hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタファー的検索の定式化とそのHTML文書検索への応用

テキストコンテンツを索引語の集合とみなす立場では、演繹データベースに文ベクトル間の類似性測度を内包述語化して扱う従来研究と同じになることから、各テキストが持つ言語構造をできるだけ反映できる類似性判定手法を与えた。具体的には、(1)まず、形態素解析と格解析の結果導出できる概念グラフの時系列データとして、各テキストコンテンツを表現し、(2)テキスト間の類似性を、共通したより抽象的なイベントの系列(一般には部分列)として捉え、(3)過度の抽象化を抑制し、計算論的に高速にしかも意味的にもある程度の妥当性を保証させる目的で、汎化限界と呼ばれるパラメータを与え、単調性の性質に基づいて有効な枝刈り探索を実現するボトムアップ探索アルゴリズムを設計・実装・評価した。その結果、25個程度のグラフ系列からなるテキストの場合は1分以内に、また、50個程度の概念グラフ系列からなるテキストの場合は10分程度で、共通な汎化イベント列を算出できることを確認した。前年度に与えた、テキストコンテンツに対する構造汎化手法を、HTML文書のメタファー的検索(GのようなAを探す問題)のために必要な技法に拡張し、アルゴリズムの高速化を行った。具体的には、(1)タグとテキストコンテンツからなるHTML文書に対する構造汎化を定めるために、テキスト部分の概念グラフをノードに、HTMLタグをロールとみなしたHTML概念グラフを新たに導入し、昨年度与えた極大類比構成アルゴリズムをHTML概念グラフの極大類比を求めるものに拡張した。(2)次に、メタファー的なHTML文書検索方式として、一つの比較的に抽象的なHTML文書を検索の目的文書Aとし、比喩的例示を与えるGとしては、複数の例示文書群を与えるとする。その前提のもとに、例示文書群の汎化でAの具体化になっているものを求めることにより、Aであって、かつ、例示文書の共通性質を持つ、最も極大なもの(極大類比)を算出する方式を策定した。極大類比に包摂されるものを検索質問「GのようなA」にヒットさせる。さらに、Aとテキスト中の語彙の包摂関係が電子化辞書の品質に大きく依存する問題点を解消するために、実際にはAと概念的に近いA'で所与の例示文書群の汎化を抑制するアルゴリズムに改良した。(3)構造汎化の計算量の問題を克服するために、評価関数のもとに、最大評価値を持つ極大類比のみを高速に算出するアルゴリズムを実装し、その有効性を検証した。(3)の手法を(2)に組み込んだものは、タグ数およびテキストコンテンツが50文程度のものに対しては、3秒程度で計算が終了し、比較的に小規模のHTML文書群の処理方式としては十分に有効であることを確かめた。
転写因子Bach2の標的遺伝子の機能的検証

免疫担当細胞であるBリンパ球は、外来抗原により活性化されると抗体を分泌する形質細胞へ最終分化を遂げる。その過程でIgM型抗体から他のIgG型抗体へアイソタイプが変換されるクラススイッチで抗原処理に多様性を生み出す。しかし、その過程での転写調節機構は不明であった。本研究では、転写因子Bach2を中心とした遺伝子制御ネットワークが、Bリンパ球がクラススイッチするのに重要であることを見いだした。Bach2ノックアウトマウスは、B細胞の活性化応答のなかでもクラススイッチ応答や体細胞突然変異の導入などの胚中心応答に障害がある。また、我々は転写因子Blimp-1をBach2の直接標的遺伝子として同定した。Blimp-1は、形質細胞分化を促進する一方で、胚中心応答に抑制的である可能性が示唆されている。そこで、Bach2ノックアウトB細胞での脱抑制的に高いBlimp-1遺伝子の発現が胚中心応答障害の原因かを検証するために、Bach2・Blimp-1ダブルノックアウト(DD)マウスを作成し、解析をおこなった。先ず、同マウスの脾臓B細胞の初代培養実験系でクラススイッチを検討した。その結果、Bach2ノックアウトB細胞では、クラススイッチしたB細胞が誘導されないのに対し、DDマウス由来のB細胞からはスイッチしたB細胞が誘導された。このとき、クラススイッチに必須の酵素AIDの遺伝子発現の障害が救済されることをあきらかにした。これらの結果は、B細胞活性化応答後のBlimp-1遺伝子の発現が、Bach2によって抑制されることがB細胞のクラススイッチ応答の実行には必須であることを示唆している。しかしながら、Bach2ノックアウトB細胞でみられるB細胞分化の障害は、DDマウスのB細胞では回復しないことから、Blimp-1以外のBach2標的遺伝子には、B細胞で重要な役割をする遺伝子が含まれることを示唆しており、引き続き標的遺伝子の探索と検証をおこなっている。Bach2ノックアウトマウスは、B細胞の活性化応答のなかでもクラススイッチDNA組換えや体細胞突然変異の導入などの胚中心応答に障害がある。そこで、Bach2ノックアウトB細胞での脱抑制的に高いBlimp-1遺伝子の発現が、胚中心応答障害の原因なのかを検証するために、Bach2およびBlimp-1ダブルノックアウト(DD)マウスを作成し、解析をおこなった。同マウスの脾臓B細胞を用いて、初代培養系でLPSやサイトカインによりクラススイッチを誘導した。このとき、クラススイッチに必須の酵素AIDの遺伝子発現の障害が救済されることを明らかにした。さらに、クラススイッチ過程では、Bach2がBlimp-1遺伝子の発現を抑制し、Blimp-1による転写因子Pax5の遺伝子の転写抑制を阻止することが、Pax5によってAID遺伝子が活性化されて発現するために必要であることを示した。従って、B細胞の活性化応答では、クラススイッチするB細胞への分化、形質細胞へ分化するB細胞の運命決定を制御する遺伝子ネットワークを明らかにした。そこで、Bach2は、形質細胞分化の遺伝子ネットワークを抑止し、クラススイッチ応答を制御する遺伝子ネットワークへの切り換えるために重要な役割を担うことを示した。
非侵襲な手法を用いた生体評価パラメータの総合と応用化

