hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
液化木材を利用したボード等木質材料の開発

更に、これを用いてファイバーボードを製造し、ボード性能を評価した。油性のエポキシ化合物を用いる事により、曲げ性能は向上し、市販のフェノール樹脂と同等の性能を示した。しかし、剥離強さにおいては性能の向上は認められず、水溶性エポキシ化合物を用いた系と同等であった。また、天然系接着剤の開発という観点から、架橋剤を添加せず液化木材を単独で接着剤として用いファイバーボードを製造した。液化木材を単独で過熱し硬化した樹脂はエポキシ化合物架橋剤を用いた場合に比べ、弾性率は高いが脆い硬化樹脂であるため、ボード用接着剤としての性能は期待できないと考えられた。しかし、製造したボードの物性は油性エポキシ化合物架橋剤を用いた系と比較すると低かったが、曲げ性能に関しては、水溶性エポキシ化合物架橋剤を用いた系以上の性能を示した。これらの成果の一部をHolzforshungに投稿し、2006年8月810日に秋田大学で開催された第56回日本木材学会大会にて報告を行った。昨年度までの研究で、液化木材の粘度を低下させることにより、液化木材樹脂をスプレーガン塗布が可能なボード用接着剤に転化できることが明らかとなっている。本年度は、ボード性能の向上を目的として芳香核を有する油性のエポキシ化合物架橋剤を用いたファイバーボードを製造し、架橋剤添加量がボード性能へ与える影響について検討を行った。ボード性能を評価した結果、油性のエポキシ化合物架橋剤を用いることにより、実用に耐え得る性能を持ったボードの製造が可能であることを明らかとなった。さらに、架橋剤を用いず液化木材を単独で接着剤として用いてある程度の性能を有するファイバーボードを製造が可能であることを明らかとした。液化木材/エポキシ樹脂接着剤では、エポキシ化合物の添加量は接着剤樹脂重量の2030%を占めているため、エポキシ化合物を用いることなしに実用に耐え得る性能を持った接着剤の調製が可能であれば、コストの面からも、石油資源の部分代替という面からも大きな利点となる。そこで、液化木材を単独で接着剤として用いたパーティクルボードの製造に関し種々の検討を行った。また、ボード性能の向上を目的どして、これまで液化の前処理として行っていたオゾン処理を生成物に対して行い、オゾン処理液化木材樹脂接着剤を調製し、ボード用接着剤としての評価を行った。オゾン処理により、液化木材中の縮合残渣が低分子化し、ハンドリング性能が向上した。オゾン処理量の増加に従い、製造したパーティクルボードの物性は向上し、JIS A 5908で定められた18タイプに要求される性能を満たす値が示された。特に、はく離強さはエポキシ化合物架橋剤を用いた系より高い値を示した。また、耐水性に関しても改善が見られた。熱圧時間を短縮した場合には、曲げ強さ、はく離強さに関しては強度が維持されたが、耐水性が劣ることが明らかとなった。液化木材のみを接着剤として用いることで、木質ボードの製造が可能であり、液化木材をオゾン処理することにより接着性能が向上することが示されたことは、新規の天然系接着剤としての実用の可能性を示唆しており、今後、さらなる研究の発展が期待できる。
亜鉛の多角的な作用による興奮性ニューロンの抑制とその機構解析

亜鉛は脳の発育、機能に必要な生体微量金属であり、その代謝異常は脳疾患の発症や進行と関係する。記憶の基礎をなすメカニズムとして、シナプス可塑性があげられる。学習・記憶を司る海馬はシナプス可塑性のひとつ、長期増強(LTP, long-term potentiation)が最初に記録された脳部位である。海馬苔状線維終末のシナプス小胞には亜鉛が高濃度(約300μM)で存在する。この亜鉛が苔状線維終末でのカルシウムシグナルを抑制し、グルタミン酸の開口放出を抑制的に調節することをこれまでに報告した。本研究では、ポストニューロンであるCA3錐体細胞の興奮に対するシナプス亜鉛の作用、また苔状線維-CA3錐体細胞間でのLTPに対する亜鉛の作用を検討した。グルタミン酸(1mM)を添加した時のCA3錐体細胞内カルシウムシグナルの上昇は、グルタミン酸とともに塩化亜鉛(100μM)を添加することによって抑制された。一方、膜不透過型亜鉛キレート剤であるCaEDTA(1-10mM)を外液中にあらかじめ添加すると、グルタミン酸添加によるカルシウムシグナルの上昇は促進された。シナプス亜鉛は、CA3錐体細胞の興奮に対して抑制的に作用することが示唆された。また、テタヌス刺激による苔状線維-CA3錐体細胞間でのLTPはCaEDTA(1mM)を添加することによって、約25%増強された。以上より、シナプス亜鉛は苔状線維-CA3錐体細胞間でのLTP誘導を抑制することが示唆された。海馬は学習・記憶を司るが、そのメカニズムにはシナプス可塑性(シナプス伝達効率の長期増強(LTP)など)が関与すると考えられている。歯状回顆粒細胞由来の苔状線維終末(苔状線維-CA3錐体細胞)でのLTPは、苔状線維終末からのグルタミン酸放出量が増加することに起因する。したがって、グルタミン酸の放出調節機構は、海馬におけるシナプス可塑性を理解する上で重要である。苔状線維のシナプス小胞には亜鉛が高濃度(約300μM)で存在するが、この亜鉛の役割は十分には明らかにされていない。インビボマイクロダイアリシス法で苔状線維終末が分布する透明層に亜鉛を添加すると、細胞外グルタミン酸濃度が低下することから、亜鉛がグルタミン酸放出を抑制することが考えられる。グルタミン酸の開口放出は細胞内カルシウム濃度の上昇により開始される。そこで、海馬スライスを用いて苔状線維終末に亜鉛とカルシウムの蛍光プローブを選択的に取り込ませ、LTP誘導に用いられる100Hz、1秒間の電気刺激を歯状回顆粒細胞に与え、苔状線維終末のカルシウム濃度上昇に対する亜鉛の作用を検討した。その結果、亜鉛は苔状線維終末のカルシウム濃度上昇を抑制した。さらに、開口放出検出用の蛍光プローブを用いた検討から、亜鉛が開口放出を抑制することが示唆された。苔状線維から放出された亜鉛は電位依存性カルシウムチャネルの抑制などを介して苔状線維終末のカルシウム濃度上昇を抑制し、グルタミン酸の開口放出を抑制することが示唆された。また、苔状線維終末に再取込された亜鉛が開口放出を抑制することも示唆された。
圧力下における造岩強磁性鉱物の磁性測定

