hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
構造化手法を用いた自閉症児者の特別支援教育空間の改善に関する研究

構造化手法は物理的構造化、視覚的構造化、作業システム、スケージュールシステムで構成される支援システムである。本研究では構造化を導入した熊本県の療育施設で継続して療育を受けてきた自閉症児を対象として、対象者への環境支援の実態とその変化について検討をおこない、構造化された空間で教育を受けることが、自閉症児にどのような影響を与えるのかについての基礎的知見を得ることを目的とする。本研究は、個々の障害者の状況に即した個別的で可変的な環境調整の手法として「構造化」を位置づけ、「支援」と「環境」を結びつけて理解することによって、空間的な要素と支援環境の関わりを捉え、建築計画的な視点から構造化を導入した支援環境の空間的様相を明らかにし、自閉症者が理解可能で意味のある環境を構築する支援のあり方を模索することを目的とする。とりわけ将来の成人期を見据えた長期的視点の中で特別支援教育の個別教育プログラムの役割に着目したい。構造化を先駆的に導入している発達障害支援センターと協働して、早期療育施設と在宅、特別支援学校、福祉的就労施設や就労の場への継続的な教育環境づくりを行う特別支援学校に通所する自閉症児を研究対象として、空間的な要素と支援環境の関わりを建築計画的な視点から考察するものである。<研究実績の概要>(22年度23年3月31まで)22年度は、下記について構造化を先駆的に導入している熊本の発達障害支援センターの早期療育施設と在宅、学校が協働して個別教育プログラムを提供する特別支援学校2校、特別支援学級2校における自閉症児の教育環境と在宅環境との包括的な支援に焦点をあてて本調査を行った。また23年度に本調査を行なう熊本県荒尾市の特別支援学校中等部・高等部の予備調査を行った。【予備調査】(特別支援学校中等部・高等部、熊本県荒尾市)A:スタッフへのインタビュー調査.1.運営について(支援体制、業務内容、就労実習の工夫)2.構造化について(なぜそのような構造化を行う必要があるのか、具体的にどういう時にどのように用いているのか。本人の余暇はどのような理由でその内容になっているのか等)、B:プラン採取、家具の状況、C:構造化(物理的構造化・視覚的構造化・日課のスケジュール、作業システム)【本調査】(特別支援学校2校、特別支援学級2校、熊本県)スタッフの行動観察調査、利用者の行動観察調査:これらの行動観察調査おいては申請者による直接観察とともに、スタッフおよび利用者の行動をビデオカメラで記録して、調査後にパソコン上で編集して場面(シーン)ごとの支援のタイミングやコミュニケーションの様子をできる限り詳細に把握した。現在その調査結果を分析し論文にまとめる作業を行なっている。構造化を先駆的に導入している発達障害支援センターと協働して、早期療育施設と在宅、特別支援学校、福祉的就労施設や就労の場への継続的な教育環境づくりを行う特別支援学校に通所する自閉症児を研究対象として、空間的な要素と支援環境の関わりを建築計画的な視点から考察する。<研究実績の概要>23年度は、前年度に引き続いて、構造化を導入している熊本の発達障害支援センターの早期療育施設と在宅、学校が協働して個別教育プログラムを提供する特別支援学校2校、特別支援学級2校における自閉症児の教育環境と在宅環境との包括的な支援に焦点をあてて継続調査を行った。また熊本県荒尾市の特別支援学校中等部について、前年度の予備調査の結果に基づいて本調査を行った。【自閉症児の療育環境に関する本調査】(特別支援学校2校、特別支援学級2校、熊本県)スタッフの行動観察調査、利用者の行動観察調査これらの行動観察調査おいては申請者による直接観察とともに、スタッフの支援内容と利用者の行動をビデオカメラで記録する行動観察調査を行なった(2年目)。調査結果を分析し論文にまとめている。【自閉症者の特別支援学校中等部、熊本県荒尾市】基礎調査(A:スタッフへのインタビュー調査.B:プラン採取、家具の状況、C:構造化(物理的構造化・視覚的構造化・スケジュール、作業システム))の後、本調査としてスタッフと利用者の行動観察調査を終日行った。
発達支援に向けた新生児・霊長類の常時包括計測系開発と生物－環境相互の発達基盤解明

NICUにて胎児期に生まれ育つヒトの初期発達について理解するために、行動・生理学的パラメータと、新生児が曝される環境との関わりについて、これらを常時計測するためのシステムを開発し、発達齢依存的な関連を数理統計学的に明らかにすることを目指した。本研究は、発達初期に曝される様々な環境が子どもの発達にどのような影響を与えるのかを明らかにし、健やかな発達を支える環境整備についての手がかりを得る上で重要な研究である。以下、臨床研究と霊長類モデル研究による2軸のアプローチにより研究を進めた。【臨床研究】NICUに入院する早産児を対象とし、行動・体表温と児が曝される温度・湿度・照度・音圧などの環境パラメータの発達齢依存的な関係について明らかにすることを目的とした。児が過ごすクベース内の温湿度などの条件は厳密に管理されているが、光波長や音圧環境については、昼夜の照明状態、近接する医療機器のアラーム音など、状況に応じて複雑に変化しうることが分かった。こうした環境パラメータや、新生児の行動・体表温度を、可視・熱画像として長期記録するためのシステムを構築し、新生児がいないクベース内を長期・連続計測できるかどうか、予備作動試験を行い、2か月間滞りなく記録できることを確認した。【霊長類モデル研究】新生期から成年期に至るまでのコモン・マーモセットを対象とし、生体・環境パラメータ間の関連を神経学的基盤とともに明らかにすることを目的とした。熱画像計測システムの構築、および、同熱画像の背景差分法に基づく行動・体表温度の長期変動を分析する画像処理アルゴリズムの開発を行った。また、幼少期における社会環境が、成年期における気候変動に対する適応能に影響を及ぼしうることを示唆した。こうした発達の神経学的基盤を明らかにするために、動物行動学の研究が進んでいるレンヌ大学に3か月間渡航し、電気生理学的実験手法を習得した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
シグナル伝達機構による細胞増殖制御

