hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪細胞数を減少させ肥満を改善する遺伝子治療の開発

近年、肥満が深刻な社会問題として取り上げられている。そこで、脂肪細胞数を適切なレベルに減少させることができれば、一時的な肥満の改善のみならず、肥満しやすい体質の改善にも有効と考えられよう。我々は、aP2遺伝子やPAI-1遺伝子のプロモーターの下流にジフテリア毒素をコードするcDNAを組み込み、これを発現するアデノウイルスを作製した。この発現はジフテリア毒素に対する抗体を用いることで確認された。アデノウイルスの系を3T3-L1脂肪細胞に感染させ、ジフテリア毒素を発現させることで、3T3-L1脂肪細胞が死滅することも確認された。従って、このアデノウイルスによって脂肪細胞数を減少させることは可能と考えられた。現在、このウイルスを肥満モデル動物に、経静脈的にもしくは脂肪組織に直接注入し、脂肪細胞に特異的にジフテリア毒素を発現させ、その脂肪細胞を死滅させる条件を検討している段階である。少なくとも局所に注入すると、その部位の脂防組織の減少を生ずることは確認された。また、周囲の皮膚組織や筋肉組織には影響が及ばないようである。この治擦方法をさらに推し進め、局所の脂肪組織の減少に加え、インスリン感受性の改善作用が引き起こされるかを検討したい。また、その場合、脂肪細胞より分泌されるPAI-1やadiptinが低下するか、検討したい。最終的には、耐糖能や動脈硬化の進展がどのように改善されるかを詳細に検討して、この遺伝子治療が人間にも応用できるものであるかを明らかにする予定である。
酸素欠損動物を用いるアンモニア解毒能の解析

本研究では尿素サイクル酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)に動力学的な異常を持つsparse-fur(spf)マウスを用い,そのアンモニア動態,血中,肝内,脳内アミノ酸濃度の変動,神経伝達物質の変化,ならびに灌流肝におけるアンモニアからの尿素合成能について検討した.spfマウスはオルニチンに対するkm値が大きくなった異常OTCを持つ.血中アンモニアは離乳期に上昇した(高アンモニア期)が,その数週間後には正常に復する(適応期)という適応現象がみられた.血中アミノ酸では適応期のグルタミンの増加,両時期でのシトルリンとアルギニンの低下以外特異的変化はみられなかったが,脳内では高アンモニア期に著しいグルタミンの増加,これと強い相関性を示すフェニルアラニン,チロシン,さらにはトリプトファンの増加がみられた.神経伝達物質の検索から5-ヒドロキシトリプタミンから5-ヒドロキシインドール酢酸にいたる代謝が亢進していることが判明した.これらの変化も適応期には正常に復した.しかし脳内のシトルリンとアルギニンは低下した状態を維持した.OTC欠損のよい示標とされる尿中オロト酸は高アンモニア期に対照の20倍以上に増量していた.適応期には低下したが,それでも対照の10倍と高いレベルを維持した.適応期に血中アンモニアが低下する機構の1つにはこの時期に肝異常OTCが若干上昇することが関与する可能性が示された.一方,適応期の灌流肝における尿素合成能の検索ではオルニチン濃度の低い条件下では尿素合成能が対照にくらべ低いが,オルニチン高濃度条件ではほぼ正常の合成能となることが示された.これらの研究から血中アンモニアの上昇と全身のシトルリンとアルギニンの低下および尿中オロト酸上昇とは若干異なる機構が働いている可能性が示されており,今後さらにそれらの機構について追及する必要性がある.本研究では尿素サイクル酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)に動力学的な異常を持つsparse-fur(spf)マウスを用い,そのアンモニア動態,血中,肝内,脳内アミノ酸濃度の変動,神経伝達物質の変化,ならびに灌流肝におけるアンモニアからの尿素合成能について検討した.spfマウスはオルニチンに対するkm値が大きくなった異常OTCを持つ.血中アンモニアは離乳期に上昇した(高アンモニア期)が,その数週間後には正常に復する(適応期)という適応現象がみられた.血中アミノ酸では適応期のグルタミンの増加,両時期でのシトルリンとアルギニンの低下以外特異的変化はみられなかったが,脳内では高アンモニア期に著しいグルタミンの増加,これと強い相関性を示すフェニルアラニン,チロシン,さらにはトリプトファンの増加がみられた.神経伝達物質の検索から5-ヒドロキシトリプタミンから5-ヒドロキシインドール酢酸にいたる代謝が亢進していることが判明した.これらの変化も適応期には正常に復した.しかし脳内のシトルリンとアルギニンは低下した状態を維持した.OTC欠損のよい示標とされる尿中オロト酸は高アンモニア期に対照の20倍以上に増量していた.適応期には低下したが,それでも対照の10倍と高いレベルを維持した.適応期に血中アンモニアが低下する機構の1つにはこの時期に肝異常OTCが若干上昇することが関与する可能性が示された.一方,適応期の灌流肝における尿素合成能の検索ではオルニチン濃度の低い条件下では尿素合成能が対照にくらべ低いが,オルニチン高濃度条件ではほぼ正常の合成能となることが示された.これらの研究から血中アンモニアの上昇と全身のシトルリンとアルギニンの低下および尿中オロト酸上昇とは若干異なる機構が働いている可能性が示されており,今後さらにそれらの機構について追及する必要性がある.本研究は尿素サイクル酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)を欠損する2種のマウス(spfおよびspf+ashマウス)におけるアンモニア解毒能を主に肝ミトコンドリアおよび灌流肝レベルで解析しようとするものである。両OTC欠損マウス共に通常の測定条件下で対照の5-30%の肝OTC活性を示すにすぎないが、spf-ashは全く、spfマウスは離乳期およびその後数週のみしか、高アンモニア血症を呈さない。このような高アンモニア血症発症には遺伝子異常の存在以外に食餌条件や遺伝的背景などの種々の因子が関与していると思われる。それらの因子を明らかにすべく、またミトコンドリアおよび臓器レベルでのOTC異常の影響を検討している。ミトコンドリアレベルでのアンモニアとオルニチンからのシトルリン合成を成長後の対照およびOTC欠損マウスで比較したところ、オルニチン濃度変化においてspfマウスは若干大きいkm値を示す傾向はあるが、Vmaxでは3者間に全く差異はなく、OTC活性が5-30%であってもミトコンドリアレベルでは律速段階になっていないことを示した。それにもかかわらず尿中へのオロト酸の排泄はspfおよびspf-ashでは対照よりも明らかに高いレベルを示すので、必ずしもアンモニア解毒能は正常とはいえない。又本年度はマウス肝を用いる肝灌流システムを作成したので、今後はこれを用いて臓器レベルでアンモニアからの尿素合成とピリミジン合成へのちっ素の流れについて検討可能になった。一方遺伝的背景が高アンモニア血症発症に与える影響を探るべく、変異OTC遺伝子を4種のマウスstrainに移入する実験を現在進めている。

