hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノアクチュエータとして機能するタンパク質モータプレスチンの駆動機構の解明

プレスチンは内耳蝸牛内の外有毛細胞の細胞膜に存在する膜タンパク質である.これまで,電子顕微鏡や原子間力顕微鏡を用いてプレスチンの構造解明が試みられてきた.しかし,プレスチンの構造は未だ不明である.そこで本研究では,プレスチンを精製し,人工脂質膜に埋め込み,そして原子間力顕微鏡で観察することで,プレスチンの詳細な構造を明らかにすることを試みた.まず,FLAGタグ融合プレスチン発現細胞から,プレスチンを含む膜タンパク質を細胞から界面活性剤を用い可溶化した.そして,膜タンパク質溶液からFLAGタグアフィニティカラムを利用してプレスチンを精製した.並行して,人工脂質膜を雲母基板上に自己組織化能を利用し作製した.さらに,界面活性剤を利用し,脂質膜を弱らせた.続いて,界面活性剤に覆われた精製プレスチンを脂質膜に加え,界面活性剤を希釈法により除去し,プレスチンを脂質膜に再構成した.その後,再構成したプレスチンを原子間力顕微鏡で観察した.原子間力顕微鏡で脂質膜を観察した結果,高密度に存在するリング形状の構造物が確認された.それらの構造物の直径を計測すると,11.0±1.3nm(n=42)であった.この値は,過去に報告されているプレスチンの直径と良く一致する.本研究では,プレスチンを精製しているため,脂質膜に存在する構造物は全てプレスチンであると考えられる.以上のことから,本研究で観察された構造物はプレスチンであるとみなせる.すなわち本研究の結果は,プレスチンが脂質膜中で直径約11nmのリング形状を形成することを示唆する.本研究は世界に先駆けてプレスチンを高分解能で可視化したものであり,聴覚の研究領域に留まらず,膜タンパク質の研究領域においても重要な成果である.2007年度は,プレスチンの変異体解析を行い,プレスチンを構成するアミノ酸それぞれの役割を明らかにすることを目指した.プレスチンが属するSLC26ファミリー内で高度に保存されている,プレスチンの127番目から始まるアミノ酸配列GTSRH,及びプレスチンに特異的に存在する122番目及び225番目のメチオニン(M122,M225),192番目及び415番目のシステイン(C193,C415),428番目のスレオニン(T428)に着目し,研究を行った.着目したアミノ酸にそれぞれ変異を加え,変異プレスチンの特性と野生型プレスチンの特性を,パッチクランプ法及びウェスタンブロッティング法により比較した.その結果,GTSRH配列はプレスチンの正しいフォールディングに不可欠であることが明らかになった.一方,M122,C193,C415,T428はプレスチンの機能発現に重要ではないことが示唆された.興味深い結果として,M225に変異を導入すると,プレスチンの活性が上昇することが示された.活性が上昇するメカニズムの解明にはより詳細な検討が必要であると考えられる.また,研究過程で,機能が低下した変異プレスチンを発現させた細胞をサリチル酸ナトリウムと共に培養すると,変異プレスチンの機能が回復するという結果を得た.変異タンパク質の機能を,遺伝子操作なしに回復させることができる本技術は,遺伝病の治療法として応用可能であると考えている.2008年度は,まずプレスチンの変異体解析を2007年度より継続して行った.2007年度にプレスチンのM225に変異を導入すると,プレスチンのイオン輸送能が上昇することを示した.プレスチンはイオン輸送能と共に,細胞を伸縮させる機能を有する.そこで,変異によりプレスチンの細胞伸縮能も増加しているかどうかをアメリカのCreighton大学のHe教授と共同で研究した.その結果,M225に変異を加えると,プレスチンの細胞伸縮能も上昇していることが明らかになった.プレスチンの機能上昇のメカニズムを調べるため,変異によりプレスチンの細胞内での局在及び存在量が変化しているかどうかを免疫染色法及びウェスタンプロッティング法でそれぞれ調べた.その結果,それらの特性は変異によって有意に変化しないことが示された.以上の結果から推察すると,M225に変異を加えると,プレスチンの細胞内での局在及び存在量は変化しないが,プレスチン分子総量における活性のあるプレスチン分子の割合が増加したことが考えられる.2008年度はプレスチンの変異体解析だけでなく,細胞から抽出精製したプレスチンを人工脂質膜に挿入し,その構造を可視化することを試みた.まず,現有するプレスチン安定発現細胞株から,プレスチンを界面活性剤及び抗体を利用して抽出精製した.また,人工脂質膜を雲母基板上に自己組織化能を利用し作製した.作製した脂質膜を界面活性剤で弱らせ,そこに精製プレスチンを加えることで,プレスチンを脂質膜に挿入することを試みた.脂質膜を原子間力顕微鏡で観察したが,プレスチンを発見することはできなかった.今後,プレスチンを脂質膜に挿入する条件の検討を行っていく.プレスチンは内耳蝸牛内の外有毛細胞の細胞膜に存在する膜タンパク質である.これまで,電子顕微鏡や原子間力顕微鏡を用いてプレスチンの構造解明が試みられてきた.しかし,プレスチンの構造は未だ不明である.そこで本研究では,プレスチンを精製し,人工脂質膜に埋め込み,そして原子間力顕微鏡で観察することで,プレスチンの詳細な構造を明らかにすることを試みた.まず,FLAGタグ融合プレスチン発現細胞から,プレスチンを含む膜タンパク質を細胞から界面活性剤を用い可溶化した.そして,膜タンパク質溶液からFLAGタグアフィニティカラムを利用してプレスチンを精製した.並行して,人工脂質膜を雲母基板上に自己組織化能を利用し作製した.

さらに,界面活性剤を利用し,脂質膜を弱らせた.続いて,界面活性剤に覆われた精製プレスチンを脂質膜に加え,界面活性剤を希釈法により除去し,プレスチンを脂質膜に再構成した.その後,再構成したプレスチンを原子間力顕微鏡で観察した.原子間力顕微鏡で脂質膜を観察した結果,高密度に存在するリング形状の構造物が確認された.それらの構造物の直径を計測すると,11.0±1.3nm(n=42)であった.この値は,過去に報告されているプレスチンの直径と良く一致する.本研究では,プレスチンを精製しているため,脂質膜に存在する構造物は全てプレスチンであると考えられる.以上のことから,本研究で観察された構造物はプレスチンであるとみなせる.すなわち本研究の結果は,プレスチンが脂質膜中で直径約11nmのリング形状を形成することを示唆する.本研究は世界に先駆けてプレスチンを高分解能で可視化したものであり,聴覚の研究領域に留まらず,膜タンパク質の研究領域においても重要な成果である.
マイクロインピーダンス法による鉄および炭素鋼の局部腐食前駆過程の評価

