hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁気検出法によるホモジニアスアッセイの深化と微量血液検査システムの開発

本研究では、酸化鉄と抗体分子からなる検出用磁気マーカーと感度の高い磁気検出センサーの組合せによる磁気的免疫検査法について、その各構成要素の深化による簡便かつ高感度な磁気的免疫分析システム(ホモジニアスアッセイ)の構築を行った。すなわち、B/F (Bound/Free)分離の洗浄工程を不要とする高感度な液相免疫検査法の確立と、試作機を用いた磁気的免疫検査法による検査実験を通して、本手法の有効性を実証した。平成27年度は、主に3つのテーマに分けて研究を行う予定であった。一つ目は、計測技術:検査システムの試作であり、現在試作している検査システムを基本として、高速・高感度に再現良く計測可能な臨床検査システムを開発する。要素技術を統合し、医療機関においてエンドユーザーによる測定が可能な迅速検査システムを開発するとともに、プロトコールの最適化を行う予定であった。しかし、改良の途中でシステムが不調となり測定できなくなってしまった。大きな原因はプログラムOSであることが分かり、現在復旧中である。二つ目は、微粒子改良:磁気マーカーの粒径制御技術の開発である。これについては最適化が完了し、分散性・磁気強度・耐久性の点から、フェルカルボトランが最も適しているとの結論に至った。現在、この粒子の基礎的物理解析を行っている。三つ目は臨床評価であった。システムの改良と同時並行で臨床検体の測定を行う予定であったが、上記システム不調によりほとんど測定できなかった。本年度はシステムが復旧次第、遅れを取り戻すべくデータの蓄積を行いたいと考えている。当初予定していたサブテーマ3つ(計測技術、微粒子改良、臨床評価)のうち、2つは順調に進行しているが、臨床評価については測定装置が不調となり、検体測定を行えなかったため。平成28年度は、開発した磁気的検査システムの臨床評価を主に行った。熊本地震の影響から測定装置の不調が続いているが、本研究で設定した測定項目の一つであるスギ花粉抗原(Cry J-1蛋白質、Cry J-2蛋白質)、スギ花粉単体を測定することに成功し、本検査システムの有効性を示した。特に、Cry J-2については、現在測定できる手法が確立しておらず、今後の進展に期待できるものである。今後、製薬メーカー等との共同研究等も視野に入れ、Cry J-2測定システムの改良を図る予定である。また、システム評価、磁気微粒子評価については、磁気印加システムを新たに開発し、導入した。大きな違いは、これまで反応後のサンプル溶液に比較的強磁気を当てていたものを、抗原抗体反応中に弱い磁気を継続的に印加する方法に変えたことである。これにより操作ステップが1段階増える煩雑性が増した反面、磁気マーカーからのシグナルが安定し、再現性が向上するとともに、強磁気によるマーカーの沈殿が減少した。総じて、計測技術に対しては操作性と測定値の再現性を、微粒子開発に関しては試薬の安定性を示すことに成功したと考えている。一方で使用した磁気マーカーは市販品であり、やや分散性に劣る面があった。これについてはメンブレンフィルターによるろ過と分散溶媒の改良で向上を図っている最中である。平成27年度の研究により生じた問題点、及び平成28年度までに設定した目標については、おおむねクリアできたと考えている。熊本地震による装置の不具合も修正でき、平成28年度に設定した研究課題と目標はおおむね達成できた。計測技術に関しては、磁気印加システムの改良に伴う検査システムの確立、臨床評価においてはスギ花粉抗原及び単体の測定及び操作法の確立による本システムの有効性を証明できたと考えている。平成29年度は本研究課題において最終年度にあたり、これまで構築・検証・改良を行ってきた磁気的免疫検査システムの臨床評価とターゲットタンパク質の検出限界の測定及びその有用性について検討を行った。ターゲットタンパク質はスギ花粉抗原2種(Cry J1, Cry J2)と肝癌関連腫瘍マーカー(alpha fetoprotein; AFP)の合計3種類である。相変わらず熊本地震の影響から装置の不調が続いているが、スギ花粉抗原についてはCry J1が現存検出法の10倍100倍程度の検出が可能であること、Cry J2については感度が低いが蛋白質そのものの検出が可能であることを日本で初めて示すことができた。Cry J2検出システムについては、興味を示した民間企業との共同研究の打ち合わせを行っている。AFPについては血中AFPの検出が可能であることは示せたものの、実用化できる水準の検出感度を得ることができなかった。検出システムの構築、検出手法の確立はCry J1で示したと思われるので、AFPの臨床検出に特化した磁気マーカーの作成、及び装置の復帰がなされれば、この点も解決されると考えている。スギ花粉に関しては現在論文を作成中であるが、同時にスギ花粉そのものを使用し待機中を浮遊する花粉の検出法の確立を行っている最中である。我々のグループが以前示したように、直径数マイクロの菌類の直接検出は本システムで可能であったことから、花粉収集の方法が定まれば、従来法に取って代わる分析方法となる可能性がある。

今回得られた磁気マーカーの物理学的性質を明らかにするとともに、検査システムの早期復旧を図る。さらに、遅れている検体測定を実施し、実用化に向けたプロトコールの改良を検討する。なお、検査システムの復旧には、開発者である日立製作所及び九州大学の協力を得るものとしたい。これまで開発してきた要素技術の全てを統合し、目標とするマイクロ臨床検査システムの構築を完成させる。測定を行う予定の項目は、平成28年度に引き続きスギ花粉と、ヒト肝がんマーカであるαーフェトプロテイン(AFP)であり、これら項目の測定限界と正確性、再現性を明らかにする。また、測定できた検査項目は、IFCC(International Federation of ClinicalChemistry)の基準に従った国際単位での統計学的解析を行い、既存の検査装置に対する優位性を示したい。臨床検査医学計画書提出時に予定していた学会発表が大学校務と重なってしまい、発表を断念したため旅費使用額が当初計画より少なかった。購入した試薬類について、当初予定では定価で計算していたが、販売業者の販促キャンペーンや多少の値引きがあり実購入額が下回ったため。システム不調と地震による故障が重なったため、その復旧費用の一部として使用する予定である。物品費(20万円)と謝金等(10万円)に使用を予定している。
インクルーシブ保育に関わる保育者のエンパワメントプログラムの開発

