hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人における薬物代謝能および体内動態の遺伝的多型性とその臨床応用

日本人における薬物代謝能を判定するtest drugの探索としてメフォバルビタール(MPB)およびシタロプラム(CTP)について,メフェニトイン(MP)型遺伝多型との関連性を検討した.1.R-MPBの代謝とS-MPの水酸化との関係ヒト肝ミクロゾームを用いた検討より、1)S-MPとR-MPBの水酸化活性との間には極めて高い相関が存在する,2)S-MPとR-MPBは相互に競合的阻害を示す,3)抗CYP2C抗体の添加はR-MPBの水酸化を強く阻害することが明らかとなった.また,MPB(ラセミ体)投与後の体内動態をS-MPの水酸化能が低いpoormetabolizer(PM)と正常なextensive metabolizer(EM)で比較したところ,1)PMではEMに比較しR-MPBの血漿中からの消失は著しく遅延していたが,2)S-MPBの消失には差は認められなかった,3)服用後24時間におけるR-MPBの水酸化体の尿中排泄率はPMがEMの約60分の1を示した.以上より,P-MPBとS-MPの水酸化は同じ酵素によって触媒されており,R-MPBが遺伝多型を示すS-MPの水酸化能を反映する薬物であることが示唆された.2.CTPの代謝に関与するCYP分子種の検討CTPの脱メチル化活性,はS-MPのPMおよびEMから得たと考えられるヒト肝ミクロゾームにおいて差は認められず,S-MPの添加による阻害も受けなかった.一方,S-MPの水酸化はCTPにより競合的に阻害されたことより,脱メチル化以外の代謝経路にS-MPの水酸化酸素が関与している可能性が示唆された.これらの結果は,第67回日本薬理学会年会,日本薬学会第114年会,第9回日本薬物動態学会年会で発表された.日本人における薬物代謝能を判定するtest drugの探索としてメフォバルビタール(MPB)およびシタロプラム(CTP)について,メフェニトイン(MP)型遺伝多型との関連性を検討した.1.R-MPBの代謝とS-MPの水酸化との関係ヒト肝ミクロゾームを用いた検討より、1)S-MPとR-MPBの水酸化活性との間には極めて高い相関が存在する,2)S-MPとR-MPBは相互に競合的阻害を示す,3)抗CYP2C抗体の添加はR-MPBの水酸化を強く阻害することが明らかとなった.また,MPB(ラセミ体)投与後の体内動態をS-MPの水酸化能が低いpoormetabolizer(PM)と正常なextensive metabolizer(EM)で比較したところ,1)PMではEMに比較しR-MPBの血漿中からの消失は著しく遅延していたが,2)S-MPBの消失には差は認められなかった,3)服用後24時間におけるR-MPBの水酸化体の尿中排泄率はPMがEMの約60分の1を示した.以上より,P-MPBとS-MPの水酸化は同じ酵素によって触媒されており,R-MPBが遺伝多型を示すS-MPの水酸化能を反映する薬物であることが示唆された.2.CTPの代謝に関与するCYP分子種の検討CTPの脱メチル化活性,はS-MPのPMおよびEMから得たと考えられるヒト肝ミクロゾームにおいて差は認められず,S-MPの添加による阻害も受けなかった.一方,S-MPの水酸化はCTPにより競合的に阻害されたことより,脱メチル化以外の代謝経路にS-MPの水酸化酸素が関与している可能性が示唆された.これらの結果は,第67回日本薬理学会年会,日本薬学会第114年会,第9回日本薬物動態学会年会で発表された.
非厳密時変評価規準を持つ遺伝アルゴリズムによる制御器の自動発生

数理的手法は論理が明確であり保証される制御性能も明確である。しかし、適用の場合の仮定の妥当性、実システムの同定の厳格性に疑問がつきまとう。また、その適用や運用に高度な数学力が必要となり、一般の技術者には難解である。ファジィ制御は原則的に人間が制御則を表現できなければ活用できない。それに反し、制御器としてニューラルネットワークを用いる方法は制御能力を自動発生させることが可能である。本研究では、制御器として3層階層型ニューラルネットを採用し、結合重みを遺伝アルゴリズム(GA)で制御能力がつくように進化させる。評価規準として本研究では独創的な評価規準を設けた:最初はともかく制御能力がつくように、次に制御能力が向上するように、段階的に緩やかな評価規準から厳しい評価規準になるよう設ける。最初から厳しい評価規準を設けると、制御能力をもったニューラルネットが発生しないか、または非常に長時間を要する。GAはシミュレータを必要とするが、数理的手法においても制御対象を同定しなくてはならないことは同じである。ただ本研究の手法では、応答さえ実システムと同じであれば、数式は不要である利点がある。本手法の有効性を確認するため、振子の振り上げ倒立制御・走行クレーンの振れどめ制御・船舶のような動揺する台の上のジブクレーンの振れどめ制御に適用した。GAでは数分で、制御能力のある制御器が発生した。発生の初期状態を変え、また、進化した制御器の制御試験を初期状態を変えて、偶然発生したものでないことを確認した。非厳密評価規準を持つ遺伝アルゴリズム(GA)による制御器を発生・進化させる方法を倒立振子の振り上げ倒立制御とクレーンシステムの振れ止め制御へ応用した。1.制御対象である倒立振子システムの振り上げ倒立制御をするニューロ制御器を非厳密評価規準GAを用いて学習させる.GAの特徴を活かすために評価規準をゆるやかなものからきびしいものへと時変的・段階的に適用させ,目的の制御性能が獲得できるように発生・進化させる.制御装置には,振り上げ制御用と倒立制御用の二種類の神経回路網を用意し,制御器を切り替えながら振り上げ倒立制御を行う.進化方法は,はじめに倒立制御用の神経回路網を非厳密評価規準を用いて進化させる.ニューロ制御器が良好な倒立制御能力を獲得したら,倒立制御可能な初期条件を求める.次に,振子をその初期条件内に振り上げるように,振り上げ制御用の神経回路網を十分に進化・学習させる.それぞれの神経回路網を用いて振子の振り上げ倒立制御を行い,シミュレーション実験と実機による実験を通して,本手法の簡便性と有用性を検証した.2.クレーンシステムにおいて,作業中に吊り荷が左右に揺れると作業効率が低下する.しかし,荷物を揺らさずに作業するということは熟練した作業者でも難しい.そのため,クレーンシステムの振れ止めに対するいろいろな自動制御法が提案されているが,これらの手法の多くは,制御対象であるクレーンシステムが非線形システムであることから,難解な数値計算と多くの数理的な理論を要する。振れ止め制御用の制御器を設計するにあたり,非厳密評価規準GAと神経回路網を組み合わせ,難解な計算や複雑な数理的理論をほとんど使用せずに振れ止め用の制御器を発生・進化させる.ロープ長さを変えながら台車の移動を伴うクレーンシステムの振れ止め制御のシミュレーション実験を行った.また,本手法を用いて構成されたニューロ制御器と同様の条件で設計した最適レギュレータを用いて比較・検証し,本手法の有効性を示した.最近知能工学と総称されるこの分野は、久しく振動工学の数学を活用して発展した。数理的手法はその論理が明確であり保証される制御性能も明確である。しかし、(1)数理的手法を適用しようとする時の仮定は適当であるか、確実に実システムを同定しているかという疑問がつきまとう。

