hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有用物質生産に関わる小胞体ストレス応答の解明

小胞体ストレスによって誘導されるIRE1のヌクレアーゼ活性によりある種のストレス関連する分泌タンパク質のmRNAが分解され、小胞体ストレスの制御に関わる機構(RIDD)があることが報告されている。我々は植物の栄養組織ではある種の分泌タンパク質(感染応答タンパク質)がERストレスの過程でRIDDの制御を受けていることを明らかにしてきた。しかし、植物でのRIDDに関する詳細の分子機構はほとんど明らかにされていない。この理由は植物そのものを利用して、RIDD制御を受ける分泌タンパク質のmRNAのIREI感受性を解析するのが困難なことによる。そこでプロトプラストを用いた一過的発現による解析で、種子登熟過程で大量に分泌タンパク質として生合成される種子貯蔵タンパク質のmRNAが、RIDDによる小胞体ストレス応答により蓄積レベルの制御を受けるのかを調査した。CaMV35Sプロモーターの制御下でプロトプラスト中に発現させたイネ貯蔵タンパク質の中で16kDaプロラミン、10kDaプロラミン26kDaグロブリンのmRNAが小胞体ストレスの制御を受け、mRNAレベルが低下したが、グルテリンにおいては低下が観察されなかった。一方、ゲノム編集によりIRE1のヌクレアーゼ活性をなくした改変IRE1を発現したイネから由来するプトトプラストを用いた解析ではmRNAの低下は観察されなかった。これらの結果から、一部の貯蔵タンパク質の生合成においてはRIDDを介した小胞体ストレス応答の制御をうけることを明らかになった。さらに貯蔵タンパク質のmRNAの組換えIRE1タンパク質による切断サイトを同定し、IRE1ヌクレアーゼの基質となるRIDDのターゲットの構造を決定した。27年度が最終年度であるため、記入しない。OsIRE1遺伝子のヌクレアーゼ活性やタンパク質キナーゼ活性に関与するアミノ酸配列に点変異を導入にそれぞれの活性を特異的に欠損させた改変遺伝子を作製し、相同組換え手法によりイネに遺伝子導入した組換えイネを作出し、世代を進めてホモ化を進めた。さらにそれぞれの活性を欠損させたOsIRE1遺伝子をユビキチンプロモーターで過剰発現させた組換えイネも作出した。まずOsIRE1のタンパク質キナーゼ活性を欠損させた変異遺伝子を相同組換えにより導入したイネにおいては、全ての作出された組換えイネで致死となり、OsIRE1のキナーゼ活性はイネの生存に不可欠であることが示された。次に、ヌクレアーゼ活性を欠損させた場合、OsbZIP50mRNAの細胞質でのスプライシングが起こらず、OsbZIP50の発現を抑制させた場合と同様に、制御下にある各種シャペロン遺伝子群の発現が抑制されてた。違いは膜タンパク質や分泌タンパク質をコードするmRNA分解が抑制されたことであった。一方、ヌクレアーゼ活性やタンパク質キナーゼ活性を欠失させたOsIRE1を恒常的に過剰発現させた場合、小胞体ストレス応答機能が失われ、成長が顕著に抑制された。植物特有の多重遺伝子を形成するBiP遺伝群の機能解析を進めるため、BiP及びBiPのコシャペロンで小胞体に局在するERdjについて、ストレス応答について調査した。根を用いてERストレスに関与するツニカマイシンやDTT処理、塩処理で調査したところ、前者の処理により全てのBiPおよびOsP58B, OsERdj3A, OsERdj3Bの3種類のERdjの発現の発現が誘導され、塩処理では全く誘導されなかった。これらに特異的な抗体を用いて、ERストレスとの関係を調査したところ、ERストレスと指標とされるBiP4&5の発現レベルと平行した、ERストレスの負荷に伴いこれら3種類のERdjの発現も高まった。OsIRE1遺伝子のヌクレアーゼ活性をアミノ酸配列の置換による点変異導入により特異的に欠損させた改変遺伝子を作製し、この改変遺伝子を相同組換え手法によりイネに遺伝子導入した相同組換えイネを準備した。この相同組換えイネと普通のイネをERストレス処理により発現される転写産物をRNAシークエンスで解析することで、普通のイネでERストレス応答した遺伝子群の中から、OsbZIP50転写因子の制御下にあるERストレス関連遺伝子群を見出すことを進めた。少なくとも38076の転写産物の中、380がERストレスに応答した。ERストレス処理で195の転写産物が増加し、185が減少した。17個がマイクロアレー解析では見出せなかった新規遺伝子であった。Hrd3/SEL1LはHrd1E3ユビキチンリガーゼ複合体のコンポーネントであり、フォールデイングが上手くいっていないタンパク質を認識し、小胞体関連分解機構により小胞体から排出され細胞質でユビキチン系での分解、品質管理に寄与する小胞体関連分解機構に関与することが期待される。そこで、タンパク質発現が顕著な種子登熟期における小胞体関連タンパク質分解機構の役割を明らかにするため、イネのHrd3遺伝子を、胚乳特異的に発現を抑制した。その結果、種子タンパク質の中でグロブリンおよび16kDプロラミンの発現が顕著に抑制された。また種子タンパク質の中で、システイン残基に富むRM1や10kDのプラミンの凝集が変化した。さらに、タンパク質のポリユビキチン化が減少し、小胞体ストレスが高まることが観察された。したがってHrd3を介したポリユビキチン化は小胞体品質管理において重要であることが明らかになった。小胞体ストレスによって誘導されるIRE1のヌクレアーゼ活性によりある種のストレス

関連する分泌タンパク質のmRNAが分解され、小胞体ストレスの制御に関わる機構(RIDD)があることが報告されている。我々は植物の栄養組織ではある種の分泌タンパク質(感染応答タンパク質)がERストレスの過程でRIDDの制御を受けていることを明らかにしてきた。しかし、植物でのRIDDに関する詳細の分子機構はほとんど明らかにされていない。この理由は植物そのものを利用して、RIDD制御を受ける分泌タンパク質のmRNAのIREI感受性を解析するのが困難なことによる。そこでプロトプラストを用いた一過的発現による解析で、種子登熟過程で大量に分泌タンパク質として生合成される種子貯蔵タンパク質のmRNAが、RIDDによる小胞体ストレス応答により蓄積レベルの制御を受けるのかを調査した。CaMV35Sプロモーターの制御下でプロトプラスト中に発現させたイネ貯蔵タンパク質の中で16kDaプロラミン、10kDaプロラミン26kDaグロブリンのmRNAが小胞体ストレスの制御を受け、mRNAレベルが低下したが、グルテリンにおいては低下が観察されなかった。一方、ゲノム編集によりIRE1のヌクレアーゼ活性をなくした改変IRE1を発現したイネから由来するプトトプラストを用いた解析ではmRNAの低下は観察されなかった。これらの結果から、一部の貯蔵タンパク質の生合成においてはRIDDを介した小胞体ストレス応答の制御をうけることを明らかになった。さらに貯蔵タンパク質のmRNAの組換えIRE1タンパク質による切断サイトを同定し、IRE1ヌクレアーゼの基質となるRIDDのターゲットの構造を決定した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。植物における小胞体におけるタンパク質の品質管理機構関するBiP、ERdjとERストレス応答の関係については計画通り進捗している。さらにこれらシャペロン遺伝子群を制御する中心的役割を担うストレスセンサーIRE1によるERストレス応答機構の解明をめざした相同組換えによる遺伝子組換え体を有効に利用した解析についても計画通り進捗している。ストレスセンサーIRE1によるERストレス応答機構の解明をめざした相同組換えによる遺伝子組換え体を有効に利用した解析については、小胞体ストレス下で誘導される遺伝子をRNAシークエンスに大量解析より同定を行い、マイクロアレーでは検出できなかった遺伝子の検出に努め、OsIRE1の制御下にある特異的シグナル伝達系の解明を進める。タンパク質の品質管理機構関するBiPとERdjの特異的相互作用や細胞内局在性などこれらシャペロンの生物機能の解明に努める。
消費者教育推進ナビゲーター育成プログラムの開発

