hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノテクノロジーを応用した、ニュートリノ実験のためのシンチレータの開発・研究

また,液体中に分散したナノ物質は,液中の不純物の影響を受けて,分散状態を変えてしまう恐れがあるため,内部を電解研磨したステンレス容器に,脱着可能な紫外線透過窓を取り付け,容器の洗浄とシンチレーション測定を容易に行うための準備を完了した本研究の遅れの原因はいくつか考えられる。もっとも大きく影響したのは、東日本大震災でナノ粒子の供給が停止したことにある。この結果、肝心のナノ粒子が入手できないまま時間が経過した。この期間を測定系の構築に充て、ナノ粒子入手後に実験がスムーズに進捗するように備えたが、その測定系でもファームウェアのアップデートに伴うトラブル等、全く想定していなかった事柄もあり、研究の遅れを取り戻すには至っていない。また、別種のナノ粒子が生産を中止したため、入手不可能となったことも研究が思うように進まない原因であった。ナノ粒子入手後の実験では、ナノ粒子の溶解度が予想より小さいこと、更には、その溶解度の再現性がないことが判明した。このこと自身は、ある面では、本研究で最もキーとなる部分であるので、時間をかけて1つ1つ可能性を探る必要があった。ナノ粒子の取り扱いでは、通常の化合物と異なった慎重さが求められるので、例えば、実験に使用する溶媒の純度を上げるにしても、純度を上げる方法としてどのような方法が適切であるのか等を詳細に調べる必要があり、限られた予算の中で研究を進めるためには、文献等を調べる時間を多く必要とした。ナノ粒子、溶質、溶媒などの化学薬品だけでなく、実験に使用する容器などに至るまで多くの要素を調べる必要がある。このように地道に原因を突き止めることは、ナノ粒子を安定して分散させることに他ならず、現在はここに注力している。しかし、ニュートリノ実験に使用する液体シンチレータの開発・研究という側面では,研究の進捗は芳しくないと言わざるを得ない。震災の影響で,ナノ粒子の供給が遅れた.肝心のナノ粒子の入手の見込みを立てること困難であった.このため実験計画の立案が遅れた.最終的には,今年度は,研究を進めるための様々な実験系を準備と,それを用いた測定を実施するに止まった.フラッシュADCのファームウェアのアップデートに関連した問題をメーカと協力して解決する。これによって、シンチレータの時間変化を測定可能な状態にし、電子・ガンマ線事象をアルファ線など重粒子の事象を弁別することが可能か否かを調べることを可能にする。シンチレータに溶解するナノ粒子の溶解度にばらつきが生じている問題に関しては、時間がかかるが、本研究の本質に深く関わると思われる点であるので、これまでのように1つ1つ原因を洗い出す作業を継続する。例えば、シンチレータ溶質であるPPOを入れない場合の溶解度等、あらゆる可能性をシラミ潰しに調べる。また、これと並行して、今後は、ナノ粒子を分散させたプラスチックシンチレータを作成する。これは本研究を立案した時点で、液体中にナノ粒子がうまく分散しない場合の研究の方向性として持っていたもので、酸化ジルコニウムのナノ粒子をアクリルに分散させた例があるため、これに倣い、炭酸カルシウムを先ず、アクリルに分散させ、ポリスチレンなどを基材とするプラスチックシンチレータを作成する。
マクロファージ泡沫化とインフラマソームの因果関係の解明と心筋梗塞発症機構の解析

生活習慣病と歯周炎の因果関係が注目されているが、その病態を分子レベルで検証している研究は見られない。そこで、歯周炎において、マクロファージ内に取り込まれた細胞内寄生細菌が、マクロファージの泡沫化とともに、インフラマソームを活性化することを見出し、これらの現象により、心筋梗塞などの生活習慣病が誘発されるという仮説を立て、研究を遂行した。マクロファージにおける歯周病原性細菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansが誘導するピロトーシスについては、フローサイトメーターを用いた細胞死の解析、炎症性サイトカインの発現など多面的な視点で検証した。その結果、ピロトーシスや炎症性サイトカインの産生において、インフラマソーム複合体の形成を介した複雑な分子機構が関与していることを明らかにした。それに加えて、多価不飽和脂肪酸が歯周病原性細菌が誘導するピロトーシスや炎症性サイトカインの産生に対して抑制的に作用することを見出した。さらに付随研究として、炎症性サイトカインであるIL-17Aが血管内皮細胞やマクロファージ系の細胞に作用して、接着分子の発現やスカベンジャー受容体であるLOX-1を介する泡沫化細胞形成を亢進することにより、アテローム性動脈硬化の病態形成へ関与していることを示唆する結果が得られた。一方、MEMSを応用した微小流路チップを開発では、このチップに血管内皮細胞をコーティングし、流路実験系の構築に取り組んだ。血栓形成だけでなく、有病者に対する口腔ケアにおいて問題視されている口腔内細菌が誘発する心内膜炎発症モデルにも応用できるような研究モデルの構築化に向けて最適化を行っている。本年度は研究計画として、「歯周病原性細菌侵入マクロファージにおけるピロトーシスおよび泡沫化におけるインフラマソームの関与の解明」と「微小血管流路実験系を使用したピロトーシスが誘導する血管形成因子の探索」の2点に着目して研究を展開した。「研究実績の概要」に示した通り、歯周病原性細菌であるA. actinomycetemcomitansによるマクロファージへの侵入実験により、ピロトーシスやインフラマソームの誘導に関する詳細な分子メカニズムを明らかにし、これを制御する因子を見出すことができた。さらに、付随研究として、同応答への免疫受容体の関与、泡沫化細胞形成との関連性等、多角的な検討を行い、興味深い研究成果を得ることができた。一方で、微小血管流路実験系については、実験モデルの開発に向けて、至適条件の模索中であるが、既に血管内皮細胞のコーテイング法は確立し、現在デバイス側の改良を継続して行っている。歯周病原性細菌侵入マクロファージの実験系について、これまでに得られた結果を取りまとめ、英文誌への投稿を行う。また、インフラマソームの形成に関しては、canonical経路、non-canocnical経路の両者について、より詳細な分子メカニズムの解析を行う。さらに、これまでに明らかにされている感染防御に関わる遺伝子を中心に、歯周病原性細菌侵入後の細胞における遺伝子発現をマイクロアレイならびに次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析し、心筋梗塞発症に関与する因子の同定を行う。その成果を踏まえて、将来的には、遺伝子改変マウスの作製に着手し、それぞれのマウスからマクロファージを調製し、様々な生物学的活性の細胞レベルならびに生体レベルの検証を目指す。微小血管流路実験系については、確立後、このモデルを使用し、集積したプラーク塊に対し、マイクロアレイ・次世代シーケンサーにて、血栓形成に関与する因子の同定を行う。

