hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
冠動脈バイパス術後のリハビリテーションによるインスリン抵抗性改善効果に関する研究

冠動脈バイパス術(CABG)後患者を対象にして、運動療法を主体とした包括的心臓リハビリテーションを約2週間実施し、短期的なインスリン抵抗性改善効果について評価した。次の項目が結論として導かれた。1)インスリン抵抗性指標として臨床現場で可能な検査は75gOGTTにおける120分での血糖値ならびにインスリン値である。2)高インスリン血症を認める症例は、若年で血中中性脂肪が高値かつBMI(体格指数)が大の傾向にある。3)入院中の包括的心リハビリテーションにより、高インスリン血症は改善傾向を示すものの十分ではなく、退院後の外来回復期リハビリテーションが重要と思われる。4)入院中における心臓リハビリテーションの運動強度はAT(anaerobic threshold)レベルが安全かつ有用と考えられた。5)血糖値改善と入院中の身体活動量は有意な相関を認めたことから、自転車エルゴメータートレーニング以外にも積極的に歩行を心がける必要がある。冠動脈バイパス術(CABG)後患者において、運動療法を主体とした急性期包括的心臓リハビリテーションによるインスリン抵抗性改善効果について検討した。対象は14名(平均年齢60.6±10.4才)のCABG後患者(男性:女性11:3)である。対象は術後7日から10日(病棟内歩行可能となった時点)に心肺運動負荷試験(CPX)と75gOGTTを実施した。CPXは自転車エルゴメーターによる毎分15ワットのランプ負荷を症侯限界性にて行い、同時に血中乳酸濃度も測定し視覚法にてLT(lactate threshold)を求めた。そしてAT(anaerobic threshold)はV-slope法にて決定した。LTは698±152ml/minで、ATは735±135ml/minとLT値の方が低い傾向にあったが有意ではなく両者の相関は良好(r=0.94,p<0.0001)であった。対象者はATレベルの有酸素トレーニングを一回1530分間一日2回、14.1±5.4日間実施した。トレーニング終了時には同様のCPXと75gOGTTを行いトレーニング前後について比較した。PeakV02は14.4±2.7から16.5±2.9ml/min/kgと有意に増加したが(p<0.01)、ATは10.2±1.9から10.9±1.9ml/min/kgと有意な増加は認められなかった。また、脂質代謝においては総コレステロール、中性脂肪、HDLコレステロールともに有意な改善は認められなかった。一方糖負荷試験において、120分値のインスリン濃度が65μU/ml以上のインスリン抵抗性ありと判定された者が5名男性患者において見られ、運動療法によって糖代謝の改善が認められた。今後は更に症例数を増やし、CABG後患者の回復期運動療法についてインスリン抵抗性と日常身体活動量に注目し検討する予定である。昨年に引き続き冠動脈バイパス術(CABG)後患者において、運動療法を主体とした包括的心臓リハビリテーション(心リハ)によるインスリン抵抗性改善効果について検討した。本年度の対象は16名(平均年齢62.4±7.8才)の男性患者である。対象は術後病棟内歩行可能となった時点に心肺運動負荷試験(CPX)と75gOGTTを実施した。その後AT(anaerobic threshold)レベルの有酸素トレーニングを一回1530分間一日2回、14.7±5.6日間実施した。PeakVO2は13.7±2.3から14.8±2.9ml/min/kgと有意に増加したが(p<0.01)、ATは9.6±1.9から9.4±1.2ml/min/kgと増加が認められなかった。また脂質代謝においては有意な改善は認められなかったが、120分値のグルコース濃度(BS120')の改善が認められた。回復期までフォローできた患者については120分値のインスリン濃度(IRI120')ならびにBS120'が改善した。IRI120'が65μU/ml以上の高インスリン血症と判定された者が5名おり、そうでない患者と比べ明らかに若年であった(55.0±3.9 vs 65.8±6.7才:p<0.01)。次に日常活動中の自律神経活動を反映する指標として24時間の平均心拍数(HR)に着目し、心リハ中の身体活動量との関連性を検討した。

上記患者のうち6名を対象に身体活動量をアクティブトレーサーAC301(ACT : GMS社)を用いて測定し、上下、左右、前後方向の総合ベクトルの24時間平均値(ACT平均値)を求めた。また同時に24時間の心拍データを記録し、心拍データ解析ソフトMemCalcシステム(諏訪トラスト社)にて平均RR間隔(RR)を求めた。その結果、ACT測定値は心リハ前後で増加傾向を認め、(50.2±41.7→70.1±31.2G)、平均RR間隔(RR)は有意な延長を認めた(679.8±64.1→775.1±58.9ms : p<0.01)。ACT測定値の心リハ前後の変化量とRRの変化量との間に有意な正相関を認めた(r=0.884:p<0.05)。以上よりCABG後患者において心リハ中の身体活動の増加はRRの延長と関連していることが示唆された。CABG後の心臓リハビリテーション(心リハ)におけるインスリン抵抗性改善効果について、本年度はコントロール群について検討した。対象は8例の男性患者であり、平均年齢は64.0±6.5才で平均バイパス枝数は3.8本であった。昨年同様に病棟内歩行が可能となった時点で心肺運動負荷試験(CPX)を行いpeak VO2とAT(anaerobic threshold)を決定した。対象者はAT(酸素摂取量)の80%以下に相当するトレーニング強度(20.1±8.8ワット)の自転車こぎを一日2回(1回30分)14.0±4.6日間実施し再度CPXを行った。また運動療法前後に75gOGTTと血中脂質について測定した。その結果、運動耐容能については運動療法前後に有意な差を認めず、またインスリン抵抗性指標も改善しなかった。入院中の日常活動量は5184±2680歩/日であった。回復期における非監視型在宅運動療法については、運動耐容能は増加傾向を示したものの有意ではなかった。運動後の心拍減衰応答(T30)は心疾患患者の予後予測指標として有用であり、心リハにより改善する。今回はT30の改善について、アクティブトレーサーを用いて安静時の自律神経活動が影響しているかどうか検討した。その結果T30の運動療法前後の変化量はHFの変化量と関連を認めず、LF/HFの変化量と相関傾向を認めた(r=0.646)。以上よりCABG後患者のT30の改善は安静時の交感神経活動に影響を受ける可能性が示唆された。*3年間の補助金交付期間中で得た結論は以下のとおりである。CABG後患者におけるインスリン抵抗性改善のための包括的心臓リハビリテーションにおいて、1)インスリン抵抗性指標として臨床現場で可能な検査は75gOGTTにおける120分での血糖値ならびにインスリン値である。2)高インスリン血症を認める症例は、若年で血中中性脂肪が高値かつBMI(体格指数)が大の傾向にある。3)入院中の包括的心リハにより、高インスリン血症は改善傾向を示すものの十分ではなく、退院後の外来回復期心リハが重要と思われる。4)入院中心リハの運動強度はATレベルが安全かつ有用と考えられた。5)血糖値改善と入院中の身体活動量は有意な相関を認めたことから、自転車こぎ以外にも積極的に歩行を心がける必要がある。
RNP複合体形成による母性RNAの局在化・翻訳の時空的制御機構

