hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬剤耐性菌流行株の拡散機構の解明

近年、薬剤耐性菌による難治性の感染症が世界的な公衆衛生上の重大な問題となってきており、特に、2000年代に急激に進化を遂げたカルバペネム系抗菌薬耐性を含む多剤耐性のグラム陰性菌は、感染症の治療に有効な抗菌薬がほとんど存在しない。MLST (multilocus sequence typing)による分子疫学分類において、アシネトバクター・バウマニのST2 (sequence type 2)、緑膿菌のST235、大腸菌のST131などは、日和見感染症の起因菌ながら同一クローンが世界中の医療機関に拡散していることが明らかになっている。本研究では、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株において、菌株特異的なVI型分泌タンパク質遺伝子tseX (それぞれtseX-ab、tseX-pa、tseX-ecと命名)を同定した。アシネトバクター・バウマニの流行株(ST2株)から同定したTseX-abは細菌、緑膿菌の流行株(ST235株)から同定したTseX-pa、および大腸菌の流行株(ST131株)から同定したTseX-ecは宿主細胞を標的としていることが推測された。細菌および宿主細胞内において各TseXの標的分子の同定を試みた。TseXの酵素活性が明らかな場合には、活性部位の変異体を作製し、野生型と変異型を合わせて検討を行なった。野生株とtseX欠損株の混合培養実験、野生株とtseX欠損株の培養細胞への感染実験を行い、TseXの細胞障害性や宿主自然免疫経路の阻害など、標的因子が細胞機能に与える影響を解析した。オプソニン化した細菌をFcγ受容体を安定発現させたCHO-Fcγ細胞に感染させ、貪食および細胞内膜輸送を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株(それぞれMLST解析にて、ST2、ST235、ST131に属する株)において、菌株特異的なVI型分泌タンパク質遺伝子tseX (それぞれtseX-ab、tseX-pa、tseX-ecと命名)を同定し、現在、臨床上問題となっている薬剤耐性グラム陰性菌の流行株において、VI型分泌タンパク質TseXの酵素活性に依存した細胞障害性の分子メカニズムを解析することができた。アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株(それぞれST2、ST235、ST131)を用いたマウス経鼻感染モデルを構築する。菌種・菌株毎に最適な投与菌量や感染期間の条件検討を行い、個体の体重増減、肺における生菌数、感染部位局所での病理組織像、血中におけるサイトカイン産生量などの項目を解析する。各菌種において、野生株とtseX欠損株の混合感染を行い、細菌-宿主間に加えて、投与した細菌-細菌間の相互作用も考慮する。細菌のVI型分泌機構(T6SS)を構成する装置は、バクテリオファージの尾部構造と類似した鞘状構造を細胞質内に形成しており、ATPをエネルギー源とする伸縮運動によって、同構造の内部に収められたシリンジを隣接細胞へ物理的に注入する。シリンジはHcpタンパク質がリング状に重合して形成されており、先端には別のトランスロケーターであるVgrGタンパク質とPAARタンパク質がスパイク状構造を形成している。今までに報告されたほとんどのVI型分泌タンパク質の分泌経路は「VgrGとの結合」または「VgrGとの融合」であり、前者の場合には、しばしばvgrG遺伝子と酵素活性を有する基質タンパク質をコードする遺伝子がオペロンを形成しており、後者の場合にはvgrG遺伝子のC末端に酵素活性ドメインが融合している。本年度は、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の多剤耐性流行株において、新規のVI型分泌タンパク質候補の探索を行った。各菌株において、流行株と非流行株を含めた大規模な比較ゲノム解析を行い、菌株特異的なvgrG遺伝子を同定した。各菌株特異的なvgrG遺伝子において、vgrGの下流に存在するtseX遺伝子の遺伝子産物が「VgrGとの結合」によってT6SSを介して分泌されることが示唆された。また、各菌株の特異的なvgrG遺伝子の遺伝子産物において、「VgrGとの融合」型のVI型分泌タンパク質となることが推測される酵素活性ドメインを同定することはできなかった。各菌株に関して、細菌用発現ベクターにHAタグを付加させたtseX遺伝子のクローニングを行い、各菌株の野生株と各vgrG欠損損株でTseXを発現誘導し、増殖速度と生菌数からTseXの酵素活性に依存した細胞障害性を確認し、培養上清中の分泌タンパク質を濃縮し、抗HAタグ抗体で検出することによって、TseXのT6SSを介した分泌を検討した。目標としていたアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の多剤耐性流行株において、新規のVI型分泌タンパク質候補TseXを同定し、各菌株において、TseXの酵素活性に依存した細胞障害性を確認し、TseXのT6SSを介した分泌を検討した。

MLST (multilocus sequence typing)による分子疫学分類において、アシネトバクター・バウマニのST2 (sequence type 2)、緑膿菌のST235、大腸菌のST131などは、日和見感染症の起因菌ながら同一クローンが世界中の医療機関に拡散していることが明らかになっている。本研究では、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株において、菌株特異的なVI型分泌タンパク質遺伝子tseX (それぞれtseX-ab、tseX-pa、tseX-ecと命名)を同定した。アシネトバクター・バウマニの流行株(ST2株)から同定したTseX-abは細菌、緑膿菌の流行株(ST235株)から同定したTseX-pa、および大腸菌の流行株(ST131株)から同定したTseX-ecは宿主細胞を標的としていることが推測された。細菌および宿主細胞内において各TseXの標的分子の同定を試みた。TseXの酵素活性が明らかな場合には、活性部位の変異体を作製し、野生型と変異型を合わせて検討を行なった。野生株とtseX欠損株の混合培養実験、野生株とtseX欠損株の培養細胞への感染実験を行い、TseXの細胞障害性や宿主自然免疫経路の阻害など、標的因子が細胞機能に与える影響を解析した。オプソニン化した細菌をFcγ受容体を安定発現させたCHO-Fcγ細胞に感染させ、貪食および細胞内膜輸送を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株(それぞれMLST解析にて、ST2、ST235、ST131に属する株)において、菌株特異的なVI型分泌タンパク質遺伝子tseX (それぞれtseX-ab、tseX-pa、tseX-ecと命名)を同定し、現在、臨床上問題となっている薬剤耐性グラム陰性菌の流行株において、VI型分泌タンパク質TseXの酵素活性に依存した細胞障害性の分子メカニズムを解析することができた。細菌内または哺乳類細胞内においてTseXと結合するタンパク質をLC-MS/MSにて探索し、標的因子の同定を行う。TseXの酵素活性が明らかな場合には、活性部位の変異体を作製して、野生型と変異型を合わせて検討を行う。TseXの標的因子の機能が未知である場合は、細菌においては欠損株の作製、哺乳類細胞においては過剰発現、shRNAによるノックダウン、CRISPR/Cas9によるノックアウトを組み合わせて検討を行う。野生株とtseX欠損株の混合培養実験、野生株とtseX欠損株のHeLa細胞およびCHO細胞への感染実験を行い、TseXの細胞障害性や宿主自然免疫経路の阻害など、標的因子が細胞機能に与える影響を解析する。また、オプソニン化した細菌をFcγ受容体を安定発現させたCHO-Fcγ細胞、RAW264.7細胞、DC2.4細胞に感染させ、貪食および細胞内膜輸送を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察する。細胞内微小構造の精査が必要な場合には透過型電子顕微鏡による観察も行う。実験の進度に合わせて、臨床分離株を用いたマウス経鼻感染モデルを構築する。菌種・菌株毎に最適な投与菌量や感染期間の条件検討を行い、個体の体重増減、肺における生菌数、感染部位局所での病理組織像、血中におけるサイトカイン産生量などの項目を解析する。野生株とtseX欠損株の混合感染を行う場合には、TseXの活性によっては、細菌-宿主間に加えて、投与した細菌-細菌間の相互作用も考慮する。アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌の臨床分離多剤耐性流行株(それぞれST2、ST235、ST131)を用いたマウス経鼻感染モデルを構築する。
保型形式の周期とL関数の特殊値