1.鉄および炭素鋼などの金属表面の電極特性を微小領域毎に評価する走査プローブ顕微鏡の構築を試みた。プローブは、試料表面近傍に配置した2本の微小電極であり、微小電極間に交流正弦電圧を印加し、同期する電流応答(マイクロインピーダンス)を計測する設計とした。微小電極には、先端径を100μm程度に絞ったガラス管内に0.5mmφの白金線を挿入したものを作製した。プローブ電極は、位置決め分解能0.1μmのXY軸およびZ軸ステージをオートマイクロエンコーダにより走査した。また、試料表面観察用にCRT上で250倍の光学顕微鏡を取り付けた。2.プローブと試料の電極間距離は、再現性良く制御する必要があった。まず、光学顕微鏡による制御法を検討したが、プローブが破壊するなどして、操作性および再現性に優れなかった。そこで、プローブ電極に別途直径10μmの微小ディスク電極を取り付け、酸化還元体を含む溶液中において定電位分極した際の限界電流を指標とする電極間距離制御法を導入した。微小電極上の拡散層の厚さ以内にプローブが試料に接近すると、限界電流は再現性良く試料の伝導性により変化した(絶縁体試料の場合、減少し、導電体試料場合には増加した)。この方法により、定量的に電極間距離の基準点を定めることが可能となった。3.原理上、マイクロインピーダンスは2つの微小電極間に存在する溶液の抵抗と容量に依存し、面分解能はプローブをより微小とすることにより向上することが予想された。本研究では、研究室に既存していたポテンショスタット、ファンクションジェネレーターおよびロックインアンプにより、先端径100μmの自作電極を用いて、濃度の異なる水酸化ナトリウム水溶液のマイクロインピーダンスを試験測定したが、重畳印加電圧を数100mVとしても、溶液濃度に依存するマイクロインピーダンスの有意差を測定することができなかった。原因としては、微小電極自身の内部インピーダンスが大きいためにノイズレベルが高いこと、およびポテンショスタットの周波数応答性が悪いことが考えられた。微小電極の改善とともにポテンショスタットの改良あるいは新規導入を検討する必要があることが明らかとなった。
骨破壊性疾患における細胞内シグナルの解明

これまでにわれわれはRA患者より手術時に採取した滑膜組織から酵素消化法によって滑膜細胞を採取し、これを活性型ビタミンD、マクロファージコロニー刺激因子の存在下で培養することによって破骨細胞様の多核細胞が形成されることを明らかにした。Receptor Activator of NF-κB Ligand (RANKL)はTNFスーパーファミリーに属する膜結合蛋白であり、破骨細胞前駆細胞である単球・マクロファージ系の細胞に発現するレセプターRANKに結合することによって破骨細胞への分化を決定すると考えられる。滑膜組織におけるRANKLの発現をノーザンブロットによって検討したところ、RA滑膜にはRANKLが大量に発現していること、一方変形性関節症患者の関節滑膜にはRANKLの発現は少ないことが明らかになった。滑膜細胞を免疫染色にて検討したところ、滑膜線維芽細胞に極めて強いRANKLの発現が認められた。RANKLの発現は活性型ビタミンD3の刺激によってupregulateされた。滑膜細胞による破骨細胞形成系にRANKLの生理的なインヒビターであるosteoprotegrin (OPG)を添加すると、この培養系における破骨細胞形成を抑制した。アジュバント関節炎ラットはRAのモデルとして用いられ、顕著な骨関節破壊を来すが、OPGを炎症関節に局所投与することによりアジュパント関節炎ラットにおける骨破壊が抑制された。以上の結果よりRANKL-RANK系をターゲットにした新しい骨関節破壊治療アプローチが可能であると考えられる。今後OPG、あるいはRANKL-RANK系を抑制するような低分子薬剤の開発が期待される。慢性関節リウマチ(rheumatoid arthritis,RA)は慢性に経過する全身の炎症性疾患であり、最終的には全身の関節の著明な破壊を来たし著しいADLの低下を引き起こす。破骨細胞は骨吸収を担う細胞であり、正常な骨モデリング・リモデリングに必要不可欠であることが知られているが、RA骨破壊においても破骨細胞が中心的な役割を果たすことが明らかになってきた。最近の分子生物学的研究から破骨細胞の分化にはtumor necrosis factor(TNF)ファミリーであるreceptor activator of NF-κB ligand(RANKL)が重要な役割を果たすことが明らかになってきた。われわれはRA滑膜組織においてRANKLが大量に発現していること、一方変形性関節症滑膜においてはRANKLの発現は低いことをNorthern blotting,immunostainingによって明らかにした。またRA滑膜細胞を活性型ビタミンD3とマクロファージコロニー刺激因子の存在下で培養することによって破骨細胞様の多核細胞が形成されるが、このときRA滑膜線維芽細胞においてRANKLの発現が誘導されること、そしてRANKLの競合阻害因子であるosteoprotegerinがこの培養系における破骨細胞様細胞の出現を抑制することを明らかにした。このようなRANKLの発現は炎症性サイトカインであるinterleukin-1やTNF-αによっても誘導された。またRAの動物モデルであるラットアジュバント関節炎における骨関節破壊はOPGの局所投与によって抑制された。以上の結果からRA骨関節破壊においてRANKLによって分化誘導された破骨細胞が重要な役割を果たしていること、破骨細胞の分化、活性化を抑制することによってRAの骨関節破壊の抑制が可能であることが明らかになった。本年度は破骨細胞分化、活性化に重要な役割を果たすRANKL-RANK系においてRANKの下流で働くシグナル伝達分子であるtumor necrosis factor receptor-associated factor(TRAF)6の働きについて検討した。TRAF6ノックアウトマウスにおいては破骨細胞の分化異常が存在し、骨組織の破骨細胞数が著しく減少し、大理石骨病様の病態を示す。このとき破骨細胞前駆細胞におけるRANKL誘導性のMAPキナーゼ活性化、NF-kB活性化が抑制されている。われわれは様々なTRAF6ミュータントを発現させることによってノックアウトマウス由来の破骨細胞前駆細胞異常のレスキューを試みた。その結果TRAF6のRINGフィンガードメインは破骨細胞分化には必須ではないが、骨吸収能の獲得に重要であることが明らかになった。
ニアフィールドのフォトン力学

