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タバコ副流煙の体細胞毒性及び遺伝毒性の研究

生殖に対する影響について、曝露後羽化したハエと通常に飼育したハエを用いて交配実験を行ったところ、曝露したハエ同士の交配によって生まれた卵からの羽化率が、尿酸欠損株において低下する傾向が見られたので、生殖能力に対して影響を及ぼしている可能性が示唆された。この成果は日本薬学会第126年会において発表した。本研究はタバコ副流煙が曝露個体そのものに及ぼす影響とその子孫に与える影響を調べることを目的とした。実験動物には世代交代の早いショウジョウバエの野生株と尿酸欠損株を用いた。尿酸は生体に比較的高濃度で含まれ、活性酸素やラジカルのスカベンジャーとして作用すると考えられている。タバコの煙を充満させた25°Cのインキュベーター内にショウジョウバエ3齢幼虫を置き、3あるいは6時間曝露後成虫まで飼育した。羽化率を算定し、曝露個体に対する致死作用を調べた。さらに、羽化した成虫を交配させた時の産卵数及びその卵の羽化率を計数することによって生殖に対する影響を調べた。遺伝子への酸化的傷害の有無を検討するため、曝露直後の幼虫からDNAを抽出し代表的な酸化傷害である8-hydroxydeoxyguanosine(8-OhdG)量を定量した。その結果6時間の曝露において、いずれの株でも生存率の低下が見られたが、尿酸欠損株では野生株の10%程度の減少に比べて有意に低い70%の減少が見られた。したがってタバコ副流煙は生体に対して致死的な作用を及ぼし、その一部は酸化的傷害によるものと考えられる。DNA中の8-OhdG量については、いずれの株でも顕著な変化は認められなかったので、細胞膜の脂質過酸化等、他の酸化傷害が致死的傷害となっている可能性がある。生殖に対する影響について、曝露後羽化したハエ同士の交配と通常に飼育したハエ同士の交配の間で、産卵数には大きな違いが見られなかったが、その卵の羽化率には曝露したハエ同士の交配で違いが見られた。7日間の産卵期間の総計で野生株では平均87%であったのに対し尿酸欠損株では63%であった。従って副流煙への曝露は生殖能力に対して影響を及ぼしている可能性が示唆された。この成果は日本薬学会第126年会ならびに日本環境変異原学会第35回大会において発表した。
腸管におけるMCT9の血清尿酸値制御機序の解明

「産生過剰型」の高尿酸血症の多くは腸管からの尿酸排泄低下に起因する「腎外排泄低下型」であることが近年明らかとなったことを踏まえ、本研究では腎外排泄低下型の高尿酸血症と関連が報告されているモノカルボン酸トランスポーター9(MCT9)に着目し、その機能を解析することで腸管におけるMCT9の血清尿酸値調節機構を明らかにすることを目指した。始めにアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いてMCT9の尿酸の輸送能の解析を行った。結果MCT9による尿酸輸送量は既知の尿酸輸送体であるURAT1と比較し1/7程度と低く輸送パラメータの算出までは至らなかった。またMCT9の変異体の尿酸輸送能は野生型と同等であった。途中、測定に使用していた放射線標識尿酸が分解していたことが判明したため、試薬の溶解法を改善し、薄層クロマトグラフィで展開しオートラジオグラムにて分解がないことを随時確認し測定を行った。MCT9の尿酸輸送量が低いことから基質輸送に補助因子となるタンパク質が必要である可能性も考え、Two-hybrid asssayによりMCT9と相互作用するタンパク質の探索を行った。MCT9のC末端側の細胞内領域をBaitとして用い、preyとしてヒト結腸癌由来caco-2細胞のcDNAライブラリーもしくはヒト腎臓のcDNAライブラリーを用いた。結果、ミトコンドリアタンパク質、脂質代謝に関わるタンパク質などが見出された。これらのタンパク質が尿酸輸送と関連するかは不明であり今後の検討課題であるが、MCT9が腸管において尿酸だけでなく脂質代謝に関わる可能性が新たに示された。本年度はMCT9の尿酸トランスポーターとしての機能特性を明らかにするために、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた尿酸輸送の解析を中心に研究を進めた。MCT9の変異体及びMCT9のアイソフォームをコードするcRNAも併せて合成し解析に用いた。その結果、MCT9は尿酸を濃度・時間依存的に輸送することが明らかとなった。既知の尿酸輸送体であるURAT1と比較し、尿酸の輸送量は1/7程度(測定条件:200μM尿酸, 30 min)であり、輸送パラメータの算出までは至らなかった。また変異体の尿酸輸送量は野生型と同程度であった。アイソフォームは尿酸の輸送が見られなかった。続いてMCT9の尿酸輸送様式を明らかにするために、Na+、H+、K+の各イオン濃度を変えた取り込みバッファーを用いて尿酸の輸送実験を行った。Na+不含のバッファーでは、MCT9の発現の有無による尿酸の輸送量の違いが見られなくなった。このことからナトリウムイオンに依存して尿酸輸送が行われている可能性が示唆された。またMCT9を発現させた卵母細胞に放射性同位体標識された尿酸をインジェクションし、その排出量を検討した結果、MCT9発現卵母細胞による尿酸の排出量はコントロールの卵母細胞のものと違いが見られなかった。以上より、MCT9の尿酸輸送体としての機能特性の一端が明らかとなった。研究計画調書に則しアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて尿酸の輸送特性の検討を行ってきたが、研究の途中で放射性同位体標識された尿酸が分解していることが明らかとなったため、多くの実験のデータを取り直さねばならなかったことが理由の一つである。また、MCT9による基質の輸送量が少なく、輸送パラメータを得るのが困難であったことから、輸送が十分量検出される条件の検討に時間がかかり研究の進展にやや遅れが生じた。

これらのタンパク質が尿酸輸送と関連するかは不明であり今後の検討課題であるが、MCT9が腸管において尿酸だけでなく脂質代謝に関わる可能性が新たに示された。前述のように尿酸の不十分な輸送量のため輸送パラメータの算出ができなかったこともあり研究の進展にやや遅れが生じたが、基質輸送に補助因子となるタンパク質が必要である可能性も考えTwo-hybrid asssayによるMCT9と相互作用するタンパク質の探索を先に開始した。現在ポジティブとなるクローンを探索中であるが、ここで見いだされたタンパク質のcRNAをMCT9のcRNAとアフリカツメガエル卵母細胞にco-injectionすることで、輸送体の細胞内局在や高次構造を改善し、より生体組織内と近い状態で輸送パラメータを算出できる可能性がある。その他、研究計画調書に則して研究を進めていく予定である。前述した理由により研究の進展状況に遅れが生じたこと、また次年度に行う予定であった実験を先に始めたことにより、本年度の実験に使用する予定であった消耗品及び物品の購入を見送ったため、次年度使用額が生じた。本年度に実施できなかった実験項目は次年度に実施予定である。次年度使用額はこれらの研究の推進に必要不可欠な消耗品および物品費等を購入するために使用する予定である。
小説に投影された大英帝国の不安-19世紀末から20世紀初頭の英国小説をめぐって

