hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2 次元検出器を用いた高効率STEM位相回復イメージング

CCDカメラを使用して各電子線入射位置での出射電子強度の2次元検出を行うためには、電子顕微鏡のプローブ走査とCCDによる像取得の同期をとる必要がある。それを実現するために、CCDカメラシステムに同期して走査電子線ビームの制御を行える装置を導入した。ビーム走査のための2段偏向コイルのコイルバランスを調整し、プローブ走査と2次元検出を同期させた動作を確認した。位相板を設置した状態で試料に対してプローブ走査を行えば、位相板の影が検出面に投影される。現状では、穴径1umに対して0.5mm程度のサイズの穴が観察できるので、CCDカメラで位置のズレが無いように調整する。2次元検出器における強度分布を利用して試料ポテンシャルの正確な位相分布と振幅分布を演算により求める。使用するCCDカメラは2k×2kであるが、まずは、ビニングにより128×128ピクセル程度の入射プローブ位置でのテスト計測を行う。全検出範囲が、位相板の穴径の125%程度、200%程度になるようにカメラ長で設定し、テスト実験を行う。まずは、穴径の内のみの信号を取り出して像を作り、検出器絞りを利用して結像した場合と比較を進めた。位相板の穴の内側と外側を別々に計測して像再生すると、球面収差の影響で内側からは低空間周波数の位相情報、外側からは高空間周波数の位相情報が得られる。ただし、穴径の外側で検出された信号は、検出器の中心部分からの信号は無いので、TEM法でホローコーン照明の条件で得られる明視野TEM像と同等の情報を有している。この点を考慮した演算処理を中心に計測方法の検討を進めている。実験遂行の過程で、現在使用しているCCDカメラは想定よりも検出効率が低いため、想定の範囲の露光時間の条件で、像検出をすることが出来なかった。そこで、露光時間とCCDカメラへ電子の信号を導入するためのカメラ長の条件、ビーム照射強度の条件について検討し、試料破壊の起こらない条件で、入射電子強度と検出される電子のS/Nを調整する実験を行う必要が生じた。カメラ長については、既存の装置で準備されているカメラ長の条件では、計画していた条件で適切な強度、および適切な解像度の像取得ができないことが分かったので、既存の装置で準備されていなかったカメラ長の条件をフリーレンズコントロールの条件で、マニュアル的にレンズの磁場強度を調整することで準備して、実験を進めることも行った。今年度導入したシステムによる方法と、従来の像取得方法で取得した像を比べ、概ね同様な像を得ることができることを確認した。現在、演算方法については検討を進めている。想定外の問題が出てきたが、今後、検出条件を詳細に検討するためには必要になると思われる検討項目であったので、H29年度に適切な光学条件を実現するカメラ長の検討を系統的に進めたことで、検出方法を検討するのに適切な条件が探しやすくなったと言える。その意味では、研究の進捗はおおむね順調である。前年度に引き続き、位相板を用いた際のCCD2次元検出器を利用した位相回復についての演算方法の検討を行う。ただし、穴径の外側で検出された信号は、検出器の中心部分からの信号は無いので、透過電子顕微鏡(TEM)法でホローコーン照明の条件で得られる明視野TEM像と同等の情報を有している。この点を考慮した演算処理により、位相回復を実現する。2次元計測器を利用した電子強度検出については、現状の計測システムを使用した場合、当初の想定以上に強度の検出が難しいことが判明した。そのため、カメラ長と露光時間を変えて、強度検出をするための最適な条件の検討を進めている。この結果を踏まえて、位相計測法の検討を行う。さらに、今年度は、位相板の厚みを変えた場合の計算について検討する。位相板はπ/2の厚み相当であれば、sin-関数部分とcos-関数部分の分離が完全であるが、位相差法の光学条件により得られる低周波領域の情報については、位相板による散乱によって欠損(強度の低下)がある。位相板の厚みを薄くすることで、2つの三角関数の重みつきの和になる、情報欠損の程度が小さくなるので、空間周波数の低い領域の位相情報のS/Nが向上する。厚みを替えた結果の比較によって、本手法で使用する位相板の適切な厚みを選ぶことができる。

全検出範囲が、位相板の穴径の125%程度、200%程度になるようにカメラ長で設定し、テスト実験を行う。まずは、穴径の内のみの信号を取り出して像を作り、検出器絞りを利用して結像した場合と比較を進めた。位相板の穴の内側と外側を別々に計測して像再生すると、球面収差の影響で内側からは低空間周波数の位相情報、外側からは高空間周波数の位相情報が得られる。ただし、穴径の外側で検出された信号は、検出器の中心部分からの信号は無いので、TEM法でホローコーン照明の条件で得られる明視野TEM像と同等の情報を有している。この点を考慮した演算処理を中心に計測方法の検討を進めている。実験遂行の過程で、現在使用しているCCDカメラは想定よりも検出効率が低いため、想定の範囲の露光時間の条件で、像検出をすることが出来なかった。そこで、露光時間とCCDカメラへ電子の信号を導入するためのカメラ長の条件、ビーム照射強度の条件について検討し、試料破壊の起こらない条件で、入射電子強度と検出される電子のS/Nを調整する実験を行う必要が生じた。カメラ長については、既存の装置で準備されているカメラ長の条件では、計画していた条件で適切な強度、および適切な解像度の像取得ができないことが分かったので、既存の装置で準備されていなかったカメラ長の条件をフリーレンズコントロールの条件で、マニュアル的にレンズの磁場強度を調整することで準備して、実験を進めることも行った。今年度導入したシステムによる方法と、従来の像取得方法で取得した像を比べ、概ね同様な像を得ることができることを確認した。現在、演算方法については検討を進めている。想定外の問題が出てきたが、今後、検出条件を詳細に検討するためには必要になると思われる検討項目であったので、H29年度に適切な光学条件を実現するカメラ長の検討を系統的に進めたことで、検出方法を検討するのに適切な条件が探しやすくなったと言える。その意味では、研究の進捗はおおむね順調である。前年度に引き続き、位相板を用いた際のCCD2次元検出器を利用した位相回復についての演算方法の検討を行う。ただし、穴径の外側で検出された信号は、検出器の中心部分からの信号は無いので、透過電子顕微鏡(TEM)法でホローコーン照明の条件で得られる明視野TEM像と同等の情報を有している。この点を考慮した演算処理により、位相回復を実現する。2次元計測器を利用した電子強度検出については、現状の計測システムを使用した場合、当初の想定以上に強度の検出が難しいことが判明した。そのため、カメラ長と露光時間を変えて、強度検出をするための最適な条件の検討を進めている。この結果を踏まえて、位相計測法の検討を行う。さらに、今年度は、位相板の厚みを変えた場合の計算について検討する。位相板はπ/2の厚み相当であれば、sin-関数部分とcos-関数部分の分離が完全であるが、位相差法の光学条件により得られる低周波領域の情報については、位相板による散乱によって欠損(強度の低下)がある。位相板の厚みを薄くすることで、2つの三角関数の重みつきの和になる、情報欠損の程度が小さくなるので、空間周波数の低い領域の位相情報のS/Nが向上する。
アルゴスシステムを用いたニホンザル雄の集団間移動に関する研究

