hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カーボンナノチューブの医療応用を目指した薬物動態学的評価に関する研究

カーボンナノチューブ(CNT)は薬物やペプチドの革新的な輸送体として医療応用が期待されている日本発のナノマテリアルである。しかし、これまで理工学分野における研究は盛んに行われてきたが、医療分野における研究は極めて少ない。薬物の薬効ならびに副作用発現には薬物の体内動態が大きく関わる。従って、輸送体としてのCNTの医療応用を目指す際に、CNTが薬物の体内動態に及ぼす影響を明らかにすることは必須である。そこで、本申請課題においては、今年度はCNTの薬物動態関連因子に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。第一に、単層CNT(SWCNT)の分散に関する検討を行った。SWCNTの溶解性は低く、水に分散させるためには困難を伴う。そのため、界面活性剤や溶解補助剤を用いて分散させる必要がある。しかし、細胞への暴露を考えた場合、細胞毒性を有する化合物を用いて分散することは不可能であったため、タンパク質を用いて分散を試みた。この結果、細胞培養液でSWCNTを分散させることに成功した。第二に、SWCNT分散液をヒト由来細胞に暴露することで、薬物代謝酵素と薬物トランスポーターの発現変動を網羅的に検討した。薬物代謝酵素、薬物トランスポーターともに84種の遺伝子について解析した。その結果、アルデヒドデヒドロゲナーゼやグルタチオンS-転移酵素などの複数の薬物代謝酵素の分子種の発現変動が認められた。また、薬物トランスポーターに関しては、複数のsolute carrier transporterとATP-bindingcassette transporterの遺伝子の発現変動が認められた。以上より、本申請課題において、SWCNTは薬物代謝酵素ならびに薬物トランスポーターの発現に影響を及ぼすことを明らかにした。
遺伝的多様性を有する癌細胞間の環境適応勝者の決定機構の解明

近年、染色体不安定性に関連する因子として細胞周期チェックポイント・有糸分裂制御・DNA修復機構が明らかにされてきており、これらの機能不全を標的とした治療法の開発が国内外で進められている。しかしながら、癌細胞が遺伝的多様性を活用して環境に適応する機構は解明されていない。染色体不安定性に順応した癌細胞は、高度な環境適応能力を備え細胞競合に打ち勝っていると考えられ、その機構の解明は、癌の進展や治療抵抗性を理解し、新たな癌治療法を開発する上で極めて重要と思われる。本研究では、癌細胞の環境適応能力の解明における重要な「問い」である遺伝的多様性を有する癌細胞間の競合勝者決定機構の解明に取り組む。
電気トレーニングを必要としない自己広背筋使用心筋形成術の開発

自己広背筋使用心筋形成術の実施には長期の電気刺激が必要である。電気刺激トレーニングを要しない心筋形成術開発が望まれるが、骨格筋表現型の心筋型への転換を遺伝子工学や細胞工学手法を用いて行えるならば本法開発の可能性がある。我々は骨格筋より心筋で発現が著明なSERCA2の骨格筋での強発現により、心筋補助可能な骨格筋への形質転換が可能と考え実験を行った。細胞工学的見地から、心筋への分化能を有する心筋芽細胞を移植したHybrid型筋組織形成が有用と考えた。さらに遺伝子工学と細胞工学の両者により、SERCA2等の遺伝子が強発現するような心筋芽細胞を作成し骨格筋に移植可能か検討した。すなわち、培養心筋芽細胞に遺伝子導入が有効に実施可能か。次に導入遺伝子由来蛋白質は細胞外に分泌されるのか、移植細胞は骨格筋内で生着するのか、以上を目的に実験を行った。その結果遣伝子導入心筋芽細胞の骨格筋への移植により、周囲へ目的蛋白を分泌し、周囲の形質を転換しながら自ら骨格筋内に生着することを確認した。以上より遺伝子導入心筋芽細胞移植による心筋型形質骨格筋組織形成が、電気刺激トレーニングを要しない心筋形成術の開発に向け重要な手法になることを示すと考えられた。平成9年度はラット下腿骨格筋の疲労耐性についての基礎的データ収集及び下腿筋への遺伝子導入方法についての比較検討を中心に実施した。1、ラット下肢骨格筋の疲労耐性獲得ラット下肢骨格筋を摘出し潅流下に反復電気刺激による収縮性測定実験を行った。反復刺激による疲労特性に関するデータを収集し次いで電気刺激トレーニング実施後の収縮性測定を行い疲労耐性獲得状況について検討した。また平行して電気刺激トレーニングを実施したラット下肢骨格筋よりtotal RNAを抽出した。現在RNase protection assayによるmRNA発現状況検索のためSERCA2mRNA及びphospholamban mRNAに対するprobe作成し遺伝子発現状況の経時的変化について検討中である。2、遺伝子導入1、骨格筋への遺伝子導入(1)GFPを組み込んだplasmidをコレステロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリンからなるリポソーム、紫外線不活化センダイウイルスと融合させ発現ベクターとした。このHVJ-liposomeをラット腹部大動脈より注入し、骨格筋への遺伝子導入を計った。2、骨格筋への遺伝子導入(2)遺伝子発現期間の延長を目的にgene gunを用いて核内にGFPを組み込んだplasmidを打ち込み長期の遺伝子発現を試みた。電気刺激に伴う発生張力変化より疲労耐性を測定し、SERCA2遺伝子mRNA発現状況をRT-PCR法にて検討した。
高等植物細胞での液胞への蛋白質輸送の分子機構

高等植物細胞の液胞内蛋白質は祖面小胞体上で合成され、ゴルジ装置で分泌経路から仕分けされて液胞へと輸送される。サツマイモ塊根貯蔵タンパク質スポラミン前駆体に存在するN-末端プロペプチド及び(NTPP)や、オオムギレクチン前駆体に存在するC-末端プロペプチド(CTPP)等のプロペプチドが液胞への仕分けシグナルとして働くことが知られている。また、これらNTPPとCTPPの一次構造に類似点は認められないが、NTPPを、持つスポラミン前駆体及びCTPPを持つ改変つスポラミン前駆体は共に液胞へと輸送される。そこで、これらのプロペプチドによる液胞への輸送の機構が同一のものであるか否かをWortmanninに対する感受性を指標として検討した。Wortmannin存在下、野生型または変異スポラミン前駆体を発現している形質転換タバコ培養細胞をパルス標識しチェ-スすると、CTPPにより液胞へと輸送されているスポラミンはほとんど培地に分泌されたが、NTPPにより液胞に輸送される野生型スポラミンは殆ど分泌されなかった。また、CTPPにより液胞へと輸送されている野生型などのオオムギレクチンは殆ど培地に分泌されたが、NTTPにより液胞に輸送される変異オオムギレクチンは殆ど分泌されなかった。以上の結果はCTPPによる液胞への輸送はNTPPによるものよりWortmannin感受性が高い事を示している。さて、Wortmanninは、動物細胞のPI3-kinaseの阻害剤として知られている薬剤である。そこでこの液胞への輸送の阻害が植物細胞のPI3-kinaseの阻害によるものであるかを検討した。PI3-kinaseの失活のWortmannin濃度依存性も、CTPPによる液胞への輸送の阻害のWortmannin濃度依存性とは異なっり、液胞への輸送の阻害には高濃度のWortmanninが必要であった。そこでWortmanninによるタバコ細胞中でのリン脂質、PI3P,PI4Pの合成の阻害を検討したところ、PI3Pを除く多くのリン脂質の合成阻害の濃度依存性が、CTPPによる液胞への輸送の阻害の濃度依存性と類似していた。従って、CTPPによる液胞への輸送には何らかのリン脂質の合成が関わっている可能性が示唆された。
ゲノム変化によるJCウイルスの病原性発現

