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フラクタルを用いた絶縁体中のトリ-状欠陥の解明

本研究は、固体絶縁体中に生ずる絶縁劣化の主要因であるトリ-状欠陥のメカニズムについて、フラクタルの考えに基づき解析すること、及びそのトリ-状絶縁劣化の絶縁診断法を確立することを主な目的としたもである。本研究で得られた成果を以下に述べる。1.連続セクショニング法と光CT法により、トリ-パターンの立体像の再構成とフラクタル次元の算出を行った結果、トリ-形状の変化とフラクタル次元の大きさとは密接に関係しており、トリ-形状のフラクタル次元による定量化が可能であることが明らかとなった。2.トリ-進展時に得られた時系列での部分放電や放電発光の特性解析から、トリ-進展に伴う部分放電と放電発光の特性がカオス性を示すことが明らかとなった。また、これらの特性から求めたアトラクターのフラクタル性も明らかとなった。3.成長確率と電位降下を考慮したトリ-のシミュレーション結果から、トリ-先端部における局部電界効果と進展時のランダム性が重要であるあることが明らかとなった。4.固体絶縁体中のトリ-状欠陥のフラクタル解析の結果から、フラクタル次元が2以下で進展する疎なトリ-に関しては、比較的容易に全路破壊に至る傾向があることが判明した。このような事実から、トリ-パターンから求めたフラクタル次元の大きさがトリ-状絶縁劣化診断の一つの指標となりうる可能性のあることが明らかとなった。今後は、実用的条件を十分踏まえ、フラクタル次元あるいはフラクタルの考えに基づいたトリ-状絶縁劣化診断のさらなる検討が必要と思われる。今年度は、実用上用いられている架橋ポリエチレンと透明高分子であるポリメチルメタクリレートを取り上げ、電気トリ-の3次元パターンの実測を行い、これらのパターンのフラクタル性を調査することを目的とした。得られた結果は、以下のようである。1.架橋ポリエチレンを取り上げ、交流電圧印加の下で、トリ-を進展させ、このトリ-を3次元に再構成し、その3次元像のフラクタル性を確認した。この場合、トリ-を3次元に再構成するために、連続セクショニング法では、疎から蜜までまでのトリ-形状のフラクタル次元が求められるが、光CT法では、密なトリ-形状のフラクタル次元を求めることが困難であることが明らかとなった。トリ-形状の変化とフラクタル次元の大きさは密接に関係しており、トリ-形状のフラクタル次元による定量化が可能であることを見いだした。2.ポリメチルメタクリレートを取り上げ、交流電圧印加の下で、トリ-進展に伴う時系列での部分放電特性と放電発光特性を測定し、それらのフラクタル性とカオス性を調査した。カオス性を確認するために、得られたデータに対して、アトラクターを作成し、そのアトラクターのフラクタル次元を求めて、検討を加えた。さらに、得られたデータから、リアブノフ指数と自己相関関数を求めて検討を行った。その結果、電気トリ-進展に伴う部分放電特性と放電発光特性がカオス性を有することが明らかとなった。また、アトラクターのフラクタル性が確認できた。3.トリ-パターンの3次元とその2次元投影パターンの関係について調査した結果、両者の間にある関係式が得られることが分かった。この関係式を用いることにより、2次元投影パターンのフラクタル次元から3次元パターンのフラクタル次元を推定することが可能となった。今年度は、成長確率と電位降下を考慮したコンピュータシミュレーションを作成するとともに、このシミュレーションの結果と、前年度までに実際の試料で得られたトリ-の結果と比較検討し、トリ-状欠陥の進展メカニズムの解明とトリ-状欠陥の絶縁診断法の一部について検討を行った。1.トリ-先端部における成長確率とトリ-管内の放電時における電位降下を考慮した3次元トリ-シミュレーションにより、実際のトリ-状欠陥の進展においても、トリ-先端部における局部電界効果と進展時のランダム性が重要であることが明らかとなった。

2.シミュレーション結果と実際のトリ-の結果より、トリ-先端部の成長確率とトリ-管内の電位降下を考慮したトリ-のモデル化が可能となった、この場合の支配要因としては、成長確率に関しては空間電荷効果が、またトリ-管内の電位降下に関してはトリ-進展に伴う分解生成ガス圧が、重要であることが明らかとなった。3.トリ-のフラクタル・カオス解析の結果から、トリ-の進展メカニズムとして、空間的には自己相似的な特徴を持つこと、即ちトリ-先端部での局部電界はトリ-の長さに関わらずほぼ一定であること、また時間的にはフィードバックメカニズムが関わっていることが推察された。4.高分子絶縁体中のトリ-状欠陥の絶縁診断法の一つとして、トリ-進展の形状のフラクタル次元による診断が可能であることがわかった。即ち、トリ-進展の形状のフラクタル次元が2以下の場合は比較的早く進展するため、絶縁破壊も容易に起こり、電気絶縁的には極めて危険であることから、フラクタル次元の分類によるトリ-状欠陥の絶縁診断の可能性が指摘された。
強誘電体ドメイン制御を利用した新規圧電デバイスおよび材料の創出