河田は、金属化カンチレバー先端に形成される増強された微小光スポットを用いることで、有機分子からのラマン散乱光を局所的に1001000倍程度増強することができ、これにより近接場ラマン光が検出できることを示した。さらに、試料の走査により、ナノメートルオーダーで近接場振動スペクトルのマッピングが行えることを、実験により検証し、近接場振動分光法の確立を図った。柳田は、機能状態の蛋白質分子の熱ゆらぎの測定法を開発した。アクチン蛋白質フィラメントの両端にビーズを付けて光ピンセットで捕捉し、回転拡散を測定した。ミオシン蛋白質存在下で、ATPの有無で回転弾性率は不変、振幅は増加した。これは、分子間のエネルギー授受をあらわす。現在、近接場によってこの反応を制御することを試みている。梅田は、エバネッセントフォトン力を、光ファイバーカンチレバーによって直接測定する方法を開発して、カンチレバー先端における勇断力とフォトン力の相互作用を明らかにするとともに、電磁場解析結果と比較してエバネッセントフォトン力場におけるその振る舞いを明らかにした。堀は、誘電体表面の原子・フォトン共鳴相互作用による擬運動量・擬角運動量移行の実験的検証のため、原子プローブ近接場偏極計測のための原子散乱装置と高感度位置敏感検出装置を完成させるとともに、検出器モードによる新しい近接場光子の量子理論を構築し、多重極子放射寿命の近接場変調効果を定量化した。羽根は、近接場光学顕微鏡用集積型プローブを実現するための微細加工プロセス技術の開発とマイクロプローブの製作を行った。プロセスの開発においては高速原子線によるエッチングの最適化を実現した。また、酸化膜の開口チップとシリコン光検出器をプローブに集積し、光源・光検出器一体の集積型プローブを実現した。河田は、チャネル導波路および微小開口において形成されるエバネッセント場によりMie微粒子に働くフォトンフォースを電磁論的に明らかにし、それらにより微粒子の運動制御が可能であることを示した。さらに、40nmφの金微粒子を水中において2次元的にレーザートラップできることを見いだし、捕捉された金微粒子をプローブとしたニアフィールド光学顕微鏡の提案および試作を行った。金微粒子のブラウン運動の影響を受けながらも、試作装置ではおよそ80nmの分解能を達成した。柳田は、全反射型の近接場光学顕微鏡を利用して蛍光分子1分子を水中観察する方法を開発し、光ピンセットによるナノメートル・ピコニユートンレベルの変位と力の測定系と組み合わせ、生体エネルギーの化学一力学変換過程を1分子計測する技術を確立した。これによりミオシンによるATPの加水分解反応と、アクチン-ミオシン間の滑り運動とのカップリングの様子を計測し、化学反応と力学反応の間に数十ミリ秒から数百ミリ秒の遅れが生じる場合があることを発見した。タンパク質が化学反応のエネルギーを分子内部にためておき、仕事が必要なタイミングを計っているという可能性が示唆された。梅田は、光軸上の任意の位置での光放射圧の光軸方向力を測定するために、先端にμmサイズの微小球を取り付けた光ファイバーカンチレバ-とその共振現象を利用する新規な方法を開発し、光強度と光放射圧は比例関係にあり、ビームの焦点を挟んで二つのピークを持つ光放射圧分布が得られ、幾何光学モデルから導かれる光放射圧の理論値と一致することを明らかにした。堀は、原子レベルのニアフィールドのフォトン力学過程として、原子・光近接場相互作用における局所的擬運動量と擬角運動量の移行に注目し、実験的に検証するため超高真空原子線散乱装置と波長以下の空間選択性と原子スピン検出を同時に可能とする光近接場共鳴二光子イオン化分光法の開発を行い、表面近傍原子の選択的高分解分光に成功した。河田は、原子間力制御による金属化カンチレバーを用いたニアフィールド光学顕微鏡の開発を行った。照明光学系に、油浸対物レンズを用い、開口数(NA)1.0以下の成分を遮光することで、プローブ先端以外からの反射光を完全に除去することを実験的に明らかにした。さらに、蛍光試料に対して、プローブ-試料間距離が50nmより近づいたときに、蛍光が急峻に励起されることを示した。また、誘電体基板の表面に高屈折率の誘電体の2本の細線が埋め込まれているフラットな試料を仮定し、3次元のFinite Difference Time Domain法を用いたシミュレーション計算により、ニアフィールド光学像におけるコントラスト特性の物質による違いを明らかにした。高屈折率部において大きな強度が得られ、また、誘電体試料に対しては線形な応答を示すことを明らかにした。さらに、Deconvolutionを用いることで、物質分布の回復が可能であることを示した。梅田は、エバネッセントフォトン力の解析及びその特性を明らかにするために、光ファイバーカンチレバーによる直接検出を試みた結果、10100pNオーダーのエバネッセントフォトン力の界面方向成分の検出に成功した。その特性は、電磁場理論に基ずく定量的解析とほぼ同じ振る舞いを示すことが明らかになった。また、エバネッセントフォトン力を指標としてシアフォース力の解明に有用であることが期待できる結果が得られた。柳田は、全反射型のエバネセント蛍光顕微鏡により、水溶液中の蛍光1分子の発光スペクトルの測定、さらに、2種の蛍光分子間の共鳴エネルギー移動の検出法を開発した。筋肉収縮の調節タンパク質であるトロポニンCを蛍光標識し、蛍光スペクトルの時間変化と、分子内蛍光共鳴エネルギー移動を1分子測定した。その結果、蛋白質分子が秒の時間スケールでいくつかの立体構造のあいだを往復していることが示唆された。

堀は、原子レベルのフォトン力学では、ニアフィールド原子・フォトン共鳴相互作用での擬角運動量移行の実験的検証と、場の量子論的理論を研究し、デュアルモード冷却CCDカメラによるナノ空間選択的で原子スピン検出可能な、微量生成イオン2次元高感度位置敏感検出装置開発と、検出器モードによる新しい場の第二量子化を行った。河田は、金属化カンチレバー先端に形成される増強された微小光スポットを用いることで、有機分子からのラマン散乱光を局所的に1001000倍程度増強することができ、これにより近接場ラマン光が検出できることを示した。さらに、試料の走査により、ナノメートルオーダーで近接場振動スペクトルのマッピングが行えることを、実験により検証し、近接場振動分光法の確立を図った。柳田は、機能状態の蛋白質分子の熱ゆらぎの測定法を開発した。アクチン蛋白質フィラメントの両端にビーズを付けて光ピンセットで捕捉し、回転拡散を測定した。ミオシン蛋白質存在下で、ATPの有無で回転弾性率は不変、振幅は増加した。これは、分子間のエネルギー授受をあらわす。現在、近接場によってこの反応を制御することを試みている。梅田は、エバネッセントフォトン力を、光ファイバーカンチレバーによって直接測定する方法を開発して、カンチレバー先端における勇断力とフォトン力の相互作用を明らかにするとともに、電磁場解析結果と比較してエバネッセントフォトン力場におけるその振る舞いを明らかにした。堀は、誘電体表面の原子・フォトン共鳴相互作用による擬運動量・擬角運動量移行の実験的検証のため、原子プローブ近接場偏極計測のための原子散乱装置と高感度位置敏感検出装置を完成させるとともに、検出器モードによる新しい近接場光子の量子理論を構築し、多重極子放射寿命の近接場変調効果を定量化した。羽根は、近接場光学顕微鏡用集積型プローブを実現するための微細加工プロセス技術の開発とマイクロプローブの製作を行った。プロセスの開発においては高速原子線によるエッチングの最適化を実現した。また、酸化膜の開口チップとシリコン光検出器をプローブに集積し、光源・光検出器一体の集積型プローブを実現した。
教師に期待される矛盾した指導を統合する指導方略の教育社会心理学的研究

