hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
身体不定愁訴とストレスマネージメントに関する日米共同研究の企画

米国側を代表してハーバード大学医学部精神科教授Arthur J Barsky氏を窓ロとし情報交換をした。(1)身体症状不定愁訴の定義、(2)身体症状の多角的評価(頻度・強さ・支障度)、(3)身体感覚増幅尺度度の質問紙の英語版と日本語版の相違点、(4)心理社会的ストレス自覚度の評価法、(5)失感情症傾向・気分状態・性格パターンの評価法、(6)身体感覚感受性の脳神経学的測定法、(7)認知機能の脳神経学的測定法(事象関連電位)、(8)日本版ストレスマネージメントプログラムの問題点、(9)ストレスマネージメントの個人療法とグループ療法との効果の相違点の各問題について、日米双方の立場から議論した。そのうち、(6)と(7)の課題については原著論文として論文刊行をした(NakaoM, Barsky AJ, Nishikitani M, et al.Neurosci Lett.2007Jan 12;[Epub ahead of print])。
内因性精神病のウイルス仮説の検討

〈はじめに〉内因性精神病のウィルス仮説を検討するために、感情障害者,精神分裂病者の血清ウィルス抗体価を測定した。〈対象と方法〉帝京大学病院精神科への入院歴があり、RDCの診断基準で感情障害(A)と診断された51名(双極病BP11名,定型・準定型うつ病D31名,その他9名),精神分裂病(S)と診断された27名と、大学生・病院職員(N)181名を対象とした。方法は血清を用い、サイトメガロ(CMV),ヘルペス【I】型(HSV),コクサッキー(COX),アデノ,麻疹ウィルスについてEIA法(IgG),CF法で抗体価を測定した。〈結果〉1.1739歳の年令階級での比較:平均年令はN(169名)=25.4歳,A(14名)=28.9歳,S(23名)=28.8歳。各ウィルスに対する抗体陽性率(CF法)は、N=76%,83%,80%,97%,98%,A=86%,93%,57%100%,93%,S=83%,100%,65%,96%,100%であった。アデノ,麻疹ウィルスでは差がみられなかったが、CMV,HSVでは疾患群で値の高い傾向がみられ、HSVではSがNより有意(PL.05)に高く、COXでは逆に疾患群で低く、AがNより有意(PL.05)に低かった。2.BPとDの比較:各ウィルスに対する抗体陽性率(全年令階級:EIA法で0.50以上)はBP=91%,91%,45%,100%,91%,D=97%,100%,45%,100%,97%で差はみられなかった。3.出生季節による抗体価の状況:NのCOXで冬春生まれで有意(PL.05)に抗体価が低く、AのHSVで夏秋生まれで有意(PL.05)に高かった。4.他の因子:精神科的遺伝負因,肝障害の有無による抗体保有率は、A,Sともに差がなかった。〈まとめ〉精神疾患患者でウィルス抗体の保有に対照よりの偏りがみられ、ウィルスの免疫学的関与が考えられるが、疾患,ウィルスにより状況が異なっており、疾患,ウィルスごとにさらに詳しい検討が必要と思われる。
発育期低栄養および食環境で獲得されるエピゲノム変化による消化管機能の撹乱

生活習慣病の発症には、発育期(胎生期・乳幼児期)における低栄養が関与する可能性がある。申請者はこれまでに、2型糖尿病の主因には、摂食を調節する消化管ホルモンレベルの変化および食後高血糖による炎症の促進があり、その根底にエピゲノムが関与することを明らかにした。そこで本研究では、発育期低栄養曝露による疾患形質の形成にエピゲノムの変化・蓄積を介した消化管ホルモンの調節異常が関与するかを調べる。本年度は、胎生期低栄養曝露による消化管機能の脆弱化について検証するため、母乳に含まれ、消化管機能に関与する中鎖脂肪酸に着目し、2つの動物実験系を立ち上げた。妊娠1日目のICRマウスを2群に分け、AIN93G基準食または低タンパク質食を与えて飼育し、仔を雌雄に分けた。1.雄性マウスを21日齢で離乳させた後、中鎖脂肪食または長鎖飽和脂肪食を与えて飼育した(現在飼育中)。低タンパク質食を与えた母マウスから生まれた仔マウスは、基準食群と比較して有意に低体重であった。また、胎生期低栄養曝露マウスに長鎖飽和脂肪食を与えると、急激な体重増加がみられたが、中鎖脂肪食を与えたマウスでは体重増加が抑制されるとともに、摂食量が低下した。このことから中鎖脂肪酸は、摂食行動を調節し、胎生期低栄養曝露による出生後の過食および肥満を抑制する可能性があることが示唆された。2.雌性マウスを18、21、28日離乳群に分けて離乳させ、35日齢に食事負荷試験を行った後、40日齢にて解剖した。胎生期低栄養曝露群では、早期離乳ほど体重が増加し、解剖前5日間の摂食量が多かった。また食餌負荷試験では、21日離乳-胎生期低栄養曝露群は、基準食群と比較して負荷15分後におけるインスリンの分泌量が低く、血糖値が増大傾向にあった。これらの結果より、胎生期低栄養曝露および出生後の栄養環境は、摂食やインスリンの分泌等に影響を与えることが示された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
精神障害者向けグループホーム職員の感情知性を育む研修プログラムの開発

精神障害者むけグループホームに関する過去5年間の研究動向を探索することで,新たな知見を概観し今後の支援や研究活動における課題を探索することを目的に文献検討を行った.結果,10編の対象文献が採用され,文献の概要と研究の結果から課題となることを検討しまとめた.1)当事者の自立への働きかけ,2)地域連携体制への参加,3)高齢化への対応,4)世話人の業務負担感への対策,5)グループホームの機能に関する探索的研究の必要性,6)グループホームの機能別効果研究の必要性の6点について,今後の支援と研究に関する示唆を得られた.これらの研究成果は論文としてまとめ、帝京平成大学紀要に投稿し「精神障害者むけグループホーム(共同生活援助)に関する過去5年間の国内文献検討」として第30巻に掲載された。文献調査の成果を受けて、精神障害者向けのグループホームにおける職員の感情知性と職場適応との関係を明確にし,利用者支援に与える影響とその資質向上に寄与する研修プログラムの開発につなげることを目的としてインタビュー調査を実施した。調査対象はグループホーム職員7名と利用当事者1名で、6080分程度の面接を行い、合計300分程度の音声データを得た。インタビュー調査は次年度も継続予定であり、グループホーム職員3名への実施を予定し了承を得ている。また、インタビューの内容はテキストデータに変換し、調査対象にピアチェックを実施してもらう予定である。当初の計画では、今年度はインタビュー調査と参与観察による質的データの抽出が完了と、またグループホーム職員に求められる感情知性の具体的な項目が検討されている予定であった。しかし、インタビュー対象との日程調整や、データ抽出に時間を要してしまったため、研究計画の練り直しが必要になり、遅れていると判断した。2018年度の文献研究の成果を踏まえ、2年目にあたる2019年度はインタビュー調査を推進し、参与観察の企画及び実施(89月)してえられた質的データの分析をもとに、研修プログラムの起案(1112月)及びNominal Group Analysisによる検討作業(23月)を進めていく予定である。2020年度の研究課題として、前年度に立案した研修プログラム案を用い、研修プログラムの施行及び効果検証を進めるとともに、本研究の目的である精神障害者向けグループホーム職員の感情知性を育む研修プログラムの開発を完了し、学会発表や論文投稿、および報告書を通じて、その成果の報告と研究の周知化を行う予定である。次年度に繰り越して実施予定のインタビュー調査・参与観察実施に係る経費(謝金、旅費等)に使用する
迷走神経求心路によるホルモン感受の細胞分子機構と摂食行動への連関

