hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
矯正力による歯の移動の際の応力分布と歯周組織変化との関連に関する三次元的研究

各々の切片にH.A.およびアザンで染色を施し組織学的な検索を行った。次にこの切片の光学顕微鏡写真を撮影し、トレ-ス後3次元画像構築ソフトにて三次元的に再構築した。1)組織学的所見(1)全ての実験において遠心歯頸部に、エオジン好性の均質で無構造な領域(無細胞帯とよぶ)と、その間にはさまれた線維芽細胞の核の濃縮した変性領域(内変性帯とよぶ)が区別された。(2)4日間例では100g、200gともに破骨細胞は無細胞帯の外縁に少数存在するのみだが7日間例では直接性骨吸収、穿下性骨吸収、背部骨吸収を行っているのが観察された。2)三次元構築像からの所見(1)全ての実験歯の歯頸部圧迫側歯根膜には限局する内変性帯と、それを取り囲むようにして無細胞帯が環状に存在するのが観察された。またこの様相は根尖部圧迫側歯根膜には認められなかった。(2)破骨細胞は、100g7日間例では遠心から頬側を通り、近心根尖側にいたるまで広範囲に分布しており、歯根膜に近い部位には背部骨吸収を認めた。一方、200g7日間例では破骨細胞は歯頸側と根尖側とにわかれ狭く分布し、さらに、背部骨吸収は、骨髄のかなり深部で観察された。なお、模型計測については現在測定を行い検討中であるが、ネコノ満蓋の形状の点から術前後の重ね合わせには精度的にはまだ不十分な点がある。今後は重ね合わせの精度を向上させていくことが必要であると思われる。
分子生物学的に口腔咽頭癌の早期発見は可能か

唾液中に含まれる癌細胞を検体として,非侵襲的で鋭敏な口腔咽頭癌の診断方法を確立し,早期発見に役立てることを研究目的として実験を行った.1)研究材料.山口大学および東海大学耳鼻咽喉科においてインフォームドコンセントを得て,治療前に採取した口腔咽頭癌患者の唾液(うがい液,腫瘍ぬぐい液)および末梢血リンパ球から,また手術時あるいは生検時に摘出した癌組織からDNAを抽出した.2)研究方法.12種類のマーカーを使いPCRマイクロサテライト解析を行った.昨年度に明らかとした頭頚部腫瘍で染色体の異常(Microsatellite instability:MSI)を高頻度に検出するマーカーを用いた.各症例の癌組織DNAを末梢血リンパ球からの正常DNAと比較しMSIを調べた.MSI陽性症例については唾液から抽出したDNAと比較し,癌組織のMSIと同様の所見を検出できるか検討した.3)結果.MSI陽性症例の頻度は20%程度であった.そのうち80%の症例で唾液DNAに同様の所見を検出した.唾液内の微量の癌細胞を検出する方法として高感度のであることが確認された.またMSIと種々の臨床病理学的因子との関連は明らかなものは見いだせなかった.以上の結果は平成12年5月の日本耳鼻咽喉科学会総会,7月の世界頭頚部癌会議で発表した.唾液中に含まれる癌細胞を検体として,非侵襲的で鋭敏な口腔咽頭癌の診断方法を確立し,早期発見に役立てることを研究目的として実験を行った.1)研究材料.山口大学耳鼻咽喉科においてインフォームドコンセントを得て,治療前に採取した口腔咽頭癌患者の唾液(うがい液,腫瘍ぬぐい液)および末梢血リンパ球から,また手術時あるいは生検時に摘出した癌組織からDNAを抽出した.2)研究方法.12種類のマーカーを使いPCRマイクロサテライト解析を行った.まず基礎実験として頭頚部腫瘍で染色体の異常(Microsatellite instability:MSI)を高頻度に検出するマーカーを検索した.次いで各症例の癌組織DNAを末梢血リンパ球からの正常DNAと比較しMSIを調べた.MSI陽性症例については唾液から抽出したDNAと比較し,癌組織のMSIと同様の所見を検出できるか検討した.3)結果.今年度までの結果ではMSI陽性症例の頻度は20%程度であり,一部の症例に唾液DNAでも同様の所見を得た.唾液内の微量の癌細胞を分子生物学的に検出することが証明された.症例を増やして検討予定である.以上の結果は平成11年9月に広島で開催された日本癌学会において発表した.唾液中に含まれる癌細胞を検体として,非侵襲的で鋭敏な口腔咽頭癌の診断方法を確立し,早期発見に役立てることを研究目的として実験を行った.1)研究材料.山口大学および東海大学耳鼻咽喉科においてインフォームドコンセントを得て,治療前に採取した口腔咽頭癌患者の唾液(うがい液,腫瘍ぬぐい液)および末梢血リンパ球から,また手術時あるいは生検時に摘出した癌組織からDNAを抽出した.2)研究方法.12種類のマーカーを使いPCRマイクロサテライト解析を行った.昨年度に明らかとした頭頚部腫瘍で染色体の異常(Microsatellite instability:MSI)を高頻度に検出するマーカーを用いた.各症例の癌組織DNAを末梢血リンパ球からの正常DNAと比較しMSIを調べた.MSI陽性症例については唾液から抽出したDNAと比較し,癌組織のMSIと同様の所見を検出できるか検討した.3)結果.MSI陽性症例の頻度は20%程度であった.そのうち80%の症例で唾液DNAに同様の所見を検出した.唾液内の微量の癌細胞を検出する方法として高感度のであることが確認された.またMSIと種々の臨床病理学的因子との関連は明らかなものは見いだせなかった.以上の結果は平成12年5月の日本耳鼻咽喉科学会総会,7月の世界頭頚部癌会議で発表した.
加齢に伴う骨格筋の形態や機能の変化に対する長期間の運動やSIRT1活性化の効果