追加採択のため研究計画を変更し、これまで連携実績のあるNPOと連携したプログラムの実施を先行させ、昨年度は予定以上にプログラムを実施することができた。今年度は、実施したプログラムについて省察し、改善の方策を検討することを主たる研究内容とした。実施したプログラムは、ナビゲーターとして養成する対象である大学生が主体的にプログラムを計画・実施するものであった。連携先は環境活動に関わるNPO、児童館における学童保育、フェアトレードショップにおける海外NPOとの交流というものであり、学生たちのふりかえりレポート等からは乳幼児から小学生、その保護者とかかわる中で多くのことを学びとっている様子がみられた。しかしながら、自身の力量不足による課題もあげられていた。対象者理解や方法論・実践力の不足等である。また昨年度は中高生とかかわる機会がなかったため、乳幼児期から社会人若年層まで切れ目のない消費者教育プログラムを構想するには、中高生の実態把握が不足していた。さらに、プログラムを運営するにあたり、連携のあり方についての検討も必要であることを実感した。よって昨年度の課題から、今年度は消費者教育の対象者理解、とくに中高生の生活や消費者意識に関する情報収集、方法論および連携のあり方に関する検討を行った。具体的には、日本家庭科教育学会による高校生および社会人の生活実態についての全国調査(昨年度発表)について論文として吟味・整理することを通して、理解を深めることができた。方法論としては昨年度、研修に参加したアクティブラーニングの手法を中学校家庭科の教育内容や大学生が主体的にエシカル調査を実施する等の試みに活用し、反応をみることができた。連携のあり方による成否もあることが認められたため、成功事例についての聞き取り調査を実施した。これらより、構想中のプログラムに活かす要素を見出すことができた。そもそもの原因として採択時期の遅れによる計画変更の影響が大きく、プログラムを先行して実施したことにより、その省察に基づく改善策を取り入れたプログラムとするため、当初予定していた海外の成功事例の調査先の変更を余儀なくされた。実施後の課題に対応するための新たな調査対象を見出したものの、日程調整が難しく実施できなかった。よって、国内の成功事例についての聞き取り調査を行い、プログラムの作成・運営・実施等にかかわる成功要因について検討することができた。昨年度、プログラム実施によって見出された課題は若年層(本研究でナビゲーターとして想定している大学生)自身の力量形成(とくに対象者理解と方法論・実践力の獲得)と考えている。若年層が精力的にエシカル行動に参画している先進事例について調査し、プログラムに活かしたいと考えている。また、今年度の国内の成功事例における成功要因についても検討し、可能な限りプログラム自体にも連携等の運営においても反映させていきたいと考えている。これらの結果をふまえて、消費者教育推進ナビゲータープログラムを策定し、提案していきたい。平成28年度の計画は、消費者行政・エシカル消費・消費者市民教育の先進地域の調査を実施し、プログラム作成のために必要な理論の整理・教材開発を行うことであった。追加認定で11月からの実施となったため、当初、予定していた海外調査は準備および日程を確保することが十分できなかった。そこで計画内容でもあった、学童保育や環境NPO、公民館職員、消費者行政等、社会教育に関する関係機関への聞き取りや次年度実施に向けたプログラムの検討を行った。また、学校教育関係としては、高等学校家庭科教諭と打ち合わせを行い、次年度に可能なプログラムを検討した。平成29年度に、学部開講科目「消費者教育」を受講した大学生を地域の環境イベントや学童保育、公民館講座に消費者教育ナビゲーターとして派遣する打ち合わせを行うことができ、次年度実施プログラムの内容をある程度、確定することができた。高校生についても大学生に準じて、高齢者が多い地域の高校にご協力いただき、高校家庭科での高齢者や消費者教育に関する学習を活かして、プログラム展開していただける道筋をつけることができた。また、3月5日の日本消費者教育学会九州支部会(大分市:JR大分シテイ会議室)において、本プログラム実施に関する研究発表および消費者教育推進状況に関する情報交換会を行うことができた。さらに、これまでの研究成果をふりかえり、「小学校家庭科の授業をつくる」(学術図書出版)に消費と環境に関する論稿(理論編・実践編・基礎知識編を分担)を執筆する機会を得て、今後の学習内容構築にむけた理論的整理ができた。授業実践の成果と課題を考察する論稿からはプログラム実施にむけた教材開発の資料としても活用できるポイントを確認できた。11月からの実施ではあったが、限られた時間の中で、次年度のプログラム実施にむけた下準備を行うことができた。追加での採択であったため、11月以降の実施となったため当初の予定より、半年ほどの遅れがあるのはやむを得ないと考えている。しかしながら限られた時間の中でも次年度のプログラム実施に必要と考えられる具体的事項について、関係諸機関との準備ができたのは成果である。消費者市民教育を推進するための消費者教育推進ナビゲーター育成プログラム開発にむけて、平成28年度11月以降に関係者と打ち合わせたプログラムを概ね実施することができた。学部開講科目「消費者教育」を受講した大学生が地域の環境イベント「アースデイ中津」(2万超の参加者)に参加することができ、その成果についても学会発表することができた。児童館での学童保育でもプログラム実施ができた。さらに、当初予定していなかったフェアトレードショップにおける海外NGO代表との交流やコミュニティカフェにおける活動も実施することができた。その成果も紀要論文に発表した。しかしながら、学生主体の体験的プログラムを予定よりも多く実施することができたものの、国内外の調査の実施ができなかった。

