hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様性に富んだインドネシアの生物資源の収集と有効活用

また、南スラウエシ州マカッサル周辺地区の40名のハンセン病新患患者から血清および鼻粘膜スワブサンプルも採取した。(4)天然生物資源のデータベースの構築:(1)から(3)で収集、保管した生物資源情報のデータベースの準備をすすめた。インドネシアから日本(北里大学)に微生物(菌株)などの生物資源/遺伝子資源を持ち込むために、UNHAS、LIPI、北里大学間での協定に合意した。また、様々な土地から病原微生物を含めた微生物資源サンプルを収集し、ライブラリーとして、保管した。さらに、スラウェシ島マロスに生育する植物の根から分離した放線菌の培養液から抗抗酸菌活性物質を単離し、同定した。引き続き、本研究では、(1)微生物資源の収集と保管、(2)天然化合物の収集と保管・創薬シーズの検索、(3)病原微生物資源の収集と保管・診断薬やワクチンへの利用および(4)天然生物資源のデータベースの構築を実施する。(1)微生物資源の収集と保管:年間2,000株を目標に、UNHASは東インドネシア地域を中心に、LIPIは西インドネシア地域を中心に、土壌、海洋生物、植物、昆虫等からの微生物を分離し、保存する。(2)天然化合物の収集と保管・創薬シーズの検索:様々な条件で培養した微生物の抽出液や植物抽出液などから、年間100化合物、1化合物あたり10 mgを目標に、化合物の単離精製を進める。また、申請者グループが構築した10種以上の細胞評価系と酵素評価系(抗菌活性および抗がん活性、脂質代謝阻害活性など)を用いて生物活性評価を進める。(4)天然生物資源のデータベースの構築:(1)から(3)で収集、保管した生物資源情報、遺伝子情報、構造情報などのデータベースを構築する。また、様々な条件で培養した微生物の抽出液をLC-MS/MS解析し、二次代謝産物情報と生物活性情報などのビックデータをデータベース化し、共有する。2019年度は、年4回(約1週間程度)は訪問し、フィールドワークを行い、微生物(菌株)を日本に持ち帰る。2018年度に購入予定だった真空凍結乾燥機がまだ選定中のため、2019年度に繰り越した。2019年度は、選定した真空凍結乾燥機を購入し、インドネシアでの現地調査の回数を増やす予定である。
光周波数コムを利用した屈折式海水塩分センサの開発

海洋大循環と呼ばれる,地球規模の海水の運動を解明することは,地球温暖化メカニズムを把握するうえでも極めて重要である.本研究では,海中に沈めて直接塩分測定が可能な絶対塩分センサの実用化を目指し,その基礎技術となる高精度な海水屈折率測定装置の開発を目指した.測定原理としては,SLDなどを用いた分光干渉センサと同様の原理を用いた.純水および海水で満たされた2つの光学セルを通って反射したビーム同士の干渉スペクトルを解析することで,純水と海水の屈折率差を求めることができる.発振波長範囲420 nm2 μmを持つ広帯域光周波数コムを光源として採用することで,海水の屈折率を高精度に測定可能なことを示した.測長センサ等に応用例のある分光干渉法を応用した,光学セル中の海水および純水の光路長差を測定するための干渉計を製作した.予備測定として,分光干渉式変位センサを用いた測定を実施し,海水の塩分の測定分解能が従来のCTDセンサと同等以上であることを確かめた.また,絶対円分測定システムの開発のため,正確な温度測定が必要である.本研究で開発する光学系の海水測定部分を0.001°Cよりも高い精度で制御・測定する温度制御系の構築を行った.海水用屈折率センサの開発において課題となる,海水・純水セルを用いた干渉測定において予期した分解能を実現することができ,当初の目標を達成することができた.海洋観測においてこれまで用いられてきた電気伝導度センサは、換算した絶対塩分の値に誤差を生じる特性があり、測定精度についても海洋研究の要求を満たしていなかった。そこで本研究では、絶対塩分をダイレクトに計測可能な屈折率センサを開発することを目的とし、分光干渉計と光周波数コムを組み合わせた計測技術の開発により、従来センサの20倍の測定精度を実現することを目標とする。初年度である平成27年度は、海水用および純水用として、光路長40 mmのセルをそれぞれ用意し、市販のレーザー分光干渉変位センサを用いて屈折率差の測定を行った。この結果から、屈折率による絶対塩分の計測で従来の電気伝導度センサと同等以上の分解能を有することを確認した。また、屈折率センサの信頼性評価に必要な絶対塩分の測定のため、液中秤量装置を用いた標準海水の密度測定を実施した。最終年度(平成28年度)は、恒温水槽中で高精度に温度制御した状態において屈折率計測を可能にすべく、新たにに光路長50 mmの密閉型円筒セル2つを導入した。ひとつを参照物質である純水で満たし、他方に海水を充填することで屈折率差を測定可能な干渉計を構成した。さらに、平成27年度に用いた市販のレーザー分光干渉変位センサに代わり、発振波長範囲420 nm2 μmを持つ広帯域光周波数コムを光源として採用し、同波長帯域における干渉スペクトルを光スペアナにより測定することで、純水を基準とし海水の屈折率を高精度に測定可能なことを示した。海洋大循環と呼ばれる,地球規模の海水の運動を解明することは,地球温暖化メカニズムを把握するうえでも極めて重要である.本研究では,海中に沈めて直接塩分測定が可能な絶対塩分センサの実用化を目指し,その基礎技術となる高精度な海水屈折率測定装置の開発を目指した.測定原理としては,SLDなどを用いた分光干渉センサと同様の原理を用いた.純水および海水で満たされた2つの光学セルを通って反射したビーム同士の干渉スペクトルを解析することで,純水と海水の屈折率差を求めることができる.発振波長範囲420 nm2 μmを持つ広帯域光周波数コムを光源として採用することで,海水の屈折率を高精度に測定可能なことを示した.今後は,本研究の特色である光周波数コムを光源とする新たな干渉計を製作し,測定精度の確認および海水の塩分濃度と屈折率の関係を実測・評価する予定である.流体熱物性、精密計測本研究において使用する,光周波数コムを用いた分光干渉計については,その性能の予備的な評価のために,海水および純水用セルを用いた干渉計の製作と,分光干渉式変位センサを用いた測定を行ったが,この予備測定に予期したよりも時間がかかり,光周波数コムを用いた干渉計の製作を翌年度に持ち越すこととした.光周波数コムを用いた干渉計については基本設計が終了しており,次年度前半に詳細設計および部品の発注・組み立てを行いう予定である.
環境や生体内生成のN-ニトロソアミンの光化学反応解析とその遺伝毒性・細胞機能影響

