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大強度パルスイオンビームによる超高硬度材料の創製

我々が世界で初めて提案した大強度パルスイオンビーム蒸着法(Ion Beam Evaporation:IBE)を用いて、超高硬度材料の創製を、特に薄膜化の観点から研究し、下記の成果を得た。作成を試みた材料は、β-C_3N_4、B_4C、Ti-Al金属間化合物等の超硬度材料である。1)大強度パルスイオンビーム(Light Ion Beam:LIB)をメラミン樹脂ターゲットに照射して高密度プラズマ化し、隣接する基板(Si)上に堆積を試みた。成膜速度は5nm/ショットである事、基板温度を上昇するとCNの三重結合が成長する事、温度上昇と共に窒素の含有量が増大する事、硬度は1GPaである事、薄膜表面のモフォロジーは極めて良好である事、等が判明した。真空中で、基板加熱の有無に関わらず、CN薄膜化に成功した事は世界で初めてである。2)LIBをB_4Cターゲットに照射し、Si(100)基板上に成膜を試みた。薄膜のフーリエ赤外吸収分光による化学結合状態は、B_4C標準資料と同じスペクトルを示し、X線回折ではB_4C構造で結晶化している。ビッカーズ硬さは16GPaで、硬質材料として十分な硬度であり、モフォロジーが良く、剥離の無い、硬質薄膜の作成に成功した。3)LIBをTi-Al合金ターゲットに照射し、基板(ガラス又はSi)上に成膜を試みた。真空中、基板加熱無しで、Ti_3Al膜が作成され、(002)面に配向する事、基板加熱すると(002)面への配向性が強くなる事、等が判明した。1988年に、我々が世界で初めて提案した大強度パルスイオンビーム蒸着(Intense Pulsed Ion Beam Evaporation:IBE)法を用いて、超高硬度材料の作製について、特に薄膜化の観点から研究を行い、下記の成果を得た。尚、得ようと試みた薄膜は、SiCとCNである。ここで前者は、高硬度、耐磨耗、耐熱性、耐蝕性に優れ、メカニカルシールやガスタービン等への応用が期待されている。一方、後者も高硬度材料として注目されているが、薄膜化が極めて困難なことでも知られている材料である。1)大強度パルスイオンビーム(Intense,Pulsed,Light IonBeam:LIB)をSiCターゲットに照射し、高密度プラズマ(プラズマ密度10^<20>cm^<-3>)化して、これを隣接する基板(Si)上に堆積して、SiCを薄膜化することに成功した。このとき、X線回折分析から、得られた薄膜は、立方晶であることが判明した。更に、スクラッチ試験から、ターゲット・基板間距離が小さい程、基板と薄膜の密着性が増加することが判明した。本実験のように、基板加熱なしで、しかも真空中での成膜は、これまでに成功例は無い。2)大強度パルスイオンビーム(LIB)をメラミンターゲットに照射し、高密度プラズマ(プラズマ密度10^<20>cm^<-3>)化して、これを基板(Si)上に堆積してCNの薄膜化に成功した。ラザフォード後方散乱計測から、窒素の欠損はそれ程顕著ではなかった。通常の成膜法では、炭素に比べて、窒素が大幅に減少することが知られており、大きな問題となっていた。CNの薄膜化はこれまで非常に困難であったが、組成が比較的類似しているメラミンに注目し、CN薄膜化に成功したことは世界初であり、独創的であると自負している。
軽量な空間リンク機構による身体拘束のない歩行補助システムの開発

1入力で歩行を補助する装置の骨格となる機構について,シミュレーションと試作を行った.2つの片脚分の試作で機構による歩行動作の創成を確認し,3つめの試作では,両脚分として,静歩行に対して腕部駆動の形式で行った.静歩行とすることで,装置の重心位置の変動は小さくなり,使用者もバランスを取りやすくなったが幾分窮屈な動作となっている.また,右手で右脚,左手で左脚を駆動する動作が腕部を含めた動作で見ると不自然さがある.一方,サドルを用いることで身体拘束を低減し,部位によっては装置を使用することで筋活動量の低下を確認した.使用対象者を限定しない装置とするには,歩容の変化への対応などが課題となる.外部からの動力供給を要することなく歩行動作の補助を行う装置の設計・製作は,使用者自身で行うことのできる装置として,本年度,製作することができた.昨年度までは,片脚のみの補助であったが,両脚分をモータで補助する形式を試作する段階を経て,今年度,両脚の補助を腕部による駆動する形式で試作するに至った.歩容としては,歩幅は小さく,足部の上下動も小さい,控えめなものである.ただ,採用されたリンク長は,クランク長が10mmであるのに対し,最大リンク長が600mmあり,このリンク長比が大きくなったために,駆動するのに練習が必要な装置となっている.あるいは,左右独立して駆動する形式であるために左右での協調動作が行なえず,使用者にある程度の熟練を要している.身体に固定するフレームにサドルを併用することで,使用者の体重を装置で支持することに一定の効果を確認することができた.ただ,装置を装着するための身体拘束による使用者への負担はまだ改善されていない.筋電位等での補助効果の評価も行っているが,装置全体の重量のために.筋肉によってはかえって活動量の大きな結果となっている.次年度は,これらを踏まえ,クランクの回転動作による足部の案内が円滑に行えるよう,機構のリンク長を適正化しながら装置の使用材料を見直し,軽量化および身体拘束による負担が使用者に及ばないよう改良が必要になる.研究実施の1年目にあたる本年度では,身体拘束の是非について考察するため,補助を行う対象の動作として,歩行,床からの立ち上がり,起き上がりの3種類の動作について計測を行った.人体への拘束を比較的緩やかにできるのは,大きな出力での補助を必要としない膝装具である.この膝装具は,膝関節の拘束を行う一方,歩行の補助を行うよう設計したものである.また,立ち上がりの補助装置では,座面の運動による大腿部への力の伝達を行う形式とすれば,人体の重心への力の作用は比較的容易であり,拘束は緩やかなもので十分である.それに対して,人体と補助装置との拘束を厳格に必要とするのは,歩行時の脚部筋肉全般の補助を行う装置や起き上がり補助の装置である.体重を支える脚部を補助するために大きな力を人体重心位置に作用させる必要があり,装置と人体の位置関係が動かないようにするためには,強い拘束が必要になっている.起き上がり動作における胸部を支える装置では,生理的曲線に沿った人体の運動が,空間的に大きいものであるため,補助装置からの力の作用線を常に人体の同一の点を通過させるのが困難であるため,拘束を必要としている.歩行の補助では,歩容の変化,特に足裏と地面の位置関係を意図的に変化させた場合で補助を行う装置を設計し(シミュレーションし),実際に製作している.ただし,片脚のみ製作であるため,体重を指示するのに十分ではなく,身体拘束が必要になっている.使用者自身が操作・駆動する形式の歩行補助装置を製作した。製作にあたり,その装置で使用する機構構造をシミュレーションで確認している。平成25年度は歩容を穏やかなものとし,静歩行への対応を試みた。装置の性格上,転倒の危険性を排除するために有効と判断したからであった。しかしながら,通常の歩行動作からの乖離が見受けられ,歩行という移動動作を補助する装置としては必ずしも使いやすいものではない。また,使用対象者に広く対応するためには,後ろへの蹴り上げの大きな動歩行への対応の可能性を検討すべきとした。本年度(平成26年度)の実績としては,機構の構造を見直し,動歩行の特徴とも言える後方への蹴り上げの大きな動作を再現できる機構定数をシミュレーションで決定した。その機構を用いた試作も行い,予備的な駆動試験を行った。足関節の描く軌跡の再現は,比較的行えているものの,使用者自身のハンドルへの回転運動の入力ではトルク不足となる位置があり,補助装置としては十分ではないことが判明している。部品の形状や駆動部の構成などを変更してある程度の改善は可能という見通しを得ているが,更なる機構構造の変更についても検討すべきと思われる。また,動歩行による転倒の危険が高まったことから,歩行器のようにキャスタ付きのフレームを試験的に追加した。このことで装置は大型化したが,装置の自重を使用者が支える必要はなくなった。将来的にはこのフレームがなくとも装置が自立する形式を目指すが,駆動を担う機構部の試作が必要な現段階においては,評価を行うのに有効な構造であると思われる。すなわち,キャスタ付きフレームにより装置が自立したことで,装置の足裏部と床の接触状態やハンドルの駆動に要する体重と床反力の関係など,課題を見出すことができた。動歩行での補助を行えるように機構の改良を試みている。

