hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高強度鋼の素材疲労強度を加味した溶接継手部の疲労強度向上法の提案

本研究は,この課題の達成を目的とするもので,高強度鋼の“素材疲労強度"を合理的に加味した疲労強度向上法の提示を目的とする.以下に,H29年度の成果について示す.1)橋梁用降伏点鋼板の素材疲労強度の把握のために,申請者のこれまでの研究実績であるSBHS700との比較を目的にSBHS500の素材試験体の疲労試験を行うとともに,金属材料素材の疲労限度を評価可能な√areaモデル適用性を検証し,√areaモデルによりSBHS700とSBHS500の疲労限を評価可能であることを示した上で,両鋼材の疲労限を提案した.2)応力集中部近傍の溶接残留応力の解明のために,溶接残留応力を変化させた試験体の残留応力をX線残留応力計測機により計測した.ここでは,小型試験体と大型試験体を製作することで試験体幅・長さを変えて残留応力を変化させた試験体を対象とした.計測の結果,小型試験体に比べ幅が広い大型試験体の方が,応力集中部近傍の残留応力が幅方向に広範囲に高くなることを明らかとした.その上で,熱弾塑性解析に基づく溶接残留応力のシュミレーションを行い,解析的にX線残留応力計測結果を概ね再現可能とした.今後は,残留応力のパラメータ解析により各種要因の検討を進めることが可能となった.3)素材疲労強度を加味した疲労強度向上効果の解明に向けて,提案したSBHS700の疲労限を加味したピーニング処理部の疲労強度評価を行い,既往の評価手法に比べてより高い精度により疲労強度を評価可能であることを明らかとした.本研究では,700MPa級の橋梁用高降伏点鋼板(SBHS700)を用いた溶接継手について,疲労強度評価,溶接部の金属組織の解析,破断部の切欠き感度の推定,溶接残留応力の評価を総合して,高強度鋼の“素材疲労強度"を加味した疲労強度向上メカニズムを解明する.H29年度の研究実績に示したように,各検討項目において下記のような進捗が得られており,想定通りの進捗が得られている.1)素材疲労強度に及ぼす切欠き感度の影響に対して,SBHS500とSBHS700の素材疲労強度を明らかにするとともに,その疲労限の提案のために,√areaパラメータモデルが適用可能であることを明らかとしている.今後,切り欠き感度を明らかとするための疲労試験を行う予定である.2)応力集中部近傍の溶接残留応力に関して,X線残留応力計測機により,応力集中部近傍の残留応力を明らかとするとともに,残留応力を変えた試験体の計測により試験体寸法の影響などについて明らかとした.今後は,結晶粒の影響などを反映する半価幅に基づき,溶接部周辺組織の解析を進める.3)素材疲労強度を加味した疲労強度向上効果の解明に向けて,提案したSBHS700の疲労限を加味したピーニング処理部の疲労強度評価を行い,本提案疲労限を用いて評価法の高度化を進めた.今後は,SBHS700の疲労試験結果に加えて,鋼材種類の差異を含む溶接部周辺のき裂発生位置を素材部とした疲労試験結果に対して,本評価手法の適用性を検討する.鋼橋への高強度鋼の適用は,軽量化や製作コスト低減など,極めて大きな効果が期待できるため,世界的に増加している.しかし,高強度鋼は切欠き感度が高いために,応力集中が起こる溶接部の疲労強度の確保が重要な課題である.本研究は,この課題の達成を目的とするもので,高強度鋼の“素材疲労強度"を合理的に加味した疲労強度向上法の提示を目的とする.以下に,H30年度の成果について示す.1)橋梁用降伏点鋼板の素材疲労強度に及ぼす応力集中の影響として,SBHS700を用いた突合せ溶接継手試験体(溶接余盛有)の疲労試験を行った.現在,余盛無とした突合せ溶接継手の疲労試験を継続して実施しており,SBHS700,500の母材疲労試験結果,並びに突合せ溶接継手試験体の結果を取りまとめて応力集中の影響,すなわち切り欠き感度について議論する.
ハンズフリー音声認識システムにおける反射音の有効利用の研究

本研究では、ハンズフリー音声認識システムの性能向上を目指して、低次の反射音を「雑音」として抑圧するのではなく「目的音」として有効利用できないかという着想に基づいた新しい反射音有効利用の枠組みの確立を目指して、科学研究費補助金交付期間内に次の点を明らかにすることを計画している。1.ハンズフリー音声受音・認識システムに適した反射音・残響に関する新たな尺度の提案2.1.の尺度に基づく、音声認識時に有効利用可能な反射音と残響分別の枠組みの確立3.1.の尺度に基づく、反射音を有効利用したハンズフリー音声認識システムの構築4.直接音レス環境(直接音受音不可環境)における反射音を用いたハンズフリー音声認識システムの構築昨年度までの研究成果により、室内音響指標IS03382に基づく「2点間信号減衰量」はハンズフリー音声認識性能と相関が高いことに着目し、室内音響指標IS03382を用いて音声認識時に有効利用可能な初期の反射音と抑圧すべき後続の残響音との最適な分離時間が25ms-30ms程度であることを確認した。そこで本年度は昨年度までの研究成果をもとに、残響時間と室内音響指標IS03382を用いてハンズフリー音声音声認識性能の推定を試みた。この試みにより、直接音レス環境を含めて音源とマイクロホン間の伝達関数さえ事前に把握することができれば、高精度にハンズフリー音声認識性能を推定できることが明らかとなった。この研究成果により、あらゆる環境でハンズフリー音声認識性能を簡潔に把握できることから、さまざまな音声認識アプリケーションのフィールドテストなどに役立つと期待している。1.ハンズフリー音声受音・認識システムに適した反射音・残響に関する新たな尺度の提案2.1.の尺度に基づく、音声認識時に有効利用可能な反射音と残響分別の枠組みの確立3.1.の尺度に基づく、反射音を有効利用したハンズフリー音声認識システムの構築4.直接音レス環境(直接音受音不可環境)における反射音を用いたハンズフリー音声認識システムの構築本年度は初期反射音と後続残響音の音声認識性能に与える影響について調査を行った。その結果、人類は初期の大きな反射音は受聴の助けとなる先行研究に対し、本研究では音声認識システムでは初期の反射音も性能の劣化を引き起こす原因になることが明らかとなった。さらに、上記1.の枠組みの確立を目指して、ハンズフリー音声受音・認識システムにおける発話者から受音点までの「2点間信号減衰量」に基づく残響尺度の検討を行った。今回残響尺度として室内音響指標ISO3382に注目して、音声認識性能との関係を調査した。その結果、室内音響指標ISO3382を用いれば、同一環境においては「2点間信号減衰量」から音声認識性能を良好に推定できることがわかった。本研究により、残響環境下における音声認識性能の自動推定の可能性を示すことができた。本年度の研究成果として学術雑誌論文1件、国際会議3件の採録を得た。来年度は引き続き反射音・残響に関する新たな尺度の提案を模索するだけでなく、反射音の積極的な有効利用方法について検討を進める計画である。本研究では、ハンズフリー音声認識システムの性能向上を`目指して、低次の反射音を「雑音」として抑圧するのではなく「目的音」として有効利用できないかという着想に基づいた新しい反射音有効利用の枠組みの確立を目指して、科学研究費補助金交付期間内に次の点を明らかにすることを計画している。1.ハンズフリー音声受音・認識システムに適した反射音。残響に関する新たな尺度の提案2.1.の尺度に基づく、音声認識時に有効利用可能な反射音と残響分別の枠組みの確立3.1.の尺度に基づく、反射音を有効利用したハンズフリー音声認識システムの構築4.直接音レス環境(直接音受音不可環境)における反射音を用いたハンズフリー音声認識システムの構築昨年度の研究成果により、室内音響指標ISO3382に基づく「2点間信号減衰量」はハンズフリー音声認識性能と相関が高いことが明らかとなった。そこで本年度は、室内音響指標ISO3382に着目して、音声認識時に有効利用可能な初期の反射音と抑圧すべき後続の残響音との最適な分離時間の検討を行った。室内音響指標IS03382における「音の透明性C値」と「音の明確性D値」を用いた評価実験の結果、直接音到着後25ms30ms以上遅れて到来する反射音については音声認識性能の劣化につながることが明らかとなった。本研究により、直接音到着後25ms30m以内に到来する反射音については有効利用できる可能性を示すことができた。来年度は本年度の成果に基づき、反射音の積極的な有効利用方法および直接音レス環境(直接音受音不可環境)における反射音を用いたハンズフリー音声認識システムについて検討を進める計画である。

