hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
孤発性ALSマウスモデルによる家族性遺伝子の分子連関の解明

孤発性筋萎縮性側索硬化症のモデルマウスであるRNA編集酵素ADAR2コンディショナルノックアウトマウスでADAR2免疫染色性のない脊髄運動ニューロンにおいてカルパインによって生じるTDP-43の断片化と局在異常が観察された。カルパインによるTDP-43の切断点を明らかにし、これらのTDP-43のカルパイン断片は全長TDP-43に比べ凝集性が高いこと、さらにTDP-43はリン酸化によりカルパイン切断に抵抗性を獲得することを明らかにした。RNA編集酵素ADAR2の活性低下によるAMPA受容体サブユニットGluA2 Q/R部位のRNA編集低下、およびTDP-43陽性の細胞質封入体形成は孤発性ALS運動ニューロンに見られる疾患特異的分子変化である。ADAR2の発現が低下した運動ニューロンにおいてTDP-43の局在異常が観察され、TDP-43がカルパインにより切断され、N端領域が凝集体形成に関与することを報告した。カルパインによるTDP-43の切断点の同定を行う為、リコンビナントTDP-43をpCold系(タカラ)を用いることで合成し、カルパインにより切断したフラグメントをMALDI-TOF massを用いて解析を行い、10の切断点を同定した。TDP-43フラグメントのウエスタンブロットの結果からメインの3つのN端フラグメントと1つのC端フラグメントを作成し、HeLa細胞に過剰発現後、凝集能と細胞死の検討を行った。プリオンドメインを含んだ2つの長いN端フラグメントは強い凝集性を示したが細胞死は見られなかった。一方短いN端フラグメント・C端フラグメントは凝集能・細胞死ともに観察されなかった。またADAR2活性低下からTDP-43病理に至る分子カスケードが孤発性ALS運動ニューロンに働いていることは、AR2マウス運動ニューロンのADAR2発現を遺伝子治療で回復することによりTDP-43の局在が正常化したことにより裏付けられた。次にFUSがカルパインにより切断されることを培養細胞、マウスの脳・脊髄のin vitroカルパインアッセイにより確認できたので、切断部位の検討のために、Flagタグを付けたFUSのコンストラクトとFUS変異を導入したコンストラクトを作成中である。RNA編集酵素ADAR2の低下によるAMPA受容体サブユニットGluA2 Q/R部位のRNA編集低下、およびTDP-43病理は孤発性ALS運動ニューロンに見られる疾患特異的分子変化である。我々が開発した孤発性ALSの分子病態モデルであるAR2マウスでは、ADAR2の発現が低下した運動ニューロンにおいてTDP-43の局在異常が観察され、ALSにおけるTDP-43病理形成のメカニズムが、活性化されたカルパインによりTDP-43が凝集性の高い断片に切断されることが引き金になること、その断片が全長TDP-43をも巻き込んだ封入体を形成しTDP-43病理として観察されることを昨年までに報告した。AR2マウスの検討から、一旦形成された凝集体もカルパインにより非凝集性断片に細断されていくことが明らかになり、凝集体を形成したTDP-43はカルパインに耐性をもつことが想定される。封入体を形成するTDP-43は過剰にリン酸化されていることが報告されているため、リン酸化がTDP-43のカルパインによる切断に及ぼす影響について検討を行った。TDP-43のリン酸化酵素であるカゼインキナーゼファミリーの4種を用いTDP-43をリン酸化後、カルパインへの耐性を調べた。数種のキナーゼによる検討から、リン酸化されたTDP-43がカルパインによる切断に耐性をもつことがわかった。TDP-43が凝集体を形成するにはどのようなカスケードにより変化が起こるのか、カルパインとTDP-43のN端フラグメントとTDP-43リン酸化の観点から検討を進めている。ALSの病因と関連するFUSもカルパインにより切断されることをマウスの脳・脊髄で昨年度確認したので、培養細胞にFlag-FUSを過剰発現することにより、数種類のフラグメントができることを確認した。現在FUSのsiRNAを用いADAR2発現への影響を検討している。我々が開発した孤発性ALSの分子病態モデルであるAR2マウスでは、ADAR2の発現が低下した運動ニューロンにおいてTDP-43の局在異常が観察され、ALSにおけるTDP-43病理形成のメカニズムが、活性化されたカルパインによりTDP-43が凝集性の高い断片に切断されることが引き金になること、その断片が全長TDP-43をも巻き込んだ封入体を形成しTDP-43病理として観察されることを見出した。さらにAR2マウスの検討から、一旦形成された凝集体もカルパインにより非凝集性断片に細断されていくことが明らかになり、凝集体を形成したTDP-43はカルパインに耐性をもつことが想定される。封入体を形成するTDP-43は過剰にリン酸化されていることが報告されているため、リン酸化がTDP-43のカルパインによる切断に影響を及ぼすことが考えられた。そのためTDP-43のリン酸化酵素であるカゼインキナーゼ1、2とtau tubulin kinase 1, 2(TTBK1, 2)の4種を用いTDP-43をリン酸化後、カルパインへの耐性を調べた。

TDP-43はリン酸化によりカルパイン切断に抵抗性を獲得することがわかった。TDP-43のカルパイン断片が全長TDP-43に比べ凝集性が高いという結果を併せて考察すると、カルパインにより断片化されたTDP-43は凝集塊を形成し、それをシーズとして核・細胞質をシャトリングしているTDP-43を巻き込み封入体を形成すると共にリン酸化を受ける。断片化、リン酸化によりカルパインへの抵抗性が高まり、TDP-43病理形成を促進することが示唆された。孤発性筋萎縮性側索硬化症のモデルマウスであるRNA編集酵素ADAR2コンディショナルノックアウトマウスでADAR2免疫染色性のない脊髄運動ニューロンにおいてカルパインによって生じるTDP-43の断片化と局在異常が観察された。カルパインによるTDP-43の切断点を明らかにし、これらのTDP-43のカルパイン断片は全長TDP-43に比べ凝集性が高いこと、さらにTDP-43はリン酸化によりカルパイン切断に抵抗性を獲得することを明らかにした。TDP-43をリン酸化することが報告されているキナーゼによって、TDP-43のリン酸化がカルパインによる切断を制御することを明らかにし、その結果の投稿準備を行っている。またFLAG-FUSを作成しin vitroにてカルパインによりFUSが数種のフラグメントに切断されることを示した。さらにFUSがADAR2の上流であることを検討するためFUSのsiRNAの検討を行ったがFUSの発現量を十分に低下させることができなかった。内科系臨床医学・神経内科学TDP-43のリン酸化がカルパインによる切断を制御することを明らかにした。TDP-43が凝集体を形成するにはどのようなカスケードにより変化が起こるのか、カルパインとTDP-43のN端フラグメントとTDP-43リン酸化の観点から検討を進める。FUSについてはFUS蛋白の発現量を十分に低下させるシステムを確立し、孤発性ALSに関与している遺伝子群がどのように関連して神経細胞死カスケードを引き起こすのか、更に検討を行いたいと考える。TDP-43のカルパインによる切断点を同定し、そのN端フラグメントは強い凝集性を示すことがわかり、その結果を論文に発表した。さらに、孤発性ALSマウスを用いたADAR2活性を回復させる遺伝子治療実験において、ADAR2からTDP-43病理へ至る分子カスケードが孤発性ALS運動ニューロンの細胞死ではたらいていることが裏付けられ、その結果を論文に発表した。またFUSがカルパインにより切断されることがわかった。当初の研究計画に従って研究を進める。今回15,964円の次年度使用額が出た。消耗品の使用の細かい金額の端数が出たことによる。これに関しては、平成27年度研究費と合わせ、消耗品費として使用する。カルパインによるTDP-43の切断点を同定しそのN端フラグメントが強い凝集性を示すことが分かった。またFUSもカルパインにより切断を受けることが明らかになった。この二つの遺伝子と他の孤発性筋萎縮性側索硬化症の関連遺伝子がどのようなつながりがあるのか、得られた結果を元に、神経細胞死カスケードについて、更に検討を行いたいと考える。
ゾーンメルテング法によるカテコール及びその誘導体の精製と接触分析への応用