【目的】本研究では高齢化が進むなか、寝たきりや痴呆の予防を目的として、非侵襲で非観血な方法で測定する骨密度が骨折危険度・身体活動低下度の予測指標となり得る可能性を探るため、身体状況の異なる施設の高齢者の骨密度およびADL,介護度などの身体状況を詳細に検討した.【方法】老人福祉センターに通所し、グランドゴルフ部に所属している6286歳の47名、介護老人福祉施設に入所している71102歳の88名を対象とした。骨密度は超音波骨密度測定機InsightA1000(Lunar社)による踵骨部位のStiffnesss値および年齢補正を行なった同年比較%値を骨密度指標とした。ADL、生活習慣、病歴等問診表による調査を実施した。特養では要介護度、食事形態、障害老人日常生活自立度、痴呆性老人日常生活自立度、骨折等についてのパラメーターを調査した。【結果および考察】AD上と骨密度間に相関関係が見られ(r=0.53、p<0.001)、ADLが高いほど骨密度が高かった。要介護度が高いほど骨密度が低く(r=-0.34、p<0.002)、食事形態が軟食になるほど骨密度は低くなった(r=-0.317、p<0.005)。歩行状態(r=-0.531、p<0.001)、障害老人日常生活自立度(r=-0.526、p<0.001)でも自立から寝たきりへと状態が進むにつれて骨密度が低下した。痴呆性老人目常生活自立度、骨折経験、骨折回数、骨折時期の違いによる骨密度には有意な相関はなかった。以上のことより骨密度は現時点での身体活動度をよく反映し、障害老人日常生活自立度や歩行状態についても相関があったことから、骨密度が身体活動低下度の指標、寝たきりの予測指標となる可能性が示唆された。ヒトの健康を阻害あるいは亢進する因子の複合的な影響を解明するため、運動・ストレス・栄養代謝等を複合的に統合した健康評価法を確立することを目的とする.これまでエネルギー代謝、血糖・血圧調節など食品がもつ生体調節機能の科学実証、メカニズムの解明を非観血・非侵襲によるヒト実験系で行ってきたが今年度は呼吸循環器系のパラメータとして心拍出量が有効か検討を進めた。1.方法------用いた拍出量計(Biotex製)はインピーダンス法を原理とした非侵襲なものであり,本来心疾患患者を対象としたものであるため,ストレスや栄養代謝,運動による微妙な心拍出量の変化を補足できるかどうか,トウガラシ(0.2g)をメルクマールとし,安静,運動時における変化をモニターし,呼吸循環器系に影響を与える呼吸数,酸素消費量,心拍も同時に測定を行った.2.被験者------21-22才の健康な男子5名を被験者し,トウガラシ摂取と摂取なしのコントロールについて,安静時2時間,および運動時(安静30分,エルゴメーター120W運動30分,回復30分)の測定を行った.3.結果-----安静時には様々な試行錯誤の結果,比較的安定した測定値が得られ,トウガラシ摂取時には1回拍出量はコントロールより有意に低下し,呼吸商,酸素消費量の上昇などの変化を補足することが確認できた,心拍出量の変化を非侵襲法であるインピーダンス式心拍出量計で測定可能であり,また食品の影響なども十分捕足できる事を確認した,しかしながら,'運動時での結果はインピーダンスと心拍のうまく同期した状態では測定できず,運動時,今回は自転車こぎの運動からおこる体動が原因と考えられ,運動時に特に変化が大きいと推察できる心拍出量の測定には運動法や測定方法についてさらに検討が必要であることことが明らかとなった.1.非侵襲な手法による酸素運搬能の評価【目的】摂取食品が運動時の心拍(HR)に及ぼす影響を評価するために、HRの変動要因である酸素運搬能、酸素利用能等のうち、酸素運搬能の指標である心拍出量(CO)増加量(一回拍出量(SV)とH_Rで規定される)に注目し、心臓ポンプ機能評価システム確立を目的として、被験者、運動負荷、食品(トウガラシ)の量の違いによる心臓ポンプ機能の応答について検討した。【結果】被験者の運動能力の違い:鍛錬者のCOはSVとHRの両者により増加、非鍛錬者ではSVの増加はなく、HRによる増加が主であった。運動負荷:相対的に負荷を揃えた75%HRmaxのCO増加は鍛錬者、非鍛錬者ともにSV増加は限界に達し、HRに依存した。摂取トウガラシ量の影響:トウガラシ嗜好性の高いものはコントロールに比べ、有意にSVを増加、HRを減少させ、低いものは有意にHRを増加、SVを減少させた。2.非侵襲な骨密度測定による寝たきり度の評価【結果】介護高齢者のADLと骨密度間に相関関係が見られ(r=0.53、p<0.001)ADLが高いほど骨密度が高かった。

歩行状態(r=,0531、p<0.001)と障害老人日常生活自立度(r=-0.526、p<0.001)でも自立から寝たきりへと状態が進むにつれて骨密度が低下した。痴呆性老人日常生活自立度、骨折経験、骨折回数、骨折時期の違いによる骨密度には有意な相関はなかった。骨密度は現時点での身体活動度をよく反映し、障害老人日常生活自立度や歩行状態についても相関があったことから、骨密度が身体活動低下度の指標、寝たきりの予測指標となる可能性や介護現場や高齢者の日常において骨折の予防につながる可能性が示唆された。【目的】本研究では高齢化が進むなか、寝たきりや痴呆の予防を目的として、非侵襲で非観血な方法で測定する骨密度が骨折危険度・身体活動低下度の予測指標となり得る可能性を探るため、身体状況の異なる施設の高齢者の骨密度およびADL,介護度などの身体状況を詳細に検討した.【方法】老人福祉センターに通所し、グランドゴルフ部に所属している6286歳の47名、介護老人福祉施設に入所している71102歳の88名を対象とした。骨密度は超音波骨密度測定機InsightA1000(Lunar社)による踵骨部位のStiffnesss値および年齢補正を行なった同年比較%値を骨密度指標とした。ADL、生活習慣、病歴等問診表による調査を実施した。特養では要介護度、食事形態、障害老人日常生活自立度、痴呆性老人日常生活自立度、骨折等についてのパラメーターを調査した。【結果および考察】AD上と骨密度間に相関関係が見られ(r=0.53、p<0.001)、ADLが高いほど骨密度が高かった。要介護度が高いほど骨密度が低く(r=-0.34、p<0.002)、食事形態が軟食になるほど骨密度は低くなった(r=-0.317、p<0.005)。歩行状態(r=-0.531、p<0.001)、障害老人日常生活自立度(r=-0.526、p<0.001)でも自立から寝たきりへと状態が進むにつれて骨密度が低下した。痴呆性老人目常生活自立度、骨折経験、骨折回数、骨折時期の違いによる骨密度には有意な相関はなかった。以上のことより骨密度は現時点での身体活動度をよく反映し、障害老人日常生活自立度や歩行状態についても相関があったことから、骨密度が身体活動低下度の指標、寝たきりの予測指標となる可能性が示唆された。
唾液腺の脂肪酸を共有結合したタンパク質の生理的意義

