hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CMPーシアル酸修飾酵素の構造と機能に関する研究

Oーアセチル転移酵素に焦点を絞り、この遺伝子のクロ-ニングを試みた。本酵素遺伝子のクロ-ニングには二つの方法が考えられた。一つは酵素を精製後、そのアミノ酸配列を基にクロ-ニングする方法であり、もう一つはOーアセチル化糖鎖に対する特異モノクロ-ナル抗体を作製して直接発現クロ-ニング法を用いる方法である。初年度、以下の実験を行った。(1)Oーアセチル転移酵素の精製:上記ヒトメラノ-マ細胞株を材料にして本酵素の局在を検討したところ、ミクロゾ-ム分画に約85%、サイトゾ-ル分画に約15%の活性が検出された。この結果は、本酵素はゴルジ-酵素であることを示した。(2)抗OーアセチルーGD3特異モノクロ-ナル抗体の作製:ヒトメラノ-マ細胞株よりOーAcーGD3を精製後マウスに免疫し、常法に従いOーAcーGD3特異マウスモノクロ-ナル抗体産生ハイブリド-マ株を樹立した。本抗体はlgM(κ)でOーAcーGD3と特異的に反応し、その他のガングリオシドや中性糖脂質とは全く反応しなっかった。メラノ-マ細胞株との反応性を解析したところ、ある種のヒトメラノ-マ細胞株に大量に発現されていることが判明した。以上の結果に基づき、直接発現クロ-ニング法を採用することにした。次年度、宿主細胞の候補であるCOS1細胞とCOP5細胞の糖脂質の発現を本研究部門で樹立された多数の抗ガングリオシド・モノクロ-ナル抗体を用いて解析した。その結果、これら細胞にはOーアセチル化ガングリオシドGD3を発現していないことが判明した。更に、COS1細胞はGM3、GD3を発現していたので、この細胞は宿主細胞に適当と判断された。次にメラノ-マ細胞よりmRNAを抽出し、CDM8ベクタ-に組み込んだcDNAライブラリ-を作製した。COS1細胞に発現させ、パンニング法で発現陽性細胞をスクリ-ニングしている。現在のところ、未だ安定したクロ-ンを得ていない。Oーアセチル転移酵素効伝子のクロ-ニングには二つの方法が考えられる。一つはOーアセチル化糖鎖に対する特異モノクロ-ナル抗体を作製して直接発現クロ-ニング法を用いる方法であり、もう一つは酵素を精製後、そのアミノ酸配列を基にクロ-ニングする方法である。本年度はどちらの方法がより優れているかを決定するために以下の実験を行った。1、抗OーアセチルーGD3特異モノクロ-ナル抗体の作製。ヒトメラノ-マ細胞株よりOーAcーGD3を精製後マウスに免疫し、常法に従いOーAcーGD3特異マウスモノクロ-ナル抗体産生ハイブリド-マ株を樹立した。本抗体はIgMでOーAcーGD3と特異的に反応し、その他のガングリオシドや中性糖脂質とは全く反応しなかった。11種類のメラノ-マ細胞株との反応性を解析したところ、ある種のヒトメラノ-マ細胞株に大量に発現されていることが判明した。2、Oーアセチル転移酵素の精製。上記ヒトメラノ-マ細胞株を材料にして本酵素の局在を検討したところ、ミクロゾ-ム分画に約85%、サイトゾ-ル分画に約15%の活性が検出された。

この結果は、本酵素もゴルジ-酵素の一つであることを示した。ゴルジ-には多数の糖転移酵素が存在している。近年、糖蛋白質の糖鎖に関して酵素を抽出・精製する方法で数種の酵素の遺伝子がクロ-ニングされている。しかし、糖脂質のそれに関しては酵素の可溶化が困難であり、本法では未だに成功した例がない。以上の結果に基ずき、直接発現クロ-ニング法を採用することにした。現在、メラノ-マ細胞株よりmRNAを抽出しcDNAライブラリ-を作製している。CMPーシアル酸修飾酵素の1つである0ーアセチル転移酵素に焦点を絞り、この遺伝子のクロ-ニングを行っている。方法は、昨年度の検討結果より、抗0ーAcーGD3モノクロ-ナル抗体を用いる直接発現クロ-ニング法と決定された。次の段階として、宿主細胞の候補であるCOS1細胞とCOP5細胞の糖脂質の発現を本研究部門で樹立された多数の抗ガングリオシド・モノクロ-ム抗体を用いて解析した。その結果、これら細胞には多種のガングリオシドを発現しているが、0ーアセチル化ガングリオシドGD3を発現していないことが判明した。更に、COS1細胞はGM3、GD3を発現しているので、この細胞は宿主細胞に適当と判断された。昨年度報告したように、0ーAcーGD3を大量に発現しているヒトメラノ-マ細胞株を既に見にだしているので、この細胞よりmRNAを抽出し、CDM8ベクタ-に組み込んだcDNAライブラリ-を作製した。COS1細胞に発現させ、パンニング法で陽性細胞をスクリ-ニングしている。現在のところ、未だ安定したクロ-ンを得ていない。糖転移酵素の遺伝子クロ-ニングは、糖蛋白の糖鎖に関して既に数種類報告され、臓器特異性の決定に関与するプロモ-タ領域の遺伝子等の解析も進んでいる。一方、糖脂質の糖鎖に関しては、殆ど報告されていない。この理由は、本酵素活性が低く、本酵素の精製が極めて困難であることによる。しかしながら、最近、直接発現クロ-ニング法によりGalNAc転移酵素がクロ-ニングされた。この事は、本方法が糖脂質の糖鎖に関与する酵素のクロ-ニングにも有用であることを明確に示した。今後、この方法により多数の糖転移酵素が短時間でクロ-ニングされると期待される。
大学のプロジェクト型学習と非公式な学生の独自活動を繋ぐ学習環境のデザイン