胚発生の開始には,卵形成の過程で合成され卵内に貯蔵されている母性因子が重要である。これら母性因子の多くは,mRNAとして卵内の特定の領域に局在化し,局在化した領域でのみ時期特異的に翻訳され機能する。このような母性RNAの時間的・空間的制御には,母性RNAとRNP複合体を形成するタンパク質が重要である。私たちは,ショウジョウバエ卵形成過程において,Me31Bが母性RNAの輸送と翻訳とを連携させているRNP複合体の構成タンパク質であることを明らかにしてきた。本研究では,Me31B複合体の新規構成タンパク質の同定とその分子機能の解析を行った。抗Me31B抗体を用いた免疫沈降により,卵巣抽出物よりMe31B複合体を精製した。次に,共沈するタンパク質についてマススペクトロメトリーを用いて同定した。その結果,翻訳開始因子eIF4EとCupタンパク質が,Me31B複合体の構成タンパク質であることが明らかになった。次に,RNase存在下における免疫沈降実験によりMe31B-eIF4E, Me31B-Cup間の結合はRNA依存的であることを明らかにした。一方,eIF4E-Cupの結合はRNA非依存的であった。さらに,GST pull down assayにより,eIF4EとCupはin vitroにおいて直接結合できることを明らかにした。また,cup突然変異体においては,oskar mRNAをはじめとする複数の母性mRNAがprematureに翻訳されていることを見出した。以上の結果は,(1)Cupがさまざまな母性RNAの輸送・局在化過程における翻訳制御に重要な役割を持っていること,(2)Cupを介した翻訳抑制が翻訳開始因子であるeIF4Eの機能を制御することにより行われていることを示唆していると考えられた。胚発生の開始には,卵形成の過程で合成され卵内に貯蓄されている母性因子が重要である.これら母性因子の多くは,mRNAとして卵内の特定の領域に局在化し,局在化した領域でのみ時期特異的に翻訳され機能する.このような母性RNAの時間的・空間的制御には,母性RNAとRNP複合体を形成するタンパク質が重要である.しかし,母性RNP複合体を構成するタンパク質やその機能ついては不明である.私たちは,ショウジョウバエの卵形成過程において,Me31Bが,母性RNAの輸送と翻訳とを連携させている,RNP複合体の構成タンパク質であることを明らかにしてきた.本研究では,Me31Bと複合体を形成している新規タンパク質の同定を行った.Me31Bをベイトとしたyeast two-hybrid法により,ショウジョウバエ卵巣由来のcDNAライブラリーをスクリーンした.その結果,最も高頻度に単離されたクローン群は,生殖質形成に中心的な役割を持っているOskarであった.ショウジョウバエの生殖質形成は,卵母細胞後極でoskar mRNAが翻訳されることによって開始される.そして,Oskarタンパク質が核となり,そこに数多くの母性RNAが局在化して翻訳されることにより生殖質が形成される.しかし,Oskarタンパク質にはRNA結合活性が認められないことから,どのようにしてOskarタンパク質が母性RNAの局在化と翻訳に関わっているのかについてはわかっていない.Me31Bはoskar mRNAの翻訳が開始される時期に一過的に卵母細胞後極に局在する.以上の結果から,卵母細胞後極で翻訳されたOskarにMe31Bが結合することにより,各種母性RNAの後極への局在化が開始されると予想された.すなわち,Me31Bは,輸送ばかりでなく,母性RNAの局在化,あるいは局在化の維持の過程にも関わっている可能性が考えられた.胚発生の開始には,卵形成の過程で合成され卵内に貯蔵されている母性因子が重要である。
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの糖鎖多様性と網膜軸索路形成における機能特異性

ニワトリ網膜視蓋投射において終脳由来コンドロイチン硫酸(CSs)は網膜神経節細胞の軸索伸長を抑制性に制御する。CSsはAからEのユニット構造の組み合わせによる多様な構造を呈する。MO-225モノクローナル抗体によって認識されるCSsは(1)胚の網膜軸索路を取り囲むneuropilに高密度で存在し、(2)網膜軸索路を取り囲むneuropilに接して視索の深層を走行する網膜軸索の細胞膜外表面に提示されていた;MO-225によって認識される特定のCSが網膜軸索路の境界の設定と、視索内部に認められる発生段階に依存した網膜軸索の層状の走行(chronological sorting、初期に走行する軸索は視索の深層を、後期に走行する軸索は視索の浅層を走行する)に関わることを示唆した。CSの構造多様性を解析するために、AからEユニットをそれぞれ濃縮した脂質誘導体(CSs-PE)を疎水的に吸着させたビーズ(CSビーズ)を作成した。CSビーズのフローサイトメトリーを行い、MO-225の抗原特異性を検討したところ、D, E,またはCユニットを豊富に含むCSビーズに強い結合を示し、これらを豊富に含むCSが網膜軸索路形成とchronological sortingに関わることを示唆した。それぞれのCSビーズを培養基質上に散布し、網膜成長円錐がCSビーズに遭遇する際の行動をタイムラプス観察した。CおよびDユニットを多く含むCSビーズは成長円錐の行動に大きな影響を与えなかったが、他のユニットを多く含むビーズについては検討中であるが、CSに対する成長円錐の感受性には多様性が有るようだ。CSsに対する成長円錐の多様な感受性は視索における網膜軸索のchronological sortingと関係すると考えられる。クジラやサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸(CS)標品を用いて培養基質上にスポットを作成し、軸索および成長円錐がスポットへ遭遇する際の振る舞いの違いから、特定のユニットを含むCSと軸索侵入阻止活性の関連に注目して実験を行った。スポットを観察するために蛍光色素でラベルされたdextranまたはalbuminを用いているが、しかしながら詳細な確認実験の結果、(1)デキストラン蛍光色素の非特異的な効果と(2)ラミニンの非特異的な効果、を無視できないことが明らかになった。(1)ある種のデキストラン蛍光色素(rhodamin-dex, alexa594-dex)にはそれ自身で軸索侵入を拒む性質があり、他種のデキストラン蛍光色素(alexa488-dex)にはそのような性質はない。しかしながらalexa488-dexはコンドロイチン硫酸の軸索侵入阻止効果を打ち消してしまう作用がある。そのためデキストラン蛍光色素を用いることは得策ではなかった。(2)代替としてタンパク質と蛍光色素をコンジュゲートしたもの(rhodamin-albumin)を検討した。rhodamin-albuminには軸索侵入阻止効果はないが、十分な濃度をスポットの標識として用いるとラミニンの吸着を阻害してスポット内のラミニン密度が下がった。その結果軸索侵入阻止効果が、コンドロイチン硫酸に相関するものなのか、ラミニンの密度減少に逆相関するものなのかの判別が困難になる。これらは「標識したスポットを培養基質上に作製する」際に付随する困難と考えられた。これらを取り除くために実験系の再設計を行っている。ラミニンからなる一様な培養基質を作成した上にCSを吸着したビーズをばらまき、ビーズに遭遇した成長円錐の行動をタイムラプスで観察する工夫をしている。

