hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Dynmaic MRIを用いた軟部腫瘍の診断-MR像と病理との対比による研究-

臨床的に軟部組織より発生したと思われた腫瘤性病変160例に対してMRI検査を施行した.造影MRI,Dynamic MRIはほぼ全例に施行可能であった.手術あるいは生検が施行され,病理組織診断が得られたものは122例で,手術施行例のうち18例においては,MRI像と病理像との詳細な対比検討を行った.最近の55例については,prospectiveにMRIの診断能を検討した.Dynamic MRI所見も加えたMRI像は,肉眼病理像を比較的よく反映していた.それにより.腫瘤内の脂肪成分,脂肪変性,嚢胞成分,液化壊死,粘液腫様成分,硝子軟骨性成分,膠原線維性成分,出血,出血壊死,凝固壊死,おから状成分,vascularityなどの推察がほとんどの症例で可能となり,質的診断において,内部成分の構成とその分布およびに臨床情報からあげた上位3つの鑑別診断にほとんどの症例で合致しており,鑑別診断を絞り込むという当初の目的は達成されたと判断した.疾患別の検討としては,症例の積み重ねにより,特に頻度が高い脂肪性腫瘍,血管性腫瘍,末梢神経腫瘍,粘液基質性腫瘍などの鑑別能の向上がみられた.良悪性の鑑別については,典型的所見を呈する約7割の例では鑑別可能であったが,Dynamic MRIのみでは例外も多く良性と低悪性度の腫瘍との鑑別や悪性と活動性の炎症性腫瘤との鑑別が困難であり,MRI診断の限界が示唆された.治療効果判定には,sizeや内部性状の変化にDynamic MRIのパターンの変化を加えることで,より正確な判定が可能となった.しかし一部の症例でvascularityの増加を再発と誤診したものもあり,今後の課題と思われた.また今年度から造影剤を用い経時的に3-4回繰り返し行うDynamic 3D MR Angiographyを使用し,小病変の発見,関与血管の検索,経時的造影経過の視覚的認識などに有用性が認められた.臨床的に軟部組織より発生したと思われた腫瘤性病変160例に対してMRI検査を施行した.造影MRI,Dynamic MRIはほぼ全例に施行可能であった.手術あるいは生検が施行され,病理組織診断が得られたものは122例で,手術施行例のうち18例においては,MRI像と病理像との詳細な対比検討を行った.最近の55例については,prospectiveにMRIの診断能を検討した.Dynamic MRI所見も加えたMRI像は,肉眼病理像を比較的よく反映していた.それにより.腫瘤内の脂肪成分,脂肪変性,嚢胞成分,液化壊死,粘液腫様成分,硝子軟骨性成分,膠原線維性成分,出血,出血壊死,凝固壊死,おから状成分,vascularityなどの推察がほとんどの症例で可能となり,質的診断において,内部成分の構成とその分布およびに臨床情報からあげた上位3つの鑑別診断にほとんどの症例で合致しており,鑑別診断を絞り込むという当初の目的は達成されたと判断した.疾患別の検討としては,症例の積み重ねにより,特に頻度が高い脂肪性腫瘍,血管性腫瘍,末梢神経腫瘍,粘液基質性腫瘍などの鑑別能の向上がみられた.良悪性の鑑別については,典型的所見を呈する約7割の例では鑑別可能であったが,Dynamic MRIのみでは例外も多く良性と低悪性度の腫瘍との鑑別や悪性と活動性の炎症性腫瘤との鑑別が困難であり,MRI診断の限界が示唆された.治療効果判定には,sizeや内部性状の変化にDynamic MRIのパターンの変化を加えることで,より正確な判定が可能となった.しかし一部の症例でvascularityの増加を再発と誤診したものもあり,今後の課題と思われた.また今年度から造影剤を用い経時的に3-4回繰り返し行うDynamic 3D MR Angiographyを使用し,小病変の発見,関与血管の検索,経時的造影経過の視覚的認識などに有用性が認められた.臨床的に軟部組織より発生したと思われた腫瘤性病変75例に対してMRI検査を施行した。造影MRI、Dynamic MRIは数例を除きほぼ全例に施行可能であった。手術あるいは生検が施行され、病理組織診断が得られたものは約60例で、手術が施工された症例のうち、9例においてはMRI像と病理像との詳細な検討を行なった。