hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
離乳期におけるラクターゼ発現低下への非コードＲＮＡの関与

また、3D-Gene®miRNA Oligo chipを用いた解析では、10日齢の方が10週齢より有意に発現量が高いものが11種類、10週齢の方が10日齢より有意に発現量が高いものが25種類あった。この25種類のうちのいくつかの低分子RNAについて、2日、10日、5週、10週での発現の変化をみるとrno-miR-29a、rno-miR-142-3pは、5週から10週にかけ急激な増加が確認された。ラクターゼーフロリジン加水分解酵素(ラクターゼ)は、哺乳動物の小腸粘膜細胞に存在し、母乳中に含まれる唯一の炭水化物源であるラクトースを加水分解する。ラクターゼは胎生期後半より発現し、出生を頂点として離乳期に至るまで著名に発現低下することが知られているがその低下機構は未だ明らかにされていない。従来の発現機構解析は、主に遺伝子配列とその結合タンパク質の解析から進められてきたが、現在までにその発現低下機構を解明した報告はない。近年、細胞内で発現しているRNAの中にタンパク質をコードしていないが、低分子RNA(miRNA)自身が遺伝子発現をmRNAレベルで抑制することが示されてきている。また、クロマチンの構造変化も視野に入れた解析方法によりラクターゼ発現低下の機構の解析を進める。本研究では低分子RNAがラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているのではないかという仮説を立てて、その検証を行う。Sprague-Dawley系ラットの哺乳期から離乳期に至るまでの2日、10日、5週、10週の小腸粘膜上皮細胞を回収し、ホルマリンでDNAとヒストンなどのDNA結合タンパク質を架橋した後、超音波処理により可溶性のクロマチンにし、これをアセチル化ヒストンに対する抗体で免疫沈降した。各種抗体による免疫沈降物からDNAを精製し、PCR法にてラクターゼ遺伝子プロモーター領域が解析したが当該遺伝子のプロモーター両液を得ることが出来なかった。また、同様の日齢の小腸粘膜上皮細胞を回収し、ゲノムDNAを調製後、バイサルファイト処理し、DNA中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換し、メチル化シトシンとの区別を行い、DNAを鋳型としてラクターゼ遺伝子の5'上流領域をPCR法により増幅したが、増幅産物を確認することが出来なかった。ラクターゼは哺乳動物の小腸に発現し、母乳中の唯一の糖質である乳糖を加水分解する酵素である。この活性は哺乳期には高く離乳期に至るまで著名に発現低下するが、その低下機構は未だ明らかにされていない。本研究では低分子RNA(microRNA; miRNA)がラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているという仮説に基づき検証を行った。miRNAを3D-Gene&reg; miRNAOligo chipを用い網羅的に解析すると哺乳期より離乳期以後で発現の高い複数の低分子RNAが存在した。しかし、候補miRNAとラクターゼmRNA、ラクターゼの転写活性化因子mRNAと比較しても相補性ではなかった。miRNAOligo chipを用いた解析により、離乳期に変化する候補miRNAを網羅的に解析し、その離乳期における変動パターン等を解析したが、直接、ラクターゼmRNAに作用するようなmiRNAの発見には至らなかった。
固液界面におけるタンパク質間相互作用に及ぼす分子クラウディングの影響

細胞内の環境は多種類の生体分子が高濃度に溶解した分子クラウディング状態にある。本研究では、細胞内における固液界面でのタンパク質間相互作用に焦点を当て、分子クラウディングが反応の静的および動的挙動に及ぼす影響について調べてきた。本年度はとくに、分子クラウディング剤の種類および固液界面に固定されたタンパク質の配向性・可動性が、拡散速度および複合体形成速度などの動力学に与える影響を調べた。分析には、昨年までと同様に、表面プラズモン共鳴(SPR)分析法を用いた。SPRセンサーチップの金蒸着表面に末端に反応性官能基をもつ自己組織化単分子膜(SAM)を形成させ、その末端にEGFを化学結合を介して固定した。このとき、アルキル鎖と官能基の間に長さの異なるエチレングリコール鎖を有するアルカンチールを用いることで、末端に固定されたEGFの可動性を変化させた。また固定化分子の配向性の影響をみるため、従来のカルボジイミド法による固定法と末端のタグを利用した固定法の両者を採用した。クラウディング剤として、ポリエチレングリコール、dextran 70、Ficoll PM70を用いた。クラウディング溶媒に溶かした抗EGF抗体をEGF固定基板上に流し、固定化抗原と抗体の結合・脱離過程を追跡した。その結果、PEG濃度の上昇に伴うkonの低下が、可動性の高い表面では、低い場合に比べ緩やかであった。また、dextranとFicollにおいては、konの変化は小さく、若干の増加傾向が示唆された。このことは、表面に固定化された抗原の可動性が分子クラウディング環境下におけるkonの低下を抑制することを示し、また、konを少しながら増加させる可能性をも示唆した。以上のように、分子クラウディング剤の種類および固定化抗原の可動性が、拡散速度および複合体形成速度などの動力学に影響を与えることが示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。このような環境下でさまざまなタンパク質間相互作用が効率よく起こることによって細胞システムは機能する。クラウディング環境下では、巨大分子であるタンパク質の排除体積効果が大きく現れるため、クラウディングの程度の上昇につれて、特定の種類のタンパク質の活量は増大するものと考えられる。したがって、細胞の振る舞いをより深く理解するには、これまで分析の中心であった希薄系でのタンパク質間反応ではなく、クラウディング環境下におけるタンパク質間反応について理解を深めることが極めて重要である。また、細胞内では、細胞質中に溶存するタンパク質間の反応以外に、固液界面での反応も数多く存在する。本研究では、細胞内における固液界面でのタンパク質間相互作用に焦点を当て、分子クラウディングが反応の静的および動的挙動に及ぼす影響を調べることを目的とした。まず、表面プラズモン共鳴法を分子クラウディング環境下での分析に展開することを試みた。センサーチップと光学プリズムの基材として高屈折率ガラスを用いることによて、分子クラウディング環境下においてもSPR測定が可能であった。次に、分子クラウディング環境における固定化抗原ー抗体反応に焦点をあて、その反応速度に及ぼす抗原の表面結合様式の影響について調べた。その結果、クラウディング環境下での抗体の結合量は、リガンドの固定化様式によらず、クラウディング剤濃度の上昇とともに増加した。これは、クラウディング剤の影響により抗体の活量が上昇したためと考えられる。一方、結合速度定数はクラウディング剤の濃度が高くなるにつれて低下した。

