hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肥大型心筋症における心筋トロポニンI遺伝子変異

遺伝子変異の検索270名の肥大型心筋症発端者患者に関し、末梢血白血球からgenomic DNAを抽出し、心筋トロポニンI遺伝子に対して作成したprimerを用いてPCR-SSCP法にてスクリーニングを行った。さらに、SSCPにて異常バンドが認められたものに対してはABI社製オートシーケンサーまたはSequencing-High(TOYOBO社製)を用いてDNA配列を調査しRFLP法にて確認を行った。その結果、10名に心筋トロポニンI遺伝子Lysine183欠失変異を見い出した。また、同意の得られたこれら10名の家族70余名についても同様の検索を実施した。Lysine183欠失変異以外の遺伝子異常は認められなかった。3.臨床的特徴の把握上記10家系70余名について心電図、心エコー図検査を実施した。また、肥大型心筋症発症者でこれまで検査歴のあるものについては、心電図ならびに心エコー図検査結果の収集を行った。さらに、ホルター心電図検査を行って悪性心室性不整脈の有無について検討した。現在計画実施案に従って調査結果を総括し、その臨床的特徴等について検討中である。1.肥大型心筋症における心筋トロポニンI遺伝子変異の検索ならびに家系調査北陸地方における関連の認められない肥大型心筋症発端者患者270名について、インフォームド・コンセントを得た後、家族に関する聞き取り調査、心電図検査、心臓超音波検査、遺伝子診断用採血(EDTA血10ml)を実施した。遺伝子検索は末梢血白血球からgenomic DNAを抽出し、心筋トロポニンI遺伝子に対して作成したprimerを用いてPCR-SSCP法にてスクリーニングを行った。さらに、SSCPにて異常バンドが認められたものに対してはABI社製オートシーケンサーを用いてDNA配列を調査し、RFLP法にて確認を行った。この遺伝子検査の結果、10名の発端者に心筋トロポニンI遺伝子Lysine183欠失変異を見い出した。また、同意の得られたこれら10名の家族についても同様の検索を実施し、その結果の総括を行った。2.臨床的特徴の把握上記10家系70余名について心電図、心エコー図検査を実施し、その臨床的特徴について検討した。その結果、以下の特徴が明かとなった。1)本遺伝子変異による肥大型心筋症は10歳代前半より発症し、心電図II, III, aVF, V5, V6誘導における異常Q波が最初に出現する。2)これらの心電図異常の出現とともに突然死のリスクが発生する。3)心エコー図検査では10歳代後半より壁肥厚などの異常が出現する。4)本遺伝子変異による肥大型心筋症は浸透率が極めて高く、20歳代でほとんどのものが発症する。5)40歳以降には、遺伝子変異を有するものの約30%において前壁中隔を中心とする壁のひはく化を生じ、収縮不全をきたす。これらの臨床的特徴について総括し、発表した。
胆汁形成におけるMDR3/ABCB4と新規共役因子RACK1の相互作用の解析

胆汁鯵滞様の症状を呈する際には、ABCB4を始めABCB11やABCC2などのABC蛋白質の細胞膜表面上の発現量が低下し、胆汁流の形成が破綻することが示唆されている。胆管結紮や大腸菌内毒素(リポポリサッカライド:LPS)投与により類似の動物モデルが構築されることが知られているため、これらの病態モデル動物におけるRACK1の発現量変動、またそれに伴う各ABC蛋白質の発現量・機能制御を検証した。マウスにLPSを腹腔内投与したところ、過去に報告のあるようにAbcb4/Abcb11/Abcc2の蛋白質発現量は低下し、またRack1の発現量は60%程度まで低下した。続いて、この胆汁欝滞モデルマウスにアデノウィルスを用いてRack1を一過性に過剰発現させ、それによりABC蛋白質の発現量が回復するか否か確認したものの、有意な効果は認められなかった。一方で、Rack1に対するshRNA配列を組み込んだアデノウィルスを投与することで肝臓選択的にRack1の遺伝子抑制を行ったマウスにおいては、Abcb4と共にAbcc2、Abcg5/g8の膜分画での蛋白質発現量が低下した。さらに、回収した胆汁中の組成を解析した結果、Abcc2の生理的基質であるグルタチオンの濃度がコントロール条件の70%程度まで低下していること、Abcg5/g8の生理的基質のコレステロール量が60%程度に低下していることが明らかになった。これらABC蛋白質に関しては、in vitroでの検討から、ABCB4やABCG2と同様にその蛋白質発現量及び細胞内局在がRACK1の発現量によって制御されることが示唆された。しかしながら、それらが選択性を持ってどのように相互作用しているのか、また生理的条件下あるいは病態時にこれらがどのように寄与しているのかに関しては明確な知見は得られなかった。今後さらなる解析を行うことで、RACK1のマスター制御因子としての可能性を明らかにするものと期待される。当初計画していたABCB4及びそれ以外に肝臓胆管側膜上に発現するABC蛋白質発現量とRACK1発現量との関連性に関してはin vitroレベルではほぼ検証することが出来たが、それらの相互作用がどのような機構により選択性を持って行われているか明らかにするには至っていない。また、胆汁流の形成に関わる複数のABC蛋白質の発現量を制御しうるRACK1が、生理的にどのような役割を担っているか解明する必要がある。RACK1によるABC蛋白質の発現・機能制御が生理的に、あるいは病態時にどのように寄与しているかを検証する必要がある。そのため、ヒト肝臓検体を収集する、もしくは市販されている肝組織切片アレイ等を利用し、RACK1の発現量と各ABC蛋白質の発現量比を比較する。それらの検討から関連性が認められた場合には、胆汁欝滞を惹起する各処理によってRACK1の発現がどのように変動するのか、その際のABC蛋白質の発現量変化を検証する。また、胆汁形成とは関連性に乏しいが、RACK1の発現量が肺線癌の救命率と有意に相関することが報告されていること、抗癌剤の排出能を持つABCG2の発現量にもRACK1が関与していることから、それら癌組織におけるRACK1の発現量制御機構を解析することで、様々な因子に関わるRACKの生理機能の一端を解明することを試みる。RACK1による制御の選択性を確かめるために、ABCB4と同じく肝胆管側膜上に発現するABC蛋白質に関してその局在及び発現量の観点から解析を行った。