hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性砒素曝露による発癌に至る曝露量・期間さらに曝露軽減による発癌回避の検証

2017年度の計画の遅れは徐々に挽回されつつあるものの、2017年度の研究の延長・繰越しが9月に終了したために、2018年度の研究開始が10月からと遅れた。2017年度研究として行われた調査データの解析に基づき、本格的な調査研究の実施に向けての検討も遅くなったこと、フィールド現場が冬季かつ旧正月休みとなったために、2018年度内のフィールド調査は実施できなかった。そのため、中国側研究協力者グループとの現地スタッフ、さらに日本側研究者とのディスカッションのみを行った。本調査に用いる予定の検査キットの事前購入を行ったが、発注し納入予定であった一部の検査キットが製品ロット不具合が生じ製品の出荷が中止されたために、2018年度内の納入が不可能となった。そのため、一度、研究費について返却をせざるを得なくなった。研究者らが1999年から住民のフォローアップ調査を行っている内モンゴル自治区包頭市の缸房営村は、天然に砒素汚染された井戸水を飲料したために慢性砒素中毒の発生が見られ、かつ同年9月から砒素濃度の低い水道水給水が開始された地域である。2016年9月に同村を訪れた際、数名の明確なボーエン病を発症した者を確認したことから、同村において可能な限り多くの住民について、砒素曝露の評価と悪性腫瘍の発生状況について調査を行う事とした。2017年7月に蘇州を訪問し中国側研究協力者グループと打合せを行った。調査対象フィールドの世帯数は400程度であり時間を要するため、中国側研究協力者グループと現地保健医療スタッフの日々の活動の中でデータ収集する事とした。中国側共同研究者が同村を管轄する衛生局と調査の交渉を行い、2018年予備調査、2019年および2020年をデータ集積の期間として設定した。中国フィールドとの調整に時間を要し、2018年9月まで研究期間を繰越し延長した。2018年7月に初回のフィールド調査を行った。314世帯(1999年当時の個人井戸名から把握)、総勢1037名の名簿を作成した。2018年9月に瀋陽を訪れ、データを受け取り概略についての説明を受けた。2018年7月時点で村に在住する者は608名で、326名が村外に移住したことが判明した。15名は同村での在住歴が無かった。996名中741名が10ppbを超える砒素濃度の井戸水を持つ世帯に属していたことが分かった。88名が既に死亡しており、10ppb以上の世帯に含まれる者の死亡率は低濃度の者より高かった。村に在住する者の内84名が悪性腫瘍以外の疾病に罹患しており、高濃度の井戸世帯の者でその率が高い傾向があった。10名(うち3名は、1999年時点での登録者ではない)の住民の皮膚について診察を行った。Bowen病の者は4名となった。研究代表者が頻回にフィールド現地に入って調査する事が難しい事がわかったため、中国側研究協力者グループによる現地調査に頼らざるを得なくなった。そこで、中国側研究協力者グループの拠点である、瀋陽、蘇州、深センを訪問しデータの解析やディスカッションを密に行う事とした。調査開始にあたって、中国側研究協力者グループが中国内モンゴルの現場フィールドを管轄する包頭市衛生局との接触を始めたが、同衛生局の事情により交渉開始が遅延した上に、中国側の事情により本調査が、中国側研究協力者グループの所属する中国医科大学と包頭市衛生局との共同研究に位置付けられ、その協定締結に時間を要した。さらに予備調査の実施も中国の旧暦正月等の長期休暇のため開始が遅れ、2017年度研究を2018年8月末まで繰越し延長をすることとなった。2018年7月に中国側研究協力者グループによる現地調査が実施されデータ収集の目途が立った。
カルボニルストレスに注目した統合失調症における神経発達障害のメカニズムの解明

本研究では、統合失調症の神経発達障害とカルボニルストレスとの関係を明らかにするため、カルボニルストレス性統合失調症患者由来のiPS細胞を用いて、神経分化効率の解析及び神経分化に影響を与えるAGEs(終末糖化産物)の同定を行った。解析の結果、患者由来のiPS細胞では、1神経細胞の発達に関わるタンパク質のAGE化が亢進していること、2ニューロスフィア(神経幹細胞の細胞塊)への分化効率が低下すること、3カルボニルストレス阻害剤(ビタミンB6)を培養液に加えることで、ニューロスフィアへの分化効率が回復することが認められた。生体内の糖、脂質、アミノ酸の酸化・還元、過酸化に由来する種々の反応性カルボニル化合物は、AGEs(advanced glycation end products:終末糖化合物)を形成する。このような非酵素的タンパク質修飾反応が亢進している状態は、カルボニルストレスと提唱されている。また、およそ2割の統合失調症患者において、AGEsが蓄積したカルボニストレス状態であることが報告されている。我々は、カルボニルストレスが統合失調症の病因の1つである神経発達障害に関わっていると考え、カルボニルストレスと神経発達障害との因果関係を明らかにすることを目的としている。本年度は、カルボニルストレスの消去に関与するGLO1遺伝子にフレームシフト変異(365番目のシトシンの欠失)を持った統合失調症患者から樹立したiPS細胞を用いて解析を行った。iPS細胞中のAGEsを測定したところ、患者由来iPS細胞では特定のタンパク質のAGE化が亢進していた。分化誘導によってiPS細胞からNeurosphereを作製したところ、健常者由来iPS細胞と比較して患者由来iPS細胞ではNeurosphereへの分化効率が低下した。そこでiPS細胞の培養時にカルボニルストレスを軽減するピリドキサミンを加え、その後Neurosphereへの分化誘導を行ったところ、患者由来iPS細胞の場合のみNeurosphereへの分化効率が上昇した。これらの結果より、神経幹細胞や神経前駆細胞への分化にはカルボニルストレスが関与し、カルボニルストレスを軽減することで神経分化の異常を回復させることが可能であることが示唆された。およそ2割の統合失調症患者においては、AGEs(advanced glycation end products:終末糖化合物)が蓄積したカルボニストレス状態であることが報告されている。我々は、カルボニルストレスが統合失調症の病因の1つである神経発達障害に関わっていると考え、カルボニルストレス性統合失調症患者からiPS細胞を樹立し、神経分化・発達に注目した解析を行うことで、カルボニルストレスと神経発達障害との因果関係を明らかにすることを目的としている。本研究では、統合失調症の発症及び、カルボニルストレスに関与する稀な遺伝子変異を持つ患者を対象とすることで、効果の大きい個別病理から普遍性を導けると考え、統合失調症関連遺伝子であり、カルボニルストレスの消去に関わるGLO1遺伝子にフレームシフト変異を持った統合失調症患者由来のiPS細胞を用いて研究を進め、本年度の研究では以下の知見を得た。健常者及び患者者由来iPS細胞と、それぞれのiPS細胞から作製したNeurosphereを用いて細胞中のAGEs量を測定したところ、患者由来のiPS細胞、NeurosphereにおいてAGEs量の増加が見られた。患者由来のiPS細胞、Neurosphereにおいて疾患特異的に変化するAGEsが存在するのか調べるために、AGE-1、AGE-3、AGE-4、CMLに対する抗体を用いてWestern blottingを行ったところ、抗CML抗体によるWestern blottingにおいて、患者由来のiPS細胞では55 kDaのタンパク質、Neurosphereでは35 kDaのタンパク質のCML化が特異的に亢進していた。iPS細胞において疾患特異的にCML化している55 kDaのタンパク質を免疫沈降法及び質量分析器により同定した結果、神経細胞の突起伸長に関わるタンパク質であった。医歯薬学本研究は、統合失調症の病因の1つである神経発達障害にカルボニルストレスがどのように関わっているか明らかにすることを目的としている。本年度の研究では、カルボニルストレス性統合失調症患者の探索を行い、患者由来T細胞の収集およびT細胞由来iPS細胞の樹立を行った。更に患者由来iPS細胞を用いてNeurosphereへの分化効率の解析を行った。Neurosphereから神経細胞への分化効率の解析については、分化条件の検討が進まず、解析を行うことが出来なかった。上記のように、申請書に記載した研究計画をほぼ実行できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。次年度においても、本研究の解析サンプル数を増やすため、カルボニルストレス関連遺伝子にナンセンス変異やフレームシフトを持つサンプルの収集を進める。また、研究計画の予定通りにTALEN、CRISPR/Cas9などのゲノム編集によってカルボニルストレス関連遺伝子を破壊・修復したiPS細胞を作製し、カルボニルストレスが神経発達や神経分化に影響を与えるか解析を進める。
質感知覚の神経基盤とその獲得および変容機構