リラクサ圧電単結晶板において、巨大横効果圧電性(巨大k_(31))をもつ要因を結晶面と分極温度・分極方向との関係およびP-Eヒステリシス曲線・変位特性と印加電界との関係からそれぞれ明らかにした。また、分極電界に対する強誘電体ドメインの振動挙動を有限要素法により解析し、巨大k_(31)の起源を明らかにした。更に、巨大k_(31)をもつ単結晶板を使用し、エネルギー変換効率で約5倍の高効率を有するバイモルフ素子の開発を行った。(1)巨大横効果圧電性、すなわち、巨大電気機械結合係数k_<31>および圧電d_<31>定数を利用した圧電デバイス(センサ/アクチュエータ/トランスデューサ)の開発に今回成功し、これまでの数倍以上の感度をもつセンサや数分の一程度の低電圧で駆動可能な大変位素子の実現が可能となった。(2)Pb[(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)_<0.91>Ti_<0.09>]O_3(PZNT91/09)単結晶板(13^L×4.0^W×0.36^Tmm)を用い、種々のプロセス処理を経て、横振動モードで巨大電気機械結合係数k_<31>(>80%)を実現した。この巨大k_<31>を利用して、圧電ユニモルフおよびバイモルフを作製し、従来のPZT系セラミックス製ユニモルフ・バイモルフとの比較検討を行った。42ニッケル材質シム板(15^L×4.0^W×0.10^Tmm)にk_<31>が86.2%(PZNT91/09)および37.3%(PZTセラミックス)を貼り付けたユニモルフの屈曲振動の電気機械結合係数k_bを測定したところ、それぞれ64.7%,20.6%が得られた。更に、PZNT91/09単結晶板(k_<31>=85.6%)およびPZT板(k_<31>=37.0%)をユニモフに貼り付け、シリーズ型バイモルフを作製した。インピーダンスの周波数応答から求めたk_bは、それぞれ69.8%(PZNT91/09),31.2%(PZT)であった。又、インピーダンスの山谷比(反共振抵抗値÷共振抵抗値)がPZTセラミックスを用いた圧電バイモルフに比べ3桁大きく、従来品では実現不可能な優れた圧電性能を示す圧電デバイスの開発に成功した。次に、直流電圧(±V)を印加した時の全振幅変位量をレーザー変位計で測定し、シリーズ型圧電バイモルフの変位量vs.印加電圧の関係(変位特性)を明らかにした。PZNT91/09単結晶およびPZT系セラミックスからなるバイモルフの変位量の印加電圧依存から、同一電圧(電界強度)で2倍近い変位を得ることができた。(3)新たな導入設備(レーザー変位計/フォトニックセンサ)による微小変位量測定システムの構築を行い、nmからμmオーダーまでの変位が連続的に測定できるようになった。すなわち、レーザー変位計とフォトニックセンサの測定変位量に対する使い分けや測定精度の見極め、卒研生が容易に使用できる環境整備を実施すると共に、そのマニュアル化を行った。(1)強誘電体ドメイン制御リラクサ圧電単結晶の新規物性創出の一貫として、新リラクサ圧電単結晶での巨大横効果圧電性について検討した。(100)面および(110)面Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>)O_3-PbTiO_3(PMNT68/32、PMNT74/26)単結晶板(13^Lx4.0^wx0.34^T/0.47^Tmm)での強誘電特性のDC分極およびパルス分極電界依存を調べた。40°Cでの比誘電率(ε_r)およびk_<31>のDC分極電界依存では、(100)面PMNTのε_rは300V/mmピークをもち、その後減少傾向を示す。又、時間経過と共に若干の減少(エージング)が見られた。一方、(110)面のε_rはE=200V/mm急に立ち上がり、その後、一定値をとる。k_<31>は(100)面で66%、(110)面で86%以上の巨大k_<31>が得られた。これらの傾向はパルス分極電界依存でも確認された。P-Eヒステリシス曲線は、(110)面でパルス電界強度E≧800V/mmで非対称になり、同時に巨大k_<31>が得られたが、(100)面では対称であった。

以上の結果より、巨大k_<31>の実現には結晶面と分極方向との関係が重要であることが明らかとなった。(3)ドメイン制御非鉛系圧電材料の探索として、これまで報告されている研究発表・論文等を調査した。その結果、材料組成としては、(1)ビスマス層状化合物系、(2)チタン酸バリウム系、(3)ニオブ酸カリウム・ナトリウム系に大別されたが、いずれもその圧電特性、特に電気機械結合係数が従来のチタン酸ジルコン酸鉛系に比べ小さい。非鉛系ではドメイン制御も含め大きなブレイクスルーが今後必要である。リラクサ単結晶である(100)面Pb[(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)_0.91Ti_0.09]O_3(PZNT(91)/(09))圧電単結晶は、[100]方向に分極した場合、80%以上の巨大電気機械結合係数k_<31>をもつことが明らかになっている。また、(110)面(1-x)Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>)O_<3-x>PbTiO_3(PMNT(1-x)/x,x=0.251-0.293)圧電単結晶板においても巨大k_<31>(>80%)が確認されている。巨大k_<31>を得るために、分極温度(40°C)でDC分極電界1000V/mm以上の電界印加で分極処理を行った時、(100)面PZNT(91)/(09)および(110)面PMNT(1-x)/x(x=0.251-0.293)単結晶板では単一振動体(シングルドメイン)となり、長さ方での単一振動が発生した。その結果、巨大k_<31>およびd_<31>定数が得られると考えられた。本年度は、有限要素法(FEM)を用いて巨大k_<31>をもつ単結晶板の周波数応答解析を行い、シングルドメイン板のインピーダンス応答との関係について調べた。また、(100)面PZNT(91)/(09)単結晶板のドメイン挙動についてもFEM解析により評価した。巨大k_<31>をもつ(100)面PZNT(91)/(09)単結晶板および(110)面PMNT(74)/(26)単結晶板のドメイン構造とインピーダンス応答との関係を明らかにするために、FEMを用いてk_<31>、k_<32>およびk_tモードのインピーダンス周波数応答解析を行った。解析では、単結晶板の長さ方向および幅方向のポアソン比OL^E,OW^Eの値を変化させることで、測定したインピーダンス応答と一致したシミュレーション結果が得られた。また、(100)面PZNT単結晶板において、ポアソン比の異なる振動体の合成周波数応答から、単結晶板のドメイン挙動を明らかにすることができた。リラクサ圧電単結晶板での巨大k_<31>および単結晶棒での巨大k_<33>と強誘電体特性および変位特性との関係を明らかにした。(100)面Pb[(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)_<0.91>Ti_<0.09>]O_3(PzNT91/09)および(110) (1-x)Pb (Mg_<1/3>Nb_<2/3>)TiO_3-xPbTiO_3[PMNT(1-x)/x](x=0.251-0.301)単結晶板[13^Lx4.0^Wx0.47^T (PZNT)/0.25^Tmm (PMNT)]を温度40°C,時間10分, DC電界強度1000V/mmで分極処理を行い、単結晶板振動子を得た。巨大k_<31>の出現とそのP-E曲線および変位特性との関係から、リラクサ圧電単結晶板で巨大k_<31>が得られる電界は、P-E曲線が非対称やトリプルヒステリシスになる電界と一致した。また、変位vs.電界特性で変位履歴が起こる電界強度とも一致していた。これらの結果はリラクサ単結晶の本質的な物性である巨大k_<31>/k_<33>の由来の解明に役立つものと考えられた。2.ニオブ酸アルカリ系非鉛圧電セラミックスの圧電特性非鉛系組成からなるニオブ酸アルカリ系(1-x)(Na, K, Li, Ba)(Nb_<0.9>Ta_<0.1>)O_3-xSrZrO_3(x=0-0.07)
南琉球方言におけるベシ由来形の記述的研究

