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ハロタン還元代謝中のシトクロムP450失活に関する研究

ハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によるシトクロム450の崩壊機構を明らかにする目的でハロセンおよび四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化反応におよぼすイソフルランの影響について検討した.測定は反応代謝物,シトクロムP450濃度,シトクロムP450還元速度についておこなった.材料は酵素標品としてハートレイ系雄性モルモット肝ミクロソーム,電子供与体としてNADPH,反応基質としてハロタンまたは四塩化炭素,反応の修飾剤としてイソフルランをもちいた.得られた結果を以下に示した.1.ハロセンまたは四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化はイソフルランによって亢進した.2.ハロセンまたは四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化反応におけるシトクロムP450濃度は反応終了時に減少した.この減少はイソフルランの存在により押さえられた.3.還元反応の代謝産物,ハロアルカンの酸化反応が生じていないことが確認された.4.イソフルランの存在することによりNADPHから電子伝達系への電子の流れが促進した.5.還元反応生成物によるシトクロムP450の崩壊が生じていないことが確認された.ハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によってシトクロム450の崩壊がおこることが報告されている.この崩壊はハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応の結果生じる脂質過酸化によるものなのか,反応中間体による直接作用なのか二つの説がある.本研究でイソフルランによって還元反応が更新しているのにも関わらずシトクロムP450の崩壊が防止されることが示された.この結果はハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によって生じるシトクロム450の崩壊は反応中間体の直接作用であることを強く示唆する.ハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によるシトクロム450の崩壊機構を明らかにする目的でハロセンおよび四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化反応におよぼすイソフルランの影響について検討した.測定は反応代謝物,シトクロムP450濃度,シトクロムP450還元速度についておこなった.材料は酵素標品としてハートレイ系雄性モルモット肝ミクロソーム,電子供与体としてNADPH,反応基質としてハロタンまたは四塩化炭素,反応の修飾剤としてイソフルランをもちいた.得られた結果を以下に示した.1.ハロセンまたは四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化はイソフルランによって亢進した.2.ハロセンまたは四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化反応におけるシトクロムP450濃度は反応終了時に減少した.この減少はイソフルランの存在により押さえられた.3.還元反応の代謝産物,ハロアルカンの酸化反応が生じていないことが確認された.4.イソフルランの存在することによりNADPHから電子伝達系への電子の流れが促進した.5.還元反応生成物によるシトクロムP450の崩壊が生じていないことが確認された.ハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によってシトクロム450の崩壊がおこることが報告されている.この崩壊はハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応の結果生じる脂質過酸化によるものなのか,反応中間体による直接作用なのか二つの説がある.本研究でイソフルランによって還元反応が更新しているのにも関わらずシトクロムP450の崩壊が防止されることが示された.この結果はハロアルカン還元的脱ハロゲン化反応によって生じるシトクロム450の崩壊は反応中間体の直接作用であることを強く示唆する.
児童養護施設における子どもの権利擁護に関する実証的研究

本研究は、児童養護施設における『権利ノート』の導入が施設現場においてどのような変化をもたらしたのかを大阪府の児童養護施設職員のインタビュー調査により明らかにしたものである。「集団指導から個人の尊重」、「子どもの声を聴く」といった変化の様相が明らかとなったが、「共通体験の不在」、「振り回される職員」、「とめられない問題行動」、「かえって混乱する子ども」といった問題も生じた。本研究は、こうした職員たちの「変えられない困難さ」を詳細に記述し、施設における権利擁護が意識向上だけでは果たされないことを示した。平成20年度は、児童養護施設経験者、児童福祉司、児童養護施設職員に対する予備調査の実施および児童養護施設職員のインタビュー本調査に着手した。同年10月から12月にかけて6名の児童養護施設職員にお話をお伺いするなかで、施設の個別性による差が大きいことから府内の地域ブロック、施設規模に考慮してバランスよく調査を実施する必要があることを実感した。予定していた他の対象者のインタビューを実施する前に、まずは児童養護施設職員のインタビュー調査を集中して行うこととし、平成21年2月に追加の依頼を経て府内の3ブロック4名ずつ12名、施設規模、性別においても非常にバランスのよい12名というサンプリングとなった。平成20年度末にかけては、インタビューの音声記録を逐語録化するとともに分析をすすめた。児童養護施設職員のインタビュー調査結果においては、『権利ノート』を導入したことによる施設体制の変化および児童養護施設職員の意識変革について多く得ることができた。これらの変化や意識改革の過程は、既往の研究において明らかでなかった点である。加えて、児童養護施設職員の意識が変革されたからこそ生じた葛藤に関する語りも多くあった。今後、追加のインタビュー等を実施しながら12名の児童養護施設職員の語りの分析をすすめていく。平成21年1月8日に厚生労働省より出された「被措置児童等虐待対応ガイドライン(案)」では、『権利ノート』の重要性が再度指摘された。大阪府では、『権利ノート』の作成から10年以上の年月がたっている。その実践現場に身を置いてきた児童養護施設職員の語りを分析することにより、児童養護施設における子どもの権利擁護を保障するために必要な諸条件についての知見が得られると考えている。本研究は、大阪府における『子どもの権利ノート』の導入が児童養護施設現場の施設職員の意識およびケア方法、施設の体制にどのような変化をもたらしたのかをインタビュー調査により実証的かつ構造的に明らかにするものである。2008年4月から2009年2月にかけて、『権利ノート』作成以前の状況も知る勤務経験が10年以上の児童養護施設職員12名の協力を得た。半構造化面接によるインタビュー調査を行い、(1)『権利ノート』の印象(2)『権利ノート』の導入過程(3)子どもとめのエピソード(4)変化した体制や意識(5)『権利ノート』に対する評価について尋ねた。インタビューデータを丹念に読み込み、ライフヒストリー法による分析を行った。問いかけに対応するデータの切片化、まとまりをあらわす言葉をコードとして付し、時系列に並べ、事実と職員の意味づけに分類し整理を行った。結果として、児童養護施設現場は、「集団指導から個人の尊重」「子どもの声を聴く」「プライバシーの尊重」「体罰によらない指導」「導くより後押しのスタンス」「抱え込み体制かち他の機関をまきこんでのチームワーク」という変化があった。しかしながら、施設の生活形態や職員配置基準の低さが変わらない状況において、新たに生じてきた問題、子どもとの葛藤、意識が高まったからこそ生じた職員の苦悩も明らかとなった。子どもの権利条約が批准されて10年以上が経過したが、生活文脈における子どもとおとなの関係性の変化はほとんが明らかにされていない。本研究は、児童養護施設現場という生活文脈において子どもの権利の理念が浸透していく過程やおとなの意識の変遷を明らかにした。同時に、施設職員、つまりおとなの意識向上だけでは子どもの権利擁護を保障することが困難である現実も詳細に描き出した。根本的な制度や生活形態の変革の重要性はかねてから指摘されるところであるが、それが望まれる現実の有様を描き出したことが本研究の特徴である。
結核菌関連細胞表層糖脂質TDCM類の系統的合成と免役活性化・制がん性

