hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
直流送電を含む電力系統の系統安定化制御手法検証のための模擬実験装置の開発

1.模擬実験装置の主要な構成要素である発電機モデルの製作および動作検証:昨年度に引き続いて同期発電機に関するモデリングをMATLAB/Simulink上のブロック線図表現を用いて遂行した特に,本年度は力学系理論を併用した発電機モデルの検討により過渡動揺時の動特性を数値的・解析的に解明すると同時に,模擬装置で得られる実験結果の妥当性検証に力学系理論の適用可能性を示した.2.模擬実験装置における送電線に相当するリアクタンスの検証:本年度は昨年度に設計・製作したリアクタンスの物理定数・Q値等の検証を行った.その結果,模擬実験装置を構成する発電機モデルおよびリアクタンスの製作および検証作業を完了した.3.上記個別に製作した発電機モデルおよびリアクタンスを組み合わせたハイブリッド形模擬実験装置の開発および動作検証:本研究ではAD/DAボード,電流センサおよび電力増幅器を用いて個別に作成した発電機モデル(ディジタル要素:DSP上のプログラム)とリアクタンス(アナログ要素)を結合しハイブリッド形実験装置を構築した.続いて,無負荷試験等により実験装置の妥当性の検証を行った.以上により,直流送電による系統制御手法検証に向けた模擬実験装置の開発および検言作業の一部を終了した.これにより初期の目的を一応達成した.4.交直連系系統の過渡安定性に関する解析的検討:本研究で開発した模擬装置により得られる実験結果を,解析的に検証することは不可欠である.本検討では交直連系系統の過渡安定境界の解析的条件を導出すると共に,直流送電における電力変換制御が過渡安定性に与える影響を理論的に初めて明らかにした.
脂溶性物質の細胞外分泌に関わる「脂質のバルク輸送」の解明

本研究では、脂質が膜系に包まれた形で細胞外に分泌される「脂質のバルク輸送」という分泌機構を想定し、その仮説の検証に挑戦した。ムラサキ細胞のシコニン生産系を脂溶性物質の細胞外分泌のモデルとして用い、シコニンが包まれた脂質一重膜のオイル・ドロップレットの分泌機構の解明に取り組み、生化学、細胞生物学両面から解析を進めた。阻害剤実験から、シコニンの分泌は、アクチン繊維依存的であること、小胞体からの出芽に関与するARF/GEFが関与することを示した。また、疎水性と結晶性が高いシコニンが安定に細胞外に分泌されるために、トリアシルグリセロールがマトリックス脂質として細胞外に分泌されることを示唆した。高等植物の生産する天然の機能性低分子は、医薬品、色素、香料等多方面で利用されるが、それらは特定の組織やオルガネラに貯まる。特にステロール類やモノテルペンなど、脂溶性物質の多くはアポプラストに分泌されて高含量で蓄積するものが多い。一般的な理解として、植物の作る多くの機能性低分子について生合成研究は著しい進展がある一方、集積の分子機構は不明な点が多く、特に脂溶性物質の輸送・蓄積の機構はブラックボックスのままである。脂質は一般に、種子等の細胞内でオイルボディーとして細胞内に蓄積される現象が良く研究されているが、「脂質の細胞外分泌機構」に関してはほとんど科学のメスが入れられていないのが実情である。しかも、一分子ずつ低分子を排出する薬剤排出ポンプのような輸送体が、これら水に不溶の脂質の細胞外分泌を担っているとは考えにくい。そこで本研究では、脂質は膜系に包まれたバルクの状態で細胞外に分泌される、すなわち「脂質のバルク輸送」という新しい輸送機構を想定し、その仮説の検証に挑戦する。研究材料として、脂溶性物質の集積研究のモデル系であるシコニンの生産系を用い、シコニンが包まれた脂質一重膜の膜ベシクルが細胞膜と融合し、内容物をアポプラストに放出する機構に関与するタンパク質の機能解明を行う。解析手法として、毛状根の形質転換法を用いた機能解析、また輸送小胞のイメージング技術も構築する。高い注目度のある植物脂質の分泌機構に関する最初の分子レベル解析として高いチャレンジ性があり、世界最高レベルの生産性を誇る独創的な実験系が特色である。本研究では脂溶性代謝産物のモデルとして、薬用植物ムラサキ(Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.)の根が蓄積するナフトキノン系赤色色素シコニン誘導体の分泌機構を研究している。シコニン誘導体は脂溶性が高く、高い生産性に加え、シコニン生産が光照射でON/OFF制御を行える点、また赤色色素であるために視認が容易である点などから、脂溶性代謝産物の分泌系として本培養細胞ならびに毛状根は優れた研究モデルであると考えている。本年度は、阻害剤処理に感受性の高いムラサキ毛状根を材料に、作用機構の異なる様々な小胞輸送阻害剤を用い、シコニンの分泌に与える影響を調べた。アクチン重合阻害剤のcytochalasin Dや小胞形成のシグナル伝達に関与するたんぱく質ARF/GEFを阻害するbrefeldin Aで処理すると、シコニン生合成活性を落とすことなく分泌のみが阻害され、シコニンはアクチンフィラメント依存的に、少なくとも一部エキソサイトーシスと共通の機構を利用して分泌されることが示唆された。また、ムラサキ培養細胞からシコニン誘導体を含む脂溶性画分を調製し、LC-MSにて脂質分析を行った。その結果、シコニンは中性脂質であるトリアシルグリセロールとともに細胞外に分泌されることが示唆された。高等植物の生産する天然の機能異性低分子は、人間生活において、医薬品、色素、香料など多方面で利用されるが、その中でも、ステロール類やモノテルペノイドな脂溶性物質の多くはアポプラストに分泌されて細胞外で高濃度に蓄積する。しかし、脂溶性物質の輸送や蓄積の機構には不明な点が多く、少なくとも分子レベルでは、ほとんど理解されていないのが現状である。本研究では、脂質は膜系に包まれた形で、バルクの状態で細胞外に分泌される、すなわち「脂質のバルク輸送」という輸送機構があるのではないかと想定し、その仮説の検証に挑戦した。研究材料として、脂溶性物質の細胞外集積のモデルとして好適な、ムラサキ細胞のシコニン生産系を用い、シコニンが包まれた脂質一重膜のオイル・ドロップレットがどのようにして細胞がに内容物を放出できるか、その機構を明らかにすることに挑む。材料として、培養細胞だけでなく、毛状根も使うことができるため、組織分化と分泌機能分化の観点からも解析を進めた。本年度は、どのようなマトリックス脂質がシコニンと共にムラサキの細胞から分泌されているのかについて解析した。その結果、ムラサキの細胞は貯蔵脂質として細胞内にオイルボディーの形態で蓄積するトリグリセライドを細胞外に相当量分泌することを見出した。さらに、トリグリセライドの構造の差により細胞内に貯蔵されるものと、細胞外に分泌されるものがあることを見いだした。また人工のリポソーム形成実験により、シコニンとトリグリセライドの共存を実際に示すことができた。これらの成果を取りまとめ、現在論文を執筆中である。

