hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PI3キナーゼの免疫系における機能の解析

本研究ではB細胞以外の免疫担当細胞におけるPI3Kの機能を検討するとともに、B細胞のシグナル伝達におけるPI3Kの詳細な機能を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。PI3K欠損マウスにおける様々な免疫担当細胞の分化を解析した結果、T細胞、NK細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球の分化はいずれも正常であったが、消化管中の肥満細胞数は著しく低下しており、肥満細胞の分化にPI3Kが必須であることが示された。マクロファージおよび樹状細胞では、IL-12,18刺激によるIFNγ産生、LPS+IFNγ刺激によるNOの産生が強く抑制されていた。しかしながらNO産生の主要経路であるNOS-2蛋白の誘導は正常であり、NOSの翻訳後調節にPI3Kが関与していることが示唆された。また、好中球ではGM-CSF依存性のシグナル伝達が、血小板ではglycoprotein VI/FcRγ依存性のシグナル伝達が抑制されていた。B細胞のシグナル伝達の詳細な生化学的解析により、いくつかの興味深い知見が得られた。B細胞受容体(BCR)刺激によるBtkの活性化はPI3Kに依存するものとこれまで考えられてきたが、PI3K欠損B細胞におけるBCR依存性のBtkの活性化は全く阻害されないという予想外の結果を得た。さらに、PI3K阻害剤によっても以前言われていたようなBtkの活性化および膜移行の阻害が起こらないことを注意深い生化学的解析により明らかにした。また、NF-kBの活性化はPI3KとBtkの双方に依存し、PI3K欠損マウスにbclxLを外来遺伝子として強制発現させるとB細胞の分化異常がほぼ完全に回復することを示した。以上の結果からPI3K欠損マウスとBtk欠損マウスの表現型は酷似しているが、両者は単純な上下関係ではなく独立した異なる機能を持つことが明らかとなった。我々はPI3キナーゼの最も主要な調節サブユニットであるP85α分子を欠失したマウスを作製し、P85αがB細胞の分化及び活性化に重要な働きをしていることを示してきた。P85αノックアウトマウスにおいてプロB細胞からプレB細胞への移行が抑制されていることは以前に示したが、これはプレBCR鎖遺伝子の再構成の阻害によるものなのか、あるいはプレBCR複合体からのシグナル伝達の異常によるものかは判別できなかった。しかしながら、今回P85αマウスと抗HEL抗体トランスジェニックマウスを交配し、既に再構成を済ませたBCRの分化においても抑制が観察されたことから、PI3キナーゼがプレBCR由来のシグナル伝達に重要な働きをしていることが明らかとなった。さらにP85α欠損マウスと抗HEL抗体トランスジェニック、膜結合型HEL(mHEL)トランスジェニックマウスとのトリプル変異マウスを作製した結果、HEL抗原による自己抗原反応性B細胞の除去(負の選択)にはPI3キナーゼは関わっていないことが示された。したがって、P85αはプロB細胞の正の選択には必要であるが負の選択には必要でないという意外な事実が明らかとなった。また、このマウスのマクロファージの機能についても検討を加え、LPS刺激によるIFNγの産生およびNOの産生が著しく抑制されていること、また細胞内寄生細菌であるクラミジアに対し易感染性を示すことなどが明らかとなった。PI3キナーゼはB細胞の分化、活性化のみならずマクロファージを介した自然免疫系の制御にも関与していることが明らかとなり、細菌等の感染に対する生体防御機構において極めて重要な働きをしていることが示された。PI3キナーゼ(PI3K)の最も主要な調節サブユニットであるp85α

遺伝子を欠失したマウスがB細胞の分化及び活性化において重大な異常を示すことを、我々はこれまでに示してきた。本研究計画では、前年度にはPI3KがプレB細胞受容体シグナルに重要であること、およびマクロファージを介した自然免疫応答にも関与しているこを示した。今年度はB細胞のシグナル伝達におけるPI3Kの機能についての詳細な生化学的解析を行い、いくつかの興味深い知見を得た。B細胞受容体(BCR)刺激によるBtkの活性化はPI3Kに依存するとこれまで考えられていたが、PI3K欠損B細胞におけるBtkの活性化を検討したところ、全く抑制されていないという意外な結果が得られた。さらに、PI3Kの阻害剤によってもこれまで言われていたようなBtkの活性化および膜移行の阻害が起こらないことを、注意深い生化学的解析により明らかにした。また、BCR刺激依存性のNF-kBの活性化はPI3KとBtkの双方に依存することを明らかにした。さらにPI3K欠損マウスにbclxLを強制発現させることによりB細胞分化の異常が回復することを明らかにした。したがって、PI3K欠損によるB細胞の分化異常はBtk欠損の際と同様にNF-kBを介したbcl-xLの誘導不全で説明できるものと考えられた。PI3KとBtkのダブルノックアウトマウスはそれぞれの単独ノックアウトマウスより重篤なB細胞分化、活性化の異常を示した。以上のことから、BCRを介したシグナル伝達においてPI3KとBtkは単純な上下関係にないことがあらためて示され、両者が独立した異なる機能を持つことがわかった。
病腎移植に関する刑事法上の諸問題の総合的検討

