hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
未(非)承認国家をめぐる国際関係に関する学際的研究

そのほか、研究代表者・分担者らによる学術的な研究成果が、今年度も続々と生み出され、さまざまな場で公開されている。「移行期の正義」「保護責任」といった国家破綻と密接に関わる概念に理論的な検討を加えた石田の研究、ソマリア・ソマリランド・南スーダンといった事例を中心に、国家破綻や未承認国家をめぐるアフリカと国際社会との関わりをさまざまな角度から考察した遠藤の研究、国家破綻の状況下における国連の暫定統治を国際法の観点から検討した連携研究者・西村の研究、あるいはソマリアを含むアフリカの角地域におけるさまざまな国家破綻や「事実上の国家」形成の過程を、シミュレーション・地理情報システムといった多様な方法論を駆使して分析した阪本の研究など、その内容はきわめて多彩である。今年度は本研究課題の最終年度であった。研究代表者・分担者らによる研究活動が引き続き精力的に推進され、豊富な研究成果へと結実した。具体的には、まず「未(非)承認国家」に関する文献・資料の収集がこれまでと同様に進められた。これら文献は、本研究の学際性を反映して、内戦や国家破綻、国際政治や国際法、さらにアフリカの歴史や政治など、きわめて広範な分野に及んでおり、その多くが東京大学大学院総合文化研究科「人間の安全保障」プログラムの図書室の蔵書として広く閲覧の対象とされている。これまで収集した膨大な文献・資料とあわせ、「未(非)承認国家」をめぐる研究活動のための貴重な研究資源となることが期待される。また海外調査については、連携研究者の柴が「未(非)承認国家」の典型例ともいうべきコソヴォを訪れ、紛争と和解をめぐる国際会議に出席したほか、セルビアも含め、史料収集などの研究活動を精力的に展開した。さらに、研究代表者・分担者らによる学術的な研究成果が、今年度も続々と生み出され、さまざまな場で公開されている。ソマリア・ソマリランドを中心に、国家破綻や未承認国家をめぐる問題を歴史的な視点もからめ広範に考察した遠藤の研究、ソマリア等国家破綻の状況においても問題となり得る海洋安全保障をめぐる国際法の文脈において非国家主体の脅威を取り上げた連携研究者・西村の研究、あるいはソマリアをはじめアフリカにおけるさまざまな国家破綻や「事実上の国家」形成の過程を、シミュレーション・地理情報システムといった多様な方法論を駆使して分析した連携研究者・阪本の研究など、その内容はきわめて多彩である。未(非)承認国家およびこれをめぐる国際政治力学を歴史的、理論的、実証的な観点から多面的に推進するという本研究の大きな目的は、上記のようにこのテーマをめぐる豊富で多彩な研究成果が研究分担者・連携分担者たちによって現に生み出されているという事実に鑑みれば、おおむね順調に達せられていると考えて良いであろう。ただし、本研究が目指す、各地域における「未(非)承認国家」のデータベースの構築については、関連する地理空間データ(紙地図等も含め)が当初の予想以上に欠乏しているため、この面で作業の進展に相当の支障が生じていることは否定できない。24年度が最終年度であるため、記入しない。文献資料収集など研究基盤の整備、およびこれらに基づく研究成果の生成とその積極的な公開は、今後もこれまでと変わらずに進めていきたい。作業に遅れが生じている上述の「未(非)承認国家」のデータベースの構築については、基本となる資料の収集を急ぐ一方で、場合によっては別の成果物で補うことも検討する。
MAPキナーゼカスケードを介した植物免疫記憶の制御機構

植物は、病原菌感染を繰り返し受けると、その情報を記憶し、病原菌の二次感染に対して、より迅速にかつ、より強く防御反応を誘導することができる(プライミング効果)。プライミングによる迅速な免疫遺伝子の活性化は、遺伝子領域のDNAの脱メチル化制御と関連していることが示唆されているが、その詳細は不明である。本研究課題では、病原菌認識に伴って活性化されるMAPキナーゼが、プライミングを誘導する分子機構に関して研究を行った。前年度のMAPKKの活性型遺伝子MKK4DDとMKK5DDの誘導系を用いた解析により、MAPKの活性化に伴い、AGO4などDNAメチル化に関連する遺伝子の発現が減少することが明らかになった。、AGO4のプロモーター領域には、WRKY型転写因子により制御されるW-boxが存在するため、AGO4の発現抑制は、MAPK-WRKYの制御系で調節されている可能性が示唆された。そこで、ネガティブに働く5個のWRKY遺伝子について、CRES-T法により、それぞれのWRKYの機能を抑制した植物体(WRKY-SRDX植物)を作出した。それぞれの植物体をMKK4DDあるいはMKK5DDの植物と交配し、両導入遺伝子をホモに持つ系統を作出し、MAPKの活性化に伴うAGO4の発現を解析したが、WRKY-SRDXによってAGO4の発現抑制が阻害される結果が得られなかった。そこで、AGO4遺伝子領域にクロマチン修飾の変化が生じている可能性を考え、AGO4の遺伝子領域のH3K27のアセチル化を解析した。その結果、MAPKの活性化に伴い、H3K27acのレベルが減少していることが明らかになった。このことから、AGO4の発現抑制が、MAPKの活性化によるH3K27acの減少によって生じていることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の細胞膜上には多くの受容体が存在し、病原菌の構成成分を認識すると、感染部位で一過的な防御反応を誘導する。この反応は、病原菌の二次感染に対して迅速な反応を活性化する「プライミング」状態を誘導する引き金となっている。このプライミング効果は、病原菌の二次感染に備えた「植物免疫記憶」である。プライミング効果による迅速な免疫遺伝子の活性化は、遺伝子領域のDNAの脱メチル化制御と関連していることが示唆されているが、その詳細は不明である。一方、植物の受容体による病原菌認識に伴って、細胞内ではMAPKカスケード(MAPKKK-MAPKK-MAPK)が活性化され、様々な免疫応答が誘導されることが知られているが、その制御下で、免疫遺伝子領域のDNAの脱メチル化が制御されているかは不明である。そこで、MAPKカスケードがDNAの脱メチル化に関与するかを明らかにするため、MAPKKの活性型遺伝子MKK4DDとMKK5DDの誘導系を用いて、MAPKの活性化に伴うDNAメチル化関連遺伝子の発現変動を解析した。その結果、AGO4やAGO6などDNAメチル化に関連する遺伝子の発現が減少することが明らかになり、これらの遺伝子発現の低下がDNAの脱メチル化を誘導していることが示唆された。実際、MAPKの活性化を誘導するべん毛タンパク質由来のペプチドflg22を処理した場合においても、AGO4などの遺伝子発現が抑制されることが明らかになった。さらに、AGO4のプロモーター領域には、WRKY型転写因子により制御されるW-boxが存在するため、AGO4の発現抑制は、MAPK-WRKYの制御系で調節されている可能性が示唆された。本年度、活性型のMAPKKを発現する植物体を用いた解析により、MAPKの制御下で、DNAメチル化に関与する遺伝子の発現が制御されていることを明らかにすることができ、当初の目的を達成することができた。また、それらの制御は、WRKY型転写因子を介して行われていることが示唆され、今後の展開に向けて重要な成果となった。

