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体育授業における教師の「身体－感性－言語」の関係に関する理論的・実証的研究

教師の成長には,「運動の知識」獲得が重要であり,優れた教師へと成長するための十分条件になっている。しかしながら,この手の知識獲得に関わった問題認識と関心の形成の前段階に,授業マネジメントなど授業の基礎固めに関わる問題といったステージなどが存在しているものと考えられた。また,今後の課題として,各教師の身体知のレベルに合った問題(抱くべき関心も含む)とは何か,どうすれば問題を認識させることが可能なのか,また認識すべき問題に順序は存在するのか,といった実践課題を導出することができた。本研究の目的は,体育科における学習成果を高めた教師は「運動の知識」と「子どものつまずきの類型と対処法に関する知識」を豊富に有し,それらを中核に授業中の「出来事の予兆」に気づき,言語的相互作用を適切に展開しているという関係を学校教育現場で実証することである。上述した研究目的を達成するために,今回,1年目の目標として次の2点を立案した。すなわち,【1】アメリカの体育授業における教師の「身体ー感性ー言語」の関係に関する論理的仮説を導出した。具体的には,Sensitivity研究の第1人者であった,アメリカのクルト・レヴィン氏を中心とした先行研究を批判的に概観し,教師の「身体ー感性」の関係性を検討した。また、【2】優れた教師は本当に体育授業中の「出来事の予兆」への気づきと言語相互作用とが関係するのか検討するため,小学校教師12名を対象に,同一の課題解決的指導法の体育授業を一単元にわたって実施してもらい,両者の関係を検討した(1年目)。その結果、Sensitivityを感性と直訳することには疑義があったこと、感性とはAwarenessと捉えられること、卓越した教師と言われた実践者の一連の著書より、優れた教師の身体と感性は密接に関係するが両者の間には関心が介入している可能性の高いことが、それぞれ導出できた。また、優れた教師ほど言語相互作用を多く展開しており、そこでの言語と体育授業中の「出来事の予兆」への気づきとの多くが対応する関係が認められた。これより、より良い言語的相互作用の展開するためには、「出来事の予兆」に気づくための準備が重要であるものと考えられた。以上のことから、優れた教師は「運動の知識」と「子どものつまずきの類型と対処法に関する知識」を豊富に獲得し,その知識を中核に授業中の「出来事の予兆」に気づき,言語的相互作用を適切に展開できるとする研究仮説は妥当であるものと考えられた。本研究課題として,下記の2点を設定した。すなわち、【1】アメリカの体育授業における教師の「身体ー感性ー言語」の関係に関する論理的仮説を導出した。具体的には,Sensitivity研究の第1人者であった,アメリカのクルト・レヴィン氏を中心とした先行研究を批判的に概観することで,教師の「身体ー感性」の関係性を検討した。また、【2】優れた教師は本当に体育授業中の「出来事の予兆」への気づきと言語相互作用とが関係するのか検討するため,小学校教師12名を対象に,同一の課題解決的指導法(フラッグフットボール)の体育授業を一単元(8時間)にわたって実施してもらい,両者の関係を検討した、の2点である。1年目では、概ね上記2つに関わった研究データの収集・整理は終えることができた。その大きな理由は、アメリカのクルト・レヴィン氏を中心とした先行研究の収集が可能であったこと、学校教育現場の協力により無事に授業研究を実施することが出来たことが大きな理由として挙げられる。とりわけ、後者については、学校現場の先生方が忙しい中で授業研究の打ち合わせに時間を割いてくれたこと、関係する保護者や子どもたちが快く調査協力に応じてくれたことが関係している。また、天候による影響が少なかったことも順調に研究が進展している理由である。2年目についても、引き続き学校教育現場からの協力を得つつ研究を推進していければと願っている。2016年度では、当初の研究計画通りに進めることができた。すなわち、教師の「運動の知識」の広さが体育授業における「出来事の予兆」への気づきと「推論ー対処」にどのような影響を及ぼすのかを検討した。合わせて、授業中の教師行動ー気づきと「推論ー対処」ー学習成果(態度得点,運動技能)の三者の関係についても検討した。調査対象およ授業は、小学校教師(知識量が多く専門的な内容まで把握していた教師を上位群、一般的な知識量を保有している教師を中位群、そうでない教師を下位群)と短距離走(学校行事および天候の関係より、5月及び9月に実施)とした。教師の「運動の知識」量については、「ゲーム理論」における「展開型」の表現様式と樹形図を用いた調査と半構造化インタビューを中心に測定した。得られた結果は次の通りである。(1)同じ小学校教師であっても保有する「運動の知識」量に顕著な相違が存在し、上位群の教師、中位群の教師、さらには下位群の教師に大別可能であったこと、(2)上位群の教師=中位群の教師>下位群の教師という順に1時間あたりの「出来事の予兆」への気づきの頻度数が有意に多く、なかでも「技術的つまずき」に関わったものが多い傾向になったこと、(3)上位群>中位群>下位群の順に学習成果(態度得点,運動技能)も高くなる結果にあった。

