hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚弱高齢者の体力・運動能力・筋量の実態と生活要因との関連

平成17年6月、持続可能な介護保険法制度の構築を目指し、介護保険改正案が国会を通過した。その柱の一つが軽度要介護者の身体機能低下を防ぐ新予防給付の創設である。健康寿命の延長や医療費・介護保険料軽減のためには、元気な者がいつまでも元気にいる事が最も望ましいが、虚弱高齢者、特に介護保険の適用までに至らない介護予備群や介護度の低い者への対応、すなわち介護予防が急務となっている。特にこのような高齢者の介護予防では、日常生活機能維持に欠かせない体力・運動能力の低下を最小限に抑えることが最優先課題である。しかし、わが国においては、虚弱高齢者の体力・運動能力の実態やその回復・維持に注目した研究はあまりなされていない現状があった。そのため我々は、虚弱高齢者の体力・運動能力の実態と生活要因との関連を明らかにし、このような虚弱高齢者に適用できる介護予防を目的とした日常生活に取り入れやすい運動プログラム作成のための研究を企画した。研究の初年度(昨年)は、施設のデイサービス利用者(要支援、要介護1程度、一部要介護3・4を含む70名)を対象として、体格(身長、体重、BMI)、体力(上肢筋力、下肢筋パワー、柔軟性、敏捷性、持久性)、筋量、重心動揺の測定を実施し、このような指標の要介護高齢者の特徴を明らかにした。最終年度にあたる本年度は、初年度結果に基づき、施設のデイサービスメニューの一つとして、スタッフが運動を提供・実施出来るようになるにはどのような支援が必要かについて先ず検討し、次に実際に運動プログラムを展開・介入した6ヶ月後の利用者の体力・生活様式の変化についてまでの測定・調査を行うことができた。今年度結果からは、体力や筋量は維持され、介護度の悪化は少なく、運動を楽しみにしている利用者が増えていたが、自宅での運動はやりたいがやっていない実態も明らかになった。
Bax発現系による発生過程で起こるニューロン死のメカニズム解析

細胞死促進分子であるBaxをニワトリ胚へ強制発現させて、網膜、脊髄神経節、脊髄運動ニューロンで起こる生理的ニューロン死(発生過程で自然に起こるニューロン死)を解析した結果、ニューロン死の時期に一致して細胞死が増強し、ニューロン死の時期が終了した後の生存ニューロン数は減少することがわかりました。同様の神経細胞集団であってもニューロン死が起こる時期の以前ではBaxが強発現しても細胞死を引き起こさないことも見出しました。興味深いことに頚髄で早期に起こる運動ニューロン死においては、導入されたBaxは死につつある運動ニューロンでは活性型として機能していることが示唆されましたが、頚髄運動ニューロン死自体は増強されませんでした。以上の結果から、Baxがin vivoで機能するためには発現しているのみでは十分でなく細胞死を引き起こすシグナルが必要であることが明らかになりました。またそのような細胞死を引き起こすシグナルは、網膜、脊髄神経節、脊髄運動ニューロンなどで起こるニューロン死においては生き残るべきニューロンにも伝達されうる一方で、頚髄で早期に起こる運動ニューロン死においては死ぬべき細胞に限定して伝達されている可能性が示唆されました。これらの研究成果は、細胞死をコントロールする重要な分子であるBaxの生体での機能に関する今後の研究の進展、及び発生過程で起こるニューロンの生死決定のメカニズムを明らかにしていく上で重要な基盤となると思われます。Baxをニワトリ胚の神経組織において過剰発現させて、発生過程で起こるニューロン死のメカニズムを明らかにすることが本研究課題の目的である。この目的を達成するためにまず、ニワトリ胚の神経組織への有効なBax導入方法を検討した。増殖型トリレトロウイルスベクターRCASBPは以前から我々が用いている遺伝子導入法であるが、Baxを組み込んだベクターは感染した組織で十分Baxを発現させることが確認された。また神経特異的な遺伝子導入を目的として、運動ニューロン特異的なプロモーターを幾つか試みたが、レトロウイルスではうまく機能しなかった。現在はそれらのプロモーターをレトロウイルスを用いるのではなく、通常の発現プラスミドの状態で生体エレクトロポレーション法を用いて導入する系を検討している。RCASBPは期待どうり広範囲の組織にBaxを過剰発現させることができたので、幾つかの神経組織でその影響を検討した。その結果、初期網膜や脊髄神経節ではBax発現によってニューロン死が増強することが明らかになった。だだしBaxを発現していてもプログラム細胞死の時期より以前の神経細胞集団には影響はなかった。これらのニューロン死の増強はBaxの細胞内局在の変化とカスパーゼ3の活性化の増強も伴っているため、Baxがそれらの細胞内で細胞死促進分子として機能した結果だと推測された。またこの細胞死の増強は単に本来のニューロン死の加速だけではなく、生き残るはずのニューロンをも含むものであることがわかった。一方で、頚髄で起こる早期の運動ニューロン死は、初期網膜や脊髄神経節と同様のBaxの活性化が起こっているにも関わらず、Bax発現によって影響を受けなかった。現在この知見をさらに詳細に検討している。Baxは細胞死を促進させるBcl-2遺伝子ファミリーの一つであり、KOマウスを用いた解析から発生で起こるニューロン死で重要な役割を果たしていることが知られている。本研究課題ではBaxをトリレトロウイルスベクターRCASBPを用いてニワトリ胚へ強制発現させて、網膜、脊髄神経節、脊髄運動ニューロンで起こる神経細胞死を解析した。その結果、これらの神経細胞集団においてニューロン死の時期に一致して細胞死が増強し、ニューロン死の時期が終了した後の生存ニューロン数は減少することが明らかになった。同様の神経細胞集団であってもニューロン死の時期の以前ではBaxが強発現しても細胞死を引き起こさないことも明らかになった。興味深いことに頚髄で早期に起こる運動ニューロン死においては、導入されたBaxは死につつある運動ニューロンでは活性型として機能していることが示唆されたが、頚髄運動ニューロン死を増強しなかった。より詳細に検討するためにテトラサイクリンで遺伝子発現誘導が制御されるようなBax発現系を構築して早期頚髄運動ニューロン死を解析した。

その結果、野生型Baxはウイルスを用いた結果と同様にニューロン死に影響を及ぼさなかったが、常時活性型Baxはこのニューロン死を顕著に増強することが明らかになった。以上の結果から、Baxがin vivoで機能するためには発現しているのみでは十分でなく細胞死を引き起こすシグナルが必要であることが明らかになった。またそのような細胞死を引き起こすシグナルは、頚髄で早期に起こる運動ニューロン死においては死ぬべき細胞に限定して伝達されている可能性が示唆された。
反応拡散方程式系における拡散の役割について

