hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病治療への臨床応用を目指した骨髄由来ミクログリア様細胞移植の解析

脳内amyloid-β(Aβ)除去がアルツハイマー病(AD)の根本的治療として期待される。脳構成細胞の一つであるミクログリアはAβの貪食機能を有する。本研究では、骨髄細胞由来ミクログリア様細胞を用いたAD細胞治療法の開発に向けた研究を実施した。マウスやヒト骨髄細胞をM-CSFで刺激すると、ミクログリア様Aβ貪食細胞へと分化し、脳室内や尾静脈からの投与により、一部の細胞が脳実質内に移行した。脳室内移植では脳内のAβ量は減少したが、尾静脈移植ではAβ量の減少や空間記憶学習の改善作用は検出できなかった。ミクログリア様細胞の効率的な脳実質移行が、AD細胞治療法の開発に繋がることが期待される。アルツハイマー病は加齢を最大の危険因子としており、超高齢化社会を迎える日本において、根本的治療法を一刻も早く開発しなければならない。その根本的治療法は、アミロイドβの異常蓄積により引き起こされる神経細胞死から神経細胞を保護することであり,究極的には既に失われた神経細胞を補充し、神経ネットワークを再構築することである。本申請課題では幹細胞を用いた細胞療法の観点から、アルツハイマー病を含む神経変性疾患に対する治療戦略の開発を目指すものである。その幹細胞として骨髄細胞に着目しており、本年度の解析では神経毒(ロテノン)により引き起こされる神経細胞死に対して、骨髄に含まれる間葉系幹細胞ならびに造血幹細胞移植の効果を解析した。その結果、間葉系幹細胞ならびに造血幹細胞をロテノン投与したマウスに移植すると神経保護に作用することがわかり、さらにそのメカニズムについては、移植細胞から産生されるglialcell line-derivedneurotrophic factorのような神経栄養因子が関与することが示唆された。この成果は、骨髄由来ミクログリア様細胞の移植による細胞治療戦略の開発においても重要な知見であり、骨髄細胞から調製されるミクログリア様細胞は、アミロイドβの貪食機能だけではなく、神経栄養因子の産生により治療効果を発現する可能性が示唆され、更なる効果が期待できることがわかった。今後の移植細胞の調製について更なる工夫が考えられ、三年度目以降の解析に大変役立つ意義深い研究成果を得ることができた。高齢化が進む日本において、加齢を最大の危険因子とするアルツハイマー病の根本的治療法開発は急務の課題であり、最も期待されているアルツハイマー病の根本的治療戦略は脳内に蓄積するアミロイドβタンパク質(Aβ)の除去である。脳構成細胞の一つであるミクログリアは、Aβ貪食機能を有しており脳内Aβ除去システムの一端を担う。しかし、加齢とともにミクログリアにも老化・機能不全が誘導され、アルツハイマー病病態形成に深く関与する可能性が示唆されている。本年度はアルツハイマー病脳でのミクログリアのAβ貪食における病態に関連した機能変化について解析した。その結果、アルツハイマー病脳のAβ蓄積部位である老人斑には、核内タンパク質として知られるHigh mobility group box protein-1(HMGB1)がAβとともに沈着していることがわかり、ミクログリアのAβ1-42の貪食については細胞内への取り込みを抑制することで、Aβ1-40の貪食についてはAβの細胞内での分解を抑制することでそれぞれ貪食を阻害していることが示唆された。以上の解析から、アルツハイマー病では細胞外にHMGB1がAβとともに沈着しており、ミクログリアのAβ貪食機能を阻害することで、病態の増悪因子として働くことがわかった。この成果は、骨髄由来ミクログリア様細胞移植による細胞治療法戦略の開発においても重要な知見であり、骨髄細胞から調製されるミクログリア様細胞の貪食機能へも細胞外HMGB1が影響を与える可能性が示唆され、調製細胞のさらなる工夫や、貪食機能促進を考慮する必要があることが示唆された。今後の移植細胞の調製についての参考となり、二年度目以降の解析に大変役立つ意義深い研究成果を得ることができた。加齢を最大の危険因子とするアルツハイマー病(AD)は、少子高齢化社会が引き起こす人口問題に直結する深刻な問題である。ADの治療戦略の一つとして、アミロイドβ(Aβ)の脳内からの除去が挙げられる。我々は,脳構成細胞の一つでAβ貪食機能を有するミクログリアの脳移植がAβ除去に有効であることを以前に明らかにしている。本研究では、骨髄幹細胞からミクログリア様のAβ貪食細胞を調製し、脳内Aβ蓄積と認知機能に対する作用をモデルマウスを用いて解析することを目的に実験を行った。その結果、骨髄幹細胞がmacrophage-colony stimulatingfactor (M-CSF)存在下で、ミクログリア様のAβ貪食細胞へと分化・誘導できることがわかった。

さらに脳室内への骨髄細胞ならびに骨髄由来ミクログリア様細胞の移植により、脳内のAβ量は減少することがわかった。一方、尾静脈からの移植では、骨髄細胞の移植によって脳内Aβ量の減少傾向がみられたが、骨髄由来ミクログリア様細胞の移植では減少傾向は認められなかった。空間学習記憶障害に対する効果についても骨髄細胞の尾静脈移植により改善傾向が認められたが、ミクログリア様細胞の移植では改善傾向は認められなかった。この理由として、尾静脈からの移植ではミクログリア様細胞の脳実質への移行数が極めて少ないことが原因と考えられる。以上の結果より、末梢血管からの細胞移植では、骨髄細胞の移植が脳内Aβの除去や空間学習記憶の改善に有効であることが示唆された。しかし、脳室内移植の結果より、ミクログリア様細胞を脳実質に移行することができれば、より有効な移植細胞として利用できることも示唆された。さらに、グリア細胞からエクソソームが放出されていることがわかり、移植細胞から分泌されるエクソソームを介した治療効果が期待できる可能性も示唆された。神経科学平成25年度の年次計画通り骨髄幹細胞からミクログリア様のAβ貪食細胞をマウスに移植してその脳移行性について解析が進んでいる。採取した骨髄細胞そのものを用いた移植も並行して解析しており、細胞の移行性への影響を検討している。投与経路についても、脳室内ならび尾静脈からの投与をおこなっており、投与経路の違いによる影響も解析できつつある。しかしながら、細胞移植による脳内アミロイドβや認知機能に対する作用は解析途中であり、この点についてはさらに解析を続ける必要がある。平成24年度の年次計画通り骨髄幹細胞からミクログリア様のAβ貪食細胞が効率良く、コンスタントに調製できている。また初代培養したミクログリアと腹腔内マクロファージ、ならびに骨髄由来ミクログリア様細胞の細胞表面抗原についても解析が進んでおり、よりミクログリアに近い細胞として判断するためのマーカーとなる候補も解析できつつある。しかしながら、移植細胞から分泌されるサイトカインの解析がまた解析途中であり、この点についてはさらに解析を続ける必要がある。平成25年度に得られた結果を基に、平成26年度は投与細胞や投与経路を工夫し、より脳移行性に有利な条件で移植をおこない脳内アミロイドβや認知機能に対する作用を詳細に解析する。また、脳移行性を高める薬剤(マンニトールなど)の併用投与なども実施し、浸透圧変化を利用した血管への浸潤性の亢進による脳移行性の促進を試み、より臨床応用において効果的な移植条件を探索する。さらには神経原線維変化を発症するアルツハイマーモデルマウスへの投与をおこない、アミロイドβだけでなく、神経原線維変化に対する作用とそのメカニズムについて解析し、細胞移植療法の有用性を評価する。平成24年度に得られた結果を基に、平成25年度はin vivoの解析を実施する。具体的には野生型マウスやラットを用い、移植細胞の脳移行性を解析する。また、Aβ海馬内投与ラット(ADモデルラット)やPS/APPマウスを用い脳内Aβ量の変化についてELISAにより解析する。さらに、記憶障害についてもモーリス水迷路を用いて解析することで、ヒトへの応用を意識したより臨床に近い解析を実施する。
GM-CSF遺伝子導入肺癌細胞の抗腫瘍効果に関わる樹状細胞重要因子の同定

