2.キュウリ果実を用いて通電によるエチレン生成誘導をACC synthase遺伝子の発現面から調べたところ、少なくとも6種類の遺伝子が存在し、この内5種類が通電によって発現した。これらの遺伝子には、傷害、オーキシンおよび高濃度炭酸ガスで発現するものも含まれていた。また、キュウリと同じウリ科植物であるメロンとカボチャ果実の傷害型、成熟型およびオーキシン型ACC synthase遺伝子との間で高い相同性を示した。3.通電によるキュウリ果実のエチレン生成誘導の内的な初期反応部位の特定を、電気インピーダンス解析により行った。等価回路として5素子モデルを用い、マルカートのアルゴリズムによる非線形最小二乗法を適用した数値演算により、通電に伴う各素子の値の変化を求めたところ、細胞外抵抗、原形質抵抗およびトノプラスト容量が大きく増加した。この内、細胞外抵抗の増加のみ、エチレンの作用性阻害剤であるジアゾシクロペンタジエンの前処理でほぼ完全に消失した。このことより、通電は原形質pHとトノプラスト状態の変化を通じてエチレン生成を誘導すると思われた。青果物のエチレン生成誘導機構を電気生理学的に解析した。1.直流電流処理がキュウリ、カボチャおよびトマトのエチレン生成を著しく誘導した。とくに、キュウリでは10分間の通電でエチレン生合成の律速酵素であるACC合成酵素とACC酸化酵素が急速に誘導された。通電処理はポリガラクチュロネースとフェニールアラニンアンモニアリエースも著しく誘導したが、エチレンの作用性阻害剤の同時処理実験により、これらの酵素は通電処理により誘導されたエチレンによる二次誘導であることが判明した。2.通電処理の作用部位を特定するために、キュウリについてマルカート・アルゴリズムによる膜インピーダンスの数値解析を試みたところ、細胞外抵抗、細胞内抵抗及びトノプラスト容量に大きな変化がみられ、エチレン生成の誘導の作用部位はトノプラストと推定できた。3.キュウリからトノプラストミクロゾームを調製し、通電処理に伴うATPase活性とプロトンポンプ活性変化を測定したところ、通電処理によりプロトンポンプ活性が著しく低下しており、エチレン生成の誘導要因としてプロトンポンプの活性低下が関与している可能性が伺えた。4.通電処理により誘導されたACC合成酵素をコードするcDNAライブラリーを作成したところ、少なくとも3種のACC合成酵素が通電により誘導されていることが判明した。現在、引き続づきこれらのcDNAの塩基配列の決定と、既知のACC合成酵素cDNAとの相同性の確認を行っている。5.本研究助成により、本年度の計画はcDNAをプローブとしてNor-thern Blot分析を除いて終了し、当初の予定以上の成果をあげることができ、エチレン生成の誘発機構の解明をかなり進展させることができた。次年度に向けて、エチレン生成の遺伝子発現研究を遂行中である。植物器官によるエチレン生成誘導因子を特定するために、主として直流電流により誘導されるキュウリ果実のエチレン生成について、物理、化学および遺伝子レベルでの解析を行った。

1.通電に伴うキュウリ果実の細胞内外の電気特性を測定したところ、エチレン生成の誘導と同時に細胞外抵抗(R_1)、細胞内抵抗(R_2)、原形質膜容量(C_1)および液胞膜(トノプラスト)容量(C_2)が大きく増加した。エチレンの作用性阻害剤であるジアゾシクロペンタジエンを合成し、果実に前処理したところ、R_1とC_1の増加は消失したが、R_2とC_2の変化には影響しなかった。このことより、エチレン生成には原形質とトノプラストの状態変化が関与していると推測した。2.エチレン生成のエリシター物質の抽出・精製をキュウリ果実から試みたところ、活性が弱く通電の有無による差が明確ではなかった。そこで、エチレン生成能が大きなカボチャを用いたところ、傷害組織のエタノール可溶性高分子画分に強い活性が認められ、無傷組織には活性はなかった。現在、この物質の化学同定と生理的意義を検討中である。3.通電誘導によるエチレン生成キュウリ果実を用いて、ACC合成酵素遺伝子のクローニングとその発現について調べた。cDNAのPCR産物プラスミドクローンの制限酵素地図から、最終的には4種類の遺伝子を得た。これらの遺伝子のDNA塩基配列を既知のACC合成酵素遺伝子と比較したところ、成熟型、傷害型およびオーキシン誘導型の3種類のACC合成酵素遺伝子と高い相同性を示した。同時に、ノーザンブロット分析を行ったところ、通電処理は傷害型ACC合成酵素遺伝子を強く誘導することが判明した。昨年度までの研究で、直流電流通電に伴うキュウリ果実のエチレン生成誘導は原形質のpH変化とトノプラストの状態変化に起因することを電気理論的インピーダンス解析により特定し、さらにエチレン生合成の律速酵素であるACC合成酵素の遺伝子フラグメントを4種類(CU-ACS-1,2,3,4)クローニングすることに成功した。最終年度である本年度は、新たな2種のACC合成酵素遺伝子のクローニングを行い、全遺伝子の塩基配列の決定と通電に伴う発現解析をノーザンブロット分析により行った。なお、傷害、オーキシンおよび高濃度炭酸ガス処理による遺伝子発現についても解析し、通電との比較を行った。また、同じウリ科であるメロン果実の既報遺伝子(ME-ACS-1,2,3)との相同性比較も行った。1)通電により、キュウリ果実より2種のACC合成酵素遺伝子フラグメント(CU-ACS-5,CU-ACS-103)をクローニングした。CU-ACS-103はACC合成酵素遺伝子に特有の保存領域をもたなかった。CU-ACS-5の塩基配列はCU-ACS-4と極めて類似していたが、鎖長は0.4Kbp長かった。3)ノーザンブロット分析では、通電によりCU-ACS-2を除く全ての遺伝子発現がみられた。CU-ACS-2は、オーキシン処理でのみ発現する特異な遺伝子であった。また、CU-ACS-3も炭酸ガス処理では発現しなかった。4)これらのことより、通電は傷害刺激と類似の遺伝子発現作用をもつが、その能力は傷害刺激より遥かに強力であると判断された。
骨格筋で癌を阻害するー食品と運動のパッケージによるエネルギー代謝介入効果の検討