細胞の増殖と癌化の機構には、細胞内シグナル伝達のネットワークを構成するリン酸化酵素・脱リン酸化酵素・膜リン脂質・アダプター蛋白質等の分子群が重要な役割を担っている。これら分子群の細胞増殖・癌化に果たす役割を解析し、以下の諸点を明らかにした。1.細胞質分裂期の中間径フィラメントの嬢細胞への分配にsmall GTP結合蛋白質Rhoの標的分子の1つであるRhoキナーゼが必須であることを証明した(稲垣)。2.上皮細胞の分化に特異的なCキナーゼη分子種のゲノムを解析し、この遺伝子がマウス染色体12番長腕に位置することを明らかにした。またキナーゼATP結合部位エクソンを消失したマウス胚性幹細胞を得た(千田)。3.MAPKホスファターゼ(MKP)のmRNAレベル肝/肝癌系で解析した。MKP-2mRNAは、正常肝・再生肝・初代肝細胞では検出されず、原発肝癌および腹水肝癌で検出され、プログレッションとともに増大することがわかった。(菊池)4.ホスホリパーゼD(PLD)の活性化を抑制すると増殖刺激によるc-fos、c-junの発現が抑制されること、またアポトーシスに伴いPLD1のmRNAが著しく減少することを明らかにした。(中島)。5.PP2CはJNKシステムには影響を与えないが、p38システムを抑制すること、および、その作用点がp38を活性化するキナーゼであるMKK3やMKK6か、それらより上流にあることが判明した(田村)。6.細胞内情報伝達に関する不飽和脂肪酸を有する天然型ならびに類縁イノシトールリン脂質類、PI(45)P2、PI(3,4)P2、PI(3,4,5)P3の化学合成に成功した(渡辺)。7.アダプター型癌遺伝子産物Crkの主たるエフェクター分子C3Gが、Crkの発現により細胞膜へ移行し、酵素活性が上昇することを見出した。(松田)。8.ヒト・ミオシンホスファターゼ調節サブユニット(MYPT)の新規アイソフォームのクローニング、組織発現および遺伝子座の解析を行った。本分子は従来のMYPTとは異なり、心筋、脳特異的に発現しており、その遺伝子座は家族性拡張型および肥大型心筋症の原因と考えられる遺伝子と同じ領域に位置することが明らかとなった(中野)。リン酸化細胞骨格蛋白質特異抗体群を作製し、応用することで細胞増殖に伴って活性化される新規キナーゼを同定した(稲垣)。Cキナーゼη分子種は表皮の分化に伴って出現する脂質、コレステロール硫酸によって特異的に活性化され、トランスグルタミナーゼを誘導して角化細胞の最終分化を引き起こす。またη分子種はマウス皮膚発癌のプロモーションに抑制的に働く可能性見出した(千田)。腹水肝癌細胞においてセリン/スレオニンホスファターゼではPP1αが転写・翻訳の両段階で亢進し、増量したPP1α蛋白は主に核に局在する。チロシンホスファターゼでは、膜型分子の遺伝子発現が激減していた(菊地)。v-ras導入NIH3T3(DT)細胞をブラジキニン刺激するとCa^<2+>オシレーションがみられるが、それはIP4(1,3,4,5)による細胞外からの流入であり、チロシンキナーゼがその調節に関与していた(中島)。PP2Cβの新アイソフォーム(PP2Cβ-3,-4および-5)は、マウス精巣の第一減数分裂のパキテン期の精母細胞において、特異的に高発現することが判明した。PP2Cβ遺伝子の持つ多重プロモーター/エクソン構造が、PP2Cβ発現の臓器特異性に関与することが示唆された(田村)。ミオイノシトールを原料として各種ホスファチジルイノシトールを合成している。長鎖飽和アシル基をもつPI(4),P,PI(3,4,5)P3の合成を行った。PI(3,4)P2を持つアフィニテイカラムを合成した(尾崎)。アダプター分子CRKに結合する主たる蛋白である180kDa蛋白の分子クローニングを行い、その全核酸配列の決定、抗体作製、機能解析を行った(松田)。ミオシンホスファターゼ(MBP)の130kD調節サブユニット(M130)のリン酸化によりホスファターゼ活性が阻害された。また、MBPがRhoAと結合しRhoキナーゼによりリン酸化されることやリン脂質と結合することも明らかにした(伊藤)。1.細胞分裂期に細胞骨格・中間径フィラメント機能を制御するキナーゼの1つにRhoキナーゼが関与する可能性を示した(稲垣)。2.CaMキナーゼIIは分化型の細胞で、Cキナーゼは分裂細胞で細胞骨格制御を行う可能性を示した(稲垣)。3.上皮の分化に特異的なCキナーゼηは他分子種と異なり活性化後の負制御、ダウンレギュレーションを受けないことを明らかにした(千田)。4.PPlα遺伝子の5′上流に、9個のSplサイトが存在し、腹水肝癌でのPPlαの転写亢進はこれを介することを示した(菊池)。

5.ホスホリパーゼD(PLD)遺伝子hPLDlにalternatesplicingを見いだし、また新規rPLD2をクローニングした(中島)。6.PP2Cβ遺伝子が多重プロモーター/エクソン構造をもつことが示唆された(田村)。7.PP2Cの6種類のアイソフォームがいずれも主に細胞核に局在すること、およびPP2Cαが細胞内でリン酸化されることが判明した(田村)。8.細胞内情報伝達に関するイノシトールリン脂質類(PIP3,PIM2)の化学合成に成功した(渡辺)。9.アダプター分子Crkの変異体が上皮細胞増殖因子容体に恒常的に結合し、癌化を阻害することを示した(松田)。10.ヒト・ミオシンホスファターゼのミオシン結合サブユニット(MBS)のアミノ酸一次構造を解析した(伊藤)11.Rhoキナーゼの細胞張力発生に対する効果を検討した(伊藤)。細胞の増殖と癌化の機構には、細胞内シグナル伝達のネットワークを構成するリン酸化酵素・脱リン酸化酵素・膜リン脂質・アダプター蛋白質等の分子群が重要な役割を担っている。これら分子群の細胞増殖・癌化に果たす役割を解析し、以下の諸点を明らかにした。1.細胞質分裂期の中間径フィラメントの嬢細胞への分配にsmall GTP結合蛋白質Rhoの標的分子の1つであるRhoキナーゼが必須であることを証明した(稲垣)。2.上皮細胞の分化に特異的なCキナーゼη分子種のゲノムを解析し、この遺伝子がマウス染色体12番長腕に位置することを明らかにした。またキナーゼATP結合部位エクソンを消失したマウス胚性幹細胞を得た(千田)。3.MAPKホスファターゼ(MKP)のmRNAレベル肝/肝癌系で解析した。MKP-2mRNAは、正常肝・再生肝・初代肝細胞では検出されず、原発肝癌および腹水肝癌で検出され、プログレッションとともに増大することがわかった。(菊池)4.ホスホリパーゼD(PLD)の活性化を抑制すると増殖刺激によるc-fos、c-junの発現が抑制されること、またアポトーシスに伴いPLD1のmRNAが著しく減少することを明らかにした。(中島)。5.PP2CはJNKシステムには影響を与えないが、p38システムを抑制すること、および、その作用点がp38を活性化するキナーゼであるMKK3やMKK6か、それらより上流にあることが判明した(田村)。6.細胞内情報伝達に関する不飽和脂肪酸を有する天然型ならびに類縁イノシトールリン脂質類、PI(45)P2、PI(3,4)P2、PI(3,4,5)P3の化学合成に成功した(渡辺)。7.アダプター型癌遺伝子産物Crkの主たるエフェクター分子C3Gが、Crkの発現により細胞膜へ移行し、酵素活性が上昇することを見出した。(松田)。8.ヒト・ミオシンホスファターゼ調節サブユニット(MYPT)の新規アイソフォームのクローニング、組織発現および遺伝子座の解析を行った。本分子は従来のMYPTとは異なり、心筋、脳特異的に発現しており、その遺伝子座は家族性拡張型および肥大型心筋症の原因と考えられる遺伝子と同じ領域に位置することが明らかとなった(中野)。
哺乳類細胞染色体のDNA複製機能領域の同定と構造解析

