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国際裁判における証拠法理論の生成と展開

本研究は、国際裁判における証拠法論の生成と展開を辿ることを通じて、裁判過程における事実認定という局面の意義と性格を明らかにすることを目的とするものである。本研究は、前年度において博士論文「国際裁判における証拠法論の生成と展開」として暫定的に完成のかたちを見た。右論文では、証拠法論の従来の理解を〈客観的真実発見説〉として整理し、その政策志向性や限界を明らかにした上で、国際裁判における証拠法論の裁判目的依存性という新たな視座〈裁判目的実現手段説〉を設定し、従前の理解との対比における事実認定の「正しさ」に関する理解の再考と、そうした視座に基づく個々の具体的解釈論を踏まえた証拠法論の再構成を試みた。具体的には、証明対象論、証明責任論、推定構造論、証明過程論、という四点に証拠法論上の問題群を整理し、個々の国際裁判制度の目的に立ち返った上で比較検討を行った(検討対象は常設国際司法裁判所・国際司法裁判所、国際仲裁、WTO紛争処理制度、国際投資仲裁)。以上の博士論文に加筆修正を加え、これを書籍として公刊することにより本研究は完結される。すなわち、当事者主義(民事訴訟モデル)、限定職権主義(非対称民事訴訟モデル)、強化された職権主義(行政訴訟モデル)という三類型を理念型とした国際裁判の証拠法論の展開の跡付けと、解釈論的基盤の提示である。かくして本研究は、国際裁判の証拠法論に対して新たな視座を提供するものと位置付けられる。(抄録なし)本研究は、国際裁判における証拠法論の生成と展開を辿ることを通じて、裁判過程において事実認定という局面がいかなる意義を備えるものであるかを明らかにすることを目的とするものである。本年度はとくに歴史的な分析に重点を置いて研究を進めた。すなわち第1に、証拠法論における従来の知見を整理することを通じて、従来の通説的理論の背景に一定の政策志向を垣間見ることができることを明らかにした。そして第2に、伝統的国際裁判における裁判例を検討することを通じて、従来の通説の意義と限界を明らかにした。以上の成果を導くにあたっては、伝統的国際裁判例における関連判断部分をある程度網羅的にデータベース化する作業に加えて、米国・ワシントンD.C.に渡航し未公刊資料の収集・調査を実施した(米国国立公文書館および議会図書館)。調査対象は多岐にわたるが、特に証拠法論上の指導的先例として扱われてきた米墨一般請求委員会のParker v. United Mexican States(1926)判断の未公刊訴答書面を入手し、本事案における論争の種となった証拠資料である宣誓供述書の現物に接することができたことが最も重要な成果である。収集した未公刊資料のより具体的な咀嚼は次年度の課題に持ち越されるが、いずれにせよ本年度の研究の結果、証拠法論の生成に対する戦間期という特殊な時代背景の影響の一端を見出すことが可能であるとの結論を得た。証拠法論の展開を歴史的に辿ることの意義は以上の意味において了解され、本年度の成果を現代国際裁判論へと架橋することを次年度の課題として設定し、これを博士論文としてまとめていく予定である。本研究は、国際裁判における証拠法論の生成と展開を辿ることを通じて、裁判過程における事実認定という局面の意義とその本質を明らかにすることを目的とするものである。2年目は、本研究を博士論文「国際裁判における証拠法論の生成と展開」としてまとめ、暫定的に完成のかたちを見た。右論文では、国際裁判における証拠法論の従来の理解を〈客観的真実発見説〉として整理し、その政策志向性や限界を明らかにした上で、国際裁判における証拠法論の展開の裁判目的依存性という新たな視座〈裁判目的実現手段説〉を設定し、従前の理解との対比における事実認定の「正しさ」に関する理解の再考と、そうした視座に基づく個々の具体的解釈論を踏まえた証拠法論の再構成を試みた。具体的には、証明対象論、証明責任論、推定構造論、証明過程論、という4点に証拠法論上の問題群を整理し、個々の国際裁判制度(検討対象は常設国際司法裁判所・国際司法裁判所、国際仲裁、WTO紛争処理制度、国際投資仲裁)の目的に立ち返った上で比較検討を行った。制度目的に立ち戻った上で当該制度の解釈論的視座を画定するという手法は、それ自体としては極めてオーソドックスな実定法解釈の方法であるが、しかし両者の有機的な連関が必ずしも意識されてこなかった従前の議論状況を前提とすれば、そうしたオーソドックスな手法によって到達した本稿の結論は、国際裁判の証拠法論に新たな視座を提供するものと位置付けられる。

具体的には、証明対象論、証明責任論、推定構造論、証明過程論、という四点に証拠法論上の問題群を整理し、個々の国際裁判制度の目的に立ち返った上で比較検討を行った(検討対象は常設国際司法裁判所・国際司法裁判所、国際仲裁、WTO紛争処理制度、国際投資仲裁)。以上の博士論文に加筆修正を加え、これを書籍として公刊することにより本研究は完結される。すなわち、当事者主義(民事訴訟モデル)、限定職権主義(非対称民事訴訟モデル)、強化された職権主義(行政訴訟モデル)という三類型を理念型とした国際裁判の証拠法論の展開の跡付けと、解釈論的基盤の提示である。かくして本研究は、国際裁判の証拠法論に対して新たな視座を提供するものと位置付けられる。資料収集やデータベース化を通じて、おおむね当初設定した仮説の検証は進展している。他方、本年度はそうした資料の咀嚼に重点を置いたため、本年の研究成果は現段階では必ずしも論文草稿の活字としては反映されていない。本研究課題は、研究代表者の博士論文として遂行してきたものであり、その提出は、本研究課題の暫定的な完成を意味する。もちろん、更に高水準のものへと引き上げた上での公刊を目指し、最終的な完成に向けて引き続き精進していく次第である。本年の資料収集・判例咀嚼の具体的成果を論文草稿の活字へと反映させていくことが、次年度の課題である。なお、海外での資料収集は引き続き実施する予定である。本研究課題は、博士論文の提出という形で一応の完成を見た。今後は、書籍としての公刊を目標とした上で、博士論文の内容をブラッシュアップしていく予定である。(抄録なし)
筋収縮時のミトコンドリア活性化に対する酸素輸送担体の分子相互作用の解明