近年、中鎖脂肪酸(MCFA)は、高カロリーにおいても、生体内の代謝が速く体内蓄積も無いことから、サルコペニアの栄養介入において注目されているが、骨格筋における直接的効果を検証した報告はない。われわれはBALB/cマウスを用い2%、5%、10%の濃度別ラウリン酸食が骨格筋に及ぼす影響を検証した。体重と骨格筋重量は5%群、10%群で対照群と比較し減少した。2%群にて酸化ストレスの減少、ミトコンドリア量の増加が確認され、10%群にてミトコンドリア量、ミオシン軽鎖の減少が確認された。次に、マウス骨格筋細胞株であるC2C12筋芽細胞と分化誘導した筋管細胞を用い、対照群、LAA処理群は0.15μg/ml・0.30μg/ml・0.60μg/mlの異なった濃度で処理し、48時間培養での増殖能とミトコンドリア量を検証した。筋芽細胞の増殖能は対照群と比較し低濃度群で増加、高濃度群で低下し、ミトコンドリア量は低濃度群で増加、中・高濃度群で低下した。筋管細胞は高濃度群でミトコンドリア量が低下した。さらにフラックス解析によりミトコンドリア機能を評価したところ、LAA投与により、basalおよびmaximumのミトコンドリア呼吸はC2C12細胞で亢進していたがROS産生は亢進しなかった。これに対し、CT26大腸癌細胞株ではLAAによりROS産生が亢進し細胞死が誘導された。MCFAの適性濃度の投与はミトコンドリアを活性化し、骨格筋に有用であることが示唆された。糖質および脂肪酸の骨格筋への効果を検討し、ミトコンドリア呼吸についても検討を行った。現在取り組んでいる、脂肪酸に種々のアミノ酸を同時付加したときの骨格筋萎縮への影響を検討する。われわれは以前より腹膜播種によるマウス悪疫質モデルを用いて、糖質(Glc)と中鎖脂肪酸(MCT)の単独摂取における栄養介入にて検証を行っている。それらの結果では、Glc負荷では濃度依存的に腫瘍重量の増加を認めたが、骨格筋組織成熟度を反映するSDS可溶性重合myosin L1(MYL1)は糖濃度依存的に有意に高値を示した。一方、MCT負荷では、腫瘍増殖を抑制し、筋重量の維持を認め、骨格筋萎縮を阻止する傾向が認められたが、MYL1は低値を示す可能性を報告している。よって本研究はGlcとMCTの同時摂取による、マウス悪液質モデルにて抗腫瘍効果、骨格筋萎縮阻止効果を検証した。実験には、BALB/cマウスと同系の大腸癌細胞株であるCT26を使用し、1×10^6個を腹腔内へ接種した。Glc摂取は10%の糖水を自由飲水投与し、MCT摂取は、ラウリン酸(Lauric acid以下LAA)を通常食であるCE2に対し重量比で2%を混合し自由経口摂取とした。群分けは腹膜播種のみ施行した対象群(以下Con群)、LAA摂取群、LAA+10%Glc摂取群の3群とした。飲水量はGlc群で高値を示し、食事摂取量はLAA群が有意に高値を示したが、総カロリーの比較は有意差は示さなかった。LAA群において体重は有意に減少した。腫瘍重量はLAA群で有意に低値を示し、LAA+10%Glc群ではGlcによる腫瘍促進効果をLAAが抑制した。骨格筋重量およびMYL1はLAA群、LAA+10%Glc群で有意に増加していた。骨格筋において糖質は有用であるが、腫瘍を持つ宿主には腫瘍増大のリスクがある。しかし、GlcとLAAを同時摂取させることで、Glcによる腫瘍増大を相殺し、さらに骨格筋では解糖系と酸化的リン酸化の両者が促進し骨格筋萎縮を予防する可能性が示唆された。本年度は、検討予定の栄養素のうちエネルギー代謝のキーとなるグルコースと中鎖脂肪酸について検討を行った。アミノ酸、長鎖脂肪酸などは検討を開始している。

これに対し、CT26大腸癌細胞株ではLAAによりROS産生が亢進し細胞死が誘導された。MCFAの適性濃度の投与はミトコンドリアを活性化し、骨格筋に有用であることが示唆された。糖質および脂肪酸の骨格筋への効果を検討し、ミトコンドリア呼吸についても検討を行った。本年度の糖と中鎖脂肪酸およびその併用についてより詳細な検討を行うとともに運動負荷についても併用を行う。また、糖・中鎖脂肪酸とともに長鎖脂肪酸、アミノ酸、ビタミン等についても悪液質モデルによる検討を行う。現在取り組んでいる、脂肪酸に種々のアミノ酸を同時付加したときの骨格筋萎縮への影響を検討する。残額は少額(1188円)であり、問題はない。
成分分画による牧草色素類およびアルファルファサポニンの高度利用

アルファルファ緑葉抽出乾燥物(LE)は、良品質アルファルファミールの5倍に及ぶカロチノイドを含み、高カロリーが求められる養鶏用飼料の添加物として有望である。しかしカロチノイドは酸化されやすく、その結果二重結合を失い色素給源としての価値を減ずるため、LEの製造及び貯蔵期間中における変性の防止法を検討するとともに、その卵黄色に及ぼす効果についても検討した。アルファルファのカロチノイド含量は開花期に達すると急激に低下するので、それまでに収穫するのが望ましい。LEの製造及び貯蔵中のカロチノイドの分解を防ぐうえで抗酸化剤とくにエトキシキンの添加が有効であった。-18°Cにおける貯蔵ではエトキシキンを添加せずとも45週に及ぶ試験期間中、安定的に保たれたが、5°Cにおけるβ-カロチン及び室温下における全カロチノイドの貯蔵には抗酸化剤が欠かせなかった。しかし高濃度のエトキシキン添加は、ニワトリによるカロチノイド蓄積を低下させ、よってアルファルファ搾汁への添加は0.05%以下でなければならず、カロチノイド貯蔵のためならば0.01%で十分であることを示した。エトキシキン処理をしなかったLEの多量投与もかえってニワトリのカロチノイドの蓄積を阻害し、投与限界は10%であった。デビュイ種アルファルファLEにはイネ科牧草にはない高脂血症抑止効果があり、その作用物質をアルファルファの特殊成分であるメジカジェニン酸(サポニンの一種)であると考え、その単離を行ったが収量的に実用性がなく、含量が多い根からの単離を試みたところ、4.5g/kg生根の粗サポニンを得た。しかしその精製及び生理活性の検討はまだ行っていない。アルファルファ(Medicago Sativa L.,cv.Natsuwakaba)を収穫後ただちに細断し抗酸化剤とよく混合したのち圧搾し、搾汁を得た。用いた抗酸化剤はエトキシキン、次亜硫酸ソーダ、ブチル化ハイドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸、α-トコフェロールおよび緑茶である。無添加を含めた7種類の搾汁を蒸気により瞬時に90°Cに熱し、生じた凝固物を連続遠心機で分離し、凍結乾燥した。この乾燥物を以後、緑葉抽出物と呼ぶ。各緑葉抽出物を100ml容の透明瓶および褐色瓶にいれ、栓をするに先立ち、各々の半数に窒素ガスを充満させた。透明および褐色瓶を28°Cに保ちつつ蛍光灯により12時間照明した場合、および暗黒下-18°Cで貯蔵した場合のカロチノイド含量の推移を60週間にわたって調査した。暗黒・冷凍下では、抗酸化剤に関係なくキサントフィルはよく保護されたが、β-カロチンの長期貯蔵には抗酸化剤の助けを必要とし、エトキシキンの添加によりほぼ完全に保護された。照明下28度では、キサントフィルおよびβ-カロチンとも減少したが、エトキシキン処理をし褐色瓶に蓄えることによりその程度は著しく緩和され、60週後でも初期値の2/3以上が保たれた。容器の窒素ガスによる充満は、まったく効果がなかった。その他の添加物の効果も、エトキシキンに比し著しく劣った。本実験ではエトキシキンを生草当り0.2%添加したが、その緑葉抽出物を5.6%添加した飼料を摂取したニワトリヒナは肝の機能が低下し、体内へのカロチノイドの蓄積は無添加の場合よりもむしろ劣った。よって現在、カロチノイド保護に必要な最低添加量およびその抽出物の動物生理上安全な添加レベルについて検討中である。