本研究の目的は,教師の「引き上げる指導性」と「受け入れる指導性」とが矛盾なく統合された指導方略とは何かを検討することである。小学校教師と児童対象の質問紙調査の結果,高学年では「あたたかく突きつける」指導方略が2つの指導性統合の形として示された。また,高学年一学級の時系列的調査では,教師があたたかい指導行動をした上で課題を突きつける行動を実践する統合過程にて児童の自律と協同が成立することが示された。本研究の目的は,教師に期待される「児童を引き上げる指導性」と「児童を受け入れる指導性」という,矛盾・対立した二つの指導を教師が無理なく同時に実践できる新たな指導方略を提起して,教師の学級経営力向上に活用できる理論的・実践的研究をおこなうことにある。このため,平成21年度は,従来の研究では注目されなかった新たな指導方略を掘り起こすために,従来の指導行動研究の成果について資料収集・整理による理論探究と仮説構築を行う一方で,以前からおこなっている小学校の学級活動観察と教師へのインタビューによって収集・カテゴリー化した指導方略をもとに質問紙を作成し,日常の学級経営における指導行動について小学校教論を対象に予備調査を実施,因子分析をおこなった。その結果,従来の研究では「児童を引き上げる指導性」としては注目されていなかった「突き放し」「待つ」「追い込み」,「児童を受け入れる指導性」としては重点が置かれていなかった「対等に話し合う」の指導行動カテゴリーが抽出された。並行して,因子分析による指導行動カテゴリーの確認のため,小学校の学級活動観察と教師へのインタビューをさらにおこなってカテゴリーの修正,予備調査データを再分析した結果,「児童を引き上げる指導性」7カテゴリー(注意統制,追い込み,気づかせる,放る,突き放し,任せる,待つ),「児童を受け入れる指導性」5カテゴリー(変化に応じる,緊張緩和,支援,見守る,対等に話し合う)が抽出された。また,「突き放し」と「待つ」をせずに積極的に働きかけて二つの指導性を実践する『積極介入型』教師と,「身守る」「待つ」を重点的におこなうが「突き放し」もほどほどに実践して二つの指導性を実践する『あたたかい突き放し型』の教師の学級では,比較的学級連帯性と児童の学習意欲が高いことが示された。平成21年度は,予備調査結果の傾向を明確にするために,項目の問題点を修正して,広範囲に多くの小学校教諭を対象とした本調査を実施する。現在,進行中である。本研究の目的は,教師に期待される「児童を引き上げる指導性」と「児童を受け入れる指導性」という,矛盾・対立した二つの指導性機能を教師が無理なく同時に実践できる新たな指導方略を提起して,教師の学級経営力向上に活用できる理論的・実践的研究をおこなうことにある。平成21年度は,まず,平成20年度の予備調査のデータについて,一人の教師がどの指導行動をともにおこなっているかの指導パターンをみるためにクラスター分析を実施した。その結果,二つの指導性機能に対応する指導行動をともに実施する指導パターンが1つ抽出された。次に,本調査の実施である。予備調査で使用した指導行動カテゴリー尺度を修正した項目(全47項目)と,児童の課題意欲・学級連帯性・課題成果を評価する項目(全18項目)によって構成された質問紙を小学校教諭145名に実施,また小学46年(34学級)児童に本人の課題意欲と学級連帯性に関する質問紙(全10項目)を実施した。カテゴリー尺度の信頼性確認後,二つの指導性機能の関連を検討するため,指導行動カテゴリー間の相関,及び児童の諸側面の変数との相関から分析している(平成22年度も継続中)。加えて,教師の二つの指導性機能の統合化に関する仮説を学級コンサルテーションの試みから検討した。小学低学年・中学年で学級経営が難しいとされる学級の担任教諭に対し,2つの指導性機能に対応する指導行動カテゴリーがいつ・どのように実施されているか(されていないか)を学級でのフィールドワークをもとに分析し,その結果を担任教諭にフィードバックして,学級経営や児童とのコミュニケーションについて担任教諭に省察を促すかたちのコンサルテーションを実施,その成果を担任教諭の児童理解の質的変容から検討した。平成22年度は,昨年度実施した本調査の継続分析とまとめである。指導行動カテゴリー尺度,児童の課題意欲・学級連帯性・課題成果評価項目にて構成された質問紙を最終的に小学校教諭191名に実施,小学46年(34学級)児童に課題意欲と学級連帯性の質問紙を実施し,統計的分析をおこなった。

その結果,高学年ではひきあげる機能の突きつける指導行動と受け入れる機能の理解行動との間に正の相関がみられ,いずれの行動も教師が多く実施するとき,教師評定による児童の課題意欲,学級連帯性,規律遵守度の評定値が高いことが示された。中学年では受け入れる機能の理解行動によって,児童の諸側面の評定値が高い結果となった。また,児童評定による本人の課題意欲・学級連帯性評定では,学級連帯性のみ教師評定と一貫した結果が得られた。学年によって指導行動内容にみる2つの指導性統合の具体像が異なり,児童の資源や課題性の違いが影響したと示唆される。加えて,教師の二つの指導性機能の統合の仕方の仮説提起に向けて,2つの指導性機能に対応する指導行動が一年間の学級経営のなかでどのような流れで生起するか検討するために,ある高学年学級を対象に一年間の時系列的調査(フィールドワークと教師・児童対象の質問紙)を実施した。分析の結果,一学期は受け入れる機能として児童の資源に応じた課題調整行動を教師は多くとるが,2学期になると減り,かわりに児童に課題を突きつける指導行動が増加すること,教師-児童の対立が顕在化するが,3学期には学級内の連帯性と児童の自律性が向上することが示された。
グルタミン酸受容体のリン酸化と神経回路形成の分子生物学的研究