GM-CSFによる抗腫瘍効果誘導メカニズムの解明を目的とし、GM-CSF遺伝子導入肺癌細胞のマウス皮下接種後の拒絶過程における所属リンパ節中樹状細胞(GM-DCs)の網羅的遺伝子発現解析をマイクロアレイ法を用いて施行した。その結果、I型インターフェロン産生形質細胞様樹状細胞(pDCs)関連遺伝子の有意な発現変動が確認された。また、pDCs欠失実験、TLR7アゴニスト併用in vivo実験結果よりpDCsが上記抗腫瘍効果の中心的役割を果たしている事が示唆された。本研究は、十分な免疫学的小薄用効果を発揮することが示されている非伝播型センダイウィルスベクター(SeV)を用いた、GM-CSF遺伝子導入LLC細胞(LLC/SeV/GM)の抗腫瘍免疫誘導メカニズムを明らかにすることである。その方法としてLLC/SeV/GM接種後の野生型マウス所属リンパ節における活性化樹状細胞と腫瘍抗原特異的細胞傷害性T細胞の誘導に関連のある遺伝子群の同定及び機能的解析を分子学的あるいは細胞学的観点からアプローチした。1.LLC/SeV/GM接種群および対照群マウスの所属リンパ節容積の経時的変化の測定により、LLC/SeV/GM接種群において接種から4日後のリンパ節容積が最大となった。2.LLC/SeV/GM接種群および対照群マウス由来の樹状細胞と野生型マウス由来のT細胞を用いたリンパ球混合培養試験により、腫瘍接種から2日後と4日後のT細胞増殖能を測定したところ、2日後、4日後いずれの場合もCD8陽性T細胞を有意に増殖した。特に接種2日後にその差が著明であった。3.LLC/SeV/GM群及び対照群マウス由来樹状細胞の成熟度解析により、LLC/SeV/GM群においては細胞接種から2日後にDCの成熟マーカーであるCD80, CD86, MHCクラス1分子の発現が上昇していた。以上の結果から、GM-CSF活性化樹状細胞によるリンパ球刺激能が最大になるのは腫瘍接種から2日目で、この時期にGM-CSF活性化樹状細胞がCD8陽性T細胞の増殖・活性化を促進することで抗腫瘍効果を発揮することが示唆された。また、GM-CSF活性化樹状細胞の刺激による免疫系の活性化は腫瘍接種から4日目に最大となり、以降は退縮すると考えられる。次年度はこの知見を元に炎症性サイトカイン解析、in vivoにおけるT細胞のdepletion実験およひマイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行う予定である。本研究は、癌に対する新規GVAX療法の開発のため、GM-CSF感作樹状細胞によるT細胞プライミングに関与する樹状細胞重要因子をcDNAマイクロアレイにて同定することを目的とした。我々は、マウス肺癌細胞LLCに非伝播型センダイウィルスベクター(SeV)を用いてGM-CSF遺伝子を導入したLLC/SeV/GMをマウスの右側腹部に皮下接種した際、有意に腫瘍形成が抑制されることを明らかにした。また、LLC接種より2日後にT細胞プライミング能が最大となることを前年度に明らかにした。
Ｇタンパク質共役受容体と疾患：シグナルクロストークの制御と創薬展望

