hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
擬集系中での活性分子の構造とダイナミックス

研究代表者および上記分担研究者5名の代表的な研究の実績の概要は下記の通りである。志田:前年度にひき続いてラジカルイオンの共鳴ラマン分光と電子吸収スペクトルの実測データを比較し、KramersーKronig変換を用いた解折法によって電子励起状態における構造パラメーターと電子緩和に関する速度を見積ることができた。この研究に関連して電子励起前後での基準振動の混合、いわゆるDuschinsky回転の寄与の見積りを試み、ビノキシラジカルについて明確にDuschinsky効果があらわれることを確認した。フッ化メチルのラジカルカチオンのESRスペクトルは顕著なヤーン・テラー効果のため解折が困難であったがメチル基の一つのプロトンを重水素置換することなどによってほぼ完全に実測スペクトルを解折した。広田:^3nπ^*と^3ππ^*が近接する4ーシアノピリジンなどについて時間分解EPR法により零磁場分裂定数・超微細結合定数などを決定しその結果から励起三重項状態では強い振電相互作用により分子構造が歪むことを明らかにした。籏野:パルスラジオリシス法を用いた実験により液体の希ガスや飽和炭化水素中での電子・イオン再結合反応の速度を測定し、古典理論が破緩することを明らかにした。現在、理論的解折を進めている。鷲田:エチレン・アセチレンなどについてクラスター内のイオン・分子反応を調べ、通常のイオン分子反応では起こらない反応が進行することを明らかにした。伊藤:ビフエニル型有機高スピン分子についてスピン整列機構を検討した。実測のESR・ENDORスペクトルの結果を、HeisenbergおよびHufbardのモデルによって解析した。加藤:水溶液でのN,Nー(ジチメチル)アミノベンゾニトリルの光励起による電子移動反応などの動力学的解析を行った。
贈与に対する法学的アプローチの再検討―フランス法における家族内贈与と慈善目的贈与

8月末にフランスでの在外研究を開始し、1月中旬まで滞在した。この滞在は全面的に《課題1:家族内贈与の網羅的把握》に充てられた。共同研究者であるソフィー・ゴドゥメ教授との緊密な意見交換を基に、聞き取り調査の課題を特定することに多くの時間を割いた。その際には、日本法から問いを立ててフランス法の特異性を際立たせるとの方針を採った。代表者からは渡仏直前に成立した相続法改正(日本)を細部に亘って紹介・分析した。夫婦財産の清算、被相続人に対する寄与の清算を強調することで、法定相続制度の枠内での互酬性の実現という視点を提示した(なお、これを基に数件の報告〔別用務での滞在時のそれらを含む〕を行った)。フランス法上、前者が夫婦財産法の問題であることはいうまでもない。対して後者については、家族経営企業(農業等を含む)における無償労務への報酬を相続財産から回収させる制度と不当利得法の活用とを考えうるにすぎず、老親介護負担の平準化は相続法上の問題として意識さえされていないという。すると当然ながら、本課題が設定していた「扶養・介護と贈与分割との接合」という視角も成立しない。この誤算が貴重であるのは、寄与分を通じた清算を「相続人間の平等」の下に語る日本法の特異性が析出されるためである。フランス法上の「相続人間の平等」は遺産分割からえられる財産のそれであり、贈与分割においても同様である。むしろ贈与分割は遺留分を尊重することで平等の砦となっている。では「不平等な財産移転」の実務はまったく存在しないのか、これが調査によって明らかにされるべき問いとなった。本格的には第二次滞在の冒頭で組織されるが、試行的に数件実施した調査では、数は少ないながらも(基課題である基盤Cの成果のひとつである)「報酬的贈与」の法理を通じて贈与の性質決定を奪うことで当該財産移転の贈与分割財産該当性を失わせる、という事例が確認された。上述のとおり、当初の想定が裏切られたことは、長期滞在による共同研究の端的な効用であり、顕著な進捗と解釈される。これに付け加えるべき成果として、日本の相続法改正の学術的発信がある。既に数度の報告を経ており、次年度前半に公表の予定である。他方、第二次滞在時に進められるべき《課題2:慈善目的贈与における団体の機能》については、現時点で確たる進捗をみていない。もっとも、もう一人の共同研究者であるムスタファ・メキ教授とはシンポジウムを共催するなど連携を強めており、他方で、財団に特化した他課題からのフィードバックもあり、次年度における展開のための環境は整っている。以上より「おおむね順調」との自己評価を付する。当初の予定通り、2019年9月末より第二次滞在を遂行する予定である。それ以前は、課題1に関する調査準備、課題2の一層の具体化に加え、「家族と連帯」をテーマにした6月の国際学会での報告、第一次滞在中に俄に動き出した遺留分制度の見直しをめぐる動向のフォローアップを行う予定である。特に最後の点は、贈与分割の性質を変えうるインパクトを秘めていることから、当初の設問への回帰の可能性を見据えて、夏前の報告書の公表後直ちに共同研究者とのコンタクトをとることとする。さらにいえば「慈善目的贈与の拡充のために遺留分を見直す」という言説は課題2にも関連しており、二つの課題間の接合にとっても示唆するところが大きいであろう。内定年度:20178月末にフランスでの在外研究を開始し、1月中旬まで滞在した。本格的には第二次滞在の冒頭で組織されるが、試行的に数件実施した調査では、数は少ないながらも(基課題である基盤Cの成果のひとつである)

「報酬的贈与」の法理を通じて贈与の性質決定を奪うことで当該財産移転の贈与分割財産該当性を失わせる、という事例が確認された。上述のとおり、当初の想定が裏切られたことは、長期滞在による共同研究の端的な効用であり、顕著な進捗と解釈される。これに付け加えるべき成果として、日本の相続法改正の学術的発信がある。既に数度の報告を経ており、次年度前半に公表の予定である。他方、第二次滞在時に進められるべき《課題2:慈善目的贈与における団体の機能》については、現時点で確たる進捗をみていない。もっとも、もう一人の共同研究者であるムスタファ・メキ教授とはシンポジウムを共催するなど連携を強めており、他方で、財団に特化した他課題からのフィードバックもあり、次年度における展開のための環境は整っている。以上より「おおむね順調」との自己評価を付する。当初の予定通り、2019年9月末より第二次滞在を遂行する予定である。それ以前は、課題1に関する調査準備、課題2の一層の具体化に加え、「家族と連帯」をテーマにした6月の国際学会での報告、第一次滞在中に俄に動き出した遺留分制度の見直しをめぐる動向のフォローアップを行う予定である。特に最後の点は、贈与分割の性質を変えうるインパクトを秘めていることから、当初の設問への回帰の可能性を見据えて、夏前の報告書の公表後直ちに共同研究者とのコンタクトをとることとする。さらにいえば「慈善目的贈与の拡充のために遺留分を見直す」という言説は課題2にも関連しており、二つの課題間の接合にとっても示唆するところが大きいであろう。
幕末明治期における漢詩文系作文書の総合的研究