採択時期の遅れにより、プログラム実施を先行実施することとなり、調査内容自体の見直しの必要性もあり、またプログラム実施の日程調整との兼ね合いもあり、次年度実施にせざるを得なくなった。しかしながら、消費生活の基本的内容を学習する家庭科の全国調査分析にもかかわり、学会での成果報告もできた。この全国調査は高校生と社会人の家庭生活における意識や行動を把握するものであり、本研究の基礎データにもなり得るものである。さらに、関連して学校教育における消費者教育の授業実践についても学会発表し、プログラムにおける教材開発にもつながったと考える。プログラムにおける方法論や具体的な教材を検討するため、エシカル消費やSDGs等のワークショップ研修にも参加し、情報収集することができた。今後は、次年度にむけて、今年度実施したプログラムの改善点を明確にし、調査結果や情報収集の成果をふまえ、改善したプログラムを提案していきたいと考えている。前年度打ち合わせていたプログラムを実施することは概ねできたが、それ以上に連携先との連携がスムーズにいき、当初予定していなかったフェアトレードショップにおける海外NGO代表との交流やコミュニティカフェにおける活動も実施することができた等の成果をあげることはできたが、調査日程が設定できず調査ができなかった。またプログラム実施を先行せざるを得ない状況となったため、調査目的が変わり、調査対象も変更することになったため、今年度も国内外の調査については実施できなかったため。追加採択のため研究計画を変更し、これまで連携実績のあるNPOと連携したプログラムの実施を先行させ、昨年度は予定以上にプログラムを実施することができた。今年度は、実施したプログラムについて省察し、改善の方策を検討することを主たる研究内容とした。実施したプログラムは、ナビゲーターとして養成する対象である大学生が主体的にプログラムを計画・実施するものであった。連携先は環境活動に関わるNPO、児童館における学童保育、フェアトレードショップにおける海外NPOとの交流というものであり、学生たちのふりかえりレポート等からは乳幼児から小学生、その保護者とかかわる中で多くのことを学びとっている様子がみられた。しかしながら、自身の力量不足による課題もあげられていた。対象者理解や方法論・実践力の不足等である。また昨年度は中高生とかかわる機会がなかったため、乳幼児期から社会人若年層まで切れ目のない消費者教育プログラムを構想するには、中高生の実態把握が不足していた。さらに、プログラムを運営するにあたり、連携のあり方についての検討も必要であることを実感した。よって昨年度の課題から、今年度は消費者教育の対象者理解、とくに中高生の生活や消費者意識に関する情報収集、方法論および連携のあり方に関する検討を行った。
統合失調症のQOLを含めた薬物治療反応の継時的評価と薬物応答性の解析

統合失調症を出来る限り抗精神病薬単剤で治療し、臨床症状とQOLの継時的な観察を行った。同時に、治療反応を規定する状態依存的な要因として、白血球内に発現するmRNA発現の変化を探索した。さらに遺伝子規定的な要因として、遺伝子多型(SNP)解析を行い薬物応答性の個体差の分子遺伝学的解析を行った。まず調査研究を行い、自己評価QOLには抑うつ症状が、観察者評価QOLには陰性症状が、家族による生活技能評価には抑うつ症状と陰性症状が規定因子として重要であることを示した。これらの所見はQOLと生活技能の向上には、抑うつ症状と陰性症状に着目する必要性を示唆している。白血球内mRNA発現においては統合失調症特有の変化があることを示唆する所見を得た。これらが診断および治療に有用な生物学的指標となるかを、リアルタイムRT-PCRを用いて引き続き検討している。遺伝子多型解析では慢性例の解析を先行させ、臨床症状を取りながら数百の検体を収集し、遺伝子を抽出した。これまでに、BDNFのVal66Met多型において、Met保有例においては発症年齢が低いことを見出した。またBDNFVal66Met多型は長期抗精神病薬治療後に残存する症状とも関連があることを示した。これらの所見を初発例の経時的な臨床経過を追いながら前方視的にも検討している。また、高磁場3テスラMRI装置が使用可能となったので研究企画の中に画像解析を組み込み複合的な検討も開始している。本研究では、統合失調症を出来る限り単剤で治療し、継時的な観察を行っている。(1)陽性症状、陰性症状、抑うつ症状、認知機能を評価するとともに、(2)QOLの主観的(自己評価)および客観的(観察者評価)評価を行う。同時に、(3)治療反応を規定する状態依存的な要因として、白血球内に発現するmRNAを網羅的に定量できるDNAチップを使用して、薬物治療に平行して生ずるmRNA発現の変化を探索し、治療反応の指標を確立する。さらに(4)遺伝子規定的な要因として、遺伝子多型(SNP)解析を行い薬物応答性の個体差の分子遺伝学的解析を行う。以上のような研究計画を進行させている。今年度には、臨床症状とQOLの主観的(自己評価>および客観的(観察者評価)評価、さらに家族による生活技能評価について外来通院患者を対象に横断面的な調査を行って、自己評価QOLには抑うつ症状が、観察者評価QOLには陰性症状が、家族による生活技能評価には抑うつ症状と陰性症状が規定因子として重要であることを示した。これらの所見はQOLの向上を目指すためには、抑うつ症状と陰性症状に着目する必要性を示唆している。白血球内mRNA発現においては10数例の予備的な検討から統合失調症特有の変化があることを示唆する所見を得た。これらが診断上および治療上に有用な生物学的指標となるかを検討している。

これまでに、BDNFのVal66Met多型において、Met保有例においては発症年齢が低いことを見出した。またBDNFVal66Met多型は長期抗精神病薬治療後に残存する症状とも関連があることを示した。これらの所見を初発例の経時的な臨床経過を追いながら前方視的にも検討している。また、高磁場3テスラMRI装置が使用可能となったので研究企画の中に画像解析を組み込み複合的な検討も開始している。
超高齢期(85歳以上)の聴覚機能と補聴―老人性難聴の末梢から中枢のレベル診断

〈目的〉老人性難聴は末梢障害と中枢障害の両方が関与していると考えられるため、老人性難聴の検査には聴力検査のほかに認知や理解の検査および他覚的検査を行なうことで聴覚障害の実態が把握できる。老人性難聴の末梢から中枢のレベルでの障害を診断し、対応した補聴を実施、認知機能を考慮した補聴のフィッティングと聴覚指導の方法について検討した。〈方法〉(1)自覚的検査、聴覚認知・理解の検査、他覚的検査から末梢から中枢のレベルの障害を予測した。(2)質問紙を用い、老人性難聴者の生活面の困難度および情緒理面での影響がどの程度であるか調査した。(3)簡易知能検査を用い認知機能について調査した。以上の結果から、障害のレベルを予測し対応した補聴について検討した。〈結果〉85歳以上の192耳についての聴力閾値は、個人差が大きく正常から重度難聴に分布が認められた(正常26dB以下:7%,軽度2640dB:20%,中等度4155dB:37%,やや高度5670dB:17%,高度7190dB:11%,非常に高度91dB以上:8%)。聴力レベル50dB以上位より語音弁別能の低下が認められる例があり、70dB以上では急激に悪化する傾向にあった。耳音響放射は40dB以下の難聴であっても出現せず、外有毛細胞の障害が示唆された。聴性脳幹反応は閾値が上昇するものの、潜時の延長や波形の異常はなく、高音圧で正常波形を認める補充現象が約60%で認められた。以上の結果から末梢の蝸牛レベルの障害がほとんどであると考えられた。85歳以上でも、語音弁別能よりも意味のある単語や単文の認知理解は良い傾向にあり補聴効果は期待されると考えられる。難聴の病態理解や補聴器の導入・装用指導において、十分なカウンセリングが必要であり、難聴による障害は実生活に限定されているのか、心理面に及んでいるのかを理解し必要に応じて心理療法的アプローチを用いる必要がある。さらに認知機能の低下を考慮した場合、家族や友人の理解や協力が不可欠で、補聴器の定期的なフォローアップは欠かすことができないと考えられた。
高分子化NAD-耐熱性酸素系を用いる酵素リアクターの長期安定運転