RACK1を導入、あるいは発現抑制したHeLa細胞において、RACK1とABCG2蛋白質発現量に正の相関が見られた一方で、ABCB11では影響が認められなかった。代謝ラベル実験の結果から、この作用がRACK1によるABCG2翻訳速度調節によることが示された。また、HeLa細胞においてABCG2・ABCB11は共に細胞膜上での局在が見られるが、RACK1発現抑制下においてABCG2のみ細胞内に分散する様子が観察された。さらに、HeLa細胞においてRACK1の導入、発現抑制はABCG2基質である抗癌剤mitoxantroneに対する感受性をそれぞれ低下、上昇させ、ABCG2阻害剤存在下でその差が消失したことから、RACK1発現の増減と連動して見られたmitoxantrone耐性の変化は主にABCG2機能の増減を反映したものと考えられた。次に、マウスRack1に対するshRNA配列を組み込んだアデノウィルスをマウスに投与することで、肝臓選択的なRack1の遺伝子抑制を行った。肝臓の組織切片を各ABC蛋白質に対する抗体で免疫染色したところ、Abcb4及びAbcg2の毛細胆管上での局在が減弱したのに対して、Abcb1とAbcb11ではその局在は変化しなかった。蛋白質発現量においてもin vitroでの結果と同様の傾向が見られ、また血管側膜上に発現する蛋白質がその影響を受けなかったことから、RACK1による選択的な発現・局在制御が生体内でも行われていることが示唆された。これらはABC蛋白質による新たな機能複合体の可能性を提唱しうるものであり、そのマスター制御因子としてRACK1機能するものと考えられる。RACK1による制御の選択性が直接的な結合によるか否かを確かめるために、ABCB4とその類縁分子であるABCB1/11の細胞内リンカー領域を組み替えたキメラ体を作出した。

酵母Two-hybrid法、GSTプルダウン法ではABCB1/11の細胞内リンカー領域とRACK1には相互作用は認められなかった。各キメラ体をHeLa細胞に一過性に導入した際に、通常時は野生型と同様に細胞膜上への局在が観察された一方で、siRNAにより内在性RACK1の発現を抑制した条件下での局在変化が細胞内リンカー領域と対応するように入れ替わる様子が観察された。すなわち、ABCB4-ABCB1/11 Linker体ではRACK1の発現抑制による局在変動が消失した一方で、ABCB1/11-ABCB4 Linker体では細胞膜上での発現が減少した。また、この際の蛋白質発現量は細胞内リンカー領域の影響を受けず、ABCB4のみがRACK1の発現抑制に伴う合成量の低下が見られた。これらのことから、少なくともABCB1/4/11においては、RACK1による局在制御は細胞内リンカー領域への直接的な結合が、発現量制御はそれ以外の作用が関わっているものと考えられた。また、マウスRack1に対するshRNA配列を組み込んだアデノウィルスをマウスに投与することで、肝臓選択的なRack1の遺伝子抑制を行った。in vitroでの解析と同様の選択性がABC蛋白質の局在・発現量において見られ、Abcb4の発現量は50%程度まで低下した。この際の胆汁中の組成を精査したところ、Abcb4選択的な基質であるリン脂質濃度はRack1ノックダウンにより有意に変化しなかったが、これはAbcb4のヘテロ欠失と一致する結果だと考えられる。今後さらなる解析を行うことで、RACK1のマスター制御因子としての可能性を明らかにするものと期待される。胆汁鯵滞様の症状を呈する際には、ABCB4を始めABCB11やABCC2などのABC蛋白質の細胞膜表面上の発現量が低下し、胆汁流の形成が破綻することが示唆されている。胆管結紮や大腸菌内毒素(リポポリサッカライド:LPS)投与により類似の動物モデルが構築されることが知られているため、これらの病態モデル動物におけるRACK1の発現量変動、またそれに伴う各ABC蛋白質の発現量・機能制御を検証した。マウスにLPSを腹腔内投与したところ、過去に報告のあるようにAbcb4/Abcb11/Abcc2の蛋白質発現量は低下し、またRack1の発現量は60%程度まで低下した。続いて、この胆汁欝滞モデルマウスにアデノウィルスを用いてRack1を一過性に過剰発現させ、それによりABC蛋白質の発現量が回復するか否か確認したものの、有意な効果は認められなかった。一方で、Rack1に対するshRNA配列を組み込んだアデノウィルスを投与することで肝臓選択的にRack1の遺伝子抑制を行ったマウスにおいては、Abcb4と共にAbcc2、Abcg5/g8の膜分画での蛋白質発現量が低下した。さらに、回収した胆汁中の組成を解析した結果、Abcc2の生理的基質であるグルタチオンの濃度がコントロール条件の70%程度まで低下していること、Abcg5/g8の生理的基質のコレステロール量が60%程度に低下していることが明らかになった。これらABC蛋白質に関しては、in vitroでの検討から、ABCB4やABCG2と同様にその蛋白質発現量及び細胞内局在がRACK1の発現量によって制御されることが示唆された。
数論多様体の分岐とL-関数に関する研究

1.近藤智氏との共同研究を行い、以下の成果を得た。前年度までの共同研究に登場した、正標数の大域体F,Fの素点∞、および正標数d【greater than or equal】1に対する、F上の階数dの、適当なレベル構造つきのDrinfeldモジュラー多様体のd-次Milnor K-群の元の改良および一般化を行い、Drinfeldモジュラー多様体の無限素点でのreductionと関係するBruhat-Tits buildingの数論的商に関する、GL_dの一般のモジュラーシンボル(の関数体類似)と関係づけることができた。まだ完成していないが、これらのモジュラーシンボルが、上記の数論的商のとあるホモロジー群を生成することが証明できる見通しが立っており、それが実元すると、Drinfeldモジュラー多様体のMilnor K-群に十分多くの元が構成できたことになる。またd=2の場合に、上記のように構成した元を用いて、関数体上の楕円曲線のK_<2->群に十分多くの元を作る事への応用を行った(プレプリント執筆中)。この方面へ応用するというアイディアは近藤氏による。当該研究者の貢献はl-進層の消滅サイクルの理論を援用して、曲線のモデルの考察を最小限にとどめる技法を開発したところにある。