(4)気づきの頻度数に差はないが学習成果で差が認められた上位群と中位群について、インタビュー調査と実際の授業中の教師行動より両者の間には、「動機づけられた見落とし」があるものと考えられた。つまり、気づいてはいるものの、対処することで授業の流れが壊れたリ止まる可能性のある「出来事の予兆」については、気づいても実際には行動していなかった現象が中位群の教師には生起していた。授業実践を依頼していた学校教育現場に大きな変化(人事異動や休職など)がなかったことが、おおむね順調に進展した理由であると考える。また、積雪などの天候の影響はあったものの、学校教育現場の先生方が臨機応変に対応して下さったおかげで、授業分析に必要なデータを収集することも可能であった点も、大きな理由であると考える。また、学校教育現場以外の職場(スポーツ教育現場)で日々の実践を蓄積している方々から収集しているデータや調査結果についてアドバイスを頂けたことも順調に進んでいる理由であろう。とりわけ、学校現場とは異なった観点や視点からアドバイスが得られたことで、不足していた調査観点を得ることができたことは、研究を進めるにあたっては大きな成果であったと考える。今年度は,研究課題【3】として体育科を専門としない教師1名と初任教師(経験年数3年以下)1名を対象に,「運動の知識」と「子どものつまずきの類型と対処方法に関する知識」を介入することで,教師の「出来事の予兆」への気づきがどのように変化し,授業中の「言語的相互作用」がどのように改善されるのか検討した。各調査対象者には,介入前にサッカーもしくは短距離走教材を,介入後の単元としてハンドボール教材を,それぞれ実施してもらった。ちなみに,知識への介入は,過去のバイオメカニクスや臨床スポーツ科学の分野を中心としたスポーツ諸科学の研究成果を収集・整理したもの,サッカー,短距離走およびハンドボールを専門とする専門家からの専門的知識提供,これらの運動教材を取り扱った過去の先行研究で認められた「子どものつまずきの類型と対処方法」を体系化したもの,さらには学校体育授業辞典の内容をそれぞれ提示した。その結果,子どもの「技術的つまずき」への気づきやスポーツ諸科学の知見から推論する「合理的推論」の量は増加したものの,実際の言語的相互作用が変化することはなかった。また,子どもたちの学習成果が高まることもなかった。これらより,「運動の知識」獲得は重要であり,優れた教師へと成長するための十分条件ではあるが,この手の知識獲得に関わった問題認識と関心の形成の前段階に,授業マネジメントなど授業の基礎固めに関わる問題といったステージなどが存在しているものと考えられた。また,今後の研究課題として,各教師の身体知のレベルに合った問題(抱くべき関心も含む)とは何か,どうすれば問題を認識させることが可能なのか,また認識すべき問題に順序は存在するのか,といった実践課題を導出することができた。教師の成長には,「運動の知識」獲得が重要であり,優れた教師へと成長するための十分条件になっている。しかしながら,この手の知識獲得に関わった問題認識と関心の形成の前段階に,授業マネジメントなど授業の基礎固めに関わる問題といったステージなどが存在しているものと考えられた。また,今後の課題として,各教師の身体知のレベルに合った問題(抱くべき関心も含む)とは何か,どうすれば問題を認識させることが可能なのか,また認識すべき問題に順序は存在するのか,といった実践課題を導出することができた。
1細胞メチル化DNA検出法の開発と血中循環腫瘍細胞の簡易検出法への展開

本研究は標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞から測定する方法を開発することを目的としている。これまでに、核酸の特殊構造であるグアニン四重鎖(G-quadruplex: G4)構造がメチル化によって安定化すると、その領域を標的とした場合PCR増幅効率が減少することを報告している。つまり、これを利用すれば標的遺伝子のメチル化レベルを、PCRを行うだけで測定することが可能である。一方、メチル化によってG4構造が安定化する詳細な条件やその物理化学的なパラメーターは不明であった。そこで、本年度は血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF)プロモーター中に含まれるG4構造を対象に、このG4構造がメチル化によって安定化する詳細な条件とその物理化学的なパラメーターを解析することを目的とした。メチル化したVEGF G4 DNAと非メチル化VEGF G4 DNAを化学合成し、種々の条件でその熱安定性を円偏光二色性(Circular Dichroism: CD)測定法で解析した。その結果、メチル化によりVEGF G4構造の熱安定性が上昇するためには20 mM NaClと2 mM MgCl2が必要であることが明らかになった。この条件下ではメチル化することによりVEGF G4構造のTm値は5.7度上昇した。VEGF G4には4か所のメチル化サイトが含まれるが、11番目のシトシンをメチル化すると熱安定性が上昇することも明らかにした。これらの結果は、標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞からPCR法で直接測定する方法を開発するために重要な知見になる。本研究はPCRを行うだけで標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞から測定する方法を開発することを目的としている。初年度に本検出法の標的となるG4構造形成領域をゲノムワイドに同定している。具体的には、G4構造結合リガンド存在下において全ゲノム増幅反応を行い、増幅されなかった領域を次世代シークエンサーで解析することにより、ヒトゲノムDNA中のG4構造形成領域を網羅的に同定している。本年度はメチル化によってG4構造の熱安定性が上昇する条件を明らかにした。標的としてはVEGFプロモーター中で形成されるG4構造を用い、20 mM NaClと2 mM MgCl2存在下ではこのG4構造のTm値がメチル化により5.7度上昇することを明らかにした。今後、これらの知見を基に測定条件の最適化を行い、標的遺伝子のメチル化レベル測定法を開発する。本年度に決定したメチル化によりG4構造が安定化する条件を基に、PCRを行うだけで細胞から直接標的遺伝子のメチル化レベルを測定する方法を開発する。初年度に同定したG4構造形成領域から疾病のマーカーとなる遺伝子領域を選択し、そのG4構造がメチル化によって安定化するか検討する。さらにその条件を基に、その領域を標的としPCRを行った際にPCR増幅効率が減少する条件を検討する。さらにゲノムDNAを細胞から抽出しないで、直接PCR溶液に細胞を加え、PCR増幅効率を測定するだけで標的遺伝子のメチル化レベルを測定できる条件を検討する。本研究は1細胞レベルでがん関連遺伝子のメチル化レベルを直接測定する方法を開発することを目的としている。これまでにグアニン四重鎖(G4) DNAがメチル化されるとその構造が安定化すること利用し、PCR増幅効率を測定するだけで標的遺伝子のメチル化レベルを測定できる方法を開発している。そこで本研究では細胞を直接PCR溶液に加え定量PCRを行うことにより癌関連遺伝子のメチル化レベルを測定する方法を開発する。本年度は本検出法の標的となるG4 DNA形成配列を複数含む領域(G4 cluster)をヒトゲノム中から網羅的に同定することを目的とした。これまでにPCR溶液にグアニン四重鎖DNAに特異的に結合する化合物7OTDを添加すると、鋳型となるDNAがG4構造を形成する場合PCRが阻害されることが報告されている。そこで、ヒトゲノムDNAに7OTDを添加し、Whole Genome Amplification (WGA)反応を行えば、ヒトゲノムDNAにおいてG4 cluster領域でWGA反応が阻害されると想定した。つまり、得られたWGA反応産物を次世代シークエンサーで解析し、WGA反応が阻害されているゲノム領域を同定すれば、ヒトゲノムDNA中で形成されるG4 clustersを網羅的に同定できると想定した。実際に7OTD存在下でヒトゲノムDNAをWGAで増幅し、それを次世代シークエンサーで解析した結果、9,651箇所のG4 clustersを同定することに成功した。さらに、その内3,766 G4 clustersは近傍に転写開始点を含み、95遺伝子ががん関連遺伝子であることが明らかになった。つまり、これらがPCRでメチル化レベルを測定する方法の標的遺伝子領域となることが明らかになった。そこで、ヒトゲノムDNAに7OTDを添加し、Whole Genome Amplification (WGA)反応を行えば、ヒトゲノムDNAにおいてG4 cluster領域でWGA反応が阻害さると想定した。実際に7OTD存在下でヒトゲノムをWGAで増幅し、そのWGA効率をPCRで解析した。G4構造形成配列を含む遺伝子としてc-MYC, c-KIT, BCL2, VEGFAを、G4構造形成配列を含まない遺伝子としてMBD3L3, CD4, CNDP2, SOD1を標的としてPCRを行った。

