hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エキソ型α-アミラーゼの基質認識と糖転移反応の分子基盤

配糖体化は化合物の構造を修飾するための重要な方法のひとつであり,様々な化合物の溶解性,安定性,吸収性および味質などが改変されることが知られている。本研究ではグルコースが3つ結合したマルトトリオースを特異的に配糖化するアミラーゼの構造情報を基に配糖化反応の分子メカニズムに迫るとともに配糖化反応を効率的に行う変異酵素の獲得を試みた。その結果,マルトトリオース特異的切断に関与するアミノ酸を同定するとともに,糖転移活性が著しく増加した変異酵素の獲得に成功した。本酵素の詳細な酵素化学的性質を解明した。各種パラメータから本酵素はG3を過分解する活性が極めて低いG3生成アミラーゼであることが示された。また,アミロースに対する還元糖生成と重合度の変化の解析,シクロデキストリンに対する反応性から,本酵素が非還元末端に対する親和性が高いものの,非還元末端が少ない反応初期にはエンド型活性を示すことで効率よくデンプンを分解することが明らかとなった。また,本酵素のX線結晶解析を行い,アポ型で1.3 Å,G3複合体で1.7 Åの解像度で立体構造を決定した。解析の結果,サブサイト-3に位置する非還元末端GlcのO4と本酵素のN134およびQ192の側鎖が水素結合を形成していることが示された。そこでN134A/Q192Aを作製し,デンプンを作用させたところ,G3特異的生成能は失われ,通常のエンド型酵素と同様G2G4が生成した。以上のことから,G3特異性を規定しているのはN134とQ192であることが明らかとなった。さらに,サブサイトプラス側を構成すると考えられる16アミノ酸に対して合計172種類の変異酵素を作製した。Glc存在下でデンプンを基質として反応させることで,糖転移反応産物であるG4と加水分解産物であるG3の生成比を野生型酵素と比較した。結果,L191R,R223K,N317Qにおいて野生型に対してG4/G3生成比が12.5,11.5,11.8倍上昇した。さらにL191R/N317Tは22.2倍にも上昇することがわかった。これら作製した多数の変異酵素を用いて,グリセロール,カフェ酸,フェルラ酸,ケルセチン,アスコルビン酸に対して配糖化活性を評価した。その結果,グリセロールについては野生型酵素で約30%の収率でG3グリセロールを合成できることがわかった。他のアグリコンについても変異型酵素を用いることで配糖化率を上昇できることが示された。本酵素の加水分解活性と糖転移反応における,温度,pH,有機溶媒の影響について検討した。その結果,温度については55°Cまで加水分解活性および糖転移反応ともに上昇したが,加水分解活性の上昇率よりも糖転移活性の上昇率の方が高くなることがわかった。pHについては加水分解活性の至適pHが5.56.5であるのに対して,糖転移反応の至適pHは8であることが明らかとなった。このpH依存性の違いが糖転移反応の機構を探る大きな鍵になると考え,pH変化に伴う立体構造の変化を測定する必要性が生じた。有機溶媒については,40%アセトンおよび20%エタノール添加でも糖転移活性が増大することがわかった。次に前年度作製した糖転移活性が大きく上昇したL191R変異酵素について,X線結晶構造解析を行った。Spring-8 BL26B2にて回折強度データを収集し,分解能はアポ型で1.78Å,G3複合体で1.81Åまでのデータを用い,WTの構造を用いた分子置換法によって構造モデルを構築した。解析によって決定した構造をWTと比較したところ,RMSDはすべて0.1Å以下であり、変異による全体構造の変化はないことを確認した。活性部位に焦点を当てたところ,置換したR191残基の側鎖のみが変化しており,アポ型ではR191側鎖がサブサイト+1の方向に伸びていることがわかった。一方G3複合体では,側鎖の電子密度が低く配置が固定されていないことが示唆されたが,G3の方を向いていることが示唆された。L191Rアポ型のR191側鎖は糖転移反応の糖受容体として認識されるグリセロールと2.4Åの距離にあり,水素結合を形成できる距離に位置することがわかった。以上のことから,L191R変異体はR191側鎖が糖受容体と水素結合が可能となり糖受容体が還元末端に接近するのを補助している,または適した場所に保持している可能性が考えられた。研究計画で平成26年度に予定していた(1)G3Amyの詳細な酵素化学的性質の解明,(2)G3AmyにおけるCBM欠損酵素の作製と基質並びに生成物特異性の解析,(3)G3Amy単独及び基質複合体の高解像度X線結晶解析については終了している。また平成27年度以降に予定していた(5)G3AmyのG3特異性に関与するアミノ酸の同定,(6)G3Amyの糖転移活性に関わるアミノ酸の同定と糖転移活性が増大した変異酵素の取得においても,立体構造解析で得られた結果を基に糖転移反応が増大した数種類の変異酵素を獲得している。獲得した変異酵素を用い,グリセロール,カフェ酸,フェルラ酸,アスコルビン酸などのアグリコンに対して配糖化を試み,それぞれのアグリコンに対して反応性の高い変異酵素を選択している。

今年度はG3Amyの加水分解活性と糖転移活性に対する温度やpH,有機溶媒の効果を検討することで,(9)目的のG3配糖体合成条件の最適化と大量合成に関する知見を得るとともに,pH依存性の差異から根本的な糖転移反応の機構に迫る大きな鍵を発見することができた。pH変化に伴う構造変化を明らかにすることで,糖転移反応機構を明らかにできると考えている。また,糖転移活性が大幅に上昇したL191R変異酵素の立体構造を解析したことによって,(8)特異な生理活性を有する配糖体合成酵素の創製への知見を得ることができた。このように予定していた実験項目をほぼ予定通りに進行することができていると考えている。今回新たに得られた3つの構造(L191R,L191R-G3複合体,L191R/D225A-G4複合体)と以前に構造を取得したWT, WT-G3複合体とのRMSDをそれぞれ算出した結果,すべて0.12 Å以下であり全体構造に大きな変化は見られなかった。活性部位について見てみると,WTとWT-G3複合体では違いは確認されなかった。またWT-G3複合体におけるL191は生成物であるG3と3.9 Åの距離であった。L191RとG3複合体を比較したところ,L191RではR191側鎖はsubsite +1方向をむいておりWTでは不可能であった糖受容体と相互作用できる距離に位置していた。一方でG3複合体では,R191側鎖はsubsite -2方向を向いておりR191側鎖は生成物G3と3.7-3.8 Åの距離に存在し,水素結合または分子間相互作用を形成していると考えられた。以上のことからL191RはLeuがArgに置換されたことで糖受容体と相互作用が可能になり糖受容体をsubsiteへの導入を補助することで糖転移活性が上昇したことが示唆された。また生成物G3との複合体から,反応後は生成物と相互作用する可能性も考えられた。L191R/D225A-G4複合体の構造の取得を試みたところ,活性部位で確認されたのは生成物G3と添加していたG4であった。確認されたG3はG4が加水分解されて生じたものであると考えられる。得られたL191R/D225A-G3+G4複合体は酵素-基質複合体に糖受容体が導入された状態であると考えられる。R191はsubsite +1付近で確認されたG4のG1分子と3.6Å,3.9 Åの距離に存在していた。L191R-G3複合体のR191側鎖と比較するとグアニジノ基の向きがわずかに異なっていたことから,subsite +1付近のG1分子と相互作用していると考えられた。配糖体化は化合物の構造を修飾するための重要な方法のひとつであり,様々な化合物の溶解性,安定性,吸収性および味質などが改変されることが知られている。本研究ではグルコースが3つ結合したマルトトリオースを特異的に配糖化するアミラーゼの構造情報を基に配糖化反応の分子メカニズムに迫るとともに配糖化反応を効率的に行う変異酵素の獲得を試みた。その結果,マルトトリオース特異的切断に関与するアミノ酸を同定するとともに,糖転移活性が著しく増加した変異酵素の獲得に成功した。研究計画で平成26年度に予定していた(1)G3Amyの詳細な酵素化学的性質の解明,(2)G3AmyにおけるCBM欠損酵素の作製と基質並びに生成物特異性の解析,(3)G3Amy単独及び基質複合体の高解像度X線結晶解析については終了することができ,当初の予定通り初年度に計画していた実験課題をほぼ全て完了することができた。また平成27年度以降に予定していた(5)
空間融合による機能化学の新機軸