衰退期にある大英帝国の不安が同時代の小説にどのように反映されているかを分析・考察した。成果の概要としては、国家としての不安が登場人物のアイデンティティクライシスに投影されている事例を具体的に示せた点があげられる。時代が要求する男性性を体現した人物を目指す自己と、男性性とは相いれない要素を多分に持つ内面的自己との葛藤に自己確立を阻まれた結果、自己破滅に陥る登場人物がコンラッド、キプリングの小説に繰り返し描かれるのはその一例とみなせる。研究活動初年度の当該年度は、研究実施計画に記したとおり研究全体の目を果たすための第一段階にあたる。不安の諸相の検証ということでRudyard Kiplingの小説The Disturber of Trafficを主たる研究対象に定めて論文を作成、大学機関誌投稿の機会を得た。この論文は、秩序に対する恐怖によって狂気に導かれ、廃人同様になった男性登場人物に焦点を当て、彼を追い詰め蝕んでいった不安を、大英帝国崩壊期にあたる作品執筆当時の社会状況に照らして論じる内容となっている。執筆に際する研究意義としては、1.帝国没落の社会不安と男性的要素(masculinity)に欠けた登場人物誕生との相関関係2.帝国主義者としての言動を躊躇なくとっていたKiplingが、帝国主義的価値観に背を向けた人物を少なからず創造し、しかも彼らを断罪していないという事実、そして3.帝国主義のアンチテーゼともいえる非男性的登場人物を排斥しなかったリーディングパブリックの存在、がそれぞれ明らかになったことに求められる。研究の重要性としては、フィクションの世界を舞台とした個人レベルでのアイデンティティクライシスが、現実の中で起こっている大英帝国のアイデンティティクライシスとちょうどパラレルの関係でとらえられる可能性を押し広げた点が指摘されうる。高度な言語操作能力により隠ぺいされている場合が多いこの不安を読み解く過程で、社会不安を投影した一芸術形態として19世紀末から20世紀初頭のイギリス小説を位置づけるために、よりいっそう幅広く社会の動きに注目しながら次年度の研究の推進をはかる。研究活動の二年目にあたる平成21年度は、主として個人に注目した前年度の研究実績を踏まえ、個人を取り囲む環境に視野を広げ両者の相関関係から19世紀後半から20世紀初頭にかけての不安に考察を加えることを試みた。考察の結果は論文の体裁を整え大学機関誌に投稿、2010年3月に刊行された。論文で取り上げたJoseph Conrad作An Outpost of Progressはコンゴに派遣された二人のベルギー人駐在員が極度の不安から精神を荒廃させ死にいたる過程を描いている。当該論文では脇役に着目し、彼らの背後にある帝国主義を前景化した内容を提示した。敢えて主人公から視点をずらしたアプローチの意義は、二人を追い込んだ要因が彼らの精神的脆弱さのみならず本社幹部たちに体現される弱肉強食に基づく帝国主義のロジックだと跡付けられた点に求められる。奥地に文明の光をもたらす使者という彼らの自負は、無能な社員は切り捨て効率よい植民地経営を意図する会社にしてみれば単なる幻想であり、見捨てられたのではないかという二人の不安は最初から織り込みずみのシナリオだったことが考察から明らかになった。1.帝国主義に地盤をもつ強国の論理の前に一個人の存在は無力であること2.植民地経営の勝ち組とも言えるヨーロッパ列強の中にあっても帝国主義の名のもとに犠牲者に転じる人々がいること3.2.が生みだす自己矛盾の拡大が帝国崩壊に影響を及ぼしていることの三点が小説から浮き彫りになった点に研究の重要性があると考える。論文執筆とは別に、日本英文学会発表用資料作成の一環として研究対象期に欧米で流行したfuture illustrationを題材に1.一般向け論考を学内誌教養講座欄に掲載2.学内研究部門フォーラムでのポスター発表を行った。どちらも一見希望に満ちたfuture illustrationのネガティブな要素を指摘した内容であり、洞察力に富んだ画家は、万事順調と感じられた経済・国力発展期であっても停滞・衰退期の訪れを予期し作品に投影していたことを示した点に意義と重要性をこめた。平成22年度は、科学研究費補助金による研究活動の最終年度にあたる。したがって1.進行中の計画の遂行2.平成20年度以来の取り組みの総括3.次年度以降の研究テーマの模索・選定という三側面を踏まえて活動した。全般的に当初の研究実施計画に沿った形で研究を実施、口頭・論文発表各一件が具体的な成果である。日本英文学会第82回大会で行った口頭発表「復讐の意味-『メアリー・ポストゲイト』におけるメアリーの変貌」は1と2の要素を併せ持つ。対象作品に『メアリー・ポストゲイト』を選んだのは、目下の研究テーマである「不安」が戦争という非日常的状況で増幅され、主要登場人物の言動を通じて表出されたプロセスの分析に研究趣旨にかなう意義と重要性を認めたからである。

平成20年度に考察したmasculinityの弱体化と社会不安の問題、平成21年度に焦点を当てた不安に根ざしたidentity crisisはどちらも当該発表の重要な部分を占め、これら二つの要素に作品のテーマである復讐行為を関連付けた発表を目指した。一橋大学『人文・自然研究』No.5に投稿した「Mary Postgateにおけるメアリーの復讐と自己表現」は、上記発表で得られたフィードバックを下敷きに、作品への新たな知見を得ることを狙った論文である。3として挙げた次年度以降の研究テーマの模索・選定を念頭に、口頭発表時よりも主人公メアリーに対する注目度を高めて執筆を試みた。理想的なコンパニオンから非情な復讐者への激変ぶりをメアリーの自己実現と位置づけた結果、「女性と暴力表象」「帝国主義下における女性の抑圧・葛藤・自己実現」といった、次の研究につながるキーワードが見出せた点に研究の意義があると考える。キプリング研究の観点からみると、自己実現という視点を持ちこんだ結果、同作品が復讐譚であり且つ自己実現の物語である可能性が裏付けられたことは、復讐譚の系譜に並ぶ他作品へのアプローチを多様なものにしうる点で重要性がある。
イメージングプレートによる電子回析構造解析の精密化

