hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新生児に対する一酸化窒素吸入療法の基礎的研究

1.新生仔豚による低酸素性肺高血圧症モデルの作製0生日の新生仔豚を用いて、右内頚静脈よりバルーンカテーテルを挿入し肺動脈圧を連続モニターした。また、臍動脈よりカテーテルを挿入し、先端を下行大動脈へ留置し、体血圧を連続モニターした。窒素混合ガスを用いて5-10%酸素の低酸素負荷による肺高血圧症を作製した。2.新生仔豚に対するNO吸入の効果と安全性に関する実験(1)NO吸入による選択的肺血管拡張作用に関する実験低酸素性肺高血圧症モデルにおいて、NO吸入直後より肺動脈圧は前値に比較して約30%低下したが、体血圧は変化しなかった。(2)吸入NO濃度に関する実験低酸素性肺高血圧症モデルに対して1ppmから10ppm(1ppm毎増加)、20、30、40、50ppmのNO濃度でNO吸入を行った時、肺動脈圧は1ppmから5ppmまでは濃度依存性に低下したが、5ppm以上では肺動脈圧の低下率に差は認めなかった。(3)人工呼吸器の設定条件が吸入NO濃度へ及ぼす影響に関する実験人工呼吸器回路内流速、NO投与回路内流速、NO濃度測定用サンプリング回路内流速、呼吸器回路Yピース内流速を測定。これらの回路内流速から呼吸器回路内のNO濃度は縞状に濃淡が生じ、人工呼吸器の設定条件により、患児に投与されるNO濃度に差が生じるころがわかった。(4)人工呼吸器モード(IMV/HFO)が吸入NO2濃度へ及ぼす影響に関する実験1.新生仔豚による低酸素性肺高血圧症モデルの作製0生日の新生仔豚を用いて、右内頚静脈よりバルーンカテーテルを挿入し肺動脈圧を連続モニターした。(4)人工呼吸器モード(IMV/HFO)が吸入NO2濃度へ及ぼす影響に関する実験1.新生仔豚による低酸素性肺高血圧症モデルの作製0生日の新生仔豚に対して全身麻酔下で気管切開による気管内挿管を行なった後、筋弛緩剤を使用し人工換気を行う。その後、右内頚静脈よりバルーンカテーテルを挿入し、X線透視下で先端を肺動脈内へ留置し、肺動脈圧を連続モニターする。また、臍動脈よりカテーテルを挿入し、先端を下行大動脈へ留置し、体血圧を連続モニターする。(3)NO吸入の副作用に関する実験・No吸入中の血中メトヘモグロビン(MetHb)濃度について20ppmNOと100%酸素を6時間吸入させた時の血中メトヘモグロビン濃度を定期的に計測したが、吸入開始後30分から60分で1%前後に増加したが、その後は有意な変化は無かった。・吸入NO濃度と吸入NO2濃度との相関について20ppmNOを100%酸素下と21%酸素下で吸入させた場合、100%酸素下の方が、NO2の産生量が高値を示した。次に、吸入NO濃度を変化させた時のNO2産生量を100%酸素下と21%酸素下で比較した結果、NO濃度が高値になるにつれて、100%酸素下でのNO2産生量が急激に増加することがわかった。胎便吸引症候群(MAS)に肺高血圧症を合併した症例に対するNO吸入の反応性に関する実験0生日の新生仔豚に対して全身麻酔下で気管切開を行った後、筋弛緩剤を使用し機械的人工換気を行う。

その後、右内頚静脈よりバルーンカテーテルを挿入し、X線透視下で先端を肺動脈内へ留置し、肺動脈を連続モニターした。また、臍動脈よりカテーテルを挿入し、先端を下行大動脈へ留置し、体血圧を連続的にモニターした。新生仔豚に対して、20%ヒト胎便溶液5-10ml/kgを気管内に注入することでMASモデルを作製した(MAS群)。このモデルに窒素混合ガスを用いて5-10%酸素の低酸素負荷による肺高血圧症を作製した。また、Control群は低酸素性肺高血圧症の新生仔豚とした。これらの両詳に対するNO吸入の反応性を検討した。低酸素性肺高血圧症モデル(MAS群、control群)に対して、5ppm、10ppm、20ppm、40ppm濃度のNO吸入を行った時、肺動脈圧は両群ともNO吸入前に比較して有意に低下した。体血圧は両群ともNO吸入前後で変化を認めなかった。control群において、PaO2はNO吸入後は吸入前に比較して有意に高値を示した。また、吸入NO濃度によるPaO2値の差は認めなかった。MAS群において、PaO2はNO吸入後は吸入前に比較して有意に高値を示した。しかし、吸入NO濃度が高値になるにつれて、NO吸入後のPaO2値は高値を示すことがわかった。
オーミクス実験データ解釈におけるボトルネックの解消

爆発的なペースでオーミクス実験データが蓄積し続ける中、研究者がそれらのデータを論文や様々なデータベースの内容に照らし合わせつつ仮説を構築するステップが生命科学研究における深刻なボトルネックとなっている。本研究では、論文データベースおよび近年様々なプロジェクトで整備されてきたデータベース群のデータをネットワークの形式で表現することで、膨大なオーミクス実験データの解釈を支援するための情報技術開発を行った。この「解釈」に関して現在事実上の標準となっている手法としては,Gene Ontology中で統計学的に有意に関連するタームを発見するものがよく用いられている。しかし、Gene Ontologyで表現できる情報はごく限られたものであり、「すでによく知られた知識のオーミクスデータによる確認」を超えて新たな知識を得る上で限界があることが問題となっている。本研究では、論文データベースおよび近年様々なプロジェクトで整備されてきたデータベース群のデータをネットワークの形式で表現することで、膨大なオーミクス実験データの解釈を支援するための情報技術開発を行っている。平成24年度は、英文中からの遺伝子名の抽出(固有表現認識)技術を医学生物学分野の文献データベースPubMedに含まれる1000万件を超える英文アブストラクトに対して適用し、網羅的に遺伝子名の抽出および遺伝子IDとの対応付けを行った注釈付き文献データベースを構築した。さらに、このデータベースに対して、オーミクスデータから得られる遺伝子IDの一覧を入力することでそれらの遺伝子IDセットに統計的に有意に相関するキーフレーズをテキスト集合中から抽出するインターフェースを実装した。これにより、オーミクスデータを文献データベースと網羅的に対応づけオーミクスデータの解釈を加速するプロトタイプとなるシステムの構築に成功した。平成25年度は、平成24年度までに作成した医学生物学分野の文献データベースPubMedから遺伝子名およびキーフレーズを抽出したデータベースを用い、ユーザーが興味を持つ医学生物学概念および遺伝子名セットのクエリに応じて関連キーフレーズをネットワーク形式で抽出する機能を実装した。これにより、オーミクスデータを文献データベースと網羅的に対応づけオーミクスデータの解釈を加速するシステムの基盤が構築できた。平成23年度は、英文中からの遺伝子名の抽出(固有表現認識)に関して、複数生物種の遺伝子名辞書・遺伝子ID辞書への対応ができるよう既存手法の改良を行い、複数の生物種の遺伝子がしばしば同一文献に現れる一般の医学生物学文献を解析できるシステムを開発した。さらに、改良した手法を実装し、医学生物学分野の文献データベースPubMedに含まれる1000万件を超える英文アブストラクトに対して適用し、網羅的に遺伝子名の抽出および遺伝子IDとの対応付けを行った。これにより、オーミクスデータを文献データベースと網羅的に対応づけ、オーミクスデータの解釈を加速するための基盤が整った。