実験室で数GPaの圧力下での交流磁化率測定とキュリー温度測定を行うための実験装置を設計・製作した。基本的な作成方法は次のとおりである。まず、外径φ2(mm)の円柱状になるように、試料を熱電対とともにセメントを用いて封入する。その周りにφ0.1のクロメル線を約30Ω程度になるように巻き、さらにセメントで固める。この上に2次コイルを巻き、その上からガラスチューブをかぶせる。ガラスチューブの上に1次コイルを巻き、雲母のシート、さらにガラスチューブで囲む。このようにしてできた検出部の外形はφ6程度である。ヒーターを一番内側に巻くことによって熱が効率的に伝わり、空気中でも約10Wの入力で700°Cまで温度を上げて測定することが可能である。このコイルを用いて、Niの交流磁化率を測定したところ、文献のデータとほぼ同じ結果が得られた。また、同様のコイルを用いて天然マグネタイトの交流磁化率の測定にも成功した。ここで、注意しなければならないことは、コイルを固定するためにセメントを使ってはならないことである。セメントの素材は約500°C程度で誘電率が急激に変化し磁化率のバックグラウンドが大きく変化する。次に、この検出部を収納することのできるタングステン・カーバイド製の圧力容器を設計・製作した。発生最大圧力は4GPa程度である。圧力媒体としてBNの微粉末を用いた。圧力容器にすべてをセットした状況で、圧力を印加しない場合には、圧力セルを使わないときと同様に交流磁化率の測定を行うことができた。しかし、検出部からのリード線が複雑に入り組んでいるため、10MPa程度の圧力で断線し、圧力下での実験には現時点では成功していない。今後の課題は、リード線の封入方法の改善あるいは液体圧力による測定である。平成17年度は、基本測定システムの設計開発と一連の予備実験を行った。測定システムは、1)CuBe製の小型圧力セル、2)圧力セル封入に適した小型電気炉、3)交流磁化率測定のためのコイルシステムとロックインアンプ、からなる。現段階では、電気炉加熱により、金属Ni試料の室温から約600°までの交流磁化率精密測定が可能となった。デジタルロックインアンプと交流ブリッジによる磁化率測定系は再現性も良好であり、Niのキュリー点を1°C以下の精度で測定できる。現在は比較的低周波(100kHz)で測定しているが、今後は測定系を改良することにより、交流磁化率の周波数特性(ロックインアンプの測定上限250kHzまで)を計測できるようにしたい。1)の小型圧力セルは、CuBe製のシリンダー(外径8.8mm、全長60mm)と非磁性タングステンカーバイド製ないしジルコニアセラミック(ZrO_2)製のピストン(外径3mm、全長10mm)で構成され、約1GPaを発生できることを確認した。この圧力セルによって加圧した試料を、圧力容器ごとMPMS(Magnetic Property Measurement System)で測定することにより、これまでに数種の人工単結晶試料の低温高圧下での磁性測定を行い、良好な結果を得ることができた。一方、自然岩石残留磁化の圧力変化の現場測定をするために、これよりやや大型の圧力セル(外径12mm、全長70mm)と従来型のSQUID磁力計を用いた測定システムを開発中である。

これまでに、圧力セル各構成部品の磁性評価を行い、10^<-3>emu程度の磁化強度をもつ試料の圧力依存性を測定できる見通しがついた。平成18年度(最終年度)は、測定システムの完成度を高め、自然岩石試料や造岩磁性鉱物を用いた応用実験を行う予定である。実験室で数GPaの高圧力下の磁化率測定を行うためには、圧力容器の内径をφ8(mm)以下にしなければならない。そのためにまず、高温交流磁化率の小型検出装置を設計・製作した。最適な作成方法は次のとおりである。まず、外径φ2の円柱状になるように、試料を熱電対とともにセメントを用いて封入する。その周りにφ0.1のクロメル線を約30Ω程度になるように巻き、さらにセメントで固める。この上に2次コイルを巻き、その上からガラスチューブをかぶせる。ガラスチューブの上に1次コイルを巻き、雲母のシート、さらにガラスチューブで囲む。このようにしてできた検出部の外形はφ6程度である。ヒーターを一番内側に巻くことによって熱が効率的に伝わり、空気中でも約10Wの入力で700°Cまで温度を上げて測定することが可能である。このコイルを用いて、Niの交流磁化率を測定したところ、文献のデータとほぼ同じ結果が得られた。また、同様のコイルを用いて天然マグネタイトの交流磁化率の測定にも成功した。ここで、注意しなければならないことは、コイルを固定するためにセメントを使ってはならないことである。セメントの素材は約500°C程度で誘電率が急激に変化し磁化率のバックグラウンドが大きく変化する。次に、この検出部を収納することのできるタングステン・カーバイド製の圧力容器を設計・製作した。発生最大圧力は4GPa程度である。圧力媒体としてBNの微粉末を用いた。圧力容器にすべてをセットした状況で、圧力を印加しない場合には、圧力セルを使わないときと同様に交流磁化率の測定を行うことができた。しかし、検出部からのリード線が複雑に入り組んでいるため、10MPa程度の圧力で断線し、圧力下での実験には現時点では成功していない。今後は、リード線の封入方法の改善あるいは液体圧力による測定を考える必要がある。
ジグリコシダーゼの触媒機構の解明から植物β-グルコシダーゼの分子進化をたどる

1.ジグリコシダーゼの基質認識と触媒機能の解明(1)チャ葉β-プリメベロシダーゼのX線結晶構造解析昨年度達成した阻害剤のβ-プリメベロシルアミジンを結合した状態での25Åの分解能に加えて、本年度はさらに結晶化条件の最適化を行ない1.8Åの分解能で解析することができた。その結果、二糖に直接相互作用するアミノ酸残基の同定、活性ポケット開口部の構造の詳細を明らかにし,本酵素の二糖認識機構の詳細を明らかにした。(2)6'-位修飾擬似二糖配糖体を用いた基質認識機構の解明p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside(pNP Glc)の6'-位の水酸基をS原子で置換してキシロースや種々のアルコール(C_<24>)を結合した擬似二糖配糖体を合成し、ジグリコシダーゼの1つのビシアニンヒドロラーゼに対して加水分解活性を調べた。本酵素はpNP β-primeveroside(pNP Pri)に対して、高い加水分解活性を示す。しかしS原子で置換したpNP PriやpNP Glcはほとんど加水分解しない。直鎖C_3アルコールを結合した配糖体に高い加水分解活性が観察された。直鎖アルコールが二糖を認識するアミノ酸残基と相互作用しているものと考えられる。2.植物界におけるジグリコシダーゼの分布・分子進化の解析ジグリコシダーゼのアミノ酸配列を元に進化系統樹解析を行ったところ、ジグリコシダーゼはそれぞれ別のβ-グルコシダーゼから並行進化していた。さらにpNP Priを用いて、無作為に選んだ18種の植物について二糖加水分解活性を調べたところ、7種もの植物に活性が見られた。以上の結果は、β-プリメベロシダーゼと類似した酵素活性を示すジグリコシダーゼが、植物界には相当数分布していることを強く示唆している。植物には単糖配糖体以外に、β-グルコシドの6-位の水酸基に様々な単糖がβ-1,6結合した二糖配糖体や、6-位にアシル基が結合した6-位置換β-グルコシドが多数見出されている。これらの6-位置換の生理的意義が不明なところが多い二糖配糖体を、二糖とアグリコンに加水分解するジグリコシダーゼとして、我々はこれまでにチャ葉由来β-プリメベロシダーゼ(PD)とムシカリ由来フルカチンヒドロラーゼ(FH)を研究し、PIとFHはファミリー1グリコシダーゼに属するにもかかわらず、単糖配糖体を加水分解しない非常にユニークなβ-グリコシダーゼであることを明らかにした。本研究では、これらのジグリコシダーゼをモデルとして、(1)ジグリコシダーゼの基質認識と触媒機能の解明、(2)植物ジグリコシダーゼファミリーの確立、(3)植物のファミリー1β-グリコシダーゼの分子進化の解析、を目的として研究を展開し、下記の成果を得た。1)ジグリコシダーゼの基質認識と触媒機能の解明:PDとFHに続いて、カラスノエンドウ(Vicia angustifolia)からvicianinを加水分解するビシアニンヒドロラーゼ(VH)を精製し、cDNAを単離した。昆虫細胞系で発現させた組換えVHは、vicianinを二糖とアグリコンに加水分解し、ファミリー1に属することが明らかとなった。種々の基質を用いて、PD、FHおよびVHの3種のジグリコシダーゼの基質特異性を明らかにした。2)糖タンパク質であるPDは昆虫細胞発現系を用いて大量発現させた。

