hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
iPS細胞を用いたヒト特有の神経回路形成に関する研究

ヒトiPS細胞から神経細胞を作製し、ヒト由来の神経細胞の分化特性を明らかにすることを目指している。本研究では、その端緒として、神経細胞分化におけるDNA修復酵素の役割に着目し、polβ欠損のヒトiPS細胞株を樹立することによって、polβ遺伝子の果たす役割を解析する系を構築した。Polβ欠損ヒトiPS細胞株の樹立のためには、ジーンターゲティング法CRISPR/Cas9システムを導入し、ホモ変異体を得た。得られたクローンは、DNA塩基損傷による細胞死に対して感受性が野生型と比較して有意に高くなっていた。さらに、Polβ欠損ヒトiPS細胞を神経幹細胞、神経細胞へと分化誘導にも成功した。本研究の目的は、ヒトiPS細胞から大脳皮質ニューロンとその神経ネットワークを作製することによって、ヒトの神経回路特有の様相を明らかにすることであり、本年度はヒトiPS細胞から大脳皮質ニューロンを作製し、その軸索伸長と分岐形成をin vitroで構築することを目指した。最初にiPS細胞をNoggin存在下で神経幹細胞に分化させ、その後細胞塊を作製することによってニューロンへの分化を促進させる方法を用いた。神経幹細胞やニューロンへの分化過程は、各ステージに発現する分子発現を指標とし、様々な抗体を用いた免疫組織化学的な手法やRT-PCR法により調べた。この培養法で、神経幹細胞の段階ではNestin陽性の細胞が約8割を占め、次のニューロンへの分化段階ではそのマーカーであるTuJ1陽性の細胞が約2割観察された。このようにニューロンに分化した細胞では、分化誘導から数週間後には、Ctip2陽性細胞が出現したことから、大脳皮質深層の細胞に分化していることが示唆された。さらに、神経幹細胞時にenhanced yellow fluorescent protein (EYFP)の遺伝子を導入することにより、少なくとも一部の細胞は錐体型とそれに特徴的な樹状突起形成が見出された。数ミリに及ぶ軸索成長も観察され、その末端では広範囲の枝分かれが形成されることも見出された。以上より、ヒトiPS細胞からニューロンへの分化誘導が生じ、軸索成長、軸索分岐が観察できる実験系が構築された。大脳皮質ニューロンの同定にはまだ十分でない点があるが、1ヶ月以上の期間培養し、錐体細胞の形状やその樹状突起形成も見出された。さらに、目的とする軸索成長、引き続く軸索分岐の過程も観察された。ヒトiPS細胞から神経細胞へ分化させる手法を用いて、発生期の細胞分化、脳発達における遺伝子発現調節の機構を明らかにすることを目指している。その端緒として、Polβ欠損ヒトiPS細胞株を樹立し、これを培養系で神経細胞へと分化誘導を行って神経発生過程を再現し、ゲノム不安定性の解析を行うことにした。Polβ欠損ヒトiPS細胞株の樹立に際しては、従来の方法よりも高効率に遺伝子改変細胞が得られることを期待して、ジーンターゲティング法にCRISPR/Cas9システムを組み合わせた。gRNAのターゲット部位はPolβの遺伝子座のエキソン4付近に設計し、それぞれヒトiPS細胞に遺伝子導入し、薬剤選択の後にホモ変異体を得ることができた。得られたクローンでPolβの機能が失われていることを確かめるために、塩基損傷を引き起こすmethyl methane sulfonate (MMS)を培地に加えて培養を行い、細胞死に対する感受性を調べたところ、野生型と比較して感受性が有意に高くなっていた。以上より、Polβ欠損ヒトiPS細胞株を樹立できたと考えられる。次に、Polβ欠損ヒトiPS細胞を神経幹細胞へと分化誘導した。誘導培地による培養を始めてから8日目の細胞に対して免疫染色を行った結果、神経幹細胞のマーカーであるNestin陽性細胞が存在し、分化誘導が成功していることを確認した。このNestin陽性細胞に対して上述のMMSによるアッセイを行うと、Polβ欠損細胞では細胞死に対する感受性が有意に高かった。この結果から、ヒトの神経幹細胞においても、塩基除去修復を通してPolβがゲノムの安定性に貢献していることが示唆される。さらに、このPolβ欠損神経幹細胞から神経細胞誘導培地を用いて神経細胞への分化にも成功した。大脳皮質ニューロンである同定基準を明確にし、皮質ニューロンから発する軸索の枝分かれ、プレシナプス形成の過程を調べる。また神経活動依存的な軸索分岐の様相を明らかにする。神経科学当初の申請額より大幅にカットされたため、今年度は神経幹細胞やニューロンへ分化させる規模を小さくすることにより試薬代を抑え、遺伝子導入のための精製プラスミドや抗体は既に調整していたものを用いた。大脳皮質ニューロンへの分化誘導に必要な試薬、免疫組織化学に用いる各種抗体、定量PCR法に用いる試薬、遺伝子導入用のプラスミド精製試薬の購入にあてる。
計算物理学-物性研究における新展開-A02相関の強い量子系

本年度は最終年度であるので、今迄に導入したワークステーションとスーパーコンピューターを活用し、これ迄の研究のまとめと新しい展開を行った。磁場中の量子細線の電子状態の研究が安藤と吉岡によって行われ、特に吉岡は「非朝永-Luttinger液体状態」が出現しうることを示した。数値繰り込み群の方法は本重点領域によって大きい進展があった。内部構造が重要な希土類の近藤効果(酒井)、超伝導体中の近藤効果(斯波、酒井)に続き、本年は無限大次元ハバード・モデルへの応用が始まった。(酒井、倉本)量子モンテ・カルロ法については、二次元の強相関系の研究(今田)や無限大次元ハバード・モデルの磁化過程への応用(佐宗)がなされた。変分モンテ・カルロ法の発展としては、近藤格子への応用がなされた。(岡部)第1年度から続いている本グループの大きい課題としてはHaldaneギャップ問題への厳密対角化法による研究がある。動的相関関数の詳細な研究(高橋)、隠れたストリング・オーダーの研究(坂井、高橋)、ESRの理論的研究(坂井、斯波)などがなされた。その他、コンピューターを利用した「一次元超対称t-Jモデル」の研究(倉本、横山)、アブリコソフ構造の数値シミュレーション(永長)なども当グループの成果である。これらの研究は平成5年度内に開かれた、谷口シンポジウムなどの国際会議のほか、平成6年度に開かれる「磁気国際会議」、「日独セミナー」、「サンタ・バーバラ・ワークショップ」において招待講演として発表されることになっている。本研究班は、解析的方法のみでは解決因難な「量子効果の顕著な相関の強い系」をスーパーコンピューターやワークステーションを活用して数値的方法により解決すること、その為の新しい方法やアルゴリズムの開発を目的としている。本年度の成果としては以下のものがある。磁場中の二次元電子の示す量子ホール効果についてedge stateの重要性が示され(安藤)、二次元と一次元の中間的系の分数量子ホール効果の興味ある性質が明らかにされた。(吉岡)数値繰り込み群の方法の発展に関しては、(1)超伝導体中の近藤効果についての詳細な研究(斯波、酒井)(2)半導体中の磁性不純物(酒井)(3)内部構造が重要な希土類の近蒔効果(酒井)、などが研究された。量子モンテカルロ法の発展としては、二次元ハバード模型と一次元系の比較により、両者の類似点、相違点が明らかにされ(今田)、また、半導体中の磁性不純物について量子モンテカルロ法と数値繰り込み群の結果がよく一致することが示された。(佐素)高温超伝導に関係した成果としては、二次元Abrikosor格子の融解のモンテカルロシミュレーション(永長)が新しい成果である。新しい厳密解をもつモデルの発見とそれをコンピュターを用いて「証明」という、コンピューターの新しい利用法により一次元のt-Jモデルを一般化したモデルの存在が報告され、注目をあびた。(倉本)昨年度からの継続として、Haldaneギャップ問題について異方性などを取り入れて「相図」を作成する仕事がなされた。(坂井、高橋)以上簡単に述べた研究は昨年開かれたいくつかの国際会議で報告され国際的評価をえている本年度は最終年度であるので、今迄に導入したワークステーションとスーパーコンピューターを活用し、これ迄の研究のまとめと新しい展開を行った。
気孔の数を調節するシグナルが細胞の外から内へ伝達される仕組み

