hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃・腸機能分子の分子機能連関と細胞内極性移動

胃酸分泌機構と腸のベクトル輸送機構の解明を目的とした。1.胃プロトンポンプ蛋白質の安定発現系の構築に成功した。αサブユニットの細胞表面への発現にはβサブユニットが必要であり、その細胞外のジスルフィド結合が重要であることを示した。更に非会合型αサブユニットは、ユビキチンープロテアソーム系により分解されることを見出した。2.αサブユニットの第4番目(M4)および第6番目(M6)の膜貫通セグメントの機能について研究した。M4のGlu-345は、ポンプの構造変化に寄与すること、M6のLeu-819とGlu-822が、ポンプのK^+感受性脱リン酸化部分反応におけるK^+親和性に関与すること、Asp-826、Ile-827、Leu-833がプロトン感受性のリン酸化部分反応に関与することを明らかにした。3.胃プロトンポンプにおいて、酸分泌拮抗薬SCH28080の結合部位は、E2コンフォメーション状態にあるポンプαサブユニットの酸分泌側cavityで、cavity表面にはTyr-801が存在することを明らかにした。4.胃プロトンポンプの分子機能としてフリッパーゼ機能もあることを証明した。5.これまで他のグループにより、胃酸のCl^-分泌を担う分子実体がCIC-2Cl^-チャネルであると提唱されてきたが、本研究ではこの説を覆した。6.温度感受性SV-40大型T抗原遺伝子を導入したマウスの胃粘膜から、胃プロトンポンプαサブユニットmRNAを発現する不死化細胞株を構築した。7.大腸における分泌性下痢誘発に係わる機構に、TXA_2が関与することを発見した。TXA_2によるベクトル的Cl^-分泌機構は、病態時にのみ機能することを示した。8.ヒト大腸がん細胞では、正常細胞に比べて、Na^+,K^+-ATPaseα1サブユニットの発現が減少するが、α3サブユニットの発現が増大していることを発見した。本研究の主たる目的は,プロトンポンプ(H^+,K^+-ATPase)のイオン認識・輸送機序およびポンプの細胞内移動機構を分子レベルで解明することである。ポンプのαサブユニットは膜を10回貫通し、βサブユニットは膜を1回貫通する。これらのサブユニットの役割として,1)どの部位(複数)がプロトン・カリウムイオンを認識するか,イオンを輸送する部位であるかを解明する2)細胞内におけるポンプ生合成後の細胞内輸送に関わる部位を明らかにすることにある。今年度においては,1)βサブユニットに結合している糖鎖の役割を明確にするための研究を行った。βサブユニットには細胞外領域に7個の糖鎖結合部位があり、いずれにも糖鎖が結合している、これらの糖鎖結合部位1個から7個までのAsnをGlnに置換し、糖鎖の数を通常より減少させた種々のβサブユニットを作成し、αサブユニット安定化作用、ポンプの管腔側細胞膜移動、酵素活性に与える影響を調べた。これらの糖鎖を3個以上除くと、α-、β-サブユニットの細胞表面への移動が見られなくなり、酵素活性も減少し,すべてを除くと酵素活性は消滅した。2)ポンプのαサブユニットのイオン認識・輸送部位機能に直接的にかかわる部位として、N末より数えて、4番目の膜貫通領域に存在するGluに注目し、このGluを種々の他のアミノ酸に置換し、ポンプの性質の変化を調べることより、その役割について研究を行った。この部位はK^+イオン結合により起きるポンプのコンフォメーション変化に直接かかわることを明らかにした。3)胃小胞体のflippaseは、内在性のリン脂質PCとPSの両方を実際に輸送することを証明した。これは、既知の2種のflippaseがPCあるいはPSの一方をATP依存的に輸送することと非常に異なることがわかった。

7.大腸における分泌性下痢誘発に係わる機構に、TXA_2が関与することを発見した。TXA_2によるベクトル的Cl^-分泌機構は、病態時にのみ機能することを示した。8.ヒト大腸がん細胞では、正常細胞に比べて、Na^+,K^+-ATPaseα1サブユニットの発現が減少するが、α3サブユニットの発現が増大していることを発見した。本研究の主たる目的は,プロトンポンプ(H+, K+-ATPase)のイオン認識・輸送機序およびポンプの細胞内移動機構を分子レベルで解明することである。ポンプのαサブユニットは膜を10回貫通し、βサブユニットは膜を1回貫通する。これらのサブユニットの役割として,1)どの部位(複数)がプロトン・カリウムイオンを認識するか,イオンを輸送する部位であるかを解明する2)細胞内におけるポンプ生合成後の細胞内輸送に関わる部位を明らかにすることにある。本年度は、αサブユニットおよびβサブユニットを安定的に発現するHEK細胞株を構築することに成功した。この細胞株において、ポンプ機能が原形質膜に発現することを確認した。αサブユニット単独で発現させると、αサブユニットは原形質膜に移行せず、ユビキチン化修飾を受け、proteasomeにより消化されることがわかった。βサブユニット単独で発現させると、単独でも、細胞膜表面に移行することがわかった。また、ユビキチン化修飾も受けない。ついで、βサブユニットのS-S結合の細胞内局在化機構において果たす役割についての研究を行った。βサブユニットの細胞外領域に3個のS-S結合がある。S-S結合に関与するCysをSerに換えたmutantを構築した。3個のS-S結合を1個でものぞくと、α/β複合体は形成されず、α-、β、-サブユニットの細胞表面への移動が見られなくなり、α鎖、β鎖ともにERにとどまり、酵素活性も消失した。αサブユニットの6番目の膜貫通部位がイオン認識に果たす役割を調べた。6番目の貫通部位全てのアミノ酸残基を1残基置換した多くのmutantを作成し、その機能の変化を調べた。αサブユニットの4,5,6番目の膜貫通部位からなるイオン認識部位に対して、コンピュータ3次元モデルを構築し、検討した。胃プロトンの細胞内の極性ある移動について、ポンプ分子内にある信号について研究を行った。ポンプ分子はα鎖及びβ鎖から構成される。本年は、主として、β鎖のS-S結合の役割について研究した。その成果を米国生化学会誌(J.Biol.Chem.2002年)に発表した。β鎖は細胞外ドメインに3個のS-S結合を有する。そのいずれかのS-S結合を欠くムータントはすべて、酵素活性を消失した。細胞膜に一番近いS-S結合がなくとも、ある程度細胞表面に移動したが、他のS-S結合を欠くムータントは細胞表面に移動せず,ERに留まった。α鎖とβ鎖の結合には、これらのS-S結合が重要な役割を果たしていた。ムータントβ鎖と結合したα鎖は不安定であった。これらの研究においては、ヒト腎臓細胞由来のHEK細胞に、ポンプのα及びβの遺伝子を組み込んで、これらの遺伝子産物を恒常的に発現し細胞原形質膜に機能を有する系を確立することに世界で初めて成功した(J.Biochem.2002年)。胃ポンプのα鎖によく似た構造を有するCa^<2+>-
神経栄養因子遺伝子の変異解析と精神神経疾患との関連研究

