hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
映画DVD対応CALL教材作成支援システムの開発

本研究では英語学習者が高い興味を持つ映画に着目し、DVD-Videoを使用して「三ラウンド・システム」に基づいたCALL教材作成支援システムを開発した。さらに、本システムを使用して実際に一種「英語CALL教材」を作成し、実際の英語学習の現場で試用し、その効果を検証したところ、期待通りの成果を挙げ、システムの機能と実用性を検証できた。本システムの開発により、他のDVDの動画素材を使用したCALL教材シリーズ開発が可能になった。本研究は英語学習者が高い興味を持つ映画に着目し,映画DVDを使用したCALL教材の作成支援システムを開発して今後の教材開発に供するとともに,実際に一種「英語CALL教材」を作成してシステムの機能と実用性を検証することを目的とする.本研究では三ラウンド・システムに基づき,開発済の教材作成支援システム(高橋他,2006)の機能を最大限活用して教材開発する方針であるが,開発済のシステムは著作権の許諾が得られた動画をWMVファイルの形式で使用し,CD-Rやインターネット等の手段で配布して複数のパソコンで使用することを前提としている.しかし,映画をCD-Rにコピーしたりインターネットで配信したりするような許諾を得ることは困難であり,本研究では学習者がひとり1枚のDVDを購入するか,業務使用の許諾を得られたDVDを借りることによって使用することとした.教材作成支援システムにDVD-Videoを直接制御する機能を実装するなどの改変作業は,綿密な打ち合わせを重ねながら業者に委託し,第一の目的であった映画DVD対応CALL,教材作成支援システムの開発に成功した.第二の目的である教材の試作をするために,映画作品の選定作業も並行して行った.前述の方法で映画の著作権を侵害することにはならないと考えるが,慎重を期して映画DVD配給会社1社と交渉して使用許諾を得た.候補となる映画61作品の一覧表を作成した後,さらに分野,内容,制作年やDVDの価格等の基準により候補を10作品に絞り込み,さらに難易度や関心度の観点から二段階に分けて英語学習者に対するアンケート調査を実施し,教材としてふさわしい作品1点を選定した.以上の研究成果に基づき,平成19年度の教材開発計画を進める予定である.本研究は英語学習者が高い興味を持つ映画に着目し,映画DVDを使用したCALL教材の作成支援システムを開発して今後の教材開発に供するとともに,実際に一種「英語CALL教材」を作成してシステムの機能と実用性を検証することを目的とする。昨年度開発に成功した映画DVD対応CALL教材作成支援システムに加え,今年度はDVD-Videoに収録された映画のうち教材に使用する部分(セグメント)の開始部分と終了部分をタイムコードで記録するプログラムを業者委託により開発した。これらのオーサリングシステムを活用七,今年度は映画作品1編を使用した教材を試作した。具体的には,(1)映像は各セグメントのタイムコードをエクセルに記述し,(2)テキスト情報は三ラウンド、システムの指導理論に基づき,設問,ヒント情報,正解例,解説情報,参考情報,補助情報,発展情報などをエクセルに入力し,これらのエクセルファイルをXMLファイルに変換した。その他,(3)参考情報および発展情報で使用する音声はネイティブスピーカー2名に依頼して録音スタジオでの収録とデジタル化を行い,(4)画像は業者委託および自作のグラフィックスを使用し,(5)これらのマルチメディア情報を統合してブラウザ上で実行可能な教材が完成した。完成した教材をCD-Rで配布してハードディスクにインストールするためのインストーラーも業者に開発委託した。教材開発の過程全体で技術的問題は発生せず,教材作成支援システムの機能と実用性も検証でき,当初の計画通り映画DVDを使用した教材の開発体制が整ったと結論した。以上の研究成果に基づき,平成20年度は開発した教材の試用と改善を行う予定である。本研究は英語学習者が高い興味を持つ映画に着目し,映画DVDを使用したCALL教材の作成支援システムを開発して今後の教材開発に供するとともに,実際に一種「英語CALL教材」を作成してシステムの機能と実用性を検証することを目的とする.今年度は一昨年度と昨年度の研究で開発を完了したソフトウェアおよび教材システムを実際の英語学習の現場で試用し,その効果を検証することを最重要課題とした.具体的にはTOEICで500点以上の学習者を対象とした半期15回の英語クラスにおいて29名の学生に試用してもらい,使用後に教員自作のアンケート(5段階評価および自由筆記),大学指定様式のアンケート(5段階)による他の英語授業との比較,TOEICを受験した学生の得点上昇量,の3つの観点で多面的に調査した.アンケート結果ではいずれも肯定的な結果が得られ,他の授業との比較においては15項目のアンケートすべてで本CALL教材を使用した授業のほうが高く評価された.TOEICについては受験した学生が3名のみで参考データとしたが,いずれも大きく得点を上昇させた。以上の結果,本システムは期待通りの成果を挙げ,映画DVDを使用したCALL教材作成支援システムの機能と実用性を検証でき,他のDVDの動画素材を使用したCALL教材シリーズ開発が可能になった.今年度で科研費を使用した研究は終了したが,本システムを活用して新たに米国のテレビドラマのDVDを使用したCALL教材の開発に着手することもできた.
琉球言語資料のデジタル化とその活用方法の研究