これまでに行った研究、視察の成果をもとに、インシデントプロセス法を用いたインクルーシブ保育に関わる保育者を対象としたエンパワメントプログラムを立案、実施した。このプログラムによる事例検討会においては、事例提供者が抱える悩みの元となる問題を丁寧に捉え直すことによって、無力感を抱えていた保育者が「自分にもできることがある」という前向きな気持ちを表出することにつながり「エンパワメント効果」が期待できることがわかった。質問紙調査の結果でも、前向きに保育に取り組む気持ちの上昇と、対応への悩みや不安の下降が有意に認められた。プログラム参加者が自発的に同様の研修会を企画実践するという成果にもつながった。1.千葉市幼稚園協会研修会(5月)、千葉市保育課主催研修会(6月)において、参加者対象に予備調査を実施した。研修会参加者150名アンケート回答者50名。内容は、現在保育者として仕事をし、バーンアウトにつながるような状況を経験したことがあるか、またインクルーシブ保育を行っていて、困っていること、対応に苦慮していること等について具体的な記述を求めた。今後エンパワメントプログラムを実施するとしたら参加可能か、日程的な希望、差支えない場合は連絡先を記入してもらい、次年度から開始予定のエンパワメントプログラムの開発、参加者募集に役立てる予定である。2.9月1日8日の日程でアメリカノースカロライナ州ウィルミントンで行われたティーチプログラムの研修会に参加した。ティーチプログラムは、環境の構造化、プログラムの構造化をはじめとした包括的プログラムによって、自閉症の子どもたちの社会適応を高め、地域社会で暮らしていけるようにするための教育プログラムである。今回の研修でTEACCHセンターが保育施設、学校等に提供しているプログラムは、保育者のバーンアウトを予防し、エンパワメントプログラムを考えるにあたり多くの示唆を与えられるものであった。また、視察の成果を臨床発達心理士実践研究論文として分担執筆者の一人としてまとめ投稿中である。3.認定こども園においてインクルーシブ保育を行っている保育者へのインタヴュー調査。区立の認定こども園で保育者として勤務して3年目の保育者を対象にインタヴューを実施した。チーム保育を行うにあたって、ペアを組んでいる保育者との保育観の違いが大きな障害になっていることが浮かび上がり、保育観を共有できるような研修プログラムの必要であることがわかった。バーンアウト傾向尺度、特別支援教育負担感尺度に代わるものとして、ポジティブな感情にも目を向け、インクルーシブ保育に関して保育者が抱える不安や,負担感とともにやりがい感、専門性への自信を図る質問紙を作成した。当初の計画に従い、エンパワメントプログラムとして連続ワークショップを実施した。7月初旬より、実施プログラムと参加者の募集方法について検討し、日程と会場を決定した。9月に入って参加者の募集を開始し、最終的には37名の参加者が集まった。平成27年11月14日平成28年1月30日まで、6回実施。インシデントプロセス法を用いたプログラムにより、参加者から「対応が難しい子ども」の事例を出してもらい、発表者への質問、グループごとの話しあい、全体討議の中で事例の詳細を明らかにし、アセスメントシートを作成した。さらに、アセスメントシートをもとに参加者自身が「明日の保育に生かせる方法」を考えた。このワークショップの成果をまとめ、平成28年4月北海道大学で行われた日本発達心理学会第27回研究大会での発表につなげた。平成26年9月に行った米国ノースカロライナ州におけるTEACCHプログラム研修に関連して、視察内容の一部を臨床発達心理学研究に投稿し、論文が掲載された。「TEACCHプログラムによる学童期の自閉症児支援」というテーマで、学童期の自閉症児支援、特に自閉症スペシャリストや担当教員の研修、コンサルテーションにおいてTEACCHセンターが教師のエンパワメントに関して重要な役割を担っていることに触れている。平成28年3月には、教育・保育におけるインクルージョンを積極的に進めているニュージーランドの保育所、幼稚園、小学校、プレイグループの視察並びに担当者へのインタヴューを行い、教師、保育者、保護者に対するエンパワメントがどのように行われているかについて多くの情報を得ることができた。平成27年度は、校務の都合と研究協力をお願いしていた幼稚園の体制が子ども園に変更されたため、これまで継続的にかかわってきた幼稚園への定期的訪問が難しくなり、幼稚園における通常保育の中でのアセスメントシートの活用とエンパワメント効果の測定が難しかった。しかし、エンパワメントプログラムの中では、保育者自身によるアセスメントシートの作成や活用が行えたので、この点を生かして、アセスメントシートの活用について研究をまとめたい。エンパワメントプログラムの実施時期が年度後半になったため、最初と最後に実施した質問紙について、効果の分析が終了していない。海外視察については、平成26年度にノースカロライナで行ったTEACCHプログラム視察に加え、平成28年3月に、インクルージョンを積極的に進めているニュージーランドの視察を実施したため、思いのほか多くの記録データがあり、分析が完了していない。したがって、平成27年度中に予定していた、海外視察の成果とまとめは、平成28年度にずれ込む見通しである。平成27年度に行ったワークショップにおける研究成果をまとめ、日本発達心理学会第27回大会(平成28年5月30日北海道大学)、並びに日本乳幼児教育学会第26回大会(平成28年11月27日神戸女子大学)において研究発表を行った。ここまでの成果は、インシデントプロセス法が保育者主体の研修の方法として有効な手段であるということを実践的に明らかにしたことであり、保育者のエンパワメント効果が期待できるというものである。

学会では、インクルーシブ保育、あるいはエンパワメントに関心、興味を持つ多くの研究者と活発なやり取りを行うことが出来た。また、インシデントプロセス法について多くの質問を受け、特別支援教育担当者の研修会ではポピュラーなインシデントプロセス法が、今後保育者の研修の場にも活用できる有効な方法であることが示唆された。平成28年9月3日には、これまでの研究成果をもとに、文部科学省大学間連携共同教育推進事業「大学間発達障害支援ネットワークの構築と幼保専門職業人の養成」平成28年度フォーラムにおいて「インクルーシブ保育と保育者の専門性ーコンサルテーションからエンパワメントへー」というテーマで、講演を行った。平成28年9月下旬までに、保育者対象に行った質問紙調査のデータ入力を終了した。入力したデータの分析については、まだ完了していない。平成28年8月に、ワークショップに参加した後に、自らインシデントプロセス法による研修会のファシリテーターを務めた保育者と、そのワークショップに参加していた保育者2名を対象とした振り返りについてのインタビュー調査を実施した。インタビューは、それぞれ1時間程度行い、ファシリテーターを務めた保育者に対するインタビューの内容は、テープ起こしをして、文字データを分析した。この結果を日本発達心理学会第28回大会(平成29年3月27日広島国際会議場)で発表した。平成27年度までの研究の進捗状況がやや遅れていたのに加えて、平成28年11月以降、研究者の個人的事情により、遅れを取り戻すことが困難となった。平成28年度までに行った研究成果のうち、エンパワメントプログラムワークショップ参加者の意識の変化について質問紙調査の結果をまとめ、日本乳幼児教育学会(平成29年11月12日西南学院大学)において発表した。プログラム参加者のうち、プレテストとポストテスト両方のデータが取れたのは15名であった。効果測定のための質問紙22項目のうち、有意差のあった項目は6項目であった。意識の上昇がみられた項目は、保育への主体的な取り組み姿勢にかかわる項目であり、下降がみられた項目は、インクルーシブ保育の悩みに関する項目であった。以上の結果から、エンパワメントプログラムがインクルーシブ保育に関わる保育者のエンパワメントに一定の効果を上げたと考えることができる。また、ワークショップに参加した保育者に対するインタヴュー調査の分析結果を日本発達心理学会(平成30年3月24日東北大学)において発表した。平成29年7月からはこれまでの成果をもとに、A乳児院において、新たなエンパワメントプログラムを用いた保育・養育職員研修を9回にわたって実施した。この乳児院は、医療機関が併設していることもあって、重度の心身障害児を含む複数の障害児のインクルーシブ保育を行っている。第1回テーマを「子どもの人権」、第2回テーマを「保育環境」、第3回テーマを「言葉」に設定し1人当たり3回の研修を全職員が受けるというものであった。
炎症性皮膚疾患おける皮膚自然免疫機構の役割