本年度購入した生物研究用酸素モニターはミトコンドリアの呼吸機能を監視する目的に、メタボリックケージは食餌摂取量の測定と尿の採取、オロト酸の尿中排泄測定に使用されている。本研究は尿素サイクル酵素であるオルンチントランスカルバミラーゼ(OTC)を欠損する2種のマウス(spfおよびspf-ashマウス)におけるアンモニア解毒能を主に肝ミトコンドリアおよび潅流肝レベルで解析しようとするものである.両OTC欠損マウス共に通常の測定条件下で対照の5-30%の肝OTC活性を示すにすぎないが, spf-ashは全く, spfマウスは離乳期およびその後数週のみしか,高アンモニア血症を呈さない.このような高アンモニア血症発症には遺伝子異常の存在以外に食餌条件や遺伝的背景などの種々の因子が関与していると思われる.それらの因子を明らかにすべく,またミトコンドリアおよび臓器レベルでのOTC異常の影響を検討している.ミトコンドリアレベルの実験は前年度行った.ミトコンドリアでのシトルリン合成はspf-ashでは正常と変わらず, spfではオルニチン濃度の影響がみられるという結果を得た.本年度は潅流肝におけるアンモニアからの尿素合成能について検討を加えた.これまでにラットを用いる潅流肝実験システムは確立していたが,マウスを用いる系は文献上も皆無であるので,その実験系をまず確立した.また潅流液中のアンモニアおよび尿素の濃度を多数検体で測定する必要があることからFlowinjection analysis法による定量法を確立した.以上の方法を用いて正常マウスの2mM塩化アンモニアからの尿素合成速度は0.40.65μmol/min/g liver(at30°C)であること,および2mMオルニチンの添加は2-4倍尿素合成速度を高めることを明らかにした.一方遺伝的背景の影響を調べるためにspfマウスと4種の近交系マウス・ストレインを9代掛け合わせることによって, 99.6%それぞれの背景を持つコンジェニックマウスを作成することに成功した.多数の病原体フリー近交系マウスの購入とOTC欠損マウスの維持に研究費を使用した.
複製因子PCNAと細胞周期調節因子p21の相互作用

細部増殖制御因子であるp21蛋白質が、細胞内で複製因子PCNAと結合していることが、細胞増殖に対しどのような機能を持つかは、まだ十分理解されていない。そこでp21蛋白質の結合とPCNAの機能の関連を明らかにするため、以下のようにPCNAの変異体を作製し、この蛋白質の機能ドメインとp21結合部位の検索を行った。1.PCNAの複製因子としての機能ドメイン(DNAポリメラーゼ、あるいは複製因子RF-Cとの相互作用部位)を変異を導入したPCNAの機能変化により解析した。その結果、鋳型DNA、DNAポリメラーゼ、さらに複製因子RF-Cと相互作用するドメインがPCNA三量体分子の内側、外側および側面にマップされた。2.野性型および変異を導入したPCNA蛋白質とp21蛋白質の相互作用の程度を、BIAコアシステム、あるい免疫沈降法により測定した。その結果、複製因子としての機能を失った点突然変異を持つPCNAでもすべてp21に結合し、複製因子間の相互作用と異なった結合様式をとること、さらに立体構造に依存した複数の結合部位と相互作用することが示された。3.p21に結合しない出芽酵母のPCNAに着目し、これとヒトPCNAのハイブリッドを作製し、p21との結合性を検討した。その結果、ヒトPCNAのN末端側領域にp21に特異的結合をする構造が存在することが明らかとなった。4.p21によるPCNAの活性への影響を、精製した複製酵素の反応系を使って解析した。その結果、PCNAがDNAポリメラーゼの活性を促進する機能は、PCNA三量体当たり約三分子のp21の結合により効率よく阻害されるのに対し、RF-Cとの相互作用はp21の結合によって影響されなかった。従って、PCNAの関与するDNA複製のDNA鎖伸長過程の中でも、DNAポリメラーゼがPCNAに結合しDNAを合成する過程が直接阻害されていると考えられる。
エマルションハイブリッド望遠鏡による宇宙ガンマ線の観測

宇宙ガンマ線観測に用いることのできるエマルション(原子核乾板)望遠鏡システムの開発を行った。その性能を確認するため地上での実証テストを重ね、気球に搭載するフライトモデルを設計・製作した。そのフライトモデル1号機を使用した気球実験をJAXAに提案し、2011年6月に打上げ予定の実験として採択された。本研究は、宇宙から飛来するガンマ線を、角度分解能に優れたエマルション(原子核乾板)を用いて精細に観測することを目的としている。検出器内で捕らえたガンマ線イベントの到来方向を天球上にマップするには、それぞれのイベントの発生時刻を正しく知る必要がある。このため、エマルション中の飛跡の通過時刻を記録するタイムスタンプ部の開発が不可欠であった。過去の研究で、飛跡の蓄積中にエマルションフィルムを相互に動かし飛跡の位置ズレ量を変化させることで、蓄積型検出器のエマルションを用いながら15分程度の精度の時間情報を得るシフターという手法を確立していた。今年度の研究で、これをさらに推し進めて複数のエマルションフィルムをアナログ時計の時針・分針・秒針のように、それぞれ異なる周期で動かし、相互の位置関係を再現することで、飛跡の通過時刻を秒単位の精度で再現できる事を実証した。この成果に基づき、ガンマ線望遠鏡のタイムスタンプ部として多段のシフターを採用することにした。飛跡通過時刻を再現する精度は、多段シフターでフィルムの位置関係を制御する精度に直結する。多段シフターの設計・製作は、顕微鏡ステージや人工衛星搭載の望遠鏡など、特殊用途の精密光学機器開発で豊富な経験を持つ三鷹光器社の協力を得て行った。上空の低温・真空環境下においても、往復する周期運動の軌道および送りの精度10μm以内を確保しつつ、多段になっても軽量・コンパクトで気球への搭載に適した機構を考案し、プロトタイプ1号機を完成させ、次年度以降の気球に搭載しての上空での観測への見通しを立てる事ができた。昨年度の研究で、飛跡の蓄積中に複数段のエマルションフィルムをアナログ時計の時針・分針・秒針のように、それぞれ異なる周期で動かし飛跡の位置ズレ量を変化させることで、蓄積型検出器のエマルションを用いながら秒単位の時間情報を得る多段シフターという手法を確立した。多段シフターの設計・製作は、顕微鏡ステーシや人工衛星搭載の望遠鏡など、特殊精密光学機器開発で豊富な経験を持つ三鷹光器社の協力を得て行い、プロトタイプ1号機を完成させた。今年度の研究においては、このプロトタイプ1号機を用いて、気球高度と同等の低温・真空環境下においても、往復する周期運動の軌道および送りの精度10μm以内が確保できるかの試験を実施した。真空環境下における乾燥にともなうエマルションフィルムの変形や低温環境下における駆動モーターの特性の変化などの問題点が発生したが、これらをひとつひとつ解決し、プロトタイプ1号機を気球に搭載しての上空での観測へ見通しを立てる事ができ、宇宙航空研究開発機構(JAXA)に気球フライトを申請中である。また、プロトタイプ1号機のテスト結果に基づき、観測感度向上のために面積を20倍に増加させつつ、駆動機構に改良を加えたプロトタイプ2号機の開発を進め、その機構部を完成させた。検出器内で捕らえたガンマ線イベントの到来方向を天球上にマップするには、それぞれのイベントの発生時刻を正しく知った上で、刻々と変化する天球に対する観測器の方向を正確に知る必要がある。エマルション中の飛跡の通過時刻を知るために、飛跡の蓄積中に複数段のエマルションフィルムをアナログ時計の時針・分針・秒針のように異なる周期で動かし、フィルム間での飛跡の位置ズレ量を変化させ、解析時にその位置ズレ量を再構成することで秒単位の時間情報を得る多段シフターという手法を確立した。昨年度までに、テストフライト用の気球搭載モデル1号機およびその20倍の観測面積を持つ2号機を製作し、1号機を用いて、気球高度と同等の低温・真空環境下においても、往復する周期運動の軌道および送りの精度10μm以内が確保できるかの試験を実施した。さらに、観測器の天球に対する姿勢をモニターするシステムの開発を行った。将来の長時間フライトを見据えて、昼間でも気球高度で星を捉えられる条件をさぐり、短波長の背景散乱光を抑えて、星の光を捉えることに最適化した、光学フィルター、大口径レンズ、高量子効率の近赤外CCDカメラを組合せたシステムを作った。最終年度に1号機とスターカメラシステムを実際に気球に搭載して観測を行う予定であったが、JAXAでの気球実験への採択が1年遅れ2011年の5月に打ち上げ予定となっている。
三陸漁村集落の津波被災状況の分析と復興計画および復興過程に関する参与的研究