合成により得たプリメベロースをグリコシダーゼ阻害活性を示す新規なグリコシルアミジン誘導体に導き、それをリガンドとしたアフィニティー吸着体がPDの精製に効率良く利用できることを明らかにし、この吸着体を用いて、PDを大量に得る方法を確立した。これを用いてX線結晶構造解析に向けての単結晶の調製を試み、糖鎖をマンノシダーゼでトリミングしたタンパク質がかなり良好な結晶を与えることが明らかとなった。3)アミノ酸配列を元に系統樹解析を行った結果、PD、FHとVHは互いに近傍に位置し、これらジグリコシダーゼはβ-グルコシダーゼから進化して新しい機能を持つようになったことが示された。4)PD検出用に調製したポリクロナール抗体やpNP β-primeverosideを用いた活性試験を利用して、数種の植物の粗酵素標品について調べ、ジグリコシダーゼが相当に広く植物界に分布していることを示唆する結果を得た。1)ジグリコシダーゼの結晶化および構造解析組換えプリメベロシダーゼ(PD)をバキュロウイルス昆虫細胞系により大量発現し、α-マンノシダーゼ処理により糖鎖を除去したのち、特異的阻害剤であるβ-プリメベロシルアミジンをリガンドとしたアフィニティ吸着体により精製した。結晶化条件を検討した結果、単結晶が得られ2.0Åの分解能で構造解析することに成功した。PDの結晶構造をトウモロコシ由来β-グルコシダーゼ(1E1F)の構造と比較したところ、活性残基およびグルコース認識残基の構造は完全に一致した。一方、1E1Fでアグリコンを認識しπ-πスタッキングしているTrp378がPDではAlaに置換しており、基質結合ポケットの入り口が広がっていた。さらに、二糖に直接作用するアミノ酸残基を同定するため、β-プリメベロシルアミジンとの共結晶化を行なった結果、二糖が結合した状態の結晶構造を2.5Åの分解能で解析することに成功した。現在、結晶化条件の最適化を行ない、より詳細な二糖認識機構の解明を進めている。2)ジグリコシダーゼの変異酵素の作成と解析フルカチンヒドロラーゼ(FH)のモデル構造を解析した結果、基質ポケットの入り口に位置するAlaが二糖結合に重要な残基であると予想された。そこでAlaをTrpに点変異したところ、ジグリコシダーゼ活性とグルコシダーゼ活性が共に著しく低下した。現在、基質ポケットを構成する残基の多重変異酵素を作製して活性への影響を調べている。3)植物のファミリー1β-グリコシダーゼの分子進化の解析4種のジグリコシダーゼ(PD,FH、ビシアニンヒドロラーゼ、ルチンヒドロラーゼ)と植物由来ファミリー1β-グリコシダーゼの進化系統樹解析を行なった結果、ジグリコシダーゼは二糖配糖体を蓄積する植物種の中でβ-グリコシダーゼから独立に平行進化したのではないかと考えられた。(1)ジグリコシダーゼの基質認識と触媒機能の解明(1)-aチャ葉β-プリメベロシダーゼのX線結晶構造解析昨年度達成した阻害剤のβ-プリメベロシルアミジンを結合した状態での2.5Åの分解能に加えて、本年度はさらに結晶化条件の最適化を行ない1.8Åの分解能で解析することができた。その結果、二糖に直接相互作用するアミノ酸残基の同定、活性ポケット開口部の構造の詳細を明らかにし,本酵素の二糖認識機構の詳細を明らかにした。(1)-b 6'-位修飾擬似二糖配糖体を用いた基質認識機構の解明p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNP Glc)の6'-位の水酸基をS
アレン化合物を鍵中間体としたアルケン型イソスターの分岐的合成法の開発と応用