その結果、7OTDを加えてWGAを行うと、G4構造形成配列を含む遺伝子特異的にWGA増幅効率が低下することが示された。そこで、このWGA産物のDNA配列をIllumina HiSeq X10 (the paired-end mode: 150bp×2)を用いて解析した。その結果、平均35 coverageのデータが得られた。全ゲノムに対して10kbp windowごとのリード数をカウントした結果、7OTDを加えた場合に特異的にリード数が減少している領域として9,651箇所のゲノム領域を同定した。つまり、9,651か所のG4 clustersを同定することに成功した。さらに、その内3,766 G4 clustersは近傍に転写開始点を含むことから、これらがメチル化測定のために標的になることが示された。本研究は標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞から測定する方法を開発することを目的としている。これまでに、核酸の特殊構造であるグアニン四重鎖(G-quadruplex: G4)構造がメチル化によって安定化すると、その領域を標的とした場合PCR増幅効率が減少することを報告している。つまり、これを利用すれば標的遺伝子のメチル化レベルを、PCRを行うだけで測定することが可能である。一方、メチル化によってG4構造が安定化する詳細な条件やその物理化学的なパラメーターは不明であった。そこで、本年度は血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF)プロモーター中に含まれるG4構造を対象に、このG4構造がメチル化によって安定化する詳細な条件とその物理化学的なパラメーターを解析することを目的とした。メチル化したVEGF G4 DNAと非メチル化VEGF G4 DNAを化学合成し、種々の条件でその熱安定性を円偏光二色性(Circular Dichroism: CD)測定法で解析した。その結果、メチル化によりVEGF G4構造の熱安定性が上昇するためには20 mM NaClと2 mM MgCl2が必要であることが明らかになった。この条件下ではメチル化することによりVEGF G4構造のTm値は5.7度上昇した。VEGF G4には4か所のメチル化サイトが含まれるが、11番目のシトシンをメチル化すると熱安定性が上昇することも明らかにした。これらの結果は、標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞からPCR法で直接測定する方法を開発するために重要な知見になる。本研究はPCRを行うだけで標的遺伝子のメチル化レベルを1細胞から測定する方法を開発することを目的としている。初年度に本検出法の標的となるG4構造形成領域をゲノムワイドに同定している。具体的には、G4構造結合リガンド存在下において全ゲノム増幅反応を行い、増幅されなかった領域を次世代シークエンサーで解析することにより、ヒトゲノムDNA中のG4構造形成領域を網羅的に同定している。
ブレインサイエンスにシミュレーションから接近する

身体運動は、自分の意志で運動を始めようとする「自律制御」と、いったん運動が始まったら、他の器官などに同調される「引き込み現象」から構築されている。これらの仕組みを明らかにするためには、その基礎づくりとして身体運動に関わる基礎原理を様々な方向から検討しておかなければならない。そのために、以下のような研究を行った。1:従来のシミュレーション研究を総括し、シミュレーション分野の進み具合を文献的に確認するとともに、その問題点を明らかにした。2:垂直跳および立幅跳を対象にした実験によって、下肢の二関節筋の役割、腕振りの効果などを明らかにした。また、超音波法を用いた実験によって、運動中の筋紡錘の働きを、伸張反射を通して明らかにした。3:ダイナミックな身体運動で大きな役割を果たす「筋腱複合体MTC」について、超音波法および力学モデルを用いた方法によって、各要素の力学特性を定量した。4:収縮要素および直列・並列弾性要素からなるHillタイプのMTCモデルを作成した。このモデル1個の動的特性を検証し、身体に配列されている筋の役割を考察した。次に、身体骨格モデルに、MTCモデルを複数個とりつけ、立位の足関節屈伸運動、垂直跳、歩行のシミュレーションを行い、成功した。この人体骨格MTCモデルを用い、神経入力を様々に変化させて動作を構築するという手順を通して、脳の高次機能に接近するという土台ができあがった。これまで、身体運動に関わる自然科学的研究は、実際の運動を実験解析して、その基となる脳の意図を探ってきた。これは、脳の意図から始まって体肢を動かすという身体構築の順序とは逆(逆ダイナミクスと呼ばれる)なのに対し、運動発現の基をコントロールして運動を具現させる方法がモデリングとシミュレーションである。人工知能つまりロボテイクス研究では、「課題を明確に幾つかの部分問題に分割し、それぞれの部分問題を解く情報処理モジュールを構築する。そこからシステム全体を構成する」というアプローチをとる。脳機能の研究においても、このようなアプローチをとり、異なる情報処理のモジュールの存在を仮定し、そのモジュールごとに理解をはかってきた。この研究法の最大の特長は、部分問題が完結している(入力と出力、その変動が予め限定されている)点である。本年度は、「シミュレーションを用いた身体運動の再構築」について、従来のシミュレーション研究を総括すること(大金と深代、JJBSE2000)と、逆ダイナミクスを用いた基本的運動:垂直跳の解析(Nagano & Fukashiro,JB,JJBSE2000)を行った。次年度以降、この2つの研究方法を融合させてシミュレーションを行い、その結果、脳をコントロールする形で「脳の高次機能」が明らかになれば、と考えている。身体運動は自分の意志で運動を始めようとする「自律制御」と、いったん運動が始ったら他の器官などに同調される「引き込み現象」から構築されている。運動を制御するこれらの仕組みを明らかにするためには、その基礎づくりとして身体運動に関わる基礎原理を様々な方向から検討しておかなければならない。これまで、主に単純な身体運動として大きな発揮パワーが得られる下肢の動作、垂直跳に注目して解析を行ってきた。動作のコントロールという観点では、下肢だけではなく上肢にも注目しなければならない。そこで、本年度は研究成果の蓄積がある垂直跳を対象に、動作中の上肢の役割を逆ダイナミクスを用いて解析した。高くあるいは遠くへ跳ぼうとする場合、通常人間は腕を振ってパフォーマンスを高めようとする。垂直跳では腕を振った場合に跳躍高が増加するが、それは身体(特に体幹)の上昇速度よりも大きな速度で腕を上方に振ることで、体幹を下に押し、結果として床反力を増加させる(床反力の力積の増大は跳躍高の増大と同義)。腕振りの貢献度を機械的仕事量の増大という形で定量した。また、ダイナミックな身体運動では、反動が用いられるが、その反動によって主動筋が主要局面直前に引き伸ばされ、伸張反射が生じることが知られている。