われわれは統合失調症やアルツハイマー病の疾患感受性遺伝子について明らかにするために、各種の神経栄養因子やその受容体をコードする遺伝子に注目して変異の検索と疾患との関連研究を行ってきている。平成1314年度においては、主に、1)ニューロトロフィン3(NT-3)遺伝子の変異と統合失調症との関連、2)ニューロトロフィンによって誘導され、胎生期から軸索成長やシナプス形成の際に強く発現しているvgf遺伝子の変異検索、3)ニューロトロフィンの低親和性受容体p75遺伝子について変異検索と精神神経疾患との関連研究を行った。1)NT-3遺伝子の2塩基(CA)繰り返し配列多型とプロモータ領域に存在する塩基置換(-3004G/A)に関してハプロタイプ解析を行ったところ、前者の23回繰返しをもつ対立遺伝子(A3)と-3004Gを持つハプロタイプは、健常対照群と比較して統合失調症患者群に有意に多く(p=0.005)、発病脆弱性と関連する可能性が示唆された。2)vgf遺伝子については、統合失調症、双極性障害、アルツハイマー病各20例のゲノムDNAを用いてエクソンとプロモータ領域について11組のプライマーを設計して直接シーケンスによって変異を検索した。その結果、先行研究と異なる塩基配列を多数見出したが、われわれのサンプル間で多型性を示さなかった。3)p75遺伝子のエクソン領域について、6組のプライマーを設計し、統合失調症、アルツハイマー病各20例のゲノムを用いて直接シーケンスによって変異を検索した。ミスセンス変異1つ、サイレント変異1つを見出した。前者について統合失調症とアルツハイマー病について関連研究を行ったが、有意な関連は見出されなかった。現在、統合失調症との関連が示唆されたNT-3の変異に関して転写活性への影響について培養細胞を用いたルシフェラーゼ・アッセイによって検討を行っている。われわれは神経発達障害が原因であることが有力視されている精神分裂病や神経変性疾患であるアルツハイマー病の疾患感受性遺伝子について明らかにするために、各種の神経栄養因子やその受容体をコードする遺伝子に注目して変異の検索と疾患との関連研究を系統的に行ってきている。今年度は、脳由来神経栄養因子(BDNF)やニューロトロフィン3(NT-3)などのニューロトロフィンによって誘導され、胎生期から軸索成長やシナプス形成の際に強く発現しているVGFタンパクをコードする遺伝子の変異検索を終了し、さらにニューロトロフィン共通の低親和性受容体であるp75をコードする遺伝子について変異の検索を行っている。vgf遺伝子については、精神分裂病20例、双極性障害20例、アルツハイマー病20例のゲノムDNAを用いてエクソンとプロモータ領域について11組のプライマーをデザインして直接シーケンス法によって変異を検索した。その結果、先行研究と異なる塩基配列を多数見出したが、いずれもわわわれのサンプル間で多型性を示さず、先行研究のシーケンスエラーであると考えられ、多型は見出されなかった。次にp75遺伝子のエクソン領域について、6組のプライマーを設計し、精神分裂病20例、アルツハイマー病20例のゲノムDNAを対象に直接シーケンス法によって変異を検索している。その結果、ミスセンス変異1つ、サイレント変異1つを見出した。前者について精神分裂病とアルツハイマー病について関連研究を行ったが、有意な関連は見出されなかった。

平成1314年度においては、主に、1)ニューロトロフィン3(NT-3)遺伝子の変異と統合失調症との関連、2)ニューロトロフィンによって誘導され、胎生期から軸索成長やシナプス形成の際に強く発現しているvgf遺伝子の変異検索、3)ニューロトロフィンの低親和性受容体p75遺伝子について変異検索と精神神経疾患との関連研究を行った。1)NT-3遺伝子の2塩基(CA)繰り返し配列多型とプロモータ領域に存在する塩基置換(-3004G/A)に関してハプロタイプ解析を行ったところ、前者の23回繰返しをもつ対立遺伝子(A3)と-3004Gを持つハプロタイプは、健常対照群と比較して統合失調症患者群に有意に多く(p=0.005)、発病脆弱性と関連する可能性が示唆された。2)vgf遺伝子については、統合失調症、双極性障害、アルツハイマー病各20例のゲノムDNAを用いてエクソンとプロモータ領域について11組のプライマーを設計して直接シーケンスによって変異を検索した。その結果、先行研究と異なる塩基配列を多数見出したが、われわれのサンプル間で多型性を示さなかった。3)p75遺伝子のエクソン領域について、6組のプライマーを設計し、統合失調症、アルツハイマー病各20例のゲノムを用いて直接シーケンスによって変異を検索した。ミスセンス変異1つ、サイレント変異1つを見出した。前者について統合失調症とアルツハイマー病について関連研究を行ったが、有意な関連は見出されなかった。現在、統合失調症との関連が示唆されたNT-3の変異に関して転写活性への影響について培養細胞を用いたルシフェラーゼ・アッセイによって検討を行っている。
Webからの画像データ自動収集と機械学習を用いたオブジェクト識別システムの構築