Kartik Prasanna(ミシガン大学)と共同で、総実代数体上の四元数体の乗法群に対し、Jacquet-Langlands対応と絶対Hodgeサイクルの研究を行った。今までの議論を大幅に簡略化し、絶対Hodgeサイクルを構成することに成功した。特に、準分裂とは限らないユニタリ群に関するArthur分類と、PEL型とは限らないアーベル型志村多様体に関するKisin-Shin-Zhuの結果をともに回避することができた。論文は二部に分けて執筆する予定であり、第一部は執筆を完了し雑誌に投稿した。Wee Teck Gan(シンガポール国立大学)と共同で、メタプレクティック群の保型離散スペクトルの研究を行った。これはArthurによる古典群の保型離散スペクトルの分類の一般化・Waldspurgerによる重さ半整数保型形式の分類の高次元化に相当する。緩増加部分については既に精密な記述を得ていたが、階数2の場合に対して非緩増加部分についても精密な記述を得ることに成功した。Shih-Yu Chen(国立台湾大学)と共同で、2次斜交群の生成的保型形式の周期の研究を行った。懸案となっていた局所積分の計算を完了し、周期を随伴L関数の特殊値で表す精密な公式を証明した。さらに、稠密性による議論を開発することで、マース形式に関しても公式を証明することができた。論文は執筆を完了し、雑誌に投稿した。Alberto Minguez(ウィーン大学)と共同で、法l表現のテータ対応の研究を行った。小さい素数lに関し、初等的だが病的な例について調査した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Wee Teck Gan(Singapore国立大)と共同で、局所Gross-Prasad予想とテータ対応に関するPrasad予想の研究を行い、完了させた。この二つの予想は、p進体上のユニタリ群の表現に関するある種の分岐則の問題を、数論的不変量であるイプシロン因子を用いて記述する。平成25年度までの研究により証明はほぼ完了していたが、証明に現れる符号が既存の文献の結果と整合しないことが分かったため、状況の解明を行う必要に迫られた。共同研究者、当該文献の著者、また当該分野の研究者数名を交えて直接討論を行った結果、文献に誤りがあることが分かり不具合の解消に至った。Erez Lapid(Weizmann科学研究所)、Zhengyu Mao(Rutgers大)と形式次数予想の研究を行い、p進体上の奇数次特殊直交群の離散系列表現に関する形式次数予想を解決した。これも平成25年度までの研究により証明はほぼ完了していたが、更なる応用を目指し実数体上のシンプレクティック群の二重被覆に対する形式次数の公式から、Lapid-Maoによる局所等式が従うことを証明した。この研究はLapid-Maoによる保型形式のWhittaker係数の研究に応用される。形式的な計算はp進体上と同様だが、積分の収束性の正当化に大きな困難が生じた。この困難をAizenbud-Gourevitchによる不変超関数に関する不確定性原理を用いて克服した。Kartik Prasanna(Michigan大)と四元数体上の保型形式の周期の研究を行った。目標としている周期関係式の証明に必要な技術的計算をすべて完了させた。Wee Teck Gan(Singapore国立大学)と共同で、メタプレクティック群の保型離散スペクトルの研究を行った。メタプレクティック群はシンプレクティック群の二重被覆であり、Arthurによる古典群に対する結果・Waldspurgerによる重さ半整数保型形式に対する結果の一般化として、その保型離散スペクトルを決定することは興味深い。テータ対応と、奇数次特殊直交群に対するArthurの結果を使うことで、メタプレクティック群の保形離散表現の近同値類に対し、そのAパラメータを定義することができた。またAパラメータが緩増加という仮定のもとで、対応する近同値類の既約分解を大域イプシロン因子を用いて記述することができた。Kartik Prasanna(Michigan大学)と共同で、四元数体上の保型形式の周期の研究を行った。まず、Weil表現・Jacquet-Langlands対応・Rallis内積公式や関連する計算を含む準備の論文の執筆を行い、完了させた。この論文は、今後の一連の研究に対して基礎的な役割を果たすものになる。また、Jacquet-Langlands対応に対して新たな進展があった。Tate予想から、Jacquet-Langlands対応は対応する志村多様体の積のサイクルを用いて実現されることが期待されている。サイクルの構成は難しいと思われるが、Hodgeサイクルの構成へのアプローチを得ることができた。Wee Teck Ganとのメタプレクティック群の保型離散スペクトルの共同研究は、平成27年度に開始したものであるが、緩増加という仮定のもとではあるが大域的な結果を得ることができた。Jian-Shu Liによる安定領域に対するテータ対応の結果をうまく援用したことで、議論が著しく単純になり結果につながったと考えられる。残っている課題は、重複度公式に現れる局所表現を局所志村対応を用いて記述することである。これもMoeglinによる局所Aパケットに対する結果を使い、非アルキメデス体に対しては解決することができた。Kartik Prasannaとの四元数体上の保型形式の周期の共同研究は、平成20年度に開始したものである。

