hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
河床地形動力学のための水深平均流体モデルの構築

今年度は,主として浸透流によるガリの形成に関する実験と,新しい掃流砂量式を用いた砂州の線形・弱非線形安定解析を行った.浸透流によるガリ群の形成実験では,これまでプラスチック粒子を用いていたが,実際の砂を用いた実験を行った.プラスチック粒子の場合,浸透流量が大きく,ガリの発生・発達が急速に進むのに対して,実際の砂を用いた実験では発達速度が遅く,ガリ頭部の分岐が頻繁に生じることが明らかとなった.河川の掃流砂量を見積もる際に良く用いられるのは,掃流層下面で限界掃流力に達しているというバグノルドの仮説である.横断方向に勾配を有する河床上ではこの仮説が成り立たないことが近年指摘されている.バグノルドの仮説を用いると横断方向の過小勾配の影響が過大に評価されるため実際の土砂輸送量と一致しなくなる.横断方向に局所勾配を有する河床上の横断方向掃流砂量が重要となる砂州の安定解析では,これは致命的なエラーを与える可能性がある.そこで,新たに提案された横断方向に河床勾配を有する場合の横断方向掃流砂量式と水深平均流体モデルを用いて,砂州の線形および非線形安定解析を行った.新たに提案された掃流砂量式はベクトル形式で書かれており,解析に用いるには扱い難いという欠点がある.そこで内挿式を作り,更に微小勾配の周りにテーラー展開することによって解析に使いやすい掃流砂量式を導いた.解析の結果,これまで余り精度良く予測できなかった砂州の波長や位相速度の予測精度を向上させることが可能となった.河川流や海岸に発生する沿岸流,台地の中を流れる地下水流など,広い領域における表面流や地下水流は,水平方向スケールに比較して水深方向スケールが十分小さいことから,それらの解析には,流れの方程式を水深方向に平均した,いわゆる水深積分型の浅水流方程式を用いることが多い.砂州やガリーなど,水深に比較して十分大きな水平方向スケールを持った多くの現象は,浅水流方程式を用いて十分記述することが可能であるものの,デューンやリップルといった,水深やそれより小さい水平方向スケールを持った現象を記述することはできない.浅水流方程式では,水深方向の流れやその分布,加速度,圧力分布などを無視しているため,水深スケールの流れの構造が重要となる現象を説明することができないのである.そこで当該年度は,浅水流方程式では通常一定と仮定されている浅水流方程式に流下方向の流速分布の影響を取り入れるため,水深方向に線形の流速分布を仮定し,それを積分することで鉛直方向の加速度と非静水圧分布の影響を取り入れた.提案した式を用いた数値シミュレーションを行い,対称な孤立波状の河床上の流れを再現することによって,提案式の有効性を検証した.実際の常流では,流れは孤立波の上流側で加速し下流側で減速するが,その際,加速・減速に若干のラグが生じるため,流速のピークは河床高さのピークより若干下流で発生する.従来の浅水流方程式を用いた場合,孤立波が対称であれば,加速・減速もほぼ対称に生じるが,提案された式を用いた数値計算では,このようなラグを良好に再現することができた.また,矩形のバンプ状の突起を有する河床上においても同様の数値シミュレーションを行い,流速分布がバンプの上下流で非対称になることを良好に再現することができた.表面が平坦でわずかに傾いた不透水層上に一様な厚さの透水層が載っているような場合,透水層内には勾配方向に定常な浸透流が発生する.このような浸透流は通常3次元のダルシー則で表されるが,特に流れ方向の長さスケールが透水層の厚さ方向長さスケールに比較して卓越しているような場合,流れは3次元のダルシー則を水深方向に積分し平均を取った方程式によって表される.これまで河川流や表面流について発展させてきた水深平均流体モデルの概念を浸透流に適用することによって,薄い浸透層内の浸透流を表現する方程式を導いた.これを用いれば浸透層内の定常な浸透流が解析的に簡単な式形で表される.浸透層の下流端が崖状になっている場合,下流端に生じた湧水によって侵食を受けた崖部は上流方向に移動していく.この際,活発な湧水が部分的に生じ崖部が選択的に侵食されるような場合,ガリ状の地形が形成される.ガリ状の地形はある一定の間隔を持って形成され,この間隔が地形スケールの最小単位となっている.上述の水深平均流体モデルを用いて得られた定常流を基本解とする線形安定解析を行い,ガリ間隔を理論的に説明できる数学モデルを構築した.それによると湧水侵食モデルに拡散型の項を付加することによって有限なガリ間隔が得られることが明らかとなった.このような拡散型の項は湧水による斜面侵食の際に斜面形状が曲率の大きな凹部になると侵食されにくくなり,逆に曲率の大きな凸部になると侵食されやすくなるという物理機構に対応していると考えられる.この仮説を検証するために実験室における模型実験を行い,実際に現れるガリ間隔を測定した.拡散項の大きさを崖部の高さと斜面方向の重力加速度で表すと,理論は実際のガリ間隔を上手く説明できることが示され,仮説が妥当である可能性が示された.今年度は,主として浸透流によるガリの形成に関する実験と,新しい掃流砂量式を用いた砂州の線形・弱非線形安定解析を行った.浸透流によるガリ群の形成実験では,これまでプラスチック粒子を用いていたが,実際の砂を用いた実験を行った.

プラスチック粒子の場合,浸透流量が大きく,ガリの発生・発達が急速に進むのに対して,実際の砂を用いた実験では発達速度が遅く,ガリ頭部の分岐が頻繁に生じることが明らかとなった.河川の掃流砂量を見積もる際に良く用いられるのは,掃流層下面で限界掃流力に達しているというバグノルドの仮説である.横断方向に勾配を有する河床上ではこの仮説が成り立たないことが近年指摘されている.バグノルドの仮説を用いると横断方向の過小勾配の影響が過大に評価されるため実際の土砂輸送量と一致しなくなる.横断方向に局所勾配を有する河床上の横断方向掃流砂量が重要となる砂州の安定解析では,これは致命的なエラーを与える可能性がある.そこで,新たに提案された横断方向に河床勾配を有する場合の横断方向掃流砂量式と水深平均流体モデルを用いて,砂州の線形および非線形安定解析を行った.新たに提案された掃流砂量式はベクトル形式で書かれており,解析に用いるには扱い難いという欠点がある.そこで内挿式を作り,更に微小勾配の周りにテーラー展開することによって解析に使いやすい掃流砂量式を導いた.解析の結果,これまで余り精度良く予測できなかった砂州の波長や位相速度の予測精度を向上させることが可能となった.
気管支喘息におけるGS-Xポンプの役割

