hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シングルセル発現解析による難治がんの抗がん剤耐性メカニズムの解明

がんの治療抵抗性はがんを構成する一部の細胞により担われると考えられるため、がん組織の多様性を理解する事はがんの治療抵抗性を克服する上で重要な問題である。そこで、インビトロで培養した大腸がん幹細胞のマウス移植にによりがん組織を再構成し、形成した腫瘍のシングルセル発現解析により、がん組織の多様性解明を試みた。移植腫瘍の担がんマウスの抗がん剤治療前後において、シングルセル解析を行うことにより、Lgr5幹細胞マーカー陽性の治療抵抗性と相関する細胞群を同定した。さらに同様のシングルセル解析を大腸炎症発がんモデルで行い、発がんに伴い発生する造腫瘍性を有する幹細胞集団を同定した。難治がんの治療抵抗性は、がん組織を構成する細胞のごく一部により担われると考えられる。従って、がん組織の細胞多様性を理解し治療抵抗性を持つ細胞群を同定する事は、抗がん剤抵抗性腫瘍の治療を考える上で重要である。これまでの研究で樹立したin vitro培養がん幹細胞のマウス移植腫瘍を対象とし、シングルセル遺伝子発現解析を行う事により、腫瘍を構成する細胞群に細分した。治療抵抗性腫瘍にのみ存在する細胞、及び抗がん剤投与後に残存する細胞を解析する事により、治療抵抗性と相関する細胞群を同定し、そのような細胞群に特徴的な遺伝子発現プロファイルを明らかにした。がん組織の細胞多様性を理解し治療抵抗性を持つ細胞群を同定する事は、抗がん剤抵抗性腫瘍の治療を考える上で重要である。これまでの研究で樹立したin vitro培養大腸がん幹細胞のマウス移植腫瘍を対象とし、シングルセル遺伝子発現解析を行なった。得られた結果のクラスタリング解析、主成分解析等の統計解析により、腫瘍を構成する細胞群に細分した。担がんマウスの抗がん剤治療を行い、抗がん剤治療抵抗性腫瘍にのみ存在する細胞、及び抗がん剤投与後に残存する細胞を解析する事により、治療抵抗性と相関する細胞群を同定した。これまでに3症例において、同様の解析を行い、治療抵抗性細胞群に特徴的な遺伝子発現プロファイルを明らかにした。本申請は、シングルセル発現解析法を用いて、抗がん剤治療抵抗性細胞の特性解明をめざすものであるが、これまで樹立したヒト難治がん幹細胞を免疫不全マウス(NOGマウス)に皮下移植し、腫瘍形成を行なった。次に、それぞれのマウス移植腫瘍を摘出し、酵素処理後、フローサイトメトリーにより単一細胞に分離した。さらに、各細胞の多遺伝子定量PCRの結果の統計的解析により、腫瘍構成細胞のクラスタリングを行なった。現在、複数の症例で抵抗性細胞群の同定を試みる事により治療抵抗性細胞群の普遍的な発現特性を明らかにした。申請書においては、複数の抗がん剤で同様の解析を行う事を予定していたが、Irinotecanのみに焦点をあてて、詳細な解析を行う事となった。それ以外は、概ね申請書に記載した通りにすすんでおり、順調に進展していると考える。一般に、がん治療抵抗性は、がん組織を構成する細胞のごく一部により担われると考えられる。そこで、治療抵抗性腫瘍にのみ存在する細胞、及び抗がん剤投与後に残存する細胞を解析する事により、治療抵抗性と相関する細胞群を同定し、そのような細胞群に特徴的な遺伝子発現プロファイルを明らかにする事を試みた。方法としては、スフェロイド形成法によるがん幹細胞のin vitro培養法を用い、ヒト大腸がん、漿液性卵巣がん症例より樹立したヒト難治がん幹細胞を免疫不全マウス(NOGマウス)の皮下移植による移植腫瘍の実験系を用いた。作成したマウス移植腫瘍を摘出し、酵素処理後、フローサイトメトリーにより単一細胞に分離する。各細胞の多遺伝子定量PCRの結果の統計的解析により、腫瘍構成細胞のクラスタリングを行なった。これらの実験を、抗がん剤抵抗性及び感受性腫瘍で行い、抵抗性腫瘍にのみ存在するLGR5陽性の細胞群を同定した。さらに、さらに、各細胞群に特徴的な遺伝子発現プロファイルを解析し、抗がん剤抵抗性と相関する遺伝子群を同定した。このようにして得られた知見は、今後の抗がん剤抵抗性遺伝子の同定、及び抵抗性の分子メカニズムの解明に役に立つと考えられる。本申請は、シングルセル発現解析法を用いて、難治固形がんの組織多様性を明らかにし、抗がん剤治療抵抗性細胞の特性解明をめざすものであるが、初年度においては、樹立したヒト難治がん幹細胞を免疫不全マウス(NOGマウス)に皮下移植し、腫瘍形成を行なった。現在、これらの実験を、抗がん剤抵抗性及び感受性腫瘍で行い、抵抗性腫瘍にのみ存在する細胞群の同定を試みている。

研究の達成状況は、概ね申請書に記載した通りにすすんでおり、順調に進展していると考える。最終年度においては、これまでの研究をさらに進展させ、抵抗性抵抗性細胞に特異的な細胞群が抗がん剤投与に抵抗性を持つ事を検証する。さらに、同定した細胞群に特徴的な遺伝子発現プロファイルを抽出し、抗がん剤抵抗性と相関する遺伝子群を同定する。このような方法により、抗がん剤抵抗性遺伝子の同定、及び抵抗性の分子メカニズムの解明に努める。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学本年度以降は、初年度の研究をさらに進展させ、抵抗性腫瘍にのみ存在する細胞群を同定した後、抵抗性腫瘍特異的な細胞群が抗がん剤投与に抵抗性を持つ事を検証する。このような方法により、抗がん剤抵抗性遺伝子の同定、及び抵抗性の分子メカニズムの解明に努める予定である。
ローレンツ型擬対称空間の大域的構造の研究