昔話・伝説・歌謡・芸能は、言葉による伝達の他に、音声・表情・ゼスチャーなどが伴う。特に、口頭伝承が豊かな沖縄の伝統文化は、身体表現による伝達の割合が大きい。しかし、伝承の〈時〉と〈場〉の変化とともに、伝統的な〈様式〉と〈精神性〉は変容してきた。なかでも、古典音楽の琉歌や古典芸能は、近代演劇の影響を受けて、〈声〉〈音〉〈身体〉は大きく変容した。したがって、琉歌・組踊・古典舞踊の琉球王朝文化については、琉球士族の言葉と身体様式、その精神性に焦点をあてて研究を進めた。2012年度は、沖縄語・宮古語・八重山語による歌謡と昔話のデジタル化作業に向けての機器備品の調達を行い、音声のデジタル化作業に取り組んだ。また、祭りや芸能の映像資料については、専門の業者に依頼してデジタル化作業を行った。そして、デジタル化した歌謡・昔話・芸能等を基に、以下の調査研究を行った。1昔話の調査研究では、粟国島の祭り及び昔話調査を行い、また公開講演会及びシンポジウムを開催して語りの特性とその保存継承方法について議論した。2歌謡の調査研究では、八重山歌謡及び琉球古典音楽をデジタル化した歌の試聴会を開き、その音及び声の特徴が現在と相違していることをテーマに討論した。3昔話の話型とユタの呪詞の構造を比較検討するために沖縄語を使用するユタとともに、八重山で実践的な調査を行ったが、沖縄語を知らない八重山では言葉の意味よりも唱えの音声の力が大きな役割を果たしていた。4芸能の調査研究では、組踊の所作と唱えについて、デジタル化した映像資料と現在の組踊役者の演技ついて比較検討した。以上の調査研究の結果、口頭伝承の昔話や民間巫者のユタの唱えは、それぞれの地域の言葉で語られるので、地域差による言葉の相違があった。特に、昔話では、竹富島・小浜島・黒島などの島ごとの言葉の相違、あるいは道路を隔てた字ごとの言葉の相違が顕著であった。しかし、それに対して、歌謡の詞章や芸能のセリフでは、地域差の相違よりも、士族と農民の身分差による言葉の違いのほうが際立った。要するに、昔話とユタの唱えはその地域の言葉で語り、唱えているが、歌謡の詞章と芸能のセリフは首里を中心とした琉球士族語が多用されている。特に、琉歌と組踊の詞章は、琉球士族の言葉が基調であり、庶民のウチナーグチ(沖縄口=沖縄方言)とは相違していることが明らかになった。2013年度は、沖縄諸島・宮古諸島・八重山諸島のシマ言葉による歌謡・昔話・芸能のデジタル化作業を行うと共に、素人では困難なカビの付着したVHSテープ等を専門の業者に委託してデジタル化作業を行った。そして、デジタル化した歌謡・昔話・芸能を活用方法について、以下の調査研究を行った。昔話の調査研究では、徳島県鳴門市に所蔵されていた福田晃氏の沖縄の昔話テープ及びノート等を調査すると共にそのテープを持ち帰りデジタル化作業を行った。ただし、ユタの祭祀伝承に関わる昔話のシンポジウムについては、予定していた山下欣一氏の体調不良のため実現できなかったが、ユタの個人祭祀の在り方を中心に公的なツカサ・ノロ等の祭祀の在り方との相違についての調査研究を行った。歌謡及び祭祀伝承の調査では、粟国島のヤガン折目、竹富島の種子取祭及び祭祀伝承、宮古島の祭祀歌謡について調査した。また、昭和四十年代に採集された八重山の古謡及び節歌のデジタル化を行うと共に、現在の歌い方との相違についての研究を行った。芸能の調査研究では、「沖縄の古典芸能を考えるII」と題して、組踊「大川敵討ー糺の場ー」と琉球古典舞踊の研究上演を東京の国立劇所小劇場で行うと共に、その研究上演をとおして琉球古典芸能役者の身体と日本本土の儀礼文化及び能楽等の身体との比較研究を行った。今年度の調査研究では、琉球士族文化の組踊や琉歌等の琉球文語と庶民文化の口語(シマ言葉)の位相について行ったが、琉球王家を中心とした琉球士族文化における言葉・身体は組踊や琉球古典舞踊に継承されており、特に「唱え」を発する組踊用語と口語(庶民のシマ言葉)の位相を明らかにすると同時に、琉球士族の身体は組踊等の古典芸能に継承され、また庶民の身体は民俗芸能へと継承されていることが明らかになった。平成26年度の研究実施計画は、「琉球の宮廷文化の系譜と地域の庶民文化の系譜に分けて琉球言語資料の研究を進める必要がある」との観点で研究を進めた。そして、身体動作を伴う芸能と祭祀歌謡の調査では、琉球王朝の式楽である組踊と琉球古典舞踊の調査を行った。組踊の場合は本研究で考案した舞台様式で「大川敵討」の〈前段の場〉を上演し、琉球古典舞踊は伊勢神宮での奉納舞踊を調査した。また、地域の庶民文化の視点から、宮古島の神歌の実演を沖縄国際大学で行った。

いずれも、実演家や観客の意識及び身体表現とその精神性について調査した。宮廷芸能は、品格を重んじ、師匠の教えに忠実であることを強調する。それに対して、庶民の祭祀歌謡の宮古の神歌の演唱者は、我が神歌の継承が常に正当であったことを強調すると同時に、神から教わったことを主張する。宮廷歌謡と民謡の関係については、国際基督教大学のマットギラン氏との意見交換会を行い、宮廷音楽と民謡の曲調・テンポなどの相違について議論した。また、説話については調査・研究の結果、昔話が伝説や史譚となる傾向が強く、村落祭祀の起源譚や琉球王国の起源伝承として語られる特性があることがわかった。ただし、琉球王国時代の歌謡・説話・芸能等は、王朝文化と庶民文化が相互に影響を受けており、琉球王国が近世本土の幕藩制封建社会に比べて身分差がはっきりしなかったことが窺える。また、琉球語には奄美・沖縄・宮古・八重山の地域差があり、それに加えて琉球の宮廷社会の琉球士族語があり多様である。ただし、話し言葉は通じ合わなくても、文字言語の及び士族社会の琉球文が共通語の役割を果たしていた。したがって、デジタル化した琉球言語資料を活用するにあたっては、以上のような琉球沖縄の文化的な特性を考慮すること、伝承者のプライバシーを尊重して、アーカイブ化を試験的に行う必要があるとの結論を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。琉球文学・琉球芸能・民俗学26年度が最終年度であるため、記入しない。デジタル化した音声及び映像資料を活用しての調査研究は、全体として順調に進んでいる。特に、歌謡と芸能については、その音声及び映像資料から、士族と庶民の身分差による身体の相違があり、身分差によって、体の動きや使い方、言葉の発音や用語が異なっていることを明らかにした。身分差による言葉や身体の相違は、本土では当然のこととして認知されているが、沖縄では近代化以降、特に戦後においては共通語化が促進されたため、その問題が意識されなくなった。また、沖縄の説話・歌謡・芸能のフィールド調査は、地域差を中心に文字化による文献中心の研究を目的として録音・録画が行われてきたが、本研究では言葉の意味よりも、声・音の聴覚や体の動きの視覚に注目して音声資料と映像資料を分析し、現在の祭祀・昔話・歌謡、そして組踊や地域の村踊りの比較検討を行った。つまり、従来の琉球言語文化の研究では、奄美諸島・沖縄諸島・宮古諸島・八重山諸島という地域間の相違に目を向け、各地域を幅広く踏査し、地域の相違に着目して研究する民俗学的な方法が中心であったが、その方法は首里を中心にした琉球士族文化の研究をおろそかにすることにつながったのである。したがって、今後は琉球の士族文化を中心にした研究が必要であり、そのことを踏まえて、本研究では身体・声・音を総合的に表現する組踊研究を進めることが有効であると考える。ただし、レコードやビデオテープのデジタル化が順調に進んでいるのに対して、当初デジタル化作業のメインと考えていた昔話のデジタル化作業がかなり遅れている。その理由は、カセットテープがすぐに切れてしまうという問題を抱えているからである。今後も、切れたカセットテープをつなぎ直してデジタル化を進めることになるが、これはかなりの時間を要すると思われる。レコードのデジタル化作業は、延べ数で、琉球古典音楽351曲、民謡444曲、沖縄芝居・沖縄歌劇24作品と八重山の歌謡等がほぼ完了した。また、組踊及び琉球舞踊の映像のデジタル化もほぼ終了し、祭祀の神歌等の映像資料のデジタル化もほぼ終了した。
B細胞における遺伝的拘束性を決定する要因の分子生物学的解析

