hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖代謝産物が歯周組織に及ぼす影響の解析と新規歯周組織再生誘導材の開発

当初、この機構に関与する分泌タンパク質のAP-1活性調整機構には、タンパク質のドメインが関与している可能性について検討していた。しかし、今回の解析結果から、分子内結合の一部が深く関与している可能性が示唆された。そこで、この結合が欠損したリコンビナントペプチドを合成し、解析を進めている。また本研究の遂行に伴って、外因性アミノ酸がの一部が、ヒト骨芽細胞と歯肉線維芽細胞の増殖を制御する可能性が判明した。そのため、ホモシステインの関与も含めて解析を進めている。このために、研究計画の一部に遅れが生じている。我々の今年度の解析で明らかになったのは以下の3点である。1.乳酸に代表されるGPR81リガンドをのうち、L-乳酸、D-乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、L-酒石酸、D-酒石酸、プロピオン酸、マレイン酸について骨誘導能について解析を行った。この結果、GPR81リガンドのうち、GPR81と親和性の高い4種類が骨芽細胞および未分化間葉系細胞の骨形成を有意に増加させることが分かった。また、これらの作用は、GPR81を強制発現することで促進作用は強調された。一方で、細胞外GPR81リガンドの一部を細胞内に輸送するMonocarboxylatetransporter 1をノックアウトしてもこの効果は維持された。GPR81リガンドの骨形成誘導におけの効果の1つとして、wntの古典経路の活性化が示唆された。2.間葉系細胞である脂肪細胞と前駆脂肪細胞へのGPR81リガンドの応用では、GPR81を介して抗インスリン様の効果を示し、細胞内のサイクリックAMP濃度を抑制した。さらに、脂肪分解を抑制し、脂肪蓄積を増加させた。またPeroxisome Proliferator-Activated Receptorαの発現が変化し、Lipoprotein lipaseの発現も短時間ながら変化することを突き止めた。3.同じ間葉系細胞である線維芽細胞への応用では、細胞増殖に変化を及ぼさず、FGFファミリーの分泌、受容体発現やIGF-1とマトリックス分泌にも影響を及ぼさなかった。さらにGPR81の強制発現でもノックダウンでも変化を示さなかった。歯周周囲組織の細胞に外因性の乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、酒石酸、プロピオン酸、マレイン酸を添加すると、GPR81受容体を介して、細胞分化が制御された。これは、シトシンの脱メチル化を促進するメチル化シトシンヒドロキシラーゼの活性制御によるものであることと、wnt経路の制御によるものであることとが示唆された。さらに、これらの一部は細胞内に取り込まれ、脂質とアミノ酸代謝能を調整することを見出した。しかしながら、この現象は、同じ間葉系細胞であっても、線維芽細胞では確認が出来なかった。今年度に同定できた数種類の中間代謝産物の臨床応用を目標として、その安全性が重要である。そこで次年度に、まずは以下の2点を解明していきたいと考えている。1.中間代謝産物が転写を促進する、分泌タンパク質の細胞内移動機構の解明2.分泌タンパク質が転写因子と結合する場合の結合様式と結合領域
変動磁場を用いた新たな細胞・組織の凍結保存方法の開発

再生医療の普及には細胞を遠方まで輸送する技術が重要である。しかしながら、細胞は輸送によりダメージを受けるため、現在の技術では高い生存率を保ったままでの長時間輸送は困難である。その解決のためには、凍結による輸送が効果的である。また、再生医療で用いられる細胞は患者本人、あるいはドナー由来の細胞であり、必要時に採取することは負担が大きい。あらかじめ採取して凍結保存することで、安定した細胞の供給が可能となる。本研究では、変動磁場を用いて、食品で使用されている技術を応用した新たな細胞保管技術を開発した。また、幹細胞の保管方法として、組織を直接凍結し、解凍後に幹細胞を採取する方法の有用性を示した。再生医療の普及には、細胞を遠方まで輸送する技術が重要である。しかしながら、細胞は輸送中の温度変化や振動、あるいは栄養供給の不足によりダメージを受けるため、現在の技術では高い生存率を保ったままでの長時間輸送は困難である。この問題を解決するためには凍結状態での輸送が望ましいが、凍結には細胞毒性のある凍結保護剤の使用が必須であるため、解凍後ただちに細胞を投与することはできない。近年、変動磁場を用いる新たな凍結方法が開発され、食品などで実用化されている。本研究では、この変動磁場による凍結法の原理をさらに進め、誘導電流制御による新たな細胞凍結技術の開発を行う。細胞の生存率を変動磁場によって向上させる検討は再現性をもって可能であった。変動磁場以外に、組織に交流と直流を同時に印加することで、凍結融解後の組織破壊が軽減されることが報告されている。この方法を組織に適応するために、専用の装置を開発し、さらに無菌的に保管が可能な導電性の袋を用いた実験を行なった。交流と直流の電圧を変化させ、さらに電流を凍結後期にOFFにした場合の細胞の生存率について検討を行なった。電圧上昇させると、細胞の生存率は低下した。また、一定の電圧において20%程度の生存率の増加が認められた。しかしながら、変動磁場による凍結と比較して安定した生存率の向上は得られなかった。本研究の目的は、マウス皮膚組織、および皮膚組織由来の線維芽細胞を用いて、凍結保護剤を用いない条件における細胞凍結方法を開発することである。凍結保護材には細胞毒性があるため、現在の凍結細胞は解凍後ただちに洗浄処置が必要となる。しかしながら、凍結保護材を用いない凍結が可能となれば、解凍後特別な設備のない施設でも使用が可能となるため、細胞製品、あるいは再生医療製品の広い応用につながることが期待される。本研究では、マウス皮膚由来線維芽細胞を用意し、変動磁場を用いたプログラムフリーザーを用いて、解凍後の生存率、翌日の生存率、および継代された細胞の増殖率を検討した。具体的にはP1の細胞マウス線維芽細胞を用い、5×105個の細胞を1mLの100%FBSに懸濁して凍結チューブに入れ、強度(電圧)および変化率(周波数)を変化させ、細胞凍結を行った。翌日、凍結した細胞を解凍し、生細胞数をカウントした後、10cm dishに播種した。培養1日後、細胞を回収して再び生細胞数をカウントし、生細胞数と生細胞率を算出した。細胞は10Hz,1Vにおいてもっとも高い生存率を示し、磁場を用いない場合の生存率と比較して平均5倍となった。生存率は実験によって異なるが、20ー45%の間で変動した。次に、組織のままで凍結するための条件についても検討した。剃毛したマウス皮膚から径5mm大の組織を切り出した。丁寧に脂肪組織を除去し、初めに10%DMSOを含む培地中で凍結を行った。解凍後にexplant cultureを行い、細胞数、幹細胞マーカーの発現、コラーゲンの産生能を測定した。コントロールとして、凍結を行わずに培養した細胞を細胞の状態で凍結、解凍したものを用いた。得られた細胞はCD105など幹細胞マーカーを発現し、そのプロファイルはほぼ直接培養を行った群と同様であった一方凍結保護材を用いない条件では、十分な生細胞数を得ることが困難であった。口腔外科学実験に必要な手技に習熟しており、予定した研究はスムーズに実行することができた。今後は凍結された細胞の電子顕微鏡による組織学的検討や、電流を使用した凍結などを通じて、さらに生存率を高めるための検討を行なっていく予定である。2013年度予算として1,798円が次年度へ繰り越しとなっているが、この残額で試薬等の購入が困難であったためである。次年度予算と一括とすることで、必要物品の購入に充てることが可能である。
東アジアから飛来する大気エアロゾル中炭素成分の放射性炭素測定に基づく起源の特定