本研究は3年間の継続研究であり、本年度はその2年目であった。本研究の目的の1つは、加齢に伴う骨格筋の廃用性萎縮のタイムコースをマウスを用いて確認し、その実験モデルを確立することであった。また、もう1つの目的は、若齢期に開始し老齢期まで継続する運動または筋活動が骨格筋の廃用性萎縮や代謝機能の低下といった老化現象を抑制しうるかを検討することであった。マウスのライフスパンが2年以上であることから、前年度にそれぞれの実験を開始し、その後の経過を観察する予定であった。しかしながら、前年度末の東日本大震災による3日間の停電と2週間の断水などにより実験の継続が困難となったため、本年度に実験の大部分を新規にスタートさせた。本年度は、3、12ヶ月齢のICR系雄性マウスの骨格筋の摘出を行った。また、3ヶ月齢マウスを用いて、回転車輪付きケージでの飼育による自発的な持久走運動、および片脚の腓腹筋の腱切除による足底筋への機能的過負荷の実験を開始した。今後、筋萎縮などの老化現象が確認できる月齢まで飼育し、対照群または対照脚と比較することにより、運動・筋活動の継続による骨格筋の老化現象の抑制効果について分析する予定である。これらの実験に加えて、不活動が筋線維数の減少を引き起こすのかを確認するためにマウスの片脚の坐骨神経を切除して筋活動を完全に阻害し、8週間後に筋を摘出して筋線維数を分析した。その結果、対照脚と比較して実験脚の筋線維数はヒラメ筋で30.4%、足底筋で29.4%、それぞれ有意に減少していた。この結果から、筋活動を継続することは老化に伴う筋線維数の減少の抑制に効果がある可能性が示唆された。本研究は3年間の継続研究であり、本年度はその初年度に当たる。本研究の目的の1つは、加齢に伴う骨格筋の変化、すなわち老化現象のタイムコースをマウスを用いて確認し、その実験モデルを確立することであった。マウスのライフスパンが2年以上であることから、本年度にそれぞれの実験を開始し、今後の経過を観察しなければならなかった。そこで本年度は、3、12ヶ月齢のICR系雄性マウスの骨格筋の摘出を行った。今後、老齢マウスの骨格筋と比較するためにそれらのサンプルはストックしている。サンプルのうち、筋線維数分析用のものはキレート剤を入れたパラホルムアルデヒドバッファーを用いて筋線維が完全に弛緩した状態で保存し、生化学および組織化学用の分析に用いるものは液体窒素で凍結させ、マイナス80°Cで保存している。なお、12ヶ月齢の時点では、筋重量から骨格筋の萎縮は見られなかったので、18ヶ月齢以降のマウスの分析を今後行う必要がある。また、3ヶ月齢マウスを用いて、回転車輪付きケージでの飼育による自発的な持久走運動、および片脚の腓腹筋の腱切除による足底筋への機能的過負荷を開始した。今後、筋萎縮などの老化現象が確認できる月齢まで飼育して、対照群または対照脚と比較することにより、運動・筋活動の継続による骨格筋の老化現象の抑制効果について分析する予定である。
微小流体包有物の迅速多元素同時分析法の確立と鉱物資源形成流体への適用

本研究課題は、1.レーザーアブレーション(LA)システムと誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)を用いて、鉱物中に取り込まれた地殻流体(流体包有物)の多元素同時分析法を確立し、2.その分析法を岩石ー流体反応によって形成した交代岩といった天然の岩石に適用することで、岩石を形成した流体の元素運搬能力を明らかにすることを目的としている。これまでに、米国標準技術研究所ガラス標準試料を用いたLA-ICP-MSによる流体包有物の多元素同時分析を確立し、天然の岩石試料への適用を行なった。その結果、沈み込み帯のヒスイ輝石石英岩が形成される深さにおいて、流体から岩石へニオブ、ジルコニウムといったHFSE(high field strength element)が蓄積され、流体は相対的にLILE(large ion lithophile elements)やリチウム、ホウ素に富む化学組成を有することが明らかとなった。このような流体が沈み込み帯深部に運搬されることで、LILEに富みHFSEに乏しい化学的特徴をもつ島弧マグマが生じる可能性があり、流体の元素運搬能力がマグマの化学組成に重要な役割を果たすことを示している。本年度は、LAシステムの度々の不具合により、長期間、流体包有物分析を実施することができなかった。しかし、このときまでに本課題で提案する高純度石英ガラスを用いた標準試料調整法はガラス標準試料に比べ定量下限が小さくなると期待されるものの、利用可能なLAシステムが高出力レーザーに限定されることやレーザー条件設定の困難さといった幾つかの課題が残ると明らかとなった。そのため、高純度石英ガラスの加工法の検討をした。また、これまでに蓄積されている微小流体包有物の迅速多元素同時分析技術とその適用について総説論文をまとめ国内誌に発表を行った。本研究課題は、1.レーザーアブレーション(LA)システムと誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)を用いて、鉱物中に取り込まれた地殻流体(流体包有物)の多元素同時分析法を確立し、2.その分析法を岩石形成に関与した天然の流体包有物に適用することで、岩石を形成する流体の元素運搬能力を明らかにすることを目的としている。平成28年度は、従来の分析法より迅速な分析を可能とするために、本研究課題で提案する標準溶液を用いた流体包有物分析用標準試料調製法に必要な装置作成を行った。標準溶液を封入した標準試料を支える治具はいくつかの金属素材を用いて試作を行った。また、標準溶液を封入する石英ガラスは、それに含有される微量元素が分析に影響しないように高純度合成石英ガラスを用い、冶具に内接するように成形した。同時に、エキシマレーザーアブレーションシステムと四重極型誘導結合プラズマ質量分析装置を組み合わせたLA-ICP-MSを用いて、従来から微量元素分析に使用されるガラス標準試料を用いて流体包有物の多元素同時分析法を確立した。この分析法を、関東山地寄居に産するヒスイ輝石石英岩の石英中の10μm程度の大きさの流体包有物に対して適用を試みた。その結果、沈み込み帯においてヒスイ輝石石英岩を形成する流体はLiやB、またRb等のLILE元素だけでなくNb等のHFSE元素に富むという化学的特徴を得ることができた。流体包有物の分析法は国際学会で報告を行ない、ヒスイ輝石石英岩中の流体包有物の化学組成はその特徴をまとめて国際誌に投稿を行った。一方で、この天然の流体包有物分析の事例を通して、ガラス標準試料を用いた場合の流体包有物のLA-ICP-MS分析の定量下限が明らかとなった。本研究課題で提案する標準試料は、ガラス標準試料に比べ定量下限が低くなることが期待される。次年度は提案する標準試料の有効性を検証する。平成28年度はLA-ICP-MSによる流体包有物の多元素同時分析を確立した。この分析法を用いて天然の岩石試料中の流体包有物を分析し、分析結果の評価を行った。この結果については学術誌に投稿を行った。また、流体包有物用標準試料調製法に必要な装置の作成を行った。その際、いくつか試作を繰り返したため、本年度は試料調製法の評価までは至らなかったが、装置を改良できたと考えており、全体として概ね順調に進展している。初年度である平成28年度に米国標準技術研究所ガラス標準試料を用いてLA-ICP-MSによる流体包有物の多元素同時分析が可能となった。その際、これまでの流体包有物多元素同時分析には、標準試料に関する課題だけでなく、複数の技術的課題が明確になった。このうち一つはレーザーアブレーション装置から誘導結合プラズマ質量分析装置までの試料運搬時間であったが、これは物理的方法で改善することができている。本年は、従来の分析法より迅速な分析を可能とするために、本研究課題で提案する流体包有物分析用標準試料調製法に必要な装置の改良を行った。この標準試料調整法では標準溶液を封入する素材には高純度合成石英ガラスを使用する。この高純度合成石英ガラスを溶解し、四重極型ICP-MSで微量元素濃度を測定し、高純度合成石英ガラスに含有される微量元素の分析への影響を評価した。一方で、平成28年度に流体包有物分析を行なった関東山地寄居に産するヒスイ輝石石英岩の石英中の10μm程度の大きさの流体包有物の追加データを得ることを試みた。加えて、このヒスイ輝石石英岩の全岩化学組成分析とSr-Nd同位体分析を行なった。