MO-225モノクローナル抗体によって認識されるCSsは(1)胚の網膜軸索路を取り囲むneuropilに高密度で存在し、(2)網膜軸索路を取り囲むneuropilに接して視索の深層を走行する網膜軸索の細胞膜外表面に提示されていた;MO-225によって認識される特定のCSが網膜軸索路の境界の設定と、視索内部に認められる発生段階に依存した網膜軸索の層状の走行(chronological sorting、初期に走行する軸索は視索の深層を、後期に走行する軸索は視索の浅層を走行する)に関わることを示唆した。CSの構造多様性を解析するために、AからEユニットをそれぞれ濃縮した脂質誘導体(CSs-PE)を疎水的に吸着させたビーズ(CSビーズ)を作成した。CSビーズのフローサイトメトリーを行い、MO-225の抗原特異性を検討したところ、D,E,またはCユニットを豊富に含むCSビーズに強い結合を示し、これらを豊富に含むCSが網膜軸索路形成とchronological sortingに関わることを示唆した。それぞれのCSビーズを培養基質上に散布し、網膜成長円錐がCSビーズに遭遇する際の行動をタイムラプス観察した。CおよびDユニットを多く含むCSビーズは成長円錐の行動に大きな影響を与えなかったが、Eユニットを多く含むCSビーズはおよそ一割の成長円錐の大きな行動変化を引き起こした;しかしながら、およそ九割の成長円錐に大きな変化を引き起こさなかった。Eユニットを多く含むCSに対する成長円錐の感受性には多様性が有り、視索における網膜軸索のchronological sortingと関係すると考えられる。
ヒト肝細胞キメラマウスと次世代シーケンサーを用いた肝炎ウイルスゲノムの解析

直接作用型抗ウイルス薬(DAAs)は今後のC型慢性肝炎の中心的役割を担うものと期待され開発されてきたが耐性ウイルスの出現が問題となる。HCV感染ヒト肝細胞キメラマウスを用いてDAAの組み合わせと治療効果、また次世代シーケンサーを用いて耐性変異の出現について解析した。ヒト肝細胞キメラマウスにDAAの標的となる各領域に変異を入れたHCVクローンやそれらの変異を組み合わせたHCVクローンを感染させDAAs投与を行った。その結果今回検討した3種類すべてのDAAの組み合わせで耐性変異の出現が見られた。3者併用療法では予めこれらの耐性変異が治療前に存在するかどうか考慮する必要があることが明らかとなった。C型慢性肝炎に対する新規Directantiviral agents(DAA)の認可を控え本研究ではDAA治療を施行した患者血清、ヒト肝細胞キメラマウスや次世代シーケンサーを用いてウイルス側因子、宿主側因子を詳細に検討しB型、C型慢性肝炎に対する治療法開発のためのシーズを探索することとした。平成25年は得られた患者血清由来の次世代シーケンサーデータ、ヒト肝細胞キメラマウス血清由来の次世代シーケンサーデータを解析し両者を比較することによりウイルス側の治療抵抗性因子を検討すること、宿主側の治療抵抗性因子と合わせて新規治療方法の標的となり得るウイルスゲノム領域、治療効果予測因子を探索することを予定していた。本年度もほぼ予定通り進行し、本研究の成果は、American Journal of Gastroenterologyに掲載された。またこの研究成果を、アメリカ(ボストン)にて開催されたAmerican Association Study for the Liver Diseasesや日本肝臓学会総会に於いて発表した。本研究のヒト肝細胞キメラマウスと感染性クローンを用いたリバースジェネティクスを利用した研究は世界的にみても例がなく当研究室でしか行うことはできない。また、DAA治療を施行した患者血清でのデータとその患者血清をヒト肝細胞キメラマウスに接種してDAAを投与した血清データを比較することで宿主の免疫反応をほぼ完全に排除しウイルス側の変異のみに焦点を当てることが可能となりウイルス側の因子を解析するうえでは理想的な環境となる。本研究成果は論文掲載、学会発表を通して世界中の他施設の研究者からは、新規抗ウイルス薬の認可に先駆けて実際の治療を想定した研究デザイン、適切なモデルを用いた点で高く評価されている。本年度、本研究ではdirect acting agents (DAAs)治療を施行した患者血清中のC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムやB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノム、さまざまな肝細胞を移植しさまざまなヒトゲノムを背景とするヒト肝細胞キメラマウスを作製し、それらのマウスに治療前の患者血清を接種してあらゆるヒトゲノムとウイルスゲノムの組合せで作製したHCV感染ヒト肝細胞キメラマウスのDAA治療中の血清に含まれるHCVゲノムをイルミナ社の次世代シーケンサーGenome AnalyzerIIxを用いて解析した。さらに当研究室でクローニングした感染性HCV genotype 1bの感染性クローンを感染させることで宿主の免疫反応をほぼ完全に排除した実験系でウイルスゲノムのquasispeciesの変化を解析するため次世代シーケンサー用のサンプル調製を行った。キメラマウスの系と患者血清の系を比較することで耐性変異導入への宿主の免疫反応の関与を解析し現在DAA治療前にその薬剤の耐性出現率を予測可能かどうかさらに解析中である。さらに現在施行中の日本人に最も多く難治性でDAAの標的であるHCV genotype 1bの感染性クローンを用いた実験も患者血清、キメラマウスの系と統合することでHCV患者ひとりひとりに合った治療方法の開発に向けてさらに解析する予定である。また、キメラマウスの系におけるHBVゲノムと各種核酸アナログとの関連についても来年度解析する予定である。当初の予定では、本年度、direct acting agents (DAAs)治療を施行した患者血清中のC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムや、さまざまな肝細胞を移植しさまざまなヒトゲノムを背景とするヒト肝細胞キメラマウスを作製し、それらのマウスに治療前のHCV患者血清を接種しあらゆるヒトゲノムとウイルスゲノムの組合せでHCV感染ヒト肝細胞キメラマウスを作製、さらに感染性HCV genotype 1bの感染性クローンを感染させたヒト肝細胞キメラマウスを作製し、これらのマウスに対して各種DAAを投与しその治療中の血清を用いて次世代シーケンサーよるHCVゲノムデータを得ることであった。患者血清、キメラマウスの系のデータ取得は終了し、感染性クローンの系は現在再検討となったサンプルを解析中でありおおむね予定通り進行していると考えられる。来年度は、次世代シーケンサーにより得られた患者血清、キメラマウスの系、感染性クローンのデータを解析しDAA治療効果予測、宿主側ウイルス側の両者の治療抵抗性因子を組み合わせた治療方法の枠組みについて検討し論文を作成、国内外の学会等で発表する。