本研究では骨格筋内の酸素貯蔵体として知られているミオグロビン(Mb)とミトコンドリアとの直接的相互作用について、個体・細胞レベルの生理学・細胞生物学的解析によってその機序を明らかにしようとした。実験の結果、Mbがミトコンドリア近傍、およびミトコンドリア内にも存在していた。さらに、ミトコンドリア内のMbが呼吸鎖複合体に相互作用している可能性や、Mbの多寡がミトコンドリアの酸素消費率が上昇する可能性を示唆した。本研究の結果は筋細胞内のMbがミトコンドリアの呼吸機能に直接的に影響することを示唆すると共に、Mbの生理機能についての新たな展開を生む契機となった。骨格筋の酸素供給機構とその規定因子については不明な点が多い。我々は、骨格筋内の酸素貯蔵体として知られているミオグロビン(Mb)に注目して、筋収縮時の細胞内貯蔵酸素(Mbに結合した酸素)の動態を検出した。実験の結果、Mbに結合した酸素は筋収縮開始とともに解離し、それに付随して細胞内酸素分圧が急進的に低下することが明らかとなった。こうしたMbの振る舞いは、Mbが単なる酸素貯蔵体としてではなく、骨格筋組織の酸素供給機構の一部として機能していることを示唆する。そこで本研究では、酸素代謝機能の背景にはMbとミトコンドリアとの密接な相互作用が起因すると予想した。そのことを検証するために、ラット摘出骨格筋の各画分におけるタンパク質解析を行った。その結果、Mbが細胞質画分だけではなくミトコンドリア画分にも検出された。さらに、ミトコンドリア画分に検出されたMb量は、ミトコンドリアの多い骨格筋に多く検出される傾向にあった。そのことは組織学的画像解析によっても確認された。加えて、Mbの酸素化状態(脱酸素化状態)によってMbとミトコンドリアの相互作用が影響を受けなかったことをMbの一酸化炭素暴露実験によっても検証した。さらに、運動トレーニングを課した骨格筋やCast材で固定した骨格筋では、ミトコンドリア画分に存在するMb量が増減する傾向にあり、こうした骨格筋ではMbから供給される酸素流量も増減する傾向にあった。上記の実験に加えて、Mbとミトコンドリアの相互作用を詳細に検証するために、タグ付きMbの安定過剰発現細胞を構築すべくMb発現ベクターを作成し、骨格筋培養細胞(L6)へ導入し、myc-Mbの発現状態を確認した。H25年度では、Mbの多寡がミトコンドリアの呼吸活性に及ぼす影響を検証するために、昨年度までに樹立したMb過剰発現筋細胞株(myc-Mbを発現するL6細胞)におけるミトコンドリアの呼吸消費速度を検証した。Mbの発現の程度はWestern Blot法によって評価し、ミトコンドリアの酸素消費速度は細胞レベル(膜透過処理)にて評価した。その結果、Mbの発現量が多いL6細胞株ではミトコンドリアの酸素消費速度が高くなる傾向が認められた。さらに、発育期におけるラット骨格筋におけるミトコンドリア呼吸活性を評価した(in vivo検証)。発育期の下肢骨格筋では骨格筋内のMb量が増加する傾向を示し、ミトコンドリア量も増加していた。その発育期の骨格筋から単離したミトコンドリアでは、その酸素消費速度も高くなる傾向が認められた。以前に我々はミトコンドリアの中にもMbが存在している可能性を示したことも考慮すれば、これらの結果はMbの存在がミトコンドリアに対して直接的に関与し、ミトコンドリアの呼吸機能を上方調節している可能性を示唆するものである。また、昨年度も検証したプロテオーム解析も再度試みた。myc-Mbを安定発現するL6細胞を用いて、myc抗体で免疫沈降したサンプルの質量解析を実施した。細胞骨格関連タンパク質(収縮タンパク質)やミトコンドリアタンパク質、シャペロンタンパク質などが検出されたが、サンプル間の再現性が十分に確認できなかった。細胞株の変更を含め、再検討を要する課題とした。そこで本年度の研究では、Mbとミトコンドリアの相互作用を詳細に検証するために、タグ付きMbの安定過剰発現細胞を構築し、骨格筋培養細胞(L6)へ導入し、mycーMbの発現状態を確認した。L6細胞を用いてmyc-抗体によって免疫沈降したサンプルを質量分析した。

その結果、数種類のミトコンドリア関連のタンパク質が共免疫沈降していた。ただし、バイトタンパク質の回収量に問題があったため、細胞株とタグの変更を検証している。また、Mbとミトコンドリアの生合成機序(因子)についてラットを用いて検証した。ラットの発育期には骨格筋内のMbが次第に増加した。一方、ミトコンドリア濃度は生後間もなく成熟レベルに達していた。このMbの上昇には、カルシウムシグナル(特にCaN活性)が関わっている可能性が示唆された。また、細胞内Mb濃度が上昇することによるミトコンドリア呼吸機能変化を検証するための、ミトコンドリア単離方法や膜透過処理法の確立を図った結果、代謝特性の違い(遅筋vs.速筋)やミトコンドリアの多寡(mtDNA量に反映)によるミトコンドリア呼吸機能の差を検出することができた。生体試料(ラット骨格筋)を用いた相互作用状態(共局在性、共免疫沈降)の検証を概ね進行させることができた。また、Mbとミトコンドリアの共局在の有無を検討するにあたり、MbのcDNA全長を含むベクターを骨格筋培養細胞(L6細胞)に導入し、myc-タグで標識したMbタンパク質を安定発現するL6細胞の樹立を図ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。myc Mbを安定発現するL6筋細胞株を用いて、Mbに相互作用するタンパク質の検討を行う。Myc-抗体で免疫沈降し、銀染色によってタンパク質の存在の可能性を確認する。また、プロテオーム解析(MassSpec,ショットガン解析)によって、相互作用するタンパク質のカタログ作成を試みる。さらに、L6培養筋芽細胞あるいは、筋組織を用いて電子顕微鏡による組織観察を行い、細胞のオルガネラ(特にミトコンドリア周辺)に散在するMbタンパク質の局在性を観察する。myc-抗体で免疫沈降し、銀染色によってタンパク質の存在の可能性を確認する。また、プロテオーム解析(Mass Spec,ショットガン解析)によって、相互作用するタンパク質のカタログ作成を試みる。
黄色植物の起源的生物、ラビリンチュラ類の系統および分類に関する研究