本研究では我々が最近開発したDNA複製の高精度同調培養法を用いて、ラット培養細胞のS期の最初に複製される複製単位群からそれらの複製開始部位を含むDNA領域を取り出し、クロ-ン化する。得られたクロ-ンとこの同調法を用いて染色体DNA上で実際に機能している複製開始部位を直接同定する事を目指している。ラット培養細胞(NRK)を、複製開始時に同調し、ブロモデオキシウリジンで複製開始部位を含む短い新生DNA鎖を密度標識した。通常のDNA精製法では複製中間体構造が壊れてしまった。そこで細胞を塩酸グアニジン・EDTA・ザルコシルで溶かし、プロテイナ-ゼK処理後、塩化セシウム平衡密度勾配遠心する方法を開発し、複製中間体の構造を保持したDNAを抽出精製した。BamH1またはHind IIIで切断後、5回の平衡密度勾配遠心法でHL鎖を分離精製した。この精製断片をシングルコピ-・ベクタ-(ミニFプラスミド・ベクタ-)とメチル化DNAも効率よくクロ-ニングできるホスト細胞(DH10B)を用いてクロ-ン化した。同調化した細胞のDNAを同様に密度標識し、HL鎖を分画し、これとクロ-ン化DNA上のユニ-クな断片をプロ-ブにしたサザン・ハイブリダイゼ-ションにより、S期の最初に複製している複製単位に由来していることを確認できたクロ-ンを2個得た。しかし、この方法ではもともと密度の高い(GC含量の高い)DNA断片の混入が多く目的のクロ-ンを得る確立が低かった。これを避けるために、複製した領域の両端にある複製フォ-クの単鎖DNA部分をマング・ビ-ン・ヌクレア-ゼで切断し、HL鎖を分離精製してから制限酵素で切断してクロ-ン化した。S期の最初に複製している複製単位に由来していることを確認できたクロ-ンを、現在までにさらに3個得ている。今後さらにクロ-ンの数を増やし、それらについてジェノミック・ウオ-キングによりその複製開始部位を細胞の同調化法と組み合わせる事によって直接同定する予定である。
現代都市における祭礼-情報化による都市の祭礼の変容を探る-

現代都市における祭礼の持続と変容に関して理論と実証の両面から研究を試みた。理論面では、文化的再生産論と都市社会学の下位文化理論の研究を深め、現代都市において祭礼を支える組織と技能が世代から世代へと受け継がれていく過程を再検討した。また実証面では、横浜の日技神社例大祭(お三の宮大祭)と神戸の生田神社例大祭(生田祭)に関して、組織と技能の文化的再生産(伝承)という視点から参与観察してデータを集めた。また、組織と技能の文化的再生産に焦点を当てて、文化的再生産が成功している都市の祭礼(名古屋地区の半田祭など)の資料も併せて収集してみた。これらの理論研究と実証的調査に基づいて、1997年に『横浜お三の宮大祭の社会学的研究-現代都市における祭礼-』(文部省科学研究費補助金による中間報告書)、「横浜お三の宮大祭の文化的再生産」(神戸女学院大学論集)を発表した。『横浜お三の宮大祭の社会学的研究』は、横浜の日技神社例大祭(お三の宮大祭)の調査結果をまとめたものである。祭礼の歴史と現在の祭礼の社会過程を論文の形でまとめると同時に、多種多様な祭礼の文書資料と写真を集めたもので適当に編集して、、祭礼のダイナミズムを直に感じ取れるように試みた。また、「横浜お三の宮大祭の文化的再生産」は、文化的再生産論の視点から横浜のこの大祭を再検討した理論的な研究成果である。祭礼は人々の組織形成能力と身体技能によって支えられ、実践される。そのような組織形成能力と身体技能は、主に地域社会と家庭における教育と訓練を通じて養成され、上の世代から下の世代へと受け継がれていく。それがまさしく文化的再生産と呼ばれる仕組みであり、論文では横浜お三の宮大祭における文化的再生産の仕組みを解明してみた。現代都市における祭礼の持続と変容に関して、理論と実証の両面から研究を試みた。まず理論の面では、ピエール・ブルデュー等の文化的再生産論と都市社会学の下位文化理論の研究を進め、現代都市という変動の激しい空間(場)における祭礼という下位文化の持続と変容の条件とメカニズムについて考察を加えてみた。そこから得られた理論的知見を踏まえて実証も試みた。以前から継続してきた横浜市の中心地にある日枝神社の例大祭典(通称はお三の宮大祭)の実施過程に関して、平成8年度の夏から秋まで現地での参与調査を続けた。例大祭の社会組織的基盤となる氏子域内の町内会の役員に対する聞き取りを行い、町内会の構造と機能を明らかにした。続いて例大祭りの時に、町内会を基軸とする祭礼委員会の活動と祭礼の実行の過程について参与観察を行った。それによって祭りの運営と経過のダイナミズムの輪郭がほぼ把握することができた。そして調査の成果と理論の結合を試みた。横浜という日本の代表的国際港湾都市の都心において神社の例大祭(お三の宮大祭)がなぜ持続しているのか、言い換えれば文化的再生産されているのか。その問題に関しては、氏子域内の町内会、氏子たちの商工業者としての実践感覚、職人的技能と技芸に答えを求めることができるように思われる。横浜にはジャズ、映画、演芸などの多様な下位文化か生成-再生産され、祭礼も一つのケースになる。昨年度に引き統き、現代都市における祭礼の持続と変容に関して理論と実証の両面から研究を試みた。

また実証面では、横浜の日枝神社例大祭(お三の宮大祭)と神戸の生田神社例大祭(生田祭)に関して、組織と技能の文化的再生産(伝承)という視点から参与観察してデータを集めた。今年度は特に組織と技能の文化的再生産(伝承)に焦点を当てて、文化的再生産(伝承)が成功している都市の祭礼(名古屋地区の半田祭など)の資料も併せて収集してみた。この他には、今年度は情報化と都市の集団の問題を取り上げ、関連資料を集めたり現地視察を試みた。横浜と神戸の情報化に加えて、現在建設中の関西学術研究都市と播磨科学公園都市の情報化の計画と現実を調べ、都市生活と祭礼に及ぼず影響を再考察した。今すぐに高度情報化により都市の生活様式と集団が大幅に変動することはあり得ないけれども、都市生活の基礎が高度情報化により少しずつ変化していることは間違いない。集団の形態については、伝統的町内会、祭礼組織、行政主導の組織だけでなく、NPOやNGOなどの新しい市民組織が福祉、教育、文化、国際関係などの生活の諸領城に広がりつつある。本研究の視点から見ると祭礼は文化と教育に関わるだけに、祭礼を支える組織も伝統的組織を受け継ぐだけの単純な文化的再生産ではなく、新しい市民組織的形態を取り入れた形式に変わっていくかもしれない。
応力下における分子集合体の振動分光学