これは、クラウディング剤の影響により抗体の拡散係数が低下したためと考えられる。これらの傾向は固定化リガンドの固定様式に影響を受けることがわかった。当初の予定通り、まず、クラウディング剤の存在下における分析系を確立することができた。また、この手法を用いて、基材上に固定されたタンパク質とバルク溶液中に溶解したタンパク質(リガンド)との2分子反応の解析を行い、平衡定数・速度定数を求めることができ、リガンドの活量および拡散定数との関係について議論することができた。引き続き、表面プラズモン共鳴分析法を用いて、界面におけるタンパク質間相互作用の分析を進める。また、固液界面反応の特徴を浮き彫りにするため、タンパク質工学を活用して固定化タンパクやリガンドを分子デザインを行う。今後は特にとくに、多価の分子間相互作用における協働性に注目する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
燃焼炎中のラジカルによる水溶液含有物質の修飾

燃焼炎中に発生する反応活性化学種のラジカルを燃焼炎吹きつけにより水溶液中に供給し、化学反応を行う場合の物理・化学的諸反応条件の影響を検討した。難分解性物質のキレート剤を反応対象として諸反応条件の影響を検討したところ、燃焼炎中で発生したラジカルの多くは水溶液に供給される前に燃焼炎周囲の気相成分と反応することがわかった。よって本手法により水溶液反応を効率的に進めるためには気相成分の調整が重要課題であることが示唆された。燃焼炎を水溶液表面に吹きつけると、燃焼炎中に生成する種々の化学種が水溶液中に供給され、様々な反応を引き起こす。本研究ではこの原理を利用し、キレート剤(EDTA:エチレンジアミン四酢酸NTA:ニトリロ三酢酸)の酸化分解に燃焼炎を用いるラジカル供給法を適用した。水素一酸素燃焼炎下で水溶液中に生成した過酸化水素濃度は時間経過とともに増加した。EDTAまたはNTA溶液中では有機化合物が含まれていないリン酸緩衝液のみの溶液とほぼ同量のH_2O_2が生成した。硝酸イオン、亜硝酸イオンが、EDTA、NTAの分解、無機化により成する。亜硝酸イオンについてはリン酸緩衝液とEDTA溶液については30分まで増加し、その後減少した。NTA溶液については殆ど変化は見られなかった。EDTAとNTA濃度の経時変化は、NTAでははっきりした変化は見られなかったが、EDTAについては60分で初期濃度の25%程度まで減少した。EDTA濃度は反応開始直後から一様に減少している。一方NTAはその濃度が反応開始から殆ど変化しなかった。測定結果から、キレート剤(EDTA、NTA)は水素一酸素燃焼炎によるラジカル供給において、EDTAは時間とともに分解が進み、NTAはほとんど分解しないことがわかった。溶液内の炭素収支の解析結果から、60分では、EDTA溶液では17%がCO_2または炭酸塩に変化し、54%はNTA、シュウ酸などの有機酸の反応中間体に変化、残りはEDTAとして残留した。これに対しNTA溶液では14%がCO_2または炭酸塩、1%が有機酸中間体、85%はNTAとして残留していた。既往の促進酸化処理法によるEDTAの分解機構として中間体にNTAが生成することが確認されている。本実験結果とあわせて考えると、EDTAはNTAまでは分解しやすいが、NTAはCO_2や他の物質に分解されにくいことを示している。燃焼炎を水溶液表面に吹き付けると,燃焼炎中に生成する種々の化学種が水溶液中に供給さ,様々な反応を引き起こす。本研究ではこの原理を利用し,キレート剤(エチレンジアミン四酢酸,EDTA:ニトリロ三酢酸,NTA)の酸化分解に燃焼炎を用いるラジカル供給法を適用した。前年度の不活性ガス(アルゴン)雰囲気下でのキレート剤の分解性検討に引き続き,今年度は本法の実際的な適用を考える上で重要となる空気雰囲気下で同様の反応を行い,その影響について検討した。水素-酸素燃焼炎中で主に発生する酸化剤であるヒドロキシルラジカルの二量化により生成する過酸化水素は,不活性ガス雰囲気下ではその生成量は分解対象物であるキレート剤の有無によりほとんど変化しなかったのに対し,空気雰囲気下ではキレート剤無しの場合と比較して過酸化水素生成量は20%程度に減少した。一方で,空気雰囲気下では燃焼炎の吹きつけ時間に伴い,火炎中に生成する窒素酸化物等が反応溶液中に溶解することで生成した硝酸イオン,亜硝酸イオンの生成量の増加が確認された。EDTA中の炭素の無機化(完全酸化分解)は両雰囲気下とも反応時間60分で20%程度であり,EDTAとしての分解率は不活性雰囲気下70%,空気雰囲気下50%であった。またNTAの分解において反応の初期に誘導期間がみられた。これらの結果より,水溶液中のEDTAの分解においては気相の雰囲気調整が,有効な酸化活性種を低減させずに,水溶液に供給するために有効な反応条件であることが示唆された。これに対し,両雰囲気下ともにNTAの分解は同程度(15%)にしか進まないことから,分解機構の律速に関わる段階については気相雰囲気の制御による酸化活性種の増減には影響を受けないことがわかった。燃焼炎は燃料に応じて炎中に各種ラジカルが生成し、燃焼炎を水溶液界面へ吹きつけると、燃焼炎中のラジカルは水溶液中へと移動し、水溶液内での化学反応に利用することができる。水素-酸素燃焼炎中で主に発生する酸化剤であるヒドロキシルラジカルの二量化により過酸化水素が生成する。過酸化水素の水溶液中での生成量をもって、水素-酸素燃焼炎中で発生したラジカル酸化剤の水溶液への移動量の指標とした。種々の単一および混合ガス雰囲気下で反応を行ったところ、窒素については、雰囲気ガスとして一定量以上存在すると、水溶液中に生成した過酸化水素による、亜硝酸イオンから硝酸イオンへの酸化が起き、過酸化水素が消費されるために、過酸化水素の生成量は低下した。

酸素については、燃焼炎中の化学種と反応し、ヒドロキシルラジカルとは別の化学種を生成するため、水溶液中に生成する過酸化水素濃度は小さくなったが、燃焼炎中での窒素酸化物生成反応を促進することが推測された。ヘリウムについては、水溶液中に生成する過酸化水素濃度は小さくなった。この原因のひとつとして、ヘリウムの熱伝導性が大きいことが挙げられる。以上のことから、燃焼炎中に生成する化学種と気相雰囲気ガスとの反応性を考えた上で、燃焼炎中に多くの化学種を生成させることができれば、水溶液中への化学種供給量も多くなると考えられる。また、水溶液中に供給された化学種も水溶液中の化学種と反応すると考えられるので、様々な燃焼ガスを用いることで、種々の水溶液内反応における化学種供給技術としての応用が期待できる。
ヒトの主観的味覚特性と味覚中枢の活動との相関に関する研究

