hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞生成にかかわる系列決定と分化の機構の解明

MLPアッセイ(multilineage progenitor assay)を用いた研究によって,われわれはT前駆細胞(p-T)はT細胞とミエロイド細胞をつくる前駆細胞(p-MT)からつくられることをを明らかにしていた.しかし,p-MTは造血幹細胞から直接につくられるのか,それとも何らかの中間段階を経てつくられるのかは明らかではなかった.このことは,従来用いていたMLPアッセイの検出能の限界によるものであった.本研究では,従来のミエロイド(M),B, T3系列に加えて赤血球(E)系列への分化能を検出できる実験システム(MLP-METBアッセイ)を開発した.この方法を用いることによって,従来はp-Multiとして定義されてきた初期前駆細胞は,p-METBとp-MTBに分けられた.すなわち,p-METBは幹細胞そのものであり,この方法によってin vitroで幹細胞の検出が可能になった.またp-MTBという段階は,p-MTとp-MBの共通の前駆細胞である.一連の研究によって胸腺へ移行する前の系列コミットメントのプロセスが明らかになった.さらに,胸腺内でのコミットメントも詳しく解析した.以前の研究で胸腺内の最も初期の前駆細胞はナチュラルキラー(NK)への分化能を持っておりp-T/NKと表現できることを示していたが,本研究において樹状細胞(DC)への分化能を含めて解析できる方法を確立し,p-T/NK/DCであることが示された.この最も初期の前駆細胞はCD44^+CD25^-→CD44^+CD25^+→CD44^-CD25^+と変化する間に1000倍以上に増殖し,その間にDC, NKへの分化能を順次失っていくことが明らかとなった.MLPアッセイ(multilineage progenitor assay)を用いた研究によって,われわれはT前駆細胞(p-T)はT細胞とミエロイド細胞をつくる前駆細胞(p-MT)からつくられることをを明らかにしていた.しかし,p-MTは造血幹細胞から直接につくられるのか,それとも何らかの中間段階を経てつくられるのかは明らかではなかった.このことは,従来用いていたMLPアッセイの検出能の限界によるものであった.本研究では,従来のミエロイド(M),B, T3系列に加えて赤血球(E)系列への分化能を検出できる実験システム(MLP-METBアッセイ)を開発した.この方法を用いることによって,従来はp-Multiとして定義されてきた初期前駆細胞は,p-METBとp-MTBに分けられた.すなわち,p-METBは幹細胞そのものであり,この方法によってin vitroで幹細胞の検出が可能になった.またp-MTBという段階は,p-MTとp-MBの共通の前駆細胞である.一連の研究によって胸腺へ移行する前の系列コミットメントのプロセスが明らかになった.さらに,胸腺内でのコミットメントも詳しく解析した.以前の研究で胸腺内の最も初期の前駆細胞はナチュラルキラー(NK)への分化能を持っておりp-T/NKと表現できることを示していたが,本研究において樹状細胞(DC)への分化能を含めて解析できる方法を確立し,p-T/NK/DCであることが示された.この最も初期の前駆細胞はCD44^+CD25^-→CD44^+CD25^+→CD44^-CD25^+と変化する間に1000倍以上に増殖し,その間にDC, NKへの分化能を順次失っていくことが明らかとなった.この数年間にわたる一連の研究で,造血前駆細胞のT細胞系列への分化決定は,胎仔肝臓(FL)の中で行われることを明らかにしてきた.この研究で用いたのはミエロイド,TおよびB細胞系列への分化能をしらべるmultilineage progenitor(MLP)アッセイ法であった.しかし,この方法で検出されたT前駆細胞(p-T)をTおよびNK系列への分化能をしらべることができるアッセイ系でしらべた結果,FL中のp-TはすべてT/NK bipotentであった.

さらに,胸腺中でのT細胞分化段階に伴うNKへの分化能の変動をしらべた結果,胎生12日目のCD44^+CD25^-FcR^-群のT前駆細胞はすべてNKへの分化能を持っていた(p-TNK).この群にはNKのみへ分化するp-NKも多く存在した.胎生14日目のCD44^+CD25^-群中にはT細胞だけをつくるp-Tが出現するが,その比率はp-T/NKと同じレベルである.TCRβ鎖の再構成を行う直前のCD44^+CD25^+群に至って初めてp-Tが大多数を占めるようになる.このような分化決定にかかわる機構を明らかにするために,胸腺中の最も未分化な前駆細胞を含む胎生12日目のCD44^+CD25^-FcR^-細胞ヘレトロウイルスペクターを用いていろいろな遺伝子を導入する準備を行っている.前年度までの研究によって,胎仔胸腺(FT)中の最も未分化なT前駆細胞はNK系列への分化能を有するp-T/NKであること,さらにT細胞分化が進むにつれてT系列のみに分化する前駆細胞(p-T)が増えることを明らかにしてきた.今年度は,p-T/NKのTおよびNK系列への決定の分子機構を明らかにするために転写抑制因子Id2の役割りを検討した.Id2はB細胞の分化に関与している転写因子E蛋白(E47,E12,HEB,E2-2)機能を阻害する抑制因子であり,Id2ノックアウトマウスではNK細胞の分化が阻害されることが知られている.いろいろの分化段階にあるFT細胞におけるId2およびE蛋白をコードする遺伝子発現を検討した結果,Id2の発現レベルはNK系列のみに分化する前駆細胞(p-NK)が多い分画で高かった.一方,E2A,HEB遺伝子の発現は分化段階にかかわらず一定であった.これらの結果から,FT中のp-T/NKでId2が発現すればNK系列に分化し,発現しなければT系列に分化することが示唆された.実際にId2ノックアウトマウスFT中の個々の前駆細胞の分化能をしらべると,上記の概念を支持するデータが得られた.そこで,胎仔肝臓(FL)中のp-T/NKにレトロウイルスベクターを用いてId2遺伝子を導入・過剰発現させ,分化におよぼす作用を調べたところ,予想に反してT系列のみならずNK系列細胞も出現してこなかった.また,FL中でp-T/NKが濃縮して存在している細胞群ではId2遺伝子が発現していなかった.これらの結果は,p-T/NKにおいてはE蛋白が必須であるとともに,NK系列決定においてもId2とE蛋白のバランスが大事であることを示している.今後の課題として,p-T/NKおよびp-TにおいてはE蛋白がどのような遺伝子群を転写調節しており,NK系列決定においてはどのような遺伝子の発現がシャットダウンされるのかを明らかにする必要があると考えられた.前年度までの研究で,マウス胎仔肝臓内で多能造血幹細胞からT前駆細胞(p-T)へ至る過程では,先ずミエロイド,TおよびB細胞をつくる前駆細胞(p-MTB)がつくられ,このp-MTBからp-MTへと進んでp-Tがつくられることを明らかにした.今年度は,p-MTB, p-MB, p-Tを純化することをこころみていたが,p-MTBとp-MBについてはまだ成功していない.p-Tについては,胎仔胸腺内および成獣胸腺内のものは,それぞれCD44^+CD25^-FcR^-およびc-kit^+CD25^-分画に純化できる.また胎仔肝臓中のものはc-kit, IL-7Rおよびその他いろいろのマーカーを用いて純化に成功した.このp-Tというのは,昨年度での研究でナチュラルキラー(NK)への分化能を持つことが明らかとなっているが,さらに樹状細胞(DC)への分化能を合わせ持つことがクローナルアッセイによって示された.すなわち、p-Tというのはp-T/NK/DCと表すことができる.さらに,p-T/NK/DCが胸腺中でDC, NKへの分化能を順次失っていくプロセスも明らかとなった.p-T/NK/DCに,レトロウィルスベクターを用いて転写因子E蛋白を負に調節するId2を導入した.この遺伝子導入によってp-NKへシフ卜することが考えられたのであるが,事実αβT細胞の生成は完全に抑制された.一方,γδT細胞の出現は強く抑制されず,したがってE蛋白はαβT細胞の分化に不可欠であることが示された.
高齢者の運動プログラムと指導法(1分間伝わり体操と指導者養成)