幕末明治期における漢詩文系作文書を網羅的に調査し、その特質を分析することで、以下の事実が明らかになった。1)幕末明治期は、日本における公的な文章の変動期であり、近代にふさわしい文章の確立期であったが、その時期において、訓読体.(普週支・今体文)の果たした役割がきわめて大きいこと。2)近世まで、漢文に対して補助的な文体として用いられていた訓読体は、その実用性の高さと、文体のモデルとして漢文を用いるこ.とができることの二つの理由から、公的な文体として広く用いられるようになったこと。3)訓読文で表すことのできる対象は、従来のどの文体よりも広く、また、漢文を基礎学問として学んだ人々にとって、教えやすく学びやすい文体であったため.、初等中等教育において、すばやく普及したこと。4)教育現場におけ季訓読文め普及にあたっては、『穎才新誌』などの作文雑誌による競争や、『習文軌範』『記事論説文例』などの作文書による規範の提示が、大きな役割を果たしたこと。5)従来の日本文章史においては、西洋の書物を翻訳したことによる文体の変動に力点が置かれ、言文一致文体の登場を近代のメルクマールとする傾向が強かったが、作文書の実態を研究することで、近世後期以降の漢文教育を背景にした訓読文の普及に注目すべきセあることが、明らかになったこと。6)訓読文は、新しい協念や文物に対応した新漢語を用いるのにも有効であり、訓読文は、,いわば新漢語を効率的に運用するたゆの文体でもあったこと。以上のことから、,これまで翻訳と言文一致を中心に考える傾向の強かった近代文体研究こ、新たな知見をもたらすことができた。本年度は、明治初年の学制発布前後における「作文」がどのようなものであったか、その全体を把握するために、東京大学・国会図書館・国文学研究資料館・京都府立総合資料館を中心に調査収集を行ない、海外では、フランス東洋語図書館にパリ万国博覧会に文部省が出品した当時の作文資料があることから、その調査収集にあたった。また、原本の購入も積極的に行った。収集方法は、マイクロフィッシュ複写、デジタルカメラによる撮影、A3対応高精細スキャナによる読み込みを中心とし、デジタルカメラおよびスキャナによるデータはもとより、デジタルカメラの低廉化によって生じた予算の余裕を利用して購入したマイクロフィッシュスキャナによってマイクロフィッシュのデジタル化も可能となり、すべての画像データは電子化されている。本年度収集した資料の中で注目すべきは、明治十年に創刊された『学庭拾芳録』という作文雑誌であろう。この雑誌は、同年発行の『穎才新誌』と比較することで、当時の小学校における作文教育がどのようなものであったのか、また漢詩文の知識がどのように要求されているのかを知る大きな材料となるのだが、所蔵機関が限られ(欠号なく揃える機関は無い)、発行期間も短いことから、『穎才新誌』がしばしば言及されるのに比して、ほとんど顧みられることのない資料であった。これについては、「作文する少年たち--『穎才新誌』創刊のころ」(『日本近代文学』70)において成果の一部を公表した。本年度は、昨年度に引き続き、明治前期における「作文」がどのようなものであったか、その全体を把握するために、東京大学・国会図書館・国文学研究資料館・京都府立総合資料館・東北大学図書館・大阪府立中之島図書館を中心に調査収集を行ない、海外では、フランス東洋語図書館にパリ万国博覧会に文部省が出品した当時の作文資料があることから、その調査収集にあたった。

収集方法は、マイクロフィッシュ複写、デジタルカメラによる撮影、A3対応高精細スキャナによる読み込みを中心とし、デジタルカメラおよびスキャナによるデータはもとより、昨年度購入したマイクロフィッシュスキャナによってマイクロフィッシュのデジタル化も可能となり、すべての画像データは電子化されている。また、本年度は、より広い視野で明治前期における「作文」のありかたを捉えるために、イギリス人宣教師が漢文で翻訳した『天路歴程』とその和訳に関係する文献に着目し、積極的に調査と収集にあたった。「作文」には文体の選択が必然的に伴い、「作文書」はその指南となるべきものであり、漢詩文系作文書においては、伝統詩文がその規範的地位を占めていたわけだが、清朝末年には、キリスト教や西洋知識を漢文(中国古典文)に翻訳した大量の書物が流通し、日本における漢文のありかたもそれによって変容を遂げていた。本研究は、明治前期における漢詩文系作文書が、漢文と明治普通文とをつなぐ役割を果たしていることに着目するものだが、さらに、欧文→漢文→和文という文体変換の行為の中にそれを捉え直すことで、そこで目指されたものが別の角度から浮かび上がると考えたのである。また、漢文訓読文体による翻訳家と見なされている森田思軒についても、同様の視点から着目し、論考を著した。前年度に引き続き、幕末から明治期にかけて発行された漢詩文系作文書の網羅的収集およびデータベース化を、デジタルメディアを用いて行った。国会図書館や国文学研究資料館など、明治期刊行物についてのデジタル画像データを提供する機関から、利用可能な範囲においてデータをダウンロードないし印刷して蓄積する一方、国内および海外(台湾大学)において文献調査を行い、デジタルカメラによる画像、もしくはマイクロフィルムをマイクロスキャナによってデジタル化した画像を収集蓄積した。古書肆より購入した原本については、スキャナによって画像を蓄積した。集積されたデータをもとに、分析検討を加えたが、その視点として、出版文化・文体・表現内容の三側面を相互連関的に捉え、作文書の登場した経緯とその果たした役割を探った。出版については、往来物から作文書への展開の中で、江戸期からの書肆が大きな役割を果たしていること、東京のみならず、京都・大阪の書肆がこの種の出版物を多く発行していることが明らかになった。また、漢字カタカナ交り普通文からひらがな交じり普通文への移行と、銅版から活版への移行が、おおむね重なりあっていることが見て取れるなど、データの集積によって有用な知見を得ることができた。これらの詳細については、別に報告書を用意したい。今年度は、これまで得られた知見を総合し、漢詩文を規範になされた作文という行為が、素読という音声の側面も含めた訓読という行為といかに関わっているか、そしてそれが明治普通文成立のメカニズムといかに関わるかを明らかにすることを目指した。結論を言えば、近世以来の素読(訓読)が明治期作文の根底にあった、ということになり、そこからの離脱が、言文一致対への転換であったということになる。これについては、『漢字圏の近代:ことばと国家』所収の「漢文の命脈:古典文から今体文へ」で一端を明らかにした。
哺乳動物のS期形成促進因子の同定と発生工学的手法を用いた機能解析