南琉球方言にみられるbe:やbja:は、東日本方言の推量や意志、勧誘にみられるベーなどと同様、古代語のベシに由来するものである。その分布は宮古地域を中心に、八重山地域では西表島にしかみられないという、興味深い分布である。その文法的な意味は地域によって差があるものの、基本的に推量、意志、勧誘のなかにおさまる。また、勧誘の意味については、宮古方言地域のなかで、北部にはその使用がみとめられるが、南部にはないことを確認した。これが古代語のベシに由来するものであることを確認したことで、南琉球諸方言におけるベシ由来形の存在はこの形式の周圏分布を意味するもので、日本語史研究にとっても大きな意味をもつ。「研究実施計画」にしたがって、当該地域の聞き取り調査を実施した。当該年度において研究代表者の金田は、八重山地域では西表島の祖納と干立の追加調査のほか、新規に黒島の仲筋を、また宮古地域では宮古島の久貝、池間島、大神島、来間島において、新規または追加の聞き取り調査を実施した。また研究分担者の下地は、宮古地域の宮古島高野、同・新里、同・野原、それに来間島で聞き取り調査を実施した。当該年度における調査結果であるが、黒島の仲筋をのぞき、ベシ由来形の存在が確認され、宮古地域におけるベシ由来形使用のおおよその全体像が明らかになった。宮古地域ではこれまですべての調査地点でベシ由来形の使用が確認されているが、そのなかで、音声的な違いや使用できる意味の範囲の違いが明らかになっている。具体的には、宮古地域では意志勧誘表現においても推量表現においても、疑問詞を含む文にベシ由来形があらわれることはない。この点、八重山の西表祖納の用法にその制限がないのと大きく異なる。また、勧誘表現における使用では、宮古地域のなかでも差異が見られ、北部の池間島や大神島でそれが使用できるのに対して、南部の久貝や来間島などでは使用できないようである。この点については最終年度にさらに注意深く補足調査する必要があるだろう。このような結果は、本研究で「ベシ由来形」と称している語形が、まさに古代語のベシに由来する語形であるという可能性がきわめて高いことを裏付けるものであり、琉球諸方言における意志勧誘推量表現の歴史的変遷を考察する際に重要な一部分となることが期待される。八重山諸方言のうち、本研究の基盤、基礎となった西表祖納方言にくわえて、24年度は、西表干立方言、鳩間島方言、小浜島方言、竹富島方言、それに当初の計画になかった新城島方言について、調査を開始した。新城島方言を追加したのは、石垣市在住の数少ない新城島出身者のお一人を紹介していただけたからである。調査を継続するなかで、調査票の提示文の見直しを数回にわたって行なった。そのため、鳩間島方言、小浜島方言、竹富島方言については複数回、同一話者から聞き取り調査を行なった。これらの島については今年度も調査を継続する。その結果、祖納方言に隣接する干立方言の話者からは、本研究が調査対象とするベシ系の語形を、推量表現や意志勧誘表現において、祖納方言に見られる使用状況と同程度に確認することができた。その一方で、それ以外の鳩間島方言、小浜島方言、竹富島方言、新城島方言の話者からは、これまでのところまったく確認することができていない。この点は、祖納、干立地区の言語的、歴史的な成立過程などを考察するうえで、きわめて注目すべき点であると考える。こうした調査結果をもとに、今後の調査としては、祖納方言でみられた以外の用法で、ベシ系語形が存在しないか、例文を増やして調査する必要があるだろう。八重山諸方言ではまだ、黒島、波照間島、与那国島での調査を開始していないが、今年度は以上のような点も考慮に入れながら、調査を進める必要がある。宮古諸方言に関しては、事前の簡易調査により、ほぼ全域での使用の確認が期待されるが、24年度は多良間島方言での使用を一部確認できたのみである。西表島祖納方言の特定の文の述語にあらわれるbe:という要素がどのような意味用法をもち、どのような分布をしめすのか、それは古代語のベシと関わるのか否か、現地調査によってそれをあきらかにすることがこの科研の目的である。平成26年度は竹富町の波照間島、西表島船浮、宮古島市の来間島、同久松、同池間島、同大神島、同狩俣、同島尻の方言調査を実施した。

全体的な結論として、南琉球方言にみられるbe:やbja:は、東日本方言の推量や意志、勧誘にみられるベーなどと同様に、そして、かつてネフスキー(1926)が指摘したように、古代語のベシに由来するもの、ベシ由来形であることを確認した。また、その分布は宮古地域を中心としていて、八重山地域では西表島にしかみられないという、興味深い分布であることがわかった。その文法的な意味は地域によって差があるものの、基本的に推量、意志、勧誘のなかにおさまる。また、勧誘の意味については、宮古方言地域のなかで、北部にはその使用がみとめられるが、南部にはないことを確認した。当該の要素が古代語のベシに由来するものであることが確認できたことにより、南琉球諸方言におけるベシ由来形の存在は、この形式の周圏分布を意味するものであり、日本語史研究にとっても相応の意味をもつだろう。研究成果については、「宮古諸方言におけるベシ由来形の使用実態」沖縄言語研究センター定例研究会(下地賀代子との共同発表2014.07.05)、および「宮古諸方言におけるベシ由来形の使用実態」『琉球の方言』39号pp.141-164法政大学沖縄文化研究所( 2015.3下地賀代子との共著)がある。方言関係資料や論文のPDFファイルを掲載。日本語学結果的に前年度の遅れをそのまま引き継いだようなかたちになったが、調査地点についても予定よりは若干少なめとはいえほぼ順調にこなすことができているので、全体としては問題の生じるような状況ではない。調査票についても、調査項目の微修正を行いながら調査を実施しており、最終年度には期待した成果がえられると考える。八重山諸方言については予定された12地点のうち5地点、当初の予定になかった新城島方言を含めて計6地点の調査を行なうことができたので、おおよそ予定どおりといえる。一方で宮古諸方言については、研究分担者の本務校の職務上の事情により、調査の実施は1地点にとどまった。以上は調査予定の24地点のうち、はじめの2年間で8割程度を調査するという、当初の予定を前提にした達成度であるが、調査期間である3年間に単純に割り振ったばあいは年に8地点であるので、初年度7地点の調査実施は想定の範囲内である。宮古諸方言の調査に遅れが出ている点をカバーするために、25年度は代表者も加わって宮古諸方言の調査を実施する予定である。最終年度は、これまでの調査地点の補足追加調査に加えて、以下の地点を新規に調査する予定である。宮古地域の伊良部島ほか、八重山地域の石垣島川平、波照間島、与那国島ほかである。すでにインフォマントはほぼ予定されていて、現地調査を実施するのみとなっている。最終年度であるので、調査結果を分析し、その結果を成果として発表や報告書、論文につなげていく。このような成果は、本研究で「ベシ由来形」と称している語形が、まさに古代語のベシに由来する語形であるという可能性がきわめて高いことを裏付ける。この成果は琉球諸方言における意志勧誘推量表現の歴史的変遷を考察する際に重要な一部分をなすことになるだろう。25年度は、研究代表者は残された八重山諸方言の調査予定7地点のうち離島を中心に5地点ていどの調査を実施する。あわせて、宮古諸方言のうち2地点程度の調査を実施したい。研究分担者は宮古諸方言の6地点程度の調査を実施する。以上の調査結果をもとに、代表者は分担者と年度の後半に検討会を行ない、調査票の妥当性にさらなる検討を加え、追加調査の必要性などを検討する。最終年度は残された調査地点の調査を実施しながら、対象地域全体におけるベシ由来形の使用状況を明らかにし、その分布状況に検討を加え、報告書にまとめる。
アセロラの大量アスコルビン酸生合成・集積機構の解明