既に得られた患者血清、キメラマウスの系のデータは現在解析中であり感染性クローンの系についても順次データ解析を行う。またデータ不良や次世代シーケンサーの新規の変異が出現した場合などの結果を受けて新たに解析が必要となったサンプルでの解析も行う。研究経費は次世代シーケンサーサンプル調製のための試薬購入に充てる。
超選択的デリバリー短寿命α線を用いた胃癌腹膜播種内照射療法の実験的検討

免疫competentであるC57BL/6マウス胃癌腹膜播種モデルを用い、短寿命α線放出核種である211Atを研究分担者が開発した超選択的ドラッグデリバリーシステムを用い投与し、胃癌腹膜播種に対しα線による内照射療法を検討し、その有効性を確認すると同時にイメージングを行う研究である。また、ヨードトランスポーターを強制発現させたMSCを用い、MSCのCAF化を利用し、ヨードトランポーターによる131-I, 211-Atのトランスポートによる内照射療法の有効性を確認する研究である。
露出象牙質の微細形態を考慮した歯頚部磨耗症の治療法に関する研究

歯頚部磨耗症の発症頻度は高いにもかかわらず象牙質の微細形態は明確ではなく、その修復法についてもレジン修復が多用されているが辺縁封鎖性等に問題点があるのが現状である。本研究では、歯頸部磨耗症象牙質の微細形態を検索するとともに、その修復法についても検討した。象牙質生検用中空ダイヤモンポイントを用いて歯頸部磨耗症象牙質より、直径約0.8mm、高さ約0.8mm生検試料を採取し、走査型電子顕微鏡(SEM)にて試料表面を観察した結果、管間象牙質は極めて滑沢で、大多数の象牙細管が微小石灰化物質により封鎖されていた。その封鎖細管数の全細管数に占める割合は平均して93.6%であり、また開口象牙細管の平均直径は1.3mumであった。この生検試料表面に2種類のボンディングシステム、KB-110(クラレ、KB)およびインパーバボンド(松風、IB)のプライマーをそれぞれ塗布し、SEMにて観察した。IBプライマー処理した試料表層では、開口象牙細管がほとんど存在せず管間象牙質に微小タグが認められる領域と、スメア-層に類似した被覆層が出現する領域とが認められた。KBプライマー処理した場合、70%以上の細管が開口している領域と、プラグ状構造物が細管内に出現している領域のほかに、被覆層が出現している領域も存在していた。プライマー処理方法は、各システムにより大きく異なっており、IBプライマーでは磨耗象牙質本来の微細形態を保持して管間象牙質に微小タグが認められたのに対して、KBプライマーではその微細形態が大きく変化し象牙細管開口領域のほか細管内腔に新しい反応生成物が出現する領域が認められた。
NMDAレセプターの大量生産とその三次元構造解析

1バキュロウイルス発現系によるレセプターの大量生産の試みまず、NMDAレセプター遺伝子を転移ベクターpBlueBacHisに組み込んだ。選別したウイルスを非感染細胞Sf9に感染させ、経時的に(2-10日)産生したタンパク質を電気泳動したところ、目的の105kDa以上のところにクマシ-染色される特異的なバンドは観察されなかった。2大量発現のためのベクターの検証すでに大腸菌で大量生産がうまくいっている蛋白質であるP糖蛋白質C末端部分の生産を指標に発現量をみたところ、pBlueBacHisをもちいると大腸菌での発現の約1/1000ときわめて発現量が低いことがわかった。発現プロモータが強力なポリヘドリンプロモータであっても、翻訳開始部位の構造の違いによって発現量が低下することが指摘されており、本ベクターはそのために発現量が低下している可能性が高い。以上の結果より、翻訳開始部位が大量発現に適した構造の遺伝子の下流に目的の遺伝子を融合させるかたちで発現させるのが有効であると考えた。研究の過程で、P糖蛋白質C末端部分中のメチオニンを翻訳開始メチオニンとした場合にP糖蛋白質C末端部分の高発現がみられたので、P糖蛋白質C末端部分中のメチオニンを翻訳開始メチオニンとした転移ベクターを作製した。これを用いて発現を試みている。3他の大量発現系の利用別の大量発現系であるメタノール資化菌(1ミリリットルの培養液につき数ミリグラムの生産が多数報告されている)によるNMDAレセプターの発現を試みている。
免疫組織の再構築と免疫監視の修復・強化

これまでに、リンパ節組織の構築を行い、その構造が自然のリンパ節に類似した抗原特異的抗体産生能を有する組織を人工的に構築する方法を確立した。本年度ではさらに改良を行ない、免疫組織構築と免疫反応を時空間的に調べるための新しい系として、また、将来的には感染症、がん、免疫不全状態の治療に応用する事も可能であることを示した。我々の人工リンパ節を非免疫状態の個体、あるいは免疫不全症(SCID)の個体に移植し抗原で免疫すると、抗原特異的抗体産生系において、正常リンパ節では到達し得ないほどの強い二次免疫反応を誘導出来た。このような高効率の免疫機能をもった人工リンパ節の成功は世界で初めてである。また、T細胞の記憶細胞、B細胞の記憶細胞が人工リンパ節内に濃縮されるという結果が得られた。このことは、人工リンパ節において強い二次免疫反応が急速に引き起こされる理由の一つと考えられた。一方、人工リンパ節を構築する際にTH1型の免疫反応を誘導するような条件下で人工リンパ節を構築すると抗原特異的にIFNγを効率に産生する組織を構築出来、担がんマウスに移植すると強い抗腫瘍効果を示した。これらの結果は、我々の人工リンパ節が将来、ヒトの免疫不全症、重症感染症、エイズなどの難治性感染症、あるいはがんの免疫療法に応用出来る可能性を示している。我々の人工リンパ節は容易に移植、脱着することが出来ることからも将来の臨床応用の可能性を示唆している。一方、このような装置は免疫反応を3次元構造物で解析することを可能にする。またリンパ組織の分化、構築の機構、免疫記憶、免疫抑制、免疫監視機構などの研究を行うことが可能となる。現在、その免疫細胞系がほぼ100%ヒト由来の細胞から構成されているヒト化マウスを用いて、ヒト型の人工リンパ節、リンパ組織の構築についても研究を開始した。我々は、リンパ節の正常な組織構築と機能に関与する因子の役割を詳細に調べるための新しいシステムとして、また、将来的には免疫不全状態の治療に応用する事を目的として、人工的なリンパ節組織の構築を行い、その構築に成功した。「人工リンパ節組織」構築には必須の3要素があるという仮定の下に研究を進め、ストローマ細胞と生体適合性高分子材料を組み合わせてマウスに移植することにより、抗原特異的抗体産生能を有する、自然のリンパ節に類似した組織を人工的に構築する方法を確立した。この人工リンパ節を非免疫状態の個体、あるいは免疫不全症(SCID)の個体に移入すると強い二次免疫反応を誘導することが出来た。このような機能をもった人工リンパ節の成功は世界で初めてである(Nature Biotechnology, December,2004)。このことは、我々の人工リンパ節が将来、ヒトの免疫不全症、重症感染症、エイズなどの難治性感染症、あるいはがんの免疫療法に応用出来る可能性を示している。今後はリンパ組織の分化、構築の機構、免疫記憶、免疫抑制、免疫監視機構などの研究を行う。このような装置は障害された免疫監視機構の機能の修復、強化に応用出来ると考える。免疫組織構築と免疫反応を三次元的、時間的に調べるための新しいシステムとして、また、将来的には感染症、がん、免疫不全状態の治療に応用する事を目的として、人工的なリンパ節組織の構築を行い、その構造が自然のリンパ節に類似した抗原特異的抗体産生能を有する組織を人工的に構築する方法を確立した。