軟部腫瘍の良悪性の鑑別に関しては、腫瘍に対して典型的かつ特異的所見を呈する場合には、比較的容易であるものの、そのような所見は比較的少なく、全体的には良悪性ともにoverlapして見られる所見が極めて多く存在するため、その鑑別は困難な場合が多い。しかしながら、MR信号とdynamic MRIにおける腫瘍内の造影パターンを把握することにより、従来に比して良悪性の鑑別の向上が可能となった。治療効果に関しては、従来より、画像上の判定としては腫瘍径の変化が主に使用されていたが、造影MRIでの造影程度やdynamic MRIにおける造影パターンの変化が重要な指標となった症例を経験した。腫瘍径のみならず、造影MRI、dynamic MRIが治療効果判定の指標となりうるものと考えられる。疾患別の検討としては、特に小児に多い横紋筋肉腫と高齢者に多いMaliqnant fibroushistiocytomaについて検討し、比較的特徴的な所見が見られた。病理組織との対比においては、腫瘤内の各種壊死、viable部分、繊維化、粘液基質などの内部性状との比較を行ない、通常のMRIに、さらに造影MRI dynamic MRIを加えることにより内部性状の推察がある程度可能であることが判明した。

臨床的に軟部組織より発生したと思われた腫瘤性病変105例(通算)に対してMRI検査を施行した.造影MRI, Dynamic MRIはほぼ全例に施行可能であった.手術あるいは生検が施行され,病理組織診断が得られたものは82例で,手術施行例のうち10例においては,MRI像と病理像との詳細な対比検討を行った.Dynamic MRI所見も加えたMRI像は,肉眼病理像を比較的よく反映していた.それにより.腫瘤内の脂肪成分,脂肪変成,嚢胞成分,液化壊死,粘液腫様成分,硝子軟骨性成分,膠原線維性成分,出血,出血壊死,凝固壊死,おから状成分,vascularityなどの推察が可能となり,これらの構成成分とその分布から,臨床上鑑別にあげられる疾患をさらにしぼりこむことができた.疾患別の検討としては,前年度から引続いているmalignant fibrous histiocytomaについての亜型別,局在別検討,粘液型を主体とした脂肪肉腫の検討などを行い,疾患にある程度特徴のある所見を認めることができた.良悪性の鑑別については,典型的所見を呈する過半数の例では比較的容易に鑑別可能であったが,良性と低悪性度の腫瘍との鑑別や悪性と活動性の炎症性腫瘤との鑑別においては,パターンにオーバーラップが多く,MRI診断の限界が示唆された.今後,MR spectroscopyやMIなど他の検査法との併用が必要かもしれない.治療効果判定には,Dynamic MRIのパターンの変化も一指標となり得たが,一部の症例でvascularityの増加を再発と誤診したものもあり,今後の研究課題と思われた.今年度にMRI検査を施行した軟部腫瘍性病変55例について,前年度までの研究成果を基にしてprospectiveにMRIの診断能を検討した.Dynamic MRII所見を加えたMRI像による内部成分の推察はほとんどの症例でほぼ可能であった.ただし量的に少ない成分については指摘できない例があり,現段階のMRIの限界と思われ,さらに高分解能の撮像法が必要と思われた.質的診断については,内部成分の構成とその分布およびに臨床情報からあげた上位3つの鑑別診断にほとんどの症例で合致しており,鑑別診断を絞り込むという当初の目的は達成されたと判断した.上位3つの鑑別診断に含まれなかった症例は,極めてまれな例(腫瘍自体,発生部位,発生年齢),炎症などの付随した変化が強い例であった.疾患別の検討としては,症例の積み重ねにより,特に頻度が高い脂肪性腫瘍,血管性腫瘍,末梢神経腫瘍,粘液基質性腫瘍の鑑別能の向上がみられた.良悪性の鑑別については,典型的所見を呈する約7割の例では鑑別可能であったが,Dynamic MRIのみでは例外も多く良性と低悪性度の腫瘍との鑑別や悪性と活動性の炎症性腫瘤との鑑別が困難であり,MRI診断の限界が示唆された.治料効果判定には,sizeや内部性状の変化Dynamic MRIのパターンの変化を加えることで,より正確な判定が可能となった.しかし,一部の症例でvascularityの増加を再発と誤診したものもあり,今後の研究課題と思われた.また今年度から造影剤を用い経時的に3-4回繰り返し行う3D MD Angiographyを使用し,小病変の発見,関与血管の検索,経時的造影経過の視覚的認識などに有用性が認められ,新しい診断手技として今後発達する可能性が示唆された.