足部の運動を1自由度の機構で案内する形式であるが、足部の位置は、機構である程度再現できるが、足部あるいは足裏の向きまで見ていくと必ずしも十分ではない。そこで、装置を構成するある一つのリンクの長さを可変とすることで冗長性を与え、足裏の向きにも対応するよう試みている。また、脚部補助機構のクランク軸まわりの回転入力を、歯車機構を介して、使用者自身の腕部でで行うよう、装置の設計・試作をしている。その際、脚部右側を腕部左側で、脚部左側を腕部右側で駆動するようにし、歩行時の脚部と腕部の位相の関係を再現している。試作した装置を実際に使用してみたところ、歩行時に腕部を回転運動させることに使いにくさがあり、連続した歩行動作で装置を使用するのが困難であった。一歩一歩、左右で別々に装置を駆動する動作となり、滑らかな歩行動作とならなかった。1入力で歩行を補助する装置の骨格となる機構について,シミュレーションと試作を行った.2つの片脚分の試作で機構による歩行動作の創成を確認し,3つめの試作では,両脚分として,静歩行に対して腕部駆動の形式で行った.静歩行とすることで,装置の重心位置の変動は小さくなり,使用者もバランスを取りやすくなったが幾分窮屈な動作となっている.また,右手で右脚,左手で左脚を駆動する動作が腕部を含めた動作で見ると不自然さがある.一方,サドルを用いることで身体拘束を低減し,部位によっては装置を使用することで筋活動量の低下を確認した.使用対象者を限定しない装置とするには,歩容の変化への対応などが課題となる.歩行動作の再現はある程度行える装置が製作できている。ところが,歩行動作を補助するには十分な補助効果が得られておらず,静歩行および動歩行に関わりなく補助を行える装置の設計指針への考察が十分でない。また,装置からの補助を効果的に得ようとすると,身体と装置との拘束が必要となり,その点での使用者への負担経験も十分ではない。工学脚部の動作が比較的大きな動歩行においても十分な補助が得られる機構構造の検討と力学的な評価手法を行う。また,試作した装置の動作を容易に測定できるシステムの構築を行う。また,身体拘束を必要としないで体を支えるフレーム構造をシンプルに構成する方法を検討する。装置の試作はできたものの,その評価から次の試作に反映させる設計がやや遅れている.また,骨盤の動きに合わせて装置も3次元の運動に対応する計画であるが,その点での対応もできていない.装置に用いる機構について,シミュレーション結果をもとに試作している.装着型歩行補助装置では,使用時での表面筋電位計による評価や機構の運動測定など行なっているが,片脚のみの製作でること,身体拘束を厳格に行う必要があるなど,まだ十分ではない.また,空間リンク機構の活用などには至っていない.モータで試験的に駆動する装置においては両脚分の補助装置を試作している.装置全体の重量もあり,使用者への負担も小さくない.最終的に採用する予定である使用者自身の腕部で駆動する形式については,片脚のみの試作であるが,その効果を確認することができた.歩行を補助する膝装具については,足の拇指関節の運動を入力として,足関節を固定しているものとそうでないものとを試作している.歩行時の膝関節でのトルクを補助するものであり,大きな出力を必要としないことから,人体への拘束は比較的緩やかなものである.
歯髄細胞培養系における活性型ビタミンD_3のオステオポンティン産生促進機構

オステオポンティン(OPN)は、高度にリン酸化され、ハイドロキシアパタイトに高い親和性を持ち、細胞外基質の石灰化過程、あるいは細胞の接着、伸展、癌細胞の転移などに関与していると報告されている蛋白であり、種々のホルモンや細胞成長因子によりその合成分泌が調節されることも知られている。ラット切歯歯髄由来の株化細胞RPC-C2Aは、OPN蛋白を合成分泌しカルシウム代謝調節因子のひとつである活性ビタミンD^3により、OPN蛋白合成量およびOPNmRNA量の促進を受けることを筆者らは報告している。(1994 Archs.Oral Biol.)この歯髄OPNmRNA量の増加が、活性型ビタミンD_3の直接作用なのか、ある蛋白を介在する間接作用なのかを解明するために、蛋白合成阻害剤のひとつであるシクロヘキシミドを細胞に作用させ、ノーザンブロット分析によりOPNmRNA量を解析した。活性型ビタミンD_3の添加により、コントロールより上昇したOPNmRNA量は、シクロヘキシミドの添加により、コントロールレベルまで下がった。ところが、活性型ビタミンD_3とシクロヘキシミドを同時に作用させると、活性型ビタミンD_3のみ添加したときと同様のOPNmRNA量を示した。このことにより活性型ビタミンD_3の添加による歯髄OPNmRNA量の増加は、活性型ビタミンD_3の直接作用であることが推測される。このことより骨牙細胞様細胞Osteosarcomaの株化細胞ROS17/2.8のOPN遺伝子の様にこの歯髄OPN遺伝子にもVitaminD Responsive Element (VDRE)が、存在することが推測される。
タンパク質の生産・品質管理の場としての小胞体網状構造の形成とその意義