1.主観的味覚特性のうち、食塩の物理的濃度及び感覚的強度とヒトの大脳皮質第一次味覚野の活動強度との関係を脳磁場計測(MEG)によって検討した。物理的濃度、感覚的強度共、第一次味覚野の活動強度と有意な相関を示したが、物理的濃度との相関の方が高い値を示した。このことは第一次味覚野の活動は物理的濃度の情報がより直接的に反映され、感覚的強度は濃度情報を反映する第一次味覚野の情報が修飾された結果と考えられる。2.MEGで第一次味覚野として同定された頭頂弁蓋部にfMRIにおいても味覚誘発の賦活が見られるかどうかを(機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI))検証した。MEG計測で用いたと同じ味刺激装置で被験者の舌先に食塩水と水を流し、食塩水で賦活される大脳皮質味覚関連領野の部位とその広がりをfMRIで計測した。12名中9名では、外側溝内の頭頂弁蓋部とそれに隣接する島皮質上部に賦活を見い出し、MEGで既に同定した部位に相当すると考えられた。このことは、これまでのPETやfMRIによる研究が前頭弁蓋部にのみ賦活を認め、いわゆるarea Gに賦活を見い出していないことと対比している。3.味覚一次野の側性について、触刺激の混入がない味覚刺激提示装置と時間分解能が高い脳磁場計測装置(MEG)を用いて、検討した。慢性中耳炎に対する手術の際、右側の鼓索神経を切断した7症例に対し、健常側の鼓索神経に対する味覚刺激を行い、中枢の味覚応答をMEGにより計測した。計測は1症例当たり6-8回施行した。46セッション中、味覚一次野に推定されたのは36セッションであった(78.3%)。応答の側性は、両側性が26セッション(72.2%)と片側性よりも多くみられた。以上より、片側鼓索神経からの味覚情報は、両側の味覚一次野にほぼ同時に投射する可能性が高いと推測された。1.主観的味覚特性のうち、塩味の感覚的強度とヒトの大脳第一次味覚野との関係を脳磁場計測(MEG)によって調べた結果、感覚的強度はヒトの大脳第一次味覚野の活動強度と有意な相関を示したが、物理的濃度と大脳第一次味覚野の有意で高い相関に比較すると小さかった。このことは第一次味覚野の活動は感覚的強度よりも濃度の情報がより直接的に反映され、感覚的強度は濃度情報を反映する第一次味覚野の情報が修飾された結果と考えられる。これについては論文を投稿した。さらに、味質の違いと味覚中枢の活動の関係について、また、味覚強度に及ぼす嗅覚の影響について実験を開始した。2.共同研究者の日本大学医学部耳鼻咽喉科池田助教授と同じ手法を用いて、研究室の職員を対象として、健常者の味覚閾値検査を行なった。附属病院の各診療科にお願いして味覚異常者の味覚検査をお願いしたが、意志の疎通が充分でなく、また、検査用機材の納品も遅れ得たため、今年度は調べる事はできなかった。この反省に基づき、熊本大学医学部内に分担者を中心とした味覚研究グループを発足させて、平成15年度には味覚異常者の味覚検査がスムーズに行えるようにするとともに、健常者・味覚異常者の客観的味覚検査をfMRIを用いて行なうために倫理委員会に申請した。

3.慢性中耳炎に対する手術の際、一側の鼓索神経を切断した7症例に対し、健常側の鼓索神経に対する味覚刺激を行い、中枢の味覚応答をMEGにより計測した。計測は症例当たり6-8回施行し、現在までのところ5症例で中枢における味応答を検出した。現在これらの症例で得られたMEGによる応答領域と応答側を検討しているところである。今後、数症例において、同様の検討を追加する予定である。1.味質の違いと味覚中枢の活動の関係を明らかにするため、塩味を呈する食塩と甘味を呈するサッカリンナトリウム及びサッカリン、うま味を呈するイノシン酸ナトリウムについて、3-6人の脳磁場応答を比較した。その結果味質によって初期の磁場応答の現れ方に違いのあることがわかったが、その中にはレセプターでの特徴の温存だけでは説明できないものがあり、今後実験的解明を行う。(産総研グループ)2.慢性中耳炎の手術の際に右鼓索神経を切断した3症例を対象に、触刺激の混入がない味覚刺激装置と時間分解能が高い脳磁場計測装置を用いて、左鼓索神経を刺激し、味覚一次野の側性について検討をおこなった。22セッション中、味覚一次野に推定されたのは17セッション(28半球)であった(77.3%)。応答の側性は、両側性が11セッション(64.7%)と片側性よりも多くみられた。両側性の11セッションにおいて、各大脳半球別に平均潜時を比較した結果、刺激と同側の方が早い傾向がみられたが有意差があるとは言えなかった。以上より、片側鼓索神経からの味覚情報は、両側の味覚一次野にほぼ同時に投射する可能性が高いものと推測された。(日大グループと産総研グループ)3.熊本大学グループは、神経学的に健常者12名(大学生)を被験者として、MEG計測時に用いた味刺激装置を用いて、食塩水で賦活される大脳皮質味覚関連領野の部位とその広がりを機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)で計測した。計測用ソフトはMATLAB上で動作するSPM99を用いた。12名中9名では、外側溝内の頭頂弁蓋部とそれに隣接する島皮質上部に賦活が見い出され、4-5名には中心溝下端とローランド弁蓋部に賦活が見い出された。これらの部位のうち前者は、MEGで既に同定したarea Gに相当すると考えられ、これまでのPETやfMRIによる研究が前頭弁蓋部にのみ賦活を認め、いわゆるarea Gに賦活を見い出していないことと対比している。(熊本大グループと産総研グループ)1.主観的味覚特性のうち、塩味の感覚的強度とヒトの大脳第一次味覚野の活動との関係について、データを再検討した。その結果、感覚的強度が増しても活動の潜時には違いがみられないことを再確認したが、濃度が0.03M、0.1M、0.3M、1Mと増大するに従って、第一次味覚野の活動量は増大したが、感覚的強度は0.3Mと1Mでは差がみられず、感覚的強度の対数関数のあてはまりは0.03Mから0.3Mの間だけであった。これらの解析を基に再投稿した。また、二つの国際学会のシンポジウムと国内の学会のシンポジウムや大学主催のシンポジウムでこの成果を発表した。また、うま味やNa-サッカリン等、塩味以外の主観的味覚特性とMEG計軌との関係について解析を行った。(産総研グループ)2.熊本大学医学部附属病院中央放射線部のMRI装置を用いて、正常人について舌先および左右の舌縁刺激および味覚障害者の舌先刺激を行ないつつ味刺激で賦活される大脳皮質を調べた。正常人の舌縁刺激では必ずしも同側の大脳皮質味覚野に賦活が見られなかったし、味覚障害者(1人)では大脳に賦活を見い出すことができなかった。(熊本大グループと産総研グループ)
島嶼沿岸域における生態系サービスと人間活動の相互関係に関する学融的研究