本研究では、Gタンパク質共役受容体(GPCR)シグナル伝達の細胞内/細胞間クロストークを解明し、シグナル制御に基づく治療法開発を展望している。1)Gs・Gq/13共役受容体間のGPCRシグナルクロストーク:本シグナルクロストークは、種々の生理機能の巧緻調節に関与することが明らかとなってきている。本研究では、(1)内分泌疾患で発見されたGs共役GPCR変異の機能異常を解析し病態の分子メカニズムを明らかにするとともに、これをrescueする薬理学的シャペロンとして機能する薬剤の作用メカニズムを解析し(Vitam & Horm 2019)、さらにこれらの知見を基盤とした臨床研究による解明を継続中である。(2) Gq/i/13共役受容体に作用する疾患原因自己抗体の作用メカニズム解析と受容体に対するpositive allosteric modulator (PAM)による治療的制御を臨床・研究両面で明らかにし(JCI Insight 2019)、現在さらに疾患とその解析データの蓄積を継続している。2)GRK2ニトロシル化とメタボリックシンドローム(METS)モデルでのシグナルクロストーク:私共はGPCRの脱感作に関与するGRK2のニトロシル化による抑制を明らかにしてきた。今年度は、(1)脂肪細胞を中心とするシグナルクロストークの解析を基盤に、(2)ニトロシル化誘導化合物アナログによる脂肪分解作用を細胞およびマウス動物実験で解析中である(学会発表、特許申請へ)。3)構造解析進歩に基づくメカニズム解明と制御ツール展望:GPCR活性化モデルと疾患変異解析を統合して作用分子メカニズムのin silico解析を継続しており(経過学会発表)、今後の制御ツール作成を展望している。GPCRシグナルの高次調節機能を担う細胞内/細胞間クロストークの詳細を明らかにし、シグナル制御による疾患に対する治療法開発をめざすという観点で研究を行っている。1)臓器保護/臓器障害に関与するGs・Gq/13共役受容体のクロストークとその場であるRho制御解明と応用:私共は、Gq/G13共役受容体に対するGs共役受容体シグナルのクロストークを検討し、以前から指摘されているRhoのリン酸化ではなくRhoGDIのリン酸化が活性型Rhoの抑制を介してシグナル抑制のに作用することを明らかにした。現在、Rhoのリン酸化は細胞内でどのように調節されるかを検討している。Rhoの翻訳後修飾との相関・クロストークにによって調節される可能性を発見した。また、疾患におけるGs共役受容体の変異解析の一環で新たな変異を発見するとともに変異による機能障害を回復させる薬理学的シャペロンとして機能する薬剤を明らかにし、論文として発表した。2)GRK2ニトロシル化(NO化)と脱感作抑制をターゲットとする創薬の展望:私共は、GPCRの脱感作を担うGRK2のNO化が、GRK2の活性を抑制し、その結果脱感作を抑制することを明らかにしてきた。そのツールとして作成したNO化化合物の構造活性相関を検討し、GRK2上のシステインの中でcys174が特異的な作用点となることがあきらかとなった。さらに、具体的な場として、脂肪細胞を用いた検討で、β受容体による脂肪酸産生を増強することが観察された。NO化を指標とする構造活性相関との比較検討を行っており、脂肪分解を増強する創薬への貢献が期待される。3)炎症モデルへの応用:ARBのインバースアゴニスト作用及び抗炎症作用について比較検討を行い、論文として発表した。(1)Gs共役受容体シグナルとGq/G13シグナルのクロストークのメカニズムを明らかにしつつある。(3)GPCR脱感作を制御するGRK2のNO化を生じる合成化合物の作用を検討している。(4)炎症モデルにおいてARBの作用を明らかにした(EJ 63:507, 2016)Gタンパク質共役受容体(GPCR)シグナル伝達の細胞内/細胞間クロストークを解明し、シグナル制御に基づく治療法開発をめざして研究を行っている。1)GPCRクロストーク:(1)臓器障害・保護を担うGs・Gq/13共役GPCRのクロストークとポイントとなるRho制御:私共は、Gq/G13共役GPCRへのGs共役GPCRのクロストークを解析、Rhoのリン酸化ではなくR hoGDIのリン酸化が活性型Rhoの抑制を介してシグナル抑制のに作用することを明らかにした。現在、Rhoの翻訳後修飾との相関・クロストークにによって調節される可能性を発見し、本修飾へのstatinの効果と局在シグナルへの影響を確認した。(2)さらに、内分泌疾患で発見されたGs共役GPCR変異の解析制御の過程で、薬理学的シャペロンとして機能する薬剤によるrescue現象を明らかにし、臨床試験を行っている。2)METSモデルでの細胞間シグナルクロストークの解析:(1)マクロファージ・脂肪細胞間のシグナルクロストークを明らかにした。(2)脂肪細胞の脂肪融解へのニトロシル化誘導化合物とそのアナログの効果を検討中である。脂肪分解を増強する創薬への貢献が期待され、現在特許出願の準備を進めている。3)構造解析の進歩によるメカニズム解明と制御ツール作成の展望:GPCR活性化モデルを疾患で明らかになった変異からの知見とin silicoでの検討を組み合わせて検討を行っている。活性化メカニズムの詳細を理解することは、制御ツール作成へと貢献してゆくことが期待される。(1)GPCRクロストークポイントであるRhoの制御と翻訳後修飾制御の相関を明らかにしつつある。

(2)METSモデルでの細胞間クロストーク、脂肪融解を制御する化合物をスクリーニングしている。また、動物モデルでの検討の基礎研究を行っている。(3)GPCR活性化のメカニズムの解明をを疾患変異とin silico解析に基づいて進行中である。本研究では、Gタンパク質共役受容体(GPCR)シグナル伝達の細胞内/細胞間クロストークを解明し、シグナル制御に基づく治療法開発を展望している。1)Gs・Gq/13共役受容体間のGPCRシグナルクロストーク:本シグナルクロストークは、種々の生理機能の巧緻調節に関与することが明らかとなってきている。本研究では、(1)内分泌疾患で発見されたGs共役GPCR変異の機能異常を解析し病態の分子メカニズムを明らかにするとともに、これをrescueする薬理学的シャペロンとして機能する薬剤の作用メカニズムを解析し(Vitam & Horm 2019)、さらにこれらの知見を基盤とした臨床研究による解明を継続中である。(2) Gq/i/13共役受容体に作用する疾患原因自己抗体の作用メカニズム解析と受容体に対するpositive allosteric modulator (PAM)による治療的制御を臨床・研究両面で明らかにし(JCI Insight 2019)、現在さらに疾患とその解析データの蓄積を継続している。2)GRK2ニトロシル化とメタボリックシンドローム(METS)モデルでのシグナルクロストーク:私共はGPCRの脱感作に関与するGRK2のニトロシル化による抑制を明らかにしてきた。今年度は、(1)脂肪細胞を中心とするシグナルクロストークの解析を基盤に、(2)ニトロシル化誘導化合物アナログによる脂肪分解作用を細胞およびマウス動物実験で解析中である(学会発表、特許申請へ)。3)構造解析進歩に基づくメカニズム解明と制御ツール展望:GPCR活性化モデルと疾患変異解析を統合して作用分子メカニズムのin silico解析を継続しており(経過学会発表)、今後の制御ツール作成を展望している。(1)RhoおよびRhoGDIのリン酸化によるシグナル制御と相互作用によるクロストークを明らかにする(当初計画通り)。(2)脱感作抑制とGRKのニトロシル化作用を有する合成化合物の構造活性相関を検討する。(3)炎症モデルでの検討を進めるとともに、GPCRシグナル制御を構造解析の視点から解析し、創薬を展望する。1)GPCRシグナルクロストークについて、細胞レベルおよび動物モデルで解析を進めてゆく。2)METSモデルでの細胞間クロストークの詳細と脂肪融解シグナルおよびこれを担う化合物開発を進める(予定通り)。3)構造解析に基づくGPCRによるGタンパク質活性化解明と制御ツール開発を進める。研究時期が年度後半からに集中したためと、一部の購入物品の納入が年度をまたいだため。年度後半に使用予定が多かったものが年度を超えることとなった。最終年度(H30年度)の実験計画を遂行する際に使用する予定。1)後ろ倒しとなった研究に対して物品費の使用が予定されている。
形状・空間配置情報を用いた内容検索を可能とする画像データベースシステムの開発