この研究は、被災集落における復興計画の策定に参与し、その過程を記録する事で、住民主体の合意形成過程、住民要求の把握と各種復興事業の実施における課題について明らかにすることを目的としている。研究対象は主として岩手県大船渡市三陸町越喜来崎浜集落及び宮城県気仙沼市大島を対象とし、以下6項目の研究を行なった。1)岩手県内沿岸集落の津波被災に関する歴史的研究、2)集落空間と生活実態の調査、3)防集事業における住宅復興の課題整理、4)被災後の集落共同空間構築過程の記録、5)漁集事業における課題整理、6)漁業史文庫の再建支援本研究は津波被災集落の被災状況について集落レベルで明らかにするとともに、その復興計画作成過程に参与しつつ復興過程について明らかにする事を目的とする。以上の研究目的の下、25年度は主として以下の研究を行った。1.防災集団移転促進事業の計画策定支援とその過程の整理分析:越喜来崎浜集落における集団移転住宅地の計画策定ワークショップに参与し、集団移転に関する住民意向の把握と計画策定上の課題について整理した。2.地域の住文化に応じた復興住宅の検討:前年度実施した崎浜地区の集落調査に基づき、地域型復興住宅のモデルを作成し、現地展示会及び検討ワークショップを実施し、被災住宅再建における要望と課題について整理した。3.生業を活かした復興まちづくりの支援と記録:気仙沼市大島地域における漁業史文庫復興および民宿のグループ再建過程を支援しその過程を記録整理した。4.5.成果の発表と討論:成果は日本建築学会大会における研究懇談会にて発表を行い、合わせて討論会を行った。1)岩手県内沿岸集落の津波被災に関する歴史的研究、2)集落空間と生活実態の調査、3)防集事業における住宅復興の課題整理、4)被災後の集落共同空間構築過程の記録、5)漁集事業における課題整理、6)漁業史文庫の再建支援本研究は津波に被災した三陸沿岸(漁村)集落の被災について集落レベルで明らかにするとともに将来の減災を目標として見据えた復興過程についてこの復興計画策定支援に参与しつつ研究することを目的としている。以上の研究目的の下、24年度は主として以下の研究を行った。1.復興計画策定支援の過程の整理:大船渡市三陸町越喜来地区における発災以降の復興計画策定支援の成果と諸問題について整理分析を行った。2.復興住宅計画に向けた聞き取り調査及び集落空間調査:越喜来崎浜集落における仮設住宅居住者を対象に、a.震災前の住まいのかたちと住まい方、b.住宅再建に向けた要望について聞き取り調査を行った。また合わせて集落空間調査として、c.隣保単位の空間構成調査(近隣図の作成)、d.共同空間の分布調査を行い、復興住宅の計画に向けた基礎的情報の整理と分析を行った。3.住民主体の復興まちづくりとしての集落集会施設の建設ワークショップの支援と記録:中心部が浸水流出した集落の核となる集会施設の自力建設計画に参与し、住民と協同の建設ワークショップを実施し、その過程の記録を行った。4.成果の発表と討論:上記の成果について、農村計画委員会春季学術研究会(6月)、日本建築学会大会(9月)、震災2周年シンポジウム(3月)の3つの公開研究会において、中間成果を報告し意見と経験を交換した。本研究は津波に被災した三陸沿岸(漁村)集落の被災について集落レベルで明らかにするとともに将来の減災を目標として見据えた復興過程についてこの復興計画策定支援に参与しつつ研究することを目的としている。以上の研究目的の下、26年度は主として以下の研究を行った。1.漁業集落防災機能強化事業の計画策定支援とその過程における課題の整理分析:大船渡市三陸町越喜来崎浜集落における漁業集落防災機能強化事業の計画支援として浸水エリアの土地利用計画の住民案策定過程に参与し、そのプロセスを記録し課題を整理した。2.住民主体の復興事業の支援と課題整理:宮城県気仙沼市大島地区における漁業に関する歴史資料の保全活動に参与しそのプロセスを記録し課題を整理した。建築計画1.越喜来崎浜集落及び気仙沼大島地区の復興に継続的支援を行い、防災集団移転等の集落における個々の事業レベルの計画策定に参与的観察することで、より詳細な課題の把握と分析を行ったこと。2.前年度および今年度に実施した集落調査および住宅再建に関するワークショップから得られた知見を公開研究会にて発表し、復興計画策定過程における課題についてより深化した検討を行ったこと。1.基礎資料の収集と分析として被災集落マップを作成した。2.越喜来地区復興委員会による復興計画策定への参与、およびその後の集落単位での個別事業に関する計画支援を行った。計画の進展スピードは遅いが、そのプロセスを国名に記録し課題の検討を行った。3.復興住宅の計画支援の過程において、仮設居住者の住需要に関するヒアリング調査に加え、集落空間、漁家住宅、住まい方などの実態調査を行った。以上より概ね当初の予定を達成し順調に進展していると言える。1.集落復興事業に関する参与的研究を推進:具体的にはこれまで継続的に参与してきた越喜来地区において、復興計画の進捗状況の記録と検証、及び周辺集落における進捗状況との比較を行う。2.住宅再建の実態と課題の把握:防災集団移転団地における住宅再建の実態を把握し、課題を整理する。3.これらの成果をもとに研究会を実施し、成果のとりまとめを行う。1.集落復興計画に関する参与的研究を推進する。

