hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IGSF1異常による新たなX連鎖性中枢性甲状腺機能低下症の概念の確立と病態解明

この変異WDR11の機能、IGSF1とWDR11の下垂体での発現、相互作用について検討を開始している。GH3細胞にPOU1F1プロモータールシフェラーゼベクターとIGSF1遺伝子を共発現を行い、アクチビン、TGF-βによる刺激で、POU1F1プロモーターのルシフェラーゼ活性を検討したが、活性化はわずかであった。また各IGSF1変異体(R1189X,V1082E, Q665X)とのルシフェラーゼ活性の差は認めなかった。IGSF1異常症により、中枢性甲状腺機能低下症が発症することを日本で初めて明らかにした。またIGSF1異常は重症であり、乳幼児期早期の成長障害、精神運動発達の遅れを示すことがある。そのため、新生児マススクリーニングのよりTSH, FT4を同時に測定し、早期発見が重要であることを提唱する。そしてIGSF1はサイロトロープの増殖分化に関与する可能性を示した。1.中枢性甲状腺機能低下症におけるIGSF1異常の意義を明らかにした。2.IGSF1異常は重症であり、乳幼児期早期の成長障害、精神運動発達の遅れを示す。見逃された場合には永続的な精神発達の遅れを示すことを明らかにした。3.IGSF1異常症の遺伝子変異は遺伝子欠損、変異であり、すべてC末に存在する。従ってC末の重要性であることを明らかにした。また日本での変異のhot spotがないことも示すことができた/4.すべの症例プロラクチンの分泌不全を起こす。従ってIGSF1がプロラクチン分泌にも関与することが明らかになった。5.IGSF1がTGFβを介してシグナル伝達に関与する可能性が示唆された。小児内分泌1.本邦でのIGSF1異常症の頻度を明らかにするため、遺伝子診断を積極的に行う。小児内分泌学会、臨床遺伝子診療部全国会議などを通じてIGSF1遺伝子解析が研究として、倫理審査のもと行われていることを明らかにし、症例の集積を一層加速させる。る。3.TGF- βスーパーファミリーは細胞の増殖、分化、アポトーシスの制御に重要な役割を果たしている。さらに多くの細胞の増殖を抑制あるいは、細胞外マトリックスの産生などにも関与する。TGFβがパラクラインに下垂体サイロトロープ、ラクトトロープに作用している可能性がある。したがってIn vivo解析でその機序の解明を行う。正常マウスにおけるサイロトロープIgsf1発現の胎児期から経年的変化の検討、ノックアウトマウス(以下KOマウス)における下垂体TSH、PRL発現の変化の検討、サイロトロープのTGF- βの発現をreal time PCR,ウェスタンブロットにて検討してゆく。1年目において上記の記載したように、臨床病態、欠損ホルモン、遺伝子異常との関連についてほぼ解析することが可能であった。従って概ね1年目の目標は到達したと考えられる。研究分担者(学外)の下垂体組織の免疫染色について、研究代表者の研究室で、研究分担者と共同で行ったため、分担者の研究費を使うことなく、繰り越しを行った。今後はさらに病態把握、実態調査を行うために、アンケート調査による全国的な発症について検討する予定である。現在までIGSF1の機能は不明であるが、インヒビンのコレセプターとして同定された経緯がある。
RNA腫瘍ウイルスの増殖をトランスに抑制するエンベロ-プ蛋白質変異体の解析

我々の教室で樹立されたフレンドウイルス変異株の1つは6960番目の塩基に点変異を持つため、Env蛋白質361番目のアミノ酸がシステインからアルギニンへと変異している。この変異Env蛋白質(FCr)は分子内および分子間S-S結合により多量体を形成し、粗面小胞体(ER)に蓄積する。DNAトランスフェクションによりモロニ-白血病ウイルス(Mo-MLV)が慢性感染したNIH3T 3細胞にFCrを導入すると、Mo-MLV Env蛋白質とFCrがヘテロ複合体を形成し、Mo-MLVのEnv蛋白質の大部分もERにトラップされる。その結果、培養上清中に産生されるMo-MLVの感染価が約百分の一に下がる。Mo-MLV Env蛋白質とFCrのヘテロ複合体形成はFCr-LCK融合タンパク質を用いたepitope taggingによっても証明できた。一方、FCrを発現させたNIH3T3細胞に後からMo-MLVを感染しようとしても、ほとんど感染させることができない。感染初期の複製中間体DNAの形成が認められないことから感染の初期過程の阻害であり、FCrがエコトロピックMLVレセプタ-とER内で結合し、レセプタ-をERに捕捉するためと考えられる。以上のようにFCrは1個の変異でウイルス増殖過程の2箇所を抑制する、我々の知る限り最初の、ドミナント・ネガティブ変異体である。FCrの作用はエコトロピックMLV特異的で、レトロウイルスベクタ-に組み込んだFCrとアンフォトロピックMLVパッケ-ジング細胞を用いてFCrを遺伝子に持つレトロウイルス粒子を作った。感染により培養細胞にFCrを強制発現させ、対照細胞集団に比べてMo-MLVに対する抵抗性を獲得させることができるようになった。
迅速･高感度PET検査による脳動静脈奇形の機能的循環代謝評価