わが国の医療機関の一部で行われている病腎移植が刑法上の正当業務行為として許容されるかについては、医学的適応性、医術的正当性からみて困難な面があり、現時点では、厚労省ガイドラインが規定するように、臨床研究としての実施が妥当である。ただ、近年の諸外国において、臓器不足を背景としつつ、extended (or expanded) donorあるいはmarginal donorとして、従来はドナーとして受け入れられなかった疾患のある者をドナーに含める動向がみられる。今後は、こうした新たなアプローチが、病腎移植の医学的適応性ないしは医術的正当性の判断にいかなる影響を及ぼすのかを注視する必要がある。平成26年度は、まず研究代表者ならびに分担者が一堂に集まる研究会を開催することにより、病腎移植、およびわが国の移植医療一般をめぐる現況、さらには今後生じる可能性のある(刑)法的諸問題の内容に関して、理解を共有し、深化させることができた。また、平成27年度3月には、スウェーデンにおける生体移植に関する調査を実施した。ストックホルム大学では、刑事法担当のProfessor Petter Aspにインタビューを行い、スウェーデン刑法の下での治療行為の正当化要件、さらには仮にわが国における病腎移植のような実例が生じた場合の刑法的対応のあり方について詳細な説明を受けた。さらに、保健福祉庁の社会委員会(Socialstyrelsen)に設置された移植協議会を訪問し、Dr. Carin Franzenをはじめとする医療専門家2名、法律専門家1名に面会し、スウェーデンにおける移植医療およびそれに対する法的規制に関するプレゼンテーションを受けたのち、わが国における病腎移植の問題について本研究班から説明を行い、互いに質疑応答をする形で情報交換を実施した。スウェーデンは、1950年代から移植医療の法整備を進めてきており、生体移植の実施率もヨーロッパ諸国の中では高いことから、今後のわが国の法規制のあり方に対しても多くの示唆を与えうるものと思われる。今年度は、研究代表者および各分担者が、それぞれの専門領域にしたがって、病腎移植をめぐる問題点を、とりわけ海外の状況との比較という面から分析する作業を中心に実施した。代表者の城下は、以前から交流のあるケンブリッジ大学法学部に新設されたCentre forまた、研究分担者の平野は、2015年10月に香川大学にて、ドイツからProf. Henning Rosenauを招聘してシンポジウム「日本とドイツの臓器移植の現状と課題」を開催し、研究分担者らも参加して活発な議論を行った。また、平野は2016年3月に同大学において「障がい者の自己決定を尊重できる法と社会に関する研究セミナー」を実施し、研究分担者の山本および研究代表者の城下が、治療ないしは臓器移植の面からの報告を行った。このように、海外調査および日本国内に向けての発信活動を交えつつ、メンバー各自の努力によって、本研究課題に関する更なる検証を重ねることができたと考えられる。全体的に、当初予定していた通りの計画に沿って研究を進めることができた。海外からのゲストを迎えてのシンポジウム等は先方の都合に左右される部分が大きいが、当初予定していた最終年度に加えて、今年度にも実施できたことは意義があったと思われる。本研究課題の最終年度である2016年度は、疾患のある(あった)臓器の移植規制に関する海外の動向を踏まえて、わが国における今後の議論に資すべく、国際ワークショップ「病腎移植をめぐる法的諸問題ードナーの拡大はどこまで可能か?ー」を企画し、2016年12月11日、北海道大学・東京オフィス(丸の内)において開催した。基調報告は、Matthew Dyson(オックスフォード大学法学部准教授)、Yang Choul Woo(韓国カトリック大学医学部教授)、奥田純一郎(上智大学法学部教授・研究分担者)の各氏であった。Dyson准教授からは、臓器移植後に、臓器に起因するドナーの発病ないし死亡事故があった場合に、イギリス法において可能な法的対応についての提案がなされた。Yang教授からは、日本において、病腎移植を実施することが臓器不足を解消するための手段となりうるのかについて、慎重な見解が表明された。また奥田教授からは、「死体移植が原則であり、生体移植は例外」というこれまでの前提に懐疑的な立場から、病腎移植において問われていることは、現在の移植医療の「常識」の欺瞞性であるとの指摘がなされた。基調報告の後に、参加者相互によるディスカッションを実施した。本ワークショップにおける奥田報告については、近く論文での公刊が予定されており、Dyson報告についても翻訳の公表が計画されている。なお、研究代表者の城下により、同翻訳に関連した調査を行うため、2017年3月に、オックスフォード大学のDyson准教授の下での検討会が実施された。研究会活動および各メンバーの個人的研究を通じて、病腎移植の法的性格と許容条件の内容については、ほぼ全体的に分析を加えることができた。

また、比較法的調査に関しても、スウェーデンにおけるインタビューを通じて、法規制の状況のみならず医療の実態についても多くの貴重な知見を得ることができ、今後のわが国における検討に際しての素地を形成することができた。最終年度を迎え、これまでの各自の研究成果の総括を開始するとともに、当初から予定していたシンポジウムを実施し、病腎移植問題の国際比較を一層深める予定である。その上で、医学・法学双方の観点を踏まえた本課題に関する提言を取りまとめることにしたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。刑事法学今後も、定例的な研究会活動を継続すると共に、適宜、海外における比較法的調査を実施し、さらにはシンポジウムの開催に向けての準備活動を行う。特に、平成27年度は、研究代表者が以前から学術的交流を行っていたケンブリッジ大学法学部に、the Centre for Law,Medicine and Life Sciencesが新設されたことから、同センターとも連携しつつ、研究を遂行する。物品費および旅費において、当初購入を予定していた文献ないし航空券よりも安価なものを選択することが可能となったため、残額が生じた。平成26年度に出版が予告されていたことから購入を予定していた外国文献に関する物品費につき、出版が次年度に延期されたことにより余剰金が生じたため。最終年度における物品費・旅費に加算して使用する。平成26年度購入予定の外国文献中、平成27年度に出版が延期されたものについて、同年度に購入するための追加的な物品費として使用する。本研究課題に基づき、研究代表者が2016年にケンブリッジ大学法学部付属の法学・医学・生命科学センターに客員研究員として滞在した際の、プロフィールおよび研究内容の紹介
生殖細胞のエピゲノムリプログラミング過程における多能性転写因子群の制御基盤の解明

平成29年度には、マウス始原生殖細胞のエピゲノムリプログラミング過程における、多能性関連転写因子群の機能制御基盤の解明を目的として研究を行った。(1)研究代表者らが開発した試験管内再構成系をさらに発展させ、再構成始原生殖細胞を平面培養増殖させる系を構築した。この細胞は、マウス精巣への移植により機能的な精子形成に効率よく寄与した。遺伝子発現プロファイルと、活性化エンハンサープロファイルを詳細に解析したところ、形成初期の始原生殖細胞としての性質をよく保っていることが判明した。この細胞は、平面培養中にDNAメチル化消去を完遂しており、これが生殖細胞の性分化や体細胞からのシグナルとは独立して、始原生殖細胞の増殖によってのみ推進されることが示された。また、ポリコーム抑制をマークするヒストン修飾H3K27me3は、平面増殖の過程でDNAメチル化が消去されるゲノム部位で顕著に増加し、DNAメチル化による抑制がポリコームによって置き換わることが示唆された。この細胞状態は、生殖細胞の内在的なプログラムによってのみリプログラミングが進行した結果であることが強く示唆される。(2)生殖細胞が有するエピゲノムコンテキストをより詳細に解明するために、生殖細胞形成過程で決定的な役割を果たす転写因子BLIMP1の、他の細胞系列における標的部位を決定した。(3)代表的な多能性転写因子群(OCT4, SOX2, NANOG)のChIP-seqを系統的に行い、複数細胞種間・複数転写因子について、定量比較を可能にするため、それぞれの転写因子をコードする遺伝子の両アレルにタグをノックインしたES細胞を作出した。それぞれの転写因子についてウェスタンブロット解析したところ、SOX2とNANOGについては当初計画した通りのタグ付きタンパク質の発現が確認された。一方、OCT4についてはタグの設計に改善の必要が認められた。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度には多能性関連転写因子Pou5f1 (OCT4), Sox2, Nanogの各アレルのC末端側にタグを付与することを目的とし、各遺伝子の終止コドン前後の約1Kbを含むターゲティングベクターを構築した。またCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集を行うためガイドRNAを設計し発現ベクターを複数構築した。ルシフェラーゼを用いたSingle strand annealing(SSA)アッセイで、良好な活性を示すガイドRNAの組み合わせを同定した。また、これら多能性因子が始原生殖細胞において潜在的多能性を形成・維持する基盤の一つと考えられるゲノムワイドなDNAメチル化動態を解析し、ヒストン修飾とのクロストークを解明して発表した。多能性関連転写因子(OCT4, SOX2,NANOG)アレルへのタグ挿入したノックイン胚性幹細胞(Embryonic stem cells; ES細胞)の作出によって、同一のタグを付与した各転写因子を、内在的な発現量と制御様式を保ったまま発現する細胞株を作出することが期待される。これを用いることで申請者が確立した微量試料からのクロマチン免疫沈降ー次世代シークエンス法(微量ChIP-seq法)による結合部位の同定が可能になると考えられる。また、同一のタグを用いることで、ChIP-seqの定量解析において、一般的に避けがたい問題である、抗体による免疫沈降効率の差異を避けることが出来る。このことで、それぞれの転写因子が、それぞれの多能性状態(ES細胞における「ナイーブ」な多能性、EpiLCにおける「プライム/フォーマティブ」な多能性、始原生殖細胞における「潜在的」な多能性)において、どのような効率でゲノムに結合するのかという全体像を得ることができると期待される。多能性関連転写因子へのタグ付与を目的としたターゲティングベクターと、高い活性が期待されるガイドRNA発現ベクターの構築を構築した。これらをBVSC ES細胞に導入することで微量ChIP-seq法を適用可能な細胞株を作出するための準備が整ったと言える。