気管支喘息はマスト細胞、好酸球、リンパ球等の多くの細胞が関与する気道の炎症性疾患である。ロイコトリエン(LT)は気道平滑筋の収縮、血管透過性の亢進による組織内浮腫、粘液の分泌亢進など種々の生理活性を示して気道炎症の惹起に密接に関与する。なかでもグルタチオンが抱合したLTC4とLTD4,LTE4はアナフィラキシーの遅発反応性物質と呼ばれ、微量でも気管支平滑筋を長時間に渡って収縮させる作用を持つことが知られている。GS-Xポンプ(glutathione S-conjugate export pump)は細胞膜に存在するATP依存性の排出ポンプであり、多剤耐性関連タンパク質(multidrug resistance-associated protein : MRP)MRP1遺伝子がヒトGS-Xポンプの一つをコードしている。GS-Xポンプはその生化学的特徴としてグルタチオン抱合体であるロイコトリエンC4を内因性基質として同ポンプより排出する。そこで我々はロイコトリエンを放出するポンプであるMRPが気管支喘息の病態に関与しているという仮説をたて、昨年度に引き続き気管支喘息患者の気管支粘膜組織におけるMRPの発現およびその局在を免疫組織染色で検討した。MRP1の発現は気道上皮、漿液腺房細胞、そして好酸球やマスト細胞に認められた。喘息の病態においてロイコトリエン産生に非常に関与している好酸球やマスト細胞にMRPの発現が認められた事は非常に興味深いものと考える。さらに我々は現在、MRPノックアウトマウスおよびワイルドマウスを卵白アルブミン(OVA)にて腹腔内(i.P. injection)感作した後、OVA吸入をさせ気道過敏性を非侵襲的体プレチスモグラフ法により評価する実験を施行中である。さらに組織学的に気道のリモデリングの評価や肺胞洗浄液中のロイコトリエン量の違いなども検討する予定である。これらのデータがでればより喘息の病態におけるMRPの関与が明らかにされるものと思われる。GS-Xポンプ(glutathione S-conjugate export pump)は細胞膜に存在するATP依存性の排出ポンプであり、グルタチオン抱合された抗癌剤などを排出するポンプとして知られている。その分子解明に関しては、Coleらによりヒト肺癌細胞アドリアマイシン耐性株から分子量190KDaの多剤耐性関連タンパク質(multidrug resistance-associated protein : MRP)が見い出され、MRP1遺伝子がヒトGS-Xポンプの一つをコードしていることが明らかにされている。そしてGS-Xポンプはその生化学的特徴としてグルタチオン抱合体であるロイコトリエンC4を内因性基質として同ポンプより排出する。そこで、本研究ではこのGS-XポンプがロイコトリエンC4を排出することで気管支喘息の病態に関与しているという仮説をたて、気管支喘息患者の気管支粘膜組織におけるMRP 1の発現およびその局在を免疫組織染色により検討した。経気管支鏡的に気管支粘膜生検を施行し、採取された気管支喘息患者群12症例および健常者コントロール群の病理組織におけるMRP 1の発現を見たところ、気管支喘息患者群の気道上皮細胞および粘液腺房細胞、そしてマスト細胞などにMRP 1の発現が認められた。GS-Xポンプに関する研究は国内外の多くの施設で精力的な研究がなされているが、その多くが抗癌剤耐性および細胞内グルタチオン解毒機構との関連であり、気管支喘息症例のヒト気管支粘膜組織におけるGS-Xポンプの発現および機能に関する報告はない。今年度は気管支粘膜生検の病理組織で検討したが、今後はさらに喘息重責発作での剖検症例も用いてさらにMRP 1の発現の局在を詳細に検討する予定である。また現在、喘息モデルとしてMRP 1ノックアウトマウスを卵白アルブミン(OVA)で吸入感作し、気道過敏性および気道形態におよぼす影響をワイルドマウスと比較検討する実験も計画しており、臨床検体、実験動物モデルの両面から気管支喘息におけるMRP1の発現および機能的役割を究明することを次年度の目標とする。

さらに我々は現在、MRPノックアウトマウスおよびワイルドマウスを卵白アルブミン(OVA)にて腹腔内(i.P. injection)感作した後、OVA吸入をさせ気道過敏性を非侵襲的体プレチスモグラフ法により評価する実験を施行中である。さらに組織学的に気道のリモデリングの評価や肺胞洗浄液中のロイコトリエン量の違いなども検討する予定である。これらのデータがでればより喘息の病態におけるMRPの関与が明らかにされるものと思われる。
確率分布の無限分解可能性とカーネルベイズ推論

