hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特発性男子不妊症の遺伝子診断法の開発に関する研究

レセプター(AR)のDNA結合領域(AR-DBD)を発現するベクターにより大腸菌を用いて、AR-DBD蛋白を大量に発現させ、既知のアンドロゲン応答配列と特異的に結合することを確認した。断片化したラットゲノムDNAを用いて、このAR-DBD蛋白と結合するDNA断片をニトロセルロースを用いて選別し、ライブラリー化した。さらに2回、AR-DBDと結合反応を行い、特異的に結合するDNA断片をもつプラスシドを選択した。得られたDNA断片をプローブとして、各種臓器での発現を検討し、副精巣にて特に強い発現がみられるクローンが得られ、LH-RHアナログを用いた実験よりアンドロゲン消失により発現が消退することより、このクローンがアンドロゲンの調節をうけていることが示唆された。現在、その応答配列を検討中である。ラットアンドロゲンレセプター(AR)のDNA結合領域(AR-DBD)をベクター(pET15b)に組込み、ヒスチジンタグを有するペプチドとの融合蛋白質として、大腸菌を用いてAR-DBD蛋白質を大量に発現し、ニッケルカラムにて高純度の精製蛋白質を得た。この蛋白質が、既知のアンドロゲン応答配列と特異的に結合することをゲルシフトアッセイ法にて確認した。断片化したラットゲノムDNA中よりこのAR-DBD蛋白質と結合するDNA断片を選別し、ライブラリー化した。さらに数回AR-DBD蛋白質との結合反応を繰り返すことによって、特異的に結合するクローンを濃縮した。得られたDNA断片(200-3500bp)をプローブとして、各種臓器における発現をノーザンブロットにより解析した結果、約5.8Kbpにメッセージをもち、副精巣(副精巣>肝>前立腺,腎臓>精巣)において特に強い発現を示すクローンが得られた。次に、アンドロゲンによるこの遺伝子の発現をノーザンブロットにより検討した結果、LH-RHアナログを用いた去勢により発現が消失したことから、アンドロゲンによりこの遺伝子の発現が制御されていることが判明した。精子形成および精子成熟にアンドロゲンが関与しているのは自明の事実である。今回我々が見いだした遺伝子は副精巣においてアンドロゲンにより発現が誘導され、精子の成熟あるいは、運動能等に関係している可能性が考えられ、今後も継続した検討が必要と考える。
真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御を可能とする刺激応答型アミノ酸の開発

本研究では真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築を目的とし、その基盤となる高速アミド結合切断反応を開発したのち、刺激応答型アミノ酸へと展開することを目指した。なお刺激応答型アミノ酸とは、外部からの刺激によりペプチド主鎖アミド結合の切断を誘起する人工アミノ酸と定義する。本研究の結果、蛍光を指標としたアミド結合切断反応のモニタリング系を確立するとともに、本反応が一次反応であり中間体の半減期から速度論的比較ができることを明らかにした。さらに、反応速度の向上を目指して種々の誘導体を合成し、この中から特に酸性条件下でのアミド結合切断を著しく加速する誘導体を見出すことに成功した。本研究では真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築を目的とし、高速アミド結合切断反応を開発したのち刺激応答型アミノ酸へと展開する。刺激応答型アミノ酸とは、外部からの刺激によりペプチド主鎖アミド結合の切断を誘起する人工アミノ酸と定義する。生命科学分野において、細胞外から細胞内現象を制御する方法が求められている。申請者はこれまで、刺激応答型アミノ酸を基盤とした細胞内でのペプチド機能制御系の構築を行ってきた。この結果、リアルタイムでの機能制御を可能とするには、アミド結合切断反応を加速する必要があることが明らかとなった。そこで本研究では、まず高速アミド結合切断反応を開発したのち、これを基盤とした刺激応答型アミノ酸を設計・合成する。さらに本アミノ酸を鍵分子として用い、真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築に挑戦する。本研究は下記順に従って進めることとした。1.アミド結合切断反応の追跡を容易とする系の構築、2.高速アミド結合切断ユニットの開発、3.アミノ酸誘導体の合成、4.ペプチド機能制御への展開、5.タンパク質機能制御への展開。申請者はまず、上記1および2について検討した。詳細は「現在までの達成度」の項に示す。今年度は下記1および2について検討した。1.アミド結合切断反応の追跡を容易とする系の構築、2.高速アミド結合切断ユニットの開発:5種類の化合物の合成に挑戦する。この結果、蛍光を指標としてアミド結合切断反応を簡便にモニタリングする方法を確立した。さらに本手法を用い、同反応が一次反応であることを明らかにするとともに、その反応速度を反応中間体の半減期で比較できることを実証した。続いて、高速アミド結合切断ユニットの開発を目指し、芳香環上のメチル基をtertーブチル基へと置換した誘導体の合成に挑戦した。しかし合成の各過程において、様々な副反応に遭遇した。当該副反応はメチル体では観測されなかったことからtertーブチル基の立体障害に起因すると考え、現在、tertーブチル基をイソプロピル基へと置換した誘導体の合成に取り組んでいるところである。以上に述べた通り、反応速度の評価系構築に成功し、また誘導体合成設計の際の課題が明らかとなり、さらにその解決のための方向性を見出すことができたことから、本研究はおおむね順調に進行していると評価した。本研究では真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築を目的とし、高速アミド結合切断反応を開発したのち、刺激応答型アミノ酸への展開を目指す。そこで本研究では、まず高速アミド結合切断反応を開発したのち、これを基盤とした刺激応答型アミノ酸の設計・合成に挑戦することとした。本研究は下記順に従って進める計画を立案した。申請者は昨年度、蛍光を指標としてアミド結合切断反応を簡便にモニタリングする方法を確立するとともに、本反応が一次反応であり反応速度を基質の半減期で比較できることを明らかにした。続いて反応速度の向上を目指し、立体障害の大きいtert-ブチル基を導入した誘導体の合成に挑戦したものの、その合成が困難であった。そこで今年度は昨年度に引き続き、上記2について検討した。詳細は「現在の達成度」の項に示す。昨年度は、蛍光を指標としてアミド結合切断反応を簡便にモニタリングする方法を確立するとともに、本反応が一次反応であり反応速度を基質の半減期で比較できることを明らかにした。そこで今年度は、まずtert-ブチル基の代わりに他の立体的に嵩高い置換基を導入した誘導体の合成を行った。この結果、目的化合物は合成できたものの、そのアミド結合切断反応速度は元の化合物と同等であることが明らかとなった。すなわち、立体障害による反応加速は困難であることが実験的に明らかとなった。そこで別のアプローチとして、水酸基をアミノ基に置換することにより求核性を上げ、アミド結合切断速度を向上させることを試みた。まず、水酸基の代わりに一級アミノ基を導入した誘導体の合成に取り組んだ。しかし不可避な副反応が起こり、目的物を得ることができなかった。そこで代わりに、二級アミンを導入した誘導体を合成し、そのアミド結合切断反応を測定した。この結果、予測に反し、反応速度の向上は見られなかった。