小松はマカクザルの下側頭皮質の微小電気刺激とムシモル注入の光沢識別課題成績への影響を解析した。光沢選択性細胞の存在場所と、微小電気刺激による影響場所は必ずしも一致していなかった。細胞の分布を詳細に再検討したところ、低光沢刺激で強く応答する細胞が光沢選択性細胞領域の後方に多く存在し、これにより微小電気刺激の結果が説明できる可能性が見いだされた。また光沢選択性細胞領域へのムシモル注入による光沢識別成績の低下は注入から18時間後の方が直後より大きく、複数回注入では最初の注入で効果が最大であった。これらの結果は下側頭皮質に光沢選択領域が複数存在し、それらのネットワークの働きで光沢識別が生じることを示唆する。また透明感に関わる物理パラメータの性質を調べる心理物理実験に着手した。本吉は以下の3つの成果を得た。(1)様々な表面テクスチャ画像に対する視覚誘発電位を計測し、低次・高次の画像統計量の符号化ダイナミクスの一端を明らかにした。(2)光景や表面の画像により引き起こされる嫌悪や恐怖の印象が、画像のなかの色信号に対して非対称的な依存性を示すことを見出した。(3)動的なテクスチャ刺激を用いて、複雑な時空間分布をもつ入力から外界の全体的な様相を判断するメカニズムを心理物理学的に解析し、素早い空間統合と遅い時間統合に基づく知覚的意思決定モデルを提案した。郷田は素材の質感認識で重要な高次画像特徴とその統計量を明らかにするため、これまでの研究で得られた素材質感に関する心理データ(視覚的・非視覚的素材特性の印象)と、物体カテゴリ認識を学習済みの深層ニューラルネットワーク各層の画像特徴との関係についての網羅的解析を進めた。また局所DNN特徴の空間平均といった単純な統計量を制御して特定の素材質感を操作するテクスチャ画像合成手法の開発を進めた。光沢選択性ニューロンが記録された場所の付近で電気刺激やムシモル注入により、光沢選択性ニューロンの活動を人工的に操作した結果を詳細に解析することで、これらのニューロンが光沢識別行動にどのように関わっているかを説明可能になり、光沢識別の神経機構の理解が前進した。また感性的質感認知については新しい実験手法の開発が進み、多数の視覚刺激の知覚量や情動価を非常に少ない試行数で順序づけ定量化することを可能にするなど、感性的質感認知メカニズムの理解に向けた方法の開発が進んだ。更に深層学習を用いて質感認知の情報処理の仕組みを調べるために構築した深層ニューラルネットワークの階層においてどのような画像特徴の処理が行われるかの分析が進展し、その結果を利用した質感操作の手法の開発も進んだ。これらのことから順調に進んでいると判断される。光沢は物体表面の視覚的質感の重要な性質であるが、表面特性にかかわる質感は光沢以外にも存在する。特に透明感や半透明感は我々が日常目にする多くの物体の素材や表面状態の識別に重要である。そこで透明感や半透明感にどのような光学の物理パラメータが関係しているかを調べるための心理物理実験を本格的に進める。またその結果を参考にして、さまざまな透明感や半透明感を持つ画像刺激を作成し、下側頭皮質ニューロンの応答を調べる。光沢に関しては、これまで解析した結果を国際学会で報告すると共に論文を作成して発表する。このように光沢やそれ以外の視覚的質感知覚の神経基盤に関する理解を深めていくことにより、多元的な質感表現の解明を進めていく。特定の視覚課題において利用される画像情報の時間的発展を分析する新たな心理物理学実験手法と脳波分析を組み合わせ、質感の認知と情動反応の時間ダイナミクスを統一的視野から検討する。また、素材識別を学習したDNNの解析により、素材質感において重要な視覚特徴が明らかになりつつあるので、その特徴を操作して画像を合成する技術を更に進める。今後これらの研究を推進することで、素材の質感に関する情報表現と変換、および脳情報処理との関係を明らかにすることを目指す。小松は郷田と共にマカクザルにおいてさまざまな素材の画像に対する脳活動を機能的MRIによって計測したデータを、素材の視触覚経験の前と後で比較した。その結果、高次視覚野である下側頭皮質後部領域では活動が経験前後で変化し、視触覚経験の後ではヒトの素材に対する知覚特性と類似の活動パターンを示すことを見出し報告した。またサルの下側頭皮質の光沢選択性ニューロンの活動のダイナミクスを下川と共に解析し、異なる情報間でニューロン集団が表現し始める潜時に違いがあることを見出した。また光沢選択性ニューロンの活動が光沢知覚と因果関係を持つかどうかを検証する実験を開始した。このために2頭のマカクザルにさまざまな物体刺激の光沢の大小関係を見分ける光沢識別課題を訓練した。本吉は,質感の美醜判断に関わるメカニズムとその時間特性を心理物理学実験と画像解析により検討した.その結果,人間は少数の画像統計量に基づき素早く特定の表面質感を心地よい・気持ち悪いと評価することを見出した.これは,表面質感の意識的な知覚とは独立に,低次の画像情報から直接に嗜好と嫌悪の反応を引き起こす処理経路が脳内に存在することを示唆している.この成果は国内学会で発表賞を受賞し,H28年度の国際会議に採択された.また,材質カテゴリの認知や質感属性の知覚において利用される画像情報の時間的発展を分析するための心理物理学実験手法を探索しつつ,眼球運動計測や脳波計測を含む実験システムの構築を進めた。光沢知覚は形状知覚とも関係する。下川は光沢画像から3次元形状を復元するアルゴリズムを作ることで、その脳内ネットワークの処理過程について調べている。

