hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物の身体をめぐる3つの位相からみる生物とモノの連続性

2018年度はフィールド調査に重点をおいて研究を実施した。具体的には7月にカナダ、ユーコン準州で開催された内陸トリンギットコミュニティにおけるトーテムポール建立セレモニーに関するフィールド調査、9月にはカナダユーコン準州のカスカのコミュニティにおける葬送儀礼に関するフィールド調査を実施した。7月の調査では、動物の表象や動物の身体を象徴的に利用するという観点から、特にセレモニーにおいて用いられる「レガリア」と呼ばれる装飾品がどのように製作、贈与されるのか、また当日どのように身に着けられ、パフォーマンスの中で役割を果たすのかといった点に注目した。そこから、動物に象徴されるクランや、祖先が内陸トリンギット内の人間関係の構築、維持に大きな役割を果たしているという点が明らかになった。また、その背景として、特にカスカなど古くからユーコン内陸部に居住してきた近隣の民族と比較して、比較的新しい時代に移動してきた海岸トリンギットと内陸のアサパスカ系諸民族との融合によって内陸トリンギットが形成されてきたという歴史的経緯が関係している様子が示唆された。また、カスカの葬送儀礼においても墓石にクラン動物を刻むなど、象徴的に動物を用いる様子が見られた。カスカもトリンギットの影響と考えられるクランシステムをもっており、このクランが墓石に刻まれることが多い。ただしクラン動物は2種類で内陸トリンギットの56種類に比較すると少ないなど、コミュニティ内の社会システムにおける動物の象徴利用は、カスカでは限定的といえる。むしろ、個々人の狩猟やメディシン・アニマルを通じが動物とのつながりに重点が置かれてきたことがこれまでの研究からも示唆されており、儀礼の場面での動物の象徴的な表現の在り方という点で、特に目に見えるモノとして二つの集団に類似点が認められながらも大きな違いがあることが明らかになった。2018年度の研究計画における目標としていた、カナダ先住民内陸トリンギットおよびカスカを対象としたフィールド調査を実施することができた。特に新しい研究領域である内陸トリンギットの芸術についてセレモニーという好機をとらえて調査を実施することができたことで、今後の研究を進めるにあたって必要な一次資料が着実に収集できた。また、カスカの葬送儀礼についてもこれまでの信頼関係の中で参加を許されたことから、カスカ動物との関係についてさらに深く理解することができた。こうした点から、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後の研究計画として、2020年までは引き続き一次資料の収集のためフィールド調査を実施する。特に内陸トリンギットの動物の狩猟や罠猟における資源としての利用について、学ぶとともに、こうした狩猟や罠猟を通じてどのような動物観が培われるのか、また食だけでなく毛皮や角などをどのように加工し、モノとして利用するのかという点についての調査が必要になる。同時に、表象される動物については、内陸トリンギットだけでなくカスカについても、彫刻や絵画といったビジュアルアートだけではなく、歌や踊り、語りなどについても調べていきたい。この際、活動や動物との関わりなどからどのように動物を表現しようという気持ちが生じるのかという点について明らかにするために、できる限り地震でも技術の習得を行いながら調査をすることを計画している。2020年以降は補助的な調査を実施しながらも、研究成果の分析とまとめ、成果の公表に力点を置く。また、これらの研究と並行して、自分自身が狩猟を行うことによって、狩猟することを通じて動物観や、動物の利用についてどのような感覚がもたらされるのかという点についても経験的に考察したい。ただし現在これまで狩猟のフィールドとしていた岐阜県揖斐川町周辺が豚コレラにより狩猟制限がかけられている状況であるため、もし岐阜での狩猟が今後もむつかしい場合は勤務地である北海道や自身の調査地の一つである西表島を含めた新しい場所での狩猟実践を視野に入れて準備を進める必要がある。従って2019年に関しては、カナダでのフィールド調査を中心に研究を進める。一方で2018年度に収集した資料に関しては研究ノート、および学会発表において公表する予定である。また関連する研究会にも積極的に参加するなどしてこれまでの研究成果の再検討と新たな知見の収集にも努める予定である。

むしろ、個々人の狩猟やメディシン・アニマルを通じが動物とのつながりに重点が置かれてきたことがこれまでの研究からも示唆されており、儀礼の場面での動物の象徴的な表現の在り方という点で、特に目に見えるモノとして二つの集団に類似点が認められながらも大きな違いがあることが明らかになった。2018年度の研究計画における目標としていた、カナダ先住民内陸トリンギットおよびカスカを対象としたフィールド調査を実施することができた。特に新しい研究領域である内陸トリンギットの芸術についてセレモニーという好機をとらえて調査を実施することができたことで、今後の研究を進めるにあたって必要な一次資料が着実に収集できた。また、カスカの葬送儀礼についてもこれまでの信頼関係の中で参加を許されたことから、カスカ動物との関係についてさらに深く理解することができた。こうした点から、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後の研究計画として、2020年までは引き続き一次資料の収集のためフィールド調査を実施する。特に内陸トリンギットの動物の狩猟や罠猟における資源としての利用について、学ぶとともに、こうした狩猟や罠猟を通じてどのような動物観が培われるのか、また食だけでなく毛皮や角などをどのように加工し、モノとして利用するのかという点についての調査が必要になる。同時に、表象される動物については、内陸トリンギットだけでなくカスカについても、彫刻や絵画といったビジュアルアートだけではなく、歌や踊り、語りなどについても調べていきたい。この際、活動や動物との関わりなどからどのように動物を表現しようという気持ちが生じるのかという点について明らかにするために、できる限り地震でも技術の習得を行いながら調査をすることを計画している。2020年以降は補助的な調査を実施しながらも、研究成果の分析とまとめ、成果の公表に力点を置く。また、これらの研究と並行して、自分自身が狩猟を行うことによって、狩猟することを通じて動物観や、動物の利用についてどのような感覚がもたらされるのかという点についても経験的に考察したい。ただし現在これまで狩猟のフィールドとしていた岐阜県揖斐川町周辺が豚コレラにより狩猟制限がかけられている状況であるため、もし岐阜での狩猟が今後もむつかしい場合は勤務地である北海道や自身の調査地の一つである西表島を含めた新しい場所での狩猟実践を視野に入れて準備を進める必要がある。従って2019年に関しては、カナダでのフィールド調査を中心に研究を進める。一方で2018年度に収集した資料に関しては研究ノート、および学会発表において公表する予定である。また関連する研究会にも積極的に参加するなどしてこれまでの研究成果の再検討と新たな知見の収集にも努める予定である。
歴史遺産を核とした持続的な地域風土を育てるための環境計画手法に関する実践的研究