炭素数が60以上の長鎖脂肪酸を有する,結核菌の細胞表層糖脂質TDMは,免疫活性化に基づく抗腫瘍活性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまでに非常に多くの研究が行われてきたが,高い毒性の故に遂に実用化されることはなかった.最近,本研究者らは,鎖長が短いジフテリア菌由来の糖脂質TDCMの,二つの不斉中心に関する全ジアステレオマー(RR体,RS体,SR体,及びSS体)を不斉合成し,天然物がRR体であることを証明すると共に,非天然物であるSS体が,天然TDMと同等以上の強力な制がん作用,及びがん転移阻害作用を示す一方で,極めて毒性が低いことを明らかにした.この結果をもとに,この徹底した誘導体合成と,活性評価を行い,これらの化合物が低分子化合物では初めての1L-6増強活性物質であることを突き止め,in vitroのアッセイ系の確立にも成功し,特許の申請に漕ぎつけ,前例のない免疫活性化に基づく制がん剤の開発を明確に視野に捕らえた.一方,本研究は生理活性物質の合成によって制がん剤の開発を目指すと共に,新しい合成手段の開拓に力を注いで来た.1983年に当教室が開発して,ごく一部で西沢試薬と呼ばれている水銀トリフラートが,2002年になって末端アセチレの水和反応を強力に触媒することが明らかになり,その反応機構の解明と,あらたな水銀トリフラート触媒反応の開発に全力を投入し,多くの研究成果を上げることが出来た.さらにステロイド生合成のC環形成の問題,酵素は如何にしてMarkovnikovの壁を越えるかに挑み,対アニオンによってカチオンの立体配座が制御される事実を立証して懸案を解決した.炭素数が60以上の長鎖脂肪酸を有する,結核菌の細胞表層糖脂質TDMは,免疫活性化に基づく抗腫瘍活性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまでに非常に多くの研究が行われてきたが,高い毒性の故に遂に実用化されることはなかった.最近,本研究者らは,鎖長が短いジフテリア菌由来の糖脂質TDCMの,二つの不斉中心に関する全ジアステレオマー(RR体,RS体,SR体,及びSS体)を不斉合成し,天然物がRR体であることを証明すると共に,非天然物であるSS体が,天然TDMと同等以上の強力な制がん作用,及びがん転移阻害作用を示す一方で,極めて毒性が低いことを明らかにした.この結果をもとに,この徹底した誘導体合成と,活性評価を行い,これらの化合物が低分子化合物では初めての1L-6増強活性物質であることを突き止め,in vitroのアッセイ系の確立にも成功し,特許の申請に漕ぎつけ,前例のない免疫活性化に基づく制がん剤の開発を明確に視野に捕らえた.一方,本研究は生理活性物質の合成によって制がん剤の開発を目指すと共に,新しい合成手段の開拓に力を注いで来た.1983年に当教室が開発して,ごく一部で西沢試薬と呼ばれている水銀トリフラートが,2002年になって末端アセチレの水和反応を強力に触媒することが明らかになり,その反応機構の解明と,あらたな水銀トリフラート触媒反応の開発に全力を投入し,多くの研究成果を上げることが出来た.さらにステロイド生合成のC環形成の問題,酵素は如何にしてMarkovnikovの壁を越えるかに挑み,対アニオンによってカチオンの立体配座が制御される事実を立証して懸案を解決した.炭素数が60以上の長鎖脂肪酸を有する,結核菌の細胞表層糖脂質TDMは,免疫活性化に基づく抗腫瘍活性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまでに非常に多くの研究が行われてきたが,高い毒性の故に遂に実用化されることはなかった.最近,本研究者らは,鎖長が短いジフテリア菌由来の糖脂質TDCMの,二つの不斉中心に関する全ジアステレオマー(RR体,R3体、SR体,及びSS体)を不斉合成し,天然物がRR体であることを証明すると共に,非天然物である33体が,天然TDMと同等以上の強力な制がん作用,及びがん転移阻害作用を示す一方で,極めて毒性が低いことを明らかにした。すなわち,脂肪酸の鎖長と,2,3位の立体化学とが,生物活性に劇的な影響を及ぼすことを明らかにしたわけで,TDCMの全立体異性体の合成手法を,SS体に絞った選択的大量合成法に発展させ,鎖長を様々に変化させた類縁体を多数合成すれば,初めての免役活性化を基盤とする,全く新しいタイプの制がん剤の開発が視野に入ってきたと言い切れる.繰り返しになるが,現在までの実験データで特筆すべきは,抗腫瘍活性と毒性の差が大きく,SS体TDCMにはほとんど毒性が無いという事実である.炭素数が60を越える長鎖脂肪酸を有する,結核菌関連細胞表層糖脂質TDM,は免役活性化に基づく抗腫瘍性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまで非常に多くの研究が行われて来たが,高い毒性の故に,遂に実用化には至らなかった.本研究者はより短い脂肪酸鎖よりなる,TDCMの類縁体を合成する研究を展開し,これらの化合物ががん転移阻害作用,制がん性を示す一方で,毒性を示さないことを明らかにしている.