迷走神経求心路は末梢因子を感受し、それを神経情報に変換して脳に伝達し、摂食を調節する。しかし、迷走神経と末梢因子の直接的な受容機構・中枢伝達機構は不明である。本研究では、初代培養した単一の求心性迷走神経細胞の細胞内Ca^<2+>濃度変化を測定し、食後分泌変動する数種の膵・消化管ホルモンがそれぞれ直接求心性迷走神経を活性化することを見出した。インスリンの迷走神経への作用はグレリンにより抑制され、GLP-1によって増強することを発見した。食事前後で分泌変動する末梢ホルモン、特にインスリンの求心性迷走神経に対する直接作用を、fura-2蛍光画像解析法による細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)測定により評価した。インスリン(10^<-12>10^<-7>M)は、マウス求心性迷走神経細胞(Nodose Ganglion Neurons,NGN)の[Ca^<2+>]_i、を上昇させた。この[Ca^<2+>]_i上昇は細胞外Ca^<2+>除去やN-及びL-type Caチャネル阻害剤存在下で著しく減少した。NGNにインスリン受容が発現していることを免疫組織化学法により初めて明らかとした。インスリン受容体の下流シグナル分子であるinsulin like substrate 2のノックアウトマウス由来NGN、そしてPI3キナーゼ阻害剤存在下でインスリン誘発[Ca^<2+>]_i上昇は有意に減少した。従って、インスリンはインスリン受容体シグナル経路によりNGNの脱分極を誘導し、電位依存性Caチャネルを介した細胞外からのCa^<2+>流入によって[Ca^<2+>]_iを上昇させることが判明した。予め逆行性蛍光トレーサーを膵臓に投与し膵支配迷走神経を標識したマウスからNGNを単離し、[Ca^<2+>]_iを測定した。標識されたNGNは非標識のNGNと比較し約3倍高頻度でインスリンに応答し、インスリンは膵臓を支配する求心性迷走神経に高頻度に作用する事が明らかとなった。摂食調節性末梢因子(摂食抑制:インスリン・膵ポリペプチド(PP)・GLP-1・PYY_<3-36>、摂食亢進:グレリン・低濃度グルコース)の迷走神経求心路への直接作用を、fura-2蛍光画像解析法による求心性迷走神経細胞(Nodose ganglion neurons:NGN)の細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)測定にて評価した。(1)昨年度インスリンのNGNへの作用を明らかにし、今年度はこの作用をGLP-1が増強し、グレリンが抑制することを発見した。GLP-1はインスリン分泌と同調して分泌され且つインスリン分泌を増強させ、一方、グレリンはインスリン分泌と相反して分泌し、インスリン分泌を抑制する。従って、GLP-1やグレリンはインスリンの分泌だけでなく迷走神経へも協働して作用する事を明らかとした。(2)食後分泌亢進する摂食抑制性NPYファミリーペプチドであるPPとPYY_<3-36>が単一NGNの[Ca^<2+>]_iを上昇させることを発見し、特に、PPはPYY_<3-36>より約100倍低濃度で作用する強力な効果であった。(3)摂食亢進性末梢因子として、低濃度グルコース(≦2.8mM)やグレリンで[Ca^<2+>]_iを上昇させるNGNを発見し、低濃度グルコース応答ニューロンのほとんどがグレリンに応答することを発見した。さらに、これら摂食亢進性因子で活性化させるNGNは摂食抑制性因子で活性化されるNGNと異なることを見出し、これら両因子は異なる迷走神経から中枢に伝達されていることを証明した。迷走神経から延髄孤束核へ伝達される神経伝達物質を同定するために、数種の神経伝達物質抗体を用いてNGNの免疫細胞染色を実施し、[Ca^<2+>]_iとの組み合わせによる応答ニューロンの細胞特徴同定法を確立した。さらに、マウス第4脳室へのカニューレッション及びその後の摂食実験の実験技法を確立させた。
来街地ベース回遊パターンの一致推定法アルゴリズムの動学化とその検証

2018年度は、昨年度に実施した某交通系ターミナルビルにて実施した社会実験より、収集できた来館者のWiFiプローブセンサーデータの分析を進める一方、本研究の基本理論となる消費者回遊行動研究で得られた知見とその理論の体系化作業の一環として、これまでの回遊行動研究を書籍として出版することに注力した。また、2018年の8月から10月にかけて、センサーデータの分析結果の比較検証のために、当該ターミナルビルにおいて、実際に、調査員を配置して、来館者への聞き取りアンケート調査を行った。アンケート調査の主な内容は、当該ターミナルビルの中をどう回遊したかを直接、被験者に聞き取るというものである。今後、アンケート調査で得られた結果とセンサーデータより推定した結果とを比較し、その精度等について検討していく予定である。さらに、現在、取り組んでいる来場者の回遊行動を推定する動的アルゴリズムについて、特許事務所と協議し、特許出願の検討を行っており、その実用化に向けて、研究開発を行っている。なお、動的アルゴリズムの今年度までの研究成果については、日本地域学会第55回(2018年)年次大会にて、その報告を行った。本研究の基盤となっている消費者の回遊行動研究の体系的整理に注力し、Springer社より、これまでの研究成果を出版することができ、世界的にアピールすることはできたが、本研究プロジェクトのメインストリームであるWiFiプローブセンサーデータを用いた回遊行動の動的アルゴリズムのシステム化への研究をもう少し進めたかった。また、予定していたセンサーデータの追加的収集のための社会実験を行うための関係者各所への働きかけが足りておらず、実現できていない状況があり、更なる推進が必要である。最終年度である今年度では、これまでの活動を整理し、研究成果の取りまとめを行うことを念頭に、社会実験の実現(年度前半)、回遊行動の動的アルゴリズムの構築(年度中盤)を行い、本研究プロジェクトで掲げた目標の実現を目指す。当研究チームは、2017年の5月の約1か月間、福岡市博多駅の隣接する交通系ターミナルビルにおいて、社会実験を行った。具体的には、ターミナルビルの各フロアにWiFiセンサーを設置し、ターミナル来館者がもつスマートフォンのWiFi接続のやりとりの信号ログを収集するといったものである。このシステムは、設置したWiFiセンサーが、その周辺にいる来館者所有のスマートフォンやタブレット等の携帯端末機器が発信するWiFi信号を感知し、自動的にデータを収集するといった仕組みになっている。収集するデータは、機器を一意に識別する暗号化済みのMACアドレス(Media Access Control Address)、また、そのMacアドレスがどのWiFiアクセスポイントで受信されたかというWiFiアクセスポイントの接続履歴と接続が確認された日時データが収集される。このログデータを各来館者の館内の回遊移動データと見立て、館内の回遊移動のパターン等を把握することを試みた。この期間に収集したレコード数は、32,508,750レコード、また、ネットのMacアドレスのレコード数は、これまでのアンケート調査でいうところのサンプル数、被験者数に置き換えることができ、602,510人が計測され、まさにビッグデータといえる。本年度は、上記データを用いて、これまで研究チームが構築してきた統計手法を適用することで来館者の館内回遊パターンの推計を行い、その成果を日本地域学会にて報告した。今後は、他の施設での社会実験の実施を模索していきながら、現在までに収集したデータをさらに詳細にみていき、新たな推計モデルの構築を目指す。まずは初年度に、某商業施設でにおいて、社会実験を実施し、消費者の移動履歴データ(正確には、移動ログ)を入手できたことは、計画通りに進んだといえる。現在までの分析結果を、全国学会で報告した点も評価できる。しかし、本研究課題の最大の目標である動的モデルの構築の足掛かりを掴んだにすぎないので、さらなる研究を進めていく必要がある。

