hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸癌を「内と外から」制御する新規治療法の開発

Nrd1は、細胞外でADAMプロテアーゼを活性化し、核内でNCoR/SMRT複合体と協調してHDAC活性を制御する。本研究では、Nrd1が癌細胞の「内と外」で大腸癌を進展させるメカニズムを検討した。そのため、(1)Nrd1 KO、Nrd1 floxed KOマウスの腸腫瘍における上皮間質相互作用や、TNF-alpha、EGFファミリーを中心とするサイトカイン・増殖因子の活性化を包括的に解析した。(2)ヒト大腸癌細胞株とスフェロイド培養系を用いて、Nrd1、HDAC、p53の機能的関連を検討した。これらの検討により、新たな大腸癌治療シーズとしてのNrd1の可能性を示した。メタロプロテアーゼNardilysin (Nrd1)は、ADAMプロテアーゼの活性を介して、TNF-α、EGFファミリーを活性化する。さらにNrd1は、核内でNCoR/SMRT複合体と協調してHDAC活性、転写を直接制御する。本研究では、細胞の「内と外」で複数の因子を一括して制御するNrd1が大腸癌で果たす役割を、以下の様に検討した。1.癌微小環境でNrd1が活性化するサイトカイン・増殖因子ネットワークの解明:Nrd1 KOマウスではほとんど腫瘍が生じないため、本申請に先立って作出したNrd1トランスジェニックマウスを用い、AOM/DSS投与およびApcMinマウスとの交配により、マウス腸腫瘍におけるNrd1の有無による種々の蛋白のシェディングを解析した。その結果、Nrd1過剰発現により、TNF-αのシェディングはマウス腫瘍局所でも顕著に亢進していた。さらに、Nrd1 KOマウスで示された顕著な抗腫瘍効果の主体が上皮か間質かを決定するために、Nrd1 floxed KOマウスと、Villin-cre、LysM-cre等のcreマウスの交配を進めた。2.核内でのNrd1によるヒストン修飾を中心とする転写制御機構の解明:Nrd1はマウス腸腫瘍およびヒト大腸癌細胞の核内にも存在し、in situ PLA法でHDAC1および3などのクラスI HDACと共在することを確認した。ヒト大腸癌細胞株においても、Nrd1とクラスI HDACが共在することを、FLAG-Nrd1を用いた免疫沈降法で確認できた。また、種々のクラスIHDAC活性をヒト大腸癌細胞株を用いて検討したところ、Nrd1のノックダウンにより一部のクラスI HDAC活性が変動することを確認した。1.癌微小環境でNrd1が活性化するサイトカイン・増殖因子ネットワークの解明:Nrd1/ADAMの標的は、TNF-α以外の炎症性サイトカインやEGFファミリーなど多岐にわたる。本研究ではより広い視点から、サイトカイン・増殖因子の活性化、ネットワークを遺伝子、蛋白レベルで包括的に検討することを予定した。まずNrd1トランスジェニックマウスを用い、AOM/DSS投与およびApcMinマウスとの交配により、マウス腸腫瘍におけるNrd1の有無による種々の蛋白のシェディングを解析することができた。さらに、Nrd1 floxed KOマウスとVillin-cre、LysM-cre等のcreマウスとの交配は順調に進捗した。2.核内でのNrd1によるヒストン修飾を中心とする転写制御機構の解明:Nrd1はマウス腸腫瘍およびヒト大腸癌細胞の核内にも存在し、in situ PLA法でHDAC1および3などのクラスI HDACと共在していた。クラスI HDAC阻害剤は次世代の癌治療薬のひとつとして、すでに多くの臨床試験が行われているため、本研究ではNrd1がNCoR/SMRT複合体を介して、クラスI HDAC活性に及ぼす影響を検証した。その結果、ヒト大腸癌細胞株において、Nrd1とクラスI HDACの共在をFLAG-Nrd1を用いた免疫沈降法で確認し、ヒト大腸癌細胞株を用いたノックダウンによりクラスI HDAC活性の変動を示すことができた。以上より、当初の予定にしたがって、おおむね順調に研究は進展していると判断した。また、Nrd1は核内でNCoR/SMRT複合体と協調してHDAC活性、転写を直接制御する。そこで本研究では、癌細胞の「内と外」で複数の因子を一括して制御するNrd1が果たす役割を検討することとした。平成29年度には、(1)癌微小環境でNrd1が活性化するサイトカイン・増殖因子ネットワークの解明のため、マウス腸腫瘍の上皮と間質の細胞とをわけて、代表的なシグナル伝達系の活性化状態を検討した。すなわち、Nrd1トランスジェニックマウスに加えて、新たに作出したNrd1 floxed KOマウスとVillin-cre、LysM-cre等のcreマウスとの複合変異マウスを用いて、AOM/DSS投与による炎症性腸腫瘍形成を検討した。また、ApcMinマウスとの交配も行い、非炎症環境下での腸腫瘍形成に及ぼすNrd1の影響を解析した。(2)核内でのNrd1によるヒストン修飾を中心とする転写制御機構の解明のため、Nrd1トランスジェニックマウスの腸腫瘍、およびNrd1ノックダウンを行ったヒト大腸癌細胞株を用いて、HDAC阻害を組み合わせて、Nrd1下流の遺伝子発現の変動をRNAレベルで検討した。

さらにスフェロイド培養系でもNrd1の発現量とクラスI HDAC阻害がもたらす抗癌効果の相関を検討した。これらの研究を通じて、Nrd1を中心とした多岐にわたるサイトカイン・増殖因子ネットワークの活性化機構を明らかにし、ヒストン修飾を中心とするNrd1の核内転写制御機構も含めて、Nrd1が大腸癌進展をもたらすメカニズムを学術的に探究することができた。Nrd1は、細胞外でADAMプロテアーゼを活性化し、核内でNCoR/SMRT複合体と協調してHDAC活性を制御する。本研究では、Nrd1が癌細胞の「内と外」で大腸癌を進展させるメカニズムを検討した。そのため、(1)Nrd1 KO、Nrd1 floxed KOマウスの腸腫瘍における上皮間質相互作用や、TNF-alpha、EGFファミリーを中心とするサイトカイン・増殖因子の活性化を包括的に解析した。(2)ヒト大腸癌細胞株とスフェロイド培養系を用いて、Nrd1、HDAC、p53の機能的関連を検討した。これらの検討により、新たな大腸癌治療シーズとしてのNrd1の可能性を示した。1.癌微小環境でNrd1が活性化するサイトカイン・増殖因子ネットワークの解明:2016年度の解析に引き続き、サイトカイン・増殖因子のネットワークが大腸癌の進展に与える影響を検討するために、Nrd1トランスジェニックマウスに加えて、Nrd1 floxed KOマウスとVillin-cre、LysM-cre等のcreマウスとの複合変異マウスを用いて、AOM/DSS投与による炎症性腸腫瘍形成を検討する。また、ApcMinマウスとの交配も行い、非炎症環境下での腸腫瘍形成に及ぼすNrd1の影響を解析する。さらに、腸腫瘍局所におけるサイトカイン・増殖因子のネットワークを解析するため、網羅的発現解析を行い、Nrd1の有無による活性化シグナルの差異を明らかにする。2.核内でのNrd1によるヒストン修飾を中心とする転写制御機構の解明:Nrd1とクラスI HDACよって制御される核内転写の動態を解析する。Nrd1トランスジェニックマウスの腸腫瘍、およびNrd1ノックダウンを行ったヒト大腸癌細胞株を用いて、HDAC阻害を組み合わせて、Nrd1下流の遺伝子発現の変動を解析する。また、それにより明らかとなった因子のうち、とくに腫瘍進展に影響を及ぼす候補因子については、クロマチン免疫沈降によって、Nrd1のプロモーター領域への結合を確認する。今後は、Nrd1を中心とした多岐にわたるサイトカイン・増殖因子ネットワークの活性化機構を明らかにし、ヒストン修飾を中心とするNrd1の核内転写制御機構も含めて、Nrd1が大腸癌進展をもたらすメカニズムを学術的に探究する。それに加えて、Nrd1のもつ空間的、機能的多面性を明らかにし、ヒト大腸癌に対する個別化医療への展開も視野にいれ、新規の大腸癌治療法開発に直結するシーズとしてのNrd1の可能性を検証したい。消化器内科学
江戸時代天文儀器への海外からの影響