この原因として、アミノ基を二級にしたことで立体障害が発生したことが考えられた。そこで現在、求核性があり、かつ立体障害の小さい官能基を導入した誘導体の合成について検討しているところである。以上に述べた通り、当初開発を計画していた各種誘導体の問題点を実験的に明らかにすることができ、さらにその解決のための方向性を見出すことができたことから、本研究はおおむね順調に進行していると評価した。本研究では真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築を目的とし、高速アミド結合切断反応を開発したのち、刺激応答型アミノ酸への展開を目指す。刺激応答型アミノ酸とは、外部からの刺激によりペプチド主鎖アミド結合の切断を誘起する人工アミノ酸と定義する。生命科学分野において、細胞外から細胞内現象を制御する方法が求められている。申請者はこれまで、刺激応答型アミノ酸を基盤とした細胞内でのペプチド機能制御系の構築を行ってきた。この結果、リアルタイムでの機能制御を可能とするには、アミド結合切断反応を加速する必要があることが明らかとなった。そこで本研究では、まず高速アミド結合切断反応を開発したのち、これを基盤とした刺激応答型アミノ酸の設計・合成に挑戦することとした。本研究は下記順に従って進める計画を立案した。1.アミド結合切断反応の追跡を容易とする系の構築、2.高速アミド結合切断ユニットの開発、3.アミノ酸誘導体の合成、4.ペプチド機能制御への展開、5.タンパク質機能制御への展開。申請者は昨年度までに、蛍光を指標としてアミド結合切断反応をモニタリングする方法を確立するとともに、本反応が一次反応であり反応速度を基質の半減期で比較できることを明らかにした。さらに、反応速度の向上を目指し、立体障害の大きいt-ブチル基を導入した誘導体の合成に挑戦したものの、その合成が困難であることが判明した。今年度はまず、同じく立体障害の大きいイソプロピル基を導入した誘導体を合成し、その反応速度を測定した。その結果、予測に反し、反応の加速は観測されなかった。そこで、求核性官能基を置換した誘導体を合成したところ、当該誘導体は特に酸性条件下でのアミド結合切断を著しく加速することが明らかになった。さらに、本骨格を基盤とした刺激応答型アミノ酸の開発に成功した。なお結果の詳細は研究成果報告書F-19-1に記載する。本研究では真に実用的なペプチド・タンパク質機能制御系の構築を目的とし、その基盤となる高速アミド結合切断反応を開発したのち、刺激応答型アミノ酸へと展開することを目指した。なお刺激応答型アミノ酸とは、外部からの刺激によりペプチド主鎖アミド結合の切断を誘起する人工アミノ酸と定義する。本研究の結果、蛍光を指標としたアミド結合切断反応のモニタリング系を確立するとともに、本反応が一次反応であり中間体の半減期から速度論的比較ができることを明らかにした。
ヒト薬物代謝酵素を用いたマイコトキシン汚染食品の浄化技術に関する研究

穀物などの食品類に混入したA. flavusは、AFB1を産生することで食品類を汚染する。AFB1は、生体内のP450酵素によりAFBOへと代謝され、強い中毒症状を示すが、AFBOの寿命は極めて短く、また、再度代謝活性化されないことが知られている。現在、世界各国において食品中のAFB1には厳しい法定基準値が設定されている。また、近年では世界における物品の流通形態が大幅に変化したことにより、特に穀物など食品類の流通は世界規模で行われている。よって、日本のみならず世界中の地域や人種に対するAFB1中毒の懸念が高まっており、早急な対応が必要であると考えられている。そこで本研究では、AFB1の代謝活性化に関わるCYP3A4に着目し、これらを用いたカビ毒の解毒化に関する研究を行った。具体的には、ヒトCYP3A4を発現させた大腸菌体とTriton X-405を添加した大腸菌溶液中へとAFB1で汚染されたトウモロコシを加え、AFB1の減少率を評価した。本浄化システムを用いる事で、A. flavus汚染トウモロコシ中のAFB1を約2 ppbにまで減少させることに成功した。一方、CYP3A4発現大腸菌添加サンプルとpCW導入大腸菌添加サンプル(コントロール)を用いた低濃度汚染サンプルを用いた実験から、両者に有意差は確認出来なかった。この要因としては、作製した汚染トウモロコシ中のAFB1量が低かったことがあげられる。即ち、本浄化システムはある程度の高濃度汚染食品には有用であったが、低濃度汚染下では有効では無いことが判明した。今後は、A. flavus汚染トウモロコシの作成条件を検討しなおし、汚染度の向上を図ることや、作製した高濃度の汚染トウモロコシにおいても、今回と同様に、AFB1を日本におけるアフラトキシン法定濃度である10 ppb以下に減少させることが可能かどうかについて検討する必要がある。最終年度は、特にCYP3A4に加えてより活性型のP450酵素の作製を目的にCYP2C9の遺伝子多型に着目し、活性評価の研究を行った。アフラトキシンB1(AFB1)は、主にAspergillusflavus (A. flavus)により産生されるマイコトキシンの一種で、変異原性、発がん性を持つことが知られている。防カビ剤や熱処理、オゾンガス、放射線照射などの多様な手法がA. flavusの生育阻害やAFB1の不活性化のために用いられつつあるが、現在まで食品にダメージを与えず付着したこれらのAFB1を効率よく解毒可能な方法は知られていない。そこで本研究では、ヒトの薬物代謝酵素を利用することで、常温・常圧下でAFB1を解毒する新たな手法の開発を試みた。本研究で用いたヒトシトクロムP450(CYP)の一種であるCYP3A4は、生体内において、AFB1を高い発がん性を持つアフラトキシンB1-8,9-エポキシド(AFBO)へと変換する主酵素である。一方、AFBOの半減期は約5秒間程度と短く、再度毒性化されないことも確認されている。そこで本研究では、ヒトCYP3A4を発現した大腸菌を用いて生体外でAFB1を一過的に高毒性のAFBOへと変換させる事で、AFB1による食中毒を防止できるのでは無いかと考えた。さらに、本大腸菌を微生物反応触媒として用いる目的で、凍結乾燥によるCYP3A4発現大腸菌菌体の保存安定性を検討した。CYP3A4発現大腸菌菌体によりAFB1標品を代謝させた結果から、アフラトキシンQ1(AFQ1)が生成することが判明した。一方、本代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなった。また、実汚染食品サンプルとしてA. flavus感染食品を作製し、本システムによるAFB1解毒能を評価した。さらに、凍結乾燥CYP3A4発現大腸菌の保存安定性に関しては、14日間の常温保存後もCYP3A4によるAFB1代謝能は失われないことが分かった。以下の理由により当初計画以上に進展していると判断した。1)CYP3A4発現大腸菌菌体によりAFB1標品を代謝させた後、HPLCにより分析した結果、AFB1代謝物と見られるHPLCピークが観察された。LC-MS分析の結果から、このHPLCピークは、アフラトキシンQ1(AFQ1)であることが判明したため。2)代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなっていたため。3)AFB1産生A.flavus懸濁培養液を用いた解析からも、同様にAFB1が代謝されていることが確認できたため。防カビ剤や熱処理、オゾンガス、放射線照射などがA. flavusの生育阻害やAFB1の不活性化のために用いられているが、食品にダメージを与えず付着したこれらのAFB1を効率よく解毒可能な方法とはなっていない。そこで本研究では、ヒトの薬物代謝酵素を利用することで、常温・常圧下でAFB1を解毒する手法の開発を試みた。RT-PCRにより、ヒトCYP3A4cDNAを取得した。