これらの結果からヒスイ輝石石英岩形成時の沈み込み帯深部における流体の化学的特徴を議論した。また、流体包有物分析を行う予定である蟹岳花崗閃緑岩の薄片を作成し、流体包有物の観察を行った。平成29年度の研究成果は、3件の国際誌論文、5件の国際学会研究発表、5件の国内学会研究発表となった。初年度である平成28年度にはガラス標準試料を用いてLA-ICP-MSによる流体包有物の多元素同時分析が可能となったが、標準試料に関する課題以外に複数の技術的課題があることが明確になった。技術的課題のうち、レーザーアブレーション装置から誘導結合プラズマ質量分析装置までの試料運搬時間は、物理的方法で改善することができる等、課題を一つずつ解決している。研究実施計画書に沿って、流体包有物分析を行う予定である蟹岳花崗閃緑岩の薄片を作成・観察を行い、流体包有物分析のための準備を行った。まだ流体包有物分析に適当な流体包有物が十分に見つかっていないため、引き続き、準備を進める予定である。標準試料調整法は何度か改良を繰り返したことで順調に進展している。本年度は、昨年度の研究成果と合わせて、研究成果を国内外の学会及び学術誌で発表することができており、概ね順調に進展していると考えている。本研究課題は、1.レーザーアブレーション(LA)システムと誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)を用いて、鉱物中に取り込まれた地殻流体(流体包有物)の多元素同時分析法を確立し、2.その分析法を岩石ー流体反応によって形成した交代岩といった天然の岩石に適用することで、岩石を形成した流体の元素運搬能力を明らかにすることを目的としている。これまでに、米国標準技術研究所ガラス標準試料を用いたLA-ICP-MSによる流体包有物の多元素同時分析を確立し、天然の岩石試料への適用を行なった。その結果、沈み込み帯のヒスイ輝石石英岩が形成される深さにおいて、流体から岩石へニオブ、ジルコニウムといったHFSE(high field strength element)が蓄積され、流体は相対的にLILE(large ion lithophile elements)やリチウム、ホウ素に富む化学組成を有することが明らかとなった。このような流体が沈み込み帯深部に運搬されることで、LILEに富みHFSEに乏しい化学的特徴をもつ島弧マグマが生じる可能性があり、流体の元素運搬能力がマグマの化学組成に重要な役割を果たすことを示している。本年度は、LAシステムの度々の不具合により、長期間、流体包有物分析を実施することができなかった。しかし、このときまでに本課題で提案する高純度石英ガラスを用いた標準試料調整法はガラス標準試料に比べ定量下限が小さくなると期待されるものの、利用可能なLAシステムが高出力レーザーに限定されることやレーザー条件設定の困難さといった幾つかの課題が残ると明らかとなった。そのため、高純度石英ガラスの加工法の検討をした。また、これまでに蓄積されている微小流体包有物の迅速多元素同時分析技術とその適用について総説論文をまとめ国内誌に発表を行った。本年度の研究を通じて、流体包有物のLA-ICP-MS分析を天然の試料に適用する際の問題点がより明確になった。流体包有物のLA-ICP-MS分析では、定量値を計算する際に、事前に冷却加熱ステージを用いて冷却することで氷の凝固点降下温度から推定した塩濃度のNaを内標準元素として用いることが一般に行われている。
動物・植物細胞のシグナル検知と伝達の構造生物学

動物細胞由来の細胞内シグナル伝達タンパク質複合体では、細胞運動で重要な低分子量Gタンパク質RacのGEFであるTiam1や、運動方向への小胞輸送に関与するmyosin-X、あるいは力学応答に関与するタンパク質のa-cateninの構造決定で成果を挙げた。また、三量体Gタンパク質とその阻害剤、難病の神経繊維腫症IIタンパク質とDCAF-1、あるいはサリドマイドとその標的タンパク質cereblonとの複合体等の構造研究でも成果を挙げて、医学・薬学の基礎に貢献した。植物細胞では、新しいホルモンのストリゴラクトンやカリキンの受容体で成果を挙げて植物科学に貢献した。1.動物細胞のシグナル検知と伝達制御:低分子量GTPaseであるRacのGEFとして細胞骨格系の制御を通して細胞運動を制御するタンパク質Tiam1については,活性化に必要な新たな膜・膜タンパク質相互作用ドメインであるPHCCExドメインの結晶構造解析を完成すると共にDCC等の認識部位を同定できた.また,運動の方向決定に関与するmyosin-Xについては,積荷認識ドメイン(MyTH4-FERMドメイン)の調製に成功して,構造解析のための結晶化実験に取りかかった.更に,細胞のメカノセンサーとしての・-cateninとvinculinとの張力依存的な特異的相互作用の調節機構を解明するために,種々のコンストラクトを検討して,試料調製を可能とした.これらを用いて,結晶化を試みる段階まで到達した.また,医学的に重要な三量体GTPaseの阻害剤複合体の構造を世界に先駆けて決定した.また,早老症原因タンパク質WRNの構造決定にも成功した.Tiam1については平成22年の年末に,共同研究者から新たな知見(分子内相互作用による活性抑制の可能性)が提供されて,その検討のために必要なドメイン,特にN-末端の構造的に柔軟な領域やRas結合ドメインとPDZドメインを,年度を繰り越して試料調製を貫徹して,分子間・分子内相互作用解析の準備が整った.2.植物細胞ののシグナル検知と伝達制御:DELLAタンパク質やその他のGRASドメインタンパク質の大腸菌での高い発現系構築に成功した.また,ストリゴラクトン受容体候補であるD14調製して結晶化に成功した.ホルモンと受容体の相互作用解析では,購入した熱量計ITC_<200>をフル稼働で使用して,定量的に結合の強さを見積もった.更に,受容体候補類似タンパク質D14Lの調製については,年度を繰り越して試料の調製を貫徹した.1.動物細胞のシグナル検知と伝達制御運動の方向決定に関与するmyosin-Xについて,積荷認識ドメイン(MyTH4-FERMドメイン)と積荷の一つであるDCCとの複合体の構造解析に成功し,結果を論文発表(EMBO J. 2011)した.又,細胞のメカノセンサーとしてのα-cateninとvinculinとの張力依存的な特異的相互作用を説明可能な複合体の構造決定に成功した.2.植物細胞のシグナル検知と伝達制御ストリゴラクトン(SL)の受容体候補であるD14の構造研究では,平成23年11月の結晶データ収集の結果,期待していたデータが得られなかったので,再度,高分解能結晶作成を行う必要が生じ,平成24年12月まで延長して実験を進めた.又,SL受容体候補類似タンパク質D14Lはカリキン(KAR)の受容体候補であることが最近示されたが,その構造解析に向けて調製を試みた.又,結晶化条件の改善の為,ホルモンと受容体の相互作用を解析した.熱量計ITC200をフル稼働で使用し,SLのアゴニスト化合物であるGR24とGR5,またKARのKAR1との定量的な結合の強さを測定すると共に,複合体結晶作成を試みた.これらの実験で得た有望結晶で,SPring-8でのX線強度データ収集を平成24年の春から夏に試みた.その結果,高分解能(1.5Å1.2Å)のX線強度データを複数の結晶から収集できた.そのデータの構造解析を試みた結果,D14とD14-PMSF(阻害剤),D14Lの構造決定に成功し,その基本構造や活性部位の詳細を解明できた.一方,D14とGR24やGR5,D14LとKAR1との複合体と期待された結晶では,これらのホルモンアゴニストに相当する電子密度を同定することはできなかった.これらは,D14やD14Lの酵素としての活性によって分解した可能性が考えられた.この点は今後の課題となった.1.動物細胞のシグナル検知と伝達制御昨年度に結果を論文発表(EMBO J. 2011)した運動の方向決定に関与するmyosin-Xの積荷認識ドメイン(MyTH4-FERMドメイン)と積荷の一つであるDCCとの複合体の構造解析に引き続いて,積荷であるintegrinやtubulinとの複合体の調製を試みた.更に,細胞のメカノセンサーとして,張力依存的な特異的相互作用を説明可能な複合体の構造決定に成功したa-cateninとvinculinとの複合体や,メカノセンサー機構を説明可能な閉じた構造のa-cateninについて,変異導入などにより機能解析を進めて,論文作成の準備が整った.また,細胞骨格・接着装置制御と細胞増殖等の細胞機能制御とのクロストーク接点の解明を目指した新展開研究では,zyxinのLIMドメインの結晶化とSPring-8でのX線強度データ収集や,Hippoシグナル上流のmerlinと種々の蛋白質との相互作用解析を進めた.2.植物細胞のシグナル検知と伝達制御