江戸時代の天文・測量儀器への海外からの影響について、国内および海外での調査研究を行ない、次の成果を得た。(1)古渡りのオクタント(八分儀)・セキスタント(六分儀)を全国調査した。新発見も含め国産品と輸入品10点を調査・計測し、両者の特性を比較した。(2)寛政期に輸入された謎の高性能天文象限儀について、その輸入経緯を記した書簡をオランダ商館文書の中に見つけた。(3)「第7回東洋天文学史国際会議」を主宰し、英文集録を出版した。1.本研究の目的は、"海外からの影響が強かった江戸時代の天文儀器"を、全国にわたって系統的に調査することである。平成22年度は、オクタント(八分儀)とセキスタント(六分儀)を、主に器物史料を中心に調査研究した。2.オクタント・セキスタントの調査成果過去に予備調査を実施した、オクタント・セキスタントに加えて、新出の矢掛町個人蒐集家(岡山県)所蔵品を調査した。これは岡山藩の測量方が幕末に実際に使用したオクタントで貴重である。また、今回の科研費調査で、下関の個人及び熊本市立博物館にも所蔵されることが判明した。3.天文学史国際会議の主催20年の歴史を持つ、東洋天文学史国際会議の第7回(ICOA-7)を、2010年9月6-10日に国立天文台(三鷹市)で主催した。海外参加者31名、国内参加者25名、発表論文数は65件の盛会だった。英文集録の編集と刊行準備を現在進めている。1.本研究の目的は、江戸時代の天文儀器の内、海外からの影響が強かった物を、全国にわたって系統的に調査することである。平成22年度に行なったオクタント(八分儀)とセキスタント(六分儀)の調査対象で一部再調査が必要な器物、平成22年度調査の過程で判明した、新たな所在を本年度は調査した。2.調査箇所は、熊本市立博物館、福山市誠之館高校、新潟県柏崎市図書館である。写真撮影と寸法の計測、聞き取り調査および関連史料の調査を実施した。3.平成22年度に主催した、第7回東洋天文学史国際会議(ICOA-7)の集録(英文)を編集し、出版した。4.伊能忠敬が四国筋測量で使用した天文測器忠敬が日本全国測量で使用した測器のうち、子午線儀は忠敬記念館にも現存しないが、その当時に製作された複製品が数年前発見された。これを調査し、広島県呉市に所蔵される現地の観測絵図記録と照合した。その結果、絵図に示された天文測量の場所と日時がほぼ明らかになった。その成果を日本科学史学会年会で発表した。平成24年度は本研究期間の最終年度であり、残された各所の調査を実施すると共に、3年間のまとめという意識で研究を行なった。1.調査研究:(1) 2012年6月、パリ天文台にて、江戸時代の日本天文学に大きな影響を与えた天文学者ラランデの調査を実施。(2) 2012年12月、米国議会図書館で、伊能忠敬の「地図大図」約10点と、関連和書を調査。米国スミソニアン国立歴史博物館で、同館所蔵の米国製のオクタント・セキスタント10数点を閲覧・調査。2.研究発表:(1) 2012年8月、韓国のイエチョンで、韓国科学文化協会主催の「第1回朝鮮王朝の科学・文化に関する国際会議」に招待され、招待講演「18ー19世紀の日本の星図と朝鮮からの影響」を行なった。(2) 2012年8月、北京の第28回国際天文学連合総会で、「日本に現存する1860年代以前の八分儀と六分儀」について発表。(3)2013年2月、国立科学博物館主催の黎明期日本天文学史研究会で、招待講演「オクタント・セキスタントの日本史200年」を行なった。3.残された今後の課題:(1)江戸時代初期に日本にもたらされた望遠鏡の一部は、中国南岸部で製作された可能性が高いことは、文献史料や僅かに残存する初期望遠鏡から知られている。国際天文学連合総会への出席を機会に、中国研究者と共同研究を実施する予定だったが、先方の都合と、史料調査及び閲覧に関する中国の制度上の問題があり、実現しなかった。今後の課題としたい。(2)寛政期に輸入された高度な天文観測装置「天文象限儀」の輸入経緯は大きな謎だった。在日オランダ人研究者の協力のもとに、出島の「オランダ商館長日記」と同館勘定帳の原本マイクロフィルムを調べた結果、若干の新たな情報が得られた。今後、関連史料を求めてさらに追及したい。

当初の研究項目の内、江戸時代に輸入された蘭製高級象限儀のオランダにおける現地調査は、先方の研究者が転出したため、実行できなかった。その他の項目はおおむね実施済みか、平成24年度に実施予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。・平成24年度は、未調査のオクタント・セキスタントの調査を完了し、最終的報告書を作成出版する。・中国地方の測量で使用された伊能忠敬の象限儀・子午線儀に関して、結果を論文にまとめ、日本科学史学会誌に投稿する予定。・平成24年8月に中国北京で開催される国際天文学連合(IAU)の天文学史分科会で、天文儀器についてのWGを主催し、オクタント・セキスタントの調査研究に関して発表する。
生物用高分解能2次元3次元複合音響インピーダンス顕微鏡の開発