生物は細胞や膜といったように、機能をコンパートメントに分け、それらを有機的に連携させることで複雑な機能を生み出している。これは、例えば分子シグナルの授受や細胞膜内外の物質移動といったナノレベルの多重な機能を協同的に連携作用させて応答を行う「流れ(flow)」の確立にある。その実現には「ナノ空間の化学」が重要な役割をしている。本課題では、生物の受容、検出、移送、変換などの基本操作を材料化学的な空間素子として設計し、それらを連携させた空間を有機的に結合・融合させる「空間融合法」の開発を目指す。具体的には、機能開拓の舞台として動的なナノ空間機能を有する多孔性配位高分子(PCP)を主として用いる。異なる機能を有するPCPを「融合(fusion)」させる界面の化学を深化させ、例えば外部刺激・環境変化といったシグナルを増幅・伝搬するflowの創出に繋がる基盤技術の確立を目的とする。本年度は「空間融合」の学理の土台構築のために不可欠なPCP結晶の界面について理解を深めるため、PCP結晶表面の直接観察手法について検討した。PCPの結晶表面・界面は、その動的変形を最初に映し出すため、極めて重要な研究対象である。また、PCP結晶を融合・接合する上で、界面の理解は最も重要である。結果、原子間力顕微鏡を用い、PCP結晶表面を安定的に長時間観察するための条件の一部を決定することができた。基盤研究(S)の採択により、本課題は2018年6月11日付で廃止となった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
腫瘍ゲノムにおけるトランスポジショナル変異の解析

生物内の全遺伝情報がひとまとめになったものがゲノムである。ヒトゲノム内にあるヒト内在性レトロウイルス(HERV)はレトロトランスポゾンとして知られており、現在の外来性レトロウイルスの遺伝情報に似ている。本研究では、腫瘍組織内のHERV挿入変異の存在を検証した。次世代シーケンサー(NGS)の結果では、複数のHERV挿入変異の候補部位が同定されたが、長鎖PCRを用いた手法ではそれらを確認することはできなかった。個人間でHERVの遺伝情報量には違いがあり、それは挿入多型として知られているが、本研究の解析の過程で際立った特徴を持つHERV挿入多型が同定された。ヒト腫瘍細胞で起こるゲノム構造異常については一塩基レベルの変異と比較して不明な点が多い。ヒトゲノムの約8%を占める内在性レトロウイルス(HERV)による長鎖配列挿入変異、即ちレトロトランスポジションについては、同じレトロトランスポゾンに属するLINEとは異なり実際に起こる現象なのかどうかも明らかになっていない。本研究では、HERVの中でも塩基配列が最も高く保持されているとされるHML-2サブグループを標的として、ヒト腫瘍のゲノムにおけるHML-2部位を網羅的に検出することを試みるためのゲノム解析を行った。肺腺がん、胃がん及び大腸癌組織からゲノムDNAを抽出し、制限酵素処理及びself-ligation処理を施すことで環状DNAを作製し、それを鋳型として高速DNAシーケンサー(NGS)用アダプター配列を含むHML-2標的プライマーを用いたinverse-PCRによりHML-2の末端にあるLTR領域とその隣接ゲノム領域を増幅させたDNAライブラリーを作製してNGSによるシーケンスを行った。シーケンスリードからLTR領域をトリミングして得られた隣接ゲノム領域をレファレンスゲノムにアライメントしてHML-2部位を同定していき、既知のHML-2部位(germline)と新規部位とに分類した。その結果、多数の新規部位を多数同定することができた。これらの新規HML-2部位は現時点では体細胞におけるレトロトランスポジション以外にも未知のHML-2挿入多型もしくはPCRによるartifactが含まれている可能性があるため、今後は情報科学的手法を用いてフィルタリングを行うとともに、非腫瘍組織DNAとの比較によりレトロトランスポジションの可能性について検証していきたい。本年度は肺腺がん7例、胃がん8例、大腸癌10例を解析した。低分化型のもの、または比較的進行しているものを選択し、肺腺がんは4例、胃がんは7例が低分化型、大腸癌は全10例がステージIIIBIVのものを解析した。発症年齢については、全25症例の平均が61歳(3981歳)であった。複数検体を同時に解読するために、NGS用アダプターには症例ごとに設定したindex配列を付与した。シーケンス対象領域には反復配列であるHML-2配列が含まれているため、単一のシーケンスプライマーで解読してしまうと単調なシーケンスシグナルを生み出してNGSによるシーケンスクオリティの低下を招く可能性があった。そのため、アダプターとHML-2標的プライマーとの間には4種の長さが異なるリンカー配列を導入して解読サイクルをずらし、シグナルの多様性を確保することでシーケンスクオリティの著しい低下を防いだ。ペアエンドシーケンスにより出力されたリードは、制限酵素により環状にself-ligationさせたDNAを鋳型としたinverse PCR産物に由来し、解読される塩基配列の範囲はHML-2のLTR領域内の使用したプライマー配列から隣接ゲノム領域の該当制限酵素部位までの領域とLTR領域内の該当制限酵素部位から使用した逆方向プライマー配列までとなる。ただし、隣接ゲノム領域が長い場合は該当制限酵素部位まで到達しないこともある。このような複雑な配列構造からLTR領域を適切にトリミングすることで隣接ゲノム領域の配列のみとなるようにデータ処理した。その後、リファレンスゲノムにマッピングされる領域から反復配列のものを除き、その中から既知HML-2挿入多型と新規LTR部位に分類した結果、多数の新規LTR部位候補を同定できたため、概ね順調に進んでいると評価できる。外来性レトロウイルスのゲノム配列を起源とするヒト内在性レトロウイルス(HERV)は、ヒトゲノムの約8%を占めるレトロトランスポゾンである。HERVは、ある部位においてはその存在の有無が個体間で異なる「挿入多型」が知られている一方、体細胞における挿入変異については具体的な報告はまだない。本研究では、HERVのサブグループであるHML-2を対象に腫瘍組織内での挿入変異を検出することを試みた。これまでに、inverse-PCR法を応用した次世代シーケンサー(NGS)用ライブラリー調整を独自に開発し、複数の新規HERV挿入候補部位を肺がん、胃がんおよび大腸がん組織から同定してきた。これら同定された候補部位の精度を担保するために、機械学習を用いて擬陽性部位を除くことを試みた。本研究において実際にペアエンドリードの片側として解読される配列は、HERVの末端十数塩基とHERVに隣接する配列数十塩基が連なったものである。この配列が擬陽性である可能性を検証するため、擬陽性の場合に想定される配列を数百程度作成し、それを教師データとして機械学習を行い、実際のNGSで解読した配列の擬陽性判定に用いた。最終的に、18症例21個所のHERV挿入変異候補部位を得ることができた。これら挿入変異をゲノムPCR法で確認することを試みたが、検出するには至っていない。これは、HERVの長さが数千から一万塩基にもなること、および腫瘍組織におけるheterogeneityが関係しているのではないかと推測される。