気孔密度を調節するペプチドホルモンと受容体タンパク質の相互作用を原子分解能で解明することが本課題の目的である。本課題ではまず大腸菌と植物培養細胞を利用して受容体タンパク質の各種ドメイン、フラグメントを調製する系を確立した。その後、これらを構造解析や相互作用実験に使用するため試料条件を探索した。各種デタージェントの効果を検討した結果、有るフラグメントについては有望な条件を見いだすことができ、非標識体試料の2次元NMRスペクトルを測定することに成功した。本課題期間中には本格的な構造解析・機能解析に至らなかったが、今後の展開を大いに加速させる基礎的な成果が得られた。平成25年度は、発現系の確立と精製方法の確立を目指した。発現系には一般的な大腸菌の系のほか独自技術である植物培養細胞の系の両方を用いた。アミノ酸配列から予測されたTMMのドメイン構造をもとにして、N末端ドメイン、LRR(ロイシン・リッチ・リピート)ドメイン、膜貫通ドメインの3種類について両方の系で発現系を構築した。精製を簡単にするためにHis x 6タグとGSTタグを利用した。それぞれの発現系について最適な培養条件、誘導をかけるタイミング、誘導後の培養時間などを最適化した。この結果、いくつかの系においては非常に高い効率での試料発現が可能であることがSDS-PAGEによって確認できた。この系においては、発現した試料タンパク質が可溶性分画と沈殿分画にほぼ同程度存在していた。次に、この発現系で生産した融合タンパク質を精製する方法の確立を試みた。始めに可溶性分画からの精製を試みた。NiアフィニティーカラムもしくはGSTレジンで粗精製した試料を質量分析したところ、試料の分子量が不均一であることが確認された。このことは、発現された試料タンパク質が分解している可能性を示唆しており、均一な試料が必要なNMRやX線結晶構造解析などの分析には不向きな試料であると考えられた。現在は、沈殿分画にある融合タンパク質を変性剤で可溶化することで回収し、ここからの精製を試みている。昨年度にほぼ確立した試料調製方法に従い、大腸菌と植物培養細胞系の双方で発現したTMMのNドメインを調製した。発現した試料は、可溶分画と沈殿分画にほぼ同じ程度の量が存在している。このうちの沈殿分画から試料を調製した。発現量や精製後の試料の量は、構造解析に利用するには十分な程度であった。大腸菌の場合、培地1Lに換算して数ミリグラム、植物培養細胞系の場合は、その10倍程度であった。しかしながら、精製最後の透析を行う段階で、試料の多くが沈殿として析出してしまった。ここの収率を高めるべく、pHや塩濃度の最適化、添加剤などの効果の検討を行ったが、大きな改善が見られなかった。結局、培養の量を増やすことで最終的な試料量を確保した。SDS電気泳動と質量分析によって、精製後試料の純度の確認を行った。まず、CD(円二色性スペクトル)を測定し、試料の2次構造に関する情報を得た。その結果、試料は安定な2次構造を形成している領域が少ないことが示唆された。温度変化も試みたが、同様の結果だった。次に、さらに詳しい構造情報を得るべくNMR測定を行った。幾つかの異なる温度で1Hの1次元NMRスペクトルを測定したが、データに大きな変化は見られなかった。どのスペクトルにも、低磁場シフトしたαプロトンや高磁場シフトしたメチル基由来のシグナルが観測できず、また、アミドプロトンもランダム構造を示す領域に集中して観測された。以上の結果から、TMMのNドメインには予測したような安定な高次構造が無い可能性が高い。その後、尿素などを利用して、一旦、試料を変性状態にして、そこから立体構造の折れたたみを助けるアルギニン等の共存下で透析し、リフォールドさせる実験も行った。この試料についてもCDとNMRで構造情報を得る実験を行ったが、先の試料と同様の結果だった。初年度(平成25年度)には、大腸菌と植物培養細胞BY-2を利用した膜タンパク質TMMとERECTAの研究用試料を発現するシステムを確立した。それぞれ、幾つかの異なる領域を発現する系を構築した。また、これらを精製する方法も確立することができた。しかしながら、構造解析のために精製した試料の濃度を上げていくことが困難を極めた。試料が比較的低濃度の段階から、そのNMRスペクトルは分子がアグリゲーションを起こしていることを示していた。このため、円二色性スペクトルも含めて構造情報を取得するための分析を行うことができなかった。2年目(平成26年度)にはこの状況を打開すべく、塩の種類と濃度、pH、温度など各種の条件を検討したが良好なコンディションを見いだすことが出来なかった。本課題期間中には本格的な構造解析・機能解析に至らなかったが、今後の研究の進展を大いに加速させる基礎的な成果が得られた。