ヒトポリオーマウイルスJC(JCV)はヒト集団に広く蔓延しているが,時として進行性多巣性白質脳症(PML)を惹起する。これまでJCVがどのようにしてPMLを発症させるか全く不明であった。しかし最近、体内に持続感染しているJCVが変異して、PMLを発症させる強毒JCVになるという説が有力になっている。1990年に我々は、その依り所となった発見をした。即ち、健常人と非PML患者の尿から初めてJCV DNAを直接クローニングした。当時JCVは専らPML患者の脳からクローニングされていた。PML患者脳からクローニングされたJCV(PML型JCV)の特徴は、その調節領域が極めて多様であることにある(この調節領域をPML型調節領域と言う)。これに対して、我々が尿からクローニングしたJCV DNAの調節領域は一定の構造を保っていた(これを原型調節領域と呼ぶ)。我々は、原型調節領域とPML型調節領域の構造を比較し、後者は前者から塩基配列の再編成によって作り出せることを見いだした。本研究の目的は、新たにPML患者の脳からJCV DNAをクローニングし、原型調節領域とPML型調節領域との関係をさらに検討することである。4名のPML患者の剖検脳からJCV DNAをクローニングすることに成功した。患者の内訳は、日本人3名、アメリカ人1名であった。全ての患者から複数のクローンが得られた。これらのクローンの構造を解析した結果、次のことが明らかとなった。1.調節領域の構造は患者毎に異なり、また既知のPML型調節領域とも異なった。2.全ての調節領域は原型調節領域から塩基配列の再編成によって作り出せることが確認された。以上の結果は、持続感染しているJCVの調節領域に再編成が無規則的に起きて、いろいろな変異ウイルスができ、そのうち中枢神経系でよく増えるウイルスが選択されたことを示唆している。現在、原型調節領域とPML型調節領域との機能比較を、アデノウイルスベクターを用いて検討している。
行政組織改革の研究-日英比較研究-

英国と日本の行政組織改革を事例に、行政組織の決定制度と改革アイデアとの関係について研究した。戦後、行政組織の決定権がほぼ完全に行政府(内閣総理大臣)に委任された英国と、逆に天皇制から民主制への転換に伴って官制大権から一転、立法府かこれを行使することになった日本とは、同じ議院内閣制をとりつつ、行政組織の決定制度において対照的である。、この制度配置によって、行政組織改革は英国では単なる行政過程となり、日本では政治過程となる。戦後、行政国家から脱行政国家への道をたどる両国において、行政組織改革に関するアイデアはほぼ同じであるが、その実現に要するエネルギーには大きな差が生した。英国では、行政国家化に伴う官僚機構の影響力拡大とバランスをとるための内閣権限の強化、執政部独自の政策集団の形成など民主性を担保するための改革と、省庁再編による巨大省の編成や、小さな政府への転換に伴う政策実施組織の切離しなど能率性を高めるための方策が、順次段階的に実施されてきた。これらは臨機応変に時代の要請を汲み取ったものの、試行錯誤の側面も否定できない。日本でもほぼ同様の改革が試みられたが、いずれも80年代まで本格的に実施されることはなく、第二臨調以降世界的な脱行政国家化の流れが始まって漸く軌道にのった。行政組織の決定制度に要求される民主性と能率性のうち、民主性を重視した日本で行政組織の継続性と影響力が強まり、その結果能率性が高まった.能率性を重視した英国では、行政府内における首相の主導力が強まり政治優位の結果を招来した点が興味深い。平成10年度は、英日の行政組織改革(サッチャー政権以降と橋本政権以降)を事例に、制度とアイデアの関係を考察した。制度の違いは改革アイデアの展開にどのような影響を及ぼしたのか。行政組織の決定制度における行政府と立法府の権限分担は国ごとに多様であるが、英国では、行政組織の決定権が内閣、行政府にあるのに対し、日本では83年の国家行政組織法改正後も基本的には国会、立法府に属する。また日本が内閣法や国家行政組織法、国家公務員法など法律によって行政組織に硬いしばりをかけているのとは対照的に、慣習法の国英国では行政組織を規律する法制度はない。その結果、行政組織そのものも沿革的に形成され複雑な英国にたいし、日本の組織は明治維新後、敗戦後と二度にわたる総括を経て合理的に計画され、より画一的である。このような英日両国の制度の違いが、行政運営の効率化という共通の課題を組織改革に結び付けていく過程、あるいはその内容にどのような影響を及ぼしたのか、あるいは及ぼさなかったのか、を検討した。結論としては、行政組織改革において制度の違いは殆ど意味をもたないことがわかった。改革のアイデアは、英日で大きな違いはなく、その時期も英日ともに改革実現の20年から50年以上も前に遡ることができる。改革を阻んできた要因は制度とは別の部分に求められることがわかった。戦後、行政組織の決定権がほぼ完全に行政府(内閣総理大臣)に委託された英国と、逆に天皇制から民主制への転換に伴って官制大権から一転、立法府がこれを行使することになった日本とは、同じ議院内閣制をとりつつ、行政組織の決定制度において対照的である。この制度配置によって、行政組織改革は英国では単なる行政過程となり、日本では政治過程となる。戦後、行政国家から脱行政国家への道をたどる両国において、行政組織改革に関するアイデアはほぼ同じであるが、その実現に要するエネルギーには大きな差が生じた。

英国では、行政国家化に伴う官僚機構の影響力拡大とバランスをとるための内閣権限の強化、執政部独自の政策集団の形成など民主性を担保するための改革と、省庁再編による巨大省の編成や、小さな政府への転換に伴う政策実施組織の切離しなど能率性を高めるための方策が、順次段階的に実施されてきた。これらは臨機応変に時代の要請を汲み取ったものの、試行錯誤の側面も否定できない。日本でもほぼ同様の改革が試みられたが、いずれも80年代まで本格的に実施されることはなく、第二臨調以降世界的な脱行政国家化の流れが始まって漸く軌道にのった。行政組織の決定制度に要求される民主性と能率性のうち、民主性を重視した日本で行政組織の継続性と影響力が強まり、その結果能率性が高まった。能率性を重視した英国では、行政府内における首相の主導力が強まり政治優位の結果を招来した点が興味深い。
トラフグ属魚類の天然雑種の形態学的・分類学的研究