今後は、新たな検出感度の高い手法を用いるなどして、NGS解析で得られたHERV挿入変異候補部位の確認を行っていく予定である。肺がん、胃がんおよび大腸がんの病変組織からDNAを抽出した。症例の選択にあたっては、体細胞変異またはモザイクを期待して、進行度の高いもの、もしくは比較的発症年齢が低いものを優先して選択した。これまでに35症例をinverse-PCR法をベースにしたNGSで解読した。この手法で解読される配列は、HERVの末端配列とそれに隣接する配列であり、HERVに隣接する配列がヒトゲノム上のどこに位置するかを解析することでHERV挿入部位を同定した。ヒトゲノムの40%低度が反復配列と呼ばれる特異性の低い領域であるため、HERVの隣接部位が反復配列であった場合は除外した。また、ヒトゲノム上には多数のHERV配列が存在しており、それら既存のHERV配列の末端と隣接配列についても多数検出されてきてしまうため、既存HERV部位をリスト化し、それらについてもHERV挿入変異候補部位から除外した。既存HERV部位のリスト化にあたり、挿入多型も考慮し、既報および自らの解析で新規に同定したものも加えた(論文投稿中)。新規HERV挿入多型部位はデータベースに登録した(accession number: LC154972-LC154976)。注意しなければならない点は、inverse-PCR時にHERV隣接領域内で伸長反応が止まってしまい、別の類似ゲノム領域から伸長反応が再開してしまう場合であり、その場合は擬陽性となってしまう。そのため、擬陽性だと想定される仮想配列を数百程度作成し、それらのレファレンスゲノムに対する類似配列数を求め、そこから算出される値を特徴量として機械学習の教師データとして用いた。その結果、擬陽性だと判定されたものについてはHERV挿入変異候補部位から除外し、最終的に18症例21個所のHERV挿入変異候補部位を得た。以上の経緯から概ね順調に進んでいると評価できる。ヒトゲノムの約8%を占めるレトロトランスポゾンであるヒト内在性レトロウイルス(HERV)は、ある部位においてはその存在の有無が個体間で異なる「挿入多型」が知られている一方、体細胞における挿入変異については具体的な報告はまだない。腫瘍組織におけるHERVの挿入変異を同定するために、前年度までにinverse-PCR法を応用した次世代シーケンサー(NGS)により複数のHERV挿入変異候補部位を得た。そこで、NGSで得られた結果を別の手法で検証するために、HERVと隣接領域との境界配列をプライマーの一つに用いて長鎖PCRによる挿入HERV配列の増幅を試みた。6個所について非常に特異性の高いプライマーを設計することができたが、想定したサイズのPCR産物は得られなかった。NGS解析は非常に高感度であり、さらにNGSを施行する前の段階でinverse-PCRによる特異的増幅を行っていることから、通常のPCRでは検出されない感度で極少数の細胞内で起きた挿入変異を検出した可能性がある。
IgA腎症の扁桃病変におけるIgA産生B細胞の発生機序

現在まで、30例のIgA腎症と20例の非IgA腎症の扁桃組織を用いて以下のことを明らかにした。3IgA腎症の扁桃組織から分離した胚中心でIgA産生関連因子をRT-PCR法で検討した結果、IgA産生に必須であるAIDとIα-CμのmRNAの発現を確認した。さらに、非IgA腎症に比べて、IgA腎症ではTSLP、TRLPR、AID、TGF-β1 mRNAの発現量が増加していた。蛋白に加えてmRNAレベルでも、IgA産生に関わる因子の過剰発現が確認された。4扁桃胚中心から分離した濾胞樹状細胞関連クラスターをTSLPで刺激すると、IgA産生が増強され、抗TSLP抗体で減少した。IgA腎症の扁桃組織から分離した胚中心でIgA産生関連因子をRT-PCR法で検討した結果、IgA産生に必須であるAIDとIα-CμのmRNAの発現が確認された。扁桃胚中心から分離した濾胞樹状細胞関連クラスターをTSLPで刺激すると、IgA産生が増強され、抗TSLP抗体で減少した。さらに、非IgA腎症に比べて、IgA腎症ではTSLP、TRLPR、AID、TGF-1 mRNAの発現量が増加していた。平成25および26年度の計画では、1IgA腎症の扁桃胚中心におけるTSLPとTSPLRの蛋白およびmRNAの発現、2扁桃胚中心内濾胞樹状細胞によるIgAの捕捉、3胚中心B細胞におけるAIDおよびswitch circle mRNA (Iα-Cμ)の発現、4扁桃胚中心内におけるサイトカインなどの発現、5リンパ濾胞内から分離した濾胞樹状細胞、胚中心内樹状細胞とB細胞におけるサイトカイン産生能について検討する予定であったが、これらについては既に検討済みである。人体病理学具体的には、1胚中心におけるpDCの有無:pDCのマーカーであるCD123とBDCA4を用いて免疫染色を行い、胚中心におけるpDCの出現頻度を非IgA腎症患者とIgA腎症患者で比較する。2機能的なpDCの有無:胚中心におけるtype I interferon産生pDCの有無を免疫染色とISH法で検討し、非IgA腎症患者とIgA腎症患者で比較する。3pDCにおけるIgA産生細胞の発生に関与する因子の発現:IgA産生細胞の発生に関与する因子(TGF-β1、IL-10、BAFF、APRILなど)について免疫組織学的に検討する。平成25年度の計画では、1IgA腎症の扁桃胚中心におけるTSLPの発現、2扁桃胚中心内濾胞樹状細胞によるIgAの捕捉、3胚中心B細胞におけるAIDおよびswitch circle mRNA (Iα-Cμ)の発現の検討、4扁桃胚中心内におけるサイトカインなどの発現について検討する予定であったが、これらについては既に検討済みである。また、平成26年度以降の計画として、リンパ濾胞内から分離した濾胞樹状細胞、胚中心内樹状細胞とB細胞におけるサイトカイン産生能の解析を実施予定であったが、これについても既に実施済みである。平成26年度は25年度までの物品費等でまかなえたため、支出がなかったが、研究はとどこおりなく行えた。今後、非IgA腎症と比較しながら、IgA腎症における、1摘出扁桃組織の胚中心における濾胞ヘルパーT細胞とIgA産生との関連を評価し、2患者血清中のTSLPおよびTSLPR値の比較検討をELISA法で行う予定である。現時点における我々の作業仮説では、IgA腎症の扁桃胚中心の濾胞樹状細胞に過剰発現されるTSLPは、TGF-β1, BAFF, AIDの作用を介してIgAの過剰産生を誘導するものと思われる。この仮説を実証する為に、さらに追加実験を行っていく予定である。平成27年度の計画に合わせて使用する予定である。研究計画は予定以上に進み、研究費の執行にも大幅な変更はなかったが、僅かの額(778円)の繰り越しを生じた。平成26年度の計画に合わせて使用する予定である。
遺伝子導入による脊髄保護に関する研究

