hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写メディエーターによる造血器腫瘍の増殖・分化の制御

哺乳類転写メディエーターは私達が発見したRNAポリメラーゼIIホロ酵素複合体の構成成分であり、多くの細胞内シグナルを最終的に統合して基本転写因子に伝える役割を果たす。本研究で私達は、メディエーターのサブユニットMED1が造血を司る核内受容体やGATA1の特異的転写共役因子として、正常造血の他、白血病細胞の各種血球系への分化や白血病細胞の増殖に重要な役割を果たすことを示すとともに、その分子機序を提唱した。私達が見出したRNAポリメラーゼIIポロ酵素複合体の構成成分であるメディエーターはサブユニット構造によって特異性を持ち種々のシグナル伝達を最終的に統合する細胞内シグナル伝達の終点である。本研究で、核内受容体やGATAファミリーの特異的コアクチベーターであるMED1サブユニットがいかに正常細胞および白血病細胞の増殖・分化に関与するかを検討した。核内受容体特異的機能を個体レベルで検討するためMED1の核内受容体結合部位を破壊した変異マウスを作成したところ、造血組織には異常を認めなかったが、PPARγの下流にある脂肪細胞とERαの下流にある乳腺の発育が顕著に抑制されていた。このことから脂肪細胞や乳腺上皮でMED1は核内受容体の下流に位置し、正常な増殖・分化に必須であることが示された。さらに、ノックアウト細胞の培養系を用いて、脂肪分化にはMED1を介する経路の他にMED1を介さない経路が存在ず喬ことを証明し、英文雑誌に報告した。次に白血病について、赤白血病細胞K562を用いて検討したところ、MED1の発現をsiRNAで抑制するとGATA-1を介する赤芽球分化が著明に抑制され、逆にMED1を過剰発現させると分化が促進した。これまでに白血病細胞HL60でMED1発現を同様に抑制すると核内受容体を介する顆粒球と単球への分化が抑制される知見を得ており、白血病細胞の各種血球への分化誘導にMED1がコアクチベーターとして重要な役割を果たすことが示された。以上のように、転写メディエーターは正常および白血病細胞の増殖・分化の重要な機能を担うことが明らかになりつつある。転写メディエーター複合体は当初核内受容体特異的コアクチベーターとして私達の手で同定された後にRNAポリメラーゼIIホロ酵素複合体のサブ複合体であることを私達が再発見したものである。メディエーターは基本的転写共役因子複合体でありながら同時にサブユニット構造によってアクチベーターに特異性を持ち、種々の特異的なシグナル伝達を最終的に統合する細胞内シグナル伝達の終点である。急性前骨髄球性白血病HL60を用いた検討でMED1が核内受容体RARやVDRのコアクチベーターとして顆粒球や単球の分化を誘導する他、K562赤白血病細胞を用いた細胞生物学的検討から、MED1がGATA1を介する赤芽球分化をも司ることが明らかになった。この際にGATA1特異的コアクチベーターとしてMED1が重要な役割を果たすが、その機序にGATA1とMED1との結合に依存しない経路が存在した。その分子機序として、核内受容体のバイパス分子CCAR1がGATA1のシグナルのバイパスとしても機能する可能性が示唆された。一方、K562細胞で、MED1発現を抑制する実験より、MED1が細胞増殖にも重要な役割を果たすことが分かった。以上よりMED1が白血病細胞の分化・増殖に重要な役割を果たすことが明らかになった。哺乳類転写メディエーターは私達が世界に先駆けてクローニングした基本的な転写共役複合体であり、RNAポリメラーセIIホロ酵素複合体を構成する一部である。本研究では、そのサブユニットMED1がこれまでに知られているような核内受容体のシグナルを統合するのと同様、GATA1シグナルをも同じ核内情報伝達の機序で統合することにより、赤芽球分化を担うことを赤白血病細胞K562を用いて検証した。本研究で、GATA1結合部位を倉まないMED1のN端のみでGATA1誘導性の赤芽球分化が強く誘導されること、またルシフェラーゼレポーターアッセイなどでGATA1誘導性の転写活性化にMED1とGATA1の直接結合が必ずしも必要ないこと、しかしMED1分子の存在は必須であることから、GATA1とMED1が直接結合する経路の他にバイパス分子を介する別経路があることが強く示唆された。一方、MED1は核内受容体VDRのコアクチベーターとして、RUNX2と協調的に、造血ニッチでオステオポンチンプロモーターの転写活性化に重要な役割を担うこと、それにより造血細胞の増殖や造血幹細胞の維持に重要な役割を果たすことを見いだし、今年度に主要英文雑誌に報告した。加えて、MED1の核内受容体特異的コアクチベーターとしての機能は、造血以外にも乳腺の発生で極めて重要な役割を果たすことをMED1の核内受容体結合部位廃絶遺伝子改変マウスを作製してたまたま見いだし、これも主要英文雑誌に報告した。
第２次世界大戦期日本・仏印・ベトナム関係研究の集大成と新たな地平

第二次大戦期のベトナム、カンボジア、ラオス、タイに関して、日本人専門家10人をコアメンバーとし、ベトナムなど関係諸国の研究者の協力を得つつ5か年の共同研究を展開。とりわけ、2014年と2016年には、現時点までの研究蓄積の到達点を確認し、関連資料に関する情報を共有するための国際ワークショップを東京で開催、それぞれの成果を論集として2015年と2018年に刊行した。さらに、戦後70周年に当る2015年に、各自の最新の研究成果を発表しあう国際シンポジウムをハノイで開催、8か国の研究者から約30本の報告を得た。その成果は丹念な編集作業を経て、2017年に300頁を超す論集として刊行した。1国内研究会、調査研究活動:科研費採択の通知を受けたのは10月であったが、それ以前から早稲田大学助成金により7月と10月に研究会を実施、分担者の菊池陽子と湯山英子、連携研究者の早瀬晋三(早稲田大学教授)と笹川秀夫(立命館アジア太平洋大学准教授)が報告した。また、戦時期仏印に駐在した日本人外交官の回想録(仏語)の邦訳に着手。科研費の交付後、さらに朝日新聞社所蔵の戦時期東南アジア関係写真コレクション(4000点余り)の目録作りに着手。また、2015年2月に第3回研究会を実施し、研究協力者のVo Minh Vu(ハノイ社会人文科学大学東洋学部講師、東京大学に滞在中)と岡田友和(大阪大学学振PD研究員)から報告を得るとともに、今後の活動方針について協議した。同時に、各メンバーはそれぞれのテーマに則して先行研究の整理、関連資料のリスト作成などに着手した。2各メンバーの資料調査など(本科研費以外の財源によって実施した調査を含む):科研費交付に先行する8-9月に代表者の白石昌也はベトナム、連携研究者の笹川秀夫はカンボジアで調査。