World Wide Web上から画像を収集し、各単語に対応する画像に共通する画像特徴量とその空間的位置関係を学習させることで、典型的な画像を抽出し、任意の画像に何が写っているかを判別する一般物体認識システムの研究開発を進めた。World Wide Webから収集された画像中のオブジェクトを認識するシステムの開発に向けて,平成21年度は全体の基礎となる手法の研究を進めた.具体的にはオブジェクト領域の抽出手法を改善し,オブジェクト認識の対象となるデータセットの精度を高めた.また,推定に使用する特徴量に関し,色空間の固定的な閾値による分割やクラスタリングを用いた分割等,複数の手法を比較し,最適な方式の検討を行った.本研究において中心となる課題として,特定の検索クエリ用いて得られた画像集合には多様なトピックに属する画像が存在するため,そのままでは画像集合とラベルの間での対応付けか行えず,これらを分離する必要がある.この問題を解決するため,統計的言語モデルで使用される意味モデルを画像集合に対して適用し,適切なトピック構造が得られることを実験によって示した.同時に各トピックに固有の特徴量の組み合わせも取得することができ,画像中に存在するオブジェクトの認識に向けて土台となる手法を構築することができた.さらに,システムのインタフェースを改良し,大規模な評価実験が容易に行えるように工夫を行った.これらの研究成果に関し,国内研究会「Webとデータベースに関するフォーラム」,ならびに国際会議「The 4th International Conference on Ubiquitous Information Management and Communication」にて発表を行った.World Wide Webから得られる大量の画像に対して特徴抽出を行い,機械学習を行うことで,画像に現れているオブジェクトを認識・識別し,高度な検索を実現するシステムの開発を進めた.平成22年度は特に認識精度の向上に必要とされる基礎的研究に取り組んだ.具体的には画像を単なる特徴量の集まりではなく,特定の意味を担う記号的構成要素(オブジェクト)の集まりであるとみなし,それぞれの構成要素がどのような意味的役割を果たしているかをトピックモデルに基づいて推定する手法の研究を進め,その有向性を検証した.実験の結果,多数の画像カテゴリにおいて記号的要素が的確に推定できることが明らかとなったが,限られた種類の特徴量を使用しただけでは推定が困難であるものも存在し,課題として残された.提案手法は他の多様なドメインにおけるデータに対しても応用することが可能であり,数値情報から記号情報を取得するための一般的な枠組みとしての役割が期待される.平成22年度はさらにシステムのインタフェースの改良を進め,評価実験を行った.これらの研究成果はJournal of Networksならびに情報処理学会論文誌(トランザクション)データベースに掲載され,また国際会議「The 21st International Conference on Database and Expert Systems Applications (DEXA 2010)」にて発表を行った.平成23年度は大量の画像集合に基づくオブジェクト認識システムの精度を向上させるため、画像の特徴量や意味的特性を表現する確率モデルに関する基礎的手法の研究を進めた。特に画像中に複数のオブジェクトが現れている場合、通常の手法では領域の推定が容易でない。これを解決するため、確率過程に基づく推定手法を行うための研究に取り組んだ。画像認識の第一段階として、オブジェクト領域と背景領域を分割するために判別分析等を用いて二値化が行われる。オブジェクトが複数の場合、領域を二つに分けるのでは十分でないため、適切な数の領域に分割することが重要となる。画像によって領域数が異なるため、データに応じて推定されることになるが、その推定量はハイパーパラメータの設定によって左右され、これの設定が課題となっている。従来の経験に基づく決め方ではなく、確率分布の分布に相当する確率過程をモデルの一部として用いることで、ハイパーパラメータがデータに基づいて設定され、領域数の適切な推定が可能になる。これによって実際のオブジェクト領域への分割精度が改善することが期待される。また、形状とテクスチャに関する適切な特徴量の選択のための統計的手法の研究に取り組んだ。この分析に基づき、輪郭追跡と合わせて概形取得に使用できるシステムの研究を進めた。これらの研究に際し、個別の課題に対するアドホックな実装ではなく、一般的な枠組みのもとでの問題解決を目指した。本研究では画像中に何が写っているかを自動判定する一般物体認識のため、画像における局所的な特徴量とその空間配置を語彙と対応づけるシステムを構築することを目的とした。画像と語彙の組を取得するため、World Wide Web上で公開されている画像データに着目した。これらの画像の多くはHTMLで記述されたWebページ中に埋め込まれており、周辺のテキストは画像に写されている対象(オブジェクト)と関連していることが多い。本研究ではこれらの周辺テキスト中の語彙と画像に写された対象(オブジェクト)に対して機械学習を適用し、画像・画像特徴量・語彙の相互変換システムを実装した。特には画像を単なる特徴量の集まりではなく、特定の意味を担う記号的構成要素(オブジェクト)の集まりであるとみなし、それぞれの構成要素がどのような意味的役割を果たしているかをトピックモデルに基づいて推定する手法の研究を進め,その有向性を検証した。画像データのソースとしてWeb検索を利用することにより、任意のカテゴリを対象とした画像認識システムを短時間/低コストで実現することが可能になる。また、このデータを用いて画像集合中からその単語において表されるもっとも典型的な画像の候補を求める手法を提案し、実験によって評価した。これらの結果について、2本の雑誌論文を発表した。

研究目的の達成に向けて基礎研究と実装を並行して進めており、おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。一般性の高い手法を提案するため、理論的な裏付けを意識しながら研究を進める。また、実用的なシステムを構築するため、実験を行いながら実装を進めていく。
多変量解析によるマウス海馬GABA作動性ニューロンの包括的な分類の確立

本年度は前年度に引き続き、マウス海馬、大脳皮質の形態学的、神経化学的性質の研究を進めた。1)逆行性、順行性のトレーサーに免疫組織化学を組み合わせて、マウスの皮質線条体路の解析を行った。まず、逆行性のトレーサーであるFluorogoldを線条体に注入し、カルシウム結合蛋白であるParvalbuminが、線条体に投射している皮質ニューロンの一部に発現していることを明らかにした。これらのParvalbumin陽性の皮質投射ニューロンは、主にretrosplenial cortexとsomatosensory cortexのLayer Vに分布していた。Parvalbuminの染色性は、投射ニューロンの方が、非投射ニューロンよりも顕著に弱かった。Fluorogoldで逆行性に標識されたParvalbumin陽性投射ニューロンの一部は、明確なapical dendriteを備えていることから、錐体ニューロンであることが示唆された。次に、免疫蛍光多重染色を用いて、逆行性に標識された線条体に投射する皮質ニューロンの神経化学的性質の解析を行った。これにより、Parvalbumin陽性皮質投射ニューロンの多くはglutamic acid decarboxylase (GAD)陰性であるが、一部はGAD陽性であることを明らかにした。さらに、順行性のトレーサーであるPHA-Lをsomatosensory cortexに注入し、線条体におけるParvalbumin陽性軸索終末の解析を行った。多くのParvalbumin陽性軸索終末がvesicular glutamatetransporter-1陽性であり、グルタミン酸作動性であると考えられたが、少数のGAD陽性の軸索終末が認められた。これらにより、従来はグルタミン酸作動性のみと考えられてきた皮質線条体路に、GABA作動性ニューロンが含まれており、それらはParvalbumin陽性ことを初めて明らかにした。2)海馬や海馬台における電位依存性K channel (Kv4.2)のsubcellular localizationを解析し、シナプス入力に選択性のclusteringが認められることを発見した。この解析は現在も継続中である。1)本年度は幼若マウス海馬のスライスを用いたパッチクランプ法を用いて、歯状回のmossy細胞の電気生理学的な解析を行った。これにより、歯状回のmossy細胞の電気生理学的性質には海馬長軸方向による差異が存在すること、腹側歯状回のmossy cellは自発性にバースト発火することを発見した。2)マウス海馬のGABA作動性ニューロンにおける、一酸化窒素合成酵素とsomatostatinの共存関係を調べ、optical disector法による定量解析を行った。3)マウス海馬のGABA作動性ニューロンについて、代表的な神経ペプチドである、Neuropeptide Y, cholecystokinin, somatostatin, vasoactive intestinal proteinを含有するサブグループについて、optical disector法による定量解析を行い、その空間密度を明らかにした。4)マウス海馬におけるcholecystokininの分布は多様であり、海馬長軸方向で顕著な差異があることを発見した。また、mossy fiber terminalにおけるcholecystokininとsynaptophysinのsubcellular localizationについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いた三次元再構築によりこれを明らかにした。5)マウス小脳において、カルシウム結合タンパクneuronal calcium sensor-1がcompartmentationに関与していることを発見した。
両側同時静的掌握運動が主働筋代謝性因子の両側性機能低下に及ぼす影響