プロジェクト型学習における学内外のSNSの活用実態を調査し、Facebookなどの一般のSNS普及前後での利用の変容を分析した。学内SNSでは投稿の頻度が少ない代わりに内省的な長めの文章の投稿が見られたこと、Facebookでは投稿頻度やコメント数は圧倒的に多いものの内省的な投稿はあまり見られないことなどが明らかになった。これらオンラインでの活動を探求の共同体フレームワークに基いて分析し、認知的存在感につながる活動そのものに対する指導だけではなく、グループ間の関係に影響する社会的存在感の向上にむけた支援を行い、教授的存在感を高めていく必要のあることが示唆された。前年度調査で明らかにした学内外のSNSの活用特性を論文としてまとめ、査読付き国際論文誌に投稿し、受理・掲載された。ここで得られた知見を踏まえ、公式な学習だけでなく、非公式な学習を誘発することを目指した学習環境を新たにデザインした。前年度と同様のプロジェクト型学習(PBL: Project Based Learning)を継続するとともに、範囲を広げてゼミ、フィールドワークといった活動においてもこうした学習環境を活用し、活動プロセスを公式・非公式に蓄積しつつ、学習成果向上を目指したeポートフォリオを作成する取り組みに着手した。eポートフォリオ作成に際しては、先行研究調査も踏まえ、(1)公式・非公式な学習・活動の過程の記録を主に自分用として蓄積する段階と、(2)外部に見せることも念頭に置きつつ、振り返りの促進のために整理・編集する段階とに分けて考えることとした。蓄積する段階では、学内外のSNSへの投稿だけでなく、活動の過程で作成される成果物・中間成果物を効率的に記録させるためのガイドラインを検討・整備した。一般的に、各種活動で発生している学びを学生が個人で認識することは難しく、第三者の支援が必要と言われているため、学生が主に自分用として蓄積する記録に関しても、教員や他の学生が適切な範囲で参照できるよう、クラウド環境を活用することとした。本年度は、10名程度の学生と、上記実践に取り組んだ。記録の量・質には個人差が見られたため、多くを記録していた1名を対象とし、試行的に記録の再編集に取り組み、一連の流れについて考察した。多くの成果物を時系列に並べることでこれまでには実感しにくかった自分自身の成長を感じることができる等、限られた事例ではあるが、一定の効果を期待できるものであったと考えている。大学における正規科目として実践しているプロジェクト型学習(PBL: Project-based Learning)実施期間中に、学生が学外ソーシャルネットワーキングサイト(SNS)をどのように活用しているか、その実態調査を行った。近年、学生の多くが利用しているFacebook、および、Mixiを対象とした。また、学内SNSの利用状況の経年的な変化についての分析も行った。複数の協力者からデータを収集の上、活用の実態を分析し、アンケート調査・分析結果とともに、PBLとの連携方法を検討する際の基礎とすることを目指した。分析の結果、PBLにおけるSNSのフォーマルな活動は継続的に行われているものの、インフォーマルな投稿は減少傾向にあり、FacebookやMixiなどの外部SNSに移行していることがうかがわれた。また、そのインフォーマルな投稿が、学内SNSに投稿されていたものと、外部SNSに投稿されるものとでは、大きく2つの点で異なることに着眼した。具体的には、<(1)外部SNSでは、学内SNSで行われていたよりもはるかに頻繁なやり取りが行われている。(2)一方で、外部SNSへの投稿内容はシンプルで短いものがほとんどであり、学内SNSにおいてみられた、PBLに関する自らの(長い)投稿はほとんど見られない。>ということである。先行研究等より、(1)は、PBLに取り組む学生同士、お互いの状況を日常を含めて共有することで、協働作業において有効に作用するであろうと分析した。(2)で減少した投稿は、体験型の学習時に重要とされるリフレクション(振り返り)を、より深く着実に行うために有効と思われるものであった。これら現状分析を踏まえ、学内外のSNSを活用した学習環境デザインについての考察を行った。前年度には、正課で行われるプロジェクト型学習(PBL: Project Based Learning)を継続的に実践する中で得られた知見から、学生同士の自発的な学習(非公式な学習)を誘発することを意図した学習環境をデザインし、ゼミやフィールドワークなどの活動においても、同環境を活用すべく準備を行った。ゼミ・フィールドワークでは、少人数で学生の主体的な取り組みがより求められるという側面もあるため、教員による支援に依存せず、学生(協働学習相手の他校学生を含む)間の相互支援(ピアサポート)により、学習成果を深めていくことを狙いの1つとした。デザインした学習環境および活用のためのガイドラインに従い、学生たちが自律的に取り組みながらオンライン協働作業のプロセスを蓄積し、これらデータを用いて学生個々人が自らのポートフォリオをまとめあげるという一連の活動を一定レベルで実施することができたと考えている。

作成されたeポートフォリオの相互評価や改訂をすることで、学習成果を高めていくことに活用できることが期待され、今後は、制作後の活動にも焦点をあてていく必要があると思われる。本年度の実践から、今後は、グループの状況や学生の個性に応じた教員の支援の必要性も示唆された。協働学習の実践時には、学生間のオンラインコミュニケーションの状況には質的な違いがあり、目的に向けて着実な活動は行われているものの、議論が表面的なものに留まっていると思われるグループが見受けられた。これらの活動状況の違いを分析したところ、活動内容そのものよりも、オンラインで協働すべきグループメンバーとの関係構築の段階で課題があるという仮説を持つに至った。本研究を通じて見出された新たな課題であり、関連分野の先行研究による知見も踏まえて、詳細な理由と取りうる対策について今後も検討していきたいと考えている。教育工学各種学習・活動状況を記録する被験者(学生)と実践の場面を確保し、概ね計画に従って実践を進めることができたため。実践的な研究であるため、ソーシャルメディアをとりまく環境の変化などを受けて、調査対象・調査方法を流動的に考えていく必要がある。しかし、ここまでの研究は実態把握が中心であるため、研究計画遂行上の流動性も少なく、順調に進行している。25年度、10名程度の学生を対象に行ったクラウド環境を活用した各種記録の蓄積、また、たくさんの蓄積からの試行的なeポートフォリオ作成の結果を踏まえて、適切なデータ管理やそのデータを活用した振り返りの促進手法についての知見を重ねる。実践に取り組む学生には、データ管理や振り返り支援の方法を教員からあらかじめ提示し、継続してeポートフォリオ作成に取り組ませる。この際、友人同士で振り返りを支援する活動(ピアサポート)も取り入れる。これにより、自分自身では気づきにくいと言われる、非公式な活動の中で発生している学びの自覚を促し、かつ、学生に対しての教員による個別の支援だけでは限界があった多くの学生への広がりを実現することを目指す。教員による支援とピアサポートの特徴については、実践・活動の場面を観察やインタビュー調査などにより、質的に詳細な分析を行う。学習面で意図したような効果が得られたかどうかに関しては、ルーブリックを整備するなどして客観的な評価となるように留意する。以上のような取り組みにより、実体験・活動のプロセスの記録方法と、それらを活用した振り返り支援の方法、人的な体制(学生間のピアサポートなど)も含めたガイドラインを成果物として完成させる。ガイドラインが有効に活用できると思われる各種活動(学生が正課授業外で行うボランティア活動など)への適用も試み、汎用的なガイドラインとすることを目指す。PBLの実践と、そこでの学内外のSNS活用状況と調査・分析結果を踏まえて検討した改良版の授業デザインに基づき、継続してPBLを実践する。
糸状菌の鉄ホメオスタシスに関わる転写制御因子HapXの機能解析