(3)代表的な多能性転写因子群(OCT4, SOX2, NANOG)のChIP-seqを系統的に行い、複数細胞種間・複数転写因子について、定量比較を可能にするため、それぞれの転写因子をコードする遺伝子の両アレルにタグをノックインしたES細胞を作出した。それぞれの転写因子についてウェスタンブロット解析したところ、SOX2とNANOGについては当初計画した通りのタグ付きタンパク質の発現が確認された。一方、OCT4についてはタグの設計に改善の必要が認められた。構築したターゲティングベクターとガイドRNA/Cas9発現ベクターを、Blimp1-mVenus/Stella-ECFP蛍光レポーター(BVSC)をもつES細胞株に導入し、OCT4, SOX2, NANOGへのタグ挿入を行う。タグ付与されたES細胞を複数株樹立し、エピブラスト様細胞(Epiblast-like cells; EpiLC)および始原生殖細胞様細胞(primordial germ cell-like cells; PGCLCs)を誘導し、申請者の開発した微量ChIP-seq法を用いて各転写因子の結合部位を定量的に同定する。最近、EpiLCへのNANOGの過剰発現によりマウスPGCLCを誘導することが出来たという報告や、霊長類PGCやPGCLCにおいてはSOX2が発現していない一方で、SOXタンパク質群の別のグループに属するSOX17が重要な役割を果たすという報告がなされている。これらの報告に関連して、各転写因子が潜在的多能性の形成や維持に寄与する機構は興味深い。各転写因子の結合部位の定量評価においても、特にNANOGやSOX2の発現量変化に関連づけた解析を行いたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
メカニカルアロイングによる分散強化及び超塑性チタン合金の創製とその変形機構

以下に示す3年間にわたる研究から得られた成果はメカニカルアロイング(MA)におけるメカノケミカルポテンシャンとその工学への応用への限界を明らかにする点できわめて重要なものである。1.投入エネルギ-の大きいボ-ルミルを使うかぎり、溶製法では困難などんな系もMAで合金粉末の作製が可能である。2.MAの致命的な欠点はボ-ルミルからの不純元素の混入合金化である。それを防ぐためにはボ-ルミルをチタン化することが必要である。チタン化はボ-ルの質量を減少させ投入エネルギ-を減少させ、MA所要時間は反比例して大きくなる。3.Tiは化学的に活性であるので、表面酸化を防ぐためには5Nや4Nの担体ガスはスポンジチタン(523K以上)で脱酸する必要がある。アルゴンガスの場合脱酸するとMA中粉末はボ-ルミルと固着しやすくなる。脱酸窒素ガス中で144ksのMAを行うとTi中に8mass%NをTiNの形で固溶させることができる。TiNは高圧下でTiーN固溶体へ分解する。4.超塑性が期待できる組成混合粉末Tiー9.5Vー2.5Moー3AlはTiボ-ルミルでβ単相にするのに432ksMAを要した。5.上記のMA処理粉末はHIPで固体・成形化を試みた。長時間MA処理合金粉末のHIP材、TiーMo、TiーVーMoーAl、TiーNはすべて室温大気圧に戻る過程で破損した。MAとHIP処理の余効が固化成形材の延性を極端に低下させる。6.MAの工学的応用はバルク材として延性を失わない固体成形化の成否にかかっている。攪はん型ボ-ルミルをつかってTi-Mo系固溶体の生成過程をX線回折、干渉顕微鏡、DSC熱分析、化学分析、電子顕微鏡によって調査した。その結果は日本金属学会誌に投稿中である。高純度アルゴン気流中300rpmで力率計によって負荷をモニタ-しながら反応時間とともにサンプルリングした。Ti粉末(<43μm)に添加するMo粉末(<12μm)を0、14、20、50、100%とした、このうち詳しく調べた組成は14、20%Moである。(1)鋼球は反応速度は大きいが不純元素(Fe)の混入が比較的大きい。ジルコニア球は摩滅が著しいので利用するのは不適当である。Ti球は反応速度は遅い(鋼の1/31/4)が球の摩滅がなく、Ti合金のメカニカルアロイング(MA)に最適である。(2)Moの添加量が多くなるほど固溶体化の時間は短くなる。20Moと50Moの所要時間はそれぞれ14Moの1/2、1/4である。(3)合金化はβ単一がまず形成されてからα相の形成を見る。β相のMA材を時効するとω相は形成されず直接明瞭なα相の形成を見る。従ってMA材には溶製材のようにω脆化の危倶がない長所があることが分かった。これは実用上極めて有益な結果である。(4)14Moより20Moの方がβ単相で経緯するMA時間は長い。β単相の粒子サイズは最小(4μm)となり、その後8μmまでに造粒されていき、表面の起伏状態も粗くなっていく。(5)β単相の微細構造は1030nmのゾ-ンからなる超微粒子接合集合体でゾ-ン中では格子像が認められる。(6)鋼球使用の場合Feの混入はMA時間と共にまたMo量と共に著しく多くなる。(7)HIPによる成形は比較的容易であることが分かった。