トラフグ属の天然雑種の形態学的特徴を調べ、その実態を究明するため標記の研究を行った。また、トラフグ属魚類の属名に関する混乱を解決するために、トラフグ属の命名をめぐる問題点を研究した。さらに、日本周辺海域に出現するトラフグ属魚類の各種についても分類学的特徴を明らかにして、検索表を作成した。本研究によって、トラフグ属には少なくとも天然雑種が3種類いることが明らかになった。第1の種類はシマフグとトラフグの雑種で、九州沿岸に出現する。この雑種は体がやや長く、体背面から側面にかけて斜めの模様が不規則ながらあることでシマフグに似るが、体背方が黒く、臀鰭が白い点ではトラフグに似る。第2の種類はシマフグとナシフグの雑種で、有明海に出現する。この雑種は鰭がすべて黄色く、体がやや長い点ではシマフグに似るが、体背方の地色が褐色で不規則な小白色点をもつ点ではナシフグに似る。第3の種類はマフグとトラフグまたはカラスの雑種で、東シナ海および日本海西部に出現する。この雑種は、体背方が濃緑褐色もしくは暗褐色で小白色点に覆われる点ではマフグに似るが、体の背腹に弱い小棘をもち、胸鰭後方の体側に白色線で縁どられる黒斑がある点ではトラフグに似る。トラフグ属の学名にはTakifugu、Fugu、TorquigenerそしてSphoeroidesと様々な属名が用いられてきた。これまでの文献と国際動物命名規約を検討した結果、Takifuguのみが有効名である。FuguはTakifuguのシノニムであることが判明したので、かなり広く用いられてきたFuguという学名は国際動物命規約によって使用できない。日本周辺海域のトラフグ属魚類の各種の分類学的特徴を明らかにして、検索表を作成した。また、これまで実態が明らかでなかったムシフグについて、幼魚も含めた特徴を示し、本種が雑種ではなく、独立種であることを明らかにした。トラフグ属の天然雑種の出現状況を調べるため、日本海沿岸と北九州の魚市場で聞込み調査を行った。その結果、マフグとトラフグあるいはマフグとカラスの雑種と思われるフグが日本海に分布することが明らかになった。この雑種の標本数は少ないが、日本海に出漁している漁船から入手することができた。雑種は、体の色彩ではマフグに似ているが、体の表面を小棘が覆う点でトラフグとカラスに似ている。鰭条数はマフグよりもトラフグとカラスに近い。骨格系の特徴はトラフグやカラスよりもマフグに類似する。この雑種は下関の魚市場にかなりの頻度で出現するので、来年度は標本数をふやして詳細に調査する予定である。九州からは体色から判断してトラフグとシマフグの雑種と考えられる標本と、ナシフグとシマフグの雑種と思われる標本を採集することができた。前者は東シナ海から、後者は有明海から採集された。標本数が非常に少ないので、現時点では、形態学的な形質の比較検討を充分に行うことはできない。しかし現地の情報によると追加標本を入手できる可能性は高いので、来年度に標本数をふやして形質の検討を進める予定である。従来、稀種とされ、雑種の可能性もあるとされていたムシフグを日本海で5個体採集することができた。外部形態と骨格系を調査した結果、雑種ではなく独立種であることが確実となった。また、初夏にかなりの数のムシフグが、佐渡島周辺に出現するとの情報を得たので、来年度は標本数をふやして本種の特徴を詳しく調べる予定である。トラフグ属の学名に関しては、これまで混乱が続いており、Fuguを用いる研究者とTakifuguを用いる研究者に分れていた。トラフグ属の学名の歴史と国際動物命名規約に関する問題点を調べたところTakifuguを用いるべきことが明らかになった。この結論は学名の混乱を一掃するため国立科学博物館の研究報告に発表する予定である。

この雑種は、体背方が濃緑褐色もしくは暗褐色で小白色点に覆われる点ではマフグに似るが、体の背腹に弱い小棘をもち、胸鰭後方の体側に白色線で縁どられる黒斑がある点ではトラフグに似る。トラフグ属の学名にはTakifugu、Fugu、TorquigenerそしてSphoeroidesと様々な属名が用いられてきた。これまでの文献と国際動物命名規約を検討した結果、Takifuguのみが有効名である。FuguはTakifuguのシノニムであることが判明したので、かなり広く用いられてきたFuguという学名は国際動物命規約によって使用できない。日本周辺海域のトラフグ属魚類の各種の分類学的特徴を明らかにして、検索表を作成した。また、これまで実態が明らかでなかったムシフグについて、幼魚も含めた特徴を示し、本種が雑種ではなく、独立種であることを明らかにした。トラフグ属魚類の天然雑種の形態学的特徴を調べ、その分類学的位置を明らかにするため標記の研究を行った。また、トラフグ属魚類の属名に関する分類学的問題を解明し、同属の種類についても分類学的特徴を明らかにして、種の検索表を作成した。現在までに明らかになったところでは、トラフグ属の天然雑種には3種類になる。第1の種類は、マフグとカラスまたはトラフグを両親種とする雑種である。この雑種は、体色は背方が濃緑色もしくは濃褐色で、腹方は白く、体の側面の胸鰭直後に白い縁どりのある大きな黒斑を有する。体の背面に小棘を備えているが、小棘の発達程度は個体によって様々である。色彩の点ではマフグに似るが、黒班の周囲に白い縁どりがあること、体に小棘がある点ではトラフグに似る。この雑種は日本海西部、東シナ海、黄海に分布する。第2の種類はトラフグとシマフグを両親種とする雑種である。この雑種の体型、体の小棘の分布、体色はトラフグとしまふぐの中間的な状態を示す。現在まで、豊後水道や有明海周辺から漁獲されている。第3の種類はシマフグとナシフグを両親種とする雑種である。この雑種は体に弱い小棘を有し、鰭が黄色という点ではシマフグに似るが、体に多数の小白色斑がある点ではナシフグに似る。この雑種は有明海から毎年漁獲されている。トラフグ属の学名には従来FuguあるいはTakifuguが用いられてきた。本属の分類学的な特徴と、動物命名規約を検討した結果、Takifuguを用いるのが正しく、FuguはTakifuguのシノニムであることが明らかになった。
数値流体解析結果から得られる耐風特性を橋梁の耐風設計へ適用するための研究