(1)部分欠失変異HapXをゲルシフト法にて解析したところ、N末端の17アミノ酸からなる部分がHapB/C/E複合体との相互作用に重要であることが強く示唆された。(2) in vivo解析の結果、HapXの機能には上記17アミノ酸が重要であることが示された。(3) C末端部分のリコンビナントタンパク質を調製することに成功した。分光学的解析から鉄硫黄クラスターを含むことが示唆された。(4) TAPタグを融合したHapXを発現する系を構築し、温和な条件でHapXを精製したところ、HapXと相互作用している因子がいくつか検出された。1)HapB/C/EとHapXとの相互作用の解析:推定相互作用ドメインを欠くような部分欠失変異HapXや同ドメイン内に変異を有するリコンビナントタンパク質を作製した。変異HapXとHapB/C/E複合体とのin vitroでの相互作用をゲルシフト解析により確認するために必要となるアッセイ系の構築を行った。非アイソトープの系でゲルシフトアッセイが可能となった。HapXとの相互作用解析についてはH26年度も継続して行う。さらに、変異HapXをHapX欠失株に導入して鉄の欠乏条件下で解析したところ、推定相互作用ドメインに変異を導入すると、HapXの機能がほとんど無くなることが明らかとなり、in vivoでのHapB/C/E相互作用ドメインの重要性が示された。2)C末端のシステインに富む領域に着目した鉄硫黄クラスターの存在の証明:大腸菌を用い、リコンビナントタンパク質をmgオーダーで調製することに成功した。分光学的にこのリコンビナントタンパク質を解析したところ、鉄硫黄クラスタータンパク質様の吸収スペクトルを示すことができた。さらに、酸化状態、還元状態におけるスペクトルの比較解析はH26年度でも引き続き継続する。4)鉄関連遺伝子プロモータ領域に対するエピジェネティック解析:鉄関連遺伝子プロモータ領域に対するChIPアッセイについては、現在検討中であり、H26年度に継続して計画を遂行する予定である。1)HapB/C/Eとの推定相互作用ドメインに着目し、HapB/C/EとHapXとの相互作用を分子レべルで詳細に解析する:平成25年度の解析に引き続き、HapB/C/EとHapXとの相互作用を分子レべルで詳細に解析をおこなった。DNAとの相互作用解析であるゲルモビリティーシフトアッセイを改良したスーパーシフトアッセイを確立した.これにより、非アイソトープ系にて高感度で相互作用を解析できるようになった。これにより、推定相互作用ドメインが、HapXとHapB/C/Eとの相互作用に重要な働きをしていることが明らかとなった.2)鉄硫黄クラスター領域内のシステイン残基の機能を解析する:鉄硫黄クラスター領域内のシステイン残基に変異を導入した変異株をいくつか取得することができた。得られた変異株の解析を引き続き、平成27年度に継続して解析する。3)HapXと相互作用するタンパク質を同定する:平成25年度の解析に引き続き、HapXと相互作用している因子をTOF-MASS等の質量分析器で解析した。CDC28の相同タンパク質を始め、いくつかの相互作用候補タンパク質が検出された。平成27年度も引き続き解析を進める。4)鉄関連遺伝子プロモータ領域に対するChIPアッセイを行い、ヒストンの修飾状態を調べる:チトクロムc遺伝子プロモータ解析の結果、このプロモータを対象にChIPアッセイを行なうことが適当であるとの結論に至った。平成27年度において、野生株、hapX欠失株、hapX過剰発現株を対象に、チトクロムc遺伝子プロモータ領域のヒストンの修飾状態をChIPアッセイによって解析する。1)HapB/C/EとHapXの相互作用の解析:蛍光プローブを使用した非アイソトープのゲルシフト解析法を確立し、HapB/C/EとHapXの相互作用を鋭敏に検出することに成功した。また、N末端に存在する菌類において配列が高度に保存されたドメインを欠くような部分欠失変異HapXをリコンビナントタンパク質して調製することに成功した。これらの変異HapXを用いて蛍光ゲルシフト解析を行なったところ、このN末ドメインを欠くとHapB/C/EとHapXの相互作用が見られなくなることから、同ドメインがHapXのHapB/C/Eとの相互作用に関与することが明らかとなった。また、これらの変異HapXを糸状菌において発現させin vivoでの解析を行なったところ、HapXの機能がほとんど見られなくなることから、同ドメインのin vivoでの重要性も確認された。2)C末端のシステインリッチドメインに着目した解析:大腸菌を用い、同ドメインをmgオーダーで取得することに成功した。分光学的に解析を行なったところ、鉄硫黄クラスターに特有の吸収スペクトルが確認できた。システイン残基を改変した変異タンパク質をいくつか取得し、吸収スペクトルを測定したところ、吸収スペクトルの減少しているものが得られた。現在、詳細な解析を進めている。3)HapXと相互作用するタンパク質の同定:HapXにTAPタグ(Tandem Affinity Purification Tag)を融合し、糸状菌内で発現させる系を確立した。温和な条件でHapXを精製したところ、HapXと相互作用しているタンパク質がいくつか検出された。これらのタンパク質をTOF-MASSにて解析したところ、興味深いタンパク質がいくつか同定された。現在、それら因子の欠失株の作製等、詳細な解析を進めている。

(1)部分欠失変異HapXをゲルシフト法にて解析したところ、N末端の17アミノ酸からなる部分がHapB/C/E複合体との相互作用に重要であることが強く示唆された。(2) in vivo解析の結果、HapXの機能には上記17アミノ酸が重要であることが示された。(3) C末端部分のリコンビナントタンパク質を調製することに成功した。分光学的解析から鉄硫黄クラスターを含むことが示唆された。(4) TAPタグを融合したHapXを発現する系を構築し、温和な条件でHapXを精製したところ、HapXと相互作用している因子がいくつか検出された。1)から4)の各項目について順調に解析が進んでいる.平成27年度の研究が順調に進むことにより、当初の目的がほぼ達成されると評価できる。応用微生物学1)の相互作用解析はほぼ終了した。2)取得した変異株の解析を進めるため、順調に計画は遂行できると考えている.3)すでに相互作用タンパク質の候補が見出されているので、計画を進めるのみである.4)研究を進めるべき対象が定まったので、解析を進めるのみである.解析方法についても共同研究者が熟知しているので、問題はない.計画通りに順調に研究は進展している。H26年度も継続して研究を遂行する実験がほとんどであるので、計画に従って、粛々と研究を遂行する予定である。ほぼ、想定した計画通りに研究は進展している。相互作用ドメインの解析については、当初想定したin vitro解析の結果のみでなく、in vivoでの解析にまで踏み込んで結果を出すことも可能な状況になってきた。本課題終了後の研究の展開に役立つことを見据え、研究を遂行したい。無理に文具などの廉価な消耗品を購入する以外に残額を0にすることが困難であったため、残額の有効利用のために次年度使用額が生じた。必要な試薬などの消耗品の購入に充てることで有効利用する。
プラズマ オン チップ