その結果、MAPKの活性化に伴い、H3K27acのレベルが減少していることが明らかになった。このことから、AGO4の発現抑制が、MAPKの活性化によるH3K27acの減少によって生じていることが示唆された。本年度、MAPKKの活性型遺伝子MKK4DDとMKK5DDの誘導系を用いて、MAPKの活性化に伴うDNAメチル化関連遺伝子の発現変動を解析したところ、AGO4やAGO6などDNAメチル化に関連する遺伝子の発現が減少することが明らかになった。このことは、MAPKの制御下で、DNAの脱メチル化が制御されていることを示唆している。また、AGO4のプロモーター領域には、WRKY型転写因子により制御されるW-boxが存在していた。このことから、AGO4の発現抑制は、MAPK-WRKYの制御系で調節されている可能性が示唆された。そこで、WRKY型転写因子のドミナントネガティブ変異遺伝子を導入した植物体(WRKY-SRDX植物)を用いて、WRKYがAGO4の転写抑制に関与しているかどうかを明らかにする。さらに、WRKY-SRDX植物を、MKK4DD植物あるいはMKK5DD植物と交配し、得られた植物体を解析することで、MAPK-WRKY-AGO4のシグナル系を明らかにする。また、生態系における病原菌感染を模倣するため、べん毛タンパク質由来のペプチドを複数回、処理したところ、AGO4の発現抑制が観察された。しかし、まだ予備的であるため、安定的なデータが得られる実験系を確立し、病原菌の二次感染が免疫のプライミング状態を誘導する機構を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
乳房超音波エラストグラフィに対する精度管理システムの開発

次の5段階で研究を実施した。1乳房超音波エラストグラフィの有用性と精度管理の必要性の啓蒙として国内コンセンサスにもとづく国内ガイドラインと国際メンバーによる国際ガイドラインを作成・報告。2精度管理が可能であるアプリケーション(AP)を開発メーカーと協同開発。3オリジナルエラストグラフィ評価用ファントムを作成、検証実験により精度を確認。4AP前向き臨床試験を実施し感度、特異度、相関性などを検証、結果を複数の国際学会で報告、現在論文作成、投稿中。5精度管理教育用の完全人乳房解剖を有する中島式エラストグラフィファントムを開発、学会総会時に検証実験を行い有用性を確認した。本結果も論文報告予定である。エラストグラフィの精度管理システムの構築には、アプリケーション・装置の精度管理、検査者の撮像技術の精度管理、アプリケーション・装置を正しく使用し、正しく読影する知識の精度管理・啓蒙が必要である。2013年度は、まず、日常臨床使用での使用法、読影知識の精度管理を進めるため、その推奨撮像法、読影方法が異なることの認知・啓蒙活動がすすめた。特に、現在は多くのエラストグラフィ装置・アプリケーションが存在し、十分な知識と注意が必要であることを強調している。具体的には、日本乳腺甲状腺超音波医学会、日本超音波医学会にてガイドライン作成チームを編成し、現時点でのエラストグラフィガイドラインを作成した。これは日本のエラストグラフィガイドラインとして、英文雑誌に投稿、すでに掲載されている(研究者が筆頭著者)。また、日本超音波医学会教育委員会エラストグラフィ小委員長に就任し、第一回エラストグラフィ講習会をパシフィコ横浜で開催した。今後、受講者に対し、受講証を発行するとともに、画像評価委員会を結成し、各施設の臨床画像を評価、施設認定を行う予定である。また、昨年度は国内外の関連学会でエラストグラフィに関する発表、講演を行った。2014年4月の米国超音波医学会(AIUM)の基調講演(New York)、2014年5月世界超音波医学会(WFUMB)のシンポジウムでの講演(Sao Paulo)、2014年5月日本超音波医学会のシンポジウムで2回、ワークショップで1回の講演(Osaka)を行っている。さらにエラスグラフィアプリケーションの精度管理のため、エラストグラフィファントムを制作しているが、昨年度のプロトタイプの制作が限界であった。今後、数タイプのファントムを作成し、完成を目指す予定である。我々が提唱するエラストグラフィの精度管理システムの構築には、アプリケーションおよび装置を正確に使用し読影するための知識および技術の普及に関わる教育システムが求められる。全国に現在多くのエラストグラフィ装置およびアプリケーションが存在しているが、研究初年度は日常臨床での使用法および読影知識の精度管理を進めるため、推奨撮像法、読影法についての認知・啓蒙活動をすすめた。日本乳腺甲状腺超音波医学会、日本超音波医学会にてガイドライン作成チームを編成し、エラストグラフィガイドラインを作成し、英文誌に掲載された(研究者が筆頭著者)。日本超音波医学会教育委員会エラストグラフィ小委員長に就任し、第一回エラストグラフィ講習会をパシフィコ横浜で開催した。画像評価委員会を設立し、各専門施設の臨床画像を評価し、施設認定を行うシステム構築を開始した。エラストグラフィ開発当初より用いられている従来型ファントムは均質な構造をしており、分解能の低いエラストグラフィでも画像化が容易である。実際の乳房は複雑な乳腺構造と間質より構成されており、エラストグラフィも複雑な画像となる。アプリケーションの精度管理のため、実際の人乳房型のエラストグラフィ用超音波ファントムの試作を開始した。複雑な構造物下に各種ターゲットが組み込まれたファントムでも画像が評価できる高性能なエラストグラフィシステムを開発する。本年度も国内外の関連学会でエラストグラフィとその精度管理の構築に関する発表、講演を国内外にて行った。本研究達成には次の5ステップが必要である:A乳房超音波エラストグラフィの有用性と精度管理の必要性を国内外へ啓蒙、B精度管理が可能であるアプリケーション作成、C作成アプリケーションのファントムによる精度評価、D作成アプリケーションの前向き臨床試験による精度評価、E撮像技術精度管理のための教育、技術評価用ファントムの作成。Bに関しては、研究初年度に精度管理が可能であるアプリケーションを開発メーカーと共同開発した。C、Dに関しては一昨年度にアプリケーションのファントムによる精度評価を行い非臨床データでの精度を確認、一昨年度昨年度に前向き臨床試験を実施、感度、特異度、相関性などを検証した。これらの結果は、すでに国内外の超音波関連学会にて報告し、高い評価を得ている。現在、研究結果を論文として作成しており、投稿準備中である。今後、別の研究にて前向き多施設共同研究を予定しており、本アプリケーションのエビデンスを確立する予定である。Eに関しても精度管理教育用として計画している中島式エラストグラフィファントム(人乳房型)の最終形設計図を3Dソフトウェアで作成しているところであり、本年度中に最終形を完成させる予定である。昨年、研究代表者が急病で長期入院したため、途中頓挫しており、半年ほど遅れており、研究期間を延長していただいた。本研究は次の5ステップで実施した。A乳房超音波エラストグラフィの有用性と精度管理の必要性の国内外へ啓蒙:国内コンセンサスのため、日本超音波医学会において「JSUM Ultrasound Elastography Practice Guideline: Breast」を作成した(研究者は筆頭著者)。また、世界コンセンサスとして、世界超音波医学会(WFUMB)より「WFUMB guidelines and recommendations forclinical use of ultrasoundelastography: Part 2: breast」を作成(研究者はセカンド著者)した。B精度管理可能なアプリケーション作成:研究初年度に撮像バイアスを排除した精度管理が可能であるアプリケーションをメーカーと協同開発した。