カテコールおよびその誘導体は過酸化水素により酸化されるが,超微量のマンガン(Mn)が共存するとその反応は著しく加速される.この現象を利用するMnの接触分析法を開発し,飲料水中のMn定量に応用した.検出はカテコールの酸化物とエチレンジアミン(en)をカップリングさせ,生成したキノキサリン誘導体の発蛍光性を利用し,蛍光検出法によりなされた.enはカップリング成分としての役割以外にアクチベータとしても作用し,更にマスキング剤としても有効であった.このenの効果により,本研究は検出限界3ppt,定量下限10ppt,妨害イオンがほとんどないという高感度,高選択性の優れた定量法を開発することができた.またカテコール誘導体であるジヒドロキシナフタレン(DHN)によるMn定量では分解速度を利用する方法で吸光光度法による定量を試みた.この方法でも吸光法ながら検出限界8pptである高感度分析法が確立できた.このようにカテコールとその誘導体を利用する分析法は高感度であるが,その反応機構については不明な点が多かった.そこでカテコール誘導体からキノキサリン誘導体に変化する反応機構について検討した.従来カテコールは酸化されオルトベンゾキノンが生成するとされているが,それ以前にカテコール-Mn-en-過酸化水素の4元錯体が中間体として生成し,その後キノキサリン誘導体に変化することが明らかにされた.この反応途中ではヒドロキシルラジカルが生成する.従ってこのラジカルを利用し,アゾ化合物の分解反応を検討した.使用した試薬はアゾ基とカテコール基を有するスチルバゾである.このスチルバゾの分解反応を利用する方法によっても高感度マンガンの定量法が確立できた.カテコールおよびその誘導体は過酸化水素により酸化されるが,超微量のマンガン(Mn)が共存するとその反応は著しく加速される.この現象を利用するMnの接触分析法を開発し,飲料水中のMn定量に応用した.検出はカテコールの酸化物とエチレンジアミン(en)をカップリングさせ,生成したキノキサリン誘導体の発蛍光性を利用し,蛍光検出法によりなされた.enはカップリング成分としての役割以外にアクチベータとしても作用し,更にマスキング剤としても有効であった.このenの効果により,本研究は検出限界3ppt,定量下限10ppt,妨害イオンがほとんどないという高感度,高選択性の優れた定量法を開発することができた.またカテコール誘導体であるジヒドロキシナフタレン(DHN)によるMn定量では分解速度を利用する方法で吸光光度法による定量を試みた.この方法でも吸光法ながら検出限界8pptである高感度分析法が確立できた.このようにカテコールとその誘導体を利用する分析法は高感度であるが,その反応機構については不明な点が多かった.そこでカテコール誘導体からキノキサリン誘導体に変化する反応機構について検討した.従来カテコールは酸化されオルトベンゾキノンが生成するとされているが,それ以前にカテコール-Mn-en-過酸化水素の4元錯体が中間体として生成し,その後キノキサリン誘導体に変化することが明らかにされた.この反応途中ではヒドロキシルラジカルが生成する.従ってこのラジカルを利用し,アゾ化合物の分解反応を検討した.使用した試薬はアゾ基とカテコール基を有するスチルバゾである.このスチルバゾの分解反応を利用する方法によっても高感度マンガンの定量法が確立できた.重金属イオンにマンガンを選び,エチレンジアミン共存下でカテコール誘導体と過酸化水素の接触反応を利用する超微量定量法を検討し,従来法より検出限界を著しく向上させた.特にカテコールと類似の構造を有する2,3-ジヒドロキシナフタレン(DHN)が溶存酸素の影響を受けず,感度,精度ともに優れた接触分析用指示反応試薬であることが明らかにされた.蛍光検出法を適用することにより,検出下限が10pptという超微量定量法が確立された。この感度は従来法の中でも最も高感度のものに比較しても遜色がなく,最終生成物であるキノキサリンの構成成分であり、またマスキング剤として作用するエチレンジアミンを共存させることにより高選択性を実現している.感度,選択性の両面から評価するならば最良の方法が確立されたといえる.またZINDOにより計算し,中間生成物の構造を推定し,反応機構について検討した.その結果,従来いわれていた,2、3-ナフトキノンの生成以前にDHNとMuのキレート生成により、エチレンジアミンと反応することが明らかにされた.その他共存させる有機溶媒の効果と生成ラジカルの安定性について検討された.現在はゾーンメルテング法による試薬の精製によるブランク値の減少をめざし努力している.DHNは空気に接触するガラス層の上下で酸化されるが、中間部分の酸化は問題とならなかった。また,従来は反応速度の測定に中間体の生成反応を利用していたが,指示反応試薬自身の分解反応を利用する方法を検討し,更に感度の向上が期待できることが明らかになった。カテコールおよびその誘導体は過酸化水素により酸化されるが,超微量のマンガン(Mn)が共存するとその反応は著しく加速される.この現象を利用するMnの接触分析法を開発し,飲料水中のMn定量に応用した.検出はカテコールの酸化物とエチレンジアミン(en)をカップリングさせ,生成したキノキサン誘導体の発蛍光性を利用し,蛍光検出法によりなされた.enはカップリング成分としての役割以外にアクチベータとしても作用し,更にマスキング剤としても有効であった.