そこで今年度は,合成法を徹底して改良し,β-ケトエステルの野依還元と,当研究室の独自技術である還元的エーテル化反応を鍵段階として,7行程で目的物に至る,新たな効率的手法を開発し,25種の類縁体合成に成功した.合成した,TDCM類縁体に関して,免役活性化剤としての検定を行うべく,海外共同研究者であるパリXII大学Dulce P.Garcia教授に送って,検討を開始した.次の2年間に,大量合成法を確立し,実用化への道をたどりたいと考えている.炭素数が60以上の長鎖脂肪酸を有する,結核菌の細胞表層糖脂質TDMは,免疫活性化に基づく抗腫瘍活性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまでに非常に多くの研究が行われてきたが,高い毒性の故に遂に実用化されることはなかった.最近,本研究者らは,鎖長が短いジフテリア菌由来の糖脂質TDCMの,二つの不斉中心に関する全ジアステレオマー(RR体,RS体,SR体,及びSS体)を不斉合成し,天然物がRR体であることを証明すると共に,非天然物であるSS体が,天然TDMと同等以上の強力な制がん作用,及びがん転移阻害作用を示す一方で,極めて毒性が低いことを明らかにした.この結果をもとに,この3年間徹底した誘導体合成と,活性評価を行い,これらの化台物が低分子化合物では初めてのIL-6増強活性物質であることを突き止め,in vitroのアッセイ系の確立にも成功し,IL-6増強活性物質の新合成法に関する特許の申請に漕ぎつけ「トレハロース化合物を用いたインターロイキンー6増加剤およびその製造方法」(特願2004-079305),前例のない,免疫活性化に基づく制がん剤の開発を明確に視野に捕らえた.また本合成研究の基礎となる新反応の開発に努力し,水銀トリフラートを触媒とするアルキニルケトンの環化反応による2-メチルフランの合成,生合成類似の触媒的タンデム環化反応を開発した.炭素数が60以上の長鎖脂肪酸を有する,結核菌の細胞表層糖脂質TDMは,免疫活性化に基づく抗腫瘍活性を有しており,大阪大学山村一門を中心にこれまでに非常に多くの研究が行われてきたが,高い毒性の故に遂に実用化されることはなかった.最近,本研究者らは,鎖長が短いジフテリア菌由来の糖脂質TDCMの,二つの不斉中心に関する全ジアステレオマー(RR体,RS体,SR体,及びSS体)を不斉合成し,天然物がRR体であることを証明すると共に,非天然物であるSS体が,天然TDMと同等以上の強力な制がん作用,及びがん転移阻害作用を示す一方で,極めて毒性が低いことを明らかにした.この結果をもとに,この徹底した誘導体合成と,活性評価を行い,これらの化合物が低分子化合物では初めてのIL-6増強活性物質であることを突き止め,in vitroのアッセイ系の確立にも成功し,特許の申請に漕ぎつけ,前例のない免疫活性化に基づく制がん剤の開発を明確に視野に捕らえた.一方,本研究は生理活性物質の合成によって制がん剤の開発を目指すと共に,新しい合成手段の開拓に力を注いで来た.1983年に当教室が開発して,ごく一部で西沢試薬と呼ばれている水銀トリフラートが,2002年になって末端アセチレの水和反応を強力に触媒することが明らかになり,その反応機構の解明と,あらたな水銀トリフラート触媒反応の開発に全力を投入し,多くの研究成果を上げることが出来た.さらにステロイド生合成のC環形成の問題,酵素は如何にしてMarkovnikovの壁を越えるかに挑み,対アニオンによってカチオンの立体配座が制御される事実を立証して懸案を解決した.
ゲノム配列情報とエピゲノム情報の維持・変異のクロスレギュレーション

ヌクレオチド除去修復におけるDNA損傷認識因子の細胞内局在制御に、ヘテロクロマチン様構造の形成が関わっている可能性を見出した。細胞のDNA損傷応答を制御するDNA修復と転写のクロストーク因子として重要なDDB2タンパク質の機能制御に関わるさまざまな翻訳後修飾(ユビキチン化、SUMO化、アセチル化等)の役割を明らかにした。また、自然突然変異の抑制と能動的DNA脱メチル化に関与する塩基除去修復酵素チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)のタンパク質安定性を制御する分子機構を解明するとともに、TDGが色素性乾皮症C群タンパク質を介してヌクレオチド除去修復機構と機能的に相互作用することを示した。DNA修復、特に損傷認識段階の制御に関わるエピゲノム環境の解析を行うため、ヌクレオチド除去修復の損傷認識因子であるXPC、およびDDB2にそれぞれFLAG、HAタグを融合したタンパク質を安定発現する細胞株を用いてクロマチン免疫沈降(ChIP)実験系を構築した。細胞に紫外線照射後、経時的にクロマチンを調製してHA-DDB2を標的としたChIPを行ったところ、照射直後に一過性にヒストンとの相互作用が検出された。これらのヒストンについて、DNA損傷認識に特異的な翻訳後修飾が存在するかどうか、質量分析による網羅的解析を現在進めている。一方、FLAG-XPCは紫外線照射の有無にかかわらずクロマチンと結合していることがChIPにより見出されたが、紫外線照射後の時間経過に伴ってFLAG-XPCのゲノム上での分布が変化する可能性が定量PCRにより示唆されつつある。この系を利用して、転写、複製の進行と修復のタイミングとの関連について、解析を進めていく予定である。一方、チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)は元々塩基除去修復の開始に関わる酵素として見出されたものであるが、最近ではDNAの能動的脱メチル化への関与が示唆されている。TDGはSUMO化修飾を受けることが知られているが、ヒト野生型TDG、およびSUMO化部位のリジン残基をアルギニンに置換したK330R変異体をそれぞれTdg遺伝子欠損マウス由来の胎仔線維芽細胞を親株として安定発現させた。これらの形質転換細胞株におけるグローバルな遺伝子発現パターンをマイクロアレイを用いて解析することにより、TDG、およびそのSUMO化の有無がエピゲノム制御に与える影響を解析している。さらにTDGが細胞周期のS期やその他いくつかの条件下で分解されることを見出し、その分子機構と生物学的意義についても調べているところである。1.DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割哺乳類のヌクレオチド除去修復におけるDNA損傷認識タンパク質であるXPCやDDB2を標的とするクロマチン免疫沈降(ChIP)により、ある種のアセチル化ヒストンが紫外線誘発DNA損傷の認識の場から積極的に排除されている可能性が見出された。細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処理することで、XPCの紫外線損傷部位へのリクルートの遅延、および細胞全体における損傷修復速度の低下が見られ、ヘテロクロマチン様の構造がDNA修復に対して促進的に作用する可能性が示唆された。一方、DDB2のN末端テール領域においてさまざまな翻訳後修飾の標的となる複数のリジン残基に変異を導入することにより、DNA修復活性とは独立して紫外線に対する細胞の感受性や遺伝子発現パターンが変化することを見出した。2.エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割自然突然変異の抑制、および能動的DNA脱メチル化への関与が示唆されている塩基除去修復因子チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)が、細胞を紫外線や過酸化水素水、メチルメタンスルホン酸などのDNA損傷剤で処理することでユビキチン-プロテアソーム系による分解を受けることを見出し、この過程に関わるユビキチンリガーゼの同定、および精製タンパク質因子によるユビキチン化反応の再構成に成功した。一方、DNAやRNAの内因性メチル化損傷の修復に関わる大腸菌AlkBの哺乳類ホモログ(ALKBH2/3)を過剰発現、および発現抑制した安定形質転換細胞株についてメタボローム解析を行い、ALKBHの発現レベルが特異的な細胞内代謝経路に影響を与える可能性を見出した。1.DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割昨年度までに、ヌクレオチド除去修復(NER)におけるDNA損傷認識因子XPCやDDB2の損傷部位へのリクルートにヘテロクロマチン様の構造が関与する可能性が示唆された。今年度は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤だけでなく、H3K9トリメチル化に関わるSUV39H1の発現抑制がXPCの損傷部位へのリクルートの遅延や、DNA修復速度の低下を引き起こすことを見出すとともに、ヘテロクロマチンタンパク質HP1とXPCが共局在すること、HP1自身がXPCやDDB2に依存せずにDNA損傷部位にリクルートされることを明らかにした。一方、XPCがDDB2の紫外線誘導性分解を負に制御することで、紫外線誘発DNA損傷の認識と修復活性の持続に寄与していることを見出すとともに、DDB2相互作用因子の探索により、細胞内代謝に関与するアポトーシス誘導因子やクロマチンリモデリング因子を新たに同定した。2.エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割能動的DNA脱メチル化への関与が示唆されている塩基除去修復酵素チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)を欠損したマウス胎仔線維芽細胞(Tdg-/- MEF)を親株として、野生型および種々の変異型TDGを安定発現する細胞株を樹立した。特にPCNAとの相互作用に関わるPIP degron motifに変異を導入したTDGが他に比べて高い発現レベルを示したことから、昨年度までに同定したTDG分解に関与するユビキチンリガーゼの役割が改めて確認された。

