hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マトリックス細胞蛋白に着目したくも膜下出血後早期脳損傷の病態解明

ラット及びマウスの血管内穿通モデルを作成し、くも膜下出血後早期脳損傷の病態におけるマトリセルラー蛋白テネイシンCの役割について調べた。まずくも膜下出血後の脳においてテネイシンCの発現に伴い神経細胞のアポトーシスが誘導されていることを示した。続いてイマチニブがテネイシンCの発現を抑制することによりアポトーシスを軽減していることを確認するため精製テネイシンCの髄腔内投与を行い、アポトーシスが誘導されることを示した。最後に各種阻害薬を用いて、テネイシンCの発現抑制がMAPキナーゼを介したMMP-9の誘導を抑制することによって、早期脳損傷を軽減させることを示した。オスのSDラット(270-320g)の左内頚動脈先端部をナイロン糸にて血管内より穿通させることによりくも膜下出血(SAH)モデルを作成し、30分後にvehicle(リン酸緩衝生理食塩水)または血小板由来増殖因子(PDGF)受容体阻害薬イマチニブ(高容量、低容量の2 dose)を腹腔内投与した。Sham群では同様の手技を行うが、内頚動脈に挿入したナイロン糸を穿通させずに回収した。SAH後24時間及び72時間の時点で盲検的に神経学的所見、Western blot法による各種蛋白(MAPキナーゼ[ERK1/2、JNK及びp38]、PDGF受容体[α、β及びリン酸化受容体]、テネイシンC、cleaved caspase-3)の発現変化、免疫組織学的評価、TUNEL染色を施行した。その結果、SAH後の大脳では広範にPDGF受容体が活性化され、neuropilにテネイシンCが発現することや、カスパーゼ依存性の神経細胞アポトーシスが生じることが明らかになった。イマチニブによるPDGF受容体の活性化抑制は大脳におけるテネイシンCの発現を抑制し、神経細胞、血管内皮細胞、グリア細胞におけるMAPキナーゼの活性化を抑制し、結果的に神経細胞のアポトーシスを抑制した。また、神経細胞アポトーシスの発生抑制により、くも膜下出血後の神経学的所見は有意に改善した。これらの成果は、マトリセルラー蛋白テネイシンCがSAH後の早期脳損傷において重要な役割を果たすという我々の仮説を支持するものである。くも膜下出血の急性期のモデルとして確立しているラットの血管内穿通モデルを作成し、近年、予後不良の原因として注目されている早期脳損傷の病態におけるマトリセルラー蛋白テネイシンCの役割を明らかにするために以下の研究を実施した。各治療群はランダムにグループ分けをおこない、くも膜下出血の重症度、神経学的所見、蛋白の発現変化(Western blot法)及び免疫組織学的所見などの評価は全て盲検的に実施した。1年目に既にくも膜下出血後の脳において神経細胞のアポトーシスが誘導され、それに伴い、テネイシンCの発現が増加していることを明らかにした。更に、テネイシンCの誘導因子である血小板由来増殖因子の受容体を阻害するイマチニブが早期脳損傷を抑制することを明らかにした。2年目は1年目の研究計画の残りを完遂し、更に、イマチニブの早期脳損傷抑制効果が真にテネイシンCの抑制によるものかを確認するために、テネイシンC蛋白を精製し、イマチニブにより早期脳損傷が抑制された状態のくも膜下出血ラットの髄腔内に投与した。その結果、イマチニブによる早期脳損傷の抑制効果は阻害された。これらの結果は、くも膜下出血後の早期脳損傷、特に神経細胞のアポトーシス発生にテネイシンCが重要な役割を果たすという我々の仮説を支持するものである。更に、免疫組織学的検討により、MAPキナーゼが細胞種類別に異なる発現をしていることが明らかになった。最終年度は、テネイシンCによるくも膜下出血後早期脳損傷におけるMAPキナーゼの関わりに関し、更に研究を進める予定である。くも膜下出血の急性期モデルとして確立しているラット及びマウスの血管内穿通モデルを作成し、近年予後不良の原因として注目されている早期脳損傷の病態におけるマトリセルラー蛋白テネイシンCの役割を明らかにするため以下の研究を実施した。各治療群はランダムにグループ分けを行い、くも膜下出血の重症度、神経学的所見、蛋白の発現変化(Western blot法)及び免疫組織学的所見などの評価は盲検的に実施した。1年目に既にくも膜下出血後の脳において神経細胞のアポトーシスが誘導され、それに伴いテネイシンCの発現が増加していることを明らかにした。2年目は1年目の研究計画の残りを完遂し、さらにイマチニブの早期脳損傷抑制効果が真にテネイシンCの抑制によるものかを確認するために、テネイシンC蛋白を精製し、イマチニブにより早期脳損傷が抑制された状態のくも膜下出血ラットの髄腔内に投与した。これらの結果はくも膜下出血後の早期脳損傷、特に神経細胞のアポトーシス発生にテネイシンCが重要な役割を果たすという我々の仮説を支持するものである。さらに、免疫組織学的検討により、MAPキナーゼが細胞種類別に異なる発現をしていることが明らかとなった。最終年度は各種阻害薬を用いて検討を行い、テネイシンCの発現抑制によりMAPキナーゼを介したMMP-9の誘導が抑制され、早期脳損傷が軽減することが分かった。以上からテネイシンCはくも膜下出血後早期脳損傷の発現において極めて重要な役割を果たしていることが示され、今後新薬開発の新たなターゲットとなりうると考えられた。

ラット及びマウスの血管内穿通モデルを作成し、くも膜下出血後早期脳損傷の病態におけるマトリセルラー蛋白テネイシンCの役割について調べた。まずくも膜下出血後の脳においてテネイシンCの発現に伴い神経細胞のアポトーシスが誘導されていることを示した。続いてイマチニブがテネイシンCの発現を抑制することによりアポトーシスを軽減していることを確認するため精製テネイシンCの髄腔内投与を行い、アポトーシスが誘導されることを示した。最後に各種阻害薬を用いて、テネイシンCの発現抑制がMAPキナーゼを介したMMP-9の誘導を抑制することによって、早期脳損傷を軽減させることを示した。当初計画通りに研究は順調に実施できており、仮説を支持する有望な研究結果を得ている。脳血管障害引き続き、計画通りに研究を実施する。最終年度はテネイシンCがどのような機序でくも膜下出血後の神経細胞アポトーシスを誘導するのかに関し、各種拮抗薬などを使用して検索する予定である。当初計画通りに研究は順調に実施できており、仮説を支持する有望な研究成果を得ている。引き続き、計画通りに研究を実施する。本年度に得られた研究成果がテネイシンCの発現抑制によるものか、その他の機序によるものか、明白にするために、イマチニブによる脳保護効果を合成テネイシンC投与により拮抗できるか検討する。また、テネイシンCの機能的作用発現機構等を各種受容体拮抗薬などを使用し探索する予定である。
20Gb/inch^2を実現する磁気ヘッド位置決めサーボ機構に関する研究