平成8年度私学助成により岡山理科大学総合機器センターに共焦点光学系立体構造解析システムが導入された。このとき電子顕微鏡用イメージングプレート(IP)読取機FDL5000(富士写真フイルム社製)がTEM画像入力装置として設置され稼働を始めた。代表者らはIPを使用し、遷移金属カルコゲン化合物などの種々の未知の結晶の回折パタンを記録してきた。今回は複雑な結晶構造を持つ、カルコゲン化合物、トンネル型酸化マンガン化合物の電子回折パタンに応用して回折斑点の強度の実験値と計算機シミュレーションの値を詳しく検討した。イメージングプレート(IP)を電子顕微鏡画像の記録素子として用い、電子回折斑点の強度を14ビット深さで読み取った。マルチスライス法などの計算機シミュレーションを行い実験で得られたパタンの数値とシミュレーションの結果を数値として比較した。試料の結晶構造を精密に決定するのが目的である。IP読取機FDL5000を使用し今回の科学研究費補助で導入したデジタルイメージバッファ(IB-200・・富士写真フイルム社製)により高速な画像記録が可能になった。また補助金により専用ソフトウエア(富士サイエンスラボ98)が導入され、像強度の数値化、2048絵素の2次元高速フーリエ変換などが可能になり、画像計測系が整備された。回折斑点に流れ込む電流値もマイクロマイクロアンメータとファラディカップで計測が可能となった。電子回折パタンと回折斑点の精密解析により2,3の遷移金属カルコゲンの未知の低温相の結晶構造について構造モデルを提案した。現在、2次電池正極材料として加能性のあるトンネル型マンガン酸化物の新たな材料の水熱合成、電気・磁気特性の測定などを行っている。これまでに遷移金属カルコゲナイドであるBaCu_3S_4やCu_<1.75>Seの低温相の構造解析を行ってきた。200kVの加速電圧を持つ透過型電子顕微鏡に液体窒素ヘリウムを冷媒として使う2軸傾斜試料ホルダーをセットし、撮影した電子回折像を得た。現れた超格子構造について構造を推定し可能な結晶模型を提案してきた。本研究が採択されたことよりイメージングプレート(IP)に記録した電子回折像に現れる斑点の強度について、定性、定量の両面より議論を進めている。まだ、定量的には電子回折の衛星斑点の強度を議論するには至っていない。Cu_<1.75>Seの低温相の構造については室温での逆蛍石型のユニットセルの結晶格子定数a,b,cの各2倍の長さを持つ超格子構造のモデルを提案し、粉末X線回折および電子回折の回折強度を説明することに成功した。これは、像記録にはまだ電子顕微鏡フイルムを用いた結果であるが、J.Elec.Microsc.誌に論文として報告した。(印刷中)また、リチウムマンガン酸化物(Li_2MnO_3のLi抽出反応による構造変化については、第1報を本学自然科学研究所紀要に報告したが(印刷中)、IPに電子回折像を記録しているので今後の精密な議論が可能である。現在、2x4トンネル構造を持つ酸化マンガン化合物(alk-RUB-7 alK=Rb,K)を水熱合成し電子顕微鏡による構造を評価している。(alK-RUB-7)は電気伝導性があり抵抗率測定や帯磁率測定では200K付近に構造相転移が期待される。

今回は複雑な結晶構造を持つ、カルコゲン化合物、トンネル型酸化マンガン化合物の電子回折パタンに応用して回折斑点の強度の実験値と計算機シミュレーションの値を詳しく検討した。イメージングプレート(IP)を電子顕微鏡画像の記録素子として用い、電子回折斑点の強度を14ビット深さで読み取った。マルチスライス法などの計算機シミュレーションを行い実験で得られたパタンの数値とシミュレーションの結果を数値として比較した。試料の結晶構造を精密に決定するのが目的である。IP読取機FDL5000を使用し今回の科学研究費補助で導入したデジタルイメージバッファ(IB-200・富士写真フイルム社製)により高速な画像記録が可能になった。また補助金により専用ソフトウエア(富士サイエンスラボ98)が導入され、像強度の数値化、2048絵素の2次元高速フーリエ変換などが可能になり、画像計測系が整備された。回折斑点に流れ込む電流値もマイクロマイクロアンメータとファラディカップで計測が可能となった。電子回折パタンと回折斑点の精密解析により2,3の遷移金属カルコゲンの未知の低温相の結晶構造について構造モデルを提案した。現在、2次電池正極材料として加能性のあるトンネル型マンガン酸化物の新たな材料の水熱合成、電気・磁気特性の測定などを行っている。
らせん高分子を用いた高効率不斉増幅を特徴とする触媒的不斉合成反応系の開発

ポリキノキサリンの不斉らせん誘起・不斉増幅の詳細について明らかにし、触媒的不斉合成へと展開するため、側鎖にアルコキシ基を有するポリキノキサリンを開発し、その主鎖の不斉らせん制御に成功した。また、末端へのキラル小分子修飾によるらせん不斉誘起についても検討し、キラル小分子による主鎖全体のらせん不斉誘起を達成した。さらに、側鎖にピレニル基を有するポリキノキサリンを合成することで、高効率らせん不斉誘起が可能な溶媒を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることが可能となった。らせん高分子に関する研究において、モノマーの鏡像体過剰率よりもポリマーのらせん方向過剰率が大幅に高くなるという不斉増幅現象が知られているが、従来不斉反応場としての利用は困難であった。一方で、近年申請者の所属する研究室において一方向巻きポリキノキサリンに金属に配位可能な部位としてホスフィノ基を導入すると、不斉触媒反応の配位子として有効に機能し、高い鏡像体過剰率を有する生成物が得られることを明らかにしている。そこで本研究課題では、まず低分子キラル化合物と高分子末端との相互作用によって高分子全体のらせん不斉の制御について検討を行なった。末端にボロニル基を有するアキラルなポリキノキサリンを合成し、光学活性ジオールと反応させたところ、主鎖に由来する円偏光二色性が観測され、ポリキノキサリンの主鎖にらせん不斉が誘起されたことが分かった。また、一旦導入した光学活性ジオールは加水分解によって除去可能であり、除去後に対掌体の光学活性ジオールを導入することで、逆の不斉らせんを誘起できることが分かった。続いて、ポリキノキサリンにおける高効率ならせん不斉誘起の詳細について検討を行なうため、ポリキノキサリンに導入されたキラル側鎖上に、ピレニル基の導入を行なった。様々な溶媒中で主鎖のらせん不斉と、ピレニル基からのエキシマー発光強度との関係を調べた所、強いエキシマー発光を示す溶媒中において、より効果的ならせん不斉誘起が起こることを見出した。これらの検討から、ポリキノキサリン特有のらせん不斉誘起・不斉増幅現象を明らかにすることができた。これらの知見を活かすことで、より効果的な不斉合成反応系の実現に繋がるものと期待される。近年、らせん高分子に関する研究において、モノマーの鏡像体過剰率よりもポリマーのらせん方向過剰率が高くなるという不斉増幅現象が知られていたが、不斉反応場としての利用は困難であった。本研究では、剛直ならせん構造を有するポリキノキサリンに着目し、不斉増幅現象を利用した高選択的不斉触媒として応用することを目的としている。今年度の研究においては、天然に多く存在し安価で入手可能なキラル源としてL-乳酸に着目し、ポリキノキサリン側鎖への導入について検討を行なった。L-乳酸エチル構造を側鎖に有するジイソシアノベンゼン誘導体を合成し、ニッケル錯体を開始剤として用いることで重合を試みたところ、重合はリビング的に進行し、狭い分子量分布で目的とするポリキノキサリンを得ることができた。側鎖の乳酸エチルの鏡像体過剰率を50%まで低下させて同様のポリキノキサリンを合成したところ、らせん方向過剰率は90%と高い値を示し、らせん高分子による不斉増幅を確認することができた。得られたポリマーを水酸化ナトリウム水溶液で処理したところ、側鎖のエステル部位の加水分解が起こり、水溶性のポリキノキサリンを得ることができた。さらに、そのらせん構造は加水分解前から反転しており、右巻き構造を有していることが明らかになった。本研究によって安価な光学活性な乳酸構造をポリキノキサリンの不斉源として適用可能であることがわかり、さらに、低い鏡像体過剰率のキラル源を用いたとしても高いらせん方向過剰率でらせん高分子を得ることができることが明らかすることができた。これは、不斉増幅現象を応用した新たな不斉反応場の構築に繋がる成果であると考えられる。さらにポリキノキサリンの水溶性化にも成功しており、水中での不斉反応への応用にも期待される。本研究では高い不斉増幅効率を持つ剛直ならせん高分子を設計し、わずかな不斉の偏りを増幅し、高選択的不斉触媒として応用することを目的としている。本年度の研究計画として、「側鎖に低鏡像体過剰率のキラル側鎖を有する一方向巻きポリキノキサリン」と「不斉分子・不斉表面と相互作用可能な置換基を側鎖に持つポリキノキサリン」の合成を目指した。まず、側鎖に低い鏡像体過剰率の乳酸構造(40%ee)を導入することで、高いらせん方向過剰率のポリキノキサリン(90%se)の合成に成功した。また、同様の手法を用いて側鎖にアキラルなカルボン酸構造を有するポリキノキサリンの合成にも成功している。