Cファントムによる精度評価:アプリケーションを評価するために正確な硬度の判明しているターゲットを乳腺、脂肪組織に相当する硬度の基材中に埋め込んだエラストグラフィ評価用の人乳房構造解剖ファントムを作成、数回の実験を行い、精度を確認した。D前向き臨床試験:20142015年に当施設にて前向き臨床試験を実施、感度、特異度、相関性などを検証。研究の途中経過を、2015年WFUMB (フロリダ)、2016年アジア超音波医学会総会(京都)、2017年欧州放射線医学会(ウィーン)にて報告、高い評価を得た。2年間の症例観察期間により最終的良悪性を判定し、本システムの精度を最終評価。現在、最終結果を論文として作成、投稿中。E撮像技術精度管理のための教育、技術評価用ファントム:本研究のノウハウを用い、教育・評価用として完全人乳房解剖構造を有する中島式エラストグラフィファントムを開発、作製した。本ファントムは次期研究「乳房超音波strain elastography自動化プログラムのエビデンス構築」で使用予定である。次の5段階で研究を実施した。1乳房超音波エラストグラフィの有用性と精度管理の必要性の啓蒙として国内コンセンサスにもとづく国内ガイドラインと国際メンバーによる国際ガイドラインを作成・報告。2精度管理が可能であるアプリケーション(AP)を開発メーカーと協同開発。3オリジナルエラストグラフィ評価用ファントムを作成、検証実験により精度を確認。4AP前向き臨床試験を実施し感度、特異度、相関性などを検証、結果を複数の国際学会で報告、現在論文作成、投稿中。5精度管理教育用の完全人乳房解剖を有する中島式エラストグラフィファントムを開発、学会総会時に検証実験を行い有用性を確認した。本結果も論文報告予定である。人乳房型のエラストグラフィ用超音波ファントムの試作に時間を要しているため。我が国でのエラストグラフィ装置とアプリケーションの進歩は著しいものがあるが、正確な知識と撮像技術の普及に必要な精度管理された教育システムの構築を進めている。論文報告と、中島式エラストグラフィファントムの完成と発表。現在、当初予定していた、単施設での前向き臨床試験と解析が終了し、論文作成中である。また、中島式エラストグラフィファントム(人乳房型のエラストグラフィ用超音波ファントム)の最終形の設計図を3Dソフトウェアで作成しているところである。
プロトン性溶媒中における触媒的斉アミド化反応の開発とD-アミノ酸の選択的標識化

従来の不斉触媒を用いた不斉アミド化反応では、カルボン酸とアミンから光学活性アミドを合成する際、ラセミ体アミンを速度論的光学分割する例しかなかった。本研究では、トリアジンを基盤とした脱水縮合反応を用い、触媒がラセミ体カルボン酸の不斉を制御する反応の開発に取り組んだ。その結果、用いるキラル第三級アミンやクロロトリアジンの構造を調整する事で、これまでにない初の反応様式で光学活性アミドが得られることを明らかとした。また、上記トリアジンの研究で得られた知見を利用して、新しいベンジル化剤の開発、トリアジニルアンモニウムの効果的な脱離反応などの解明に至った。本研究の目的は、不斉合成反応によって疾患の分析が可能となるという新しい概念を創出することである。そのための基盤となる不斉脱水縮合反応の開発を進め、以下のような成果を得た。我々がこれまでに開発したトリアジンを基盤とした脱水縮合反応において、キラルアミン触媒を用いると光学活性なアミドが得られることを明らかとした。この反応では、反応中間体であるオニウムの対アニオンの種類によって立体選択性が変化すること、反応進行とともに生成する酸は中和不要であることを見出している。また、触媒やトリアジンの置換基を変えることで生成物の立体選択性は変化し、触媒置換基とトリアジン置換基の組み合わせが脱水縮合反応の反応性および立体選択性に大きく影響することを解明した。アミド結合は安定であるため、タンパク質をはじめとする生体高分子などを形成し、また材料科学や医薬品科学などで応用されており重要な役割を担っている。そのため、これまでの方法では実現が難しかったプロトン性溶媒中での触媒的不斉アミド化反応を可能とした本成果は、不斉合成反応開発の推進、さらには上記分野の発展に大きく寄与するものと期待される。また、本課題の元来の研究目的ではないが、上記トリアジンの研究で得られた知見を利用して、新しいベンジル化剤の開発、トリアジニルアンモニウムの効果的な脱離反応などの解明などに至った。本研究では、不斉合成反応によって疾患の分析が可能となるという新しい概念を創出するにあたり、そのための基盤となるカルボン酸の速度論的光学分割を用いた触媒的不斉アミド化反応の開発を進めている。触媒がラセミ体カルボン酸の不斉を制御する本反応は、これまでにない初の反応様式であり、生成物アミドの不斉中心を活かした医薬品などの合成を可能とする研究でもある。これまでの研究で、以下の知見を得た。(1)不斉合成反応による疾患の分析を行うため、タンパク質への反応について詳しい知見を得る必要がある。タンパク質への標識化反応、すなわちモジュール式アフィニティーラベル化法(MoAL法)のこれまでの研究から、第3級アミンを導入したリガンド分子(リガンド触媒)は厳密な設計を要しないことが示唆されていた。そこで、アビジン標識化反応に最適化したリガンド触媒を用い、リガンドが共通であるが標識反応部位となるカルボン酸側鎖(グルタミン酸)の存在位置が全く異なるストレプトアビジンについて標識化反応を行ったところ、標識化反応が進行することを見出した。この結果は、MoAL法が未知の標的タンパク質の探索に有用な実用的技術であることを示すもので、学会発表や論文発表を行った。(2)開発を行っている本不斉アミド化反応の重要な中間体は、トリアジニルアンモニウム塩である。このトリアジニルアンモニウムの研究で得られた知見を利用して、トリアジニルアンモニウムの効果的な脱離反応の開発や新しいベンジル化剤の開発などに至り、学会発表および論文発表を行った。該当年度の研究で、以下の知見を得た。(1)不斉アミド化反応において、その立体選択性や反応性を決める重要な因子のひとつは、トリアジン部位にあると考えられる。そこで、このトリアジン部位の置換基を変換することを計画し、電子的および立体的効果が反応に与える影響を調査することとした。まず不斉反応に先立ち、アミド化反応によってこれら置換基の評価を行った。その結果、良好な縮合剤活性を有する脱水縮合剤を開発することができ、その成果を学会で発表した。現在、論文発表の準備中である。このトリアジニルアンモニウム塩の研究で得られた知見から、トリアジニルアンモニオ基の効果的な脱離能を利用し、環状アンモニウム塩の合成法の開発に至り、論文発表の準備を行っている。また、トリアジニルアンモニウム塩の性質を利用し、新しいベンジル化剤の開発も行った。