本年度は、(1)マップ原案の作成とアンケート、(2)住民との共同によるマップ最終案の作成、(3)行政提案、及び(4)地区環境計画案の作成を行った。(1)については、金ケ崎町で古老にヒアリングをしたり、水系の現況を観察して「散歩マップ」や「水系マップ」等をつくり、潜在的な町の個性を確認した。これらを仮想評価法(CVM)等により評価する検討を行ったが、個人的プライバシーに関わる点、CVMが元来外部評価の手法であった点から、同地区でのアンケート実施を断念した。一方で重要比較地区である弘前市で伝建地区の外からみた歴史資源の価値意識調査を行う予定であったことから、こちらで調査を実施した。弘前市民における伝建地区の存在感は期待値には至らなかったが、現在の投資金額よりは高い数字が出た。(2)および(3)については作成したマップを基に、もの/ひと/ことの3位相に留意し、環境づくりを施すべき対象を明らかにしていった。特に商業的観光化と無縁なこの地区においては、真新しいハードの整備を求める声は少なく、高齢化という「ひと」の問題、草取り等の環境管理(=こと)の問題が特に取り沙汰された。つまり地域に欠けているのは単なる施設機能やインフラではなく、もの・ひと・ことを「つなぐ」存在(空間、ひと、情報等)に集約されるのである。このことから、実際の地区環境計画立案においては、キーワードとして「接続/継続」が相応しいという観点に達した。(4)についてはこれまでの軌跡を俯瞰し、キーワードを基に「コミュニテイをつなぐ家並」「防災機能と景観復活を目指す雨水利用」「内外の人物交流を生む文化財活用」等、具体的な計画を立案した。地区への最終提案は3月に予定している。以上、演繹性には幾分欠けたものの、ある程度のリアリティを持った環境計画案が提示できた。また明解な科学的調査手法には至らなかったが、環境計画における着眼点についての重要な知見が得られたと考える。本年度の研究予定項目として、(1)研究領域の体系化、(2)対象地区の情報整理、(3)フィールド調査と比較研究、及び(4)対象地区の空間設計原案と自動アンケートプログラムの作成を掲げていた。(1)については、先ず、文献調査のみならず国内外のまちづくり事例を視察すべく、ドイツのコブレンツやライネフェルデ、国内においては弘前から小布施等の様々な地域を訪れ、「核となる歴史遺産」の相違や、これをどう生かそうと考えているのか、その真意を探ることを心がけた。(2)については、「実践的研究」の名からも分かるとおり、対象地域である岩手県金ヶ崎町城内諏訪小路地区における住民とのコミュニケーションを軌道に乗せ、同時に地域風土の本質や一見見過ごしがちな地域独自の内情を探ることとした。中でも地域住民が毎年行っている日常生活の一つである生垣の剪定作業をワークショップによって他地域住民にも公開したことにより、「持続性」の実情を窺い知ることが出来た。(3)については、「地域環境計画」の多くの対象となるであろう各屋敷地における家と家の間の「屋外空間」に着目し、その存在要素と特性をひろく把握する実測作業を進めた。なお、これに関しては別の伝建地区である弘前においても部分的に同様の作業をおこなうことにより、より実測における着目点を明確化することができた。現在は(4)の作業を中心に進めているところである。今後の問題として、現在試作中のアンケートプログラムの最適化が挙げられるが、前例が必ずしも豊富であるとは言えないため、別調査に関連して行った調査方法を参考にして、その細部に関する検討を行う予定である。いずれにせよ、環境計画そのものに必要な情報の列挙はある程度充実してきたので、構築した地域住民との関係を育てながら、プレゼンテーションと意見徴収、計画のバージョンアップ、すなわち「総合化」の方法論を探って行きたい。

(4)についてはこれまでの軌跡を俯瞰し、キーワードを基に「コミュニテイをつなぐ家並」「防災機能と景観復活を目指す雨水利用」「内外の人物交流を生む文化財活用」等、具体的な計画を立案した。地区への最終提案は3月に予定している。以上、演繹性には幾分欠けたものの、ある程度のリアリティを持った環境計画案が提示できた。また明解な科学的調査手法には至らなかったが、環境計画における着眼点についての重要な知見が得られたと考える。
ベンチマーキングの手法を用いた糖尿病療養指導に携わる看護師の自律性尺度の開発

本研究の目的は、ベンチマーキングの手法を用いて糖尿病療養指導に携わる看護師の自律性尺度を開発することである。29年度は、研究代表者の産休・育休の取得により調査を中断したため、30年度は調査再開に向けて新たな対象者への調査を主な活動とした。前年度とは異なる施設へ調査を依頼し、当該施設の倫理審査会への申請を行った。昨年度は3名の看護師への調査を実施したが、30年度は新たに8名の対象看護師からの承諾が得られ、観察調査(患者と対象看護師との面接の様子)と面接調査(療養指導時に意識して配慮していること)を実施することができた。今後、得られたデータの分析と考察、学会発表を行う予定である。これまでの面接調査において得られたデータの分析・考察により、外来における対応困難な糖尿病患者への看護師の関わりについて以下のことが明らかになった。「多角的な患者理解」「話す機会の確保」「肯定的なフィードバック」「介入の見極め」「多方面からの介入」の5つのカテゴリーと12のサブカテゴリーが抽出された。以上のことから、自律的に療養指導を実践している看護師は、対応困難と感じる場面において、経験に裏付けされた患者理解の視点により多角的に患者の背景をアセスメントし、患者の気持ちを汲み取りながらコミュニケーションの機会を多くもつことで、介入時期の見極めを行っていた。また、自分だけでなく他職種と連携しながら、介入の好機を逃さない専門職としてのスキルをもつことが重要であると自覚して指導にあたっていることが分かった。調査再開にあたり、対象施設を増やしたことで倫理審査申請や対象看護師への調査の説明、観察・面接調査の実施までに半年以上を要したため、当初予定していた期間でデータを収集できなかったため。平成30年度は、当初予定していた期間より時間を要したが、対象看護師を8名増やすことができ観察・面接調査も順調に進んだため、今後データの分析と考察を早急に行う。明らかになった内容について学会発表を行うとともに、試作版尺度を作成し、全国の看護師対象の調査を実施する予定である。看護師は医療職者の中で中心的な役割を担い、多岐にわたる項目を指導することが求められているため、施設規模や部署、経験年数に差異があっても、療養指導内容に差が生じないような各看護師の資質向上が必須であると考える。自立性尺度の開発過程において、ベンチマーキングの手法を用いることで、看護師の指導力評価のみを行うのではなく、どのような点をさらに強化するとベスト・プラクティスへ近づくことができるのかを明らかにすることができ、糖尿病療養指導の質向上の一助になると考える。初年度となる29年度は、1文献レビューによる自律性の構成概念の明確化、2対象施設及び対象者の選定、3対象看護師への観察調査(患者との面接の様子)・面接調査(療養指導時に意識して配慮していること)を予定していた。1及び2と並行して3の各調査も実施していたが、看護師3名の調査を終えた時点で研究代表者が産休・育休を取得したため、中断している状態である。結果については分析途中であるが、観察調査を通じて客観的に捉えた看護師が療養指導時に患者へ配慮している点を以下に挙げる。1)療養行動以外の話をしたり、労いの言葉をかけたり話しやすい空気づくりに努める、2)医師との診察内容についての理解度の確認を行う。3)検査結果と自覚症状の差について確認する、4)コミュニケーションをとりながら全身状態をアセスメントする、5)患者の頑張ったことを認める、6)経済面へ配慮する。今後も観察調査と面接調査の分析をすすめ、新たな対象者への調査も再開する予定である。研究代表者が出産のため平成29年7月平成30年3月まで産休・育休を取得し、研究活動を一時中断したため、初年度に予定していた文献検討や調査が完了していない。