この人工リンパ節を非免疫状態の個体、あるいは免疫不全症(SCID)の個体に移入すると強い二次免疫反応を誘導することが出来た。このような機能をもった人工リンパ節の成功は世界で初めてである。特に免疫不全マウスにこの人工リンパ節を移植して抗原刺激すると、通常のマウスを過免疫した場合に比べて50-100倍の強い抗体産生が誘導されることがわかった。また、T細胞の記憶細胞、B細胞の記憶細胞が人工リンパ節内に濃縮されるという結果が得られた。このことは、我々の人工リンパ節が将来、ヒトの免疫不全症、重症感染症、エイズなどの難治性感染症、あるいはがんの免疫療法に応用出来る可能性を示している。一方、このような装置は免疫反応を3次元構造物で解析することを可能にする。今後はさらに一層、改良を重ねてより実用的な装置の構築を行う予定である。またリンパ組織の分化、構築の機構、免疫記憶、免疫抑制、免疫監視機構などの研究を行う。現在、その免疫細胞系がほぼ100%ヒト由来の細胞から構成されているヒト化マウスを用いて、ヒト型の人工リンパ節、リンパ組織の構築についても研究を開始した。将来、このような装置は障害された免疫監視機構の機能の修復、強化に応用出来ると考える。これまでに、リンパ節組織の構築を行い、その構造が自然のリンパ節に類似した抗原特異的抗体産生能を有する組織を人工的に構築する方法を確立した。本年度ではさらに改良を行ない、免疫組織構築と免疫反応を時空間的に調べるための新しい系として、また、将来的には感染症、がん、免疫不全状態の治療に応用する事も可能であることを示した。我々の人工リンパ節を非免疫状態の個体、あるいは免疫不全症(SCID)の個体に移植し抗原で免疫すると、抗原特異的抗体産生系において、正常リンパ節では到達し得ないほどの強い二次免疫反応を誘導出来た。このような高効率の免疫機能をもった人工リンパ節の成功は世界で初めてである。このことは、人工リンパ節において強い二次免疫反応が急速に引き起こされる理由の一つと考えられた。一方、人工リンパ節を構築する際にTH1型の免疫反応を誘導するような条件下で人工リンパ節を構築すると抗原特異的にIFNγを効率に産生する組織を構築出来、担がんマウスに移植すると強い抗腫瘍効果を示した。これらの結果は、我々の人工リンパ節が将来、ヒトの免疫不全症、重症感染症、エイズなどの難治性感染症、あるいはがんの免疫療法に応用出来る可能性を示している。我々の人工リンパ節は容易に移植、脱着することが出来ることからも将来の臨床応用の可能性を示唆している。またリンパ組織の分化、構築の機構、免疫記憶、免疫抑制、免疫監視機構などの研究を行うことが可能となる。
フグ毒の生産ならびにフグの毒化に関する研究

昭和61・62年度の研究成果の概要を以下にまとめる.フグ毒(テトロドトキシン, TTX), anhydro TTX産生菌としてVibrio科19株(内V.alginolyticus6株), Alteromonas属8株(新種A.alga sp., A.tetrodonas sp.を含む)およびSewanella putrefaciens sp.を分離した.しかし,人工培地で培養したこれらの菌株はいずれもTTX産生能低く,長時間の保存でTTX産生能が激減するため,現状ではこれらの菌株を用いてのTTX生合成経路の追求ならびにフグの毒化機構の解明は至難と考えられる.ついで, TTX誘導体C4-SEtの合成を行なうとともに, TTXをアルカリ処理して得たC9-baseをトリメチル体とした後GC-MSを用いて分析する方法を開発した.該方法は尿および血漿中のTTXの検出に有効である.一方, TTXの代謝および生合成経路はTTXの各同族体の化学構造相互から推察が可能と考え,クサフグから6-epi TTX, 11-deoxy TTXを,イモリからはさらにanhydro 6-epi TTX, 11-deoxy-4-epi TTX, anhydro-11-deoxy TTXを発見した.ところで,クサフグにTTX・anhydro TTX混合物(1:4)を腹腔内投与したところ,体内での相互変換は極めてわずかであり, TTXの来源としてのanhydro TTXの可能性は非常に少ない.他方,抗生物質を適量以上添加した海水中で有毒フグと無毒フグの混養を行ったところ,依然として無毒フグの毒化が進み,混養による毒化の原因がTTX産生菌である可能性は少ない.ついで,ニホンイモリにも毒性を発見したが,その毒性は有毒フグの肝臓以上であり,個体差が大きく,成長とともに毒性が増加する.毒性の原因はTTXおにびその同族体の混合物と理解している.他方,養殖中の無毒のクサフグが自然産卵を行ない,その稚魚を飼育中である.この事実はクサフグ,ひいては有毒種のフグの産卵およびその後の成長にとって, TTXが必ずしも必要でないことを明らかにしている.昭和61・62年度の研究成果の概要を以下にまとめる.フグ毒(テトロドトキシン, TTX), anhydro TTX産生菌としてVibrio科19株(内V.alginolyticus6株), Alteromonas属8株(新種A.alga sp., A.tetrodonas sp.を含む)およびSewanella putrefaciens sp.を分離した.しかし,人工培地で培養したこれらの菌株はいずれもTTX産生能低く,長時間の保存でTTX産生能が激減するため,現状ではこれらの菌株を用いてのTTX生合成経路の追求ならびにフグの毒化機構の解明は至難と考えられる.ついで, TTX誘導体C4-SEtの合成を行なうとともに, TTXをアルカリ処理して得たC9-baseをトリメチル体とした後GC-MSを用いて分析する方法を開発した.該方法は尿および血漿中のTTXの検出に有効である.一方, TTXの代謝および生合成経路はTTXの各同族体の化学構造相互から推察が可能と考え,クサフグから6-epi TTX, 11-deoxy TTXを,イモリからはさらにanhydro 6-epi TTX, 11-deoxy-4-epi TTX, anhydro-11-deoxy TTXを発見した.ところで,クサフグにTTX・anhydro TTX混合物(1:4)を腹腔内投与したところ,体内での相互変換は極めてわずかであり, TTXの来源としてのanhydro TTXの可能性は非常に少ない.他方,抗生物質を適量以上添加した海水中で有毒フグと無毒フグの混養を行ったところ,依然として無毒フグの毒化が進み,混養による毒化の原因がTTX産生菌である可能性は少ない.ついで,ニホンイモリにも毒性を発見したが,その毒性は有毒フグの肝臓以上であり,個体差が大きく,成長とともに毒性が増加する.毒性の原因はTTXおにびその同族体の混合物と理解している.他方,養殖中の無毒のクサフグが自然産卵を行ない,その稚魚を飼育中である.この事実はクサフグ,ひいては有毒種のフグの産卵およびその後の成長にとって, TTXが必ずしも必要でないことを明らかにしている.サンゴ礁海域,沿岸地域の海水,海そう,底質中のTTX(テトロドトキシン)産生菌,さらには有毒フグの腸管,皮膚などの組織におけるTTX産生菌のスクリーニングを行なうとともに、TTX産生菌の培養ならびにTTX産生菌による無毒フグの毒化に関する研究を行ない、以下の結果を得た。1、TTX産生菌を数種類発見したが、これらはいずれも有毒フグの組織のみならず、海水中にも極くありふれた細菌であり、今のところ特筆すべき細菌であるとは考えられない。2、TTXを生産していると判定した細菌、あるいは該細菌の培養液でも、往往にして化学的分析ではTTXのパターンを示しても、マウスに対して相応の毒性を示さない場合が認められた。3、TTX産生菌を培養液と共に養殖の無毒フグに経口投与した場合、無毒フグは毒化した。しかし、該TTX産生菌も培養継続中、あるいは-80°C保管中にTTX産生能力が無くなり、培養方法の研究が大きな課題となった。