本課題期間中には本格的な構造解析・機能解析に至らなかったが、今後の展開を大いに加速させる基礎的な成果が得られた。試料は調製できるようになったものの、構造解析に適した試料が調製できていない。そのため、NMR実験などの物理化学的な実験が進展していない。また、他の領域をドメイン化したものも、発現系を植物培養細胞で構築しているが、精製方法の確立ができていないため、構造を調べるための物理化学的な実験を開始するにいたっていない。構造生物化学幾つかの異なる領域を発現する系を用いて、試料の調製を試みる。具体的には、LRR(ロイシンリッチリピート)領域、その前後のunstructuredと予測されるリンカーまで含んだフラグメント、Nドメインにリンカーをつないだ領域、NドメインとLRRを含む細胞外ドメイン全長などである。これらについて、調製方法を確立し、安定な高次構造を形成しているかどうかを物理化学的な実験で調べる。初年度に各種のドメインを含むフラグメント化した試料の発現を試した。この結果、良好な試料発現の系を構築することができた。また、それについて、現在、調製の方法を確立中であり、試料を調製する見通しがつきつつある段階である。このまま研究が遂行すれば、2年目に純度の高い試料を調製することができると予想される。その試料を用いてCDやNMRなどの物理化学的分析手法で、構造と物性に関しての各種データを計測できる可能性が高まった。従って、これまでの研究はおおむね順調に進展していると判断できる。3月に発注した試薬が年度末までに納品されなかったため試料調製方法を確立する。また、ドメインをタンデムに連結した比較的分子量の大きい試料や両端にunstructuredと予測される領域を付加したドメインについても2種類の試料調製系で発現を試みたい。精製した試料を用いてCDやNMRの実験を行い、立体構造情報を得る。また、タンパク質の一部もしくは全体を安定同位体標識した試料を調製し、解析可能なNMRデータを得る。発現させた試料のタグ部分を切断除去する実験に使うため予定通り上記の試薬を購入する
神経芽腫の発がんにおけるMYCNアンチセンス遺伝子(NCYM)の機能解析

がん遺伝子MYCNは神経芽腫で高頻度に遺伝子増幅し、神経芽腫の悪性化を促進する。MYCNのアンチセンス遺伝子であるNCYMはMYCNとともに遺伝子増幅し、過剰発現することが示されていたが、その生理的機能は明らかではなかった。本研究において、NCYM遺伝子がタンパク質をコードすることを見いだし、このNCYMタンパク質がMYCNを安定化することで、神経芽腫細胞の生存に寄与することを明らかにした。がん遺伝子MYCNは神経芽腫で高頻度に遺伝子増幅し、悪性化に中心的な役割を果たすことが明らかになっている。1990年、MYCN遺伝子領域のアンチセンスDNA鎖からmRNAが転写されることが示され、このアンチセンス転写産物はNCYMと命名された。NCYMはMYCNとともに神経芽腫予後不良群において増幅し、過剰発現することが示されていたが、その生理的機能は明らかではなかった。神経芽腫106検体におけるNCYM mRNA発現量をリアルタイムPCR法により定量したところ、NCYM mRNA発現量はMYCN mRNA発現量と有意に相関し、予後不良群において高発現した。内在性NCYMタンパク質を同定するため、抗体を作製し、神経芽腫細胞株における発現量をウエスタンブロッティング法により検討したところ、核内タンパク質として検出され、NCYMタンパク質はMYCNの増幅した細胞において高発現した。また、クロマチン免疫沈降法による解析の結果、NCYMタンパク質がMYCNのプロモーター領域に結合し、ヒストンのアセチル化を昂進することで、MYCNの転写活性化に寄与することを見出した。ヒト神経芽腫細胞CHP134にレチノイン酸を処理すると細胞死が誘導されるが、このときMYCNおよびNCYM発現量は低下した。さらに、CHP134細胞におけるNCYMノックダウンによりMYCNの発現低下およびアポトーシスが誘導された。以上の結果から、NCYMは転写因子としてMYCNを誘導することで、神経芽腫の悪性化に寄与する可能性が示唆された。がん遺伝子MYCNは神経芽腫において高頻度に遺伝子増幅し、神経芽腫の発生および悪性化を制御する。実際、ヒトMYCNを交感神経系において強制発現させたマウス(以下、MYCN tgマウス)は神経芽腫を自然発生するなど神経芽腫の発生に中心的役割を担うことが示されている。本研究において我々はNCYMが核内タンパク質をコードし、MYCNタンパク質の安定化に寄与することを明らかにした。MYCNタンパク質の安定性はGSK3βによるリン酸化とそれに続くユビキチンプロテアソーム系による分解によって制御されるが、我々の研究によりNCYMタンパク質が直接的にMYCNタンパク質及びGSK3βに結合し、GSK3βによるMYCNタンパク質のリン酸化を阻害することを明らかにした。さらに、交感神経系において特異的にNCYMを強制発現するマウス(NCYM tgマウス)を作成し、MYCN tgマウスと交配させ、NCYM/MYCN tgマウスを作出した。このマウスはMYCNtgマウスに比べ遠隔転移の頻度が上昇し、生体内においてNCYMは神経芽腫の悪性化に寄与することが示された。
経年劣化と消費電力を改善する高性能・高信頼アーキテクチャ

