hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時間的・空間的遺伝子発現システムと環境要因操作による統合失調症モデルマウスの開発

より妥当性の高い疾患モデル動物の作製は、病因・病態の理解から治療法の開発まで大きく貢献すると考えられる。統合失調症の発症には、遺伝的要因と環境要因の両者が関わっていると考えられているが、実際の患者の状況に合致するモデル動物の作製には至っていない。本研究では、環境要因をそれ単独では表現型が検出できないほど軽微な負荷とし、遺伝的要因と組み合わせた場合に増悪されうるのか、特に死後脳研究で異常が報告されている前頭前野や海馬に着目して研究を行った。統合失調症の発症には、遺伝学的要因と環境要因の両者が関わっていると考えられているが、実際の患者の状況に合致するモデル動物の作製には至っていない。本研究では、環境要因をそれ単独では表現型が検出できないほど軽微な負荷とし、遺伝学的要因と組み合わせた場合にどのような増悪が観察されるか、特に死後脳研究で異常が報告されている前頭前野や海馬に着目して研究を行った。まず、polyI:Cを妊娠マウスに投与した母体ウイルス感染モデルマウスを作製し、様々な濃度のpolyI:C投与に対する仔マウスの表現型をPrepulse Inhibition (PPI)を指標に解析し、環境要因操作とした。また、遺伝要因の操作として発生期の大脳皮質層構造形成に関わるReelinシグナルを前頭前野において乱したマウスの作製を試みた。細胞内アダプター蛋白であるDab1の選択的スプライシングバリアントの強制発現を通じて遺伝子導入時期に依存した層構造異常とPPIの関係を調べた。統合失調症の発症には、遺伝学的要因と環境要因の両者が寄与しているとされている。しかしながら、遺伝的要因によってどのような発生学的あるいは細胞生物学的な現象が引き起こされ発症要因となっているのかは不明である。また、遺伝的要因によって引き起こされた潜在的なリスクと環境要因との関連性も明らかでない。本研究では、統合失調症の発症に関与が示唆されるReelinシグナルを胎生期の前頭前野あるいは海馬原基の神経幹/前駆細胞にて操作し、一部の患者脳で観察されるようなニューロンの微細な層構造異常を起こしたマウスの作製を行った。Reelinシグナルの操作には、レセプターであるApoER2と細胞内アダプタータンパクであるDab1の選択的スプライシングバリアントの強制発現を通じて行い、それぞれの発現効果を解析した。さらに、遺伝子導入時期に依存した層構造異常の位置や細胞運命決定への影響を免疫組織化学的解析により調べた。また、環境要因として母体ウイルス感染を模倣するためpolyI:Cを妊娠マウスに投与したマウスの作製を行った。統合失調症の中間表現型として感度が優れているとされるPrepulse Inhibition (PPI)を指標にpolyI:Cの投与により表現型に有意差が認められなくなる濃度の設定を行った。基礎データとして胎児の発生時期の違いによるApoER2及びDab1の選択的スプライシングバリアント発現効果を概ね評価できた。また、polyI:Cの投与濃度の設定ができたことで、次年度で行う遺伝学的要因と環境要因を組み合わせたマウスを作製するために必要な情報を得ることができたと考える。Reelinシグナルを操作することにより引き起こされるニューロンの微細な層構造異常が、マウスの行動学的評価にどう影響するのか検討する。評価した項目で表現型が観察されない場合、polyI:C投与との組み合わせたマウスの作製を行う。これにより遺伝学的な要因単独による微細な層構造異常と行動異常の因果関係あるいは、環境要因であるpolyI:C負荷と層構造異常による遺伝・環境の両者の要因が重なった場合の行動学的因果関係が明らかになると考えられる。行動学的表現型が検出されない場合は、電気生理学的解析や免疫組織学的解析により何らかの異常の増悪があるか否かを検討する。マウスの購入や飼育費用、分子生物学的実験に使用する試薬や免疫組織科学的解析のための抗体購入などに大部分を使用する予定である。その他は、情報収集や発表のための学会参加のための旅費に使用する。
インフルエンザウイルス分節化ゲノムの粒子内立体配置決定

インフルエンザウイルスはマイナス鎖RNAウイルスであり、ゲノムが8本に分節化していることが特徴の1つである。子孫ウイルスを形成するためには8種のゲノム分節すべてが1つの粒子に取り込まれる必要があるが、8分節の選択的パッケージング機構は明らかとなっていない。本研究ではウイルス粒子内における分節間RNA-RNA結合を網羅的に解明することで、選択的パッケージング機構の解明を試みた。RNAクロスリンクと次世代シークエンサーを利用して網羅的にRNA-RNA相互作用を明らかとする系を構築し、検討を行った結果、ウイルス粒子内における特定の分節間でのRNA-RNA相互作用が検出された。インフルエンザウイルスゲノムは8本に分節化されている。8種8本のウイルスゲノムが1つの粒子にパッケージングされる分子機構を明らかとする目的で、ウイルス粒子内で空間的に近距離に存在するゲノム分節同士の網羅的同定を行った。空間的に近距離に存在するゲノム分節を網羅的に同定するため、核内で近接しあう遺伝子群を網羅的にマッピングする方法である3C-seqアッセイを参考に精製インフルエンザウイルス粒子に対してクロスリンクを行い、RNA切断、RNAライゲーションを行う系を構築し、それぞれの処理に対して条件検討を行い反応条件の決定を行った。支援型新学術領域「ゲノム支援」の支援により、RNAライゲーションまで行ったサンプルをillumina社次世代シークエンサーにより解読を行い、分節間で結合したリードの同定、抽出を行った。この結果、RNAライゲーション特異的に分節間で結合したリードが確認された。得られた分節間結合部の特異性や妥当性の検証のため、引き続き「ゲノム支援」の支援を受け、データの解析を進めている。また、ウイルス粒子中のウイルスゲノムRNA-RNA相互作用部位の網羅的同定を行う目的で、一本鎖特異的RNA修飾試薬処理の条件検討を行い、処理条件の決定を行った。今後、次世代シークエンサーによる解読を行い網羅的にRNA修飾部位を同定することで、ウイルス粒子内におけるRNA-RNA相互作用部位の同定を行う予定である。ウイルス粒子内で空間的に近距離に存在するゲノム分節を検出する系の構築が完了し、支援を受けて次世代シークエンサーによる網羅的解読を行うことで、解析の基盤となるデータの取得は完了した。ウイルス粒子内におけるRNA-RNA相互作用部位の同定においてもRNA修飾試薬の処理条件等の条件決定は完了しており、概ね順調に進展していると考えている。インフルエンザウイルスゲノムRNAは8本に分節化されており、8種8本のゲノムRNAが1つの粒子中に取り込まれると考えられている。1セットのウイルスゲノムが1つの粒子中にパッケージングされる分子機構を明らかとする目的で、RNA間のクロスリンクおよび特定分節のpull downを用いた新たな系を構築し、ウイルス粒子内における分節間RNA-RNA相互作用を網羅的同定を行った。まず、系の構築のため、1つの分節に着目し、RNA間のクロスリンク-特定分節のpull downを行い、沈降したRNAからcDNAライブラリーを作成後、次世代シークエンサーMiSeqで読み取りを行った。得られたデータから共沈降された他の分節について解析を行った結果、RNAクロスリンク特異的に沈降する他の分節が存在した。この結果はウイルス粒子内で特定分節RNAと相互作用する他の分節RNAが存在する事を示唆している。実験条件の決定を行った後に、支援型新学術領域「先進ゲノム支援」の支援を受けて、すべての分節でそれぞれpull downを行い次世代シークエンサーHiSeqで読み取りを行うことで共沈降する他の分節RNAについてのデータを得た。得られたデータを条件検討段階で得られたデータと比較を行い、再現性の確認を行った。現在、得られたデータの詳細なバイオインフォマティクス解析を行っている最中であり、この解析から得られる結果から、インフルエンザウイルス粒子内における分節間相互作用の全体像が明らかになると考えられる。解析の結果が得られた後に速やかに論文化を行い成果を発表する予定である。分節間で結合したリードについての妥当性や特異性の検証のため、統計的処理が必要となる。このため、引き続き「ゲノム支援」の支援を受け、統計的処理を行っていく。また、今年度は一本鎖RNA特異的修飾試薬を用いた処理後に次世代シークエンサーによる解読を行うことにより、ウイルス粒子内でのウイルスゲノムRNA相互作用部位の同定も行う。前年度および本年度に得られるデータを統合することでウイルスゲノム立体配置を総合的に明らかにしていく。ウイルス学研究計画がほぼ順調に推移したため、ほぼ当初計画した通りの使用額であった。当初計画との差も1%程度である。次年度使用額が生じた理由は、消耗品試薬等のキャンペーン時の購入により有効に経費を使用したためである。次年度使用額については額も少額であることから、翌年度の助成金の物品費、特に消耗品代として使用する。具体的には細胞培養用のプラスチックディッシュの購入費に使用する予定である。
シロイヌナズナの内生ペプチドエリシターによる耐塩性向上のメカニズムの解明