さらに、付随研究として、同応答への免疫受容体の関与、泡沫化細胞形成との関連性等、多角的な検討を行い、興味深い研究成果を得ることができた。一方で、微小血管流路実験系については、実験モデルの開発に向けて、至適条件の模索中であるが、既に血管内皮細胞のコーテイング法は確立し、現在デバイス側の改良を継続して行っている。歯周病原性細菌侵入マクロファージの実験系について、これまでに得られた結果を取りまとめ、英文誌への投稿を行う。また、インフラマソームの形成に関しては、canonical経路、non-canocnical経路の両者について、より詳細な分子メカニズムの解析を行う。さらに、これまでに明らかにされている感染防御に関わる遺伝子を中心に、歯周病原性細菌侵入後の細胞における遺伝子発現をマイクロアレイならびに次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析し、心筋梗塞発症に関与する因子の同定を行う。その成果を踏まえて、将来的には、遺伝子改変マウスの作製に着手し、それぞれのマウスからマクロファージを調製し、様々な生物学的活性の細胞レベルならびに生体レベルの検証を目指す。微小血管流路実験系については、確立後、このモデルを使用し、集積したプラーク塊に対し、マイクロアレイ・次世代シーケンサーにて、血栓形成に関与する因子の同定を行う。インフラマソーム複合体検出に関する試薬の購入費が少なく済んだためである。翌年度の詳細な歯周病原性細菌の侵入に誘導されるピロトーシスおよびインフラマソーム形成に関する詳細な分子機構の解明に必要な試薬購入費として計上する。
書換え帰納法を利用したプログラム等価性検証技術の開発

初年度はまずC言語で書かれたプログラムを対象に,ポインタ以外の基本データ型やユーザ定義データ型(構造体や共用体を含む)を扱うプログラムを固定長の0,1の列であるビットベクトル上で定義された論理制約付き項書換えシステムに変換する枠組みを構築し,実装した.その際に,大域変数とそれにアクセスする関数を扱うプログラムの変換を改良した.この枠組みでは従来はデータとして整数とその1次元配列のみを扱うプログラムしか変換対象でなかった点を,より多くの種類のプログラムを変換して解析できる枠組みに拡張した.論理制約付き項書換えシステムを対象とした定理自動証明ツールの開発として,これまでに本研究で開発してきたツールCtrlがビットベクトルを扱えるための理論定義ファイルを作成した.さらに,自動証明機能の改良を目的として試行錯誤を容易にするラッパーの開発に取り組んだ.このラッパーはCtrlの対話型証明機能には実装されていなかった補題候補の等式の追加を可能にした.さらに,対話証明の際に利用したコマンドの履歴に対して,改めてCtrlを実行する際に,ファイルに記載された履歴を自動実行したのちに対話証明を開始できる機能を追加した.これにより推論規則の適用戦略の開発のための試行錯誤が容易となり,実際に試行錯誤を行った結果,新たな補題候補の自動生成法を開発するに至った.新たな補題生成法を組み込んだ自動証明では,従来のCtrlが自動証明に成功していなかった例題の自動証明に成功した.高信頼な検証法の開発に向けて,対話型定理証明支援系Isabelle/HOL上で論理制約付き項書換えシステムを形式化する課題にも着手した.論理制約付き項書換えシステムの形式化,整数上の簡単な命令型言語から論理制約付き項書換えシステムへの変換の形式化を完了した.本研究の目的の一つは論理制約付き項書換えシステムへの変換と帰納法に基づく証明体系を命令型プログラムに応用し,命令型プログラムの新たな検証法の枠組みを確立することである.その目的に対し,変換対象となるプログラムの範囲を拡大したことは研究目的の達成に向けて順調に研究を遂行していると言える.さらに,ツールの開発および検証法の強化についても,これまでに開発してきたCtrlの機能を補完するラッパーの実装,それを利用した試行錯誤から新たな補題生成法を実現したことは当初の計画に実現性が十分にあることを示しており,初年度にこれらを達成できていることは研究目的を達成できることを十分に期待できる進捗状況であると言える.一方,対話型定理証明支援系Isabelle/HOL上で提案手法を形式化することは2年目に取り組む予定であったが,当初の計画を順調に遂行できていたこと,さらに形式化は容易な課題ではなく時間を要する可能性が高いことから,初年度からIsabelle/HOL上での形式化に着手した.以上のことから本研究の進行状況は概ね順調であると言える.Ctrlはプログラムの停止性や等価性を証明する上である程度,完成されたツールであるが,ビットベクトルなど新たなデータ構造を扱うには大幅な改修が必要であることがわかった.特に,ビットベクトルとその配列を扱うシステムを検証するには内部のデータ構造の改修が必要である.また,検証時にはSMTソルバを呼び出し,論理式の充足可能性や恒真性を証明するが,その際のデータのやり取りについては字句解析・構文解析を行いながら処理を進める.SMTソルバではSMT-LIBのような共通フォーマットがある一方で,その共通フォーマットは定期的に拡張される.その際にはCtrlの字句解析・構文解析を変更する必要がある.拡張性の高い検証ツールを開発することは,有用な検証システムの開発には必須であるため,これまでの研究の知見で得た特徴,必要な機能などを十分に検討し,定理自動証明器の開発に取り組む必要がある.これまでのCtrlを利用した検証実験から,定理自動証明に求められる機能,要件を精査し,拡張性のある検証システムを開発することをめざす.一方で,推論規則の適用戦略や補題生成法の開発は本研究で目指す強力な検証システムの実現には不可欠である.そのために2年目以降も様々な例題に対して等価性や停止性の検証実験を行い,多くの知見を得ることに取り組む.また,高信頼性を保証するために,継続してIsabelle/HOL上での形式に取り組む.初年度はまずC言語で書かれたプログラムを対象に,ポインタ以外の基本データ型やユーザ定義データ型(構造体や共用体を含む)を扱うプログラムを固定長の0,1の列であるビットベクトル上で定義された論理制約付き項書換えシステムに変換する枠組みを構築し,実装した.その際に,大域変数とそれにアクセスする関数を扱うプログラムの変換を改良した.この枠組みでは従来はデータとして整数とその1次元配列のみを扱うプログラムしか変換対象でなかった点を,より多くの種類のプログラムを変換して解析できる枠組みに拡張した.論理制約付き項書換えシステムを対象とした定理自動証明ツールの開発として,これまでに本研究で開発してきたツールCtrlがビットベクトルを扱えるための理論定義ファイルを作成した.さらに,自動証明機能の改良を目的として試行錯誤を容易にするラッパーの開発に取り組んだ.このラッパーはCtrlの対話型証明機能には実装されていなかった補題候補の等式の追加を可能にした.さらに,対話証明の際に利用したコマンドの履歴に対して,改めてCtrlを実行する際に,ファイルに記載された履歴を自動実行したのちに対話証明を開始できる機能を追加した.これにより推論規則の適用戦略の開発のための試行錯誤が容易となり,実際に試行錯誤を行った結果,新たな補題候補の自動生成法を開発するに至った.新たな補題生成法を組み込んだ自動証明では,従来のCtrlが自動証明に成功していなかった例題の自動証明に成功した.