【緒言】両側同時に最大筋力を発揮した時の一側あたりの筋力は、一側単独で発揮した最大筋力よりも低下する両側性機能低下という現象が報告されている。筋出力低下のメカニズムのなかで、末梢性要因としては運動単位活動の選択的抑制が報告されている。筋線維動員パターンを推定する方法として、^<31>P-MRSにおける無機リン酸(Pi)のピークの分裂パターンから判断する方法が知られている。そこで我々は、最大下負荷で疲労困憊まで行った持続的な静的両側同時掌握運動時には、同負荷を一側単独で行った時と比較してST筋線維の動員が低下するという仮説を立て、^<31>P-MRSにより本運動形態が活動筋の筋線維動員パターンに及ぼす影響について検討することを目的として研究を行った。【研究方法】被験者は健康な成人男性5名とした。被験者は上腕外転90°の座位姿勢にてハンドグリップエルゴメータを用いて一側単独および両側同時にて最大筋力の40%に相当する錘を垂直方向に3cm持ち上げた状態をall-outまで維持する静的掌握運動を行った。^<31>P-MRSにより測定する腕は常に右腕とし、クレアチンリン酸(PCr)、アデノシン3リン酸(ATP)およびPiの相対濃度を求めた。Piピークが分裂した場合には、これまでの先行研究を参考に各ピークがhigh-pHピーク(pH値6.8以上)とlow-pHピーク(pH値6.7以下)の領域に分かれているかについて判定し、この条件に当てはまる場合には2ピークの波形として扱った。細胞内pH値はPCrを基準としたPiの化学シフト値からTaylorらが示した式により算出した。【研究結果と考察】5名の被験者の内3名は一側運動時にはPiピークの分裂が認められたものの、両側運動中にはPiピークに分裂が認められなかった。この3名のpH値の変化を時間に対するプロットで示すと、両側運動時のpH動態は、一側運動時に得られたPiピークの分裂データからhigh-pHピーク値の動態を除いた、low-pHピーク値動態と同様な傾向を示した。この結果は、両側運動時においてhigh-pHピーク値に影響を及ぼすST筋線維動員の低下を反映するものと考えられる。研究テーマ:両側同時掌握運動が活動筋の酸素消費に及ぼす影響【目的】両側同時脚伸展時における肺胞レベルでの酸素消費量は、一側伸展時に得られた値の2倍には達しない。こうした背景には、心拍数や心拍出量などの循環系応答が活動筋量の増加に一致しないことが原因とされている。一方、掌握運動時における活動筋の動脈血流量や交換神経活動といった局所応答も、中心循環と同様に必ずしも算術的加算にはならないことから、何らかの抑制機構の存在が考えられている。例えば、掌握運動時の筋交換神経活動は右側(左半球)優位であるとの報告から、こうした現象には大脳半球の機能的な差異が関係する可能性が示唆されている。そこで本研究では、両側同時運動により、一側時と比較して活動筋酸素消費において生ずる変化について検討することを目的とした。【方法】被験者は健康な成人男性5名であった。被験者は上肢がハンドグリップエルゴメータ上で肩の高さになるように椅子に座り、両側同時および一側単独に掌握運動を行った。掌握運動は10,20および30%MVCに相当する錘を4秒に一回、2cm持ち上げるものとした。各負荷での運動は3分間行い、運動終了後に3分間の休息を挟みながら30%MVCまで連続して行った。各負荷における運動終了直後より30秒間、300mmHg以上の圧で両腕上腕部の動脈血流遮断を行い、前腕屈筋群の酸素動態(Oxy-Hb/Mb)を近赤外分光測定装置(NIRS : HEO-210、OMRON)を用いて測定した。測定した(Oxy-Hb/Mb)の低下率から筋の運動時酸素消費(Vo2)を算出し、安静時酸素消費に対する倍率で示した。また、同筋群より表面電極法によりEMGを導出し、運動開始から1秒間のiEMGを算出した。【結果】両側同時掌握運動時の負荷増加に対するVo2増加率は左右で同様となる傾向にあった。しかし、両側同時運動時の右腕において、Vo2とiEMGの変化率(Vo2/iEMG)が他の運動時より高まる傾向にあった。【考察】両側同時運動における右腕のVo2増加率は、一側による先行研究の結果とほぼ一致していた。両側同時運動時の右腕において、Vo2/iEMGが他の運動時より高まる原因として、両側同時運動による活動筋量の増加によりFT線維動員の低下および大脳半球からの運動指令出力の低下が推察された。