本研究では、南太平洋島嶼域における産業上重要種である二枚貝の生態系における機能的重要性を指摘し、村内の伝統的制度と国内・国際的制度の現状との関係を解明した。そして、それらの成果を基に総括として、太平洋の研究者を招へいし、太平洋の島々の人々の現状を見つめながら、「人と自然の関係」を「学融的」に研究を推進するときの課題と問題点を指摘し、今後の太平洋島嶼を中心とした「人と自然の在り方」について考えた。南太平洋の社会では、生態系の持続性を実現することは特に重要である。生態系の状態が、住民に食料、所得をもたらす資源量を規定するからである。本研究は、フィジー先住民社会では基幹的な資源である貝類(カイコソ)を研究対象とする。カイコソは、連続した生態系(マングローブ-干潟-サンゴ礁)における物質循環「基盤サービス」のバランスを取る「調節サービス」の機能を果たす。また、人間の社会経済活動は、資源を収奪するばかりではなく、地域・国家・グローバルな制度を通じて調整機能を果たす。本研究は、このような、連続する生態系の「基盤サービス」における特定資源による「調整サービス」と人間活動の相互関係を、経済発展水準の異なる複数の村落において、安定同位体比による手法を用いて明らかにすることを目的にしている。平成24年度はフィジー諸島共和国における一番翁島であるビチレブ島南部の村落に滞在し、貝類の生態、経済的利用、コミュニティーでの利用、関連する制度、について調査を行った。これらの成果は毎月の研究会で議論を行い、その村におけるシステムの解明を行っている。これと共に、その研究会では関連する分野の研究者を沖縄から招聘し、沖縄の事例と比較することによって、多様な人と自然の関係について議論を行った。また、安定同位体における物質の流れにおいても実験を推進しており、その結果を解析中である。これらの成果をもとに、平成25年度の計画を実施する予定である。平成25年度において本調査はレンタボートとレンタカーを用いビチレブ島東岸の新しい村落で行った。各担当者は村にホームステーを行い、各調査項目(家計調査、制度の調査、海洋調査、貝の生態調査)について調査を行った。平成24年の村と比較して大きく異なる点(経済レベルと貝の生態要因)については特に注目し、相違を生み出す社会経済的要因、制度的要因、生態的要因などについて現在検討した。また、水産資源がどのような経路で消費・流通するのか注目し調査を行った。その際、村落における労働構造、とりわけカイコソの漁獲と販売を行う女性の役割の変化について注目して行った。その結果、カイコソの資源量はあまり多くなかったが、この地域は比較的交通が発達しており、公共交通機関を用い、流通をしていることが分かった。また、経済レベルは沿岸域村落としてはおそらく中程度の経済レベルにあると考えられる。村の制度については聞き取り調査を行い、村でのカイコソ採集の有無、野外生息サイズなどについて調査を行った。制度については明確な制度はあまりなく、資源量に対する大きな制約要因にはなっていなかった。一方、村々に行きランダムに選んだ約20家庭の子供から髪の毛をもらい、安定同位体比によりその家庭の経済レベルを推定した。これは本調査で行う家計調査には調査に時間がかかるため髪の安定同位体比で解析する簡易方法を用いている。この成果はまだ解析中である。フィジー諸島共和国ビチレブ島東部沿岸域には広大なマングローブ林とその沖合域にサンゴ礁が形成されており、この地域の人々はマングローブ林とサンゴ礁を利用し維持する社会経済システムと文化を持っている。従って、このような地域の社会や自然、およびその相互関係を明らかすることは、自然と人間社会の共生を考慮する上で有益なヒントがある。2012年より2014年まで、フィジーのビチレブ島、バヌアレブ島において、貝類(カイコソ)に焦点を当てて、資源利用を決定する要因を明らかにする試みを行った。調査地は、ビチレブ島東部のヴェイヴァツロア、同島、西部のナコロクラ、およびヴァヌアレブ島のラケンバである。経済的視点から、ヴィチレブ島東部のワインガナケのデータと、同じくヴァヌアレブ島に位置する、ヴェイヴァツォア(東部)とナコロクラ(西部)の3集落に関して、カイコソ捕獲についての比較を行った。その結果、東西でカイコソに対する重要が大きく異なることが明らかになった。また、市場への距離が資源利用の点で非常に重要であることが明らかとなった。貝類の生態的データの視点から、今回調査を行った地域でのコストとして、漁場へのアクセス時間とボートにかかる費用とし、ベネフィットとしてカイコソの平均殻長と密度として、村民のカイコソ漁場へのアクセスを考えた。その結果、このコストとベネフィットの相互関係により、漁場へのアクセスが関係していることが考えられる。そして、この地域の漁場の管理を考えるうえで、今後このような要因を考えていく必要があると考えられる。

26年度が最終年度であるため、記入しない。海洋生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の調査は順調に終え、そのデーターの解析は順調に進んでいるため。本実験は3年間で行う3つの村の比較から、それぞれの資源量の管理に与える影響について研究しようとしている。そのため、3年目の村での成果が得られないと、十分に比較が行えない点がある。そのため、若干遅れているように考えられる。今後は平成24年度と同様の調査を、異なる村落において推進する予定である。本研究は3つの村を対象に、同じ方法を用いて比較研究をすることは主な手法の一つになっている。そのため、平成24-25年度に行った手法の多くの点で同じ手法を用いて行う。ただ、幾つかの点で改善した方がよいと考えられる点があるため、その点は改善をし研究を推進する。平成24年度の安定同位体の解析の前処理に時間がかかったため、平成25年度にその解析を平成25年度分の解析と共に行う。
都市成熟時代における住宅地の環境変化-持続的発展に向けた地理学からの施策提言-

