hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗体遺伝子クラススイッチ組み換え及び体細胞突然変異におけるに於けるAIDの役割

B細胞は、抗原とであった後、ヘルパーT細胞依存的に胚中心を形成する。胚中心において、B細胞はその抗体遺伝子をDNAレベルで改編する。第一は、体細胞突然変異(SHM)である。これは主に点変異を抗体可変領域遺伝子に高頻度で蓄積されるもので、その中から抗原親和性の高い変異クローンが選択されることが、抗体の親和性成熟の分子基盤である。第二は、抗体定常部領域遺伝子(C)のクラススイッチ組み替え(CSR)で、C-mu遺伝子の5'側にあるスイッチ領域(S-mu)と、delta以外の定常領域遺伝子の5'側に各々存在するスイッチ領域(S)間で組み替えが起りその間のDNAを欠失させる事で下流の定常領域遺伝子が可変領域遺伝子のすぐ下流に位置する様になる。その結果B細胞はIgM/D以外のアイソタイプの抗体産生能を獲得する。近年、SHM,CSR両方に必須の蛋白質AID(activation induced deaminase)が同定され、さらに、AIDの欠損したB細胞ではCSR、SHM誘導に伴うDNA切断が起こらなくなっていることが示唆された。この発見によりDNA切断にいたるまでのステップにAIDが必須である事が強く示唆されるが、その分子機構、並びになぜSHMおよびCSRは、別々に制御されうるのか、という新たな疑問が提示されていた。我々は、AID蛋白質の機能ドメインとその活性との関係を明らかにするする目的で、AID遺伝子に変異を持つヒトの免疫不全病"高IgM症候群タイプ2"患者及び人工的に得られた合計16種のAID変異体のCSR、SHM活性をin vitroの培養系で検討し、C末端側の17アミノ酸残基の部分がCSRには必要だがSHMには重要ではないことを明らかにした。また、大腸菌を用いたDNAに対する変異誘導能を指標に変異AIDのデアミナーゼ活性を検討した結果酵素活性が残存する物でもCSR,SHM活性が認められない例があり、そこからAIDがリンパ球での機能を発揮する為には、おそらくCSR,SHM特異的な補助因子が必要であると結論した。B細胞は、抗原とであった後、ヘルパー細胞依存的に胚中心を形成する。胚中心において、B細胞はその抗体遺伝をDNAレベルで改編する。近年、SHM, CSR両方に必須の蛋白質AID(activation induced deaminase)がその遺伝子のノックアウト及びヒトの遺伝子解析から同定された。この発見により少なくとも1つの重要なステップが共用されている事が強く示唆されるが、AIDの機能は今だ明らかでは無い。どの段階にAIDの機能が必要かを明らかにするため、まずCSR, SHM刺激を受けたAID欠損細胞でDNAの、単鎖、二重鎖切断が起きているかを検討し、AIDがDNA切断ステップに効くのか、その後の修復ステップに関与しているのかを明らかにするため、マウス正常細胞に、LPA/IL-4でCSRをinvitroで誘導し、その時に起るS領域のmicro-deletionを検出する為、ゲノムDNAwoPCRで増幅クローニングし、塩基配列を決定した。興味深いことに、CSR組み換えのおきていないアレルにおいてもSHM様の点変異が刺激依存性に蓄積することが明らかになった。この変異はAID欠損で完全になくなり、AID欠損B細胞にレトロウィルスでAIDの発現を戻してやることで、回復する。この点変異はパターンがSHMとCSR両方の特徴に合致することとと合わせ、AIDが両現象共通の初期段階おそらくはDNA切断ステップに重要であることが示唆された。

我々は、AID蛋白質の機能ドメインとその活性との関係を明らかにするする目的で、AID遺伝子に変異を持つヒトの免疫不全病"高IgM症候群タイプ2"患者及び人工的に得られた合計16種のAID変異体のCSR、SHM活性をin vitroの培養系で検討し、C末端側の17アミノ酸残基の部分がCSRには必要だがSHMには重要ではないことを明らかにした。また、大腸菌を用いたDNAに対する変異誘導能を指標に変異AIDのデアミナーゼ活性を検討した結果酵素活性が残存する物でもCSR,SHM活性が認められない例があり、そこからAIDがリンパ球での機能を発揮する為には、おそらくCSR,SHM特異的な補助因子が必要であると結論した。
新たなアクチン線維制御分子によるシナプスバイオロジーと自閉症の解明

我々が見出したFILIPは成体の脳において梨状皮質の神経細胞で発現し、アクチン線維の動態を制御し、樹状突起上のスパインの形態や機能を制御していることを示した。このFILIPの関連分子であるFRM1 (FILIP-related molecule 1)は大脳皮質や海馬の神経細胞で発現しており、海馬神経細胞におけるFRM1の機能解析が重要であると考えた。海馬培養神経細胞においてFRM1はスパインの形態や細胞膜上のNMDAレセプタ2Aの発現に関与することを見出した。また大脳皮質や海馬の神経細胞でFRM1を欠損したcKOマウスは行動解析のおいて不安様行動を示すことを見出した。自閉症の原因となる遺伝子はシナプス関連分子が多く、シナプスでの神経伝達の異常が原因と考えられるが、その発症メカニズムは未だ不明な点が多い。神経伝達においてシナプスの機能変化は重要で、後シナプスである樹状突起上の棘突起(スパイン)の変化はシナプスの可塑性等に深く関わる。我々は新たなアクチン線維関連分子LUZP1の解析から、LUZP1がスパインの形態や機能を制御することを見出した。最近、自閉症の患者において、LUZP1が大脳皮質の領野間で発現量に差がある遺伝子群の上位に位置することが報告された。以上の事から、自閉症におけるLUZP1の発現変化はスパインの機能に影響し、大脳皮質の領域間における神経連絡の異常を生じさせると考えられ、LUZP1の機能解析は自閉症の発症/病態メカニズムの新たな解明に繋がると期待される。初年度は、自閉症モデルマウスにおけるLUZP1遺伝子の発現部位の解析をLUZP1-lacZマウスを用いて行う予定であったが、予定よりも早くLUZP1-cKOマウスの作成が出来たので、予定を早めてLUZP1-cKOマウスを用いて行動解析実験や電気生理学的実験を行った。結果、LUZP1-cKOマウスとコントロールマウスと比較して、電気生理学的解析では差を見出すには至らなかったが、行動学的解析においては不安様行動を示すことを見出した。自閉症の原因となる遺伝子はシナプス関連分子が多く、シナプスでの神経伝達の異常が原因と考えられる。しかし、その発症メカニズムは未だ不明な点が多い。我々はスパインの形態や機能を制御するLUZP1が自閉症との関わりが示唆されていることから、マウス成体におけるLUZP1の機能解析を行った。1) LUZP1のKOマウスは胎生致死になるため、成体におけるLUZP1の機能解析は行われていなかった。我々が作成したLUZP1-cKOマウスと大脳皮質や海馬でCreタンパク質を発現するEmx1-Creマウスと交配し、大脳皮質や海馬で特異的にLUZP1を欠損させ、神経細胞の形態にどの様に影響を与えるのかを解析した。成体における神経細胞の形態を観察したが、培養海馬神経細胞で得られた結果と比較し、顕著な異常は見いだせなかった。この点に関しては、引き続き詳細な解析が必要であると考えられる。2) LUZP1-cKO/Emx1-Creマウスにおいて、形態的な変化は伴わないがLUZP1の欠損によりスパインの機能に異常が生じることが期待されたことから行動解析を行った。幾つかの行動解析を行い、オープンフィールド解析においてLUZP1 cKOマウスがコントールマウスと比較し、不安性様行動を取ることが示された。今回の結果より、LUZP1は神経細胞のシナプスの機能に影響を与え、自閉症の一つの表現形の原因となる可能性が示された。今後はシナプスにおいてLUZP1と相互作用する分子との関わりを明らかにしていく。LUZP1-cKOマウスの作成過程で得られたLUZP1-lacZマウスを用いて、X-gal染色により脳におけるLUZP1遺伝子の発現解析を行った。LUZP1遺伝子の発現は大脳皮質や海馬で発現していることを確認し、神経細胞のマーカーであるNeuN陽性の細胞がX-gal染色陽性であることを確認した。これまでLUZP1-KOマウスは作成されていたが胎生致死になり、成体におけるLUZP1の機能解析は行われていなかったのでLUZP1-cKOマウスの作成を行った。大脳皮質や海馬の神経細胞で組換え酵素Creタンパク質を発現するEmx1-CreマウスとLUZP1-cKOマウスを交配し、大脳皮質や海馬で特異的にLUZP

