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超対称性と素粒子の統一理論

日.参加者数十名.外国人講師4名を招いて,超弦理論のトピックス(AdS_5/CFT_4対応,D_5/D_1系,DブレーンとK理論,位相的弦理論など)を議論した.また,平成12年2月21日一22日に東大本郷で11年度の総括研究集会を開いた.「Summer Instutute'99」の成果は活動報告集に収められている.研究会(2),(3),(4)はそれぞれ幾つかの計画班が中心となってオーガナイズされたものでいずれも盛会であった.研究連絡,連携は順調に行われている.これらの研究会の成果は近く特定領域研究の出版物として刊行される.特定領域研究「超対称と素粒子の統一理論」の総括班は昨年度に引き続き,領域研究の国内連絡,外国人研究者の招聘,研究成果の刊行等の活動を行った.特に次の4つの研究集会を企画,主催した.(1)「Summer Instutute 2000」,日経連人材開発センター富士研修所(山梨県富士吉田市),平成12年8月7日-8月21日.参加者のべ約100名.前半が超弦理論後半が現象論中心の滞在型研究集会.活発な議論が展開され成功を収めた.現在までにこの研究会に感謝する論文が18篇出版されている.(4)「弦理論と場の理論における非可換幾何」,京大基研,平成13年2月19日-21日.最近の弦理論で話題となっている非可換幾何をテーマとした研究会.数学者による講義も行う.「Summer Instutute 2000」の成果は活動報告集に収められている.研究会(2),(3),(4)はそれぞれ幾つかの計画班が中心となってオーガナイズされたものである.研究連絡,連携は順調に行われている.研究会(2)の成果はすでに特定領域会議録シリーズNo.6として刊行されている.研究会(3),(4)の成果も近く刊行される予定.特定領域研究「素粒子の統一理論と超対称性」の総括班は昨年度に引き統き、領域研究の国内連絡、外国人研究者の招聘、研究成果の刊行など活動を行なった。特に、次の5つの研究集会を企画、主催した。1."Workshop on Field Theory"2001年6月9日-6月11日、小樽市朝里クラッセホテル,参加者約50名、外国人研究者3名が講演した。場の理論の様々な話題、特に行列模型、リュービル理論などが討論された。講演者のトランスペレンシーがwebに公開されている。2.2001年サマー・インスティテュート(弦理論、M理論の現在と未来)、2001年8月6日-8月13日、日経連富士研修所、山梨県富士吉田市、国内参加者約50名は応募者のなかから選抜した。外国からは3名の参加者があった。超弦理論の最新の発展に関して活発な講演、討論が行われた。講演内容はサマー・インスティテュート報告書にまとめた。3."Strings, Branes and Unified Theories",2001年11月12日-11月16日、京都大学基礎物理学研究所、参加者約120名、外国人招待講演者8名。最近の超弦理論の発展、特にDブレーンの力学やタキオン凝縮、ブレーンワールド、高次元のゲージ理論などが議論された。会議録を出版した。4."D-branes and Mirror Symmetry"2002年2月5日-2月8日、京都大学数理解析研究所、参加者約120名、外国から3名の招待講演者があった。Dブレーンの力学やミラー対称性に関連した幾何学が議論された。会議録を出版する予定。5.特定研究総括研究集会、2002年2月19日-2月21日、東京大学山上会館、参加者約40名。当特定研究分担者ほぼ全員が出席し4年間の研究のまとめを行なった。平成10-13年度にわたって展開された特定領域研究「超対称性と素粒子の統一理論」の全体の研究成果をとりまとめた。
トリアリールメタン型構造を持つ高分子磁性体の構築

1.目的:本研究は、メタ位で連結したトリアリールメタン型ポリラジカルからItoh-Matagaモデルにしたがう高分子磁性体を構築することを最終目標としている。今年度は、(1)高フッ素化トリアリールメタン型樹脂から発生するラジカルの安定化、(2)フェロセンを含むトリアリールメタン型樹脂の構造解析と磁気測定について研究することにした。2.研究成果:2-1.高フッ素化トリアリールメタン型樹脂:これまで、3,5-ジフルオロフェノール/ペンタフルオロベンズアルデヒド系高フッ素トリアリールメタン型樹脂の脱水素処理によるポリラジカルの発生を検討した。今回、のポリラジカルについて磁気測定を行なったところ、低温下での測定においてもItoh-Mataga理論に従わずに常磁性的な挙動が観測された。この原因について、ポリラジカルの構造を詳細に調べたところ、脱水素処理前後においてジフルオロフェノール核の一部にキノイド構造の生成が認められ、これがラジカルサイトのスピンの整列を妨げていることが本実験で示唆された。そこで、キノイドが生成できないジフルオロアニソールを原料として樹脂を合成しポリラジカルの生成を行なうことにした。その結果、脱水素処理によってもキノイドの生成を伴うことなく安定なラジカルを発生させることができることが分かった。現在、この樹脂について、磁気測定やESRスぺクトルなどの測定を行ない磁気特性を解析しているところである。2-2.フェロセン系トリアリールメタン型樹脂:フェロセンカルボキシアルデヒドを連結剤として合成した樹脂の磁気特性にはフェリシニウムイオン核やラジカルの生成が関係していることがわかったが、ラジカルの発生気構が明確でなかった。そこで、本研究ではピレンやフェロセン核なの嵩高さが樹脂の連結部からのメチン水素の脱水素を熱的に容易にしているのではないかと仮定し、分子サイズの小さいジヒドロキシベンゼンを原料として樹脂を合成し磁気的性質を測定した。その結果ジヒドロキシベンゼン系はラジカル濃度が低く、磁気測定でも常磁性成分が少ないことが明らかになった。この実験により嵩高い芳香族を用いることによってラジカル濃度を高めることができるのではないかと思われる。本研究では、A01班の木下ら(東大物性研)や、本重点領域総括責任者の伊藤らおよびA01班の工位ら(阪市大理)との共同研究を通して行なわれた。
母体由来因子がロタウイルスワクチン免疫原性に与える影響の解明