2.体上の楕円曲線EのK_1群とK_2群を、Gersten複体の部分複体を用いて記述する予想を与え、E上のベクトル束の分類およびFourier-向井変換を用いて、それを証明するための計算の主要な部分を実行した。Burns, Flach, Greither, Huber, Kings,加藤,深谷らによる,Bloch-Kato予想における係数の非可換化を踏まえ,剰余標数が加逆なnoether環に係数をもつ,局所体のWeil群の表現に対するε_0-因子の構成について,係数環が副有限環の場合に係数の非可換化を行った.係数が正標数の体場合のε_0-因子のDeligneによる構成に関するgapを埋めた.代数体上Fの楕円曲線Eと素数pについて,Gal(F(E[p^∞])/F)の実既約指標ρであって,root number W(E,ρ)が-1となるものが,無限個存在する,有限個しか存在しない,ひとつも存在しない,のそれぞれに関する確かめやすい十分条件を求めた.Kを,剰余体が完全体となる混標数の局所体とするとき,β_<dR>の元に入るslopeを用いて,de Rham表現のArtin導手およびSwan導手を記述するColmezによる公式をrefind Swan導手の式に一般化する目的で,K^^-の元がB_<dR>の元としての記述をより詳しく計算した.ただし,これだけでは有限商を経由する表現に対してのみしか,公式が一般化できない.一般のde Rham表現に対する公式を得るためには,B_<st>に属する周期についての,より深い考察が必要であることがわかった.1.p-進体Kの絶対ガロア群G_Kの適当な具体的表示(例えばJannsen-Wingbergによるもの)を用いた,pro-PG_K-加群Tのガロアコホモロジーを与えるperfect complexの具体的な構成法を開発した.例えばQ_pの円分Z_p^-拡大におけるlocal unitの射影極限の,岩澤加群としての記述がこの方法でも得られる.当初の目標であったε-因子との関係付けを得るためにはさらなる考察が必要である.2.近藤智氏との共同研究を行い,以下の成果を得た.素点をひとつ固定した正標数の大域体F上の,適当なレベル構造つきの階数d【greater than or equal】1のDrinfeldモジュラー多様体のd-次Milnor K-群の元κ_<I,J>(I,Jはレベル構造のパラメータ)を構成し,それらがK-群のノルム写像とHecke作用素に関して,Euler系と呼ぶべき関係を満たすことを証明した.この結果は,いくつかの技術的な仮定のもとで既に近藤氏が得ていたが,今回それらの仮定は不要になり,また異なる証明方法を用いるため証明がより簡明となった.さらに∞における境界写像(これはBeilinson regulator写像の関数体類似とみなせる)によるκ_<I,J>の像を計算し,それをF上のGL_dに関する尖点的保型表現πのL-関数五(π,s)の特殊値と関連づける公式を得た.その公式には,L-関数の特殊値の他に,GL_dの極大分裂トーラスの正規化群上でのπに属する尖点形式fの積分P(f)が現れるが,4=3かつFが有理関数体の場合に,P(f)もまた関数L(π,s)の特殊値を用いて表示されることがわかった.1.近藤智氏との共同研究を行い、以下の成果を得た。

まだ完成していないが、これらのモジュラーシンボルが、上記の数論的商のとあるホモロジー群を生成することが証明できる見通しが立っており、それが実元すると、Drinfeldモジュラー多様体のMilnor K-群に十分多くの元が構成できたことになる。またd=2の場合に、上記のように構成した元を用いて、関数体上の楕円曲線のK_<2->群に十分多くの元を作る事への応用を行った(プレプリント執筆中)。この方面へ応用するというアイディアは近藤氏による。当該研究者の貢献はl-進層の消滅サイクルの理論を援用して、曲線のモデルの考察を最小限にとどめる技法を開発したところにある。2.体上の楕円曲線EのK_1群とK_2群を、Gersten複体の部分複体を用いて記述する予想を与え、E上のベクトル束の分類およびFourier-向井変換を用いて、それを証明するための計算の主要な部分を実行した。
なぜ連携が起きるのか？－環境保全活動における多主体連携の生起要因に関する研究－

連携の実態と団体の特徴を把握するために『環境NGO・NPO総覧オンラインデータベース』に記載されている環境保全を行う特定非営利活動法人・任意団体1707団体を対象にアンケート調査票を実施した.調査は2018年8月2日から11月23日,回答数は156件(有効回答率は9.1%)であった.その結果,「現在,連携している」団体が80.8%(126団体)であった.連携活動の内容は「研修会・交流会などの開催」が56団体と最も多く,続いて「自然保護のための環境改善」が40団体,「課題解決のための議論や計画づくり」が38団体であった.また,連携期間は,平均値は約9年,中央値は6年,最大値は68年,最小値は1年であった.さらに,連携活動のために各団体が提供している資源について,回答団体は「人手」と「専門スキル」,他の市民団体は「人手」,行政は「資金」と「場所」,企業は「資金」と「人手」,大学は「人手」と「専門スキル」を主に提供していることが分かった.また,連携主体間の調整役であるコーディネーターがいると回答した団体は64.4%(85団体)であった.以上の回答結果を用いて連携活動を6種類に分類した.各類型の特徴を確認したところ,例えばモニタリング調査や環境教育などを実施している場合,会員やスタッフに対する人材育成の頻度が高く,団体内には専門スキルを有した会員やスタッフが多いことが明らかとなった.また,団体設立当時よりも活動事業数が増加するなど,団体としての成長や活動の発展につながっていること,団体の予算規模が小さいため予算の確保のために他の組織と連携することが多いことなどが考えられた.文献調査やプレ調査を踏まえ,アンケート調査項目を検討し,調査を実施することができた.また,単純集計と類型化より,連携内容に応じた実施団体の特徴について考察を行うことができた.しかし,今後,より客観的な分析を実施する必要があると考える.実施されたアンケート調査の回答結果を用いてより客観的な統計解析を行う.具体的には,主成分分析などを用いて連携活動内容や各主体の提供物によって活動を類型化し,活動内容に応じた連携促進要因・阻害要因を明らかにする.