機械学習でカーネル法とベイズ推論を組み合わせたカーネルベイズ推論が研究されている.カーネルベイズ推論は確率分布の再生核ヒルベルト空間における特徴量である「カーネル平均」を推論する.確率分布からカーネル平均への写像が単射となる正定値カーネルを特性的カーネルという.特性的カーネルはカーネル平均を利用するアルゴリズムで重要な役割を果たす.特性的カーネルと無限分解可能分布の関係を明らかにする研究成果として,有界連続で対称な無限分解可能密度関数は特性的カーネルとして使えることを示した.さらにカーネル法の効率的計算を可能にする関係式にカーネルトリックがあるが,これを拡張した畳み込みトリックを提案した.確率分布を特徴写像の平均により再生核ヒルベルト空間(RKHS)に写像させた元をカーネル平均と呼ぶ.確率分布からカーネル平均への写像はRKHSを一意に定める正定値カーネルに依存する.カーネル平均写像が単射のとき,正定値カーネルを特性的カーネルと呼ぶ.特性的カーネルのとき,カーネル平均は確率分布を一意に定め,カーネル平均はRKHS内で確率分布の表現を与える.機械学習分野のカーネル法では,特性的カーネルを利用した様々なアルゴリズムが提案されている.本研究では,正定値カーネルが特性的カーネルとなるための条件を研究する.研究結果として,対称無限分解可能分布の密度関数から作られる平行移動不変カーネルは特性的カーネルになることをLevy Khintchine公式の視点から与えた.これにより\alpha-stable kernel,様々な部分クラスを持つgeneralized hyperbolic kernelは特性的カーネルになることが直ちに分かる.新しい特性的カーネルの生成方法を無限分解可能分布の視点で与えた.確率モデルのカーネル平均について,確率モデルとカーネル平均が同じ密度関数形になる共役カーネルを概念化した.通常カーネル平均は,データ上の特徴写像の線形和で推定量を構成するが,確率モデルのカーネル平均を利用した推定量を構成することを提案した.確率モデルのカーネル平均に関するRKHSノルムの計算方法を与え,確率モデルのカーネル平均を一般的に使えるようにした.機械学習におけるカーネル法では,確率分布の処理にカーネル平均を用いたアルゴリズムが研究されている.カーネル平均は,確率分布の特徴写像による再生核ヒルベルト空間(RKHS)内での平均で定義され,データの特徴量に対して,確率分布の特徴量を考える自然な拡張である.確率分布からカーネル平均への写像が単射となる正定値カーネルを特性的カーネルと呼ぶ.特性的カーネルは,カーネル平均により確率分布を一意に定めることが可能という意味で重要な性質である.カーネル平均表現でベイズ推論を行うカーネルベイズ推論でも,特性的カーネルを使うことを基礎とする.有界連続な対称無限分解可能分布の密度関数から作られる正定値カーネルをConvolutionally Infinitely Divisible (CID)カーネルと呼ぶ.CIDカーネルは特性的カーネルである.本年度はCIDカーネルの(加法,積,畳み込み演算による)閉構造の性質を明らかにする研究を行った.また,2つのRKHS関数f,gが特徴量の線形結合で表されるとき,fとgのRKHS内積はkernel trickにより容易に計算可能であるが,f,gが無限分解可能分布のカーネル平均の線形結合で表される関数形でもRKHS内積計算が可能となるようなconvolution trickの研究を行った.CIDカーネルを持つ畳み込み半群について,convolution trickが成り立つ.これらの数学的事実とともに,状態空間モデルにおけるノンパラメトリックカーネルベイズスムージングアルゴリズムの開発に成功した.CIDカーネルの集合について,(加法,積,畳み込み演算による)閉構造の性質を明らかにすることは重要である.Kernel Trickの拡張であるConvolution Trickを明確に与えておくこともカーネル法の基礎として重要である.また状態空間モデルにおけるノンパラメトリックカーネルベイズスムージングアルゴリズムを開発することに成功し,ソフトウェアへの実装も行った.このアルゴリズムは,セミパラメトリックカーネルベイズスムージングアルゴリズムを開発するために足がかりとなり重要である.d次元ユークリッド空間上で有界連続な無限分解可能分布の密度関数から作られる正定値カーネルを畳み込み無限分解可能(convolutionally infinitely Divisible; CID)カーネルと定義した.CIDカーネルは特性的カーネルであることを示した.CIDカーネルの全体は,畳み込み演算で閉であり,しかし和や積で閉でないことを示した.d次元ユークリッド空間上のCIDカーネルの範囲でカーネルトリック(kernel trick)を拡張した畳み込みトリック(convolution trick)を提案した.畳み込みトリックの計算が容易となる共役カーネル(conjugate kernel)に注目し,それを概念化した.共役カーネルを一般化した吸収的カーネルと被吸収的カーネルを定義した.吸収的かつ被吸収的カーネルは共役カーネルに特別化される.以上の具体例として,正規分布族,コーシー分布族,ラプラス分布族,alpha-安定分布族,一般化双曲型分布族(正規逆ガウス分布族,variance Gamma分布族を含む)の場合の畳み込みトリックを与えた.これらの研究成果は,カーネル法と無限分解可能分布を組み合わせた様々なアルゴリズムを生み出すための基礎となる.研究成果はJournal of Machine Learning Research (JMLR)に掲載された.この結果を使い,無限分解可能分布とカーネルベイズ推論を組み合わせたセミパラメトリックカーネルベイズ推論に基づく状態空間モデルのフィルタリングアルゴリズムを提案した.さらに畳み込みトリックと無限分解可能分布を組み合わせたカーネルベイズ推論をMatlab上で計算するためのソフトウェアを作成した.今後の展開では,畳み込みトリックを利用し様々なアルゴリズムを開発し研究を深化させることがある.機械学習でカーネル法とベイズ推論を組み合わせたカーネルベイズ推論が研究されている.カーネルベイズ推論は確率分布の再生

核ヒルベルト空間における特徴量である「カーネル平均」を推論する.確率分布からカーネル平均への写像が単射となる正定値カーネルを特性的カーネルという.特性的カーネルはカーネル平均を利用するアルゴリズムで重要な役割を果たす.特性的カーネルと無限分解可能分布の関係を明らかにする研究成果として,有界連続で対称な無限分解可能密度関数は特性的カーネルとして使えることを示した.さらにカーネル法の効率的計算を可能にする関係式にカーネルトリックがあるが,これを拡張した畳み込みトリックを提案した.2014年度は,2014年10月に統計数理研究所から電気通信大学に異動したことから,環境設備構築,専攻運営,研究室運営,外部研究会運営,全国大会運営,授業準備と研究以外に多くの時間を費やすことになった.研究課題についてすでに構想や初歩結果が得られていたことから,何とかスムースに研究遂行を実施することができた.今年度、状態空間モデルにおけるノンパラメトリックカーネルベイズスムージングを開発することに成功したが,新たにパラメトリックモデルと組み合わせるカーネルベイズ則(モデルベースカーネルベイズ則)を提案する研究を行う.これを提案することで様々な条件下でセミパラメトリックカーネルベイズ推論が適用可能となる.カーネルベイズの枠組みを豊富にする研究を行う.状態空間モデルにおけるセミパラメトリックカーネルベイズ推論を提案する.機械学習、応用数学今後の研究計画として,共役カーネルを利用した確率モデルのカーネル平均のアルゴリズム開発を行う.アルゴリズムをソフトウェアに実装し,数値実験の検証を行う.また今年度の結果は,ユークリッド空間上の無限分解可能分布に関する話題であったが,これらの一般化を考えたい.2014年度に統計数理研究所から電気通信大学に所属がうつり,大学運営と他の研究費の執行のため,国内・国際会議への参加,共同研究者との打ち合わせ時間が限られ,旅費が減ったことが挙げられる.今年度は,次年度使用額とともに,国内・国際会議への参加,共同研究者との打ち合わせ旅費用に研究費を充てたいと計画している.
固体NMRを用いたヌクレオソーム中のヒストンの動的構造解析