このポリキノキサリンの水溶液に、不斉分子として光学活性な酒石酸を加えることで一方向巻きらせんが誘起されることも見出している。また、従来のポリキノキサリンでは、有機溶媒のみに可溶であり水には不溶であったが、今回合成したポリキノキサリンは水溶性を示し、ポリキノキサリンの応用範囲をさらに拡大することができたものと考えられる。以上より、本研究は当初の計画以上に進展していると考えている。今年度の研究によって低い鏡像体過剰率のモノマーを用いてらせん方向過剰率の高いポリキノキサリンを得ることができた。今後の研究においては、ポリキノキサリンにプロキラルな側鎖を導入しキラルな刺激を与えることで、主鎖のらせん不斉の制御について検討し、最終的にポリキノキサリンに触媒機能部位を導入し、不斉増幅に関する知見に基づいて、低い鏡像体過剰率の不斉源から、高い鏡像体過剰率の生成物を得る一般的な方法論の確立を目指したいと考えている。これまでの研究において、ホスフィン部位を有するジイソシアノベンゼン誘導体を共重合することで、一方向巻きポリキノキサリンが不斉配位子として機能することが分かっており、これを利用した触媒機能の付加を検討する。また、今年度の研究で得られた一方向巻きかつ水溶性を示すポリキノキサリンを用いた、水中での不斉反応場の構築についても検討を行いたい。次年度の研究を進めるに当たって必要な施設・機器はすでに所有しており、特段の高額機器の追加購入は必要としない。次年度の研究費の大部分は、らせんポリマーの合成に必要不可欠な有機合成用試薬や汎用有機溶媒に関わるものである。旅費としては、情報収集や本研究に関連する研究者との討議のための国内旅費を計上している。またその他の費用として、論文作成の際の英文校正にかかる費用も計上している。
妊婦・授乳婦の骨密度検診の提案および食生活指導方針の確立

1.妊婦および授乳婦では、カルシウムは骨密度を高める方向に、たんぱく質は骨密度を低下させる方向に作用するので、妊娠、授乳期の骨密度保持のためには、両者のバランス、すなわちカルシウム/たんぱく質摂取比を高めることが重要である。「日本人の食事摂取基準(2005年版)」では妊娠期の付加量について、たんぱく質では必要であるがCaではその必要なしと変更されている。ここで得られた結果からは骨密度保持のためには、たんぱく質の付加量に応じたCaの付加量が必要と考えられる2.妊娠初期に骨密度測定を行い、食事指導を行うことを提案する。妊娠前半期の骨密度増加は妊娠全期間の骨密度低下を抑制するので有意義である。3.妊娠初期にBMIの低い者では前半期に骨密度が低下する。骨密度保持のためには妊娠初期に適正な体重であることが重要である。2006年712月に、妊娠初期と妊娠中期の2回の骨密度測定および周産期の特性、生活状況、連続した3日間の食事記録の調査を行った妊婦の中から、開始時の妊娠週数が21週以上の者、サプリメント摂取者、栄養調査に協力の得られなかった者を除き29名を縦断的研究に関する分析対象とした。縦断的解析の結果、1.対象者の半数以上において、妊娠中期には妊娠初期に較べ骨密度が高くなる場合が認められた。2.重回帰分析の結果、中期における骨密度変化率に有意に影響を与えている要因は、タンパク質およびカルシウム摂取量、妊娠回数で、タンパク質では負、カルシウムでは正、妊娠回数では正の関連が認められた。3.カルシウムとタンパク質の摂取量の比(Ca/Pro)と、骨密度変化率との間にr=0.46(n=29,p<0.01)の正の相関が認められ,タンパク質摂取量に対しカルシウム摂取量が多い場合、骨密度変化率は上昇した。妊娠前半期においてCa/Pro比の増大が妊娠前半期の骨密度付加に対して重要であると言える。4.タンパク質摂取源では肉・魚類、カルシウム摂取源では乳・乳製品との相関が最も大きかった。食品群別に見ると、〔肉・魚類のタンパク質g/乳・乳製品類のカルシウムmg〕摂取比が10以上の場合、骨密度は低下しないことが判明した。横断的解析の結果対象者71名のうちCa剤を摂取していた3名を除いた68名について横断的解析を行った。(1)密度の分布をみると最頻値は8085で、ほぼ正規分布を示した。(2)妊娠回数が多いほど骨密度が低くなる傾向が見られた。(3)尿中H.p/creと妊娠週数の間にはr=0.30(n=34,p<0.05)の有意の正相関が見られた。(4)生活習慣の項目では、「職業の有無」で専業主婦が、「妊娠前の活動量」では「運動をする」ほど、「日中の外出頻度」では外出頻度が多いほど骨密度が有意に高かった。以下の2方法によるデータ収集、および過去のデータを用いた論文作成を行った。1.2007年79月に昨年度からの追跡者で出産後の授乳者について、出産後6カ月の骨密度測定、および授乳状況、食生活状況、尿、血液中骨代謝物質の測定を行った。栄養調査の得られた14人について、昨年のデータをもとに縦断的解析を行った。2.2007年11月2008年(現在も進行中)に、あらたに妊娠初期の対象者30人について、昨年度と全く同様の方式により、コホート研究を開始した。本年3月現在、妊娠中期の測定・栄養指導・調査を進行中である。昨年度の対象者を加えた100人について、妊娠初期の骨密度とライフスタイルについて、横断的解析を試みた。縦断的解析の結果は、(1).出産後6カ月では出産時に較べ-21%+10.3%とさらに低下した者と回復した者の個人差が大きかった。(2).骨形成指標(BAP, Osteocalcine)は上昇、骨吸収指標(DOP, NTx)は低下しており、骨形成が亢進していることがわかる。(3).尿中尿素窒素は骨密度変化率と有意の負相関が見られ、たんぱく質摂取量が多い程、骨密度が低下したことを示唆する。横断的解析は、Ca剤を摂取していた3名を除き97名について解析した。その結果、(1)骨密度は最頻値8085でほぼ正規分布を示した。(2)出産回数が多いほど骨密度が低い傾向が見られた。