本研究では、論文データベースおよび近年様々なプロジェクトで整備されてきたデータベース群のデータをネットワークの形式で表現することで、膨大なオーミクス実験データの解釈を支援するための情報技術開発を行っている。平成26年度は、平成25年度までに作成したソフトウェアを、肺がんサンプルから得られたSNVデータなど様々なオーミクスデータへと適用し、作成された医学生物学概念ネットワークから仮説生成を行った。さらに、RNA-SeqデータとChIP-Seqデータの統合解析によるマウス肝臓における概日時計ネットワークの俯瞰的解明、細菌性ロドプシン遺伝子を持つ微生物ゲノム進化の解明、魚類における浸透圧関連遺伝子の網羅的同定、動画データ解析による複数動物トラッキングアルゴリズムの開発などの成果が得られた。バイオインフォマティクス平成23年度は東日本大震災およびそれに伴う解析サーバの停電があったため研究の遂行がやや遅れたが、平成24年度は平成23年度に達成できなかった点から順に研究を推進し、順調に遅れを取り戻しつつある。平成23年度に東日本大震災およびそれに伴う解析サーバの停電があったため研究の遂行がやや遅れたが、順調に遅れを取り戻しつつある。おおむね順調に進行しているが、東日本大震災およびそれに伴う解析サーバの停電があったため、研究の遂行がやや遅れた。順調に研究推進の遅れを取り戻しつつあり、このまま当初計画通りに研究を推進することを目指す。このまま当初計画通りに研究を推進する。平成23年度は東日本大震災およびそれに伴う解析サーバ停電のため研究の遂行がやや遅れた。そこで、平成24年度は平成23年度に達成できなかった点から順に研究を推進する。一部計算機購入や研究発表旅費にかかる繰り越しが生じたが、順次、平成24年度に達成できなかった点に必要な研究費を使用する。研究代表者の異動に伴い、年度をまたぐ研究に関して計算機購入や研究発表旅費にかかる繰り越しが生じた。平成26年度に順次執行する。
非線形波動方程式系の解の爆発に関する研究

1.非線形クライン・ゴルドン方程式の定在波解の不安定性について,G.Todorova氏(Tennessee大学,アメリ力合衆国)と共同研究を行なった.従来,基底状態に対して,臨界振動数の場合を除き,軌道安定性と不安定性が分類されていたが,軌道不安定性よりも強い意味での不安定性に関しては,振動数が0の場合を除いては知られていなかった.本研究では,軌道不安定であることが示されていた基底状態は,すべて強い意味で不安定であることを示した.また,臨界振動数の場合には,基底状態に対しても,軌道不安定性は分っていなかったが,本研究では,基底状態に限らず,球対称な定在波解はすべて強い意味で不安定であることを示した.さらに,プラズマ物理に現われるクライン・ゴルドン・ザハロフ方程式系に応用し,同様の結果を得た.2.異なる伝播速度をもつ半線形波動方程式系の初期値問題の小さいデータに対する解の時間大域存在と爆発について,久保英夫氏(大阪大学)と共同研究を行なった.昨年度までの共同研究により,空間2次元で非線形項の次数が3以下の場合に,小さいデータに対しても解の爆発が起きることが分っていたが,今年度は,これまでの解に対する評価を精密にし,解の最大存在時間に関する上下からの評価を改善した.異なる伝播速度をもつ空間3次元の非線形波動方程式系の初期値問題の小さいデータに対する解の時間大域存在と爆発について研究を行なった。非線形項が未知関数の導関数のみに依存する場合は、自己相互作用項を含まなければ、小さいデータに対して解が時間大域的に存在することが、横山和義氏(北海道工業大)により示されていた。この結果を受けて、片山聡一郎氏(和歌山大)は、非線形項に未知関数とその導関数が共に含まれる場合にも、自己相互作用項及び未知関数のみに依存する項を含まなければ、小さいデータに対する大域存在定理が成り立つのではないかと予想し、この予想を裏付けるいくつかの部分的な結果を得ていた。これに対して、今年度の本研究では、片山氏の予想が一般には成り立たないことを示す反例を構成することに成功した。これ以外に、Grozdena Todorova氏(University of Tennessee)と非線形クライン・ゴルドン方程式の定在波解の強不安定性に関して共同研究を行なった。非線形項が単一冪型の場合、定在波解の軌道安定性・不安定性に関しては完全に分類されていたが、爆発による強不安定性に関しては、振動数が0である定常解以外には知られていなかった。これに対して、Todorova氏との共同研究では、振動数が小さい場合に強不安定性を示すことに成功した。昨年度に引き続き、異なる伝播速度をもつ半線形波動方程式系の初期値問題の小さいデータに対する解の時間大域存在と爆発について研究を行なった。今年度の最大の研究成果は、久保英夫氏(大阪大)との共同研究により、空間2次元の場合に解の爆発を証明することができたことである。久保氏との以前の共同研究により、空間3次元の場合には、強非線形相互作用系に対しては、伝播速度が異なれば常に小さいデータに対する解の大域存在が成り立つことが分っていた。これに対して、空間2次元の場合には、非線形項の次数が3以下の場合には、小さいデータに対しても解の爆発が起きることが分った。また、非線形項の次数が3より大きい場合には、小さいデータに対する解の大域存在が成り立つので、この結果は最適である。3次元空間と異なり、2次元空間においては、ホイヘンスの原理が成り立たないことは周知の事実であるが、この事実が解の大域的な性質に影響を及ぼすことを明確にした結果はこれまであまり知られていないのではないかと思われる。この意味で、空間3次元と2次元の場合の本質的な違いを明らかにした本研究成果の意義は大きいと考えられる。1.非線形クライン・ゴルドン方程式の定在波解の不安定性について,G.Todorova氏(Tennessee大学,アメリ力合衆国)と共同研究を行なった.従来,基底状態に対して,臨界振動数の場合を除き,軌道安定性と不安定性が分類されていたが,軌道不安定性よりも強い意味での不安定性に関しては,振動数が0の場合を除いては知られていなかった.本研究では,軌道不安定であることが示されていた基底状態は,すべて強い意味で不安定であることを示した.また,臨界振動数の場合には,基底状態に対しても,軌道不安定性は分っていなかったが,本研究では,基底状態に限らず,球対称な定在波解はすべて強い意味で不安定であることを示した.さらに,プラズマ物理に現われるクライン・ゴルドン・ザハロフ方程式系に応用し,同様の結果を得た.2.異なる伝播速度をもつ半線形波動方程式系の初期値問題の小さいデータに対する解の時間大域存在と爆発について,久保英夫氏(大阪大学)と共同研究を行なった.昨年度までの共同研究により,空間2次元で非線形項の次数が3以下の場合に,小さいデータに対しても解の爆発が起きることが分っていたが,今年度は,これまでの解に対する評価を精密にし,解の最大存在時間に関する上下からの評価を改善した.
フロリゲン長距離移動のライブイメージング