分化転換におけるRNA代謝解析

本研究は細胞が分化転換した際に細胞内で起きるRNA代謝がどのように代謝されているのかを解析することを目的としている。そこで分化転換のモデル細胞として、TGFB2を加えることで容易に上皮間葉転換がおきるA549細胞を用いた。またRNA代謝は実際にRNA代謝が行われているProcessingbody(PB)と呼ばれるRNAとタンパク質の複合体に含まれるRNAを解析することで評価する。このPBにはDDX6と呼ばれるタンパク質が分化転換時にFociを形成することが知られている。そこで我々はDDX6タンパク質と蛍光タンパク質を融合したレトロウィルスベクターを作製し、A549細胞に導入した。A549にEGFPを融合したDDX6をレトロウィルスにて感染し、GFP強度の高い分画をソーティングし、A549-EGFP-DDX6 highregion(以下、A549EDhとする)を樹立し、single cell sortingによる細胞の純化も試みた。この細胞にTGFB2による刺激を加え、二日後に細胞を回収した。回収した細胞は既報の論文(Hubstenberger A. Mol Cell. 2017)をもとに細胞質からPBを単離し、cell sorter SH800(SONY社)によるソーティング条件を検討した。この結果、EGFP-DDX6感染させた細胞株に特異的な分画を見出すことができ、その部位の回収に成功した。回収したRNAはBioAnalyzerにてRNA純度を評価したところ、微量ながらも長鎖RNAが含まれていることが明らかとなった。現在は微量RNA-seq解析を進めており、その結果の解析を次のステップとして考えている。モデル細胞(A549EDh)の作成と分化転換誘導法と評価法は確立済みでFACSを用いたPBのソーティングも上手くいっている。現在は回収したRNAサンプルをRNA-seqに外部委託先に提出しており、その解析結果を待っている。以上のことから概ね順調に進展しており、本結果の一部は2019年度の国内学会にて発表を予定している。PBに特異的に存在するRNAを特定し、各条件との関連を比較しながら網羅解析等の手法で決定していく。この結果をもとにFACSによるPBソーティングが上手くいっているのかを評価しつつ、生物学的な意義も決定していく。次にこの特異的なRNAをCRISPR法でKnock outし、A549の分化転換に与える影響を遺伝子発現解析等で評価する。
ブタモデルにおけるビタミンB2ワンショット肺マーキング法の確立

近年、小型肺癌の増加と共に肺マーキングの必要性が高まっている。理想的な肺マーキングには確実性、簡便性、安全性が極めて重要である。当教室ではビタミンB2および蛍光内視鏡を利用した経気道的肺マーキング法を開発した。しかし臨床では気管支鏡を用いた術前肺マーキング法は時間を要し、操作が煩雑である。今回、ビタミンB2を経皮的に直接肺に注入することで更なる簡便性を求めた。また、蛍光内視鏡は高価なため、ブラックライトによりビタミンB2が蛍光を発する性質を用いて本法の実用化を目指した動物実験を行う。この研究によりこれまでにない安全かつ簡便で画期的なビタミンB2ワンショット肺マーキング法の臨床応用が可能となると考える。
死海文書に基づく旧約聖書の原型探究-「歴史書と預言書」

ヘブライ語聖書の第2区分であるネヴィイーム(預言者)に属する8つの書物(ヨシュア記、士師記、サムエル記、列王記、イザヤ書、エレミヤ書、エゼキエル書、十二小預言書)の本文生成過程を、主として死海文書資料、七十人訳ギリシア語聖書との照応関係と乖離・不整合に関する比較研究を通して、紀元前3世紀以降、紀元後1世紀に亘る期間について追究し、現在の欧米の学界での成果に迫る基本的理解を得ることが出来た。第1年度には、研究の第一段階と位置づけたネヴィイーム(「預言者」)に属する個々の諸文書、前半のヨシュア記、士師記、サムエル記、列王記と後半のイザヤ書、エレミヤ書、エゼキエル書、十二小預言書に関して、死海文書が照射する新しい視座からの精査を分担して行った。イザヤ書に関してはほぼ完全な写本である1QIsaiah^aとそれより古い1QIsaiah^bの新版が漸く年度末に補遺として出版され、今後の新しい研究が可能になった。エレミヤ書に関しては、マソラ本文と七十人訳ギリシア語聖書との構成上の乖離が大きく、その生成過程と伝承過程について本文研究が焦眉の急であるが、エレミヤ書は預言書研究のみならず、その編集問題は、前半の歴史書研究、殊にいわゆる申命記史家によるバビロン捕囚期の記述とペルシア時代の復興問題に関する記述とも密接に関わりがあり、両方の側からの連携研究が今後の課題となることが判明してきた。その他の預言書全てについて死海文書は新しい資料を提供し、従来の本文研究の再検討を迫っていることを確認したので、今後これらの作業が集中して行なわれる。