分泌蛋白質や膜蛋白質は、小胞体に於いて作られた後にゴルジ体に送られ、そこで修飾・選別されて、目的地に送られていく。これら小胞体やゴルジ体はそれぞれ網状構造と扁平膜積層構造という特徴的な形態を呈しているが、これらの形成維持に働く細胞内膜融合機構として97ATPaseによる膜融合機構がある。細胞内小器官は、分裂期に入ると小胞化して細胞質全体に広がり、細胞分裂期終期に於いて娘細胞に於いて再構成される。この娘細胞における再構成に必要なp97膜融合機構としてp97/p47経路を我々は見出しており、さらに間期における細胞内小器官の維持に必要な膜融合機構としてp97/p37経路を報告している。さらに我々は、このうちのp97/p47経路によるゴルジ体の再構成がVCIP135の脱ユビキチン化活性を必要とすることを先に明らかにしている。そこで、今回は、小胞体におけるp97ATPase膜融合機構がVCIP135の脱ユビキチン化活性を必要とするかどうかについて検討した。そこで先ず、小胞体の網状構造を試験管内で再構成するin vitro系を立ち上げた。この系において、脱ユビキチン化活性を持たない変異VCIP135が、p97/p47及びp97/p37経路の両方に於いて依然として機能していた。また、VCIP135と結合してその脱ユビキチン化活性を促進するWACは小胞体には存在せず、WACの発現を抑制しても小胞体の形態には変化は見られなかった。以上から、小胞体の形成に働くp97膜融合経路に於いては、VCIP135の脱ユビキチン化活性は必要でないことが明らかとなった。試験管内で小胞体の網状構造を再構成する我々独自の系が動きだしたので、今後のより一層の研究の進展が望みうる。小胞体形成に働くp97膜融合経路の新規因子をさらに同定していきたい。小胞体はタンパク質の産生・品質管理の場であり、細胞の根幹をなす細胞内小器官である。その形態は大変に特徴的で、細胞質全体に拡がる網状構造を示す。それらの構造は下等生物から哺乳類まで幅広く見られることから、その複雑な構造はその機能であるタンパク質の産生・品質管理と密接に結びついていると考えられる。そこで本研究では、以下の二点を明らかにすることを目的として研究を行っている。I.小胞体の、チューブ状膜が分岐して形成する特徴的な網状構造が、どの様に形成・維持されるのか。II.その網状構造がタンパク質の生産・品質管理という小胞体の機能とどのように関連しているのか。本年は、上記のうちIについて主に研究した。まず最初に、ゴルジ体の膜融合に働くp97/p47経路とp97/p37経路が小胞体膜の融合にも働くことを、試験管内における小胞体再構成系で明らかにした。さらに、VCIP135がゴルジ体膜の融合ではp97/p47経路とp97/p37経路の両方で必要なことは分かっていたが、今回、小胞体膜の融合でもp97/p47経路とp97/p37経路の両方で働くことを明らかにした。興味深いことに、VCIP135の脱ユビキチン化活性は小胞体膜の融合では必要でなかった。加えて、VCIP135に結合してその脱ユビキチン化活性を促進する因子として、我々はこの程にp87を同定している。このp87はゴルジ体の膜融合では必須であったが、この小胞体の膜融合では機能してなかった。このことは、小胞体の膜融合ではVCIP135の脱ユビキチン化活性が必要でないことと一致する。

以上から、小胞体の形成に働くp97膜融合経路に於いては、VCIP135の脱ユビキチン化活性は必要でないことが明らかとなった。試験管内で小胞体の網状構造を再構成する我々独自の系が動きだしたので、今後のより一層の研究の進展が望みうる。小胞体形成に働くp97膜融合経路の新規因子をさらに同定していきたい。
ビフィズス菌を用いた経口がんワクチンのエピトープ解析とヒトへの有効性の検討

ビフィズス菌をプラットフォームとした経口がんワクチンが抗腫瘍効果を持つことがマウスモデルにおいて確認されている。これを元に、ヒトにおいてもHLAに抗原提示されるかどうか、また抗腫瘍効果が発揮されるかどうかを、ヒトHLAトランジェニック(Tg)マウスを用いて検討する。このことにより本剤がヒトの細胞においてもスプライシングされ提示されるかどうかを検討し、将来のヒトへの臨床応用につながる。一方、マウスの細胞株においてもヒトのHLAを導入する必要があり、現在遺伝子編集によって行っている。この経口がんワクチンをヒトへ応用する可能性が示唆されれば、がん治療において既存の化学療法や放射線治療に加え、新たな免疫療法が拓かれることになる。本WT1蛋白を発現させたビフィズス菌投与群におけるエピトープの検出を目的として、オーバーラッピングペプチド法を用いて試みている。このために予備実験としてヒトHLA-A2402陽性ドナーから単核球を採取しPBS、WT1ペプチド投与群、WT1蛋白を発現させたビフィズス菌にわけ各々と共培養をおこなった。培養開始後6日、12日後に単核球を回収しWT1特異的キラーT細胞の検出を試みた。この結果、PBS、WT1ペプチド投与群よりWT1蛋白を発現させたビフィズス菌投与群では有意にWT1特異的キラーT細胞を検出され、その割合はWT1蛋白を発現させたビフィズス菌投与量依存性、培養時間依存性であった。この結果からWT1蛋白を発現させたビフィズス菌投与はヒトの末梢血単核球を刺激し、クロスプレゼンテーションによりWT1特異的キラーT細胞を刺激することが明らかになった。この結果を踏まえWT1蛋白を11アミノ酸ごとに3アミノ酸ずつずらし、WT1蛋白のほぼ全域をカバーするペプチドを約100個合成した。現在、どのエピトープが効率よくWT1特異的キラーT細胞を誘導するか、検討中である。ヒトHLAトランスジェニックマウスの作製とともにマウス腫瘍細胞3LLにヒトWT1遺伝子とヒトのHLAを導入することを試みている。現在、ヒトトランスジェニックマウスの作製を試みており、遺伝子編集でヒトHLAとマウス腫瘍にヒトWT1遺伝子とヒトのHLAの導入を試みているが、HLA遺伝子、WT1逸電子とも導入に難渋している。今後導入方法を変更して試みる予定である。またオーバーラッピングペプチド法によってヒトでWT1を標的とした免疫として、WT1特異的な免疫反応を引き起こすエピトープを特定する。マウスでエピトープと判明したペプチドをヒトにおいても挿入してペプチドを合成する。これをIL-4/IL-7存在下にヒト末梢血単核球と共培養することで、エピトープ部分を特定することができる。

本年度の実験では、実験物品の購入にかかった金額が当初予定していたよりも少ない金額となり、それで実験を行うことができた。次年度使用額の使用計画としては、実験物品の購入や研究成果を発表する学会参加の旅費などを検討している。
グリア細胞における増殖性シグナルを担うp21^<ras>活性の細胞分化に準じた増強機構

