hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗てんかん薬胎生期暴露による神経幹細胞制御異常と成体マウス行動異常の関連解析

本研究の目的は、(1)バルプロ酸によるヒストン脱アセチル化酵素阻害が胎生期神経幹細胞に与える影響の解明、(2)胎生期から成体期の長期に渡る同阻害影響の解明、(3)同阻害影響を回復・最小化する方策の確立の3点である。これら目的を達成する為、申請者は、神経産生が顕著な時期において妊娠マウスにバルプロ酸を経口投与した。その結果、バルプロ酸投与により胎児の脳におけるヒストンアセチル化が増加した。また、バルプロ酸のアナログであるバルプロミド投与では、ヒストンアセチル化の増加は認められなかった。さらに、胎児における神経産生はバルプロ酸投与により亢進した。これは、成体海馬由来培養神経幹細胞において、神経細胞新生がピストン脱アセチル化作用により引き起こされる事を示した過去の報告と整合性がある。また、この神経細胞新生の様式の大部分は、中間前駆細胞の形成が関与する神経幹細胞からの非直接的な神経細胞産生経路を介し、浅層神経細胞層厚の増加と深層神経細胞層厚の減少が観察された。さらに申請者は、マウス胚性幹細胞由来神経幹細胞を用いた浅層および深層神経細胞産生の評価モデルを確立し、in vitroにおいても同様に浅層神経細胞の産生量増加と深層神経細胞産生量の減少を確認した。加えて、胎児期のピストン脱アセチル化酵素阻害により、海馬歯状回における成体脳神経細胞新生および神経細胞形態は異常を示し、胎児期バルプロ酸投与マウスにおける、後の記憶学習能力の低下の原因の一部だと考えられる。これは、成体海馬由来培養神経幹細胞において、神経細胞新生がヒストン脱アセチル化作用により引き起こされる事を示した過去の報告と整合性がある。加えて、胎児期のヒストン脱アセチル化酵素阻害により、海馬歯状回における成体脳神経細胞新生および神経細胞形態は異常を示し、胎児期バルプロ醸投与マウスにおける、後の記憶学習能力の低下の原因の一部だと考えられる。申請者は、バルプロ酸投与マウスは、学習や記憶能力の低下を示す事を明らかにした。興味深いことに、この学習および記憶能力の低下は、自発運動を促すことで顕著に改善された。この結果は我々の予想を超えるものであり、これらの知見は、バルプロ酸を用いたてんかん治療により引き起こされる同様の機能障害の回復手段確立の一助となる事を期待できる。バルプロ酸投与により神経細胞産生が亢進し、浅層および深層神経細胞層厚に変化が生じる事が示された。申請者は、引き続きこれらの表現型を引き起こす分子機構の解明に着手する。また、自発運動によるバルプロ酸投与マウスの学習および記憶能力の回復機構の解明を行う。その為に、発生各段階および自発運動後におけるgene chip解析を行い、候補遺伝子のスクリーニングを行う。

その後、候補遺伝子の発現を定量RT-PCRにより評価し、候補遺伝子の制御機構を解明するべく、該当遺伝子に関してクロマチン沈降やノックダウン、ノックアウト、過剰発現実験を行う。
魚病細菌Edwardsiella tardaの鉄代謝と病原性の関係

新鮮血清、トランスフェリン、あるいはEDDAによってEdwardsiella tardaの非病原株の発育が阻止されるのに対し、病原株は抵抗性であることを既に報告している。これらが鉄をキレ-トする作用をもつ物質であることから、E.tardaがシデロフォアを産生し、その性質が病原性と関連するのではないかと考え、これを証明することを試みた。まず、Salmonella typhimuriumを使うバイオアッセイによってシデロフォアの検出を試みたが、試験培地中のクエン塩がE.tardaの発育を阻止するため利用できないことが分かった。そこで、ケミカルアッセイでありシデロフォアの種類を問わず検出できるクロムアズロルS(CAS)検定法を採用した。なお、CAS試薬だけでは明確な検定ができなかったため、キレ-ト力の弱いシデロフォアも検出できるCASシャトル試薬を用いた。基礎培地にはイ-グルMEM(グルタミン、pH指示薬を含まず)、緩衝液にはPIPESを用い、クロロフォルムー8ーヒドロキシキノン抽出によって除鉄を行った。除鉄処理によりMEMーPIPES培地の鉄含量は6ppb以下となり、CAS検定に十分堪える培地となった。シデロフォアは供試した16株すべてに検出され、病原性株と非病原性株の間に差異を見出することができなかった。病原性株2株と非病原性株2株からシデロフォアを抽出し、高圧ろ紙電気泳動法によりpH5.6でのH_2PO_4^ーに対する移動度を測定したところ、いずれもー0.05の価を示した。この移動度をもつ既知シデロフォアにはものは知られておらず、新しいシデロフォアであることが示唆された。今回、E.tardaが特異なシデロフォアを産生することは分ったが、病原性との関係を見出すことはできなかった。シデロフォアのリセプタ-が存在すると思われる外膜蛋白の検討などが今後の課題であろう。
虚血再還流を併用した筋力トレーニングによる疲労耐性および他臓器保護効果の検証