平成23年3月8日(立教大学)の研究集会で、個々の研究者の1年間の研究成果の発表と、平成24年度に計画されている国際研究集会での研究発表の分野の分担責任と招聘者の選考を行った。また、この研究集会の直前に前回の基盤研究(B)の成果が『古代世界におけるモーセ五書の伝承』(京都大学学術出版会)として出版されたので、これを再検討しながら、今後の研究を進めることとなった。連携研究者:月本昭男立教大学・文学部・教授、山我哲雄北星学園大学・文学研究科・教授、山田重郎筑波大学・人文社会科学研究科・教授、勝村弘也神戸松蔭女子学院大学・文学部・教授当該年度は、研究分担者2名と連携研究者2名が長期に亘る在外研究となったため、全体の研究集会を持つことが物理的に不可能となったため、第1年度末の研究集会(平成23年3月8日、立教大学)で確認した研究者個々人の課題にそれぞれが従事することとなった。研究代表者の守屋彰夫は、ネヴィイーム前半部の「前の預言者」(ヨシュア記、士師記、サムエル記、列王記)と後半部の「後の預言者」(イザヤ書、エレミヤ書、エゼキエル書、十二預言書)でのバビロン捕囚に関する記述の精査を行い、両者の照応関係と乖離・不整合関係に関するやや煩環な本文研究に集中した。また、残存している死海文書の該当箇所との比較研究を行い、第二神殿時代後半の本文伝承過程の研究成果に拠りながら、ネヴィイームの原型探究作業を行った。これと併せて、サマリア五書に関する研究をも継続して行い、モーセ五書とネヴィイームの形成過程との相互関連にも注意を払った。研究分担者の秦剛平は七十人訳ギリシア語聖書の「前の預言者」の本文研究の傍ら、翻訳作業を進め、出版の準備を行っている(歴史書部分の翻訳は既に完了)。ゲッチンゲン版の本文校訂作業が進行する中で、英語圏でも多数の研究者による新たな翻訳が完成したが、その動向に呼応するものである。研究分担者の佐藤研は、七十人訳ギリシア語聖書の新約聖書研究に集中し、パウロの伝道旅行での精神活動の軌跡を1冊に纏めた。連携研究者の山田重郎は、ハイデルベルグ大学での在外研究の傍ら、古代オリエントの歴史資料と旧約聖書の歴史記述との比較など幅広く研究を推し進め、ドイツとイタリアのいくつかの大学で研究発表をこなした。連携研究者の月本昭男、山我哲雄、勝村弘也は歴史書と預言文学の研究を、死海文書研究を視野に個別に研究を進めている。研究者個々人の研究は順調に進んでいると言えるので、最終年度に全員での総合研究の場を設定し、成果を残す準備が整いつつある。研究代表者の守屋彰夫は、ヘブライ語聖書の第二区分のネヴィイーム(預言者)は前年度からの研究課題である「前の預言者」と「後の預言者」に属する8つの書物でのバビロン捕囚に関する記述の精査を行い、それらの書物間の照応関係と乖離・不整合に関する本文研究を行った。また、近年、バビロン捕囚期(前6世紀初めからの半世紀間)のパレスチナに関する考古学的研究が進捗したので、その成果をも取り込んだ本文研究にするよう注意を払った。

またネヴィイーム(預言者)に属する本文と前回の科研で取り扱ったモーセ五書の生成発展過程は、現在の段階ではどちらかを前提(既存)にして他方の生成発展過程を論ずることが出来ないという学界の動向に鑑み、必然的にモーセ五書の生成発展についての研究をも並行して進めることとなった。その成果をエルフルト(ドイツ)での第8回サマリア五書研究国際学会(2012年7月1520日)で発表する機会を得た。またこの学会での議論を通して、サマリア五書研究が旧約聖書の原型探究に、死海文書研究とともに大いに寄与することを学び、この分野の研究との交流を深めることが出来た。研究分担者の佐藤研は前年度から引き続き、七十人訳ギリシア語聖書(旧約聖書と所謂旧約聖書続編部分など)が新約聖書でどのように引用され、ヘレニズム時代末期の文化状況の中で解釈されていたかを探究し、2冊の単行本に纏めた。研究協力者(昨年度まで研究分担者。退職により、研究協力者として残る)秦剛平は、七十人訳ギリシア語聖書の翻訳作業を推し進める傍ら、オックスフォード大学とケンブリッジ大学でフェローとして研究教育活動に従事し、両大学で行われた学会での研究発表(3回)を行った。また、ネヴィイーム(預言者)部分を対象にした著書を2冊に纏めた。連携研究者の月本昭男、山田重郎、山我哲雄、勝村弘也は業績欄にある通り国内外でそれぞれこの研究課題に貢献をした。9.研究実績の概要で述べたように、在外研究者が続出したため、全体の研究の進捗状況は、相互の連絡に基づいているが、個々の研究者の研究は概ね、所期の目的を達成していると考えられる。最終年度には研究集会を公開で開ける準備が整っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度に当たる今年度の3月に全体の研究集会を公開で開催し、成果を問う予定でいる。