高分子基板に接触した生体軟組織断面の特性音響インピーダンスを画像化し,非染色,非接触で定量観察できる超音波顕微鏡を提案した。ラットの脳腫瘍モデルを観察した結果をもとに,腫瘍部における音響物性のばらつきを画像化して,腫瘍をハイライトすることに成功した。培養したグリオーマ細胞に抗癌剤を投与し,細胞の形態変化を追尾した。さらに,細胞や腫瘍組織の3次元画像と,断面の音響インピーダンス画像を同時に取得することに成功した。平成21年度は、音響インピーダンス顕微鏡システムのハードウエアを構築した。生物用光学顕微鏡ステージを改造し、コンデンサレンズの代わりに振動子を取り付け、基板の背面側から結合媒体を介して基板表面に収束させた超音波を出射した。基板表面には生体組織が密着しており、界面での反射を同一の振動子で受波した。参照波と比較することにより、組織の局所特性音響インピーダンスを算出し、振動子を2次元走査することにより顕微画像を得た。サンプリング周波数8ギガサンプル/秒のA/Dコンバーターを計測用コンピュータに組み込み、計測制御ソフトウェアを自作して、機械走査部と連携したデータ取得を行った。取得した信号全てをA/Dコンバータ内のメモリに格納して一回で転送することにより、これまで観察速度を律速していたデータ転送の問題を解決し、1枚の画像が30秒程度で取得できるレベルの高速観察を実現した。中心周波数120MHzを有するものと、同300MHzを有するものを使用し、組織レベルから細胞レベルの観察を可能とした。超音波ビームの経路を勘案し、系のインパルス応答を計算し、基板を介した送受波にともなう収差の発生を予測した。この結果をもとに、2次元走査で得られる音響インピーダンス像の収差を補正した結果、より鮮明な画像が得られることが判った。実際にラットの小脳組織を観察し、その効果を確認した。細胞観察に関しては、ラット小脳由来のグリア細胞をフィルム上に培養し、音響インピーダンス像を取得した。細胞の内部構造、すなわち細胞骨格、核、細胞質などを観察できることが判った。平成22年度はソフトウェアによる高分解能化と音響インピーダンス測定の高精度化を行った。音響インピーダンス顕微鏡では、平面波ではなく集束させたビームを使用する。そのため異なる角度で入射した音波は、基板表面で屈折し、入射角によって異なる透過率と反射率で振動子に戻るとともに、角度によって中心軸から外れたところで焦点を結ぶ。さらに、反射面への往復時間も入射角によって異なる。高分解能化にあたって集束角を大きくとると、見かけの反射係数の角度依存性および、平面・時間方向の収差が無視できなくなる。この収差を補正できれば、空間分解能をさらに向上させることが可能となる。そこで、系の3次元インパルス応答、すなわち、振動子の各点から同時に発せられた音波が振動子に戻るときの時間遅れ分布と反射面の音場分布を計算した。実際にビーム走査で得られたデータと、系のインパルス応答の計算結果をもとに、3次元逆畳み込み処理を行い、音響インピーダンス画像を高精細化するアルゴリズムを作成した。実際に脳組織の形態と音響インピーダンス分布を測定観察するとともに、高精細化の効果を評価した。併せて、細胞骨格の状態を変化させる種々の薬品を投与し、音響インピーダンス分布の経時変化をトレースすることに成功した。平成23年度は、ラットの脳腫瘍モデルを観察した。腫瘍部の音響インピーダンスは、平均値で見ると正常部に比較して大きな差がみられなかったが、画像で見ると正常部に比較して荒れていることが判った。そこで、この画像の荒れを数値化するため、音響インピーダンスの局所粗さを表す局所標準偏差を計算することとした。画像の自己相関関数から特性相関距離を求め、これより広い範囲の標準偏差を計算することとした。空間分解能をよくするためにはできるだけ狭い範囲の標準偏葦を計算する必要がある。これらを勘案し、140ミクロン角の正方形を計算範囲とした。音響インピーダンスの局所標準偏差で画像を再表示した結果、腫瘍部分をハイライトすることができた。再現性を確認するため、合計5個体について同様の実験を行ったところ、いずれも良好な結果が得られた。また、Bモード、Cモード複合表示を行うことにより、断面の奥に腫瘍がどの程度拡がっているのかを測定するため、3次元観察を行った。細胞観察については、300MHz程度の中心周波数をもつ超音波信号によりラットのグリオーマ細胞を観察した。細胞核および細胞骨格が音響インピーダンス像で明瞭に観察できた。この状態で薬物(抗癌剤)を投与すると、正常細胞に対する副作用により細胞骨格が消失していくことが観察された。細胞が生きた状態で連続観察できる手法としてすぐれたものであることが実証された。次年度以降、グリア(正常細胞)とグリオーマ(腫瘍細胞)細胞をに対する、抗癌剤の効果を比較する。また、細胞の音響インピーダンス分布測定に加えて、細胞の3次元形状を観察する機能を追加した。
三次元粒状体の微視的構造と巨視的挙動の精密計測および解析手法の開発

砂礫などの粒状体を材料として扱う工学分野では、その材料の巨視的な性質に関する実験結果に基づく理論や経験則を背景に変形解析が行われている。しかしながら粒状体の巨視的性質は、個々の構成単位である個別の粒子が持つ基本性質(一次情報)に加えて、これらが積みあがって構成される粒子骨格(fabric)に大きく依存し、これを的確に把握しなければ現行の解析法が直面している諸問題(ひずみの局所化、力学的ラチェット現象など)の解決は難しい。本研究では研究代表者らが開発した三次元粒状体内部の可視化手法(レーザー援用トモグラフィー:LAT)を粒状体の標準的試験の一つである平面ひずみ試験装置などに応用し、供試体内部の三次元的な粒子運動や形態という従来手法では得ることのできない情報を、粒子集合体としての巨視的性質の精密計測と関連付ける手段を提供する。本年度は昨年度に構築したLAT/平面ひずみ試験システムを用いて、引き続き供試体の光学的切断面を多数撮影し、三次元粒状体内部のあらゆる粒子の3次元画像画像から、これがせん断変形する場合の粒子パラメータを統計的に処理して、全体変形に与える粒子ミクロ構造の影響を検討した。さらにこうした構成関係を新たに開発した大変形解析プログラム(Lagrangian Particle Finite Difference Method:LPFDM)に反映させ粒状体構造の大変形解析を進めた。本年度は粉砕したガラス粒子をボールミルで攪拌し、その加工時間を増すことで自然粒子の粒形に近づくことを確認し、実験材料とした。そしてメンブレンや脱気の工夫を様々にこらし、最終的に平面ひずみ装置の試作品を完成させ、供試体の光学的切断面を多数撮影することに成功した。そして撮影された画像解析プログラムを作成し、これによって半自動ではあるものの三次元粒状体内部のあらゆる粒子の3次元画像の作成などが可能になった。これらの成果をとりまとめたものを査読論文として投稿することを準備中である。
難治性真菌感染症に対する新規タンパク質医薬のデザイン及び病原因子の解析