多様体上に定義されるリーマン型計量とローレンツ型計量を対比して研究し、得られた主な成果を次の二つの論文にまとめました。どちらも研究代表者・後藤ミドリと研究分担者・菅原邦雄の共同研究であり、投稿・出版を目指しています。1.前者において、1866年のC.G.J.Jacobiの仕事に端を発するLiouville構造を含むgeneralized Liouville構造を定義しました。n+1次元数空間において、ユークリッド計量に限らず、ミンコフスキー計量をはじめとする不定値計量に関しても、すべての2次曲面がgeneralized Liouville構造を持っことを統一的に示すことに成功しました。また、清原、および、五十嵐・清原・菅原のRiemann-Liouville曲面の分類の仕事では特異点の個数が鍵となりましたが、Lorentz-Liouville曲面においてはその種の特異点が存在しないことなどが明らかにできました。3次元以上においてもgeneralized Liouville多様体特異点集合を研究し、決定できました。この成果がgeneralized Liouville多様体の分類にどのような意味を持つかは今後の課題です。2.後者において、Riemann計量の接続とLorentz計量の接続が一致する3次元多様体が存在することを知りました。この結果により、Riemann計量では曲率と位相構造が密接なかかわりを持つのに、Lorentz計量では、定曲率の場合を除いて、そういうことは望めないだろうと予想しています。3次元ローレンツ型擬対称空間(M, g)が局所共形平坦で、局所既約であるとする。もしこの(M, g)が完備、かつ、断面曲率の下限が正ならば、(M, g)は非コンパクトである、ということを示すことができた。これは、2004年秋の日本数学会幾何学分科会(千葉大学で開催された)での特別講演、小林利行氏の講演の中にあった予想のひとつを特別な場合に考察した結果である。すでに、(M, g)が3次元以上のローレンツ幾何における正曲率の空間形(完備で、定曲率)の場合には(M, g)が非コンパクトになることが、Calabi-Makusにより示されている(1962年)。彼らは、さらに、(M, g)の基本群が有限であることも示している。上記のわれわれの結果は、曲率を摂動させた場合のものである。擬対称空間とはリーマン空間(M, g)であって、その曲率テンソルがある等式を満たすものをいう。定曲率空間や2次元リーマン空間は擬対称空間である。これらは自明なものである。そこで、3次元で、定曲率空間でないものに注目することにしよう。その場合、このような空間は、O.Kowalski等により、次のように特徴付けられている:主リッチ曲率3つのうち2つが等しくて可変で、残りのひとつはゼロではない定数である。(この定数がゼロである場合には、とくに、半対称空間とよばれている。断面曲率の下限が正であるときに大域的構造を調べることを目標とする本研究にはまったく無関係なので、ゼロではない定数の場合のみを本研究の対象にする。)定数の主リッチ曲率に対応するリッチテンソルの固有方向に注目する。計量gに関するLevi Civita接続を調べると、その方向の積分曲線が測地線であることがわかる。計量gに随伴するローレンツ計量hとする。(M, g)が局所共形平坦である場合には、計量hに関しても、前述の測地線はやはり測地線であることが確かめられる。このような考察をとおして上の結果を得た。後藤:擬対称空間を分解したとき,未知な部分を含む構成要素が登場するのが3次元である.そこで3次元擬対称空間を研究対象に選び、とくに局所共形平坦である場合に幾何学的構造を調べた結果をまとめたものが下の研究発表論文のリストに記したもので現在印刷中である。

この研究の高次元版を研究している.ローレンツ型計量も3次元で局所共形平坦な擬対称空間ならば,知られている結果を組み合わせると局所的構造が分かる.現在その大域的構造を研究中である.さらに,局所共形平坦とは限らない3次元擬対称空間上のローレンツ計量の局所的構造も分かるので,その大域的構造を研究している。西原:下の研究発表論文のリストに記した論文において、EをC上の核型空間とし、FをC上の連続なノルムを持つフレッシュ空間とするとき、EからFへの正則写像がEを部分空間として含む任意の局所凸空間へ正則拡大できるための必要十分条件を与えた。これはMeise-Vogt(1984年)の結果の改良になっている。現在、C上の連続なノルムを持つフレッシュ空間というFの条件を緩めることを研究している。また、有界集合上弱連続な正則関数を定義する位相の性質について調べ、それを$1_1$問題に応用することを研究している。菅原:Lorentz曲面上の測地線の方程式をRiemannの場合と対比して研究している。(1)Lorentz曲面で、測地線の方程式が可積分なものは局所的にはRiemannの場合と類似の表現を持つ。(2)Riemannの場合は、第一積分の特異点の個数によって分類され、それぞれの場合において形が完全に決定されている。しかし、Lorentzの場合は、第一積分が存在しないため、ただ一種類になっている。この一種類がRiemannの場合と同様な形であると予想されるが、その点は未解決である。西山:上の菅原の研究の中に含まれている未解決の部分を検討中である。また,研究発表論文は下のリストに記述した。なお、科研費補助金の多くを旅費として使い、情報交換・情報収集等に大変有効であった。n+1次元ユークリッド空間の楕円面はLiouville多様体であることが知られている。1978年に出版されたKlingenbergの著書等に、n=2である場合に、測地線の方程式とその第一積分の形が楕円座標系を使って具体的に述べられている。1991年、清原により、コンパクトなLiouville曲面が定義され分類された。その後、五十嵐-清原-菅原により、1993年に、非コンパクトなLiouville曲面が定義され分類された。今課題の研究において、Liouville構造や、ローレンツ型Liouville構造を含めた新しい概念generalized-Liouville構造を定義し、次の成果を得た:成果の一つとして、n+1次元数空間においては、ユークリッド計量に限らず、ミンコフスキー計量をはじめとする不定値計量に関しても、すべての2次曲面がgeneralized-Liouville構造を持つことを統一的に示すことができた。二つ目の成果は、n+1次元数空間の半空間に通常の双曲計量だけでなく、不定値型の双曲計量を付与した場合においても、2次超曲面をその部分に制限すると、第一基本形式に関してgeneralized-Liouville多様体の構造をもっていることを明らかにできたことである。三つ目の成果は、Lorentz-Liouville曲面においては、特異点が存在しないことを明らかにできたことである。
初期神経発生過程に生じる体細胞変異の頻度とパターンの解析