これまでは鏡面反射成分におけるorientationと形状曲率との関係を用いて形状の復元を試みていた。H27年度はそれに拡散反射成分における輝度極性と形状曲率符号との関係を加えることで、より複雑な形状復元が行えることがわかった。素材知覚という質感の重要な機能について、サルを用いた研究から視触覚経験により脳の特定の活動の変化が、素材印象の変化と対応していることが示され、素材知覚のメカニズムの一端を明らかにすることができた。また感性的質感認知についても嗜好や嫌悪に関わる処理の解明に向けて新しい知見が得られてきた。これらのことから順調に進んでいると判断される。小松はマカクザルの下側頭皮質において見出した光沢選択性ニューロンの活動が光沢知覚と因果関係を持つかどうかを検証する実験を進めた。このために光沢識別課題を訓練したサルの下側頭皮質からニューロン活動を記録し、微小電気刺激を加え行動への影響の解析を始めた。また下川と共同で光沢選択性ニューロンのダイナミクスについてより詳しく調べた。光沢の2つのパラメータ、コントラストと鮮明さ、に対する神経応答の立ち上がりには10ms程度の差が見られるが、情報量の時間解析を行った結果、その差は一過性の応答を示す細胞の有無に因ることを明らかにした。また横井らと共同してプロジェクションマッピングで円柱の棒にさまざまな素材の画像を投影した時に、サルが実物の素材に対して示す反応の差が部分的に再現できることを見出した。本吉は,質感の美醜判断に関わる視覚情報処理メカニズムを検討している。今年度は,生態学的に重要な刺激である「食べ物」に分析の対象を広げ,多くの食べ物は気持ち悪さを示唆する画像統計量をもつにも関わらず,食べ物であると認識されると心地よいと判断されることを明らかにした。これは材質カテゴリ認知が画像統計量と同じく質感の情動価の判断に重要な役割を果たすことを意味する。また、表面画像に対する誘発電位を計測・分析する系を構築し,脳波の様々な成分と質感の心地よさ・気持ち悪さとの対応関係を分析した。また深層ニューラルネットワーク(DNN)を用いた解析も始めた。郷田は素材識別に関する解析を行い、DNNの異なる層が素材識別に関わる異なる情報に対応することを見出した。下川はコンピュータグラフィックスを用いて様々な形状、光沢パラメータ、照明下にて、多数の物体画像を作成し光沢パラメータを深層学習させると共に、光沢と形状との相互作用を調べるため、画像に真の3次元形状情報を追加して深層学習させたときの結果との比較も行った。光沢知覚を特徴づける重要なパラメータの間で、光沢選択性ニューロンの活動に見られる時間的な差の原因が情報論的解析から明らかになり、光沢選択性ニューロンのダイナミクスについて理解が深まった。また感性的質感認知については生態学的に重要な食べ物についての分析が進み、材質カテゴリ認知が質感の情動価の判断に影響することを示すなど、感性的質感認知メカニズムの理解が進んだ。
Development of Reactive Separation Technology Employing the Synergy of Sub/Supercritical H2O-CO2 System

超臨界CO2と亜臨界H2Oの相乗効果を利用したプロセスを用いてヘスペリジン(HPD)からヘスペレチン(HPT)を加水分解することが成功した。提案された新しい反応分離を用いた従来の方法と比較して約2倍の収率が得られた。HPTの同時かつ選択的な分離は、単に反応生成物にSCCO2を通すことによって達成された。ラマン分光法の使用に関するバリャドリッド大学を含む国際的な協力が始まった。また、ASEAN大学と協力し、バイオマスからプラットフォーム化学物質および燃料への変換を含むようにさらに拡張された。今後、量子計算技術と分子動力学シミュレーションを用いて反応メカニズムを詳しく解明したいと考えている。超臨界流体工学及びマイクロ波技術
正答のある意思決定と正答のない意思決定の統合的理解：MRIと計算モデルによる検討

正答のない意思決定と内因性の脳活動との関連については,外側前頭の内因性の脳活動が正答のない意思決定時の内側前頭の活動を調整していることが明らかとなった。また,正答のない意思決定においては過去にその選択肢を自分で選択したものが選択されやすくなることが知られているが,その程度がうつ症状,報酬感受性,意思決定後に観察される前部帯状回を発生源とするβγ波のパワーの程度によって影響を受けることを初めて明らかにした。強化学習モデルは正答のある意思決定と同様,正答のない意思決定にも適用できることが示されたが,単純な強化学習の適用では不十分であり,刺激の自己関連性といった要因が介在している可能性が示唆された。本研究では、ヒトの脳内における意思決定プロセスを解明するため、これまでに多くの検討がなされてきた「1つの正答が存在する事態での意思決定」に加え、それとは異なる特徴を持つ「正答が存在しない事態での意思決定(例:職業選択)」について検討を行っている。当該年度はまず、機能的核磁気共鳴断層画像法(functional magnetic resonance imaging: fMRI)よりも比較的簡便に脳活動を記録できる近赤外線分光法(Near-infrared spectroscopy : NIRS)を用い、安静時に記録される内因性脳活動と正答のない事態においける意思決定との関連について、その背景にある神経基盤の検討を行った。実験の結果、安静時の外側前頭前皮質における低周波成分の振幅が大きい個人ほど、正答のない意思決定時に機能する内側前頭前皮質の活動が低下していることが明らかとなった。このことから正答のない意思決定の特徴の一つである内因性の脳活動との関連について、これまで不明であったその関連の背景にある神経基盤の一部を明らかにすることができた。現在は引き続き、より詳細にその神経基盤を明らかにするため、NIRSよりも空間解像度の高いfMRIを用いた同様の実験を実施している。また本研究では、意思決定プロセスの解明のために計算モデルも使用することを計画していたが、当該年度では意思決定プロセスを説明しうる複数種類の計算モデルの構築を行った。さらにモデルの妥当性を検討するための実験を実施し、行動データとのフィッティングを行うことで、適切なモデルの選択や各種パラメータの設定についての検討も行った。本研究課題では、ヒトの脳内における意思決定プロセスを解明するため、これまでに広く検討されてきた一つの正答が存在する事態での意思決定に加え、それとは異なる特徴をもつ正答が存在しない事態での意思決定(例:職業選択)について検討を行っている。当該年度では,昨年度に引き続きデータ収集を進めるとともに,データ解析に使用する計算モデルの検討を進めた。計算モデルについては、これら2つの意思決定の統合的理解の枠組みとして,正答のある事態の意思決定において用いられてきた強化学習モデルに注目し、正答がない事態についても適用することを検討した。行動データや脳波データからは、正答のない事態においても強化学習のような学習過程が生じていることが見出されたが、シミュレーションによる検討からモデルへの入力データとして主観的評定の値を用いることに技術的な問題があることが明らかとなった。その問題の解決にはモデルによる解析面でのアプローチよりも実験パラダイムを工夫することが重要であることも明らかとなり、実験パラダイムについての検討も進めた。当該年度ではまた、昨年度までの研究成果を学会等で公表した。本研究課題では,ヒトの脳内における意思決定プロセスを解明するため,これまでに広く検討されてきた一つの正答が存在する事態における意思決定に加え、それとは異なる特徴を持つ正答が存在しない事態での意思決定(例:職業選択)についての検討を行っている。当該年度では以下の4つの成果を得た。1.MRIを用いて記録した安静時のデフォルトモードネットワーク(DMN)のグルタミン酸濃度が,正答のない意思決定(刺激の自己関連性判断)を予測する内因性の脳活動と相関することを明らかとした。この成果はSocial Neuroscienceで誌上発表した。2.正答のない意思決定(職業選択)時に正答のある意思決定と同様,強化学習で説明可能な学習が生じていることを行動データから明らかにした。しかし,その学習による行動の変化を予測する脳活動は,正答がない場合とある場合とで異なることも明らかとなった。この成果について,論文にまとめ投稿した。3.正答のない意思決定(好み判断)時に,強化学習で説明可能な学習が生じていることを好みの主観評定データから明らかにした。また,正答のある意思決定の場合と同様,正答のない意思決定においても選択結果のフィードバックに対して予測誤差を反映していると考えられる前部帯状回の活動増加が観察された。さらに,正答のない意思決定においても,正答のある意思決定の場合と同様,報酬感度や抑うつの程度といった個人差が意思決定を通しての学習の程度を予測することを明らかとした。これらの成果についても論文にまとめ投稿した。4.昨年度明らかとなった強化学習モデルを用いて正答のない意思決定時の行動データを解析する際の問題点とその解決法についても論文にまとめて投稿した。当該年度では,これまでの成果を複数の論文としてまとめ投稿することができた。本研究課題の目的の一つである正答のない意思決定について内因性の脳活動の関連については初年度に報告したFrontiers in Human Neuroscienceの成果に加え,本年度新たに追加実験のデータがSocial Neuroscienceに掲載された。