アセロラは、熱帯植物の一つであるが、アスコルビン酸を、特に、果実に大量に蓄積し、その含量はレモンの20倍以上にも達する。本研究では、なぜアセロラがアスコルビン酸を高含量含むことができるか、その分子機構を解き明かした。また、アスコルビン酸増強を目的として、アセロラのアスコルビン酸の生合成酵素等の遺伝子を植物に導入発現させ、アスコルビン酸含量が2-3倍増大するアスコルビン酸高含量植物を作出した。熱帯植物の一つであるアセロラは、特に、果実に大量のアスコルビン酸を含む(レモンの20倍以上)。本研究では、植物のアスコルビン酸の増強を目的として、アセロラのアスコルビン酸生合成遺伝子をクローニングし、その発現を調べた。また、アセロラに大量のアスコルビン酸が含まれる機構について考察するとともに、アセロラのアスコルビン酸生合成酵素遺伝子を植物に導入発現させ、アスコルビン酸高含量遺伝子組換え植物を作出することを目的とした。アセロラのアスコルビン酸生合成酵素の一つであるGDP-D-mannose pyrophosphorylaseのmRNA発現を、シロイヌナズナやトマトの発現と比較した結果、アセロラのGDP-D-mannose pyrophosphorylaseのmRNA発現はシロイヌナズナやトマトのものに比べ非常に高かった。アセロラのGDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子のプロモーター解析を行った結果、そのプロモーター活性は、植物の高発現プロモーターとして知られているcauliflower mosaic virus 35SプロモーターやシロイヌナズナのGDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子のプロモーターより高かった。アセロラのGDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子をタバコに導入し、過剰発現させたところ、タバコのアスコルビン酸含量は野生植物の約2倍に増大した。このように、本研究では、アスコルビン酸含量の高いアセロラのアスコルビン酸の生合成を調べ、興味深い新たな知見を明らかにするとともに、応用的には、アスコルビン酸高含量ストレス抵抗性植物の開発が可能であることを示した。熱帯植物であるアセロラは、アスコルビン酸を大量に含む植物としても知られている。特に、果実に大量のアスコルビン酸を含み、その含量はレモン果実の20倍以上となる。本研究は、アスコルビン酸を大量に含有するアセロラに焦点をあて、アスコルビン酸の生合成、代謝および生理機能について調べることを目的とした。また、応用学的には、アスコルビン酸高含量ストレス抵抗性植物の作出を目指した。本年度は、まず、アセロラからアスコルビン酸をリサイクルする酵素モノデヒドロアスコルビン酸還元酵素とデヒドロアスコルビン酸還元酵素のcDNAをクローニングし、その一次構造を解析した。また、アセロラの両酵素の遺伝子発現とアスコルビン酸含量との関係、および環境変動に伴う両酵素の遺伝子発現変動を調べた。興味深いことに、モノデヒドロアスコルビン酸還元酵素、デヒドロアスコルビン酸還元酵素はともに、暗所では発現が低下するものの、低温処理や塩処理をすることにより発現が増大した。一方、アセロラのモノデヒドロアスコルビン酸還元酵素のcDNAを導入した形質転換タバコでは、アスコルビン酸含量が高まり、塩ストレスに対して抵抗性を示した。このように、本研究では、アスコルビン酸をリサイクルする酵素が、環境応答的に発現しながら、酸化ストレス抵抗性の獲得にも寄与できることを示唆できた。また、応用的には、アスコルビン酸高含量ストレス抵抗性植物の開発へと道を開くもので興味深く、今後の研究が期待される。本研究では、なぜアセロラがアスコルビン酸を高含量含むことができるか、その分子機構を解き明かすとともに、アスコルビン酸増強を目的として、アセロラのアスゴルビン酸の生合成酵素等の遺伝子を植物に導入発現させ、アスコルビン酸高含量植物を作出することを目的とした。アスコルビン酸を生合成する酵素として知られるGDP-D-mannose pyrophosphorylaseについて、リアルタイムPCR法を用いて、アセロラのmRNA発現とシロイヌナズナのmRNA発現を比較した。その結果、アセロラのGDP-D-mannose pyrophosphorylaseのmRNA発現はシロイヌナズナのものに比べ非常に高いことがわかった。また、その他のアスコルビン酸生合成酵素のmRNA発現についてもアセロラとシロイヌナズナの発現と比較した結果、アセロラの発現がシロイヌナズナのものに比べ著しく高かった。さらに、アセロラのGDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子のプロモーター解析を行った結果、そのプロモーター活性は、植物の高発現プロモーターとして知られているcauliflower mosaic virus 35SプロモーターやシロイヌナズナのGDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子のプロモーターより高かった。

これらのことから、アセロラのアスコルビン酸生合成酵素の転写活性が高いことが、アセロラのアスコルビン酸の生合成能を高め、結果的にアセロラのアスコルビン酸含量が著しく高くなることが明らかになった。アセロラのアスコルビン酸生合成酵素GDP-D-mannose pyrophosphorylase遺伝子をタバコに導入し、過剰発現させたところ、タバコのアスコルビン酸含量は野生植物の約2倍に増大した。また、アセロラのアスコルビン酸リサイクリング酵素monodehydroascorbate reductaseのcDNAを導入した形質転換タバコではアスコルビン酸含量が高まり、塩ストレスに対して抵抗性を示した。このように、本研究は、応用的にもアスコルビン酸高含量ストレス抵抗性植物の開発へと道を開くもので興味深く、今後の実用化レベルの研究が期待される。
江戸堂上派武家歌壇の「歌文集」に関する研究

計画の5本の柱のうち、第1の資料収集に関しては、(1)叢書類からの資料抄出は昭和63年度・平成元年度に片玉集、墨海山筆、扶桑残葉集、扶桶残玉集などからの作業を行なった。また(2)各地文庫図書館の調査では、約400点の書目を集成し整理することができた。この調査によって、福井市立図書館松平文庫、仙台市民図書館岡千仭旧蔵書、岩手県立図書館新渡部文庫、川崎市市民ミュ-ジアム池上家文書等にまとまった資料のあることが明かになった。第2の翻刻原稿の作成では、歌文集(1)『大沢文稿』(石野広通)(2)『三蛙文集』(京極高門)(3)『遊角筈別荘記』(長谷川安卿等)(4)『墨水遊覧記』(北村季文)関連資料『霞関集(初撰本)』『霜葉集』の翻刻原稿を作成した。(3)(4)は注を付して新古典大系(岩波書店)『近世歌文集上』に入れる予定。第3の成嶋家歴代と畑中盛雄の業績の整理については、本報告書11研究発表の論文2.3.4にまとめて公表した。第4の『歌林一枝』注解原稿作成に関しては、若手研究者との共同研究に発展したため速度は落ちたが、多角的研究が可能となり、目下進行中である。第5の江戸堂上派雅文資料の伝本書目の作成については、研究成果報告書にその成果を発表した。ただ資料は今後も発見されて行く可能性が大きく、改訂が必要となってこよう。10月1日付で東北大学より国文学研究資料館に配置換となったので9月末までの分を記述する。計画の4本の柱のうち、第1の「資料収集」に関しては、(1)著書類からの資料抄出作業は夏休を利用してかなり進捗した。(2)各地文庫図書館の調査では、7月20日からの藤枝、清水各市立図書館の蔵書、8月24日の酒田市立図書館の調査を行ない、それぞれ「歌文集」資料の所在の確認をした。内容的には(1)(2)とも、10月以降の作業に継続される性質のものである。第2の『大沢文稿』の翻刻原稿作成も予定通り進行した。逆行して作業していた『霜葉集』の原稿は完成した。ただし索引は未着手である。第3の近世中期冷泉派幕臣グループの「場」の解明は、成嶋家の家系を中心に進んだが、新資料がかなり加わったので、計画の練り直しが必要となってきている。第40『歌林一枝』注解原稿は新発見の伝本(東洋文庫本)の異文校合が必要となったため、東京移住後に本文作成を先行させた上で行なうこととし、「注解」は少々遅れる見通しとなった。計画の5本の柱のうち、第1の資料収集に関しては、11月の岡山ノ-トルダム清心女子大学の畑中多沖資料、素兄堂止静関係のもの(新潟の資料を含む)、2月の福井市立図書館を中心にした越前松平家本の季文古稀歌集・百合連詠の新発見を含めて、ほぼ順調に進んだ。第2の翻刻原稿の作成では、『大沢文稿』『霞関集(初度本)』『和歌泉杣』『霜葉集』等順調に進捗し、後二者は完成した。なお、この他に作成した『貞享落穂集』(南部家本)が完成して当館紀要に載り、先に活字化された。江戸歌壇の初期歌会資料として、この分野の研究に大いに利用されると思われる。第3の成嶋家歴代と畑中多沖研究に関しては、前者について三代信遍4代和鼎の歌論を整理し、片野達郎氏編『正統と異端』(印刷中)に発表した。多沖の歌業は目下資料収集と整理中。