画像データベースシステムでは、視覚的な情報を大量に蓄積、管理すると同時に、利用者に対しそのアプリケーションに適した視覚的なインタフェースを提供することで情報を効率良く提供することが期待される。昨年度は特定のアプリケーション(水墨画の検索)を対象とした検索インタフェースについて検討を行い、明暗強調による画像オブジェクトの抽出とその空間配置情報の類似性による画像の内容検索を実装し、本研究の有効性を確認した。本年度は、画像データベースの機能を拡張すべく、一般画像からオブジェクトを抽出し画像内におけるオブジェクトの空間的な配置関係を把握する手法を確立した。即ち、二次平面で表現される画像の空間配置を人間が認識する場合、視覚系の特性に依存した複雑な処理機構により認識される。本研究では、この視覚系のモでル化を行い、画像に対する階層的モジュール構成の処理機構を構築した。さらにこの処理機械を用いて、データ入力段階において一般画像からのオブジェクトとその空間配置を抽出することで、利用者からの柔軟な検索を可能とする方式を開発した。実際に一般画像として大規模衛星画像を対象としてデータベースを構築し、雲、海岸線、陸地、海面等をオブジェクトとし、その配置情報をデータベースの属性に加えたシステムを実現した。このシステム上では、問合せをグラフ構造で記述することによりオブジェクトの空間配置の類似性に基づく画像の内容検索を実現し、画像中のオブジェクトまたは得られたオブジェクトの形状・空間配置等に関する情報を統合的に利用して(例えば、雲海の状態とその時の陸地の配置)、多量のデータの中から類似の衛星画像(例えば、快晴の画像)の検索を行うことを可能とした。本研究において確立した視覚系モデルによる一般画像からのオブジェクト抽出方式と空間配置情報による検索方式の有効性を確認することが出来た。画像デ-タベ-スシステムは,利用者とシステムとの間に視覚的なインタ-フェ-スを備え,優れたコミュニケ-ションおよび記録のメディアである視覚的な情報を大量に蓄積・管理して,利用者が求める情報を効率よく提供することが期待される。現在までにリモ-トセンシング画像,医用画像,文書画像,地形図などを対象として,文字・数値型デ-タ向きのデ-タベ-スに画像デ-タを統合した画像蓄積・検索システムが提案されてきた。視覚的な情報を多く含む絵画等の画像デ-タに対しても同様なシステムが構築されているが,この種の画像デ-タに特徴的な画像内容に依存した検索手法を実現するシステムについて検討された例は少ない。本研究の目的は,一般画像からオブジェクトを抽出して画像内における空間的な配置関係を把握する手法を確立すること,さらにこの情報をデ-タベ-スの属性に加えてオブジェクトの空間配置の類似性に基づく画像の内容検索を実現することにある。本年度は画像デ-タベ-スに対する検索インタフェ-スについての検討進め,従来の様なキ-ワ-ド方式ではなく,画像のオブジェクトフィ-チャによる内容検索的なアプロ-チについて検討した。生体の視覚系には,ある条件のもとで実際の物理刺激とは異なった見え方を示す特性例えば,水墨画や点描画などでは,同じ輝度でも周囲の輝度刺激により見かけの明るさが違ったり実際には存在しない図形や輪郭線を知覚するという現象がある。実際に,水墨画を対象としてシステムを実装し,このような視覚特性の一つである明暗強調により生じる明暗差が効果的な表現法となっていることを検証するとともに水墨画画像デ-タベ-スに対し本研究の有効性を確認した。画像データベースシステムでは,視覚的な情報を大量に蓄積,管理すると同時に,利用者に対しそのアプリケーションに適した視覚的なインタフェースを提供することで情報を効率良く提供することが期待される。昨年度は特定のアプリケーション(水墨画の検索)を対象とした検索インタフェースについて検討を行い,明暗強調による画像オブジェクトの抽出とその空間配置情報の類似性による画像の内容検索を実装し,本研究の有効性を確認した。

本年度は,画像データベースの機能を拡張すべく,一般画像からオブジェクトを抽出し画像内におけるオブジェクトの空間的な配置関係を把握する手法を確立した。即ち,二次平面で表現される画像の空間配置を人間が認識する場合,視覚系の特性に依存した複雑な処理機構により認識される。本研究では,この視覚系のモデル化を行い,画像に対する階層的モジュール構成の処理機構を構築した。さらにこの処理機構を用いて,データ入力段階において一般画像からのオブジェクトとその空間配置を抽出することで,利用者からの柔軟な検索を可能とする方式を開発した。実際に一般画像として大規模衛星画像を対象としてデータベースを構築し,雲,海岸線,陸地,海面等をオブジェクトとし,その配置情報をデータベースの属性に加えたシステムを実現した。このシステム上では,問合せをグラフ構造で記述することによりオブジェクトの空間配置の類似性に基づく画像の内容検索を実現し,画像中のオブジェクトまたは得られたオブジェクトの形状・空間配置等に関する情報を統合的に利用して(例えば,雲海の状態とその時の陸地の配置),多量のデータの中から類似の衛星画像(例えば,快晴の画像)の検索を行うことを可能とした。本研究において確立した視覚系モデルによる一般画像からのオブジェクト抽出方式と空間置情報による検索方式の有効性を確認することが出来た。
分子標的を用いた癌早期発見と癌二次予防の前臨床研究

腫瘍促進因子FEATタンパクがほとんどのヒト癌の細胞質で異常に増加し、患者の血中に漏出していることを見出した。この発見に基づいて、血中FEATを高感度で検出して癌化を早期発見し、FEAT活性を阻害する薬剤で癌化を停止する方法論を着想した。FEATの欠失で発癌が抑制されるかを明らかにするために、コンディショナル・ノックアウトマウスを作出する。International Mouse Phenotype Consortium(IMPC)のKnockout-Mouse Program (KOMP)よりターゲティングベクターを購入した。がん研究ネットワークメンバーに対する「個体レベルでのがん研究支援活動」の協力を得て、コンディショナル・ノックアウトマウス作出を試みたが、不成功に終わった。原因はES細胞の質が低いためと考えられた。今年度は、この技術的問題を克服するために、株式会社トランスジェニックに受託し再挑戦した。生殖系列移行効率が高く戻し交配(backcross)の不要なRENKA株のES細胞を用い、相同組換えの起ったES細胞を選別し、凝集法によりキメラマウスを得た。キメラマウスを自然交配し、ヘテロ接合型マウス取得を確認し、凍結胚を保存した。今後、ヘテロ接合型マウスの雌雄を交配してホモ接合型マウスを得る。この発癌モデルマウスとホモ接合型マウスとを交配後に、組織特異的Cre発現マウスと交配することで、種々の組織における発癌が、FEAT欠失で抑制されるか解剖、組織のHE染色、免疫組織染色などで明らかにしたい。【研究目的】我々は、腫瘍促進因子FEATタンパクがほとんどのヒト癌の細胞質で早期癌の段階から異常に増加していることを見出した。この発見に基づき、FEAT活性を阻害する薬剤で癌化を停止する方法論を着想し、当研究では癌予防法の研究開発を行う。(1)遺伝子改変マウスを用いて、FEATを標的とした癌予防の妥当性を検証する。(2)FEAT結合タンパクを基質として用いるFEAT酵素活性アッセイキットを用いて、FEAT阻害剤を同定し、癌化を早期に停止させる薬剤の開発を目ざす。【研究実施状況】1)FEATコンディショナル・ノックアウトマウスの作出がん研究ネットワークメンバーに対する「個体レベルでのがん研究支援活動」の支援を得て作出した相同組換えの起った4クローンのES細胞のゲノムを、PCR及びoutside, inside, neo probeを用いた確認のためのサザン・ブロッティングで解析し、2クローンを選別した。文部科学省新学術領域「先端モデル動物プラットフォーム」の支援を得て、マウス胚盤胞期胚へ注入し、仮親の子宮へ移植してキメラマウスを得る作業を開始した。2)FEAT酵素活性アッセイキットの作成コールドショック発現系pCold IIベクター(Takara)を用い、大腸菌Chaperone Competent BL21 Cell (Takara)にFEATを発現させ、テトラサイクリンとIPTGの濃度を最適化した結果、可溶性のHisタグ融合FEATを得た。非変性条件でCo2+レジンよりもNi2+レジンに結合しやすいとがわかり、TALON Metal Affinity Resin(Clontech)からNi-NTA Agarose(Qiagen)に変更し、精製条件を再検討中である。1)ES細胞のゲノムをサザン・ブロッティングで解析する際に、検出する断片のサイズが大きいための技術上の困難2)Hisタグ融合FEATの凝集しやすさ腫瘍促進因子FEATタンパクがほとんどのヒト癌の細胞質で異常に増加し、患者の血中に漏出していることを見出した。International Mouse Phenotype Consortium(IMPC)のKnockout-Mouse Program (KOMP)よりターゲティングベクターを購入し、がん研究ネットワークメンバーに対する「個体レベルでのがん研究支援活動」の協力を得て、マウスES細胞に導入し、240個のneo耐性ES細胞を拾い上げ、PCRで27クローンが陽性で、サザンブロッティングで4クローンの相同組換えES細胞を同定した。2クローン(#7, #144)のES細胞をマウス胚盤胞期胚へ注入し仮親の子宮へ移植してキメラ率5-10%のオスのキメラマウス(#7, 7匹、#144, 3匹)を得た。精子を人工授精で正常C57BL/6系統と交配したが、#7系統より生まれた441匹、#144系統より生まれた183匹は全てブラックで、agoutiは1匹も得られなかった。FEATノックアウトマウス作出は、Mettl13+/ーマウスが不妊で成功しなかった。コンディショナル・ノックアウトマウス作出は、現在までのところ成功していない。原因はES細胞の質が低いためと考えられる。