環境などから体内に取り込まれたN-ニトロサミンや生体内で生成したN-ニトロソアミノ酸が全身循環して皮膚に達し、日光などの光照射により反応して、活性酸素種・NOラジカル・アルキルラジカルなどを生じ、光遺伝毒性・変異・蛋白機能傷害を起こす可能性を明らかにするために、次の研究を行った。UVAにより活性化したN-ニトロソプロリン(NPRO)によるデオキシアデノシン(dA)への反応をLCMSMS等で定量解析したところ、dAの2位及び8位への新規のピロリジル付加体を見出した。8位付加体形成はNPROのUVA吸収曲線にそっており、光エネルギーがNPROに吸収されて反応を起こしたことを示している。が、2位付加体形成は光依存性ではあるが、NPROのUVA吸収曲線には沿わなかったため、なんらかの2次反応が介在していると考えられる。子牛胸腺DNAへの、UVA活性化NPROによる付加体形成をLCMSMS等で定量解析を行った結果、デオキシグアノシン(dG)の8位、dAの2位及び8位へのピロリジル付加体6種と8-オキソグアニンを見出した。付加体形成は好気的条件・嫌気的条件ともにみられた。dA付加体は嫌気的条件で生成量が増しており、光反応は主に活性酸素を経由しないType I機構で起こると考えられる。一方、dG付加体は好気的条件での生成量がやや多く、活性酸素種も関与している可能性がある。さらに、NPROに加えて、N-ニトロソピロリジン(NPYR)とN-ニトロソモルホリン(NMOR)の光遺伝毒性研究を行った。NPROおよびNMORの光活性化体は37°Cで10日以上安定,かつpH 5からpH 11までの液性で変異原性を保つことがわかったので、全身循環に回りうると考えられる。またNPYRおよびNMORが、UVA活性化によりヒト由来表皮角化細胞HaCaTへ小核形成を誘導し、光遺伝毒性を示すことを見出した。環境などから体内に取り込まれたN-ニトロサミンや生体内で生成したN-ニトロソアミノ酸が全身循環して皮膚に達し、日光などの光照射により反応して、活性酸素種・NOラジカル・アルキルラジカルなどを生じ、光遺伝毒性・変異・蛋白機能傷害を起こす可能性を明らかにすることを目標として、次の研究を行った。皮膚モデルとして、ヒト由来表皮ケラチノサイトHaCaT細胞を用い、N-ニトロソアミノ酸の一つN-ニトロソプロリン(NPRO)のUVA光反応を解析した。NPROの光反応で放出されるNOラジカルはグアニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cGMP量を上昇させ、cGMP依存性のキナーゼやホスホジエステラーゼなどの活性を擾乱すると予想される。NPRO存在下、UVA照射したHaCaT細胞内のcGMP量を定量したところ、対照と比べcGMPの増加が見られた。従って、光反応によるNO放出でcGMPの関与するシグナル伝達を擾乱している可能性のあることが分かった。また、NPROの光反応によるDNA付加体形成機構の解析のため、好気性および嫌気性条件におけるDNA損傷量をLCMSMS測定による定量的比較を行った。その結果、嫌気性条件において、DNA上の8-oxoguanine量は減少したが、DNAへのアルキル付加体量は減少せず、むしろ増加することが分かった。従って、NPROの光反応は主に活性酸素を経由しないType I機構で起こることが明らかとなり、体内のような嫌気性条件下でもNPROの光遺伝毒性反応は起きうることが分かった。また、水環境に加えて疎水環境でも、NPROが光遺伝毒性を示すことを明らかとした。さらに、N-ニトロサミンを含む、環境化学物質の光遺伝毒性研究を行った。その結果、タバコ副流煙はUVA照射によりむしろ変異原性を減弱することが分かった。これは、変異原性成分の光分解によるものと思われ、大気など環境滞留中における光化学変化は無視できないと考えられる。本研究の目的とするN-ニトロサミンやN-ニトロソアミノ酸が光照射により光遺伝毒性・変異・蛋白機能傷害を起こす可能性について研究を行い、おおむね順調に推移している。すなわち、(i)N-ニトロソアミノ酸の一つN-ニトロソプロリン(NPRO)のUVA反応により、表皮由来培養細胞内でcGMP量の変動を起こすことを明らかとし、cGMPを介するシグナル伝達とタンパク機能に対する光活性化NPROによる擾乱を明らかとした。(ii)N-ニトロソプロリンのUVA反応による光遺伝毒性機構を進めた。これまでにNPROの光反応でデオキシグアノシンに2種類の付加体、デオキシアデノシンに4種類の付加体を形成することを見出しており、それら付加体がDNA上のグアニン残基とアデニン残基にも、同様の付加体形成することを見出した。DNAの酸化障害並びにアルキル化傷害の反応機構を解析し、むしろ嫌気条件で反応が進むことからTypeIの光反応機構であることをを明らかとした。光反応機構解析を一段と進めた。(iii)NPROの光活性化が水環境に加え疎水環境下でも起きることを明らかとした。(iv)NPRO以外のN-ニトロサミンを含む環境化合物に対する、光反応の遺伝毒性影響を明らかとした。以上、研究目的に沿い、H27の計画の主な部分、並びにH28年計画の一部についても達成している。

また、成果公表のため、国内学会発表2回、国際学会発表1回行っており、さらに国際学会発表1回をすでに予定している。以上より、おおむね順調に成果をあげていると考えられる。環境などから体内に取り込まれたN-ニトロサミンや生体内で生成したN-ニトロソアミノ酸が全身循環して皮膚に達し、日光などの光照射により反応して、活性酸素種・NOラジカル・アルキルラジカルなどを生じ、光遺伝毒性・変異・蛋白機能傷害を起こす可能性を明らかにすることを目標として、次の研究を行った。皮膚モデルとして、ヒト由来表皮角化細胞HaCaTに対する、N-ニトロソプロリン(NPRO)のUVA光反応を解析した。NPRO存在下、UVA照射したHaCaT細胞内のcGMP量を定量したところ、対照と比べcGMPの増加が見られた。光反応によるNO放出でcGMPの関与するシグナル伝達を擾乱している可能性がある。NPRO+UVAの光反応によるDNA付加体形成を、LCMSMS測定で定量解析を行った結果、NPROの光反応でDNAに6種類の新規付加体を見出した。嫌気性条件において、DNAへのアルキル付加体形成量が増加することが分かったので、NPROの光反応は主に活性酸素を経由しないType I機構で起こることが明らかとなり、体内などの嫌気性条件下でもNPROの光遺伝毒性反応は起きうることが分かった。また、水環境に加えて疎水環境でも、NPROが光遺伝毒性を示すことを明らかとした。さらに、NPRO+UVAが誘起する突然変異のスペクトラムをM13mp2ファージで解析したところ、GC→TAとGC→CGのトランスバージョンが47%を占め、GC→CGの変異割合が増加した。変異の原因として、NPRO+UVA処理によるG付加体が考えられる。さらに、NPRO以外のN-ニトロサミンとしてN-ニトロソピロリジン(NPYR)を含む環境化学物質の光遺伝毒性研究を行った。NPYRのHaCaT細胞への光遺伝毒性を見出した。また、高分子重合開始剤で注射薬中の残存が検出されているMTMPが光変異原性を示すことを見出した。本研究の目的とするN-ニトロサミンやN-ニトロソアミノ酸が光照射により光遺伝毒性・変異・蛋白機能傷害を起こす可能性について研究を行い、おおむね順調に推移している。すなわち、(i)N-ニトロソアミノ酸の一つN-ニトロソプロリン(NPRO)のUVA反応により、表皮由来培養細胞内でcGMP量の変動を起こすことを明らかとし、cGMPを介するシグナル伝達とタンパク機能に対する光活性化NPROによる擾乱を明らかとした。(ii)N-ニトロソプロリンのUVA反応による光遺伝毒性機構を進めた。これまでにNPROの光反応でDNAにグアニンおよびアデニンに対する6種類の新規付加体を形成することを見出した。DNAの酸化障害並びにアルキル化傷害の反応機構を解析し、むしろ嫌気条件で反応が進むことからType Iの光反応機構であることを明らかとした。(iii)NPROの光活性化が水環境に加え疎水環境下でも起きることを明らかとした。(iv)NPRO+UVA処理により、M13mp2ファージにGC塩基を主な標的として突然変異が起こり、特にGCからCGへの変異割合の増加することを見出した。(v)NPRO以外のN-ニトロサミンとしてN-ニトロソピロリジンを含む環境化合物や医薬品混在物に対する、光反応の遺伝毒性影響を明らかとした。
Hippo-YAP経路を標的とした心筋再生を促進する薬剤の開発