調査再開にあたり、対象施設を増やしたことで倫理審査申請や対象看護師への調査の説明、観察・面接調査の実施までに半年以上を要したため、当初予定していた期間でデータを収集できなかったため。平成29年度は産休・育休取得に伴い、当初計画していた文献検討や調査が実施途中である。平成29年度の計画の未完部分である文献検討、調査、学会発表等について、平成30年度に実施する予定である。平成30年度は、当初予定していた期間より時間を要したが、対象看護師を8名増やすことができ観察・面接調査も順調に進んだため、今後データの分析と考察を早急に行う。明らかになった内容について学会発表を行うとともに、試作版尺度を作成し、全国の看護師対象の調査を実施する予定である。研究代表者の出産に伴い、産休・育休を取得したため研究が中断しており、産休取得までの研究活動においては、調査対象者に対する謝金のみの支払いであったため、次年度に繰り越す額が多い状態となった。30年度に実施すべき調査開始までに大きな遅れがあったため、調査対象者への謝礼と調査施設への交通費の使用にとどまり、分析に使用するソフト購入や学会発表のための旅費などに使用することがなかった。次年度は解析ソフトの購入や学会発表のための旅費、全国調査に向けての通信費等に使用する予定である。
大正自由教育における子ども・教師の参画による学校の教育空間の設計

本研究は、大正自由教育をリードした学校において、子ども学校空間の設計において・教師の参画による学校空間の創造の試みがあったかを検討しようとするものである。筆者は、大正自由教育を担った学校の中から私立の自由学園、文化学院並びに成城学園に絞って、これら3校の学校所蔵資料の収集に努めた。収集した資料を基に、これらの学校の子ども・教師の参画による学校空間の創造の事例をできる限り具体的に明らかにした。本研究の目的は、日本の近代学校の歴史、とりわけ大正自由教育の歴史の中で見落とされてきた子ども・教師の参画による学校空間の歴史に光を当てることにある、この研究目的を達成するために、平成24年度から資料収集活動と研究報告書の作成に力を尽くしてきている。平成25年度の研究実績の概要は、次のとおりである。1、(学校所蔵資料の収集)本研究の目的を達成するために、本年度は、自由学園と文化学院を訪問して、子ども・教師の参画という視点から資料の収集に力を入れた。とくに、自由学園の『学園新聞』等の資料を探索しできたのは有益であった。また、文化学院においても、学園関係の資料を閲覧し、子ども・教師の参画にかかわる資料を収集した。2、(東京都公文書館の資料の探索)1920年代以降東京市で設立された私立学校のうち、大正自由教育の一翼を担った学校の設立認可申請書等を探索した。自由学園をはじめとする諸学校の資料を収集することができた。3、(国立国会図書館の資料の探索)本研究の対象として重要な文化学院の創設者西村伊作並びに自由学園の建築を行った遠藤新の著書等を探索した。4、、学校建築・施設関係図書、大正自由教育関係図書並びに欧米教育視察関係図書等の収集を行った。以上1から4の資料を収集すると同時に、以下の分析視角を念頭において平成26年度に作成する予定の研究報告書の構成を考えた。分析視角(1)、子ども・教師の参画による教育空間の創造を可能にした条件は何であったのか。分析視角(2)、それは、欧米の学校建築を視野に入れたものであったのか。分析視角(3)、今日の日本における学校の教育環境を改善することにつながる理論・実践はあったのか。平成24年度においては、かつて大正自由教育をリードした明星学園(東京都三鷹市)と玉川学園(東京都町田市)を訪問し、19201930年代における教育空間に関する資料を中心に学校所蔵資料の閲覧・複写を行った。両校のご厚意により、貴重な資料を入手できた。また、国立国会図書館と東京公文書館を訪問し、「学校建築・施設」、「大正自由教育」、「欧米教育視察」に関連する著書・論文並びに文化学院、明星学園、玉川学園が19201930年代に東京府に提出した設立申請書(学校の図面も含む。)の閲覧・複写を行った。それに加え、東京都内の古書店を訪れ澤柳政太郎ほか『現代欧米教育大観』・山枡儀重『欧米革新教育の実際』をはじめとする教師の「欧米教育視察」等に関する古書を購入した。しかし、当初計画していたことのうち、実施できない事項もあった。平成24年度の反省点を示すと、以下のとおりである。1、当初文化学院(東京都千代田区)の学校所蔵資料の閲覧・複写を計画していたが、資料調査をお願いする依頼状に対する同学院からの回答を頂戴できなかったので、調査を実施できなかった。(平成25年度に、改めて学校所蔵資料の調査をお願いする予定である。)2、当初計画していた大学図書館における「学校建築・施設」、「大正自由教育」、「欧米教育視察」に関連する図書・雑誌論文の調査も十分できなかった。平成24年度に実施できなかったことを、平成25年度の研究活動において取り戻すよう努力したいと思う。平成27年3月31日、本研究の総まとめとして『大正自由教育における子ども・教師の参画による学校の教育空間の設計』という研究報告書(62ページ)を作成した。目次を示すと以下のとおりである。はじめにI、日本の学校建築・設備改善のための提言一、子ども・教師の視点を重視した学校建築・設備改善論ー棚橋源太郎『学校設備用品』(1915年)の分析を通してー二、教師の参画による学校空間の創造を目指してー山松鶴吉の学校建築・設備改善論ーII、子ども・教師の参画による学校空間の創造一、自由学園のばあい二、文化学園のばあい三、成城学園のばあい「大正自由教育における子ども・教師の参画による学校の教育空間の設計」というテーマを設定して、大正自由教育をリードした日本の新学校において、学校の教育空間を創造するうえで子ども・教師がどのようにかかわったのか、子ども教師の参画による学校の教育空間の創造の事例があったかどうかを検証した。具体的に言うと、自由学園・文化学園・成城学園においては、子ども・教師の参画による学校空間創造の試みがあったことが確認できた。本研究においては、先に述べた子ども・教師の参画の試みにつながる学校建築・設備改善論があったかどうかについても検討した。