われわれはこれまでの研究において、BALB/cマウスにM104Eミエロ-マ蛋白を免疫したとき、M104E CRI特異的に抗体産生を増強するB細胞群を同定した。このイディオタイプ特異的増強性B細胞活性は、抗体産生(CRI産生)B細胞との間の協同作用に主要組織適合性抗原(MHC)の一致を必要とし、その拘束性はクラスII分子によるものであった。またイディオタイプ特異的増強性B細胞活性が誘導されるためには、その個体がM104ECRI産生能を有しておらねばならないことを明らかにした。これらMHC拘束性分子の本体、ならびに、Igh拘束性の可能性を検索するためには、増強活性を有したB細胞クロンを得なければならない。そこでわれわれが以前確立した方法に従って、B細胞の長期培養とクロン化を行なった。M104Eミエロ-マ蛋白で免疫したBALB/cB細胞を、コンカナバリン刺激マウス脾細胞培養上清を含む合成培地で培養し、M104Eで刺激を続けた。約6ケ月後、クロン化して、増強性B細胞活性を持つB細胞クロンB19ー1^dを得た。このクロンはそれ自体では抗体を産生しないがLPSで刺激すると抗体産生細胞に分化した。LPS刺激したクロンをP3U1細胞と融合してハイブリド-マ(HB19)を得、これからcDNAを得た。一方M104EからもDNAをクロン化し、両者の塩基配列を決定した。両者の塩基配列を比較すると、互いに異なったDーJ遺伝子断片を用いてはいるが、leader peptide領域、VH遺伝子領域は極めて類似性が高く、DNAレベルで91%、アミノ酸レベルで89%の類似性を示した。文献的に、BALB/cマウスのJ558germ line gene subfamilyと比較しても、他subfamilyとの類似性がたかだか70ー80%ぐらいにとどまっており両者は極めて密に連関したgerm line遺伝子由来の抗体遺伝子であると考えられ、この類似性がIgh拘束性の本体であることが強く示唆された。イディオタイプ特異的に、抗体産生を増強するB細胞群を同定した。この活性を有するB細胞のクロン化を試み、B細胞クロンB19-1^d及びそのハイブリド-マ細胞HB19の樹立に成功した。B-B細胞間相互作用は、免疫グロブリン重鎖遺伝子群、及び主要組織適合性抗原による遺伝子的拘束性が存在することが証明できた。そこで、B細胞クロン由来ハイブリド-マHB19、及び標的イディオタイプの典型としてのHOPC104Eミエロ-マ細胞からcDNAライブラリ-を作成し、V-D-J領域の遺伝子クロ-ニングを行ない、それぞれの塩基配列を決定した。その結果、両者は極めて類似した塩基配列を示し、その相同性は89%であった。このことは、両者が同じV_H遺伝子サブファミリ-に属する近縁関係にあることが予想される。次いで、両V_H遺伝子のGerm Line DNA上の相対的位置関係を推定する目的で、両者のgenomic DNAをクロ-ニングした。HB19及び、MOPC104EよりDNAを得、J_Hをプロ-ブとしてrearranged DNA E_<CO>KI断片をλgt10ファ-ジにクロ-ニングし、次いでpuC19にサブクロ-ニングした。

次いで、それぞれに特異的なDNAプロ-ブを遺伝子5'側上流に求めた。E_<CO>RI genomic DNA断片上最も5'側の部分をpuC19にサブクロ-ニングし、得た断片をプロ-ブとして、マウス肝高分子DNAとサザンハイブリダイゼ-ションを行なった。その結果、high stringency conditionにおいて、それぞれの5'側プロ-ブに反応するDNA断片が検出された。この結果は、5'側プロ-ブがV_H遺伝子の特異的プロブになり得ることを示唆する。一方、このプロ-ブを用い、肝DNAライブラリ-、charon 28 LIO16をスクリ-ニングしたところ、両者にハイブリダイズするクロ-ンが1つだけ見つかった。現在、その遺伝子構造の解析を行なっている。われわれはこれまでの研究において、BALB/cマウスにM104Eミエロ-マ蛋白を免疫したとき、M104E CR1特異的に抗体産生を増強するB細胞群を同定した。このイディオタイプ特異的増強性B細胞活性は、抗体産生(CRI産生)B細胞との間の協同作用に主要組織適合性抗原(MHC)の一致を必要とし、その拘束性はクラスII分子によるものであった。またイディオタイプ特異的増強性B細胞活性が誘導されるためには、その個体がM104E CR1産生能を有しておらねばならないことを明らかにした。これらMHC拘束性分子の本体、ならびに、Igh拘束性の可能性を検索するためには、増強活性を有したB細胞クロンを得なければならない。そこでわれわれが以前確立した方法に従って、B細胞の長期培養とクロン化を行なった。M104Eミエロ-マ蛋白で免疫したBALB/c B細胞を、コンカナバリン刺激マウス脾細胞培養上清を含む合成培地で培養し、M104Eで刺激を続けた。約6ヶ月後、クロン化して、増強性B細胞活性を持つB細胞クロンB19ー1^dを得た。このクロンはそれ自体では抗体を産生しないがLPSで刺激すると抗体産生細胞に分化した。LPS刺激したクロンをP3U1細胞と融合してハイブリド-マ(HB19)を得、これからcDNAを得た。一方M104EからもDNAをクロン化し、両者の塩基配列を決定した。両者の塩基配列を比較すると、互いに異なったDーJ遺伝子断片を用いてはいるが、leader peptide領域、VH遺伝子領域は極めて類似性が高く、DNAレベルで91%、アミノ酸レベルで89%の類似性を示した。文献的に、BALB/cマウスのJ558germ line gene subfamilyと比較しても、他subfamilyとの類似性がたかだか70ー80%ぐらいにとどまっており両者は極めて密に連関したgerm line遺伝子由来の抗体遺伝子であると考えられ、この類似性がIgh拘束性の本体であることが強く示唆された。
Gjb2のコンディショナル・ノックアウト・マウスの遺伝子導入による難聴レスキュー