哺乳類の心筋細胞の増殖能は生後に急速に低下するが、成体の心筋細胞の分裂能は保持・再獲得可能で、僅かながらに自己再生していることが明らかとなった。この内因性心筋再生のメカニズムを解明して増幅することは、従来の心不全治療や開発中の細胞治療(骨髄移植やiPS医療)の効果を補足して新たな治療手段となり有益である。近年、臓器の「適切な大きさ(増殖の程度)」を決めるHippo-YAP/TAZ-TEADs経路が、心筋細胞の増殖にも関与することが報告され、注目されている。本課題では転写因子TEADsの転写活性を指標に、心筋細胞増殖と心筋再生(修復)を促進する薬剤の創出を試みた。約18,600種類の化合物ライブラリーから上皮細胞(2種類の細胞アッセイ系)を用いてHippo経路のTEADs転写因子を活性化する化合物をスクリーニング、得られた化合物を改変することで、心筋細胞の増殖と、心筋梗塞後の線維化軽減・心機能改善をもたらす化合物TT-10を創出した。この化合物の作用機序を検討し、心筋細胞でのYAP-TEADs転写活性を促進し、Wnt/β-catenin経路も活性化させることで、強力な増殖促進作用を発揮すること、また、RNA-seqによる網羅的な発現解析から、細胞周期の進行とサルコメア蛋白分解などの効果の他、酸化ストレス応答転写因子NRF2の効果(抗酸化・抗アポトーシス作用)も増強させることを見出した。さらに、この化合物はヒト由来iPS心筋細胞の増殖も促進することを確認しており、今後、臨床応用につなげていきたい。本課題では転写因子TEADsの転写活性を指標に、心筋細胞増殖と心筋再生(修復)を促進する薬剤の創出を試みる。これまでに、新規のフッ素化化合物Xが、培養心筋細胞においてTEADsレポーター活性を上昇させ、Hippo経路とクロストークするWnt/β-catenin経路も活性化させることを見出していたが、抗酸化に関与するKEAP1-NRF2複合体に直接作用し、抗酸化・抗アポトーシス作用を有することも明らかにした。現在、フッ素化化合物Xをさらに改変しており、心筋細胞分裂を促進させる化合物に必要な構造骨格を検証中である。また、フッ素化化合物Xをマウス心筋梗塞モデルに腹腔内投与したところ、梗塞境界域での心筋細胞の細胞周期の促進とクローン性増殖が誘導され、線維化軽減と心機能の改善にも効果的であった。これらの効果には、抗酸化・抗アポトーシス作用が影響していることも明らかとした。このマウスモデルの解析をすすめ、Hippo経路、Wnt/β-catenin経路、抗酸化・抗アポトーシス作用が、心筋再生に与える影響を検証していく予定である。新規化合物を心筋梗塞モデルマウスへ投与すると、心筋再生が促進されることを見出しており、その作用機序の一部も明らかとしているため。新規化合物を投与した心筋梗塞モデルマウスの解析により、Hippo経路、Wnt/β-catenin経路、抗酸化・抗アポトーシス作用が、心筋再生に与える影響を検証していく予定である。また、新規化合物Xの改変も同時に行い、より有効性の高い化合物の創出も行う予定である。
乳児の音声コミュニケーション行動の発達に関する研究

本研究は、乳児と母親のコミュニケーション場面における乳児音声を解析することによって、1)母親は乳児の音声からどのような非言語的情報をどの程度認知するか、2)それは乳児の月齢と共にどのように変化・発達するかを明らかにし、さらに、採録した音声を音声信号処理によって加工し種々のコンテキスト下で聴取実験を行うことによって、3)乳児音声のどのような特徴がどのような非言語的情報を伝達するのか、また、乳児に対する聴覚的嗜好実験により、4)乳児がどのような非言語情報をどの程度知覚できるか、5)それは月齢と共にどのように発達変化するかを調べ、乳児の認知系の発達を検討することを目的としたものである。平成5及び6年度にわたり以下のことを明らかにした。1)乳児は言語運用能力を発揮し始める以前から、音声上に観測される非言語的特性を活用してコミュニケーション行動を行い得る。2)2カ月齢でも多様な非言語的情報を表出し得る。また、3)音声上の非言語情報の発現は月齢を追って多様になるものの、個人差がみられる。さらに4)乳児の発声時の環境(コンテキスト)と伝達される非言語的情報との関係は、母親・保育者・大学生など評定者による差異が一部見いだされたものの、評定者の経験等の差を超えた一般性も観測される。5)幼児を対象にした実験を行った結果、成人による実験結果に比べ、乳児音声上の非言語的情報をより豊かに聴取している傾向、とりわけ音声上の「快」「不快」の情報だけでなく多様な感性に関わる情報を聴取している可能性が示唆され、幼児期の音声知覚についての新知見が得られた。なお、乳児に関する聴覚嗜好実験については現在検討中である。本研究は、乳児と母親のコミュニケーション場面における乳児音声を解析することによって、1)母親は乳児の音声からどの様な非言語的情報をどの程度認知するか、2)それは乳児の月齢と共にどの様に変化・発達するか、さらには、3)乳児音声のどの様な特徴がどの様な非言語的情報を伝達するのか、を明らかにすることを目的としている。また、乳児に対する聴覚的嗜好実験により、4)乳児がどの様な非言語的情報をどの程度知覚できるか、5)それは月齢と共にどの様に発達変化するかを調べ、乳児の認知系の発達を検討することも目的としている。今年度は当初の目的である作業仮説1)「乳児音声から母親は、快・不快など乳児の内的状態を反映した感性に関わる非言語情報や、食物の要求や対人通信的な非言語情報を他の聴取者より強くかつ正確に認知する。さらに、快・不快など乳児の内的状態を反映した非言語情報表出が先行し、泣き声に依らない音声での食物の要求や干渉拒否などの、対人通信的な表出は9から12カ月齢以降に成熟する」について、母親・保育者と、乳幼児に関係を持たない成人(大学生)、さらに幼児・児童を対象に乳児音声の聴取・評定実験を、乳児の数及び聴取者の種類をより増加して検討・確認を行なった。その結果、乳児は言語運用能力を発揮し始める以前から、音声上に観測される非言語的特性を活用してコミュニケーション行動を行い得ることが明らかになった。さらに、6カ月齢でも多様な非言語的情報を表出し得ることも明らかになった。また、乳児の発声時の環境(コンテキスト)と伝達される非言語的情報との関係は、母親・保育者・大学生など評定者による差異が一部見いだされたものの、評定者の経験等の差を超えた一般性も観測された。なお、幼児・児童を対象に実聴取験を行った結果、成人による実験結果に比べ、乳児音声上の非言語的情報をより豊かに聴取している傾向、とりわけ音声上の「快」「不快」の情報だけでなく多様な感性に関わる情報を聴取している可能性が示唆され、幼児期の音声知覚についての新知見が得られたものと考えている。平成6年度においては作業仮説