1.ハンズフリー音声受音・認識システムに適した反射音・残響に関する新たな尺度の提案2.1.の尺度に基づく、音声認識時に有効利用可能な反射音と残響分別の枠組みの確立3.1.の尺度に基づく、反射音を有効利用したハンズフリー音声認識システムの構築4.直接音レス環境(直接音受音不可環境)における反射音を用いたハンズフリー音声認識システムの構築昨年度までの研究成果により、室内音響指標IS03382に基づく「2点間信号減衰量」はハンズフリー音声認識性能と相関が高いことに着目し、室内音響指標IS03382を用いて音声認識時に有効利用可能な初期の反射音と抑圧すべき後続の残響音との最適な分離時間が25ms-30ms程度であることを確認した。そこで本年度は昨年度までの研究成果をもとに、残響時間と室内音響指標IS03382を用いてハンズフリー音声音声認識性能の推定を試みた。この試みにより、直接音レス環境を含めて音源とマイクロホン間の伝達関数さえ事前に把握することができれば、高精度にハンズフリー音声認識性能を推定できることが明らかとなった。この研究成果により、あらゆる環境でハンズフリー音声認識性能を簡潔に把握できることから、さまざまな音声認識アプリケーションのフィールドテストなどに役立つと期待している。
運動負荷やNSAIDsの服用による食物抗原の吸収と食物アレルギー発症への影響解析

本研究では、食物アレルゲンの消化管吸収と感作におよぼす運動負荷とアスピリンの影響について解明することを試みた。その結果、アレルゲンに感作した際には正常時よりもアレルゲンの吸収が増加し、アスピリンを処置した時には細胞間隙輸送を介した吸収がさらに増加することで、重篤なアナフィラキシー症状が惹起されルことを明らかにした。一方で、クロモグリク酸ナトリウムはマスト細胞依存的なアレルゲンの吸収を抑制し、アレルギー症状の誘発を抑制することが示された。さらに、アスピリンは臨床投与量で食物アレルゲンの感作を増加させた。これらの結果は、FDEIAの病態解明や新たな予防法・治療法の開発につながるものと期待される。H26年度は、食物アレルゲンのモデルとして卵白アルブミン(OVA)を用い、OVAの消化管吸収特性を明らかにするとともに、OVAの消化管吸収と経口感作能におよぼすアスピリンの影響についてラットで検討した。OVA感作ラットに、OVAと細胞間隙輸送マーカーであるFD-40の混合液を経口投与した場合、それらの吸収はいずれも非感作ラットより高く、アスピリンを処置することでさらに高い吸収を示した。一方、OVAやFD-40の吸収はマスト細胞の脱顆粒を抑制するクロモグリク酸ナトリウムを処置することにより用量依存的に低下し、高用量(100 mg/kg)のクロモグリク酸ナトリウム投与時には非感作ラットで認められた吸収と同程度まで低下した。このことから、感作ラットでは細胞間隙輸送などの非特異的な吸収経路の増加によりOVAやFD-40の吸収が促進され、それらの吸収増加にマスト細胞の脱顆粒が関与する可能性が考えられた。また、OVAを高用量のアスピリンと共に週3回、8週間経口投与したラットでは、アスピリンを処置していない群に比べて、血漿中のOVA特異的IgE抗体価やIgG1抗体価が有意に増加した。一方、低用量のアスピリン処置群においては、コントロール群と比べて有意な変化は見られなかった。以上の結果から、高用量のアスピリンはOVAの経口感作能を増強する可能性が示された。今後、経口感作能が血中濃度の上昇と関連するのかについても明らかにしていきたい。運動負荷やアスピリン(ASP)などの非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)の服用は食物アレルゲンの消化管吸収を増加させ、食物依存性運動誘発アナフィラキシー(FDEIA)の症状を誘発する。しかし、これらの因子がどのように食物アレルゲンの消化管吸収を増加させるのかは明らかでない。また、運動負荷やNSAIDsによる食物アレルゲンの吸収増加はアレルギー感作率を増強させることが予測されるが、そのような報告はない。本研究では、食物アレルゲン(卵白アルブミン、OVA)の消化管吸収と感作におよぼす運動負荷とASPの影響について解明することを試みた。非感作ラットの消化管におけるOVAの吸収特性について検討した結果、OVAの吸収にクラスリン介在性エンドサイトーシスと細胞間隙輸送が関与することが明らかとなった。また、ASPはOVAの細胞間隙輸送を増加させることにより、消化管吸収を増加させることが明らかとなった。感作ラットを用いた検討により、OVAに感作した際には非感作時よりも細胞間隙を介したOVAの消化管吸収が増加すること、ASP処置時にはOVAの細胞間隙輸送がさらに増加し、より重篤なアナフィラキシー症状を惹起することが明らかとなった。一方、クロモグリク酸ナトリウムを処置した際にはOVAの吸収や症状の誘発が抑制されることから、OVA吸収の増加にマスト細胞が関与することが示唆された。さらに、OVA経口感作モデルにおいて、ASPを処置した群ではコントロール群と比べ、高いOVA特異的IgE抗体価を示した。以上の結果は、ASPが臨床的に服用する量でOVAの消化管吸収を増加させ、かつOVAの経口感作を増加させることを示すものである。今後、運動負荷による影響についても解明したいと考えている。これらの結果は、FDEIAの病態解明や予防法・治療法の開発に有用な知見となると考える。当初の研究目的であった食物アレルゲンである卵白アルブミン(OVA)の消化管吸収機構とアスピリンによる吸収増加機構の解明、経口感作能への影響についての検討はおおむね順調に遂行できている。今後、OVAの吸収に及ぼす運動負荷の影響についても合わせて検討する予定である。医療薬学H27年度は、卵白アルブミンの消化管吸収におよぼす運動負荷の影響について検討するとともに、その機構を明らかにする予定である。物品費の見積ミスによる。翌年度に申請した物品費に対する予算と合算して使用する。
出血性ショックにおけるアポトーシス発現と高張食塩液の免疫賦活作用に関する研究

