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蛋白質リン酸化を介した情報ネットワーク阻害剤の分子基礎理論の確立的研究

蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ、PK)が細胞内シグナリングに果たす役割は重要である。その阻害剤は、複雑な細胞内情報ネットワーク研究での蛋白質リン酸化の機能解明に、又は細胞内シグナリング異常に由来する病気の治療に利用できる、と考えられる。我々はこの作業仮説をPK-A研究用阻害剤H-89,PK-C研究用阻害剤H-7,カルモジュリン依存性PK研究用阻害剤KN-62,そしてくも膜下出血後の脳血管れん縮に抑制効果のあるPK阻害剤HA-1077を開発し、証明してきた。しかし、H-series薬物開発の歴史は、膨大な数のイソキノリンスルフォナミド誘導体からのランダムスクリーニングによる選択的なPK阻害剤の探索そのものであった。当該研究目標は、H-series薬物の作用機構、構造活性相関、そしてPK-H-series薬物複合体構造の研究を総合し同阻害剤の作用を分子レベルに明らかとし、将来のPK阻害剤の分子設計に役立てよう、とするものであった。研究成果を以下に要約する。1.H-7、8、89とPK-A複合体のX線結晶の解析により同複合体の構造が決定された(Bossmeyer et al.,JBC,1996)。我々々が以前提唱したように、そこではH-series薬物のイソキノリンスルフォナミドがPK-Aに対してATPのアデニン環と同じような空間配置をとっていた。H-series薬物のPK阻害選択性は、そのイソキノリンスルフォナミドに付加された構造がそれぞれのPKでどれほど安定した構造配置をとるかで決まる。と考えられた。2.HA-1077はPK-A、ミオシン軽鎖キナーゼなど様々なPKを阻害し、複合的に脳血管れん縮抑制に作用する。その誘導体にHA-1077とはPK阻害の選択性で大きく異なる薬物を同定した。これは上記1の研究成果と関連して、そのイソキノリンスルフォナミドに結合する構造を変えることでH-series薬物のPKに対する阻害活性、そして選択性が調節可能であることを示す。3.KN-62の構造活性相関の研究から、その中心骨格は構造的に、そして機能的にチロシン残基であり、他にもカルボニル酸素、チロシンに付くイソキノリンスルホン酸が重要であった。目下、そのPK阻害機構、及びPK分子上の作用部位の解明のためKN-62のアジド体、放射能ラベル体の合成を計画している。H-series薬物はPK阻害剤のシ-ド薬物となり、解明の進みつつあるPKの構造情報を参考に新たな薬物開発も可能である、と我々は考えている。と考えられた。本研究の目的である蛋白質リン酸化を介した情報ネットワーク阻害剤の分子基礎理論を確立するためには、統一的かつ総合的研究が不可欠である.正常ないし病態における細胞内情報伝達系おいて特異的プロテインキナーゼ阻害剤を用いる分子薬理学的手法をプロテインキナーゼの機能ドメインを変異させる分子生物学的手法を活用することにより蛋白質リン酸化酵素の生理的役割を検討した.即ち

1)W-77,H-87を用いて癌細胞の薬剤耐性,抗腫瘍作用機序を検討した.2)培養心筋細胞において,カルモデュリンキナーゼが細胞内カルシウム濃度や,心拍数の調節に重要な役割を果たしていることをKN-62を用いて明らかにした.又,個々の蛋白質リン酸化酵素の各ドメインに特異的な阻害剤を創製するために標的とする蛋白質リン酸化酵素の活性中心構造の解析を行った.カルモデュリンキナーゼの一員としてカルモデュリンキナーゼI(CaMKI)がクローニングされ全アミノ酸配列が決定されたが,PCRテクニックを用いて各種のC末端欠失変異CaMKIcDNAを作成し,CaMKIに特有な活性調節部位が存在するか検討した.これらの欠失変異CaMKIの酵素活性をカルシウム/カルモデュリン存在下、非存在化にて測定すると共に,合成したC末端ペプチドを用いて反応速度論的解析を行った.CaMKIのC末端領域のアミノ酸配列に自己活性制御領域があり,その近傍ないしはそれを重複してカルモデュリン結合部位が存在することが示唆された.また合成したC末端ペプチドにより自己活性制御領域が基質に拮抗して酵素活性を制御していることが明らかになった.更に,この結果を踏まえた上で種々の蛋白質リン酸化酵素と阻害剤との反応様式により,より詳細な分子構造機能解析の解明が可能となると考えられる.細胞内情報ネットワークを構成し、その調節因子である多機能性蛋白リン酸化酸素はその反応が俊敏であり、そしてリン酸化された蛋白質は蛋白質脱リン酸化酵素によって以前の状態に復元させることなどで細胞内シグナリングにおける蛋白リン酸化は大いに注目されてきている。とりわけ細胞内セカンドメッセンジャーを代表するcAMP,Ca^<2+>により各々調節されるAキナーゼ、CaMキナーゼは物質代謝、筋トーヌス、遺伝子転写から神経活動といった多くの生命活動に関与していることが明らかにされてきた。これまでに我々は一群の有機化合物の中にこれら酵素に対する比較的特異的な阻害剤をランダムスクリーニングを通して見つけてきた。本年度中にそれら阻害剤の作用機作について若干の知見を得たので以下に報告する。1.Aキナーゼについて:これまでに我々はイソキノリンスルフォナミドを母骨格とする有機化合物が蛋白質リン酸化酵素の阻害剤になり得ることを多くの事例をもって証明してきた。Cキナーゼの阻害剤とされてきた某薬物である特定の位置にメチル基を1つ付加すると、その蛋白質リン酸化酵素阻害スペクトラムは大きく移行し、Aキナーゼを最も強く阻害するようになった。これらの薬物は蛋白質リン酸化酵素のATP結合ポケットに作用しているとされているだけに、この微妙な構造修飾に比べてその作用の違いの大きさは蛋白質リン酸化酵素間でのATP結合ポケット構造の微妙な違いを反映しているものと考える。このメチル基を他の化学基に置換したものを合成し、どのような変化が生ずるのか目下検討中である。我々は蛋白質リン酸化酵素間のATP結合ポケット構造には微妙な違いがあることを確信し、そこに作用点を持つそれぞれの蛋白質リン酸化酵素に対する特異的阻害剤の創製に日々努力している。2.CaMキナーゼについてCaMキナーゼIIの阻害剤KN-62の分子上の作用点について目下検討中であるが、詳細は明らかにできていない。
アトピー性眼合併症におけるIFNG-PAI-1シグナル