「乳児音声における感性情報は声質を含むプロソディによって伝達される」を中心に検証を行った。成人を対象とした乳児音声の聴取・評定実験を行い、まず6・9・12・17カ月齢乳児音声上の月齢による聴取傾向の差異を明らかにした。また、早期乳児音声を対象とした同様の実験を行い、音声のどの様な音響的特徴がどの様な非言語的情報を伝達するのかを検討した。その結果、6070日齢児(2カ月齢)の発声についても個人差はあるものの、音声上の非言語要素を通してコミュニケーションを行うのに必要な諸要素が発現していること、また、音声上の非言語情報と音響的特徴(基本周波数FOレンジ・パタン、分節数、音声長等)との有意な関連が明らかになった。以上、平成5及び6年度にわたり、以下のことを明らかにした。1)乳児は言語運用能力を発揮し始める以前から、音声上に観測される非言語的特性を活用してコミュニケーション行動を行い得る。2)2カ月齢でも多様な非言語的情報を表出し得る。また、3)音声上の非言語情報の発現は月齢を追って多様になるものの、個人差がみられる。さらに4)乳児の発声時の環境(コンテキスト)と伝達される非言語的情報との関係は、母親・保育者・大学生など評定者による差異が一部見いだされたものの、評定者の経験等の差を超えた一般性も観測される。5)幼児を対象にした実験を行った結果、成人による実験結果に比べ、乳児音声上の非言語的情報をより豊かに聴取している傾向、とりわけ音声上の「快」「不快」の情報だけでなく多様な感性に関わる情報を聴取している可能性が示唆され、幼児期の音声知覚についての新知見が得られた。なお、乳児に関する聴覚嗜好実験については現在検討中である。
虫害耐性を高めた植物の開発

本研究は植物が本来有する害虫に対する免疫機構を強化することで「害虫に強い植物」の開発を目指すものである。具体的には害虫に対する免疫機構を制御している有用な転写制御因子を選抜し、利用することで「害虫に強い植物」の開発を目指した。その結果、転写因子候補を遺伝子導入した幾つかのラインにおいて実際にアザミウマによる虫害に対する耐性度の上昇が認められ、「害虫に強い植物」の開発の道筋を確立することができた。昆虫による食害は、干ばつなどの環境要因、病原菌などによって引き起こされる病害と並び、植物の生育を脅かす重大な要因の一つである。しかし、農業生産上、非常に重要であるにも関わらず、植物の食害応答の分子メカニズムはあまり明らかになっていない。近年、植物のストレス応答に植物ホルモンが深く関わっていることが分子レベルで明らかになり、その重要性が再認識されるに至った。我々はシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)とミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)を用いて、植物の虫害応答に植物ホルモンがどのように関わっているのか解析を行なっている。ミカンキイロアザミウマは野菜や果物、そして花等を加害するだけではなくウイルス媒介虫としても知られ、世界的に問題となっており、その防除が切望されている。ミカンキイロアザミウマにより食害を受けたシロイヌナズナを用いてマイクロアレイ解析を行い、エチレン、ジャスモン酸、サリチル酸といった植物免疫にかかわる植物ホルモン応答のマーカー遺伝子として知られているPDF1.2、VSP2、PR1などの遺伝子発現が誘導されており、これら植物ホルモンの重要性が示唆された。また、いくつかの転写制御因子をコードする遺伝子の発現レベルがアザミウマの食害により強く上昇することが分かった。更に、虫害により早くタイミングで強く誘導する遺伝子の選抜を行い、定量的RT-PCRにより発現解析を詳細に行った。それらの幾つかについては実際にプロモーター領域の単離を行った。現在、転写制御因子の過剰発現ラインの作出を行っている。具体的には害虫に対する免疫機構を制御している有用な転写制御因子を選抜し、利用することで「害虫に強い植物」の開発を目指す。本年度は、昨年度作出した「害虫に強い植物」の分子育種に有用な転写因子候補を遺伝子導入したシロイヌナズナ、および、遺伝子破壊株のライン化を中心に行った。この際、幾つかのラインについては矮化するなどの形態的な変化が観察されたために、その後の解析からは除外した。また、ライン化が完了した植物体を用いて、害虫に対する抵抗性を実際に評価し、「害虫に強い植物」の分子育種に有用な転写因子の絞込みも試みた。この際、抵抗性を効率的に評価することが望まれたために、リーフディスクを用いて食害痕を数値化することで簡便な評価法を開発した。また、gene chipを用いた網羅的遺伝子発現データを取得し、アザミウマの食害に対して、「よりすばやく」、「より強く」、応答する遺伝子を選抜した。そのような遺伝子についてはプロモーター領域を単離した。これらのプロモーターは「害虫に強い植物」の分子育種に有用と考えられることから、有望な転写因子が選抜できしだい、open reading frameと連結させシロイヌナズナに遺伝子導入を行う予定である。本課題の最終年度である来年度は、「害虫に強い植物」の選抜を重点的に行い、「害虫に強い植物」の開発の道筋を確立したい。本年度は、昨年度までに作出しライン化した「害虫に強い植物」の分子育種に有用な転写因子候補を遺伝子導入したシロイヌナズナ、および、遺伝子破壊株の虫害耐性に関る評価を行った。評価は昨年度までに開発したリーフディスクアッセイ法や、植物体を用いたアッセイなどにより行った。その結果、転写因子候補を遺伝子導入した幾つかのラインにおいて実際にアザミウマによる虫害に対する耐性度に変化が認められた。次に、それら転写因子の遺伝子破壊株についても同様な解析を行った。しかし、耐性度に有意な変化は認められなかった。次に、アザミウマ虫害に対する耐性度が向上していた植物について別の害虫であるハモグリバエ食害に対する耐性度を調べたところ、程度の差はあるものの耐性度の向上が認められた。アザミウマ及びハモグリバエはそれぞれ難防除害虫として世界的に問題となっていることから本課題で得られた知見は非常に興味深いといえる。また、本課題の目的である「害虫に強い植物」の開発の道筋を確立することができた。今後、アザミウマの食害に対して、「よりすばやく」、「より強く」、応答する遺伝子のプロモーターの制御下で、これら転写因子を発現させたラインの評価を進めていく予定である。
大豆たんぱく質・米粉混合系食品の物性と咀嚼性