設定を行うだけでも多くの計算を必要とする困難なものであったが、ようやく準備の論文の執筆を完了することができた。Hodgeサイクルに関して進展があったため、もともと行っていた周期関係式の研究は一時中断し、新たな研究に集中した。Kudla-Milsonによる調和形式の制限を詳しく調べ、今まで行っていた四元数体に対するテータ対応の研究を組み合わせることで、所望のHodgeサイクルの構成へのアプローチを得た。今年度も、研究は着実に進展したといえる。Wee Teck Gan(Singapore国立大学)と共同で、シンプレクティック群の二重被覆であるメタプレクティック群の保型離散スペクトルの研究を行った。これはArthurによる古典群の保型離散スペクトルの分類の一般化・Waldspurgerによる重さ半整数保型形式の分類の高次元化に相当する。平成27年度の研究において、安定領域のテータ対応を用いることで大域理論を完成させ、さらに安定領域のテータ対応と同階数のテータ対応を比較することで、実数体の場合を除いて局所理論も完成させていた。平成28年度はこの残っている実数体の場合の局所理論を研究した。解決には至らなかったものの、概ね方針を立てることができた。Kartik Prasanna(Michigan大学)と共同で、四元数体上の保型形式と周期、特にJacquet-Langlands対応とHodgeサイクルの研究を行った。Tate予想によると、Jacquet-Langlands対応は対応する四元数志村多様体の積のサイクルにより実現されるはずである。このサイクルの構成は非常に難しいため、対応するHodgeサイクルの構成を目標として研究を行った。四元数志村多様体の積をユニタリ志村多様体に埋め込み、テータ対応を用いてユニタリ志村多様体上のHodgeサイクルを構成し、それを制限することで所望のHodgeサイクルを構成した。またユニタリ志村多様体のコホモロジーに現れるガロア表現に対する標準的な予想の仮定のもと、このHodgeサイクルがTateサイクルであることも明らかになった。Wee Teck Ganとのメタプレクティック群の保型離散スペクトルの共同研究は、実数体の場合の局所理論を除いて完成している。この局所理論においては、安定領域のテータ対応と同階数のテータ対応が整合していることを示す必要がある。最終的には重複度公式を用いた大域的議論を援用する予定だが、そこまで帰着させるために標準加群とは限らないある種の誘導表現の既約性を示す必要があった。この既約性はKazhdan-Lusztigアルゴリズムを比較することにより、内視群の標準加群の既約性に帰着できることが明らかになった。Kartik Prasannaとの四元数体上の保型形式と周期の共同研究は、平成27年度までの研究においてその基礎付けを完了してある。これに基づいて、新しい進展が見られたJacqeut-Langlands対応とHodgeサイクルの研究を優先して行った。鍵となるのは四元数体上の歪エルミート形式を用いた定式化である。
仮想肺組織量を指標とした、肺切除後のリモデリング“代償性肺成長”の検証

ヒトでは肺は一般的に再生しない臓器とされるが、その再生能力は本当にゼロであろうか。動物実験では、肺切除後の残存肺の摘出検証が可能であり、重量・容積・DNA量が肺損失を代償するように回復し代償性肺成長と称される。同検討法はヒトでは使用できないため、非侵襲的な検証が必須であった。我々は、急性呼吸促迫症候群の重症度定量法を参考にし、CT画像解析ソフトを用いた仮想肺組織量測定法を提唱した。健常成人による同手法の検証では、吸気相の影響を受けず、肺重量の測定が可能と判断した。健常成人ドナーの肺葉切除後および肺癌の肺切除後(10亜区域以上)において、代償性肺成長類似の現象を仮想肺組織量で検出した。一般的に再生しない臓器とされる肺は、再生医療研究の分野で、他臓器に比較し大幅に遅れている。しかし動物実験では再生に関する実験は進みつつあり、肺を切除した後の残存肺重量・容積・DNA量が肺損失を代償するように回復し、代償性肺成長(Compensatory lung growth:以下CLG)と称されている。ヒトにおいて、肺切除後の残存肺を切除して代償性肺成長を直接的に検証することができないため、我々はCT画像解析ソフトを用いた“仮想肺組織量:Estimated Lung Weight、以下ELW"測定法を新規に開発し、昨年度にその検証実験を行った。昨年度に施行の肺癌肺切除後のCLGの検証をさらに推し進め、肺癌患者40名におけるCLGの検証を行った。切除亜区域数が10未満の肺葉切除後(N=20)のELWは予測値比で平均89.5±19.6%と低下を示したが、切除亜区域数10以上の肺葉切除後(N=20)のELWは予測値比が平均128±30.2%と有意差を持って予測値より良好であった(p<0.0001)。成人においてもある一定量以上の肺切除後には、動物実験と同様に代償性肺成長が生じている可能性があると考えられた。Wistar ratより両側肺を摘出し、気管気管支洗浄後に消化酵素を用いて蛋白分解を行い、細かく分割し、フィルタリング、酵素処理を加えることでラットAT-II細胞を高い純度で分離した。左肺全摘後ラットに経気道的にAT-II細胞を注入するモデルを作成した。これらは先の全摘群の右残存肺と比較して、肺容量は同等でありながら、肺胞腔は小さいという結果であった。また、左肺全摘後にAT-II細胞を気道内注入した群では、肺胞壁間距離は全摘群と比べて有意に小さい結果であった。以上より、ATーII細胞を肺全摘後ラットの気道内注入することで、肺再生が促された可能性が示唆された。ヒトでは肺は一般的に再生しない臓器とされるが、動物実験では、肺切除後の残存肺重量・容積・DNA量が肺損失を代償するように回復し代償性肺成長(ELW)と称される。この現象を検証には残存肺切除が必要であるが、同手法はヒトでは使用できないため、CT画像解析ソフトを用いた“仮想肺組織量:Estimated Lung Weight、以下ELW"測定法を開発した。肺切除後、生体にもともと備わっている肺の再生能力を、ELWで詳らかにし、肺再生を起こし易い患者背景を抽出することを目標とする。今まで低肺機能が故に標準治療が受けられなかった肺癌患者の中で、肺機能回復が大きく期待できるのであれば、マージナルな症例に対し手術を提供できると考える。さらに、肺胞組織幹細胞を内包するとされるII型肺胞上皮(AT-II)の気道内移入による肺再生技術を実験動物レベルで、ELWの概念を併用し実証することが可能になれば、将来ヒトへの応用への道が開けると確信する。2012年臨床呼吸生理に“重喫煙者の慢性閉塞性肺疾患の患者では、肺切除後に有意なELWを示さない"が掲載された。一方、2013年Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgeryに健常成人ドナーの肺葉切除後に代償性肺成長類似の現象が認められることを示した論文が掲載された。また、肺癌の術後肺においても10亜区域以上の切除において、健常成人ほどではないものの代償性肺成長類似の現象を検出可能であり、同論文は2013年Surgery TodayにIn pressとなり、2014年に掲載の予定である。マウスに左肺全摘を行い、術後継時的に動物CTを撮影し、継時的に肺容積の増大およびELWの増大を認めた。また、肺全摘後の残肺に今後AT-IIを注入すること、すなわちセルソースの追加が代償性肺成長を促進する事を検証したい。基礎実験として、CTを用いた"