本研究では、1細胞に対して低温大気圧プラズマを照射し、細胞の活性状態を制御することを目的としている。そこで、プラズマ技術とマイクロ電子機械システム(MEMS)技術を駆使して、1細胞へのプラズマ照射を実現するマイクロデバイスPlasma-on-Chipを作製した。このデバイスは、プラズマ活性種が細胞培養マイクロウェル底面に作られた貫通孔を通って、ウェル内の細胞に供給される構造になっている。生体試料としてChlorella細胞にプラズマを照射したところ、Chlorella細胞が発する蛍光の強度が減少した。プラズマ中の活性酸素種等が、Chlorella細胞の活性度に影響を与えたと考えられる。患者に低温大気圧プラズマを照射することで、皮膚疾患などで症状の改善を目的とした研究が報告されている。この「プラズマ医療」の本質は、プラズマ中の活性種と被照射部表面との物理・化学反応にある。従来のプラズマ医療は皮膚疾患・外傷治療を目的とした、広い領域への処置であった。プラズマ医療を微視的に考えると、プラズマと組織の反応を制御するために、プラズマと細胞1個への反応の理解が必要である。本研究ではMEMS技術を駆使し、1細胞よりも小さな領域へのプラズマ照射を実現して細胞活性状態や分化を制御し、細胞1個のレベルからのテーラーメード医療への道を切り拓くことを目的としている。本年度は、液中に保持されている細胞にプラズマを照射するためのデバイス「プラズマオンチップ」の試作を行った。MEMS技術を用いて、シリコン基板に小さなウェル構造を作製する。そのウェルの底部にスルーホールを設け、その背面に低温大気圧プラズマを発生させるための微小電極対を作製した。ウェルに細胞を含む液体を注ぐと、液体は表面張力によってウェルの中に保持される。ウェル構造の背面に作製した電極部でプラズマを発生させると、生成した反応活性種がスルーホールそして気液界面を通って、細胞へ到達する仕組みになっている。バイオ試料として、近年エネルギー源として着目されているChlorellaを用いた。Chlorellaは培養が比較的容易であり、扱いやすい。プラズマオンチップのウェル部にChlorellaを含む溶液を注ぎ、ウェル背面の電極部にHeガスを吹き付け、電極間に高電圧を印加してプラズマを発生させた。このプラズマ照射処理の有無と、Chlorellaが出す蛍光強度との相関を調べたところ、プラズマ照射によってChlorellaからの蛍光強度が減少した。「プラズマ医療」と呼ばれる分野である。従来のプラズマ医療は、皮膚疾患・外傷治療を目的とした、広い領域への処置であった。プラズマと生体組織の反応を制御するためには細胞1個のレベルでの反応の理解が必要である。本研究ではマイクロ電気機械システム(Micro Electro Mechanical Systems: MEMS)技術を駆使し、1細胞よりも小さな領域へのプラズマを照射することが出来るマイクロデバイス「プラズマオンチップ」を作製する。そのプラズマオンチップを用いて、プラズマ照射した際の細胞の応答反応を調べる。そして、細胞の応答反応の理解に基づいて、細胞の活性状態や細胞の分化を制御することを目的としている。2015年度は、まず、前年度までに試作したプラズマオンチップの改良を進めた。プラズマ生成部のマイクロ電極構造を改良することで、デバイスの連続運転時間の5倍以上に延長することが出来た。続いて、生体試料として、酵母を用いて、プラズマ照射実験を行った。しかしながら、プラズマ照射後の酵母には、外見上の大きな変化は見られなかった。前年度の実験では、プラズマ照射によってChlorella細胞が発する蛍光の強度が減少したことを考えると、酵母はプラズマ照射に対する耐性があると考えられる。本研究の期間では、1細胞にプラズマを照射することができる「プラズマオンチップ」の開発と生体細胞試料に対するプラズマ照射を行った。本手法は、プラズマと細胞の相互作用を直接的に理解する情報を生み出すものといえる。今後の一層の発展が期待できる。プラズマオンチップデバイスを試作し、発光分光法を用いてプラズマ中に生成した反応活性種を調べた。印加電圧および供給するHeガスの流量を変えて、反応活性種の生成量が多くなる条件を見出した。クロレラを用いたバイオ試料へのプラズマ照射試験でも、プラズマ照射の有無による違いが見出されている。これまでに国際会議ISPlasma2015、国内会議2015年春季応用物理学会で成果発表をしている。ナノバイオテクノロジー、プラズマ、MEMS2015年度はデバイスの改良とバイオ試料への照射試験を推進する。デバイスの改良としては、特に耐久性の向上を進める。バイオ試料への照射試験として、Chlorellaに加えて、大腸菌への照射も試みる予定である。消耗品の中に、消費スピードが緩やかに済んだものがあったため。主として物品費として使用する予定である。
高選択性抗真菌剤開発を目的とする真菌ステロール脱メチル化酵素の構造解析