高齢者の増加に伴い、医療費の増大、介護供給の不足が深刻化することが懸念されているが、それは平均寿命と健康寿命に差があることに由来する課題である。そこで、運動が生活習慣として定着していない一般成人へのアプローチとして、1日1回1分間をキャッチコピーに、神経と筋肉の伝わりをよくすることを狙って、1分間体操を制作した。音楽著作権の問題をクリアーできることなどを条件に選曲し、天国と地獄の序曲として誰でもが知っている「カンカンポルカ」を選んで、1分間の簡単な体操を制作し「伝わり体操」と命名し、CDとDVDを制作し、youtubeでも公開した。地域包括ケアシステムでも介護予防が重要視される中、誰でも、どこでも利用できる。この伝わり体操については60-80歳代の健常男女における運動ユニット機能(筋放電量、筋線維伝導速度等)と各種体力(歩容、筋力、敏捷性、平衡性等)との関連性についても併せて解析することを目的に2か月間、1日1回、1分間の体操を実施する介入研究を終了し、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistryに投稿した。次に、伝わり体操とウォーキングの運動生理(心拍数・呼気ガス・筋電図の関係)について検証し、音楽のテンポの違いによる身体の変化を探って、論文にまとめJournal of Exercise Physiologyonlineに投稿した。また、平均寿命と健康寿命の差である男性約9年、女性約12年は、日常生活に制限のある「健康ではない期間」と考えられ、この短縮が大きな課題となっている。そこで、運動が生活習慣として定着していない人のために、1分間体操などで健康長寿を目指し、食事と運動をチェックし記録する「かめおか健康長寿お宝ノート」を制作し、介護予防を進めたい人へのプログラムとして、亀岡市のHPで公開している。現在、厚生労働省では地域包括ケアシステムの構築を目指している。具体的には、団塊の世代が75歳以上となる2025年を目途に、重度な要介護状態となっても住み慣れた地域で自分らしい暮らしを人生の最後まで続けることができるよう、医療・介護・予防・住まい・生活支援が一体的に提供される地域包括ケアシステムの構築を実現する計画である。高齢者人口の増加、あるいは地域人口の減少によって、市町村や都道府県が抱える課題は深刻化を増し、地域の特性に応じて地域包括ケアシステムを作り上げることが必要である。そのため単に高齢者の運動機能や栄養状態といった心身機能の改善だけを目指すものではなく、支援する人材の養成やプログラムとその展開の仕組みが重要である。加えて、高齢者の日常生活活動を高め、家庭や社会への参加を促し、一人ひとりの生きがいや自己実現のための取組を支援して、QOLの向上を目指す仕組みが必要である。そこで、従来から継続してきたスポーツ・芸術・文化の垣根を越えた「かめおか遊友ネットワーク」という組織団体の地域展開をステップアップし、介護予防終了後の活動的な状態を維持するための多様な通いの場を創出し、次のステップへと繋げた。このような体制づくりとともに、高齢者本人へのアプローチとしての1分間体操の運動定着を図るツールとして、「かめおか健康長寿お宝ノート」を制作し、その普及システム構築とボランティア養成を行った。また1分間体操の活動量についても検証した。そして、生活環境の調整や、地域の中に生きがい・役割をもって生活できるような居場所と出番づくり等、高齢者本人のバランスのとれたアプローチのため、地域において住民自身が運営する体操の集いなどの活動継続、人と人とのつながりを通じて亀岡市を中心に京都府下に通いの場が継続的に拡大していくような地域づくりを推進した。並行して、現在マニュアルの制作をしている。生活習慣病の予防,社会生活機能の維持および向上,生活の質の向上の観点から,身体活動や運動はますます重要性を増している(厚生労働省, 2012).これを踏まえて,厚生労働省(2013)は,健康づくりのために必要なスポーツや体力づくり運動で身体を動かす量,すなわち運動量の基準として,18から64歳の人に対して,3メッツ以上の強度の運動を1週間あたり4メッツ・時行うことを推奨し,息が弾み,汗をかく程度の運動を1週間に60分行うことを具体的に求めている.運動の習慣化ができていない層に対しての運動定着を図るツールとして、「かめおか健康長寿お宝ノート」の制作と普及人材育成、地域展開を図るとともに、地域に元気アップ体操教室を継続開催し、体操人口の拡大を図り、次には体操実施者やボランティア活動への参加度による体力向上の検証を行いたい。また、健康を中核としたまちづくりが、自治体の長期計画に位置づけられていることや大学や研究者、医療機関や医師と連携して、健康づくり事業の計画策定や推進に取り組むなどのシステム構築はできているが、積極的な実践にはつながっていない。そこで、体操で元気になった後のアクティビティの開発を目的に、我々が注目したのがクアオルトというドイツの取組みや自然環境や自然資源を活用した健康増進プログラムである。日本ではクアオルト財団があるが、まずは自然プログラムを活用した取り組みとして、フォトロゲイニングというナビゲーションスポーツを学生を中心に展開し、今後は高齢者やファミリーを対象として、研究を進めるとともに、ご当地体操の展開や体操発表の場のステップアップを図り、QOLの向上を目指す仕組みを開発し、エビデンスを構築する。これまでの研究と活動成果を出版する予定である。これまでに、元気な高齢者であっても33%がうつ傾向であり、元気な高齢者とうつ傾向の高齢者では身体機能の低下が顕著であることから、両者に運動介入し、総合型介護予防プログラムの介入が高齢者の身体活動量を増加させ、老年期うつ病尺度