本研究の目的は,環境保全を目的とするNPOの行政・事業者・他のNPOとの連携事例から,連携のタイプとタイプごとの特徴および連携生起要因を明らかにすることである。これまでの進捗状況として,2016年度は特に生物多様性保全を目的とした連携活動として,しが生物多様性大賞の受賞事例全7件について文献調査及びヒアリング調査を実施した.その結果,連携が起こる要因として,以下の4つが考えられた.(1)活動に高い専門性を持たせるとともに,誰でも実施可能な方法を採用したことによって,活動への参加のしやすさや専門的な信頼性を持たせることができ,複数の企業が集まった事例があった.このことから,信頼関係に基づく連携が起こる要因として「専門家と連携したこと」が考えられる.(2)行政が信頼関係の構築のための役割を果たし,地域住民と連携している事例があった.行政が企業と地域住民との間に仲介役として入ったため,企業は地域住民からの信頼を得ることができた.このことからは,連携が起こる要因として「行政が仲介したこと」が考えられる.(3)民間助成団体が信頼関係の構築のための役割を果たした事例があった.同基金の制度やこれまでの実績が活動団体から企業への信頼に,また同基金に応募した団体に対して,書類選考や現地ヒアリングが行われるため,企業から団体への信頼に結びついた.このことから,連携が起こる要因として「従業員が保全活動に参加できるような制度を持っていたこと」が考えられる.(4)企業が元々持っていたネットワークが他団体との信頼関係の構築に役立っていた事例があった.仕事上のネットワーク,つまり企業の資源を活用したことから,連携が起こる要因として「自社の資源を活用したこと」が考えられる.アンケート調査項目を作成するためのヒアリング調査が終わっていないため.当初は地域によって,もしくは,活動分野によってNPOの活動に特徴があると考え,幅広い,地域と分野でヒアリング調査を実施する予定であった.そのため,全国へのヒアリング調査を実施する時間を多くとることができず,調査が完了していない状況である.本研究では,全国の環境保全団体を対象に,同団体の連携の実態と連携に影響を与えると考えられる組織体制や連携に対する考え方,外部からの信頼度等について把握することを目的としている.また,これらの回答結果から,連携に影響を及ぼす要因を明らかにし,環境保全団体が他団体との連携を促進させるための方法について提案する.本研究によって,他団体との連携がしたくてもできない環境保全団体が連携できるようになること,既に連携している団体が,連携活動の内容を充実させられることなどが期待できる.これまで,文献調査およびヒアリング調査を実施した.その結果,継続的な河川の維持管理活動において,地域型NPOと河川管理者・流域住民がフォーラム開催などに置いて連携を行なっていた.同事例では地域型NPOが対象河川に関する専門スキルを持っていたということと,対象地域で活動を行っていたということが連携要因であるとされていた.また,ネットワーク組織への参加している団体では,海岸林の保全,理科教員の研修プログラムの開発,政策提言運動などネットワーク組織とのかかわりがあることによって連携が促進されるという事が要因として挙げられていることが分かった.

これらの結果より,連携の具体的な内容,組織の日常的な活動概要,組織基盤や実施体制,外部からの信頼度,連携するための働きかけ,専門性の有無などの項目を確定し,環境保全団体に対して実施するアンケート調査の準備を完了した.調査票の作成,調査対象団体の特定,依頼方法などが確定し,調査を実施できる状況になった.これ以降,9月までに調査を完了し,分析を行う.連携の実態と団体の特徴を把握するために『環境NGO・NPO総覧オンラインデータベース』に記載されている環境保全を行う特定非営利活動法人・任意団体1707団体を対象にアンケート調査票を実施した.調査は2018年8月2日から11月23日,回答数は156件(有効回答率は9.1%)であった.その結果,「現在,連携している」団体が80.8%(126団体)であった.連携活動の内容は「研修会・交流会などの開催」が56団体と最も多く,続いて「自然保護のための環境改善」が40団体,「課題解決のための議論や計画づくり」が38団体であった.また,連携期間は,平均値は約9年,中央値は6年,最大値は68年,最小値は1年であった.さらに,連携活動のために各団体が提供している資源について,回答団体は「人手」と「専門スキル」,他の市民団体は「人手」,行政は「資金」と「場所」,企業は「資金」と「人手」,大学は「人手」と「専門スキル」を主に提供していることが分かった.また,連携主体間の調整役であるコーディネーターがいると回答した団体は64.4%(85団体)であった.以上の回答結果を用いて連携活動を6種類に分類した.各類型の特徴を確認したところ,例えばモニタリング調査や環境教育などを実施している場合,会員やスタッフに対する人材育成の頻度が高く,団体内には専門スキルを有した会員やスタッフが多いことが明らかとなった.また,団体設立当時よりも活動事業数が増加するなど,団体としての成長や活動の発展につながっていること,団体の予算規模が小さいため予算の確保のために他の組織と連携することが多いことなどが考えられた.文献調査やプレ調査を踏まえ,アンケート調査項目を検討し,調査を実施することができた.また,単純集計と類型化より,連携内容に応じた実施団体の特徴について考察を行うことができた.しかし,今後,より客観的な分析を実施する必要があると考える.NPO活動の地域性についてはそれほど大差ないと考え,様々な分野の活動における連携事例について把握することを重点的に実施する.そのため,今後は近畿地方の連携活動を中心に情報収集し,その他の地方についてはヒアリング件数を減らす.その結果を踏まえてアンケート調査項目を設定する.得られたデータから活動分野や組織の特徴と連携実態の関係性を明らかにする.その際,SPSSを用いて因子分析を行う.実施されたアンケート調査の回答結果を用いてより客観的な統計解析を行う.具体的には,主成分分析などを用いて連携活動内容や各主体の提供物によって活動を類型化し,活動内容に応じた連携促進要因・阻害要因を明らかにする.学生の卒業研究と関連させたため作業のための人件費がかかっていない.また,調査補助をできる人材が限られているため,作業分担できなかった.