ロタウイルスは小児急性胃腸炎の代表的な原因ウイルスであり、2種類のロタウイルス経口弱毒生ワクチンが開発された。出生後半年以内に接種するため、母乳中の分泌型IgAや経胎盤IgGなど母体由来の免疫学的要素がワクチンの効果を大きく左右するが、わが国においては母体要因に焦点を当てた研究は無い。本研究では、1日本人褥婦における母乳中抗ロタウイルス中和活性の測定2母乳・母体血清中抗ロタウイルスIgA、IgG抗体の定量的測定3児のロタウイルスワクチンへの免疫応答と12との相関の検討を目的とする。平成30年度は、29年度に引き続き東京大学医学部附属病院産婦人科外来の後期妊婦健診(妊娠32週以降)受診者を対象に研究参加のリクルート活動を行った。同意が得られた方からの検体(健診時の残血清、初乳、成乳)、その児の検体[東都文京病院小児科における単価ロタウイルスワクチン(ロタリックス)接種前後の血清と便]の回収を行った。また、発達医科学教室にて、母体血清中抗ロタウイルス抗体(IgA,IgG)測定(ELISA)実験に着手した。ロタリックスワクチン原液をMA104細胞(サル胎児腎細胞)に播種し、大量培養後、sucrose cushionを敷いて超遠心にて精製し、ELISAプレートをコートする抗原として用いた。標準血清の段階希釈によるstandard curveを作成し、標準血清の100倍希釈時のOptical density値を100としたarbitrary unitとして抗体価を定量化した。抗ロタウイルスIgG抗体では、36歳以上群の方が有意に抗体価が低かった。抗ロタウイルスIgA抗体は同様に年齢が高い群の方が平均値は低かったが、有意差は認められなかった。経産婦群の方が、初産婦群より抗ロタウイルスIgA抗体価の平均値は高かったが、有意差は認められなかった。今回の結果は、高年齢妊婦はロタウイルス好発年齢の児との接触機会が少ないために抗ロタウイルス抗体価が低くなる可能性を示唆すると考えられた。医学博士課程の学生をResearch assistantとして短期雇用してサンプリング活動の充実化を行い、研究参加者リクルートおよびサンプルの回収活動を当初の予定どおり、平成30年度内にすべて終了することができた。実験室的解析として、母体血清中抗ロタウイルス抗体測定実験に着手し、母体の年齢、および養育する児の数が血清中ロタウイルス抗体価(IgG)に影響を与える可能性を明らかにした。引き続き下記の実験室的解析を行う。1母乳中のロタウイルス中和活性の測定:ロタリックスと同じ遺伝子型G1P[8]のヒトロタウイルス標準株であるWa株と、段階希釈した母乳(初乳、成乳)を混和してMA104細胞上で培養し、細胞障害作用が見られなくなった希釈倍率をもって中和活性を評価する。母乳(初乳、成乳)中のロタウイルス結合蛋白の視覚化・半定量を目的に、抗Wa株ポリクローナル抗体を用いてWestern blottingを行う。2ロタリックス排泄期間中のウイルス定量:ロタリックス接種後、継時的に採取した便を対象として、ロタウイルスのNSP2とVP4遺伝子上に存在するロタリックス特異的遺伝子配列をターゲットとしたRealtime RT-PCR法(Gautam et al., 2014)を用いることにより、市中流行のwild typeのコンタミネーションを排除してロタリックス株のみの定量を行う。以下の3点に着目して全てのデータをまとめ、学会発表、論文作成を行う。1)母体由来免疫物質と児のロタウイルスワクチン免疫反応の相関、2)母体由来免疫物質と児のロタウイルスワクチン株クリアランスの相関、3)初乳、成乳中における抗ロタウイルス中和活性、抗ロタウイルスIgA、IgG抗体量の差異の比較。平成29年度開始直後より、研究代表者、分担研究者、研究協力者の間でサンプリングのプロトコール作成を開始し、7月には9名の研究者が参集して班会議を行った。この検討結果をもとに、産婦人科、小児科の研究協力者とさらに議論を重ね、9月に東京大学医学部倫理委員会に審査依頼を提出、個別審査等を経て10月に承認通知を得た。11月より東京大学医学部附属病院産婦人科外来の後期妊婦健診(妊娠32週以降)受診者を対象に研究参加のリクルート活動を開始した。同意が得られた方から健診時の残血清を回収した。また分娩5日目以内の初乳を回収、併せて調査キット説明と配布を行った。東都文京病院小児科にて、単価ロタウイルスワクチン(ロタリックス)接種1回目に母から成乳を、児よりワクチン接種前の便と血清検体を回収した。その後、自宅にて児より1回目接種1, 2, 3, 4週目の便を採取していただき、ワクチン2回目接種時に回収した。自宅にて児より2回目接種1, 2, 3, 4週目の便を採取していただき、ワクチン2回目接種4週後の定期ワクチン接種時に回収した。

また、ワクチン接種後としての血清検体を回収した。発達医科学教室実験室にて、母乳・血清・便中抗ロタウイルス抗体(IgA,IgG)測定系(ELISA)のパイロット試験を開始した。母子ペアのサンプリングにあたり、非常に複雑なスキームを構築する必要があったが、班会議や直接の面談、インターネットによるコミュニケーション等を通じて、関係各部署の担当者と詳細な検討を行った結果、スムーズな検体回収が可能となっている。これには、東京大学が独自に展開している育児・介護支援のための研究者サポート要員配置事業の助成も受けたことが功を奏したと考えている。平成30年の年明けより、電子カルテシステム仕様の大幅な変更があり、一時的に患者数の減少、それに伴う新規研究参加者数の減少がみられたが、おおむね当初の想定範囲内のリクルート活動が行えている。ロタウイルスは小児急性胃腸炎の代表的な原因ウイルスであり、2種類のロタウイルス経口弱毒生ワクチンが開発された。出生後半年以内に接種するため、母乳中の分泌型IgAや経胎盤IgGなど母体由来の免疫学的要素がワクチンの効果を大きく左右するが、わが国においては母体要因に焦点を当てた研究は無い。本研究では、1日本人褥婦における母乳中抗ロタウイルス中和活性の測定2母乳・母体血清中抗ロタウイルスIgA、IgG抗体の定量的測定3児のロタウイルスワクチンへの免疫応答と12との相関の検討を目的とする。平成30年度は、29年度に引き続き東京大学医学部附属病院産婦人科外来の後期妊婦健診(妊娠32週以降)受診者を対象に研究参加のリクルート活動を行った。同意が得られた方からの検体(健診時の残血清、初乳、成乳)、その児の検体[東都文京病院小児科における単価ロタウイルスワクチン(ロタリックス)接種前後の血清と便]の回収を行った。また、発達医科学教室にて、母体血清中抗ロタウイルス抗体(IgA,IgG)測定(ELISA)実験に着手した。ロタリックスワクチン原液をMA104細胞(サル胎児腎細胞)に播種し、大量培養後、sucrose cushionを敷いて超遠心にて精製し、ELISAプレートをコートする抗原として用いた。標準血清の段階希釈によるstandard curveを作成し、標準血清の100倍希釈時のOptical density値を100としたarbitrary unitとして抗体価を定量化した。抗ロタウイルスIgG抗体では、36歳以上群の方が有意に抗体価が低かった。抗ロタウイルスIgA抗体は同様に年齢が高い群の方が平均値は低かったが、有意差は認められなかった。経産婦群の方が、初産婦群より抗ロタウイルスIgA抗体価の平均値は高かったが、有意差は認められなかった。今回の結果は、高年齢妊婦はロタウイルス好発年齢の児との接触機会が少ないために抗ロタウイルス抗体価が低くなる可能性を示唆すると考えられた。医学博士課程の学生をResearch assistantとして短期雇用してサンプリング活動の充実化を行い、研究参加者リクルートおよびサンプルの回収活動を当初の予定どおり、平成30年度内にすべて終了することができた。実験室的解析として、母体血清中抗ロタウイルス抗体測定実験に着手し、母体の年齢、および養育する児の数が血清中ロタウイルス抗体価(IgG)に影響を与える可能性を明らかにした。
気相成長ナノ粒子直接照射による酸化物ナノコンポジット機能材の低温高速成膜法の開発