高等動物細胞における外来情報伝達機構の概要が明らかになりつつあるが、この機構の一部に脂肪酸化タンパク質(acylated protein;AP)の関与の可能性が指摘されている。そこでラットだ液腺細胞をモデル系としてAPの脂肪酸鎖およびタンパク質の両面から検討することによってその生理的機能を明らかにしようと試みた。ところでAPの脂肪酸鎖は生体膜リン脂質(PL)脂肪酸鎖と共通のアシルCoaから導入されることから、高純度に精製した各種オルガネラ標品の各膜リン脂質脂肪酸鎖組成を検討したところ、それぞれのオルガネラおよび各リン脂質に特徴的な差異が見られた。さらに得られた分泌顆粒画分はin vitro系で形質膜との間に特異的な相互作用を認め、開放分泌観察のモデル系としても使用可能であることが明らかになった。一方、生体膜からのAP抽出のため、各種界面活性剤を検討したところ、非イオン性界面活性剤、中でもTriton X-114を用いたphase separation法が効果的である示唆を得た。この方法で耳下腺細胞の各オルガネラ膜タンパク質中の脂肪酸組成を検討したところ、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸含量か高く、生体膜PLの脂肪酸鎖組成と異なっていた。そこで、アシルCoA前駆体である遊離脂肪酸(FFA)の分析と、だ液分泌刺激時のその動的変化を検討したところ、APの脂肪酸鎖組成とは大きく異なり、APへの脂肪酸導入時には非常に厳密な基質特異性が存在することが示唆された。APの機能を検索する目的で、フェニレフリンおよびホルボールエステル(PMA)によるだ液分泌刺激時のAPタンパク質部分、及び脂肪酸鎖の動的変化を標識脂肪酸を導入した細胞を用いて検討した。しかしながら、用いた実験条件下では膜タンパク質側および脂肪酸鎖側の両者とも刺激による変化は観察されなかった。今後はAPの単離・精製を進め、生化学的、物理化学的特性を明確にするとともに、機能の検索をし、APの生理的意義を解明する。唾液腺細胞中の脂肪酸化蛋白質(acylated protein:AP)の細胞内局在性を明確にするために高純度の形質膜画分や各種オルガネラの分画法を検討した.その結果,ホモジナイズした耳下腺細胞では庶糖及びPercoll密度勾配遠沈法による分画で,代表的な局在酵素の活性発現の特性観察から供試し得る画分が得られた.このうちの分泌顆粒はin vitro系では形質膜との間に特異的な相互作用を認め,開放分泌観察のモデル系としても使用可能であることを明らかにした.本顆粒の膜脂質組成はミクロソーム由来のものなどと比較して明らかに特異的であり,ホスファテジルエタノールアミン含量の外にリゾ燐脂質含量がたかく,電子スピン共鳴法による膜流動性の観察結果もこれら組成の特性と相関する物性を示した.APの生化学的特性を検討する目的から,各種試料でアシル基を標的とした抽出法を検索し,非イオン性界面活性剤のTriton Xー114を用いるphase separation法が効果的であり,これによって分画したAPのアシル基の確認と,蛋白質部分の電泳的特性が明らかになりつつあるが,精製を進めることにより,所謂,アンカー物質の特性,並びに膜機能と相関した蛋白質燐酸化酵素活性の関与について検討が進行中である.主要唾液腺の膜燐脂質構成脂肪酸の特性比較は既に完了した.

一方, AP生合成の基質となるアシル基については各種アシルーCoAを基質とし,アシル基転移反応に係る酵素系の検索を行い,本酵素系の各唾液腺における活性発現の特性の外,薬理的な唾液分泌刺激を行うと特有の性性変動を認めることを明らかにした.以上のように,現在進行中の実験を含めて引き続き来年度はこれらの成果を基礎とし,機能と相関したAPの細胞内動態を標識した脂肪酸あるいは酢酸のレベルから追求していく.今回の主要機器であるラジオガスアナライザーは目的とするがガクロマトグラフィーとの接続に技術的な問題があったが,既に解決した.細胞外からの各種刺激の受容並びに細胞内伝達機構の概要が明らかにされつつあるが、この機構の一部にはユニークなタクパク質(脂肪酸化タンパク質、acylated protein;AP)の関与の可能性が指摘されている。このタンパク質の脂肪酸組成は特徴的で、アシルCoAを共通の脂肪酸鎖供与体とするリン脂質(PL)脂肪酸組成と大きく異なっている。そこで、唾液腺細胞をモデル系としてこのAPを検索し、タンパク質及び脂肪酸の両面から検討することによって、その生理的機能を明らかにしようと試みた。生体膜からのAP抽出のため各種界面活性剤を検討したとこめむ、非イオン性界面活性剤、中でもTritonX-114を用いた相分離分画抽出法が有効である示唆を得た。ところで、ラット耳下腺細胞の生体膜タンパク質中の脂肪酸組成をミトコンドリア、ミクロソーム画分で分析するとパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸が含量が高く、中でもこの傾向はミトコンドリア画分で著明であった。この結果は我々が明らかにしている各種生体膜PLと大きく異なっていた。そこで、AP,PLの両脂肪酸鎖供与体の全駆体である遊離脂肪酸(FFA)の分析と、唾液分泌刺激時のその動的変化を検討したところ、PLの場合はある程度FFA組成を反映しているものの、APとは大きく異なり、APへの脂肪酸導入時いは非常に厳密な気質特異性が存在することが示唆された。唾液腺細胞を用いてAPの機能を検索するには、唾液分泌刺激時のAPタンパク質部分、及び脂肪酸鎖の動的変化を観察することが有効である。そこで標識脂肪酸を取り込ませた細胞をフェニレフリン及びホルボールエステル(PMA)で刺激し、膜タンパク質組成の変動を検討した。しかしながら、用いた実験条件下ではタンパク質側及び脂肪酸鎖側の両者とも刺激による変化は観察されなかった。今後はAPの単離・精製を進め、生化学的、物理化学的特性を明らかにすると共に、機能の検索をし、APの生理的意義を解明する。
共生による新規性創出の遺伝子基盤の解明