1を欠損させてLUZP1の機能解析を行った。まず大脳皮質や海馬の神経細胞においてLUZP1タンパク質が欠損していることを新たに作成したLUZP1抗体により確認を行った。また行動学実験によりLUZP1-cKOマウスが自閉症様行動を示すのかどうかを調べ、LUZP1-cKOマウスはオープンフィールドテストにおいて不安様行動を示した。これまでにLUZP1タンパク質はMyosin-2bと結合することや、海馬神経細胞においてLUZP1の発現を低下させると膜表面に発現するNMDAレセプタの量に影響を与えることを見出していた。しかしLUZP1の神経細胞における機能をしる上では不十分であった。生化学的にLUZP1の解析を行ったところ、LUZP1タンパク質がNMDAレセプタの機能に関与するタンパク質と結合することを見出し、神経細胞におけるLUZP1の機能を解明する緒を見出した。自閉症のモデルマウスであるNeuroligin3(R451C)マウスとLUZP1-lacZマウスを掛け合わせ、大脳皮質におけるLUZP1遺伝子の発現変化を解析し、自閉症とLUZP1遺伝子発現との関連性を明らかにする。LUZP1の発現抑制によりNMDAレセプタ2Aの細胞膜表面への発現量の増加について、LUZP1とMyosin-2bとの関連に着目してLUZP1の変異分子を用いて解析を行う。特に初年度において、LUZP1タンパク質がNMDAレセプタの機能に関与するタンパク質と結合することを見出したことから、このタンパク質を中心にして機能解析を進める。LUZP1-cKOマウスにおいて不安様行動が観察されたことから、この表現形が生じる理由について詳細に解析を行っていく。またLUZP1の欠損による大脳皮質の神経回路形成異常等も考えられることから、小動物用超高磁場MRIを用いて拡散テンソル画像解析等により明らかにしていく。申請通り研究を行ってきたが、LUZP1-cKOマウスを用いた外部との共同研究の為にマウスの輸送費(10万円/回)を想定していたが、予想よりもマウスの輸送回数が少なかった為に差額が生じた。順調に解析は進んでおり、それに伴い共同研究におけるマウスの国内輸送が増えるので、差額分はそれらに充てる予定である。
Angptl2 と骨粗鬆症や歯周炎の発症との関連性についての研究

Angptl2が骨代謝に及ぼす影響を検討するため、以下の実験計画を立案した。まず、1正常マウスの長管骨骨髄より単離・培養したBMMSCsのAngptl2及びそのレセプターの発現レベルを確認する。次に、2BMMSCsを用いた骨芽細胞誘導培養条件下及び脂肪細胞誘導培養条件下において、リコンビナントAngptl2の骨芽細胞の分化並びに脂肪細胞分化に及ぼす影響を検討する。過剰発現細胞を作製し、検証する。更に、3BMMSCsとマクロファージを用いた共培養系において、リコンビナントAngptl2が破骨細胞分化に及ぼす影響を検討する。また、4マクロファージを用いたM-CSF-RANKL刺激系において、リコンビナントAngptl2の破骨細胞分化に及ぼす影響を検討する。当初、上記の研究計画での実験の実施を試みたが、マウス長管骨骨髄から単離したBMMSCsの状態が極めて悪く、計画通りの実験を試みることが難しかった。そこで、マウス骨髄から細胞を単離する代わりに、マウス骨髄由来未分化間葉系幹細胞株ST2を用いた。新たな研究計画として1ST2の骨芽細胞分化誘導前、分化誘導後1日目、分化誘導後3日目の時点でAngptl2をノックダウンし、骨芽細胞分化マーカー及び脂肪細胞分化マーカーの発現に及ぼす影響を検討する。とした。結果、リアルタイムPCR法にて、ST2において骨芽細胞分化誘導後1日目で最も骨芽細胞分化マーカーの抑制、脂肪細胞分化マーカーの発現亢進が見られた。Angptl2が間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化を促進する役割を果たす可能性を示す重要なデータと考える。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。とした。
超音波エコーを活用した母乳育児支援のための妊娠・産褥期の乳房管理法の確立