ヌクレオソームは染色体の最小単位で、ヒストン4種類8分子にDNAが巻きついて形成されている。その構造決定は既に行われているが、DNAの転写にかかわる非常に重要な領域であるヒストンテールの構造は示されなかった。本研究では固体NMRを用いてヌクレオソーム中のヒストン分子の動的な構造解析をおこなった。ヒストンテールはランダムコイル構造をとって運動していることが分かった。それはクロマチン形成下でも、さまざまな機能発現を可能にしていると考えられた。固体NMRを用いたヌクレオソーム(分子量200 kDa)中のヒストン(分子量110 kDa)の動的な構造解析をおこなっている。固体NMR法では、試料調製において結晶化、可溶化が必要なく、溶液NMR法のような分子量の限界(20 kDa)は存在しない。そこで、これまで研究で用いられてきたX線結晶構造解析では解析できない運動性の大きい領域や溶液NMRでは測定できない大きな分子量をもつヌクレオソームについて、固体NMR法を適用し、ヌクレオソーム中のヒストンの運動性の高い領域の構造の解析を行う。その運動性の高い領域こそが、DNAの転写にかかわる非常に重要な領域で、その構造を解析し、機能発現機構の解明することを目指している。本年度は超分子構造体(ヌクレオソーム)の動的構造解析のために適した試料調製法の確立に重点をおいて研究を行った。^<13>C,^<15>N標識したH2Aを作成し、標識していない他のヒストンを加えて、ヒストン8量体を作成し、さらにDNA146塩基対を巻いてヌクレオソームを作成した。そして、ヌクレオソーム約1mgを作成することに成功した。感度の悪い固体NMR測定では約20mgが必要になるので、スケールアップをするとともに5回は操作を繰り返さなければいけないことが分かった。固体NMRの試料を調整するためにはサンプルを固体化あるいは濃縮させる必要があるが、Mnなどの金属で凝集、沈殿させる方法が適していると考えられた。その方法ではヌクレオソームの沈殿がクロマチンファイバーに近い形になる可能性がある。また、今後の固体NMR測定のモデルとして、凍結乾燥した^<13>C,^<15>N標識したH2A単量体の固体NMR測定をおこなった。凍結乾燥したサンプルなのでスペクトルの質は悪かったが、単量体でも二次構造はヌクレオソーム結晶構造やH2A/H2Bダイマー中のH2Aと同様の構造をとることが予測された。本研究において、固体NMRを用いたヌクレオソーム(分子量200 kDa)中のヒストン(分子量110kDa)の動的な構造解析をおこなった。これまでの構造決定、構造解析で用いられてきたX線結晶構造解析では解析できない運動性の大きい領域や溶液NMRでは測定できない大きな分子量をもつヌクレオソームについて固体NMR法を適用した。今回、結晶構造解析で決定できなかったヌクレオソームの運動性の高い領域(ヒストンテール)の構造の解析を行った。そのヒストンテールこそが、DNAの転写にかかわる非常に重要な領域で、その構造を解析し機能発現機構の解明することを目指した。昨年度に完成した^<13>C,^<15>N標識したヌクレオソームの精製、再構成法をもとに、本年度は精製規模をスケールアップし、固体NMRに必要な約16mgのH2Aのみ^<13>C,^<15>N標識したヌクレオソームを作成することに成功した。そして、固体NMR用試料を作成するために、凍結乾燥法とMg^<2+>イオンによる凝集法の2つを検討した。凍結乾燥法では大量の凍結保護剤を用いることでヌクレオソームの分解が避けられた。一方、イオン凝集法ではヌクレオソームのみでできた沈殿を得られた。この沈殿は凍結融解にも強く、クロマチン構造のモデルとして考えられ、生物学的にも重要である。そこでイオン凝集法を採用した。イオン凝集法よって作ったサンプルを固体NMRにより構造解析を行った。INEPTなどの溶液NMRで使われる手法とマジック角試料回転法を組み合わせることで、運動性の高い領域の2次元H-C相関測定を行った。このスペクトルを解析すると、ヒストンテールが観測されていることが分かった。つまり、クロマチン形成下でもヒストンテールは運動していて、さまざまな機能発現を可能にしていると考えられた。こうして世界で初めてヌクレオソーム中のヒストンの固体NMRによる解析が成功した。
蛋白質の品質管理からみたシナプスの構造・機能維持の分子基盤解明と神経再生への応用

研究代表者は神経軸索末端の構造的、機能的破綻を特徴とする軸索ジストロフィーマウス(略してgadマウス)の原因が脱ユビキチン化酵素の一つで神経細胞特異的な発現を示すubiquitin C-terminal hydrolase I (UCH-L1)遺伝子の欠失であることを以前に明らかにした(Nature Genetics,1999)。本研究ではこの成果をもとに、脱ユビキチン化酵素、とりわけUCH-L1と相互作用する蛋白質の同定・機能解明を行い、シナプスの構造・機能維持の分子基盤における脱ユビキチン化酵素の重要性を解明することを目的とした。その結果、UCH-L1は水解酵素として作用するだけでなくモノユビキチンと結合し、ユビキチン代謝を安定化させる因子であることを明らかにした。実際gadマウスではモノユビキチン量が低下していた。UCH-L1は多面的な機能を有する蛋白質であることが示唆される。また、gadマウスのプロテオーム解析から、対照マウスに比して発現が変動している酸化修飾蛋白質4種を同定した。さらにUCH-L1自身が酸化修飾をうけ、その修飾の程度に応じてhydrolase活性が減じることを見出した。他方、gadマウスにおけるシナプス可塑性の変化など神経伝達においてもUCH-L1が重要な役割を果たしていることを見出した。UCH-L1は脳内においては神経細胞特異的に発現しており、本研究の成果から、蛋白質の品質管理機構として近年重要性が高まっているユビキチンシステムがシナプスの構造や機能の維持に重要な役割を担っていることが明らかになった。gracile axonal dystrophy(gad)マウスは本邦で見出された遺伝性ミュータントで神経軸索の逆行性変性、すなわちシナプス前終末の構造的・機能的障害を特徴とする。本研究開始までにgadマウスの原因がユビキチンシステムの一員である脱ユビキチン化酵素UCH-L1の遺伝子欠失であることを見出したので、今年度はUCH-L1の生理作用、病態生理作用の解析を進めた。gadマウス及び正常対照マウスから後根神経節を摘出し3次元器官培養を行い、突起伸展力を比較したところ頚髄レベルの後根神経節では差が見出されなかったが腰髄レベルの後根神経節では中枢端の突起伸展力がgadマウスで有意に低下していることが示された。病理学的には軸索ジストロフィーを主体とし、臨床的には感覚性失調や下肢の運動麻痺を特徴とするgadマウスの病態をよく説明する結果である。またUCH-L1発現ベクターを調製し、種々の動物細胞にtransfectionし、ユビキチン量の変動を免疫組織学的に解析したところ、UCH-L1が遺伝子導入された細胞ではユビキチンの免疫染色性が増加した。神経系の細胞においてはユビキチン染色性の増強は細胞体よりも軸索において顕著であった。同様の傾向はUCH-L1発現トランスジェニックマウスにおいても認められた。これらの結果はUCH-L1が神経軸索機能において重要な役割りを果たしていることを示唆するものでUCH-L1の機能解明を通して神経再生の新たな治療法開発が展望できるようになった。gracile axonal dystrophy (gad)マウスは本邦で見出された遺伝性ミュータントで神経軸索の逆行性変性、すなわちシナプス前終末の構造的・機能的障害を特徴とする。本研究開始までにgadマウスの原因がユビキチンシステムの一員である脱ユビキチン化酵素UCH-L1の遺伝子欠失であることを見出したので、今年度はUCH-L1の生理作用、病態生理作用の解析を昨年度に続き進めた。その結果、gadマウス及び正常対照マウスなどを使用した生化学的研究から、UCH-L1がin vivoでユビキチンと結合していることを見出した。