今後は、他の施設での社会実験の実施を模索していきながら、現在までに収集したデータをさらに詳細にみていき、新たな推計モデルの構築を目指す。最終年度である今年度では、これまでの活動を整理し、研究成果の取りまとめを行うことを念頭に、社会実験の実現(年度前半)、回遊行動の動的アルゴリズムの構築(年度中盤)を行い、本研究プロジェクトで掲げた目標の実現を目指す。5月に実施した社会実験の経費が、当初、考えていた金額よりも安くすることができた。残った金額については、2017年度に購入を予定していたコンピューターのスペックをランクの高いものに切り替えたいと考えている。2018年度に予定していた社会実験が実現できておらず、多少の差異が発生した。最終年度の2019年と合わせて、社会実験への実現に向けた活動費用に充てたいと考えている。
前立腺がん「脂質欠乏低酸素環境」の病態解析と進行度予測腫瘍マーカーの開発

申請者らが見出した「がん組織の脂質欠乏低酸素環境」において特異的に発現誘導される分子は,がんの進行度が予測できるマーカーとして,治療対応が必要な初期進行前立腺がんの診断マーカー/治療分子標的となる可能性がある.本年度は,「脂質欠乏低酸素環境」で発現誘導される遺伝子群から,低酸素x低脂質で相乗的に10倍以上の発現誘導が起こる7回膜貫通のGタンパク質共役型受容体分子(仮称:GPCR-X)に着目して研究を進めている.GPCR-Xの前立腺がん細胞における機能は未知であるが,診断のみならず,治療の分子標的としても期待できる.Western Blotや免疫染色ができる抗GPCR-X抗体があれば,研究が飛躍的に進むと判断し,初年度から複数の市販抗体の検定(研究に使える抗体がないと判明),種々の方法での独自の抗体作製を試みていたが,研究に使用可能な抗体を得ることが困難であるとの結論に至った.そこで,まずは,臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は,タンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換した.また,GPCR-Xの前立腺がん細胞の性質に与える影響の解析を,CRISPR/Cas9システムによるGPCR-X遺伝子ノックアウト細胞(GPCR-X KO細胞)で行うこととし,アンドロゲン感受性を残しているヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP細胞でのGPCR-X KO細胞の作製を完了し,RNAseqによるmRNA発現プロファイルの網羅的解析を進めた.この解析の結果,低酸素x低脂質環境下で,野生型のLNCaP細胞で発現が誘導される遺伝子のうち,GPCR-X KO細胞では誘導されなくなる遺伝子の候補を複数得ることができ,次年度での,GPCR-Xの機能解析の進展が期待できる.理由低酸素低栄養状態での発現誘導の強度,と,これまでに研究が進んでいない新規性,を考慮してGPCR-Xを標的として研究に着手した.他分野(神経科学)での研究報告があり,抗体も複数市販されているが,Western Blotで使えるものがなかった.また,独自に,特異性等を考慮し,ペプチド抗原,大腸菌で作製した組換えタンパク質を抗原として,独自の兎ポリクローナル抗体の作製を試みたが成功しなかった.一般的に,GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている.不充分ながら研究過程で得られた複数の抗体を組み合わせて使うことで,特異度を上げて研究に利用する試みも成功しなかったので,発現解析を,タンパク質レベルから,mRNAレベルに切り替えざるを得なかった.臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は,最終産物のタンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換し,奈川県立がんセンター病理診断部門が保有する前立腺がん針生検標本,前立腺全摘標本で,GPCR-X発現と臨床病理学的因子との関連を解析する.また,アンドロゲン感受性を残しているヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP細胞でのGPCR-X KO細胞のRNAseqによる網羅的mRNA発現プロファイル解析の結果から,低酸素x低脂質環境下で,野生型のLNCaP細胞で発現が誘導される遺伝子のうち,GPCR-X OK細胞では誘導されなくなる遺伝子の候補を複数得ているので,これらの遺伝子の機能から,GPCR-Xの機能を推測して研究を進めると共に,特異性が高く,Western blotやELISAなどの検出系で利用可能な,高い性能の抗体等の解析ツールが揃う遺伝子の中から,GPCR-Xのサロゲートマーカー(代用マーカー)となる分子を同定して研究を進める.申請者らが見出した「がん組織の脂質欠乏低酸素環境」において特異的に発現誘導される分子は,がんの進行度が予測できるマカーとして、治療対応が必要な初期進行前立腺がんの診断マーカー/治療分子標的となる可能性がある.本年度は、「脂質欠乏低酸素環境」で発現誘導される遺伝子群から、低酸素x低脂質で相乗的に10倍以上の発現誘導が起こる7回膜貫通のGタンパク質共役型受容体分子(仮称:GPCR-X)に着目して研究を進めた。GPCR-Xについては、前立腺がんに関する研究は殆どなく、また、蛋白質レベルの研究が殆どされていない。そこで、市販されている4種類の抗体を購入、RNA発現解析でGPCR-X mRNAの発現が低酸素・低脂質条件で誘導されるLNCaP細胞のLysateで、Western Blotを実施したが、いずれの抗体もGPCR-Xタンパク質を検出することはできなかった。一般的に、GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている。そこで、Western Blotや免疫染色ができる抗GPCR-X抗体が作製できれば、研究が飛躍的に進むと判断し、抗体作製を試みた。2種類の新規ペプチド、1種類の組換え大腸菌タンパク質を作製、兎に免役して3種類のポリクローナル抗体を作製した。抗原に反応する抗体はできたが、LNCaP細胞のWestern BlotではGPCR-Xタンパク質を検出することはできなかった。一方、RNAscopeを用いたIn Situ Hybridizatonでは、LNCaP Xenograft、ヒト前立腺癌組織で、HIF-ialpha免疫染色で見出した低酸素領域周辺に、GPCR-X mRNAの陽性所見が検出された。低酸素低栄養状態での発現誘導の強度、と、これまでに研究が進んでいない新規性、を考慮してGPCR-Xを標的として研究に着手した。他分野(神経科学)での研究報告があり、抗体も複数市販されているが、Western Blotで使えるものがなかった。また、独自に、特異性等を考慮し、ペプチド抗原、大腸菌で作製した組換えタンパク質を抗原として、独自の兎ポリクローナル抗体の作製を試みたが成功しなかった。