日本の母乳育児率は約50%と低率であり、母乳育児のための乳房管理(ケア)の見直しが求められている。現在、母乳育児支援のための乳房管理は助産師が行っているが、その乳房の評価は症状や主観的評価によるもので正確性に欠ける。そこで、超音波検査(エコー)を用いて客観的で正確な乳房の評価方法を明らかにする。そのために、以下3つを明らかにするために研究を実施した。1)乳汁分泌の促進のための妊娠・産褥期の乳房管理におけるエコーの有用性の明らかにする。2)乳汁分泌不足や乳腺炎の程度とエコーの画像所見との関係を明らかにする。3)乳汁分泌不足や乳腺炎時の乳房ケアの効果を、エコーを用いて評価する。結果:非妊婦女性、妊娠各期の妊婦、産後の女性の乳腺および乳管の生理的変化をエコーで調査し、特に妊娠中期から乳腺の肥厚、乳管の拡張が見られ、妊娠経過にともない増大することが明らかになった。乳腺炎時では、局所的な乳管の拡張が明瞭にみられ、乳腺ではエコー画像の減衰が示され、乳腺炎によって乳腺が硬くなっていることがエコー画像でも明らかとなった。乳腺炎ケア後では、乳管拡張は縮小した。一方で、乳腺の肥厚の減少は軽度であった。しかし、画像上で減衰が減少し、深層組織がやや明瞭となり、硬さが軽減したことが示された。乳腺炎ケア前後の乳房の硬さの変化は、助産師の触診と一致していた。しかし、乳腺炎による乳管の拡張について、1事例では、施設の異なる助産師の触診において、その硬結が乳管であるかは判別できず、エコーにて明らかとなった。触診では分からないことがエコーでは視覚的に明らかとなり、母乳育児支援には有用と考えられる。また、副次的な結果として、乳腺の変化を母親が視覚的にみることで、母乳育児への自信、乳腺炎後のケアの変化を視覚的に行え満足度が上がっているようであった。今後症例を増やして更なる検討が必要である。1.目的:超音波診断装置(エコー)を用いての妊婦・褥婦の母乳育児のための乳房の評価を行うことを目標に、以下を明らかにする。1乳汁分泌促進、母乳育児のための妊娠・産褥期の乳房管理におけるエコーの有用性、2乳汁分泌不足や乳腺炎の程度とエコー画像の関連、3乳汁分泌促進ケアの効果をエコーを用いて評価する。当該年度では測定方法の確定とフィールド調査を予定していた。2.方法:測定方法の確定のため文献検討、2名の超音波検査技師、3名の産婦人科医師、1名の放射線技師から妊婦・褥婦の乳房の測定についてアドバイスを受けた。1名の助産師より関西地域のフィールドについてアドバイスを受けた。3.成果:測定方法の確定に時間を要し、フィールド調査までは行っていない。文献検討では、エコーによる妊婦・褥婦の母乳育児のための乳房の評価方法は見当たらなかった。専門家からのアドバイスにより、エコーによる妊婦・褥婦の母乳育児のための乳房の評価の難しさ、いくつか課題が明らかにされた。乳房の全体的なボリュームや妊娠・産褥の時期による変化の個別性が大きく、すべての人・時期で同様に計測するのは難しいこと。仰臥位で測定することで乳房の形状が変わり、測定の信頼性が得難いこと。エコーの妥当性を見るためにMRIで基準関連妥当性を見るべき等々の課題が明らかにされた。そこで、測定方法には2通り考えられ、次年度ではこの結果をもとにプレテストから行っていく予定である。フィールドについては、関西地域で10病院の選定がされ、今後特性に合わせて厳選しフィールド交渉を行う。また、状況によっては関東地域で行うことも考慮に入れている。母乳育児支援を目指した妊娠期、産後の乳房の超音波エコーを用いた計測方法は一般化されておらず、その方法を探索するのに時間を要した。また、研究代表者の異動のためフィールドが関東から関西になる可能性もあり、フィールドの再検討が必要であったため研究が計画よりも遅れている。1.目的:超音波診断装置を用いて、母乳育児のための妊婦・褥婦の乳房の評価を行うことを目標に以下を目的として調査を行う。1超音波診断装置を用いた母乳育児のための妊娠期・産褥期の乳房の評価方法を明らかにする。2乳汁分泌不足や乳腺炎の程度と超音波診断装置による画像の関連を明らかにする。3乳汁分泌促進ケアの効果を超音波診断装置を用いて評価する。当該年度では、倫理申請、フィールド調査、測定方法の確定を計画した。2.方法:大学倫理委員会での承認を得て、関東の分娩施設において助産師が、妊婦・褥婦を対象に超音波診断装置で乳腺等の測定を行った。調査施設において、助産師を対象に超音波の使用方法・測定方法を説明し、プレテストで測定手技の統一を図った。測定方法は静止画・動画で一定の方法を用いて行っている。3.成果:MRIでの妥当性の評価等を検討していたが、調査実施施設およびMRI測定可能な施設確保の関係で、実施可能性が低いため、先行研究および専門家の意見から測定妥当性と、専門家からの画像評価により測定方法と結果の妥当性を確保することとした。現在妊婦において、超音波診断装置による乳房のデーターを収集している。

また、質問紙の表面妥当性を確保するために、質問紙の内容について助産師および研究者の確認をおこない、対象者からの評価を受けて分かりやすい質問紙に修正を行っている。現在フィールド調査を継続的に実施しており、方法論等の修正、フィールド調査の手順の確認をしているところである。来年度はプレテストを参考に調査を継続すす。異動に伴い、倫理申請の手続き等の違いにより、申請及び承認に6か月以上の時間を要したため、計画よりも遅れている。一方で、関東のフィールドで調査の快諾が得られ、フィールド調査への移行はとてもスムースであった。日本の母乳育児率は約50%と低率であり、母乳育児のための乳房管理(ケア)の見直しが求められている。現在、母乳育児支援のための乳房管理は助産師が行っているが、その乳房の評価は症状や主観的評価によるもので正確性に欠ける。そこで、超音波検査(エコー)を用いて客観的で正確な乳房の評価方法を明らかにする。そのために、以下3つを明らかにするために研究を実施した。1)乳汁分泌の促進のための妊娠・産褥期の乳房管理におけるエコーの有用性の明らかにする。2)乳汁分泌不足や乳腺炎の程度とエコーの画像所見との関係を明らかにする。3)乳汁分泌不足や乳腺炎時の乳房ケアの効果を、エコーを用いて評価する。結果:非妊婦女性、妊娠各期の妊婦、産後の女性の乳腺および乳管の生理的変化をエコーで調査し、特に妊娠中期から乳腺の肥厚、乳管の拡張が見られ、妊娠経過にともない増大することが明らかになった。乳腺炎時では、局所的な乳管の拡張が明瞭にみられ、乳腺ではエコー画像の減衰が示され、乳腺炎によって乳腺が硬くなっていることがエコー画像でも明らかとなった。乳腺炎ケア後では、乳管拡張は縮小した。一方で、乳腺の肥厚の減少は軽度であった。しかし、画像上で減衰が減少し、深層組織がやや明瞭となり、硬さが軽減したことが示された。乳腺炎ケア前後の乳房の硬さの変化は、助産師の触診と一致していた。しかし、乳腺炎による乳管の拡張について、1事例では、施設の異なる助産師の触診において、その硬結が乳管であるかは判別できず、エコーにて明らかとなった。触診では分からないことがエコーでは視覚的に明らかとなり、母乳育児支援には有用と考えられる。また、副次的な結果として、乳腺の変化を母親が視覚的にみることで、母乳育児への自信、乳腺炎後のケアの変化を視覚的に行え満足度が上がっているようであった。今後症例を増やして更なる検討が必要である。測定方法の確定について、専門家からの意見、論文から明らかにされたため、倫理申請を行った後に、少人数の対象者に測定方法の妥当性を検討し、フィールド調査を行う。現在プレテストを行い、助産師のエコー技術の質と質問紙、測定方法の見直しを行っている。修正後に、本調査をスターとしデータの収集と解析を行い学会発表および論文として公表する予定である。平成28年度に測定機器である超音波診断装置(エコー)を購入、もしくはリースする予定であったが、次年度に行うこととしたため、次年度使用額が生じた。理由としては、1.研究代表者が関東から関西に異動したこと、それに伴うフィールドの再調整が生じた。2.正常妊婦、褥婦のエコーによる乳腺等の評価方法について、先行研究と専門家のアドバイスを受けたが、見解が一致しないため、方法を確定するのに時間を要した。【理由】倫理の承認に時間を要したためにフィールド調査の実施が遅れた。そのため、調査に必要な謝礼、質問紙印刷、フィールド調査の交通費などが次年度に必要となり、次年度の使用額が生じた。【使用計画】
分子スプリングの創製と機能