具体的には、震災以降継続的に参与してきた越喜来地区において、a.当初の復興計画と具体的事業の進捗状況の記録と検証、b.防災集団移転等の各種個別事業の計画支援を行いその過程の記録と課題の分析を行う。2.復興住宅のモデル提案と計画支援ワークショップの実施及びその記録を行う。24年度に調査を実施した崎浜地区の集団移転を予定する世帯を対象に、崎浜型復興住宅のモデル作成ワークショップを実施するとともに、その過程からより具体的な住需要の把握と課題の整理を行う。3.これらの成果をもとに研究会を実施し、成果の中間とりまとめを行う。主として調査旅費を効率的に使用する事ができたことによる。具体的には被災地支援に関する学内の旅費支援制度を使う事ができたことや学会参加時に研究打ち合せを行う等で旅費支出を大幅に減らす事ができた。26年度の研究費は、当初の予定にこの残金を加えた全体の使用計画として、調査関連文具、印刷用消耗品等の物品費40000円、調査打ち合せ旅費として400000円、資料整理作成補助者謝金として100000円、その他としてレンタカー借り上げ費用50000円。報告書冊子印刷費200000円の使用を見込む。24年度の研究費については、効率よく使用できたため残金が6万円程度発生した。25年度の研究費は、当初の予定にこの残金を加えた全体の使用計画として、調査関連文具等の物品費として50,000円、調査旅費として740,000円、調査資料作成整理補助者謝金として120,000円、その他の費用として、レンタカー代として50,000円の使用を見込む。
ATP合成酵素のATPモーターとプロトンモーターをつなぐ分子内クラッチ

本年度は、不活性変異体を用いた脱共役状態の解析などに取り組んだ。cサブユニットにプロトン結合部位を持たない変異体は、cサブユニットリングが回転できないため、共役状態においてはF1の回転も抑えられ、したがってATPase活性を持たないものと予想していたが、実際にはATPase活性を持つことが確認された。この変異体ではcサブユニットリングが空回りしてしまう可能性が考えられた。そこで低いながらもプロトン輸送活性を持ち、F1ではなくcサブユニットの回転が律速となるような変異体を作製し、そのATPase、GTPase活性を検討することとした。プロトン結合部位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した変異体や、アミノ酸の位置をずらした変異体をいくつか作製した。これらの変異体では、予想通りATPaseの低下が観察されたが併せてGTPaseの低下も観察された。この結果からGTPを基質とした場合でも完全に脱共役しているわけではなく、ATPを基質した場合の半分程度は共役している可能性や、脱共役状態でもcサブユニットリングが回転している可能性などが考えられた。これらの変異体のプロトン輸送活性は低いと考えられ、まだ測定できていない。今後測定条件を検討しNTPase活性だけでなくプロトン輸送活性についても評価したいと考えている。この他、枯草菌ATP合成酵素の活性調節が生理的にはどのように機能するのかを明らかにした。脱共役状態の生理的な意義についても、このような実験系を用いることで明らかにできると期待される。現在得られている結果が、変異体そのものの性質を反映したものなのか、あるいは培養条件やサンプル調製の条件に依存して部分的に機能が損なわれてしまっているのかを明確に区別することが難しいため、当初予定より進捗がやや遅れている。引き続き不活性変異体を用いた解析やBiacore測定のためのサンプル調製の検討を行うとともに、本研究で主な対象としている好熱菌ATP合成酵素の高分解能の全体構造が明らかとなったので、この情報を用い、以前行ったサブユニット間架橋の実験について架橋部位を再検討し、再度試みることを予定している。これまでに予備的な実験として、Biacoreを用いてγサブユニットとεサブユニットの結合及びγεサブユニットへのcサブユニットの結合を解析した。cサブユニットの標品としては、cサブユニットの細胞質側ループ部分のみを含む合成ペプチドを用いた。この条件では、ATPを加えない場合が脱共役状態、ATPを加えた場合が共役状態に対応すると考えられる。γサブユニットを固定し、εサブユニットの結合を測定した結果では、ATPの有無による差は見られなかった。また、ε非存在下でのγへのcサブユニットループの結合はほとんどみられなかった。γサブユニットにεサブユニットを結合させた状態で、cサブユニットループの結合を観察すると、ATP存在下で、より強い結合が観察された。しかしながら、観察されたcサブユニットループ結合の化学量論比は、εサブユニットに対して1程度であり、ATP合成酵素複合体中での値である10と比較すると小さなものであった。そこで、cサブユニットの10量体であるcリングを調製し、同様の測定を行う事とした。cリングの大量発現系を作製し、発現を確認したところである。また、サブユニット間架橋による共役の回復についても検討した。ここでは、γーεサブユニット間にジスルフィド架橋を形成しうる変異体ATP合成酵素を作製した。作製した変異体を含む反転膜小胞を用い実験を行ったところ、酸化剤処理による共役の回復は見られなかった。しかしながら、この際に用いたサンプルを調べたところ、この条件では架橋が形成されていなかった。現在、架橋形成のための条件を検討している。この他、脱共役状態と直接関係のあるεサブユニットへのATP結合について、その結合が非常に強い変異体を作製することに成功し、論文として発表した。脱共役状態の解析に活用できるものと考えている。サブユニット間架橋による共役の回復は観察できていないが、Biacoreによるサブユニット間相互作用の解析では、共役状態と脱共役状態で結合の強さに差が見られている。これらの結果を基に、さらに解析を行う。昨年度に引き続き、好熱菌(Bacillus PS3)ATP合成酵素の脱共役状態でのサブユニット間相互作用について、サブユニット間架橋による共役の回復、Biacoreによる結合測定の準備を進めた。サブユニット間架橋については、昨年度検討したγ-ε間架橋だけではなく、ε-c間の架橋についても検討した。その結果、作製した変異体において、架橋の形成は確認できたが、架橋による共役の回復は観察されなかった。この結果から、脱共役状態ではγの回転を伴わないATP加水分解が起こっている可能性と架橋部位が不適切であった可能性が考えられた。そこでこれらの可能性を検討するために、β-γ間を架橋することで、γサブユニットが回転できなくなる変異体を作製し、架橋状態でのGTP加水分解活性を検討した。その結果、γが回転しない状態では、GTP加水分解活性は見られなかった。このため、ε-c間の架橋をした変異体では、架橋導入位置が不適切であったために共役の回復が見られなかったものと考えた。さらに架橋部位の検討を行う予定である。また、Biacoreでの解析のためにcサブユニット単独での発現系からのcリングの調製を試みたが、発現が不安定であったため、a,b,cサブユニットを含むFoの発現系から調製することとした。