本研究では,拡散の役割と非線形性の関係を調べるために,拡散のもつ性質のうち,通常予想されてこなかった意外な側面の発見を行い,それによって拡散のもつ性質を外延しようと試みてきた.現在のところ,拡散の性質が際立った状態で現れる問題に注目して研究を行っている.特に,研究代表者等によって近年発見された拡散誘導現象反応拡散系に見られる拡散誘導爆発の仕組みを研究している.爆発問題は,特異性のある問題なので,拡散のもつある性質が,拡大されて導き出されることが予想されるからである.また,拡散誘導爆発は,拡散の効果によって爆発しない常微分方程式系が爆発することがあることを結論づける興味深い結果である.この結果は単に拡散の役割が空間一様化だけでなく,非線形性との兼ね合いで爆発にまで影響を与えることを述べただけにとどまらず,モデル方程式を建てる際にも拡散のこの意味での役割も考慮に入れる必要があることを示唆している.ここで作られた方程式系は人工的なモデルであったが,数理生物学や化学反応などに現れるモデルにおいても,拡散誘導爆発が見られることが数値計算によって明らかになってきた.拡散誘導爆発が起きる状況を把握するために,その自己相似解の果たす役割と方程式系の退化の関係を調べている.反応拡散系における拡散の役割は従来考えられてきた空間一様化という役割より,多くのものを含んでいることが最近知られるようになってきた.チューリングによる拡散不安定性の発見はその一つである.本研究では,拡散の役割を考えるために,拡散のもつ性質のうち,意外な側面の発見を行い,それによって拡散のもつ性質を外延しようと試みてきた.現在のところ,研究代表者等によって近年発見された2つの拡散誘導現象1)2種の生物種が競争する問題に見られる拡散誘導絶滅2)反応拡散系に見られる拡散誘導爆発の仕組みを研究している.また,拡散誘導爆発は,拡散の効果によって爆発しない常微分方程式系が爆発することがあることを結論づける興味深い結果である.この結果は単に拡散の役割を調べるだけにとどまらず,モデル方程式を建てる際にも拡散のこの意味での役割も考慮に入れる必要があることを示唆している.ここで作られた方程式系は人工的なモデルであったが,生物学や物理学に現れるモデルにおいても,拡散誘導爆発が見られることが数値計算によって明らかになってきた.拡散誘導爆発が興る状況を把握するために,その自己相似解の果たす役割と方程式系の退化の関係を調べている途中である.本研究では,拡散の役割と非線形性の関係を調べるために,拡散のもつ性質のうち,通常予想されてこなかった意外な側面の発見を行い,それによって拡散のもつ性質を外延しようと試みてきた.現在のところ,拡散の性質が際立った状態で現れる問題に注目して研究を行っている.特に,研究代表者等によって近年発見された拡散誘導現象反応拡散系に見られる拡散誘導爆発の仕組みを研究している.爆発問題は,特異性のある問題なので,拡散のもつある性質が,拡大されて導き出されることが予想されるからである.また,拡散誘導爆発は,拡散の効果によって爆発しない常微分方程式系が爆発することがあることを結論づける興味深い結果である.この結果は単に拡散の役割が空間一様化だけでなく,非線形性との兼ね合いで爆発にまで影響を与えることを述べただけにとどまらず,モデル方程式を建てる際にも拡散のこの意味での役割も考慮に入れる必要があることを示唆している.ここで作られた方程式系は人工的なモデルであったが,数理生物学や化学反応などに現れるモデルにおいても,拡散誘導爆発が見られることが数値計算によって明らかになってきた.拡散誘導爆発が起きる状況を把握するために,その自己相似解の果たす役割と方程式系の退化の関係を調べている.
統合失調症候補遺伝子産物DISC1のKendrinを介した中心体での機能の解析

中心体におけるKendrinの微小管形成作用に対するDISC1の関与を明らかにするために,in vitroの合成系において中心体分画を抗DISC1抗体で前処理してDISC1とKendrinの結合を阻害したが,星状の微小管形成は有意な影響を受けなかった.またRNA干渉によりDISC1の発現をノックダウンさせた培養細胞においても,中心体での微小管形成は阻害されなかった.胎生期マウスの中枢神経系を含む各組織において,Kendrin mRNAはG_0期細胞に優位に発現し増殖細胞では発現は低く,有糸分裂による増殖期よりも分化期にKendrinは生物学的な意義を持つことが示唆された.さらにKendrinタンパクは胎生期マウスの中枢神経系を含む各組織において,細胞あたり1本存在する不動性の1次繊毛の基部に局在していることが見出された.これは培養細胞を用いてKendrinの1次繊毛形成への関与を示した最近の研究を支持し,哺乳類の発達段階でKendrinが繊毛形成に広く関与することが示唆された.近年,神経細胞の1次繊毛がセロトニン6型受容体などの特異的なサブタイプの受容体を介して細胞近傍環境を感知し,そのシグナルが神経伝達を修飾するという機構が提唱されている.本研究はDISC1の結合因子としてのKendrinが神経細胞1次繊毛の形成を介してその感知機構に関与し得ることを示唆し,その機構の異常が精神疾患への脆弱性をもたらす可能性を提示した.統合失調症・感情障害と相関する(1;11)(q42.1;q14.3)転座家系の解析により、染色体1上の新規遺伝子DISC1(Disrupted-In-Schizophrenia 1)がこの転座により途切れることが報告された。我々はこの遺伝子がコードするタンパクDISC1の機能解析を行っている。その一環として、酵母2-Hybrid法を用い、DISC1の結合タンパクを検索した。ヒトDISC1(854アミノ酸)のカルボキシ端側507アミノ酸をbaitとしてヒト成人脳cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、数個のポジティブクローンが得られた。その1つはcalmodulin結合性中心体タンパクkendrin/pericentrin-Bをコードしていた。DISC1とkendrinとの結合を免疫沈降法により確認し、kendrinとの結合に関与するDISC1の分子内領域を酵母2-Hybridアッセイにより決定した。また、SH-SY5Y細胞およびHeLa細胞内で発現させたGFP標識DISC1の一部がkendrinと中心体において共局在したが、kendrin結合領域を欠くタンパクは細胞質中に瀰漫性に存在した。さらに胎生期マウスのin situ hybridization法による解析では、発達段階にある大脳皮質において、ventricular zoneの増殖神経上皮細胞ではkendrinの発現は低く、intermediate zoneを遊走中の分化期の細胞では発現は高く、cortical plateのMAP2強陽性の成熟神経細胞では発現は低下していた。これらの結果より、kendrinおよびkendrinをその結合因子の1つとするDISC1は、発達期の中枢神経における細胞分化に関与する可能性が示唆された。中心体におけるKendrinの微小管形成作用に対するDISC1の関与を明らかにするために,in vitroの合成系において中心体分画を抗DISC1抗体で前処理してDISC1とKendrinの結合を阻害したが,星状の微小管形成は有意な影響を受けなかった.またRNA干渉によりDISC1の発現をノックダウンさせた培養細胞においても,中心体での微小管形成は阻害されなかった.胎生期マウスの中枢神経系を含む各組織において,Kendrin mRNAはG_0期細胞に優位に発現し増殖細胞では発現は低く,有糸分裂による増殖期よりも分化期にKendrinは生物学的な意義を持つことが示唆された.さらにKendrinタンパクは胎生期マウスの中枢神経系を含む各組織において,細胞あたり1本存在する不動性の1次繊毛の基部に局在していることが見出された.これは培養細胞を用いてKendrinの1次繊毛形成への関与を示した最近の研究を支持し,哺乳類の発達段階でKendrinが繊毛形成に広く関与することが示唆された.近年,神経細胞の1次繊毛がセロトニン6型受容体などの特異的なサブタイプの受容体を介して細胞近傍環境を感知し,そのシグナルが神経伝達を修飾するという機構が提唱されている.本研究はDISC1の結合因子としてのKendrinが神経細胞1次繊毛の形成を介してその感知機構に関与し得ることを示唆し,その機構の異常が精神疾患への脆弱性をもたらす可能性を提示した.
高等植物における異型精細胞形成機構の解明