明治以降の近代学校において、このような学校建築・設備改善論を展開した二人の教師を取り上げた。一人目は、棚橋源太郎である。棚橋は、欧米教育視察の経験を生かし、学校建築・設備改善論を展開した。そのポイントは、校舎を使用する子ども・教師の立場から、子どもと教師にとって快適な学校空間を創造することにあった。二人目は教師の参画による学校空間の創造を提案した山松鶴吉である。山松は、教師の参画を通して子ども・教師にとって快適な学校空間の創造の実現を願っていた人物である。教育学1、本研究の目的を達成するために必要な資料収集が、おおむね達成できている。収集する資料の性格から、なかなか得にくい資料ではあるが、自由学園の『学園新聞』をはじめ、本研究をまとめるうえで不可欠な資料を多く集めることができた。2、研究報告書をまとめるための構想が、ほぼまとまってきた。子ども・教師の参画というキーワードを基に、明治末から大正昭和初期において大正自由教育を担った私立学校の教育実践とそれに対応した教育空間の創造をまとめることが第一に必要である。次いで、そうしたことを可能ならしめた要因の分析を行うことが不可欠である。ある私立学校の場合、学校の建築も含め、教師・父母・生徒が一体となて取り組む体制が確立されていた。こうした視点からの分析が必要になる。さらに、奈良女子高等師範学校附属小学校をはじめとする師範学校附属小学校並びに公立学校における教育空間の創造の試みにも光を当てたいと思う。研究実績の概要で述べたように、平成24年度においては文化学院の学校所蔵調査を実施できなかったことに加え、大学図書館における「学校建築・施設」、「大正自由教育」、「欧米教育視察」に関する資料調査も十分実施できなかった。しかし、その他の調査については、ほぼ計画通りに実施できたので、おおむね順調に進展していると考える。平成25年度の研究活動において、平成24年度に実施できなかった事項については、十分取り戻せると思う。来年度(平成26年度)は、本研究の総まとめをする時期に当たる。平成24・25年度における資料収集活動と研究構想の立案を基盤として、平成26年度においては、研究報告書を作成する。報告書の主な内容は以下のとおりである。はじめに1、明治以降の学校建築に対する教師の疑問と意見2、大正自由教育における教育空間の創造3、子ども・教師の参画による教育空間の創造ー日本の学校の事例ーおわりに先に述べたように、本研究はおおむね順調に進展しているので研究報告書の作成は、予定通り進めることができると考える。なお、平成26年度においても、補足的な資料収集活動を実施する。東京都公文書館における私立学校の設立申請書の調査、国立国会図書館等で学校の教育空間関連資料の収集を行いたい。それに加え、大正・昭和和初期にかけての日本の教育界の動向、とりわけ学校の教育空間の動向に関する資料の収集にも力を入れたいと思う。「大正自由教育における子ども・教師の参画による学校の教育空間の設計」というテーマのもとに、平成24年度に収集した資料を活用して、子ども・教師の参画による学校の教育空間の設計の具体像の分析に力を尽くしたい。それと並行して、平成25・26年度においても資料収集を行い、本研究の仮説を実証できるようなデータを補充できるよう努力したい。
肩腱板のエンテーシスの修復に関する研究

エンテーシスは筋肉が生み出す力を腱を介して骨へ伝達する重要な部位であり、腱のコラーゲン線維が線維軟骨を介して骨に連結している.しかし,損傷したエンテーシスが修復される課程を詳細に観察した報告は少ない.我々は,1997より解剖学的に特殊な構造を持つエンテーシスの修復に関する研究を開始した.その結果,腱の断裂端を骨に逢着した場合,腱より骨へ至るコラーゲン線維は骨側の縫合面の状態により異なって再生することが明らかにされた.つまり,骨側に腱の断端が残存している場合は,コラーゲン線維は腱の断端を介して骨に連結した.骨側の表面が石灰化線維軟骨の場合は,骨へのコラーゲン線維の連結が遅れた.骨側の表面が海面骨の場合は,肥厚した骨梁にコラーゲン線維が強固に連結した.この事実は,臨床的に行われている腱を海綿骨に縫着する手術手技が,確かであることを証明している(J Shoulder Elbow Surg,2001,in press,他).さらに,我々は新生コラーゲン線維が骨に連結して修復する課程を詳細に観察する目的で,走査電子顕微鏡(SEM)を用て観察した.その結果,骨梁への新生コラーゲン線維の連結は,術後2週でコラーゲン線維と線維骨とが同時期に形成されることより始まった.術後4週でコラーゲン線維は配向性をもつ線維束となり線維骨および骨梁に連続し,術後6週でコラーゲン線維束は密になり肥厚した骨梁と連結した.これは,骨へのコラーゲン線維の連結を解明した初めての報告である(J Orthop Res,2001,in press,他).これまでの動物を用いた研究で,我々は骨と腱が結合する状態を組織学的に観察してきた.その結果,良好な血流と適度な張力が加わった場合,腱や靭帯は骨と良好に結合することが明らかにされた.今後必要な実験は,欠損した腱板を再建する理想的な方法を考案することであろう.エンテーシスは筋肉が生み出す力を腱を介して骨へ伝達する重要な部位であり、腱のコラーゲン線維が線維軟骨を介して骨に連結している.しかし,損傷したエンテーシスが修復される課程を詳細に観察した報告は少ない.我々は,1997より解剖学的に特殊な構造を持つエンテーシスの修復に関する研究を開始した.その結果,腱の断裂端を骨に逢着した場合,腱より骨へ至るコラーゲン線維は骨側の縫合面の状態により異なって再生することが明らかにされた.つまり,骨側に腱の断端が残存している場合は,コラーゲン線維は腱の断端を介して骨に連結した.骨側の表面が石灰化線維軟骨の場合は,骨へのコラーゲン線維の連結が遅れた.骨側の表面が海面骨の場合は,肥厚した骨梁にコラーゲン線維が強固に連結した.この事実は,臨床的に行われている腱を海綿骨に縫着する手術手技が,確かであることを証明している(J Shoulder Elbow Surg,2001,in press,他).さらに,我々は新生コラーゲン線維が骨に連結して修復する課程を詳細に観察する目的で,走査電子顕微鏡(SEM)を用て観察した.その結果,骨梁への新生コラーゲン線維の連結は,術後2週でコラーゲン線維と線維骨とが同時期に形成されることより始まった.術後4週でコラーゲン線維は配向性をもつ線維束となり線維骨および骨梁に連続し,術後6週でコラーゲン線維束は密になり肥厚した骨梁と連結した.これは,骨へのコラーゲン線維の連結を解明した初めての報告である(J Orthop Res,2001,in press,他).これまでの動物を用いた研究で,我々は骨と腱が結合する状態を組織学的に観察してきた.その結果,良好な血流と適度な張力が加わった場合,腱や靭帯は骨と良好に結合することが明らかにされた.今後必要な実験は,欠損した腱板を再建する理想的な方法を考案することであろう.平成10年度は、棘下筋腱を腱の停止部近傍の非石灰化線維軟骨層で切離し元の場所にもどす非石灰化線維軟骨層逢着モデルと、切離した腱を石灰化線維軟骨層に逢着する石灰化線維軟骨層逢着モデルを作製し、腱の骨への停止部の修復を組織学的に観察した。両モデルの作製にそれぞれビーグル犬5匹(10-15kg)を用い、腱縫合を4 strand Savage法(2-0 Ethibond)で行なった。術後、犬をケージ内で飼育し、経過観察期間3,6,9,12,16週で各1匹ずつ屠殺し骨付きの腱標本を採取した。採取した腱をホルマリン固定し、脱灰後にHE染色、Azan染色を行い、偏光顕微鏡下で腱より骨に向かって再生するコラーゲンの構造を、経過を追いながら観察記録した。非石灰化線維軟骨層逢着モデルでは術後6週で新生コラーゲン線維が残存している非石灰化線維軟骨層に連結し始め、術後12週ではコラーゲンが成熟を開始した。術後16週では4層構造のdirect enthesisがほほ完成した。腱と非石灰化線維軟骨層を連結する線維性結合組織の細胞は主に腱断端及び周囲の新生血管より供給される像を示した。Tide markを越えた骨からの血管の新生は認めなかった。