迅速、かつ高感度化PET装置での定量精度が確保され、従来から限界要因となっていた脳血液量補正法の改良がなされた新法(DBFM法)による15O標識ガス吸入PET検査を用いることで、脳動静脈奇形(AVM)における特に病変部(nidus)近傍の脳循環代謝を評価し、その臨床的意義を明らかにすることを目的に、8例の患者においてDBFM法と従来法(DARG法)での検査パラメータの比較をおこなった。その結果、nidusより遠隔部では両検査法は高い相関を示したが、nidus周囲における評価では、従来法では新法よりも過大評価する傾向にあり、新法においてより正確な評価ができる可能性が示唆された。平成25年度はまず脳動静脈奇形患者に対する安静時15O標識ガス吸入PET検査を開始した。これまでに当院で精査をおこなった12例のAVM症例においてPET検査を施行している。当該研究費を利用して画像所見をデータベース化し、ワークステーション上での頭部MRI画像とのregistration作業を完了した。今後、region of interestの設定をおこない、臨床症候(出血、てんかん、頭痛)やAngiography所見(high flow/low flow AVM、静脈灌流障害の有無など)との関連を検討するための準備をおこなった。また、上記登録症例のうち2例で開頭摘出術、4例でガンマナイフ、7例で経過観察(過去の治療後の経過観察を含む)をおこなっており、臨床経過との関連についても検討していく予定である。本研究の目的は、脳循環代謝評価におけるgold standardである15O標識ガス吸入PET検査において、従来からの限界要因となっていたCBV補正法を改良し、AVM周囲の脳組織における脳循環代謝を詳細に検討することである。平成26年度は脳動静脈奇形患者に対する安静時15O標識ガス吸入PET検査を継続した。PETの撮像法に関して、脳血液量の補正を改良した新法(DBFM法)と従来法(DARG法)との比較を中心にregion of interest解析をおこない、nidusより遠隔部では両検査での測定値に高い相関性を認めたが、nidus近傍ではその相関性が低下し、DARG法で過大評価する傾向であることを確認した。本解析結果を複数の国内学会、研究会で報告した。26年度が最終年度であるため、記入しない。脳循環代謝26年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画時に想定していたよりも症例集積に若干の遅れがあると思われる。特に治療(摘出術)症例の集積が少ないが、症例は当科での臨床症例に依存しており、また近年無症候性脳動静脈奇形に対する積極的治療に関して否定的な大規模研究の結果が報告されたことも影響している可能性がある。また、eloquent領域の病変における機能的賦活PET検査に関しては、当初計画していた運動に関わるeloquent領域に病変を持つ適切な症例が得られていないため、現段階では計画は進行していない。ただし、得られたPET画像データに関してはMRIとのregistration作業が完了しており、解析準備は進んでいる。今後、まずは安静時15O標識ガス吸入PETで得られたデータをもとに、1臨床症候やAngiography所見との関連や2従来の画像解析方法との比較をおこない、また3他の脳循環代謝画像(IMP-SPECTなど)との比較によるvalidationをおこない、研究成果を発表する予定である。また、登録症例のフォローアップデータを集積していく。さらなる症例集積をおこない、特に運動に関わるeloquent領域に病変を持つ症例に関しては、機能的賦活PET検査の実施や多のmodality(MRI tensor imagingなど)との関連についても可能であれば検討したい。
心停止者を肝移植ドナー・ソースとする方法の開発

心停止者の肝を同所性に移植すると,脳死者の場合より類洞内皮細胞障害が高度に生じる。従って,心停止者の肝を肝移植に用いる場合には,類洞内皮細胞を保護することが必須となる。類洞内皮細胞の生存,維持にはVEGFが必須である。また,VEGFは類洞内皮細胞の増殖を促進するが,その一方でporosityを増大し,また,そのpericyteである星細胞の収縮を抑制することによっても,類洞血流を調節することが判明した。しかし,冷保存肝では肝細胞におけるVEGF発現は増強していたが,類洞内皮細胞はその障害に先行してVEGF受容体の発現が消失していた。従って,VEGFが存在しても有効に作用し得ないことが,類洞内皮細胞障害の要因となる可能性がある。さらに、外因性にVEGFを補充することではそのviabilityを維持するのは困難と考えられた。移植肝ではクッパー細胞が活性化しており,これも類洞内皮細胞障害の要因になる。活性化クッパー細胞はオステオポンチンを発現することを見出した。本因子はTh1免疫応答の開始に必須のサイトカインであるが,遺伝子型の異なるマウスを用いた検討からマクロファージの肝浸潤に必須のケモカインであることも証明した。従って,オステオポンチンの発現を調節することで,クッパー細胞を介した類洞内皮細胞障害を制御できる可能性がある。そこで,B6マウスのオステオポンチンcDNAをクローニングし,これを肝細胞に特異的なhuman serum amyloid P蛋白のプロモーターを有する発現ベクターに組み込み、トランスジェニックマウスを作成した。このマウスを用いることで,移植肝の内皮細胞障害における本因子の役割を検討中である。分子設計したVEGFの生理活性を生体内で評価するためには,本因子の作用点を把握しておく必要がある。そこで,各種プロテオグリカンの肝内分布やVEGFとの結合性を評価するに先だって,類洞内皮細胞の増殖以外にVEGFが作用を発揮し得るかの検討を行った。ラットの初代培養類洞内皮細胞は,10ng/mLのVEGFを添加するとviabilityが維持され,100ng/mLを添加した際には増殖した。走査電顕による観察下に小孔の数及び面積からporosityを計測したところ,100ng/mLのVEGFを添加すると,10ng/mL添加した場合に比して有意に高値になることが判明した。従って,VEGFは類洞内皮細胞の増殖を促進するのみならず,porosity増大から物質の透過性亢進にも作用すると考えられた。また,HUVECを用いた検討では,VEGF添加によりその受容体であるflt-1,KDR/flk-1のmRNA発現も増強することが明らかになった。また,VEGFを介する細胞内情報伝達はPKC,PLC-γ,MAPKの系を介することが報告されていたが,porosity増大や受容体の発現増強に関わるシグナルはこの系を介さないことも見出した。また,肝では類洞内皮細胞のみならず星細胞もVEGF受容体を発現することを見出した。VEGFは活性化星細胞に作用して,その増殖には影響を与えないが,平滑筋αアクチン発現の減弱から収縮を抑制することを明らかにした。その際,収縮抑制に関わるシグナルはPKC,PLC-γ,MAPKの系を介している可能性も見出している。以上の様に,肝におけるVEGFの作用点は多彩であり,分子設計したVEGFの生理活性も類洞内皮細胞とともに星細胞でも評価する必要があることが判明した。現在は,これらVEGFの作用機序に関する基礎検討とともに,各種プトテオグリカンの肝内分布に関する免疫電顕での実験を進行中である。心停止者の肝を肝移植に用いる際には,脳死者の場合より重篤である類洞内皮細胞の障害を予防する必要がある。