ムラサキ細胞のシコニン生産系を脂溶性物質の細胞外分泌のモデルとして用い、シコニンが包まれた脂質一重膜のオイル・ドロップレットの分泌機構の解明に取り組み、生化学、細胞生物学両面から解析を進めた。阻害剤実験から、シコニンの分泌は、アクチン繊維依存的であること、小胞体からの出芽に関与するARF/GEFが関与することを示した。また、疎水性と結晶性が高いシコニンが安定に細胞外に分泌されるために、トリアシルグリセロールがマトリックス脂質として細胞外に分泌されることを示唆した。シコニンとともに細胞外に分泌される脂質分子に関しては、データの定量化など詳細なデータを追加して、平成29年度中での論文化を目指す。脂質分泌時における膜のダイナミクスに関しては、既にムラサキのシコニン生産系において、シコニン生産時に特異的に発現上昇してくる遺伝子、あるいは蛋白質を網羅的に取得すべく、大規模なRNA-Seq、並びにproteome解析を行っている。これまで、それら大規模データの精査、ならびに両オミックスデータの相互対比を行うことにより、シコニン生産時特異的に、mRNAあるいは蛋白質レベルで発現に明確な違いのあるメンバーを合計13種(トランスクリプトームから4種、プロテオームから9種)選び出した。その中には、小胞輸送系に関わると思われるタンパク質や、膜輸送体などが含まれている。今後は、これらタンパク質を蛍光タンパク質と融合し、ムラサキ毛状根の安定形質転換系、あるいは培養細胞の一過的発現系により、シコニン輸送小胞と共存するものを見出し、その細胞内の挙動を明らかにするため、共焦点レーザー顕微鏡を用いたライブイメージング系の構築を目指す。植物生化学、分子生物学
牛プリオン遺伝子の構造領域ならびにプロモータ領域の多様性に関する研究

我々は、昨年度Bos indicusの遺伝的影響が強いアジア在来牛やBos gaurusを家畜化したといわれるミタンなどのDNAサンプルを使って、本遺伝子の変異性を調査した。その結果、今まで報告されていた変異以外にも4つのアミノ酸置換を伴う1塩基多型(SNP)をミタンで4ヶ所(Lys-3→Thr、Gly-49→Ser、Ser-154→Asn、Met-252→Asn)、アジア在来牛で2ヶ所(Lys-3→Thr、Ser-154→Asn)同定している(前田ら,2003)。そこで、本報告ではこれまでに得られた成果を鹿児島県黒毛和種種雄牛集団に適用し、鹿児島県和牛のPRNP多型に関するデータを集積した。今回調べた4個所の多型領域のうち、黒毛和種集団のPRNPは、プロモーターと8アミン酸残基のくり返し数に多型が観察された。すなわち、プロモーターにおいて対立遺伝子AとBが、くり返し回数において5回と6回の多型が得られた。プロモーターの多型はHillsら(2001)の報告と一致していた。さらに、調査集団のPRNPは対立遺伝子Aの頻度(0.554)がBの頻度より少し高かった。くり返し数は、対立遺伝子6の頻度(0.722)が5(0.278)よりも高く、対立遺伝子6が主要な対立遺伝子であった。この傾向はこれまでの報告と一致していた。また、本領域をスコットランドのウシ370頭で調査した報告(Hunter et al.,1994)と比較すると、黒毛和種のPRNPは対立遺伝子5の頻度が高い(本報告:0.278、スコットランド:0.051)ことが示された。したがって、調査集団には、これまで報告の少なかった遺伝子型55の個体が7頭得られた。これまでに、スイスブラウン種で対立選伝子7、ミタンで対立遺伝子4が報告されているが、今回の調査ではそれらをまったく得ることが出来なかった。目的:プリオン遺伝子(PRNP)は牛海綿状脳症(BSE)などの伝達性海綿上脳症(TSE)に係わる遺伝子である。ヒトやヒツジではPRNPIの遺伝的多型がTSEに関係することが報告されている。他方、ウシPRNPの多型とBSEとの関連性は報告されていないが、これはウシPRNPの多型があまり明らかにされていないことがその理由の一つと考えられる。それゆえわが国でもBSEにかかりにくいウシを育種するためのプロジェクトが始動した。当研究室では、アジア在来牛のDNAサンプルのストックを持っているので、アジア在来牛のプリオン遺伝子の多様性の解析を行なった。材料と方法:材料には、ミタン、アジア4カ国(ベトナム、ラオス、ミャンマー、モンゴル)の在来牛及び日本の和牛ならびに口之島野化牛集団を用いた。既知の多型についてはプロモーター領域の12bpの欠失の多型(A or B)、翻訳領域の8アミノ酸残基の反復配列(24bp)の多型を解析した。さらに構造領域のDNAシークエンスを行い、多型解析を行なった。結果:プロモーター領域の欠失の有無の多型は、正常型(B)の遺伝子頻度は、東南アジア集団で、0.2以下を示し、東アジア集団で0.5以上を示した。また、反復配列では、PRNP^6の頻度が東南アジア集団で0.99、東アジア集団で0830.89であった。これらの結果は、PRNPは基地の多型で見ると東アジアの集団のほうが東南アジア集団よりも多様性に富むことを示唆している。ミタンを含む、11個体のアジア在来牛のDNAシークエンスを行なった結果、新たに、ミタンで4箇所、アジア在来牛で2箇所のアミノ酸置換を得た。これらの結果を、PrP型として纏めると本研究で初めて得られた3種類を含め、5種類得ることができた。ミタンおよびアジア在来牛でともに得られた2箇所のアミノ酸置換は、制限酵素Tsp451を用いたPCR-RFLP法で検出することができた。

また、本領域をスコットランドのウシ370頭で調査した報告(Hunter et al.,1994)と比較すると、黒毛和種のPRNPは対立遺伝子5の頻度が高い(本報告:0.278、スコットランド:0.051)ことが示された。したがって、調査集団には、これまで報告の少なかった遺伝子型55の個体が7頭得られた。これまでに、スイスブラウン種で対立選伝子7、ミタンで対立遺伝子4が報告されているが、今回の調査ではそれらをまったく得ることが出来なかった。
好熱性真核生物のゲノム情報を基盤とした小胞体関連分解装置の構造生物学研究