一方、無毒フグにTTXあるいはanhydTTXを単独および混合して投与し、経時的に各組織中のTTXおよびその誘導体の組成を調べたところ、TTX,anhydTTXともに体内に蓄積され、排せつは非常に少ない。また、TTX,anhydTTX相互間の転換はいずれも極くわずかであり、フグにおけるTTXの来源としてanhydTTXの可能性は非常に少ないものと考えられる。他方、養殖中の無毒フグが水産実験所において自然産卵し、目下飼育中である。この結果は卵にTTXを含む有毒フグにおいても、産卵・ふ化にTTXが無関係であることを示唆している。また、これらの無毒フグの稚魚もTTXに対する抵抗性は有毒フグの稚魚のそれと同程度であり、フグのTTXに対する抵抗性は後天的なものではなく、遺伝によるとの強い示唆を得た。
Evi-1による難治性白血病発症にポリコーム群が及ぼす影響の解明

申請者は難治性白血病原因遺伝子の一つであるEvi1やAML1/Evi1融合タンパク質が複数のポリコーム複合体と結合することを見出した.また,Evi1とAML1/Evi1ががん抑制遺伝子PTENの転写を負に制御することを見出した.Evi1とAML1/Evi1はそれぞれポリコーム複合体をPTENのプロモーター上にリクルートすることで、ヒストン3リジン27のメチル化を介してPTENの転写をエピジェネティックに抑制することが示唆され,同所見はマウスモデルやヒトの白血病臨床検体を用いた解析から確認された.Evi1とAML1/Evi1はPTENの転写抑制を介して,下流のAKT/mTORシグナルを活性化したことから,mTOR阻害薬であるRapamycinがEvi-1高発現白血病細胞に対して優れた増殖抑制効果をもつ可能性が考えられた.そこで予後不良難治性白血病であるEvi-1高発現白血病のマウスモデルを世界ではじめて確立し,同マウスモデルにRapamycinを投与したところ,有意にマウスの生存が延長した.また、Evi1あるいはAML1/Evi1を導入することによって不死化したマウスの骨髄細胞は、ポリコーム複合体阻害薬(DZNep)に対して強い感受性を示した。以上の結果から,今回の研究により,Evi1高発現白血病、あるいはAML1/Evi1陽性白血病に対して新たな分子標的療法が確立され、難治性白血病の克服につながる可能性がある2つの新規標的治療の開発に向かって大きな前進が得られたと考えられる.さらに、Evi1とPTENの発現量と急性骨髄性白血病の予後について解析した結果、Evi1低発現かつPTEN高発現群は予後が良好であることを見出した。このことから、Evi1とPTENの発現量を定量することで予後予測および治療方針決定に役立つことが示唆され、臨床上も重要な知見と考えられた。申請者は難治性白血病原因遺伝子の一つであるEvi-1がポリコーム複合体とタンパク-タンパク結合することを見出した.また,それを手掛かりに新たなEvi-1の標的遺伝子としてがん抑制遺伝子PTENの転写を負に制御することを,マイクロアレイ解析から見出した.面白いことに,Evi-1はポリコーム複合体をPTENのプロモーター上にリクルートすることで主にヒストン3リジン27(H3K27)のメチル化を介してPTENの転写を抑制することが,クロマチン免疫沈降やレポーターアッセイの結果から示唆され,同所見はマウスモデルだけでなくヒトの白血病検体でも確認された.同時に,ヒトの白血病細胞の発現解析より,Evi-1とPTENの発現量の間には逆相関の関係があることが確認された.Evi-1はPTENの転写を抑制し,下流のAKT/mTORシグナルを活性化する所見が得られたことから,mTOR阻害薬であるRapamycinがEvi-1高発現白血病細胞に対して優れた増殖抑制効果をもつ可能性が考えられた.そこで予後不良難治性白血病であるEvi-1高発現白血病のマウスモデルを世界ではじめて確立し,同マウスモデルにRapamycinを投与したところ,有意にマウスの生存が延長した.以上の結果から,今回の研究により,いままで治療標的が明らかでなかったEvi-1高発現白血病に対して新たな分子標的療法が確立された上に,Evi-1とポリコーム複合体のinteractionについても有望な治療標的となることが示され,難治性白血病の克服につながる可能性のある新規治療法の開発に向かって大きな前進が得られたと考えられる.申請者は難治性白血病原因遺伝子の一つであるEvi1やAML1/Evi1融合タンパク質が複数のポリコーム複合体と結合することを見出した.また,Evi1とAML1/Evi1ががん抑制遺伝子PTENの転写を負に制御することを見出した.Evi1とAML1/Evi1はそれぞれポリコーム複合体をPTENのプロモーター上にリクルートすることで、ヒストン3リジン27のメチル化を介してPTENの転写をエピジェネティックに抑制することが示唆され,同所見はマウスモデルやヒトの白血病臨床検体を用いた解析から確認された.Evi1とAML1/Evi1はPTENの転写抑制を介して,下流のAKT/mTORシグナルを活性化したことから,mTOR阻害薬であるRapamycinがEvi-1高発現白血病細胞に対して優れた増殖抑制効果をもつ可能性が考えられた.そこで予後不良難治性白血病であるEvi-1高発現白血病のマウスモデルを世界ではじめて確立し,同マウスモデルにRapamycinを投与したところ,有意にマウスの生存が延長した.また、Evi1あるいはAML1/Evi1を導入することによって不死化したマウスの骨髄細胞は、ポリコーム複合体阻害薬(DZNep)に対して強い感受性を示した。
バラの根頭がんしゅ病抵抗性機構の解明