アゾール系抗真菌剤は、真菌のP450(14DM)を阻害してその効力を発揮する.したがって,アゾール系抗真菌剤は,動物のP450に影響を与えずに真菌のP450(14DM)を阻害するという選択性を持つことが望ましい.本研究は,アゾール系抗真菌剤に選択性を与えるために有効な構造を推定するべく,P450(14DM)の基質認識に関係する構造を解析することを目的としたものであり,その成果は以下に要約できる.(1)真菌のP450(14DM)は,基質であるラノステロールの3β水酸基,Δ8ステロールの骨格構造,およびステロール側鎖末端部分に対して構造特異的な認識を示す.(2)基質は,ステロール環をピロールCとヘム鉄の上におき,側鎖をピロールAに近接して存在するアミノ酸側鎖上に乗りあげさせた形で真菌P450(14DM)の活性中心に結合する.(3)ラットのP450(14DM)は,真菌のP450(14DM)と基本的に同じ様式で基質と結合すると考えられるが,側鎖末端部分に対する認識において明瞭な差違を示した.以上の知見は,P450(14DM)のステロール側鎖末端認識部位と相互作用するアゾール化合物は,真菌のP450(14DM)に対して選択性を示す可能性を示唆する.この可能性を確認するため,ステロール側鎖に相当するゲラニル基を有するアゾール化合物とその誘導体の酵母とラットのP450(14DM)に対する阻害作用を比較し,以下の知見を得た.(4)ゲラニル基を有する化合物は予期したとおり,側鎖認識部位に結合し,強い阻害作用を発揮した.(5)ゲラニル基を長さの異なるイソプレノイド基に置換した場合に見られる阻害力の低下は,酵母よりラットのP450(14DM)の方が顕著であった.(6)ラットの7-エトキシクマリン脱エチル化P450に対する阻害作用には,上記誘導体間での差があまり認められず,その阻害作用も弱いものであった.以上の知見は,P450(14DM)の側鎖認識部位と構造特異的に相互作用するアゾール化合物は,真菌の酵素に対する選択性を示す可能性を示唆する.アゾール系抗真菌剤は、真菌のP450(14DM)を阻害してその効力を発揮する.したがって,アゾール系抗真菌剤は,動物のP450に影響を与えずに真菌のP450(14DM)を阻害するという選択性を持つことが望ましい.本研究は,アゾール系抗真菌剤に選択性を与えるために有効な構造を推定するべく,P450(14DM)の基質認識に関係する構造を解析することを目的としたものであり,その成果は以下に要約できる.(1)真菌のP450(14DM)は,基質であるラノステロールの3β水酸基,Δ8ステロールの骨格構造,およびステロール側鎖末端部分に対して構造特異的な認識を示す.(2)基質は,ステロール環をピロールCとヘム鉄の上におき,側鎖をピロールAに近接して存在するアミノ酸側鎖上に乗りあげさせた形で真菌P450(14DM)の活性中心に結合する.(3)ラットのP450(14DM)は,真菌のP450(14DM)と基本的に同じ様式で基質と結合すると考えられるが,側鎖末端部分に対する認識において明瞭な差違を示した.以上の知見は,P450(14DM)のステロール側鎖末端認識部位と相互作用するアゾール化合物は,真菌のP450(14DM)に対して選択性を示す可能性を示唆する.この可能性を確認するため,ステロール側鎖に相当するゲラニル基を有するアゾール化合物とその誘導体の酵母とラットのP450(14DM)に対する阻害作用を比較し,以下の知見を得た.(4)ゲラニル基を有する化合物は予期したとおり,側鎖認識部位に結合し,強い阻害作用を発揮した.(5)ゲラニル基を長さの異なるイソプレノイド基に置換した場合に見られる阻害力の低下は,酵母よりラットのP450(14DM)の方が顕著であった.(6)ラットの7-エトキシクマリン脱エチル化P450に対する阻害作用には,上記誘導体間での差があまり認められず,その阻害作用も弱いものであった.以上の知見は,P450(14DM)の側鎖認識部位と構造特異的に相互作用するアゾール化合物は,真菌の酵素に対する選択性を示す可能性を示唆する.酵母のラノステロ-ル14ー脱メチル化酵素をモデルとして、基質であるラノステロ-ルの側鎖部分に置換基を導入した誘導体との相互作用を解析し、以下の成果を得た。すなわち、酵母の酵素は基質側鎖末端部分の構造変化に敏感であり、24位の二重結合を飽和しただけで基質の親和性が著しく低下した。しかし、24位にメチレンを導入した誘導体は本来の基質であるラノステロ-ルに匹敵する活性を有していた。この事実は、24ーメチレンジヒドロラノステロ-ルが糸状菌の14ー脱メチル化酵素に対する天然の基質であることと関連して興味深い。また、上記の結果を動物の14ー脱メチル化酵素と比較するため、ラット肝臓ミクロゾ-ムの酵素を用いて同様の実験を行ったところ、酵母の酵素とは逆に、24位の二重結合の飽和による活性の低下より、24位へのメチレンの導入による活性低下が著しかった。

この結果は、真菌と動物の14ー脱メチル化酵素が基質側鎖末端の構造に対して異なる認識性を有する、すなわち、側鎖末端と相互作用する基質結合部位の構造が真菌と動物の酵素では異なっていることを示すものである。酵母の14ー脱メチル化酵素に対して高い親和性を示すために必要なアゾ-ル系抗真菌剤の構造に関する情報を蓄積する目的で、立体異性体を持つアゾ-ル化合物や置換基の構造を系統的に変化させたアゾ-ル誘導体を選び、それらによる酵素活性阻害の強さを解析した。解析に用いた化合物は、パクロブトラゾ-ル、AFKーシリ-ズ(花王)、SSFー109(シオノギ)などであったが、いずれの化合物においても酵母の14ー脱メチル化酵素の阻害には立体選択性が認められた。これらの知見は、アゾ-ル誘導体が酵素に高い親和性を示すためには、アゾ-ル基と疎水性置換基の幾何学的な配置が酵素のヘム鉄と基質結合部位の空間配置に一致することが必要であるという我々の仮説を支持するものである。前年度の研究で明らかにされた,真菌と動物のラノステロール14α脱メチル化酵素(P450(14DM))がステロール側鎖の構造に対して異なる特異性を示すという事実を基に,この部分に結合すると考えられる構造を有するアゾール化合物について,真菌とラットのP450(14DM)に対する反応性を精製酵素を用いて検討した。ラットから精製したP450(14DM)を得る方法はいまだ確立されていないので,この研究の目的に叶うラットのP450(14DM)を精製する方法を開発した。また,この目的に叶う構造を有するアゾール化合物としては,花王株式会社が合成している一連のイミダゾール誘導体の中から,ラノステロールの側鎖と基本的に同一の構造であるゲラニル基を持つAFK-108およびゲラニル基をプレニルおよびファルネシル基で置換した誘導体(AFK-122およびAFK-110)を選んだ。これらの化合物について,酵母およびラットから精製したP450(14DM)に対する阻害効果を詳細に比較検討し,以下の知見を得た。(1)酵母およびラットのP450(14DM)は共にゲラニル基を持つAFK-108によってもっとも強い阻害を受けた。この事実は,AFK-108のゲラニル基がP450(14DM)の基質結合部位のうちステロール側鎖を認識する部位に結合する可能性を強く示唆するものである。(2)ゲラニル基以外のイソプレノイドを持つAFK-110,122に関しては,酵母とラットのP450(14DM)に対する反応性が異なり,酵母のP450(14DM)はこれらの化合物によっても低濃度で阻害されるのに対して,ラットのP450(14DM)はこれらの化合物に対する感受性が著しく低かった。この事実は,酵母とラットのP450(14DM)がステロール側鎖の構造に対して異なる特異性を示すという前年度の知見に一致するものであり,この部分に結合するような構造を持つアゾール化合物の中には真菌と動物のP450(14DM)に対する親和性を異にするものが存在することを示すものである。前年度までの研究によって,真菌と動物のステロール14alpha脱メチル化酵素の間で基質ステロールの側鎖を認識する部位に相違があり,この部分と相互作用する構造を有するアゾール化合物が両者の酵素に対して異なる親和性を示すことを明らかにした。本年度はこの知見を基にして,アゾール系化合物の構造とP450に対する選択性の関係をより広範囲にわたって検討した。我々は既に肝臓ミクロゾームの薬物代謝に関与するP450は分子種によってアゾール系抗真菌剤に対する感受性が異なり,7-エトキシクマリンの脱エチル化反応を触媒する分子種のひとつがケトコナゾールなど一般に用いられているアゾール化合物に比較的高い感受性を示すことを見出だしていた。そこで,この活性をモデルに選び,前年度に用いたと同じイソプレノイド置換基を有する一連のイミダゾール化合物の構造と阻害活性の関係を解析した。
幹細胞の未分化状態維持機構の解析