このenの効果により,本研究は検出限界3ppt,定量下限10ppt,妨害イオンがほとんどないという高感度,高選択性の優れた定量法を開発することができた.またカデコール誘導体であるジヒドロキシナフタレン(DHN)によるMn定量では分解速度を利用する方法で吸光光度法による定量を試みた.この方法でも吸光法ながら検出限界8pptである高感度分析法が確立できた.このようにカテコールとその誘導体を利用する分析法は高感度であるが,その反応機構については不明な点が多かった.そこでカテコール誘導体からキノキサリン誘導体に変化する反応機能について検討した.従来カテコールは酸化されオルトベンゾキノンが生成するとされているが,それ以前にカテコール-Mn-en-過酸化水素の4元錯体が中間体として生成し,その後キノキサリン誘導体に変化することが明らかにされた.この反応の途中ではヒドロキシルラジカルが生成する.従ってこのラジカルを利用し,アゾ化合物の分解反応を検討した.使用した試薬はアゾ基とカテコール基を有するスチルバゾである.このスチルバゾの分解反応を利用する方法によっても高感度マンガンの定量法が確立できた.
いもち病菌感染イネにおけるエフェクターとそのターゲットの相互作用の解明

研究代表者らは、イネいもち病菌の3つの非病原力エフェクターAVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pikと1つの病原性分泌タンパクMC69の同定に成功するとともに、イネにおいては、いもち病抵抗性(R)遺伝子Piaの単離同定に成功している。その後、MC69がイネいもち病菌およびウリ類炭疽病菌の感染に共通して必要な病原性分泌タンパク質であることを見出した。また、イネのRタンパク質Pik1が直接的タンパク質相互作用によってAVR-Pikを認識することを明らかにした。さらに、R遺伝子Piiの単離同定に成功した。植物病原体は、宿主植物への感染時にエフェクターと呼ばれる分泌タンパク質を宿主細胞または細胞間隙に注入し、宿主細胞または組織内機能を撹乱することでその病原性を発揮する。一方、あるエフェクターを認識する抵抗性タンパク質遺伝子を宿主植物が保有している場合、そのエフェクターは植物の抵抗性誘導を引き起こす(非病原力エフェクター)。我々は、一昨年度までに3つの非病原力遺伝子AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pikおよび1つの病原力遺伝子MC69の単離に成功している。そこで昨年度、これらのエフェクターターゲットを探索した結果、AVR-Piaは2つのイネ遺伝子SasRGA4とSasRGA5産物と相互作用して抵抗性を誘導することが示された。この結果から、イネいもち病抵抗性遺伝子Piaは、2つの遺伝子SasRGA4とSasRGA5で構成されていることが明らかとなった。昨年度、新たに3つのエフェクター候補遺伝子について解析を進めた。そのうち、MAS1とMAS3は既報のイネいもち病菌病原性遺伝子であるが、詳細な機能については未報告である。そこで、いもち病菌感染イネ組織内におけるMAS1とMAS3の局在を観察したところ、いずれも細胞内に局在していた。一方、Mg119と名付けた遺伝子の過剰発現体は矮化症状を呈した。したがって、Mg119もエフェクター候補と考え、同様にその局在を調べたところ、イネ組織の細胞間隙で検出された。また、MC69についてもイネ組織の細胞間隙で検出された。In planta共免疫沈降法によるエフェクターターゲット探索の材料として、すでに細胞内局在エフェクターであることがわかっているAVR-Pia、AVR-Pii、AVR-PikおよびMAS1、MAS3タンパク質については細胞内、Mg119とMC69タンパク質については細胞外にそれぞれ蓄積する形質転換イネ懸濁培養細胞を作出した。植物病原体は宿主植物への感染時にエフェクターと呼ばれる分泌タンパク質を宿主細胞または細胞間隙に注入することによりその病原性を発揮する。一方あるエフェクターを認識する抵抗性タンパク質遺伝子を宿主植物が保有している場合、そのエフェクターは植物の抵抗性を誘導する。我々は、平成22年度までにイネいもち病菌由来の3つの非病原力エフェクター遺伝子(抵抗性誘導)および1つの病原力遺伝子MC69の単離同定に成功している。平成23年度の研究により、MC69は、単子葉および双子葉植物にそれぞれ病原性を示すイネいもち病菌およびウリ類炭疽病菌の感染に共通して必要な病原性分泌タンパク質であることが明らかとなった(Saitoh et al.,2012 PLo S Pathogens,in press)。ウリ類炭疽病菌はベンサミアーナタバコにも感染可能である。この宿主植物では目的のタンパク質の一過的過剰発現および共免疫沈降法により植物由来ターゲット因子を同定する手法、および候補遺伝子の発現抑制法が確立されている。したがって、ベンサミアーナタバコを用いてウリ類炭疽病菌由来MC69(CoMC69)のターゲット因子の同定およびその機能解析が可能であり、さらにその因子のイネ由来オルソログはイネいもち病菌由来MC69(MoMC69)のターゲット因子となり得ると推察できる。そこで、3xFLAGタグ付きCoMC69のベンサミアーナタバコでの一過的過剰発現および検出を試み、成功した。平成23年度までにいもち病菌の3つの非病原力エフェクターAVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pikと1つの病原性分泌タンパクMC69の同定に成功するとともに、イネにおいては、いもち病抵抗性(R)遺伝子Piaの単離同定に成功している。