本研究は、わが国の50年近いニホンザル研究がなお明らかにすることができていない、集団から離脱したオスザルの生活史を明らかにするための基礎的研究であった。そのための手段としてわれわれが利用したのは、人工衛星を利用したテレメトリーシステム(アルゴスシステム)であり、観察対象としたのは、現在まで40年以上の研究史を持つ、岡山県勝山町神庭の滝付近に生息するニホンザル餌付け自然集団(勝山集団)であった。アルゴスシステムは、世界の多くの動物行動研究者によってさまざまな動物の生息圏の調査や渡りの調査に利用され、実績を上げているテレメトリーシステムであるが、ニホンザルのような森林棲の動物種では研究例がほとんどない。そのため本研究期間の多くを、同システムのニホンザルへの応用の可能性を探ることに費やした。具体的には、発信器の開発からスタートし、ニホンザルへの発信器の装着法の試行錯誤的検討を経て、システムのキャリブレーションを長期間にわたって行った。その結果、ニホンザルへの発信器の装着法が確立され、位置情報が概ね正確に得られることを確認した。本研究の研究期間中に、勝山集団では一部の成体メスと未成体を含む分派集団に周辺部の若い成体オスが入り込み、分派活動を強めていたが、結局明確な集団の分裂を経験するには至らなかった。また、集団周辺部における周辺オスや他集団出自のオスの動向に関する補足的データは、この34年間にわたってオスたちの集団からの移出入が、結果として多くは起こらなかったことを示していた。集団周辺部における若オスたちの顔ぶれに大きな変動はなく、また、数年前から集団周辺部で確認できている他集団出自と思われる成体オス数頭の顔ぶれも変わっていない。集団からのオスザルの離脱を前提とした本研究は、結果として集団を離れて他集団へ移入するオスザルの移出入過程を明らかにすることはできなかったが、アルゴスシステムの応用の可能性を十分に検討し証明したといえるであろう。集団から離脱し、群れ落ちしたニホンザルの雄がいったいどこへいっていまうのかについて、40年を越えるニホンザルの研究は未だ明らかにしていない。我々はテレメトリーシステムを利用したニホンザル追跡の方法を模索し、昨年度までにアルゴスシステム(人工衛星を利用したテレメトリーシステム)を用いた周辺オスの追跡が可能であることを確認した。本研究ではさらにその追究目的を進め、同一地域に生息する複数のニホンザル集団からそれぞれ対象個体を選定し、周辺化、あるいは集団から離脱する個体を同時に追跡することで、集団同士の相対的な関係を把握し、地域個体群としてのニホンザルの生態学的位置づけを行うことを目的とした研究を開始した。研究の対象とするのは、岡山県勝山町神庭の滝付近に生息するニホンザル餌付け自然集団(勝山集団)と、岡山県高梁市に生息するニホンザル餌付け自然集団(臥牛山集団)である。本年度の研究においては、各集団において、57歳の若オスを対象として個体追跡法による観察を行い、個体発見の容易さ、集団内での滞在時間や集団周辺部での活動時間、彩食行動、社会関係の調査を行なった。勝山集団では、数年前より集団の分節化が進みつつあり、分裂の前兆ともいえるような個体の離合集散が繰り返されている。その中で、一部の周辺部の若オスは主集団と分派集団の間を行き来している。このような状況の中で、本年度の観察においてはこれらの若オスの動向をある程度把握することができた。若オスの中には、時間の経過に伴ってその動向を確認することが困難になってきたものがおり、早晩集団から離脱する可能性もある。

今後、これらの個体の動向をより詳細に調査したうえで、発信器の取り付け作業など、研究の次の段階へと進展を図る予定である。本研究は、集団から離脱し、群れ落ちしたニホンザルの雄がどこへいってしまうのかを明らかにするための、テレメトリーシステムを利用したニホンザル追跡研究である。研究の対象は、岡山県勝山町神庭の滝付近に生息するニホンザル餌付け自然集団(勝山集団)と、岡山県高梁市に生息するニホンザル餌付け自然集団(臥牛山集団)である。本年度も昨年度に引き続いて、主として勝山集団において、57歳の若オスを対象とした個体追跡法による観察を行い、個体発見の容易さ、集団内での滞在時間や集団周辺部での活動時間、採食行動、社会関係の調査を行なった。勝山集団では数年前から、一部の成体メスと未成体を含む分派集団に、周辺部の若い成体オスが入り込み、さらに分派活動を強めている。このような背景の中で、主集団と分派集団がそれぞれ異なる遊動域を持つようになってきた。このような中で分派集団に入り込んだ若い成体オスが、集団内の他個体とどのような社会関係を結び、どのように集団の遊動に関与しているかの把握が必要となってきている。本年度の観察においてはこれらの若オスの動向をある程度把握することができた。これらの若オスの中には、時間の経過に伴ってその動向を確認することがさらに困難になってきたものがおり、集団からの離脱も時間の問題と思われる。次年度においては、これらの個体の動向をより詳細に調査したうえで、発信器の取り付け作業など、研究の次の段階へと進展を図る予定である。この準備のために、本年度にはアルゴス発信器の発信試験を勝山集団の遊動域周辺で複数回にわたって行い、位置情報データのキャリブレーションを行った。その結果、得られた位置データがかなり精度の高いものであることを確認した。本研究は、わが国における50年近いニホンザル研究が現在なお明らかにできていない、集団から離脱したニホンザルオスの生活史を明らかにするための追跡研究である。そのための手段として我々が利用しているのは、人工衛星を用いたテレメトリーシステム(アルゴスシステム)である。本研究が対象とするのは、現在まで40年の研究史を持つ、岡山県勝山町神庭の滝付近に生息するニホンザル餌付け自然集団(勝山集団)である。本年度は昨年度に続き、主として勝山集団において、57歳の若オスを対象とした個体追跡法による観察を行い、個体発見の容易さ、集団内での滞在時間や集団周辺部での活動時間、採食行動、そして特に、周辺オスと集団内のメスたちとの社会関係の調査を行った。そして最近では、主集団と分派集団がそれぞれ異なる遊動域を持つようになってきた。このような中で分派集団に入り込んだ若い成体オスが集団内の他個体とどのような社会関係を結び、どのように集団の遊動に関与しているかの把握が必要となってきている。昨年度と本年度の2年間の追跡観察によって、これらの若オスの動向と社会関係をある程度把握することができた。
表皮組織のバリア機能を維持する細胞競合因子の同定と作用機序の解明