胸部大動脈瘤手術後の対麻痺発症率は3-15%と依然高く、この合併症は患者の生活の質に大きく影響を及ぼすだけに防止策の確立は急務である。oxygen-regulated protein 150kD(ORP150)は、低酸素ストレスによる神経細胞死を抑えることが報告されている。本研究は、脊髄神経細胞にORP150遺伝子を導入発現させることで、耐虚血性を高め、対麻痺発生頻度を低下し得るか、明らかにすることを目的とした。ORP150 cDNAの合成をラットの脳組織からのRT-PCR法によって行い、これを組み込んだORP150発現プラスミドを作製し、これをリポフェクション法で培養細胞に導入し、Western blotting法でORP150遺伝子のタンパク発現を確認した。ウサギ脊髄にin vivoで遺伝子導入する効率をリポーター遺伝子(LacZ)発現プラスミドのリポフェクションで確認したところ、LacZの発現は確認できず、その改善は今後の課題となった。リポフェクトアミン脊髄注入後の対麻痺スコアは、sham群と比較し低下しており、この手法は脊髄に対し侵襲的と考えられた。遺伝子導入効率を上昇させる目的で、ORP150発現アデノウィルスベクターをCosmidとCre-loxPを用いて作製した。しかし実験に必要な数を大量複製することができなかつた。CAGプロモーターは、多くの細胞内で非常に高い活性を有することから、過剰に産生されたORP150が293細胞に毒性をもたらした可能性は否定できない。活性の低いプロモーターに置き換えることで、大量複製可能となる可能性があり、更なる課題が残った。脳神経細胞において、適度なレベルでのORP150発現が神経細胞の虚血耐性を高めることが報告されているが、外科手術に遺伝子治療を併用することで対麻痺の発症頻度を下げるという戦略を実現して行く上で、遺伝子導入方法のみならず、発現レベルの調整が重要であることが示唆された。本研究は、eNOS及びORP150の発現プラスミドをそれぞれ作製し、naked DNA法およびリポフェクション法を用いた遺伝子導入法により、脊髄動脈内皮細胞にeNOS遺伝子を導入発現させ、脊髄動脈の血行改善を図り、かつ好中球の浸潤を抑えることで虚血再潅流障害を抑え、また脊髄神経細胞にORP150を発現させることで、耐虚血性を高め、対麻痺発生頻度を低下し得るか、明らかにすることを目的としている。本年度の実績導入遺伝子の作製eNOS及びORP150のcDNAを採取する目的で、虚血ストレスを加えたラットの脳からmRNAを採取し、RT-PCR法により、ORP150 cDNAの合成に成功した。eNOS cDNAも同様に、RT-PCR法による採取を試みたが、PCR伸長が得られず、プライマーを数種類作製したがやはり伸長しなかった。このORP150 cDNAを発現プラスミドに組み込み、ORPl50発現プラスミドを作製した。この組み込まれたORP150の下流にEGFP遺伝子を組み込み、このプラスミドが細胞内で発現した際に、蛍光顕微鏡で発現効率を確認できるよう工夫した。このORP150発現プラスミドをリポフェクション法で培養細胞に導入し、in vitroでの発現を確認した。さらにORP150 cDNAを組み込んだアデノウィルスを作製した。このORP150発現アデノウィルスを培養細胞に感染させ、蛍光発色を確認した。ウサギ脊髄遺伝子導入モデルの作製全身麻酔下のウサギを用いて、リポーター遺伝子発現プラスミドをリポフェクション法にて導入した。

2日後、ウサギ脊髄標本を採取し、種々の至適条件の設定をおこなった。本研究の目的は、eNOS及びORP150の発現プラスミドをそれぞれ作製し、naked DNA法及びリポフェクション法を用いた遺伝子導入法により脊髄動脈内皮細胞にeNOS遺伝子を導入発現させ、脊髄動脈の血行改善を図り、かつ好中球の浸潤を抑えることで虚血再灌流障害を抑え、また脊髄神経細胞にORP150を発現させることで耐虚血性を高め、対麻痺発生頻度を低下し得るかを明らかにすることである。本年度は、昨年作製した導入遺伝子pCAGGS-ORP150をnaked DNA法、lipofection法にてウサギ脊髄に導入した。それと同時に今年度新たに購入したブロックインキュベータセットを用いてpCAGGS-eNOSを作製した。既に作製済みであるバルーンカテーテルを用いたウサギ脊髄虚血モデルに対し、pCAGGS-eNOSは経脊髄動脈に血行性に遺伝子導入を行い、pCAGGS-ORP150は脊髄腔内へ遺伝子導入を行った。その後、27日後の脊髄機能の評価、免疫組織染色及びNF-kBの発現度、接着因子の発現度、好中球浸潤度、3-L-Nitrotyrosine発現度の評価、TUNNEL法による脊髄神経のアポトーシスの評価など、脊髄保護効果についての解析を行った。研究最終年度である次年度は、今年度の結果をふまえさらに34例の遺伝子導入を実施することによって引き続きデータの充実を図り、脊髄動脈の血行改善、虚血再灌流障害予防、また対麻痺発生予防への具体的効果について検討する予定である。胸部大動脈瘤の手術成績は年々向上し、死亡率は低下してきているが、術後対麻痺の発症率は手術患者数の3-15%と依然高い。本研究では、一酸化窒素(NO)の合成酵素であるendothelial nitric oxide synthase(eNOS)及びoxygen-regulatedprotein 150kD(ORP150)の発現ブラスミドをそれぞれ作製し、naked DNA法およびリポフェクション法を用いた遺伝子導入法により、脊髄動脈内皮細胞にeNOS遺伝子を導入発現させ、脊髄動脈の血行改善を図り、かつ好中球の浸潤を抑えることで虚血再潅流障害を抑え、また脊髄神経細胞にORP150を発現させることで、耐虚血性を高め、対麻痺発生頻度を低下し得るか、明らかにすることを目的とした。本年度は、まずeNOS発現プラスミドの作製を試みたが、eNOS cDNAがRT-PCR法では得ることができず、断念せざるを得なかった。昨年度までに作製したoxygen-regulated protein 150kD(ORP150)発現プラスミドを、リポフェクション法によりウサギ脊髄へ遺伝子導入を行い、脊髄虚血モデルに対する脊髄保護効果の評価を行った。結果、対麻痺発症率の改善は得られなかった。ウサギ脊髄に対する遺伝子導入効率の評価を行うため、LacZ発現プラスミドを用いてウサギ脊髄への導入効率の確認を行った。結果、脊髄組織での遺伝子導入は確認されなかった。リポフェクション法の導入効率が低いことが原因と考え、ORP150発現アデノウィルスベクターの作製を行った。結果、ORP150発現
神経発達症／神経発達障害の治療・予防における小胞体ストレスの病態生理学的解析