科研費交付後の12月に白石はベトナム、2-3月にベトナムを含むインドシナ3か国、また分担者の古田元夫は3月にベトナム、難波ちづるは3月にフランス、菊池陽子は2月にラオス、湯山英子は2月に京都、3月に台湾、連携研究者の早瀬晋三は3月にラオス、連携研究者の笹川秀夫は2-3月にカンボジア、研究協力者の立川京一(防衛研究所戦史研究室長)は3月にフランスで、それぞれ関連資料調査や関係者とのインタビュー、そして現地の研究機関・研究者と意見・情報交換した。3国際ワークショップなどでの口頭発表:難波は2015年3月フランス出張の際に国際シンポジウムに参加し関連テーマについて口頭発表、また湯山は2月に京都で開催された国際ワークショップに参加、各国の研究者と意見交換した。1国際ワークショップ開催とモノグラフ刊行:14年12月に各国の研究動向と一次資料の所在を概観する国際ワークショップを開催。代表者と4名の分担者全員、さらに国内の連携研究者・協力者5名、ベトナム、タイ、台湾、フランス、中国の協力者10名が、報告もしくはコメントを担当。その成果を基に、日英2か国語のモノグラフ(研究発表の欄参照)を15年3月早稲田大学アジア太平洋研究センターより刊行。2国内研究会:第1回(14年5月)で難波、湯山、および協力者の立川京一(防衛研究所)が前年度の海外調査成果報告;第2回(11月)でゲストスピーカーによる報告。あわせて、12月国際ワークショップ準備、および翌年度開催予定の国際シンポジウム打合せ。3その他の国内での主要な活動:朝日新聞社所蔵の戦時期東南アジア関係写真コレクションの目録作り継続。既存のマイクロフィルム資料の整理など。4各メンバーの調査活動(本科研費以外の財源によって実施した調査を含む):白石は14年8ー9月、15年2ー3月ベトナムにて資料調査、およびハノイ社会人文科学大学と翌年度に予定する国際シンポジウム打合せ。その間、14年8ー9月には菊池がラオス、連携研究者の村嶋英治(早稲田大学教授)と笹川秀夫(立命館アジア太平洋大学准教授)がそれぞれタイとカンボジア、9ー10月に湯山が台湾、11ー12月に湯山が長崎、15年2ー3月に古田が協力者の岩月純一(東京大学准教授)とともにベトナム、菊池がラオス、湯山が奈良、難波および協力者の立川がフランス、連携研究者の村嶋と笹川がそれぞれタイとカンボジアで、資料調査やインタビューを継続的に実施し、併せて各地の研究機関、研究者と意見・情報交換。5国際学会などへの参加:難波は14年6月にカンボジア、10月に台湾での国際学会にて口頭発表、湯山は15年3月京都での国際ワークショップに参加、情報交換。1国際シンポジウムの実施:2015年9月18-19日ハノイにて国際シンポジウムをハノイ社会人文科学大学と共催。2国内研究会など:2015年7月18日早稲田大学にて国内研究会、9月19日ハノイにて国際シンポジウム終了後に打合せ会合。3その他の国内での主要な活動:科研費基盤B「植民地史を書き換えるー東南アジアの日本占領行政からみた欧米植民地支配」(代表者・早瀬晋三早稲田大学教授)と連携しつつ朝日新聞社所蔵戦時期写真コレクションのリスト化作業ほぼ完了。関係者手記類の刊行に向けた編集作業継続。東京朝日新聞の関連記事リスト化作業着手。4各メンバーの調査

活動:代表者の白石昌也、分担者の岩月純一、連携研究者の古田元夫はベトナム、分担者の村嶋英治はタイ、分担者の笹川秀夫と難波ちづるはカンボジア、分担者の菊池陽子はラオス、分担者の湯山英子は台湾、協力者の立川京一はフランスで、関連資料調査を継続的に実施。第2次世界大戦終結70周年の節目に当たる2015年に国際シンポジウムを当初予定通りにハノイで開催した。その際に、マッチングファンドとして国際交流基金からの助成金も首尾よく獲得でき、研究メンバー全員のほか、ベトナムを初め各国から多数の研究者を招致できた。朝日新聞社所蔵の戦時期関連写真類の整理が完了したほか、東京朝日新聞の関連記事リスト化作業にも着手、また関係者の手記類の刊行に向けた編集作業も進捗している。各メンバーによる調査、研究活動も予定通りに進捗している。2国際シンポジウムのプロシーディングス(英文):前年度(2015年7月)ハノイで開催した国際シンポジウムの成果を、研究代表者・白石が中心となりハノイ社会人文大学Nguyen Van Khanh教授、シンガポール国立大学Bruce Lockhart教授などの協力を得つつ編集し、早稲田大学アジア太平洋研究センターから刊行。3大戦期写真資料リスト:科研費基盤B「植民地史を書き換えるー東南アジアの日本占領行政からみた欧米植民地支配」(代表者・早瀬晋三早稲田大学教授)と連携しつつ、朝日新聞大阪本社所蔵の第二次大戦期写真コレクションのリスト化を終了し、早稲田大学アジア太平洋研究センターから刊行。早瀬は本科研費プロジェクトの連携研究者でもある。4その他の国内での主要な活動:菊池が中心となって東京朝日新聞の大戦期関連記事のリスト化作業を継続。白石と難波を中心として仏印に駐在した日本人外交官の回想録(原文仏語)の日本語訳の監修を継続。菊池、湯山、笹川が国内各地の図書館、資料館などでの調査を続行。村嶋がタイに駐屯した日本人憲兵中佐の手記を編集、刊行。5各メンバーの調査活動:本研究費もしくは他研究費を用いて、村嶋がタイ、菊池がラオス、笹川がカンボジア、湯山がベトナムならびに台湾での資料調査、難波は10月からサバティカルでハノイに滞在し文書館での調査などを継続。研究協力者の古田元夫(日越大学学長)はハノイに拠点を置きつつ関連する研究活動を継続、研究協力者の立川京一(防衛研究所)はフランスでの資料調査を実施。第2回国際ワークショップを予定通りに開催し、また前年度に開催した国際シンポジウム(ハノイ)の成果もプロシーディングスとして刊行、また朝日新聞大阪本社所蔵の第二次大戦期写真コレクションのリストも完成した。一方で、代表者・白石が7月9月に病気入院、療養したために、予定していたベトナムでの資料調査や国内研究会の実施などを翌2017年度に繰越すことを余儀なくされ、それに連動して国際ワークショップの成果刊行も次年度にずれ込むこととなった。1国内研究会:11月4日早稲田大学で研究会を実施、波多野澄雄・アジア歴史資料センター長、加納寛・愛知大学教授をゲストスピーカーとして招くとともに、各メンバーが5年間の活動に関する総括的報告を行った。2日本人回想録:白石と難波が中心となって大戦期仏印に駐在した外交官・横山正幸の回想録(原文仏語)の監訳作業を完了し、アジア太平洋研究センターから刊行した。3国際ワークショップ報告書など:前年度(2016年5月)に早稲田大学で実施した国際ワークショップの成果を、白石が中心となってシンガポール国立大学Bruce Lockhart教授の協力を得つつ編集し、アジア太平洋研究センターから刊行した。
子宮内膜癌局所におけるストレスホルモンの動態と癌への作用