本研究では、直接および間接的preconditioningが下肢最大筋力と筋疲労に与える効果と必要回数を検証したが、回数によらず明らかなパフォーマンス向上効果は得られなかった。成果のpreliminaryデータを、国内学会(日本体力医学会2016, 2017年)にて発表した。問題点を考察し、実践的な運動(連続跳躍)での検証、機序に関わる一酸化窒素発生を助長する食餌性硝酸塩の併用も試みたが、統計学的に有意なパフォーマンス向上、筋保護効果は認められなかった(臨床運動療法学会,日本心臓リハビリテーション学会2017年)。最終データは本年の国内学会で発表予定であり、国際論文として投稿準備中である。1.運動能力における直接preconditioning効果の検証(進行中):“ischemic preconditioning"(IPC)は、右大腿部をカフにて加圧し、虚血時間5分、解放4分を1セットとして施行した。プロトコールは、1カフのみ巻いて虚血を施行しないコントロール、2IPC1セット施行、32セット、43セット、54セットの5条件とした。各施行後に等速性筋力測定器(BIODEX)用いて右膝伸展筋力および屈曲筋力の測定を行った。各条件はランダムに、7日以上の間隔を空けて行った。この研究では、IPCが最大筋力/筋疲労に与える効果とIPCの必要回数を検証している。2.運動能力における遠隔(間接的)preconditioning効果の検証(進行中):上記1と同様の研究デザインを用い「右」大腿部にてIPCを施行し、「左」膝伸展筋力および屈曲筋力の測定を行った。3.虚血を併用した運動トレーニング効果のメカニズムの解明(解析中):虚血を併用した低強度レジスタンス運動と低酸素環境での低強度レジスタンス運動による筋力、筋形態および血液生化学指標への影響を比較し、虚血を併用した運動トレーニングが筋肥大を導く要因の解明を試みた。被験者を無作為に常酸素対照群、常酸素血流制限群、低酸素対照群、低酸素血流制限群(各8名)に分けた。低酸素条件は、低酸素室にて空気中酸素濃度12.8%、常酸素は21%で行なった。トレーニング方法は、右下腿底屈運動とし、運動強度は最大挙上重量の20%、1セット30回(2秒に1回のペースで拳上)を2セット、2回/日、3日/週、4週間実施した。初回、最終回のトレーニング前後にて、新バイオマーカーを含む血液生化学的指標の測定を行った。期間前後において同様に血液生化学的測定と右下腿三頭筋の最大筋力および超音波にて筋厚評価を行った。これらの結果は今年度発表の予定である。「直接的および間接的ischemic preconditioning」については、順調に研究は進んでいるが、当初の予想と異なり、これまでの先行文献のような効果が本当にあるか否か疑問が残る結果となっている。しかしながら、その結果については、いくつかの原因を推測しており、検証する計画を立てている。一方、国内外学会や学術誌における公表は順調に進んでいる。「虚血(血流制限)を併用した運動トレーニング」については応用方法を発展させ、一部のデータをまとめてWorld Congress of Physical Therapy 2015(シンガポール)に投稿し、acceptされ発表の機会を得た。さらに国際学術雑誌へ投稿準備中である。また心不全患者におけるこれまでの検討は、International Journal of Cardiology(Impact factor 4.036, 2014)に掲載できた。心疾患における一連の成果を評価され、国際学会(EuroPRevent 2015,ポルトガル)および国内学会(第22回未病システム学会、第29回日本冠疾患学会学術集会など)にて招待講演の機会を得た。「骨格筋のコンディショニングと健康状態を反映するバイオマーカーの探索」に関しても、新たなに複数の知見を得て、学会にて発表している(血液生化学的動脈硬化指標の有用性と問題点:介入による体組成変化を踏まえた検討など)。さらに新たな得られた成果について、アメリカスポーツ医学会、日本心臓リハビリテーション学会などで公表予定となっている。1.運動能力における直接preconditioning効果の検証:この研究では、直接preconditioningが最大筋力/筋疲労に与える効果と必要回数を検証したが、施行回数によらず明らかなパフォーマンス向上効果は得られなかった。この実験のpreliminaryデータは、昨年の日本体力医学会で発表したが、最終データは今年度の日本体力医学会で発表予定であり、また国際論文として投稿準備中である。2.運動能力における遠隔(間接的)preconditioning効果の検証:直接と同様に施行回数によらず明らかなパフォーマンス向上効果は得られなかった。1と合わせて、発表予定である。3.虚血を併用した運動トレーニング効果のメカニズムの解明:虚血を併用した低強度レジスタンス運動と低酸素環境での低強度レジスタンス運動による筋力、筋形態および血液生化学指標への影響を比較し、虚血を併用した運動トレーニングが筋肥大を導く要因の解明を試みた。被験者を無作為に常酸素対照群(21%)、常酸素血流制限群、低酸素対照群(12.8%)、低酸素血流制限群に分けて右下腿のトレーニングを4週間行った。→いずれの4つの条件においても筋力・筋量の有意な増加がみられ、増加度において条件間の違いはなかった。これらの結果から,4週間の低強度レジスタンストレーニングにおける虚血の併用および低酸素環境の付加による筋肥大および筋力増大の上乗せ効果は得られないことが示唆された。

4. preconditioningの疲労耐性への効果:特に疲労耐性への効果を検証するため、両下肢にpreconditioningを施行し(直接効果)、連続ジャンプを行う実験も施行し、結果を解析中である。5. preconditioningとNO(nitric oxide)供与体(食事性硝酸塩)の併用効果を検証中である(後述)。1.「直接的および間接的preconditioning」については、綿密な実験であったにも関わらず当初の予想と異なり、先行研究のような有効性は得られない可能性が示された。この理由の一つとして、今回用いた大腿筋の筋量が先行研究で多く用いられている上肢筋より遥かに大きいことが考えられた。そこで、骨格筋のpreconditioning機序として考えられている虚血によるNO(nitric oxide,一酸化窒素)増加に注目し、虚血下のウオーミングアップ運動とさらに食事性NO供与体(硝酸塩)であるビートルートジュース(BJ)投与の併用を考案した。両研究は、現在進行中である。さらに、疲労耐性への効果について、preconditioningを両下肢に施行し、筋力測定ではなく、より実際の運動・スポーツパフォーマンスに近い「連続ジャンプ」におけるジャンプ高の維持を測定することで検証中である。さらにこの測定系においてもBJの上乗せ効果を検証中である。2.成果公表としては、2016年の日本体力医学会(岩手県)においてIPC効果および必要回数に関するpreliminaryデータを公表し、本年は追加検討を含めたデータを日本体力医学会(愛媛県)、日本臨床スポーツ医学会(東京都)で発表予定である。すでに終了している「間欠的虚血(血流制限)を併用した運動トレーニングの有効性」については国際学術雑誌へ投稿中である。また「骨格筋のコンディショニングと健康状態を反映するバイオマーカーの探索」に関したデータは、2016年度のアメリカ心臓病会議およびヨーロッパ心臓病学会において公表している。また両下肢麻痺(脊随損傷)患者における運動療法の効果をバイオマーカーにて評価した成果をArch Phys Med Rehabil(IF= 2.565)に掲載した。また関連の研究を複数の学会と学術誌で公表できている。[1]骨格筋虚血preconditioning(以下IPC)効果の検証(H27年度):直接および遠隔(間接的)IPC(1回:5分虚血と5分再灌流)が最大筋力/筋疲労に与える効果と必要回数(対照および14回施行)を検証したが(12名)、施行回数によらず明らかな効果は得られなかった。骨格筋IPCは、標準的手法も確立しないまま、有効性を前提に多くの研究が行われてきたが、その信憑性自体を問う重要な成果を得た。[2]虚血併用運動トレーニング効果の機序解明(H27年度):虚血併用運動と低酸素環境での同運動による筋力・筋形態および血液生化学指標への影響を比較し、虚血併用運動の効果の機序解明を試みた。無作為に常酸素対照群(21%)、常酸素血流制限群、低酸素対照群(12.8%)、低酸素血流制限群に分けて(各8名)
ＡＴＲＡによるＡＰＬ細胞の分化誘導の分子メカニズム