現在HIP処理したものを使って機械的性質の測定を確かめつつある。撹はん型ボ-ルミルをつかってチタン-チタン窒化物、チタン-チタン酸化物系分散強化合金の原材料となる粉末の作製とその熱的安定性について調査した。また粉末の透過電子顕微鏡用試料作製法として画期的なニッケルメッキ固定によるイオン薄膜化法を確立した。前年度までの成果としてTiーMo合金のメカニカルアロイング(MA)に関する論文2編が発行された。ボ-ルのみならずジルコニアタンクからの不純物の混入という前年度来の問題にたいしては、新しくチタン製タンクを作製し、メカニカルアロイング装置のチタン化を達成した。これを用い、窒素および酸素量を調節し、目的の化合物分散型Ti粉末の作製を行った。MAによる合金化機構解明のためイオン結晶のMAも試みた。(1)キャリアガス(N_2ガス)中の微量の酸素と水分の除去のため、平成2年度科学研究費補助金で導入された電気炉で450°Cに加熱したスポンジチタンにガスを接触させ、純TiNの作製を達成した。(2)MA窒化物と純正窒化物(JohnsonーMatthey製)の熱安定性の比較を行った。上記電気炉を用いて、真空中450°C、550°C及び650°Cで熱処理を行ったところ、MA窒化物は不安定であるため室温空気中で酸化が認められたが、純正窒化物には何の変化も認められなかった。(3)MA時間と酸化物生成量の関係の測定により、初期10時間以内にほとんどの酸化物が形成されることが判明した。それ以上MAを施しても酸化量の増加はわずかであった。(4)合金化機構の解明には微細構造の観察が必須であるが、試料が粉末であることから薄膜化が困難であった。粉末をNiメッキ層に埋め板材を作製し、イオン薄膜化により透過電子顕微鏡試料の作製に成功した。(5)イオン結晶物質のうち、例えばNaBr+KClではMAによってイオンの置換が置き、NaCl+KBrが生じることを確認した。メカニカルアロイング(MA)による(a)TiーMo合金、(b)TiーTiN分散強化合金、(c)Ti基超塑性合金等の創製を、またMAの基礎的知見を得るために(d)無機化合物の生成能力、(e)液体急冷アモルファスNi_<75>B_7Si_<16>の機械的優乱による構造緩和、(f)TiーNi金属間化合物のアモルフフス化能、さらに(g)上記MA粉末(a,b)のHIPによる焼結成形性について調べた。この3年間の研究結果は博士論文「MAにおける相転移と微細構造に関する研究」(林梅栄)にまとめ、一部は論文に投稿中である。主な研究結果は:(1)MAで作製した「Ti及び合金粉末のHIP(1000気圧、1000°C、Pyrexガラスに真空封入)による焼結成形材によれば、MA20hr純Ti粉末のHIP材は引張強さ450MPa、伸び21%、硬さ261で溶製材純Tiの硬さ180に較べかなり高いこと。またTiー14MoではMA40hr以上のものでは大気圧・室温に戻すまでに音を発して脆性破砕を起こした。MA20hrの硬さはHV=420であり溶製材のそれ280と較べ著しく高い。ω相の析出を予想させるが、X線回析では脆化を促すω相は認められず、α+βであった。(2)MAで作製したTiーTiN合金粉末はHIP処理によってTiNは消滅してTiーN固溶体となり、HIP焼結成形できたものはMA10hr(1.1wt%N)まで、その硬さは760にも達した。MA40hr(8wt%N)では硬さ1500に達し、純TiNの2000に迫る。(1)(2)からMA材におけるTi合金系では固化成形と延性低下が今後の最大の課題であることがわかった。
哺乳動物の腸管内に由来するプロバイオテイック乳酸菌の染色体遺伝子解析

本研究ではヒト消化管由来のLactobacillus属(L. acidophilusグループ)およびBifidobacterium属といったいわゆるプロバイオテイック乳酸菌を用いて、その染色体遺伝子に関する基礎的な知見の蓄積と染色体解析に必要とされる実験手法の確立を試みた。パルスフィールドゲル電気泳動法により染色体遺伝子を解析した結果、L. acidophilusグループ6種およびBifidobacterium8種はそれぞれ種特異的な泳動パターンを示した。特にBifidobacteriumでは、これが顕著であり、種同定に利用可能であることが判明した。また、同時にこれまで明らかにされていなかったBifidobacterium属乳酸菌の染色体サイズも測定することができた。多くの株は2メガベース前後のサイスであり、L. acidophilusグループ染色体とほぼ同様であった。さらに、この知見をもとに、染色体制限酵素地図の作成を進めている。染色体上に存在する遺伝子の同定や外来遺伝子の染色体への挿入に有用なトランスポゾン変異法をL. acidophilusグループやBifidobacterium属の乳酸菌に導入するための検討を行った。まず、これらの菌種(菌株)へのトランスポゾンを有するプラスミドベクターを用いたエレクトロポレーション法による形質転換法を確立した。さらに、プラスミドpHV1248を利用することにより、染色体へのトランスポゾンのランダム挿入にも成功し、手法の完成に至った。今後、この手法を利用することにより、パルスフィールドゲル電気泳動法との組み合わせにより、染色体地図の作成が効率よく実施できる。
ポリマーにドープした色素分子の電子格子相互作用の研究

1。電子状態の対称性の異なる二つの色素分子(Mg-オクタエチルポルフィリン(OEP)、Mg-オクタエチルクロリン(OEC))をそれぞれポリスチレン、PMMA、ポリイソブチレン、エポキシ樹脂、ポリブタジエン等にドープした試料にたいし、時間相関単一光子計数法により時間ゲートを設定してレーザーの散乱光を除いてゼロフォノン線を含む領域でサイト選択蛍光分光を行い、単一サイトにある色素分子の蛍光スペクトルを求めた。さらに、このスペクトルを一次の電子格子相互作用を考慮した理論に基づいて解析し、電子格子相互作用強度で重みづけられたポリマーの低振動数モードの有効状態密度(WDOS)を求めた。WDOSはポリマーによって形状やピーク周波数が異なるが、ピークが一致するように横軸のスケールを変えると以上の試料で求めたすべてのWDOSの形状はほぼ一致することがわかった。今のところ、この珍しい現象が説明できる理論はなく、今後その研究が必要とされる。実験的にももっと組成の異なった試料(例えば、サイズの異なるゲスト分子、無期ガラス、生体蛋白質等)に対しこの研究を進める予定である。2。ポリスチレン、PMMA等のポリマーについて、遠赤外吸収及びラマン分光を行ったが、形状の比較が出来る程度のSNの良いスペクトルが得られなかった。今回は、中性子散乱によって得られたポリスチレンの低振動モードの状態密度を用いてWDOSとの比較を行った。その結果、電子格子相互作用は、振動モードの周波数の約二乗に比例して弱くなることがわかった。このことを明らかにするには、今後、より多くのポリマーの状態密度を求め、それぞれのWDOSとの比較を行う必要がある。1。2。
マルチメディアリテラシー育成方法の検討