キルタンサスでは、花粉管伸長過程で一組の精細胞が異型化し、雄原細胞分裂直後の表層微小管構成時に蓄積の差異が生じる事が明らかとなった。精細胞形成の分子基盤情報を得るために遺伝子解析を行い、異型化特異的ステージの前後で発現量が変化する遺伝子の候補リストが得られた。花粉に重イオンビーム照射することで、雄性配偶子の研究に有用な新たな材料を作出するとともに、雄性配偶子のDNA損傷応答機構を明らかにした。高等植物が持つ独自の生殖機構`重複受精'には未だに解明されていない現象が数多く存在する。植物材料として用いるキルタンサスでは、花粉管伸長過程で一組の精細胞が異型化しその異型化には微小管が関与することが明らかとなった。本研究では雄性配偶子の花粉管内での挙動を更に詳細に解析している。本年度は新たな研究ツールとして、DNA二本鎖切断を高頻度に誘導する重イオンビームをキルタンサス成熟花粉に照射し、花粉管伸長時における雄性配偶子の挙動を調査した。炭素イオンビーム照射花粉では、発芽遅延,発芽率の低下が見られない照射線量においても精細胞形成率が低下することを発見した。この精細胞形成の低下の原因を明らかにするため、雄原細胞の細胞周期の調査に加え、DNA2本鎖切断が生じた際に誘導されるリン酸化ヒストンH2AX(_YH2AX)の検出系を構築し雄性配偶子のDNA損傷応答を調査した。重イオンビーム照射による精細胞形成率の低下は修復されずに残存したDNA2本鎖切断によって分裂の遅延が起きていることが明らかとなり、細胞周期を監視するチェックポイント機構が関与することが示唆された。次世代に正確な遺伝情報を伝達するためには雄性配偶子におけるDNA損傷修復機構が必要と考えられるがその詳細は不明である。本研究成果により花粉管伸長過程の雄性配偶子におけるDNA損傷応答機構の一端が初めて明らかとなった。また、重イオンビーム照射後に形成される精細胞および分裂が遅延した雄原細胞では、一部が異常な形態を示す。この現象を更に精査することにより、異型精細胞形成研究への新たな展開が期待される。キルタンサスでは、花粉管伸長過程で一組の精細胞が異型化し、その異型化には微小管が関与することが明らかとなっている。異型化は雄原細胞分裂直後の表層微小管の再構成時に生じることから、異型化のKey遺伝子の発現は精細胞形成時もしくは形成直後であると推定される。精細胞形成の基盤情報を得るために、花粉培養6時間の雄原細胞および12時間の精細胞形成期においてRNA抽出し、増幅後にcDNAライブラリーを作成しEST解析を行った。それぞれのライブラリーをGS juniorによりシーケンシングし、培養6時間においてisotig 529個、培養12時間においてisotig 1563個取得した。各isotigのアノテーション付けを行ったところ、培養12時間では細胞周期関連遺伝子の発現が確認されたことから、ライブラリーには雄原細胞由来のcDNAが含まれると推測される。現在更に多くの配列情報を得るためにシーケンシングを行っており、それぞれの時間で発現する遺伝子を比較することで精細胞形成時に発現する遺伝子の網羅的情報が得られると考えられる。花粉管内における雄原細胞の分裂制御機構を明らかにするために、DNA二本鎖切断を高頻度に誘導する重イオンビームをキルタンサス成熟花粉に照射し、花粉管内の雄性配偶子の挙動を本年度も引き続き調査した。これまでに花粉管伸長過程においても雄原細胞に生じたDNA損傷が細胞周期のチェックポイント機構により監視されていること、また高線量を照射した雄原細胞では微小管の配向は精細胞であるが染色体の分配が起こらない非還元性精細胞を形成することが明らかとなった。今後精細胞異型化機構および分裂制御機構を精査する上で、正常な精細胞と非還元性精細胞というように比較可能な材料が得られたことは研究の遂行上意義深い。キルタンサスでは、花粉管伸長中に形成される一組の精細胞が異型化することが明らかになっている。精細胞形成時における遺伝子発現の基盤情報を得るために、精細胞形成以前(花粉培養6時間)の花粉管および形成直後の精細胞および分裂期の細胞を含む培養12時間の花粉管からTotal RNAを抽出しEST解析を行った。RNA増幅後にcDNAライブラリーを作成し、それぞれのライブラリーを454 FLX systemによりシーケンシングし、本年度新たに培養6時間で202,642個、培養12時間で412,663個のリード配列を取得した。昨年度得たシーケンス結果と合わせ、MIRA assemblerを用いて6時間、12時間を合わせた全てのリードより45,555個のコンティグ/シングレット配列を得た。配列情報をもとに相同性解析を試みたが、同一タンパク質に相同性を示す

コンティグ/シングレット配列が非常に多くみられ、さらに配列の統合が必要であった。従って、MIRAに加えCAP3 assemblerを用いることで最終的に25,786個のコンティグ/シングレット配列情報を取得した。これら配列情報には細胞周期関連遺伝子が多数確認されたことから、ライブラリーには雄原細胞由来のcDNAが含まれていると考えられる。遺伝子の発現量を比較する手法としてRPKM値を用いることで、6時間特異的なコンティグ/シングレット配列が1,217個、12時間特異的なものが5,571個抽出され、異型化特異的ステージの前後で発現量が変化する遺伝子の候補リストが得られた。リストには微小管形成関連遺伝子が含まれていることから、異型化機構解明に向けた基盤情報として活用可能と考えられる。研究計画において目標としていた精細胞形成時に発現する遺伝子情報の一部が得られており、花粉の重イオンビーム照射実験については計画していた実験がほぼ終了している。従って、順調に研究が進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。花粉培養時間として2試験区設け、それぞれの遺伝子発現情報が得られているが、その量は十分とは言えない。従って、来年度に更なる解析を続け情報量を増やすことで、試験区間で発現に差がある遺伝子がリストアップ可能となる。遺伝子発現情報を得るのと並行して、現在得られている遺伝子の発現部位の確認等を行うことで研究の効率化を図る。
選択的スプライシングを制御する新しいリン酸化シグナルカスケード