大豆たんぱく質・米粉混合系の加熱凝固と酸凝固のレオロジー特性を研究した。大豆タンパク質の加熱に伴うゲル化速度は混合系より速く、ゲル化時間は短く、米粉のゲル化はゆっくりで大豆タンパク質は米粉の糊化を抑制することが推察された、豆乳・米粉混合系は、豆乳に米粉と酢酸を混合するとpHが低下し、さらに添加酢酸量の増加に伴いpHは低下し、ゲルを形成した。豆乳濃度が高く、酢酸量が少なすぎる場合はゲルが弱くなった。油混合により、初期過程ではゲル化を抑制するが、ある点からゲル化を促進しており、これは不活性フィラーとして作用していた油滴が、その後活性フィラーとして作用することでゲル化が進むことが推察された。たんぱく質と澱粉は食品中に多く含まれ食品ハイドロコロイドとしての役割を担い、食感改良のための素材、高齢者向け食品素材、メタボリックシンドローム予防効果をもつ食品素材として発展してきている。大豆たんぱく質およびペプチドの生体調節機能が注目され、大豆たんぱく質を利用した加工食品が多くみられ、大豆たんぱく質の濃度や加熱温度の影響を検討することは意義があると考える。本研究では、大豆たんぱく質と米粉の混合比率を変えた試料調製を行い、加熱凝固の影響を動的粘弾性測定の時間依存性と周波数依存性より検討した。加熱温度により、大豆たんぱく質と米粉の混合系の貯蔵弾性率G'と損失弾性率G"の時間依存性は異なる挙動を示した。60°C加熱ではG">G'でゾルの挙動を示したが、70°C加熱で、G'>G"となり、澱粉の糊化温度とたんぱく質の変性温度の影響を受け、ゾルからゲルへの変化が推察された。80°Cのときがゲル化進行が速く最も粘弾性は高くゲルの挙動を示した。また濃度により異なる挙動を示した。総多糖類濃度が6%では、低周波数側でG'とG"は同程度を示し、高周波数側でG'>G"を示した。総多糖類濃度9%ではG'>G"となり構造のある液体の挙動を示した。総多糖類濃度が同じで混合比率が異なる場合、大豆タンパク質の混合比率が高いほどゲル化開始時間が短く、ゲル化速度が増した。水分吸収量では米粉より大豆粉が多かったことから、大豆粉の混合比率が増すと大豆粉が水を多く吸収することで、実際の濃度が高くなることが推察された。実測値から30分間加熱後の推測値による規格化を行ったところ、加熱温度70°Cの試料が80°C試料より安定したゲルであることが推察された。これらの結果は、大豆タンパク質と米粉混合系食品の食感改良が期待できる。タンパク質と澱粉は食品中に多く含まれる高分子成分であり食品ハイドロコロイドとしての役割を担っている.これらは,日常食品の素材,食感改良のための素材から,高齢者用食品,メタボリックシンドロームの予防効果をもつ優れた食品素材へと発展してきている.本研究では,タンパク質の酸凝固に及ぼす2成分の相互作用について,豆乳と米粉の混合系を用いて,豆乳と米粉濃度の影響について検討を行った.また,油脂添加の物性への影響を検討した.豆乳・米粉混合は,酢酸無添加では分離を示し,酢酸添加では,pHの変化に伴い,試料の米粉量が多く豆乳濃度が高いほど,ゲル化の傾向が見られた.酢酸量の増加に伴い,強いゲルを形成した.しかし,豆乳濃度に対する酢酸量が少ない場合はゲル化が抑制され,米粉と豆乳濃度に応じて最も強いゲルになる酢酸量は異なることが推察された.焼成後は,全試料において,試料の米粉量が多く豆乳濃度が高いほど,膨らみが増し広がり程度の減少傾向が見られた.米粉中の澱粉の影響を検討した.また,油脂添加による初期の時間依存性では初めゆるやかに上昇し,ある点で急上昇し,またゆるやかに上昇し最終点では,油脂無添加より上昇することが見られた.油脂がゲル化を抑制するが,ある点からゲル化を促進し,その後はゆるやかに進行することが推察された.豆乳・米粉混合は,米粉と豆乳濃度に適した酸添加でゲルが強くなり,また油脂添加は豆乳・米粉混合ゲルのゲル化速度に影響を及ぼす結果を得た。これらの結果は豆乳の酸ゲルを素材とした場合の米粉と油脂混合による食感改良の結果を得ることができた.大豆タンパク質混合系について、酸凝固、加熱凝固、多糖類添加の影響を検討した。大豆タンパク質・米粉混合系について、豆乳・米粉・油脂からなるエマルションの酢酸添加によるゲル化の進行をレオロジー挙動から検討した。豆乳は、米粉の混合と酢酸添加によりpHが低下した。動的粘弾性の時間依存性より、豆乳に酸と米粉を混合することによりゲルを形成し、豆乳濃度が高く酢酸量が少ない場合はゲルが弱くなった。