本研究では,らせん分子であるヘリセンジオールの構造と機能・物性の関連を明らかにするため,立体的に嵩高い置換基を有する新規なヘリセンの合成を行なった。すなわち,[7]チアヘテロヘリセンに2.4等量のブチルリチウムを作用させてジリチオ体を作り,これに3等量のベンゾフェノンを反応させることにより,ヘリセンジオールを72%の収率で合成することに成功した。このヘリセンジオールをエタノールとクロロホルムの混合溶媒で再結晶して淡黄色の結晶を得た。結晶のX線構造解析を低温(150K)で行なったところ,結晶の空間群はP2_1であり,エタノール1分子とクロロホルム1分子を取り込んでいることが明らかとなった。結晶中では,ヘリセンジオールの水酸基間の水素結合の距離は2.84オングストローム,ヘリセンジオールとエタノールの水酸基間の水素結合は2.69オングストロームあった。また,ヘリセンジオールをアセトンから再結晶したところ,ヘリセン、ジオール:アセトン=1:2とヘリセンジオール:アセトン=2:3の2種類の包接結晶を得ることができた。以上のように,らせん分子の構造を変化させることにより,自己集合や包接現象という新しい機能を発現することに初めて成功した。チオフェンよりラセミ体ならびに光学活性なヘリセンジオールを合成した。ラセミ体ヘリセンジオールをエタノールやクロロエタンから再結晶すると,これらの溶媒分子を結晶中に取り込み,クラスレートを形成することを見出した。また,右巻きヘリセンジオールは自己集合により四つ葉のクローバー型の超分子組織体を形成することを見い出した。次に,これらクラスレートや超分子結晶のX線結晶構造解析を行ったところ,いずれの結晶中においてもヘリゼンジオールは水素結合によるネットワークを形成しており,ヘリセンのらせんのピッチは周りの環境に応じて大きく変化していることが明かとなった。すなわち,ヘリセンの末端のチオフェン環の二面角は33.8°から54.5°と20.7°も変化しており,61%もピッチが伸びている。ヘリセン骨格の結合距離はほとんど同じであることから,これらの結果はヘリセン分子がバネの様に伸び縮みしていることを示している。申請者は最近,ヘリセン骨格が柔軟性を持つことを明らかにしたが,らせんのピッチの変化が共役系に及ぼす影響は全く知られていない。そこで,らせんのピッチをスペーサーで固定したヘリセンを4種類合成し,らせんのピッチがπ-電子共役系に及ぼす影響を検討した。4種類すべてのヘリセン分子の構造をX線結晶構造解析で明らかにすることができた。結晶中では,スペーサーの長さに応じて架橋ヘリセンの二面角が23゚から59゚まで変化していることを明らかにすることができた。架橋ヘリセンでは二面角が大きくなるにつれてCD強度やモル旋光度が大きくなることがわかった。23゚の二面角を持つヘリセンのUVスペクトルは,15nmほど長波長シフトしていることが明らかとなった。これはヘリセン骨格が平面性を帯びることによって,共役が伸びたためであると考えられる。さらに,非架橋ヘリセンは架橋ヘリセンに比べて旋光度が大きくなることも明らかになった。このようにスペーサーを変化させることによりらせんのピッチを制御することが可能となり,ヘリセン分子の旋光度を2.5倍も増加できることを見いだした。これはナノスケールの制御による光学特性のマニピューレーションとして興味が持たれる結果である。
膵ベータ細胞の増殖調節機構の研究

1.IRS-2発現・タンパク量調節の分子機序解明:マウス膵島や単離膵島を用いた実験より以下の事実を見出した。A.膵島IRS-2発現は主としてグルコース刺激によって正に制御されている。B.このグルコースによるIRS-2発現増加はグルコース代謝とカルシウム流入を必要とする。C.グルコースによるIRS-2発現増加は転写因子CREBの活性化を必要とする。D.グルコースによるCREBの活性化、IRS-2の上昇はPKAでなく、カルモジュリン依存キナーゼの役割が大きいことを見出した。2.膵島代償増殖におけるグルコース・IRS-2経路の重要性:肥満糖尿病マウス(ob/ob、db/db、KK-Ay,KK/Taマウス)の膵島において、膵島が代償性増殖を起こしている時にはCREBが活性化しておりかつIRS-2量が増殖しており、この経路が膵島の代償性増殖に果たしている役割が確認された。3.IRS-2の膵島代償性増殖における役割:既報(J Clin Invest. 2004;114:917-27. Diabetes. 2000;49:1880-9.)に加え、代償性膵島増殖障害を来たす膵臓特異的グルコキナーゼ欠損マウスの膵島にIRS-2を過剰発現させることにより、代償性増殖をある程度回復させえることを示した。4.DNAマイクロアレイによる探索:代償性増殖を起こしている膵島の網羅的遺伝子解析を行い、発現量が有意に変化している遺伝子群を300以上同定した。2型糖尿病患者ではインスリン分泌の障害に加え膵β細胞量が減少していることが報告されており、膵β細胞の分泌能や増殖を生理的に規定する因子とその作用機序の同定が新規治療法開発の上で重要である。インスリン受容体基質(IRS-2)の発現調節が膵β細胞の増殖を決定付ける重要な研究テーマと考え、病態モデルや、遺伝子改変動物、初代培養細胞、株化培養細胞を使っての総合的な検討を通じて、IRS-2のタンパク量調節の分子機構に迫ることを目標とした。A.IRS-2発現・タンパク量調節の分子機序解明1.インスリン抵抗性下の膵島IRS-2の発現・タンパク量調節(1)(2)インスリン抵抗性モデルマウス膵島のIRS-2タンパク量、mRNAレベル肥満糖尿病モデルマウス(db/db、ob/ob、KK/Taなど)でIRS-2 mRNA、タンパクが両者ともに膵島で上昇していることを見出した。(3)インスリン抵抗性モデルマウス膵島の発現遺伝子の網羅的解析2.単離膵島初代培養を用いたIRS-2発現・タンパク量調節の検討(1)(2)種々の刺激による膵島初代培養でIRS-2タンパクを増加グルコースなどの脱分極刺激がIRS-2mRNA、タンパクを増加させることを見出した。B.IRS-2タンパク増加が膵島増殖に果たす役割の解明1.インスリン抵抗性マウスにおける検討インスリン抵抗性マウス(db/db、ob/ob、KK/Taなど)膵島のIn Vivoに於ける増殖を検討した。インスリン抵抗性下で膵島が増殖していることが確認された。2.膵島初代培養による検討グルコースなどの脱分極刺激が膵島において細胞周期を進展させることが確認された。3.膵β細胞特異的IRS-1過剰発現マウスおよび膵β細胞特異的IRS-2過剰発現マウスの解析これらのマウスのコロニー維持と拡大が進められ、実験に必要な例数が整えられた。