申請者はこれまで、in vitroの実験から、生理活性物質であるエンドセリン(ET)-1がグリア細胞の一種であるアストロサイトに対して強力な増殖因子として作用し、その細胞内情報伝達系にprotein kinase C依存性とras依存性の独立する2つの経路があることを証明するとともに、in vivoの実験から、脳傷害後の傷害部位において組織内ET-1濃度が有意に上昇することを見出している。そこで本年度は、以下の2つのテーマについて検討した。1)ET-1のアストロサイトにおける増殖シグナルのうち、ras依存性pathwayの感受性が細胞分化に伴って増加することを予備的実験から確認しているので、その機構のspecificityを検討するとともにmechanismについても検討を加えた。2)中枢神経系(CNS)傷害後の組織再構築過程におけるアストロサイトの増殖に内因性ET-1が生理的に関与するか否かを、脊髄損傷モデルラットおよび一過性虚血傷害脳モデルラットを作製し、それらの傷害後のアストロサイトの増殖におけるET-1の関与を検討した。結果)1)現在、このテーマに関しては引き続き検討中であるが、ET-1以外に少なくともaFGFにおいても同様の現象が認められること、また、この細胞分化に伴う感受性の増加は単純に受容体の発現レベルのみでは説明がつかないことも明らかにしている。2)脊髄損傷ラットにおいて傷害部位でのET-1濃度の上昇に準じて、RC1-positive(RC1:未分化なグリア細胞を認識するmonoclonal antibody)かつBrdU-positiveの細胞が出現する。しかし、ET受容体のnonselective blockerであるSB209670を傷害部位に共存させると、このグリア細胞の増殖が抑制された。また、一過性虚血傷害脳モデルラットでは、脳傷害部位から調製したextractによる培養アストロサイトに対する細胞増殖活性が、ET-1の中和抗体によって抑制された。これらのことから、CNS傷害後の組織再構築過程におけるアストロサイトの増殖に、内因性ET-1が生理的に関与することを直接証明することができた。これらの成果を、Brain Res.およびJ.Neurosci.Res.に発表した(研究発表の項を参照)。
新生児ECMOによる呼吸,循環補助の研究

1.準備新生児の血管径の評価;正常新生児例に対し頚動静脈径、大腿動静脈径、臍動静脈径を超音波にて計測した。臍動静脈は生後12日目ぐらいまでの新生児でしか使用はできないと判断された。頚動静脈、大腿動静脈については、8Fr以下のカテーテルが使用可能と判断された。しかしながら、体外計測では血管径にかなりのばらつきがあり、また1mm以下の血管径の差がカテーテルサイズの選択性を持つかは疑問である。よって臨床的には開創後にカテーテルを選択するのが妥当と考える。2.実験ウサギが1羽しか入手出来ず、頚動脈より送血カニュラ、頸静脈より脱血カニュラを挿入したV-A ECMOの実験を行った。頚動静脈を露出した後、カテーテルサイズを測定した結果8Frのトロッカー(胸腔用)が適合した。ヘパリン0.5mlにてACTを200に保った。遠心ポンプは順調に回転し、1.0L/Kg/min間で流量がでたところで心室細動となった。この時点での血圧は20mmHgで、生命維持をすることができなかった。今回の実験より、循環補助には限界が有り、このカニュラサイズでは心停止時には対応が出来ないと考えられた。また、心室細動は体温低下によるものと考えられ、熱交換器の回路への組み込みの必要性を感じた。さらに実験を重ねて完全な循環補助をめざしたいと考える。
宇宙線変性衝撃波における粒子加速と磁場増幅

天体衝撃波における宇宙線加速機構の問題点である非線形反作用の問題を注入問題との関連に着目しながら議論した。数値シミュレーションおよび理論解析によって新しい注入問題の解を提唱し、これが既存の観測を矛盾なく説明し得ることを明らかにした。また、反作用によって変性を受けた宇宙線変性衝撃波の安定性を詳細に調べた。更に、相対論的衝撃波においては相対論的強度の電磁波によって、新しいタイプの変性衝撃波が形成されることも分かった。現在では宇宙空間中の無衝突衝撃波が高エネルギー宇宙線の起源であるとの説がほぼ確立されているが,未解決の大問題として注入問題と(宇宙線の)非線形反作用の問題が挙げられる.本研究では宇宙線の反作用まで考慮した宇宙線加速効率を理論・数値シミュレーションの立場から明らかにするのが目的である。本年度では主に注入問題の素過程について扱った.(注入問題と非線形問題は相互に密接に関連しており,相互理解が不可欠である.)天文学的な観測的では多くの場合において電磁波の放射効率の良い電子成分が重要な手がかりを与えるため,電子の注入効率を調べることが必要になる.我々は衝撃波ドリフト加速による上流の電子反射と,それに伴うホイッスラー波動の励起による電子注入モデルを提案してきたが,このモデルにおける注入効率の定量評価を試みている.これまでに衝撃波面がプラズマ不安定性による波状構造を持つことが示唆されていたが,この波状構造が電子注入に与える効果について調べた.波状構造をモデル化した衝撃波構造中での電子軌道を数値的に追尾した結果,電子の反射効率は落ちる傾向であること,しかしその一方で反射せずに下流に透過した成分は単純な理論予測以上にエネルギーを得ていること,などが明らかになったここで加速された電子は磁力線垂直方向に大きなエネルギーを持つことなどから,ホイッスラー波動の強度を増大させることが考えられ,その効果を含めた議論を今後行っていく予定である.宇宙線加速源の最有力候補である超新星残骸衝撃波では宇宙線の圧力によって衝撃波構造が変性を受けた宇宙線変性衝撃波が形成されている可能性が指摘されている。そのような衝撃波では衝撃波構造の変性が宇宙線の加速効率自体を変化させ、それがまた衝撃波構造に反映されるという非線形のシステムになっている。また加速された宇宙線の励起する不安定性は上流の磁場を増幅するとも考えられている。これらの過程は観測結果の解釈において非常に重要となってくる。一方で、本研究によってコンパクトな天体から放出される相対論的なアウトフローと星間物質との相互作用で形成される衝撃波においてもこのような衝撃波構造の変性が重要になってくることが分かった。相対論的なパルサー風は中心星由来の強い磁場を伴うと考えられるが、観測が示唆する磁場強度は理論予測よりも何桁も小さなものである。これは磁場のエネルギーを粒子のエネルギーに変換する過程が存在することを意味している(σ問題)。我々は新たに開発した相対論的な2流体シミュレーションコードを用いてパルサー起源の波(円偏波の磁気シア)を伴う相対論的フロー中に発生する衝撃波の数値シミュレーションを行った。その結果、典型的なパルサーのパラメータでは上流の磁気シアが衝撃波との相互作用によって大振幅の電磁波に変換され、その減衰に伴って電磁気エネルギーが粒子のエネルギーに非常に効率良く変換されることが分かった。この時励起された大振幅の電磁波は上流に伝播し(前駆波)、衝撃波の構造が大きく変性を受けることも分かった。この構造は宇宙線変性衝撃波と非常に類似しており、宇宙線の役割をここでは電磁波が果たしていることが推察される。この結果はこれまで知られていなかった全く新しい発見であり、今後は相互理解の発展が期待される。超新星残骸衝撃波を始めとする天体衝撃波では衝撃波で加速された宇宙線の反作用によって衝撃波の構造が変性を受ける宇宙線変性衝撃波が重要となる可能性が指摘されている.これは被加速粒子のスペクトルが衝撃波の変性によって影響を受け,更にはこれによって粒子加速効率が向上する正のフィードバック機構が働く可能性があるためである.一方で,我々の最近の研究ではパルサー風の終端衝撃波に見られるような相対論的衝撃波において大振幅の電磁波が自発的に励起され,上流のプラズマとの強い非線形相互作用を通じて同様の衝撃波構造の変性が起こることが分かってきた.そこで本年度は,より広い視点から変性衝撃波の構造に着目して研究を進めた.新たに開発した相対論的2流体シミュレーションを用いて,高速回転するパルサーによって励起された電磁流体波動を伴うパルサー風中の終端衝撃波の数値シミュレーションを行うことに成功した.これによって,パルサーの回転周波数が終端衝撃波における固有プラズマ周波数よりも高周波の場合には上述のような電磁波の励起が起こり,励起された電磁波は超音速の上流に伝搬し,散逸を通して上流プラズマの強い加熱および減速を引き起こすことが分かった.