また、上記トリアジンの研究で得られた知見を利用して、新しいベンジル化剤の開発、トリアジニルアンモニウムの効果的な脱離反応などの解明に至った。研究の中心であるラセミ体カルボン酸の触媒的速度論的光学分割を用いたアミド化反応において、触媒置換基やトリアジン置換基を変更し、脱水縮合反応の反応性および立体選択性への影響をすでに明らかとしている。特に触媒がラセミ体カルボン酸の不斉を制御する本反応は、これまでにない初の反応様式であり、学術的価値も高いと判断される。また、タンパク質への反応についての知見や、この研究結果を基に開発された反応などについて論文発表をするまでに至った。以上の理由からおおむね順調であると判断した。有機化学これまでの成果に基づいて、環状アミドであるラクタムの不斉合成を試みたり、また、ジカルボン酸のアミド化による不斉非対称化反応の検討を行う予定である。また、速度的光学分割法が100%の収率で生成物を得ることができないことに対し、N-アシルアミノ酸ラセミ化酵素を共存させた動的速度論的光学分割も検討する予定である。最後にタンパク質を対象とした不斉合成反応について検討を行いたい。研究実績に記したとおり今年度の研究の中心である触媒置換基やトリアジン置換基を変化させ、脱水縮合反応の反応性および立体選択性への影響を明らかとした。特にプロトン性溶媒中触媒による光学活性なアミドの合成は、これまで世界でまだ誰も成功していないことから、得られた成果は、脱水縮合反応における学術的に重要な知見となると思われ、波及効果が高いと期待される。研究室にストックされている試薬やガラス器具を活用することで、当初予定していた反応剤の原料や反応基質、ガラス器具の購入が抑えられたため。これまでの成果に基づいて、アミノ酸誘導体や有用と考えられるキラルカルボン酸など反応基質について検討を行う。不斉炭素が、アミド化されるカルボン酸のβ位やγ位となる基質についても検討を行い、高エナンチオ選択的反応となるようにし、生体内分子への応用に繋げる基盤とする予定である。また、触媒や反応中間体のX線結晶構造解析を行い、立体選択性発現のメカニズムについて研究を進める。今後は、反応剤自身の改良も必要となるため、この合成研究に使用する。また、論文投稿や学会発表にも使用する。平成25年度の研究では、必要とする試薬や反応物、溶媒を多量に使用せずとも、良好な結果を得るに至った。また、研究において必要な消耗品の使用方法を検討し、本年度の助成金の使用を抑えることができた。次年度の研究に使用する反応基質などは、平成25年度で使用した反応基質と比較して複雑で高価となることが予想されるため、これらの購入のための消耗品費を計上している。
口唇・口蓋裂発生抑制因子に関する研究ー自然発生、口唇・口蓋裂マウスによる本症発生抑制因子の追及

研究成果についての詳細は、平成2年度文部省研究成果公開促進費を受けて、朝日出版社より「口唇・口蓋裂発生機序に関する最近の進歩」との書名で、印刷中(平成2年2月28日発刊予定)である。ここでは研究成果は多岐にわたるので本研究で実行し成果を得たテ-マを連記する。第III章実験動物による口唇・口蓋裂発生機序の解明(1)走査型電子顕微鏡を用いた(1次及び2次口蓋の)形態学的解析(2)ドラックインデュ-スモデルにおける解析(3)疾患モデル動物を用いた口唇・口蓋裂の解析1)口唇・口蓋裂自然発生マウス2)コンジェニックマウスによる解析(4)金胎仔培養法による解析(5)卵巣移植法による口唇・口蓋裂発生の研究の可能性(6)医療用薬剤の本症に対する催奇形性、(7)環境要因と口唇・口蓋裂発生1)細菌感染による口唇・口蓋裂発生2)ウィルス感染による口唇・口蓋裂発生3)ホルモンによる口唇・口蓋裂発生4)貧血と口唇・口蓋裂発生5)その他の環境因子と口唇・口蓋裂発生(8)心奇形等他の合併症との関連の解析の可能性について研究を行い、論文発表又は学会発表をした。本年度は,全胎仔培養による解析を新たに開始するとともに従来の研究を継続した.また,その成果の一部を下記の如く学会発表した.1.麻酔薬による催奇形性に関する実験的研究. IV報,エンフルレンの催奇形性とO_2濃度による変化.第34回日本麻酔学会総会.2.麻酔薬による催奇形性に関する実験的研究. V報,エンフルレンの催奇形成とO_2濃度による変化.第30回日本形成外科学会総会.3.口唇,口蓋裂発生に関する実験的研究. IX報.妊娠時の血液性状の変化と口蓋裂発生について.第11回日本口蓋裂学会総会.4.口唇,口蓋裂発生に関する実験的研究. IIX報第11回日本口蓋裂学会総会5.同上X報,第12回日本口腔外科学会中部地方会6.同上XV報,第10回日本形成外科学会中部地方会7.同上XIV報,第32回日本口腔外科学会総会8.同上IX報,第4回日本障害者歯科学会総会9.同上XIII報,第4回日本障害者歯科学会総会10.同上XIV報,第4回日本障害者歯科学会総会11.同上XVI報,第59回東海小児外科学会12.同上XVII報,第59回東海小児外科学会13.同上XX報,第31回愛知学院大学歯学会総会14.同上XXI報,第31回愛知学院大学歯学会総会また,本研究にて得られた成果の一部を,第45回米国口蓋裂学会,並びに第9回世界麻酔学会において発表を許可され,現在準備中である.本年は、当初の予定の如く研究を行い、その成果の一部について下記の如く発表した。第32回日本形成外科学会総会学術集会;1989.4.20.(2演題)、第13回日本口蓋裂学会総会;1989.5.31(6演題)、第29回日本先天異常学会学術集会;1989.7.13.(3演題)、71st.AnnualMeeting and Scientific Sessions;1989.9.21(1演題)、第24回日本形成外科学会中部支部学術集会;1989.9.22(1演題)、第4回日本病院歯科口腔外科協議会総会;1989.10.26(1演題)、第34回日本口腔外科学会総会;1989.10.28(3演題)、第6回日本障害者歯科学会総会および学術大会;1989.11.26(1演題)、第23回日本小児外科学会東海地方会・第63回東海小児外科懇談会;1989.12.9(2演題)。