次に、CYP3A4 cDNAをP450発現プラスミドであるpCWROmpA-Lへと挿入することで、ヒトCYP3A4を高発現させた組換え大腸菌を調製した。その後、AFB1標品、A. flavus懸濁液またはA. flavus感染食品をCYP3A4発現大腸菌菌体と直接反応させた。AFB1代謝物と代謝物の変異原性について、HPLC分析およびUmuテストにより各々評価した。さらに、CYP3A4発現大腸菌を凍結乾燥することによる長期保存の可能性に関して、常温で714日間保存した後にAFB1代謝能を測定することで評価した。その結果、AFB1代謝物は、アフラトキシンQ1(AFQ1)であることが判明した。一方、本代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなった。また、凍結乾燥CYP3A4発現大腸菌に関しては14日間の保存後もCYP3A4によるAFB1代謝能は失われることがないと分かった。さらに、凍結乾燥保護剤としてスクロースを加えると長期保存後の活性が多く残存することも分かった。以下の理由により当初計画以上に進展していると判断した。1)CYP3A4発現大腸菌菌体によりAFB1標品を代謝させた後、HPLCにより分析した結果、AFB1代謝物と見られるHPLCピークが観察された。LC-MSによる分析から、このHPLCピークは、アフラトキシンQ1(AFQ1)であることを明らかにできた。2)一方、本代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなった。AFB1を生成することを確認したA.flavus懸濁液を用いた場合も同様に、AFB1が代謝されていることが確認できた。3)さらに、イムノアフィニティーカラムを用いたアフィニティー精製により、時と千サンプルからのアフラトキシン類の回収にも成功した。アフラトキシンB1(AFB1)は、主にAspergillusflavus (A.flavus)により産生されるマイコトキシンの一種で、極めて高い変異原性、発がん性を持つことが知られている。そこで本研究では、ヒトの薬物代謝酵素を利用することで、常温・常圧下でAFB1を解毒する手法の開発を試みた。ヒトCYP3A4は、生体内において、AFB1を高い発がん性を持つアフラトキシンB1-8,9-エポキシド(AFBO)へと変換する主酵素である。一方、AFBOは非常に不安定な反応中間体であることから、生体外では約5秒でAFB1-8,9-ジヒドロジオールへと自然分解され、すみやかに変異原性を消失することが知られている。そこで本研究では、ヒトCYP3A4を発現した大腸菌を用い、AFB1を生体外で一過的に高毒性のAFBOへと変換させることで、AFB1による食中毒を防止することを試みた。RT-PCR法により取得したヒトCYP3A4cDNAを、P450発現プラスミドであるpCWROmpAへと挿入後、形質転換法によりヒトCYP3A4を高発現させた組み換え大腸菌を調製した。さらに、AFB1標品をCYP3A4発現大腸菌菌体と直接反応させた後、AFB1代謝物の変異原性についてUmu試験により評価した。また実汚染食品サンプルとしてA.flavus感染トウモロコシを用い、本システムによる汚染トウモロコシ中のAFB1解毒能を評価した。CYP3A4発現大腸菌菌体によるAFB1標品の代謝産物について、Umu試験を行った。その結果、代謝物は変異原性を消失していることが確認できた。
マイクロ波凝固の不整脈外科への応用に関する実験的研究

平成5年度は平成4年度の急性実験の結果を受け、マイクロ波凝固を心臓に対して適応した場合の慢性期の安全性を中心に検討を行った。実験には体重913kgの雑種成犬を用いた。急性実験の結果より、電極の形状は直径0.7mm、長さ1cmの針電極、出力は50W、通電時間は30秒に設定し、常温拍動下に左室の自由壁に対してアブレーションを行った。マイクロ波凝固の1、3、7、14日、1、3、6、13ヵ月後に各1頭ずつ慢性期の検討に供した。プログラム刺激を行い、心室頻拍の誘発を試み、凝固部位が不整脈の新たな起源になるか否かにつき検討した。その後、10%ホルマリンで固定し、肉眼的観察を行った後、光顕により組織学的に検討した。マイクロ波凝固1、3日後では出血を伴う心筋壊死が認められ、1週間後では壊死に陥った心筋の周囲にマクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、新生毛細血管からなる肉芽組織が出現した。2週間後では変性領域の周囲の肉芽組織は中心部に広がった。1ヵ月後では変性領域の中心部を残して壊死心筋の吸収が進み、辺縁部では膠線維に置換された。3ヵ月では壊死心筋は膠原線維に完全に置換されて線維性瘢痕となり、一部では脂肪組織の浸潤が認められた。13ヵ月後のマイクロ波凝固部位は周辺と境界明瞭な白色の硬い瘢痕組織で、組織学的には脂肪浸潤を伴う瘢痕組織であった。全経過を通じて、マイクロ波凝固部位に心室瘤の形成は認められなかった。遠隔期の電気生理学的検査では心室頻拍は誘発されなかった。以上の結果より、マイクロ波凝固は左室壁の全層性アブレーションが容易に行え、心臓破裂・心室瘤形成等の合併症を認めず、遠隔期に催不整脈性がなく、不整脈外科の補助手段として応用可能と考えられた。平成4年度はマイクロ波凝固を心臓に対して適応した場合の急性期の安全性を中心に検討を行った。実験には体重912kgの雑種成犬を用いた。電極の形状は直径0.7mm、長さ1cmの針電極とし、マイクロ波の波長は2450MHzで、出力は30W、50W、通電時間は1060秒に設定し、常温拍動下に右室および左室の自由壁に対してアブレーションを行った。マイクロ波凝固時の心電図変化をモニターし、マイクロ波のエネルギーと凝固変性領域の関係を組織学的に検討したアブレーション後に電気生理学的検査を行い、凝固部位が不整脈の新たな起源になるか否かにつき検討した。長さ1cmの針電極は刺入により右室壁では貫通し、左室壁では貫通に近い状態であった。マイクロ波凝固中心室性期外収縮の多発が認められたが、血行動態は安定していた。マイクロ波凝固により心臓破裂等の重症な合併症は生じなかった。凝固変性領域は境界明瞭で右室および左室自由壁の全層性の変性凝固が容易に可能であった。凝固変性領域の横径はマイクロ波のエネルギーが大きい程大きく、凝固時間が延長する程大きくなった。凝固後急性期に行った電気生理学的検査ではプログラム刺激による心室頻拍等の致死的不整脈の誘発は認められなかった。