グルタミン酸受容体は興奮性神経伝達に関与し、シナプスの長期増強(LTP)のメカニズムとしてAMPA型グルタミン酸受容体のリン酸化により膜への受容体の組み込みやチャネル活性の増加が関与しているという報告がある。また脱リン酸化によるLTDも報告されている。この研究ではAMPA型グルタミン酸受容体のリン酸化を可視化するための蛍光センサーを試作し、試作したセンサーを用いてグルタミン酸受容体の活動を時間的空間的に捉え、神経回路に及ぼす作用を明らかにすることを目的とする。AMPA型グルタミン酸受容体のC末端の細胞内領域に存在するカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII (CaMKII)およびAキナーゼによりリン酸化部位を含むアミノ酸配列の前後に、GFPの変異体であるYFPおよびCFPを付加した蛍光センサー分子のcDNAを試作した。試作したセンサーの機能を調べるため、センサーcDNAをHEK293細胞に発現させ、リン酸化を即す刺激により蛍光変化を測定した。Aキナーゼを活性化するForskolinおよびdibutyryl cAMPによる刺激ではYFP/CFPの蛍光比の微弱な増加が観測された。またCaMKIIを刺激するためIonomycinを投与した結果、明らかなYFP/CFPの蛍光比の増加が観測された。今回、グルタミン酸受容体のリン酸化のFRETを用いた蛍光センサーを作成した。リン酸化刺激により蛍光変化が観察された。しかし、その程度は小さく、実用的には検出感度の点でまだ厳しく、神経回路の検討にまでは至れなかった。神経回路形成にはしばしば神経活動が関与することが知られており、特に興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体は神経回路形成に関与することが知られている。これまでの我々のセンサー作成のノウハウを活かして、この研究ではAMPA型グルタミン酸受容体の活性を可視化できるセンサーの作成を行う。これにより神経細胞でのAMPA型グルタミン酸受容体の活動を可視化し、神経細胞のシグナル伝達を時間的空間的により直接的に捉え、神経回路網の形成の分子基盤を明らかにする。平成15年度は蛍光AMPA型グルタミン酸受容体センサーの試作について:分子生物学的方法により蛍光蛋白質であるGreen Fluorescent Protein(GFP)をAMPA型グルタミン酸受容体に結合するために受容体蛋白質の部位を結晶構造データおよびポイントミューテーションの結果から検討したが、今年度はプラスミドを作製するにいたらなかった。来年度に作製に移る。蛍光相関スペクトロスコピー(FCS)装置の作製について:アルゴンレーザーまたはヘリウム・ヘオンレーザーを用いた共焦点光学系を形成し倒立顕微鏡にセットした。蛍光シグナルは光ダイオードで検出し相関器をつなぎFCS装置を作製した。現段階ではまだ自己相関スペクトルしかとれないが、この装置を用いてローダミンを標準サンプルとして使用したところ自己相関シグナルを得ることができた。次の段階として相互相関スペクトルを測定できるようにすべく装置の改造を進める。
ヒアルロン酸の変形性関節炎アップストリーム治療薬としての新展開と関節保護作用

1)ヒアルロン酸(HA)によるサイトカイン誘導性アグリカナーゼ発現抑制micro RNAの検出分解系酵素を制御すると考えられる複数のmiRNAを検出した。2) OAモデルラットへのHA投与の長期効果長期(9w)投与試験では有意な軟骨損傷抑制効果は見られたが、効果は中期間より減少した。3)メカニカルストレスのヒアルロン酸受容体遺伝子発現への影響軟骨細胞のHA受容体CD44、ICAM1mRNA発現変動は見られなかった。4)メカニカルストレスによるマトリックスタンパク発現への影響弱いメカニカルストレス刺激で軟骨細胞のマトリックスタンパク、アグリカン、2型コラーゲン遺伝子発現が増大した。1ヒアルロン酸のヒアルロン酸合成酵素発現への影響ヒアルロン酸は無刺激、炎症性サイトカイン刺激の両条件下で軟骨細胞のヒアルロン酸合成酵素(HAS1、HAS2、HAS3)のmRNA発現に影響を及ぼさなかった。ヒアルロン酸によるオートクライン作用による合成促進効果はないと判断した。2ラットOAモデルへのヒアルロン酸短期投与ラットOAモデルに対しヒアルロン酸を長期間(6w)に投与した際に関節軟骨損傷抑制効果があることは前研究(課題番号22591687)にて報告している。そこで短期間(2.5w)に投与期間を短縮し同様の試験を実施した。短期投与においてもほぼ同等の軟骨損傷抑制効果が見られた。このことはOA初期にヒアルロン酸投与を行うと抑制効果が高いことを示し、ヒアルロン酸投与時期が治療効果に大きな影響を及ぼすことを示していると判断している。3軟骨メカノセンサーの解析炎症性サイトカイン誘導性の軟骨マトリックス分解酵素発現をメカニカルストレスが抑制し、メカノセンサーの介在を前研究(課題番号22591687)にて確認している。siRNAを用いたノックダウン試験を実施し、メカノセンサー分子の特定を実施している。1)ヒアルロン酸(HA)によるサイトカイン誘導性アグリカナーゼ発現抑制micro RNAの検出軟骨様細胞OUMS-27を用いて無処理群、炎症性サイトカイン処理群、ヒアルロン酸前処理群からmicroRNAを調製しmicroRNAarrayを実施し分解系酵素を制御すると考えられる炎症性サイトカインで減少し、ヒアルロン酸前処理で回復する複数のmiRNAを検出した。2) OAモデルラットへのHA投与の長期効果前十字靱帯、内側側副靱帯を切断、半月板内側切除したOAモデルラットに対し、手術後5日後から分子量2700kDaのヒアルロン酸50μL(10mg/ml)、週2回のスケジュールで投与し、9週後に殺処分し大腿骨遠位端の骨頭軟骨の損傷度をOARSIスコアリングシステムにより数値化した。その結果。長期(9w)試験で有意な軟骨損傷抑制効果は見られたが、その効果は中期間(6W)より減少した。3)メカニカルストレスのヒアルロン酸受容体遺伝子発現への影響軟骨細胞に0.5Hz、5%伸張のCTS(Cyclic Tensile Strain)を付加しHA受容体であるCD44、ICAM1mRNA発現量変化をRT real-time PCR法にて比較した。メカニカルストレス付加前後での変動は見られなかった。マトリックスバイオロジー研究開始時に設定した項目のうち初年度で2項目(研究実績1ヒアルロン酸のヒアルロン酸合成酵素発現への影響2ラットOAモデルへのヒアルロン酸短期投与)の検討をほぼ終えている。また1項目(3軟骨メカノセンサーの解析)についてはsiRNAを用いたノックダウン試験を実施し複数のTRPVファミリーの中から絞り込み作業を開始しており、順調に特定が進んでいる。メカノセンサーの解析ではアゴニストを用いて更に特定を進める。未実施であるヒアルロン酸受容体とメカニカルストレスとの関係に関する解析を開始する。またヒアルロン酸によるサイトカイン誘導性アグリカナーゼ発現抑制に関わる因子のRNAレベルでの解析をarray法にて実施する。計画時よりも試薬、物品が安く購入できたため計画通りに物品、試薬等を購入し研究を遂行する
βーグルカン構造に基づく新規ワクチンアジュバントの開発