(3)骨密度は測定時のBMI(r=0.288, p=0.002)および妊娠前のBMI(r=0.267, p=0.004)といずれも有意の正相関が見られ、BMI18未満では骨密度が低かった。(4)生活習慣の項目では、「職業の有無」で専業主婦が、「妊娠前の活動量」では「運動をした」ほど、「日中の外出頻度」では外出頻度が多いほど骨密度が有意に高いまたは高い傾向が見られた。これまでの一連の研究により、妊娠期および授乳期のいずれも骨代謝が亢進し、骨密度は低下すること、低下の程度は個人差が大きく、影響要因として妊娠期では年齢、妊娠回数、3週間以上の臥床、食生活、授乳期では出産回数、授乳期間、体重変化、前回の出産・授乳との間隔、授乳中および回復期の食生活が認められた。妊娠、授乳、離乳期は骨密度が大きく変動する時期であり、ことに食生活要因はすべての時期に関連が見られること、栄養素ではたんぱく質に対するカルシウム(Ca)の摂取バランスが骨密度保持の決定要因となることが示唆された。そこで、本年度はさらに例数を増やして、食事との関係を代謝指標との関係も含めて検討した。妊娠前半期および後半期、全期間について検討した。研究成果は、1.妊娠前半期に骨密度が増加する場合と低下する場合が認められ、増加群では低下群に較べて妊娠全期間の低下率は有意に低く、前半期の増加が意義があることが判明した。2.妊娠前半期の骨密度変化率はCa摂取量は正、たんぱく質摂取量は負の関連が認められ、両者の比Ca/ProはCa、たんぱく質単独の場合より強い正の関連が認められ、両者のバランスの意義が再確認された。3.前半期のCa/Proは初期および中期の血清Ca/Pと正の有意相関、また初期の血清Ca/Pは初期、中期のBAPと正、初期Ca/Cre、尿中NTXといずれも負の有意相関が認められた。これらの結果は妊娠前半期の食事中のCaとたんぱく質摂取バランスが妊娠中の骨密度低下を抑制するのに重要であることを示している。妊娠中の骨密度保持のためには、「日本人の栄養摂取基準」において、たんぱく質付加量に応じたCaの付加量が必要であることが示唆された。
差周波励起ナノスペクトロスコピーの原理解明

走査トンネル顕微鏡(STM)の探針直下に波長の異なるレーザー光を照射すると局所的に発生する差周波光に対するSTM電流の応答を用いてナノ空間分解能で赤外吸収分光を行う新しい顕微分光法として、フーリエ変換(FT)干渉計に通し多波長同時変調した広帯域・超短パルススーパーコンティニュウム光を照射光に用いるシステムを構築し実験を行ったところ、差周波発生した赤外光が試料に吸収されたためと解釈できるFTスペクトルの観測に成功した。2つの異なる波長のレーザー光を走査トンネル顕微鏡(STM)の探針と試料間のギャップに照射すると局所的に差周波光が発生する。その発生原理と、赤外吸収スペクトル信号の起源、を解明することによって、分子(広義)の同定と特定部位の結合・電子状態を室温においてもナノスケールで解析できる新しい顕微分光手法=差周波励起ナノスペクトロスコピー=の適用可能範囲を明らかにすることを目的とし、今年度は次の実験を行った。(1)集光光学系の改良:レーザー光の照射強度を高めるため、波長限界近く(5μ)まで集光し、スポット位置を微調整できる光学系を組んだ。(2)偏光変調法による探針熱膨張抑制:レーザー光を集光する代償として、断続照射による探針の熱膨張効果が大きくなり、所望の信号がこれに埋もれてしまう。これを回避するために、所望の信号が強い偏光依存性を持つことに着目し、従来の強度変調の替わりに偏光変調法を試み、熱膨張による余計な信号を大幅に抑制することに成功した。(3)カーボンナノチューブSTM探針の作成技術の開発:差周波励起ナノスペクトロスコピーを実現するためには、STM探針直下での照射レーザー光の光電場を増強することが有効である。アスペクト比の大きなカーボンナノチューブ(CNT)は、バンド間共鳴吸収によって大きな光電場増強効果が期待される。様々な化学処理を施したCNT粉末を脱イオン水に分散させ、高周波電気泳動法によりW探針の先端にCNTを吸着させる方法を開発した。化学処理効果はラマン分光装置により評価し、加熱した過酸化水素水により完全性の高いCNTを残す処理が最も有効であることを見出した。(1)フーリエ分光方式STM光吸収分光法の開発波長逐次掃引方式の分光測定では、STM探針の時間的状態変化に伴う偽のスペクトルが得られることが多く、これを回避するため、フーリエ変換(FT)方式による分光測定を試みた。今回は、FT分光器の干渉計を通した白照射光を探針-試料間に照射し、多波長変調光に応答して生じるトンネル電流の時系列信号のフーリエ変換を求めることにより、Si試料の光吸収スペクトルを取得することに成功した。(2)探針用単層カーボンナノチューブ(CNT)の光照射欠陥生成差周波発生に有利となる探針先端での大きな光電場増強効果が期待されるCNTに強い光を照射すると欠陥生成や構造変化・イオン脱離が起こる可能性が危惧され始めたため、これを調べた。今回用いた照射光は軟X線領域の比較的光エネルギーを大きな3種の光(Mgターゲットからの1.25keV特性線、SP-8およびPFアンジュレータ放射光(240・310eV)、)で、欠陥生成は欠陥由来のラマン散乱信号の増大により、構造変化はX-ray吸収スペクトル変化、イオン脱離はTOFイオン質量分析によりそれぞれ調べた。その結果、わずかではあるが、光照射効果があることが見出された。今後もっと低エネルギーのレーザー光でも同様の構造変化が起こらないかどうかを調べ、CNT探針の光照射に対する安定性を調べる。その発生原理を解明することによって,ナノスケールの物質の同定を室温においても可能にする新しい顕微分光手法=差周波励起ナノスペクトロスコピー=の適用条件を明らかにすることを目的とし,今年度は次の実験を行った。(1)光整流電流の検出による非線形光学応答の起源解明差周波電流と同時に発生するはずの光整流電流を検出することにより,光整流電流の大きくなる条件を探索し,非線形光学応答の起源を調べた。光変調電流には光整流電流のほかに光熱膨張効果による余剰信号が存在するので,後者を抑制するために一作年度開発した偏光変調法を用いたうえで,後者の信号成分の有無を判定するために探針一試料距離を変調したときに表れる信号と光変調信号のゆらぎの時間的相関を観測した。