MAPキナーゼカスケードも選択的スプライシングの制御において重要な役割を果たしていると想定されている。MAPキナーゼカスケードは種々の細胞外刺激によって活性化されるが、最近MAPKフォスファターゼ(MKPs)が続々と報告されつつある。我々はチロシンとセリン/スレオニンの双方を脱リン酸化するフォスファターゼSKRP1をクローニングして、そその酵素がMKK7と結合しJNKを脱リン酸化する全く新しいタイプのMKPとして働いていることを見い出した(Zama T. et al. J.Biol.Chem.2002a)。さらに驚くべきことに、SKRP1はMAPKKKの一つであるASK1とも特異的に結合しScaffold蛋白として機能することが判明した(Zama T. et al. J.Blol.Chem.2002b)。初期発生において、転写制御のみならず、mRNAのプロセシングや輸送の制御も極めて重要な役割を担っていると考えられる。高次神経系においても、神経細胞の興奮に伴ってスプライシングパターンが変化したり、シナプスへ特定のRNAが輸送される現象が観察されているが、その分子機構や生理的意義は不明のままである。リン酸化などの蛋白修飾反応は、転写過程だけでなくmRNAプロセシングや輸送のシグナル制御過程でも重要な役割を果たしていると想定される。我々はこれまで、mRNAプロセシングやmRNA輸送を制御する可能性のある蛋白リン酸化酵素としてSRPK2、Clk4、及びhPRP4をクローニングし、その細胞内局在や蛋白間相互作用を明らかにしつつある。本研究では、細胞外からのシグナルによりmRNAプロセシングや輸送過程を制御する、新しいリン酸化酵素カスケードの同定を目指した。SRPK2を恒常的に発現する293細胞株の樹立を試みたところ、SRPK2発現ベクターを導入した細胞は形態変化を起こし、培養デイッシュから乖離し易くなって増殖が著しく遅延する減少が見られた。この現象はSRPK2の発現量と比例するため今後は接着に関わる細胞骨格系の蛋白がSRPK2の下流カスケードに位置し、このリン酸化酵素で機能制御されている可能性を検討していく予定である。Clk1とClk4のリン酸化活性を特異的に阻害する合成阻害剤を既に我々は見出しているが、その解析から脊椎動物においてもClk1とClk4は、初期発生、特に頭部形成に必須の分子であることが示唆された。この後は、Clk1とClk4を活性化するシグナルと、その下流でリン酸化されて制御を受けている蛋白を同定する。近年のヒトゲノム配列解析の進行により、ヒトゲノムは従来考えられていたよりも少数の遺伝子で構成されていることが明らかとなり、限られた遺伝子から膨大な種類のタンパク質産物を作り出すpre-mRNAの選択的スプライシング機構の重要性が改めて認識されることとなった。選択的スプライシングによって遺伝子発現の多様化が可能となり、発生や分化など真核生物の複雑性をもたらす種々の現象に重要な役割を果たしていると考えられる。選択的スプライシングはRNA認識モチーフとアルギニン・セリンが連続的に続くRSドメインを持つSR(serine/arginine-rich)タンパク質のリン酸化・量変化・局在変化を通じて制御されることが知られている。SRタンパク質リン酸化酵素としてSRPKファミリー、Prp4、Clk(cdc2-like kinase)ファミリーなどが知られている。Clkの過剰発現により、Clk自身やアデノウイルスElA遺伝子のpre-mRNAのスプライス部位選択に影響が出ることが知られているが、脊椎動物におけるClkの機能は不明である。そこで今回我々は,新しいClkファミリーの特異的阻害剤を創製しClkの機能解析を試みた。ベンゾチアゾール骨格を持つ一連の化合物を合成し、そのClkに対する作用を検討した結果、TG003と名づけた化合物がClk1およびClk4を特異的に阻害することを見出した。アフリカツメガエル初期胚にClkを過剰発現させると、重度の形態異常、発生遅延が観察されたが、TG003存在下ではその発生異常が抑制され正常化した。このことはClk依存的な選択的スプライシングの抑制が、正常発生過程にとって必須であることを示唆している。今後、選択的スプライシングの異常に起因する疾患に対し、TG003が薬理学的作用を有するか検討してゆく予定である。
遺伝子導入系を用いたボツリヌス菌神経毒素産生調節機構の解析

ボツリヌス神経毒素の産生調節機構を調べる目的で、以下の実験を行った。1.神経毒素遺伝子領域の構造の決定:ボツリヌスE型菌の神経毒素産生に関わる遺伝子領域を特定するために神経毒素遺伝子周辺の塩基配列を決定し、神経毒素を産生する菌株間での比較を行った。この結果、神経毒素構成成分の遺伝子領域の上流に、毒素産生菌株間で保存された3つの遺伝子からなる遺伝子領域が存在し、また下流にはABCトランスポータのファミリーに属する遺伝子が存在していることが明らかになった。上流、下流の両遺伝子クラスター共に、神経毒素構成成分遺伝子と逆方向で存在していた。また、ABCトランスポータファミリーの遺伝子は、他の型の菌株では保存されていなかったが、上流の3遺伝子は、A型菌など他の菌株でも神経毒素構成成分遺伝子のすぐ近傍に存在していた。2.ボツリヌス菌株の薬剤耐性試験:遺伝子導入の予備実験として、選択マーカーとしてマクロライド耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子の使用が可能かどうか調べたところ、日本で分離されたボツリヌスE型菌株には、クロラムフェニコールは有効であったが、多くがマクロライド耐性形質を獲得していた。3.p47、orfX_1への相同組換えによる変異導入のためのベクター構築:菌体外に放出される神経毒素の構成成分の遺伝子と、同一方向に隣接して存在しているORFである、p47遺伝子及び、E型菌株ではそのすぐ上流に位置するorfX_1遺伝子のノックアウト株を作製するために、これらの遺伝子をcatP遺伝子(クロラムフェニコール耐性遺伝子)に相同組換えより置き換えるためのベクターを作製した。このベクターは、ボツリヌス菌体内で複製されないため、これをエレクトロポレーション法によりボツリヌスE型菌に導入し、クロラムフェニコールに耐性化した菌株を選別して神経毒素遺伝子の転写量の変化及び、神経毒素産生を調べることにより、これらの遺伝子がどのように毒素産生に関わるのか明らかにすることができるとおもわれる。ボツリヌス菌の神経毒素産生量は、菌増殖時の栄養状態、pH、温度など様々な環境要因によって左右されると考えられている。本研究ではボツリヌス菌の神経毒素産生機序を明らかにし、毒素産生と環境要因との関連について明らかにすることを最終目的としている。平成10年度の科学研究費により、まずボツリヌスE型菌の神経毒素産生に関係する遺伝子領域を特定するために、神経毒素遺伝子下流域の塩基配列を決定し、A型菌の対応する領域との比較を行った。この結果、A型菌株の神経毒素遺伝子のすぐ下流にはリゾチウム遺伝子(LycA)が存在していることがすでに報告されているが、ボツリヌスE型菌ではこれと異なったオープンリーディングフレームが存在していることが明らかになった。この遺伝子のコードするタンパク質は、ATP結合ドメインをもち、p47、orf-x_1、orf-x_2などと同様に神経毒素遺伝子と隣り合って存在していることから神経毒素産主の制御に直接関わる可能性が考えられた。そこで現在、E型菌株でこれらの遺伝子の発現と、神経毒素遺伝子やサブコンポーネント遺伝子の発現との間に関連性があるのかどうか調べるとともに、E型毒素産生ブチリカム菌や、AC型菌株に、同様にこの遺伝子が存在しているのかどうかについても解析を進めている。またこれと並行して、今回見つかった遺伝子や、p47、orf-x_1、orf-x_2などの遺伝子産物の機能を明らかにするために、まずE型毒素遺伝子クラスター中のp47遺伝子を抗生物質耐性遺伝子に置き換えたプラスミッドを作製し、エレクトロポレーション法によりボツリヌス菌に導入してp47遺伝子欠損株の選別を行っている。