胚性幹細胞(ES細胞)は、白血病阻害因子(LIF)の存在下においては、未分化状態を維持して増殖する。この時のES細胞の憎殖速度は他の細胞に比べて非常に速く、そのdoubling timeは約8時間である。一方、培地からLIFを除去すると、ES細胞の増殖速度が低下し、それとともに分化が誘導される。LIFの存在、非存在下でのES細胞の細胞周期を調べたところ、LIF存在下では全周期の30%程度の長さであったG1期が、LIF非存在下では50%ぐらいにまで伸びていた。このことから、ES細胞においては、LIFのシグナル伝達系の下流にES細胞の細胞周期を制御する因子が存在する可能性が考えられた。そこで、本研究ではそのような細胞周期制御因子の同定を試みた。まずマイクロアレイやRT-PCR法を用いることによって、LIF除去の際にその発現量が変動する細胞周期関連分子を探索した。その結果、LIF除去によって発現量が減少するものとして、cyclin E1やcyclin D1,Chk1を見い出した。一方、逆に発現レベルが上昇するものとしては、Cip1,14-3-3σ,cyclin G1,cyclin G2を見い出した。さらにCip1に関しては、強制発現させることによってLIF存在下でもES細胞のG1期を伸ばすごとが可能であることも見い出した。このことはLIFがCip1の発現を抑制することによってES細胞のG1期を短くしている可能性を示唆する。また興味深いことにLIF除去によって発現が上昇する4つの分子のうち、3つの分子がp53の標的分子である。そのためLIFがp53の発現量を制御してこれらの分子の発現を制御している可能性が考えられたが、LIF除去に伴うp53 mRNAの増加は観察されなかった。このことから、LIFが転写ではなく、翻訳後修飾を誘導することによってp53タンパク質の活性制御を行っている可能性が考えられた。胚性幹細胞(ES細胞)は体内に存在する様々な細胞に分化できる能力をもつため、再生医療の材料としての利用が期待されている。しかし、実際にES細胞の医療への応用を考えた場合には、「いかにして材料となるES細胞を効率良く増やすか」という点が重要な問題となってくる。そこで本研究ではES細胞の増殖機構を分子レベルで明らかにすることを目的として実験を進めた。ES細胞は白血病阻害因子(LIF)の存在下で培養することによって未分化状態を維持することが可能となり、約8時間で1回分裂する。しかしLIFを除くと、ES細胞の分化が開始され、それに伴いES細胞の増殖速度が低下する。このことから、LIFの下流に未分化状態を維持し増殖を促進する因子が存在する可能性が考えられる。そこでそのような因子を見い出すために本研究ではDNAマイクロアレイを用いた解析を行った。LIF存在化で3日間培養したES細胞と、LIF非存在下で6日間培養したES細胞からcDNAを調製し、両者の間で発現量が異なる遺伝子を検索した。その結果、CKS-2、p38-2G4、cdc25B、cyclinD、cyclinE、Chk1といった細胞周期関連遺伝子がLIF存在下で培養した場合に多く発現していることが判明した。さらにcdc25B、cyclin Eに関しては、RT-PCR解析やNorhtern blot解析より、LIFによって発現が誘導されることが明らかとなった。現在、これらの遺伝子のES細胞の増殖における役割を解析中である。
非可換岩澤理論における局所理論の研究

岩澤理論といつのは,イテアル類群等の代数的な対象とゼータ関数の特殊値等の解析的な対象との関係をp進的に研究する理論である.岩澤理論においてはこれまで有理数体Qのp進円分拡大体の塔等,Galois群が可換群となるGalois拡大の塔について,拡大体達のイデアル類群と,そのGalois拡大のGalois群の表現でひねる事で得られるゼータ関数の特殊値をp進補間するp進ゼータ関数との間の関係が研究されてきた.非可換岩澤理論とは,Galois群が可換とは限らない場合に一般化して,代数側の対象と解析側の対象の関係を研究する理論である.本研究ではこの非可換岩澤理論の中でも局所理論を主に扱っている.円分拡大の可換岩澤理論において局所理論であるColeman巾級数の理論を用いて,局所単数の逆系から岩澤群環への写像を得る理論は重要であった.筆者は非可換拡大の場合にも,この理論に相当する写像の存在とその特徴づけを与える予想を以前にたて,これを部分的に証明する理論を得た.この予想をより詳しく述べると,p進Lie群GをGalois群とするQpの拡大体の塔で,ある条件を満たすものについて,その単数群のノルム逆系の群からK_1(Zp[[G]]_S)への写像である条件で特徴付けられるものが存在するという予想である.ここにZp[[G]]_SはZp[[G]]のある局所化である.2009年度はこの予想を支持する結果を,購入したパソコンを用いて論文に著し,投稿をした.更に,この予想をpで良通常であるGalois表現に対し,一般化する予想の定式化をほぼ得,これに対し,上記の結果に相当する結果が得られる事をほぼ示した(予想と結果について,最終確認をしている段階である).これらの内容について,国内の数論研究者と研究打合せ等を行った.岩澤理論とは,イデアル類群等の代数的な対象とゼータ関数という解析的な対象との関係をp進的に研究する理論である.岩澤理論ではこれまで有理数体Qのp進円分拡大体の塔等の可換Galois拡大の塔について,拡大体達のイデアル類群と,そのGalois拡大のGalois群の表現でひねったゼータ関数の特殊値をp進補間して得られるp進ゼータ関数との間の関係が研究されてきた.非可換岩澤理論とは,研究の対象を可換Galois拡大とは限らない場合(非可換拡大)に一般化する事を目指す理論である.本研究ではこの非可換岩澤理論の中でも局所理論を主題として扱っている.円分拡大の可換岩澤理論において局所理論であるColeman巾級数の理論は重要であった.筆者は非可換拡大の場合にも, Coleman巾級数に相当する写像の存在とその特徴づけを与える予想を以前にたてた. p進Lie群GをGalois群とするQpの拡大体の塔である条件を満たすものについて,その単数群のノルム逆系の群からK_1(Zp[[G]]_S)への写像,ここにZp[[G]]_SはZp[[G]]のある局所化で,ある条件で特徴付けられるものが存在するという予想である. 2008年度はこの予想を完全に証明する事はできなかったがこの予想を支持する結果を証明した.具体的には筆者が存在を予想した写像と, Artin表現によってもたらされるK_1(Zp[[G]]_S)からQpの代数閉包への写像との合成で,考えている単数群のノルム逆系からQpの代数閉包へ写像が与えられる.あるArtin表現の族に対し,この写像の像のp進付値の様子が予想を支持する振る舞いをする事を証明した.可換岩澤理論の場合と同様,局所理論は非可換岩澤理論においてそれ自体重要で,更に(大域)非可換岩澤理論へも示唆を与える事と思われる. 2008年度は上記の結果についての発表も国際研究集会にて行った.岩澤理論といつのは,イテアル類群等の代数的な対象とゼータ関数の特殊値等の解析的な対象との関係をp進的に研究する理論である.岩澤理論においてはこれまで有理数体Qのp進円分拡大体の塔等,Galois群が可換群となるGalois拡大の塔について,拡大体達のイデアル類群と,そのGalois拡大のGalois群の表現でひねる事で得られるゼータ関数の特殊値をp進補間するp進ゼータ関数との間の関係が研究されてきた.非可換岩澤理論とは,Galois群が可換とは限らない場合に一般化して,代数側の対象と解析側の対象の関係を研究する理論である.本研究ではこの非可換岩澤理論の中でも局所理論を主に扱っている.円分拡大の可換岩澤理論において局所理論であるColeman巾級数の理論を用いて,局所単数の逆系から岩澤群環への写像を得る理論は重要であった.筆者は非可換拡大の場合にも,この理論に相当する写像の存在とその特徴づけを与える予想を以前にたて,これを部分的に証明する理論を得た.この予想をより詳しく述べると,p進Lie群GをGalois群とするQpの拡大体の塔で,ある条件を満たすものについて,その単数群のノルム逆系の群からK_1(Zp[[G]]_S)への写像である条件で特徴付けられるものが存在するという予想である.