がん研究ネットワークメンバーに対する「個体レベルでのがん研究支援活動」の協力を得て、コンディショナル・ノックアウトマウス作出を試みたが、不成功に終わった。原因はES細胞の質が低いためと考えられた。今年度は、この技術的問題を克服するために、株式会社トランスジェニックに受託し再挑戦した。生殖系列移行効率が高く戻し交配(backcross)の不要なRENKA株のES細胞を用い、相同組換えの起ったES細胞を選別し、凝集法によりキメラマウスを得た。キメラマウスを自然交配し、ヘテロ接合型マウス取得を確認し、凍結胚を保存した。今後、ヘテロ接合型マウスの雌雄を交配してホモ接合型マウスを得る。この発癌モデルマウスとホモ接合型マウスとを交配後に、組織特異的Cre発現マウスと交配することで、種々の組織における発癌が、FEAT欠失で抑制されるか解剖、組織のHE染色、免疫組織染色などで明らかにしたい。1)FEATコンディショナル・ノックアウトマウスの作出と発癌の解析キメラマウスを正常C57BL/6系統と交配し、PCRとサザン・ブロッティングによりヘテロ接合型マウスを同定する。ヘテロ接合型マウスの雌雄を交配してホモ接合型マウスを得る。CAGプロモーターでCreリコンビナーゼを発現するマウスと、FEATコンディショナル・ノックアウトマウスとを交配し、FEATノックアウトマウスを作出する。表現型の解析として、解剖、組織切片のHE染色・顕微鏡観察、血清生化学的検査を行う。発癌モデルマウスと組織特異的FEATノックアウトマウスとを交配して、発癌がFEAT欠損によって抑制または遅延されるかを観察する。FEAT欠失によって発癌がどのように影響を受けるかを、解剖、HE染色組織の顕微鏡観察などで明らかにする。2)FEAT阻害剤の同定FEAT結合タンパクをGST融合タンパクとして大腸菌に発現して精製し、基質として用い、メチル転移反応時に発生する蛍光を検出するアッセイ法を樹立する。このFEAT酵素活性アッセイキットを用いて、京都大学大学院医学研究科の医学研究支援センター「創薬拠点コアラボ」の化合物ライブラリーをスクリーニングして、阻害物質を同定する。FEAT阻害物質をマウスに投与する毒性試験を行う。重篤な毒性の無いFEAT阻害剤が得られたら、それを発癌モデルマウスに投与し、薬剤による発癌抑制効果を調べる。ES細胞の質が低い技術的問題を克服するために、株式会社トランスジェニック社に受託し、生殖系列移行効率が高く戻し交配(backcross)不要なRENKA株のES細胞を用いて、コンディショナル・ノックアウトマウスを作出する。相同組換えの起ったES細胞の作出、マウス胚盤胞期胚への注入によるキメラマウスの作製、ヘテロマウスの作製までを同社で行う。
胎生期のsubplate neuron損傷が脳の成長発達に与える影響の解析