石灰化線維軟骨層逢着モデルでは術後6週までは新生コラーゲン線維の発育が少なく、石灰化線維軟骨層の表面との連結が粗であった。術後12週では新生コラーゲン線維が石灰化線維軟骨層の表面に連結した。術後16週で初めてコラーゲン線維が石灰化線維軟骨層の骨組織に軟骨層介さずに侵入している像が観察された(indirect enthesis)。Tide markを越えた骨からの血管の新生は認めなかった。以上の結果より、逢着された腱は非石灰化線維軟骨層の表面に連結し易く、早期よりdirect enthesis構造を再生した。これは、線維軟骨層の表面が足場となって腱が逢着し易い何らかの機序が働いているものと予測された。一方、鍵は石灰化線維軟骨層に接続し難く、これは露出している石灰化線維軟骨層が腱の接続を妨げている可能性を示唆した。今後、骨髄内逢着モデル、骨皮質逢着モデルを作製する予定である。エンテーシスは筋肉が生み出す力を腱を介して骨へ伝達する重要な部位であり、腱のコラーゲン線維が線維軟骨を介して骨に連結している.しかし,エンテーシスの再生を詳細に監察した報告は少ない.我々は,1997より解剖学的に特殊な構造を持つエンテーシスに関する研究を開始した.その結果,腱の断列端を骨に逢着した場合,腱より骨へ至るコラーゲン線維は骨側の縫合面の状態により異なって再生することが明らかにされた.つまり,骨側に腱の断端が残存している場合は,コラーゲン線維は腱の断端を介して骨に連結した.骨側の表面が石灰化線維軟骨の場合は,骨へのコラーゲン線維の連結が遅れた.骨側の表面が海面骨の場合は,肥厚した骨梁にコラーゲン線維が強固に連結した.この事実は,臨床的に行われている手術手枝が,確かであることを証明している.さらに,我々は骨へのコラーゲン線維の連結を詳細に観察する目的で,走査電子顕微鏡(SEM)を用い,コラーゲン線維が海面骨骨梁に連結する初期の微細構造を観察した.その結果,骨梁への新生コラーゲン線維の連結は,術後2週で新生コラーゲン線維と新生骨とが同時期に形成されることより始まった.術後4週で新生コラーゲンは配向性をもつ繊維束となり新生骨および骨梁に連結し,術後6週でコラーゲン繊維束は密になり肥厚した骨梁と連結した.これは,骨へのコラーゲン線維の連結を解明した初めての報告である.以上の結果に基づき,エンテーシス部分でのコラーゲン線維の再生やリモデリングを促進するための条件を解明する.そのために,コラーゲンの解析,成長因子の発現,メカニカルストレスの関与について実験を進めて行く予定である.エンテーシスは筋肉が生み出す力を腱を介して骨へ伝達する重要な部位であり、腱のコラーゲン繊維が線維軟骨を介して骨に連結している。しかし、損傷したエンテーシスが修復される課程を詳細に観察した報告は少ない。我々は、1997より解剖学的に特殊な構造を持つエンテーシスの修復に関する研究を開始した。その結果,腱の断裂端を骨に逢着した場合、腱より骨へ至るコラーゲン線維は骨側の縫合面の状態により異なって再生することが明らかにされた。つまり、骨側に腱の断端が残存している場合は、コラーゲン線維は腱の断端を介して骨に連結した。骨側の表面が石灰化線維軟骨の場合は、骨へのコラーゲン線維の連結が遅れた。骨側の表面が海面骨の場合は、肥厚した骨梁にコラーゲン線維が強固に連結した。この事実は,臨床的に行われている腱を海綿骨に縫着する手術手技が、確かであることを証明している(J Shoulder Elbow Surg,2001,in press,他)。
内耳における複合糖質とその糖鎖構造に関する組織化学的研究

カチオン化コロイド金と各種のグリコシダーゼ処理を組み合わせて蝸牛管側壁での陰性荷電部位を検討し、また銀増感処理を施し可視化することで走査電顕により表面上の分布を観察した。1、辺縁細胞の内リンパ腔表面には陰性荷電部位を認めなかったが、らせん隆起表面の内リンパ腔表面には認めた。各種グリコシダーゼ処理により、らせん隆起表面細胞膜の陰性荷電は主としてコンドロイチン硫酸によるものであることが判明した。2、血管条の内リンパ腔表面には陰性に荷電しているらせん隆起の上皮細胞群が入り込んでおり、さらにこのらせん隆起と血管条との境界線上には、らせん隆起上皮細胞の形態を示しながらも辺縁細胞と同様に細胞表面に陰性荷電部位を検出できない中間的な細胞を存在し、蝸牛管内リンパ腔表面には酸性複合糖質に関して移行帯が存在することが推定された。本研究でらせん隆起と血管条の内リンパ腔表面で陰性荷電状態に差異を認め、吸収部位としてのらせん隆起と産生部位としての血管条の役割が推測された。またその境界に、辺縁細胞とらせん隆起上皮細胞の移行帯細胞とも言える中間的な細胞が存在していることが明らかとなった。α2,8ポリシアル酸に対する特異抗体(MAb735)と神経細胞接着因子(N-CAM)に対する特異抗体を用いてモルモット内耳でのポリシアル酸の検出をも比較検討してみた。らせん神経節細胞の膜周期、らせん板縁の歯間細胞で共に強く染まった。血管条では辺縁細胞、中間細胞及びそれらの細胞膜上で部分的に染まったいる部分を共に認めた。血管条血管は染まらなかった。蝸牛軸血管に分布する自律神経終末をMAb735のみが染色した。蝸牛軸の血管は神経支配を受けて機能していることを反映していることを確認できたもの考える。
線維化疾患治療薬を目指した分子シャペロン阻害剤の創製