本研究では、ナノ粒子をビーム状に基板へ直接照射しながらマトリックス材の同時成膜を行う新しい成膜技術を独自のプラズマ生成法を利用して開発することを目的とし、酸化物ナノコンポジット機能材の低温高速成膜を目指している。3年間の研究計画の最終にあたる本年度は、マトリックス材の形成に用いるプラズマ源の特性解明による製膜プロセスの高品質化への指針確立と共に、気相でのナノ粒子改質特性の解明に重点を置いて、以下の研究を行った。まず、マトリックス材の形成に用いる内部アンテナ型誘導結合プラズマにおいて、高品質の製膜プロセスの実現に資することを念頭に、プラズマ生成の起源であるアンテナ周辺でのプラズマパラメータの分布について詳細に調べた。アンテナ周辺での放電は、アンテナのアスペクト比、すなわち誘導電界の分布に大いに依存し、さらに静電結合に伴うプラズマの電位揺動ならびにプラズマ電位を抑制する上で、アンテナの低インダクタンス化が有効であることを明らかにした。これらの知見を基に開発したプラズマ源では、対地に対するイオンエネルギーを510eVまで低減可能であることが明らかとなり、イオンダメージを抑制した高品質プロセスへの足がかりが得られた。さらに、昨年度に開発した誘導結合型プラズマノズルを用いたナノ粒子プロセス系による粒子製膜の重要なポイントとして、気相でのナノ粒子改質特性について調べた。昨年度に得られた結果をさらに詳細に検討し、希土類を含有する3元系酸化物ナノ粒子を用いた実験により、希ガスプラズマのみによる急速加熱を施した場合には相分離を生じるのに対し、反応性気体を微量含有する高密度プラズマを用いることにより、相構造の安定性を保った状態で低温相から高温相への相変換が可能となることを明らかにした。また、プラズマCVD法の併用によりナノ粒子膜へのマトリックス材の形成も容易に可能であることを示した。本研究では、気相成長させたナノ粒子を粒子ビームとして基板へ直接照射しながらマトリックス材の同時成膜を行う新しい成膜技術を独自のプラズマ生成法を利用して開発すると共に、微細構造に及ぼすナノ粒子ビーム照射効果を明らかにすることを目的とし、酸化物ナノコンポジット機能材の低温高速成膜を目指している。3年間の研究計画の初年度にあたる本年度は、主として、プラズマ源の構築に向けた要素技術の開発に重点を置いて、以下の研究を行った。まず、マトリックス材の形成に用いる低インダクタンスアンテナを複数個装着した内部アンテナ型誘導結合プラズマ源の特性について調べた。アンテナ周辺での電子加速特性について調べた結果、放電ガス圧が高圧力領域(概ね100mTorr以上)に向かうにしたがって、電子エネルギー分布関数が狭まり、放電自体もアンテナ周辺に局在する構造となることが、分布形状と共に明らかとなった。また、直径500mmの円筒状プラズマ源ならびに一辺が1000mmを超える角形プラズマ源におけるプラズマ生成について、アンテナ配置とプラズマの均一性についても調べ、壁でのプラズマ密度の減衰と高周波電力の吸収分布を考慮したアンテナ配置を考慮することが重要であることを示した。さらに、大面積プロセスを考慮するため、高周波電力給電部における定在波形成の影響を回避する方策についても検討を行った。上記のほか、構築したプラズマ源に付加するナノ粒子生成系と加速系に関連して、粒子サイズと加速エネルギーの関係について検討を行った。本研究では、ナノ粒子をビーム状に基板へ直接照射しながらマトリックス材の同時成膜を行う新しい成膜技術を独自のプラズマ生成法を利用して開発すると共に、微細構造に及ぼすナノ粒子ビーム照射効果を明らかにすることを目的とし、酸化物ナノコンポジット機能材の低温高速成膜を目指している。3年間の研究計画の2年目にあたる本年度は、プラズマ源の制御と粒子プロセス系の開発に重点を置いて、以下の研究を行った。まず、マトリックス材の形成に用いる内部アンテナ型誘導結合プラズマ源の制御性について調べた。プラズマの均一性を制御する上での基礎として、単一の低インダクタンスアンテナによる放電特性を調べ、プラズマ密度分布がアンテナからの距離に対し指数関数的に変化し、複数のアンテナの重ね合わせにより大面積プラズマ源での分布制御が可能であることを明らかにした。また、プラズマの生成効率について調べ、アンテナの形状と共にインピーダンス整合回路を含む高周波電力供給系の最適化が重要であることを明らかにした。さらに、上記のプラズマ源に付加するナノ粒子プロセスとして、誘導結合型プラズマノズルを用いたナノ粒子プロセス系を構築し、放電特性と共にナノ粒子の相構造に関する制御性について調べた。高密度プラズマを高効率で生成するため、誘導結合による放電モードの維持条件を調べ、放電気体圧力ならびに解離性気体混入割合が高い領域では、より高い高周波電力を供給することが不可欠であることが明らかになった。また、高密度の希ガスプラズマを用いた酸化物ナノ粒子における六方晶系(低温相)から立方晶系(高温相)へ相構造の改質では、プラズマへの酸素混入の重要性を示唆する結果が得られた。

アンテナ周辺での放電は、アンテナのアスペクト比、すなわち誘導電界の分布に大いに依存し、さらに静電結合に伴うプラズマの電位揺動ならびにプラズマ電位を抑制する上で、アンテナの低インダクタンス化が有効であることを明らかにした。これらの知見を基に開発したプラズマ源では、対地に対するイオンエネルギーを510eVまで低減可能であることが明らかとなり、イオンダメージを抑制した高品質プロセスへの足がかりが得られた。さらに、昨年度に開発した誘導結合型プラズマノズルを用いたナノ粒子プロセス系による粒子製膜の重要なポイントとして、気相でのナノ粒子改質特性について調べた。昨年度に得られた結果をさらに詳細に検討し、希土類を含有する3元系酸化物ナノ粒子を用いた実験により、希ガスプラズマのみによる急速加熱を施した場合には相分離を生じるのに対し、反応性気体を微量含有する高密度プラズマを用いることにより、相構造の安定性を保った状態で低温相から高温相への相変換が可能となることを明らかにした。また、プラズマCVD法の併用によりナノ粒子膜へのマトリックス材の形成も容易に可能であることを示した。
ALSにおけるポリグルタミン凝集体結合タンパク質DDX-17異常蓄積の病態解明