フロリゲンは花芽分化を誘導する強力な運命決定因子であり、その正体はHd3a/FTと呼ばれる球状タンパク質である。フロリゲンは葉で合成された後、茎の先端に位置する幹細胞領域・茎頂メリステムへと輸送されて機能する。この長距離輸送の過程、とくにメリステムに到達する様子は、長距離移動性の発生制御因子を介した成長相制御の最終段階であり極めて興味深い。本研究では、独自に開発したフロリゲンの生体イメージング系を駆使して、生きたままの茎頂メリステムを固定せずにライブイメージングすることを試みた。その結果、フロリゲンが様々に分布を変えながらメリステムの成長相転換を進める様子を初めて観察することに成功した。Hd3a/FTタンパク質は長距離移動性の花成誘導因子・フロリゲンの分子実体であり、葉で合成された後に茎頂メリステムまで輸送されて機能する。フロリゲンが茎頂に蓄積することは、私達のHd3a-GFP発現イネにおける直接的なイメージングをはじめ複数の分子遺伝学的な実験によって示されており、広く受け入れられてきている。しかし、フロリゲンが茎頂メリステムに到達する様子やその時の正確な輸送経路等は不明である。これらの問題を解決するためには、フロリゲンが到達するプロセスを動画で撮影することがもっとも直接的であるが、この実験にはいまだ誰も成功していない。本研究では、私達が独自に確立してきたフロリゲンのイメージング系をさらに発展させ、フロリゲンがメリステムに到達するもっとも初期の様子を明らかにすることを目指している。このために、熱ショック誘導系を用いたHd3a-GFPの発現誘導系を構築し、一細胞レベルで熱ショックを与える事が可能なIR-LEGOによって局所的にHd3a-GFPの発現を誘導した後、Hd3a-GFPタンパク質の挙動を追跡することを試みる。これまでに、Hd3a-GFPの熱ショック誘導系イネを多数作出し、Hd3a-GFPの誘導過程が優良な系統を複数同定することができた。この過程で、翻訳効率を上昇させるエンハンサー配列の使用や強力なターミネーターの導入等を行った。今後はこれらの系統を用いて熱ショックで誘導したHd3a-GFPの顕微鏡観察を試みる。Hd3a-GFP発現イネを用いた茎頂のイメージングによって、フロリゲンがメリステムでどのように分布を変えながら成長相転換を進めていくのかを明らかにした。その結果、フロリゲンは花芽分化を開始させるだけでなく、花芽分化が進行する間もメリステムに蓄積し続けることが明らかとなった。誘導性プロモーターの制御下でHd3a-GFPを発現するイネを開発し、熱ショック後のHd3a-GFPの発現を調査した。複数の系統でHd3a-GFPタンパク質の増加が見られたが、イメージングに用いることのできる植物は得られなかった。Hd3a-GFPの熱ショック誘導系のイネから優良系統を選抜できた。またフロリゲンの茎頂メリステム内の分布を明らかにし、フロリゲンのメリステム到達初期の分布も明らかにしたため。植物分子遺伝学Hd3a-GFPの熱ショック誘導系を用いて、一過的な誘導とその後のタンパク質の分布をイメージングする。26年度は優良な翻訳エンハンサー配列や転写ターミネーター配列など本研究の熱ショック誘導系を強力なものにするために重要な要素に検討を加えることに集中し、タンパク質実験や観察のためのセットアップに研究費を使用しなかったため。26年度に作成した形質転換イネを用いて27年度に観察を行う計画である。ここでは植物の共焦点レーザー顕微鏡観察に係るセットアップ、IR-LEGOのセットアップや誘導系植物の栽培等を行う技術補佐員が必要となる。
染色体の複製機構