本研究の成果として、IFN-γにより誘導されるPAI-1分子が、水晶体上皮細胞の線維化を促進し、アトピー白内障の病態生理に重要な働きをしていることが明らかになった。また新たな疾患概念としてのアトピー緑内障の臨床像、病態に関してまとまった提言をすることができた。これらの成果は欧文学術誌に受理され、今後の臨床への還元が期待されるとことである。アトピー眼合併症の遺伝子多型研究の結果と最近の基礎研究の成果から、インターフェロン-γ(IFNG)シグナルとその下流にあって組織の繊維化を促進するplasminogen activator inhibitor type-1(PAI-1)分子が前房水中にあってアトピー白内障およびアトピー関連緑内障の発症に関与しているとの仮説を検証することを目的に研究を進めている。平成22年度はアトピー白内障患者10名から臨床サンプルを収集し、PAI-1発現をリアルタイムPCR法で検討した。またアトピー白内障患者の病変部位から採取した組織サンプルを用い免疫組織染色と免疫電顕法によりアトピー白内障病変部位にPAI-1タンパクが沈着していることを示した。また、PAI-1分子が水晶体上皮の上皮間葉移行の足場になっている可能性を示唆する形態学的な所見を得たため、同部位での上皮間葉移行のマーカーαsmooth muscle actinタンパクの発現を検討したところ、発現の亢進を認めた。さらに培養水晶体上皮細胞にPAI-1siRNAを加えてPAI-1分子の発現を抑制するとTGF-β刺激による上皮間葉移行のマーカーαsmooth muscle actin遺伝子の発現を抑制することを発見した。これらの結果から、アトピー白内障の病態には組織線維化を促進するPAI-1分子を足場に水晶体上皮細胞が上皮間葉移行を生ずることによって、特徴的なヒトデ型の水晶体前嚢混濁を呈することが強く示唆された。平成23年度は前年の成果に基づき、PAI-1分子が水晶体上皮の上皮間葉移行の足場になっている可能性を検討するため、近畿大学医学部松尾理教授のグループと共同で、PAI-1ノックアウト(KO)マウスにTGF-beta誘発白内障を作成し、PAI-1 KOマウスでは、コンジェニックなワイルドタイプマウスと比較して、水晶体嚢下の白内障形成が有意に抑制されることを見出した。また免疫電顕法により、アトピー白内障の臨床サンプルにおいて、PAI-1分子の沈着部位と水晶体上皮の上皮間葉移行部位の一致が確認された。これら一連の研究成果は原著論文としてInvestigative Ophthalmology and Visual Science誌に受理された。
高選択的光反応機能サイトを有する半導体微結晶表面状態のin-situ観測

(1)有機溶媒中で安定に分散可能なCdS超微結晶を用いたCdのk-edgeにおけるin-situXAFS測定の為の手法を確立した。これによりこれまでに固体状態のみでしか測定が出来なかった当該の系について長光路セルを適用することにより溶媒内条件下にて良好なSN比をもってXAFS測定を可能とした。(2)平均粒系3.6nmのDMF溶媒中のCdS微結晶についてEXAFS測定を行い、微結晶表面の溶媒和状態を検討した。その結果、Cd原子に対する酵素原子の配位の寄与が見いだされその配位数と配位距離の検討から表面のCdサイトが非常に強く溶媒和されており単サイト当たり複数のDMF分子の酵素原子により溶媒和されていることが明らかとなった。(3)これまでに光触媒活性、光学特性の変化が確認されている有機分子、無機イオンなどによる表面修飾が施された系についてXAFS測定を行い微結晶表面の溶媒和状態と光機能との相関を明らかにした。特に表面修飾に伴う溶媒和分子と表面との距離の増大が明瞭に観測され、溶媒和状態の変化が確認された。また、硫黄原子の配位数も増大し、以上の表面修飾が微結晶表面の欠陥を減少させることが明らかとなった。(4)XANES測定から溶液内微結晶のCd原子の電子密度が上記の示したように強く溶媒分子で分極されているにも関わらず、バルクの状態に非常に近いことが示された。
酸化チタン光触媒の磁場効果とその機構解明

磁場が種々の光触媒の触媒能に与える影響について調査を行った.その結果、条件により磁場は光触媒反応を促進したり、遅らせたりすること、酸化チタンだけでなく多くの光触媒に同様の効果がみられることが明らかとなった。本研究では特に酸化亜鉛、メチレンブルーンの組み合わせに注目し、詳細に検討した。完全な機構解明までは至っていないが、.なくとも溶存酸素が影響を与えていることが明らかになった。本年度は予備実験で得られている光触媒の磁場効果について、酸化チタン、酸化亜鉛を用いて精密な測定を行った。メチレンブルーの分解反応を対象として、初期濃度の影響、磁場の影響、温度の影響を4回以上同一条件で測定し、磁場効果と測定誤差について詳細に分析を行った。また、光触媒の水和に対する影響を調べるために予備加熱した試料としていない試料についても比較検討を行った。その結果、酸化チタンについてはほぼ予備実験と同様の結果が得られたが、酸化亜鉛については実験誤差と同程度の効果しか確認されなかった。また、初期濃度と分解速度の関係についてはこれまで報告されているように線型関係は成立しなかったが、従来高濃度側で影響が小さくなるという報告がされているが、今回酸化亜鉛で低濃度側で濃度影響が小さくなる傾向が見られた。さらに、粒径の違いによる影響を調査したところ、酸化チタンで顕著な差が見られたが、酸化亜鉛についてはそれほど大きな差が見られなかった。以上から、磁場効果が酸化チタン特有の現象である、あるいは顕著な現象である可能性が高いことがわかった。その理由の一つとして、酸化亜鉛の触媒能力が高く、磁場による影響が出にくいことが考えられる。そのため、磁場の大きさを小さくして同様の実験を行ったが、やはり顕著な差は見られなかった。今後、さらに詳細な検討が必要であり、現在、精度を高くした実験を検討中である。また、本年度導入したゼータ電位計により、より詳細な表面状態の解析を行う必要がある。酸化チタン、酸化タングステン、酸化亜鉛の各粉末において光触媒反応を磁場中および磁場なしの状況でおこさせ、その反応速度を測定した。光強度、反応物質の濃度、溶媒の影響などをゼータ電位計、FTIRなどを用いて詳細に分析を行い、磁場効果の起こる条件の特定とそのメカニズム解明を行った。その結果、いくつかの重要な結果を得たが、それらの条件を完全に特定できていないので公開できるレベルには達していない。また、本年は磁場効果の測定を精密に行うことができるよう工夫し、わずかな磁場効果も見逃すことなく測定できるよう改良を行った。その結果、溶媒の極性の有無、溶存酸素量など直接光触媒反応に寄与しない特性が磁場効果に大きな影響を及ぼす可能性が示唆されるデータを得た。さらに、温度条件の影響を調べるために温度を変化させた実験も行ったが、光照射のために温度変化を生ずるため、紫外線照射のため紫外線照射用LEDを用いて極力温度上昇が起こらない条件設定で精密な測定を行った。酸化チタンについては、窒素ドープした酸化チタン薄膜を測定し、その光触媒効果を調べ、微量元素の磁場効果に与える影響についても調査している。昨年度に引き続き磁場効果が光触媒反応に与える影響をより精度良く定量的に測定する。一昨年度導入したゼータ電位計やそれに付随する粒径分布測定装置を用い、磁場の大きさや、光触媒材料の粒子径といったパラメータを変えながら測定を行い、磁場効果とラジカル種の挙動との関係について評価を行った。その主な成果は以下のとおりである。光源としてUV-LEDランプを用いることにより、再現性のある実験結果を得、種々の光触媒(酸化チタン、酸化亜鉛、酸化タングステン)において磁場効果が確認された。ただし、磁場による影響は光触媒効果を高める場合、あるいは弱める場合があることがわかった。メチレンブルー溶液の調合後の放置時間と磁場効果に明確な関係があり、特に酸化亜鉛光触媒において顕著であった。そのため、溶存酸素量を測定したところ、放置時間により溶存酸素は変化することが分かった。さらに詳細に調べるため、溶液に酸素吹き込み、アルゴン吹き込みなどにより溶存酸素をさらに変化させ、磁場効果との関係を調査した。しかし、得られた結果を総合して考察したところ溶存酸素のみが重要なパラメータではなく、他の要因もあることが示唆された。ゼータ電位については誤差が大きく系統的な変化を観測するには至らなかった。その他、メチルオレンジなどの色素や、水以外の溶媒(アルコールなど)を用いた場合も光触媒反応に磁場の影響がみられたがさらなる精査が必要である。
中国少数民族の研究