橋梁の耐風性を数値流体解析を用いて把握するとき、問題となることは、実際の設計との連携が十分に確立されていないことである。よって、本研究の目的は、これまでの解析手法の研究成果を踏まえた上で、解析で得られた耐風設計上必要な結果を実際の耐風設計に即座に反映できる有効な手法を開発することにある。本研究では、94年度は2次元問題に限定し、流速・圧力・橋梁断面に作用する力ならびに橋梁断面の振動応答を解析する数値流体解析のソフトウェアーの開発を行った。95年度以降は、3次元解析へ拡張することを試みた。これと並行し、以下の実際の橋梁断面や部材に本手法を適用し、有効性を確認した。(1).大型斜張橋の並列ケーブルで発生しているウェーク・ギャロッピング現象への適用斜張橋の並列ケーブルを2次元の近接する並列円柱複数構造物としてモデル化し、迎角と加振振幅をパラメータとして、静止した状態および後方円柱を強制加振した状態での並列円柱まわりの流れの解析とビジュアル化を行た。この結果から、わずかな迎角や振幅の変化により円柱間の流れの特性が変化し、これにより後方円柱の平均揚力係数と減衰率が大きく変化することを掴んだ。(2).実橋梁断面での3次元解析実際に施工された箱桁断面の風荷重の解析を、2次元、3次元の両者の解析を行い、3次元解析が、風洞実験結果と一致する結論を得た。これより、実構造の設計には、3次元解析が必要であることが分かった。(3).耐風設計との連携数値流体解析で得られた結果と実際の耐風設計に生かすことを試みた。耐風設計のための基本的なパラメータを正確に数値解析により評価するには、3次元数値解析が必要であることが分かった。ただし、概略設計段階では、加重が大きくはなるが2次元数値解析でも設計上のパラメータを決定するには実用に耐えうることが分かった。数値流体解析は、活発に行われるようになってきてはいるが、橋梁の耐風性問題の場合は、橋梁断面が非流線型でスケールが大きいこと、風が制御されていない乱流であること、さらに空力弾性問題に主要な工学的関心があること等々困難な要因がある。さらに、最も大きな問題は、解析で得られた結果と、実際の設計との連携も十分に確立されていないことである。よって、本研究では、これまでの解析手法の研究成果を踏まえた上で、解析で得られる耐風設計上必要な結果をリアルタイムにビジュアル化し、実際の耐風設計に即座に反映できるようにする有効的な手法を開発した。本研究の基本的な考え方は、解析結果をリアルタイムにビジュアル化できれば、実際の設計現場との連携が可能となり、耐風設計のための基本的なパラメータを数値解析により評価するためのアプローチが明確となることである。よって、本年度は、2次元問題に限定して、耐風設計上必要な流体解析結果の流速,圧力,橋梁断面に作用する力を、それぞれ解析と並行してリアルタイムにビジュアル化できる手法を構築した。具体的には、2台の計算機を利用し、1台で数値流体解析を実施し、ネットワークを介してもう1台の計算機に接続されたグラフィックディスプレに結果を示した。さらに結果表示のからグラフィックディスプレにスキャンコンバータを介して結果をVTRに出力できるようにした。これによって、実際の風の流れの変化、橋梁に作用する力の変動等をリアルタイムに設計者にデータ提供ができることなった。

数値流体解析は、活発に行われるようになってきているが、橋梁の耐風性問題の場合は、橋梁断面が非線形型でスケールが大きいこと、風が制御されていない乱流であること、さらに空力弾性問題に主要な工学的感心があること等々困難な要因がある。さらに、最も大きな問題は、解析で得られた結果と実際の設計との連携も十分に確立されていないことである。よって、本研究の目的は、これまでの解析手法の研究成果を踏まえた上で、解析で得られた耐風設計上必要な結果をリアルタイムにビジュアル化し、実際の耐風設計に即座に反映できる有効な手法を開発することにある。まず、2次元問題に限定し、流速・圧力・橋梁断面に作用する力ならびに橋梁断面の振動応答を解析する数値流体解析のソフトウェアーの開発を行った。さらに、結果のビジュアル化手法に関しても開発を行った。さらに、開発された手法を、3次元の問題に拡張する事を行なった。一方、実際の橋梁への適用も同時に検討を進めた。実際の問題では、現在、大型斜張橋の並列ケーブルで発生しているウェーク・ギャロッピング現象に着目し、この現象解明のために、本研究での成果を適用した。斜張橋の並列ケーブルを2次元の近接する並列円柱複数構造物としてモデル化し、迎角と加振振幅をパラメータとして、静止した状態および後方円柱を強制加振した状態での並列円柱まわりの流れの解析とビジュアル化を行た。この結果から、わずかな迎角や振幅の変化により円柱間の流れの特性が変化し、これにより後方円柱の平均揚力係数と減衰率が大きく変化することを掴んだ。この現象がウェーク・ギャロッピング現象の起振力となりえるかどうかに関しは、現在考察中である。95年度のまでの研究は、2次元流れの場での解析が中心であった。しかし、実際の構造物での空力弾性問題を扱う場合、2次元解析では物体に作用する力が実際よりも大きめに求まることが分かった。それは、2次元的な流れの場でも、主流方向と直角の方向の流れが若干生ずるが、これが流れの中に置かれた物体に作用する力に大きく影響していることによる。よって、数値解析では3次元性を考慮する必要があることが判明した。そこで、本年度は、前年度に開発された手法を、3次元問題に拡張することを行なった。さらに、実際の橋梁は3次元性を有していることから、ここでは、実際の橋梁への適用も同時に検討した。(1).3次元空力弾性問題への数値流体解析の適用2次元流れの場での解析手法の研究成果を踏まえた上で、3次元空力弾性問題の一つである橋梁の耐風設計に、即座に反映できる有効的な解析手法を開発した。数値流体解析の基本断面である円柱まわりの解析をレイノルズ数をパラメータとして解析を行い、実験地と結果が良く一致する結果を得た。(2).実橋梁断面での3次元解析実際に施工された箱桁断面の風加重の解析を、2次元、3次元の両者の解析を行い、3次元解析が、風洞実験結果と一致する結論を得た。これより、実構造の設計には、3次元解析が必要であることが分かった。(3).耐風設計との連携数値流体解析で得られた結果を実際の耐風設計に生かすことを試みた。耐風設計のための基本的なパラメータを正確に数値解析により評価するには、3次元数値解析が必要であることが分かった。ただし、概略設計段階では、加重が大きくはなるが2次元数値解析でも設計上のパラメータを決定するには実用に耐えうることが分かった。(4).
変異型p53誘導性上皮間葉転換を起こした肺癌のシグナル経路の解明及び治療法の確立