培養株の確立:前年度に検討したサンプリング技術を用い,今年度は新たにスラウストキトリウム科57株の培養株を確立することに成功した。生活史と各ステージの形態比較:光学顕微鏡と連続観察のためにビデオ撮影装置を組み合わせて,スラウストキトリウム科の12株について生活史の調査・解析を行った。1)個々の栄養細胞が1つの遊走子嚢になるもの,2)栄養細胞が2分裂を繰り返す能力をもち,娘細胞のそれぞれが遊走子嚢になるもの,3)栄養細胞がアメーバ細胞へと変態した後に遊走子嚢になるもの,といった様々な形態パターンが観察できた。それぞれの形態形質はThraustochytrium属,Schizochytrium属,Ulkenia属の特徴になっている。さらに,それぞれの形質を同時にもつような株も得られており,このような形態形質の妥当性について問題提起をすることができた。分子系統解析:18SrRNA遺伝子のPCR増幅実験によって,その領域の増幅サイズが他のスラウストキトリウム科のものと異なる株(RT0100株)が出現した。これについて18SrRNA遺伝子の全塩基配列決定を行い,既知の配列と共に分子系統解析を行った。既報告の知見としてラビリンチュラ類には大きく2つの系統群が存在していることが知られている。前年度に分離された株はこれまでのところすべてThraustochytrium系統群に属していたが,RT0100株はもう一方のLabyrinthula系統群に属することがわかった。まとめ:これまでの生活史を通じた形態観察では,特に系統関係と一致し,分類形質として適当な特徴を特定するには至らなかった。しかしながら,ラビリンチュラ類の多様な株の確立に成功し,基礎的な観察結果を得たことは,今後の体系作りの礎となると考えている。培養株の確立:分離方法の検討を行い,沖縄県,静岡県からスラウストキトリウム科135株,ラビリンチュラ科9株の培養株を確立することに成功した。脂肪酸組成比較:今回確立したスラウストキトリウム科の94株について脂肪酸分析を行い,特に高度不飽和脂肪酸の組成を比較した。全体は7つの組成タイプに分かれた。これら7つの脂肪酸組成タイプを作業仮説的なグループとし,それぞれから適当な株を選択して詳細な系統・分類学的解析を行うこととした。まず, Schizochytrium limacinumと同じタイプである静岡県浜名湖から分離されたHmB3株を実験対象株として選択した。生活史と各ステージの形態比較:HmB3株の栄養細胞には,星形細胞を経て遊走子を放出する様式と,一度アメーバ細胞へと変態した後で遊走子へと再度変態する様式が見られた。この生活史パターンと各ステージの形態やサイズはUlkenia visurgensisと類似するものであった。分子系統解析:HmB3株の18S rRNA遺伝子の塩基配列決定を行い,既知の配列と共に分子系統解析を行った。HKY85モデルによる遺伝距離から近隣結合法で系統樹を構築させたところ,HmB3株はThraustochytrium pachydermumと単系統群を形成し,その統計学的な支持率も高かった。しかし,Schizochytrium limacinumとUlkenia visurgensisとは近縁性を示すものではなかった。現時点のまとめ:上記3種の中にはHmB3株と総合的に一致するものが見られないので,現段階での同定・分類をすることを保留した。今後は詳細に調査する材料を増やし,さらに微細構造比較も行うことでラビリンチュラ類全体の分類体系の見直しを行っていく予定である。
『デジタル伊能図』を活用した高等学校におけるアクティブ・ラーニングの実践研究

PCソフト『デジタル伊能図』を活用し,高等学校「地理」学習におけるアクティブ・ラーニングの教材開発・授業実践を試みた。『デジタル伊能図』は,近世古地図「伊能図」と現代の「地理院地図」との重ね合わせが最大の特徴である。地形単元では,平野の発達や埋立・干拓など海岸の地形改変を調べる学習を試みた。グループ毎に地形変化の大きい地域を探し,その理由を調べ報告させた。村落・都市単元では,検索機能で全国の「新田」集落を探し,その地形の特徴を考えさせた,また小・中学校での既習事項の城下町の街路の特徴を,身近な浜田城下町や広島城下町での伊能測量隊のコースで確認することで,これまでの学習の「一般化」ができた。生徒の活動も活発で能動的な学習に効果があることが分かった。地元の郷土資料館に出かけ,所蔵の古地図と伊能測量隊の歩いた道とを比べた。学習指導要領にも資料館・博物館の活用が謳われているが,見慣れない近世絵図や旧版地形図などを見る手がかりとして伊能図の活用は効果的であろう。また伊能測量隊は多くの高校の所在地附近を通っている。身近な地域の教材として有効である。地理学習だけでなく歴史学習や他教科での利用も勧めていきたい。一方,教材として用いる場合,小・中縮尺のスケールでは伊能図と現代地図と重ね合わせに効果があるが,大縮尺での「ズレ」が大きな課題であろう。伊能図の測線(伊能の測量コース)がシェープファイルで示されるのもこのソフトの特徴ではあるが,ミクロスケールでは誤差が大きい箇所もあり,修正・反映に時間と技術が必要である。このソフトに限らないが, PC1台を交代で使用するのには限界がある。機能を制限した学校向け廉価版があると望ましい。地域の街歩きイベントで,市内の伊能の宿泊地について生徒が現地で説明する場面を設け参加者に好評であった。こうした地域での学習成果のアウトプットの活動も増やしていきたい。
非平衡マグネトロンスパッタリング法による強磁性形状記憶合金薄膜の作製

Ti-Ni合金に代表される従来の形状記憶合金を用いたアクチュエーターは、加熱・冷却速度がネックとなり高速駆動が困難であることが最大の欠点と言われている。これに対して、Ni_2MnGaおよびFe-Pdなどの強磁性形状記憶合金は温度変化のみならず磁場によってもマルテンサイト変態が誘起されることが知られでおり、磁場のon/offによってTi-Ni合金より高速に駆動できるアクチュエータを構成する材料として期待されている。本研究では、非平衡マグネトロンズパッタリング装置を用いて、実際に形状記憶挙動を示す組成および構造が制御されたFe-Pd形状記憶合金薄膜を安定に合成する技術を確立することを目的とした。まず、Fe-Pd合金ターゲット上にPdチップを配置した複合ターゲットをスパッタリングすることによって薄膜の組成制御を試みた。その結果、配置するPdチップの量によって24-32at%の間でPdの組成を制御してFe-Pd合金薄膜を成長させることができた。as-deposited薄膜では温度に伴うマルテンサイト変態挙動は認められなかったが、900°C×60min→IWQの溶体化処理を施すと2832at%のPdを含有するFe-Pd合金薄膜においてfct-fcc熱弾性型マルテンサイト変態を示すことが明らかとなった。また、剥離した2μmのFe-29at%Pd薄膜において、温度に伴う形状記憶挙動を示すことを確認した。薄膜のFe-Pd合金における形状記憶挙動の確認は、著者らの知るところ世界で初めてである。上述した方法では作製できる薄膜の厚さに限界があるため、2源同時スパッタリングによる成膜に切り替えてさらに詳細な実験を行った。その結果、合金ターゲットの場合とほぼ同様の結果を得られたが、変態温度に膜厚依存性があることがわかった。これに対して、Ni_2MnGaおよびFe-Pdなどの強磁性形状記憶合金は温度変化のみならず磁場によってもマルテンサイト変態が誘起されることが知られており、磁場のon/offによってTi-Ni合金より高速に駆動できるアクチュエーターを構成する材料として期待されている。本研究では、非平衡マグネトロンスパッタリング装置を用いて、実際に形状記憶挙動を示す組成および構造が制御されたFe-Pd形状記憶合金薄膜を安定に合成する技術を確立することを目的とした。本年度は、まずFe-Pd合金ターゲット上にPdチップを配置した複合ターゲットをスパッタリングすることによって薄膜の組成制御を試みた。その結果、配置するPdチップの量によって2432at%の間でPdの組成を制御してFe-Pd合金薄膜を成長させることができた。この結果については、2000年12月に開催された国際会議(THERMEC2000)において発表済みである。上述した方法では作製できる薄膜の厚さに限界があるため、今後2源スパッタリング装置を用いた成膜に切り替えて、さらに詳細な実験を行っていく予定である。