一般的な高信頼化設計手法では、極めて稀な動作ケースに対応するため過剰に高信頼化が行われている。本研究では、これらの点に着目し、電力効率と信頼性を両立するプロセッサアーキテクチャを提案し、このようなアーキテクチャに関して詳細に検討を進め、定量的評価を行う。特に、(1)時間冗長化と空間冗長化を融合するアーキテクチャの提案と評価;(2)3重化を用いないシームレスな不安定モジュール検出機構の提案と評価;(3)回路ユニットの経年劣化低減のためのコア内細粒度動的電源電圧制御機構の提案と評価;に取り込んだ。この研究の結果について、論文誌論文7件、国際会議論文(査読有)9件を発表した。本研究は、電力性能比向上と、高信頼化に基づく製品寿命延長を両立できるプロセッサ構成方式の確立を目的としている。高信頼化の一般的手法である多重化は消費電力の観点から無駄が多いため、電力効率と信頼性は一般にトレードオフの関係にある。平成24年度には、平成23年度の多重化プロセッサ構造に基づき、【1】3重化を用いずに不安定モジュールを検出できる自己チューニング機構回路の開発、【2】部分的冗長化により信頼性を向上する手法、【3】ユニットの経年劣化低減のためコア内細粒度動的電源電圧制御の研究を行った。特に、実用化に向けた技術移転を探索するため、多くの実装・実測を行った。H24年度には、H23年度にASIC化を完了した2重化DARAプロセッサを用いて、α線を照射する実験を行い、回路稼働電圧などの影響からエラー注入頻度との関係を定量的に測定し、H25年度の信頼性と消費電力と最大限バランスする機構設計の根拠を得られた。また、実験結果による、アーキテクチャの冗長化方法は回路レベルの強靭化方法により、信頼度コスト比が向上できることが分かった。査読付き国際学会発表1件(学会発表1に該当)を行い、論文誌論文が1件(論文誌論文3)掲載された。ASIC化したアクセラレータ(LAPP、論文誌論文1)に基づき、明示的な冗長化高信頼プロセッサEReLAを設計し、ASIC化した。プログラマブルな冗長化を行い、正常動作できることが分かった。EReLAに関する口頭発表を2件(学会発表37)、国際会議を1件(学会発表2)報告した。EReLAにおける高信頼写像手法に関する論文誌論文が1件(論文誌論文4)採択し、掲載された。回路ユニットの経年劣化低減のためのコア内細粒度動的電源電圧制御機構に関する論文が1件(論文誌論文2)掲載され、またはコア内平均温度を低減するため設計を行い、H25年度の前半にASIC化予定である。本研究は、ソフトウェア・ハードウェア両面からのアプローチで電力効率と信頼性を最適化することを目的としている。平成25年度には、【1】部分的冗長化により信頼性を向上する、【2】ユニットの経年劣化低減のためコア内細粒度動的電源電圧制御、【3】非同期2重化方式の研究を行い、多くの実装・実測を行った。H23年度にASIC化した2重化チップDARAは、多重化実行の際に回路で発生する熱の蓄積に伴って温度上昇が起き、それによるNBTI劣化現象によりプロセッサの一部または全体の寿命が減少する問題に着目したものである。3つの同一パイプライン・モジュールを搭載してそのうち2つだけ動作させ、なおかつ一定期間ごとにその組み合わせを変更することで各パイプラインが長時間連続動作することを回避し温度上昇が低減できる。この動作モードをblurDMRと呼称し、実チップでα線照射下の環境でも正常に動作できることを実証した。またこの実チップを用いてプログラム特性を解析した結果に基づき、永久エラーの耐性と電力性能の最適化手法をさらに追加で提案し論文誌論文1で掲載された。さらに、非同期比較回路による低電圧で稼働できる多重化プロセッサ方式を提案し、信頼性を維持しつつ、12%の電力効率の向上が可能なことがわかった(学会発表8,10)。H24年度にASIC化した明示的な冗長化を特長とする高信頼プロセッサEReLA(学会発表7件)では、電力特性の解析結果をベースとして近年応用が大きく期待される近似計算と呼ばれる分野のプログラムとの相性を探索し、6%の追加消費電力で2桁程度のエラー耐性が上がることを測定した(学会発表の5、論文誌論文2)。またα線照射による高いエラー注入率の環境下において、14%の追加消費電力で、チップ全体のMTTF(平均エラー発生時間)が2.3秒から33秒へ向上することを確認した(学会発表11)。

これらの点に着目し、平成23年度に、(1)3重化を用いない不安定モジュール検出できる自己チューニング機構の提案と評価;(2)時間冗長化と空間冗長化を融合するアーキテクチャの提案と評価の2つを計画した。H23年度に2重化によるエラー検出・自動訂正機能付きDARAプロセッサを7月にテープアウトし、11月にASIC化を完了した。α線を照射する実験により、高率のエラー注入を行い、信頼性を測定したところ、正常動作できることが分かった。結果に関する口頭発表(学会発表4に該当)を行った。本研究領域で著名な国際会議に1件採択され、7月中に発表を行う予定。また、ASIC化したアクセラレータ(LAPP)に基づき、明示的な冗長化高信頼プロセッサEReLAを提案した。LAPPのASIC化に関する口頭発表を2件(学会発表5、6)、EReLAに関する口頭発表を2件(学会発表9、10)報告した。H23年度実施計画の(1)に関する故障個所特定のために、一時的に全ての演算結果を比較する機構を考案し、モデル構築を行った。口頭発表(学会発表3,7に該当)を行った。また、原著論文を5末に投稿予定である。実施計画(2)に関する1.5wayDARA構成方式のモデル構築を行った。結果を査読付き国際会議に発表(学会発表1)した。H24年度の実施計画、(3)回路ユニットの経年劣化低減のためのコア内細粒度動的電源電圧制御機構の提案と評価のアイデアを発展させ、設計を行った。口頭発表と査読付き国際学会発表(学会発表2、8)を行った。また、口頭発表1件を予定している。H24年度は、当初予定したシミュレータによるアーキテクチャの手法を評価する計画に加え、ASIC化による実チップの動作を基に実用性を検証し、アイデアの実用化に強く貢献した。特に、H23年度に試作した2重化に基づくエラー検出およびと回復制御モジュール(DARA構造)を用い、α線照射による、0.4ビット反転/秒の高率なエラー注入率でも正常動作できるアーキテクチャ設計を実証した。また、このASICのFFチェインを用い、回路稼働電圧、環境温度、回路のエラー耐性との関係を定量的に測定した。優位性比較では、アーキテクチャレベルで冗長化を行うDARAが、回路レベルの強靭化手法に基づく設計よりも、信頼度面積比が60%向上することを達成し、面積オーバーヘッドの目安を示すことができた。その結果は、コストを最適化できる高信頼プロセッサの実用化の理論的な根拠になり、IEEEレーディエーション分野で、常にトップランクされている論文誌Transactions on Nuclear Science(Impact Factor: 1.5)に採択し、掲載された(論文誌論文3に該当)。また、一時エラー・永久エラーの両方に対応できる冗長度を明示的な機械語命令で指定できるアーキテクチャ(EReLA)を設計し、ASIC化を完了し、回路に組み込んだ疑似エラー生成機構のエラー注入による、正常動作を検証した。EReLAはアレイ型アクセラレータのスペア・ユニットを効率的に利用する高信頼写像手法を行うため、13%の全体消費電力(動的な静的な電力両方)増加のみで、ソフトエラーを完全にカバーできることを実証した。
X線分光法による鉱物固溶体の局所構造と結晶化学