カロチノイドの酸化を防ぐ目的で、破砕前の新鮮なアルファルファに新鮮重当たり0.2%のエトキシキンほか6種類の抗酸化剤を添加したところ、エトキシキンがもっとも有効だった。搾汁液を加熱して得た凝固物(Leaf extract:LE)をカロチノイドを含まない飼料に約5.7%添加してニワトリヒナに給与したところ、エトキシキン無添加の場合は飼料中の含量差がそのまま肝、皮膚及び血漿中の含量及び脚色に反映された。しかし、搾汁液にエトキシキンを0.2%添加して調製したLE中のカロチノイド含量はやや増加したにもかかわらず、これらを給与したヒナの蓄積量は有意に低下した。搾汁液にエトキシキンを0.01,0.02,0.05,0.10及び0.20%添加して調製したLEのエトキシキン濃度は、搾汁液中の濃度の約10倍になった。これらのLEをカロチノイドを含まない合成飼料に約5%添加してニワトリヒナに給与したところ、高濃度のエトキシキン添加はヒナのカロチノイド蓄積を抑制したが、低濃度のエトキシキン(飼料中50及び125ppm)添加は皮膚の黄色素量、飼料効率及び体重増加を高め、血漿コレステロールを減少させるうえで有効であった。ウズラ飼料へのLE10%添加は卵黄のカロチノイド含量を有意に高めたが20%添加は卵巣内でのカロチノイド蓄積を抑制して10%添加の場合より低くし、産卵後の卵黄の色及びカロチノイド含量は10%添加の場合と変わらなかった。このことはLEを高濃度で添加した場合の阻害効果を示しており、同様の傾向が血漿及び肝においても観察された。アルファルファ緑葉抽出乾燥物(LE)は、良品質アルファルファミールの5倍に及ぶカロチノイドを含み、高カロリーが求められる養鶏用飼料の添加物として有望である。しかしカロチノイドは酸化されやすく、その結果二重結合を失い色素給源としての価値を減ずるため、LEの製造及び貯蔵期間中における変性の防止法を検討するとともに、その卵黄色に及ぼす効果についても検討した。アルファルファのカロチノイド含量は開花期に達すると急激に低下するので、それまでに収穫するのが望ましい。LEの製造及び貯蔵中のカロチノイドの分解を防ぐうえで抗酸化剤とくにエトキシキンの添加が有効であった。-18°Cにおける貯蔵ではエトキシンを添加せずとも45週に及ぶ試験期間中、安定的に保たれたが、5°Cにおけるβ-カロチン及び室温下における全カロチノイドの貯蔵には抗酸化剤が欠かせなかった。しかし高濃度のエトキシン添加は、ニワトリによるカロチノイド蓄積を低下させ、よってアルファルファ搾汁への添加は0.05%以下でなければならず、カロチノイド貯蔵のためならば0.01%で十分であることを示した。エトキシキン処理をしなかったLEの多量投与もかえってニワトリのカロチノイドの蓄積を阻害し、投与限界は10%であった。デピュイ種アルファルファLEにはイネ科牧草にない高脂血症抑止効果があり、その作用物質をアルファルファの特殊成分であるメジカジェニン酸(サポニンの一種)であると考え、その単離を行ったが収量的に実用性がなく、含量が多い根からの単離を試みたところ、4.5g/kg生根の粗サポニンを得た。しかしその精製及び生理活性の検討はまだ行っていない。
大学における英語学習者のライティングによる語彙評価ツールの開発と運用

本研究は、日本の大学・短大における英語学習者の語彙習熟度とプロダクトとの関係を明らかにし、語彙評価のための評価項目を作成することを目的としている。まず、本研究で使用する語彙テストの信頼性を検証した結果、語彙テストと一般に用いられる英語能力テストとの信頼性を確認することができた。次に、語彙テスト、ライティング・サンプル、質問紙調査より得られたデータ結果を分析し、英語学習者の語彙を評価するのに有用な項目を作成した。またこれらの評価ツールの具体的な指導法、運用方法を検証し、今後、教室での指導者・学習者双方が利用できるツールへの改善に取り組んでいる。本研究は、「大学における英語学習者のライティングによる語彙評価ツールの開発と運用」という課題を取り扱うものである。英語学習において語彙は重要な役割を果たすものであるが,学習者が意味や用法を知っている英単語(認識語彙)と,実際に発話や書き言葉として使える英単語(発表語彙)との間には大きな隔たりがあり,認識語彙を発表語彙につなげるための学習方策の体系化が必要とされている。したがって本研究では,学習者の使える語彙力を増進させるための指導ツールの開発に取り組んでいる。現在,英語学習者のライティングを評価するために,テストや用途に応じて開発されたさまざまな評価ガイドラインが広く使用されている。多くのガイドラインは,いくつかの項目(内容・構成・文法・語彙など)から成り,さらにいくつかのレベル(点数)に分けられている。そのなかで「語彙」項目の評価基準は,使用語彙の多様性や適切性について言及されたものが多く,評価項目のなかでもあまりに一般的で,評価が困難であるとされる項目である。このことを解消するためにも,評価者・学習者にとって使いやすく,英語教育の現場で機能しうる語彙評価ツール開発の検証を行うことにした。語彙指導ツールの開発・運用のためには、まず学習者による語彙使用の多様性・習熟度を測る必要がある。具体的には,英語学習者の習熟度を測定するためのテスト(C-Test)を実施し,そこから得られた結果をもとに,学習者のライティングを詳細に分析した。これによって英語学習者の習熟度とプロダクトとの関係を明らかにすることができる。現在,学習者の発表語彙力を把握するため,ライティングをサンプルとした語彙の多様性について検証中である。その結果をもとに英語学習者の語彙力を評価するうえで必要となる評価項目を作成し,新たな評価ツールを開発する。本研究は、「大学における英語学習者のライティングによる語彙評価ツールの開発と運用」という課題を取り扱った。具体的な目的は以下のとおりである。(1)日本の大学・短大における英語学習者の習熟度とプロダクトとの関係を明らかにする。(2)研究目的(1)で得られたデータ結果をもとに、指導者・学習者が使用できる語彙評価のための評価項目を作成し、その信頼性について検証する。(3)評価項目を語彙力促進のために教室で活用する方策を探り、自律的かつ自立的な学習者育成のため、語彙指導ツールとして運用する方法について探る。まず(1)の目的については、英語学習者の習熟度を測るための語彙テスト、C-Testを実施した。また語彙テストとC-Testの信頼性を検証することで、語彙学習が学習者の語彙力を促進させることを示した。次に(2)の目的では、学習者によるライティング・サンプルを収集し分析を行った。そして、学習者の語彙テスト、C-Testの結果とライティング・データの結果を比較することで、学習者の語彙力が総合的な英語力と関連していることが明らかになった。あわせて質問紙調査を実施し、学習者の語彙学習に対する学習動機について調査を行った。最後に(3)の目的では、質問紙調査より得られたデータ結果をもとに因子分析を行い、質問項目がどのような共通の特性から影響を受けているかを明らかにし、語彙評価項目を作成した。この評価項目が教室で活用できる語彙評価ツールとして有用であるかを確認するため、具体的な指導法、教室での運用方法を検証した。英語教育学本研究の目的の一つである「日本の大学・短大における英語学習者の習熟度とプロダクトとの関係を明らかにする」について,調査対象となる英語学習者にたいして,習熟度を測るため学期始めと最後に2回のC-Testを実施した。そこから得られたデータをもとにC-Testの信頼性を明らかにするため相関係数,信頼性係数を算出し,t検定を行った結果,C-Test自体の信頼性と学習者によるスコアの伸びが確認された。次に,同じ学習者によるライティングのサンプルをC-Testと同様に学期始めと最後に2度収集した。ライティングの内容は,与えられたトピックについて10分間で書くというTimed Writingの方法をとった。収集したライティング・サンプルについては,学習者の使用語彙の多様性の観点から分析した。この分析結果をもとに語彙使用に関する英語学習者に共通する特徴・問題点を見出し,学習者が使用する語彙を評価するための評価項目(候補)を作成中である。