本研究において自然免疫機構が皮膚炎症性疾患に与える影響を検討するために、表皮細胞と炎症性細胞における抗菌ペプチドカセリサイディンが与える影響を調べた。カセリサイディンによって表皮角化細胞から誘導されるILー1ファミリーに属するサイトカインILー36群を同定し、その作用を確認した。カセリサイディンとILー36は相加的、相乗的に炎症性サイトカイン誘導に関与することを確認した。カセリサイディンとILー36皮膚炎症性疾患の乾癬において高発現していることから、これらが皮膚炎症性疾患の増長に作用していることが確認された。本研究においては、自然免疫機構が皮膚炎症性疾患に与える影響を検討するために、表皮細胞と樹状細胞における抗菌ペプチドカセリサイディンが与える影響を調べた。カセリサイディンによって、表皮角化細胞から誘導されるサイトカインとしてIL-1ファミリーに属するIL-36群を同定し、その発現が幾つかの皮膚炎症性疾患で増加していることを確認した。表皮角化細胞におけるIL-36の誘導は、カセリサイディンの高発現と相まって、IL-8, IL-1, IP-10, CXCL1, CCL20, CXCL9などのケモカイン発現を表皮角化細胞に増強させ、さらに単球を活性化させるサイトカイン(G-CSF, GM-CSF, MCP-1, CCL5, IL-6, etc)の発現も誘導した。これらは、p38 MAPKもしくはNF-kBシグナルを介する転写制御によって誘導された。カセリサイディンによるケモカインとサイトカイン誘導の一部は、IL-36 siRNAによって抑制されたことから、IL-36は表皮角化細胞でオートクライン様式で働き、炎症性サイトカインの誘導に関与していることが示唆された。カセリサイディンで刺激された表皮角化細胞の培養上清は、ヒト末梢血由来単球(CD14+)にCD206の発現を誘導し、炎症性マクロファージへの誘導を来すことが示された。これらの結果は、感染や創傷機転によって誘導されるカセリサイディンが、IL-36の誘導を介して皮膚炎症性疾患の誘導に関与することを示唆した。現在、投稿論文の査読後改訂中。

カセリサイディンで刺激された表皮角化細胞の培養上清は、ヒト末梢血由来単球(CD14+)にCD206の発現を誘導し、炎症性マクロファージへの誘導を来すことが示された。これらの結果は、感染や創傷機転によって誘導されるカセリサイディンが、IL-36の誘導を介して皮膚炎症性疾患の誘導に関与することを示唆した。皮膚科研究計画は順調に進行しており、in vitroを中心とした実験系で、皮膚炎症性疾患における自然免役機構の抗菌ペプチド表皮角化細胞炎症性単球誘導の経路を確認できた。投稿論文の修正中であり、概ね順調な進捗と考える。研究計画は順調に進行しており、in vitroを中心とした実験系で、皮膚炎症性疾患における自然免役機構の抗菌ペプチド表皮角化細胞炎症性単球誘導の経路を確認できた。論文修正のための追加実験を行い、成果をまとめる。研究計画通りにin vivoの実験系を確立すると共に、他の自然免疫シグナル機構についても計画通りに進行する。該当無し
形式言語に基づいたポートフォリオ評価支援手法の開発とデータベース化の実現