また、MC69がイネいもち病菌およびウリ類炭疽病菌の感染に共通して必要な病原性分泌タンパク質であることを明らかにした(Saitoh et al., 2012 PLoS Path. 8:e1002711)。植物病原体は宿主植物への感染時にエフェクターと呼ばれる分泌タンパク質を宿主細胞または細胞間隙に注入することによりその病原性を発揮する。一方あるエフェクターを認識する抵抗性タンパク質遺伝子を宿主植物が保有している場合、そのエフェクターは植物の抵抗性を誘導する。平成23年度までにいもち病菌の3つの非病原力エフェクターAVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pikと1つの病原性分泌タンパクMC69の同定に成功するとともに、イネにおいては、いもち病抵抗性(R)遺伝子Piaの単離同定に成功している。いもち病菌由来非病原力エフェクターAVR-Piaは、イネ由来の2つの遺伝子産物SasRGA4およびSasRGA5と相互作用して抵抗性を誘導することが示された。この結果から、イネいもち病抵抗性遺伝子Piaは、2つの遺伝子SasRGA4とSasRGA5で構成されていることが明らかとなった。モデル植物であるベンサミアーナタバコに感染するウリ類炭疽病菌由来MC69ホモログ、CoMC69も病原性分泌タンパク質であることが明らかにされ、生化学的手法を用いてMC69のターゲット因子を同定できる可能性が高まった。25年度が最終年度であるため、記入しない。PikがAVR-Pik産物とのタンパク質直接的相互作用を介して抵抗性を獲得し、AVR-Pikと共進化していること、Pik1の変異がAVR-Pikアリルに対する抵抗性認識に重要な役割を担っていることを明らかにした。In planta共免疫沈降法により、MC69ターゲット因子候補を見出した。単子葉および双子葉植物にそれぞれ病原性を示すイネいもち病菌およびウリ類炭疽病菌の感染に共通して必要な病原性分泌タンパク質MC69が同定されたことから、MC69のターゲット因子を探索し、MC69を介した植物病原菌-植物の相互作用の解明を最優先する。イネいもち病菌由来3つのエフェクター候補MAS1、MAS3、Mg119のHAタグ付きタンパク質を過剰発現するイネ懸濁培養細胞を供試し、各エフェクター候補と結合するイネ由来ターゲット因子の同定を試みる。それによって、イネいもち病菌の病原性におけるMAS1、MAS3およびMg119の機能を解明する。AVR-PikとPikの関係においては、AVR-PikがPik1のCoiled-coilドメインに結合することを明らかにした。同様にAVR-PiaとPia、AVR-PiiとPiiの結合様式や結合部位を明らかにし、各AVRとそれらに対応する各R遺伝子産物との相互作用によって誘導される抵抗性の分子機構解明を目指す。さらに、AVR-Rの相互作用が直接的な結合によるものか、あるいは別のターゲット因子を介するのかを調査する。一方、MC69はエフェクターか、あるいはいもち病菌のエフェクター分泌機構に関与する可能性も示唆されている。したがってMC69については、いもち病菌由来およびイネ由来ターゲット因子の両方の存在が推察できる。そこで、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik、MC69のターゲット因子を同定し、それらの相互作用を解明する。
垂直壁面移動ロボットの開発研究

世界の多くの都市では、多数の高層ビルが建設されている。これらは機能的に優れているが、火災などの災害時には多くの人命が危険にさらされる。また、ビルの外壁面は年月と共に風化するので、保守点検が必要となる。災害時の人命救助や壁面の保守点検には、凹凸のある壁面を自由に移動できる壁面移動ロボットの開発が必要である。この研究を進めるために、この方面の世界の最先端の研究を進めてきた宮崎大学工学部と中国でこの方面の優れた研究を続行しているハルビン工業大学が協力して平成8年度から研究を進めてきた。これまでの研究から、両大学でそれぞれ多くの形式のロボットモデルの開発を行ってきたが、本年度は最終段階として、低圧空気アクチュエータを用いた歩行形式の自立型モデルを開発した。実用ロボットは屋外で使用され、ビルの外壁面を移動するので、電線によってエネルギーを供給することが出来ない。それ故、小型ガソリンエンジンを用いた自律形式とするのが適当である。しかし、実験室でのテストには、取り扱いや騒音、排ガス処理が必要となり不向きであるので、今回のモデルには、等価な電気モーター駆動の送風機を採用している。送風機のよって作られる低圧空気によって吸盤の吸着と、エアータービン方式による関節の移動機構を開発した。このモデルの実験の結果、移動速度が目標値よりも少し遅いが、確実に作動し、安全に壁面を移動できることが判明した。今後はこのモデルと同型式の実用ロボットを製作することで、高層ビルの凹凸のある壁面を移動して、救難や壁面検査に実用出来るロボットの開発が可能となった。1。本研究の目的世界の大都市では、高層ビルやタワーなどの建設が急ピッチで進められている。これらは機能的には優れているが、一旦災害が発生すると多くの人命が失われる危険がある。また、年月と共に外壁面の検査や小修理が必要となる。このような目的には、垂直壁面を自由に移動できるロボットの開発が急務である。これまで多くのロボットモデルを開発してきた当研究室と中国でこの方面の研究が進んでいるハルビン工業大学が協力して、実用に向けて開発研究を行う。2。平成8年度の研究実績(1)両機関でこれまで研究してきた実績をまとめ、共同研究のモデルを決定した。宮崎大学では、これまで全く形式の異なる4種類のモデルを開発した。一方、ハルビン工業大学でも、2種類のモデルを開発した。今後共同で開発するモデルは、屋外で使用が可能にするため、エンジンで駆動される自律型のモデルで、歩行形式かまたはクローラを用いたモデルとする。(2)宮崎大学では、このモデルに使用する空気式アクチュエータの開発を実施することとした。同時に、これまでの経験を基に、制御機構の設計を行った。アクチュエータはほぼ完成し、この結果を近日中に発表する予定である。(3)ハルビン工業大学では、クローラ機構を持つ移動機構の開発を実施中である。従来は鋼鉄製のタンクに応用する目的で、磁石による移動機構の研究を行ってきたが、今回は高層ビルを対象に吸盤とクローラを組み合わせた移動機能を開発中である。(4)双方で簡単な第1段階のモデルを組み立て中である。以上のように、本年度は予定したスケジュールに従って、ほぼ予定通りに進行した。世界の大都市では、多数の高層ビルや高層の建造物が建設されている。これらは機能的に優れているが、火災などの災害時には、多くの人命が危険にさらされる。また、ビルの外壁面は年月と共に風化され、保守点検が欠かせない。この様な目的のために人間に代わって危険な作業を行えるロボットの開発が急務である。この種のロボットの研究で世界的にリ-ドしてきた宮崎大学工学部と、中国での進んだ研究を行っているハルビン工業大学が協力して新しい型式の壁面移動ロボットを開発中である。本年度は昨年度に引き続いて、自立型の歩行ロボットに関する研究を実施した。

吸着のために必要な低圧空気を得る目的で低圧空気源を使用するが、この排気を利用してロボットの全ての関節を駆動できるエアータービン型式のアクチュエータを開発した。このアクチュエータは、直流モータ特性とほぼ同じトルク特性を持ち、正逆転が可能である。また、このアクチュエータは、早い応答特性を持ち、良好な性能を持っている。それ故このアクチュエータは、壁面移動ロボットへの利用に限らず、将来多くのロボットの制御に利用できる。宮崎大学では、この新しいアクチュエータを装備した自立型2足歩行ロボットを試作中である。一方、ハルビン工業大学では、エアータービン式アクチュエータを用いた新たな移動機構を検討中である。これらの研究に基づき、次年度には、おのおの別々の型式の壁面移動ロボットを開発する予定である。世界の多くの都市では、多数の高層ビルが建設されている。これらは機能的に優れているが、火災などの災害時には多くの人命が危険にさらされる。また、ビルの外壁面は年月と共に風化するので、保守点検が必要となる。災害時の人命救助や壁面の保守点検には、凹凸のある壁面を自由に移動できる壁面移動ロボットの開発が必要である。この研究を進めるために、この方面の世界の最先端の研究を進めてきた宮崎大学工学部と中国でこの方面の優れた研究を続行しているハルビン工業大学が協力して平成8年度から研究を進めてきた。これまでの研究から、両大学でそれぞれ多くの形式のロボットモデルの開発を行ってきたが、本年度は最終段階として、低圧空気アクチュエータを用いた歩行形式の自立型モデルを開発した。実用ロボットは屋外で使用され、ビルの外壁面を移動するので、電線によってエネルギーを供給することが出来ない。それ故、小型ガソリンエンジンを用いた自律形式とするのが適当である。しかし、実験室でのテストには、取り扱いや騒音、排ガス処理が必要となり不向きであるので、今回のモデルには、等価な電気モーター駆動の送風機を採用している。送風機のよって作られる低圧空気によって吸盤の吸着と、エアータービン方式による関節の移動機構を開発した。このモデルの実験の結果、移動速度が目標値よりも少し遅いが、確実に作動し、安全に壁面を移動できることが判明した。今後はこのモデルと同型式の実用ロボットを製作することで、高層ビルの凹凸のある壁面を移動して、救難や壁面検査に実用出来るロボットの開発が可能となった。
ヒト聴器の病理組織学的研究(内耳の死後変化、自己融解に関する研究)