このベクターは、ボツリヌス菌体内で複製されないため、これをエレクトロポレーション法によりボツリヌスE型菌に導入し、クロラムフェニコールに耐性化した菌株を選別して神経毒素遺伝子の転写量の変化及び、神経毒素産生を調べることにより、これらの遺伝子がどのように毒素産生に関わるのか明らかにすることができるとおもわれる。
深宇宙探査機データのGISへの統合と遠隔共同解析技術の研究

月探査機かぐや(SELENE)を題材として、地理情報システム(GIS)に準拠したデータ統合とウエブベースのオンライン恊働解析技術の開発を行った。また、小惑星探査機はやぶさを題材として、不規則形状天体における地理情報に頼らない三次元GISツールを開発した。それらを通じて、月惑星科学成果を挙げた。本研究は、2007年9月14日に打ち上げられ、12月より通常観測が始まった月周回衛星かぐや(SELENE)を主な題材とし、理学・工学にまたがったチーム構成で、地理情報システムに準拠した深宇宙データの遠隔共同解析基盤技術の確立・提供、およびそれを用いて月の起源と進化を明らかにすることを目的としている。研究初年度は、必要とされる実装技術のアップデートと、それを実現するハードウエア機器の選定を行い、サーバ機器および大容量データストレージ部分の導入、分散する研究分担者を繋ぐ環境整備を行った。また、実装技術のプロトタイプを作り、2008年1月中旬から会津大学に提供が始まったかぐやの実データを用いて、会津大-国立天文台-東大-阪大の研究分担者と共に試験的な解析を行い、方針の正しさを確認し、且つ一定の初期成果を挙げることができた。具体的には、かぐや数値地形図の作成手順、数値地形図および各種地理情報システムに準拠した電子データに基づいて表面地質分類を行うアルゴリズム、オンライン共同解析環境とその実装要素、そしてそれらの予備的成果が形になった。また、JAXAおよび他機関との大容量通信回線として、独立行政法人情報通信研究機構の提供するJapan Gigabit Networkのサービス、JGN-IIのプロジェクトを申請、採択されてそれに準拠した環境基盤の整備を開始した。それらの経過は、年度途中の国際学会では計画と実装要素の準備状況について、年度末の国際会議では試験解析結果について、それぞれ発表した。更に、解析技術の幾つかが査読付論文および査読付学会集録に採択された。本研究課題の目標は次の3つである。1)効率の良い電子地質マッピング技術を開発する。2)重力をはじめとした測地学・地形学・岩石鉱物学の知見・深宇宙探査機データをGIS統合した、遠隔地に分散する研究者の協働解析環境を提供する。3)上記を組み合わせた協働作業で月の進化履歴を明らかにする。これを実現するために、主に月周回衛星かぐや(SELENE)のデータとその理学解析を題材として、月惑星データの地理情報システム(GIS)機能強化統合、および遠隔地に分散した研究者同士の意見交換・解析環境を支えるサーバ構築の研究開発を行ってきた。また、独立行政法人情報通信研究機構(NICT)の研究開発テストベッドネットワークJGNを介した宇宙航空研究開発機構(JAXA)との分散型GIS実証試験も行い、期待した速度での稼働を確認した。最初に挙げた目標の1と2については、データ統合の部分を除いてほぼ予定通りに完成している。最終年度を控えて、解析環境を除く主な基盤技術の雛形は確立され、試験的な解析成果も挙がり始めており、工学面の開発は順調である。一方、理学面では、観測機器単独の成果が挙がりはじめたところで、統合サイエンスを実施する手前の段階にあり、やや遅れ気味である。る。研究グループだけでなく、関連コミュニティに広く貢献することも視野に入れており、これらは最終年度で重点的に行うと待ち越された。本研究課題の3つの目標は次の3つである。これらの実現のために、小惑星探査機「はやぶさ」および月周回衛星「かぐや(SELENE)」の観測データプロダクトの整理および理学解析を題材とした地理情報システム(GIS)機能の提供と支援を行った。解析機能の強化については、最先端研究者と我々開発グループとの連携が功を奏し、研究者が使える機能の大半は実装された。しかし、不特定多数にその機能を提供することは、現実的なサーバ能力では困難であることも分かり、どの機能を制限した形で進めるかが課題として残された。またアクセスレベルで管理されたデータのセキュリティ機能の強化が強く求められ、利便性とのトレードオフを踏まえて、幾つかの試行モデルを作るところまでは完成した。広く公開することはまだできていないが、全国に分散していた研究者同士の意見交換・解析環境を支えて研究成果が挙げられつつある。この最終年度では、いわゆる統合サイエンスを担う基盤として貢献し、結果として情報系の関連コミュニティにも貢献することができたといえる。方法が確立し、広く活用できるめどをつけたことで、所期の目的は達成された。
土壌系を活用した排水処理技術の研究―10年以上経過した土壌トレンチの処理能力調査―