細胞増殖および細胞周期進行に関与する因子の分解機構の解明をめざし、特にG1からS期の進行に関与するユビキチンリガーゼ複合体の解析を試みた。今回は特に、大腸癌の発生およびその細胞増殖に関与するβ-カテニンのユビキチンリガーゼの同定とそれによるβ-カテニンの分解機構の解析を行い次の結果を得た。1.酵母ですでに知られているSCFユビキチンリガーゼの構成因子Skp1、Cul1のマウス相同遺伝子を単離した。2.ショウジョウバエの研究からSlimb変異がβ-カテニンの蓄積を伴うことから、そのマウス相同遺伝子を単離しFWD1と命名した。3.細胞内でFWD1はそのC末端側のWD40領域でリン酸化型β-カテニンと特異的に結合し、さらに、GSK3、Axin、APCを加えた複合体を形成していることを見い出した。4.FWD1のN端側のF-boxではSkp1、Cul1とユビキチンリガーゼ複合体SCF^<FWD1>を形成し、β-カテニンのユビキチン化を実行することが判明した。APCの変異のある大腸癌ではβ-カテニンのリン酸化が低下することにより、SCF^<FWD1>が形成できずにβ-カテニンの蓄積が引き起こされると考えられる。5.一方でFWD1はGSDXXSのふたつのSerがリン酸化された場合それを認識するが、同様の配列をもつIκBαもIKKのリン酸化を受けると、このSCF^<FWD1>複合体が形成されて、ユビキチン化されることも見い出した。6.さらにSkp1、Cul1のノックアウトマウスを作製し、その表現型を解析した。Skp1及びCul1ノックアウトマウスはいずれも胎生6.57.5日目に死亡する早期の胎生致死であり、β-カテニンの蓄積が見られた。以上の研究成果よりβ-カテニンの分解機構が明らかになり、大腸癌の診断治療に応用が期待される。本研究の目的は噛乳動物の細胞周期のG1期からS期への進行に必須なS期形成促進因子複合体の同定と解析である。酵母においては基質であるサイクリンやCDK阻害蛋白質の分解実行因子であるSCFユビキチンリガーゼ複合体がS期形成促進因子複合体の本体と考えられる。F-box蛋白質は特異的な基質を認識すると同時にSKP1,cdc53(Cul-1)と結合してユビキチンリガーゼ複合体を形成し、E2であるcdc34およびE1からユビキチンを基質に重合させる。我々はまずマウスSCFユビキチンリガーゼ複合体の構成成分のクローニングを行い、それらを用いて機能解析した。2.酵母F-box蛋白質cdc4と同様にF-boxと7つのWD40リピートをもつF-box蛋白質のcDNAをESTデータベースよりクローニングし、全配列を決定し、FWD1と名付けた。3.昆虫細胞の系で作成した組み換えタンパク質を用いてFWD1,SKP1,Cul-1が複合体を形成することを確認した。4. FWD1はサイクリンやCDK阻害蛋白質には結合しなかった。しかし重要なサイトカインシグナル伝達因子であるNFκBの阻害分子であるIκBαのリン酸化型とβ-cateninのリン酸化型に特異的に結合した。5.リン酸化されたIκBαとβ-cateninはFWD1を介してユビキチン化されたあと、プロテアソームに認識され分解されることが明らかになった。本研究の結果より、FWD1はIκBαとβ-cateninのユビキチンリガーゼであることがあきらかになった。今後、FWD1,SKPl,Cul-1のノックアウトマウスを作成、解析して、個体レベルでのSCFユビキチンリガーゼ複合体の機能を解析する予定である。

6.さらにSkp1、Cul1のノックアウトマウスを作製し、その表現型を解析した。Skp1及びCul1ノックアウトマウスはいずれも胎生6.57.5日目に死亡する早期の胎生致死であり、β-カテニンの蓄積が見られた。以上の研究成果よりβ-カテニンの分解機構が明らかになり、大腸癌の診断治療に応用が期待される。細胞増殖および細胞周期進行に関与する因子の分解機構の解明をめざし、特にG1からS期の進行に関与するユビキチンリガーゼ複合体の解析を試みた。今回は特に、大腸癌の発生およびその細胞増殖に関与するβ-カテニンのユビキチンリガーゼの同定とそれによるβ-カテニンの分解機構の解析を行い次の結果を得た。1.酵母ですでに知られているSCFユビキチンリガーゼの構成因子Skp1、Cul1のマウス相同遺伝子を単離した。2.ショウジョウバエの研究からSlimb変異がβ-カテニンの蓄積を伴うことから、そのマウス相同遺伝子を単離しFWD1と命名した。3.細胞内でFWD1はそのC末端側のWD40領域でリン酸化型β-カテニンと特異的に結合し、さらにGSK3、Axin、APCを加えた複合体を形成していることを見い出した。4.FWD1のN端側のF-boxではSkp1、Cul1とユビキチンリガーゼ複合体SCF^<FWD1>を形成し、β-カテニンのユビキチン化を実行することが判明した。APCの変異のある大腸癌ではβ-カテニンのリン酸化が低下することにより、SCF^<FWD1>が形成できずにβ-カテニンの蓄積が引き起こされると考えられる。5.一方でFWD1はGSDXXSのふたつのSerがリン酸化された場合それを認識するが、同様の配列をもつIκBαもIKKのリン酸化を受けると、このSCF^<FWD1>複合体が形成されて、ユビキチン化されることも見い出した。
ヒトT細胞ハイブリドーマを用いたネフローゼ症候群の血管透過性因子の産生

リポイドネフローゼの発症の原因はいまだ不明である。毛細血管、特に腎糸球体基底膜の透過性亢進にはT細胞機能異常の関与が報告され、二種のリンホカインが関与していると推測されている。我々はこの透過性亢進を惹起する因子を分析するために、ヒトT細胞-T細胞融合法を用いて、リンホカインを産生させ、腎潅流系にてその因子を測定し、種々のリンホカインの測定を行った。結果:(1)血管透過性因子の測定:ラット腎潅流系を用いて培養上清を投与したところ3、2,3の上清で尿蛋白の出現をみた。(2)インターロイキン【II】の測定MTHマウスIL-【II】依存性細胞株を用いて上清を加えたところ、【^3H】の取込みは対照に比して有意に低下した。(3)浮遊増殖性細胞株(Daudi,Raji,Molt3,K562)の増殖を有意に抑制した。(4)正常リンパ球の幼若化反応の増殖促進率は12時間目,24時間目,48時間目と増加し、正常の510倍増強された。この現象は上清の濃度依存性であった。(5)上皮性腫瘍細胞株の増殖に対する影響は胃癌,胆のう癌,扁平上皮癌で培養上清高稀釈においても腫瘍細胞壊死効果が認められた。以上の因子は同一細胞上清中に認められたが、これらが単一細胞株に由来するか否かを検討するために阻界稀釈法を用いてクローニングを行った。3回のクローニング後得られた上清およびクローニング前上清を同様の系で測定したところ、上皮性腫瘍細胞に対して細胞毒性を示した上清はConA刺戟によるリンパ球増殖反応を促進した。しかしながらクローニング前後の培養上清ともにこれらの活性が時間とともに低下し、またハイブリドーマ細胞もリンホカインの産生が著しく低下した。以上の結果より、透過性亢進因子とリンパ球増殖促進因子等の解析、同定までには至らなかったが、これらの因子に何らかの関連があるものと考えられる。
「植物のダイニン」探索