本研究は、小胞体において糖タンパク質の運命決定を下す小胞体品質管理マシーナリー(フォールディング装置、選別輸送装置、小胞体関連分解装置)の分子認識および作動機構の解明を目的とした。また、特徴となるアプローチは、真核生物の中で高い生育温度(約60°C)を持つ好熱カビのゲノム情報を活用することにある。本研究では、X線結晶構造解析によって、ジスルフィド結合の形成と異性化を触媒するプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)と糖タンパク質のプロセッシングに関わるグルコシダーゼIIの触媒ドメインの立体構造決定に初めて成功した。本研究は、小胞体において糖タンパク質の運命決定を下す小胞体品質管理マシーナリー(フォールディング装置、選別輸送装置、小胞体関連分解装置)の分子認識および作動機構の解明を目的としている。本研究の特徴の一つは、真核生物の中で高い生育温度(約60°C)を持つ好熱カビのゲノム情報を活用することにある。最終年度では、好熱カビの小胞体関連分解装置に加えて、UGGT、グルコシダーゼII、カルネキシンなどを中心としたフォールディング装置の構成因子のcDNAクローニング、大量発現系の構築、結晶化を行った。その結果、糖タンパク質のプロセッシングに関わるグルコシダーゼIIの触媒サブユニットの結晶構造解析に初めて成功した。これにより、グルコシダーゼIIの基質認識に関する有益な知見を得ることが出来た。本研究は、小胞体において糖タンパク質の運命決定を下す小胞体品質管理マシーナリーの分子認識および作動機構の解明を目的としている。本研究の特徴の一つは、真核生物の中で高い生育温度(約60°C)を持つ好熱カビのゲノム情報を活用することである。そこで平成24年度では、好熱カビの小胞体品質管理マシーナリーを構成するタンパク質素子の網羅的なcDNAクローニング、大量発現系の構築、および結晶化を行った。その結果、幾つかの構成素子の大腸菌での組換えタンパク質の大量発現に成功した。特にタンパク質成熟化に関わるプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)に関して、基質結合に関わるb'-a'ドメインの酸化型および還元型の結晶構造の決定に成功した。これにより、酸化還元に伴うPDIの構造変化に関して有益な知見を得ることが出来た。現在、好熱カビの小胞体品質管理マシーナリーを構成する幾つかのタンパク質素子の大量発現系の構築に成功している。さらに、構成素子の一つであるPDIの酸化型および還元型の結晶構造解析に成功している。以上、総合的に判断しておおむね順調に研究は進展している。小胞体品質管理マシーナリーが標的とするモデル基質の調製およびそれを用いた機能解析を行い、その結果を鑑みて、タンパク質複合体のX線結晶構造解析、NMR解析、電子顕微鏡解析などの多角的な構造生物学研究を順次遂行していく。モデル基質の調製は、タンパク質工学的アプローチに加えて、ケミカルバイオロジー的手法も併せて検討する。最近、私たちのグループでは、組換え酵母により安定同位体標識した高マンノース型糖鎖を調製することにも成功している。これをNMRによる相互作用解析に活用することも視野に入れて研究を遂行する。フォールディングセンサーなど柔構造を持つことが推測されるドメインと基質との相互作用解析は主にNMRを用いる。そこでは、アンフォールドタンパク質の解析が可能な分子研の超高磁場NMRを積極的に活用する。一方、ある程度の静的構造を持つことが予想されるドメインの立体構造解析についてはX線結晶構造解析を用いる。平成24年度において、好熱カビの小胞体品質管理マシーナリーを構成するタンパク質素子の大量発現系の構築が当初の計画より進展しなかったため、経費の大部分を計上していたNMR解析や結晶構造解析を十分に行えなかった。ただし、本年度末にかけて研究が大きく進捗したため、現在では計画通り研究は進展している。
磁場駆動材料を応用したインプラント即時負荷における骨形成機構の解析と臨床応用

1.磁場駆動材料の開発と調整:材料は、磁場勾配を利用して駆動する材料である磁性体コバルトフェライト粉を使用するため、脆さの改善を目的としてエポキシ樹脂と混合したものを利用した。安定的な再現性のある磁場を発生させるため生体外にて振動発生の調整を行い、期間内で磁場発生装置についても改良を行い、より再現性のある交流磁場とそれによる磁場駆動材料装置の振動制御について検討した。磁場発生装置は、磁極間距離10mm磁場0.5テスラー、電源ユニポーラとする磁場発生装置を用いた。磁場駆動材料は直径5mmの円盤状に成形し、動物実験で設置する方法と同様のやり方で直径1.2mm、長さ約20mmのワイヤーに設置し、磁場内での振動について振幅、振動数について生体外で距離、電流などの調整により検討した。2.動物実験モデルでの検討:動物実験では、実験部位の選択を行うために、四肢の標本を作製し埋入部位を検討した。はじめに円柱型、テーパー型のチタン合金を大腿骨に埋入し、組織標本により組織反応を観察した。組織標本からインプラント周囲において為害作用がないことや骨形成を確認した。また実験方法がより簡便で筋肉からの影響を受けにくい脛骨モデルとして、約15週齢の雄ラットを用い、脛骨に長さ1020mm、直径1.2mmの円柱状チタン製インプラントを埋入した。対照群として埋入後、骨外に突出した部分を削除した群と骨外に突出した部位を皮膚上に露出させた群とした。埋入後、1日2回の振動刺激を与え、実験後1,2,4,6,8週後屠殺を行った。マイクロCTにて骨および材料を撮影後、樹脂包埋した。研磨組織標本を作製しており、それらを用いて計測学的手法を用いて骨形態をはじめ、骨芽細胞、破骨細胞の数や局在について検討した後、骨、インプラント接触面積の計測を行い骨形成能について比較する。1.動物実験モデルの作製平成18年度は、動物実験モデルについて検討した。(1)実験部位についての検討:動物はラット、ウサギの後肢骨、大腿骨、脛骨について標本を作製し皮質骨の厚さ、海綿骨骨梁の量、配列について観察を行った。いずれも海綿骨骨梁は、比較的疎で結果としてラット大腿骨の近位端を用いることに決めた。(2)インプラント体の設計:長さ20mm、最大直径1.5mmの円柱状と円錐状のインプラント2種類を作製した。(3)ラット大腿骨埋入と経過観察:負荷をかけない群におけるインプラント周囲の組織反応について検討した。全身麻酔および局所麻酔後、皮膚を切開し、大腿骨を開放した後、バーにて皮質骨を穿孔し、インプラントを埋入した。実験後1,3、7日後、2,4,6週後に堵殺した。標本は、パラフィン包埋後、インプラントを除去し薄切しHE染色標本を作製した。埋入後1週間では、線維性結合組織が大部分取り囲み、2週間以降で、インプラント体表面の一部に骨の接触がみられた。2.振動に関する検討(1)振動材料の選択:磁場勾配を利用して駆動する材料である磁性体コバルトフェライト粉を使用するため、脆さの改善を目的としてエポキシ樹脂と混合した。インプラントの生体からの露出部分と下面に着脱可能な状態にするための穴をあけた。(2)振動の調整:材料には材料は交流磁気により振動させるため、コイルを作製し磁場シミュレーションを行った後、磁場の大きさによる振動数、振幅量を調整した。

生体外から動きを調整するため、材料の形状を円柱状、円盤状構造にし、3次元的な制御が可能であることを確認した。平成19年度では、振動数、振動時間を変えた状態での骨の形成を確認する。(1)安定的な再現性のある磁場を発生させるため主に磁場発生装置の改良を行った。より再現性のある交流磁場とそれによる磁場駆動材料装置の振動制御について検討した。磁場発生装置は、安定した磁場を発生させるために、磁極間距離10mm、磁場0.5テスラー、電源ユニポーラとする磁場発生装置を用いた。磁場駆動材料は直径5mmの円盤状に成形し、動物実験で設置する方法と同様のやり方で直径1.2mm、長さ約20mmのワイヤーに設置し、磁場内での振動について振幅、振動数について生体外で観察、調整した。(2)動物実験は、より簡便で筋肉からの影響を受けにくい脛骨モデルとして、約15週齢の雄ラット(Wistar rat)を用いた。ジエチルエーテル、ネンブタールにより全身麻酔の後、脛骨部を切開し、ラウンドバーにて直径1.2mmの穴を開けた。洗浄後、長さ約1020mm、直径1.2mmの円柱状チタン製インプラントを埋入した。対照群として埋入後、骨外に突出した部分を削除した群と骨外に突出した部位を皮膚上に露出させた群とした。埋入後、1日2回の振動刺激を与え、実験後1,2,4,6,8週後屠殺を行った。マイクロCTにて骨および材料を撮影後、樹脂包埋した。マイクロCTにてインプラント周囲の骨形成を確認した。今後、研磨組織標本を作製し、計測学的手法を用いて骨形態をはじめ、骨芽細胞、破骨細胞の数や局在について検討した後、骨、インプラント接触面積の計測を行い骨形成能について比較する。
抗DNA依存性プロテインキナーゼ抗体の臨床的意義と産生機序に関する研究