昨年度の研究において、C. albicansの病原性プロテアーゼであるSapをターゲットとして、C. albicansを特異的に攻撃可能なデザインペプチドの設計が完了していた。本年度では、病原性プロテアーゼによって特異的に切断されるリンカー配列に蛍光基と消光基を結合させることで、カンジダ症診断薬のプロトタイプを作成した。この消光ペプチドを、クエン酸バッファー中でSapと混ぜ合わせたところ、20分ほどで強い蛍光が観察され、短時間でカンジダ症を診断できる可能性を示唆した。また、実際の臨床の条件を模するために、模擬唾液サリベートを用いて実験を行ったところ、その場合でも強い蛍光が短時間で見られることがわかった。C. albicansが血中に侵入すると、致死率が非常に高い全身性カンジダ症を発症するが、その機構はよくわかっていない。そこで、未知病原性因子を網羅的に決定するために、プロテオーム解析を行った。具体的には、C. albicansをfetal bovine serum中で培養し、その条件において特異的に発現が上昇するタンパク質群をLC-MS/MSによって決定したところ、数十個の因子が見つかった。その中でも、我々がBlplと名付けたタンパク質は12倍もの発現上昇率を示したため、Saccharomyces cerevisiaeの異種発現系を用いて、その機能を調べた。その結果、Blplは各種ストレス耐性に関わる因子であり、熱耐性・抗生物質耐性・塩濃度耐性などを上昇させた。C.albicansの病原性因子として、分泌型酸性プロテアーゼが有名であるが、その性質はまだあまり知られていなかった。Pichia pastorisを用いた異種発現を試みたところ、世界で初めて全種類のSapの機能的な発現・精製に成功した。病原性プロテアーゼの基質特異性の解析のため、475種類の蛍光消光性ペブチドライブラリー用いたところ、P1部位においてはLys、Arg、Leuのようなアミノ酸を好んだ。また、GVIRAFPK配列が多くのSapに共通して切断されやすいことが判明した。新規抗真菌薬のデザインのため、抗菌ペプチドとその活性を制御する抑制ペプチドをGVIRAFPKで接続したペプチドを設計したところ、Sap依存的に抗真菌活性を持つことがわかった。この薬剤は既存薬剤の重い副作用・耐性菌の出現といった問題点を解決可能であり、抗真菌薬の開発に大きな一石を投じると考えられる。病原性接着因子ALS genefamilyのクローニング:上記のSapと共に、C.albicansのALS gene familyは主要な病原性因子として知られているが、どのような物質を認識するのかは未だわかっていない。C.albicans genomeからALS遺伝子のクローニングを試みたところ、全ての遺伝子の単離に成功した。この遺伝子をSaccharomyces cerevisiaeで異種発現させたところ、全てのAlsタンパク質が正常に生産されていることを確認できた。Alsのプラスチック結合性の解析:様々な無機物質とAls提示酵母を相互作用させた結果、ポリスチレンやポリプロピレン、ホウケイ酸ガラスなどに強い接着能力を示すことが判明した。一方、ポリウレタンに対してはAls1Als9の全てで接着能力を示さなかった。1.Sap7がpepstatinA非感受性であることの証明昨年度の研究において、我々はCanduda albicansの病原性因子である分泌型酸性プロテアーゼ(Sap)に注目した。C. albicansのSap1-10を全種類精製し、その基質特異性を決定する過程で、Sap7がpepstatinA非感受性であることを偶然発見した。Pepstatin Aはほぼ全てのアスパラギン酸プロテアーゼに効果的な阻害剤であり、カンジダ症の研究において、Sap familyの病原性を調べるためによく使われている。しかしながら、そのpepstatin Aが効かないSapが存在するということは、今までの研究に対して問題を提示することになる。なぜSap7がpepstatin Aに非感受性であるかを調べるために、Sap7の生化学的な性質を網羅的に調べた。その結果、Sap7の活性中心付近のアミノ酸をアラニンに置換したある変異体において、活性は完全に保持しているが、pepstatin Aに対して強い感受性を示すものを取得した。この結果から、Sap7の活性中心付近の構造が、pepstatin Aの接近を阻むモデルを提唱することができる。今後、Sap7を含む全てのSapに有効な阻害剤を設計できれば、新しいカンジダ症治療薬になりうるだろう。C. albicansを特異的に攻撃し、副作用が少なく、他の常在菌叢に影響を与えない新しい薬剤の設計を目指した。その薬剤の基本設計は、抗菌ペプチドとその活性を抑制する抑制ペプチドを、Sapによって特異的に切断されるリンカーで接続したものである。このデザインによって、通常時は活性を抑制されているが、Sapの活性を検知することで初めて活性化されるデザインが可能である。このデザインペプチドの性質を、まずC. albicansの近縁種であるがSapを持たないSaccharomyces cerevisiaeに対して調べた。その結果、生理的なpHにおいてはデザインペプチドが活性を持たないこと、しかし、Sapを用いることで抗菌活性が戻ることをしめすことができた。実際にC. albicansに特異的かどうかを調べるために、このデザインペプチドをC. albicans及びS. cerevisiaeと混ぜ合わせてしばらく培養したところ、C. albicansの生存率のみを大きく下げることに成功した。

これらの結果から、病原性因子の存在を検知して、病原性真菌だけを殺菌する新しいデザイン戦略に基づく医薬を開発することができたと考えられる。今後は、より特異性の高いペプチドリンカーを取得していく予定である。昨年度の研究において、C. albicansの病原性プロテアーゼであるSapをターゲットとして、C. albicansを特異的に攻撃可能なデザインペプチドの設計が完了していた。本年度では、病原性プロテアーゼによって特異的に切断されるリンカー配列に蛍光基と消光基を結合させることで、カンジダ症診断薬のプロトタイプを作成した。この消光ペプチドを、クエン酸バッファー中でSapと混ぜ合わせたところ、20分ほどで強い蛍光が観察され、短時間でカンジダ症を診断できる可能性を示唆した。また、実際の臨床の条件を模するために、模擬唾液サリベートを用いて実験を行ったところ、その場合でも強い蛍光が短時間で見られることがわかった。C. albicansが血中に侵入すると、致死率が非常に高い全身性カンジダ症を発症するが、その機構はよくわかっていない。そこで、未知病原性因子を網羅的に決定するために、プロテオーム解析を行った。具体的には、C. albicansをfetal bovine serum中で培養し、その条件において特異的に発現が上昇するタンパク質群をLC-MS/MSによって決定したところ、数十個の因子が見つかった。その中でも、我々がBlplと名付けたタンパク質は12倍もの発現上昇率を示したため、Saccharomyces cerevisiaeの異種発現系を用いて、その機能を調べた。その結果、Blplは各種ストレス耐性に関わる因子であり、熱耐性・抗生物質耐性・塩濃度耐性などを上昇させた。当初申請においては、デザインペプチドの最適化とその活性測定を予定していた。本年度は、その結果のみではなく新たにSap7がpepstatin A非感受性であること、そしてその悲感受性の原因を特定することにも成功している。そのため、当初予定以上に進展したと言える。今後は当初の予定通り、本年度に同定したペプチドリンカーをベースに、C.albicansの挙動を調べることができるイメージングツールを開発する予定である。
深層ガウス過程に基づく統計的音声合成