本研究の目的は、東アジア地域における大気エアロゾル中に存在する炭素成分の発生源と挙動を理解することである。特に、様々な有害化学物質のプラットホームとしての機能を果たしつつ、人間の肺胞などにも容易に吸入されてしまい、様々な健康被害を与えることが懸念され、また、広域にわたって輸送される黒色炭素(BC)に注目し、発生源の特定は大気環境の改善のためにも、施策を策定する上でも重要な研究課題であると考えられる。大気エアロゾルの採取は国立環境研究所大気・エアロゾル観測ステーション(NIES-CHAAMS)で行った。エアロゾルサンプルは2週間単位でハイボリウムエアサンプラー(1000 L min-1)を用い、石英ろ紙上に粒径10μm(PM10)以下の大気エアロゾルを捕集した。2008年には比較的弱い黄砂イベントが3月と4月に発生した。黄砂イベント時に収集したデータは、6月の非黄砂イベント時に収集したデータと比較した。14C/12C比の測定は国立環境研究所タンデム加速器分析施設(NIES-TERRA)にて、加速器質量分析装贋(AMS)で行った。黄砂イベント期間中のAPMの濃度(Hedo-1からHedo-3; mean=22.0μg m-3)は、非黄砂イベント期間(Hedo-7 and Hedo-8;mean=6.64μg m-3)に比べて約3倍高い値を示していた。黄砂イベント期間中のOC濃度は非黄砂イベント期間の約2倍であった。BC濃度もまた黄砂イベント期間のサンプルのほうが高い値(39%)を示したが、その差はわずかであった。これらの結果は、PM10とOC濃度は黄砂イベント期間に明らかに高くなる傾向を示唆しているが、BC濃度はPM10とOC濃度と同じ規模で増加しなかった。黄砂イベント期間中に採集したサンプル中のBCとOCのpMC値(mean=45.6% and 65.9%)は非黄砂イベント期間(mean=69-4% and 93.2%)と比べるとはるかに小さい値を示し、黄砂イベント期間の化石燃料に起因する炭素の強い影響力を示唆していた。黄砂期間のBC濃度の増加は、化石燃料に起因する炭素の増加に寄与されていた。BC中のバイオマスに起因する炭素濃度(mean±1 standard deviation=27.9±3.2 ngm-3)が全てのサンプリング期間で比較的類似していたことは、注目する点である。現在、この傾向について完全に説明することは出来ないが、沖縄に到来する気団の方向に影響を受けなかったことから、BC中のバイオマスに起因する炭素濃度は沖縄におけるバックグラウンドのBCレベルとみなすことができると考えられる。Hedo-1からHedo-3サンプルのOCは明らかに化石燃料に起因する割合が高いが、バイオマスに起因するOCもOC濃度の増加に寄与しており、黄砂イベント期間におけるOC濃度の増加は、単に化石燃料に起因する炭素の増加によるものではなかった。非黄砂イベント期間において、OC濃度の支配的な割合は、沖縄でのバイオマスに起因する炭素が原因であると考えられる。APM濃度は、非黄砂期間(辺戸-7、辺戸-8:平均値=6.64μgm-3)より黄砂期間(辺戸-1から辺戸-3:平均値=22.02μgm-3)のほうがほぼ3倍高かった。TOC濃度は、黄砂期間のほうが、およそ2倍高かく、EC濃度は黄砂期間のほうがわずかに高かった。これらの結果から、APMとTOC濃度が黄砂期間に明らかにより高かったことを示唆したが、EC濃度はAPMとTOCほど増加しなかった。ECとTOCのpMCは、非黄砂期間(59.8%と87.4%)より黄砂期間(39.3%と62.0%)のほうが非常に小さかった。これは、黄砂期間に化石燃料由来カーボンの強い影響を示していると考えられる。黄砂期間中、ECのpMC値は、2003年と2004年の春に東京で採集されたエアロゾル(PM1.1)から得られた値(38.9%)とほぼ近い値を示していた(Yamamoto et al., 2007)。一方で、黄砂期間中のTOCのpMC値は、東京の値(46.4%)より非常に大きかった。このことから、沖縄で採集したエアロゾル中のTOCのpMC値により、バイオマス由来カーボンの影響がより重要であることが示唆される。pMCから算出したTOC、EC中の化石燃料由来カーボンとバイオマス由来カーボンの割合や、ECとTOC中のバイオマスと化石燃料由来カーボンの比較をでは、黄砂期間のEC濃度の増加は、化石燃料由来カーボンの増加に寄与されていた。EC中のバイオマス由来カーボン濃度(27.9±3.2ngm-3)が全てのサンプリング期間で比較的類似していたことは、注目する点である。現在、この傾向について完全に説明することは出来ないが、沖縄に到来する気団の方向に影響を受けなかったことから、EC中のバイオマス由来カーボン濃度は沖縄におけるバックグラウンドのECレベルとみなすことができると考えられる。次に、黄砂期間中のTOC濃度に関し、辺戸-1から辺戸-3サンプルでは、他の期間に比べ明らかに化石燃料由来カーボンの占める割合が強い。このことは黄砂期間中のEC中の化石燃料由来カーボンの不完全燃焼の一部がTOCの化石燃料由来カーボンの割合を増やしていると考えられる。