UCH-L1はユビキチンと結合することでユビキチンのライソゾーム移行シグナルをマスクし、結果としてユビキチンのライソゾームでの分解を抑制する可能性が高く、実際パルスラベル法などによる実験からUCH-L1がユビキチンのhalf-lifeを延長する作用を有することを見出した。これらの結果から、UCH-L1の生理作用はユビキチンプールサイズを増加させ、蛋白分解を促進させることであると考えられる。また神経変性だけでなく神経伝達においてもUCH-L1がATP受容体、ノルエピネフリントランスポーターなど神経伝達物質受容体・トランスポーター活性を制御していることを見出した。UCH-L1が神経軸索機能において重要な役割りを果たしていることを示唆する結果でUCH-L1の機能解明を通して神経再生の新たな治療法開発が展望できるようになった。この点において神経幹細胞がニューロン前駆細胞に分化する過程においてUCH-L1がニューロン前駆細胞の良き識別マーカーになることを見出したことは再生医学研究に応用可能な成果として注目されよう。gracile axonal dystrophy(gad)マウスは本邦で見出された遺伝性ミュータントで病理学的には神経軸索の逆行性変性、すなわちシナプス前終末の構造的・機能的障害を特徴とし、臨床的には後索症状と下肢の運動麻痺の症状を呈する。本研究開始までにgadマウスの原因がユビキチンシステムの一員である脱ユビキチン化酵素UCH-L1の遺伝子欠失であることを見出した成果に基づき研究を推進し、昨年度までにUCH-L1はユビキチンのキャリアー蛋白質としても機能し、ユビキチン単量体レベルを制御することを見出した。今年度はUCH-L1の生理作用、病態生理作用の解析を昨年度に引き続き行った。その結果、gadマウス及び正常対照マウスを使用したプロテオーム解析から、gadマウスにおいて発現が変動してる酸化修飾された蛋白質4種を同定した。またUCH-L1自身がi酸化修飾をうけ、その修飾の程度に応じてhydrolase活性が減じることも見出した。これらの結果はgadマウスの病態に酸化ストレスによる細胞障害性の機序か働いている可能性を示唆する。また、神経変性だけでなくシナプスにおける神経伝達においてもUCH-L1が重要な役割を果たしていることを見出した。すなわち、gadマウスにおいてはシナプスの可塑性や情動性行動に変化を認めた。UCH-L1はユビキチン・プロテオソームシステムの構成員であることから、今年度見出された結果はユビキチン・プロテオソームシステムなど蛋白質の品質管理系がシナプスの構造や機能の維持に重要な役割を担っていることを強く示唆する。
肺吸虫感染実験系確立のための代替終宿主動物モデル作出の試み

本研究によって得られた知見は以下のとおりである。1.近交系ラット4系統(F344/DuCrj, LEW/Crj, BN/Crj, WKY/NCrj),クローズドコロ二一3系統(Crj:SD, Crj:Wistar, Crj:Donryu)の計7系統における日本産肺吸虫4種(ウエステルマン肺吸虫、ペルツ肺吸虫、宮崎肺吸虫、大平肺吸虫)の感染性は、各系統間に顕著な差を見出し得なかったものの、概して、BN/Crjは日本産の肺吸虫属4種に共通して高い虫体回収率を示すと共に、肺における高いシスト形成傾向を示し、肺吸虫感染実験系確立のための代替終宿主動物モデル侯補としての有用性が示唆された。2.免疫抑制剤(プレドニゾロン)および免疫機能不全ラット(F344/NJcl-rnu)を用いた実験における日本産23種肺吸虫(ウエステルマン肺吸虫、ベルツ肺吸虫、大平肺吸虫)の感染牲については、通滞の感染実験結果と比較して、虫体の発育、回収率、シスト形成傾向等に著しい違いは認められなかった。このことから肺吸虫の感染には少なくとも細胞性免疫の関与はないものと推量された。3.食虫目の実験動物、スンクス(sunkus)における感染実験は、ウエステルマン肺吸虫とベルツ肺吸虫の2種を用いてその感染性を検討したが、虫体は全く回収されなかった。肺吸虫はイヌ、ネコなどの食肉目動物やラットなどのげっ歯目動物と異なり、食虫目動物には殆ど適応していないものと考えられる。4.フェレット(ferret)における肺吸虫4種を用いた感染実験では、大平肺吸虫を除いては感染が成立しなかった。このことから、フェレットが日本産肺吸虫の好適な実験的終宿主となり得るとする報告があるが、これについては再度の検討が必要と思われる。日本産6種肺吸虫-ウエステルマン肺吸虫の染色体の違いによる2型を別種と考えて-のうち、十分量の被嚢幼虫(Mc)が得られた4種の肺吸虫につき感染実験を実施した。これにより、どのような実験動物がこれらに共通した代替終宿主モデルとなるかを検討した。使用した動物は、現在、実験継続中のものを含め以下のとおりである。3.フェレット5頭(マーシャルフェレット)4.スンクス30頭(カトマンズ産及び長崎産)このうち、既に実験を終了しているラットでは、各種肺吸虫のラット系統別虫体回収率(剖検日数85日)は以下の順となった。2.ウエステルマン肺吸虫-P.westermani-以上の結果から、ほぼすべての種に共通した好成績が得られたのは、BN系ラット(7387%)であったが、他系統についてはまちまちの成績を示した。またLEW系については4073%とBN系と比較して回収率は低かったが、肺に高率に虫嚢を形成するなど宿主特異性の面からもBN系と共に終宿主モデルとして優れていることがわかった。本研究では、年度内にヌードラット、フェレット、スンクスの剖検を行う予定もあり結果が期待される。肺吸虫感染実験系を確立するために,入手が困難となってきたイヌ,ネコに代わりうる終宿主動物モデルを作出するための研究を行った。その結果,以下のことが明らかとなった。

近交系ラット4系統(F344/DuCrj.LEW/Crj,BN/Crj,WKY/NCrj),クローズドコロニー3系統(Crj:SD,Crj:Wistar,Crj:Donryu)の計7系統における日本産肺吸虫4種(ウエステルマン肺吸虫,ベルツ肺吸虫,宮崎肺吸虫,大平肺吸虫)の感染性は,各系統間に顕著な差を見い出しえなかったものの,概して,BN/Crjは日本産の肺吸虫属4種に共通して高い虫体回収率を示すと共に,肺における高いシスト形成傾向を示し,代替動物モデル候補としての有用性が示唆された。2.免疫機能不全ラット(F344/nJcl-run)における日本産3種肺吸虫(ウエステルマン肺吸虫,ベルツ肺吸虫,大平肺吸虫)の感染性については,虫体回収率,シスト形成傾向共に他の近交系ラット,クローズドコロニーに比して著しい違いは認められなかった。このことから肺吸虫の感染には少なくとも細胞性免疫の関与はないものと推量された。3.食虫目の実験動物,スンクス(sunkus)における感染実験は,ウエステルマン肺吸虫とベルツ肺吸虫の2種を用いて実施した。60日と85日の2群でその感染性を検討したが,虫体は全く回収されなかった。肺吸虫はイヌ,ネコなどの食肉目動物やラットなどのげっ歯目動物に比して,食虫目動物には殆ど適応していないものと考えられる。4.フェレット(Marshal-ferret)における肺吸虫4種を用いた感染実験では,太平肺吸虫を除いては感染が成立しなかった。このことから,フェレットがとりたてて肺吸虫の好適な実験的終宿主となるとは思われない。
結晶質-非晶質複合塩化物イオン伝導体の開発と塩素ガスセンサへの応用