初期発生過程における体細胞変異パターン解析のための超深度エクソームデータを昨年度取得した。本年度はエクソームデータの解析および解析結果に基づく多検体解析の準備を進めていたが、新学術領域研究課題の新規採択に伴う規定により6月29日より中断した。今後、新たに採択された研究費との関係を見直し再開する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、精神疾患動物モデルを用い、初期神経発生過程で生じる体細胞変異について頻度やパターンをエクソーム解析から明らかにすることを目的とする。精神疾患動物モデルとして、poly(I:C)投与妊娠マウスを用い、仔の脳神経系を対象とした解析を行う。本年度は、次年度以降の多数例のサンプル解析時の最適なシークエンシング条件の設定を行うことを目的とした。妊娠マウスへのpoly(I:C)投与は、申請者らが既に確立した、レトロトランスポゾンLINE-1のコピー数が安定して増加する条件を用いて投与した。poly(I:C)投与妊娠マウスから得られた出産直後の仔マウスの前頭葉部位および心臓組織や尻尾組織などからゲノムDNAを抽出し、トランスポゾンLINE-1のコピー数定量を行い、最も顕著に前頭葉でのLINE-1コピー数増加を示した個体を選んだ。選んだ個体由来の前頭葉ゲノムDNAを超高深度エクソーム解析に供した。エクソーム解析は、アジレント社のマウス用エクソーム解析プラットフォーム(SureSelect Mouse All Exon Kit)を用い、SureSelect XT HS Target Enrichment Sysmtem(アジレント社)プロトコールに従い、分子バーコード付加条件下で次世代シークエンス用ライブラリーを調整した。調整したサンプルは、Illumina社のHiSeq2500を用いたシークエンスを行い、約18億リード、総計約183Gbのシークエンス情報を得た。現在、quality controlを行った後、マウスゲノムへのマッピングおよび変異検出を行っている。超高深度解析のためのシークエンスデータ取得に成功した。得られたシークエンスデータについて詳細な検討を行い、限られた個体数ではあるが顕著にゲノム変異が生じている個体について体細胞変異のランドスケープを明らかにし、以後の多数例解析のための実験条件の設定を行っていく。
脳神経回路網形成と機能制御の分子基盤

脳神経回路網は発達期におけるシナプスの形成と再編を経て構築される。シナプスはシナプスオーガナイザーと呼ばれる細胞接着分子同士の物理的会合が引き金となり構築されるが、物理的会合がなぜシナプス形成を誘導することになるのか、構築されたシナプスがどのように消失するのか、そのメカニズムには不明な点が多い。本研究では、シナプスオーガナイザーに働きかけてシナプス形成と再編を制御しうる分子に注目し、その働きを明らかにしシナプス形成、再編の分子基盤を解明することを目的とする。シナプスの制御機構の基礎的知見は、シナプス形成・機能異常の破綻に起因する神経発達障害の病態の解明や治療戦略の進展に寄与すると期待される。
感染増悪を導くマラリア免疫応答の分子的解析

われわれはマラリアにおいて原虫非特異的T細胞が影響を受けることを見出した。本現象のメカニズムとそれがもたらす影響を解析したところ、通常のT細胞の活性化とは全く異なる経路で影響を受けていることを見出した。また感染マウスの非特異的T細胞の機能変化はリステリア感染や接触性皮膚炎といったマラリアと無関係の免疫症状に影響を及ぼすことを明らかにした。免疫学的特異性は免疫応答における最も重要な性質の一つであり、この性質が守られなければ、外来抗原とは全く無関係な免疫応答をしてしまい、その結果自己免疫疾患などの原因となりうる。我々はマラリア感染において、この免疫学的特異性を無視した病原体非特異的な免疫応答を起こすことを見出した。一般にマラリアになっても免疫が出来にくく、このためワクチン開発をより困難なものにしているが、この「免疫が出来にくい」という性質と我々の見出した「病原体非特異的な免疫応答」とがどのように関連しているのかを追究した。まずPlamodium berghei NK65株(以下NK65)の弱毒株であるP. berghei XAT株(以下XAT)をC57BL/6野生型マウスに感染させると、NK65感染の場合と同様にT細胞の活性化マーカーCD62Lの変動が認められ、弱毒株の感染においても強毒株の場合と同様に病原体非特異的なT細胞の応答が認められた。またXAT感染マウスとNK65感染マウスとの各種サイトカイン生産に差があるかどうかをELISA法によって調べたところ、両者間において主要なサイトカインの生産に差は認められなかった。XAT感染において病原体非特異的免疫応答が認められるにもかかわらず、強い免疫記憶が生じることから、防御免疫応答や免疫記憶の生成は病原体非特異的免疫応答によってほとんど阻害されないことが考えられる。XATによる強い防御免疫応答とその後の免疫記憶は、XAT固有の感染様式もしくは物質によって生じる可能性が示唆された。我々はマラリア感染において、免疫学的特異性を無視した病原体非特異的な免疫応答を起こすことを見出した。免疫学的特異性という免疫学的基本性質が守られなければ、侵入病原体と全く無関係な免疫応答が起こり、自己免疫疾患などの原因となりうる。またマラリアに罹患しても免疫が出来にくく、このためワクチン開発をより困難なものにしている。この免疫が成立しにくい性質と病原体非特異的な免疫応答という性質がどのように関連しているのかを追究した。まず、ある抗原に対して既に成立した免疫記憶に対し、マラリア感染がどのようにこの免疫記憶に影響を及ぼすのかについて検討した。まずマウスに対し、感染後に強い免疫記憶が生じることで知られているリステリア菌を感染させ、その2ヶ月後に弱毒ネズミマラリア原虫Plasmodium berghei XAT株を感染させ、リステリアに対する免疫記憶がマラリア感染によってどのように変化するかを検討した。すると、マラリア感染マウスが生産するリステリア特異的T細胞から生産されるIFN-γがマラリア感染マウスにおいて著明に低く、またマラリア感染マウスは体内からのリステリア菌の排除能が極めて低下することが確認された。以上の結果から、マラリアで観察される非特異的免疫応答への影響は、マラリア原虫に対する免疫記憶の形成能がきわめて低いことだけでなく、他の病原体に対する免疫記憶の形成能もきわめて低下するという現象が認められた。もしこの特異性が厳密に守られなければ、病原体とは全く無関係な免疫応答が起こり、例えば自己免疫疾患などの原因となりうる。また免疫応答の中で本来の目的となる感染防御免疫が成立にくく、このためにマラリアで一般的に語られる防御免疫及び免疫記憶が生じにくい原因である可能性が示唆される。この防御免疫が成立しにくい性質と病原体非特異的な免疫応答という性質がどのように関連しているのかを追究した。まず、リステリア菌に対して既に防御免疫記憶が成立したマウスに対し、弱毒ネズミマラリア原虫、Plasmodium berghei XAT株を感染させ、リステリアに対する免疫記憶がマラリア感染によってどのように変化するかを検討した。すると、マラリア感染マウスが生産するリステリア特異的T細胞から生産されるIFN-γだけでなく、T細胞が生産するほとんどすべてめサイトカインがマラリア感染マウスにおいて著明に低く、またそれらのマウスは攻撃感染後のリステリア排除能が極めて低いことが確認された。以上の結果から、マラリアで観察される非特異的免疫応答への影響は、他の病原体に対する免疫記憶の形成能もきわめて低下するという現象が認められた。原虫側のどのような因子が本現象を引き起こしているのかについて、引き続き現在研究を行っているところである。
放射光真空紫外円二色性による蛋白質精密構造解析の新展開