本年度は本研究最終年度として多くの報告を行った。ここでは文字数の関係で、発表項目のみ列挙する。第52報in vitroにおけるA/J系マウスの口唇裂発現に関する研究(第33回日本形成外科学会学術集会,東京,1990年4月)、第53報in vitroにおけるエストラジオ-ルの口唇裂抑制作用の検討(第14回日本口蓋裂学会総会,郡山・1990年、5月).第54報A/J系マウスの糖ユルチュイド誘発口蓋裂発現におけるウィルス関与について(第14回日本口蓋裂学会総会、郡山,1990年、5月)、第56報A/J系マウスの糖ユルチュイド誘発口蓋裂発現におけるウィルス関与について(第15回日本口腔外科学会中部地方会、岡崎1990年6月)、第61報顎、口腔領域における全胚培養法の検討(第36回愛知学院大学歯学会学術大会、総会、名古屋、1990年6月)、第56報自然発生口唇、口蓋裂(A/J系)マウスの一次口蓋発生に関する走査電子顕微鏡的考察(第35回日本口腔外科学会総会、岡山、1990年10月)
人類進化における遺伝子の動的進化

ヒト成人T細胞白血病I型ウイルス(HTLV-I)には由来不明のpXと呼ばれるDNA領域が存在する。本研究ではこのレトロウイルスHTLV-IのpX領域を指標とし、真核生物における動く遺伝子の1つとみなすことのできるレトロウイルスが宿主ゲノムへの内在化と放出をくり返す過程で生じた宿主ゲノムのウイルスゲノム内への取り込みとその再構成について進化的見地からの構造解析を行なった。まずpX領域全体をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション法によりヒトゲノムDNAにおける相同DNA領域の検索を行なった。ハイブリダイゼーションの条件を種々検討した結果、マイルドな条件下で多数の明確なバンドが6塩基認識酵素、4塩基認識酵素のいずれを用いても検出できた。またこれらのバンドのうちの複数で個体間に差がみられ、高い多型性を示すことが示唆された。一方、HTLV-IのpX領域は大きく、2つの部分に分けて考えることができる。すなわちpX40およびpX27タンパクをコードする遺伝子tatおよびrexを含む3^+側の領域と、これらの遺伝子が発現される際にスプライスアウトされる5'側の領域に分けられる。そこでこれら2つの領域からのDNAをプローブとしサザン法による解析を行なったところ、双方のプローブ共に多数の明瞭なDNAバンドを検出した。これら両者のバンドを合わせると、先のpX領域全体をプローブとして得られたバンドパターンと一致したが、5'側および3'側プローブで得られたバンドパターンおよびそれらのバンドの強さは両プローブ間で大きく異なっていた。更にpX領域と相同性を示すヒトDNAをクローニングした結果、オリゴピリミジン/オリゴプリンを単位とするくり返し構造が見い出された。これらの配列にはヒトのゲノム中に高頻度にくり返し存在しており、以上の結果はHTLV-Iのホストゲノムへの複数回の内在化によりpX領域を獲得したことを示唆する。
局所麻酔薬中毒に関する数学的検討

下顎孔伝達麻酔時に血管内に誤注入された局所麻酔薬は,総頸動脈まで逆流して内頸動脈に入ることがあるといわれているが,この説には賛否両論あり,意見の一致をみていない。本研究は誤注入された局所麻酔薬が動脈内の血液と経時的に混合してゆく様子をモデルにより調べ,脳に達する局所麻酔薬濃度を明らかにするものである。下顎孔伝達麻酔時の下歯槽動脈の誤穿刺を想定した流路モデル作成し,1188要素,700節点に分割したものを解析領域とした。流路モデルは総頸動脈で直径7mm,外頸動脈で3mm,下歯槽動脈で1mmとした。血流速度は血管中央で収縮期毎秒40cm,拡張期毎秒25cmとし,毎分脈拍は60回とした。なお血液は純粘性流体と見なし,血流速度は管中央から放物線状に分布するものとして各節点の血流速度を与えた。このモデルを有限要素分割し,各点の動脈血の流速を求めた。誤注入は局所麻酔薬(リドカイン)の濃度分布を針先において2%とすることで表現した。流路モデル内において流速により局所麻酔薬の濃度分布の変化を有限要素法を用いて演算した。演算のソフトウエアはFortranを用いた自作プログラムにより,ハードウエアは大阪大学大型演算機センターのACOS(NEC)を用いた。その結果、局所麻酔薬の濃度分布は血液の流速と密接に関係しており,誤注入時の血流速度が中毒発生に関与していることが分かった。また私のモデルでは内頸動脈に逆流させるには2.5秒に1.8cc注入するという,相当に速い速度で注入する必要がある事,誤注入時のタイミングも関係している事が分かった。
粉粒体における相転移ダイナミクスと非線形レオロジーの競合