平成2年度中に論文化できよう。第4の『歌林一枝』注解では発足した研究会が既に6回開かれ、一度成稿したものを吟味して発展させている。第5の雅文資料の伝本書目作成は第1の柱にも関連するが、新資料の発見が相次ぎますます充実してきている。如上の計画のほか、本研究の関係資料の多くが新日本古典文学大系『近世歌文集上』(岩波書店)の収集するところとなったため、全体に注解作業が必要となり、研究目的を更に深め、進展させるのに役立ってきている。計画の4本の柱のうち、第1の資料収集に関しては、(1)仙台市民博物館、宮城県図書館、仙台市図書館、東北大学図書館、(2)ノ-トルダム清心女子学園図書館、岡山大学図書館、(3)神宮文庫、舞鶴中央図書館などでそれぞれ「歌文集」の調査・収集を行ない、特に畑中盛雄の著作類で新見を得た。緊急度を優先させたため、四国・九州の予定を割愛せざるを得なくなった。第2の翻刻原稿の作成については、『大沢文稿』『霞関集(初度本)』を完成させ、近世中期雅文壇活動の解明の端緒に就くことが可能になった。初期の『落穂集』(南部家本)は本報告11の如く活字翻刻して一般の活用に供することができた。第3の奥儒者成嶋家歴代と仙台藩畑中盛雄の業績の整理については、成嶋家初代・二代の歌論を整理し、公家と異る現実政治担当者としての「士大夫」意識に拠る文学観を指摘して、古学派の本居宣長の歌観との差を明らかにした。また、中近世を通しての最高最大の釈教歌注釈『類題法文和歌集注解』を初め畑中盛雄の業績を和文・漢文のそれぞれについて整理をした(本報告11参照)。第4の『歌林一枝』注解は、鈴木健一、古相正美両氏との共同研究に発展したため、速度は鈍ったが、多角的な見地から進めることが可能になり、目下進行中である。第5の雅文資料の書目作成に関しては、和文題の整理の見地から資料を再編成し、一覧原稿を本報告11の第1論文に発表した。
ダニ媒介感染症の診断精度の向上を目指して

ダニ媒介感染症である日本紅斑熱と重症熱性血小板減少症候群(SFTS)は新興感染症であり、共に4類感染症に指定されている。両感染症の患者数は年々増加しているが、これらの感染症に対する検査には時間を要し、臨床現場において検査結果を治療計画に役立てることはほぼできておらず、臨床現場即時検査法として迅速鑑別診断キットの開発が求められている。本研究では、日本紅斑熱及びツツガムシに対するマウスモノクローナル抗体を作製し、抗SFTS抗体とともに同一のキットとして組み合わせたダニ媒介感染症鑑別用抗原検出迅速診断キットの開発及び評価を行い、臨床現場におけるダニ媒介感染症の診断精度の向上を目指す。
急速凍結免疫エッチングレプリカ法による細胞膜裏打ち細胞骨格の制御機構解析

Rac1とCdc42の標的蛋白質であるIQGAPやSra-1は、アクチンフィラメントに直接結合することで遊走する細胞のリーディングエッジに濃縮し、ラメリポディアの形成に関与している。私は急速凍結免疫エッチングレプリカ法により、細胞膜近傍におけるRac1、IQGAP1、Sra-1の局在を電子顕微鏡下で検討した。その結果、IQGAP1とSra-1はそれぞれ異なる局在を示し、Rac1との共局在もそれぞれ特徴的であった。生化学的に細胞膜画分を分離したところ、Rac1やSra-1はTriton不溶画分(細胞骨格画分)に優位に分画されるのに対し、IQGAP1はTriton可溶画分と不溶画分に分画されるごとを見出した。これらのことから、細胞膜上のRac1は空間的に異なる場所でそれぞれの標的蛋白質を介してその生理機能を発揮することを示唆することが考えられる。細胞膜でIQGAP1は微小管結合蛋白質を介して、微小管を捕捉すると考えられている。私はCLASP2(CLIPs associating protein)をIQGAP1の新規結合蛋白質として同定し、その結合がGSK-3(Glybogen synthase kinase-3)によるCLASP2のリン酸化で負に制御されることを見出した。GSK-3は遊走細胞においてリーディングエッジで特異的に不活性化されており、CLASP2はリーディングエッジに向かう微小管にのみ局在することから、IQGAP1は局所的に微小管と細胞膜上のアクチンとを繋ぐ仲介分子であることを明らかにした。細胞は細胞内外のシグナルに応答し、細胞骨格を始め細胞内小器官、多種多様な蛋白質を非対称に分配して極性を獲得する。この過程で、低分子量GTP結合蛋白質Rac1やCdc42は特定の細胞膜上で活性化し、細胞膜近傍における細胞骨格の再構築・極性を制御すると考えられているが、その詳細な分子機構は未だ不明な点が多い。Rac1とCdc42の標的蛋白質であるIQGAPやSra-1は、アクチンフィラメントに直接結合することで遊走する細胞のリーデングエッジに濃縮し、ラメリポディアの形成に関与している。私は急速凍結免疫エッチングレプリカ法により、細胞膜近傍におけるIQGAP1とSra-1の局在を電子顕微鏡下で検討した。その結果、IQGAP1は細胞膜直下のアクチンフィラメント上に多く認められた。一方、Sra-1は細胞膜近傍のアクチンフィラメントと微小管に局在していた。また、Rac1やCdc42は細胞膜およびアクチンフィラメント上にその局在が観察された。さらに、IQGAP1やSra-1の局在をRac1と同時に比較したところ、IQGAP1とRac1は主にアクチンフィラメント上で共局在していた。一方、Sra-1はアクチンフィラメント上でRac1と共局在したが、微小管上ではRac1と共局在しなかった。これら結果から、Rac1はIQGAP1やSra-1と共に細胞膜近傍におけるアクチンフィラメントの配向を制御していることが明らかとなった。さらに、Sra-1はRac1とは独立して微小管上に局在していることが明らかとなった。また、我々は新規Rac1/Cdc42標的蛋白質としてIQGAP3を同定し、その性状解析を行った。その結果、IQGAP3は細胞骨格の再構築を介して、PC12細胞における神経突起や初代海馬神経細胞における軸索伸長を正に制御することを明らかとした。
エピジェネティクスによるインスリン遺伝子発現機構の検討