そこで,類洞内皮細胞の維持に必須であるVEGFの肝類洞に対する作用点を検討し,平成11年度は本因子が類洞内皮細胞の増殖を促進するのみならずporosityを増大させること,また,星細胞に対しては収縮を抑制するなど,血流調節にも寄与すること明かにした。この検討の過程で,類洞構造の維持には内皮細胞の維持,増殖のみでは不十分であり,pericyteである星細胞との相互作用により類洞を構築することが重要であることを見出した。平成12年度はこの点に関する検討を加えた。星細胞と類洞内皮細胞の相互作用に関わる因子としては,Angiopoietin(Ang)-1及び-2に注目した。Ang-1はpericyteの増殖と内皮細胞への裏打ち促進に,Ang-2はpericyteが血管からのdrop-outする過程に関与するとされる。70%部分切除ラット肝において,Ang-1,-2とその受容体であるTIE-1,-2の発現を定量的なcompetitive RT-PCRにより評価した。肝における両Angと受容体のmRNA発現は,VEGFの発現とほぼ一致して,類洞内皮細胞が増殖する時期の増強することを見出した。従って,類洞内皮細胞と星細胞が類洞を構築する過程でも,Ang・TIE受容体系が重要な役割を果たしている可能性がある。現在,免疫組織染色や単離肝構成細胞を用いたRT-PCRにより,Ang及びTIEの発現細胞を同定するとともに,その作用をin vitroで検討している。また,冷保存肝における検討も行い,類洞内皮細胞の保護に繋がるVEGFとAng系を介した治療法に関しても探索を行っている。心停止者の肝を肝移植に用いる際には,脳死者の場合より重篤である類洞内皮細胞の障害を予防するとともに,その再生を促進する方法を確立する必要がある。また,増殖した類洞内皮細胞はpericyteである星細胞とともに,類洞を再構築しなければならない。そこで,平成13年度はAngiopoietin(Ang)-1及び-2に注目して,肝類洞再構築の機序を検討した。先ず,ラットより単離した肝構成細胞におけるRT-PCRで,類洞内皮細胞と星細胞は両Angの受容体であるTIE-2mRNAを発現することを証明した。更に,70%肝部分切除や四塩化炭素投与を行ったラットで,類洞の再構築や毛細血管化が生じる時期には,肝における両AngとTIE-2のmRNA発現が増強することを明らかにした。内皮細胞へのpericyteの裏打ちにはAng-1が,drop-offにはAng-2が関与することから,肝でもAng-TIE受容体系が血管系の再構築に関与していると考えられた。現在,免疫組織染色により,蛋白レベルで両AngとTIE-2の発現変化を確認している。移植肝における類洞内皮細胞障害には活性化Kuppfer細胞が関与する。そこで,本年度はKuppfer細胞の活性化機構に関しても検討を追加した。Th1免疫応答の開始にはOsteopontinが必須であることから,そのトランスジェニック・マウスを作成した。このモデルを今後は肝移植実験に用いて,類洞内皮細胞障害の機構解明に役立てる予定である。
中東における国家安全保障と国民統合の課題―新たな平和構築・開発支援論

「アラブの春」後の中東は、シリア紛争をはじめとする中東における紛争の深化と政治・経済・社会情勢の不安定化により、異なる宗教間の争いのみならず、イスラーム教徒同志が戦う局面がおこった。そうした状況下、中東における国家の安全保障とトランスナショナルな市民社会運動はきわめて拮抗した関係になっていることが判明した。当該諸国に生きる人々の生活が安全にかつ平和的に継続するには、平和構築と開発支援のあり方が抜本的に変化する必要がある。本年度は、本事業の初年度であるため、当初の計画どおり、各分担者ともに各自の分担にそって予備調査を開始した。中西は、イランでの現地調査から、イラクでのイランのIS(「イスラム国」)との戦闘において、非国家組織でもある一方国家と一体化した組織でもあるイラン革命防衛隊の役割が大きい点、核交渉とイランの安全保障上の戦略とが連動している点を解明した。内藤は、トルコでの調査から、中東情勢が過去に例を見ないほど悪化し、従来の中東の秩序が崩壊しつつあるとの見解を出した。横田は、カイロで、ムスリム同胞団の傘下の医療NGOや同胞団関係政党にて聞き取り調査を実施した。その結果、現政権下でイスラーム主義運動の政治的周縁化が進む中、運動への根強い支持基盤が今も存在することを明らかにした。末近は、シリア内戦の現況を、国際関係論と安全保障研究の視点から分析し、イランとシリアの同盟関係が内戦の長期化、硬直化に作用していること、ヒズブッラーやISなどの非国家組織の役割が拡大していることを明らかにした。山根は、ロンドンの題詠図書館及びパキスタンのらーホールにあるイスラーム党(ジャマーアテ・イスラーミー)本部にて調査し、同党創設者で、現代イスラーム復興思想家アブル・アーラー・マウデゥーディー著作に関する調査、及び現在のパキスタンの治安、安全保障に関する調査を実施した。研究協力者のダニシマズ氏は、トルコの市民社会と権威主義化するトルコ政治の関係性について概況を把握する予備調査を実施した。総じて、平成26年度は、平成27年度の本格調査に向けた準備が順調に進んだと言える。25年度は本格調査の年度であった。中西はイランの国家安全保障の重要課題であるサウディアラビアとの関係改善、イラクでのISとの闘い、シリア和平問題への政策についてイランとレバノンで調査し、エネルギー分野の制裁解除に向けて核合意後は概して国際協調型路線にシフトした点,現政権が新たな中東外交を模索している点を明らかにした。内藤は,シリア内戦に端を発した大量難民の発生が2015年後半トルコからEU諸国への奔流となり、難民問題への対処が困難を極めるなか、送出国トルコ、通過国のスロベニアなどを対象に、難民問題が既存の国民国家体制に与える影響を分析した。トルコがEUとの難民問題交渉での存在感を高める一方、中東・欧州関係に新たな緊張を創出している点を明確にした。横田は、イスタンブルおよびラバトで、ムスリム同胞団メンバー・関係者との聞き取り調査を行い、エジプト国内での社会奉仕活動や国外での政治活動が継続されており、一定数の同胞団支持層が存続する点を指摘した。末近は、ロンドン大学SOASを拠点に、「アラブの春」後の政治的混乱期の中東諸国への援助や政治的関与を強める欧州のアラブ・ムスリム移民の活動を調査し、欧州でのイスラーム系NGOや国際NGOを通じた祖国への支援チャンネルの確立やベルベルの市民社会組織のネットワークの現状を分析した。山根は、憲法修正の動向が、宗教を掲げる過激派への批判が困難だったパキスタンの民主化に貢献した点を明らかにした。研究協力者の小山田は、インドネシアで研究者、NGO、政府職員と面談し、政府の安全保障問題に関与する市民社会の活動が限定的であることを明らかにした。塩崎は、クアラルンプール、スランゴールを中心に、国際イスラーム大学を拠点にイスラーム運動やNGOが行政との連携で地域住民の教育や治安へ組織化を調査した。ダニシマズは、トルコのギュレン運動への政府の政策を調査した。各分担者はそれぞれの研究領域及び分担された研究調査地での海外調査を予定通り実施し、その成果は論文や国際会議などで発信している。それぞれの分担者は基本的に分担されたテーマに沿って調査を実施した。エジプトやシリアなど治安の影響で調査が実施できない場合には、本研究課題の申請時に対応を想定したとおり、周辺国での調査に切り替えたり、シリア難民の流出が激しいヨーロッパでの調査に変えたりするなど柔軟に対応した。また、それぞれの分担者及び研究協力者は、著書、論文、国際会議での報告などの成果をあげている。さらに、最終年度での成果のとりまとめと国際会議の実施のために必要な国際的なネットワークを構築している。本研究の対象国家5カ国について、研究調査の結果、以下の点があきらかになった、第一に、ムスリム同砲団のような市民社会組織の場合、エジプトの政権交代(軍事政権化)後は国家の安全保障上の脅威として位置づけられ、それまでの国家の役割との補完関係は激減した。組織の活動はトルコなど中東の他の国家に移植されたため、活動の性格が大きく変化し、移転先の国家の安全保障との関係性が新たな課題として生じる。第二に、イランのようにシリア内戦の長期化とそれへの関与が深化するにつれ、准軍組織である革命防衛隊の重要性が国家安全保障上高まった。2013年の穏健派政権の樹立後実現した核合意により、イランの域内での脅威の認識やや減じられたが、スンニ派対シーア派の対立は激化した。