D.グルコースによるCREBの活性化、IRS-2の上昇はPKAでなく、カルモジュリン依存キナーゼの役割が大きいことを見出した。2.膵島代償増殖におけるグルコース・IRS-2経路の重要性:肥満糖尿病マウス(ob/ob、db/db、KK-Ay,KK/Taマウス)の膵島において、膵島が代償性増殖を起こしている時にはCREBが活性化しておりかつIRS-2量が増殖しており、この経路が膵島の代償性増殖に果たしている役割が確認された。2000;49:1880-9.)に加え、代償性膵島増殖障害を来たす膵臓特異的グルコキナーゼ欠損マウスの膵島にIRS-2を過剰発現させることにより、代償性増殖をある程度回復させえることを示した。4.DNAマイクロアレイによる探索:代償性増殖を起こしている膵島の網羅的遺伝子解析を行い、発現量が有意に変化している遺伝子群を300以上同定した。
小児成長軟骨帯損傷における新規軟骨再生治療の確立

小児期の成長軟骨帯損傷は四肢長管骨の変形や短縮をもたらすため、損傷軟骨の再生治療の開発が期待されている。本研究ではウサギ同種肋軟骨移植を用いた損傷成長軟骨帯の再生実験を行った。部分成長軟骨帯損傷モデルを作成し移植実験を行い、画像評価及び組織学的評価を行った。画像評価では肋軟骨移植群では対照群に比較して有意に下肢変形の改善を認めた。組織学的評価において肋軟骨移植群では骨性架橋部位の減少を認め、移植部位に柱状の層構造を有しサフラニンO染色で濃染される軟骨基質を有した軟骨様細胞の再生を認めた。以上から成長軟骨帯損傷に対する肋軟骨移植が有効であることを証明することができた。小児の成長軟骨帯損傷に対しては従来は人工物や自己の脂肪などの組織移植が行われているが、損傷した成長軟骨の再生は認められず治療成績も不十分である。そのため本研究では動物を用いた成長軟骨帯損傷に対する新規成長軟骨帯再生方法の開発を目的としている。平成26年度においてウサギを用いた下肢成長軟骨帯損傷をモデルを確立した。成長期のウサギを用いて成長軟骨損傷を手術的に作成し、成長軟骨が安定して骨組織に置換され下肢変形を呈するモデルを確立した。さらに成長軟骨帯損傷後の変化を組織学的に検討し、骨組織置換のタイミングが詳細に判明した。それらから損傷後3週経過して成長軟骨が骨組織に置換されてから再度組織移植をする実際の臨床と類似するモデルを確立した。移植に適した組織の検討を行い第6,7,8肋骨から採取した肋軟骨を組織学的に検討た。肋軟骨には成長軟骨帯での静止層に存在する細胞と形態が類似し、大量に軟骨細胞が採取可能であった。以上から移植には第6,7,8,肋軟骨が適していると考えられた。膝蓋下脂肪体も組織学的に検討したが、間葉系幹細胞を含む組織であり再生実験への応用も可能であったが、肋軟骨の方がより大量に軟骨細胞の採取が可能であったため移植実験としては肋軟骨を移植することにした。以上より作成したウサギ成長軟骨帯損傷モデルに同家または同種の肋軟骨(第6,7,8肋骨より採取)移植を行い、比較群として移植なし、従来の治療として骨蝋を移植いた合計3群を作成し実験を行っている。小児成長軟骨帯損傷に対する新規治療方法として自家または同種肋軟骨を用いた新規成長軟骨帯再生方法の開発を目的としている。平成27年度としては平成26年度に確立したウサギを用いた下肢成長軟骨帯損傷モデルを用いている。片側脛骨の成長軟骨部分的に手術で掘削することで部分成長軟骨損傷モデルを確立した。そのモデルに対して同種の第6,7,8肋骨から採取した肋軟骨の移植を行った。移植後4週および8週での画像評価および組織検査を行った。実験群としては移植しない群、従来の治療としてのボーンワックスを移植する群と比較検討を行った。肋軟骨移植群では他群と比較して単純X線およびμCT検査で下肢変形の改善を認めた。4週,8週では移植しない群と比較して単純X線において統計学的に有意に変形改善を認めた。μCTでも移植部位での骨性架橋の減少を認めた。移植部位の組織検査では移植しない群では成長軟骨部分に骨性架橋形成、ボーンワックス群でも一部骨性架橋形成を認めた。肋軟骨移植群ではHE染色で成長軟骨帯様組織の再生及びサフラニンO染色で濃染される軟骨組織の再生を認めた。現在観察期間を延長して移植した組織の変形改善効果及び組織での損傷した成長軟骨の再生の観察を行っている。また移植組織としての肋軟骨の初代培養を試みて細胞としての性質解明を行っている。さらに培養、継代を行い肋軟骨組織の軟骨形成能及び軟骨分化誘導した際の軟骨形成能の評価を行なっている。申請時の計画をおおむね達成している。組織を移植実験を行っている。小児期の成長軟骨帯損傷は四肢長管骨の変形や短縮をもたらす。現在の実際の臨床で行われている自家脂肪移植術やボーンワックスに代表される人工物充填術では損傷した成長軟骨の再生は困難であり、下肢変形や短縮が残存することが多い。このことから損傷した成長軟骨帯の再生を目的とした治療の開発が期待されている。本研究では損傷した成長軟骨帯を再生する目的でウサギを用いた同種肋軟骨移植を行い、成長軟骨帯の再生が可能か検討した。成長期ウサギ脛骨近位の成長軟骨帯を外科的に部分損傷させ、手術後に損傷部成長軟骨帯が骨性架橋に置換され下腿変形を呈する部分成長軟骨帯損傷モデルを確立した。次にウサギ部分成長軟骨帯損傷モデルに対して移植実験を行った。方法として損傷部位に移植しない対照群、ボーンワックス移植群、採取した同種肋軟骨移植群の3群に分けて移植後4週及び8週で画像評価及び組織学的評価を行った。画像評価では肋軟骨移植群では対照群、ボーンワックス群に比較して有意に下肢変形の改善を認めた。組織学的評価において肋軟骨移植群では成長軟骨帯損傷後変形の原因となる骨性架橋部位の減少を他群に比較して有意に認めた。また移植部位に成長軟骨帯の特徴である柱状の層構造を有し、サフラニンO染色で濃染される軟骨基質を有した軟骨様細胞の再生を認めた。以上のことから従来の治療方法に比較して損傷した成長軟骨帯に対する肋軟骨移植の有効であることをウサギ動物実験モデルを用いて証明することができた。小児期の成長

