hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半構造パタンマイニングによる糖鎖構造の分析

本研究の当初目標は、糖鎖データベースから特徴的な構造パタンを抽出するマイニング手法を開発し、糖鎖構造と機能の解明に寄与することとした。しかしながらアルゴリズムの開発が困難であったため、ネットワーク構造の解析,及び、その機能の解析のための新たな手法の開発を行うことを新たな目標とした。この目標に対して(1)糖鎖関連パスウェイ解析、及び、(2)糖鎖遺伝子解析を容易にする手法の研究開発を行った。(1)グラフノードクラスタリングの新たな統計モデルの構築を行った。従来法は最適なクラスタ数の決定問題やスケーラビリティに関する問題、あるいは統計モデルの場合、クラスタ内でエッジが密・クラスタ間でエッジが疎となるクラスタが必ずしも得られないという問題がある。本研究では、これらの問題に対し1最適クラスタ数の自動決定、2従来法より高速、3クラスタ内でエッジが密・クラスタ間でエッジが疎、の3点を実現するクラスタリングモデルを提案・実装した。(2)バイクラスタリングと呼ばれる遺伝子発現解析手法とその出力結果の解析を容易にするツールの開発を行った。バイクラスタリングは特定の実験条件下で共発現する遺伝子群を発見する手法として広く研究されており、近年では頻出アイテムセットマイニングを応用した手法が他手法に比べてパフォーマンスが高いことが示されている。しかしながら頻出アイテムセットマイニングに基づくアルゴリズムは冗長な出力をもつため個々の結果の解釈が困難になるという問題があった。本研究では、従来法では発見することが出来ない重要なバイクラスタも列挙し、結果を非冗長かつコンパクトな重み付きネットワーク構造に集約する手法を提案し実装して公開した。以上の(1)(2)により糖鎖関連パスウェイの解析、及び、糖鎖遺伝子の解析を従来よりも容易に行うことを可能にした。(抄録なし)当初計画では、頻出パタンマイニングアルゴリズムについて研究を行い、頻出グラフパタンの探索空間(列挙木)において、探索中に一定数以上の子パタンを持つ親パタン(ハブパタン)を発見する効率的なアルゴリズムを開発し、糖鎖構造の解析を行う予定であった。しかしながら、探索中にハブパタンを発見するアルゴリズムの開発が困難であったため、マイニングアルゴリズムに共通する出力の冗長性排除と膨大な出力の要約を行う問題に対する知見を得るために、頻出アイテムセットマイニングを応用した遺伝子発現解析手法の開発を行うことにした。またそれにより糖鎖関連遺伝子の解析を行うことを目標とした。この課題設定のもと、本年度は頻出アイテムセットマイニングを応用した新しいバイクラスタ列挙手法と列挙されたバイクラスタの要約を行うツールの開発を行った。バイクラスタリングは、行列から特定の条件を満たす部分行列を抽出する技術として研究されている。マイクロアレイのデータセットは、行方向に遺伝子、列方向に実験条件をとることでテーブル形式のデータ(以下、発現行列)として表現できるため、バイクラスタリングは遺伝子発現解析に応用され、数多くのアルゴリズムが開発されている。しかしながら、既存の多くのバイクラスタリング手法は、重要なバイクラスタを探索中に見落とす可能性があるため、今回、頻出アイテムセットマイニングを応用して重要なバイクラスタを完全列挙する新しいアルゴリズムを開発した。さらに、列挙されたバイクラスタから統計的に有意なものだけをフィルタリングし、結果を遺伝子ネットワークとして要約するツールの開発を行い、Webサイトとして公開した。今回提案したバイクラスタリング手法が、競合手法よりも生物学的に重要な遺伝子群を多く発見できることを確認した。その結果をふまえ、糖鎖関連遺伝子の解析に着手した。当初計画では、糖鎖構造解析のための効率的なグラフマイニングアルゴリズムの開発を行う予定であった。しかしながら、効率的なアルゴリズムの開発が困難であったため、テーマ変更してマイクロアレイからバイクラスタを抽出するマイニングアルゴリズムの開発を行った。

開発したアルゴリズムが、既存のアルゴリズムより生物学的に有意なバイクラスタを多く生成することを確認した。成果は、webサーバーとして公開し、またジャーナルに論文を投稿中である。これらの成果は、糖鎖関連遺伝子の解析にも役立つものと期待でき、進展があったと考えている。槍鎖の構造・機能間の多様性を理解するためには、糖鎖の部分構造情報と糖鎖関連遺伝子情報を結びつけることが重要であると考えている。本年度は遺伝子解析ツールの開発を行ったものの、効率的なグラフマイニングアルゴリズムの開発が出来なったため別の視点からグラフ構造の解析について再度検討する必要がある。そこで、半教師付き学習のラベル伝搬アルゴリズムやリンク伝搬アルゴリズムを応用することで糖鎖構造の機能や予測を行うことを目標に、研究を推進する予定である。(抄録なし)
トランスナショナル・ローの法理論の研究ーグローバルな土地収奪を事例としてー