第三に、レバノンのようにシリア難民がレバノンの人口の20%を越える事態がシリア内戦の長期化でおこると、レバノン内の国内政治の派閥政治から派生している国民への資源配分の不均等性への国民の不満が高まり、国家安全保障上の脅威が内側から派生する結果となる。また、越境的組織であるヒズボラの活動の性格がシリア内戦への介入により激変し、中東域内での派閥対立事態となっている。第四に、トルコのように現政権の強権化は、ディアスポラ社会で活動を継続してきた市民社会組織への圧力を強化する結果となった。またシリア内戦の長期化により、越境的なテロ活動を行うPKKやISなどに対する政策が刻々と変化し、トルコの国家安全保障上の課題も変化せざるをえず、中長期的には内部矛盾をはらんでいる。第五に、パキスタンではこれまで軍事政権とイスラーム過激派組織との関係が対立と相互依存関係の両面を有し推移してきたが、2014年以降は後者の前者へのテロを展開し始め、より対立が深まった。その背景に軍事政権に対するアメリカの経済支援の問題があり、今後も部族地域で特に不安定化は進む。「アラブの春」後の中東は、シリア紛争をはじめとする中東における紛争の深化と政治・経済・社会情勢の不安定化により、異なる宗教間の争いのみならず、イスラーム教徒同志が戦う局面がおこった。そうした状況下、中東における国家の安全保障とトランスナショナルな市民社会運動はきわめて拮抗した関係になっていることが判明した。当該諸国に生きる人々の生活が安全にかつ平和的に継続するには、平和構築と開発支援のあり方が抜本的に変化する必要がある。研究代表者、分担者ともに当初の計画どおり、それぞれの分担地域及び研究領域において予備調査を実施した。詳細は、研究実績の概要どおりであるが、初年度である平成26年度は、主として1先行研究の調査、2平成27年度の本格調査に向けた予備調査を海外調査で実施すること、の2つを達成目標としていた。研究チームのメンバーは、1及び2ともに実施した。その結果。トランスナショナルな非国家組織、特にIS(イスラム国)の急激な勢力版図の拡大とともに、特にイラク、シリアにおいて、、各国の「国家の安全保障」を脅かす存在になったこと、それに伴う国家の安全保障のレジティマシーがトルコで問われる事態になったこと、ムスリム同胞団というエジプト国内で軍体制下でその活動が制限を受けている組織に対する人々の支持がいまだに大きいこと、イランの核問題が交渉国間で突破口が開けた一方、イエメンなどシーア派政権が暫定的に発足した国家において、イランとサウディアラビアのイラク及びシリアでの対立軸が発現したことで中東全体の安全保障が脅威に晒されている点などが明らかになった。こうした成果は、中東の国家安全保障とムスリム市民社会との錯綜した関係を洗い出すことが目的となっている本事業においては、変貌する中東の基盤的な見取り図となっている。平成28年度は、本課題の最終年度であり、過去2年間の研究成果をとりまとめ、発信するのが目的である。具体的には、2016年秋に国際会議を開催し、国内外の研究者を招聘し、その成果をプロシーディングとして出版する。また、3年間の研究成果として日本語による本の出版を準備する。また英語での出版についても計画している。28年度が最終年度であるため、記入しない。中東の国際政治と安全保障
ガレクチンによる糖鎖認識を介した白血球活性化の分子機構

変異体や各種阻害剤を用いた実験から、天然型galectin-9の持つtandem-repeat型構造およびgalectin-9と細胞表面のN-結合型糖鎖の相互作用が細胞死誘導に必須であることが示された。MOLT-4細胞の場合と同様、Jurkat細胞においてもgalectin-9刺激により細胞内カルシウム濃度の増大が観察された。またgalectin-9は、Jurkat細胞ミトコンドリアの膜電位の低下、ミトコンドリアからのcytochrome c、AIFの遊離、およびcaspase-3の活性化を促進した。しかし、各種caspase阻害剤の効果が限定的であることから、galectin-9はcaspase-依存性とcaspase-非依存性の2つの経路を介してJurkat細胞の細胞死を誘導していることが示唆された。galectin-9による細胞死誘導の詳細な分子機構に関しては依然不明な点が多いが、これらの結果は、細胞死に至るgalectin-9シグナルの伝達経路が、細胞の種類によって異なることを示している。本研究では哺乳類ガレクチンファミリーの役割、特にタンデムリピート型ガレクチン(galectin-8、-9など)の免疫系細胞の活性化と糖鎖認識を介した情報伝達機構の解析を行っている。これまで各種培養細胞を使って、galectin-9がT細胞(Jurkat,Molt-4)のアポトーシスと細胞接着の両応答を惹起し、galectin-8はT細胞、B細胞(Daudi, Namalwa)、単球(THP-1)などの細胞接着を誘導することを見出した。さらにJurkat T細胞をモデルに、galectin-8の細胞接着誘導に関与する候補分子の精製を試み、CD45やIntegrin-α4を同定できた。今回、細胞接着について、糖鎖認識特異性が異なる植物レクチンとも比較して、ConA,WGA,LCA,RCA-120などがJurkatの接着を誘導し、同時に各々がintegrin-α4と結合することが分かった。さらに、galectin-8による細胞接着がintegrin-α4とintegrin-β1に対する抗体で抑制されたことから、Jurkat細胞接着誘導にはintegrin-α4β1が主に関与しているものと考えられた。インテグリンはαおよびβサブユニットから構成され、細胞接着(機能発現)にはβサブユニットから繋がる細胞内情報伝達系の活性化が予想されたことから、細胞内情報伝達分子の解析も行った。インテグリンを介した細胞接着にはPyk2のようなFAKやその下流に位置するERK1/2のキナーぜ群の活性化が知られているが、galectin-8によってこれらのリン酸化(活性化)が惹起され、阻害剤でリン酸化と接着が同時に抑制された。従って、galectin-8による細胞接着誘導はインテグリンとの結合に始まる細胞内リン酸化カスケードの活性化とアクチンフィラメントの形成にあると考えられる。
ひずみ速度履歴の影響を受ける弾粘塑性波伝播のハイブリッド法に基づく数値解析