都市が成熟時代を迎えた現代にあって、都市やその居住者に生じている変化を的確にとらえ、そこから将来の課題を探っていくことが必要である。本研究では、日本の千里ニュータウン、カナダ・バンクーバーのウェストブロードウェイ、中国・上海の田子坊を事例地域として、これらの成熟地域が近年において経験した変化の実態把握、問題点の洗い出し、将来の発展に向けた活性化方策の模索と提案を行った。経済発展や社会の状況に応じて都市は変化するが、とりわけ住宅を取り巻く環境は、居住者の加齢や転出入によって大きな影響を受ける。本研究では、社会経済的な情勢変化が旧来の住宅地に及ぼした影響の実態把握、そこから生じた諸問題の解明、将来に向けた問題解決のための糸口の模索、これらを主な目的として研究を進めている。研究対象地域は、研究代表者が研究を蓄積してきた地域で、なおかつ住宅をめぐる現況把握や将来展望が急務である地区を、日本、カナダ、中国から選んだ。住宅をめぐる制度やシステムの違いから単純な相互比較は難しい部分もあるが、住宅老朽化や少子高齢社会の進展など、国家間に共通する基礎環境も多いため、国内地域の相互比較では得られない示唆を海外の事例から学ぶことが可能である。とくに都市に持続的発展を求める社会的要請は全世界的課題でもあり、高齢者が快適に暮らせる住宅地が、若年層や乳幼児にとっても安心して暮らせる住宅地である必要性が高まっている。よりよい住宅と暮らしを求める研究は、成熟社会にとって不可欠かつ喫緊の課題であるといえる。上記の目的を達成するため、本研究では日本から大阪府の千里ニュータウン、カナダからブリティッシュコロンビア州のバンクーバー、中国から上海を取り上げた。いずれの都市においても、数十年前に整備された住宅が近年において大胆に再生を始める過程にある地区に着目して研究を進めている。初年度にあたる平成20年度は、国内フィールドの千里ニュータウンにおいて、親子の居住関係を探るアンケート調査を実施し、公営住宅居住者と分譲マンション居住者から、分析に耐え得るだけのサンプルを集めた。現在は集計を終えて、分析を始めた段階にある。成果については、平成21年度の秋季に口頭発表の予定である。海外フィールドは、当初タイのバンコク郊外を予定していたが、政情不安のためと候を見合わせ、前倒しで中国の上海に赴いた。ここではメインフィールドとなる芦湾区の田子坊において予備調査を実施した。本格的なフィールド調査は平成21年度の夏季以降に予定している。これについての研究成果の公表は、まず口頭発表を平成21年度末に行う予定である。また、海外フィールドの一つであるカナダのバンクーバーでは、別の費用で渡航した折に予備調査を実施した。当初予定していたアンケート調査が難しいことが判明したため、現地での観察調査と聴き取り調査に手法を変更し、平成21年の6月に第1回目のフィールド調査を実施する予定である。平成20年度に実施した、千里ニュータウンでの調査結果の分析を進め、11月の人文地理学会大会(名古屋大学)で口頭発表した。その資料に使った書籍2冊の書評を「地理科学」64-3に掲載した。また、中国上海における予備調査で得た資料を活用して住宅研究を進める過程で、中華人民共和国発足直前の上海都心部における銀行・保険業店舗の空間的展開を知り得たため、この成果を副産物として、10月の東北地理学会(弘前大学)で口頭発表した。この研究に使った資料については、「人文地理」61-4の文献解題で公表した。バンクーバーについては、6月に1週間の現地調査を実施し、成果の一部を10月の日本地理学会秋季大会(琉球大学)で口頭発表した。また、同じくバンクーバーの研究成果の一部を、雑誌「地理」54-11における特集「バンクーバー冬季オリンピックの舞台」の表紙、巻頭カラーグラビア、巻頭論文として掲載した。さらに、2010年冬季オリンピックに合わせてバンクーバーが持つ住環境を一般に広く公表するため、研究成果の一部を『バンクーバーはなぜ世界一住みやすい都市なのか』(ナカニシヤ出版)にまとめた。住宅地について別角度から分析と考察を施した成果も得られており、それについては『都市の景観地理』のシリーズの中の一冊において掲載が確定している(22年度秋に刊行予定)。他方、政情不安で調査の実施が実質的に不可能となったタイ・バンコクは、現地調査の中止を決断した。その代替として22年2月、斜面住宅地の持続的発展方策の実施例として捉えるべく、長崎市を訪問して、資料収集と予備調査を実施した。また、バンクーバーについても調査の一層の精緻化を図るため、3月に5日間の現地補足調査を実施した。その成果については、千里ニュータウンにおける親子近接別居についての研究とともに、査読付雑誌に投稿すべく執筆中である。平成22年度は、平成20・21年度に現地調査を実施したカナダのバンクーバー、および日本の千里ニュータウンにおける成果の分析と磨き込みに加え、中国の上海において旧市街地の再開発にともなう住宅地の変化を主なターゲットに定め、年度当初より上海調査に向けた準備を進めた。上海

調査は8月の現地調査に先駆けて、インタビュー調査の設計、謝金を活用してのインタビュー項目の翻訳を実施し、現地調査では研究代表者の所属大学と長年の交流実績がある上海師範大学の助力を得て、2人の専任教員アドバイザー、4人×2日の調査要員学生を手配し、上海市芦湾区田子坊において「自然発生的な商業化にともなう旧来の住宅地の変化とその意味」を調査した。帰国後もこの調査の分析は現在まで継続し、その一部については後述するように既に公表した。研究成果としては、夏季までに当補助金で整備を継続している「全国マンション市場動向」(国内の分譲マンション統計)を活用して分担執筆著書『図説大都市圏』に短い論考を掲載した。また、海外対象地域のひとつであるバンクーバーに関しては、夏までに分担執筆著書『都市の景観地理イギリス・北アメリカ・オーストラリア編』に論文1本を、さらに21年度(22年2月)に刊行した著書『バンクーバーはなぜ世界一住みやすい都市なのか』の初版第1刷(1500部)が売り切れたため、ごく一部の字句修正で改善を図った初版第二刷(500部)を8月月に刊行した。上海に関する成果は、23年3月末に開催された国際シンポジウムで成果発表(論文発表での参加)、および日本地理学会春季大会(震災のため中止、発表は成立)で公表した。平成23年度は4年間の研究期間の最終年度にあたるため、平成22年度までに行ってきた調査のまとめを実施した。それは研究成果を発表するための作業、投稿論文の編集委員会とのやり取りなどである。論文は、千里ニュータウン(NT)とバンクーバーに関するものを、ともに英文要旨を付して査読付雑誌に公表できた(千里NTについては『人文地理』第63巻3号に英文要旨を添えて、バンクーバーについては『都市地理学』第6号に英仏語要旨を付した)。学会口頭発表は、23年度の4月と3月(24年3月)に2回実施した。前者は上記の論文でも深く触れた千里NTの分譲マンション供給が主要テーマで、対象地域はNT内にとどまらず、NTに関連する物件名称を持つ分譲マンションの展開地域まで拡大した。この口頭発表における対象期間の後にも多くの物件が供給されているため、継続的に供給業者への聴き取り、現地での確認作業、住宅地図を併用しての従前用途のチェックなどを行った。この成果については、骨子を単行本(分担執筆)にまとめ、詳細を学術雑誌に投稿すべく準備を進めている。また、年度末の24年3月には上海の田子坊に関する研究報告を行った。その際、現地の研究協力者から必要な情報を提供してもらった。この成果についても執筆途上にあるが、カラー図版が掲載できる査読付雑誌『都市地理学』第8号に英語・中国語要旨を付して投稿予定である。また、バンクーバーの調査過程で、バリアフリー対応への地理額的な考察が必要であることが判明したため、今後の研究転回に向けてバンクーバー及びサンフランシスコ(ベイエリア)で公共交通機関や都心の諸施設で予備的調査を実施した(23年12月)。
多期間ポートフォリオにおける評価系および最適政策の動的計画法による研究