本研究ではアブラムシとその細胞内共生細菌をモデルに用いて、共生による新規性創出の遺伝子基盤の解明を目指した。次世代シーケンシングなどの新技術を用いた探索の結果、宿主昆虫が共生器官で大量に発現する新規の分泌ペプチド群を発見しBCRファミリーと命名した。あるBCRは細菌の増殖に影響を与えることもわかった。BCRはアブラムシ類のみが持つ遺伝子群であるが、宿主が共生細菌を制御するためにアブラムシの系統で特異的に進化した遺伝子かもしれない。「共生」は生物が新規機能を獲得する上で重要な役割を果たしているが、その新規性創出の遺伝子基盤はほとんどわかっていない。本研究では「共生による新規性創出は、異種間相互作用による遺伝子ネットワークの進化の結果である」という仮説を提唱し、昆虫=微生物の共生系、特にアブラムシとその細胞内共生細菌Buchneraの絶対共生系をモデルに用いて検証する。進化発生学の理論に立脚し、新規性創出のキーとなる転写因子・シグナル分子及びそれら標的遺伝子を同定することが目的である。すでにトランスクリプトーム解析により共生器官で多数のアブラムシ特異的遺伝子、新規の分泌タンパク質が高発現していることを確認していた。今年度これら新規分泌タンパク質10種類以上のmRNA発現パターンをin situ hybridizationで調べた。その結果、すべての分泌タンパク質が同一の時空間摘発現パターンを示すことが明らかになった。つまり、胚発生におけるstage7と呼ばれるcellular blastodermに相当する時期--興味深いことにこの時期に共生細菌が母から胚に感染する-に共生器官原基の予定核の近傍で発現を開始し、以降、共生器官でのみ特異的に高レベルで発現する。さらに、分子進化的解析を行ったところ、これらの新規分泌タンパク質はお互い一時配列はあまり似ていないが、システイン残基が多い点等似た特徴を共有することがわかった。この分子は、宿主から分泌され共生細菌へターゲッティングされると予想しており、来年度以降検証する。偶然にも、システインリッチな分泌タンパク質がマメ科植物=根粒菌の共生に重要な役割を果たしていることが、本年度報告され(Van de Velde 2010, Science)、彼らとの交流も開始したところである。平成23年度は、「共生器官に発現するアブラムシ特異的分泌タンパク質の機能解析」において大きな進展があった。すでにトランスクリプトーム解析により共生器官で多数のアブラムシ特異的遺伝子、新規の分泌タンパク質が高発現していること、10以上の遺伝子のmRNA発現パターンをin situ hybridizationで検討済みであった。H23年度にはこれらを追試、データ・整理を行い、これらの新規分泌タンパク質をBCRと命名し、論文としてまとめた(論文投稿中)。さらに、BCR遺伝子のタンパク質レベルの機能解析に向けて、HisタグをつけたBCRリコンビナントタンパク質の大腸菌や酵母での大量発現系を試みた。多数のジスルフィド結合をもつためか、標準的な大腸菌の大量発現系はうまくいかなかったが、プロトコールを工夫することにより1つのBCRでは発現と精製に成功した。また、Pichia酵母の系ではほとんどのBCRで大量発現が可能となりそうな予備実験結果が得られており、来年度の研究の進展が期待できる。BCRは根粒菌のNCRとの構造的・機能的類似性を見いだし、植物研究者との共同研究も開始した。またアブラムシ=Buchneraの共生に関する総説論文を発表した。本研究では、昆虫=微生物の共生系、特にアブラムシとその細胞内共生細菌Buchneraの絶対共生系をモデルに、新規性創出のキーとなる分子を同定することが目的である。本年度は、新規性創出のキーとなる分子として、新規分泌たんぱく質BCRを同定し論文発表することができた(Shigenobu & Stern, 2013, Proc Roy Soc B)。次世代シークエンサーを使った共生器官のトランスクリプトーム解析により共生器官に選択的に発現する遺伝子を探索し、アブラムシ特異的な新規分泌タンパク質ファミリーを発見し、それらのmRNAが共生器官特異的に発現することを明らかにした。これらは、100アミノ酸残基以下の短いペプチドをコードし、分泌シグナルをN末に持ち、C末側にシステインを6個もしくは8個持つ特徴的な一次構造持っており、BCR遺伝子群と命名した。さらに、BCR遺伝子の機能解析に向けてBCRリコンビナントタンパク質の発現と精製を試みた。試行錯誤の上、酵母の大量発現系を利用することにより、いくつかのBCRの発現と精製に成功した。

1つのBCRについてはこれを抗原に抗体を作成した。またあるBCRを大腸菌に添加したところ細胞膜の透過性を変化させる活性があることが明らかになった。システインリッチ分泌ペプチドは動植物に広く見られ、コミュニケーションや異種間相互作用に関わっている。例えばマメ科植物タルウマゴヤシの根粒の内部では400以上のシステインリッチ短ペプチドが組織特異的に発現し、これらの一部は共生細菌の内部まで運ばれて共生の確立と維持に必要である。アブラムシの共生系でも同様な共生システムの制御がBCRを介して成されているのではないかと考えられる。2つの小課題のうち「共生器官に発現するアブラムシ特異的分泌タンパク質の機能解析」については、計画以上に進展している一方で「転写因子D11の制御する遺伝子ネットワークの解明」が実験技術上の困難がありやや遅れているので、総合的に判断して「(2)おおむね順調に進展している」とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。2つの小課題のうち「共生器官に発現するアブラムシ特異的分泌タンパク質の機能解析」については、大量発現系の構築に成功したので精製タンパク質を利用したin vitroアッセイや抗体を利用した研究を進める。「転写因子D11の制御する遺伝子ネットワークの解明」は次世代シークエンサー実験の技術上の困難があり計画よりやや遅れていたが、申請者は他の研究課題でChIP-seqのノウハウを共同研究者から得る機会を得たので、その情報をとりいれて実験系を再構築する。
SUMOリガーゼPIAS/Sizファミリーのドメイン構造と分子認識機構の解明