相転移・不安定化現象に伴う強い非平衡状態と粉粒体の非線形レオロジーとの間の動的競合についての実験的研究を行った。本課題では、ウェットフォーム薄膜のDewetting(界面不安定化の一種)を例にとり、一粒子レベルの運動が関与する不安定化の起点から、中・後期過程のマクロな粗大化に至るプロセスの実時間・実空間観察を行った。特にウェットフォームの非線形レオロジーにより、粘性流体における従来型のスケーリング則がどのように破れるのかという点に着目し、粉粒体の相転移・不安定化ダイナミクスにおける新たなスケーリング則を見出した。粉粒体のレオロジーは、通常の流体とは全く異なるユニークな性質を示す。例えば、十分に弱い応力下での非線形応答や、外力(駆動力)の消失によるエネルギーの散逸などが挙げられる。これらの非線形レオロジーの理解は、非平衡物理学分野の大きな潮流の一つである。しかし、相転移や不安定化現象に伴う強い非平衡状態と粉粒体の非線形レオロジーの動的競合については未解明な点が多く残されている。本研究では、二次元系の一次相転移・不安定化現象の一つである(撥水)Dewettingを例にとり、粉粒体の非線形レオロジーより出現する非平衡過程(秩序化過程)における新たな動的スケーリング則と、それに付随する空間不均一性(パターン)の形成メカニズムの解明に取り組んでいる。平成25年度は、特にウェットフォーム(泡)に着目し、マクロレンズを搭載した高速度カメラを用いて、粉粒体膜の撥水による秩序化の素過程(平易に表現すれば、粉粒体膜に穴が空くプロセス)を1粒子レベルでの実空間・実時間観察を行った。当初の予想通り、構成粒子サイズが大きく、かつ粒子間相互作用の弱いウェットフォームという系の特徴を反映して、ダイナミクス自体が極めて遅くなり、転移の起点(瞬間)を直接捉えることに成功した。今後定量的な解析が必要であるが、転移が1つの泡(構成単位)の崩壊(破れ)から始まることを見出した。この初期における素過程と転移の中・後期におけるマクロな粗大化の関係は、ミクロとマクロをシームレスに繋ぐという観点から極めて興味深いと考えている。本課題の研究対象であるウェットフォーム(泡)は、粉粒体(巨視的な粒子の集合体)の一種であり、適度な外力下で「流れ」を有するユニークな物質群である。従来の粉粒体の研究では、そのユニークなレオロジー特性そのものに主眼を置いていたが、本研究では相転移・不安定化現象との動的競合に着目し、フォームの非線形レオロジーを利用することで、相転移ダイナミクスにおける新しいタイプの普遍性の構築を目指している。本研究では特に薄膜の不安定化現象の一種であるDewetting(撥水)に焦点を当て、非平衡過程における粗大化の新たなスケーリング則と、空間不均一性の形成メカ二ズムの解明に取り組んだ。平成25年度は高速度カメラとマクロレンズを併用した実験系の構築を主に行い、この不安定化の起点(核生成)を捉えることに成功した。平成26年度は、一粒子レベルの運動が関与する不安定化の始まりから、中・後期過程のマクロな粗大化に至るプロセスの解明に取り組んだ。この点については、核生成というミクロなスケールと粗大化過程というレオロジーとしての性質が関与するマクロなスケールをつなぐという観点から極めて興味深い。そして実験の結果として、フォームの粗大化過程は粘性流体の撥水で理論的に予測される線形成長則には従わず、フォームの有限の降伏応力を反映した緩和型(指数関数型)でスケールされることを見出した。更にその素過程では、上述したミクロな領域からマクロな領域へのクロスオーバー挙動は見られず、シームレスに指数関数型でスケール可能であることも分かった。今後の課題としては、Dewettingの起点となる場所での粒子配置(応力に弱い配置か否か)を特徴付けること、外力下(例えばフォーム薄膜を伸長した時の膜の穴開き、破壊)でのDewetting挙動の解明が挙げられる。後者については予算内で新たな実験系を構築し、引き続き研究を遂行している。液体物理学研究を遂行するための実験系の構築については概ね順調に進展しており、対象とする現象の観察自体は既に成功している。今後は、定量的な解析をするために、より理想的な実験系の構築が不可欠であると考えている。この観点からの克服すべき課題としては、単層の粉粒体膜の作成と、膜の撥水を自発的に起こすことが可能な撥水性の高い基板を用いる、という2点が挙げられる。これらの点については現在、より精密に制御されたロールコート(粉粒体膜を基板上にコーティングする手法)を用いることで、2層から3層程度の粉粒体膜の作成に成功している。また自発的な撥水を誘起する超撥水性基板についても購入予定である。また、自発的な撥水ではないが、外力下での撥水は容易に起こり(超撥水基板を必要としない)、かつ興味深い。

例えば、薄膜を地面に対して傾けることで、重力により粉粒体に流れが生じる。この流動は撥水を誘起する。この現象は、流動場下における相転移現象とのアナロジーからも魅力的な問題である。当初計画をしていた異方性粒子も非常に興味深いが、現在の実験系の状況を踏まえ、外力下での粉粒体の撥水の研究に優先的に取り組む予定である。(この点については、研究計画調書の多方面からの検討状況においても記載している。)当初購入を予定していたDigimo社製の高速度カメラより安価なディテクト社製のカメラを購入したため。Degimo社製のカメラは、その特性から高速度カメラでありながら長時間現象も同時に撮影することができるが、予備実験の段階で長時間撮影よりも高速度撮影の性能(画素数、フレームレート)が優れたディテクト社製のカメラの方が、本研究に適していると判断した。先の項目で、超撥水基板上での実験を今後の課題として挙げた。差額分(次年度使用額)はその基板の作成、もしくは購入の費用に充てる予定である。
３次元光位相計測システムの構築と細胞検査への応用

本研究では,厚みのある細胞や液中浮遊細胞の定量位相計測に向けて,3次元位相計測システムを構築した.はじめに精度低下の要因の一つである位相アンラッピング処理を必要としないスキャン型定量位相顕微計測システムを構築した.次に球面参照波を用いたデジタルホログラフィック顕微鏡における,最適な設計手法,オートフォーカス手法を提案し,確立した.これにより広視野・高精度な定量位相顕微計測に加え,垂直方向において異なる位置で浮遊しているような細胞に対しても,精確な位置特定が可能となった.これらの定量位相計測システムを用いて,細胞の機能と形態の相関性を実験により解析した結果,細胞検査への有用性を確認した.本研究では,3次元光位相計測システムとして,レンズレスフーリエ変換デジタルホログラフィック顕微鏡(LF-DHM)を試作し,細胞検査応用への基礎検討を行った.下記に概要を示す.デジタルホログラフィック顕微鏡における回折計算では,高速フーリエ変換を利用したフレネル回折計算が利用されることが多いが,位相重畳ノイズは顕微位相計測における重大な課題の一つになる.本研究では,高精度に広い面積の位相計測が可能なレンズレスフーリエ変換型顕微計測に着目し,その結像条件を利用することで,1回の高速フーリエ変換でのフレネル回折計算においても,振幅,位相情報ともに高精度計測が可能な新設計法を確立した.新設計法により試作したLF-DHMを評価したところ,空間分解能1 μm以下,計測面積は最大2 mm ×2 mm,位相分解能5 nmを得ることに成功した.さらに奥行き方向に対しコンピュータ上で再生距離を変えることで,2次元位相情報に加えて3次元位相計測を実現できることを確認した.次にデジタルホログラフィック顕微鏡における高精度な位相像の自動取得に向けてオートフォーカス手法の提案と実証を行った.位相顕微像を計測する際,サンプル設置時において数100μm単位でのサンプルの位置ずれが起こる.この位置ずれは精密な検査等において利用する場合は,細胞の浮遊状態や接着条件などに応じたエラーとなるため,最適なフォーカス距離を自動的に探す必要がある.今回,透明位相物体の強度分布に着目したオートフォーカス手法を提案し,区画に分けた焦点距離マッピングを行うことで広視野での高精度位相計測を実証した.さらに,細胞検査へ向けた基礎検討として,再生医療に利用されている角膜上皮細胞シートの計測を行い,欠落検査等への応用の可能性を示した.本研究では,厚みのある細胞や液中浮遊細胞の定量位相計測に向けて,3次元位相計測システムを構築した.はじめに精度低下の要因の一つである位相アンラッピング処理を必要としないスキャン型定量位相顕微計測システムを構築した.次に球面参照波を用いたデジタルホログラフィック顕微鏡における,最適な設計手法,オートフォーカス手法を提案し,確立した.これにより広視野・高精度な定量位相顕微計測に加え,垂直方向において異なる位置で浮遊しているような細胞に対しても,精確な位置特定が可能となった.これらの定量位相計測システムを用いて,細胞の機能と形態の相関性を実験により解析した結果,細胞検査への有用性を確認した.申請者のこれまで構築してきたスキャン型位相計測システムに、スキャンエラー補正と校正デバイスによるキャリブレーションなどを導入し、高精度かつ高ダイナミックレンジ測定が可能な非侵襲・無染色位相計測システムを実現した。これにより、従来の技術(位相像を取得時に位相接続処理を用いた技術)では計測が困難な数nmから3λ程度の光路長変化量を持つ細胞を計測できることを積層培養細胞を用いて実験的に示した。次に、細胞検査への応用として、正常細胞とがん細胞を対象にして、細胞内の平均光路長変化量(Average Optical Path-length Difference:AOPD)を用いて、識別アルゴリズムを構築した。上位100個のAOPDを用いることで、がん細胞誤受け入れ率(がん細胞を誤って正常細胞として判断してしまうエラーレート率が0%の時、正常細胞誤拒否率(正常細胞を誤ってがん細胞と判断してしまう率)は5%20%という識別結果を得た。特に転移性乳がんや転移性大腸がんではEpCAMが低い傾向にあることから、これらが識別できることはがん識別において極めて有用である。さらにすでに臨床応用されつつある、皮膚(線維芽細胞)、軟骨組織(軟骨細胞)および骨髄由来間葉系幹細胞を対象とし、位相情報が細胞機能である増殖活性、II型コラーゲン等の産生との相関があることを確認した。最後にスキャン型の位相計測システムの調整が複雑性の課題を打破するとして、位相シフト型デジタルホログラフィック顕微鏡の開発を行った。画像再構築の計算手法などを工夫することで、位相変化1波長分のRMS(Root Mean Square)が0.127rad(光路長変化量:12.8 nm)の精度を達成し、空間分解能は、0.98umとなり高空間分解能化を実現した。本年度は,昨年度に提案したホログラフィック顕微鏡におけるオートフォーカス手法を改良し,広視野でより高精度な3次元位相計測システムを実証した.このオートフォーカス手法により,垂直方向において異なる位置で浮遊しているような細胞の位置の特定が可能となった.高精度な広視野計測では,サンプル設置時における数100μm程度微小なずれや傾きにより,焦点距離が変動しぼけが生じる.この影響により,細胞が固定され,焦点位置が同一面内であったとしても,再生距離が最適な焦点位置からずれてしまい,再生像が劣化する.そこで,昨年度提案したオートフォーカス手法を利用し,最適な焦点距離を検討した.