「土壌を活用した雑排水トレンチ」は、大村湾沿岸地域の排水処理対策として公共下水道の準備期間に建設された。閉鎖性海域の富栄養化を押さえることを目的とした「雑排水トレンチ」への補助事業は、家庭の台所排水のみを対象にして安価で即効性を期待して実施されてきた。この補助事業は1985年から進められ、すでに初期の目的を終え多くのトレンチが廃棄された。しかし、それは公共下水道の区域外で現在も使用されている。我々は、建設後十年経過したトレンチの土壌をサンプリングし、そのリン酸吸収係数の低減状況を調べ、施設の耐用年数を検討した。調査の結果、当初のリン酸吸収係数は10001200程度であったが、10年以上経過する中で500程度に減少した。その耐用年数は5年7、8年であることが明らかとなった。土壌系を活用した排水処理は、佐賀県白石平野の数多く分布した「ユドネ」や、長崎県高来町の「ゼゼダメ」などの伝統的排水処理形式に見ることが出来る。本研究では、こうした「自然浄化機能を活用した伝統的排水処理形式」の事例調査も併せて実施した。木村湾沿岸に於ける生活排水処理対策は、(1)公共下水道(2)集落排水処理施設(3)合併処理浄化槽(4)雑排水トレンチ等、様々なレベルのメニューが用意され、それぞれに対し補助事業が実施されたきた。その中でも、雑排水トレンチは公共下水道等の本格的対策に先駆けた啓蒙的な意味合を持ちつつ取り組まれてきた。雑排水トレンチの補助事業は、家庭単位の台所排水のみを対象にして安価で即効性を期待して実施されたきた。十数年前から実施されすでに初期に目的を終え廃棄された施設が大半であるが、現在でも下水道処理区域外でも使用されている。今回の調査では、十年程度経過した施設を対象に処理に使用されている土壌をサンプリングしそのリン酸吸収係数の低減状況を調べた。調査の結果、当初のリン酸吸収係数10001200程度が200300程度まで低減しており、十年程度使用した本装置に於けるリン吸着処理はもはや期待できない状況にあることが明らかとなった。大村湾沿岸に於ける生活排水処理対策は、(1)公共下水道(2)集落排水処理施設(3)合併処理浄化槽(4)雑排水トレンチ等、様々なレベルのメニューが用意され、それぞれに対し補助事業が実施されてきた。平成11年度は生活雑排水処理施設(土壌トレンチ)の処理性能などの調査を主に実施し、リン吸着能力の耐用年限が5年7,8年であることを明らかにした。平成12年度は、当初予定していなかった「自然浄化機能を活用した伝統的排水処理形式」の事例調査((1)佐賀県のクリーク地帯の排水処理形式である「ユドネ」の分布とその処理のメカニズム(2)長崎県諌早湾沿岸T町の「井出」の伝統的水利用システム)を併せて実施した。かつて佐賀県のクリーク地帯に普及した「ユドネ」はクリークの水質保持のために不可欠の物であった。大村湾沿岸に普及した「土壌を用いた排水処理施設」は、この「ユドネ」のような自然条件を巧みに利用した伝統的排水処理形式の延長上に位置づけられる。「ユドネ」などの処理形式は現在ほとんど見ることが出来なくなったが、これらは今後の排水処理対策を考えていく上での重要な資料、もしくは一つの選択肢となりうると考える。
異種のフテロ元素の特性を活用したハイブリッド型不斉触媒の開発

本研究は異種のヘテロ元素の特性を活用したハイブリッド型不斉触媒を開発し新しい不斉反応の可能性を開拓するものである。まず、不斉配位子としてイミダゾール誘導体の合成を検討した。従来の触媒的不斉合成法は適用することができなかったので、光学活性な保護基の導入による不斉合成を検討した。光学活性な6-フェニルテトラヒドロピラニル基をイミダゾールの1位に導入後2位のリチオ化と続くアルデヒドへの付加により種々の(1-ヒドロキシアルキル)イミダゾール誘導体を合成した。また、光学分割による合成も行った。一方、ピラゾール誘導体の合成も検討し、軸不斉ピラゾール誘導体が得られた。これらの光学活性なヘテロ環化合物を不斉配位子として種々の反応に用いた。その結果、エノラートの不斉プロトン化でイミダゾール誘導体が60%eeを超える不斉誘起を示した。また、ランタノイド金属イオンを用いる不斉マイケル付加反応では軸不斉ピラゾール誘導体が有用で、50%ee以上の付加体が得られた。最後にサレンマンガン錯体と今回合成したヘテロ環化合物とのハイブリッド型不斉触媒による反応を検討した。サレンマンガン錯体は遊離のオレフィンの不斉エポキシ化の触媒として大変有用であることが筆者らの研究等により既に明らかになっている(有合化,53.940(1995))。この錯体に光学活性な軸配位子を導入すればさらに有用な反応になると期待される。そこで、まず光学活性な軸配位子による不斉誘起能を明らかにする目的で、アキラルなサレンマンガン錯体と種々の光学活性な軸配位子とのハイブリッド化を検討した。その結果、今回合成したイミダゾール誘導体を用いた時に初めて20%eeを超える光学純度のエポシキドが得られることが判明した。高くはないが不斉誘起が観測されたことは、反応機構などを考察するうえで大変重要である。また、不斉触媒反応における新しい方法論を提供するものとして実用上も有用であると考えている。
電磁超音波・渦電流マルチセンサによる構造健全性モニタリングに関する研究

単一の装置及びセンサ構成により同時に渦電流探傷信号と超音波探傷信号を得る電磁超音波-渦電流マルチセンサを提案している。本研究では、き裂のオンラインモニタリングに適した電磁超音波-渦電流マルチセンサセンサに関する研究を行うともに、電磁超音波-渦電流マルチセンサをオンラインき裂モニタリングに適用し、単体のセンサから超音波と渦電流に関する情報を同時に取得することが可能なシステムを構築する。本年度は、疲労き裂を評価するという課題に対応するために、超音波を探傷面に対して斜め方向に発生させることが可能な電磁超音波-渦電流マルチセンサを提案し、試作プローブを用いてオーステナイト系ステンレス鋼の疲労き裂に対する深さ評価を行った。本マルチセンサの超音波探触子としての機能については、反射波の信号強度に着目することによりき裂の深さを評価することが可能であることが示された。渦電流プローブとしても機能についても、信号の強度と位相に着目することによりき裂の深さを評価することが可能であることが示された。さらに、深さの異なる疲労き裂に対してモニタリングのシミュレーション実験を行い、渦電流信号と超音波信号について分析を行った。その結果、両者を用いることにより、マルチセンサの超音波モードを用いることにより、浅い裏側疲労き裂を評価することが可能であり、渦電流モードを用いることにより深い裏側疲労き裂を評価することが可能であることが示された。即ち、幅広いき裂深さに対してき裂深さを評価することが可能であることが示され、渦電流信号と超音波信号の相補性を確認した。本研究では、単一のセンサ構成により同時に渦電流探傷信号と超音波探傷信号を得る電磁超音波・渦電流マルチセンサを提案し、電磁場と音場からの情報を融合して構造物の健全性を評価するためのモニタリングに関する方法論を議論する。また、超音波探傷信号と渦電流探傷信号とのデータ融合とき裂形状の逆問題解析を検討し、き裂形状の推定の精度を高めることを試みる。このために、平成18年度は、コイル形状と磁石構造について、超音波の送受信と渦電流分布の2つの観点から検討し、内面/外面き裂や様々な深さのき裂の形状評価が可能なセンサ構造を数値解析により決定した。以上の検討結果を基に、モニタリング用EMAT/ECTマルチセンサを試作し、放電加工による模擬欠陥を導入したアルミニウム試験片を用いてモニタリング用EMAT/ECTマルチセンサの基本性能を確認した。EMAT/ECTマルチセンサを用いたモニタリングでは、超音波と渦電流から得られるそれぞれのき裂信号を適切に融合し、き裂形状評価の信頼性を高めることが重要である。本研究項目では、これまでに開発している超音波探傷信号および渦電流探傷信号のシミュレータを用いて、EMAT/ECTデータ融合手法とき裂形状推定法の検討を行った。具体的には、超音波信号と渦電流信号のパラメータ化を行い、超音波信号と渦電流信号とからなる探傷パラメータの情報の集約法を検討した。さらに探傷パラメータに基づいて、マルチフィジックス逆問題解析手法の検討を行った。
2つの鍵穴をもつ転写因子が父鍵と母鍵と結合することで胚の体軸が形成される