ダイニンは動物細胞で微小管上をマイナス端方向へと長距離歩行できる唯一のモータータンパク質であり、微小管上のカーゴ(積み荷)の逆行輸送(マイナス端方向への輸送)をはじめ、微小管が関与するほぼ全ての細胞内運動に必須の役割を果たす。ところが、植物は逆行輸送を遂行するにも関わらず、進化の過程でダイニン遺伝子を失った。では植物はどうやってこれらのプロセスを遂行しているのだろうか?本研究では、ヒメツリガネゴケを材料として、植物の逆行輸送モーターの同定に挑戦した。そして、陸上植物で高度に保存された3つのキネシン14(KCBP、KCH, ATK)が、核や葉緑体、そして微小管自体の逆行輸送を担うことを発見した。ヒメツリガネゴケに6種類存在するXVI型キネシンについて、試験管内運動アッセイを通じて分子活性を網羅的に決定した。またその中のキネシン14-VIbタンパク質については細胞内での動態を斜光照明蛍光顕微鏡法により追跡した。その結果、キネシン14-VIbタンパク質がクラスター化することで微小管上をマイナス端方向へと長距離歩行することを見出した。この動きは動物や菌類のダイニンモーターで認められるものと同等であり、ダイニンを失った植物における代替モータータンパク質の候補を提唱できたことになる。この成果はNature Plants誌に発表した(Jonsson et al. 2015)。当初の期待通り「植物のダイニン」の候補分子をひとつ提唱できたため。前年度、ヒメツリガネゴケを用いた研究から、クラスター化したVI型キネシン14 (KCBP)が試験管内と細胞内の両方でマイナス端方向へ長距離歩行することを見出し、KCBPがダイニン様の機能を担うモーターではないかと予想した。この仮説を検証するため、パラログが4つ存在するKCBPの完全遺伝子破壊株を樹立し機能解析を行った。KCBPは生育必須遺伝子ではなかったものの、四重遺伝子破壊株では原糸体細胞の成長遅延が認められ、細胞分裂直後の微小管依存的な核輸送や葉緑体配置に異常をきたした。また、KCBPは細胞質全体に分布することに加え、分裂直後には核周縁部に集積し、この時期の微小管極性はKCBPの核輸送方向と一致していた。さらに、配置異常が認められた葉緑体は微小管のプラス端側が配向する細胞先端に集積しており、マイナス端方向への輸送がなくなったため、プラス端側にカーゴが集積するというモデルに一致していた。KCBPにはFERMドメインと呼ばれる膜結合ドメインが存在しており、二つの異なるオルガネラがカーゴとして示唆されたことからも、膜とKCBPが直接結合する可能性が考えられた。そこで、リン脂質からなるリポソームを作製し、KCBPとの結合を調べた結果、酸性脂質特異的にKCBPがリポソームに結合することが示された。これらの結果は、KCBPが植物細胞で複数のカーゴに直接結合し輸送を行う微小管依存的なマイナス端方向性モーターとして機能していることを示唆している。一方、微小管から新たに生成された短い微小管は一定の頻度で微小管上をマイナス端方向へ輸送されることが当研究室の先行研究によって明らかにされていた。この輸送を担うモーターとして、I型キネシン-14であるATKを見出した。当初の期待通り「植物のダイニン」の分子をふたつ同定できたため前年度までに、キネシンー14の一つであるKCBPタンパク質が細胞内の一部のオルガネラの逆行輸送を担うことが明らかとなった(Yamada et al. J Cell Biol. 2017)。しかしながら、キネシンー14サブファミリーの中にはまだ機能が明らかにされていない遺伝子もいくつか存在し、それらもまた逆行輸送を担っている可能性も考えられたため、他のキネシンー14についても詳細な解析を行った。KCHタンパク質ははアミノ末端側にカルポニンホモロジー(CH)ドメインを持つことで特徴付けられるII型キネシンー14である。被子植物のKCHは微小管とアクチンの両方に結合する活性を持つことが報告されているが、高い遺伝子重複が問題となり遺伝学的解析は部分的であり、その機能の全貌は不明であった。そこで、ヒメツリガネゴケで4つ存在するKCHの局在解析、表現型解析を行った。すなわち、KCH遺伝子産物をそれぞれGFPで可視化して細胞内動態を調べるとともに、相同組換えを用いて4つすべてを遺伝子破壊したトランスジェニック株を作成して細胞内の動態を観察した。以下の新しい知見を得た。1)KCHは原糸体頂端細胞の先端に局在すること2)細胞先端で細胞骨格の集合体の安定的な維持に必要であること3)細胞周期の大部分で、核の逆行輸送に寄与していること細胞伸長には微小管とアクチンの両方が必要とされること、KCHが微小管とアクチンの両方に結合する活性を持つことから、KCHは核の輸送を担うとともに微小管とアクチンを架橋することで細胞伸長に寄与するキネシンである可能性がある。一方、興味深いことに、アクチン結合能を有するCHドメインを欠いたKCHも野生型と同様の機能を保持していることもわかった。

ところが、植物は逆行輸送を遂行するにも関わらず、進化の過程でダイニン遺伝子を失った。では植物はどうやってこれらのプロセスを遂行しているのだろうか?本研究では、ヒメツリガネゴケを材料として、植物の逆行輸送モーターの同定に挑戦した。そして、陸上植物で高度に保存された3つのキネシン14(KCBP、KCH, ATK)が、核や葉緑体、そして微小管自体の逆行輸送を担うことを発見した。当初の予定どおり、長距離歩行能力を持つことがわかったキネシン14-VIモーターが実際に細胞内で何を運んでいるのかを探究する。他のキネシン14モーターに長距離歩行能力があるか、実際に細胞内で何を運んでいるのかを探究する。細胞生物学消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品購入に使用予定消耗品購入に使用予定
中国内陸部の乾燥草原の砂漠化におよぼす放牧家畜の影響と荒廃草原の修復技術の確立