ならびに認知機能(注意機能)の改善を導くことが明らかになった。加えて、身体組成の改善(体脂肪量の減少と下肢骨格筋量の増加)及び歩行能力(最大歩行速度)、GDSスコアの改善が見られた。今回は特に神経と筋の伝わりをよくする1分間体操を制作し、ビデオを作製した。高齢者の運動指導者のため、エビデンスのあるプログラムを楽しく安全に指導できる実践力をつけるため、バーバルキューイングのマニュアルを作成した。一方、6083歳の健常男女71名(男性13名、女性58名)を対象とし、群分け後10週間、1分間体操(自宅で、1分間程度で怒責なく実施でき、且つ神経から筋肉への運動シグナルの伝達機能向上を図る為、複数部位を同時にリズミカルに動かすことを意識して設計した)を実施すると共に、MFGM(MFGM: 1g/日)を含む健康食品、或いはプラセボ(全脂粉乳: 1g/日)のタブレットを毎日摂取した。介入開始時、開始後4週及び8週時に運動機能評価を行い、10m障害物歩行、膝伸展力、10秒間高速足踏み回数、及び20秒間開閉ステッピング回数を計測した。二重盲検プラセボ対照試験を行神経筋の伝達機能改善を促す体操とMFGMの併用は、敏捷性等の運動機能を高めることが明らかとなった。この結果より、本体操の持つ運動効果は、適切な栄養付加により更に高められることが示唆された。この結果を公衆衛生学会において発表した.現在マニュアルを利用した指導者のスキルアップを行い評価法について検討するとともに、ヘルスプロモーションの進捗状況を探るアンケートを作成中である。運動についての介入及び効果の検証をする中、企業との共同研究に結びつき、運動と栄養を加えた研究として発展している。また、行政より、我々が作成した京都式総合型介護予防プログラムのひょぷかが高まり、現在4市で採用され、4市ともに運動介入効果としての体力測定も実施できている。また、市民サポーター養成も同時に進行し、運動指導の際に必要なノウハウについても抽出しつつある。H28には624名の高齢者の体力を測定し、H29は475名であった。厚生労働省の報告によれば、平成26年度に基本チェックリストに回答して二次予防対象者に該当した高齢者は、全国平均で基本チェックリスト実施者の26.8%であった。亀岡市の体力測定全参加者のうち、男性約25%、女性約33%、全体で30%が二次予防対象者であった。自力で生活を営み、体力測定や体操教室に参加する意欲のある高齢者の中でも男性の4人に1人、女性の3人に1人が二次予防対象者に該当する。体力測定項目では、男女とも多くの項目で一次予防対象者と二次予防対象者の体力差がみられた。女性は片足立ちや歩行機能に関する項目の多くで、男性も筋力を代表する握力や、生活機能を反映するタイムアップ&ゴーや足腰の粘り強さを反映するチェアスタンドの値で二次予防対象者の体力低下がみられた。運動器の機能維持による体力維持・口腔衛生・認知症予防の啓発と支援が高齢期の生活の質を保つ上で重要と考えられる。
気温変動が常緑広葉樹林の物質循環に及ぼす生理・生態学的研究

北限に近い千葉県にあるマテバシイ林およびスダジイ林の物質循環についての継続調査およびとりまとめを行った。その結果、緯度と地上部の現存量、リターフォール量(窒素量)の間には、負の相関がみられ、21世紀に3±1.5°Cの増加で、北限の照葉樹林の地上部のバイオマスは17%増加し、リターフォール量およびリターフォールに含まれるN量はそれぞれ15%、19%増加すると推定した。また、北限に近い照葉樹林の特徴として、A_0層量が多く、着用年数も3年と長く、少ない葉への養分配分で、高い純生産を行い、効率の良い成長がみられた。北限に近い、照葉樹林の土壌の窒素無機化速度は、土壌温度30°Cで頭打ちになるが、南限の窒素無機化の速度は、30°C以上になるとさらに増加する。このように、北限と南限では窒素無機化特性は大きく異なった。スダジイ林およびマテバシイ林の全炭素量に対する可分解性炭素量はスダジイ林で814%、マテバシイで1820%で、この値はスギ林たヒノキ林の2倍であった。マテバシイ林の土壌は可分解性の有機物量を多く含んでいるが、それを分解するには熱エネルギーを多く必要とする有機物であるなど、照葉樹林の有機物の分解特性を明らかにすることができた。大気条件の2倍のCO_2濃度にした場合、樹種によって葉やシュートは異なった。2倍のCO_2濃度で、土壌に栄養が少ないと、古い葉から黄変するタイプと全葉が同時に黄緑色になるタイプ、側枝の伸長するタイプなど、樹種によって異なることが明らかになった。その他、北関東の温帯落葉広葉樹林での養分集積状態と養分循環についても明らかにすることができた。北限の常緑広葉樹林の物質循環の特徴を明らかにするために、千葉県にあるスダジイ林の地上培養分量、A0層養分量および鉱物土壌層の養分量、リターフォールの養分量の調査を行った。地上部現存量は237t/ha、養分量はN:615、K:373、Ca:543、Mg:102kg/haであった。赤道付近の常緑広葉樹林の現存量は450t/haで、北緯35度の北限に近い林分で150t/ha程度と推定された。A_0層量は28.4t/haで、C量は8.1t/haであった。既往のわが国の常緑広葉樹林のA_0層量は平均9.9t/haで、C量は5.2t/haで、本調査地のA_0層量は非常に多い。スダジイの落葉は46月に集中し、年間のリターフォール量は7.3t/haで、養分量はN:93、P:3、K:18、Ca:82、Mg:19kg/haであった。常緑広葉樹林の緯度とリターフォール量の関係は、直線的な負の相関がみられ、赤道付近でのリターフォール量は約11t/ha、北限でおよそ6t/haと推定された。同様の傾向がリターフォールのN量にもみられ、赤道付近で約130t/ha、北限で約60kg/haと推定された。年間の地上部の乾物生産量は20.3t/haで、地上部への養分吸収量はN:120、P:7、K:36、Ca:109、Mg:23kg/haであった。この値は既往の常緑広葉樹林の養分吸収量よりも大きい。