1.目的抗Ku抗体は強皮症一多発性筋炎重複症候群患者血清中に特異的に見出された自己抗体であり,その対応抗原(Ku蛋白)は2重鎖DNA末端に結合し,転写調節,DNAの修復,複製に関わる.その語,Ku蛋白は2重鎖DNA存在下で種々の複製・転写因子をリン酸化するDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の補助因子であること,DNA-PKの欠損がSCIDマウスの原因であることが報告された.本研究では,1)DNA-PKの構造および機能とアポトーシスとの関連の追究,2)自己抗体産生へのアポトーシスの関与の追究,3)自己抗原エピトープの同定と,4)抗DNA-PK触媒サブユニット(DNA-PKcs)自己抗体の病因的および臨床的意義の追究を目的とした.2.方法(1)膠原病患者920例を対象とし,免疫沈降法により自己抗体を検出した.(2)プロテインAセファロースビーズ上にDNA-PKホロ酵素を再構成させ,試験管内リン酸化反応を行った.(3)Jurkat細胞に抗Fas抗体によりアポトーシスを誘導し,DNA-PKの動態を調べた.3.結果(1)抗DNA-PKcs抗体陽性は11血清で,診断は全身性エリテマトーデス3例,全身性硬化症2例,多発性近炎2例,膠原病重複症候群4例であった.11例中7例では抗Ku抗体が陽性で高率に併存した.(3)アポトーシス誘導後,DNA-PKcsがCPP32の標的となり230kDa,160kDaと120kDa蛋白に限定分解され,活性は1低下した.DNA-PKcs上の複数のエピトープと自己抗体反応様式は多様で,p160に主要な抗原決定基が含まれた.4.結語1.目的抗Ku抗体は強皮症一多発性筋炎重複症候群患者血清中に特異的に見出された自己抗体であり,その対応抗原(Ku蛋白)は2重鎖DNA末端に結合し,転写調節,DNAの修復,複製に関わる.その語,Ku蛋白は2重鎖DNA存在下で種々の複製・転写因子をリン酸化するDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の補助因子であること,DNA-PKの欠損がSCIDマウスの原因であることが報告された.本研究では,1)DNA-PKの構造および機能とアポトーシスとの関連の追究,2)自己抗体産生へのアポトーシスの関与の追究,3)自己抗原エピトープの同定と,4)抗DNA-PK触媒サブユニット(DNA-PKcs)自己抗体の病因的および臨床的意義の追究を目的とした.2.方法(1)膠原病患者920例を対象とし,免疫沈降法により自己抗体を検出した.(2)プロテインAセファロースビーズ上にDNA-PKホロ酵素を再構成させ,試験管内リン酸化反応を行った.(3)Jurkat細胞に抗Fas抗体によりアポトーシスを誘導し,DNA-PKの動態を調べた.3.結果(1)抗DNA-PKcs抗体陽性は11血清で,診断は全身性エリテマトーデス3例,全身性硬化症2例,多発性近炎2例,膠原病重複症候群4例であった.11例中7例では抗Ku抗体が陽性で高率に併存した.(3)アポトーシス誘導後,DNA-PKcsがCPP32の標的となり230kDa,160kDaと120kDa蛋白に限定分解され,活性は1低下した.DNA-PKcs上の複数のエピトープと自己抗体反応様式は多様で,p160に主要な抗原決定基が含まれた.4.結語【目的】抗Ku抗体は強皮症一多発性筋炎重複症候群患者血清中に特異的に見出された自己抗体であり,その対応抗原(Ku蛋白)は2重鎖DNA末端に結合し,転写調節,DNAの修復,複製に関わる.その語,Ku蛋白は2重鎖DNA存在下で種々の複製・転写因子をリン酸化するDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の補助因子であることが報告された.本研究では,1)DNA-PKの構造および機能とアポトーシスとの関連の追究,2)自己抗体産生へのアポトーシスの関与の追究,3)自己抗原エピトープの同定と抗体産生に関与するT細胞の抗原認識機構の解明,4)抗DNA-PKcs自己抗体の病因的および臨床的意義を追究することを目的とした.平成16年度は,DNA-PK触媒subunitに対する自己抗体(抗DNA-PKcs抗体)の臨床的意義および免疫学的特異性を追求した.【方法】膠原病患者920例を対象とし,35Sメチオニン標識HeLa細胞抽出物を用いた免疫沈降法により,抗DNA-PKcs抗体および併存自己抗体を検出した.【結果】免疫沈降法により抗DNA-PKcs抗体陽性の11血清を得た.これら11例の臨床診断は,全身性エリテマトーデス3例,全身性硬化症2例,多発性近炎2例,膠原病重複症候群4例であった.併存自己抗体を検索したところ,抗DNA-PKcs抗体陽性11例のうち7例では抗Ku抗体が陽性で,両者の高率の併存が示された.【目的】