上記の研究課題につき、今年度は以下のように研究を行なった。1.クライオスタット中に挿入し、試料に応力をかけるための治具の製作使用するクライオスタットを実際に購入し試料空間の大きさを調べたところ、当初考えたギアを用いる治具は、十分な応力を発生できない恐れがあることが分かったので、方針を変更し、高圧ガスを用いる治具を設計した。現在、部品を手配している。この関係で、計画した具体的な測定は来年度行なうことになった。2.フェノチアジンの精製および単結晶の作成予定通りに精製とブリッジマン法により単結晶の作成を行った。現在、昇華法により、さらに良い単結晶をつくることを試みている。これらの結晶は、上述の治具ができ次第、測定に供する予定である。3.応力下におけるLaNbO_4結晶のラマンスペクトルの時間変化の研究表記の結晶のラマンスペクトルを詳細に解析し、NbO_4^-イオンの回転的格子振動によるバンドのバンド幅が、分域界面の移動の後のある時点において、わずかな不連続変化を示すことを見いだした。これは、応力下で準安定な状態にあった結晶が、協力的に緩和をすると解釈できる。この結果について、後に示す論文を発表した。4.他の物質についての関連する研究ビフェニルとそのハロゲン置換体の結晶に圧力を掛けることにより、格子振動と分子内振動の混合状態を変化させることができることを見いだした。ビス-パラクロロフェニル-スルフォン結晶が、光学モードのソフト化を伴う相転移を140k近傍にもつことを見いだした。
生物画像の定量的解析のためのソフトウェアの開発

時空間分解能に優れた光学機器の一般化が進む昨今,時空間並びに複数チャネルを併せもつ多次元画像データを簡便かつ大量に得られるようになった.その一方で,これらを定量的に解析し,統計的な記述を行う際に著しい困難を伴うようになっている.特に,立体的に複雑な形態をとる組織の形態を精緻に計測するためには計算機による形状抽出による自動化が必須である.その一方,定量対象となる生物に特有の特徴は,その状態が非常に不安定であり,完全な自動化による特徴抽出は不可能である場合が多い.この種の生物学的な特徴を抽出するため,顕微観察画像において見出される自由曲線の構造を認識し,記述する系を作成,種々の観察対象について適用した.特に,細胞内アクチン繊維や微小管,更にはコラーゲンといった繊維状の構造物の抽出を試みている.これにより,アプリケーションの実用性についてさらなる向上を目指し調整を行った.また,この種の自動化アプリケーションにおいて避けられない問題である誤認識について,これを目視での作業によって除去を行う方法について検討を行った.3D空間における自由曲線を簡便に遂行するユーザーインターフェイスの構成は操作効率に直結するためその定義にあたっては慎重に行う必要がある.そのため,OpenGLをはじめとした3D空間を前提とした表示系について,その可用性ならびに実装実現性を検討した.表現する対象となる物体を描画する対象として,OpenGL派生のWebGLや,これをサポートするデスクトップアプリケーションの基盤であるnode.jsならびにElectron等について検証を行った結果,この種の高水準言語による実装によっても凡そ所定の目的を実現することが可能であるという結果が得られた.アプリケーションの実装を行うにあたり,特に計算負荷が高い部分についてその処理を外部に設置した大型並列計算機もしくはクラウド上の計算機に移譲する系の実装を行い,実用に供している.また,実装方法の検討を重ねた結果新たに高水準言語での実装方法についての実現可能性を見出した点からは,より広いプラットフォームでの実装の可用性を示唆する.さらに,これら処理系の精度を高めるべく教師あり機械学習による分類を行うための教師データの作成を行っている点から,本課題の進捗について概ね順調に推移しているものと考えられる.OpenGL等のハードウェアの直接支援を利用した画像表示系として改修し,時・空間画像の表示の高速化を図ることで,これまでに作成したアプリケーションの利便性の向上を図る.このアプリケーションについて,自動的に抽出した物体モデルの編集を行う機能の実装を開始する.具体的には,ユーザが画面上で任意に選択した立方体内部について固有のパラメータを設定し物体の再抽出等を行うフィルタ機能や,マウスなどを用いた線分の直接編集など,対話型のモデル修正系を盛り込む等の実装を行う.上記アプリケーションの実装により,個別の細胞並びに細胞内小器官など空間中の任意の構造をモデルの要素として簡単に選択可能とし,その形態的特徴や,輝度などについて定量的な解析を行う事が可能となるよう整備を行う.時空間分解能に優れた光学機器の一般化が進む昨今,時空間並びに複数チャネルを併せもつ多次元画像データを簡便かつ大量に得られるようになった.その一方で,これらを定量的に解析し,統計的な記述を行う際に著しい困難を伴うようになっている.特に,立体的に複雑な形態をとる組織の形態を精緻に計測するためには計算機による形状抽出による自動化が必須である.その一方,定量対象となる生物に特有の特徴は,その状態が非常に不安定であり,完全な自動化による特徴抽出は不可能である場合が多い.この種の生物学的な特徴を抽出するため,顕微観察画像において見出される自由曲線の構造を認識し,記述する系を作成,種々の観察対象について適用した.特に,細胞内アクチン繊維や微小管,更にはコラーゲンといった繊維状の構造物の抽出を試みている.これにより,アプリケーションの実用性についてさらなる向上を目指し調整を行った.また,この種の自動化アプリケーションにおいて避けられない問題である誤認識について,これを目視での作業によって除去を行う方法について検討を行った.3D空間における自由曲線を簡便に遂行するユーザーインターフェイスの構成は操作効率に直結するためその定義にあたっては慎重に行う必要がある.そのため,OpenGLをはじめとした3D空間を前提とした表示系について,その可用性ならびに実装実現性を検討した.表現する対象となる物体を描画する対象として,OpenGL派生のWebGLや,これをサポートするデスクトップアプリケーションの基盤であるnode.jsならびにElectron等について検証を行った結果,この種の高水準言語による実装によっても凡そ所定の目的を実現することが可能であるという結果が得られた.アプリケーションの実装を行うにあたり,特に計算負荷が高い部分についてその処理を外部に設置した大型並列計算機もしくはクラウド上の計算機に移譲する系の実装を行い,実用に供している.また,実装方法の検討を重ねた結果新たに高水準言語での実装方法についての実現可能性を見出した点からは,より広いプラットフォームでの実装の可用性を示唆する.さらに,これら処理系の精度を高めるべく教師あり機械学習による分類を行うための教師データの作成を行っている点から,本課題の進捗について概ね順調に推移しているものと考えられる.OpenGL等のハードウェアの直接支援を利用した画像表示系として改修し,時・空間画像の表示の高速化を図ることで,これまでに作成したアプリケーションの利便性の向上を図る.このアプリケーションについて,自動的に抽出した物体モデルの編集を行う機能の実装を開始する.