これらの細胞株を用いてゲノムDNAにおける5-mC、5-hmCの定量を行うとともに、iPS細胞への誘導を行ってTDG変異の影響を調べる実験を進めている。また、DNAやRNAの内因性メチル化損傷の修復に関わるALKBH3過剰発現細胞でポリアミン合成経路が亢進していること、この細胞がポリアミン合成阻害剤に対して高感受性を示すことを新たに見出した。1.DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割ヌクレオチド除去修復(NER)におけるDNA損傷認識因子DDB2のアセチル化ミミック変異体を発現する細胞が示す紫外線誘導性アポトーシスの亢進が、がん抑制遺伝子産物p53の機能及びDNA二重鎖切断を介したDNA依存性プロテインキナーゼの活性化に依存することを明らかにした。またDDB2と相互作用する因子として新たに見出したヒトRuvBホモログの発現抑制によって細胞のNER活性が低下するとともに、紫外線感受性が増強されることを見出し、RuvBホモログをサブユニットとして含むクロマチンリモデリング複合体がNERの調節に関わることが示唆された。一方、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)においてヒストンH3K9のトリメチル化を担うSuv39h1/2の発現抑制を行い、損傷認識因子XPCのヘテロクロマチン局在がHP1とは異なる分子機構で制御されていることを明らかにした。2.エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割塩基除去修復酵素チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)を欠損したMEFを親株として、野生型TDG及び種々の変異型TDGを安定発現する細胞株を用いてゲノムDNA中の塩基修飾を質量分析により定量的に解析した。その結果、いずれのTDG発現細胞においても、親株と比べてゲノム中の5-hmCレベルの有意な低下が見られたことから、TDGの塩基除去修復酵素としての機能とエピゲノム制御における機能とが分離できる可能性が示された。また以前に報告したTDGとXPCとの物理的・機能的相互作用に関連して、TDGの発現レベルと細胞のNER活性が負の相関を示すこと、さらにXPCの発現レベルがTDGの発現または安定性に影響することを見出した。以上の結果から、既に報告したNERと塩基除去修復間のクロストークに加えて、NERとエピゲノム制御間のクロストークの存在が強く示唆された。ヌクレオチド除去修復におけるDNA損傷認識因子の細胞内局在制御に、ヘテロクロマチン様構造の形成が関わっている可能性を見出した。細胞のDNA損傷応答を制御するDNA修復と転写のクロストーク因子として重要なDDB2タンパク質の機能制御に関わるさまざまな翻訳後修飾(ユビキチン化、SUMO化、アセチル化等)の役割を明らかにした。また、自然突然変異の抑制と能動的DNA脱メチル化に関与する塩基除去修復酵素チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)のタンパク質安定性を制御する分子機構を解明するとともに、TDGが色素性乾皮症C群タンパク質を介してヌクレオチド除去修復機構と機能的に相互作用することを示した。
関節疾患と時計遺伝子

本研究では、軟骨細胞に発現する時計遺伝子群(Bmal1, ClockあるいはPer1等)の生理学的あるいは病態生理学的役割を解明した。Bmal1欠損マウスや各種分子生物学的解析の結果、軟骨細胞では分化調節能を有するIhhの発現が、Per1をはじめとする時計遺伝子群によって直接的に転写制御され、骨の伸長過程が24時間周期にて制御されている可能性が示唆された。初代培養軟骨細胞では、細胞成熟度にかかわらず各時計遺伝子のmRNA発現が認められた。また、Per1を軟骨細胞株であるATDC5細胞に安定発現させたところ、Alcian Blueの染色性の有意な低下とともに、軟骨細胞分化マーカーであるII型およびX型コラーゲンmRNAの有意な発現低下が観察された。Per1安定発現細胞ではSox6 mRNA発現が低下していることに加え、ATDC5細胞を培養すると14日目まで経時的にIhh mRNA発現が上昇するのに対して、Per1安定発現細胞ではこのようなIhh mRNA発現上昇は観察されなかった。このことから、Per1が軟骨細胞の分化過程に対して抑制的に作用するがIhhやSox6遺伝子を介している可能性が示唆された。続いて、ATDC5細胞にBmal1とClock両時計遺伝子を一過性に強制発現させたところ、Ihh mRNA発現の著明な上昇が招来されたが、このときさらにPer1遺伝子を共発現させると、Bmal1とClockによるIhh mRNA発現上昇は消失した。また同様に、Bmal1とClock両遺伝子の強制発現によって上昇したIhhのプロモーター活性は、Per1遺伝子の導入により有意に抑制された。さらに、ChIPassayを行ったところ、Ihhプロモーター上のE-boxにCLOCKタンパクが結合する可能性が示された。時計遺伝子によるIhh発現制御が示唆されたので、マウス肋軟骨における遺伝子発現振動を解析したところ、Per1、Bmal1およびIhhにリズム性の発現変動が観察された。本研究結果より、軟骨組織においては、PTH誘導性の時計遺伝子Per1によって細胞の分化過程が制御されるが、これは軟骨分化調節能を有するサイトカインであるIhhの発現調節を介している可能性が示唆される。時計遺伝子の関節組織における役割をin vivoで解析する目的で、Bmallノックアウトマウスを作成し、軟骨細胞の分化成熟過程における時計遺伝子の役割を解析した。生後1日齢Bmall欠損マウスの新生仔より肋軟骨を摘出し、軟骨細胞の初代培養を行った。アスコルビン酸を添加することにより分化誘導を行い、培養7、14および21日目に各種解析を行った。軟骨細胞の成熟マーカーであるAlcian blue染色およびアルカリフォスファターゼ(ALP)活性の測定を行った結果、Bmall欠損マウス由来軟骨細胞では、野生型マウス由来軟骨細胞と比較して、それらの染色性および活性が有意に低下していた。軟骨細胞は間葉系幹細胞から分化するが、Sox5、Sox6およびSox9はいずれも、静止軟骨細胞が増殖軟骨細胞に成熟するときに必須の転写因子であるのに対し、IhhとRunx2はともに増殖軟骨細胞から肥大化軟骨細胞への成熟を促進する因子である。これら軟骨細胞成熟を制御する遺伝子や、軟骨細胞の成熟前期マーカーであるcollagen IIおよび後期マーカーであるcollagenXのmRNA発現量をReal-time PCR法にて解析した。その結果、野生型マウス由来軟骨細胞と比較して、Bmall欠損マウス由来軟骨細胞では、IhhとcollagenXのmRNA発現が有意に低下していたのに対して、Sox5, Sox6, Sox9およびRunx2のmRNA発現には著明な変化は認められなかった。また、生後1日齢のBmall欠損マウス、あるいは野生型マウスの新生仔より脛骨を摘出し、固定、脱灰および脱水後、凍結切片を作成し、in situ hybridizationにより各種軟骨細胞成熟関連遺伝子のmRNA発現を解析した。その結果、IhhとALPのmRNA発現量がBmall欠損マウスの脛骨において有意に低下していた。本研究結果より、Bmall欠損マウスにおいてはIhhのmRNA発現量が減少し、軟骨細胞の成熟化が抑制されている可能性が示唆される。したがってin vivoにおいても、軟骨細胞の成熟を促進するIhhの発現が、Ihhの上流に存在するE-box配列を介し、時計遺伝子により制御されている可能性が考えられる。
先天的発声の制御機構の解明