仮想肺組織量"測定法の妥当性の検証を健常成人5人に対して行った。Spiro meterを併用し、深吸気位→中間位→深呼気位の3相で肺容積(ml)、平均肺密度(g/ml)を測定した。肺容積は吸気から呼気に移行するにつれて増加傾向を示し、逆に平均肺密度は低下傾向を示し、両者を掛け合わせることで算出した"仮想肺組織量"は、呼吸相に関わらず一定であった。CTの撮影条件に関わらず、CTを用いた"仮想肺組織量"測定法は妥当であると判断した。全25例において、亜区域数を用いた予想式を用いて、呼吸機能、術側の肺容積と"仮想肺組織量"について、術後実測値と予測値との相違を検証した。FVCは113±11%、FEV1は110±13%であり、有意差は認めないものの、予測値より良い傾向を示した。術側肺容積は143±36%と、有意に改善し(p < 0.003)、術側"仮想肺組織量"は105±33%でほぼ予測値どおりであった。COPD症例群(A群:4例)および非COPD症例群(B群:21例)に分けて同様の検討を行った。手術後平均3.4年で当検討を行った。術側肺容積の術後予測値に対する変化率(%)は、A群では117±9.3%であったのに対し、B群では147±37%であった。COPD群に比較し、非COPD群において、有意に良い容積の改善率を示した(p < 0.005)。術後"仮想肺組織量"の予測値に対する変化率(%)で示す。A群は74±3.3%であったのに対し、B群は、110±33%であった。COPD群は、非COPD群より有意に低い術後"仮想肺組織量"を示した(p < 0.00001)。肺切除後の代償過程において、COPD群では、肺組織量の低下を伴う肺容積の増大を示した。COPD群では、肺組織の再生・修復機能の低下を窺わせる肺の過膨張を示したと考えられた。本年度達成目標であった、ヒトにおける肺切除後のリモデリング“CLG"の検証に関して、昨年度に施行の肺癌肺切除後のCLGの検証をさらに推し進め、肺癌患者40名におけるCLGの検証を行うことができた。動物実験では、CLG発生のため一定量以上の肺切除後による物理的肺膨張刺激、血流の増加、増殖因子が必要であるとされていた。我々の研究では、上記3因子の影響が大きいと考えられる切除亜区域数10以上の肺葉切除後(N=20)と比較的小さな肺葉切除の切除亜区域数が10未満の肺葉切除後(N=20)の2群に分けて、CLGを検証し、大きな切除群のみにCLGと思われる現象を確認することができた。本年度達成目標のヒトにおける肺切除後のリモデリング“CLG"の検証は、順調に進展したと判断された。さらに、動物実験も部分的に施行が可能であった。Wistar ratより体性幹細胞とされるラットAT-II細胞を高い純度で分離し、肺全摘後ラットの気道内注入することで、形態学的検証に肺胞構造の再生が促された可能性が示唆された。1AT-II細胞の分離と培養2AT-II細胞を用いた肺再生モデルの作成に着手できたと判断した。以上より、「研究の目的」の達成度はおおむね順調に進展していると判断した。肺切除後の再成長モデルとして、動物実験では片肺全摘がしばしば用いられている。片肺全摘後に残存肺が代償性再成長を示すことは、大型動物でも報告されている。このCLGは,片肺全摘後の残存肺過膨張を抑制することにより生じなくなることから、ストレッチなどの機械的刺激がトリガーになっていると考えられている。
幹細胞の未分化性を長期維持し分化効率を高める再生医療バイオインターフェイスの創製

本研究の目的は胚性幹細胞の分化・未分化特性を制御する培養システムを構築することである。分化系においては効率的に胚様体を誘導することを試みた。培養基材としてU字型形状を有し、その表面に生体細胞膜と同様のリン脂質極性基を集積化した表面(PCサーフェイス)を作製した。PCサーフェイス上でES細胞は全く接着することなく、かつ、基材中央部に集中した。その結果、通常の作製方法と較べて迅速な胚様体の誘導を可能にした。PCサーフェイス上では単一かつサイズを制御した胚様体の作製に成功した。これは、これまでの不均一な胚様体を規格化することにつながると期待できる。また、分化誘導因子による刺激添加後、神経細胞への誘導を確認した。新しい培養基材を創製するために、光反応性のリン脂質ポリマーを調製した。光反応性リン脂質ポリマーは基材表面に塗布後、紫外線を照射することでゲル化する。これをもちいて培養基材の表面修飾を行った。また光照射時にフォトマスクを介することで任意のマイクロパターン表面を得ることができる。ここでは、光反応性リン脂質ポリマーを用いて、任意のサイズのマイクロパターン化表面を得た。マイクロパターン表面上にES細胞を播種すると、細胞はリン脂質極性基の集積化表面上には接着することなく、それ以外の細胞外マトリックス吸着領域のみに選択的に接着した。培養を継続すると、細胞外マトリックス領域のみで成長した。この細胞の未分化性を評価したところ、ES細胞が高い未分化性を維持していることがわかった。これは、マイクロパターン表面がES細胞の機能を誘導できることを示唆した。本研究の目的は胚性幹細胞(ES細胞)の分化・未分化を制御する培養システムを構築することである。分化系においては効率的に胚様体(EB)を作製することを目的にした。基材表面に生体膜類似構造を構築できる2-メタクリロイルオキシエチルポスホリルコリン(MPC)を一成分としたMPCポリマーを用いた。MPCポリマー表面では既存の培養基材と比較して迅速なEB形成および細胞播種数に応じたサイズ制御を可能にした。形成したEBは既存法で作製したEBよりも細胞間接着に関与する転写因子発現が亢進していた、一方で分化に関与する転写因子発現を抑制していた。特定の分化刺激後ではそれに関与する転写因子発現の亢進を認めた。これまでのEBはその不均一性から分化誘導効率が低かったと考えられる。均一サイズのEBを提供できる基材は分化誘導研究におけるボトルネックを解消できると期待される。今後は分化におけるEBサイズの影響を検討する。未分化系においてはフォトリソグラフィーによる光反応性ポリマーを用いたマイクロパターン化表面を作製した。細胞接着領域として100マイクロメートル四方のゼラチン表面とし、その周囲にMPCポリマーを固定化したマイクロパターンとした。マイクロパターン内ゼラチンに接着したES細胞は増殖するに従いコロニー形成した。コロニーはパターンサイズ以上に成長することはなかった。一方、マイクロパターン外の表面ではコロニーが巨大化した。マイクロパターン内のコロニーは免疫染色の結果、未分化性を維持しているのに対し、それ以外の領域で巨大化したコロニーは未分化性を消失していたことを示した。つまり、既存の細胞培養法は実験者の経験則に依存するのに対し、マイクロパターン基材では常にコンスタントに未分化を維持したES細胞培養が可能であると考えられる。今後は種々のサイズのマイクロパターンを作製し、分化抑制培養に最適なコロニーサイズを規定できる基材の作製を検討する。
リンチ症候群発症機序の解明と創薬に向けたDNAミスマッチ修復蛋白質の構造機能解析