抗Ku抗体は強皮症-多発性筋炎重複症候群患者血清中に特異的に見出された自己抗体であり,その対応抗原(Ku蛋白)は2重鎖DNA末端に結合し,転写調節,DNAの修復,複製に関わる.その語,Ku蛋白は2重鎖DNA存在下で種々の複製・転写因子をリン酸化するDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の補助因子であること,DNA-PKの欠損がSCIDマウスの原因であることが報告された.本研究では,1)DNA-PKの構造および機能とアポトーシスとの関連の追究,2)自己抗体産生へのアポトーシスの関与の追究,3)自己抗原エピトープの同定と抗体産生に関与するT細胞の抗原認識機構の解明,4)抗DNA-PK触媒サブユニット(DNA-PKcs)自己抗体の病因的および臨床的意義を追究することを目的とした.平成17年度は,昨年度見出した抗DNA-PKcs抗体と抗Ku抗体を用いて,DNA-PK活性検出法を開発し,自己抗体のDNA-PK活性に及ぼす影響を検討することした.【方法】1.HeLa細胞より免疫アフィニティーカラムにより精製したKu蛋白とDNA-PKcsを用いて試験管内リン酸化反応を行い,自己抗体がDNA-PK活性へ与える影響を検討した.2.HeLa細胞より自己抗体が免疫沈降しプロテインAセファロースビーズ上に結合したDNA-PKcsに,精製Ku蛋白とdsDNAを加え,DNA-PKホロ酵素を再構成させ,試験管内リン酸化反応を行った.【結果】1.自己抗体が免疫沈降したDNA-PKcsはKu蛋白とdsDNA存在下で基質をリン酸化し,DNA-PK活性が検出された.【結語】簡便なDNA-PK活性検出法の確立し,抗Ku抗体がDNA-PKの機能を制御することを明らかとした.本研究成果は,SCIDや自己免疫疾患の病因・病態の解明に有用と考えられる.1.目的抗Ku抗体は強皮症-多発性筋炎重複症候群患者血清中に特異的に見出された自己抗体であり,その対応抗原(Ku蛋白)は2重鎖DNA末端に結合し,転写調節,DNAの修復,複製に関わる.その語,Ku蛋白は2重鎖DNA存在下で種々の複製・転写因子をリン酸化するDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の補助因子であること,DNA-PKの欠損がSCIDマウスの原因であることが報告された.本研究では,1)DNA-PKの構造および機能とアポトーシスとの関連の追究,2)自己抗体産生へのアポトーシスの関与の追究,3)自己抗原エピトープの同定と抗体産生に関与するT細胞の抗原認識機構の解明,4)抗DNA-PK触媒サブユニット(DNA-PKcs)自己抗体の病因的および臨床的意義の追究を目的とした.平成18年度は,アポトーシスがDNA-PKの動態,機能に及ぼす影響を調べ,自己抗体産生との関連を追求した.2.方法Jurkat細胞に抗Fas抗体によりアポトーシスを誘導し,DNA-PKの動態を調べた.3.結果(1)アポトーシスを誘導後,DNA-PK複合体のうちDNA-PKcsがプロテアーゼCPP32の標的となり,230kDa蛋白(p230),160kDa蛋白(p160)と120kDa蛋白(p120)に限定分解された.限定分解に伴い,DNA-PK活性は低下した.(2)抗DNA-PKcs抗体陽性患者11血清のうちNS血清を除く10血清がp160と強く反応し,NS血清もp160と弱い反応をした.p230との反応は,TK, TB, YY, ZM血清で強くみられ,他の6血清との反応は弱かった.以上,DNA-PKcs上の複数のエピトープと自己抗体の反応様式の多様性とp160に主要な抗原決定基が含まれることが明らかとされた.4.結語
ヘリックスバンドル形成をモデルとした蛋白質の構造エントロピーの定量化

ヘリックスバンドル構造をもつ蛋白質の疎水性コアにHisを導入し、さらに不安定化することで、金属イオン結合に伴いランダム構造からヘリックスバンドル構造に変化するモデル蛋白質を調製した。同構造変化の構造エントロピーの定量化、さらにアンサンブル量と1分子解析結果の相関解明を目指し、NMR、等温滴定型熱量計(ITC)、高速X線1分子追跡(DXT)実験などを行った。これまでの成果として、目的蛋白質の調製に成功し、ITCを用いて結合熱力学量を決定した。さらにDXTを用いて、動的構造変化の1分子解析を行い、金属イオン結合前後での動きの経時変化を観測した。DeGradoらによりNMRで構造決定されたαヘリックスバンドルを鋳型とし、疎水性コア形成残基となる3残基分をHisに置換し、元はランダム構造をとるものの、金属イオン結合に伴いヘリックスバンドルに構造変化するモデル蛋白質の構築を試みた。構造変化は主に円二色性分散計(CD)を用いて解析した。その結果、3残基分をHisに置換しただけではランダム構造とならず、計6残基をHisに、さらに3残基分をGlyまたはAlaで置換することで、金属結合前後で、ランダムからヘリックスへの構造転移が示唆され、これらをそれぞれHG, HAと命名し、以降のさらなる解析を行った。NMR解析を、亜鉛イオン添加前後で行ったところ、同添加に伴い、HGではヘリックス構造はとるもののバンドル構造ではないこと、HAでヘリックスバンドル構造をとることが示唆された。また高速X線1分子追跡法(DXT)を行うにあたり、HG, HAともにそのN末端にHis-tagを配し、同部位を介して基板上に固定化、さらに金ナノ結晶の結合部位として、第3ヘリックスの溶媒露出面にMet残基を入れたペプチドを用いて実験を行った。亜鉛イオン添加前後でのHG, HAの運動性の違いは有意な差として観測されなかったが、金属イオン添加前の運動性はHGで大きいという結果が得られた。これはCD測定で、HGの方がランダム構造の程度が大きいという結果とも一致した。金属イオン添加時に、同結合がX線放射圧などの影響を受けていないかなどを精査する必要がある。また予備実験程度ながら、等温滴定型熱量計(ITC)を用いて、亜鉛イオンや銅イオンとの結合を観測した。鋳型タンパク質は比較的安定で、結果として、その疎水性コア形成部位3か所(計9残基)のうち、2か所すべてをHisに、残り1か所をGlyまたはAlaで置換することで、金属結合前後で、ランダムからヘリックスへの構造転移が示唆され、これらをそれぞれHG、HAと命名し、以降のさらなる解析を行った。また亜鉛イオンとの結合熱力学解析を、等温滴定型熱量計(ITC)を用いて行ったところ、HG、HAともに、解離平衡定数はμM程度で、エンタルピー駆動型であった。HAで、より結合エンタルピー変化量が負に大きく、金属イオン結合に伴う安定化が示唆された。さらに、高速X線1分子追跡法(DXT)を用いて、1分子レベルでの動的挙動を解析したところ、HAに比べて、HGでその運動性は大きいという結果が得られた。これは円二色性分散(CD)測定で、HGの方がランダム構造の程度が大きいという結果とも一致した。今後はさらに解析を進め、特にNMRやITCで得られるアンサンブル量としての動的挙動と、DXTで得られる1分子量の総和との相関付けを行いたい。金属イオン結合に伴いランダム構造からαヘリックスバンドル構造へ変化するモデルペプチドについて、当初の予想よりもDeGradoらのモデルペプチドの構造が固く、ランダム構造にできるアミノ酸置換が多く苦労したが、年度内にHG, HAという理想形に近いモデルペプチドに到達することができた。当初の計画通り、CDやDXT測定を行い、各ペプチドの金属添加に伴う構造変化や動的挙動を観測した。特にDXTについては、実験系の問題点などを吟味する必要があるものの、概ね計画通りに推移していると考えられる。蛋白質科学金属イオン結合の熱力学量を、ITCを用いて決定する。ここで得られるエントロピー変化量を、構造変化の揺らぎの程度の差として定量化する。さらに13C, 15Nラベル化HA(またはHG)を調製し、3次元NMR測定により各シグナルを帰属、さらに亜鉛イオン添加前後での緩和測定を行うことで、各部位の動的挙動変化を定量化する。

これらITCとNMRで得られる動的挙動変化は、いずれも統計量ながら、前者は系全体の、後者は部位特異的な情報として、相互に相関づける。一方、DXTでは、1分子単位での運動性が観測できることから、1分子ごとの総和としての運動性の違いが、前記の統計量との違いと如何に相関するかを解析する。さらにHGやHAのHis残基と金属イオンとの結合は、pHを酸性にすると弱まることを踏まえ、ケージドプロトン化合物を各ペプチドと金属イオンとの複合体に加え、同溶液にレーザーを照射することで、pHを瞬時に酸性pHにし、同変化に伴う動的挙動の経時変化を観測することで、蛋白質フォールディングの速度論情報を取得する。
複合収着材ナノ細孔内の金属塩の結晶性制御と次世代ケミカル冷凍機の実現