本研究は,収集するポートフォリオの種類と評価内容との関係を「形式言語」を用いて形式化し,収集ポートフォリオの効果的な評価利用を支援することを目的とする.形式言語を用いることにより,ポートフォリオ問の関係構造と,評価との関係を文法として表現することができた.その結果,支援システムの開発が容易となった.これは,拡張BNF記法を用いてポートフォリオ格納構造を表現し,評価セマンティックス(評価法の記述)をBNFに付随させた属性文法を用いることで,効果的な評価を実現できた.さらに,BNF非終端ノードをもとにしたデータベース構築が可能となり,ポートフォリオ群の共有が可能となった.ポートフォリオ作成支援システムやSCORM, LOM, PAPI, LIP, IMSLDといったメタ言語の開発,学習指導案データベースに関する研究は数多く報告されてはいるが,ポートフォリオ群と効果的な評価方法を関連づけたり,およびそれらの関係付けに形式言語を用いたアプローチをとったものは,国内外で本研究が最初である.形式文法に基づいたポートフォリオ評価の設計と評価の実施は,経験の浅い教師に対し理論的側面からの支援を実現することができたといえよう.本研究はプログラム言語を定義する手法と同様のアプローチをとったもので,支援システムの開発にとどまらず,システムの開発を行う理論体系を確立したことから,今後のこの分野の研究に多いに貢献することができると考えられる.当初の目的を十分に達成することができたといえる.本研究は,収集するポートフォリオの種類と評価内容との関係を「形式言語」を用いて形式化し,収集ポートフォリオの効果的な評価利用を支援することを目的とする.形式言語を用いることにより,ポートフォリオ問の関係構造と,評価との関係を文法として表現することができた.その結果,支援システムの開発が容易となった.これは,拡張BNF記法を用いてポートフォリオ格納構造を表現し,評価セマンティックス(評価法の記述)をBNFに付随させた属性文法を用いることで,効果的な評価を実現できた.さらに,BNF非終端ノードをもとにしたデータベース構築が可能となり,ポートフォリオ群の共有が可能となった.ポートフォリオ作成支援システムやSCORM, LOM, PAPI, LIP, IMSLDといったメタ言語の開発,学習指導案データベースに関する研究は数多く報告されてはいるが,ポートフォリオ群と効果的な評価方法を関連づけたり,およびそれらの関係付けに形式言語を用いたアプローチをとったものは,国内外で本研究が最初である.形式文法に基づいたポートフォリオ評価の設計と評価の実施は,経験の浅い教師に対し理論的側面からの支援を実現することができたといえよう.本研究はプログラム言語を定義する手法と同様のアプローチをとったもので,支援システムの開発にとどまらず,システムの開発を行う理論体系を確立したことから,今後のこの分野の研究に多いに貢献することができると考えられる.当初の目的を十分に達成することができたといえる.ポートフォリオ評価を行うためには,教師はあらかじめ,どのような種類のポートフォリオを収集し,それらをどのように利用してどのような評価を行うか決める必要がある.しかし,ポートフォリオを評価を行うには次のような問題を解決する必要がある.1.ポートフォリオ群を評価に有効活用するのが難しい.2.ポートフォリオ群の異なるシステム間での参照・共有が難しい.3.教師が意図したポートフォリオを設計することが難しい.4.設計に基づいた評価活動が困難である.そこで,今年度は次の3点に的を絞った.(1)収集すべきポートフォリオを授業の形式別に分類した.ポートフォリオは学習成果物に関するポートフォリオ,評価に関するポートフォリオ,過程の記録に関するポートフォリオ,その他のポートフォリオの4つに分類することが効果的であることが分かった.(2)収集したポートフォリオを用いた評価方法を明確にする.授業における課題の設定者が教師なのか学習者なのか,評価基準の作成者は誰か(教師,学習者,第3者),によってポートフォリオの評価を行うこととした.(3)ポートフォリオ評価を実施しやすいように支援するためのモデルを明確にする.ポートフォリオ評価を行うために教師はそのための授業設計を行う.したがって,ポートフォリオ評価支援には,授業設計段階の支援と授業実践段階の支援の2つが必要であることを明らかにした.また,形式言語による評価支援支援システムのプロトタイプの開発を行った.本年度の研究業績は次の2つのシステムの開発である.(1)指導計画書作成支援システム(既開発)との融合本年度開発の指導計画書作成支援システムは,16年度に本研究で開発したポートフォリオ評価支援システムのプロトタイプシステムと融合を諮り,指導計画書作成時に,これらのデータを参照・共有・再利用を実現するようなシステムとして開発できた.また,指導計画書記述文法にポートフォリオ評価記述文法をサブルーチンとして組み込むことで,単一の文法として再定義することができた.(2)総合的学習支援システムの開発ポートフォリオ評価支援システムと指導計画書作成支援システムを統合した,総合的授業支援システムを開発した.このシステムで次のような機能を実現することができた.学習指導計画書作成の支援:これにより教師は効率的に学習指導計画書の作成が可能となった.学習指導計画書のデータベース登録:データの検索や共有化が容易となり,計画書の重複開発がなくなった.学習指導計画書と指導事例の検索:Webベースで検索が可能となり,どこでもいつでも検索が可能となった.ポートフォリオ評価設計の支援:ポートフォリオ評価は難しい課題であるが設計支援が可能になった.ポートフォリオ評価実施の支援:ポートフォリオ評価実施の支援が可能となった.ポートフォリオのデータベース登録:画像を含むポートフォリオをデータベース化することができた.これらのシステム開発の一部は本研究グループの設計に基づき,外部委託により開発を行った.言語はJavaScriptおよびJavaを用い,Webベースのシステムとして実現した.

本研究は,収集するポートフォリオの種類と評価内容との関係を「形式言語」を用いて形式化し,収集ポートフォリオの効果的な評価利用を支援することを目的とする.形式言語を用いることにより,ポートフォリオ間の関係構造と,評価との関係を文法として表現することができた.その結果,支援システムの開発が容易となった.これは,拡張BNF記法を用いてポートフォリオ格納構造をを表現し,評価セマンティックス(評価法の記述)をBNFに付随させた属性文法を用いることで,効果的な評価を実現できた.だらに,BNF非終端ノードをもとにしたデータベース構築が可能となり,ポートフォリオ群の共有が可能となった.ポートフォリオ作成支援システムやSCORM, LOM, PAPI, LIP, IMSLDといったメタ言語の開発学習指導案データベースに関する研究は数多く報告されてはいるが,ポートフォリオ群と効果的な評価方法を関連づけた,およびそれらの関係付けに形式言語を用いたアプローチをとったものは,国内外で本研究が最初である.形式文法に基づいたポートフォリオ評価の設計と評価の実施は,経験の浅い教師に対し理論的側面からの支援を実現することができたといえよう.本研究はプログラム言語を定義する手法と同様のアプローチをとったもので,支援システムの開発にとどまらず,システムの開発を行う理論体系を確立したことから,今後のこの分野の研究に多いに貢献することができると考えられる.当初の目的を十分に達成することができたといえる.
難治性小児喘息児童のストレスマネジメントに有効な園芸プログラムに関する研究