4年間で主として以下のような研究に取り組んできた。1.国際協力ボランティアとの交流を通した高校の総合的学習の研究2.中学校および高校における情報教育の開発研究3.総合的学習と情報教育を中心とした学校の診断的研究4.環境番組の連続視聴が視聴者に及ぼす影響についての研究5.異文化間理解教育における外国制作による日本用地理番組の効果に関する実証研究6.学校放送番組とWebを連携させた交流学習システムの開発と評価7.動画クリップ活用に関する実証的研究8.大学における遠隔双方向学習の事例分析と評価9.諸外国におけるICT教育の事例の動向把握10.メディアに対する子どもの態度に関する実証的研究(学校教育におけるインターネット利用の有無、諸外国間の比較に注目して)11.携帯電話などの新しいメディアについての調査研究12.高等教育における外国語教育でのマルチメディア活用そして、4年間にわたる研究成果を報告書としてまとめた。1.総合的学習と情報教育の接点(水越敏行)2.中学校の情報教育(水越敏行)3.高等学校の情報科(黒田卓)4.諸外国の情報教育(木原俊行)5.子どもはメディアをどう見ているか-比較文化的考察-(生田孝至)6.日常文化の中でのメディア教育(岡田朋之)7.テレビとインターネットをつないだ共同学習(黒上晴夫)8.遠隔学習の新しい可能性(久保田賢一)9.外国語教育におけるメディア利用(竹内理)4年間で主として以下のような研究に取り組んできた。1.総合的学習と情報教育の接点(水越敏行)2.中学校の情報教育(水越敏行)3.高等学校の情報科(黒田卓)4.諸外国の情報教育(木原俊行)5.子どもはメディアをどう見ているか-比較文化的考察-(生田孝至)6.日常文化の中でのメディア教育(岡田朋之)7.テレビとインターネットをつないだ共同学習(黒上晴夫)8.遠隔学習の新しい可能性(久保田賢一)9.外国語教育におけるメディア利用(竹内理)今年度は(1)マルチメディアリテラシー概念の整理と育成事例の収集、および(2)情報教育先進校における質問紙調査、の両面から研究を進めた。(1)に関しては以下の通りである。水越、久保田らは全国の義務教育学校を対象とした事例調査である「学校の研究体制やメディア環境に関する調査」と、関西大と他大学による「遠隔双方向学習の実験研究」をすすめており、現在調査継続中もしくは分析中である。また竹内はマルチメディア教材の基礎になる視覚・映像情報に関しての研究を深め、その中でも、視覚情報の特徴は何か、外国語教育とどのように関係するかという、ほとんど手がつけられていない分野に関して調査を試み、別記の通り成果を発表した。岡田は学校教育外におけるリテラシー育成の可能性について主に移動体通信を中心とした検討を試み、文献収集ならびに分析をおこなっている。(2)については、生田・黒上・木原・黒田が日本、ドイツ、韓国、マレーシアから調査対象者を選んだ「高度情報通信社会における人間のメディア行動に関する基礎的研究」をおこない、現在結果分析中である。また木原は単独で「子どものマルチメディアイメージの変容に関する研究メタファ法を用いて」を教育実践の追跡と質問紙調査を通じてすすめ、その知見を教育工学会において口頭報告している。西田はコンピュータを利用した情報リテラシー教育を受講した学生を対象として、インフォーマントからの報告をもとに情報処理に対する考え方の変化を探り、情報リテラシー概念の再検討をおこなっている。さらに黒上は、環境学習をモチーフとして日常的学習活動とメディア機器の利用経験を結びつける方向性をもったマルチメディアリテラシー育成のカリキュラム開発もおこなった。同様の実践としては、田中がマルチメディアプロジェクトの単元を開発し、現場での実践を試みている。これについては現在分析中である。平成11年度は以下のテーマを分担して研究してきた。1.教師や一般成人を対象にした情報リテラシーの質問紙調査,およびブラウザ,電子メール,ホームページなどの個別学習で、学習の収録、ききとり調査を実施2.環境教育番組(クローズアップ現代,アメリカの教育番組)を組み合わせて,小学生と大学生に視聴能力や環境問題へのセンス等を調査した。3.移動体メディアを中心に日常的なコミュニケーション行動とメディア・リテラシーとの関係性について、大学生などを対象に質問紙調査を実施した。4.自分たちの町を象徴するイメージ映像と,現実とのギャップを知ることから,新しいイメージを映像化させる。このことを通じて、メディア表現の技法や限界を感じさせると共に、わが町を理解するこういう新単元を小学校で開発研究.5.子どものメディア行動を絵画投影法で調査し、情報行動とメディアの違いを検討する.日本とマレーシア韓国での比較研究を中心に。

6.テクノロジーを利用した遠隔学習、早大を基点にした複数大学での双方向学習の実験研究7.イギリスBBC教育とChannel4での放送番組とマルチメディア教材との組み合わせ.その利用の実態を視察した.フィンランドの放送局YLEも視察し、学校と協同したメディア教育の実情視察。平成12年度は主として次のテーマを分担して調査研究した.1.BBC教育番組(Japan2000),NHK一般番組(クローズアップ現代)などを用いて,視聴能力や発達差の研究.小学生,中学生,大学生を同一方法で調査実施.2.スウェーデンでの移動体メディアの使用に関する調査研究3.子供はコミュニケーションメディアをどうみているか-年代を追っての比較と日本と中国東北区の比較研究4.情報教育におけるベテラン教師の学習指導を中心にした授業評価の研究5.NHK教育「たったひとつの地球」を視聴しての共同学習の支援と分析研究6.小中学校管理職の情報教育やメディアに関する意識調査と,学習環境整備状況の分析研究7.中学校の研究紀要を全国から集め,約40校にしぼって,総合的学習,選択学習,情報通信教育(ICT),必修教科,ティームティーチングなどの観点からの比較分析.いくつかの学校は訪問調査も実施.平成13年度は次のような課題の研究を進めてきた。1.国際協力ボランティアとの交流を通した高校の総合的学習の研究2.中学校および高校における情報教育の開発研究3.総合的学習と情報教育を中心とした学校の診断的研究そして、4年間にわたる研究成果を報告書としてまとめた。1.総合的学習と情報教育の接点(水越敏行)総合的学習と情報教育が、相互にどう関連し、支えあってきているのかについて全国各地の研究出版物などを分析している。2.中学校の情報教育(水越敏行)中学校におけるICTの実態を研究紀要や報告集などで、分析考察している。3.高等学校の情報科(黒田卓)高校の情報科での先導的実践研究を分析している4.諸外国の情報教育(木原俊行)諸外国、特にイギリスやフィンランドにおける、放送局が取り組む新しいデジタル番組、そしてネットワーク環境の変化など実地調査した結果を報告している。5.子どもはメディアをどう見ているか-比較文化的考察-(生田孝至)世界各地の子どもを対象に、映像や活字も含めたメディアをどう捉えているのかについてイラスト画による比較調査の結果を報告している。6.日常文化の中でのメディア教育(岡田朋之)携帯電話という新しいメディアが、われわれのコミュニケーションや思考にいかなる変化を与えてきているのかについてメディア論から考察をしている。
生体シグナル解析用分子材料群の創製