本研究は、レチノイン酸誘導体(ATRA)による急性前骨髄球性白血病(APL)細胞の分化誘導において、NAMPTやNAD依存性脱アセチル化酵素SIRT1の活性化と、これらに伴う転写因子FOXO3Aの脱アセチル化亢進による活性化が関与することを明らかにすることを目的としている。平成23年度の研究から、我々の予想に反して、ATRA処理後のAPL細胞内では、SIRT1の活性化が生じないこと、SIRT1の阻害剤として知られているTenovin-6によりAPL細胞の好中球様細胞への分化が誘導されることが、明らかとなった。そこで、ATRAによるAPL細胞の好中球様細胞への分化誘導メカニズムを解明する目的で、Tenovin-6による細胞分化誘導のメカニズムについて解析を行なった。すると、APL細胞の分化が誘導される条件下では、Tenovin-6によるSIRT1の酵素活性の阻害が起きていないことが明らかになった。続いて、Tenovin-6による酵素活性の阻害が報告されているSIRT2について、詳細な検討を行なった。すると、APL細胞の分化が誘導される条件において、SIRT2の脱アセチル化基質であるαチューブリンのアセチル化が亢進していた。さらにウイルスベクターを用いたshRNAや遺伝子導入によって、SIRT2遺伝子の発現を低下させるとNB4細胞は好中球様細胞に分化し、過剰発現によりこの阻害剤による分化誘導が阻害された(PLOS ONE, vol. 8:e57633, 2013)。以上の結果から、SIRT2の活性阻害が、APLの好中球様細胞分化を誘導することが明らかになった。これにより、ATRAによるAPL細胞の好中球様細胞への分化誘導が、SIRT2の阻害を介していることが示唆された。今後の解析により、ATRAによる好中球分化誘導の詳細なメカニズムが明らかにされることが大いに期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。まずATRAでSIRT1が活性化されるかを調べる目的で、SIRT1の脱アセチル化酵素活性を試験管内で測定したが、細胞から抽出されたSIRT1の活性に、ATRA処理の有無で変化は見られなかった。試験管内のアッセイ系では、細胞内のNAD濃度により変化するSIRT1の活性を反映できないことから、細胞内のSIRT1活性を評価するため、基質であるp53のアセチル化状態について、アセチル化特異的抗体を用いてウエスタンブロット法により、解析を行なった。この結果、p53のアセチル化状態は、ATRA処理の有無にかかわらず、変化が見られなかったことなどから、ATRA処理によるSIRT1の活性化が生じていないことが示唆された。次に、SIRT1が、ATRAによるAPL細胞の好中球分化に必要であるかどうかについて、ATRA処理時に阻害剤を用いてSIRT1の活性を阻害し、ATRAによる好中球分化が掬制されるかについて、検討を行なった。その結果、Tenovin-6の添加によるATRA依存的な細胞分化に対する影響は見られなかった。しかし、予想に反して、Tenovin-6単剤でAPL細胞を処理した際に、ATRAと同様の好中球様細胞への分化が観察された(53回米国血液学会にて発表)。これは、我々の仮説とは逆に、SIRT1の活性の阻害が、AT踏によるAPL細胞の分化誘導を引き起す事を強く示唆している。現在、ATRAが、どのようにSIRT1の活性低下を引き起すのかという点に着目して、研究を進めている。

これにより、ATRAによるAPL細胞の好中球様細胞への分化誘導が、SIRT2の阻害を介していることが示唆された。今後の解析により、ATRAによる好中球分化誘導の詳細なメカニズムが明らかにされることが大いに期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。1年目の計画はほぼ完了している。我々の仮説とは異なる現象が見いだされたが、ATRAによるAPL細胞分化のメカニズム解明に近づいている。SIT1阻害剤を用いることでATRAによるAPL細胞の分化にSIRT1が関わっていることが示唆されたが、FOXO3Aのアセチル化レベルについては十分な検討がなされていない。これは免疫沈降した内在性のFOXO3Aのアセチル化を検出するウエスタンブロット法で安定した結果が得られなかったためであり、エピトープタグのついたFOXO3Aを遺伝子導入し、タグに対する抗体を用いて免疫沈降を行ない、アセチル化を評価することを検討している。またSIRT1阻害剤によりAPL細胞の分化がみられたが、これが特異的なものかを評価するため遺伝子発現ノックダウンなどによる確認を行なう予定である。
生体吸収性ステントを応用した末梢動脈疾患に対する新戦略

ミニ豚8頭に対し、全身麻酔下に透視用Cアームを用いて大腿動脈よりコントロール金属ステントと生体吸収ステントをそれぞれ腸骨動脈に留置した。ステント留置前には全例、血管撮影および血管内超音波を施行し、至適ステントサイズを同定した。ステント留置後も血管撮影および血管内超音波を施行し、ステントが的確に留置されていることを確認した。全例手技的成功を得た。ステント留置後は抗血小板剤を内服させた。留置8週後に血管撮影および血管内超音波検査を行った後、ステント留置部血管を露出、採取しホルマリン固定した。全例、コントロールステントおよび生体吸収ステントともに開存を得た。採取した検体はステント留置近位部、中間部、遠位部で切片を作成し、HE染色およびElastica van Gieson染色を行い病理組織学的検討を行った。両群ともに著明な内膜肥厚を認め、また生体吸収ステント群では中膜領域の肥厚も顕著であった。それぞれ画像解析ソフトを用い、血管壁全体、内膜肥厚、中膜肥厚部の面積を同定し、統計学的解析を行った。狭窄率に有意差なく、新生内膜面積は有意にコントロールステントが大きかった。中膜面積は有意に生体吸収ステントが大きかったが、血管リモデリングには有意差はなかった。ステント留置部の血管内超音波データは現在解析中である。また、病理組織学的にステント留置部の炎症スコアおよび血管損傷スコアを検討中で、こちらも統計学的解析を行う予定である。
表現論の視点から見た有限群のコホモロジー