ペプチド結合の生物学的等価体(バイオイソスター)への置換は、生理活性ペプチドをリードとする創薬研究において、生物活性や生体内安定性の向上を目指すための重要な方法論の一つである。このうち、ペプチド結合部位に新たな構造的・静電的特性を付与した官能基への変換は、活性や安定性の大幅な向上が期待できることから、多様な骨格が開発されると共にその成功例が報告されている。報告者は、ペプチド結合に似た二重結合性を有する塩基性官能基であり、水素結合供与能を持つアミジン型イソスターに着目し、化学合成法の確立と生理活性ペプチドへの応用について検討を行った。報告者は、Fmoc固相合成法により合成したペプチドアルドキシムを原料とし、系中で生成したニトリルオキシドに対してペプチドのα-アミノ基を作用させ、アミドキシムを鍵中間体として得た。続いて、得られたアミドキシムを還元反応に付すことで、目的とするアミジン型イソスターを合成した。本合成法を用いて、インテグリンα_vβ_3アンタゴニストとして知られる環状RGDペプチド誘導体と、ケモカイン受容体CXCR4拮抗活性を示す環状ペンタペプチドFC131誘導体を合成した。さらに、アミジン含有FC131誘導体はFC131と比較して高いCXCR4拮抗活性を示し、アミジンへの変換による塩基性官能基の導入が活性に寄与していることが示唆された。以上の結果より、報告者は、本法がアミジン含有生理活性ペプチドの合成に適用可能であることを示した。また、FC131の分子サイズを変えることなく、FC131よりも大幅に活性の高い複数のアミジン含有誘導体を見出した。これらの誘導体は、SDF-1/CXCR4系が関与する様々な疾患に対する薬剤および研究用試薬として有用であると考えられる。生体内で容易に加水分解されるペプチド結合の非水解性結合への置換は、ペプチドリード創薬において重要な方法論のひとつである。トリフルオロメチルアルケンジペプチドイソスター(CF3-ADIs)はアミド結合と類似の双極子モーメントを有するため、優れたペプチド等価体として機能する可能性を有している。報告者は、従来法の欠点であるXaa-Gly型イソスターのδ位の立体制御の問題を克服しうる新規合成法の開発を検討し、光学活性なα-アミノ酸由来のアリルカルボナートに対するカルボニル化を利用したCF3-ADIsの立体選択的な合成法の開発に成功した。また、CF3-ADIsの合成中間体より種々の三置換型アルケンジペプチドイソスター(TADIs)へと誘導した。次に、新規イソスターとしてアミドオキシムイソスターの合成に着手した。アミドオキシムイソスターは、立体的及び静電的にペプチド結合に似た性質を維持し優れたペプチド等価体となる可能性を秘めているが、効率的合成法の開発、構造活性相関研究は殆どなされていない。報告者は、光学活性なペプチドアルデヒドをアルドキシムへ変換し、N末端無保護のペプチドと反応させることで、ラセミ化を起こすことなく目的とするアミドオキシムイソスターを合成できることをすでに確認した。また固相担体にアミノアルドキシムを結合し、固相ペプチド合成法(SPPS法)で長鎖ペプチドへと導き、担体からの切断後、ペプチドとの反応により得られたアミドオキシムを加水分解によりアミド結合へと変換することで新たなNative Chemical Ligation法に応用できると考えた。これまでに樹脂上でアルドキシムを合成することに成功し、現在SPPS法によるペプチド等価体の合成を検討している。今後、環状ペプチドおよび等価体の効率的合成の開発に展開する予定である。生本内で容易に加水分されるペフチド結合の非水解性結合への置換は、ペプチドリード創藥において重要な方法論のひとつである。報告者は、新規イソスターとしてアミドオキシムイソスターの合成に着手した。アミドオキシムイソスターは、立体的及び静電的にペプチド結合に似た性質を維持したペプチド等価体となる可能性を秘めているが、効率的合成法の開発、構造活性相関研究は殆どなされていない。報告者は、光学活性なペプチドアルデヒドをアルドキシムへ変換し、N末端無保護のペプチドと反応させることで、ラセミ化を引き起こすことなく目的とするアミドオキシムイソスターを合成できることをすでに確認した。また固相担体にアミノアルドキシムを結合し、固相ペプチド合成法(SPPS法)で長鎖ペプチドへと導き、担体からの切断後、ペプチドとの反応により得られたアミドオキシムを加水分解によりアミド結合へと変換することで新たなフラグメント縮合法に展開できると考えた。これまでに樹脂上でアルドキシムを合成し、長鎖ペプチドに導くことに成功した。現在は、縮合条件、切断条件の最適化を検討している。一方ペプチド中のアミドオキシム部位が、ペプチドの全メチル化条件においてNメチル化されず、新規保護基として有効であることを見出した。この新規保護基を用いれば、一般的に合成が困難であるとされるNメチル基を多く含むペプチドを簡便に合成することができるようになるものと期待される。現在は、Nメチル化条件の最適化と、アミドキシムのアミドへの変換反応について検討している。

このうち、ペプチド結合部位に新たな構造的・静電的特性を付与した官能基への変換は、活性や安定性の大幅な向上が期待できることから、多様な骨格が開発されると共にその成功例が報告されている。報告者は、ペプチド結合に似た二重結合性を有する塩基性官能基であり、水素結合供与能を持つアミジン型イソスターに着目し、化学合成法の確立と生理活性ペプチドへの応用について検討を行った。報告者は、Fmoc固相合成法により合成したペプチドアルドキシムを原料とし、系中で生成したニトリルオキシドに対してペプチドのα-アミノ基を作用させ、アミドキシムを鍵中間体として得た。続いて、得られたアミドキシムを還元反応に付すことで、目的とするアミジン型イソスターを合成した。本合成法を用いて、インテグリンα_vβ_3アンタゴニストとして知られる環状RGDペプチド誘導体と、ケモカイン受容体CXCR4拮抗活性を示す環状ペンタペプチドFC131誘導体を合成した。さらに、アミジン含有FC131誘導体はFC131と比較して高いCXCR4拮抗活性を示し、アミジンへの変換による塩基性官能基の導入が活性に寄与していることが示唆された。以上の結果より、報告者は、本法がアミジン含有生理活性ペプチドの合成に適用可能であることを示した。また、FC131の分子サイズを変えることなく、FC131よりも大幅に活性の高い複数のアミジン含有誘導体を見出した。これらの誘導体は、SDF-1/CXCR4系が関与する様々な疾患に対する薬剤および研究用試薬として有用であると考えられる。
ナノバブルによる海産生物の付着忌避システムの開発

本研究は、流体工学によるナノバブルの海産生物付着忌避機構を生物学的観点と流体工学的観点の両面から新たな学問分野への展開と海水利用産業への応用展開について考案することを目的とし,以下の実験を行った。野外フィールド実験:プランクトンの発生量が多い4月と10月を含むように4月から12月にかけて宮城県女川湾にある筏にホタテガイおよびマガキを入れた養殖用ネットを吊し、通常養殖区とナノバブル区での付着生物種組成、付着量を調査した(生物学的調査)。また、同時に各実験区の流量、流速、溶存酸素量、pH、塩分濃度等の分布(上層、中層、下層)を調べた(物理的・化学的調査)。その結果、ナノバブル区において付着生物が顕著に少なくなることを昨年に引き続き確証できた。しかし、物理的、化学的な環境特性に違いは認められなかった。飼育水槽実験:そこで、4月から12月にかけて宮城県女川町の海生センターにある1トン水槽(3槽)に野外フィールド実験と同様にホタテガイとマガキを入れた養殖ネットを吊し無濾過海水を1トン/日加え、ノンバブル区、マクロバブル区、ナノバブル区での付着生物種組成、付着量を毎月調査した(生物学的調査)。その結果、どの区も物理・化学的特性に顕著な差はみられなかったがナノバブル区において表層に膜状の物質が出現した。そこで、膜状の物質を採集し、顕微鏡で観察したところ、微小生物の死骸と見なされ、ナノバブルの海産生物付着忌避が、ナノバブルによる微小生物の死滅除去による可能性が示された。これらの成果は船舶における付着生物防除や陸上養殖における付着生物防除に応用できると考えられ、今後の展開につなげられた。また、これらの成果は応用性の確証をした後に公表する。沿岸生物の幼生は沿岸の岸壁、漁網、養殖施設、発電所の冷却水取水管など、あらゆる場所に付着し、その脱離と洗浄に多大な労力と費用がかかっている。これまで我々は極めて微細な空気の泡(ナノバブルと称す)を発生させる装置を流体工学的に作成し、その応用としてナノバブルの貝類養殖生産に対する効果の研究を行ってきた。その結果、生産効果に与えるナノバブルの効果は小さかったが、室内実験、フィールド実験ともにナノバブル実験区において顕著に付着生物が少ないことに気が付いた。本研究は、流体工学によるナノバブルの海産生物付着忌避機構を生物学的観点と流体工学的観点の両面から明らかにすること、およびナノバブルを実験手法とした新たな学問分野への展開と海水利用産業への応用展開について考案することを目的とした。本年度は、飼育水槽実験用、野外フィールド実験用のナノバブル発生装置およびそれを用いた実験装置を設定した。野外フィールド実験ではナノバブル実験区と対照区を女川湾養殖施設近傍に設置し、経過観察を行った結果、ムラサキイガイをはじめ固着性付着生物および非固着性付着生物の付着がいずれも認められたが、量的には明確にナノバブル実験区で少なくなっていた。また、同時に開始した飼育水槽実験において、ナノバブル実験区、新ナノバブル実験区、エアレーション実験区、無バブル実験区を設定し、付着生物量を計測した。その結果、フィールド実験区と比較して明確な差異は認められなかったが、ナノバブル実験区では表層に多くの有機物残骸が認められ、水中のプランクトン防除機能が予測された。有機物残骸に関しては現在分析中である。フィールド実験および飼育水槽実験に関しては計画どおりに実施でき、ナノバブルの付着忌避効果を確証できたが、人工種苗を用いた実験は、昨年の海洋状態の不順(夏期の低水温)のため十分な実験ができなかった。