この伸張反射は反動動作の効果の一つと考えられている。伸張反射は通常関節角速度との関係で検討されてきたが、実際は筋自体(筋紡錘)の伸張によって生じる。そこで、伸張反射が生じる筋(筋束)の伸張速度を超音波法を用いて定量した。身体運動は、自分の意志で運動を始めようとする「自律制御」と、いったん運動が始まったら、他の器官などに同調される「引き込み現象」から構築されている。これらの仕組みを明らかにするためには、その基礎づくりとして身体運動に関わる基礎原理を様々な方向から検討しておかなければならない。本年度は、運動方向の調節という観点から、その場からの跳躍、つまり垂直方向と水平方向へ跳躍を対象に検討した。これまで、我々は垂直跳と立幅跳を比較して、二関筋筋である大腿直筋が運動方向の調節に大きく関わっていることを指摘した(Nagano, A. and S. Fukashiro : Biomechanical comparison of therole of bi-articular rectus femoris in standing broad jump and vertical jump. Jpn. J. Biomech. Sports Exerc. 4(1):8-15, 2000.)。この研究をさらに進めて、下肢の単関節筋である内側広筋・外側広筋、二関筋筋である大腿直筋・半膜様筋・大腿二頭筋・腓服筋長頭・短頭の計7筋を対象に両跳躍を比較検討した。その結果、膝関節の単関節筋(内側広筋・外側広筋)および足関節の二関節筋(腓服筋長頭・短頭)は両跳躍で差がなく、これらの筋は関節トルク増大のみに貢献していることがわかった。一方、大腿の二関節筋については、垂直跳で大腿の前面(大腿直筋)が、立幅跳で後面(半膜様筋・大腿二頭筋)が大きく働いていた。この筋活動により、立幅跳の股関節トルクが垂直跳に比べてかなり大きくなった。この2種類の跳躍の運動方向の調節は、足部に対する体幹位置とともに、大腿前面と後面の二関節筋によって行われていることが明らかになった。運動を制御するこれらの仕組みを明らかにするためには、その基礎づくりとして身体運動のメカニズムを様々な方向から検討しておかなければならない。本年は、収縮要素と並列・直列弾性要素からなるHillタイプの筋・腱複合体モデル(Muscle-tendon complex : MTC)を作成し、その力学的特徴をシミュレーションした。すなわち、筋と腱の長さ比および負荷重量を変えて収縮要素を最大活動させたところ、腱の長いMTCでは軽い負荷の時に、筋の長いMTCでは重い負荷の時に、相対的に大きな仕事がなされることがわかった。一方、身体の中の体幹(例えば大殿筋)では筋が長いMTC、末端(例えば下腿三頭筋)では腱が長いMTCが配列されていることが、解剖学的にわかっている。
現代イランにおけるイスラームと科学知の併存―環境分野のイスラーム議論を手がかりに

本年度は、現地調査及び文献資料調査を通して、環境分野をめぐる科学知とイスラーム知の関係性に関する知見を深めた。特に、調査地(テヘラン)あるいはオンライン上で入手した一次資料を活用して、イスラーム法学者及び環境エキスパートによるイスラーム的知識の援用のしかた、理由づけ(リーズニング)に着目しながら、彼らの議論の特徴や傾向について概括した。また、環境分野を含めたイランの諸社会分野における、包括的な科学知の適用のあり方にも留意しながら関連情報の収集を進めた。これらの分野における科学知の適用事例は、環境分野における科学知とイスラーム知の関係性を相対化し、多層的に検討する上で有用であった。本研究課題は当初の研究計画よりやや遅れて進行しているが、今年度の現地調査において、研究課題に関わる新たなネットワークを構築することができ、来年度の調査を円滑に実施していく上で収穫があった。以上のような調査により、とりわけ、環境問題に関する(イラン国内の)イスラーム法学者及び環境エキスパートによる所見や問題意識の特徴、問題解決に向けてこれらの環境活動家の間で期待されているイスラーム伝統による貢献、およびイラン国内外の諸社会分野における科学知とイスラーム知の併存関係性について新たな視座から考察し、理解を深めることができた。本年度の研究成果については、英文論考や国際学会・フォーラムでの研究発表を通して幅広い読者層へ発信できた。本年度が研究課題の最終年度であったが、イランでは反政府組織によるテロや急激なデフレーションにより国内情勢が著しく不安定化したため、従来の調査計画の変更(延期)を強いられた。しかし、過年度の研究活動により本研究課題に関する基礎的情報の収集、整理を進められたため、今後、イラン国内外の動向に注視しながら、現地調査・文献資料調査を継続できれば、研究課題の完遂は可能であると考える。来年度は本研究課題の総仕上げに向けて、テヘラン、可能であればコムを訪れ、特にイスラーム知を基底とした環境啓発の実践に焦点を当てて調査を実施する。また、文献資料調査は随時継続し、関連情報のアップデートを行う。すなわち、環境啓発・教育の現場でのインタビュー及び参与観察調査を通して、過年度の研究より明確化してきたイスラーム的環境言説の実践についての理解を深めると共に、イラン国内で発信される環境言説を俯瞰しながら、環境分野をめぐるイスラーム知と科学知の関係性について批判的に検討していく。来年度の下半期に調査データを整理、統合し、研究成果を国際的に発信することを目指す。具体的には、海外からの識者を招聘しての国際シンポジムの開催、国際学術誌への論文投稿、国際学会での研究発表を通して、研究成果をより広い読者と共有し、社会へ還元していく。本年度は、主に文献資料調査を通して、環境分野におけるイスラーム的視座について研鑽をおこなった。具体的には、イランで入手した「環境問題とイスラーム」を題材にした一次資料より、イラン宗教指導者層やイスラーム法学者の環境問題への見解について知見を深めることができた。また、メディア媒体(新聞、ラジオ、雑誌等)を介して発信されている環境問題が、どのようにイスラームの規範と関連づけられて提起されているのかという点に特に着目しながら、情報収集をおこない分析を進めた。イラン国内外における環境問題ニュースについては随時確認を行い、同国を取り巻く国内外の諸事情にも留意しながら、関連情報をアップデートした。以上のような調査から、イラン政府によるイスラーム教義を媒介させた環境問題政策、イスラーム法学者による環境問題に対する視座、イスラーム聖典の援用のされ方についての傾向性が明らかになってきた。本年度の研究成果については、論考や学会・研究会などを通して発信できた。当初の計画では、平成29年度に現地調査を実施予定であったが、イランの国内事情により、調査の延期を強いられた。昨今、環境活動家や環境保全活動の政治性が当局より問題視され始めたことは、今後の現地調査のあり方に影響を及ぼす可能性があり、国内情勢の動向に注視していく必要がある。現在は、文献資料調査を継続しながら、これまで蓄積してきたデータと合わせて、科学知とイスラーム知の併存関係性について総合的に分析を進めている。