高信頼な検証法の開発に向けて,対話型定理証明支援系Isabelle/HOL上で論理制約付き項書換えシステムを形式化する課題にも着手した.論理制約付き項書換えシステムの形式化,整数上の簡単な命令型言語から論理制約付き項書換えシステムへの変換の形式化を完了した.本研究の目的の一つは論理制約付き項書換えシステムへの変換と帰納法に基づく証明体系を命令型プログラムに応用し,命令型プログラムの新たな検証法の枠組みを確立することである.その目的に対し,変換対象となるプログラムの範囲を拡大したことは研究目的の達成に向けて順調に研究を遂行していると言える.さらに,ツールの開発および検証法の強化についても,これまでに開発してきたCtrlの機能を補完するラッパーの実装,それを利用した試行錯誤から新たな補題生成法を実現したことは当初の計画に実現性が十分にあることを示しており,初年度にこれらを達成できていることは研究目的を達成できることを十分に期待できる進捗状況であると言える.一方,対話型定理証明支援系Isabelle/HOL上で提案手法を形式化することは2年目に取り組む予定であったが,当初の計画を順調に遂行できていたこと,さらに形式化は容易な課題ではなく時間を要する可能性が高いことから,初年度からIsabelle/HOL上での形式化に着手した.以上のことから本研究の進行状況は概ね順調であると言える.Ctrlはプログラムの停止性や等価性を証明する上である程度,完成されたツールであるが,ビットベクトルなど新たなデータ構造を扱うには大幅な改修が必要であることがわかった.特に,ビットベクトルとその配列を扱うシステムを検証するには内部のデータ構造の改修が必要である.また,検証時にはSMTソルバを呼び出し,論理式の充足可能性や恒真性を証明するが,その際のデータのやり取りについては字句解析・構文解析を行いながら処理を進める.SMTソルバではSMT-LIBのような共通フォーマットがある一方で,その共通フォーマットは定期的に拡張される.その際にはCtrlの字句解析・構文解析を変更する必要がある.拡張性の高い検証ツールを開発することは,有用な検証システムの開発には必須であるため,これまでの研究の知見で得た特徴,必要な機能などを十分に検討し,定理自動証明器の開発に取り組む必要がある.これまでのCtrlを利用した検証実験から,定理自動証明に求められる機能,要件を精査し,拡張性のある検証システムを開発することをめざす.一方で,推論規則の適用戦略や補題生成法の開発は本研究で目指す強力な検証システムの実現には不可欠である.そのために2年目以降も様々な例題に対して等価性や停止性の検証実験を行い,多くの知見を得ることに取り組む.また,高信頼性を保証するために,継続してIsabelle/HOL上での形式に取り組む.
不飽和カルボニル化合物による細胞傷害と病態発症におけるプロテインキナーゼCの役割

本研究の最終目的は、環境中の毒性化合物である不飽和カルボニル化合物が、どのようにして細胞傷害を引き起こし、疾病につながっているかを解明することである。既に不飽和カルボニル化合物による細胞傷害には、プロテインキナーゼC(PKC)が深く関与していることを見いだし、報告していることから、本研究では主にPKCに着目して研究を進めることとした。2018年度は、不飽和カルボニル化合物がPKCの生化学的な性質に対する影響を調べることを目的とした。そして代表的な不飽和カルボニル化合物であるアクロレインがPKCを化学的に修飾することを示した。またPKCの様々な変異体を作製して解析をおこなったところ、化学修飾を受ける部位が特定のアミノ酸残基であることが判明した。続いて、PKCの生化学的な解析にあたり不可欠であるPKCの発現精製系の確立を試みた。PKCを大腸菌で発現させると封入体に移行することが知られていることから、昆虫細胞を用いた発現系を検討した。分泌シグナルの付加やPKCのリン酸化に関与するとされる別のキナーゼとの共発現など、様々な条件検討を実施したが、バキュロウイルスを用いた発現系では充分なPKCを得ることができなかった。これはPKCが昆虫細胞内の他のタンパク質と相互作用していることが原因ではないかと考え、無細胞発現系の適用を試みた。プロモーター及びリボソーム結合部位を付加したPKCのcDNAを精製リボソーム等とインキュベートしたところ、解析に用いることが可能な量のPKCの発現を確認することができた。2018年度には、当初予定していた、不飽和カルボニル化合物によるPKCの化学的修飾に関する解析、ならびにPKCの発現系の構築に目処がついたことから、ほぼ当初の予定どおりに研究が進捗していると判断した。2019年度以降には、PKCを介した不飽和カルボニル化合物の生体への作用に関する解析を進めるため、無細胞発現系で発現させたPKCの精製系の確立を試みる。精製されたPKCを用いてin vitroキナーゼ活性測定を実施し、不飽和カルボニル化合物がPKCの活性に与える影響に関する解析を試みる予定である。
植物のアルミニウム耐性遺伝子の分離とその機能解析に基づく分子育種への応用