平成5年以降、上記課題のもとに継続的に実施した研究成果のうち、平成7年度の実績の概要は下記のようにまとめられる。1)ヒト聴器(側頭骨)の病理組織学的研究では、その標本の組織保存の問題は重要である。とくに死直後の標本の固定や生検が不可能のヒト側頭骨では、死後変化としての自己融解は程度の差はあれ不可避であり、その中でも内耳組織はとくに死後変化に感受性が高いことが知られている。死後変化の程度を規定する因子として死後の標本の採取・固定までの時間と、標本の保存された温度の両者があげられるが、後者については遺体はほぼ例外なく冷蔵保存されるので、前者の死後の標本の採取・固定までの時間が最も重要視されている。ところが死後時間がほぼ同様であってもその組織保存の程度にかなりの差がみられる事実も最近報告されるようになり、各固体の死因や死に至る過程もまた死後変化に影響を及ぼす第三の因子となる可能性が示唆されてきて、われわれはこの点を確認すべく検討を行った。その結果、脳死状態を長期間経過した症例や高度の換気不全を経て死亡に至った個体などでは、内耳組織の死後変化が、他因死の症例に比較して明らかに促進される事実が判明した。2)一方、脳死状態を長期間経過し、剖検時に完全に脳の液状化壊死に陥った個体であっても、身体死後短時間、(24時間前後)で採取固定された標本では、内耳膜迷路や神経系の組織保存は良好であって、この傾向は高度の低酸素・高二酸化炭素血症を経て死亡した個体においても同様であった。音による情報を受容して身体活動を行うために重要な聴器が、悪条件にもかかわらずその恒常性を維持しようとする機構が存在することを示唆する所見のひとつではないかと考えている。3)本研究の副次的成果として、(1)筋萎縮性側索硬化症(ALS)における顔面神経の運動ニューロンの変性パターンに関する新知見や、(2)側頭骨への転移性悪性腫瘍による顔面神経に対する侵襲病態などについてもあわせて新しい所見がえられた。平成5年度はいわゆる脳死状態にあって、比較的長期にわたり人工呼吸器管理下にあった数症例の側頭骨を入手し側頭骨病理標本を作製した。これら組織学的に観察した内耳の感覚上皮や神経系の状態と死亡前の全身状態、とくに呼吸状態、また剖検時の脳の組織学的変化とを比較検討した結果、これらの症例の標本の中にはいわゆる心臓停止から側頭骨を摘出して固定するまでの死後時間がほぼ同様であるその他の症例に比較しても、内耳感覚上皮や神経系の保存状態が決して悪くない症例も認められ、長期の呼吸器装着によりしばしば見られる脳組織の自己融解パターンと、内耳膜速路の変化は必ずしも平行していない可能性が示唆された。またこれとは別に、純粋に生前の呼吸状態が内耳の感覚上皮や神経系に及ぼす影響をヒト側頭骨で検討するために、筋萎縮性側索硬化症、拘束性呼吸障害症例など末梢性呼吸不全で死亡した症例の側頭骨を収集し、その内耳感覚上皮や神経系への影響についても検討を加えた。その結果、これらの症例では死後時間のほぼ同様であるその他の死因の症例に比較して、死後変化に基づく自己融解は若干ながら促進される傾向は決められたものの、末梢性呼吸不全状態が生前にきわめて長期にわたった症例の標本においても、内耳の感覚上皮や神経系の保存状態が良好に保たれている症例も少なくなく、種々の低酸素・高二酸化炭素状態を付加した実験動物における結果とは異なる事実も明らかとなっている。これらの結果については今後のさらなる検討を加える予定である。平成5年以来上記課題のもとに継続的に行われた研究成果の概要は下記のごとくである。1.脳死状態に陥り、長期の人工呼吸器装着の後に身体死に至ったことが臨床的にもまた剖検時にも確認された個体の側頭骨における内耳膜迷路や神経系を組織学的に検索した結果では、身体死後短時間内に採取固定された標本においては、これら内耳感覚上皮や神経系は組織学的に良好に保たれており、脳死の個体でしばしば観察される脳実質の液状化壊死のような身体死以前に現れる高度の自己融解は、内耳組織では現れないとする考え方が妥当と思われる。2.脳死のような中枢性呼吸不全を示す個体とは別に、長期にわたる高度の末梢性呼吸不全が前提となり死に至る筋萎縮性側索硬化症や重症の拘束性呼吸疾患などの個体の側頭骨における内耳感覚上皮や神経系を組織学的に検索した結果においても、これら内耳組織は死後短時間のうちに採取固定さた標本を観察する限りでは、その保存状態はかなり良好であることもほぼ明らかとなっている。すわなち長期の低酸素・高二酸化炭素血症の状態が内耳組織に及ぼす影響は、予想に反してさほど高度には現れ難いとこが示唆される。3.ただしこれらの脳死状態や高度の末梢性呼吸不全状態の後に身体死に至った個体では、内耳感覚上皮や神経系の死後変化によるとみられる自己融解所見は、死後同様の時間経過後に採取固定された他因死の個体の標本と比較すると、明らかに高度に現れやすい傾向が認められている。このことはヒト内耳に現れる死後変化としての自己融解は、標本の採取固定までの時間経過や温度条件のほかに、各個体の臨死状態や死因、つまりは死に至る過程によってもその組織保存にかなり大きな影響を及ぼしている可能性が示唆される。さらに標本の検索を継続して明年度には一定の結論をえたいと考えている。