難治性小児気管支喘息による入院児童に対し、種まき-栽培-収穫-摂食の行程を中心とした園芸プログラムを実施した結果、活動による呼吸機能の低下は認められず、栽培体験と児童個人への管理責任の設定と栽培した植物を自宅家族に持ち帰ることが植物へのこだわりを高めて自主的行動を誘導した。このプログラムにより一症例で顕著なストレス軽減が認められ、病棟内での行動の改善と退院につながるなど、プログラムによる精神的安定と退院の時期に関連性があった。プログラムを提供する庭園内での児童の行動解析から、下草が繁茂して見通しの悪い植生が行動の制限要因となった。難治性小児気管支喘息による入院児童7名に対し、3ヶ月から1年の入院期間に、種まき-栽培-収穫-食べるの行程を中心とした園芸プログラムを実施し、活動時のモチベーション、フェイスマーク、会話量について7段階の指標を設定してプログラム毎に経時的に評価した。併せて活動前後の呼吸機能について入院中の呼吸機能モニタリングデータに照らし合わせた。多くのケースで、活動へのモチベーションがフェイスマークに先行して上昇する傾向があり、活動時間内にモチベーションの極端な低下や表情の悪化は認められなかった。また、暑い、寒いなどの気象条件等を理由として自ら欠席を希望したケースはなかった。プログラムにおける積極性は、収穫作業とこれに伴う食べる行程で高く、野菜嫌いな児童のほとんどが活動中の自身の収穫物であれば食べた。一方、プログラムの参加が長期にわたる児童では植物の種子あるいは幼苗期からの栽培体験と、児童個人への管理責任の設定が、植物へのこだわりを高め、プログラム内での自主的行動を誘導することがわかった。参加した多くの児童がハウスダスト(ダニ)へのアレルギー反応を有したが、プログラム中の土や植物、有機質肥料への接触による咳などの喘息症状は確認せず、ピークフローモニタリングでの呼吸機能の低下は認められなかった。現時点でプログラムの内容に対する児童のモチベーションにかかる量的方向性見いだせたが、一人ひとりの個性や背景を踏まえ、個々のストレス緩和を目的とした質的研究の必要性が認められた。プログラム内で多くの児童の積極性を減退させる事象は気象条件よりもハチや蚊の出現期における足下の見えにくい植生への進入であった。また、自らが介入していない既存植生に対する関わりが少なく、花が美しいといった景観は児童の行動範囲の拡大につながらなかったことから、次年度はこれまでに集積した行動パターンを基に空間の積極的活用にむけた児童のための庭園デザインを進める。病院の屋外空間の植栽デザインと児童の行動について、基礎的知見の蓄積を行うことを目的として、児童の活動場所の選択頻度と植栽植物との関係をとらえた。対象となった児童は小学生6名、中学生2名の計8名であった。児童が頻繁に利用する場所は植栽空間にある作業小屋であり、特定の座席に荷物を置き、1日の出来事を話してから屋外に出ることが多かった。植栽空間利用では、日々の変化や作業内容がわかりやすい畑で圧倒的に多く、植物への関心は自分の印の付いたプランターなど、固有の物に対しての反応が明確で、「水が無くなってしおれていた」など、活動時間外での観察報告があった。高学年の児童に活動のプロモーションを兼ねた定期的な写真撮影を促すと、自主的に植栽空間の奥にまで足を伸ばし、季節の花々を一つずつ捉えて撮影することが多く、人に見せる意識が働く場合には、野菜よりも積極的に花や木々の緑を捉えた。しかし、過密に植物が繁茂する空間への進入を拒絶するケースがほとんどの児童で見られ、アクセスを制限する要因となることがわかった。植物の皮膚への接触や虫さされなど、経験的なアレルギーに対する防御反応とも捉えることができ、空間形成において重要なポイントとなった。一方、活動参加による児童の変化を観察した結果、活動終了後の病棟において、活動に参加していない入院児・看護師に対して活動の説明をしたり、栽培物についての話をしたりするなど、園芸活動に参加する以前との様子の違いが看護師に対するヒヤリング等で捉えられた。継続した活動において、活動に参加して間もない児童の7段階評価によるフェイスマーク、モチベーション、会話量は、不安定なことが多く、活動後半に表情が良好となるパターンが多いが、活動開始時から良好に安定するようになる時期と、退院計画をすすめる時期がリンクしており、症状の改善と活動中の精神的な安定に関連性が認められた。入院児童のストレスマネジメントに有効なプログラム構築について、種まき、幼苗から育てるという一連の栽培管理が園芸へのこだわりを高めること、栽培した植物や作品を家族など他の人に見せることがやりがいを高めることが明らかとなった。これをもとに、種まき-栽培-収穫-利用(食べるなど)の行程に加え、家族や周囲め人と成果物を共有するプログラムを追加し、最終年度に対象児童4名に構築したプログラムを実施した。

あらかじめ花などの成果物は病院玄関に植えて来院者の観賞用とする、収穫物は家族にプレゼントするなどの目的を明らかにすることで、これまでの収穫物を食べることによる達成感に加え、人を喜ばせる楽しみが目的意識ややりがいを高めることに役立ち、参加した全員が一時帰宅中に園芸を話題として家族とのコミュニケーションをはかったことが報告された。うち一人は病棟内での行動に顕著な改善が認められ、スムーズな退院へとつながった。入院児童のストレス特性を把握するために、学童保育に参加する20名程度の児童を対照群として水稲および大根の栽培プログラムを実施した。結果、対照児童は植物への関心について個人差が大きく、目的の明確な収穫で積極性が高いが、栽培管理でストレスが高まるケースがあった点で入院児童とは異なった。医療機関における庭園デザインについて、これまでの調査から、下草が繁茂して見通しの悪い植生が行動の制限要因となったことから、既存植栽について児童の目線よりも低い枝を積極的に刈り込み、下草管理を頻繁に行った結果、植栽エリアへの進入について抵抗が小さくなったことから、入院児童が関わりやすい庭造りのあり方が一部明らかとなった。
環境影響評価を考慮した露天採掘シミュレーションシステムの開発

露天採掘による開発が環境に及ぼす影響、なかでも採掘跡地の景観変化と周辺地域の微気象変化を、開発計画の段階で予測・評価できる露天採掘シミュレーションシステムを確立することを目的として研究を行った。本研究で得られた成果を要約すると以下の通りである。1.採掘進展に伴う景観変化の予測方法として、メッシュ標高データから3次元数値地形モデルを作成し、ワイヤーフレーム法およびポリンゴン処理法で立体画像をディスプレイする方法を確立した。これにより、様々な採掘形態や眺望地点を想定して、採掘進展に伴う景観変化を開発計画の段階で予測することが可能となった。2.メッシュ標高データを用いて、採掘跡地と任意の地点を結ぶ直線の高度が途中のどのメッシュの標高よりも高いか、1箇所でも低いかによって、採掘跡地が見える(可視)領域と見えない(不可視)領域に区分するシステムを開発した。これにより、採掘進展に伴って可視域、すなわち景観評価の対象となる範囲を予測することが可能となった。3.採掘跡地の景観評価に、計量心理学的手法である評定尺度法、選択法およびSD法を導入することにより、定量的な評価を可能にした。4.地形改変を伴う大規模な露天採掘が周辺地域の風体系に及ぼす影響について検討した。露天採掘に伴う地形改変状況をコンピュータグラフィックスによりシミュレーションし、風向変化をビジュアルに予測する方法を確立した。地形と風向頻度との関係を数量的に表す方法を用いて、地形改変に伴う風向頻度変化を定量的に予測する方法を確立した。森林の減風効果を調べ、伐採による風速への影響の推定を可能にした。以上のように、露天採掘をシミュレーションして、開発に伴う環境影響評価を計画段階で行うことにより、環境への影響を極力小さくする採掘が可能になるものと思われる。露天採掘による開発が環境に及ぼす影響、なかでも採掘跡地の景観変化と周辺地域の微気象変化を、開発計画の段階で予測・評価できる露天採掘シミュレ-ションシステムを確立することを目的として研究を行った。本年度に得られた成果を要約すると以下の通りである。1.採掘進展に伴う景観変化の予測方法として、パ-ソナルコンピュ-タを用いて、メッシュ標高デ-タから3次元数値地形モデルを作成し、タイル法でディスプレイする方法を確立した。2.景観評価は、コンピュ-タグラフィックスによりシミュレ-トした原石山の改変状況を、現況写真にモンタ-ジュしてスライドを作成し、これらを用いて評定尺度法による実験を行った。3.計量心理学的評価手法に基づく統計処理を行うことによって、景観評価を定量的に扱うことが可能となり、開発計画の段階で景観的に許容できる開発限界を推定することが可能となった。4.採掘進展に伴う地形改変が周辺地域の微気象に及ぼす影響については、3次元数値地形モデルによる鳥瞰図から、風向の変化や風の流れの様子をビジュアルに予測することが可能となった。5.16方位別の地形傾斜の偏差を求めることにより、地形因子による方位別の風向頻度の計算が可能となり、地形改変による卓越風向の変化や風向頻度の変化を定量的に予測できるようになった。以上の結果をもとに、露天採掘が環境に及ぼす影響が極力小さくなる範囲で、可採鉱量や生産コストなどの生産性をより大きくするためには、どのような開発を行うことが最も合理的であるかを検討できるシミュレ-ションシステムの確立を現在進めている。露天採掘による開発が環境に及ぼす影響、なかでも採掘跡地の景観変化と周辺地域の微気象変化を開発計画の段階で予測・評価できる露天採掘シミュレーションシステムを確立することを目的として研究を行った。