報文を参考に精製を試みたが、cリングの単離ができなかったため、精製条件の検討を行う予定である。この他、脱共役に直接関与するεサブユニットへのATP結合能が変化した種々の変異体を作製、解析を行った。分子内架橋による解析は当初の予定通り進んでいる。また、得られた結果から作業仮説についても検討を行い、当初のモデル以外のモデルもあわせて検討している。本年度は、不活性変異体を用いた共役の解析、Biacoreでのサブユニット間相互作用解析に向けたサンプル調製条件の検討などを行った。不活性変異体を用いた共役の解析では、脱共役する条件を詳細に検討することを目的とし、好熱菌(Bacillus PS3)ATP合成酵素(TFoF1)のFo-cサブユニットにプロトンが結合しない変異体を作製し、解析を行った。この変異体は、共役条件下では低いNTPase活性を持ち、脱共役条件下では高いNTPase活性を持つことが期待される。作製した変異体について、共役条件下であるATPase活性を測定したところ、予想に反し高い活性を示した。また、この変異体にさらにεサブユニットへの変異を加え、ヌクレオチド条件によらず共役すると考えられる変異体も作製したところ、二重変異体においても高いATPase活性が見られた。これらの結果から、通常使用しているサンプルには、εサブユニットへのヌクレオチド結合に依存した条件的脱共役ではない形で脱共役したものが含まれていることが示唆された。現在、共役の良いTFoF1が得られるサンプル調製の条件を検討している。Biacoreでのサブユニット間相互作用解析に向けたサンプル調製では、これまでにcサブユニット単体、Foでの発現系を検討してきたが、いずれからもcサブユニットリングを調製することができなかった。そこで本年度は、FoF1全体での発現系からcサブユニットリングを調製することを試みた。しかし、適当な精製条件を見出すには至っていない。この他、ATP結合能の高い変異体εサブユニットについて、その構造・構造変化のモデルを検討した。脱共役時のεサブユニットC末端ドメインの働きについての重要な情報になるものと考えている。Biacoreでの解析に必要なサンプルの調製が遅れている。また、使用しているサンプルに、εサブユニットのヌクレオチド結合状態に依存しない脱共役が見られたため、これを改善する必要がある。本年度は、不活性変異体を用いた脱共役状態の解析などに取り組んだ。cサブユニットにプロトン結合部位を持たない変異体は、cサブユニットリングが回転できないため、共役状態においてはF1の回転も抑えられ、したがってATPase活性を持たないものと予想していたが、実際にはATPase活性を持つことが確認された。この変異体ではcサブユニットリングが空回りしてしまう可能性が考えられた。そこで低いながらもプロトン輸送活性を持ち、F1ではなくcサブユニットの回転が律速となるような変異体を作製し、そのATPase、GTPase活性を検討することとした。
リーシュマニア原虫のP-糖タンパク質の発現制御機構に関する研究

リーシュマニア原虫の薬剤耐性の分子機構として、遺伝子増幅によるP-糖タンパク質の発現の高進が、リーシュマニア症の治療薬である5価アンチモン剤やそのほかの薬剤に対する耐性株において認められている。この場合、遺伝子の増幅に先だって、転写の活性化によるmRNA量の増加が起こることが、耐性獲得の初期反応であるものと推定される。そこで、リーシュマニアのP-糖タンパク質遺伝子の発現を誘導する物理、化学的要因について、同遺伝子(pgpA)をプローブとしたノーザン・ハイブリダイゼイション法によって検討した。まず、熱ショックの影響を調べるため、Leishmania amazonensisの前鞭毛型虫体を37-42°Cに加温したが、同遺伝子の発現の高進を認めることができなかった。次に、5価アンチモン剤であるmeglumine antimonateに同虫体を暴露したが、本法ではそのmRNAの増加を検出できなかった。これらの刺激によるP-糖タンパク質遺伝子の発現は、一過性であることや発現量の少ないことも予想される。したがってmRNAの高感度検出法や刺激条件について、今後さらに詳細に検討することが必要であると考えられた。P-糖タンパク質遺伝子の染色体上の位置について、パルスフィールド電気泳動法とpgpAをプローブとしたサザン・ハイブリダイゼイション法によって検討した。リーシュマニア属原虫のWHO標準株11種を含む21株について調べたところ、同遺伝子は、ほとんどの株で約700kbの大きさの一つの染色体上に存在することが判明した。しかし、エクアドルで分離したL.mexicana株においては、pgpAプローブが700kbから750kbの大きさの複数の染色体と反応したため、P-糖タンパク質の遺伝子座が他のリーシュマニア株とは異なっている可能性が示唆された。
山陵制度にみる律令国家の転回