昨年度から9ヶ月延長して実験を進めたストリゴラクトン(strigolactone, SL)の受容体候補であるD14と阻害剤との複合体の構造研究決定に成功した.更に,カリキン(karrikin, KAR)の受容体候補であることが最近示されたSL受容体候補類似タンパク質D14Lは,当初イネホモログで実験を進めたが,良好な結果は得られなかった.そこで,シロイヌナズナに切り替えて,平成25年7月までの4ヶ月延長して実験を進めることとした.高親和性アブシジン酸受容体Pyl9については,以前に決定した構造に基づいて機能解析を購入した熱量計ITC200をフル稼働して進めて,高親和性の新しいメカニズムを発見して論文作成を開始した.【動物細胞における細胞骨格系を制御するタンパク質】細胞運動野研究としては、RacGEFであるTiam1のPHCCExドメインと相互作用のNMRによる解析を進めるとともに、運動機能のリン酸化による制御に重要なRho-キナーゼのPH-C1ドメインの溶液中での構造決定と相互作用を解析した(三島・箱嶋)。また、新たに軸索伸長で重要な成長円錐の運動に関与するタンパク質の生化学的/構造学的研究の予備実験を終了した(箱嶋)。運動の方向の研究では、ミオシン-Xによる成長円錐端への特異的輸送機構を、tubulinやintegrinとの複合体結晶の作成の可能性を検討した(箱嶋)。更に、力学的応答の研究に関しては、vinculinとα-cateninでの複合体、ならびに、自己阻害型のα-cateninのデータ収集や構造解析を完成するとともに、更に、張力センサー部位のAFMによる伸長実験やシュミレーションにより、力応答曲線を求めて、定量的なバネ特性を明らかにする研究に拡張した(箱嶋・平野)。また、密着結合でのアクチン繊維制御に関わるRacGEFであるRich1や、その制御に関わるアクチン結合AMOTの生化学的解析と構造決定した(箱嶋)。発展型として、細胞の張力依存性と細胞の大きさや細胞の増殖抑制との関係で重要と考えられるα-cateninとmerlin、あるいはYAP1との相互作用解析も開始した。【植物シグナル伝達における構造生物学の新展開】DELLAタンパク質関連の研究では、GRASドメインの結晶構造解析を完成した。また、GRASドメインと相互作用する転写因子との相互作用解析や結晶化を進めた(箱嶋・平野)。更に、植物ホルモン受容体:strigolactoneの受容体候補となっているD14タンパク質や、karrikinの受容体候補のD14Lの複合体の構造を決定して論文発表した。1.動物細胞における細胞骨格系を制御するタンパク質本項目では、(i)細胞運動、(ii)運動の方向、(iii)力学的応答の研究を進めてきており、本年度は研究の遅れていた(iii)力学的応答での実験と論文作成と論文投稿をおこなった。具体的には、vinculinとa-cateninでの複合体、ならびに、自己阻害型のa-cateninの構造解析結果の整理と、a-cateninの張力センサー機構の生物物理的な解析(京都大学・安達教授との共同研究)を進めた(箱嶋・平野)。この共同研究では、張力センサー部位のAFMによる伸長実験やシュミレーションにより、力応答曲線を求めて、定量的なバネ特性を明らかにすることができて,論文作成と投稿することができた.
胚中心B細胞の増殖・分化および細胞死の分子機構とその制御

本研究は、胚中心B細胞の分化制御機構、免疫記憶の維持機構、選択されたB細胞の細胞死の機構を明らかにし、ひいてはB細胞の分化制御の分子機構を明らかにすることを研究の目的としている。本研究をする期間中に、(1)胚中心B細胞の発生・分化における、抗原レセプターや免疫機能分子(細胞接着分子、CD40/VD40L,CD19,CD21,CD38,サイトカインレセプターなど)の役割とその発現調節機構を解明し、(2)B細胞表面の抗原レセプター複合体やサイトカインレセプターを介するシグナル伝達機構の検討をし、(3)胚中心B細胞の分化誘導や寛容誘導の試験管内アッセイ系を確立する。(4)胚中心B細胞の分化におけるチロシンキナーゼの役割を分子レベルで明らかにすることを目的とした。研究は、当初の計画に基づき順調に進み興味ある成果が得られた。(1)ヒト胚中心B細胞はCD38分子に応答して分裂することが知られているが、マウス胚中心B細胞はCD38刺激に応答しないことがわかった。(2)sIgD陽性ナイーブB細胞を抗CD38抗体、CS/2とIL-5で刺激するとIgGl,IgG2b,IgG3の産生が誘導されるが、CS/2やIL-5の単独刺激は無効であった。CS/2と相乗的にB細胞に作用しIgGl産生を惹起するサイトカインを調べたところ、調べた範囲内でIL-5のみが有効であり、IL-4は無効であった。IL-4^<-/->マウスやSTAT6^<-/->マウスのB細胞もCS/2とIL-5に応答してIgGlを産生することから、このシステムはIL-4に非依存性のIgGl産生を誘導できるシステムであることがわかった。(3)CS/2刺激により非翻訳型γ1mRNAの転写が起こるが、μからγ1への遺伝子組み替えは起こらなかった。しかし、CS/2刺激されたB細胞をIL-5で刺激するとμからγ1への遺伝子組み替えが惹起されることが、スイッチサークルDNAを増幅し解析してはじめて明らかになった。本研究は胚中心B細胞の分化制御機構、免疫記憶の維持機構、選択されたB細胞の細胞死の機構を明らかにし、ひいてはB細胞の分化制御の分子機構を明らかにすることを研究の目的としている。本研究をする期間中に、(i)胚中心B細胞の発生・分化における、抗原レセプターや免疫機能分子(細胞接着分子、CD40/VD40L,CD19,CD21,CD38,サイトカインレセプターなど)の役割とその発現調節機構を解明し、(ii)B細胞表面の抗原レセプター複合体やサイトカインレセプターを介するシグナル伝達機構の検討をし、(iii)胚中心B細胞の分化誘導や寛容誘導の試験管内アッセイ系を確立する。(iv)胚中心B細胞の分化におけるチロシンキナーゼの役割を分子レベルで明らかにする。研究は当初の計画に基づき順調に進んでおり、本年度は以下の3点を中心に研究を進め、興味ある成果が得られつつある。(1)胚中心