平成30年度は、変異型p53を導入した肺癌細胞株に上皮間葉転換(EMT)が起こることや、スタチンによるこれらのphenotypeの変化を抑制可能であることが実験的に確かめることが出来た。また臨床的にも変異型p53の有無により、スタチンの効果に違いがあることを確認し、これらの内容を論文として発表することができた。まず肺癌細胞株に野生型及び変異型p53を発現するlentivirusを導入し、FACSによるsortingを行って、安定発現細胞株を作成した。これらの継代により、オリジナルは上皮型マーカーを発現していた細胞株から間葉型への変化が起こることが確認できた。また細胞形態も紡錘形へとなり、phenotypeの変化としても浸潤能の亢進や薬剤耐性化がみられた。これらのマーカーやphenotypeの変化はスタチン投与により抑制され、間葉型から上皮型への回復、浸潤能や耐性化の抑制がみられた。さらに臨床検体を用いた研究では、我々がこれまでに作成した肺腺癌完全切除例239例を用いたTissueMicroarrayを使用して、p53遺伝子変異の有無による層別化を行い、EMTマーカー発現や、そしてスタチン内服の有無による術後生存に対する影響を確認した。p53遺伝子変異グループにおいては、スタチン内服群は予後良好であったが、野生型p53グループでのスタチン内服には、それらの効果がみられなかった。これらの結果を論文化し、報告した。肺腺癌において変異型p53がEMT活性化を誘導することを実験的に確かめることが出来た。またその治療法としてスタチン投与がEMT活性化を回復することを示し、臨床的にも、有意な差があることを確認した。これらのメカニズム解明により、今後の治療法開発の可能性を示した。なぜ野生型p53肺癌においてスタチン投与が浸潤能の亢進や薬剤耐性化を来し、患者予後を悪化させるのかを検証する必要がある。同じ研究室内で研究試薬、機器の共有利用が可能だったため消耗品費の使用を押さえる事が出来、次年度に予算を回すことが出来た。
数学モデルを用いた頚動脈狭窄症の治療適応に関する検討

頚動脈狭窄症の治療の効果を定量評価するためにマルコフモデルを作成した。4つの健康状態を設定し、それぞれの間の移行確率を代表的なRCTから推定した症候性頚動脈高度狭窄に対するCEAは多くの状況下において有効性を示した。一方、無症候性頚動脈高度狭窄に対するCEAの適応は、一部の限定した状況下(若年者、合併症なし、低い手術リスク)に限られることが示唆された。平成20年度の研窄では、まず頚動脈狭窄を有する患者の推定死亡率を解析に組み入れることから始めた。一般人の死亡率は年齢の指数関数であらわされることが知られているが、我々のこれまでの研究では、厚労省から発表されている年齢別の死亡率データより得られた、年齢xでの死亡率:P'(x)=e-10.58+0.095xの回帰式を用いて解析してきた。予想された問題点は、こうした一般人の死亡率に比し、CEA candidatesの死亡率は高いことであった。前述の年齢別の死亡率を示す数式に心血管イベントに関するリスク係数(comorbidity index:c)を設定し、年齢xでの死亡率:P(x)=cxe-10.58+0.095xとmodificationを行った。そしてスウェーデンにおけるpopulation-based study(Swedvasc)と比較した結果、c=1が特にリスクを有しない一般人、c=2が平均的なCEA candidates、c=3がhigh risk CEA candidatesの年間死亡率にほぼ近似できる事を確認した。更に、膨大な量に及ぶ頚動脈狭窄の疫学データや頚動脈内膜剥離術(CEA)に関する無作為化比較試験(RCT)のデータを収集し、解析を行い、頚動脈狭窄を有する患者に関するマルコフモデルの作成を始めている。それぞれの健康状態に生活の質調整年(quality adjusted life year, QALY)を設定。手術の効果はQALYgainの形で表現、すなわち手術をした場合の総QALYと手術をしない場合の総QALYの差とする。その結果、基礎解析では症候性頚動脈狭窄では手術の効果は大きいが、無症候性頚動脈狭窄では手術の効果が非常に小さい事が判明しつつある。今後は更に感受性分析を進める予定である。すなわちその解析段階で行った様々な仮定値の検証、推定した仮定値が動いた場合に手術で得られる効果がどの程度変化するかを検討する。同時にこれは得られたモデルの信頼性の確認にもなるはずである。続いて、狭窄度が比較的軽度である例に対しての解析を行う予定である。中等度狭窄(50-69%)、軽度狭窄(30-49%)に関してのデータもRCTから収集可能であり、その他の報告データとあわせて信頼に足る仮定値の決定が可能であると考えている。マルコフモデルは比較的慢性の経過をとる疾患を対象とした数学モデルで、今回は頚動脈内膜剥離術(CEA)の効果の定量評価を目的として、内頚動脈狭窄患者とCEAに関するマルコフモデルを作成した。設定した4つの健康状態間の移行確率を代表的な無作為化比較試験などから推定した。各年齢での死亡率は厚労省が発表したデータから得た回帰式(年齢xでの死亡率:P'(x)=e^<-10.58+0.095x>)を用いたが、心血管系のリスクを有する頚動脈狭窄患者の死亡率はこの回帰式にcomorbidity index(c)を乗じることでmodifyした(p(x)=c・e^<-10.58+0.095x>)。条件設定は、後遺症を残した状態の生活の質調整年(quality-adjusted life year : QALY)を0.6、割引率を年間3%とした。CEAの効果はCEAを受けた場合と受けなかった場合の予想されるQALY値の差(QALY gain)として表現した。70才の無症候性頚動脈狭窄患者に関する基礎解析では、CEAの効果は極めて小さかった(0.07 QALY)。しかも、年齢、手術リスク、comorbidity indexが増すとその効果は更に減少ししばしばマイナスとなった。一方、70才の症候性頚動脈狭窄に対するCEAの効果は比較的大きく(0.31 QALY)、この有効性は、年齢、手術リスク、comorbidity indexなどが増した状況においても維持された。様々な仮定値の不確実性の検討するための感受性分析では、無症候性狭窄においては梗塞発生率、QALY値などの仮定値が変化するとQALY gainがマイナスになることが示された。

各年齢での死亡率は厚労省が発表したデータから得た回帰式(年齢xでの死亡率:p'(x)=e^<-10.58+0.095x>)を用いたが、心血管系のリスクを有する頚動脈狭窄患者の死亡率はこの回帰式にcomorbidity index(c)を乗じることでmodifyした(p(x)=c・e^<-10.58+0.095x>)。条件設定は、後遺症を残した状態の生活の質調整年(quality-adjusted life year:QALY)を0.6、割引率を年間3%とした。CEAの効果はCEAを受けた場合と受けなかった場合の予想されるQALY値の差(QALY gain)として表現した。現在までに報告されているCEAを受けた患者の5年生存率、10年生存率はそれぞれおよそ80%、50%である。上述の回帰式をグラフ化して生存率をプロットしてみると、C=2とした場合の生存曲線がスウェーデンなどでおこなわれたpopulation-based studyときれいに重なることが示された。C=2を基礎解析として、70才の無症候性頚動脈狭窄患者に関する解析では、CEAの効果は極めて小さかった(0.07QALY)。C=1は特別の心血管系のリスクを有さない患者、C=3は全身性の動脈硬化を有する高リスク患者と考えられるが、前者では治療効果が高く、後者では低下することが示された。しかしその程度は、無症候性患者では比較的小さかった。
高分子および界面等の難認識性基質への酵素触媒糖鎖付加反応システムのデザイン