出血性ショック後の免疫抑制状態にCD4^+CD25^+制御性T細胞が胸腺および脾臓でどの程度変化しているか、またアポトーシスが関与しているかを検討した。C57BL6/Jマウスを用いて全身麻酔下に左大腿動脈にPE10のカテーテルを挿入し、ヘパリン100U/Kgを投与後脱血し血圧を40±5mmHgに60分保つ。蘇生液として4ml/Kgの7.5%NaClとSB (Shed blood:脱血血液); HS群と脱血血液の2倍量のラクテートリンゲル液と脱血血液;2LR群を作製し、無処置のControl群とHS群と2LR群の蘇生後2h,6h,24h,48hの時点でのCD4^+CD25^+制御性T細胞と24h,48hの時点での制御性T細胞に特異的なCD4^+CD25^+Foxp3の脾臓及び胸腺での蘇生後の変化を検討した。CD4^CD25^+制御性T細胞は脾臓において6h,24h,48h時点でコントロール群と比較して有意に増加した。CD4^+CD25^+制御性T細胞のアポトーシスは脾臓において48h時点でコントロール群と比較して有意に増加した。これらのHS群と2LR群間には有意差は認められなかった。胸腺においては24h時点のHS群でCD4^+CD25^+制御性T細胞が増強したが、アポトーシス発現の変化は認めなかった。CD4^+CD25^+Foxp3は脾臓、胸腺の24h,48h時点においてコントロール群と比較して有意に増加したが、HS群と2LR群間では有意差を認めなかった。CD4^+CD25^+制御性T細胞は出血性ショック後の免疫抑制に関与していたが、高張食塩液投与(HS)は制御性T細胞を介する免疫抑制には関与していなかった。マウスの出血性ショックモデルとして、左大腿動脈よりカテーテルを挿入し、ヘパリン投与後脱血して血圧を40mmHgに90分保つ。蘇生方法として、高張食塩液(HS:7.5% NaCl)を4ml/kgと脱血血液で蘇生した場合:HS+SBと2LR+SB(2倍量の脱血血液量のラクテックリンゲル液と脱血血液)とSham群とコントロール群での、小腸での障害とアポトーシス発現との関係を蘇生後2h,6h,24h,48hで観察した。小腸障害は2LR+SB蘇生群の6hの時点で他の群に比較して有意に小腸の絨毛の基底部に最も強く空胞化が出現し、また同時期にHS+SB 6h群は2LR+SB 6h群よりも有意に障害の程度が抑制されていた。一方、アポトーシス発現をTUNEL法で検索すると、アポトーシスの発現は絨毛の上皮よりむしろ基底部に多く出現し、2LR+SB群の2hの時点で最も強く出現していた。同時期のHS+SB 2h群は2LR+SB 2h群よりも有意に抑制されていた。これらを肝臓、脾臓、胸腺で調べると小腸と同様に出血性ショック2h後の時点でアポトーシス発現が見られ、高張食塩液群でアポトーシス発現が抑制されていた。脾臓、胸腺などの免疫関係臓器においても、アポトーシス発現が抑制されていることから、他の報告でもみられている様に、免疫賦活的に作用していることが強く推察されるので、アポトーシスとの関連を検索しているところである。

小腸では蛋白修復機能を持つ分子シャペロンのHSP40,HSP70は高張食塩液投与により増強しており、出血性ショック後の臓器障害防御効果に関与している可能性が示唆された。今後、アポトーシス発現及び抑制のメカニズムを解析することにより、出血性ショックなどの後に続発する臓器障害の防御に役立つものと思われる。出血性ショックモデルとして、812週齢のBALB/cマウスを用いで全身麻酔下に左大腿動脈よりPE10のカテーテルを挿入し、ヘパリン100U/Kgを投与後脱血して血圧を40±5mmHgに90分保つ。蘇生方法として、高張食塩液(HS:7.5%NaGl)を4ml/kgと脱血血液で蘇生した場合;HS+SBと2LR+SB(2倍量の脱血血液量のラクテックリンゲル液と脱血血液)とSham群とコントロール群での、胸腺と脾臓でのアポトーシス発現を2h,6h,24h,48hで観察した。アポトーシス関連蛋白での関係は蘇生後1h,2h,6h,24h,48hで観察した。アポトーシス発現をTUNEL法で検索すると、アポトーシスの発現は胸腺、脾臓ともに2LR+SB群の2hの時点で最も強く出現していた。同時期のHS+SB2h群は2LR+SB2h群よりも有意に抑制されでいた(P<0.05)。アポトーシス関連蛋白を検索のためにHSP70で免疫沈降すると、Apaf-1,p53が胸腺ではHS2hが2LR2hよりも増強し、脾臓では2LR2hがHS2hよりもp53,Apaf-1ともに増強していた。一方、JNKは脾臓、胸腺ともにHSP70免疫沈降後では変化を認めなかった。胸腺と脾臓ではアポトーシス関連蛋白の反応が違うと考えられ、これらが出血性ショック後の免疫抑制に関与しでいる可能性が示唆された。出血性ショック後の免疫抑制状態にCD4^+CD25^+制御性T細胞が胸腺および脾臓でどの程度変化しているか、またアポトーシスが関与しているかを検討した。C57BL6/Jマウスを用いて全身麻酔下に左大腿動脈にPE10のカテーテルを挿入し、ヘパリン100U/Kgを投与後脱血し血圧を40±5mHgに60分保つ。蘇生液として4ml/Kgの75%NaClとSB(Shed blood:脱血血液);HS群と脱血血液の2倍量のラクテートリンゲル液と脱血血液;2LR群を作製し、無処置のControl群とHS群と2LR群の蘇生後2h,6h,24h,48hの日寺点でのCD4^+CD25^+制御性T細胞と24h,48hの時点での制御性T細胞に特異的なCD4^+CD25^+Foxp3の脾臓及び胸腺での蘇生後の変化を検討した。CD4^+CD25^+制御性T細胞は脾臓において6h,24h,48h時点でコントロール群と比較して有意に増加した。CD4^+CD25^+制御性T細胞のアポトーシスは脾臓において48h時点でコントロール群と比較して有意に増加した。これらのHS群と2LR群間には有意差は認められなかった。胸腺においては24h時点のHS群でCD4^+CD25^+制御性T細胞が増強したが、アポトーシス発現の変化は認めなかった。CD4^+CD25^+Foxp3は脾臓、胸腺の24h,48h時点においてコントロール群と比較して有意に増加したが、HS群と2LR群間では有意差を認めなかった。CD4^+CD25^+制御性T細胞は出血性ショック後の免疫抑制に関与していたが、高張食塩液投与(HS)は制御性T細胞を介する免疫抑制には関与していなかった。
風食発生の指標となるごく薄い地表面の土壌水分モデルの開発