DNAミスマッチ修復系関連因子の機能異常は、主要な遺伝性腫瘍症候群のひとつであるリンチ症候群の原因となる。ミスマッチ修復系で中心的な役割を果たすMutLタンパク質の立体構造および機能を明らかにすることで、mutL遺伝子上の変異がリンチ症候群発症に繋がる分子メカニズムを明らかにし、リンチ症候群の診断基準の構築に貢献する。また、MutL阻害薬は免疫チェックポイント阻害薬のアジュバントとなる可能性が指摘されている。そのため、MutLタンパク質の立体構造解析によって創薬のための基盤を構築することを目指す。
放射線による細胞死(アポトーシス)におけるp21遺伝子の役割

p21遺伝子は細胞周期を止め、増殖を停止させる働きを持つ遺伝子である。よって、p21遺伝子を細胞内で絶えず発現させると細胞は増殖を停止させるため、p21遺伝子を細胞内で永続的に発現させた細胞を得た論文はない。本研究では、p21遺伝子と制御遺伝子を同時に細胞に導入しp21遺伝子の発現を制御できるシステムを作り、永続的な発現細胞を作製し、p21遺伝子による細胞周期の停止と放射線に対するアポトーシス制御のメカニズムを明らかにする予定である。実験概要は、【発現ベクターの作製】ヒトp21遺伝子の制御遺伝子を薬剤(ハイグロマイシン)耐性遺伝子を持つ発現ベクターに組み込んだ(発現ベクター1)。ヒトp21遺伝子を薬剤(ネオマイシン)耐性遺伝子を持つ発現ベクターに組み込んだ(発現ベクター2)。【細胞への導入と発現細胞の選択】細胞(白血病細胞であるU937)に発現ベクター1を電気穿孔法にて導入した。培地中に薬剤(ネオマイシン)を入れ薬剤耐性の細胞を単離した(50個)。単離した細胞が制御遺伝子を発現しているかどうか各細胞から蛋白質を調製してWestern法を行った。その内、制御遺伝子を発現している細胞を2種選択し増殖させた。それに発現ベクター2を電気穿孔法にて導入した。培地に薬剤(ネオマイシン)を入れ薬剤耐性の細胞を単離した(50個)。この細胞では、制御遺伝子蛋白がp21遺伝子のプロモーターに結合することにより、p21遺伝子の発現を通常は制御している。そして、IPTGを細胞に加えることにより、制御遺伝子蛋白はp21遺伝子のプロモーターより外れ、p21遺伝子を発現させるというメカニズムなので、単離した細胞の培地中にIPTGを入れた後、p21蛋白質を発現しているかどうか各細胞から蛋白質を調製してWestern法を行った。IPTGを細胞に加えることによりp21蛋白質を誘導する細胞を得た。しかし、p21遺伝子の発現を完全に制御することができる細胞は得れないため、再度細胞の選択を行う予定である。
フロベニウス多元環のガロワ被覆と変形理論の研究

アルチン多元環A上の有限次元左A-加群のなすカテゴリーをmodAと表わす。Aがフロベニウスの場合にカテゴリーmodAの代数的構造を解明することを目指し、とくにAがガロワ被覆をもつ場合について調べた。群Gによって定義されるAのガロワ被覆をAとすると、一般にAは単位元をもたないが有限次元A-加群の成すカテゴリーは、局所的には有限次元多元環上の加群の成すカテゴリーとみなせる。このときの環が大局次元有限となる場合がもっとも重要となる。そこで上記課題の解明への手がかりとして、次の二つの方向から取り組んだ。(1)フロベニウス多元環が変形イデアルIをもつ場合に、Aの(Iによる)任意の拡大環もフロベニウスになるが、-意的には決らない。そこでこれ等拡大環上の加群の成すカテゴリーについて普遍的な性質は何か、という問題について考察を試みた。その結果、socleによる剰余環上の加群のカテゴリーは射影加群を法として同型になることが証明できた。(2)大局次元有限な環の構造を明らかにするためのある予想が立てられた。もし肯定的な証明が発見されればホモロジー次元についての未解決問題とも関連すると思われる。現在のところ証明の見通しは立っていないが、中山環(=単列環)の場合について肯定的に成立することが証明できた。来年度は、これらの結果をもとにしてさらにフロベニウス多元環のカテゴリーについて研究を続ける予定である。
ウイルス様粒子を新規材料とした膜タンパク質結合RNAアプタマー創製法の開発

本研究は、膜タンパク質の生理的構造を維持できるウイルス様粒子(VLP)に着目し、これを次世代医薬として期待される核酸抗体「RNAアプタマー」の新規選抜材料とすることで汎用的な膜タンパク質結合分子創製技術基盤を確立することを目的とする。本年度は、昨年度の技術基盤の構築に引き続き、創薬標的として困難でありながら需要の高い数種のGタンパク質共役型受容体(GPCR)を標的としてアプタマー選抜技術の最適化と受容体に対して機能阻害効果を発揮する分子探索を行った。最適化では、非特異的な結合分子、非標的に特異的に結合する分子を取り除くため、非標的のGPCRを発現するVLPを用いて効果的に除去する条件を見出した。またハイスループットシーケンサーで解読した膨大な情報量を活かすため、アプタマーに特化した解析ソフト(doi: 10.1038/mtna.2015.4.)の利用によって配列的特徴が異なる幅広い候補分子を効率的に抽出する解析手段を構築した。また、GPCRに対する機能阻害効果を検証するため、細胞内のcAMPおよびカルシウムの濃度変化を解析するセルベースアッセイも最適化した。その結果、GPCRに対して機能阻害効果を持つ分子を複数同定する事に成功したことに加え、その中の分子の一部は微弱なアゴニスト活性を併せ持つパーシャルアゴニストであることを示唆する従来のアプタマーには見られない興味深い結果を得ることができた。現在、当該分子に対する詳細な解析を進めている。このように本研究課題では、膜タンパク質のなかでも特異的結合分子の創製が困難とされるGPCRを標的として、VLPという新たなアプタマー選抜材料、それに対する選抜技術や配列解析手法などの最適化によって、目的とする膜タンパク質に対するアプタマー選抜技術基盤を構築することができた。本研究は、細胞膜に深く埋没する膜タンパク質の生理的構造を維持する支持媒体としてウイルス様粒子が優れている点に着目し、これを新規材料とした膜タンパク質に対する汎用的なRNAアプタマー創製技術基盤の構築を目的とする。開始年度となる本年度は、創薬標的として注目される数種のGタンパク質共役型受容体(GPCR)(EP4、ETB、A2a、P2Y2)を発現するウイルス様粒子の作製と発現レベルの確認を行った。その結果、標的GPCRを過剰発現させた細胞の抽出液と比較し、ウイルス様粒子の方が、遥かに高い効率で標的タンパク質を高発現・濃縮できていることが確認できた。ウイルス様粒子はアプタマー選抜材料として、細胞やリコンビナントタンパク質よりも生理的構造の維持や操作性の点において優れていることを確認し、その生産技術を確立することが出来た。また、これを材料にアプタマーのセレクションを実施した結果、通常のリコンビナントタンパク質を材料に実施するセレクションと同様、約7回程度の選抜と増幅作業の繰り返しによってライブラリを濃縮できる事が分かった。現在、濃縮したライブラリをハイスループットシーケンサーで解析を終え、候補となる配列をSPR解析法による結合性評価を開始している。また同時に、各標的GPCRに合致したアッセイ系(cAMPやカルシウム濃度測定系)の確立を終え、培養細胞を用いた機能阻害効果の検証実験も開始できる状況にある。このように本年度は、目標達成のための技術基盤の構築と十分な予備知見を得ることが出来ており、当初の計画通りに進行できたと考えている。計画していた、ウイルス様粒子の安定な生産技術、それを材料としたアプタマーライブラリの濃縮技術、結合を評価するためのSPR解析法、培養細胞を用いた機能阻害効果評価系の全てにおいて技術構築が完了したため。本年度に構築した種々の技術の再評価を行いつつ、標的膜タンパク質に結合する分子の取得を目指す。