本年度は、昨年度の研究の進展も踏まえつつ、主に以下の点を中心に研究を進めた。第二に陵墓と寺院の関係について。昨年度までの研究においては、11世紀以降に置かれる天皇陵がみな〈寺陵〉、ないしそれに准ずるものであったことを明らかにしてきたが、ここでは、11世紀以前に設置された山陵が〈寺陵〉化する様相を具に明らかにした。また平安前期の山陵制度の転換点を検討し、これまでも注目されてきた嵯峨・淳和両太上天皇の薄葬に関する史料を丁寧に読み直すことにより、それまでの天皇は譲位してもなお帝王であり、山陵を作らねばならなかったのに対し、嵯峨・淳和は、譲位して上皇になることにより、帝王ではなくなり、山陵を作らなくてもよくなったことを明らかにした。加えて、文徳天皇の山陵政策を取り上げ、これが唐皇帝のそれに倣ったものであることを発見した。この点については、すでに国外で報告したが、近く国内でも報告、活字化を期す。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は研究計画に従い、まず浄妙寺の位置を正確に把握することから始めた。国土地理院発行の1:25000地図と、明治期の陸軍仮製図、及び12世紀の古図「山階郷古図」とを対照しつつ、現地を実際に踏査することで、古代から中近世を経て現代にまで残る古道を確かめることもでき、また古図の写真を確認し、これまで見過ごされてきた記載を活用することで、ほぼ正確な位置を把握できた。文献調査では、儀式、所作に注意することで、史料毎に異なる名辞の建物が、みな浄妙寺南大門に関連する記載である事を発見し、その特質を明らかにできた。研究の成果については論文として公表した。次に『本朝世紀』にたった1度だけ確認できる謎の陵墓、観隆寺陵について検討し、この陵の被葬者を明らかにした。ここではまず『本朝世紀』の古写本(宮内庁書陵部所蔵伏見宮家本)を写真によって確認し失部分の復原をおこなった。その後、この記事が後三条天皇の即位由山陵奉告に関するものである点に注目して、平安時代の即位山陵使を知りうる限り調べ上げ、そこから山陵奉告の性格を抽出した。また同時に観隆寺そのものの性格や所在を調べ、合わせて考察した。この結果、観隆寺陵が三条天皇陵であることが明らかとなった。これも論文として公表した。ついで、円融寺について検討した。円融寺は円融天皇が建立した御願寺であり、「円融院山陵」と呼ばれる天皇家一門の墓所を管理した寺院であったことを既に明らかにしている。本研究ではこの点を踏まえ、先の浄妙寺に関する成果と合わせて考察し、これが円融天皇により、陵墓群の管理のために建立された寺院であること、そして彼がみずからそこに起居することにより、陵墓群の管理者としての立場を明確にし得たこと、それら陵墓群が代々の天皇陵を含むものであることから、これによって彼の皇統が、兄冷泉天皇の皇統に対して優位な立場を獲得したことを明らかにした。本研究課題については、ほぼ計画通り進行していると考える。特に研究のベースとなるべき踏査については、事前の調査を繰り返し行っておいたことにより、採用後スムーズに検討に移ることができた。また文献調査についても、これまでの史料カードの蓄積を活かすことによって、極めて効率よく行うことができたと考える。また研究成果の公表に関しても、年度内に2本の論文を公表できたことは大きな成果であろう。まだ公表できていない部分についても、採用二年目の次年度中に文書化して公表する見込みが立っている。その一方で、さらなる現地踏査を行うべきだった点、原本史料に就いてさらに検討すべき点が反省点として残ったことも否めず、この点に関しては次年度に精度の向上を期するものである。今後も、基本的には研究計画通りに研究を進めていく予定である。まず本年度において公表することができなかった研究成果についての公表を急ぎたいと思う。これを踏まえた上で、次のステップへと進む。円融寺の研究においては家産としての墓所の性格が明らかになったが、この点に注意したとき、嵯峨院の存在が新たな課題として浮上する。

そこで次なる研究としては、近年、律令国家の転換の起点になったとも目される承和年間の山陵制度の展開と天皇(太上天皇)の性格の変化を明らかにする。本研究が繰り返し述べてきたように、山陵は死後の天皇の所在であるから、天皇(太上天皇)の性格変化は、彼らの山陵の変化という形であらわれるものと予想する。またこれに続く文徳天皇時代については、すでに指摘されている部分もあるが、中国皇帝祭祀との比較検討が必要であり、場合によってはそのために現地に赴くことも必要であろう。唐皇帝との比較によって、文徳天皇の山陵政策の特徴をよりクリアにすることができ、また先行する承和期、この後に続く貞観期に隠れて影の薄い彼の人物像に迫ることにもなるのではないだろうか。今後は上述の点に注目しつつ研究を進め、成果については文書化して公表したいと考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。
神経再生、神経可塑性に関与する未知の遺伝子のクローニング(RLGS法を用いて)

我々は従来から、ヒトのびまん性軸索損傷(diffuse axonal injury)と酷似した病理組織学的所見を呈するラット脳損傷モデルの作成に成功し、分子生物学的、記憶行動学的検索を始め、様々な角度から研究を続けてきた。そこで今回の研究助成を得て、このラットびまん性軸索損傷モデルの脳損傷から回復する過程における、神経再生および神経可塑性を司る未知の遺伝子を発見しクローニングすることを最終目的として研究を行った。本研究設備備品として新たに購入したゲノムスキャン二次元電気泳動装置を用い、Hayashizaki等によって開発されたRLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)法を改変して用いた。近年、遺伝子DNAのメチル化、脱メチル化が遺伝子発現の制御機構として重要な役割を果たしていることが注目されており、RLGS法はゲノムDNAのメチル化の変化をスクリーニングする方法である。原法ではメチル化感受性制限酵素(その制限酵素に特異的な配列であっても、一部の塩基がメチル化されているとそのDNAを切断できなくなるような制限酵素)でゲノムDNAを切断後、ラジオアイソトープで切断断端を標識するのだが、我々はその代わりにジゴキシゲニンddUTPを用いて標識し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いた発光反応を用いて、非ラジオアイソトープ的方法による検出システムを確立することを最初の課題とした。すなわち、ゲノムDNAの標識後原法通りに一次元泳動を行い、二次元泳動には8%ポリアクリルアミドゲルを用いた。ゲルをアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体で処理し、最後に発光基質を反応させて高感度フィルムを感光させることによってスポットの検出に成功した。次にラットびばん性軸索損傷モデルにおけるスクリーニングに入った。最も神経突起の新生が盛んな時期として受傷後18日目、および神経連絡の再構成が盛んになる時期として受傷後25日目をターゲットとして選び、それぞれのスポットパターンを受傷後7日目と比較した。それぞれ数個の新たなスポットの出現を認め、現在それらをクローニングして塩基配列の決定を急いでいるところである。最も重症の脳損傷であるびまん性脳損傷において、損傷後に活性化されてくる神経再生、可塑性に密接に関わる未知の遺伝子をクローニングすることを最終目的とし、今年度は、その方法論の確立を目指して研究を行ってきた。RLGS (Restriction Landmark Genomic Scanning)法に関してはHayashizakiらの方法を部分的に変更して行った。近年、ゲノムDNAのメチル化状態が遺伝子の転写調節に大きな役割を果たしていることがわかっている。そこで、われわれが開発したラットびまん性脳損傷モデルを用い、損傷後に新しく活性化、もしくは不活性化された遺伝子を、DNAのメチル化の変化を標的にクローニングするというのが本法の原理である。具体的には、脳損傷ラットの脳から抽出したDNAをメチル化感受性を持った制限酵素(認識配列中の一部がメチル化されていると切断できなくなるという性質を持った制限酵素)で切断し、断端をジゴキシゲニンdUTPでラベルした。このDNAを二次元電気泳動し、アルカリフォスファターゼを結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いた発光システムを用いてX線フィルム上にスポットとして焼き付け、ゲノムDNA上のメチル化に変化を生じた部位を検索した。原法ではラジオアイソトープを用いてラベリングを行っているが、今年度われわれは上述したような非ラジオアイソトープ的方法を用いて、原法と同様のはっきりしたスポットを得る方法を確立した。