Ti-Ni合金に代表される従来の形状記憶合金を用いたアクチュエーターは、加熱・冷却速度がネックとなり高速駆動が困難であることが最大の欠点と言われている。これに対して、Ni_2MnGaおよびFe-Pdなどの強磁性形状記憶合金は温度変化のみならず磁場によってもマルテンサイト変態が誘起されることが知られており、磁場のon/offによってTi-Ni合金より高速に駆動できるアクチュエーターを構成する材料として期待されている。本研究では、非平衡マグネトロンスパッタリング装置を用いて、実際に形状記憶挙動を示す組成および構造が制御されたFe-Pd形状記憶合金薄膜を安定に合成する技術を確立することを目的とした。本年度は、2源直流スパッタリング装置を用いてFe-Pd薄膜の作製し、昨年までの合金ターゲットの結果と比較・検討した。まず、Feターゲットへの投入電力を一定とし、Pdターゲットへの投入電力を変化させることによって成長する薄膜の組成制御を試みた。その結果、約1at%の精度で膜中のPd組成の制御が可能であることがわかった。as-deposited薄膜では温度に伴うマルテンサイト変態挙動は認められなかったが、900°C×60min→IWQの溶体化処理を施すと約30at%のPdを含有するFe-Pd合金薄膜は室温においてfct構造となり、4050°Cの温度領域においてfct-fcc熱弾性型マルテンサイト変態を示すことが明らかとなった。また、剥離した薄膜において、温度に伴う形状記憶挙動を示すことも確認した。これらの挙動は、昨年までの合金ターゲットによる結果と同様であり、薄膜における変態温度がバルクよりも高くなることが確認された。この結果については、2002年3月に開催される金属学会春期大会において発表する予定である。
口腔保健に配慮した嚥下食開発のための包括的研究

術後嚥下食を摂取する食道がん周術期の患者の口腔環境を調べた結果、嚥下食摂取中は唾液が少ない反面、唾液中ミュータンス連鎖球菌数や歯垢の酸産生能が増加することが分かった。一方、嚥下補助食品の口腔清掃作用を調べた結果、嚥下機能の低下した条件では、食後のゼリーやとろみ調整水摂取により食品の口腔内残留が低下することが示された。以上のことから、口腔衛生状態を保つために水分を含んだ嚥下補助食品を食後摂取することが効果的であることが示唆された。本研究では、「口腔保健に配慮した機能的な嚥下補助食品・流動食や経腸栄養剤の開発」を最終目的とし、初年度は嚥下食を経口摂取している入院患者の方を対象に口腔内診査と口腔衛生状態のアセスメント調査を開始した。まず、栄養管理室の協力を得て徳島大学病院内である一定期間に、嚥下食を摂取されている患者さんを抽出したところ、食道乳腺甲状腺外科、消化器外科、耳鼻咽喉科、神経内科、消化器内科、呼吸器内科の順に該当患者さんが多いことが分かった。そこで、該当患者さんが最も多い食道乳腺甲状腺外科のご協力を頂き、術前に経腸栄養剤を飲用し、術後に嚥下食を摂取される食道癌周術期の方を対象に口腔内診査を開始することとした。院内の臨床研究倫理審査委員会の承認が遅れたこともあり、これまでに、3例の患者さんを対象に継続的な観察を行っているところであるが、現時点では経腸栄養剤摂取前のベースラインでの各患者データの個体差が大きく、嚥下食摂取による口腔内環境の変化を予測できるレベルには達していない。但し、1症例では経口摂取が禁止される時期が続くと安静時唾液の分泌量が低下するとともに口腔乾燥が増強し、嚥下食が開始されてもその状況はすぐには回復しないのではないかという知見が得られている。また、安静時唾液に比べてチューイングペレットを咀嚼して分泌した刺激唾液において高い緩衝能を示したことから、咀嚼を要しない嚥下食の摂取が長期間続くことが唾液の性状にも大きく影響するのではないかということが示唆された。次年度は食品についての基礎的研究を進める一方、対象患者の症例数を増やし、嚥下食摂取前後の口腔衛生状態に及ぼす影響因子についてさらに検討を加える予定である。今年度は昨年度に引き続き臨床研究として、術前に経腸栄養剤を飲用し、術後、絶食から一定期間嚥下食摂取をした後常食にいたる食道癌の周術期患者を対象として、術前約7日前の栄養剤摂取前(E1)、術前約3日前の経腸栄養剤飲用期間中(E2)、術後約8日後の嚥下食摂取前(E3)、嚥下食摂取期間中(E4)、常食摂取期間中(E5)の5つの時期で口腔内診査および唾液分泌量測定、齲蝕活動性試験、Plaque Index (PI)測定等を行った。対象者21名中、E1E5すべての時期にデータが得られたのは6名であり、まずこの6名のデータを分析した結果、E2に比べてE3で安静時唾液量が減少しており、E4からE5の時期に回復している傾向がみられた。また、PIはE3よりE4、E4よりE5で増加するケースが多かった。さらに、嚥下食摂取の影響を見るためE3とE4のデータが揃っている12例について分析を進めたところ、この時期にほとんどのケースで刺激唾液量の増加、PIの増加を認め、さらに舌背のミュータンス連鎖球菌数が増加するケースが多いことが明らかとなった。一方、基礎研究としては、嚥下補助食品(トロミ剤)を用いて調整した飲料の物性と口腔内残留量の関連性を調べるための予備実験を行った。すなわち、デンプンを主原料とするものとキサンタンガム系の2種類のトロミ剤を市販の水あるいは緑茶に添加したものを用いて物性測定、官能評価および口腔内残留量の測定を行った。その結果、デンプンを主原料とするものは、唾液に溶けやすいという特性から嚥下物性が劣るということがわかった。一方、キサンタンガム系のトロミ調整食品は嚥下物性としては優れているが、嚥下障害者では口腔内残留も多くなる可能性があることが示唆された。

今年度も昨年度に引き続き、周術期に経腸栄養剤を飲用し、術後絶食から一定期間嚥下食摂取をする食道がんの患者を対象として術前の栄養剤摂取前(E1)、術前3日前の栄養剤摂取中(E2)、術後8日後の嚥下食摂取前(E3)、嚥下食摂取期間中(E4)、E4より食形態が向上した時点(E5)g)5つの時期で口腔内診査、唾液分泌量測定、う蝕活動性試験、Plaque Indek測定等を行った。調べた30名のデータをもとに統計学的に分析した結果、E3では唾液分泌量や唾液中のミュータンス連鎖球菌数が低下していることが分かった。その後の時点では唾液分泌量の回復と比較して、ミュータンス連鎖球菌数やPIは嚥下食摂取開始とともに早い時点で増加することが分かった。このことから、術後の嚥下食摂取状況下では歯垢細菌が増加し、う蝕や歯周病のリスクが大きくなることが示唆された。一方、基礎研究としてとろみ調整水とゼリー状食品の口腔内残留量を客観的に評価するとともに、それらの口腔清掃性について調べた。嚥下障害のない健常な成人13名を対象に、被験食品を一定条件で摂取してもらった後の洗口吐出液の濁度(660nmの吸光度)をもって口腔内残留量とした。その結果、とろみ調整水もゼリー状食品も小さじ1杯を摂取することで、先に摂取したクッキーの残留を半減することが分かった。クラッシュゼリー状の食品を用いて、摂取量、摂取(嚥下)回数、咀嚼の有無などの条件について比較検討した結果、ゼリー状食品を咀嚼して食べた方がより口腔清掃性を発揮することが分かった。また、2倍量(大さじ1杯)を1回摂取するよりも、1倍量(小さじ1杯)を2回摂取する方が残留量を効果的に減少させることが分かった。以上のことから、嚥下食摂取が長期に続くときには口腔衛生管理が重要で、また、嚥下食摂取の際には口腔内残留を考えた食事の指導を行うことも重要であると考えた。
骨分化・筋分化に関わるマイクロRNAの同定とその機能解析