また、現行の標的GPCRでは、アプタマー取得が困難であった場合は、外部ドメインが大きなクラスCのGPCRやインテグリンなどの細胞接着タンパク質群を標的としたセレクションも実施・検討する。これらの取り組みによって、ウイルス様粒子の特性を活用した、生理的構造を持つ膜タンパク質に結合する分子の創製技術基盤の構築を目指す。
発ガンとAKTキナーゼ活性化の分子機構

セリンスレオニンキナーゼAKTの活性化は発ガンの重要な原因となっている。AKTは様々な分子に結合しその活性を制御する。我々はprotooncogene TCL1がAKTの活性化を制御する「AKT活性補助因子であることを報告した。AKT活性化補助因子TCL1の生理的な発現は免疫系細胞などの発生の初期の分化段階に限定している。今回このTCL1の転写調節領域にあるAKTの細胞内基質であるsteroid受容体性転写調節因子Nur77結合配列TCL1-NBREに注目し、AKT活性のNegative Feed Back制御機構の解明を進めた。1.ヒトゲノムからPCR法によりTCL1の転写調節領域1をクローニングし、TCL1の5'promoter上にAKT基質であるNur77の認識部位(NBRE CCAAGGTCA)が存在することを明らかにした。2.EMSA法によりNur77が特異的にTCL1-NBRE配列に結合することを確認した。3.Luciferase AssayによりTCL1-NBREがTCL1の転写活性を制御していることを明らかにした。4.CHIP法(Chromatin Immunoprecipitation法)によりPC12細胞においてsteroid受容体であるNur77がTCL1-NBREと特異的に結合することを示した。これらの研究によりAKTの活性化補助因子TCL1の発現がAKTの活性化とNur77のリン酸化を介したnegativefeed back機構により転写レベルで制御されて生体のホメオスターシスを制御していることを明らかにした。この研究によりNur77の初めての分子標的を明らかにし、このnegative feed back制御機構の破綻は神経、免疫系の癌の発症における重要性が示唆される(manuscript submitted 2006)。
てんかんミュータント由来胚性幹細胞を用いた胎生期てんかん原生の解明と治療への応用

樹立したELマウス由来ES細胞の分化誘導においては、NSS法を適宜改良して用いた結果、浮遊培養(4日間)に伴い、効率良くEmx1陽性神経系細胞へと分化した。また、浮遊培養を更に継続した場合、分化した神経幹細胞が神経細胞のみならず、アストロサイトへと分化する傾向が強い事が示された。この多分化能に関わる性質は、C57BL/6由来のES細胞とは異なった。よって、増殖因子等を積極的に加えていないNSS法での浮遊培養条件においては、神経系細胞への終末分化に関わる因子への応答性などELマウス由来NSCの生物学的特徴を反映したものと推測した。発作原性及び、てんかん原性獲得に関わる中枢神経系の初期発達過程の異常を解明するため、日本で樹立されたヒト側頭葉てんかんの自然発症モデル動物であるELマウスを用いた再現性の高い研究アプローチを突破口とすべく、平成25年度の本研究では以下について取り組んできた。1.ELマウスから樹立した胚性幹細胞(ES細胞)の細胞生物学的な性質を解析する。2.ES細胞から終脳由来神経幹細胞や大脳皮質及び海馬神経細胞を含む神経系細胞を分化誘導する。3.神経幹細胞マーカーの詳細な発現解析を行う。これらの解析を通じて、ELマウスの発作及びてんかん原性獲得に関わる初期神経発達期の異常をin vitroで検出・再現できる可能性を持つものと考えられる。これまでに、ELマウス由来胚盤胞から樹立したES細胞は、C57BL/6由来ES細胞と比べて、ES細胞の細胞生物学的諸性質が異なる傾向があり、詳細な解析を進めている。終脳由来神経系細胞の分化誘導は、分化培養技術Neural Stem Sphere法(NSS法)を基に中枢神経系の発生領域特異的な神経幹細胞の調製を試みた。調製した神経幹細胞の神経幹細胞マーカー発現等を詳細に解析している。発作原性及び、てんかん原性獲得に関わる中枢神経系の初期発達過程の異常を解明するため、日本で樹立されたヒト側頭葉てんかんの自然発症モデル動物であるELマウスを用いた再現性の高い研究アプローチを突破口とすべく、本研究では以下について平成24年度取り組んできた。<1.ELマウスから胚性幹細胞(ES細胞)の樹立と樹立したES細胞の細胞生物学的性質の解析>これまでに、ELマウス由来胚盤胞からES細胞を複数細胞種を単離、培養に成功した。これらの細胞は、一般的なマウス系統であるC57BL/6由来ES細胞と比べて、ES細胞の細胞生物学的諸性質が異なる傾向があることも明らかになりつつある。現在、自己増殖能や多分化能などの性質に加えて、ES細胞マーカー発現の比較解析などの詳細な解析を行っており、本計画中に明らかに出来るものと考えている。<2.ES細胞から終脳由来神経幹細胞、大脳皮質及び海馬神経細胞への選択的分化誘導>終脳由来神経系細胞の分化誘導法については、分化培養技術であるNeural Stem Sphere法(NSS法)を基に中枢神経系の発生領域特異的な神経幹細胞の調製を試みるとともに単離、樹立した神経幹細胞の培養法の至適条件を検討している。これらのES細胞培養技術及び、神経系細胞への分化誘導技術は、ELマウスの発作及びてんかん原性獲得に関わる初期神経発達期の異常をin vitroで再現できる可能性を持つものと考えられる。発作原生及び、てんかん原生獲得に関わる中枢神経系の初期発達過程の異常を解析する為、日本で樹立されたヒト側頭葉てんかんの自然発症モデル動物であるELマウスの初期神経発達期に生じる異常をin vitroで再現する事を目標として、本研究では以下について取り組んだ。樹立したELマウス由来胚性幹細胞(ES細胞)からの終脳由来神経幹細胞及び神経系細胞の分化誘導においては、高効率な分化誘導法であるNeural Stem Sphere(NSS)法をES細胞コロニーのコンパクション形成能が低い事等を考慮して適宜改良して用いた。その結果、浮遊培養(4日間)に伴い、効率良くEmx1陽性神経系細胞へと分化した。また、浮遊培養を更に継続した場合、ELマウス由来ES細胞から分化した神経幹細胞(NSC)が神経細胞のみならず、アストログリア細胞へと分化する傾向が強い事が示された。この多分化能に関わる性質の傾向は、通常用いているC57BL/6由来のES細胞とは異なった。他方、NSSを増殖因子(FGF-2, EGF)存在下で接着・遊走により得られたNSCは通常の増殖能、多分化能を維持していた。したがって、増殖因子等を積極的に加えていないNSS法での浮遊培養条件においては、神経系細胞への終末分化に関わる因子への応答性などELマウス由来NSCの生物学的特徴を反映した結果であると推測した。