ヒト染色体のDNA複製に要求されるヘリカーゼの単離

複製に必要とされるDNAヘリカーゼの検索をヒト培養細胞より行なった。これまで真核生物から複数のDNAヘリカーゼが単離されているが、複製に要求されるものは明らかにされていない。そこで複製に要求される活性ということに視点を置いてDNAヘリカーゼ検索を行ない、以下の点が明らかになった。1.DNAヘリカーゼを検索するために、この酵素活性依存的にDNA合成を開始するDNA配列をクローニングした。この配列には、二塩基反復配列があり、DNAをアンワインディングさせる機能を持っていた。2.抗DNAポリメラーゼα抗体カラムに結合するタンパク質分画よりDNAヘリカーゼ活性(DNAヘリカーゼAA)を見いだした。この酵素は、見かけの分子量210kDa、3′->5′という反応の方向性を持ち、ヒト由来の一本鎖DNA結合タンパク質、RPA依存的であった。しかしこれ単独では、上記の反応で活性を示さなかった。3.DNAヘリカーゼ基質を改良し、反応進行の連続性(processivity)の高いDNAヘリカーゼを検索した。この結果、細胞核に強く結合しているDNAヘリカーゼを見いだしDNAヘリカーゼn(nuclear)とした。DNAヘリカーゼnは、沈降係数9.2S、見かけ上の分子量190kDaを示した。この酵素を構成する110kDaのペプタイドにATPが結合し、反応の方向性は、3′->5′であった。DNAヘリカーゼnの活性はヒト由来のRPAに依存して活性を示し、RPAと特異的な相互作用により活性を持つと考えられる。既存のDNAヘリカーゼにはこれらの特性に対応するものがなく、DNAヘリカーゼnは新規のものと考えられる。特に複製タンパク質であるRPAに依存する点は、このDNAヘリカーゼが複製に関与することを強く示唆するものである。二本鎖DNAを解く活性を持つDNAヘリカーゼは複製に必須であるが、細胞内には、複製以外の反応に使われ同様の活性を持つ酵素が多数存在することが知られている。これらの中から特に複製に要求されると言う特性を持つDNAヘリカーゼの単離を試みた。1)複製のDNAへリカーゼは一般にDNAポリメラーゼはお互いに相互作用することが知られているので、この特性に着目して、抗DNAポリメラーゼα抗体カラムにDNAポリメラーゼと共に結合するタンパク質分画の中からDNAヘリカーゼ活性を探した。この結果、この分画からユニークなDNAヘリカーゼ活性を検出することができた。このヘリカーゼをmonoQカラムクロマトグラフィーとグリセロール密度勾配遠心を使って分画した。この結果、沈降係数約9.4S(分子量200Kダルトンに相当)の分画に3'-5'の方向性を持つヘリカーゼ活性が精製された。今後は、このヘリカーゼの特性の解析を行ない、実際に複製反応にどのような影響を与えるかを検討する予定である。2)試験管内複製反応を用いて複製に要求されるヘリカーゼを検索する系を開発することを考え、この反応に用いる染色体の複製開始点の検索を行なった。そのためヒト染色体の約350kb領域を約10kbのDNA断片にしたプラスミドライブラリーを作成し、これを鋳型として、ヒト細胞由来の精製された複製タンパン質とSV40ウイルスT抗原を使って複製反応を行なわせたところ、有為に高いDNA合成能を有するクローンを数個得た。現在このプラスミドを基質として、ヒト培養細胞粗抽出液から、この複製反応を促進する因子としてDNAヘリカーゼ活性を検索する研究を進行させている。真核生物の複製に要求されるDNAヘリカーゼの検索を目的としてヒト培養細胞抽出液よりDNAヘリカーゼの分画を行った。

まず最初にDNAポリメラーゼαと相互作用するものを検出した。これは、抗DNAポリメラーゼαカラムに結合するタンパク質のなかで、0.5M NaClで溶出される分画の中に含まれる。このDNAヘリカーゼの性質を解析した結果、3'-5'の方向性を持ち、ネイティブな分子量は160kダルトンであった。しかしながら、精製される量が微量であるため、このタンパク質を電気泳動上で検出するに至っていない。さらにこの研究と平行して、in vitroの複製反応を応用して、直接プラスミドライブラリーから複製開始点を単離する研究を行った。この結果、精製したDNAポリメラーゼα/プライマーゼとLargeT抗原に依存してDNA合成を開始するDNA配列を検出した。この配列はプラスミド上で一本鎖になってDNAヘリカーゼ等の複製タンパク質を鋳型DNA上に取り込む機能を持つと考えられる。そこでこのDNA配列をつかってLargeT抗原のDNAヘリカーゼ活性の代りをする細胞由来のDNAヘリカーゼの検索を行った。これまでにヒト培養細胞の核抽出液より約7種のDNAヘリカーゼ活性を検出し、これらのDNA合成活性促進効果を検討した。しかしいずれのDNAヘリカーゼもこのような活性を持たなかった。これは、これらの酵素の純度、精製量が不十分なことが一因と考えられる。現在、いくつかのものについてより大量の出発材料から精製を行うとともに、さらに未同定のDNAヘリカーゼの検索を続けている。複製に必要とされるDNAヘリカーゼの検索をヒト培養細胞より行なった。これまで真核生物から複数のDNAヘリカーゼが単離されているが、複製に要求されるものは明らかにされていない。そこで複製に要求される活性ということに視点を置いてDNAヘリカーゼ検索を行うために以下の方法を確立した。1.DNAヘリカーゼ依存的にDNA合成を開始するDNAアンワインディング配列をクローニングし、DNA合成活性に基づいてDNAヘリカーゼの機能を検索する。2.一本鎖DNA結合タンパク質、RPAを反応に加え、この複製タンパク質依存的DNAヘリカーゼを検索する。これらの方法を使いDNAヘリカーゼを検索した結果、ヒト培養細胞の核抽出液よりDNAヘリカーゼを一種、見いだした。核からの抽出様式から、このDNAヘリカーゼは細胞核に強く結合していると考えられたので、DNAヘリカーゼn(nuclear)とした。DNAヘリカーゼnは、沈降係数9.2S、見かけ上の分子量190kDaを示した。ATPとのクロスリンク反応によりこのDNAヘリカーゼのATR結合ペプチドは110kDaであることが分かった。DNAヘリカーゼの反応の方向性は、3′->5′であり、各種ヌクレオチド三リン酸の活性への要求性は、ATPで高い活性を示すが、dATP存在下ではさらにATPの4倍の高い活性を示すという特徴を持っていた。DNAヘリカーゼnの活性はヒト由来のRPAに依存しているのに対し、由来の異なる一本鎖DNA結合タンパク質、E.coilのSSBとT4ファージのgene32タンパク質では逆に阻害が観察された。