本研究の目的は明・清代の中国西南諸省における少数民族と漢族の関係を明らかにしていくことにあった。この度の研究では清代雍正朝期の少数民族政策、すなわち「改土帰流」政策の展開を中心にとりあげた。対象とした少数民族は〓族であり、地域的には金沙江を挾んで西に位置する四川省涼山一帯から東に位置する雲南・貴州省の烏蒙山一帯である。この地域の地方志から関係史料を収集し分類するとともに、購入した資料『雍正朝漢文批奏摺彙編』に収録されている当該地方の〓族に対する改土帰流政策文件を分析した。その成果は二つの論文「清代雍正朝期の改土帰流政策烏蒙・鎮雄両土府の場合」「清代雍正朝期の少数民族統治について改土帰流後の烏蒙府を中心に」にまとめている。これらの論文で次の事を明らかにした。1.西南諸省の少数民族に対する中央王朝の直接統治は雍正朝期に大規模に実行され、その政策は改土帰流と言われた。烏蒙地方の改土帰流実行の立役者は雍正帝の信任厚い雲貴総督爾奏であり、彼は四川総督岳鐘と対抗しながらこの政策を進めた。2.烏蒙地方は明代以来〓族の拠点であり、〓族の支配層は改土帰流に激しい抵抗を示したが、鄂爾奏は「以夷征夷」政策により、この地方の直轄を完成した。3.改土帰流後の烏蒙地方では急激な支配体制の変化に対して〓族旧支配層は抵抗を試みた。その反乱はいずれも厳しく鎮圧され、結果として清朝の少数民族地域への直接支配が進展する。4.清朝において盛んに実施された改土帰流方式による少数民族の直接支配は、伝統的な政策として現代の民族政策にまで継承されているものである。
脳性麻痺へのCD133＋細胞投与効果の発現機序と制御するマイクロRNAの解明

同意を得た妊婦の分娩または帝王切開での児娩出後の臍帯から採取した臍帯血から、自動磁気細胞分離装置(autoMACS)を用いて、単離、保存したヒト臍帯血由来CD133+細胞を以下の研究に用いた。ヒト臍帯血由来CD133+細胞投与により分泌される脳性麻痺の抑制因子の同定を新生仔ラット脳組織のex vivoモデルを用いて行った。生後3日齢の新生仔ラット(Sprague Dawleyラット)の大脳皮質スライス(400μm厚)を培養し、培養開始の翌日から24時間の低酸素負荷により低酸素障害を与えた群(低酸素群)と低酸素負荷を行ってない群(コントロール群)、と低酸素負荷後にCD133+細胞を投与した群(投与群)の3群を作成した。これら3群における脳性麻痺の発症を抑制していると考えられる因子の発現量をreal-time RT-PCRにより確認した。CD133+細胞投与3日後の培養組織を用いて、rat VEGF、human VEGFについて検討を行った。しかし、今回の検討において、rat VEGF、human VEGFともに、低酸素群に比し、投与群で発現量の増加は認めなかった。また、Angiopoietin-1についても発現量の確認を行ったが、低酸素群と投与群での発現量に有意差は認めなかった。投与群での大脳皮質組織の障害の抑制には、ほかの因子が関与している可能性や障害後の時間経過が影響を及ぼしている可能性が考えられる。同意を得た妊婦の分娩または帝王切開での児娩出後の臍帯から臍帯血を採取し、自動磁気細胞分離装置(autoMACS)を用いて、ヒト臍帯血由来CD133+細胞を単離、保存した。臍帯血由来CD133+細胞投与により分泌される脳性麻痺の抑制因子の同定を行った。生後3日齢の新生仔ラット(SDラット)の大脳皮質スライス(400μm厚)を培養し、培養開始の翌日からの24時間低酸素負荷を行った群(低酸素群)と低酸素負荷を行ってない群(コントロール群)、低酸素負荷後にCD133+細胞を投与した群(投与群)の3群を作成した。まず、CD133+細胞投与3日後の培養組織を用いて、神経成長因子である神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NT-3および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を確認した。NGF、BDNF、NT-3においては、3群間で有意な差は認めなかったが、VEGFではコントロール群に比し、低酸素群、投与群において有意に発現量が低下していた。この結果はVEGFの減少が大脳皮質の低酸素障害後の神経障害に負の影響を及ぼしている可能性を示唆している。しかし、投与群での障害の抑制にはほかの因子が関与している可能性や障害後の時間経過が影響を及ぼしている可能性も考え、引き続いて、Ang-1の発現、および低酸素障害後のより早い時期での諸因子の発現について確認を行っている。他の業務の影響を受け、当初予定していたエフォートの配分(20%)を当該研究にあてることができなかった。研究分担者の大学院への進学による離脱のため、研究の進行が遅滞した。脳性麻痺の発症を抑制していると考えられる因子のreal-time RT-PCRによる発現量の確認を引き続き行う。また、当初の予定通り、脳性麻痺の抑制に関与していると考えられるマイクロRNAの探索も進めていく。研究の遂行を計画通り行うため、研究分担者の増員を行う。脳性麻痺の発症を抑制していると考えられる因子の発現量を確認するためのreal-time RT-PCRの検索回数が想定より少なかったため。
地球温暖化や人為撹乱といった外的撹乱が,生物群集にどのような影響を与えるかは,生態学における古典的課題であるのみならず,生物多様性保全上の重要課題でもある。実際に環境変動に対する生物群集の応答を理解するには,個々の生物が環境にどのように応答するかということと,生物同士の相互作用を同時に考慮する必要がある。本研究では,生物種の持つ特徴として,「環境や他の生物からの影響の受けやすさ」と「他の生物へ与える影響力の強さ」を,データから解析し、それらがどのように生物群集の応答に関わるかを分析ことで,群集の環境応答を見通しよく理解する。
新規生理活性物質・エンドセリン(1-31)の意外な顆粒球・好酸球ケモカイン作用