本研究では磁気ディスク装置の磁気ヘッド追従位置決め制御の精密化を目的として2年間研究を進めてきた.本年度は,まず,位置決め制御の精密化のためのキーテクノロジーはヘッド位置決め機構の固有振動数の向上であることから,ヘッド位置決め機構の高共振化に焦点を絞り,位置決め機構単体の最低次逆相固有振動数を既存装置の約5kHzから約13kHzに向上させることを目標として位置決め機構の最適設計を行った.設計に当たっては2.5inchディスク1枚片面記録を仮定した.現存の装置では1枚片面記録の装置は存在しないが,記録密度が向上すると1枚片面記録でも十分な容量を得ることができることから,今後,情報家電などに用いられるローコスト機種には採用される可能性がある.本研究では,研究代表者らがこれまでに提案してきた位置決め機構の同相設計の概念を用いて駆動用のコイル位置をアーム中央に移動した高剛性軽量位置決め機構を提案し,有限要素法解析によりその動特性を明らかにした結果,最低次固有振動数が従来の位置決め機構の2倍以上である12.4kHzに高められ,目標の13kHzをほぼ達成できることが明らかとなった.一方,提案する高共振位置決め機構の質量中心位置は位置決め機構の揺動中心軸から約4mm離れており,外部衝撃に対する耐衝撃性が悪化することが予想された.そこでさらに本研究では,装置を弾性回転支持する新たな支持方法を提案するとともに,簡略モデルを用いて支持位置および支持剛性の設計法を明らかにした.本研究では磁気ディスク装置のヘッド位置決め機構を対象に,20 Gb/inch^2を実現できる追従誤差の少ないヘッド位置決め機構-制御系を明らかにすることを目的に研究を行った.本研究で対象とする磁気ディスク装置のヘッド位置決め機構-制御系に対しては,エリアスを有するサンプル値系に対して高いサーボ帯域を有する追従制御器の設計法の確立が必要である.この問題に対して研究代表者は,(1)ZOH,計算遅れ,エリアスを考慮した連続時間領域の制御対象モデルの作成,(2)連続時間領域でのH∞混合感度問題の定式化とH∞最適制御器の設計,(3)位相適合法による離散時間制御器の再設計,という制御系設計スキームを提案している.本年度は,まず,従来形,同相設計形および高減衰形の3種類のヘッド位置決め機構に対して提案する制御系設計スキームを用いて,低次数,低サンプリング周波数の制御器を設計し,追従サーボ帯域の比較を行った.その結果,(1)提案する制御系設計スキームにより高サーボ帯域の制御器の設計が行えること,(2)サーボ帯域は,同相設計形<従来形<高減衰形の順に高くできること,を明らかにした.このとき,従来形および高減衰形のサーボ帯域の制限となるのは4.3kHzの主共振モードであったが,同相設計形のサーボ帯域の制限となるのは8kHz以上の固有振動数を有する高次振動モードであることを明らかにした.次に,主共振を非干渉化しながら高次振動モードの共振ピークを抑えることができる新たな位置決め機構を作成し,測定した周波数応答関数を用いたシミュレーション結果により,提案した位置決め機構を用いれば,従来形の位置決め機構に比べ約1.2倍にサーボ帯域を向上させることができることを示した.本研究では磁気ディスク装置の磁気ヘッド追従位置決め制御の精密化を目的として2年間研究を進めてきた.本年度は,まず,位置決め制御の精密化のためのキーテクノロジーはヘッド位置決め機構の固有振動数の向上であることから,ヘッド位置決め機構の高共振化に焦点を絞り,位置決め機構単体の最低次逆相固有振動数を既存装置の約5kHzから約13kHzに向上させることを目標として位置決め機構の最適設計を行った.設計に当たっては2.5inchディスク1枚片面記録を仮定した.現存の装置では1枚片面記録の装置は存在しないが,記録密度が向上すると1枚片面記録でも十分な容量を得ることができることから,今後,情報家電などに用いられるローコスト機種には採用される可能性がある.本研究では,研究代表者らがこれまでに提案してきた位置決め機構の同相設計の概念を用いて駆動用のコイル位置をアーム中央に移動した高剛性軽量位置決め機構を提案し,有限要素法解析によりその動特性を明らかにした結果,最低次固有振動数が従来の位置決め機構の2倍以上である12.4kHzに高められ,目標の13kHzをほぼ達成できることが明らかとなった.一方,提案する高共振位置決め機構の質量中心位置は位置決め機構の揺動中心軸から約4mm離れており,外部衝撃に対する耐衝撃性が悪化することが予想された.そこでさらに本研究では,装置を弾性回転支持する新たな支持方法を提案するとともに,簡略モデルを用いて支持位置および支持剛性の設計法を明らかにした.
テトロノマイシン類の効率的合成法の開発研究

α-アルシル-β-テトロン酸を金属イオン捕捉基とするポリエーテル・イオノフォア抗生物質としてテトロノマイシンとテトロナシンの2種が知られている。本研究は,共通する10個の不斉中心が鏡像関係にある両天然物の効率的全合成を達成するとともに,同等以上の活性をもつ構造単純化モデルの創製をめざすもので,これまでに天然テトロノマイシンおよびテトロナシンの初の(現時点で唯一の)全合成に成功した。1,ポリエーテルAB環部の合成:テトラヒドロフラン単位を共通の出発原料L-ラムノースより,テトラヒドロピラン単位を市販の(R)または(S)の3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸メチルより調製,両部分の連結によって両天然物のポリエーテル部を合成した。2.シクロヘキサンC環部の合成:4連続不斉中心をもつ脂環部のエナンチオマーを2種のルートで調製した。1つは1-シロキシメチル-3-メトキシ-5-メチルシクロヘキサジエンと(2-アセトキシ)アクリロニトリルの環化付加体より誘導した双環ケトン中間体を光学分割,そのオキシムをベックマン開裂にかけるものである。第2のルートは,ビス共役エステルの環元的閉環を鍵工程とするもので,この新規反応の展開についても検討中である。3.全合成:AB環エステルとC環アルデヒドとのアルドール反応によってABC環を構築した。ついで、テトロノマイシンの場合はABC環アルデヒドとγ-メチレン・テトロン酸メチルとのアルドール縮合を,テトロナシンではABC環アルデヒドとジアゾアセトキシ酢酸メチルの反応で得たβケトエステル中間体の閉環を実施,それぞれ天然物へ誘導した。なお,この全合成により天然物の絶対構造を確認するとともに,融点の大幅な訂正をおこなった。本研究はテトロン酸系イオノフォア抗生物質であるテトロノマイシンとテトロナシンの効率的全合成を第一の目標とし,併せて修飾モデルの簡易合成を行うものである.その中心課題は,1)テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピランから成るポリエ-テル部光学活性体の合成,2)三置換シクロヘキサン部エナンチオマ-の合成,3)これらフラグメントの縮合による骨格合成を多角的に検討することにある.1.テトロノマイシン(1)とテトロナシン(2)に共通するエナンチオメリックなテトラヒドロピラン部を,(R)ー及び(S)ー3ーヒドロキシイソ酪酸メチルより合成した.一方,テトラヒドロフラン部は,Lーラムノ-スを共通の出発原料に用い,その4,5位立体配置の保持または反転を含むル-トで合成した.両フラグメントの縮合にはジュリア・カップリング法又はラクト-ル・エ-テルのアリル化法により実施し,全合成に必要なポリエ-テル部を合成した.2.1及び2のエナンチオメリックなシクロヘキサン部の改良合成法を開発した.すなわち,(R)ー又は(S)ー3ーヒドロキシイソ酪酸メチルを出発原料として得た2,7ーノナジエノア-ト中間体の新規還元的閉環反応を開発,三置換シクロヘキサン部両エナンチオマ-を効率的に合成することができた.3.ポリエ-テル部エステルとシクロヘキサン部アルデヒドをアルド-ル縮合させて線状の三環骨格を構築,ついでメチレン・テトロン酸とのアシル化反応を経てテトロノマイシンの初の全合成を達成した.本研究は,α-アシル-β-テトロン酸系ポリエーテル・イオノフォア抗生物質テトロノマイシンとテトロナシンの効率的全合成を達成するとともに,同等以上の活性をもつ構造単純化モデルの創製をめざすもので,平成4年に天然テトロノマイシンの初の(現時点で唯一の)全合成を報告している.