神経発達症とは,自閉スペクトラム症(ASD)や注意欠損多動症を始めとする中枢神経系の機能障害である。本研究では,胎児期および新生児期における小胞体ストレス負荷が神経回路構築に及ぼす影響を解析した。小胞体ストレスは,神経細胞の樹状突起伸長を抑制させることが明らかとなった。また,小胞体ストレスは,シナプスオーガナイザーの発現を低下させることが明らかとなった。さらに,4ーフェニル酪酸(4-PBA)は,ASDモデルマウスにおいて認められる社会相互性の異常を改善させた。つまり,ASD発症において,小胞体ストレスが関与することは明らかである。小胞体ストレスが神経発達症/神経発達障害の原因の一つである可能性が高いことを報告してきた.そこで本研究では,微弱かつ長期間の小胞体ストレスをもたらす要因の同定と自閉症の予防法および治療法の確立を目的とすることにある.まず,小胞体ストレスに及ぼす要因の手がかりとして,小胞体ストレス負荷によりGABAA受容体の各種サブユニットの発現が減少していた.GABAA受容体は,自閉症患者の原因遺伝子としてゲノムインプリンティング領域にコードされている遺伝してあり,自閉症発症に関して多くの報告がなされている.今後は,小胞体ストレスとGABAA受容体の発現異常について詳細に解析するとともに,神経の成熟に関しても解析を進めていきたい.次に,自閉症の治療法に関して,4-phenylbutyric acid(4-PBA)の効果について検討した.これまでの解析より,小胞体ストレスが自閉症発症の要因となっている可能性が高い.そこで,ケミカルシャペロンであり,小胞体ストレスを軽減する効果のある4-PBAを用いることとした.4-PBAは,自閉症モデルマウスを出産予定の雌マウスに投与した後に子孫マウスに対して行動解析あるいは生化学的な解析を行った.行動解析に関しては,現在検討中である.生化学的解析に関しては,プロニューラル遺伝子Hesファミリーにおいて,4-PBAの効果が認められる傾向にあった.ただし,神経細胞マーカーおよびシナプス関連タンパク質については,変化が認められなかった.今後は,投与時期の再検討および投与薬物の変更などを視野に入れつつ継続して解析を行っていく予定である.動物の繁殖に関して,一時的に何らかのトラブルが発生し,繁殖しない時期が続いていた.時計遺伝子に関する研究に関して,予想した結果が出ずに計画変更することにしたため,予定通りには進行していない.本研究では,妊娠中期の小胞体ストレスがその子孫における神経発達症(特に,自閉スペクトラム症(ASD))発症の原因の一つであることを提唱してきた.当該年度では,その前年度から引き続き,ASDモデルマウスにおけるタンパク質凝集抑制作用を有する4ーフェニル酪酸(4ーPBA)の効果について解析した.ASDモデルマウスは,不安行動やコミュニケーション能力の低下などの行動異常が認められた.一方,妊娠中期での4ーPBA投与は,これら行動異常のうち,不安行動に対しては影響しなかったが,コミュニケーション能力の低下を予防した.さらに,脳内での変化を解析すると,大脳皮質ではシナプス形成因子の発現抑制が,4ーPBA処置により改善されることが明らかとなった.しかしながら,海馬において,シナプス形成因子の発現に4ーPBA処置による大きな変化は認められなかった.今後は,4ーPBAの効果について詳細に解析していくと共に,その誘導体などの薬物について,ASDに対する効果を検討していく予定である.4ーPBAの検討については,概ね予定通り検討できている.一方,in uteroによるツニカマイシンの投与は,条件検討が思うように進まず,予定より遅れている.本研究は,神経発達症(特に自閉スペクトラム症)の発症メカニズムを解明し,その治療および予防方法の確立を目的としている。自閉スペクトラム症(ASD)において小胞体ストレスが誘引されている状態であることが判明した。さらに,ASDでは,シナプス形成に関与するニューロリジン,ニューレキシン,Shank,CADMなどのタンパク質発現に異常が認められている。そこで,ケミカルシャペロンである4ーフェニル酪酸を妊娠期の母親マウスに用いることで,仔マウスの小胞体ストレスを軽減させるとともに,ASD関連タンパク質の発現異常を回復させることが明らかとなった。この成果は,ASDの予防においてこれまでにない新規の知見であり,ASDの治療を検討する上で非常に重要な要因となりうる結果である。今後は,小胞体ストレス軽減によるASD発症抑制および症状改善効果について,詳細な検討を実施するとともに,ASD治療における創薬シーズ探索にも尽力したい。上記に記載しているとおり,GABAA受容体と小胞体ストレスに関しては,小胞体ストレスとGABAA受容体の発現異常について詳細に解析するとともに,GABAA受容体と神経の成熟に関しても解析を進めていきたい.また,4-PBAに関しては,投与時期の再検討および投与薬物の変更(例:IPAや統合失調症治療薬など)などを視野に入れつつ継続して解析を行っていく予定である.4ーPBAあるいはその誘導体を用いたASDの予防効果および治療効果について今まで通り検討する.