本研究では、ショウジョウバエ蛹期にみられる腹部表皮細胞の入れ替わりを細胞競合の一例と捉え、遺伝学的スクリーニングを用いることで細胞間に介在する非自立的細胞死を誘導する因子の同定を目指している。RNAi系統を用いた遺伝学的スクリーニングにより、細胞競合制御因子の候補を同定し、その解析を行っている。敗者(幼虫細胞)側の細胞競合実行因子として、ショウジョウバエミオシンVIホモログであるjarが同定された。ミオシンVIは哺乳類で、クラスリン依存的な小胞輸送に関与することが報告されており、エンドサイトーシスを介した細胞競合の実行経路が想定され、その解析を進行している。jar::venusノックインショウジョウバエを、CRISPR/Cas9システムを使って作製し、jarが幼虫細胞内で、成虫細胞側に蓄積すると、その幼虫細胞が細胞死を起こすことが明らかになった。また、jarは幼虫細胞がアポトーシスを起こす際の頭頂部収縮の過程において、収縮のタイミングで細胞接着領域に強く局在することが、観察により明らかになった。細胞死の実行メディエーターであるカスパーゼの阻害タンパク質p35を発現させた幼虫細胞ではjarの集積が起こらないことから、jarの集積はカスパーゼシグナルの下流にあることが示された。また、jarの集積は頂端部収縮の直前以外にも幼虫細胞と成虫細胞の境界に位置する幼虫細胞でも観察され、その集積はp35によって抑制されないことから、カスパーゼ活性化よりも前のタイミングで集積し、細胞死の実行に何らかの寄与をしていることが示唆された。幼虫細胞におけるjarの機能について引き続き解析を行っていく。また、細胞集団の形状に基づいたスクリーニングにより同定されたチロシン脱リン酸化酵素についても、細胞競合との関連性を見いだしており、その詳細について解析を行っている。スクリーニングにより同定された、成虫細胞または幼虫細胞での細胞競合制御因子に関して、トランスジェニックやノックイン、ノックアウトの作製にとりかかり解析を進行している。また、トランスクリプトーム解析によって得られた情報を解析し、候補遺伝子の選別、検証実験について遂行している。また、領域内の連携として公募研究代表者の藤本先生と細胞競合の力学的フィードバック機構について共同研究を行い、共著論文を報告した。また、同じく公募研究代表者の林先生と、ショウジョウバエ上皮組織における細胞競合の共通メカニズムを題材に、意見交換や材料授受など、共同研究を展開している。RNAi系統を用いたスクリーニングによって同定された候補遺伝子の解析は引き続き行う。候補分子が既知の細胞競合に関与する分子群と相互作用するかどうか、人工的な細胞競合モデルを用いて、遺伝学的相関を確認する。また、トランスクリプトーム解析によって得られた情報を解析し、候補遺伝子の選別、検証実験についてさらに遂行する。前述した領域内共同研究をさらに進展させていく。加えて、in vivo RNAiスクリーニングにより同定された、解析中の勝者因子と敗者因子について、データを取りまとめ、論文として報告する。組織特異的に発現するGAL4/UASシステムとRNAi系統を用いて、成虫細胞(勝者)側で特異的に遺伝子をノックダウンし、遺伝学的スクリーニングを行った。細胞死が阻害された場合、幼虫細胞は成虫の腹部に残存し、成虫表皮の形態異常を引き起こす。この形態異常を指標に644遺伝子が解析され58遺伝子が絞り込まれた。その中でも血管内皮細胞増殖因子のショウジョウバエホモログであるPvf1を、候補遺伝子として解析を行った。成虫細胞でのPvf1 RNAiによって幼虫細胞の細胞死が細胞非自律的に抑制されることを確認した。また、ショウジョウバエPvf1の受容体として知られるPvrのRNAiによって幼虫細胞の細胞死が抑制されたことから、本細胞非自律的な細胞死はPvf1/Pvrシグナルを介していることが示唆された。Pvf1の時空間的発現・局在パターンを解析するために、Pvf1::venusノックインショウジョウバエを、CRISPR/Cas9システムを使って作製中である。今後さらなる解析を行っていく。研究計画実施予定であったRNAi系統を用いた遺伝学的スクリーニングについては、確認実験を当初の予定より早く完了することが出来た。このスクリーニングにより、成虫細胞側で産生される細胞競合制御因子として複数の候補遺伝子を同定し、トランスジェニックやノックイン、ノックアウトの作製にとりかかり解析を進行している。一方で、同時進行していたトランスクリプトーム解析を用いた生化学的スクリーニングの進行が遅れている。その理由として、解析に用いるサンプル調整が難航していることが挙げられる。1回の実験につきGFP陽性細胞は1000個程度回収できたが、トランスクリプトーム解析を行うmRNA量には遠く及ばなかった。別の研究課題で行っている翅成虫原基を用いた実験では、1回の実験につき、3万-4万個の細胞が回収できたため、十分なmRNA量が抽出され、既にトランスクリプトーム解析を完了している。サンプルとなる成虫表皮前駆細胞集団の細胞数の少なさと、少ない細胞からのmRNA抽出に難航したため、平成26年度中に委託する予定だったトランスクリプトーム解析を次年度に繰越して研究を行う予定である。

RNAi系統を用いた遺伝学的スクリーニングにより、細胞競合制御因子の候補を同定し、その解析を行っている。勝者(成虫細胞)側で働く候補因子の一つとして特に注目しているPvf1の分子動態を追跡するためにPvf1::venusノックインショウジョウバエ系統を作製した。Pvf1::venusが内在性のPvf1を反映しているかどうかについて、RNAiや抗体染色を用いた検証を行った。また、ライブイメージングにより、細胞競合様現象の視られる前後で、時空間的にその挙動がどのように変化するかについて、詳細な観察を行っている。また、同時進行として敗者(幼虫細胞)側の細胞競合実行因子の同定を試みている。幼虫細胞側でのRNAi系統を用いたスクリーニングによって、ショウジョウバエミオシンVIホモログであるjarが同定された。ミオシンVIは哺乳類で、クラスリン依存的な小胞輸送に関与することが報告されており、エンドサイトーシスを介した細胞競合の実行経路が想定され、その解析を進行している。このjarについても、jar::venusノックインショウジョウバエを、CRISPR/Cas9システムを使って作製中である。今後さらなる解析を行っていく。研究計画実施予定であったRNAi系統を用いた遺伝学的スクリーニングについては、確認実験を前年度までに完了することが出来たため、敗者側でのスクリーニングを同時並行することで、両方向性の細胞競合制御因子の同定を試みている。スクリーニングにより同定された、成虫細胞または幼虫細胞での細胞競合制御因子に関して、トランスジェニックやノックイン、ノックアウトの作製にとりかかり解析を進行している。また、トランスクリプトーム解析によって得られた情報を解析し、候補遺伝子の選別、検証実験について遂行している。また、領域内の連携として公募研究代表者の藤本先生と細胞競合の力学的フィードバック機構について共同研究を行っている。加えて、同じく公募研究代表者の林先生と、ショウジョウバエ上皮組織における細胞競合の共通メカニズムを題材に、意見交換や材料授受など、共同研究を展開している。本研究では、ショウジョウバエ蛹期にみられる腹部表皮細胞の入れ替わりを細胞競合の一例と捉え、遺伝学的スクリーニングを用いることで細胞間に介在する非自立的細胞死を誘導する因子の同定を目指している。勝者(成虫細胞)側で働く候補因子の一つとして特に注目しているPvf1シグナルが、細胞死誘導に十分であるのかどうか確認するために、敗者側の幼虫細胞でPVf1の受容体(Pvr)を過剰発現し、アポトーシス誘導能について解析した結果、Pvf1/Pvrシグナルの活性化では幼虫細胞の細胞死を誘導出来ないことが明らかになった。細胞競合においては、周辺細胞との質の違いが条件であることが想定されたため、Pvrをキメラに発現するために、光遺伝学を用いた実験を準備している。
胃腸疾患におけるカルパインの関与と機能性食品による治療・予防法の検討