ここにZp[[G]]_SはZp[[G]]のある局所化である.2009年度はこの予想を支持する結果を,購入したパソコンを用いて論文に著し,投稿をした.更に,この予想をpで良通常であるGalois表現に対し,一般化する予想の定式化をほぼ得,これに対し,上記の結果に相当する結果が得られる事をほぼ示した(予想と結果について,最終確認をしている段階である).これらの内容について,国内の数論研究者と研究打合せ等を行った.
疎水化DNAニ重らせん鎖の配向固定化フィルムの作製

本研究は、DNA-脂質複合体を有機溶媒からキャストしてフィルムを作製し、一方向に延伸することにより、二重らせん鎖を一方向に配向固定化したフィルムを作製することを目的として行い、以下の成果を得た。1)サケ精子由来のDNA(分子量約200万)を超音波照射により分子量10万くらいの長さに切断した。DNA中のリン酸アニオンと等モルのカチオン性脂質を加えて、DNA-脂質複合体ポリイオンコンプレックスの沈殿として得た。2)これをクロロホルムなどの有機溶媒に溶解して、現有の高速液体クロマトグラムに設備備品として購入した送液ポンプを接続してDNA-脂質複合体を精製した。円偏光二色性CDスペクトルや500MHz-NMRスペクトル(いずれも現有の設備)などから有機溶媒中でも二重らせん構造を形成していることを確認した。3)これをガラス板上にキャストしてフィルムを得た。このフィルムは水に不溶で自立性となったので、基板からはがして一方向に延伸した。X線回折によりフィルム中での塩基間距離が4.8nmであり、二重らせん鎖間の距離や配両方向なども決定した。二重らせん鎖の配向は偏光紫外吸収スペクトルの二色性比から2.4の異方性があり、DNA鎖は二重らせんを保持したまま延伸方向に配向していることがわかった。X線回折によりフィルム中での塩基間距離が4.8nmであり、二重らせん鎖間の距離や配向方向なども決定した。DNA中のリン酸アニオンと等モルのカチオン性脂質を加えて、DNA-脂質複合体ポリイオンコンプレックスの沈澱として得た。2)これをクロロホルムなどの有機溶媒に溶解して、設備備品として購入した送液ポンプを現有の高速液体クロマトグラムに接続してDNA-脂質複合体を精製した。X線回折によりフィルム中での塩素間距離が4.8nmであり、二重らせん鎖間の距離や配向方向なども決定した。二重らせん鎖の配向偏光紫外吸収スペクトルの二色性比から2.4の異方性があり、DNA鎖は二重らせんを保持したまま延伸方向に配向していることがわかった。
末梢血中核酸を用いたゲノム統合解析による難治性肝癌の治療反応機構の解明

近年、脂肪肝など非ウイルス性の背景を持つ肝癌が急増しているがそれらの病態に関わる癌ゲノム要因の詳細は不明であり、また全身化学療法の選択肢が多様化する中で治療反応性の規定因子の解明が求められている。本研究では、特殊な病態の肝癌や分子標的治療効果に関与するゲノム要因を解明するために、1血漿中の微量核酸を用いた癌関連遺伝子変異の探索、その結果と臨床情報の対比に基づき2肝癌の病態および3全身化学療法の治療反応性を規定するゲノム要因を同定する。さらに、見出したゲノム異常の機能解明のため4ヒトiPS細胞由来肝細胞を用いて機能解析を行い、精密医療に向けた知的基盤形成を目指す。
前立腺癌再燃時に関与する遺伝子の同定と遺伝子治療

5週齢SCIDmouse背部皮下両側に前立腺癌細胞株LNCaP 1.O×10^6を50%matrigelとともにそれぞれinoculate。腫瘍が増大したmouseから一方の腫瘍を摘出し、subline化した(LN-Pre)。その後、mouseをcastrationし、そのうち再び増大した腫瘍を摘出し、新たなsublineを樹立(LN-REC0)。LN-REC0をcastrationしたSCID mouseにinoculate。増大した腫瘍を摘出し、低アンドロゲン環境下においても腫瘍増殖を認める新しい前立腺癌細胞株(LN-REC4)を樹立した。この細胞株を用いてin vitro, in vivoにおいて、増殖速度、細胞特性につき検討した。新しく樹立した細胞株LN-REC4はin vitroではアンドロゲン感受性を保持していた。しかし、in vivoにおいては、castrationしたmouseでは造腫瘍能、増殖速度とも親株LNCaP、LN-Preと比較して速く、再燃前立腺癌の良いモデルであると考えられた。また、同時に前立腺癌の再燃に関与する遺伝子として、可能性のあるものをmedline等で調べたところ、Cyclooxygenase-2(COX-2)の関与が考えられた。このため、COX-2の発現に乏しいLNCaP細胞でCOX-2を強制発現させ、COX-2の機能を調べた。COX-2はLNCaP細胞の増殖をin vitro, in vivoにおいても促進した。また、血管新生に関与する遺伝子のう右VEGFの発現を亢進させていた。アンドロゲン感受性前立腺癌培養細胞LNCaPを100万個matrigelとともにオスSCIDマウスの背部に2カ所接種し、癌細胞の発育を観察した。約2ヵ月経過してその2ヵ所の部位で癌細胞の発育が観察された。一方の癌細胞を摘出し、それから再び、primary cultureを行い、新たなcell lineを樹立した(LN-Pre)。LN-Preはin vitroにおいてLNCaPと同様にandrogenによって増殖が促進された。その後、castrationを行い、残された腫瘍が一度縮小して再増殖したものを摘出し、それから新たにprimary cultureを行い、新たなcell lineを樹立した(LN-REC0)。このLN-REC0は前立腺癌再燃モデルと考えられたが、さらに本当に再燃するかどうかを確認するために、in vitroで増殖を確認したが、やはり、LNCaPと同様にandrogenで増殖が促進された。このため、再びLN-REC0をcastrationしたオスSCIDマウスの背部にmatnigelとともに接種し、腫瘍の増殖を確認した。このcell lineはcastrationしたオスSCIDマウスでも造腫瘍能を保持していた。念のため、できた3個の腫瘍を摘出し、praimary cultureを行い、3種類のcell lineを樹立した(LN-REC2,3,4)。現在、これらcell lineのcharacterをin vitro, in vivoにおいて確認中である。5週齢SCIDmouse背部皮下両側に前立腺癌細胞株LNCaP 1.0×10^6を50%matrigelとともにそれぞれinoculate。また、同時に前立腺癌の再燃に関与する遺伝子として、可能性のあるものをmedline等で調べたところ、Cyclooxygenase-2 (COX-2)の関与が考えられた。