本調査地のスダジイ林はリターフォール量およびA_0層量が多い。着葉年数も3年と他の常緑広葉樹林に比較して長い。少ない葉への配分で高い純生産率であり、効率のよい成長を行なってるといえる。従って、物質循環量および生産量は、西南日本の常緑広葉樹林における既往の報告と比較しても、同等かそれ以上であることが分かった。本研究は北限に近い常緑広葉樹林の生理・生態的特性が気温変動によってどのように変化するかを明らかにするものである。平成7年度に調査を開始した千葉県にあるマテバシイおよびスダジイ林分の調査を継続し、養分の植物-土壌系の維持機構を解析した。具体的な調査項目は、地上部現存、A_0層量、リターフォール量およびそれらに含まれる養分量、鉱物土壌層の養分量などである。本調査および既往の調査結果から、赤道付近の常緑広葉樹林の現存量はおよそ450t/ha、北緯35度の北限に近い林分では150t/haと推定された。リターフォールの調査から、赤道付近で約11t/ha、窒素量で約130kg/ha、北限でおよそ約6t/ha、窒素量で約60kg/haであることなどなど、北限での常緑広葉樹林の現存量および養分量の特性を明らかにすることができた。北限での常緑広葉樹林土壌での炭素と窒素の動態と地温との関係を明らかにするため、反応速度的解析を適応させて解析した。その結果、地表へのCフラックは8.5t/haと推定された。この値は北関東地方のスギやヒノキ林の3.84.3t/haに比較して大きいなど、炭素と窒素の循環特性の温度依存を明らかにすることができた。常緑広葉樹の光合成能の季節的変化を明らかにするため、マテバシイおよびシラカシを用いて調査した。その結果、常緑広葉樹の最大光合成速度は当年葉であるが、初夏では2年葉の方が高い能力を示した。温度-光合成曲線から得られた光合成適温域は20°C前後と推定された。冬期も着葉したままでいる常緑広葉樹では、生理的機能を変えて低温環境に適応していると予測され、常緑広葉樹の光合成特性を明らかにすることができた。北限に近い干葉県にあるマテバシイ林およびスダジイ林の物質循環についての継続調査およびとりまとめを行った。その結果、緯度と地上部の現存量、リターフォール量(窒素量)の間には、負の相関がみられ、21世紀に3±1.5°Cの増加で、北限の照葉樹林の地上部のバイオマスは17%増加し、リターフォール量およびリターフォールに含まれるN量はそれぞれ15%、19%増加すると推定した。また、北限に近い照葉樹林の特徴として、A_0層量が多く、着用年数も3年と長く、少ない葉への養分配分で、高い純生産を行い、効率の良い成長がみられた。北限に近い、照葉樹林の土壌の窒素無機化速度は、土壌温度30°Cで頭打ちになるが、南限の窒素無機化の速度は、30°C以上になるとさらに増加する。このように、北限と南限では窒素無機化特性は大きく異なった。スダジイ林およびマテバシイ林の全炭素量に対する可分解性炭素量はスダジイ林で814%、マテバシイで1820%で、この値はスギ林たヒノキ林の2倍であった。マテバシイ林の土壌は可分解性の有機物量を多く含んでいるが、それを分解するには熱エネルギーを多く必要とする有機物であるなど、照葉樹林の有機物の分解特性を明らかにすることができた。大気条件の2倍のC0_2濃度にした場合、樹種によって葉やシュートは異なった。2倍のC0_2濃度で、土壌に栄養が少ないと、古い葉から黄変するタイプと全葉が同時に黄緑色になるタイプ、側枝の伸長するタイプなど、樹種によって異なることが明らかになった。その他、北関東の温帯落葉広葉樹林での養分集積状態と養分循環についても明らかにすることができた。
乾癬におけるエイユサペンタエン酸治療効果とサイトカイン遺伝子発現との相関

ポリクローナル抗IL-8抗体を用いて、エイコサペンタエン酸投与前後の乾癬病巣でのIL-8の染色態度を検討した。IL-8は、主として角層の特にMunro's microabscessの部位に陽性所見がみられ、また一部では基底層部分にも認められた。また乾癬患者の病巣部でのIL-8及びgroのmRNAが強く発現していることがnorthern blotting及びPCR法によって明らかになった。そしてこれらの発現はシクロポリンAを内服することによって消退することも確認された。乾癬患者単球をConAで刺激して、IL-1,IL-6,IL-8などのサイトカインの産生をみたところ、EPA治療前に亢進していたものが、軽快後は正常化していることをみいだした。EPAの乾癬への効果はすでに報告したが、さらにシクロスポリンAの副作用を軽減し、両者の併用により、相乗効果がみられるか否かを判定すべく、低用量のシクロスポリンAとEPAを組み合わせた乾癬患者への臨床効果を検討しており、一部では有用な結果を得ている。現在さらに症例数を増やして検討中である。平成6年3月時点での研究実績の概要ポリクロナル抗IL-8抗体を用いて、エイコサペンタエン酸投与前後の乾癬病巣でのIL-8の染色態度を検討した。IL-8は、主として角層の特にMunro's microabscessの部位に陽性所見が得られ、また一部では基底層部分にも認められた。我々はすでに乾癬病巣部でのIL-8及びgroのmRNAが強く発現しており、病勢とも相関していることを報告しているので、IL-8の由来が果たして今までの報告のように表皮角化細胞によるのか、あるいはその他の浸潤細胞によるのかを更に遺伝子レベルまで確認するために、初めにanti-sense sequence DNA probeを用いてin situ hybridizationを行った。しかしながら現時点ではバックグラウンドが高いためか明確な結論を得ていない。そこでジゴキシゲニンラベルのRNA probeを用いた手法に変えて検討中である。乾癬患者単球をConAで刺激して、IL-1,IL-6,IL-8などのサイトカインの産生をみたところ、EPA治療前に亢進していたものが、軽快後は正常化していることを見いだしその結果を報告する予定である。臨床においては、シクロスポリンAとEPAの併用により、両者の相乗効果が見られるか否かを検討中である。最終結論には至っていないが、良好な途中経過である。結果に有意差が出れば、in vitroでの併用の際の種々の変化も検討する予定である。
刈り出ししない刈り払い「筋残し刈り」を用いた省力的天然更新作業の開発