1.採掘進展に伴う景観変化の予測方法として、メッシュ標高データから3次元数値地形モデルを作成し、ワイヤーフレーム法およびポリゴン処理法で立体画像をディスプレイする方法を確立した。これにより、様々な採掘形態や眺望地点を想定して、採掘進展に伴う景観変化を開発計画の段階で予測することが可能となった。2.メッシュ標高データを用いて、採掘跡地と任意の地点を結ぶ直線の高度が途中のどのメッシュの標高よりも高いか、1箇所でも低いかによって、採掘跡地が見える(可視)領域と見えない(不可視)領域に区分するシステムを開発した。これにより、採掘進展に伴って可視域、すなわち景観評価の対象となる範囲を予測することが可能となった。3.採掘跡地の景観評価に、計量心理学的手法である評定尺度法、選択法およびSD法を導入することにより、定量的な評価を可能にした。4.地形改変を伴う大規模な露天採掘が周辺地域の風体系に及ぼす影響について検討した。露天採掘に伴う地形改変状況をコンピュータグラフィックスによりシミューションし、風向変化をビジュアルに予測する方法を確立した。地形と風向頻度との関係を数量的に表わす方法を用いて、地形改変に伴う風向頻度変化を定量的に予測する方法を確立した。森林の減風効果を調べ、伐採による風速への影響の推定を可能にした。以上のように、露天採掘をシミュレーションして、開発に伴う環境影響評価を計画段階で行うことにより、環境への影響を極力小さくする採掘が可能になるものと思われる。
繊毛運動可能な刺激応答性ソフトアクチュエーターの開発

アゾベンゼンの光異性化反応を利用し高分子ゲルの網目構造を直接的に変化させることで、高分子ゲルの物性を制御することができる。アゾベンゼンは400nm付近の光を照射することでtrans体からcis体へと変化し、可視光照射または熱的にもとのtrans体へと戻る。このtrans-cis光異性化に伴い、アゾベンゼンの長軸方向の距離は0.90 nmから0.55 nmへと変化する。ピロメリト酸二無水物pyrromellitic dianhydride (PMDA)とアゾベンゼンを含むジアミン4, 4'-diaminoazobenzene (DAA)をそれぞれ5wt%, 7wt%, 9wt%, 10wt%で重合させて得たポリアミド酸オリゴマーを三官能性アミンの架橋剤1, 3, 5-tris (4-aminophenyl)benzene (TAPB)を用いて末端架橋し、光応答性ポリアミド酸ゲル(PMDA/DAAゲル)を合成した。このポリアミド酸ゲルは、400nm付近の光を照射することで収縮し、可視光または熱で元に戻った。また、7 wt%で合成されたゲルにおいて光異性化に伴いゲルの網目サイズが0.65nmから0.43nmへ変化することが動的光散乱によって観測された。分子動力学法により編目構造の形成過程を解析した。剛直なアミド酸オリゴマーを三官能性の架橋剤と反応させた場合には均一な網目を形成し、網目が相互に入り組んだ構造となった。柔軟なアミド酸オリゴマーを架橋剤と反応させた場合には相互に入り組んだ網目は形成されず、ミクロな領域では均一な網目ではあるが、マクロにはボイドが形成された。この光応答性ポリアミド酸を二光子励起重合にて作成したナノホールテンプレート中で重合し、マイクロニードルアレイを作成した。このアレイに405および532nmのレーザーを交互に照射すると、マイクロニードルアレイが繊毛運動することを見出した。剛直な主鎖骨格に光応答性部位である、アゾベンゼンを導入したポリアミド酸ゲルあるいはポリイミドゲルを合成した。ジメチルフオルムアミド(DMF)中で膨潤している直径200ミクロンのロッド状ゲルに440nmのブルーレーザーを照射すると、光異性化が起きて、光を吸収した表面のみがアゾベンゼンの光異性化により体積収縮を起こすため、ゲルは光照射方向へ直角に曲がった。この時、ゲルの網目サイズは2.3nmから0.8nmへ変化することが走査型顕微動的光散乱測定により明らかになった。また、レオメーターによる拮弾性測定により、光照射前のゲルの弾性率は37kPaであるが、光照射後は80kPaになることが明らかになった。これはゲル中に存在する潜在的なエンタングルメントが、光照射による主鎖の屈曲により顕在化したためであることが、ゴム弾性理論より明らかになった。このゲルの光照射時に発生する力をガラスキャピラリーで測定した所、nN程度の値であることが明らかになった。このロッド状ゲルをアレイ状に並べ、光を照射した所、照射方向に繊毛運動することが確認できた。さらに、このゲルをマイクロシリンジ中で合成した所、チューブ状のゲルが合成できた。440nmの光をチューブの周囲から照射し、チューブに沿ってスキャンし、その後500nmの光で同様な操作を行うことによりぜん動運動を行う新奇アクチュエーターを作製した。

このアクチュエーターはDMFなどの極性溶媒中でのみしか作動しなかった。アクチュエーターを溶媒から取り出すと、溶媒が蒸発し、ゲルが収縮してしまうために大気中では利用できなかった。この問題点を克服するために、不揮発性の溶媒であるイオン性液体でDMF溶媒を置換したゲルを作製した。その結果、大気中でも光化学反応を示す光応答性アクチューターが開発できた光応答性部位であるアゾベンゼンを有し、かつ規則正しい網目構造を有する高分子ゲルを合成した。このゲルは光照射により、アゾベンゼンがトランス体からシス体へと異性化する際にミクロな構造変化にシンクロして、マクロな構造変化が誘起された。ゲルの光応答性を評価するために、分子動力学法により、網目サイズの分布に関してシミュレーションを行った。その結果、剛直な主鎖を用いることによって、相互に入り組み、ミクロポアの無い均一な網目ができることが判明した。このゲルをロッド上に加工し、大気中で442nmの光を照射すると、光照射方向に曲がるゲルが作製できた。このロッドをさらにスライスして顕微鏡下で可視光を照射して観察した。この際にゲルに青色レーザーを照射すると、ゲルが収縮し、青色レーザーを切ると、膨潤した。この青色レーザーのOn、Offを繰り返すとゲルが拍動し、その中に含まれている溶媒をはき出し、ポンプとして機能することが明らかになった。また、光照射により溶液を噴射し、魚のようにイオン液体中を泳いでいく挙動も観察できた。レオメーターによる測定によって、光照射時には高分子ゲルの弾性率が約2倍に上昇することが明らかになった。これは光照射によって高分子ゲル中に擬似的な架橋点が形成されたことを意味している。光照射によって新たに構築された架橋点の割合は全体の40%程度であった。このゲルを3次元光造形によって作製した型の中で重合することにより、マイクロニードルアレイを作製した。マイクロニードルアレイに青色レーザー光を照射すると、繊毛運動することが確認できた。
ショット分析に基づく授業観察視点の記述方法に関する実証的研究