先天性難聴の原因として、GJB2遺伝子変異が重要であることはよく知られている。ヒトでの解析には限界があるので、動物モデルでの解析が検討されている。Cre recombinase存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようなコンストラクトを作成し、ES細胞に相同組換えにより導入した。ネオマイシンによる選別を行いサザンブロット法により組替え体を同定した。ES細胞をB6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作製した。続いてB6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。Cre recombinaseを持つトランスジェニックマウスと交配させ、遺伝子欠失マウスを同定し解析に供した。聴性脳幹反応で聴力閾値を測定し、内耳を採取、パラフィンまたはエポンに包埋した。パラフィンに包埋したサンプルをヘマトキシリン・エオジン(H & E)染色、免疫組織染色で解析した。(Gjb2欠失マウスでは最大100dBのクリック音刺激でも脳幹反応を得ることができなかった。一方、野生型ではI-V波の明瞭な聴性脳幹反応を認め、閾値は30dB以下であった。欠失マウスではspiral limbusの線維細胞の減少が認められた。またコルチ器の構造がやや虚脱している所見が得られ、優性的阻害効果のあるgjb2変異マウスに類似した。血管条、ラセン靱帯の線維細胞、ラセン神経節細胞、ライスネル膜、蓋膜などは両者に明らかな違いは認めなかった。聴性脳幹反応による聴力検査では変異体では極めて高度な難聴像を示した。今回作製したマウスはヒトのGJB2の異常による言語習得前の高度難聴と極めて類似した表現型を示すことが判明し、ヒト(GJB2遺伝子変異による難聴のマウスモデルとなることが示唆された。パラフィンに包埋したサンプルをヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色、免疫組織染色で解析した。Gjb2欠失マウスでは最大100dBのクリック音刺激でも脳幹反応を得ることができなかった。今回作製したマウスはヒトのGJB2の異常による言語習得前の高度難聴と極めて類似した表現型を示すことが判明し、ヒトGJB2遺伝子変異による難聴のマウスモデルとなることが示唆された。

今回作製したマウスはヒトのGJB2の異常による言語習得前の高度難聴と極めて類似した表現型を示すことが判明し、ヒト(GJB2遺伝子変異による難聴のマウスモデルとなることが示唆された。
次世代型心不全治療法の開発へ向けたゲノム編集による老化心筋幹細胞の若返り

近年、高齢者由来心筋幹細胞が幹細胞老化に陥っている可能性が指摘されており、特に高齢患者に対する心筋幹細胞移植の実施には慎重な対応が迫られている。本研究では、2-83歳の26名の心不全患者から単離した心筋幹細胞を用いて個体老化と心筋幹細胞老化との関係性を明らかにし、心筋幹細胞の老化誘導因子の同定と老化幹細胞の若返り誘導法の開発を当初の目的とした。しかし結果として、高齢患者由来のヒト心筋幹細胞における“老化"は極めて限定的であり、若返りの必要性は必ずしもないことが明らかとなった。このことは、高齢者が大半を占める重症心不全患者に対する自己心筋幹細胞移植療法の実施を大いに後押しする成果である。心筋幹細胞は、不全心に対する細胞移植治療において極めて有用な細胞種の一つである。しかし、加齢や背景疾患の影響により組織内在性の体性幹細胞の機能が低下してしまう可能性が示唆されており、心不全患者の大半を占める高齢者に対する自己心筋幹細胞移植治療の効果に疑問が残る。そこで本研究では、当院および関連病院において開胸手術を施行する患者から心筋幹細胞を採取し、年齢および背景疾患と心筋幹細胞の機能との関連性について検討する。また、細胞老化関連因子を同定し、老化心筋幹細胞の若返り法を開発することを本研究の目的の一つとする。平成27年度は、2歳児から83歳までの計26人の患者から心筋幹細胞をそれぞれ単離した。患者由来ヒト心筋幹細胞において、細胞老化に関連する遺伝子群の発現解析を行ったところ、患者年齢と各遺伝子群との間で有意な差は認められなかった。次に、ヒト心筋幹細胞の増殖能、細胞老化率、DNA損傷率、血管形成能、などについて比較検討したところ、驚くべきことに、これまでの報告とは異なり年齢と心筋幹細胞の基礎的な性質との間に有意な差は認められなかった。すなわち、心筋幹細胞の機能低下は、加齢に直接影響を受けるものではないことを示唆している。得られた成果については、関連学術誌への投稿および関連学会での発表により積極的な情報発信を行った。平成28年度には、さらに詳細な検討を進め、心筋幹細胞を用いた心不全治療の新たな可能性を提示したい。平成27年度は、山口大学医学部附属病院および関連病院において小児から高齢者まで26名の心臓組織を採取し、さらにそれらの組織から心筋幹細胞を樹立することができた。ゆえに研究は順調に進展していると言える。細胞老化に関連する遺伝子の同定には至らなかったが、一方で、心筋幹細胞の基礎機能に加齢が与える影響は小さいという重要な発見がなされたことは評価に値する。前年度までに、山口大学医学部附属病院で心臓手術を施術された2歳児から83歳までの26例の患者から採取した心筋幹細胞を用いて、細胞の増殖能、細胞成長因子産生能、細胞老化状態、等を比較検討したところ、患者年齢と心筋幹細胞老化との間に有意な相関性は見出されなかった。このことは、定説となりつつあった「高齢患者由来心筋幹細胞=老化幹細胞」の図式を崩す極めて興味深い結果である。本年度は、qPCR法を用いて、高齢者由来心筋幹細胞と若齢患者由来心筋幹細胞との間で発現変化の見られる因子について比較検討を行った。特に、これまで細胞老化誘導因子として報告されてきた因子に注目したところ、高齢者由来心筋幹細胞においてsFRP1の発現が有意に亢進していることが明らかとなった。sFRP1は、DNA障害により発現が誘発される因子として知られ、事実、我々の検討においても平均値の比較では差は認められないものの、高齢患者ほど心筋幹細胞のDNA障害率が高まっている傾向があることを見出しており、関連性が強く示唆される。最終年度である平成28年度には、樹立した26株の心筋幹細胞を用いて、加齢による幹細胞機能への影響についてさらに詳細に検証する。また、平成27年度には同定できなかった細胞老化誘導因子の同定についても引き続き検討する。具体的には、樹立した細胞株にストレスを与えることで人為的に細胞老化を誘導し、細胞老化関連因子群の発現解析を行う。心臓外科平成27年度に行う予定であった網羅的発現解析を行わずに、標的とする遺伝子を絞った発現解析法に変更したため次年度使用額が発生した。平成27年度に予定していた網羅的解析を平成28年度に実施する。
上皮増殖因子前駆体細胞内ドメインをターゲットとした新規薬剤開発