植物も動物と同様に、父親に由来する精細胞と、母親に由来する卵細胞の融合によって受精卵が作られ、これが胚として発生することで、子供の形作りが実現する。研究代表者はこれまで、シロイヌナズナにおいて、父母に由来する因子群が協力することで、受精卵の極性化や胚のパターン形成を適切に進行させることを見出した。しかし、これらの父母因子が胚発生の何を制御するかという分子機構は未だ不明である。そこで本研究では、これらの因子の下流で働く因子を網羅的に同定し、その役割を明らかにすることで、父母の協働効果が次世代の形作りを担う分子機構を明らかにする。
多方向不規則波浪の統計的性質に関する研究

本研究においては、多方向不規則波浪に対する波別解析法に着目し、個々の波の波高と波向の確率分布を理論的に導き、その結果を現地観測結果と比較して検証することを目的としている。今年度行った理論的考察は以下のごとくとりまとめられる。すなわち、まず多方向不規則波浪場について狭帯域スペクトルを仮定し、水面変動と水平2成分水粒子速度を対象として包絡線波形を用いた波別解析を行った。個々波の波向を水粒子速度の絶対値が最大になる方向と定義し、方向スペクトルのモーメントにより記述された(a)流速振幅・波向の結合確率密度、(b)波高・波向の結合確率密度、(c)波高・周期・波向の結合確率密度、を導いた。理論の妥当性を検証するため、1988年10月に茨城県大洗港において現地観測を行った。得られた波浪データをゼロダウンクロス法により波別解析し、理論地との比較を行った。さらに、平均波向的な個々波の波向の定義を用いて昨年度導いた理論値との比較をも行った。以上により、以下のような知見を得た。(1)流速振幅・波向の分布については理論曲線と実測値が定性的にはよく合うが、定量的には流速振幅の小さい領域では合うものの全体としての一致はあまりよくない。これに関しては実測データの流速振幅をどのように決定するかが重要な問題であり、今後検討の余地がある。(2)波高・波向の結合分布については、波向として平均波向的な定義を用いた場合、理論値と実測値の一致があまりよくなかったが、今年度用いた主波向的な定義によれば、両者の一致は極めて良好であった。この結果、主波向的な定義による理論を、工学的諸問題に応用していくことの妥当性が確かめられた。単一方向の不規則波浪の解析法にはテペクトル法と波別解析法とがあるが,多方向不規則波浪に対してはもっぱら方向スペクトル法が用いられてきた.本研究においては,多方向不規則波浪に対する波別解析法に着目し,個々の波の波高と波向の確率分布を理論的に導き,その結果を現地観測結果と比較して検証することを目的としている.ガウス過程の仮定に基いて,多方向不規則波浪を波物解析した場合の個々の波について,まず平均波向的な考え方から個々の波の波向を定義した.そして,波高と波向の結合分布の理論式を導いた.結果として得られた結合分布の式は,水面変動および水平2成分水粒子速度の分散および共分散から決定されるものとなっている.理論の検証を行う目的で,現地観測を行った.期待される波浪条件等を勘案して,茨城県大洗港周辺を選定し,昭和62年11月に観測を行った.あらかじめ設定された観測地点に,超音波式波高計および電磁流速計の組合わせを,船上より投入し,波と流れの同時観測を行った.観測前日までは風波で,波高が高かったが,当日は風もおさまり無事に観測データを得ることができた.得られたデータは,電子計算機を用いて処理を行い,理論値との比較・検討を行った.波高と波向の結合分布という2次元の確率密度分布を検証するに足る長時間の観測結果と比較したところ,理論値との一致は非常に良好であった.従って,本研究における理論的アプローチの妥当性が裏付けられたといえる.今後は主波向的な波向の定義についても検討を行うとともに,これらの理論の応用についても研究を進めていく予定である.これにより,波向に関する波浪の不規則性を,工学上の諸問題に合理的にとり入れる方法を提案することができる.本研究においては、多方向不規則波浪に対する波別解析法に着目し、個々の波の波高と波向の確率分布を理論的に導き、その結果を現地観測結果と比較して検証することを目的としている。
分子内二重ミカエル反応を利用する生理活性インドールアルカロイドの立体制御合成

不飽和アミドとα,β-不飽和エステル基とを合せ持つ化合物をトリアルキルシリルトリフロロメタンススルホネートと三級アミンとで処理すると分子内二重ミカエル反応が起って、橋頭位に窒素原子が存在する多環性化合物が生成することを明かにした。特にインドロキノリチジン合成に際してはインドールの窒素原子をトシル基で保護することが重要であった。この方法を利用して、β位にシリル基を持つ不飽和アミドの分子内二重ミカエル反応を行い,インドロキノリチジン体を立体選択的に合成した。これにエチル基を導入後、隣接するシリル基の影響によって立体化学の調整を行い、さらにエステル部を増炭してタカモニンの全合成を検討している。今後、さらに本合成ルートを応用してタカモニンの類縁体を立体異性体を含めて合成し、そのムスカリン受容体に対する拮抗活性を検討する計画である。さらに、著者が開発した上記の分子内二重ミカエル反応はベンゾキノリチジン骨格の効率的な合成法となることを、示すことができた。また、既知のデカリン体から誘導できる同一分子内にα,β-不飽和エノンとα,β-不飽和エステル基とを持つ化合物の分子内二重ミカエル反応によってラダリンAのジテルペン部位を一挙に合成する計画で研究を行っている。すでに、分子内ディールス・アルダー反応を用いて、目的とする化合物がが高選択的に得られる事を明かにした。
嗅覚受容体における匂い情報統合機構の解析