本年度は類似構造をもち共通する10個の不斉中心が鏡像関係にあるテトロナシンの全合成を達成することができ,両天然物の実用的合成の開発に多くの指針をうることができた.1.シクロヘキサンC環部の合成:本セグメントはテトロノマイシンのそれとエナンチオメリックであることから,(S)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸メチルより調製した2,4-ジメチル-2,7-ノナジエン酸エステルの還元的閉環反応(L-セレクトライド)によって骨格と立体化学を確保,官能基変換によって目的物を得た.2.テトラヒドロフランA環部の合成:L-ラムノースより誘導した4,5-ジヒドロキシ-2-メチルヘキサナールの不斉クロチル化と閉環により,5個の不斉中心をもつA環部スルホンを合成した.3.テトラヒドロピランB環部の合成:C環部の場合と同一の出発原料を用いて1,3-ジヒドロキシ-4-メチル-7-ヘキセンを得,そのピラン閉環によって正しい立体配置を確保,B環部アルデヒドを合成した4.トリエーテルAB環部の合成:両ヘテロ環部のジュリア・カップリングで行なった.5.テトロナシンの全合成:トリエーテル部エステルとC環部アルデヒドの縮合によりABC環を合成,最後に本研究者が開発した新規テトロン酸骨格合成法に従い,テトロナシンの初の全合成を達成した.
出産前にダウン症候群確定診断を受けた後「妊娠継続」の選択をもたらす要因の検討

出生前診断は方法が簡便化し精度が増している。2011年に開発された無侵襲的出生前遺伝学的検査(NIPT)は、採血だけの検査で精度も高く、日本でも臨床研究を実施、今後一般化される見通しである。NIPT判定後、羊水検査でダウン症候群の確定診断を受けた胎児の9割以上が中絶されている。本研究では、確定診断後「妊娠継続」を選択し出産した親たち2030組を対象とする。「妊娠継続」の選択に至るまで、どんな葛藤があったのか、専門家/非専門家からの助言内容、対象者の人間観・障害観をインタビューで明らかにし、命の選別ではなく、命の多様性を認めあう社会の構築に向けて必要な要因を明らかにする。
シンビオジェネシスの基礎となるプロモーター獲得原理の解明

シンビオジェネシスの過程では、一般に、細胞内共生者から宿主核への遺伝子移動が生じる。本研究の目的は、この過程で生じるプロモーター獲得の一般的な原理を明らかにすることである。本年度の具体的な研究成果を以下に示す。(1)CT-MPSS法を用いて、シロイヌナズナの転写開始点(TSS)をゲノム上に約16万マップした。これは植物のTSSデータとしては世界最大規模であり、かつ、定量的な解析のできる唯一のデータセットである。(2)上記のTSSデータを解析したところ、シロイヌナズナのコアプロモーター領域では、ヒトやマウスのコアプロモーターにはみられない配列要素やコンテキストが使われていることが明らかになった。さらに、動物ゲノムでの転写開始領域に頻出するCpGアイランドがシロイヌナズナでは見出されず、動物のCpG配列に相当するニッチを植物ではピリミジンに富んだ配列が占めていることがわかった。(3)本研究によって蓄積されつつある植物の転写開始点とプロモーター配列の情報を一般に公開するため、Ppdbと名付けたデータベースを作成した。2007年6月末からの半年間で、世界49カ国から約100,000件のアクセスがあった。(4)ヒメツリガネゴケのTSS/プロモーターデータを解析してPpdbに収録する作業を、基生研の長谷部先生のグループと共同で進めた。また、東大の佐藤直樹先生と共同して、植物オルソログ遺伝子プロモーターの比較解析を進めている。(5)非常に微弱な転写活性しか見られなかったゲノムの領域に「プロモーターの無いマーカー遺伝子」が挿入されると、その領域からの転写物レベルが大きく増大する事例が見出された。この現象のメカニズムを実験的に検討したところ、「下流の構造遺伝子配列」が「コアプロモーター領域」の位置を決定するシス因子として作用している可能性が示唆された。本研究の目的は、この過程で生じるプロモーター獲得の包括的原理を明らかにすることである。本年度は、植物の核ゲノム中に転移・挿入された新規構造遺伝子がプロモーターを獲得するメカニズムを解明するため、次の3点の解析を行った。【A】植物ゲノム上のプロモーター配列に関する解析MPSS(Massively parallel signature sequencing)法を応用した転写開始点の新しい網羅的解析法を開発し、それを用いてシロイヌナズナのゲノム上に約5万の転写開始点をマップした。次に、それらの転写開始点に対して特徴的な位置分布をしめすプロモーター成分配列を網羅的に抽出し、カタログ化した。この成果を一般に公開するために、特定領域研究「基盤ゲノム」の支援を受けて、「植物プロモーターデータベース」を作成した。【B】植物ゲノム上での新規プロモーター出現機構に関する実験的解析昨年までの研究から、「構造遺伝子の挿入」が当該ゲノム領域での転写開始を活性化する可能性が示唆された。もしそうなら、実験に用いた「構造遺伝子配列」の中に、その活性化を誘導するシス機能が隠されていることになる。その機能を検出するため、種々のキメラプロモーターをシロイヌナズナに導入し、転写開始点の位置分布がどのように変化するのかを解析した。その結果、「構造遺伝子領域には上流近傍のコアプロモーター領域を選択的に活性化する機能」のあることが強く示唆された。【C】オルガネラから核に転痙したDNA断片の発現解析葉緑体ゲノムおよびミトコンドリアゲノムに由来する多くの配列断片がシロイヌナズナの核トランスクリプトーム中に出現していることを明らかにした。
全エクソンシークエンスによる自己免疫性肝疾患の原因となる新規遺伝子の同定