ほとんどの動物は学習をしなくとも種特有な発声を獲得することができるが、この先天的発声のメカニズムはいかなる生物においても明らかにされていない。本研究課題では、ニワトリの「コケコッコー」をモデルとして、「ニワトリは朝に鳴く」という生命現象が、外因性の光や音ではなく、内因性の体内時計により制御されていることを明らかにした。本研究課題の目的は、ニワトリのCrowingをモデルとして、先天的発声の制御機構を集団レベルから分子レベルまで明らかにすることである。平成25年度の研究実施状況は、以下に示す通りである。1集団レベルにおける制御機構:これまでに、明暗条件下ではCrowingが点灯前から予知的に観察されること、恒薄明条件下では24時間より短い周期で自由継続することを報告している。この結果を基に集団レベルでの解析を実施したところ、最上位個体が集団内のCrowingのタイミングを決めていることを強く示唆する結果が得られており、現在、論文投稿の準備を進めている。2分子レベルにおける制御機構(トランスクリプトーム解析):これまでに、Crowingはテストステロン依存的であり、テストステロン投与により雛においてCrowingが誘起されること、去勢手術により雄鶏においてCrowingが制御されることを確認した。このようなCrowingを示す個体と示さない個体のCrowing中枢部位からcDNAライブラリーを作製し、次世代シークエンサーを用いたRNA-seqにより網羅的に遺伝子発現解析を実施した。3分子レベルにおける制御機構(フォワードジェネティクス):正常のCrowingを示す系統と異常なCrowingを示す系統を用いて家系を作出した結果、この異常なCrowingは優性遺伝することが明らかになった。表現型と遺伝子型の解析方法を確立し、これまでに得られた個体の表現型および遺伝子型判定を実施した。本研究課題の目的は、ニワトリのCrowingをモデルとして、先天的発声の制御機構を集団から分子レベルまで明らかにすることである。平成26年度の研究実施状況は、以下に示す通りである。1.集団レベルにおける制御機構:集団レベルにおけるCrowingの社会的相互作用を解析したところ、最上位個体が集団内のCrowingのタイミングを決めていることが明らかとなり、さらに下位個体はそれを辛抱強く待っていることが示唆された。2.分子レベルにおける制御機構(トランスクリプトーム解析):雄と雌のように、Crowingを示す個体と示さない個体において、Crowing中枢で発現変動している遺伝子をRNA-seqを用いて解析し、バイオインフォマティクスにより共通して発現変動している遺伝子を抽出することに成功した。3.分子レベルにおける制御機構(フォワードジェネティクス):QTL解析を用いて、異常なCrowingを示す遺伝領域の探索をしたところ、LOD socreが高い染色体上の領域を特定することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。システム行動生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、集団レベルおよび分子レベルでの制御機構の解明に必須な基盤を十分に整えることができた。特に、集団レベルでの制御機構については、最上位個体が集団内のCrowingのタイミングを決めているという生命現象を発見し、論文投稿の準備をするところまで研究を前進することができた。平成26年度は、以下のことを目標とする。1集団レベルにおける制御機構:論文の投稿および受理。2分子レベルにおける制御機構(トランスクリプトーム解析):バイオインフォマティクス解析により、各比較群において共通して発現変動している遺伝子をCrowing関連遺伝子として抽出する。3子レベルにおける制御機構(フォワードジェネティクス):QTL解析により、Crowing制御遺伝子が存在する候補領域を特定する。
ウエルナーヘリカーゼのもつ抗老化・抗がん化作用の分子基盤の探索

ウエルナー症候群(WS)はウエルナーヘリカーゼ遺伝子(WRN)のホモ不全により早老症状を発症する。これまでに、本ヘリカーゼがテロメア構造に存在することが報告されているが、相互作用する分子は確定されていない。また、WSでは平均的人口とは異なる種類の悪性腫瘍(肉腫)が若年で発症してくる臓器特異的発がんの問題は全く不明である。これらをふまえて、私達はWRNがテロメア構造を維持することにより染色体安定化・抗がん化作用をもたらすとの作業仮説をたてた。私達はコントロール研究として続けてきた非選別剖検症例の解析から、大脳灰白質テロメアは年齢と相関して短縮せず(統計的有意な短縮を認めない)、70歳を超える長寿者は長い灰白質テロメアを有すること、大脳テロメア長と癌死率は負相関を示すことを明らかにした(Experimental Gerontology2007)。また、食道癌組織周囲の粘膜上皮細胞を培養し、Q-FISH法によりテロメア長の有意な短縮と染色体不安定性所見を検出し、癌化の基盤としてテロメア短縮があることを示した(Int.J.Molecul.Med.2007)。一方、WS患者皮膚組織を収集しSouthern blot法により、患者組織のテロメア長は年齢を校正した健常者皮膚の平均長より短いことを明らかにした。(論文作成中)。また、数年来収集してきたWS由来繊維芽細胞のmetaphaseサンプルに対しサブテロメァプローブを用いたFISH解析を行い、染色体組換えが異常亢進を見出した(正常人由来繊維芽細胞では、同様の方法で組換えは殆ど検出されない)。同時にQ-FISH法により、テロメア長を解析した結果、個人差が大きいこと、正常例に比較して著しい短縮を認め長期継代出来ない例を見出した。検体を増やし、さらなる解析を進めている。本研究によりWSにおけるテロメア領域のダイナミズムの基盤データが拡充された。ウエルナー症候群はウエルナーヘリカーゼ遺伝子(WRN)のホモ不全により早老症状を発症する。これまでに、ウエルナーヘリカーゼがテロメア構造に存在することがいくつかの研究室から報告されているものの、相互作用する分子の確定には至っていない。また、本症候群で平均的人口(コントロール)とは異なる種類の悪性腫瘍が若年で発症してくる臓器特異的発がんの問題は全く不明である。以上の経過をふまえて、私達はウエルナーヘリカーゼがテロメア構造を維持することにより染色体安定化・抗がん化作用をもたらすとの作業仮説をたて研究を進めてきた。私達はコントロール研究として十年来続けてきた非選別(コントロール)剖検症例のテロメア研究から、大脳灰白質テロメアは加齢によって短縮しないこと(たとえあったとして統計的有意差は得られない)、70歳を超える長寿者は長い灰白質テロメアを有すること、大脳テロメア長と癌死率は負相関を示すことを明らかにした(Experimental Gerontology in press)。一方、ウエルナー患者皮膚組織を収集しSouthern blot法により解析した結果、患者組織のテロメア長は年齢を校正した健常者皮膚の平均長より短いことを明らかにした(論文作成中)。今後、当該組織をQ-FISHにより解析し、WRN遺伝子欠損が細胞系列特異的なテロメア長の短縮を来すか否かを明らかにすることを通じて、ウエルナー症候群における特異的発癌形質の分子基盤解明をめざす。数年来収集してきたウエルナー症候群患者由来繊維芽細胞のmetaphaseサンプルに対しサブテロメアプローブを用いたFISH解析を行い、染色体組換えが異常に亢進していることを見出した(正常人由来繊維芽細胞:TIGシリーズでは、同様の方法で組換えは殆ど検出されない)。解析検体を増やし、個人差・組換え染色体の特異性を検討中である(論文準備中)。(論文作成中)。同時にQ-