砂塵は,土の粒に働く力の釣り合いに起因して地表から離脱した土の粒が,浮遊(飛遊)する現象である。この飛遊する土の粒に働く力のうち,重力による下向きの力は土の粒の飛遊を抑制するため、土の粒の質量が大きいことは砂塵の発生を抑制する因子である。しかし砂塵になる土の粒は、微細であっても団粒や単粒を含んでおり,密度は単なる土粒子密度とは異なることが容易に推察される。「風食発生の指標となるごく薄い地表面の土壌水分モデルの開発」の1年目である2018年度は団粒で内部に空隙を有する土の粒の密度の算出方法を開発した。以下、土の粒は「土粒」と記す。まず土粒は、粒径画分ごとに均一の粒径の球と仮定し,単純立方体型充填を仮定した。単純立方体型の充填モデルでは,土の体積Vに占める土粒の体積は土粒子の体積Vsと土粒内部の空隙の体積Vwiの合計の割合kは一定で0.524とる。したがって土の体積Vに占める土粒の外部の空隙の体積Vwoの割合は0.476となる。この関係を採用すると、土粒密度ρpは、であらわされた。球体の単純立方体型充填と同粒径の球体を円筒に充填する場合では,土粒体積:容器体積は同値にはならないが,簡単化のための同値と仮定した。算出された土粒密度は土粒径2.00.074mmの範囲で,1.631.74g/cm3であった。これは土粒内部が飽和した飽和土粒の密度で,土粒内部の水分を除去した乾燥土粒密度は1.271.35g/cm3であった。飽和土粒密度は,粒径が小さくなると大きくなる傾向があったが,乾燥土粒密度にその傾向は認められなかった。以上から,乾燥土粒の1cm3当たりの質量は,飽和土粒より0.3g程度低下することがわかった。これが,土粒が乾燥すると砂塵として地表面を離脱しやすくなることに関与していると考えられる。「風食発生の指標となるごく薄い地表面の土壌水分モデルの開発」の1年目である2018年度に団粒の内部に空隙を有する土の粒の密度の算出方法を整理した。当初、風食発生の指標となる地表面のごく薄い土層の土壌水分量を明らかにすることを目的として本研究が始まったが、地表面を構成する最小単位である土粒の密度を算出することができるようになったことで、開発目標の「ごく薄い」地表面の土壌水分モデルの開発のための初年度の計画は十分に達成された。しかしながら、土粒充填モデルとして、画分ごとの土粒は均一であること、球体の充填モデルに単純立方体型充填を採用していること、さらに実際の全体積Vの測定には円筒のメスシリンダを採用していることから、より精度の高い土粒密度の算出モデルに進歩させる必要がある。さらに2018年度は1種の土によって本研究が遂行されたが、土性の異なる数種の土壌試料に対して適用が広げられなければならない。2019年度以降、地表薄層に出入りする水の量的把握について検討を開始する。これは、前述のとおり地表面を構成する最小単位である土粒の密度ρpを求めるモデルが開発できたことを意味している。すでに周知の土粒子密度ρsとの関係においてρp/ρsが「土粒内部の固相率es」を表すころから、1-esは空隙率eを表し、これが土粒内部の最大含水率となる。したがって、力の釣り合いにおいて砂塵として飛遊しやすいかを決定する因子である土粒の質量は、このeの範囲で乾と湿の状態が変化することで特定される。2019年度は、土粒内部の空隙の水の比率の伴う蒸発の特徴、降雨、凝結ならびに昇華に伴う乾湿の変化モデルの開発を行う。

これは土粒内部が飽和した飽和土粒の密度で,土粒内部の水分を除去した乾燥土粒密度は1.271.35g/cm3であった。飽和土粒密度は,粒径が小さくなると大きくなる傾向があったが,乾燥土粒密度にその傾向は認められなかった。以上から,乾燥土粒の1cm3当たりの質量は,飽和土粒より0.3g程度低下することがわかった。これが,土粒が乾燥すると砂塵として地表面を離脱しやすくなることに関与していると考えられる。「風食発生の指標となるごく薄い地表面の土壌水分モデルの開発」の1年目である2018年度に団粒の内部に空隙を有する土の粒の密度の算出方法を整理した。当初、風食発生の指標となる地表面のごく薄い土層の土壌水分量を明らかにすることを目的として本研究が始まったが、地表面を構成する最小単位である土粒の密度を算出することができるようになったことで、開発目標の「ごく薄い」地表面の土壌水分モデルの開発のための初年度の計画は十分に達成された。しかしながら、土粒充填モデルとして、画分ごとの土粒は均一であること、球体の充填モデルに単純立方体型充填を採用していること、さらに実際の全体積Vの測定には円筒のメスシリンダを採用していることから、より精度の高い土粒密度の算出モデルに進歩させる必要がある。さらに2018年度は1種の土によって本研究が遂行されたが、土性の異なる数種の土壌試料に対して適用が広げられなければならない。2019年度以降、地表薄層に出入りする水の量的把握について検討を開始する。これは、前述のとおり地表面を構成する最小単位である土粒の密度ρpを求めるモデルが開発できたことを意味している。すでに周知の土粒子密度ρsとの関係においてρp/ρsが「土粒内部の固相率es」を表すころから、1-esは空隙率eを表し、これが土粒内部の最大含水率となる。したがって、力の釣り合いにおいて砂塵として飛遊しやすいかを決定する因子である土粒の質量は、このeの範囲で乾と湿の状態が変化することで特定される。2019年度は、土粒内部の空隙の水の比率の伴う蒸発の特徴、降雨、凝結ならびに昇華に伴う乾湿の変化モデルの開発を行う。土の体積を測定するために購入した10mLメスシリンダが、予定より安価に購入できたため123円の次年度使用額が生じた。2019年度には別の10mLメスシリンダを購入する必要があり、次年度使用額を2019年度の助成金に加えて使用する。
転写調節因子とDNAの相互作用の理論的解析