細胞複製の観点からみると,染色体複製の課題は細胞周期との接点となる複製開始の分子機構の解明である.原核生物では開始に必要なDNA制御配列と開始に関与するタンパク群を核とする複製開始装置の実体が明らかになりつつあり,細胞複製と結びついた開始調節機構の研究を課題として設定できる段階に達している.本研究班はプラスミドと細菌染色体の複製開始の調節に重点をおき,研究が立遅れている真核生物は分子遺伝学的方法を導入した萌芽的研究と,ウィルスによるモデル的研究を採用して組織した.1.プラスミド:複製開始遺伝子の発現の事故抑制機構をinvitro転写実験で解析し,精製した開始タンパクが制御配列に強く結合して転写を抑制することを実証した.一方同じタンパクの開始配列への結合は弱く,それだけではinvitroの複製を起さない.現在他の因子の関与を考慮検討している(山口).2.細菌染色体:枯草菌,大腸菌,シュードモナスの開始領域,構造を解析し, DoaAタンパクとその結合配列(DnaA-Box)が細菌に共通で基本的な複製開始装置であることを示した(吉川).又枯草菌ではDnaA-Boxが開始頻度を負に制御する因子であることを明らかにした(小笠原).大腸菌ではinvitroにおいて, oriCの転写と複製の調節因子の研究が進められた(岡崎・安田)1.2共順調に進んでおり,複製開始とその調節の分子機構を解明する方法が明確になり,解析のための準備がとゝのったと評価できる.3.真核生物染色体:マウス細胞の変異株を用いてDNAポリメラーゼαの複製における役割の解析とヘリカーゼの同定を行い,複雑な染色体装置の実体の解明に重要な進展をみた(花岡).4.動物ウィルス:宿主染色体と相互作用をもつユニークなDNAウィルス(B型肝炎ウィルス)の培養細胞における複製に初めて成功し,複製中間体の検出を行った(千坂).細胞複製の観点からみると,染色体複製の課題は細胞周期との接点となる複製開始の分子機構の解明である.原核生物では開始に必要なDNA制御配列と開始に関与するタンパク群を核とする複製開始装置の実体が明らかになりつつあり,細胞複製と結びついた開始調節機構の研究を課題として設定できる段階に達している.本研究班はプラスミドと細菌染色体の複製開始の調節に重点をおき,研究が立遅れている真核生物は分子遺伝学的方法を導入した萌芽的研究と,ウィルスによるモデル的研究を採用して組織した.1.プラスミド:複製開始遺伝子の発現の事故抑制機構をinvitro転写実験で解析し,精製した開始タンパクが制御配列に強く結合して転写を抑制することを実証した.一方同じタンパクの開始配列への結合は弱く,それだけではinvitroの複製を起さない.現在他の因子の関与を考慮検討している(山口).2.細菌染色体:枯草菌,大腸菌,シュードモナスの開始領域,構造を解析し, DoaAタンパクとその結合配列(DnaA-Box)が細菌に共通で基本的な複製開始装置であることを示した(吉川).又枯草菌ではDnaA-Boxが開始頻度を負に制御する因子であることを明らかにした(小笠原).大腸菌ではinvitroにおいて, oriCの転写と複製の調節因子の研究が進められた(岡崎・安田)1.2共順調に進んでおり,複製開始とその調節の分子機構を解明する方法が明確になり,解析のための準備がとゝのったと評価できる.3.真核生物染色体:マウス細胞の変異株を用いてDNAポリメラーゼαの複製における役割の解析とヘリカーゼの同定を行い,複雑な染色体装置の実体の解明に重要な進展をみた(花岡).4.動物ウィルス:宿主染色体と相互作用をもつユニークなDNAウィルス(B型肝炎ウィルス)の培養細胞における複製に初めて成功し,複製中間体の検出を行った(千坂).
パーキンソン病関連カチオンポンプATP13A2の機能解明による創薬基盤の構築

本研究は、神経細胞のリソソームに発現するパーキンソン病の病因遺伝子の一つとして同定されたATP13A2のイオン輸送機構の全容、およびATP13A2のイオン輸送機能異常が関与する新規のパーキンソン病発症メカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度の研究から、ATP13A2の酵素活性が反応溶液中のK+濃度に依存性することから、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補である可能性が示唆された。また、パーキンソン病患者において報告されている各種点変異体において、A746T、R449Q変異体では発現レベルが、G533R、R980H変異体では酵素活性がそれぞれ減少することを見出した。本年度はまず、K+のカウンターカチオンの探索を行った。反応溶液中にK+に加えてNa+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Al3+などをそれぞれ加えて酵素活性を測定したが、いずれもさらなる活性上昇は観察されなかった。従って、従来のP型ATPaseの輸送基質や酵母のATP13A2ホモログが輸送すると推測されているMn2+やZn2+は、ATP13A2の輸送基質では無い可能性が示唆された。また、ATP13A2と機能を調節する分子として、ATP13A2と同じP型ATPaseに属し、小胞体に発現しているオーファンカチオンポンプER-ATPase(仮称)を見出した。興味深いことにER-ATPaseをATP13A2と共発現させることで、ATP13A2の酵素活性は著しく低下した。また、ER-ATPase単独発現細胞を用いた解析において、ER-ATPaseの酵素活性は、反応溶液中のNa+とK+濃度に依存することが示唆された。昨年度までの研究により、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補であること、ATP13A2のloss of functionがパーキンソン病に関連している可能性を見出した。また本年度の研究において、ATP13A2の活性を負に制御する分子としてER-ATPaseを見出した。マウスおよびヒトER-ATPaseの遺伝子クローニングおよびER-ATPaseの発現系は構築を完了している。現在、各種抗体を用いたATP13A2とER-ATPaseとの免疫沈降実験を行い両者の分子会合の可能性についての検討を進めている。また、ER-ATPaseのNa+およびK+輸送に関与すると推定されるアミノ酸残基の変異体を作製し、ER-ATPaseの詳細な機能解析についても行っている。さらに、今後の実験計画として予定している単離リソソームを用いたイオン輸送解析にむけて、ATP13A2発現細胞からインタクトなリソソームを高純度で精製する方法を検討中である。以上の点から、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。1) ATP13A2発現細胞より精製したリソソームサンプル、ATP13A2を再構成したリポソームにおいてK+の放射性同位体である86Rb+を用いたトレーサー実験等を行うことで、リソソーム膜を介したATP13A2のイオン輸送機能の詳細を明らかにする。2)パーキンソン病モデルマウスから単離した初代培養神経細胞やリソソームを用いてATP13A2の病態生理機能の解析を行う。3)パーキンソン病モデルマウスにおけるER-ATPaseの発現レベルおよび機能を解析することで、パーキンソン病の発症と両者の機能的関連性の関連性について検討する。4) ATP13A2の機能調節に関与するER-ATPase以外の分子を探索する。5)これまでに構築した発現系、機能評価系を用いて、ATP13A2およびER-ATPaseの機能もしくは発現レベルを変化させることで、パーキンソン病モデルマウスの神経変性症状を緩和させる化合物を探索する。以上の研究成果を総括し、新しいパーキンソン病治療法開発の研究基盤につなげる。パーキンソン病の病因遺伝子として同定されたATP13A2(Park9)は、その構造からカチオン輸送ポンプであると推定されているが、その輸送イオン種およびイオン輸送メカニズムについてはこれまで未解明である。本研究は、神経細胞リソソームにおけるATP13A2のイオン輸送機構の全容、およびATP13A2のイオン輸送機能異常が関与する新規のパーキンソン病発症メカニズムを明らかにすることを目的としている。加えて、ATP13A2を標的とした新たなパーキンソン病治療法の開発基盤の構築を目指す。本年度はまず、遺伝子クローニングしたヒトおよびマウスATP13A2をヒト胎児由来HEK293細胞に過剰発現させ、様々なカチオンおよびpH条件下で解析を行い、輸送イオン種の探索を行った。ATP13A2の発現に伴い上昇したATPase活性は、反応溶液中からK+を除去することで消失したことから、ATP13A2がK+輸送性のカチオンポンプとして機能する可能性が示唆された。また、ATP13A2由来のATPase活性は、弱酸性条件において上昇した。次に、パーキンソン病患者において報告されている各種点変異体(A746T、R449Q、G533R、R980H)を作製し、ATP13A2の発現と機能変化について検討した。G533RおよびR980H変異体では、ATP13A2の発現レベルが顕著に減少した。他方、A746TおよびR449Q変異体では、K+依存性のATPase活性が減少する傾向が見られた。