FISH法により、テロメア長を解析した結果、個人差が大きいこと、正常例に比較して著しい短縮を認め長期継代出来ない例を見出した。検体を増やし、さらなる解析を進めている。本研究によりWSにおけるテロメア領域のダイナミズムの基盤データが拡充された。
リツキシマブ投与後の低免疫グロブリン血症とB細胞形質変化

未治療悪性リンパ腫16例に対してR-CHOPを施行した際の免疫グロブリン値を連続的に検討し、低免疫グロブリン血症はIgG800mg/dl以下、と定義した。治療開始前のIgG値は1312±391mg/dl(平均±SD)であった。R-CHOP療法後、11人(69%)の患者が中央値3ヶ月(2-7ヶ月)低免疫グロブリン血症を発症した。末梢血解析では低免疫グロブリンが持続している症例でもCD20/CD27陽性IgD陰性の記憶B細胞の回復遅延は見られなかった。自家移植を併用しないR-CHOP療法でも低免疫グロブリンの合併は高い頻度で見られるが、それらは一時的、かつ自家移植併用時よりも軽度であり、自家移植後の持続する低免疫グロブリンは特異的な現象であることが示唆された。自家移植をすることなく、R-CHOPのみの治療を受けたB細胞性リンパ腫症例23例についての検討を行った。1.最終リツキシマブ投与後中央値20ヶ月(範囲12-39ヶ月)で、血清IgA、IgG、IgMの平均値は正常範囲内であった。(それぞれ121±28mg/dl、1129±58mg/dl、88±23mg/dl)投与後の期間が短い症例ほど、免疫グロブリン値が低い傾向があり、その後回復していく傾向がみられた。これは自家移植にリツキシマブを併用した際に、数年経っても免疫グロブリン値が回復しないことに比較して、際だった違い、と考えられた。2.表面マーカーでは、自家移植併用リツキシマブ投与群の様なCD27陽性メモリーB細胞の選択的欠損をしている症例は存在しなかった。しかし、リツキシマブ最終投与からの時間が長い症例ほど、CD27陽性IgD陰性のクラススイッチメモリーB細胞比率が高い傾向があった。3.末梢血単核球のisotypeが欠損している症例は1例のみ(IgG3の欠損)に存在していたが、IgM・IgAが欠損している症例は存在しなかった。5.Fc受容体遺伝子多型についても、既にゲノムDNAを採取・凍結保存しており、今後、検討予定としている。自家移植を施行し、リツキシマブを併用した症例は本年度は2例のみであった。これらの患者についての検討も行っているが、傾向は二例のため、評価困難である。A)B細胞性リンパ腫初発例の抗癌剤およびリツキサン投与前のB細胞性質について5例で検討を行った。(びまん性大細胞型4例、濾胞性リンパ腫1例、年齢中央値60歳、男性3名、女性2名)1.B細胞数は健常人と比較して有意差を認めなかった。2.B細胞の性質も健常人と有意差を認めず、ナイーブB細胞、Classs witch前および後のメモリーB細胞比率についても健常人と有意差を認めなかった。3.末梢血単核球のisotypeについては欠損例は一例もなかった。4.IgG500mg/d1台に低下している症例が一例あった(濾胞性リンパ腫症例)が、その他の症例のIgG・IgA・IgMは正常範囲であった。5.以上から、申請者が見出したリツキサンを併用した自家移植後に低免疫グロブリンを合併する症例のB細胞異常は治療によるものであり、病気そのものには寄らない可能性が高いことが示唆された。B)R-CHOPのみの治療を受けたB細胞性リンパ腫症例7例、リツキサン併用自家移植を受けた症例3例をこれまでの症例検討に加えることが出来た。2.表面マーカーでは、R-CHOPのみを受けた症例では自家移植併用リツキシマブ投与群の様なCD27陽性メモリーB細胞の選択的欠損をしている症例は存在しなかった。4.Fc受容体遺伝子多型については低免疫グロブリンを認めることがなかったため、DNA抽出にとどまっている。5・自家移植を施行し、リツキシマブを併用した症例は本年度は3例のみであった。未治療悪性リンパ腫16例に対してR-CHOPを施行した際の免疫グロブリン値を連続的に検討した。男性8例、女性8例で年齢中央値は68.5歳(45-92歳)であった。低免疫グロブリン血症はIgG 800mg/dl以下、と定義した。治療開始前のIgG値は1312±391 mg/dl (平均±SD)であった。R-CHOP療法後、11人(69% )の患者が低免疫グロブリン血症を発症した。

これら11人が低免疫グロブリン血症を発症するまでの期間はR-CHOP開始後中央値3ヶ月(2-7ヶ月)であった。一名は急性腸炎を発症し、免疫グロブリンの補充を要した。R-CHOP終了後、中央値9ヶ月(2-14ヶ月)の段階で全症例のIgGは914±265mg/dlと開始前と比較し、有意に低下していた。しかし、これまで申請者が報告してきた様な自家移植にリツキサンを併用した際の、持続する低免疫グロブリンと異なり、11人の低免疫グロブリン症例のうち、7名はIgG 800mg/dl以上に回復した。末梢血解析ではR-CHOP症例ではCD20陽性細胞の回復が観察期間が短いため、見られていない症例が多く、CD27やIgD陽性細胞の細かい検討には至らない症例が多かったが、解析可能な8例では低免疫グロブリンが持続している症例が2例あったが、CD20/CD27陽性IgD陰性の記憶B細胞の回復遅延は見られなかった。自家移植を併用しないR-CHOP療法でも低免疫グロブリンの合併は高い頻度で見られるが、それらは一時的、かつ自家移植併用時よりも軽度であり、自家移植後の持続する低免疫グロブリンは特異的な現象であることが示唆された。予想に反し、R-CHOP例での免疫異常が認められないことと、R-CHOPによる治療成績向上のまて、自家移植適応症例が減っているため24年度が最終年度であるため、記入しない。R-CHOP症例で免疫異常が認められなければ、それが事実であり、症例数を予定通り蓄積し、一定の結論を出す予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
国家形成・成立期の金属器からみた東アジア交流の基礎的研究