二つ目の目的である「学習者のデータ結果をもとに,指導者・学習者が使用できる語彙評価のための評価項目を作成し,その信頼性について検証する」点においては,評価項目が確定されたうえで今後確認することになる。三つ目の目的は,本研究の完成年度である平成26年度以降引き続いて「評価項目を語彙力促進のために教室で活用する方策を探り,自律的かつ自立的な学習者育成のため,語彙指導ツールとして運用する方法について探る」予定である。平成26年度現在,語彙評価項目候補の決定に向けて検証中であるが,評価項目の決定については,今後の信頼性の検証に備えて,時間をかけて慎重かつ適切な判断を下す必要がある。さらに現場の教員を含めた学内外からの専門家の助言を得ながら研究を進める予定である。また,平成25年度から始まった本研究のデータ収集・分析・評価項目の検証・決定までの過程を1つの区切りとして研究発表する。具体的には,語彙評価項目の検証過程についてまとめた論文を執筆し,学会誌に投稿する予定である。評価項目の信頼性の検証については,次の研究段階として捉え,学習者のライティング・サンプルをもとに教育現場に従事する複数の研究者の協力を得て評価してもらい,評定者間信頼性を算出する。これをもとに複数の評定者の評定が一貫しているか否かを確認することで,語彙評価項目の信頼性を確認することが可能になる。また,評定者には,単なる数字による評価だけでなく,気づいた点などを記載してもらうことで,そのコメントを分析しデータ結果だけでなく経験にもとづく判断も語彙評価項目の改訂・修正作業に役立てることができる。最終的に確定した語彙評価項目は,学習者のライティングを評価するときの評価ガイドラインとして使用される以外に,教室内でライティングをする際の指導ツールとして,学習者にたいして指標を示すことも可能である。これによって学習者が自ら学び,学習者の自律・自立性を育成することにつながるのである。当初,平成25年度に予定していた研究成果発表のための旅費(海外学会参加費)を使用していないことによるものである。平成26年度にデータ(コメント)分析として使用するNvivoなどの統計ソフトを購入する予定である。
プロスタノイド受容体の生理活性に基づく医薬品への応用研究

【京都大学グループの成果】"1"プロスタノイド受容体特異リガンドの作製:EP3受容体の第7膜貫通領域にあるアルギニン(Arg-306)とリガンドのカルボン酸との結合では、そのGiの活性化には水素結合で十分であること、しかし、他のG蛋白質の活性化にはイオン結合が必須であることを見出した。また、その下流に存在するアスパラギン酸(Asp-318)の負電荷は、G蛋白との結合には無関係ながら結合後のGi蛋白の活性化(GTPase活性促進とアデニル酸シクラーゼ活性抑制)には必須であることを証明した。"2"受容体遺伝子欠損による各プロスタノイド受容体の生理機能評価:4種類のEPサブタイプ受容体欠損マウスを作製し、それらを用いて受容体の生理機能を評価した。その結果、EP3は細菌感染(LPS)による発熱反応に関与することを明らかにした。そのメカニズムは、LPS→macrophageでのIL-1bの産生→中枢発熱領域周辺でのIL-1βによるCOXの活性化→PGE2の産生→EP3の活性化の経路で起こることがわかった。また、EP4は胎児期循環から新生児期循環に交換する際に必須の動脈管閉鎖反応に働くことを明らかにした。EP2受容体は、卵の成熟・受精に働く卵丘細胞に発現し、同様に発現するCOX-2により産生されたPGE2がEP2に作用した結果、排卵と受精の効果率に寄与していることを明らかにした。【小野薬品工業(株)研究所グループの成果】"3"4種類あるPGE2受容体サブタイプの遺伝子クロンを発現させた動物細胞を用いて、それぞれのサブタイプ受容体に選択的なアゴニストを開発した。代表的な化合物として、EP1:AE1-259,ONO-EA-248,EP4:ONO-AE1-329を発見した。これら薬物は、その選択性において既知物質をはるかに凌ぐ。本年度の実験計画に従い以下の研究成果を得た。(1)プロスタノイド受容体特異リガンドの作製:EP3受容体の第7膜貫通領域にあるアルギニン残基とリガンド官能基の一つであるカルボン酸との結合においては、従来考えられていたイオン結合ではなく水素結合で十分であること、また、この性質は他のEPサブタイプEP1,EP2,EP4受容体での結合においても適応できることを明らかにした。しかし、EP3はアイソフォーム受容体が複数のG蛋白質を活性化する際には、Giとの共役には水素結合で、GsあるいはGqとの共役いはイオン結合が必須であることがわかった。(2)受容体遺伝子欠損による各プロスタノイド受容体の生理機能評価:EPの4種類のサブタイプ受容体遺伝子欠損マウスを作製し、それらを用いて受容体の生理機能を評価している。本年度はEP3とEP4について重点的に評価した。そのメカニズムは。LPS→macrophageでのIL-1βの産生→中枢発熱領域周辺でのIL-1βによるCOXの活性化→PGE@S22@E2の産生→EP3の活性化の経路で起こることがわかった。一方、EP4は胎児期循環から新生児期循環に変化するのに必須の動脈管閉鎖反応に働くことを明らかにした。EP4欠損マウスは生後3日以内に動脈管開存症とみられる症状で死亡するが、数パーセントの確立でホモマウスの一部は生存する。このホモマウスの動脈管は、野生株のマウスにみられるのと同様に動脈管が閉鎖している。