高分子及び界面等は酵素に認識されづらいが、糖鎖の機能をより積極的に活用するためにこれらに対する付加反応の開発が必須である。本研究においては、酵素に対するこれら基質の認識性を向上させるための有機化学的な処理を行い、従来法より効率的な高分子及び界面への配糖化反応を開発した。糖鎖が糖鎖以外の分子と共有結合した分子である複合糖質は、生理作用を示す分子として知られるだけでなく、機能性材料にも成り得たりすることから有用な分子群として認識されている。これら複合糖質を調製しようとした場合、各々の分子の特性が影響するため、反応温度や反応溶媒等,適した反応条件が異なる場合が多く、合理的な反応系を設計するのが困難である。しかし生体内においては、全ての共有結合の形成は酵素反応によって完結している。このことは、合理的な反応系を設計することにより、酵素反応を効率的に進行させることが可能であることを示している。本研究においては、自然界で自発的に起きている2つの現象である、アマドリ転位反応と多糖による包接現象を活用する、酵素触媒糖鎖付加反応システムを、より多様な手法とするための条件検討を行い、高効率化へ向けた手法への展開を目出す。これまでに酵素反応による糖ペプチドや配糖体の糖鎖合成反応は究めて多く報告されているが、高分子、界面、糖脂質への配糖化は困難であった。それは、酵素がタンパク質でできているためであり、界面付近での酵素の失活や基質への近接不可能、さらに、基質可溶化のための有機溶媒等の添加による変性が原因としで挙げられる。従って、これら特異的な環境に特化した酵素反応の反応場のデザインをする必要性があった。以上の間題点を解決するに辺り、平成19年度は以下の項目こついて検討した。1.アマドリ転位反応の促進因子の探索これまでの予備的な研究成果から、アマドリ転位反応の促進因子としてリン酸が優れていることが明らかになっている。これまで、アマドリ化に2週間程度必要であることから、1日程度に短縮できるような促進因子の探索を行った。しかしながら十分に促進する要因は見いだせなかった。そのため、リン酸をアマドリ転位の促進因子として用い、各種アマドリ化ペプチドを合成し、次項の反応に用いた。2.アマドリ化糖アクセプターの酵素認識性の検討アマドリ化した糖脂質または糖ペプチドに対して、3種類の糖加水分解酵素を作用させ,反応生成物をMALDI-TOF MSで解析したところ、所望の糖脂質の生成が確認できた。従って、アマドリ化糖の構造は、酵素の認識性に大きく影響しないことが明らかになった。現在までのところ、生成物の効率的な分離方法が確立していないことから、レクチンカラム、ボロン酸カラム等を駆使して、生成物の構造解析などを進めていく。3.今後の展望アマドリ転位反応は、未知なところが多いことを再確認したことから、アマドリ転位反応マップを作成し、その最適化を図りたい。それは、酵素がタンパク質でできているためであり、界面付近での酵素の失活や基質への近接不可能、さらに、基質可溶化のための有機溶媒等の添加による変性が原因として挙げられる。以下、前年度の結果を基に検討し今年度の成果を示す1.多糖の特性を活用した糖脂質の合成脂溶性分子を包接することで知られるデンプンとカードランに糖脂質を包摂させ、デンプンまたはカードランを加水分解する酵素を作用させたところ、オリゴ糖を有する糖脂質を好収率でえた。また、糖脂質のアグリコン部位を変えることにより、糖の結合位置が変化することが明らかになった。今後、非天然型糖鎖を有する糖脂質を、高位置選択的に得る条件を検討していく。2.アマドリ転位反応を活用する糖タンパク質の合成アマドリ転位反応を活用してリゾチームとRNA分解酵素に対してセロビオースを導入したところ、50%程度の収率で目的糖タンパク質を得た。これらに対し、酵素的配糖化反応を行い、質量分析及び電気泳動を用いて反応物を分析したところ、所望の糖タンパク質の生成を確認した。また、ペプチドマッピングにより糖鎖はリジン残基に特異的に導入されていることが明らかになった。現在、収率の向上と分離条件の検討を行っている。3.今後の展望別の研究成果により、酵素反応に適した基質が簡便に得ることが可能になった。当該技術を本研究に取り込むことにより、本研究が加速度的に進展することが期待できる。これまでに酵素反応による糖ペプチドや配糖体の糖鎖合成反応は極めて多く報告されているが、酵素反応による高分子、界面、糖脂質への配糖化は困難であった。それは、酵素が高分子であるタンパク質でできているためであり、界面付近での酵素の失活や基質への近接が不可能であったり、さらに、基質可溶化のための有機溶媒等の添加により酵素が変性したりすることが原因として挙げられる。

従って、以上のような特異的な環境に特化した酵素反応の反応場のデザインをする必要性があった。以下、前年度の結果を基に検討し今年度の成果を示す。1.アマドリ転位反応の効率化に向けた条件検討アマドリ転位反応に限らず、化学反応速度を上げる要因として反応温度が上げられる。アマドリ転位反応の場合、反応温度を高くすることにより目的とする反応の速度を上昇させることができるが、同時に副反応の速度も上昇するため、両刃の剣となる。しかしこれら副反応の促進因子として、反応溶液中に共存する微量の酸素や金属イオンが想定されていることから、これらを取り除いた条件で、かつ90°Cでの反応について評価した。金属イオンを取り除いた超純水と、蒸留水を反応溶媒として用いたところ、超純水の方が副生成物が少なかった。超純水に含まれる金属イオンを完全に取り除くことを目的として種々のキレーターを添加して反応を行ったところ、変化は見られなかった。又、酸素を取り除くことも効果があったことから、超純水脱酸素下で行うことにより、目的化合物の収率を向上させることが期待できる。2.今後の展望以上の結果とこれまでの結果を勘案すると、糖の3位の置換基(アルデヒド基から見てβ位)を変えることにより、高効率なアマドリ転位反応を達成する可能性が出てきた。今後、様々な置換基を導入した糖を化学合成し、安定な糖化タンパク質合成を達成したい。
中性子散乱による物質中の水質の波動関数の研究

中性子散乱は、水素に対する散乱断面積が他の原子に比して異常に大きいことから、水素研究の重要な手段であった。本研究で確立をめざす中性子コンプトン散乱は、これまでの用いられてきた中性子散乱技法とは異なり、直接、基底状態の波動関数の研究を可能にするものである。さらに、中性子コンプトン散乱では散乱原子の質量によって、その散乱ピ-クが異なった位置に出現する。これは、水素(質量が一番小さい)からの散乱を他の原子からのものと全く分離して観測できるという大きなメリットをもたらす。本研究の目的は、中性子コンプトン散乱技術を確立するとともに、この技法によって、誘電体KDP中の水素の波動関数に対する知見を得、相転移機構における水素の役割を研究ことにあたった。1。中性子コンプトン散乱技術の確立。中性子コンプトン散乱研究用クライオスタットを製作し、標準試料として水素の波動関数がharmonicと考えられているZrH2を用いて中性子コンプトン散乱研究を行った。この結果、ZrH2中の水素の基底状態の波動関数がやはりharmonic wavefunctionであることが確認された。また、他の標準物質TiD2,VH2でも同様の研究を行い、一般に、中性子コンプトン散乱によって基底状態の波動関数が研究できることを確認した。(Y.Nakai,E.Akiba,H.Asano and S.Ikeda、J.Phys.Soc.Jpn.、掲載予定)。2。中性子コンプトン散乱によるKDP中の水素の波動関数の研究。単結晶KDPを用い、通常の非弾性中性子散乱実験を行うとともに(K.Shibata et al.J.Phys.Soc.Jpn.掲載)、相転移温度の上下の温度で中性子コンプトン散乱研究を行った結果、相転移温度で、水素の波動関数は全く変化しないことが確認された。この結果は、KDP等の水素結合型誘電体の相転移機構として考えられていた水素のトンネルモデルを否定するものであり、大きな波紋をなげかけている(S.Ikeda et al.、投稿予定)。1。2。
高品質の溶液絶縁膜を用いた高速・高性能グラフェントランジスタの開発