その結果,,探針一試料間距離の近いとぎに限って光整流電流と推定される信号が一時的に桁違いに大きくなる状態が現れること,カーボンナノチューブ(CNT)探針を用いると光熱膨張によらない信号が強くなること,が分かった。信号のゆらぎが大きいことから,差周波分光スペクトルを再現性よく測定するには,昨年度開発した波長掃引を必要としないフーリエ分光方式の適用が有利との見通しを得た。(2)探針用単層カーボンナノチューブ(SWNT)の電流注入による欠陥生成上記に述べたようにCNT探針が差周波発生に有利となる可能性があることが分かったが,いっぽうSWNTに電流注入すると欠陥生成が起こることが懸念された。金基板上に散布した半導体SWNT試料に対してSTMの探針から電子,正孔を注入すると,バイアス極性によって異なる閾値電圧で欠陥がSWNTに導入されることを確かめた。金属SWNTで同様の効果が起こらないかどうか,引き続き検討中である。2つの異なる波長のレーザー光を走査トンネル顕微鏡(STM)の探針と試料間のギャップに照射すると局所的に差周波(DFG)光が発生することを利用した新しい顕微分光手法=差周波励起ナノスペクトロスコピー(STM-DFG)法=の最適測定条件を明らかにすることを目的とし、今年度は次の実験を行った。1カーボンナノチューブ(CNT)探針とその構造変化:通常のW探針やPr-Ir探針では再現性よく所望の信号が得られないが、CNT探針を用いると、DFG光発生に有利な大きな光電場増強効果もしくは非線形光学応答を示唆する異常状態が時々現れることが分かったしかし、異常状感の一時的出現の原因がSTM探針の状態変化である可能性があるため、金属単層CNTに対するトンネル電流注入効果を調べたその結果、95Kの低温で3.5eV以上のエネルギーを持った電子を金属単層CNTにトンネル注入すると、約0.7eVのHOMO-LUMOギャップを伴う欠陥が発生することが分かった。この欠陥は室温で構造変化を起こすことから、探針不安定性の原因である可能性がある。しかしこのことから、電流とバイアス電圧を小さくすれば、これを原因とする探針不安定性を回避できると考えられる。2フーリエ分光方式多重差周波光吸収法の試み:これまでの研究から、探針の状態変化による信号のゆらぎが大きい場合は、分光スペクトルを再現性よく測定するには、波長掃引を必要としないフーリエ変換(FT)分光方式の適用が現実的には必須であることが分かったFT方式によるSTM-DFG測定を模擬するため、波長幅を有する超短パルスレーザー光と固定波長レーザー光を重ねてFT干渉計に通すことにより生成した多波長同時変調光を、金微粒子により光電場増強効果と非線形光学応答を実現した模擬試料に照射することにより、多重DFG光吸収分光測定が可能であることの実証を試みた。
植物と病原体の攻防における分子機構

本研究室においてこれまでに解析をおこなってきた植物免疫における重要タンパク質である活性酸素発生酵素群とPAMP受容体群を中心に、これらタンパク質の複合体構成因子およびリン酸化タンパク質の同定を試みた。主には免疫沈降法で精製した複合体およびリン酸化ペプチドを高感度質量分析器した。同定された因子をPAMP受容体の結合因子と比較した所、両者のリストに含まれるLRR型受容体型キナーゼ(LRR-RLK)を同定した。シロイヌナズナにおける欠損変異体ではPAMP誘導性の活性酸素生成、MAPKリン酸化、及び病原細菌に対する抵抗性が亢進していた。一方で過剰発現体では、PAMP誘導性の活性酸素生成、MAPKのリン酸化、及び病原細菌に対する抵抗性が抑制されていた。これらの結果はこのLRR-RLKがPAMP誘導性の活性酸素生成、MAPK活性化、及び病原細菌に対する抵抗性を負に制御することを示している。また、PTIとETI誘導時のリン酸化プロテオーム比較解析をおこなって、共通にリン酸化されるタンパク質およびそのリン酸化部位を同定した。さらに、病原体の多様性から病原体因子を同定するため、各種病原体のゲノム・トランスクリプトームをおこない、病原体解析の分子解析基盤確立を推進した。このうち、C. orbiculareの再シークエンス、C. higginsianum、C. shisoi、C. trifolii, C.とC. spinosum. C.およびネコブ線虫と計6種のデノボゲノム解析をおこない、論文として発表した。同時に、機能的に重複するエフェクターを研究するために、複数の遺伝子破壊がしばしば必要とされるが、遺伝子ターゲティングに使用できる選択マーカーの数は限られている。そこで、C. orbiculareにおいて連続的な形質転換を可能にするマーカーリサイクルシステムを確立した。免疫沈降法で精製した複合体およびリン酸化ペプチドを高感度質量分析器で解析する技術が確立しており、実際に本技術によって同定した新規タンパク質が植物免疫に重要であることを変異体や過剰発現体を用いて示すことができた。また、PacBio Sequelシステムを用いて、デノボゲノム解析をおこなう技術を確立できたことにより、数多くの日本産病原菌の染色体レベルでのゲノムアセンブリーを完成できている。染色体レベルでのゲノムアセンブリーにより、全染色体レベルでの比較ゲノム解析が可能となり、例えば、染色体の欠損や置換などの詳細解析が可能となっている。真菌の病原菌はミニ染色体に病原性遺伝子を座乗させていることが報告され、ゲノムシークエンスによりミニ染色体が同定できることは大きな進歩と言える。これに加えて、マーカーリサイクル技術を確立できたことで、多数(例えば10遺伝子以上)の遺伝子をノックアウトすることが可能となる。これによって機能が重複するエフェクター遺伝子群のノックアウトを作り、表現型解析をおこなえば、病原性への関与を検証できる。PTIを制御する因子として同定されたタンパク質群に関して、変異体や過剰発現体を用いて、PTIシグナル伝達系の何処で制御がおこなわれているかを引き続き解析する。例えば、活性酸素生成、及びMAPK活性化に影響を及ぼす場合は、その上流のPAMP受容体や共受容体等の上流因子を制御している可能性が示唆される。この場合は、PAMP受容体のタンパク質量を調べる等して、制御様式を明らかにしていく。また、病原細菌の侵入には気孔が重要であることから、気孔の開閉能等を詳細に解析して、制御部位を明らかにする。病原体ゲノムシークエンスを継続しておこない、病原性エフェクター候補の同定をおこなう。感染時に発現が上昇する、あるいは、変異が入りやすい等有望なエフェクター候補に関しては、マーカーリサイクル技術を用いて、ノックアウトを作成し、病原性の有無を確認する。さらに、CRSPR/CASシステム等を導入して、マーカーリサイクル技術の効率を上げる努力をする。表現型が確認できたエフェクターに関しては、蛍光タンパク質のタグを付け植物内で発現させ、細胞内での局在を確認し、かつ植物免疫を応答の抑制や活性化を誘導するかどうかを詳細に解析する。これまで未解明であった植物免疫シグナル伝達系の全容解明や、解析が難しかった病原体の感染機構に着目して解析を進める。これまでに本研究室で確立したオミックス解析基盤(ゲノム、トランスクリプトーム解析、プロテオーム、ケミカルゲノミクス)、そしてタンパク質構造解析基盤を駆使し、植物免疫や病原性に重要なタンパク質複合体の同定と機能解析を通して植物免疫システムを解明していく。カルシウムセンサーであるイクオリンを発現させたシロイヌナズナを用いたスクリーニング系で、過酸化水素の添加時に細胞質内にカルシウム濃度が上昇しない変異体を11系統獲得し、この表現型がすべて劣性変異であることから、原因遺伝子が、過酸化水素を認識してカルシウム濃度を上昇させるシグナルに必須であることが示唆された。全ゲノムシークエンスにより、原因遺伝子がLRR-RLK(ロイシンリッチリピート・レセプター様キナーゼ)をコードしており、すべてのアリルの変異が同定された。また、この遺伝子が陸上植物で高度に保存されていることから、その機能も陸上植物で重要であることが考えられる。このタンパク質は膜貫通ドメインを持つLRR-RLKであることから、細胞膜タンパク質である可能性が高い。これを検証するため、蛍光マーカーであるGFPをC末にタグし、変異体の相補実験をおこなった。過酸化水素認識能力は回復し、共焦点顕微鏡によって細胞膜に局在することが明らかになった。また、C末の配列から抗原をデザインして作り、特異的抗体を作成して、その発現量を確認した。またシスティン残基を変異させたタンパク質を発現させ、機能に重要なシスティン残基を同定した。