また(2)その適用や運用に極めて高度な数学力が必要となり、一般の技術者では容易に活用できない現実がある。ファジィ制御は原則的に人間が制御則を表現できなければ活用できない。それに反し、制御器としてニューラルネットワークを用いる方法は自動的に制御能力を自動発生させることが可能である。この制御器として3層階層型ニューラルネットをもちいることとし、そのニューラルネットの結合重みを遺伝アルゴリズム(GA)で制御能力がつくように進化させる。GAには評価規準が必要である。ここで、評価規準として、最初はともかく制御能力がつくように、次に制御能力が向上するように、段階的に緩やかな評価規準から厳しい評価規準になるよう設ける。最初から厳しい評価規準を設けると、制御能力をもったニューラルネットが発生しないか、または非常に長時間を要し、進化のシミュレーションであるGA操作を途中で断念することになる。本研究は、この評価規準に工夫をしたところに特徴がある。GAはシミュレータを必要とするが、数理的手法においても制御対象を同定しなくてはならないことは同じである。ただ本研究の手法では、応答さえ実システムと同じであれば、数式は不要である利点がある。本手法の有効性を確認するため、振子の振り上げ倒立制御・走行クレーンの振れどめ制御・船舶のような動揺する台の上のジブクレーンの振れとめ制御に適用した。発生の初期状態を変え、また、進化した制御器の制御試験を初期状態を変えて、偶然発生したものでないことを確認した。
液胞型 ATPase の全体構造決定を突破口とした回転プロトン輸送機構の解明

V-ATPaseは、真核生物の酸性小胞(リソゾーム、エンドソームなど)に存在するATP駆動性のプロトンポンプであり、小胞内の酸性化を通して、タンパク質の品質管理や物質代謝を担っている。ATP合成酵素FoF1と同様の回転触媒機構でATPのエネルギーを回転力に変えてプロトンを輸送する。我々は、V-ATPaseの機能を明らかにするために、全体構造の構造決定を試みてきた。結晶構造解析による全体構造の決定はいまだ達成されていないが、回転運動に由来する構造多形により分解能が上がらないことが考えられる。そこで構造多形を持つタンパク質の構造解析にも対応できるクライオ電顕による単粒子解析を試みた。試料調製、クライオグリッドの調製条件を検討した結果、比較的良好なクライオ電子顕微鏡画像を撮影することができた。ここから画像解析ソフトRELIONにより、単粒子画像を抽出し、2次元クラス分けによる画像選別を経て、3次元クラス分けを行った。クラス数を12以上にした結果、回転状態に対応した3つの構造が得られた。精密化を進めることで部分的にはアミノ酸側鎖をおける分解能の構造を得た。この構造を解析することにより、プロトンの透過経路や回転に伴う外周部分の動きを明らかにすることができた。この成果は、2018のNature Communicationsに掲載された。さらに分解能を上げるために粒子数を増やしてクラス分けしたところ、もっとも数の多い単粒子からなるクラスの構造から、サブクラスに相当する構造を得ることができた。この構造はやや軸が傾いていおり、回転中間体に相当するものと思われる。本年度も、引き続き単粒子解析によるVoV1の構造解析を行い、分解の改善を目指した。分解能を向上させるためには、S/N比の良い電子顕微鏡画像を多く撮影する必要がある。そのための条件検討を前年度に引き続き行った。LMNGで可溶化したVoV1の画像をさらに撮影し、100万程度の単粒子画像を抽出し、解析を行った。特に一番分解能の良いクラスに注目し、Focused Classificationなど解析法を工夫することで、軸がやや傾いたサブクラスを得ることができた。ただ、クラス分けをすることで単粒子数が減り分解能は以前5A程度で、原子分解能に至っていない。平行して可溶化条件の異なる試料の撮影も行った。ナノディスクは、膜タンパク質の疎水性部分に円盤状の脂質領域を作り出し、膜タンパク質を水溶液中に分散させる方法である。界面活性剤がないので、ミセルによるS/N比の低下や、表面張力の低下による氷厚調整の難しさを回避することができる。ナノディスクへのVoV1の組み込み条件を検討した結果、単分散性の良い試料を得ることができた。この試料を使ってクライオグリッドを作製し、観察したが、乖離したと思われるV1の単粒子が沢山観察され、VoV1の歩留まりが悪かった。調製直後のVoV1は、ゲル濾過で検定しても単一ピークを示すことから、V1部分の乖離は、クライオグリッド作製時に起きていると考えられる。歩留まりが悪いながら、6-7 A程度の分解能の構造が得られている。Voの単粒子解析にも着手し、比較的良好な電子顕微鏡画像を得ることができた。現在、VoV1については、LMNGで可溶化したもの、ナノディスクに組み入れたもの、GDNで可溶化したもの、についてクライオグリッドを作製し、クライオ電顕画像を撮影し、単粒子解析を進めている。それぞれ解析を進めたところ、現状ではLMNGが一番分解能が上がっている。しかし、粒子数と分解能の関係を示すR-H plotで解析すると、100万粒子以上つかっても4Aを切る程度の分解能の構造しか得られないことが予想されている。この分解能では、アミノ酸側鎖をすべておいて原子分解能のモデルを構築するのは難しい。ナノディスクを使用した場合の問題点としてV1部分の乖離がある。表面張力による引張力で乖離が起こることが考えられる。そこで、クライオグリッドの作製条件を検討する。具体的には、ブロットに使うろ紙の種類を変えて水の吸い取り時間を細かく設定する、片面からの吸い取りができる装置を使う、等を検討する。また、脂質ディスクを作るタンパク質の長さを変えて、直径の大きなナノディスクに組み入れることで乖離の軽減を狙う。LMNG, GDNに関しては、支持膜にアモルファスカーボンを使っているが、厚みがあり画像のS/N比を下げる原因の一つになっている。そこで単相グラフェンを支持膜に使うことで、S/N比のよい画像を取得する。グリッドの素材を金にすることで電子の照射時のグリッドの歪みによる分子の動きを軽減できる。グリッドの素材を変えることも検討する。Vo部分の分解能を上げるために、Vo部分だけを取り出して単粒子解析することも行う。予備実験では、良好な電子顕微鏡画像が得られることがわかった。Voだけにすると、V1とVoの分子内の動きによる分解能の低下を抑えられることが期待できる。