中国の半乾燥草原では、砂漠化が進行しており、特にヤギによる過放牧が砂漠化の主要な原因である。ヤギがおもに飼育されているところは、開発の歴史が古く、人口も多いので丘陵地帯の斜面の大半は畑になっていた。ヤギが放牧できる草原は、ほぼ垂直に切り立っている斜面だけであった。逆に、開発の歴史が浅く、人口も少ないところでは、丘陵地帯の緩やかな斜面の多くは草原となっており、そこでは主にヒツジが放牧されていた。平成18年度は、中国西北部の黄土高原において、自然草地の植生を調査し、同時に放牧家畜の管理状況も調査して、草原の砂漠化におよぼす要因の解析を行った。中国に滞在中の7月27日8月2日の間は固原に、8月37日の間は華池に滞在し、町の周辺に広がる丘陵地帯の草原を調査対象とした。斜面の方位を基礎として大きな斜面を6ケ所選定した。ついで、それぞれの斜面において上部、中間、下部を調査地とした。1つの地点で5ケ所をランダムに選び、50センチ四方のコドラートを置き、その中に生育している植物すべての被度を測定し記録した。同時に、GPSを用いて調査地の詳細データを記録し、また、傾斜度と斜面の方位を測定し記録した。この会議の後、Hustai National Parkへ行き、自然草地の植生を調査し、同時に、11種のイネ科植物について葉身のサンプルを採取した。これらのサンプルを日本に持ち帰り、葉身の乾物重、引張り強度、せん断強度、曲げ強度を測定して、家畜の採食と植物の生体力学的特性との関連性について検討した。モンゴルの乾燥草原に生育しているイネ科植物の半数以上は、日本などの湿潤なところで生育している植物と比べ、非常に硬く、引張り強度、せん断強度、曲げ強度も大きな値を示した。このような乾燥した自然草原に生育するイネ科植物について生体力学的特性を調査した研究例はこれまで発表されておらず、今回の調査で初めて明らかになった研究成果である。研究代表者の本江は、平成19年7月2330日に、中国寧夏回族自治区の固原に滞在し、黄土高原における自然草地の植生を調査し、同時に放牧家畜の管理状況も調査して、草原の砂漠化におよぼす要因の解析を行った。今回は雲霧山および上黄村の丘陵地帯の草原を調査対象とした。また、20種のイネ科植物について葉身のサンプルを採取し、葉身の乾物重、引張り強度、せん断強度、曲げ強度を測定して、家畜の採食と植物の生体力学的特性との関連性について検討した。中国のステップに生育しているイネ科植物の半数以上は、日本などの湿潤なところで生育している植物と比べ、非常に硬く、引張り強度、せん断強度、曲げ強度も大きな値を示した。ついで、研究分担者の平田は、平成19年11月110日に、中国内モンゴル自治区ジャルート旗に滞在して、モンゴル牧畜民の移動パターン、定住化の状況、および、畜産物利用、特に乳製品の加工と利用について調査した。さらに、本江と平田は、平成20年3月918日に、シリアのアレッポにある、ICARDA(International Center for Agricultural Research in the Dry Areas)において放牧家畜に関するワークショップに参加した。またこの組織に所属する研究者と共に、西アジアの乾燥地帯における自然草地の植生を調査した。同時に、22種のイネ科植物について葉身のサンプルを採取し、葉身の乾物重、引張り強度、せん断強度、曲げ強度を測定して、家畜の採食と植物の生体力学的特性との関連性について検討した。このような西アジアの乾燥草原に生育しているイネ科植物の葉身について生体力学的特性を調査した研究例はこれまで発表されておらず、今回の調査で初めて明らかになった研究成果である。研究代表者の本江は、平成20年6月28日7月5日の間、中国内モンゴル自治区のフフホトに滞在した。6月2930日は国際会議において開催されていた、国際草地学会に参加して、"Sheep recognize chewing easiness of grass leaves prior to prehensionthrough sensing bending strength"という演題でポスター発表を行った。次いで、7月14日にフフホトから20キロ南にある和林格弥の自然草地の植生を調査し、同時に放牧家畜の管理状況も調査して、草原の砂漠化におよぼす要因の解析を行った。また、Stipa(ハネガヤ)属などのイネ科植物15種について葉身のサンプルを採取し、葉身の乾物重、引張り強度、せん断強度、曲げ強度を測定して、家畜の採食と植物の生体力学的特性との関連性について検討した。生体力学的特性の測定のために、使用する機材を日本から持参した。このような内モンゴルの乾燥草原に生育しているイネ科植物の葉身について生体力学的特性を調査した研究例はこれまで発表されておらず、今回の調査で初めて明らかになった研究成果である。

研究分担者の平田は、平成20年6月29日7月4日、中国内モンゴル自治区の科弥泌区に滞在して、草原の植生の状況、牧畜民の移動パターン、定住化の状況、および、畜産物利用、特に乳製品の加工と利用について調査した。また、本江と研究分担者の稲村は、平成20年8月1117日に、中国四川省のチベット高原に滞在し、乾燥地帯における自然草地の植生を調査した。同時に、放牧家畜の管理状況も調査して、草原の砂漠化におよぼす放牧強度の影響について解析を行った。
乳癌細胞をターゲットとした複数の機能性ペプチドから成る遺伝子ベクターの開発