シロイヌナズナの23アミノ酸ペプチドAtPep1の前駆タンパク質AtproPep1の過剰発現体では、塩ストレス耐性が向上している。本研究では、NaClストレスをかけた過剰発現体においてAtproPep1タンパク質量が増加すること、AtproPep1をプロセッシングすると予想された2つのメタカスパーゼ遺伝子の発現量およびNa+排出に関わるSOS遺伝子の発現量が顕著に増加していることが分かった。また、植物体内のNa+蓄積量が低く保たれていることから、NaClストレス下で多くのAtPep1が発生することにより、Na+排出機構が活性化される可能性がある。シロイヌナズナの内生ペプチドエリシターAtPep1は、病害抵抗生反応を誘導することが知られているが、申請者らはこれまでの研究により、AtPep1の前駆タンパク質AtproPep1の過剰発現体で耐塩性が向上していることを見出しており、本研究の目的をその耐塩性向上の分子メカニズムを解明することにおいている。平成26年度においては、解明の手がかりとなる現象の探索を行った。以前の研究によって、土で栽培したAtproPep1過剰発現体に200mMのNaClを処理しても地上部での耐塩性に関わるマーカー遺伝子の発現誘導が観察されないことを発見していた。今回、ICP-MS解析によって地上部のナトリウムイオン含量を測定した結果、AtproPep1過剰発現体では野生体と比べて顕著に地上部のナトリウム含量の蓄積が低下していた。また、液体培地で無菌的に栽培した植物体をNaCl処理し、細胞内のナトリウムイオンの蓄積量を可視化する試薬を与えて観察したところ、根でも同様の結果が得られた。細胞内へのナトリウムイオン蓄積量は、主にナトリウムイオンの排出に働くSOS(salt overy sensitive)経路の活性に依存しているとされている。そこで、SOS経路で働く遺伝子の発現量を半定量的RT-PCR法により解析した。その結果、塩ストレスによって誘導されるこれらの遺伝子の発現量が、AtproPep1過剰発現体で増幅されていることが示唆された。以上の結果から、AtproPep1過剰発現体での耐塩性の向上は、SOS経路の活性化による根へのナトリウム流入量の抑制によるものと考えられた。シロイヌナズナの内生ペプチドエリシターAtPep1の前駆タンパク質AtproPep1を過剰に発現させた形質転換体が、野生型よりも強い耐塩性を示すことを明らかにしてきたが、平成26年度の実験により、地上部へのナトリウムイオンの輸送が制限されていること、そのために地上部での塩ストレス応答遺伝子の発現が顕著に抑えられていることが分かってきていた。これらのことからナトリウムイオンの排出を行うSOS (salt overy sensitive)経路が、AtproPep1過剰発現株で活性化している可能性が出てきていた。半定量的なRT-PCRによりSOS経路の遺伝子発現量が根で高まっている可能性を示唆していたが、平成27年度には、水耕栽培を用いて塩処理したシロイヌナズナの根由来RNAを用いて、定量的RT-PCRによりSOS経路の転写活性化の再現性を調べたところ、過剰発現体と野生型で顕著な違いは認められなかった。しかし、SOS経路はリン酸化などタンパク質レベルでの制御を受けることが知られている。そこでSOS1、SOS2、SOS3にそれぞれタグをつけたタンパク質を発現する系統の入手・作出を行い、現在タンパク質レベルでの解析を始めるところである。また、根におけるAtproPep1タンパク質をウェスタンブロッティングにより検出したところ、過剰発現株において塩ストレスで翻訳量が増加すること、つまり塩ストレスにより翻訳レベルでの制御を受けていることが明らかとなった。AtPep1がAtproPep1より切断されて放出される機構は現在明らかとなっていないが、その候補としてメタカスパーゼがあげられている。本研究ではシロイヌナズナに存在する9つのメタカスパーゼの中で、2つの遺伝子の発現量が塩ストレス処理時の根で顕著に増加することを見つけた。塩ストレスを受けた時にこれらのメタカスパーゼによってAtpep1が成熟して機能するのではないかと考えている。SOS経路の転写レベルでの変動について、予定通り定量的RT-PCRで再現性の確認を行った。残念ながら再現性は見られなかったが、タンパク質レベルでの解析にターゲットを絞ることができ、現在そちらを進めている。また、当初予定していた病害抵抗性と耐塩性との関係についての解析は進んでいないが、AtproPep1の翻訳が塩ストレスにより正に制御されていること、塩ストレス条件下でのAtproPep1からAtPep1への成熟に働く候補として、新たに二つのメタカスパーゼを見出すことができた。そのため、達成度を「おおむね順調に進展している」とした。シロイヌナズナのDAMPであるAtproPep1の過剰発現による耐塩性向上のメカニズムを、1上流のAtproPep1からのAtPep1の発生と、2下流のAtPep1受容後のナトリウムイオン排出機構の活性化(SOS1の活性化)の両方から明らかにすることを目的に研究を行ってきた。1昨年度選抜した2つのメタカスパーゼ(AtMC5とAtMC7)について、塩ストレスに応答した根での転写量の上昇を確認した。さらに、AtMC5とAtMC7の転写量がAtproPep1過剰発現体で高いこと、塩ストレス条件下でさらに上昇することを見出した。