平成5年以降、上記課題のもとに継続的に実施した研究成果のうち、平成7年度の実績の概要は下記のようにまとめられる。1)ヒト聴器(側頭骨)の病理組織学的研究では、その標本の組織保存の問題は重要である。とくに死直後の標本の固定や生検が不可能のヒト側頭骨では、死後変化としての自己融解は程度の差はあれ不可避であり、その中でも内耳組織はとくに死後変化に感受性が高いことが知られている。死後変化の程度を規定する因子として死後の標本の採取・固定までの時間と、標本の保存された温度の両者があげられるが、後者については遺体はほぼ例外なく冷蔵保存されるので、前者の死後の標本の採取・固定までの時間が最も重要視されている。ところが死後時間がほぼ同様であってもその組織保存の程度にかなりの差がみられる事実も最近報告されるようになり、各固体の死因や死に至る過程もまた死後変化に影響を及ぼす第三の因子となる可能性が示唆されてきて、われわれはこの点を確認すべく検討を行った。その結果、脳死状態を長期間経過した症例や高度の換気不全を経て死亡に至った個体などでは、内耳組織の死後変化が、他因死の症例に比較して明らかに促進される事実が判明した。2)一方、脳死状態を長期間経過し、剖検時に完全に脳の液状化壊死に陥った個体であっても、身体死後短時間、(24時間前後)で採取固定された標本では、内耳膜迷路や神経系の組織保存は良好であって、この傾向は高度の低酸素・高二酸化炭素血症を経て死亡した個体においても同様であった。音による情報を受容して身体活動を行うために重要な聴器が、悪条件にもかかわらずその恒常性を維持しようとする機構が存在することを示唆する所見のひとつではないかと考えている。3)本研究の副次的成果として、(1)筋萎縮性側索硬化症(ALS)における顔面神経の運動ニューロンの変性パターンに関する新知見や、(2)側頭骨への転移性悪性腫瘍による顔面神経に対する侵襲病態などについてもあわせて新しい所見がえられた。
ガングリオシドの構造と免疫源性の系統的再検討

今年度はガングリオシドGM1を中心に免疫原性、その反応性を検討した。肺小細胞癌は化学療法によく反応する。また最近ガングリオシドGM1に結合するコレラトキシンが肺小細胞癌株の増殖を特異的に抑制する報告がでて、癌細胞の増殖にGM1が密接に関係することが知られてきた。しかしながら、この癌細胞は薬剤耐性が生じやすく治療上の深刻な問題となっている。そこでGM1に対するモノクローナル抗体を作製し、その性状を検討し、肺小細胞癌から樹立した細胞株、肺小細胞癌組織との反応性を調べることで,GM1分子を利用する新しい治療法への応用の可能性を検討した。モノクローナル抗体はリポソームにGM1とラフ型LPSを同時にいれて免疫し、蛍光色素カルボキシフルオレセイン封入リポソームでスクリーニングする方法で作製できた。3株を選んだがいずれもIgMタイプで、その特異性はガングリオシドではGM1にのみに限られていた。肺小細胞癌株とこの抗体との反応性をFACSでみると10株中で3株に陽性所見があった。コレラトキシンとの反応性は9株で陽性となった。培養細胞の増殖抑制効果を検討したところ、培養液に抗体をくわえることでこの抗体で1株、コレラトシキンで4株が抑制された。毒素の結合活性と増殖抑制が乖離する株もあり、抗体または毒素が結合しても細胞増殖抑制のシグナルがうまく伝わらない細胞株のあることが示唆された。このモノクローナル抗体のヒト小細胞癌細胞との反応性を免疫組織化学で調べたところ、細胞株ではFACSで陽性の株の膜表面にあまり強くない反応がみられた。肺癌組織では30例中の4例の癌細胞で明らかな陽性反応がみられ、その染色像は細胞膜に強かった。GM1が肺小細胞癌の一部に特異的なマーカーの可能性が示唆された。
エリートの凝集性からみる体制変動：フィリピンとマレーシアの比較研究

フィリピンとマレーシアを事例に、政治エリートの協調や分裂がどのように起こるか、そのようなエリート関係のダイナミクスが政治体制の持続や変動にどのように影響するかを明らかにする。本研究では、エリートの協調や分裂を引き起こす要因として、各国予算、政府系企業役員報酬、国外からの援助や投資といった国内外からのリソースの調達や分配に注目する。
胃のニューラルエマージェンシーシステムにおけるPGE_2,PGI_2の役割

研究A.粘膜傷害面積の測定および胃内腔液のCGRPを測定カプサイシン(Cap)によるエタノール(EtOH)胃粘膜傷害の抑制で(ニューラルエマージェンシーシステムそのもので)1.Capによる胃粘膜傷害抑制とCGRPの遊離量はCapの用量(0.016-1.6mM)に依存的であった.2.Capによる胃粘膜傷害抑制はCGRPの拮抗薬であるCGRP8-37にて消失する事よりCGRPを介する抑制作用である.3.Capによる胃粘膜傷害抑制はPGの合成酵素阻害薬であるインドメタシンにて消失し,この時CGRPが遊離されなくなった.4.CapとEtOHを胃粘膜に投与するとPGI_2が産生されるがPGE_2は産生されなかった.5.ワイルドタイプマウスとIPレセプターノックアウト(KO)マウスを用いてCapによる胃粘膜傷害抑制の実験を行うとIPレセプターKOマウスではCapによる傷害抑制は消失し,またCGRPの遊離も起こらなかった.以上よりニューラルエマージェンシーシステムにおいてCapにより内因性のPGI_2が産生されてそのPGI_2の存在によりCGRPが遊離しやすくなり傷害抑制が起こっていた.よって少なくとも内因性PGI_2はニューラルエマージェンシーシステムにとって重要なものと考えられる.PGE_2は作用しているのか否かは現時点では判明していない.今後の展開が期待される.研究B.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いてKOマウスを使用する関係でマウスの胃粘膜基底部微小循環観察法を確立する事が出来た.rat CGRP (0.01-1μM)は細動脈を用量依存的に拡張させ,その拡張はhuman CGRP 8-37 (10μM)にて抑制された.この反応はラットと同等で,rat CGRPとhuman CGRP 8-37はマウスのCGRPレセプターに作用する事が確認された.しかしまだ本研究の内容に迫る実験迄には到達していない.研究A.粘膜傷害面積の測定および胃内腔液のCGRPを測定カプサイシン(Cap)によるエタノール(EtOH)胃粘膜傷害の抑制で(ニューラルエマージェンシーシステムそのもので)1.Capによる胃粘膜傷害抑制とCGRPの遊離量はCapの用量(0.016-1.6mM)に依存的であった.2.Capによる胃粘膜傷害抑制はCGRPの拮抗薬であるCGRP8-37にて消失する事よりCGRPを介する抑制作用である.3.Capによる胃粘膜傷害抑制はPGの合成酵素阻害薬であるインドメタシンにて消失し,この時CGRPが遊離されなくなった.4.CapとEtOHを胃粘膜に投与するとPGI_2が産生されるがPGE_2は産生されなかった.5.ワイルドタイプマウスとIPレセプターノックアウト(KO)マウスを用いてCapによる胃粘膜傷害抑制の実験を行うとIPレセプターKOマウスではCapによる傷害抑制は消失し,またCGRPの遊離も起こらなかった.以上よりニューラルエマージェンシーシステムにおいてCapにより内因性のPGI_2が産生されてそのPGI_2の存在によりCGRPが遊離しやすくなり傷害抑制が起こっていた.よって少なくとも内因性PGI_2はニューラルエマージェンシーシステムにとって重要なものと考えられる.PGE_2は作用しているのか否かは現時点では判明していない.今後の展開が期待される.研究B.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いてKOマウスを使用する関係でマウスの胃粘膜基底部微小循環観察法を確立する事が出来た.rat CGRP (0.01-1μM)は細動脈を用量依存的に拡張させ,その拡張はhuman CGRP 8-37 (10μM)にて抑制された.この反応はラットと同等で,rat CGRPとhuman CGRP 8-37はマウスのCGRPレセプターに作用する事が確認された.しかしまだ本研究の内容に迫る実験迄には到達していない.研究A.粘膜傷害面積の測定および胃内腔液のCGRPを測定カプサイシン(Cap)によるエタノール(EtOH)胃粘膜傷害の抑制で(ニューラルエマージェンシーシステムそのもので)1.Capの用量を変えて(0.016-1.6mM)傷害の抑制とCGRPの遊離の用量反応曲線を作成すると傷害の抑制とCGRPの遊離量と用量依存性あり.2.Capによる胃粘膜傷害抑制はCGRPの拮抗薬であるCGRP 8-37にて消失する事よりCGRPを介する抑制作用であることがわかった.3.Capによる胃粘膜抑制はPGの合成酵素阻害薬であるインドメタシンにて消失し,この時CGRPが遊離されなくなる事がわかった.4.CapとEtOHを胃粘膜に投与するとPG12が産生されるがPGE2は産生されない事がわかった.5.ワイルドタイプマウスとIPレセプターノックアウトマウスを用いてCapによる胃粘膜抑制の実験を行うとIPレセプターノックアウトマウスではCapによる傷害抑制は消失し,またCGRPの遊離も起こらなかった.