本研究課題の目的は,蛋白質がDNAに結合する過程に注目し,転写調節因子の一つであるCREBがDNAのCRE配列を認識し,結合する機構を理論的に明らかにすることである.更に,CRE配列に結合した後CREBがどの様な構造変化を起こしているのかについても知見を得る.【モデル】計算に使用したモデルは,CREBがCRE配列に結合した状態の3次元構造(PDB登録名:1DH3)データを用いた.この結晶データにはCREBとCREとの結合領域に水和したMg2+が存在している.このCREB,CRE配列(21塩基対),金属イオンの周りに水分子を配置した構造を元にして,次の3点について計算を行った.【結果】1)CREBはCRE配列以外のDNAに結合するのか?一般的に,CREBはDNAのどの様な配列にも結合すると言われている.CREBは特定のCRE配列を認識して結合するのか,そうではなくてDNA自体を認識してどんな配列にも結合するのかについてエネルギー面から検討した.その結果,CREBはDNAのCRE配列以外の場所にも結合し得ることが分かった.2)CRE配列以外にも結合できるなら,CREBはDNA上をスライドできるのか?CREBがDNA上をCRE配列方向へスライディングする可能性について,分子動力学計算により経時変化を観測した.CREBをCRE配列以外の場所に結合させて計算した結果,10ns程度の時間では有意な動きは観察できなかった.3)CREBのCRE配列結合後の動的構造変化分子動力学による計算結果,10ns程度の時間経過ではCREBとDNAには有意な動きは観測できなかった.以上のように,CREBがCRE配列を特異的に認識する様子は観測できなかった.これらの結果から,計算に考慮している観測時間が10nsのオーダーでは短過ぎることや,今回考慮しなかったピストンとの相互作用など他の要因が欠如していることが考えられる.現在,観測時間を100nsオーダー以上にするため計算を継続中である.本研究課題の目的は,蛋白質がDNAに結合する過程に注目し,転写調節因子の一つであるCREBがDNAのCRE配列を認識し,結合する機構を理論的に明らかにすることである.更に,CRE配列に結合した後CREBがどの様な構造変化を起こしているのかについても知見を得る.【モデル】計算に使用したモデルは,CREBがCRE配列に結合した状態の3次元構造(PDB登録名:1DH3)データを用いた.この結晶データにはCREBとCREとの結合領域に水和したMg2+が存在している.このCREB,CRE配列(21塩基対),金属イオンの周りに水分子を配置した構造を元にして,次の3点について計算を行った.【結果】1)CREBはCRE配列以外のDNAに結合するのか?一般的に,CREBはDNAのどの様な配列にも結合すると言われている.CREBは特定のCRE配列を認識して結合するのか,そうではなくてDNA自体を認識してどんな配列にも結合するのかについてエネルギー面から検討した.その結果,CREBはDNAのCRE配列以外の場所にも結合し得ることが分かった.2)CRE配列以外にも結合できるなら,CREBはDNA上をスライドできるのか?CREBがDNA上をCRE配列方向へスライディングする可能性について,分子動力学計算により経時変化を観測した.CREBをCRE配列以外の場所に結合させて計算した結果,10ns程度の時間では有意な動きは観察できなかった.3)CREBのCRE配列結合後の動的構造変化分子動力学による計算結果,10ns程度の時間経過ではCREBとDNAには有意な動きは観測できなかった.以上のように,CREBがCRE配列を特異的に認識する様子は観測できなかった.これらの結果から,計算に考慮している観測時間が10nsのオーダーでは短過ぎることや,今回考慮しなかったピストンとの相互作用など他の要因が欠如していることが考えられる.現在,観測時間を100nsオーダー以上にするため計算を継続中である.
機能性成分や生育阻害活性の網羅的分析によるアスパラガス未利用部位の利用価値の創出