申請者らが見出した「がん組織の脂質欠乏低酸素環境」において特異的に発現誘導される分子は,がんの進行度が予測できるマーカーとして,治療対応が必要な初期進行前立腺がんの診断マーカー/治療分子標的となる可能性がある.本年度は,「脂質欠乏低酸素環境」で発現誘導される遺伝子群から,低酸素x低脂質で相乗的に10倍以上の発現誘導が起こる7回膜貫通のGタンパク質共役型受容体分子(仮称:GPCR-X)に着目して研究を進めている.GPCR-Xの前立腺がん細胞における機能は未知であるが,診断のみならず,治療の分子標的としても期待できる.Western Blotや免疫染色ができる抗GPCR-X抗体があれば,研究が飛躍的に進むと判断し,初年度から複数の市販抗体の検定(研究に使える抗体がないと判明),種々の方法での独自の抗体作製を試みていたが,研究に使用可能な抗体を得ることが困難であるとの結論に至った.そこで,まずは,臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は,タンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換した.また,GPCR-Xの前立腺がん細胞の性質に与える影響の解析を,CRISPR/Cas9システムによるGPCR-X遺伝子ノックアウト細胞(GPCR-X KO細胞)で行うこととし,アンドロゲン感受性を残しているヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP細胞でのGPCR-X KO細胞の作製を完了し,RNAseqによるmRNA発現プロファイルの網羅的解析を進めた.この解析の結果,低酸素x低脂質環境下で,野生型のLNCaP細胞で発現が誘導される遺伝子のうち,GPCR-X KO細胞では誘導されなくなる遺伝子の候補を複数得ることができ,次年度での,GPCR-Xの機能解析の進展が期待できる.理由低酸素低栄養状態での発現誘導の強度,と,これまでに研究が進んでいない新規性,を考慮してGPCR-Xを標的として研究に着手した.他分野(神経科学)での研究報告があり,抗体も複数市販されているが,Western Blotで使えるものがなかった.また,独自に,特異性等を考慮し,ペプチド抗原,大腸菌で作製した組換えタンパク質を抗原として,独自の兎ポリクローナル抗体の作製を試みたが成功しなかった.一般的に,GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている.不充分ながら研究過程で得られた複数の抗体を組み合わせて使うことで,特異度を上げて研究に利用する試みも成功しなかったので,発現解析を,タンパク質レベルから,mRNAレベルに切り替えざるを得なかった.GPCR-X遺伝子のmRNAは誘導がかかるが、タンパク質が産生されていない可能性も否定はできない。そこで、まず、分子量は大きいが目的タンパク質発現の成功率が高いHALOタンパク質をN末端側にタグとして付けたGPCR-Xの発現ベクターを導入し、HEK293細胞に強制発現させて、細胞Lyasteを調整し、HALOタグに対する発光反応でタンパク質の産生を確認する。この陽性コントロールに対して、作製した抗体の反応性を検討して、抗体の性能を評価する。
血管内皮細胞におけるカルシウム活性化カリウム及び塩素イオンチャネルの機能相関

血管内皮細胞のアセチルコリン(ACh)に対する膜電位応答は、持続性の過分極から一過性過分極に持続性脱分極が続く反応まで報告や使用された標本により異なるが、その理由はまだ解明されていない。そこでモルモット腸間膜動脈から急性単離した内皮細胞層標本にperforated or conventional whole-cell clamp法を適用し、AChおよびATPで誘発される電流を研究した。内皮細胞は平滑筋層と連絡した状態では通常の静止膜電位を示すが、単離された状態では静止膜電位が-10mVより浅くなった。内皮細胞同士は豊富なギャップ結合で連絡しているので、このままの多細胞標本では膜電位の制御が不可能であった。そこで先端直径が150μm程度のガラスピペットを標本に押しつけて円周状に細胞を破壊し、小数の細胞を周りの細胞と電気的に隔離することでパッチ電極による細胞膜電位固定が可能になった。この標本では、AChはK+およびCl-電流を同時に活性化した。K^+電流はcharybdotoxinとapaminにより完全に阻害され、IK_<ca>およびSK_<ca>チャネルに依ることがわかった。C1^-電流はtamoxifen、niflumicacid、DIDSで部分的に抑制され、Ca^<2+>活性化C1^-チャネルに依ることがわかった。細胞内C1^-濃度が低い場合は1分間のACh投与中K^+コンダクタンスは徐々に減少し、一方C1^-コンダクタンスは持続した。これによって持続性過分極反応が惹起されると考えられた。細胞内C1^-濃度が高い場合は、両コンダクタンスともACh投与中から急速に減少した。これが一過性過分極反応の原因と考えられた。このような細胞内C1^-濃度の違いがACh応答の違いの一因である可能性がある。また、ATPで活性化される電流系はAChのものと同じであった。そこでモルモット腸間膜動脈から急性単離した内皮細胞層標本に穿孔パッチクランプ法を適用し、AChで誘発される電流を研究した。この標本では、AChはK^+およびCl^-電流を同時に活性化した。K^+電流はcharybdotoxinとapaminにより完全に阻害され、IK_<Ca>およびSK_<Ca>チャネルに依ることがわかった。Cl^-電流はtamoxifen、niflumic acid、DIDSで部分的に抑制され、Ca^<2+>活性化Cl^-チャネルに依ることがわかった。細胞内Cl濃度が低い場合は1分間のACh投与中K^+コンダクタンスは徐々に減少し、一方Cl^-コンダクタンスは持続した。