溶液法とマイクロアニーリングを組合せてエピタキシャル成長するグラフェンの上にダメージを与えずに高品質な絶縁膜の形成方法を提案する。この方法はグラフェンにドーピングや歪を与えなく、グラフェン固有特性を保存する。この方法で製作した絶縁膜は表面粗さが0.237nm、誘電率が7.5である。漏洩電流は自然酸化した絶縁膜より1000倍の低い漏洩電流を示した。この優秀な特性は絶縁膜中にヒドロキシル基とカルボキシ基が効果的に消去されたためだと考えられる。高品質の溶液絶縁膜を用いた高速・高性能グラフェントランジスタの開発することを目標に、グラフェンにダメージを与えずに高品質のゲート絶縁膜を形成及びセルフアラインゲート構造を製作する研究を行っている。このため本年度は、グラフェンの上に薄いアルミなし、直接に高品質な絶縁膜を形成する方法を開発した。ゲート絶縁膜を形成するためにはSiC(Silicon Carbide)の上に溶液を塗布した後マイクロウェーブアニーリングする方法で様々な成長条件の最適化を実施した。その結果、溶液を塗布した後1000 Wで5分間マイクロウェーブアニーリングの条件でグラフェンにダメージを与えずに10 nm程度の非常に薄い絶縁膜を形成できることを見出した。さらにマイクロウェーブアニーリングだけ適用することにより、優秀な表面状態、かつ、グラフェンにドーピングを与えずに優秀な絶縁膜の形成に成功した。この結果を基にホールデバイス構造を製作し、移動度を測定した。その結果、最高マイクロウェーブアニーリングで製作したゲート絶縁膜を有するデバイスは最高25,000 cm2/Vsという非常に高いホール移動度を示した。すなわち、マイクロウェーブ溶液法を用いることにより、グラフェンの上に絶縁膜があるにも関わらず、グラフェンの電気特性の劣化を最小化することに成功した。以上、本研究で開発したマイクロウェーブ溶液法を用いることにより、グラフェンドーピングが発生せず、非常に高いホール移動度を示していることを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。電子工学28年度が最終年度であるため、記入しない。
正常組織におけるPAF(血小板活性化因子)とその内在性インヒビタ-

PAFは多彩な生理活性をもった最初の天然燐脂質である。その医学生物学的意義としては2面性があり、1つはよく知られている様に免疫・炎症に関わるメジエ-タ-であり、他の1つは研究仮説の段階であるが、オ-タコイドとして正常細胞の機能を維持し、発現する作用である。今回、我々が研究したのはPAFがオ-タコイドの1種であることを示そうとしたもので、次の成果を得た。1.正常ラットの胃のPAFレベル部位によってPAFレベルに差があり、前胃、腺胃の前庭部と体部、12指腸では前庭部に最も高く(940nmol/mol組織燐脂質)、次いで12指腸、体部、前胃の順であった。このラットを23°Cで水浸拘束を加えると、体部に潰瘍を形成するが、体部、前庭部のPAFは水浸後直に、潰瘍形成より遥かに早期に減少した。2.正常ラットの心筋に発見されたビニ-ルPAFについてPAFと構造類縁のビニ-ルPAFがラット、およびモルモットの心筋に存在することを初めて報告した。血小板凝集能で比較するとビニ-ルPAFはPAFの約20%の生物活性を示した。3.卵巣摘出ラットのPAFおよびPGに及ぼすエストラジオ-ルの影響卵摘により子宮のPAFは減少し、エストラジオ-ルの投与により回復するが、その挙動はPGF_<2α>と同じであり、PGE_2とはむしろ逆の関係にあった。以上の成績はPAFおよびその類縁体が正常組織に存在し、そのレベルが種々の非炎症刺激に応じて変動していることは、研究仮説の様にオ-タコイドとしてのPAFの意義を確証するものと考えている。将来更にこの方向で研究を発展させたい。PAFは免疫炎症反応のメディエーターと見なされ、一般には正常組織に常在する成分ではないと考えられていた。然しながら、我々は外から何らの刺激を加えない正常なラット子宮にPAFが存在することを既に報告した。今回も、引き続き同じ考えの下で研究を行い、次の成果を得た。1.ラット心筋中のPAFとそのアナローグ特にビニール型PAFについてビニール型PAF(l-alk-l'enyl-2-acetyl GPC)の前駆体と見なされいるコリン・プラスマローゲンの豊富な心筋を材料として、灌流の後、各種クロマトグラフィーを併用してビニール型PAFを単離し、質量分析法により16:0、18:0、18:1のビニール型PAFを同定した。量的には16:0が量も多かった。心筋にはこのビニール型PAFの他にPAFとそのアシル型も存在しており、量的にはアシル型が最も多く、次いでビニール型、PAFは最小であった。一方、16:0ビニール型PAFを半合成し、その血小板凝集能を調べた結果、16:0PAFの約1/5であった。2.ラット胃におけるPAFとその変動正常なラット胃にもPAFおよびそのアシル型が存在し、後者が約7倍多かった。部位的には幽門部に最も多く、次いで体部、前胃の順であった。このPAFは水浸拘束ストレスにより直ちに反応して減少した。この変化は潰瘍の発現より早期にみられた。以上のようにPAFは炎症免疫反応に関係するのみならず、正常組織の機能にも深く関わっており重要な研究課題である。PAF(血小板活性化因子)は免疫・炎症反応のメジィエ-タ-と見なされ、一般には正常組織には存在しないと考えられていた。

