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発酵熱の生化学的制御と低温廃熱発電への応用

古くから知られているがほとんど議論されることが無かった発酵熱生成の機構について、(a)菌体外酵素などによって進行する有機物の分解に附随するエネルギーの放出、(b)本来であればATP生成へ向かうべきエネルギーがリークして生成、(c)微生物がATP分解や呼吸鎖の脱共役などによって積極的に熱を生産する、との3つの場合を想定し、天然インジゴ生産の工程である藍葉の発酵を系に研究を行った。乾燥させた藍葉に適量の水を加えることによって発酵が開始し、約40°Cまでの温度上昇が起こる系を構築した。発酵時の微生物叢をメタゲノムの変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)法によって解析したところ、Pantoeacalida、Bacillus amyloliquefaciensなど6種の細菌と、Rhizopus sp.、Aspergillus sp.、Lichtheimia ramoseの3種のカビの存在が示唆された。発酵時にPenicillinとStreptomycinを添加しても温度上昇には変化がなく、Nystatinを加えた場合には温度上昇は起らなかった。そこで単離した菌を滅菌した藍葉に稙菌したところ、Aspergillus sp.を稙菌した場合のみ、無処理の藍葉とほぼ同程度までの温度上昇が見られた。なおリアルタイムPCRの解析では他の2種の真菌についてはAspergillus sp.と同程度の生育があったにも関わらず、温度の上昇は得られなかった。さらに培地を藍から糠に変え、これらのカビを無菌的に植菌した系においても同様の結果を得たことから、発酵熱生成がAspergillus sp.に特異的に起る可能性を示唆するものであり、同菌には何らかの発熱装置が存在する可能性が示唆された。微生物が関与する発酵過程では発酵熱が産生される。発酵熱は有機物の酸化分解に伴って生成すると考えられているが、その意義や詳細な機構については未だ本質的な理解がなされていない。本研究では、発酵熱産生の機構や意義を明らかにし、最終的には熱発生の制御を可能とすることを目的とする。本研究では発酵熱産生のモデル系として、藍染めを行う過程のすくも作製時に産生される発酵熱の生成過程を解析した。発酵熱産生に必要とされる栄養源の検討や、発酵過程における菌叢解析と微生物の単離・同定を行った。発酵熱産生は適量の乾燥藍葉に水を加え、その後の温度変化を測定することで確認した。発酵終了後の、温度上昇が認められなくなった残渣に、藍葉や桑の葉、グルコースもしくはカザミノ酸を追加したところ、いずれの場合にも再度の温度上昇がみられた。この結果、藍葉における発酵熱の産生には藍葉に特有な成分は要求されず、グルコースやカザミノ酸などの一般的な培地成分でも代替可能であることが示唆された。次に、発酵の進行に伴う菌叢の遷移をDGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)法によって解析した。その結果、Pantoea agglomerans、Sanguibacter marinus、Pseudomonas alcaligenesの近縁種の存在が確認され、温度上昇に伴いPantoea属細菌が優位となることが示された。本研究ではまた発酵中の藍葉から菌の単離を試み、その熱産生への寄与を検討した。11種類の菌を単離し、これらが7種の属に分類されることを確認した。グルコース、カザミノ酸培地における熱産生能を検討した結果、本条件でKlebsiella属とPantoea属の近縁種が熱産生能を示すことを見出した。平成23年度は、(1)メタゲノムの手法を用いた発酵熱生産菌の解析と発酵熱発生の実験系の確立、(2)発酵熱測定法の確立および菌種・培地と発酵熱の相関解析、(3)脱共役タンパク質UCPおよび植物での脱共役タンパク質の候補と考えられるAlternative Oxidase (AOX)のE. coliでの発現と発酵熱産生への影響の解析、の3つを研究課題とした。(1)については、藍葉を用いることで実験室で安定的に発酵熱生産を行う系を確立できた。またメタゲノムの手法を用いて、Klebsiella属とPantoea属の近縁種など発酵熱生成菌を検出した。(2)については発酵熱を、培地温度の直接的な計測、およびAntares 0201微生物計測システムによる代謝熱測定の2方法で計測することに成功した。(3)については現在AOX遺伝子の入手を試みているところである。このように(1)と(2)については完全に当初の目的を達成した。(3)については研究が進行中であるが、本年度の研究において、ある条件下で発酵熱を生成する微生物と生成しない微生物が存在すること、発酵熱生成は培地によらないこと、の重要な知見を得ることができた。このことから当初の予想を上回る成果が得られたものと考えている。平成24年度は、まず発酵熱生成菌と非生成菌のそれぞれについて、代謝熱測定により発酵熱生産性を定量的に評価し、菌体の生育と発酵熱生産を比較することにより、菌体形成へのエネルギーフラックスと発酵熱生成に向かうエネルギーフラックスの比を明らかにする。これにより発酵熱生成菌では発酵熱生成に向かうエネルギーフラックスの比が非生成菌に比べ高いのかどうかを明らかにする。それぞれの菌においてこの比が変わらなければ、発酵熱は微生物によって起こる化学反応に伴う一般的な発熱反応と結論できる。

一方、発酵熱生成菌では発酵熱生成に向かうエネルギーフラックスの比が特異的に高いとの結果が得られれば、熱生産を行う微生物が存在するとの結論が得られる。なおこの実験では、代謝熱測定を行う半固体培養の状態で、どのように菌体の生育を測定するかという技術的な課題を解決する必要がある。平成24年度はまたAOX遺伝子を大腸菌や酵母に導入し、発酵熱生産性の向上を試みる。また大腸菌のATP合成酵素の変異を行い、発酵熱生成への影響を解析する。これらの結果、発酵熱生成の増加が認められた場合は、ペルチェ素子等による発電を試みる。研究費の多くは、微生物の培養や計測のための試薬、あるいは遺伝子工学用の試薬等、消耗品に用いる。さらにこの研究で用いるAntares 0201微生物計測システムは「けいはんな」の研究機関にあるものを使用するため、旅費としても使用する。
高分子液滴の乾燥と薄膜生成のダイナミクス