造岩鉱物、硫化鉱物、各種の金属酸化物は広く固溶体を形成し、固溶体の物性や原子的尺度のミクロ構造は、鉱物の熱・圧力履歴を反映し、固溶体の結晶化学や熱・圧力履歴の解明に重要な手懸りを与える。本研究はX線吸収端近傍の微細構造(エクサフス)の解析から、固溶している各種元素の局所構造を明らかにし、その知見に基づいて固溶体の結晶化学を明らかにすることを目的として行われた。主な成果は次のとおりである。(1)マグネシウム、鉄系のかんらん石の鉄吸収端のエクサフス解析を行い、種々の鉄固溶量の固溶体の局所構造を明らかにした。その結果、鉄の局所構造は、固溶量にほとんど依存しない。マグネシウム、鉄系のかんらん石は全領域で固溶体を形成するが、構成する元素の局所構造が、それぞれの端成分組成の局所構造とほぼ同構造をとることは、これまでの回折法では得られなかった成果である。(2)硫化鉱物キュ-バ鉱の高温形と低温形、オウドウ鉱の鉄、銅の吸収端スペクトルの解析を行い、高温形の鉄、銅の無秩序配列状態の結晶構造においても、それぞれの元素の局所構造は、秩序配列状態の結晶構造のものと等しいことを明らかにした。この結果は、秩序一無秩序転移の機構を説明するのに有力な知見である。(3)酸素のイオン導電体である三二酸化ビスマスと希土類金属(ガドリニウム)酸化物との固溶体のビスマスおよびガドリニウムの局所構造の変化と固溶量との関係を明らかにした。その結果、ホタル石型固溶体のガドリニウム組成の増加による安定性とイオン伝導率の低下はガドリニウム配位多面体のクラスタ形成により説明できる。以上の結果、固溶体には(1)のように組成によらず、構成元素の局所構造が変化しないもの、(3)のように組成により局所構造が変化するものがあり、固溶体の組成範囲、安定性、物性と局所構造は密接な関係があることが明らかになった。造岩鉱物や硫化鉱物は広く固溶体を形成し,固溶体の物性や原子的スケールのミクロ構造は,鉱物の熱・圧力履歴を反映し,固溶体の結晶化学や熱・圧力履歴の解明に重要な手懸りを与える.本研究は, X線分光法による解析を駆使し,上記固溶体の結晶化学を,固溶している各種元素の周囲の局所構造の詳細から明らかにする.(1)X線吸収端近傍のスペクトルにみられる微細構造(EXAFS法)の測定実験法,特に高温での測定用として,試料をチッ化ボロンあるいはアルミナ粉末と混合し,ペレット状に成形して測定する方法を開発し成果を収めた.高温で還元され易い試料では,アルミナ粉末と混合すると特に有効である.また高温測定用の炉を試作した.(2)EXAFS解析法は,大型計算機およびマイクロコンピューターでもデータ処理が行えるよう整備した. (3)三二酸化ビスマスと三価の希土類金属(ガドリニウム)酸化物との固溶体のビスマスおよびガドリニウムの局所構造の変化と固溶量との関係を明らかにした.その結果,ホタル石型固溶体の熱履歴の違いによる安定性は,局所構造の違いにより説明できる.設備備品のプリセッションおよびワイセンべルグカメラは,試料の同定に使用した.(4)マグネシウム,鉄系にかんらん石の鉄吸収端スペクトルの再測定を行った.種々の鉄固溶量の固溶示

局所構造の解析から,鉄の局所構造は,固溶量にほとんど依存しないことを明らかにした.(5)硫化鉱物キューバ鉱の高温形および低温形,オウドウ鉱の鉄,銅の吸収端スペクトルの解析を行い,高温形の鉄,銅の無秩序配列状態の結晶構造においても,それぞれの局所構造は,秩序配列状態の結晶構造と等しいことを明からにした.本研究はX線吸収端の微細構造(エクサフス)の解析から、鉱物の局所構造を明らかにし、その知見に基づいて鉱物固溶体の結晶化学を明らかにすることを目的としている。本年度は、エクサフス測定装置を購入し、この装置および高エネルギー物理学研防射光施設の装置の双方を用い実験を行った。(1)研究代表者の移動に伴い研究分担者を一部変更した。解析は大阪大学のプログラムを使用し引続き行うと共に、購入備品により標凖試料として銅箔、マンガン箔、セレン金属を測定した。(2)徳島県眉山地方の三波川変成帯産紅レン石および無色ランセン石のマンガン、鉄のK吸収端の測定を行った。参照試料としてマンガンK吸収端は、バラ輝石、鉄K吸収端はカンラン石、赤鉄鉱、磁鉄鉱について測定した。紅レン石、無色ランセン石の両吸収端は共に2価の吸収端よりそれぞれ共に高エネルギー側にシフトし、3価金属状態であることが確かめられた。(3)軽元素シリコンK吸収端のエクサフスをシリカの種種の多形について行う予定で、まず、高圧形スティショバイトについて防射光施設の蛍光エクサフス測定装置について行った。エクサフスの微細構造の特徴から、Siー0のみならず第2隣接のSiーSiについての知見も得られることが予想される。(4)種々の希土類元素を固溶させた安定化ジルコニアのエクサフス解析から、ホタル石型構造中の希土類元素は8配位、ジルコニウム元素は6配位をとることを明らかにした。これらの配位は、パイロクロア型構造に見られるものとほぼ同じである。本研究はX線吸収端の微細構造(エクサフス)の解析から、鉱物および無機化合物の局所構造を明らかにし、その知見に基づいて固溶体の結晶化学を明らかにすることを目的としている。本年度は最終年度に当るので、これまでの実験、解析を引継き行うと共に、総括を行った。実験は、主にエクサフス測定装置および高エネルギ-物理学研放射光実験施設の装置の双方を用いて行い、解析は、大阪大学蛋白質工学研で行った。本年度は特に、希土類元素ガドリニウムを固溶させた酸化ビスマスの、組成の違いによる局所構造の解析を行った。この固溶体は酸素のイオン導電体である。酸素欠損のホタル石型構造で、酸素空孔の量は固溶体で常に一定であるが、イオン伝導率は、ガドリニウムの固溶量の増加と共に減少する。純粋な三二酸化ビスマスのホタル石型構造は高温でのみ安定であるが、固溶体では、室温でもガドリニウムの固溶量の増加と共に安定化する。エクサフスの解析の結果、ガドリニウムの周囲の酸素の配位多面体は、まぼ立方体であり、一方、ビスマスの配位は六配位から固溶量の増加と共に減少し、ひずんだ酸素の配位多面体となる。組成によるビスマス、ガドリニウムの周囲の酸素の配位多面体の変化は、吸収端のごく近傍のスペクトルの変化によっても確かめられた。固溶量の増加と共に、ガドリニウム配位多面体がクラスタを形成し、構造を安定化するが、逆に、酸素空孔を介在とした酸素イオンの拡散を阻害し、イオン伝導率は低下することを明らかにした。以上の成果は、固体イオニクス国際会議で発表し、印刷中である。
海底堆積物コアのBa安定同位体比で古海洋環境変動をトレースできるか？

バリウムには質量数の異なる7つの安定同位体が存在する。海底堆積物に含まれるバリウムには、堆積した場所や時代により、この同位体の存在割合(同位体比)がわずかに変化することが明らかにされつつある。本研究では、このわずかな変化が古海洋の環境変遷を地球規模で反映しているのかを、南大西洋やインド洋の海底堆積物コア試料を対象にしたバリウム安定同位体の高精度高密度分析により、明らかにすることを目的とする。
生物機能を持ったモデリング要素「モデロン」による自律分散システムの構成