ここで,大振幅電磁波が宇宙線変性衝撃波における宇宙線と同様の役割を果たすことを明らかにした.即ち,衝撃波において励起された電磁波は初期には下流向きに伝播しているが,密度擾乱によって散乱されることで上流に染み出し,変性を引き起こす.これは宇宙線が散乱を受けながら上流へ拡散し,上流で変性を引き起こす過程に酷似している.宇宙線変性衝撃波では変性による粒子加速効率の向上が示唆されているが,同様の効果が相対論的衝撃波の変性でも起こるかどうかは大変興味深い今後の課題である.当初の目的は宇宙線の効果による衝撃波構造の変性の理解を大きな目的としていたが、これまでの研究によって類似の衝撃波構造の変性が衝撃波で自発的に形成される大振幅の電磁波によっても起こることが分かってきた。これは当初予想し得なかった成果であり、またこれまで全く知られていなかった新しい現象である。そのため、これを詳細に調べることに重点を置いており、当初目的とは少し異なる研究を展開している。24年度が最終年度であるため、記入しない。通常の電磁流体的な衝撃波構造の変性は宇宙線の効果によってのみではなく、衝撃波で励起される大振幅の電磁波によっても引き起こされることがこれまでの研究で明らかになってきた。このような現状においては、当初目的のように必ずしも宇宙線に固執せず、非熱的成分(高エネルギー粒子および大振幅波動)による衝撃波構造の変性を調べるというより一般的な立場から変性衝撃波の構造を理解することが肝要であると考えている。特に両者の類似点および相違点を意識しながら研究を進めていく。
射影代数多様体の上の自己準同型写像の研究

非特異射影代数多様体Xから自分自身への全射正則写像fが非定値写像かつ同型写像でないとき、非自明な自己準同型写像(endomorphism)という。この時、fは必然的に有限写像となり、更にXの小平次元が非負ならばfは不分岐である事が知られている。私の研究目的は、非自明な自己準同型像を数多く持つ射影代数多様体の構造を代数多様体の分類論の視点から出来る限り具体的に調べることである。2002年に私は森理論(端射線の理論)と楕円ファイバー空間の理論とを駆使して、小平次元が非負の非特異3次元射影代数多様体Xで、非自明な自己準同型写像を許すものの完全な記述にほぼ成功していた:Xの小平次元=1で飯高ファイバー空間の一般ファイバーがアーベル曲面の場合のみが唯一、未解決であった。当該研究の成果として、この残された場合も中山昇氏(京大数理研)との共著論文(Endomorphisms of smooth projective 3-folds with nonnegative Kodaira dimension,II,J.Math.Kyoto Univ.47-1(2007),79-114)において解決した。更に以前の結果を精密化して、非自明な全射正則写像を持つ小平次元が非負である非特異3次元射影代数多様体の分類は以下の理想的な形で完成した。主定理:小平次元が非負な非特異3次元射影代数多様体Xが非自明な全射自己準同型写像を持つ為の必要十分条件は、Xの適当な有限次エタール・ガロワ被覆Yが或る非特異射影代数多様体W上のabelianスキームの構造を持ち、これがガロワ群Ga1(Y/X)の作用と同伴なことである。非特異代数多様体Xから、自分自身への全射正則写像fが、非定値写像であり、かつ同型写像でないとき、非自明な自己準同型写像(endomorphism)という。この時、fは必然的に有限写像となり、更にXの小平次元が非負ならば、fは不分岐である事が知られている。私の研究目的は、非自明な自己準同型写像を数多く持つ代数多様体の構造を、代数多様体の分類論の視点から調べることである。代数多様体の自己準同型写像は基本的対象でありながら、主に小平次元が負であるファノ等質空間(例えば、射影空間、グラスマン多様体)の場合に単発的に調べられているだけだった。又、複素力学系では、主に射影空間の上の非自明な自己準同型写像が研究されてきたが、我々の研究対象は写像でなく、多様体の構造である。それは、楕円曲線やアーベル多様体、トーリック多様体を含むクラスであり、非常に簡明な構造を持つと予想される。実際、私は論文(Endomorphisms of Smooth Projective 3-F olds with Nonnegative Kodaira Dimension, Publ. RIMS, 2002)において、極小モデル理論と楕円ファイバー空間の理論とを駆使して、小平次元が非負の非特異3次元射影代数多様体Xで、非自明な自己準同型写像を許すもののほぼ、完全な記述に成功した。唯一、未解決として残された場合が、Xの小平次元が1かつXの飯高ファイブレーションのファイバーがアーベル曲面の場合であった。今回、この場合も中山昇氏(京大・数理研)との共同研究で完全に解決した。更に我々は以前の結果を精密化し、以下の完全な結果を得た:小平次元が非負な3次元非特異射影代数多様体Xが、非自明な全射自己準同型写像を持つ為の必要