AtproPep1のAtMC5とAtMC7による切断の可能性を検証するために、AtMC5とAtMC7のHisタグ融合組換えタンパク質を発現する大腸菌用ベクターを作製し、現在組換えタンパク質の大量発現と精製を試みている。AtPep1はその処理により根の伸長阻害を引き起こすが、単なるAtproPep1の過剰発現のみでは観察されない。しかし、少量(10 nM)のAtPep1の投与によりWTに比べて著しく根の伸長が阻害される。加えて、塩処理による根の伸長阻害もWTに比べてAtproPep1過剰発現では著しい。従って、少量のAtPep1処理と塩ストレスによってAtproPep1からのAtPep1の切り出し、あるいは細胞外への放出が誘導されることが示唆された。2SOS1-HA過剰発現シロイヌナズナを水耕栽培または液体培養し、塩処理およびAtPep1処理の有無によるSOS1-HAタンパク質のリン酸化状態の比較を試みた。しかし現在のところ、塩処理によるSOS1-HAタンパク質のSDS-PAGEでのリン酸化による移動度の変化を検出するに至っていない。昨年度確認できなかったAtPep1処理によるSOS経路の転写活性化については、AtproPep1過剰発現体への塩処理では、WTへの塩処理に比べてSOS1-3の転写産物の蓄積が顕著に認められた。従って、AtproPep1過剰発現と塩ストレスが重なった場合には、SOS経路の活性化が強くなる可能性が示された。シロイヌナズナの23アミノ酸ペプチドAtPep1の前駆タンパク質AtproPep1の過剰発現体では、塩ストレス耐性が向上している。本研究では、NaClストレスをかけた過剰発現体においてAtproPep1タンパク質量が増加すること、AtproPep1をプロセッシングすると予想された2つのメタカスパーゼ遺伝子の発現量およびNa+排出に関わるSOS遺伝子の発現量が顕著に増加していることが分かった。また、植物体内のNa+蓄積量が低く保たれていることから、NaClストレス下で多くのAtPep1が発生することにより、Na+排出機構が活性化される可能性がある。当初予定していた耐塩性に関わる機構の解析のうち、活性酸素種の発生量と適合溶質含量の測定については進んでいない。しかし、27年度に予定していたナトリウムイオンの蓄積量の違いを明らかにできたこと、ナトリウム排出に関わるSOS経路で働く遺伝子の発現量を調べた。その結果今後の解析のターゲットとしてSOS経路をおくことができた。そのため、達成度を「おおむね順調に進展している」とした。入手・作成しているSOS13の過剰発現シロイヌナズナを使って、外生的に与えたAtPep1がタンパク質レベルでの活性化をもたらすか調べていく。また、塩ストレス下でのAtproPep1の成熟に関わっている可能性のある二つのメタカスパーゼについて、組換えタンパク質を作成して実際にAtproPep1の切断能力があるかを調べるとともに、T-DNA挿入変異体を使ってこれらのメタカスパーゼの存在がAtPep1の成熟に必要であるかin vivoで解析していく。
生体組織構築技術を用いたバイオ人工筋肉の開発

これまでに得られた長さ15mm、直径0.5mmの培養骨格筋をソフトアクチュエータとして利用するため、3つの課題で研究開発を行った。1.培養骨格筋の長大化、2.屈筋ー伸筋構造による屈伸運動機構の導入、3.1ヶ月間の駆動期間を目標とした体外培養機構の開発、である。その結果、1では、血管様構造を有する多孔質コラーゲンスポンジを作製し、バイオリアクターにて培養することによって大型化でき、肉眼で確認できる収縮運動を確認した。2では、培養筋と並行に電極を組み込み、電界分布を適切に制御することで、同一媒体中での培養筋駆動の可能性を示した。3では、培養液循環機構を導入することで、1ヶ月の連続培養を可能にした。本研究は、これまでに得た、コラーゲンゲルに包埋した樹立筋芽細胞の伸張培養によって作製した三次元培養骨格筋を、工学的に応用することを目的としている。特に、福祉ロボットやマイクロマシンなどへ応用することを最終目標としており、現在得られている長さ約15mm、直径約0.5mmの培養骨格筋を、ソフトアクチュエータとして利用するための研究開発を行っている。具体的には、3つの課題において改良ならびに検討を行っている。すなわち、1.培養骨格筋の長大化、2.屈筋ー伸筋構造による屈伸運動機構の導入、3.1ヶ月間の駆動期間を目標とした体外培養機構の開発、である。本年度は、主として課題1および3について検討した。昨年度より引き続いて基材(スキャフォールド)としてコラーゲンゲルから血管様構造を有するコラーゲンスポンジについて検討した。可溶化コラーゲン溶液を発泡後架橋することで血管様構造を有する多孔質スポンジを作製し、循環培養型の自作バイオリアクターを用いて樹立筋芽細胞を播種・培養することによって大型化できたが、大きな収縮力を得るには至っていない。そこで、細胞組み込み後の分解を狙って、新たにケラチンタンパクの利用について検討した。一方、強力な培養骨格筋を得るため、培養時の電気刺激も導入し、そのための装置も製作した。現在、長期電気刺激の影響について、MyoD等のマーカ遺伝子の発現を指標として検討しており、電気刺激培養によって成熟が促進されることを見出し、論文を作製した(投稿準備中)。具体的には、3つの課題において改良ならびに検討を行う。初年度は、主として課題1について検討した。基材(スキャフォールド)としてコラーゲンゲルから血管様構造を有するコラーゲンスポンジへ変更し、その効果を検討した。可溶化コラーゲン溶液を発泡後架橋することで血管様構造を有する多孔質スポンジを作製し、循環培養型の自作バイオリアクターを用いて樹立筋芽細胞を播種・培養することによって、大型化できる可能性が示唆された。より強力な培養骨格筋を得るため、樹立細胞初代細胞の利用についても検討を行っているが、まだ有効な成果は得られていない。また、筋芽細胞の成熟を促進するために、電気刺激培養も導入した。リアルタイムPCR装置にてMyoD等のマーカ遺伝子の発現を指標として細胞分化効率を調べたところ、電気刺激培養によって成熟が促進されることを見出し、論文投稿準備中である。課題1については、昨年度より引き続いて基材(スキャフォールド)として血管様構造を有するコラーゲンスポンジについて検討した。可溶化コラーゲン溶液を発泡後架橋することで血管様構造を有する多孔質スポンジを作製し、循環培養型の自作バイオリアクターを用いて樹立筋芽細胞を播種・培養することによって大型化できた。その収縮運動は肉眼で確認できるものであり、収縮力は250uNであった。課題3については、培養液循環機構を導入することで、1ヶ月の連続培養を可能にした。さらに長期の培養を行ったところ、3ヶ月後でも培養骨格筋の収縮運動を確認することができた。本研究では、コラーゲンゲルに包埋した樹立筋芽細胞の伸張培養によって作製した三次元培養骨格筋を、工学的に応用することを目的としている。特に、福祉ロボットやマイクロマシンなどへ応用することを最終目標としており、これまで得られいた長さ約15mm、直径約0.5mmの培養骨格筋を、ソフトアクチュエータとして利用するための研究開発を行った。具体的には、3つの課題において改良ならびに検討を行った。すなわち、課題