ヒューマン・マシン・コミュニケーションにおいて重要な機能である音声合成において,深層モデルを用いた機械学習は不可欠なものとなっている.しかし,広く用いられる深層ニューラルネットワーク(DNN)は,未知のデータに対する頑健性を保証しないという問題点がある.そこで本研究課題では,未知のデータに頑健なモデルとして提案されている深層ガウス過程に注目し検討を行う.具体的には,統計モデルに基づく音声合成において,DNNに替わるモデルとして深層ガウス過程に基づくモデルを提案し,応用研究の十分でない深層ガウス過程モデルに対し,音声合成への応用を通じて,学習データに頑健な学習法や時系列を考慮したモデル構造を検討する.ヒューマン・マシン・コミュニケーションにおいて重要な機能である音声合成において,深層モデルを用いた機械学習は不可欠なものとなっている.しかし,広く用いられる深層ニューラルネットワーク(DNN)は,未知のデータに対する頑健性を保証しないという問題点がある.そこで本研究課題では,未知のデータに頑健なモデルとして提案されている深層ガウス過程に注目し検討を行う.具体的には,統計モデルに基づく音声合成において,DNNに替わるモデルとして深層ガウス過程に基づくモデルを提案し,応用研究の十分でない深層ガウス過程モデルに対し,音声合成への応用を通じて,学習データに頑健な学習法や時系列を考慮したモデル構造を検討する.
アジア型MSを惹起するインターロイキン17産生性T細胞分化の研究

多発性硬化症(MS)は、T細胞が介在する自己免疫性脱髄性疾患であると考えられている。マウス動物実験において,インターロイキン(IL-)17産生性T細胞(Th17細胞)が高い病原性を有することが近年確立されつつある。また、視神経脊髄型(アジア型)MSで、髄液中のIL-17濃度上昇が報告され,MSにおいても、同様の可能性が示唆されている。本研究の目的は,ヒトTh17細胞の分化と機能制御機構の解明とMS病態における役割の解明である。T細胞が病巣へ浸潤するには、ケモカインによる病巣への誘導が必須である。Th17細胞のケモカイン反応性は不明であったが,我々はCD4陽性メモリーT細胞分画のケモカインレセプターCCR2陽性CCR5陰性細胞が、大量のIL-17を産生する一方,IFN-γは殆ど産生せず、この分画がヒトTh17細胞であると報告した(J.Immunol.2007)。我々と同時期に他の研究グループからCCR4陽性CCR6陽性細胞がTh17細胞であると発表された(Nat.Immunol.2007)。我々は,6-color-flow cytometryにより、2つの分画のフェノタイプおよび機能解析を行った。その結果,この2つの分画は,互いにオーバーラップの無い,異なる分画であるが,IL-17産生能については,同等であることが判明した。以上より,これら2つのTh17細胞分画は,異なる炎症の場に動員され,それぞれ独特の役割を果たしていると考えられる。この結果は,MSのTh17細胞の病巣への浸潤機構の解明のみならず、ヒトTh17細胞の分子生物学的解析にも貢献するものと考えられる。多発性硬化症(MS)は、自己免疫性脱髄性疾患である。動物実験においては,病原性T細胞としてのインターロイキン(IL-)17産生性T細胞(Th17細胞)、が近年確立されつつある。本研究において,我々はヒトTh17細胞分化機構の解析を行っている。ヒトTh17細胞の機能,分子生物学的解析にあたって,長期培養細胞ではなく,ヒト末梢血からTh17細胞が分離可能となれば,生体内での機能を反映するデータを得ることが出来,非常に有用であると考えられる。そこで我々は,末梢血中のTh17細胞分離を試みた。活性化T細胞は,サイトカイン産生能の獲得と同時に、特異的なケモカインレセプター発現を獲得することが知られている。Th17細胞のケモカイン反応性は不明であったが,我々は,IL-17産生細胞とケモカインレセプター発現細胞の関係を解析し,CD4陽性メモリーT細胞分画のケモカインレセプターCCR2陽性CCR5陰性細胞が、大量のIL-17を産生する一方,IFN-γは殆ど産生しないことを見出した(J. Immunol. in press)。更にこの分画は,Th17細胞にとって最も重要なサイトカインであるIL-23に対するレセプター発現率が、CD4陽性T細胞中最も高い一群であることが判明した。以上の様な特徴から,この分画はヒトTh17細胞であると考えられる。この結果は,Th17細胞の病巣への浸潤機構の解明のみならず、ヒトTh17細胞の分子生物学的解析にも貢献するものと考えられる。
自己充てん性ランク1の高流動コンクリートのポンプ圧送性能の評価・改善方法の研究

本研究課題では,自己充てん性ランク1の高流動コンクリートのポンプ圧送性能を確保するための改善方法を明確にすることである。平成15年度は,脈動に耐えうる分離抵抗性を含む管内閉塞に対する安全性を総合的に事前評価できる試験方法を確立することを目的として,スランプを18cm程度の普通コンクリートおよびフライアッシュを30%細骨材代替したランク1の高流動コンクリートを用いて,順調圧送から閉塞までの圧送状況を再現できる水平換算距離59.5m程度の小規模な循環圧送試験を行った。平成16年度は,脈動による分離抵抗性を含んだ試験方法の確立を目的として,変形性試験に用いる小型ポンプ圧送試験装置に脈動発生装置を付加し,脈動を発生させたコンクリートの室内流動実験を行った。実験に供したコンクリートは,平成15年度で実施した現場圧送実験で製造したコンクリートと同材料,同配合の普通コンクリートおよびランク1の高流動コンクリートである。脈動を発生させた変形性試験のテーパ管吐出位置の管内圧力損失と著者らが行った実機ポンプによる現場圧送実験結果^<3)>の水平管の管内圧力損失の比に冠する相似性を検討した。その結果,1)高粘性コンクリートの水平管1mあたりの圧力損失は,普通コンクリートの約2倍である。2)管壁を流動するコンクリートの骨材粒子と管壁が衝突する際に発生する振動にはコンクリートのコンシステンシーに起因する卓越周波数が存在し,卓越周波数が普通コンクリートと高粘性コンクリートで異なる。3)小型ポンプ圧送装置のピストンの可動と停止を制御することで,実際のポンプ圧送のような脈動波を再現させることができる。4)実際のポンプ圧送と本変形試験の管内圧力損失に関する相似性は,普通コンクリートに対しては問題がないが,粘性の高いコンクリートに対しては変形性試験の結果が危険側の評価を与える可能性がある。以上の実験的検討から,変形性評価試験装置に脈動発生装置を組み合わせて,高流動コンクリートのポンプ圧送性能として特に重要な脈動に対する材料分離抵抗性を評価する試験方法として「フレッシュコンクリートの脈動を発生させた変形性評価試験方法(案)」を提案することができた。平成15年度は,脈動に耐えうる分離抵抗性を含む管内閉塞に対する安全性を総合的に事前評価できる試験方法を確立することを目的として,順調圧送から閉塞までの圧送状況を再現できる水平換算距離59.5m程度の小規模な循環圧送試験を行った。生コンプラントで製造した練上り直後のスランプを18cm程度の普通コンクリートおよびフライアッシュを30%細骨材代替した自己充填性に近い粘性の高粘性コンクリートを用いて,実機コンクリートポンプ車の周囲に直管24.5m,テーパ管1本およびベント管2本,フレキシブルホース8mからなる水平配管系を循環させる圧送試験を行い,管内圧力の乱れ特性や水平管の圧力損失について検討した。なお,本年度は,自己充てん性コンクリートではなく,スランプ18cm程度の高粘性コンクリートを対象とした。直管,ベント管およびテーパ管の前後の管内圧力差に関する乱れ特性を統計的指標により評価し,水平管の圧力損失を求めた。また,管壁に取り付けた加速度センサーによって音響情報を取り出し,圧送中の骨材の衝撃や回転によって生ずる微小な周波数成分をFFT解析した。