我々がポリグルタミン凝集体タンパク質(PAIP)として同定してきたFUS/TLS、EWS、TAF15、ubiquilin2、matrin3はALS/FTLDの責任遺伝子がコードするタンパク質であることが次々と判明している。未発表PAIPのうちDDX17はDEAD box RNA helicaseファミリーの一つで、RNA代謝においてリボソーマルRNA生成、スプライシング、転写といった重要なポイントに関与するとされている。一方ALSはその病因として近年、RNA代謝異常が注目されてきている。そこで我々はDDX17が孤発性ALSの病態に関連しているのではないかと仮説をたて、研究を行った。病理学的にALSと診断された13例のALS剖検例と6例のコンントロール剖検例を用いて、脊髄前角細胞におけるDDX17の分布を確認するため免疫組織学的評価を行った。コントロール症例では、細胞質はびまん性に淡く染色され、核に染色性はみられなかった。一方孤発性ALS症例では核に染色性はみられないが、細胞質はコントロールより強くびまん性に染色され、かつ微細な顆粒状の蓄積が複数観察された。この所見は孤発性ALS13例全例に認められた。細胞質への微細顆粒状蓄積が形態的に小胞体の局在と類似していたため、小胞体マーカーであるGRP78、PDIとの免疫蛍光染色を行ったところ、いずれとも共局在を確認できた。また孤発性ALSの代表的病理所見であるTDP-43陽性細胞質内封入体との共局在は認めなかった。以上の結果より、DDX17が孤発性ALSの小胞体に蓄積することでALSの病態に関与している可能性を示す重要な証拠を得ることができたと考えられる。DDX17はDEAD box RNA helicaseファミリーに属するRNA結合タンパク質であり、遺伝子発現の多くの段階で機能し、特にmiRNAの生合成や選択的スプライシングの制御などに関与している。ALSでは、TDP-43、FUS/TLS、matrin 3をはじめとするRNA結合タンパク質が病態形成に重要な役割を担い、運動ニューロンを中心に異常蓄積すること、さらにはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が家族性ALSの責任遺伝子であることが知られている。我々はこのDDX17も孤発性ALSの運動ニューロンに異常蓄積するという重要な知見を見いだしており、本研究ではDDX17のALSの病態への関与について、病理学的側面、分子細胞生物学的側面から検討を行い、ALSの新たな病態形成機序を明らかにすることを目標としている。抗DDX17抗体を用いた免疫組織化学的検討を孤発性ALS剖検例14例およびコントロール症例7例の腰髄のパラフィン包埋切片で行った。抗DDX17抗体では細胞質に顆粒状に分布する所見をALS症例全例で、コントロール症例では7例中3例のみで認めた。またALS/FTLDにおける既知の細胞質内封入体構成タンパク質であるTDP-43との細胞内局在の関連性について評価するため、二重染色を行ったところ、TDP-43との共局在は認められなかった。さらに細胞質内の顆粒状蓄積が、形態学的に小胞体に蓄積している可能性が推測され、小胞体マーカーとして知られるGRP78、PDIとの二重染色を行ったところ、共局在がみとめられた。以上より、DDX17がALSでは小胞体に蓄積している可能性が示唆された。ALS症例ではコントロール症例と比較して、DDX17が細胞質にびまん性に、顆粒状に分布していることを複数例で確認することができた。TDP-43との共局在はみられなかったが、小胞体マーカーとの二重染色で共局在を認め、小胞体に蓄積する可能性を示すことができた。以上より、研究については概ね順調に進展しているといえる。

以上の結果より、DDX17が孤発性ALSの小胞体に蓄積することでALSの病態に関与している可能性を示す重要な証拠を得ることができたと考えられる。DDX17の凝集体形成に与える影響を検討するため、Neuro2a細胞、SHSY-5Y細胞に、ALS病因タンパク質であるTDP-43、FUS/TLSの野生型および変異体を過剰発現し、DDX17の凝集を観察する。また、逆にDDX17発現ベクターまたはsiRNAを同時にトランスフェクションし、ALS病因タンパク質凝集体の凝集速度・細胞質移行を蛍光顕微鏡で観察、定量する。また不溶性細胞分画を抽出し、ウェスタンブロット解析を行うことで凝集体の定量を行う。これらの解析により、DDX17と孤発性ALSの既知の病因タンパクとの凝集の相互関係を明らかにする。DDX17はmiRNAの生合成に関与することが報告されており、一方で孤発性ALSの血清中においてもmiRNAの変化が確認されている。DDX17の蓄積に基づく機能障害が孤発性ALSでみられるmiRNA変化に寄与する可能性について、培養細胞を用い検討する。すなわち、DDX17の過剰発現・ノックダウン状態におけるmiRNAプロファイリングを行い、孤発性ALSで見られる変化と比較検証する。抗体購入費用で残額が生じた。次年度にDDX-17の凝集体生成に与える影響についてNeuro2a細胞、NSC細胞を用いて検討し、さらにmiRNAの変化についても検索を予定しているため、siRNAの購入費用、培養用血清等の購入に使用する計画である。
光の散乱解析に基づく画像の鮮明化

本研究で目指すのは,実環境中において光が散乱することにより視認性が低下してしまう現象に対し,散乱光のふるまいに基づいた画像の鮮明化を実現することである。最終年度となる本年度では散乱光のモデルに基づく画像の鮮明化とその応用について研究を行った。1.散乱光のモデルに基づく画像の鮮明化初年度において光学的に濃い媒体において観測される散乱光は入射光の方向に関わらず同じ強度であり,各位置において等方的に広がるという特徴が得られた。この事実から媒体境界面における光の散乱の効果が画像のぼけモデルで表せることが明らかとなった。そのため,既存の画像のぼけ除去を適用することで散乱光の影響を取り除いた鮮明化画像を得ることができる。2.画像の鮮明化の応用散乱光が生じるシーンに対する画像の鮮明化の応用として,半透明物体における照度差ステレオ法に着目し,散乱光による形状推定誤差の軽減を目指した。古典的な照度差ステレオ法は拡散反射を起こす物体に対してその面の向きを推定する手法として提案されたが,半透明物体においては散乱光による推定誤差が存在する。それに対して本手法を適用することで散乱光の影響を抑制し,散乱光による形状推定誤差を小さくすることを実現した。我々の身の回りには人肌や食物,大理石やプラスチックなど散乱光を生じる半透明物体が数多く存在しており,それらに対する形状推定の実現は物体の形状を扱う技術(製品の外観検査,コンピュータグラフィックスに用いる形状モデルの取得,ロボットの自動制御等)において非常に重要である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で目指すのは,実環境中において光が散乱することにより視認性が低下してしまう現象に対し,散乱光のふるまいに基づいて画像を鮮明化することである。初年度においては,散乱媒体における散乱光の計測・解析に焦点を当て,光学特性の異なる散乱物体を用いてそれぞれの境界面における散乱光の特性を考察した。また,この結果に基づき散乱光の近似モデル及び画像の鮮明化についての検討を行った。1.散乱光の計測及び解析散乱媒体中の光の伝播においては,散乱特性が変化する境界面でのふるまいが問題となる。そこで,まず散乱物体表面における光の伝播を対象として散乱光の計測及び解析を行った。散乱光を正確に計測するには光の入射方向・入射位置・出射方向・出射位置の全てを変化させる必要があるが,プロジェクタと鏡を用いた既存の計測システムにより効率的なデータ取得を実現した。散乱光の解析においては,計測したデータに対し光の入射方向や位置を変化させながら可視化した散乱光を比較することで,光学的特性に対する散乱光の特徴を明らかにした。また,計測された散乱光の明るさを光の出射方向に関して解析することで指向性を持つ散乱成分と,指向性が失われた散乱成分を分離できることを示し,各成分の割合や広がりから光学的特性を推定できることを明らかにした。2.散乱光のモデルおよび画像の鮮明化手法の検討既存の物理学の知見による散乱光のモデルについて,実際に計測・解析した散乱光によるモデルの評価を行った。また,光学的に濃い媒体における散乱光においては,画像のボケと対応付けたモデルを適用できると仮定し,その妥当性及び画像の鮮明化手法への発展について検討を行っている。散乱光の計測及び解析については,計測に既存の装置を利用したことで散乱光の解析に注力することができ,早期に研究成果として発表することができた。その一方で,散乱光のモデルの検討については散乱光のシミュレーションにおける計算コストが高いため,解析に時間がかかっている。これについては計算機サーバーの利用やアルゴリズムの工夫により時間の短縮を図っているところである。現在検討している光学的に濃い媒体における散乱光の近似モデルに基づき,画像の鮮明化手法を構築する。また,他の光学特性における散乱光についても同様の検討を行い,さまざまな散乱媒体に適用できる鮮明化手法への拡張を目指す。
19世紀ドイツにおけるユダヤ学の成立に関する思想史的研究