1.培養骨格筋の長大化、課題2.屈筋ー伸筋構造による屈伸運動機構の導入、課題3.1ヶ月間の駆動期間を目標とした体外培養機構の開発、である。本年度は、課題2について、マイクロデバイスに培養骨格筋2本を組み込み、各筋を個別に駆動し得る電気刺激システムを構築について検討した。その結果、培養筋と並行に電極を組み込み、電界分布を適切に制御することで、同一媒体中での培養筋駆動のめどが立った。現在、これらの成果について英語論文を作製して投稿し、再修正中である。これまでに得られた長さ15mm、直径0.5mmの培養骨格筋をソフトアクチュエータとして利用するため、3つの課題で研究開発を行った。1.培養骨格筋の長大化、2.屈筋ー伸筋構造による屈伸運動機構の導入、3.1ヶ月間の駆動期間を目標とした体外培養機構の開発、である。その結果、1では、血管様構造を有する多孔質コラーゲンスポンジを作製し、バイオリアクターにて培養することによって大型化でき、肉眼で確認できる収縮運動を確認した。2では、培養筋と並行に電極を組み込み、電界分布を適切に制御することで、同一媒体中での培養筋駆動の可能性を示した。3では、培養液循環機構を導入することで、1ヶ月の連続培養を可能にした。本年度は、課題1および3について主として検討した。課題1については、メタノールを含有させたコラーゲンゲル溶液を傾斜凍結することによって血管構造を有する長さ4cmのスポンジを作製し、自作の循環培養型バイオリアクターで筋芽細胞を播種した。その結果、コラーゲンスポンジ内部への細胞浸潤を確認し、その収縮運動も肉眼で確認することができた。今後、より大型の組織を作製するため、動物体内への埋入についても検討して行きたい。さらに、培養中に電気刺激を与えることで、より強力な収縮力を得られることが確認できた。現在、論文作製中である。しかしながら、課題2については、マイクロデバイスの設計に時間を要し、翌年度に繰り越すこととした。以上のことから、今年度の達成度は「やや遅れている」と自己評価し、翌年度での計画達成を確実にする予定である。組織工学延長した翌年度は、課題2を集中的に検討を進める。これまでに作成した培養骨格筋組織を組み込んだマイクロデバイスの改良を行う。生体骨格筋でも自ら弛緩して伸びることはなく、収縮すると関節が曲がる屈筋と、収縮すると関節が伸びる伸筋とが拮抗的に働くことで、関節が曲げ伸ばしされる。したがって、培養筋2本を互い違いに駆動することで、効果的なアクチュエータ駆動を行うことができる。これまでに、培養骨格筋1本とゴム弾性体1本とを組み合わせたアクチュエータについて検討を行ったが、電気パルス刺激の周波数に呼応した振幅運動を得たものの、大きな運動量を得ることはできなかった。そこで、ゴム弾性体に代わり、培養骨格筋2本を組み込み、かつ各筋を個別に駆動し得る電気刺激システムを構築する。
デンドリマ-及び分岐ポリマーのグラフト化による無機超微粒子の表面改質と分散相制御

無機超微粒子の表面に、デンドリマ-や高度に分岐した構造を有するポリマーをグラフトすることにより、これらの無機超微粒子が非相溶型ポリマーアロイとの複合材料系で利用された場合の、無機超微粒子の分散相を、任意に、しかも精密に制御することを目的とした。無機超微粒子としてカーボンブラック及びシリカを取り上げ、粒子表面に導入したアミノ基を利用したマイケル付加反応、及び、これに続くアミド化反応による末端アミノ基の導入反応を、交互に繰り返すことにより、粒子表面にデンドリマ-をグラフトできることがわかった。この際、デンドリマ-のグラフト率は、反応が不均一系で進行するために、反応を繰り返す毎に理論値よりも低下していくことが明らかになった。また、グラフト鎖間の立体障害のために、反応の開始核となる粒子表面へのアミノ基の導入量は、0.40mmol/gが最適であることもわかった。次に、アゾ基を導入した無機超微粒子を用いて、ペンダントにペルオキシエステル(CO-O-O)基を持つポリマーを粒子表面に1次グラフトし、次いで、導入したペンダントCO-O-O基を用いて、メタクリル酸グリシジルの2次グラフト重合を行うことにより導入したエポキシ基を足場として、2次グラフト鎖中にペンダントアゾ基を導入した。これらの一連の反応を数回繰り返すことにより、粒子表面に高度に分岐した構造を有するコポリマーをグラフトできることが明らかになった。得られたポリマーグラフト化無機超微粒子を、非相溶型ポリマーアロイ(ナイロン6/変性ポリオレフェン系)中へ分散させ、その分散状態を透過型電子顕微鏡により観察したところ、デンドリマ-(単一性分)をグラフトしたものは、グラフト鎖と相溶性の良いナイロン中へのみ選択的に分散するのに対して、2次グラフト化により分岐コポリマー(2成分)をグラフトしたものは、ポリマーアロイ中へ均一に分散することが確認できた。
1989年ロマプリ-タ地震によるサンフランシスコ湾岸地域の被害に関する調査研究

1989年10月17日午後5時4分(現地時間)に発生したLoma Prieta地震は、サンタクルズ郡一帯の震源域、および北方のサンフランシスコ市とオ-クランド市を含むサンフランシスコ湾岸地域に大きな被害をもたらした。この地震がサンアンドレアス主断層の破壊であったことに加え、人口500万人を越える湾岸地域の大都市圏を襲った地震であること、軟弱地盤による地震動の著しい増幅や砂地盤の液状化が広範に見られたことなど、わが国の地震防災と関連が深い要素が重なっていたことから、この地震の被害とその発生機構を十分に調査することが重要と考えられた。本研究は、科学研究費の突発災害予算によりLoma Prieta地震の調査を行ったものである。都市地震防災の観点から調査項目は多岐にわたり、以下のような7つの分野に分けて調査に当たった。1)震源過程・地震動、2)地盤・液状化、3)建築構造物、4)橋梁・土木構造物、5)ライフライン系6)地震火災、7)情報伝達・防災組織調査団の主力は1989年11月3日12日の間現地で活動を行ったが、分野により調査時期を遅らせた場合もある。以上の活動に基づき、現地調査団としての総合報告書をとりまとめた。
多核白血球による心筋細胞conditioningの検討-Hypochlorous Acidの心筋細胞内Zn^<2+>動員作用-