一方,in uteroによるツニカマイシンの効果については,今後の条件検討次第で他の方法に切り替えることも検討している.神経精神薬理学動物を用いた研究において,動物の繁殖が予定通り進行せず,実験が滞ってしまったため.急遽,予定を変更して解析を進めたが,次年度使用額が生じてしまった.当該研究は,おおむね順調に進行していたが,使用物品の在庫不足および納期未定に伴い次年度使用額が生じた.動物に関するトラブルは,現在一部解決しているため,当該年度に出来なかった動物を用いた研究を次年度に継続して実施する.使用予定にしていた初代培養関係の消耗品に使用する予定である.
競泳競技におけるレース進行に伴う泳速度の変化について

本研究では競泳競技について、レース進行に伴い常時変化する泳速度(SV:m/sec)と、ストローク長(SL:m/stroke)およびストロークタイム(ST:sec/stroke)の関係を分析することにより、種目別にレースパターンの特徴を明らかにすることを目的とした。被験者は1995年度日本選手権水泳競技大会における100m自由型、バタフライおよび背泳のA決勝およびB決勝に出場した選手とした。撮影には観客席上段に5台のビデオカメラを設置し、レース全体の撮影を行った。分析にはビデオデータ解析システム(VA-60AB)を使用し、1ストローク毎に移動した選手の頭部の位置をデジタイズし、それぞれのポイントからのSV、STおよびSLを求めた。本研究においては種目の違いによるレースパターンの特徴はみられなかったことより、全ての種目において共通にみられたレースパターンの特徴について報告する。SVについてはレース進行に伴い低下するパターンを示し、それはSLの変化パターンと類似していることが判明した。つまりSVの大きさはSLの大きさの影響を受けていることが伺える。またSTは、前半についてはレース進行に伴い延長するパターンを示し、後半については維持、延長および短縮の3パターンがみられた。レース進行に伴い疲労が蓄積されることから、筋出力の低下や抵抗の増大が考えられる。すなわちSLの低下が起こりSVの低下を招くことが考えられる。したがってSVの低下を抑えるためにはSTの短縮が求められる。つまりSTについては、レース後半あるいは終盤に短縮するパターンが有効であると考えられる。しかし本研究では現象を捉えたものであるため、その有効性について検証するには至らなかった。尚、今回の報告では分析に問題の生じた平泳のデータについては割愛した。
メタゲノミクスを活用したオリゴ糖合成酵素の網羅的探索及び機能性オリゴ糖の創出

ホスホリラーゼは、無機リン酸存在下で糖質のグリコシド結合を非還元末端側から順次加リン酸分解して糖1-リン酸を遊離する酵素である。その反応は可逆的であり、糖供与体としての糖1-リン酸と糖受容体を出発材料とした際、オリゴ糖を効率的に合成することが出来る。当該合成反応は非常に厳密な位置選択性を有しており、目的とするオリゴ糖の選択的合成が可能であるが、合成可能なオリゴ糖の種類はホスホリラーゼの種類に依存する。これまで報告されたホスホリラーゼの種類は他の糖質関連酵素に比べて圧倒的に少なく、今後合成可能なオリゴ糖のバリエーション拡大には、新たな反応特異性を示すホスホリラーゼの発見が必須である。そこで本研究では、バイオインフォマティクス手法及びメタゲノミクス解析を駆使することにより、オリゴ糖合成に有用な新規ホスホリラーゼの網羅的探索を行い、得られた新規酵素が触媒する加リン酸分解反応時の基質特異性およびオリゴ糖合成反応時の糖受容体特異性の解明を通して、オリゴ糖ライブラリー構築を試みた。まず、バイオインフォマティクス手法を活用することで選定したホスホリラーゼ様タンパク質をコードする遺伝子群をPCR法により単離し、大腸菌による異種宿主発現系を用いて調製された組換え酵素群の詳細な機能解析を行った。さらに、糖資化性を改変した大腸菌を構築することで、新規ホスホリラーゼの探索に特化したメタゲノミクススクリーニング手法も開発した。その結果、これまで報告例のない新規なホスホリラーゼを複数発見することが出来た。得られた新規酵素群が触媒するオリゴ糖合成反応を用いて様々なオリゴ糖の合成にも成功した。これら新規酵素の発見は、当該酵素が関与する新たな生体内糖質代謝機構の解明にも繋がり、生物学的意義からも学術的に重要な研究と評価できる。生体内糖質代謝に関与する糖質加リン酸分解酵素(ホスホリラーゼ)による糖質合成収率は極めて高く、産業上有用な酵素になり得る。しかしながら、既知のホスホリラーゼは他の糖質関連酵素に比べて報告例が少なく、今後生産可能な糖質のバリエーション拡大には新たな反応特異性を示すホスホリラーゼの発見が必須である。近年ゲノム全塩基配列の解読を目標としたゲノムプロジェクトが様々な生物種を対象に実施されており、今後新規なホスホリラーゼの発見の可能性は極めて高い。本研究では、バイオインフォマティクス手法及びメタゲノミクス解析を駆使することにより、生体内糖質代謝を理解する上で生物学的意義から学術的に重要な新規ホスホリラーゼの網羅的探索を行い、得られた新規酵素が触媒する加リン酸分解反応時の基質特異性およびオリゴ糖合成反応時の糖受容体特異性の解明を通して、オリゴ糖ライブラリー構築を試みる。本年度は、まず機能未知ホスホリラーゼ遺伝子を有する生物種のゲノムDNAから目的遺伝子をPCR法により単離し、大腸菌による各種組換え酵素の異種宿主発現系を確立した後、本発現系を用いて調製した組換え酵素の機能解析を行った結果、これまで報告例のない新規なホスホリラーゼを発見することが出来た。また、得られた新規酵ホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応を用いて、複数の新規オリゴ糖の合成にも成功している。現在、X線結晶構造解析により新規ホスホリラーゼの立体構造を解明中である。また、複数の環境中から回収したメタゲノムを制限酵素処理により断片化し、大腸菌発現用ベクターに組み込むことでメタゲノムライブラリーを作製した。現在、メタゲノムライブラリーを導入した改変大腸菌を用いて、新規ホスホリラーゼを探索中である。バイオインフォマティクス手法を活用したホスホリラーゼの網羅的探索により、新規酵素を発見できており、オリゴ糖ライブラリーの拡充も達成されていることから、今後の研究進展が大いに期待される。メタゲノムをスクリーニング源とした探索についても、順調に進行している。今年度は、バイオインフォマティクス手法を活用することで昨年度発見した新規なホスホリラーゼの酵素化学的諸性質(最適pH、pH安定性、温度安定性、基質特異性)の決定、様々な糖受容体基質を用いた新規ヘテロオリゴ糖の合成および構造解析を行った。また、複数の環境中から回収したメタゲノムおよび糖質関連酵素を豊富に有する微生物ゲノムを制限酵素処理により断片化し、大腸菌発現用ベクターに組み込むことでメタゲノムライブラリーを作製し、現在新規ホスホリラーゼを探索中である。バイオインフォマティクス手法を活用したホスホリラーゼの網羅的探索の結果得られた新規酵素の性質決定およびオリゴ糖ライブラリーの拡充も達成されており、当初の計画通りの研究進展が見込まれる。メタゲノムをスクリーニング源とした新規酵素探索についても、順調に進行している。