アスパラガスは人気の野菜であり,健康に有益な機能性成分を多く含むものの,アスパラガスの生産現場では,未利用部位の産出量が多く,その処理が課題となっている.アスパラガスの未利用部位における有用成分資源としての利用の可能性を探るため,アスパラガスのそれぞれの部位について,2018年度は代表的な機能性成分であるルチンおよびプロトディオシンの分布を調べた.その結果,ルチンは擬葉に,プロトディオシンは鱗芽に最も多く含まれていた.ルチンは既報と同様,地上部に多い傾向であったが,地下部の貯蔵根の褐色根や表皮にも多く含まれていた.一方,プロトディオシンは地下部に多い傾向であったが,地上部の幼果や種子にも多く含まれていた.本研究の結果は,日本のアスパラガスの生産現場だけでなく,海外の生産現場でも急務の課題となっている連作障害の解決のため,アスパラガスの未利用部位における新たな利用価値の創出につなげられる可能性がある.特に擬葉や主茎などはルチンの供給源として,幼果や種子などはプロトディオシンの供給源として有効利用できる可能性がある.一方,アスパラガスの地下部において,プロトディオシンは鱗芽,若茎の土寄せ部分および地下茎に,ルチンは貯蔵根の褐色根や表皮に多く含まれ,機能性成分の供給源としてそれぞれが有効利用できる可能性があるものの,地下部を掘り上げる作業は手間がかかるため,掘り上げなどの方法を検討する必要があると考える.アスパラガスのそれぞれの部位について,2018年度は代表的な機能性成分であるルチンおよびプロトディオシンの分布を調べた.それらの研究成果について現在,学会誌に投稿し,審査中である.2019年度から行う予定の試験についても順調に準備が進んでいる.アスパラガスのそれぞれの部位について,現在,学会誌に投稿中の機能性成分のほか,生育阻害活性,無機成分およびバイオマスについても分析し,それぞれの関係を明らかにする.また,閉鎖型環境(植物工場)と露地栽培において,それぞれの成分および活性を比較検討し,アスパラガスの未利用部位における新たな利用価値の創出につなげる.現在,日本で栽培されるアスパラガスの品種は多様化していることから,今後は本研究で得られた知見を基に,ルチンおよびプロトディオシンの品種間差異を明らかにするとともに,機能性成分を高める栽培技術を検討し,アスパラガスの未利用部位の新たな利用方法を提案していきたい.アスパラガスは人気の野菜であり,健康に有益な機能性成分を多く含むものの,アスパラガスの生産現場では,未利用部位の産出量が多く,その処理が課題となっている.アスパラガスの未利用部位における有用成分資源としての利用の可能性を探るため,アスパラガスのそれぞれの部位について,2018年度は代表的な機能性成分であるルチンおよびプロトディオシンの分布を調べた.その結果,ルチンは擬葉に,プロトディオシンは鱗芽に最も多く含まれていた.ルチンは既報と同様,地上部に多い傾向であったが,地下部の貯蔵根の褐色根や表皮にも多く含まれていた.一方,プロトディオシンは地下部に多い傾向であったが,地上部の幼果や種子にも多く含まれていた.本研究の結果は,日本のアスパラガスの生産現場だけでなく,海外の生産現場でも急務の課題となっている連作障害の解決のため,アスパラガスの未利用部位における新たな利用価値の創出につなげられる可能性がある.特に擬葉や主茎などはルチンの供給源として,幼果や種子などはプロトディオシンの供給源として有効利用できる可能性がある.一方,アスパラガスの地下部において,プロトディオシンは鱗芽,若茎の土寄せ部分および地下茎に,ルチンは貯蔵根の褐色根や表皮に多く含まれ,機能性成分の供給源としてそれぞれが有効利用できる可能性があるものの,地下部を掘り上げる作業は手間がかかるため,掘り上げなどの方法を検討する必要があると考える.アスパラガスのそれぞれの部位について,2018年度は代表的な機能性成分であるルチンおよびプロトディオシンの分布を調べた.それらの研究成果について現在,学会誌に投稿し,審査中である.2019年度から行う予定の試験についても順調に準備が進んでいる.アスパラガスのそれぞれの部位について,現在,学会誌に投稿中の機能性成分のほか,生育阻害活性,無機成分およびバイオマスについても分析し,それぞれの関係を明らかにする.また,閉鎖型環境(植物工場)と露地栽培において,それぞれの成分および活性を比較検討し,アスパラガスの未利用部位における新たな利用価値の創出につなげる.現在,日本で栽培されるアスパラガスの品種は多様化していることから,今後は本研究で得られた知見を基に,ルチンおよびプロトディオシンの品種間差異を明らかにするとともに,機能性成分を高める栽培技術を検討し,アスパラガスの未利用部位の新たな利用方法を提案していきたい.2018年度は研究初年度であり,研究は順調に進んでいるものの,学会参加および論文投稿は2019年以降を中心に行う.現在,論文を学会誌投稿中であり,採択されれば掲載費が必要となる.また,2018年度は大学内で試験(分析)可能であったが,2019年度からは閉鎖型環境(植物工場)における栽培が大学外で始まるため,その出張旅費などに研究が必要となる。
CAMP依存性蛋白質リン酸化反応によるカルシウム情報伝達の制御機構

cAMPはカルシウムイオンと共に重要な細胞内情報伝達物質であり、広範な細胞機能を調節している。細胞の刺激応答の発現においてcAMP系とカルシウム系は相互に作用しながら、精密な調節をしていると考えられている。しかしながら、これらの相互作用の分子機構については不明であるのが現状である。最近、平滑筋のミオシン軽鎖リン酸化酵素は、cAMP依存性にリン酸化されるとカルシウム-カルモデュリン複合体との親和性が減弱することや、心筋小胞体カルシウム輸送ATPaseの調節蛋白質であるホスホランバンはcAMP依存性蛋白質リン酸化酵素(Aキナ-ゼ)、カルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素及び、プロテインキナ-ゼC(Cキナ-ゼ)によってリン酸化され、その結果小胞体へのカルシウム輸送が促進されることが報告されている。しかしながら、cAMP系とカルシウム系の相互作用を完全に理解するには至っていない。そこで申請者は、平滑筋及び非筋細胞からカルモデュリン結合蛋白質を調製し、これらの蛋白質のAクナ-ゼ及びCキナ-ゼによるリン酸化反応を検討したところ分子量3.5万のカルポニンがこの2つのキナ-ゼによりリン酸化されることが明らかとなった。カルポニンは、平滑筋や非筋細胞に多量に存在し、トロポミオシンやアクチンとも結合することが明らかにされている。そこで、平滑筋からカルポニンを精製し、2種類のキン-ゼによるリン酸化反応を詳細に検討したところ、Aキナ-ゼよりCキナ-ゼの方がよくリン酸化し少なくとも1モルpi/カルポニン1モルのリン酸化反応が認められた。さらにこれらのリン酸化反応はカルモデュリンによって抑制されてることが判明した。これらの結果は、細胞内のカルシウムイオンにより調節されている平滑筋や非筋細胞のアクトミオシン系がカルポニンを通じてCキナ-ゼによっても調節されていることが明らかになった。
脳卒中予防医療におけるドック診療と外来診療の看護活動連携プログラムの構築