海外からの研究者(Professor Hugh G.M.Williamson,University of Oxford)の招聘が実現した場合には、彼も参加した研究集会になり、死海文書研究、預言書研究、第二神殿時代史研究のどの分野でも現在の国際的レヴェルでの研究発表が求められるので、その方向への準備をすることになっている。また、この成果も前回の基盤研究同様、日英両語での出版を予定している。前回の基盤研究成果としての英語版は、13研究発表(平成23年度の研究成果)の図書の項目の冒頭に記載してある。このBrill Academic Pressからの英語版は、日本も死海文書研究の1つの拠点として名乗りを挙げたものとして高い評価を得ている。その日本語版は前年度の成果の中に掲載した(秦剛平、守屋彰夫編著『古代世界におけるモーセ五書の伝承』、京都大学学術出版会、2011年2月刊)。
アミノ酸およびヌクレオチドを配位した遷移金属多核錯体の合成と反応

[Fe_3(μ_3ーO)(μーRCO_2)_6(L)_3]^<n+>(μーRCO_2:架橋型配位カルボン酸イオン,L:単座配位子)の架橋配位子をカルボン酸イオン(R=CF_3,CCL_3,CH_3CH_2)やアミノ酸両性イオンとするFe^<III>_3型三核錯イオンの過塩素酸塩またはFe^<III>_2Fe^<II>型三核錯体を合成単離した.また,ジカルボン酸(マロン酸,フマル酸,oーフタル酸)イオンを架橋配位子として,その配位子により三核単位構造がさらに2個から数個結合した構造の,Fe^<III>_3型三核錯体多量体も合成した.これらの錯体の有機溶媒中における電気化学的測定より酸化還元挙動を明らかにした.Fe^<III>_3【double half arrows】Fe^<III>_2Fe^<II>+e【double half arrows】Fe^<III>Fe^<II>_2+2eのそれぞれの過程に対応する酸化還元電位は,架橋配位子や単座配位子Lの性質に大きく依存した.特に,三核多量体においては架橋配位子を通しての鉄中心どうしの相互作用がみられるものがあることがわかった.モリブデン(IV)三核錯体[Mo_3(μ_3ーO)(μーCCH_3)(μーCH_3CO_2)_6(L)_3]^+の単座配位子としてイミダゾ-ル,γーピコリン,4ーアミノピリジンなどを持つものを新たに合成し,BF_4^ー塩として単離した.またLがアミノ酸やヌクレオチドなどの配位子と置換するかどうかを,紫外可視吸収, ^1HNMRなどにより調べ,新しい錯体を合成する経路についての手がかりを得た.またモリブデン(V)二核錯体[Mo_2O_2S_2(H_2O)_6]^<2+>,およびモリブデン(IV)三核錯体[Mo_3O_4(H_2O)_9]^<4+>と,各種ヌクレオチドとの水溶液内での錯形成について, ^1HNMR,紫外可視吸収,円二色性スペクトルを用いて調べ,溶液のpHにより配位部位が異なることを明らかにした.[Fe_3(μ_3ーO)(μーRCO_2)_6(L)_3]^<n+>(μーRCO_2:架橋型配位カルボン酸イオン,L:単座配位子)の架橋配位子をカルボン酸イオン(R=CF_3,CCL_3,CH_3CH_2)やアミノ酸両性イオンとするFe^<III>_3型三核錯イオンの過塩素酸塩またはFe^<III>_2Fe^<II>型三核錯体を合成単離した.また,ジカルボン酸(マロン酸,フマル酸,oーフタル酸)イオンを架橋配位子として,その配位子により三核単位構造がさらに2個から数個結合した構造の,Fe^<III>_3型三核錯体多量体も合成した.これらの錯体の有機溶媒中における電気化学的測定より酸化還元挙動を明らかにした.Fe^<III>_3【double half arrows】Fe^<III>_2Fe^<II>+e【double half arrows】Fe^<III>Fe^<II>_2+2eのそれぞれの過程に対応する酸化還元電位は,架橋配位子や単座配位子Lの性質に大きく依存した.特に,三核多量体においては架橋配位子を通しての鉄中心どうしの相互作用がみられるものがあることがわかった.モリブデン(IV)三核錯体[Mo_3(μ_3ーO)(μーCCH_3)(μーCH_3CO_2)_6(L)_3]^+の単座配位子としてイミダゾ-ル,γーピコリン,4ーアミノピリジンなどを持つものを新たに合成し,BF_4^ー塩として単離した.またLがアミノ酸やヌクレオチドなどの配位子と置換するかどうかを,紫外可視吸収, ^1HNMRなどにより調べ,新しい錯体を合成する経路についての手がかりを得た.またモリブデン(V)二核錯体[Mo_2O_2S_2(H_2O)_6]^<2+>,およびモリブデン(IV)三核錯体[Mo_3O_4(H_2O)_9]^<4+>と,各種ヌクレオチドとの水溶液内での錯形成について, ^1HNMR,紫外可視吸収,円二色性スペクトルを用いて調べ,溶液のpHにより配位部位が異なることを明らかにした.