そこで構造多形を持つタンパク質の構造解析にも対応できるクライオ電顕による単粒子解析を試みた。試料調製、クライオグリッドの調製条件を検討した結果、比較的良好なクライオ電子顕微鏡画像を撮影することができた。ここから画像解析ソフトRELIONにより、単粒子画像を抽出し、2次元クラス分けによる画像選別を経て、3次元クラス分けを行った。クラス数を12以上にした結果、回転状態に対応した3つの構造が得られた。精密化を進めることで部分的にはアミノ酸側鎖をおける分解能の構造を得た。この構造を解析することにより、プロトンの透過経路や回転に伴う外周部分の動きを明らかにすることができた。この成果は、2018のNature Communicationsに掲載された。さらに分解能を上げるために粒子数を増やしてクラス分けしたところ、もっとも数の多い単粒子からなるクラスの構造から、サブクラスに相当する構造を得ることができた。この構造はやや軸が傾いていおり、回転中間体に相当するものと思われる。本年度も、引き続き単粒子解析によるVoV1の構造解析を行い、分解の改善を目指した。分解能を向上させるためには、S/N比の良い電子顕微鏡画像を多く撮影する必要がある。そのための条件検討を前年度に引き続き行った。LMNGで可溶化したVoV1の画像をさらに撮影し、100万程度の単粒子画像を抽出し、解析を行った。特に一番分解能の良いクラスに注目し、Focused Classificationなど解析法を工夫することで、軸がやや傾いたサブクラスを得ることができた。ただ、クラス分けをすることで単粒子数が減り分解能は以前5A程度で、原子分解能に至っていない。平行して可溶化条件の異なる試料の撮影も行った。ナノディスクは、膜タンパク質の疎水性部分に円盤状の脂質領域を作り出し、膜タンパク質を水溶液中に分散させる方法である。界面活性剤がないので、ミセルによるS/N比の低下や、表面張力の低下による氷厚調整の難しさを回避することができる。ナノディスクへのVoV1の組み込み条件を検討した結果、単分散性の良い試料を得ることができた。この試料を使ってクライオグリッドを作製し、観察したが、乖離したと思われるV1の単粒子が沢山観察され、VoV1の歩留まりが悪かった。調製直後のVoV1は、ゲル濾過で検定しても単一ピークを示すことから、V1部分の乖離は、クライオグリッド作製時に起きていると考えられる。歩留まりが悪いながら、6-7 A程度の分解能の構造が得られている。Voの単粒子解析にも着手し、比較的良好な電子顕微鏡画像を得ることができた。V-ATPaseは、真核生物の酸性小胞(リソゾーム、エンドソームなど)に存在するATP駆動性のプロトンポンプであり、小胞内の酸性化を通して、タンパク質の品質管理や物質代謝を担っている。ATP合成酵素FoF1と同様の回転触媒機構でATPのエネルギーを回転力に変えてプロトンを輸送する。低温電子顕微鏡(クライオEM)による単粒子解析は、タンパク質の構造を決定する有力な方法の1つである。
干渉計制御信号の外部光共振器による分離

本年度は主干渉計の光リサイクリング動作の安定度・感度の向上、および副共振器の設置・調整を行った。主干渉計である国立天文台の重力波検出器においては、昨年度までに達成している高調波復調法によるリサイクリング干渉計の動作をさらに推し進め、高出力(10W)レーザーによる動作とリサイクリング動作による感度向上を実現した。これにより、主干渉計ではリサイクリングゲイン4.5、変位感度にして8×10^<-19>m/√Hzが達成された。副共振器は主干渉計の反射光ポートに設置された。副共振器の各鏡は本研究にて購入したマウントに固定されており、また終端鏡はPZT素子アクチュエータに貼り付け、このアクチュエータをマウントに取り付けることで固定している。これにより副共振器の光路長を変化させることができるようになった。現段階では副共振器への搬送波の共振が確認されているが、共振状態へのロックは行われていない。昨年度までの研究で、空間モード不整合が本研究の目的である搬送波信号の抑圧を妨げる、ということが明らかになっている。それに関連した事実として、主干渉計からの反射光のモード品質が主干渉計の動作状態に依存することが判明した。これは、主干渉計に入射する光が入射望遠鏡の不完全性によってゆがんでしまうことが主たる原因であると突き止められた。この状態では主干渉計が動作状態に無いときには干渉計信号の分離比が悪化することが想定される。この干渉計射出モードの動作状態による信号分離比の変化については、今後も継続して調査していくつもりである。本年度は主干渉計の光リサイクリング動作、副共振器の光学系の設計と設置、および副共振器における光モード不整合による性能悪化の評価を行った。まず、主干渉計である国立天文台の重力波検出器においてリサイクリング干渉計に必要である4つの光路長自由度を制御することに成功した。この主干渉計の制御信号の取得においては高調波復調法を適用し、リサイクリング共振器の光路長変動が長基線共振器の光路長変動からなるべく分離されて取得できるようになっている。この手法と本研究における外部共振器による搬送波抑圧をあわせることで信号の分離度を飛躍的に向上させることが期待される。副共振器については、反射鏡が納入されてからまだ間がないため、現段階では搬送波の共振には至ってはいない。現在、光学定盤上で試験用の光学系の設置を行っている。この試験光学系では空間モードの整っているNd : YAGレーザーの光でどれだけ搬送波抑圧できるかを評価する。現在までに、レーザーの設置と共振器の各鏡の配置を行った。副共振器の終端鏡は本研究にて購入したPZT素子アクチュエータに取り付けたのち、マウントに固定している。期待される性能として、外部共振器によって得られる搬送波抑圧比が、モードの不整合によってどれくらい悪化するかを評価した。副共振器の鏡の反射率に不整合があると、共振器から搬送波が反射して抑圧比が悪化する。同様にモード不整合があると、共振器に反共振の搬送波が反射され、抑圧比が悪化する。これにより、モード不整合は共振器の搬送波反射率以下程度に抑える必要があることがわかった。試験光学系で用いているような空間モードの整っているレーザー光では、典型的には99%以上のモード整合を取ることが可能であり、この場合の搬送波の抑圧比は最良の場合で0.01と推定された。これは副共振器の搬送波反射率で決まる値よりも十分良いと思われるため、モード不整合が性能を制限しないようにできると結論付けられた。ただし、本研究では主干渉計の出力光を副共振器に入射するため、主干渉計の出力光のモード形状によってはよりモード整合が悪化する可能性がある。どれくらい出射光のモードがどのようになっているか明らかにすることが、今後の実験では重要であると認識された。
脳血管支配自立神経及び知覚神経の加齢による変化