本研究では、生物を自律分散システムの手本と考え、従来から研究を行ってきた生物機能を持つモデリング要素「モデロン」をサブシステムとして利用することにより、自律分散システムを構成する。自律分散システムは、中央統括部を持たないシステムであるから、その構成要素であるモデロンには、まず、自発性が備わっていなければならない。そのために、モデロンはワ-キングスペ-ス(WS)と呼ばれる環境を持ち、そのWSに現れるデ-タ、情報、メッセ-ジなどを自分で監視し、その内容に応じて自発的に処理を進める。次に、自律分散システムがある目的を達成するためには、各モデロンが単に自発的に処理を進めるだけでなく、他のモデロンと協調的に働かなくてはならない。そのための一つの方法として、要求駆動の方式を取り入れた。すなわち、モデロンはWSにある要求を発見すると、その要求に答えられるかどうかを判断し、もし答えられるならば処理を開始する。そのときに、自分ではわからないことがあれば、それを新たな要求としてWSに置き、その答を待つことにより他との協調を図る。このようなモデロンを利用した一つの例として、自律分散的な生産システムを構成することを考えた。すなわち、工場の3つの構成要素(作業機械、搬送システム、倉庫)をモデロンとして定義し、それら全てが自律的に移動可能であるとすることにより、多品種少量生産に対応できるフレキシブル生産システムを提案した。また、より高度な自律分散システムを構成するためには、その構成要素(モデロン)に要求される性質として、上記の自発性、協調性の他に、置かれた環境(他のモデロンやWSの状態)に順応して自己を改新していく機能、すなわち、進化機能が重要となると考えられる。本年度はその基礎研究を行ったが、さらに検討が必要である。
反芻家畜の代謝性疾患を予見するためのバイオマーカー探索

近年のウシ生産においては効率やコストの観点から穀物飼料を多給する傾向にあり、これに伴い第一胃(ルーメン)内発酵異常に端を発する代謝性疾患(生産病)が問題となっている。本申請課題ではルーメン発酵の主体である細菌群のうち、生産病と連動して増減する細菌をバイオマーカーとして活用することの可能性を検討することを目的とした。前年度(平成29年度)までに、ウシの口腔内反芻残渣(ルーメン内容物の吐き戻し)を用いることでルーメン細菌叢の解析が可能であることを確認した。最終年度は確立した解析手法を応用し、黒毛和種肥育牛のルーメン菌叢解析を実施した。同一牛群(48頭)について、濃厚飼料の給与量が増加する14ヶ月齢から18ヶ月齢にかけて反芻残渣を採取した。いずれの月齢においても、過去の研究で特定した重要ルーメン細菌5菌群が総細菌の1035%の割合で検出された。重要5菌群の分布量は月齢の進行に伴い変化し、14ヶ月齢に比べて18ヶ月齢ではButyrivibrioグループ、Ruminococcaceae C1グループなどが減少した。一方、重要5菌群の分布量には大きな個体差が認められたことから、各菌群の分布割合に基づいて菌叢タイプを類型化したところ、15ヶ月齢ではPrevotella属優勢型(P型)、Ruminococcaceae C1グループ優勢型(C型)およびそれらの中間型(M型)の3タイプに分かれた。18ヶ月齢では、C型とM型が減少した一方、Butyrivibrio優勢型(B型)型が出現し、ルーメン菌叢はP型とB型に大別された。P型で多く見られたPrevotella属細菌はプロピオン酸産生に関与し、B型で多く見られたButyrivibrioグループは酪酸を産生する。この結果より、本研究の菌叢タイピング手法を用いることで、黒毛和種肥育牛のルーメン発酵の予測・把握につながるものと考えられる。平成29年度はウシ口腔内の反芻残渣(ルーメン内容物の吐き戻し)を用いてルーメン細菌群の構成を正確に把握するための手法確立を目指した。ルーメンカニューレを装着したウシから口腔残渣とルーメン内容物を同時間帯に採取し、両者の細菌群構成を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法およびreal-time PCR法により解析した。また、口腔内反芻残渣の採材の方法(用いる道具、採取時間)についても検討した。口腔内の反芻残渣とカニューレから採取したルーメン内容物おいて、両者の細菌叢の類似度は高く、主要細菌群の分布量に有意な違いは認められなかった。採材方法についても、反芻が活発に起こる給餌後3から5時間において、安定的に口腔内の反芻残渣が採取できることを確認し、複数の作業者が行った場合でも同様の採材が可能であることを確認した。さらに、採材は1頭あたり5分以内で終えられることから、迅速かつ低侵襲性の採材が可能であることも確認できた。サンプルの保存性についても検討を行い、既報に基づいて調製した核酸分解抑制バッファーにおいて、少なくとも室温で1週間の保存が可能であった。以上より、ルーメン細菌叢解析に口腔内の反芻残渣が利用できることを確認した。採材法の検討に想定よりも時間を要した。これについてすでに問題は解消しており、今後の採材はスムーズに行える状況にあるため、平成30年度には遅れを取り戻せるものと考えている。

18ヶ月齢では、C型とM型が減少した一方、Butyrivibrio優勢型(B型)型が出現し、ルーメン菌叢はP型とB型に大別された。P型で多く見られたPrevotella属細菌はプロピオン酸産生に関与し、B型で多く見られたButyrivibrioグループは酪酸を産生する。この結果より、本研究の菌叢タイピング手法を用いることで、黒毛和種肥育牛のルーメン発酵の予測・把握につながるものと考えられる。確立した手法については、妥当性の検証を行った上で論文化を目指す。同時に、当初の予定どおり生産病の発症リスクが高い肥育牛や周産期の乳牛から継時的に口腔内反芻残渣を採材し、随時分析を進めていく。対象個体において採食量の低下、体重増加の停滞、エネルギーバランスの悪化、もしくは繁殖障害といった生産病の兆候が認められた場合には、発症よりも前に遡って口腔内反芻残渣の菌叢(ルーメン細菌叢)を解析し、生産病発症牛にのみ認められる細菌の増減について検討する。一方、採材は実験環境ではなく、実際の生産動物として飼養している個体より行うため、生産病を発症しないことも大いに考えられる。しかし、採材対象とする肥育期や周産期には給与飼料の構成が大きく変化することから、ルーメン細菌叢の変動は必ず起こる。したがって、採材期間中に増減する細菌を特定すれば、生産病との関連が疑われる候補細菌群として今後の研究に繋げられると考えている。さらに、肥育期または周産期のルーメン細菌叢の変動を多個体について継時的に実施した研究例は極めて少なく、この期間中のルーメン細菌叢変動に関して価値のある基礎的知見が得られるものと期待している。
識別モデルと平均場モデルの融合による機械学習と画像認識への応用