この生存EP4欠損マウスは、動脈管開存症のメカニズムの解析、及びEP4の関与が予想される細胞反応の解析に応用できることがわかった。【京都大学グループの成果】1.プロスタグランジン(PG)受容体のリガンド認識ドメインと機能ドメインの解析:PGE2の1位カルボン酸は、EP3サブタイプ受容体の第7膜貫通領域にあるアルギニン(Arg-306)残基と結合する。両者の結合の化学的性質は、Gi活性化のおいては水素結合で十分であるが、GsおよびGqの活性化にはイオン結合が必須であることが明らかにした。Arg-306残基の少し下流にあるAsp-318の負電荷は、受容体とGi蛋白との結合には無関係であるが、結合後のGi蛋白の活性化(GTPase活性の促進およびアデニル酸シクラーゼ活性の抑制)には必須であることを証明した。さらに、アゴニスト結合前の受容体では、Asp-318残基が第二細胞内ループのN-末側にあるG蛋白活性化モチーフ(DRY)のArg残基との間にイオン結合していることを示唆した。2.PG受容体欠損マウスの代表的なフェノタイプの解析:EP2受容体のフェノタイプとして、排卵、受精の異常による出産数の顕著な減少を見出した。さらに、このフェノタイプを解析して、卵の成熟・受精に働く卵丘細胞にEP2受容体とCOX-2が発現していること、および排卵、受精の過程にはEP2受容体を介してのcAMPの産生が重要であることを明らかにした。【小野薬品工業(株)研究所グループの成果】1.4種類あるPGE2受容体サブタイプの遺伝子クロンを発現させた動物細胞を用いて、それぞれのサブタイプ受容体に選択的なアゴニストを開発した。代表的な化合物として、EP1:ONO-DI-004,EP2:ONO-AE1-259,EP3:ONO-EA-248,EP4:ONO-AE1-329を発見した。これらは既知物質より選択性においてはるかに優れている。
複式学級における異学年協同学習の教育効果についての研究-「寺子屋」式授業形態導入の試み-

今研究の成果は、フィンランドの教育状況を視察することができたことである。異年齢集団での学びの可能性を探るために、PISA型学力で成功しているフィンランドの教育状況を視察した。訪問した複式学級の小学校では、1年生11人、2年生10人など日本のように何人以下だから複式学級になるというようなことではなく、日本よりも多い人数でも複式学級で授業をしていた。時間の都合もあり、私が考えていたような異年齢という特徴を生かして、同単元同内容の授業を創造しているというような取り組みは、視察した限りでは見られなかった。新学年が始まってすぐという時期的なこともあったのかもしれない。校長の話でも、道徳的や情緒的な面では、異年齢の集団というのは意味があると話していたが、授業にどう異年齢を取り入れているかというところまではきけなかった。ただ、それぞれの学年での授業内容をきちんと子どもに保障していくことがもとにあって、それに異年齢という特徴が作用しているように感じた。もっと時間をかけた丁寧な視察が必要だと感じた。この視察を受けて、2学年複式授業だけでなく、全6学年による協同学習のカリキュラムの開発に取り組んだ。本校複式学級は各学年8名ずつ全48名を4つの異年齢グループに分けて体を使った影絵の表現活動を行った。5年生6年生が各グループのリーダーとなって、テーマに沿って動物や車などの影絵を作り出し表現していた。はじめはグループの活動がなかなかうまく進まなかったが、高学年がうまく低学年に教えられるように成長してきて、3学期にはすばらしい影絵の発表ができた。なお、研究費で購入したプロジェクターは研究発表会でのプレゼン投影だけでなく、影絵の練習の光源としても利用できた。
薬剤による増殖制御型腫瘍融解ウイルスと神経幹細胞を用いた脳腫瘍治療の研究

薬剤(テトラサイクリン)/放射線照射などの外来刺激条件下で複製するoncolyticvirus (OV)を、神経幹細胞に感染させ、brain tumor stem cell(以下、BTSC)由来の脳腫瘍モデルで治療効果を検討する本研究の前段階として、本年度は各種予備実験を行った。実験では慶應義塾大学大学院先端医科学研究所遺伝子制御学教室に協力頂いた。同教室のプロトコールに基づき、マウス脳実質におけるsubventricular zoneから神経幹細胞を採取し、神経幹細胞の培養・継代技術を習得した。野生株神経幹細胞の長期継代は困難であるが、今回も野生型では十分量の神経幹細胞を得ることは困難だった。In vitro培養条件下での神経幹細胞への感染対策(抗菌薬の種類や採取手技の迅速化、contaminationを招く手技の回避)や更なる至適培養条件の検索も課題だろうと考えられた。研究実施計画では外来刺激条件下で複製開始する新たなoncolytic herpes virus株の作成を本年度の予定としていたが、上述の理由で十分量の安定した神経幹細胞が得られていない状況であることから、現時点では条件複製型の新規oncolyticvirus作製は計画中の状況である。また、不安定な細胞発育状況での免疫不全マウスへのin vivo神経幹細胞移植実験は倫理面・コスト面から許容できないものと判断した。本年度は免疫不全マウスを用いた移植実験は行わず、現在も安定した細胞培養条件を探索している。実際には、その他にもマウスの脳解剖、研究員の安定した神経幹細胞採取技術の習得、顕微鏡下での迅速な細胞採取を目標とした顕微鏡手技の修練、FACS解析やコンフォーカル顕微鏡での組織免疫染色手技の習得など、実験の確実性を向上させ、今年度の実験は終了した。薬剤(テトラサイクリン)/放射線照射などの外来刺激条件下で複製するoncolytic virus (OV)を、神経幹細胞に感染させ、brain tumor stem cell(以下、BTSC)由来の脳腫瘍モデルで治療効果を検討する本研究の前段階として、本年度は各種予備実験を行った。
ペプチド性伝達物質遊離に関与するシナプス膜蛋白質の同定と遊離機構の解明