本研究では次の2点について明らかにした。1)本邦の自己免疫性肝疾患(自己免疫性肝炎と原発性胆汁性胆管炎)における疾患感受性・抵抗性遺伝子の候補としてHLA遺伝子、PTPN22遺伝子、PRKCB遺伝子が関連している。2)長期に経過観察している原発性胆汁性胆管炎患者から非侵襲的な肝線維化予測、予後予測因子として血清中のMac-2結合タンパク、細胞死、可溶性CD14、IL-8の値が有用であることを証明した。本研究は次世代シークエンサーを用いて、自己免疫性肝炎(AIH)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者の全エクソン領域のリシークエンシングを行い、真の疾患感受性遺伝子とその多型・変異を特定し、臨床応用へと展開することが目的である。今年度はAIH患者156例におけるHLA遺伝子6座(HLA-A、-B、-C、;-DR、-DQ、-DP)のタイピングを行い、HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01ハプロタイプがAIHの発症と強く関連がある事を報告した。(Umemura et al.PLOS ONE 2014)さらに、このハプロタイプ保有者では血清IgG値、抗平滑筋抗体陽性率が高いことも明らかとした。肝不全発症例、肝癌発症例ではそれぞれHLA-DRB1*08:03-DQB1*06:01ハプロタイプ、DRB1*15:01-DQB1*06:02ハプロタイプが高率になることを発見した。本研究では次世代シークエンサーを用いて自己免疫性肝炎(AIH)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者のHLA領域のリシークエンシング、さらにはエクソーム解析を行い、真の疾患感受性遺伝子とその多型・変異を特定し、臨床応用へと展開することは目的である。今年度は白人の自己免疫疾患の発症と有意に関連のあるPTPN22遺伝子多型についてAIH 166名、PBC 262名、健常者322名で解析検討を行った(Umemura et al. Scientific Reports revise中)。自己免疫疾患の発症と関連のある2つの遺伝子多型rs3996649とrs2476601は日本人750名の検討では1例も多型を有していなかった。次に7つの遺伝子多型を選択し、検討をするとAIHでは4つの遺伝子多型がPc = 0.046と有意な関連性を有することが判明した。これらはAIHの疾患抵抗性と関連を認めた。PBCでは有意な差を示す多型は認めなかった。さらに、推定ハプロタイプの検討では同じハプロタイプがAIH (P=0.0067)、PBC (P=0.0048)の疾患抵抗性に関して有意な関連性を示した。AIH 166名とPBC 262名についてはHLAの通常のタイピングは終了しており、現在健常人についてタイピング中である。AIHとPBCについて30例ずつランダムに抽出し、次世代シークエンサーで全HLA遺伝子のPCRを施行し、解析は終了して6桁から8桁のHLAのタイピングは終了している。現在得られた塩基配列について従来から報告のある配列との相違を検討中である。新しいアリルの発見もあり投稿準備中である。本研究は自己免疫性肝炎(AIH)、原発性胆汁性胆管炎(PBC)患者において真の疾患感受性遺伝子とその多型・変異を特定し、臨床応用へと展開することが目的である。PBCについては肝生検施行時でウルソデオキシコール酸投与前の136名の保存血清を用いて各種バイオマーカー、サイトカイン、ケモカインを計36種類を網羅的に測定し、予後(非代償期への移行、肝関連死)の予測が可能かどうか検討を行った。多変量解析から血清可溶性CD14(sCD14)とIL-8がそれぞれ独立した予後予測因子であることが明らかとなった。さらに、カプランマイヤー解析では高sCD14・高IL-8血症の患者群は予後不良であることを証明した。以前から報告のあった抗gp210抗体陽性者も予後不良であることを追加で証明した。(Umemura etal. LiverInternationalinpress)以上の結果から本邦におけるAIH、PBCにおける疾患感受性・抵抗性遺伝子、病態進行と関連のあるバイオマーカーを明らかにした。AIHとPBCについてそれぞれ約150例と300例の検体が収集されている。全症例について通常のHLAタイピングは終了し、論文報告を行った。また、ランダムに抽出した検体をAIHとPBCについて30症例ずつ次世代シークエンサーで全HLA遺伝子のPCRを施行することに成功した。現在これらのHLAの塩基配列について報告の配列との相違などについて検討している。新しいアリルの発見もあり、投稿準備中である。HLA領域のリシークエンシング解析は現在投稿準備中である。

全エクソン領域のゲノム配列の決定を行う検体は家族発症例であるAIH 3組6名、PBC 3組6名について準備している。平成28年度中にこれらの症例について解析を行い、疾患感受性を規定する遺伝子変異が見つかるか検討を行う。発見された変異について残りの検体で発見された多型・変異が病態と関連性があるか統計学的な検討を行い、確認をする予定である。肝臓病学次に、全エクソン領域のゲノム配列の決定を15症例ずつ施行して、疾患に特異的な遺伝子変異が見つかるかどうか検討を行う。発見された変異について残りの検体でDNAタイピングを行い、最終的に疾患感受性を規定する多型・変異として正しいかどうか統計学的な解析を行い確認する予定である。本年度施行したPTPN22遺伝子多型の解析、細胞死マーカーの測定が安価に行えたこと、海外学会への参加予定であったが諸事情で渡航できなくなり、旅費が使用されなかったため。本年度施行したHLAタイピングとM2BPGiの測定が安価に行えたこと、海外学会への参加を予定していたが諸事情で渡航できなくなり、旅費が使用されなかったため。HLA全領域のリシークエンシングについて平成28年度請求額とあわせて次年度使用額をあてることが出来るため健常者全症例で測定、解析が行えるようになった。これに加え、全エクソン領域解析で明らかになると予想される遺伝子多型の全症例での解析にも次年度使用額をあてることが出来るため、より詳細かつ正確なデータ解析が行えると考えられる。次年度のHLA全領域のリシークエンシングはH27年度の予算通りに行うことに加えて、全エクソン領域解析の消耗品購入に次年度使用額をあてることができるため解析可能な症例数をAIHとPBC5例ずつ増やす計画に変更する。この計画変更により、より正確なデータ解析が行えると考えられる。
メタゲノム解析・メタボローム解析からみた肥満関連腫瘍発現における腸内細菌の役割