いわゆるマルコビッツのポートフォリオ理論では平均・分散基準の確定的最適化を数理計画法によって行っている。これは時間を含んだダイナミックな問題を、期待値操作または極限操作により、瞬時の静的問題として解析している。すなわち、時間推移に伴うダイナミズムの取り扱いを無視していた。しかし、本研究においては、【動的な問題には動的な解析】を通して、最適化を行っている。まず、数理ファイナンス分野おける新しい評価基準として単一評価クラスと複合評価クラスを導入して、その不確実性の下での動的最適化手法を提案している。とくに、リスクとリターンをマルコフ連鎖として確率変数列そのものとして取り扱い、制御マルコフ連鎖上で分数型基準の条件つき期待値を再帰的に最適化している。分数型評価は複合評価の典型的な基準の一つであるが、他に、範囲、分散などの複合型基準の動的最適化を行った。さらに、動的計画法を中心とした動学的最適化手法として、(1)原始政策法、(2)拡大マルコフ政策法、(3)(4)多段確率決定樹表を開拓し、既存の最適化手法では解けない問題を提案し、これらの最適解を導いた。また、動的最適化手法をより分かりやすく、説得力あるものにするために、各種グラフィックス表示およびその開発をおこなった。とくに、不確実性の下において非加法型評価の多段階意思決定過程の最適化を動的計画法によって行った。さらに加法型評価と非加法型評価との相違を最適解・アプローチにおいて解明し、三つの手法で多段決定過程の最適化を行った。ここでは評価系を加法・非加法の枠を超えて、広く単一・複合としてとらえ、動的計画法が広く適用できることを実例とともに示した。本研究によって、多期間ポートフォリオ理論に新しい評価基準が導入され、その下での互いに同等な動的最適化手法が広く利用できるようになった。これはまさしく本萌芽的研究の一つの成果である。マルコビッツのポートフォリオ理論では平均・分散基準の確定的最適化を数理計画法によって行っている。しかし、本研究においては、【動的な問題には動的な解析】を行って、最適化を行おうとしている。とくに、リスクとリターンを確率変数そのものとして取り扱い、制御マルコフ連鎖上で分数型基準の条件つき期待値を再帰的に最適化している。分数型評価は複合評価の典型的な基準の一つであるが、他に、範囲、分散などの複合型基準の動的最適化をおこなっている。さらに、動的計画法を中心とした動学的最適化手法として、(1)原始政策法、(2)拡大マルコフ政策法、(3)多段確率決定樹表を開拓し、既存の最適化手法では解けない問題を提案し、これらの最適解を導いた。具体的には、(1)事前条件付き意思決定過程と(2)事後条件付き意思決定過程の二つを新たに導入し、(3)条件なし(本来の)意思決定過程との最適解の構造およびそのアプローチにおいて三つの過程の相違点を明らかにした。

さらに加法型評価と非加法型評価との相違を最適解・アプローチにおいて解明し、三つの手法で多段決定過程の最適化を行った。ここでは評価系を加法・非加法の枠を超えて、広く単一・複合としてとらえ、動的計画法が広く適用できることを実例とともに示した。本研究によって、多期間ポートフォリオ理論に新しい評価基準が導入され、その下での互いに同等な動的最適化手法が広く利用できるようになった。これはまさしく本萌芽的研究の一つの成果である。
腫瘍抗原遺伝子TGF-βR遺伝子導入iPS細胞由来DCを用いた新規癌ワクチン療法

6例の大腸癌患者がエントリーした.6例すべての切除標本よりCTOS法を用いて、cell line化に成功し,そのうち4例がCEA蛋白陽性2例がWT1蛋白陽性であった.4例のCEA陽性大腸癌患者のおのおののiPS-DCにアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入し,その導入効率をFACSにて検討した.のこりの2名は同様にWT1遺伝子を導入し,その発現を確認した.その後,担癌患者6名のおのおののPBMCに対してiPS-TAA-DCのin vitro刺激を3回行い,28日かけてbulk CTLを誘導,その後MACSにてCD8+CTLを選別し,effector細胞とした.Target細胞はCTOS法で得られたcell lineとし,細胞傷害活性をCr release assay法を用いて検討した.結果として,全例にTAA特異的なCTLが誘導され,おのおののcell lineに対して強力な殺腫瘍効果を認めた.現在,テトラマーassayを行い,population数のチェックを行っている.しかし,数回行ったが,明らかなテトラマー陽性細胞は検出できず,現在は抗体を変更したり,assay法を工夫しながら研究を進めているところである.平成30年度は担癌患者iPS-TAA-DC in vitro刺激で得られたCTLのTAA特異的細胞傷害活性の解析を行った.結果6例の大腸癌患者よりTAA特異的なCTLが誘導された.6例中4例が初回のCr release assayで作業仮説どうりの結果が得られ,2例も2回目のassayで結果が得られた.計画通りに研究は進んだ考えている.現在そのpopulationの解析を行うためテトラマーassayを行っているが,現時点ではテトラマー陽性細胞はdetectできず,繰り返し研究を行っている.以上のごとく,おおむね順調に研究は進展していると評価した.平成31年度も引き続き,新たな癌患者からのCTOS法を用いたcell lineの作成,iPS-DCの樹立,in vitroでのCTL誘導を行っていく.現在停滞しているテトラマー陽性細胞の検出に関しては,抗体を変更し,行っている.また,これまでは大腸癌でのみCTOS法が成功しており,平成31年度は胃癌患者および膵癌患者からのCTOS法確立を目指す.平成29年度は担癌患者iPS-TAA-DCを用いたin vitro抗腫瘍効果を行った。ヒト腫瘍抗原遺伝子を恒常発現するiPS細胞由来DCの癌ワクチン療法の可能性を,担癌患者のPBMCから樹立したiPS細胞由来DCを用いたin vitroでの抗腫瘍効果を確認した.本研究はiPS-DC癌ワクチン療法の臨床応用に向けてのpreclinical studyであり,当大学倫理委員会の承認を得てから行った(approval number 1594) (UMIN:000021105).6例の大腸がん患者をエントリーして行った.平成29年度は担癌患者iPS-TAA-DCを用いたin vitro抗腫瘍効果を行った。当初20例の担癌患者エントリーを目指していたが、患者由来の癌細胞のセルライン化に当初は難渋し、時間を要した。癌性腹水や胸水のセルライン化を行っていたが、長期培養に適さず、固形腫瘍を用いたCTOS法へと手技を変更したところ、セルライン化が可能となった.その後は、担癌患者からのiPS細胞の樹立、樹状細胞への分化誘導などは計画通りに進んだ.これまでの5 step法をより効果的にするため、サイトカインカクテルの内容を改良しnew 5 step法を確立し、現在に至っている.CTOSで得られたセルラインは主にCEA WT1を発現していたため、2種のアデノウイルスベクターを調整し、研究に用いた.6例の担癌患者由来のiPS-DCにターゲットTAA遺伝子を導入し、in vitroでのCTLを誘導し、6例ともCTLが誘導され、その腫瘍効果を確認した.現在裏付けとして、テトラマー陽性細胞の検出を行っている.上記のごとく、おおむね順調に研究は進展していると評価した.6例の大腸癌患者がエントリーした.6例すべての切除標本よりCTOS法を用いて、cell line化に成功し,そのうち4例がCEA蛋白陽性2例がWT1蛋白陽性であった.4例のCEA陽性大腸癌患者のおのおののiPS-DCにアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入し,その導入効率をFACSにて検討した.のこりの2名は同様にWT1遺伝子を導入し,その発現を確認した.その後,担癌患者6名のおのおののPBMCに対してiPS-TAA-DCのin vitro刺激を3回行い,28日かけてbulk CTLを誘導,その後MACSにてCD8+CTLを選別し,effector細胞とした.Target細胞はCTOS法で得られたcell lineとし,細胞傷害活性をCr release assay法を用いて検討した.結果として,全例にTAA特異的なCTLが誘導され,おのおののcell lineに対して強力な殺腫瘍効果を認めた.現在,テトラマーassayを行い,population数のチェックを行っている.しかし,数回行ったが,明らかなテトラマー陽性細胞は検出できず,現在は抗体を変更したり,assay法を工夫しながら研究を進めているところである.平成30年度は担癌患者iPS-TAA-DC in vitro刺激で得られたCTLのTAA特異的細胞傷害活性の解析を行った.結果6例の大腸癌患者よりTAA特異的なCTLが誘導された.6例中4例が初回のCr release assayで作業仮説どうりの結果が得られ,2例も2回目のassayで結果が得られた.計画通りに研究は進んだ考えている.