このオートフォーカス手法は,透明位相物体において強度分布の変化が微小であることに着目し,強度分布のヒストグラムの上位と下位領域の平均強度の差を算出し,その最小値から焦点距離を推定する手法である.また,物体はある一定の大きさを持つので,光軸中心からずれた位置から伝搬する物体光によるぼけも生じる.そのため,撮像面の光軸中心からの各位置における位相差を算出し,補正する必要がある.これらを考慮し,直径18 μmのプラスチックビーズをサンプルとし,計算から求まる位相差と,計測範囲の中央から面方向(XY軸)に数百μm単位でずらした際の,焦点の合う再生距離Zを比較した結果,オンフォーカス位置が計算値通りの曲線上にあることを確認した.本オートフォーカス手法により,サンプル設置位置のエラーや,垂直方向において異なる位置で浮遊しているような細胞位置の特定を自動的に行うことが可能となった.光情報処理当初計画していた3次元光位相計測システムの試作に成功し,細胞検査応用に対する基礎的な実証も進展した.マッハツェンダー型干渉計に基づく簡易な光学系に閉ループフィードバック制御に、さらにスキャンエラー補正と校正デバイスによるキャリブレーションを施すことで、数nmから3λ程度の光路長変化という高ダイナミックレンジ測定を可能にした。3λ以上の計測が可能になったため、非侵襲・非接触で、ある程度の無色透明の積層された細胞シートや細胞膜内・外での作用の可視化が可能となった。これらのスペックは現状開発されている位相計測システムにおいて最も高精度かつ高ダイナミックレンジである。さらにこのシステムの精度のおかげで、従来の位相計測システムでは得られなかったEpCAMの発現量が低いがん細胞でも検出できることが判明した。この結果は工学分野ではなく医療分野においても極めて新しい知見であると考えている。今後、3次元の定量位相情報に加え,新たな光学物性や,力学物性などを計測可能な非染色・非接触断層顕微解析システムを構築を目指す.さらに,異常・正常細胞検査への適用を目指す.昨年度、開発した高精度位相計測システムは培養細胞における活性度の判断やがん細胞の識別を定量的に識別するシステムとして有効であることが確認できた。今後、スキャン速度の向上、アライメントの簡易化機構の導入、対象物体の違いを考慮した解析プロセスの自動化を行い、OCTや偏光計測などと組み合わせることで、新たな多次元情報を計測への展開を行っていく。具体的には、1.「特徴的な要素のみ計測できるようにシステムの最適化・簡素化、識別への検討2.「新たな多次元情報を計測可能な位相計測システムの構築3.「バイオ研究者用プロトタイプシステムの設計」を行っていく。1.特徴的な要素のみ計測できるシステムの最適化・簡素化、識別への検討:まずは、培養細胞の形と増殖、分化機能(軟骨らしさ)の相関、積層細胞の測定を行う。次に細胞培養の経時的な変化、解像度による特徴抽出、データベース化の検討を行っていく。干渉計測において常に課題にアライメントがある。
乳酸菌由来DNAの腸管における抗炎症作用に関する研究