酸性土壌における作物の生産性低下は、土壌溶液中に溶解するアルミニウムイオン(Al^<3+>)によると考えられている。本研究は酸性土壌における生産性の増大をはかることを目的として、植物のアルミニウム耐性機構を解明することを目的とした。本年度は(1)耐性機構に関与するミトコンドリアのシアン耐性呼吸系の遺伝子(AOX遺伝子)と酸化ストレス(活性酸素ストレス)の関係、および(2)成長の制御にかかわる水吸収の分子機構について研究を行った。活性酸素については、アルミニウム耐性タバコ培養細胞ではアルミニウムストレス後に活性酸素発生が減少すること、また感受性細胞では逆に増加することが認められた。活性酸素の細胞での生成/消去に関係があるとされるAOXについては、アルミニウム感受性タバコ培養細胞ではアルミニウムストレス後に発現が大きく減少した。しかしアルミニウム耐性タバコ培養細胞ではアルミニウムストレス後に発現が減少することなく、発現量はストレス前と同程度であった。次にAOX遺伝子を過剰発現させたタバコ植物とその培養細胞系を確立した。AOX過剰発現細胞ではアルミニウムストレス後の成長がコントロール細胞より20%向上していた。これらのことからAOXがアルミニウムストレス耐性に関与していることが示された。次に細胞の伸長成長に必須の水吸収を分子機構のレベルで検討した。具体的には細胞膜での水輸送を担っているアクアポリン蛋白質の遺伝子発現を調べた。オオムギ根細胞の原形質膜で発現していると考えられる遺伝子候補をESTおよびContigデータから11個見出して、その発現をPCRで確認した。現在、塩ストレス、浸透圧ストレス、重金属ストレス、活性酸素ストレス(過酸化水素処理)による各分子種の発現量の変化を調査中である。細胞およびエンドウ根におけるAl毒性と耐性の分子機構についてAlシグナルによるミトコンドリア機能の変動について研究し、以下の成果を得た。Al感受性タバコ(SL細胞)とAl耐性タバコ(ALT301)はともにAl処理18時間で生育の低下が認められた。SL細胞、ALT301細胞ともに、単離ミトコンドリアのステート3および4呼吸の低下がAlストレスで誘導された。しかしALT301細胞の方が阻害の受け方ははるかに小さかった。SL細胞をAl処理するとAOX-およびCYT-呼吸ともに阻害されたが、ALT301細胞のミトコンドリアではAOX-経路が逆に15%程度増加していた。SL細胞のミトコンドリアではROS(活性酸素類)の生成が増加したが、ALT301細胞では逆にAlストレス下で減少した。両細胞ともにミトコンドリアの内膜機能の低下とチトクロームCの流出をともなわない内膜孔の開口が認められた。またTONEL反応に陽性の核が認められたことから、Al処理を18時間行うと細胞死が起こることを認めた。ウエスタンブロット解析からALT301細胞のミトコンドリアではAOXタンパク量が増加していたが、SL細胞では変化していなかった。AOX経路の増大とその構成タンパクの増加を考慮すると、AOX1遺伝子がALT301細胞におけるAl耐性をになっている有力な遺伝子の候補と考えられた。そこでAOX1遺伝子をタバコから調製し発現量を調べた。Al処理12,18時間後ではSL, ALT301細胞ともに転写抑制が認められたが、ALT301に比べてSL細胞ではダウンレギュレーションの割合が大きかった。エンドウ根解析ではAl誘導性の呼吸阻害、ROSの生産増大をともなった酸化還元ホメオスタシスの破壊、エネルギー産物の変動などを認めた。
卵巣がんにおけるマイクロRNAの新規治療標的としての有用性の検討

マイクロRNAが卵巣がんにおいて治療標的分子として利用できるかを検討するために、マイクロRNAの卵巣がんにおける機能解析を行った。Mir-182の過剰発現により細胞増殖能の亢進が認められるだけでなく、mir-182高発現卵巣癌においてCD8Tリンパ球の浸潤が少ないことがわかった。これらのことが予後に影響している可能性が示唆され、マイクロRNAが卵巣がんにおいて臨床マーカー、あるいは治療標的分子として利用できる可能性があると考えられた。私たちはすでに卵巣がんのマイクロRNAマイクロアレイのデータよりmir-182, mir-146などが卵巣がんの悪性度や予後と強く相関していることを見出した。マイクロRNAが卵巣がんにおいて臨床マーカー、あるいは治療標的分子として利用できるかを検討するためには、これらのマイクロRNAの卵巣がんにおける機能解析がまず必要と考え、Mir-182、mir-146のpre-miRNAをすでに構築してあった発現ベクターpcDNA3.1-GFPspに組み込み、mature miRNAだけでなく、レポーターとしてgreen fluorescent protein (GFP)も同時に発現するようにした。レポーター遺伝子や、リアルタイムPCRにて各々のマイクロRNAの過剰発現が卵巣癌培養細胞用いてトランジェントな系で確認できた。しかしこれらについて細胞増殖能等の変化を検討したが、明らかな差を認めなかった。同様に、mir-182, mir-146に対する阻害剤を用いて検討を行ったが。明らかな細胞増殖に関する変化が認められなかった。一過性発現のみでの検討では不十分と考え、安定発現細胞株の作成を続けていたが、作成が困難であったため、現在ウイルスベクターを用いた恒常的発現系を用いて、さらなる解析を行う準備中である。さらに、以前のマイクロアレイの結果から卵巣癌のがん抑制遺伝子となる可能性のあるmir-376, mir-432についても同様にpcDNA3.1-GFPspに組み込み検討を開始した。私たちはすでにmir-182,mir-146などが卵巣がんの悪性度や予後と強く相関していることを見出している。マイクロRNAが卵巣がんにおいて臨床マーカー、あるいは治療標的分子として利用できるかを検討するためには、これらのマイクロRNAの卵巣がんにおける機能解析がまず必要と考え、Mir-182、mir-146のpri-miRNAをすでに構築してあった発現ベクターpcDNA3.1-GFPspに組み込み、これらについて細胞増殖能等の変化を検討したが、明らかな差を認めなかった。恒常的発現系を用いて増殖能について検討したが、やはり明らかな差を認めなかった。現在足場非依存性の増殖能について追加検討中である。様々な細胞におけるmir-182,およびmir-146の発現を検討したところ、mir-182は卵巣癌腫瘍細胞で過剰発現が認められるが、mir-146はがん細胞ではなく、マクロファージに高発現していることがわかった。マクロファージの浸潤は卵巣癌の予後不良因子としても知られ、卵巣癌組織におけるmir-146はマクロファージの浸潤を反映している可能性が考えられた。またCD8T細胞の浸潤は逆に卵巣癌の予後良好な因子として報告されている。Mir-182の発現とCD8Tリンパ球浸潤の関連性を調べたところ、mir-182高発現卵巣癌組織においてCD8Tリンパ球の浸潤が少ないことがわかった。Mir-182が何らかの機序によりCD8陽性Tリンパ球の浸潤をブロックし、これが予後に影響している可能性が示唆された。mir-376,mir-432については、予測プラグラムによりMICBがmir-432のターゲットの可能性であることがわかった。ある種の卵巣癌細胞株では、mir-432の過剰発現によりMICBの発現低下が確認できた。以上のような機序からも考え、マイクロRNAが卵巣がんにおいて臨床マーカー、あるいは治療標的分子として利用できる可能性があると考えられた。
企業のイノベーションと人的資本の測定・開示に関する先端的研究