肥満背景発癌モデルマウスとコントロールマウス(C57/BL)とでは発癌に違いがあることがわかり、肥満背景発癌モデルマウスでより多くまた大きい腫瘍が形成される事がわかった。それぞれの腸内細菌を比較検討したところ腸内細菌の分布に違いがあることまでが分かった。腸内細菌の分泌の違いについて、追加実験を行うこととした。1)抗菌薬を投与し無菌化状態にすることで、腫瘍形成や腸内細菌叢にどのような影響を与えるか。2) Co-Housingにより2種間の腸内細菌叢が類似するかどうか、また腫瘍形成にどのような影響を与えるか。腸内細菌叢の変化が肥満関連性腫瘍に影響を及ぼすという仮説のもと、肥満関連大腸腫瘍における腸内細菌叢の変化について検討することを目的に2つの実験を行った。1つ目の実験はコントロールマウスと肥満モデルマウス(KKAy)に抗菌薬を投与し、無菌化状態(一度腸内細菌叢をリセット)にしても、2種間で腸内細菌叢、腫瘍形成において差があるかどうかを検討した。結果、肥満モデルマウスで有意に腫瘍数は多かった。これより、無菌化状態による腫瘍形成への影響はないことが分かった。また、無菌化状態にしても、2種間の腸内細菌の成分は異なるままであった。一時的な無菌化状態は腸内細菌叢、腫瘍形成に影響を与えないと言える。2つ目の実験はCo-Housingにより2種間(コントロールと肥満モデルマウス)の腸内細菌叢が類似するかどうか、腫瘍形成に影響を与えるかどうかを検討した。結果、環境の変化による腫瘍形成への影響はなかった。環境を変化させても、2種間の腸内細菌の成分は異なるままであった。相互作用は見られなかった。これより、環境の変化は腸内細菌、腫瘍形成に影響を与えないことが分かった。当初の研究の予定通り実験は進んでいる。既に2つの実験が行えており、双方において肥満関連大腸腫瘍を形成し、それぞれの腸内細菌の検討まで行うことができているため、おおむね順調と言える。それぞれの腸内細菌を比較検討したところ肥満モデルマウスとコントロールマウス、肥満背景発癌モデルマウス、発癌のコントロールマウスそれぞれで、腸内細菌の分布に違いがあることまでが分かった。今後腸内細菌の分泌の違いについて更なる検証が必要と考えた為、以下の追加実験を行うこととした。1)抗菌薬を投与し無菌化状態(一度腸内細菌叢をリセット)にすることで、腫瘍形成や腸内細菌叢にどのような影響を与えるかということを検証する。2) Co-Housing(肥満モデルマウスとコントロールマウスを共環境)により2種間の腸内細菌叢が類似するかどうか、また腫瘍形成にどのような影響を与えるかどうかを検証する。現在上記の研究を進めているところである。2つの実験で得られた結果を踏まえて、コントロールと肥満モデルマウスにおける腸内細菌の多種多様性について2種間での違いについて、更に検討していく予定である。また、定量PCRなどを用いて、肥満関連大腸腫瘍に関与している特定の腸内細菌がいるかについても検討をすすめていく予定である。消化管悪性腫瘍前年度の余剰金として前年度の余剰金として
土壌が凍結する積雪寒冷地流域における異常融雪出水メカニズムの解明

北海道東部地域(北見・帯広)は,他の地域に比べ積雪が少なく寒さが厳しいために流域の土壌が凍結し,晩秋期あるいは融雪期に異常出水を引き起こす一因になっている.本研究はこの土壌の凍結と融雪出水の関係について,1.十勝川水系士幌川など4河川の水文・気象資料を用いた融雪出水に及ぼす凍結土壌の影響の定性的な評価,2.北見市郊外富里ダム流出試験地(流域面積8.4ha)の'93,'94年融雪期の観測結果を基にした土壌が凍結した流域の融雪出水機構の解明,を目的としている.以下に,その検討結果を要約する.1.十勝川水系諸河川の水文資料による解析流域の土壌凍結が流出に及ぼす影響は,定性的には流出率で評価できる.夏期の降雨-流出の流出率と比較すると,融雪期の同程度の降雨による流出率が約5割増となり,土壌凍結による流域の不浸透域の増加,すなわち一時的な流域の都市化現象と見なすことができる.2.富里ダム流出試験地の観測(1)厳冬期に流域の土壌は,日平均気温が0°Cを下回る頃から凍結を始め,積雪深が落ち着く2月初旬まで凍結深は増大した.しかし,河道の近傍はほとんど凍結せず,最大でも10cmを越えることはない.土壌中を浸透してくる湧水からの熱の供給を受けるためと考えられる.(2)融雪期に入ると,融雪の進行とともに河川水の水温が次第に上昇を始めた.融雪水(水温0°C)が河道に直接流入する場合は,逆に水温が低下すると考えられるので,融雪水が地中に一旦潜って地熱で暖められてから河道に流出してくるメカニズムを想定した.また,土壌の凍結は,積雪が消失した6月中旬まで存在していた.(3)上述の流出機構をモデル化した融雪出水モデル(並列タンクモデル)を構築した.(4)'95年融雪期(現在)は河道近傍と斜面部の2カ所で地温を詳細に観測中であり,融雪水の水温をトレーサにして(2)で仮定した流出経路の特定を行う予定にしている.北海道東部地域(北見・帯広)は,他の地域に比べ積雪が少なく寒さが厳しいために流域の土壌が凍結し,晩秋期あるいは融雪期に異常出水を引き起こす一因になっている.本研究はこの土壌の凍結と融雪出水の関係について,1.十勝川水系士幌川など4河川の水文・気象資料を用いた融雪出水に及ぼす凍結土壌の影響の定性的な評価,2.北見市郊外富里ダム流出試験地(流域面積8.4ha)の'93,'94年融雪期の観測結果を基にした土壌が凍結した流域の融雪出水機構の解明,を目的としている.以下に,その検討結果を要約する.1.十勝川水系諸河川の水文資料による解析流域の土壌凍結が流出に及ぼす影響は,定性的には流出率で評価できる.夏期の降雨-流出の流出率と比較すると,融雪期の同程度の降雨による流出率が約5割増となり,土壌凍結による流域の不浸透域の増加,すなわち一時的な流域の都市化現象と見なすことができる.2.富里ダム流出試験地の観測(1)厳冬期に流域の土壌は,日平均気温が0°Cを下回る頃から凍結を始め,積雪深が落ち着く2月初旬まで凍結深は増大した.しかし,河道の近傍はほとんど凍結せず,最大でも10cmを越えることはない.土壌中を浸透してくる湧水からの熱の供給を受けるためと考えられる.(2)融雪期に入ると,融雪の進行とともに河川水の水温が次第に上昇を始めた.融雪水(水温0°C)が河道に直接流入する場合は,逆に水温が低下すると考えられるので,融雪水が地中に一旦潜って地熱で暖められてから河道に流出してくるメカニズムを想定した.また,土壌の凍結は,積雪が消失した6月中旬まで存在していた.(3)上述の流出機構をモデル化した融雪出水モデル(並列タンクモデル)を構築した.(4)'95年融雪期(現在)は河道近傍と斜面部の2カ所で地温を詳細に観測中であり,融雪水の水温をトレーサにして(2)で仮定した流出経路の特定を行う予定にしている.
生細胞導入DNAビーズを使った小胞体・核膜様の膜のアセンブリー機構の解明