一方で、辺戸-4から辺戸-8サンプルの化石燃料由来カーボンの占める割合は少なく、バイオマス由来カーボンが80.8%以上を占め、平均でも85.6%を占めていた。このことから、TOC濃度の増加は、単純に化石燃料由来カーボンの増加に寄与していなかった。本研究の目的は、東アジア地域における大気エアロゾル中に存在する炭素成分の発生源と挙動を理解することである。特に、様々な有害化学物質のプラットホームとしての機能を果たしつつ、人間の肺胞などにも容易に吸入されてしまい、様々な健康被害を与えることが懸念され、また、広域にわたって輸送される黒色炭素(BC)に注目し、発生源の特定は大気環境の改善のためにも、施策を策定する上でも重要な研究課題であると考えられる。大気エアロゾルの採取は国立環境研究所大気・エアロゾル観測ステーション(NIES-CHAAMS)で行った。エアロゾルサンプルは2週間単位でハイボリウムエアサンプラー(1000 L min-1)を用い、石英ろ紙上に粒径10μm(PM10)以下の大気エアロゾルを捕集した。2008年には比較的弱い黄砂イベントが3月と4月に発生した。黄砂イベント時に収集したデータは、6月の非黄砂イベント時に収集したデータと比較した。14C/12C比の測定は国立環境研究所タンデム加速器分析施設(NIES-TERRA)にて、加速器質量分析装贋(AMS)で行った。黄砂イベント期間中のAPMの濃度(Hedo-1からHedo-3; mean=22.0μg m-3)は、非黄砂イベント期間(Hedo-7 and Hedo-8;mean=6.64μg m-3)に比べて約3倍高い値を示していた。黄砂イベント期間中のOC濃度は非黄砂イベント期間の約2倍であった。BC濃度もまた黄砂イベント期間のサンプルのほうが高い値(39%)を示したが、その差はわずかであった。これらの結果は、PM10とOC濃度は黄砂イベント期間に明らかに高くなる傾向を示唆しているが、BC濃度はPM10とOC濃度と同じ規模で増加しなかった。黄砂イベント期間中に採集したサンプル中のBCとOCのpMC値(mean=45.6% and 65.9%)は非黄砂イベント期間(mean=69-4% and 93.2%)と比べるとはるかに小さい値を示し、黄砂イベント期間の化石燃料に起因する炭素の強い影響力を示唆していた。黄砂期間のBC濃度の増加は、化石燃料に起因する炭素の増加に寄与されていた。BC中のバイオマスに起因する炭素濃度(mean±1 standard deviation=27.9±3.2 ngm-3)が全てのサンプリング期間で比較的類似していたことは、注目する点である。現在、この傾向について完全に説明することは出来ないが、沖縄に到来する気団の方向に影響を受けなかったことから、BC中のバイオマスに起因する炭素濃度は沖縄におけるバックグラウンドのBCレベルとみなすことができると考えられる。Hedo-1からHedo-3サンプルのOCは明らかに化石燃料に起因する割合が高いが、バイオマスに起因するOCもOC濃度の増加に寄与しており、黄砂イベント期間におけるOC濃度の増加は、単に化石燃料に起因する炭素の増加によるものではなかった。非黄砂イベント期間において、OC濃度の支配的な割合は、沖縄でのバイオマスに起因する炭素が原因であると考えられる。
ポストコロニアルの視座から見るフランス近現代美術の状況

4月から5月にかけて、フランスの都市郊外に暮らす人々をテーマとした制作を行っている作家ヴァレリー・ジューヴの映像作品に関する調査を行い、作家および映像作品配給会社Light Coneに連絡を取った。8月には、Aesthetics(国際版『美学』)第22号に拙稿“Transformation etsignifications de lanotion delyrisme :Aproposdes theories del'art dans les annees 1910-20"が掲載された。次年度に現地で調査を行うための準備として、FRAC(Fonds Regionaux d'Art Contemporain)Reunionの活動について資料収集を行い、1月には、現代美術のギャラリーGalerie Dohyang Leeに所属する作家について調査を行った。3月には、「分身の会」において、フランスにおけるポストコロニアル概念をめぐる議論について報告を行った。研究代表者がこれまでに行ってきたシュルレアリスム研究の一環として、現在、イギリスの美術批評家ハーバート・リードがフランスのシュルレアリスムの影響を受けて主導し、ヘンリー・ムーアらが参加したイギリスの近代美術・建築運動「ユニット・ワン」および日本の近現代美術におけるシュルレアリスムの動向に関しても文献資料の収集と調査を進めており、現在、書評の執筆と翻訳を進めている。本研究の特色はフランスの近現代美術がヨーロッパ中心主義への批判に対してどのように向き合ってきたのかを問う点にあり、フランスおよび仏海外県・海外領土の美術館、FRAC、アートセンター、ギャラリー等における展示や収蔵作品の傾向、施設の整備状況や運営体制を調査する準備を進めている。研究代表者の業務により、予定している計画より遅れているため、次年度を含めた期間で研究を遂行予定である。次年度も引き続き美術館、ギャラリー、作家にコンタクトを取り、調査を行うとともに、文献の翻訳を進める。初年度に計画していた海外調査の予定を変更し、次年度に実施することにしたため。
「縁」概念に着目した宗教的共同性の研究：チベットのボン教徒を中心に