カルパインは細胞質内に存在し、Ca^<2+>により活性を制御されるプロテアーゼである。細胞内タンパク質に直接作用し、これらの活性・構造を変換・制御するモジュレータ・プロテアーゼである。哺乳類では15種類の遺伝子が同定され、スーパーファミリーを形成する。その内のいくつかに関しては、ヒト疾患や遺伝子改変マウスの結果から、遺伝子の変異によって致死、あるいは疾患を呈することが判明している。また、他の生物でも同様で、ほぼ全ての生物の健康な状態に必須な酵素であることが明らかとなっている。ヒトでは、組織に特異的な発現の見られる組織特異的カルパインがいくつか報告されており、申請者らが発見したnCL-2/-2'やnCL-4は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、興味深い構造をもつ選択的スプライス産物が同時に発現している。さらに最近、nCL-2/-2'が胃粘膜保護に重要な役割を持つ胃表層粘液(ピット)細胞に限局すること、膜タンパク質の逆輸送に関与するβ-COPと相互作用すること、を見出し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃腸は食品の消毒、消化、免疫など、様々な点で極めて重要であり、また、食品成分による影響を著しく、かつ即時的に受ける器官である。そのため胃酸、粘液、消化酵素の分泌をはじめ、非常に特殊化した機能を有する。これらは、胃・腸特異的カルパインの生理機能と密接に結びついていると考えられる。事実、申請者らの作出した不活性型nCL-2を野生型の代わりに発現するノックインマウスは、胃出血の傾向にあることが判明した。本研究では、さらにこのノックインマウスとプロテオーム解析を含む生化学的解析により、胃・腸特異的カルパインの酵素学的性質とその生理的意義に関して解析し、機能性食品による治療・予防法について考察し、後述した論文や学会などでこれを発表した。カルパインはCa^<2+>依存的に基質機能を変換する細胞質内モジュレータ・プロテアーゼである。哺乳類では14種類存在し、遺伝子の変異によって致死、あるいは疾患を呈することが判明している。ヒトでは、組織特異的に発現するカルパインがいくつか報告されており、nCL-2/2'/4は、胃や腸に発現が限定される。さらに、nCL-2が胃粘膜保護に重要な胃表層粘液細胞に限局すること、膜タンパク質逆輸送に関与するβ-COPと相互作用することを見出し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが示唆された。胃腸は食品の消毒、消化などで極めて重要であり、また食品成分による影響を著しく、即時的に受ける。そのため胃酸、粘液、消化酵素の分泌をはじめ、特殊化した機能を有する。これらは、胃・腸特異的カルパインの生理機能と密接に結びつくと考えられる。そこで本研究は、ノックインマウス(活性中心Cys→Serの不活性型カルパインを発現)とプロテオーム解析を含む生化学的解析を用いてカルパインの生理機能を解析し、胃疾患の治療・予防を様々な機能性食品によって実現することを目的とする。まず、nCL-2/4の遺伝子改変マウスの作出・解析を行なった。ヒト疾患の症例が一切無いnCL-4に関しては、遺伝子改変マウスの作出を計画し、ターゲティングベクターを作製し相同組み換え体ES細胞を取得した。現在は、マウス個体を得るべく実験中である。nCL-2に関しては、ノックインマウスの作出を完了し、ストレス性胃出血という表現型を得た。

同時に、これらの遺伝子改変マウスは、疾患モデルマウスとして、その分子機構の解析を行なった。野生型マウスとの比較解析が重要であり、DNAマイクロアレイ解析および二次元電気泳動-マススペクトル解析により、いくつかの興味深い分子がnCL-2/4と相互作用することが判明した。今後、その生理的意義を解析していきたい。カルパインは細胞質内に存在し、Ca^<2+>により活性を制御されるプロテアーゼである。細胞内タンパク質に直接作用し、これらの活性・構造を変換・制御するモジュレータ・プロテアーゼである。哺乳類では15種類の遺伝子が同定され、スーパーファミリーを形成する。その内のいくつかに関しては、ヒト疾患や遺伝子改変マウスの結果から、遺伝子の変異によって致死、あるいは疾患を呈することが判明している。また、他の生物でも同様で、ほぼ全ての生物の健康な状態に必須な酵素であることが明らかとなっている。ヒトでは、組織に特異的な発現の見られる組織特異的カルパインがいくつか報告されており、申請者らが発見したnCL-2/-2'やnCL-4は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、興味深い構造をもつ選択的スプライス産物が同時に発現している。さらに最近、nCL-2/-2'が胃粘膜保護に重要な役割を持つ胃表層粘液(ピット)細胞に限局すること、膜タンパク質の逆輸送に関与するβ-COPと相互作用すること、を見出し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃腸は食品の消毒、消化、免疫など、様々な点で極めて重要であり、また、食品成分による影響を著しく、かつ即時的に受ける器官である。そのため胃酸、粘液、消化酵素の分泌をはじめ、非常に特殊化した機能を有する。これらは、胃・腸特異的カルパインの生理機能と密接に結びついていると考えられる。事実、申請者らの作出した不活性型nCL-2を野生型の代わりに発現するノックインマウスは、胃出血の傾向にあることが判明した。本研究では、さらにこのノックインマウスとプロテオーム解析を含む生化学的解析により、胃・腸特異的カルパインの酵素学的性質とその生理的意義に関して解析し、機能性食品による治療・予防法について考察し、後述した論文や学会などでこれを発表した。
消化管癌におけるサイクリンEの癌遺伝子としての役割の解明