細胞機能を制御する生体機能シグナルは、物理シグナルだけでなく分子が担う化学シグナルが重要な位置を占める。具体的には、局所的な電位や温度、pHから金属イオン、アニオン種、有機小分子、糖類や核酸、脂質、ペプチド、タンパク質などが色々な局面で生体機能のデジタル情報を担っている。細胞内外の機能情報を網羅的に解析するために、このような非常に多様で複雑かつ微量な分析対象それぞれをハイスループットに検出・分析できるセンサーやプローブ、種々の材料を、人工小分子から核酸、ペプチド、タンパク質、ナノ構造体を基盤として開発することに成功した。浜地は、分子センサーとして細胞表層の糖鎖を可視化イメージングできる蛍光性バイオセンサーの構築手法を確立し、乳がん細胞の表層のハイマンノース型糖脂質の可視化に成功した。また、超分子ヒドロゲルアレイが、生体機能小分子であるATPをはじめとする各種リン酸アニオン種のハイスループットなセンシングに有効であることを実証した。また杉本を中心に、DNAが形成する高次構造(二重鎖・三重鎖・四重鎖)に対する細胞内環境として考慮すべき重要な要素である分子クラウディング効果を定量的に調べた結果、ポリエチレングリコールやグリセロール等の共存分子はWatson-Crick構造を不安定化させるが、Hoogsteen構造は逆に不安定化させることが明らかとなった。三原は、生体シグナル解析用のペプチドチップ創成のためにタンパク質解析用ドライペプチドアレイフォーマットを確立し、また新規のタンパク質特異的リガンド探索システムを構築するためのペプチドライブラリ(200種ヘリックスペプチド)を設計・合成することに成功した。養王田は、分子認識Toolとしての利用が期待できるプレフォルディンの機能・構造の解明と利用技術の開発を行った。Pyrococcus由来プレフォルディンの末端のαヘリックスの向きを変えることにより変性タンパク質捕獲能を変えることができることを発見した。また、CdSe量子ドットを捕獲し、水中での凝集を防ぐ能力があることを発見した。さらに、Thermococcusのプレフォルディンの発現、精製、機能解析にも成功した。金原は、大腸菌由来のシヤペロニンGroEL機能化の一環として、スピロピランを導入したシャペロニンに紫外可視光照射することにより、GroESの脱着を制御することに成功した。その結果、可逆的に変性タンパク質のリフォールディング活性を制御できることを明らかにした。浜地は、特定のタンパク質を可視化イメージングできる手法として、アスパラギン酸連続配列とそれを選択的に認識できる蛍光性小分子プローブペアの創製に成功した。また、超分子ヒドロゲルアレイを基盤素材としたレクチンチップの構築に成功し、糖鎖や糖タンパク質のパターン解析あるいは糖鎖存在のクラスタリングによる細胞プロファイリングに成功した。また杉本は、分子クラウディング環境でDNAが形成する二重鎖・三重鎖・四重鎖の構造安定性に対する定量データの比較から、構造体の種類によって分子クラウディングの作用が異なることを見いだし、この現象が構造体によって分子問相互作用及び金属イオンとの結合形態が異なるためであることを明らかとした。三原は、生体シグナル解析用のペプチドチップ創成のために平成17年度に合成したタンパク質特異的リガンド探索システムを構築するためのペプチドライブラリを利用し、リン酸化反応、特にキナーゼとホスファターゼの検出システムを構築した。またペプチドチップを利用したタンパク質解析のデータマイニングを行った。さらに新規ラベルフリーの検出システムである金の異常反射法をペプチドチップ用に構築した。特にデンドリマーによる3次元表面を用いた検出を実施した。養王田は、Thermococcus kodakaraensisのゲノム配列情報をもとに、Thermococcussp.KS-1プレフォルディンの4つのサブユニット遺伝子(α1,α2,β1,β2).をクローニングし、塩基配列を決定した。大腸菌内でそれぞれのα及びβサブユニット遺伝子を共発現させ、4種類のプレフォルディン複合体(α1-β1,α2-β1,α1-β2,α2-β2)を作成することに成功し、それぞれの詳細な機能を解析した。また、β1がシャペロン機能を有するホモテトラマーを形成することも発見した。金原は、シャペロニンGroELの人工物ゲストとして,表面にカルボキシレート基を有するデンドリマーポルフィリンが取り込まれることを示した。また,一度取り込まれたデンドリマーポルフィリンがATPを添加しても放出されないことが分かった。デンドリマー構造を利用することで,様々なプローブ分子をシャペロニンに導入できることを示唆する結果を得た。A01班では、新しい人工分子や機能性材料の定量的パラメーターを用いた分子設計による合成と開発,その特性の解析と生体シグナル解析への利用というアプローチで多様な細胞内シグナルとなる物質群の網羅的解析に必要となる機能性分子群の創製を遂行している。その中で、浜地は、平成18年度までに成功した人工合成プローブとリン酸化タンパク質結合ドメインをハイブリッドして、特定のリン酸化ペプチドを配列選択的に蛍光変化としたセンシングできる新規な蛍光ハイブリッドバイオセンサーの構築に成功した。