本研究の目的は、材料の高ひずみ速度下における構成則を精密な実験で明らかにして、正確な弾粘塑性波の伝播解析を実現することにある。高速変形域の構成方程式は単にその瞬間のひずみ速度に依存するだけでなく、ひずみ速度履歴の影響を受ける。本研究では、ひずみ速度急変試験、動的試験、静的試験後に動的再負荷を与える試験の3種類の実験を応力棒法に基づいて実施し、ひずみ速度履歴効果を明らかした。応力棒法は、長い試験片の端面で動的応力-ひずみ関係を正確に測定できると同時に、塑性ひずみ波の伝播も計測できる。弾性棒側で測定した端面の応力と試験片側の端面近くに貼ったゲージで直接計測したひずみのデータから定式化した粘塑性構成方程式を用いて、一次元境界要素と塑性変形による応力緩和項を分布させた領域要素とを結合したハイブリッド法による塑性波伝播解析を行った結果、試験片の端面近くでは、ひずみが急勾配になる事実が明らかとなった。そこで、ゲージと端面の間のひずみ分布に対する補正を伝播解析結果に基づいて行い、ひずみ速度依存性と履歴効果を表す正確な構成方程式を決定した。再度、この補正した構成方程式を用いて弾粘塑性波の伝播シミュレーションを行った結果、応力棒法に基づく衝撃ねじり実験において、試験片上の端面から離れた所で計測したひずみのデータと解析結果はよい一致を示すことが明かとなった。本実験結果を塑性波の伝播解析により補正して求めた構成関係は、過応力と塑性ひずみ速度の関係が線形に近いものであった。従って、本実験の高ひずみ速度域における微視的な転位の運動は、熱活性化過程より粘性抵抗機構で律則されているものと考えられる。そこで、熱活性化過程と粘性抵抗の両方の機構に基づく転位運動のモデルについて考察し、過応力と活性化エネルギーの関係を評価した。
新規核タンパク質修飾アルグピリミジン化による神経分化制御

近年、翻訳後修飾がタンパク質の機能を調節していることが明らかとなり注目されている。解糖系の副産物メチルグリオキサールは、タンパク質のアルギニン残基に結合してアルグピリミジンを形成するが、その生理的役割については全くわかっていない。本研究では神経細胞においてクロマチンリモデリング複合体の構成タンパク質のひとつがアルグピリミジン化されること、またそのタンパク質が神経分化に必須であることを明らかにした。申請者はこれまでに、GLO1蛋白質が、神経幹細胞が豊富に存在する脳室帯で非常に強く発現していることを見出した。GLO1は糖代謝産物メチルグリオキサールの解毒酵素である。細胞内にメチルグリオキサールが過剰に存在すると、蛋白質に結合してアルグピリミジン構造を形成する。そこで、脳組織におけるアルグピリミジンの分布を調べたところ、その分布は一様ではなく、分化した神経細胞に多く存在し、脳室帯ではわずかしか検出されなかった。つまり、GLO1が強く発現する脳室帯ではメチルグリオキサール修飾のひとつアルグピリミジン形成(以後、アルグピリミジン化と呼ぶ)があまり起こっておらず、逆にGLO1の発現量が低い神経細胞ではアルグピリミジンが多く形成していた。また、非常に興味深いことに、アルグピリミジンの局在は主に神経細胞の核に見られ、神経細胞の20種類以上の核タンパク質がアルグピリミジン化を受けていることが明らかとなった。生化学的な解析から、アルグピリミジン化を受けるタンパク質のひとつがクロマチンリモデリング因子SWI/SNF複合体の構成因子であることを明らかにした。分化の際にその修飾が変動することから、まず、株化培養細胞の分化誘導系を用いて、クロマチンリモデリング因子SWI/SNF複合体の分化における役割を解析した。その結果、構成因子のひとつをノックダウンさせるとSWI/SNF複合体が正常に形成されず、分化が阻害されることがわかった。その結果、構成因子のひとつをsiRNA法を用いてノックダウンさせるとSWI/SNF複合体が正常に形成されず、分化が阻害されることがわかった。そこでこのSWI/SNF複合体構成因子の解析をさらに進めるためにモノクローナル抗体の作製を行い、免疫沈降に適した抗体を樹立することに成功した。そして、この抗体とアルグピリミジン抗体を組み合わせたクロマチン免疫沈降を行い、解析を進めている。これまでの生化学的な解析から、アルグピリミジン化を受けるタンパク質のひとつがクロマチンリモデリング因子SWI/SNF複合体の構成因子であることを明らかにした。構成因子のひとつをノックダウンさせるとSWI/SNF複合体が正常に形成されず、分化が阻害されることがわかった。したがって、細胞分化の際にSWI/SNF複合体がどのような遺伝子発現の制御を行うか、またその遺伝子発現制御におけるSWI/SNF複合体アルグピリミジン化の役割を明らかにすることが非常に重要となる。そこで本年度は以下の実験を行った。・SWI/SNF複合体構成因子抗体および抗アルグピリミジン抗体を用い、クロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)を行った。さらに次世代シークエンサーによる遺伝子配列解析法と組み合わせたChIP-Seq法を用い、アルグピリミジン修飾を受けたSWI/SNF複合体が結合するゲノム領域を同定した。
地方文化としての「おわら風の盆」の創造‐再生産と社会的想像力