具体的には,ユーザが画面上で任意に選択した立方体内部について固有のパラメータを設定し物体の再抽出等を行うフィルタ機能や,マウスなどを用いた線分の直接編集など,対話型のモデル修正系を盛り込む等の実装を行う.上記アプリケーションの実装により,個別の細胞並びに細胞内小器官など空間中の任意の構造をモデルの要素として簡単に選択可能とし,その形態的特徴や,輝度などについて定量的な解析を行う事が可能となるよう整備を行う.導入を予定していた計算機について,当該年度において所望の仕様を満たすものではなかったため,次年度に持ち越すこととなった.
軟骨魚類サメの鱗の細胞系譜解析ー脊椎動物の骨格の起源の解明ー

本研究では、軟骨魚の鱗の骨形成細胞が由来する組織を細胞系譜解析によって明らかにするために、胚操作技術をトラザメに導入すること、また、メダカやゼブラフィッシュの鱗や鰭条が体節内のどの細胞を起源とするのかについて明らかにすることを目指した。その結果、30ゲージ注射針を用いていわゆる腹腔手術の要領でトラザメ胚の胚操作が可能であること、また、ゼブラフィッシュ体節細胞のうち脊索近くに位置する皮筋節細胞群の一部が移動して背側の間葉集団に分化し、これらの一部が鰭条の骨細胞を供給することが示唆された。本研究によって脊椎動物の骨格の進化について新たな知見が得られる道が開かれた。脊椎動物の骨は無顎類の化石種がまとっていた最古の骨格(甲冑)が歯様組織であったことなどから、神経堤によって発明されたと広く考えられてきた。本研究では、甲冑の組織構造の特徴をほぼそのまま保っている軟骨魚類のサメの鱗(皮歯;現存する最古の骨格)の由来する組織を明らかにすることによって骨格の起源を探る。申請者の仮説は、象牙質やエナメル質を持つ歯にそっくりなサメの鱗であっても、神経堤ではなく、体節に由来するというものである。平成25年度は、この仮説の妥当性を発生学的に検討した。体節は分節後、筋節(筋肉)と皮筋節(筋肉と真皮)と硬節(脊椎骨)の3種類の組織に分化することが知られている。もしサメの鱗の骨細胞が体節由来であるとすれば、真皮を作る皮筋節細胞から供給されるはずであるが、そもそも魚類の体節の分化過程は不明な点が多く皮筋節の存在が証明されたのもごく最近である(Hollway et al., 2007)。そこでまずメダカを用い、皮筋節マーカーであるPax3/7発現細胞の挙動を追った。Pax3/7発現細胞は体節分節後10体節前後で体節全体の水平回転運動によって体の表面に現れて体側に分布した。この細胞行動はゼブラフィッシュと同様であった。また、発生後期ではPax3/7の発現は低下するが、zic1は引き続き皮筋節で強く発現維持されることがわかり、キメラ解析によって、zic1発現細胞は一度背側端で増殖して間葉集団を作った後に鰭条の骨細胞に分化することが示された。これらから、メダカとゼブラフィッシュという系統的に離れた魚類でも体節の分化過程が極めて保存されていること、また、体節から由来する皮筋節細胞の少なくとも一部は鰭条の骨細胞の前駆細胞であることが示唆され、サメの鱗が体節由来であることを支持する結果を得た。脊椎動物の最大の特徴の一つは、カルシウムの貯蔵庫を兼ねたリン酸カルシウムからなる骨を持つことである。これまで骨の起源に関しては「無顎類の化石種がまとっていた最古の骨格(甲冑)が歯様組織であったことから、神経堤によってもたらされた」とする“神経堤説"が広く受け入れられてきた。しかし骨格の細胞系譜解析は羊膜類でしか行われておらず、この説を裏づける実験データは非常に乏しかった。申請者は最近、甲冑と同じ外骨格である鱗や鰭条が神経堤由来ではなく体節由来であることを見いだした(Shimada et al, Nature Communications, 2013)。しかし骨の起源を推定するためには、現存する最古の外骨格であり、甲冑の組織構造の特徴をほぼそのまま保っている軟骨魚類のサメの鱗(皮歯)の由来する組織を調べる必要がある。そこで、実験発生学技術がほとんど開発されていないサメにこの技術を導入し、サメの鱗の骨形成細胞がどの胚組織から由来するかを明らかにすることが本研究の目的である。平成24年度は、トラザメ胚の基本的な胚操作技術の開発を行うとともに、鱗の正常発生過程など細胞系譜解析に必要な基礎的な知見を得ることを目的に実験をおこなった。その結果、トラザメ胚は紙ヤスリで殻を薄くすることによって、中の胚が可視化できること、その薄い部分に30ゲージ針を使って微笑な穴を数カ所あければ、胚が浸っている卵液を一時的に抜くなど、腹腔手術の要領である程度の胚操作ができることがわかり、ニワトリ胚のエレクトロポレーションによる遺伝子導入技術をサメに応用できる可能性があることがわかった。脊椎動物の骨格は、甲冑魚などの初期の脊椎動物が歯の組織構造に似た外骨格に覆われていたことから、神経堤によって獲得されたとする説が長年信じられて来た。申請者は体節や神経堤の移植法を魚類(メダカ)で開発し、甲冑と同じ外骨格である鱗や鰭条が神経堤由来ではなく体節由来であることを見いだし(Shimada et al, Nature communications, 2013)、そもそも脊椎動物の間葉は、頭部では神経堤由来であるが、体幹部ではもっぱら体節由来であるという、新たな仮説を提唱した。これを検証するためには体節の発生に関する基礎的知見が必須なため、平成26年度はメダカの体節細胞の挙動をIR-LEGOによって詳細に調べた。〔方法〕熱ショックプロモーターの下流にCreをつなげたトランスジェニックメダカと、恒常的なactinプロモーターの下流にloxPおよびEGFPを導入したトランスジェニックメダカのF1胚の体節の様々な部位に、IR-LEGOシステムを用いて熱ショックを与え、少数の細胞のみ恒常的にGFPを発現させ、細胞の挙動を追った。