子宮内膜癌においてコルチゾールは11β-HSD1と11β-HSD2によって癌局所での濃度が調節されている。コルチゾールは間質細胞に発現するグルココルチコイド受容体(GR)を介して、エストロゲン合成酵素aromataseの発現を誘導し、エストロゲン依存性に寄与している。また、コルチゾールは間質細胞のGRに結合し、Annexin A1を誘導し、癌細胞の増殖に関与すると考えられる。ストレスと関連するDHEAは、steroid sulfataseによって癌局所で合成される。ホルモン濃度の階層クラスター解析では、ストレス関連ホルモンであるコルチゾール、コルチゾン、DHEAが同一クラスターに分類された。子宮内膜癌(40例)を対象に癌組織中のコルチゾール濃度測定及びアロマターゼ活性測定を行った。ヒト組織を使用するに際しては、研究プロトコールについて東北大学医学部倫理委員会の承認を得た。コルチゾール濃度測定はliquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)を用いた。また、アロマターゼ活性測定については13C標識したアンドロゲン(androstenedione及びtestosterone)を添加し、13C標識されたエストロゲン(estrone及びestradiol)をそれぞれ測定LC-MS/MSにて測定した。結果、ストレスホルモであるコルチゾールは組織中のアロマターゼ活性と有意な正相関を示した。一方、別途対照として行ったアンドロゲン合成酵素の活性(5alpha-reductase, 17beta-haydoxysteroid dehydrogenase 5)については、有意な関係は得られなかった。また、コラゲナーゼ法にて子宮内膜癌組織から分離した初代子宮内膜癌間質細胞(2株)を用い、コルチゾール添加による遺伝子レベル(定量的PCR)及び活性レベル(アンドロゲン添加/エストロゲン測定:LC-MS/MS)でのアロマターゼが誘導を明らかにした。アロマターゼは女性ホルモンであるエストロゲンを体内で合成する重要な酵素として知られており、ストレスによって分泌されるコルチゾールが、生体内の女性ホルモンの環境を攪乱するのではと考えられる。当初計画通りに子宮内膜癌組織中のストレスホルモン濃度を評価することができた。さらに、当初の計画を上回るアロマターゼとの関連にまで言及することができた。このアロマターゼとの関連については新規知見であり、ストレスと女性ホルモンのバランスの不調に関する科学データを示すことができた。一方でコルチゾール代謝酵素のエピジェネティクスに関するデータが次年度へ持ち越しとなったが、前述の成果を含めて総合的に「当初の計画以上に進展している」と判断した。子宮内膜癌を対象に、コルチゾール受容体であるグルココルチコイド受容体(GR)の発現を免疫組織化学にて評価した。GRは子宮内膜癌の癌細胞での発現は低く、周囲間質の線維芽細胞や炎症細胞に発現が多く認められた。さらにコルチゾールによって誘導される遺伝子(標的遺伝子)として、Annexin A1を見いだし、同様に免疫組織化学での検討を行った。GRと同様にAnnexinA1は癌細胞と間質細胞の両方に発現を認めた。Annexin A1はコルチゾール/GRの標的遺伝子と想定されるため、両者の関係について統計解析を行った。なお、本研究では間質のGRの発現について、線維芽細胞(様細胞)に注目して評価した。その結果、癌細胞においてはGRとAnnexin A1の発現に関連は認められず(p=0.7194)、間質線維芽細胞において両者に有意な関連が認められた(p=0.0031)。さらに癌組織のコルチゾール濃度との関連についても、間質線維芽細胞のAnnexin A1陽性群において有意にコルチゾール濃度が高かった(p=0.0183)。癌細胞のAnnexin A1陽性群においてもコルチゾール濃度が高い傾向が認められた(p=0.0621)。癌組織の間質線維芽細胞は癌関連線維芽細胞(Cancer-Associated Fibroblasts: CAF)と称され、癌の悪性度に大きく関与することが知られている。子宮内膜癌ではCAFにおいてコルチゾールによってAnnexinn A1が誘導され、分泌型Annexain A1がパラクライン的に癌細胞に影響を及ぼしていると示唆される。Annexin A1の癌細胞増殖との関連を示唆する結果も得られており、今後、in vitroでの機能実験にて検証を行う予定である。子宮内膜癌におけるコルチゾールによって誘導される遺伝子(標的遺伝子)として、Annexin A1という因子を具体的に見いだすことができた。この因子は癌細胞そのものではなく、周囲間質の線維芽細胞(CAF)において着目される現象であり、当初想定していた癌細胞への直接的作用ではないが、関節作用(パラクライン)として腫瘍学的にも興味深い成果であると判断している。癌細胞でのコルチゾール受容体の発現が思いの外、低いことが明らかとなり、着眼点を間質細胞に移すこととなったが、CAFの機能とストレスホルモンを結びつけることは斬新なアイデアであると考えている。実際に成果報告を行った米国内分泌学会においても、同様の観点からの議論を展開することが出来た。以上のことから本研究課題のテーマであるストレスホルモンの癌への影響を解明するために概ね順調に進展していると判断した。DHEA (Dehydroepiandrosterone)は、コレステロールから生成され、弱いアンドロゲン活性を持つ。DHEAは免疫機能の維持やストレスへの抵抗力などに関わるホルモンであることも知られている。本研究では、子宮内膜癌におけるDHEAについて検討を行った。

まず、子宮内膜癌組織中のDHEA濃度をLC-MS/MSにて測定した。また、DHEAの硫酸抱合酵素であるDHEA sulfotransferase (DHEA-ST)およびその脱硫酸にかかわるSteroid sulfatase (STS)の発現について免疫組織化学にて検討した。結果、癌増殖マーカーであるKi-67とDHEA濃度との比較では逆相関が認められた。免疫組織学の結果については、STS陽性症例では子宮内膜癌組織中のDHEA濃度が優位に高いことが明らかとなった。DHEAは種々の合成酵素によってアンドロゲンやエストロゲンに変換されるが、それらの濃度との関係についてさらに検討を行った。LC-MS/MSにてエストロゲン(estradiol, estrone)、アンドロゲン(testosterone, 5a-dihydrotestosterone)およびグルココルチコイド(cortisol, corticosterone)を測定し、DHEAを含めて階層的クラスター解析を行った。結果、DHEAはアンドロゲンやエストロゲンと同一クラスターには分類されず、グルココルチコイドと同一クラスターに分類された。以上、DHEAは子宮内膜癌において癌増殖抑制に関連すると考えられ、STSの免疫組織化学が代替マーカーとして有用であると考えられる。子宮内膜癌ではDHEAは従来考えられてきた性ホルモンの前駆物質としての位置付けよりも、グルココルチコイドと同様にストレスホルモンとしての位置付けが高い可能性が考えられた。