マイクロRNA(miRNA)はタンパク質をコードしない22塩基程度のスモールRNAで遺伝子発現を翻訳レベルで制御する機能を持つ。本研究では新規に骨分化で発現が亢進するmiRNAを同定した。これら骨分化研究において重要な知見である。また骨・筋分化に伴って共通して減少する一群のmiRNAを同定した。細胞の増殖制御機構に広く関与すること考えられ、今後の展開が期待される。また筋分化に関与するmiRNAに関しては、筋管細胞、休止細胞に着目することで新たな知見を見出した。マイクロRNA(miRNA)は植物から動物まで広く保存した20塩基程度のタンパク質をコードしないスモールRNAで、翻訳レベルで遺伝子発現を制御しており、近年、発生や分化、癌、アポトーシスといった生命現象にひろく関与することが明らかにされつつある。これまでの多くの研究がタンパク質をコードする遺伝子に着目したものであることから、miRNAの機能解明は複雑な生命現象への理解に必須であると考えられる。マウスC2C12細胞は培養条件により筋分化、骨分化を誘導できる性質を持つ。心筋や骨格筋の分化に関与するmiRNAも報告されているが、筋分化に関与するmiRNAの標的遺伝子はまだ少ししか同定されておらず、一方、骨分化に関してはmiRNAの研究はほとんど報告されていない。そこで、私はC2C12細胞を用いて骨・筋分化におけるmiRNAの機能を解明することを目的として本研究を行っている。平成19年度は、miRNAをリアルタイムPCR法で検出する系を立ち上げた。miRNAマイクロアレイ解析を行い分化に伴って変動するmiRNAを数種見出した。また筋分化で発現が亢進するmiRNAの標的遺伝子を新規に同定できた。miRNAはmiRNPと呼ばれるタンパク質の複合体として機能するが、miRNPを免疫沈降することで活性も持ったmiRNAを効率よく精製する系を構築した。現在、同定したmiRNAの分化における機能の解析を進めている。マイクロRNA(miRNA)は、植物から動物まで広く保存したタンパク質をコードしない22塩基程度のスモールRNAで遺伝子発現を翻訳レベルで制御する機能を持ち、近年、発生や分化、癌、アポトーシスといった生命現象に広く関与することが明らかにされつつある。これまで多くの研究がタンパク質をコードする遺伝子に着目したものであることから、miRNAの機能解明は複雑な生命現象への理解に必須のものであると考えられる。本研究では、細胞分化に関与するmiRNAの機能の解析を目的とし、培養条件により骨分化・筋分化を誘導できる性質を持つマウスC2C12細胞を用いて研究を行った。マイクロアレイ解析により発現が共通して減少する一群のmiRNAを同定できた。これらmiRNAの中には細胞増殖を正に制御することが報告されているmiRNAが多数含まれており、分化に伴って細胞増殖が停止することによく合致した。一部に関してはC2C12細胞においても増殖を正に制御することを確認した。また骨分化に伴って発現が亢進するmiRNAを数種同定したが、その内の一つはコーディング遺伝子のイントロン中にコードされていた。これを親遺伝子と呼ぶが、その親遺伝子も発現が亢進することを確認した。現在その発現機構の解析を続けている。一方、筋分化に伴って亢進するmiRNAはすでに報告されており、本研究でもそれらmiRNAが同定できた。C2C12細胞は筋分化を誘導した際、一部分化せず休止した細胞も存在する(サテライト細胞に相当すると考えられている)。筋細胞と休止細胞を分離し解析したところ、筋特異的miRNAは休止細胞ではほとんど発現していないことが分かった。さらに休止細胞でのみ発現が見られる遺伝子が、筋特異的miRNAの標的配列を持ち、miRNAの標的遺伝子となることを見出した。現在、休止細胞と分化細胞の違いに着目してさらなる解析を行っている。
新規がん抑制遺伝子産物MY018Bのがん悪性化における機能解析

新規ミオシンファミリータンパク質をコードするMYO18B遺伝子は、ヒト肺がん細胞で高頻度に失活しており、新規がん抑制遺伝子である可能性が示唆されている。MYO18Bの個体における機能を解析する為、ジーンターゲティング法を用い、MYO18B遺伝子のプロモーターの下流にβ-gal遺伝子を挿入し、遺伝子欠損マウスを作成した。ヘテロマウスを用いたLacZ染色により、MYO18Bは骨格筋、心筋に強い発現することがわかった。MYO18B遺伝子のプロモーターの解析により、筋細胞におけるMYO18B遺伝子の発現に、転写因子MEF2が寄与することが示唆された。ヘテロマウス同士の掛け合わせにより得られる胎児の解析により、MYO18Bノックアウトマウスは、心筋細胞のサルコメア構造の異常により、受精後10-12日目に致死になることがわかった。以上の結果よりMYO18Bは心筋の発生・機能において重要な役割を担っていることが示された。新規ミオシンファミリー蛋白質をコードするMYO18B遺伝子は、ヒト肺がん細胞で高頻度に失活しており、新規がん抑制遺伝子である可能性が示唆されている。また、MYO18B遺伝子産物はアクチン結合し、細胞骨格形成や細胞運動に関与することが予想される。MYO18B遺伝子産物の細胞内における機能を解析する為、初めにMYO18BのEGFP結合蛋白質を用い、MYO18Bの細胞内局在の解析を行った。その結果、MYO18Bは他のミオシンファミリー蛋白質と同様に、アクチン鎖上に局在することがわかった。更にMYO18Bは中心体にも局在が確認された。次に、肺がん細胞株で見つかったアクチン結合部位もしくはATP結合部位の変異を導入したMYO18BのEGFP結合蛋白質の細胞内局在を解析したところ、野生型のMYO18Bとの細胞内局在の変化は認められなかった。更にMYO18Bのアクチンフィラメント及び中心体への局在に必要な部位を同定する為、MYO18Bの欠失変異体のEGFP結合蛋白質を作製し、細胞内局在を解析した。その結果、MYO18BのN末端側の、MYO18B特異的な配列を持つ領域がアクチン鎖上に局在しうることが確認された。一方、中心体への局在にはMYO18BのC末端側の領域が必要なことがわかった。現在、作製した欠失変異体の過剰発現による細胞分裂、細胞運動への影響を検討中である。また、MYO18B遺伝子産物の個体における機能を解析する為、MYO18B遺伝子の遺伝子欠損マウスを作成している。現在、ターゲッティングベクターの作製及びES細胞のスクリーニングが終了し、キメラマウスを作成中である。MYO18B遺伝子産物の細胞内における機能を解析する為、MYO18Bタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成した。抗原として、他のミオシンファミリー蛋白質と相同性の低い領域3ヶ所をGST融合タンパクとして精製し、用いた。これらの抗体を用い、内在性MYO18Bの細胞内局在の解析を行ったところ、MYO18Bは筋分化したC2C12細胞においてアクチン鎖上に局在することがわかった。次にMYO18Bの個体における機能を解析する為、ジーンターゲティング法を用い、MYO18B遺伝子のプロモーターの下流にβ-gal遺伝子を挿入し、遺伝子欠損マウスを作成した。ヘテロマウスを用いたLacZ染色によりMYO18Bの発現部位の解析を行ったところ、成体の組織では、骨格筋、心筋及び平滑筋に強い発現が認められた。胎児では、心臓及び体節の一部に強い発現が認められた。ヘテロマウス同士の掛け合わせによる仔の遺伝子型解析により、MYO18B遺伝子を両アレル欠損したノックアウトマウスは、胎生致死になることがわかった。ヘテロマウス同士の掛け合わせにより得られる胎児の解析により、MYO18Bノックアウトマウスは、受精後9日目から12日目の間に致死になることがわかった。現在、致死の原因について解析を行っている。今後、ノックアウトマウスの胎児より樹立した細胞を用い、MYO18B欠損による細胞骨格形成、細胞運動への影響の解析を計画している。更に、ヘテロマウスを用い、がんの発生及び悪性化におけるMYO18B遺伝子欠損の影響について解析を行う予定である。