しかし、過年度の研究活動により本研究課題に関する基礎的情報の収集、整理を進められたため、今後、イラン国内外の動向に注視しながら、現地調査・文献資料調査を継続できれば、研究課題の完遂は可能であると考える。来年度はテヘラン、コムを中心に、可能であれば複数回、現地調査を実施する。本年度の調査より明らかになってきた環境分野におけるイスラーム言説が、当該地域の人びとの間でどのように受け入れられているのか(あるいは、受け入れられていないのか)について批判的に検討する。環境教育を行っている諸機関への訪問、関連イベントへの参与観察、環境エキスパートおよび市民への聞き取り調査などを通じて、環境分野で展開しているイスラームの多義性に関するデータを蓄積し、分析を試みる。同時に、イランの環境分野における科学技術の発展についても着目しながら、科学知とイスラームを媒介とする知識の競合、併存性のあり方への理解を深める。現地調査後は、得られた全てのデータを整理・吟味し、環境分野において西洋近代科学を背景に展開する現代イスラーム解釈についての様相を読み解く。本研究の成果を人類学や宗教社会学などの分野における国際学術誌や学会発表を通して発信する。来年度は本研究課題の総仕上げに向けて、テヘラン、可能であればコムを訪れ、特にイスラーム知を基底とした環境啓発の実践に焦点を当てて調査を実施する。また、文献資料調査は随時継続し、関連情報のアップデートを行う。すなわち、環境啓発・教育の現場でのインタビュー及び参与観察調査を通して、過年度の研究より明確化してきたイスラーム的環境言説の実践についての理解を深めると共に、イラン国内で発信される環境言説を俯瞰しながら、環境分野をめぐるイスラーム知と科学知の関係性について批判的に検討していく。来年度の下半期に調査データを整理、統合し、研究成果を国際的に発信することを目指す。具体的には、海外からの識者を招聘しての国際シンポジムの開催、国際学術誌への論文投稿、国際学会での研究発表を通して、研究成果をより広い読者と共有し、社会へ還元していく。当初の計画では、平成29年度に現地調査を実施予定であったが、イランの国内事情により、調査の延期を強いられたため。イランの国内事情を考慮しながら、平成30年度(場合によっては翌年度)に複数回イランで調査を実施することを検討している。本年度が研究課題の最終年度であったが、イランでは反政府組織によるテロや急激なデフレーションにより国内情勢が著しく不安定化したため、従来の調査計画の変更(延期)を強いられた。来年度の予算は主に現地調査、図書購入、国際シンポジウムの開催にあてる計画である。具体的には、来年度は本研究課題の総仕上げに向けて、テヘラン、可能であればコムを訪れ、特にイスラーム知を基底とした環境啓発の実践に焦点を当てて調査を実施する。
ATトラクトを認識する核マトリックス蛋白質のDNA結合機構