H3K36メチル化転移酵素Mmsetの造血幹細胞における機能の解明

ヒストンH3リジン36番目のメチル化修飾酵素であるWHSC1(NSD2,MMSET)KOマウスおよびVav1-Creコンディショナルノックアウトマウスの造血機能の解析を実施した結果、成体マウス造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell; HSC)数はコントロールWTと比較して数が増加していたものの、in vivoで移植実験を実施するとHSCの長期骨髄再構築能の低下が確認された。転写領域にマークされるヒストンH3の36番目リジン残基メチル化(H3K36me1/2/3)の転移酵素の一つであるWHSC1(NSD2,MMSET)はいずれも造血異常を伴う疾患である多発性骨髄腫、Wolf-Hirschhorn症候群の原因遺伝子であるが、HSCの自己複製能と多分化能にどのように関わるか、その機能解析は乏しく明らかでない。そこで我々はWhsc1ノックアウト(KO)マウス及びコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを用いて造血機能の解析を行った。Whsc1 KOマウスは生後致死であることから、胎生14.5日の胎仔肝を用い競合移植を実施した。その結果、末梢血及び造血幹細胞のキメリズム低下が観察できたことからWhsc1欠損HSCは造血再構築能が低下していること、そしてHSCの幹細胞活性にWhsc1の分子機能が重要であることが確認された。一方、Whsc1 cKOは、1造血発生に従って造血特異的にCreを発現させWhsc1を欠損させるVav1-Creの系と2タモキシフェン誘導的にWhsc1を欠損させるCre-ERtの系を用いて競合移植を行った。その結果、前者ではKOマウスと同様の結果が観察できたものの、後者では末梢血及び造血幹細胞のキメリズム低下の表現形が緩和される結果になった。これまでの研究からWhsc1はH3K36me2/3修飾を介してDNAダメージ修復に関与することが明らかになってきていることから、cKOでみられた表現形の違いはWhsc1欠損してからの経過時間の違いによるDNAダメージの蓄積の違いであると想定している。造血特異的にMmsetを欠損できるVav1-Cre;Mmsetfl/flコンディショナルノックアウトマウスを育成し、生後8週で造血幹細胞(HSC)数等の造血解析をFACSを用いて実施したところ、コントロールマウスと比較してHSCの数が変わらない個体と増加している個体と2種類が認められ、少なくとも数の減少がみられないことを確認した。しかしながら同じマウスから骨髄を摘出し骨髄移植を実施した結果、主にリンパ球系への再構築能が低下しており、HSCの機能低下が示唆された。WHSC1(NSD2,MMSET)はヒストンH3リジン36番目のジ、トリメチル化(K36me2/3)修飾を介してDNAダメージ修復に関与することが近年報告されている分子である。前年度までに、Whsc1 KOマウスは生後致死で、胎生14.5日の胎仔肝を用い競合移植を実施した結果、末梢血及び造血幹細胞のキメリズム低下が観察できたこと、Vav1-Cre;Whsc1コンディショナルノックアウトマウスの成体造血機能の解析を実施して、成体マウス造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell; HSC)数はコントロールWTと比較して数が増加していたものの、in vivoで移植実験を実施するとHSCの長期骨髄再構築能の低下が確認された。HSCの数が増えるものの、その能力が低下しているというフェノタイプはDNAダメージ修復分子を欠損させたHSCに度々みられる。これらの情報を鑑み、Whsc1はHSCのDNA損傷修復に必要である、と仮定してDNA損傷修復関連遺伝子の発現を見るためにRNA-Seqを実施しようと計画した。RNA-Seqに使用するHSCのサンプリングは行なったが、実施、解析に至っていない。本年6月に研究協力者のCobaleda氏から我々のKOマウスを使用して、造血の解析を行った報告が出された。それによると、Whsc1欠損細胞でファンコニ貧血(Fanconi Anemia; FA)関連因子の発現上昇がみられる。また、Whsc1欠損マウス線維芽細胞(MEF)およびB細胞は複製フォーク数の減少および複製速度の減少がみられる。現在、FAノックアウトマウスを使用できる環境を得たので、今後はこれらの結果を念頭に、Whsc1とFAとの関連を検討して行きたい。これまでの報告から、MmsetはH3K36me2/3を介してDNAダメージ修復に関与する可能性がある。また、HSCはDNAダメージが入ると分化に比較して自己複製の効率を上げることが明らかになっており、Vav1-Cre;Mmsetfl/flコンディショナルノックアウトマウスのHSC数が増加していることはMmset欠損マウスでDNAダメージが増加している可能性を示唆している。今後はHSCの網羅的遺伝子発現解析(RNA-Seq)を試みて実際にDNAダメージ修復因子が変動しているか、H3K36me2/3はどのように変動しているかを明らかにしてゆきたい。血液学
新規な1,1-ジチオレートを配位子とするオキソモリブデン錯体の合成と反応性