ヘテロマウス同士の掛け合わせにより得られる胎児の解析により、MYO18Bノックアウトマウスは、心筋細胞のサルコメア構造の異常により、受精後10-12日目に致死になることがわかった。以上の結果よりMYO18Bは心筋の発生・機能において重要な役割を担っていることが示された。
神経ペプチドによる痴呆モデルの確立と抗痴呆薬の創製

Dynorphin A-(1-13)およびドパミンD_1受容体作動薬SKF38393はgalanin誘発受動的回避学習障害を有意に抑制したが,ドパミンD_2受容体作動薬RU24213,ドパミンD_1受容体拮抗薬SCH23390あるいはドパミンD_2受容体拮抗薬S(-)-sulpirideはほとんど影響しなかった.3.Scopolamine誘発自発的交替行動に対するタキキニン類の改善作用Dynorphin A-(1-13)およびドパミンD_1受容体作動薬SKF38393はgalanin誘発受動的回避学習障害を有意に抑制したが,ドパミンD_2受容体作動薬RU24213,ドパミンD_1受容体拮抗薬SCH23390あるいはドパミンD_2受容体拮抗薬S(-)-sulpirideはほとんど影響しなかった.3.Scopolamine誘発自発的交替行動に対するタキキニン類の改善作用1. Scopolamine誘発自発的交替行動障害に対するタキキニン類の改善作用(1) SubstanceP,neurokininAおよびsenktideの側脳室内投与は,scopolamine誘発自発的交替行動障害を有意に改善させた.(2) Substance Pによる改善作用は,naloxoneの前処置によって,ほぼ完全に抑制された.2.タキキニン類によるscopolamine誘発自発的交替行動障害改善作用におけるドパミン神経系の関与(1)ドパミンD_2受容体拮抗薬S(-)-sulpirideは,scopolamine誘発自発的交替行動障害を有意に改善させたが,ドパミンD_1受容体拮抗薬SCH23390は無効であった.(2)ドパミンD_2受容体作動薬RU24213は,substancePおよびneurokininAによるscopolamine誘発自発的交替行動障害改善作用を抑制した.しかしながら,SKF38393あるいはRU24213は,senktideによるscopolomine誘発自発的交替行動障害改善作用にほとんど影響しなかった.(3) SKF38393,RU24213,SCH23390あるいはS(-)-sulpirideは自発的交替行動にほとんど影響しなかった.
関節軟骨の階層構造の形成及び関節軟骨の維持におけるRho調節因子の機能の解析

関節軟骨は階層構造を持つが、その発生・維持のメカニズムは殆ど知られていない。代表者は今までの研究成果から、Rhoファミリータンパクの機能を調節する複数の因子が、関節軟骨で層特異的に発現し、各層に特異的な基質形成を誘導する事で、関節軟骨の階層構造が形成・維持されるのではないかとの仮説に至った。本研究では、このRho調節因子について、発生段階及び病的状態にある関節軟骨での機能を、in vivo、in vitroの両面で解析する。それによって関節軟骨の再生医療や変性治療に有用な知見を得る事が本研究の目的である。
土壌相互作用に基づく環境適応型跳躍移動手法に関する研究

本研究では未知環境における跳躍行動戦略の構築を行う.月・火星のような惑星環境におけるローバの探査では,その場で環境を認識し適切な行動を選択する必要がある.加えて,惑星表面の大部分はレゴリスと呼ばれる砂で覆われており,探査機の移動効率を著しく下げてしまう.そこで本研究では,認識した環境に基づいて探査機自身が適切な行動を選択するアルゴリズムを構築することで探査効率を向上させる.跳躍移動の特徴を生かすことで,周囲の環境を認識しながら目的地に向かうための効率的な行動を選択でき,土壌相互作用に基づいた跳躍軌跡推定により移動の不確実性を考慮することで,経路の安全性も保証される.本研究では未知環境における跳躍行動戦略の構築を行う.月・火星のような惑星環境におけるローバの探査では,その場で環境を認識し適切な行動を選択する必要がある.加えて,惑星表面の大部分はレゴリスと呼ばれる砂で覆われており,探査機の移動効率を著しく下げてしまう.そこで本研究では,認識した環境に基づいて探査機自身が適切な行動を選択するアルゴリズムを構築することで探査効率を向上させる.跳躍移動の特徴を生かすことで,周囲の環境を認識しながら目的地に向かうための効率的な行動を選択でき,土壌相互作用に基づいた跳躍軌跡推定により移動の不確実性を考慮することで,経路の安全性も保証される.
精子・卵子相互作用と不妊症関連遺伝子欠損マウスを用いた不妊機構の解析