有限群およびに有限次元多元環のコホモロジー論について、表現論的な手法により研究を行った。外積代数や次数付きホップ代数上の加群に対して、ホッホシルド・コホモロジーを用いた加群の多様体と、加群のランク多様体の性質について調べ、特に、テンソル積に関する結果を得た。また、有限群のmod-pコホモロジー環への両側バーンサイド環の作用について研究を行い、その組成因子に関する結果を得た。有限群の内部構造とコホモロジーの関係について,有限群のモデュラー表現の観点から研究を行うことが本研究の目的である。pを素数とする。群のp-部分群についての内部構造や融合(fusion)の様子と,標数pの体を係数とするmod pコホモロジーとの関係について,群の表現論を通して考察を行う。有限群のp部分群の融合状況を表現する対象がSylow p-部分群上のfusion systemである。その一般化としてのp-群上のfusion systemとコホモロジーとの関係を明確にすることが目的である。p-群上のfusion systemの典型例としてはブロック多元環の不足群上に構成されるBrauer対を利用して定義されるfusion systemがある。有限群の自明な表現を含むブロックすなわち主ブロックの場合が有限群とSylow p-部分群から得られるものに相当する。本年度の研究では,研究実施計画に記載されたMackey関手やBurnside環を用いた研究に先立ち,まずブロックを多元環として調べることが必要となり,より一般的な有限次元多元環の加群とコホモロジーに関する研究をなった。自己移入的な有限次元多元環での加群の多様体の理論を群環の場合と比較した場合に,最も不都合な点はテンソル積に関する点である。群環はホップ代数の構造を持ち加群のテンソル積にまた群の作用が定義され,加群の多様体についていわゆるテンソル積定理が成り立つ。一般の多元環での理論を応用しやすいものとするためにテンソル積定理の一般化が必要である。本年度得られた,(1)両側加群のテンソル積を行った場合,(2)次数付きなど制限がついたホップ代数上の加群のテンソル積,についての成果は次頁,11.研究発表(21年度の成果発表)に記された2つの学会にて報告した。有限群の内部構造とコホモロジーの関係について,有限群の正標数pの体上でのモデュラー表現の観点から研究を行うことが本研究の目的である。本年度は,研究実施計画に記載された項目のうち、有限次元多元環における加群の多様体の理論とブロックへの応用、両側Burnside環のコホモロジー環への作用、の2点に重点をおいて研究を行った。前者は平成21年度の研究を引き継いだものである。後者については、特に、両側Burnside環の既約加群について研究を行った。Fusionsystemは、Burnside環のべき等元と関係しており、既約表現の次元や重複度が重要となってくる。本年度はいくつかの非可換p-群に対して既約加群の次元を決定した。本研究の目的は、有限群のmod pコホモロジーとp-部分群に関する内部構造との関係について、表現論の視点から考察することである。従来、代数的位相幾何学的な立場からは群の分類空間とホモトピー論の手法を用いた研究がなされている。本研究は、有限群のモデュラー表現とバーンサイド環の表現論を通して、群の構造、コホモロジー論、ホモトピー論の間の関係を解明しようとするものである。ただしpは素数とし、多元環や加群、コホモロジーは全て正標数pの体を係数とするものである。本年度は、有限p-群Pの両側バーンサイド環上の加群の構造を調べ、コホモロジーの両側バーンサイド環上の加群としての組成因子について研究を行った。バーンサイド環の既約加群は、Pの部分群とその外部自己同型群の群環上の既約加群である条件をみたすものより構成されるが、その中でも特に、真部分群から誘導されずP自身の外部自己同型群の表現から得られるものに重点をおいて研究を行った。Pの真部分群から構成される加群については、その真部分群の両側バーンサイド環のコホモロジーへの作用から、帰納的に情報が得られる。

本年度は特に、pを3とし、位数が27で各元の位数が3である非可換3-群Pのコホモロジー環について解析を行った。このコホモロジー環は非常に複雑な構造を持っているため、バーンサイド環の作用で閉じている部分環で、より単純なものを考察した。中心による剰余群のコホモロジーから膨張写像により得られる部分とPの中心からのノルム写像により得られる元で生成される部分環に着目し、各既約加群を、部分加群の剰余加群として具体的に構成し、真部分群からは得られない既約加群(素体上の2次一般線型群の既約表現に対応し6種ある)が、次数6、8、10、12、14、16の部分に現れることを証明した。これらの結果は一般の奇素数pについて、同様のp-群に対して成立していることが予想される。
ヒトT細胞白血病ウイルスI型シェ-グレン症候群発症機序の解明と治療法に関する研究

私達はHTLV-I感染と一次性Sjogren症候群(SjS)との関連に注目し研究を進めている。まず、疫学的にはSjS患者は対照者(供血者)に比較して抗HTLV-I抗体陽性頻度が有意に高かった。すなわち、抗HTLV-I抗体陽性者はSjSに罹患する危険率が対照者より高く、これは特に50歳以下の陽性者で顕著であった。ウイルス学的にはSjS患者は血清中の抗HTLV-I抗体価が高く、特にIgMクラスの抗体はHAM患者と同程度に検出された。最も注目される結果は唾液中にはIgMクラスの本抗体がSjS患者でのみ検出され、HAMキャリアーでは検出されなかった。この結果からSjS患者では唾液腺内でHTLV-Iに対する免疫応答が活発に惹き起こされていることが考えられた。口唇唾液腺組織ではHTLV-IcDNA(gag,pol,Tax,LTR領域)がPCRで検出された。HTLV-Iはin vitroで滑膜細胞や血管内皮細胞に感染し、感染した細胞はGM-CSF,G-CSFやIL-6を産生した。また、Tax蛋白はIL-6遺伝子をトランスに活性化させる。これはIL-6遺伝子のエンハンサー/プロモーター領域のNF-kB領域が重要であることを明らかにした。以上より、Tax蛋白はウイルスの複製と同時にIL-6をはじめ、TNF-α、TGF-β、GM-CSF,c-fosなどの遺伝子を活性化させることができ、SjSの進展・増悪の一因になっていることが考えられた。新しい治療法の開発ということで、合胞体形成系を確立し研究を進めた。すなわち、合胞体形成を低分子デキストラン、ヘパリンや抗接着分子抗体(CD18とICAM-3)が抑制することを明らかにした。最近、慢性関節リウマチをはじめ自己免疫疾患の原因としてレトロウイルスが脚光を浴びている。今回の私達の結果はSjSの病因としてHTLV-I感染が関与していることを明らかにした。疫学:長崎におけるSjS患者の中に占めるHTLV-I感染者の比率はコントロールに比べ有意に高く、特に50才以下の若年者群において高かった。臨床症状:抗HTLV-I抗体陽性SjSはブドウ膜炎、HTLV-I関連脊髄症(HAM)、繰り返す発熱などの腺外症状を伴いやすい。抗HTLV-I抗体:血清中の抗体価はHTLV-Iキャリアーより有意に高く、IgM抗体陽性もHAMと同等に高かった。唾液中の抗体価はIgA抗体が特異的に高かった。COS細胞やU937細胞にTax発現プラスミドとCAT遺伝子の上流にヒトIL-6遺伝子プロモーター/エンハンサー領域を挿入したレポータープラスミドをコトランスフェクションしておこなったCATアッセイによりIL-6遺伝子プロモーター/エンハンサー領域にTaxがトランスに作用することを明らかにした。A-IV.血管内皮細胞へのin vitroでのHTLV-I感染血管内皮細胞をヒト臍帯静脈から分離し、HTLV-I感染T細胞株(MT-2細胞)と2日間混合培養した。この血管内皮細胞にHTLV-Iがトランスミッションし、同時にIL-1alpha,IL-6,G-CSF,GM-CSFを多量に産生した。合胞体形成の系で、抗ICAM-3抗体が合胞体形成を抑制することを見い出した。