細胞内Cl^-濃度が高い場合は、両コンダクタンスともACh投与中から急速に減少した。これが一過性過分極反応の原因と考えられた。このような細胞内Cl^-濃度の違いがACh応答の違いの一因である可能性がある。モルモット腸間膜動脈から急性単離した内皮細胞層標本に通常のwhole-cell clamp法を適用した。前年度はAChにより活性化されるK^+およびC1^-電流の性質について研究して一定の成果を得たが、実際はAChの内皮細胞生理的刺激物質としての可能性は低い。そこで今年度はより生理的な刺激物質として注目されているATPを使用し、それによって活性化される電流系がAChの場合と同じかどうかを研究した。その結果、ATPでもAChと同様の電流系が活性化されることが確かめられた。その他、前年度にC1^-電流を同定する際、niflumic acidなどのいわゆるC1^-チャネル遮断薬に対する感受性を確認したが、同時にniflumic acidなどにより遮断されないはずの電流成分(K^+電流)もずいぶん小さくなる現象が観られた。この原因を調べるためにギャップ結合に対するniflumic acidの影響を観たところ、内皮細胞のギャップ結合も他の標本での報告同様niflumic acidで遮断されることが判明した。この実験で使用したような多細胞標本では、niflumic acid存在下でギャップ結合の電気抵抗増加が起きると、観察される電流が小さくなるため、K^+電流がniflumic acidで遮断されたように見える現象が起きていたと結論された。
回転するアームの非線形干渉力を利用した推力発生機構に関する研究

研究代表者は、台車-単リンク系について、その運動方程式の楕円積分を解析的に得ることに成功し、それにもとづく系の運動解析のための新しい方法を提案してきた。本年度は、まず台車-単リンク系で提案した方法が多の系についても同様に適用できることを確認するために、2リンクアーム系の自由運動と強制運動のそれぞれについて段階的に検討を行った。まず自由運動では、台車-単リンク系とのアナロジにより第一積分を得ることに成功し、それに基づく解析を行った。その結果、自由運動は振動モードと回転モードの二つに分類でき、運動がどちらのモードをとるかは第一積分に含まれる積分定数(軌道パラメータ)の値により決定されることが明らかになった。また強制運動では、リンク間の間接部にアクチュエータを持つ場合について検討を行った。その結果、系は非可制御であるが出力可制御であることが明らかになった。また、静止状態からの運動では、回転モードのみが生じ、振動モードは決して現れないことを理論的に示した。そしてこれらの結果に基づき、2リンクアーム系のための制御則を求める方法を提案し、その有効性をコンピューターシュミレーションおよび実験により確認した。さて、台車-単リンク系および2リンク系の解析結果を利用して直進運動が可能な台車を設計した。車輪にはブレーキを操作するタイミングをとるためのロータリーエンコーダを取り付けてある。アームの質量は50g、重心の回転半径は0.05m、アームを含む台車の総重量は約1kgである。この仕様で、アーム1回転当たりの移動量は0.005mとなる。したがってアームの回転速度を20rpsとすれば、台車の移動速度は0.1m/sとなる屡この台車は現在製作中である。
家庭における性教育と父子関係に関する研究

本研究の目的は,高校生とその父親の性に関する会話の実態を知ることと,性に関する会話と父子関係や家族システムとの関連,性に対する態度との関連を検討することである。公立高校2校の1,2年生とその父親を対象に,無記名自記式質問紙調査を実施した。調査に同意が得られたのは生徒136名(回収率35.1%),父親96名(同24.7%)であった。(文献検討により,性に関する会話と性に対する態度との関連を検討した研究がないことがわかった。そこで,性に対する態度が形成されていると考えられる高校生を対象とした。)質問紙の内容は,性に関する会話(20項目),父子の接触頻度(7項目),父親による子どもの生活の把握(8項目),性に対する態度(4項目),家族システム評価尺度(FACESKG-IV)である。有意差検定にはχ^2検定,t検定を用いた。父子間で性に関する話をしたことのある生徒の割合は38.2%,父親は63.5%だった。先行研究よりも高い割合を示した。性に関する会話項目に,性に関する社会問題などを含めたため,父親の性教育関与がより明らかとなった。しかし,父子88組のデータを分析したところ,性に関する会話をしたと回答した父親の割合は63.6%だったのに対して,生徒の割合は44.3%であり,有意差が認められた。性に関する会話経験のある生徒は,父親との接触および父親が把握していると思う自分の生活の項目数が多く,家族の連帯性が高く,婚前性交に対して寛容ではなかった。会話経験のある父親は,子どもとの接触と把握している子どもの生活の項目数が多かった。以上より,父子間の性に関する会話に対する認知の差,および,特に子どもの認知による性に関する会話と,父子関係・家族システム・性に対する態度との関連が明らかになった。子どもの性的健康を促進する一要因として,家族関係の重要性が示唆された。質問紙作成にあたり,国内外の文献検討をさらにすすめた。父親を対象としたいくつかの国内の性教育の研究では,性教育を行ったことがある父親は2割程度しかおらず,その姿勢も子どもの質問にまじめに答えていないなど,消極的・拒否的なものであった。国内の研究では,父親の子どもに対する性教育経験の有無やその項目に焦点がおかれ,項目も第二次性徴などの身体的変化に偏っているものが多いが,国外では身体的変化のほか,性に対する価値観・態度・規範,エイズや若年妊娠,同性愛などの性に関する社会的問題を含み,モラルや社会的な視点を項目に盛り込んでいる。父親はモラル・社会的な項目をよく子どもに話しているという結果を考えると,身体的変化に関する項目を中心とした国内の研究で,父親の性教育経験が著しく少ないのも当然であると考える。会話の多さより,父親のこどもに対する理解度が,子どもの主観的幸福感を高めるという国内の研究結果や,親が子どもの興味・関心にどれだけ敏感かが,性教育の関与に関連しているという国外の研究結果から,性に関する会話以外に,日本の父親の子どもの理解度と性教育参加との関連を調査することも必要である。家庭にいる時間が短く,子どもの教育への関わりも少ない日本の父親は母親を通して,あるいは家族関係の中で子どもを理解していると推測される。そこで,子ども理解のプロセスや家族関係も調査する。以上の文献検討を参考に父親と子ども(中学生)に対する質問紙を作成し,調査する予定である。
ゲージ/重力対応におけるデュアリティの研究と、そのクォークの閉じ込めへの応用