本研究は、無症候性脳血管障害患者のQOL支援する包括的看護活動の探求を目的とした。方法1は、未破裂脳動脈瘤で自然経過観察患者の生活体験に注目した。その結果、『動脈瘤を忘れる』『生活を変えない』『病気ではない』という認識の一方で、患者の背景ごとに特有な体験も明らかになった。方法2は、脳卒中看護に関わる看護師91名に質問紙調査を実施した。看護師は未破裂脳動脈瘤の発見を良い傾向と認識し、自然経過観察患者の「心理的サポート」「生活改善」に関心が高いことが分かった。結果より、看護師と患者の認識には若干の乖離を認めた。今後は看護プログラムの個別化や医療と患者のつながりを維持するシステムの検討が示唆された。平成22年度の研究課題は、無症候性脳血管障害患者(以下、無症候患者とする)や脳ドック健診を考える健診者、そして、健診や無症候患者に対する看護活動に携わる看護師達の情報源となるWebサイトの開設である。開設に当たっては、サイトの趣旨を再確認し、構成するコンテンツの検討を入念に議論した。サイト内は大きく分けて情報発信ページと情報を吸い上げる伝言板ページで構成した。情報発信では、サイトの趣旨に賛同する脳外科医の協力を得て、無症候脳血管障害を医学的観点から分かりやすく説明する。無症候だからこそQOLを落とさない医療が求められることから「QOLとは・・・・」を考える、といったメインコンテンツを配置した。そして下位ページには、無症候性患者の体験談を許可を得た上でできるだけリアルな語りの内容のまま変化させずに掲載した。また、脳ドックに関する情報や脳ドック健診者の健康観や脳疾患に対する認識に関する調査結果を掲載、さらに、脳ドックでの看護活動に関する実態調査結果、看護師への聞き取り得られたインタビュー内容を許可の上、掲載した。このように多面的でより現実的な情報を発信するサイトであると考える。情報吸収する伝言板ページは、今後研究的観点でのデータ収集の入り口と考えるが、アクセス状況などを見極め、今後具体的な研究支援システムへの移行・修正も考えている。来年度は、本サイトから情報を発信していくことでユーザーのニーズに応える一方で、無症候性患者の生活実態やQOLに関連する研究課題や看護活動のネットワーク強化に関連する研究のデータ収集を検討していく。(サイト名称:無症候Know-netURL:http://musyoukou.jpサブ名称:無症候性脳血管障害の情報ステーション平成23年4月11日(月)オープン予定)(平成23年度の重点目標)平成23年度の研究活動の主たる目的は、無症候患者脳血管障害患者(無症候性患者)のネットワークをはかり、無症候性患者の研究参加によるデータ収集から無症候性患者の健康生活の質(QOL)を明らかにすることであった。(研究データ収集・分析)当初の予測ほどWebサイトからのネットワークは広がりにくい状況であった。そのため病院施設の協力の基に研究協力患者からのデータ収集を実施した。現在までに8名の研究対象者からの聞き取りを完了している。逐語録データの分析は現在進行中である。データの特徴に偏りがあり(年齢70歳以上・女性・自然経過観察)今後は、多様な治癒方針の患者からのデータ収集に努力する必要がある。また、1事例ではあるが、脳出血の経験から経過観察中の検査で未破裂脳動脈瘤(2個)の診断を受け患者の体験に遭遇した。2重の脳疾患と戦う患者の体験はこれまでの患者とは幾分違いがあると思われた。近々に分析が完了するため、この事例に関しては、平成24年10月「脳神経看護研究学会」での発表を予定している。今後も随時、分析の洗練に努める必要がある。(今後の方向性)(1)無症候性患者のデータ収集・分析の継続。対象者の特性にバリエーションが出るように選出する。(2)Webサイトの構成の見直し。脳卒中予防看護も含めて脳卒中ケアの枠組みを検討する。無症候性患者のデータの更新を検討する。(3)看護活動システム構築に向けて現在脳卒中看護の前線にいる脳卒中リハビリテーション看護認定看護師を連携研究者に含み、脳卒中予防医療における看護活動の実践を具体的に検討する。平成25年度の研究活動は、脳卒中医療に関わる看護師の看護活動の検討を中心に実施した。現在、無症候性脳血管障害患者(以下、無症候性患者)の看護は、脳卒中リハビリテーション看護認定看護師(以下、認定看護師)と脳神経外科病棟やSCU(Stroke Care Unit)に勤務する者である。したがって、本調査は広く脳卒中ケアに携わっている看護師92名に実施し、59名からの有効回答を分析対象とした。

調査の結果、無症候性患者と関わった経験は76.3%。無症状での病変の発見は患者にとってラッキーであり、良い傾向と受けとめている看護師は74.6%。しかし、良い傾向とした看護師は自然経過観察を選択した患者への心理的サポートに関心が高く(p<.05)、経験が長いほどその傾向が強かった(p<.01)。看護活動の関心事は、自然経過観察の場合、「心理的サポート」「発症時(破裂時)の救急対処」「脳卒中予防への生活改善」「血圧の自己管理」「自覚症状への注意」の順で、予防的手術の場合、「後遺症出現時の精神的ケア」「後遺症出現時の身体的ケア」「急性期の看護」「術後の脳卒中再発への注意・生活指導」の順となった。看護活動の連携は、精神的サポート、後遺症を残した患者・家族のサポート、定期健診や生活指導、無症候性患者のネットワークの充実など、活動の必要性が確認された。特に、自然経過観察患者は増加しているため、外来看護でのフォローやその後の社会生活のフォローが必要であり、予防的手術患者には、急性期看護に続き、回復期、後遺症を抱え社会生活の支援など看護活動は多岐に渡ることが確認された。その場合、在宅看護を巻き込み、コメディカルとの連携も必要である。特に自然経過観察患者の看護活動に関して、その必要性が大きいことも示唆され、外来と在宅看護の連携プログラムの提案が求められる。引き続き、脳卒中ケア研究会を活用し、調査を継続する。平成24年度の研究活動目標は、1無症候性未破裂脳動脈瘤患者で自然経過観察を選択した者に関する調査、及び2脳卒中医療に関わる看護師の看護実践の現状把握であった。1に関しては、対象者を自然経過観察ケースに絞り調査を実施した。その結果、70歳以上の高齢者に自然経過観察の選択が多い傾向が見られた。さらに本年度の対象者の中で、脳卒中の体験に加え、未破裂脳動脈瘤の発見という重複した脳疾患を持つケースが見られた。無症候性脳血管障害は脳ドック健診だけでなく、脳卒中後のfollow upの脳検査の際に偶発的に発見される場合もある。本調査では、脳卒中と未破裂脳動脈瘤という2重の脳疾患を抱える患者の体験を記述できた。この体験は、すでに脳卒中の後遺症のために「他者にはわかりにくい後遺症との闘い」の中で「自己と他者へのいらだちと我慢」の生活を過ごしながら、脳動脈瘤の存在は「自分の中にある爆弾への関心」として脳卒中の記憶を呼び起こし、再発への恐怖となっていた。しかし、脳動脈瘤への関心や脳卒中への恐怖は常にではなく身体の不調を自覚すると意識化される感情であった。つまり、動脈瘤は無症候であるために、現実的な後遺症との日々が意識の多くを占めていることが分かった。「動脈瘤への関心の薄れ」は、突然の発症への対応に影響する可能性が示唆された。2に関しては、23年4月に開設した関連Webサイト「無症候Know-net」を通じて看護活動の現状の情報収集拡充のためにサイトのリニュアル(URL:http://www.strokecare-net.jp/)を図り、平成25年3月現在で研究会登録30名を確認している。サイトへのアクセスも4000件を超えた。今後も登録者からの情報収集を計画し、看護実践活動の方向性を探求していく。無症候性患者からのデータ収集は現在までに8名である。
「ケインズ革命」の理論史的ならびに政策論史的視座からの研究