子宮内膜癌においてコルチゾールは11β-HSD1と11β-HSD2によって癌局所での濃度が調節されている。コルチゾールは間質細胞に発現するグルココルチコイド受容体(GR)を介して、エストロゲン合成酵素aromataseの発現を誘導し、エストロゲン依存性に寄与している。また、コルチゾールは間質細胞のGRに結合し、Annexin A1を誘導し、癌細胞の増殖に関与すると考えられる。ストレスと関連するDHEAは、steroid sulfataseによって癌局所で合成される。ホルモン濃度の階層クラスター解析では、ストレス関連ホルモンであるコルチゾール、コルチゾン、DHEAが同一クラスターに分類された。当初計画通りに子宮内膜癌培養細胞を用いて、コルチゾールの癌細胞への影響を検討する。その検討ではアロマターゼとの関連、更には細胞増殖、浸潤の観点からのデータを採取し、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行う。さらに27年度から持ち越したコルチゾール代謝酵素のエピジェネティクス解析を実施する。当初計画の通りに、上記結果のin vitroでの検証を行う。その際に子宮内膜癌由来のCAF培養細胞が必要となるが、既に5症例分のCAFを分離し、維持している。また、ストレス負荷マウス(社会隔離ストレス)を用い、子宮局所と血液中のコルチゾール濃度を比較する。
空間パターン情報の広域計算処理による蛋白質機能解析

本研究では、広域計算技術を積極的に活用することにより、蛋白質の三次元表面構造(空間パターン情報)の網羅的処理による機能解析(構造からの機能予測、機能発現部位の発見など)を実現する枠組について検討している。本年度は、既に提案している蛋白質表面データの比較手法をもとに、広域計算環境下での利用を想定した表面類似蛋白質高速検索システムProSurFinをGlobus Toolkitを用いて実装した。ProSurFinは、クライアント計算機、仲介ホストならびに複数のマスタースレーブ並列計算機から構成される。複数の並列計算機は、処理の均等化を図るため、複数の論理クラスタに再構成され、各論理クラスタにおいて2つの蛋白質表層間の比較が実行される。この枠組においては、いかに適切な論理クラスタを形成するか、すなわち、クラスタリングパターンの形成法が重要となる。そこで、類似蛋白質検索手法の処理内容の分析をもとにクラスタリングパターンの性能評価尺度を定式化した。表面比較処理は、ベクトルマッチングフェーズと局所探索フェーズのそれぞれにおいて並列化され、MPIを用いて実装されているが、両フェーズは、逐次的に実行され互いに独立な処理である。そこで、各処理に対して要求される計算時間を、計算ノードの性能指標、ネットワーク遅延などのパラメータをもとに定式化し、各種係数を実験により法定した。3台のPCクラスタの混成環境上にProSurFinを構築し、各種クラスタリングパターンに対する性能評価値ならびに実処理時間について計測することで、定式化した性能評価尺度が検索時間に対する正確な見積りを与えていることを検証した。また、PCクラスタを複数の論理クラスタに分割することにより、検索処理全体の性能向上が認められ、本システムの有効性を確認した。
金属間化合物の中間温度および高温疲労挙動

B2型規則構造を持つ体心立方晶β-CuZn(銅-亜鉛)合金単結晶について、室温から300°Cまでの範囲の所定の温度で引張り圧縮繰返し変形による疲労試験を行った。高温型ひずみゲージを用いて1/10^<-3>ミリメートル程度の塑性ひずみ振幅を一定に制御した疲労試験を行った。疲労変形の繰返しに伴い変形応力は増加し、その加工硬化率は、引張り変形において降伏応力の逆温度依存性が現れる室温から200°Cまでの温度域では、引張り変形の応力ひずみ曲線のステージIの加工硬化率のおよそ2倍程度であることを見いだした。200°C以上の温度では、動的回復が大きく加工硬化率は極めて小さいことを確認した。さらに、本研究で得られた引張り変形と疲労変形による加工硬化挙動について、その機構を転位論から解析した。B2型金属間化合物における強度の逆温度依存性については、異なる機構がいくつか提唱されているが、そのうちの1つに、交差すべりによる硬化の機構がある。本研究の結果は、交差すべりによる刃状転位上のジョグの形成を考えれば、そのジョグが不動となり加工硬化をもたらすとするメカニズムから矛盾無く説明できることを示した。また、変形温度の逆温度依存性は、温度が高くなるほど超格子転位の部分転位の拡張幅が大きくなるために交差すべりしにくくなることに律速されているとすれば理解できる。この結果は、その他のB2型規則合金の疲労における加工硬化の機構として一般性を持つものであるので、所定の研究目的は達成されたものと見なすことができる。金属間化合物である銅-亜鉛(Cu-Zn)合金β相について、いわゆる強度の逆温度依存性が現れる200°C前後の温度における引張り試験と、引張り-圧縮の交番応力下の繰返し変形試験を行い、応力-ひずみ挙動を検討した。得られた結果は以下の通りである。1.純度99.999%以上の純度の銅と亜鉛を用いて、Cu-48at.%Zn(銅-48原子%亜鉛)合金単結晶を作製した。この単結晶の室温での降伏せん断応力は20MPa以下であり、過去の研究よりも欠陥密度の小さい結晶の作製に成功した。2.室温で単一すべりのみ生じる結晶方位を持つ単結晶試験片を作製し、室温から250°Cまでで引張り試験を行い、応力-ひずみ曲線を得た。すべり線観察、変形による軸の回転、結晶形状の変化、から活動するすべり系を同定した。応力-ひずみ曲線の形状変化と活動するすべり系の関係を決定した。3,引張り試験において活動するすべり系と加工硬化率の値との関係を求めた。加工硬化率は、降伏応力と同様な温度依存性を示す。4.降伏応力の逆温度依存性が現れる温度での繰返し変形による加工硬化率は、引張り変形のおよそ2倍である。繰返し変形中の引張りおよび圧縮変形中には、さらに大きな加工硬化率を示すが、応力の反転によるバウシンガー効果による軟化が顕著であり、それらの平均である。5.転位エッチピット法により、引張り試験の降伏前と繰返し変形初期の転位分布を観察した。6.以上の結果から、この金属間化合物における強度の逆温度依存性が現れる温度における加工硬化のモデル化と定量的説明が可能となった。現在、その理論的解析を検討中である。
弱視治療年齢の調節麻痺下屈折値を非侵襲的検査で推測するための等高線図を作成する