高分子液滴の乾燥、薄膜形成過程に関する研究の中でも、本年度は主に一連の過程を外部より制御するための手法を提案する研究に従事した。具体的にはマランゴニ効果を用いた制御手法、及び溶媒蒸気による再流動化現象を用いた手法の2つである。以下、それぞれの詳細を記す。研究代表者等は、水溶性高分子(水-PDMA)の液滴乾燥家庭において、接触線のダイナミクス、及び溶媒蒸発後に形成される薄膜の形状が一般的なケースとは著しく異なることを発見し、その原因が液滴中に生じる局所的な表面張力勾配(マランゴニカ)であることを明らかにした。本研究を元に、任意の高分子液滴系でも界面活性剤を微量に添加することでマランゴニ力を内部に駆動し、液滴乾燥後の薄膜形状を制御できることも明らかに出来た。また、他の有効な薄膜形状制御法として研究代表者等が提案した手法が溶媒蒸気による再流動化現象を用いたものである。これは一度液滴滴下、乾燥により形成された薄膜を溶媒蒸気浴中に適当な時間さらすことで、薄膜形状を再成形できるというものであり、最適な形状を得るために必要な時間に関しても、見積もる為の物理モデルを提案した。(1)蛍光測定による濃度場の動的測定蛍光測定により、コーヒーステイン現象による濃度不均一性の成長を可視化することで、現象の理解を試みた。以下実験で用いた試料、及び実験方法について記す。溶質高分子としては、蛍光ポリスチレンを合成し、用いた。蛍光ポリスチレンは、スチレンと微量の4-アクリルアミドフルオレセインを、エタノール中でラジカル共重合させることにより作成している。次に実験手法を記す。シランカップリング処理により濡れ性を適切にコントロールしたガラス基板上に液滴を滴下、乾燥していく過程での液滴内部の蛍光強度分布を下面から倒立型ビデオ蛍光顕微鏡(オリンパス社製IX71)で観測し、その経時変化を追った。また、液滴側面にデジタル顕微鏡を設置し、形状プロファイルを同時に観測。両データを比較し、解析を行った。底面からの蛍光測定により、液滴内部のポリマーの分布が蛍光強度の分布として得られる。この蛍光画像より、各点の蛍光強度を取得し、それを側面形状より得られたその点の高さで規格化することにより、濃度分布を得ることが出来る。以上の手法により、コーヒーステイン現象を動的に評価することに成功した。本研究の実験結果、及びそれに基づく解析は学術論文としてLangmuir誌に投稿し、掲載された(発表論文(1))。また国際学会7th Liquid Matter Conferenceにおいて発表した。(2)水-PDMA系で観測された特異な接触線ダイナミクス多くの先行研究で示されている様に、液滴の乾燥過程では多くの系でコーヒーステイン現象が観測される中、我々は水-ポリジメチルアクリルアミド(PDMA)により構成される液滴の乾燥過程において、接触線がこれまでに報告されている研究とは全く異なった挙動を示すことを発見した。水-PDMA系の液滴では、接触線は乾燥の早い段階で接触線のピンニングが解け、以後乾燥の最後まで後退を続ける。しかし、接触線は後退すると同時に、薄いポリマーのフィルムをその軌跡に残して行く。乾燥終了後には、リング状ではなく、図4に示すような火山形のポリマーフィルムが残される。我々は、高分子濃度、及び基板の濡れ性をコントロールパラメータとして接触線の動き、および乾燥後のフィルム形状の依存性を調べ、特に濡れ性が本現象に大きく寄与するという知見を得た。また、接触線のメカニズムとして、溶液の表面張力がポリマー濃度に対し負の依存性を持つことより、マランゴニ効果による内向流と粧性力とが競合するというモデルを提唱した。
ペプチドライブラリーを用いたT細胞の特異性の研究

1分子レベルでのMHC-ペプチド-TCR会合の特異性の解析1.ポジショナルスキャニングによるMHC class I分子のペプチド選択性の解析と予想1アミノ酸位を固定した合成ペプチドライブラリーを作製し、MHC class I分子のペプチド結合特異性を解析した(Data Base公開準備中)。これをもとに任意のペプチドのMHC結合能を測定し、予測値と比較した。その結果、位置ごとにアミノ酸を独立に扱うことの有効性と限界が示唆された。2.ガン抗原、自己抗原、肝炎ウイルス由来のMHC結合ペプチドの同定上記予想法を応用して、未熟白血病細胞や多くの固形ガンに高発現をみせるヒト、マウスのガン抗原WT1や自己抗原、肝炎ウイルス、マラリア原虫のMHC結合ペプチドを同定した。3.可溶化MHC classI分子、可溶化T細胞レセプター(TCR)の作製TCR-MHC-ペプチド間の結晶構造解析、また1分子レベルでの結合能を測定するため、これらの分子の細胞外ドメインの、酵母、大腸菌による発現を試みた。1細胞レベルでの自己-非自己のみわけの分子機構ペプチドライブラリーを用いたポジショナルスキャニングにより、TCRに対し結合親和性の異なる一連の1アミノ酸置換ペプチドを作製し、T細胞による認識を比較した。ごく弱い結合親和性をもつMHC-ペプチドの認識においてはTCR周辺へのCD8分子の動員の効率が顕著に落ち、CD8の動員を伴わないTCRからの刺激はT細胞の活性化に負に働くことがわかった。1.異なるMHCクラスI分子間でのペプチドレパートリーの比較目的MHCの遺伝子多型性は、進化の過程を通じて維持されてきた。この理由として、異なるMHCが異なるペプチドを提示し、多様な病原体への対応を可能にした可能性があげられる。そこで我々は、ペプチドライブラリーを用いてそれぞれのMHC分子が提示できるペスチドのレパートリーを予想する試みを行った。成果3種のマウスMHCクラスI分子(Kb,Db,Ld)について特異性を調べた。自然のCTLエピトープは親タンパク質中に存在するすべての9残基ペプチドの中で、2SD(標準偏差)以上の予想スコアーを示した。また、60余りのペプチドについて予想結合能と実際の結合能を比較したところ、ばらつきは大きいものの両者の間には直線的な関係がみられた。また、任意のペプチドの80%余りについて、解離定数を一桁以内に予想することができた。この予想能の範囲内でKb,Db,Ldに結合するペプチドのレパートリーを比較したところ、相互の重なりはわずかであった。2.TCRが異なる結合親和性のMHC-ペプチドを見分けるしくみ目的TCRが単なるon/offのスイッチでなく、結合の程度を見分けるしくみを探る成果ペプチドライブラリーを用いてTCRの特異性を探り、エピトープペプチドの1残基置換体をデザインした。これらに対するCTLの反応性をみたところ、CD8の動員の効率とTCRに対するアンタゴニスト活性の間に関連がみられた。そこで、TCRには会合するがCD8を動員しないリガンドからシグナルがCTLの活性化に及ぼす影響を調べた。その結果、CD8の動員を伴わないTCRへのリガンドの会合は、よほど大量に存在する場合を除いて、CTLの活性化を抑えるようなシグナルを送ることがわかった。
Neural-Synergy as biological signal processing and its application to neurorehaibiltiation

プロジェクトの全体的な成果は満足のいくものであり、新しい研究の方向性を示す有望なものでした。この研究の中核である入力信号(または入力シナジー)は、中枢神経系(CNS)に対して、出力運動を定式化する筋肉パターンの設計および募集において非常に重要な役割を果たすと思われる。この研究期間では、(1)感覚的相乗作用を表面的に特定して計算することができ、(2)内部モデルの構造に影響を与える2つの要因を特定することもできる。
心臓血管機能を中心とした多面的生体負担評価に基づくギャッチベッド背上げ構造の提案