【目的】炎症性腸疾患において、腸管の持続する活動性炎症より大腸癌(colitic cancer)を合併する。しかしそのメカニズムは不明である。潰瘍性大腸炎では、炎症細胞や腸管上皮から放出される炎症性サイトカイン(IL-8)がcolitic cancerの増殖・進展に重要な役割を果たしている。HB-EGF C末端細胞内ドメイン(HB-EGF-CTF)核移行が細胞増殖に重要な役割を果たす。HB-EGF-CTF核移行を阻害することが新たな癌治療戦略になり得ると考え新規薬剤の探索を行い、その候補薬剤の細胞増殖抑制効果を調べた。【方法】HB-EGF-CTFとPLZFとの結合を抑制する6000種類のchemical compoundをAlpha Screensystemを用い網羅的にスクリーニングした。数種の大腸癌細胞株を使用し細胞増殖カーブにて検討した。HB-EGF-CTFおよびPLZFに対する蛍光免疫染色を行い、細胞内局在の変化を調べた。EGFRリン酸化については、免疫沈降にて確認した。【結果】HB-EGF-CTFとPLZFとの結合を抑制する薬剤として化合物No.8016が得られ、No.8016と類似構造をもつ2種類の化合物(compoundA,B)をみつけだすことができた。IL-8による細胞増殖抑制効果は、compoundBに比べAの方が強かった。IL-8刺激によるHB-EGF-C末端核移行は、compoundAのみで阻害できた。compoundA,B共にEGFRリン酸化を阻害しなかった。【結論】compoundAは、IL-8により誘導されるHB-EGF-CTF核移行を抑制することにより、細胞増殖抑制作用を発揮すると考えられた。HB-EGF-CTF核移行シグナルを抑制するcompoundAは、新たな癌治療戦略になりうる薬剤と考えられた。【方法】HB-EGF-CTFとPLZFとの結合を抑制する9000種類のchemical compoundをAlpha Screensystemを用い網羅的にスクリーニングした。大腸癌細胞株(HT29, HCT116)を使用し細胞増殖カーブおよびMTSアッセイにて検討した。【結果】HB-EGF-CTFとPLZFとの結合を抑制する薬剤として化合物No.8016が得られ、No.8016と類似ビフェニール構造をもつ2種類の化合物(カンデサルタン、テルミサルタン)をみつけだすことができた。IL-8による細胞増殖抑制効果は、カンデサルタンに比べテルミサルタンの方が強かった。IL-8刺激によるHB-EGF-C末端核移行は、テルミサルタンのみで阻害できた。カンデサルタン、テルミサルタン共にEGFRリン酸化を阻害しなかった。【結論】テルミサルタンは、IL-8により誘導されるHB-EGF-CTF核移行を抑制することにより、細胞増殖抑制作用を発揮すると考えられた。HB-EGF-CTF核移行シグナルを抑制するテルミサルタンは、新たな癌治療戦略になりうる薬剤と考えられた。【結論】telmisartanやその誘導体によるHB-EGF-CTF核内移行シグナル抑制は、新たな大腸癌治療戦略になりうると考えられた。9000種類のchemical compoundをAlpha Screensystemを用い網羅的にスクリーニングした結果、テルミサルタンとNo.8016がHB-EGF-CTFとPLZFとの結合を抑制する薬剤であるとわかった。また、これら薬剤が増殖抑制効果も発揮することが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらにこれら薬剤が、in vivo(マウス発癌実験)においても、増殖抑制効果が認められることが示せれば、臨床応用も可能となってくる。アゾキシメタンを投与後慢性DSS腸炎惹起発癌モデルにおいて、これら薬剤を同時投与し、大腸癌増殖進展が抑えられれば、in vivo実験でも示せたことになる。現在、実験準備、進行中。
全身性強皮症を含む皮膚線維化疾患におけるlong non-coding RNA

平成27年度は、TSIXが強皮症患者の病変部皮膚で他の疾患や正常皮膚よりも発現が増加しており、さらにその局在は皮膚線維細胞であることを突き止めた。また、TSIX siRNAによりcollagen mRNAの安定性が有意に減少した。そして平成28年度は、多数の強皮症患者群で血清TSIX濃度を測定したところ、正常対照群に比較して強皮症患者群で有意に増加していたため診断に有用である可能性が示唆された。平成29年度は皮膚線維化モデルマウスにおいてTSIXを阻害して、生じる変化を観察した。その結果、TSIX siRNAはブレオマイシンによる皮膚真皮厚の増加を有意に抑制した。平成27年度は、皮膚線維化疾患や膠原病の皮膚組織からRNAを抽出し、全身性強皮症の病態に関係する可能性の高い3種類のlncRNAを中心にreal-time PCRやin situ hybridizationで病変部での発現量・局在を調べた。その結果、TSIXは強皮症患者の病変部皮膚で他の疾患や正常皮膚よりも発現が増加しており、さらにその局在は皮膚線維芽細胞であることを突き止めることができた。その他のlncRNA(XISTやHAR1A)については、強皮症とそれ以外のサンプルで有意な差を認めなかった。次に、siRNAやexpression vectorで培養細胞における機能解析を行った。TSIXsiRNAを培養皮膚線維芽細胞に強発現すると、collagenのmRNAあるいは蛋白の発現が減少することが分かった。そのメカニズムとして、TSIX siRNAによりcollagen mRNAのstabilityが有意に減少していた。つまり、TSIXそのものは皮膚線維芽細胞においてcollagen mRNAのstabilityを維持することでコラーゲン発現をコントロールするが、強皮症皮膚線維芽細胞ではTSIXが増加することでコラーゲン発現が恒常的に増加し、ひいては組織の線維化が誘導されると考えられた。以上より、本研究によりTSIXは本症の病態に強く関わる因子であるとともに、新しい治療のターゲットになりうることが明らかとなった。すでに平成27年度の研究計画については完了し、平成28年度以降に計画していた血清中lncRNAの解析に進んでいるため。平成27年度は、TSIXが強皮症患者の病変部皮膚で他の疾患や正常皮膚よりも発現が増加しており、さらにその局在は皮膚線維細胞であることを突き止めることができた。また、TSIX siRNAによりcollagen mRNAのstabilityが有意に減少した。つまり本研究によりTSIXは本症の病態に強く関わる因子であるとともに、新しい治療のターゲットになり得ることが明らかとなった。そして平成28年度は、TSIXの血清中濃度の疾患マーカーとしての有用性を評価するため、少数の血清サンプルからRNAを抽出し、TSIXが実際に血清中にも発現していることをreal-time PCRで確認することができた。また、多数の強皮症患者群で血清TSIX濃度を測定したところ、正常対照群に比較して強皮症患者群で有意に増加していたため診断に有用である可能性が示唆された。さらに患者群において臨床症状との相関を調べたところ、スキンスコアとの相関を認め、病勢マーカーとしての有用性も示唆された。以上の結果をExp Dermatol雑誌に投稿し掲載された(Wang Z et al. Exp Dermatol 2016)。すでに平成27-28年度の研究計画については完了し、平成29年度以降に計画していたマウスモデルを用いた研究に進んでいるため平成27年度は、TSIXが強皮症患者の病変部皮膚で他の疾患や正常皮膚よりも発現が増加しており、さらにその局在は皮膚線維細胞であることを突き止めることができた。・平成29年度は震災や異動により研究が遅延したが、in vivoでのTSIXをターゲットとした治療の効果を調べるため、皮膚線維化モデルマウスにおいてTSIXを阻害して、生じる変化を観察することで治療応用の可能性を明らかにした。過去のmicroRNAの投与実験に準じて(Makino K, et al. J Immunol 2013)、TSIX siRNAを週に一度腹腔内注射し、ブレオマイシン28日間連続局注による皮膚の線維化を抑制出来るかを評価した。また、TSIXsiRNAはコラーゲンmRNAの発現を抑制していたことより、抗線維化作用は想定された機序によると考えられた。