豆乳と米粉混合系に油脂の添加により、初期では豆乳のゲル化を抑制するが、その後はゲル化を促進することが推察された。これは不活性フィラーとして作用していた油滴が、その後活性フィラーとして作用したことが推察された。大豆タンパク質と米粉の混合比率の異なる試料による加熱凝固の影響を動的粘弾性測定、示差走査熱量計(DSC)より検討した。大豆タンパク質比率が高く、米粉比率が小さいほど、ゲル化開始時間が短くゲルの平衡値は高くなった。DSC測定温度範囲内で、米粉は65°C付近に吸熱ピークが認められたが、大豆タンパク質ではピークは見られなかった。加熱温度は60°Cでは大豆タンパク質の加熱による影響が大きく澱粉の影響は小さく、70°Cではタンパク質変性と米粉糊化が起こるが、大豆タンパク質の吸水の影響が大きく澱粉の糊化は抑制され、80°Cでは大豆タンパク質の変性によりゲルが強固する挙動がみられた。大豆タンパク質・多糖類混合系による酵素への影響を動的粘弾性測定より検討した。大豆タンパク質は酵素により分解されるが、多糖類混合により酵素反応が遅延した。ゼロずり粘度が同じ場合、多糖類の分子量が小さく濃度の高い方が大豆タンパク質の分解が遅延することが推察された。大豆タンパク質の酵素による影響は咀嚼状態について筋電位より検討した。これらの結果は大豆タンパク質を含む食品の食感改良に役立つことが期待できる。食品プロセス科学調理科学平成24年度の検討課題であった大豆タンパク質と米粉混合系の調製を行った。研究方法では、大豆たんぱく質と米粉の加熱凝固の影響について、動的粘弾性測定に加えて、示差走査熱量測定を行う予定であったが、動的粘弾性測定は実施完了したが、示差走査熱量計測定の結果にばらつきが見られ、総多糖類濃度の変更検討が必要となった。現在の実験系の総多糖類濃度を変更する必要があることから、達成度はやや遅れていると考える。大豆タンパク質と米粉の酸凝固に及ぼす2成分の相互作用について,豆乳(液体)と米粉(粉末)の混合系を用いて,豆乳と米粉濃度の影響について物性検討を行った.また,試料調製において,分離大豆たんぱく質(粉末)と米粉(粉末)での検討も行った.豆乳の酸ゲルを素材とした場合の米粉と油脂混合による食感改良の結果を得ることができた.豆乳・米粉混合系は,試料の米粉量が多く豆乳濃度が高いほど,ゲル化の傾向が見られ,米粉と豆乳濃度に適した酸添加(pH約5.8)でゲルが強くなった.焼成後は,全試料において,試料の米粉量が多く豆乳濃度が高いほど,膨らみが増したことより,目的の結果を得ることができた.咀嚼実験については,予備実験で生体情報解析プログラムを用い一定の結果を得たが,本実験は平成25年に実施することとした.この点は.計画よりやや遅れている.また,油脂添加の物性への影響についても検討し,油脂添加は豆乳・米粉混合系のゲル化速度に影響を及ぼす結果を得た.分離大豆たんぱく質(粉末)と米粉(粉末)の調製方法は次年度への検討課題とした.平成24年度の目標はおおむね順調に進展していると評価する.大豆たんぱく質粉末が米粉粉末より水分吸収量が多いため、水分量が異なることの改善として、総多糖類濃度を69%の範囲で検討した。今後は、大豆たんぱく質と米粉の総多糖類濃度の幅を広げ、加熱による澱粉の糊化と老化の検討を行う。示差走査熱量測定を行い、発熱、吸熱曲線の観測によりたんぱく質の変性と澱粉の糊化による熱的挙動を調べる。
19世紀と21世紀のセルビア民法典--近代法受容をめぐる法典間の継承と断絶

1844年セルビア民法典は、オーストリア一般民法典ABGBをモデルにしているが、セルビア独自の規定も相当数含まれているとの再評価がなされつつある。400年以上にわたりオスマントルコ帝国の支配を受けつつも、西欧法中心地域にもっとも近い周辺に位置していたセルビアが、19世紀の近代化の過程で、どのように近代法を摂取したのか、制定された民法典が社会において実際にどれだけ適用されていたのかを検討する。そのような近代法の基礎の上に、社会主義法が継受された後、セルビアは新たな21世紀を迎えることとなった。2006年セルビア民法典草案が、1844年民法典から何を継承し、何を捨てたのかを明らかにする。
上皮細胞のアピカル膜ドメインの異常を伴う病態に関わる新規シグナル伝達経路の解析

癌や炎症性腸疾患の病変部位の上皮組織では、アピカル膜ドメインの異常が観察されているが、その異常と病態との関係については不明であった。本研究では、酸化ストレス傷害モデルラット肝臓を用いて、酸化ストレスのaPKC-PARR複合体に形成と細胞極性に与える作用を検討した。その結果、酸化ストレスによりPI3キナーゼシグナルを介したaPKCの異常活性化が起こりaPKC-PAR複合体の形成が阻害され細胞極性の異常が誘導される事が明らかとなった。本研究により酸化ストレスによる細胞傷害の新たな分子機構の一端が明らかとなった。上皮細胞のアピカル膜ドメインは、極性化した上皮細胞が持つ構造であり、上皮細胞が持つ固有の形態・機能を決定する因子である。我々はaPKC,PAR-3,PAR-6の3者複合体(aPKC-PAR複合体)の機能阻害により正常な上皮細胞のアピカル膜ドメインの形成が異常になる事を発見したが、その詳しい分子機構は不明である。一方、PAR-3がイノシトールリン脂質と結合する事を発見し、イノシトールリン脂質シグナル伝達の中でaPKC-PAR複合体が機能する可能性が浮上してきた。本研究課題の目的は「イノシトールリン脂質によるaPKC-PAR複合体の機能制御が、哺乳類上皮細胞のアピカル膜ドメインの形成・制御に関与するか明らかとすること」である。平成21年度では、PAR-3の発現を抑制した上皮細胞を使った解析から、PAR-3とaPKCとの結合が正常な上皮細胞のアピカル膜ドメインの形成に必要である事を見いだした(研究成果・雑誌論文)。イノシトールリン脂質代謝に関わるPTENは、酸化ストレスによりその活性が抑制される。本年度では、酸化ストレスにより、培養上皮細胞の極性が異常になること、また、ラット肝臓の組織の極性も異常になる事を新たに見いだした。平成22年度では、精製標品を用いてaPKC-PAR複合体とイノシトールリン脂質との相互作用と、酸化ストレスによる作用の検討を行う。また、それら相互作用がaPKC-PAR複合体の形成や活性に与える作用を検討する。さらに、培養上皮細胞を使い、それら相互作用が上皮細胞の極性制御に必要であるか検討する。本研究によりアピカル膜ドメインの制御機構を解明する事は、その異常が観察される癌や炎症性腸疾患などの病因の解明から、その治療法の子基盤を確立する事が可能となる。本研究課題の目的は「イノシトールリン脂質(PIPs)シグナル伝達によるaPKC-PAR複合体の機能制御が、哺乳類上皮細胞のアピカル膜ドメインの形成・制御に関与するか明らかとすること」である。平成21年度では、極性制御分子であるaPKC,PAR-3,PAR6からなる3者複合体(aPKC-PAR複合体)の機能阻害により、正常な上皮細胞のアピカル膜ドメインの形成が阻害される事を明らかとした。近年の解析から、癌や炎症性腸疾患の病変部位の上皮組織では、アピカル膜ドメインの異常が観察され、それら病態の発生に酸化ストレスが関与すると考えられている。重要な事に、酸化ストレスを培養上皮細胞であるMDCKに処理するとアピカルドメインに局在するaPKCの局在異常が誘導される事を突き止めた。平成22年度では、酸化ストレス傷害モデルラット肝組織を用いた解析から、aPKC-PAR複合体形成および細胞間接着部位への局在化が阻害される事が明らかとなった。また、PIPs代謝に関わるPI3キナーゼシグナルが活性化しaPKCの異常活性化が確認された。aPKCによるPAR-3のリン酸化は、それら両者の結合を弱めaPKC-PAR複合体形成を阻害する。これらの解析結果から、「酸化ストレス→PI3キナーゼシグナルの活性化→aPKCの異常活性化→aPKC-PAR複合体の形成阻害→細胞極性の異常→細胞傷害」というシグナルカスケードの存在が強く示唆された。本研究により酸化ストレスによる細胞傷害の分子機構の一端が明らかとなった。今後、酸化ストレスが関与する癌、炎症性疾患や動脈硬化などの病態でaPKC-PAR複合体に機能変化が生じているか検討し、それら病態に果たす細胞極性の役割とその分子機構を解明する。これにより、それら病態の治療法の分子基盤の確立を目指す。
SNPs検索による動脈硬化症の遺伝的解析