現在そのpopulationの解析を行うためテトラマーassayを行っているが,現時点ではテトラマー陽性細胞はdetectできず,繰り返し研究を行っている.以上のごとく,おおむね順調に研究は進展していると評価した.平成29年度に研究にあたり、2点大きな変更点改良点を要した.ひとつは担癌患者からの癌細胞セルライン化であるが、現在のCTOS法に変更することで安定したライン化が可能となった.またiPS細胞から樹状細胞への分化誘導であるが、サイトカインカクテル内容の変更するなど、modifyすることで改良を加え、new 5step法を確立した.今年度も引き続き、担癌患者からの癌細胞セルライン化iPS-DCの樹立in vitroCTL誘導を行っていく予定だが、現在までに大腸癌患者でのみ成功しており、今後の課題としては、胃癌や膵癌の患者からの樹立を成功させる点である.胃癌膵癌との腫瘍細胞以外の繊維芽細胞が多く存在しており、CTOSでの癌細胞単離化が困難である点が課題である.対応策としては、繊維芽細胞除去シートを用いたCTOS法の改良や、腹水からの樹立を考えている.上記の担癌患者を用いた研究と並行して、可溶性TGF-beta受容体遺伝子導入マウスiPS細胞由来DCを用いた抗腫瘍効果の基礎研究を推進していく予定である.平成31年度も引き続き,新たな癌患者からのCTOS法を用いたcell lineの作成,iPS-DCの樹立,in vitroでのCTL誘導を行っていく.現在停滞しているテトラマー陽性細胞の検出に関しては,抗体を変更し,行っている.また,これまでは大腸癌でのみCTOS法が成功しており,平成31年度は胃癌患者および膵癌患者からのCTOS法確立を目指す.今年度末の論文登載料の使用計画にずれ(年度末にアクセプトしたため,支払いが新年度になってしまった).33334円が次年度繰り越しになってしまいました。今年度末の論文投稿料の使用計画にずれ(年度末の投稿にて支払いが新年度になってしまった)、次年度繰越金が発生しました.
Ｘ線結晶構造解析による細胞内及び細胞間での物質輸送の研究

高度に制御された輸送に関わる3種の複合体の構造決定を行った。イクスポーテイン-5:ランGTP:pre-miRNA複合体,イクスポーテイン-5:ランGTP複合体及びイクスポーテイン-5の構造解析によって数百種あるpre-miRNAを他の小さなRNAと区別して核外に輸送する仕組みを解明した。ラット肝臓のボルトに続いて発現系で得たMVP-ボルトが39回対称を持つ事を決定し、長年提唱されて来た48回対称の可能性を完全に排除した。コネキシン26ギャップ結合チャネルの構造に基づいたホモロジーモデリングと機能解析によって、異なったヘミチャネルが結合してチャネルを形成する際の選択性を決める要因を明らかにした。高等な生物では、特定の分子を働くべき場所に輸送する仕組みがあり、そのことによって高度に制御された生命の営みが可能になっている。こうした輸送に関わる生体超分子の立体構造を決定して、その働きの仕組みを明らかにするのが本研究の目的である。。細胞間輸送ではギャップジャンクション、細胞質から細胞外排出及び核内への輸送ではボルト、核外への輸送ではイクスポーティンを研究対象に取りあげる。本研究では核外輸送機構の研究の典型例として、Exportin・RanGTP・Pre-microRNA3者複合体のX線結晶構造解析を行った。Exportin・RanGTは野球のファーストミットのような形をしていて、pre-microRNAの3'オーバーハング構造を約10本の水素結合で強固に結合し、正に帯電したミットの内側でRNAの2重螺旋部分を柔らかく捕まえている。その結果、核内にある約700種のpre-microRNAが特異的に捕獲されて核外に運ばれる仕組みが明らかになった。ボルトは3種の蛋白質と1種のRNAで構成され、分子量が10MDaを超える巨大な粒子である。ボルトの39量体構造を形成するのに重要と思われるC末端領域の構造が未知である。そのためには3Aを越える分解能の結晶を得る必要がある。結晶方法を改善して大きな結晶を得ることに1成功した。現在と凍結法を検討している。ギャップ結合チャネルの開孔型の構造を3.5A分解能のX線結晶構造解析を既に報告した。開閉機構の解明の必要な閉鎖型の結晶得たが、分解能が4Aであった。現在分解能の改善を図っている。細胞間輸送ではギャップジャンクション、細胞質から細胞外排出及び核内への輸送ではボルト、核外への輸送ではイクスポーティンを研究対象に取りあげている。細胞内での輸送に関わると考えられているボルトは分子量が10MDaを超える巨大な粒子である。そのためには3Åを越える分解能の結晶を得る必要があり、回折強度データを収集している。構造に基づいて半チャネルが細胞間でドッキングしてチャネルを形成する仕組みを明らかにした。また、再現性良く良質の結晶を得る条件検索を行った。そのためには3Åを越える分解能の結晶を得る必要があり、ラット肝臓のボルトに加えて昆虫細胞の発現系でボルトの調製法を確立した。その結晶化にも成功して高分解能回折強度データを収集している。構造に基づいて半チャネルが細胞間でドッキングしてチャネルを形成する際に鍵になるアミノ酸残基を特定することができた。N末ヘリックスの端にあるAsp2がチャネルの開閉に重要な役割を果たすことを明らかにした。高等な生物では、特定の分子を働くべき場所に輸送する仕組みがあり、輸送に関わる生体超分子の立体構造を決定して、その働きの仕組みを明らかにするのが本研究の目的である。