十分条件は、Xの適当なエタール・ガロワ被覆Xがとれて、次元が2以下の或る非特異多様体Wの上に、ガロワ群の作用と同変なアーベリアン・スキームの構造を持つ事である。非特異代数多様体Xから、自分自身への全射正則写像fが、非定値写像であり、かつ同型写復でないとき、非自明な自己準同型写像(endomorphism)という。この時、fは必然的に有限写像となり、更にXの小平次元が非負ならば、fは不分岐である事が知られている。私の研究目的は、非自明な自己準同型写像を数多く持つ代数多様体の構造を、代数多様体の分類論の視点から調べることである。複素力学系では主に射影空間の上の非自明な自己準同型写像が研究されてきたが、我々の研究対象は写像でなく多様体の構造であり、それは楕円曲線やアーベル多様体・トーリック多様体を含むクラスで非常に簡明な構造を持つと予想される。2次元の場合や、3次元で小平次元が非負な場合には、中山昇氏(京大・数理研)との共同研究によってこれらの多様体の構造は完全に解明された。それに反して、非自明な自己準同型写像を持つ小平次元が負の3次元非特異射影代数多様体の分類は'自己準同型写像がエタール'という条件を付加しても容易ではない。今年はこの条件付の場合を完全解決する事を主要目標に研究を行った。端射線の型が因子型ならば、端射線の収縮写像は楕円曲線を中心とする爆発の逆であることは以前の証明と同様に示せる。難点は端射線の個数が必ずしも有限個でなく極小モデルプログラムを自己準同型写像の範疇で走らせる為には種々の還元が必要なことである。その結果、非自明なエタール自己準同型写像を持つ小平次元が負の3次元代数多様体Xは、適当なエタール・ガロワ被覆をとることで、楕円曲線と曲線との直積または楕円繊維曲面の上のP^1-束、或いは楕円曲線の上のP^2-束を然るべき楕円曲線にそって逐次、爆発させて得られる。後者の場合にはAtiyahによる楕円曲線上のベクトル東の分類結果を用いることで、より詳細な構造解析が可能である。これらの多様体の候補の上に、実際に非自明なエタール自己準同型写像を構成することは今後に残された課題である。
高付加価値化を目指した紫黒米アントシアニンの一括分析法と栽培指針の確立

アントシアニンを豊富に含む紫黒米は健康食品として広く認識されているが、アントシアニンは環境条件によって含有量が大きく変化し、品種によってもその組成は大きく異なる。したがって、紫黒米の高付加価値化を目指すためには、品種ごとの正確な組成データとそれに裏付けられた栽培指針の確立が不可欠である。そこで本研究では、紫黒米に含まれる約20種類のアントシアニンを一括して正確に定量できるHPLC分析法を新たに確立し、アントシアニン組成のプロファイリングを行う。そして、環境条件に対する品種別の特性を明らかにし、それぞれの栽培指針を設定することで、アントシアニンに着目した紫黒米の栽培と利活用の拡大につなげる。
日韓R&Dスピルオーバー効果の実証分析

一国の経済成長は資本の蓄積や労働力の増加、さらには人的資本の蓄積による労働の質の向上だけでは十分に説明できない。新古典派成長論ではSolow以来、生産要素の投入によって説明できないすべての残差要因を技術進歩と呼んできた。しかし研究開発に関する多くの研究は、技術進歩が伝統的な新古典派成長理論が仮定するように努力なしで得られるものではなく、研究開発投資によって蓄積された技術知識ストックによって達成されていることを示している。内生的な経済成長の源泉である技術進歩と研究開発活動の関係を検証するためには、長期的な技術知識ストックを推計する必要がある。また日本経済の長期低迷の原因を理解する上でも、最近の全要素生産性上昇の下落が研究開発投資の減少によって引き起こされているか否かを検証することは重要な課題であると考えられる。このような問題意識から、1970年から1998年を対象とする日本の54産業分類業種別技術知識ストックの推定を行った。さらに,当該産業に中間財を供給している他産業における技術知識ストックが当該産業の全要素生産性上昇に与える波及効果の有無についても検証した。当該産業の技術知識ストックと日本国内の産業間のR&Dスピルオーバーの生産性上昇への貢献はいずれも大よその期待通り大きいことが分かった。一般的に技術知識ストックと生産性上昇の標準的な関係だけを実証する傾向があるが、標準的な実証モデルに全要素生産性に影響を与えるかもしれない他の要因,つまりITストック,開放の程度,稼働率,政府の政策等,を導入してもR&Dスピルオーバー効果があるかどうかもテストした。他の要因を考慮してもR&Dスピルオーバーの効果は十分あるということを確認した。日本の長期的な経済成長に技術知識ストックの蓄積及びR&Dスピルオーバーは重要な要因であることが実証分析に通じて明らかになった。日本の政府は技術知識ストックの蓄積とR&Dスピルオーバーを促進させる政策を実施するべきである。
倍数性コムギの生殖成長過程における同祖遺伝子の機能分化

当初の研究計画にあったように、祖先種および合成コムギを用いたWLHS1同祖遺伝子の発現解析、メチル化解析を順調に進めることが出来た。その結果、WLSH1に関しては機能的な同祖遺伝子が1コピーとなるような未知の計数機構が働き、しかもどの同祖遺伝子が機能的アリルとして選択されるかには優先順位があることを示唆するデータが集積されてきた。この成果は、これまで現象の理解に留まっていた同祖遺伝子の相互作用メカニズムを解明するための手がかりとなるだろう。さらに、WAP3についても予定通りコムギ形質転換体の作出に成功しており、(1)転写バリアントであるWAP3sがWAP3と同様なタンパク質機能を有する、(2)WAP3とWAP3sの転写制御システムは独立しており、WAP3がリンピおよび雄ずいで発現するのに対して、WAP3sはリンピ特異的に高い発現ことが示された。さらに、WAP3解析の過程で、Aゲノム同祖遺伝子のみが、不完全なmRNAを形成しながら変異を蓄積していることが明らかになった。これは同祖遺伝子の一つが徐々に機能を失っていく変遷過程にあると考えられた。これはWLHS1のAゲノム同祖遺伝子がダイナミックな構造変化によって一度に機能を失ったことと対照的であり、同祖遺伝子の分化の多様性を示すデータである。一連の研究の中で、特にWLSH1解析で示唆された計数機構は、「研究の目的」で掲げていた目標である倍数種に特有なゲノム制御システムの解明につながる成果が得られており、その意義は大きいと考える。
易服用性によるアドヒアランス改善を期待した新規経口製剤の開発