極低出生体重児における中枢神経系合併症の病像は近年大きな変化を遂げてきた.1990年代に注目された脳室内出血や嚢胞性脳白質損傷などの組織破壊性病変は母胎管理ならびに新生児集中治療の発達に伴って著しく減少した.その一方で,核磁気共鳴像(MRI)を用いた詳細な画像解析の導入によって,びまん性脳白質損傷,脳灰白質容量の減少,脳回形成異常など,明らかな組織破壊を伴わず脳の構造的発達を変容させる病変が臨床現場で徐々に認識され始めている本研究では,胎児期に大脳の皮質白質境界に存在して皮質形成に重要な役割を果たしているsubplate neuronに注目し,ヒツジ胎仔の慢性実験系を用いて,胎児期の炎症もしくは虚血がsubplate neuronの発達過程に与える影響を解析する.同時に,これら胎児期の炎症や虚血の結果として,これまで注目されてきた脳白質損傷のような組織損傷による脳障害だけではなく,大脳皮質の容量減少や脳回形成異常など正常な脳の発達とは異なった「脳発達の変容」に近い病変が誘導されるか,組織病理像とMRI画像に基づいて検討する.平成29年度には7.0 teslaのMRI装置によって解像度とコントラストのよい画像が得られており,subplate neuron層の同定が可能であった.またMRI画像を用いて大脳皮質及び白質の容量測定と脳表面積測定,並びにsubplate neuron層の容量測定を行っている.平成30年度には妊娠95日(ヒト妊娠25週相当)のヒツジを用いて8回の実験を計画したが,2回は受胎が得られず,3回は子宮内胎仔死亡となり実験を完遂できなかった.そのため合計3回(いずれも炎症負荷群)の実験から剖検組織を得た.平成30年度には妊娠95日(ヒト妊娠25週相当)のヒツジを用いて8回の実験を計画したが,2回は受胎が得られず,3回は子宮内胎仔死亡となり実験を完遂できなかった.そのため合計3回の実験から剖検組織を得るにとどまった.来年度は統計学的に解析可能な数のデータを取得できるように実験を計画する.またsubplate neuron層における神経細胞全般を神経細胞の特異抗体Neu-Nで免疫染色し,またその中のsubplate neuronを特異抗体であるNurr-1で染色することによって,subplate neuron層における神経細胞全般とsubplate neuronの密度解析を行ってsubplateneuronの損傷を解析する.極低出生体重児における中枢神経系合併症の病像は近年大きな変化を遂げてきた.近年,脳室内出血や嚢胞性脳白質損傷などの組織破壊性病変は母胎管理や新生児集中治療の発達に伴って著しく減少した.一方で脳MRIを用いた画像解析によって,びまん性脳白質損傷,脳灰白質容量の減少,脳回形成異常など,明らかな組織破壊を伴わず脳の構造的発達を変容させる病変が認識され始めている.本研究では,胎児期に大脳の皮質白質境界に存在して皮質形成に重要な役割を果たしているsubplate neuronに注目し,ヒツジ胎仔の慢性実験系を用いて,胎児期の炎症,虚血,グルココルチコイド負荷がsubplate neuronの発達過程に与える影響を解析する.同時に,これら胎児期の炎症,虚血,グルココルチコイド負荷の結果として,脳白質損傷のような組織損傷による脳障害だけではなく,大脳皮質の容量減少や脳回形成異常などの構造的発達を変容させる病変が誘導されるか,組織病理像とMRI画像に基づいて検討する.平成29年度には妊娠95日のヒツジ胎仔7頭を用いて慢性実験系を計画したが,2回は受胎が得られなかったため,5回の実験を行った.妊娠105日にグルココルチコイド群(n=2),炎症負荷群(n=1),sham群(n=2)の脳MRI撮影と組織解析を行った.7.0 teslaのMRI装置によって解像度とコントラストのよい画像が得られており,subplate neuron層の同定が可能であった.またMRI画像を用いて大脳皮質及び白質の容量測定と脳表面積測定,並びにsubplate neuron層の容量測定を行っている.今後はsubplate neuron層における神経細胞全般を神経細胞の特異抗体Neu-Nで免疫染色し,またその中のsubplate neuronを特異抗体であるNurr-1で染色することによって,subplate neuron層における神経細胞全般とsubplate neuronの密度解析を行ってsubplateneuronの損傷を評価する.平成29年度には7回の実験を計画したが,2回は受胎が得られなかったため,データを取得できたのは5回であった.極低出生体重児における中枢神経系合併症の病像は近年大きな変化を遂げてきた.1990年代に注目された脳室内出血や嚢胞性脳白質損傷などの組織破壊性病変は母胎管理ならびに新生児集中治療の発達に伴って著しく減少した.

その一方で,核磁気共鳴像(MRI)を用いた詳細な画像解析の導入によって,びまん性脳白質損傷,脳灰白質容量の減少,脳回形成異常など,明らかな組織破壊を伴わず脳の構造的発達を変容させる病変が臨床現場で徐々に認識され始めている本研究では,胎児期に大脳の皮質白質境界に存在して皮質形成に重要な役割を果たしているsubplate neuronに注目し,ヒツジ胎仔の慢性実験系を用いて,胎児期の炎症もしくは虚血がsubplate neuronの発達過程に与える影響を解析する.同時に,これら胎児期の炎症や虚血の結果として,これまで注目されてきた脳白質損傷のような組織損傷による脳障害だけではなく,大脳皮質の容量減少や脳回形成異常など正常な脳の発達とは異なった「脳発達の変容」に近い病変が誘導されるか,組織病理像とMRI画像に基づいて検討する.平成29年度には7.0 teslaのMRI装置によって解像度とコントラストのよい画像が得られており,subplate neuron層の同定が可能であった.またMRI画像を用いて大脳皮質及び白質の容量測定と脳表面積測定,並びにsubplate neuron層の容量測定を行っている.平成30年度には妊娠95日(ヒト妊娠25週相当)のヒツジを用いて8回の実験を計画したが,2回は受胎が得られず,3回は子宮内胎仔死亡となり実験を完遂できなかった.そのため合計3回(いずれも炎症負荷群)の実験から剖検組織を得た.平成30年度には妊娠95日(ヒト妊娠25週相当)のヒツジを用いて8回の実験を計画したが,2回は受胎が得られず,3回は子宮内胎仔死亡となり実験を完遂できなかった.そのため合計3回の実験から剖検組織を得るにとどまった.来年度は統計学的に解析可能な数のデータを取得できるように実験を計画する.また免疫染色を実施し,subplate neuronの密度解析を行ってsubplateneuronの損傷を評価する.来年度は統計学的に解析可能な数のデータを取得できるように実験を計画する.またsubplate neuron層における神経細胞全般を神経細胞の特異抗体Neu-Nで免疫染色し,またその中のsubplate neuronを特異抗体であるNurr-1で染色することによって,subplate neuron層における神経細胞全般とsubplate neuronの密度解析を行ってsubplateneuronの損傷を解析する.平成29年度には妊娠95日のヒツジ胎仔7頭を用いて慢性実験系を計画したが,2回は受胎が得られなかったため,データを収集できたのは5回であった.そのため残額が生じた.次年度は当初予定していたよりも実験数を増やす必要があるため,その際の薬品や消耗品の購入代金に残額を使用する.平成30年度には妊娠95日(ヒト妊娠25週相当)のヒツジを用いて8回の実験を計画したが,2回は受胎が得られず,3回は子宮内胎仔死亡となり実験を完遂できなかった.そのため合計3回の実験からデータを得るにとどまった.そのため必要とした薬品や消耗品代金が少なく残額が生じた.次年度は当初の予定よりも実験数を増す必要があるため,生じた残額はその必要物品の購入費とする.
アディポネクチン及びアディポネクチン受容体を介した糖尿病治療薬・食品の開発