疫学:長崎におけるSjS患者の中に占めるHTLV-I感染者の比率はコントロールに比べ有意に高く、特に50才以下の若年者群において高かった。臨床症状:抗HTLV-I抗体陽性SjSはブドウ膜炎、HTLV-I関連脊髄症(HAM)、繰り返す発熱などの腺外症状を伴いやすい。抗HTLV-I抗体:血清中の抗体価はHTLV-Iキャリアーより有意に高く、IgM抗体陽性もHAMと同等に高かった。唾液中の抗体価はIgA抗体が特異的に高かった。COS細胞やU937細胞にTax発現プラスミドとCAT遺伝子の上流にヒトIL-6遺伝子プロモーター/エンハンサー領域を挿入したレポータープラスミドをコントランスフェクションしておこなったCATアッセイによりIL-6遺伝子プロモーター/エンハンサー領域にTaxがトランスに作用することを明らかにした。A-IV.血管内皮細胞へのin vitroでのHTLV-I感染血管内皮細胞をヒト帯静脈から分離し、HTLV-I感染T細胞株(MT-2細胞)と2日間混合培養した。この血管内皮細胞にHTLV-Iがトランスミッションし、同時にIL-1α、IL-6、G-CSF、GM-CSFを多量に産生した。合胞体形成の系で、抗ICAM-3抗体が合胞体形成を抑制することを見い出した。
重症筋無力症の病態における免疫チェックポイント分子の関与と新たな治療薬への応用

重症筋無力症(MG)の病態における免疫チェックポイント分子の関与について明らかにすることを目的としている。平成30年度の研究としては、MG骨格筋における免疫チェックポイント分子(PD-L1)およびβ2-microglobulin(β2-mg)の発現を蛋白レベルおよびmRNAレベルで確認した。この研究では、MG、筋炎、非筋原性疾患における骨格筋を用いた。抗PD-L1抗体、抗HLA-ABC抗体による免疫組織染色にて蛋白レベルでの発現を調べた。また、骨格筋より抽出したmRNAを用いて、PD-L1およびβ2-mgのmRNAの発現量を半定量化した。抗体を用いた免疫組織染色では、MGおよび筋炎骨格筋において、PD-L1およびHLA-ABCが骨格筋にて染色され、これらの蛋白の発現が亢進していることが証明された。また、MG及び筋炎の骨格筋ではPD-L1およびβ2-mgのmRNA発現が亢進していることが確認された。PD-L1およびβ2-mgの発現量は相関することが明らかとなり、両者の発現には共通した誘導因子があると考えられた。臨床症状との関連について一般化加法モデルにて解析したところ、PD-L1の発現量とQMGスコアとの間には一峰性の関連があることが示された。つまり、MGの症状の軽い時点ではPD-L1の発現は弱く、中等度の症状でPD-L1の発現がピークとなり、重症例ではPD-L1の発現は低値を示した。このことは、症状に応じPD-L1の発現が誘導されるが、PD-L1の発現が低いままであった場合、MGの症状が重症化する可能性を示していると考えられた。この結果は、MG骨格筋におけるPD-L1の発現がMGの病態に関わる重要な因子であることを世界で初めて示したものとなった。この成果はJ Neuroimmunology325:75-78,2018に掲載された。重症筋無力症骨格筋において、免疫チェックポイント分子(PD-L1)の発現が蛋白レベルおよびmRNAレベルで亢進していることが証明された。免疫チェックポイント分子は、免疫機能の調整分子として重要な因子であり、自己免疫における発症抑制においても機能していることが明らかになっている。重症筋無力症の骨格筋におけるPD-L1の発現亢進は、骨格筋に免疫調整機能が存在し、骨格筋を介した自己免疫抑制作用が働いている可能性を示していると考えられた。悪性腫瘍に対する治療の一つとして免疫チェックポイント阻害薬が使用されるが、この治療薬の使用に伴い生じる免疫関連有害事象の一つにMGがあり、骨格筋におけるPD-L1の発現は、免疫チェックポイント阻害薬関連MGの発症にも関与している可能性がある。この研究結果は、MGの新たな病態を発見したこととなり、今後のMGの治療法の開発にも有用な結果になると考えられ、この研究の進捗は順調であると判断される。現在、MG血清中の免疫チェックポイント分子の測定法および免疫チェックポイント分子に対する自己抗体の測定法を開発している段階である。サンドイッチEIA法に使用する抗体および血清濃度を調整し、最適濃度を確認している段階となっている。来年度前半には測定法を開発できる見込みであり、測定法が確定された段階でMGおよびコントロール血清中のPD-L1およびPD-L1に対する自己抗体測定を行う。これらの結果と臨床症状や予後との関連についても明らかにしていく予定である。免疫チェックポイント

分子は、免疫機能の調整分子として重要な因子であり、自己免疫における発症抑制においても機能していることが明らかになっている。重症筋無力症の骨格筋におけるPD-L1の発現亢進は、骨格筋に免疫調整機能が存在し、骨格筋を介した自己免疫抑制作用が働いている可能性を示していると考えられた。悪性腫瘍に対する治療の一つとして免疫チェックポイント阻害薬が使用されるが、この治療薬の使用に伴い生じる免疫関連有害事象の一つにMGがあり、骨格筋におけるPD-L1の発現は、免疫チェックポイント阻害薬関連MGの発症にも関与している可能性がある。この研究結果は、MGの新たな病態を発見したこととなり、今後のMGの治療法の開発にも有用な結果になると考えられ、この研究の進捗は順調であると判断される。現在、MG血清中の免疫チェックポイント分子の測定法および免疫チェックポイント分子に対する自己抗体の測定法を開発している段階である。サンドイッチEIA法に使用する抗体および血清濃度を調整し、最適濃度を確認している段階となっている。来年度前半には測定法を開発できる見込みであり、測定法が確定された段階でMGおよびコントロール血清中のPD-L1およびPD-L1に対する自己抗体測定を行う。これらの結果と臨床症状や予後との関連についても明らかにしていく予定である。
ドライマウスの診断方法の確立　～唾液を用いた新しい鑑別診断方法～