補酵素(担体型)を必要とする酵素反応を連続自動化するためには、補酵素の高分子化と、補酵素再生用の酵素反応との共役が必要である。当研究室では、ポリエチレングリコール結合NAD(PEG-NAD)が高い補酵素活性を有し、2酵素共役連続反応系に使用しうることを示してきた。とくに、耐熱性酵素であるThermus thermophilusのmalate dehydrogenaseとBacillus stearothermophilusのlactate dehydrogenaseがPEG-NADに対して高い活性を示し、かつ非常に安定であることが明らかとなった。本年度は、酵素リアクターの長期安定運転の条件を確立するために、上記両耐熱性酵素とPEG-NADを用いた連続酵素反応を温度を変化させて行なった。本酵素リアクターによるピルビン酸からL-乳酸生成速度の半減期は、30、40、45および50°Cにおいて、それぞれ9.7、6.2、5.4、および3.6日であった。リアクター中の酵素およびPEG-NADの安定性を調べたところ、両酵素は安定に存在していたが、PEG-NADがやや不安定であった。また、緩衝液中での安定性はリアクター中のものとは異なっており、PEG-NADの場合、緩衝液中の方が安定であった。以上の結果より、温度および緩衝液等の条件を適宜設定することにより、高分子化NAD-耐熱性酵素系を用いた酵素リアクターの長期安定運転が可能であると結論できる。NADで成功した本システムを、もう一つの酸化還元補酵素であるNADPに拡大するために、ポリエチレングリコール結合NADP(PEG-NADP)を新たに合成した。その際、NADPの2′位のリン酸基が、合成反応の副反応に関与することを見出し、その問題点を解決することにより、従来報告されている高分子化NADPに比べてはるかに高い補酵素活性を有するPEG-NADPを得ることができた。PEG-NADPもPEG-NADと同様、2酵素共役連続反応系に使用しうることが確認されており、高分子化NAD(P)-耐熱性酵素系を用いる酵素リアクターの長期安定運転が可能になった。
有限幾何的な手法による頂点作用素代数の研究

本研究費によるこれまでの研究によって,以下のことがわかった。与えられた3互換群が頂点作用素代数に中心電荷1/2のVirasoro代数に附随する自己同型を通じて作用する場合には,その3互換群に附随するFischer空間の各線に対して中心電荷7/10のVirasoro代数の表現が構成され,その最高ウェイトの分類から,考えているFischer空間はSymplectic型でなければならない。さらに,その3互換群に附随するグラフを考えると,その固有値は-8以上でなければならない。以上の条件を満たす3互換群はすべてリストアップでき,そのリストに現れる3互換群が作用する頂点作用素代数は,格子に附随する頂点作用素代数の適切な部分代数を取り出すことによって実現される。この研究で現れた3互換群の一部は,当研究室に所属する学術振興会PDの佐久間伸也氏と山内博氏によって,モンスターの2A元に関するマッカイのE8観察と関係するようなある頂点作用素代数と深く関わっていることが見出された。彼等はこの頂点作用素代数を実現しその表現を分類した。これによって,モンスターグラフの上部構造を解明する端緒が開かれた可能性もあり,この方向の研究を今後も続けていく必要がある。一方,W代数の表現論を展開するため,名古屋大学の土屋昭博氏および大阪大学の永友清和氏と共同で,然るべき有限性条件を満たす頂点作用素代数について,その表現を統制する普遍展開環の代数構造についての研究を行った。そのような環については,エネルギー固有値に関するスペクトル分解を利用すると,いわゆるZhu代数を一般化した有限次元代数が構成され,その表現の圏ともとの頂点作用素代数の表現の圏の間の圏同値関手が得られることがわかった。頂点作用素代数の有限群論的な側面について研究を行った。中心電荷1/2のVirasoro代数(Ising模型)を部分代数として含むような頂点作用素代数のなかで,Ising模型のスペクトルのうち固有値1/16のセクターを持たない場合については,Ising模型のフュージョン則の自己同型が生成する部分群が3互換群であることが宮本雅彦氏によって示されており,特にIsing模型のテンソル積によって有限個のセクターに分解されるようなもの(枠付き頂点作用素代数)については,その分類が北詰正顕氏と宮本雅彦氏によりすでになされている。本研究では,そこに現れる3互換群を特徴づけるグラフの不変量と頂点作用素代数の性質との関係を利用することにより,より一般的な条件の下でIsing模型の生成する自己同型群を分類することができた。その際に,3互換群の分類結果を極力使わないようにするため,シンプレクティック型の3互換群の構造についても考察し,有限幾何のみに基づいて理論構成を見直す可能性も見いだすことができた。3互換群と頂点作用素代数の関係について、昨年度にやり残した部分を完成させた。特に,任意のFischer空間から出発して,非退化な内積を持つ非結合的代数を構成する一般的手続きを構成し,従ってGriess代数のレベルでは,任意の(中心を持たない)3互換群が自己同型群として実現されることを示した。よって,3互換群が我々が考察する型の頂点作用素代数の自己同型群として実現されるかどうかの問題は,そのようなGriess代数を次数2の部分空間として持つ頂点作用素代数が存在するかどうかの問題に帰着される。以上の研究成果は論文にまとめて投稿中である。このような組合せ論的な研究と平行して,大阪大学の永友清和氏と名古屋大学の土屋昭博氏と共同で,頂点作用素代数に基づく共形場理論の構成について一般的な研究を進めた。特に,楕円曲線上の理論の再定式化を行った。
骨髄異形成症候群(MDS)の分子基盤の解明