前年度までの研究によって、R電荷が十分大きいオペレータに対するホログラフィック二点関数を定義することに成功したが、本年度はそれを有限温度系へと応用する試みを行った。クオークの閉じ込めに向けたAdS/CFT対応の応用という観点において、有限温度における対応関係を確認することは非常に重要である。なぜなら、有限温度にすることによって、AdS/CFT対応において重要な役割を果たしている共形対称性や超対称性が破れるからである。ところが、ホログラフィーがAdS/CFT対応の本質と考えるならば、それらの対称性がなくてもゲージ理論と重力理論との間に対応関係が成り立っている可能性がある。今年度の研究では、上に述べたホログラフィック二点関数を重力側で計算することによって対応する有限温度の場の理論のR電荷が大きいオペレータの二点関数が持つべき性質を予言することに成功した。特に、近距離におけるゼロ温度からの摂動を計算することによって、通常の有限温度の場の理論の摂動論から得られる性質とは全く異なった性質を見つけることができた。この結果は、有限温度において重力理論とホログラフィックに対応する場の理論は温度の摂動論が有効でない相に属しているというwittenの解析と無矛盾である。さらに、球面上の有限温度のゲージ理論から導かれる高温相のエネルギーの期待値とホログラフィック二点関数の間にある数値的な一致を見つけることができた。もし、この一致に何らかの物理的な解釈をつけることに成功すれば、有限温度におけるAdS/CFT対応の定量的な比較を初めて行ったことになる。ただし、その詳細については現在研究中である。T-dualityは、超重力理論の段階においては計量に対してブッシャールールを適応することによって実現されるが、それをCFT側で実現しようとすると、超重力理論側の座標が、CFT側においてどのような量に対応するかを知ることが重要になる。これについては、近年のスピニングストリング/スピン鎖対応の発展によって部分的には理解されつつある。しかしながら、実はこの対応関係はAdS/CFT対応の最も重要な関係式であるGKP-Witten関係式と相容れなかったが、我々の研究室の成果であるトンネリングピクチャーを用いることによって、現在これらの間の矛盾を解消しつつある。具体的にはAdS方向については点状であり、五次元球面上ではスピニングストリング、とくにフォールディッドストリングとなるような量子数を持ったストリングを考え、それの二点関数をトンネリングピクチャーを用いて計算することにある程度成功した。その結果、2-ループに至るまではCFT側における対応する物理量と一致していることがわかった。目下抱えてる問題としては、トンネリングピクチャーを用いたときに必ず現れる無限大の評価ならびに、境界にあるオペレータとスピン鎖の関係を解き明かすことであるが、それについては現在研究中であり、これらの問題を解決することによって初めて座標のCFT側へのマッピングが完全に理解され、それによってCFTにおけるdualityが明らかになると思われる。AdS/CFT対応のメカニズムを解明する試みとして、現在BMN対応や回転弦/スピン鎖対応などがあるが、回転弦とスピン鎖の対応についてはそのホログラフィックな解釈が得られていなかった。他の背景時空上の弦理論と、その境界にあるゲージ理論の対応関係を調べることはAdS/CFT対応の拡張性を議論する上で重要な問題であるから、それはホログラフィックな解析を用いて議論することであるので、今まで知られているAdS/CFT対応において、そのホログラフィックな理解を得ることは、自分の研究テーマである、AdS/CFT対応の拡張を議論するうえで、非常に重要なステップとなった。結果として、トンネル効果を通して弦理論の古典作用を具体的に計算することで、ホログラフィックな二点関数が得られ、それが境界上の二点関数と一致することが確かめられた。さらに、クォークの閉じ込めに向けた研究として、超対称性や共形対称性がこわれているような、AdSブラックホール上の弦理論とその境界上のゲージ理論に対して、そのホログラフィックな二点関数を計算した。これは、ゲージ/重力対応が成り立つ要因として、AdS/CFT対応の特殊性である超対称性や共形対称性がどれほど重要であるかを考察する上で大きな示唆を与えると考えられる。通常のAdS時空の場合と同じように、古典作用を計算し、その長距離の振る舞いをみることによって境界上の複合演算子がもつ有効質量に対する知見を得た。

さらに、球面上の有限温度のゲージ理論から導かれる高温相のエネルギーの期待値とホログラフィック二点関数の間にある数値的な一致を見つけることができた。もし、この一致に何らかの物理的な解釈をつけることに成功すれば、有限温度におけるAdS/CFT対応の定量的な比較を初めて行ったことになる。ただし、その詳細については現在研究中である。
妊娠中毒症に対する血管内皮前駆細胞を用いた細胞治療の開発

平成15年度は正常妊婦(20例)末梢血よりFicoll-gradient法を用いて単核球を分離、さらに細胞接着性の相違を利用して血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cells,EPC)の純化を行った。光学顕微鏡による形態学的観察では、得られた細胞は培養当初クラスターを形成、引き続いてクラスター周囲に紡錘形の細胞が増殖した。純化した細胞を4 chamber slidesに培養し、免疫細胞染色によるLDL uptake,UEA-1(lectin)染色を施行、二重染色された細胞を血管内皮前駆細胞とした。さらに細胞の性格を確認するために、CD31、von Willebrand Factor、eNOS、AC133による細胞免疫染色を行った。次に48 well dishに培養した細胞のクラスター数をカウントしたところ、妊娠週数が進むにつれてクラスター数が増加し、両者の間に正の相関関係を認めた。さらには同妊婦の血清中のEstradiol濃度と血管内皮前駆細胞クラスター数との関連を検討したところ、Estradiol濃度が上昇するに従い、末梢血中血管内皮前駆細胞クラスター数は増加し、極めて強い正の相関関係を認めた。以上の結果から、血管内皮前駆細胞は妊娠中の血管内皮機能の維持、胎盤形成、発育に重要な役割を担っている可能性が示唆された。さらに血管内皮前駆細胞の機能発現にはエストロゲンが深く関連すること、エストロゲンの血管保護作用は血管内皮前駆細胞を介して制御されている可能性が示された。今後、女性ホルモンによる血管内皮前駆細胞の機能制御を解明することによって、胎盤機能改善を目的とした細胞治療の開発が期待される。なお、これらの実験は東北大学医学部倫理委員会にてすべて承認されている。平成14年度は正常妊婦(20例)および妊娠中毒症妊婦(10例)末梢血よりFicoll-gradient法を用いて単核球を分離、さらに細胞接着性の相違を利用して血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cells, EPC)の純化を行った。光学顕微鏡による形態学的観察では、得られた細胞は培養当初コロニーを形成、引き続いてコロニー周囲に紡錘形の細胞が増殖した。純化した細胞を4 chamber slidesに培養し、免疫細胞染色によるLDL uptake, UEA-1(lectin)染色を施行、二重染色された細胞を血管内皮前駆細胞とした。次にlaser scannerを用いて染色された細胞数をカウントし比較検討中である。また、24 well dishを用いたBoyden chamber法によってfilterを通過してきた細胞を染色、カウントし細胞移動性の検討を実施している。さらには同患者の血清中のVEGFその他の血管新生因子濃度と血管内皮前駆細胞数、移動性との関連を検討中である。平成15年度においては、前年の結果を総括、血管内皮前駆細胞の末梢血中への導入に関連する液性因子、アポトーシス関連因子、細胞運動性関連因子と細胞数、細胞運動性との関連性を検討する。さらに妊娠中毒症モデルマウスを用い血管内皮前駆細胞を純化、同定し高血圧、子宮内胎児発育遅延、子宮内胎児死亡との関連性を検討する。
大腸がん発症機構における脂質応答性核内レセプターの機能解析