実験終了後の心臓標本では中心部は凝固壊死、正常心筋との境界部はcontraction band necrosisを呈し、正常心筋とは境界が明瞭であった。心内膜面に血栓形成は認められなかった。以上より、マイクロ波凝固は常温拍動下の心筋に対して安全に全層性の凝固を行うことが可能であると判明した。平成5年度は慢性実験を行い、組織学的変化と電気生理学的検査による催不整脈性の点から慢性期の安全性を検討し、マイクロ波凝固のアブレーション手段としての確立をめざす予定である。平成5年度は平成4年度の急性実験の結果を受け、マイクロ波凝固を心臓に対して適応した場合の慢性期の安全性を中心に検討を行った。実験には体重913kgの雑種成犬を用いた。急性実験の結果より、電極の形状は直径0.7mm、長さ1cmの針電極、出力は50W、通電時間は30秒に設定し、常温拍動下に左室の自由壁に対してアブレーションを行った。マイクロ波凝固の1、3、7、14日、1、3、6、13カ月後に各1頭ずつ慢性期の検討に供した。プログラム刺激を行い、心室頻拍の誘発を試み、凝固部位が不整脈の新たな起源になるか否かにつき検討した。その後、10%ホルマリンで固定し、肉眼的観察を行った後、光顕により組織学的に検討した。マイクロ波凝固1、3日後では出血を伴う心筋壊死が認められ、1週間後では壊死に陥った心筋の周囲にマクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、新生毛細血管からなる肉芽組織が出現した。2週間後では変性領域の周囲の肉芽組織は中心部に広がった。1カ月後では変性領域の中心部を残して壊死心筋の吸収が進み、辺縁部では膠線維に置換された。3カ月では壊死心筋は膠原線維に完全に置換されて線維性瘢痕となり、一部では脂肪組織の浸潤が認められた。13カ月後のマイクロ波凝固部位は周辺と境界明瞭な白色の硬い瘢痕組織で、組織学的には脂肪浸潤を伴う瘢痕組織であった。全経過を通じて、マイクロ波凝固部位に心室瘤の形成は認められなかった。遠隔期の電気生理学的検査では心室頻拍は誘発されなかった。以上の結果より、マイクロ波凝固は左室壁の全層性アブレーションが容易に行え、心臓破裂・心室瘤形成等の合併症を認めず、遠隔期に催不整脈性がなく、不整脈外科の補助手段として応用可能と考えられた。
超高分解能電子顕微鏡による鉱物の微細組織と超構造

九州大学超高圧電子顕微鏡室に設置してある超高分解能透過電子顕微鏡を用いて2,3のアンチゴライト・カリオピライトの超構造の高分解能観察を行なった.今回実験に用いた超高分解能電子顕微鏡はSi-0,Mg-0などの結合距離に近い点分解能(0.17nm)を有している.今回得られたアンチゴライトの高分解能電子顕微鏡観察結果は以下の通りである.(1)実際に撮影できたHRTEM像の光学的フーリエ変換を行ってみると,ほぼ0.2nm-0.15nm程度の情報が得られていることがわかった.従来のHRTEMを用いた鉱物の研究では得られていない分解能で観察ができることが明らかになった.(2)今回検討した試料のように電子線損傷が激しい鉱物では撮影条件(焦点はずれ量)を変化させた一連の像を得ることが非常に困難であった.(3)c軸方向からの高分解能像は次の2つのタイプに区別される.第1のタイプは0.25nmの面間隔の連続的な(200)格子縞と不連続な(130)格子縞を示す物である.そして,(130)格子縞の食い違いは3.5nmの間隔で生じる.そのsupercellはM=6.5に対応する.第2のタイプは0.46nmの面間隔の連続的な(020)格子縞と不連続な(110)格子縞を示す物である.そして,(110)格子縞の食い違いは3.5nmの間隔で生じる.(4)上記の2つのタイプを解釈するためにマルチスライス法によってシミュレーション像を計算した.観察像との比較から原子分解能が得られていることがわかった.(5)c面心の空間格子をもつ新しい超構造が篠栗産アンチゴライト試料A1において確かめられた.これはM=(2n+1)/2のsupercellを示す物で真のX軸方向の周期は2倍で2Aとなる.そのC面心の超構造モデルはUehara and Shirozu(1985)が予想した物である.(6)大きなβ角をもつ(β=95゚)単斜晶系の1層構造の超構造がいわゆる"ピクロライト"試料S7(Uehara and Shirozu,1985)において見いだされた.九州大学超高圧電子顕微鏡室に設置してある超高分解能透過電子顕微鏡を用いて2,3のアンチゴライト・カリオピライトの超構造の高分解能観察を行なった.今回実験に用いた超高分解能電子顕微鏡はSi-0,Mg-0などの結合距離に近い点分解能(0.17nm)を有している.今回得られたアンチゴライトの高分解能電子顕微鏡観察結果は以下の通りである.(1)実際に撮影できたHRTEM像の光学的フーリエ変換を行ってみると,ほぼ0.2nm-0.15nm程度の情報が得られていることがわかった.従来のHRTEMを用いた鉱物の研究では得られていない分解能で観察ができることが明らかになった.(2)今回検討した試料のように電子線損傷が激しい鉱物では撮影条件(焦点はずれ量)を変化させた一連の像を得ることが非常に困難であった.(3)c軸方向からの高分解能像は次の2つのタイプに区別される.第1のタイプは0.25nmの面間隔の連続的な(200)格子縞と不連続な(130)格子縞を示す物である.そして,(130)格子縞の食い違いは3.5nmの間隔で生じる.そのsupercellはM=6.5に対応する.第2のタイプは0.46nmの面間隔の連続的な(020)格子縞と不連続な(110)格子縞を示す物である.そして,(110)格子縞の食い違いは3.5nmの間隔で生じる.(4)上記の2つのタイプを解釈するためにマルチスライス法によってシミュレーション像を計算した.観察像との比較から原子分解能が得られていることがわかった.(5)c面心の空間格子をもつ新しい超構造が篠栗産アンチゴライト試料A1において確かめられた.これはM=(2n+1)/2のsupercellを示す物で真のX軸方向の周期は2倍で2Aとなる.そのC面心の超構造モデルはUehara and Shirozu(1985)が予想した物である.(6)大きなβ角をもつ(β=95゚)単斜晶系の1層構造の超構造がいわゆる"ピクロライト"試料S7(Uehara and Shirozu,1985)において見いだされた.四国三波川変成帯の蛇紋岩および四国秩父帯のMn鉱床中のMn-Fe-蛇紋石の産状調査及び試料採集を行った。そして,採集試料一部について,X線回折法,EPMA電子顕微鏡を使用して構成鉱物の同定を行い,X線的性質,化学組成などを明らかにした。その結果,四国三波川帯のアンチゴライトの超構造が生成温度に対応して変化していることがあきらかになった。また,Mn-蛇紋石(カリオピライト)の分析電子顕微鏡を用いた化学分析と超構造の解析については現在進行中である。さらに2,3のアンチゴライト,カリオピライトについては,HRTEMを用いて超構造の高分解能観察を行なった。今回実験に用いた超高分解電子顕微鏡はSi-O,Mg-Oなどの結合距離に近い点解能(0.17nm)を有している。実際に撮影できたHRTEM像の光学的フーリエ変換を行ってみると,ほぼ0.2nm-0.15nm程度の情報が得られていることがわかった。