1)成熟精子に存在する卵子卵子活性化関連タンパク質の機能発現:(1)イムノグロブリンスパーファミリータンパク質・ラット鞭毛タンパク質MC31/CE9;受精過程におけるMC31/CE9の分子修飾と機能を解析した。MC31/CE9は精巣上体通過中に糖鎖を含む部位のプロセッシングを受けて分子サイズを減少させ、先体反応中に局在が鞭毛から頭部へと移動し、卵子細胞膜との接着に関与した。(2)卵子活性化因子関連タンパク質・精子核周囲関連物質MN13:卵子活性化時期におけるMN13の挙動と機能解析を行った。抗MN13抗体で処理した精子を未受精卵内に注入すると卵子は活性化できなくなり、卵子活性化に関与することが判明した。MN13は受精後紡錘体の両極に移動した。(3)精子先体タンパク質アクリン(MN7):精巣上体成熟過程における精子先体の変化の解析の他、Spergen-1とspergen-2の解析を行った。2)癌関連遺伝子GOPC遺伝子欠損マウスの解析:GOPC遺伝子欠損マウスの雄は典型的な無先体のヒト円形頭部精子症のモデルマウスであった。先体前駆物質は先体への輸送過程で互いに融合しにくいため、核周囲に先体が形成されず、部分的に形成された先体様構造は伸長期細胞時期までに核から脱落した。3)gcl遺伝子欠損マウスの解析:このマウスの雄は多形精子を産生した。gcl分子は核と密接に関連したため、核膜あるいは核の裏打ち構造の成分に何らかの異常があるために精子構成成分の輸送や分配に障害が起こり、また細胞質分離がうまく行かないために多形精子が形成された。4)カルニチントランスポーター2(OCTN2)の分布と局在(精子成熟あるいは閉塞性無精子症による不妊症の解析):OCTN2mRNAは精巣上体遠位部に特異的に強く発現した。OCTN2の発現部位はJVS精巣上体遠位で起こる閉塞性通過障害のやや遠位部に見られ、OCTN2が精巣上体内の精子通過に重要な働きをしていることが判明した。平成14年度に得た結果を記す。1.鞭毛表面タンパク質ベイシジン(43-66K)受精過程におけるベイシジンの分子修飾と機能解析を行い報告した(Saxena et al.,(2002)Reproduction 123,435-444)。主な結果:1)キヤパシテーションと先体反応の過程において、ベイシジンの局在変化(頭部への移動)と分子サイズ減少が起こる。2)ベイシジンは透明帯との結合に関与する。2.精子核周囲関連物質MN13機能解析を行い報告した(Manandhar, G. and Toshimori, K.(2003)Biol. Reprod. 68:655-663)。主な結果:1)抗MN13抗体で処理した精子を未受精卵子に注入すると卵子は活性化できなくなった。従って、MN13は卵子活性化に関与する。2)卵子内に取り込まれたMN13は紡錘体の両極に移動し、発生初期の卵子周期に関与する可能性が示唆された。3.癌関連遺伝子GOPC欠損マウスの解析

このマウスがヒト円形頭部精子症のモデル動物となることを証明した(Yao, R. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA-99:1121H1216.)。主な結果:1)先体が形成されない(無先体円形精子)。部分的に形成されてもやがて脱落する。2)GOPC分子はゴルジ装置由来の輸送小胞構造に関連して局在する。4.gcl遺伝子欠損マウスの解析このマウスは多核多鞭毛精子が形成されることを証明した(Kimura, T.et al. (2003)Mol Cell Biol. 23,1304-1315.)。主な結果:多核多鞭毛精子が形成される原因は、1)細胞質分離がうまく行われないためである。2)gcl分子は核と密接に関連して存在する。5.その他1)表面タンパク質MC31/CE9(26-35K):卵子細胞膜レベルでの相互作用に関与する(投稿準備中)。2)カルニチン(分子量162)と精子成熟/不妊症(閉塞性無精子症)の関係:精巣・精子・生殖組織におけるOCTN2の局在を免疫組織化学的に検索し、現在、in situ hybridizationにより、カルニチントランスポーター遺伝子(mRNA)レベルで、OCTN1-3の遺伝子発現を解析している。3)MN9/エクアトリン分子の精製を行った結果、幾つかのバンドが得られた。1)成熟精子に存在する卵子卵子活性化関連タンパク質の機能発現:(1)イムノグロブリンスパーファミリータンパク質・ラット鞭毛タンパク質MC31/CE9;受精過程におけるMC31/CE9の分子修飾と機能を解析した。MC31/CE9は精巣上体通過中に糖鎖を含む部位のプロセッシングを受けて分子サイズを減少させ、先体反応中に局在が鞭毛から頭部へと移動し、卵子細胞膜との接着に関与した。(2)卵子活性化因子関連タンパク質・精子核周囲関連物質MN13:卵子活性化時期におけるMN13の挙動と機能解析を行った。抗MN13抗体で処理した精子を未受精卵内に注入すると卵子は活性化できなくなり、卵子活性化に関与することが判明した。MN13は受精後紡錘体の両極に移動した。(3)精子先体タンパク質アクリン(MN7):精巣上体成熟過程における精子先体の変化の解析の他、Spergen-1とspergen-2の解析を行った。2)癌関連遺伝子GOPC遺伝子欠損マウスの解析:GOPC遺伝子欠損マウスの雄は典型的な無先体のヒト円形頭部精子症のモデルマウスであった。先体前駆物質は先体への輸送過程で互いに融合しにくいため、核周囲に先体が形成されず、部分的に形成された先体様構造は伸長期細胞時期までに核から脱落した。3)gcl遺伝子欠損マウスの解析:このマウスの雄は多形精子を産生した。gcl分子は核と密接に関連したため、核膜あるいは核の裏打ち構造の成分に何らかの異常があるために精子構成成分の輸送や分配に障害が起こり、また細胞質分離がうまく行かないために多形精子が形成された。4)カルニチントランスポーター2(OCTN2)の分布と局在(精子成熟あるいは閉塞性無精子症による不妊症の解析):OCTN2mRNAは精巣上体遠位部に特異的に強く発現した。OCTN2の発現部位はJVS精巣上体遠位で起こる閉塞性通過障害のやや遠位部に見られ、OCTN2が精巣上体内の精子通過に重要な働きをしていることが判明した。
子宮頸癌の放射線治療効果予測における病理医の早期介入：治療早期の上皮間葉移行評価