本研究では、膵組織特異的転写因子PDX-1、我々が明らかとしたインスリン遺伝子に結合するmethylation-sensitiveな転写因子であるGABP、およびエピジェネテックな遺伝子の転写調節の組み合わせにより非β細胞(膵内分泌前駆細胞、体細胞)から膵β細胞へ分化誘導し、インスリン遺伝子を発現させて、再生医療に応用することを目的とするものである。非β細胞としてHepG2細胞、膵β細胞としてRIN細胞のインスリン遺伝子プロモーターのCpG siteのmethylation rateを検討したところ、HepG2細胞ではメチル化、RIN細胞では脱メチル化傾向を示した。AR42J細胞、BRL細胞、HepG2細胞にhistonedeacetylase inhibitor(Depsipeptide)あるいはDNA脱メチル化剤である5-Azacytidineを投与し、インスリン遺伝子の発現を誘導できるか検討したが、RT-PCR法、インスリン抗体免疫染色法では発現の確認はできなかった。PDX-1遺伝子をstable transfectionしたHepG2細胞、BRL細胞においては、Depsipeptideと5-Azacytidineの両者の投与によりRT-PCR法によりインスリン遺伝子の発現をわずかに認めたが、ノーザン解析およびインスリン抗体免疫染色法では発現の確認はできなかった。上記結果より、膵β細胞の分化にエピジェネティクスの関与する可能性はあるが、PDX-1、および脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤の組み合わせにより培養非β細胞(HepG2細胞、BRL細胞)にインスリン遺伝子を発現することは、困難であると考えられた。一方、我々が既に明らかとしたように転写因子GABPはヒトインスリンプロモーターに結合するが、今回、抗GABPα抗体、抗GABPβ抗体による免疫組織染色によりGABPは膵臓においては、ランゲルハンス島にのみ存在することが明らかとなった。これはGABPが膵臓においてインスリン遺伝子の転写促進に関与することを支持する結果と思われる。今後膵臓の発生過程でのインスリン遺伝子などランゲルハンス島特異遺伝子のエピジェネティクスを検討することは興味深いと思われる。本研究は、転写因子PDX-1、Ngn3、GABP、およびエピジェネテックな遺伝子の転写調節の組み合わせにより非β細胞(膵内分泌前駆細胞、体細胞)から膵β細胞へ分化誘導することを目的とするものである。平成17年度は、非β細胞としてHepG2細胞、膵β細胞としてRIN細胞のインスリン遺伝子プロモーターのCpG siteのmethylation rateを検討したところ、HepG2細胞ではメチル化、RIN細胞では脱メチル化傾向を示した。AR42J細胞にhistonedeacetylase inhibitor (Depsipeptide)とDNA脱メチル化剤である5-Azacytidineを投与し、インスリン遺伝子の発現を誘導できるか検討したが、RT-PCR法、インスリン抗体免疫染色法では発現の確認はできなかった。現在Ngn3遺伝子、PDX-1遺伝子を組み合わせてstable transfectionしたAR42J細胞、HepG2細胞、BRL細胞を作製したところであり、Depsipeptideと5-Azacytidineを投与し、インスリン遺伝子の発現を誘導できるか検討する予定である。本研究は、膵臓特異的な転写因子およびエピジェネテックな遺伝子の転写調節の組み合わせにより非β細胞(膵内分泌前駆細胞、体細胞)から膵β細胞へ分化誘導することを目的とするものである。

PDX-1遺伝子をstable transfectionしたHepG2細胞、BRL細胞においては、Depsipeptideと5-Azacytidineの両者の投与によりRT-PCR法によりインスリン遺伝子の発現をわずかに認めたが、インスリン抗体免疫染色法では発現の確認はできなかった。上記結果より、膵β細胞の分化にエピジェネテイクスの関与する可能性はあるが、PDX-1、および脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤の組み合わせにより培養非□細胞(HepG2細胞、BRL細胞)にインスリン遺伝子を発現することは、困難であると考えられた。一方、我々が既に明らかとしたように転写因子GABPはヒトインスリンプロモーターに結合するが、今回、抗GABPα抗体、抗GABPβ抗体による免疫組織染色によりGABPは膵臓においては、ランゲルハンス島にのみ存在することが明らかとなった。これはGABPが膵臓においてインスリン遺伝子の転写促進に関与することを支持する結果と思われる。
空力最適設計のためのデジタルモックアップ構築に関する研究

研究実施計画に従い今年度は三次元複雑形状に対する高Reynolds数での粘性計算用空間格子生成法を確立した。物体壁面付近の境界層を効率よくとらえるためにその部分に十分なプリズム(三角柱)層を配し、残りの部分を四面体格子で離散化することで、複雑な形状に対しても完全自動のハイブリッド格子生成が可能となった。具体的には信頼性を高くするために流れ場全体を覆う等方的な四面体空間格子を出発点とした。等方的な四面体格子生成法は既に成熟しており、どのような形状に対してもロバストに格子生成が行える。指定した境界条件(物体壁面、遠方外部境界、対称面などの物体壁面に接した面)と、追加するプリズム層を指定する3つのパラメータ(最小格子幅、プリズム層数、拡張比)を元にプリズム層を物体壁面に自動で追加していく。翼後縁などのように尖った部分にはプリズム層を追加するための法線ベクトルを2本用意することで格子の質を向上させている。プリズム層の追加により四面体格子を移動させる必要があるが、その際に潰れた要素が生じる可能性がある。ここでは計算負荷が少なく、かつ効率よく格子の質を向上させられる角度を元にしたスムージング法を適用することでその問題を解決している。本格子生成法を航空宇宙技術研究所の超音速実験機風洞試験モデルに対して適用した。得られた粘性計算結果を実験値と比較し、その有効性を確かめた。研究成果は3回の会議において発表された。6月と9月にアメリカで格子生成の国際会議、7月に航空宇宙技術研究所で航空宇宙数値シミュレーション技術シンポジウムに参加した。また博士論文においてより詳しく格子生成法がまとめられた。さらにこの粘性計算用空間格子生成法に関する成果を今後国際雑誌に投稿する予定である。
リン酸化で制御される、ＲＮＡ結合性マルチドメインタンパク質全長の構造研究