1)抵抗性品種と抵抗性が低い品種を用いて植物細胞への病原菌の付着過程を走査型電子顕微鏡で比較観察した.菌から伸長した繊維状の構造体が植物体への付着に関与していた.植物細胞の表面に植物由来の顆粒状物質が観察され,抵抗性品種では顆粒状物質が菌の植物細胞への付着を阻害し,また菌を不動化させていた.抵抗性が低い品種では,顆粒状物質が少なく,菌から伸長した繊維状構造体が相互に繋がって植物細胞に付着していた.菌由来の繊維状物質は植物由来の顆粒状構造体と結合しやすく,根頭がんしゅ病抵抗性品種では顆粒状物質の形成量が多いため,これが植物細胞表面への菌の付着を阻害すると共に,菌の不動化を引き起こして感染を抑制していると考えられた.これに対して抵抗性が低い品種では植物由来の顆粒状物質が少なく,菌由来の繊維状構造体によって容易に植物細胞表面に菌が付着し,感染が成立するものと考えた.2)バラ品種が示す病徴発達抵抗性の発現機構を明らかにするため,抵抗性の高い品種と低い品種を用い,IAAとZeatinに対する反応性と抵抗性との関係を調べた.抵抗性を持つ品種は必ずしも抵抗性が低い品種よりカルス生長率が高いとはいえず,根頭がんしゅ病抵抗性は植物ホルモンに対する反応性と関係していなかった.3)抵抗性が強く,Sinapic acidの生合成量が低い'Pekcougel'にSinapic acidを添加し,ゴール形成におよぼす影響を調べた.'PEKcougelの抵抗性発現にSinapic acidは関与しておらず,Sinapic acidを生合成している'Dukat'に添加した場合にはゴール形成の抑制がみられた.1)抵抗性品種と抵抗性が低い品種を用いて植物細胞への病原菌の付着過程を走査型電子顕微鏡で比較観察した.菌から伸長した繊維状の構造体が植物体への付着に関与していた.植物細胞の表面に植物由来の顆粒状物質が観察され,抵抗性品種では顆粒状物質が菌の植物細胞への付着を阻害し,また菌を不動化させていた.抵抗性が低い品種では,顆粒状物質が少なく,菌から伸長した繊維状構造体が相互に繋がって植物細胞に付着していた.菌由来の繊維状物質は植物由来の顆粒状構造体と結合しやすく,根頭がんしゅ病抵抗性品種では顆粒状物質の形成量が多いため,これが植物細胞表面への菌の付着を阻害すると共に,菌の不動化を引き起こして感染を抑制していると考えられた.これに対して抵抗性が低い品種では植物由来の顆粒状物質が少なく,菌由来の繊維状構造体によって容易に植物細胞表面に菌が付着し,感染が成立するものと考えた.2)バラ品種が示す病徴発達抵抗性の発現機構を明らかにするため,抵抗性の高い品種と低い品種を用い,IAAとZeatinに対する反応性と抵抗性との関係を調べた.抵抗性を持つ品種は必ずしも抵抗性が低い品種よりカルス生長率が高いとはいえず,根頭がんしゅ病抵抗性は植物ホルモンに対する反応性と関係していなかった.3)抵抗性が強く,Sinapic acidの生合成量が低い'Pekcougel'にSinapic acidを添加し,ゴール形成におよぼす影響を調べた.'PEKcougelの抵抗性発現にSinapic acidは関与しておらず,Sinapic acidを生合成している'Dukat'に添加した場合にはゴール形成の抑制がみられた.バラの根頭がんしゅ病抵抗性品種'Pekcougel'と罹病性品種'Dukat'との交雑を行い、抵抗性の遺伝について検討した結果、抵抗性形質は後代に遺伝した。しかし、抵抗性の程度は連続的に変化し、単独の主働遺伝子支配を受けていないことが明らかとなり、複数の抵抗性因子が存在することが示唆された。抵抗性発現に関わる要因を検討した結果、細胞間多糖類に関して差異が認められ、罹病性品種では細胞間多糖類の著しい発達が見られたのに対して、抵抗性品種ではこれらの発達が認められず、Agrobacterium tumefaciensのバラ細胞への接着に関連する因子が抵抗性発現に関与していることが明らかとなった。また、Agrobacterium tumefaciensの病原性の発現に深く関与しているといわれるAcetosyringone誘導体の含量について罹病性品種と抵抗性品種を比較した結果、罹病性品種では多種類のAcetosyringone誘導体の生合成が確認されたのに対して、抵抗性品種ではそれらの生合成量が著しく少なく、Acetosyringone誘導体の生合成に関わる因子も抵抗性の発現に関与していることが明らかとなった。これらのAgrobacterium tumefaciensに関する研究を進める過程で、岐阜県内より採取した根頭がんしゅ病菌Agrobacteriumtumefaciensを遺伝子組換え体として利用する試みを行った結果、効率よく組換え体を作出でき、理科教材として本菌を使用することができることが明らかとなった。1)温室で栽培されている根頭がんしゅ病罹病性品種Dukatから1015cmに伸長した若いシュートを採取し、その節間をAgrobacterium tumefaciens懸濁液に48時間あるいは72時間浸漬した後、クラフォランで3回洗浄して、その後植物ホルモン無添加培地で培養した結果、菌密度1010個/mlの懸濁液に72時間浸漬して接種し、クラフォラン100ppmで3回洗浄して培養することで、6週間後に70%の個体でゴールが形成された(図1)。