そこで我々は、最大下負荷で疲労困憊まで行った持続的な静的両側同時掌握運動時には、同負荷を一側単独で行った時と比較してST筋線維の動員が低下するという仮説を立て、^<31>P-MRSにより本運動形態が活動筋の筋線維動員パターンに及ぼす影響について検討することを目的として研究を行った。【研究方法】被験者は健康な成人男性5名とした。被験者は上腕外転90°の座位姿勢にてハンドグリップエルゴメータを用いて一側単独および両側同時にて最大筋力の40%に相当する錘を垂直方向に3cm持ち上げた状態をall-outまで維持する静的掌握運動を行った。^<31>P-MRSにより測定する腕は常に右腕とし、クレアチンリン酸(PCr)、アデノシン3リン酸(ATP)およびPiの相対濃度を求めた。Piピークが分裂した場合には、これまでの先行研究を参考に各ピークがhigh-pHピーク(pH値6.8以上)とlow-pHピーク(pH値6.7以下)の領域に分かれているかについて判定し、この条件に当てはまる場合には2ピークの波形として扱った。細胞内pH値はPCrを基準としたPiの化学シフト値からTaylorらが示した式により算出した。【研究結果と考察】5名の被験者の内3名は一側運動時にはPiピークの分裂が認められたものの、両側運動中にはPiピークに分裂が認められなかった。この3名のpH値の変化を時間に対するプロットで示すと、両側運動時のpH動態は、一側運動時に得られたPiピークの分裂データからhigh-pHピーク値の動態を除いた、low-pHピーク値動態と同様な傾向を示した。この結果は、両側運動時においてhigh-pHピーク値に影響を及ぼすST筋線維動員の低下を反映するものと考えられる。
炭素安定同位体と遺伝的解析による気孔開度評価に基づいた街路樹の環境ストレス診断

都市域において環境ストレスが街路樹に与える影響を調べるため、京都市内に植栽されている街路樹5種について苗木を購入し、乾燥ストレスを与えて生理的応答を調査した。さらに、水利用効率に関わる遺伝子の候補である、アクアポリンのはたらきを解明するため、ユーカリの形質転換体(アクアポリン過剰発現体)を用いて大気ストレスに対する光合成応答を調査するとともに、RNA-seqおよびRT-PCRを用いて遺伝子の発現解析を行った。(1)街路樹の乾燥ストレス応答:ヒラドツツジ、カンツバキ、シャリンバイ、レンギョウ、クルメツツジの5種を比較したところ、乾燥ストレスに対する応答戦略に明瞭な種間差が認められた。調査した5種の中ではマルバシャリンバイが乾燥ストレスに対して光合成速度も茎の水分もいずれも最も高い維持率を示し、都市域の乾燥に対して高い適応性を有していることが明らかになった。一方、葉の炭素安定同位体比に関してもマルバシャリンバイが高い値を示したことから、上記の高い適応力に高い水利用効率が関与していることが示唆された。(2)気孔制御に対するアクアポリンのはたらきと遺伝子発現:ハツカダイコンのアクアポリン遺伝子RsPIP2を過剰発現させたユーカリを用いて大気の乾燥ストレスを与える実験を行ったところ、過剰発現体の方が光合成速度が高く維持され、かつ気孔コンダクタンスの減少度合いが緩やかである明らかになった。RT-PCR解析により、RsPIP2遺伝子の発現量が多いほど光合成速度は高くなることが示されたことから、RsPIP2には二酸化炭素の気孔からの取り込み量を増加させ、光合成を高めるはたらきがあることが示唆された。平成30年度は、5種の樹木について乾燥ストレスに対する応答の詳細な調査、および研究の最終目的である乾燥ストレス応答の評価を行うことができた。さらに、形質転換ユーカリを用いて、大気の乾燥ストレスに対するアクアポリン遺伝子のはたらきを解明するための電子解析を行うことができた。(1)低木5種にについて、前年度までに得られた実験結果を併せて解析することにより、街路樹として乾燥ストレスに対する適応性が高い樹種は「マルバシャリンバイである」という明瞭な結論を得ることができた。(2)気孔制御に対するアクアポリンンのはたらき:平成29年度から開始した実験に加えて、当初からの計画であったアクアポリン遺伝子の発現量解析を行った。その結果、アクアポリン遺伝子の発現量が大気の乾燥ストレスに対する応答に影響を与えていることを初めて示すことができた。本研究は、2019年度からスタートした基盤B「都市樹木における適性診断法の確立:アクアポリンを介した気孔応答評価の導入」の助成を受けてさらに発展させる計画である。京都市内における街路樹の調査を継続する。また、苗木の実験により、環境ストレスとして新たに塩ストレスを加え、塩ストレスにに対する光合成応答メカニズムを明らかにする。さらに、「アクアポリン」遺伝子に注目し、モデル植物であるシロイヌナズナの様々なアクアポリン変異体を用いて、光合成応答とアクアポリンとの関連を明らかにする。(1)街路樹調査、塩ストレス負荷実験:2019年度は、樹種を2種に絞り込み、より多くの調査地で光合成機能と炭素安定同位体比の関係を明らかにし、京都市内を対象にマッピングを行う。塩ストレスを街路樹に与え、光合成応答の種間差やそのメカニズムを明らかにする。(2)シロイヌナズナ変異体の光合成機能解析:シロイヌナズナのさまざまなアクアポリン変異体を用いて、それぞれのアクアポリン分子種が光合成機能や気孔の応答にどのように関与しているのかを明らかにする。本研究では代表的な街路樹の葉の「炭素安定同位体比(δ13C)」を用いて気孔の開度判定を行うことにより環境ストレスを診断する。併せて気孔開閉に関連する遺伝子群の解析により、環境ストレスをもたらす遺伝的な背景を明らかにし、夏期の環境ストレスを緩和する管理用法や樹木種を見いだし、都市の高温化や二酸化炭素放出量の抑制に資することを目的としている。平成27年度は京都市内において大気汚染レベルが異なる調査地を設定し、街路樹として国内で最も多く植栽されているイチョウ(高木)およびヒラドツツジ(低木)を対象に、ガス交換法および葉の炭素安定同位体を用いて光合成機能を比較・評価した。イチョウは調査地間で光合成機能はほとんど変わらなかった。また、炭素安定同位体の比率も調査地間でほぼ同等であった。一方ヒラドツツジについては、大気汚染濃度が最も高い調査地「大宮」のヒラドツツジは、大気汚染濃度がもっとも低い調査地「西ノ京」と比較すると気孔開度(気孔コンダクタンス)が42%しかなく、気孔を閉じていることが分かった。「大宮」に植栽されていたヒラドツツジの葉の炭素安定同位体比は「西ノ京」と比較すると2パーミル高かった。また、乾燥ストレスをかけて栽培したヒラドツツジについて、葉の光合成機能と炭素安定同位体比を比較したところ、乾燥ストレスをかけた葉の光合成速度は52%に低下し、気孔開度は38%に低下、水利用効率は1.3倍になり、炭素安定同位体比は0.6パーミル増加した。これらの結果から、光合成機能、特に気孔開度の指標として炭素安定同位体比が有効な評価指標となりうることが示された。当初の計画では、初年度である平成27年度は、京都市内に生育している樹木を使用して環境モニタや光合成機能の測定を中心に行う計画であった。