そこで、膜状の物質を採集し、顕微鏡で観察したところ、微小生物の死骸と見なされ、ナノバブルの海産生物付着忌避が、ナノバブルによる微小生物の死滅除去による可能性が示された。これらの成果は船舶における付着生物防除や陸上養殖における付着生物防除に応用できると考えられ、今後の展開につなげられた。また、これらの成果は応用性の確証をした後に公表する。
サイトカインアンタゴニストによる重症細菌感染症の治療法の開発

生体は、病原細菌の侵入に対し、腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン(IL-1、IL-6)、インターフェロン-γ(IFN-γ)等のサイトカインを産性する。特にブドウ球菌や連鎖球菌から産性される細菌外毒素(スーパー抗原)や大腸菌の内毒素(リポポリサッカライド(LPS))は、過剰にサイトカインを誘導し、致死性ショックを引き起こす。また結核菌感染等による慢性肉芽腫性炎症においてもサイトカインが病態形成に重要であることが明らかになっている。このような細菌感染症から生体を防御するためには、サイトカイン産生を抑制することが必要である。結果1)本研究において、細菌外毒素またはLPSによる致死性ショックモデル及び結核菌、Rhodococcus aurantiacusの慢性肉芽腫症のモデルをマウスの系で樹立し、サイトカインアンタゴニストの治療の有用性について検討することが可能となった。また、感染マウスの脳・脊髄内には、CD4、CD8陽性細胞が浸潤しており、これらの抗体投与が脳炎の発症を抑制したことにより、T細胞を介した炎症反応が脳炎の誘発に関与することが示唆された。
金属錯体型人工DNAによる金属イオンのヘテロ集積化と新規機能発現制御

本研究は、核酸塩基として金属配位子を有する人工DNAをテンプレートとして、DNA中に多種・多数の金属イオンをデザインした配列や個数で集積することを目的としている。今までに、Cu^<2+>イオンにより選択的に金属錯体型塩基対を形成するヒドロキシピリドン型(H)、およびHg^<2+>イオンに選択的なピリジン型ヌクレオシド(P)をDNAオリゴマー中に導入し、DNA上の配位子の配列をテ:ンプレートとして、Cu^<2+>イオンとHg^<2+>イオンとを位置選択的に配列化することに成功した(Nature Nanotech(2006))。そこで、配列できる金属イオンの種類を拡張するために、ソフトな金属配位子を有するメルカプトピリドン型ヌクレオシド(S)をデザイン・合成した。紫外可視(UV-vis)吸収スペクトルを用いた金属イオンの適定実験、およびマススペクトル測定から、ヌクレオシドSがPd^<2+>イオンやNi^<2+>イオンと2:1錯体を形成し、S-Pd^<2+>/Ni^<2+>-S塩基対を定量的に形成したことが示された(J.Org.Chem.投稿中)。このように、ヌクレオシドを適切にデザインすることにより、DNA鎖中に導入できる金属イオンの種類を拡張することに成功した。さらにDNA三重鎖モチーフを用いて六配位型の金属イオンを配列することを考え、人工ヌクレオシドのみからなるDNAオリゴマー5'-H_n-3'(n=2-4)を合成した。Fe^<3+>イオンの滴定実験およびマススペクトル測定から、3:1錯体H_3Fe^<3+>の形成によって、Fe^<3+>イオンの一次元配列d(5'-H_n-3')_3・Fe^<3+>_n(n=2-4)が定量的に構築できたことが示された(投稿準備中)。以上のように、数や配列を自由にデザインして合成できる人工DNAの特性を生かし、DNAの骨格構造の中に同種・異種の金属イオンを望んだ数や配列で一次元的に集積する方法論を確立した。本研究では、核酸塩基として金属配位部位を持つ人工DNAを合成し、金属錯体型塩基対の形成により、多種・多数の金属イオンを定量的かつ位置選択的に集積化することを目指している。複数種の金属イオンを目的に合わせて配列化するには、金属配位子である人工ヌクレオシドと目的の金属イオンとを1:1に対応させることが必要である。そこで、ソフト・ハードによる親和性の差に基づいて、新規金属配位型ヌクレオシドとしてメルカプトピリドン型ヌクレオシド(M)をデザインした。メルカプトピリドン型ヌクレオシドは、3-メルカプト-4-ピリドンを核酸塩基部位として有し、金属配位部位としてソフトなドナーであるチオール基を持っている。そのため、すでに報告しているヒドロキシピリドン型ヌクレオシド(H)と金属イオンの選択性に大きな違いを示すことが期待できる。核酸塩基部位は、4-クロロピリジンを原料とし、4位をメトキシ基に変換した後、3位選択的にSを導入し、官能基を保護した4-メトキシ-3-チオアセチルピリジンとして合成した。続いて、水酸基を保護したデオキシリボースとのカップリングにより、ピリジニウム塩としてヌクレオシド骨格を得た。1'位の立体が異なるアノマーが得られたが、その一方(α体)を単離・精製し、^1H NMRおよびNOESYにより構造を決定した。カップリング反応において、目的とするβアノマーの収率の向上を目指し、反応基質の保護基、ルイス酸、反応溶媒、反応温度などの検討を行い、α:β=4:1でヌクレオシド骨格が得られることが明らかとなった。また、ヨウ化ナトリウムを用いて、アノマー比率を維持したまま、メチル基の脱保護することができた。今後は、アノマーの分離と脱保護を経て、ヌクレオシドMを合成し、金属錯体型塩基対形成について評価する。本研究では、核酸塩基として金:属配位部位を持つ人工DNAを合成し、金属錯体型塩基対の形成により、多種・多数の金属イオンを定量的かつ位置選択的に集積化することを目指している。そこで、ソフト・ハードによる親和性の差に基づいて、新規金属配位型ヌクレオシドとしてメルカプトピリドン型ヌクレオシド(M)をデザイン、合成した。チオール基を保護した核酸塩基部位とリボース誘導体のカップリング反応により、ヌクレオシド骨格を合成した。天然型ヌクレオシドと同じ立体であるβアノマーの単離・精製ののち、脱保護反応を経て、目的のメルカプトヒ。リドン型ヌクレオシドを得た。構造は、^1H NMR、^<13>C NMRおよびNOEにより決定した。得られたヌクレオシドに対し、各種金属イオンの滴定実験をおこなったところ、UV吸収スペクトルの変化から、Pd^<2+>イオン、Ni^<2+>イオンなどのソフトな金属イオンとの錯形成が示唆された。