骨髄異形成症候群(MDS)およびその関連疾患は、骨髄不全と急性骨髄性白血病への進展を特徴とする、高齢者に好発する慢性骨髄性腫瘍である。MDSの主な死因である骨髄不全および急性白血病に関して、本研究課題において昨年度までに、全ゲノムおよびRNAシーケンスを含む世界トップレベルの遺伝子解析技術とマウスモデルを駆使した手法を用いて、多様な遺伝子変異がMDSを発症させ、MDSを白血病へ進展させるメカニズムについて明らかにした。本年度は、その成果に基づき、以上の解析結果を臨床情報と併せて解析することにより、予後を規定する遺伝子変異および発現異常の臨床的なインパクトを確認した。スプライス因子の変異に関しては、マウスモデルによる基礎的な機能解析を行い、変異マウスに特徴的なスプライス異常と、造血障害を確認した。さらに、コヘシン変異のマウスモデルに関しては、合併する変異とのマウスの交配を行い、詳細な機能解析を行った。その結果、コヘシン変異にRUNX1変異が合併することにより、コヘシン変異単独に比較して、DNAの三次元構造に著明な変化をみとめた。この三次元構造の変化は、付属するヒストン修飾蛋白の機能を変化させ、エピジェネティックな機序によりMDSから急性白血病への進展に関与する遺伝子発現に異常を起こし、臨床経過と関連することを明らかにした。この結果は学会発表をへて、現在論文化の予定である。このほか、最も予後が不良であることが知られているTP53変異陽性のMDSに関しても、その予後解析を詳細に行い、典型的な複雑核型をともなわないTP53変異陽性MDSの特徴について、国際共同研究を行い論文化し報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1MDSにおける集団内多様性とクローン進化の解析: MDSから進展したAMLの症例に進展した患者の剖検例について、直接的な多数サンプリングに関する全エクソンシーケンスによって、MDS/AMLでは空間的な多様性が生じていることが明らかとなった。再生不良性貧血(AA)については439例のシーケンス解析から、AAからMDSに至る過程で生じるクローン進化についてその全体像の解明を行った(NEJM in press)。2変異RNAスプライシング因子の遺伝子標的の同定: 200例のMDS患者試料についてRNA sequencingを行い、スプライシング因子の変異がRNAスプライシング及ぼす効果を解析した。SF3B1変異例では、特徴的に3'スプライス部位のご認識が生じ、3'側の新たなスプライス部位が認識されることによって異常なトランストランスクリプトが生ずること、一方、SRSF2変異例では、エクソンの脱落や挿入が多数の遺伝子で生ずることが明らかとなった。またSF3B1変異例では3つのヘム合成に関わる遺伝子のミススプライシングが生じ、これらがこれらの変異に特徴的な環状鉄芽球の生成に重要な役割を担う可能性が示唆された(投稿準備中)。3マウスモデルを用いた解析:主要な変異RNAスプライシング因子(sf3b1, srsf2, u2af1およびzrsr2)およびCohesin (smc3/stag2 cKO)、setbp1(cKOおよびD866N)に関してこれらの欠失アレルおよび機能獲得型アレルの構築を行い、B6系統への戻し交配が進行中である。Srsf2 P95H変異体マウスについてはその造血系の表現型の解析を行った。同マウスは、軽度の貧血を除いて末梢血には大きな変化を認めなかったが、造血幹細胞の造血再構築能の低下、幹細胞分画の数の低下、RNAスプライシングの異常が確認された。1MDSにおける集団内多様性とクローン進化の解析: MDSから進展したAMLの症例において、剖検時に異なる骨髄の部位および末梢血より直接的に多数サンプリング(5か所以上)を行った。各検体について全エクソンシーケンスを施行し、MDS/AMLでは空間的な多様性が生じていることが明らかとなった。さらに、前MDS状態とみなされる再生不良性貧血(AA)については439例のシーケンス解析により、AAからMDSに至る過程で生じるクローン進化についてその全体像の解明を行い、論文を発表した(Yoshizato et al. NEJM 2015)。2変異RNAスプライシング因子の遺伝子標的の同定: 200例のMDS患者および複数例の健常者の試料についてRNAシーケンスを行い、スプライシング因子の変異がRNAスプライシングに及ぼす効果を解析した。特に、骨髄単核球のみならず、造血幹細胞分画についても同様の検討を行った。SF3B1変異例では、野生型例に比較して、特徴的に3'スプライス部位の誤認識がおこり、異常なトランスクリプトが生ずることを明らかにした。実際に、3つのヘム合成に関わる遺伝子のミススプライシングが生じ、これらがこれらの変異に特徴的な環状鉄芽球の生成に重要な役割を担う可能性が示唆された(投稿準備中)。一方、SRSF2変異例では、変異タンパクが認識する部位のモチーフに基づき、エクソンの脱落や挿入が生ずることが明らかとなった。1MDSにおける集団内多様性とクローン進化の解析については、概ね予定どおり研究が進捗している状況である。集団内多様性の検討は、複数例にて検体を採取しエクソームシーケンスにて解析した。さらに、再生不良性貧血からMDSへのクローン進化の研究については、クローン進化について詳細に明らかにすることができ、今年度NEJM誌へ掲載され、予想以上の成果がえられたと考えている。

2変異RNAスプライシング因子の遺伝子標的の同定についても200例以上のMDS患者試料および健常者コントロールの検体に関するRNAシーケンスの解析がほぼ終了した。最も頻度の高いスプライシング変異(U2AF1, SRSF2, SF3B1)においては、特徴的なスプライシング異常の解明と標的遺伝子が同定され、この点では予定通りの進捗が認められている。特にSF3B1変異においては病態と深く関わる遺伝子にスプライシング異常が検出され、大きな成果が得られたと考えている。3マウスモデルを用いた解析:MDSにおける主要な変異のうち、RNAスプライシング因子(sf3b1, srsf2, u2af1およびzrsr2)およびCohesin (smc3/stag2 cKO)、setbp1(cKOおよびD866N)に関してこれらの欠失アレルおよび機能獲得型アレルの構築を行い、B6系統への戻し交配がほぼ終了している。現在、setbp1およびzrsr2に関しては、造血細胞の形質を解析する準備を進めている。さらに研究が先行しているSrsf2 P95H変異体マウスについては、スプライシング異常を解析可能な状況となっており、全体として、おおむね順調に進捗しているものと考えられる。骨髄異形成症候群(MDS)は、骨髄不全と急性骨髄性白血病(AML)への移行を特徴とする、高齢者に多い慢性骨髄性腫瘍である。本研究では、近年の申請者らの研究成果(Yoshida et al., Nature. 2011)を踏まえ、RNAスプライシング因子の変異と、それらと共存する遺伝子変異が、どのようにしてMDSの発症を誘導し、白血病への進展が生ずるのかについて、世界トップレベルのゲノム解析技術を駆使した遺伝学的解析を通じて明らかにした。MDSにおける世界最大数204例の全エクソームシーケンス解析により、変異の数は、低リスクMDS期(一症例あたり6.4個)に比較し二次性AML期(12.7個)において、有意に増加していた(Makishima et al, Nat Genet. 2017)。続いて、病期進行に伴いどの遺伝子に異常が獲得されるのかについて検討するため、標的遺伝子シーケンスとしては、これまでの世界最大コホートである2,250例を解析した。高リスクMDS例から二次性AMLに進展する際に高頻度に獲得されるタイプ1異常(FLT3, PTPN11, WT1, IDH1, NPM1, IDH2, NRAS変異)と、低リスクMDSから高リスクMDSへ進行する際に獲得されるタイプ2異常(TP53, GATA2, KRAS, RUNX1, STAG2, ASXL1, ZRSR2, TET2変異)を明らかにした。タイプ1異常陽性の症例は、陰性の場合よりも白血病になりやすく早期に死亡し、タイプ2異常陽性の症例は、タイプ1が陽性の場合よりもインパクトは弱いものの他の異常よりも白血病になりやすいことが明らかにされた。以上の結果は今年度Nature Genetics誌へ掲載され、一定の成果が得られた。MDSにおける集団内多様性とクローン進化の解析については、概ね予定どおり研究が進捗している状況である。集団内多様性の検討は、複数例にて検体を採取しエクソームシーケンスにて解析した。
溶媒粘度による光電子移動反応の制御