また,もう一つの目的である正答のある意思決定と正答のない意思決定の統合的理解に向けた検討も順調に進んでおり,すでに複数の論文としてその成果をまとめ投稿している。以上のことから、計画全体の達成にむけて十分な進捗がみられた。本研究課題では,ヒトの脳内における意思決定プロセスを解明するため,これまでに広く検討されてきた一つの正答が存在する事態における意思決定に加え、それとは異なる特徴を持つ正答が存在しない事態での意思決定(例:職業選択)についての検討を行っている。当該年度では以下の4つの成果を得た。1.正答のない意思決定(職業選択)時に正答のある意思決定と同様,強化学習で説明可能な学習が生じていることを行動データから明らかにした。また,その学習による行動の変化を予測する脳活動は,正答がない場合とある場合とで異なることも明らかとなった。この成果についてはScientific reportsに掲載された。2.正答のない意思決定においても,正答のある意思決定の場合と同様,報酬感度や抑うつの程度といった個人差が意思決定を通しての学習の程度を予測することを明らかとした。報酬感度との関連については生理心理学と精神生理学への掲載が決まり現在印刷中である。抑うつとの関連については英語論文としてまとめ,現在修正再投稿中である。3.正答のある意思決定の場合とは異なり,強化学習モデルを用いて正答のない意思決定時の行動データを解析する際には各刺激についての選好の初期値を推定する必要があるといった技術的な問題点が存在することを明らかにした。その問題点とその解決法についての論文は現在投稿中である。4.意思決定課題で使用する表情刺激作成時に収集したデータを論文にまとめ, Current psychologyとJournal of Nonverbal Behaviorに掲載された。正答のない意思決定と内因性の脳活動との関連については,外側前頭の内因性の脳活動が正答のない意思決定時の内側前頭の活動を調整していることが明らかとなった。また,正答のない意思決定においては過去にその選択肢を自分で選択したものが選択されやすくなることが知られているが,その程度がうつ症状,報酬感受性,意思決定後に観察される前部帯状回を発生源とするβγ波のパワーの程度によって影響を受けることを初めて明らかにした。強化学習モデルは正答のある意思決定と同様,正答のない意思決定にも適用できることが示されたが,単純な強化学習の適用では不十分であり,刺激の自己関連性といった要因が介在している可能性が示唆された。当該年度ではデータ収集に加え,予定していたモデルについての検討も進めることができた。正答のある事態と正答のない事態における意思決定の統合的理解のために強化学習モデルが有用であることが明らかとなった。正答のない事態に強化学習モデルを適用するための技術的な問題点が明らかとなったが,その解決策も見出すことができた。強化学習モデルを正答のない意思決定課題に適用するには問題点を解決する必要があった。その問題を解決するために開発した実験パラダイムについて,現在実験を実施するための準備を進めている。本年度中にデータ収集とその解析を進める予定である。
反応の計測,診断

光励起プロセスに関する基礎過程を理解し、この手法を発展させるためには、反応過程の計測、診断が必須であり、本研究グル-プは、その手段の開発と実際のシステムへの応用を行っている。反応も、気相反応と表面反応に分けられるが、前者については、各種の最新のレ-ザ-分光法を利用し、後者については、未だ計測手法が確立されてなく、必要に応じて装置を自作することも含めて多角的な計測を行っている。これまでの成果としては、まず、アルミ薄膜の形成とそのプロセス診断の研究がある。(CH_3) _2 AlHに紫外光を照射すると、伝導性の高いアルミ薄膜を形成できる。その初期過程を、x線電子分光法(XPS)を利用して調べると、核形成を始めるためには、材料ガスが基板上へ吸着して、アルミとメチル基が結合していて、それが真空紫外光で分解されること、その核上にアルミが堆積することには、異なった種類の吸着種が形成されることが分かった。さらに、走査型トンネル顕微鏡を利用して、その核形成の模様が観測され、光照射の方が熱反応によるより、核の生成密度が高くなることが観測された。さらに、Si(100)面上にGe膜を成長させる過程をRHEEDにより観測して、光励起下で反応種の表面泳動があるらしいことが分かった。これはまだ予備的結果であるが、光誘起表面泳動を示唆するデ-タは少なく、貴重な成果といえる。その外、気相診断では、赤外ダイオ-ドレ-ザ-分光法とレ-ザ-誘気蛍光法で、シラン等半導体プロセスで重要なガスの気相分解が精密に調べられている。
スフィンゴリン脂質シグナル制御による新しい気管支喘息治療へのアプローチ