我々はこれまで多核白血球のもつ極めて反応性の高いoxidantであるhypochlorous acid(HOCl)が細胞内の蛋白質をoxidationし、蛋白質のsulfhydryl(SH)基に結合しているZn^<2+>を動員し細胞内のイオン環境を変化させるなどの重要な生理的作用を示すことを報告してきた。梗塞部心筋は多核白血球の浸潤の後、交感神経の亢進、組織レニン・アンギオテンシン系の賦活化などの種々のcytokineの影響を受ける。そこでHOClの持つ細胞内作用にconditioningされた心筋細胞が、梗塞後のリモデリングに関与し、心肥大を誘導すると考えられるangiotensin IIに対する反応にどの様な影響を受けるかを培養心筋細胞を用いて検討した。1.ラット新生仔培養心筋細胞のprimary cultureをBromodeoxyuridine(BrdU,100μM)の存在下に24-36時間培養し、serum-freemediumの条件下で24-48時間以内に実験を行った。2.まずcontrol条件下の心筋細胞のangiotensin II刺激に対する蛋白合成能の変化をみる目的で、10^<-9>-10^<-7>M angiotensin IIによる[^3H]Phenylalanineの取り込みを検討したが、angiotensin IIにより蛋白合成能は濃度依存性に増加し、48時間の10^<-8>M angiotensin II刺激で約1.3倍に増加した。5.25μMの濃度のHOClでconditioningされた心筋細胞のangiotensin II刺激に対する[^3H]Phenylalanineの取り込み及びc-fosの発現はcontrol条件と比較し有意な差を認めることができなかった。また50μMの濃度のHOClでも細胞のliftingが著明となる以外大きな変化を認めなかった。以上より今回用いた生理的濃度のHOClは心筋細胞のangiotensin IIに対する反応に影響を与えなかった。
ソーシャリー・エンゲイジド・アートとしてのダンス：その理論と実践の探求

本研究は、舞台芸術の演出家や振付家などの芸術家の協力を得ながら、通常の舞台芸術の観客のみならず、特に舞台鑑賞を趣味とするわけではない一般市民が芸術を介していかに社会的関与や参加を実現しうるかを試行し、その方法について考察を行い、効果を測定するものである。2018年度は、商業演劇から実験的な演劇、「脱出ゲーム」などの演出や創作を手がける演出家の長谷川寧氏と、新潟県の(公財)妙高文化振興事業団の協力を得て、新潟県妙高市のダンスの実践者や愛好者を主な出演対象者とした一般参加型のダンス作品『Attack On Dance妙高バージョン』の上演を実施した。また、この上演の理解を促進するために、鑑賞に訪れた妙高市民に対して、「ダンスと社会」をテーマとした講演を行い、歴史上のダンスは何らかの形で社会や共同体の形成に寄与してきた様々な事例を紹介し、現代のダンスが「他者」への理解や多様性を可視化する上で重要な役割を担うことを論じた。作品の出演者としては、プロアマ問わず、日本舞踊、ヒップホップ、コンテンポラリーダンス、社交ダンスなど異なるジャンルのダンスを愛好する者たちが集い、通常では同一の舞台に集まることがあり得ない多彩なメンバーが集った。この作品では、単にそれぞれのダンサー/出演者が普段研鑽を積んでいるダンスを見せるだけに止まらず、出演者の理解を得た上で、それぞれのダンス観やダンス活動を続けることによる周囲の理解や無理解、舞台衣装にかける金額など、数十の質問を公開で投げかけ、YES/NO方式でその場で回答を示す場面を取り入れた。そのことにより、同じ市に住みながらも交流を持たない出演者、観客も、通常の舞台公演とは異なり、踏み込んだ形での相互理解を促進することができた。なお、この公演と講演は地元紙「上越タイムス」妙高版の一面で紹介され、一定の反響を得ることができたと思われる。本研究の計画時には、地方における公演の試演は含まれていなかったが、新潟県の公立ホールの協力と演出家長谷川寧氏の協力を得ることができたことで予想以上の成果を得ることができたと考えている。公立ホールの協力によって市単位の参加の呼びかけができたことにより、予想以上に多様な出演者が集まった。また、観客に対して行ったアンケート調査でも、ある程度ダンス鑑賞層がいる首都圏以外の場所でも、長谷川寧氏の『Attack On Dance』が大きなインパクトともに受け入れられることも判明した。妙高市という都市の多面性、その社会を構成している人々の多様な文化活動がまさに身を以て著されたと言える。ダンスには馴染みのない人々にとっては「ダンサー」という異人種の意識や生態調査を行なう作品が出来上がり、共同体の成員の相互理解、ひいては「他者」への理解が促進された。それにより本研究の課題の一つである、現代においてダンスがいかに社会の多様性の可視化することができるか、あるいはダンスが趣味嗜好の乱立や世代格差など様々な社会上のギャップをいかに埋めることができるか、という仮説を具体的に検証することができたと考える。2016年度以降行った、文献研究及び、アーティストの協力を得ながら、実際に鑑賞者を募った試演の内容と結果を考察することで、その成果と反省点を論文などの形でまとめたいと考えている。社会関与型芸術という観点からダンスの歴史を捉え直すために、1960年代のポスト・モダンダンス以降のダンスの歴史を見直す必要があったためまず、パブロ・エルゲラによる『ソーシャリー・エンゲイジド・アート入門』(フィルムアート社、2015年)などを参照し、社会関与型芸術がいかなる実践であり、何が問題となっているかを明確にした。次いで、社会関与型芸術に近いダンスの事例として考えられるポスト・モダンダンスを捉え直す上で、舞踊史家サリー・ベインズによる『デモクラシーの身体(Democracy's body)』(1993, Duke University Press)や『スニーカーを履いたテレプシコレ(Terpsichore in sneaker: Post-modern dance)』(Wesleyan University press,1987)といった文献を読解する作業を行い、社会関与型芸術とダンスとの歴史的、理論的接点を見出すことができた。また、「対話」「参加」「協働」「コミュニティ」といった社会的な含意を持つキーワードからダンスを捉え返し、社会関与型芸術の理論的と方法論を構築する上で、『参加の芸術:1950年から現在まで(The Art of Participation:1950 to now)』(Sanfrancisco Museum of Modern Art, 2008)などの文献を参照し、理論研究を行った。この研究により、当時から現代に至るまでに発表されたダンス作品が他領域の芸術や社会的実践と関連させる道筋を開くことができた。本研究は、最終的に理論・歴史研究に基づいた、ワークショップや公演の実現をも見据えたものであるが、国内外で評価を高めているパフォーマンス集団contact Gonzoと研究内容を踏まえた公演の実現などについて議論する機会も設けることができた。研究を進める上で課題としていた文献の読解をある程度進めることができた。また、本研究の成果を公開し、検証する意味も含めた公演の実施について、上演団体と話し合う機会を持つことができ、その実現の可能性を高めることができたと考えられる。1990年代後半から現代に至るまでフランスや日本の振付家たちがポスト・モダンダンスの振付家の創作方法に関心を寄せ、再解釈を行っているが、こうした歴史的変遷を、時代や社会背景の違いを考察しながら、社会関与型芸術として再文脈化すること挑む予備的研究を行うことができたと考えている。