粘度の高いエチレングリコール(EG)を溶媒に用いて、(i)電子受容性消光剤としてランタノイドイオン(Eu^<3+>,Yb^<3+>)を、電子供与性蛍光体として種々の芳香族分子を用いた系について蛍光消光電子移動を調べ、蛍光消光の速度定数(k_q)、消光距離(r_q)、そして蛍光消光一回当たりの三重項収量(Φ_T)とフリーラジカル収量(Φ_R)を測定した。また、(ii)電子受容性蛍光体、電子供与性消光剤ともに芳香族分子を用いた系についても同様の測定を行った。k_q vs. ΔG(電子移動反応の自由エネルギー変化)のプロットからk_qはΔG<-1.2eVの領域においてk_q=k_<dif>(拡散律速)であることがわかった。しかし、down-hill領域は(ii)の場合にΔG>-0.4eV、(i)の場合にΔG>-1.4eVと異なっている。また、ΔGがより負になるにつれてΦ_Tは減少し、Φ_Rは増加する。これらの結果は、r_qのΔG依存性の結果も考慮すると、消光機構はΔGに依存し、ΔG≒-1.4eVで消光機構が切り替わることを示している。ΔG<-1.4eVの領域における消光機構は長距離電子移動であり、ΔG>-1.4eVの領域においてはExciplex形成である。しかし、ΔG>-1.4eVの領域の全ての系でExciplex蛍光は検出されなかった。ランタノイドイオンを消光剤として用いた場合、Exciplexは[D^<δ+>A^<(3-δ)+>]という電荷分布を取るので、クーロン反発力により不安定化し、寿命が非常に短くなることが示唆された。また、ランタノイドイオンのEG溶液の粘度測定によって、ランタノイドイオンの濃度が高くなるにつれてEG溶液の粘度が高くなることがわかった。この事実は、ランタノイドイオンとEGの間に強い相互作用があることを示している。(i)の系においてdown-hill領域が拡大した理由として、ランタノイドイオンのサイズが小さいことによる溶媒の再配向エネルギーが大きくなること、そして、この強い相互作用による蛍光体とランタノイドイオンの直接接触の阻害によって、k_qの値が小さくなることが考えられる。粘度の高いエチレングリコールを溶媒に用いて、(i)電子消光剤としてEu^<3+>とYb^<3+>イオンを、電子供与性蛍光体として種々の芳香族分子を用いた系について蛍光消光電子移動を調べ、蛍光消光の速度定数(k_q)、消光距離、そして蛍光消光一回当たりの三重項収量とフリーラジカル収量を測定した。(i)、(ii)の測定で得られたk_qの値を蛍光消光電子移動反応の自由エネルギー変化ΔG_fに対してプロットを行い、系(i)、(ii)の相違を調べた。

さらに、これらのプロットを粘度の低いアセトニトリル中で得られた同様のプロットと比較した。系(ii)の場合、溶媒粘度の違いに起因する拡散係数の違いを考慮すれば、このプロットに対する溶媒粘度効果はほとんどないことがわかった。しかし、系(i)の場合はこのプロットに対して、溶媒粘度の違いに帰することのできない溶媒粘度効果を見いだすことができた。Downhill regionにおける電子移動消光は主としてExciplex形成によることを考慮すると系(ii)の場合、高粘度溶媒中でもExciplexが形成されやすいことがわかる。しかし、系(i)の場合は、高粘度溶媒中でExciplexが形成されにくいことがわかる。その理由としては、ラジカルイオン対が共に正電荷をもつことになるので、クーロン反発力によりExciplexが安定化されないことの他に、高粘度溶媒であるエチレングリコールの特殊な性質の寄与があると考えられる。また、系(i)のDownhill regionがΔG_f=-1.0eVまで拡大しているのは芳香族分子より金属イオンのサイズが小さいことによると考えられる。粘度の高いエチレングリコール(EG)を溶媒に用いて、(i)電子受容性消光剤としてランタノイドイオン(Eu^<3+>,Yb^<3+>)を、電子供与性蛍光体として種々の芳香族分子を用いた系について蛍光消光電子移動を調べ、蛍光消光の速度定数(k_q)、消光距離(r_q)、そして蛍光消光一回当たりの三重項収量(Φ_T)とフリーラジカル収量(Φ_R)を測定した。また、(ii)電子受容性蛍光体、電子供与性消光剤ともに芳香族分子を用いた系についても同様の測定を行った。k_q vs.ΔG(電子移動反応の自由エネルギー変化)のプロットからk_qはΔG<-1.2eVの領域においてk_q=k_<dif>(拡散律速)であることがわかった。しかし、down-hill領域は(ii)の場合にΔG>-0.4eV、(i)の場合にΔG>-1.4eVと異なっている。また、ΔGがより負になるにつれてΦ_Tは減少し、Φ_Rは増加する。これらの結果は、r_qのΔG依存性の結果も考慮すると、消光機構はΔGに依存し、ΔG≒-1.4eVで消光機構が切り替わることを示している。ΔG<-1.4eVの領域における消光機構は長距離電子移動であり、ΔG>-1.4eVの領域においてはExciplex形成である。しかし、ΔG>-1.4eVの領域の全ての系でExciplex蛍光は検出されなかった。ランタノイドイオンを消光剤として用いた場合、Exciplexは[D^<δ+>A^<(3-δ)+>]という電荷分布を取るので、クーロン反発力により不安定化し、寿命が非常に短くなることが示唆された。また、ランタノイドイオンのEG溶液の粘度測定によって、ランタノイドイオンの濃度が高くなるにつれてEG溶液の粘度が高くなることがわかった。この事実は、ランタノイドイオンとEGの間に強い相互作用があることを示している。(i)の系においてdown-hill領域が拡大した理由として、ランタノイドイオンのサイズが小さいことによる溶媒の再配向エネルギーが大きくなること、そして、この強い相互作用による蛍光体とランタノイドイオンの直接接触の阻害によって、k_qの値が小さくなることが考えられる。
マウスモデルを用いた睡眠時無呼吸症候群の病態解明