実験動物としてラットを用い、加齢に伴う脳血管支配神経(交感神経、副交感神経、知覚神経)の分布様式を調べるために、光学顕微鏡、及び電子顕微鏡レベルでの多重染色を試みた。それぞれの標識抗体として交感神経:抗tyrosine hydroxirase抗体、副交感神経:抗vasoactive intestinal peptide抗体、知覚神経:抗substancP抗体を用い、光学顕微鏡レベルではDAB反応とニッケル加DAB反応を組み合わせることにより同一切片上で二重染色し、また、電子顕微鏡レベルでは2次抗体として、大きさの異なる金コロイドを結合させた抗IgG抗体を用い二重染色を試みた。光学顕微鏡レベルでは、例えば、交感神経系と副交感神経系が一部寄り添う様に走行していることがわかった。しかし、電子顕微鏡レベルでは、単染色は可能であったが、多重染色による同一切片上での各神経の同定には至らなかった。そこで、交感神経、あるいは知覚神経に対して金コロイドで単染色した切片に、副交感神経に特異的に反応すると考えられるNADPH-diaphoraseとnitro blue tetramideにより発色させ、交感神経、知覚神経と副交感神経の走行について相互関係を検索し、それぞれの関係の加齢による変化を観察した。また、主要脳血管でのそれぞれの神経分布密度を免疫染色の手法を用いて特異的に染色し電子顕微鏡レベルで測定しそれらの加齢による変化も観察している。
コールセンタにおける雇用と人材育成関す調査研究

コールセンタ従業員に対するアケト調査を実施し、その分析を通して人事管理上の課題を解明た。職場定着志向が低く、これが高い離職率につながっていること、その背景に給与への不満があることが明らかとなった。本年度は、アンケート調査実施準備がメインであり、そのための文献研究を行うとともに、国際比較研究を実施するための調査票の設計と調査方法等の検討を主に行った。そのために、日本に研究者を招き、またこちらから訪欧して打ち合わせを行うなどして準備を進めた。また、プリテストを兼ねて実施した沖縄コールセンター訪問調査には、フランスの連携研究者である野原氏も同行し、問題関心の共有化を行うことができた。これらの活動を通じて、共通調査票(日本語のものをベースとすることとした。仏、独の研究者とも日本語を解するため)を確定した。これに基づき、フランスでは、アンケート調査を開始し、4月はじめの段階で、約250票を確保している。調査票がある程度固まった段階で、調査対象企業に協力依頼を開始した。こちらはある程度予想されたことだが、難航している。とくに、コールセンター業務受託専業企業(アウトソーサーと呼ばれる)は、クライアント企業との関係から調査協力に難色を示しているので、なんらかの対応策を講ずる必要があることがわかった。本研究の目的は、急拡大するコールセンターにおける雇用と人材育成の実態を、国際比較の観点から、従業員に対するアンケート調査等を用いて解明し、人事管理施策改善の方途を探ることである。本年度は、事業所を通ずる従業員アンケート調査を実施するとともに、対象事業所についての面接調査を実施した。アンケート調査では、従業員の属性、職業経歴、担当業務の内容、教育訓練の内容・程度、処遇、仕事上・生活上の不満や希望などについての約60の質問をしている。この調査によって、どのようなコールセンター、どのような人事管理施策が従業員の定着を促進し、あるいは離職を促すか、コールセンター従業員がどのようなキャリア展望をもち、それを可能にする業務経験や技能形成に成功しているか、どのような雇用政策がコールセンター従業員の勤務条件を改善し、キャリア展望を拓くことに役立ちうるかを探ろうとするものである。平成21年度においては、4センターから555票を回収し、うち2センター436票分については原票チェックの上、入力と基本集計済みである。本格的な分析は平成22年度の課題となるが、多数の非正規社員が働くコールセンターのオペレーターに若年から高齢者まで、多様な人々が働いている実態が明らかになり、彼らがどのような問題を抱えているかを追究している。また、国際比較の観点からの分析を進めるために、代表者がフランス訪問し、研究打ち合わせを実施し、また、日本を訪問したフランス・チームメンバーからフランス調査の中間的結果(回収314サンプル)について報告を受け、討議した。本研究の目的は、コールセンターにおける雇用と人材育成の実態を、従業員に対するアンケート調査を用いて明らかにすることである。本年度においては、引き続き特定のコールセンターの協力を得て、当該センター従業員の調査を実施するとともに、職種を特定した大規模モニター調査(ネット調査)を実施することに活動の重点を置いた。その結果、事業所ルートでの調査によって、3事業所合計595人からの回答を得、ネット調査によって478人からの回答を得た。合計すると、1073人となり、調査対象を特定することが困難なこの種調査では、それなりの成果を挙げることができた。また、ネット調査の特性を活かして、現在コールセンターで働いていないが、過去に働いた経験のある対象者を特定し、コールセンター経験者調査を実施した。この結果、1123人の経験者から回答を得ることができた。これは、コールセンター経験者のキャリアを理解する上で、貴重なデータとなる。ネット調査結果によると、現在コールセンターで働いているオペレータのうち、今後も現在の職場で働き続けようと考えている人は32.0%にとどまり、54.0%の人がいずれは転職しようと考えていること、そして、14.0%の人は近々に転職しようと考えていることが明らかとなっている。もっとも、流動性の高さは、この業界の特徴であり、必ずしも全て否定的にとらえるべきではない。コールセンターに勤務を続けて、社内で昇進・昇格していく機会は必ずしも大きくないからである。重要な論点の一つは、コールセンター勤務経験がその後のキャリアに生かされるかどうかである。経験者調査によると、73.9%の人がコールセンター勤務経験は現在の仕事に役立っていると回答している。対人折衝能力やコミュニケーション能力向上効果が認められる。
膀胱癌とN-アセチルトランスフェラーゼの遺伝的多型性との関連性

アリルアミンは、尿路上皮癌(膀胱癌、腎盂尿管癌)の発癌化学物質として知られている。アリルアミンは、N-アセチルトランスフェラーゼ(以下NAT)によって代謝されることが知られている。NATには、NAT1とNAT2の2つの酵素があり、NAT2には以前より、活性に関して遺伝的多型があり、NAT2の活性の弱い表現型と膀胱癌発癌との関連性が指摘されてきた。最近、NAT1にも遺伝的多型があることが報告され、癌との間連も指摘されている。今回、尿路上皮癌患者群115例(膀胱癌85例、腎盂尿管癌30例、平均年齢66.9±11.8歳)、健常者群122例(平均年齢62.4±16.6歳)について、NAT1とNAT2の遺伝的多型について検討した。末梢血中の白血球より、ゲノムDNAを抽出し、NAT1とNAT2の遺伝子をPolymerase Chain Reaction(PCR)法により増幅させ、それをRestriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)法により、遺伝的多型の解析を行った。NAT1の解析では、発癌に関係すると言われるrapid NAT1遺伝子型の頻度は、健常者群62.3%に対し、膀胱癌群74.1%,腎盂尿管癌群73.3%,膀胱癌と腎盂尿管癌を合わせた尿路上皮癌群で73.9%であり、健常者群に比し、相対危険度(オッズ比)は、それぞれ1.73,1.66,1.71であったが、統計学的有意差は認めなかった.NAT2の解析では、slow NAT2遺伝子型の頻度が、健常者群5.7%に対し、膀胱癌群20.0%,腎盂尿管癌群16.7%,尿路上皮癌群19.1%であり、それぞれのオッズ比(OR)と95%信頼区間(95%Cl)は、膀胱癌群4.11,1.62-10.41,腎盂尿管癌群3.29,0.96-11.20,尿路上皮癌群3.89,1.59-9.50と統計学的に有意な差を認めた。また、NAT1とNAT2の遺伝子型の両者をあわせ検討すると、normal NAT1とrapid NAT2併せた群のORを1とすると、rapid NAT1とslow NAT2を併せた群のORは、7.56と増加し、rapid NAT1とslow NAT2の尿路上皮癌発癌危険度に対する相乗効果が示された。末梢血中の白血球より、ゲノムDNAを抽出し、N-acetyltransferase2(以下NAT2)の遺伝子を、Polymerase Chain Reaction(以下PCR)法により増幅させ、その得られた遺伝子を、Restriction Fragment Length Polymorphism(以下RFLP)法により、その遺伝的多型性について解析を行った。