B細胞の発生・分化におけるCD38,IL-5レセプター(IL-5R)の役割を解明を解明するため、IL-5Rα鎖遺伝子欠損マウスを免疫し胚中心B細胞の生成とその応答性を調べた。IL-5Rα鎖遺伝子欠損マウスでも抗原刺激により胚中心は野生マウスと同じように形成され、B細胞はCD40やIL-4刺激で抗原特異的なlgG1産生をした。(2)ヒト胚中心B細胞はCD38分子に応答して分裂することが知られているが、マウス胚中心B細胞はCD38刺激に応答しないことがわかった。(3)B細胞の分化段階でプロBからプレB細胞への移行に必須のチロシンキナーゼBtkに1アミノ酸変異を持つ伴性B細胞不全(XID)マウスにおける胚中心の生成およびそのB細胞の応答性を調べた。XIDマウスの一次抗原刺激では胚中心の形成が悪いが二次抗原刺激すると野生型マウスと同様に胚中心を形成すること、胚中心B細胞はCD40とIL-4刺激によりlgG1産生をするが、IL-5刺激には応答できないこと、つまりIL-5応答性に異常があることが初めてわかった。本研究は、胚中心B細胞の分化制御機構、免疫記憶の維持機構、選択されたB細胞の細胞死の機構を明らかにし、ひいてはB細胞の分化制御の分子機構を明らかにすることを研究の目的としている。本研究をする期間中に、(1)胚中心B細胞の発生・分化における、抗原レセプターや免疫機能分子(細胞接着分子、CD40/VD40L,CD19,CD21,CD38,サイトカインレセプターなど)の役割とその発現調節機構を解明し、(2)B細胞表面の抗原レセプター複合体やサイトカインレセプターを介するシグナル伝達機構の検討をし、(3)胚中心B細胞の分化誘導や寛容誘導の試験管内アッセイ系を確立する。(4)胚中心B細胞の分化におけるチロシンキナーゼの役割を分子レベルで明らかにすることを目的とした。研究は、当初の計画に基づき順調に進み興味ある成果が得られた。(1)ヒト胚中心B細胞はCD38分子に応答して分裂することが知られているが、マウス胚中心B細胞はCD38刺激に応答しないことがわかった。(2) sIgD陽性ナイーブB細胞を抗CD38抗体、CS/2とIL-5で刺激するとIgG1,IgG2b,IgG3の産生が誘導されるが、CS/2やIL-5の単独刺激は無効であった。CS/2と相乗的にB細胞に作用しIgG1産生を惹起するサイトカインを調べたところ、調べた範囲内でIL-5のみが有効であり、IL-4は無効であった。IL-4^<-/->マウスやSTAT6^<-/->マウスのB細胞もCS/2とIL-5に応答してIgG1を産生ずることから、このシステムはIL-4に非依存性のIgG1産生を誘導できるシステムであることがわかった。(3)CS/2刺激により非翻訳型γ1 mRNAの転写が起こるが、μからγ1への遺伝子組み替えは起こらなかった。しかし、CS/2刺激されたB細胞をIL-5で刺激するとμからγ1への遺伝子組み替えが惹起されることが、スイッチサークルDNAを増幅し解析してはじめて明らかになった。
化学遺伝学研究法を用いたヒトES細胞の未分化維持・分化制御機構の解明

化学遺伝学研究法を用いて、ある種の類似化学構造をもった神経伝達物質拮抗剤はヒトES細胞の未分化維持・増殖に効果があることを見出した。これらの化合物を用いることでヒトES細胞の未分化維持・増殖に不可欠な役割を果たしていると考えられているbFGFを培地中に添加することなく、ヒトES細胞の長期培養が可能になった。長期培養後も細胞は未分化状態を示し、正常染色体であり、多分化能を有していた。ヒトES細胞は、体を構成する全ての細胞種に分化する能力及び多分化能を保持したまま、培養下で無制限に増殖できる株細胞である。このような特性から、将来ヒトES細胞を用いた再生医療への展開が期待されている。また近年ヒト体細胞からiPS細胞というES細胞と極めて似た性質を持つ細胞の作出法も見出されている。しかしながら、再生医療に賄うべき必要な正常ES/iPS細胞(以下ES細胞と統一して表現する)を大量にどう調達するか、またその分子的基盤を含めて今後明らかにしていく必要がある。本研究ではchemical genetics(化学遺伝学研究法)によるアプローチを用いたヒトES細胞の分子制御機構の理解を目指しており、本研究期間ではそのための土台づくりまでを目標とする。平成22年度はヒトES細胞の未分化・分化状態に対する化合物の効果を、より客観的に評価する指標として、数値化を目指した。数値的な評価が確立できると、より多種の化合物をスクリーニングできるハイスループットスクリーニング(HTS)への発展が可能となる。具体的には、ヒトES細胞の未分化維持に不可欠な役割をしていることが知られている既知の遺伝子のプロモータ領域にGFPをレポーターとしてつなげたベクター遺伝子を導入したヒトES細胞株を樹立した。そしてこのGFPの蛍光強度が、ヒトES細胞の分化・未分化状態と極めて相関していることを見出した。さらに細胞の形態などの要素を加味し、未分化・分化状態をより厳密な評価をすることにも成功した。この成果については分子生物学会、再生医療学会などで、発表を行い、非常に好評であった。次年度は本プロジェクトを発展させること、すなわちヒトES細胞に対して化学遺伝学研究のために化合物ライブラリを用い、ヒトES細胞への未分化・分化効果を評価することでスクリーニングを進める。平成23年度は、この系を用い約1000化合物についてスクリーニングを進めた。その中で比較的類似した化学構造を有する化合物5種が存在することを見出した。さらにこれらの化合物を用いることで、ヒトES細胞の未分化維持増殖にほどんど不可欠であると考えられていたbFGFの代替として機能しうることも見出した。長期間培養された細胞では、未分化ヒトES細胞の特徴をもち、染色体も正常のままであり、多分化能を有していることも見出した。