1.HSP47阻害剤デザインのためのペプチドシード化合物の最適化HSP47が認識するコラーゲン3重らせん上の2つのアミノ酸残基に関して、前年度までに得られていた情報を基にして、徹底した構造活性相関データを収集した。すなわち、HSP47が認識するArg残基(第一ファーマコフォア残基)およびそのArgの3残基N-末端側にあるアミノ酸(Yaa-3:第二ファーマコフォア残基)について、非天然アミノ酸を含むシステマティックな置換を施した40種類以上のコラーゲン様ペプチドを化学合成した。それらのペプチドとHSP47との結合アフィニティーをin vitroで定量的に評価し、HSP47上に存在する「コラーゲン認識ポケット」の性状についての情報を得た。その結果、第一ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はArgであり、とくに側鎖グアニジノ基の存在が必須であることが明らかになった。また、第二ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はThrであった。2.HSP47とコラーゲンとの結合を阻害する小分子化合物のスクリーニングについてHSP47がin vitroでのコラーゲンの線維形成を阻害することを利用した、マルチウェルプレート対応のスクリーニングシステムを構築した。上記1で使用したペプチド性阻害剤を用いてこのスクリーニングシステムのバリデーションを行った。その結果、今回構築したシステムは従来我々が用いてきたpull-downアッセイや、BIAcoreをもちいた競合結合実験と同等の精度・感度を有することが確認され、薬物のスクリーニングに使用可能であると判断できた。1.HSP47結合に重要なコラーゲン上のファーマコフォア位置の同定HSP47との結合に必要なアルギニン残基(第一ファーマコフォア)を中心部分にもち、かつ、さまざまな位置に光反応性アミノ酸(Bpa)を組み込んだコラーゲンペプチドを用いて、HSP47のフォトアフィニティーラベリングを行った。その結果、アルギニン残基の3残基N末端側のアミン酸残基が、HSP47により直接認識されていることが強く示唆された。以下このアミノ酸残基位置を第二ファーマコフォア位置と称する。2.第二ファーマコフォアの必要構造第一ファーマコフォアにアルギニンを持ち、第二ファーマコフォアをさまざまなアミノ酸に置換したコラーゲンモデルペプチドを種々合成し、HSP47との結合を検討した。その結果、第二ファーマコフォアとして、4-ヒドロキシプロリン、プロリン、スレオニン、セリン残基が優れていることが明らかになった。逆に、この位置に荷電を有するアミノ酸を導入するとHSP47との結合は消失した。3.第一および第二ファーマコフォア構造を持つヘテロ3本鎖型コラーゲンモデルの合成コラーゲン3本らせん上の第一および第二ファーマコフォアの相対的位置関係を明らかにするために、ヘテロ3本鎖型コラーゲンモデルの合成に着手した。すでに我々は、位置選択的ジスルフィド結合形成によるヘテロ3量体コラーゲンモデルの合成法を報告しているが、さらに効率よく構造活性相関研究を行うために、合成ルートの簡略化を試みでいる。1.HSP47阻害剤の創製に重要な最小ファーマコフォア構造の同定HSP47との結合に必要なコラーゲン様ペプチド上のArg残基(第1ファーマコフォア)と3残基N末端側に存在する第2ファーマコフォア残基との、3本らせん上での相対的位置関係を明らかにするため、様々な位置関係をもつヘテロ3量体型コラーゲンペプチドを合成した。これらペプチドとHSP47との結合実験から、HSP47は第1ファーマコフォア残基と第2ファーマコフォア残基が同一のポリペプチド鎖上に存在するときにのみ結合することを明らかにした。HSP47結合モチーフが一次構造として記述できることが分ったので、ゲノム情報データベースからESP47の基質となる蛋白質を検索するためのコンピュータサーチプログラムを構築した。検索の結果は、コラーゲン様3本らせんをもつ蛋白質すべてがHSP47と結合するわけではないということを示した。2.HSP47-コラーゲン結合インターフェイスの構造解析コラーゲンペプチドとHSP47との光架橋体の酵素消化断片の解析を行うため、光架橋体の大量調製を行った。3.低分子阻害剤のスクリーニングカナダAnanthanarayananのグループが報告した、HSP47の低分子阻害剤の活性評価を行った。その結果、彼らが報告した4化合物にHSP47-コラーゲン結合阻害活性は認められなかった。

2.HSP47とコラーゲンとの結合を阻害する小分子化合物のスクリーニングについてHSP47がin vitroでのコラーゲンの線維形成を阻害することを利用した、マルチウェルプレート対応のスクリーニングシステムを構築した。上記1で使用したペプチド性阻害剤を用いてこのスクリーニングシステムのバリデーションを行った。その結果、今回構築したシステムは従来我々が用いてきたpull-downアッセイや、BIAcoreをもちいた競合結合実験と同等の精度・感度を有することが確認され、薬物のスクリーニングに使用可能であると判断できた。
Dectin-1を介した選択的Foxl1制御に基づく腸管再生の基礎的検討

マウス筋線維芽細胞の単離に時間を要したため、in vitroでの検討が十分に行えていない。in vivoの準備を並行して行っている。腸管上皮細胞と間葉系細胞との相互作用(epithelial-mesenchymal interaction)は腸管上皮細胞の分化・増殖に大変重要な因子である。消化管の上皮細胞を裏打ちするように存在する筋線維芽細胞は上皮幹細胞のniche形成に重要な役割を果たしている。以前は上皮細胞の単培養は不可能とされてきたが、wnt3a、Noggin、R-spondin1の添加により可能となっている(Sato T. et al. Nature. 2009)。今回、我々は間葉系細胞である筋線維芽細胞に発現する転写因子であるFoxl1に着目し、その制御を行うことにより小腸の腸管上皮細胞の分化・増殖を促進させることを研究目的としている。Foxl1は筋線維芽細胞などの間葉系細胞に特異的に発現し、Foxl1ノックアウトマウスにおいて筋線維芽細胞のWnt発現亢進と上皮細胞の増殖亢進が報告されている(Takano-Maruyama M. et al.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006)。筋線維芽細胞にはパターン認識受容体であるDectin-1が発現しており、本研究ではDectin-1依存性にSchizophyllan(SPG)というβ-1,3-glucanを担体とし、Foxl1アンチセンスDNA塩基配列を筋線維芽細胞内に導入する。Dextran sulfatesodium(DSS)腸炎モデルにFoxl1アンチセンスDNA塩基配列とSPGとの複合体(Foxl1-LNAs-ODN/SPG complex)を投与することにより起こるwnt関連遺伝子の発現変化をin vitroで解析するとともに、in vivoではマウス小腸での分化増殖に与える影響を検討する。マウス筋線維芽細胞の単離に時間を要したため、in vivoの検討が十分に行えていない。腸管上皮細胞と間葉系細胞との相互作用は腸管上皮細胞の分化・増殖に大変重要な因子である。以前は上皮細胞の単培養は不可能とされてきたが、wnt3a、Noggin、R-spondin1の添加により可能となっている。今回、我々は間葉系細胞である筋線維芽細胞に発現する転写因子であるFoxl1に着目し、その制御を行うことにより小腸の腸管上皮細胞の分化・増殖を促進させることを研究目的とした。Foxl1は筋線維芽細胞などの間葉系細胞に特異的に発現し、Foxl1ノックアウトマウスにおいて筋線維芽細胞のWnt発現と上皮細胞の増殖を亢進することが報告されている。筋線維芽細胞にはパターン認識受容体であるDectin-1が発現しており、Dectin-1依存性にSchizophyllan(SPG)というβ-1,3-glucanを担体とし、Foxl1アンチセンスDNA塩基配列を筋線維芽細胞内に導入することが可能である。本研究では、Dextran sulfatesodium(DSS)腸炎モデルにFoxl1アンチセンスDNA塩基配列とSPGとの複合体(Foxl1-LNAs-ODN/SPG complex)を投与することにより腸炎におけるFoxl1の効果を検討している。Foxl1アンチセンスDNA塩基配列とSPGとの複合体(Foxl1-LNAs-ODN/SPG complex)をDSS腸炎マウスモデルに投与したところ、複合体を投与した群において体重減少率の低下と大腸腸管長の短縮抑制、大腸陰窩長の延長が確認できた。マウス筋線維芽細胞にFoxl1-LNAs-ODN/SPG_complexを導入し、惹起されるwnt関連遺伝子の発現変化とin vivoではマウスの小腸障害モデルへの投与を行い、再生能力の評価を行う。内科学臨床医学
水中原子移動ラジカル重合による糖鎖高分子合成を用いる微粒子表面の高密度糖鎖被覆