本研究の最終目的は免疫学的応用が可能な新しいグルカン誘導体を開発することである。助成を受けた期間中は主にβ-グルカンを基に本研究を行った。最初に1,3-β-グルカンを基に新しい種類のβ-グルカン開発を行った。その結果免疫システムは3重らせん型の長いグルカンを認識することが判明した。数回の実験後、複合糖質を合成に成功し現在その構造的そして生物的アッセイを行っている。β-グルカンを他の生物高分子と複合させるため、低酸性条件で高速そして選択的に反応を起こすグライコブロッティング方法を選択した。本研究は固形および液状化学合成、そして生物的評価を含んだ挑戦的研究であり、その研究にて良い結果を得た。β-グルカン固相合成法2012年度はβ-グルカンを固相合成する上で原料となる単糖誘導体を高純度で調製し、NMRおよび質量分析にて同定した。本誘導体は脱離基にチオフェニル基、2、4、6位水酸基にベンゾイル保護基を有する。さらに、3位水酸基には9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはアリル基を一時的保護基として導入した。β1-3結合を連続して有するオリゴ糖鎖のオルソゴナル合成には本保護基が鍵となる。本化合物を用いて長鎖オリゴ糖の固相合成条件を最適化した。これにともない、合成中に生成するヒドロキシル基の比色検定法も独自に開発した。糖鎖形成反応の状態を精度よくモニター可能になったため、効率的に反応条件検討を実施することができた。コンピューター上にて種々の構造を持つβ-グルカンライブラリを構築し、デクチン-1とのドッキング計算を行った。結果、高親和性のリガンド候補を見出した。かねてよりリガンド糖鎖の分岐構造が相互作用に重要であることが指摘されてきた。シミュレーションツールを利用した本解析により、分岐糖に直接作用するデクチン-1上のアミノ酸残基を詳細に推測することが可能となった。一方、共同研究者からデクチン-1組み換えタンパク質の供与を受けたことにより、糖鎖マイクロアレイを用いた生化学的アッセイが可能となった。本アレイの作成に用いる基板の表面にはアミノオキシ基が提示されており、遊離の糖鎖を温和な条件下で化学選択的に固定化することができる。本年度中に糖鎖アレイを用いた評価系を構築し、本アレイによりリガンドスクーリングの準備を完了する。βーグルカン構造に基づく新規ワクチンアジュバントの開発本研究の最終目的は免疫学的応用が可能な新しいグルカン誘導体を開発することである。原料化合物の合成は困難が予想されたが、鋭意検討の結果、純度よく効率的に化合物を得ることができた。これが研究計画遂行の原動力となり、最適な固相合成条件を確立するに至った。さらにモデルリングおよびドッキングによるデクチン-1との相互作用解析から高親和性のオリゴ糖鎖構造を見出すなど有益な情報が得られた。さらに、デクチン-1組み換えタンパク質や糖鎖マイクロアレイなどのリソースおよび基盤技術は既に準備が整っており、最初の糖鎖ライブラリーが合成され次第、アレイを用いたアッセイを実施する。2013年度には良質な結果を国際会議や査読有学術誌にて発表できると考えている。長鎖β-グルカンライブラリを構築する。β-グルカンが直鎖状か分枝鎖状かによって2つの固相合成プロトコールを使い分ける。本ライブラリを用いて糖鎖マイクロアレイを作成する。デクチン-1との結合アッセイにてヒットした高親和性リガンドを大量合成し、NMR研究およびin vivoアッセイに供する。来年度の予算の大半は試薬購入に使用する。残りの予算は実験機器、消耗品、および参考書の購入に使用する。国際学会での研究発表のため、旅費にも一部使う予定である。
東南アジアの「老い」の総合的研究-セーフティーネット制度再構築にむけて

この3年間において、東南アジアの糖尿病の実態を検出し、その検診、介入ネットワークを構築した。平成18年度、ラオスのソンコン郡地域在住高齢者504名にブドウ糖負荷試験を実施し、17%に糖尿病、10%に境界型糖尿病を認めたことを報告した。さらに社会経済的調査の結果、糖尿病の有病率は、日本では裕福層に多くついで貧困層が続くJ型-ブを描くのに対して、ラオスでは貧困層に多発しついで裕福層が続く逆J型-ブを示した。ラオスにおいて、ただちに薬物療法の導入は現実的ではないので、平成19年度は、ラオスの糖尿病患者ならびに境界型糖尿病患者に対して、1年間にわたる運動と食事指導などの非薬物的なライフスタイル改善介入を実施した。その結果、体重、肥満度、血糖値、インスリン抵抗性に有意の改善を認めた。またラオスにおけるライフスタイル改善介入のための現地医療スタッフネットワークの構築に成功した。ラオスにおけるライフスタイル改善介入効果の有用性を確認したのち、同様の方法を、高知県土佐町在住高齢者における軽症糖尿病ならびに境界型糖尿病患者にも適用し、その有効性を認めた。2004年度に高齢者医学調査を実施したベトナム・プート地域在住高齢者においてブドウ糖負荷試験を実施した結果、当該地域においても糖尿病を含めたメタボリック症候群の増加が認められた。この背景には、近年の生活習慣の変容が大きく影響している可能性が示唆された。ベトナムのプートー地域においても、地元ヘルスネットワークを通じて、生活習慣改善のためのセーフティーネットの構築に着手した。またタイのコンケン大学医学部との共同研究によって、コンケン市内と郊外のタンカン村との比較において前者で生活習慣病の頻度が有意に高いことを確認し、コンケン大学医学部家庭医学講座において、地域在住高齢者の生活主観病予防チームが発足し、介入ならびに予防活動を開始している。上記のように、本研究は、アジアの高齢者健康増進のためのセイフティーネットの確立に寄与している。アジアでも、少子高齢化はかつての欧米諸国以上のスピードで進行している。2000年頃を境にアジアの全域で人口の高齢化が始まり、2050年には、日本についで、シンガポール、韓国、タイ、中国が高齢社会となり、その他のアジア諸国も高齢化社会をむかえることが予測されている。アジア各国も、きたるべき高齢社会にむけての医学的対応に迫られている。しかし、アジアでは欧米諸国がすでに克服し去った感染症がいまだに重大な課題として残されている。さらに、保健福祉にふりむけられる財政は豊かではない。アジアの人々はその地でうまれ、既存の医療システムのなかで疾病とむきあい、やがて老い、ある種の死生観をもって死んでゆく。本年度は、共通の高齢者総合機能評価を用いてタイ、ラオス、中国雲南省において、地域在住高齢者のべ1000名の健康実態を把握し、あわせて地域固有の高齢者ケアーシステムのありかたを調査した。その結果、ラオス、タイ高齢者では、他の周辺東南アジア諸地域に比して、糖尿病の有病率が有意に高く、これは近年の経済発展と一定の関連があることが示唆された。また、経済的要因は、アジア各国と本邦においても、高齢者の日常生活自立と有意の関連を示し、経済要因が高齢者の健康と密接な関連があることが明らかとなった。アジアの今後の医療の動向が、欧米諸国がかつてたどった同じ道をめざすという保証はいまのところない。高齢者の保健とケアーに関するセイフティーネットには、地域性がきわめて重要でありさらなる観察を要する。その意味で人の、生・老・病・死は、その地域固有の生態系とその民族の歴史と価値観が規定する相対的な概念でもある。