シェーグレン症候群(SS)患者は健常者と比較して、炎症性・Th1およびTh2タイプの濃度が有意に高かった。しかし、その他のドライマウスについては、健常者と比較していずれの分子においても有意差は認めなかった。また、SS患者をリンパ球の浸潤程度で重度・軽度の2群に分けて比較したところ、重度の症例では、IL-4、IL-17の有意な増加を認めた。sIgA濃度については、SSと放射線性では健常者より高く、薬物性では健常者より低かったが、いずれも有意差は認めなかった。これらの結果から、唾液中サイトカイン濃度測定は、SSの診断および病態把握に有用であることが示唆された。本研究は、シェーグレン症候群(SS)患者45例、薬物性口腔乾燥症患者14例、放射線性口腔乾燥症患者8例、健常者11例を対象とした。唾液採取用チューブ(サリソフト)を用い、口腔内より採取した唾液を遠心分離し、その上清を研究サンプルとした。唾液中サイトカイン濃度の測定は、50ulという少量で数十種類のタンパクを同時に測定することが可能であるCytometric Beads Array Flex Systemを用いた。さらに、ストレス関連物質であるSecretory IgA (SIgA)の濃度をELISA法(SALIMETRICS社)を用いて測定した。その結果、SS患者は健常者と比較して、Th1タイプ(INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-8)およびTh2タイプ(IL-5、IL-10)の濃度が有意に高かった。また、SS患者をリンパ球の浸潤程度で重度・軽度の2群に分けて比較したところ、重度の症例では、IL-6、IL-17の有意な増加を認めた。SIgA濃度については、ドライマウス患者は健常者より平均濃度が高かったが、有意差は認めなかった。今回の結果から、ごく少量の唾液を用いて微量なタンパクを解析できることが明らかになった。今後は症例数を増やし、経時的に測定することにより、従来困難であったドライマウスの診断や病態把握に有用かを検討していく予定である。近年、ドライマウスに対する社会的関心の高まりとともに、的確な診断と治療が求められている。しかし現在のところ、シェーグレン症候群(SS)以外のドライマウスには明確な診断基準がないため、診断に苦慮することが多い。そこで本研究では、ドライマウス患者の臨床所見を検討し、また非侵襲性で簡便かつ繰り返し採取可能な唾液を用いたドライマウスの新しい診断方法に繋がるかを検討した。SS患者90例、神経性・薬物性ドライマウス(DND)患者22例、放射線性ドライマウス(RD)患者30例、健常者36例を対象とし、安静時唾液分泌量(UWS)、刺激時唾液分泌量(SWS)、visual analog scale (VAS)による自覚症状を測定した。次に、フローサイトメトリー法にて唾液中サイトカイン濃度を、ELISA法にてストレス関連物質である分泌型IgA(SIgA)、クロモグラニンA(CgA)濃度を測定し、健常者と比較検討した。その結果、SSとRDはUWS、SWSともに基準値以下であり、DNDはUWSのみ基準値以下であった。VASによる口腔症状は、全ての患者群で健常者と比較して有意に高値であったが、眼症状はSSのみ有意に高値であった。サイトカイン濃度では、SSは健常者と比較して、Th1・Th2全ての分子で有意に高かったが、DNDはIL-10のみが有意に低く、RDは有意差を認めなかった。また、SSを口唇腺のリンパ球浸潤程度で軽度と重度の2群に分類し、サイトカイン濃度を比較した結果、Th1が軽度で、Th2が重度の症例で有意に高かった。SIgA濃度はいずれの患者群も健常者と有意な差は認めなかったが、CgA濃度はDNDで健常者と比較して有意に高かった。臨床所見、唾液中サイトカインおよびCgAの検索は、ドライマウスの診断に有用であることが示唆された。また、経時的な唾液中サイトカインの検索は、繰り返し行うことが困難な口唇腺生検に代わって、SSの病態進展の把握にも応用できる可能性が考えられた。本年度は以下のような研究を行った。1)ドライマウス患者からの唾液採取健常ボランティア、シェーグレン症候群(SS)患者、放射線性ドライマウス、神経性あるいは薬物性ドライマウス(XND)患者を対象として刺激時・安静時唾液唾液を採取している。現時点では各々20例前後の採取が完了している。またドライマウスの鑑別診断は、唾液分泌量測定や唾液腺シンチグラフィーなどの従来の口腔関連の検査を行っている。2)高感度で再現性のある解析方法の検討

BD社のCytometric bead arraysystemを用いて、まず健常者とSS患者のサイトカイン・ケモカインの濃度を測定した。その結果、SS患者では健常ボランティアと比較して、Th1およびTh2タイプのサイトカイン・ケモカイン濃度が有意に高く、さらにSS患者を口唇腺のリンパ球浸潤で重度・軽度の2群に分類すると、重度の患者ではTh2タイプのサイトカイン・ケモカインの濃度が有意に高かった。これら結果はわれわれの過去の口唇腺における研究結果と相関するもので、唾液を用いた測定方法が病態把握に十分に有用であることが示唆された。本研究の研究成果の一部は、Clinical & Experimental Immunologyに掲載中であり、世界的にも注目されている。唾液を検体として用いた新しい検査方法の開発を目指していく中で、今年度の研究成果は期待通りのものと思われる。本研究の研究成果は、Clinical & Experimental Immunologyに掲載準備中でなり、世界的にも注目されている。今後は症例数を増やし、また検索項目(sIgAなど)も増やして検討を加え、ドライマウスの鑑別診断や病態の把握に有用なものを選択する。さらに、臨床所見との関連も考え、データ収集を行っていく予定である。今後は、測定するタンパクの種類(イムノグロブリンや自己抗体なども含む)、唾液の種類、症例数を増やして検討を加え、ドライマウスの鑑別診断や病態の把握に有用なものを選択する。ドライマウスの鑑別診断や病態の把握に有用と思われるタンパクや唾液の種類を決定し、全てのタンパクを一度で測定できるようにビーズの蛍光強度を調整する。これにより、微量の唾液を用いて一度にフローサイトメトリーで測定することができ、簡便かつ迅速な新しい診断方法が確立を目指す。口腔関連の検査体系の確立:ドライマウスの鑑別診断や病態の把握に有用と思われるタンパクや唾液の種類を決定し、全てのタンパクを一度で測定できるようにビーズの蛍光強度を調整する。これにより、微量の唾液を用いて一度にフローサイトメトリーで測定することができ、簡便かつ迅速な新しい診断方法が確立できる。さらに、唾液分泌量測定、唾液腺造影、唾液腺シンチグラフィー、超音波検査などの従来の口腔関連の検査結果を組み合わせ、正診率、感度、特異性を検討して検査体系の確立を目指す。その際、可能な限り、簡便、非侵襲的、高感度、かつ再現性が高いことを重視し、必要最小限の検査方法を選別することとする。平成25年度は、平成23年度と平成24年度の研究の進行具合をみながら以下のように行う。1)口腔関連の検査体系の確立ドライマウスの鑑別診断や病態の把握に有用と思われるタンパクや唾液の種類を決定し、全てのタンパクを一度で測定できるようにビーズの蛍光強度を調整する。
注意の選択フィルターを形成するマウス頭頂連合野の機能解析