筋残し刈り完了後に放置された林齢20年生の天然更新林分における樹種組成と林分構造を調査した。前林分がアカマツ高齢天然生林だった皆伐跡地に成立した再生植生に対し,林齢5年生から10年生時にアカマツを目的樹種として筋刈りを実施した(筋刈り部分の隣接部には筋残し部分が存在する)。この筋刈り区と対照区(無処理区)を林齢20年生時に比較すると,斜面上部の筋刈り区ではアカマツが上層(樹高4m以上の層)で6千本/haと顕著に優占したものの,斜面上部の対照区や斜面下部の両区では上層を占める高木性樹種が2千本/ha前後と少なかった。このことから,目的樹種を複数にするとともに,成長が旺盛な斜面下部では筋残し刈りに加え,残したい高木に対して坪刈りを実施することも必要と考えられる。また,前林分がコナラ等の広葉樹高齢天然生林だった残伐地(母樹を50本/ha前後残した伐採地)に成立した再生植生に対し,林齢1年生から6-8年生時まで筋残し刈りを毎年実施した。林齢6,8,9年生林分に侵入した高木性広葉樹には鳥散布型種子を有する樹種が多かった。一方,母樹を多く残したクリとコナラの侵入木密度は対照的で,クリ幹はいずれの林分でも250本/ha以上生立していたものの,コナラ幹は33本/ha以下と極めて少なかった。この両種の母樹本数は同一であるため,コナラでは散布制限または定着制限が生じていると考えられる。さらに,前林分がアカマツ高齢天然生林だった残伐地に筋残し刈りを林齢3年生時から毎年実施した。この調査地を林齢3年生時と5年生時で比較したところ,高木幹数はそれぞれ36千本/ha,34千本/haと同程度であった。このことから,筋残し刈りにより高木性樹種の生存率を高く維持できる可能性が考えられる。ただ,刈り払い筋からのつる植物の繁茂が著しい箇所もあり,毎年のつる切りが必要と考えられる。平成29年度末に論文を執筆する予定だった研究項目1(筋残し刈り完了後に放置された林分の調査による初期保育作業体系の設計)について,平成30年度中に論文2報を執筆した。このため,研究項目1については年度当初にやや遅れていた状態を解消し,年度末ではおおむね順調に進展している。研究項目2(筋残し刈り実施後の幼齢林分の動態解明)については,前林分がコナラ等の広葉樹高齢天然生林だった残伐地のうち,林齢7年生林分に初期保育(処理としてのつる切り)を実施するとともに,つる切り区と対照区の林分調査を実施した。また,林齢9,10年生林分も予定通り再測した。このため,研究項目2は順調に進展している。研究項目3(筋残し刈りが初期遷移に及ぼす影響の解明)については,前林分がアカマツ高齢天然生林だった残伐地における林齢5年生時の調査で,2平方m調査枠をさらに30個増やして計60個とした。これにより,母樹からの距離が遠い斜面中部において高木幹数が少なく,小高木・低木との競合が激しいため,残し筋への坪刈りが必要であることを定量的に把握できた。これは初期保育作業体系の設計に関する重要な知見であり,研究項目3は順調に進展している。物品購入や資料収集にかかる出張については計画通りに実施した。ただし,当初学会発表する予定であった130回日本森林学会大会(新潟市)の開催日程が勤務する大学の卒業式(学位記授与式や前日の準備日)と重複するため,止むを得ず発表申込を断念した。以上を総合すると,平成30年度にはおおむね順調に研究が進展していると言える。研究項目1(筋残し刈り完了後に放置された林分の調査による初期保育作業体系の設計)について,前林分がコナラ等の広葉樹高齢天然生林だった残伐地のうち,林齢10,11年生広葉樹林を引き続き再測し,コナラの幹数が少ない理由を解明するとともに,目的樹種を確保するための初期保育作業体系を明らかにする。研究項目2(筋残し刈り実施後の幼齢林分の動態解明)については,前林分がコナラ等の広葉樹高齢天然生林だった残伐地のうち,林齢8年生広葉樹林を引き続き再測するとともに,新規に林齢5,6,7年生広葉樹林も調査し,局所的な樹種組成の違いや各樹種の生存率の違い,つる植物の繁茂状況を明らかにする。研究項目3(筋残し刈りが初期遷移に及ぼす影響の解明)については,前林分がアカマツ高齢天然生林だった残伐地(林齢6年生広葉樹林)を対象に,その斜面上,中,下部に坪刈り区と対照区を設置し,坪刈りの有無が樹種組成や高木の樹高成長に及ぼす影響を調査する。上記の調査のために,研究実施計画どおりに消耗品を購入する。また,平成29年度からの3年間の研究実施状況を精査するため,3年間に収集した全てのデータについて図表を作成し,統計解析をおこなう。これを踏まえて,学会発表(131回日本森林学会大会)にかかる出張を実施する。筋残し刈り終了後の初期保育(つる切り,除伐)作業体系を設計するため,筋残し完了後に放置された林齢8,9,20年生の天然更新林分における生活型組成と林分構造を調査した。

前林分がアカマツ高齢天然生林だった林齢20年生の天然更新林は,斜面上部でアカマツが最も優占し,広葉樹を含めた高木幹数割合は62%であった。これに対し,斜面下部では小高木や低木が優占し,広葉樹を含めた高木幹数割合は38%と低かった。前林分が広葉樹高齢天然生林だった林齢8,9年生の天然更新林における高木幹数割合はそれぞれ74,64%と高かった。これらのことから,更新適地であれば,皆伐または残伐と天然更新を組み合わせた粗放的な育林方式であっても,高木性樹種が優占可能であることを確認できた。林齢20年生の林分では被圧されたアカマツも散見され,除伐が必要である。これに対し,林齢8,9年生の林分ではつるの巻きついた林木が目立つことから,筋残し完了後だけでなく,それ以前からつる切りを実施しておくことが重要と考えられる。前林分が広葉樹高齢天然生林だった林齢6年生の天然更新林を調査したところ,高木幹数割合は50%であり,先に調査した林齢8,9,20年生林分よりも割合がやや低かった。そして,この6年生林分でも林木へのつるの巻きつきが目立ったことから,刈り払い筋を歩道代わりに移動しながら,剪定ばさみでつるを地上高1m以下で切除した。加えて,主要な高木種であるクリを被圧するクマイチゴの幹も地上高1m以下で切除した。前林分がアカマツ高齢天然生林だった林齢3年生の天然更新林分における生活型組成と林分構造を調査した。高木幹数割合は33%と先に調査した林齢6,8,9,20年生林分よりも低いものの,樹高0.3m以上の高木幹はha当たり4万本と多く,今後の筋残しやつる切りにより,高木幹数割合を高められる可能性を確認できた。研究項目1(筋残し刈り完了後に放置された林分の調査による初期保育作業体系の設計)については,予定した調査のうち,樹幹解析を実施しなかった。林分構造を調査した結果,胸高直径と樹高の関係が林分間で分離せず,同様の成長をしており,各林分の林齢の違いから平均樹高成長量を説明できるためである。樹幹解析以外の調査については予定通り実施しており,おおむね順調に進展している。研究項目2(筋残し刈り実施後の幼齢林分の動態解明)については,予定通り,初年度の林分調査をおこなうとともに,つる切り処理をした残し筋と対照の残し筋を設定した。予定通り順調に進展している。研究項目3(筋残し刈りが初期遷移に及ぼす影響の解明)については,林齢2,3,4年生の林分ではなく,林齢1年生のササ優占型林床の林分と,林齢3年生の木本優占型林床の林分の計2林分で林分調査した。現在,林齢2年生のササ優占型林床の林分において,次年度から筋残し刈りが実施されるため,この林分の調査を翌年度(の筋残し刈り実施後)に先送りした。そのため,計画的先送りとは言え,わずかに遅れている。物品購入や資料・情報収集にかかる出張については計画通りに実施した。また,データ解析および論文執筆については二報分を遂行した(現在,審査中)。以上を総合すると,平成29年度には,おおむね順調に研究が進展していると言える。筋残し刈り完了後に放置された林齢20年生の天然更新林分における樹種組成と林分構造を調査した。前林分がアカマツ高齢天然生林だった皆伐跡地に成立した再生植生に対し,林齢5年生から10年生時にアカマツを目的樹種として筋刈りを実施した(筋刈り部分の隣接部には筋残し部分が存在する)。この筋刈り区と対照区(無処理区)を林齢20年生時に比較すると,斜面上部の筋刈り区ではアカマツが上層(樹高4m以上の層)で6千本/haと顕著に優占したものの,斜面上部の対照区や斜面下部の両区では上層を占める高木性樹種が2千本/ha前後と少なかった。このことから,目的樹種を複数にするとともに,成長が旺盛な斜面下部では筋残し刈りに加え,残したい高木に対して坪刈りを実施することも必要と考えられる。
低酸素トレーニングに対する骨格筋の無酸素的および有酸素的エネルギー供給能の適応