匂い物質の中には、生物に特定の情動やそれに付随した行動・生理応答を本能的に誘発するものが知られている。これら一連の匂い物質に対する応答がどのようなメカニズムによって誘発されているのか、これまで明らかになっていることは少ない。本研究では、これら応答の起点となる、末梢における匂い物質の受容体の役割を明らかにすることを目指した。このために、特定の行動・生理応答を誘発することが知られている匂い物質の受容体スクリーニングで得られた受容体候補群を、マウスを用いてin vivoの機能解析を行った。この結果、恐怖情動を誘発する匂い物質を提示した際に引き起こされる恐怖行動が、複数種の受容体遺伝子ノックアウトマウスにおいて低下する傾向が観察された。また、神経活性化マーカーであるc-fosの発現を調べたところ、恐怖誘発匂い物質の暴露時に、受容体発現神経細胞でc-fosの発現が観察される受容体を明らかにした。さらに、この受容体発現細胞の軸索の投射領域近傍においてもc-fosの発現上昇が見られた。一方、受容体ノックアウトマウスにおいてはこのc-fos発現誘導が低下していた。この受容体ノックアウトマウスでは、この他にも恐怖情動に関与することが知られている脳中枢領域においても、恐怖誘発匂い物質の暴露時に発現誘導されるc-fos陽性細胞が減少していた。これらのことから、受容体の下流で恐怖応答の発現に重要な脳領域が機能していることがわかってきた。本年度は、in vitroのスクリーニングで同定された、生理活性を持つ匂い物質と結合する嗅覚受容体のin vivoにおける解析を試みた。このためにまず、同定された受容体を発現する嗅神経細胞を蛍光標識するために、BACトランスジェニックマウスの作製を行った。このトランスジェニックマウスにおいては、CFP蛍光タンパク質およびCreリコンビナーゼが目的受容体とポリシストロニックにコードされ共発現することが期待される。これまでに6種類のF0マウスが得られ、野生型マウスと掛け合わせたのちにF1マウスの解析を行った。このうち2系統においてCFPの発現が観察され、嗅神経細胞の投射先である嗅球において糸球体への軸索の投射が見られた。しかしながら、嗅球におけるCFP蛍光が非常に弱く、投射糸球体を簡便に同定することは困難であった。そこで次に、この匂い物質の構造類似体であり、かつマウスにおいて恐怖情動を惹起する匂い物質を用いた解析を試みた。この恐怖誘発物質の機能的な受容体であることが示唆されていた4種類の嗅覚受容体のノックアウトマウスを作製し、恐怖応答に変化が見られるかを調べることにした。ノックアウトマウスの作製にはCRISPR/Cas9システムを用い、4種類の嗅覚受容体をターゲットとしたガイドRNAを同時に導入した。この結果、3種類の嗅覚受容体においては遺伝子の前半部においてフレームシフトを誘発する変異が確認された。現在、これらマウス同士を掛け合わせることで、ホモに変異を持つ嗅覚受容体のノックアウトマウスの作製を試みている。嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞を標識するためのトランスジェニックマウスの作製を行い、複数系統得ることができた。しかし、これら嗅神経細胞の投射先である嗅球上の糸球体の同定を容易に行うことが難しかった。嗅覚受容体のノックアウトマウスの作製については、複数のガイドRNAを用いた方法は順調に進んでいるが、現在のところ目的とした4種類のうち3種類の受容体の変異マウスのみが得られている。前年度の研究により、恐怖情動を誘発する匂い物質の受容体候補である、3種類の嗅覚受容体遺伝子に変異を持つマウスを作製した。本年度はこれらマウスを掛け合わせ、受容体遺伝子にホモで変異を持つ3種類のノックアウトマウスを作製した。次にこれらノックアウトマウスを用いて恐怖行動の解析を行った。この結果、2種類の嗅覚受容体のノックアウトマウスにおいて、恐怖誘発物質に暴露時の恐怖行動が対照群のマウスよりも低下する傾向が観察された。さらに、この恐怖誘発物質の受容情報の伝達機構を詳細に解析するために、上記に示した3種類以外の受容体候補、およびその受容体と相同性を持つ遺伝子との2重ノックアウトマウスを作製した。また、これら受容体が発現する神経細胞を特異的に、薬理的にシステマティックに破壊したマウスの作製も行った。これらマウスを用いて恐怖誘発時の行動・生理応答を解析した結果、恐怖誘発物質暴露時の恐怖応答が著しく低下することがわかった。そこで、これら受容体が発現する神経細胞を、特定の脳領域に薬剤を注入することで、領域特異的に破壊する実験を行った。この結果、領域特異的な神経破壊を行ったマウスでは対照群のマウスと比較し、恐怖誘発物質暴露時の恐怖行動や恐怖時に誘発される生理応答に有意な低下が見られた。以上のことから、本研究で用いた恐怖情動を誘発する匂い物質の受容体、および恐怖応答の発現に重要な神経細胞群が存在する脳領域の候補について新たな知見を得ることができた。恐怖応答を誘発する物質の機能的な受容体の同定が進んだ。また、恐怖応答の発現に重要な神経細胞群の同定および解析が進展し今後の研究の足掛かりとなることが期待される。

このために、特定の行動・生理応答を誘発することが知られている匂い物質の受容体スクリーニングで得られた受容体候補群を、マウスを用いてin vivoの機能解析を行った。この結果、恐怖情動を誘発する匂い物質を提示した際に引き起こされる恐怖行動が、複数種の受容体遺伝子ノックアウトマウスにおいて低下する傾向が観察された。また、神経活性化マーカーであるc-fosの発現を調べたところ、恐怖誘発匂い物質の暴露時に、受容体発現神経細胞でc-fosの発現が観察される受容体を明らかにした。さらに、この受容体発現細胞の軸索の投射領域近傍においてもc-fosの発現上昇が見られた。一方、受容体ノックアウトマウスにおいてはこのc-fos発現誘導が低下していた。この受容体ノックアウトマウスでは、この他にも恐怖情動に関与することが知られている脳中枢領域においても、恐怖誘発匂い物質の暴露時に発現誘導されるc-fos陽性細胞が減少していた。これらのことから、受容体の下流で恐怖応答の発現に重要な脳領域が機能していることがわかってきた。3種類の嗅覚受容体のノックアウトマウスを掛け合わせを行うことで作製する。その後、恐怖を惹起する匂い物質に対するノックアウトマウスの行動解析を行うことで、匂い物質と嗅覚受容体の機能的な結び付けを試みる。1種類の匂い物質に対して複数の嗅覚受容体が結合することも知られていることから、必要があれば2重あるいは3重の受容体ノックアウトマウスの作製も試み、生理活性を持つ匂い物質における嗅覚受容体のコーディングロジックの解明も目指す。本研究で用いた恐怖応答を誘発する物質の構造類似体を用い、それら類似体が誘発する生理応答と誘発の原因となる受容体を明らかにすることで、複数の匂い物質と受容体およびその下流で支配される生理応答の関係性を解析する。また、匂い物質による恐怖応答に伴って誘発される様々な生理現象における受容体の役割の解明も目指す。
廃棄物から貴金属・希土類元素を分離するための不活性バイオ由来材料の設計及び製造

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。研究環境が分担者の希望に沿わなかったため研究が当初の計画どおりに進まなかった。今後は研究代表者を交替し、分担者の希望に沿った実験設備や研究環境も有する部署に移動し研究を遂行する。