臨床場面では身体が虚弱となった患者がベッド上で半座位(ファーラー位)となることがある.そのため,ベッド上で座位をとる際には低負担な姿勢つくることが可能なベッド構造が要求される.我々は心血管系への負担の少ないベッド構造を検討することとし,実験用ベッドに着座した状態で心電図と連続血圧,換気量を記録した.その結果,半座位中に上部体幹軽度屈曲位となることが可能なベッド構造が循環器系にとってより低負担である可能性が示唆された.臨床場面では身体が虚弱となった患者がベッド上で半座位(ファーラー位)となることがある.そのため,ベッド上で座位をとる際には低負担な姿勢つくることが可能なベッド構造が要求される.我々は心血管系への負担の少ないベッド構造を検討することとし,実験用ベッドに着座した状態で心電図と連続血圧,換気量を記録した.その結果,半座位中に上部体幹軽度屈曲位となることが可能なベッド構造が循環器系にとってより低負担である可能性が示唆された.背景:臨床場面では身体が虚弱となった患者がベッド上で半座位(ファーラー位)となることがある.そのため,ファーラー位では身体にとって低負担であることが要求される.しかし,どのような半座位姿勢であれば低負担となるのか明らかとなっていない.そこで本研究では,半座位中の体幹部の姿勢に着目し,心血管系への負担の少ない背上げ姿勢を検討することとした.また今回は特に循環調節系に着目し検討することとした.方法:実験用ベッドに着座した状態で心電図と連続血圧を記録した.計測条件として,上部体幹(胸郭部)ボトムの傾斜角度を30度,60度の2通りを設定した.このとき,下部体幹部は全ての条件で30度の傾斜角とした.すなわち上部体幹部ボトムが30度の時は,体幹は真っ直ぐであり,60度では胸郭が軽度屈曲した姿勢となる.心電図・連続血圧よりシーケンス法による圧受容器反射感受性(BRS)を算出した.BRSは迷走神経性の心血管系の調節を反映するもので,身体が休息状態にあるときにBRSは上昇する.結果:上部体幹角度が45度,60度の時の方が30度のときより,BRSが優位に高い状態であった.結論:上部体幹軽度屈曲位の半座位では循環器系にとって休息しやすい状態となる可能性が示唆された.背景:臨床場面では身体が虚弱となった患者がベッド上で半座位(ファーラー位)となることがある.そのため,ファーラー位では身体にとって低負担であることが要求される.しかし,どのような半座位姿勢であれば低負担となるのか明らかとなっていない.本研究では,半座位中の体幹部の姿勢に着目し,心血管系への負担の少ない背上げ姿勢を検討することとした。また今回は特に自律神経による循環調節系に着目し検討することとした.方法:実験用ベッドに着座した状態で心電図と連続血圧を記録した。計測条件として,体幹30度傾斜姿勢,体幹60度傾斜姿勢,上部体幹屈曲姿勢(上部体幹部30度・下部体幹部30度)の3通りを設定した.すなわち上部体幹部ボトムが30度と60度の時は,体幹は真っ直ぐであり,60度の方がより起立姿勢といえる.上部体幹屈曲姿勢は上部体幹(胸部)のベッドボトムを60度,下部体幹(腹部・骨盤部)を30度の傾斜角としており,胸郭が軽度屈曲した姿勢である.心電図・連続血圧よりシーケンス法による圧受容器反射感受性(BRS)を算出した.BRSは迷走神経性の心血管系の調節を反映するもので,身体が休息状態にあるときにBRSは上昇する.結果:BRSは体幹60度傾斜姿勢で最も低くなり,上部体幹屈曲姿勢で最も高くなった.なお全ての条件間で統計学的有意差が認められた.結論:上部体幹軽度屈曲位の半座位では循環器系にとって休息しやすい状態となる可能性が示唆された.
『ロランの歌』の電子校訂(PTL写本)と データベース(OPTL写本)の構築

2019年3月末日に、『ロランの歌』のパリ写本、リヨン写本、ケンブリッジ写本の校訂作業を終了した。とはいえ、当初の予定通り、すべての写本の校訂本を公開するには至っていない。目下、校正作業を進めており、順次、WEB上にPDF書籍として公開する予定である。こうした遅滞が生じたのは、研究期間の三年目に和歌山大学から名古屋大学に本務校を変更したことにより、予想外の業務が生じたことにも原因があるが、三写本の一つの写本を精査すると、他の二写本を改めて検討するというように作業が循環し、なかなか出口が見つけ出せない状態になったことの影響も大きい。こうした事態は、研究計画立案の時点でも、ある程度の予想されはていたが、想定を上回る困難をもたらした。とはいえ、それにより、予想以上の成果がもたらされたことも事実である。過去の校訂本に存在する多数の問題点を明らかにすることができたが、それは単なる誤植の指摘にとどまらず、テクストの修正における時代錯誤や、詩句の解釈の誤りなどに及ぶ。また、辞書の記述を書き換えるような、語彙や表現に関する発見も少なくない。ハパックス(他の作品に用例のない語や形態)、従来の辞書に指摘のない古い時代の初出(単語のそのものの場合も、用法の場合もある)、たった一例しか用例が知られていなかった(つまりそれまでハパックスであった)単語の新たな用例の発見などである。こうした発見は、現在、論文としてまとめており、海外の学術専門誌への投稿を予定している。また、一部はすでに国内の研究報告などで発表済みである。なお、パリ写本、リヨン写本、ケンブリッジ写本の校訂テクストそのものは、前回の研究計画で完成させたオックスフォード本の校訂テクストとともに、データベース化した。そして、写本間の行き来を容易にするソフトウェア、Joyeuseに組み込んで、すでにWEB上に公開している。フランス語で書かれた最古の文学作品の一つである『ロランの歌』は、複数の写本によって現在まで伝わっている。本研究ではそのうち、三写本の校訂を行う(それぞれ、フランス国立図書館、ケンブリッジ大学トリニティカレッジ図書館、リヨン市立図書館に保管されている)。ここでいう校訂とは、人の手で書き写された本(写本)を印刷本の形に仕立て直す作業のことを言う。とはいえ、それは、手書きの文字を活字に置き換えるというような単純なものではない。中世の写本は独特の書体をもって書かれており、様々な略号が用いられているため、それ自体、解読には熟練を要するが、さらに、羊皮紙に手で書き写された写本は、時に損傷し、時に頁が脱落しているだけでなく、そこには、多数の書き間違えも存在する。とはいえ、古い時代の言葉についての我々の知識は、限られた数の写本に基づくものである以上、その書き間違えや脱落箇所を修正するのは、大変困難な作業となる。本研究で校訂対象となる、三つの写本は共通の祖本から生じたと考えられ、互いに補い合う関係にある。この一つ一つを校訂し、互いのテクストを突き合わせることで、ここの写本の中では、不明だった箇所が明らかになる。それは、長い時代の中で変化してきた『ロランの歌』の、一つの時代の姿をかいま見る絶好の機会をもたらす。他方、それぞれの写本は異なった時代に、異なった地域で書き写されたため、それぞれが異なった言語的特徴を有する。これらを個別に検討することは、当時のフランス語の多様性を知るための重要な手がかりともなる。本研究は、三つの写本のテクストを個別に電子テキスト化し、上記二つの観点から、それぞれの詩行を詳細に見比べることができるようにすることを目的とする。また、最終的には、前回の研究課題で作成したオックスフォード本の電子テキストとの統合を目指す。2015年度の研究計画で予定した「パリ写本」の校訂作業を一通り終えた。ただし、上記に記した通り、「シャトールー写本」の校訂本の検討ならび書評執筆に研究時間を大幅に割いたため、校訂テクストは、まだ、荒削りの状態である。今後かなりの手直しが必要になるだろう。校訂テクストの写本の校合、Annalee C. Rejhon, The of Roland, The Paris Version (Brepols, 2005)、Raoul Mortier, Les Textes de laChanson de Roland, la versionde Paris (Geste Francor, 1943)などの既存の校訂本との比較検討などには、まだまだ不十分なところもある。また、Tobler-Lommatsch Altfranzoesiches Woerterbuch, Von Wartburg, Franzoesisches etymologisches woerterbuchなどの大型辞書の検索にもさらに時間を費やす必要がある。しかし、当初の研究計画では「パリ写本」の校訂作業にはさらに半年を割くことができる。また、研究計画全体では、まだ、3年の時間が残されているため、遅れが生じているとまでは言えない。2015年度には、リヨン写本の校訂作業を進めたので、その作業過程で発見した事実について、2016年5月27日に亜細亜大学で開催された、国際叙事詩学会日本支部、研究発表会において、「リヨン写本『ロランの歌』のテクスト」と題した研究発表を行った。そこでは、写本画像を示しつつ、従来の校訂者の読み違えを指摘するとともに、いくつかの詩行について、新たな解釈を提案した。