脊髄後角組織の神経伝達物質に関与するシナプス蛋白質の存在を確認するため、ラット脊髄後角シナプトゾームを調整し、SDS-PAGE後、シナプトタグミン,シンタキシン,シナプトブレビン(VAMP), SNAP-25,シナプトフィジン、Rab3A、Rab3A/B/Cの抗体を用いてWestern blottingを行った。陽性コントロールとしてラットの大脳皮質膜シナプトゾーム画分を用いた。その結果、脊髄後角では1.基本的に大脳皮質に存在するシナプス蛋白質の存在が確認された、しかし、2.シナプトブレビン(VAMP)は、ほとんど検出できなかった、3.Rab3A、Rab3A/B/Cについては、脊髄のRab3Cが検出できなかった、4.シンタキシンのアイソフォームでは、Aタイプの存在が脊髄では確認できなかった。以上、脊髄後角でのシナプス蛋白質の分布が大脳皮質のそれらとは異なり、脊髄後角でペプチド性神経伝達物質を含有しているシナプスには、脊髄特異的なシナプス蛋白質が存在し、遊離を制御している可能性が示唆された。一方、ラット後根神経節初代培養細胞から刺激に応じてサブスタンスPが遊離することを確認し、複数の遊離制御機構の存在すること可能性を明らかにした。後根神経節初代培養細胞では、培養条件特にNGF (nerve growth factor)によりサブスタンスPの生合成が制御されていることもサブスタンスP合成酵素のmRNAの定量で明らかになった。
角膜表面上のディスプレイ反射像を用いた可視光視線計測技術

角膜表面上に反射するディスプレイ領域を推定するため,本年度は非接触な角膜イメージング法に取り組んだ.これまで角膜イメージングの歪み補正に用いていた3次元眼球モデルに加えて,3次元顔モデルを導入することで,頭部に移動が生じた場合も眼球の3次元位置を正確に求めることができ,非接触な角膜イメージングが実現できた.頭部を追跡するアルゴリズムとしては,カメラの台数に依存しないアルゴリズムを採用しており,単眼での計測から複数のカメラを用いた計測まで対応できる.眉毛,目尻,目頭,唇などの特徴の動きベクトルから3次元的な動きを推定し,頭部の位置,姿勢を推定する.頭部の位置,姿勢を基準として眼球中心を求めるが,虹彩追跡については3次元眼球モデルを用いたモデルベースの追跡法を採用した.頭部位置,姿勢及び眼球位置,姿勢が求まった時,眼球の3次元姿勢を考慮して角膜表面から歪みのない画像を抽出できる.また,平成31年度に実施予定であったディスプレイ領域の抽出についても着手した.光学機器を積極的に用いた手法に取り組み,2つのカメラを用いた偏光カメラシステムを構築した.2つのカメラにはそれぞれ向きの異なる偏光フィルタが設置されており,片方だけディスプレイの反射像が観測される.これはディスプレイ内部にも偏光フィルタが内蔵されており,ディスプレイから発せられる光は直線偏光されているからである.2つのカメラによって取得された画像は,ディスプレイ領域のみ異なるものとなることから,単純に差分を求めるだけで,ディスプレイ領域を抽出することに成功した.平成31年度に取り組む予定であったディスプレイ領域の抽出に,既に着手することができており,成果を挙げている.虹彩追跡の精度が視線計測結果に影響を与えていることが確認された.近赤外を一部併用することや,虹彩追跡の精度を増すことで,視線計測の精度向上を目指す.角膜表面上に反射するディスプレイ領域を推定するため,本年度は非接触な角膜イメージング法に取り組んだ.これまで角膜イメージングの歪み補正に用いていた3次元眼球モデルに加えて,3次元顔モデルを導入することで,頭部に移動が生じた場合も眼球の3次元位置を正確に求めることができ,非接触な角膜イメージングが実現できた.頭部を追跡するアルゴリズムとしては,カメラの台数に依存しないアルゴリズムを採用しており,単眼での計測から複数のカメラを用いた計測まで対応できる.眉毛,目尻,目頭,唇などの特徴の動きベクトルから3次元的な動きを推定し,頭部の位置,姿勢を推定する.頭部の位置,姿勢を基準として眼球中心を求めるが,虹彩追跡については3次元眼球モデルを用いたモデルベースの追跡法を採用した.頭部位置,姿勢及び眼球位置,姿勢が求まった時,眼球の3次元姿勢を考慮して角膜表面から歪みのない画像を抽出できる.また,平成31年度に実施予定であったディスプレイ領域の抽出についても着手した.光学機器を積極的に用いた手法に取り組み,2つのカメラを用いた偏光カメラシステムを構築した.2つのカメラにはそれぞれ向きの異なる偏光フィルタが設置されており,片方だけディスプレイの反射像が観測される.これはディスプレイ内部にも偏光フィルタが内蔵されており,ディスプレイから発せられる光は直線偏光されているからである.2つのカメラによって取得された画像は,ディスプレイ領域のみ異なるものとなることから,単純に差分を求めるだけで,ディスプレイ領域を抽出することに成功した.平成31年度に取り組む予定であったディスプレイ領域の抽出に,既に着手することができており,成果を挙げている.虹彩追跡の精度が視線計測結果に影響を与えていることが確認された.近赤外を一部併用することや,虹彩追跡の精度を増すことで,視線計測の精度向上を目指す.
政策評価研究における刷新の試み――平和政策を題材に――