(ただしIPレセプターノックアウトマウスにおいてCGRPが胃粘膜に存在しているか現在検討中)以上よりCapによるEtOH胃粘膜傷害の抑制で(ニューラルエマージェンシーシステムそのもので)はCapにより内因性のPGI2が産生されてそのPGI2の存在によりCGRPが遊離しやすくなり傷害抑制が起こっていた.よって少なくとも内因性PGI2はニューラルエマージェンシーシステムにとって重要なものと考えられる.PGE2は作用しているのか否かは現時点では判明していない.研究B.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いて今年度はノックアウトマウスを使用する関係でマウスの胃粘膜基底部微小循環観察法を確立する事が出来た.しかしまだ本研究の内容に迫る実験迄には到達していない.研究A.粘膜傷害面積の測定および胃内腔液のCGRPを測定カプサイシン(CaP)によるエタノール(EtOH)胃粘膜傷害の抑制で(ニューラルエマージェンシーシステムそのもので)ワイルドタイプとIPレセプターノックアウト(KO)マウスを用いてCapによる胃粘膜抑制の実験を行うとIPレセプターKOマウスではCapによるCGRPの遊離は起こらず,傷害抑制も消失した.またIPレセプターKOマウスの胃をすりつぶしCGRPの含有量を調べるとワイルドタイプと同量であった.以上よりCapにより内因性のPGI2が産生されて(昨年度判明したこと)そのPGI2の存在によりCGRPが遊離しやすくなり傷害抑制が起こっていた.よって内因性PGI2はこのシステムにとって重要なものと考えられる.PGE2は作用に関しては今年度も判明していない.研究B.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いてEPレセプターKOマウスを用いた実験のために咋年度マウスの胃粘膜基底部微小循環を観察する事を可能にしたが,実験開始し30分以上in vivoで観察していると死亡することが多く実験系を見直した.(今年度はこの障害の解決に多くを費やした.)通常のヘマトクリツト(Ht)は50-60%であるのに対して死亡例は65-75%となっており脱水が死亡原因と考えられ,生理的食塩水を0.5mL/hrで持続静注する事によりHtを50-60%に保て,2時間近く実験可能となった.アセチルコリンは用量依存的に細動脈を拡張させ,エピネフリンは用量依存的に収縮させた.またrat CGRP(0.01-1μM)は細動脈を用量依存的に拡張させ,その拡張はhuman CGRP8-37(10μM>にて抑制された.ラットと比較するとほぼ同等であった.またrat CGRPとhuman CGRP8-37はマウスのCGRPレセプターに作用する事が確認された.
エストロゲンによる細胞分化を修飾するビタミンAの働きに関する研究