喘息マウスの肺組織ではS1PR1とS1PR3の発現が亢進していた。S1PRの非選択的阻害薬)、選択的拮抗薬(S1PR1、3拮抗薬であるVPC23019、S1PR2特異的拮抗薬JTE013)を投与したところ、いずれのマウスにおいても気道炎症が抑制された。また、気道過敏性も抑制され、肺胞洗浄液中のIL-4、IL-13の発現低下も見られた。阻害薬を投与経路変え、比較したが、気道内の蛋白量に差異は見られなかった。FTY720投与マウスでは抗原取り込みが抑制されるのに対して、JTE013では正常であったことから、S1PR2は抗原取り込み能に関与することなく、喘息の気道炎症に関わっていることが示唆された。OVA(卵白アルブミン)の腹腔注射による感作、OVA吸入喘息モデルマウスに対する非選択的S1P阻害薬のDMSとS1P1受容体拮抗薬であるFTY-720の投与効果について検討した。BALB/cマウスをOVAで感作し、OVA吸入群と非吸入群にわけ、それぞれの群に薬剤(DMS、FTY-720)を腹腔内投与した群と、エアロゾル化し吸入させた群分けしFTY-720の投与で、気道内へ浸潤する好酸球数の減少やEPOの低下がみられた。DMS投与群のEPO活性を喘息マウスと比較した時、DMS腹注群は44.9±19.1%、DMS吸入群は47.6±28.8%であった。FTY-720投与群のEPO活性を喘息マウスと比較した時、FTY-720腹注群は56.5±32.5%、FTY-720吸入群は61.0±11.0%であった。また、生理学的にもS1Pの阻害薬投与によって気道過敏性が抑制されることが明らかになった。肺胞洗浄液中のTh2サイトカインであるIL-4,IL-5,IL-13のいずれも発現が抑制されていることから、S1Pが好酸球の活性、遊走を制御している可能性が示唆された。一方で、S1Pが血管透過性を制御しているとの報告もあることから、血管透過性の違いが好酸球浸潤の程度に影響を及ぼしている可能性を考慮し、Evasblueを用いて気道内へのタンパク浸潤を比較したが、DMS,FTY-720のいずれの薬剤も血管透過性には影響を与えなかった。卵白アルブミン(OVA)感作、誘導喘息モデルマウスを作製し、Evas blueを用いて、血管から肺胞への蛋白漏出(血管透過性)を評価した。通常の喘息モデルマウスと非選択的スフィンゴシンキナーゼ阻害薬であるDMS(N,N-dimethylsphingosine)を投与した喘息モデルマウスで、血管透過性を比較したが、有意な差は認められず、喘息の病態におけるS1Pの血管透過性への影響は少ないと考えられた。次に、喘息マウスモデルから、肺組織を採取し、スフィンゴシン1リン酸(S1P)の免疫染色を行ったところ、気道上皮細胞と肺胞上皮細胞にS1P受容体のうち、S1P1受容体とS1P3受容体の発現が亢進していることが示された。S1P1およびS1P3受容体の各特異的阻害薬を投与することで喘息の気道炎症に影響を与えるか?評価する予定であるが、阻害薬投与マウスでは死亡する個体が多いため、現在原因を解析中です。S1P2受容体を除くS1P受容体スーパーアゴニストであるFTY-720とS1P2受容体拮抗薬であるJTE-013を投与した喘息モデルマウスの気道炎症、気道過敏性も評価を行ったが、両群ともに、気道内への好酸球浸潤がコントロールマウスに比較して抑制されることがわかり、気道過敏性も抑制されていた。さらにFITCで標識したOVAを両群のマウスに吸入させ、所属リンパ節内の抗原提示細胞であるCD11c陽性樹状細胞への取り込みを評価した。FTY-720投与群では取り込みは認められなかった。一方、JTE-013投与群ではOVAの取り込みが認められたことより、S1P2受容体は抗原取り込み能に関与することなく、喘息の気道炎症を抑制することが示唆された。OVA(卵白アルブミン)の腹腔注射による感作、OVA吸入喘息モデルマウスを作製した。

マウス喘息モデルの気道上皮細胞にSPHK(Sphingosine kinase)の発現がみられ、二重染色で粘液の主成分であるMUC5ACとSPHKの発現の共在を認めた。次に喘息モデルマウスに対する非選択的S1P阻害薬のDMSとS1P1受容体拮抗薬であるFTY-720の投与効果について検討した。BALB/cマウスをOVAで感作し、OVA吸入群と非吸入群にわけ、それぞれの群に薬剤(DMS、FTY-720)を腹腔内投与した群と、エアロゾル化し吸入させた群にわけ、比較した。DMSやFTY-720の投与で、好酸球数の減少やEPOの低下がみられた。DMS投与群のEPO活性を喘息マウスと比較した時、DMS腹注群は44.9±19.1%、DMS吸入群は47.6±28.8%であった。FTY-720投与群のEPO活性を喘息マウスと比較した時、FTY-720腹注群は56.5±32.5%、FTY-720吸入群は61.0±11.0%であった。DMSやFTY-720は、喘息における好酸球の気道への遊走を抑制している可能性が示唆された。好酸球遊走について、好酸球の選択的浸潤に関与したり、気道炎症の中心的な役割を果たしたりすると考えられているサイトカインであるIL-4やIL-13の肺胞洗浄液中の濃度も、DMSやFTY-720の投与により低下がみられた。実験開始前から予想していた結果を得ている。しかしS1Pの各受容体を後天的にsiRNAの手法を用いてノックダウンすることで、各受容体の活性化の違いによって、気管支喘息の表現型が変化することを証明する実験計画を組んでいたが、siRNA法では十分なノックダウンができていないため、S1P各受容体の阻害薬を用いた実験に変更する必要があるため。実験開始前から予想していた結果を得ており、実験はおおむね順調に進展していると考える。S1Pの各受容体を後天的にsiRNAの手法を用いてノックダウンすることで、各受容体の活性化の違いによって、気管支喘息の表現型が変化することを証明する実験計画を組んでいたが、siRNAの経鼻投与で十分なノックダウンができていないため、siRNAの投与方法について検討しないといけないため、今後の実験が遅れる可能性はある。S1P受容体の各siRNA投与による気管支喘息の表現型の変化を解析を予定していたが、SiRNA法によるノックダウンが十分にかからないため、各受容体のアゴニストを使った実験系で研究を遂行していく。DMSやFTY-720は、喘息における好酸球の気道への遊走を抑制していることが示されたので、その結果が、肺組織や気道過敏性に反映されているかを検証する。マウス肺組織のパラフィン切片を作成し、HE染色ならびにPAS染色を行い、気道への炎症細胞浸潤の程度、PAS陽性の粘液産生goblet細胞数の増多の程度を評価する。Massaon-Tricrome染色により気道線維化の評価を行う。また、メサコリン吸入による気道抵抗、気道過敏性につての評価を加える。血管内皮に発現するS1P受容体にも着目し、気管支喘息の急性期における炎症細胞の血管透過性について、Evans Blueを尾静脈より投与し、血清とBAL液の吸光度で評価する。S1P受容体の各siRNA投与にかかわる実験系の遂行が困難になっているため、各受容体アゴニストによる表現型解析を行うため、それらアゴニストの購入費用あてる。また、当成果を国際学会等に発表していくための資金に使用する。マウスの喘息表現型解析のためのサイトカイン測定用のELISAやフローサイトメトリーの試薬やSiRNAの導入に使用する導入キットなども複数検討する必要がありそうなので、費用が掛かることが予想される。マウスの飼育、維持費も計上している。当該年度に計上した研究費のうち、前述のごとくSiRNA導入実験において、経鼻投与では十分にノックダウンがかからず、ノックダウンマウスの表現型解析に計上していたELISAキット等の費用が繰り越しになったため、次年度にSiRNA導入が順調に進んだのち、表現型解析の費用として併せて使用する予定である。
重症脳損傷症例の脳循環・代謝についての研究