メチルセルロース/ジェランガム液剤は嚥下障害患者の服用に適した粘度を示し、投与時には液体でありながら、胃内でゲルを形成することが示唆された。本剤はpHに関わらず、薬物放出制御能を示した。本剤のラット経口投与後における血中薬物濃度推移より、薬物徐放性が確認された。以上より、メチルセルロース/ジェランガム液剤は優れた服用性によるアドヒアランス改善を期待できると同時に、薬物徐放性により服用回数を低減できることが考えられた。前年度の検討より、メチルセルロース/ジェランガム液剤のin vitro薬物放出制御能が明らかになった。本年度はラットを用いた検討より、in vivoレベルでの薬物徐放性を評価した。また、高齢者は嚥下機能だけでなく、胃酸分泌機能の低下も多く見られることから、無酸症患者への応用も視野に入れた検討も併せて実施した。モデル薬物にはアセトアミノフェンを用いた。メチルセルロース/ジェランガム液剤をラットに経口投与したところ、初期の血漿中薬物濃度の上昇を強く抑制するとともに、長時間に渡り有意に高い血漿中薬物濃度を維持した。薬物動態パラメーターを算出したところ、メチルセルロース/ジェランガム液剤では水溶液と比較して、Cmaxの低下、さらにtmaxおよびMRTの延長が認められたことから、本剤の薬物徐放性が明らかになった。また、無酸症患者を想定した検討では、pH 6.8のJP16崩壊試験第2液におけるメチルセルロース/ジェランガム液剤のゲル形成性が確認された。拡散セル法ではメチルセルロース/ジェランガム液剤の薬物放出量は、水溶液と比較して大きく低下した。胃内pHを約5.5に調整したラットでは、胃酸度を調整しないラットに液剤を投与したときと同様に、メチルセルロース/ジェランガム液剤は水溶液と比較して、投与直後における血漿中薬物濃度の上昇を抑制し、長時間に渡って有意に高い血漿中薬物濃度を維持した。メチルセルロース/ジェランガム液剤は胃酸度調整ラットにおいても、水溶液と比較して、Cmaxの低下、tmaxおよびMRTの延長が認められたことから、メチルセルロース/ジェランガム液剤は弱酸性から中性付近のpHにおいても薬物徐放性を示すことが明らかになった。また、AUCも差のない値を示したことから、メチルセルロース/ジェランガム液剤の異なる胃内pH間におけるバイオアベイラビリティーの同等性が示唆された。高齢化に伴い、嚥下障害患者が増加していることから、安全で服用しやすい医薬品製剤は重要である。本研究は、嚥下補助食品に用いられる高分子材料に着目し、その粘性や薬物放出制御能を経口徐放性液剤に応用することで、服用時における誤嚥リスク軽減の観点から、QOL向上を目指した医薬品製剤を設計することを目的とする。具体的には、体温に応答するメチルセルロース/ソルビトール系と胃液中の酸および金属イオンに応答するジェランガムを混合した経口徐放性液剤を設計し、服用すると胃内でゲル化して薬物放出を制御する経口徐放性液剤の有用性を評価した。メチルセルロース/ジェランガム混合液剤はヒト体温および胃液に応答してゲル化することが確認された。また、メチルセルロース液剤にジェランガムを添加することで相乗的に粘性は増大し、流動性は準粘性流動から降伏値を有する準塑性流動に変化した。これらのレオロジー的性質の結果から、メチルセルロース/ジェランガム混合液剤の最適組成は2%メチルセルロース/0.5%ジェランガム/20%ソルビトールと判断した。拡散セル法により、メチルセルロース/ジェランガム混合液剤からの薬物放出性を評価したところ、液剤は拡散セルの内部で温度とイオンへの応答によりゲルを形成し、薬物放出量は水溶液と比較して低下したことから、本剤の徐放性が確認された。したがって、メチルセルロース/ジェランガム混合液剤の徐放性基材としての実用性が示唆された。スクリーニング的なゲル化温度、ゲル形成性、粘度のレオロジー的性質の検討結果より、温度に応答するメチルセルロースと酸および金属イオンに応答するジェランガムの最適組成が明らかになり、薬物徐放性の検討組成を限定することができた。服用性についても適度な粘性の付与により、誤嚥リスクの軽減が期待できる液剤であることが期待される。薬物徐放性についても、in vitroの検討では既存のメチルセルロース液剤と同等以上であることが示唆されたため、次年度にはラットを用いた検討により体内動態から徐放性を詳細に検討できる目処はついている。前年度はおおむね予定通り、研究を遂行することができたため、申請当初の予定通り実施する。すなわち、メチルセルロース/ジェランガム混合液剤をラットに経口投与したときの血中薬物濃度推移から、本剤の薬物徐放性を評価する。

また、高齢者には胃酸分泌機能が低下していることが多いことから、無酸症状態を想定したin vitro薬物放出試験を行い、ラットによるin vivo薬物吸収性の結果と併せて、胃内環境が異なる患者におけるメチルセルロース/ジェランガム混合液剤の実用性を評価する。研究に必要な費用を捻出した結果、わずかな金額ではあるものの端数が生じたため、繰越金が発生した。次年度の消耗品購入等に充てる予定である。
トランスロケーションマウスモデルを用いたカンジダ属の病原性評価

カンジダの血流感染の経路の一つとして、腸管からのトランスロケーションが重要である。播種性カンジダ血症マウスモデルはカンジダ血症の病態や治療法の解析に有用であるが、その多くは経静脈的に菌を投与するモデルであり、トランスロケーションマウスモデルを使用した研究は少ない。これまでの研究でカンジダ属の病原性評価に適したトランスロケーションマウスモデルを作製し、菌種によって腸管への定着能や血流への侵入門戸や機序が異なる可能性を考えている。本研究では、カンジダに対する生体の腸管免疫応答について、トランスロケーションマウスモデルとカンジダの臨床分離株および遺伝子変異株を用いて解明する。
新規EMT関連遺伝子MTDHが誘導する口腔扁平上皮癌の浸潤機構の解析