研究1年目にあたる本年度は、トランスナショナル・ローの理論につき、その理論的な精緻化の方向性を見定めるとともに、今後の事例研究に向けた準備作業を開始することができた。まず、理論研究については、我が国および欧米諸国の近時の研究を広範にレビューするとともに、国際的な学会・研究会に参加し(2018年4月、5月、及び2019年3月)、国外の研究者と議論を深めることで、検討の方向性を見定めることができた。すなわち、新たな法学方法論を考察する理論としてのトランスナショナル・ローという大筋の課題設定を踏まえ、日本の文脈及び国際的な文脈それぞれに合わせた理論的考察の方向性を見出すことができた。次に、事例研究については、土地収奪を専門として研究をする国外の研究者と、国際的な学会・研究会の機会において意見交換を行うことを通じて、事例研究の切り口・方法について検討を重ねるとともに、事例研究の実施に必要なネットワークも得ることができた。更に、諸外国において、事例研究に伴う問題として、調査研究方法そのものに伴う植民地主義的バイアスが活発な議論の対象となっていることを見出し、不可欠の新たな論点の設定も行うことができた。本研究は、トランスナショナル・ローという研究動向について理論的に考察し、その有用性を土地収奪の問題を主たる事例としつつ検討することを目的としている。本年度は、理論研究及び事例研究の両面において、以下の進展を得た。まず、理論研究については、以下の二点の進展があった。第一に、新たな法学方法論を考察する理論としてのトランスナショナル・ローという課題設定につき、国際的な議論動向に照らした場合、思弁的な検討を行うというよりも、越境的契約の規律や国際機関・国際NGO等による規範形成活動の整序といった、個別具体的な問題について事例を介して検討を進めていくことがスダンダードな研究方法であることを明らかにできた。第二に、我が国における議論の文脈とトランスナショナル・ローの理論との関係を考察し、新たな法学方法論を考察するという大枠の課題設定の意義を確認しつつ、関連する先行研究について整理することが出来た。上記の二点は、何れも次年度以降の研究公表の基礎を提供する不可欠のものである。次に、事例研究については、以下の二点の進展があった。第一に、土地収奪に関わる規範形成に参画するフォーラム・アクターについて把握することができ、今後の事例研究の検討対象を絞ることができた。第二に、事例研究と関連して、事例研究の実施方法そのものに伏在する植民地主義的バイアスに関する関心が高まっていることも、諸外国の研究者との意見交換から把握することができた。本問題は、日本の研究者として国際的な議論に参画していくにあたり検討が必要なものであり、その問題の存在を把握できたことは有益であった。上記の二点は、今後事例研究を実施するために不可欠な進展である。最後に、これらの基盤構築作業に留まらず、端緒的な研究成果の公表も行うことが出来た。以上のように、本研究課題は概ね順調に進展している。今後は、理論研究については、学会・研究会での報告や論文執筆に研究の力点を移し、研究成果の公表を行い、研究へのフィードバックを得るとともに、それを通じて、国外の研究者との強固な研究ネットワークの構築をも図ることを目指す。その際、前年度の研究において、理論的視座の精緻化を着実に進めるためには思弁的な検討に留まらず個別の事例・分野に着目しつつ多角的に光を当てることが必要であることが明らかとなったため、報告・執筆に際しては、トランスナショナル・ローの問題状況がよく現れている事例を取り扱うことでこれを行うこととする。具体的には、土地収奪と密接に関連する事例でもある食糧安全保障に関わる国際的規律、途上国における伝統知の保護とバイオ・パイラシーの問題、労働者保護の国際的な規律の展開について夫々取り扱いつつ、理論的枠組のさらなる精緻化を目指す。また、それらの検討と並行して、国際的な研究ネットワークの構築と諸外国の研究者との意見交換を継続し、トランスナショナル・ローという新規の分野を今後研究していく足場をより確実なものとする。また、事例研究については、前年度の研究から得た研究対象の確定を承け、実際にインタビュー調査等を交えた研究作業に入る。具体的には、前年度に実施することのできなかった国連食糧農業機関イタリア本部、コロンビア大学持続可能な開発研究センター並びに世界銀行へインタビュー調査を実施し、それらを足がかりとしつつ、継続的に土地収奪に関連する諸アクターとの意見交換を進めていく。最後に、事例研究を進める上での方法論につき、倫理的観点から考察を深めるという新たな課題について、検討に着手する。検討に際しては、諸外国におけるポスト植民地主義の研究動向を中心として議論の大筋を掴むところから開始し、日本の研究者として如何なる立場を取りうるのかについて慎重に考察を進めていく。

次に、事例研究については、土地収奪を専門として研究をする国外の研究者と、国際的な学会・研究会の機会において意見交換を行うことを通じて、事例研究の切り口・方法について検討を重ねるとともに、事例研究の実施に必要なネットワークも得ることができた。更に、諸外国において、事例研究に伴う問題として、調査研究方法そのものに伴う植民地主義的バイアスが活発な議論の対象となっていることを見出し、不可欠の新たな論点の設定も行うことができた。本研究は、トランスナショナル・ローという研究動向について理論的に考察し、その有用性を土地収奪の問題を主たる事例としつつ検討することを目的としている。本年度は、理論研究及び事例研究の両面において、以下の進展を得た。まず、理論研究については、以下の二点の進展があった。第一に、新たな法学方法論を考察する理論としてのトランスナショナル・ローという課題設定につき、国際的な議論動向に照らした場合、思弁的な検討を行うというよりも、越境的契約の規律や国際機関・国際NGO等による規範形成活動の整序といった、個別具体的な問題について事例を介して検討を進めていくことがスダンダードな研究方法であることを明らかにできた。第二に、我が国における議論の文脈とトランスナショナル・ローの理論との関係を考察し、新たな法学方法論を考察するという大枠の課題設定の意義を確認しつつ、関連する先行研究について整理することが出来た。上記の二点は、何れも次年度以降の研究公表の基礎を提供する不可欠のものである。次に、事例研究については、以下の二点の進展があった。第一に、土地収奪に関わる規範形成に参画するフォーラム・アクターについて把握することができ、今後の事例研究の検討対象を絞ることができた。第二に、事例研究と関連して、事例研究の実施方法そのものに伏在する植民地主義的バイアスに関する関心が高まっていることも、諸外国の研究者との意見交換から把握することができた。本問題は、日本の研究者として国際的な議論に参画していくにあたり検討が必要なものであり、その問題の存在を把握できたことは有益であった。上記の二点は、今後事例研究を実施するために不可欠な進展である。最後に、これらの基盤構築作業に留まらず、端緒的な研究成果の公表も行うことが出来た。以上のように、本研究課題は概ね順調に進展している。今後は、理論研究については、学会・研究会での報告や論文執筆に研究の力点を移し、研究成果の公表を行い、研究へのフィードバックを得るとともに、それを通じて、国外の研究者との強固な研究ネットワークの構築をも図ることを目指す。その際、前年度の研究において、理論的視座の精緻化を着実に進めるためには思弁的な検討に留まらず個別の事例・分野に着目しつつ多角的に光を当てることが必要であることが明らかとなったため、報告・執筆に際しては、トランスナショナル・ローの問題状況がよく現れている事例を取り扱うことでこれを行うこととする。具体的には、土地収奪と密接に関連する事例でもある食糧安全保障に関わる国際的規律、途上国における伝統知の保護とバイオ・パイラシーの問題、労働者保護の国際的な規律の展開について夫々取り扱いつつ、理論的枠組のさらなる精緻化を目指す。
ゼブラフィッシュ摘出脳脊髄標本を利用した眼球運動とロコモーションの統合機構の解明