昨年度の研究によって、ラオスのソンコン地域ならびににタイ・コンケン地域高齢者では、他の周辺東南アジア諸地域に比して、糖尿病の有病率が有意に高く、これは近年の経済発展と一定の関連があることが明らかとなった。この事実を詳細に確認するために、両当該地域において、60歳以上の高齢者に対するブドウ糖負荷試験を実施し、糖尿病頻度が高い事実を確認した。本年度のフォローアップ調査により、糖尿病高齢者は、非糖尿病高齢者に比して、オズ比3倍の死亡率を示し、その対策の重要性が示唆された。タイでは、重症ケースでは積極的な薬物導入が可能であるが、ラオスでは医療制度の関係で、まだライフスタイルの改善と伝統医療による介入にとどまらざるを得ないのが実情である。しかし、ラオス保健省も当該研究結果を受けて、早急に対策をとりたいとの意向を示しており、そのシステム構築を検討中である。上記研究との補完において、本邦においても地域在住高齢者に対するブドウ糖負荷試験を実施した結果、65歳以上の地域在住高齢者の12%に新たな糖尿病が検出された。日本人高齢者では、糖尿病ならびに糖尿病予備群である耐糖能異常者の割合は50%弱を数え、老年医学領域における糖尿病の重要性をあらためて再認識させる結果となっている。東南アジア諸国と異なり、医療アクセスが容易でしかも、自治体健診の発達した本邦においても、従来の空腹時血糖値やヘモグロビンAICのみによるスクリーニングでは糖尿病ならびに耐糖能異常の検出には不十分なことがわかり、地域在住者に対するブドウ糖負荷試験導入の重要性を提言している。平成18年度、ラオスのソンコン郡地域在住高齢者504名にブドウ糖負荷試験を実施し、17%に糖尿病、10%に境界型糖尿病を認めたことを報告した。さらに社会経済的調査の結果、糖尿病の有病率は、日本では裕福層に多くついで貧困層が続くJ型-ブを描くのに対して、ラオスでは貧困層に多発しついで裕福層が続く逆J型-ブを示した。ラオスにおいて、ただちに薬物療法の導入は現実的ではないので、平成19年度は、ラオスの糖尿病患者ならびに境界型糖尿病患者に対して、1年間にわたる運動と食事指導などの非薬物的なライフスタイル改善介入を実施した。その結果、体重、肥満度、血糖値、インスリン抵抗性に有意の改善を認めた。またラオスにおけるライフスタイル改善介入のための現地医療スタッフネットワークの構築に成功した。ラオスにおけるライフスタイル改善介入効果の有用性を確認したのち、同様の方法を、高知県土佐町在住高齢者における軽症糖尿病ならびに境界型糖尿病患者にも適用し、その有効性を認めた。2004年度に高齢者医学調査を実施したベトナム・プート地域在住高齢者においてブドウ糖負荷試験を実施した結果、当該地域においても糖尿病を含めたメタボリック症候群の増加が認められた。この背景には、近年の生活習慣の変容が大きく影響している可能性が示唆された。ベトナムのプートー地域においても、地元ヘルスネットワークを通じて、生活習慣改善のためのセーフティーネットの構築に着手した。
細胞増殖の調節(特にG1期とG2期で)に関与するヒト遺伝子のクローニング

細胞周期のうち増殖調節が主としてなされているG1期とG2期に的をしぼって、これらの時期に変異を持つBHK21細胞由来の温度感受性変異株を用いて研究を進めている。G1期の変異株としてはtsBN462株をG2期の変異株としてはtsBN2株を選び、前年度までにこれらの変異を野性型に変換する生物活性を持つヒト遺伝子を単離しそのcDNAを分離した。本年度はこれらcDNAの塩基配列より予想される遺伝子産物がヒト由来の細胞に存在することを抗体を用いて証明しさらにその機能についての検討を行った。ヒトCCG1遺伝子はG1期温度感受性変異株tsBN462を相補するヒ遺伝子である。このcDNAより予想されたタンパク質のペプタイドを合成し、これに対する抗体を作ることによってCCG1タンパク質が核タンパクであることを証明した。ところが現実のタンパクは予想された分子量180KDaよりさらに大きく200KDa以上であると推定された。一方、分離されたCCG1遺伝子の5'端を解析することによって分離された遺伝子は本来のヒトCCG1遺伝子とハムスターのある種の遺伝子との融合遺伝子であることがわかった。つまり本来のCCG1遺伝子はさらに大きなものでその産物もまた分離されたcDNAより大きいものであると思われる。現在、分離されたCCG1遺伝子の5'端を用いて完全なCCG1遺伝子の単離を行っている。またCCG1遺伝子がヒトX染色体の8^<11>-g13領域より由来していることを証明した。RCC1遺伝子は染色体凝縮の調節遺伝子と考えているが、その機能は不明である。本年度はこのタンパクが核にあってDNA結合能を持つことを明らかにした。またカエルのRCC1cDNAを単離し、ヒト、ハムスター、カエルの間でこのタンパク質がよく保存されていること及びXenopus oocyteのなかでRCC1mRNAが既にあることがわかった。
粘液細菌におけるチロシン残基のリン酸化を介した情報伝達機構の解明