以上、本年度の研究成果より、ATP13A2の発現量およびK+輸送機能の抑制が、パーキンソン病の病態と関連している可能性が示唆された。本年度の研究では、ATP13A2の機能解析を行うための発現系の構築およびパーキンソン病に関連する各種点変異体の作製を行い、ATP13A2のイオン輸送解析を行うことで、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補であること、ATP13A2のloss of functionがパーキンソン病に関連している可能性を見出した。従って、本年度の計画として予定していた、ATP13A2の輸送イオン種の解明およびATP13A2とパーキンソン病との関連性についての研究は、順調に進んでいると考える。単離リソソームを用いたATP13A2のイオン輸送解析については、次年度に行う予定である。また、本年度に構築したATP13A2発現系およびK+依存性ATPase活性の評価方法は、今後の実験計画として予定しているATP13A2のイオン輸送機能を抑制・促進させる薬物のスクリーニング、およびATP13A2の機能を調節する関連分子の探索において有用である。以上、総合的に、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断する。本研究は、神経細胞のリソソームに発現するパーキンソン病の病因遺伝子の一つとして同定されたATP13A2のイオン輸送機構の全容、およびATP13A2のイオン輸送機能異常が関与する新規のパーキンソン病発症メカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度の研究から、ATP13A2の酵素活性が反応溶液中のK+濃度に依存性することから、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補である可能性が示唆された。また、パーキンソン病患者において報告されている各種点変異体において、A746T、R449Q変異体では発現レベルが、G533R、R980H変異体では酵素活性がそれぞれ減少することを見出した。本年度はまず、K+のカウンターカチオンの探索を行った。反応溶液中にK+に加えてNa+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Al3+などをそれぞれ加えて酵素活性を測定したが、いずれもさらなる活性上昇は観察されなかった。従って、従来のP型ATPaseの輸送基質や酵母のATP13A2ホモログが輸送すると推測されているMn2+やZn2+は、ATP13A2の輸送基質では無い可能性が示唆された。また、ATP13A2と機能を調節する分子として、ATP13A2と同じP型ATPaseに属し、小胞体に発現しているオーファンカチオンポンプER-ATPase(仮称)を見出した。興味深いことにER-ATPaseをATP13A2と共発現させることで、ATP13A2の酵素活性は著しく低下した。また、ER-ATPase単独発現細胞を用いた解析において、ER-ATPaseの酵素活性は、反応溶液中のNa+とK+濃度に依存することが示唆された。昨年度までの研究により、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補であること、ATP13A2のloss of functionがパーキンソン病に関連している可能性を見出した。また本年度の研究において、ATP13A2の活性を負に制御する分子としてER-ATPaseを見出した。マウスおよびヒトER-ATPaseの遺伝子クローニングおよびER-ATPaseの発現系は構築を完了している。
アトピー性皮膚炎の慢性炎症におけるS100A8/A9と新規レセプターの役割解析

アトピー性皮膚炎における皮膚バリア破綻後の炎症の慢性化にS100A8/A9が重要と考えた。S100A8は新規レセプターとしてneuroplastin-βを介して細胞増殖の作用を、S100A9はEMMMPRINを介して炎症作用を示したが、S100A8/A9ヘテロダイマーに対しこれらレセプターもヘテロダイマーとして機能し、細胞増殖と炎症の慢性化に寄与することでアトピー性皮膚炎の病態に重要な役割を果たす可能性が示唆された。アトピー性皮膚炎の原因究明には、皮膚バリア破綻に起因する炎症の惹起とその慢性化に至るメカニズムの解明が重要であると考える。これまでに、報告者らは皮膚の慢性炎症に関わる因子について検討してきた結果、S100A8/A9がケラチノサイトに対し一連の炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を誘導し、さらにこれらの因子がS100A8/A9を誘導する現象を見出した。このことから、S100A8/A9は皮膚バリア破綻後の炎症の慢性化に重要な役割を果たすと考えられる。S100A8, A9に対する新たなレセプターとして、Neuroplastin, EMMPRINを同定することができたことから、S100A8, A9とこれらの新規レセプターとの相互作用について解析を進めた。なお、本年度は産休・育休取得のため、一時研究を中断した。これまでに以下の結果が得られている。S100A8, S100A9とその新規レセプターNeuroplastin, EMMPRINの相互作用の検討;S100A8/A9の細胞増殖への関与について、ケラチノサイトにおけるこれらのレセプターをノックダウンし、S100A8/A9刺激による細胞増殖の変化を比較した。その結果、いずれかのレセプター単独でのノックダウンでは、増殖抑制効果は有意ではあるものの極低いレベルに留まっていたが、同時に両方のレセプターを抑えた場合、増殖が強力に抑制された。また、これらレセプターの生体内におけるオリゴマー形成について、アトピー性皮膚炎患者皮膚切片上で、Proximity Ligation Assay(PLA)法を用いて検討した。これらのレセプター同士の反応が、皮疹部の顆粒層付近に最も強く認められた。また、増殖の著しい部位においては、基底層付近にも陽性反応が認められ、レセプター同士もheterodimerを形成している可能性が示唆された。皮膚バリア破綻後の炎症の慢性化に重要な役割を果たすと考えられるS100A8, S100A9について、各々の新規レセプターNeuroplastin, EMMPRINを介した信号系について解析を進めた。S100A8-Neuroplastin、S100A9-EMMPRINの反応において、Grb2およびTRAF2が各々のアダプター蛋白として同定された。これらのレセプターまたはアダプター蛋白をノックダウンすることにより、ケラチノサイトのS100A8/A9刺激に伴うp38およびERKのリン酸化が抑制されたことから、これらの信号系への関与が示唆された。また、S100A8/A9が炎症の慢性化に寄与するか、これまでに作製した表皮特異的S100A8, S100A9 Tgマウスによる検証を行った。SDSによる単純刺激およびTNCBによる炎症・感作刺激の結果、前者ではwild typeに比べS100A8Tgマウスの表皮肥厚が強く、後者においては炎症の遷延が認められた。そして、増殖マーカーであるKi-67染色陽性の細胞が、刺激後のS100A8Tgマウスの表皮基底細胞で顕著に増加していた。さらに、皮膚組織より合成したcDNAを用いて、Th1およびTh2サイトカインの発現変化をqPCRにて検証した結果、S100A8優位の状態ではTh1が誘導され、S100A9が過剰発現している状態ではTh2系への分化が促進される可能性が示唆された。本研究課題の目標は、皮膚バリア破綻に起因する炎症の惹起とその慢性化に至るメカニズムを解明し、アトピー性皮膚炎の発症の原因究明に迫ろうとするものである。本年度は、慢性炎症に関わるS100A8/A9とそのレセプターの信号系を解析し、また、Tgマウスの検証等から、S100A8, S100A9に各々特異的な作用を有する可能性を示すことができた。以上のように、おおむね順調に進展している。アトピー性皮膚炎におけるバリア破綻後の炎症の慢性化にS100A8/A9が重要な役割を果たすのではないかと考え、S100A8、S100A9各々の新規レセプターとして同定したNeuroplastin(NPTN)およびEMMPRINとの相互作用について検討を進めてきた。培養ケラチノサイトにおいてNPTNおよびEMMPRINの発現を抑制すると、S100A8/A9刺激によるIL-8、TNFα、CXCL1などの炎症性サイトカインやケモカインの発現が抑制されることから、S100A8/A9と一連の炎症性サイトカインおよびケモカインとのポジティブフィードバック機構に、これらの新規レセプターが寄与していることが示された。また、NPTN、EMMPRINは培養ケラチノサイトにおいて膜型の局在を示し、ほとんど共局在を示していることが確認された。