そして平成28年度は、多数の強皮症患者群で血清TSIX濃度を測定したところ、正常対照群に比較して強皮症患者群で有意に増加していたため診断に有用である可能性が示唆された。平成29年度は皮膚線維化モデルマウスにおいてTSIXを阻害して、生じる変化を観察した。その結果、TSIX siRNAはブレオマイシンによる皮膚真皮厚の増加を有意に抑制した。現在、同定された強皮症の疾患特異的・機能的lncRNAの血清中濃度の疾患マーカーとしての有用性を評価するため、血清からRNAを抽出し、特異的lncRNAが実際に血清中にも発現しているかを少数のサンプルを用いてreal-time PCRで確認している。今後、血清中での発現が確認されたlncRNAについては多数の患者群で血清lncRNA濃度を測定し、正常対照群や他疾患との比較を行い診断マーカーとしての評価をする。さらに患者群において臨床症状との相関を調べて病勢マーカーとしての評価も行う。具体的には、例えば全身性強皮症においてはスキンスコアや皮膚潰瘍および肺病変・腎病変の有無との相関を調べる。本年度はin vivoでのTSIXをターゲットとした治療の効果を調べるため、皮膚線維化モデルマウスにおいてTSIXを強発現あるいは阻害して、生じる変化を観察することで治療応用の可能性を明らかにする。例えば過去のmicroRNAの投与実験に準じて(Makino K, et al. J Immunol 2013)、TSIX siRNAを週に一度腹腔内注射して、ブレオマイシン28日間連続局注による皮膚の線維化を抑制出来るかを評価する。加えて他の各疾患においても、増加しているlncRNAについてはsiRNAで抑制し、減少しているlncRNAについてはlncRNAを補充して治療薬としての有用性を検討する。皮膚科学
糸状菌由来セルロース膨潤タンパク質の機能解析

セルロース膨潤タンパク質Swolleninの反応機構とセルラーゼの反応促進における役割を解明することに成功した。また,Swolleninの作用によるセルロースの構造変化を明らかにし,セルラーゼによる反応との違いを見出すことに成功した。本結果は,セルロース分解に携わるタンパク質の新規反応機構を明らかにしただけでなく,セルロースの加水分解反応を促進する新たな因子としてバイオマスの有効利用において活用できる可能性が考えられる。セルロース膨潤タンパク質であるSwolleninを遺伝子組換え技術によって作成し,その反応機構と反応によって調製されたセルロースの構造解析を行った。1.セルロースの膨潤は,Swolleninによる加水分解反応によって引き起こされるのかーSwolleninのセルロース膨潤活性は,セルロース表面のごく一部で生じ,機器分析によって膨潤に起因する結果を得ることはできなかった。しかし,セルラーゼ活性の促進効果を調べることでSwolleninの作用を定量化することに成功した。一方,Swolleninによるセルロースの加水分解力を生成物のゲル浸透クロマトグラフィーによって定量化することにも成功した。その結果,Swolleninの作用によって,高重合度のセルロースに対しても,可溶性の糖質は確認されないものの,重合度の低下が起こり加水分解が生じていることが明らかとなった。また,加水分解とセルラーゼ活性の促進効果には関連性が確認された。同様に,Swolleninと類似した構造をもつTrichoderma reesei由来エンド型セルラーゼ(EG5)を用いて同様の実験を行った。本酵素の添加によってもセルラーゼの活性促進効果が確認されるが,その効果はSwolleninに比較して明らかに低く,Swolleninの促進効果はその加水分解力だけでなく,他の要因が関与していることが示唆された。2.セルロース膨潤に関与するアミノ酸残基の同定ーカルボキシメチルセルロースを基質としてSwolleninの加水分解生成物のアノマー型を決定した。その結果,反転型であることを明らかにした。この結果は,Swolleninと類似した構造を持つEG4の特性と一致しており,構造のみならず反応機構も類似していることが示唆された。EG5においては,加水分解に寄与する2つの触媒アミノ酸残基はアスパラギン酸であることが判明しており,Swolleninに保存されているアスパラギン酸の変異体の作出を試みる予定でいる。1. Swolleninの局在部位の特定1Swolleninペプチド抗体の作製と反応性ーSwolleninに特異的なアミノ酸配列から抗原となる配列を決定し,ペプチド抗体を作製した。T. reeseiの培養液上清を用いて抗体の反応性を調査したところ,Swolleninと思われる約70 kDaのタンパク質と反応性を示した。今後は,本抗体を使用してバイオマス中におけるSwolleninの局在性を調査する予定である。2Swolleninのセルロースへの吸着力ーSwolleninのセルロースへの吸着力を各種CBM1を有するセルラーゼと比較した。Swolleninは,CBH1と同様にセルロースに吸着したタンパク質の90%以上が離脱することから,可逆的な吸着であると考えられた。2. Swolleninの発現時期と発現量の調査リアルタイムPCR法によって調査を行った。Swolleninの発現時期はセルラーゼ(cbh1, cbh2, eg1)と完全に一致していることが明らかとなった。セルロースをC源としたときの発現量は,cbh1と比較して約4%であり,Reference gene (act1)に比較すると約200%であった。3.各種セルラーゼ成分の調製Swolleninによる活性促進効果を調査するために,T. reesei由来の各種セルラーゼ成分を組換え酵素として調製した。麹菌を利用した発現系を構築し,計画通りにCBH1, CBH2, EG1, EG2, EG4, BGL1の発現に成功し,精製を完了した。1.セルラーゼ加水分解反応に及ぼすSwoleninの活性促進効果T.reesei由来各種セルラーゼによるセルロースの分解反応にSwolleninを添加して,その分解率を測定した。セルラーゼ成分としてCBH1,CBH2およびβ-Glucosidaseなどのエキソ型グルカナーゼに対しては,高い相乗効果が確認された。一方,EG1,EG2, EG5, EG4 (Cel61A)などのエンド型酵素に対しては相乗効果は確認できたものの,その程度は低かった。これらの結果は,Swolleninはセルロース鎖内部をエンド型に分解していることを支持するものであった。2.Swolleninの反応機構とセルラーゼの関連性平成26年度までに作製したSwolleninアミノ酸変異体を使用して,反応機構を調査した。活性中心と考えられる2つのアミノ酸残基を同定し,これらの変異によってSwolleninによるセルラーゼの分解反応促進効果が消失することを明らかにした。このことは,Swolleninは活性は弱いが加水分解酵素の一種であり,反応によって生じたセルロース末端が増えることでエキソ型グルカナーゼの反応を促進している可能性が考えられた。