われわれが見出した遺伝子Metadherin(MTDH)が関与していると考えられる口腔扁平上皮癌の高度浸潤能獲得におよぼすEMTの機構の詳細を明らかにすることを目的として本研究を行った.これまでにわれわれが研究し,解明してきた細胞運動能,基質分解酵素の発現上昇,細胞接着因子の発現低下等をさらに詳細に検討した.その結果,MTDHは口腔扁平上皮癌細胞の高度浸潤能獲得に関与している可能性が示唆された.また,その高度浸潤能獲得に際し,同時に幹細胞様形質の獲得とも緊密に関連している可能性が考えられた.われわれは,これまでにEMT型癌細胞と非EMT型癌細胞におけるmicroRNAの発現プロファイル解析を行った.そこで,EMTに深くかかわっていると考えられるmicroRNA,miR320ファミリーを見出した.さらにmiR320ファミリーの標的遺伝子をターゲットスキャンで検索したところ,Metadherin(MTDH)を見出した.口腔扁平上皮癌において,MTDHがEMTに関与していることを報告している論文は国内外で皆無である.また,一方で他臓器癌ではあるが,MTDHが一部の癌細胞を癌幹細胞様形質へと誘導することが報告されている.高度浸潤・転移能を獲得したEMT型癌細胞は,癌幹細胞と非常に近似した特徴を持つと考えられている.以上のことを踏まえ,われわれが見出したMTDH遺伝子がいかにEMTや癌幹細胞様形質の獲得に関与するかを詳細に解明することを今回の研究の主目的とする.MTDHが関与していると考えられる口腔扁平上皮癌の高度浸潤能獲得におよぼすEMTの機構の詳細を明らかにする.これまでにわれわれが研究し,解明してきた細胞運動能,基質分解酵素の発現上昇,細胞接着因子の発現低下等をさらに詳細に検討する.われわれが見出したEMT関連遺伝子MTDHmRNAの発現とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞の相関関係を確認する.さらにその発現細胞からMTDH mRNAを抽出し全長cDNAをRT-PCRで増幅しシークエンスを確認後,発現ベクターに組み込む.これをMTDHの発現が消失している細胞にリポフェクチン法によって遺伝子導入する.G418などの選択マーカーを培地に添加し,耐性細胞をクローニングリングによって分離し,それぞれの細胞における導入遺伝子産物の発現を,抗体を用いたウエスタンブロッティング法で確認する.現在までに,MTDH発現の有無とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞との相関はmRNAレベルで確認した.さらに過剰発現細胞株あるいはノックダウン細胞株作製を鋭意行っているところである.われわれは「臨床的に口腔扁平上皮癌の浸潤・転移を抑えることを目的とした基礎的研究」という口腔癌研究における基本理念の下で研究を行っており,その中でも口腔扁平上皮癌の浸潤・転移機構の本質の一つとして上皮間葉移行(EMT)に着目して研究を継続して行っている.一方,近年,EMTの生じた一部の細胞で癌幹細胞様形質があることが他臓器癌で報告されている.口腔扁平上皮癌ではEMTと癌幹細胞との関連についての報告はほとんどない.本研究は,口腔扁平上皮癌におけるEMTと癌幹細胞の浸潤・転移への関与を明らかにすることを目的としている.昨年までに,Metadherin(MTDH)がEMTに関与している可能性があることを明らかにしてきた.現在,MTDH発現の有無とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞との相関はmRNAレベルで確認した.さらに過剰発現細胞株あるいはノックダウン細胞株作製が完了し,Wound healing assayを用いて遊走能,Matrigel invasion assayおよび再構成三次元培養を用いて浸潤能と浸潤様式の検討を行いその細胞生物学的性状の解析を鋭意行っているところである.さらに,癌幹細胞の関与についての解析するために,MTDH過剰発現細胞からFACS解析により得られたCD44高発現細胞をヌードマウス背部皮下および舌におのおの100万個程度移植して,腫瘍形成能を検討する段階にある.過剰発現細胞株あるいはノックダウン細胞株作製が完了し,Wound healing assayを用いて遊走能,Matrigel invasion assayおよび再構成三次元培養を用いて浸潤能と浸潤様式の検討を行いその細胞生物学的性状の解析を鋭意行っているところである.さらに,癌幹細胞の関与についての解析するために,MTDH過剰発現細胞からFACS解析により得られたCD44高発現細胞をヌードマウス背部皮下および舌に移植して,腫瘍形成能を検討する.われわれは,浸潤形式Y-K分類の浸潤様式4D型の高度浸潤型口腔扁平上皮癌から独自に高度浸潤型口腔扁平上皮癌細胞株を樹立した.これら細胞株は共通して間葉細胞様形態とin vitroにおける高い浸潤能を示し,細胞接着分子E-カドヘリンの発現消失とその転写抑制因子であるSnailの高発現を認めたことからEMT型癌細胞であることを見いだした.さらに扁平上皮癌細胞株にSnailを強制発現させたところ,EMT型癌細胞と同様の細胞生物学的形質と遺伝子発現プロファイルが再現されたことから,高度浸潤型口腔扁平上皮癌の浸潤がSnail誘導によるEMTによって制御されていることをこれまで報告してきた.さらにわれわれは,これまでにEMT型癌細胞と非EMT型癌細胞におけるmicroRNAの発現プロファイル解析を行った.そこで,EMTに深くかかわっていると考えられるmicroRNA,miR320ファミリーを見出した.さらにmiR320ファミリーの標的遺伝子を検索したところ,Metadherin(MTDH)を見出した.以上のことを踏まえ,われわれが見出したMTDH遺伝子がいかにEMTの獲得に関与するかを詳細に解明することを今回の研究の主目的とする.

これまでに,MTDH発現の有無とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞との相関はmRNAレベルで確認している.EMT関連遺伝子MTDHmRNAの発現とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞の相関関係を確認し,さらにその発現細胞からMTDH mRNAを抽出し全長cDNAをRT-PCRで増幅しシークエンスを確認後,発現ベクターに組み込んだ,これをMTDHの発現が消失している細胞にリポフェクチン法によって遺伝子導入し,細胞運動能,基質分解酵素の発現上昇,細胞接着因子の発現低下等,EMTを介した高度浸潤能の獲得にMTDHが関与している可能性を見出した.われわれが見出した遺伝子Metadherin(MTDH)が関与していると考えられる口腔扁平上皮癌の高度浸潤能獲得におよぼすEMTの機構の詳細を明らかにすることを目的として本研究を行った.これまでにわれわれが研究し,解明してきた細胞運動能,基質分解酵素の発現上昇,細胞接着因子の発現低下等をさらに詳細に検討した.その結果,MTDHは口腔扁平上皮癌細胞の高度浸潤能獲得に関与している可能性が示唆された.また,その高度浸潤能獲得に際し,同時に幹細胞様形質の獲得とも緊密に関連している可能性が考えられた.現在までに,MTDH発現の有無とEMT型/非EMT型口腔扁平上皮癌細胞との相関はmRNAレベルで確認した.さらに過剰発現細胞株あるいはノックダウン細胞株作製を鋭意行っているところである.口腔外科学MTDH過剰発現細胞株およびノックダウン細胞株を用いて,上皮間葉移行と癌幹細胞との関連を解明する予定である.当該助成額は少額であり,誤差と考えられます.使用している細胞株のバイアビリティが不十分であったため,良好な細胞導入効率が得られないということ事象が見受けられたが,培養環境の確認と培養液,血清の再確認により現在までに改善された.実験が順調に進行したと仮定した場合,本来であれば細胞培養関連の消耗品として21549円を使用予定であったが,実験の進行がすこし滞ったため,次年度使用額として生じた.現在では,概ね順調に進展している.翌年度の予算とあわせ,有効利用させていただきます.次年度使用額に関しては,細胞培養関連用品の購入に使用予定である.