初年度の研究から得た知見をもとに、国際的に活躍する日本のパフォーマンス・グループであるcontact Gonzoの協力を得て、従来のダンスにおいて主流であった作品の概念から逸脱した観客の関与を重視した作品の試演を実施することができた。作者のメッセージを内包した作品をプロのダンサーが踊り観客に見せるという作品ではなく、観客の関与や参加に作品の形成が委ねられるタイプの作品をいかに成立させるか、という議論をcontact Gonzoと行なった。その結果、既存作『訓練されていない素人のための振付コンセプト』の1部と2部を一部改変するとともに続編となる3部を創作し、一般観客およそ200名を招き、公演後にはゲストとして舞踊研究者の外山紀久子氏と舞踊批評家の桜井圭介氏を招いて、パブリック・トークを実施した。この作品は、基本的に誰もが行えるように振付の指示書を予め観客に渡しているところに特徴がある。1部、2部はcontact Gonzoのメンバーが観客の目の前で、実際に振付の指示書に基づいた行為を行うが、3部では、観客のほぼ全員が参加するものとして行われた。試演後のアンケート調査からも明らかとなったが、この公演では、参加者は従来のダンス作品を鑑賞するように作品の中のメッセージや情感を解釈するのではなく、参加することで自らの身体にかかる外的な負荷/変化に対して身体が否応なく処する自らの身体能力や運動感覚を駆使し、認識する機会となったと考えられる。3部ではバラバラのサイズの角材を他の観客の身体(肩や手、背中、脚部など)との間で挟み、維持することが振付のタスクとして課されるが、この状態を指してアンケートで「社会の縮図」のようだと指摘する観客もいたように、他者同士である観客たちが協同してタスクを実行することで、物理的、感覚的に繋がり一つの共同体を生成する様子を観察することができた。3年目に実施する予定であった芸術家と協業しての試演が、芸術家との協議やディスカッションが順調に進んだため、1年早く実施することができた。1年目の研究成果とこの試演に対する分析と考察を行い、3年目にまとめる下準備が順調に整ったと言える。本研究は、舞台芸術の演出家や振付家などの芸術家の協力を得ながら、通常の舞台芸術の観客のみならず、特に舞台鑑賞を趣味とするわけではない一般市民が芸術を介していかに社会的関与や参加を実現しうるかを試行し、その方法について考察を行い、効果を測定するものである。2018年度は、商業演劇から実験的な演劇、「脱出ゲーム」などの演出や創作を手がける演出家の長谷川寧氏と、新潟県の(公財)妙高文化振興事業団の協力を得て、新潟県妙高市のダンスの実践者や愛好者を主な出演対象者とした一般参加型のダンス作品『Attack On Dance妙高バージョン』の上演を実施した。また、この上演の理解を促進するために、鑑賞に訪れた妙高市民に対して、「ダンスと社会」をテーマとした講演を行い、歴史上のダンスは何らかの形で社会や共同体の形成に寄与してきた様々な事例を紹介し、現代のダンスが「他者」への理解や多様性を可視化する上で重要な役割を担うことを論じた。
人間の骨格筋ダイナミクスのリアルタイム計測の試み

本研究の目的は,超音波法を用いて筋収縮時の筋束の移動の様子を明らかにすることから,関節運動中の筋線維長変化を見る事である.これまでの研究結果により,膝関節角度変化に伴う筋束長の変化の様子を定量することが出来た.その結果,等速性脚伸展動作(一定速度で膝関節を伸展させる)中に筋線維の短縮速度は著しく変化することが観察された.本年度は足関節底屈背屈中の腓腹筋(内側頭)の筋線維の力-速度関係を明らかにした.その結果,関節の角速度-関節トルク関係から推定される筋線維の短縮速度よりも実際の短縮速度は高い傾向が示された.この事は,関節の角速度変化が必ずしも筋線維の短縮速度を示すものではないことを示している.さらに,関節角速度と筋線維短縮速度との間には発揮筋力の影響が強いことが示された.つまり,高い筋力発揮時には腱組織が伸長されその結果,筋線維の短縮量が多く,短縮速度が高くなる事が考えられた.この結果は,これまで一般に考えられていた関節の動きから筋線維の動態を推定する手法に問題点が多い事を示すものである.本年度の研究目的は,超音波法を用いて筋収縮中の筋形状(筋束の長さ,角度及び腱および腱膜の形状)を自動的に分析するシステムを構築することであった.これまでの研究からヒト生体に於ける筋活動中の筋-腱複合体の変化の様子を測定する方法が提案されているが,この現象をリアルタイムで記録する為のシステムとして,関節トルク記録装置の開発と,観測する筋群に超音波プローブを装着する為のアタッチメントの開発が行われた.その結果,足関節及び膝関節についての関節角度と関節トルクを測定する事が出来,腓腹筋及び外側広筋の筋活動中の筋線維及び腱組織のダイナミックな動きの様子がリアルタイムで記録することが可能になった.更に,力を徐々に増加していくに伴い腱組織が伸張し,筋線維が短縮する様子が確認された.このデータから腓腹筋,前頚骨筋及び外側広筋の筋-腱複合体の粘弾性特性を定量することが可能になった.次年度はこの計測システムを用いて各種トレーニングが筋-腱複合体の弾性特性及び粘性特性に及ぼす影響を見る予定である.本研究の目的は,超音波法を用いて筋収縮時の筋束の移動の様子を明らかにすることから,関節トルクの変化に伴う筋線維長変化を見る事である.これまでの研究結果により,等尺性トルク発揮時にも筋線維の短縮することが明らかにされてきた.本年度の研究は,各種関節各速度時の筋線維短縮速度の変化を見る事である.膝伸展動作を実施時の外側広筋の筋束長を超音波法により測定し,膝関節角度変化に伴う筋束長の変化の様子を定量することが出来た.その結果,等速性脚伸展動作(一定速度で膝関節を伸展させる)中に筋線維の短縮速度は著しく変化することが観察された.つまり,膝屈曲位から伸展するに伴い筋線維の短縮速度は急激に増加し,膝関節角度が約70度で筋線維短縮速度が最大を示し,その後は関節の伸展に伴い短縮速度は再び減少する傾向が見られた.この様な,関節角速度と筋線維の短縮速度の関係の不一致は筋腱複合体の弾性特性により引き起こされることが推察された.同時に,膝伸展動作に於ける外側広筋の場合には膝関節角度が約70度で筋線維長は約90mmを示し,その時に発揮張力も最大であった.つまり,外側広筋の自然長(生体長,至適長)は約90mmと考えられた.本研究の目的は,超音波法を用いて筋収縮時の筋束の移動の様子を明らかにすることから,関節運動中の筋線維長変化を見る事である.これまでの研究結果により,膝関節角度変化に伴う筋束長の変化の様子を定量することが出来た.その結果,等速性脚伸展動作(一定速度で膝関節を伸展させる)中に筋線維の短縮速度は著しく変化することが観察された.本年度は足関節底屈背屈中の腓腹筋(内側頭)の筋線維の力-速度関係を明らかにした.その結果,関節の角速度-関節トルク関係から推定される筋線維の短縮速度よりも実際の短縮速度は高い傾向が示された.この事は,関節の角速度変化が必ずしも筋線維の短縮速度を示すものではないことを示している.さらに,関節角速度と筋線維短縮速度との間には発揮筋力の影響が強いことが示された.つまり,高い筋力発揮時には腱組織が伸長されその結果,筋線維の短縮量が多く,短縮速度が高くなる事が考えられた.この結果は,これまで一般に考えられていた関節の動きから筋線維の動態を推定する手法に問題点が多い事を示すものである.
二重免疫染色法を用いた血管周皮細胞の検討と腎細胞癌の予後との関連