我々は最近31個のアミノ酸からなる新規生理活性ペプチドのET(1-31)が、肥満細胞に由来するキマーゼによってBig ETから形成されることを見い出した。ET(1-31)はET(1-21)と同様に平滑筋収縮能を示すが、in vitroにおいてET(1-21)には全く見られない顆粒球と単球対するケモカイン作用(白血病遊走作用)をET(1-31)は示し、中でも好酸球に対するケモタキシス作用の強いことが明らかになった。さらにET(1-31)は顆粒球に高濃度存在し、血管壁に付着した後に放出され末梢循環不全を引き起こすことが予測される。このことは、心筋梗塞や脳の血流障害の病態を良く説明する。本年度はET(1-31)とET(1-21)の好酸球に対するケモカイン作用をin vivoレベルで検討した。その結果、ET(1-31)とET(1-21)は局所のエオタキシンとIL-5レベルを増加させ、好酸球を最も強く遊走させた。一部弱いながらも好中球の遊走も認められたが、リンパ球の遊走作用はほとんど認められなかった。好酸球の遊走に先立ってエオタキシンが誘導されることから、好酸球の遊走に直接関与するケモカインはエオタキシンであると考えられ、また好酸球の遊走後にIL-5が上昇することから、局所の好酸球の活性化にはIL-5が関与すると推定された。なおエオタキシンの誘導と、好酸球の遊走は、エンドセリンAレセプターのアンタゴニストでほぼ完全に抑制され、エンドセリンレセプターの関与が推定された。
オンチップスクリーニングと1細胞時系列イメージングによる細胞運動因子のキノーム解析

細胞運動は、器官形成などにおいて重要な役割を担うだけでなく、がん細胞の浸潤にも関与している。しかし細胞運動の制御過程は複雑であり、未だ断片的な知識しか得られていない。そこで本研究では、独自技術である細胞運動評価チップを用いて細胞運動調節因子を全キナーゼ及び関連因子群からスクリーニングする。さらに細胞外マトリックス依存的に発現誘導を受ける遺伝子の情報と上述の結果の統合することで、転写レベルのECM依存的発現誘導からがんの悪性度を左右する細胞運動調節キナーゼの活性化に至る一連の作用機序について理解を深める。本年度では実験条件の最適化が容易に可能となり、安定的に細胞運動を再現する環境が整ったため、一次スクリーニングで絞り込まれた遺伝子を再評価した。昨年度の結果に対して24遺伝子が残り、新たに6遺伝子が同定された。新規同定6遺伝子に対するsiRNAの抑制効果を確認したところ、5遺伝子で抑制効果が確認できた。新規同定6遺伝子は該当しなかったが、24遺伝子のうち3遺伝子が昨年度報告したように細胞外マトリックス依存的に発現誘導を受ける遺伝子と重複した。さらに、L2b細胞とL2bの亜種でありコラーゲン依存的な細胞運動が遅いT1細胞との間で上記遺伝子の発現量を比較したところ、L2b細胞での発現が上記とは別の3遺伝子について高くなった。また、新規同定6遺伝子の細胞内局在も検討したところ、細胞膜、小胞体、移行型小胞体、細胞質に局在した。さらにタンパク間相互作用のデータベースを用いて30遺伝子について最短経路を描画した結果、EGFRを中心としたパスウエイが浮かび上がった。すなわちEGFRを抑制することですべての細胞運動のシグナルを停止させることが可能であると思われる。以上のことから、我々のスクリーニング手法で浮かび上がってきた遺伝子群は局在・機能も多様であったが、パスウェイ解析の結果最上流にEGFRがあることが示唆された。細胞運動は、器官形成や免疫担当細胞の遊走・損傷治癒などにおいて重要な役割を担うだけでなく、悪性化した癌細胞の浸潤にもその関与が示唆されている。しかしながら、細胞運動の制御過程は非常に複雑であるため未だ完全な理解には至っていない。そこで本研究では、独自の技術である細胞運動評価チップを用いて全キナーゼから細胞運動関連遺伝子のスクリーニングを行い、蛍光プローブにより当該遺伝子が細胞運動のどの過程に影響をもたらすのかを明らかにし、それら情報のカタログ化を行うことを目的とした。本年度は、1.ラットキナーゼsiRNAライブラリーをプリントした細胞運動評価チップ(148枚)による全時系列画像の取得を完了した。さらに、2.Cell Voyager解析ソフトを用いて1の時系列画像の数値化及び、その数値化データを用いて平均細胞運動速度を指標としたキノーム解析を行った。その結果、49遺伝子において対照と比較して有意に当該遺伝子に対するsiRNAが導入された際、細胞運動が抑制されることを見出した。また、3.通常のトランスフェクション方法による予備的な2ndスクリーニングを行ったところ、26遺伝子において2と同様の抑制効果が確認され、うち22遺伝子においてsiRNAの導入による発現抑制効果が確認できた。現在、上記2ndスクリーニング結果のさらなる検証作業及び当該遺伝子のクローニングに着手している。また、新規画像評価手法に関してはガラス基板を均一に蛍光ビーズでコートする手法について検討中である。今年度の結果を踏まえ、次年度以降は計画通り各種プロープを用いて絞り込まれた遺伝子の機能解析を展開する予定である。しかしながら、細胞運動の制御過程は非常に複雑であるため未だ断片的な知識しか得られていないのが現状である。そこで本研究では、独自の技術である細胞運動評価チップを用いて全キナーゼ及び関連因子群から細胞運動を調節する物をスクリーニングし、さらにデータ取得済みの細胞外マトリックス依存的に発現誘導を受ける遺伝子情報とその結果の統合を目指す。これによって、転写レベルのECM依存的発現誘導からがんの悪性度を左右する細胞運動調節キナーゼの活性化にいたる一連の作用機序について解析できるものと考えている。昨年度までに、TypeIコラーゲンコートしたディッシュ上をラット膀胱がん由来細胞NBT-L2b細胞が運動する際に必要と思われる31遺伝子を絞り込んだ。本年度は、この情報をもとにクローニングされた29遺伝子の細胞内局在を検討した結果、2遺伝子が核に、4遺伝子が核と細胞質、3遺伝子が細胞膜、1遺伝子が小胞、1遺伝子が骨格、1遺伝子が細胞質と細胞膜、1遺伝子がミトコンドリア、15遺伝子が細胞質に局在した(1遺伝子は発現がほとんど認められなかった)。さらに絞り込まれた遺伝子群の結果を次世代シークエンシングによるECM依存的に発現変動する遺伝子群と照会したところ、3遺伝子が重複した。3遺伝子のうち1つは上述の核に局在した遺伝子であり、論文情報によると転写因子であるSMAD3と相互作用することが報告されていた。さらに、L2bの亜種であり、コラーゲン依存的に細胞運動をしないT1細胞とL2b細胞の間で絞り込まれた遺伝子の発現量を比較したところ、L2b細胞での発現が4遺伝子について高く、うち1遺伝子は上述のECM依存的に発現が昂進するものであった。以上の結果より、スクリーニングにより興味深い遺伝子が絞り込まれていたことが分かった。