現在まで解析を行ったのは、膀胱癌患者群は74例(平均年齢69.8±11.2歳)、健常者群は、99例(平均年齢61.3±15.6歳)である。NAT2の代謝速度の緩慢なslow acetylatorの頻度は、膀胱癌患者群の13例(17.6%)、健常者群の6例(6.1%)に認められた。slow acetylatorの頻度は、膀胱癌患者群で統計学的に有為な増加(P<0.05)が認められた(オッズ比3.30,95%信頼区間1.19-9.11)。NAT2の遺伝的多型性は、民族差があると言われており、欧米ではslow acetylatorの頻度が高く、膀胱癌の発症と関連性があるとされているが、slow acetylatorの頻度が低いと言われる本邦においても、NAT2の遺伝的多型性を膀胱癌発癌との関連性が示唆された。N-acetyltransferase 1(以下NAT1)の遺伝子多型については、Bellら(1995年)の方法に従って解析を行っているが、PCR産物やRFLP法による解析が、安定した結果が得られず、現在健常者群の解析の途中であり、NAT1の遺伝子多型については、現在のところ信頼できる結果を得られていない。健常者群、膀胱癌患者群とも症例を増やしさらに検討したい。アリルアミンは、尿路上皮癌(膀胱癌、腎盂尿管癌)の発癌化学物質として知られている。アリルアミンは、N-アセチルトランスフェラーゼ(以下NAT)によって代謝されることが知られている。NATには、NAT1とNAT2の2つの酵素があり、NAT2には以前より、活性に関して遺伝的多型があり、NAT2の活性の弱い表現型と膀胱癌発癌との関連性が指摘されてきた。最近、NAT1にも遺伝的多型があることが報告され、癌との関連も指摘されている。今回、尿路上皮癌患者群115例(膀胱癌85例、腎盂尿管癌30例、平均年齢66.9±11.8歳)、健常者群122例(平均年齢62.4±16.6歳)について、NAT1とNAT2の遺伝的多型について検討した。末梢血中の白血球より、ゲノムDNAを抽出し、NAT1とNAT2の遺伝子をPolymerase Chain Reaction(PCR)法により増幅させ、それをRestriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)法により、遺伝的多型の解析を行った。NAT1の解析では、発癌に関係すると言われるrapid NAT1遺伝子型の頻度は、健常者群62.3%に対し、膀胱癌群74.1%腎盂尿管癌群73.3%膀胱癌と腎盂尿管癌を合わせた尿路上皮癌群で73.9%であり、健常者に比し、相対危険度(オッズ比)は、それぞれ1.73,1.66,1.71であったが、統計学的有意差は認めなかった。NAT2の解析では、slow NAT2遺伝子型の頻度が、健常者群5.7%に対し、膀胱癌群20.0%,腎盂尿管癌群16.7%,尿路上皮癌群19.1%であり、それぞれのオッズ比(OR)と95%信頼区間(95%CI)は、膀胱癌群4.11,1.62-10.41,腎盂尿管癌群3.29,0.96-11.20,尿路上皮癌群3.89,1.59-9.50と統計学的に有意な差を認めた。また、NAT1とNAT2の遺伝子型の両者をあわせ検討すると、normal NAT1とrapid NAT2併せた群のORを1とすると、rapid NAT1とslow NAT2を併せた群のORは、7.56と増加し、rapid NAT1とslow NAT2の尿路上皮癌発癌危険度に対する相乗効果が示された。
核とミトコンドリア複製の連携機構に関する研究

核のチェックポイント制御機構に関わるATR遺伝子は、酵母からヒトに至るすべての真核生物に広く保存している。近年、ヒト遺伝病の1つSeckelsyndromeが本遺伝子の発現低下に起因し、その症状は多面的であるが核以外での機能については未知であった。本研究では、線虫ATRCe-atl-1の欠損変異によりmtDNAのコピー数が低下すること、さらに抗酸化酵素の転写が活性化し過酸化脂質の蓄積も抑えられること、寿命が延長することを見出した。また、ヒト培養細胞でATRを過剰発現することでオートファジー細胞死が誘導されることも明らかにし、生物種を越えてATRが核以外でも多面的な働きを担うことを明らかにした。細胞周期のチェックポイント機構に関わるATMならびにATRのヒト培養細胞における細胞内局在性について、それぞれの複数の抗体を用いて解析を行った。その結果、いずれも核ならびに細胞質の画分に検出されるとともに、ATRはミトコンドリア画分においても見出された。さらに、現在、ヒトATRのGFP融合体を作成し、培養細胞に形質導入することでGFPシグナルを用いた生細胞内における局在性の解析を行っている。また、ヒトATRと相互作用する因子を調べる目的で、免疫沈澱法により共沈する蛋白質について、質量分析装置を用いた解析を展開している。なかでも、ミトコンドリア特異的な転写因子(TFAM)、DNA合成酵素(POLG)、DNA helicase(TWINKLE)、1本鎖DNA結合タンパク質(SSBP1)の抗体を用いて、共沈画分に含まれるか否か現在解析中である。ミトコンドリア障害時における細胞内シグナル伝達応答に関して調べる目的で、線虫を用いてミトコンドリア呼吸鎖複合体の阻害剤を用いて処理し、発現変動する遺伝子についてリアルタイムPCRにより定量解析を行った。その結果、HIF-1依存的な低酸素応答に関わる遺伝子が発現誘導されること、また、その誘導にはMAPKのシグナル伝達系が関与していることを明らかにした。この実験系を進めることで、ミトコンドリア障害時のレトログレードシグナル伝達系の分子機構について更なる解析を次年度以降に進める。また、放射線照射による酸化ストレスならびにDNA損傷の応答について、線虫ならびにヒト培養細胞を用いた解析を行い、複数の論文発表を行った。次年度は、これらとミトコンドリア障害時との比較解析を実施する予定である。さらに、ヒトATRのGFP融合体を作成し、培養細胞に形質導入することでGFPシグナルを用いた生細胞内における局在性の解析を行った。その結果、細胞分画と同様に、核と、細胞質ならびにミトコンドリアにも、シグナルが観察されることが明らかになった。さらに、このATRの発現系において、細胞の液胞化をともなう細胞死が誘導される現象も見出した。現在、オートファジーとの関連性について調べている。また、ヒトATRと相互作用する因子を調べる目的で、免疫沈澱法により共沈する蛋白質について調べたところ、ミトコンドリア特異的な複製・転写に関わる因子TFAMと相互作用を示すことが確認された。また、ミトコンドリア障害時におけるATR遺伝子の働きに関して調べる目的で、線虫の野生型ならびにATL1(線虫ATR)の欠損変異体を用いて解析を行った。その結果、ATL1欠損では、ミトコンドリアストレスに高感受性になることが確認され、核のチェックポイント制御に関わる因子のミトコンドリアでの制御が確実なものになり、新たな知見へとつながっている。また、放射線照射による酸化ストレスや高温ストレスによる障害ならびにDNA損傷の応答について、植物や線虫ならびにヒト培養細胞を用いた解析を行い、ミトコンドリアと核との連携について、解析を引き続き展開している。さらに、線虫を用いた宇宙実験のサンプルを解析することで、宇宙環境がおよぼす影響について、特に、筋委縮とミトコンドリアとの関係についてもDNAマイクロアレイならびにプロテオーム解析を実施している。本研究は、核とミトコンドリアの連携機構に関する分子解明を目指すものである。具体的には、モデル生物の1つである線虫ならびにヒト培養細胞、各種植物を用いて、以下の実験を実施した。・ヒト培養細胞におけるATRタンパク質過剰発現によって引き起こされる空胞化現象の解析では、この空胞化がオートファゴソームの形成によるものかを明らかにするために、オートファゴソームの形成に重要な役割を果たすLC3の活性化、空砲とLC3タンパク質の局在について調べたところ、オートファジーが生じていることを明らかにした。