研究の目的:血管壁の主要な構造物である血管周皮細胞は、血管の成熟に重要な働きをもつが、腫瘍組織内での状態・働きは、未だ多くの点で明らかでない。淡明腎細胞癌における、血管周皮細胞の状態、腫瘍進展・転移との関連を解明する事を目的とする。研究の目的:根治的腎摘出術を施行した162人より得られた淡明腎細胞癌組織、転移巣切除を施行した20人より得られた転移性淡明腎細胞癌組織を対象とした。検体を血管周皮細胞マーカーであるanti-SMA抗体と、血管内皮細胞マーカーであるanti-CD34抗体で2重免疫染色した。Nuance Multispectral Imagingを用いて、血管内皮細胞と血管周皮細胞を識別・定量化し、血管周皮細胞の状態と淡明腎細胞癌の臨床的特長(悪性度、転移の有無、生存率)との関連につき検討した。研究成果:血管周皮細胞の含有率が高い血管(成熟度が高い血管)をもつ腫瘍では、血管周皮細胞の含有率が低い血管(成熟度が低い血管)をもつ腫瘍に比較して、生存率が優位に高かった。成熟度の低い血管をもつ腫瘍は、腫瘍悪性度、転移との関連が示唆された。血管の成熟度は淡明腎細胞癌の進行に重要であると考えられた。腎細胞癌は成人腎に発生するもっとも頻度の高い腫瘍であり、その発生率は年々増加している。しかし腎細胞癌は手術療法以外に有効な治療法がなく、腫瘍細胞を栄養する新生血管を阻害するAnti angiogenesis therapyはここ数年注目を浴びており、その効果が期待されるが、その基礎となる腫瘍血管の新生メカニズム、新生血管の構造・機能についてはいまだ多くの部分で解明されていない。本研究はこの問題に対して免疫染色技術を用いて腎細胞癌中の新生血管の構造を解析するとともに、血管新生のメカニズムを解明する事を目的とする。腎細胞癌患者の原発巣切除検体および転移性腎細胞癌患者の転移層切除検体より、癌部および正常組織を採取し、4-・mパラフィン標本を作製した。二重免疫染色として、血管内皮細胞のマーカーであるmouse anti-humanCD34 antibodyおよび血管周皮細胞のマーカーであるrabbit anti-human SMA antibodyを用いて、作成したパラフィン標本の2重免疫染色を行なった。二次抗体として3,3-diaminobenzidine (DAB)でラベルされたrabbit anti-mouse multimer (for CD34)およびalkaline phosphatase (AP)でラベルされたanti rabbit multimerを用い、Counterstainingとしてhematoxylinを用いた。染色された標本は腫瘍の辺縁部と中心部に分けて評価。顕微鏡観察下(200・)でもっとも血管数が多い部位を5箇所Pick upしてNuance multispectral imaging system(Cambridge Research & Instrumentation,Inc)を用いてデジタル画像として取り込んだ後、独自で開発した解析ソフトを用いて、血管内皮膚細胞および血管周皮細胞を測定し検討を行なった。腎細胞癌患者の原発巣切除検体および転移性腎細胞癌患者の転移層切除検体より、癌部および正常組織を採取し、4-mmパラフィン標本を作製する。二重免疫染色独自で開発した解析ソフトを用いて、血管内皮膚細胞および血管周皮細胞を測定し検討する。(1):血管内皮細胞および血管周皮細胞の解析(3):腫瘍細胞中の血管内皮細胞、周皮細胞の定量測定。(4)血管周皮細胞と予後の相関。(5)血管周皮細胞濃度別の分子標的薬に対する効果の検討腎細胞癌患者の原発巣切除検体および転移性腎細胞癌患者の転移層切除検体より、癌部および正常組織を採取し、4-μmパラフィン標本を作製。二重免疫染色独自で開発した解析ソフトを用いて、血管内皮膚細胞および血管周皮細胞を測定し検討した。(4):血管周皮細胞と予後の相関。(5):血管周皮細胞濃度別の分子標的薬に対する効果の検討
精神分裂病脳におけるwingless/Wntpathway、細胞接着異常について