弱視治療年齢で非侵襲的な検査により、眼軸長(x)と平均角膜曲率半径(y)から調節麻痺下等価球面屈折値(z)を予測する推測式を作成した。推測式は3歳z=1111.43/x-321.97/y-7.17、4歳z=1120.68/x-285.33/y-11.83、5歳z=1245.87/x-309.57/y-14.20、6歳z=1177.68/x-278.23/y-14.80、7歳z=1206.80/x-362.55/y-4.59、8歳z=1075.00/x-307.39/y-5.88となり、これらの式から簡便に球面屈折値が求るための、眼軸長を縦軸、平均角膜曲率半径を横軸にした等高線図を作成した。全身疾患の既往から調節麻痺点眼薬を使用できない幼児の屈折値を非侵襲的に推定するため、眼軸長と角膜曲率半径とによる調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を年齢ごとに作製している。研究計画にのっとり下記の通りの手順で実施した。1)福島県立医科大学附属病院眼科斜視弱視外来に通院している3歳8歳の幼児のうち、1%アトロピン点眼薬を1日2回7日間使用した調節麻痺下屈折検査を予定された患児を対象とする。2)受診日の屈折検査と視力検査に合わせて、光学的眼軸長測定装置IOLマスターを用いて眼軸長と角膜曲率半径を測定する。3)検査時の年月齢、眼軸長と角膜曲率半径および調節麻痺下等価球面屈折値のデータを集積する。4)収集したデータをもとに、年齢ごとの眼軸長と角膜曲率半径とによる調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を作成する。平成26年度は、症例数が最も多く集積できた3歳児のデータ(49例98眼)について、第39回日本小児眼科学会とアメリカ小児眼科斜視学会との合同学会で、英文でポスター発表を行った。また、その内容を眼科臨床紀要に和文で投稿し、平成27年度中に掲載予定となっている。3歳児における眼軸長(x1)、強弱主経線の平均角膜曲率半径(x2)とした場合の、調節麻痺下等価球面屈折値(y)の近似式は、y =967.37/x1-287.99/ x2-4.78であった。当初計画どおりの各年齢50例100眼を目標に症例蓄積を継続し、年齢ごとに目標に到達した段階で、遅滞なく学会での成果発表の準備に移行する。平成27年度は、3歳児(49例98眼)のデータについて眼科臨床紀要に投稿し、論文が掲載された。当初の計画通り各年齢50例100眼を目標に症例蓄積を継続した。また、平成27年度には、自然人口の抽出者を対象に、小学校の健診現場において、光学的眼軸長測定装置IOLマスターの検査可能率と所要時間を調査した。1年生と4年生の60名を対象とし、検査可能率は100%で90分を要した。3歳児の結果については予定通りに論文掲載まで進めることができた。それに対して、他の年齢の症例蓄積は目標(50例100眼)に到達しておらず、平成27年度中の成果発表には至らなかった。全身疾患の既往から調節麻痺点眼薬を使用できない幼児の屈折値を非侵襲的に推定するため、眼軸長と角膜曲率半径とによる調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を年齢ごとに作製を進めている。研究計画にのっとり、下記の通りの手順で実施した。1)福島県立医科大学附属病院眼科斜視弱視専門外来に通院している3歳8歳の幼児で、アトロピン点眼薬を使用した調節麻痺下屈折検査を予定された患児を対象とする。2)受診日の屈折検査と視力検査に合わせて、光学的眼軸長測定装置を用いて眼軸長と角膜曲率半径を測定する。3)検査時の年月齢、調節麻痺下等価球面屈折値と眼軸長および角膜曲率半径のデータを集積する。4)集積したデータをもとに、年齢ごとに眼軸長と角膜曲率半径とによる調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を作成する。

平成28年度は、4歳児のデータについて学会発表の準備を進め、平成29年4月に第121回日本眼科学会総会で報告した。当初の計画通り、各年齢50例100眼を目標に症例蓄積を継続した。また、平成28年度には自然人口の抽出者を対象に、福島市3歳児健康診査視覚検査の現場において、光学的眼軸長測定装置の検査可能率と所要時間を調査した。検査可能率は84%(37名中31名)であった。検査不能であった6名のうち、恐怖感などで機械に近づくことができなかったものが3名、顎台に顔をのせられたものの体動のため測定できなかったものが3名であった。一人当たりの所要時間(中央値)は1分16秒であった。第73回日本弱視斜視学会総会での発表予定である。治療開始時の低年齢層(3歳、4歳)については、計画通りに症例数の蓄積ができた。それに対して、5歳8歳の症例蓄積は目標(50例100眼)に到達しておらず、平成28年度中の成果報告に至らなかった。全身疾患の既往から調節麻痺点眼薬を試用できない幼児の屈折値を非侵襲的に推定するため、眼軸長と角膜曲率半径とから推測した調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を年齢ごとに作製を進めた。平成29年度は第43回日本小児眼科学会において、弱視治療年齢である3歳から8歳(対象:756眼)で、それぞれの年齢での等価球面屈折値の推測式を報告した(3歳:z=1111.43/x-321.97/y-7.17、4歳:z=1120.68/x-285.33/y-11.83、5歳:z=1245.87/x-309.57/y-14.20、6歳z=1177.68/x-278.23/y-14.80、7:z=1206.80/x-362.55/y-4.59、8歳z=1075.00/x-307.39/y-5.88)。また、学術展示では、それらの推測式に基づいて作成した、眼軸長を横軸、平均角膜曲率半径を縦軸とした調節麻痺下等価球面屈折値の等高線図を提示した。本内容は論文での投稿を進めている。また、平成29年度は新たな対象をもとに、平成27年度に報告した3歳児の推測式(森隆史,他:日本人3歳児における眼軸長と角膜曲率半径による調節麻痺下等価球面屈折値の推測.眼臨紀, 2015)の精度について検証を行い、第58回日本視能矯正学会で報告した。推測式による予測値と実測値の差は、本法を報告した際0.5D未満であったものが47%、1.0D未満であったものが71%だったのに対し、追加研究では0.5D未満であったものが50%、1.0D未満であったものが87%と比較的良好な精度を確認することができた。そして、平成29年度には、「3歳児健診でのIOLマスターの使用経験」について、第73回日本弱視斜視学会で報告し、眼科臨床紀要11巻に論文掲載された。弱視治療年齢で非侵襲的な検査により、眼軸長(x)と平均角膜曲率半径(y)から調節麻痺下等価球面屈折値(z)を予測する推測式を作成した。推測式は3歳z=1111.43/x-321.97/y-7.17、4歳z=1120.68/x-285.33/y-11.83、5歳z=1245.87/x-309.57/y-14.20、6歳z=1177.68/x-278.23/y-14.80、7歳z=1206.80/x-362.55/y-4.59、8歳z=1075.00/x-307.39/y-5.88となり、これらの式から簡便に球面屈折値が求るための、眼軸長を縦軸、平均角膜曲率半径を横軸にした等高線図を作成した。遅滞なく学会発表を行い論文投稿を進めた。遅滞なく本研究の成果を社会に発信するため、目標の症例数(50例100眼)に到達した年齢ごとに順次、学会発表を計画する。遅滞なく本研究の成果を社会に発信するため、目標症例数に到達した年齢ごとに人事、学会発表を計画する。眼科学平成26年度に得た知見を基に症例数を増加させ、その成果を学会で発表し論文投稿を行う。平成27年度中に4歳から8歳の症例蓄積が目標数に至らず、成果発表を平成28年度に持ち越したため。平成28年度中に症例蓄積が目標数に至らず、成果発表を平成29年度に持ち越したため。平成28年度に学会発表および論文投稿による成果発表を行う。平成29年度に学会発表および論文投稿を行う。