本年度は以下の2点を中心におきながら、19世紀ドイツにおけるユダヤ学の諸問題について掘り下げた。第一に、ユダヤ教の集合的記憶論で著名なY.H.イェルシャルミのユダヤ学批判について考察した。彼によれば、古代・中世のユダヤ人は歴史叙述に関心を寄せることはなかった。しかし、近代以降、歴史叙述がユダヤ人の思想を捉えはじめ、それによってユダヤ教は根本的な変化を被ることになった。そのさい、大きな影響力をもったのが19世紀ドイツのユダヤ学であり、とくにI.ヴォルフのユダヤ学の構想であった。本研究課題の一つはヴォルフの思想の解明に焦点を当てるものであるが、彼の思想が正当に評価されていない理由としてイェルシャルミの否定的評価が部分的に影響を与えているのではないかと考えることができる。ユダヤ学の全体像を解明するうえで、イェルシャルミのユダヤ学批判が一つの出発点になることが判明したと同時に、ユダヤ思想史のなかで記憶と歴史叙述の関係がユダヤ学とは無関係ではないこともはっきりした。第二に、M.ブーバーの聖書解釈・聖書学について考察した。ブーバーの聖書解釈方法論において神話や歴史の概念は重要な役割を果たしている。ブーバー自身ははっきり書いていないが、このような彼の傾向は合理的なユダヤ教理解を目指したユダヤ学に対する批判であることは明らかである。ユダヤ学の歴史理解とユダヤ教の歴史理解のあいだには大きな溝があるはずだが、ユダヤ学はその違いに無自覚だったところがあり、この問題はイェルシャルミのユダヤ学批判ともつながる重要な視点である。ユダヤ学を正確に把握するためには、20世紀のユダヤ思想が行ってきた批判を慎重に検討し、それによって覆い隠された部分を丁寧に取り出す作業が不可欠である。昨年度の方法論の問題とあわせて、ユダヤ学研究の枠組みや視角をより明確にすることができたはずである。19世紀ドイツのユダヤ学の研究はわが国においてほとんど未開拓の領域である。それゆえ、説得力のある成果を出すためには慎重な研究が求められる。とくに(1)ユダヤ学において何がもっとも重要な関心事だったのか、(2)ユダヤ学の分析においていかなる枠組みが有効なのか、そして(3)20世紀のユダヤ思想の影響力のなかで何が隠されてしまったのかを慎重に解明しなければならない。本研究はこれら3つの視点について一定の見通しを立てることができた。それゆえ、こうした状況を踏まえて自己評価を「おおむね順調に進展している」とした。この2年でいくつかの重要な視点を得ることができたので、それに基づいてL.ツンツとI.ヴォルフのテクストをさらに分析する予定である。同時に、引き続きユダヤ学の分析枠組みの洗練化とコンテクストの明確化に励みたいと考えている。本年度は、L.ツンツとI.ヴォルフのテクストを分析するための枠組みや当時の哲学史・宗教思想史・社会史的コンテクストの検討に主眼をおいて研究した。当初、この課題は平成30年度に予定していたが、精査した結果、先に着手したほうが今後の研究にとって有益であると考えた。明らかになったのは次の点である。19世紀ドイツに成立したユダヤ学は〈ユダヤ教を学問的(=歴史批判的)に研究すること〉〈近代ユダヤ人のアイデンティティを形成すること〉〈周囲の非ユダヤ的文化に対してみずからの立場を弁証すること〉という三つの課題を担った学問である。こうした課題は当時の複雑なコンテクストのなかで生まれたものである。M. A.マイアーはユダヤ学には「二つの持続する緊張」があると述べたが、上記のユダヤ学における三つの課題はマイアーの分析枠組みを批判的に読解し、本研究に組み入れたことで明らかになったものである。しかし、こうした課題を担ったユダヤ学は「学問としてのユダヤ学」と「学問の対象としてのユダヤ教」のあいだで揺れ動くことになった。これが学問としてのユダヤ学の成立可能性に関わる重要な視点であり、方法論的問題こそユダヤ学の成立のみならず、ユダヤ教と近代世界の複雑な関係を解明するうえでの鍵であることが判明した。また、ユダヤ学に批判的だったフランツ・ローゼンツヴァイクのメシアニズム思想を掘り下げることができた。学問は人間の生に何も答えてくれないという問題意識をローゼンツヴァイクのような20世紀前半の若き知識人たちは共有していた。ローゼンツヴァイクもまた学問に見切りをつけ、非学問的なメシアニズムからの誘惑を受け入れたように見えながらも、彼の真理論は性急なメシア到来の要求に限界づけを設けようとした。ここにもまた「学問としてのユダヤ学」と「学問の対象としてのユダヤ教」の問題が示唆されているのである。【研究実績の概要】でも短くふれたように、研究計画の変更(平成29年度と平成30年度の内容の交代)を行った。当初はテクストの読解を中心に進める予定だったが、ユダヤ学の重要問題が方法論にあることがわかり、それとの関連で対象の分析枠組みの精緻化や当時のコンテクストの再構成を先にもってきた方がよいと判断した点が、変更の大きな理由である。最初から組み込んでいた研究内容であり、すでに手元にある資料を十分に使うこともできたので特段問題は発生しなかった。こうした状況を踏まえて自己評価は「おおむね順調に進展している」とした。