これまでグリア細胞のてんかんへの関わりについては、シナプスから分泌された神経伝達物質の取り込みや炎症性サイトカインの分泌への関与が主に議論されてきた。また、異常な苔状線維突起形成と並んで、発作に伴うNSCからの過剰な神経新生もてんかん原生に関わる機序の1つとされてきた。今回の研究結果は、ELマウスのてんかん原生獲得の機序にNSCの多分化能に関わる性質の違いやNSCから分化したグリア細胞についても検討する必要性を示すものである。幹細胞生物学ELマウス由来ES細胞の細胞生物学的諸性質を解析したこと、最近、新規性の高い神経幹細胞マーカーが創出されたことが、当初の計画で示した研究の進捗に影響したと言える。一般的なマウス系統であるC57BL/6由来ES細胞と比べて、ELマウス由来ES細胞の細胞生物学的諸性質が異なることが現在までの結果から示されつつあり、このことが当初の計画で示した研究の進捗に影響したと言えるが、今後新たな知見が得られるものと考えている。<終脳由来大脳皮質及び海馬神経細胞を含む神経系細胞への分化誘導法、維持法の確立及び、得られた神経幹細胞の細胞生物学的性質の解析>神経発生に伴い、中枢神経系は前後軸及び背腹軸に沿って空間的な特異性を獲得するが、この領域特異化は種々のモルフォゲンと呼ばれる液性因子の濃度勾配によって厳密に制御される。そこで、大脳皮質及び、海馬神経系細胞を得る為、中脳領域を効率よく誘導出来る通常のNSS法にこれらの液性因子を添加する等の改良を行い、終脳領域を含む各領域の神経幹細胞を効率良く誘導する条件を確立する。得られた神経幹細胞の幹細胞としての諸性質及び、機能性神経細胞への分化・成熟化能の解析を種々のマーカー分子の時間、空間的発現変化を指標に比較解析する。1.てんかんミュータントELマウス由来ES細胞の細胞生物学的性質の解析未分化ES細胞マーカー発現解析についてはアルカリフォスファターゼ活性や未分化ES細胞マーカー(Oct-3/4, Nanog, SSEA-1など)の発現を蛍光染色法等により確認する。また、核型解析は染色体分染法(Gバンド法)を用いて解析する。in vitro分化能評価については、胚様体形成もしくは、三胚葉由来体細胞への選択的分化誘導法を用いて培養・誘導後、それぞれの細胞系譜に特有のマーカー発現をリアルタイムPCR法もしくは、蛍光染色法等により解析する。2.終脳由来大脳皮質及び海馬神経細胞を含む神経系細胞への分化誘導法、維持法の確立とこれら神経系細胞の機能解析及び、機能関連遺伝子の発現解析神経発生に伴い、中枢神経系は前後軸及び背腹軸に沿って空間的な特異性を獲得するが、この領域特異化は種々の液性因子(Shh, BMPs, Wnts, FGFs,レチノイン酸等)の濃度勾配によって厳密に制御される。大脳皮質及び、海馬神経系細胞を得る為、通常のNSS法(中脳領域を高効率に誘導出来る)をこれらの液性因子を添加する等の改良を行い、終脳領域を効率よく誘導する条件を確立する。誘導した神経幹細胞から機能性神経細胞への分化・成熟化能の解析を分化・成熟化に伴うシナプス関連遺伝子群の遺伝子及びタンパク質レベルでの時間、空間的発現変化を指標に比較解析する。ELマウス由来ES細胞の細胞生物学的諸性質を解析したこと、最近、新規性の高い神経幹細胞マーカーが創出されたことが、当初の計画で示した研究の進捗に影響したと言える。
モデルマウスを用いたミトコンドリアセントラルドグマの破綻病理の解明