本研究で対象とする金属塩/陽極酸化アルミニウム複合材は,ケミカル冷凍機の主要素である反応材熱交換器を構成する高伝熱性蓄熱材料であり,冷媒蒸気の収着と熱移動がほぼ同じ場所で進行し得る点が最大の特徴である。本研究では,本複合材の冷媒蒸気収着能を最大化するために多孔質酸化皮膜内に添着する金属塩の結晶性を向上させる調製法を確立し,本複合材のケミカル冷凍機への適用性について検討することを目的としている。今年度の研究実績は以下に示す通りである。金属塩の添着担体となる多孔質酸化アルミニウム皮膜を,シュウ酸およびリン酸を用いる陽極酸化処理により調製し,皮膜細孔の拡大処理を施した後に,塩化カルシウム(CaCl2)を溶液含浸法で細孔内に添着した。その結果,CaCl2添着複合材の水蒸気収着平衡は担体皮膜の細孔容積とCaCl2添着量の影響を受け,収着速度は皮膜細孔の直径と開孔率が大きい場合に速くなることを明らかにした。また,CaCl2添着量が少ない複合材は水蒸気収着容量が減少し,結晶性CaCl2単体とは異なる収着挙動を示すことを確認した。一方で,CaCl2添着複合層のX線回折結果から,CaCl2の結晶性は複合材調製条件の影響を受け,特に,含浸溶液中のCaCl2濃度が高く,そして,含浸後の焼成温度を200°Cとする場合に,高い結晶性を有するCaCl2を皮膜細孔内に添着できることを明らかにした。CaCl2添着アルミニウム複合材に対する水蒸気収着挙動を理論的に検討する第一段階として,蒸気吸着平衡ならびに速度データの蓄積がある活性炭素繊維成形体/メタノール吸着系の熱・物質移動モデルを構築し,吸着速度定数をパラメータとする数値解析を実施した結果,成形体への蒸気吸着と熱移動の過渡的挙動を良好に再現できることを確認した。そして,CaCl2添着複合材/水蒸気収着系に展開するために本モデルの修正を行った。アルミニウム平板を酸性浴中で電解処理することにより得られる酸化アルミニウム皮膜には直径数十nmオーダーの無数のシリンダー状細孔が生成する。この細孔内に水蒸気等の冷媒蒸気を収着する金属塩を添着することで,蒸気収着と熱移動が迅速に進行する高伝熱性蓄熱材が得られる。今年度は,塩化カルシウム(CaCl2)添着アルミニウム複合材の水蒸気収着能の向上を目指し,酸化アルミニウム皮膜担体およびCaCl2添着複合材の調製条件を広範囲に変化させて,複合材の水蒸気収着平衡,収着速度ならびに添着CaCl2の結晶性について実験的検討を行った。皮膜担体の調製では,電解浴種,通電条件,そして,細孔径拡大処理時のカソード分極操作条件を適切に組み合わせることで,所望の細孔構造を有する酸化アルミニウム皮膜を得ることができた。そして,調製したCaCl2添着複合材の水蒸気収着特性(平衡および速度)と複合材調製条件の関連性を系統的に明らかにするとともに,細孔内CaCl2の結晶性に及ぼす影響因子を概ね把握することでき,特に,高結晶性のCaCl2を析出させるためには,一定濃度以上のCaCl2溶液が必要であり,溶液含浸後の試料焼成には最適温度が存在することを見出した。一方で,CaCl2添着アルミニウム複合材の水蒸気収着挙動の理論解析に関しては,その第一段階として多くの実験データを保有する活性炭素繊維成形体/メタノール吸着系に対して1次元熱・物質移動モデルを構築し,成形体への蒸気吸着と熱移動が平衡に至るまでの過渡的挙動を良好に再現できることを実証した(論文発表)。そして,本モデルをCaCl2添着複合材/水蒸気収着系に展開するために,皮膜細孔内の水蒸気拡散速度と添着CaCl2の水蒸気収着速度を加味した2次元モデルの構築を行った。以上より,本研究の進展はおおむね順調と考えられる。今年度得られた研究結果を踏まえて今後は以下に示すように,冷凍操作により好適な金属塩/陽極酸化アルミニウム複合材の調製に取り組み,本複合材を適用する高出力収着冷凍システムの構築に向けた検討を進める。なお,金属塩と冷媒の組み合わせは塩化カルシウムー水系を第一候補とし,研究の進展に基づいて,塩化カルシウムーメタノール系,塩化リチウムー水系等の検討も視野に入れる。金属塩添着複合材の蒸気収着容量の増大には,添着担体となる多孔質酸化アルミニウム皮膜の細孔容積や比表面積が大きく,より多くの金属塩を添着することが望まれ,これに加えて,高い結晶性の金属塩の析出が重要となる。一方で,収着速度の向上には,細孔内の蒸気拡散空間の確保と複合材中の熱授受の基となるアルミニウム基材部のある程度の残存が必要である。これらに鑑み,陽極酸化アルミニウム皮膜担体と金属塩添着複合材の調製条件を高度に制御することで冷凍操作に最適な複合材を取得する。また,添着金属塩の結晶性は析出処理条件のみならず細孔壁との相互作用により変化する可能性があり,皮膜細孔内での金属塩の結晶化過程(核形成,結晶成長)についても検討し,金属塩の蒸気収着促進に繋げる。収着冷凍システムの構築に関しては,金属塩/アルミニウム複合材を適用する収着熱交換器を設計・試作するために,複合材の蒸気収着および伝熱特性を理論的に明らかにする。