ベンサミアナタバコにおいて強発現させる系を確立し、mg単位の細胞外部位のタンパク質を得ることができた。また、下流のMAPキナーゼの活性化にこのタンパク質が必要であることが明らかになった。新規ロイシンリッチリピート・レセプター様キナーゼが過酸化水素の認識に重要であることが、全ゲノムシークエンスベースのクローニングと相補実験の結果から確認された。さらに特異的抗体作製の成功により、さらなる機能解析が可能となった。機能に重要なシスティン残基が同定されたことは、どのようにして過酸化水素を認識するかの分子機構が明らかになる可能性が高い。また、ベンサミアナタバコにおいて強発現させる系を確立し、mg単位の細胞外部位のタンパク質を得ることができたことから、構造生物学的なアプローチも視野に入ってきた。本遺伝子下流のシグナル伝達系においてもMAPキナーゼカスケードの関与が示唆されたことにより、他変異体との掛け合わせ、リン酸化プロテオーム解析、遺伝子発現解析等の技術を利用しての全容解明へむけた手がかりがつかめたと判断する。よって、本課題はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究室においてこれまでに解析をおこなってきた植物免疫における重要タンパク質である活性酸素発生酵素群とPAMP受容体群を中心に、これらタンパク質の複合体構成因子およびリン酸化タンパク質の同定を試みた。主には免疫沈降法で精製した複合体およびリン酸化ペプチドを高感度質量分析器した。同定された因子をPAMP受容体の結合因子と比較した所、両者のリストに含まれるLRR型受容体型キナーゼ(LRR-RLK)を同定した。シロイヌナズナにおける欠損変異体ではPAMP誘導性の活性酸素生成、MAPKリン酸化、及び病原細菌に対する抵抗性が亢進していた。一方で過剰発現体では、PAMP誘導性の活性酸素生成、MAPKのリン酸化、及び病原細菌に対する抵抗性が抑制されていた。これらの結果はこのLRR-RLKがPAMP誘導性の活性酸素生成、MAPK活性化、及び病原細菌に対する抵抗性を負に制御することを示している。また、PTIとETI誘導時のリン酸化プロテオーム比較解析をおこなって、共通にリン酸化されるタンパク質およびそのリン酸化部位を同定した。さらに、病原体の多様性から病原体因子を同定するため、各種病原体のゲノム・トランスクリプトームをおこない、病原体解析の分子解析基盤確立を推進した。このうち、C. orbiculareの再シークエンス、C. higginsianum、C. shisoi、C. trifolii, C.とC. spinosum. C.およびネコブ線虫と計6種のデノボゲノム解析をおこない、論文として発表した。同時に、機能的に重複するエフェクターを研究するために、複数の遺伝子破壊がしばしば必要とされるが、遺伝子ターゲティングに使用できる選択マーカーの数は限られている。
腎発癌抵抗性動物モデルの作製とその応用