本研究では、日本列島出土の朝鮮半島・中国系の金属器-とくに装飾付大刀・銅鋺・銅鏡の変遷について整理し、それら遺物が受容される過程について検討した。結果、各時期の東アジア国際情勢を反映しながら威儀具的性格を有する金属器が日本列島で製作され、古代国家成立過程においてとりこまれていく過程の一端が明らかになった。本研究は、6世紀から8世紀の期間における金属器の検討により、国家形成期の日本列島を古代東アジア交流のなかに位置付けようとする試みである。古墳時代後期から奈良時代にかけての時期を「国家形成期」として包括して扱い、金属器とくに金・銀・金銅製品などの伝来や変遷、列島各地への分散など、その意味づけを検討することにより、文献では伝わってこない歴史的事象をうかがうための基礎的研究を行う。本年は、6世紀7、8世紀の代表的な金工品として、銅鋺および銅鏡の調査を行った。・銅鋺の調査岡山県津山市殿田1号墳および同市荒神西古墳出土銅鋺の調査を行った。とくに、殿田1号墳に関しては2007年に行った発掘調査と出土遺物の分析を通して、6世紀末という副葬年代の確定を行った。殿田・荒神西両例とも鉛同位体比分析が行われており、本調査の成果によって、6世紀末には朝鮮半島産の素材が使用されたのに対して、7世紀半ばには日本列島産の素材を使用されることが明らかになった。また、出土墳の位置づけが、畿内とは異なる様相を示すことを推定した。・隋唐鏡の調査南北朝隋代、唐初期の銅鏡を対象とした考古学的研究は前後の時期と比較すると、十分なされているとは言い難い。そこで、早稲田大学會津八一記念博物館が所蔵する永徽元年(唐650年)の紀年銘をもつ方格四神鏡や同時期の鏡の調査を行った。また、中国隋唐墓出土の銅鏡を加えた分類・編年の基礎的作業を行い、6世紀末から7世紀半ばまで、4時期に区分を行った。本年度は、昨年度に調査報告を行った岡山県津山市殿田1号墳・荒神西古墳出土銅鋺について、さらに調査を進めた。新たに入手した鉛同位体比・金属成分分析の結果では、朝鮮半島産鉛を含む殿田1号墳出土銅鋺が銅・錫・鉛合金であるのに対し、日本産鉛を含む荒神西古墳出土銅鋺は錫を含まない銅・鉛合金であることが判明した。各遺跡出土品や法隆寺、正倉院伝来品などの既発表データなどと対比させ、日本列島出土品のうち、6世紀後半から7世紀初頭の段階の銅鋺や、7世紀後半以降でも朝鮮半島から伝来したと考えられる製品は、錫の成分比が高い資料が多く、7世紀後半以降の、とくに日本産鉛を使用している製品は錫が少ない、または使用されていないという資料が多いという傾向を示した。鉛原料の出自の差と製品の金属成分比の差は、当時の錫・鉛原料の入手性や、製作工人たちの製作技術などの問題と考えた。また、荒神西古墳の年代から、日本産鉛の利用開始時期が7世紀半ばまで遡ると予測している。以上の調査結果および考察は、2010年8月に島根県古代出雲歴史博物館において開催されたアジア鋳造技術史学会出雲大会において発表を行った。その後、さらに銅鋺製作の問題を追及するために、広島県竹原市横大道7号墳、香川県高松市久本古墳、岡山県真庭市定北古墳、鳥取県智頭町黒本谷古墳、それぞれの古墳出土の銅鋺について資料調査を行った。装飾付大刀、隋唐鏡は継続して資料収集を継続しており、次年度に成果を報告したい。本研究は、6世紀から8世紀の期間における金属器の検討により、国家形成期の日本列島を古代東アジア交流のなかに位置付けることを目的とする。古墳時代後期から奈良時代にかけての時期を「国家形成期」として包括して扱い、金属器とくに装飾大刀・銅鋺・鏡などの伝来や変遷、列島各地への分散など、その意味づけを検討することにより、文献では伝わってこない歴史的事象をうかがうための基礎的研究を行う。本年実施した研究は、以下の通りである。67世紀出土の銅鏡に関して、22年度に実施した広島県竹原市横大道8号墳、岡山県真庭市定北古墳、香川県高松市久本古墳、鳥取県黒本谷古墳出土遺物の調査と蛍光X線分析、鉛同位体比分析結果について検討した。国産・海外産の鉛を含む銅鏡では、それぞれ銅・錫・鉛の成分比も大別でき、その成分比も時期により変遷することが明らかになった。成果については学会発表を行った。隋唐鏡の研究では、昨年度に引き続き資料集成作業をおこなうと同時に、国内所蔵資料の実測・写真撮影等の資料調査を実施した。現在も資料の整理中であり、21年度に行った基礎的な分類・編年体系の構築を行った。23年度中にはできなかったが、近く発表を行いたい。
変異TTR型家族性アミロイドポリニューロパチーにおけるグリコサミノグリカンの役割