アトピー性皮膚炎の皮疹部では、S100A8、S100A9の発現部位にNPTN、EMMPRINの発現が認められ、PLA法によりこれらS100蛋白とレセプターの相互作用およびレセプター同士の相互作用も認めていることから、リガンドであるS100A8/A9に加え、これらレセプターもヘテロダイマーを形成することが示された。さらに、S100A8-NPTNはGRB2をアダプター蛋白としてERKの活性化により細胞増殖に関与し、S100A9-EMMPRINはTRAF2を介してp38の活性化を通じ炎症に寄与している可能性が示唆され、S100A8/A9はNPTN/EMMPRINを介して炎症や細胞増殖に機能する可能性が示された。以上より、アトピー性皮膚炎の病態にS100A8/A9とNPTN/EMMPRINが重要な働きしている可能性が示唆された。アトピー性皮膚炎における皮膚バリア破綻後の炎症の慢性化にS100A8/A9が重要と考えた。S100A8は新規レセプターとしてneuroplastin-βを介して細胞増殖の作用を、S100A9はEMMMPRINを介して炎症作用を示したが、S100A8/A9ヘテロダイマーに対しこれらレセプターもヘテロダイマーとして機能し、細胞増殖と炎症の慢性化に寄与することでアトピー性皮膚炎の病態に重要な役割を果たす可能性が示唆された。本年度は産休・育休取得のため一時研究を中断したが、S100A8, A9とその新規レセプターとの相互作用について検討し、その結果は米国研究皮膚科学会(SID)で発表された。研究実績においても示したように、最も重要な発見は、リガンドであるheterodimer化したS100A8/A9 (calprotectin)に加えて、我々が見出したそれぞれの新規レセプターであるNeuroplastinとEMMPRINもまたheterodimerを形成し、新たなレセプターとして機能するということを示した点にある。S100A8およびS100A9が生体内でheterodimerを形成し、安定化すると推定されているが、レセプターについては、S100の一般的レセプターと言われているRAGEか、S100A8が結合することが知られているTLR-4との関連で論じられてきた。我々の発見は、これまで考えられてきたS100蛋白の生理機能の更なる解明に寄与するものと考えられる。これまでの検証から、S100A8, S100A9はそれぞれ特異的な作用を持つのではないかという結果が得られてきた。そのため、S100A8, S100A9それぞれの特徴的な生理的機能の解明、免疫系への影響についてもさらに研究を進める。また、これまでのmicroarrayによる検討結果などの報告から、アトピー性皮膚炎の皮膚においてはS100A9の発現亢進が顕著であり、乾癬ではS100A8がより亢進していると推定される。アトピー性皮膚炎においてS100A9が実際に優位であるのかどうか、免疫組織学的、生化学的手法を用いて明らかにする。以上の検討から得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。皮膚科学1S100A8/A9とそのレセプターの信号系の解析;S100A8, A9と新規レセプターの反応に関与するアダプター蛋白の同定、およびアダプター蛋白の発現抑制に伴うS100A8, A9誘導の炎症因子への影響を検証する。2これまでに作製した表皮特異的S100A8, A9 Tgマウスを用いて、S100A8/A9が炎症の慢性化に寄与するかin vivoにおいて検証する。
がん関連遺伝子の構造、発現、機能解析によるがんの分子診断と病態の解明