機械学習には,データの確率分布による生成モデルとそれを考慮しない識別モデルがある。本研究では,この二つのモデルを組み合わせることにより,識別性能を上げる事を目的とし二つの主な成果を得た。一つは,識別ランダムフィールドと呼ばれ,生成モデルに識別機能を直接設けたモデルである。ビデオ画像識別に応用した。もう一つは,生成モデルにカーネルを導入したカーネルランダムフィールドであり,画像分類に応用した。条件付き確立場は,識別モデルとランダムフィールドの融合された典型的形である。一方識別モデルの学習では,二次最適化法を用いたサポートベクトルマシンが成功している。本研究では,条件付き確立場において二次最適化法をサポートベクトルマシンと同様の形で適用し,画像処理のような複雑な分布の学習に対応できる学習機械を目指して研究を行った。従来このような考え方での研究もあるが,対象として用いているのは,表現能力の小さいグラフィカルモデルであり,一般的なモデルに関する学習は未解決である。この状況を受けて,本研究では一般的モデルの学習法を理論とアルゴリズムの両面で確立した。解決すべき点は,条件付き確立場の計算がNP困難であるため近似モデルの作成が必要である。ナーブな平均場近似では,高次相関をモデル化できず近似精度は良くない。そこで,二次平均場近似を提案し理論を構築した。さらに,平均場近似モデルで効率的な学習を行うためには,平均場を表すカーネルの一次結合の平均が,カーネルの中の変数の平均場で置き換えられなくてはならない。これは一般的カーネルでは不可能であり,この性質を持つカーネルは自明な線形カーネルのみである。そこで,本研究では一般的カーネルと同じ性能を持ち計算効率も良い対称式カーネルを考案した。このカーネルは,通常の多項式カーネルよりもサホートベクトルマシンで比較すると識別性能が上がることを確認した。また計算量は通常の多項式カーネルとオーダ的には同じであるが,次数が増えると計算量は応用状かなり増えることも問題点として分かった。この欠点も改善しながら,応用を行って行くのが今後の課題である。条件付き確率場は,識別モデルとランダムフィールドの融合されたものである。識別モデルの学習において,二次最適化法を用いたサポートベクトルマシンに対応する学習法である。本年度は,前年度において確立したカーネル条件付き確立場の性能を評価し,また画像処理への応用を考えることを目指して研究を行った。識別モデルとして最も代表的なサポートベクトルマシンは,その識別能力が高く広く用いられている。そこで,顔検出問題に対し,サポートベクトルマシンとカーネル条件付き確率場を同一条件で適用し,両者の性能を評価することにより,カーネル条件付き確率場の識別器としての性能がサポートベクトルマシンよりもかなり性能が向上することを確認した。これに基づき,アスベスト検出への応用を行い,実用的な検出率が得られることを示した。またKTHデータベースによるビデオ画像の識別問題を条件付き確率場により行った。この問題では世界トップクラスの識別率を出ししかも,処理時間は短く実時間応用が可能な手法を提案できた。条件付き確率場の応用を広げるため,タンパク質二次構造予測問題についても検討し,まずはサポートベクトルマシンにより,一定の性能が得られることを示した。この問題には本手法が適用でき,その成果が期待できるのであるが今年度はこの成果に基づいて予備実験の準備を行った。医用画像への応用と合わせて次年度にこれらの応用を検討する。識別モデルと平均場生成モデルの融合手法を使って以下のテーマについて研究を行った。第一は,対称多項式カーネルを自製し,マルコフランダムフィールドのエネルギー関数として定式化することで,大きな記憶容最をもつ生成モデルを構築し,画像のカテゴリ識別に応用した。画像のカテゴリ識別に対し,このモデルを応用し,SVMや階層型ディリクレモデルと比べて,3-5%識別性能が上がることを確認した。第二はビデオ画像認識に対し,特徴を疎なオプティカルフローをベースにした渋滞の方法に対し,ノイズに弱い欠点を補うため,それを補完するST-PETCH特徴量を併用することで認識精度を上げた。選択された時点の特徴に対し,識別器としてSVMを用いて高速な処理を実現した。第三に,インターネット上の情報分類の手法として,大量の画像をカテゴリに分類する手法についての研究を行った。一般に画像データクラスはラベルと入力空間の直積空間である高次元空間の部分多様体上に分布している.ラベルデータと大量の非ラベルデータから画像分類する場合,この多様体が十分ななめらかさを持つ条件で半教師付き学習を行うことができる.本論文では,クラスタリングを用いて,多様体上の複数の代表点近傍でのサブセットグラフラプラシアンを構成し,なめらかさの指標として用いることで高速で精度のよい半教師あり学習によるカテゴリ分類を行った.従来法では,全データでグラフラプラシアンを構成したため計算量が膨大になった.提案手法では高速かつ高精度な分類手法を与えることが示された.第四に,画像中の自動車の一を推定する手法について,生成モデルと識別モデルの融合による方法であるレリバンスベクトルマシンを適用し,従来法より高い精度を得ることに成功した。
化学物質リスク評価のための3次元多媒体動態モデルの構築と適用