軟骨帯損傷は四肢長管骨の変形や短縮をもたらすため、損傷軟骨の再生治療の開発が期待されている。本研究ではウサギ同種肋軟骨移植を用いた損傷成長軟骨帯の再生実験を行った。部分成長軟骨帯損傷モデルを作成し移植実験を行い、画像評価及び組織学的評価を行った。画像評価では肋軟骨移植群では対照群に比較して有意に下肢変形の改善を認めた。組織学的評価において肋軟骨移植群では骨性架橋部位の減少を認め、移植部位に柱状の層構造を有しサフラニンO染色で濃染される軟骨基質を有した軟骨様細胞の再生を認めた。以上から成長軟骨帯損傷に対する肋軟骨移植が有効であることを証明することができた。申請時の計画をおおむね達成している。実験モデルは確立し、移植材料の検討を行うことができた。平成28年度は計画通り移植実験を継続し結果を画像および病理組織にて詳細に検討する。得られた結果を国内外を含めて学術集会などで発信してく予定である。医歯薬学平成27年度以降は計画どおり確立したウサギ成長軟骨帯損傷モデルに対して肋軟骨移植を継続して行い、成績をX泉、μCT、病理組織などを用いて詳細に検討する。それにより従来の治療に代わる新規再生治療となりうるかを評価する。またその結果を国内外を含めて学術集会などで発信していく予定である。動物実験モデルを作成するために必要な実験数が予定より少なく結果を得られたため動物実験モデルを作成するために必要な実験動物数が予定より少なく十分な結果を得られたため。組織評価の項目を増加し検討する予定移植実験の組織の評価の項目を増やしさらに詳細に検討する予定である。
リピッドラフト制御による新たな免疫抑制剤の開発

T細胞活性化に重要なリピッドラフトについて細胞膜スフィンゴミエリンに着目して解析した.スフィンゴミエリン欠質T細胞では,有意にT細胞レセプター刺戟による細胞活性化およびそのシグナル伝達が低下していた.全身性エリテマトーデス患者ではT細胞上のリピッドラフト発現が有意に亢進しており,リピッドラフト制御による新たな免疫抑制剤が治療に有効である可能性が明らかになった.T細胞活性化に重要なリピッドラフトについて細胞膜スフィンゴミエリンに着目して解析した.スフィンゴミエリン欠質T細胞では,有意にT細胞レセプター刺戟による細胞活性化およびそのシグナル伝達が低下していた.全身性エリテマトーデス患者ではT細胞上のリピッドラフト発現が有意に亢進しており,リピッドラフト制御による新たな免疫抑制剤が治療に有効である可能性が明らかになった.1)スフィンゴミエリン欠失細胞株の樹立とその解析:SMS1-siRNAをJurkat T細胞に遺伝子導入し、スフィンゴミエリン(SM)欠質細胞株(SM-kd)およびコントロール細胞(SM+)を樹立した。FACS解析および共焦点顕微鏡で、SM-kd細胞では、細胞膜SM発現が欠質していることを確認した。また、SMに結合するライセニンに抵抗性を示した。2)T細胞機能における細胞膜SMの役割:SM-kdおよびSM+細胞をCD3抗体で架橋刺激を加え細胞増殖を検討したところ、SM-kd細胞で著明に低下していた。これは、CD3/TCRのクラスター形成が障害されているためであることを共焦点顕微鏡顕微鏡を用いて証明した。SM-kdおよびSM+細胞をCD3抗体で架橋刺激を加えたところ、SM-kd細胞ではLAT,ZAP70等のチロシン燐酸化が著明に低下しており、LATとZAP70の会合も減少していた。4)シグナル伝達物質のリピッドラフト内への移行:1)SMS1-siRNAをJurkat T細胞に遺伝子導入し、スフィンゴミエリン(SM)欠質細胞株(SM-kd)を樹立し、SM-kd細胞では細胞膜SM発現が欠質していることをFACSおよび共焦点顕微鏡で確認した。2)SM-kd細胞では、CD3架橋刺激による細胞増殖が著明に低下していた。これは、CD3/TCRの凝集形成が障害されているためであった。3)SM-kd細胞のCD3架橋刺激によるLAT,ZAP70のチロシン燐酸化は著明に低下しており、LATとZAP70の会合も減少していた。さらに、PKC-θのリン酸化も障害されていた。以上より、細胞膜スフィンゴミエリンはT細胞活性化のおいて、レセプター凝集およびその後の細胞内シグナル伝達に深く関わっている事が明らかになった。5)人の自己免疫疾患の代表である全身性エリテマトーデス患者末梢リンパ球上のリピッドラフト発現をCD4,CD45RO,ガングリオシドGM1の3重染色で検討した結果、SLE患者血では、疾患活動性に比例してリンパ球上のリピッドラフト発現が増加していた。この結果は、リピッドラフトが生体内でも細胞活性化に深く関わっていること、さらに、その異常発現が自己免疫疾患の病因病態に関与している可能性を示唆するものである。
軸糸タンパク質の特異的位置決定の分子メカニズム