本研究は、グローバルに展開するチベットの宗教文化を主な対象に、宗教を実践する人びとの間に形成される共同性を「縁」概念に着目して解明することを目的としている。平成30年度においては、宗教的共同性に関する先行研究文献や、チベット仏教およびボン教の僧侶による著作の収集と分析を継続するとともに、ボン教僧院におけるフィールド調査を実施した。文献調査においては、チベットの高僧の伝記の精読を継続し、その中における「縁」「因果」「業」といったことばの用例を収集した。今年度はチベット仏教の重要人物の伝記や、僧院生活を扱った文献も分析対象とした。また、縁と共同性に関する文献分析を哲学、宗教学分野にも拡大し、縁を仏教的な文脈にとどまらない形でコミュニティ論と接続するための道筋を探った。そこから、異質なもの同士の出会いが新たな共同性を生み出す過程に関する考察を行った。フィールド調査においては、こうした理論的背景をもとにして、インド、ヒマーチャル・プラデーシュ州のボン教僧院における調査を行った。僧院の座主就任儀礼の参与観察と、世界各地から儀礼に参加したボン教徒に対するインタビュー調査を実施した。とくに、アメリカ、ニューヨークを拠点として活動するボン教僧侶と米国人信徒に対するライフストーリー調査を重点的に行い、かれらがいかなる過程をへてボン教と出会い、そこに「縁」のリアリティを感じるか、それを英語とチベット語でどのように表現するのかを調査した。関連する成果について、研究会での口頭発表および論文にまとめ公表した。今年度は、予定していた通りのフィールド調査を行い、文献調査を含めて、チベットにおける「縁」概念の用法と宗教的共同性をめぐる議論との接続について知見を整理することができたため。これまで得られた知見を踏まえて、引き続き文献調査およびフィールドワークによる研究を進めていくとともに、成果の公表につとめる。また、チベットの事例を他の宗教や哲学・思想との対話の中で深化し、従来のコミュニティ論にフィードバックしていく必要性が明らかになったので、本研究計画の範囲内で関連する調査研究を進めていきたい。平成28年度においては、宗教的共同性に関する研究文献や、チベット仏教およびボン教の僧侶による著作を対象にした調査を行い、本研究の理論的基盤の構築を目指した。その過程で、縁概念をいくつかのカテゴリーに分類し、相互の関係について考察した。文化人類学および関連分野においてもちいられてきた社会関係をあらわす概念としての縁を「社会的縁」としてとらえ、生得的な社会関係から成長に伴って加入する組織、個人を基盤とするネットワークへとその変容を跡づけた。こうした変容の中で、縁は個人が自立した主体として選び取るものとしての性格が強化されてきたことを見いだした。一方、チベット仏教をはじめとする仏教の教理哲学で構築されてきた、世界と事物の成り立ちを説明するための縁を「哲学的縁」としてとらえ、その用例について分析した。このカテゴリーは、インド思想から初期仏教にみられる因果説から、チベット仏教中観派を中心とする縁起説まで、多様な展開をとる。文献調査を進める中で、仏教以外の宗教における類似の概念、たとえばキリスト教における「神の摂理」との共通点や相違点を明らかにするという課題も提起された。これらを架橋するために、非日常的経験の中で非主体的に巻き込まれる経験を捉えるための視座として「宗教的縁」を提起した。これまで収集してきたチベットにおける僧侶および俗人のライフストーリーから、人生の転機となった縁の体験を抽出し、それが仏教的因果関係で説明される場合と、むしろ説明不可能なものとして語られる場合があることを見いだした。特に後者の要素を説明するための、チベット固有の概念について分析を開始した。平成28年度においては、本研究の理論的基盤となる視座の構築を行うことを目的としていたため、その目的はおおむね達成された。その一方で、予定していた通りのフィールド調査を行うことができなかったため、本年度に得られた知見を踏まえた上で、次年度において追加の調査を行い、計画に沿った知見が得られるようにする。平成29年度においては、宗教的共同性に関する先行研究文献や、チベット仏教およびボン教の僧侶による著作の収集と分析を継続するとともに、ボン教僧院におけるフィールド調査を実施した。文献調査においては、チベットの高僧の伝記の精読を行い、その中における「縁」「因果」「業」といったことばの用例を収集した。今年度はボン教僧侶に加えて「ツォンカパ伝」や「ミラレーパ伝」など、チベット仏教の重要人物の伝記も分析対象とした。そこでは、人生の転機となる出来事や出会いは、仏教/ボン教の教えとの縁によってもたらされるものであり、過去の行為に起因するものであることが示唆されるが、その具体的な過程は明示されない、もしくは凡人には不可知とされることが多い。そのため、この過程を解釈する際に、土着のものを含めた多様な概念が入り込む余地があると考えられる。フィールド調査においては、中国四川省成都市のボン教徒、および松潘県のボン教僧院を対象とした調査を行った。とくに後者においては、研究代表者が2005年以来調査を継続しているS僧院(仮称)集会堂改築に伴う落慶法要の参与観察を行い、参列者と僧院のつながりについての資料を収集した。並行して、ボン教僧侶のライフストーリー調査を行った。

ボン教の僧院は僧院長の系譜に基づく血縁関係と、宗教的空間を共有する地縁関係を基盤とする複雑なネットワークを構築しているが、それに加えて近年個別の地域性をこえた「ボン教徒」としてのつながりが大きな役割を果たしていることが明らかになった。今年度は、昨年度に構築した理論的視座を踏まえたフィールド調査を行うことを目的とし、予定していた通りのフィールド調査を行い、文献調査を含めてチベットにおける「縁」概念の用法をめぐる知見を整理することができた。また、本研究に関連する成果として、論文3篇を公表した。このため、昨年度の遅れを挽回し、当初の計画通り次年度の研究を実施できる見通しがたったと考える。本研究は、グローバルに展開するチベットの宗教文化を主な対象に、宗教を実践する人びとの間に形成される共同性を「縁」概念に着目して解明することを目的としている。平成30年度においては、宗教的共同性に関する先行研究文献や、チベット仏教およびボン教の僧侶による著作の収集と分析を継続するとともに、ボン教僧院におけるフィールド調査を実施した。文献調査においては、チベットの高僧の伝記の精読を継続し、その中における「縁」「因果」「業」といったことばの用例を収集した。今年度はチベット仏教の重要人物の伝記や、僧院生活を扱った文献も分析対象とした。また、縁と共同性に関する文献分析を哲学、宗教学分野にも拡大し、縁を仏教的な文脈にとどまらない形でコミュニティ論と接続するための道筋を探った。そこから、異質なもの同士の出会いが新たな共同性を生み出す過程に関する考察を行った。フィールド調査においては、こうした理論的背景をもとにして、インド、ヒマーチャル・プラデーシュ州のボン教僧院における調査を行った。僧院の座主就任儀礼の参与観察と、世界各地から儀礼に参加したボン教徒に対するインタビュー調査を実施した。とくに、アメリカ、ニューヨークを拠点として活動するボン教僧侶と米国人信徒に対するライフストーリー調査を重点的に行い、かれらがいかなる過程をへてボン教と出会い、そこに「縁」のリアリティを感じるか、それを英語とチベット語でどのように表現するのかを調査した。関連する成果について、研究会での口頭発表および論文にまとめ公表した。今年度は、予定していた通りのフィールド調査を行い、文献調査を含めて、チベットにおける「縁」概念の用法と宗教的共同性をめぐる議論との接続について知見を整理することができたため。これまで得られた知見を踏まえて、引き続き文献調査およびフィールドワークによる研究を進めていくとともに、成果の公表につとめる。特に、今年度新たに収集できなかった僧侶のライフストーリーについて、積極的に一次資料の収集を行っていく。また、今年度の調査から、本研究が扱う宗教的共同性が、個別の宗教を越えた普遍的な課題へと接続していることが提起されたので、本研究計画の範囲内で、関連する文献調査を進めていきたい。
Optical stimulationを用いたBMIの培養細胞による安全性評価