〔結果〕体節は分節後、筋節、真皮と筋肉を作る皮筋節、背骨を作る硬節に分かれるが、外骨格がどの部分から作られるかは未だ不明である。そこで各体節の腹側の脊索寄りに位置する硬節と外側前方に位置する皮筋節をそれぞれねらって熱ショックを与え、細胞を追跡したところ、硬節細胞はその後脊索を取り囲むようにして背側に移動し、脊索の液胞化が進むステージになると、一部の細胞はさらに脊索の背側に位置する神経管の周囲を背側に移動するが、鱗の骨細胞には分化しなかった。一方、皮筋節細胞の多くはいったん体節と体節の間に潜むが一部が体表に現れて鱗の骨細胞となった。この結果から、鱗を作る細胞系譜は背骨を作る細胞系譜とは全く独立であることが確認できた。平成27年度は、体節細胞由来の細胞が鱗や鰭条への分化する過程を解析するために、メダカを用いて体節細胞をラベルしてトレースする実験系を2種類作出した。一つ目はCreER-loxPシステムによる方法である。まず、bアクチンプローモーターの下流にCreERをつないだトランスジェニック(Tg)メダカを作出した。このTgとすでに確立されていたbアクチンプロモーター-loxP-mCherry-loxP-GFP TgのF1に対してTamoxifenを処理すれば、Creが核以降することによりloxPに組み替えが生じて時期特異的にGFPを発現させることが可能である。実際に幼魚に対して5uM Tamoxifenを処理したところ、鱗や鰭条に分化すると推定される体節の外側に位置する皮筋節細胞群(鱗や鰭条に分化すると推定される)がモザイク的にラベルされることがわかった。少数の皮筋節細胞群がラベルされた個体を選べば、細胞追跡が可能となる。2つ目の方法は、osterix-GFP :bアクチン-DsReddouble Tgの細胞を胞胚期で野生型に移植する方法で、移植した細胞はすべてDsRedでラベルし、そのうち骨に分化したことをGFPで証明できる実験系である。実際に予定中胚葉領域に100個程度の細胞を移植すれば高い確率で少数の体節細胞を追跡できることがわかった。bアクチンプロモーター-GFPが一生涯安定に発現し続けることは確認ずみであり、今後、ラベルされた細胞が鱗と鰭条の骨細胞に分化する過程を時系列的に追跡する予定である。特に羊膜類では筋肉と真皮に分化することが知られている皮筋節細胞が魚類ではこれらのlineageからいつどこで鱗と鰭条に分かれるのかに注目する。本研究では、軟骨魚の鱗の骨形成細胞が由来する組織を細胞系譜解析によって明らかにするために、胚操作技術をトラザメに導入すること、また、メダカやゼブラフィッシュの鱗や鰭条が体節内のどの細胞を起源とするのかについて明らかにすることを目指した。その結果、30ゲージ注射針を用いていわゆる腹腔手術の要領でトラザメ胚の胚操作が可能であること、また、ゼブラフィッシュ体節細胞のうち脊索近くに位置する皮筋節細胞群の一部が移動して背側の間葉集団に分化し、これらの一部が鰭条の骨細胞を供給することが示唆された。本研究によって脊椎動物の骨格の進化について新たな知見が得られる道が開かれた。申請者は体節や神経堤の移植法をメダカで開発し、メダカの鱗が体節由来であることを見いだし、その一般性を検証するためにサメの鱗の発生由来の解明を目指している。しかし体節細胞がどのように鱗の骨細胞に分化するのかは、全く知見がなく、サメの鱗の発由来を調べるために、まず魚類の体節の発生に関する基礎的知見を得る必要があったため。
魚類が示す筋肉の高い再生能力と成長能力を可能にする分子メカニズムを探る

ヒトの筋肉は加齢により減弱するが、魚類では、筋線維が生涯増え続ける。こうした魚の「終生成長」は、魚の成長と哺乳類の加齢性筋肉減弱を理解する上で重要だが、その機構は不明である。本研究では新生筋線維維で発現する遺伝子に着目し、その発現には、筋修復に関わるNFATが寄与することを示した。また、加齢に伴い、魚類筋肉でMSTN/GDF11およびTORシグナルが低下することを示した。逆にTORの活性化は筋肉における老化を促進した。こうした結果は、TORシグナルによる老化抑制とNFATおよびMSTN / GDF11シグナルによる筋幹細胞の維持が、魚類筋肉の終生成長の分子基盤であることを示している。本年度はトラフグで孵化後の新生筋線維に特異的に発現するミオシン重鎖遺伝子のプロモーターを利用してゼブラフィッシュで当該プロモーター下流で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統を確立することができた。当該系統は、ゼブラフィッシュの筋形成おいて新生筋線維の形成が活発な領域で特異的に蛍光タンパク質を発現することを、組織学的に確認した。また、その時期の違いから、大型魚(トラフグ)と小型魚(ゼブラフィッシュ)の成長度の違いが生まれている可能性を示した。また、哺乳類では出生後の筋線維数はほぼ一定であるが、損傷を受けると修復のため新しく筋線維が作られ、そこでは一過的に胚型/新生児型ミオシン重鎖が発現する。さらに、この胚型/新生児型の発現には転写因子NFATが関わることがマウスで報告されている。本研究で用いたトラフグプロモーター内にもNFAT結合部位が3ヵ所存在することが確認され、これらを欠損することでプロモーター活性が有意に低下することがゼブラフィッシュでのin vivoレポーターアッセイで示された。以上の結果は、NFATが魚類における孵化後の筋線維数の増大に寄与する可能性を示す。本成果をMechanisms of Development誌に投稿し、受理された。その他、本年度は筋衛星細胞の可視化を目的に、筋衛星細胞マーカーであるPax7の周辺領域をゼブラフィッシュゲノムDNAからPCRで増幅した。また、ゼブラフィッシュバイオリソースから、RW系統の若齢魚(1歳齢)と老齢魚(2歳6ヵ月齢)を入手し、次世代シーケンシング用のライブラリーを、筋肉、中枢神経、肝臓から構築した。また、トラフグ成魚骨格筋を用いて、メチローム解析を行い、筋形成におけるエピジェネティクス情報についての網羅的情報を取得した。昨年度までにトラフグの新生筋線維で特異的に発現する遺伝子MYHM2528-1のプロモーター制御下でGFPを発現するトランスジェニック系統をゼブラフィッシュで確立し、それを用いたレポーターアッセイから、3か所のNFAT結合部位が、プロモーター活性に寄与することを明らかにした。本年度は、NFAT結合部位に加え、2か所のmyoD結合部位についても、それらを欠損させたレポーターベクターを作成した。その結果、いずれについてもプロモーター活性の有意な低下を確認することができた。哺乳類では筋肉の損傷時に筋再生のために新生筋線維が作られ、そこで胚型/新生児型MYHが一過的に発現するが、その発現にはNFATおよびmyoDが寄与する。われわれの結果は、哺乳類の筋再生に関わる分子経路が、魚類の終生成長に関与する可能性を示す。また、哺乳類では加齢に伴って筋肉の再生能力は低下し、筋量が減少する。一方、魚では筋線維数が終生増加し、再生能力も高く維持される。そこで、ゼブラフィッシュ筋肉の加齢に伴う遺伝子の発現変化を網羅的に調べ、哺乳類との違いを検討することとし、昨年度から今年度にかけて、2ヵ月齢(幼魚区)、1年齢(若齢魚区)、および3年齢(老齢魚区)のゼブラフィッシュを用いて、骨格筋でRNAseqを行った。また、ラット骨格筋におけるRNAseqデータ(Yu et al., 2013)を用い、メタ解析を行った。遺伝子発現パターンの階層的クラスター解析の結果、幼魚区は他の二区と明らかに区別され、一つのクラスターを形成するが、若齢魚区と老齢魚区は同一のクラスター内で混在し区別されなかった。一方、マウス骨格筋においては、同様の解析で若齢個体と老齢個体の遺伝子発現パターンが明確に区別された。以上の結果は、哺乳類と異なり、魚類骨格筋においては、全体的な遺伝子発現パターンは加齢によってほとんど変化しないことを示す。Pax7を用いた筋衛星細胞の可視化にはまだ成功していないが、新生筋線維を可視化するトランスジェニック系統を用いて、筋衛星細胞が働く筋肉の再生経路の活性化が、魚類における終生成長の鍵であることを示す結果を得ることができた。また、予定通り、ゼブラフィッシュの加齢に伴う遺伝子発現変化の網羅的解析を行い、データを得た。この解析および哺乳類における既存のデータとのメタ解析から、哺乳類筋肉では加齢により遺伝子発現パターンが明確に変化するが、魚類筋肉では老齢魚と若齢魚の遺伝子発現パターンは区別できないことが示された。