SUMO化翻訳後修飾は被修飾タンパク質の分子認識様式を変化させて広範な細胞機能の制御にかかわっている。SUMO化修飾に必要な3種類の酵素(E1,E2,E3)のうち、標的タンパク質の識別において中心的な役割を果すE3はSUMO化反応で最も重要な酵素といえる。本研究では、動・植物および酵母のRING型SUMOリガーゼE3であるPIAS/SizファミリーのSAPドメインとPHDフィンガーの構造と機能を解析した。本研究は、動・植物および酵母のRING型SUMOリーガーゼE3であるPIAS/Sizファミリーの作用機構を構浩生物学的見地から解明することを目指し、本年度は以下の研究を行った。1.酵母およびイネSiz1のN末端SAPドメインの立体構造決定とDNA認識機構の解析溶液NMR法を用いて立体構造を決定した。イネのSAPはヒトPIAS1のSAPと同様に、4本のヘリックスで構成されるバンドル構造を形成するのに対して、酵母のSAP構造は5本のヘリックスで形成され、イネやヒトのSAPにはないヘリッソクスα5がα2及びα4と相互作用するために、DNA結合に関与するα2ヘリックスの空間配置が変化レていることを見出した。ゲルシフトアッセイとNMR滴定実験によりDNA結合能と結合様式を解析し、酵母のSAPはイネやヒトのSAPよりもDNA結合の特異性が高いことを明らかにした。2.イネSiz1のPHDフィンガーの立体構造決定とメチル化ヒストン結合能の解析PIAS/Sizファミリーのうち植物のSizに固有のPHD)フィンガーの機能を明らかにするために、溶液NMR法を用いて立体構造を決定した。さらに、NMR滴定実験から、イネSiz1のPHDは4位のリシンがメチル化されたヒストンH3(H4K4me3)に結合することが明らかになった。H3K4のメチル化率が低下するにつれて、PHDの結合能も低下していき、非修飾ピストンH3にはほとんど結合しない。また、このPHDはヒストンH3の9位、27位、36位めリシンやピストンH4の20位のリシンがトリメチル化されたペブチドフラグメントには結合せず、H3K4me3にのみ特異的に結合する。本研究は、動・植物および酵母のRING型SUMOリガーゼE3であるPIAS/Sizファミリーの作用機構を構造生物学的見地から解明することを目指し、本年度は以下の研究を行った。1.酵母およびイネSiz1のN末端SAPドメインの立体構造解析とDNA認識機構の解析前年度に得られた結果をもとに、SAPドメインの構造とDNA認識機構における生物種特異性と普遍性を明らかにして論文を作成し、PROTEINSに受理された。2.イネSiz1のPHDフィンガーの立体構造決定とメチル化ヒストン結合の解析PIAS/Sizファミリーのうち植物のSizに固有のPHDフィンガーの機能を明らかにする目的で、前年度に引き続いて溶液NMR法による構造機能解析を行った。本年度は、4位のリシンがトリメチル化されたヒストンH3(H3K4me3)とPHD複合体の立体構造モデルを構築するとともに、複合体形成における2位アルギニンのメチル化の影響を検討し、PHDは4位と2位がともにメチル化されたH3R2me2aK4me3に対してより高い結合能を示すことを見出した。これは、既報のPHDではH3K4me3の2位アルギニンがメチル化されると結合能が失われるとの結果とは逆の結果である。そこで、H3R2me2aを用いて同様の相互作用解析を行ったところ、イネSiz1のPHDはH3R2me2aに結合すること、さらには、その結合能はH3K4me3への結合よりも高いことが明らかになった。アルギニンがメチル化されたヒストンを認識する構造モチーフはこれまでに報告例がなく、今回のイネSiz1のPHDが初めてである。1.植物のRING型SUMOリガーゼSiz1のPHDフィンガーのメチル化ヒストン認識機構の解明前年度には、PIAS/Sizファミリーのうち植物のSizに固有のPHDフィンガーがヒストンH3の4位のリシンがトリメチル化されたH3K4me3のみならず、2位のアルギニンがジメチル化されたH3R2me2aにも結合することを見出した。本年度は、PHDのE3R2me2a認識残基を特定してPHD-H3R2me2a複合体のモデル構造を構築した。さらに、2種の点変異PHD(Q110AとE112A)のH3R2me2a結合能が天然型PHDの50%程度に低下することを明らかにし、H3R2me2a結合におけるQ110とE112の機能的重要性を検証した。

本年度までの成果を総合的に勘案すると、植物のSiz1はSAPドメインのDNA結合とPHDのR2またはK4がメチル化されたH3への結合を介してクロマチンを認識し、その構造と機能を調節している可能性が示唆される。2.植物のRING型SUMOリガーゼSiz1のPHDフィンガーとSUMO結合酵素E2の相互作用解析ごく最近、シロイヌナズナのSUMO結合酵素E2がSiz1を介してSUMO化されることが報告され、この反応においてはSiz1の典型的なE2認識ドメインと想定されるSP-RINGとPHDがそれぞれE2を1分子ずつリクルートしてE2がSUMO化されるモデルが提唱された。そこで、このモデルを構造生物学的見地から検証するために、溶液NMR法によるPHDとE2の分子間相互作用解析を行ったが有意な相互作用は検出されなかった。Siz1を介したE2のSUMO化反応経路については再考が必要である。
阻害剤をプローブとするアロマターゼ反応メカニズムの解析

いまだ不明な点のあるアロマターゼ反応メカニズムの解明を目的として、アロマターゼ活性中心部位での阻害剤・基質との結合にみられる多様性をふまえ、阻害剤を有効にプローブとして用い、以下の成果を得た。1.天然基質ADならびにDHEAの3-デオキシ体1と2について、それぞれの19-oxo体5と6の立体選択的NaB^2H_4またはNaB^3H_4還元により[19,19-^2H_2]19-hydroxy体3と4または[19R-^3H]19-ols3と4とその異性体[19S-^3H]体を合成した。2.[19,19-^2H_2]-19-Hydroxy体3と4をヒト胎盤ミクロゾームとともにNADPH存在下インキュベート。19-oxo体5と6への変換をGC-MSにて分析した。このとき、非標識基質3と4からの5と6への変換と比較し、19-hydroxy体→19-oxo体への変換にアイソトープ効果の全くないことをまず明らかにした。3.ついで、[19R-^3H]-と[19S-^3H]19-ols3と4を前述同様インキュベートし、アロマターゼ反応により遊離する^3H_2Oと^3HCOOHを測定した。その結果、19-hydroxy体→19-oxo体への変換では、より有効な基質である19-hydroxy-3-deoxyDHEA(4)で19-hydroxyADの場合と同じに19-pro-R水素が立体選択的に、一方、より強力な阻害剤19-hydroxy-3-deoxyAD(3)では、pro-R:pro-S=75:25の選択性で脱離することが証明された。また、C(10)-C(19)結合の切断反応も同定された。4.一方、化合物1と2の4位置換体によるアロマターゼ阻害の様相を明らかにするとともに、2α-置換ADや2,4,や6-置換エストロゲンのアロマターゼ阻害の構造活性相関を明らかにし、新たなアロマターゼ活性中心部位空間構造を構築することができた。1.ADならびにその3β-hydroxy-5-ene異性体(DHEA)を出発原料とし3-deoxyAD(1)とその5-ene異性体(2)の19-hydroxy体(3と4)と19-oxo体(5と6)をそれぞれ化学的に合成した。次いで,この19-oxo体をNaB^3H_4との還元反応に付し、[19R/19S-^3H]標識19-hydroxy体3と4をそれぞれ得た。これら^3H標識体は、TLCやHPLCで精製後、逆同位体希釈法により同定した。それぞれの比放射活性は、HPLCでの吸光度と放射活性から求めたところ、前者では0.61mCi/mmol、後者では、0.55mCi/mmolであった。これら標識体の19位立体化学は、立体化学既知のADとDHEAの[19S-^2H]19-hydroxy体を標準品の[19S-^2H]