インターロイキン－１９の肝免疫システムにおける新規調節機能

平成30年度は、四塩化炭素を用いた急性肝障害モデルを作製し、IL-19遺伝子欠損(IL-19KO)マウスと野生型(WT)マウスの間にて比較解析を行った。WTマウスとIL-19KOマウスに、四塩化炭素を0.2、0.5、1、および2 mL/kgの各濃度にて腹腔内に投与した。この濃度変化により、弱い肝障害、中強度の肝障害、強度の肝障害、かなり強度の肝障害を誘発させることができる。投与後の解析時間を24時間と定めて、投与濃度を4段階設定して評価した。まずはじめに、血清中のASTおよびALT値をキットにより測定したところ、4種類すべての濃度において、WTマウスとIL-19KOマウスの間で、明確な相違を見いだすことはできなかった。次に、HE染色を施し肝細胞などの損傷を観察したところ、ASTやALTで相違が認められたなかったことと一致して、まずWTマウスでは濃度増加に伴い肝細胞の障害が認められたが、IL-19マウスにおいても同様の変化を示し、WTマウスとの間に顕著な差は認められたなかった。続いて、投与量を2 mL/kgに固定して、評価時間を4時間後、8時間後、16時間後について解析を加えた。しかしながら、AST値、ALT値、およびHE染色による組織評価いずれも、WTマウスとIL-19KOマウスの間に顕著な差異を認めることはできなかった。したがって、四塩化炭素による急性肝障害モデルにおいて、IL-19は重要な役割は演じていない可能性が示唆された。初年度の計画では、急性肝障害モデルにおいて、IL-19遺伝子欠損マウスを用いて、IL-19の役割を明らかにすることを目的としていた。実験条件としては、濃度を4点振り、さらに測定時間も4点振って、各種強度の急性肝障害モデルを作製して検討を実施した。得られた成果からは、いずれの実験条件においてもIL-19の際だった作用を明らかにすることは叶わなかったものの、次年度以降は、異なる急性肝障害モデル、さらには、線維化モデルを用いてさらに解析を進める予定である。次年度以降は、脂肪肝から肝線維化へと進行モデルを用いてIL-19の役割解明を進展させたい。用いる肝線維化モデルは、申請した当初の研究計画に従って、コリン欠乏メチオニン(0.1%)高脂肪(60%)コレステロール(2%)食を給餌させることで作出する。これを組織レベル、細胞レベル、かつ分子レベルにて解析することで、IL-19が肝組織でどの細胞から産生され、さらに、IL-19受容体は肝組織内のどの細胞に発現しているのかを明らかにして、肝臓におけるIL-19ネットワークを解析する。
アジア比較に基づく基礎教育課程の「一貫制」に関する理論的・実践的研究

国際学力調査OECD-PISAで上位を占めるアジア諸国・地域の基礎教育課程(初等・中等教育課程)の「一貫制」を比較調査した結果、1生涯学習者の育成を目指して、2K-9やK-12等の全体的視野から段階的に国家基準を構成し、3教科領域等を整理しつつ、4学校裁量の工夫枠を設けていることが分かった。日本の小中一貫・連携教育おいても将来の生涯学習を見通して基礎教育課程・教師教育・学校経営の三者一体的な視点からのカリキュラム・マネジメントが必要である。4年間継続研究の初年度に当たり、計5回の講演研究会(台湾・韓国・シンガポール・中国・香港)の結果をもとに、研究上の論点整理を行った。基礎教育課程という問題設定の意義、一貫性ではなくなぜ一貫制なのか、アジア比較で一貫制を調べる視点、さらに理論と実践の研究をどうつなげるか等の問題をめぐって予備調査の結果をもとに一定の見通しと仮説を構成した。OECD-PISA調査で上位を占めるアジア諸国(地域)が抱える社会変動の共通点から整理した結果、基礎教育課程の一貫制を確保しようという政策意図は当該国を取り巻く社会状況と不可分であり、その状況認識の在り様が教育課程改革に関するモデルの選択に影響している。注目すべき社会変動要因の第1は、教育のグローバル化への対応である。グローバル化の波は経済のみならず教育の世界にも押し寄せており、国際学力調査の上位国を模倣する結果、学校教育改革のモデルが次第に同型化しつつある。第2の要因は少子高齢化の趨勢であり、とくに台湾では教員採用試験が激戦化して、これが教員評価や学校・大学評価の厳格化と競争を促している。少子高齢化への危機意識が基礎教育課程の高度化・早修化・到達度化・差別化という一連の一貫制への動きを加速している面がある。移民政策がこれと何らか関係している。第3は、生涯学習社会に向けて基礎教育課程の開発モデルを自前で創造する動向である。その際、日本の改革は参照されておらず、アジアで影が薄いというより非注目と脱モデル化の対象とされる。この点で日本は、基礎教育課程を生涯学習に接続する一貫制の対応が遅れている印象が強い。各国(地域)は、競争的に非欧米モデルを模索しながら、モデル地区やモデル校を中心に、それを創出する段階へ移行しているようである。また、注目すべきことに、現職教育を含む教師教育の標準化とその生涯学習化の施策も中国・香港を中心に進められている。25年度は、研究発表5件(うち1件は学内研究会)と論文発表1件を行った。アジア比較による基礎教育課程の「一貫制」に関する理論的研究においては、特に香港と台湾の事例を中心にグローバル化や少子高齢化への対応と生涯学習の目標化の関連づけを行った結果、何れの場合も、生涯学習者の形成を教育目標の上位に掲げ、これを達成するため、教科領域の再編統合、到達目標のスタンダード化、及び各学校でのカリキュラム開発等を推進しており、しかも各学校のカリキュラム経営と教師教育を並行して展開していることが明らかとなった。また、「一貫制」の世界モデルの一つとして、国際バカロレア(IB)のプログラムも検討し、高度な生涯学習者を育成するための教育課程の枠組に関して、上記の事例と類似した特徴が見られることを明確にした。「一貫制」の実践的研究では、つくば市教育委員会が主催した第8回小中一貫教育全国サミットに際し、研究代表者及び分担者が基調講演者と分科会助言者を務め、「一貫制」の実践的な諸課題を整理し、理論的研究の成果をもとに助言と提案を行った。