また、タンパク質の選択的ラベリングのための化学的新手法として、(1)リアクティブタグシステムの開発(2)リガンド連結触媒によるレクチン選択的ラベル化手法の開発に成功した。杉本は、疑似細胞内環境における核酸の挙動を熱力学的・速度論的に検討し、核酸とカチオンや水分子の結合を定量化した。さらに、PCRを高効率化する分子クラウディング剤を開発した。このように、非水溶液環境での核酸エネルギーのデータベース化が大きく進んだ。また、金属イオンや低分子化合物に応答して構造変化するDNAを開発し、センシングシステムへの展開が可能となった。三原は、平成18年度に合成した約200種のαヘリックスペプチドのライブラリを用いて、細胞毒性活性のスクリーニングアッセイを行った。ペプチドの静電荷が増すほどに細胞毒性は増加する蛍光にあるが、詳細には高い細胞毒性活性を有する特異的配列の獲得に成功した。また、同様なライブラリーからキナーゼ捕捉システムの構築に成功した。養王田は分子動力学計算によりPyroccous由来プレフォルディンの変性蛋白質認識結合部位を同定した。Thermococcus由来プレフォルディンのβ2サブユニット及びα1サブユニットのX線結晶構造を解明した。GPCR受容体結合ペプチド配列を導入したプレフォルディンを構築し、そのAntagonist活性を確認した。金原は、スピロピランにより修飾したシャペロニンGroELが、金属イオンの存在下直線状に配列し、チューブ状の超分子集合体を形成することを見出した。一方、様々な生体分子を分子間相互作用のみを介して修飾できる、ポリグアニジン型デンドリマーを開発し、実際にBSAをモデルとしてタンパク質と相互作用することを見出した。A01班では、新しい人工分子や機能性材料の定量的パラメーターを用いた分子設計による合成と開発,その特性の解析と生体シグナル解析への利用というアプローチで多様な細胞内シグナルとなる物質群の網羅的解析に必要となる機能性分子群の創製を遂行している。その中で、浜地は、平成18年度までに成功したリン酸化タンパク質結合性の人工合成プローブを基体として細胞内でも使用できるATPに対する蛍光センサーの開発に成功した。また超分子ヒドロゲルとナノ細孔を有するMCMをハイブリッドしたアニオン性多糖類センサーチップの構築に成功した。杉本は、細胞内環境因子が核酸の構造安定性に及ぼす影響を定量的に検討し、水和状態によって核酸の構造と熱力学的安定性が劇的に変化することを見出した。この知見をもとにして、分子クラウディグ、金属イオン、代謝産物、光などに応答して細胞の機能を制御できる核酸スイッチを開発した。三原は、ペプチドチップの創製において、ヘリックス構造ペプチドライブラリを用いた細胞挿入活性リガンドのスクリーニング系の構築に成功した。さらに金の異常反射を利用したラベルフリー検出システムの構築にも高感度化を達成した。
多層光メモリ用二光子吸収材料の開発

メモリデバイスとしての応用に適した二光子吸収材料を探索した。具体的には、産業界から渇望されていた660、780nm帯の波長で、かつ、固体の状態で、半導体レーザーによる記録が可能な材料を得ることを目的とした。この目標は、研究申請時期に発表された「経済産業省ロードマップ2007」において、2015年頃に実現が予想されていたものである。粘土-色素ハイブリッド系に着目し、目的とする性能をもつ材料が創製できた。有機化合物の示す二光子吸収を利用した多層光記録には、ポストブルーレイ次世代大容量光記録の候補として期待がもたれている。二光子多層光記録を実現するためには、実際に記録メディアとしての利用が想定される、スピンコート膜のような固相薄膜状態で、二光子吸収断面積(二光子吸収の効率を示す量)が大きい化合物の開発が不可欠である。本年度は、独自に開発した固体試料の二光子吸収断面積の測定技術を駆使することで、これまでは難しかった固相薄膜状態にある有機色素の二光子吸収特性の評価を可能とし、固体状態と様々な溶媒への溶液とした状態との同一の化合物における二光子吸収挙動の変化を精査した。その結果、二光子吸収も、一光子吸収と同様に顕著なソルバトクロミズムを示すことが解明できた。例えば、ビス(ジメチルアミノシンナミリデン)シクロペンタノン(DMACCP)のテトラヒドロフラン中での二光子吸収断面積は1280GMであったのに対し、ベンジルアルコール中では500GMに過ぎなかった。一方、固体試料で測定した二光子吸収断面積は3800GMにも及んだ。このように、二光子多層光記録のための有機化合物を選別する際には、実際に用いられる固相状態での評価が極めて重要であることを実証した。また、固相状態でDMACCPの二光子吸収断面積が増加した理由を明らかにするために、粘土鉱物と高効率二光子吸収材料との複合系をモデルとした解析を行った。その結果、固相状態で一部の分子がJ会合体に類似したパッキングをとると、二光子吸収断面積が10倍以上にも大きくなることを明らかに出来た。しかし、全ての色素の二光子吸収断面積が、粘土鉱物との複合膜化で増加するわけではない。そこで本年度は、どのような色素を、どのような条件で粘土鉱物と複合膜化すると、二光子吸収断面積が顕著に増加するか、集中的に検討した。その結果、多カチオン性の色素を用い、そのカチオンサイト間の距離が、平均アニオンサイト間の距離と一致する粘土鉱物を選び複合膜化すると、二光子吸収断面積が増加するという規則性を見いだすことが出来た。また、色素の粘土層表面への吸着密度が低いほど、増加が顕著であることもわかった。以上の知見に立脚し、光記録メディアとしての有用性の高いさらに短い波長領域で、二光子吸収断面積が大きい材料の創製を今後進める計画である。そこで本研究では、二光子多層光記録を実現するために、実際に記録メディアとしての利用が想定される、スピンコート膜のような固相薄膜状態で、かつ、光記録に実際に用いられる波長で、二光子吸収断面積(二光子吸収の効率を示す量)が大きい材料の開発を目指した。前年度までの研究で、ある種の有機化合物を粘土鉱物との複合体固相膜にすると、DVD-Rの記録に用いられている波長である660nmにおいて、13000GMにも上る二光子吸収断面積を示す固体試料の創製に成功し、研究の目標を達成することが出来た。しかし、全ての色素の二光子吸収断面積が、粘土鉱物との複合膜化で顕著に増加するわけではないことも明らかとなった。そこで本年度は、粘土鉱物との複合膜化で、二光子吸収断面積がどの程度増加するのか、定量的に予測できるようにするための研究を進めた。

その結果、(1)溶液状態では有機化合物が三次元的にランダムな配向をとっているのに対し、複合体中では有機化合物の配向が二次元に制限されるので、入射光が効率良く吸収される効果、(2)無機層状化合物の層間という二次元平面内に有機化合物が閉じ込められることで、有機化合物の平面性が向上し、遷移モーメントが大きくなることによる効果、(3)粘土層間という疎水的な環境に有機化合物が置かれることによる効果、(2)に起因する(4)デチューニングエネルギーが減少することによる効果により、二光子吸収断面積が増加することを突き止めた。この知見に立脚し、極めて効率の高い二光子吸収材料を実際に創製できた。
原風景と音風景の創造性についての研究