今後は、NMR, MSなどによる錯形成挙動の評価、および金属イオンの選択性の評価を行っていく。さらに、DNA合成機に導入可能なフォスフォロアミダイト体へと誘導し、合成機による逐次縮合反応が円滑に進行することを確認した。今後は、脱保護・精製条件を検討するとともに、メルカプトピリドン型ヌクレオシドおよびヒドロキシピリドン型ヌクレオシドを導入したオリゴヌクレオチドによる、異種金属イオンの集積化について検討していく。本研究は、核酸塩基として金属配位子を有する人工DNAをテンプレートとして、DNA中に多種・多数の金属イオンをデザインした配列や個数で集積することを目的としている。今までに、Cu^<2+>イオンにより選択的に金属錯体型塩基対を形成するヒドロキシピリドン型(H)、およびHg^<2+>イオンに選択的なピリジン型ヌクレオシド(P)をDNAオリゴマー中に導入し、DNA上の配位子の配列をテ:ンプレートとして、Cu^<2+>イオンとHg^<2+>イオンとを位置選択的に配列化することに成功した(Nature Nanotech(2006))。そこで、配列できる金属イオンの種類を拡張するために、ソフトな金属配位子を有するメルカプトピリドン型ヌクレオシド(S)をデザイン・合成した。紫外可視(UV-vis)吸収スペクトルを用いた金属イオンの適定実験、およびマススペクトル測定から、ヌクレオシドSがPd^<2+>イオンやNi^<2+>イオンと2:1錯体を形成し、S-Pd^<2+>/Ni^<2+>-S塩基対を定量的に形成したことが示された(J.Org.Chem.投稿中)。このように、ヌクレオシドを適切にデザインすることにより、DNA鎖中に導入できる金属イオンの種類を拡張することに成功した。さらにDNA三重鎖モチーフを用いて六配位型の金属イオンを配列することを考え、人工ヌクレオシドのみからなるDNAオリゴマー5'-H_n-3'(n=2-4)を合成した。Fe^<3+>イオンの滴定実験およびマススペクトル測定から、3:1錯体H_3Fe^<3+>の形成によって、Fe^<3+>イオンの一次元配列d(5'-H_n-3')_3・Fe^<3+>_n(n=2-4)が定量的に構築できたことが示された(投稿準備中)。以上のように、数や配列を自由にデザインして合成できる人工DNAの特性を生かし、DNAの骨格構造の中に同種・異種の金属イオンを望んだ数や配列で一次元的に集積する方法論を確立した。
アレルギー性気道炎症でのTリンパ球の局所集積・活性化における気道上皮細胞の役割

気管支喘息では、抗原特異的あるいは非特異的な機序によりおもにTh2タイプのリンパ球が気道局所で活性化され、好酸球の浸潤を主体とするアレルギー炎症が成立していると考えられる。しかし、気道粘膜におけるこれらのリンパ球の動員の機構や活性化のメカニズムについては知見が乏しいのが現状である。私たちは、気道上皮細胞が外界からの抗原や刺激物質と第一に接触する位置にあることに着目し、これまでにそのサイトカイン(とくにIL-6,IL-8,GM-CSF,RANTES)の発現能や好酸球との接着機構について検討してきた。今回はさらに、リンパ球の気道局所への動員に気道上皮細胞が積極的に関与しているのではないかという仮説をたて、その際重要と考えられるサイトカイン・ケモカイン群(RANTES,MIP-1,さらに最近同定されたTARCなど)のヒト気道上皮細胞における発現・産生とその制御機構をin vitroで検討した。その結果、ヒト気管支上皮細胞はTリンパ球への遊走因子のうちRANTESおよびTARCを遺伝子レベルでまた活性のあるタンパクとして産生することを明らかにした。また、第2として、粘膜上皮細胞のリンパ球の活性化・分化誘導での役割については、ヒト気道上皮細胞がTリンパ球への抗原提示およびその活性化に重要なMHC class II抗原およびco-stimulatory signalであるICAM-1などを発現することを見いだした。本研究により明らかにされた、Tリンパ球の気道局所への動員機構や活性化の機序における気道上皮細胞の役割は、アレルギー性気道炎症の病態と治療戦略に多くの知見を与え、気管支喘息の治療の進展に多大の貢献をするものと考える。気管支喘息をはじめとするアレルギー性気道炎症では、Tリンパ球とくにTh2タイプのリンパ球の役割が重視されている。しかしながら、このTリンパ球の気道局所への動員機構や活性化の機序についての知見はきわめて乏しいのが現状である。本年度はまず、ヒト気道上皮細胞から産生されるTリンパ球へのケモカインとして、RANTESとMIP-1を中心に検討し,前者はTh2タイプのリンパ球が産生するIL-3+GM-CSF刺激で誘導されそのmRNAもRT-PCR法にて発現の増強を確認した。また、最も強力な喘息治療薬である副腎皮質ステロイドはこの過程を用量依存的に抑制した。しかし、後者の発現は試みたいづれの刺激によっても認められなかった。さらにthymus and activation-regulated cytokine (TARC)のヒト気道上皮細胞での遺伝子発現を同じくRT-PCR法にて確認した。今後そのin vitroでの発現調節機構とin vivoでの発現状況を明らかにしたい。また、気道上皮細胞のTリンパ球活性化における意義については、主にヒトTリンパ球のヒト気道上皮細胞への接着の検討を進めており、IFNγおよびTNFαによる増強効果とその際の気道上皮側でのICAM-1(CD54)の発現増強、さらに抗ICAM-1中和抗体による接着過程の抑制傾向を認めた。また、その際Tリンパ球からのIL-10産生・遊離も抑制される傾向を認めた。このように、リンパ球の気道上皮への接着自体がリンパからのTh2タイプのサイトカイン産生を調節する可能性につき、今後さらに遺伝子発現も含め検討する予定である。気管支喘息におけるTリンパ球の動員の機構や活性化のメカニズムの解明のため、私たちは、外界からの抗原や刺激物質と第一に接触する位置にある気道上皮細胞の役割に着目し、前年度はリンパ球の気道局所への動員に重要と考えられるサイトカイン・ケモカイン群のうち、RANTESを中心にその遺伝子発現機構などを検討した。今年度は、さらに最近同定されたTARCのヒト気道上皮細胞における発現・産生とその制御機構をin vitroで検討した。