しかし細胞運動の制御過程は複雑であり、未だ断片的な知識しか得られていない。そこで本研究では、独自技術である細胞運動評価チップを用いて細胞運動調節因子を全キナーゼ及び関連因子群からスクリーニングする。さらに細胞外マトリックス依存的に発現誘導を受ける遺伝子の情報と上述の結果の統合することで、転写レベルのECM依存的発現誘導からがんの悪性度を左右する細胞運動調節キナーゼの活性化に至る一連の作用機序について理解を深める。本年度では実験条件の最適化が容易に可能となり、安定的に細胞運動を再現する環境が整ったため、一次スクリーニングで絞り込まれた遺伝子を再評価した。昨年度の結果に対して24遺伝子が残り、新たに6遺伝子が同定された。新規同定6遺伝子に対するsiRNAの抑制効果を確認したところ、5遺伝子で抑制効果が確認できた。新規同定6遺伝子は該当しなかったが、24遺伝子のうち3遺伝子が昨年度報告したように細胞外マトリックス依存的に発現誘導を受ける遺伝子と重複した。さらに、L2b細胞とL2bの亜種でありコラーゲン依存的な細胞運動が遅いT1細胞との間で上記遺伝子の発現量を比較したところ、L2b細胞での発現が上記とは別の3遺伝子について高くなった。また、新規同定6遺伝子の細胞内局在も検討したところ、細胞膜、小胞体、移行型小胞体、細胞質に局在した。さらにタンパク間相互作用のデータベースを用いて30遺伝子について最短経路を描画した結果、EGFRを中心としたパスウエイが浮かび上がった。すなわちEGFRを抑制することですべての細胞運動のシグナルを停止させることが可能であると思われる。以上のことから、我々のスクリーニング手法で浮かび上がってきた遺伝子群は局在・機能も多様であったが、パスウェイ解析の結果最上流にEGFRがあることが示唆された。被災に伴う特別研究員採用中断を行ったため。今後は、重複した3遺伝子を中心にがんの悪性度との関連、転写調節機構、さらに接着斑や仮足形成にどのような影響をもたらすのか、分子生物学・イメージングの手法を中心に明らかにする予定である。
好酸球性副鼻腔炎の術後再発予防戦略の構築を目指した局所免疫応答の解明

慢性副鼻腔炎に対して内視鏡下鼻内手術を施行した症例において、術後経過良好群、粘膜浮腫を認めた群、粘膜浮腫に対してステロイド内服を行っても鼻茸の再発を来たした(ステロイド抵抗)群について検討した。ステロイド抵抗性を認めた群において組織中の好酸球の浸潤が高度な傾向があるとともに、mRNAレベルにおいてIL-5の発現が高い傾向にあった。また、術後の副鼻腔粘膜病変の客観的の評価方法として鼻腔FeNOの測定が有用である可能性が考えられた。好酸球性副鼻腔炎は、鼻副鼻腔粘膜に著明な好酸球浸潤を来たし、内視鏡下鼻内手術後にも再発を繰り返す難治性副鼻腔炎である。好酸球性副鼻腔炎における再発に関与する因子を明らかにする事を目的に研究を行った。慢性副鼻腔炎術後における客観的な炎症の評価として、内視鏡下鼻内手術後41症例において、携帯型NO(一酸化窒素)濃度測定モニター(Nobreath, Bedfont社)を用いて鼻呼気NOを測定するとともに、上顎洞粘膜の粘液線毛機能の評価として、上顎洞内にサッカリン顆粒をおき甘みを感じるまでの時間を測定した(サッカリンテスト)。その結果、NOを過剰産生している症例では粘液線毛機能機能は低下しており、またNOの産生が低下している症例においても低下が認められ、決定係数は低いが優位な二次回帰曲線が得られた(R2=0.173, p=0.027)。また、初回症例に限定した場合も同様の結果が得られた(R2=0.260,p=0.017)。この結果からは、NOが過剰産生している症例では、炎症に加えてNOによる上皮細胞障害により粘液線毛機能が障害されていると考えられ、低下している症例は、主に副鼻腔炎そのものによる上皮細胞障害により粘液線毛機能が障害されていると考えられた。粘液線毛機能の点からは適度なNOの産生が重要である事が判明した。また、Th細胞のバランスと各Th細胞サイトカインを検討するため、慢性副鼻腔炎症例において鼻茸もしくは副鼻腔粘膜を採取後、直ちに液体窒素にて凍結して-70°Cにて保存し、本研究の登録症例とした。採取した組織よりmRNAを抽出し、転写因子やTh細胞が産生するサイトカインについてリアルタイムPCRにて解析する予定である。好酸球性副鼻腔炎は、鼻副鼻腔粘膜における好酸球浸潤を特徴とし、内視鏡下鼻内手術後にも再発を来たす難治性副鼻腔炎である。本研究は、術後再発に関わる因子を明らかにするとともに、術後鼻副鼻腔粘膜病変の客観的評価として、鼻呼気中一酸化窒素濃度(Nasal FeNO)の有用性を評価した。術後2年以上経過観察し得た慢性副鼻腔炎症例36例において検討したところ、17例において術後再発が認められ、17例中5例はステロイド内服治療においても副鼻腔の粘膜の正常化が確認できず、ステロイド抵抗性と考えられた。再発に関わる因子については、過去の報告と同様に好酸球浸潤が高度の症例において再発傾向を認めるとともに、再発症例、特にステロイド抵抗性の再発例において鼻茸におけるmRNAレベルにおいてIL-5の発現が高かった。また、術後におけるNasal FeNOの検討は、内視鏡下鼻内手術後の慢性副鼻腔炎41症例に対して、携帯型NO濃度測定モニターを用いてNasal FeNOを測定するとともに、粘液線毛機能の評価として上顎洞のサッカリンテストを行った。その結果、粘液線毛機能が低下している症例において、炎症に加えてNOによる上皮細胞障害により粘液線毛機能が低下していると考えられるNasal FeNOが高値の群と副鼻腔炎そのものによる上皮障害により低下していると考えられるNasal FeNOが低値の群に分けられた。サッカリンテストにおいて正常な粘液線毛機能をもつ症例は、適度なNOの産生が認められることから、術後鼻副鼻腔粘膜病変の客観的評価の一助になると考えられた。鼻科学平成25年度は、本研究に必要な症例は順調に登録ができ、NOに関する研究は鼻呼気NO測定用のアダプターの開発が順調に進んだことにより予定通りに行えているが、リアルタイムPCRによるサイトカインのmRNAの発現の解析までは至らなかった。慢性副鼻腔炎症例の登録の蓄積や、登録症例の内視鏡下鼻内手術の術後経過をさらに調査するとともに、採取保存している検体を用いて、各転写因子(FOXP3, GATA3, T-bet, RORγt)、各Th細胞が産生するサイトカイン(IL-5,IL-13,IFN-γ, IL-10, IL-1β, TGF-β, IL-17)のmRNAをリアルタイムPCRにて解析する。リアルタイムPCRによる、転写因子やTh細胞が産生するサイトカインのmRNAやタンパク質の解析まで至らなかったため今年度施行予定であった、リアルタイムPCRによるmRNAやELISAによりタンパク質の解析のためのキットや試薬の購入する予定である。
頭頸部癌を含む重複癌への遺伝子異常メチル化および遺伝子多型の関与