1.MAR結合タンパク質SP120の認識配列を明らかにするため,人工MARとして種々の合成コンカテマーDNAを合成し,競合DNA存在下に末端ラベルしたコンカテマーの特異的結合を測定した.2つのATトラクトを含むモノマー(26塩基長)のヘキサマー(156bp)がSP120との結合に必要な最短のコンカテマーであることが明らかになった.ATトラクトの配列が異なる36種類のヘキサマーを合成し,それぞれの結合親和性を比較したところ,poly(dA)・poly(dT)で強く競合されるというMARの特徴を示す数種類のコンカテマーが同定された.しかし,結合活性と厳密な相関をもつATトラクトの配置パターン(バーコード)を特定することは未だできていない.2.DNAトポイソメラーゼIIのアイソフォームβ(トポIIβ)がin vivoで直接作用しているゲノム領域をクローン化し,多数のMARを含むクローンを得た.複数のターゲット・クローンの塩基配列を決定した結果,ATトラクトの配置パターンに,ある種の法則性が見いだされた.トポIIβはSP120と同様にATトラクトを認識するが,その配置パターンは異なることが示唆された.3.天然のMAR内部に共通して見出される,約120bpにわたって特定の間隔で現れる4つのATトラクト(Aトラクト2つとTトラクト2つ)からなるモチーフ(MARモチーフと呼ぶ)を,市販の配列解析ソフトウェアのモチーフ検索機能を利用して,インプットした任意の塩基配列の中で検索するアルゴリズムを作った.この方法により,ヒトのβグロビン遺伝子座(約75kb)のMARを予測した.計17箇所のMAR候補領域を同定し,PCRクローニングで12箇所のクローンを得た.核マトリックスとの結合を調べると,11/12が強いMAR活性を示した.negative controlとした3つの領域にはMAR活性を検出しなかった.この方法は未知のゲノム領域の塩基配列情報のみからMARの位置を予測する際に有用であると思われる.1.MAR結合タンパク質SP120の認識配列を明らかにするため,人工MARとして種々の合成コンカテマーDNAを合成し,競合DNA存在下に末端ラベルしたコンカテマーの特異的結合を測定した.2つのATトラクトを含むモノマー(26塩基長)のヘキサマー(156bp)がSP120との結合に必要な最短のコンカテマーであることが明らかになった.ATトラクトの配列が異なる36種類のヘキサマーを合成し,それぞれの結合親和性を比較したところ,poly(dA)・poly(dT)で強く競合されるというMARの特徴を示す数種類のコンカテマーが同定された.しかし,結合活性と厳密な相関をもつATトラクトの配置パターン(バーコード)を特定することは未だできていない.2.DNAトポイソメラーゼIIのアイソフォームβ(トポIIβ)がin vivoで直接作用しているゲノム領域をクローン化し,多数のMARを含むクローンを得た.複数のターゲット・クローンの塩基配列を決定した結果,ATトラクトの配置パターンに,ある種の法則性が見いだされた.トポIIβはSP120と同様にATトラクトを認識するが,その配置パターンは異なることが示唆された.3.天然のMAR内部に共通して見出される,約120bpにわたって特定の間隔で現れる4つのATトラクト(Aトラクト2つとTトラクト2つ)からなるモチーフ(MARモチーフと呼ぶ)を,市販の配列解析ソフトウェアのモチーフ検索機能を利用して,インプットした任意の塩基配列の中で検索するアルゴリズムを作った.この方法により,ヒトのβグロビン遺伝子座(約75kb)のMARを予測した.計17箇所のMAR候補領域を同定し,PCRクローニングで12箇所のクローンを得た.核マトリックスとの結合を調べると,11/12が強いMAR活性を示した.negative controlとした3つの領域にはMAR活性を検出しなかった.この方法は未知のゲノム領域の塩基配列情報のみからMARの位置を予測する際に有用であると思われる.1.SP120に特異的に結合することが示された合成コンカテマ-DNA(random concatemer,RC)をセファロースに固定化し,これを吸着体として核の抽出液からSP120をアフィニティー精製しすることが可能になった.2.合成したRC(鎖長は不均一)をゲル電気泳動にかけて鎖長の違いにより分画・精製した.それぞれを^<32>Pで末端ラベルし,過剰の大腸菌DNAの存在下にSP120とのフィルター結合反応を行って結合親和性を比較したところ,ユニット・オリゴマー(26-mer)のhexamer(156bp)がSP120との結合に必要な最短のオリゴ・コンカテマ-であることがわかった.3.計画調書に詳述した手順により特定の配列をもったオリゴ・コンカテマ-を合成する方法を確立した.具体的には,重合方向に制限を加えるためにユニット・オリゴマーの5′端の4塩基の配列(ライゲーションのタッグとなる)を変化させた11種類のオリゴマーとそれらの相補配列を合成した.これらを適当に組み合わせてアニーリング・ライゲーションし,制限酵素で切り出すことにより,すべての可能なhexamer配列(36種類)を合成した.これらを用いた結合実験はまだ完了していない.4.ATトラクトに変異を導入した数種類のユニット・オリゴマーを合成し,ランダムライゲーションによりコンカテマ-を調製した.これらを末端ラベルして精製SP120との結合親和性をフィルター結合法で検討した.

ATトラクトをG/Cの挿入で破壊したもの,ATトラクトをheteropolymeric(例えば,TATやTAAT)にしたもの,TトラクトをAトラクトに転換させたものやATトラクトの間隔を変えたものでは著しく親和性が低下することが明らかになった.この結果はATトラクトの存在と極性,及び出現間隔がSP120との結合にとって重要な因子であるというバ-コードモデルを支持するものである.1. MAR結合タンパク質SP120の認識配列を明らかにするため,付着端が異なる22種類のユニット・オリゴマー(26塩基長で2つのATトラクトを含む)を組み合わせて36種類のオリゴ・コンカテマー(hexamer)を合成し,それぞれの精製SP120に対する結合親和性をフィルター結合法により比較した.しかし,期待したほどの結合活性の差は検出されず,結合活性と厳密な相関をもつATトラクトの配置パターン(バーコード)を特定することはできなかった.現在,SP120のDNA結合領域をもつGST融合タンパク質を調製し,新たな結合測定法を用いて解析をやり直している.2. SP120と同様の機構でMARを認識すると思われるDNAトポイソメラーゼII(トポII)に関する研究を開始した.まず,トポIIアイソフォームβがin vivoで直接作用しているゲノム領域をクローン化する技術を開発し,この酵素の主要なターゲットはATトラクトに富む領域であり,トポIIβによる切断点はMAR内部か,その近傍2-3kbの非コード領域内にあることを証明した.現在,切断点周辺のATトラクトの配置パターンに法則性が見いだされることを期待して,複数のターゲット・クローンの塩基配列と切断点の解析を行っている.3. ATトラクトの間隔に注目して十数種類のMARの塩基配列を調べると,約120bpにわたって特定の間隔で現れる4つのATトラクト(Aトラクト2つとTトラクト2つ)からなるモチーフが頻繁に出現することがわかった.いくつかの塩基配列について,このモチーフをコンピュータで検索することにより,かなりの確度でMARを予測できることがわかった.上記のオリゴ・コンカテマーの一部にもこのモチーフが存在することから,バーコードモデルはMAR一般についても成立する可能性が示唆された.1.MAR結合タンパク質SP120の認識配列を明らかにするため,SP120のDNA結合領域(N末端領域)をもつGST融合タンパク質を調製し,これをグルタチオン-セファロースに結合させたものを結合基質として用いる結合反応系を作製した.競合DNA存在下に末端ラベルしたDNA断片の特異的結合を測定した.既知のMARやトポII標的クローンに見出された新たなMARを用いて,この系が働くことを確認した.次に,156塩基長で12のATトラクトを含む36種類のオリゴ・コンカテマー(hexamer)を合成し,それぞれの結合親和性を比較したところ,poly(dA)・poly(dT)で強く競合されるというMARの特徴を示す数種類のコンカテマーが同定された.しかし,やはり結合活性と厳密な相関をもつATトラクトの配置パターン(バーコード)を特定することはできなかった.
Wolbachia感染天敵製剤の放飼における生態リスク評価