化合物3と4へ誘導し、3-deoxy-19-oxo体5と6を同様に重水素化試薬で還元したものと、これら標準品との^1H-NMR解析から求めた。その結果、化合物5ではR:S=10:90、他は30:70と判明した。2.得られた[19S-^3H]19-hydroxy体(3と4)を[^3H]19-oxo体(5と6)に酸化後、非標識NaBH_4還元に付し、19位立体化学の逆転した[19R-^3H]化合物(3と4)を得た。3.[19R-^3H]ならびに[19S-^3H]19-hydroxy体(3と4)をヒト胎盤ミクロゾームとともにNADPH存在下インキュベートし、放出される^3H_2Oと酸性物質を、酸性またはアルカリ性条件下凍結乾燥することにより分画した。まず、酸性物質画分の^3HCOOHについて、9-methylanthranyl esterへ誘導化し逆同位体希釈法により同定した。1.[19-^3H]19-hydroxy-3-deoxyステロイドの19-oxo体への変換過程における19位の立体選択性を検討するためには、そのアイソトープ効果の有無を確認することが必須であることが判明した。そのため、まず、[19,19-^2H_2]19-hydroxy-3-deoxyステロイドを合成した。すなわち、19-oxo-3-deoxyandrostenedioneとその5-ene異性体を限定量のNaB^2H_4で還元し、それぞれ[19-^2H]19-hydroxy体に変換した。ついで、これらをPCD酸化とNaB^2H_4に順次付し、目的とする[19,19-^2H_2]19-olsを得た。ついで、これらを非標識体と1:1の混合物とし、ヒト胎盤ミクロゾームとともにNADPH存在下インキュベートし19-oxo体への変換における重水素アイソトープ効果を、19-oxo体の生成と残存基質のアイソトープ比によりGC-MSを用いて分析した。その結果、この変換にはアイソトープ効果の無いことを明らかにし、[1β-^3H]標識体を用いる立体化学の解析が可能であることを立証した。2.Δ^1-ADの19-methylと19-halogeno(Cl,Br,I)体を合成し、それらのアロマターゼ阻害活性を検討した。その結果、これらはK_i値が30-600nMの拮抗阻害剤であった。この中では、19-methyl体が最も強力な阻害活性を示し(K_i:30-40nM)、19-I体のK_i値は390-600nMと大きなものであった。また、19-Cl体は不可逆的阻害剤(K_I870nM,k_<inact>0.038min^<-1>)の特性を示すとともに、GC-MS分析の結果、アロマターゼの基質となりestrogenに変換されることが判明し、アロマターゼ反応機構解明に重要な知見が得られた。1.前々年度で合成した[19-pro-R-^3H]ならびに[19-pro-S-^3H]19-hydroxy-3-deoxy-4-eneステロイドならびにそれらの5-ene異性体を、ヒト胎盤ミクロゾームとともにNADPH存在下インキュベートし、放出される^3H_2Oと^3HCOOHを分画した。まず、生成する^3HCOOHの同定はジアゾ化反応により生成する9-hydroxymethylanthranylformateへと誘導後、逆同位体希釈法により行った。この^3H_2Oと^3HCOOHの放出は、インキュベーション時間15minまで、一方、ミクロゾーム蛋白は500μgまで直線的に増加した。この初速度条件下、これらの放出は、基質ADと阻害剤4-OHADの添加により効率的に抑制された。このことから、アロマターゼ触媒によるC(10)-C(19)結合の切断反応も明確となった。つぎに、初速度条件下[19-pro-R-^3H]ならびに[19-pro-S-^3H]体からの^3H_20と^3HCOOH
高アンモニア耐性微細藻類による環境水中の栄養塩負荷削減・リン回収システムの研究

アンモニア耐性の高い微細藻類を利用して、人為的発生源から排出される高負荷リンおよびアンモニアを除去すると同時にリン資源を回収するシステムの構築に向けた基礎科学研究を行うことを目的とする。本研究ではまず、生物多様性の高い熱帯・温帯域から現地藻株を確立し、アンモニア耐性の高い微細藻類の探索を行う。アンモニア耐性藻類株から、細胞内リン蓄積能を有する高性能な藻株のスクリーニングを行い、選定した高性能藻株を対象にリン蓄積率に及ぼす環境因子の影響を総合的に明らかにする。最後に、リン蓄積能が最大となる環境条件下で実廃水からの栄養塩除去・リン回収の有用性評価実験を行う。
RNAウイルスの進化的脆弱性に関する研究

ウイルス粒子の最外殻を構成する外被蛋白質は、宿主免疫との攻防に曝され、常時変化する。その際、ウイルスの存続に必須の蛋白質機能を維持する必要があり、無秩序な変化は許されない。しかし、変化の秩序を司る原理はほとんどわかっていない。本研究では、この制御原理の解明を目的とした。研究成果は、ウイルスの高度可変蛋白質の進化上の弱点や進化の方向性のより良い理解に繋がり、感染症対策研究の基盤を提供する。(1)ノロウイルスカプシドの変化の秩序:公共データベース由来のカプシド全長配列(n=930)のアライメントより相互相関行列を構築し、ランダム行列理論によりノイズを除去することで、“必然的に"共変異している部位(セクタ)を推定した。カプシドには4つのセクタが存在し、カプシドの機能領域(血液型抗原結合部位周辺、および二量体境界面)に位置することがわかった。セクタにはエピトープが含まれることから、抗体の標的となるアミノ酸残基は、機能的ネットワークを構成し、他の特定部位と共変異する必要があることがわかった。(2)ヒト免疫不全ウイルスエンベロープgp120の変化の秩序:Gp120の全長構造モデルを構築し、分子動力学計算によりアミノ酸残基の溶液中の揺らぎの相互相関行列を構築し、ランダム行列理論によりノイズを除去することで、“必然的に"連動する部位(セクタ)を推定した。Gp120には3つのセクタが存在し、機能領域を連結する未報告のアロステリックパスが存在することがわかった。以上、数理科学の理論とコンピュータ科学を取り入れて、蛋白質の機能を維持しながら秩序だった変化を行うためのアミノ酸ネットワークを包括的に予測した。今後、セクタの生物学的機能を実験で、物理化学的機能をコンピュータ科学で検証する予定でいる。26年度が最終年度であるため、記入しない。数学・物理学の理論、及び計算科学や情報科学の手法を用いて易変異性RNAウイルスの変化の制約や未知の機能部位を明らかにし、進化上の弱点を特定することを目的とする。平成25年度(研究初年度)は、ノロウイルスの粒子表面に存在する可変性構造蛋白質(カプシド)に働く変化の制約を検証した。ノロウイルス全国流行株の全ゲノム情報を収集し、ゲノムと蛋白質の経時変化を調べた。その結果、ゲノム配列や他の構造蛋白質は年々多様性が増大する一方で、カプシドはほとんど変化しないことを見出した。さらにハミング距離を調べることで、カプシドの高度可変部位にも強い変化の制約が働くことを示した。さらにランダム行列理論を用いて必然的に共変異するアミノ酸群が存在することを明らかにし、単独の変異を許容しないアミノ酸残基ネットワークが存在することを示した。以上の結果から、一部のウイルス株が勝利者(全国流行株)となると、その後はカプシドの変化が必然的に強く抑制されることがわかった。流行株カプシドの優れた構造・機能(免疫逃避能や宿主指向性)を維持するためと考えられる。カプシドは抗体の主要標的であることを勘案すると、ノロウイルス流行株は免疫学的制御が可能と考えられる。実際に、この流行株は数年間流行した後に衰退した。カプシドが変化できないため、この株への集団免疫が強化されるに従い、感染感受性の宿主が減少したためと考えられる。これらの発見は、一般に高度可変とされるノロウイルス粒子表面蛋白質にも、自然界では強い変化の制約が働くことを世界で初めて明らかにしたもので、新しい視点でのウイルス学研究の創成につながる。また、流行株の免疫学的弱点を示唆するもので、ウイルスとヒトとの攻防を理解し、ノロウイルス感染症の制御法を論理的に開発するための基盤情報となる。