(1)5月に研究成果の一部が論文「身体を獲得する芸能、芸能に幻/現出する自画像」(伊藤守(編)『文化の実践、文化の研究:増殖するカルチュラル・スタディーズ』所収)として出版された。(2)7月に琉球大学で行われた文化研究の国際会議「カルチュラル・タイフーン2005」で、分科会「ミュージアム化・テーマパーク化する生活文化/空間」をコーディネートし、米国シカゴ学派の影響をうけた日本研究者ジェラルド・フィガル氏や長浜市の歴史遺産を通じた活性化を研究する矢部卓也氏らとパネルを組み、研究発表および討論を行った。(3)「おわら風の盆」の現状をパフォーマンスと運営のふたつの側面から明らかにするために、昨年度と同様「おわら風の盆」開催時期にあわせた現地調査を行った。新興の芸能グループに対する反応、町民と町外の文化人との交流に関して新たな知見を得た。(4)ローカルな文化活動の様相を歴史的に明らかにするために、八尾町おわら資料館の所蔵調査を行った。八尾町教育委員会、富山県民謡おわら保存会、八尾町おわら資料館の協力を得ることができた。新規に関係者から提供された史料および未整理の史料200点あまりを対象におこなったものだが、新史料の発見を含め、非常に実りのある調査となった。すでに整理・目録化がすんだ史料についても一部複写、撮影を行い、分析を行った。(5)本研究が対象とする文化現象・実践をより広い文脈や問題構成に位置づけるため、文化理論をはじめ、表象研究、映画研究、メディア研究、文化人類学、民俗学、民族誌など関連分野の文献を渉猟した。また同様の目的で、3月に英国ブライトンで行われた国際会議"Globalisation and Representation"に参加し、ローカルな文化とグローバルな力がどのように拮抗しているか、また9.11事件後の世界情勢のなかでローカルなるものをどのように再概念化するべきかについての検討を行った。(1)現在の「おわら風の盆」がどのように行われているかをパフォーマンス(身体芸術、芸能・祭の象徴作用)と運営のふたつの側面から明らかにするために、「おわら風の盆」開催時期にあわせた現地調査および資料収集を行った。その結果、保存会の活動資金を得るためのサポート制度発足やCD企画・販売などに関する情報を得ることが出来、また若年層におけるインフォーマルな芸能伝承や一般家庭での祭りの日の様子の観察、芸能伝承者との交流を行った。(2)ローカルな文化活動の様相を歴史的に明らかにするために、富山県立図書館、八尾町図書館にて多種類にわたる資料収集を行った。北陸地方でもっとも古い郷土新聞である「富山日報」、「北陸タイムス」については、明治期以降昭和15年までの関連記事を特定、収集することができたことは大きな収穫であった。また、ジェンダーの視点を重視しつつ、消費社会・消費文化の進展を考察するうえで、有効な参照点となりうる宝塚歌劇団関連の資料を池田文庫等にて渉猟した。(3)現代の文化生成の問題における理論的可能性をさぐるために、上記調査で得られた資料の整理・分析を行った。また、聞き取り調査で得られた音声データを文字化し、分析にたえるものに加工した。(4)学会等で成果を発表する機会は予定より少なくなってしまったが、6月に早稲田大学で行われた文化研究の国際会議「カルチュラル・タイフーン2004」では、分科会「旅と眼差しの地理学」をコーディネートし、現代の文化生成の問題における理論的可能性をさぐることができた。これを契機として本研究の一端を会議の報告を兼ねた論集の一部として発表する計画が進行中である。また同様の目的で、3月に英国ブライトンで行われた国際会議"Globalisation and Representation

"に参加し、ローカルな文化とグローバルな力がどのように拮抗しているか、また9.11事件後の世界情勢のなかでローカルなるものをどのように再概念化するべきかについての検討を行った。
近代英語期の声楽作品による当時の英語の発音の推定

本研究は、近代英語期のうち特に16世紀から18世紀の英語の音変化について、楽譜に書かれた歌詞と音楽の情報を用いて、英語学の先行研究の成果と照合することにより、当時の英語の発音を推定し演奏の音響を再現することを目的とする。そのために、当時の世俗音楽や教会音楽等様々なジャンルの音楽について、音節と音符との対応関係や、歌詞の内容を音楽で表す技法、韻律の表現などの手法を参考にして分析を行う。さらに、従来の英語の音変化の研究手段に加えて、楽譜資料もその手掛かりになり、未だ完全に解明されるには至っていない大母音推移などの音変化の時期や状況について楽譜の分析により解明できるものがあることを示す。
海洋環境におけるダイオキシン類の汚染とその動態に関する研究

昨年度に引き続き、英国との共同研究を行った。まずは、殺菌剤のトリクロサンが、紫外線照射下で脱塩素化して二塩化ダイオキシンになることに着目し、純水と淡水と海水を用いて、人工光照射下での光分解実験を行った。その結果、純水中のトリクロサンはほとんど分解せず、淡水に比べて海水中のトリクロサンの方がほぼ倍の速さで分解した。これは、環境水中に含まれる有機物や塩類が、トリクロサンの光分解を促進していることを示唆する。特に塩類の効果に関しては、本研究で初めて示された。一方で、ダイオキシンは海水中で残存しやすいことが示唆された。次に、揮発性および残留性有機化合物における、炭素と塩素の安定同位体比(13Cと37Cl)および炭素の放射性同位体比(14C)に関する文献を集め、個別化合物おける各種同位体比の測定法、起源推定における適用例をレビューした。その結果、新しい炭素が含まれる生物起源炭素と古い炭素が含まれる人為起源(化石燃料起源)炭素を識別できる14Cが、最良の起源推定ツールとして示された。一方で、13Cと37Clに関しては、環境動態(同位体分別効果)を調べるツールとしての可能性が示された。そこで、英国沿岸で採取した汚染底質の抽出試料を分画し、Natural Environment Research Councilに13C測定を依頼し、14C測定のためにプリマス大学で分取型GCを用いて分取濃縮した。また、国際学会では「バイオアッセイを用いた廃油中PCBの簡易分析法の開発」と「トリクロサンの光分解」を発表した。閉会式では、注目すべき研究として、後者の研究が紹介された。1.研究目的海洋環境におけるダイオキシン類の汚染の実態とその動態の解明、および廃棄(分解)技術とモニタリング手法の提案2.研究方法観測船で大気・海水・底質・生物試料を採取し、そのダイオキシン類の濃度を測定することで、海洋環境における汚染実態と環境動態の解明を行う。さらにその知見を生かし、ダイオキシン類の廃棄(分解)法とモニタリング(簡易分析)法の提案を行う。3.研究成果等本年度(1年目)は、来年度以降の海洋観測船でのサンプリングの準備を行った。海洋科学技術センターの海洋地球研究船「みらい」の公募では、来年度の研究観測航海への参加が認められた。また、以下の海洋関連の学会・シンポジウム・会議等に積極的に参加し、協力体制を築いた。(a)荒波一史「海洋表層におけるDMS生成過程」東京大学海洋研究所共同利用シンポジウム,東京,2003年11月(b)荒波一史「北部北太平洋表層-洋上大気間における硫化ジメチルの季節的比較」第26回極域気水圏シンポジウム,東京,2003年11月(c)荒波一史,角皆静男「冬季鉛直混合が生物起源揮発性硫黄化合物濃度に及ぼす希釈効果」ブルーアースシンポジウム(第7回みらいシンポジウム),横浜,2004年1月さらに水中におけるダイオキシン類の分解技術として、酸化チタン光触媒を用いた太陽光による酸化分解、そして(PCBを含む)ダイオキシン類の簡易モニタリング法として、バイオアッセイを用いた簡易分析法の開発で誌上発表および学会発表を行った。(a)荒波一史,北村公義,伊藤裕康,安原昭夫,森田昌敏,馬萬紅「水中に分散させた酸化チタン(TiO_2)光触媒によるダイオキシン類(PCDD/Fs)の酸化分解」第12回環境化学討論会,新潟,2003年6月英国のプリマス海洋研究所およびプリマス大学に行き、以下の3つの仕事をした。1.以下のレビュー論文をJournal of Environmental Rradioactivityに投稿した。2.英国のターマー川河口において採取した淡水と海水を用いて、トリクロサンの光分解実験を行った。試料の違いによって、トリクロサンの光分解速度(ダイオキシンの生成速度)とダイオキシンの分解速度が異なった。今後、GC/C/IRMSを用いて、トリクロサンとダイオキシンの安定炭素同位体比を測定する予定。執筆予定の論文は、以下の通り。3.英国沿岸において底質試料を採取し、化学分析を行った。塩素系有機汚染物質は検出されなかったが、フタル酸エステル等の可塑剤が検出された。今後、自然起源と人為起源を識別するために、GC/C/IRMSとPCGC-AMSを用いて、安定および放射性炭素同位体比を測定する予定。