(1)抗Dvl1抗体の作製;ヒトDvl1の部分アミノ酸からなるペプチドを合成し、このペプチドに対するポリクローナル抗体を作製した。抗体の特異性および感受性の検討した結果、特異性および感受性とも高いことが明らかとなった。(2)in situハイブリダイゼーション;ヒトDvl1のmRNAに対するプローブとして、合成したオリゴヌクレオチドを用いる。これらのプローブを用いて正常ヒト脳切片で、in situハイブリダイゼーションを行い、mRNAレベルでの発現分布の検討中である。(3)作製した抗ヒトDvl1抗体を用いて、正常ヒト脳切片で免疫組織染色を行い、タンパク質レベルでの発現分布の検討をした。ヒト脳におけるDvl1の分布の特徴として、大脳皮質(錘体細胞)、海馬(錘体細胞)、小脳(プルキンエ細胞)に高い発現を認めることが明らかとなった。(4)in situハイブリダイゼーション;ヒトDvl1のmRNAに対するプローブとして、合成したオリゴヌクレオチドを用いる。これらのプローブを用いて精神分裂病患者および正常対照者の脳切片で、in situハイブリダイゼーションを行なった。特に海馬領域の検討を行ない、結果の解析中である。。(5)作製した抗ヒトDvl1抗体を用いて、精神分裂病患者および正常対照者の脳切片で免疫組織染色を行なった。特に海馬領域の検討を行なった。この時に今回申請した、CCDカメラを使用し画像解析を行い、結果を解析中である。(6)体質性に関連した精神分裂病についても、合併症を中心に検討中である。。
細胞傷害の原因となる一重項酸素を細胞内外で特異的に消去する薬剤の開発

プテリンとエダラボンを反応させてジメチルプテリン(DPH)と命名した化合物を得た。このDPHはラマン分光法により、一重項酸素消去能を有することが分かった。さらにDPHはヒト好中球が産生する活性酸素のうち一重項酸素のみならずスーパーオキシドも消去した。DPHは、神経細胞内で一重項酸素を発生させた細胞死モデルおよび初代培養したヒト角化上皮細胞を用いた放射線照射によるDNA傷害モデルにおいて、傷害を抑制した。1.神経細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討ラットの初代培養神経細胞を用いて、光増感剤であるフォトフリンを細胞内に取り込ませ、波長630 nmの赤色光を照射することで細胞内に一重項酸素を発生させ、神経細胞死の検出を試みた。その結果、一重項酸素誘導性傷害モデルにおける神経細胞活性の低下及び、その細胞活性低下が一重項酸素消去剤によって緩和されることをAlamar Blue法及び蛍光染色により確認した。また、その傷害時にオートファジーが起こっていることを走査型電子顕微鏡観察及び蛍光免疫染色により確認した。次に、グルタミン酸による神経細胞傷害モデルを構築し、同様に神経細胞死の検出を試みた。その結果、グルタミン酸傷害モデルにおける神経細胞活性の低下及び、その細胞活性低下が一重項酸素消去剤によって緩和されることを確認した。これは、先の一重項酸素誘導性傷害モデルで見られた細胞死形態と一致した。さらに、一重項酸素が発生していることを電子スピン共鳴法(ESR)により検出した。このことから、グルタミン酸による神経細胞傷害には一重項酸素が関与していることが示唆された。2.皮膚細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討初代培養したヒト角化上皮細胞を用いて構築した放射線照射による細胞傷害モデルにおいて、DNA損傷の検出を試みた。その結果、damage-specific DNA binding protein 2 (DDB2)及びその上流のp53の活性化が検出され、一重項酸素消去剤によりその発現及び活性化が抑制されることを確認した。また、ESRにより放射線照射後に産生された一重項酸素を検出した。このことから、放射線障害には一重項酸素が関与していることが示唆された。1.新たな薬剤の合成についてa)合成用原料のプテリン、ジメチルホルムアミド(DMF)ならびに塩化ピバロイルを反応用フラスコに入れて撹拌し、12時間おきに反応溶液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分析し、反応物の生成をモニターする。b)得られた生成物は混合物であるのでクロロホルム-メタノール溶媒に溶かし、シリカゲルカラムを用いて分離精製を行う。c)溶媒をエバポレーターで除去し、質量分析機能付き液体クロマトグラフィー(LC-MS)を用いて物質の同定と純度の測定を行い、仮称ジメチルプテリン(DP)と命名した単一生成物の粉末を得る。d)このDPとエダラボンを反応用フラスコに入れてリン酸バッファー溶液(PBS)中で反応させ、反応物をHPLCを用いて分取し、さらにLC-MSを用いて物質の同定と純度の測定を行い、仮称ジメチルプテリン(DPH)と命名した単一最終反応物を得る。ここまでは成功したが、次の、e)得られた最終反応物の化学構造を質量分析法や核磁気共鳴法を用いて決定する。が予想以上に困難であったため、成功していない。2.試薬系における新たに合成した薬剤の一重項酸素消去能の評価については、ラマン分光法を用いた測定を行い、新たに合成した薬剤は、エダラボンやアジ化ナトリウムに匹敵する一重項酸素消去能を有することが分かった。3.細胞系における新たに合成した薬剤の一重項酸素消去能の評価については、ヒト好中球が産生する活性酸素に及ぼす新たに合成した薬剤の効果を検討し、この薬剤は、エダラボンと同様に、一重項酸素消去能を示すのみならず、エダラボンが有さないスーパーオキシド消去能をも有することが分かった。新たな薬剤の合成については、とこかくもDPHと命名した単一最終反応物を得たわけであり、さらにはその効果を試薬系ではラマン分光法を用いて、ならびにヒト好中球という細胞系では化学発光法を用いて検討したわけであるから、研究計画自体はおおむね順調に進展している。達成出来なかったことは、得られた最終反応物の化学構造を質量分析法(LC-MS)や核磁気共鳴法(NMR)を用いて決定するという点である。これは得られたた化合物の構造が複雑なため、LC-MSでは構造決定に必要な情報が十分に得られず、またこの化合物が水素分子を多く含むため、我々が用いた通常の水素検出NMRではこれまた構造決定に必要な情報が十分に得られなかったためと考えられる。

今年度は、得られた最終反応物の化学構造を質量分析法(LC-MS)や核磁気共鳴法(NMR)を用いて決定することができなかった。これは、前述のように、得られた化合物が水素分子を多く含むため通常の水素検出NMRでは構造決定が困難なためと考えられた。そこで次年度では炭素検出NMRや、場合によっては通常は用いられない方法ではあるが、窒素検出NMRや酸素検出NMRを用いて構造決定を試みることも考えている。なお、ラット大脳皮質神経細胞を用いた神経細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討や、ヒト角化細胞を用いた皮膚細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討は予定通り行う。窒素検出NMRや酸素検出NMRを用いて得られた最終反応物の化学構造の決定を試みる場合は、内部標準物質として窒素-15や酸素-17などの安定同位元素を用いる必要がある。これらの安定同位元素は非常に高価なので、その購入にかなりの費用を要する。また、窒素検出NMRや酸素検出NMRを実施しない場合でも、予定通り行うラット大脳皮質神経細胞を用いた神経細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討や、ヒト角化細胞を用いた皮膚細胞の細胞内外で人為的に活性酸素を発生させた時に惹起される細胞傷害に対する新たに合成した物質の効果の検討には、ラット大脳皮質神経細胞やヒト角化細胞を購入して用いる必要がある。これらの細胞は正常細胞なので、細胞株と異なり、継代により大量に増殖させて用いるということが出来ない。そのため実験毎に新たに購入して用いる必要があり、その購入に多くの費用を要する。