こうした結果は、TORシグナルによる老化抑制とNFATおよびMSTN / GDF11シグナルによる筋幹細胞の維持が、魚類筋肉の終生成長の分子基盤であることを示している。ゼブラフィッシュにつき、幼魚から老齢魚までの各成長段階の骨格筋のRNAseqの結果、ゼブラフィッシュ骨格筋では成熟後の個体と老齢魚のトランスクリプトームが良く類似し、クラスター解析やPCAで区別されなかった。これは魚類筋肉が顕著な老化を示さないということとよく一致する。ラット骨格筋の加齢に伴う遺伝子発現変化との比較では、魚類特異な現象として、老齢魚におけるHSP遺伝子群の発現上昇とリボソーマルタンパク質群の発現低下が認められた。HSPの発現上昇が老化を抑制し寿命を延長することは哺乳類や線虫、ショウジョウバエで報告されている。また、リボソーマルタンパク質の発現抑制が寿命延長に効果があることが線虫や一部魚類で報告されている。HSPやリボソーマルタンパク質の発現はTORシグナルの支配を受け、成長と寿命のバランスを調整することが知られる。TORは酵母からヒトまで保存された寿命と成長のバランスを制御するシグナル経路の中核を成し、TORが抑制されるとHSPの発現が上昇、リボソーマルタンパク質の発現は抑制され、寿命が延長する。ほ乳類でTORの抑制により発現が上昇するATF3の発現が、老齢のゼブラフィッシュ骨格筋で発現が上昇していることも確認され、ゼブラフィッシュ骨格筋ではTORの抑制により老化抑制が起きていることが考えられた。そこで成長ホルモンを過剰発現するゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を作出し、人為的にTORを活性化したところ、老化の促進が認められた。別途、哺乳類における老化による筋委縮への関与が示唆されているGDF11につき、ゼブラフィッシュでは哺乳類とは逆の加齢に伴う発現変化を示すことが明らかになった。TORシグナル抑制による老化抑制とGDF11シグナル抑制による筋衛星細胞の活性維持が、魚類筋肉の高い再生能力と終生成長の分子的基盤となっている可能性が考えられた。本年度予定していた新生筋線維を可視化するトランスジェニック魚の確立を行うことができた。予想通り、当該トランスジェニック系統は新しく形成された筋線維で特異的に蛍光タンパク質を発現し、魚類筋肉の終生成長の良い解析系として使えるものと期待される。さらに、当該トランスジェニック系統を用いた解析から、魚類筋肉の終生成長に幾つかの特定の転写因子が寄与する可能性を示すことができ、これは予定以上の成果といえる。また、筋衛星細胞の可視化を目的として、ゼブラフィッシュから筋衛星細胞のマーカーであるPax7の周辺配列を抽出したが、これを用いたトランスジェニック魚については、現在構築の途上である。また、予定していたゼブラフィッシュの幼魚老成魚(2歳齢程度)の筋肉のRNAseqについて、RW系統の若齢魚と老齢魚から筋肉を含む幾つかの組織から全RNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築した。その他、予定にはなかったが、トラフグ骨格筋のメチローム解析を次世代シーケンサを用いて行った。エピジェネティックな制御は幹細胞制御において重要で、筋衛星細胞の増殖や分化にも関連する可能性がある。
走査型レーザー検眼鏡を用いた広角蛍光眼底造影装置の開発及び小児ぶどう膜炎への応用

1)走査型レーザー検眼鏡(SLO)に蛍光眼底面像処理用のパーソナルコンピュータを接続。2)パーソナルコンピュータの新規画像処理プログラムにより、画像のノイズ軽減に有用な加算平均化処理作業を簡易化および高速化した。なお、コンピュータの2000年問題によりプログラム設置に若干の時間を要した。3)近幾大学眼科に新たに受診した小児の間質性腎炎ぶどう膜炎症候群患者群に対し,インドシアニングリーン蛍光眼底造影検査を施行。SLOによる通常の造影法を利用した眼底観察に加え、広角螢光眼底用の眼底観察レンズを活用して本疾患の眼底広範囲にわたる検索を行った。4)得られたSLO画像を加算平均化処理したところ、眼底周辺部の病変がより明瞭に確認された。特に脈絡膜循環障害によると思われる脈絡膜大中血管の不明瞭化と、さらに複数の斑状低蛍光が描出された。5)広角蛍光眼底造影法は、眼底周辺部まで観察可能となりうるが得られる画像全体の通度が低下することが改めて確認され、今後改善すべき課題である。ただし現時点では造影装置(SLO)本体の光源に関する問題であるため解決には時間を要すると考えられる。
細胞傷害性タンパクperforinの流産誘発因子としての可能性

当初perforinの流産因子としての可能性について研究を行ってきたが、平成12年度の研究ではperforinと流産との関連性は低く感じられる成果を得た。むしろ、perforinを欠いた状態で体内IL-2濃度が上昇すると胎盤の形態異常が見られた。つまり、胎盤内perforinが正常な胎盤形成に関与することが示唆された。そこで平成13年度は形態形成中の胎盤組織に対するIL-2、perforinの作用について検討した。マウス胎盤内のIL-2receptor β-chainの発現は妊娠初期を除く広範囲の時期で発現していた。また、妊娠マウスにIL-2を投与すると、perforin, granzyme、B, Fas ligandなどのアポトーシス関連因子の発現量が増加した。IL-2投与後の胎盤組織では、迷路部における栄養膜細胞に扁平化を主とする退行変化が見られた。IL-2投与は通常の実験マウスでは繁殖能力には影響しなかったが、perforinを遺伝的に欠損するPKOマウスでは胎児数の著明な減少をもたらした。無処置のPKO胎盤では、基底脱落膜に線維化を伴った退行変化が見られた。また、PKOにIL-2を投与すると栄養膜グリコーゲン細胞層が著明に肥厚し、基底脱落膜まで侵入していた。栄養膜グリコーゲン細胞のアポトーシス変化は、無処置のPKOマウスでは通常マウスと差異は無かったが、IL-2を投与したPKOではその割合が有意に減少した。IL-2は栄養膜細胞に作用し、迷路部では退行変化、基底部の肥厚をもたらし、胎盤に形態異常を引き起こすことが考えられた。しかしながら、通常の胎盤ではperforinがIL-2の作用に拮抗し、栄養膜グリコーゲン細胞にアポトーシスを起こして正常な胎盤形成に関与することが示唆された。ヒトを含む多くの胎生哺乳類には、胎盤内にNK細胞(子宮NK細胞)が出現する。この細胞は細胞傷害能タンパクのpore forming protein(perforin)を含む一方、胎盤形成に有用なサイトカインを産生する。ヒトの習慣性流産は、子宮NK細胞の機能異常に由る可能性がある。有効なモデルマウスを用いて、perforinと流産の因果関係について実験を行った。RT-PCR法によりマウス胎盤内のperforinを調べると、妊娠913日に最も強い発現が見られた。この傾向は子宮NK細胞の出現動態と一致した。また、この時期にリコンビナントIL-2(rIL-2)を腹腔内投与すると、胎盤内perforinの発現量が増加することが分かった。妊娠913日の間、通常の実験用C57BL/6(B6)マウスにrIL-2を投与しても、コントロールに比べ顕著な妊娠率の低下は認められなかった。一方、遺伝的にperforinを欠損するperforin knockout(PKO)マウスに、妊娠913日でrIL-2を投与すると、妊娠率は50.1%に低下した。このPKOの胎盤では、基底脱落膜の顕著な肥厚と胎盤迷路部の変性が見られた。TUNEL法でアポトーシス細胞の組織学的検出を行うと、PKOの脱落膜細胞の陽性率はB6より有意に低かった。電顕観察では、B6の脱落膜細胞に典型的なアポトーシス像が見られたが、PKOでは遊走像などの活発な形態が観察された。妊娠中期でのrIL-2投与は、perforinの発現量を増加させたが、perforinは流産には関与しないと思われた。むしろ、perforinを欠いた状態で体内IL-2濃度が上昇すると,胎盤の形態異常を誘導することが考えられた。本実験の結果は、胎盤内perforinの胎盤形成に関する働きという可能性を新たに示した。