従来のHRTEMを用いた鉱物の研究で得られていない分解能で観察ができることが明らかになった。さらに,高分解能像観察結果を解釈するために計算機を用いて,マルチスライス法によりシミュレーション像を計算した。それらを観察像との比較し,適切な観察条件を選べば,ほぼ,原子スケールの観察が可能であることがわかった。九州大学超高圧電子顕微鏡室に設置してある超高分解能透過電子顕微鏡を用いて2,3のアンチゴライト・カリオピライトの超構造の高分解能観察を行なった.今回実験に用いた超高分解能電子顕微鏡はSi-O,Mg-Oなどの結合距離に近い点分解能(0.17nm)を有している.実際に撮影できたHRTEM像の光学的フーリエ変換を行ってみると,ほぼ0.2nm-0.15nm程度の情報が得られていることがわかった.従来のHRTEMを用いた鉱物の研究では得られていない分解能で観察ができることが明らかになった.さらに,高分解能像観察結果を解釈するために計算機を用いて,マルチスライス法によりシミュレーション像を計算した.それらを観察像との比較し,適切な観察条件を選べば,ほぼ,原子スケールの観察が可能であることがわかった。しかしながら、今回検討した試料のように電子線損傷が激しい鉱物では撮影条件(焦点はずれ量)を変化させた一連の像を得ることが非常に困難であった.これでは原子位置を一義的に決定し得ない場合を生じることになるが、パーソナルコンピューターなどで可能な画像処理を用いてできる限り正確に定量的に読み取り対応したい.そして,原子スケールの評価を行うための観察条件などの基礎的な研究を行い,新しい鉱物の組織観察法として確立したい.
唾液腺における分泌関連分子の相互作用

唾液腺における分泌は細胞外からの情報受容に引き続き,細胞内シグナルを介し,分泌に至る。唾液腺における分泌関連分子の相互作用の研究において,平成13-14年度に明らかにしたことは,1)ウサギ耳下腺腺房細胞において,一酸化窒素(NO)合成酵素がムスカリン性受容体刺激で活性化され,NOが産生されることから,腺房細胞はNO産生細胞であること,2)腺房細胞で産生されたNOは神経での神経伝達物質を介してアミラーゼ分泌調節に関わること,3)ラット耳下腺線房細胞や分泌顆粒にRaftが存在すること,4)ラット耳下腺腺房細胞においてムスカリン受容体活性化に関与するGTP結合タンパク質活性化によるイノシトール三リン酸(IP_3)を生成は,スフィンゴ脂質の1つスフィンゴシンにより抑制されること,5)ラット耳下腺腺房細胞のβアドレナリンおよびムスカリン性受容体刺激によるアミラーゼ分泌調節にホスホリパーゼDが関わっているが,低分子量GTP結合タンパク質の1つArfは,この調節には関与しないこと,6)低分子量GTP結合タンパク質の1つ,RhoAがラット耳下腺腺房細胞に存在し,βアドレナリン受容体刺激によるアミラーゼの開口放出に関与すること,7)RhoAの下流にRhoキナーゼが存在し,アミラーゼ分泌に関わること,8)ウサギ顎下腺腺房細胞において,一酸化窒素(NO)を介したcyclic GMPシグナルが存在すること,9)ラット舌下腺におけるシンタキシン1Aが存在することなどである。唾液腺において,βアドレナリン受容体やムスカリン性受容体刺激はタンパク成分および水やイオンを分泌する。耳下腺を用いて,アミラーゼ分泌に関与するシグナルとそれに関わる分子の相互作用を検討した。セカンドメッセンジャーの1つであるcAMPに依存したアミラーゼ分泌にSNAREタンパク質の1つであるVAMP2が関わることをすでに報告したがpantophysinというタンパク質が耳下腺腺房細胞において顕著な発現が見られ,分泌顆粒膜画分に多く検出されることが明らかになった。これらのことから,pantophysinが分泌顆粒膜上でVAMP2と結合している可能性が示された。また,分泌顆粒膜上に存在するVAMP2複合体の解離には,何らかの細胞質タンパク質のPKAによるリン酸化が必要であることもすでに示しており,今回このタンパク質の同定を試みたところ,細胞質に高分子量のVAMP2複合体解離を引き起こす活性をもつ分画の存在が,ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを用いて明らかになった。ホスホリパーゼD(PLD)はホスファチジルコリンからコリンとホスファチジン酸を産生する酵素である。PLDの活性阻害と考えられるネオマイシン処理やブタノールによるホスファチジン酸の産生阻害はcAMP依存性アミラーゼ分泌を阻害することから,アミラーゼ分泌におけるPLD活性の役割が考えられた。PLD活性にはホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸およびGTPγSが必要でありことが知られている。Arfはその調節に関与する低分子量GTP結合タンパク質の1つであるが,ArfペプチドはPLD活性を抑制するが,アミラーゼ分泌との相関は認められなかった。唾液腺における分泌関連分子の相互作用の研究において,平成14年度には次のことを明らかにした。1)ラット耳下腺腺房細胞においてムスカリン受容体活性化は水やイオン分泌を引き起こすが,この受容体は三量体GTP結合タンパク質と共役し,ホスホリパーゼCを活性化し,Ca^<2+>動態に関わるイノシトール三リン酸(IP_3)を生成する。スフィンゴ脂質の1つスフィンゴシンがGTPγS刺激によるIP_3生成を抑制することを明らかにした。2)ラット耳下腺腺房細胞のアミラーゼ分泌とホスホリパーゼDについて検討し,βアドレナリンおよびムスカリン性受容体刺激によるアミラーゼ分泌調節にホスホリパーゼDが関わっていることを明らかにした。

しかし,以前にわれわれが報告した低分子量GTP結合タンパク質の1つArfは,この調節には関与しないことが示唆された。3)低分子量GTP結合タンパク質の1つ,Rhoについて検討し,ラット耳下腺腺房細胞において,RhoAがβアドレナリン受容体刺激によるアミラーゼの開口放出に関与することを明らかにした。また,RhoAの下流にRhoキナーゼが存在することも明らかにした。4)ウサギ顎下腺腺房細胞において,一酸化窒素(NO)を介したcyclic GMPシグナルが存在することを明らかにした。5)ウサギ耳下腺腺房細胞におけるNOの役割を検討し,腺房細胞で産生されたNOは神経での神経伝達物質を介してアミラーゼ分泌調節に関わることが示唆された。6)ラット舌下腺におけるSNAREタンパク質について検討し,シンタキシン1Aが存在することをウエスタンブロットおよびノーザンブロット解析により明らかにし,細胞間接着部位に局在することを形態学的に明らかにした。
骨髄肥満が骨芽細胞－骨細胞分化系列に与える影響とその制御機構の解明