本研究は、生細胞内に導入したDNAビーズの周囲に小胞体・核膜様の膜構造がアセンブリーする現象を利用して、核膜形成の分子機構を明らかすることを目的とする。細胞内に導入したDNAビーズ周辺で起こる現象を蛍光顕微鏡と電子顕微鏡を用いて解析し、barrier-to-autointegration factor(BAF)が早い段階でDNAビーズに集積することを発見した。RNAiにより細胞内のBAFの量を減らすと、ビーズへの核膜タンパク質の集合が減弱した。これらの結果から、BAFが核膜形成に関与することを明らかにした。本研究は、生細胞内に導入したDNAビーズの周囲に観察される"非分解系"の膜構造について、(1)膜の集合機構を顕微鏡イメージングによって解明し、(2)ビーズの初期認識に関わる細胞内センサー因子を同定することで、細胞による外来異物の認識機構の一端を解明することを目的としている。まず、エンドサイトーシスによってDNAビーズをHeLa細胞内に取り込ませ、各種オルガネラマーカータンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、DNAビーズの周囲に、核膜内膜タンパク質であるemerinをはじめとするLEMドメインタンパク質、および、LEMドメインタンパク質への結合能を有するbarrier-to-autointegration factor (BAF)が局在していることが分かった。次に、EGFP-BAFを安定発現するHeLa細胞にDNAビーズを導入し、BAF陽性となってからの経過時間毎にサンプルを固定してビーズ周囲に存在する膜構造を電子顕微鏡で観察したところ、BAF陽性となってから約10分が経過した時点で、すでにDNAビーズ周囲を取り囲むような連続した膜構造が観察された。BAFには、in vitroでDNA配列非依存的にDNAと結合する機能があることから、本実験結果は、BAFが細胞内でもDNAビーズに結合し、LEMドメインタンパク質を含む膜をビーズ周囲に集合させる働きを持つことを示している。以上のデータは、BAFが外来DNAを認識する細胞内センサーとして働いている可能性を示唆している。本研究は、ヒト細胞に導入したDNA結合ビーズ(DNAビーズ)の周囲に形成される'非分解系'の膜構造について、膜のアセンブリー機構を顕微鏡イメージングによって解明し、DNAビーズの初期認識に関わる細胞内センサー因子を同定することで、細胞による外来異物認識機構の一端を解明することを目的としている。昨年度までの研究で、エンドサイトーシスによってDNAビーズをHeLa細胞内に取り込ませると、ビーズ周囲にbarrier-to-autointegration factor(BAF)およびBAF結合能を持つ核膜内膜タンパク質が集積すること、および、BAFの集積が見られてから約10分が経過した時点で、DNAビーズ周囲を部分的に取り囲むような核膜様の膜構造が形成されることが分かった。そこで今年度は、BAFがDNAビーズ周囲における膜構造の形成にどのように関与しているかについて詳細に解析した。まず、pH感受性色素であるpHrodoを利用してエンドソーム崩壊とBAF集積の時間的な関係を調べたところ、BAFはエンドソーム崩壊から30秒以内という非常に早い時間帯にDNAビーズ周囲に集積し始めることが分かった。一方、この時間帯では、オートファジー関連の(分解系の)膜構造はビーズ周囲に見られなかった。次に、RNAi法による機能解析を行ったところ、内在性BAFの発現抑制により、DNAビーズ周囲における非分解系の膜構造の形成が阻害され、代わりに、オートファジー様の膜構造がビーズ周囲を取り囲むように形成されることが分かった。これらの結果は、BAFが細胞内に侵入してきた外来DNAを認識し、オートファジーとは異なる非分解系の膜構造の形成に関わるセンサーとして働いていることを示している。本研究で得た知見は、効率良い遺伝子デリバリー法の開発等に直結するため非常に意義深いといえる。
ATP合成酵素の次世代1分子生物物理

F1-ATPaseの分子機構に関し大きな進展があった。細胞内制御に係わる阻害状態への遷移する機構の解明に加え、加水分解とリン酸解離の角度が異なることを明らかとした。また、ATPのリン酸部部分との相互作用がトルクに直接寄与することを明らかにした。ナノロッドの異方性散乱を用いた超高速1分子計測技術を確立し、F1に加えキネシンの新しい反応中間体を発見することに成功した。また、超微小リアクタを脂質二重膜でシールした膜チャンバー技術を開発し、1分子のATP合成酵素のプロトン輸送活性測定に成功した。以上の通り、ATP合成酵素に関する根源的理解を進め、普遍的な新しい1分子計測技術を確立した。本研究の目的は、次世代型の新しい1分子計測技術を開発することであり、以下の3つの手法を開発する。1金属ナノ粒子を利用した表面増強ラマンを用いた「酵素に結合したヌクレオチドの化学状態1分子計測技術」2supported membrane法もしくは平面膜法を用いた「膜ポテンシャル駆動の膜タンパク質1分子計測技術」3平面膜チャンバーアレイを用いた「イオン能動輸送活性1分子計測技術」の確立である。「酵素に結合したヌクレオチドの化学状態1分子計測技術」昨年度は顕微鏡システムの開発を中心に行った。結果、金属ナノ粒子の暗視野観察と表面増強ラマンスペクトルを同時に取得できる顕微鏡の作成に成功した。この顕微鏡を用いて、アデニン分子を計測したところ、非常に再現性良くアデニン環の呼吸振動に対応するピークを確認できた。「膜ポテンシャル駆動の膜タンパク質1分子計測技術」本項目は、交付申請にある実施計画通りに進展し国際的にも評価の高い雑誌に論文として発表を行うことができた。(Waranabe R. etal. Naturecommunications)「イオン能動輸送活性1分子計測技術」本項目も順調に進めることができた。具体的には、平面膜チャンバーアレイにFoF1-ATP合成酵素を再構成し、1分子の酵素が輸送するH+濃度変化を検出することに成功した。本結果も、論文として投稿準備中である。ATP合成酵素は、分子モーターとして最も解析と理解が進んだモデルタンパク質となった。理論物理、計算化学者なども巻き込んだ1大分野を形成している。しかし、その機能解析は主として回転運動計測に偏っており、肝心のトルク発生ユニットの構造変化直接計測、触媒部位の化学状態計測、プロトン輸送活性計測はまだ粗い計測しかなされていないため、最も基本的な反応スキームですら研究者によって意見が異なる状態にある。本研究は、上記の新しい1分子計測技術を開発・確立・活用することで、ATP合成酵素の機能解析に新しいブレークスルーをもたらし、他のタンパク質の機能解析にも道筋を付けることにある。本研究では、1分子解析技術を革新することでATP合成酵素の1分子生物物理学の地平線を広げることを目的とした。当初掲げた大きな目標は2つある。1つ目は表面増強ラマンなど表面プラズモンを用いたナノ粒子計測技術の開発である。2つ目は、平面膜や膜チップを用いた膜輸送活性の1分子解析技術の開発である。1つ目の柱であった表面増強ラマンを用いた1分子計測は、ナノ粒子毎に得られる信号の不均一性が原因となり難航している。一方、ナノロッドを用いた異方性散乱を利用した超高速構造変化イメージングの開発は成功し、これを用いたトルク発生ユニットの構造変化も達成した(in preparation)。これは、わずか10度程度の構造変化を10マイクロ秒の時間分解能で計測する手法であり、他のタンパク質への応用が期待される。2つ目の課題である膜輸送活性の1分子解析は予想以上に大きく進展した。まず、独自の膜チャンバー技術を確立し、ATP合成酵素のプロトン能動輸送活性の1分子計測に成功した。さらに、膜チャンバーの体積をaL (=10-15L)レベルまで下げることで計測時間の大幅な短縮も達成した。この技術を他のトランスポーター計測へ拡張するための技術開発も進展しており、非対称膜を作成する技術、外部電圧を印可する技術などの開発にも成功している。これ以外にも、データマイニング技術を利用したF1-ATPaseの反応メカニズム解明、1分子操作によるF1-ATPAseの反応経路の制御などに成功した。さらに、萌芽的な試みとして人工合成分子(合成ポルフィリン、ダブルデッカー)の1分子イメージングと1分子操作による回転ポテンシャル計測にも成功した。以上、当初目標の殆どは達成し十二分な成果をあげたと言える。一方、表面増強ラマンを利用した1分子計測技術と、ATP合成酵素の回転とプロトン移動の同時計測には至っていない。いずれも、引き続き技術革新が必要である。上記目的のために、本研究では主に以下の3つのプロジェクトを推進している。1:トルク発生ユニットβの構造変化