状況依存的な行動は感覚入力によって惹起される複数の基本的運動プログラムの統合により実現される。眼球運動と体幹運動(ロコモーション)が協調・統合される過程の神経活動記録のための動物モデルとしてゼブラフィッシュ脳眼球脊髄摘出標本を確立し、眼球運動とロコモーションの統合機構の解明を目指した。しかし前年度の研究において、ゼブラフィッシュ成魚では血流遮断後、視蓋および前脳の反応性の低下が著しく脳眼球脊髄摘出標本から満足のいく神経活動を安定して記録することが難しかった。そこで今年度は、ゼブラフィッシュに代えメダカでの脳眼球脊髄摘出標本の作製に着手した。同標本では、視蓋等への電気刺激により良好な神経応答を観察できたが、現段階では視覚刺激による十分な応答を視蓋に誘発できていない。そこで摘出標本による光記録の前段階として、無麻酔非動化したメダカ成魚の視蓋における視覚応答の時空間パターンを、膜電位感受性色素RH1691を用いた光計測システムにより記録した。生体の下方からサイン波状明暗が変化する縞模様を縞と直行する向きに動かしながら提示し、視蓋における神経活動を、実時間光計測法によって記録した。視蓋の比較的限局した部位に縞模様の時間周波数に一致した神経活動が記録された。また無麻酔で体幹の運動を部分的に拘束したメダカにおいて、同様の視覚刺激によって、縞模様の移動方向に応じたロコモーションが惹起されることを確認した。環境や周囲の状況に応じた行動は感覚入力によって惹起される複数の基本的運動プログラムの統合により実現される。しかしこの神経機構については殆ど知られていない。今回眼球運動と体幹の協調運動をモデルとして感覚運動統合過程の神経基盤を明らかにしたい。研究は2段階で計画した。第一段階では正常動物におけるこれらの感覚運動統合機構を詳細に調べる。第二段階では、各種疾病モデル動物や変異体について同様の神経機構を調べる。双方の神経機構の相同を明らかにすることによって、神経回路および分子機構レベルでの感覚運動統合の神経機序を明らかにすると同時に、臨床応用の可能性も探りたい。今年度は第一段階のうちで、ゼブラフィッシュの摘出脳脊髄標本の作製方法と、その標本における神経活動のリアルタイム光計測法の確立を計画していた。成熟動物での摘出脳脊髄標本は、ヤツメウナギ成魚や、成熟カメで成功している。しかし酸素需要が高いと考えられるゼブラフィッシュ成魚では、当初の計画と異なり摘出脳脊髄標本の作製が難航した。そこで同じ小型魚類でゼブラフィッシュ同様、当初の研究目的に適うメダカ(Oryzias latipes)にモデル動物を変更し、計画通り、摘出脳脊髄標本の作製方法を確立した。またこの標本での視蓋や脊髄の神経活動を光計測する方法についてもほぼ完成することができ、22年度以降の予定である、正常動物ならびに各種疾病モデル動物等の眼球運動ロコモーションの統合機構を明らかにしていくための準備が整ったと考えている。
直交異方性平板を対象とする波動制御理論の構築

本研究では,これまでに提案されている平板構造物の波動制御法を,直交異方性平板の場合にまで拡張することを目的としている.まず,伝達マトリクス法によって直交異方性矩形平板の動特性を記述することから始め,平板が直交異方性を有する場合はcut-on周波数が2つ存在することを明らかにした.さらに,当該構造物に対して,フィードフォワード制御とフィードバック制御の両面から,波動制御理論を体系的に構築した.本研究では,これまでに提案されている平板構造物の波動制御法を,直交異方性平板の場合にまで拡張することを目的としている.まず,伝達マトリクス法によって直交異方性矩形平板の動特性を記述することから始め,平板が直交異方性を有する場合はcut-on周波数が2つ存在することを明らかにした.さらに,当該構造物に対して,フィードフォワード制御とフィードバック制御の両面から,波動制御理論を体系的に構築した.波動制御法は,構造物にダンピングを付加するのではなく,モード励振の元凶となる反射波を除去することで,全振動モードの不活性化を可能とする.さらに,構造物中のある領域に流入する波動を除去することにより,無振動状態の生成を実現する.本研究ではこれまでに等方性構造物を対象に展開されてきた波動制御理論を,直交異方性を有する構造物の場合にまで拡張することを目的としている.当該年度において得られた成果は以下の通りである.(1)等方性平板の場合,cut-on周波数(波動の種類が変化する周波数.具体的には,波動項の指数関数の肩が実数から虚数に転じる,あるいは実数から複素数に転じる周波数)は1種類のみであったが,直交異方性平板の場合は2種類のcut-on周波数が存在することが明らかになった.したがって,直交異方性平板における波動は,2つのcut-on周波数によって分割された3つの帯域において,異なる特性を持つことが明らかになった.さらに,波動解の基本的な構成は等方性平板の場合と変わらないことから,従来の波動フィルタリング法を比較的容易に転用できることが明かになった.(2)直交異方性平板を対象にフィードフォワード型波動制御法を提案し,当該手法の有用性を数値解析の観点から立証した.当該制御系を構築する際には,常に振動を抑制するために,cut-on周波数によって分割される帯域ごとに,適切な波動項を抑制対象に選択する必要があることを明らかにした.この結果は,今年度に行われるDynamics and Design Conference 2010において発表予定である.波動制御法は,構造物にダンピングを付加するのではなく,モード励振の元凶となる反射波を除去することで,全振動モードの不活性化を可能とする.さらに,構造物中のある領域に流入する波動を除去することにより,無振動状態の生成を実現する.本研究ではこれまでに等方性構造物を対象に展開されてきた波動制御理論を,直交異方性を有する構造物の場合にまで拡張することを目的としている.当該年度において得られた成果は以下の通りである.(1)直交異方性平板を対象にフィードバック型波動制御法を提案し,当該手法の有用性を数値解析の観点から立証した.当該制御系を構築する際には,フィードフォワード型波動制御法の場合と同様に,cut-on周波数によって分割される帯域ごとに,適切な波動項を抑制対象に選択する必要があることを明らかにした.特に,無振動状態の生成については,ゲイン特性の漸近線レベルを抑制することが重要であるため,制御則の切り替えは重要である.(2)一般に波動制御則は,ラプラス演算子の有理関数によって記述されることはなく,非因果的な制御則となる場合が多い.また,フィードバック制御の場合,系の安定性を担保する必要がある.そこで,本研究では,根軌跡およびナイキスト線図によって手法そのものの安定性を議論した後に,コロケーション条件の下に無条件安定が保証されているDVDFB制御(Direct Velocity and Displacement Feedback)をクラスタ制御にまで展開し,指定された周波数を対象に波動吸収が達成できる手法を提案した.
豚の腸管免疫に関する研究-粘膜関連リンパ組織由来リンパ球の性状-

1.豚腸上皮間リンパ球(iIEL)の分離はマウスでの方法に準じて行った。すなわち,回腸口から回腸側に約1mから2mの部分を採取し,洗浄した後パイエル板を除去し,細切してiIEL分離液(5%Glucose,5mMEDTA加PBS)を加え,37°Cで15分間振盪し,ついで洗浄・細胞の回収を繰り返し,PBSに再浮遊させ,グラスウ-ルカラムにかけて未吸着細胞を回収した。その結果,10ml容積の腸断片から約5x10^7個の生細胞が得られた。次に,腸断片から粘膜固有層リンパ球(LPL)を分離するためD,分離液(0.015%コラゲナーゼ2%FCS加PBS)中で,37°C,75分間振盪し,200メッシュ上で濾過した後,腸断片をすりつぶし,PBSで洗浄回収した。濾過した細胞浮遊液はグラスウ-ルカラムにかけ,比重遠心法によりリンパ球を回収した。その結果,10ml湿潤容積の腸断片から約2x10_7個の細胞が得られた。2.iIELおよびLPLについてCD4,CD8,Surface Ig(SIg)の陽性細胞率を脾臓リンパ球と比較した。豚脾臓リンパ球ではCD4,CD8,SIgの陽性率はそれぞれ,13.7%,19.5%,31.2%であった。一方,iIEL,LPLともにSIg陽性細胞はほとんど観察されなかった。CD4の特異蛍光は弱く,陽性細胞率はiIELで10.3%,LPLで14.7%であった。CD8の特異蛍光はCD4と比較して強く、その陽性細胞率はiTELで52.3%,LPLでは26.6%であり,iIELで極めて高い陽性率を示した。以上のように,豚iIELおよびLPLは分解可能であり,また材料も豊富に採取できることから,比較医学上からもその利用が有用と考えられた。また,サプレッサー/細胞障害性T細胞とされるCD8陽性細胞率がiIELで極めて高いことは,経口免疫寛容などの点から極めて興味深い所見である。
超臨界流体下での高分子の動的粘弾性測定と振動印加熱延伸