今後、セクタの生物学的機能を実験で、物理化学的機能をコンピュータ科学で検証する予定でいる。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.当初の予定どおり、数学、計算科学、情報科学の解析手法を取り入れながら研究を進め、一般には高度可変とされるノロウイルス粒子表面の構造蛋白質に、自然界において強い変化の制約が働くことを立証できた。成果は国内外の学会で発表し、論文にまとめて投稿した(審査中)。学際的なアプローチを取り入れることで、ノロウイルス蛋白質の構造・機能・進化の研究に新しい視点を導入したと考えている。2.当初の計画には無かったが、領域内の共同研究を進めた。我々の研究を通じて強化される数学、計算科学、情報科学の解析基盤を領域内の他の研究グループに利用してもらうことにより、領域内の研究推進への貢献を目指した。俣野研究グループ(霊長類動物モデル)と共同研究を実施し、ウイルス変異の包括的解析(次世代シークエンサーの使用と解析)を支援し、ウイルスの変異蛋白質の構造特性情報を提供した(J. Virol. 88:3598-3604, 2014)。また、連携研究者とも共同研究を実施し、ウイルス蛋白質の構造特性情報を提供した(J. Virol.87:11447-11461, 2013, J Virol. 87:5424-36, 2013)。初年度研究で、ウイルス粒子表面の可変性蛋白質にも強い変化の制約が働くことが明らかになった。そこで平成26年度以降は、変化の制約を司る要因について解析を進め、当初の研究目的(進化上の弱点の検証)の達成をめざす。平成26年は、(1) -(5)を進める。(1)公共データベース等の大容量アミノ酸配列情報を基に相互相関行列を構築し、共変異する部位を包括的に抽出する。(2)蛋白質立体構造の分子動力学計算情報を基に揺らぎの相互相関行列を構築し、溶液中で連動して揺らぐ部位を包括的に抽出する。(3)ランダム行列理論を用いて偶然による見かけの相関を排除する。(4)固有ベクトル成分の分析により、必然性をもって共変異する、あるいは揺らぐアミノ酸群(セクター)を同定する。これらは、蛋白質の機能的ネットワークを形成し、進化の方向性を司る部位で、進化の制約の要因になる。(5)情報科学の手法を用いてセクターの可変性を調べる。(6)変異導入解析等を用いてセクターの生物学的役割を調べる。(7)分子動力学法を用いてセクターの構造学的役割を調べる。以上により、ウイルスの粒子表面蛋白質について、セクターの有無、並びにセクターの構造、機能、可変性の情報を収集する。それらの情報を用いて、ウイルスに固有の生存戦略を維持するために「必然的に」変化しにくい蛋白質領域の存在を検証する。一方で、引き続き領域内の共同研究を推進し、我々の研究グループの汎用性の高い解析プラットフォームを他の研究グループに利用してもらうことにより、領域内の研究推進への貢献を目指す。
結び目と３次元多様体の量子トポロジー

結び目のKashaev不変量と双曲体積を関連づける体積予想は、量子トポロジーと双曲幾何を結びつける懸案の予想であり、最近15年間世界的にこの分野の中心的な話題となってきた。本研究の目標は、体積予想を多くの結び目について解決し、Kashaev不変量の漸近展開として得られるべき級数を新しい結び目不変量として研究することである。これにより、量子トポロジーと双曲幾何を融合する新しい研究テーマが創出されることが期待される。また、3次元多様体の量子不変量の漸近展開に双曲体積が現れることを主張する「3次元多様体の体積予想」も近年定式化されており、8の字結び目を整数係数手術して得られる3次元双曲多様体に対してこの予想が成立することを筆者は証明して、論文を執筆した。また、漸近展開の準古典極限の項にはReidemeister torionが現れることが観察され、いくつかの例に対してそれを証明して、論文を執筆した。計画していた国際会議と研究集会は、予定通りに開催され、十分な成果を挙げた。Kashaev不変量と量子不変量の漸近展開の研究も、予定通りに遂行中である。今年度も、国際会議と研究集会を開催する予定であり、準備をすすめている。Kashaev不変量と量子不変量の漸近展開についての研究もすすめる予定である。また、3次元多様体の量子不変量の漸近展開に双曲体積が現れることを主張する「3次元多様体の体積予想」も近年定式化され、これについての研究もすすめた。とくに、漸近展開の準古典極限の項にはReidemeister torionが現れることが観察され、いくつかの例に対してそれを証明した。Kashaev不変量の漸近展開の研究も、予定通りに遂行中である。Kashaev不変量の漸近展開についての研究もすすめる予定である。
吸着脂肪族ケトン・アルデヒドの光化学反応における固体表面の効果