彼によれば、古代・中世のユダヤ人は歴史叙述に関心を寄せることはなかった。しかし、近代以降、歴史叙述がユダヤ人の思想を捉えはじめ、それによってユダヤ教は根本的な変化を被ることになった。そのさい、大きな影響力をもったのが19世紀ドイツのユダヤ学であり、とくにI.ヴォルフのユダヤ学の構想であった。本研究課題の一つはヴォルフの思想の解明に焦点を当てるものであるが、彼の思想が正当に評価されていない理由としてイェルシャルミの否定的評価が部分的に影響を与えているのではないかと考えることができる。ユダヤ学の全体像を解明するうえで、イェルシャルミのユダヤ学批判が一つの出発点になることが判明したと同時に、ユダヤ思想史のなかで記憶と歴史叙述の関係がユダヤ学とは無関係ではないこともはっきりした。第二に、M.ブーバーの聖書解釈・聖書学について考察した。ブーバーの聖書解釈方法論において神話や歴史の概念は重要な役割を果たしている。ブーバー自身ははっきり書いていないが、このような彼の傾向は合理的なユダヤ教理解を目指したユダヤ学に対する批判であることは明らかである。ユダヤ学の歴史理解とユダヤ教の歴史理解のあいだには大きな溝があるはずだが、ユダヤ学はその違いに無自覚だったところがあり、この問題はイェルシャルミのユダヤ学批判ともつながる重要な視点である。ユダヤ学を正確に把握するためには、20世紀のユダヤ思想が行ってきた批判を慎重に検討し、それによって覆い隠された部分を丁寧に取り出す作業が不可欠である。昨年度の方法論の問題とあわせて、ユダヤ学研究の枠組みや視角をより明確にすることができたはずである。19世紀ドイツのユダヤ学の研究はわが国においてほとんど未開拓の領域である。それゆえ、説得力のある成果を出すためには慎重な研究が求められる。とくに(1)ユダヤ学において何がもっとも重要な関心事だったのか、(2)ユダヤ学の分析においていかなる枠組みが有効なのか、そして(3)20世紀のユダヤ思想の影響力のなかで何が隠されてしまったのかを慎重に解明しなければならない。本研究はこれら3つの視点について一定の見通しを立てることができた。それゆえ、こうした状況を踏まえて自己評価を「おおむね順調に進展している」とした。平成29年度に予定していたL.ツンツとI.ヴォルフのテクストを読解する予定である。その過程で引き続きユダヤ学の分析枠組みやコンテクストの精緻化にも取り組みたい。この2年でいくつかの重要な視点を得ることができたので、それに基づいてL.ツンツとI.ヴォルフのテクストをさらに分析する予定である。同時に、引き続きユダヤ学の分析枠組みの洗練化とコンテクストの明確化に励みたいと考えている。外国語の校閲に必要な金額がはっきりせず、少し多めに残していたため次年度使用額が生じた。平成30年度の物品費(関連図書の購入)に組み込むことを計画している。校費による長期の海外出張が認められたため、当初計上していた外国旅費に残額が生じた。残額については主として令和元年度(平成31年度)の物品費(関連図書の購入)に組み込み、必要資料の購入費用として活用するよう計画している。佐藤貴史
膀胱付着に関与する大腸菌線毛の同定と膀胱炎発症機序の解析

尿路感染症患者分離大腸菌の保有する各種の線毛Adhesinのレセプタ-認識能に関する諸性質を赤血球、酵母、各種の線毛レセプタ-糖鎖含有脂質を有するリポソ-ム、レセプタ-結合ラテックスおよび糖蛋白質糖鎖を分離後脂質に結合したグリコネオリピドを用いたオ-バ-レイアッセイにより解析を加えた。その結果、同一タイプの線毛にもAdhesin特性の著しく異なった多くの株が存在し、感染様式および宿主細胞表層レセプタ-認識能の多様性が明らかとなった。一方、膀胱炎発症機序解析のため、マウスでの実験的膀胱炎モデルの作成を試みた。各種の実験から、マウス膀胱への少量のトリプシン注入により、マウス膀胱のIntermidiate cellになんらの障害も与える事なく、菌の付着が起こらないSuperficial cellを剥離することで、type1線毛保有菌による膀胱感染の成立が観察された。この実験的膀胱炎モデルは、その取り扱いが非常に簡単であり、かつ実験の再現性も高いので今後の感染実験および治療実験には非常に有効な方法となるものと思われる。以上の成績以外にも、最近各種の膀胱上皮細胞の細胞機能解析から、膀胱のSuperficial cellが有する全く新しい感染防御機構として膀胱pH変化が重要な因子であることも明らかになった。この事は、ムチンを含む膀胱上皮、特にSuperficial cellにおける局所的な細胞機能の変化が大腸菌の膀胱上皮細胞付着に重要であることが明らになった。また、マウス膀胱Intermidiate cellへの菌付着因子としてマウス1gG関与の可能性も示され、今まで報告されていない全く新しい大腸菌付着・定着様式の在存も明らかとなった。尿路感染症患者分離大腸菌の保有するAdhesinの諸性質を、赤血球、酵母及び各種の線毛レセプタ-糖鎖を含有するリポソ-ム及びラテックス粒子を用いた凝集法により解析を加えた。その結果、Type1線毛保有菌株間に多くのType1線毛サブタイプの存在が明らかとなった。Type1線毛を構成する主要蛋白には明確な差異をみとめなかったので、これらのType1線毛サブタイプは線毛のAdhesin部分での差と考えられ、目下Type1線毛Adhesin遺伝子の調整を試み、Adhesin遺伝子の相同性に検討を加えている。膀胱炎発症機序解析のため、マウスでの実験的感染モデルの作製を試みた。予備実験から、正常マウスの膀胱Superficial cellの膀胱腔側にはType1線毛保有菌の付着は観察されなかった。反転膀胱及び剥離膀胱上皮細胞へのType1線毛保有菌の付着を検討した結果、Superficial cellの基底膜側およびIntermediate cell及びBasal cellへの菌の付着が観察された。我々は、in vivoでの感染実験のため、Superficial cellを剥離する条件に検討を加え、トリプシンの膀胱注入によりIntermediate cell等にほとんど障害を加える事なくSpuerficial cellを剥離させることが出来た。またこの処理を行ったマウスでは、Type1線毛保有菌の膀胱注入により膀胱炎の発症が観察された。この実験膀胱炎マウスモデルは、その取扱が非情に簡単であり、実験の再現性も高いので今後の感染実験には非常に有効な方法となる。今後のこれらの実験系を用いて各種のType1線毛保有菌株の付着・定着機構の分子レベルでの解析を行うとともに各菌株の病原性発現機構に検討を加えたい。