その結果,2種類のコンクリートともに,ポンプ圧送を続けると,スランプと空気量が低下しコンクリート温度が上昇するが,その上昇率は高粘性コンクリートの方が大きい。循環式配管系で圧送されるコンクリートは,脈動の影響により負の圧力損失が生じるような大きい圧力の変動を受ける。高粘性コンクリートの水平管1mあたりの圧力損失は,普通コンクリートの約2倍であることが明らかになった。また,管壁を流動するコンクリートの骨材粒子と管壁が衝突する際に発生する振動にはコンクリートのコンシステンシーに起因する卓越周波数が存在し,卓越周波数が普通コンクリートと高粘性コンクリートで異なることが明らかになった。本研究課題では,自己充てん性ランク1の高流動コンクリートのポンプ圧送性能を確保するための改善方法を明確にすることである。平成16年度は,脈動による分離抵抗性を含んだ試験方法の確立を目的として,変形性試験に用いる小型ポンプ圧送試験装置に脈動発生装置を付加し,脈動を発生させたコンクリートの室内流動実験を行った。実験に供したコンクリートは,平成15年度で実施した現場圧送実験で製造したコンクリートと同材料,同配合の普通コンクリートおよびランク1の高流動コンクリートである。脈動を発生させた変形性試験のテーパ管吐出位置の管内圧力損失と著者らが行った実機ポンプによる現場圧送実験結果^<3)>の水平管の管内圧力損失の比に関する相似性を検討した。その結果,1)高粘性コンクリートの水平管1mあたりの圧力損失は,普通コンクリートの約2倍である。2)管壁を流動するコンクリートの骨材粒子と管壁が衝突する際に発生する振動にはコンクリートのコンシステンシーに起因する卓越周波数が存在し,卓越周波数が普通コンクリートと高粘性コンクリートで異なる。3)小型ポンプ圧送装置のピストンの可動と停止を制御することで,実際のポンプ圧送のような脈動波を再現させることができる。4)実際のポンプ圧送と本変形性試験の管内圧力損失に関する相似性は,普通コンクリートに対しては問題がないが,粘性の高いコンクリートに対しては変形性試験の結果が危険側の評価を与える可能性がある。以上の実験的検討から,変形性評価試験装置に脈動発生装置を組み合わせて,高流動コンクリートのポンプ圧送性能として特に重要な脈動に対する材料分離抵抗性を評価する試験方法として「フレッシュコンクリートの脈動を発生させた変形性評価試験方法(案)」を提案することができた。
緑内障患者の両眼視機能に関する検討

目的:緑内障患者と視野に変化が生じていない緑内障疑い患者の立体視とQOLを調査し、緑内障患者と緑内障疑い患者で立体視が低下しているかどうかを確かめ、緑内障性視野障害の程度と立体視低下とQOLの低下との相互関連について明らかにする。対象:当院眼科外来に通院する76歳未満の緑内障患者44名、緑内障疑い患者9名、正常対象者14名。矯正視力(0.7)未満、視力の左右差が2段階以上ある者、無水晶体眼及び斜視、眼底疾患の既往、4か月以内に眼科手術既往のある者は予め除外した。方法:一般的な眼科検査に加え、立体視及び視野検査、QOLの評価を行った。立体視はFrisby stereotest、Titmus stereotestsを用いた。視野測定はHumphrey視野計を使用し、結果の平均偏差(MD値)を用いて検討した。QOL評価には、Glaucoma Quality of Life-15(以下GQL45)を日本語訳したものを用いた。結果:Frisby stereotestの結果は、コントロール群と比較して有意に緑内障群の立体視が低下していたが、その他の群間では有意差はなかった。Titmus stereotestsの結果も同様であった。視野障害の程度と立体視には、MD値と立体視の値に有意な相関をみとめ、MD値とGQL-15スコアの間にも有意な相関があった。しかし、立体視とGQL-15スコアには相関はなかった。考按:視野障害の進行に伴う立体視低下は確認できたが、緑内障疑い患者の立体視低下は確認できなかった。視野障害に伴う立体視の低下は、Titmus stereotestsを使用しても、Frisby stereotestと同様に証明することができた。またGQL-15は、緑内障性視野障害の進行に伴うQOL低下を評価できる可能性が示唆された。しかし、立体視低下に伴うQOL低下の確認はできなかった。
ヒト卵子老化の原因因子群における種特異的発現変化の解明と人為的卵子改良への応用

母体加齢によるヒトの高流産率(9割)の主因は、卵子の成熟不良や加齢変性に伴う染色体分離異常の急増(20%→50%以上)である。この現象はヒトに特有であり、齧歯類などの短命な実験動物での解析が不可能なためメカニズムが未解明で克服も厳しい現状である。一方、申請者は薬剤処理したヒト成熟不良卵子を利用して初めて人為的な卵子老化抑制に成功し、この現象にオーロラ蛋白とコーヒシンの発現変化が関連する可能性を見出した。ヒト卵子老化メカニズムが解明され、臨床応用されれば不妊治療の成績が大きく向上する可能性がある。本申請では、ヒト卵子老化メカニズムにおけるオーロラ蛋白及びコーヒシン蛋白の働きに焦点をあてる。平成30年度は、オーロラ蛋白およびコーヒシン蛋白の発現変化を蛋白レベルで明らかにすることにあった。そこで、老化モデル卵子の核にリコンビナントのリン酸化オーロラ蛋白を注入した場合の遺伝子発現の変動をマイクロアレイで調査し、これを薬剤処理によりオーロラ蛋白が上昇して老化がキャンセルされた卵子の遺伝子発現の変動と比較して卵子老化へのオーロラ蛋白の関与を検討した。その結果、オーロラ蛋白の注入に伴ってオーロラ遺伝子の発現が有意に低下することが認められた。一般にオーロラ蛋白の発現は転写後調節によると考えられているが、蛋白発現により遺伝子発現に負のフィードバックがかかる可能性が考えられた。一方で、コーヒシン蛋白等の老化関連因子の発現変動はオーロラ蛋白注入および薬剤処理した卵子で共通しており、オーロラ蛋白が卵子老化に重要な関わりをもつことが示唆された。平成30年度は、オーロラ蛋白およびコーヒシン蛋白の発現変化を蛋白レベルで明らかにすることにあったが、本研究3年間の中心課題である、ヒト卵子老化においてオーロラ蛋白が鍵となることが確認された。この点は来年度位後のテーマも含んでおり、今年度の目標の一部であった継時的な蛋白発現変化の確認は完了していないが、概ね順調に進んでいる。当初の計画通りにオーロラ蛋白およびコーヒシン蛋白の発現変化を蛋白レベルで次年度にかけて進めていく。本年度から来年度にかけてオーロラ蛋白およびコーヒシン蛋白の発現変化を蛋白レベルで継時的に明らかにすることにあった。この際に使用する抗体の補充分の納品が遅れているために未使用額が生じた。この分は来年度での購入の予定である。
脳磁図による選択的末梢神経刺激時の脳内反応評価-先天性無痛無汗症での評価-