しかしながら、通常の胎盤ではperforinがIL-2の作用に拮抗し、栄養膜グリコーゲン細胞にアポトーシスを起こして正常な胎盤形成に関与することが示唆された。
サイクロフィリンを基盤とする心血管病の成因解明と新しい診断・予防・治療法の開発

心血管病発症における酸化ストレス分泌蛋白Cyclophilin A (CyPA)の基礎的・臨床的有用性については、研究目的をほぼ達成できた。遺伝子改変動物を用いた基礎研究を継続し、CyPAが動脈硬化・大動脈瘤・心不全・肺高血圧症にとって重要な促進蛋白であることを証明した。また、基礎研究の成果を昇華させるべく、心血管病患者由来の組織や血清を用いた血清学的診断法の開発を行った。特に、冠動脈疾患や肺高血圧症患者の重症度に応じて、血漿中CyPA濃度が高くなることや、CyPA高値群は長期生命予後が著しく悪いことを証明した。助成期間内に計42演題の国際学会発表および計36本の英文論文発表を行った。【背景】酸化ストレスは心血管疾患発症の強力な促進因子である。これまで、酸化ストレスによりサイクロフィリンA(CyPA)が血管平滑筋細胞より分泌され、酸化ストレス増幅の悪循環に寄与することを報告した。【目的】心血管病の発症・進行における酸化ストレス分泌蛋白CyPAの役割および臨床的有用性を検討する。CyPA遺伝子改変マウスおよびその受容体欠損マウスを用い、詳細な分子学的基盤解明を行う。さらに、心血管系疾患患者由来の組織や血清を用いた発症前診断法の開発を目指す。基礎研究および臨床研究の両面から、心血管病の新しい診断・予防・治療法の開発を目指す。【結果】CyPA遺伝子欠損マウスおよび血管平滑筋特異的過剰発現マウスを用い、大動脈瘤モデル、頚動脈内膜肥厚モデル、動脈硬化モデル、心肥大モデルでの検討を行った。いずれのモデルにおいてもCyPAは心血管疾患発症に重要であり、動脈硬化進行や大動脈瘤形成において必須蛋白であることが分かった。また、心筋梗塞患者の冠動脈硬化病変の免疫染色により、不安定プラークの病変部に強いCyPAの発現が確認された。さらに、冠動脈の狭窄病変を有する患者において、末梢血CyPA濃度が健常者に比して有意に上昇していることが確認された。この末梢血CyPA濃度は冠動脈病変の重症度に応じて有意に上昇することも確認された。【結論】CyPAは動脈硬化を促進する重要蛋白であると同時に、分泌蛋白としての特性から、新しい心血管疾患のバイオマーカーとして有用であることが示唆された。【学会・論文報告】以上の研究成果を、国内外の学会やシンポジウムで報告し(日本循環器学会総会シンポジウム、米国心臓病学会議、欧州心臓学会議)、論文発表を行った。さらに、新しい診断薬としての可能性につき特許申請を行った。「サイクロフィリンAによる心血管疾患の検査方法」(2012年10月30日)。これまで、酸化ストレスによりサイクロフィリンA (CyPA)が血管平滑筋細胞より分泌され、酸化ストレス増幅の悪循環に寄与することを報告した。

また、心筋梗塞患者の冠動脈硬化病変の免疫染色により、不安定プラークの病変部に強いCyPAの発現が確認された。さらに、冠動脈の狭窄病変を有する患者において、末梢血CyPA濃度が健常者に比して有意に上昇していることが確認された。この末梢血CyPA濃度は冠動脈病変の重症度に応じて有意に上昇することも確認された。【結論】CyPAは動脈硬化を促進する重要蛋白であると同時に、分泌蛋白としての特性から、新しい心血管疾患のバイオマーカーとして有用であることが示唆された。【学会・論文報告】以上の研究成果を、国内外の学会やシンポジウムで報告し(日本循環器学会総会シンポジウム、米国心臓病学会議、欧州心臓学会議)、平成26年度は計14本の英語原著論文発表を行った。さらに、新しい診断薬としての可能性につき特許申請を行い、国際段階で2015年2月に認められた。「サイクロフィリンAによる心血管疾患の検査方法」【背景】酸化ストレスは心血管疾患発症の強力な促進因子である。これまで、酸化ストレスによりサイクロフィリンA (CyPA)が血管平滑筋細胞より分泌され、酸化ストレス増幅の悪循環に寄与することを報告した。【目的】心血管病の発症・進行における酸化ストレス分泌蛋白CyPAの役割および臨床的有用性を検討する。CyPA遺伝子改変マウスおよびその受容体欠損マウスを用い、詳細な分子学的基盤解明を行う。さらに、心血管系疾患患者由来の組織や血清を用いた発症前診断法の開発を目指す。基礎研究および臨床研究の両面から、心血管病の新しい診断・予防・治療法の開発を目指す。【結果】CyPA遺伝子欠損マウスおよび血管平滑筋特異的過剰発現マウスを用い、大動脈瘤モデル、頚動脈内膜肥厚モデル、動脈硬化モデル、心肥大モデルでの検討を行った。いずれのモデルにおいてもCyPAは心血管疾患発症に重要であり、動脈硬化進行や大動脈瘤形成において必須蛋白であることが分かった。【学会・論文報告】以上の研究成果を、国内外の学会やシンポジウムで報告し(日本循環器学会総会シンポジウム、米国心臓病学会議、欧州心臓学会議)、論文発表を行った。さらに、新しい診断薬としての可能性につき特許申請を行った。「サイクロフィリンAによる心血管疾患の検査方法」(2012年10月30日)。心血管病発症における酸化ストレス分泌蛋白Cyclophilin A (CyPA)の基礎的・臨床的有用性については、研究目的をほぼ達成できた。