本研究の目的は、真核生物の鞭毛・繊毛の微小管に結合するタンパク質がなぜ決まった位置にしか結合しないのか、その特異的位置決定の分子機構を解明することにある。真核生物の鞭毛・繊毛は生物種を越えてよく保存された9+2構造をもつ。9組の周辺微小管が2本の中心対微小管を取り囲んだ円筒状の構造をしている。各周辺微小管の上の決まった位置にモータータンパク質ダイニンの外腕と内腕が長さ方向に周期的に結合している。このダイニンが隣接する微小管に対してATP依存的に滑り運動を行うために鞭毛は波打ち運動を行う。この運動は、微生物や精子の運動だけでなく、人体における脳室、気管上皮、輸卵管上皮などにも存在し、ヒトの健康に重要な役割を果たしている。ダイニンが決まった位置に周期的に結合していることが運動形成において重要であると考えられるが、この位置決定メカニズムは不明である。我々は、鞭毛研究のモデル生物である緑藻クラミドモナスを用いて、外腕ダイニンの位置決定に関わるダイニン外腕ドッキング複合体と相互作用するタンパク質を探索することでその解明を目指した。微小管上でドッキング複合体サブユニットと結合する2つのタンパク質を化学架橋法と免疫沈降法によって同定した。これらのタンパク質の局在を調べたところ、微小管内部であった。近年、クライオ電顕技術の発展に伴って微小管内部微細構造が明らかになってきたが、2つのタンパク質はその実体であった。我々はこれらのタンパク質が微小管の内側から微小管上の構造の位置を決定している仮説を立てた。しかし、このタンパク質の欠損株はダイニンは野生株と同様に存在しており、残念ながら位置決定には関わらないことが明らかになった。一方で、興味深いことに、このタンパク質の欠損株の微小管は物理的刺激によって分解しやすいことが判明した。この新規タンパク質は微小管安定化に関わるという副産物的な知見を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、計画通り、(1)外腕ダイニン基部タンパク質の位置決定に関与するタンパク質の機能解析と、(2)ダイニン2重変異株の電子顕微鏡解析を並行して行った。(1)について、このタンパク質が位置決定に関与することを期待していたが、得られたミュータントの表現型解析から、当初予想していたダイニンの位置決定には関与していないが、意外なことに別のダイニンの活性調節に関与していることを示唆する結果が得られた。これらの結果を論文としてまとめる予定である。(2)について、当該2重変異株をクライオ電子線トモグラフィーによって構造解析したが、現在までのところ、ダイニン以外に欠失した構造は明らかになっていない。この2重変異株は鞭毛が2本のうち1方しか動かないことが特徴で、このことはダイニンの配列の2本の鞭毛での非対称性を示唆するものである。電顕解析のときには鞭毛を単離するため、平均化の際にデータが混ざり、本来あったかもしれないダイニン以外に欠失した構造を見落としている可能性がある。上記(1)について、予想外であったとはいえ、当該タンパク質の機能解析は順調に進んでいる。(2)については、想定される範囲の難しさではあったが、目標とする構造欠失を明らかにするには至っていない。あわせて、概ね順調に進んでいる、と言える。

今後は(1)の成果を論文化することと、(2)のために2本の鞭毛を区別して解析する方法の開発に入る予定である。さらに、片方の鞭毛が止まるダイニン2重欠失変異株の組み合わせが我々が明らかにしたものだけなのか、さらなる検証を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
生細胞内クロスリンク反応によるDDSを用いない二本鎖核酸導入法の開発

クロスリンク反応のためのチオール基を有する新規C-ヌクレオシドの合成に成功した。また、オリゴヌクレオチドへの導入も行った。また、チオールと反応可能な新規C-ヌクレオシドの合成も行った。これらの新規ヌクレオシドの反応性を検討したところ、遊離のチオールと速やかに反応可能であった。そこで、タンパク質中のチオール基と共有結合する核酸医薬品の開発へと展開した。合成した修飾オリゴヌクレオチドはがん細胞を用いたアッセイにおいても殺細胞活性を示すことが明らかとなった。本研究ではsiRNAの医療応用を目指し、DDSを必要としない一本鎖核酸を導入するだけで二本鎖siRNAを細胞内で発現する系の開発を行うことを目的としている。まず、平成25年度は新規ヌクレオシド誘導体の合成について検討を行った。これまでにアミノチオフェノール類の中で、4、5ージメトキシー2ーアミノチオフェノールが迅速な反応を示すことを明らかにしている。そこで、置換位置および置換数を変更したアミノチオフェノール誘導体の合成について検討した。pーメトキシアニリンを出発原料として、ニトロ化、ヨード化、還元を経た後にチオールカップリングに付すことにより保護チオール体を得た。本チオールカップリング条件はヌクレオシド誘導体にも応用可能であると考え、ヌクレオシド塩基部にアミノチオフェノール骨格を利用した誘導体の設計を行った。2ーニトロー4ーヨードアニリンを出発原料として、ヘック反応によりC-ヌクレオシドを合成した後、アミノ基をヨード基へと変換した。得られたヨード体を先の条件と同様にチオールカップリングに付したところ、速やかに反応は進行し、目的とするチオール保護体が得られた。つづいてニトロ基の還元を行い、生じたアミノ基をアセチル基で保護し、数工程を経て、目的とするDNA自動合成機に導入するためのホスホロアミダイト体を得た。DNA自動合成機を用いてオリゴデオキシヌクレオチドを合成したが、アミノ基の保護基であるアセチル基の脱保護ができなかった。現在、新たな保護基での合成について検討中である。本研究ではsiRNAの医療応用を目指し、DDSを必要としない一本鎖核酸を導入するだけで、二本鎖siRNAを細胞内で発現する系の確立を行っている。平成26年度は前年度に引き続き新規ヌクレオシド誘導体の合成検討と新たに設計したチオールと反応するヌクレオシドのオリゴヌクレオチドへの導入・性質の検討を行った。前年度までの検討ではヘック反応によりC-ヌクレオシドとした後に、アミノ基のヨード化を経由して目的とするホスホロアミダイト体の合成を行っていたが、本経路では収率が悪く、必要量の合成を行うには効率が悪かった。そこで、置換基をフッ素としておき、直接的にチオールを反応させる合成経路へと変更した。また、チオール基と選択的にクロスリンクする核酸塩基部として、新たに4-halopyridine誘導体を設計した。本誘導体の合成は4-halopyridineを出発原料としてヨード化、ヘック反応によるC-グリコシル化を行った後に各種保護基を導入し、ホスホロアミダイトユニットへと導く経路により合成を行った。まずはモノヌクレオシドを用いてチオールとの反応を検討した。その結果、多少反応時間はかかるものの、反応は単一の生成物を与えて進行することが明らかとなった。そこで、本ヌクレオシド誘導体をオリゴヌクレオチドへと導入した。オリゴヌクレオチドの合成は通常のDNA合成機の条件にて可能であった。HPLCによる単離精製を行った後に得られたオリゴヌクレオチドの二本鎖融解温度(Tm値)の測定を行った。その結果、Tm値は10度程度低下することが明らかとなった。これはhalo基として導入したクロロ基の大きいため、立体反発を生じ、いわゆるワトソン・クリックタイプの水素結合を形成できなくなったためであると考察した。一方、CDスペクトルの測定から、二本鎖全体の構造については天然型と比較して大きな違いはないものと考えられる。本研究ではsiRNAの医療応用を目指しDDSを必要としない一本鎖核酸を導入するだけで二本鎖siRNAを細胞内で発現する系の確立を行っている。前年度までに合成を完了した4-halopyridine誘導体に加えて、さらに電子求引性基であるシアノ基を導入した誘導体の合成を行った。合成した、4-chloro体、4-fluoro体、4-chloro-3-cyano体のモノヌクレオシドに対してβーメルカプトエタノールとの反応性を検討した。その結果、4-chloro体<4-fluoro体<4-chloro-3-cyano体の順で反応性が高いことを明らかにした。そこで、本ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドがタンパク質中に存在するシステイン残基と選択的に反応するのではないかと考え、4-halopyridineヌクレオシドを含む核酸医薬品の創製研究へと展開した。標的をエピジェネティックに関与するDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)とした。合成したオリゴヌクレオチドを5'-末端標識化し、DNMTとインキュベーションし、変性ゲル電気泳動にて解析した。その結果、DNMTと修飾DNAが共有結合性の結合をしていることを明らかにした。またその反応性はヌクレオシドの反応性とは異なり、4-fluoro体が最も高くなった。得られた複合体は熱的にも安定であり、強固な結合により、酵素(DNMT)の活性部位を塞ぐことに成功した。さらに、二本鎖DNAをHeLa細胞にトランスフェクションした結果、殺細胞活性を示すことが明らかとなった。