本研究においては、(1)企業のイノベーションに向けた人的資本の測定・管理に関する学際的研究、(2)人的資本情報とイノベーションに関する実証研究、(3)人的資本情報にもとづく融資に関する国際比較研究を行った。(1)では、人間の心理・行動の側面から人的資産などのインタンジブルズ情報がマネジメント・コントロールや意思決定プロセス、例えば新しい予算管理モデルにおいてどのように利用されているかを明らかにした。(2)では、人的資産に関するKPIsと企業のイノベーションの関連性について究明を試みた。(3)では、人的資本情報の開示方法は企業の規模に依存して決定されるべきであることを示唆した。本研究は、企業のイノベーションを促進するための中核をなす人的資本(人材)に焦点をあて、これら資本をいかにして、どこまで認識・測定するかについて考証することを通じて、わが国企業のイノベーションを促進させるビジネス・モデルを推進し、もって企業の長期的・持続的成長に資する会計理論・制度構築のあり方を研究することを目的とする。平成26年度においては、(1)人的資本の会計的認識・測定に関する先行研究レビュー、(2)管理会計における人的資本の戦略的利用状況に関する研究を実施した。(1)では、過去10年間にわたる日本におけるイノベーション研究に関する議論をレビューし、今後の研究課題の整理を行った。そして、経済成長が現在の日本経済における喫緊の課題であり、また経済成長やキャッシュ・フローの源泉はイノベーションであるという問題意識から、コミュニケーション・ツールやネットワーク力を通じたナレッジ向上や価値創造といった観点で革新性(innovativeness)が求められていること、さらに知的資産(人的資本)に代表されるような様々なビジネスの場で利用可能であるインタンジブルズを活用することを通じて企業内の資源を動員することの重要性が明らかとなった。(2)では、従来のハード・プロダクトに焦点を置く管理会計モデルから、人的資源、ノウハウ、R&Dなどソフトの無形価値ないしインタンジブルズのコントロールと意思決定を重視した新時代の管理会計モデルの開発と発展を背景に、心理・行動の側面からインタンジブルズ情報がマネジメント・コントロールや意思決定プロセスにおいてどのように利用されてきたかを明らかにした。本研究は、企業のイノベーションを促進する中核的な役割を担う人的資本を研究対象とし、いかにして、どこまで人的資本を認識・測定・開示すべきかを研究することを目的としている。平成27年度においては、(1)信頼を人的資本のKPIと位置付けた研究(2)人的資本による融資という2側面からの研究を中心に研究活動を行った。(1)では、信頼をいかに測定するかに関する論理的モデル研究に基づきモデルを構築し、日本と中国のデータを利用して実証的に分析を実施した。また、(i)諸外国のデータを収集して信頼にかかるKPIの国際的差異とその原因を究明する研究、そして(ii)認知的(cognitive)信頼と感情的(emotional)信頼という二側面から人的資本のKPIを創出し、これらと企業のイノベーションの相関分析を行う研究を海外研究者と始動させており、今後更なる研究成果を得る予定である。(2)では、諸外国における知的資産経営の概要を調査し、とりわけ融資の側面から、わが国の知的資産経営への適用可能性について検討を行った。多くの国や企業において人的資産は企業の価値創出のためのドライバーであると認知されており、知的資産報告書や統合報告書において人的資産に関する情報開示がなされていた。また、わが国の統合報告のベスト・プラクティス企業においても人的資本は知的資産情報の需要なインプット項目として位置付けられていた。今後、人的資本等の非財務情報を活用した知的資産経営とその開示のあり方としては、大企業では統合報告形式による積極的な情報開示が適切であり、成長指向の中小企業では情報開示の拡充化が望まれる一方、中小・零細企業では従業員の理解向上やリクルーティングに特化することが有効であると結論づけ、知的資産と企業目標・戦略との明確なリンケージのもとで知的資産の質の評価が求められることが示唆された。平成26年度においては、本目的達成の根幹をなす理論的フレームワークの構築に不可欠な先行理論研究のレビューを完了しているとともに、コミュニケーション・ツールやネットワークといった観点からイノベーションにおける人的資産の重要性を明らかにした。さらに、財務会計的な分析視座のみならず、管理会計における行動科学的研究という視座から人的資本(インタンジブルズ情報)の戦略的な利用に関する研究を実施しており、イノベーション研究に求められる学際的研究を遂行できている。それゆえ、本研究の達成度はおおむね順調に進展していると評価する。研究成果の一部は、経済産業省・平成27年度中小企業知的財産金融促進事業(諸外国における知的資産経営の取組に関する調査研究)報告書として経済産業省ウェブサイトに公表予定(執筆者:古賀智敏・姚俊・島田佳憲他13名)。会計学

平成26年度における研究を基礎に、企業のイノベーションならびに長期的・持続的成長を促進する人的資本にかかる会計理論の構築について深化を図る。また、こうした理論をベースにして、学際的視点から人的資本がどのように長期的・持続的成長に活用されているかに関する実態調査を実施する。
久山町一般住民におけるむずむず脚症候群と脳心血管病についての検討

一般地域住民疫学調査において、むずむず脚症候群につき調査を行った。2000名を超える住民が対象となり、国際むずむず脚症候群研究斑による診断基準により診断した。日本における既報の研究結果よりもやや多くなっている可能性が考えられた。わが国のむずむず脚症候群の有病率を包括的な健診成績を解析することで明らかにした。今後むずむず脚症候群の認知度を高めて、積極的に診断・治療の介入が必要であると思われた。福岡県久山町地域住民疫学調査において、一般住民のむずむず脚症候群(RLS)が疑われる症状、RLSの治療状況を保険師が質問表を用いて調査した。その質問表でRLSが疑われる方にはさらに追加の質問表を医師が行い、現在の睡眠時間、VASスケールによるRLS症状の困惑度、内服薬の摂取状況等を調査し、専門医による二次調査を行なった。同時に既往歴、家族歴、飲酒歴、喫煙歴を聴取し、採血、検尿を行った。その結果、40歳以上の住民2452名(男性1067名:43.5%、女性1385名:56.5%)が対象となった。International Restless Legs Syndrome Study Group(IRLSSG)による診断基準が各年度に改訂が成された。改訂順に、2003年の質問項目4つ当てはまる方は68例:2.7%、2005年のRLS確定診断104例:4.2%、2014年RLS確定診断101例:4.1%であった。日本における調査では2008年が4.0%、1.8%、2009年が0.96%であり、2008年の調査の結果に近くなっていることが判明した。同時に健診のデータセットを作製した。今後、RLSの罹患と生活習慣病データおよび心筋梗塞などの血管障害を中心とした包括的な関連性を解析する予定である。今年度は、福岡県久山町地域住民疫学調査において、RLSの問診票、二次調査でRLSの診断を確定することが目標であり、次年度のRLSのデータセット固定までができた。また、健診受診時の検査漏れなども確認を行い、採血、検尿、既往歴、家族歴、飲酒歴、喫煙歴などのデータも固定できた。福岡県久山町地域住民疫学調査において、一般住民のむずむず脚症候群(RLS)が疑われる症状、RLSの治療状況を保健師が質問票を用いて、RLSが疑われる方は追加の質問票を医師が行い、調査を行った。現在の睡眠時間、VASスケールによるRLS症状の困惑度、内服薬の摂取状況等を調査し、専門医による二次調査を同日に行った。International Restless Legs Syndrome Study Group(IRLSSG)による診断基準が2003年、2005年、2014年に改訂が成され、それぞれ質問項目4つに当てはまる方は68例:2.7%、104例:4.2%、101例:4.1%であった。また2014年の診断基準は、診察上明らかにmimicが疑われた症例は除外した。現在までに報告された日本のRLS疫学調査論文で、2008年に2報(RLS有病率4.0%、1.8%)、2009年に1報(RLS有病率0.96%)あり、2008年に報告された結果に近くなっていることが判明した。また、同時に健診での身体測定、採血結果、検尿結果などのデータクリーニングを行い、全ての健診のデータセットを作成した。データセットから統計解析を行い、RLSの罹患と生活習慣、心筋梗塞、脳卒中などの血管障害を包括した関連性を解析中である。昨年度は、福岡県久山町地域住民疫学調査の検査漏れがないかどうかを確認し、RLSのデータセット固定を行い、統計的解析中である。RLSの一般住民での罹患率を出し、RLSと生活習慣病(高血圧、糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、高尿酸血症)、心血管病(心筋梗塞、脳梗塞、脳出血)との関連を解析中であり、おおむね順調に進展していると判断した。また、むずむず脚症候群と生活習慣病などと関連があることが判明した。わが国のむずむず脚症候群の有病率、危険因子を包括的な健診成績を解析することで明らかにした。