直接計測2:ラマン顕微鏡を用いたF1の化学状態直接計測3:Foのプロトン輸送活性計測1分子計測なかでも、1と3において大きな進展があり、本プロジェクトが目指していた目標をほぼ達成したのでいかに簡単に報告する。βの構造変化計測では、当初検討した蛍光標識したアクチン線維を接続した系から、金ナノロッドを用いた系に変更した。そこで、まずナノロッドのもつユニークな異方性散乱を利用した角度変化計測の系を開発した。μ秒の時間分解能で1°以下の角度決定制度を持つ計測系の開発に成功した(Enoki et al. Anal. Chem. 2015として発表)。これをβの計測に応用したところ、結晶構造から予想される運動が検出され、しかもその運動は一方向性が高く、発生するトルクも30-60pNnmに達することが分かった。H27年度発表を目指して詳細を解析する。また、プロトン輸送活性計測においても、脂質二重膜で封をしたフェムトリットルチャンバーの開発に成功し、さらにそこにATP合成酵素を1分子だけ再構成した系を用いて1分子のプロトンの能動輸送活性計測に成功した(Watanabe et al. Nat. Comm. 2015)。ラマン顕微鏡を用いた計測は、H26年度は顕微鏡自体の立ち上げに集中した。すでに、レーザー視野顕微鏡と表面増強ラマンイメージングを融合したシステムの開発に成功した。今後、実際の計測に取り組む27年度が最終年度であるため、記入しない。1分子生物物理1トルク発生ユニットβの構造変化直接計測;H27に達成したナノロッドを用いたβサブユニットの構造変化計測系を用いて、その運動の詳細解析を行う。特に、βの構造変化に伴うエネルギー散逸量を見積もることで、構造変化前後の自由エネルギー変化量を実測する。これと反応スキームを照らし合わせることで、各化学状態変化でどれだけのエネルギーが放出されるのかを見積もる。2ラマン顕微鏡を用いたF1の化学状態直接計測;H27年度に確立したラマン顕微鏡イメージングを利用して、F1の触媒反応を計測する。ただし、ATPそのものでは信号が弱いことが予想されるため、アデニン環やγリン酸にラマン用の化学プローブであるアルキンを導入した基質アナログを各種検討する。3Foのプロトン輸送活性計測1分子計測;H27年度は世界に先駆けてプロトンの揺動輸送計測に成功したが、最終目標は回転との同時計測である。現在、極めて厚みが薄いチャンバーの開発に取り組んでおり、これを用いて脂質二重膜に再構成したATP合成酵素の回転とプロトン輸送の同時計測にチャレンジしたい。一方で、酵素の再構成方法や脂質二重膜の安定性に問題があるため、引き続き手法の改善にも取り組んでいく。項目2と3に関しては、当初計画をほぼ達成できている。特に、項目2に関しては国際的にも評価の高い雑誌に掲載され、非常に注目度も高い。また、項目1に関しても計画通り順調に進めている。
大学数学基礎教育を学習指導要領改訂に対応して改善するための総合的研究

本研究は,大学初年次数学教育を,近年の学力低下,学習指導要領の内容削減に対応する形で改善する目的を持って行われた。したがって,理論的な事柄と並んで,実際的研究が大きな部分を占める。一方理系初年次教育は従来から専門学部教育の基礎教育を担う役目を持っていることから,本研究は初等中等教育と学部専門教育両者との接続をも視野に入れるものとなった。これらの研究は,前期日本学術会議数学教育小委員会との連携の下に行われ,前者に関しては,すでに始まっている新たな学習指導要領改訂への提言を行った。後者に関しては,工学系を主とした,学部専門での数学の実際の応用例を集めて,データベース化への手がかりを作った。初年次数学教育そのものの改善のためには,担当数学系部局のネットワーク組織を作り,情報交換とアンケート調査,学力調査などを行った。この組織は今後も継続させたい。1アンケート調査では,学力低下が深刻である私立工学系での対応の早さが目立つが,まだ全国の大学には十分波及しておらず,コア・カリキュラムなどの基本用語もについても,本アンケート自身が一種の普及効果を持った。数学の場合,数学教員養成系大学・学部カリキュラムにも大きな問題であることがアンケート調査で判明した。この問題解決に向けての実践の一つとして,研究代表者は所属組織で現場教員と教員志望大学院生とが共通の場で数学および数学教育について学び議論できる場としてのセミナーを立ち上げ,活動を続けている。本研究はこのように,深刻化する学生の状況変化の中で改善を行おうとするもので,即効的結果は望めないが,問題点を明らかにし,解決に向けて数歩を踏み出したという成果は上げ得たと信じる。本年度は、次年度からの本格的調査研究の準備として、過去の研究成果を共有することと、予備的な調査・研究を行うこと、環境を整備することを行った。また本研究では数学研究連絡委員会数学教育小委員会(研究代表者が委員長)と緊密に連絡を取りつつ活動を進めている。まず基礎教育研究部会では、西森が以前の日本数学会数学基礎教育WGの研究成果をホームページで公開する準備を整えると共に、数学教育小委員会で大学基礎教育WGを主催し、これからのアンケート調査の企画を行った。HP公開のためパソコン一式を購入した。また根上は同じく以前行った理系大学生の数学学力調査結果を見直し、調査資料をpdf化すると共に、新たな経年調査を行うための予備的な調査を行った。配分経費はそれらのために用いられた。浪川・西森は昨年夏にコペンハーゲンで行われた第10回数学教育世界会議に参加し、前者は招待講演を、後者は応募発表を行った。同時に世界からの参加者と交流し、本課題に関し諸外国での状況を知ると共に本研究計画を紹介し、大きな興味を持って迎えられた。一方浪川・三宅は来名した中国数学者から、中国での大学教育についての現状を聞いた。学部専門教育との接続については、数学教育小委員会で予備的な議論を始めた。ネットワーク構築のために名古屋大学にサーバを設置するが、その準備としてパソコン一式を購入した。数学教育小委員会および科研費グループ、全国大学数学教室間の3種類のメーリングリストを杉田・鈴木が設置し、運用に入っている。本年度は,数学基礎教育大学間ネットワークを充実させ,本格的な活動を開始した。基礎教養教育研究部会では,大学生の学力低下に対する基礎教育レベルでの各大学における対応,特に初年次導入教育について予備的なアンケート調査を行い,また学力調査に向けた準備研究を行った。このため以前の学力調査報告の増刷を行い,併せて関係方面への成果の周知をはかった。分野別専門教育研究部会においては、1)工学系学部専門教育における数学教育の役割の調査;2)数学教員養成系における数学教育カリキュラムの現状と問題調査を行った。前者では,基礎教育が用いられる具体例を集め,データベース化することを始めた。