Nrd1は4つのRRMドメインを持つ分裂酵母のRNA結合タンパク質で、細胞質分裂時のアクトミオシン環の収縮に必須なミオシンIIの軽鎖をコードするCdc4のmRNAに結合し安定化することで、細胞質分裂を制御することが知られている。この過程において、Nrd1はpmk1によりリン酸化され、ストレス顆粒が形成される。リン酸化によりどのような影響があるのかを調べるために、リン酸化ミミック体を用いた実験を行った。リン酸化されたスレオニンの負電荷を模倣し、Nrd1のスレオニン残基をグルタミン酸やアスパラギン酸に置換した変異体を調製し、NMR測定を行った。その結果、RRM1-2領域におけるリン酸化ミミック体は、野生型のスペクトルとは一致せず、分離したピークはRRM2単独のスペクトルと非常に近いことが明らかとなった。また、RRM1単独領域のリン酸化ミミック体のスペクトルは、線幅が広く分離していないため、立体構造がほどけ、さらに凝集を起こしていることが示唆された。Nrd1はリン酸化されていない状態ではRRM1とRRM2の間にドメイン間相互作用が存在するものの、リン酸化されるとRRM1の構造が崩れ、RRM1とRRM2の間の相互作用が失われた状態になっていることが考えられる。そしてNrd1がリン酸化されるとRRM1の構造が崩れ、Nrd1全体の凝集性に影響を及ぼし、ストレス顆粒の形成が促進されているのではないかと推察される。共にストレス顆粒を形成する重要な因子であるCpc2とNrd1の相互作用の解析を行った。また、相互作用部位を構造的に明らかにするために、Cpc2の構造を決定した。決定した構造及び示唆された相互作用部位に基づき、リボソーム40SサブユニットやmRNAを巻き込んだストレス顆粒形成による翻訳停止機構の一端を推察した。28年度が最終年度であるため、記入しない。Nrd1(negative regulator of differentiation 1)はRRMを4つ持つRNA結合タンパク質で、細胞質分裂時のアクトミオシン環の収縮に必須であるミオシンIIの軽鎖をコードするcdc4のmRNAに結合し安定化することが知られている。興味深いことに、この過程において、Nrd1はN末端領域からRRM1にかけて存在するThr40、Thr126残基が成長シグナルを伝達するMAPキナーゼPmk1によってリン酸化されることによりRNA結合能が抑制される。本研究では、構造解析によって、MAPキナーゼによる翻訳マシナリーの直接のリン酸化が分子スイッチとして機能制御する機構を解明する。各領域の試料を調製し、NMR測定を行ったところ、RRM1-RRM2及びRRM3-RRM4タンデムドメインと各RRM単独ドメインのスペクトルは一致しなかった。4つのRRMドメインを含んだ領域のスペクトルをRRM1-RRM2及びRRM3-RRM4のスペクトルと比較したところ、それぞれのスペクトルが一致した。したがって、RRM1とRRM2の間に相互作用があり、RRM3とRRM4の間にも相互作用が存在するものの、RRM1-RRM2とRRM3-RRM4の間には相互作用が存在しないことが明らかとなった。Nrd1のリン酸化ミミック体(T126E)を調製し測定したところ、RRM1の構造が崩れていることが明らかとなった。Pmk1によりリン酸化されるとRRM1の構造変化により全体が凝集し、RNAが結合できなくなるのではないかと示唆される。Nrd1のリン酸化によるRNAとの結合抑制メカニズムの解明に大きく近づいたからである。RNAとの結合が抑制されるのはキナーゼによりリン酸化されるRRM1ドメインの構造変化のみによるものではなく、リン酸化によるRRM1の凝集により、ドメイン間の相互作用が失われ、Nrd1全長が凝集し、RNA結合領域にRNAが結合できなくなるためであると示唆された。また当初の計画外であった実験にも着手しており、Nrd1と相互作用することが知られているタンパク質であるCpc2の結晶化に成功している。Cpc2およびCpc2/Nrd1複合体の構造解析へと発展することができる結果が得られている。

そしてNrd1がリン酸化されるとRRM1の構造が崩れ、Nrd1全体の凝集性に影響を及ぼし、ストレス顆粒の形成が促進されているのではないかと推察される。共にストレス顆粒を形成する重要な因子であるCpc2とNrd1の相互作用の解析を行った。また、相互作用部位を構造的に明らかにするために、Cpc2の構造を決定した。決定した構造及び示唆された相互作用部位に基づき、リボソーム40SサブユニットやmRNAを巻き込んだストレス顆粒形成による翻訳停止機構の一端を推察した。Nrd1全長の構造解析に向けて、各ドメインの構造情報を取得する必要があるため、決定済みのRRM2以外にRRM1-RRM2、及びRRM3-RRM4タンデムドメインの構造解析をNMRの定法を用いてそれぞれ行っている。Nrd1はリン酸化によりRNAとの結合が抑制されるとともに、RACKホモログであるCpc2と結合し、ストレス顆粒を形成することが見出されている。ストレス応答の制御メカニズムを原子レベルで理解するため、Cpc2と結合するNrd1の領域の特定を行い、Cpc2とリン酸化Nrd1の複合体の構造解析にも取り組む。Cpc2と結合するNrd1の領域の特定は、SPR法及びNMR法を用いて行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
脊椎動物の中枢神経系と感覚器の複雑化を可能にしたゲノム基盤の解明