現在、激増している糖尿病は、心筋梗塞・脳卒中発症のリスクを増大させる。当研究室では、アディポネクチン(Ad)が糖尿病の鍵分子であることを見出し(Nature Medicine7,941-946,2001)、その受容体を世界に先駆けて単離・同定した(Nature 423,762-769,2003)。さらにその受容体欠損マウスの解析により、Adとその受容体がインスリン抵抗性を改善させることを明らかにした(Nature Medicine,13,332-339)。本研究では、(1)Ad受容体の特異的アゴニストを植物(果物・野菜)から抽出・精製し糖尿病の根本的治療薬・食品を開発する。既に、植物ペプチド、オスモチンが、立体構造上Adと相同性を持ち、受容体に結合してAMPKを活性化すること(Molecular Cell,17,171-180,2005)を明らかにした。平成20年度では、野菜・果実由来の素材の中から、AMPKを活性化する物質をスクリーニングし、候補物質を絞り、再現性を確認した。現在、有効成分について、同定を行っている。また、(2)Ad遺伝子の鍵転写調節因子であ新規Znフィンガー型転写因子Debl(Diabetes-relatad element binding protein)を脂肪細胞特異的に活性化する糖尿病・メタボリック症候群の根本的治療薬・食品を開発する。当研究室が同定した転写因子Deblの発現が肥満・糖尿病で低下することによりAdの発現が低下することから、Debl発現低下を抑制する薬剤が糖尿病の根本的治療薬・食品と成り得ることを明らかにした。また、Deblの発現が肥満に伴う酸化ストレスや炎症、ホルモンの変化によって抑制されることから、脂肪細胞特異的な抗酸化・抗炎症薬・食品が、Adの血中レベルを高めることにより、糖尿病の根本的治療法として有用である可能性が高い。平成20年度では、Adの血中レベルを上げる物質をスクリーニングし、再現性を確認し、有効成分について、同定を開始した。罹患者数が約740万人にものぼる糖尿病は、心筋梗塞・脳卒中発症のリスクを増大させ国民の健康をおびやかしている。当研究室では、アディポネクチンが糖尿病の鍵分子であることを見出し(Nature Medicine 7,941-946,2001)、その受容体を世界に先駆けて単離・同定した(Nature 423,762-769,2003)。さらにの受容体欠損マウスの解析により、アディポネクチンとその受容体がインスリン抵抗性を改善させることを明らかにした(Nature Medicine,13,332-339)。本研究では、(1)アディポネクチン受容体の特異的アゴニストを植物(果物・野菜)から抽出・精製し糖尿病の根本的治療薬・食品を開発する。既に、酵母におけるホモログのリガンドである植物ペプチド、オスモチンが、立体構造上アディポネクチンと相同性を持ち、受容体に結合してAMPキナーゼを活性化すること(Molecular Cell,17,171-180,2005)(特許出願:A homolog of human adiponectin receptor controls osmotin-induced apoptosis in yeast)を明らかにした。まず、オスモチンとそのファミリー物質をAMPキナーゼ活性化能を指標として果物・野菜からスクリーニングし抽出する。平成18年度では、野菜・果実由来の素材の中から、AMPKを活性化する物質をスクリーニングすることができた。さらに候補分子を挙げるためにスクリーニングを遂行していると共に、AMPK活性化能をもった素材については再現性を確認している.また、(2)アディポネクチン遺伝子の鍵転写調節因子である新規Znフィンガー型転写因子Deb1 (Diabetes-related element binding protein)を脂肪細胞特異的に活性化する糖尿病・メタボリック症候群の根本的治療薬・食品を開発する。当研究室が同定した転写因子Deb1の発現が肥満・糖尿病で低下することによりアディポネクチンの発現が低下することから、Deb1発現低下を抑制する薬剤が糖尿病の根本的治療薬・食品と成り得ることを明らかにした(特許出願:Agents for inducing expression of adiponectin:出願番号60/557,708)。また、Deb1の発現が肥満に伴う酸化ストレスや炎症、ホルモンの変化によって抑制されることから、脂肪細胞特異的な抗酸化・抗炎症薬・食品が、アディポネクチンの血中レベルを高めることにより、糖尿病の根本的治療法として有用である可能性が高い。まず、これまで知られている抗酸化・抗炎症剤でDeb1活性を促進し、脂肪組織への特異的な組織移行がよいものをスクリーニングする。平成18年度では、スクリーニングの系を確立しつつ、有用な候補分子を探索してきている。さらにその受容体欠損マウスの解析により、アディポネクチンとその受容体がインスリン抵抗性を改善させることを明らかにした(Nature Medicine,13,332-339)。

既に、酵母におけるホモログのリガンドである植物ペプチド、オスモチンが、立体構造上アディポネクチンと相同性を持ち、受容体に結合してAMPキナーゼを活性化すること(Molecular Cell,17,171-180,2005)(特許出願:A homolog of human adiponectin receptor controls osmotin-induced apoptosis in yeast)を明らかにした。まず、オスモチンとそのファミリー物質をAMPキナーゼ活性化能を指標として果物・野菜からスクリーニングし抽出する。平成19年度では、野菜・果実の由来の素材の中から、AMPKを活性化する物質をスクリーニングすることができた。細胞レベルだけでなく、個体レベルでもそれらの物質の効果を検討し、実験動物においてもその効果を発揮する有望候補物質をあげることができている。さらに候補分子を挙げるためにin vitro及びin vivoスクリーニングを遂行していると共に、AMPK活性化能をもった物質ついては再現性を確認している。また、(2)アディポネクチン遺伝子の鍵転写調節因子である新規Znフィンガー型転写因子Deb1(Diabetes-related element binding protein)を脂肪細胞特異的に活性化する糖尿病・メタボリック症候群の根本的治療薬・食品を開発する。当研究室が同定した転写因子Deb1の発現が肥満・糖尿病で低下することによりアディポネクチンの発現が低下することから、Deb1発現低下を抑制する薬剤が糖尿病の根本的治療薬・食品と成り得ることを明らかにした(特許出願:Agents for inducing expression of adiponectin:出願番号60/557,708)。また、Deb1の発現が肥満に伴う酸化ストレスや炎症、ホルモンの変化によって抑制されることから、脂肪細胞特異的な抗酸化・抗炎症薬・食品が、アディポネクチンの血中レベルを高めることにより、糖尿病の根本的治療法として有用である可能性が高い。まず、これまで知られている抗酸化・抗炎症剤でDeb1活性を促進し、脂肪組織への特異的な組織移行がよいものをスクリーニングする。平成19年度では、培養脂肪細胞を用いたスクリーニングの系を確率しつつ、有用な候補分子を探索してきている。現在、激増している糖尿病は、心筋梗塞・脳卒中発症のリスクを増大させる。当研究室では、アディポネクチン(Ad)が糖尿病の鍵分子であることを見出し(Nature Medicine7,941-946,2001)、その受容体を世界に先駆けて単離・同定した(Nature 423,762-769,2003)。さらにその受容体欠損マウスの解析により、Adとその受容体がインスリン抵抗性を改善させることを明らかにした(Nature Medicine,13,332-339)。本研究では、(1)Ad受容体の特異的アゴニストを植物(果物・野菜)から抽出・精製し糖尿病の根本的治療薬・食品を開発する。
優勢卵胞ダブル選抜モデルによるウシ卵胞選抜遺伝子の機能解析と排卵誘起法への展開