複数の機能性ペプチドから構成される融合ペプチドを合成し、遺伝子キャリアとして用いることで、特定の細胞に遺伝子導入することに成功した。ガン細胞に特異的な相互作用を示すTumorHoming Peptideを用いることで、ガン細胞特異的に遺伝子を導入することに成功した。さらに、遺伝子と融合ペプチドが形成する複合体の表面に存在するTumor Homing Peptideの比率を向上させることで、遺伝子導入効率を向上させることにも成功した。ガン細胞に特異的に相互作用することが知られている二種類のTHPを用いて、ガン細胞への特異的な遺伝子導入効率を調べた。具体的には、シルクーpoly(L-lysine)ーTHPトリブロック構造を有する融合ペプチドを合成し、プラスミドDNAと混ぜ合わせることで直径約143nm、表面電荷+13.8 mV程度のコンプレックスを得ることができた。このコンプレックスはほぼ細胞毒性を示さず、また遺伝子導入効率は低いものの、特異的に癌細胞にのみ遺伝子導入することにin-vitroおよびin-vivoの系で成功した。ガン細胞特異的な遺伝子導入効率の更なる向上を目指して、融合ペプチドとプラスミドDNAの複合体表面におけるTHPの存在比率を上げることを試みた。シルク部分の分子量を6分の1に、ポリリジンの部分を3分の1に低下させ、相対的にTHPの比率を高めた。その結果、In-vitroにおける遺伝子導入効を更に向上させることに成功した。この複合体が細胞に取り込まれる過程を走査型電子顕微鏡で観察した結果、ガン細胞へは複合体が吸着し、比較的短時間で取り込まれるのに対し、健常細胞へは吸着せず、取り込まれる複合体の数が圧倒的に少ないことが明らかとなった。以上の結果から、ポリリジン配列によりプラスミドDNAとイオンコンプレックスを形成し、THPの存在比および融合ペプチドの配列を工夫することにより劇的に遺伝子導入効率を向上させられること、および癌細胞への特異的な導入が可能であることが明らかとなった。ポリカチオンーシルクーTumor-homing peptide(THP)トリブロック共重合体を設計した。シルク配列は分子量がポリイオンコンプレックスの粒径に与える影響を評価するために、分子量が異なるNephila clavipesクモ由来のMaSp1の1量体および6量体を用いた。テトラブロック共重合体をコードしたプラスミドベクターをクローニングし、大腸菌BL21に形質転換した。この大腸菌の培養により、目的のペプチドポリマーを発現させ、Urea水溶液によりペプチドポリマーを抽出した後にNi-NTAカラムにより精製した。さらに、透析によりUrea水溶液を超純水に置換することで、テトラブロック共重合体の水溶液を得た。得られたトリブロック共重合体とレポータータンパク質であるルシフェラーゼをコードしているpDNAを異なる比率で混ぜ合わせ、多様なポリイオンコンプレックスを調製した。得られたポリイオンコンプレックス試料を、ゼータ電位測定装置によりゼータ電位、粒径、および粒径分布、原子間力顕微鏡により形態、アガロース電気泳動により耐酵素分解性、および細胞生存率に基づく細胞毒性を明らかにした。これらの結果を基に、粒径分布が単一かつウィルスと同程度の80nm程度の粒径を有する試料に関して、in-vitro遺伝子導入実験をMDA-MB-231乳癌細胞および対照実験としてMCF-10A乳腺上皮細胞に対して行った。その結果、シルクモノマーを用いた遺伝子導入効率は、6量体を用いた場合と比べ高い値を示した。この結果から、コンプレックス表面に存在するTHPが多ければ多い程、遺伝子導入効率が向上することが明らかとなった。CPPやアミノ酸配列を再検討すること無く、これまで以上の遺伝子導入効率を示すことに成功したため。ペプチドと遺伝子がどのように複合体を形成しているか調べると共に、構造と機能の相関を明らかにする。引き続き、アミノ酸配列の検討は行い、更に高い遺伝子導入効率を示す組み合わせを探索する。癌細胞だけでなく、ガンに影響していると言われるミトコンドリアをターゲットとした遺伝子デリバリーも開始する予定。ペプチドポリマーの合成および精製に必要な経費、および動物細胞の培養に掛かる費用は材料の合成およびin-vitroの評価を行うために引き続き必要である。ミトコンドリアをターゲットとしたデリバリーシステム構築のため、新たな分子設計を行うための経費も必要である。
筋ジストロフィーの中枢神経障害:ジストロフィン複合体と相互作用する分子の解明

Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)は、しばしば知的障害を見るが病理学的には特異的な異常はなく、その分子機構は明らかではない。ジストロフィン結合タンパク質の一つα1-syntrophinは中枢神経系に豊富に発現し、ジストロフィン欠損に伴い発現が低下するが、PDZドメインを介し膜の機能分子と相互作用をする可能性がある。本研究では第一にYeast Two-Hybrid Systemを用いα1-syntrophinと相互作用する機能分子の検索を行った。その過程で、baitとして用いた同分子のPDZドメインは、リポーターであるGAL4遺伝子に対し自己活性能を持つため、これを用いた検索が困難であることが明らかになった。そこで、中枢神経系でα1-syntrophinと複合体を作る水チャネルAquaporin-4のC端をbaitとし、1 x 10^6クローンに対し相互作用タンパク質を検索をした。得られた陽性コロニーを解析したところ、同分子はα-CateninやVinculinと高い相同性を持つα-Catulinに対し強い相互作用を示した。そこでα-Catulinに特異的な抗体を作製しその局在を調べたところ、同分子はユビキタスな発現パターンを示し、骨格筋においてはα1-syntrophinなどと共に形質膜に発現することが明らかになった。そこで、中枢神経系でα1-syntrophinと複合体を作る水チャネルAquaporin-4のC端をbaitとし、1x10^6クローンに対し相互作用タンパク質を検索をした。第二にα1-syntrophinと相互作用するタンパク質の網羅的検索を行うため、脳の膜成分のプロテオーム解析を行う第一歩として、骨格筋膜画分を用いたプロテオーム解析に着手した。この際、正常マウス、及びα1-syntrophin欠損マウスより得られた骨格筋を超遠心及び界面活性剤を用いて分画し、膜画分を抽出した。今後Differential 2D-PAGEにより発現量に差のあるスポットを検索しPeptide Mass Fingerprinting法などにより同定を行う予定である。
プロテアソームを基軸としたタンパク質分解系の包括的研究

我々は過去四半世紀以上に亘り、プロテアソームと名付けた巨大で複雑なタンパク質分解装置の構造と機能から生理・病態に至る研究を多面的に推進してきた。本研究期間においては、プロテアソームによる動態・作動機構(核移行機序・ユビキチンレセプターの同定など)の解明、形成機構の解明(多数の分子集合シャペロンを発見)、胸腺プロテアソームによるCD8+T細胞のレパトア形成機構(正の選択仮説)等の研究を包括的に進めた。と同時にユビキチン研究(PINK1/Parkin系によるミトコンドリアの品質管理機構)やオートファジー研究(選択的基質p62によるNrf2依存性ストレス制御機構)においても先駆的な成果を挙げてきた。26Sプロテアソームは不要になった細胞内のタンパク質を選択的に分解するための大規模な細胞内装置である。本酵素は触媒機能を司る20S CP(Core Particle:別名20Sプロテアソーム)の両端に調節ユニットである19S RP(Regulatory Particle)が会合した分子量250万の巨大で複雑な多成分複合体である。CPはα-Ringとβ-Ring(各々7種のα/βサブユニットから構成)がαββαの順で会合した円筒型粒子であり、RPは6個のATPase(Rpt1-6)と約15個のnon-ATPase(Rpn1-15)サブユニットがLid(蓋部)とBase(基底部)を構成している。本年、以下の3項目で顕著な成果を挙げた。(1)われわれはこれまでにシャペロン(PAC1-4)依存性20Sプロテアソームの分子集合機構を明らかしてきたが、19S RP粒子、とくにATPase-Ringを含むBase複合体の分子集合に必須である新たに4つのシャペロン分子を発見、それらが構造的・機能的に酵母から哺乳類まで進化的に高く保存されていることを明らかにした。(2)一昨年に世界で最初にマウスで発見した(胸腺におけるCD8+Tリンパ球の正の選択を介したレパトア形成に関与する可能性が示唆された)胸腺プロテアソームがヒトの胸腺皮質の上皮細胞にも存在することを証明した。(3)他方、細胞内のユビキチンプールを監視・維持する新しい機構(ユビキチンが24分子が直鎖状に繋がったフリーのユビキチン鎖が、脱ユビキチン化酵素とその阻害タンパク質によって環境ストレス応答依存的に可逆的に制御されているメカニズム)を発見、国内外のユビキチン代謝研究に大きな影響を与えた。本酵素は触媒機能を司る20S CP(Core Particle :別名20Sプロテアソーム)の両端に調節ユニットである19S RP(Regulatory Particle)が会合した分子量250万の巨大で複雑な多成分複合体である。本年、以下の4項目で顕著な成果を挙げた。(1)プロテアソームの遺伝学的研究においては、プロテアソーム分子集合因子(PAC1 : α-Ring形成因子)の条件的KOマウスを作出、このシャペロン依存性の20Sプロテアソーム形成がマウスの個体発生、脳の増殖・分化、肝臓の恒常性維持に必須であることを明らかにした。(2)われわれが作出した胸腺プロテアソーム欠損マウスと単一のMHCクラスI分子を持った遺伝子改変マウスとの交配実験から胸腺プロテアソームが胸腺におけるCD8^+Tリンパ球の正の選択を介したレパトア形成に関与していることを証明した。(3)オートファジー選択的基質であるp62がKeap1(酸化ストレス応答ユビキチンリガーゼ)に直接会合して(抗酸化/解毒応答)マスター転写因子Nrf2を解離・(核移行)活性化する新しいオートファジー障害依存性のストレス応答機構を発見した。(4)家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるPINK1とParkinが介在したミトコンドリアの新しい品質管理(選択的オートファジーによる損傷ミトコンドリアのクリアランス/浄化)機構の発見とパーキンソン病の発症機構の解明に成功した。本酵素は触媒機能を司るCP(Core Particle)の両端に調節ユニットであるRP(Regulatory Particle)が会合した分子量250万の巨大で複雑な多成分複合体である。