放射光真空紫外円二色性法により,蛋白質の精密な溶液構造情報の獲得を可能にすると共に,この手法を生体膜と結合した蛋白質の精密構造解析に応用した。またアルツハイマー病などの原因蛋白質であるアミロイド線維の円二色性スペクトルを,最先端の計算科学を用いて帰属し,アミロイド線維の形成や毒性に重要な分子間構造を明確にした。円二色性研究の国内外の専門家14名を招聘し円二色性国際ワークショップ(広島,2014年3月4日)を開催し,円二色性法による蛋白質構造解析の有効性を広く発信した。放射光を利用した真空紫外円二色性(VUVCD)分光法により,蛋白質二次構造の含量・本数・配列解析(VUVCD-NN法)が可能である。本年度は,本手法の高度化に向けて,(1)蛋白質VUVCDスペクトルのデータベースの拡張,(2)芳香族残基励起子相互作用のVUVCD研究を行うと共に,本手法を用いて(3)アルコール変性蛋白質の構造解析を行った。(1)蛋白質VUVCDスペクトルのデータベースの拡張8種の構造既知β-rich蛋白質のVUVCDスペクトル測定を行った。既存のデータベースに組み込み,VUVCD解析による蛋白質二次構造の含量と本数予測の評価を行った。(2)芳香族残基励起子相互作用のVUVCD研究芳香族残基間に励起子相互作用を持つDihydrofolate reductaseの芳香族残基変異体のVUVCDスペクトル解析から,真空紫外領域で励起子相互作用に起因される新たな特性ピークの存在を明らかにした。VUVCD分光法は,蛋白質の種類に制限が無く,様々な実験条件に対応できるため,これまで未解明であった蛋白質の精密構造解析に有効となっている。上記の研究成果は,この解析法の高度化に寄与する点で意義がある。(3)アルコール変性蛋白質の構造解析変性蛋白質の構造特異性は,酵素である蛋白質の巻戻り・構造安定性・アミロイド線維形成のメカニズムを解明する上で重要である。トリフルオロエタノール及びメタノール存在下での6種の蛋白質VUVCDスペクトルをVUVCD-NN法で解析し,アルコール変性に対するジスルフィド(SS)結合の寄与を調査した。その結果,SS結合はアルコール変性で観測されるα-helix構造の形成(含量や長さの増加)を強く阻害することが分かった。しかし,SS結合に関係するシステイン残基の多くはα-helix上に位置したので,蛋白質全体のflexibilityの減少がα-helix構造形成を阻害したと考えられる。放射光真空紫外円二色性(VUVCD)を用いた蛋白質構造解析法の構築を進めた。以下に研究内容の概要を記す。1真空紫外円二色性と線二色性(LD)による膜結合蛋白質の二次構造の配向解析:Flow型LD(FLD)観測システムを利用することで、3種の膜結合蛋白質のFLD測定を実施した。膜と結合したへリックス構造に由来するFLDの詳細な解析により,膜表面に対するへリックス構造の配向を明確化した。また当該研究で高度化したアミノ酸配列レベルでのへリックス構造の位置解析と組み合わせ、どの部位がへリックス構造を形成し生体膜と相互作用しているかを明らかにした。2 VUVCD実験と理論を用いたアミロイド線維の分子間構造の解明:β2-microglobulinコアフラグメントの溶液中でのアミロイド線維のCDスペクトルを、近紫外から真空紫外領域まで放射光を用いて高精度で測定した。このスペクトルには、二次構造だけでなく三次構造(芳香族アミノ酸側鎖)の寄与が多く含まれることが分かった。フラグメントから形成可能なアミロイド線維のモデル構造を原子レベルで網羅的に構築し、分子動力学とCD理論からスペクトルを計算した結果、アミロイド線維のβシートが逆平行で積み重なったモデル構造を使用した場合で、実測スペクトルを再現できた。アミロイド線維内の分子間芳香族アミノ酸側鎖が、3種の配向パターンで存在することを明らかにした。3 VUVCDとバイオインフォマティクス技術を融合した天然蛋白質構造の解析:VUVCD分光から得られる蛋白質二次構造情報(含量・本数・配列)を、アミノ酸配列から蛋白質三次構造を予測できるMD法やHomology modeling法の制約条件として利用した。両手法から、制約条件に適合した構造を得ることに成功した。しかし、適用できる蛋白質分子が非常に小さいこと等のいくつかの課題を残した。放射光真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を用いることで、蛋白質二次構造の含量・本数・配列解析が可能である(VUVCD -NN法)。

本年度は、1Turn構造の解析に向けたVUVCD-NN法の高度化,2蛋白質CDスペクトルの算出に向けた芳香族残基間の励起子相互作用の研究、3蛋白質二次構造の配向解析に向けたFlow-LD(線二色性)観測システムの構築を行い、VUVCDによる蛋白質構造解析の高度化を進めた。2芳香族残基間の励起子相互作用の研究:ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)のTrp変異体のVUVCDスペクトルから,真空紫外(VUV)領域におけるCDへのTrp残基の寄与を解析した。その結果、DHFRではVUV領域のCDに、芳香環と主鎖との励起子相互作用が大きく影響していることが分かった。これらの結果は、蛋白質CDスペクトルの算出や二次構造解析法の高度化に向けた重要な情報となる。3Flow-LD観測システムの構築:VUVCD分散計を改良することで、CDとLDの同時測定を可能にした。また、送液ポンプとFlow光学セルを組み合わせたFlow-LD観測システムを構築した。標準試料となるDNAのFlow-LD測定及び球状蛋白質のCD・LD測定等からLD観測システムが正常に稼働していることを確認した。Flow-LDスペクトルからは二次構造の配向情報を得ることできるため、アミロイド線維や膜結合蛋白質の配向解析に有効となる。放射光真空紫外円二色性(VUVCD)を用いた蛋白質構造解析法の開発を進めた。以下に研究内容の概略を記す。1.時間分解VUVCD測定システムの構築:放射光を利用したVUVCD装置は,市販のCD装置よりも良好なS/Nでスペクトル測定ができるため,蛋白質の時間に依存した構造変化の追跡に有効である。そこで本年度は,マイクロ流路型の時間分解セルの開発を行った。2種類の溶液が測定ポイントで均一にMixingされていることを確認した後,VUVCD装置用のセルホルダーを作成し,放射光を用いた動作確認を行った。今後,このシステムを用いて,生体膜相互作用における蛋白質構造の時間変化について調査する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理化学26年度が最終年度であるため、記入しない。1.データベースの拡張が終了すると共に,励起子相互作用を持つ蛋白質のVUVCDスペクトル解析が進んでいるため。2.蛋白質二次構造の位置決定法の高度化が進行中であるため。3.VUVCD分光法を変性蛋白質の構造解析に応用でき,変性構造に対する新たな知見を得ることができたため。以上のことより,おおむね順調に進展していると判断した。(尚,本研究課題は平成23年度11月18日から開始した。)以下の利用により、当初の計画以上に進展していると評価した。1.生体膜と結合した蛋白質の精密構造解析:送液ポンプとFlow光学セルを組み合わせたFlow型LD観測システムはVUVCD装置に設置され、標準試料となるDNAを用いた性能評価は終了した。応用研究として、3種の膜結合蛋白質のへリックス構造の生体膜内での配向情報を明確化でき、論文作成中である。現在では、生体膜と結合したα1酸性糖蛋白質の構造解析への応用研究に着手している。2.アミロイド線維の精密構造解析:本研究は、VUVCD実験・MD法・CD理論を組み合わせることで、蛋白質の3次構造に近い情報を得ることが目的である。
感染・汚染劣化防止機能を有した抗菌性医療用人工皮膚の開発