塩素ガスは、毒性の強い腐食性ガスであるため、排出ガス中や工場内の塩素ガス濃度をモニターできるセンサの設置が切望されている。我々はこれまでに塩化物イオン伝導体である塩化物系化合物を塩素ガスセンサへ応用し成果をあげているが、これまで10ppm以下の低濃度域の応答が十分に得られていなかった。これらの結果を考慮し、塩化物結晶を伝導母体とし、粒界の気孔を溶融により低融点のガラス材料で密閉することにより、高導電率を維持しつつ高緻密化した材料を開発し、低濃度でも検知可能なセンサへの応用を目指すことを考え実験を行った。まず、PbCl_2にPbCl_2-PbO-SiO_2系三成分系ガラスを入れた材料を用いて実験を行ったが、塩化物中にPbOなどの酸化物が存在すると塩素ガスと反応する副反応が起こり、起電力が変化したり応答が遅くなり、PbOを含むガラス材料を添加すると逆にセンサ応答が著しく低下することが明らかになった。ハロゲン化物のみで塩化物伝導性ガラスを作製することが困難であることから、塩素ガスに対する素子の安定化を図る目的で、ハロゲン化物を全く含まない安定な酸化物を材料として用いることを試みた。その結果、Na^+イオン伝導体としてよく知られるNASICON系複合酸化物でNa_2O-Al_2O_3-4SiO_2ガラス相を含ませることにより緻密性の高い材料が得られ、この材料を用いてCl_2,Air,RuO_2+NaCl/Na+伝導体/RuO_2,Airのプローブを作製し、10ppm以下の抵濃度塩素ガスについての応答を検討したところ、センサ濃度の対数に2電子反応の勾配が得られ、抵濃度塩素ガスセンサへの応用が可能であることが明らかになった。我々はこれまでに塩化物イオン伝導体である塩化物系化合物を塩素ガスセンサへ応用し成果をあげているが、これまでの研究では多結晶体を固体電解質として用いていたため、粒界にわずかなすき間ができ、それにより10ppm以下の低濃度域の応答が十分に得られないことが考えられた。実験で使用したのはPbCl_2-PbO-SiO_2系三成分系であり、PbClp_2量を大きくすると伝導性の高いPbCl_2結晶がガラス中に析出し、伝導性も緻密性も高い、結晶-ガラス複合固体電解質ができる。しかし、実験を進めて行くうちに、塩化物中にPbOなどの酸化物が存在すると塩素ガスと反応する副反応が起こり、起電力が変化したり応答が遅くなり、ガラス化剤として酸化物を添加するとセンサ応答が著しく低下することが明らかになった。その結果、Na^+イオン伝導体としてよく知られるNASICON系複合酸化物でガラス相を含ませることにより緻密性の高い材料が得られ、この材料は塩素ガスセンサへの応用が可能であることが明らかになった。
ヒト角膜内皮細胞の再生医療に関する基礎研究

1)プロモーター領域をもつルシフェラーゼ、GFPをエレクトロポーレーターで遺伝子導入した結果、今回の実験系では通電圧25V、パルス幅20ms、パルス間隔100ms、回数8回が最も遺伝子効率良かった。これ以降の遺伝子導入実験はすべて、この設定条件で遺伝子導入を行なった。2)予めクローニングしておいたG1ポイントのバイパス因子であるE2FファミリーcDNA(E2F2、E2F1)をエレクトロポーレーターで遺伝子導入した。細胞周期の進行は、Ki67の発現で調べた。その結果、家兎角膜内皮細胞では、E2F1、E2F2ともに増殖期の細胞がそれぞれ23%、30%増加した。また、アメリカ・アイバンクアイを用いた人角膜の実験では、E2F1遺伝導入部位でKi67遺伝子の発現が認められ、細胞周期が後期G1から進行したことを示した。しかし、M期まで進行した細胞はごくわずかで、G2期で抑制を受けたか、S期でアポトーシスが誘導された可能性があった。E2F2も同様にKi67遺伝子の発現が認められ細胞周期が後期G1から進行したことを示した。E2F1よりはM期まで進行した細胞が多かったものの遺伝子導入の効率はE2F1より低く5%に満たなかった。今後この点については再検討してゆく必要がある。一方で、アポトーシスの誘導も示唆されており、この点はどのぐらいの確立で誘導されたかを再検討してゆくつもりである。3)現在、E2FファミリーがRbタンパクの脱リン酸化を受けて開放されたあと、DP1と結合後核内に誘導を受けることから,DP1遺伝子導入およびDP1とE2Fとの同時導入によって細胞周期の変化を検索中である。家兎角膜を用いた基礎実験を現在行っているが、この実験結果を踏まえて、ヒト角膜内皮細胞を用いて同様の実験を行うつもりである。現在、E2F1E2F3cDNAのクローニングを行い実験に用いている。現在のところサブクローニングを行い増やしたcDNDは、E2F1,E2F2、E2F3、DP-1でこれらは、角膜内皮細胞のG-1期抑制に深く関与していると思われる。またGFPをエレクトロポーレートし遺伝子導入に成功している。現在、最も良い電圧(角膜に恒久的な障害を残さず、最も効率の良いエレクトロポーレーターの設定)を検証中である。また、全長のE2FファミリーのcDNA特にE2F2の遺伝子導入をエレクトロポーレートで導入する条件を検証中である。一方、同様の方法を用いてクローニングしたP27のアンチセンスを白色家兎角膜内皮細胞に遺伝子導入しG-1制御の解明に努めている。この結果、p27アンチセンス導入を行うと、角膜内皮細胞はG-1後期からS期へと進行した。しかし、S期以降の進展は認められずS期チェック機構の抑制を受ける可能性が示唆されている。(論文投稿中)一方で、p27アンチセンス導入後に角膜内皮細胞は細胞間結合が低下することより、G-1期抑制と細胞-細胞接触阻害は深く関わっているものと思われる。今後、同様の方法で、細胞周期促進因子の遺伝子導入の効果、および細胞周期抑制因子のアンチセンス導入の効果を調べるとともに、これらのイベントの更に上位で細胞増殖抑制に関与していることが報告されているTGF-βとの関連性についても研究してゆきたい。現在、GFPをエレクトロポーレートのマーカーとしてE2F2、E2F1、DP-1の遣伝子導入を行っている。

最も良い電圧(角膜に恒久的な障害を残さず、最も効率の良いエレクトロポーレーターの設定)を検証した結果、25w、20msec、100回通電が最も効率が良かった。本実験結果をもとに、E2F1,E2F2の遺伝子導入を白色家兎に行った。その結果GFPの発現を認める内皮細胞(遺伝子導入とその発現が認められた細胞)と一致して、Ki67(S期M期のマーカー)の発言が認められ、明らかに細胞周期の進行が認められた。E2F2導入細胞では、E2F2の発現が核内に移行しており、カテゴリーに従った細胞周期の進行と考えられたが、E2F1導入細胞では、細胞質内での発現のみで、核内への移行は認めず、今後検討を要する。また、いずれの遺伝子導入でも分裂期まで至った細胞はなく、G2期での抑制およびアポトーシスの誘導が認められた。この点に関して、今後E2F2の結合因子であるDP-1の遺伝子導入結果と比較検討してみる必要があると思われた。一方、同様の方法を用いてクローニングしたP27のアンチセンスを白色家兎角膜内皮細胞に遣伝子導入しG-1制御の開放が起こるかどうか実験を行った。この結果、p27アンチセンス導入を行うと、角膜内皮細胞はG-1後期からS期へと進行した。しかし、やはりS期以降の進展は認められずS期チェック機構の抑制を受ける可能性が示唆されている。興味ある知見として、p27アンチセンス導入後に角膜内皮細胞は細胞間結合が低下することより、G-1期抑制と細胞-細胞接触阻害は深く関わっているものと思われる。今後、同様の方法で、細胞周期促進因子の遺伝子導入の効果、および細胞周期抑制因子のアンチセンス導入の効果を調べるとともに、これらのイベントの更に上位で細胞増殖抑制に関与していることが報告されているTGF-βとの関連性についても研究してゆきたい。
学習者用デジタル教科書プラットフォームの標準化に関する基礎研究