本研究では、ビデオカメラにより録画された授業の記録(以下,「映像記録」と呼称する)に,ショット分析を適用し,撮影者の授業観察視点の抽出を行った。ショット分析は,映像記録ショット(何を被写体としてどういうフレームサイズで撮影をしているか)に着目し,映像記録を「基本カテゴリー」と「サブカテゴリー」の枠組みに基づいて記述し,個々のショットと撮影者の有する子ども観,教材観,授業観等との関連を分析するものである。研究は,次のような経過で進めた。1.授業観察視点に関するカテゴリーの設定:フレーム検討視点群(浦野・平山,1995)の一部を修正した「発現者の有無」「フレーム内に捉えられている対象」「フレーム内の対象と発言者とはどんな関係か」等のサブカテゴリーを設定した。2.授業の録画:秋田大学教育学部付属小学校において,授業を録画し,プロトコールを作成した。その際に,撮影者の授業の観察視点を検討するために,撮影している様子を別の位置からビデオカメラにより録画した。3.映像記録の検討:撮影者が教育実習性と現職教員による映像記録を対象に,撮影者としての授業観察視点を比較,検討した。その結果,対象とした教育実習生の授業を観察する視点として,「一連の教授行動として授業場面を認知できる能力」の育成が必要であることを明らかにした。
金属酸素錯体と生体高分子との相互作用

アルツハイマー病患者の脳には、いわゆる老人斑と呼ばれているアミロイド班がみられ、これは痴呆症と関連していることが指摘されて以来、これに関する研究が多くなっている。しかし、最近ではこの老人斑そのものより、アミロイド蛋白の毒性が指摘されるようになっている。この老人斑には3つの特徴、(1)多くの金属イオンが含まれている、(2)メチオニン部位が酸素化されている、(3)本来老化現象と関連している、があるが、全容はほとんど解明されていない。今回各種アンカーを有する銅(II)錯体と、アミロイド蛋白(1-40)の相互作用をこれまでにない新しい手法、キャピラリー電気泳動法で調べた。その結果、いくつかの銅(II)錯体は、アミロイド蛋白(1-40)と特異的に結合することを世界で初めて明らかにした。また、ある錯体では、過酸化水素の存在下で特異的に結合する錯体もあることを見出した。後者の場合、メチオニン部位の酸素化と関連していることを発見した。これらの結果は、上で述べたアミロイド斑の3つの特徴、ペプチドからなる銅(II)キレートが生体での神経性疾患を引き起こす源になりうるという、という考えで説明できるものであり、これは今後の老人斑形成を考える上で、またアルツハイマー病の予防を考える上で非常に画期的な結果である。
音響分析を用いた映画の副音声同期化システムの開発

視覚障害者に映画の音声ガイドを提供しようという活動がある。このとき,フィルムに新たな情報を書き込む余地が無いため,申請者らは,フィルムの動きを検出する同期化アダプタを映写機に取り付け,これをパソコンに接続して断片化した副音声を映写機固有の該当時刻に順次再生するシステムを開発した。しかしこのシステムでは,フィルムの動きを検出する同期化アダプタを映写機に直接取り付ける必要があり,またその取り付けにはある程度の知識や技術が必要であるため,取り付け具合によってはフィルム動作の検出に誤差を生じる可能性があった。そこで,映写機がフィルムを送る際に定期的に発する機械音を録音し,その機械音をコンピュータで分析した結果から映写機の再生ピッチ(フィルムの動き)を検出することにより,同期化アダプタを必要としない副音声同期化システムを開発することを目的とし,ピッチ抽出アルゴリズムの開発を行ってきた。本年度は,昨年度開発を行った「音響分析による再生ピッチ自動検出ソフトウェア」について,リアルタイム性を考慮したアルゴリズムの改良を行い,実装を行った。また,実際の劇場で上映中の映写機が発する機械音を用いた実験を行い,ピッチ抽出の精度について検討を行ったところ,リアルタイムにピッチ検出が可能であることを確認した。本研究の目的は,映写機がコマ送りで発する音響信号を分析し,その機械固有の音響成分を抽出することによってピッチを自動検出するアルゴリズムの開発および,そのアルゴリズムによって副音声を同期再生するシステムの開発を行うことである。既存システムでは,映写機のコマ送りを行う装置の凹凸をセンサによって検出してコマ数に換算し,映写機の再生ピッチを取得していたが,検出装置の取り付けが映写機によって異なり,検出した凹凸を時間に換算するための同期化アダプタなど,専用のハードウェアが必要であるという問題があった。そこで,映写機から1コマ送るごとに発生する「カタカタ・・」という機械音を分析し,映写機の再生ピッチを取得するアルゴリズムの開発を行った。映画館常設の映写機,ポータブル映写機など,様々な映写機の音響分析を行った結果,映写機によっては,約1/24秒ごとに発生するコマ送りによる機械音以外に,電源のモータ音と思われる60Hzの非常に大きな音が発生する場合があり,単純にはピッチを抽出することができないことがわかった。しかし,コマ送りによって発生する音が発生した直後には,その音色に相当する映写機固有の周波数成分が2kHz10kHzに存在することがわかり,この部分を特徴成分として基準波形を生成することとした。このような特徴成分を用いて基準波形を生成し,複数の映写機から得た音響信号に対してピッチ抽出を行ったところ,正しくピッチ抽出が行えることを確認した。以上の成果を2006年3月に開催された電子情報通信学会2006年総合大会において発表した。本年度は,そのアルゴリズムを用いた「音響分析による再生ピッチ自動検出ソフトウェア」の開発をおこなった。当初,音響分析にはDSPを用いる予定であたったが,実験の結果,ある程度高速なPCであれば,PC上でもリアルタイム処理が可能であることがわかった。そこで,PC上で動作するピッチ自動検出ソフトウェアの開発を行った。さらに,実際の劇場で上映中の映写機が発する機械音を用いた実験を行い,ピッチ抽出の精度について検討を行ったところ,多少誤差はあるものの,リアルタイムにピッチ検出が可能であることを確認した。
高分子ナノミセルに搭載した転移抑制マイクロRNAを用いた核酸医薬への挑戦