Ser/Thrキナーゼのcatalytic loop配列を有しない粘液細菌の14個の真核生物様キナーゼのうち、4つの酵素においてTyr残基の自己リン酸化がみられたが、それらは基質タンパク質のTyr残基リン酸化活性を有していなかった。活性の強い2つのキナーゼはTyr残基の自己リン酸化により、活性化された。また、細菌型Tyrキナーゼ(BTK)を活性化するレセプター領域を特定し、BTKの活性化にはBTKのC末端に存在するTyrクラスターの自己リン酸化は不要であることを示した。また、本菌が有する2つのApaH様ホスファターゼのうち、PrpAはTyrホスファターゼとして機能することを明らかにした。1.真核生物様キナーゼの酵素学的諸性質の検討粘液細菌Myxococcus xanthusが有する真核生物様キナーゼのうち、Ser/Thrキナーゼ型のVIb配列を有しないものを選択し、大腸菌で発現させた酵素を用いて、自己リン酸化反応後、抗リン酸化Tyr抗体を用いたWestern blottingを行った結果、3種のキナーゼが検出された。このうちDspAについて、金属塩、ATP、基質に対するKm値測定、キナーゼ阻害剤の影響などの諸性質を明らかにした。このdual specificity kinaseのVIb配列をSer/Thrキナーゼ及びTyrキナーゼが有する特異的な配列にアミノ酸置換した変異酵素を作製した結果、全てにおいてキナーゼ活性の消失が見られた。さらに、activation loopにおける自己リン酸化アミノ酸及び自己リン酸化Tyr残基の特定を行い、それらの変異酵素ではキナーゼ活性が減少あるいは消失したことから、自己リン酸化及びホスファターゼによるリン酸化アミノ酸残基の脱リン酸化によって本酵素は活性調節されることが明らかになった。2.低分子Tyrプロテインホスファターゼの酵素学的諸性質の検討本菌は、低分子Tyrプロテインホスファターゼ(LMWTPP)と相同性の高い酵素(ArsA)を1つ有している。本酵素を大腸菌で発現させ、酵素学的諸性質の検討を行った結果、本酵素は弱いホスファターゼ活性を有するものの、Tyr残基リン酸化タンパク質の脱リン酸化活性を有せず、強いヒ酸レダクターゼ活性を有していたことから、本酵素はLMWTPPとしては機能せず、ヒ酸から亜ヒ酸に触媒する酵素であることが明らかになった。3.細菌型Tyrキナーゼの酵素学的諸性質の検討本菌は2種類の細菌型Tyrキナーゼを有しており、既に本菌における機能解析は終えている。現在、本酵素の自己リン酸化を活性化する領域、キナーゼ活性に必要なアミノ酸などの特定を行い、論文を作成中である。粘液細菌Myxococcus xanthusが有する細菌型チロシンキナーゼBtkAとBtkBの機能解析を行った。レセプターの細胞質領域がチロシンキナーゼ触媒領域を活性化するかどうかを確認するために、チロシンキナーゼ領域のN末端領域にそれぞれのレセプター細胞質領域を結合させると、両キナーゼともレセプターの2番目の細胞質領域によって自己リン酸化及びキナーゼ活性が活性化された。また、BtkBはC末端にあるチロシン残基をリン酸化するが、それらのチロシン残基をフェニルアラニンに置換すると自己リン酸化は見られなくなったが、キナーゼ活性の減少は少なく、C末端のリン酸化はキナーゼ活性には影響を与えないと考えられた。また、BtkBはチロシンキナーゼインヒビターによって活性阻害が見られた。一方、M. xanthusは100程度の真核生物様キナーゼを有するが、VIbドメインにあるcatalytic loopは、セリン/スレオニンキナーゼやチロシンキナーゼでは見られない配列が半分程度存在する。このうち、活性を有するのに必須アミノ酸が保存されているキナーゼを14選択し、大腸菌で発現後、精製酵素を調製して酵素活性の測定を行った結果、4つのキナーゼは、自己リン酸化反応においてチロシン残基のリン酸化がみられ、このうち2つにおいては高いキナーゼ活性が見られた。しかしながら基質タンパク質ではチロシン残基のリン酸化が見られなかったことから、dual specificity kinaseと推定された。さらに2つのApaH様プロテインホスファターゼの酵素学的諸性質の検討を行ったところ、1つ(PrpA)は主にチロシンホスファターゼとして機能し、もう1つ(ApaH)は主にアデノシン4リン酸などを分解する酵素として機能していると推定した。また、両酵素に存在する4つのモチーフのうち、2つのモチーフにて違いのあるのアミノ酸を変異させ、基質特異性に関与するアミノ酸を推定した。粘液細菌Myxococcus xanthusは100程度の真核生物様プロテインキナーゼを有する。セリン/スレオニンキナーゼ及びチロシンキナーゼは、12のサブドメインを有し、そのうちVIbドメインにあるcatalytic loopにRDxKxxN及びRDx(A/R)A(A/R)N配列をそれぞれ有しているが、本菌の真核生物様キナーゼの半分程度は、それらとは異なる配列を有している。我々は前年度に14個の典型的なcatalytic loopを有しないキナーゼを大腸菌で発現させ、酵素活性を測定したところ、2つ(DspA, DspB)を除いて低い活性しか示さなかったことから、典型的なcatalytic loopを有しないキナーゼの大半は低いキナーゼ活性しか有していないと推定した。

活性の高かった2つのキナーゼは塩基性ミエリン(MBP)のセリン/スレオニン残基をリン酸化し、自己リン酸化においてチロシン残基のリン酸化を示すdual specificity kinaseであった。高いキナーゼ活性を有するDspBは、catalytic loopにRDVAQKN配列を有し、これをセリン/スレオニンキナーゼ型に置換した変異酵素(A165K)では、MBPに対するキナーゼ活性が1.3倍増加した。本酵素はRDキナーゼでactivation loopにセリンとスレオニン残基をそれぞれ1つ有しており、それらのアミノ酸をアラニンに置換した変異酵素ではキナーゼ活性に変化は見られなかった。RDキナーゼはactivation loopのアミノ酸がリン酸化されることで酵素活性が活性化されるが、本酵素はそのような機構を有しないと考えられた。一方、本酵素はチロシン残基を自己リン酸化するため、5つのチロシン残基(Y25, Y102, Y145, Y173, Y205)をフェニルアラニンに置換した変異酵素を作製したところ、Y145F変異酵素はキナーゼ活性を大幅に減少させたことから、Y145の自己リン酸化が本酵素の活性化に必要であることが明らかになり、本菌が有するチロシンホスファターゼによって活性調節を受けている可能性が示唆された。Ser/Thrキナーゼのcatalytic loop配列を有しない粘液細菌の14個の真核生物様キナーゼのうち、4つの酵素においてTyr残基の自己リン酸化がみられたが、それらは基質タンパク質のTyr残基リン酸化活性を有していなかった。活性の強い2つのキナーゼはTyr残基の自己リン酸化により、活性化された。また、細菌型Tyrキナーゼ(BTK)を活性化するレセプター領域を特定し、BTKの活性化にはBTKのC末端に存在するTyrクラスターの自己リン酸化は不要であることを示した。また、本菌が有する2つのApaH様ホスファターゼのうち、PrpAはTyrホスファターゼとして機能することを明らかにした。当初計画しているとおりに研究は進行しており、結果も得られている。今年度、それらの結果をまとめた論文を3報報告しており、初年度と合計すると計6報の論文数となっており、研究は順調に進展していると考えている。微生物学最終年度は、dual specificity kinaseの機能解析を進めるため、保存アミノ酸の変異酵素を作製し、それらの活性測定を行っていくことで活性に重要なアミノ酸の特定を行っていく。また、これらの酵素がチロシン残基をリン酸化する活性が上昇するような変異酵素の作製を試みる。さらに本菌が有するセリン/スレオニンキナーゼを数種類発現後、比活性の測定を行い、既に明らかにしている2種類のdual specificity kinaseとの活性比較を行うことで、本菌におけるdual specificity kinaseの機能について推定したい。今年度の研究目標に対して、順調に実験結果が得られており、その結果を2報の論文にて報告した。また、次年度の目標に関しても、結果が得られており、現在、関連した論文を数報作成中で順調に研究は進展していると考えている。1.真核生物様キナーゼの酵素学的諸性質の検討粘液