また、2015年中には、2014年に刊行されたシャトルー本『ロランの歌』(The Chateauroux Version of the <Chanson de Roland> A Fully Annotated Critical Text, (ed.)Marjorie Moffat, De Gruyter)を詳細に考察にしたが、それについては、書評を、19世紀に創刊された権威あるドイツの専門誌、『ロマンス語文献誌』(Zeitschrift fur romanisches philologie, De Gruyter)に投稿し、2016年10月10日に掲載された。書評ではあるが、写本や他の校訂本との詳細な比較検討を行い、当該刊行本の多数の誤りを指摘するにとどまらず、モファット氏を含む、従来の研究者たち全てが、解釈を誤っていた箇所について、文献学的証拠に基づき、新たな解釈を提案した。したがって、32ページにおよぶ、本書評は実質上、雑誌に匹敵する内容を有している。最後に、私の校訂作業はコンピュータやタブレットといった電子機器を最大限に利用しようとする電子校訂法に基づく。そして、その作業の過程では様々なソフトウェアを独自開発する。2016年度には、iPad用のアプリとして、AiVeillantif, AiDurendal, AiAlmaceという三つの電子辞書・PDF閲覧アプリを開発し、AppStoreに公開した。研究計画ではリヨン写本(L写本)、パリ写本(P写本)、ケンブリッジ写本(T写本)の順に校訂作業を行う予定であったが、2016年度初めに予定を変更し、ケンブリッジ写本の校訂作業を先に行うこととした。裏写りする紙に、滲むインクで書かれた本写本は、マイクロフィルム上では大変読み取りにくい写本ではあったが、一応、全体を読み通し、電子テクストの作成を終えた。その後、テクストの詳細な検討に入る予定であったが、所属機関を変更することとなり、年度後半はまとまった研究時間の確保が難しくなった。そのため、分散した隙間時間でも、比較的作業の進めやすいパリ写本の校訂作業を行った。目下、この二写本については、写本と校合をすませた電子テクストが完成した段階であるが、他の校訂本との比較考察、句読点の付加などの作業は、ほとんど手付かずである。2015年度に、シャトルー本『ロランの歌』の新刊行本の詳細な検討を行ったことによる作業の遅れとあいまって、作業日程はかなりタイトなものとなりつつあるが、それでも、取り返しがつかないほどの遅れとは言えない。『ロランの歌』のパリ写本とケンブリッジ写本の校訂作業を交互に進めた。研究活動の主軸、すなわちテクストの全行が対象となる作業は、次の三つである。第一に、写本のトランスクリプションと写本の校合作業、すなわち、両者を見比べて転写のミスをなくしていく作業である。第二に、既存の刊行本との校合作業である。パリ写本はアナレー・レイハンとラウール・モルティエの校訂本、ケンブリッジ写本はウォルフガンング・ヴァン・エムデンとモルティエの校訂本を、主な比較対象としたが、時に、フランシクス・ミシェルやヴェンデリン・フェルスターといった十九世紀の校訂本をも考慮の対象とした。第三にトランスクリプションを、校訂テクストとして、体裁を整える作業である。
プラスチックス表面に機能性セラミック薄膜を作製する革新的技術の創成