頭頸部癌由来細胞株でのDAP-K、MGMT、hMLH1のプロモーター領域の異常メチル化頻度は過去の報告例と同程度であり、また、検索した遺伝子のうちいずれか一つ以上に異常メチル化を認めたものは57.1%であり、頭頸部癌発生過程に異常メチル化の関与が示唆される。MSIは、BAT25、BAT26、D9S54、D9S168、TP53の5つをマーカーとして用いた場合に、重複癌罹患群で、頭頸部癌単独罹患群に比べ、high-frequency MSIが有意に高頻度であった(p=0.0310)。頭頸部扁平上皮癌罹患患者において、MSIは今後の重複癌発症リスクの評価因子のひとつとなりうる可能性が示唆される結果である。マイクロサテライト不安定性(microsatelhte instability : MSI)については臨床検体を用いて、BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D9S168、D9S54、TP53をマーカーとしてMSIが高頻度に出現するかを確認した。平成20年度に用いた検体では、頭頸部癌単独発症群と頭頸部癌を含む重複癌発症群とにおいて、MSIの頻度に有意差は認められなかった。研究開始段階での予測としては、重複癌発症群においてMSIが有意に高くなると考えていた。現在選択しているマーカーでは頭頸部癌を含む重複癌発症のリスク群スクリーニングとしては適さない可能性が示唆され、今後マーカーを追加し、頭頸部癌において適するマーカーを決定する必要性が生じた。平成20年度における研究結果では、頭頸部扁平上皮癌由来細胞株ではp16、hMLH1、hMSH2のプロモーター領域における異常メチル化は高頻度といえる結果ではなかった。このため、平成21年度当初は頭頸部領域内での発生臓器によるかたよりの可能性を考え、異なる臓器由来の培養細胞株を追加し再度検討予定としていたが、検索する遺伝子を追加することに方針を変更した。DAP、MGMTを追加し、primerを設定。同2遺伝子についてbisulfite処理後methlyation-specific PCRを行いプロモーター領域における異常メチル化についてその有無を確認。現在結果を解析中。マイクロサテライト不安定については、ひきつづき、検体数をふやし、BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D9S54、D9S168、TP53をマーカーとして実験を追加。また、同マーカーのみを指標としたのでは頭頸部癌単独発症群と頭頸部癌を含む重複癌発症群とで有意差がなく、D17S250をマーカーとして追加することにし、primer設定を行った。本年度は新たなprimer追加や検体数増加に時間を要したため、当初の研究計画より大幅に遅れており、具体的な解析結果を得るにはいたらなかった。新に追加したマーカーをふくめ、来年度もデータ収集追加が必要である。来年度は追加データを加え結果解析、研究に用いたマーカーの中より、頭頸部での適切なマーカーを考察する。頭頸部扁平上皮癌由来細胞株であるSa3、HSC-2、HSC-4、Ho-1-u-1、RPMI、HSQ-89、Hep2においてp16、DAP、MGMT、hMLH1、hMSH2各遺伝子でのプロモーター領域における異常メチル化頻度はそれぞれ0%、28.6%、28.6%、14.3%、0%であった。DAP、MGMT、hMLH1での頻度については過去の報告例と一致する結果であり、今回の結果でも頭頸部癌発生過程に異常メチル化の関与が示唆される。ただし、p16の不活化機序としてプロモーター領域の異常メチル化が高頻度に認められるとの報告が一般的であるにもかかわらず今回0%であった。この点については、現在測定中である臨床検体での結果をふまえ検討予定である。現在までの結果、他臓器同様に頭頸部扁平上皮癌発生に異常メチル化が関与。修復遺伝子等に生じた異常メチル化によりMSIが発生し、MSI陽性群で陰性群にくらべ有意に重複癌発生が認められる。本研究は継続中であるが、MSIが頭頸部扁平上皮癌罹患者における重複癌発症予測因子となりえる可能性が現時点では示唆される。
DDSを充たす高分子化LIFの開発とそのin vivo血小板造血機能の解析

制癌抗生物質は顕著な抗腫瘍効果を有するものの、あまりに副作用が強いために、投与中断を余儀なくされ、これまでの臨床成績は必ずしも芳しいものではない。これら副作用の中でも骨髄抑制に伴う血小板減少が最大の問題となっているが、未だこれに有効な医薬品は存在しない。この様な血小板減少症は、近年の癌治療の一端を担う放射線療法やセフェム系薬剤等によっても生じてしまっており、これを克服する医薬品の開発が急がれている。一方、近年LIFが、巨核球を刺激し、血小板を増大させることが見出され、今後の臨床応用が切望されている。しかしながら、LIFは生体内安定性に乏しいため、臨床応用する際には大量頻回投与を余儀なくされ、予期せぬ副作用を招いてしまっている。そのうえLIFは多様なin vivo生理作用を有しているために、選択的に副作用のみを制御することは困難である。以上の問題は、殆ど全てのサイトカインに当てはまることである。この点、申請者はすでにTNF-α等のサイトカインを最適条件で水溶性高分子ハイブリッド化することで、サイトカインの生体内安定性を飛躍的に改善できること、さらにはサイトカインに作用の選択性を付与し得ることを見出している。本研究では、LIFなどを最適条件でハイブリッド化することにより、生体内安定性を高めるとともに、作用の選択性を導入することにより、次世代を見据えたサイトカイン製剤の開発概念を追求しようとするものである。以上の観点から本年度はポリビニルプロリドン(PVP)-ハイブリッド化LIFのin vivo血小板増加作用を評価した。その結果、最適条件でLIFをPVPハイブリッド化することで、LIFの目的とする治療作用(血小板増加作用)を効率よく高め得ることが判明した。今後、本年度得られたPVP-LIFの医薬品としての有用性をさらに確保していく観点から、Targeting能等の付加価値を有したPVP誘導体を新規合成し、本修飾高分子によるLIFのハイブリッド化などを試みる予定である。以上、当初計画通りの有益な知見が得られた。以上の観点から本年度は、LIFのハイブリッド化に最適の修飾高分子を検索したところ、PVPが最適であると判明した。そこでPVPを用い、LIFのハイブリッド化を試みたところ、修飾率の増大に伴って著しくin vitro比活性が低下してしまうことが判明した。これは、LIFの活性発現部位に位置するLys残基を修飾してしまったこと、LIFに結合するPVPが形成する立体障害によってレセプター結合阻害が生じたためと考えられた。以上の知見をもとに今後、in vivo活性評価をすることで、最適ハイブリッド化条件の設定を試みる予定である。