子宮頸癌は若年発症が特徴で罹患率は増加傾向を示す。放射線照射が行われるが、個々の腫瘍反応性は異なり治療効果も様々である。放射線照射後再増殖腫瘍の分子メカニズムを解析することで個々の腫瘍の特性に応じた治療効果予測ができる可能性があるのではないかと考えた。これまでの研究結果から放射線照射後の耐性細胞ではHippo経路を介したEMT関連分子及びstemness関連分子の発現誘導、EGFR, PDGFRのリン酸化が関与することがわかった。現在、Hippo経路あるいはEMT経路を抑えて放射線照射を行うことで悪性形質転化を抑制できるか検討中である。個々の腫瘍の性質に応じた個別化診断、それに基づく分子標的治療が施行され、肺腺癌や大腸癌などに対する分子標的治療は、その高い奏功率と副作用が少ない薬剤として、患者さんのQOL及び延命に多大な役割を果たしている。一方、放射線治療においては個々の腫瘍の性質を考慮せず一律な照射が行われており多くの子宮頚癌に有効であるが、一部の癌では、治療後の耐性獲得や悪性形質への変化により早い時期での転移巣の形成などが起きること、実験レベルでは放射線照射後の上皮間葉移行(epithelial-mesenchymal transition: EMT)を介した悪性形質への転換も報告されている。今回我々は、子宮頚癌を対象に患者検体を用いた免疫染色、細胞株を用いた遺伝子変異の解析などによる腫瘍性質の評価放射線治療効果予測、治療への積極的な貢献を目指すことを目的に昨年度に続き以下の検討を行った。4種類の子宮頸癌細胞株(Caski, C33A, SiHa, Hela)を用いて放射線照射(10Gyx1, 2Gyx10)を行いその早期(48時間後)及び再増殖期(21日後)のEMT関連蛋白の発現をreal time PCR法やwestern blotting法を用いて調べた。C33AとCaskiは照射に反応しいずれの放射線照射法においても50%以上の細胞が死に至ったが、SiHaとHelaは放射線照射抵抗性で同じ線量では50%以上の細胞が生き残った。また、C33AとCaskiの放射線照射後再増殖期の細胞ではMMP-2, 9の発現や酵素活性、運動能の亢進を認めた。また、cDNAマイクロアレイ解析結果から、C33Aでは照射早期と細胞増殖期でいずれも照射前に比較して2倍以上の遺伝子発現を認めるものが9個同定された。子宮頸癌の治療法としては、その進行期分類に応じて、手術療法、放射線療法、化学療法などが行われている。そのうち、放射線療法は高い治療効果と低侵襲性が特徴であり根治的治療法としてあるいは術後補助治療としても応用されている。近年、腫瘍の特性に応じた個別化診断を元に様々な分子標的治療が行われているが、放射線療法に関しては腫瘍の性質に応じない一律な治療が行われている。また、他の固形腫瘍の一部では放射線照射による上皮間葉移行(epithelial-mesenchymal transition: EMT)に伴う腫瘍の性質の悪性化も報告されており、放射線治療に関しても個別に効果を判定する必要があると考えた。今回我々は4種類の子宮頸癌細胞株(扁平上皮癌:Caski、C33A、腺癌:Siha, Hela)を用いて、4Gyと10GyのX線照射を行った。照射48時間後及び21日後にmRNA, proteinを回収し間葉系マーカーであるVimentin、EMT関連分子であるSnai, Slug, TwistmRNA及びproteinの発現、MMP-2、9mRNAの発現及び活性をreal time PCR法、免疫沈降法、zymographyを用いて定量した。放射線照射後いずれも細胞株においてもvimentinの発現は増加したが、EMT関連分子の発現はそれぞれの細胞株で異なっていた。また、21日後の表現型の解析ではtranswell migrationがいずれも亢進していた。以上の結果から、放射線照射によりEMT様の現象が起きることを確認したが、その過程で介在するEMT関連分子は異なっていた。よって、それぞれの細胞株で重要と思われたEMT関連分子のノックダウンを行い表現型の評価を今後行う予定である個々の腫瘍の性質に応じた個別化診断、それに基づく分子標的治療が施行され、肺腺癌や大腸癌などに対する分子標的治療は、その高い奏功率と副作用が少ない薬剤として、患者さんのQOL及び延命に多大な役割を果たしている。一方、放射線治療においては個々の腫瘍の性質を考慮せず一律な照射が行われており多くの子宮頚癌に有効であるが、一部の癌では、治療後の耐性獲得や悪性形質への変化により早い時期での転移巣の形成などが起きること、実験レベルでは放射線照射後の上皮間葉移行(epithelial-mesenchymal transition: EMT)やstemnessの獲得による悪性形質への転換も報告されている。近年、Hippo pathwayとEMTやstemnessの関与が報告されている。

外科病理学細胞株を用いたin vitroの実験系では放射線感受性の細胞株と耐性の細胞株が存在し、感受性細胞でも再増殖期にはEMT関連蛋白の発現やその運動能が亢進していることがわかった。現在、EMT関連転写因子のひとつをノックダウンすることによってそれらの表現型への影響を解析中である。免疫染色学的解析では、子宮頸癌の診断時と再発して多発転移から死亡された剖検検体が6症例集まり初診時及び再発転移時それぞれの検体に関してEMT関連蛋白の発現を中心とした蛋白発現プロファイルを検討中である。in vivoの系での検討が未着手であり、早急に検討を進める。4つの細胞株を用いた放射線照射はいずれも予定通り進んでおり、その分子生物学的解析も順次進行中である。その結果から標的となるEMT分子が予測され、今後の研究発展につながると思われる。in vitroの検討と並行してin vivoの転移実験を行う。in vitroの検討で確認されたC33Aの放射線治療後の悪性表現型を示した細胞と放射線照射を行っていないC33Aを用いて、ヌードマウスの尾静脈投与を行い肺転移の個数を評価する。免疫染色を行う対象症例を10症例程度に増やすため関連病院などへの協力を仰ぐ予定である。ヒト検体を用いて、初発及び再発時の腫瘍の免疫染色を進める。現在ヒト検体での解析に関しては共同研究者である婦人科の渡利先生を中心として倫理委員会関係の書類を作成提出済みであり、許可がありれば直ちに免疫染色にて上皮系、間葉系、EMT関連分子の発現を評価する。in vivoの研究に関しては、ノックダウン細胞株をヌードマウスの皮下に移植しその増殖を見る予定である。該当なし
近接場光を用いた生体機能分子の分子構造変化の観察と制御

本研究では、生命現象にとって大切な分子を、細胞内で"機能する状態"そのままに、その動的変化を近接場光を用いて研究する。研究対象とする分子は神経細胞の情報の受け渡しを行うシナプスの機能を担っている蛋白質シナプトタグミンである。シナプスとは神経細胞の間の情報を受け渡しする場所である。脳における情報処理の根幹は、シナプスによる情報の受け渡しにあるとされる。シナプトタグミンはこのシナプスにあって情報の担い手である伝達物質を貯えている小胞の膜に存在し伝達物質を神経細胞が放出するときに重要な役割をになっていると考えられている。この蛋白質分子に遺伝子工学の技術を用いて蛍光を発するアミノ酸配列(GFP)を付け加えて、蛍光シナプトタグミンを作った。この技術は近接場をはじめとする細胞イメージングにとって極めて重要である。すなわち生命現象を担う大切な分子をことごとく蛍光蛋白質分子に変えることができ、生きた細胞で観察することができるからである。全反射モードの近接場顕微鏡を構成し、培養細胞で発現した蛍光シナプトタグミンを、生きた細胞の中で、全反射型近接場光顕微鏡で観察ができた。このようにして近接場光で観察している細胞を興奮するように化学的な刺激を与えると、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がみられ、それとともに斑点状にGFPの蛍光が変化することが見出された。この斑点状の蛍光変化の意味の検討を行うために、細胞からの伝達物質の放出の標識色素FM464を細胞に導入して、伝津物質の放出とシナプトタグミンGFPの蛍光変化の関係を検討した。その結果、伝達物質の放出に伴なってGFPの蛍光変化がおこることが明らかになった。