プラスチック基材表面にセラミック薄膜を作製するために代表者の独自技術に関し、以下の成果を得た。まず、6001000°Cという高い温度でセラミック膜を焼成しても、プラスチック基板への転写が可能な場合があることを見出した。次に、セラミック膜のプラスチック基板への転写を可能とするための剥離補助層の厚さには上限と下限があることがわかった。また、極性基をもたないプラスチックス基材とセラミック膜の密着性は低いが、基材表面をUV/オゾン処理しておくと密着性が向上することがわかった。高い温度で焼成したセラミック薄膜には、プラスチック基板の湾曲過程で亀裂が発生しやすいことがわかった。研究代表者が独自に開発したプラスチックス基材表面上セラミック薄膜作製技術は、剥離層(有機高分子膜またはその熱分解生成物)をもつ耐熱性基板上に、ゾル-ゲル法によってセラミック薄膜を形成し、これを、プラスチックス基材の表面を溶融して接着層とすることによってプラスチックス基材表面に転写するというものである。この技術を、汎用性の高い成膜技術とすることが本研究の目標であるが、平成24年度の研究実施計画では、転写過程における「亀裂発生」「表面平滑性の変化」「プラスチックス基材の熱的損傷」を支配する因子の学術的解明を目的とした。TiO_2薄膜ならびにITO薄膜を対象とし、ポリカーボネート(PC)、アクリル(PMMA)、ポリエチレン(PE)、ポリスチレン(PS)、ポリ塩化ビニリデン(PVDC)、ポリエチレンテレフタレート(PET)をプラスチックス基材とする転写を実施し、以下のことを明らかにした。(1)極性基をもつプラスチックス基材(PC、PMMA、PET)上には、亀裂発生を伴うことなく、TiO_2薄膜を転写することができる。一方、極性基をもたないプラスチックス基材のうち、PPとPEにおいては、転写時にTiO_2薄膜に亀裂が発生する。(2)テープ剥離試験により評価されるTiO_2薄膜とプラスチックス基材の密着性は、極性基をもつプラスチックス基材(PC、PMMA、PET)においては高く、極性基をもたないプラスチックス基材(PP、PE、PC)においては極めて低い。ただし、後者においては、基材の表面を酸化処理することにより、密着性は向上する。(3)転写されたTiO_2薄膜ならびにITO薄膜の表面と、薄膜・基材界面は、nmスケールで平滑である。(4)転写時にプラスチックス基材を加熱する際の昇温速度が小さいほど、また、到達温度が高いほど、プラスチックス基材に転写される薄膜の面積は大きくなるが、プラスチックス基材の変形量も大きくなる。平成25年度には(i)転写されたセラミック膜のプラスチック基材との密着性を決定する因子の解明、(ii)転写されたセラミック膜の力学的耐久性を決定する因子の解明、(iii)転写されたセラミック膜の熱的耐久性を決定する因子の解明、(iv)より高い結晶性と緻密さをもつセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する技術の開発、(v)パターニングされたセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する技術の開発を目指した。しかし、(i)、(iv)、(v)において検討すべき点が多かったため、(ii)と(iii)は平成26年度に実施することにした。(i)について:セラミック薄膜と極性基をもたないプラスチック基板との密着性は良好でないことを平成24年度に示した。しかしながら、平成25年度には極性基をもたないプラスチック基板の表面粗さが大きいことに気づいた。そこで、極性基をもたないプラスチック基板の表面粗さを低減したが、表面粗さを低減しても、密着性が良好にならないことが確かめられた。(iv)について:より高い温度でセラミック膜を焼成し、膜の結晶化と緻密化が促進させたところ、剥離層が消失するにもかかわらず、プラスチック基板への転写が可能な場合があることを見出した。これは、「高い結晶性と緻密さをもつセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する技術」を実現する上で非常に大きい前進である。(v)について:周期的な溝をもつシリコン単結晶基板を使用することによって、プラスチック表面に、異なる種類のセラミックリボンが交互に並んだパターニング表面を実現することに成功した。チタニア膜を対象とし、プラスチック基板の種類が転写性及び薄膜と基板の密着性に及ぼす効果を検討した。ポリビニルピロリドン・ポリイミド混合膜を剥離補助層としてコートした単結晶シリコン基板上にチタニアゲル膜を作製し、600 °Cまで昇温して厚さ60 nmのチタニア結晶膜を得た。チタニア結晶膜とプラスチック基板を密着させ、近赤外集光加熱炉を用いて単結晶シリコン基板側から加熱し、チタニア膜をプラスチック基板上に転写した。

その結果、極性基をもつポリカーボネート(PC)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)基板への転写面積率と密着性は高く、極性基をもたないポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)基板へのそれらは低くなることがわかった。さらに、極性基をもつ基板の表面をUV/オゾン処理によって酸化させると、転写面積率と密着性が向上することがわかった。上記の方法によってPC基板上に作製したチタニア膜を対象として、PC基板を徐々に湾曲させ、チタニア膜に亀裂が発生するときの基板の曲率半径(限界曲率半径)を調べた。その結果、チタニア膜の厚さが50400 nmの範囲では、限界曲率半径は膜厚に依存しないが、チタニア膜の焼成温度の上昇に伴って、同半径が増大する、すなわち、チタニア膜に亀裂が発生しやすくなることがわかった。このように、転写に先立つ焼成によってセラミック膜の結晶性を高め、かつ、気孔率を減少させると、プラスチック基板上のセラミック膜の柔軟性はむしろ下がることが明かとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。無機材料化学26年度が最終年度であるため、記入しない。本技術を汎用化する上で、セラミック薄膜を転写する先のプラスチックス基材の種類をどこまで広げることができるかを知ることが重要であるが、プラスチックス基材の種類が転写性と薄膜の密着性に及ぼす効果をほぼ明らかにすることができた。さらに、転写された薄膜の表面と、薄膜・基材界面がnmスケールで平滑であることを実証することができた。以上の理由により、本研究はおおむね順調に進展しているといえる「転写されたセラミック膜の力学的耐久性を決定する因子の解明」「転写されたセラミック膜の熱的耐久性を決定する因子の解明」を平成26年度に行なうことにしたものの、「転写されたセラミック膜のプラスチック基材との密着性を決定する因子の解明」「より高い結晶性と緻密さをもつセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する技術の開発」「パターニングされたセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する技術の開発」においては前進が見られた。とくに、剥離層が消失する高い温度での焼成によって作製されるセラミック膜がプラスチックス表面に転写できることを見出したことは、結晶性に優れ、緻密で高い性能をもつセラミック膜によってプラスチックス表面を機能化する道が拓かれたことを意味し、非常に大きい前進であるといえる。平成25年度の研究実施計画通りに研究を推進するが、それ以外に、(1)パターニングされたセラミック薄膜をプラスチックス基材上に作製する方法としての本技術の可能性を探るとともに、(2)より高い温度で焼成されたセラミック薄膜をプラスチジクス基材上に作製するための技術の開発も進める。(1)高い温度での焼成によって剥離層が消失するにもかかわらず、セラミック膜がプラスチック基板に転写できるための条件を明らかにするとともに、転写が可能である原因を解明する。(2)転写されたセラミック膜の「力学的耐久性」を決定する因子の解明するために、複数の種類と厚さをもつセラミック膜を、複数種のプラスチック基材上に作製し、「セラミック膜の種類と厚さ」「プラスチック基材の種類」「残留応力」「セラミック膜前駆体ゾル中の無機重合体分子量」が、セラミック膜を転写したプラスチックス表面の硬さに及ぼす効果を系統的に調べる。
光ファイバーへの超音波伝送手法の基礎的研究とその医療用探触子としての応用