物質表面の化学的、物理的な改質技術は、材料科学において重要である。本研究では、表面改質技術の一種である表面開始原子移動ラジカル重合(ATRP)を駆使し、ポリスチレン微粒子表面の糖鎖高分子による被覆を行った。作製した粒子は高い分散安定性、レクチンとの特異的凝集能を示した。糖鎖機能をより積極的に解明・利用していくにあたっては、界面への高密度な糖鎖高分子の集積化が求められる。高分子微粒子は取り扱いが容易で、大きな表面積(=界面)を有するにも関らず、その表面上への糖鎖高分子の集積化はあまり検討されてこなかった。本研究では、高分子微粒子表面上で、水中での原子移動ラジカル重合法(水中ATRP法)により糖鎖高分子を調製する「糖鎖高分子被覆微粒子」の簡便な調製法の開発を目的とし実験を行った。H20年度研究においては、水中ATRP法に適応可能なスルホンアミド基含有のスチレン型糖鎖モノマーのライブラリーを新たに調製し、まず水中での会合挙動について検討した。その結果、合成した糖鎖モノマーは水中でミセル形成能を有することが確かめられた。また、実際に水中でのATRPにより重合挙動を検討した結果、リビング的に重合が進行することが分かった。表面を高分子微粒子で被覆するために、微粒子表面にリビング重合開始基を導入し、マクロモノマー型高分子微粒子を作製した。作製した微粒子表面から水中でATRP法により重合を行い、DLS、NMR、IR、SEMにより測定を行った結果、微粒子表面に数十nm程度の糖鎖高分子の膜が形成されていることが示された。またヘテロ凝集法により作製した異型粒子表面からの糖鎖高分子層の形成も可能であることが明らかとなった。H21年度研究においては、まず、前年度までに確立した水中ATRP法に適応可能なスルホンアミド基含有のスチレン型糖鎖モノマーの大量合成をおこなった。合成した糖鎖モノマーを用いて、各種重合法により調製した高分子微粒子表面に糖鎖高分子層を形成した。ソープフリー乳化重合により調製した粒子を利用することで、効率よく糖鎖高分子被覆、ならびに精製が行えることがわかった。作製した微粒子の解析、DLS、NMR、IR、SEMにより測定を行った結果、微粒子表面に3040nm程度の糖鎖高分子の膜が形成されていることが示された。レクチンを用いた凝集能の評価を検討したところ、ラクトース、グルコースを導入した粒子では、それぞれ対応するレクチンPNA、ConAを添加した際に凝集が確認された。一方、対応しないレクチンを添加した際は凝集が観測されなかったことから、作製した糖鎖高分子被覆微粒子は特異的凝集能を示すことが明らかとなった。
電子が直接的に関与する相転移現象の熱力学的研究

熱力学は物質を相として捉え,そのエネルギーやエントロピーを通して物質の本質を明らかにする学問分野である。本研究では,幾つかの集積型金属錯体の熱容量測定を行い,相転移の機構に関する研究を行った。1. MMX型1次元ハロゲン架橋複核白金錯体Pt_2(dta)_4Iの相転移本錯体は電気伝導が300Kから350Kにかけて見かけ上,半導体→金属→半導体と異常な挙動を示し,しかも電気抵抗率の温度変化が負のヒステリシスをもつという,熱力学的には考えにくい現象を示すことが報告されている。本錯体の熱容量測定を行い,373.4Kに相転移を観測した。この相転移は秩序・無秩序型であり,4つのdta配位子のねじれ構造に基づく2つの配座間の動的無秩序化がシンクロナイズして起こることを明らかにした。2.積層型異種金属錯体{X[MM'(ox)_3]}_nの磁気相転移積層型異種金属錯体{X[MM'(ox)_3]}_n(X=NBU_4^+,PPh_4^+;M=Cu^<2+>,Fe^<2+>,Mn^<2+>;M′=Cr^<3+>,Fe^<3+>)はox配位子の遷移金属への配位結合の違いにより,2次元構造と3次元構造の2通りの可能性が考えられている。この系列のほとんどの錯体は粉末結晶でしか得られないので,正確な結晶構造が決定されていない。これら錯体の熱容量を測定し,強磁性やフェリ磁性相転移を観測した。また相転移の高温側には低次元磁性体に特徴的な短距離秩序による熱異常を見出した。相転移の高温側の熱異常を2次元および3次元強磁性ハイゼンベルクモデルと比較したところ,全ての錯体が2次元モデルでうまく表された。このことから,これらの錯体が2次元構造をとっていることを明らかにした。
臨床実用化に直結したマクロファージ制御剤を用いた新規肝線維溶解療法の開発