本研究では、変異型ミトコンドリアDNA(mtDNA)を導入したマウス群の作製と活用から、1)mtDNAのtRNA-Lysに点突然変異を有する新たなモデルマウスの作製に成功し、このマウスが筋疾患を発症することを明らかにし、2)mtDNAのND6に生じた点突然変異が老化依存的なリンパ腫の発症に寄与することを見出し、3)糖尿病という生体環境は変異型mtDNAの病原性を増強することを立証し、ミトコンドリアセントラルドグマの破綻病理の一端を解明した。ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の突然変異が、ミトコンドリア病のみならず、糖尿病や神経変性疾患、さらにはがんや老化など、多様な疾患の遺伝的原因になる可能性が示唆され、変異型mtDNA分子種を起点とした多様な病態発症機構の存在が注目されている。本研究では、変異型mtDNAを導入したマウス(ミトマウス)群に加え、新たなミトマウスを随時作製して、多様な変異型mtDNA分子種を起点としたミトコンドリアセントラルドグマの機能基盤、さらには、核セントラルドグマとの連携、そしてそれらの破綻による病理機構の全貌解明を目指している。今年度は1)変異種とミトコンドリア呼吸機能不全誘導における細胞種感受性や臓器特異性の関係、2)変異種と細胞死誘導の関係、3)変異種とそれらの病原性によって変化する生体エネルギーネットワークの代謝適応(糖感受性の増強、解糖系の増強、脂質代謝の増強など)の関係に焦点をしぼって解析を行った。その結果、1)欠失型mtDNAがマウスの胚発生-出生-成長において細胞種特異的にその病原性を変化させること、2)これにより、ミトコンドリア病の病型が遷移することを示唆する所見を得た。さらに、3)欠失型mtDNAの病原性発揮に際してはマウスの核背景や代謝適応能力が重要であることが分かった。この結果はmtDNA関連疾患の病態理解はもとより、治療法の開発にとって有効な基礎戦略を提案するものである。モデルマウスの作製に関しては、4)変異型mtDNAを導入したES細胞の樹立に成功した。本研究では、変異型mtDNAを導入したマウス(ミトマウス)群の作製とその応用活用から、ミトコンドリアセントラルドグマの機能基盤とその破綻病理の全貌解明を目指している。今年度は特に、1)ヒトのミトコンドリア病の主要病型の1つであるMERRFのモデルマウスの作出と2)既に作製に成功しているヒトのミトコンドリア病の主要病型の1つであるKSSのモデルマウスを活用して、mtDNA変異の病原性発揮における核ゲノム背景の影響に関して解析を進めた。結果として、以下の成果を得た。1)mtDNAにコードされたミトコンドリアtRNA-Lysに病原性の点突然変異を有するマウスの作製に成功した。このマウスに導入された変異型mtDNAはヒトのミトコンドリア病のMERRRの症例から検出される変異型mtDNAと類似している。このため、このマウスはMERRFの病態モデルマウスになる可能性が高い(継続して解析を進める予定である)。2)既に作製している欠失型mtDNAを導入したマウスの核背景を糖尿病モデルマウスのそれと置換すると、欠失型mtDNAの病原性が増強することを突き止めた。3)欠失型mtDNAを導入したマウスのミトコンドリア分裂を阻害すると、欠失型mtDNAの病原性が増強することを突き止めた。特に、2)と3)の成果は、変異型mtDNAの病原性制御にインスリンシグナルや糖代謝、ならびにミトコンドリアの分裂・融合といった動的性格の重要性を示唆している。ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の突然変異が、ミトコンドリア病のみならず、糖尿病や神経変性疾患、さらにはがんや老化など、多様な疾患の遺伝的原因になる可能性が示唆され、変異型mtDNA分子種を起点とした多様な病態発症機構の存在が注目を集めている。本研究では、変異型mtDNAを導入したマウス(ミトマウス)群に加え、異なる変異型mtDNA分子種を導入した新たなミトマウスを随時作製して、多様な変異型mtDNA分子種を起点としたミトコンドリアセントラルドグマの機能基盤、さらには、核セントラルドグマとの連携、そしてそれらの破綻による病理機構の全貌解明を目指している。今年度の成果としては、1)欠失型mtDNAの蓄積に対する細胞特異的な感受性により、単一の欠失型mtDNA分子種が複数の病型を誘導できることを実験的に立証し、2)欠失型mtDNAの病原性制御に糖代謝が重要な役割を果たすこと、さらには、3)欠失型mtDNAの病原性制御にミトコンドリアの分裂/融合といったミトコンドリアの動的性格が重要な役割を果たす可能性を見出した。また、4)変異型mtDNAの導入により活性酸素種が漏出されるモデルマウスではリンパ腫と高血糖が誘発されることが分かり、5)ランダムな突然変異が生じた多様な変異型mtDNA分子集団もミトコンドリア呼吸機能低下を誘発できることを突き止めた。モデルマウスの作製に関しては、6)複数の変異型mtDNAを導入したES細胞の樹立に成功し、キメラマウスの作製に至った。項目1)変異型ミトコンドリアゲノム(mtDNA)を導入したマウスの作製と解析について:mtDNAのtRNA-Lys遺伝子に点突然変異を有するマウスの作製に成功したため、このマウスの系統維持ならびに病態解析を行った。その結果、点変異型mtDNAを70%程度含有するマウスコロニーの維持に成功した。このようなマウス群の大規模な病態解析を実施したが、現状、筋力低下以外の病態は観察されていない。

そこで、項目3)の成果(後述)を考慮し、このモデルマウスに糖尿病を誘導することで、導入したtRNA-Lys遺伝子に点突然変異を有するmtDNAの病原性を増強させる試みを開始した。また、新たな点変異型mtDNA導入マウスの作製に着手し始めた。項目2)ミトコンドリアの品質管理と病態発症制御について:肝臓と血液細胞特異的にミトコンドリアの分裂を阻害し、且つ、欠失型mtDNA(複数の遺伝子を喪失した分子種)を導入したモデルマウスの作製に成功しているため、このマウスの大規模な病態解析ならびに導入した欠失型mtDNAの動態変化を解析した。このようなマウスでは、欠失型mtDNAの含有率が低いにもかかわらず(野生型の核背景では病態誘導が起こらない)、肝臓での鉄代謝の異常ならびに貧血が誘導された。また、ミトコンドリア分裂を阻害すると導入されている欠失型mtDNAが明らかに蓄積しやすいことが分かった。この結果は、ミトコンドリア分裂は異常なミトコンドリア集団を正常なミトコンドリアネットワークから隔離する働きがあることを示唆している。項目3)核とミトコンドリア両ゲノムによる病態発症機構の解明:欠失型mtDNAの病原性が糖尿病の核背景で増強される現象の分子基盤を把握するため、このような組織におけるミトコンドリア関連因子の変動を解析した。その結果、ミトコンドリアバイオジェネシスに関わる因子群が糖尿病環境下で低下してしまうことが分かった。ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の突然変異がミトコンドリア病、糖尿病、神経変性疾患、がんなどの遺伝的な原因になる可能性が示唆されているものの、変異型mtDNA分子がどのようにしてこれほどまでに多様な病型を誘導するのか、といった根源的な命題は未だに解明されていない。本研究ではこのような命題に対し、変異型mtDNAを導入したモデルマウスの作成と活用を通して、ミトコンドリアセントラルドグマの機能基盤と破綻病理の解明を目指している。今年度は以下の研究項目を実施した。1)核とミトコンドリア両ゲノムによる病態発症機構の解明変異型mtDNAを導入したマウスの核背景を糖尿病の核背景(db/db)に置換すると、変異型mtDNAの病原性が増強される。この病原性の増強は糖尿病という生体環境がミトコンドリアバイオジェネシス(mtDNAの複製・転写・翻訳)を低下させることに起因していることを明らかにした。また、変異型mtDNAを含有するヒト培養細胞でも同様の現象が起こることを明らかにした。2)ミトコンドリア品質管理と病態発症機構の理解ミトコンドリアの品質管理においては正常なミトコンドリア集団から異常なミトコンドリアを隔離することが縦横であるため、ミトコンドリアの分裂や融合が重要な役割を果たすと考えれている。そこで、変異型mtDNAを含有し、さらにミトコンドリア分裂因子を破壊したマウスを作製した。その結果、このマウスでは、変異型mtDNAが優位にしていない状況であっても、変異型mtDNAの病原性が誘導され、また、異常なミトコンドリアの蓄積、ならびに変異型mtDNAの蓄積も観察された。これらの結果は、ミトコンドリアの分裂は、変異型mtDNAやそれの病原性を抑制するために重要な役割を果たしている事を示唆している。