低酸素トレーニングに対する骨格筋エネルギー代謝の適応について検討した。最初に、短時間・高強度の固定負荷運動時の代謝動態について常酸素環境と低酸素環境の違いを調べた。その結果、同一絶対強度での運動時において、常酸素環境と比較して低酸素環境では、運動中の有酸素的エネルギー供給量が小さく、無酸素的エネルギー供給量が大きいことが示された。次に、低酸素環境での短時間・高強度の運動トレーニングの骨格筋エネルギー代謝に対する効果を調べた。その結果、低酸素環境での短時間・高強度のトレーニングは、常酸素環境で同様のトレーニングを行うよりも、骨格筋の無酸素的エネルギー供給能力を高める効果が高いことが示唆された。平成23年度の研究において、常酸素下と低酸素下での高強度固定負荷運動時の代謝動態について検討したところ、同一絶対強度での運動時において、低酸素下では常酸素下よりも有酸素的エネルギー供給量が小さく、無酸素的エネルギー供給量が大きいことを示唆する結果が得られた。平成24年度は、低酸素環境での短時間・高強度の運動トレーニングが代謝的な適応に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした検討を行った。自転車競技選手12名を、常酸素下(酸素濃度20.9%)でトレーニングを行う群(常酸素群)と低酸素下(酸素濃度16.2%)でトレーニングを行う群(低酸素群)の2群に分け、週あたり4回、3週間のトレーニングを行わせた。1セッションあたりのトレーニングの内容は、自転車エルゴメータを用いて65ー70秒間維持できる最大強度での70秒間の固定負荷自転車運動を15分間の休息を挟んで3回行わせるものであった。事前のテストにおいて65ー70秒間維持できる最大強度は常酸素下と低酸素下とで差がないことを確認してあり、常酸素群と低酸素群のトレーニング時の仕事量には差がなかった。3週間のトレーニングの前後で最大酸素摂取量、65ー70秒維持できる最大強度での固定負荷自転車運動時の酸素摂取量および血中乳酸濃度を測定した。その結果、最大酸素摂取量は両群ともに有意な変化を示さなかった。トレーニング前の65ー70秒維持できる最大強度での運動持続時間は両群ともにトレーニング後に有意に延長した(いずれもP < 0.05)。これに対して運動時の血中乳酸濃度は低酸素群のみトレーニング後に高まった(P < 0.05)。以上のことから、3週間の短時間・高強度での運動トレーニングに対して、常酸素環境と低酸素環境とで運動パフォーマンスは類似した適応を示すものの、代謝的には異なった適応を示すことが明らかになった。無酸素的エネルギー供給能力の向上を主な目的とした低酸素トレーニングの効果を検証するためのトレーニング実験を行った。自転車競技選手を対象として、トレーニングを常酸素環境で行う群(常酸素群、6名)と低酸素環境で行う群(低酸素群、6名)の2群に分けた。測定項目は、65ー70秒間持続できる最大強度での固定負荷自転車運動時の酸素摂取量および血中乳酸濃度、漸増負荷自転車運動時の乳酸カーブテストおよび最大酸素摂取量、90秒間全力ペダリング運動時の総仕事量および血中乳酸濃度、リン31ー磁気共鳴分光法(31P-MRS)を用いた動的膝伸展運動時の骨格筋エネルギー代謝および運動持続時間であった。トレーニング内容は、70秒間持続できる最大強度での固定負荷自転車運動を、1日あたり70秒間×3セット(セット間の休息は15分間)、週4日、3週間行うものであった。3週間のトレーニング後、65秒ー70秒間持続できる最大強度は両群ともに増加した。同運動時の総酸素摂取量はトレーニング後において常酸素群で増加した(P<0.05)のに対し、低酸素群では変化しなかった。また、同運動時の血中乳酸濃度は、低酸素群においてのみトレーニング後に有意に増加した(P<0.05)。これらのことから、低酸素群では運動時の無酸素的エネルギー供給量が増加したことが示唆された。31P-MRS測定時の動的膝伸展運動の持続時間は低酸素群のみでトレーニング後に有意に延長し(P<0.05)、エネルギー代謝では無酸素性エネルギー供給能が増加したことを示唆する結果が得られた。乳酸カーブテスト、最大酸素摂取量、90秒間全力ペダリング時の総仕事量には3週間のトレーニングによる有意な変化はみられなかった。本研究の結果から、低酸素環境での短時間・高強度の運動トレーニングは、無酸素的エネルギー供給能力を高める方法として有効であることが示唆された。

平成23年度は,無酸素的エネルギー供給能力の向上を目的とした低酸素トレーニングの有効性を検証することを目的として,自転車トラック競技短距離選手が実際に行っているトレーニングの運動時における代謝に低酸素曝露が及ぼす影響を調べた.日本代表を含む男子自転車トラック競技短距離選手11名(年齢22.2±4.5歳)を対象に,被験者ごとに設定した70秒間持続できる最大の仕事率(558±76.9W)での固定負荷自転車運動を常酸素下(20.9%)と低酸素下(14.4%)で行わせた.運動時間は70秒間,ペダリングの回転数は100回/分であった.運動中の酸素摂取量(VO2)をブレス・バイ・ブレス法で測定した.また,運行終了後に血中乳酸濃度を測定した. VO2は,運動開始後20秒までは両条件で同様の変化を示したが,それ以降は運動終了まで低酸素下のほうが常酸素下よりも低値を示した(p<0.05).運動中の総酸素摂取量は低酸素下において常酸素下よりも有意に低かった(常酸素下:2.98±0.25L,低酸素下:2.60±0.26L,p<0.01).運動終了後の血中乳酸濃度の最高値は低酸素下において常酸素下よりも有意に高かった(常酸素下:13.7±1.6mM,低酸素下:15.4±1.4mM,p<0.01).以上の結果から,短時間・高強度の同一絶対強度の運動時においては,低酸素下のほうが常酸素下よりも有酸素性エネルギー供給量が小さく,無酸素性エネルギー供給量が大きいことが示唆された.運動後の血中乳酸濃度の差や,運動開始後20秒以降でVO2に条件間で差がみられたことから,低酸素下では常酸素下よりも解糖系によるエネルギー供給が大きくなると思われる.以上のことから,短時間・高強度のトレーニングを行う際には,常酸素環境よりも低酸素環境のほうが無酸素性エネルギー供給機構に与える刺激が大きいことが示唆された.平成23年度に実施した一過性の低酸素環境での運動による基礎的検討に基づき、平成24年度は低酸素環境でのトレーニング効果を検証するためのトレーニング実験を実施した。被験者の協力により実験はおおむね計画通りに遂行できた。その結果、トレーニングの効果が常酸素環境と低酸素環境とでどのように異なるかを明らかにするための資料を得ることができた。平成24年度の研究では、被験者の体調不良により途中で実験を中止したこともあり、当初の予定よりも若干被験者が少なかった。今後は実験データの精度を高めるためにも被験者を若干名追加して検討を行う予定である。平成23年度は,自転車トラック競技短距離の日本代表選手および大学生競技選手に被験者としての協力を得られたため,当初の予定を若干変更して,競技選手が実際に行っているトレーニングの有効性を検証することに焦点を当てて研究を遂行した.その結果,短距離種目の選手が無酸素的エネルギー供給能力向上を目的として低酸素トレーニングを行うことの有効性が示唆され,次年度以降に行う研究のベースとなる有意義な成果が得られた.平成23年度は低酸素環境での高強度固定負荷運動時の代謝動態を明らかにでき,無酸素的エネルギー供給能力の向上を目的とした効果的な低酸素トレーニングを行うための基礎資料が得られたため,おおむね順調に研究が進展したと判断できる.平成24年度の研究において実施したトレーニング実験の被験者を若干増やし、データの精度を高める予定である。また、一過性の低酸素暴露下での運動時のエネルギー代謝について、これまでに行った実験とは異なる運動強度・運動時間で実験を行い、競技選手がパフォーマンス向上のために有効な低酸素トレーニングを行うための基礎資料作成を目的とした検討を行う。
全ゲノムシークエンス時代に向けた統合失調症の病態の類型化と診断・治療戦略の確立