重症頭部外傷急性期の頭蓋内循環動態と脳損傷のタイプとの関連及び各種治療法(外科的手術やバルビタール療法)の効果について検討した。対象症例は入院時Glasgow Coma Scale(GCS)score8以下の重症頭部外傷15例(17歳88歳:平均48歳)で、全例カミノシステムにより頭蓋内圧を持続測定した。また、右内頚静脈球部にfiberoptic catheterを留置し、内頚静脈酸素飽和度(SjO_2)を持続測定し温度センサーにより脳表温を持続測定した。脳循環の指標として経頭蓋超音波ドップラー(TCD)を用いて中大脳動脈血流速度(MCA-FV)測定を行った。その他近赤外線スペクトロスコピーによる脳組織酸素飽和度も同時測定した。これらをdiffuse brain injuryとfocal brain injuryとで比較するとともに外科的減圧術やバルビタール療法前後の推移について検討した。脳灌流圧(CPP)とSjO_2の経時点変化はdiffuse,focal brain injuryともに生存例は死亡例に比して高い値で推移し、またGCS5以下の最重症例ではその他の症例に比べSjO_2は抵値であった。focal brain injuryではCPPの低下に伴いMCA-FVは進行性に低下したのに比べ、diffuse brain injuryでは一定の関連はなかった。両群ともSjO_2,組織酵素飽和度,CPPは50%、50mmHg以下の症例に有意に死亡例が多かった。以上の結果より重症頭部外傷急性期の頭蓋内循環代謝動態は脳損傷のタイプにより異なるが、CPP,SjO_2のcritical levelはおよそ50%,50mmHgであり、外科的治療やバルビタール療法などでそれ以上の値に維持しなければならないと考えられた。これらの結果の一部は、第12回日本脳・神経超音波研究会(1993東京),第3回脳静脈酵素飽和度(SjO_2)研究会(1993東京),並びにIASTBI(1993東京)において発表した。
有機金属ペロブスカイトのメソ構造体ハイブリッド化による物質変換と高機能化

本年度は、鉛を含まない金属2種以上からなるビスマス(Bi)系ペロブスカイト材料として、カチオンに銀(Ag)とBiを用いるオール無機組成のAgBi2I7ならびにAg2BiI5を、溶液法によって製膜し光物性と光電変換特性を評価した。両者とも製膜中に副生物(不純物)としてヨウ化Bi(BiI3)が微量に混入する問題があったが、このBiI3の混在量を意図的に制御してペロブスカイト結晶のpassivationに利用することによって、Ag-Bi系のペロブスカイト材料の光電変換特性を向上させることができることを見出した。一方Ag2BiI5は光電変換物性が低く機能しないと判断し、AgBi2I7結晶中に生成する量を抑制した。発電層にAgBi2I7を用い正孔輸送層にはドーパントフリーの高分子材料(P3HT)を用いて作製した素子で、Ag-Bi系のペロブスカイトの最高値である2%を超える変換効率が得られた。また、AgBi2I7材料は長期保存で安定であり、P3HTもドーパントを含まず安定であることから、作製した素子は耐久性に優れており水と触れても劣化しないことを確認した。本成果をまとめて原著論文として出版した。また、昨年度に続き、オール無機構造のCs2BiAgBr6の組成のダブルペロブスカイト結晶を溶液法によって合成し、この材料の電子構造とバンド構造を解析し光物性の基礎データを補充した。以上の本研究で扱った無塩組成のペロブスカイト材料の全てについて、物性と光電変換特性をほかのペロブスカイト材料と比較して、特徴をまとめた総説を、アメリカ化学会のChemical Reviews誌に出版した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。スズを金属とする有機無機ペロブスカイト結晶の薄膜について、その光物性を評価する前段階として、溶液法で作製する薄膜の安定性を評価した。鉛の一部をスズに置換したペロブスイカイト結晶CH3NH3Pb1-xSnxX3の薄膜を、前駆体原料溶液から大気下のスピン塗布法によって合成し、Al2O3ならびにTiO2のメソ多孔薄膜へ充填固定化した。メソ多孔薄膜上に形成したペロブスカイト結晶膜は、Snモル比がx=1に近いペロブスカイトではすべてのハロゲン(X)組成について大気中(湿度、酸素)で速やかに褪色して分解する不安定を示した。Snをモル比0.050.5の範囲でPbに混合したものは、安定性が高まり、Pb含量の高いモル比0.05の組成は鉛ペロブスカイトに近い安定性と光吸収特性を示した。また、SnとPbは固溶体としてペロブスカイト結晶に均一に混合することが知られているが、Sn含量の高いものは製膜と物性評価を不活性ガス(窒素)雰囲気中で行う必要性を確認した。本科研費の経費の範囲では、この製膜と評価に必要な大型グローブボックスの入手が困難なために、別の経費で特注のグローブボックスを27年度内に設備導入することを決定した。素子の作製においてはペロブスカイトを安定的に固定化するのに有効なscaffoldとして、表面親水性が高くペロブスカイトの結晶核生成に有利と期待できるAl2O3とSnO2のメソ多孔膜の検討を行った。Al2O3多孔膜を用いると鉛ペロブスカイトの系で膜の均一性が良くなる効果を見出し、また、SnO2多孔膜では鉛ペロブスカイトの系で良質の製膜が出来上がり光電変換に応用したところエネルギー変換効率が13%に届く成果が得られた(論文出版)。これらのメソ多孔膜をSn系ペロブスカイトの製膜と固定化に応用する予備実験を進めている。鉛の一部をスズに置換したペロブスイカイト結晶CH3NH3Pb1-xSnxX3は、光吸収特性とバンドギャップがPb1-xSnxの混合モル比によってほぼ連続的に変化すること、メソ多孔薄膜に充填した結晶は、XRDによって分析した結果、Sn(II)の混合モル比が0.050.5の範囲のものは比較的安定性であり、Pb(II)含量の高いモル比0.05の組成は鉛ペロブスカイトに近い安定性と光吸収特性を示した。しかしながら、大気中の酸素との接触ではSn(II)がSn(IV)に酸化されSn(IV)の微量の混入によって固体物性が不安定となり、多くの構造欠陥が導入される傾向が明らかである。また光電変換素子の作製では、CH3NH3Pb1-xSnxX3の組成はPb100%組成に対して感光吸収の長波長化(集光の強化)は達成できるが、素子の開回路電圧が大きく低下するためにエネルギー変換効率が一方的に低下した。このため、改善として、Sn(II)に代えてビスマス(III)を金属カチオンに用いるペロブスカイト結晶を合成した。(CH3NH3)3 Bi2I9の組成の結晶の薄膜をスピン塗布によってTiO2多孔膜上に製膜した。薄膜の物性を評価した結果、吸光係数はPb、Sn系と同程度に高く波長620 nmまでの光吸収をもち、XRDによる結晶構造分析においても大気中で組成と物性が変化せず高い安定性を示した。