ここでは,最適化した複合材の蒸気収着平衡と収着速度をそれぞれ定式化し,これらを数値解析モデルに組み込み,その妥当性を検証した上で,冷凍操作に最適な収着熱交換器の設計指針を得る。そして,実際に調製した金属塩添着アルミニウム複合材を適用した収着冷凍システムにより冷凍出力の評価を定量的に行う。本研究で対象とする金属塩/陽極酸化アルミニウム複合材は,ケミカル冷凍機の主要素である反応材熱交換器を構成する高伝熱性蓄熱材料であり,冷媒蒸気の収着と熱移動がほぼ同じ場所で進行し得る点が最大の特徴である。本研究では,本複合材の冷媒蒸気収着能を最大化するために多孔質酸化皮膜内に添着する金属塩の結晶性を向上させる調製法を確立し,本複合材のケミカル冷凍機への適用性について検討することを目的としている。今年度の研究実績は以下に示す通りである。金属塩の添着担体となる多孔質酸化アルミニウム皮膜を,シュウ酸およびリン酸を用いる陽極酸化処理により調製し,皮膜細孔の拡大処理を施した後に,塩化カルシウム(CaCl2)を溶液含浸法で細孔内に添着した。その結果,CaCl2添着複合材の水蒸気収着平衡は担体皮膜の細孔容積とCaCl2添着量の影響を受け,収着速度は皮膜細孔の直径と開孔率が大きい場合に速くなることを明らかにした。また,CaCl2添着量が少ない複合材は水蒸気収着容量が減少し,結晶性CaCl2単体とは異なる収着挙動を示すことを確認した。一方で,CaCl2添着複合層のX線回折結果から,CaCl2の結晶性は複合材調製条件の影響を受け,特に,含浸溶液中のCaCl2濃度が高く,そして,含浸後の焼成温度を200°Cとする場合に,高い結晶性を有するCaCl2を皮膜細孔内に添着できることを明らかにした。CaCl2添着アルミニウム複合材に対する水蒸気収着挙動を理論的に検討する第一段階として,蒸気吸着平衡ならびに速度データの蓄積がある活性炭素繊維成形体/メタノール吸着系の熱・物質移動モデルを構築し,吸着速度定数をパラメータとする数値解析を実施した結果,成形体への蒸気吸着と熱移動の過渡的挙動を良好に再現できることを確認した。そして,CaCl2添着複合材/水蒸気収着系に展開するために本モデルの修正を行った。アルミニウム平板を酸性浴中で電解処理することにより得られる酸化アルミニウム皮膜には直径数十nmオーダーの無数のシリンダー状細孔が生成する。この細孔内に水蒸気等の冷媒蒸気を収着する金属塩を添着することで,蒸気収着と熱移動が迅速に進行する高伝熱性蓄熱材が得られる。今年度は,塩化カルシウム(CaCl2)添着アルミニウム複合材の水蒸気収着能の向上を目指し,酸化アルミニウム皮膜担体およびCaCl2添着複合材の調製条件を広範囲に変化させて,複合材の水蒸気収着平衡,収着速度ならびに添着CaCl2の結晶性について実験的検討を行った。皮膜担体の調製では,電解浴種,通電条件,そして,細孔径拡大処理時のカソード分極操作条件を適切に組み合わせることで,所望の細孔構造を有する酸化アルミニウム皮膜を得ることができた。そして,調製したCaCl2添着複合材の水蒸気収着特性(平衡および速度)と複合材調製条件の関連性を系統的に明らかにするとともに,細孔内CaCl2の結晶性に及ぼす影響因子を概ね把握することでき,特に,高結晶性のCaCl2を析出させるためには,一定濃度以上のCaCl2溶液が必要であり,溶液含浸後の試料焼成には最適温度が存在することを見出した。一方で,CaCl
ゼラチンハイドロゲルスポンジを用いた骨細胞誘導法の確立と関節リウマチ治療への応用

骨細胞に関しては、マウスを中心とした研究が主体で、ヒトにおいては十分に検討されていない。本研究では、in vitroにおいて三次元培養系を用いたヒト間葉系幹細胞からの効率的なヒト骨細胞分化誘導法を確立するとともに、ヒト骨細胞に対する炎症性サイトカインの作用、炎症性サイトカイン刺激を受けた骨細胞の骨代謝への影響を明らかにすることで関節リウマチ(RA: Rheumatoid arthritis)病態におけるヒト骨細胞の病的意義を明らかにし、骨細胞に着目したRA新規治療法の開拓に繋げることを目指した。ゼラチンハイドロゲルスポンジを足場とした三次元環境下でヒト間葉系幹細胞を28日間培養したところ、走査電子顕微鏡による形態学的な評価において、骨細胞に特徴的な突起の伸長を伴う細胞が分化誘導されることが確認された。また透過電子顕微鏡および質量分析において、同細胞周囲のリン酸カルシウムの沈着が確認された。その上で骨細胞マーカーの発現をRT-PCR法で評価したところ、IL-1β刺激およびPPARγアンタゴニストの添加によりBSP(bone siaroprotein)、MEPE(matrix extracellular phosphoglycoprotein)、SOST(sclerostin)、PHEX(phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome)の発現が亢進した。本研究の結果から、in vitroにおけるヒト間葉系幹細胞の三次元培養によりヒト骨細胞が分化誘導され、さらにIL-1β刺激とPPARγ阻害により効率化される可能性が示された。本研究では、ヒト骨細胞の効率的な分化誘導法を確立するともとにRA病態における骨細胞の病的意義を明らかにすることを目的としている。そのためヒト骨細胞を分化誘導することが最も研究の基礎となる。初年度までに三次元培養法を用いることでヒト間葉系幹細胞からヒト骨細胞を分化誘導することができ、さらにその効率化に繋がる培養条件の設定も可能となっている点から本研究は概ね順調に進展しているものと考える。一方、RA病態におけるヒト骨細胞の病的意義を明らかにするためには、ヒト骨細胞の詳細な機能解析が必須である。本年度は、初年度に分化誘導可能となったヒト骨細胞を用い炎症環境下(RA病態)におけるヒト骨細胞の機能評価(破骨細胞や骨芽細胞への影響)を計画し実行中である。RA病態におけるヒト骨細胞の病的意義を明らかにするためには、ヒト骨細胞の詳細な機能解析が必須であると考え、本年度は、初年度に分化誘導可能となったヒト骨細胞を用い炎症環境下(RA病態)におけるヒト骨細胞の機能評価(破骨細胞や骨芽細胞への影響)を計画した。具体的には、炎症性サイトカイン刺激を加えたヒト骨細胞と無刺激ヒト骨細胞を用い、1RANKL、OPG、スクレロスチン産生能(RT-PCR法・ELISA法により評価)、2単球由来の破骨細胞前駆細胞との共培養実験における破骨細胞分化・成熟への作用と骨吸収能への影響(マーカー遺伝子発現、TRAP陽性細胞数・細胞核数・細胞融合、ピットフォーメーションアッセイにより評価)、3ヒト間葉系幹細胞との共培養実験における骨芽細胞分化への影響(マーカー遺伝子の発現、アリザリンレッドS染色・ALP染色により評価)を評価する。なお、本研究で用いる破骨細胞前駆細胞は、健常人末梢血より分離したCD14陽性細胞に3日間M-CSFを加え誘導したものを用いる。すでに本手法により誘導される細胞は、破骨細胞のマーカー遺伝子(NFATc1,カテプシンK)を発現していることをRT-PCR法で確認している。以上、本年度は、骨細胞に対する炎症性サイトカイン刺激の影響、炎症性サイトカイン刺激時のヒト骨細胞の骨代謝への影響を明らかにすることに主眼を置き研究を推進する。初年度までに三次元培養法を用いることでヒト

間葉系幹細胞からヒト骨細胞を分化誘導することができ、さらにその効率化に繋がる培養条件の設定も可能となっている点から本研究は概ね順調に進展しているものと考える。一方、RA病態におけるヒト骨細胞の病的意義を明らかにするためには、ヒト骨細胞の詳細な機能解析が必須である。本年度は、初年度に分化誘導可能となったヒト骨細胞を用い炎症環境下(RA病態)におけるヒト骨細胞の機能評価(破骨細胞や骨芽細胞への影響)を計画し実行中である。RA病態におけるヒト骨細胞の病的意義を明らかにするためには、ヒト骨細胞の詳細な機能解析が必須であると考え、本年度は、初年度に分化誘導可能となったヒト骨細胞を用い炎症環境下(RA病態)におけるヒト骨細胞の機能評価(破骨細胞や骨芽細胞への影響)を計画した。具体的には、炎症性サイトカイン刺激を加えたヒト骨細胞と無刺激ヒト骨細胞を用い、1RANKL、OPG、スクレロスチン産生能(RT-PCR法・ELISA法により評価)、2単球由来の破骨細胞前駆細胞との共培養実験における破骨細胞分化・成熟への作用と骨吸収能への影響(マーカー遺伝子発現、TRAP陽性細胞数・細胞核数・細胞融合、ピットフォーメーションアッセイにより評価)、3ヒト間葉系幹細胞との共培養実験における骨芽細胞分化への影響(マーカー遺伝子の発現、アリザリンレッドS染色・ALP染色により評価)を評価する。なお、本研究で用いる破骨細胞前駆細胞は、健常人末梢血より分離したCD14陽性細胞に3日間M-CSFを加え誘導したものを用いる。すでに本手法により誘導される細胞は、破骨細胞のマーカー遺伝子(NFATc1,カテプシンK)を発現していることをRT-PCR法で確認している。以上、本年度は、骨細胞に対する炎症性サイトカイン刺激の影響、炎症性サイトカイン刺激時のヒト骨細胞の骨代謝への影響を明らかにすることに主眼を置き研究を推進する。
教育機関の防災・理科教育の活性化と防災拠点化のための戦略と素材の構築