さらに、この空胞化には、ATRのキナーゼ活性領域は必要なく、N末端側のHEATリピート配列の過剰発現で生じることを明らかにした。また、類似のATM、mTOR、SMGなどの過剰発現では観察されず、ATR特異的な現象であることが確かめられた。・線虫のATR(atl-1)欠損変異体を用いて、ミトコンドリア障害に対する個体レベルの応答を調べた。ミトコンドリアの複製および転写阻害剤であるエチジウムブロマイド、呼吸複合体IIIの阻害剤であるアンチマイシンAを処理したときの表現型を解析したところ、これらに対する感受性がATRの欠損により増加することが確認された。・植物を用いた実験では、高温や低温が特に生殖成長に及ぼす影響を、核とミトコンドリア、さらに葉緑体のDNA複製の関連から研究を展開した。その結果、これら温度ストレスがオルガネラDNAの複製に対して、より顕著な影響を及ぼすことが明らかになった。本研究では、核とミトコンドリアの連携機構に関する分子解明を目指した。具体的には、モデル生物線虫Cエレガンスならびにヒト培養細胞、各種植物を用いて、以下の研究成果が得られた。ヒト培養細胞において、核のチェックポイント制御に関わるATRタンパク質を過剰発現させた際に細胞質に空胞化が生じ、これはオートファジーが生じた結果であることをつきとめた。さらに、この空胞化にはATRのキナーゼ活性領域は必要なく、N末端側のHEATリピート配列の過剰発現で生じることを明らかにした。以上の結果から、これまで核のチェックポイント制御タンパク質ATRの新たな機能として、細胞質におけるオートファージの制御にも関与していることが発見された。また、CエレガンスのATR(atl-1)欠損変異体を用いて、細胞質のなかでも、特にミトコンドリア障害に対する個体レベルの応答について調べた。また、哺乳類におけるATRの欠損では早老症になることも知れれており、線虫ATRの欠損と寿命との関連について調べた。その結果、線虫では逆に長寿命となった。このことは変異体において軽いミトコンドリア不全が生じており、その結果、SODなどの抗酸化酵素の活性化により寿命が延びたと判断された。植物を用いた実験では、高温や低温が特に生殖成長に及ぼす影響を、核とミトコンドリア、さらに葉緑体のDNA複製の関連から研究を展開し、温度ストレスがオルガネラDNAの複製に対して、より顕著な影響を及ぼすことを見出した。ただし、3月11日の震災にともなう長期間の停電により、超低温において保存していた線虫の各種変異体、培養細胞、ベクターなどが失われ、この点においては、やや遅れが生じた。
放射線による腸死に対する治療法としての幹細胞移植の可能性の探索

放射線による腸死に対し幹細胞移植による治療の可能性を探るためマウスを用いたモデル実験を行うのが目的である。昨年の結果から胎仔期の小腸上皮細胞を用いれば幹細胞移植がより効率的に行える可能性が示唆されたので、本年度はまず小腸上皮細胞をsingle cellとしてより多く回収する方法を検討した。具体的には細胞が緑の蛍光を発するように改変されたEGFPマウスの17.518.5日齢胎仔小腸を用い、文献情報から得られたコラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、トリプシン、DNase I、EDTAの単独及びそれらの2つ以上の組み合わせた処理について検討した。また処理方法は0°C×60分、20°C×20分、37°C×20分についてチェックした。指標としてはsingle cellsuspensionが得られるか、蛍光蛋白が細胞内によく保持されているか、細胞の収率はよいかの3点で行った。その結果、EDTA存在下でヒアルロニダーゼを37°C×20分処理後トリプシン+DNase Iを20°C×20分を行うのが最適であることが分かった。この時の細胞の回収率は0.31×10^5 cells/マウスであった。次にこの細胞を用い10Gy照射したマウスの尾静脈に投与した結果、マウスの生存期間は911日であった。これは何も処理しない時の生存期間とほぼ同じであり、生存率への影響はみられなかった。このとき小腸にはかなりの数の移植された蛍光細胞がみられたが、幹細胞から絨毛上皮に向けた直線状の細胞のつながりは見えなかったので、幹細胞をうまく移植できたかどうかは不明である。個体の腸死を回復させるためには今後さらなる検討が必要である。放射線のリスクを考える時、被曝後の処置によって誘発され得る障害を軽減化できるかどうかは重大なことであり、癌の放射線治療時だけでなく事故やテロによる放射線障害を抑制するためにも有効な手段となり得る。これまでに510Gyの放射線による障害に対しては骨髄移植が有効であることが示されているが、それ以上の線量についてはまだ分かっていない。ヒトでもマウスでも10100Gyの放射線を全身に受けると腸死となるが、本研究では幹細胞移植によってこの腸死を軽減化することができないかについてマウスを用いて解析している。本年度(H21年度)は以下の3点を明らかにした。(1)蛍光蛋白EGFPを発現しているマウスの骨髄細胞を15Gy照射した同系統のマウスの尾静脈から注入すると小腸クリプト部位に蛍光をもった細胞が生着すること、(2)注入は照射直後に行うよりも照射後18時間経過後に行う方が生着率が高くなること、また(3)2ヶ月齢の成獣マウスの骨髄細胞の移植よりも18日令胎仔の小腸細胞を用いた方がより多くの細胞が小腸に生着する。ただしこの場合、細胞の生着部位が小腸の位置(近位と遠位)によって異なる可能性が示唆された。これらの結果は放射線による腸死を胎仔の小腸幹細胞あるいはそれに類似した幹細胞を移植することによって治療するあるいは軽減化できる可能性を示唆するものであり、今後さらに小腸からの細胞の分離法を改良するとともに、細胞移植によって実際に個体レベルでの腸死をどれ程軽減化できるかを解析してゆきたい。
窒素酸化物変換反応に関与する金属タンパク質の活性点構造とその性質に関する研究