家族立ち会い出産に参加した子どもの同胞誕生前後の行動特徴に関する調査研究-出産参加群・非参加群の母親への妊娠末期から産後6ヵ月までの追跡調査より-

本研究は、第2子以降の誕生に際して、上の子ども(以下上子と記載する)を立ち会い出産に参加させた母親の体験及び同胞の誕生場面に参加するという体験をした上子への影響を明らかにすることを目的とした縦断的継続研究の一部である。今回は、上子を同胞誕生場面に参加させた母親と、参加させなかった母親の両群を対象として、妊娠末期から産後6カ月まで縦断的質問紙調査を行い、誕生場面に参加した上子の同胞誕生前後の行動に見られる特徴を明らかにすることを目的とした。H14年4月からH16年12月までに上子参加予定群108名、非参加予定群100名の合計208名への妊娠末期の調査を開始し、その後引き続き産後3日目、1ヵ月、6ヵ月と追跡調査を行っている。以下、現在回収できたデータについて分析結果の概要を報告する。χ^2検定、t検定、Wilcoxonの順位和検定、Kruskal-Wallisの順位和検定を用いて統計的解析を行った。1)対象者の特徴:年齢、学歴、就業形態、家族形態、子どもの人数・性別等に両群間の統計的有意差は認められなかった。過去の出産体験については、上子参加予定群に前回家族立ち会い出産を体験した者の割合が有意に多く、出産への満足感が有意に高かった。2)上子への準備:参加予定群は、同胞誕生予告の時期が有意に早く、また「妊婦健診への同伴」「出産の知識提供」等同胞誕生にむけての準備を行っているものが多く、10項日中7項目に有意な差を認めた。3)上子の行動特徴:妊娠初期の『同胞誕生予告への反応』には両群に有意な差は認められなかった。妊娠末期までの『今回妊娠中に出現した行動(22項目)』の有無では、「愛着行動のまね」「母親へのいたわり」等7項目に有意な差がみられ、同22項目の『行動頻度』(5段階リッカート式)調査では12項目に有意差が認められた。さらに、同胞誕生後の『行動頻度(23項目)』調査では、参加群と非参加群との間に統計学的に有意な差が認められる行動が、産後3日目に9項目、1ヵ月時に11項目、6ヵ月時に2項目存在した。今後は、産後6ヵ月の全てのデータを回収後、『行動頻度』等について妊娠末期から4回に亘る一連の経時的な変化に着目して、参加群と非参加群との間に違いが認められるかを解析したい。本研究は、第2子以降の誕生に際して上の子どもを家族立ち会い出産に参加させた母親の体験と、同胞の誕生場面に参加するという体験をした子どもへの影響を明らかにすることを目的とした縦断的継続研究の一部である。今回、萌芽研究として補助を受けた研究期間内に、上の子どもを同胞誕生場面に参加させた群と、参加させなかった群の母親を対象として、妊娠末期から産後6ヵ月までの縦断的質問紙調査により、誕生場面に参加した上の子どもの同胞誕生前後の行動特徴を明らかにしたいと考えた。本研究着手後の経過として、妊娠末期・産後3日目・産後1ヵ月・産後6ヵ月の質問紙原案を作成し、2ヵ月にわたり両協力施設において10名のプレテストを行い、内容、表現、記載量(所要時間)等の妥当性を検討し、次いでパイロットスタディを行った後、本調査を開始した。H14年4月から3年間に、同胞の誕生場面に上の子どもを参加させた経産婦100名と、対照群として、子どもを誕生場面に参加させなかった経産婦100名の合計200名のデータ収集を計画しているが、14年度内に、誕生場面に上の子どもを参加させた経産婦61名と、参加させなかった経産帰21名の合計82名のデータを収集した。現在、データ収集と平行してデータ内の不明確箇所を電話により本人に確認した後、SPSSへの入力を行っている。尚、上の子どもを出産に参加させなかった経産婦のデータ数が少ないことから、協力施設の拡大を検討中である。また、本調査研究は『上の子どもを家族立ち会い出産に参加させた母親の体験』に関する帰納的、記述的研究から得た知見を、演繹的に検証する縦断的継続研究である。従って、重要な関連研究として帰納的研究を縦断的に継続している。本研究は、第2子以降の誕生に際して上の子どもを家族立ち会い出産に参加させた母親の体験と、同胆の誕生場面に参加するという体験をした子どもへの影響を明らかにすることを目的とした縦断的継続研究の一部である。今回、萌芽研究として補助を受けた研究期間内に、上の子どもを同胞誕生場面に参加させた群と、参加させなかった群の母親を対象として、妊娠末期から産後6カ月までの縦断的質問紙調査により、誕生場面に参加した上の子どもの同胞誕生前後の行動特徴を明らかにしたいと考えた。本研究着手後1年目のH14年度に収集したデータについて、上の子どもを出産に参加させた経産婦のデータ数(61名分)に比較して、対照群である出産に参加させなかった経産婦のデータ数(21名分)が少ないという問題が生じた。従って、研究2年目となる15年度は、協力施設を4ヵ所に拡大することによってデータ数の偏りの是正を図った。その結果、14年4月から2年間に収集したデータ数は、誕生場面に上の子どもを参加させた経産婦87名と、参加させなかった経産婦65名の合計152名分となり、両郡間のデータ数の差が減少した。