1.サイクリンE発現ベクターの作成とマウスNIH/3T3細胞への導入(1)米国スクリップス研究所S.Reed博士より供与されたサイクリンEcDNAの全コーディング領域を含むEcoRI断片(2.5kbp)をサイトメガロウイルスプロモーターを有する真核生物発現ベクターpCDNA3にサブクローニング後、制限酵素断片解析ならびにインサートのシークエンシングにより、恒常的サイクリンE過剰発現ベクターを得た。(2)恒常的サイクリンE過剰発現ベクターを、リポフェクチン法によりNIH/3T3マウス線維芽細胞株に導入した。導入後、ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い、pCDNA3のみの導入株を含め、各細胞株につき10クローンを回収、DNAレベルならびに蛋白レベルでサイクリンEcDNAの組込みならびに発現を確認した。(3)サイクリンE発現ベクター導入NIH/3T3マウス線維芽細胞株とpCDNA3空ベクター導入株の平皿培養下での増殖態度の差を観察したところ、両群の間に有意の増殖速度の差を認めることは出来なかった。また、サイクリンE発現ベクター導入株において形質転換フォーカスの形成はみられなかった。2.サイクリンEアンチセンスベクターの作成とヒト胃癌細胞株への導入(1) 1-(1)で使用したサイクリンEcDNAの転写開始部位を含む110bp断片をpCDNA3にアンチセンス方向にサブクローニング後、制限酵素断片解析ならびにインサートのシークエンシングにより、サイクリンEアンチセンスベクターを得た。(2)サイクリンEアンチセンスベクターを、リポフェクチン法によりサイクリンE過剰発現株TMK-1、MKN-7胃癌株、サイクリンE低発現株MKN-28、MKN-74胃癌株に導入した。導入後、ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い、ベクターのみの導入株を含め、各細胞株につき10クローンを回収した。(3)サイクリンEアンチセンスベクター導入胃癌細胞株とpCDNA3空ベクター導入株の平皿培養下での増殖態度の差を観察したところ、両群の間に有意の増殖速度の差を認めることは出来なかった。以上より、今回の研究ではサイクリンEが癌遺伝子として作用する直接の証拠を得ることは出来なかった。1.サイクリンE発現ベクターの作成(1)米国スクリップス研究所S.Reed博士より供与されたサイクリンEcDNAの全コーディング領域を含むEcoRI断片(2.5kbp)をサイトメガロウイルスプロモーターを有する真核生物発現ベクターpCDNA3にサブクローニング後,制限酵素断片解析ならびにインサートのシークエンシングにより,恒常的サイクリンE過剰発現ベクターを得た.(2)(1)により得られた恒常的サイクリンE過剰発現ベクターを,リポフェクチン法によりNIH/3T3マウス線維芽細胞株に導入した.導入後,ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い,pCDNA3のみの導入株を含め,各細胞株につき10クローンを回収した.2.サイクリンEアンチセンスベクターの作成・導入

(1)1-(1)で使用したサイクリンEcDNAの転写開始部位を含む110bp断片をpCDNA3にアンチセンス方向にサブクローニング後,制限酵素断片解析ならびにインサートのシークエンシングにより,サイクリンEアンチセンスベクターを得た.(2)(1)により得られたサイクリンEアンチセンスベクターを,リポフェクチン法によりサイクリンE過剰発現株TMK-1,MKN-7胃癌株,サイクリンE低発現株MKN-28,MKN-74胃癌株に導入した.導入後,ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い,ベクターのみの導入株を含め,各細胞株につき10クローンを回収した.1.サイクリンE発現ベクターの線維芽細胞株への導入(1)前年度作成した恒常的サイクリンE発現ベクターを、リポフェクチン法によりNIH/3T3マウス線維芽細胞株に導入した。導入後、ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い、pCDNA3空ベクターのみの導入株を含め、各細胞株につき10クローンを回収した。(2)サイクリンE発現ベクター導入NIH/3T3マウス線維芽細胞株において、DNAレベルならびに蛋白レベルでサイクリンEcDNAの組込みならびに発現を確認した。(3)サイクリンE発現ベクター導入NIH/3T3マウス線維芽細胞株とpCDNA3空ベクター導入株の平皿培養下での増殖態度の差を観察したところ、両群の間に有意の増殖速度の差を認めることは出来なかった。また、サイクリンE発現ベクター導入株において形質転換フォーカスの形成はみられなかった。2.サイクリンEアンチセンスベクターの胃癌細胞への導入(1)前年度作成したサイクリンEアンチセンスベクターを、リポフェクチン法によりサイクリンE過剰発現株TMK-1、MKN-7胃癌株、サイクリンE低発現株MKN-28、MKN-74胃癌株に導入した。導入後、ネオマイシン誘導体G418にて選択を行い、ベクターのみの導入株を含め、各細胞株につき10クローンを回収した。(2)(1)で得られたサイクリンEアンチセンスベクター導入胃癌細胞株とpCDNA3空ベクター導入株の平皿培養下での増殖態度の差を観察したところ、両群の間に有意の増殖速度の差を認めることは出来なかった。以上より、今回の研究ではサイクリンEが癌遺伝子として作用する直接の証拠を得ることは出来なかった。
骨軟骨棘に着目した早期変形性膝関節症の病態と画像解析研究

変形性関節症(OA)は、超高齢社会の我が国において罹患率の高い運動器疾患であり、OAの病態解明に基づく早期診断・治療法開発は重要な研究課題である。本研究では、膝OA関節病態における骨軟骨棘(骨棘)に焦点を当てて、骨軟骨棘形成に参画する細胞成分や組織内微小環境因子の探索、膝OA動物モデルでの骨軟骨棘形成と内側半月板逸脱との関係、骨軟骨棘形成に着目した早期膝OAの画像解析に関して詳細な研究を進める。
明治期における滋賀県下小学校の社会認識教育に関する研究

1,明治期の滋賀県下小学校の社会認識教育に関して,滋賀県教育行政資料,県内の小学校所蔵資料の調査を行ない,資料目録の1集・2集を作成した。資料目録の作成を行ったのは,研究途中で滋賀県教育史が明治以降,一度も編纂それておらず,基本資料の所在や残存状況が明からになっていなかったからである。(1)県教育行政資料しとして,滋賀県学事年報(明治10-14年),師範学校年報及び県布達書目録を発見した。又,定期試験巡視功程(明治10年)の記録を収集できた。これらの資料類により,明治初期の県下の小学校教育の就学実態や教授・学習の具体的な様相が明らかとなった。(2)旧蒲生郡,甲賀郡,栗太郡,阪甲郡,犬上郡,神崎郡,などの小学校の沿事誌・学校日誌・公文書・実践資類及び教材科書の調査を行ない,資料の複写をした。とくに,旧甲賀郡内沿革誌の資料では,明治16年段階の郡役所収集の沿革事誌数校分が水口学校所蔵資料にあり,学制期の統計資料として県下で最も古い資料と考えられる。2,明治期の小学校での滋賀県の郷土教育として,郷土地誌教科書にもとづく教育実態の資料を収集し,報告書に論文としてまとめた。県地誌や各郡地誌の郷土地誌教科書だけでなく,郷土読本,習学,修身,博物の教科書を収集し,現物を複写した。又,明治期の滋賀県下で使用された万国研教科書の調査を行い,万国研の教授方法や問答法による授業について論文にまとめた。滋賀県下の小学校における会社認識教育の研究として,上記の郷土教育(郷土地誌・郷土史)と万国研について分析したが,小学校所蔵資料のいっそうの資料発掘を行う必要があろう。また,修身教科書や法制・経済の教科書ついて,今回は分析できなかった点が今後の課題として残った。1.明治期の滋賀県下小学校の社会認識教育に関して、明治初年の県教育行政資料,県内湖東・湖南地域の小学校所蔵資料の調査を行った。(1)明治期教育行政資料では,「薄冊目録」から学事関係記事の目録づくりを行い、発掘した布達書目録より明治4年ー16年の教育関係布達ー覧を作成した。これは明治期の滋賀県教育行政の販取図を作るためである。また,近江八幡市江頭文書から学事年報・巡視功程の資料を発見し,従来の県教育史の空白を埋める資料と評価できると考える。(2)旧蒲生郡,栗太郡,甲賀郡の郡内各小学校の沿革誌類・学校日誌・公文書の調査を行い,資料の複写を行った。とくに,旧甲賀郡の小学校沿革誌および所蔵教科書の調査では,信楽小学校や水口小学校の貴重な明治期郡役所文書を始め,地域版教科書である「甲賀郡地誌」(高谷柳台編)他を収集した。これらはすべて資料目録一覧を作成した。2.滋賀県の動向を全国的視野から位置づける研究として、都道府県教育史の調査と県下の市町村史の教育史の調査を,明治期から現在まで年表に整理した。刊行一覧にまとめると,全国で戦前・戦後を通じて滋賀県教育史が一度も出ていないことが目を引いた。体系的な資料収集が行われておらず,教育制度資料とともに実践資料の調査も,今後の課題であることがわかった。県下市町村史の教育史編の叙述はこの状況を反映して,概して平板な叙述のものが多い。