統合失調症の症状、治療反応性、予後には患者間で大きな差があり、その差の一部は遺伝要因が関与していると推測されている。近年のゲノム解析の進歩により、非家族性の統合失調症の一部は突然変異が大きな役割を演じていることが知られてきたが、約1/3を占める家族性では関係する遺伝子は捉えれていない。そのため家族性と非家族性で病態の違いに関して大きな障壁となっている。日本人の家族性の統合失調症では第1染色体短腕に連鎖が認められていたことから、本研究では連鎖部位の統合失調症の関連遺伝子を次世代シークエンサーなどにより探索し、CELSR2遺伝子が関わっていることを発見した。2人の統合失調症患者の末梢血由来のゲノムDNAを用いて、エクソーム解析を行った。その結果、遺伝子機能に影響を与える多くの変異を同定した。統合失調症は多因子性疾患であるため、多くのゲノム変異が発症に寄与している可能性があるため、変異を機能的にグルーピングする必要がある。そこで統合失調症の病態に関わっているグルタミン酸シグナル伝達に影響を与える変異を中心に解析を行った。その結果、ひとつの統合失調症の病態の深く関わっていることが知られている遺伝子のナンセンス変異を同定し、この変異がそれを有している患者の統合失調症の発症に大きく関わっていることが推測された。一方、グルタミン酸受容体機能に関わっている遺伝子のうち、SLC1A1遺伝子内のSNPsが統合失調症と関連していることを発見し、最も関連が強かったのはrs7022369であった。このSNPのリスクアレルがヒト死後脳の前頭前野解析によりSLC1A1遺伝子発現レベルが高いことと関連していることが分かった。しかし、エクソーム解析ではSLC1A1遺伝子の機能変化を予測させる変異は検出されなかった。本研究により、SLC1A1遺伝子多型が統合失調症の疾患感受性に関与する可能性を示唆し、統合失調症のグルタミン酸病態仮説に関わるものであると推測された。しかし、この結論には他の集団での確認と共に、頻度は低くても統合失調症に対する強いリスクを持った変異を同定するなどSLC1A1遺伝子と統合失調症との関連に関するより強い証拠が必要である。統合失調症は症状、治療反応性、予後に患者間で大きな差があり、その差の一部は遺伝要因が関与していると推測されている。統合失調症には家族性と孤発例があり、遺伝的要因の違いのひとつの目安となっている。日本人における家族性の統合失調症の原因遺伝子を同定するためにこれまで罹患同胞対法により連鎖解析を行い、第1染色体の短腕部分に原因遺伝子が存在していることが示唆されてきた。発症リスクに関わる可能性のある多型頻度のゲノム多様性を全ゲノム関連解析用マイクロアレイとカスタムアレイで検索したが、連鎖を説明できる関連多型は検出されなかった。残っているのは稀な変異が原因となっている可能性である。そこで連鎖解析の対象となった統合失調症家系の発端者を対象に連鎖領域の遺伝子のエクソン領域に関して、発端者14例を対象にエクソーム解析を行い、候補遺伝子を選び、その候補遺伝子の全エクソンについて、全発端者を対象にリシークエンスして、すべての変異を検出した。SOLiD 5500によるエクソーム解析に続いてサンガー法により確認して検出された変異についてさらにPolyPhen2でDamagingと予測される変異に絞った結果、候補遺伝子としてCELSR2遺伝子が検出された。続いて、全家系メンバーを対象に同遺伝子の全エクソンをIon PGMによってターゲットリシークエンスを行い、サンガー法により確認した結果、2000人のコントロールと比較して、個々の家系により変異の種類は異っていたもの、遺伝子単位で見ると有意に患者に変異が多く、また、伝達不平衡テスト(TDT)法によっても有意に変異が発端者に伝達されていた。日本人の家族性の統合失調症の原因としてCELSR2遺伝子が関わっていることが示された。しかし、家系により関与する変異は異なることから個々の患者ごとにゲノム解析することの必要性が診断・治療戦略をたてる上で必要であることが確認された。統合失調症の発症には遺伝要因が大きく関係する。統合失調症の発症に関連するゲノムの多様性や変異は民族間で共通の頻度の高いものでは影響力は小さく、比較的頻度の低い、あるいは、民族特異的な変異が比較的強い影響力を持っていることが知られつつある。本研究は全ゲノム関連解析を通じて、頻度の低い、日本人あるいは東アジア人特有の変異を持つ可能性のある候補遺伝子の解析と次世代シークエンサーを利用して統合失調症に関連するゲノム変異の特徴を明らかにすることにより、患者の全ゲノム情報をさらに有効に診断・治療に利用する方法を開発することを目的とする。

本年度は対象疾患を統合失調症と遅発性ジスキネジアとして、すでに終了しているGWASデータと本研究で遂行するプールしたサンプルによる解析により日本人に特異的に見られる頻度の低い変異のうち、統合失調症と関連する変異を検出し、replication解析を行った。その結果、DPP6遺伝子が新たな遅発性ジスキネジアの関連遺伝子であり、DPP6が発現低下することが遅発性ジスキネジアのリスクになることを解明した。さらに、ニューロンで発現しているグルタミン酸トランスポーターであるSLC1A1遺伝子にある東アジア人特異的なコピー数変異が統合失調症に関連することを見出した。このコピー数減少はSLC1A1遺伝子の発現上昇と関連しており、民族特異的な統合失調症のリスク因子と考えられた。そこで、サンプル数をさらに増やして計4000人のサンプルで検討したところ、このコピー数変異は統合失調症と関連せず、むしろ、このコピー数変異と連鎖不平衡にある一塩基多型が統合失調症と関連することがわかった。次世代シークエンサーの立ち上げにやや時間がかかり、解析したサンプル数が少数にとどまっている。一方、関連解析や遅発性ジスキネジアに関しては順調に論文として発表することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。次世代シークエンサーによる解析数が当初予定したよりも少なく、解析を遂行できるサンプル数に至っていない。最大のハードルである次世代シークエンサーによる解析が軌道に乗ったので今後はサンプル数を増やすことにより、目的を達成できるものと予想される。次世代シークエンサーにより、ケース・コントロールデザインでエクソーム解析を行い、統合失調症と関連する変異の特徴を明らかにし、多因子遺伝性疾患の次世代シークエンサー解析の一手法を提示する。
個人対応型多能性幹細胞の作製技術開発