その結果、新しい炭素が含まれる生物起源炭素と古い炭素が含まれる人為起源(化石燃料起源)炭素を識別できる14Cが、最良の起源推定ツールとして示された。一方で、13Cと37Clに関しては、環境動態(同位体分別効果)を調べるツールとしての可能性が示された。そこで、英国沿岸で採取した汚染底質の抽出試料を分画し、Natural Environment Research Councilに13C測定を依頼し、14C測定のためにプリマス大学で分取型GCを用いて分取濃縮した。また、国際学会では「バイオアッセイを用いた廃油中PCBの簡易分析法の開発」と「トリクロサンの光分解」を発表した。閉会式では、注目すべき研究として、後者の研究が紹介された。
アンボンド極軟鋼を軸方向鉄筋に用いるＲＣ造柱の力学的特性とその活用に関する研究

ピロティ建築や高層建築のように、地震時に建物全体がしなるような挙動(全体曲げ変形)が卓越する鉄筋コンクリート(RC)造架構を対象として、軸変形が大きくなる柱の断面内に、アンボンド処理した極軟鋼を芯筋などの軸鉄筋として配筋することで、エネルギー吸収能力の向上を図ることを提案するものである。平成30年度は本研究課題の総括として,軸鉄筋として挿入するダンパー量の決定方法に関して検討を行った。本提案架構では芯筋として鋼材ダンパーを過度に入れてしまうと軸剛性の増大により,架構の全体曲げ変形が拘束され,層せん断型の地震応答性状を示し,それによりピロティ柱の頭脚部の曲げモーメントが増大し,提案意図とは異なる破壊性状を示すことがこれまでの検討で明らかになっている。そこで張間スパンの異なる3種類の12層ピロティ架構を対象に,軸鉄筋量を変数とするパラメトリックスタディを実施し,地震応答低減効果を検討した。その結果,どのピロティにも軸鉄筋(ダンパー)のエネルギー吸収量が最大となる最適量が存在していることがわかった。次に,この最適量の設定方法を検討するため,これまで検討してきた12層ピロティモデルを,2層のピロティモデルに縮約して検討を行った。その結果,この最適量は動的解析に依らずに静的増分解析結果のみを使って設定できることがわかった。具体的には全体曲げ崩壊形となるピロティ架構に対して,第2ヒンジ発生時点での引張側軸変位とダンパー降伏変位とを対応付けることでダンパーのアンボンド区間が設定され,引張側柱の引張軸耐力に対する比率(本研究では0.2倍程度)として,ダンパーの降伏耐力が設定できるというものである。今回は,12層ピロティ架構のみの検討なので,一般的な有用性にはさらに詳細な検討が必要であるが,本研究から全体曲げ変形が卓越するピロティ架構の地震応答低減手法の一提案を行うことができた。本研究で提案するRC造柱の力学的性状を、一定/変動軸力条件下での静的漸増載荷実験により明らかにし、数値解析モデルを構築する。さらに全体曲げ変形が卓越するRC造架構モデルを対象とした、サブストラクチャ・オンライン地震応答実験ならびに数値シミュレーションを実施して、地震応答の低減効果を検証し、本提案の有用性について明らかにする計画である。平成28年度は、アンボンド極軟鋼を軸鉄筋とする柱の力学的性状を実験的に把握するため、RC造柱試験体の設計と、本提案の耐震性能向上に対する有用性を数値シミュレーションにより実施した。架構形状(塔状比)の異なる3種類の中層のRC造純ピロティ架構を対象として,軸鉄筋の量をパラメータに静的増分解析と地震応答解析を実施した。検討の結果、本提案は適用する架構の形状によって応答性状が大きく異なることを確認した。また軸鉄筋の量により、建物頂部の加速度応答の低減に効果がある場合と、最下層の層間変形の低減に効果ある場合のトレードオフ関係を明らかにした。また軸鉄筋については、断面積、強度といった主要なパラメータのほか、コンクリートとの付着を除去するアンボンド区間長さも重要なパラメートであることが明らかとなった。アンボンド区間長さや位置によっては、柱のせん断破壊を誘発する可能性も示唆されたため、アンボンドの状況に応じたせん断補強の必要性が明らかとなった。当初の計画のとおり、アンボンド軸鉄筋を有するRC造柱試験体の設計を実施した。計画では平成28年度中に1体の試験体を製作して、その力学的性状を把握する予定であった。しかし数値シミュレーションによる予備的検討で、当初想定していなかった柱のせん断破壊の可能性が示唆されたため、試験体製作ならび実験的検討を中断し、詳細な静的解析と地震応答解析を実施した。この検討は、当初の計画を前倒ししたものである。以上のことから、現在までの進捗状況を「やや遅れている。」と評価する。ただし、前倒しで詳細な数値解析を実施したことにより、耐震性能向上により最適な軸鉄筋の仕様を検討することができている。平成29年度は架構の塔状比に着目して、4種類(塔状比35)の12層純ピロティ架構と、比較として同規模の純ラーメン架構(塔状比4)を対象に、数値シミュレーションにより本提案の有用性を検討した。まず設計の基本となる静的増分解析結果では、全てのモデルで引張側柱の軸降伏が先行する全体曲げ崩壊となるように設計したが、塔状比34ではピロティ層の層間変形角のみが大きくなる傾向が確認できた。このようなモデルの柱軸方向に鋼ダンパーを設置すると、ダンパーによるエネルギー吸収能の付加よりも、剛性付加による架構軸剛性の増大の影響が大きくなることがわかった。このため、前年度までに明らかになっていた、地震応答時における建物頂部の加速度応答の低減効果と、最下層の層間変形の低減効果のトレードオフ