ウシ卵胞におけるセリンプロテアーゼインヒビターファミリー遺伝子発現の解析セリンプロテアーゼインヒビター(SERPIN)は、線溶系、炎症系、細胞分化などに関与するプロテアーゼ群を制御する。本研究では、ウシ卵胞におけるSERPINファミリー遺伝子の発現および局在を解析した。黒毛和種雌ウシより、直径が最大の優勢卵胞(10.7±0.7mm)と二番目に大きい次席卵胞(7.8±0.2mm)を採取した。各卵胞から総RNAを抽出し、ウシオリゴDNAマイクロアレイおよびリアルタイムPCR法を用いて、SERPINファミリーの遺伝子発現を解析した。さらに、食肉処理場由来のウシ卵胞(直径>8mm)を、卵胞液中ステロイド濃度を基に健常または閉鎖に分類し、マイクロアレイ解析で発現に変化が見られたSERPINのうち、ウシ卵胞で発現していることが初めて明らかとなった4個について、in situハイブリダイゼーション法によりmRNA発現局在を解析した。マイクロアレイ解析の結果、ウシ卵胞において11個のSERPIN遺伝子の発現が認められた。優勢卵胞では5個のSERPIN遺伝子(SERPINA5,B6,E2,F2,H1)の発現が高く、次席卵胞では2個(SERPINE1,G1)の発現が高いことが明らかとなった。また、In situハイブリダイゼーションの結果、SERPINA5、SERPINB6およびSERPINF2 mRNAは健常卵胞の顆粒層にのみ局在し、SERPING1 mRNAは閉鎖卵胞の顆粒層および卵胞膜で発現していることが明らかとなった。以上から、SERPINファミリーがウシ卵胞の健常性の違いにより特徴的な発現を示し、卵胞発育および閉鎖に関与している可能性が示された。1)優勢卵胞ダブル選抜モデルを用いた、卵胞発育に伴う特異的な遺伝子発現の網羅的解析卵胞選抜時および選抜後における、優勢卵胞ダブル選抜モデルの2個の優勢卵胞と、通常の排卵後の第1卵胞波の主席卵胞および閉鎖卵胞における遺伝子発現動態を解析するため、優勢卵胞ダブル選抜モデルの2個の優勢卵胞および排卵後の第1卵胞波の優勢卵胞と閉鎖卵胞を、卵胞選抜時(卵胞吸引後2日目または排卵後2日目)および卵胞選抜後(卵胞吸引後5日目または排卵後5日目)に卵巣を摘出して採取した。採取した各卵胞から、卵胞膜と顆粒層細胞を採取した。2)ウシ大卵胞における遺伝子発現の網羅的解析本研究は、ウシ主席卵胞の発育および閉鎖に特徴的な発現を示す遺伝子群の特定を試みることを目的とした。黒毛和種雌牛より採取した卵巣から、直径8mm以上の卵胞(5個)を単離し、ウシオリゴDNAマイクロアレイを用いて各卵胞の遺伝子発現動態を解析した。その結果、卵胞間で20倍以上の発現差が認められた遺伝子は78個だった。クラスター解析の結果、卵胞は2つのグループに分類された。一方のグループ(3個)は、46個の遺伝子の発現が高く、その中には、FSHレセプターやCYP19など、健常卵胞で高い発現が報告されている遺伝子が含まれていたことから、このグループは健常卵胞と推測された。もう一方のグループ(2個)では、IGFBP5やTIMP1などを含む32個の遺伝子が高発現を示し、閉鎖卵胞であると推測された。さらに、78個の遺伝子のうち19個について、リアルタイムPCR法によりmRNA発現を定量した。本研究より、大卵胞における遺伝子発現動態の相違が明らかとなり、主席卵胞の発育および閉鎖に、それぞれ特異的な遺伝子群が関与していることが示唆された。1)優勢卵胞ダブル選抜モデルを用いた、卵胞発育に伴う特異的な遺伝子発現の網羅的解析優勢卵胞ダブル選抜モデルの2個の優勢卵胞と、通常の排卵後の第1卵胞波の主席卵胞および閉鎖卵胞における、卵胞選抜時の遺伝子発現動態の違いを解析するため、ホルスタイン種経産牛より、卵胞選抜時(卵胞吸引後2日目または排卵後2日目)に卵胞を採取した。採取した各卵胞より、卵胞膜と顆粒層細胞を採材した。今後、ウシオリゴDNAマイクロアレイを用いて、卵胞膜および顆粒層細胞の遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析し、優勢卵胞ダブル選抜モデルの卵胞選抜において特徴的に発現する遺伝子を同定する。2)ウシ大卵胞における遺伝子発現の網羅的解析黒毛和種雌牛より採取した主席卵胞と次席卵胞のマイクロアレイ解析により、卵胞間で発現差が認められた遺伝子のうち、主席卵胞で発現が高い3個の遺伝子(AMH,CYP19,PGF)と、次席卵胞で高発現だった3個の遺伝子(GADD45A,IGFBP5,TSP2)について、卵胞液中のステロイドホルモン濃度を基準に分類した健常卵胞と閉鎖卵胞における、mRNA発現の局在を、in situ hybridization法を用いて解析した。その結果、CYP19およびAMH mRNAは、健常卵胞と閉鎖卵胞の顆粒層細胞で検出された。PGF mRNAは、健常卵胞の顆粒層細胞と卵胞膜の両方で発現が見られたが、閉鎖卵胞では発現が見られなかった。IGFBP5 mRNAは閉鎖卵胞の顆粒層細胞のみで発現が見られた。GADD45AおよびTSP2 mRNAは、閉鎖卵胞では顆粒層細胞と卵胞膜の両方で発現が見られたが、健常卵胞では顆粒層細胞のみに局在していた。以上より、卵胞の健常性の違いによる、各遺伝子の特徴的な発現動態が示された。

ウシ卵胞におけるセリンプロテアーゼインヒビターファミリー遺伝子発現の解析セリンプロテアーゼインヒビター(SERPIN)は、線溶系、炎症系、細胞分化などに関与するプロテアーゼ群を制御する。本研究では、ウシ卵胞におけるSERPINファミリー遺伝子の発現および局在を解析した。黒毛和種雌ウシより、直径が最大の優勢卵胞(10.7±0.7mm)と二番目に大きい次席卵胞(7.8±0.2mm)を採取した。各卵胞から総RNAを抽出し、ウシオリゴDNAマイクロアレイおよびリアルタイムPCR法を用いて、SERPINファミリーの遺伝子発現を解析した。さらに、食肉処理場由来のウシ卵胞(直径>8mm)を、卵胞液中ステロイド濃度を基に健常または閉鎖に分類し、マイクロアレイ解析で発現に変化が見られたSERPINのうち、ウシ卵胞で発現していることが初めて明らかとなった4個について、in situハイブリダイゼーション法によりmRNA発現局在を解析した。マイクロアレイ解析の結果、ウシ卵胞において11個のSERPIN遺伝子の発現が認められた。優勢卵胞では5個のSERPIN遺伝子(SERPINA5,B6,E2,F2,H1)の発現が高く、次席卵胞では2個(SERPINE1,G1)の発現が高いことが明らかとなった。また、In situハイブリダイゼーションの結果、SERPINA5、SERPINB6およびSERPINF2 mRNAは健常卵胞の顆粒層にのみ局在し、SERPING1 mRNAは閉鎖卵胞の顆粒層および卵胞膜で発現していることが明らかとなった。以上から、SERPINファミリーがウシ卵胞の健常性の違いにより特徴的な発現を示し、卵胞発育および閉鎖に関与している可能性が示された。