平成27年度は、京都市内に調査地を設定し、高木であるイチョウ、および低木であるヒラドツツジについて、気温、光強度、大気汚染物質濃度などの各種の環境モニタに加えて光合成機能の測定および炭素安定同位体比の測定をほぼ計画通りに行うことができた。イチョウについては調査地の間で差がなかったが、ヒラドツツジについては調査地間でほぼ予想通りの光合成機能および炭素安定同位体比の差を得ることができた。この成果は日本生態学会仙台大会にて発表した。街路樹の光合成機能と炭素安定同位体との関係を調べるため、屋外における街路樹調査、およびポット植えした街路樹の苗に乾燥ストレス負荷を与える実験の2種類の研究を行った。(1)京都市内における街路樹調査:京都市内において、大気汚染物質濃度が異なっていることが分かっている3カ所の調査地を選定し、オゾンの濃度を実測するとともに、街路樹として植栽されているヒラドツツジおよびソメイヨシノの光合成機能および炭素安定同位体比の評価を行った。高木であるソメイヨシノについては、調査地間で光合成速度の差が見られたものの、大気汚染物質濃度とは関係がなかった。それに対して低木のヒラドツツジでは、NO2などの大気汚染物質濃度が1.5倍である調査地で光合成速度が16%低かった。さらにヒラドツツジでは、大気汚染物質濃度が高い調査地で葉の炭素安定同位体比が1パーミル高くなっていたことから、葉の光合成機能判定のために炭素安定同位体比が有用であることが強く示唆された。(2)乾燥ストレス負荷実験:ポット植えした5種の街路樹(カンツバキ、マルバシャリンバイ、レンギョウ、ヒラドツツジ、クルメツツジ)について、1ヶ月間灌水を停止することによって乾燥ストレスを与え、葉の光合成機能や水分状態、および炭素安定同位体比がどのように変化するかを調べた。乾燥ストレスに対する光合成の生化学機能の応答には大きな種間差はなかった。一方、気孔や水分状態の応答には樹種間で顕著な差異が認められた。調査を行った5種の中ではヒラドツツジおよびマルバシャリンバイは乾燥ストレスに対して水ポテンシャルの減少が約10%に留まっており、さらに乾燥ストレスからの回復率もほぼ100%であったことから、乾燥ストレスには強い樹種であることが示唆される。一方、炭素安定同位体比については、予想に反して、いずれの樹種でも1ヶ月間の灌水停止によって変化が生じなかった。平成28年度は、平成27年度までに行った屋外における調査実験を継続してデータを補強するとともに、当初計画でも平成28年度に行う計画であった街路樹の苗木栽培実験を行った。(1)京都市内における街路樹調査:高木については平成27年度までとは異なる樹種を、低木については平成27年度までと同一の樹種を対象とし、平成27年度までに行った実験をもう一度行うことで研究結果の検証を行った。その結果、高木および低木いずれについても平成27年度までとほぼ同様の結果が得られ、「高木の光合成は大気汚染物質濃度に対してあまり応答しないが低木は敏感に応答する」というこれまでに得た結論を裏付けることができた。(2)乾燥ストレス負荷実験:苗木栽培実験については、街路樹の植栽を実施している事業者である西日本高速道路の担当者と議論を重ね、樹種を5種にまで絞り込み、ほぼ計画通りの実験を実施することができた。実験を行った5種の間ではストレス応答に明瞭な差異が認められ、期待した通りの結果を得ることができた。
ライブイメージングを利用した体節の分節化・上皮化機構の研究

体節の分節化や上皮化にはNotchやEph等の細胞間の連絡を介したシグナル伝達系が重要であり、既に、これらの遺伝子を破壊すると体節の形成が乱れること、一部の関連遺伝子については予定体節領域でmRNAの発現が分節に同調しながら周期的に変化すること等が知られている。ところがこれらのシグナル伝達系が体節形成に果たす役割はいまだ完全に理解されていない。なぜなら、NotchやEphなどのシグナル伝達分子は、隣り合う細胞間にシグナルのやり取りを成立させる分子であり、その役割を十分に理解するためには予定体節域でのタンパク質の組織分布や細胞内局在、さらにはこれらのシグナルがどのようなパターンで活性化されているかを知る必要があるからである。RNAの細胞内局在を可視化する方法を開発し、分節パターンの形成時にNotchシグナルの活性が振動していることを明らかにした.そのパターンは、細胞内で周期的にON-OFFを繰り返すことに加え、予定体節細胞集団でみると、集団として位相同期していることがわかった.局所的にNotchシグナルの発生を変化させることで、全体の振動パターンを変化させることも可能であったことから、細胞を単位とする振動子がNotchを介して細胞間相互作用することで、集団として同調した振動を作り出していることが明らかになった.体節の分節化にはDelta-Notchによる細胞間シグナル伝達系が重要であり、既に、これらの遺伝子を破壊すると体節の形成が乱れることが知られている。というのも、NotchやEphなどのシグナル伝達分子は、隣り合う細胞間にシグナルのやり取りを成立させる分子であるにもかかわらず、その機能の解析は、胚全体を対象としたものに限られ、細胞レベルでの研究が欠失しているからである。そこで機能阻害細胞を野生型胚に移植し、分節パターンの形成に与える影響を検討した。するとNotchの機能阻害細胞を移植した場合には分節パターンが乱れたままである一方、Delta機能阻害細胞を移植した場合にはパターン形成は正常に行われることがわかった。この結果はNotchが細胞間シグナルの受容に必須であり、その機能を失うと周囲の正常細胞からの情報を受け取ることができないため分節パターンが乱れてしまうこと、またDeltaはシグナルを送ることに必須であるがシグナルの受容には必要でないことから、周囲に正常な細胞が存在していればそれらの細胞に由来するシグナルに応答し通常のパターン形成に参加できることを示唆している。次に体節の分節パターンの形成にはhaily遺伝子を核とする振動体が重要であることが示唆されているので、Delta-Notchの機能と振動体との関係を解析した。Haily遺伝子の発現が過剰な細胞と発現をなくした細胞とを正常胚に移植したところ後者の場合でのみ分節境界の位置が細胞非自律的に変化することがわかった。遺伝学的な解析から、この効果にはDeltaの機能が必須であることもわかった。以上の結果から振動体であるhaily遺伝子の発現が減少するとDeltaの機能が活性化され周囲の細胞にシグナルを送り、周囲の細胞はNotchによりそのシグナルを受容することで振動体の振動周期を補正するという分子機構の存在が明らかになった。脊椎動物はその発生過程で、分節振動体が作り出す周期的なリズムをもとに分節性を構築しているが、その詳細な性質はほとんどわかっていない。そこで結合振動システムとしての分節振動体の基本的性質を明らかにするため、以下のような研究を行った。個々の振動子の振る舞いは転写、翻訳や修飾といった化学反応に依存するが生体内におけるこれらの反応は少なからずノイズの影響を受ける。たとえば細胞分裂中は、一般に転写や翻訳に時間がかかるし、細胞形態の変化にともなう細胞間相互作用の効率のゆらぎはやはり振動周期に何かしらの影響を与えうる。実際に分裂する細胞の分布をライブイメージングにより調べてみると、振動子の同調振動ゾーンである後方PSMでは一周期あたり25%もの細胞が分裂を経験していることがわかり、それらの細胞では振動の位相がずれていることが確認された。こうした効果により個々の振動子の振る舞いは少しずつずれてくるはずだが、実際の生体内では振動の同調性は維持される。こうした安定性が結合振動システムの持つ基本性質に由来するかどうかを確かめるため、シミュレーションと実際の実験による検証を行った。分節振動体の振る舞いにノイズの影響を考慮に入れた場合、細胞間相互作用がなければ振動の同調性はすぐに破綻するが、細胞間相互作用の存在下では振動の同調性が維持された。さらに生体内で細胞間相互作用を薬剤で阻害すると、予測されるとおり振動の同調性が大きく影響を受けた。以上により振動子間の相互作用が全体としての同調性を維持するために必須であることを示すことができた。RNAの細胞内局在を可視化する方法を開発し、分節パターンの形成時にNotchシグナルの活性が振動していることを明らかにした.