本研究の目的は、1,1-ジチオレート配位子がオキソモリブデン錯体の酸化還元反応性に及ぼす影響について系統的に検討することである。得られた成果を以下にまとめた。1)[MoO_2(RR'dtc)_2]のジチオカルバミン酸イオン上の置換基Rをいろいろと変えた錯体19種を合成し、得られた錯体とPPh_3との間の酸素原子移動反応の速度定数(k_1)を系統的に調べた。その結果、k_1は置換基によって大きく変化し(50倍の範囲)[MoO_2(RR'dtc)_2]の第1還元電位とlog(k_1)とは比例関係にあることがわかった。ただし、ジチオカルバミン酸イオン上の2つ置換基ともにフェニル基やベンジル基である場合には、相関からはずれる。これは錯体のオキソ配位子の強いトランス影響によると考えられた。2)分子内に2つの1,1-ジチオレート部をもつ新規なポリジチオカルバミン酸イオンを配位子とするcis-ジオキソモリブデン錯体の合成に成功した。この錯体とPPh_3との酸素原子移動反応を調べたところ1)で述べた錯体の酸素原子移動反応とは異なった反応をすることがわかった。これは、本研究で合成した新規なジチオカルバミン酸イオンの立体的な要因によるものと考えられた。3)ジチオカルバミン酸イオンを配位子とするオキソモリブデン(IV)錯体を本研究で申請した合成装置によって合成することができた。この錯体の還元電位はジチオカルバミン酸イオン上の置換基の影響を受けるが、酸化電位は影響を受けない。一方、還元電位は溶媒による影響は受けないが、酸化電位は影響を受けることがわかった。4)ジチオカルバミン酸イオンを配位子とするオキソバナジウム(IV)錯体も本研究で申請した合成装置によって合成することができた。還元電位は置換基の影響を受ける。影響の受け方をcis-ジオキソモリブデン(VI)錯体と比較したところcis-ジオキソモリブデン(VI)錯体の方が配位しているチオレートとのπ的な相互作用が重要であることがわかった。以上の成果については1)は学術雑誌に投稿中であり、その他については投稿の準備を進めている。本研究の目的に沿った、さまざまな、1,1-ジチオレート配位子の合成を行い、新規錯体を含む、19種のcis-ジオキソモリブデン(VI)錯体の合成を行った。これらの錯体は後続反応を含む電気化学的1電子還元を受けることがわかった。また、これらの錯体の1電子還元過程の酸化還元電位は、1,1-ジチオレート配位子上の置換基の性質によって、広い範囲で変化することがわかった。特に置換基としてフェニル基を導入した場合、酸化還元電位は特徴的な変化を示したので、そのことに対する考察を行った。さらに、これらの錯体とPPh_3との酸素原子移動反応の速度定数は、錯体の1電子還元過程の酸化還元電位と良い相関があることが明確となった。合成した錯体の典型的なものの、構造をX-線回折によって、決定した。

M=O結合の強いトランス効果が確認され、配位子の結合様式が、その効果によって、選択的に決定されるであろうと考えられた。そして、それが、酸化還元電位や速度定数の変化に重要な影響を及ぼすことを結論した。その他、各種の物性測定なども行った。溶液中でのMo=Oの伸縮振動は1,1-ジチオレート配位子の性質によってある程度影響は受けるが、伸縮振動数の変化に、一定の限界があることがわかった。1,1-ジチオレート部分の^<13>CNMRの化学シフトは、錯体の配位子となっているときの方が、そうでないときに比べて、高磁場であることがわかった。以上の成果については論文としてまとめ、学術雑誌に投稿の準備を進めている。本研究の目的は、1,1-ジチオレート配位子がオキソモリブデン錯体の酸化還元反応性に及ぼす影響について系統的に検討することである。得られた成果を以下にまとめた。1)[MoO_2(RR'dtc)_2]のジチオカルバミン酸イオン上の置換基Rをいろいろと変えた錯体19種を合成し、得られた錯体とPPh_3との間の酸素原子移動反応の速度定数(k_1)を系統的に調べた。その結果、k_1は置換基によって大きく変化し(50倍の範囲)[MoO_2(RR'dtc)_2]の第1還元電位とlog(k_1)とは比例関係にあることがわかった。ただし、ジチオカルバミン酸イオン上の2つ置換基ともにフェニル基やベンジル基である場合には、相関からはずれる。これは錯体のオキソ配位子の強いトランス影響によると考えられた。2)分子内に2つの1,1-ジチオレート部をもつ新規なポリジチオカルバミン酸イオンを配位子とするcis-ジオキソモリブデン錯体の合成に成功した。この錯体とPPh_3との酸素原子移動反応を調べたところ1)で述べた錯体の酸素原子移動反応とは異なった反応をすることがわかった。これは、本研究で合成した新規なジチオカルバミン酸イオンの立体的な要因によるものと考えられた。3)ジチオカルバミン酸イオンを配位子とするオキソモリブデン(IV)錯体を本研究で申請した合成装置によって合成することができた。この錯体の還元電位はジチオカルバミン酸イオン上の置換基の影響を受けるが、酸化電位は影響を受けない。一方、還元電位は溶媒による影響は受けないが、酸化電位は影響を受けることがわかった。4)ジチオカルバミン酸イオンを配位子とするオキソバナジウム(IV)錯体も本研究で申請した合成装置によって合成することができた。還元電位は置換基の影響を受ける。影響の受け方をcis-ジオキソモリブデン(VI)錯体と比較したところcis-ジオキソモリブデン(VI)錯体の方が配位しているチオレートとのπ的な相互作用が重要であることがわかった。以上の成果については1)は学術雑誌に投稿中であり、その他については投稿の準備を進めている。
腫瘍血管内皮細胞特異抗原をターゲットとした治療法の研究・開発