先天性無痛無汗症患者に対して、選択的な末梢神経の刺激時の中枢神経系における感覚認識機構に関して調査を行った。選択的な末梢神経の刺激装置としては、(1)手首正中神経の電気刺激、(2)手指への触角刺激、(3)手指へのCO2レーザーによる刺激、の三種類を用いた。(1)手首正中神経の電気刺激では、(刺激後からの脳磁場応答までの時間、(2)波形強度、(3)磁場発生源(皮質活動)部位)座標、(4)皮質活動強度、のいずれにも健常人との有意な差は見られなかった。(2)手指への触角刺激でも、上記の(1)から(4)の各項目に健常人との有意な差は見られなかった。(3)手指へのCO2レーザーによる刺激での皮質応答は、健常人と比較して、(1)両者とも1-4Mの磁場成分をふくむ皮質応答が記録された、(2)両者間で潜時に差はない、(3)磁場振幅は患者群でレーザー出力依存的に優位に小さかった。以上より、本症患者では、触圧覚をコードする末梢/中枢神経系には障害がないこと、CO2レーザーによる刺激、すなわちAδ/C線維の刺激によって皮質活動が見られること、の二点が明らかとなった。これは本疾患で痛覚を欠損していることと矛盾するが、この理由としては(1)皮質ニューロンの機能異常、(2)皮質情報投影部位の異常が考案された。今年度は先天性無痛無汗症患者に対して、選択的な末梢神経の刺激時の中枢神経系における感覚認識機構に関して調査を行った。(1)手首正中神経の電気刺激では、(1)刺激後からの脳磁場応答までの時間、(2)波形強度、(3)磁場発生源(皮質活動部位)座標、(4)皮質活動強度、のいずれにも健常人との有意な差は見られなかった。これは本疾患で痛覚を欠損していることと矛盾するが、この理由としては(1)皮質ニューロンの機能異常、(2)皮質情報投影部位の異常が考えられ、現在、他方向からの検討中である。遺伝性感覚性自律神経ニューロパチーの第IV型である先天性無痛無汗症(Congenital Insensitivity to Pain and Anhidrosis;以下CIPA)患者を対象に、感覚(落痛を含む)刺激時の脳における認識機構を、機能的脳画像診断法を用いて調査した。機能的脳画像診断法のうち申請者らは、時間的解析能および空間的解析能の有利さを考慮し、脳磁図検査をCIPA患者に適応した。その結果、CIPA患者では、電気刺激を用いた体性感覚検査では刺激に対する磁場応答として潜時で約20ms、40ms、70msの3つのピーク波が共通して認められ、潜時20msでの体性感覚誘発脳磁場(SEF)から推測されるEquivalent Current Dipoles(ECDs)は全例で刺激房対側の一次体性感覚野(SI)に観察され、対象群と同一であることが確認された。

さらに、触圧覚刺激装置を用いた末梢Aβ-線維の選択約刺激、およびCO2レーザによる末梢C-線維の選択的刺激においても体性感覚検査と同様に、対象群とCIPA患者の間に明らかな差異は認められず、胎生期における神経成長因子(NGF)の欠乏によって引き起こされる末梢Aδ-、C-線維の欠落が主病因であり、なかでも末梢C-線維の欠落が大きな病因とこれまで説明されてきたCIPAの病態が、必ずしも正しくはないことが示唆された。すなわち、CIPA患者は末梢において痛覚刺激あるいは侵害刺激を末梢受容器で受容し、その活動が大脳、特に島皮質レベルまで上行しているが、そこで痛覚刺激、あるいは侵害刺激を感じていない可能性が今回の研究によって示唆された。
副腎皮質細胞糸粒体内核酸蛋白合成の加齢による変動に関する電子顕微鏡的研究

内分泌器官の副腎において観察される副腎皮質細胞に多数観察される糸粒体のDNA合成、RNA合成、蛋白合成と実験動物各個体の加齢との関係を明らかにすることを目的にして、実験動物にはddY系マウスを用い、胎生期19日から出生直後の生後1日、3日、7日、14日の新生期マウス、生後1ケ月、2ケ月の成体、生後6ケ月、12ケ月、24ケ月の老化マウスまで、それぞれの各群同腹、雌雄両性3匹ずつについて、DNA、RNA、蛋白質の前駆物質にRI標識した放射性化合物(3H-thymidine、3H-uridine、3H-leucine)を腹腔内注射し、1時間後に副腎組織を取り出し、化学固定、脱水、樹脂法埋、超薄切して、ラジオオートグラフ乳剤をかぶせて、露出、現像し、完成したラジオオートグラフを超高圧電子顕微鏡(400kV)で観察し、RI標識前駆物質により出現する現像銀粒子の細胞内局在、特に糸粒体の取り込みを示す銀粒子を計数して、各群の標識率を算出し、実験動物各群間を比較して、胎生期から新生期、さらに加齢と老化によるこれらの巨大分子合成の変動を解析した。その結果、平成20年3月末現在までに得られた成果は胎生期から生後1日、3日、7日、14日の新生期マウス、成体1、2、6ケ月までの、副腎皮質細胞糸粒体の加齢に伴うDNA合成の変動が明らかにされた。その概要は、副腎皮質球状帶、束状帯、綱状帯各帯の細胞における糸粒体の1細胞断面積当たり平均糸粒体数は胎生期に15から生後1日で25、14日で38、1ケ月から2ケ月までに60となり、漸増したが、DNA合成を示す平均標識糸粒体数は細胞あたり胎生期の0.5から生後1日で1.5、14日で1.8、2ケ月で5.0、6ケ月で2.5となり、一旦増加して2ケ月で最高となった後、6ケ月で減少した。これらの成績から計算した標識率は胎生期2.5%から漸増して生後2ケ月で8%と最高に達した後、6ケ月で4%に低下した。これらの数値は副腎皮質各層の間に有意差はなく、加齢により同様に変動することが明らかとなった。
Disease Oriented Screening法による疾患別有効薬剤の選択