本研究では、顔面、耳介等のエピテーゼや義指、義手、義足、人工乳房等のソマトプロテーゼに応用される人工皮膚材料として、超軟質ウレタン樹脂に着目した。また、長期間使用による汗・汚れ・材料劣化に起因する皮膚感染の予防目的で新規無機系抗菌剤「塩化セチルピリジニウム(CPC)担持モンモリロナイト」を応用し、物性、抗菌性、安全性及び耐劣化性について検証することで、「感染・汚染劣化防止機能を有した抗菌性医療用人工皮膚の開発」を目指した。ここで、抗菌成分であるCPCは、医薬品・化粧品などの分野で広く応用されており、その安全性は確認され、黄色ブドウ球菌、溶血レンサ球菌、真菌、う蝕・歯周病菌に対して効果を有するとされる。平成28年度は、超軟質ウレタン樹脂への新規無機系抗菌剤CPC担持モンモリロナイトの最適添加量を決定するため、添加量2、5、10、15重量%の試料を作製し、黄色ブドウ球菌及びカンジダ菌に対する抗菌性試験(JIS Z 2801)を行った。その結果、黄色ブドウ球菌においては、接種0日目では5重量%以上、1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。また、カンジダ菌においては、1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。よって、2及び5重量%添加試料についていずれかの添加量を決定するため検証を進めることとした。平成29年度は、2及び5重量%添加試料について、nonGLP細胞毒性試験(OECDガイドラインTG439/皮膚刺激性試験専用三次元培養ヒト皮膚モデル使用)により、いずれの添加量においても「非刺激性」と判定され安全性を確認した。平成30年度は、3年間の経年劣化後の物性としてシリコーン樹脂への粘着性について検証し、未添加試料の粘着性をコントロールとすると、2重量%添加試料で42%に、5重量%添加試料で77%に粘着性が低下することが明らかとなった。本研究では,顔面,耳介等のエピテーゼや義指,義手,義足,人工乳房等のソマトプロテーゼに応用される人工皮膚材料として,超軟質ウレタン樹脂に着目した。また,長期間使用による汗・汚れ・材料劣化に起因する皮膚感染の予防目的で新規無機系抗菌剤「塩化セチルピリジニウム(CPC)担持モンモリロナイト」を応用し,物性,抗菌性,安全性及び耐劣化性について検証することで,「感染・汚染劣化防止機能を有した抗菌性医療用人工皮膚の開発」を目指している。ここで,抗菌成分であるCPCは,医薬品・化粧品などの分野で広く応用されており,その安全性は確認され,黄色ブドウ球菌,溶血レンサ球菌,真菌,う蝕・歯周病菌に対して効果を有するとされる。平成28年度は,超軟質ウレタン樹脂への新規無機系抗菌剤CPC担持モンモリロナイトの最適添加量を決定するため,添加量2,5,10,15重量%の試料を作製し,黄色ブドウ球菌及びカンジダ菌に対する抗菌性試験(JIS Z 2801参照)を行った。その結果,黄色ブドウ球菌においては,接種0日目では5重量%以上,1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。また,カンジダ菌においては,1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。よって,2及び5重量%添加試料についてさらに検証し,物性に影響を与えず抗菌性を発現する最適添加量を決定することとした。平成29年度の目標は,CPC担持モンモリロナイトを最適量添加した試料について,nonGLP細胞毒性試験(OECDガイドラインTG439/皮膚刺激性試験専用三次元培養ヒト皮膚モデル使用)により安全性を,紫外線促進劣化試験により耐久性を検証し,試作抗菌性人工皮膚の仕様を決定する予定である。新規無機系抗菌剤の超軟質ウレタン樹脂への最適添加量を2又は5重量%に絞り込め,平成28年度の目標はほぼ達成できた。よって,2及び5重量%添加試料についていずれかの添加量を決定するため検証を進めることとした。