とくに施設分離型の小中一貫教育を実践するときに、教育目標の共有と基礎教育課程としての意義付け、そして小中教員協働による5・6年次での教科担任制の部分的な導入と授業研究の推進等を討議し、参加者からの質疑に答えた。また、筑波大学で開催されたSEAMEO(東南アジア教育大臣機構)の国際シンポジウムとグループ討議において、「一貫制」の研究成果を紹介し、東南アジア各国の改革動向と研究構想について意見交換を行った。これらの研究成果は、『筑波教育学研究』(筑波大学教育学会)第12号,2014年3月,pp.5-17,に発表した。4年継続の3年目に当たる26年度は、とくに台湾における12年制一貫教育課程改革の動向とその問題点に注目すると共に、アジア比較の対象国に東南アジアのシンガポールを含めて現地調査を行った。その結果、両国とも生涯学習者を育成すべく基礎教育課程の一貫制を確保するための施策を積極的に展開していることが分かった。12年制一貫教育課程の導入を図っている台湾の場合、高校への入学者選抜方式の公平性をめぐって反対運動が強まり、当面、今年度からの導入が見送られた。台湾政府はこの制度設計の趣旨を貫くことを表明しており、この議論は選挙でも取り上げられる程に大きな争点となっている。これに対しシンガポールでは一貫制を保証するための行政・大学・学校システム間の連携を緊密化して今後の労働市場を展望しつつ生涯学習の施策を充実させている。とくに普通教育を含めてキャリア教育に関する基礎教育を高度化しようと試みている点が注目される。PISAで上位を占める諸国・地域での積極的な教育改革の動向と比較して、日本の一貫教育のシステムは小中一貫教育と中高一貫教育の両者を混在させており、これが大都市部の施設一体型小中一貫校では7年次生の再募集を行わざるを得ないような「矛盾」を生じさせている面がある。

この問題点は地方の小中一貫教育の場合にはあまり見られない傾向であるが、しかし中都市部を中心に今後保護者や学習塾等による進路選択の方向付けによっては「一貫制」の在り方が大きく左右される可能性がある。その実際を調べる過程で研究代表者と分担者計3名は小中一貫教育を進める茨城県つくば市で「学園」を単位とする学校評価研究事業に専門家として加わり、カリキュラム・マネジメント等の展開に注目しながら実践的な共同研究を行った。4年継続の最終年度に当たる27年度は、中国上海市において補足調査を行うと共に、学会発表と論文発表を行った。そしてこれまでの研究結果をもとに共同研究者による集団討論方式による座談会を3回開催し、各専門分野の立場から理論的な論点を整理し討議の録音記録による研究のまとめを行った。その結果、生涯学習を目標化・一貫化するには学力観の転換だけにとどまらず、教育課程の接続と環境整備まで伴う全体設計と実践・検証が必要なことが確認された。日本の小中一貫教育の場でもこの種の全体論によって生涯学習にとって必要な学習スキル等を習得させるための踏み込んだ提案が求められる。具体的には「学び方を学ぶ」(Learning to learn)、「自立的・自律的な学習者」(Independent and autonomous learners)等の目標表現が示すように、児童生徒が将来「有能な生涯学習者になる」ことを基礎教育課程の主たる目標に明記することが必要である。そこで実践的研究では、茨城県つくば市の小中一貫教育の指定校において中学校区単位の「学園」学校評価や学校評議会及び調査研究に参加して、とくに独自教科である「つくばスタイル科」のカリキュラム・マネジメントに協力した。生涯学習を目標化・一貫化する上で基礎教育課程の垂直的な全体設計が必要であるが、その理論的課題の多くは教員免許制度や教員養成・採用・研修をめぐる「不整合」をどう再設計し調整するのかというカリキュラム研究とは別領域の問題である。ただしこれを異校種間でのカリキュラム・マネジメントの課題として捉え直せば、「一貫制」の確保を内側から支える教師集団の協働(組織化)と環境整備の優先度が高い。基礎教育課程の「一貫制」は学習活動の高度化を達成するためのものである。小中一貫教育の場でも生涯学習スキル等の習得を図るための実践的共同研究が求められる。(1)生涯学習社会に向けた基礎教育課程の「一貫制」を見直す必要性に関してはアジア調査結果による裏づけがほぼ行えた。ではなぜ21世紀を展望した日本の教育課程改革においては「生涯学習体系への移行」政策が十分に機能しなかったのか、その理由に関しては十分な検討が行えなかった。この解明不足については小中一貫教育をめぐる集団討論の座談会においても指摘された。とくに2000年代以降の中央教育審議会で「生涯学習の視点」が次第に後退して、近年では言及されなくなったその原因を解明する必要がある。(2)「一貫制」の概念に関する理論的検討はカリキュラム研究を中心に行われてきたが、学校経営や教師教育の分野ではあまり取り上げられていないようである。カリキュラム・マネジメントが教育課程・教師教育・学校経営の三者を関連づける概念として注目されるが、その概念を実践研究の場で十分には活用できなかった面がある。アジア比較調査の結果をもとにした分野別のグループ研究も期待したほどには行えなかった。
外科的矯正治療による顔の表情の変化に関する研究

本研究の目的は、表情を作成するときの顔面皮膚の動きを表示できるコンピュータシステムを作成し、顔画像モデルを用いて、外科的矯正治療前後の表情表出の違いを調べることと、この顔画像モデルの動きを見なから外科的矯正治療後の患者が表情筋を動かして表情表出を行うトレーニングが行えるまでに発展させることである。研究成果1.表情を作る顔画像ソフトの作成三次元標準顔モデルに正面顔写真を整合させて、表情を作る顔画像ソフト「顔ツール」ができた。これにより、任意の正面顔写真を資料として、コンピュータディスプレイ上でFacial Action Coding SystemのAction Unitsに応じた顔面の動きを与えるものである。2.外科的矯正治療による表情表出の変化この「顔ツール」を使い、外科的矯正治療前後のそれぞれの正面写真から基本的感情カテゴリーの6表情を作成し、42名の被験者に評価させた結果、「驚き」、「恐れ」、「嫌悪」で治療後に印象が強かった。これにより、外科的矯正治療による表情変化が明確となった。3.表情表出トレーニング「顔ツール」を用いて、一つあるいは複数のAction Unitsを動かした顔画像と鏡に写った顔を対比させながら、表情表出するトレーニングが行えた。