前年度までの研究成果を踏まえ,今年度は吸着媒としての多孔性バイコールに微小量のNi酸化物を担持,その上に吸着したケトンの光化学反応性を検討した.バイコール上にNi酸化物を担持させると, Niイオン担持量の増加とともにケトンの光分解反応の収率が著しく増大し,極大を経てその後減少することが解った.このことは,微量のNi酸化物をバイコールに担持することにより,ケトンの光化学反応性が向上することを示すものである.Ni酸化物担持バイコールでは,ケトンの吸着後も表面OH基のIR吸収の変化は見られなかった.一方,四配位Ni^<2+>イオンのC-T吸収がケトンの吸着量の増加とともに減少し,代わって六配位のNi^<2+>イオンに基づく新たな吸収が出現することが解った.担持したNi^<2+>イオンの量を増加させた時の四配位Ni^<2+>イオンのUV吸収強度の変化は,ケトンの光分解収率の変化と同様の変化を示し,光分解収率の増加が四配位Ni^<2+>イオンの濃度と良い対応関係にあることが明らかになった.ケトンのリン光スペクトルとその励起スペクトルの波長域には,バイコールだけの場合と比較して大差は認められなかった.一方,リン光の収率は大きく変化し, Ni酸化物を担持したバイコール上に吸着した場合には,ケトンのリン光収率が著しく増大することが解った.リン光の減衰から求めた励起三重項の寿命は, Ni酸化物を担持していないバイコール上のものと比較し約10倍長くなることが解った.以上の結果を考慮すると, Ni酸化物を担持したバイコール上ではケトンは選択的に四配位Ni^<2+>イオン上に配位子と吸着し,このような孤立した状況下では光励起により生成するケトン励起三重項の失活は起こり難く,寿命が長くなりその結果光分解反応の収率の向上が見られるものと考えられる.このように吸着媒表面を化学的に修飾することにより,その上に吸着した化合物の光化学反応性が向上することが解った.前年度までの研究成果を踏まえ,今年度は吸着媒としての多孔性バイコールに微小量のNi酸化物を担持,その上に吸着したケトンの光化学反応性を検討した.バイコール上にNi酸化物を担持させると, Niイオン担持量の増加とともにケトンの光分解反応の収率が著しく増大し,極大を経てその後減少することが解った.このことは,微量のNi酸化物をバイコールに担持することにより,ケトンの光化学反応性が向上することを示すものである.Ni酸化物担持バイコールでは,ケトンの吸着後も表面OH基のIR吸収の変化は見られなかった.一方,四配位Ni^<2+>イオンのC-T吸収がケトンの吸着量の増加とともに減少し,代わって六配位のNi^<2+>イオンに基づく新たな吸収が出現することが解った.担持したNi^<2+>イオンの量を増加させた時の四配位Ni^<2+>イオンのUV吸収強度の変化は,ケトンの光分解収率の変化と同様の変化を示し,光分解収率の増加が四配位Ni^<2+>イオンの濃度と良い対応関係にあることが明らかになった.ケトンのリン光スペクトルとその励起スペクトルの波長域には,バイコールだけの場合と比較して大差は認められなかった.一方,リン光の収率は大きく変化し, Ni酸化物を担持したバイコール上に吸着した場合には,ケトンのリン光収率が著しく増大することが解った.リン光の減衰から求めた励起三重項の寿命は, Ni酸化物を担持していないバイコール上のものと比較し約10倍長くなることが解った.以上の結果を考慮すると, Ni酸化物を担持したバイコール上ではケトンは選択的に四配位Ni^<2+>イオン上に配位子と吸着し,このような孤立した状況下では光励起により生成するケトン励起三重項の失活は起こり難く,寿命が長くなりその結果光分解反応の収率の向上が見られるものと考えられる.このように吸着媒表面を化学的に修飾することにより,その上に吸着した化合物の光化学反応性が向上することが解った.
脱窒細菌の産出する新種のアズリンのX線構造解析と生体内電子伝達機構の解明

脱窒菌Achromobacter xylosoxidans NCIB11015の産出する電子伝達タンパク質アズリンは菌体内にただ1種類のみその存在がしられていたが、X線構造解析によって2種のアズリンが存在することを明らかとした。従来法で精製したが、種結晶化法を用いたため、2種のうちただ1種のみが結晶化したと考えられる。2.5Å分解能でのX線構造解析の結果、得られた電子密度は以前報告されていたアミノ酸配列と一致しないことから、本結晶が新種のアズリンの結晶であること、またその構造情報を新知見としていち早く論文投稿したが、その後英国Montfort大学のDr.S.Hasnainらのグループが我々と同一のタンパク質を使って1.9Å分解能での構造を発表した。しかし、報告された銅イオンの配位構造は、ステラシアニン以外のすべてのブルー銅タンパク質の配位子であるメチオニンが配位しておらず、我々の解析結果とは異なってた。現在我々も1.8Å分解能までのデータ収集を行い、より精度の高い構造精密化を進めている。また、アズリン1についても世界で初めて結晶化に成功した。X線回折実験を行い、この結晶は空間群がC2の単斜晶系に属し、格子定数もa=130.3,b=54.2,c=75.0Åであることがわかった。分子置換法による構造解析にも成功し、非対称単位中に存在する4分子の配向を決定することにも成功し、現在2.5Å分解能での精密化を進めている。これらは両アズリンの構造精密化を進めた後、合わせて論文報告を行う予定である。また、同じ脱窒菌に属するAchromobacter xylosoxidans GIFU1051についても新種のアズリンが存在する可能性が示唆されたため、GIFU由来の亜硝酸還元酵素およびアズリンを精製した。精製方法を検討した結果、本菌体からも新種のアズリンが精製された。同一菌体内に種類の異なるアズリンが存在することが発見されたのは、C1資化性菌Methylomonas J、脱窒菌Achomobactere xylosoxidans NCIBに次いで3種目となった。これら亜硝酸還元酵素、アズリン1.、アズリン2は本年度すべて結晶化に成功し、現在、それぞれ2.0Å、2.5Å、2.0Å分解能での構造解析を進めている。
ダブルケア（育児と介護）を夫婦協働で行う「コ=ケアラー」モデルの開発

日本において少子高齢化とともに出産の高齢化が進み、親の介護と未就学児の育児が同時に進行する「ダブルケア」を行う者が増加している。本研究の目的は、ダブルケア(育児と介護)を行う夫婦の、とりわけ男性側の主体性を高める要因を検討し、夫婦協同のもと育児や介護を行う「コ=ケアラー」モデルの開発を行うことである。方法としてインタビューによる質的調査で夫婦協働のメリットや男性の主体性を高める要因を明らかにし、モデルの概要を創り上げ、量的調査によりモデルの検証を行い「コ=ケアラー」モデルを開発する。ダブルケアに対応し、夫婦の関係性も保ちつつ育児や介護により離職せずに夫婦が望む人生を送るための示唆を得る。