加齢に伴って骨内では脂肪組織が増加し、骨組織が減少する。このいわゆる骨髄肥満(脂肪髄化)の進行にアディポカイン産生異常、遊離脂肪酸による脂肪毒性などの脂質代謝異常が関与している可能性を考慮し、本事業を行ってきた。本年度は、脂質代謝異常を誘導するため、グルココルチコイド(デキサメサゾン)を骨芽細胞ー骨細胞系ならびに骨髄脂肪組織に投与し、さらに、脂質代謝改善薬であるピタバスタチンを投与して、その影響を検討した。骨芽細胞ー骨細胞系に対しては、濃度依存性に増殖能・遊走能の低下、アポトーシスの増加、骨細胞分化の抑制、細胞外基質との結合性の低下を認めた。一方、骨髄脂肪組織に対しては、組織片周囲に新生する紡錘形の間質細胞に占める前脂肪細胞の割合が増加した。そこにピタバスタチンを投与すると、濃度依存性に前脂肪細胞の割合の低下がみられた。この結果は、ピタバスタチンが、デキサメサゾンによる骨髄内間葉系幹細胞からの脂肪細胞分化亢進を抑制することを示唆している。これまでの研究により、脂肪組織は液性因子を介して骨芽細胞ー骨細胞分化系列に対して、増殖抑制ならびに分化抑制を来すとともに骨芽細胞・骨細胞は脂肪細胞からの前脂肪細胞新生を抑制すること、レプチンを始めとするアディポカインの産生を変化させることが明らかとなった。すなわち骨芽細胞・骨細胞は骨髄脂肪に作用し、骨髄肥満を抑制する作用があると考えられる。また、スタチン系の薬剤は、骨髄脂肪組織における脂肪細胞分化の抑制とともに骨内の脂質代謝を改善し骨形成能の促進を誘導できる可能性があり、骨粗鬆症の新規予防・治療法として期待される。今後、検体数を増やすとともに、アディポカインや酸化ストレスマーカーの発現など脂肪細胞の機能に着目した研究、至適濃度の検討、他臓器に対する影響を含めた更なる研究が必要である。骨では加齢とともに脂肪組織が増加する、いわゆる骨髄肥満(脂肪髄)の状態となる。全身的な肥満症では脂肪細胞肥大によるアディポカイン産生異常、遊離脂肪酸による脂肪毒性、マクロファージによる慢性炎症が、種々の生活習慣病を引き起こす。骨髄脂肪も同様の機序を介して骨形成に影響を与え、骨粗鬆症の発症に関与していることが推測される。ヒト骨髄脂肪組織の単独培養では、1)ヒト骨髄脂肪組織の中心部では、3週まで成熟脂肪細胞および造血細胞が保持され、辺縁部では、紡錘形のBone marrow stromal cell (BMSC)が出現した。このBMSCのうち、CD105/CD44共陽性の間葉系幹細胞が2.8%、脂肪滴を有する前脂肪細胞が0.75%含まれていた。2)ヒト骨髄脂肪組織内に含まれるCD45陽性の白血球はB・Tリンパ球、マクロファージによって構成され、これらにBrdUの取り込みが見られた。一方成熟脂肪細胞の核には陽性所見は認めなかった。BMAT辺縁部では、脂肪滴を有しないBMSCの約3%にBrdUの取り込みが見られた。前脂肪細胞にBrdUの取り込みはなかった。3)骨髄肥満を誘導するためデキサメサゾンを投与したところ、BMSCに占める前脂肪細胞の割合が32%に増加した。インスリンでは増加しなかった。全体のBMSCの数に変化はなかった。骨髄脂肪組織と骨芽細胞の混合培養を行うと、BMSCの新生が有意に抑制された。アディポネクチン分泌は単独培養同様に低値であった。レプチンは骨芽細胞との混合培養で有意に低下した。一方、骨芽細胞の増殖は、骨髄脂肪組織との混合培養により有意に減少した。骨芽細胞分化マーカーはいずれも著明に低下した。今回の実験により骨髄脂肪組織と骨芽細胞は液性因子を介して、互いの増殖、分化を抑制していることが示された。加齢に伴い骨組織が減少するとともに脂肪組織が増加する、いわゆる骨髄肥満(脂肪髄)の状態となる。全身的な肥満症においては脂肪細胞肥大によるアディポカイン産生異常、遊離脂肪酸による脂肪毒性、マクロファージによる慢性炎症が、種々の生活習慣病を引き起こす。前年度までの実験結果より、骨髄脂肪組織と骨芽細胞は液性因子を介して、互いの増殖、分化を抑制していることが示された。本年度は、骨芽細胞の骨芽細胞へ向かう分化段階によって脂肪組織が与える反応性に違いがあるかを検討するため、骨芽細胞ー骨細胞分化系列培養モデルを構築した。マウス由来骨芽細胞株MC3T3-E1をコラーゲンゲル上に40万個播種し、分化誘導因子を添加した。その結果、1骨芽細胞は3週まで細胞数が増加した。22週目以降から骨芽細胞周囲に石灰化がみられ、3-5週では骨小腔様構造を形成した。3sclerostin, DMP1などの骨細胞マーカーの発現が経時的に増加した。すなわち、本培養系では、骨芽細胞がコラーゲンゲル内に遊走し、骨小腔様構造の形成および骨細胞への分化を認めた。本培養系は、骨芽細胞から骨細胞への分化誘導が可能であり、今後、骨芽細胞系細胞の各分化段階に骨髄脂肪組織が与える影響を評価できる有用なツールである。これまで、in vitroで骨細胞を作製することは困難であったが、我々は比較的簡便な手法で骨細胞様細胞の作製に成功した。

この細胞は骨小腔や骨細管に類似した構造を伴い、sclerostin, DMP1などの骨細胞マーカーを発現していることから、形態的、機能的にも骨細胞に近い細胞と考えられる。今後、骨芽細胞の分化段階に対する骨髄脂肪組織ならびにグルココルチコイドなど脂肪分化誘導因子の影響を検討する。加齢に伴って骨内では脂肪組織が増加し、骨組織が減少する。このいわゆる骨髄肥満(脂肪髄化)の進行にアディポカイン産生異常、遊離脂肪酸による脂肪毒性などの脂質代謝異常が関与している可能性を考慮し、本事業を行ってきた。本年度は、脂質代謝異常を誘導するため、グルココルチコイド(デキサメサゾン)を骨芽細胞ー骨細胞系ならびに骨髄脂肪組織に投与し、さらに、脂質代謝改善薬であるピタバスタチンを投与して、その影響を検討した。骨芽細胞ー骨細胞系に対しては、濃度依存性に増殖能・遊走能の低下、アポトーシスの増加、骨細胞分化の抑制、細胞外基質との結合性の低下を認めた。一方、骨髄脂肪組織に対しては、組織片周囲に新生する紡錘形の間質細胞に占める前脂肪細胞の割合が増加した。そこにピタバスタチンを投与すると、濃度依存性に前脂肪細胞の割合の低下がみられた。この結果は、ピタバスタチンが、デキサメサゾンによる骨髄内間葉系幹細胞からの脂肪細胞分化亢進を抑制することを示唆している。これまでの研究により、脂肪組織は液性因子を介して骨芽細胞ー骨細胞分化系列に対して、増殖抑制ならびに分化抑制を来すとともに骨芽細胞・骨細胞は脂肪細胞からの前脂肪細胞新生を抑制すること、レプチンを始めとするアディポカインの産生を変化させることが明らかとなった。すなわち骨芽細胞・骨細胞は骨髄脂肪に作用し、骨髄肥満を抑制する作用があると考えられる。また、スタチン系の薬剤は、骨髄脂肪組織における脂肪細胞分化の抑制とともに骨内の脂質代謝を改善し骨形成能の促進を誘導できる可能性があり、骨粗鬆症の新規予防・治療法として期待される。今後、検体数を増やすとともに、アディポカインや酸化ストレスマーカーの発現など脂肪細胞の機能に着目した研究、至適濃度の検討、他臓器に対する影響を含めた更なる研究が必要である。ヒト骨髄脂肪組織の器官培養により、皮下脂肪組織と同様に成熟脂肪細胞の形態および機能の維持が長期間にわたり可能であった。さらに脂肪組織片周囲に間葉系幹細胞および前脂肪細胞を含む間質細胞が新生し、これが、脂肪組織の増殖に関与していることが示唆された。また、前述のとおり混合培養において、骨芽細胞とのアクティブな相互作用を解析することが可能であった。さらに、骨芽細胞ー骨細胞分化系列モデルを用いた骨髄脂肪との混合培養系の解析も現在進行中であり、おおむね順調に進展している。本研究により、骨髄脂肪組織と骨芽細胞との混合培養による相互作用が示された。骨芽細胞による脂肪組織からの骨髄間質細胞の遊走抑制因子の解明は、脂肪組織のexpansiveな増殖を抑制することになり、肥満の治療に役立つ可能性がある。一方、脂肪細胞による骨芽細胞の増殖・分化の抑制因子を解明することは骨粗鬆症のリスク因子の同定、さらには治療薬の開発につながる。また、骨組織は、骨芽細胞により産生される骨基質およびその中に埋没する骨細胞によって構成され、破骨細胞と骨芽細胞がそのリモデリングを行っている。骨組織は様々な細胞を含む組織であり、骨髄脂肪組織が分泌する液性因子がどの細胞種に影響を与えているのかについても注目する必要があると思われる。
ヒト培養胃癌細胞株を用いた転移モデルの開発とそれに対する各種因子の及ぼす影響