超臨界流体下で応力測定が可能な装置を作製した。超臨界二酸化炭素下でポリフッ化ビニリデンフィルムを延伸すると大気圧下に比べて応力が低下して大きな変形回復性を示すようになるのに対して、ガスバリア性フィルムでは材料中に含まれている水が抽出されることで逆に応力が低下することが見出された。また、ポリプロピレンフィルム試料を二酸化炭素下で配向結晶化させると、大気圧下では剪断方向に対して平行方向に長いフィブリル構造が形成されるが、2MPaの二酸化炭素雰囲気下では剪断誘起相分離が発現して、剪断方向に対して垂直方向に長い密度揺らぎに由来するマイクロメートルオーダーのバンド状構造が形成されることが見出された。超臨界二酸化炭素雰囲気下で高分子フィルム試料に振動を印加できる装置の試作を行うとともに、装置完成後の適切な温度・圧力条件の探索のために既設の超臨界延伸装置を用いて超臨界二酸化炭素雰囲気下での高分子の変形・回復性について調べた。1)振動印加装置の試作では、既設の大延伸可能な超臨界延伸装置に対してモーターと歯車の異なる装置を組み立て、また、チャックにヒズミゲージを取り付けて動的ひずみ測定器で信号を検出することで微小変形に対する応力測定を可能にした。2)超臨界二酸化炭素雰囲気下での高分子の変形・回復性については、既設の大変形可能な超臨界延伸機を用いて、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)フィルム試料をひずみ100%延伸して延伸ー変形回復挙動を調べた。大気圧下ではネッキングを生じてほとんど変形回復性を示さないのに対して、高圧CO2雰囲気下ではネッキングせずに試料全体で均一に伸長して、その後の変形回復により残留ひずみが約35%になるまで大きく収縮することが見出された。四つ葉状のHv光散乱像が観察されるPVDF球晶を大気圧下あるいは低圧CO2下で延伸すると球晶がフィブリル化するために赤道方向に長いストリーク状の散乱像が観察されるのに対して、5MPaよりも高い高圧CO2雰囲気下では球晶構造に由来する四つ葉状散乱が得られ、歪み100%の塑性領域まで延伸したにも関わらず、フィブリル化せずに球晶構造が維持されることが明らかになった。小角X線散乱の結果から、大気圧下で得られた試料ではフィブリル構造に由来する赤道方向へのストリーク状散乱像が得られたのに対して、高圧CO2雰囲気下ではラメラ晶間の非晶領域が引き伸ばされて形成された空隙による子午線方向に長い散乱像が得られたことから、ラメラスタックの秩序性が保たれることが示唆された。超臨界二酸化炭素雰囲気下で高分子フィルム試料に振動を印加できる装置の試作を行うとともに、既設の超臨界延伸装置を用いて装置完成後の適切な温度・圧力条件の探索を行った。1)振動印加装置の試作では、大延伸可能な超臨界延伸装置のモーターと歯車を取りかえ、チャックにヒズミゲージを取り付けて動的ひずみ測定器で信号を検出することで微小変形に対する応力測定を可能にした。この装置に種々の振動子を取り付けて、フィルム試料への周期的な振動を印加できる可能性について調べた。2)既設の超臨界延伸機を用いて、種々の二酸化炭素圧力下においてポリプロピレン(PP)フィルム試料に二酸化炭素を十分に含浸させた後に、二酸化炭素雰囲気下で溶融させ、結晶化できる温度に冷却した後に剪断を印加して等温熱処理することで、配向結晶化させた。大気圧下では剪断方向に対して平行方向にフィブリル構造が形成されるが、2MPaの二酸化炭素雰囲気下では剪断誘起相分離が発現して、剪断方向に対して垂直方向に密度揺らぎに由来するマイクロメートルオーダーのバンド状構造が形成されることを見出した。二酸化炭素雰囲気下での剪断誘起相分離の発現は、PPと二酸化炭素の分子運動性の違いで動的非対称性が生じたことによると考えられる。剪断誘起相分離を経て得られた結晶化PPでは、結晶化度が73%の高結晶化度となり、融解温度も大気圧下で得られた試料に比べて5°C以上も上昇することがわかった。剪断誘起相分離により結晶化が誘発され、促進されたために、高結晶化度かつ高融点の結晶化PPが得られたと考えられる。ポリプロピレン(PP)フィルム試料に二酸化炭素を十分に含浸させた後に、二酸化炭素雰囲気下で溶融させ、結晶化できる温度に冷却した後に剪断を印加して等温熱処理することで、配向結晶化させた。大気圧下では剪断方向に対して平行方向にフィブリル構造が形成されるが、2MPaの二酸化炭素雰囲気下では剪断誘起相分離が発現して、剪断方向に対して垂直方向に密度揺らぎに由来するマイクロメートルオーダーのバンド状構造が形成されることが見出された。