平成29年度は,2及び5重量%添加試料について,nonGLP細胞毒性試験(OECDガイドラインTG439/皮膚刺激性試験専用三次元培養ヒト皮膚モデル使用)により,いずれの添加量においても「非刺激性」と判定され安全性を確認した。現在、紫外線促進劣化試験により耐久性を検証中である。平成30年度の目標は,試作抗菌性人工皮膚の最終仕様を確定した後,物性を確認し,量産ベースの製品規格を決定する予定である。新規無機系抗菌剤を2又は5重量%添加した試作抗菌性人工皮膚について,nonGLP細胞毒性試験により安全性を確認し、また、紫外線促進劣化試験による耐劣化性については,現在,検証中であり、平成29年度の目標はほぼ達成できた。本研究では、顔面、耳介等のエピテーゼや義指、義手、義足、人工乳房等のソマトプロテーゼに応用される人工皮膚材料として、超軟質ウレタン樹脂に着目した。また、長期間使用による汗・汚れ・材料劣化に起因する皮膚感染の予防目的で新規無機系抗菌剤「塩化セチルピリジニウム(CPC)担持モンモリロナイト」を応用し、物性、抗菌性、安全性及び耐劣化性について検証することで、「感染・汚染劣化防止機能を有した抗菌性医療用人工皮膚の開発」を目指した。ここで、抗菌成分であるCPCは、医薬品・化粧品などの分野で広く応用されており、その安全性は確認され、黄色ブドウ球菌、溶血レンサ球菌、真菌、う蝕・歯周病菌に対して効果を有するとされる。平成28年度は、超軟質ウレタン樹脂への新規無機系抗菌剤CPC担持モンモリロナイトの最適添加量を決定するため、添加量2、5、10、15重量%の試料を作製し、黄色ブドウ球菌及びカンジダ菌に対する抗菌性試験(JIS Z 2801)を行った。その結果、黄色ブドウ球菌においては、接種0日目では5重量%以上、1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。また、カンジダ菌においては、1日目及び7日目では2重量%以上で菌は検出されなかった。よって、2及び5重量%添加試料についていずれかの添加量を決定するため検証を進めることとした。平成29年度は、2及び5重量%添加試料について、nonGLP細胞毒性試験(OECDガイドラインTG439/皮膚刺激性試験専用三次元培養ヒト皮膚モデル使用)により、いずれの添加量においても「非刺激性」と判定され安全性を確認した。平成30年度は、3年間の経年劣化後の物性としてシリコーン樹脂への粘着性について検証し、未添加試料の粘着性をコントロールとすると、2重量%添加試料で42%に、5重量%添加試料で77%に粘着性が低下することが明らかとなった。平成29年度は,新規無機系抗菌剤を2又は5重量%添加した試作抗菌性人工皮膚について,物性を確認した後,nonGLP細胞毒性試験による安全性及び紫外線促進劣化試験による耐劣化性を検証する予定である。本年度の成果である新規無機系抗菌剤を2又は5重量%添加した試作抗菌性人工皮膚について、次年度に外注試作を予定しており、その経費捻出のために節約したから。(理由)平成29年度に実施予定の紫外線促進劣化試験を現在行っており、本試験相当助成金を次年度使用額として残したため。(使用計画)平成30年度の目標は,試作抗菌性人工皮膚の最終仕様を確定した後,物性を確認し,量産ベースの製品規格を決定する予定である。次年度の試験に供する2種類の試作抗菌性人工皮膚は、量産ベースでの安定した製品化を目指すため外注試作する。これらの外注試作品について試験を実施する予定である。
液体への直接蒸着有機膜の性質の研究

液体表面でのパリレン成膜は分子の拡散現象に大きく影響を受けると考えられる。この分子の拡散現象を決定する重要なパラメータの一つに分子量が挙げられる。本研究では、液体の分子量が大きければ大きいほどPOLDパリレン膜の多孔質層が厚くなる傾向を確認した。このような多孔質層を持つPOLDパリレン膜は、液体をカプセル化するだけでなく、多孔質層がガス透過性を有するので、ガスセンサにも利用可能だと考えられる。また従来研究では、パリレンの表面は疎水性であると報告されている。しかし、前述のとおり液体上に蒸着したパリレンの性質には液体分子の拡散が影響する可能性があると考えられる。そこで、液体の種類を変えることで、パリレン表面の性質が変化すると考えた。液体によるパリレン膜の性質への影響を確認するために、水と混ざる液体と、そうでない液体にパリレンを蒸着し、形成したパリレン膜を洗浄、乾燥した後、そのパリレン膜表面に水滴を垂らし、接触角を計測した。グリセリンと親水性イオン性液体の表面でできたパリレン膜は親水性を有した。一方、油性液体の表面でできたパリレン膜は疎水性になる(接触角130度まで)という傾向を確認し、蒸着に使用する液体の種類によってパリレン膜の新・疎水性を制御可能であることを確認した。均一なマイクロ液滴アレイは多くのマイクロデバイス、例えば、ディスプレイ用液滴アレイやマイクロレンズアレイなどに適用可能である。しかし、現在、高機能な液体ディスペンサーでも、ナノリットルより小さい液滴を精度よく作ることが困難で、また、そのサイズの液滴をアレイ状に配置してデバイスにすることは、さらに困難である。この作業を効率よく行うために、電動ステージを用いた液体スタンピングシステムを試作した。このシステムを用い、平坦なウェハ上にスピンコートした液体を、親水性/疎水性パターン付きウェハに移すことで、均一な液滴アレイを形成することができた。平成23年11月に採用期間終了(短縮)届を提出し、グェンビンキェム外国人特別研究員が就職のために採用期間を平成23年4月8日平成25年4月7日(24か月間)から平成23年4月8日平成23年11月30日(8か月間)に短縮した。平成23年4月8日平成23年11月30日(8か月間)の採用期間の間、平成23年度の交付申請に記載した研究内容を計画通りに実行し、予想した成果を出した。
一次求心性神経由来因子によるかゆみの慢性化メカニズムの解明

一次求心性神経で産生された機能分子は軸索輸送により皮膚側と脊髄後角側の神経終末へ運ばれ各組織の恒常性維持に関わることが徐々に明らかにされている。アトピー性皮膚炎モデルマウスの一次求心性神経においては分子発現が大きく変動していることから,これらの機能分子が皮膚および脊髄後角において恒常性の破綻に寄与していることが想定される。そこで本研究では,慢性掻痒モデルマウスの一次求心性神経で発現増加するNPTX2に注目し,慢性掻痒病態メカニズム解明を目的に検討を行った。NPTX2の基礎的知見を得るためにNPTX2の時空間的特徴と発現細胞種の特定を試みた。リアルタイムPCR法により掻痒モデルマウスでのNPTX2のmRNA発現量を定量した結果,痒み行動の進行・維持期に有意な増加することが明らかとなった。さらに一次求心性神経の各神経サブポピュレーションマーカーとの多重免疫染色を行った結果,ペプチド性の神経であるCGRP陽性神経との共局在がみとめられた。以上の結果より,慢性掻痒モデルの進行・維持期においてNPTX2がペプチド性神経において発現上昇することが明らかとなった。次に,慢性掻痒時の皮膚炎および掻痒行動におけるNPTX2の役割について明らかにするために,NPTX2の遺伝子欠損マウスを用いた。NPTX2遺伝子欠損マウスではDCP誘発接触性皮膚炎でみられる痒み行動や皮膚炎が有意に抑制された。これによりNPTX2が慢性掻痒病態の形成に関与していることが示唆された。さらにアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いた一次求心性神経への選択的な遺伝子発現法の確立した。次年度はこれらの技術とNPTX2のドミナントネガティブ体やshRNA干渉法を組み合わせることで一次求心性神経での選択的機能制御を目指し,慢性掻痒時の一次求心性神経におけるNPTX2の役割について明らかにしていく予定である。当該年度の目標であった慢性掻痒時の一次求心性神経における遺伝子発現パターンについて詳細に解析し、時空間的特徴および発現細胞種について明らかにすることができた。また遺伝子欠損マウスにおいて痒み行動の減少という表現型が得られたことから、同因子の慢性掻痒における役割についても示唆することができた。また,次年度の目標を達成する上で重要な一次求心性神経への遺伝子発現技術についても確立できており,おおむね順調に進展していると考えられる。前年度の遺伝子発現技術を用いて,同因子を一次求心性神経選択的に機能制御することが方法を確立する。具体的には,同因子のドミナントネガティブ体とshRNA干渉法の二つが挙げられる。それぞれの遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルスベクターを作製し,一次求心性神経に発現導入後,慢性掻痒モデルの痒み行動および皮膚炎について検討を予定している。また,一次求心性神経での発現細胞種解析より,TrkA陽性神経での発現上昇が明らかとなった。このことから,同因子の発現上昇におけるNGF-TrkAシグナルの役割について検討を進める予定である。最終年度には,慢性掻痒時の同因子の作用メカニズムについて明らかすることを目標としている。既報の研究を踏まえて,同因子が脊髄後角における神経可塑性に関与していることが予想される。そこで,脊髄後角神経回路の中でも痒みの伝達を担うGRPR陽性神経細胞に焦点を当て,電気生理学的に同神経細胞からシナプス入力の記録を行う。これに際して,同神経細胞のの蛍光標識法の確立と電気生理学的特徴について検討を予定している。さらに,慢性掻痒時の同神経細胞の神経活動について検討し,慢性掻痒時の脊髄後角における神経可塑性の有無について検討する予定である。次年度はこれらの技術とNPTX