背景と目的:動脈硬化症は高血圧、虚血性心疾患、脳血管障害の原因となることが知られており、多因子疾患であると考えられている。しかしながら、実際に多因子疾患の関連遺伝子を同定することはしばしば困難なことも多い。そこで我々は、動脈硬化症の基礎疾患となる高脂血症に注目した。すでに原因変異が証明されているアメリカユタ州の高脂血症一大家系を用い,高脂血症関連遺伝子や脂質代謝関連遺伝子の一塩基多型(SNPs)と血清脂質値との間で相関解析を行うことにより、高脂血症の増悪因子と考えられる関連遺伝子を明らかにする。また、血管の収縮、拡張に直接関与すると思われる遺伝子のSNP検索を行い虚血性心疾患との関連解析を行う。検討結果:高脂血症一大家系のなかでLDL受容体に変異をもつ79名の患者を対象に、高脂血症関連遺伝子、脂質代謝関連遺伝子など46候補遺伝子のSNPsを検討する。SNPsのタイピングは、NCBI,HGBASEなどデータベースに報告されているものや、文献で報告されているアリル頻度の比較的高いものを選び、ダイレクトシーケンス法およびSNaP shot法にてを行った。なかでもアミノ酸置換を伴うcoding領域のSNPやプロモーター領域のSNPを中心に、血清脂質値との間で相関解析を行った。現在までの解析では、Apo H、Apo A2、HTGL、LCATにおいて、SNPsと血清脂質値の間で相関が認められた。これらの遺伝子が、高脂血症を増悪させる修飾因子となっている可能性がある。SNP検索においては血管拡張に関与するCRLR遺伝子に日本人において8箇所新規SNPを同定した。考察:今後、有意差の認められた4つの遺伝子につき同家系内の変異をもたない患者において年齢と性別を厳密にあわせ関連解析を行う。これによりLDL受容体変異の相乗効果により高脂血症を増悪させているのか、あるいは変異に関係なく単独で高脂血症を増悪させうる因子なのかが推測できる。日本人で同定した血管の収縮、拡張因子のSNP検索と虚血性心疾患との関連解析も継続していく。
エチオピア・アムハラ州における健康観と医療実践に関する医療人類学的研究

本研究の目的は、エチオピア・アムハラ州の農村における人びとの医療実践を包括的に明らかにすることである。病気治療に重点を置いた先行研究を発展させ、予防、健康維持・促進にまで視点を広げて人々の認識と行動を把握、分析する。対象地域には徒歩圏内に近代医療施設があり、人びとは必要におうじてこれを利用することができる。そうした環境において、人びとが心身を良好に保つうえで意識するのは日々の食事である。本年度は2018年8月から2019年3月にかけてエチオピアに滞在し、フィールドワークを実施した。1世帯を対象に毎日の食事について聞き取りと観察を110日間おこない、食事内容、材料、作り方、摂取頻度を記録した。村内のほかの5世帯にたいしても断続的に同様の調査を実施した。あわせて、じっさいに提供された食品について、健康にかかわる語りの収集と食事の様子の観察をおこなった。本年度の調査により得られた知見は以下である。日々の食事のなかで、彼らがとくに健康と結びつけて認識している食品があることがわかった。代表的な例として、香辛料と自家製のカッテージチーズ(ayb)をもとにつくるマタタイブ(met'at'ayb)と呼ばれる地域独自の副食や、シコクビエやトウモロコシ、クロウメモドキ科の灌木ゲショ(gesho)を味付けの原料とする醸造酒タラ(t'ela)などが挙げられる。語りと行動から、人びとはこれらの飲食物の熟成度合いを、味、健康への効果と結びつけていることがわかった。風味に関して、前者では仕込んでから1週間以上、後者では2ヶ月以上経過したものが好まれる。他方で、6ヶ月以上熟成されたものは食事としてというよりもむしろ薬として摂取される傾向にあった。アムハラの人びとは、仕込み後の時間の経過と味の変化によって、マタタイブとタラのもつ健康の維持と増進に対する効果をとらえていることが明らかになった。[フィールドワーク]本年度の計画では、博士論文執筆のための主要なデータを収集することを研究活動の軸とした。長期フィールドワークをつうじて、現地における日常の医療実践をおおむね計画に沿って進めることができた。本年度の調査中に新たに明らかになった点に、人びとが健康との結びつきをとくに強調する飲食物の原料には彼らが栽培する作物が含まれていたということが挙げられる。健康認識を明らかにするためには、完成品としての飲食物のみを切り離すことはできず、原料となる作物の栽培・収穫の過程も見逃せない。本年度は農繁期後半の作業を観察したにとどまったため、来年度、未観察の過程を観察する予定である。[学会発表]当初の計画どおり、4月には第27回日本ナイル・エチオピア学会学術大会にてポスター発表をおこない(最優秀発表賞受賞)、10月にはエチオピアのメケレ大学にて開催された国際エチオピア学会にて口頭発表をおこなった。この機会に、本年度前半のフィールドワークで収集したデータの整理を進めることができたこと、課題を再検討して本年度後半のフィールドワークにおけるデータ収集に臨むことができた点において有意義であった。本年度のフィールドワークで得られたデータの整理・分析および文献調査を進めて論文を執筆し、『African Study Monographs』へ投稿する。この作業をつうじて、現時点で不足している内容を明らかにしたうえで、6月から8月にかけてエチオピアへ渡航して追加調査を実施する。前年度と異なる時期に調査地に滞在することにより、作物の栽培に関する未観察の過程を調査して重要な植物の栽培過程を詳細に把握するとともに、食事内容を観察して年間を通じた食事の変化を明らかにする。博士論文を執筆する。