リスク評価のためのモデル開発として,暴露解析モデルの開発を行った.暴露解析モデルは,3次元多媒体モデルとして構築することと,ケーススタディへの適用である.このため,H17年度前半においては,産総研で構築したAIST-SHANEL(産総研水系暴露解析モデル)、AIST-ADMER(産総研大気系暴露解析モデル)の使用を通じて,モデルのコンセプトの理解,入出力構造の理解ツールとしての使い方を習得した.2年間の特別研究員の期間で3編の原著論文を作成した.さらに,物質を換え,適用対象地域をかえて,アンチモンの環境動態に関する知見の収集と整理,諸外国でなされたアンチモンのリスク評価事例の取り纏めをおこない,暴露解析を実施するに際して必要な要素の抽出を行った.この準備の下で,先に取り上げた本モデルの適用性の検討を行った.難燃助剤として使われ,一部の河川水濃度が懸念されている,アンチモンをとりあげた.国内の事業所から公共用水域へ排出されている河川を取り上げて,暴露解析を行った.地球化学的なメカニズムを取り入れ,自然水中の共存有機物濃度,溶存酸素濃度をとりいれたモデルを構築した.希釈と沈殿の確率的変動特性を明らかにするモンテカルロ解析を実施した.この成果を論文としてまとめ,投稿した.なお,本人は,これまでの専門を伸ばすとともに,リスク評価分野の基礎的な学習を積み,本研究センターの基本ミッションである,分野横断横糸研究を着実に進めることができた.本研究では、リスク評価のためのモデル開発と事例研究の2つを実施する。リスク評価のためのモデル開発として,暴露解析モデルの開発を行った.暴露解析モデルは,3次元多媒体モデルとして構築することと,ケーススタディへの適用である.このため,H17年度前半においては,産総研で構築したAIST-SHANEL(産総研水系暴露解析モデル)、AIST-ADMER(産総研大気系暴露解析モデル)の使用を通じて,モデルのコンセプトの理解,入出力構造の理解,ツールとしての使い方を習得した.さらに,物質を換え,適用対象地域をかえて,本モデルの適用性の検討を行った.難燃助剤として使われ,一部の河川水濃度が懸念されている,アンチモンをとりあげた.国内の事業所から公共用水域へ排出されている河川を取り上げて,暴露解析を行った.地球化学的なメカニズムを取り入れ,自然水中の共存有機物濃度,溶存酸素濃度をとりいれたモデルを構築した.希釈と沈殿の確率的変動特性を明らかにするモンテカルロ解析を実施した.なお,リスク評価分野の基礎的な学習およびスキルの獲得のため,アンチモンの環境動態に関する知見の収集と整理,諸外国でなされたアンチモンのリスク評価事例の取り纏めをおこない,暴露解析を実施するに際して必要な要素の抽出を行った.本研究センターの姿勢である,分野横断横糸研究を着実に進めることができた.リスク評価のためのモデル開発として,暴露解析モデルの開発を行った.暴露解析モデルは,3次元多媒体モデルとして構築することと,ケーススタディへの適用である.このため,H17年度前半においては,産総研で構築したAIST-SHANEL(産総研水系暴露解析モデル)、AIST-ADMER(産総研大気系暴露解析モデル)の使用を通じて,モデルのコンセプトの理解,入出力構造の理解ツールとしての使い方を習得した.2年間の特別研究員の期間で3編の原著論文を作成した.さらに,物質を換え,適用対象地域をかえて,アンチモンの環境動態に関する知見の収集と整理,諸外国でなされたアンチモンのリスク評価事例の取り纏めをおこない,暴露解析を実施するに際して必要な要素の抽出を行った.この準備の下で,先に取り上げた本モデルの適用性の検討を行った.難燃助剤として使われ,一部の河川水濃度が懸念されている,アンチモンをとりあげた.国内の事業所から公共用水域へ排出されている河川を取り上げて,暴露解析を行った.地球化学的なメカニズムを取り入れ,自然水中の共存有機物濃度,溶存酸素濃度をとりいれたモデルを構築した.希釈と沈殿の確率的変動特性を明らかにするモンテカルロ解析を実施した.この成果を論文としてまとめ,投稿した.なお,本人は,これまでの専門を伸ばすとともに,リスク評価分野の基礎的な学習を積み,本研究センターの基本ミッションである,分野横断横糸研究を着実に進めることができた.
急性肺傷害におけるリゾリン脂質の解析と同アシル基転移酵素遺伝子導入の効果

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は治療法の少ない、死亡率の高い呼吸器疾患である。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスホリパーゼA2の作用によりリゾフォスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。これらリゾリン脂質は炎症をさらに増悪させると推測されるが、ARDSの病態生理における意義はかならずしも明らかにされてこなかった。本研究は生体への抗原性の乏しく遺伝子導入に優れているとされるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、ARDSにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、ARDSに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。今回我々は肺細胞への親和性の高いとされる血清型AAV6.2を新たに作成した。A549細胞を用いてコントロールAAV6.2としてのLacZ酵素発現の確認を細胞染色およびフローサイトメーターによる定量解析を行った。同細胞へのリポポリサッカライド(LPS)添加による細胞障害がリゾフォスファチジルコリンアシル基転移酵素(LPCAT)1を組み込んだAAV6.2-LPCAT1の導入により抑制されることを確認した。またラットに経気道的にAAV6.2-LacZを1回投与し1週間後に気管支肺胞洗浄を施行し、炎症細胞を解析したが、生食水投与と差はみられず、炎症惹起性が無いことを確認した。In vivo肺におけるLacZ遺伝子発現をlacZアッセイで確認したところ、1010 vg以上の投与量で肺でのLacZ発現を確認した。しかしAAV6.2-LPCAT1経気道投与7日後にさらにLPSを経気道投与し2日後に施行した気管支肺胞洗浄では著名な炎症細胞とくに好中球の著増がみられ、AAV6.2-lacZ投与群との間に有意差はみられなかった。急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は治療法の乏しい、いまだに死亡率の高い疾患である。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスフォリパーゼA2の作用によりリゾホスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。これらリゾリン脂質は炎症をさらに増悪させると推測されるが、ARDSの病態生理における意義は必ずしも明らかにされてこなかった。リゾリン脂質アシル基転移酵素はリゾリン脂質に対しアシル基を転移し、元の安定なリン脂質に戻す作用がある。本研究は抗原性の乏しいアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ARDS実験モデル肺に同酵素を遺伝子導入することで、ARDSにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、有効な薬物治療の乏しいARDSに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。本年はリゾフォスファチジルコリンアシル基転移酵素(LPCAT)およびコントロールとしてlacZ酵素を組み込んだAAVウイルスベクターの作成を行った。両酵素とも293細胞へトランスフェクションすることで、LPCATはウェスターンブロットで、lacZは293生細胞でのlacZアッセイでそれぞれ発現を確認した。またラットより肺胞II型上皮細胞を単離し、インサートウェル上に播きこみ、気相培養することで分化機能を残した肺胞II型上皮細胞を維持できることを確認した。以上の研究成果より、本年度分として計画していた本研究のin vitroの部分はほぼ終了させることができた。1.アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター作成プラスミッドベクター作成:Agilent社、AAV Helper Free Systemキットを購入して用いる。これまでの研究でマウスLPCAT1およびlacZ遺伝子を組み込んだアデノベクターを作成済みである。この際に作成したpDC516プラスミッドより両cDNAを制限酵素で切り出し、AAVベクター作成用のpAAV-MCSプラスミッドに組み込んだ。組み換えウイルス作成:pAAV-LPCAT1またはpAAV-lacZ(コントロール)のいずれかをpHelper, pAAV-RCプラスミッドとともにAAV-293細胞にトランスフェクションした。目的タンパク質発現測定:組み換えAAVウイルスを感染させたAAV-293細胞を経時的に回収し、抗6×ヒスチジン抗体でウェスターンブロットを施行し、目的タンパク質の発現を確認した。またコントロールAAVウイルスはX-galを基質にlacZアッセイで確認した。2.肺胞II型上皮細胞単離と細胞アッセイ・ラットII型細胞単離・培養:肺胞II型細胞株や培養ディッシュに培養した単離II型細胞は脱分化し、肺サーファクタントの研究には使用できない。そこでSprague-Dawley (SD)ラットからエラスターゼ消化およびメトリザマイド密度勾配遠心法にてII型細胞を単離し、これをインサートウェルの内側底側マトリゲル膜上に培養し、途中から上皮側を気相にして、分化機能を維持したII型細胞を培養した。分化機能をSP-A, SP-B, SP-DのmRNA発現をリアルタイムPCRで分析したところ、培養ディッシュに培養した細胞に比し高発現していることを確認した。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスホリパーゼA2の作用によりリゾホスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。