近年、化学肥料や化学農薬の使用量を削減した環境保全型農業が推進され、化学農薬に替わる害虫防除法として天敵製剤の利用が年々増加している。しかし、細胞内共生細菌Wolbachiaが感染した天敵製剤を放飼した場合、特定の組合せ(非感染雌と感染雄など)でふ化率が減少する細胞質不和合(CI)によって放飼個体が個体群中で分布拡大し、個体群構造を変えてしまう可能性がある。これまで天敵製剤の放飼が野外個体群の遺伝的多様性に影響を及ぼすかどうか定量的に調査した研究は少なく、Wolbachiaによる影響もあまり考えられていない。そこで本研究では、CIを引き起こす2種類のWolbachia、wOus1およびwOus2が感染している天敵製剤タイリクヒメカメムシを放飼することで野外個体群の遺伝的多様性に影響を与えているかを明らかにすることを目的とした。本年度は1.放飼地域と無放飼地域の遺伝的多様性調査、2.シミュレーションモデルによる放飼個体の分布拡大予測をおこなった。前年度と引き続き、複数の遺伝マーカーを用いて放飼地域と無放飼地域の遺伝的多様性を調査した結果、前年度同様の傾向がみられた。さらに、単感染個体群に2重感染個体である放飼個体が侵入した場合、どのように放飼個体が分布拡大するかCaspari and Watsonモデル(Hoffmann et al.1990による改良)およびTravelling Wave Model(Turelli and Hoffmann,1991;Schofield,2002)を用いて予測した。その結果、タイリクヒメハナカメムシでは細胞質不和合の強さや放飼量によって単感染個体より放飼個体の適応度が高くなり、野外個体群に侵入した放飼個体が分布拡大すると予測された。細胞質不和合を引き起こすWolbachiaが感染した天敵製剤を放飼するとミトコンドリア遺伝子の多様性を低下させる可能性があるため、今後も引き続き放飼地域と無放飼地域の野外個体を採集し、継続的な遺伝的多様性の調査が必要である。Wolbachiaが感染した天敵製剤を放飼している地域と放飼していない地域においてサンプルを採集し、遺伝的多様性に関する貴重なデータを蓄積できた。本研究によって天敵製剤を実用化する際の事前評価として、今後共生微生物の調査が必要となってくると考えられる。これらの点から本研究は農学分野の技術発展に貢献できると思われる。本研究でおこなったシミュレーションモデルによる野外個体群内における放飼個体の分布拡大予測と野外個体の遺伝的多様性のデータを相互に照らし合わせることによって、これまで明確ではなかった天敵製剤の放飼による農業生態系への影響を科学的に評価していく予定である。また、今後も引き続き放飼地域と無放飼地域の野外個体を課集し、継続的な遺伝的多様性の調査が必要であると考えられる。まず、複数の放飼地域と無放飼地域からタイリクヒメハナカメムシの野外個体を採集し、Wolbachia感染の有無を調査した。その結果、各地域のWolbachia感染率は100%で、単感染個体より2重感染個体の割合が多かった。続いて、遺伝的多様性を調査するために核ではマイクロサテライト領域、ミトコンドリアではCytb領域の遺伝マーカーを選定し、天敵製剤および各地域のタイリクヒメハナカメムシの遺伝的多様性を調査した。ミトコンドリア領域による調査では、両地域で天敵製剤と同様のハプロタイプが多く検出された。地域間のハプロタイプ多様度では差がみられなかったが、塩基多様度では放飼地域の方が有意に低かった。一方、マイクロサテライト領域による調査では、地域間の遺伝的多様性に差はみられなかった。今後も野外個体の採集および解析をおこない、Wolbachia感染天敵の放飼による野外個体群の遺伝的多様性に与える影響を検証する。

本年度は1.放飼地域と無放飼地域の遺伝的多様性調査、2.シミュレーションモデルによる放飼個体の分布拡大予測をおこなった。前年度と引き続き、複数の遺伝マーカーを用いて放飼地域と無放飼地域の遺伝的多様性を調査した結果、前年度同様の傾向がみられた。さらに、単感染個体群に2重感染個体である放飼個体が侵入した場合、どのように放飼個体が分布拡大するかCaspari and Watsonモデル(Hoffmann et al.1990による改良)およびTravelling Wave Model(Turelli and Hoffmann,1991;Schofield,2002)を用いて予測した。その結果、タイリクヒメハナカメムシでは細胞質不和合の強さや放飼量によって単感染個体より放飼個体の適応度が高くなり、野外個体群に侵入した放飼個体が分布拡大すると予測された。細胞質不和合を引き起こすWolbachiaが感染した天敵製剤を放飼するとミトコンドリア遺伝子の多様性を低下させる可能性があるため、今後も引き続き放飼地域と無放飼地域の野外個体を採集し、継続的な遺伝的多様性の調査が必要である。Wolbachiaが感染した天敵製剤を放飼している地域と放飼していない地域においてサンプルを採集し、遺伝的多様性に関する貴重なデータを蓄積できた。本研究によって天敵製剤を実用化する際の事前評価として、今後共生微生物の調査が必要となってくると考えられる。これらの点から本研究は農学分野の技術発展に貢献できると思われる。本研究でおこなったシミュレーションモデルによる野外個体群内における放飼個体の分布拡大予測と野外個体の遺伝的多様性のデータを相互に照らし合わせることによって、これまで明確ではなかった天敵製剤の放飼による農業生態系への影響を科学的に評価していく予定である。また、今後も引き続き放飼地域と無放飼地域の野外個体を課集し、継続的な遺伝的多様性の調査が必要であると考えられる。
組換え昆虫細胞による次世代インフルエンザワクチンの迅速高生産技術の開発