超音波ファイバー線路を実現し、その工学的応用を検討した。結果は基礎的特性のものであるが、今までにない新しいデバイスを開発できることを明らかにした。以下概要をのべる。(ファイバーへの超音波伝送手法について):結果的に光ファイバーとカーボン・ファイバーへの超音波伝送手法を検討した。これに関して光ファイバーは応用が難しい事が判った。被覆が必要で圧電トランスドュ-サとの接合が難しいからである。また、この事が超音波伝搬減衰を大きくする。一方、カーボン・ファイバーは可撓性が高く、丈夫で切れにくい、トランスドュ-サとの接合も容易で、帯状構成も可能である。このカーボン・ファイバー使用の考案によって、超音波伝搬の予想された困難さがほとんど解決された。即ち、超音波は、ファイバーを2つ折りにしても、減衰はほとんど変化しない。位相変化はみられるので、超音波発振線路の容易な構成が明らかになった。従って、電子デバイス、特にセンサとしての応用が期待される。(超音波ファイバーの応用について):初期の段階とし医療用探触子としての応用を考えた。しかし、光ファイバーは芯が折れやすく人体への実用化は問題視された。また、パワー伝送が被覆のために限定されるとの結論となった。むしろ、カーボン・ファイバーを使用し、センサとしての応用の好ましいことが明らかになった(カーボン・ファイバーでの医療用探触子の検討は今後の課題)。センサとしては、超音波ファイバー・ジャイロ、位置検出センサ(微少変化も周波数変化としての検出で可能)、高温センサ(一般に熱などの状態変化センサ)なとが実現できるファイバー・ジャイロの特性はまだ基礎的なものである。今後、リング構成のためのターン数の増加、発振器構成とするなどの改良が必要である。この超音波ファイバー・センサは多様でより発展できる。以下概要をのべる。光ファイバーへの超音波伝送手法の基礎的研究として、本年度は次のような項目に注目し、それぞれ以下述べるような研究成果を得ることができた。[具体的な検討項目]:1.光ファイバーへの超音波伝送手法の検討(超音波ファイバーの構成)2.超音波の伝搬様子の解明〔方法ならびに結果]:1.について:(1),光ファイバーのシールド被膜をはぎ、その両端を2枚の圧電セラミックス振動子でサンド・ウィッチした。(2),圧電セラミックスとしては、30mm^φx 1.0mmの円板を使用し、電気的に励振した。すなわち、その共振特性を利用し、ファイバーに縦波ならびに屈曲波の伝搬を試みた。(3),その結果、縦波、屈曲波とも比較的容易に送出・抽出できることがたしかめられた。(4),但し、超音波のもっとも効率よく伝搬できる周波数は、共振周波数点ではなく、それよりも少し高い反共振点近傍であることが分った。(5),すなわち、超音波ファイバーは容易に構成できることが明らかになった。2.について:(6),超音波は、ファイバーを2つ折りにしても屈曲波の減衰はほとんど変化しない。(7),ファイバーを捩ると多少減衰は増加する。(8),しかし、屈曲波の音速は380(m/sec)と非常に遅い。(9),今後、縦波での測定、超音波の伝搬はシールド被膜かファイバー芯か等の検討が重要である。また、位相変化も検討が必要である。[次年度への展開]:超音波ファイバーは医療用探触子ばかりでなく、広く電子センサ・デバイスへの展開が大きいこと、実感された。

可撓性のある細いファイバーへの超音波伝送手法の基礎的研究として、本年度は次のような項目に注目し、それぞれ以下述べるような研究成果を得ることができた。[具体的な検討項目]:1.光ファイバーに代わるカーボン・ファイバーへの超音波伝送手法の検討2.超音波ファイバーの電子デバイスへの応用[方法ならびに結果]:1.について:(1),光ファイバーは線路が折れ易い、従って、実用化がしにくく、特に、被覆のない場合は人体への応用に適さない、並びに、圧電セラミックス・トランスドュサとの接合がしにくい、などの欠点が判明した。(2),これに代わる超音波ファイバーとして、カーボン・ファイバーの適用の好ましいことを明らかにした。即ち、新しい超音波ファイバーを開発することが出来た。(3),カーボン・ファイバーは、可撓性が大きく、丈夫で切れにくい、人体に安全、被覆を必要としない、高温での使用が可能、などの特長を有していることが判った。(4),カーボン・ファイバーは、線状だけでなく帯状構成も容易で、圧電セラミックスとの接合がより容易で、減衰も比較的小さい、ことを確かめた。縦波が伝搬しやすい。2.について:(5),カーボン・ファイバー線路は、むしろ新しい電子デバイスの開発に応用することの好ましいことを確かめた。その一例として、(6),超音波ファイバー・ジャイロを試作し、特性を測定した。その結果、回転角度の入力に対して、位相変化の生ずることを明らかにした。今後の改良が期待される。(7),その他、各種の応用を考案し実験も試みた。その中で、高温センサーや位置検出センサーとしての幅広い応用の可能性を示唆することができた。
Anoxic depolarizationに対するイオンチャンネルの関与

高度な血流低下に伴う脳損傷を保護する目的で、ischemic coreに生じるanoxic depolarization(AD)の脳損傷発現の関与を検討し、さらに脳虚血保護について各種イオンチャンネル作働薬、体温を中心にADとの関連より検討した。1.常温下では15分以上ADが持続した場合高度な虚血脳損傷出現が高頻度に生じたが、20分の虚血でもADを生じなかった例では虚血脳損傷を認めなかった。2.常温下でAD出現の脳血流(CBF)低下閾値はコントロール値の約20%以下であり、10%以下となると全例でADが出現した。1020%を示す例では約半数がADをきたしたが、脳損傷出現に関してCBF値よりもADの出現有無がより高い相関を示した。3. NMDA拮抗剤であるMK801の前投与はADの出現の血流閾値を変化することはなかったが、高度な脳損傷出現までのAD持続時間を約5分間延長した。4.非NMDA拮抗薬であるDNQXは、AD出現の血流値を低下させる傾向を認めた。しかし一旦ADが出現した例においては、虚血保護作用を示さなかった。前項の結果と合わせ、ADに伴うCa ion流入が脳損傷に密接に関連することが示唆された。5. 3031度の低脳温とした場合、AD出現の血流値は5.0%前後と有意に低下し、低脳温が虚血に伴うグルタミン酸放出を抑制するとの過去の報告と一致するものと思われた。また血流がコントロールの5%近くまで低下してもADを生じない場合は、30分の虚血負荷においても脳損傷出現は認めなかった。6.低脳温における虚血負荷に際してADが出現した場合、20分の虚血には耐性を認めるも、30分虚血では高頻度に脳損傷を認めた。低脳温では虚血に伴うグルタミン酸放出、即ちAD出現の血流閾値を高める結果、脳保護作用を示ことが本検討で示唆された。【目的】Anoxic depolarization(AD)発現に関する各種イオンチャンネルの関与に関して、in Vivo実験系において検討し、脳虚血損傷におけるイオンチャンネル作働薬の保護作用について考察する。【方法】SDラットに、低血圧+両側内頚動脈閉塞を行い一過性前脳虚血を作成した。両側頭頂葉に骨窓を形成し、硬膜上からpore型Ag-AgCl電極でDC変動を記録した。皮質血流はlaser Doppler法で右頭頂葉骨窓から測定した。虚血時間は右頭頂葉記録でADが出現した場合はAD出現後15分とし、AD非出現時は20分間とした。血流再開後30分間経過観察し、麻酔を覚醒した。体温は37.5°C前後に、側頭筋温は37.0°C前後に維持しその後も2時間は体温を37.5°C以上に保った。7日後ホルマリンで脳潅流固定後脳し、HE染色にて組織学的検討を行った。今年度は非治療コントロール群と非NMDA拮抗剤(DNQX)の効果について検討した。DNQXは虚血開始30分前に30mg/kgを腹腔内に投与した。【結果】(1)右DC記録にてADは非治療群の11/17例およびDNQX群の9/13例に出現。