2のドミナントネガティブ体やshRNA干渉法を組み合わせることで一次求心性神経での選択的機能制御を目指し,慢性掻痒時の一次求心性神経におけるNPTX2の役割について明らかにしていく予定である。当該年度の目標であった慢性掻痒時の一次求心性神経における遺伝子発現パターンについて詳細に解析し、時空間的特徴および発現細胞種について明らかにすることができた。また遺伝子欠損マウスにおいて痒み行動の減少という表現型が得られたことから、同因子の慢性掻痒における役割についても示唆することができた。また,次年度の目標を達成する上で重要な一次求心性神経への遺伝子発現技術についても確立できており,おおむね順調に進展していると考えられる。前年度の遺伝子発現技術を用いて,同因子を一次求心性神経選択的に機能制御することが方法を確立する。具体的には,同因子のドミナントネガティブ体とshRNA干渉法の二つが挙げられる。それぞれの遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルスベクターを作製し,一次求心性神経に発現導入後,慢性掻痒モデルの痒み行動および皮膚炎について検討を予定している。また,一次求心性神経での発現細胞種解析より,TrkA陽性神経での発現上昇が明らかとなった。このことから,同因子の発現上昇におけるNGF-TrkAシグナルの役割について検討を進める予定である。最終年度には,慢性掻痒時の同因子の作用メカニズムについて明らかすることを目標としている。既報の研究を踏まえて,同因子が脊髄後角における神経可塑性に関与していることが予想される。そこで,脊髄後角神経回路の中でも痒みの伝達を担うGRPR陽性神経細胞に焦点を当て,電気生理学的に同神経細胞からシナプス入力の記録を行う。これに際して,同神経細胞のの蛍光標識法の確立と電気生理学的特徴について検討を予定している。さらに,慢性掻痒時の同神経細胞の神経活動について検討し,慢性掻痒時の脊髄後角における神経可塑性の有無について検討する予定である。
交差共鳴磁束バイアスによる超伝導量子ビット測定法の研究開発

量子コンピュータの最小構成要素である量子ビットを取り扱う上で、量子ビットの測定は大変重要である。特に、量子コンピュータのエラー訂正には速く正確な量子ビット測定が不可欠である。そこで、本研究では、超伝導量子ビットの一種である磁束量子ビットを測定するために、交差共鳴磁束バイアスを用いた測定法(交差共鳴法)の開発に取り組む。交差共鳴法は、従来法である分散シフト法より信号の分離が速く、高速かつ低誤り率な量子ビット測定が期待できる。交差共鳴法による磁束量子ビットの測定回路を設計・作製し、測定時間、誤り率等の性能を分析することで、高性能な量子ビット測定法を実現する。
生分解性ポリエステルと多糖から成る医用高分子傾斜機能複合材料の創成

本研究の目的は、生分解性、生体適合性を持つ脂肪族ポリエステルと多糖材料など全く異質の2種の高分子材料を材料の表面から内側に向けて組成に傾斜をつけて複合化し、これにより材料の生分解性、生物活性などの機能に傾斜を持たせた高機能性医用高分子複合材料を創成することである。異質の高分子材料を組成傾斜をつけて複合化する方法を開発することも本研究の目的である。本年度は次の二つの複合系について組成傾斜複合フィルムの作製を検討した。(1)微生物由来のポリ(3-ヒドロキシ酪酸)と多糖キチン及びキトサン(2)化学合成ポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)と多糖キチン及びキトサンフィルム中に組成傾斜を発生させるために、片方の成分高分子のフィルムの表面に、もう一方の成分高分子の溶液を注ぎ、拡散、含浸させると同時に溶媒を制御条件で除去した。組合わせ(1)について作製した複合フィルムからミクロトーム(平成11年度に本科研費補助金にて購入)により切り出した超薄切片を光学顕微鏡と顕微FTIRにより観察した結果、共通溶媒ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)を使用して作製したフィルムの厚み方向に組成傾斜が形成されていることを証明することができた。組合わせ(2)については、先ずHFIPを溶媒として普通のブレンドを作成し、熱分析を行った結果、PCLと多糖キチン及びキトサンは部分相溶であり、組成傾斜複合フィルムの作製に適した組合わせであることを確認した組合わせ(1)の場合と同様にして、組合わせ(2)についても多糖フィルムにPCL溶液をキャストして複合フィルムを作製した結果、厚み方向に組成傾斜を持つフィルムが得られた。(1)微生物由来のポリ(3-ヒドロキシン酪酸)と化学合成ポリ(ビニルアルコール)(2)微生物由来のポリ(3-ヒドロキシン酪酸)と多糖材料フィルム中に組成傾斜を発生させるために、(a)2成分高分子材料を共通溶媒に溶解、混合後、フィルムをキャストする;(b)各成分高分子のフィルムを別々に作製し、重ね合わせて熔融、圧縮する;(c)片方の成分高分子のフィルムの表面に、もう一方の成分高分子の溶液を注ぎ、拡散、含浸させると同時に溶媒を制御条件で除去する、という3方法を検討した。組合わせ(1)について作製した複合フィルムからミクロトーム(本科研費補助金にて購入)により切り出した超薄切片を光学顕微鏡と顕微FTIRにより観察した結果、方法(c)により共通溶媒を使用して作製したフィルムの厚み方向に組成傾斜が形成されていることを証明することができた。組合わせ(1)について、ポリ(ビニルアルコール)の立体規則性と分子量が組成傾斜に及ぼす効果、組成傾斜複合フィルムの物性と分解性を引き続き研究中である。組み合わせ(2)については使用する多糖材料と共通溶媒を検討している。
STM法を用いた髄膜炎菌の新規病原性因子の網羅的探索