3.明治初期の郷土教科書として,県地誌・郡地誌など郷土地誌(地理)や郷土史,郷土読本(滋賀県管内小学校読本),習字や修身や博物などが刊行されていることを確認し,現物を複写した。この教科書内容を分析することと,滋賀県下の教育雑誌「滋賀県私立教育会雑誌」のバックナンバ-を収集することは,次年度に行う。1.明治期の滋賀県下小学校の社会認識教育の研究として、明治期の滋賀県教育史の資料調査を行ない、目録にまとめた。主として、湖西及び湖北地域の創立の古い小学校所蔵資料の調査を中心に行い、貴重な資料を収集した。(1)明治5年学制以前の滋賀県下で創立された5校のうち、4校の学校沿革誌・学校日誌・所蔵教科書などの調査を行った。彦根市高宮小学校では、明治510年の小学教則表と県令告諭書を発見できた。とくに58年の教則は、長浜小学校でも発見できなかった旧犬上県小学教則であり、きわめて価値の高い資料であった。(2)高宮小や長浜小・神照小・八日市南小など所蔵教科書調査を行い、明治1020年代の和本教科書の目録を作成した。この調査の中で、滋賀県で刊行、使用された郷土教科書(郷土読本、郷土地誌、習字、作文他)が多数発見でき、これらの目録をカード化した。2.明治期における郷土教育と万国史教育の教科書や教授法に関して、論文にまとめた。(1)明治期の滋賀県での郷土教育は、明治10年代と明治20年代半ば30年代半ばの2つのピークがあり、郷土地誌教科書(県地誌・郡地誌)が2つの時期の多数刊行されている。10年代は郷土地理だけ、20年代30年代は郷土地理と郷土史、理科が入った郷土教育であった。(2)万国史教育については、明治14年の小学校学科及びその程度で法令的に廃止されるまでの約10年間、滋賀県下で使用された万国史教科書とその教授書の内容を分析し、小学生の世界史的知識を検討した。明治期の滋賀県小学校教育の実態について、前年度収集した滋賀県学事年報、師範学校年報類から、滋賀県の小学教則の変遷を押さえ、就学実態をおさえた。
高等植物の温度適応におけるω-3脂肪酸不飽和化酵素の役割とその発現制御機構

シロイヌナズナから単離した葉緑体局在型ω-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(FAD7)をカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターにつなぎ,形質転換タバコで過剰発現させたところ,葉において全脂肪酸に占めるトリエン脂肪酸(18:3+16:3)の割合を60%から70%までおよそ10%増加させることができた。また,トリエン脂肪酸の増加は,MGD,DGD,PG,SLなど主要な葉緑体の脂質分子種すべてにおいて見られた。このようなトリエン脂肪酸の増加がタバコの低温適応能力に及ぼす効果を調べるために,25°Cで生育させた植物体に連続光照射下で1°C7日間の低温処理を行ない,その後の生育(25°C)について,野生株と形質転換タバコとの比較を行なった。このような低温ストレスを与えた野生株の成熟葉には傷害は起きなかったが,幼葉はその後の成長が著しく阻害され,半数以上の植物体においてクロロシスが見られた。また,クロロシスは暗黒中で低温ストレスを与えても生じないことから,光依存性の傷害であることがわかった。一方,形質転換タバコでは,成熟葉と幼葉のどちらも低温処理を行なっていない植物の葉と同様の成長を示し,クロロシスもほとんど見られなかった。野生株と形質転換タバコにおいて,葉の成長に伴う脂肪酸の不飽和度の変動を調べると,ともに幼葉の段階ではトリエン脂肪酸の含量は少なく,葉が伸長する(すなわち成熟する)につれて増加することがかわった。しかし,形質転換タバコの場合,トリエン脂肪酸の含量は,葉の伸長のほぼ全ての段階で野生株に比べ10%程度高いことがわかった。これらの結果は,野生株の幼葉で生じた低温ストレスによる成長阻害やクロロシスはトリエン脂肪酸の含量が低いことに起因していることを示している。よって,葉緑体局在型ω-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することにより,トリエン脂肪酸含量を増加させることができれば,高等植物の低温適応能力を向上させることが可能であると考えられる。
経直腸超音波ガイド下前立腺生検支援リアルタイムMRI3D画像システムの構築