学習者用デジタル教科書において、育成を目指す資質・能力の育成や、各教科書間や他システムとの連携を考えつつ、どのようなデータ構造を持つべきか、どのように外部システムとの接続形態を取るべきか、児童生徒が使用するインターフェイスはどのようなものが適当であるか、学習履歴を次の学びに生かすためにはどのような履歴項目が必要となるか、について基礎研究を行った。平成29年度は、デジタル教科書開発の指針を得るために先行研究の調査を行ったのち、デジタル教科書コンテンツの実装方法を検討した。具体的には、福岡教育大学附属久留米小学校をはじめ、東京都出前ICT事業による実践校を訪問し、情報教育や授業におけるデジタル教科書の使われ方を視察した。平成30年度は、実装仕様について、具体的な検討を行い、教科横断的な観点と、学習の様相について分析に耐えうるだけの学習履歴を保存し取り出すという点から、実装する機能を決定した。また、実際にiPad iOS11上にデジタル教科書の機能を実装した。作成した学習者用デジタル教科書について、教職大学院生や教育学部生を対象にその使用感などをテストした。これら研究成果について、日本教育工学会研究会にて口頭発表を行った。本研究は、学習者用デジタル教科書において、育成を目指す資質・能力の育成や、各教科書間や他システムとの連携を考えつつ、どのようなデータ構造を持つべきか、どのように外部システムとの接続形態を取るべきか、児童生徒が使用するインターフェイスはどのようなものが適当であるか、学習履歴を次の学びに生かすためにはどのような履歴項目が必要となるか、について基礎研究を行うことを目的としている。平成29年度においては実装仕様の検討を行った。教科書会社の協力会社から協力が得られるかもしれないとの情報を基に、その可能性を探ったが、ソースコード等の知的財産権の関係もあって、結果として自主開発を選択した。また、福岡教育大学附属久留米小学校をはじめ、東京都出前ICT事業による実践校を訪問し、情報教育や授業におけるデジタル教科書の使われ方を視察した。実装仕様の検討については、当初関連企業の協力が得られる予定であったが、諸般の事情によりそれが困難となり、対応策を検討するのに時間を要したため予定よりもやや遅れることとなった。今後は、実装仕様について自主開発により対応を進めていくこととしている。先述の理由(「現在までの進捗状況」参照)により調査実施の遅れはあるが、主たる研究計画に大きな変更はないものである。平成30年度に実装仕様を早急に決定し、実装を行う。また、教育学部学生を対象に模擬授業を行い、実装したデジタル教科書の操作性や機能を確認することとしている。【理由】先述の理由(「現在までの進捗状況」参照)により実装仕様の検討に当初の想定より多くの時間を要したため作業期間が不足してしまい、予定していた経費の執行ができなかった。【使用計画】次年度当初から契約手続きをすすめてプラットフォームを実装し、評価を実施する。また実践での検証を行ない、有効性について評価する計画である。
新しく発見された多機能プロテア-ゼ複合体の構造解析と細胞生物学的意義の研究

多機能プロテア-ゼ複合体は同一分子内に複数の触媒活性をもつ巨大な多成分集合体であり、プロテアソ-ムとも呼ばれている。本年はこの新種の細胞内プロテア-ゼの構造解析と生理機能解析について多角的に且つ組織的な研究を行った。1.構造解析研究酵母、ラット及びヒトの主要成分(合計15個)のcDNAをクロ-ニングして、それらの一次構造を決定した。そり結果、プロテアソ-ムは既知の蛋白質群とのホモロジ-がなく、新種の分子群から構成された多成分複合体であることが判明した。しかし、同種及び異種生物のサブユニット群には高い相同性が認められたことから、プロテアソ-ムは進化的に保存された新しい遺伝子ファミリ-を形成していると想定された。また、電子顕微鏡で観察した分子形状の高い保存性はプロテアソ-ムの構造の維持が機能発現に重要であることを示唆している。2.生理機能研究プロテアソ-ムが初期発生、特に卵成熟や受精に密接に関係していることを解明すると共にその遺伝子発現が胎児期で極めて高いこと、またヒト肝・腎癌組織や白血病細胞で異常に亢進していることを発見した。更に、プロテアソ-ムが細胞分裂周期に応答して核と細胞質を往来していることが判明し、この酵素が細胞の増殖や分化に密接に関係していることが示唆された。このプロテアソ-ムの生理的意義を直接的に解明する為、本研究ではさらに酵母系を用い分子遺伝学的解析を行った。酵母プロテアソ-ムの主要成分の各々の染色体遺伝子をマ-カ-遺伝子による挿入破壊或は、遺伝子欠失法で不活性化した後、四分子分析でその表現型を調べた結果、ほとんどの場合、劣性致死効果を示した。このことはプロテアソ-ムの個々のサブユニットの必須性を証明すると共にこの複合体の形成が細胞増殖に不可欠であることを示唆している。市原明:多機能プロテア-ゼ複合体の特異抗体を用いた酵素免疫測定法によりその組織分布を検索した結果、本酵素は調べた全ての組織に広く分布し、また免疫組織化学分析から核と細胞質に共分布することが判明した。猪飼篤:電子顕微鏡解析によって多機能プロテア-ゼ複合体の分子構造を研究し、本酵素が環状型粒子であることを証明した。石井信一:アボヤ卵多機能プロテア-ゼ複合体に対するモノクロ-ン抗体を用い、本酵素がアボヤの受精及び胚発生に関係することを証明した。石井勝利:アフリカツメガエル卵母細胞の初期発生に多機能プロテア-ゼ複合体が関係することを証明すると共に実際にツメガエル卵より本酵素を分離精製した。石浦章一:アルツハイマ-病の脳に蓄積するアミロイドA4ペプチドのN-末端側を切断する酵素を分離したところ、その酵素が多機能プロテア-ゼ複合体であることが判明し、この酵素が老化に関係することを示唆した。佐々木實:ヒト赤血球から多機能プロテア-ゼ複合体を分離精製してその酵素学的性質を検討すると共に、その構成サブユニットを分離した。田中啓二:多機能プロテア-ゼ複合体の構成サブユニット群の主要成分cDNAをクロ-ニングしてその一次構造を決定した。これらの結果から、この酵素が既知の蛋白質群とはホモロジ-のない新種の分子集合体であることを証明した。豊原治彦:魚類の筋崩壊に拘るプロテア-ゼを検索した結果、その酵素が多機能プロテア-ゼ複合体であることを証明した。村地孝:動物細胞のCa^<++>依存性プロテア