CPはa-RingとR-Ring(各々7種のα/βサブユニットから構成)がαββαの順で会合した円筒型粒子であり、RPは6個のATPase(Rpt1-6)と13個のnon-ATPase(Rpn1-15:4,14欠)から構成されている。本年、プロテアソームの研究を中心に以下の5項目で顕著な成果を挙げた。(1)26Sプロテアソームの形成機構についてこれまで10余種の分子集合シャペロンを発見してきたが、構造生物学的解析を進めると共に脱ユビキチン酵素Ubp6が関与していることを明らかにした。また26Sプロテアソームの内在性サブユニットRpn10とRpn13(ユビキチン受容体)の位置情報を極低温電子顕微鏡解析から突き止めた。(2)最近発見した胸腺プロテアソームの胸腺特異的発現に関与する転写因子の同定に成功した。(3)以前に発見していた免疫プロテアソームのキモトリプシン型活性をコードするβ5i遺伝子(PSMB8)のミスセンス変異が、中条-西村症候群(凍瘡様皮疹と限局性脂肪萎縮を伴う遺伝性周期熱症候群)を引き起こすことを突き止めた。(4)オートファジーを肝臓で長期間欠損させると、選択的基質p62が蓄積、Keapl(酸化ストレス応答ユビキチンリガーゼ)に直接会合・安定化して(抗酸化/解毒応答)マスター転写因子Nrf2を持続的に活性化することにより、肝細胞ガンが発症することを発見した。(5)家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるPINK1とParkinがミトコンドリアの品質管理(不良品処理機構)を行うメカニズムを解析する過程で,新しい仕組みの糸口を掴んだ。プロテアソームを基軸としたタンパク質分解系の包括的研究1,プロテアソームの動態研究我々は26Sプロテアソームを構成するCP(触媒粒子)とRP(調節粒子)の形成に必須の特異的な分子集合シャペロンを8種発見、それら殆ど全ての立体構造解明に成功し、プロテアソームの形成機構を分子レベルで解明した。蛍光相関分光法(FCS/FCCS :蛍光のゆらぎを高感度に測定し、溶液中や細胞内の絶対濃度や大きさ、形状などを決定する方法)により、細胞質と核のプロテアソームの濃度が各々200nM、1mMであることを測定することに成功した。またプロテアソームが細胞質で形成された後、核に輸送されることを見出した。2,ユビキチンの研究我々は膜電位の低下した不良ミトコンドリアが常染色体劣性若年性パーキンソン病原因遺伝子PINK1(タンパク質リン酸化酵素)とParkin(ユビキチン連結酵素)によって識別された後、プロテアソームやオートファジーによって浄化されることを見出した。このとき、PINK1が自己リン酸化によって活性型に転換されること、そしてParkinがPINK1依存性のParkinとユビキチンのリン酸化とによって活性化される新機構を発見した。また、TR-TUBEを考案して細胞内に存在するポリユビキチン鎖の長さを決定する方法、さらにUb-catcherを作製して細胞内に存在するポリユビキチン鎖化基質を同定する方法を開発した。3,オートファジーの研究我々はすでに肝臓特異的オートファジー欠損マウスを長期間飼育すると肝炎・肝硬変を経て、最終的に100%の確率で肝細胞ガンが発生することを報告したが、このときオートファジー選択的基質p62がと蓄積し、p62が直接に酸化ストレスマスター転写因子Nrf2を活性化すること、そしてp62がmTORCによってリン酸化されることによってNrf2に親和性を著しく増強させることを発見した。
苦痛を訴えられない慢性創傷を有する高齢患者の客観的創部痛アセスメント指標の開発