本研究では、窒素酸化物変換反応に関与する酵素の活性点構造、反応機構、構造-活性相関等を明らかにすることを目的として実験を行なった。本研究では、従属栄養硝化細菌としてArthrobacter globiformisを用いた。Arthrobacter globiformisの培養は、酢酸ナトリウムを炭素源、硫酸アンモニウムを窒素源として用い、好気的条件下で行なった。本細菌より、まず、ヒドロキシアミン酸化酵素の精製を試みた。ヒドロキシアミン酸化酵素の活性は、チトクローム_cあるいはフェリシアン化カリウムを電子受容体として用い、生成した亜硝酸を呈色反応により定量することにより測定した。独立栄養硝化細菌より精製したヒドロキシアミン酸化酵素は、その分子中にCタイプのヘムとP460と呼ばれるヘムを有するヘム鉄蛋白質であることが報告されている。Arthrobacter globiformisより精製したヒドロキシアミン酸化酵素の吸収スペクトルを測定すると、ヘムにもとずく吸収は観測されなかった。このことから、Arthrobacter globiformis由来のヒドロキシアミン酸化酵素は、ヘム蛋白質ではないことが分かる。活性測定の際に、反応溶液中に二価の鉄イオンを添加すると活性の上昇が観測されたことから、本酵素は、非ヘム鉄を活性中心とする、非ヘム鉄蛋白質であると考えられる。
マウス骨格筋細胞の三次元認識メカニズムの解明

マウス骨格筋由来細胞C2C12を用いて、細胞がどのようにして2次元環境と3次元環境を認識して区別しているかについて、転写因子NFκBを足がかりに研究を行った。具体的には、C2C12細胞をコラーゲンゲル内で三次元培養を行い、NFκBを制御する物質の動態とインテグリン、細胞骨格の関係について解析を行った。さらにNFκBに関連した物質以外についても、DNAマイクロアレイを用いて検討した。NFκBの上流である、TNFa、TGFas、I1-1、I1-2、I1-6などの成長因子、サイトカインとそのレセプターの発現について、コラーゲンコートならびにコラーゲンゲル内の培養下での発現の違いにつき、免疫染色ならびにwestern blotting法を用いて検討した。コラーゲンと細胞を結び付けているものは各種インテグリンであり、さらに、これまでは未知ではあるが、インテグリンは細胞骨格は関係していて、三次元培養により細胞骨格が変化することが予想されるのでインテグリンと細胞骨格、特にアクチン繊維との経時的変化についてNFκBとの関係を、免疫染色を用いて検討した。さらに、これらの因.子がNFκBブロッキングペプチド添加でどのように変化するか調べたところ、ブロッキングペプチドで分化の抑制が認められた。DNAマイクロアレイで変化のあった物質につき、real timeRT PCRを用いて、定量的に検討し、2次元培養と3次元培養で様々な因子の違いが確認できた。マウス骨格筋由来細胞C2C12を用いて、細胞がどのようにして2次元環境と3次元環境を認識して区別しているかについて、C2C12細胞をコラーゲンゲル内で三次元培養を行い、NFκBを制御する物質の動態とインテグリン、細胞骨格の関係について解析を行った。NFκBファミリーとその関連物質(cRel, ReIA, Re1B, p52, p50, IκB, Bcl-3など)について、免疫染色を行い、核移行するかどうかで、コラーゲンゲル内三次元培養下での活性の有無を検討したところ、cRelの核移行が認められた。NFκBの活性をブロックするペプチド(SN50 cell permeable inhibitor peptide, CARBIOCHEM)とそのコントロールペプチドを添加して、コラーゲンゲル内のC2C12の分化が変化するか否か検討したところ、SN50によりC2C12の分化は抑制された。さらに、3次元培養下で発現が変化する物質につき、用いてDNAマイクロアレイで比較した。
植物遺伝子の糖による発現調節の分子遺伝学的研究

作物の生産性に炭素及び窒素などの栄養源の転流・蓄積の制御は大きく関わっている。そして、この制御に関わる遺伝子の多くは組織に供給される糖濃度によって発現調節を受けている。本研究では、この糖による遺伝子発現調節に関わる因子の同定を目指して、シロイヌナズナの変異株を得るシステムの構築をおこなった。サツマイモ塊根貯蔵タンパク質スポラミンの遺伝子は糖の濃度によって発現が変動する事が知られている。形質転換タバコを用いたこの遺伝子のプロモーター解析は、糖応答には2つのシス配列が必要であることが明らかにした。AG221はスポラミン遺伝子のプロモーターより糖応答に関与しない領域を除いて糖濃度に対する反応応答性を著しく改善したプロモーターである。今回はこのプロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子をシロイヌナズナに導入した。導入された遺伝子はシロイヌナズナでも、ショ糖・グルコースなどの容易に代謝される糖による処理を行った場合に24時間以内に濃度依存的に発現が活性化された。多数の形質転換体の中から一系統について種子を変異原(EMS)処理し、その後代についてスクリーニングを行った。これまでに4000ラインの種子についてスクリーニングを行い、0%および6%ショ糖いずれでも強いルシフェラーゼ活性が得られる変異株29株、6%ショ糖処理でルシフェラーゼ活性が全く見られないもの19株、6%ショ糖処理で誘導されるルシフェラーゼ活性が極弱い変異株25株を得ている。本年度は、糖レベルによる遺伝子の発現誘導に異常を生じた変異株をシロイヌナズナから単離するための準備を行った。糖レベルによる遺伝子の発現誘導の指標としては、シロイヌナズナのβアミラーゼを用いた。βアミラーゼ遺伝子の翻訳開始点から転写開始点上流-340bPの領域とルシフエラーゼ遺伝子をつなげた融合遺伝子(β-Amy:LUC)と同じプロモーター領域にGFP遺伝子をつなげた融合遺伝子(β-Amy:GFP)を作製を行い、それぞれin planta法を用いて20系統以上の形質転換体を作製した。形質転換植物のレポーター遺伝子の発現量の検定を行ったところ、GFP遺伝子をレポーター遺伝子として用いた場合は、植物体の蛍光観察で発現量を調べるには厳しい量しか発現していなかったので、GFPレポーターを用いた植物は解析から除外することにした。それに対し、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子にしたものについては、ルシフェラーゼが十分解析できる量発現誘導されていた。各形質転換体に導入された遺伝子の数を検討したところ、一系統の種子については染色体の一カ所のみに遺伝子が導入されていたので、今後この種子を基本株とすることにした。将来のスクリーニングに備え、どの器官に着目するとレポーター遺伝子産物の増減を検出しやすいか、また処理時間などの検討も行った。無糖もしくは3%ショ糖を含む培地で5日間暗条件下で生育した植物は、子葉でのレポーター遺伝子産物の発現量が著しく異なっている事が明らかになった。また以前より行われている切り取り葉を用いた糖処理の最適条件も再検討を行った。来年度は種子を変異源処理を行い、本格的な変異株の選抜に入る予定である。形質転換タバコを用いたこの遺伝子のプロモータ解析は、糖応答には2つのシス配列が必要であることが明らかにした。