平成15年度は音風景に関する研究を中心に行なった。主な対象は,北陸奥能登の輪島市に継承されている御神事太鼓である。当該の太鼓は,太鼓芸能の盛んな北陸ならではの技術と伝統を有する。音風景の点から明らかにしたことは主に以下の3点である。第1点は,音そのものの調査である。そのため,御神事太鼓および「お祭り太鼓」と呼ばれる輪島大祭での太鼓のリズム採譜を実施した。第2点は,演奏者たる御神事太鼓保存会メンバーへの聞き取りである。主な調査点は,御神事太鼓の形式的特徴と御神事太鼓に対する意識である。その結果,予想以上に,能楽に通じる表現様式や同じ輪島の御陣乗太鼓との表現の違いといった,美意識に関わる問題が重視されていることが分かった。第3点は,音風景としての御神事太鼓の位置付けである。これについては,現地調査から得られた事実を,地域的特徴との関連や現代の創作太鼓との違いから説明する方法を取った。結論的には,御神事太鼓の音には,北陸特有の気象と,輪島で盛んな伝統産業の音との関連があることが明らかになった。また現代の創作太鼓との差異は,言説ではなく,「小バイ」と呼ばれる地打ちのリズム構成という技術面に見られることが分かった。このことから,御神事太鼓が,場所性を有する音風景の具体的な形であることが明かになった。さらに報告者は,こうした音風景の問題を文化研究の枠組みで議論するために,もとは音楽概念であったが今日では文化理論の一部となり,かつ伝統的太鼓を考察する際に頻繁に持ち出されるポリフォニーという考え方に注目した。しかし報告者は,バロック期の通奏低音との類似性は無理をすれば言えなくもないが,ポリフォニーについては安易に適用することは不可能で,文化理論としての音楽概念の適用は今後の研究課題であると結論づけた。平成14年度は,原風景に関する問題を中心に研究を行なった。研究遂行の中心は,人びとの抱く風景観の収集とその分析であった。報告者は,調査対象として青年層と中高年層それぞれ15名程度を設定し,それぞれの年齢層がどのような風景観を抱いているかを,自由記入アンケートと聞き取りから明らかにした。その際に,報告者の当該研究の趣旨にしたがって、単純な原風景という概念は設定せず,「好きな風景」あるいは「印象に残っている風景」というかたちで,できるだけ調査対象者の自由な風景観が得られるような資料収集の方法を試みた。その結果,いろいろな風景観が集まったが,とくに青年層と中高年層で大きな違いが見られた。それは,中高年層にとって風景はあくまで自然環境に対する視覚的なものであるのにたいして,青年層の風景はかなり多様であることであった。青年層の風景は,かならずしも視覚以外の感覚で捉えられる風景というだけでなく,むしろ日常のあらゆる「光景」というべきものであった。そこには,メディア世代のポストモダン的なイメージ感覚があることが予想される。そこで報告者は,そうした把握が妥当かどうかを,より詳細な資料収集から明らかにしようと試みた。すなわち青年層5名に一年間にわたって風景についての日記をつけてもらい,そこから彼らの風景意識を探るという方法を用いた。この調査の結果,記憶の中で高度にイメージ化された原風景的な風景観だけでなく,日常レベルでの現実味のある風景意識が得られた。それを現在分析しつつあるが,そこには風景を身体性に基づい創造行為とする視点が見られる。そのなかでもとくに,自己の内面的・実際的体験が風景に投影されている場合と,四季の変化を身体感覚的かつ擬人的に捉える視点とが多い。したがって,風景が自己表現のメディア(媒体)である可能性が明らかになったと言える。

しかし報告者は,バロック期の通奏低音との類似性は無理をすれば言えなくもないが,ポリフォニーについては安易に適用することは不可能で,文化理論としての音楽概念の適用は今後の研究課題であると結論づけた。
生物機能中分子の細胞内への新規導入基盤の創出

近年、ペプチドや核酸を基盤とする中分子が次世代医薬品の候補として熱い視線を集めている。その特長である精密分子認識能を活かした細胞内の疾病関連分子相互作用の調節は、様々な医薬品の開発に結びつくが、これには中分子の細胞内送達が必要となる。本研究期間において、研究代表者は、細胞内輸送小胞(エンドソーム)に保持された生理活性ペプチドやタンパク質を、従来にない効率で効果的に細胞質に放出可能とする「エンドソーム不安定化ペプチド(L17E)」を開発した。また、その効率的な細胞質への放出が、エンドソーム内のpH低下に呼応するのみならずエンドソーム膜組成の酸性化に呼応している可能性があることや、液相エンドサイトーシス(マクロピノサイトーシス)の誘導による細胞への物質取込能の向上に依ることを指摘した。一方、近年分子内架橋によりヘリックス構造を規制したステープルドペプチドが中分子医薬品のプロトタイプとして注目されている。細胞内移行性を有するペプチドも報告され、理由として架橋による分子全体の疎水性の向上が示唆されているが、詳細な検討はなされていない。本研究では、構造規制中分子の細胞透過性向上のための設計指針を得ることを究極の目的とし、ステープルドペプチドの細胞内移行機序の検討を行った。この結果、ステープル化のための非天然アミノ酸の導入によるペプチドの脂溶性の向上やマクロピノサイトーシス誘導によるエンドサイトーシス活性化が、ステープルドペプチドの細胞内移行に重要な役割を果たすことを見出した。29年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者は、最近、細胞内輸送小胞(エンドソーム)に保持された抗体を、従来にない効率で効果的に細胞質に放出可能とする「エンドソーム不安定化ペプチド(L17)」を開発した(国際特許出願)。L17は、本領域研究で開発が期待される核酸や糖誘導体などの細胞内導入にも大きな威力を発揮すると考えられるが、中分子送達への応用性は十分検討されていない。本研究では、L17を生物機能中分子の細胞内送達に適用し、その有用性を確認する(目的1:新規エンドソーム不安定化ペプチドL17誘導体を用いた細胞内中分子送達)。一方、分子内架橋によりヘリックス構造を規制したステープルドペプチドが中分子医薬品のプロトタイプとして注目されている。本研究では、ステープルドペプチドの細胞内移行機序を理解し、構造規制中分子の細胞透過性向上のための設計指針を得るとともに、ステープルドペプチドを超える、新しい細胞内送達概念の創出につなげる(目的2:構造規制ヘリックスペプチドの細胞内移行機序の理解と細胞透過設計指針の樹立)。本年度はエンドソーム不安定化ペプチドL17の活性向上に関わる検討を行い、さらに高機能のペプチドを得た。また、ステイプルドペプチドの細胞内移行機序に関するエンドサイトーシスの関与に関して検討した。エンドソーム不安定化ペプチドL17の活性向上に関わる検討を行い、さらに高機能のペプチドを得た。L17および関連ペプチドの核酸送達への応用や、ステイプルドペプチドの膜透過性向上に関してさらに検討を深める。