トランスサイレチン型家族性アミロイドポリニューロパチー(I型FAP)は原因タンパク質である変異型トランスサイレチン(TTR)が異常に凝集することによりアミロイドと呼ばれる線維状の不溶性物質を形成し、それが様々な臓器に沈着することによって引き起こされる難治性の疾患である。本研究では、TTRの異常な凝集に関与し得る生体分子としてグリコサミノグリカンに着目し、その一種であるヘパラン硫酸とその多硫酸化アナログヘパリンについて、TTRの凝集ならびに細胞取り込みおよびI型FAP病態に関与する可能性を発見した。アミロイドーシスとは、前駆体タンパクが凝集して形成するアミロイドと呼ばれる線維状の不溶性物質が様々な臓器に沈着することによって引き起こされる難治性の疾患である。この内、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は遺伝性アミロイドーシスであり、主に肝で産生される変異型のTTRやアポリポプロテインA-I(apoA-1)などが線維化し組織に沈着することにより発症する疾患である。さらに、TTR型であるI型FAPはapoA-1に関連したFAP(III型FAP)等に比較して日本国内で最も患者数が多く、長野県と熊本県に集積地が存在し、これまでに100を超える変異が報告されている。現在のところ、肝移植によって原因となる異常タンパク質の供給を絶つことはできてもアミロイドの沈着とその結果として生じる臓器傷害を改善させるには至っていない。グリコサミノグリカン(GAG)は種々の細胞が合成する直鎖状の細胞外糖鎖であり、主要な部分はアミノ糖とウロン酸の二糖が数十回繰り返す二糖繰り返し領域によって構成される。GAGは構成単糖の種類や硫酸化パターンなどの違いにより、ヘパラン硫酸(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などに分類される。GAGは様々なアミロイドーシス患者組織においてアミロイドと共沈着することが報告されており、アミロイドーシスの発症や病態に関与することが示唆されている。本研究においてヒトTTRアミロイドーシス患者組織切片の免疫組織化学染色を行った結果、腎臓でTTRアミロイドとヘパラン硫酸が共沈着していることが分かった。また、TTR線維化におけるGAGの役割について検討するため、チオフラビンT及びヘパリン-BSA複合体を用いたin vitroの評価系の構築を行った。抗ヘパラン硫酸抗体を用いたヒトTTRアミロイドーシス患者組織切片の染色はおおむね順調に進んでおり、複数例においてヘパラン硫酸の沈着が確認できた。また、TTR線維-細胞間相互作用の評価系については、予備実験として容易に入手可能であるアポリポタンパク質A1(apoA-I)を用いて行い、免疫細胞化学及びドットブロットによる評価系の確立に成功した。引き続きこの実験系及び前述のTTR線維化の評価系を用い、今後の研究が予定通り進捗すると期待される。アミロイドーシスは前駆体タンパク質が凝集して形成するアミロイドと呼ばれる線維状の不溶性物質が様々な臓器や組織に沈着することにより引き起こされる難治性の疾患である。このうち、トランスサイレチン(TTR)を前駆体とするATTRアミロイドーシスは日本国内で最も患者数が多く、集積地も存在する。一方で、アミロイドはそのタンパク質成分のみで沈着することはなく、グリコサミノグリカンを含むさまざまな生体分子と共沈着することが知られている。本研究で、ヒトATTRアミロイドーシス患者切片の免疫組織化学染色を行い、腎臓、末梢神経等でグリコサミノグリカンの一種であるヘパラン硫酸とTTRが共沈着していることが分かった。また、心臓ではTTR線維の沈着は観察されたが、ヘパラン硫酸は検出されなかった。次に、ヘパラン硫酸のATTRアミロイドーシス病態発症の役割をin vitroの実験系で解析した。まず、ヘパラン硫酸の多硫酸化アナログであるヘパリンとBSAの複合体でコーティングしたプレートを用い、TTR線維化に対するヘパラン硫酸の影響をチオフラビンアッセイにより解析した。その結果、TTRの線維化はヘパリンの存在下において促進されることが分かった。また、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞とそのヘパラン硫酸欠損株を用いて実験を行った結果、TTR線維の細胞取り込み及び細胞毒性が細胞表面上のヘパラン硫酸に依存すること判明した。従って、ヘパラン硫酸はTTRのアミロイド形成及びTTR線維の毒性を促進、仲介することによりATTRアミロイドーシスの発症に重要な役割を果たしていることが示唆された。前年度で構築したチオフラビンT及びヘパリン-BSA複合体を用いたin vitroの評価系を用い、様々なTTRドメインの線維化におけるGAGの役割についてさらに詳細な解析を行う。また、TTR線維-細胞間相互作用においてGAGがどのような役割を果たしているかについて、前年度に構築したapoA-I線維を用いた実験系を用いて解析する。

この際、細胞における全ての硫酸基付加反応の阻害剤である塩素酸ナトリウムやGAG伸長阻害剤であるbeta-D-キシロシドを用いてCHO細胞などの細胞表面のGAG構造を改変し、同様の実験を行う。さらにこれらに加え、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びそのHS欠損株pgsD-677細胞やHS/CS欠損株pgsA-745細胞を用いる。また、TTR線維の検出が抗体で困難な場合、直接蛍光プローブ等で標識し、実験を行う予定である。TTRアミロイドーシス患者組織切片について、腎臓以外の組織についても免疫組織化学染色を行う。引き続き、免疫細胞化学並びに免疫組織化学に用いるカバーガラスやスライドガラス等の消耗品及び各種抗体、TTRの様々なドメインの合成ペプチド、酵素結合免疫吸着検定法用の高吸着プレート、ドットブロット用のニトロセルロースメンブレン、細胞培養用の培地および血清を購入する。また、上記のTTR線維の標識に用いるタンパク質標識蛍光プローブキットを新たに購入する必要が生じる可能性がある。医化学一般消耗品の購入について、出来る限りキャンペーン等を利用して節約に努めたため、当初予定金額より支出が抑えられた。合成ペプチドの購入に関し、種類を当初予定より増やす予定である。これにより、さらに研究の進展が期待できる。また、当初の計画にはなかったタンパク質の蛍光標識用プローブキットの購入にも充てる。
分子イメージングによる原核細胞のナノオルガネラ制御機構の解明

磁性細菌は、MamK細胞骨格とマグネトソームと呼ばれる磁気オルガネラの相互作用によってナノサイズの棒磁石のような構造を形成し、地磁気を感知できる高感度な磁気センサーをもつ。細菌は微小な細胞内でどのようにして、ナノサイズのオルガネラの細胞内配置を制御しているのだろうか。原核細胞オルガネラの形成や制御の分子機構は、真核細胞のそれと比較して未知である。マグネトソームは、オルガネラ形成と制御に関わる蛋白質群が同定されており原核細胞オルガネラのモデルとして適している。本研究では、高速原子間力顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡などの分子イメージング技術によりマグネトソーム制御の分子機構に挑む。
ヒトDNAミスマッチ修復蛋白質1遺伝子の構造と機能に関する分子生物学的研究

1)MRP1遺伝子のゲノムDNAの単離と構造解析:メソトレキセート耐性HL-60細胞よりゲノムDNAを抽出し、sCos1をベクターとしゲノムライブラリーを作成した。MRP1cDNAをプローブとしてスクリーニングを行ったところ11個の陽性クローンが得られ、MRP1遺伝子のほぼ全域を含んでいた。cDNA中の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプローブに用い、得られた陽性クローンの配列化を行った。さらに同じオリゴヌクレオチドをプライマーとしてDNA断片のシークエンスを行いエクソン・イントロン接合部を決定した。MRP1遺伝子は24のエクソンよりなり全長160kb以上と推測された(第67回日本生化学会発表)。2)Mutator Assay:MRP1蛋白質とDNA修復との関わりを、MRP1蛋白質を大腸菌で発現させた後のリファンピシン耐性変異率の変化により検討した。MRP1蛋白質のC末側76%、55%、27%をpTrc99Aに組み入れて発現ベクターを作成し、大腸菌にトランスフォーム後の変異率の変動を調べたところ、いずれの発現ベクターを用いた系においても若干の上昇がみられたのみであった。MRP1蛋白質のC末側27%を用いた場合には、発現に伴い大腸菌の成長阻害がみられた。3).MRP1遺伝子と癌との関わり:40例の造血器腫瘍患者の骨髄細胞より得られたRNAを用いてRT-PCR法によりMRP1遺伝子の発現を調べたところ、7例(18%)においては欠如、24例(60%)においては著しい減少がみられた。(第36回日本臨床血液学会発表)。食道癌5例及び腎癌5例を同様に調べたが減少はみられなかった。