1.研究目的婦人科領域の悪性腫瘍である子宮体癌と卵巣漿液性脳嚢胞腺癌の抗癌剤感受性を、これらの腫瘍のヒト由来細胞株を用いて検査し、これらの腫瘍に特異的に有効な化学療法regimenの開発をめざした。2.方法3.結果子宮体癌は分化型と低分化型で薬剤感受性が異なっており、低分化型の方が薬剤感受性が高かった。有効性が認められた薬剤はADM、THP-ADM、ACR、Act-D、NCS、VLB、CDDP、254-S、ETPであった。一方、卵巣漿液性腺癌はいずれも薬剤感受性が低かったが、3株に共通して有効と判定されたのはACR,Act-D,CDDPの3薬剤であった。各方面にヒト由来の癌細胞株の分与を依頼し、多数の株細胞を入手した。これらの細胞株の中には、細胞の増殖が悪く、我々の研究室では感受性検査を施行するほどに増殖させられない細胞株もあった。従って、DOSSによる薬剤感受性検査が施行できたのはこの中の一部であった。本年はこの内、子宮体癌と卵巣漿液性腺癌の抗癌剤感受性をnivitroで検査した。その結果、子宮体癌は薬剤感受性の比較的高い低分化型と薬剤感受性の低い高分化型に分かれた。低分化型に対して有効な薬剤はanthracycline系薬剤とET,CDDPであり、高分化型に有効な薬剤はMMC,Act-D,CDDPであった。一方、卵巣漿液性嚢胞腺癌は細胞株ごとに薬剤感受性が異なっており、全体的に薬剤耐性が強かった。この理由は、細胞株樹立時に既に化学療法を受け、再発した患者から樹立された細胞株が多く、細胞自体に耐性が備わっているためと考えられた。従って、本腫瘍に対する評価はまだ下していない。その結果、子宮体癌は高分化型と低分化型とでは薬剤感受性が異なっており、高分化型の方が薬剤感受性が低かった。特にACRとCDDPは5株すべてに有効であった。一方、卵巣漿液性腺癌はいずれも薬剤感受性が低かったが、3株に共通して有効と判定されたのはACR,Act-D,CDDPの3薬剤であり、2株に共通して有効と判定されたのはVLB,VCR,5-FUの3薬剤だった。以上の薬剤感受性検査結果に基づき、子宮体癌、卵巣漿液性腺癌に対するより有効な新しい化学療法レジメン開発の可能性が示唆された。
慢性肝疾患における肝小葉構築変化に関する免疫組織学的検討

慢性肝疾患々者32例の肝生検組織を、本研究における対象とした。胆管上皮はsecretory component(SC)、CA19ー9、血管は第VIII因子関連抗原(FVIIIRAg)、OKM5、神経軸索はγーエノラーゼ、シュワン細胞はS100蛋白、クッパー細胞はリゾチームなどをマーカーとして、免疫組織化学的にその局在を明かにすることで、肝小葉改築におけるこれらの細胞の形態学的変化を検討した。胆管上皮細胞はSC、CA19ー9が染色され、肝硬変症では、SC、CA19ー9陽性の増生胆管が門脈域で多数観察されたが、不規則な分岐、管腔の不整、狭窄もみられた。門脈域では、FVIIIRAg陽性、OKM5陰性の血管内皮が増生していたが、小葉内の類洞内皮は、FVIIIRAg陰性、OKM5陽性であり、血管のheterogeneityがみられた。しかし、小葉内へ線維化進展している部位の増生血管は、FVIIIRAg陽性、OKM5陰性であった。これは、電顕による超微形態上も区別された。慢性肝炎の拡大した門脈域では、S100蛋白、γーエノラーゼ陽性の神経線維が血管、胆管とともに増生していた。肝硬変症でも、線維性隔壁の中では同様の増生がみられたが、再生結節内には、これらの神経線維はほとんどみられなかった。類洞被覆細胞との関係では、リゾチーム陽性のクッパー細胞やOKM5陽性の類洞内皮細胞には、神経支配は観察されなかった。伊東細胞は、正常肝において、その周囲に神経線維が存在しており、類洞の神経性血流調節は伊東細胞を介することが示唆された。慢性肝炎から肝硬変症に進行するに従って、胆汁分泌、代謝調節等の機能が障害されてゆくが、これは、線維化のみでなく、血管、胆管および神経線維の増生と分布変化によることが、明らかにかった。慢性肝疾患患者の肝生検組織20例につき病理組織所見を検討した.15例が慢性肝炎であり, 5例が肝硬変症であった.これらの症例について, secretary component(SC), CA19-9,第VIII因子関連抗原(FVIIIRAg), OKM5, γエノラーゼおよびS100蛋白に対する各種抗血清を用いた免疫組織化学を行い,光顕観察を行った.その結果,以下のことを明らかにすることができた.胆管上皮細胞にはSC, CA19-9が染色された.肝硬変症では, SC, CA19-9陽性の増生胆管が門脈域に多数観察された.また,門脈域では, FVIIIRAg陽性, OKM5陰性の血管内皮が増生していたが,小葉内の類洞内皮は, FVIIIRAg陰性, OKM5陽性であり,門脈域と小葉内では,血管にHeterogeneityがみられた.しかし,小葉内へ線維化が進展している部位の増生血管は, FVIIIRAg陽性, OKM5陰性となっていた.拡大した門脈域では, S100蛋白, γエノラーゼ陽性の神経線維が増生していた.肝硬変症では, S100蛋白, γエノラーゼ陽性の神経が線維性陽壁の中で増生していたが,再生結節内にはほとんど観察されなかった.

これらの神経線維は, FVIIIRAg陽性の血管およびCA19-9陽性の胆管に随伴しているのが,重染色にて確認された.以上,慢性肝炎の際, piecemeal neceosisの組織修復として門脈域より小葉内への線維化の進展がみられるが,この現象は単に線維増生にとどまらず,増生胆管,増生血管および増生神経線維もその中に容れての線維化であると考えられた.増生した血管・胆管およびそれらをregulateする神経線維も慢性肝疾患で小葉改築を生じてゆくことが光顕的に示されたが,さらに超微形態的検討を行うことにより,慢性肝疾患における線維・血管・胆管および神経系の機能的関連について明らかに出来ると考えられる.昨年度、慢性肝疾患々者の生検肝組織において、piecemeal necrosisの部位の組織修復として、門脈域から小葉内への線維化の進展がみられるが、この現象は単に線維増生にとどまらず、増生した胆管、血管および神経線維も随伴していることを、免疫組織学的光顕レベルで明らかにしえた。本年度は、超微形態的手法をとりいれ、小葉改築に伴うこれらの形態学的変化について検討した。piecemeal necrosisの部位に出現した第VIII因子関連抗原陽性、OKM5陰性の血管内皮細胞は、基底膜を有し、内皮小孔は存在せず、既存の類洞内皮細胞とは超微形態的にも免疫組織学的にも異なり、門脈域血管の特微を有することがわかった。増生胆管は、secretory component.およびCA19ー9が陽性であり、既存の胆管と同様の免疫組織学的特微を有していたが、不規則な分岐と管腟の不整、狭窄がしばしば観察された。拡大した門脈域および小葉内へ侵入した線維組織中には、上記の増生した血管、胆管ともにSー100蛋白およびγーエノラーゼ陽性の神経線維が認められた。これらは、増生血管の周囲に主として観察された。神経線維の約半数は、NPY陽性であった。一方、VIP陽性線維は少く、小葉間胆管以上の太い胆管周囲に観察された。類洞被覆細胞と神経線維との関係をみると、リゾチーム、C_3b receptor陽性のクッパー細胞およびOKM5陽性の類洞内皮細胞には正常肝および病的肝のいずれにも神経支配は観察されなかった。正常肝では、伊東細胞の周囲に神経線維が存在し、類洞の血流調節は、伊東細胞を介してなされることが示唆されたのに対し、肝硬変症の再生結節内では神経線維が著しく減少もしくは欠如しており、微小循環障害の一因と考えられた。慢性肝炎から肝硬変症に進行するに従って胆汁分泌、代謝調節等の機能が障害されてゆくが、これは、線維化のみではなく、血管、胆管および神経線維の増生と分布変化によることが、明らかになった。