今後むずむず脚症候群の認知度を高めて、積極的に診断・治療の介入が必要であると思われた。今年度は、データセットの見直しをしながら、RLSの罹患と生活習慣病データとの解析(高血圧、糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、高尿酸血症)、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血などの血管障害との関連性を解析、検討する予定である。解析終了後は、日本睡眠学会をはじめとした国内学会、アメリカ睡眠学会などの睡眠を主体とした国際学会への成果を発表し、英文論文にして発表を行っていく予定である。今年度は、解析データを詳細に解析し、考察を加えて、英文誌に投稿する予定である。その後国内学会、国際学会で報告するとともに、英文誌に掲載されたら、マスメディアおよび公開講座を計画し、情報の発信に努めることとする予定。睡眠、疫学採血測定に関わる費用(2550,000円)を計上していたが、台風などにより健診が数日中止となったためか、健診受診者が予定より少なくなったため、採血項目の変更をした。承諾の上、ほとんどの採血を取り置きしており、追加の採血検体を考慮中である。また、平成27年度にデータ入力・解析の補助者に関わる人件費(250,000円)を計上していたが、入力・解析等は自らで行った。平成28年度は解析内容がより複雑、かつ膨大になることが予想されるため、その際に有効活用できるよう、平成28年度での繰り越し金として計上することとした。前年度で健診受診者承諾の上、取り置き採血にて追加測定を検討したが、検体量が微量のものもあり、測定しようとした項目の測定が全ては困難であると判明した。また、解析を行っているうちに、現状の採血項目で充分であると思われ、SAS統計などの統計処理や論文作成、学会発表などにて予算を繰り越すこととなった。追加採血検体の提出を検討する。データ解析はSAS統計を駆使しなければならず、複雑な統計処理・解析が必要である。そのため、専門家の補助を得るために人件費、学会発表・論文発表、その他の消耗品に計上することとしたい。SAS解析が久山町でしかできない形になっており、SAS統計解析を進めるため、新しいSAS専用のパソコンを追加購入することで、統計解析を加速させて行く予定である。また、専門家の補助を得るために人件費、論文発表・学会発表、その他の消耗品に使用を予定している。
プロスタシン中和抗体の作成と抗体医薬開発への応用

上皮型Naチャネルを活性化するセリンプロテアーゼであるプロスタシンは原発性アルドステロン症患者の尿中に多量に排泄され、副腎腫瘍の摘出により高血圧の改善とともに尿中プロスタシン排泄量が減少している。この高血圧におけるプロスタシンの役割を検討するためには抗体による抑制実験が重要であると考え以下の検討を行った。初年度までにウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体15種類およびマウス抗プロスタシン組換えタンパクモノクローナル抗体4クローンを作成した。これらの抗体の機能解析を種々の観点から行ったところ1つのポリクローナル抗体がプロスタシンの活性を阻害することが明らかとなった。この抗体はヒトプロスタシンのペプチド配列をもとに作成したものであったが、ラットプロスタシンの活性も阻害することが判明している。この抗体の抗原ペプチドのアミノ酸配列の中でラットプロスタシンの配列と共通した配列が連続した9アミノ酸として存在しているため、この9アミノ酸に対する抗体がプロスタシンの活性阻害に働いている可能性が考えられた。この9アミノ酸に対するモノクローナル抗体を大量に作成し、プロスタシンの活性阻害の詳細について検討した。この抗体を用い、ヒト高血圧患者150例で、尿中のアルドステロン濃度と尿中プロスタシン濃度の関係について検討したところ、有意な相関関係が認められた。現在、純粋な組換えプロスタシン蛋白質を用いてさらに詳細な検討を行っている。これまでにウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体15種類およびマウス抗プロスタシン組換えタンパクモノクローナル抗体4クローンを作成してきた。これらの抗体の機能解析を種々の観点から行ったところ1つのポリクローナル抗体がプロスタシンの活性を阻害することがプレリミナリーな研究から明らかとなった。本年度はこの知見を発展させ、この9アミノ酸に対するモノクローナル抗体を大量に作成し、プロスタシンの活性阻害の詳細について検討している。現在、純粋な組換えプロスタシン蛋白質が作成でき、in vitroでの反応系が順調に進んでいる。昨年度までにウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体15種類およびマウス抗プロスタシン組換えタンパクモノクローナル抗体4クローンを作成してきた。
再処理過程で自発的につくられる抽出錯体溶液の階層構造とそのダイナミクスの研究