次世代のBrain Machine Interface (BMI)には、より精細な情報のインプットのために空間分解能の向上が必要である。現在、電気刺激によるBrain MachineInterfaceが研究されているが、分解能向上には注入電荷量の制限による電極の微細化の限界、および多極化による電気配線の増加がボトルネックである。そこで、非結線で刺激が可能かつ直接神経組織に接触せず、構造によっては広範囲刺激も可能となり得る、光刺激によるBrain Machine Interfaceの開発と安全性の確認を行っている。本研究では、光応答性のない神経細胞にPhotoswitchと呼ばれる化合物により光応答性を付与する研究に取り組んでいる。本年度はPhotoswitchのうちBENAQの合成を試みた。BENAQの前駆体であるNitroazobenzen S1およびAminoazobenzen 4の合成が安定して行えるようになった。合成したAminoazobenzen 4の末端にAcid chloride Fを修飾するとBENAQを得ることができるが、Acid chloride Fが化学的に不安定であり、BENAQの合成に至ってない。その原因が溶媒中に存在する、水および酸素であることを結論づけた。また、Acid chloride Fの前駆体であるベタインがベタイン類の中で一般的なトリメチルグリシンでなく、トリエチルグリシンが必要なことも判明した。市販されていない物質で、トリエチルグリシンの合成も必要となる。次年度以降は、トリエチルグリシンの合成を行い、最終合成過程に必要な間接条件を確立し、PhotoswitchのうちBENAQおよびDeNAQの合成を行う予定である。合成したPhotoswicthを用い光刺激に対する閾値および繰り返し暴露による応答の安定性、安全性の検証に着手する。合成に必要なAcid chloride Fの前駆体のベタインが一般的なトリメチルグリシンでなく、トリエチルグリシンが必要なことが判明し、トリエチルグリシンは市販試薬として販売されていない化合物であるため、ベタインの合成から必要になったためベタインの合成を早急に行い、完成されたPhotoswitchを得る。Photoswitchの合成に至らなかったため、本年度導入予定であった光刺激装置の導入は次年度に行う。合わせて赤外線刺激による光応答についても安全性を確認する。現在、電気刺激によるBrain Machine Interfaceが研究されているが、分解能向上には注入電荷量の制限による電極の微細化の限界、および多極化による電気配線の増加がボトルネックである。BENAQの前駆体であるNitroazobenzen S1およびAminoazobenzen 4の合成を行い、NMRにて合成の成功を確認できた。各合成プロセスにおける反応温度および時間、分取クロマトグラフィーの精製条件など、間接的な合成条件を得ることができた。合成に必要なAcid chloride Fの前駆体のベタインが一般的なトリメチルグリシンでなく、トリエチルグリシンが必要なことが判明し、トリエチルグリシンは市販試薬として販売されていない化合物であるため、ベタインの合成から必要になったため最終合成過程であるAminoazobenzen 4末端にAcid chloride Fを修飾するプロセスの確立を早急に行い、完成されたPhotoswitchを得る。

ベタインの合成を早急に行い、完成されたPhotoswitchを得る。Photoswitchの合成に至らなかったため、本年度導入予定であった光刺激装置の導入は次年度に行う。合わせて赤外線刺激による光応答についても安全性を確認する。BENAQ合成の最終合成過程であるAminoazobenzen 4末端にAcid chloride Fを修飾するプロセスにおいて、当初予期していなかったAcid chloride Fの不安定性が問題になり、BENAQの合成まで至らなかった。次年度以降に完成されたPhotoswitchを得る予定であり、そのため本年度導入予定であった光刺激装置の導入は次年度に行う。BENAQ合成の最終合成過程であるAminoazobenzen 4末端にAcid chloride Fを修飾するプロセスにおいて、当初予期していなかったトリエチルグリシンの合成が必要になり、BENAQの合成まで至らなかった。また、MEAアンプが故障し修理のため予定外の支出が生じた。
全ゲノムデータを基盤とする大規模な遺伝子情報を指標とした霊長類の系統的起源の解明

本研究の目的は、レトロポゾンと呼ばれるゲノム中の散在性反復配列の挿入パターンを指標として哺乳類の目間の系統解析をおこない、霊長類の系統的起源を解明することである。哺乳類の中でも古くに分岐した系統関係に関しては、膨大な遺伝子情報の解析、およびレトロポゾンの挿入を指標とした系統解析が強力な手法となる。本研究ではまず様々なレトロポゾン情報をゲノムDNAライブラリおよびデータベースから収集した。一方で、大量の遺伝子配列情報に基づいた哺乳類系統樹の再構築をおこなった。その結果、哺乳類の中でも比較的初期に分岐した北方獣類、アフリカ獣類、貧歯類の関係について興味深い結果が得られた。収集した遺伝子配列データを塩基レベル、アミノ酸レベル、コドンレベルで解析した結果、全く異なる結果が得られた。特に全塩基配列を繋げた配列をそのまま解析するといった一般的によく用いられる手法ではアフリカ獣類と貧歯類の単系統性を非常に強く支持した。しかしこの配列データを遺伝子ごとの進化速度・進化パターンの違いを考慮して再解析した結果、上記のいずれのレベルにおいてもアフリカ獣類が最初に分岐したという結果を得た。このことから明らかになったことは、大量遺伝子データを用いた分子系統学においては、遺伝子ごとの進化速度やパターンの違いを考慮に入れなければ大きく誤った結果を導いてしまう危険性があるということである。近年の分子系統学においては豊富なデータ量を用いた系統解析が主流であるが、この研究によってその問題点と解決策について重要な提言をおこなった。
戦争法秩序の規範構造

本研究は、戦争法がいかなる構造の下で規範的に機能し得るのかを、歴史的展開に即して検討することを目的としている。本年度は、戦争法の中核的問題である戦争犯罪処罰制度における非戦闘員の敵対行為の法的評価に焦点を絞り、こうした本研究の課題に取り組んだ。従来の戦争法違反者たる戦争犯罪人の処罰について、慣習国際法は、当該違反者を補足した交戦国に処罰権を認めるにとどまっていた。したがって、たとえ補足された者が戦争法違反者であっても、結局は各国の(軍事)刑法上の国内犯罪人として処罰されたのである。この意味において、少なくとも従来の戦争犯罪処罰制度の側面において、戦争法秩序は各国国内法に基づく国内法秩序に基盤を有していたと言える。こうした構造を背景に、非戦闘員の敵対行為に関するこれまでの学説も、当該行為を戦争法上禁止されるか否かといった国際法秩序の平面で捉えることなく、もっぱら交戦国の国内(刑法)秩序の枠組みで捉えていた。しかしながら、戦後のニュールンベルクおよび東京裁判以降、国際法違反者は、各国の国内裁判所での処罰対象にとどまらず、国際裁判所での処罰対象となり得る。つまり、戦後の戦争法秩序は、国際刑事裁判所を中心とする国際犯罪処罰制度に象徴されるように、各国の国内法秩序-主権国家体系を超えた規範構造を有するに至ったのである。このことに鑑みれば、非戦闘員の敵対行為をこれまで国際法の平面ではなくもっぱら国内刑法の平面でとらえてきたこれまでの一般的学説は再構成を迫られていると言えよう。では、非戦闘員の敵対行為は、国際法上どのように評価され得るのか。本年度は、オランダ・ハーグおよびスイス・ジュネーヴで一次資料の収集を行い検証を進めた結果、当該行為が戦争法上禁止される背信行為であることがわかった。したがって、上述した国内刑法秩序を基盤とした戦争法秩序から国際犯罪処罰制度を基礎とする戦争法秩序に転換した今日において、戦争法(戦時国際法)違反であることは、国内犯罪人を超えて国際犯罪人となり得る。本年度は、現代における戦争法秩序の一翼を構成する、1899年および1907年の「陸戦ノ法規慣例ニ関スル条約」(ハーグ条約)の基礎的研究を行った。具体的には、1863年の米国一般命令第百号を研究対象とした。同命令は、ハーグ条約に影響を与えた現代戦争法の起源と高く評価されており、本研究課題である戦争犯罪処罰制度の問題を検討する上では必要不可欠の素材である。このことから、まず、本研究課題の観点からこの米国一般命令第百号に関する今日の評価がいかなるものかについて先行研究の調査を行い、その結果、先行研究が、不正現兵に対する処罰制度はもっぱら国際法の埒外にあるがゆえに国内法違反として処理する現代の犯罪人処罰制度の始まりとして同命令の意義を評価していることが明らかとなった。次に、こうした先行研究の評価をふまえて、米国一般命令第百号が、本当に先行研究の評価するような法制度を有していたかどうかの検討作業に移った。具体的には、同命令の起草過程の調査を行い、そのために、起草者であるFrancis Lieberの戦争法講義録、個人書簡、そして南北戦争時の米国北部連合軍の公式記録を検討しに米国ジョンズホプキンス大学(ボルチモア)、ワシントンの米国公文書館(NARA)そしてハンティントン図書館(サンマリノ)を訪問した。その結果、米国一般命令第百号の規定する不正規兵の処罰制度は、従来の先行研究が評価するような、国際法の埒外にあるがゆえに国内法違反としてとらえるものではなく、国際法違反として国内処罰するものであることがわかった。以上の結果は、現代戦争法とは異なる法構造を米国一般命令第百号は有していたことを実証するものであり、同命令を現代戦争法秩序の起源として現代の法解釈論に位置づけるこれまでの先行研究の妥当性に異議を提示してその転換をせまる有意義な成果である。以上。