2007年度から2008年度にかけ200例のPSA高値患者のMRIを実施した。得られた画像から3D構築を行いDWIの画像とのfusionを行った。この画像から超音波モードにて経直腸的な画像に任意再構成できるシステム構築を行った。事前にMRIにて広範囲の画像を得て生検方法をシミュレーションすることが可能となり、合併症としての出血、急性前立腺炎の予防などさらなる安全性の向上にもつながると考えられた。MRIの急速な発達はCTよりも組織分解能にすぐれた3Dイメージを被検者に対し被曝させることなしに得ることを可能とし,MRIから得られた高分解能のT2強調画像を立体構築し,3次元の情報を得ることが可能となればもともとCTよりも組織分解能にすぐれるMRIの利点を最大に生かし,立体診断や手術前計画などに広く応用できる可能性がある。平成19年度はPSA高値に対する前立腺癌スクリーニングとしてMRIを、前立腺生検前に行いデータを収集し,高精細のT2強調画像と拡散強調画像のフユージョンに関して座標系の最適化を行った。これらの画像から経会陰的な擬似超音波断面再構成画像を作成し前立腺癌及び周囲臓器との関連を明瞭に描出することに努め,拡散強調画像から得られている前立腺癌の存在確率が高いポイントを指し示すことが可能となった。画像の転送や画像再構成ソフトウエアの自動化などのシステム構築はまだ行われておらずマニュアル作業が多いためリアルタイムな擬似超音波断面再構成には至っていない。またMRIの座標系と超音波画像のキャリブレーションに関して最適な方法を模索中である。平成20年度はMRIの3D画像の座標と超音波検査の画像の座標とのリンクおよびリアルタイムにMRI擬似超音波断面再構成画像を作成し,経直腸超音波下に前立腺生検中の術者に情報提供することをめざす。このような環境では簡便に使用可能であるが目的とするものの描出に多くの経験を必要とする超音波という手技のガイドとなり,前立腺癌が最も疑われる部位を短時間で効率的にかつ安全に生検することが可能となるはずである。また当院では前立腺癌の治療として経直腸的超音波ProSound SSD-3500(ALOKA社製)を購入しこれにより前立腺の超音波3D画像を桃築し針刺しを行っている。2007年度から14症例に対し針刺し治療を開始した。2008年1月からは、術中計画を施行するようになった。線源の挿入はプレプランに従って施行されるが、前立腺の変形やねじれ、外套針の位置のズレ、挿入位置のズレ等が治療計画装置に術中入力され、前立腺内の低線量領域には追加挿入が施行できる。これらの術中プランの操作や計画変更は、全て放射線科医が施行した。線源の挿入は矢状断の経直腸的超音波ガイド下で施行され挿入1ケ月後にはポストプランとして、MRIが撮像され、線量分布が算出される。これらの症例はまだ観察期間は短いもののいずれも順調な経過となっている。今後ともMRIの前立腺画像の有用性は診断のみならず治療にも役立つものと思われさらなる症例の蓄積が望まれた。
風波と気流の局所相似構造に基いたエネルギー供給および逸散量の評価に関する研究

波浪推算を高精度に行うためには,気流からの風波へのエネルギー供給項および砕波や乱れによるエネルギー逸散項を精度よく評価する必要がある.しかしながら,エネルギー供給項や非線形エネルギー輸送項に比べて,エネルギー逸散項に関する研究はあまり進んでおらず,Hasselman(1974)による白波砕波モデルとPhillips(1985)による擬似飽和モデルがあるに過ぎない.エネルギー逸散項をモデル化するにあたって,波高と周期との間に鳥羽の3/2乗則がほぼ成立すること,および風波のスペクトルには平衡領域が存在し,その領域ではエネルギー供給項,非線形項およびエネルギー逸散項がバランスしている事実を上手く利用することである.また,風波下の乱流にも相似構造が存在し,それを実験を通して具体的に調べ,エネルギー逸散スペクトルのモデル化等に活用することである.本研究では,まず風波による気流の変動特性を測定し,その特性を明らかにすると共にエネルギー供給量やそれに重要な役割を果たす海面抵抗係数の波齢および波形勾配との関係を調べた.また,小型超音波流速計を用いて風波下の流速場を測定し,乱れの相似構造を詳細に調べた.さらに,これらの結果とこれまでの平衡スペクトルの存在および飽和度の考えを応用して,新たなエネルギー逸散スペクトルのモデル化を行った.本モデルでは,エネルギー逸散率が流速成分の3乗に比例するという仮定の下に,新たに定義した飽和度を用いてエネルギー逸散スペクトルを評価したところ,それは方向スペクトルの3/2乗に比例し,波齢の逆数の関数として表されることが示された.また,平衡領域におけるエネルギー逸散スペクトルは,周波数の-3乗および海面摩擦速度の3乗に比例し,波齢の逆数の関数となることが理論的に示された.波浪推算を高精度に行うためには,気流からの風波へのエネルギー供給項および砕波や乱れによるエネルギー逸散項を精度よく評価する必要がある.しかしながら,エネルギー供給項や非線形エネルギー輸送項に比べて,エネルギー逸散項に関する研究はあまり進んでおらず,Hasselman(1974)による白波砕波モデルとPhillips(1985)による擬似飽和モデルがあるに過ぎない.エネルギー逸散項をモデル化するにあたって,波高と周期との間に鳥羽の3/2乗則がほぼ成立すること,および風波のスペクトルには平衡領域が存在し,その領域ではエネルギー供給項,非線形項およびエネルギー逸散項がバランスしている事実を上手く利用することである.また,風波下の乱流にも相似構造が存在し,それを実験を通して具体的に調べ,エネルギー逸散スペクトルのモデル化等に活用することである.本研究では,まず風波による気流の変動特性を測定し,その特性を明らかにすると共にエネルギー供給量やそれに重要な役割を果たす海面抵抗係数の波齢および波形勾配との関係を調べた.また,小型超音波流速計を用いて風波下の流速場を測定し,乱れの相似構造を詳細に調べた.さらに,これらの結果とこれまでの平衡スペクトルの存在および飽和度の考えを応用して,新たなエネルギー逸散スペクトルのモデル化を行った.本モデルでは,エネルギー逸散率が流速成分の3乗に比例するという仮定の下に,新たに定義した飽和度を用いてエネルギー逸散スペクトルを評価したところ,それは方向スペクトルの3/2乗に比例し,波齢の逆数の関数として表されることが示された.また,平衡領域におけるエネルギー逸散スペクトルは,周波数の-3乗および海面摩擦速度の3乗に比例し,波齢の逆数の関数となることが理論的に示された.風波下の乱流の相似構造およびエネルギー逸散特性を調べるために,室内風洞水槽において風波の水位変動と3次元流速場を測定した。流速の測定には,50Hz程度まで測定可能な小型3チャンネル超音波流速計を用いた。風波は一般的には不規則波であるため,乱流成分の流速の抽出が難しいが,本研究では水面変動とコヒーレントな成分を波動流成分,インコヒーレントな成分を乱流成分として抽出している。抽出された乱流成分の周波数スペクトルは,風波の低周波数側および高周波数側の両方において,Kolmogoroffの5/3乗則がほぽ成立していることが分った。低周波数側の乱れについては,一部風波の非線型性により生じたものと推測されるが,その他の乱れはやや大きなシアーを持つ吹送流により発生したものと考えられた。このことを詳しく調べるために,乱れエネルギーの方程式を用いて,乱れの発生項,移流項,拡散項およぴエネルギー逸散項の各項を測定結果に基き評価した。その結果,ほぼ対数則に従っている吹送流のシアーとReynolds応力の積である乱れの発生項は正の値を示しており,吹送流からも乱れエネルギーが供給されていることが明らかとなった。風波下の乱れ強度およびReynolds応力の相似構造を調べるために,代表長さとして乱流境界層の厚さ,代表速度として摩擦速度を採り,それらを無次元化することにより分布を比較した。その結果,乱れ強度およびReynolds応力ともに相似性があることが明らかとなった。さらに,乱れエネルギー方程式よりエネルギー逸散率を評価し,その特性についても調べたところ,風速10m/s以上の高風速の場合には相似性があることも見出された。これらのことは,乱れ強度,Reynolds応力およびエネルギー逸散率が,摩擦速度u^*および境界層厚さΔによって規定され,それらの鉛直積分量がこれらの量で評価されることを意味している。