16年度は、引き続きデータ数の偏りの是正に配慮して、当初の予定に従い同胞の誕生場面に上の子どもを参加させた経産婦100名と、対照群として、子どもを誕生場面に参加させなかった経産婦100名の合計200名のデータを収集し、分析を行うことを計画している。現在、データ収集と平行してデータ内の不明確箇所を電話により本人に確認した後、SPSSへの入力を行っている。また、本調査研究は『上の子どもを家族立ち会い出産に参加させた母親の体験』に関する帰納的、記述的研究から得た知見を、演繹的に検証する縦断的継続研究である。従って、重要な関連研究として帰納的研究を縦断的に継続している。本研究は、第2子以降の誕生に際して、上の子ども(以下上子と記載する)を立ち会い出産に参加させた母親の体験及び同胞の誕生場面に参加するという体験をした上子への影響を明らかにすることを目的とした縦断的継続研究の一部である。今回は、上子を同胞誕生場面に参加させた母親と、参加させなかった母親の両群を対象として、妊娠末期から産後6カ月まで縦断的質問紙調査を行い、誕生場面に参加した上子の同胞誕生前後の行動に見られる特徴を明らかにすることを目的とした。H14年4月からH16年12月までに上子参加予定群108名、非参加予定群100名の合計208名への妊娠末期の調査を開始し、その後引き続き産後3日目、1ヵ月、6ヵ月と追跡調査を行っている。以下、現在回収できたデータについて分析結果の概要を報告する。χ^2検定、t検定、Wilcoxonの順位和検定、Kruskal-Wallisの順位和検定を用いて統計的解析を行った。1)対象者の特徴:年齢、学歴、就業形態、家族形態、子どもの人数・性別等に両群間の統計的有意差は認められなかった。過去の出産体験については、上子参加予定群に前回家族立ち会い出産を体験した者の割合が有意に多く、出産への満足感が有意に高かった。2)上子への準備:参加予定群は、同胞誕生予告の時期が有意に早く、また「妊婦健診への同伴」「出産の知識提供」等同胞誕生にむけての準備を行っているものが多く、10項日中7項目に有意な差を認めた。3)上子の行動特徴:妊娠初期の『同胞誕生予告への反応』には両群に有意な差は認められなかった。妊娠末期までの『今回妊娠中に出現した行動(22項目)』の有無では、「愛着行動のまね」「母親へのいたわり」等7項目に有意な差がみられ、同22項目の『行動頻度』(5段階リッカート式)調査では12項目に有意差が認められた。さらに、同胞誕生後の『行動頻度(23項目)』調査では、参加群と非参加群との間に統計学的に有意な差が認められる行動が、産後3日目に9項目、1ヵ月時に11項目、6ヵ月時に2項目存在した。今後は、産後6ヵ月の全てのデータを回収後、『行動頻度』等について妊娠末期から4回に亘る一連の経時的な変化に着目して、参加群と非参加群との間に違いが認められるかを解析したい。
末梢神経修復術における筋枝神経束の識別に関する実験的および臨床的研究

末梢神経修復に際し,筋枝・知覚枝の各神経束を識別することは機能的予後を確実なものとするのに根本的に重要である。A.上肢における筋枝,知覚枝の識別について1.実験的研究成猫の前肢における〓骨神経深枝(筋枝)と浅枝(知覚枝)の識別な以下の結果により可能であった。i)椎問板刺激法(C5/6):まず筋枝のみから電位が導出された。ii)硬膜外後方刺激法(C_5):知覚枝から導出された電位はnonーsynapticな活動電位と後根反射電位からなり,筋枝からの電位はnonーSynapticな活動電位と単シナプス反射電位からなると考えられた。iii)椎間板導出法:知覚枝刺激ではC_<4/5>,C_<5/6>およびC_<6/7>高位において著明な第2陽性電位が出現するのに反して筋枝刺激ではその電位は得られなかった。この電位の起源は脊髄内電位の検討によって脊髄背面近くに存在することが示唆された。2.臨床応用上位型〓神経叢損傷の神経修復術に際して,全身麻酔下(GOE^^<^>),C_<5/6>およびC_<6/7>椎間板ではC_7皮膚筋である中指刺激を行うこと,初期陰性成分に続く大きな陽性成分が観察されたのに反して,C_7筋節である上〓三頭筋々枝刺激によっては出現しなかった。この事実は実験結果ともよく一致した。B.下肢における筋枝,知覚枝の識別について成猫を用いて以下の実験を行なった。馬尾硬膜外背側を刺激し,下腿三頭筋々枝および腓腹神経から下行性末梢神経活動電位を導出し,上行性馬尾活動電位と対比した。筋枝のH波は前者において観察されやすく,知覚枝の後根反射は前者でのみ観察された。下行性脊髄刺激法(上位腰髄)によれば,筋枝導出の電位群には単シナプス反射が含まれ,知覚枝から導出された電位群は,nonーsynapticな活動電位と後根反射電位から成ると考えられた。上記により両者の識別は可能であった。問題点経皮的針導出によって馬尾一下行性末梢神経活動電位の臨床役用において,これら脊髄反射波はは誘発筋電位に隠されやすかった。さらに筋弛緩剤を用いても導出困難な例が多く認められた。末梢神経修復にさいし、筋枝・知覚枝の各神経束を識別することは、それらの神経束間でのmissdirectionを避け、機能的予後を確実なものとするのに根本的に重要である。そこで成猫を用い以下の結果を得た。1.上肢における筋枝・知覚枝の識別(1)橈骨神経深枝(筋枝)と浅枝(知覚枝)を露出し、それぞれを電気刺激し、C_6_/_7椎間板から針電極により電位を記録すると知覚枝刺激による方がその第2陽性成分が大きかった。

(2)C_6_/_7椎間板刺激により筋枝および知覚枝記録を行なうと、弱刺激では前者からは順行生活動電位(10400w)を含む電位が得られたが、後者からは電位(2-3w)は導出されなかった。(3)C_7椎弓下刺激の強度を上げると筋枝では活動電位、およびそれに続く2つの反射電位が得られたが、知覚枝では活動電位のみあった。(4)今後の展開:経頭蓋刺激を行なわなくとも上記方法による臨床応用の可能性が示唆された。今後橈骨神経のみならず、正中、尺骨神経についても脊髄と関連させて検討を加え、また今回得られた反射電位の起源も調べる予定である。2.下肢における筋枝・知覚枝の識別(1)下腿三頭筋々枝および知覚枝(腓腹神経)を脛骨神経から剥離し、馬尾刺激により、それぞれから下行性末梢神経活動電位(CE-CNAP)を導出した。筋枝からはH波に相当する電位、知覚枝においては後根反射と考えられる電位が観察され、この2種類の電位の替時および波形の相違によって識別は可能であった。(2)筋枝、知覚枝をそれぞれ電気刺激し上行性馬尾活動電位(A-CEAP)を導出し、CE-DNAPと比較すると、筋枝のH波は後者において観察されやすく、知覚枝の後根反射は後者でのみ観察された。従って実験上これらの脊髄反射波の観察にはCE-DNAPの方が有用と思われた。(3)今後の展開:経反的針導出によってCE-DNAPの臨床応用を数例に施行したが、これらの脊髄反射波は誘発筋電位に隠されやすかった。筋池緩剤を用いても導出困難例が多く認められ、今後検討の予定である。1.上肢における筋枝、知覚枝の識別についてA.猫を用いた実験的研究a)橈骨神経浅枝および深枝体性感覚誘発電位:浅枝刺激によるSEPの方が深枝刺激によるよりも明瞭であり、両者の識別は可能である。b)硬膜外刺激による浅枝および深枝神経活動電位:C_7椎弓下硬膜外刺激により筋枝からは3個の陰性電位が観察された。それらに対する高頻度刺激(100Hz)の効果から、第1、第2陰性成分はそれぞれnon-synapticな活動電位、単シナプス反射電位と考えられた。刺激強度を1.2mAから5.7mAに上げると、浅枝からは最初の陰性成分に続く陽性成分が観察され、後者の電位は、picrotoxinの投与(i.v.)によりおさえられたので後根反射電位と考えられ、両者の識別は可能であった。c)椎間板刺激による筋枝および知覚枝NAP:C_<5/6>椎間板刺激では、先ず深枝のみ電位の導出された。