剪断誘起相分離を経て得られた結晶化PPは高結晶化度となり、融解温度も大気圧下で得られた試料に比べて5°C以上も上昇することがわかった。剪断誘起相分離により結晶化が促進されたために、高結晶化度かつ高融点の結晶化PPが得られたと考えられる。ポリフッ化ビニリデン(PVDF)フィルム試料を大気圧下で延伸するとネッキングを生じてほとんど変形回復性を示さないのに対して、高圧二酸化炭素雰囲気下では応力が著しく低下してネッキングせずに試料全体で均一に伸張して、その後の変形回復により残留ひずみが小さくなることが見出された。小角X線散乱の結果から、大気圧下で得られた試料ではフィブリル構造に由来する赤道方向へのストリーク状散乱像が得られたのに対して、高圧二酸化炭素雰囲気下ではラメラ晶間の非晶領域が引き延ばされて形成された空隙による子午線方向に長い散乱像が得られたことから、ラメラスタックの秩序性が保たれることが示唆された。それに対して、ガスバリア性材料では応力の低下は見られず、逆に材料中に含まれている水が二酸化炭素により抽出されることで応力が低下することも見出された。高分子物性本研究テーマである高分子に弾性変形域内で振動を印加させるという発想を、高分子を塑性変形域で変形させた後の変形回復性を明らかにするという研究に発展させることができた。その発展的な研究を行うことで、超臨界二酸化炭素雰囲気下において結晶性高分子のポリフッ化ビニリデン(PVDF)を変形させると大きく変形回復するという、平成24年度とは全く異なる新しい現象を見出すことができた。超臨界延伸機を用いて、1)高圧二酸化炭素雰囲気下で溶融高分子フィルムの配向結晶化をさせることを可能にさせた、2)ある二酸化炭素圧力下でポリプロピレンを配向結晶化させると剪断誘起相分離が生じることを見出すことができた、3)剪断誘起相分離を経て配向結晶化させることで高融点かつ高結晶化度のポリプロピレン結晶を作製することができた、ことから新材料創製としての研究は順調に進展していると言える。また、振動印加装置の試作でも、大微小変形に対する応力測定が可能になり、振動子を取り付けてフィルム試料への周期的な振動の印加できる可能性を確認している段階まで進んでいることから、順調に進展していると言える。平成24ー25年度に試作した装置を調整して、超臨界流体下でフィルム試料への周期的な振動を印加して、その応答を検出することで貯蔵弾性率や損失弾性率の動的粘弾性測定を可能にさせる。また、装置の改造により振動印加中に延伸させることも可能にさせる。平成24年度の成果から得られたポリプロピレンの配向結晶化の知見、平成25年度の成果から得られたポリフッ化ビニリデンの変形回復性の知見に基づいて、種々の二酸化炭素圧力、温度において振動印加させて動的粘弾性測定を行い、ポリプロピレンの剪断誘起相分離やポリフッ化ビニリデンの変形回復性が生じる条件と動的粘弾性特性の関係について調べる。振動印加させた得られたポリプロピレン結晶やポリフッ化ビニリデン結晶の高次構造や物性の特異性について考察する。平成24年度に試作した装置を調整して、超臨界流体下でフィルム試料への周期的な振動を印加して、その応答を検出することで貯蔵弾性率や損失弾性率の動的粘弾性測定を可能にさせる。
インスリン抵抗性と高血圧に関する実験的研究-血管平滑筋Caチャンネル異常の検討

1.目的:インスリン/インスリン抵抗性の、高血圧発症、維持における役割と機序を血管壁細胞内Ca^<++>代謝の観点から検討する。2.方法:(1)ラット大動脈ラセン条片にFura-2を負荷し、平滑筋、内皮細胞内Ca^<++>濃度,([Ca^<++>]i)と張力を同時測定し、norepinephrine (NE)存在下でインスリンの効果を検討した。(2)Wistarラットに3U/kg/dayのインスリンを浸透圧ミニポンプにて4週間皮下に持続投与した後に、内皮を剥離した大動脈ラセン条片を作製し、[Ca^<++>]iと張力を同時に測定した。(3)20週齢の雄性Zucker肥満ラット(ZF群)の大動脈ラセン条片において、KCl、phenylephrine(PE)、セロトニン(5-HT)投与による平滑筋内[Ca^<++>]iと張力変化を同時測定した。対照として同週齢のZuckerleanラット(ZL群)を用いた。3.結果:(1)インスリンの累積投与はNEによる収縮を濃度依存性に弛緩し、平滑筋[Ca^<++>]iを減少させた。内皮保存標本においてインスリンは内皮の[Ca^<++>]iの上昇および静止張力の下降を惹起し、この反応はL-NMMAにより拮抗された。(2)インスリン投与群(I群)の静止時[Ca^<++>]iは有意に低く、KCl、PEによる[Ca^<++>]iの上昇、発生張力の増加も対照群に比べ抑制されていた。(3)ZF群の血圧はZL群に比べ有意に高く、ZF群の大動脈の、KCl、PE、5-HTによる発生張力、[Ca^<++>]iの上昇はZL群に比べ著しく亢進していたが、BAY K 8644を追加投与してもZL群に比ベあまり亢進しなかった。4.結論:インスリンは内皮依存性、非依存性の血管弛緩作用を有する。内皮依存性作用はNOの遊離を介し、内皮非依存性作用は平滑筋細胞内Ca^<++>濃度の減少を伴う。このインスリンの血管弛緩作用は生体で起こり得る程度のインスリン濃度でも認められる。しかし、インスリン抵抗性を有するZucker肥満ラットでは、逆に、種々の血管作動物質に対する張力、平滑筋内[Ca^<++>]iの増加反応が亢進しており、これは血管平滑筋細胞の電位依存性Caチャンネルの機能亢進に関連することが示唆された。
海水中の溶存有機物の光分解過程におけるラジカル類の役割解明

本年度は、昨年度に引き続き1)海水中一酸化窒素(NO)の測定法の開発を行った。すなわち、海水中で光化学的に発生したNOを化学プローブ(4,5-diminofluorescein)を用いて捕捉した後、HPLC-蛍光検出法で測定する方法を開発した。NOと4,5-diaminofluoresceinとの反応速度定数は、室内実験から(6.28±0.45)×10^6M^<-1>s^<-1>と見積もった。この方法は、海水試料5mLを分析に用い、pMからnMレベルのNOを検出可能である。検出限界は25nMであった。この方法を用いて、2)瀬戸内海海水(2008年8月及び10月の豊潮丸航海時に採取)および黒瀬川河川水(2008年10月採取)中NOの光化学的生成速度を求めたところ、それぞれ(5.3-32)×10^<-12>および(0.09.4-300)×10^<-12>Ms^<-1>であった。さらに、亜硝酸や硝酸などの栄養塩、過酸化水素、溶存有機炭素、溶存酸素などを測定した。これらのデータをもとに発生機構に関して考察した結果、海水および河川水中のNOの主な発生源は、亜硝酸イオンであることが明らかとなった。次に、3)上記の海水試料を用いて、ヒドロキシルラジカル(OH)の光化学的発生速度を測定した結果、(167-375)×10^<-12>Ms^<-1>であった。OHの発生源を調べたところ、すべての海水試料において、90%以上のOHは未同定の物質から発生したことが分かった。これはおそらく溶存有機物からの光化学的生成に因ると考えられる。最後に、4)3年間の溶存有機物の光分解過程にかかわるラジカル類の役割解明に関する研究成果をまとめ、2編の論文を作成し(投稿中)、1回の学会発表を行い、また最終報告書を作成した。1.広島湾海水中の溶存有機物(DOM)の光分解過程に関する研究広島湾海水中DOMの主要発生源の一つである植物プランクトンからのDOM発生量及び有機物組成、分子量分布を解明するため、渦鞭毛藻およびラフィド藻を一定期間培養し、培養液中に放出された蛍光性溶存有機物(FDOM)を3次元蛍光マトリクス分析法およびゲルろ過高速液体クロマトグラフィー蛍光検出法(HPLC-FD)により調べた。その結果、渦鞭毛藻からは分子量数十万のタンパク質様物質が、ラフィド藻からは分子量2000-3000の海洋性腐植様物質が、特に多く放出されていることが確認された。次に、これらの有機物に擬似太陽光照射装置を用いて光照射を行い、その光分解過程を調べた。分子量数十万のタンパク質様物質は、速やかに光分解し、低分子量化されることが、一方海洋性腐植様物質は最初は速やかに分解するが、その後分解速度が大きく減少するような、二段階の減少傾向を示すことがわかった。したがって、これら二つのFDOMは異なった光化学特性を有すること、そして海洋性腐植様物質は光分解されにくいため、海水中に残存する可能性が考えられた。従来、腐植物質は微生物による分解も遅いと考えられているため、難分解性DOMとして、海水中DOMの大きな部分を占めている可能性がある。2.海水中一酸化窒素(NO)測定装置の試作本年度は、海水中NOを誘導体化した後、濃縮分離し、HPLC-FD法により測定する装置の開発を行った。すなわち、海水1L中に含まれるNOを市販の蛍光試薬と反応させ、発生した蛍光物質を海水から固相抽出した。HPLCにプレカラムを用いて再濃縮で1000倍程度濃縮した後、HPLC-FDにより定量することにした。現段階は、NOと蛍光試薬との反応率や、濃縮・分離のさいの回収率を検討して、高感度測定が可能なように諸条件を設定しているところである。1.広島湾海水中のOHラジカルの存在状態に関する研究海水中の溶存有機物の光分解過程で、酸化剤として最も重要な役割を果たすと考えられるOHラジカルの存在状態を研究した。2007年春季および夏季に、広島大学生物生産学部の豊潮丸に乗船し、広島湾海水を採取してOHラジカルなどの活性酸素種の分析を行った。溶存有機炭素や亜硝酸などの化学成分も分析し、CTDデータなども併せて、OHラジカルの発生・消失過程を解析した。その結果、OHラジカルの発生速度、消失速度定数、定常状態濃度、寿命は、それぞれ56-146 nMhr^<-1>、260-400 x10^4 s^<-1>、3-9.7 x 10^<-18>M、0.23-0.38μsであった。これらの値は、米国の研究者が別の分析法で測定した値とほぼ同レベルであった。次にOHラジカルの発生源を調べたところ、亜硝酸、過酸化水素、硝酸などの光分解による寄与は、9-75%であり、残りの25-91%は未同定の物質(おそらく腐植物質などの溶存有機物)から発生することが明らかとなった。特に広島湾奥部の太田川河口域では、未同定の物質からの寄与が大半を占めることから、河川から供給される物質がラジカル発生過程に深く関与することが示唆された。(現在論文作成中)2.海水中過酸化水素および一酸化窒素の新規分析法の開発