-ゼを多機能プロテア-ゼ複合体の相互作用について検討し両者が異なる生理機能を示すことを証明した。吉村哲郎:細胞内で不活性型として存在する多機能プロテア-ゼ複合体の活性制御機構について分子論的に検討した。本年度の研究成果の概要を以下にまとめた。本研究題目の多機能プロテア-ゼ複合体は最近プロテアソ-ムと命名されたので以下この各称を用いる。(1)プロテアソ-ムの遺伝子発現が発生初期で非常に高く成長に伴って激減するが、癌細胞では逆に異常に上昇する。(市原)(2)ヒト・プロテアソ-ムの5種のサブユニットのcDNAを単離し、その塩基配列より一次構造を決定し、プロテアソ-ムが進化的に保存された新しい遺伝子ファミリ-を形成していることを証明した。(田中、徳永)(3)プロテアソ-ムの分子形状について新しいトンネル型電子顕微鏡を用い解析した。(猪飼)(4)20Sプロテアソ-ムが新しい細胞内制御因子群とATP依存的に会合して26Sの巨大分子集合体を形成し、この複合体がユビキチン標識蛋白質を分解する活性型酵素であることを証明した。(吉村、佐々木)(5)酵母プロテアソ-ムの3種のサブユニットの染色体遺伝子を欠失させた結果、二種のサブユニットの場合には致死効果を示したが他の一種は増殖速度に影響したが必須ではなかった。(石浦)(6)卵細胞の初期発生においてプロテアソ-ムが核と細胞質を往来していることをモノクロ-ナル抗体を用いた蛍光抗体で示した。(横沢、石川)
侵略的外来種アライグマとマングースの新たな個体数抑制手法となる避妊ワクチン開発

本研究の最終目標である野生化アライグマとマングースに対する経口避妊ワクチンの実用化は、本申請研究期間で完了できるものではないが、今回得られた知見の概要は以下の通りである。アライグマでは、卵透明帯蛋白の塩基配列と立体構造を参考に合成した3種類のペプチドに対する抗ウサギ血清において、抗体産生誘導および誘導抗体の種特異性が確認され、これらがワクチンの抗原候補として有力であることが示された。マングースでも同様に、卵透明帯蛋白の塩基配列をもとに合成した2種類のペプチドに対する抗マングース血清において、抗体の持続期間や誘導抗体の生体抗原認識能が確認され、両ペプチドのワクチン抗原としての有用性が示された。本研究の最終目標は,野外で実用化しうる野生化アライグマとマングースに対する避妊ワクチン開発である。実用的なワクチン開発は本申請研究期間の3年で完了できるものではなく,継続した研究が必要と考えている。平成26年度は,卵透明帯蛋白質-精子卵結合部位の塩基配列を参考に合成した2種類のペプチド(A,B)をマングース生体雌に免疫し,次のような実験を行った。免疫処置群6頭(ペプチドA,B各3頭(A-13およびB-13))に2週間間隔で4回皮下投与し,対照群5頭にはペプチドの代わりにPBSを投与した。採血は,免疫前および3,4回目の免疫時と最終免疫1週間後に実施し,その後に安楽殺して卵巣を採取した。安楽殺をせずに継続飼育をしている2頭(A-1およびB-2)では,さらに約3ヶ月後,7ヶ月後,10ヶ月後にも採血を行った。これらの材料を用いて,血液中の抗体価をELISA法にて経時的に評価した。また,免疫による卵巣への組織学的な障害の有無を調べるため,卵巣の組織学的解析をHE染色にて行った。その結果,A群では投与開始時およびコントロールと比較して概ね経時的な抗体価の上昇が見られ,B群ではB-2は増加傾向が認められるがその他は変化や増加傾向を認めなかった。よって,ワクチン抗原候補としてペプチドAはBよりも有力である可能性が示唆された。しかし,今後,ELISA法の改良や継続飼育個体の抗体価の測定による詳細な解析が必要と考えている。免疫個体の卵巣組織学的解析では,A投与個体でコントロールと比較して卵透明帯に形態学的な変化は認めず,副作用となる卵巣への組織学的損傷は起こさない可能性が示唆された。今後は,例数および電子顕微鏡など,より詳細な組織学的解析を実施する予定である。マングースについては,平成2627年度に卵透明帯蛋白質-精子卵結合部位の塩基配列を参考に合成した2種類のペプチド(A,B)を各3頭の生体雌に2週間隔で4回皮下投与し,投与前および3,4回目の投与時と最終投与1週間後に交代価を測定した。ペプチドA,Bで免疫した各2頭は安楽殺して卵巣を採取した。免疫した各1頭ずつは安楽殺せずに継続飼育をし,初回投与から約5ヶ月後,8ヶ月後,12ヶ月後(ここまで26年度に実施して結果は報告済み),18ヶ月後にも抗体価の推移を評価した。さらに,初回投与から19ヶ月後に2週間隔で2回の追加接種および抗体価を測定して免疫記憶を評価した(ここまで平成27年度に実施)。18ヶ月後の抗体価も12ヶ月後と同様に免疫前の値にまで低下していた。追加接種による抗体価の上昇は,ペプチドA投与個体では中程度であったが,B個体では抗体価の上昇は認められず,高度な免疫記憶はなかった。これらのことから,ワクチン抗原候補としてペプチドAはBよりも有力であるが,免疫持続期間は最長でも1年で抗体価を維持するためには毎年追加接種する必要があるものと推察された。一方,アライグマについては,卵透明体蛋白質をもとにこれまでに作成した2種の合成ペプチドα,βの種特異性が低かったことから,本年度は新たな合成ペプチドを設計して種特異性を確認している。種特異性が確認されれば,飼育個体を用いてアライグマ生体に免疫を行う準備を進めている。マングースについては,飼育個体を用いた実験が順調に行えているが,経口で免疫賦与させるためのデリバリーシステムの開発が課題である。一方,アライグマについては飼育個体の確保および飼育実験に至っていない。これは,新たな避妊ワクチン抗原候補タンパクの探索と再設計を行っていること,本種が特定外来生物のために学術研究目的であっても捕獲や飼育に関する制限が大きいことにも起因している。本研究の最終目標は,野生化アライグマとマングースに対する経口避妊ワクチン開発である。実用ワクチンの開発は本申請研究期間の3年で完了できるものではないが,本申請研究により得られた成果の概要を以下に示す。1)アライグマ本種の卵透明帯蛋白(ZP3)の塩基配列を参考に合成した5種類のペプチド(15)のワクチン抗原としての有用性を評価した。各ペプチドをそれぞれ1羽のウサギに免疫して得た血清中の抗体価を測定したところ,抗体価は有意に上昇した。次に,各抗血清とアライグマおよびその他のネコ目6科9種の卵巣を用いて免疫組織化学を行い,血清中抗体の各動物種の卵透明帯への結合性を評価した。