脊椎動物型視物質オプシンをもつ視細胞を包含し、脳から派生して形成される光受容器は、ホヤと脊椎動物の共通の形質である。ホヤの光受容器は単純な眼点であるのに対し、脊椎動物の眼は多様で特殊化した細胞から構成される精緻で複雑な器官である。光受容器の複雑さの獲得過程とその制御機構の解明を目指し、ホヤと脊椎動物のそれぞれについて、光受容器の発生の制御機構に関する解析を行った。前年度にホヤ胚の脳原基の特定の細胞核をレーザー光照射によって蛍光標識し、発生運命を追跡することにより明らかにしたホヤ眼点の細胞系譜の解析を、さらに発展させて、細胞分裂パターンの制御による眼盃の形態形成機構と転写因子群のダイナミックな発現による眼点視細胞の発生機構を明らかにした。また、視細胞で確立した細胞系譜解析手法を、脊椎動物視床下部ニューロンとの相同性が指摘されているホヤ幼生の脳内細胞群に適用し、細胞系譜を明らかにした。脊椎動物においては、視細胞の多様性を制御する因子の候補として研究代表者らが同定したmiRNAの機能を解析した。CRISPR-Cas9法によるゲノム編集を駆使して、網膜特異的miRNAや視細胞特異的転写に関わるシス制御領域を欠損させたメダカ系統を作製し、次世代シークエンサーを用いて網膜のトランスクリプトーム解析を進めた。その結果、視細胞の多様性制御に関与することが知られている転写因子群やオプシン遺伝子に加え、これまで視細胞の発生・分化や機能制御との関わりが知られていないいくつかの転写因子についても、miRNA欠損網膜で有意に発現量の変動がみられた。これらの転写因子群は網膜の発生や機能制御に関わる可能性がある。さらに、脊椎動物ゲノムを網羅的に解析した結果、網膜における視細胞多様性および色覚機能と視細胞特異的miRNAをコードする遺伝子のゲノム中の有無に相関がみいだされた。前年度に論文発表したホヤ幼生の細胞系譜を詳細に明らかにする手法を、眼点視細胞以外に適用して、脳・感覚器の細胞系譜の解明が進展した。EXPANDEコンソーシアムと共同で明らかにしたカタユウレイボヤトランスクリプトームは、発生段階の網羅性と精緻さにおいて、これまでのホヤを対象とした研究のなかでも突出している。これを用いたホヤ-脊椎動物間のトランスクリプトーム比較解析の論文を発表することができた。また、視細胞特異的miRNAのノックアウト個体のトランスクリプトーム解析と比較ゲノム解析が順調に進み、眼の発生と進化に関して興味深い結果が得られつつある。前年度に引き続き胚組織・器官や遺伝子機能を操作した胚・幼生についてのトランスクリプトーム解析を進めるとともに、脳領域・感覚器の発生への関与が推定される細胞間シグナル分子・受容体、転写因子、ノンコーディングRNAについて、ノックダウン実験やゲノム編集法によるノックアウト、野生型および変異体の強制発現などの実験を行い、表現型の解析、作用する標的分子の同定を行う。ホヤと脊椎動物の相同器官や相同な細胞種の間で、発生プログラムおよび細胞機能の比較を行い、脊椎動物の脳・感覚器の高度な発達の背後にある分子的基盤と脊椎動物ゲノムの特性を考察する。ホヤにおいては、受精卵を起点とする眼点の細胞系譜の詳細な解析、眼点特異的な遺伝子発現制御機構の解析、眼点の発生を制御する転写因子の解析を行った。脊椎動物においては、メダカを用い、視細胞の多様性を制御する因子の候補として研究代表者らが同定したmiRNAの機能を解析した。ホヤ胚の脳原基の特定の細胞核をレーザー光照射によって蛍光標識し、発生運命を追跡する手法を開発し、眼点視細胞の細胞系譜が従来の推定とは全く異なることを明らかにした。得られた結果について論文を発表し、ホヤと脊椎動物の共通祖先において、神経堤と神経管のコラボレーションという脊椎動物の頭部形成に重要な組織間相互作用の萌芽がみられることを指摘した。一方、脊椎動物ではCRISPR-Cas9法によるゲノム編集を駆使して、網膜特異的miRNAや視細胞特異的転写に関わるシス制御領域を欠損させたメダカ系統を作製し、次世代シークエンサーを用いて網膜のトランスクリプトーム解析を進めた。まだ解析途中であるが、これまでにmiRNA欠損メダカの網膜で、mRNA量が有意に上昇または減少する遺伝子が多数見出されている。光受容器以外の器官についても、ホヤと脊椎動物の相同性に注目し、脳特異的小分子RNA結合タンパク質の解析、中枢神経系の形成と神経回路の構築、GnRH神経系の比較解析、ヘッジホッグ遺伝子の発現制御機構の解析などを進めた。ホヤ幼生の中枢神経系の細胞系譜に関して、完全解明につながることが期待できる手法を開発し、それを用いて光受容器の発生および進化について新しい知見を得て論文を発表したことは大きな成果である。各組織・器官のトランスクリプトーム解析は進行中であり、まとまった結果を得るまでにいたってないが、網膜特異的miRNAのノックアウト系統のトランスクリプトームの解析結果が得られつつあり、網膜細胞の多様性形成について新しい知見が得られることが期待できる。

脊椎動物型視物質オプシンをもつ視細胞を包含し、脳から派生して形成される光受容器は、ホヤと脊椎動物の共通の形質である。ホヤの光受容器は単純な眼点であるのに対し、脊椎動物の眼は多様で特殊化した細胞から構成される精緻で複雑な器官である。光受容器の複雑さの獲得過程とその制御機構の解明を目指し、ホヤと脊椎動物のそれぞれについて、光受容器の発生の制御機構に関する解析を行った。前年度にホヤ胚の脳原基の特定の細胞核をレーザー光照射によって蛍光標識し、発生運命を追跡することにより明らかにしたホヤ眼点の細胞系譜の解析を、さらに発展させて、細胞分裂パターンの制御による眼盃の形態形成機構と転写因子群のダイナミックな発現による眼点視細胞の発生機構を明らかにした。また、視細胞で確立した細胞系譜解析手法を、脊椎動物視床下部ニューロンとの相同性が指摘されているホヤ幼生の脳内細胞群に適用し、細胞系譜を明らかにした。脊椎動物においては、視細胞の多様性を制御する因子の候補として研究代表者らが同定したmiRNAの機能を解析した。CRISPR-Cas9法によるゲノム編集を駆使して、網膜特異的miRNAや視細胞特異的転写に関わるシス制御領域を欠損させたメダカ系統を作製し、次世代シークエンサーを用いて網膜のトランスクリプトーム解析を進めた。その結果、視細胞の多様性制御に関与することが知られている転写因子群やオプシン遺伝子に加え、これまで視細胞の発生・分化や機能制御との関わりが知られていないいくつかの転写因子についても、miRNA欠損網膜で有意に発現量の変動がみられた。これらの転写因子群は網膜の発生や機能制御に関わる可能性がある。さらに、脊椎動物ゲノムを網羅的に解析した結果、網膜における視細胞多様性および色覚機能と視細胞特異的miRNAをコードする遺伝子のゲノム中の有無に相関がみいだされた。前年度に論文発表したホヤ幼生の細胞系譜を詳細に明らかにする手法を、眼点視細胞以外に適用して、脳・感覚器の細胞系譜の解明が進展した。EXPANDEコンソーシアムと共同で明らかにしたカタユウレイボヤトランスクリプトームは、発生段階の網羅性と精緻さにおいて、これまでのホヤを対象とした研究のなかでも突出している。これを用いたホヤ-脊椎動物間のトランスクリプトーム比較解析の論文を発表することができた。また、視細胞特異的miRNAのノックアウト個体のトランスクリプトーム解析と比較ゲノム解析が順調に進み、眼の発生と進化に関して興味深い結果が得られつつある。胚組織・器官や遺伝子機能を操作した胚・幼生についてのトランスクリプトーム解析を進めるとともに、脳領域・感覚器の発生への関与が推定される細胞間シグナル分子・受容体、転写因子について、ノックダウン実験やゲノム編集法によるノックアウト、薬剤による機能阻害、野生型および変異体の強制発現などの実験を行い、表現型を解析する。マイクロRNAをはじめとするノンコーディングRNAについても、個体レベルの機能解析と標的分子の同定を進める。また、ホヤの感覚器官と神経系について、確立した手法を駆使して、細胞系譜の高精度の解析をさらに進める。前年度に引き続き胚組織