睡眠は脳にとって、その機能を維持するのに必要不可欠な生理機能である。また睡眠障害に由来する居眠り等は交通事故などの原因となって、経済的損失をもたらす社会的問題でもある。中でも睡眠時無呼吸症候群(Sleep Apnea Syndrome : SAS)は、睡眠中に無呼吸・低呼吸が起こるために睡眠が障害される疾患で、一般の少なくとも数%が罹患している最も頻度の高い睡眠異常の一つである。またSASにおいては、正常な睡眠が取れない上に、無呼吸による睡眠中の血中酸素濃度の著しい低下および血中二酸化炭素濃度の著しい上昇が起こっており、身体に何らかの障害が生じていることが考えられる。そこで研究代表者は、マウスの脳波と筋電図を計測しながらリアルタイムで睡眠を自動で判定し、その結果に基づいてマスフローコントローラーを制御することにより、マウス・ケージ内の酸素濃度、二酸化炭素濃度を自在にコントロールできるシステムを開発した。このシステムを用いて睡眠時のみに低酸素や高二酸化炭素を吸気させて覚醒させ、長期間・自動でマウス睡眠を障害することができる。これはブレイン・マシン・インターフェースを用いた新しい睡眠障害システムである。ヒトのSASにおいては、気道閉鎖による低酸素や高二酸化炭素状態が原因となって睡眠を妨げているため、この実験系はSASのマウスモデルと考えられる。これによりSASがどのような生理学的・生化学的な影響を与えているかが解明できる。マウスで酸素濃度・二酸化炭素濃度の双方を制御してSASの病態を再現するモデルは我々のシステムが初めてのものである。このシステムを用いて1週間マウスの睡眠を障害したところ、血圧が上昇することが明らかとなってきた。今後はこの実験系を用いてさらに解析することにより、睡眠呼吸障害と生活習慣病(メタボリックシンドローム)との関係を解明することが期待される。マウスの脳波と筋電図を計測しながらリアルタイムでコンピュータにより解析し、吸気中の酸素・二酸化炭素濃度を自在にコントロールする実験系を作成した。それを用いて長期に睡眠を障害した際に生じる変化を解析することにより、睡眠調節機構を解明することを目指している。睡眠時に低酸素・高二酸化炭素を投与することにより睡眠を障害出来ることは既に確認済みであった。ヒトの睡眠呼吸障害(眠気を伴えば睡眠時無呼吸症候群)において、気道の物理的閉塞により低酸素血症及び高二酸化炭素症をきたし、その覚醒効果によって睡眠が障害されることが病態の中心と考えられている。我々の実験系によりマウスの睡眠を障害すると、障害中止直後に著明な睡眠の増加を認め、強い眠気を来していると考えられるので、我々の実験系はヒトの睡眠呼吸障害及び睡眠時無呼吸症候群の病態をよく再現していると考えられる申請時には1匹を対象とした実験系を稼働させていたが、平成16年度中に同時に34匹を実験出来るよう改良した。また、高二酸化炭素投与にては酸素飽和度の低下はないが、低酸素投与すると投与する酸素濃度が14%以下になると著明な低酸素血症を来すことが明らかとなった。睡眠調節には概日リズムの調節機構も関与している。中枢における概日リズムの制御機構は遺伝子レベルで解明されつつあるが、末梢での同調機構については不明な点が多い。そこで、末梢におけるリズム調節の同調がどのように行われているかを解明するために、培養細胞(NIH3T3細胞)・マウス個体における種々の時計遺伝子の発現量の変化、および、マウス個体の活動量の変化を解析した。その結果、プロスタグランジンE2(PGE2)が末梢の概日リズムを同調する作用があることを見出した。

中でも睡眠時無呼吸症候群(Sleep Apnea Syndrome : SAS)は、睡眠中に無呼吸・低呼吸が起こるために睡眠が障害される疾患で、一般の少なくとも数%が罹患している最も頻度の高い睡眠異常の一つである。またSASにおいては、正常な睡眠が取れない上に、無呼吸による睡眠中の血中酸素濃度の著しい低下および血中二酸化炭素濃度の著しい上昇が起こっており、身体に何らかの障害が生じていることが考えられる。そこで研究代表者は、マウスの脳波と筋電図を計測しながらリアルタイムで睡眠を自動で判定し、その結果に基づいてマスフローコントローラーを制御することにより、マウス・ケージ内の酸素濃度、二酸化炭素濃度を自在にコントロールできるシステムを開発した。このシステムを用いて睡眠時のみに低酸素や高二酸化炭素を吸気させて覚醒させ、長期間・自動でマウス睡眠を障害することができる。ヒトのSASにおいては、気道閉鎖による低酸素や高二酸化炭素状態が原因となって睡眠を妨げているため、この実験系はSASのマウスモデルと考えられる。これによりSASがどのような生理学的・生化学的な影響を与えているかが解明できる。マウスで酸素濃度・二酸化炭素濃度の双方を制御してSASの病態を再現するモデルは我々のシステムが初めてのものである。このシステムを用いて1週間マウスの睡眠を障害したところ、血圧が上昇することが明らかとなってきた。ヒトSASは二次性高血圧の原因とされており、その発症メカニズムに迫れると考えている。このSASの病態を再現する実験系を用いて、二次性高血圧を筆頭に合併症の成因を含むSASの病態解明に貢献していきたい。
超越整函数の無理的中立周期系と複素力学系の解析的研究