小RNAの核外輸送に関わる、イクスポーティン-5の研究では、イクスポーティン-5・ランGTP・プレ-マイクロRNA3者複合体の、イクスポーティン-5・ランGTP2者複合体の結晶構造解析に加えて、イクスポーティン-5単体の結晶構造解析を行った。意外にも2者複合体は3者複合体と同じ構造であった。細胞内での輸送に関わると考えられているボルトは分子量が10MDaを超える巨大な粒子である。ボルトの39量体構造を形成するのに重要と思われるC末端領域の構造が未知である。この領域の構造を新しい構造精密化法によって決定した。昆虫細胞の発現系でボルトの調製法を確立し、昆虫細胞発現系によってフレキシブルなMVPのN末端(粒子ウェストを形成)をロイシンジッパーで固定化した組み換えボルトを調製して、均一な電子顕微鏡像を与える試料の大量調製に成功した。異方性が有るが2.8Åの回折像を与える結晶を得た。ギャップ結合チャネルの構造に基づいて、半チャネルが細胞間でドッキングしてチャネルを形成する機構を明らかにする研究を行った。Cx26の変異体,Cx32の野生型及び変異体を調製して、ホモロジーモデリングに基づいてチャネル形成に重要な水素結合を特定した。コネキシン26ギャップ結合チャネルは3.5Å分解能で構造決定されているが、細胞内ループやC末端ループの構造は未確定である。分子動力学計算を加味した構造解析法を考案して、この部分の構造を決定した。高等な生物では、特定の分子を働くべき場所に輸送する仕組みがあり、そのことによって高度に制御された生命の営みが可能になっている。こうした輸送に関わる生体超分子の立体構造を決定して、その働きの仕組みを明らかにするのが本研究の目的である。細胞間輸送ではギャップジャンクション、細胞質から細胞外排出及び核内への輸送ではボルト、核外への輸送ではイクスポーティンを研究対象に取りあげている。そのためには3Åを越える分解能の結晶を得る必要がある。ラット肝臓のボルトに加えて昆虫細胞の発現系でボルトの調製法を確立した。昆虫細胞発現系によってフレキシブルなMVPのN末端(粒子ウェストを形成)をロイシンジッパーで固定化した組み換えボルトを調製して、昆虫細胞1L培養あたり80mgの高純度ボルト粒子(LZ-ボルト)を得る事が可能となった。その結晶化にも成功して高分解能回折強度データを収集している。ホモロジーモデリングに基づいた変異体を調製して、機能解析と光学顕微鏡観察によってチャネル形成を解析した。その結果、チャネル形成に重要なアミノ酸残基および相互作用様式を明らかにした。イクスポーティンは当初目標を超過達成している。ボルトは3オングストロームを越える分解能で構造決定をして、構造未確定の部分の構造を決定することを目指している。そのために発現系による試料調製法を確立できた。
可塑性遺伝子産物Arcを介するシグナル伝達機構の解明

可塑性遺伝子産物Arcを介するシグナル伝達を明らかにするために、Arcと相互作用するタンパク質をTwo-hybrid systemにより解析し以下の結果を得た。(1)Arcと相互作用する新しいSH3タンパク質であるSH3P13を見い出した。(2)ArcとSH3P13が相互作用することをArc-GST融合タンパク質を用いが免疫沈降により確認した。(3)ノーザンブロットにより、SH3P13mRNAは精巣、脳、肝臓に存在していた。また、SH3P13の標的を解析し、その1つとしてDynaminを見い出した。SH3P13とDynaminとの相互作用を調べ、以下の結果を得た。(1)DynaminはGTPase活性をもち受容体のエンドサイトーシスに関与することが知られている。SH3P13のDynamin GTPaseに対する効果を調べたところ、SH3P13の添加によりα-[^<32>P]GTPは脱リン酸化されGDPとなることから、SH3P13がDynaminの機能を調節することが明らかとなった、(2)Dynaminの抗体を用いた免疫沈降を行うと、SH3P13とDynaminが共沈することから、両者が直接結合することが明かとなった、(3)脳における分布を調べたところ、DynaminとSH3P13はいずれも神経細胞に存在し、大脳皮質II-III層およびV層に共存していた、(4)培養細胞に受容体、受容体のリン酸化酵素およびSH3P13のcDNAをCOS-7細胞にトランスフェクションしを発現させ、放射性リガンドを用いて受容体のエンドサイトーシスを調べた結果、SH3P13はドーパミンD2受容体のDynamin依存性エンドサイトーシスを抑制することが明らかとなった、(5)myc抗体でD2受容体を可視化し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した場合も、SH3P13がドーパミンD2受容体のDynamin依存性エンドサイトーシスを抑制することが確認された。可塑性遺伝子産物Arcを介するシグナル伝達を明らかにするために、Arcと相互作用するタンパクSH3P13の性質と、SH3P13とその標的タンパク質であるdynaminとの相互作用に注目して研究を行ない次のような結果を得た。1.Arcと相互作用するタンパクSH3P13の性質と機能:(1)ArcとSH3P13が相互作用することをArc GST融合タンパク質を用いた免疫沈降により確認した。(2)ノーザンブロットにより、SH3P13mRNAは精巣に最も多く存在し、ついで脳の各組織および肝臓に存在した。脳では、海馬、線条体に多く存在していた。しかし、神経活動を高めた時、Arcとは異なり、活動に依存した変化は示さず、常に一定であった。(3)SH3P13に対する特異抗体を調製し、脳における局在を調べたところ、大脳皮質II-III層およびV層のneuronが免疫反応陽性であった。(4)ArcがSH3P13に結合し、次にどのような変化が起るかを調べるために、SH3P13をbaitにして、two hybrid systemを行ない、相互作用するタンパク質を調べたところ、Dynamin、SH3P8、Synapsinのクローンが得られた。2.SH3P13とDynaminの相互作用:(1)two hybridsystemにより得られたクローンの中で、特にDynaminとSH3P13との作用について調べた。DynaminはSH3ドメインを持ったタンパクによりGTPase活性が調節されることが知られているため、GTPase活性をα-[^<32>P]