長期フィールドワークをつうじて、現地における日常の医療実践をおおむね計画に沿って進めることができた。本年度の調査中に新たに明らかになった点に、人びとが健康との結びつきをとくに強調する飲食物の原料には彼らが栽培する作物が含まれていたということが挙げられる。健康認識を明らかにするためには、完成品としての飲食物のみを切り離すことはできず、原料となる作物の栽培・収穫の過程も見逃せない。本年度は農繁期後半の作業を観察したにとどまったため、来年度、未観察の過程を観察する予定である。[学会発表]当初の計画どおり、4月には第27回日本ナイル・エチオピア学会学術大会にてポスター発表をおこない(最優秀発表賞受賞)、10月にはエチオピアのメケレ大学にて開催された国際エチオピア学会にて口頭発表をおこなった。この機会に、本年度前半のフィールドワークで収集したデータの整理を進めることができたこと、課題を再検討して本年度後半のフィールドワークにおけるデータ収集に臨むことができた点において有意義であった。本年度のフィールドワークで得られたデータの整理・分析および文献調査を進めて論文を執筆し、『African Study Monographs』へ投稿する。この作業をつうじて、現時点で不足している内容を明らかにしたうえで、6月から8月にかけてエチオピアへ渡航して追加調査を実施する。前年度と異なる時期に調査地に滞在することにより、作物の栽培に関する未観察の過程を調査して重要な植物の栽培過程を詳細に把握するとともに、食事内容を観察して年間を通じた食事の変化を明らかにする。博士論文を執筆する。
皮質脊髄路側枝形成に関与するリガンド受容体シグナリングの解明

大脳皮質からの主要な出力路である皮質脊髄路は主軸索より複数の神経核に軸索側枝を伸ばし、脳神経活動の協調性を可能としている。この側枝形成を制御する分子機構を明らかとするべく、我々は、これまでにスクリーニングで得た側枝形成に関与する候補受容体とそのリガンドについて解析を進めた。すると、それら分子が皮質と橋核それぞれで相補的に発現し、その発現パターンが軸索側枝の投射領域の調節に関与する事が明らかとなった。さらに、脳傷害時の代償機構を担う側枝形成に関しても共通の受容体が関与することを示した。このことは、側枝形成現象の共通分子基盤の解明や、神経機能回復への応用などを考える上で、大変意義深い。皮質脊髄路はその途中で複数の神経核に「軸索側枝」を伸ばす。「軸索側枝」は脊髄への出力と同時に複数の神経核に信号を送ることで、脳全体としての神経活動の協調性を実現し、一方で、神経傷害時に傷害領域を越えて伸びることで代償機構としての役割も担う。本研究では、ヒトで高度に進化し、大脳と小脳の協調的な神経活動を担う橋核への「側枝形成」をモデルにその分子基盤を解き明かすことを目的とする。1.平成26年度は、我々がこれまでに、皮質脊髄路起始細胞での網羅的ノックダウン実験から見出した、側枝形成への関与が示唆される候補受容体について、KOマウスの作成をすすめ、そのマウスの脳組織を用いて、軸索側枝への影響を検証した。国内外の研究施設より得た候補受容体のKOマウスおよびその固定脳組織に加えて、3候補受容体に関してはCRISPR/Cas9技術を利用して迅速なKOマウスの作成を行った。各KOマウスについて、DiIトレーサーを大脳皮質運動野に入れ、皮質脊髄路をラベルし、軸索側枝を観察した。すると、その中で、KDによって側枝伸長促進効果がみられた候補受容体は、KOマウスにおいても同様に側枝伸長が促進される傾向が見られた。現在、他の候補受容体KOマウスと共に詳細な解析を進めている。2.受容体候補分子およびリガンドの発現時期、細胞内局在・脳内分布の詳細な解析を行った。今回、解析した中で、1.で述べた、KOマウスで側枝伸長促進効果の観察された受容体は、大脳皮質領野特異的な発現様式を示した。さらに、その受容体に対するリガンドは橋核の特定領域に偏った発現パターンを示したとから、これら分子は皮質領野特異的な軸索側枝の投射パターン制御に関与している可能性が示唆された。候補受容体の一部が、実際に生体内で軸索側枝形成に関与していることを示したことは大変意義深く、次年度以降もその分子機構の解明に向けて研究を進展させる。本研究は、ヒトで高度に進化し、大脳と小脳の協調的な神経活動を担う橋核への側枝形成をモデルにその分子基盤を解き明かすことを目的とする。平成27年度は、これまでのスクリーニング結果から、側枝形成への関与が示唆された6つの候補受容体に対して、ノックアウト(KO)マウスの解析を進めた。その中でノックダウン(KD)およびKOマウスで共に側枝伸長促進と投射の乱れが見られた受容体(#13)に着目し、既知の反発性リガンドと共に発現解析を行い、これら受容体とリガンドは皮質・橋核・小脳で相補的な発現パターンを示すことを見出した。そこで、それぞれを大脳皮質でKDし橋核への側枝を詳細に調べると、側枝伸長促進と共に、橋核における互いの発現領域へ側枝が進入している様子が観察された。逆に、受容体の皮質脊髄路での過剰発現はリガンドが発現する橋核尾側領域への側枝伸長が阻害され、また、リガンドの橋核での過剰発現は、大脳皮質受容体発現領域からの側枝形成を阻害した。このことより、これら分子によって皮質特定領野と橋核特定領域を結ぶ側枝の投射が制御されていることが示唆された。また、当初の実験計画に則り、皮質脊髄路傷害時の代償機構としての軸索側枝形成について、上記で得られた、KOマウスで側枝伸長促進が見られた受容体(#13)の関与を調べた。KOマウスで片側運動野傷害モデルを作成し、Biotinylated dextran amines (BDA)を健常側大脳皮質運動野に注入することで皮質脊髄路をトレースし、4週後に脊髄切片を作成し、正中を越えて傷害側へと伸びる側枝の数をWTと比較した。すると、KOマウスにおいて正中を越えて伸びる側枝の数が増加する傾向が見られた。このことより、代償機構としての軸索側枝形成にも受容体(#13)が関与していることが示唆された。平成27年度の目標である、スクリーニングで得られた候補受容体とそのリガンドについての側枝形成における機能解析を行い、側枝の投射パターン形成への関与を示唆する結果を得た。また、研究計画書に則り、障害時の代償機構としての側枝形成についての実験を行い、上記で得られた受容体(#13)の関与を示唆する結果を得た。以上、平成27年度の当初の実施計画に沿った研究を行い、一定の成果を得ていることから、目標に対して、おおむね順調に進展していると判断した。平成28年度は、昨年度の研究結果から、ノックアウトマウスで側枝伸長促進と投射の乱れが見られた受容体#13と、その受容体に対する既知の反発性リガンドについて、さらなる解析を行った。