そのパターンは、細胞内で周期的にON-OFFを繰り返すことに加え、予定体節細胞集団でみると、集団として位相同期していることがわかった.局所的にNotchシグナルの発生を変化させることで、全体の振動パターンを変化させることも可能であったことから、細胞を単位とする振動子がNotchを介して細胞間相互作用することで、集団として同調した振動を作り出していることが明らかになった.
非線形消散型波動方程式の解の大域ダイナミクス

本研究では、非線形消散型波動方程式の解の大域ダイナミクスの解明を目的としている。そこでまず、本年度はエネルギー臨界な非線形項を持つ非線形消散型波動方程式の局所解の存在および初期値が小さい時の解の振る舞いについて調べた。この非線形方程式を研究するに当たって、まずは線形の消散型波動方程式の解に対する時空間評価、いわゆるStrichartz評価をまずは証明した。今回得られた結果によって、消散型波動方程式のStrichartz評価は、熱方程式の性質と波動方程式の性質を合わせ持っていることが明らかになった。具体的には、Strichartz評価が成立するための条件となる許容対の条件が熱方程式と類似しており、一方で熱方程式では生じ得ない微分の損失が波動方程式と同様な形で生じることが明らかになった。さらにこのStrichartz評価を非線形問題に応用することで、エネルギー臨界な非線形項を持つ非線形消散型波動方程式の、エネルギー空間内の局所解の存在を証明し、初期値が十分小さい時には、時間無限大で解がゼロに減衰することを証明することができた。また、変分法の議論を応用することで、初期値が大きい場合には有限時間で爆発する解が存在することも証明できた。加えて本年度は、共同研究によって、端点Strichartz評価が成立することも証明した。さらにこの端点Strichartz評価を用いることで、エネルギー臨界な非線形項を持つ非線形消散型波動方程式の解の無条件一意性を証明することができた。当初の予定通り、Strichartz評価を証明でき、非線形消散型波動方程式の解の存在および小さな解の減衰を明らかにできた。当初の研究計画通り、定常解未満での解の大域挙動の初期値による分類に挑戦する。
総力戦体制下における教育方法

本研究によって得られた新しい知見について(1)総力戦体制下における教育立法は,教育立法の主体が明治期における枢密院及びその他重圧も,またこれに対立する大正期以後における議会の役割も消滅し,これに変って「革新」をめざす軍部と官僚がその執行権を握ることになる。この転換と象像する問題が昭和12年の義務教育法案問題であり、また昭和13年枢密院官制のの改正問題であり、この両者に関する関係資料を明らかにすることができた。とくに後者の官制第6条の改正に伴う枢密院御諮詢事項に関する諒解事項(国議決定)は教育立法の勅令立義の根幹となる事項の失効の宣言を意味するものであった。(2)転換以後における総力戦体制下においては、軍部と革新官僚がファシズムの執行権を握り拡大された強力な内閣による要綱行政,指導行政が教育法と関係なく政策決定をして行くこととなる。とくに沢戦体制といわれる昭和18,19,20年における政策決定関係の資料と収集した。(現情勢下国政運営要綱,国幸行業8号学校非常体制確立要綱集,国内態勢強化策措置(文部省),国民学校令等戦時特例.緊急学徒勤労動員方策要綱,学児疎用ノ促進ニ関スル件,新規中等学校卒業者,勤労動員継続に関スル措置要綱,学童疎用強化要綱,決戦体制措置要綱,勤労動員例等)。これら要綱等の最初のものである昭和18年9月における現情勢下国政運営要綱及びこれにしめる文教政策決定資料は,この時期の政策反立怯方式を明らかにする上に極めて重要な意義をもつものであり、今後の詳細な検討が必要とされる。(3)昭和20年8月の「枢密院諮詢事項ノ維例ニ関スル件」は、「各学校令中(野範教育令ヲ含ム)及幼稚園令ノ政正又ハ特例ニ関スル勅令ニシテ見ノ事次重要ナラザルモノ」は枢密院に諮詢するを要しないこととなり,勅令主義の根幹であった枢密院の排除を示す重要な事柄である。
歯周炎の初期臨床モデル：歯肉溝フローラコントロールによる歯周炎予防法の開発