大腸がんの発症には、欧米型食習慣との関係が深いとされ、動物性脂肪の摂取に伴い腸管内に増加する二次胆汁酸や多価不飽和脂肪酸の発がんへの関与が強く疑われている。二次胆汁酸及び多価不飽和脂肪酸または関連化合物に応答する核内レセプターの大腸がん細胞における発現及び機能を解析した。複数の大腸がん細胞株における遺伝子発現を解析したところ、薬剤や胆汁酸に反応するPXR、胆汁酸に反応するFXRの発現が低下しており、ビタミンD及び二次胆汁酸の受容体VDRの発現も低下しているものが多かった。VDRは大腸がんの抑制因子として報告されている。オキシステロール受容体LXRα及びこれらの核内レセプターとヘテロ二量体を形成するRXRαの発現は、いずれの細胞でも認められた。核内レセプターとがん関連遺伝子との遺伝子発現パターンでの相関性は認めなかったが、ある種の核内レセプターの発現低下ががん化と関連することを示唆している。VDRの発現が保たれているSW480細胞において、アゴニストである活性型ビタミンD3及び胆汁酸リトコール酸の誘導体の遺伝子発現に対する効果を比較したところ、誘導されるVDR標的遺伝子にパターンに相違が認められた。オキシステロール受容体LXRα及び単量体型核内レセプターLRH-1にβ-Cateninの転写誘導特性を抑制する効果を認めた。また、がん抑制遺伝子産物p53にVDR、FXR及びLXRαなどとヘテロ二量体を形成するRXRαの転写活性を抑制する効果を見出した。変異型p53にはこの効果は認められなかった。これらの結果は、脂質代謝制御機構とがん化機構との機能的関連性を示唆している。核内レセプター及びがん関連遺伝子を強発現させた細胞株を作成し、機能的関連性の詳細を検討する予定である。
定量位相顕微鏡による石鹸薄膜中における非平衡模様の生成と成長の研究

純石鹸水にコの字型の針金の枠を浸し、上方に引き上げると枠内に石鹸膜が形成され薄膜化する。この垂直石鹸膜を反射干渉顕微鏡で観測すると、複雑な模様の生成と成長を観測できる。0.1 Mオレイン酸ナトリウム水溶液など三種類の界面活性剤水溶液から作製した石鹸膜では、複雑な模様形成は見られなかった。また、0.1 Mオレイン酸ナトリウム水溶液から作製した石鹸膜を定量位相顕微鏡で観測すると、400 nmを超える大きな段差の形成を見出した。本研究では非平衡条件下にある石鹸薄膜中に生じる模様生成および成長機構の解明を目指し、平成21年度は主として石鹸膜形成・定量位相顕微鏡観測装置の開発を行った。右鹸膜を作製・保持する金枠の位置制御に精密さと再現性を加えるために、4台の自動ステージを導入した。それぞれのステージの役割は以下の通りである:(1) 1台の垂直移動ステージは、石鹸水に金枠をつけ、引き上げる動きで石鹸膜を形成させる:(2)もう1台の垂直移動ステージと2台の水平移動ステージにより、石鹸膜の撮影位置(垂直方向および水平方向)を調節する。これら4台のステージを、自作ソフトウェアによりコンピュータ制御可能にした。定量位相顕微鏡観測装置は、光源をHe-Neレーザー(633nm)とし、既存の金属顕微鏡に申請備品の定量位相イメージングユニット(以下、QPIと略)を組み込み構成した。金属顕微鏡には、二つの撮影用ポートがあり、一方にQPI+高速度カメラ(640×480画素・200枚/秒)を装着した。そして、他方のポートに同じ仕様の高速度カメラを装着し、落射照明(405nm)による反射干渉画像を取得可能にした。後のデータ解析を容易にするため、二つのカメラの撮影タイミングは200Hzの外部同期信号により一致させている。ハードディスクを利用した画像記録装置(自作)により、定量位相顕微鏡画像と反射干渉画像を長時間同時記録可能とした。試作した石鹸膜形成・定量位相顕微鏡観測装置で、試験的なデータ取得を行い、光学系の調整と共に定量位相顕微鏡画像(干渉縞画像)から「試料透過による位相遅れ」を算出する解析ソフトウェアの作成を進めている。本研究では非平衡条件下にある石鹸薄膜中に生じる模様生成および成長機構の解明を目指し、平成22年度は主として観測装置(定量位相-反射干渉顕微鏡観測システム)の改良とデータ取得・解析を並行して行った。観測装置の改良では、633nm光による定量位相顕微鏡画像(干渉縞画像)と405nm光による反射干渉顕微鏡画像を明確に分離・記録するために、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターを含む光学系を新規導入した。この改良装置で石鹸薄膜の同時観測画像を取得・記録・解析した。まず反射干渉画像の二光束干渉近似による解析により、きわめて薄くなった石鹸膜(厚み100nm以下)で、これまでの研究(たとえばA.A.Sonin and D.Langevin, 1993, Europhys.Lett.Vbl.22, pp271-277)でも知られている「段階的薄膜化(stratification)」が確認できた。一方、定量位相顕微鏡画像(干渉縞画像)の解析では、この段階的薄膜化を検出できなかった。これは石鹸膜で生じている階段状の厚み変化(一段10-20nm程度)で生じる干渉縞変位がきわめて微小なためと考えられる。この極微小な変位の検出には干渉縞画像画質の大幅な向上が必要と考え、現在コヒーレントノイズの除去(スーパールミネッセントダイオードなどの低コヒーレンス光源の導入)に取り組んでいる。さらに、干渉縞画像の撮影用に画素大きさが小さいCCDカメラを選択し、空間サンプリング周波数を向上させることも検討中である。以上に加えて、石鹸膜形成液の基礎的な物性(屈折率、表面張力など)測定の環境整備も進めた。本研究では非平衡条件下にある石鹸薄膜中に生じる模様生成および成長機構の解明を目指し、平成23年度は石鹸膜の定量位相顕微鏡観測の精度向上とデータ取得・解析を行った。定量位相顕微鏡観測の精度向上では、684nmのスーパールミネッセントダイオード(ファイバ出力)と顕微鏡対物レンズ(コリメート用)の組み合わせにより、低コヒーレンスながら高輝度かつ直進性の高い照明用光源を構成した。これによりコヒーレントノイズの少ない干渉縞画像が得られた。また干渉縞画像の撮影用に画素大きさが比較的小さい(4.4μm)CCDカメラを導入し、空間サンプリング周波数を向上させた。しかし、残念ながら所望の石鹸膜厚み測定分解能(1-2nm)は達成できなかった。その原因として、照明用光波面の歪みが考えられ、その改善には空間位相変調器の導入が考えられる。上記の改良した定量位相顕微鏡で、試験的にオレイン酸ナトリウム水溶液から作製した垂直石鹸膜を観察したところ、石鹸膜内で400nm程度の急峻な膜厚変化が生じることが分かった。