当初の予定よりも抗体の反応性の評価に時間を要し,Swolleninの局在性の調査が年度内に実施できなかったため,やや遅れていると判断した。その他の項目については,当初の研究計画を予定通り実行できている。酵素化学平成26年度の結果を受けて,以下のように実施する。1. Swolleninの局在性の調査(H26年度に未実施の項目)2.セルラーゼ反応に対するSwolleninの活性促進効果3. Swolleninによるセルロースの膨潤とセルラーゼ反応の関連性の調査平成25年度における,研究計画を実施・終了したため。Swolleninの作用機構を解明するために,その基礎となる知見を明らかとした。具体的には,セルロース膨潤作用の定量化,加水分解とセルロース膨潤作用の関連性および生成物のアノマー型の同定である。平成25年度の結果を受けて,以下の事項について実行する。1.Swollenin存在部位の特定ーSwolleninのセルラーゼ活性促進効果には,加水分解力以外の要因も関与していることが明らかとなった。これには,バクテリアExpansinでも報告されているセルロースへの吸着作用が関与している可能性がある。平成26年度実施予定の抗体によるセルロースへの吸着部位の特定では,その吸着力をセルラーゼと比較することを実施する。2.Swollenin発現量と発現時期の特定ーSwolleninの役割を解明するために,RT-qPCRによって発現時期と発現量を調査する。1で作成した抗体によって,タンパク質レベルでの調査も実施する。
老化ストレスシグナルによる腸管上皮幹細胞制御機構の解明

腸管上皮細胞は様々な異物に対するバリアーとなるとともに,`生理的炎症'に常に曝されている。このような環境において,腸管上皮幹細胞は遺伝子変異を加齢とともに蓄積していくと考えられる。このようなステムセルエイジングは,加齢に伴う大腸がん率上昇や潰瘍性大腸炎のがん化に寄与すると考えられる。我々は,大腸がんも含め,慢性的な炎症ストレスシグナルがステムセルエイジングを介した発がんを導くと考え,本研究を考案した。申請者は腸管上皮幹細胞培養技術の開発に成功し,幹細胞の加齢現象を細胞生物学的に追及することができる(Nature 2009, Nature Medicine 2011)。既に,ヒト腸管上皮幹細胞はマウスに比し高い細胞ストレス感受性をもつことを見出し(Gastroenterology 2011),長寿命であるヒトの組織を用いたステムセルエイジング研究に着目した。本研究は加齢に伴う腸管上皮幹細胞のゲノム・トランスクリプトーム変化と幹細胞機能異常を包括的に理解し,加齢を誘導する分子およびシグナル機構を解明することを目的とする。ヒト大腸がんや正常大腸上皮からオルガノイドライブラリーを構築し,様々な年齢や疾患を有するオルガノイドの包括的な分子プロファイルを取得した(Cell Stem Cell 2016).また,ヒト大腸オルガノイドのマウスへの同所異種移植システムを確立し,幹細胞の組織内の動態を観察するプラットフォームを開発した.その結果,マウスに比して,ヒトの大腸上皮幹細胞は細胞増殖スピードが遅いことを見出した(Cell Stem Cell 2018).さらに,様々な年齢の潰瘍性大腸炎患者の大腸オルガノイドの作製と遺伝学的解析を行った(submitted).こうしたデータは,加齢や炎症ストレスが大腸上皮幹細胞にどのような生物学的な変動をもたらすかを知る鍵になると考えられる.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。腸管上皮細胞は腸内細菌や食餌抗原などの様々な異物に対するバリアーとなるとともに,`生理的炎症'に常に曝されている.このような過酷な環境において,腸管上皮幹細胞は遺伝子変異やエピゲノム変化を加齢とともに蓄積していくと考えられる.このようなステムセルエイジングは,加齢に伴う大腸がんの発症率上昇や潰瘍性大腸炎のがん化に寄与すると考えられる.潰瘍性大腸炎は,国内に14万人の患者を有し,比較的若年者においても大腸発がんリスクを有することから社会的問題となっている.我々は,通常の大腸がんも含め,慢性的な炎症ストレスシグナルがステムセルエイジングを介した発がんを導くと考え,本研究を考案した.佐藤らはこれまで不可能であった腸管上皮幹細胞培養技術の開発に成功し,幹細胞の加齢現象を細胞生物学的に追及することができる(Nature 2009, Nature Medicine 2011).既に,ヒト腸管上皮幹細胞はマウスに比し細胞ストレスに対して高い感受性をもつことを見出しており(Gastroenterology 2011),長寿命であるヒトの組織を用いたステムセルエイジング研究に着目した.本研究は加齢に伴う腸管上皮幹細胞の(エピ)ゲノム・トランスクリプトーム変化と幹細胞機能異常を包括的に理解し,加齢を誘導する分子およびシグナル機構を解明することを目的とする.さらに,加齢分子メカニズムに基づいた人工的な加齢誘導モデルを作製し,加齢変化を抑制する全く新しい発がん予防治療の創出を目指す.また,包括的ゲノムデータを数理化し,ステムセルエイジングによる大腸がんハイリスクグループの予測を目指す.慢性炎症による発がんは本邦で発症率の高い慢性胃炎や慢性肝炎などを背景とするため,本研究の成果は我が国のライフサイエンスの進展ならびに健康長寿社会の実現につながると考える.腸管上皮細胞は腸内細菌や食餌抗原などの様々な異物に対するバリアーとなるとともに,`生理的炎症'に常に曝されている.このような過酷な環境において,腸管上皮幹細胞は遺伝子変異やエピゲノム変化を加齢とともに蓄積していくと考えられる.このようなステムセルエイジングは,加齢に伴う大腸がんの発症率上昇や潰瘍性大腸炎のがん化に寄与すると考えられる.我々は,通常の大腸がんも含め,慢性的な炎症ストレスシグナルがステムセルエイジングを介した発がんを導くと考え,本研究を考案した.佐藤らはこれまで不可能であった腸管上皮幹細胞培養技術の開発に成功し,幹細胞の加齢現象を細胞生物学的に追及することができる(Nature 2009, Nature Medicine 2011).既に,ヒト腸管上皮幹細胞はマウスに比し細胞ストレスに対して高い感受性をもつことを見出しており(Gastroenterology 2011),長寿命であるヒトの組織を用いたステムセルエイジング研究に着目した.本研究は加齢に伴う腸管上皮幹細胞の(エピ)ゲノム・トランスクリプトーム変化と幹細胞機能異常を包括的に理解し,加齢を誘導する分子およびシグナル機構を解明することを目的とする.