複素力学系とネヴァンリンナ理論の間の辞書の構築を行った.さらにその数論における類似にも理論を拡大した.複素力学系に現れる数論的問題である無理的中立周期系の解析的線型化問題を有理函数のみならず超越整函数に対しても研究し、とくに自然な幾何学的有限性のもとでこの問題を解決した.一方、この問題をネヴァンリンナ理論の手法を用いても研究し、70年来の古典的結果を大きく改良することに成功した.さらにこの研究を複素力学系とネヴァンリンナ理論の横断的研究へと発展させ、数論における類似とも併せて辞書を構築した.具体的には、超越整函数の無理的中立周期系の複素力学系の解析的研究の基礎をなす、有理函数の平均化値分布の極限測度を多重ポテンシャル論の観点から研究し、それにより理論の再構成を行った。その結果、反復合成の力学系に対しては代数的、力学系的、ネヴァンリンナ理論的にそれぞれ定義される種々の例外値集合が全て一致すること、特に高々2点からなるという結果を得た.さらに遂次合成列の力学系に対してもそれらの自然な包含関係を明らかにし、それら例外値集合が全て可算的であるというネヴァンリンナ理論的に根本的な問題を解決した.同時に、公理論的ポテンシャル論の収束定理をこれらの結果から見直すことで新たな研究結果を多数得た.とくに複素力学系と解析数論の中心的研究対象である、回転領域の上でのポテンシャルの収束に関する研究結果を得た.本年度は超越整函数の無理的中立周期系の複素力学系の解析的研究の基礎をなす、有理函数の平均化値分布の極限測度に関して以下の研究結果を得た。リーマン球面上の有理函数の2次元複素ユークリッド空間への持ち上げから生じる円盤状領域を斉次対数ポテンシャル論を用いて研究することにより、有理函数の平均化値分布の極限測度の存在と一意性を1次元複素ユークリッド空間上の多項式の場合と全く同様の形でポテンシャル論的に証明し特徴づけ両者を統合することに成功した。また、擬似フラクタル集合である、有理函数の複素力学系のジュリア集合を、有理函数の平均化値分布の極限測度を用いて値分布理論的、スペクトル幾何学的に研究し、ジュリア集合に属するクレーマー周期系に関する、従来の解析数論による研究結果をネヴァンリンナ理論の観点から進展させることに成功した。その結果、反復合成の力学系に対しては代数的、力学系的、ネヴァンリンナ理論的にそれぞれ定義される種々の例外値集合が全て一致すること、特に高々2点からなるという結果を得た.さらに遂次合成列の力学系に対してもそれらの自然な包含関係を明らかにし、それら例外値集合が全て可算的であるというネヴァンリンナ理論的に根本的な問題を解決した.同時に、公理論的ポテンシャル論の収束定理をこれらの結果から見直すことで新たな研究結果を多数得た.とくに複素力学系と解析数論の中心的研究対象である、回転領域の上でのポテンシャルの収束に関する研究結果を得た.
白血病細胞の生存に対する骨関連細胞の関与

白血病細胞のニッチを解明するため、骨芽細胞、破骨細胞、骨片および白血病細胞の共培養系を樹立した。本実験系を用いて、骨芽細胞は白血病細胞の増殖を促すこと、骨から破骨細胞がTGF-・・を組みだし、そのTGF-・・によって白血病細胞は休止期に入り、ABL阻害剤に耐性を獲得することを明らかとした。慢性骨髄性白血病(CML)の完治には、CML幹細胞の根絶が必要と考えられる。しかしABLチロシンキナーゼ阻害剤(TKIs)はCML幹細胞に効果がないことが明らかにされ、ABLTKI単剤ではCMの完治が困難と予測される。CML幹細胞は、ニッチと呼ばれる部位に存在し休止期を保ち、各種抗がん剤の攻撃から自身を守っていると考えられている。正常造血幹細胞のニッチは、主に骨芽細胞(OB)が形成することが報告されている。しかし、CML幹細胞のニッチに関しては、未だほとんど不明である。CML幹細胞のニッチに対するOB、破骨細胞(OC)、骨組織などの骨関連細胞の関与を明らかにするため、実験を行った。TypeIコラーゲンゲル500μLを12穴トランスウェルの底面にコーティングし、マウス大腿骨を設置、OB、マウス骨髄細胞を添加し、ビタミンD_3およびプロスタグランディンE_2存在下でOCを分化誘導する。CML細胞(Ba/F3/wt bcr-abl)を1×10^4個/wellを加え、経時的に生細胞数と細胞周期を計測した。本実験によって、OBはCML細胞の増殖を促進し、骨組織からOCによって汲み出されるTGF-βがCML細胞を休止期に誘導することで、増殖が抑制されることが明らかとなった。また、CML細胞、OB、OC、骨組織の共培養系を容量240nLのナノチャンバー内での再構築に成功した。さらにin vivoの実験を行い、ヌードマウスに皮下チャンバー(ゲルのみ)を留置し、尾静脈よりBa/F3/wt bcr-abl^<GFP>を移植すると、誘導された血管とGFP陽性細胞の生着が認め、ゲル内にOBを加えることで皮下チャンバー内のCML細胞の生着が増加することが明らかとなった。しかしABLチロシンキナーゼ阻害剤(TKIs)はCML幹細胞に効果がないことが明らかにされ、ABL TKI単剤ではCMの完治が困難と予測される。CML幹細胞のニッチに対するOB、破骨細胞(OC)、骨組織などの骨関連細胞の関与を明らかにするため、我々はOB,OC,骨組織と白血病細胞の共培養系を樹立し、白血病細胞を静止期に維持するためにOCが重要であることを明らかとした。さらにこれら骨関連細胞で形成される白血病細胞ニッチを攻撃し白血病細胞を殲滅するために、OCを特異的に阻害するビスホスホネート製剤ゾレドロン酸の効果を検討した。そしてゾレドロン酸は、新規ABLチロシンキナーゼ阻害剤ニロチニブの効果を相乗的に増強することを明らかとした。また、ニロチニブなどの新規薬剤でも克服できない変異ABLに対して、オーロラ阻害剤AT9283が効果を示すことや、OCが多数存在する骨端部の低酸素環境下での白血病細胞の動態を報告した。さらにゾレドロン酸は、骨関連細胞の腫瘍化である骨肉腫細胞に対して効果を有し、また放射線療法に対する効果を増強することも明らかにした。慢性骨髄性白血病(CML)の完治が難しい原因として、CML幹細胞は、ニッチに守られG_0期にあるために、ABLチロシンキナーゼ阻害剤の攻撃を受けないと考えられている。我々は、より生理的な環境下で白血病細胞ニッチの研究を行うため、骨芽細胞、破骨細胞、骨片と白血病細胞の共培養系を構築した。そして破骨細胞が骨内のTGF-βを吸い上げ、培養液中に放出し、白血病細胞をG_0期に誘導することを報告した。本年度の共培養系を用いた研究により、破骨細胞周囲に接着している白血病細胞はABL阻害剤・ニロチニブに暴露されても死滅され難いことが分かった。In vivoにおいて破骨細胞を阻害するビスホスホネート製剤・ゾレドロン酸を投与すると、共培養系内の破骨細胞もやはり死滅した。ニッチを構成すると考えられる破骨細胞が死滅したことにより、白血病細胞はニロチニブに対する感受性を回復した。以上の結果から、破骨細胞がくみ出すTGF-βがニロチニブの治療抵抗性に重要であることが明らかとなったため、単純なinvitro実験系でTGF-βの関与について再検討を行った。

骨関連細胞を含まない培養系において、ゾレドロン酸はニロチニブの作用を相乗的に増強したが、TGF-βを添加することで、この併用効果はキャンセルされ、逆にゾレドロン酸はニロチニブと拮抗作用を示した。本結果は、白血病細胞に対する併用効果を検討する際に、単純なin vitroの系だけでは不十分であり、今回我々が用いたような共培養系下での検討も必要であることが示唆された(論文準備中)。またがん細胞がゾレドロン酸に暴露した際に放出するイソペンテニルピロリン酸濃度の測定を可能にした。過去の報告と以上の結果を合わせ、白血病細胞の殲滅には破骨細胞を除去することが不可欠と考え、特に破骨細胞がその病態と密接に関与する成人T細胞性白血病に対して、抗がん剤治療にゾレドロン酸を併用する臨床試験を開始した。