ホスホリラーゼは、無機リン酸存在下で糖質のグリコシド結合を非還元末端側から順次加リン酸分解して糖1-リン酸を遊離する酵素である。その反応は可逆的であり、糖供与体としての糖1-リン酸と糖受容体を出発材料とした際、オリゴ糖を効率的に合成することが出来る。当該合成反応は非常に厳密な位置選択性を有しており、目的とするオリゴ糖の選択的合成が可能であるが、合成可能なオリゴ糖の種類はホスホリラーゼの種類に依存する。これまで報告されたホスホリラーゼの種類は他の糖質関連酵素に比べて圧倒的に少なく、今後合成可能なオリゴ糖のバリエーション拡大には、新たな反応特異性を示すホスホリラーゼの発見が必須である。そこで本研究では、バイオインフォマティクス手法及びメタゲノミクス解析を駆使することにより、オリゴ糖合成に有用な新規ホスホリラーゼの網羅的探索を行い、得られた新規酵素が触媒する加リン酸分解反応時の基質特異性およびオリゴ糖合成反応時の糖受容体特異性の解明を通して、オリゴ糖ライブラリー構築を試みた。まず、バイオインフォマティクス手法を活用することで選定したホスホリラーゼ様タンパク質をコードする遺伝子群をPCR法により単離し、大腸菌による異種宿主発現系を用いて調製された組換え酵素群の詳細な機能解析を行った。さらに、糖資化性を改変した大腸菌を構築することで、新規ホスホリラーゼの探索に特化したメタゲノミクススクリーニング手法も開発した。その結果、これまで報告例のない新規なホスホリラーゼを複数発見することが出来た。得られた新規酵素群が触媒するオリゴ糖合成反応を用いて様々なオリゴ糖の合成にも成功した。これら新規酵素の発見は、当該酵素が関与する新たな生体内糖質代謝機構の解明にも繋がり、生物学的意義からも学術的に重要な研究と評価できる。今後、得られた新規ホスホリラーゼのX線構造解析を行い、構造と機能の相関解明に取り組む。また、安価に入手可能な天然糖資源から目的オリゴ糖への高収率変換技術の開発にも取り組む。
船体縦強度設計基準の再検討

波高の高い波浪中の船体構造応答には次の3つの非線型性が助けられる。1)船体断面の上下運動に対する流体抵抗力の非線型性、2)船底露出後のスラミング、3)船体が弾性であることによる振動現象。異なる船型に対するシミュレ-ションおよびそれに基づいた統計的処理した結果と実船計測結果と比較検討した。T継手曲げ疲労試験では止端を加工し応力集中を小さくすればAsWeldに比べて疲労強度が改善され、強度の板厚効果も減少する。広帯域ランダム荷重下の中央切欠付軟鋼板試験片では荷重変動にかかわらず裂開口点はほぼ一定である。また、等価応力範囲とき裂閉口を考慮すれば一定振幅試験結果からランダム荷重下でのき裂伝播挙動が推定できる。船体を含む一般の浮遊体の波浪に対する荷重運動応答および複数の浮遊体を弾性体で結合した複合体の構造応答の周波数応答関数を3次元特異点分布法と干渉理論に基づいて算定する数値計算手法を開発した。3次元特異点分布法におけるグリ-ン関数の評価における高速演算法の導入と任意形状の複数浮体間の波浪相互干渉を考慮した効率的な計算法が特色である。非線形系の正規分布入力に対する弱非正規応答の確率密度関数と、それを利用した最大極大値の予測法を導いた。そして波浪中係留船舶の前後揺の実験結果から本予測法の妥当性、有効性を示した。低次有限要素による強非線形構造解析コ-ドすなわち、(1)線形チモシェンコはり要素による空間骨組構造・解析コ-ド、(2)定モ-メント四辺形ミンドリン板要素による薄肉シェル構造・解析コ-ド、(3)定ひずみ四辺形要素に軸対称体・解析コ-ドを開発し、クラッシュ実験結果との比較を通じ、計算精度・効率に関し検討した。1.正面波および斜め波に向って航行する船舶の構造応答を解明するためのプログラムを有限要素除を使用して開発中である.これは,船種,波高出合い周期・角度を変化させ,また船舶のもつ弾性を考慮した場合とそれをしなかった場合の応解を計算させるものである.また, AIを用いて船体強度部材の最展設計を行うプログラムを一部開発した.2.船体を含む一般の浮遊構造体の規測波に対する波荷重算定のため,浅水影響を考慮した3次元特異点分布法に基づくポテンシャル計算プログラムを開発している.これにより通常状態における波浪荷重の非線形成分の効自を評価するための基準が得られる.3.弱非線形の応答のうち,ボルテラ汎関数級数に展開した時, 3次以降の項が無視できるものについて,その確率密度関数について調べた.通信工学の分野で知られている様に,ボルテラ2項展開された確率過程は標準正規型確率変数を利用して特性関数が得られる.級数の第1項,既ち線形応答が無視できる時は確率密度関数も計算できるが,その時平均値は安定して得られるものの正しい分散を得るためには,特別の注意を要する事が明らかになった.さらに線形応答が無視できない場合の確率密度関数の近似式を求めて,線形および非線形応答の干渉効果を明らかにした.4.船体縦強度解析において有効な非線形応答解析法を開発することを目的に,非線形有限要素法による構造要素の圧壊強度解析および動的応答解析を実施した.前着については,円筒銅菅・角型銅菅に対する圧壊実験も合わせて行ない・開発したプログラムが十分な精度を有することを確認した.後者については特に動的接触問題に重点を置き,ペナルティ関数法の適用に関して検討した.