ウイルス様粒子は,ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとして利用が期待されている.本研究の目的は,インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤を確立することである.このため本研究では,A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し,両タンパク質と脂質二重層から構成されるインフルエンザウイルス様粒子の連続分泌生産系を構築する.これまでに,インフルエンザAウイルスのHAおよびM1の遺伝子を,異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターにそれぞれクローニングし,両プラスミドをTrichoplusia ni由来のBTI-TN-5B1-4 (High Five)にコトランスフェクションし,薬剤耐性遺伝子に対応する2種類の抗生物質の存在下で培養をおこなった.両抗生物質存在下で培養を継続することによりHAおよびM1を共発現する細胞を効率よく取得できるが,Drosophila由来のBiPシグナル配列をHA,M1両遺伝子の上流に付加することにより,付加していない場合に比べて,HAおよびM1の分泌生産量が著しく増大することを確認した.また,培養上清を濃縮・精製し透過電子顕微鏡で観察したところ,脂質二重層やHAのスパイク構造を有する粒子が確認された.このことから,作製した組換え昆虫細胞はインフルエンザウイルス様粒子を分泌生産していると考えられる.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとして,ウイルス様粒子の利用が期待されている.本研究では,インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤の構築を検討する.このため本研究では,A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し,両タンパク質と脂質二重層から成るウイルス様粒子の連続分泌生産系の確立を目指す.本年度は,まず,インフルエンザAウイルスのHAおよびM1のcDNAを,GenBankに公開されている塩基配列に基づきそれぞれ全合成した.この際,昆虫細胞における発現に向けてコドンの最適化をおこなった.合成した遺伝子を,異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターpIHAblaおよびpIHAneo (Yamaji et al.: Biochem. Eng. J., 41, 203-209 (2008))にクローニングした.作製したHAおよびM1の発現ベクターをTrichoplusia ni由来のBTI-TN-5B1-4 (High Five)にコトランスフェクションし,一過性発現を試みた.培養上清を抗インフルエンザAウイルスHA H1抗体および抗M1抗体を用いるウェスタンブロット法で分析したところ,HAおよびM1に相当する分子量付近にそれぞれ特異的なバンドを検出することができた.このことから,発現ベクターを導入した昆虫細胞はHAおよびM1を分泌発現することがわかった.HAおよびM1の発現ベクターを構築し,両発現ベクターをコトランスフェクションした昆虫細胞がHAおよびM1を分泌発現することを確認している.ウイルス様粒子は,ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとしての利用が期待されている.本研究では,インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤の確立を目指す.このため本研究では,A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し,両タンパク質と脂質二重層から構成されるウイルス様粒子の連続分泌生産系の構築について検討する.本年度は,HAおよびM1のcDNAをそれぞれクローニングした,異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションすることにより,HAおよびM1を共発現する安定形質転換細胞の構築を試みた.HAおよびM1の発現ベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションした後,これらのプラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子に対応する2つの薬剤の存在下で長期間培養を続けることにより,薬剤耐性株を取得した.得られた薬剤耐性株の培養上清を抗HA抗体および抗M1抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析したところ,HAおよびM1に相当する分子量付近にそれぞれ特異的なバンドを検出することができた.このことから,HAおよびM1を連続的に分泌生産する組換え昆虫細胞を作製に成功したと言える.また,培養上清をショ糖密度勾配遠心分離により分画した各フラクションをウェスタンブロッティングで分析すると,HAとM1がほぼ同等のショ糖密度のフラクションに確認された.さらに,培養上清を動的光散乱法で分析したところ,上清中に最頻粒子径が約120 nmの粒子が存在することがわかった.これらのことから,組換え昆虫細胞が分泌生産したHAとM1はウイルス様粒子を形成している可能性が示唆された.HAおよびM1の発現ベクターをコトランスフェクションし,2種類の薬剤の存在下で長期間培養することにより得られた組換え昆虫細胞がHAおよびM1を分泌発現することを確認できたとともに,HAとM1がウイルス様粒子を形成している可能性が示唆された.ウイルス様粒子は,ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとして利用が期待されている.本研究の目的は,インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤を確立することである.このため本研究では,A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し,両タンパク質と脂質二重層から構成されるインフルエンザウイルス様粒子の連続分泌生産系を構築する.

これまでに,インフルエンザAウイルスのHAおよびM1の遺伝子を,異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターにそれぞれクローニングした.これらのプラスミドを昆虫細胞にコトランスフェクションし,薬剤耐性遺伝子に対応する2種類の抗生物質の存在下で培養することにより,HAおよびM1の両遺伝子が染色体に組み込まれた安定形質転換細胞を取得している.この際,Drosophila由来のBiPシグナル配列をHA,M1両遺伝子の上流に付加したところ,付加していない場合に比べて,HAおよびM1の分泌生産量が著しく増大することを見出した.また,ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集試験により,培養上清中のHAが赤血球凝集活性を有することを確認した.さらに,培養上清をポリエチレングリコール沈殿法およびショ糖密度勾配遠心分離法で処理することによりインフルエンザウイルス様粒子を精製し,これを抗原としてウサギに免疫することにより抗血清を作製した.今後,この抗血清を用いた酵素免疫測定法(ELISA)を確立し,HAを定量することにより,組換え昆虫細胞によるインフルエンザウイルス様粒子の生産特性を明らかにする.Drosophila由来のBiPシグナル配列をHAおよびM1両遺伝子の上流に付加することにより,組換え昆虫細胞によるインフルエンザウイルス様粒子の分泌生産量を著しく増大することに成功した.また,赤血球凝集試験により,分泌されたHAが赤血球凝集活性を有することを確認できた.ウイルス様粒子は,ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとして利用が期待されている.本研究の目的は,インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤を確立することである.このため本研究では,A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し,両タンパク質と脂質二重層から構成されるインフルエンザウイルス様粒子の連続分泌生産系を構築する.これまでに,インフルエンザAウイルスのHAおよびM1の遺伝子を,異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターにそれぞれクローニングし,両プラスミドをTrichoplusia ni由来のBTI-TN-5B1-4 (High Five)にコトランスフェクションし,薬剤耐性遺伝子に対応する2種類の抗生物質の存在下で培養をおこなった.両抗生物質存在下で培養を継続することによりHAおよびM1を共発現する細胞を効率よく取得できるが,Drosophila由来のBiPシグナル配列をHA,M1両遺伝子の上流に付加することにより,付加していない場合に比べて,HAおよびM1の分泌生産量が著しく増大することを確認した.
ナノポアシークエンサーを用いたRNA二次構造決定法の開発

本研究では,RNAの構造と機能の網羅的な相関解析へ向けて,その基盤となるRNA二次構造決定のための新しい技術を開発する.具体的には,RNA二次構造特異的な化学修飾を引き起こす化合物でRNA配列を処理し,ナノポアシークエンサーでその化学修飾を直接読み取ることによって二次構造プロファイルを計測する方法を確立する.また,得られた二次構造プロファイルをRNA二次構造予測に利用することによって予測精度の劇的な向上を目指す.本研究では,RNAの構造と機能の網羅的な相関解析へ向けて,その基盤となるRNA二次構造決定のための新しい技術を開発する.具体的には,RNA二次構造特異的な化学修飾を引き起こす化合物でRNA配列を処理し,ナノポアシークエンサーでその化学修飾を直接読み取ることによって二次構造プロファイルを計測する方法を確立する.また,得られた二次構造プロファイルをRNA二次構造予測に利用することによって予測精度の劇的な向上を目指す.