この膜厚変化は、これまで良く知られている「段階的薄膜化(stratification)」での階段状の厚み変化(一段10-20nm程度)に比べて遥かに大きく、石鹸膜研究における新たな知見と考えている。一方、界面活性剤について、予備実験で用いた純石鹸の主成分であるオレイン酸ナトリウムを選択し垂直石鹸膜を作製したところ、円形の領域の成長が見られ、純石鹸のような複雑な模様(非平衡模様)形成は見られなかった。またオレイン酸ナトリウムにラウリン酸ナトリウム(純石鹸の副成分)を加えた混合水溶液から作製した垂直石鹸膜でも、やはり非平衡模様形成はみられなかった。実際の純石鹸には先述の二つを含めて数種類以上の界面活性剤が含まれており、今のところ、これらの複合作用によって非平衡模様が生じると推測している。
脳動脈瘤発生増大に対するプロスタグランディンの役割の解析

1、脳動脈瘤形成に対するEP2-NF-kB情報伝達系の関与の検討本年度は、まず、NF-kBの転写活性依存的に蛍光タンパク質を発現するマウスを使用しNF-kBが活性化の時間経過の検討を行った。その結果、脳動脈瘤壁において初期には内皮細胞を中心にNF-kBが活性化しその後病態の進展につれ浸潤するマクロファージ、平滑筋細胞に活性化が進展拡大する事を確認した。その後、Cre-loxP依存的にNF-kB活性化を特異的に抑制するIkB変異体を発現するtransgenic mouseを使用して条件付けマウスの作出をはじめ現在継続中である。EP2によるNF-kB活性化機構を詳細に解析する事を目的としEP2を恒常的に発現するHEK細胞を用いEP2刺激薬によるEP2刺激の元でのNF-kB活性化機構を解析した。まず、EP2刺激がp50/p65ヘテロ二量体としてのNF-kBを活性化する事を確認した。そのリン酸化を仲介する情報伝達経路としてcAMP-PKA経路を介したp50の前駆体p105のリン酸化とERK,p38経路を介したタンパク質合成依存的なp65のリン酸化を確認した。引き続き、NF-kB reporterを使用しluciferase assayにてEP2刺激によるNF-kB活性化機序の解明を進めた。その結果、EP2刺激は確かにluciferase活性を亢進したがその程度は予想に反し軽度なものであった。その原因を探るため検討を進めたところ、NF-kB活性化経路は一つは脱リン酸化酵素であるPP2の誘導を介して、さらに別にcAMPを介したcfosの誘導により抑制されている事を確認した。以上のように本年度はin vivoでは脳動脈瘤壁におけるNF-kBの活性化状態を経時的に確認でき、また細胞実験ではEP2によるNF-kB活性化機序の一端を明らかとした。1脳動脈瘤形成に寄与するProstaglandin受容体の同定Prostaglandin受容体の各ノックアウトマウスに脳動脈瘤誘発術を施行し、脳動脈瘤形成を病理学的に評価した。その結果、EP2欠損マウスでのみ有意に脳動脈瘤形成が抑制された。さらに、免疫染色とwesterb blot法により脳血管においての炎症反応(NF-kappaB活性化、IL-1β,iNOS,MMP発現)が抑制されている事を確認した。これらの結果から、脳動脈瘤形成にはProstaglandinE2-EP2経路が関与していることが示唆された。2In vitroの系での内皮細胞でのEP2受容体の機能解析マウスの脳血管の内皮細胞の初代培養法確立は成功していないため、ヒトの頚動脈由来の初代培養内皮細胞を使用した。この細胞では、ProstaglandinE2刺激により容量依存的にNF-kappaBの活性化とMCP-1の発現上昇を認めた。各種EP受容体刺激薬を用いてMCP-1の発現亢進作用を確認したがEP2受容体刺激薬でのみ効果を確認でき、in vivoでの結果と合致していた。EP2ノックダウンによりEP2刺激薬によるMCP-1発現亢進作用が阻害されることから、確かにEP2受容体が情報伝達を仲介していることを確認した。3血行ストレスと脳動脈瘤脳動脈瘤は血行ストレスにより誘発される疾患である。しかし、実際に血行ストレスから脳動脈瘤形成にいたる分子機序は不明である。そのため、内皮細胞に血行ストレスを負荷することにより生じる変化をprostaglandin産生に注目して解析した。血行ストレスは既報により1.5Paとした。このストレスにより内皮細胞においcyclooxygenase-2の発現が有意に上昇した。すなわち、血行ストレスがprostaglandin産生を直接制御することが明らかとなった。1)プロスタグランディン(PG)の脳動脈瘤形成への関与の検討1-1)選択的シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬を使用した検討脳動脈瘤形成のどの段階でPG産生が必要かを検討するため、脳動脈瘤モデル動物に選択的COX-2阻害薬を投与した。結果、脳動脈瘤形成初期にのみCOX-2阻害薬を投与することで脳動脈瘤形成を著明に抑制することができた。1-2)培養細胞を使用したPGの炎症反応に対する関与の検討脳動脈瘤形成には、PG受容体であるEP2が関与することが昨年度の検討で明らかとなっている。まず、選択的EP2刺激薬がヒト初代培養頸動脈内皮細胞において、脳動脈瘤壁での炎症を司るNF-κBの活性化を起こすことを確認した。NF-κBの活性化はその下流の炎症関連遺伝子であるMCP-1の発現亢進を誘導した。これらの作用はEP2のノックダウンにより抑制できた。1-3)血流ストレスによる血管内皮細胞でのPG系の亢進の検討脳動脈瘤の形成には脳血管壁にかかる血流ストレスが重要である。そこで、ヒト初代培養頸動脈内皮細胞にin vitroの状態で血流ストレスに模したシェアストレスを負荷した。ヒト初代培養頸動脈内皮細胞では、シェアストレスによりNF-κBの活性化、COX-2の発現誘導、EP2の発現誘導が生じる事を、RT-PCR法他にて確認した。2)EP2条件付け欠損マウスの作製EP2の条件付け欠損マウスの作製をloxP-Cre系を用いて行い、血管内皮細胞や炎症細胞におけるEP2の関与を細胞種特異的にEP2を欠損させることにより検討することを計画している。