初等・中等・高等教育ならびに社会人教育について多数の実践を行い、その結果から新たな教材の開発、これまでの教材の改良と利用方法の工夫、さらに教育関係者との意見交換や、地域と一体となった教育方法の模索などを行った。特に理科・災害・環境教育に関する展開が得られている。具体的な成果を以下に示す。1.昨年度に引き続き、地震・耐震・防災等に関連する教育教材の開発・試作・改良を行った。「電動振動台」、「台車を利用した振動台」「建物振動模型」、「プレート衝突地震発生実験装置」など。これらを用い、視覚・体感効果も考慮した教育・啓発用教材セットとしてまとめた。2.愛知県教育委員会と連携して、小学校8校における親子参加型防災訓練の企画と実施を行った。開発した各種教材の活用法、小学生・教員・地域住民・専門家が一体となった総合教育の方法論と実践について新たな知見を蓄積した。来年度以降も引き続き40数校での実施が予定されており、更なる展開が見込まれる。このほかに、のべ100回を超える一般向け講演会や、建設等技術者向けのセミナーなどで教材を活用し、その教育・啓発効果を検討している。3.昨年までに開発した理科・環境・防災教材「現代版百葉箱」を発展させ、建物規模での揺れ、エネルギー消費、映像等をリアルタイムでモニタできるシステムを開発した。これは一般社会人向けの防災・環境教育に利用されると同時に、前年度に開発したネットワークを用いた地域防災拠点システムの一部としての機能を担う。4.開発した教材と組み合わせて使うための映像教材と簡単なテキストを作成した。これを用いることにより、最低限の予備知識で教材を活用することが期待できる。まず初等・中等・高等教育および社会人教育などにおける理科教育・災害教育の実践を通して現状を分析し、また企業・技術者教育への展開なども踏まえて、今後のあり方や必要な教材を探った。その上で、以下の教材の試作・試用・評価・改良を行っている。1.現代版百葉箱の試作と、これを用いた環境・災害モニタリングシステムの構築各種気象センサ(温湿度、雨量、風向風速、気圧など)、地震計、モニタカメラなどを備え、情報をネットワーク経由で参照できるリアルタイム環境・防災モニタリングシステムを試作した。本システムは各小学校に設置し、ネットワークを介した高密度環境モニタリング装置として理科教育に活用し、またウェブカメラ映像は防犯にも利用できるものである。2.双方向災害情報システムを用いた地域防災情報システムの展開すでに開発中の地域の災害関連情報を扱う地理情報システムを整備し、児童・生徒により地域の災害関連情報の収集・整理・蓄積が行えるようなインターフェイスの改良を行った。特に、従来は紙の地図上で行っていたDIG(Disaster Imagination Game)をウェブインターフェイスを通じて電子的に行えるシステムを提案している。総合学習において本システムを用いて防災教育を行うことにより地域の防災活動を活性化するなど、小学校における災害教育方法の提案にも踏み込んだ。3.体感を重視した教材の試作携帯型手回し振動台「ぶるる」、振動台を用いた学習用の建物振動模型、地盤振動模型などを製作し、建物のゆれや被害の発生を実感できる教材の検討を行った。さらに人が揺らす大型の振動装置と建物模型の試作も進めている。また平野規模での地下構造が一目でわかる立体模型も製作した。
アルツハイマー病におけるM16メタロプロテアーゼの役割

我々はこれまでに、in vitroでM16メタロプロテアーゼnardilysin(NRDc)がαセクレターゼ(ADAM9、ADAM10、TACE/ADAM17)を活性化し、アミロイドβペプチド(Aβ)の産生を抑制することを明らかにした。今回、脳でのNRDc発現量が約3倍に増加しているNRDcトランスジェニックマウス(NRDc-Tg)と約半分に減少しているNRDcヘテロ欠損マウス(NRDc+/-)の作製に成功し、アルツハイマー病(Alzheimer's disease ; AD)モデルマウス(APP-Tg)との交配により、in vivoでのNRDc発現量とAD病態との関連を検討した。APP/NRDc-TgはAPP-Tgと比べてアミロイドプラークの減少が認められたことから、NRDcがin vivoでもαセクレターゼ活性化因子として機能していることが明らかになった。APP/NRDc+/-に関しては現在解析中である。我々はこれまでに、in vitroでM16メタロプロテアーゼnardilysin (NRDc)がαセクレターゼを活性化し、アミロイドβペプチド(Aβ)の産生を抑制することを明らかにした。今回、脳でのNRDc発現量が約3倍に増加しているNRDcトランスジェニックマウス(NRDc-Tg)と約半分に減少しているNRDcヘテロ欠損マウス(NRDc+/-)の作製に成功し、アルツハイマー病(Alzheimer's disease ; AD)モデルマウス(APPとプレセリニンのダブルトランスジェニックマウス:APP/PS1-Tg、以下APP-Tgと省略)との交配により、in vivoでのNRDc発現量とAD病態との関連を明らかにすることを目的に研究を行っている。APP-TgとNRDc-Tgを交配した子供であるAPP-TgとNRDc-Tg/APP-Tg(1年齢)の脳をAβ抗体で免疫染色したところ、APP-Tgに比べてNRDc-Tg/APP-Tgでは、有意にアミロイドプラークの減少が見られた。また、ELISA法により、脳中のAβ量を測定したところ、免疫染色の結果と同様の傾向が見られた。まだ、数が少ないため、引き続き解析を行う予定である。一方、APP-TgとNRDc+/-を交配した子供であるAPP-TgとAPP-Tg/NRDc+/-も順調に生まれてきており、1年齢になった時点で解析を行う予定である。APP-TgとNRDc-Tgを交配したAPP-TgとNRDc-Tg/APP-Tg(1年齢)の脳をAβ抗体で免疫染色したところ、APP-Tgに比べてNRDc-Tg/APP-Tgでは、有意にアミロイドプラークの減少が見られた。以上の結果から、NRDcはin vivoでもαセクレターゼ活性化因子として機能し、Aβ産生抑制に働くことが強く示唆された。一方、APP-TgとNRDc+/-を交配したAPP-TgとAPP-Tg/NRDc+/-は解析に必要な数が揃わず、現在も継続中である。