本研究では、プルトニウムの模擬抽出系としてジルコニウムイオンをリン酸トリブチル(TBP)/オクタン中に抽出した有機相について、広域X線吸収微細構造法、中性子小角散乱法、分子動力学計算を用いてその微視的構造を明らかにする検討を行った。その結果、ジルコニウムイオンとTBPによってつくられる抽出錯体どうしが、水分子、硝酸分子を介した水素結合によって会合を起こし、数ナノメートルの1次凝集体を形成することを明らかにした。さらに、この1次凝集体は逆ミセル的な構造をつくり、それらがファンデアワールス相互作用によってさらに大きな高次の凝集体を形成することを明らかにした。リン酸トリブチルやモノアミド化合物はウランやプルトニウムと錯形成する代表的な有機配位子である。錯形成のためには溶液二相間分配(溶媒抽出法)を用いるのが一般的である。通常これらの配位子は有機相中に分散させて利用するが、本年度は有機相中におけるこれらの配位子のミクロ構造を明らかにする研究を行った。X線及び中性子小角散乱法を相補的に利用した溶液状態の観察を行った結果、これらの配位子は1分子で孤立して溶液中に分散してはおらず、2量体、或いはそれ以上の会合体を形成して存在することが明らかになった。会合体の形状は楕円状のものから円筒状のものまで様々であり、これらの構造が金属イオンとの錯形成に対してどのような影響を与えているかの考察を進めている。具体的には、分子動力学計算やDFT計算によるシミュレーションと散乱実験の結果を比較する作業をすすめている。計算科学による検討はマンチェスター大学からの協力を受けながら進めており、有機溶液中における配位子の存在状態を可視化しつつある。また、放射性廃棄物中に含まれるセシウムイオンやランタノイド、マイナーアクチノイドと配位子がつくる錯体や、様々な分離材料と金属イオンが形成する複合構造も、本事業で明らかにされる錯体溶液のミクロ構造と比較をしながら考察を進めていく必要がある。その際の波及効果として、セシウムイオンと固体分離材料が溶液中でどのようなミクロ構造を形成しているかを明らかにすることに成功したためその成果を論文発表するに至った。平成26年度までの研究において、リン酸トリブチルを用いて硝酸溶液中から4価のジルコニウム錯体を抽出した有機相(オクタン)中では、錯体が一様に分散して存在していないことが明らかになっている。平成27年度はこの錯体溶液の階層構造を広域X線吸収微細構造(EXAFS)法と中性子小角散乱(SANS)法を用いて詳細に検討した。その結果、EXAFSからは溶液中の錯体濃度に関わらず、常にZr(NO3)4・2TBP錯体が同じ配位構造を保って存在していることが明らかになった。さらにSANS法による測定結果から、Zr(NO3)4・2TBPを基本構成単位として、それらが約20ナノメートル程度の凝集構造をオクタン中でつくることが明らかになった。凝集体における錯体の会合数は約100程度に達することから、現在、計算科学的な手法を組み合わせてその凝集体の構造と特性を分析している。また、凝集体の内部には水分子や硝酸が多く含まれており、これらの形態が第三相の生成に強く関与すると考えられる。平成27年度までに得られた成果は12月にホノルルにて開催された環太平洋化学国際会議2015において報告され、現在、2報の学術論文として投稿中である。広域X線吸収微細構造(EXAFS)法と中性子小角散乱(SANS)法を駆使することで、抽出錯体溶液のつくる階層構造をナノ-メソスケールで明らかにしつつある。偏極中性子を利用した測定結果や、計算科学からの取り組みも2報の論文として投稿(査読中)されており来年度以降の発展も期待できる。平成27年度までの研究により、溶液2相間分配系において第三相が生成する原因は複数の抽出錯体が数十ナノメートル程度の凝集体を形成し、それが成長していくためであることを解明している。これに対して本年度は、これらの凝集体が抽出錯体の親水部における水素結合ネットワークの形成による1次凝集体の構築と、この1次構造がファンデアワールス相互作用を介して相互作用することで高次の凝集体がつくられることが原因であることを明らかにした。これにより、第三相の生成を防ぐためには水素結合とファンデアワールス相互作用を制御した新規抽出剤・システム設計を行う必要があることを示すことができた。これらの結果は中性子小角散乱(SANS)法と広域X線吸収分光法によって得られた成果であるが、計算科学的な手法により詳細な水素結合状態、電子状態を明らかにする取り組みもマンチェスター大学との共同研究により推進した。これらの成果は1報の学術論文(J. Phys. Chem. B, 2016)としてまとめられた他、現在続報を投稿中である。さらに、抽出錯体溶液によって得られたSANSデータの信頼性を向上させるために中性子偏極解析法の導入が有用なことを示すことに成功した。この成果は中性子散乱実験において試料中の水素原子から発せられる非干渉性散乱成分を取り除く方法である。SANS実験において、この非干渉性散乱成分は干渉性散乱成分に対するノイズのように働いてしまうことが問題視されていたが、実際に非干渉性散乱成分をどのようにして取り除けば良いかを米国国立標準技術研究所(NIST)に設置される中性子スピンエコー装置を用いてデモンストレーションした。この成果も1報の学術論文(Solvent Extr. Ion Exch.)として掲載させている。

抽出錯体溶液のつくる階層構造をナノ-メソスケールで詳細に明らかにするとともに、分子動力学計算やDFT計算から分子レベルの構造と電子状態を明らかにする取り組みも進めている。論文執筆も順調にするんでおり来年度以降の発展が期待される。昨年度までの研究により、金属イオンの溶液2相間分配系における有機相中では、複数の抽出錯体が数十ナノメートル程度の凝集体を形成していることを明らかにしている。これは、抽出錯体の親水部における水素結合ネットワーク形成でつくられる1次凝集体と、この1次凝集体がファンデアワールス相互作用を介してさらに集合した高次の凝集体であることがわかっている。本年度は、1次凝集体をつくる駆動力の水素結合の状態を分子動力学(MD)計算を用いることで詳細に解析した。錯体、硝酸、水、配位子(リン酸トリブチル; TBP)の間にどのような水素結合が形成されているかを検討したところ、1つの水分子は2つの硝酸分子と水素結合をつくりやすいことや、系中に存在する硝酸のうち約半数は他の硝酸と水素結合をつくりやすいこと、水分子どうしの水素結合はつくりにくいこと等を明らかにした。MD計算のスナップショットに含まれる全ての原子座標をフーリエ変換すれば、X線小角散乱プロファイルを計算できる。この結果と実際のX線小角散乱測定により得られた結果を比較したところ、双方は良い一致を示した。このことから、MD計算で得られた結果の信頼性が確認され、水素結合ネットワークのサイズや形状が明らかになった。結果の一部は米国化学会の物理化学誌(J. Phys. Chem. B, 2018)にまとめられた。本研究で明らかにされた知見は、今後、第三相を形成しない新規な抽出剤や分離システムの開発に波及することが期待される。本研究では、プルトニウムの模擬抽出系としてジルコニウムイオンをリン酸トリブチル(TBP)/オクタン中に抽出した有機相について、広域X線吸収微細構造法、中性子小角散乱法、分子動力学計算を用いてその微視的構造を明らかにする検討を行った。その結果、ジルコニウムイオンとTBPによってつくられる抽出錯体どうしが、水分子、硝酸分子を介した水素結合によって会合を起こし、数ナノメートルの1次凝集体を形成することを明らかにした。さらに、この1次凝集体は逆ミセル的な構造をつくり、それらがファンデアワールス相互作用によってさらに大きな高次の凝集体を形成することを明らかにした。有機溶液中で配位子がつくる会合構造を明らかにすることができた。X線及び中性子小角散乱実験が有効に機能している。中性子偏極解析技術をデータ解析に組み込むことにも成功しており、来年度以降は金属錯体のミクロ構造解析を発展させる。広域X線吸収微細構造(EXAFS)と中性子小角散乱(SANS)法のデータを組み合わせるために、DFT計算を活用した取り組みを開始する。これによって約1nmから数百nmの幅広い空間スケールの構造を明らかにする。さらに、中性子・X線小角散乱による測定結果をMDシュミレーション等を用いて解析することで、溶液内の状態を実空間イメージとして可視化していく取り組みをマンチェスター大学、及び、オークリッジ国立研究所の研究員と協力しながら推進する。また、錯体の凝集構造のダイナミクスを明らかにするために必要な、中性子準弾性散乱測定を実施するための試料調製に着手する。
CRISPR-Casエフェクター複合体の構造機能解析