HNFl(hepatocyte Nuclear factorl)遺伝子プロモーター下にヒトRb遺伝子を連結したコンストラクトを受精卵に注射して作製したHNF1-Rbトランスジェニックマウスは外見上野生型マウスと同じであり、同様に子孫も作ることができた。A系統のマウスはトランスジーンを11.0コピー/ハプロイド、B系統のマウスは4.2コピー/ハプロイドそれぞれ持っている。まず、生後の肝臓重量と腎臓重量を月を追って計測し比較したが、野生型とトランスジェニックマウス両群の間に差は認められなかった。次に化学発癌を起こす準備を始めた。腎臓発癌のためには鉄ニトロ三酢酸を3カ月腹腔内投与し、肝発癌のためには最初ジエチルニトロサミンを腹腔内投与の後フェノバルビタール8カ月飲水させる。このプロトコールによりそれぞれ腎臓癌および肝細胞癌がおこるかどうかをまず検討した。その結果、コントロールマウスでは腎臓癌または肝臓癌の発生を確認できた。次に、HNFl-Rbトランスジェニックマウスにも化学発癌剤を投与して癌を誘導したところ、肝細胞癌の発生は認められなかったが、腎臓癌の発生はコントロールマウスと有為差がなかった。肝臓と腎臓の間に結果の遊離が認められたので、同時に注射したトランスジーンHNFl-LacZにて、肝臓と腎臓における発現パターンを検討した。その結果、HNFlの9kbpのプロモーターでは、肝細胞には100%強く発現しているが、腎臓には尿細管細胞の一部にしか発現していないことが判明した。このことは、今回得られた発癌抑制結果によく一致している。癌抑制性遺伝子Rbは細胞内の種々の増殖に働く蛋白質に結合しその活性を抑えることにより増殖抑制に働く。肝臓、腎臓、腸に特異的に発現する転写因子HNF1遺伝子のプロモーターの支配下にヒトRb遺伝子を連結し、このコンストラクトを受精卵に微小注射してトランスジェニックマウスを作製した。2系統のマウスが得られた。A系統のマウスはトランスジーンを数十コピー、B系統のマウスは約10コピーのトランスジーンをもっていることがサザン解析の結果判明した。まず、HNF1プロモーターの発現パターンを確認するために、HNF1プロモーターの支配下にLacZ遺伝子を連結させたコンストラクトも同時にトランスジーンとして注射してあるので、LacZの酵素活性染色で胎児期および出生後のHNF1プロモーターの発現がモニターできる。その結果、トランスジーンに用いたHNF1プロモーターは胎児期10.5日から肝臓原基細胞で転写され、胎生12.5日の肝臓では肝細胞に強く発現することが確認できた。また、12.5日では小腸上皮細胞に発現が認められた。胎生13.5日の後腎でも発現が弱く認められ、出生後は腎臓では尿細管細胞にのみ発現が認められた。以上の結果はトランスジーンは内因性のHNF1遺伝子と非常に似た発現パターンを示すことが明らかになった。そこで、まずウエスタン解析により、Rb蛋白の同定を試みた。A系統のマウスでは多量のヒトRb蛋白が、B系統のマウスでは少量のヒトRb蛋白が、コントロールのマウスではヒトRb蛋白は検出できなかった。トランスジェニックマウスの2系統の特徴が把握できたので、次年度は化学発癌剤による腎臓癌の発生に対するトランスジーンの効果を検定できることになった。特に、多量のRbをもつA系統、少量のRbをもつB系統、コントロールの間で比較検討できるので、好都合の実験系となった。HNF1 (hepatocyte Nuclear factor 1)遺伝子プロモーター下にヒトRb遺伝子を連結したコンストラクトを受精卵に注射して作製したHNF1-Rbトランジェニックマウスは外見上野生型マウスと同じであり、同様に子孫も作ることができた。A系統のマウスはトランスジーンを11.0コピー/ハプロイド、B系統のマウスは4.2コピー/ハプロイドそれぞれ持っていることが判明した。

まず、生後の体重及び肝臓重量を月を追って計測し比較したが、野生型とトランスジェニックマウス両群の間に差は認められなかった。また急性期反応に対するHNF1プロモーター活性の変化を肝切除後の肝臓内Rb蛋白量の変化でもって検討したところ、切除後Rb蛋白はすぐに消失し3日目に出現することを見いだした。このことは、トランジェニックマウスが肝切除後野生型と同じ大きさまで肝再生をする事実を説明する。次に化学発癌を起こす準備を始めた。腎臓発癌のためには鉄ニトロ三酢酸を3カ月腹腔内投与し、肝発癌のためには最初ジエチルニトロサミンを腹腔内投与の後フェノバルビタール8カ月飲水させる。このプロトコールによりそれぞれ腎臓癌および肝細胞癌がおこるかどうかをまず検討した。その結果、コントロールマウスでは腎臓癌または肝臓癌の発生を確認できた。現在、HNF1-Rbトランスジェニックマウスにも化学発癌剤を投与して癌を誘導中である。HNF1(hepatocyte Nuclear factor 1)遺伝子プロモーター下にヒトRb遺伝子を連結したコンストラクトを受精卵に注射して作製したHNF1-Rbトランスジェニックマウスは外見上野生型マウスと同じであり、同様に子孫も作ることができた。A系統のマウスはトランスジーンを11.0コピー/ハプロイド、B系統のマウスは4.2コピー/ハプロイドそれぞれ持っている。まず、生後の肝臓重量と腎臓重量を月を追って計測し比較したが、野生型とトランスジェニックマウス両群の間に差は認められなかった。次に、HNF1-Rbトランスジェニックマウスにも化学発癌剤を投与して癌を誘導したところ、肝細胞癌の発生は認められなかったが、腎臓癌の発生はコントロールマウスと有為差がなかった。肝臓と腎臓の間に結果の遊離が認められたので、同時に注射したトランスジーンHNF1-LacZにて、肝臓と腎臓における発現パターンを検討した。その結果、HNF1の9kbpのプロモーターでは、肝細胞には100%強く発現しているが、腎臓には尿細管細胞の一部にしか発現していないことが判明した。このことは、今回得られた発癌抑制結果によく一致している。
強酸性を示す特異な遷移金属ヒドリド錯体の創製と高効率触媒反応への応用

1.1,2-ジアリール-3,4-ジホスフィニデンシクロブテン配位子(DPCB-Y)をもつ一連のカチオン性パラジウム(II)およびロジウム(I)錯体を合成単離した。[Pd(MeCN)_2(DPCB-Y)]^<2+>錯体はα,β不飽和ケトンとカルバミン酸ベンジルとの共役付加反応(エノンのヒドロアミド化反応)に対して特に高い触媒活性を示した。同様の触媒活性は[Pd(MeCN)_4]^<2+>について報告されているが、触媒の活性と安定性の両面においてDPCB-Y錯体が優れていた。この触媒反応は、1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン等の二座ホスフィン配位子では全く進行せず、低配位リン化合物であるDPCB-Y配位子の特異性を示す結果と言える。2.DPCB配位子をもつヒドリドパラジウム錯体を触媒活性種として用いることにより、2-ブテン-1,4-ジオールと活性メチレン化合物との脱水環化反応が起こり、2-ビニル-2,3-ジヒドロフラン誘導イ本が生成した。ピリジンを助触媒として添加し、活性メチレン化合物のエノール化を促進することにより、最高91%の単離収率で目的生成物を得ることができた。3[Ru(μ-Cl)(Cl)(CO)(DPCB-Y)]_2と水およびヒドロシランとの反応により、シラノールの副生を伴ってヒドリドルテニウム錯体[RuH(Cl)(CO)(DPCB-Y)]が合成された。この錯体は極めて不安定であったが、PPh_3を用いて[RuH(Cl)(CO)(PPh_3)(DPCB-Y)]として捕捉し、単離同定することができた。4[IRh(μ-OH)(DPCB-Y)]_2とヒドロシランとの反応より[Rh_2(μ-H)(μ-OH)(DPCB-Y)_2]が生成した。この錯体はギ酸との反応によってさらに[Rh(μ-H)(DPCB-Y)]_2へと変換され、ジエンの存在下ではπアリル錯体を与えた。