本年度は「ケインズの理論的変遷過程-その1.ケインズ関連文書の検討を中心として」を研究テーマとして掲げたのであるが、その研究実績は以下のとおりである。第1は、Rymes,Keynes's Lectures;1932-35,Macmillan,1989の翻訳作業である。これは『ケインズの講義:1932-35年』(東洋経済新報社)と題して7月に刊行した。この作業にさいして著者との綿密な打合せを行うとともに、関連する重要資料Keynes's Lectures,1932-35をCarleton大学から取り寄せて検討した。これらを通じてこれまで知りえなかった貴重な事実(例えば、1933年、1934年におけるケインズの体系だった理論展開とか、流動性選好説の具体的展開等)が明らかとなった。そしてこの点を中心にして論文「ケインズの講義録(1932-35年)の検討」を発表した。第2は、『市場社会の検証』(ミネルヴァ書房)の編集である。ここでは全体の編集以外に、序章(2名で分担)および第9章「ケンブリッジ学派における二つの流れとケインズ革命」を執筆した(7月に刊行)。第3は、『ケインズ全集』第27巻『戦後世界の形成-雇用と商品』(東洋経済新報社。現在、初校ゲラ段階)の翻訳作業である。同書は「商品」政策や「雇用」問題をめぐる晩年のケインズの取組を理解するうえできわめて貴重な資料であることを、改めて確認することができた。なおこれに関連して論文「国際主義とナショナリズムの相剋」および「価格の安定化をめざして」(未発表)を執筆した。第4は、拙著『ケインズ研究』(東大出版会、1987年)を英訳したものを、本年度にリリースされたKeynes's Papers(マイクロフィルム)、当該分野での最新の研究動向、ならびにその後研究を加えてきた「ヴィクセル・コネクション」などを組み入れつつ、大幅に改訂する作業である(横80桁×縦35行換算で535ページを執筆済み。最終的には650ページを予定している)。
唾液腺癌浸潤増殖による間質改造現象における基底膜分子とその分解酵素群の動態

本年度は以下の実験をおこない、培養唾液腺腺様嚢胞癌細胞が自ら基底膜分子を生合成して細胞外に沈着し、かつ自身の分解酵素によってこれを改造していることを示唆する所見をみいだした。(1)細胞培養:ヒト腺様嚢胞癌由来株細胞ACC2及びACC3を35mmペトリ皿または24穴マイクロプレート上で単層培養し、^<35>S-硫酸と^3H-ロイシンによる標識を行った。(2)免疫染色:単層培養細胞は、培養開始後24時間毎に固定し、免疫染色をおこなった。培養細胞は同様に固定後、ショ糖氷晶防止処理後、凍結超薄切片も作製した。切片はI型コラゲンと四種の基底膜分子:IV型コラゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンのウサギ抗体と、ヘパリチナーゼ、ヘパラナーゼ、カテプシンD、コラゲナーゼ(MMP9)のマウス抗体,さらにコロイド金またはロ-ダミン標識二次抗体を用いて染色をおこなった。(3)共焦点レーザ顕微鏡による観察:前記2)のとおりに作製された標本を共焦点レーザ顕微鏡で、断層影像を三次元再構築し、立体的に細胞内外の分子移動を観察した。細胞内での基底膜分子の生合成開始と同時に細胞質内に酵素の発現がみられ、基底膜分子の細胞外沈着開始後に酵素群も細胞外空間に放出されていることが確認された。(4)凍結超薄切片法による免疫電顕的観察:前記2)のとおり氷晶防止された試料は、超低温凍結固定し、凍結超ミクロトームで凍結切片を作製し、間接金コロイド法で免疫染色、電子顕微鏡で観察した。細胞内小胞に基底膜分子と酵素が局在することが判明した。小胞は合成から分泌までの経過にあるものと、細胞外の基質分子が飲み込まれたのち、分解過程にあるものがみいだされた。いずれの過程でも多胞小体、水解小体が関与するようであることが判明した。(5)細胞ならびに培地中基底膜分子分解産物の追跡:免疫染色の標本採取時期に準じて、細胞と培地をそれぞれ採取し、各抗体をもちいて免疫沈降反応によって回収し、電気泳動後フルオログラフィによって可視化した。培地中には、標識後3時間でヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質に相当する蛋白質と、約300kDaのその分解物と考えられるペプチドが出現した。これは硫酸基を有していなかった。また、培地及び細胞可溶化物のゼラチンザイモグラフィによってMMP2およびMMP9がACC3細胞から放出されていることが判明した。本年度はつぎの実験をおこない、培養唾液腺腺様嚢胞癌細胞が自ら基底膜分子を生合成して細胞外に沈着し、かつ自身の分解酵素によってこれを改造していることが判明した。

(1)細胞培養:ヒト腺様嚢胞癌由来株細胞ACC2及びACC3を35mmペトリ皿または24穴マイクロプレート上で単層培養し、^<35>S-硫酸、^<35>S-メチオニン、^3H-ロイシンによる標識を行った。(2)免疫染色:単層培養細胞は、培養開始後24時間毎に固定し、免疫染色をおこなった。培養細胞は同様に固定後、ショ糖氷晶防止処理後、冷結超薄切片も作製した。切片はI型コラゲンと四種の基底膜分子:IV型コラゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンのウサギ抗体と、ヘパリチナーゼ、ヘパラナーゼ、カテプシンD、コラゲナーゼ(MMP9)のマウス抗体,さらにコロイド金またはロ-ダミン標識二次抗体を用いて染色をおこなった。(3)共焦点レーザ顕微鏡による観察:前記2)のとおりに作製された標本を共焦点レーザ顕微鏡で、断層影像を三次元再構築し、立体的に細胞内外の分子移動を観察した。細胞内での基底膜分子の生合成開始と同時に細胞質内に酵素の発現がみられ、基底膜分子の細胞外沈着開始後に酵素群も細胞外空間に放出されていることが確認された。(4)凍結超薄切片法による免疫電顕的観察:前記2)のとおり氷晶防止された試料は、超低温凍結固定し、凍結超ミクロトームで凍結切片を作製し、間接金コロイド法で免疫染色、電子顕微鏡で観察した。ネガティブ染色によって、細胞内小胞に基底膜分子と酵素が局在することが判明した。それぞれの小胞の異同について検討中である。(5)細胞ならびに培地中基底膜分子分解産物の追跡:免疫染色の標本採取時期に準じて、細胞と培地をそれぞれ採取し、各抗体をもちいて免疫沈降反応によって回収し、電気泳動後フルオログラフィによって可視化した。培地中には、標識後3時間でヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質に相当する蛋白質と、約300kDaのその分解物と考えられるペプチドが出現した。これは硫酸基を有していなかった。これが分解産物である確証を蛋白質化学的に検索中である。本年度は以下の実験をおこない、培養唾液腺腺様嚢胞癌細胞が自ら基底膜分子を生合成して細胞外に沈着し、かつ自身の分解酵素によってこれを改造していることを示唆する所見をみいだした。(1)細胞培養:ヒト腺様嚢胞癌由来株細胞ACC2及びACC3を35mmペトリ皿または24穴マイクロプレート上で単層培養し、^<35>S-硫酸と^3H-ロイシンによる標識を行った。培養細胞は同様に固定後、ショ糖氷晶防止処理後、凍結超薄切片も作製した。(3)共焦点レーザ顕微鏡による観察:前記2)のとおりに作製された標本を共焦点レーザ顕微鏡で、断層撮像を三次元再構築し、立体的に細胞内外の分子移動を観察した。(4)凍結超