では、非戦闘員の敵対行為は、国際法上どのように評価され得るのか。本年度は、オランダ・ハーグおよびスイス・ジュネーヴで一次資料の収集を行い検証を進めた結果、当該行為が戦争法上禁止される背信行為であることがわかった。したがって、上述した国内刑法秩序を基盤とした戦争法秩序から国際犯罪処罰制度を基礎とする戦争法秩序に転換した今日において、戦争法(戦時国際法)違反であることは、国内犯罪人を超えて国際犯罪人となり得る。
脂質メディエーター分解酵素を標的とした肺線維症の新規治療法の基盤開発

スフィンゴシン1-リン酸(S1P)とリゾホスファチジン酸(LPA)は生体膜を構成するリン脂質の代謝産物であり,肺線維症に関与する重要な脂質メディエーターである。網羅的遺伝子発現解析から,S1PとLPAの分解活性を持つ脂質リン酸ホスファターゼ3(LPP3)の遺伝子発現が線維化肺で低下していることを見出した。以上の研究成果から,LPP3は肺線維化抑制因子の一つとして重要であると考える。本研究では,「線維化肺では,S1PとLPAの分解酵素LPP3の発現低下がS1PとLPAの蓄積を引き起こし,線維化を促進する。」という仮説を検証し,LPP3を標的とした肺線維症の治療法の開発に繋げる。
造血幹細胞の自己複製と分化の制御機構の解明とその再生医療への応用のための基盤研究

Gemininは、造血幹細胞の自己複製と静止期維持を同時に制御する造血幹細胞制御の鍵分子の候補であり、Gemininの発現や機能の精妙な操作により造血幹細胞活性を支配することができると考えられる。本研究では、Geminin-EYFPノックインマウス由来の骨髄細胞から、静止期の造血幹細胞と自己複製中の造血幹細胞を分画し、その遺伝子発現の違いをシングルセルレベルで解析した。また、Gemininを自在に発現導入できるシステムとして、膜透過型リコンビナントGemininタンパク質を作成した。細胞ソーティング法により、Geminin-EYFPノックインマウスの骨髄細胞から造血幹細胞を分画し、Gemininの発現レベルによりさらに亜分画に分けた。このマウスにBrdUを投与し細胞周期解析を行いCD34-KSL Geminin-high細胞がS/G2/M期の細胞であることを確認した。次に単離したCD34-KSL Geminin-high細胞を致死的放射線照射したマウスに移植し、移植細胞から細胞周期の各期にある造血幹細胞が出現すること、そしてさらに各細胞系譜の前駆細胞や成熟血球細胞が長期にわたって生み出されることを確認し、CD34-KSL Geminin-high細胞が機能的にも自己複製中の造血幹細胞であることを確認した。そして、それらの分画における造血幹細胞や前駆細胞のマーカー遺伝子群や自己複製と分化の制御に重要とされる遺伝子群の発現をFludigm社のシングルセルRT-PCRシステムを用いて解析を行った。一方、Geminin-EYFPノックイン骨髄細胞に導入することを目的に、赤色蛍光をマーカーにしたレトロウイルスベクターを用いたGeminin高発現系、shRNAを用いたノックダウン系、またはGeminin発現変化系(Geminin-MERやGeminin-Tetoff)作成を試みた。しかし、赤色蛍光マーカーをいろいろ試したが、細胞毒性が問題となり、高発現を維持する赤色マーカーを持ったレトロウイルスシステムの作成は難航している。現在、別のGeminin発現操作法として膜透過型リコンビナントGemininタンパク質の有用性に着目し、基礎実験を行っている。現在、幹細胞マーカーのみならず、アポトーシス、細胞生存シグナル、相同組換え修復、非相同組換え修復、p53関連、DNA複製ライセンス化、細胞周期などのマーカーを加え、幅広くシングルセルの遺伝子発現情報を収集している。別のGeminin発現操作法として膜透過型リコンビナントGemininタンパク質の有用性に着目し、基礎実験を行った。上記のごとく、自己複製中の造血幹細胞のプロスペクティブ同定法の開発については当初の予定よりも順調に進展した。一方、Geminin発現操作法の確立については、赤色蛍光を共発現するレトロウイルスベクター系は、赤色蛍光タンパク質の細胞毒性のため生細胞を維持することに困難性がでる可能性があることがわかった。また、シングルセル解析は、多様なマーカーを組み合わせて多面的な幹細胞の遺伝子発現の状態を捉えることができるようになってきた。前年度までに、細胞ソーティング法により、Geminin-EYFPノックインマウスの骨髄細胞から造血幹細胞を分画し、Gemininの発現レベルによりさらに亜分画に分けた。本年度は、幹細胞マーカーのみならず、アポトーシス、細胞生存シグナル、相同組換え修復、非相同組換え修復、p53関連、DNA複製ライセンス化、細胞周期などのマーカーを加え、幅広くシングルセルの遺伝子発現情報を収集した(論文準備中)。