平和政策と政策評価、それぞれ大きな進展があった。政策評価は目標管理型業績測定の方法が主流になって、地方創生に代表されるPDCAサイクルとKPI方式が一般化した。ただこの方法は、数値目標を設定しその達成度を測定するので分かり易いが、数値化できない政策に関しては何もできない。トヨタのカイゼンのように生産現場のコストカット方法だからである。他方、平和政策は非常に難しい側面に突入した。東アジアにおける中国の進出、それに対応する自衛隊、中東におけるISの脅威、沖縄辺野古問題に関する国と沖縄県の紛争など、平和政策が評価困難な局面に突入したことは間違いない。この研究テーマはますます興味深いものになっている。2013年度は、新川達郎・編著の『政策学入門』(法律文化社)に2本の論文を執筆した。1第3章「政策評価」は政策に関する情報を集め、分析や比較を試し、その結果をとりまとめて提示するクールで価値中立的なツールが政策評価であり、誰が、何のために政策評価を行わせるのか、これが評価方法、スケジュール、評価基準に大きく影響することを明らかにした。2第4章「政策の失敗・変更・修正」では政策の成功、失敗は言う人によって認識が違い、あるいは時代によっても判断は違う。あるいは、外交政策のように、個々の対策を見れば成功したとは言えないが、長い目で見たら結果としてうまくいっていた、そう評価され、政策の継続を指示されることもある。これらの状況で、政策の変更や修正はどのように行われるのかについて、詳しく分析した。この2本の論文は、本科研の研究目的、「現行の政策評価制度が想定していなかった政策領域」に取り組む第一歩として、まずは政策の評価制度のあり方を明確にする意味があった。2014年度山谷は論文を1本発表した。「政策評価の『メタ評価』システムー客観性と評価の質ー」(『同志社政策科学研究』、第16巻第1号、2014年9月)である。評価が客観的であることと評価の質が良いことは別のことであるとの前提から、実務上、いかなる客観的チェックを評価に対して行いうるのか論じている。また以下の日程で研究会を開催して、関係者の知見を深めた。6月15日「政策評価とその現状について」報告者・山谷清志、7月12日「ODA評価と政策評価」報告者・山谷清志、8月2日「民主主義のツールとしての政策評価」報告者・山谷清志、8月23日「行政評価と地方自治体の評価」報告者・山谷清志、9月16日「経済産業省の政策評価」報告者・小林誠氏(経済産業省)、10月5日「NPOの参加型評価]報告者・渋谷典子氏(NPO法人参画プラネット代表理事)・林やすこ氏(NPO法人参画プラネット常任理事)、10月18日「防衛省の政策評価」報告者・田邊哲也氏(防衛省)、11月3日「こうべソーシャルファームプランの構築」報告者・山本英子氏、「教育専門職支援プログラムの評価ー発達障害のある生徒への支援を中心にー」報告者・長谷川法子氏、2月26日「紛争の和解とその評価」報告者・熊谷智博氏(大妻女子大学文学部)。政策評価は国内では目標管理型測定が主流になり、PDCA(Plan-Do-Check-Act)方式が一般化した。この方法は政策に数値目標を設定し、その達成度を測定するので判断し易いが、数値化困難な目標には何もできない。この不安がある政策評価の理論と実践について、再考を迫る大きな事実が出現した。2015年度はこの研究の最終年度であるだけでなく、国連の`Millennium Development Goals(MDGs)'の最終年度でもあり、「国際評価年」でもあったという事実である。目標を達成できなかったMDGsが`Sustainable Development Goals'に変わったのもよく知られている。大きな国際環境の変化、たとえばシリアの紛争、IS(Islamic State)によるテロに代表される事態が出現したからである。これはMDGsだけでなく、平和構築政策評価もまた困難である状況を再認識させた。すなわち平和政策主体、客体(政策対象)の把握を困難にし、平和構築の政策ツールを無力化した。まさに、日本で一般化している目標管理型の政策評価が、国際社会においても方法的課題を持っていると問題が提起されたのである。もちろん、各国政府、国際機関が取り組みを試行錯誤しているが、実はこの試行錯誤にこそ、政策評価がその本領を発揮できるところである。評価に関する研究の所与の目的(理論構築)は達成されている。紛争解決の評価に関しては想定通りの困難が、理論的に存在することも既に認識した。この点は織り込み済みである。しかし、国内外での大きな社会的、政治的変化があり、紛争の評価の段階に至らない状況になっている。

すなわち、国内では沖縄問題や原子力発電所の再稼働問題に代表されるように、容易に解決の糸口を見いだせない状態がある。他方、国際的には新たな国際紛争やテロの問題が数多く発生したため、現実に研究が追いつかないという状況がある。政治学2015年度は最終年度であるため、研究のとりまとめを行いたい。ただし、研究の一応の結論を、どこに置くかについてはいまだに悩ましいところではある。2013年度は英国で刊行する書籍の共同準備作業に大きく時間をとられ、論文執筆時間が制約された。ただし、人権研究者たちとの共同研究会(金沢)、沖縄の米軍基地の実態調査などでは研究の資料や手がかりを入手できたので2014年度にはこの部分で成果を出すことができる。書籍や文具等の購入時に発生した。研究方針は変わらない。したがって、2014年度は実際に防衛省や内閣府をはじめとする中央府省での調査、ODA、平和構築などの政策分野に集中する予定である。とくにODA大綱は改訂をする予定との方針が外務大臣から示されたので(2014年3月)、これまでのODA大綱の事後評価が行われるはずである。本研究にとっては絶好の研究対象ができたと考えている。適切に使用する予定である。
小児期・思春期肥満が,早期の動脈硬化性変化と左室肥大に及ぼす影響の検討

[目的と方法]本研究では、20歳以下の小児ならびに若年成人を対象として、若年肥満にともなう心血管系への影響、合併症の実態を把握するために身体計測、BMI(body mass index)、肥満度、血圧、血液検査(総コレステロール、中性脂肪、LDLコレステロール、HDLコレステロール、空腹時インスリン値(IRI)、空腹時血糖値(FBS)、レプチン、PAI-1(plasminogen acitvator inhibitor-1)、HOMAインスリン抵抗性指標)、心臓超音波検査(左室心筋重量係数(LVMI)、左室壁厚係数(LVWT/height)、左室拡張終期内径指数(LVIDD/height)、腹部超音波検査(皮下脂肪厚、内臓脂肪厚)、上腕動脈血管超音波検査(血流依存性血管拡張率(%FMD)により検討した。43名の肥満・2型糖尿病の患者(年齢10.7歳、身長148cm、体重60.7kg、各平均値)を対象とした。[結果]4例(9.3%)に左室肥大(LVMI>45g^*m^<-2.7>)を認めた。多変量解析ではBMIのみがLVMIの独立した関連因子であった。BMIは単独でLVMIの変動の46%を説明した。同様にIRIにたいしてはPAI-1が、PAI-1にたいしては内臓脂肪厚が独立した関連因子であった。左室肥大様式としてはLVWT/heightには有意にBMIと相関したが(r=0.35,p=0.02)、LVIDD/heightとは相関しなかった。肥満患者の%FMD(6.6+/-5.2%)は有意に正常対照(13.1+/-5.3%)に比べて低下していた(p<0.001)。%FMDと相関が認められたのは、LVWT/height(r=-0.43,p=0.05)、LVMI(r=-0.35,p=0.027)であった。[結論]以上より、小児肥満にともなう左室肥大は求心性肥大を主体とし、肥大程度には肥満重症度が主たる関連因子で、かつ肥大の成因には末梢血管内皮機能異常が関連すると考えられた。平成11年度は、本研究の基礎的検討として小児期に早期に動脈硬化をきたすモデル疾患としてWilliams症候群(以下WSと略)患者について検討した。以下の値は平均±標準偏差で示す。[結果]WS9名(年齢11.4±6.7歳)と、年齢のマッチした動脈硬化リスク因子を持たない対照14名(以下Cと略)(年齢16.1±8.9歳)について以下の結果を得た。(1)総頚動脈内膜中膜厚(IMT):C群ではIMTは0.526±0.076mmであったのに対し、WS群では0.735±0.141mmとWS群でC群に比べてIMTの肥厚が認められ(P<0.0001)、WSでは動脈硬化が小児期においても出現していることが認められた。(2)上腕動脈の血流増加ならびにニトログリセリン投与による血管拡張反応