海水中の過酸化水素の新規分析法を開発した。開発したのはフェントン反応を利用したHPLC分離一蛍光分析法であり、検出感度は数nMと高感度で船上での分析が可能である。従来の分析法と比較したところ、分析値がほぼ1対1に対応した。論文を作成し,現在投稿中である。次に、海水中一酸化窒素に関して、これを誘導体化した後、濃縮分離し、HPLC-FD法により測定する装置の開発を前年度に引き続き行った。本年度は、高感度測定が可能なように諸条件を設定し、海水への分析応用性を確認した。本年度は、昨年度に引き続き1)海水中一酸化窒素(NO)の測定法の開発を行った。すなわち、海水中で光化学的に発生したNOを化学プローブ(4,5-diminofluorescein)を用いて捕捉した後、HPLC-蛍光検出法で測定する方法を開発した。NOと4,5-diaminofluoresceinとの反応速度定数は、室内実験から(6.28±0.45)×10^6M^<-1>s^<-1>と見積もった。この方法は、海水試料5mLを分析に用い、pMからnMレベルのNOを検出可能である。検出限界は25nMであった。この方法を用いて、2)瀬戸内海海水(2008年8月及び10月の豊潮丸航海時に採取)および黒瀬川河川水(2008年10月採取)中NOの光化学的生成速度を求めたところ、それぞれ(5.3-32)×10^<-12>および(0.09.4-300)×10^<-12>Ms^<-1>であった。さらに、亜硝酸や硝酸などの栄養塩、過酸化水素、溶存有機炭素、溶存酸素などを測定した。これらのデータをもとに発生機構に関して考察した結果、海水および河川水中のNOの主な発生源は、亜硝酸イオンであることが明らかとなった。次に、3)上記の海水試料を用いて、ヒドロキシルラジカル(OH)の光化学的発生速度を測定した結果、(167-375)×10^<-12>Ms^<-1>であった。OHの発生源を調べたところ、すべての海水試料において、90%以上のOHは未同定の物質から発生したことが分かった。これはおそらく溶存有機物からの光化学的生成に因ると考えられる。最後に、4)3年間の溶存有機物の光分解過程にかかわるラジカル類の役割解明に関する研究成果をまとめ、2編の論文を作成し(投稿中)、1回の学会発表を行い、また最終報告書を作成した。
腎近位尿細管におけるNa^+依存性グルコース輸送体(SGLT1, SGLT2)の発現

腎近位尿細管、小腸粘膜におけるグルコースの再吸収は、Na^+依存性グルコース輸送体(管腔膜)による細胞内への“登り坂輸送"とNa^+非依存性グルコース輸送体(側底膜)を介する血管側への“下り坂輸送"の2段階上皮膜輸送によって行われる。腎近位尿細管の管腔膜には2種類のNa^+依存性グルコース糖輸送体アイソフォーム(SGLT1,SGLT2)が、側底膜には、2種類のNa^+非依存性グルコース糖輸送体アイソフォーム(GLUT1,GLUT2)が同定されている。これらの糖輸送体の欠損、発現量不足、機能不全は、糸球体濾液中のグルコース再吸収不良を引起こし糖尿の原因になる。本年は、Na^+非依存性グルコース輸送体アイソフォーム(GLUT1)の発現誘導を、新生児期ラットの成長に合わせて調べた。初めに、ラットGLUT1 mRNAに対する特異的cDNAプローブを作成し、生後5,10,15日齢ラットの腎皮質から抽出したRNAにおいて、ノーザンプロット解析を行った。GLUT1 mRNA発現量の成長に伴う変化は、100%(5d),118%(10d),132%(15d)であった。糖質コルチコイドによる発現促進作用を調べるため、4,14日齢ラットにBetamethasone(60μq/100g body wt.)を腹腔内投与し、24時間後に腎臓を摘出した。GLUT1 mRNAは、5日齢で3.8倍に増加し、15日齢では2.6倍に増加した。昨年の結果と総合すると、ラット腎Na^+依存性/非依存性グルコース輸送体遺伝子は、新生児初期(5日齢)にすでに発現し、その発現量は成長とともに増加した。Betamethasone投与は、新生児期ラット腎皮質のSGLTl, SGLT2, GLUT1 mRNAsの発現誘導に効果があり、未成熟な近位尿細管の多い5日齢ラット腎において特に発現誘導効果が大きかった。腎皮質(近位尿細管)におけるNa^+依存性グルコース輸送体(SGLT1,SGLT2)の発現を、mRNAと蛋白レベルで調べた。最初に、新生児期のWistarラットを用い、成長に比例するSGLT1とSGLT2 mRNAの発現量を調べた。SGLT1とSGLT2 mRNAの発現量(15日齢)は、5日齢ラットに比べ、それぞれ6倍と2倍に増加した。この発現が、糖質コルチコイドの作用を受けるかどうかを調べるために、鉱質コルチコイドの作用が弱い合成ホルモンbethamethazone (60μg/100g,i.p.)を5日齢と15日齢ラットに投与し、24時間後の変化を調べた。SGLT1とSGLT2 mRNAの発現量(5日齢)は、それぞれ9倍と6倍に増加し、SGLT1とSGLT2 mRNAの発現量(15日齢)は、ともに約2倍に増加した。以上の結果から、新生児期のSGLT1とSGLT2 mRNAの発現量は、日齢とともに増加し、部分的に糖質コルチコイドの調節を受けることが明らかになった。さらに、SGLT1とSGLT2の蛋白レベルでの発現量を調べるため、ラットSGLT1とSGLT2のc末端の一部を使い、抗体(ウサギとマウス)を作製した。抗体価はそれぞれ5倍と10倍であった。次年度(平成10年)に、糖尿病併発時の腎近位尿細管におけるSGLT1とSGLT2の発現量の変化を調べる予定である。