胚性幹(ES;Embryonic Stem)細胞は、胚盤胞の内部細胞塊細胞に由来する多能性幹細胞であり、体の全ての組織細胞に分化できる性質をもつ。ES細胞のもう一つの特異な性質が、限られた機能を果たすために分化した体細胞に再び多能性を呼び覚ます能力、いわゆる再プログラム化能である。ES細胞は、体細胞と細胞融合すると体細胞核の記憶をES細胞様に書き換えることができる。最近、ヒトES細胞も同様の再プログラム化能を持つことが明らかになり、ES細胞による体細胞の幹細胞化を目指した再生医療への応用が考えられている。本研究では、移植細胞の免疫拒絶に深く関わるMHC遺伝子群が集積する第17番染色体(Chr17)のうちES細胞由来のものだけを選択的に取り除く技術開発に成功した。免疫拒絶反応を評価する目的で、体細胞由来型MHCのみを持つ融合細胞を同系統のマウスの腎臓被膜下に移植した。その結果、Chr17除去済み融合細胞は、長期間生着し様々な分化細胞を含むテラトーマを形成した。これに対して、Chr17除去前の融合細胞はテラトーマをほとんど形成しなかった。組織学的観察、炎症反応関連の遺伝子やタンパク質の発現、さらにCTLによる細胞傷害活性の測定結果の全てにおいて、ES細胞のChr17(MHC)の選択的除去により、体細胞型MHCのみをもつ分化融合細胞への免疫拒絶が有意に軽減されていることが明らかになった。(投稿予定)胚性幹(ES;Embryonic Stem)細胞は初期胚由来の幹細胞で、分化能や増殖能に優れているが由来する分化細胞は移植により拒絶反応を引き起こす。我々はES細胞が体細胞を未分化細胞に変化させる再プログラム化能を持つことを細胞融合実験から発見した。この再プログラム化能を応用して、融合細胞からES細胞由来の染色体を選択的に除去し個人対応型多能性幹細胞の作製を目指している。これまで常染色体を丸ごと除去した報告はなく、独自に染色体除去カセット(CEC)を構築した。CECは薬剤耐性遺伝子と蛍光マーカー遺伝子を含んでいる。CECをランダムに導入したクローン(Puro耐性/GFP陽性)を任意に選別し解析したところ、11番(CEC11tg/+)と12番(CEC12tg/+)染色体への導入を確認した。これらのESクローンを胸腺細胞と細胞融合し、CECを活性化しFACSソーティングによりGFP陰性細胞を分取したところ、融合細胞核から11番または12番染色体が選択的に除去されている事を核型や染色体ペインティング解析から明らかにした。この様に、CECで印された染色体を核から選択的に除去する技術開発に成功した。次に、CEC(Neo/GFP)を相同組換えにより6番染色体に導入後、G418のHigh dose処理によりES細胞の2本の6番染色体にCECが導入されたクローンを選別した(CEC6tg/tg)。JF1マウス胸腺細胞との融合細胞でCECを活性化し、ES細胞由来の1対の6番染色体を除去した融合細胞を作製した。6番染色体上には未分化維持因子Nanogが同定されており、体細胞由来Nanogが未分化維持に働くことを明らかにした。(投稿中)胚性幹(ES)細胞は初期胚由来の幹細胞で、分化能や増殖能に優れているが、由来する分化細胞は移植により拒絶反応を引き起こす。この再プログラム化能を応用して体細胞融合ES細胞からES細胞由来の染色体を選択的に除去し、拒絶反応を引き起こさない個人対応型多能性幹細胞の作製を目指している。我々は、染色体除去技術の開発を目的に、DNA複製後の姉妹染色分体間で効率よく組み換えを起こすDNA配列(染色体除去カセット)を構築した。初めに、取り除きたい染色体に染色体除去カセットを組み込んだES細胞を準備する。次に体細胞と細胞融合した体細胞融合ES細胞をDNA組み換え酵素で処理すると、融合細胞の核から染色体除去カセットが導入された染色体のみが選択的に除去される。この染色体除去技術の有効性は、マウスES細胞由来の第11番染色体、および第12番染色体の選択的除去により確認された。次に、この染色体選択的除去技術を応用し、ES細胞由来の第6番染色体を2本とも除去した。マウス第6番染色体には、未分化維持因子Nanog遺伝子が存在するため、ES細胞の未分化性維持に必須の染色体である。第6番染色体2本に染色体除去カセットを導入後、亜種マウス体細胞と融合細胞した。DNA組み換え酵素の処理により、ES細胞由来の第6番染色体が2本とも除去されたことが亜種間DNA配列多型を利用して確認された。このことから、再プログラム化により再活性化された体細胞由来のNanogの働きのみで融合細胞の未分化性が維持されている事が示された。(Matsumura et al.,Nature Methods(2007))今後は、染色体除去技術を応用し移植細胞の免疫拒絶に深く関わるMHC遺伝子群が集積する第17番染色体の除去を試みる予定である。

ES細胞は、体細胞と細胞融合すると体細胞核の記憶をES細胞様に書き換えることができる。最近、ヒトES細胞も同様の再プログラム化能を持つことが明らかになり、ES細胞による体細胞の幹細胞化を目指した再生医療への応用が考えられている。本研究では、移植細胞の免疫拒絶に深く関わるMHC遺伝子群が集積する第17番染色体(Chr17)のうちES細胞由来のものだけを選択的に取り除く技術開発に成功した。免疫拒絶反応を評価する目的で、体細胞由来型MHCのみを持つ融合細胞を同系統のマウスの腎臓被膜下に移植した。その結果、Chr17除去済み融合細胞は、長期間生着し様々な分化細胞を含むテラトーマを形成した。これに対して、Chr17除去前の融合細胞はテラトーマをほとんど形成しなかった。組織学的観察、炎症反応関連の遺伝子やタンパク質の発現、さらにCTLによる細胞傷害活性の測定結果の全てにおいて、ES細胞のChr17(MHC)の選択的除去により、体細胞型MHCのみをもつ分化融合細胞への免疫拒絶が有意に軽減されていることが明らかになった。(投稿予定)