性:血流の一過性途絶後に認めれられる血流増加反応により上腕動脈はC群ではコントロール値に比べて13.1±5.3%増加にしたのに対して、WS群では7.4±5.4%と拡張性の低下が認められた(P=0.02)。これに対してニトログリセリン投与によってC群は22.7±7.5%拡張したのに対して、WS群では20.0±9.3%と有意差なく拡張した。すなわちWS群では内皮依存性の血管拡張反応性は小児期においても低下するのに対して、内皮非依存性の拡張性は比較的温存されることが明らかになった。以上により本研究で用いる方法は動脈硬化をきたすモデル疾患において正しく病態を表現しうることが示唆された。[目的と方法]本研究では、20歳以下の小児ならびに若年成人を対象として、若年肥満にともなう心血管系への影響、合併症の実態を把握するために身体計測、BMI(body mass index)、肥満度、血圧、血液検査(総コレステロール、中性脂肪、LDLコレステロール、HDLコレステロール、空腹時インスリン値(IRI)、空腹時血糖値(FBS)、レプチン、PAI-1(plasm inogen acitvator inhibitor-1)、HOMAインスリン抵抗性指標)、心臓超音波検査(左室心筋重量係数(LVMI)、左室壁厚係数(LVWT/height)、左室拡張終期内径指数(LVIDD/height)、腹部超音波検査(皮下脂肪厚、内臓脂肪厚)、上腕動脈血管超音波検査(血流依存性血管拡張率(%FMD)により検討した。43名の肥満・2型糖尿病の患者(年齢10.7歳、身長148cm、体重60.7kg、各平均値)を対象とした。[結果]4例(9.3%)に左室肥大(LVMI>45g^*m^<-2.7>)を認めた。多変量解析ではBMIのみがLVMIの独立した関連因子であった。BMIは単独でLVMIの変動の46%を説明した。同様にIRIにたいしてはPAI-1が、PAI-1にたいしては内臓脂肪厚が独立した関連因子であった。左室肥大様式としてはLVWT/heightには有意にBMIと相関したが(r=0.35,p=0.02)、LVIDD/heightとは相関しなかった。肥満患者の%FMD(6.6+/-5.2%)は有意に正常対照(13.1+/-5.3%)に比べて低下していた(p<0.001)。%FMDと相関が認められたのは、LVWT/height(r=-0.43,p=0.05)、LVMI(r=-0.35,p=0.027)であった。[結論]以上より、小児肥満にともなう左室肥大は求心性肥大を主体とし、肥大程度には肥満重症度が主たる関連因子で、かつ肥大の成因には末梢血管内皮機能異常が関連すると考えられた。
発生工学を用いた神経細胞壊死の機構解析

虚血による神経細胞壊死、とりわけ一過性の虚血による遅発性の神経細胞の壊死にグルタミン酸受容体の関与が考えられてきたが、その詳細は不明のままであった。我々は、この遅発性の神経細胞壊死にNMDA受容体チャネルがどのように関与するのかを明らかにするために、NMDA受容体チャネルを構成し、この受容体の機能的多様性を決定している4種類のεサブユニットを欠損したマウスを用いて検討をおこなった。一過性虚血による神経細胞壊死の人工的モデルとして、眼圧を上昇させることにより虚血状態を作る方法を採用した。マウスを麻酔下に片眼の前眼房に針を挿入し、1200mmの静水圧を経時的に加えることにより網膜の神経細胞に一過性の虚血を負荷した。この虚血負荷後、経時的に眼球を摘出し、形態学的な変化を検討した。その結果、30-45分の眼圧上昇により遅発性神経細胞壊死が惹起されることが明らかになった。この神経細胞の壊死は、アポトーシス様の過程をたどる。成体マウスの網膜では、ε1およびε2サブユニットが主に発現している。そこで、成体まで成長し、光顕レベルで組織に異常が認められないε1サブユニットを欠損したマウスと野生型マウスに眼圧上昇を負荷し比較検討した。その結果、ε1サブユニット欠損マウスでは、45分の眼圧上昇を負荷しても網膜神経細胞の壊死はほとんど認められなかった。一方この条件では、野生型マウスのほとんどの網膜神経細胞が変性脱落する。このことは、虚血による遅発性神経細胞壊死にNMDA受容体チャネルを介する過程が含まれることを示唆する。
糖尿病網膜症におけるMechanical Stressの役割

糖尿病網膜症発症に活性酸素(ROS)が重要な役割を果たしている可能性が報告されている。一方、全身高血圧症が糖尿病網膜症の増悪因子であることがよく知られている。そこで、我々は血圧上昇時における血管壁伸展の網膜症発症に及ぼす影響及びその機序について検討した。方法:ブタ網膜血管周皮細胞(PRPC)を用い、Flexcer Cell細胞進展装置を使用し、細胞が日常生体内で経験していると思われる10%/60cpmの周期的機械的伸展を負荷した。細胞内シグナル伝達の検討はWestern blot法を用いた。キナーゼの詳細な検討は特異的薬理的阻害剤及びアデノウイルスベクターによる強制発現を用いた。アポトーシスはTUNEL法及びDNALadder法により評価した。結果:周期的伸展によりROS産生増加(3.6+/-0.9 fold,p<0.01)が認められた。時間依存性、伸展強度依存性にSAPK/JNKのリン酸化が認められ、ROS阻害剤により抑制された(83%,p=0.011)。さらに周期的伸展はCaspase3の活性化(6.5+/-1.4fold,p<0.01)及びTUNEL陽性細胞の増加(17.8% vs 39.8%,p<0.01)、DNA断片化を誘導し、これらはJNKの阻害により正常化された(83%,p=0.0089,90%,p=0.0045)。結論:周期的伸展により産生された活性酸素がJNK-caspase経路を活性化し、周皮細胞のアポトーシスを誘発することによりpericyte lossを促進し、網膜症を増悪する可能性が示唆された。これにより、高血圧症の合併が網膜症発症を促進する機序が示唆された。糖尿病網膜症の血管新生、血管透過性の亢進には血管内皮増殖因子(VEGF)が主要な役割を担っていることが明らかになり、研究代表者もVEGF自体やその調節機構の制御による治療法の開発に関して数々の研究成果をあげてきた。高血圧症もまた糖尿病網膜症を増悪させることが疫学的に知られている。高血圧は血管内圧によって、血管壁を構成する血管細胞が周期的に過剰伸展(stretch)される状態ととらえることが出来る。今回の研究目的はグルコース依存性の各経路、特に酸化ストレスの亢進がstretchによってどのように変化するかを細胞レベルで検討し、高血圧によるより初期の糖尿病網膜症増悪において主要な役割をはたす既存の、もしくは新しいメカニズムを提唱し、さらに高血圧合併糖尿病動物モデルを用いて生体内での役割を確認することである。本年度は周皮細胞によるin vitroの系で検討した。(2)フレクサーセルテンションシステム(米国FLEXCELL社)を用い細胞にstretchを負荷しstretchの周皮細胞のアポトーシス促進効果を明らかにした。続いてstretchが如何にしてそれらの経路を修飾するのかを細胞内シグナル伝達の視点から検討した。我々はすでにstretchが細胞内でtyrosine kinase, PI3-kinase, Akt, MAP-kinase, PKCなどの細胞内シグナル伝達分子群を活性化することを報告しているが、各シグナル分子のinhibitor(genistein, wortmannin, PD98059,GF109203X等)、またはそれぞれの優勢変異型(dominant negative mutant)をアデノウイルスベクターを用いて過剰発現することにより各経路を抑制し、stretchの効果が酸化ストレスを介することを明らかにした。