Signature tag mutagenesis(STM)法を用いて約5000個の独立したトランスポゾン挿入変異株のライブラリーを構築し、ヒト脳内皮血管細胞への接着もしくは侵入能が低下した変異株のスクリーニングを行なった。その結果、最終的に31個の宿主細胞への接着もしくは侵入が低下した変異株を同定することが出来た。敗血症や髄膜炎症状を引き起こす髄膜炎菌は従来までの解析によりいくつかなお接着因子が同定されているがその病原性の分子機構は依然不明な点が多い。そこで、トランスポゾンに40merの識別配列を導入して個々のトランスポゾン変異株が識別できるようにしたsignature tag mutagenesis (STM)を高病原性株ST-2032株に導入してそのトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを作成し、ヒト脳血管内皮細胞(HBMEC、への感染性(細胞侵入性)が低下する変異体を単離するネガティブスクリーニングを行なうことにより、髄膜炎菌のゲノム上に散在している病原因子を網羅的に探索することにした。このスクリーニングにより髄膜炎菌の感染(殊に細胞侵入)機構をより詳細に解明して将来的には髄膜炎菌の治療における作用点を探り出せる可能性を秘めると考えられる。本年度においては当初の予定通りに40merのDNAタグを導入したTn10変異体を構築し、髄膜炎菌ST-2032株の精製染色体DNAに対してin vitroでトランスポゾンによる変異導入(以下STM)を行なった後そのSTMを施した染色体DNAを髄膜炎のnatural cometenceを利用して色体上に組み込み、Spc^R ST-2032株として得られるトランスポゾン挿入変異体を約5000株単離し、96ウェルプレニトの1ウェルに植菌、培養、凍結保存してSTM変異株のライブラリーを作製した。さらにはヒト脳血管内反細胞(HBMEC)への威染の至適条件を検討する目的でST-2046株(非病原性髄膜炎菌株)をネガティブ、ST2032株をポジティブコントロールとしてその差が最も顕著に現れるin vitroでの感染条件(時間、感染濃度{宿主細胞に対する細菌の数}等)を検討する。そこで、トランスポゾンに40merの識別配列を導入して個々のトランスポゾン変異株が識別できるようにしたsignature tag mutagenesis(STM)を高病原性株ST-2032株に導入してそのトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを作成し、ヒト脳血管内皮細胞(HBMEC)への感染性(細胞侵入性)が低下する変異体を単離するネガティブスクリーニングを行なうことにより、髄膜炎菌のゲノム上に散在している病原因子を網羅的に探索することにした。本年度においては当初の予定通りにin vitroでの感染条件を検討し、4時間でMoi=500の感染濃度(宿主細胞に対する細菌の数)で十分であることが明らかとなった。さらに96ウェル上の作製した変異体ライブラリー50枚(96×50=4800株)のスクリーニング用のライブラリーも作製した。それらを用いて上記条件でHBMECへの感染能力が低下した変異体の一次スクリーニングを行なった。その結果、約4800の変異体の中から136の一次有望株が単離出来た。来年度からはさらに定量的な感染実験を行なうことによって、有望株の絞り込みと、その株の破壊遺伝子の同定を行なって行く予定である。STMにより第二次候補変異株をマススクリーニングにより選択した後にその候補株の個別の感染能を定性的に実施することにより第二次候補変異株をさらに絞り込み、第三次候補変異株約150株を得た。それらの候補株すべてにおいて染色体DNAを精製後、制限酵素ClaIで切断してその断片と結合する合成DNAアダプタとin vitroでligationした後、そのligated DNAを鋳型としてDNAアダプタ及びspc^r遺伝子の内側を認識するプライマーを用いてPCRし、その後シークエンスするvectrette PCR法により挿入変異株のトランスポゾン挿入破壊遺伝子を同定した。それらの破壊遺伝子の種類を大別後、さらに詳細に二段階の感染実験を繰り返し、最終的に31個の宿主細胞への接着もしくは侵入が低下した第5次候補変異株を同定することが出来た。それらの変異株の中には線毛やLOSの合成や修飾に関与する遺伝子、また栄養源の合成に関わる遺伝子の他、機能が全く未知の遺伝子が破壊された候補株も9株含まれ、それらが髄膜炎菌の新規病原性因子である可能性が示唆された。特にNMB1964及びNMB1965とゲノムシークエンスから命名された遺伝子が破壊された株が4株得られており、それらの挿入変異株は細胞接着能は低下していないが細胞侵入能は野生株の約1%までに低下しており、この二つの遺伝子群が髄膜炎菌の細胞侵入に深く関与する可能性を見出すことが出来た。

これらの結果から髄膜炎菌の感染(殊に細胞侵入)機構をさらに解明する糸口が見出せ、髄膜炎菌の感染様式にを明確にすることにってワクチン候補や髄膜炎菌性感染症の治療薬の作用点を明らかにすることが期待される。
CFDによる海流発電用回転装置の動特性の解析と形状の最適化

東日本大震災を契機に自然エネルギーの活用が重要になりつつあるが,代表的なエネルギー源である風力や太陽光は天候に左右される.そこで本研究では安定的なエネルギー源であり,かつ日本において潜在力が大きい海流や潮流を利用した海流・潮流発電に着目した.そして,数値シミュレーションを用い発電用回転装置の最適形状を決定する.具体的には,1流れの方向に左右されない垂直軸型回転装置と2水平軸型回転装置の中で海流・潮流発電に適している新型装置について,(1)海流・潮流に特徴的な流速パターン,(2)回転装置の複数配置という条件のもとで解析を行い,定量的データを得る.本研究の成果は海流発電の実用化に大きく寄与できる.東日本大震災を契機に自然エネルギーの活用が重要になりつつあるが,代表的なエネルギー源である風力や太陽光は天候に左右される.そこで本研究では安定的なエネルギー源であり,かつ日本において潜在力が大きい海流や潮流を利用した海流・潮流発電に着目した.そして,数値シミュレーションを用い発電用回転装置の最適形状を決定する.具体的には,1流れの方向に左右されない垂直軸型回転装置と2水平軸型回転装置の中で海流・潮流発電に適している新型装置について,(1)海流・潮流に特徴的な流速パターン,(2)回転装置の複数配置という条件のもとで解析を行い,定量的データを得る.本研究の成果は海流発電の実用化に大きく寄与できる.