その結果、ヒト気管支上皮細胞は、TARCを遺伝子レベルで発現することがRT-PCR法によって確かめた。また活性のあるタンパクとして産生することも明らかにした。さらに、IFNγやIL-13による産生増強作用もみている。また、第2として、粘膜上皮細胞のリンパ球の活性化・分化誘導での役割については、ヒト気道上皮細胞とTリンパ球をco-cultureするとTh2サイトカインであるIL-13などの産生が増強されることを見いだした。また、マウスの喘息モデルにおいて気道上皮などにTARCの発現の増強がみられることもあきらかにしえた。現在、TARCの中和抗体投与による喘息への治療効果を検討中である。
精密に構造設計された高分子微粒子の開発とその二次元薄膜化

本研究の目的である微粒子の自発的な配列化方法の開発を達成するため、気液界面を利用した粒子の二次元薄膜化を検討した。このため、平成18年度は(1)高分子微粒子の合成と(2)合成した粒子の界面活性能評価および粒子の薄膜化方法の開発を行った。(1)では、両親媒性高分子であるN-置換型アクリルアミドを用いて重合条件を種々検討することにより、サイズを制御されたゲル微粒子を作製できることがわかった。また、金属(Au)ナノ微粒子を用い、表面に両親媒性高分子をグラフトすることにより、N-置換型アクリルアミドで表面が覆われたナノ微粒子(粒径40nm)を開発した。これらの実験により、表面に両親媒性なN-置換型ポリアクリルアミドを有する微粒子として、粒径40nm-1500nmの範囲内でサイズの制御可能な材料を得ることができた。(2)では、(1)により合成した種々のサイズの微粒子の界面活性能を懸濁液の表面張力測定より確認し、気液界面から粒子を二次元に配列させ、規則構造を有する粒子薄膜を得る方法を提案した。N-置換型ポリアクリルアミドを表面に有する微粒子は、水中で懸濁液の表面張力を40mN/m程度まで低下させ、気液界面に吸着することがわかった。また、光学顕微鏡による観察の結果、気液界面に吸着した微粒子は最密充填構造をとっており、この規則構造は溶媒の蒸発によって基板上に転写・固定できることがわかった。電子顕微鏡(SEM)による観察の結果、N-置換型ポリアクリルアミドを表面に有する微粒子は、気液界面から二次元に配列化させることができ、規則構造を有する粒子の薄膜が容易に形成できることが明らかとなった。得られる粒子の二次元薄膜の周期構造は、粒子のサイズによって制御可能であった。また、粒子間隔が1000-1400nm程度である場合には、回折干渉によって構造色を呈したことから、新規色材としての利用可能性が示された。
1分子ケミカルイメージング法

1分子ケミカルイメージングの実現のために、(1)プローブ先端へのナノ構造形成について、FDTD計算によりチップ全体を覆う銀薄膜形成により、400-800 nmの幅広い波長範囲で、単一分子感度ラマン検出を与える共鳴が得られた。実験的にこの点の実証を進めた。(2)ギャップモードに関して、任意の金属及びシリコン基板上で、半径50 nmの金ナノ粒子を用いることで、一分子感度が実現できることを理論計算及び実験で見出した。(3)全反射配置でギャップモードを励起する光学系を用いて、高効率化を進めた。(1)1分子感度ナノラマン分光の実現:銀ナノ粒子を加熱処理したカンチレバーチップ及び先鋭化光ファイバ先端に真空蒸着法により形成した。これまでの検討を継続し、シリコン製カンチレバーの加熱処理条件の最適化を進めた。温度及び加熱時間を制御することで、チップ先端に銀ナノ粒子(直径約20-30 nm)を成長させることに成功した。FDTD計算によると、このプローブは、金属基板との間のギャップモード励起で10^10のラマン増強を与えるとともに、増強電場で決まる空間分解能として、5-7 nmの実現が期待できる。実験的に、チップ増強ラマン効果と先端銀ナノ粒子の安定性を確認した。(2)金属粒子プローブと金属基板間のギャップモードの効率的な利用のために、全反射配置での伝搬性プラズモンを介して、ギャップモードを励起する手法について、FDTD法及びDoveプリズムを用いて検討し、外部反射は位置よりも10-100バイクおかんどかが図れることを見出した。(3)ケミカルイメージング:分子間力測定とナノラマン分光の複合.金属ナノ粒子プローブ及び金属基板双方に固定した官能基を含むチオール分子を用いて、分子間力を発現させ、分子間力と同時にラマンスペクトルを測定し、実験手法の改善を進めた。金属ナノ粒子プローブ表面にアルカンチオール、環状チオール及びカルボキ基やアミノ基を有するチオールの単分子膜を形成し、基板側の吸着種や溶液中のイオンとの相互作用について、この手法により詳しい情報が得られることを見出した。以上のように本研究の目標実現のための重要な進展が得られた。1分子ケミカルイメージングの実現のために、1-1)プローブ先端へのナノ構造形成について、FDTD計算により、銀ナノ粒子1個の固定では、現実的に利用しにくい400 nm付近に巨大な電場増強が得られるが、長波長側では急激な電場の減衰が見られた。それに対して、チップ全体を覆う銀薄膜形成により、400-800nmの幅広い波長範囲で、単一分子感度ラマン検出を与える共鳴が得られた。1-2)ギャップモードに関して、任意の金属基板上で、十分な大きさの金ナノ粒子または銀ナノ粒子を用いることで、一分子感度が実現できることを理論計算により予測し、実験的に確かめた。また、シリコンなどの高屈折率非金属基板表面でも同等のラマン増強が得られることを見いだした。2)顕微鏡集光系の高効率化、AFMスキャナと試料が独立可動なX-Yステージを試作し、実用性を確かめた。全反射配置でギャップモードを励起する光学系を用いて、金属薄膜上の金属ナノ粒子の被覆率の低下と共に、より大きなラマン信号の増強が得られることを見いだした。これは、伝搬性表面プラズモンとギャップモードの複合によるもので、ナノラマンイメージング配置で最大の感度が得られることを意味している。これらの成果をもとに、ケミカルイメージング法を直実に進めた。表面ナノ分光当初の目標に沿って、ほぼ順調に着実に研究成果を上げている。大きな実験的な課題は今のところない。この調子で進めることで、時年度末までに、2年間での目的達成が期待できる。目標設定に従い、学生を指導し、種々の実験上の工夫をしながら、着実に研究を進める。与えられた研究環境の下で最善を尽くす。
アルツハイマー病予防に有益な運動誘発性ERストレスの分子経路