それぞれ非治療AD(+)群、DNQX-AD(+)群としたが、虚血時間は17.5【plus-minus】0.3分、17.9【plus-minus】0.5分であった。右DC記録でのAD非出現例は、非治療AD(-)群、DNQX-AD(-)群とした。(2)虚血15分の血流値(虚血前に対する%)は、必要治療AD(+)群、非治療AD(-)群、DNQX-AD(+)群、DNQX-AD(-)群で11.4【plus-minus】1.2%、16.2【plus-minus】2.7%、7.1【plus-minus】1.1%、11.0【plus-minus】2.3%であり、非治療AD(+)群とDNQX-AD(+)群の間で有意差を認め(P<.02)、逆に非治療AD(+)群とDNQX-AD(-)群の間で有意差を認めなかった。(4)組織検査ではAD(-)群には広範囲の虚血神経細胞損傷を認めなかった。AD(+)例の右頭頂葉では、非治療群の7/11例、DNQX群の8/9例で15分持続するADがみられ、これらの皮質を加えて組織検討を行った。その結果、非治療例の77.8%、DNQX例の52.9%に広範な虚血神経細胞損傷が出現し、両者間【まとめ】(1)非NMDA拮抗薬により、AD出現の血流閥値が上昇すると思われた。細胞外グルタミン酸濃度上昇が強くAD発現に関与することを示唆すると推測された。(2)しかし、一旦ADが発現した場合、非NMDA拮抗薬は神経細胞損傷を阻止できないものと思われた。高度な血流低下に伴う脳損傷を保護する目的で、ischemic coreに生じるanoxic depolarization (AD)の脳損傷発現の関与を検討し、さらに脳虚血保護について各種イオンチャンネル作働薬を中心にADとの関連より検討した。1.15分以上ADが持続した場合高度な虚血脳損傷出現が高頻度に生じたが、20分の虚血でもADを生じなかった例では虚血脳損傷を認めなかった。2.AD出現の脳血流(CBF)低下閾値はコントロール値の約20%以下であり、10%以下となると全例でADが出現した。1020%を示す例では約半数がADをきたしたが、脳損傷出現に関してはCBF値よりもADの出現有無がより高い相関を示した。3.NMDA拮抗剤であるMK801の前投与はAD出現の血流閾値を変化することはなかったが、高度な脳損傷出現までのAD持続時間を約5分間延長した。4.非NMDA拮抗薬であるDNQXは、AD出現の血流閾値を低下させる傾向を認めた。しかし一旦ADが出現した例においては、虚血保護作用を示さなかった。以上の結果、グルタミン酸の非NMDA受容体阻害薬は、虚血時にNaの細胞内への流入を阻害することでADの出現を抑制し脳保護として作用すると考えられた。一方、NMDA受容体阻害薬は本チャンネルを介したカルシウムイオンの流入を阻害することで、ADが出現した後であっても一定の期間は虚血保護作用を有するものと思われた。高度な血流低下に伴う脳損傷を保護する目的で、ischemic coreに生じるanoxic depolarization(AD)の脳損傷発現の関与を検討し、さらに脳虚血保護について各種イオンチャンネル作働薬を中心にADとの関連より検討した。1. 15分以上ADが持続した場合高度な虚血脳損傷出現が高頻度に生じたが、20分の虚血でもADを生じなかった例では虚血脳損傷を認めなかった。2. AD出現の脳血流(CBF)低下閾値はコントロール値の約20%以下であり、10%以下となると全例でADが出現した。
絶滅危惧種クビワオオコウモリに人為的撹乱が及ぼす影響とその保全に関する研究

本研究は、南西諸島に生息するクビワオオコウモリの生態、特に対象種個体群の現状とその動態について明らかにし、科学的根拠に基づいた保全策を提言することを目的としている。日本では、国内に生息する哺乳類約100種のうち、約1/3をコウモリ類が占めているが、コウモリを専門とする研究者は少なく、日本に生息するコウモリ類の生態には分布など基本的な点を含めて未解明な点が多い。しかし、主に人間活動の影響により、コウモリ類の生息域の減少が強く危惧され、保護のためにまず実態を明らかにする必要がある。本研究で対象とするクビワオオコウモリに関しては、原亜種が国の天然記念物に指定され、絶滅危惧種として環境省レッドリストに記載されている亜種もあるにも関わらず、個体群の分布やサイズ、遺伝的関係などの基礎的な情報が得られていないのが現状である。本研究は、1)糞試料からのDNA抽出とその利用可能性の確認、2)マイクロサテライトを用いた個体群間の関係の解明、3)その結果に基づく保全策の提言、からなる計画に沿って進められた。平成25年度は、糞試料・体組織資料の採取を行い、現在も継続して、資料の採取・保存方法、DNA抽出とその利用可能性など、方法論の確認および得られた試料に関する遺伝的データの収集を実施している。加えて、野外調査対象地において、対象種であるクビワオオコウモリが地元の農業従事者から害獣と見なされているという情報を得、それに基づいて地域住民の対象種に関する知識および意識について調査を行った。なお、野生個体の捕獲調査に際しては、環境省からの野生動物捕獲に関する許可を受け、京都大学の動物実験に関する規定に従って調査を実施している。対象種クビワオオコウモリの遺伝情報に関しては、引き続き分析とデータ収集を行っている段階である。野外調査の際に得られた情報に基づいて行った地域住民の知識および意識に関する調査については、一定の結果を得て既に国際会議で報告を行った。平成26年3月末をもって科学研究費助成事業(科学研究費補助金)の補助は終了したが、研究分担者の外国人特別研究員としての採用が平成24年7月末であり、平成26年7月末までは特別研究員としての研究を継続する。引き続き試料の分析・データ解析を行い、7月に開催される国際会議で結果を発表する予定である。本研究は、おおよそ1)糞試料からのDNA抽出とその利用可能性の確認、2)マイクロサテライトを用いた個体群間の関係の解明、3)その結果に基づく保全策の提言、という段階を追って進めていく計画である。平成24年度は、試料採取を実施するための主たる調査地を決定する前に、南西諸島各地を視察し、対象種および近縁種の生息状況について情報収集を行った。平成25年1-3月には予備調査を実施し、糞試料・体組織資料の採取を行った。現在も計測して、資料の採取・保存方法、DNA抽出とその利用可能性など、方法論の確認を実施している。なお、捕獲調査に際しては、環境省からの野生動物捕獲に関する許可を受け、京都大学の動物実験に関する規定に従って調査を実施している。