マウス頭頂連合野から一次視覚野への逆行性投射が存在し、一次視覚野を抑制することを見出したが、その生理学的役割は不明であった。そこで、「頭頂連合野からの投射が一次視覚野に選択的注意の初期選択フィルターを形成しているのでは?」という仮説を立て解析を進めたところ、1一次視覚野抑制の可塑性は、視覚刺激への特異性を有していること、2一次視覚野興奮性細胞の方位選択性を修飾すること、3抑制機能は頭頂連合野にマッピングされた、等を明らかにした。これらの結果は、仮説を支持するものと考えられ、さらに踏み込んだ解析を勇気づけるものであった。1、大脳皮質頭頂領域(頭頂連合野・後部帯状回・内側高次視覚野)から、大脳皮質視覚野への抑制投射経路の形態解析。GAD-GFPマウス(抑制神経細胞に緑色蛍光蛋白質GFPを発現している遺伝子改変マウス)の頭頂領域に順行性トレーサーを注入して解析したところ、一次視覚野の抑制神経細胞にシナプス結合しているという予備的な実験結果を得ることができた。この結果は、一次視覚野の活動を抑制的に制御するという頭頂領域の機能に対して、構造的な基盤があることを示したものであり、本研究課題にとって極めて重要な成果である。ただし現段階では、実験例数が少なく、定量的な解析も試みていない。これらの点を改善する必要があると考えられる。2、2光子顕微鏡in vivoカルシウムイメージングを使った一次視覚野チューニングカーブの解析。まずは、難易度が高いとされる2光子顕微鏡カルシウムイメージング実験の習熟を目的として、予備的な実験を繰り返しおこない、一次視覚野の神経細胞の方位選択性や方向選択性を測定することができるようになった。現在、頭頂領域から視覚野への抑制投射経路を切断したマウスでのイメージング解析を進めている。また、頭頂領域を電気刺激したところ、カルシウム指示色素により染色された一次視覚野は陰性の応答を示した。この結果は、抑制応答のイメージング解析は、フラビン蛋白蛍光イメージング以外の手法でも可能性があることを示しており、研究課題の将来的な発展にとって重要な知見が得られた。1、2光子顕微鏡in vivoカルシウムイメージングを使った選択フィルター特性の解析。一次視覚野の神経細胞の方位選択性や方向選択性を測定した。GAD-GFPマウス(抑制神経細胞に緑色蛍光蛋白質GFPを発現している遺伝子改変マウス)を使用することで、興奮性および抑制性神経細胞を同定・区別して解析した。頭頂領域から視覚野への大脳皮質内抑制性投射経路を切断した直後のマウス(急性群マウス)、切断後3週間以上の回復期をおいたマウス(慢性群マウス)、および切断していないマウス(対照群マウス)での結果を比較・検討した。興奮性神経細胞の方位選択性は急性群マウスでのみ低下が見られた。この結果は、抑制性投射経路が方位選択性の形成には関係しないが、モジュレーションに関与していることを示唆していた。一方、興奮性神経細胞の方向選択性は急性群マウスおよび慢性群マウスにおいて低下が見られ、抑制性投射経路が方向選択性の形成に働いていることを明らかにした。さらに、抑制神経細胞の方位選択性は抑制性投射経路の切断に影響されないという結果を得られた。これは、視覚野抑制応答のメカニズムとして想定していた、視覚野抑制性神経細胞の活性化という単純なモデルでは説明できず、研究課題の将来的な展開にとって重要な知見が得られた。2、頭頂連合野から視覚野への抑制投射経路の形態解析。頭頂連合野に順行性トレーサーを注入して解析したところ、前帯状回・背側線条体・視床の背側外側核・後外側核へ投射していた。それら各部位を電気刺激したところ、前帯状回・背側線条体では視覚野に抑制応答が、背側外側核・後外側核では逆に興奮性の応答が見られ、視覚野抑制のメカニズムとその機能を明らかにするうえで極めて重要な成果が得られた。当初計画での実行順序を変更して、2光子顕微鏡カルシウムイメージング実験とトレーサー注入実験を優先的に進めてきたが、それらの実験からその後の研究の進展を左右する重要な成果を得られた。一方、後回しにした「2音弁別学習システムを用いた注意機能の行動解析」と「ペアリング刺激による選択フィルターの形成実験」の準備は進行中であり、無理なく実行できると考えている。以上のように実験予定に変更があったが、全体を見渡して検討し、おおむね順調に進展していると判断した。1、一次視覚野を負に制御する頭頂皮質領域を正確にマッピングした。MNI-ケージド-L-グルタミン酸を頭頂部のいくつかの部位に注射し、UVフラッシュ光を照射してグルタミン酸を放出させた。グルタミン酸によって放出部位に誘起された興奮とともに、一次視覚野の抑制をフラビンイメージングにより解析した。頭頂連合野の活性化が最も効果的であることを見出し、頭頂連合野のひとつの機能が一次視覚野の抑制制御であることを明らかにした。2、一次視覚野抑制の可塑性に視覚刺激への特異性があるか否かを調べた。2種類の視覚刺激(縦縞または横縞)を30秒ごとにマウスに交互に提示した。いずれか一方の視覚刺激と頭頂連合野の電気刺激とを5分間隔でペアリングしたところ、ペアリングした視覚刺激に対する一次視覚野の応答は、ペアリング形成後に有意に減少した。