さらに,加齢分子メカニズムに基づいた人工的な加齢誘導モデルを作製し,加齢変化を抑制する全く新しい発がん予防治療の創出を目指す.また,包括的ゲノムデータを数理化し,ステムセルエイジングによる大腸がんハイリスクグループの予測を目指す.慢性炎症による発がんは本邦で発症率の高い慢性胃炎や慢性肝炎などを背景とするため,本研究の成果は我が国のライフサイエンスの進展ならびに健康長寿社会の実現につながると考える.平成26年度に計画していた,潰瘍性大腸炎患者及び健常者の臨床大腸粘膜サンプルからのオルガノイドクローン樹立ならびにエキソーム解析を8検体終了している.また,TP53変異を可視化したVillinCreER/RosaLacZ/TP53fl/flマウスにDextran Sodium Sulfateの定期的投与を行い,TP53変異腸管上皮クローンの腸炎による領域拡大への寄与を検討した.TP53変異頻度と腸炎の期間に応じて大腸がんを発症頻度が変化することを見出し,九州大学波江野共同研究者との数理モデルのためのデータ収集を行っている.現在まで,実験計画は計画通り進んでいる.腸管上皮細胞は腸内細菌や食餌抗原などの様々な異物に対するバリアーとなるとともに,`生理的炎症'に常に曝されている。このような過酷な環境において,腸管上皮幹細胞は遺伝子変異やエピゲノム変化を加齢とともに蓄積していくと考えられる。このようなステムセルエイジングは,加齢に伴う大腸がんの発症率上昇や潰瘍性大腸炎のがん化に寄与すると考えられる。我々は,通常の大腸がんも含め,慢性的な炎症ストレスシグナルがステムセルエイジングを介した発がんを導くと考え,本研究を考案した。佐藤らはこれまで不可能であった腸管上皮幹細胞培養技術の開発に成功し,幹細胞の加齢現象を細胞生物学的に追及することができる(Nature 2009, Nature Medicine 2011)。既に,ヒト腸管上皮幹細胞はマウスに比し細胞ストレスに対して高い感受性をもつことを見出しており(Gastroenterology 2011),長寿命であるヒトの組織を用いたステムセルエイジング研究に着目した。本研究は加齢に伴う腸管上皮幹細胞の(エピ)ゲノム・トランスクリプトーム変化と幹細胞機能異常を包括的に理解し,加齢を誘導する分子およびシグナル機構を解明することを目的とする。さらに,加齢分子メカニズムに基づいた人工的な加齢誘導モデルを作製し,加齢変化を抑制する全く新しい発がん予防治療の創出を目指す。また,包括的ゲノムデータを数理化し,ステムセルエイジングによる大腸がんハイリスクグループの予測を目指す。慢性炎症による発がんは本邦で発症率の高い慢性胃炎や慢性肝炎などを背景とするため,本研究の成果は我が国のライフサイエンスの進展ならびに健康長寿社会の実現につながると考える。平成26年度に計画していた,潰瘍性大腸炎患者及び健常者の臨床大腸粘膜サンプルからのオルガノイドクローン樹立ならびにエキソーム解析を15検体終了している。また,TP53変異を可視化したVillinCreER/RosaLacZ/TP53fl/flマウスにDextran Sodium Sulfateの定期的投与を行い,TP53変異腸管上皮クローンの腸炎による領域拡大への寄与を検討した。TP53変異頻度と腸炎の期間に応じて大腸がんを発症頻度が変化することを見出し,九州大学波江野共同研究者との数理モデルのためのデータ収集を行っている。現在まで,実験計画は計画通り進んでいる。腸管上皮細胞は腸内細菌や食餌抗原などの様々な異物に対するバリアーとなるとともに,`生理的炎症'に常に曝されている。
ヒト生活史の背景文脈を構成する匂いが過去の時間解釈を書き換える-その脳基盤の解明

ヒト生活史において、匂い自体がエピソードの主役であることは多くないが、匂いと結びついエピソードは多いかもしれない。例えば、2年前にピクニックで嗅いだ花の匂い。4年前に付き合っていた彼女の香水の匂い。などである。これら過去のエピソードはこころの中で時間の前後関係をもって記憶されている。想起する際に、その過去の匂いに暴露された場合、その前後関係は修飾されるのかわかっていない。我々は、行動実験で過去の匂いに暴露された条件下で想起すると、時間の前後関係に関して錯覚を起こすことが分かった。この錯覚効果を起こす脳部位を同定するためにMRI脳機能画像法を用いて調べた。まず、過去の匂いに暴露されず、錯覚を起こさず時間の前後関係を知覚する脳部位を求めた。既報に一致して海馬傍回、側頭葉、角回などが関与していると考えた。これを時間順序回路と名づけた。過去の匂いで時間順序に錯覚を起こす場合、海馬、後部帯状皮質などが活性化していることが分かった。これら活性化部位が角回と強く機能連関を持つことが分かった。一方で、角回は時間順序回路との結びつきが弱くなった。以上から、過去の匂いが海馬、後部帯状皮質を活性化させ、時間順序回路の作動を妨害する。割り込んで角回と結びつくことで錯覚を起こさせるのではないかと考えた。29年度が最終年度であるため、記入しない。などである。匂いによる過去の時間順序の錯覚効果と関係のある脳部位を同定することができた。データをさらに詳細に解析して論文で発表する予定である。などである。現段階の成果を論文で発表する。この結果をもとに新しい問いが生まれた。さらに新しい研究に発展させる。
活性化アストロサイトの神経栄養効果における細胞接着因子、細胞外マトリックスの役割

当教室では、サイトカインにより活性化されたアストロサイトが、脳損傷時の神経機能維持、再生に重要な役割を果たしていると想定し、fibroblast growth factor(FGF)、trnsforming growth factor-β1(TGF-β1)などの、脳に障害が生じた際に供給される各種サイトカインが、アストロサイトによるNGFをはじめとする様々なneurotrophic factorの産生もしくは分泌を増強することを明らかにしてきた。本年度は、これらの液性因子に加え、アストロサイト、神経細胞に発現している細胞接着因子のサイトカインによる発現調節を解明することを目的とした。2.同様にアストロサイトの初代培養を行い、その培養上清(ACM)、また上記サイトカインにて刺激した培養上清(SACM)を神経細胞の初代培養系に作用させ、1と同様にNCAMの発現を検討した。その結果、ACM,SACMでは、神経細胞に発現しているNCAMに明らかな変化は認められなかった。結論として、神経細胞に発現しているNCAMには、変化は認められなかったものの、アストロサイトに発現しているNCAMは、TGF-β1により発現調節を受けていることが明らかとなった。これにより、サイトカインにより刺激されたアストロサイトは、液性因子の産生、分泌を増強することに加え、自らに発現しているNCAM等の細胞接着因子を調節することにより、障害された神経回路網の修復に一役を担っている可能性が示唆された。