我々はヒト培養胃癌細胞株を用いて、培養皿の中央に一定面積の円形sheet状にinoculationし、その後の細胞の周囲への遊走性を、位相差顕微鏡上で経時的に測定するとともに画像解析装置により、その転移の方向性、速度などの広がりを検討するモデルを開発した。この癌転移モデルは、in vitro系で簡便に癌細胞の遊走能や増殖活性を定量的に解析できるモデルである。このモデルを用いて、我々はヒト培養胃癌および大腸癌細胞株の細胞運動、遊走性を定量的に解析し、細胞骨格蛋白であるアクチンの阻害剤であるcytochalasinB、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤であるwortmannin、カルモジュリンの阻害剤であるW7を各種濃度添加することにより、細胞骨格の役割を検討することから始めた。その結果、アクチン阻害剤、ミオシン阻害剤、カルモジュリン阻害剤により転移能が有意に抑制されることが明らかとなった。さらに培養液の細胞外基質をコラゲーンI型、コラゲーンIV型、ラミニン、フィブロネクチンなどに変えることにより、その影響をも検討し、癌転移のメカニズムを細胞生物学的に検討した。その結果、ラミニン、フィブロネクチン、コラゲーンI型、コラゲーンIV型の順に転移能の低下が確認された。現在、培養液の細胞外基室をコラゲーンIV型に固定し、各種濃度のEGF、TGF-α、TGF-β、HGFなどの各種癌増殖因子や抑制因子を添加し、その転移能を検討中である。
フラーレンナノ微粒子を用いた超精密加工技術に関する研究

コロイダルシリカスラリーに水酸化フラーレン水溶液を混合させることで,サファイアCMPにおける材料除去レートが向上をすることを確認した.材料除去レートの向上に関してはいくつかの水酸化フラーレンの調合条件について確認したところ,水酸化フラーレンの濃度の影響が最も支配的であった.このときの微粒子の状態を動的光散乱法(DLS)や走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した場合,水酸化フラーレンがコロイダルシリカ上に2分子程度吸着していることを示唆する結果が得られた.水酸化フラーレンが吸着した複合微粒子においては,ポリシング前後で水酸化フラーレンの分子構造が崩壊しないことがラマン分光法により確認されている.本年度は水酸化フラーレンによる効果を顕著にするため水酸化フラーレン混合スラリーおける微粒子の粒子径や種類に関する評価やマイクロパッドの作製技術の確立と効果検証,およびエバネッセント光を利用した微粒子計測技術の開発を中心に研究を行った.微粒子の評価は当初コロイダルシリカ微粒子を中心に行う予定であったがダイヤモンド粒子についても検証した.その結果,水酸化フラーレンにおける材料除去レートの向上がコロイダルシリカ微粒子以外にダイヤモンド微粒子でも確認されており,この効果は両者とも粒子径が100nm以下の領域で確認された.ここでは粒子径が小さくなるにつれ研磨レートの向上する傾向を示しており,微粒子径が15nmでは従来のスラリーと比較して2倍程度まで向上することは確認できた.現在メカニズムについては解明されていないが微粒子径が重要な支配的要因であることから微粒子の表面による影響が水酸化フラーレンの効果を顕在化させるものと推測される.マイクロパターンパッドの作製技術としてはパッド材料の選定やインプリントプロセスの開発そしてマイクロパターンの寸法依存性について評価した.パッド材料としてはウレタンやPEEK材などで評価をした.インプリントプロセスは昨年度作製した専用熱圧着炉を使用した.その結果,4インチサイズの均一ぱマイクロパターンパッドを作製することが可能となった.ここではパターン寸法を3μm7μmで評価したところ5μmのパターンでICパッドと比較し2倍程度の研磨レートが得られた.エバネッセント光を利用した微粒子計測技術については研究室所有の専用測定冶具でコロイダルシリカ微粒子がガラス基板に接触する様子を観察した.その結果,コロイダルシリカ微粒子がガラス基板に付着し転動する様子が確認できた.本研究の目的はフラーレンC60の高い化学反応性や分子自体の高硬度な性質を利用し,分子レベルのナノスケール高効率平坦化技術を確立することである.そのため研究実施内容としてはサファイア基板に水酸化フラーレンをシリカスラリーに混合させたとき(以後,混合スラリーと記載)のポリシング効率の向上や水酸化フラーレンにおける水酸基数の影響,さらに紫外線性照射によるポリシング効率の向上に関して評価した.その結果,水酸化フラーレンがポリシング効率の向上に有効であることを確認した.ここではDLSやラマン分光でポリシング前後の混合スラリー中における微粒子について評価したところ水酸化フラーレンがシリカ表面に分子2層程度吸着していることやポリシング前後で変化しないことも確認した.具体的には以下の内容である.混合スラリーに関してはC60(OH)n n=ca.10で水酸化フラーレンの濃度依存性やpH依存性,ポリシング前のサファイア基板の表面粗さの影響についてる評価した.ここでは濃度のが支配的であり,濃度が高くなるにつれポリシング効率向上する結果が得られた.さらに水酸化フラーレンの向上効果はサファイア基板の表面粗さに関する影響する.水酸化基数に関しては水酸化基数12と36の2種類の水酸化フラーレンで混合スラリーを作製し評価を実施した.その結果水酸化基数12が最もポリシング効率が高い結果が得られた.現在も引き続き12が高い理由について検証を行っているが水酸基数の増加にともないフラーレン骨格自体の硬度が低下するためサファイアなどの高硬度な基板に対しては硬いケージ構造が有効ではないかと推測される.最後に混合スラリーに紫外線照射を実施したところ混合スラリーよりポリシング効率の向上効果が確認された.ここではコロイダルシリカ微粒子上に吸着した水酸化フラーレンが光により異なった炭素相へと反応したためと思われる.コロイダルシリカスラリーに水酸化フラーレン水溶液を混合させることで,サファイアCMPにおける材料除去レートが向上をすることを確認した.材料除去レートの向上に関してはいくつかの水酸化フラーレンの調合条件について確認したところ,水酸化フラーレンの濃度の影響が最も支配的であった.このときの微粒子の状態を動的光散乱法(DLS)や走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した場合,水酸化フラーレンがコロイダルシリカ上に2分子程度吸着していることを示唆する結果が得られた.水酸化フラーレンが吸着した複合微粒子においては,ポリシング前後で水酸化フラーレンの分子構造が崩壊しないことがラマン分光法により確認されている.本研究の目的はフラーレンC60の高い化学反応性や分子自体の高硬度な性質を利用し,分子レベルのナノスケール高効率平坦化技術を確立することである.ここでは二酸化炭素低減に貢献するため,LED素子の消費電力の低減や生産性の向上を目指す.具体的にはLED基板に用いられる難加工材料であるサファイア基板について高速加工や高精度化を実現させる.そのため本年度は水酸化フラーレン混合スラリーに関する研究やマイクロパターンパッドの開発,動的光散乱によるフラーレン微粒子の挙動観察を実施した.水酸化フラーレン混合スラリーはダイヤモンド粒子の分散液やコロイダルシリカスラリーに水酸化フラーレン水溶液を混合することにより作成した.