非ラジオアイソトープ的方法は、今後の世界的動向に鑑みると極めて重要なことと考えられる。来年度は、ラットびまん性脳損傷モデルにおいて、受傷後経時的にゲノムDNAのメチル化の変化を追い、活性化、もしくは不活性化された遺伝子をクローニングし、その中で神経再生、可塑性に密接に関わると考えられる遺伝子について機能的解析を進めていく予定である。我々は従来から、ヒトのびまん性軸索損傷(diffuse axonal injury)と酷似した病理組織学的所見を呈するラット脳損傷モデルの作成に成功し、分子生物学的、記憶行動学的検索を始め、様々な角度から研究を続けてきた。そこで今回の研究助成を得て、このラットびまん性軸索損傷モデルの脳損傷から回復する過程における、神経再生および神経可塑性を司る未知の遺伝子を発見しクローニングすることを最終目的として研究を行った。本研究設備備品として新たに購入したゲノムスキャン二次元電気泳動装置を用い、Hayashizaki等によって開発されたRLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)法を改変して用いた。近年、遺伝子DNAのメチル化、脱メチル化が遺伝子発現の制御機構として重要な役割を果たしていることが注目されており、RLGS法はゲノムDNAのメチル化の変化をスクリーニングする方法である。原法ではメチル化感受性制限酵素(その制限酵素に特異的な配列であっても、一部の塩基がメチル化されているとそのDNAを切断できなくなるような制限酵素)でゲノムDNAを切断後、ラジオアイソトープで切断断端を標識するのだが、我々はその代わりにジゴキシゲニンddUTPを用いて標識し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いた発光反応を用いて、非ラジオアイソトープ的方法による検出システムを確立することを最初の課題とした。すなわち、ゲノムDNAの標識後原法通りに一次元泳動を行い、二次元泳動には8%ポリアクリルアミドゲルを用いた。ゲルをアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体で処理し、最後に発光基質を反応させて高感度フィルムを感光させることによってスポットの検出に成功した。次にラットびまん性軸索損傷モデルにおけるスクリーニングに入った。最も神経突起の新生が盛んな時期として受傷後18日目、および神経連絡の再構成が盛んになる時期として受傷後25日目をターゲットとして選び、それぞれのスポットパターンを受傷後7日目と比較した。それぞれ数個の新たなスポットの出現を認め、現在それらをクローニングして塩基配列の決定を急いでいるところである。
チタン合金を用いた環境に優しい高出力熱電発電モジュールの開発

本研究では、環境にやさしく安価なチタン合金で高性能熱電材料を開発し、それを用いて高出力発電モジュールを実現することを目的としている。材料としてはチタン系ハーフホイスラー化合物を取り上げ、n型とp型の両タイプで、300°C500°Cの中高温域高性能を示す新規熱電材料の開発を目指す。今年度は、各種チタン系ハーフホイスラー化合物を合成し、高性能熱電特性を示す材料として、特にp型材料の開発を試みた。TiNiSnならびにTiCoSbをベースに、Tiサイトを一部ZrやHfで置換した(Ti,Zr,Hf)NiSnや(Ti,Zr,Hf)CoSbの系について研究を実施した。材料は、アーク溶解炉ならびにプラズマ放電焼結機を用いて作製した。ハーフホイスラー化合物では、構成元素のイオン半径差に起因する構造のディスオーダーが存在し、アニーリング条件が熱電特性に多大な影響を与えるといわれている。また、熱電材料に限らず材料一般において、その微細構造が物性に与える影響は大きい。さらにハーフホイスラー化合物中には微量の不純物酸素や窒素も混入していると考えられる。我々は、アニーリング条件・微細構造・不純物酸素に着目し、それらがハーフホイスラー化合物の熱電特性に与える影響について、特に的を絞って研究をすすめた。加えて、(Ti,Zr,Hf)CoSb系については、Snサイトに適切な量のSnをドーピングすることで、p型特性の発現と性能の向上を試みた。結果、(Ti,Zr)CoSb_<1-x>Sn_x系の材料について、これまでのp型ハーフホイスラー材料では最高レベルに匹敵するZT=0.5が達成された。材料としてはチタン系ハーフホイスラー化合物を取り上げ、n型とp型の両タイプで、300°C500°Cの中高温域で、ZT>1を示す高性能材料の開発を目指す。また、発電モジュールの出力密度としては、1W/cm^2以上の実現を目指す。今年度は、各種チタン系ハーフホイスラー化合物を合成し、高性能熱電特性を示す材料として、特にn型材料の開発を試みた。結果、(Ti,Zr,Hf)NiSn系の材料について、最高でZT=0.75が達成された。今後は、n型材料についてさらなる性能向上を目指すとともに、p型材料の開発もあわせて実施する予定である。

今年度はミリ各種チタン系ハーフホイスラー化合物を合成し、高性能熱電特性を示す材料として、特にp型材料の開発を試みた。TiNiSnならびにTiCoSbをベースに、Tiサイトを一部ZrやHfで置換した(Ti,Zr,Hf)NiSnや(Ti,Zr,Hf)CoSbの系について研究を実施した。材料は、アーク溶解炉ならびにプラズマ放電焼結機を用いて作製した。ハーフホイスラー化合物では、構成元素のイオン半径差に起因する構造のディスオーダーが存在し、アニーリング条件が熱電特性に多大な影響を与えるといわれている。また、熱電材料に限らず材料一般において、その微細構造が物性に与える影響は大きい。さらにハーフホイスラー化合物中には微量の不純物酸素や窒素も混入していると考えられる。我々は、アニーリング条件・微細構造・不純物酸素に着目し、それらがハーフホイスラー化合物の熱電特性に与える影響について、特に的を絞って研究をすすめた。加えて、(Ti,Zr,Hf)CoSb系については、Snサイトに適切な量のSnをドーピングすることで、p型特性の発現と性能の向上を試みた。結果、(Ti,Zr)CoSb_<1-x>Sn_x系の材料について、これまでのp型ハーフホイスラー材料では最高レベルに匹敵するZT=0.5が達成された。0
宿主植物細胞内で機能する根粒菌分泌タンパクの探索と共生成立の分子モニター系の開発