一方、Geminin-EYFPノックイン細胞に導入することを目的に、赤色蛍光をマーカーにしたレトロウイルスベクターを用いたGeminin発現操作系の作成を試みた。しかし、赤色蛍光マーカーは細胞毒性が問題となり、高発現を維持する赤色マーカーを持ったレトロウイルスシステムの作成は難航した。そこで別のGeminin発現操作法として膜透過型リコンビナントGemininタンパク質の有用性に着目し、Gemininタンパク質の細胞内への迅速な誘導と迅速な消退が可能であることを証明し、論文を作成した(PLoS One 2016)Gemininは、造血幹細胞の自己複製と静止期維持を同時に制御する造血幹細胞制御の鍵分子の候補であり、Gemininの発現や機能の精妙な操作により造血幹細胞活性を支配することができると考えられる。本研究では、Geminin-EYFPノックインマウス由来の骨髄細胞から、静止期の造血幹細胞と自己複製中の造血幹細胞を分画し、その遺伝子発現の違いをシングルセルレベルで解析した。また、Gemininを自在に発現導入できるシステムとして、膜透過型リコンビナントGemininタンパク質を作成した。上記のごとく、自己複製中の造血幹細胞のプロスペクティブ同定法の開発については当初の予定よりも順調に進展した。一方、Geminin発現操作法の確立については、赤色蛍光を共発現するレトロウイルスベクター系は、赤色蛍光タンパク質の細胞毒性のため生細胞を維持することに困難性がでる可能性があることがわかた。前年までの研究で確立された自己複製中の造血幹細胞のプロスペクティブ同定法を用いて分画された自己複製中の造血幹細胞と静止期にある造血幹細胞の遺伝子発現の違いを、シングルセルRT-PCR解析だけではなく、シングルセル次世代シーケンサー解析まで広げたいと考えている(予備実験を完了した。)。また、PDC (paired daughter cell)解析などのより機能的な解析を行うことで造血幹細胞の増殖と分化を掛け分ける分子機構におけるGemininの役割を解明したい。Gemininの発現操作系に対しては、赤色蛍光を持ったレトロウイルスベクターだけではなく、膜透過型リコンビナントGemininタンパク質とその変異体を用いてGemininの発現や機能を精妙に制御できるようにしたい。膜透過型リコンビナントGemininタンパク質に関しては既に予備実験を完了した。さらに、以上の研究成果を用いて、「新規Geminin発現制御シグナル系を介した造血幹細胞の自己複製と分化を制御する分子機構の解析」と「ES/iPS細胞からの造血幹細胞の発生誘導法の開発」に取り組みたいと考えている。幹細胞生物学平成26年度の研究で確立された自己複製中の造血幹細胞のプロスペクティブ同定法を用いて分画された自己複製中の造血幹細胞と静止期にある造血幹細胞の遺伝子発現の違いを、シングルセルRT-PCR解析だけではなく、シングルセル次世代シーケンサー解析まで広げたいと考えている。
間質性肺疾患の末梢血中線維細胞に関する研究

健常者及び間質性肺炎患者末梢血から末梢血単核球系細胞(PBMCs)を分離し、磁気ビーズを用いCD14陽性細胞を単離しIL-13やIL-4の刺激によるfibrocyte(CD45, collagenI陽性細胞と定義)への分化の可能性を検討した。形態的に明らかな変化は見られず、FACS解析でもfibrocyteの増加は認めなかった。間葉系マーカーのmRNAレベルでの増加も認めなかった。さらに単球系の細胞株であるU937細胞を用いた同様の実験でも有意な差は認めなかった。以上より少なくともin vitroの系では、Th2系サイトカインによるfibrocyteへの分化誘導の可能性は低いことが考えられた。ヒト末梢血を採取し末梢血単核球細胞の分離を更に行い、preliminary studyとして磁気標識抗体を用いてCD14陽性の単球を分離し、無血清培地を用いての比較培養を実施した。蛋白産生量に関してはIL-13の有無での比較検討を行ったところIL-13含有下での培養で総蛋白量が若干増加する可能性がある(統計学的に有意差があるかは今後実証する)。産生蛋白量が増えるということは、初めの仮説でのコラーゲンなどの膠原線維やIL-13作用下で他種のサイトカインの産生促進が考えられるが、産生蛋白のプロファイルに関しての追加のassayは今年度は実施できなかった。現在は健常者のヒト末梢血単核球を用いているが、今後当院倫理委員会で承認が降りたのち患者の末梢血を用いた実験も随時行ってゆく予定とする。1患者血球を用いる前段階の検討として、ブレオマイシン(BLM)肺障害モデルにおけるfibrocyteの挙動を確認した。実験手技の熟練も必要なため、fibrocyteの検出が比較的容易な肺内で検討した。同時に、新規抗線維化薬pirfenidone (PFD)の作用も検討した。C57BL/6マウスに浸透圧ポンプでBLMを7日間持続的に投与,同時にPFDを14日間投与する予防モデルを作成。FACSでは、fibrocyteがBLM群で26.5%と増加し,PFD併用で13.7%へ減少した。BLM投与後10日目から21日目までPFDを投与する治療モデルでも同様の傾向であった。単離fibrocyteを用いた遊走能の検討ではCCL2へのfibrocyteの遊走がPFDで有意に抑制された。CCR2の発現もPFDで有意に抑制された。以上の成果は学術誌に報告した(Inomata M, Kamio K, Azuma A, Matsuda K, Nei T, Gemma A. Respir Res. 2014;15:16)。2FibrocyteとIL-13との関連を評価するため,健常者の末梢血から密度勾配遠心法にて単球系細胞PBMCsを分離し5日間無血清で培養後FACSで解析した。Shaoらの報告と異なり(J Leukoc Biol. 2008, 83(6): 1323-33)、IL-13 (10 ng/mL)との共培養でfibrocyteは4.0%から1.0%へ減少した。高濃度のIL-13 (100 ng/mL)でも増加は見られなかった。IL-4(10 ng/mL)との共培養では6.1%から4.3%へ減少した。また健常者PBMCsをIL-13で3日間培養し、TGF-b1の発現をmRNAで確認した所、1.3倍に上昇していた。23年度は実験計画を作り、倫理委員会への申請準備と研究用試薬・器具の購入を行い、研究準備を行ったが、震災の影響もあり研究体制・計画の見直しや検体採集に若干の困難が生じたこともあり必要検体を十分に採取できなかった。非特異性間質性肺炎患者の末梢血からPBMCsを分離後、磁気ビーズを用いてCD14陽性細胞をpositive selectionし同様に培養を行ったが、形態的な差は認められなかった。Cell lysateを用いた定量的PCRでは、CD14の発現は非刺激群と比較しIL-4、IL-13、IL-4+IL-13刺激群で減少傾向を示したが、S100A4に関しては発現の差に傾向は認められなかった。単球系の細胞株であるU937細胞を用いたin vitroの実験では、U937をIL-4、IL-13、IL-4+IL-13とともに5日間培養し、FACSでfibrocyteへの分化を検討したが、明らかな分化は見られなかった。またCD14や各種間葉系のマーカーの発現にも違いは見られなかった。