アルツハイマー病(AD)の原因機構は不明だが、豊かな環境や運動が効果的とされる(Lazarov,Cell,2005).の機構は不明だが,種々の神経栄養因子による細胞増殖作用,保護作用,並びにERストレス防御作用など我々は、運動がアルツハイマー病(AD)などの認知症に有効かどうかを検討するために、海馬の活性化や可塑性を促進する運動条件、とりわけ運動強度に着目し検討した。運動強度は、独自のラット走運動モデルを用い、乳酸やコルチコステロン分泌を伴う(SE)/伴わない(NSE)運動強度を設定した。【目的】本研究では、神経可塑性を高める運動適応の分子機構について、遺伝子発現とプロテオミクス双方から網羅的に明らかにする。【方法】成熟Wistar系雄ラットをLTを指標に低/高強度の2群に分け、6週間のトレッドミル走運動トレーニングを行わせた。運動終了後、同一海馬サンプルをもとにマイクロアレイ並びにプロテオミクス解析を行った。生物情報分析にはIngenuity Pathway分析(IPA)を用いた。【結果】トランスクリプトームは運動強度依存的な増加が見られたが、プロテオームでは低強度群での発現が顕著にみられた。IPA分析では運動によるIGF-I経路を中心にエストロゲンやグルココルチコイド経路の関与が示された。【結論】海馬では低強度運動によって認知機能改善に有益な分子ネットワークが構築されることが示唆された。【今後の検討】このトレーニング条件で、海馬の神経新生や空間認知機能の湖上を認めている。今後の解析では、そうした機能に関係する分子群の分子間相互作用について明らかにする予定である。海馬に対する運動効果についてはDNAアレイ(Molteni et al.,2002;Tong等、2001)、プロテオミクス(Dingら、2006)らしか報告がない。この解析が完了すれば、当初想定したERストレス関連のシャペロン分子のみならず、それらがどう神経栄養因子や情報伝達因子と関係するかについて生理学的な理解か可能となる。運動は骨・筋や心臓血管系だけでなく脳にも有益な効果をもたらす。動物の自発運動は、海馬の神経新生を増加させ、認知機能を高める(2005)。同様な効果は、豊かな環境に置かれたアルツハイマー(AD)モデルマウスでも認められ、アミロイド繊維の形成を防止することも報告された(Lazarovら、2005).しかし、この背景となる分子機構はいまだ解明されていない。我々は、ラットの輪回し運動モデルを用い、統計的によく走るラットと走らないラットの2群に分け、それぞれの脳でどんな遺伝子発現が起こるかを蛍光ディファレンシャルディスプレイ(FDD)法を用いてスクリーニングした。その結果、海馬などでGRP-78の遺伝子発現の増加を認めた。GRP78は、UPRやミスフォールディング蛋白の阻害を誘導するERストレスに関与することから、(アミロイド)蛋白のミスフォールディングを一因とするAD症状を軽減するなどの効果が期待される。果たしてこの蛋白は運動の様式、ならびに量・強度のいずれに依存するのか。これには速度や時間を自由に変えられるトレッドミルが有効なのでモデルを作成した。2週間の走行学習後、一過性の走運動に対する脳の活性化や可塑性に関係するBDNF(脳由来神経栄養因子)の発現を調べた。その結果、視床下部では中等度以上の負荷が必要なのに対して、海馬では低強度で十分活性化し、BDNFも短時間で誘導されることがわかった。これらを踏まえ、輪回し運動では距離との関係で、トレッドミルでは強度との関係で運動によるGRP78蛋白の発現・機能を解析することになった。現在、RT-PCRならびにGRP78ならびにPERKのWestern blottingを確立した。輪回し運動では脳脊髄内の蛋白を測定する。さらにトレッドミルでは6週間の低強度運動トレーニングを行わせ同様に測定する予定である。我々は、運動がアルツハイマー病(AD)などの認知症に有効かどうかを検討するために、まず、海馬の活性化や可塑性を促進する運動強度に着目し検討した。その結果、海馬は両条件とも同等にc-fos遺伝子発現を高めることから低強度(NSE)でも十分活性化しうることが明らかとなった。この応答は連携する視床下部とは異なる点で興味深い。一方、ADの20-70%で減少するとされる脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現(遺伝子/タンパク質)は30分の走運動後に増加傾向を示したが、低強度群のみが26時間後に有意となった。さらに、この条件で26週間に及ぶ走運動トレーニングをラットやマウスに課し、神経新生や認知機能に及ぼす効果を検討した。今のところ、ラット/マウス共に、2週間のトレーニングで両群ともに海馬歯状回での神経新生を高めることから、低強度でも十分可塑性を高めることが明らかとなった。認知機能は6週間で増加する傾向にあり、その際、低強度がより高い効果のあることを示している。現在、その際の神経新生、ならびに、それに関わる分子機構をtranscriptome(DNAマイクロアレイ)とプロテオーム解析(2-DEゲル)を結合させ、最終的にはbioinformaticsを利用して関連因子を網羅的につきとめる最新の方法を応用している。

これまで、海馬に対する運動効果についてはDNAアレイ(Molteni, et. al.,2002;Tong等、2001)、プロテオミクス(Dingら、2006)らしか報告がない。この解析が完了すれば、当初想定したERストレス関連のシャペロン分子のみならず、それらがどう神経栄養因子や情報伝達因子と関係するかについて生理学的な理解が可能となるアルツハイマー病(AD)の原因機構は不明だが、豊かな環境や運動が効果的とされる(Lazarov,Cell,2005).の機構は不明だが,種々の神経栄養因子による細胞増殖作用,保護作用,並びにERストレス防御作用など我々は、運動がアルツハイマー病(AD)などの認知症に有効かどうかを検討するために、海馬の活性化や可塑性を促進する運動条件、とりわけ運動強度に着目し検討した。運動強度は、独自のラット走運動モデルを用い、乳酸やコルチコステロン分泌を伴う(SE)/伴わない(NSE)運動強度を設定した。【目的】本研究では、神経可塑性を高める運動適応の分子機構について、遺伝子発現とプロテオミクス双方から網羅的に明らかにする。【方法】成熟Wistar系雄ラットをLTを指標に低/高強度の2群に分け、6週間のトレッドミル走運動トレーニングを行わせた。運動終了後、同一海馬サンプルをもとにマイクロアレイ並びにプロテオミクス解析を行った。生物情報分析にはIngenuity Pathway分析(IPA)を用いた。【結果】トランスクリプトームは運動強度依存的な増加が見られたが、プロテオームでは低強度群での発現が顕著にみられた。IPA分析では運動によるIGF-I経路を中心にエストロゲンやグルココルチコイド経路の関与が示された。【結論】海馬では低強度運動によって認知機能改善に有益な分子ネットワークが構築されることが示唆された。【今後の検討】このトレーニング条件で、海馬の神経新生や空間認知機能の湖上を認めている。今後の解析では、そうした機能に関係する分子群の分子間相互作用について明らかにする予定である。海馬に対する運動効果についてはDNAアレイ(Molteni et al.,2002;Tong等、2001)、プロテオミクス(Dingら、2006)らしか報告がない。この解析が完了すれば、当初想定したERストレス関連のシャペロン分子のみならず、それらがどう神経栄養因子や情報伝達因子と関係するかについて生理学的な理解か可能となる。