がん細胞と宿主の遺伝子解析を行い、がんの分子診断に有用な技術、標的分子を明らかにした。まず、我々が開発したアレル当りの遺伝子発現の高度定量的解析法であるRNA Difference Plot法を用いて、家族性腫瘍の原因遺伝子のアレル当りの発現が、その変異保因者間の表現型の予測に有用であることを見出した。次に、非小細胞肺がん、腎淡明細胞がんでは、CADM1、並びにその結合タンパク質である4.1Bががん抑制遺伝子として働くことを見出した。一方、成人T細胞性白血病ではCADM1が特異的に高発現し、下流ではTiam1が結合し、RACタンパク質を活性化して細胞浸潤能を亢進すること、従ってこの経路が浸潤抑制の標的分子経路となることを見出した。がんの予防、診断に重要な標的分子を同定し、宿主側の遺伝的要因、環境因子と、各臓器がんにおける遺伝手異常、並びにその相互作用を明らかにすることを目的として、以下の研究を行った。1.アレル特異的発現を指標とした、がん感受性に関わる遺伝子多型の意義の解析:我々が開発したアレル当りの遺伝子発現の高度定量的解析法であるRNA Difference Plot (RDP)法を用いて、がん関連遺伝子のアレル当りの発現の実態を、定常状態、並びに発現を誘導した状態で検討した。すなわち、EBウイルスで不死化した健常人のリンパ球12例を用い、5Gyの放射線の照射前、並びに照射後4時間の全細胞RNA、並びにゲノムDNAを抽出し、18個のDNA修復酵素遺伝子群のアレル当たりの発現量の実態を検討した。この結果、照射前には、17遺伝子(94%)が両アレルから均等に発現したのに対し、照射4時間後には8遺伝子(44%)が、アレル間の不均衡発現を示した。この結果から、放射線照射によって発現を誘導すると、DNA修復酵素遺伝子の発現には相当量の個体差が現れることが明らかになった。現在、この発現誘導の差の原因となる遺伝子多型、ハプロタイプを解析中である。2.腎、尿路系腫瘍におけるがん抑制遺伝子経路の解析:我々が以前同定した非小細胞肺がんのがん抑制遺伝子TSLC1は腎臓では遠位尿細管のみに発現し、腎明細胞がんの発生母地と考えられる近位尿細管ではTSLC1類似分子TSLL2が発現する。我々は、TSLL2遺伝子、ならびにDAL-1遺伝子の発現が腎明細胞がん細胞で高頻度に欠如、低下し、DAL-1遺伝子のメチル化が原発性腎明細胞がん55例中25例(45%)に認められ、無再発生存期間と逆相関を示し、独立した予後因子となること、またTSLL2の発現は原発性前立腺がんでも高頻度に欠如し、前立腺がんの抑制遺伝子候補となることを示した。がんの易罹患性に関わる遺伝子多型の生物学的、病的意義を明らかにする目的で、放射線照射前後のヒトリンパ球におけるDNA2本鎖切断修復酵素郡のアレル特異的遺伝子発現をcSNPを指標として解析した。その結果、18遺伝子の19 SNP中、6 SNPにおいて、放射線照射後の3SDを超えるアレル間の発現不均衡が認められた。その生物学的意義に関しては検討中である。一方、腎、尿路系腫瘍における細胞接着分子群の異常の有無を明らかにする目的で、がん抑制遺伝子TSLC1/CADM1とその構造類似分子TSLL2/CADM4並びにその経路上の分子群の異常の有無を解析した。まず、腎明細胞がん55例の解析においてTSLC1/CADM1蛋白質と結合し、アクチンとも結合する細胞内裏打ち蛋白質DAL-1/4.1Bの遺伝子プロモーター領域のメチル化が45%に認められ、無再発生存期間と逆相関を示し、独立した予後因子となることを示した。このことからDAL-1/4.1Bは腎明細胞がんの抑制遺伝子であることが示唆された。次に、TSLL2/CADM4が免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する細胞接着分子であり、腎近位尿細管、尿管、膀胱などの移行上皮と、前立腺の腺上皮に発現すること、ホモ2量体を形成してトランスに作用し、細胞接着活性を示すことを明らかにした。そして、前立腺がんの進展に伴ってTSLL2/CADM4の発現が欠如すること、またヒト前立腺がん培養細胞PPC-1にTSLL2/CADM4を発現させると、ヌードマウスにおける腫瘍原性が抑制されることを示した。TSLL2/CADM4遺伝子の位置する第19染色体q13.2領域は、前立腺がんで高頻度にヘテロ接合性の消失を示すことから、TSLL2/CADM4が前立腺がんの抑制遺伝子である可能性が示された。癌の予防、診断に重要な分子診断法の確立、並びに標的分子の同定を目的とし、細胞接着分子CADM1/TSLC1の癌の発生、進展における意義について検討した。

まず、平成19年度までに我々が開発したアレル当りの相対的遺伝子発現の高感度解析法であるRNA Difference Plot (RDP)法を用いて、様々な癌関連遺伝子のアレル当りの発現量の多様性の実態を検討し、癌を含む様々な病態で関連遺伝子のアレル発現の不均衡が認められることを見出した。また、CADM1のアレル特異的発現に一定の差を示す多型を見出した。一方、我々が同定した癌抑制蛋白質であるCADM1のヒト腫瘍における意義の検討を続け、非小細胞肺癌や腎癌のみならず、神経芽細胞腫や子宮頸癌においても、その進展にCADM1の不活化が関わり、予後と相関することを共同研究で報告した。また、Cadml遺伝子ホモ欠損マウスにおいて、精子形成障害による不妊に加え、15月齢以後、肺腺腫、肺腺癌が高頻度に発生することを見出した。一方、遺伝子欠損マウスの背景となるC57BL6マウスは一般に肺腫瘍発生に抵抗性であることから、CADM1が強力な癌抑制遺伝子であることが示された。今後この系を用いて、肺癌の発生、進展の分子機構の解明や治療、予防の研究を発展させる予定である。一方、CADM1が成人T細胞白血病(ATL)では過剰発現するという以前に共同研究で報告した知見に基づきATLにおけるCADM1の意義を検討し、CADM1がATL細胞の葉状仮足の形成を誘導すること、一方CADM1の発現をsiRNAで抑制すると、ATL細胞の葉状仮足形成と、初代培養由来線維芽細胞への接着が強く抑制されることを見出した。このことから、CADM1はATLでは浸潤を促進する可能性が示された。1.アレル特異的発現量の高感度解析による、がんの質的診断、易罹患性の診断(村上) :CADM1遺伝子の発現がレチノイン酸によって誘導されることを確認し、この転写活性化にはCADM1遺伝子プロモーター領域のSp1結合部位が重要であることを見出した。一方、Cadm1遺伝子欠損ヘテロマウスでも肺腫瘍の発生頻度が上昇すること、腫瘍では野生翌Cadm1アレルがメチル化等により不活化され、発現欠如を示すことを見出した。2.尿路系腫瘍等を対象とした、がんのDNA遺伝子異常、発現異常の網羅的解析(伊藤、村上) :臨床グループとの共同研究により、非小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、尿路系腫瘍、子宮頸がん、神経芽細胞腫の症例について、CADM1遺伝子のメチル化、EGFR, KRAS2, TP53遺伝子等の変異の有無を解析した。この結果、CADM1のメチル化が非小細胞肺がんではEGFR, KRAS2遺伝子変異とは独立に生じること、子宮頸がん、神経芽細胞腫では予後不良の指標となること、頭頸部がん、乳がん、尿路系腫瘍でも高頻度に認められることを明らかにした。3.細胞接着分子CADM1経路を標的としたがん診断の新たな分子標的の同定(桜井、村上) :細胞接着分子CADM1の関わる分子経路とその異常を、免疫沈降・質量分析法、in vitro CADM1接着を介した細胞伸張アッセイ等を用いて検索し、候補分子の確認、同定を行った。この結果、新規CADM1結合タンパク質として、特定のチロシン・キナーゼ活性を制御し、すでにがん抑制タンパク質として機能することが示唆されている分子を含む3種の分子を新たに同定した。また、CADM
男児外陰部異常症における化学物質曝露バイオマーカーとＤＮＡメチル化レベルの関連性