d)筋枝ならびに知覚枝刺激による椎間板導出電位では特にC_<4/5>、C_<5/6>およびC_<6/7>高位において著明な第2陽性電位が出現し、筋枝刺激では現れなかった。この電位は刺激側のC_4へT_1後根切断により消失することから、脊髄内電位を反映していると思われ、現在タングステン電極(φ100μ)による脊髄内電位の検討を行なっている。B:臨床的研究GOE^^麻酔下、中指指神経刺激によるC_<5/6>およびC_<6/7>椎間板電位において、実験結果と同様、初期陰性成分に続く大きな陽性成分が観察されたのに反して、上腕三頭筋々枝刺激によっては出現しなかった。2.下肢における筋枝、知覚枝の識別実験的にはL_7硬膜外電極による馬尾刺激により、下腿三頭筋筋枝からはH波に相当する電位、腓腹神経からは後根反射電位が導出され、両者の識別は可能であった。臨床的には針電極を皮膚上から脛骨、総腓骨神経近くに挿入する方法を用いているため、通常のミオブロック投与量では神経活動電位は誘発筋電位に隠されることが多い。ミオブロック投与量を検討中である。末梢神経損傷に対する修復術を確実に成功させるためには運動神経を筋枝神経束へ,知覚神経を皮膚神経束へ再生させるべく神経縫合を行なうことが根本的に重要である。A,上肢における筋枝,知覚枝の識別について1.実験的研究
ナノ・マイクロ操作技術を用いたDNA修復蛋白質の一分子解析

今年度は前年度より引き続き、Rad51蛋白質がDNAをねじる際のトルクの計測のため、我々が用いているFree Rotation Magnetic Tweezersの使用に際し問題であった残留磁界を最小限に抑えるため、磁気ピンセットの永久磁石のアライメントなどによる残留磁界の抑制と、顕微鏡の視野を広げるなど、より高精度でかつ効率よく実験が進められるよう主にセットアップの改善につとめた。結果、これまでDNAのねじり運動による磁気ビーズの回転1つを確認する時間を、数時間から数十分に短縮することができた。一方で、Rad51のDNAへの重合過程は次第に明らかになってきているが、その次のステップであるHomology searchなど、相同組み換えの核心といえる過程を解析するためには、ねじり方向の計測だけではなく、DNA上での蛋白質フィラメントの挙動の計測と解析も同時に進める必要がある。また一度に多数のデータを取得するため、ハイスループット化も重要な課題であった。そのため、マイクロチャネルとナノチャネルを組み合わせたハイスループットDNA配列チップの開発も進めた。マイクロチャネル内のDNA分子は空洞の親水性ナノチャネル(幅100nm、高さ100nm)内へ1本ずつ、毛管力(キャピラリーフォース)により無動力で進入する。DNAの伸長の度合いは最適なナノチャネルの幅と高さを設計することにより制御できる。これらの現象を用い、ナノチャネルを用いてDNAを一分子ごとに引き延ばし、任意の位置で任意の向きに配向する技術の開発を行い、ナノチャネル内にDNAを一分子ごと挿入することに成功した。ナノチャネルの長さの最適化により試料の拡散現象を利用してDNA周辺の生化学的条件を調節し、種々の生化学実験を行うことができる。またナノチャネルの出口付近の形状を最適化することにより、DNAを任意の位置に配向することも期待できる。このデバイスを用いたDNA上におけるRad51やRecAなどの蛋白質フィラメントの挙動の直接計測により、相同組み換え機構において重合の次の過程であるHomology searchやStrand exchangeなどの重要なステップの解析が期待される。本研究の目的はRad51蛋白質に代表されるDNA修復酵素がDNAと重合する際におこる機械的挙動を一分子単位で計測することにより、機械的挙動や消費エネルギーなどのパラメタを計測し、DNA修復過程の解明を目指すことである。これまで測定可能であったDNAの伸長方向への挙動だけでなく、回転方向の挙動を測定する測定機器を製作することにより、一分子レヴェルでの挙動を高感度で検出することに成功した。DNAをねじる際に生じるトルクを付着させたマイクロビーズの振動から測定した結果約15pN・nmであることがわかった。その値はDNAの2重螺旋をほどくために必要とされる機械的トルクそ計測した先行研究の値と比較するとやや大きな値となり、DNAの2重螺旋ほどくのに十分な値であり、生物学的にも納得のいく値となった。ただし実験セットアップにみられる残留磁界などの影響による大きな誤差が予測されるため、さらなる精度向上が求められる。また回転運動時にみられるステッピング運度の解析を行った。ステップの大きさを正確に求めるため、実験をくりかえし、より多くのステップのデータを集めた。Pairwise analysisやフーリエ解析や、近年Svodobaらにより提案された解析法を用い、一分子がDNAをねじる角度は65度であるという正確な値を算出することに成功した。この値は結晶解析などの研究から予測されていた30度から75度の範囲内であり、先行研究と照らし合わせて納得のいく値であった。またこの値から、蛋白質1つにつきDNAの塩基対3.5に相当するstoichiometryを算出することができた。この値も先行研究と照らし合わせて納得のいく値であった。現在これらの成果と、成果の生物学的重要性をもとに論文を執筆し、投稿する予定である。これまでFree Rotation Magnetic Tweezers(以下FRMT)により相同組み換えたんぱく質であるRad51の2本鎖DNAへの重合過程を蛋白質一分子レベルで測定することに成功していた。今年度はたんぱく質1分子当たりのDNAをねじる角度に関してさらに多くのデータを集め、統計的な解析をすることにより1分子あたりのねじり角度65度を割り出した。またRad51は1分子ごとにDNAに重合すること、75-100nM以下のたんぱく質濃度では重合が開始しないことなどもわかった。この一分子ずつ付着するメカニズムは多分子で重合する場合よりも、フィラメントに欠陥ができる確率を減らすことができるメカニズムである。これらの結果をもとにして出筆した論文を国際学会誌に提出した。その後査読結果のレフリーのコメントにもとづき、DNAに固定したビーズの逆回転運動がたんぱく質のDNAからの乖離であるという主張を補足するため、ATPとRad51でフィラメントを形成した後にADP溶液で置き換える、ないしATPもADPも存在しない溶液で置き換える実験を行った。その結果、ATPもADPも存在しない溶液ではDNAに固定されたビーズの逆回転が見られたのに対し、ADP存在下では逆回転が見られなかった。これは少なくともフィラメントがADPを放出しない限りはたんぱく質がDNAから乖離しないことを意味する。これらの実験結果を含めたことにより論文が採択された。また国内の学会においてもこれらの成果を発表した。今後はこれらのたんぱく質がDNAをねじる際に出すトルクのより精密な計測に焦点を絞る予定である。