自ら訴えることのできない患者の創部痛を客観的にアセスメントできる指標の作成を目的に実施した。本研究では静脈性潰瘍を有する成人患者を対象とし、非侵襲的にモニタリング可能な皮膚温・創滲出液中の疼痛関連マーカーと主観的な疼痛との関連を検討した。滲出液の採取は創部へのガーゼ貼付により、安全・安楽に実施することが可能であった。皮膚温では周囲皮膚より創内の温度が高い群は強い痛みを訴えていた。滲出液中のNGFは主観的評価の持続的・間欠的・神経障害性痛と負の相関を示し、S100A8/A9は現在の痛みの強さと正の相関を示した。これらのバイオマーカーが客観的な創部痛評価指標の一助となる可能性が示唆された。【目的】本研究は患者の苦痛を増強し、ウェルビーイングに影響を及ぼす創部痛に着目し、特に寝たきり高齢者や認知症患者等、自ら痛みを訴えられない患者の創部痛を客観的にアセスメントできる指標を探索、確立することを目的としている。本年度は痛みが特に強いとされる静脈性潰瘍を有する患者の創部痛を非侵襲的・非拘束にモニタリング可能な生体指標とその測定方法を検討した。【方法】本研究は縦断研究であり、静脈性潰瘍と診断され、疼痛を訴えることのできる成人患者15名を対象とする。調査機関は神奈川県内の一般病院及び都内のクリニックであり、平成26年3月から調査を開始した。東京大学医学部倫理委員会の承認を得ている。調査項目は、基本属性・治療内容・足関節上腕血圧比・血液データ・創部アセスメント指標・サーモグラフィ・滲出液pH・滲出液マーカー・主観的疼痛評価(Numerical Rating Scale・Short-Form McGill PainQuestionnaire)・精神的健康評価(General Health Questionnaire)とした。【現在の実施状況】1滲出液中の疼痛関連マーカーを抽出:文献等より検討した結果、静脈性潰瘍の滲出液中から採取可能なマーカーとしてIL-1β・NGF・コルチゾールが挙げられた。2滲出液採取条件の検討:滲出液は患者に負担をかけないよう、非固着性のドレッシング材とガーゼを1分間創部に貼付することでELISAで測定可能な滲出液量を採取できることが明らかとなったため、本方法を採用することとした。3調査の開始:平成26年3月より対象者のリクルートを開始し、現在調査を始めたところである。【意義と重要性】滲出液中の疼痛関連マーカーが測定でき、痛みと相関することが明らかとなれば、痛みを訴えられない患者においても非侵襲的、客観的に疼痛を把握し、ケアに繋げることが可能となる。2年目のなる本年度は、痛みを訴えることのできる患者を対象とし、主観的な痛みの訴えと客観的指標としての静脈性下肢潰瘍の滲出液中の2つの疼痛バイオマーカー候補(nerve growth factor ;NGF、S100A8/A9)の濃度の関連を検討した。【方法】横断的研究であり、調査は2014年4月から10月に2医療施設で実施した。対象は静脈性下肢潰瘍を有し、同意が得られ、創部から滲出液が採取可能な患者とした。通常の創傷ケアを実施する際に、患者に数値評価スケールを用いて創部痛を評価してもらった。創部の滲出液サンプルは創洗浄後に採取した。滲出液中のNGFとS100A8/A9はELISAを用いて測定し、測定値は創面積で標準化された。疼痛の状態と標準化された2つのバイオマーカー値の関係はスピアマンの相関係数を用いて評価した。本研究は所属大学の倫理審査委員会の承認を得て実施した。【結果】13名の患者から30サンプルを採取した。標準化NGF値は持続的な痛み、間欠的な痛み)、神経障害性痛と負の相関を示した。一方標準化S100A8/A9値は現在の痛みの強さ、持続的な痛みと正の相関を示した。【結論】静脈性下肢潰瘍の滲出液から採取されたNGFとS100A8/A9は、創部痛と関連した。これらの2つのバイオマーカーが静脈性下肢潰瘍を有し、疼痛を訴えることができない患者の客観的な創部痛評価指標として役立つ可能性が示唆された。本研究は患者の苦痛を増強し、ウェルビーイングに影響を及ぼす創部痛に着目し、特に寝たきり高齢者や認知症患者等、自ら痛みを訴えられない患者の創部痛を客観的にアセスメントできる指標を探索、確立することを最終目標としている。目標達成のために1静脈性潰瘍および乳癌癌性創傷の痛みの実態の把握、2痛みが特に強いとされる静脈性潰瘍を有する患者の創部痛を非侵襲的・非拘束にモニタリング可能な痛みの発生原因を反映する生体指標の探索とその測定方法の検討、3創部痛によって生じる生体反応を反映する浸出液内マーカーの検討を目的に研究を実施した。いずれも所属施設の倫理委員会の承認を得た。

1では、静脈性潰瘍もしくは乳癌癌性創傷と診断され疼痛を訴えることのできる成人患者37名(静脈性潰瘍15名・乳癌癌性創傷22名)を対象とし、短縮版McGill疼痛質問紙を用いて創部痛の実態を横断的に調査した。いずれも痛みを訴える患者は80%以上を占めており、静脈性潰瘍・乳癌癌性創傷ともに"触ると痛い""ずきんずきんとした""疼くような"痛みを訴える患者が多かった。2では、滲出液に着目し、静脈性潰瘍を保有する13名の患者の創部から30サンプルの滲出液を採取した。短縮版McGill疼痛質問紙による疼痛評価と滲出液中の痛みマーカーであるNGFとS100A8/A9の関連を分析した。その結果、標準化NGF値は持続的な痛みや間欠的な痛み、神経障害性痛と負の相関を示した。一方標準化S100A8/A9値は現在の痛みの強さ、持続的な痛みの強さと正の相関を示した。これにより滲出液から創部痛マーカーを検出できることが示唆された。3では、ラットの背部に全層欠損創を作成し、痛み刺激を与えることで創部痛によるストレス反応を反映する、滲出液中の創部痛マーカーを検出するための実験系の確立を行った。自ら訴えることのできない患者の創部痛を客観的にアセスメントできる指標の作成を目的に実施した。本研究では静脈性潰瘍を有する成人患者を対象とし、非侵襲的にモニタリング可能な皮膚温・創滲出液中の疼痛関連マーカーと主観的な疼痛との関連を検討した。滲出液の採取は創部へのガーゼ貼付により、安全・安楽に実施することが可能であった。皮膚温では周囲皮膚より創内の温度が高い群は強い痛みを訴えていた。滲出液中のNGFは主観的評価の持続的・間欠的・神経障害性痛と負の相関を示し、S100A8/A9は現在の痛みの強さと正の相関を示した。これらのバイオマーカーが客観的な創部痛評価指標の一助となる可能性が示唆された。本年度計画していた「訴えることのできる患者」の創部の滲出液から、創部痛関連マーカー候補を絞り込む、という目標は達成できたと考える。老年看護学、創傷看護学これまでに静脈性下肢潰瘍における滲出液中から、創部痛と関連するバイオマーカーの候補を絞り込むことができた。今後はこれらのバイオマーカーの他の創傷への応用可能性について、動物実験を組み込みながら検証していく予定である。対象となる静脈性潰瘍を有する患者における、特異的な疼痛関連の生体指標の探索と、痛みを伴う静脈性潰瘍から滲出液を採取し、測定するための方法の検討に時間を要した。特に、滲出液中に含まれる創部痛関連マーカー候補について網羅的に文献から探索し絞り込む過程、ならびに滲出液を患者にとって安全・安楽に、必要量を採取可能な方法を確立する基礎的検討に十分な時間をかけたため、当初よりやや達成度は遅れている。但し、測定方法が確定したため、すでにデータ収集に入ることができている。候補とした疼痛関連バイオマーカーの数を今年度はある程度限定したため。当初の予定では、「疼痛を訴えることが可能な下肢潰瘍を有する患者の創部痛や創の状態、全身状態を質的記述的に分析し、客観的に創部痛を評価可能な指標を導き出す」こととしてた。しかし創や全身状態の記述だけではなく、痛みの原因となる創傷自体から発生する「滲出液」に着目し、そこに含まれる疼痛関連マーカーを探索することにより、より創部痛を直接的に反映した客観的な疼痛アセスメント指標が確立できると考える。