研究分担者の外国人特別研究員としての採用が7月末であったため、平成24年度は実質的には8ヶ月間の研究期間となった。その間に、現地視察と調査地選定、第一回のサンプル採取を実施し、現在はサンプルの分析を実施している。そのため、公表された成果はまだないが、現在分析中のサンプルに関しては平成25年度にその結果を国際会議にて公表する予定で準備を進めている。対象種クビワオオコウモリの遺伝情報に関しては、引き続き分析とデータ収集を行っている段階である。野外調査の際に得られた情報に基づいて行った地域住民の知識および意識に関する調査については、一定の結果を得て既に国際会議で報告を行った。前年度に引き続きサンプルの採取を行う(平成25年7月平成26年2月)他、得られたサンプルの分析およびデータ解析に注力する。平成26年4月頃までに全てのデータを収集し終える予定であり、マイクロサテライト解析の結果を用いて、メタ個体群構造および島嶼間の遺伝子流動などについてデータ解析を行う。これらの結果は、国際学会で発表するだけでなく、影響力のある国際誌に論文として投稿する予定である。また、得られたデータを用いて個体群存続可能性分析モデルなどのモデルによるシミュレーションを行い、絶滅が危惧される本研究の対象種の保全に関して提言を行う。平成26年3月末をもって科学研究費助成事業(科学研究費補助金)の補助は終了したが、研究分担者の外国人特別研究員としての採用が平成24年7月末であり、平成26年7月末までは特別研究員としての研究を継続する。引き続き試料の分析・データ解析を行い、7月に開催される国際会議で結果を発表する予定である。
細胞分化のタイミングを制御する転写因子Hesの分解システムの解明

転写因子Hesは、周期的に発現を振動させてリズムを刻み、個体発生のタイミングを制御すると考えられてきた。リズムを刻むためにはHesの速やかな分解が必要だが、その分解がどのように制御されているのか、またHesのリズムが実際にどのように細胞分化を制御しているのかは分かっていなかった。まず、Hes7タンパク質の分解について検討を行い、いくつかのアミノ酸がタンパク質分解だけではなくHes7の機能に必須であることを明らかにした。また、マウス胚性幹(ES)細胞においてHes1の発現量が3-5時間の周期で振動(オシレーション)しており、Hes1の発現量に応じて分化の方向が異なること(Hes1が高い細胞は初期中胚葉に、低い細胞は神経に分化すること)を見いだした。さらに、Hes1の発現を完全に失ったES細胞は、高い効率で均一に神経系に分化することを明らかにした。遺伝的に均一な集団であるES細胞が、Hesのリズムを利用して様々な細胞に分化する能力を調節していることが分かった。Hes7タンパク質の分解について検討を行った。Hes7のリジン残基のそれぞれをアルギニンに変換した変異体タンパク質(K14R, K17R, K22R, K52R, K55R.K129R.K211R)を用いてユビキチン化のターゲットとなるリジン残基を探索した。その結果、Hes7の不安定性に必須のリジン残基を複数個(K14, K22, K52, K55)同定することが出来た。興味深いことに、K22, K52, K55は細胞内蓄積量が多いにもかかわらず、リプレッサー活性を失っていることが分かった。全ての変異体で、細胞内での核局在のパターンやホモ二量体化に異常は見られなかったが、K22R.K55R変異体ではターゲットDNA配列への結合能力が低下し、K52R変異体では、野生型に比べて他のHes family遺伝子との相互作用が強く、(おそらく不活性な)ヘテロ二量体を作りやすいことが分かった。これらの発見は、Hes7の22番目、52番目、55番目リジン残基は、タンパク質分解だけではなくHes7の機能発現(DNA結合や正しい二量体の形成)に必須であることを明らかにした。しかし、以下の問題は未だ解決されていない。まず、これらのリジン残基のリプレッサー活性の低下自体が、(例えば機能を発現したHes7を優先的に分解するメカニズムがあり、)タンパク質分解の遅延を引き起こすのかどうか、次に、Hes7を特異的に認識するユビキチン化酵素(E3)が存在するのかどらか、である。今後、これらのリジン残基の変異体を用いて、結合タンパク質を野生型と比較することにより、未だ同定されていないHes7のユビキチン付加酵素(E3)を同定することを試みる。昨年度はHes7の分解機構を検討したが、本年は、Hes1の分化調節における新たな機能を解明した。胚性幹(ES)細胞から様々な種類の細胞を分化誘導する方法が確立されてきているが、ES細胞は均一に分化するのではなく、個々の細胞がばらばらなタイミングで分化することが知られている。このES細胞分化の不均一性は長年観察されていたものの、そのメカニズムはほとんど分かっていなかった。我々は、ES細胞においてbHLH転写因子群に属する抑制型の転写因子Hes1が、未分化性維持因子であるLIF, BMPの制御下で豊富に発現しており、その発現は同じ細胞コロニー内であっても細胞間で不均一であり、個々の細胞内ではHes1の発現がES細胞内で3_5時間の周期で発現振動(オシレーション)していることを見いだした。Hes1の発現のオシレーションは、Hes1の下流遺伝子Gadd45gやDelta-like1 (Dll1)の発現変動を引き起こした。Gadd45gは細胞周期のG2/M期のインヒビターであり、Dll1は神経分化に必須とされるNotchシグナルのリガンドであることから、これらの下流遺伝子の発現変動は細胞の分化能力に影響すると予想された。そこで、Hes1の発現レベルが高い細胞と低い細胞を分離した結果、Hes1タンパク質の発現が高い細胞は初期中胚葉に、発現が低い細胞は神経に分化する傾向があった。この結果は、分化誘導時のHes1の発現レベルによって、その後の分化の方向性が決定されることを示す。

さらに、Hes1ノックアウトES細胞株を作成し、神経への分化誘導を行った結果、非常に高い効率で均一に神経系に分化した。以上の発見により、Hes1の短周期のオシレーションによって、様々な分化ポテンシャルをもつES細胞が作られ、幹細胞の不均一な分化に寄与することを見いだした。遺伝子の発現振動は、同じ遺伝的背景を持つES細胞が、多様な細胞分化を可能にする基本メカニズムの一つであろう。今後、Hes1のオシレーションを支える細胞システムを解明する予定である。