腎近位尿細管、小腸粘膜におけるグルコースの再吸収は、Na^+依存性グルコース輸送体(管腔膜)による細胞内への“登り坂輸送"とNa^+非依存性グルコース輸送体(側底膜)を介する血管側への“下り坂輸送"の2段階上皮膜輸送によって行われる。腎近位尿細管の管腔膜には2種類のNa^+依存性グルコース糖輸送体アイソフォーム(SGLTl,SGLT2)が、側底膜には、2種類のNa^+非依存性グルコース糖輸送体アイソフォーム(GLUT1,GLUT2)が同定されている。これらの糖輸送体の欠損、発現量不足、機能不全は、糸球体濾液中のグルコース再吸収不良を引起こし糖尿の原因になる。本年は、Na^+非依存性グルコース輸送体アイソフォーム(GLUT1)の発現誘導を、新生児期ラットの成長に合わせて調べた。初めに、ラットGLUT1 mRNAに対する特異的cDNAプローブを作成し、生後5,10,15日齢ラットの腎皮質から抽出したRNAにおいて、ノーザンブロット解析を行った。GLUT1 mRNA発現量の成長に伴う変化は、100%(5d),118%(10d),132%(15d)であった。糖質コルチコイドによる発現促進作用を調べるため、4,14日齢ラットにBetamethasone(60μg/100g body wt.)を腹腔内投与し、24時間後に腎臓を摘出した。GLUT1 mRNAは、5日齢で3.8倍に増加し、15日齢では2.6倍に増加した。昨年の結果と総合すると、ラット腎Na^+依存性/非依存性グルコース輸送体遺伝子は、新生児初期(5日齢)にすでに発現し、その発現量は成長とともに増加した。Betamethasone投与は、新生児期ラット腎皮質のSGLT1,SGLT2、GLUT1 mRNAsの発現誘導に効果があり、未成熟な近位尿細管の多い5日齢ラット腎において特に発現誘導効果が大きかった。
半導体低次元構造における励起子分子の局在化と光学利得の生成機構

本研究では、ワイドギャップ半導体の中でも最も大きな励起子分子効果が期待できるZnS系量子井戸構造を設計・作製し、低次元系励起子分子の輻射再結合過程を利用した紫外半導体レーザ構造の作製を試みた。特に、励起子分子の結合エネルギーと局在化の度合いを定量的に評価し、励起子分子に対する量子閉じ込め効果の最適化と励起子分子の局在化が光学利得生成に与える効果を明らかにすることを目的とした。まず、減圧有機金属気相成長法により、混晶量子井戸層のCdの組成比と量子井戸層幅を変化させて作製した一連のCd_xZn_<1-x>S-ZnS量子井戸レーザ構造に対して、励起子分子発光の励起スペクトルの測定を行った。その結果、励起子分子の2光子吸収過程が明瞭に観測され、励起子共鳴とのエネルギー差より励起子分子の結合エネルギーを定量的に評価した。現在までに、その結合エネルギーとして最大値約34meVが得られた。この値はZnS薄膜における励起子分子結合エネルギー(8.0meV)の約4倍であり、室温における熱エネルギー(26meV)を上回っている.次に、一連の試料を用いて共振器構造を作製し、光励起下でのレーザ発振特性を測定したところ、Cdの組成比がx=0.22、井戸層幅がl.6nmの試料において約240K程度まで励起子分子の輻射再結合過程に基づいた誘導放出を観測することができた。この上限温度は、これまでに励起子分子による誘導放出として報告されているものの中では最も高い。また、励起子分子による誘導放出が生じている場合、そのしきい値と励起子分子の局在化の度合いはほとんど無関係であることが明らかにされた。従って、励起子分子による誘導放出機構を室温においても達成するためには、今後、その結合エネルギーの更なる増大(少なくともLOフォノンエネルギー(40meV)以上)が必要不可欠であると考えられる。励起子分子の輻射再結合過程、即ち、励起子分子を始状態として励起子を終状態とした光学遷移過程は本来的に反転分布状態にあり、同時にその過程には極めて大きな振動子強度が期待される。従って、この励起子分子の輻射再結合過程を利用することにより、高性能かつ高効率なレーザダイオードの実現が期待される。減圧有機金属気相成長法により作製した一連のCd_xZn_<1-x>S-ZnS量子井戸レーザ構造に対して、励起子分子の2光子吸収過程の測定を行った結果、現在までに、その結合エネルギーとして最大値約34meVが得られた。この値はZnS薄膜における励起子分子結合エネルギー(8.6meV)の約4倍であり、室温における熱エネルギー(26meV)を上回っている。また、励起子分子の2光子共鳴位置により、観測された励起子分子発光は局在状態を介したものであることが明らかにされた。