尿道下裂は胎児期の環境汚染物質曝露が原因で増加しているとされているが、ヒト集団における因果関係は定かでない。本研究では尿道下裂と埋没陰茎患者の包皮組織を用い、化学物質曝露バイオマーカーのCYP1ファミリーとアンドロゲン関連遺伝子の解析を行った。尿道下裂群では埋没陰茎群に比べ、CYP1B1が高くARが低かった。尿道下裂患者群内ではCYP1ファミリーとSRD5A2 mRNA発現に正の相関が見出された。また、SRD5A2のメチル化とCYP1ファミリー発現との間に負の相関が見られた。この知見は尿道下裂症患者に対する化学的曝露を示唆しているかもしれない。本研究目的はヒト集団における男児外陰部異常症と化学物質曝露の関連性を明らかにすることである。この目的達成のため、尿道下裂患者手術時に微量採取される「新鮮包皮サンプル」を利用する。回収できるトータルRNAとゲノムDNAを用い、まず、曝露指標となるバイオマーカー遺伝子群のmRNA発現レベルと発症に関与すると考えられる性ホルモン関連遺伝子群の発現レベルを比較し、疾患との相関性を検討する。さらにエピジェネティックな変化と疾患との関連性も検討するため関連遺伝子のDNAメチル化を測定するとともに、曝露バイオマーカーとの相関性を検討する。これまで、尿道下裂患者の手術時に採取した包皮サンプルと比較対照群として用いた埋没陰茎患者サンプルを用いて薬物代謝酵素とステロイド合成酵素の発現解析を行ってきた。その結果、尿道下裂、埋没陰茎ともにCYP1A1とCYP1B1の発現レベルに群内での有意な相関関係が認められた。また、CYP1B1発現レベルは尿道下裂患者で埋没陰茎より高い傾向にあった。皮膚における薬物代謝酵素発現はPAH等の曝露レベルを反映するとの報告がラットなど一部の動物種で報告されており、今回の結果は疾患と曝露との関連性を示唆しているかも知れない。人の集団における男児外陰部異常症と化学物質曝露の関連性が指摘されて久しい。この件について検討するため、尿道下裂患者手術時に微量採取される「新鮮包皮サンプル」を利用、回収できるトータルRNAとゲノムDNAを用い、まず、曝露指標となるバイオマーカー遺伝子群のmRNA発現レベルと発症に関与すると考えられる性ホルモン関連遺伝子群の発現レベルを比較し、疾患との相関性を検討した。さらにエピジェネティックな変化と疾患との関連性も検討するため関連遺伝子のDNAメチル化を測定するとともに、曝露バイオマーカーとの相関性を検討した。尿道下裂患者の手術時に採取した包皮サンプルと比較対照群として用いた埋没陰茎患者サンプルを用いて薬物代謝酵素とステロイド合成酵素の発現解析を行った。尿道下裂患者の手術時に採取した包皮サンプル(n=23)と比較対照群として用いた埋没陰茎患者サンプル(n=16)を用いて、薬物代謝酵素とステロイド合成酵素の発現解析を行った。CYP1B1 mRNAレベルが尿道下裂群で埋没陰茎群より有意(P<0.001)に高い傾向にあるという所見を見出した。一方、AR mRNAレベルは尿道下裂群で埋没陰茎群より有意(P<0.001)に低かった。また、尿道下裂、埋没陰茎ともにCYP1A1とCYP1B1の発現レベルに群内での有意な相関関係(P<0.001)が認められた。この結果を米国内分泌学会誌に投稿したがリジェクトされた。その理由として、対照群に埋没陰茎を用いており比較対象とならないというものであった。レフリーからの提案では、「割礼」を行っているような他国から正常包皮サンプルを入手し、正確な対照群にすべきとの示唆があった。【研究の背景】人の集団における男児外陰部異常症と化学物質曝露の関連性が指摘されて久しい。特に尿道下裂は前世紀末から上昇していることが疫学的に報告されているため、環境汚染物質が誘発しているとの仮説がある。【研究目的】

この仮説を検証するため、尿道下裂患者手術時に微量採取される「新鮮包皮サンプル」を利用し、回収できるトータルRNA・ゲノムDNAを用いて曝露指標遺伝子発現レベル、DNAメチル化レベルを解析した。【研究の方法】まず、表皮でも化学物質の曝露指標として適用可能なバイオマーカー(CYP1A1とCYP1B1)のmRNA発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。対照群には埋没陰茎表皮を用いた。また、発症に関与すると考えられる性ホルモン関連遺伝子群のエピジェネティックな変化をバイサルファイトゲノミックシークエンス法で測定し、疾患との関連性も検討した。【研究成果の概要】尿道下裂、埋没陰茎ともにCYP1A1とCYP1B1の発現レベルに群内での有意な相関関係が認められた。また、CYP1B1発現レベルは尿道下裂患者で埋没陰茎より高い傾向にあった。皮膚における薬物代謝酵素発現はPAH等の曝露レベルを反映するとの報告がラットなど一部の動物種で報告されており、今回の結果は疾患と曝露との関連性を示唆しているかも知れない。尿道下裂患者の手術時に採取した包皮サンプル(n=23)と比較対照群として用いた埋没陰茎患者サンプル(n=16)を用いて、薬物代謝酵素とステロイド合成酵素の発現解析を行った。CYP1B1 mRNAレベルが尿道下裂群で埋没陰茎群より有意(P<0.001)に高い傾向にあるという所見を見出した。一方、AR mRNAレベルは尿道下裂群で埋没陰茎群より有意(P<0.001)に低かった。また、尿道下裂、埋没陰茎ともにCYP1A1とCYP1B1の発現レベルに群内での有意な相関関係(P<0.001)が認められた。米国内分泌学会誌に投稿したがリジェクトされた理由を鑑み、今後、「割礼」を行っているような他国から正常包皮サンプル入手を試みる必要がある。国内医療機関での入手は不可能である。しかしこれは国際的共同研究の足がかりとなろう。またその際、術時の年齢が1歳児以下であることが条件となる。環境毒性学DNAメチル化解析を網羅的手法も用いることで実施して、メチル化CpGバイオマーカーの探索を行い、曝露指標である遺伝子発現との関連性を解析する。その際、検体には純度の高いDNAを用いることが求められるが、そのためのサンプル選定基準が問題となると考えられる。論文リジェクトを受けて、指摘項目にはすべて対応しきれないものの、曝露レベルの推定をさらに行うため、発現解析を追加で実施するため。一部の解析用試薬と投稿費用に充当させる。論文受理までが期限であるため、最長平成28年度一年間を使用期限とする。