導入された遺伝子はシロイヌナズナでも、ショ糖・グルコースなどの容易に代謝される糖による処理を行った場合に24時間以内に濃度依存的に発現が活性化された。多数の形質転換体の中から一系統について種子を変異原(EMS)処理し、その後代についてスクリーニングを行った。これまでに4000ラインの種子についてスクリーニングを行い、0%および6%ショ糖いずれでも強いルシフェラーゼ活性が得られる変異株29株、6%ショ糖処理でルシフェラーゼ活性が全く見られないもの19株、6%ショ糖処理で誘導されるルシフェラーゼ活性が極弱い変異株25株を得ている。
液体電極プラズマの発生過渡現象の解明と有機・無機分析への応用

液体電極プラズマの発光過渡現象とその有機・無機分析応用について研究を行い次の知見を得た。プラズマ中での元素の発光量には、界面濃縮が大きく関わっており、T字型の流路やプラズマ発光部の壁面に窪みを設けることで、感度アップが可能なことを明らかにした。また、交流電源を用いることで、感度はそのままに、流路へのダメージが従来のおよそ1/3000に減るプラズマを発生できた。またイオン交換樹脂を詰めたカラムの先に液体電極プラズマの検出器を組み合わせたチップの開発を行い、これを固相抽出濃縮に用いた例では、チップ外でカラム濃縮処理をしたときに比べ、検出限界が1/40に、必要サンプル量も1/40に向上できた。液体電極プラズマの発生過渡現象の解明と有機・無機分析への応用の為に、本年度は以下の研究を行った。得られた実績をまとめる。1)プラズマの過渡現象の解明プラズマの過渡現象の解明のために、分光的アプローチとシミュレーション的アプローチをとっている。分光的アプローチでは、まず電圧印加パルスの波形依存を調べる方針を立てた(沖野・高村)。放電の高出力化と安定性向上を目的として、実際に様々な波形およびの電圧を印加して放電の基礎実験を行ったところ、放電の生成条件などが明らかになり、また電源改良のための指針を得た。(沖野)2)プラズマの気液界面の制御プラズマの界面の動きを制御する方法として、(a)非対象流路と(b)圧力制御を試みた(高村・浮田)。非対称流路ではある程度の感度アップが見られたが、より積極的に界面を制御する方法として、T字型の流路を作成し、液体の逃げを抑え、ガスの圧力を逃がす工夫によって、界面の移動を制御することに成功した。この流路を用いて、元素分析を行ったところ、界面濃縮を示唆する発光の増強が観察され、理論的な解析結果とほぼ一致するデータを得た。現在、データをより詳しく解析中である。また、(c)界面の動きを制御する方法として、溶液中の元素の逃げの抑制が期待できる流路を新たに設計製作した。現在データを取得中である。(高村・浮田)3)モデリングH25年度から開始予定の、モデリングについて打ち合わせ行い、ターゲットモデルと対象とするプラズマ条件の選定を行った。(沖野・高村)液体電極プラズマの発光に大きく関わる界面の動きを制御し、本プラズマのさらなる解明と検出限界の向上、及び応用を進める。平成25年度は、次の項目について研究を行った。1.プラズマの過渡現象の解明と感度上昇:平成24年度の研究により、プラズマ中での元素発光には、界面濃縮が関わっていることがわかった。平成25年度は、「溶液中の元素の逃げを抑制」することで、この濃縮を効果的に起こし、これを検証する。具体的には、プラズマ発光部の壁面にくぼみ(行き止まりになっている副流路)を設け、パルス電圧でプラズマを発光させる。電圧印加前は、副流路も含め、流路は溶液で満たされている。電圧の印加により気泡ができプラズマが発生するが、この時副流路の中の溶液は副流路内に留まる。副流路は行き止まりになっているので、この溶液はプラズマと接し続け、連続的に揮発し、濃縮も進む。1回の電圧印加パルスで、副流路中の溶液が丁度蒸発するように副流路の長さを調整することで、溶液中の元素は、全てプラズマに直接接し、元素の種類に関係なく全てプラズマに入ってくることが期待できる(逃げの完全抑制)。これらの結果、様々な元素で2倍から5倍感度の上昇が確認でき、本メカニズムの重要性も確認され、過渡現象の解明と、感度上昇に大きく前進した。本年度はこの項目に集中したため、電圧2段階制御の研究は実施していない。2.モデリング:上記副流路中の蒸発に対して数値モデルをたてて、モデリングを行った。その結果は、副流路の実験結果と合致し、副流路のモデルの妥当性がある程度検証できた。3.バイオアッセイ系との組み合わせ:現在カラムとの一体化を検討している。このためには、少ない流量で感度良く発光させる必要がある。本年度は、マイクロポンプとカラムをプラズマ発光部と同じチップに集積化させることに成功した。これにより流量の大幅な削減にも成功した。本プラズマが感度に及ぼす因子を解明し、更なる高感度化と応用を図る。本年度得られた結果を以下にまとめる。1.プラズマの過渡現象の解明これまでの研究で、様々なプラズマパラメータと、その結果発光を左右するのは、プラズマ発生初期の過渡現象であり、それは気液界面の動きが支配していることが判ってきた。本研究では、これらを調べ、本プラズマのさらなる解明と検出限界の向上を図る。(1)気液界面の制御では、本年度は、これまでの副流路に加え、2.バイオアッセイ系との組み合わせに於ける界面制御を試みた。組合せには、三叉路やカラム等がぶら下がるので、界面の移動が異なってくる。適当な流路負荷を導入することで、界面の動きを制御し、感度/精度を向上させることに成功した。また、(2)電圧の印加方法の制御では、電圧の2段階印加より効果的と考えられる、分担者の沖野先生の開発した電源を用いて、ダイナミックな電圧制御を導入した。同時に、これまで用いていた、直流パルスではなく、交流も導入した。