以上の観点から本年度はポリビニルプロリドン(PVP)-ハイブリッド化LIFのin vivo血小板増加作用を評価した。その結果、最適条件でLIFをPVPハイブリッド化することで、LIFの目的とする治療作用(血小板増加作用)を効率よく高め得ることが判明した。今後、本年度得られたPVP-LIFの医薬品としての有用性をさらに確保していく観点から、Targeting能等の付加価値を有したPVP誘導体を新規合成し、本修飾高分子によるLIFのハイブリッド化などを試みる予定である。以上、当初計画通りの有益な知見が得られた。
複合載荷型実時間ハイブリッド載荷実験システムの開発

構造要素の振動台実験とコンピュータによる構造系全体の数値応答解析をリアルタイムで連動して実行するリアルタイムハイブリッド実験手法において,新たに実験部分にアクチュエータ載荷や回転加振を加えた,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド実験システムを開発した.載荷システムとして、動的アクチュエータ、モーメント(トルク)加力装置および振動台を含めて想定し、回転自由度を含む複合的な載荷条件を実現するハイブリッド実験を実時間で実行するための回転載荷機構を考案し,この載荷機構を含む実験法の検討を行った。実験システムの基本的な性質を調査するため,状態空間法を用いた安定性解析を行い,加振機の遅れやモデルの質量,固有周期,減衰比等がハイブリッド実験システム全体の安定性に及ぼす傾向を調査した.さらに,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド振動台実験をコンピュータ上で再現する実験シミュレーションを実施し,対象とする構造物モデルの特性や加振機の遅れにより,実験結果に大きな誤差が発生する可能性を示唆した.また,DSPを用いたハイブリッド実験制御システムを構築し,仮想実験を実施することで,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド振動台実験に構築したシステムを適用できる可能性を示すとともに、加振中・加振前後の振動台の特性変化に対応できる適応制御の導入について検討した.最後に,実験の実現性を調査するため,逆振子型振動子を供試体として振動台によるリアルタイムハイブリッド実験を実施し,モーメント反力の実験制御への適用可能性について検討し,有望な結果を得た.構造要素の振動台実験とコンピュータによる構造系全体の数値応答解析をリアルタイムで連動して実行するリアルタイムハイブリッド実験手法において,新たに実験部分にアクチュエータ載荷や回転加振を加えた,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド実験システムを開発した.載荷システムとして、動的アクチュエータ、モーメント(トルク)加力装置および振動台を含めて想定し、回転自由度を含む複合的な載荷条件を実現するハイブリッド実験を実時間で実行するための回転載荷機構を考案し,この載荷機構を含む実験法の検討を行った。実験システムの基本的な性質を調査するため,状態空間法を用いた安定性解析を行い,加振機の遅れやモデルの質量,固有周期,減衰比等がハイブリッド実験システム全体の安定性に及ぼす傾向を調査した.さらに,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド振動台実験をコンピュータ上で再現する実験シミュレーションを実施し,対象とする構造物モデルの特性や加振機の遅れにより,実験結果に大きな誤差が発生する可能性を示唆した.また,DSPを用いたハイブリッド実験制御システムを構築し,仮想実験を実施することで,並進・回転自由度を有するリアルタイムハイブリッド振動台実験に構築したシステムを適用できる可能性を示すとともに、加振中・加振前後の振動台の特性変化に対応できる適応制御の導入について検討した.最後に,実験の実現性を調査するため,逆振子型振動子を供試体として振動台によるリアルタイムハイブリッド実験を実施し,モーメント反力の実験制御への適用可能性について検討し,有望な結果を得た.構造物の地震時性能の実験的検証を行うこと等を目的としたハイブリッド実験手法において、従来の方法では適用対象外であった境界条件の異なった2つ以上の要素の載荷を要する試験を、複数の載荷装置を同時に用い統合的に制御することで実現する新しい実験法を提案することを目的としている。載荷システムとして、動的アクチュエータ、モーメント(トルク)加力装置および振動台を含めたものを想定していることから、検証の第一段階として、円筒型液体貯蔵タンクを水平振動台上で加振する実験を行い、液体貯蔵タンクの動的応答により発生する転倒モーメントの実験的計測の可能性について検討した。大振幅振動による液面のスロッシングに加えて砕波と固定屋根板への衝突に伴う非線形領域における計測が可能であること、および線形領域における計測値は理論的な想定値と対応することを確認し、計測を反映した実時間スケールでのハイブリッド実験に用いることが可能であることを確認した。さらに、基礎のスウェイ・ロッキング応答と動的相互作用を考慮した構造物の応答の評価が可能な実時間ハイブリッド実験を実現するために必要な、モーメント(トルク)載荷を行うための小型載荷装置の試作のための検討および試設計を行った。新たに多自由度振動台を導入するよりも経済的な方法として、別個に電気モーター制御を導入することで必要な性能を持つ回転載荷装置の製作に必要な諸元案の試算を行った。構造要素の振動台実験結果を計算機による構造全体系の応答解析に実時間で取り込む実時間振動台ハイブリッド実験システムに,従来の方法では適用対象外であった境界条件の異なった2つ以上の要素の載荷を要する試験を、複数の載荷装置を同時に用い統合的に制御することで実現する新しい実験法を提案し、ハイブリッド実験の適用範囲を大幅に拡張することが可能な新たな手法の実現性を実証した。その中で,強い非線形特性を持つ実験部分構造を採用できるようにするため,加振中・加振前後の振動台の特性変化に対応できる適応制御の概念を導入し,本研究ではMinimal Control Synthesis (MCS)を採用し,振動台の出力を理想状態である規範モデルの出力と等しくなるよう規範モデルと制御対象の応答差の情報に基づき,所定のルールに従い制御ゲインを更新する方法を用いた.全体構造のうちの計算部分構造の挙動を,振動台応答の規範モデルと設定して制御系を構成するという方法を適用したハイブリッド実験システムによる実験により,従来の定係数デジタルフィルタ補償制御で生じる低周波の影響が除去され実験の信頼性が向上されることを確認した.