平成22年度はヒトES細胞の未分化・分化状態に対する化合物の効果を、より客観的に評価する指標として、数値化を目指した。数値的な評価が確立できると、より多種の化合物をスクリーニングできるハイスループットスクリーニング(HTS)への発展が可能となる。平成23年度は、この系を用い約1000化合物についてスクリーニングを進めた。その中で比較的類似した化学構造を有する神経伝達物質拮抗剤5種を見出した。さらにこれらの化合物を用いることで、ヒトES細胞の未分化維持増殖にほどんど不可欠であると考えられていたbFGFの代替として機能しうることも見出した。長期間培養された細胞では、未分化ヒトES細胞の特徴をもち、染色体も正常であり、多分化能を有していることも見出した。平成24年度は前年度の結果を詳細に確認するとともに、その成果を国際誌Biochemical and Biophysical Research Communicationsに掲載することができた(DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.03.061)。平成22年度には実験系を確立し、平成23年度にはその実験系用い化合物スクリーニングを行い、ヒトES細胞の未分化維持に効果のある化合物を単に見出した。また見出された化合物はその効果はヒトES細胞培養に対して長期間効果があることも見出しており、非常に効果のある化合物を見出せたと考えている。さらに、見出された化合物の中には類似構造を有するものが存在していたことを見出しおり、本課題研究で提案した、化学遺伝学研究法の有用性を示すこともできている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は順調に遂行している。平成24年度においては、化合物の分子的な作用機序を進めるとともに、研究期間内に学術論文、学会発表、ホームページでのなどを通して本研究課題成果を広く知らしめたいと考えている。
経年分析に基づく訪問看護事業所の質・事業継続に関する実証研究

1)訪問看護事業所数の伸び率が高い都道府県に所在する新規開設の訪問看護事業所を対象とした質問紙調査データを用い、地域ネットワークの取り組みに関連する要因について分析した。その結果、地域連携には88.9%の事業所が取り組んでいた。一方、ニーズ把握、地域貢献の取り組み割合は58.238.5%であり、それらに取り組む要因は、開設時における訪問看護経験のある看護職員数が少ない、非営利法人、同一法人が他にも訪問看護事業所を運営していること等を明らかにした。本成果は日本在宅看護学会誌に投稿し、採択された。2)「介護サービス情報公表システム」掲載の全国の訪問看護事業所のデータベースの2014年度調査分を用い、訪問看護事業所の事業継続期間に関連する要因を検討した。事業継続年数は、15年以上が43.9%、10年15年未満は13.9%、5年以上10年未満が17.9%、5年未満が14.3%であった。多変量解析の結果、「高齢化率が高い」「指示書発行医療機関数が多い」「居宅介護支援を併設」「生活保護法の指定を受けている」「土曜日の営業」「看護職員常勤換算数が多い」「訪問看護経験年数10年以上の看護職員割合が大きい」「管理者が他の業務と非兼務」「事務職員が従事」「要介護4以上の利用者割合が大きい」「人口呼吸療法を必要とする利用者の受け入れを行っている」「第三者評価を実施」「訪問看護記録に利用者等の希望、健康状態等が記載」「倫理規定がある」「全ての現任従事者を対象とする研修の実施記録がある」ほど事業継続年数が有意に長いことを明らかにした。本成果は学会誌に投稿予定である。3)2014年度および2016年度の訪問看護事業所のパネルデータを作成し、新規参入、休止・廃止した訪問看護事業所の特性について分析中である。4)これまでの成果を踏まえ、次年度実施予定の全国調査の調査設計中である。本研究は、本年度(平成30年度)が最終年度であったが、全国の訪問看護事業所のパネルデータベースの作成(データクリーニングおよび廃業した事業所の確定等)に想定以上の時間を要した。さらに、これらの結果をもとに本年度、全国調査を実施する予定であったが、実施が困難となり、補助事業期間を延長し、実施予定である。次年度(令和元年度)に、本年度(平成30年度)に作成したパネルデータを用いて、訪問看護事業所の新規参入および休止・廃止に関連する要因を明らかにする。そして、これまでの成果をもとに、訪問看護事業所の質の評価指標を選定し、全国レベルでの実態調査を実施する。これらの成果は、国内外の学会誌に投稿し、公表を行う予定である。本研究の目的は、近年の訪問看護事業所数の急増、民間企業の参入拡大に着目し、開設者の違いや特性、参入時期当が訪問看護事業所の質や事業継続に影響を及ぼしているかを検証することである。初年度である平成28年度は、訪問看護事業所の質を測定するための指標を開発するために、先行的な都市や第三者評価等の団体で既に使用中の質指標および国内外の論文のレビューを行うとともに、居宅サービス事業所の指定権者である都道府県・市町村で、かつ平成24年以降、訪問看護事業所数が急増している都道府県・市町村の担当者等で本研究に協力が得られた6名を対象に訪問看護ステーションの質に関するインタビュー調査を実施した。また、訪問看護事業所におけるサービスの質確保への取組に関する実証研究の分析に使用するデータベース(介護サービス情報公表システムに掲載されている訪問看護事業所の情報:約8000か所)の作成を行った。インタビュー調査終了が3月となり、平成28年度中にデータ分析が終了せず、専門パネルによるディスカッションを通じた訪問看護事業所の質を測定するための総合指標の抽出は平成29年度に実施することになった。本年度(平成29年度)の研究実績は以下のとおりである。1)前年度実施した日本の訪問看護事業所の質評価に関する国内外の文献レビューから訪問看護事業所の質を測定するための候補となる指標の抽出を行った。2)介護保険事業の推進や指導監督を担当する自治体職員が捉えた訪問看護事業所における質的評価の視点を明らかにするために、前年度末に実施した訪問看護事業所数の伸び率が高い都道府県及び政令指定都市の指導監督等を担当する部署に配属されている職員を対象に行ったインタビュー調査データを用いて質的記述的分析を行った。その結果、【24時間365日安定的に訪問看護が提供できる体制】がある、【情報開示や証拠に耐えうる記録が整備されている】、管理者に【地域包括ケアシステム推進の役割認識がある】等が抽出された。その成果を日本プライマリ・ケア連合学会誌に投稿し、採択された。3)訪問看護事業所数の伸び率が高い都道府県に所在する新規開設の訪問看護事業所を対象とした質問紙調査データを用い、地域ネットワークの取り組みに関連する要因について分析した。その成果は学会誌に投稿中である。4)介護サービス情報公表システム掲載の訪問看護事業所のデータクリーニングを行うとともに、経年分析を行うためのパネルデータベースの作成した。5)4)で作成したデータベースの単年度分を用い、サービスの質評価への取り組みおよび事業存続・継続期間に関する分析を行った。6)4)のパネルデータを用い、新規参入、休止・廃止した訪問看護事業所の確認作業を行っている。前年度実施した研究の成果について今年論文にまとめ、順次学術誌に投稿中である。