U937をPMAでマクロファージに分化させた細胞を用いた検討では、IL-13の刺激により、CD14の発現は低下し、S100A4の発現は増加する傾向が見られた。今回の検討では、末梢血単球系細胞からfibrocyteを誘導することができなかった。呼吸器内科学研究のための時間を割くことができなかったことが要因です。間質性肺炎患者の血液を用いる前のpreliminaryな条件設定で苦慮している。Shaoらの報告にあるIL-13あるいはIL-4によるPBMCの刺激でfibrocyteの増加を確認することができないでいる。今後は刺激をTGF-b1や血清そのものを用いることも検討するが、患者血球を用いる前に最適な系を確立するのに時間を要している。ただしin vivoの系においては、CD45とcollagen Iを指標としたfibrocyteの検出が技術的に安定したものとなっており、今後系が確立すれば解析は速やかに進むものと考えられる。震災の影響により、研究体制の大幅な見直しが必要となり、本格的な実験までには至らなかったため。今年度は分離細胞の培養の検体数を飛躍的に伸ばしてゆきたい。またFACSを用いての線維細胞の測定を平行して行ってゆく。週に半日は実験のための時間を確保します。引き続き健常者由来の末梢血液から密度勾配遠心法にてPBMCを分離する。分離PBMCからT細胞(CD3)、NK細胞(CD56)の大部分を磁気ビーズを用いて除去し,残った細胞分画にIL-13, IL-4, TGF-b1あるいは血清などを用いてfibrocyteへの分化誘導を促す。培養液中における線維化促進因子や線維化抑制因子の産生をELISA法で測定し無刺激群と比較する。またfibrocyteへの分化誘導因子をより網羅的に解析するため、monocyteのcell lineを用いる事も予定している。MonocyteへのIL-13などの影響を動物実験でも確認するため,C57BL/6マウスに浸透圧ポンプでBLMを持続皮下注射する肺線維症モデルマウスで,BLM投与開始から14日目で末梢血を採取する。PBMCを分離し,IL-13とともに培養後,CD45+collagen-I+細胞の含有率をflow cytometry法で測定しIL-13 free群と比較する。培養液中の線維化促進因子や線維化抑制因子の産生も同様にELISAで測定しIL-13 free群と比較する。IL-13だけでなく,IL-4でもfibrocyteを増加させることが報告されているため,上記と同様の実験系でIL-4と共培養した場合のfibrocyteや各種サイトカイン,ケモカインをIL-4 free群と比較する。各種間質性肺炎の患者検体は収集を進めており凍結保存中であるが,健常者での系が確立次第解析を開始する。採取した血清も凍結保存をし,PBMCを10%患者血清や健常者血清と共培養し,線維化促進因子の産生量を測定し,血清中の線維化促進因子の存在を検討する。また,PBMC採取とほぼ同時期に診断のための気管支肺胞洗浄が得られれば,これを用いた共培養も行い,産生蛋白に関する検討を行う。積極的に検体を収集し、必要な項目について測定・解析等を行っていく予定。細胞分離、FACS用の備品の購入、蛋白質の解析に関しての費用捻出があると考えております。間質性肺炎患者の血液を用いる前のpreliminaryな条件設定の段階で苦慮しています。既報ではIL-13あるいはIL-4によるPBMCの刺激でfibrocyteの増加が見られておりますが、われわれの検討ではこれを確認することができないでいます。
GADD45を標的とした新規癌予防エピジェネティクス

癌予防の実現のためには、DNAメチル化等のエピジェネティックな要因により失活した癌抑制遺伝子の発現を回復させることが重要である。近年、発癌予防に最も重要とされるp53遺伝子の下流因子GADD45が、DNA脱メチル化を促すと考えられる結果が報告された(Nature. 445, 671, 2007)。一方、私達はゲニステインやケルセチンがGADD45を誘導することを見出していた。そこで、これらのGADD45誘導食品成分がDNA脱メチル化を介して癌抑制遺伝子の発現を回復させ、癌予防効果を発揮する可能性を考えた。しかし複数の細胞株をゲニステインやケルセチンで処理し、GADD45の発現を誘導しても、DNAメチル化により失活した癌抑制遺伝子p16の発現回復はみられなかった。p53依存的にGADD45を強力に発現誘導しても、p16発現は回復しなかった。DNAメチル化阻害剤5-アザシチジン処理群では発現回復がみられたことから、GADD45を発現誘導するだけでは消失したp16遺伝子の発現を回復させるのに十分な脱メチル化は起こせないと考えられた。また、私達はヒト前立腺癌由来DU145に対しゲニステインで処理するとGADD45の発現が誘導されることを見出した。DU145や同じヒト前立腺癌由来LNCaP細胞では、GADD45自体がDNAメチル化で失活しているとする報告(Cancer Res. 69, 1527, 2009)から、ゲニステインがDNA脱メチル化を介してGADD45を誘導している可能性を考え検討した。しかし、両細胞を5-アザシチジンで処理してもGADD45発現は誘導されず、LNCaPに対してはゲニステインによるGADD45の発現誘導も観察できなかった。以上より、ゲニステインによるGADD45発現誘導はDNA脱メチル化を介さない別の細胞特異的な機構による可能性が示唆された。発癌は癌抑制遺伝子や癌遺伝子の突然変異に起因する疾患であると信じられ、突然変異を起こす環境要因や、その突然変異を予防することによる癌予防法の開発研究が試みられてきた。一方で、突然変異が存在しなくとも、癌抑制遺伝子の発現がDNAメチル化等のエピジェネティックな要因により減少することにより、発癌に至る経路の重要性が明らかとなった。本研究では発癌予防に最も重要とされるp53遺伝子の下流因子GADD45に着目し、エピジェネティックな作用による新しい癌予防法の確立を目指す。まず、本教室で見出されたGADD45誘導食品成分がDNAメチル化により失活した癌抑制遺伝子p16の発現を回復できるかどうか調べた。異常メチル化によってp16遺伝子発現が消失している数種のヒト癌由来培養細胞をゲニステイン、ケルセチンで処理すると、GADD45の発現が誘導されたが、p16の発現回復はみられなかった。5-アザシチジン処理群では発現回復がみられたことから、GADD45を発現させるだけでは消失したp16遺伝子の発現を十分に回復させるだけの脱メチル化は起こっていないと考えられた。次に、DNAメチル化によりGADD45の発現が抑制されたヒト前立腺癌由来DU145細胞に対し、ゲニステインがGADD45の発現を誘導することを見出した。この時、DNA脱メチル化によりGADD45の発現が誘導されている可能性があり、今後その機構について解析を行う。また、ヒストンのアセチル化もDNAメチル化同様に重要なエピジェネティック制御機構として知られているが、ヒストン脱アセチル化阻害剤と15-デオキシ-△12,14-プロスタグランジンJ_2の併用によって癌細胞内にROSが蓄積し、相乗的にアポトーシスが増強できることを見出した。