1.不規則波中の船体構造の応答性を予測するために必要な解析法として、船体の剪断変形を考慮の上有限要素法を用いて高次振動の影響を導入し、流体力系数として二次元的に正格な値を用いる方法を開発した。この計算法を用いて船首部析損事故解析、船首尾波浪衝撃の解析および波浪外力の非線形性を考慮した研究を実施した。昨年度開発したAIを使用して船体強度部材を最適設討するためのプログラムをより確実にした。2.非線形性を考慮した船体縦強度解析および局部応力解析の精密化の一助として、有限要素法による構造非線形解析に関する一連の基礎的研究を実施した。すなわち、一般骨組構造に対し、極限解析用の低次要素モデルを用いた。弾塑性有限変形プログラムを開発した。また、スラミングなどの衝撃荷重を受ける種々の構造部材のエネルギ吸収能力を評価することを目的とした板殻構造解析プログラムを開発し、多数の実験結果との比較・検討により、その有用性および問題点を明らかにした。3.冷間圧延鋼板を供試材とする中央亀裂試験片を用いて広帯域ランダム荷重下における疲労亀裂伝播挙動について検討した。亀裂開閉口挙動および累積被害則概念に基づいて解析し、一定振幅とランダムの各試験における結果の対応関係を明らかにした。また、T字継曲げ疲労試験を板厚2080mmについて行い、強度の板厚効果を応力論的視点から検討をすすめ、現象を概略説明しうる状況に至っている。大波高波浪中の船体構造応答に次の3つの非線形性が考えられることは良く知られている。1)船体断面の上下運動に対する流体力係数の非線形性。2)船底露出後のスラミング。3)船体が弾性であることによる振動現象(ホイッピング)。ここで2)および3)による非線形性は各船ごとならびに海象条件に固有の特性であり、船底と波面の相対速度、相対角度接触面積などの条件が少しでも異なるとその大きさが著しく変化する。したがって設計規準においてこれら2)、3)の非線形を個別に考慮する事は物理的にも現実的にもなじまない。むしろこれらの非線形性は安全係数および船首部の局部的な補強でカバ-することが望ましいと考えられる。そこで本年度は1)の非線形性を設計規準に取り入れるため、コンテナ船、タンカ-といった異なる船型に対する非線形動的応答シミュレ-ションを行った。その結果、1)の非線形性によりコンテナ船のような痩せた船ではサギングモ-メントがホギングモ-メントより大きくなることが明らかになった。この結果は実験計測からも確認された。また、せん断分布に関しても同様のシミュレ-ションを行い実船との比較を行った。以上の結果に対し統計的処理を行うことにより、10^<-8>の発現確率における船体縦曲げモ-メントの値を求めた。この結果はIACSに対する縦強度に関する国際統一規則の日本案を提出際の基礎デ-タの1部となった。この日本案は国際基準として承認され、さらにせん断強度についても1991年4月末までに各国船級協会において新提案規則が一斉に実施される運びとなった。
駆動力付きの平均曲率流方程式の解の挙動とその応用

固相と気相を隔てる界面、例えば結晶表面が時間とともにどのように成長するかを予測することは、理論的にも、実際的にも重要な自然科学の課題である。例えば、体内の結石がどれくらいで大きくなっていくかといった問題は、生命科学でも重要である。このような現象を記述する方程式の一つである駆動力付平均曲率流方程式の数学解析を行い、その解の性質を多方面から明らかにしていくことを目指す。
上咽頭癌における細胞接着シグナリング機構の解明

EBウイルスの癌蛋白であるLMP1はそのような多くの分子を誘導し上咽頭癌の高転移性に寄与していると考えられているが、その詳しいメカニズムは不明である。近年、核内タンパクであるSATB1がDNAの遺伝子発現に深く関与し、多くの遺伝子発現を制御することが報告された。我々はLMP1とSATB1の上咽頭培養細胞および上咽頭癌組織標本での相互作用を検討した。上咽頭培養細胞においてLMP1を形質導入するとSATB1の誘導が確認された。上咽頭癌組織標本において免疫組織学的検討から、LMP1の発現とSATB1の発現も有意に相関していた。以上から上咽頭癌においてLMP1はSATB1を通して細胞増殖、アポトーシスを制御していることが示唆された.EBウイルスの癌蛋白であるLMP1はそのような多くの分子を誘導し上咽頭癌の高転移性に寄与していると考えられているが、その詳しいメカニズムは不明である。以上から上咽頭癌においてLMP1はSATB1を通して細胞増殖、アポトーシスを制御していることが示唆された.上咽頭癌の悪性化とEBウイルスの潜在的膜蛋白であるLMP1との関連について検討した。これまでLMP1は多くの転移関連因子を誘導することで上咽頭癌の悪性化に関与していることを当教室のこれまでの研究でしめしてきた。しかし依然としてLMP1の詳細な機能は不明な部分が多い。本研究ではLMP1のさらなる機能解明を目的とした。細胞核内において多くの遺伝子の発現調節を行っているSATB1蛋白に着目し、LMP1がSATB1の発現増強を起こすことを確認した。誘導されたSATB1蛋白はMTTアッセイで細胞増殖を亢進した。また血清の非存在下のもとアポトーシスを誘導した培養細胞において、LMP1発現細胞は親細胞に比べ有意にアポトーシスに抵抗性を示した。しかしLMP1発現細胞でSATB1をshRNAにより選択的に抑制すると、このアポトーシス抵抗性が現弱された。さらにこうした現象にはアポトーシス関連蛋白であるSurvivinが関与していることを突き止めた。すなわちLMP1→SATB1→Survivin→アポトーシス抑制といったシグナル伝達があることが分かった。今回の研究でEBウイルス蛋白の一つであるLMP1が遺伝子発現調節蛋白であるSATB1を誘導することで細胞増殖能を亢進し、さらにアポトーシス抑制を引き起こすことを見出した。これは上咽頭癌においてLMP1の悪性化関与機構の一つの可能性を示唆した。今後はさらに先に示したシグナル伝達機構の詳細な解明を行う予定である。LMP1を介したシグナル伝達機構の全容を解明し、鍵となる分子を同定できれば、将来的には分子標的治療薬の開発へとつながるもの思われる。上咽頭癌の悪性化とEBウイルスの潜在的膜蛋白であるLMP1との関連について検討した。すなわちLMP1→SATB1→Survivin→アポトーシス抑制といったシグナル伝達であることが分かった。また上咽頭癌の生検標本においてLMP1とSATB1の免疫組織学的検討において両者の発現が優位に相関していることがわかった。EBV LMP1による細胞増殖能亢進及びアポトーシス制御機能背景:がんの転移は多くの転移関連因子が複雑に絡み合った現象である。

近年、核内タンパクであるSATB1がDNAの遺伝子発現に深く関与し、多くの遺伝子発現を制御することで乳癌の悪性化に寄与していることが報告された。我々はLMP1とSATB1の上咽頭培養細胞および上咽頭癌組織標本での相互作用を検討した。結論:上咽頭培養細胞においてLMP1を形質導入するとSATB1の誘導が確認された。これにはLMP1の細胞内シグナル活性化領域であるCTAR1及びCTAR2の両者が必要であった。またLMP1発現細胞は親細胞に比して細胞増殖能が亢進し、また無血清下においてアポトーシスに抵抗性を示した。しかしSATB1を抑制するとこれらの表現型は減弱した。上咽頭癌組織標本において免疫組織学的検討から、LMP1の発現とSATB1の発現も有意に相関していた。以上から上咽頭癌においてLMP1はSATB1を通して細胞増殖、アポトーシスを制御していることが示唆された. LMP1は上咽頭癌の悪性化に寄与していることが報告されており、本研究成果がその解明の一つになりえた。以上、上記の内容について研究成果を収めJ Gen Virol 2013に掲載された。当初、研究の遅れがあったが、現在論文投稿中24年度が最終年度であるため、記入しない。EBウイルスの上咽頭癌での悪性化メカニズムの解明さらに、治療への応用についてさらなる検討をする予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。