一方、本年度、全国調査を予定であったが、今年度実施した文献レビューや自治体へのインタビュー調査等の分析の結果から次年度予定分析結果を踏まえた上で、訪問看護事業所の質を測定するための指標を選定し、実態調査を実施したほうがよいと判断されたため、今年度、介護サービス情報公表システムの訪問看護事業所のデータベース化を前倒しして実施し、全国レベルでの調査は次年度に実施することとした。全体の進捗としては、概ね順調に進展している。1)訪問看護事業所数の伸び率が高い都道府県に所在する新規開設の訪問看護事業所を対象とした質問紙調査データを用い、地域ネットワークの取り組みに関連する要因について分析した。その結果、地域連携には88.9%の事業所が取り組んでいた。一方、ニーズ把握、地域貢献の取り組み割合は58.238.5%であり、それらに取り組む要因は、開設時における訪問看護経験のある看護職員数が少ない、非営利法人、同一法人が他にも訪問看護事業所を運営していること等を明らかにした。本成果は日本在宅看護学会誌に投稿し、採択された。2)「介護サービス情報公表システム」掲載の全国の訪問看護事業所のデータベースの2014年度調査分を用い、訪問看護事業所の事業継続期間に関連する要因を検討した。事業継続年数は、15年以上が43.9%、10年15年未満は13.9%、5年以上10年未満が17.9%、5年未満が14.3%であった。多変量解析の結果、「高齢化率が高い」「指示書発行医療機関数が多い」「居宅介護支援を併設」「生活保護法の指定を受けている」「土曜日の営業」「看護職員常勤換算数が多い」「訪問看護経験年数10年以上の看護職員割合が大きい」「管理者が他の業務と非兼務」「事務職員が従事」「要介護4以上の利用者割合が大きい」「人口呼吸療法を必要とする利用者の受け入れを行っている」「第三者評価を実施」「訪問看護記録に利用者等の希望、健康状態等が記載」「倫理規定がある」「全ての現任従事者を対象とする研修の実施記録がある」ほど事業継続年数が有意に長いことを明らかにした。本成果は学会誌に投稿予定である。3)2014年度および2016年度の訪問看護事業所のパネルデータを作成し、新規参入、休止・廃止した訪問看護事業所の特性について分析中である。4)これまでの成果を踏まえ、次年度実施予定の全国調査の調査設計中である。本研究は、本年度(平成30年度)が最終年度であったが、全国の訪問看護事業所のパネルデータベースの作成(データクリーニングおよび廃業した事業所の確定等)に想定以上の時間を要した。さらに、これらの結果をもとに本年度、全国調査を実施する予定であったが、実施が困難となり、補助事業期間を延長し、実施予定である。平成28年度に実施した文献レビューおよび訪問看護ステーションの質に関するインタビュー調査の結果については論文にまとめ公表予定である。平成29年度に計画している訪問看護事業所におけるサービスの質確保への取組に関する実証研究については、平成28年度に分析に使用するデータベースを作成しており、分析を進める。以上の結果を踏まえ、平成29年度に開発した質評価指標を用い、全国調査を実施し、国内における訪問看護事業所の質を検証予定である。
シトクロムP450還元酵素からシトクロムP450への電子移動機構解明

シトクロムP450(P450)はステロイドの生合成などの脂質代謝や薬物代謝において重要な役割を果たす酵素である。P450が酵素反応に必要な酸素分子を活性化するためには、鉄硫黄クラスターを補因子とするアドレノドキシン(Adx)やフラビン酵素であるシトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力が必要である。この電子移動系路の詳細を明らかにするためには、酸化還元複合体の立体構造が必要である。Adx-P450複合体については、バクテリアホモログにおいて既に構造解析例があるが、CPR-P450複合体に関してはいまだに構造解析例がない。そこで、本研究ではCPR-P450複合体について立体構造情報を得ることを目的とした。昨年度までに第一段階として、open型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450をラット肝マイクロソーム画分から、免液沈降法および質量分析法を使って探索した結果、二種類のP450を同定し、大腸菌を用いた発現精製系を作製した。しかし、精製標品とΔTGEEとの相互作用を表面プラズモン共鳴法及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いて検討した結果、期待したほど強いΔTGEEとの相互作用は見られなかった。引き続き、別のP450を探索したが、有望な結果は得られていない。また、天然のCPR-P450融合タンパク質であるP450-BM3に着目し、そちらから立体構造情報を得ることも試みている。大腸菌における発現精製系を作製し、X線小角散乱法により、概形の取得に成功した。P450-BM3は複数のドメインから構築されているので、それぞれのドメインを欠損させた変異体を作製し、概形のどの部分がどのドメインに相当するのかを検討している。シトクロムP450(P450)はステロイドの生合成等の脂質代謝や薬物代謝において重要な役割を果たす酵素である。この電子移動経路の詳細を明らかにするためには、酸化還元複合体の立体構造が必要である。Adx-P450複合体については、バクテリアホモログにおいて、すでに構造解析例があるが、CPR-P450複合体に関しては、いまだに構造解析例がない。そこで、本研究では、シトクロムP450還元酵素とシトクロムP450との複合体について、結晶構造を得ることやそれらを用いた二酵素間の電子移動反応の機能解析を目的とした。その目的を達成する第一段階として、本年度はopen型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450の探索を行った。FLAGタグを付加したΔTGEEと抗FLAGタグ抗体を使用した免疫沈降法により、ΔTGEEと相互作用すると思われるタンパク質分子を、ラット肝マイクロソーム画分から共精製した。その成分について、質量分析法による同定を行った結果、ΔTGEEと相互作用すると思われるP450が二種類同定された。今年度得られた結果をもとに、次年度以降の研究では相互作用すると思われるP450二種類の発現・精製系の確立を行い、精製ΔTGEEとの相互作用測定を行うことができる。以上のように次年度以降の研究進展へとつながる結果を本年度は得ることができた。平成28年度の研究計画の目標は、ΔTGEEと強い相互作用を示すシトクロムP450を同定することであった。実際に抗FLAGタグ抗体を使用した免疫沈降と質量分析法により、ΔTGEEと相互作用を示すシトクロムP450の候補二種類が同定できたため。昨年度はその第一段階として、open型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450をラット肝マイクロソーム画分から、免液沈降法および質量分析法を使って探索した結果、二種類のP450を同定した。今年度はそれら二種類のP450について、大腸菌を用いた発現・精製系を作製し、精製標品とΔTGEEとの相互作用を表面プラズモン共鳴法及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いて検討した。しかし期待したほど強いΔTGEEとの相互作用は見られなかった。引き続き、別のP450を探索していく必要がある。大腸菌における発現・精製系を作製し、X線小角散乱測定から、分子の概形を得ることに成功した。