(CH3NH3)3 Bi2I9を光吸収層に用いて光電変換素子を試作した結果、0.6Vの開回路電圧とエネルギー変換効率0.2 %が得られた。これは太陽スペクトルの光吸収能力(バンドギャップ)から期待される到達可能効率(約8%)からずっと低いが、この組成のペロブスカイトを使った光電変換素子として報告される値の最高値である(論文投稿中)。また、大気中に未封止の素子を暴露して性能安定性を調べた結果、10週間以上、光電変換が持続する安定性が確かめられた。鉛に代わる金属を用いる有機無機ペロブスカイト結晶として、ビスマス(III)を用いるペロブスカイト結晶が安定性と光吸収能力に優れ、溶液塗布によって製膜できることが示された。ビスマスのみを金属に用いる無鉛系の光電変換素子から、この材料としては最も高いエネルギー変換効率0.2%の光電変換特性が得られ、大気中の極めて高い安定性を明らかにした。しかし、エネルギー変換の損失が大きい理由として、結晶膜の質(平坦性、緻密性)が悪い点と電荷輸送層との接合として界面の構造が不連続であり欠陥の多い点が問題であり、これらの改善が課題であることを明確化した。昨年度は鉛をスズ(Sn)に置換した有機無機ペロブスカイト結晶の評価を行ったのに対して、本年度は、鉛をビスマス(Bi)に置換したペロブスイカイト結晶の薄膜を作製して、その光物性と光電変換特性を高める方法を検討した。Bi置換ペロブスカイトはSn置換型よりも圧倒的に大気(酸素)、熱、そして湿気に対して安定であることが特長であり、本研究の重要な部分である。Bi系ペロブスカイトとしてメチルアンモニウムBiヨウ化物(CH3NH3)3Bi2I9の微結晶をDMF溶液からスピンコート法によって析出して薄膜形成し、溶媒の種類と製膜条件(原料溶液濃度、温度、乾燥条件など)を最適化することで、物理欠陥のない緻密な薄膜を作ることを試みた。通常の方法では結晶は樹状(デンドライト)のランダム形状に成長しピンホールの多い多孔膜が形成したため、原料のDMF溶液に高沸点溶媒としてNメチルピロリドン(NMP)を添加して溶媒の揮発を遅らせて結晶成長を遅らせることで製膜条件の調整を図った結果、比較的ピンホールの少ない(CH3NH3)3Bi2I9結晶膜が得られることがわかった。この製膜をメソポーラスチタニア膜を下地(scaffold)に使って行った結果、scaffold内に結晶が充填され表面を覆うピンホールの少ない(CH3NH3)3Bi2I9膜が得られた。光電変換セルを作製して、特性を評価した結果、光電応答はこの結晶の吸収に位置する550nmまでの分光感度を示し、出力電圧0.55Vと1mA/cm2程度の光電流が得られ、エネルギー変換効率は0.3%と低い値となった。しかしモルホロジーを改善させたことによってデンドライト状の結晶からは効率は大きく向上し、(CH3NH3)3Bi2I9を用いる光電変換としてはこれまでに報告される中でも最高値に近い値となった。本結果を論文に出版した(RSC Advances)。鉛に代わりBiを用いる有機無機ペロブスカイト結晶(CH3NH3)3Bi2I9が、溶液塗布法の溶媒種を改良することで比較的平坦な膜として製膜でき、薄膜が湿気に対しても極めて高い安定性をもつことがわかった。光物性においては吸光係数が高く光伝導性も有しており、光吸収端が短波長(550nm)で集光性の点で劣る点を除くと鉛系ペロブスカイトを置き換える可能性を有している。光物性の改善には、溶液法で作る薄膜のモルホロジーの改善すなわち緻密性と平坦性を高めることが重要であることを明らかにした。溶液製膜原料のDMF溶液に高沸点溶媒としてNメチルピロリドン(NMP)を添加して溶媒の揮発を遅らせてペロブスカイトの結晶成長を遅らせることで製膜法を改良した結果、比較的欠陥の少ない(CH3NH3)3Bi2I9結晶膜が得られることがわかった。
各種幹細胞の脳内移植による神経疾患の治療パーキンソン病脳梗塞脊髄損傷を中心として

申請者は本研究プロジェクトでパーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷モデルを完成した。とくに脊髄損傷モデルは損傷後脊髄を切除短縮するという独創的モデルの作成に成功した。さらにパーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞モデル動物に幹細胞を移植し、その行動学的変化を検討した。パーキンソン病では6OHDA投与ラットにES細胞由来のドーパミン細胞を移植し、amphetammine誘発回転行動を観察したところ有意な回転行動の減少を認めた。ES細胞と骨髄間質細胞を共培養してドーパミン細胞への分化をはかった細胞が宿主脳内で生着し突起を伸ばしていた。また骨髄間質細胞の培養液を移植部に注入することによって、ES細胞の生着とドーパミン細胞への分化を促進させた。脊髄損傷モデルには空洞瘢痕部を鋭的に切除した後、脊椎短縮術を施し錐体路の再生を試みた。この際、脊髄断端部にES細胞の移植し各種神経栄養因子を持続的に注入したところ運動機能の改善を見た。さらに腰部にDiIを注入したところ、移植動物ではDiIの大脳皮質錐体細胞への取り込みを認めた。これによって錐体路の再生が証明された。脳梗塞モデルは絹糸による中大脳動脈閉塞モデルを用い、ES細胞由来の内皮前駆細胞を梗塞巣周辺(penumbra)領域に移植して、良好な生着を得た。パーキンソン病モデル動物に対する胚性幹細胞移植脊髄損傷への移植今年度は脊髄損傷モデルとその再生のためのモデル動物を作成した.脊髄損傷はクリップによるピンチ法を行った.空洞を切除するために脊椎椎体を1-2個切除し、空洞を切除後損傷脊髄を縫合した.これにより空洞は完全に切除され、錐体路の再生がより容易になった.手術は侵襲的だが動物を長期間生存させることも可能となった.脳梗塞モデル動物への移植中大脳動脈閉塞モデル(intraluminal thread model)でラットに脳梗塞を作成した後、gCSFにて骨髄間葉細胞を刺激したところ、梗塞巣へ間葉細胞由来の内皮細胞の誘導を行うことが可能であった.この部で新生血管の再生が確認されたが、梗塞巣が縮小していることはまだ確認されていない.本研究プロジェクトで我々は幹細胞移植を応用すべきモデル動物を作成した。パーキンソン病では6OHDA投与ラットとMPTP投与サルによるパーキンソン病モデルを開発した。特に6OHDA線条体投与による緩徐発症パーキンソン病モデルを開発し実験に応用している(Ooiwa et al, Brain Research,2002)。損傷モデルはラットを用いてクリップによる損傷作成しその後、歩行運動を分析した。脳梗塞モデルは内頚動脈内絹糸挿入法を用いた。幹細胞は主にマウス未分化ES細胞を用いた。マウス未分化ES細胞のドーパミン細胞への分化を促進させるため、骨髄由来間質幹細胞を用いた。マウス未分化ES細胞を骨髄由来間質細胞と共培養したところ、ES細胞は高率にTuJ1,NeuNやMAP2を示す神経細胞へと分化した。さらにこの神経細胞の多くはtyrosine hydroxylase(TH)陽性のドーパミン細胞としての特徴を示した。骨髄間質細胞と共培養したES細胞をマウス脳内に移植したところ、脳内で高率に生着しドーパミン細胞へと分化した。さらに6-OHDAパーキンソン病モデルラットへの移植でアンフェタミンによる回転行動が改善した。以上の結果はES細胞から神経細胞への分化と増殖に骨髄間質細胞との共培養が有効であることを示し、将来ES細胞をヒトパーキンソン病脳に移植するときに、患者骨髄の間質細胞を採取してES細胞の分化を促進させ、パーキンソン症状を改善させることに役立つものとして注目される。脊髄損傷には胎児脊髄をドナーとして使用した。脊髄損傷に対してES細胞と骨髄間質細胞を移植すると、ラット両後肢の運動が改善することを確認した。さらにこの改善がラット皮質脊髄路の再生によるものであることがtracerを用いた形態学的研究で明らかにされた。申請者は本研究プロジェクトのうち平成15-16年度にパーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷もモデルを完成した。

とくに脊髄損傷モデルは損傷後脊髄を切除短縮するという独創的モデルの作成に成功した。またマウス胚性幹(ES)細胞を骨髄間質細胞と共培養しSHHとFGFを添加することで高率にドーパミン細胞に分化することを明らかにした。本年度はパーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞モデル動物に幹細胞を移植し、その行動学的変化を検討した。パーキンソン病では6OHDA投与ラットにES細胞由来のドーパミン細胞を移植し、amphetammine誘発回転行動を観察したところ有意な回転行動の減少を認めた。ES細胞と骨髄間質細胞を共培養してドーパミン細胞への分化をはかった細胞が宿主脳内で生着し突起を伸ばしていた。また骨髄間質細胞の培養液を移植部に注入することによって、ES細胞の生着とドーパミン細胞への分化を促進させた。脊髄損傷モデルには空洞瘢痕部を鋭的に切除した後、脊髄短縮術を施し錐体路の再生を試みた。この際、脊髄断端部にES細胞の移植し各種神経栄養因子を持続的に注入したところ運動機能の改善を見た。さらに腰部にDiIを注入したところ、移植動物ではDiIの大脳皮質錐体細胞への取り込みを認めた。これによって錐体路の再生が証明された。脳梗塞モデルは絹糸による中大脳動脈閉塞モデルを用い、ES細胞由来の内皮前駆細胞を梗塞巣周辺(penumbra)領域に移植して、良好な生着を得たが梗塞巣の大きさを減少させるにはいたらなかった。本年度の研究でES細胞由来の各細胞が脳に移植可能で、かつその機能を発揮することが証明された。
アンカリングプロテインに制御されたA-キナーゼによるイオン輸送担体の機能調節

1.ラット耳下腺から基底側膜を単離し,cAMP存在下で[γ-^<32>P]ATPとインキュベートすると膜のNa^+,K^+-ATPaseおよびNa^+-K^+-2Cl^-cotransporterを含む種々の膜蛋白質が膜由来の内因性のPKAによってリン酸化された。2.ラット耳下腺のアンカリングプロテイン(AKAP)をRT-PCR,ウエスタンブロット法で調べた結果,AKAP-150サブタイプが検出された。オーバーレイアッセイ法で調べた結果,フィルター上のAKAP-150にPKAのRII調節サブユニットが結合した。RII調節サブユニットに対する特異抗体でAKAP-150が共沈した。以上の結果からAKAP-150が基底側膜中でPKAと複合体を形成していることを明らかにした。3.ラット耳下腺から遊離細胞を調製し,イソプロテレノール刺激するとNa^+-K^+-2Cl^-cotransporterのN-末端がリン酸化され,Na^+,K^+,2Cl^-の共輸送の促進およびブメタナイドの結合量が増加することを明らかにした。4.Na^+-K^+-2Cl^-cotransporterはin vitroの系でAKAP/PKA複合体およびPKAによって直接リン酸化された。しかし,イオンの共輸送活性およびブメタナイドの結合量は変化せず,機能調節に関与するN-末端部分のリン酸化も全く認められなかった。5.遊離細胞をジギトニンでパーメアビライズした遊離細胞にcAMPを添加し,受容体を介さず直接PKAを活性化すると,Na^+-K^+-2Cl^-cotransporterの機能調節に関与するN-末端のリン酸化が認められた。ラット耳下腺から基底側膜を単離し,cAMP存在下で[γ-^<32>P]ATPとインキュベートすると300,180,92,50kDaの4種の膜蛋白質がリン酸化された。このリン酸化はPKAへの特異的な阻害剤である[5-24]PKIペプチドによって完全に阻害されたことから,膜に結合したPKAによることを明らかにした。耳下腺のアンカリングプロテイン(AKAP)のサブタイプをRT-PCR法によって検討した結果,AKAP-150の発現を検出した。引き続き次年度,単離した基底側膜にAKAP-150が局在し,アンカリングプロテインとして機能しているかどうかを膜レベルで検討する。上記計画と並行してイオン輪送担体のリン酸化を調べた結果,上記4種のリン酸化膜蛋白質のうち,92kDaのリン酸化蛋白質はNa^+,K^+-ATPaseであることを明らかにした。また,13年度に予定していた"リン酸化されたNa^+-K^+-2Cl^-cotransporterの機能変化"に関連する結果の一部を,本年度の結果に加え,American J.Physiologyに以下の内容で掲載した。耳下腺の遊離細胞をイソプロテレノールで刺激(in vivo)するとNa^+-K^+-2Cl^-cotransporterが著しくリン酸化され,これに伴いイオンの共輸送および阻害剤であるブメタナイドの高親和性結合部位が増加した。しかし,単離した基底側膜を[γ-^<32>P]ATPとcAMP存在下でAKAP/PKAによるin vitroの系でリン酸化すると,Na^+-K^+-2Cl^-cotransporterのリン酸化は促進されたが,イオンの共輸送およびブメタナイドの結合量は全く変化しなかった。