さらに、この試料を用いて共振器構造を作製し、光励起下でのレーザ発振特性を測定したところ、約200K程度まで励起子分子の輻射再結合過程に基づいた誘導放出を観測することができた。この上限温度は、これまでに励起子分子による誘導放出として報告されているものの中では最も高い。励起子分子による誘導放出を室温においても達成するためには、今後、その結合エネルギーの更なる増大(目標値40meV以上)と局在化の制御との双方から検討する必要があるものと考えられる。本研究では、ワイドギャップ半導体の中でも最も大きな励起子分子効果が期待できるZns系量子井戸構造を設計・作製し、低次元系励起子分子の輻射再結合過程を利用した紫外半導体レーザ構造の作製を試みた。特に、励起子分子の結合エネルギーと局在化の度合いを定量的に評価し、励起子分子に対する量子閉じ込め効果の最適化と励起子分子の局在化が光学利得生成に与える効果を明らかにすることを目的とした。まず、減圧有機金属気相成長法により、混晶量子井戸層のCdの組成比と量子井戸層幅を変化させて作製した一連のCd_xZn_<1-x>S-ZnS量子井戸レーザ構造に対して、励起子分子発光の励起スペクトルの測定を行った。その結果、励起子分子の2光子吸収過程が明瞭に観測され、励起子共鳴とのエネルギー差より励起子分子の結合エネルギーを定量的に評価した。現在までに、その結合エネルギーとして最大値約34meVが得られた。この値はZnS薄膜における励起子分子結合エネルギー(8.0meV)の約4倍であり、室温における熱エネルギー(26meV)を上回っている。次に、一連の試料を用いて共振器構造を作製し、光励起下でのレーザ発振特性を測定したところ、Cdの組成比がx=0.22、井戸層幅が1.6nmの試料において約240K程度まで励起子分子の輻射再結合過程に基づいた誘導放出を観測することができた。また、励起子分子による誘導放出が生じている場合、そのしきい値と励起子分子の局在化の度合いはほとんど無関係であることが明らかにされた。従って、励起子分子による誘導放出機構を室温においても達成するためには、今後、その結合エネルギーの更なる増大(少なくともLOフォノンエネルギー(40meV)以上)が必要不可欠であると考えられる。
がん代謝とエピゲノムコード是正による血管新生阻害薬の耐性克服

がん細胞の薬剤耐性にはその特異的代謝の関与が示唆されている。本研究では、HDAC阻害剤であるトリコスタチンA(TSA)がエピジェネティック調節によって腎細胞癌(RCC)の偏った代謝を改善できるか、またその代謝シフトがRCCの第一選択薬であるスニチニブ(SU)の薬剤耐性に寄与するかどうか検討した。その結果、TSAはRCCの酸化的リン酸化を増加させ、アミノ酸や核酸の産生を抑制した。電子伝達系の複合体I阻害剤であるメトホルミンは、SUとTSAの増殖に対する併用効果を有意に減弱した。以上より、エピジェネティック調節薬はがん細胞の代謝調節により細胞死を誘導する可能性が示された。本研究は血管新生阻害薬の耐性化の機構にがん特異的な代謝変化が寄与する可能性を確かめ、またその克服を目指すことを目的としている。薬物抵抗性の高い腎細胞がんに対して検討を行った。まずは非腫瘍近位尿細管由来細胞株(HK-2)を対照として、腎細胞がん細胞株(786-O)の代謝状態を比較した。がん細胞では一般に解糖系が亢進して代謝回転が高まるため、糖取込能が高いとされる。Intactな細胞における糖取込みを2-DGアッセイで確認した結果、786-OはHK-2の1.5倍程度に有意に糖取込みを増加させた。また、細胞内代謝物の一斉分析するための条件検討を行い、786-O細胞で約50種の代謝物を検出する系を立ち上げた。一方、代謝の異常はエピゲノムの異常に起因するという観点からエピジェネティック治療薬が抗がん薬抵抗性を解除する可能性が期待されている。そこで現在臨床で用いられるvolinostatと同様に強力なヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を持つtrichostain A(TSA)を用いてSUとの併用効果を検討した。その結果、SU単独時と比較してTSAの併用により増殖抑制やアポトーシス誘導作用が強まった。併用効果は相加的であったが、この傾向は786-Oを含む3つのヒト腎細胞がん株で同様であり、確かな効果と考えられた。TSAによるアセチル化修飾を受ける因子にがん抑制遺伝子をコードするp53が存在するが、TSA群では確かにアセチル化p53(活性化体)の発現が高まり、p53により転写促進される下流経路の亢進が確認された。p53は代謝調節にも関係が深い因子である。そこでTSAによるp53誘導を期待し、CE-TOFMSを用いて24時間薬物曝露後の786-Oの細胞内代謝物の一斉分析を実施した。その結果、TSAは解糖系・アミノ酸代謝・ヌクレオチド代謝を全体的に抑制する傾向を示した。Sunitnib耐性株での検討は当初もっと早期に取り掛かる予定であったが、予想よりも耐性化が生じづらく、H27度は検討できなかった。現在、sunitnib長期曝露下で順調に育ちつつあるため、H28年度にまとめて検討する。がん細胞の特徴的な代謝変化はヒストン修飾等のエピゲノム変化により実現する可能性が報告されている。逆にエピジェネティック薬を活用してがん代謝を調節できるかもしれない。前年度までに腎細胞がんに対するスニチニブ(SU)耐性化に対してhistone deacetylase (HDAC)阻害薬のトリコスタチンA(TSA)がSU感受性を高めることを確認したが、H28年度は主にメタボローム解析を中心に検討した。まず細胞内代謝物の一斉分析を行い、多変量解析を行った。非腫瘍細胞であるHK-2と腎細胞がんの786-Oとで比較したところ、intactな状態では明らかな代謝組成の差異がみられた。786-OにおいてはTSA曝露によってその濃度依存的に代謝組成が変化した。すなわちTSAは全体的な傾向としてはがん細胞に多い嫌気的な代謝からミトコンドリア依存性の酸化的リン酸化の向きにシフトさせた。ミトコンドリア酸化的リン酸化の寄与をcomplex I阻害剤(metformin)によって確認したところ、TSAとの併用効果をみとめたSUの増殖抑制は有意に減弱した。一方、このようなTSAの作用が、TSAにより発現制御を受ける遺伝子変化とどのように関係するのか確認するため、786-OのTSA曝露後のトランスクリプトーム解析とメタボローム解析の結果を比較した。発現が5倍以上変動した遺伝子群の中で代謝に関係する因子は11遺伝子に絞られ、その中でエネルギー産生に関わるミトコンドリアクレアチンキナーゼ(mtCK)に着目した。mtCKはTSAで20倍程度上昇していた。RNAiによりmtCKをノックダウンし薬物感受性への影響を確認したところ、やはり併用による増殖抑制作用が有意に減弱した。以上の結果より、TSAはがん細胞の代謝を調節し、このような代謝変化がSU感受性増強作用の一機序となることが確認された。

H27年度の検討より、SUの併用薬としてHDAC阻害薬のTSAが候補に挙がった。28年度はこれを受けて以下の検討を実施する。1)実際にSUと併用した際のメタボロミクスを実施し、アポトーシス感受性に対する代謝変化の関与を検証する。2)高容量のSU曝露により樹立したSU耐性細胞株に対して、SUとTSAの併用効果を増殖、アポトーシス、代謝における変化から確認する3)TSAの作用によって変化する遺伝子群とメタボローム解析により変動する代謝経路の関係性について、クラスター解析等を駆使して集約的に評価し、前年度に観測されたp53のアセチル化誘導に起因する経路を含め、TSAの作用点となるターゲット経路を客観的・定量的に探索する。4)3)と関連して、他のHDAC阻害薬の活用性や他の血管新生阻害薬への応用性を含めて耐性克服手段を提案する。応用薬理学