本研究では、Rho family GTPaseを介したマクロファージ(Mφ)の表現型制御による肝線維溶解療法の開発研究を行った。四塩化炭素誘導肝線維化マウスにおいて、Rac1/Cdc42阻害剤R-Ketorolac投与は肝線維化改善効果を認めず。一方、Rac1阻害剤NSC23766投与でMMP9陽性細胞数増加と肝線維化改善を認めた。Rac1を含むRho family GTPaseを標的とするmiR142-3pの導入は、ヒトMφのMMP12発現、ヒト肝星細胞のMMP1、BAMBI発現を増加した。これらの結果は、Rho family GTPaseが肝線維化の治療標的となり得る可能性を示唆する。進行した肝硬変患者では、肝臓内に蓄積した線維のために肝再生機構が十分に機能しておらず、改善するためには線維を溶解する必要がある。そこで本研究では、マクロファージにおいて細胞運動に関与するRho family GTPase(Rac1, Cdc42)の阻害が線維溶解酵素MMPの発現を増加させることに着目し、アメリカ食品医薬品局の認可受けた消炎鎮痛剤Ketorolacの光学異性体であり、Rac1/Cdc42阻害作用を持つR-Ketorolacが線維溶解療法に応用可能かについて検討することを目的とした。これまでの我々のin vitro検討で、マクロファージではRac1阻害剤NSC23766添加によりMMP9発現が、Cdc42阻害剤ML141添加によりMMP13発現が増加することが明らかとなった。そこで、これらのRho family GTPase阻害剤をin vivoで四塩化炭素誘導肝線維化マウスモデルに週2回腹腔内投与し、肝線維化改善効果について検討した。結果、Rac1阻害剤NSC23766投与マウスとコントロールマウスの比較において、血液生化学検査では肝酵素の上昇は同等であり、病理組織学的検討でも肝細胞障害の部位と程度に差は認めず、肝障害の程度は同等であった。一方で、Rac1阻害剤NSC23766投与マウスにおいて肝内MMP9発現細胞の増加、肝線維化の抑制を認め、肝内マクロファージの貪食像減少などの副作用は認めなかったことから、Rac1が肝線維化治療の標的として有効であることが明らかとなった。また、Rac1/Cdc42阻害剤R-Ketorolacのマクロファージに対する作用を検討するため、in vitroでマウス骨髄由来マクロファージにR-Ketorolacを添加したところ、MMP9, 12, 13発現の増加傾向を認めた。当初の計画通り、in vivoでは肝線維化マウスモデルにおいてRho family GTPase(Rac1、Cdc42)阻害剤の肝線維化抑制作用を検討し、in vitroではR-KetorolacのマクロファージMMP発現への作用について検討を行った。in vivoでRac1阻害剤による肝線維化抑制を認めたことから、本研究におけるコンセプトの確認ができたものと考える。一方で、マクロファージMMP発現に対するR-Ketorolacの作用は、Rac1阻害剤やCdc42阻害剤単独よりも軽度であり、今後in vivoで肝線維化改善効果を有するかを検討する必要がある。肝硬変患者では、蓄積した線維により肝再生が阻害されており、改善には線維溶解が必要である。そこで本研究では、マクロファージ(Mφ)の細胞運動を制御するRho family GTPase(Rac1, Cdc42)が線維溶解酵素MMPの発現に関与することに着目し、Rac1/Cdc42阻害作用を持つR-Ketorolacを線維溶解療法に応用すべく検討を開始した。in vitroでマウス骨髄由来マクロファージにR-Ketorolacを添加すると、MMP9, 12, 13発現の増加傾向を認めたが、Rac1阻害剤(NSC23766)やCdc42阻害剤(ML141)単独よりも軽度であった。in vivoでは、四塩化炭素誘導肝線維化マウスモデルにR-Ketorolacの腹腔内反復投与を行い、肝線維化改善効果を評価したが、肝線維化の改善は得られなかった。R-KetorolacがRac1/Cdc42の両者を阻害することが改善効果不十分の原因であると考え、以後、Rac1を標的としたmicroRNA(miR) 142-3pによる肝線維溶解療法について検討した。in vitroで、ヒト末梢血単球由来マクロファージにmiR142-3pを導入すると、MMP12発現が有意に増加した。また、miR142-3p導入ヒト肝星細胞では、細胞形態が紡錘形から類円形に変化し、増殖が有意に低下した。また、線維化関連遺伝子発現では、TGFβreceptor(TGFBR)1の発現低下、BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI)の発現増加、MMP1の有意な発現増加を認めた。これらの結果は、miR142-3pが肝線維化改善に働く可能性を示唆しており、in vivoで四塩化炭素誘導肝線維化マウスモデルにmiR142-3pを導入し、肝線維化への影響についての検討を継続している。

一方、Rac1阻害剤NSC23766投与でMMP9陽性細胞数増加と肝線維化改善を認めた。Rac1を含むRho family GTPaseを標的とするmiR142-3pの導入は、ヒトMφのMMP12発現、ヒト肝星細胞のMMP1、BAMBI発現を増加した。これらの結果は、Rho family GTPaseが肝線維化の治療標的となり得る可能性を示唆する。今回の検討により、in vivoでRac1阻害により肝線維化が抑制されたことから、Rho family GTPaseを標的とする線維溶解療法のコンセプトを確認することができた。そこで次年度は、in vivo四塩化炭素誘導肝線維化マウスモデルを用いてR-Ketorolacの肝線維化抑制効果について検討を行う。一方、in vitroでR-KetorolacのマクロファージMMP発現に対する作用は認めているが、Rac1阻害剤やCdc42阻害剤単独よりも軽度であり、in vivoで線維化抑制作用が十分でない可能性がある。R-KetorolacがRac1とCdc42の両方を阻害していることが原因の可能性があるため、in vitroでRac1阻害剤とCdc42阻害剤を同時に添加し、マクロファージMMP発現への作用を評価する。その結果、Rac1とCdc42の同時阻害がMMP発現増加作用を減弱していることが明らかとなれば、標的をRac1に絞り、Rac1を阻害する他の方法について追加検討する。近年、C型肝炎治療薬ミラヴィルセン(miravirsen)などの核酸(microRNA)医薬品の開発が進んでおり、新規治療薬として注目されている。我々は既にRac1を標的としたmicroRNAを同定しており、同microRNAによる肝線維溶解療法について検討する。消化器病学本年度はRho family GTPase阻害剤の肝線維化抑制効果を評価するためのマウス肝線維化モデルを用いたin vivo実験とR-Ketorolacのマクロファージに対する作用を検討するためのin vitro実験を行った。in vitro実験で用いたR-Ketorolacはこれまでに使用しておらず、新規購入を要し、また骨髄由来マクロファージ作製のためのマウスを要した。一方、これまでにもRho family GTPase阻害剤を用いたin vitro検討を行ってきたため、Rho family GTPase阻害剤は保有しており、in vivo検討で予想していた投与量よりも少量で肝線維化抑制作用を確認できたため、次年度使用額が生じた。次年度は、in vivoで四塩化炭素誘導肝線維化マウスモデルを用いてR-Ketorolacの肝線維化抑制効果について検討を行う予定であり、投与量の検討から肝線維化抑制効果の評価までを行うため、本年度よりも多くのR-Ketorolac、肝線維化モデルマウス作製のためのマウス、分子生物学関連試薬や免疫組織化学染色用試薬を要する。また、本年度の研究成果を基に新規検討項目としてin vitroでRac1阻害剤とCdc42阻害剤の同時添加によるマクロファージへの作用を評価するため、Rac1阻害剤、Cdc42阻害剤の購入を要する。