現在、siRNAへの応用を目指してチオール含有ヌクレオシドの大量合成とオリゴヌクレオチドの合成について検討している。クロスリンク反応のためのチオール基を有する新規C-ヌクレオシドの合成に成功した。また、オリゴヌクレオチドへの導入も行った。また、チオールと反応可能な新規C-ヌクレオシドの合成も行った。これらの新規ヌクレオシドの反応性を検討したところ、遊離のチオールと速やかに反応可能であった。そこで、タンパク質中のチオール基と共有結合する核酸医薬品の開発へと展開した。合成した修飾オリゴヌクレオチドはがん細胞を用いたアッセイにおいても殺細胞活性を示すことが明らかとなった。平成26年度は前年度に行ったヌクレオシド誘導体の合成経路を改善し、フッ素体を経由することでより効率よく合成することができる経路を確立した。また、別途新規ヌクレオシド誘導体として、4-halopyridine誘導体を設計し、その合成を達成した。さらにこのものをオリゴヌクレオチドへと導入し、その性質についても解析を行った。その結果、二本鎖の熱的安定性は低下するものの、全体の構造は維持されていることを明らかにした。現在はクロスリンク反応の検討中である。生物有機化学平成27年度は最終年度であるので、まずは先行している4-halopyridineを含むオリゴヌクレオチドについてクロスリンクの評価と細胞での評価を行う。また、合成法を変更したヌクレオシド誘導体についても順次オリゴヌクレオチドへの導入、性質の検討、クロスリンクの評価、細胞系での評価を行う予定である。平成25年度は新規ヌクレオシド誘導体の合成について主に検討した。その結果、ヌクレオシドへと導入した後にチオールカップリングにより、チオール保護体が導入可能であることが明らかとなった。このことから以前の研究では合成の出来なかった種々の誘導体の合成が可能になったと考えられる。また、オリゴヌクレオチドへの新規ヌクレオシド導入も可能であることを明らかとした。平成26年度に実施した物品費の支払いが反映されていないため。平成26年度はまず、保護基を変更した誘導体を早急に合成し、その評価を行う予定である。また、メトキシ基の置換位置による性質の変化についても、以前の評価系を用いて評価を行う。オリゴヌクレオチドの評価については、当初の予定通りにオリゴヌクレオチドの鎖長等についても検討する。熱的安定性については50%二本鎖融解温度(Tm)を測定して評価する予定である。平成26年度の残金分15256円については平成26年度に実施した新規ヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドの性質評価に使用する。平成25年度に実施した物品費の支払いが反映されていないため。平成25年度の残金分175161円については平成25年度に実施した新規ヌクレオシド誘導体の合成に使用する。
HCV排除後肝発癌におけるmiRNA 発現と遺伝子多型に関する研究

肝細胞癌との関係が報告されている4つの遺伝子多型(MICA, DEPDC5, HCP5, PNPLA3)を717例のC型慢性肝疾患例について解析した.唯一MICAminor型を非発癌C型肝疾患例に比較してC型肝癌症例に多数検出した(p = 0.0185)。またMICA遺伝子多型は血液中のsoluble MICAタンパク量と相関していた.さらにサブグループについてMICA遺伝子多型の頻度を調べた結果,70歳以上の高齢者や血小板数低値のグループにおいてより顕著に肝癌発症例でのminor多型を多く認めた.以上よりC型慢性肝疾患例おける肝発癌にMICA遺伝子多型が関与していることを明らかにした.肝細胞癌との関係が報告されている4つの遺伝子多型(MICA, DEPDC5, HCP5, PNPLA3)を717例のC型慢性肝疾患例について解析した.唯一MICAminor型を非発癌C型肝疾患例に比較してC型肝癌症例に多数検出した(p = 0.0185)。またMICA遺伝子多型は血液中のsoluble MICAタンパク量と相関していた.さらにサブグループについてMICA遺伝子多型の頻度を調べた結果,70歳以上の高齢者や血小板数低値のグループにおいてより顕著に肝癌発症例でのminor多型を多く認めた.以上よりC型慢性肝疾患例おける肝発癌にMICA遺伝子多型が関与していることを明らかにした.医歯薬学平成27年度,28年度研究実施計画1HCV治療実施症例にてSNPs解析を実施し肝発癌の有無を前向きに追跡する。2抗HCV治療前の肝生検サンプルにてmiRNA発現解析を実施。1年目の研究にて抽出されたmiRNA制御遺伝子の発現を解析する。3癌にはRNAスプライシングの異常の関与している。さらにウイルスの排除の有無によって発癌の様式が異なるか否かを明らかにするために次世代シークエンサーを使いエクソンアレイを解析する。4総評。出張費の使用予定があったが、出張が取り消しとなったため。出張費の使用の予定があったが、出張が取り消しとなったため。物品費に充てる予定である。物品購入に充てる予定である。