その結果、同一タイプの線毛にもAdhesin特性の著しく異なった多くの株が存在し、感染様式および宿主細胞表層レセプタ-認識能の多様性が明らかとなった。一方、膀胱炎発症機序解析のため、マウスでの実験的膀胱炎モデルの作成を試みた。各種の実験から、マウス膀胱への少量のトリプシン注入により、マウス膀胱のIntermidiate cellになんらの障害も与える事なく、菌の付着が起こらないSupeficial cellを剥離することで、type1線毛保有菌による膀胱感染の成立が観察された。この実験的膀胱炎モデルは、その取り扱いが非常に簡単であり、かつ実験の再現性も高いので今後の感染実験および治療実験には非常に有効な方法となるものと思われる。以上の成績以外にも、最近各種の膀胱上皮細胞の細胞機能解析から、膀胱のSuperficial cellが有する全く新しい感染防御機構として膀胱pH変化が重要な因子であることも明らかになった。この事は、ムチンを含む膀胱上皮、特にSuperficial cellにおける局所的な細胞機能の変化が大腸菌の膀胱上皮細胞付着に重要であることが明らかになった。また、マウス膀胱Intermidiate cellへの菌付着因子としてのマウスIgG関与の可能性も示され、今まで報告されていない全く新しい大腸菌付着・定着様式の存在も明らかとなった。
骨細胞のＰＴＨ応答性を利用した、新たな骨リモデリング調節因子の探索

骨リモデリング機構の破綻の代表疾患は骨粗鬆症だが、現在使われている治療薬に骨細胞を標的として開発されたものはない。破骨細胞を標的とした薬剤は副作用に顎骨壊死がある。一方、骨芽細胞を標的とした薬剤のPTH(副甲状腺ホルモン)製剤には顎骨壊死の副作用はない。PTHと骨細胞の関連については、PTHの作用により骨細胞の持つsclerostinが減ることが報告されているが、PTHの作用により増える因子は不明である。本研究代表者は骨細胞を骨基質に埋入したまま培養する方法を開発済みであるため、これを利用し、PTHの作用により骨細胞からの分泌が増える因子を探索することによって新規治療薬の候補因子を見出したい。
炭酸ガスレーザー加工機を活用した鋳造用木型の製作

1.研究目的苫小牧高専機械工学科学生向けに教育改善の一環として,学生自身がパソコンのDrawingソフトおよび炭酸ガスレーザー加工機を活用し,木材およびスタンプゴム等の材料を彫刻および切断した鋳造用木型を設計および製作し,鋳造用木型を砂型製作および鋳込み等の鋳造作業を行い,また,アンケートを行い,「ものづくり」における教育効果の調査を目的とする.2.研究方法研究方法を下記の1)3)に示す.1)パソコンにインストールされたDrawingソフトを活用し,学生自身が自由にデザイン等を設計し,プログラムを作成する.2)プログラムをパソコンからレーザー加工機に出力し,木材およびスタンプゴム等の材料を彫刻および切断を行い,ドレッサー、紙ヤスリおよび接着剤等を用いて木型を仕上げる.3)砂型の製作および鋳込みを行い、湯口・湯道等を切断し,製品を仕上げる.また,実習終了後に学生にアンケートを行った.3.研究成果本研究内容によって考えられる効果を以下の1)3)に示す.1)鋳造用木型の設計,製作,砂型製作および鋳込みまでを一貫して学生自身が作業を行うことにより,学生の理解度が高まり,また,アンケート結果より、全体の平均が5段階評価において4.29と高い値となり,「ものづくり」における思いを感じることができた。2)パソコン等を活用することにより,時代に即応した技術を体得できた.3)実習のみならず,実験,研究,鋳造に関する依頼作業および公開講座等において,本研究内容の活用が期待される.1.研究目的苫小牧高専機械工学科学生向けに教育改善の一環として,学生自身がパソコンのDrawingソフトおよび炭酸ガスレーザー加工機を活用し,木材およびスタンプゴム等の材料を彫刻および切断した鋳造用木型を設計および製作し,鋳造用木型を砂型製作および鋳込み等の鋳造作業を行い,また,アンケートを行い,「ものづくり」における教育効果の調査を目的とする.2.研究方法研究方法を下記の1)3)に示す.1)パソコンにインストールされたDrawingソフトを活用し,学生自身が自由にデザイン等を設計し,プログラムを作成する.2)プログラムをパソコンからレーザー加工機に出力し,木材およびスタンプゴム等の材料を彫刻および切断を行い,ドレッサー、紙ヤスリおよび接着剤等を用いて木型を仕上げる.3)砂型の製作および鋳込みを行い、湯口・湯道等を切断し,製品を仕上げる.また,実習終了後に学生にアンケートを行った.3.研究成果本研究内容によって考えられる効果を以下の1)3)に示す.1)鋳造用木型の設計,製作,砂型製作および鋳込みまでを一貫して学生自身が作業を行うことにより,学生の理解度が高まり,また,アンケート結果より、全体の平均が5段階評価において4.29と高い値となり,「ものづくり」における思いを感じることができた。2)パソコン等を活用することにより,時代に即応した技術を体得できた.3)実習のみならず,実験,研究,鋳造に関する依頼作業および公開講座等において,本研究内容の活用が期待される.
プロテオグリカン生合成におけるデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸の選別