一方、ペアリングしていない視覚刺激への応答はわずかに増強された。これらの結果は、視覚刺激に選択的な可塑性変化を一次視覚野応答に引き起こす機能を頭頂連合野が有することを示唆している。3、視覚刺激と頭頂連合野活性化との時間的関係を解析した。LED発光による視覚刺激と頭頂連合野の電気刺激とを様々なタイミングで組み合わせた。LED刺激による一次視覚野のON応答は、LED発光開始の前後の広い時間枠内で頭頂連合野が電気刺激されたときに有意に抑制された。この結果は、頭頂連合野からの神経活動が、視覚刺激前後の広い時間枠内で一次視覚野を調節することができることを示しており、マウス頭頂連合野がトップダウンおよびボトムアップの注意において生理学的役割を持つという示唆を得られた。計画した研究の要となるアデノ随伴ウイルスベクターを平成27年11月に発注した。通常3週間ほどで発送されるはずが、生産者の都合により大幅に遅延、入手できたのは平成28年7月となり、研究の進展を遅らさざるを得なくなった。また、研究代表者(新潟県在住)の母親(滋賀県)が平成28年4月に亡くなった。遠隔地での葬儀・法事・実家の後始末・相続関係の手続き等で多くの時間を要した。1、一次視覚野の周辺領域の神経活動が一次視覚野に及ぼす影響を調べた。二次視覚野のLM領域の賦活は一次視覚野を正に制御することを示した。MNI-ケージド-L-グルタミン酸をLM領域に注射し、UVフラッシュ光を照射してグルタミン酸を放出させた。グルタミン酸によって放出部位に誘起された興奮とともに、一次視覚野の抑制をフラビンイメージングにより解析した。頭頂皮質領域の賦活が一次視覚野を負に制御することとは逆の効果であり、対照実験としても意義のある結果を得られた。2、一次視覚野抑制に可塑性があることを示した実験の対照実験を行った。視覚刺激を30秒ごとにマウスに交互に提示し、5分間隔で視覚刺激と頭頂連合野の電気刺激とをペアリングし、ペアリング形成後の視覚刺激に対する一次視覚野の応答が有意に減少することを示したが、このペアリングを行わなかった場合には応答の減弱が見られないことを明らかにした。この結果は、先の応答減弱が、イメージング実験における励起光照射がもたらした退色によるものではないことを示し、対照実験として重要な結果が得られた。3、頭頂連合野の構造的破壊が一次視覚野の応答を増強することを明らかにした。頭頂連合野から一次視覚野への皮質内経路の構造破壊や、薬物注入による頭頂連合野の機能的破壊が、一次視覚野抑制を阻害して応答を増強することと同様の結果であり、頭頂連合野の機能についてより厳密に議論できるようにできた。マウス頭頂連合野から一次視覚野への逆行性投射が存在し、一次視覚野を抑制することを見出したが、その生理学的役割は不明であった。そこで、「頭頂連合野からの投射が一次視覚野に選択的注意の初期選択フィルターを形成しているのでは?」という仮説を立て解析を進めたところ、1一次視覚野抑制の可塑性は、視覚刺激への特異性を有していること、2一次視覚野興奮性細胞の方位選択性を修飾すること、3抑制機能は頭頂連合野にマッピングされた、等を明らかにした。これらの結果は、仮説を支持するものと考えられ、さらに踏み込んだ解析を勇気づけるものであった。当初の計画では、「2音弁別学習システムを用いた注意機能の行動解析」、「ペアリング刺激による選択フィルターの形成実験」を行う予定であった。
力学的刺激に対する骨の適応的リモデリングに関する研究

本研究では,骨の適応的なリモデリングについて研究するために,非侵襲的な状況で骨に規定された荷重を負荷するラット脛骨の3点曲げ実験系,およびイヌ尺骨を部分切除した状況でイヌに運動させ残された撓骨に生理的な荷重を負荷させるイヌ撓骨の生理的荷重実験系の2つの実験系を開発した.そしてラット脛骨の3点曲げ実験系においては,静的な応力や動的な応力でも引張応力は骨形成に対して有効な刺激ではなく唯一動的な圧縮応力のみが骨形成に有効であることを示した.また応力の動的性を規定するのは,非荷重状態の継続する時間であり,非荷重時間が長いほど,そして荷重の繰り返し数が36回程度以上あることが,刺激として有効となることを示した.一方,イヌ撓骨の生理的荷重実験系においては,同一個体の経時的な骨形成状況をCT観察および骨の蛍光ラベリングにより解析し,荷重が増大しても骨は表面の全周にわたって生じるのではなく,撓骨の離断された尺骨側において特異的に生じることを示した.本来ならば2本の骨で支える荷重を1本で支えるのであるから,残された骨の失われた骨を向く側においては,圧縮応力が作用している可能性が高い.このことは現在ひずみ測定を行って詳細を検討中であるが,少なくとも全周で骨が形成されることは実験的に否定出来た分けであり,単に応力レベルが増大しただけでは骨形成に結びつかないことが明らかとなった.以上の2つの実験系の結果より,適応的骨形成は動的な圧縮応力の作用のもとで生じることを示すことができた.本研究では,骨の適応的なリモデリングについて研究するために,非侵襲的な状況で骨に規定された荷重を負荷するラット脛骨の3点曲げ実験系,およびイヌ尺骨を部分切除した状況でイヌに運動させ残された撓骨に生理的な荷重を負荷させるイヌ撓骨の生理的荷重実験系の2つの実験系を開発した.そしてラット脛骨の3点曲げ実験系においては,静的な応力や動的な応力でも引張応力は骨形成に対して有効な刺激ではなく唯一動的な圧縮応力のみが骨形成に有効であることを示した.また応力の動的性を規定するのは,非荷重状態の継続する時間であり,非荷重時間が長いほど,そして荷重の繰り返し数が36回程度以上あることが,刺激として有効となることを示した.一方,イヌ撓骨の生理的荷重実験系においては,同一個体の経時的な骨形成状況をCT観察および骨の蛍光ラベリングにより解析し,荷重が増大しても骨は表面の全周にわたって生じるのではなく,撓骨の離断された尺骨側において特異的に生じることを示した.本来ならば2本の骨で支える荷重を1本で支えるのであるから,残された骨の失われた骨を向く側においては,圧縮応力が作用している可能性が高い.このことは現在ひずみ測定を行って詳細を検討中であるが,少なくとも全周で骨が形成されることは実験的に否定出来た分けであり,単に応力レベルが増大しただけでは骨形成に結びつかないことが明らかとなった.以上の2つの実験系の結果より,適応的骨形成は動的な圧縮応力の作用のもとで生じることを示すことができた.本年度は実験装置を改良し,コンピュータ制御により荷重の制御が任意に可能なようにした.まず圧縮負荷と除荷の波形を非対称に設定して,ラットを利用した動物実験を行った結果,これまでの動物実験の問題点は荷重波形の設定にあることが明らかとなった.従来の研究では,荷重として一定圧縮荷重と零荷重の間で正弦波状に振動する圧縮荷重波形を採用しているが,この波形において生体組織が認識不可能であると考えられる直流成分を除き交流成分のみについて注目すると,圧縮の刺激と引張の刺激が打消し合う波形となってしまい,このために骨の形成が応力に非依存的になるようである.実際に本実験系においても正弦波的な荷重波形のもとでは,骨は主に中立軸付近に形成され,骨形成は応力に非依存的であった.これに対して,一定圧縮荷重を短時間保持し零荷重の時間を比較的長時間保持する矩形波形を採用し,交流的に圧縮荷重負荷である荷重波形を設定して実験を行うと,骨は圧縮応力側において特異的に形成され,骨形成に明らかな応力依存性が生じた.さらに相補的な波形として,一定圧縮荷重を比較的長時間保持し無荷重の時間を短時間保持する矩形波形を設定すると,骨の形成される部位が骨の断面内で逆転した.この波形は交流的に引張荷重負荷波形になることから,部位の逆転は先の実験結果と整合的である.