然しながら、我々は外界から何らの刺激を加えない正常組織例えばラット子宮にも微量ながらPAFが存在することを初めて報告したが、その生理的意義については全く不明である。今年も引き続き正常組織のPAFについて、また他方、疾病とPAFとの関係について以下の実績を得た。1.ラットおよびモルモット心筋に存在するPAF類縁化合物についていづれにもPAF、アシル型PAFおよびビニ-ル型PAFが存在し、このビニ-ル型が発見されたのはこれが始めてである。量的にはアシル型が一番多く、次いでビニ-ル型そしてPAFの順であり、いづれも16:0が主成分であった。2.ラット胃におけるPAF類似化合物について胃では胃前庭、体部、前胃の順に、十二指腸では胃体部より多量にPAFおよびアシル型PAFが存在しており、アルコ-ルの経口投与によって著明に低下した。この際アセチ-ル・ヒドロラ-ゼ活性は上昇していた。正常組織におけるPAFとその関連化合物の意義は不明ではあるが、オ-タコイド様の機能を持っていると考えている。3.アレルギ-と関係の深い鼻ポリ-プの中に、好酸球および好中球の含まれた胸水の中に、PAFおよびアシル型PAFを検出し同定した。また人単核球は殆ど特異的に尿酸刺激にてPAFを生成した。以上の様にPAFは炎症免疫反応に関係するのみならず、正常組織の機能にも深く係わる重要な生理活性物質である。I.ラット子宮のPAF及びプロスタグランジンに及ぼす女性ホルモンの影響に関してモデル実験として卵巣摘出ラットを用い、女性ホルモンの1つであるエストラジオ-ルを投与して子宮内PAFレベルが如何に変化するかを実験した。その結果、(1)正常ラット子宮のPAF量は子宮燐脂質1モル当り約0.8μモルであり、その分子種組成は16:0が主で、次いで18:1、18:0の順であった。一方、PAF類縁体のアシルPAFもPAFの約5倍量存在し、分子種では16:0、18:0、18:1の順であった。プロスタグランジン(PG)としてはPGF_2α、PGE_2が主であった。(2)卵摘による子宮のPAFは燐脂質1モル当り約0.3μモルに減少した。その時のPGF_2α、PGE_2の分量はそれぞれ3μモル、1μモルであった。(3)エストラジオ-ル投与により、PAFは6倍に、PGF_2は4倍に上昇したが、PGE_2は逆に約35%に減少した。以上の事実はPAFはホルモンの支配化にあることを示唆するものであり、またPG特にPGF_2αとの密接な関連性が明らかになった。II.ラット子宮に存在する内在性PAFインヒビタ-に関してPAFの皿小板凝集能を阻害する内在性インヒビタ-が子宮の燐脂質画分にあることがわかり、それらはリゾレシチンとスフィンゴミエリンであることが明らかになったが、その特異性、作用濃度は化学的に合成されたCVー3988などの約100分の1程度であった。
肺がん転移に関与するシアリルルイス抗原キャリアータンパク質の同定と診断法の開発

シアリルルイスX(sLeX)抗原は肺がんの血行性転移に関与する。ヒト肺腺がん細胞ABC-1には分子量190kDaと分子量250kDa以上の二つのsLeXキャリアータンパクが存在する。ABC-1細胞膜と培養液からイムノアフィニティークロマトを用いてsLeXキャリアータンパクを精製し、質量分析によりタンパクXとYを同定した。siRNAを用いてABC-1上のタンパクXの発現をノックダウンして、細胞表面におけるシアリルルイスX抗原の発現変化がみられなかった。このことから、細胞表面のシアリルルイスX抗原キャリアータンパクはYであると推定された。タンパクYの発現抑制実験を進行中である。大量培養したヒト肺腺がん細胞ABC-1から膜タンパク質を可溶化し、WGAレクチンアフィニティークロマトグラフィー、シアリルルイス抗原に対する抗体を固相化したイムノアフィニティークロマトグラフィー、MonoQイオン交換クロマトグラフィーに順次かけてシシアリルルイスX抗原キャリアータンパク質を精製した。精製タンパク質をSDS-PAGEにかけ、分子量190 kDaの部位のゲルを切り出し、トリプシンでゲル内消化を行った後、抽出したペプチド断片をnanoLC-MALDI-TOF/TOF質量分析装置にかけ、タンパク質を同定した。Gal3ST-2導入細胞の膜タンパク質抽出液を、同定したタンパク質に対する抗体を用いて吸収実験を行い、分子量170 kDaのスルホルイスX抗原キャリアータンパク質が親細胞ABC-1のシアリルルイスX抗原キャリアータンパク質と同じタンパク質であることを確認した。siRNAテクノロジーを用いてABC-1細胞における190 kDaタンパク質の発現をノックダウンして、細胞表面におけるシアリルルイスX抗原の発現変化をフローサイトメトリーで調べたが変化がみられなかった。このことから細胞表面のシアリルルイスX抗原キャリアータンパク質は別のタンパク質であることが示された。このため、抗シアリルルイスX抗体で認識される分子量250 kDa以上の高分子量タンパク質が目的のタンパク質である可能性が考えられたので、これを精製して質量分析装置で同定した。この高分子量タンパク質のペプチド部分に対する抗体は、抗シアリルルイスX抗体と同様に細胞表面を染色するので、このタンパク質が目的タンパク質である可能性が高い。いろいろと試みたが、これまでのところsiRNAテクノロジーでこのタンパク質をノックダウンすることに成功していない。現在CRISPRテクノロジーによるノックアウトを同時進行で試みている。シアリルルイスX抗原はがんの血行性転移に関与する。ヒト肺腺がん細胞には分子量250kDa以上と分子量190kDaの二つのシアリルルイスX抗原キャリアータンパクが存在する。これらを同定するため、大量培養したヒト肺腺がん細胞ABC-1から、WGAレクチンクロマト、抗シアリルルイスX抗体を固相化したイムノアフィニティークロマト、MonoQイオン交換くクロマトを組み合わせて精製した。精製タンパクをSDS-PAGEにかけ、分子量250kDa以上と190kDaの部位を別個に切り出し、トリプシンでゲル内消化を行った後、抽出したペプチド断片を質量分析装置にかけシアリルルイスX抗原キャリアータンパクXとYを同定した。Gal3ST-2導入細胞の膜タンパク抽出液を、同定したタンパクXとYに対する抗体を用いて吸収実験を行い、分子量250kDaと分子量170kDaのスルホルイスX抗原キャリアータンパクが親細胞ABC-1のシアリルルイスX抗原キャリアータンパクX、Yとそれぞれ同じタンパクであることを確認した。siRNAを用いてABC-1細胞における190kDaタンパクYの発現をノックダウンして、細胞表面のシアリルルイスX抗原の発現変化をフローサイトメトリーで調べたが変化がみられなかった。このことから細胞表面のシアリルルイス抗原キャリアータンパクは分子量250kDa以上のタンパクXであると考えられた。タンパクXに対する抗体で染色すると抗シアリルルイスX抗体と同様に細胞表面が染色された。最終年度である今年度はCRISPR/Cas9を用いてシアリルルイスX抗原キャリアータンパクXのノックアウトを試みたが、タンパクX欠損細胞が得られなかった。タンパクXは生存に必須である可能性が考えられたので、誘導可能なCas9のシステムを構築中である。糖鎖生物学平成25年度計画の目標であったシアリルルイスX抗原キャリアータンパク質の同定が完了したので。計画どおり、シアリルルイスX抗原キャリアータンパク質の血行性転移への関与を明らかにするとともに、シアリルルイスX抗原とキャリアータンパク質を同時検出するサンドイッチELISA法を開発する。