これにより、顎変形症患者が手術後にこのトレーニングを行うことで、術後に危惧される知覚麻痺の予防にも効果があることが予想された。本研究の目的は、表情を作成するときの顔面皮膚の動き表示できるコンピュータモデルを作成し、この顔モデルを用いて外科的矯正治療前後の表情表出の違いを調べることと、この顔モデルの動きを見ながら外科的矯正治療後の患者が表情筋を動かして表情表出を行うトレーニングシステムを作ることである。本年度の研究成果1.表情表出時の顔面の動きの計測、ならびに顔の表情表出のできる顔モデルの作成本研究の主旨に同意した被験者に、「喜び」、「怒り」、「驚き」などの情緒的な表情表出時の顔の動きを測定し、その結果を基に表情筋の動きに従った顔面皮膚の変化を表示できる本研究用の顔モデルを作成した。この顔モデルを構成しているワイヤーフレームモドルと被験者の正面写真上の各部分との適合が従来のモデルより簡便に操作できるようになり、被験者の正面顔の写真を顔モデルに適合させ、表情筋の動きに従った顔面皮膚の変化をシミュレートすることが可能となった。この顔モデルを用いることで表情表出時の表情筋の動きを記録、再現が可能となった。同一に設定した表情筋の動きの値を用いて、歯科矯正治療前後の表情表出の違いを比較することで治療による変化を客観的に捉えることができるシステムとなった。2.表情表出トレーニングシステム表情筋の動きに従った顔面皮膚の変化が可能である本システムは、被験者本人が実際に行えない動きも表示できることから、シミュレートした顔を見ながら表情筋を動かすトレーニングシステムを構築するための基礎ができた。本研究の目的は、表情を作成するときの顔面皮膚の動きを表示できるコンピュータシステムを作成し、顔画像モデルを用いて、外科的矯正治療前後の表情表出の違いを調べることと、この顔画像モデルの動きを見ながら外科的矯正治療後の患者が表情筋を動かして表情表出を行うトレーニングが行えるまでに発展させることである。本年度の研究成果1.外科的矯正治療による表情表出の変化昨年度に、三次元標準顔モデルに正面顔写真を整合させて、表情を作る顔画像ソフト「顔ツール」ができ、この「顔ツール」を使い、外科的矯正治療前後のそれぞれの正面写真からそれぞれ普遍性の基本的感情カテゴリーの6表情を作成した。そして、顔に関して関心の高い42名の被験者に評価させた。その結果、結果、「驚き」、「恐れ」、「嫌悪」で治療後に印象が強かった。2.表情表出トレーニング「顔ツール」を用いて、一つあるいは複数のAction Unitsを動かした顔画像と鏡に写った顔を対比させながら、表情表出するトレーニングが行えた。
マイクロRNAの解析と発現ベクターの開発

siRNAやmiRNAなど、小さな機能性RNAが通常の神経新生や神経幹細胞の細胞増殖、成熟ニューロンへの分化誘導過程などとどのように関係しているのか、いくつかの報告が出ているが、その詳細な分子機構はまだ明らかになっていない。本研究では、脳神経領域で効率よく安定した機能性RNAの研究を行うために、機能性RNAのデリバリー系の開発と、その検討を行った。動物にsiRNAを導入するためにレンチウイルスコンストラクトを作成し、機能性RNA発現カセットが導入された感染細胞を識別するために、マーカーとしてGFPをともに発現する様に設計した。分化に影響を与えない緩衝液で懸濁され濃縮したレンチウイルス液をコントロールとし、siRNAを発現するレンチウイルスコンストラクトを、直接マイクロインジェクションによって神経新生が頻繁に起きる脳海馬領域に導入した。インジェクション後2ヶ月経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。この方法での導入デリバリー法とは別に、blood brain barrierを通過できるような薬剤(1.6Mアラビノース)の動物への導入法も検討した。頸動脈を取り出し、カテーテルで固定後アラビノースを注射、一定時間経過後レンチウイルス液を固定カテーテルから注入する。3週間経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。これらの結果から、脳に直接マイクロインジェクションを行った方法では、非常に効果的なGFPマーカーの発現と、表的遺伝子のノックダウンによる神経新生阻害現象が、インジェクション箇所である海馬Dantate Gyrus領域に確認できた。本研究成果をもとに、論文投稿の準備を現在進めている。ヒトゲノムプロジェクトの完了に伴い、タンパク質をコードする遺伝子は、染色体DNAにしめる領域のわずか2%にすぎず、70%の領域では、タンパク質をコードしない「ノンコーディングRNA」が発現されていることが明らかとなってきた。この事実から、ノンコーディングRNAによる未知の遺伝子発現の制御機構が、高等生物において重要な役割を担う可能性があると指摘されるようになっている。マイクロRNA(miRNA)は、このようなノンコーディング領域から転写されるRNAであり、成体で重要な役割を果たしていると考えられている。miRNAは遺伝子の発現を抑制する20塩基程度の小さなRNAである。ヒトでは現在までに、500種類にも及ぶmiRNAが発見されており、それぞれ別々の発現パターンを示し、異なる遺伝子の発現を抑制していると考えられている。日本学術振興会外国人特別研究員のSlawomir Janusz Antoscyk博士には、miRNAが、転写されてからプロセッシングを受けて小さなRNAへと成熟していく過程を調べるため、miR30を例にとってmiRNA発現系の実験に着手してもらった。その結果、miRNAのプロセッシングには、ステムループ構造の周辺配列が強い影響を及ぼす事が判明した。特に、天然のmiR30周辺配列とステムループを同時に発現させた場合に、プロセッシングの効率が高まる事が明らかとなった。この天然のmiRNA周辺配列を利用すれば、任意の遺伝子発現を制御できるsiRNA発現ベクターに応用できる可能性がある。プロモーターに依らず、様々な遺伝子の発現を抑制する事が明らかとなり、ウイルスベクター等に利用できることが明らかとなった。さらに、ステムループ付近に変異を導入したところ、天然型の配列よりも高い活性が得られ、期待していた以上の成果が得られている。