本研究の課題は二つあり、一つはRNAseで分解されやすいmiRNAを体内で如何に安定させるかであり、もう一つは体内でmiRNAを腫瘍まで効率よく運搬するドラッグデリバリーシステム(DDS)の確立である。前者は一本鎖であるmiRNAの3末側約10塩基をDNAに置換したキメラmiRNAを合成し、さらにこれを2重鎖とすることで従来のmiRNAと比べて遥かに安定した体内動態を確立できた。またアンチセンス鎖はDNAに置き換わっているために、オフターゲット効果を抑制できる利点もある。これをunit polyion complexes (u-PIC)とキメラmiRNAを調整し、その内部にキメラmiRNAを効率よく包有できるナノミセル型DDSを確立した。そこで、今回はまずin vivo実験のための至適条件を探るためのin vitro実験を行った。これまでのin vitro実験で著名な抗腫瘍効果があった4種類のmiRNA (miR-1, miR-133a, miR-145, miR-218)の配列をキメラ型2重鎖miRNAとして人工合成した。uPICと調整して40nMの濃度で培養細胞に添加したところ、各miRNAの細胞内濃度は投与前に比べて100倍以上に上昇することが観察された。細胞内濃度のターンオーバーは早く、投与6時間後にはほぼゼロとなった。次にmiR-218細胞内導入によるCAV2ノックダウン効果をリアルタイムPCR法で検討したところ、細胞株によってややばらつきはあるが2050%のノックダウン効果を得た。MagicRed解析によるアポトーシス実験ではmiR-218を100nM濃度で投与すると、確実にアポトーシスが誘導された。今回の一連の研究により、uPICはキメラ型2重鎖miRNAを内包することが可能であり、膀胱癌培養細胞に効率よく取り込まれて抗腫瘍効果を発揮することが確認できた。腎癌では「治療抵抗性腎癌マイクロRNA発現プロファイル」に基づき、腎癌組織で発現が抑制されているマイクロRNAについて機能解析を施行した。まずはmicroRNA-210-3pに着目して、ゲノム編集技術であるCRISPR-Cas9を用いたノックアウトを行った。そして、レンチウイルスによりCas9およびguideRNAを発現させるCRISPR / Cas9システムを用いて、腎癌細胞株でmiRNAのノックアウトを行った。guideRNAはWebデザインツールで選択し、また、オフターゲット効果の可能性を最小にするため、いずれのmiRNAに対してもguideRNAは2種類以上作成した。CRISPR / Cas9を導入したいずれの細胞株においても100%に近い発現抑制を得ることができた。microRNA-210-3は腎癌においては正常腎組織と比べて、その発現が上昇していたが、進行癌においては逆にその発現は低下しており、癌抑制的作用を有することが明らかになった。その標的電子の一つとして癌遺伝子的作用を有するTWIST1が挙げられ、カプランマイヤー解析では予後予測因子であることが判明した。膀胱癌では次世代シークエンサーによるmiRNA発現解析を行い、933個の既知miRNAと17個の新規miRNAの発現を解析し得た。933個の既知miRNAのうち、膀胱癌で有意に発現が低下していた60個のmiRNAの中でリストの上位のものから解析を行ってきた。その結果、microRNA-199familyの発現高値は膀胱癌患者の予後良好の予測因子であり、インテグリンシグナル伝達を制御して、癌抑制的に働くことが示唆された。このようにマイクロRNAを基点とした膀胱癌の新しい癌シグナル経路が明らかにし、次年度ではin-vivoにおいてナノミセルを用いた癌抑制マイクロRNAのマウス尾静脈投与実験を計画している。マイクロRNA発現プロファイルに基づいて実験が進行中であり、結果を論文化できている。前年度に引き続き、「治療抵抗性腎癌マイクロRNA発現プロファイル」に基づき、腎癌組織で発現が抑制されているマイクロRNAについて機能解析を施行した。今回、腎癌で発現が亢進していたmiR-1274aに着目し、anti-miRを用いた発現抑制による機能解析を行った。その結果、anti-miR投与群で細胞増殖・浸潤・遊走能が著明に抑制された。miR-1274aは腎癌臨床検体においては正常腎組織と比べて、その発現が上昇していた。その標的電子の一つとして癌遺伝子的作用を有するbone morphogenetic protein receptor type 1B (BMPR1B)がピックアップされた。癌抑制的作用を有するBMPR1Bは癌遺伝子的miR-1274aにより直接制御されることがルシフェラーゼアッセイで明らかになった。TCGAのデータベース解析により、BMPR1B低発現は生命予後不良因子であることが確認された。膀胱癌でも次世代シークエンサーによるmiRNA発現解析を行い、933個の既知miRNAと17個の新規miRNAの発現を解析し得た。933個の既知miRNAのうち、膀胱癌で有意に発現が低下していた60個のmiRNAの中でリストの上位のものから解析を行っている。このようにマイクロRNAを基点とした膀胱癌の新しい癌シグナル経路が明らかになりつつある。現在、in-vivoにおいてナノミセルを用いた癌抑制マイクロRNAのマウス尾静脈投与実験が進行中である。

前者は一本鎖であるmiRNAの3末側約10塩基をDNAに置換したキメラmiRNAを合成し、さらにこれを2重鎖とすることで従来のmiRNAと比べて遥かに安定した体内動態を確立できた。またアンチセンス鎖はDNAに置き換わっているために、オフターゲット効果を抑制できる利点もある。これをunit polyion complexes (u-PIC)とキメラmiRNAを調整し、その内部にキメラmiRNAを効率よく包有できるナノミセル型DDSを確立した。そこで、今回はまずin vivo実験のための至適条件を探るためのin vitro実験を行った。これまでのin vitro実験で著名な抗腫瘍効果があった4種類のmiRNA (miR-1, miR-133a, miR-145, miR-218)の配列をキメラ型2重鎖miRNAとして人工合成した。uPICと調整して40nMの濃度で培養細胞に添加したところ、各miRNAの細胞内濃度は投与前に比べて100倍以上に上昇することが観察された。細胞内濃度のターンオーバーは早く、投与6時間後にはほぼゼロとなった。次にmiR-218細胞内導入によるCAV2ノックダウン効果をリアルタイムPCR法で検討したところ、細胞株によってややばらつきはあるが2050%のノックダウン効果を得た。MagicRed解析によるアポトーシス実験ではmiR-218を100nM濃度で投与すると、確実にアポトーシスが誘導された。今回の一連の研究により、uPICはキメラ型2重鎖miRNAを内包することが可能であり、膀胱癌培養細胞に効率よく取り込まれて抗腫瘍効果を発揮することが確認できた。今後、さらに解析のスピードを速める。腎癌における分子標的薬の著効例や、膀胱癌におけるPD1抗体治療の著効例に対する次世代シーケンサーによる遺伝子・マイクロRNA発現解析も検討している。マイクロRNA発現プロファイルに基づいて実験は順調に進んでいるが、購入予定の実験試薬が、年度内の納品に間に合わないことが分かったため繰越金が生じた。この繰越金はそのまま試薬の購入にあてられる。