出生直後の雌マウスがエストロゲンの曝露を受けると、卵巣除去後も膣上皮の角質化が持続し、やがて癌化する。また、雄では精子数が減少する。ホルモン標的器官の発生過程でのエストロゲン曝露は、細胞に不可逆的異常を引き起こす事から、いわゆる内分泌撹乱物質の影響として一番問題となる点である。このモデルを用いてエストロゲンと同時にビタミンA (VA)を投与すると、エストロゲン作用が抑えられることが本研究代表者により明らかにされている。そこで本研究では、VAによるエストロゲン作用の阻害機構を明らかにするため、膣上皮と精巣上体および輸精管のエストロゲン受容体の変動を調べた。その結果、VAはall ornone的にエストロゲンの細胞に対する作用を阻止していることが判明した。VAによるエストロゲン作用の阻止が、エストロゲンが受容体に結合したあとの転写の開始、さらには次々に起こる転写のカスケードのどの部分で行われるのかを調べるため、エストロゲンの膣上皮に対する作用の実質的刺激物質である角質化細胞成長因子を投与する実験を行ったところ、その作用もまたVAにより阻止されることが判明した。さらに内分泌攪乱物質とされるビスフェノールAの幼若マウスに対する投与が、エストロゲンと同様に、動物が成体になった時点で精子の減少という景響をもたらし、また、その影響もVAにより阻止されることが判明した。この精子数の減少は精巣における精子産生能の低下ではなく、むしろ精巣上体と輸精管におけるエストロゲン受容体発現の異常により、間接的に産生が阻害されていることを明らかにした。これらの成果を基に現在行っている実験から、幼若期のエストロゲンあるいはエストロゲン様物質の毒性作用は、直接作用ではなくVA代謝系を攪乱することにより起こるのであるとの成績を得た。出生直後のマウスにエストロゲンを投与すると、その動物が成体に達した時点で卵巣を除去しても、膣の角質化が持続する、いわゆる不可逆的連続発情となる。しかも、この動物をさらに長期間飼育続けると、やがて膣上皮ががん化することが知られている。この膣の未分化な発生過程でのエストロゲン暴露は、標的細胞に不可逆的異常を引き起こすことから、いわゆる内分泌撹乱物質の影響としても一番問題となる点である。このマウスモデルを用いて、エストロゲンと同時にビタミンAを投与すると、エストロゲン作用が抑えられることが本研究代表者により明らかにされた。そこで、本研究ではビタミンAによるエストロゲン作用の阻害機構を明らかにするため、膣上皮のエストロゲン受容体の変動を調べた。その結果、ビタミンAはある意味で、all or none的にエストロゲンの細胞に対する作用を阻止していることが判明した(論文として報告した)。ビタミンAによるエストロゲン作用の阻止が、エストロゲンが受容体に結合したあとの転写活性のスタート、さらには次々に起きる転写のカスケードの、どの部分で行われるのかを調べるため、エストロゲンの膣上皮に対する作用の実質的刺激物質である角質化細胞成長因子(KGF)を投与する実験を行ったところ、KGFの作用もまたビタミンAにより阻止されることが判明した(論文作成中)。これらの研究と平行して、内分泌撹乱物質とされるビスフェノールAの幼若マウスに対する投与が、エストロゲンの場合と同様に、動物が成体になった時点での精子の減少という影響をもたらすことを再確認し、さらにその影響もビタミンAにより阻止されることを明らかにした(論文として報告した)。出生直後のマウスにエストロゲンを投与すると、雌では卵巣を除去しても、膣上皮の角質化が持続し、やがて癌化する。このようにホルモン標的器官の発生過程でのエストロゲン暴露は、細胞に不可逆的異常を引き起こすことから、いわゆる内分泌攪乱物質の影響としても一番問題となる点である。

このマウスモデルを用いて、エストロゲンと同時にビタミンAを投与すると、エストロゲン作用が抑えられることが本研究代表者により明らかにされている。そこで、本研究ではビタミンAによるエストロゲン作用の阻害機構を明らかにするため、膣上皮と精巣上体および輸精管のエストロゲン受容体の変動を調べた。その結果、ビタミンAはある意味で、all or none的にエストロゲンの細胞に対する作用を阻止していることが判明した。ビタミンAによるエストロゲン作用の阻止が、エストロゲンが受容体に結合したあとの転写活性のスタート、さらには次々に起こる転写のカスケードの、どの部分で行われるのかを調べるため、エストロゲンの膣上皮に対する作用の実質的刺激物質である角質化細胞成長因子(KGF)を投与する実験を行ったところ、KGFの作用もまたビタミンAにより阻止されることが判明した。これらの研究と平行して、内分泌攪乱物質とされるビスフェノールAの幼若マウスに対する投与が、エストロゲンの場合と同様に、動物が成体になった時点での精子の減少という影響をもたらし、また、その影響もビタミンAにより阻止されることが判明した。この精子数の減少は、精巣における精子産生能の低下ではなく、むしろ精巣上体と輸精管におけるエストロゲン受容体発現の異常により、間接的に産生が阻害されていることを明らかにした。さらに幼若期のエストロゲンあるいはエストロゲン様物質の毒性作用は、ビタミンA代謝系を擾乱することにより起こるのではないかとの成績を得た。
神経突起成長における低分子量G蛋白質の機能解析および機能的に関連する分子群の探索

Rac1,Cdc42と機能的に関連する遺伝子群を同定することを目的として、それぞれを複眼の神経細胞において特異的に不活性化させることで適度な表現型(rough eye)を持つショウジョウバエの系統を確立し、それらの表現型についての遺伝的相互作用を見ることによる遺伝的スクリーニングを行なった。突然変異の誘発はX線によって行ない、それぞれ約4万のF1世代のハエをスクリーニングした。その結果、Rac1については約40、Cdc42については約20の再現性のあるエンハンサーを得ることができた。それらの変異体の解析は進行中であるが、現在までにほとんどの変異体を系統として確立した。既知の変異体としては、Delta, Starなどが得られた。StarはEGFのプロセシングに関与する遺伝子であるが、眼の形態形成にも関与すると考えられている。そこで低分子量Gタンパク質の複眼の初期発生における機能について調べてみた。その目的のために眼の形態形成の初期からRac1,Cdc42,EGF受容体をそれぞれ不活性化したところ、眼が非常に小さくなった。一方、EGFシグナルを活性化するためにRas1の活性化を同様に行なってみたところ、予想通り眼の組織に細胞の過増殖が見られた。ところが、Rac1あるいはCdc42を活性化すると、意外なことに複眼が触角に形質転換するという驚くべき事実を見い出した。そこでは複眼原基に本来は起こらない遠位化が起こるが、その分子レベルでの証拠としてDistal-lessタンパク質の異所的発現が起きていることも確認した。またそれを制御するパターン遺伝子の異所的発現が起きていることも確認した。現時点では、Rac1とCdc42が転写を直接制御するというよりは、組織の形態・極性の決定に関与する結果としてパターン遺伝子の発現に異常が起こるという可能性を考えている。神経突起成長における細胞骨格の制御に関与する低分子量G蛋白質、Rac1とCdc42の機能解析を目的として、それぞれの活性化の神経突起成長に対する効果について、ショウジョウバエ胚の初代培養の系を用いた解析を行ってきた。その結果、それぞれの成長円錐の形態形成における機能についての類似性と差異を明確に示すことができた。また中枢神経の回路形成を詳細に観察することにより、Rac1の不活性化とCdc42の活性化の効果が、roboの表現型に非常によく似ていることを見い出した。そこでは本来中心線を交差することのない神経軸索が数多く中心線を交差するようになる。またRoboシグナルが強く活性化された状態では、中枢神経における中心線の交差は全く起きないが、その条件でRac1の不活性化あるいはCdc42の活性化を行うと、多くの神経軸索が中心線を交差するようになることが明らかになった。このことはRac1とCdc42がRoboの下流で拮抗的に機能していることを強く示唆した。今後の課題は、Rac1とCdc42に機能的関連のある分子群を遺伝学的スクリーニングにより探索することである。そのために、それぞれを複眼の神経細胞において特異的に不活性化させることで、適度な表現型(rough eye)を持つハエの系統を確立した。それらの表現型についての遺伝的相互作用を見ることによる遺伝的スクリーニングを行なう予定である。すでにCdc42についてX線による変異体作製が進行中であり、現在までに25,000以上のハエをスクリーニングした結果、約10の再現性のあるいいエンハンサーが、またその他に10以上の強いエンハンサの候補が得られている。