歯周疾患の予防法を研究する上で、不可欠なバイオフィルムを用いたシミュレーション開発を2016年より開始した。本年度は、Red complexを構成するPorphyromonas gingivalis(P. g)、Tannerella forsythia (T. f)、Treponema denticola (T. d)の3菌種とS.gordonii (S. g)を用いて、バイオフィルム形成を可能にした。さらに、このシミュレーションの実用化に向けて、洗口剤の人工バイオフィルムに対する影響評価法を検討した。バイオフィルム形成は、0.1% acetylmuramic acid添加TYGVS培地を使用した。バイオフィルム形成には、ヒト唾液による人工的ペリクル加工済み容器(ラボテックチャンバーカバーグラスと細胞培養用96ウェルプレート)上に行った。はじめにODを1.5に調整したS.gの懸濁液を容器内に各々満たし、24時間培養した。次いで懸濁液を除去し、各ODを1.5に調製したP. g、T. fとT. d懸濁液を容器内に入れ、さらに嫌気条件下で48時間培養し、形成させたバイオフィルムを用いて各濃度(00.09%)に調整したグルコン酸クロルヘキシジンに10分間作用させ、人工プラークの変化を観察・測定した。蛍光色素染色を用いて共焦点レーザー顕微鏡および蛍光マイクロプレートリーダーにて菌の生死を観察・測定した。共焦点レーザー顕微鏡での観察では、曝露したグルコン酸クロルヘキシジンの濃度によりダメージを受けた細菌の分布が異なることがわかった。また、蛍光マイクロプレートリーダーでの測定では、濃度依存的に生菌率が低下した。以上のことからこのシミュレーション応用において、今回用いた蛍光色素染色による細菌生死観察・測定は優れた評価指標であると判断された。本年度の研究計画では、バイオフィルムの作製として、人工歯肉溝装置を用いて、S.g.、F.n.およびP.g.からバイオフィルムを作製し、歯肉溝内の環境を再現することであった。人工歯肉溝装置を用いてのS.g.、F.n.およびP.g.からバイオフィルム作製は成功しており、次年度の課題である歯周病予防効果が期待される薬剤をバイオフィルムに作用させ、そのバイオフィルムに対する影響の評価についても一部実験を行っている。今後は、研究計画に従い、S.g.、F.n.およびP.g.作製したからバイオフィルムを用いて、歯周病予防効果が期待される薬剤のバイオフィルムに対する影響の評価を様々な手法で、詳細に行っていく予定である。使用期限を最大限長くし、実験回数を多くする目的で、購入時期を次年度にずらしたため、生じた次年度使用額である。使用計画に問題はないと考えている。
脳由来神経栄養因子のプロモター配列に対するsiRNAを用いた鎮痛法の開発

本研究は脳神経由来神経栄養因子(BDNF)のプロモーターエクソンをターゲットとして、siRNA法を応用した疼痛治療の基礎を確立し、臨床治療を目指した。まず、疼痛モデルラットの後根神経節で特異的に増加しているBDNFエクソンを確定する研究を実施した。疼痛モデルとしては神経因性疼痛モデルおよび炎症性疼痛モデルを作成し、PCR法を用いてBDNF mRNFの各エクソンを定量した。その結果、どちらの疼痛モデルにおいてもBDNFエクソン-1が特異的に増加していることが明らかとなった。そこで、エクソン1-に対するsiRNAを作成し、ラット脊髄内に投与して、その鎮痛効果を確認した。その結果、ラットにsiRNAを脊髄内投与すれば疼痛行動が抑制することが観察された。しかし、疼痛行動の効果が予想以上に小さいため、培養細胞を用いてsiRNAが転写を完全に抑制していることを確認する実験を次の確認作業として実施した。すなわち、培養後根神経節細胞においてまず、BDNFの産生を神経成長因子(NGF)で刺激して、いかなる変化が見られるかを観察した。その結果、NGFで培養後根神経節細胞を刺激するとBDNFの著明な増加が観察できた。また、その際特異的に増加しているエクソンがエクソン-1であることもPCRで確認できた。そこで、NGFで刺激した培養後根神経節細胞でsiRNAを投与してBDNFエクソン-1の産生抑制を期待して観察した。しかし、siRNAのBDNF産生抑制効果は有意ではあるが完全ではないことが確認された。すなわち、siRNAの疼痛抑制効果が十分でないことは、BDNF産生抑制が不十分である可能性を示した。以上の内容は論文、また学会で発表しsiRNAを使用してのBDNFエクソン阻害による鎮痛治療の限界を示した。難治性疼痛に大きく関与する神経栄養因子群に注目し、その中でも重要な役割を果たすと考えられるBrain Derived Neurotrophic Factor(BDNF)をとりあげ、ノックダウンすべき遺伝子のターゲットとした。BDNFにはサブタイプとして5つのエクソンがあり、慢性痛でも急性痛でもエクソン1が特異的に増加していることを確認し、エクソン1に対する2種類のsiRNAを作成した。ラット左後肢足底にcomplete Freund's adjuvant(CFA)を皮下注射し、炎症モデルを作成した。CFA注入9日前にクモ膜下カテーテルを挿入した。CFA注入の7日前と2日前の2回、クモ膜下に2種類のsiRNAまたは生理食塩水を投与した。CFA注入前、1日目と2日目に疼痛反応をそれぞれの群で比較した。結果として、2種類のsiRNA投与群は疼痛反応の減弱が認められた。しかし、この効果は統計学的には有意であるが、完全に疼痛を抑制するには不十分であった。この原因検索するため脊髄でのBDNFmRNAを測定したが、この発現を今回の投与量と回数では完全に抑制できていないことが確認できた。前年度に引き続き、脳神経由来神経栄養因子(BDNF)の中で痺痛時に特異的に増加しているエクソンであるBDNFエクソン-1に対するsiRNAの効果の確認を目指した。まず、作成した2種類のsiRNAをラット脊髄内に投与して、その鎮痛効果を確認する研究では、投与時期をさまざまに変えてみた。その結果、ラットで炎症物質(CFA)投与の7日前と2日前の2回でsiRNAを投与すれば疼痛行動が抑制することが観察された。次にその投与量に関して、高容量と低容量で効果を観察したが、その行動に有意な差は無く、両群ともある程度の疼痛行動の抑制が認められた。

疼痛行動の効果が予想以上に小さいため、培養細胞を用いてsiRNAが転写を完全に抑制していることを確認する実験を次の確認作業として実施した。すなわち、培養後根神経節細胞においてまず、BDNFの産生を神経成長因子(NGF)で刺激して、いかなる変化が見られるかを観察した。その結果、高容量のNGFで培養後根神経節細胞を刺激すると刺激6時間目をピークとしてBDNFの著明な増加が観察できた。また、その際特異的に増加しているエクソンがエクソン-1であることもPCRで確認できた。そこで、NGFで刺激した培養後根神経節細胞でsiRNAを投与してBDNFエクソン-1の産生抑制を期待して観察した。その結果、2種類の作成したsiRNAのBDNF産生抑制効果は有意ではあるが完全ではないことが確認された。すなわち、今回作成したsiRNAの疼痛抑制効果が十分でないことは、BDNF産生抑制が不十分でで可能性を示した。以上の内容は論文、また学会で発表しsiRNAを使用してのBDNFエクソン阻害による鎮痛効果の限界を明らかにした。