このため、COX-2の発現に乏しいLNCaP細胞でCOX-2を強制発現させ、COX-2の機能を調べた。COX-2はLNCaP細胞の増殖をin vitro, in vivoにおいても促進した。また、血管新生に関与する遺伝子のうちVEGFの発現を亢進させていた。
科学ワークステーションの構成

平成6年度はいくつかの自然科学分野の研究者をたずね、彼らとの議論とインタビューを通じて、科学研究の現場における多種多様な情報処理と管理について観察と問題点の検討を進めてきた。このなかで、特徴的なことは、情報処理過程の節目のところで、紙による記録や転記、または記憶に頼るなど、情報保存の観点からみて非常に弱い還がしばしば存在することで、これが情報処理過程としての科学研究の質と能率を強く軛している可能性がある。また最近の記憶装置の大容量化と低価格化によって、個人レベルでも大量の情報を自己の計算機内に保有することが可能となり、実際にGB(ギガバイト、10の9乗文字)オーダーのデータを蓄積することができるようになってきたことにともない、人手によるその管理には限界が見えはじめている。このような点をふまえ、とくに研究者個人の情報管理については、現在研究者たちが置かれている情報環境からの円滑で速やかな移行のできる新しい情報システムの構築についてはこれを優先的に進めていく必要性を認めた。
マツ枯れに関わる環境諸因子・複合作用系の研究

マツ枯れ被害の沈静化が困難な理由の一つに、この疾病が多くの生物要素の相互関係から成立する複雑な系であることがあげられる。本研究では、この複雑な系に影響する環境要因のなかから、酸性雨と菌根共生をとりあげ、これらが本病の流行の動向をどのように支配するのかを研究した。酸性雨は本病の誘因として働き、本病の進展を促進すると想定して仕事をはじめたが、その作用は複雑で、その酸性度により、本病を促進する場合もあれば、むしろ抑制的に働くことがあることを明らかにした。その作用点を明らかにすべく、発芽数ヶ月という小さな実生マツ苗を用いて、何段階かの密度に調整した病原線虫を接種し、その後の病徴の進展を評価するという手法で、病徴進展度を初期線虫密度と接種後の経過時間からもとめた負荷の関数として解析することができた。この解析法により、これまで雑然と見えた結果は、マツ樹側の耐性限界と病原体側の病原力という二つのパラメーターで整理することができるようになり、それぞれ侵入抵抗や増殖力といった現象と関連づけて評価することができた。また、本病が萎凋病の一種である点から、発病・枯死過程を研究しているが、そのメカニズムの一つとして、木部柔細胞からの物質の漏出→ピットメンブレンへの物質の沈着→キャビテーションの発生→水分通導不全という仮説を補強する組織化学的知見を得ることに成功した。さらに、水分ストレスが発病・枯死に深く関わることから、菌根共生を水分ストレスとの関係で研究し、菌根相が水分条件に応じて動的に変化し、マツ樹への養水分補給機能をまかなっていることが示唆される結果を得た。これらの結果をとりまとめ、すでに4つの報文として公表しているほか、現在投稿中の成果もある。これまでに、2つの実験を実施した。一つは海岸砂地土壌と内陸山地土壌を室内に持ち帰り、その中に生息する菌根菌を比較するため、これらをそれぞれ一定量入れた鉢に、アカマツとクロマツの無菌実生を併せ植え込み、これら実生苗に形成される菌根を顕微鏡下で比較検討した。この際、菌根形成に及ぼす水分ストレスの影響を調べるため、潅水条件を3段階に設定して、この点についても比較した。実験の結果、海岸砂地土壌と内陸山地土壌の間では、形成される菌根相に大きな違いがあったが、アカマツとクロマツの間にはそれほど顕著な菌根相め違いはなかった。水分条件は、菌根形成に顕著に影響し、水分ストレスが大きい場合には、菌根形成は阻害された。しかし、水分ストレス条件下でも少数の菌根が形成され、それらは概ね外部菌系を発達させたタイプの菌根であった。このように,水分ストレスに適応したタイプの菌根が選択的に形成されることにより、寄主マツ類は乾燥条伴下でも生息できるものと考えられる。二つ目の実験として、酸性雨に被曝させた実生マツ苗に対するマツノザイセンチュウの接種試験を実施した。ただし、この実験では線虫接種密度を3段階に変えることにより、その後の、マツ苗の発病過程、マツ苗中での線虫の増殖過程を定量的に比較解析した。得られた結果は興味深いもので,酸性雨は、病原線虫の侵入に対する寄主側抵抗を促進する一方で、いったん侵入した線虫の増殖を促進するという二面性を示し、環境因子としての役割の複雑さが明らかになった。

酸性雨は本病の誘因として働き、本病の進展を促進すると想定して仕事をはじめたが、その作用は複雑で、その酸性度により、本病を促進する場合もあれば、むしろ抑制的に働くことがあることを明らかにした。その作用点を明らかにすべく、発芽数ヶ月という小さな実生マツ苗を用いて、何段階かの密度に調整した病原線虫を接種し、その後の病徴の進展を評価するという手法で、病徴進展度を初期線虫密度と接種後の経過時間からもとめた負荷の関数として解析することができた。この解析法により、これまで雑然と見えた結果は、マツ樹側の耐性限界と病原体側の病原力という二つのパラメーターで整理することができるようになり、それぞれ侵入抵抗や増殖力といった現象と関連づけて評価することができた。また、本病が萎凋病の一種である点から、発病・枯死過程を研究しているが、そのメカニズムの一つとして、木部柔細胞からの物質の漏出→ピットメンブレンへの物質の沈着→キャビテーションの発生→水分通導不全という仮説を補強する組織化学的知見を得ることに成功した。さらに、水分ストレスが発病・枯死に深く関わることから、菌根共生を水分ストレスとの関係で研究し、菌根相が水分条件に応じて動的に変化し、マツ樹への養水分補給機能をまかなっていることが示唆される結果を得た。これらの結果をとりまとめ、すでに4つの報文として公表しているほか、現在投稿中の成果もある。