乳酸菌Lactobacillus caseiのゲノムDNA上に発見した抗炎症作用を示す14種のオリゴDNA中で最も高頻度に含まれるODN 7F (TTTTGCCG)が上皮細胞および免疫細胞において抗炎症作用を示し、IBDモデルマウスの症状を軽減したことより、7Fが新たなIBD予防・治療薬となる可能性が示した。さらに、7Fの抗炎症作用にはTLR9が関与すること、また、その作用の発現にはTLR9だけではなくHsp90を介したHsp70の発現増加が重要であることなど、抗炎症作用の機序の一部を明らかにし、乳酸菌から特定した抗炎症作用を持つODNの創薬への可能性を示した。腸管における炎症には、上皮細胞だけでなく、免疫細胞も重要な役割を果たす。そこで、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1にIBDの原因の一つとして知られるLPSを添加し、炎症の指標となるCOX-2およびiNOSの発現増加を測定することにより、免疫細胞におけるODNの抗炎症作用をODN7-F (TTTTGCCG)、ODN-7R (CGGCAAAA)およびODN-8F (TTGTCACC)を用いて評価した。その結果、7FのみがLPSによるCOX-2およびiNOSの両方の発現増加を抑制した。以上の結果、免疫細胞において7Fが強い抗炎症作用を持つことが分かった。RNAiによりTLR9の発現を抑制したCaco-2細胞では、7FのIL-8遊離抑制作用は完全には消失しなかった。そこで、TLR9以外の作用機構として、heat shock protein (Hsp)に着目した。Hsp90はDNAとの結合によりそのATPase活性が阻害されて、NF-κβの核内移行を抑制する作用を持つHsp70の発現を増加させることが知られている。そこで、7FとHspの関係について検討した結果、7FはHsp90に高い親和性を持ち、そのATPase活性を阻害することが分かった。また、7FはCaco-2細胞およびマウス大腸でHsp70の発現を増加させた。また、RNAiによりHsp70の発現を抑制したCaco-2細胞では、7FのIL-8遊離抑制作用が完全に消失した。以上の結果、7Fの抗炎症作用には、TLR9およびHsp90を介したHsp70の発現増加という2つの経路が関与することが分かった。(1) D2905株の死菌体を曝露したCaco-2細胞では、Elafinの分泌量が曝露時間および菌体濃度比例して有意に増加した。一方、生菌体を曝露したCaco-2細胞では、Elafinの分泌増加は観察されなかった。以上より、死菌化により生成した菌体成分がElafinの分泌に関与している可能性が示唆された。(2)D2905株死菌体のElafin分泌作用における菌体成分の関与を調べた結果、D2905株のゲノムDNAによってElafinの分泌量が増加した。(3)Caco-2細胞において細菌由来のDNA認識に機能するToll様受容体9 (TLR-9)の発現をsiRNAで抑制した結果、ゲノムDNAによるElafinの分泌は抑制された。従って、D2905株の死菌体によるEafinの分泌量増加は、TLR-9を介したゲノムDNAの作用によることが示唆された。Lactobacillus casei以外の乳酸菌ゲノムDNAに存在する抗炎症性ODN配列の出現頻度を特定するために、Caco-2細胞からの抗炎症性ペプチドelafinの産生を促進させたLactobacillusplantarumD2905株の全ゲノムDNAシークエンスを実施したが、contig間連結のためのシークエンスが未完了で抗炎症性ODN配列頻度の特定に至っていない。DSS誘発性大腸炎マウスに対するODN投与の影響については実施が出来ていない。L. caseiのゲノムDNAで特定した強い抗炎症作用を示すオリゴデオキシシヌクレオチド(ODN)である7F (TTTTGCCG)の免疫細胞と大腸炎モデルマウスにおけるODNの抗炎症作用およびその作用機構を検討し、ODNを利用した抗炎症薬を創出するための基礎的研究を行った。腸管における炎症には、上皮細胞だけでなく免疫細胞も重要な役割を果たすので、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1にIBDの原因の一つとして知られるLPSを添加し、炎症の指標となるCOX-2およびiNOSの発現増加を測定することにより、免疫細胞におけるODNの抗炎症作用を7Fを用いて評価した。その結果、7FはLPSによるCOX-2およびiNOSの両方の発現増加を抑制した。更に、7Fによる抗炎症作用へのTLR9、Hsp70、Hsp90、NF-κβ/Iκβ-αの関与を検討した結果、7Fの抗炎症作用には、TLR9およびHsp90を介したHsp70の発現増加という2つの経路が関与することが分かった。DSS投与IBDモデルマウスを用いてODNのマウス大腸炎に対する症状軽減作用を検討した結果、7Fの投与により、大腸炎の指標であるDAI値が減少し、更に、大腸の短縮および好中球遊走に対して抑制作用を示した。また、COX-2、iNOSの大腸におけるmRNA発現量は、7F投与で発現増加が抑制され、7FがIBDモデルマウスの症状を軽減することが分かった。L.

plantarum D2905株について、抗炎症性ペプチドElafinの発現をCaco-2細胞で調べた結果、死菌体の曝露によりElafinの分泌量が上昇し、その分泌にDNAの関与が示唆された。D2905株のゲノム塩基配列を決定し7F配列の頻度を調べたが、その存在比は低く他の配列の関与が示唆された。乳酸菌Lactobacillus caseiのゲノムDNA上に発見した抗炎症作用を示す14種のオリゴDNA中で最も高頻度に含まれるODN 7F (TTTTGCCG)が上皮細胞および免疫細胞において抗炎症作用を示し、IBDモデルマウスの症状を軽減したことより、7Fが新たなIBD予防・治療薬となる可能性が示した。さらに、7Fの抗炎症作用にはTLR9が関与すること、また、その作用の発現にはTLR9だけではなくHsp90を介したHsp70の発現増加が重要であることなど、抗炎症作用の機序の一部を明らかにし、乳酸菌から特定した抗炎症作用を持つODNの創薬への可能性を示した。本研究は、乳酸菌のゲノムDNAから特定したODNの抗炎症作用の検討およびその作用機構の解明を行うことで、ODNを抗炎症薬として臨床応用へと展開するための基礎的な研究を行う事を目的としており、平成26年度においては、当初の計画通り、(1) THP-1細胞に対するODNの抗炎症作用および(2) ODNによる抗炎症作用へのTLR9、Hsp70、Hsp90、NF-κβ/Iκβ-αの関与を検討した。その結果、研究実績の概要に記した一連の結果を得ることが出来たため、おおむね順調に進展していると判断した。DSS誘発性大腸炎マウスに対するODNの予防・治療効果を検証する。大腸炎に対するODNの予防効果の検討では、DSSを投与する1週前よりODNの経口投与を開始する。治療効果の検討では、DSSの投与終了後にODNの経口投与を開始し、大腸炎の症状改善を評価する。炎症の評価は、体重減少、下痢、血便、大腸の短縮、好中球遊走の指標であるミエロペルオキシダーゼ活性の増大、組織のHE染色を指標にして行う。また、大腸からmRNAを抽出後、リアルタイムPCRを用いて、MIP-2 (ヒトIL-8のマウスホモログ)、COX-2、iNOSのmRNA発現量を測定しODNの抗炎症効果を評価する。生物系薬学今後は、in vivoにおけるODNの抗炎症効果を検証するために、「DSS誘発性大腸炎マウスに対するODNの予防・治療効果」について検討を行う。炎症の評価は、体重減少、下痢、血便、大腸の短縮、好中球遊走の指標であるミエロペルオキシダーゼ活性の増大、組織のHE染色を指標にして行い、更に大腸からmRNAを抽出し、リアルタイムPCRを用いて、炎症関連因子であるMIP-2 (ヒトIL-8のマウスホモログ)、COX-2、iNOSのmRNA発現量を測定し抗炎症効果を評価する。また、他のLactobacillus属やそれ以外の乳酸菌種においても、そのゲノムDNA上に存在する抗炎症性のODN配列を特定する。年度末にDNAシークエンサーが故障し、DNAシークエンス関係の消耗品費として執行できなかった。DNAシークエンサーの故障が継続しているため、シークエンスの外注費用として使用する他、平成28年度分の助成金と合わせて消耗品費に充当する。