後者では,数学教員となる者のための数学教育カリキュラムをどうするかが喫緊の問題であることが認識された。これらの課題解決のため,本研究計画の次年度の企画を始めている。学部専門教育研究部会では,上記基礎教養教育部会と協力して教育改革アンケートを行い,各大学での取り組みを調査した。私立工学部系で,学生の学習支援組織が多く設けられていること,教員養成系で具体的な取り組みがやや遅れていることなどが分かった。ネットワークでの情報交換活動の支援,従来の研究成果の公開などのため,報告書資料の増刷,ウェブページでの公開などを行うこととし,このため次年度計画を前倒しする形で,パソコン,関係ソフト,プリンターなどを購入配置した。また本研究活動は,日本学術会議第19期数研連付置数学教育小委員会の活動,特に大学基礎教育WGおよび教員養成WGの活動と密接に連携する形で行われた。本年度は,最終年度として前年度からの活動を継続発展させた。まず,大学初年次数学教育について前年度末に行った予備的アンケート調査をまとめ,その報告を公にするとともに,それに基づく調査項目等の改善を加えた本調査を実施した。この結果は大筋で予備調査のそれと異なっておらず,それによれば,例えばかなりの大学でカリキュラム改革を行って,学力低下,履修内容の減少に対応していること,特に私立工学部系では大学主導の形で個別学生の支援システムを作りはじめていること,教員養成系は対応に遅れが見られるが,それは別の要因があることなどが明らかになった。また学力調査を実施したが,時期的問題もあってその分析はこれからである。初年次教育と初等中等教育の接続の問題として,学習指導要領のあり方について昨年度に引き続き議論を行い,具体的には年度当初に中央教育審議会への提言を纏め,各方面に送付するなどの活動を行った。今年度新たに開始したものとして,名古屋大学の数学教育セミナーがある。これは上に触れた教員養成系の問題が教員養成システムのそれであることに鑑み,一つの実践の試みとして現職教員と教員志望の大学院生とがともに集い,数学および数学教育について学びかつ考える場を設け,この活動を本研究の一環として支援した。これは昨年度本研究で行った教員養成系数学カリキュラムについてのアンケート調査を踏まえたものである。時間的制約もあって,本研究の中で始めた活動の多くがまだ完結した形で成果となっていない。これについては次年度以降さらに研究を進める予定である。
大腸菌で生産される超好熱菌由来グルタミン酸脱水素酵素の活性化の分子機構の解明

研究代表者は超好熱菌Pyrobaculum islandicum由来グルタミン酸脱水素酵素(GDH)がリコンビナントタンパク質として大腸菌を宿主に用いて生産されると不活性な形(不活性型酵素)で生産され、熱または常温での5M尿素溶液中で天然由来の同酵素と同等の活性を有するまで活性化されること、酵素活性を有するには正しい4次構造形成が必要であることを見出している。昨年度の成果より、不活性型酵素は疎水性残基が表面に露出し、プロテアーゼ消化によるアミノ酸配列解析は172位のPhe付近が表面に露出していることを明らかとした。本年度は、上記の結果を踏まえ、GDHが大腸菌体内で不活性型として生産される原因を解明するため、シャペロンに着目し研究を行った。シャペロンには好熱菌肪Thermococcus sp. KS-1由来FKBPの2種で、プロリン異性化酵素活性を持つものと持たないものを用いた。精製後のGDHに、それらシャペロンを加えても酵素活性に変化は見られなかった。そこで、それらシャペロンを大腸菌体内でGDHと共発現させた結果、プロリン異性化酵素活性を有するものでは大腸菌体内での生産にもかかわらず、酵素活性の上昇が見られた。このことからプロリンの異性化が活性に影響を与えていると考え、172位近傍のプロリンをアラニンに置換し、それらの大腸菌体内で生産させた際の酵素活性を測定した。その結果、142,144位のプロリンをアラニンに置換した変異体は酵素活性が上昇した。これらのことよりGDHの大腸菌体内での不活性型としての生産は、プロリン残基の異性化が正しく起こらず、その結果、誤ったフォールディングを導くことが原因と考えられた。研究代表者は超好熱菌物Pyrobaculum islandicum由来グルタミン酸脱水素酵素がリコンビナントタンパク質として大腸菌を宿主に用いて生産されると不活性な形(不活性型酵素)で生産され、熱または尿素処理で天然由来の同酵素と同等の活性を有するまで活性化されることを見出している。さらに、活性化に伴って不活性型酵素の分子サイズが小さくなることをX線溶液散乱測定(SXS)より見出している。そこで、活性化過程での中間体の存在の有無及び、各過程での構造を求めることを目的に、活性化に伴う構造の経時変化を測定し、特異値分解(SVD))法を用いることによって反応の段階の数の解析を行った。それらの結果から、熱及び尿素処理での活性化ともに中間状態は存在せず2状態転移であることが明らかとなった。また、既に代表者はアニリノナフタレン-8-スルホン酸を用いた蛍光測定より、不活性型酵素は疎水性残基が表面に露出していることを明らかとしている。そこで、プロテアーゼを用いた限定分解を不活性型・活性型で行い、不活性型で活性型とは異なり表面に露出している残基の探索を行った。分解された酵素をSDS-PAGEによって分離し、N末端アミノ酸配列を解析したところ不活性型酵素では172位のPheの後ろで切断されやすくなっていた。このことは、この残基付近が表面に露出していることを意味している。同酵素は4次構造形成に関与するドメイン1と補酵素結合に関与するドメイン2からなっており、172位付近はドメイン1に位置している。このことは、4次構造形成が活性化に大きく関与していることを示唆していた。