昨年度、open型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450として同定した二種類の候補について、大腸菌を用いた発現・精製系を構築し、高純度に精製した試料を得たが、いずれも期待したほど強いΔTGEEとの相互作用は見られなかったため。シトクロムP450(P450)はステロイドの生合成などの脂質代謝や薬物代謝において重要な役割を果たす酵素である。P450が酵素反応に必要な酸素分子を活性化するためには、鉄硫黄クラスターを補因子とするアドレノドキシン(Adx)やフラビン酵素であるシトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力が必要である。この電子移動系路の詳細を明らかにするためには、酸化還元複合体の立体構造が必要である。Adx-P450複合体については、バクテリアホモログにおいて既に構造解析例があるが、CPR-P450複合体に関してはいまだに構造解析例がない。そこで、本研究ではCPR-P450複合体について立体構造情報を得ることを目的とした。昨年度までに第一段階として、open型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450をラット肝マイクロソーム画分から、免液沈降法および質量分析法を使って探索した結果、二種類のP450を同定し、大腸菌を用いた発現精製系を作製した。しかし、精製標品とΔTGEEとの相互作用を表面プラズモン共鳴法及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いて検討した結果、期待したほど強いΔTGEEとの相互作用は見られなかった。引き続き、別のP450を探索したが、有望な結果は得られていない。また、天然のCPR-P450融合タンパク質であるP450-BM3に着目し、そちらから立体構造情報を得ることも試みている。大腸菌における発現精製系を作製し、X線小角散乱法により、概形の取得に成功した。P450-BM3は複数のドメインから構築されているので、それぞれのドメインを欠損させた変異体を作製し、概形のどの部分がどのドメインに相当するのかを検討している。免疫沈降と質量分析の結果、同定されたシトクロムP450の候補二種類について、発現・精製系を構築し、実際にΔTGEEと強い相互作用を示すかどうかを精製シトクロムP450を用いて検討する。強い相互作用を示す場合は、そのシトクロムP450とΔTGEEとの共結晶を得るために、結晶化スクリーニングを進める。免液沈降法および質量分析法による再スクリーニングを行い、別のopen型安定化CPR(ΔTGEE)と強く相互作用するP450を探索する。また、天然のCPR-P450融合タンパク質であるP450-BM3について、X線小角散乱結果から得られた概形に、既知のドメイン構造をフィッティングし、電子移動機構について推察する。ほぼ計画通りに使用したため、次年度使用額は少額であった。その差は試薬等の見積り額と実際の支払額の若干のずれによって生じた。研究計画の遅れにより、使用を見込んでいた消耗品・試薬と実際に使用した消耗品・試薬が異なるため。差額は次年度の研究において、物品費として使用する。次年度の研究に必要な試薬・消耗品の購入に使用する
フランスにおける公民教育の強化と非行・暴力対策プログラムに関する実証的研究

1.本研究は、校内暴力の防止のための具体的な方策とともに、市民性教育の充実を学校教育の中でどのように図っていくのかについて、フランスの事例との比較研究をおこなうことを目的としていた。申請書に明記した研究目的と計画に沿って、関連文献を収集・整理し、グルノーブル大学区における先駆的事例を調査したほか、代表的な研究者および実践者の研究レビューを受け、その結果として数本の論文を公表した。2.近年フランスでは、大都市近郊を中心に中学校や高校あるいは地域社会での暴力さらには凶悪な事件が頻発し、深刻な社会問題となってきている。これに対して教育行政当局は、青年層を対象とした雇用の創出により社会不安を減少する方策をとり、また厳罰主義といった即時的対応をとってきただけでなく、学校における市民性教育を重視し、学校生活を充実させることにより、道徳と社会性の定着・育成を図るという中長期的な方法も追求してきている。3.申請者が注目したのは、生徒たち自身が中学校や高校の管理運営に参加する中で学校生活をいかに充実させるか、その生徒代表教育をより完全なものにしていくかについて腐心し、1970年代以来、生徒向けのガイドブックを毎年改訂発行し続けている取り組みであった。この点でDamian DUREND氏とPierre JOURDAN氏とは、2度にわたって研究成果の検討をおこなったほか、訳本として『フランスの中学生生徒参加と市民性の育成』を発行した。1.中学校や高校あるいは地域社会での青年の問題行動は、フランス社会の最も喫緊の教育課題であり、青年層を対象とした雇用の創出や厳罰主義の適用といった即時的政策の一方で、学校における教科としての「公民科」教育、および生徒の参加制度を充実させつつ、学校生活全体を通して公共道徳と社会性の定着・育成を図るという、中長期的な方法をも追求してきている。2.研究初年度においては、まず小学校、中学校および高校の公民教育に関する教科書並びに各種の参考図書、さらに近年目だって多くなってきている校内暴力・非行に関する研究文献、さらには生徒代表の育成に関する資料を収集し、整理するとともに、分析の枠組みについての基本構想を立てた。3.フランスへの現地調査においては、フランス文部省が特にその生徒参加の定着と生徒代表の養成教育についての特別プロジェクト地域に設定し、一定の成果をあげてきているグルノーブル大学区での活動状況を調査した。現地の中学校および高校を訪問し、また生徒代表とも意見交換をおこなった。特に、長くその活動の中心を担ってきたジュールダン(Pierre Jourdan)氏、およびその後任となったデュラン氏(Damien Durand)による研究レヴューでは、多くの示唆を受けた。1.生徒代表養成教育と公民教育について、グルノーブル大学区を中心に、フランス全土において出版され定評の高いガイドブック"Delegue deseleves aucollege"(ピエール・ジュルダン著)の翻訳本とその解説を『フランスの中学生生徒代表参加と市民性の育成』として発行し、関係各方面に頒布した。これは今後のわが国における公民教育啓発のプログラムを作成するための基礎資料となるものである。また同時に、高校生版の"Delegue flash"(ダミアン・デュラン著)を『フランスの高校生生徒参加と市民性の育成』として翻訳・発行する準備段階にある。2.校内の治安維持、非行・暴力対策については、即効的には若者雇用による学校補助員の導入にみられる各種の物的・人的条件整備であると同時に、問題行動や犯罪を犯した者に対する厳罰主義の適用、あるいは被害者に対するケアの充実である。しかし近年のフランスでは、中・長期的には中学生や高校生の市民性教育に重点を置いて、足腰の強い学校を作ることに腐心している。3.当初予定していたフランス現地調査は、諸般の事情から実施しなかったが、文献調査と収集を続行し、校内暴力および非行について、市民性教育と生徒代表の学校管理運営に関して、それぞれの書籍文献、雑誌論文の文献リストの作成をおこなった。また、最終年度の研究報告に向けて、分析の枠組みについて基本構想を立てた。1.本研究を始めた3年前では、青少年の犯罪と非行は、現代フランスにおける主要教育問題の一つであったが、その後今日では深刻な社会問題の一つとしてとらえられる傾向がますます強くなってきた。