ここでは水酸化フラーレン混合により従来の加工液と比較して,研磨速度の向上することを確認した.特にコロイダルシリカスラリーの混合実験においては水酸化フラーレンの濃度,pH,微粒子の粒径の影響について評価したところ,水酸化フラーレン濃度が研磨レートに対して最も支配的であった.これらのパラーメータを最適化した結果,水酸化フラーレンを混合により研磨効率が30%向上した.さらに本研究では実用化も視野に入れ,水酸化フラーレンのリサイクル技術についても検討を行っている.次にマイクロパターンパッドの製作プロセスの開発について報告する.マイクロ金型はシリコンウェーハにウェットエッチプロセスによりホール形成することで作成した.マイクロパターンパッドはこのマイクロ金型に熱可塑性樹脂板を押しつけ,加熱することにより樹脂板表面にホール形状を転写することにより形成した.今回は寸法10μm程度のピラミッド形状のマイクロパターンを形成し,研磨性能を評価した.その結果,パターン寸法や形状については最適化は実施してはいないが従来パッドと同等な性能が得られてた.本研究では水酸化フラーレンによるナノスケール超平坦化技術を確立することであり,ここでは研磨レートの向上や加工後の表面粗さを分子レベルにすること,そしてメカニズムの解明を目指している.研磨レートの向上については本年度はフラーレン砥粒の粗大化および粒子径性制御技術の確立を実施する予定であったが,コロイダルシリカ微粒子やダイヤモンド微粒子などの混合微粒子の粒子径による影響が顕著であることが確認できたため,当初これらの評価を優先した.その結果,水酸化フラーレンにおける研磨レートが向上する効果は両者とも粒子径が100nm以下の領域で確認された.ここでは粒子径が小さくなるにつれ研磨レートのが向上し,微粒子径が15nmでは2倍程度まで向上することは確認できた.またフラーレン砥粒の粗大化については水酸化フラーレン水溶液の場合混合溶媒ではフラーレン砥粒の粗大化せず,pH14からpH3まで変化させた場合pHの低下によりフラーレン砥粒のサイズが増大することを確認できたことから概ね順調に進展していると判断した..マイクロパターンパッドについては昨年度購入した専用熱圧着炉を使用し,ウレタンやPEEK材などで研磨レートの効果について検証した.ここではパターン寸法を3μm7μmで評価したところ5μmのパターンでICパッドと比較し2倍程度の材料除去レートが得られており,パターンの最適化についても概ね順調に進展している.フラーレン砥粒の微粒子計測については研究室所有の専用測定冶具で観察を行いエバネッセント光からの散乱光を解析することにより微粒子がガラス基板に付着し転動する様子を観察できたのでおおむね順調に進展している.
セルトリ細胞における周期的遺伝子発現変化の解析

セルトリ細胞は、精細管内に唯一存在する体細胞で、精子形成に必要な微小環境の形成に中心的な役割を果たしている。さらにセルトリ細胞の遺伝子発現は、I-XIIに分類される生殖細胞のステージに合わせて周期的に変化していくことが知られている。前年度までの研究で、レチノイン酸シグナルがステージVII-XIIで活性化されていることを示唆するデータが得られていたが、in vivoにおける周期的発現との関連性は不明であった。そこで、in vivoにおいてセルトリ細胞特異的にレチノイン酸シグナルを不活性化し、精子形成およびステージ依存的遺伝子発現への影響を調べたところ、ステージVII-XIIでセルトリ細胞における遺伝子発現の変化が抑制されるとともに、生殖細胞のアポトーシスが誘導されることがわかった。さらにin vivo RNAiの実験から、このアポトーシスの原因の一部は、血液-精巣関門のステージ依存的な制御の異常であることが判明した。さらにレチノイン酸シグナルの他に、Notchシグナルもステージ依存的発現パターンに関与していることを見いだしている。これらの結果は、セルトリ細胞の遺伝子発現、すなわち精子形成における周期的な微小環境の変化がどのような機構で制御されているかを示す新たな発見であり、これらの知見は、現在不可能であるex vivoでの精子形成といった不妊治療への応用が期待される。現在は、これらの研究成果を発表すべく論文を執筆中である。これまでの研究から、レチノイン酸シグナルが精子形成の周期性に関わっていることが示唆されていたが、その詳細な制御機構はよくわかっていなかった。また、セルトリ細胞の周期性が精子形成においてどのような役割を担っているかも不明であった。本研究では、まずセルトリ細胞の周期的発現変化の全体像を理解するため、マイクロアレイを用いて網羅的な解析を行い、419コのステージ依存的遺伝子群を単離した。また、精細管内のレチノン酸シグナルの活性化レベルは、ステージI-VIで低く、ステージVII-XIIで高いことがわかり、この周期的なレチノイン酸シグナルの変動によって、ステージ依存的遺伝子群の発現パターンの一部を説明できることを発見した。さらに、セルトリ細胞特異的なレチノイン酸シグナルの不活性化や、レチノイン酸シグナルによって発現が誘導される転写因子MafBのin vivoノックダウンによって精子形成に異常が生じることから、レチノイン酸シグナルによるセルトリ細胞を介したステージ特異的微小環境の構築が精子形成に必須であることを示した。これらは、今まで不明であったセルトリ細胞における周期性の制御機構の一部を明らかにするものであり、その精子形成における重要性を示す新たな発見である。さらにこれらの知見は、現在不可能であるex vivoでの精子形成といった不妊治療への応用が期待される。