本研究では、根粒菌と宿主植物の遺伝子発現調節機構を解明することを最終目標として、根粒菌のバクテロイド化による遺伝子発現の変化を把握すると同時に、根粒菌に対する宿主植物の遣伝子発現応答を容易にモニターできるシステムの構築を目指した。ミヤコグサとその根粒菌をモデル共生系として使用した。(1)根粒菌ゲノムアレイによる遺伝子発現の解析と遺伝子破壊培養菌体と根粒細胞内のバクテロイドでの遺伝子発現について、ミヤコグサ根粒菌の全ゲノムアレイを使用して網羅的に解析した。その結果、バクテロイドは、あたかも植物の細胞小器官のような状態となり、共生窒素固定に専念していることが明らかとなった。バクテロイドで最も転写活性の高かったACCデアミナーゼの遺伝子破壊株と野生株との混合接種などの実験結果から、ACCデアミナーゼは、根粒着生時の競合性に関与していることが明らかとなった。(2)形質転換ミヤコグサによる共生型ヘモグロビンのプロモーター解析共生型ヘモグロビンのプロモーター領域とGFP構造遺伝子との融合遺伝子(Ljpro/GFP)を構築し、Agrobacteriumを介してミヤコグサへ導入した。Ljpro/GFPを保持する形質転換体にミヤコグサ菌を接種した場合、根の表皮には、菌の接種に応答してGFPが発現したと思われる細胞が点在していた。本実験系を使用することにより、グロビン遺伝子は根粒菌が侵入していない細胞でも発現応答することを視覚的に検出可能であった。さらに、その応答強度、応答細胞の分布を容易に把握することが可能であり、本実験系の特徴と有用性を示すことができた。根粒菌接種に対する融合遺伝子の発現は、内在性の共生型ヘモグロビン遺伝子より鋭敏に応答している可能性が示された。検討の余地はあるものの、根粒菌の接種に応答して発現する宿主遺伝子のモニターシステムを構築することができた。ミヤゴグサ根粒菌のバクテロイド化とミヤコグサのグロビン遺伝子の発現誘導をモデルケースとして遺伝子発現の可視化と培養細胞系を利用した遺伝子発現の新しいモニター系を構築し、根粒菌と宿生植物の遺伝子発現調節機構を解明することが目標である。本年度は、以下の2点を中心に研究を進めた。(1)根粒菌ゲノムアレイによる遺伝子発現の解析と遺伝子破壊株の作製ミヤコグサ根粒菌の全ゲノムアレイを使用して、培養菌体、及び、根粒細胞内のバクテロイドでの遺伝子発現の相違を網羅的に把握した。ミヤコグサ根粒菌には、植物のヘモグロビン遺伝子のプロモーター部位に結合するタンパク質のホモログが存在しており、その遺伝子(LjBin1)は、根粒細胞内のバクテロイドで発現していた。ミヤコグサ根粒菌でトランスポソンと自殺プラスミドによる遺伝子破壊法を確立し、LjBin1を標的とした遺伝子破壊株の作製を試みた。遺伝子破壊株と思われる菌株を単離し、PCRとサザン法による遺伝子破壊の確認、及び、ミヤコグサとの共生における表現型の確認を行っている。(2)ミヤコグサの形質転換系の確立ミヤコグサの3種の共生型ヘモグロビンと1種の非共生型ヘモグロビンの全ての塩基配列を決定した。共生型ヘモグロビンのプロモーター領域(約1.5kb)とGFP構造遺伝との融合遺伝子(Ljpro/GFP)を構築し、Agrobacteriumのバイナリーベクターに連結した。A.tumefaciensを介したミヤコグサの形質転換では、苗条体カルスまで成育しており、PCRによりLjpro/GFPが導入されていることを確認した。

また、A.rhizogenesを介した形質転換では、発生した毛状根のうち約40%に、Ljpro/GFPが導入されていた。形質転換毛状根にミヤコグサ根粒菌を接種したところ、正常な根粒が着生した。GFP発現の有無については、検討中である。ミヤコグサ根粒菌のバクテロイド化とミヤコグサのグロビン遺伝子の発現誘導をモデルケースとして、遺伝子発現の可視化と培養細胞系を利用した遺伝子発現の新しいモニター系を構築し、根粒菌と宿主植物の遺伝子発現調節機構を解明することが目標である。本年度は、以下の2点を中心に研究を進めた。.(1)根粒菌ゲノムアレイによる遺伝子発現の解析と遺伝子破壊株の解析ミヤコグサ根粒菌の全ゲノムアレイを使用して、培養菌体と根粒細胞内のバクテロイドでの遺伝子発現の変化を網羅的に解析した。その詳細な解析は進行中であるが、本年度は、バクテロイドで最も転写活性の高かったトランスポサーゼ遺伝子の破壊株作出に着手し、進行している。また、ミヤコグサ根粒菌には、植物のヘモグロビン遺伝子のプロモーター部位に結合するタンパク質のホモログが存在しており、その遺伝子(LjBin1)は、根粒細胞内のバクテロイドで発現していた。昨年度作出したLjBin1の遺伝子破壊株のミヤコグサとの共生における表現型について検討したが、野生株との大きな違いを見いだすことはできなかった。(2)形質転換ミヤコグサによる共生型ヘモグロビンのプロモーター解析共生型ヘモグロビンのプロモーター領域とGFP構造遺伝子との融合遺伝子(Ljpro/GFP)を構築し、Agrobacteriumを介してミヤコグサへ導入した。、A. rhizogenesを介した形質転換で発生した毛状根には、正常な根粒形成が観察された。蛍光顕微鏡による根粒形成過程の観察では、根粒原基へと発達すると予想される細胞集団近傍の維管束周辺で、GFP遺伝子の発現が観察された。また、組織培養した毛状根では、組織全体で発現が検出された。このことは、共生型ヘモグロビンの遺伝子発現は、根粒菌の感染以外の要因にも応答しうることを示している。A. tumefaciensを介したミヤコグサの形質転換では、再生個体を得ることができた。PCRによりLjpro/GFPが導入されていることを確認したが、次世代の種子は未だ得られていない。ミヤコグサ根粒菌のバクテロイド化とミヤコグサのグロビン遺伝子の発現誘導をモデル系として、遺伝子発現の可視化と培養細胞系を利用した遺伝子発現の新しいモニター系を構築し、根粒菌と宿主植物の遺伝子発現調節機構を解明することが目標である。本年度は、最終年度であり、以下の2点を中心に研究を進めた。(1)根粒菌ゲノムアレイによる遺伝子発現の解析と遺伝子破壊培養菌体と根粒細胞内のバクテロイドでの遺伝子発現について、ミヤコグサ根粒菌の全ゲノムアレイによる網羅的解析を終了した。その結果に基づいて、バクテロイドで最も転写活性の高かったACCデアミナーゼの遺伝子破壊株作出とその表現型の解析に取り組んだ。ACCデアミナーゼ破壊株は、バクテロイド状態で完全にACCデアミナーゼ活性を失っていた。野生株との混合接種などの実験結果から、ACCデアミナーゼ活性は、根粒着生時の競合性に関与することが明らかとなった。