本研究は、デルマタン硫酸(DS)とコンドロイチン硫酸(CS)の仕分け機構を明らかにすることを目的とし、DS合成に関与するC5エピメラーゼのクローニングを行ない、同酵素の特徴を明らかにする。また、CS/DS同様細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸(HA)にも着目し、その合成阻害機構の解析も行う。CS/DS同様グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸(HS)では、そのエピマー化を触媒するC5エピメラーゼが近年明らかになり、これはHSの硫酸転移酵素とゴルジ装置内にて複合体を形成している。そこで、CSでも同様に複合体を形成していることを仮定した。これに基づき、ヒトCS硫酸転移酵素をBaitとし、Yeast Two Hybridを用いたクローニングを行なうためのcDNAライブラリーを作製した。また、C5エピメラーゼのより簡便なアッセイ法を確立する為に、FACSを用いる方法の開発に着手した。まずGAG-リピドを用いたELISAを行ない、この結果、コンドロイチナーゼB処理をした際にCS/DS間にΔDi-4S抗体に対する反応性の差を確認できた。さらに蛍光染色で細胞での検討を行なった結果、ELISA同様CS/DS間の差をコンドロイチナーゼBとΔDi-4S抗体により比較できることがわかった。そこで、細胞表面上のDS分析を行なう為にFACSを行なった。様々な細胞でCS/DSを比較分析した結果、両者の間に差を確認できた。2.HA合成阻害機構の解析4-メチルウンベリフェロン(MU)は、ヒト皮膚線維芽細胞やC型連鎖球菌のヒアルロン酸(HA)合成を阻害することがこれまでに見い出されている。しかしながら、その作用機序に関する情報は極めて少ない。そこで、MUによるHA合成阻害の機構について、HA合成酵素(HAS)の遺伝子導入細胞を用いて解析した。その結果、MU-グルクロン酸の産生増加に伴って、MUの阻害効果が増強することを見い出した。以上の結果から、細胞内在性UDP-糖転移酵素(UGT)の糖転移反応とそれに伴うUDP-グルクロン酸の消費が、HA合成と競合した可能性が考えられた。本研究はデルマタン硫酸(DS)/コンドロイチン硫酸(CS)の仕分け機構の解明を目指し、DS合成に関与するC5エピメラーゼの遺伝子クローニングを行ない、同酵素の特徴を明らかにすることを目的としている。本年度は簡便なアッセイ系の確立とエピメラーゼのクローニングに向けてのアプローチを行なった。詳細は以下に示す。1 C5エピメラーゼのアッセイ法の確立について大量のクローンを簡便に扱うアッセイ法として、FACSを用いる方法の開発に着手した。その前段階として、まず、GAGリピドを用いたELISAを行ない、各種コンドロイチナーゼ処理後の不飽和二糖に対する抗体の反応性を検討した。その結果、コンドロイチナーゼBを用いた場合にCSとDSとの間にΔDi-4S抗体に対する反応性に差が見られた。次に、細胞を用いて蛍光染色を行なった。ELISAと同様にコンドロイチナーゼBとΔDi-4S抗体を用いることによって、細胞に発現するCSとDSを識別することが可能であることがわかった。現在FACSを利用して差が最も顕著になる酵素濃度と反応時間等の条件を検討している。2.C5エピメラーゼのクローニングについてヘパラン硫酸(HS)のC5エピメラーゼに関する情報に基づいて、ホモロジー検索を行なった。現時点では相同性をもつクローンは得られておらず、引き続き探索している。HSのC5エピメラーゼは、HSの硫酸転移酵素とゴルジ装置内にて複合体を形成することが知られており、CSについても同様に複合体を形成していると思われる。この2つの仮説に基づき、ヒトCS硫酸転移酵素をBaitとしてYeast Two Hybrid法を用いたクローニングを行なうために、cDNAライブラリーを作製した。デルマタン硫酸(DS)/コンドロイチン硫酸(CS)の生理機能を明らかにすることを目的とし、DS合成に関与するC5エピメラーゼの遺伝子クローニングを行ない、DS/CSの仕分け機構のメカニズムの解明を目指す。本年度は簡便なアッセイ系の確立エピメラーゼのクローニングに向けてのアプローチを行なった。詳細を以下に示した。1.C5エピメラーゼのアッセイ法の確立最終的にクローンを大量に扱う為、簡便なアッセイ法が必要となる。そこで、FACSを用いる方法の開発に着手した。そこでこれを基にFACSを行ない、細胞表面上のDSの分析を行なった。現在種々の細胞でのCS/DSを比較分析し、両者間の差を確認した。来年度はさらに差が顕著になる酵素濃度と反応時間等の条件を検討し、より効率のよいアッセイ系の確立を検討する.2.C5エピメラーゼのクローニング他のグリコサミノグリカンである、ヘパラン硫酸(HS)のエピマー化を触媒するC5エピメラーゼは、HSの硫酸転移酵素とゴルジ装置内にて複合体を形成することが近年明らかになり、CSについても同様に複合体を形成していると思われる。

これらの仮説に基づき、ヒトCS硫酸転移酵素をBaitとしてYeast Two Hybrid法を用いたクローニングを行なうために、cDNAライブラリーを作製した。現在相互作用をする分子を検討している。またHS C5エピメラーゼの遺伝子情報に基づき、ESTデータベース検索も行なった。現時点では相同性をもつクローンは得られておらず、引き続き探索している。来年度も引き続きクローニングを進めていく予定である。本研究は、デルマタン硫酸(DS)とコンドロイチン硫酸(CS)の仕分け機構を明らかにすることを目的とし、DS合成に関与するC5エピメラーゼのクローニングを行ない、同酵素の特徴を明らかにする。また、CS/DS同様細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸(HA)にも着目し、その合成阻害機構の解析も行う。CS/DS同様グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸(HS)では、そのエピマー化を触媒するC5エピメラーゼが近年明らかになり、これはHSの硫酸転移酵素とゴルジ装置内にて複合体を形成している。そこで、CSでも同様に複合体を形成していることを仮定した。これに基づき、ヒトCS硫酸転移酵素をBaitとし、Yeast Two Hybridを用いたクローニングを行なうためのcDNAライブラリーを作製した。また、C5エピメラーゼのより簡便なアッセイ法を確立する為に、FACSを用いる方法の開発に着手した。まずGAG-リピドを用いたELISAを行ない、この結果、コンドロイチナーゼB処理をした際にCS/DS間にΔDi-4S抗体に対する反応性の差を確認できた。さらに蛍光染色で細胞での検討を行なった結果、ELISA同様CS/DS間の差をコンドロイチナーゼBとΔDi-4S抗体により比較できることがわかった。そこで、細胞表面上のDS分析を行なう為にFACSを行なった。様々な細胞でCS/DSを比較分析した結果、両者の間に差を確認できた。2.HA合成阻害機構の解析4-メチルウンベリフェロン(MU)は、ヒト皮膚線維芽細胞やC型連鎖球菌のヒアルロン酸(HA)合成を阻害することがこれまでに見い出されている。しかしながら、その作用機序に関する情報は極めて少ない。そこで、MUによるHA合成阻害の機構について、HA合成酵素(HAS)の遺伝子導入細胞を用いて解析した。その結果、MU-グルクロン酸の産生増加に伴って、MUの阻害効果が増強することを見い出した。以上の結果から、細胞内在性UDP-糖転移酵素(UGT)の糖転移反応とそれに伴うUDP-グルクロン酸の消費が、HA合成と競合した可能性が考えられた。
新しい分子シャペロン蛋白機能の発見とこれによる基質との動的相互作用

分子シャペロン蛋白質のHSP70,DnaK蛋白質および14-3-3蛋白質(別名MSF)は、代表的な分子シャペロンとして蛋白質の立体構造の維持、巻き戻し反応、さらにオルガネラ間の蛋白質輸送に関与している。これらの蛋白質は、これまでATPase活性を持ちATPからADPに変換するエネルギーがこれら蛋白質の機能発現に必要と解釈されてきた。我々は本年度の研究でこれらの分子シャペロン蛋白質の持つ酵素活性がATPase活性でなく、Nucleoside diphosphate (NDP) Kinaseで、ATPからADPへの変換と同時にADPからATPへの変換反応を合わせ持つことを明らかにした。またこの酵素反応が、γ位のリン酸を転移させるさいに酵素反応中間体として一時的に分子シャペロン上のヒスチジンがリン酸化され、高エネルギーリン酸化中間体を形成することが明らかとなった。ヒスチジンの化学修飾により分子シャペロン蛋白質のNDP Kinase作用がなくなることより、ヒスチジンが活性中心として作用していることが明らかである。このことは分子シャペロン蛋白質が基質蛋白質と結合、解離を繰り返すさいに必要とされたATP/ADP交換反応が分子シャペロン蛋白質自体の持つNDP kinaseで調節されていることを示唆する。今後分子シャペロン蛋白が持つNDP Kinaseの役割を明確にしてゆく。なかでもNDP kinaseの持つヒスチジンキナーゼ様の作用の結果、基質蛋白質がリン酸化され基質の立体構造変化を導くか否かを明らかにしてゆく。