関係がより顕著となることがわかった。一方で塔状比が5のように立面形状が細長い架構では、ピロティ層だけでなく全層の層間変形角が均一に近くなる性状を示すことが確認され、このような建物に対して、本提案手法はより効果的であることがわかった。さらに、ダンパー耐力を過度に高くしすぎると、ピロティ層の層せん断力や頂部絶対加速度応答、ピロティ層の層間変形角が増大する傾向が見られたのに対し、ダンパー剛性の違いでは、柱軸変形とピロティ層の層間変形角への影響が見られ、頂部絶対加速度や応答モードへの影響は小さいことが明らかになった。昨年度の検討で計画当初想定していなかった柱のせん断破壊の可能性が示唆されたため、試験体製作ならびに実験的検討を中断し、平成29年度は詳細な静的解析と地震応答解析を実施した。このため、当初に計画していたRC造柱の実験を平成30年度にずらしたため、現在までの進捗状況を「やや遅れている。」と評価する。ただし、前倒しで詳細な数値解析を実施したことにより、アンボンド軸鉄筋を有するRC造柱試験体の設計について、より有用な知見が得られている。ピロティ建築や高層建築のように、地震時に建物全体がしなるような挙動(全体曲げ変形)が卓越する鉄筋コンクリート(RC)造架構を対象として、軸変形が大きくなる柱の断面内に、アンボンド処理した極軟鋼を芯筋などの軸鉄筋として配筋することで、エネルギー吸収能力の向上を図ることを提案するものである。平成30年度は本研究課題の総括として,軸鉄筋として挿入するダンパー量の決定方法に関して検討を行った。本提案架構では芯筋として鋼材ダンパーを過度に入れてしまうと軸剛性の増大により,架構の全体曲げ変形が拘束され,層せん断型の地震応答性状を示し,それによりピロティ柱の頭脚部の曲げモーメントが増大し,提案意図とは異なる破壊性状を示すことがこれまでの検討で明らかになっている。そこで張間スパンの異なる3種類の12層ピロティ架構を対象に,軸鉄筋量を変数とするパラメトリックスタディを実施し,地震応答低減効果を検討した。その結果,どのピロティにも軸鉄筋(ダンパー)のエネルギー吸収量が最大となる最適量が存在していることがわかった。次に,この最適量の設定方法を検討するため,これまで検討してきた12層ピロティモデルを,2層のピロティモデルに縮約して検討を行った。その結果,この最適量は動的解析に依らずに静的増分解析結果のみを使って設定できることがわかった。具体的には全体曲げ崩壊形となるピロティ架構に対して,第2ヒンジ発生時点での引張側軸変位とダンパー降伏変位とを対応付けることでダンパーのアンボンド区間が設定され,引張側柱の引張軸耐力に対する比率(本研究では0.2倍程度)として,ダンパーの降伏耐力が設定できるというものである。今回は,12層ピロティ架構のみの検討なので,一般的な有用性にはさらに詳細な検討が必要であるが,本研究から全体曲げ変形が卓越するピロティ架構の地震応答低減手法の一提案を行うことができた。当初の計画で想定してなかった軸鉄筋を有するRC造柱のせん断破壊の課題については、軸鉄筋量とアンボンドとする長さ、位置によって適切なせん断補強筋を配筋することで解決できている。また、計画を前倒しで実施した詳細な数値解析により、計画時に想定してた性能よりも優れた耐震性能を発揮する最適な仕様を決定することができている。今後は実際に試験体を製作して、検討結果どおりの性能を発揮できるか実験的な検討を進めていく予定である。
Volvoxの多細胞体制構築機構の解明を目指したMicroRNAの網羅的解析

単細胞生物クラミドモナスとその近縁種である、もっとも単純な多細胞生物であるボルボックスは緑藻植物ボルボックス目の多細胞化過程を反映していると考えられている。本研究ではこれらに存在すると予想されるMicroRNAを同定し、2種間での配列比較、発現部位、時期の検討、比較を通じてMicroRNAレベルでの両生物の共通性と特異性を明らかにすることを目的とした。H15年度の研究で、クラミドモナスおよびボルボックスから低分子RNAを純度良く単離するプロトコルを確立し、両生物から複数のMicroRNA候補配列を同定した。H16年度は引き続いてMicroRNA候補配列の同定を継続し、最終的に両生物種から各約100ずつの候補配列を同定した。その後データベースによる検索でそれぞれ候補配列を約30に絞った後、ノザン解析によってそれらの配列中、実際にMicroRNAの鎖長で発現しているクローンを検索した。その結果、両生物からそれぞれ2-3の配列を同定することができたが、両種間で配列に共通性は見られなかった。それらのクローン中クラミドモナスにおいて最も強く発現していたクローンについてゲノムプロジェクトのデータベースから前後の配列を同定し、前駆体RNAの二次構造予測を行った結果、MicroRNAで見られるヘアピン型の前駆体構造をとることが明らかとなった。現在、さらにクローンの数を増やすと共に、発現しているMicroRNAをより直接的に単離、同定する新しい手法の開発を試みている。上記の研究課題遂行のため、Volvoxおよび、同属の単細胞種であるchlamydomonasより低分子RNAを抽出する手法の確立を試みた。他の生物種からの抽出法を参考に、プロトコールを確立した。ついで、そのRNAにタグ配列を付加し、逆転写-PCRによってDNAに変換、増幅した後、プラスミドに組み込み、クローニングを行った。これらの、手法の確立によりVolvoxからのmicroRNA種の基本的な単離手法を確立した。ついで、これらのプラスミド・クローンに組み込まれたmicroRNA候補の塩基配列決定し、主としてchlamydomonasのゲノムプロジェクトによるデータベースを用いつつ、候補配列の選別を試み、その配列が実際にmicroRNAとして発現しているかをnorthern blotting法により検定した。その結果、chlamydomonasからはmicroRNAと思われる複数のクローンの発現が確認できたが、volvoxよりは現在、発現が確認されたクローンは得られていない。上記の研究によりVolvoxからのmicroRNA種からの基本的な単離手法は確立できたものの、Volvoxから発現が確認されたクローンは得られていない、などクローニングの効率に問題があることも明らかになった。そうした問題の解決を図るため、上記の研究と平行し、2003年6月3日より、同11月19日まで、スイス連邦連邦工科大学Hilvert教授研究室(スイス、チューリッヒ)に滞在し、主としてmicroRNAを効率的に単離、同定するためのRNA chemical ligation法の開発を行った。連結反応時の脱離基であるイミダゾールの脱離能と化学的安定性の相関を置換基を系統的に変化させ、反応効率上最適な置換基の同定を試みた。その結果、従来法より効率よくRNA chemical ligationをおこなう誘導体の候補を同定した。しかし、残念ながら、脱離能の高い誘導体は、化学的安定性に欠け、化学実験の設備のない申請者の研究室で用いることは困難と考えられたため、実用性の点で従来法を超える手法の実現にはいまだ至っていない。