したがって,局所相似性の仮定を用いてエネルギー逸散量の評価が可能となった。風波のスペクトルの局所相似性を調べるために,周波数fの-4乗則に従うKitaigorodskiiおよび鳥羽のスペクトル,および-11/3乗則に従うKolmogoroffスペクトルと比較した.その結果,概略的には-4乗則に従っているものの,風速12m以上の高風速では,表面張力の影響を考慮する必要があることが分った.また,平衡スペクトルに漸近するのは,室内風洞水槽実験においては,ピーク周波数のおよそ2倍から3倍以上の周波数であることも明らかとなった.一方,風波下の流速成分の周波数スペクトルに関しては,Koimogoroffの-5/3則がピーク周波数の2倍程度以上の周波数で成立していることが示された.これらのことから,風波の水面波形と流速場のスペクトルには,局所的な平衡スペクトルが存在し,前者においては海面摩擦速度u^*と重力加速度gが支配的なパラメタとなり,後者においてはエネルギー逸散率εと代表速度urが支配的なパラメタとなることが分った.風波下の流速のスペクトルにピーク周波数の2倍程度以上の周波数において,慣性小領域が現れることは,風波の内部逸散率がその周波数以上においてほぼ一定であることを示唆するものであり,風波のエネルギー逸散スペクトルをモデル化する際に重要な特長となるものである.エネルギー逸散スペクトルが,飽和度の関数として表され,かつ流速成分の3乗の比例するものとして,方向スペクトルを用いて評価された.その結果,エネルギー逸散スペクトルは方向スペクトルの3/2乗の比例し,エネルギー供給項とバランスすることを考慮すると,その比例係数は波齢の逆数の関数になることが分った.また,十分に発達した風波の平衡スペクトルは,周波数の-4乗に比例して減衰することも示された.以上のことにより,平衡スペクトルを考慮した風波のエネルギー逸散スペクトルのモデル化がなされ,この評価式を用いることにより,風波の波浪推算の精度向上つながるものと期待される.
オールイン型デンドリマーを用いた癌の「見張り」リンパ節のイメージング・薬物送達

日本の死因の第一位である癌の克服のため、本研究では、転移性癌細胞の最初の通り道であるリンパ節の正確なイメージングと薬物送達を行うことを目的とした。まず、サイズや構造を制御でき、かつデリバリー機能をもつデンドリマーとよばれる合成高分子の構造最適化を行い、リンパ節へ多く移行するデンドリマーを得た。そして、このデンドリマーにイメージング剤を付与し、リンパ節の検出に成功した。さらに、癌細胞集積性と抗腫瘍活性を併せ持つデンドリマーを作製し、癌細胞に選択的な殺傷効果を示すデンドリマーを作製することにも成功した。日本の死因の第一位である癌の克服のため、転移性癌細胞の検出・薬物送達は非常に重要である。我々はこれまでサイズや構造を制御することができる合成高分子であるデンドリマーを利用して薬物運搬体やイメージング剤の作製を行ってきた。本研究では、転移性癌細胞の最初の通り道であるセンチネルリンパ節(「見張り」リンパ節)を正確にかつ様々な手法で検出できるデンドリマーイメージング剤を作製すること、さらには、イメージング素子だけでなく、癌標的化分子、薬物を付与したオールイン型デンドリマーを作製して、センチネルリンパ節に移行した転移性癌細胞のイメージング・薬物送達を行うことを目的としている。本年度は、その初期検討として、デンドリマーのサイズ、化学構造とセンチネルリンパ節への移行性との相関を明らかにするため、世代数および表面構造の異なるデンドリマーイメージング剤を合成し、センチネルリンパ節への移行性を検討した。その結果、第4世代(粒径が6nm)以上のカルボキシ末端のデンドリマーがセンチネルリンパ節へ多く移行することがわかった。そして、キレート剤を結合させ、続いて放射性インジウムイオンでラベルしたデンドリマーを用いて、センチネルリンパ節の核医学イメージング(SPECTイメージング)を行うとともに、蛍光色素を結合したデンドリマーを用いて、センチネルリンパ節の蛍光イメージングを行った。そして、組織切片の蛍光免疫染色によって、上記のカルボキシ末端のデンドリマーはマクロファージなどの免疫細胞にはあまり取りこまれないことが明らかとなった。本研究では、申請者がこれまで研究を行ってきたサイズや構造を制御することができる樹状合成高分子(デンドリマー)を利用して、転移性癌細胞の最初の通り道であるセンチネルリンパ節(「見張り」リンパ節)を正確にかつ様々な手法で検出できるデンドリマーイメージング剤を作製することを目的にしている。さらに、イメージング素子だけでなく、癌標的化分子や薬物を付与したオールイン型デンドリマーを作製し、センチネルリンパ節に移行した転移性癌細胞のイメージング・薬物送達も目指している。前年度に、デンドリマーの構造を最適化し、センチネルリンパ節に移行することができるデンドリマーを作製した。また、当初は本年度の目標であった放射性物質、蛍光色素を有するデンドリマーイメージング剤の作製も、前倒しにて前年度に既に達成している。そこで、当該年度では、これらの成果を論文としてまとめ、発表した。そして、ガン細胞が分泌する酵素によって蛍光を発することができるアクチベータブルON型の蛍光色素を作製した。そして、センチネルリンパ節へ移行することができるデンドリマーにこれを導入した。この有機色素は、デンドリマーに導入した後も、ガン細胞に対する応答性を維持していることを明らかにし、このデンドリマーを用いてガン細胞の蛍光イメージングを実施することができた。当初の計画通りに進行しているため。我々はこれまでサイズや構造を制御することができる合成高分子であるデンドリマーを利用した薬物運搬体やイメージング剤の作製を行ってきた。本研究では、まず、デンドリマーのサイズ、化学構造とセンチネルリンパ節への移行性との相関を検討し、第4世代(粒径が6nm)以上のカルボキシ末端のデンドリマーがセンチネルリンパ節へ多く移行することを見出した。次に、このデンドリマーを放射性物質もしくは蛍光色素で標識し、センチネルリンパ節の核医学イメージング(SPECTイメージング)および蛍光イメージングを行った。さらに、ガン細胞をイメージングするための蛍光プローブを合成した。これをG4のカルボキシ末端のデンドリマーに結合させることで、センチネルリンパ節移行性とガン細胞の検出能をあわせもつデンドリマーを作製することができた。一方、ガン標的化能と細胞透過能をもつペプチドと抗腫瘍活性をもつペプチドを結合したデンドリマーを作製し、ガン細胞に選択的な殺傷効果を示すデンドリマーを作製することにも成功した。