CRISPR遺伝子座から転写されたRNAはCas6により切断され、5'タグをもった前駆体crRNAとなる。その後、前駆体crRNAの3'側がプロセシングされcrRNAとなりCmr複合体に取り込まれる。しかしながら、前駆体crRNAの3'側のプロセシングに関わるタンパク質因子は同定されていない。本研究では、前駆体crRNAの3'側のプロセシングに関わるタンパク質因子の同定を試みた。Cmr複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析およびCmrΔ1複合体(Cmr1を含まないCmr複合体)の結晶構造解析の結果、crRNAの3'側はCmr1と結合することが推定された。Cmr1の立体構造は既に明らかとなっており、Cmr4などに代表されるRNA recognition motifフォールドを有している。Cmr4がヌクレアーゼ活性を持っていることから、Cmr1にもヌクレアーゼ活性があるのではないかと推定した。そこで、Cmr1が前駆体crRNAの3'側のプロセシングに関わるのではないかと仮説を立て、その寄与を検討した。まず、CmrΔ1複合体を再構成し、Cmr1の有無による前駆体crRNAのプロセシングの様子を観察した。変性PAGEによる解析の結果、Cmr1を添加した条件で、前駆体crRNAが切断されることが明らかとなり、Cmr1が前駆体crRNAのプロセシングに関わることが示唆された。次に、CmrΔ1複合体とCmr1の結晶構造をクライオ電子顕微鏡マップに重ね合わせ、crRNAの3'末端と相互作用するCmr1の領域を推定した。その結果、幾つかの親水性アミノ酸残基を特定した。これらのアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体Cmr1を調製し、前駆体crRNAのプロセシング活性を測定した結果、いずれの変異体もプロセシング活性を保持しており、現段階ではプロセシング反応に関わるアミノ酸残基の特定には至っていない。III型エフェクター複合体を構成するタンパク質の構造を解析し、また、crRNAのプロセシングに関わるタンパク質を同定したため。III型エフェクター複合体がcrRNAをプロセシングするしくみと標的RNAの切断における反応機構の解明を目指す。CRISPR-Cas系は原核生物における獲得免疫に関わる。まず、細胞に侵入してきたファージなどの外来DNAの一部が宿主ゲノムのCRISPR遺伝子座に取り込まれる。続いて、CRISPR遺伝子座から転写されたRNAがプロセシングされ、crRNAが合成される。crRNAはCasタンパク質と会合してエフェクター複合体を形成する。エフェクター複合体はcrRNAと配列相補的な外来核酸と結合し、それらを分解して外来遺伝子の発現を抑制する。エフェクター複合体は数種類のクラスに大別される。本研究では、III型エフェクター複合体の機能構造解析を行った。III型エフェクター複合体は、さらに、III-A型のCsm複合体とIII-B型のCmr複合体に分類される。Csm複合体は5種のCasタンパク質とcrRNAから成り、crRNAと相補的な外来RNAを加水分解する。Csm複合体が働くしくみを解明するために、Csm2の結晶構造を解析した。大腸菌を用いてCsm2の組換えタンパク質を合成し、各種クロマトグラフィーを用いて精製した。SEC分析により、Csm2は溶液中でモノマーであることが判明した。結晶化条件をスクリーニングし、PEG3350を沈殿剤として用いた条件で結晶が得られた。放射光施設を利用してSAD法により結晶の位相を決定した。結晶構造を解析したところ、Csm2はαへリックスから成り、Cmr複合体を構成するCmr5の構造と類似することが判明した。これまでの構造解析から、Cmr5はCmr複合体のヘリカル領域を構成するタンパク質であり、Cmr4や標的RNAと相互作用することを明らかにしている。さらに、Csm3がCmr4と類似していることも明らかにしている。したがって、Cmr5と同様に、Csm2はCsm3や標的核酸と相互作用すること、また、Csm複合体中では多量体化しヘリカル領域を構成することが示唆された。Csm複合体を構成するCsm2の結晶構造を決定できたため。Csm複合体は5種類のCasタンパク質(Csm1Csm5)とcrRNAから、Cmr複合体は6種類のCasタンパク質(Cmr1Cmr6)とcrRNAから構成されている。両者はcrRNAのガイド鎖と相補的なRNAを切断するとともに、転写と共役して外来DNAを切断する。これまでに、Cmr複合体の結晶構造を決定し、Cmr4で保存されたAsp残基がRNA加水分解反応における触媒残基の一つ(酸触媒)であることを特定した。本研究では、RNA加水分解反応機構の解明を目的に塩基触媒の同定を目指した。Cmr複合体の結晶構造において、加水分解されるリン酸結合はCmr4とCmr5の近傍に配置されていた。しかしながら、Cmr4のAsp残基以外に保存されたアミノ酸残基を確認することができなかった。そこで、加水分解されるリン酸結合の周辺に存在する親水性アミノ酸残基をそれぞれAlaに置換した変異体Cmr4および変異体Cmr5を作製した。変異型Cmr複合体を再構成しRNA切断活性を測定した。その結果、いずれの変異型Cmr複合体もRNA切断活性を保持しており、これらのアミノ酸残基が触媒反応には関与しないことが明らかになった。Cmr5はCsm複合体を構成するCsm2の構造と類似する。