ゴールのオピンアッセイを行った結果、全てのゴールでノパリンが確認でき、Agrobacterium tumefaciensの感染によって形成されたゴールであることが確認できた。2)標準菌株を用いたPCRによってノパリンを生成するグループとオクトピンを生成するグループに分類でき、ノパリンタイプはRFLPによってA208とR225fに分類できた。全国各地のバラから単離した54菌株について分類を行った結果、35菌株はR225fノパリンタイプで、7菌株がオクトピンタイプでであった。この他、GOU1はA208ノパリンタイプであり、11菌株は他のオピンタイプと分類された。1)抵抗性品種と抵抗性が低い品種を用いて植物細胞への病原菌の付着過程を走査型電子顕微鏡で比較観察した.菌から伸長した繊維状の構造体が植物体への付着に関与していた.植物細胞の表面に植物由来の顆粒状物質が観察され,抵抗性品種では顆粒状物質が菌の植物細胞への付着を阻害し,また菌を不動化させていた.抵抗性が低い品種では,顆粒状物質が少なく,菌から伸長した繊維状構造体が相互に繋がって植物細胞に付着していた.菌由来の繊維状物質は植物由来の顆粒状構造体と結合しやすく,根頭がんしゅ病抵抗性品種では顆粒状物質の形成量が多いため,これが植物細胞表面への菌の付着を阻害すると共に,菌の不動化を引き起こして感染を抑制していると考えられた.これに対して抵抗性が低い品種では植物由来の顆粒状物質が少なく,菌由来の繊維状構造体によって容易に植物細胞表面に菌が付着し,感染が成立するものと考えた.2)バラ品種が示す病徴発達抵抗性の発現機構を明らかにするため,抵抗性の高い品種と低い品種を用い,IAAとZeatinに対する反応性と抵抗性との関係を調べた.抵抗性を持つ品種は必ずしも抵抗性が低い品種よりカルス生長率が高いとはいえず,根頭がんしゅ病抵抗性は植物ホルモンに対する反応性と関係していなかった.
新規骨特異的チャネル分子パネキシン3の骨形成における機能解析

平成21年度は、骨・軟骨におけるPannexin3の重要性を明らかにするために、培養骨芽細胞および骨・軟骨組織におけるPannexin3の発現を検討した。まず、培養骨芽細胞からmRNAを抽出し、RT-PCRにて遺伝子レベルでPannexin3が発現していることを確認した。さらに、蛋白レベルでPannexin3の発現を確認するために、2種類の特異的ペプチドをウサギに免疫し、抗Pannexin3抗体を作製した。作製した抗体および市販の抗Pannexin3抗体を用いてウエスタンブロッティングをおこなったところ、培養骨芽細胞において蛋白レベルでPannexin3が発現していることを確認できた。また、マウスのティッシュブロットによって、骨組織及び軟骨組織においてmRNAレベルでPannexin3が発現していることを明らかにした。次に、Pannexin3 KOマウスの解析に着手した。KOマウスのN1世代はレントゲン写真および骨格標本に明らかな表現型を認めなかった為、C57BL/6系統へのbackcrossを進めながら、レントゲン写真および骨格標本の解析を進めた。ところが、N5世代から出生直後に死亡するマウスが出始め、N8世代ではすべてのKOマウスが出生直後に死亡することがわかった。原因は明らかでないが、肋骨の異常による呼吸不全が考えられた。以上の結果から、Pannexin3が骨・軟骨組織において重要な働きを担っていることが示唆された。
多機能酵素複合体の基質チャネリングメカニズムの解明

基質チャネリングとは、連鎖反応中の中間基質が溶媒中へ自由拡散する前に次の反応を行う酵素へ結合する現象またはその分子メカニズムのことである。これまでに基質チャネリングを示唆する間接的な実験データは数多く報告されているものの、現象の有無を含めて未だに議論のある問題である。われわれは、関連する多機能酵素複合体の立体構造情報が限られていることが原因であると考え、多機能酵素複合体の原子レベル立体構造を決定し、それに基づいた実験から基質チャネリングの本質を明らかにしたいと考えた。そのために、脂肪酸分解に関わる多機能酵素複合体である脂肪酸β酸化酵素複合体にターゲットを絞り、研究を行った。利用したのはPseudomonasfragi由来の脂肪酸β酸化酵素複合体である。この複合体は、αサブユニット(分子量約8万)2分子とβサブユニット(分子量約4万)2分子からなる分子量約24万のヘテロ4量体である。我々は、この超分子複合体を結晶化し、最終的に立体構造決定に成功した。脂肪酸β酸化酵素複合体は、2つのαサブユニット(2-エノイルCoAヒドラターゼおよび3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を含む)と2つのβサブユニット(3-ケトアシルCoAチオラーゼ活性を含む)がリング状に会合した立体構造をとっていた。そのリング状構造の内側に面している3つの活性部位と、2つの結晶形から推定されるリング構造の変形を伴う四次構造レベルの変化は、活性部位間の連係メカニズムの存在が予想された。さらに、αサブユニット上の基質結合部位の同定を行った。最初に、予想されたαサブユニット上の基質結合部位に変異を加えることによって、基質結合能が低下するかどうかを確認した。その結果、アデニン結合領域に相当するL290D/L293D変異体では、αサブユニットの活性が野生型の14%に低下することがわかった。一方、近傍のF294AやK142Aでは野生型の活性と大きな変化は見られなかった。この部位は、活性部位からは遠く離れているために、L290D/L293Dで導入された負電荷が疎水相互作用を主としたアデニン部分の結合を阻害した結果と解釈された。さらに、アセチルCoAが結合した結晶の立体構造決定を行い、予想通りに基質が結合することを確認した。また、基質結合に伴って起こる四次構造変化を追跡するために、X線溶液散乱実験を行った。この目的のためには高輝度のX線が必要なので、高輝度光科学研究センターSPring-8のビームラインBL40B2にて実験を行った。実験データの解釈は、測定した溶液散乱と結晶構造から計算される散乱曲線と比較することによって行った。まず、リガンドフリー状態では2回対称を示すForm Iに近い四次構造をとることがわかった。さらに、基質となるNADやアシルCoAを加えると散乱が変化し、2回対称のForm Iと非対称のForm IIの間の散乱曲線を与えた。すなわち、Pseudomonasfragi由来の脂肪酸β酸化酵素複合体は、リガンドフリー状態では2回対称のForm Iに近い構造を取るが、リガンド添加によってリング状構造が変形することが示唆された。

さらに、アセチルCoAが結合した結晶の立体構造決定を行い、予想通りに基質が結合することを確認した。また、基質結合に伴って起こる四次構造変化を追跡するために、X線溶液散乱実験を行った。この目的のためには高輝度のX線が必要なので、高輝度光科学研究センターSPring-8のビームラインBL40B2にて実験を行った。実験データの解釈は、測定した溶液散乱と結晶構造から計算される散乱曲線と比較することによって行った。まず、リガンドフリー状態では2回対称を示すForm Iに近い四次構造をとることがわかった。さらに、基質となるNADやアシルCoAを加えると散乱が変化し、2回対称のForm Iと非対称のForm IIの間の散乱曲線を与えた。すなわち、Pseudomonasfragi由来の脂肪酸β酸化酵素複合体は、リガンドフリー状態では2回対称のForm Iに近い構造を取るが、リガンド添加によってリング状構造が変形することが示唆された。