また,載荷システムとして、動的アクチュエータ、モーメント(トルク)加力装置および振動台を含めて想定し、回転自由度を含む複合的な載荷条件を実現するハイブリッド実験を実時間で実行するための回転載荷機構を考案し,この載荷機構を含む実験法の検討を行った。
魚道を含んだ河川における魚類の挙動モデル

河川を遡上あるいは降下する魚類にとって堰などの河川横断構造物は大きな障害となる.その障害を少しでも軽減させるために,魚道が設けられる.本研究では,効果的な魚道の設計に資するため,1.魚道内の流れ及び魚道を含んだ河川の流れを再現するモデルの作成,2.魚道内の魚類の挙動特性の解明,3.河川を遡上する魚類の挙動モデルの開発,を目的とした.各目的に対する結果を以下に示す.1.3種類の魚道(粗石付き斜路式魚道,バーティカルスロット式魚道,アイスハーバー式魚道)に対する流れ解析モデルを作成した.粗石付き斜路式魚道とバーティカルスロット式魚道は浅水流方程式を基礎式とする平面2次元モデル,アイスハーバー式は3次元VOF法を基礎としたモデルである.前者は河川との接続が完了したが,後者は研究期間内に河川との接続が完了できなかった.2.岩木川取水堰の全面越流型階段式魚道プールにおいて水中TVカメラを3台用いて魚類等の遊泳行動を観察し,その行動実態について検討した.観測結果から,魚類は流れの局所的な低流速空間域(プール中央部下層(底から20cm程度),切り欠き背面,潜孔周辺)を上手に利用しながら速い流れに刺激を受けて上流へと遡上していくことがわかった.また,底生魚では垂直な隔壁部を吸盤で吸い付きながら移動し,切り欠き部を遊泳していく行動も確認された.3.向流性を基本としながらも確率論を加味した遡上方向を決定するプロセスと,普通筋と血合筋の使い分けによる泳ぐ速度を決定するプロセスを結合した魚の挙動モデルを作成した.以上のモデルを結合して,バーティカルスロット式魚道における魚類の遡上経路シミュレーションを実施して,体長に応じて遡上率が高くなることとプールを休憩のために利用していることがシミュレーション結果から示された.河川を遡上あるいは降下する魚類にとって堰などの河川横断構造物は大きな障害となる.その障害を少しでも軽減させるために,魚道が設けられる.本研究では,効果的な魚道の設計に資するため,1.魚道内の流れ及び魚道を含んだ河川の流れを再現するモデルの作成,2.魚道内の魚類の挙動特性の解明,3.河川を遡上する魚類の挙動モデルの開発,を目的とした.各目的に対する結果を以下に示す.1.3種類の魚道(粗石付き斜路式魚道,バーティカルスロット式魚道,アイスハーバー式魚道)に対する流れ解析モデルを作成した.粗石付き斜路式魚道とバーティカルスロット式魚道は浅水流方程式を基礎式とする平面2次元モデル,アイスハーバー式は3次元VOF法を基礎としたモデルである.前者は河川との接続が完了したが,後者は研究期間内に河川との接続が完了できなかった.2.岩木川取水堰の全面越流型階段式魚道プールにおいて水中TVカメラを3台用いて魚類等の遊泳行動を観察し,その行動実態について検討した.観測結果から,魚類は流れの局所的な低流速空間域(プール中央部下層(底から20cm程度),切り欠き背面,潜孔周辺)を上手に利用しながら速い流れに刺激を受けて上流へと遡上していくことがわかった.また,底生魚では垂直な隔壁部を吸盤で吸い付きながら移動し,切り欠き部を遊泳していく行動も確認された.3.向流性を基本としながらも確率論を加味した遡上方向を決定するプロセスと,普通筋と血合筋の使い分けによる泳ぐ速度を決定するプロセスを結合した魚の挙動モデルを作成した.以上のモデルを結合して,バーティカルスロット式魚道における魚類の遡上経路シミュレーションを実施して,体長に応じて遡上率が高くなることとプールを休憩のために利用していることがシミュレーション結果から示された.魚道における魚の挙動の数値モデル開発を目的として,数値モデルの作成と実証のための現地観測の2方面から取り組んだ.数値モデルの作成に関しては,3次元のVOF法を基本として,まず流れの再現性について検討した.全面越流タイプの階段式魚道とアイスハーバータイプの魚道の2種類の計算を行った.前面越流タイプの魚道については,理論値との比較から,アイスハーバータイプの魚道については現地観測結果との比較から,その再現性について検証した.現地観測に関しては次のことを行った.(1))現地河川の魚道中に円筒パイプを設置した人工産のヤマメ稚魚(体長:3cm台6cm台)の遊泳実験を行い,突進速度について検討した.その結果,突進速度に上限値が見られることや管内流速が190cm・s^<-1>の高流速条件で1秒以上遊泳した個体の平均突進速度と平均遊泳時間はそれぞれ約210cm・s^<-1>と約2.0sであったこと,また,160cm・s^<-1>195cm・s^<-1>の条件で遊泳した個体の遊泳距離について30cmまで泳ぐ個体数の割合は約半数で体長4cm5cm程度の稚魚が速い流れ場を移動する際の移動距離の目安が示された.(2)岩木川取水堰の幅4.0m・プール長3.0・段差0.2mの全面越流型階段式魚道プール内において水中TVカメラを3台用いて魚類等の遊泳行動を観察し,その行動実態について検討した.

その結果,全面越流状態の水理条件で,魚類等は鉛直方向には底から20cmまでの低層部にいることが多く観察され,平面的にはプール中央部の低流速域を主に利用して横断方向や縦断方向へ移動し,上流隔壁直下の空間を利用して横断方向へ移動するのが顕著に見られ,既往の実験室での実験結果とは異なる観察結果となった。また,プール中央部では底部でアユが摂食する様子も見られた。河川を遡上あるいは降下する魚類にとって堰などの河川横断構造物は大きな障害となる。その障害を少しでも軽減させるために、魚道が設けられる。本研究では、効果的な魚道の設計に資するため、1.魚道内の流れ及び魚道を含んだ河川の流れを再現するモデルの作成、2.魚道内の魚類の挙動特性の解明、3.河川を遡上する魚類の挙動モデノセの開発、を目的とした。各目的に対する結果を以下に示す。1.3種類の魚道(粗石付き斜路式魚道、バーティカルスロット式魚道、アイスハーバー式魚道)に対する流れ解析モデルを作成した。粗石付き斜路式魚道とバーティカルスロット式魚道は浅水流方程式を基礎式とする平面2次元モデル、アイスハーバー式は3次元VOF法を基礎としたモデルである。前者は河川との接続が完了したが、後者は研究期間内に河川との接続が完了できなかった。2.岩木川取水堰の全面越流型階段式魚道プールにおいて水中TVカメラを3台用いて魚類等の遊泳行動を観察し、その行動実態について検討した。観測結果から、魚類は流れの局所的な低流速空間域(プール中央部下層(底から20cm程度)、切り欠き背面、潜孔周辺)を上手に利用しながら速い流れに刺激を受けて上流へと遡上していくことがわかった。また、底生魚では垂直な隔壁部を吸盤で吸い付きながら移動し、切り欠き部を遊泳していく行動も確認された。3.向流性を基本としながらも確率論を加味した遡上方向を決定するプロセスと、普通筋と血合筋の使い分けによる泳ぐ速度を決定するプロセスを結合した魚の挙動モデルを作成した。以上のモデルを結合して、バーティカルスロット式魚道における魚類の遡上経路シミュレーションを実施して、体長に応じて遡上率が高くなることとプールを休憩のために利用していることがシミュレーション結果から示された。