血管新生は癌の増殖、進展に重要な役割を果たしており、臨床試験でも血管新生と癌の転移や患者の予後との有意な関係が報告されている。新生血管をターゲットとした治療法の開発は癌の治療、特に手術的切除不能症例や転移例の治療に大きく貢献する可能性が考えられる。本研究では新生血管内皮細胞に特異的に発現する抗原をターゲットとした治療法を開発し、臨床への応用を目的とした。我々は血管新生誘導因子であるVEGF、basic FGF等で刺激した臍帯静脈由来の内皮細胞(HUVEC)をマウスに免役し、内皮細胞と反応する抗体を作製した。作製した抗体のうち、大腸癌組織における腫瘍内及び周囲の血管の内皮細胞と特異的に反応する抗体を選別し、解析を行ってきた。腫瘍血管内皮細胞と特異的に反応する抗体のうち、エンドグリンやインテグリンであるαVβ3等を認識する抗体が得られた。免疫染色では、大腸癌、胃癌、乳癌、脳腫瘍の腫瘍血管内皮細胞に特異的に反応し、それらの正常組織の内皮細胞とは反応性を示さないことが確認された。また、マウスを用いた大腸癌肺転移モデルにおいても、これらの抗体を投与することにより、転移個数の有意な減少が認められた。以上より、血管新生のターゲッティングは癌治療の新たなストラテジーになる可能性があり、今後ヒトへの投与を考慮し、更に研究を発展させる予定である。我々は腫瘍血管内皮細胞をターゲットにした新しい癌治療法の開発を目指した研究を行っている。腫瘍血管内皮細胞に特異的に発現する抗原を固定するため、次の2つのアプローチを試みている。(1)腫瘍内血管に発現す既知の抗原の固定;(2)新たな抗体作製により、未知の腫瘍血管内皮特異抗原の固定。(1)に関しては、大腸癌組織及び正常粘膜の免疫染色を行い、以下の物質の腫瘍組織及び内皮細胞における発現を調べた。今回注目したのは、癌の浸潤に必要な酵素であるマトリックス・メタロプロテイナーゼ(以下MMP)、血管新生との関係が報告されているPlatelet-derived enothelialcell growthfactor(PD-ECGF)及びCyclooxygenase-2(以下COX-2)である。今回の検討では、MMP-1(文献1)、COX-2(投稿中)は主に癌細胞に発現が認められ、内皮細胞における発現はほとんど見られなかった。COX-2の特異的阻害剤により、大腸癌の血行性転移が抑制されることも証明した(文献2、3)。また、PD-ECGFは腫瘍間質に湿潤するマクロファージに発現ししており(文献4)、腫瘍細胞及び内皮細胞にはほとんど発現していなかった。しかし、炎症組織においては内皮細胞におけるPD-ECGFの強発現が認められた。(2)については、現在抗体作製を試みている段階である。我々は腫瘍血管内皮細胞をターゲットとした癌治療法の開発を目的として腫瘍血管内皮細胞特異抗原について研究を進めてきた。まずヒト臍帯静脈より内皮細胞の分離・培養を行い、数多くの内皮細胞を凍結・保存した。このヒト臍帯静脈内皮細胞を血管新生誘導因子(VEGF,FGF)による刺激環境下に培養し、これをマウスに免疫してリンパ球を採取し、マウスリンパ球と骨髄腫細胞との融合により約500のHybridomaを作製した。得られたHybridomaの培養上清について、血小板での方法と同様にヒト臍帯静脈内皮細胞を固相化したU底96穴プレートを用いてMixed-passive hemagglutination(MPHA)法に準じスクリーニングを行った。その結果、数10種類のヒト臍帯静脈内皮細胞に対する抗体を産生するHybridomaが選択された。さらにこれらの抗体について大腸癌凍結切片免疫染色によるスクリーニングを行い、大腸癌の腫瘍血管内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体が数種類得られた。

Flow cytometryによりヒト臍帯静脈内皮細胞,血管新生因子で刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞、血小板、顆粒球、単球およびリンパ球についてそれぞれの抗体に対する抗原の発現を解析したところ、いずれの抗体もヒト臍帯静脈内皮細胞と血管新生因子で刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞には強く発現していたが、血小板など他の血球には発現を認めなかった。現在、Hybridomaをマウスに腹腔内投与して腹水を採取し、担癌マウス(colon26接種)に投与して動物実験モデルにおける抗体の腫瘍抑制効果について検討している。また同時に、作製したモノクローナル抗体が認識する腫瘍血管内皮細胞特異抗原を検出するため免疫沈降法等を用いて解析を進めている。血管新生は癌の増殖、進展に重要な役割を果たしており、臨床試験でも血管新生と癌の転移や患者の予後との有意な関係が報告されている。新生血管をターゲットとした治療法の開発は癌の治療、特に手術的切除不能症例や転移例の治療に大きく貢献する可能性が考えられる。本研究では新生血管内皮細胞に特異的に発現する抗原をターゲットとした治療法を開発し、臨床への応用を目的とした。我々は血管新生誘導因子であるVEGF、basic FGF等で刺激した臍帯静脈由来の内皮細胞(HUVEC)をマウスに免役し、内皮細胞と反応する抗体を作製した。作製した抗体のうち、大腸癌組織における腫瘍内及び周囲の血管の内皮細胞と特異的に反応する抗体を選別し、解析を行ってきた。腫瘍血管内皮細胞と特異的に反応する抗体のうち、エンドグリンやインテグリンであるαVβ3等を認識する抗体が得られた。免疫染色では、大腸癌、胃癌、乳癌、脳腫瘍の腫瘍血管内皮細胞に特異的に反応し、それらの正常組織の内皮細胞とは反応性を示さないことが確認された。また、マウスを用いた大腸癌肺転移モデルにおいても、これらの抗体を投与することにより、転移個数の有意な減少が認められた。以上より、血管新生のターゲッティングは癌治療の新たなストラテジーになる可能性があり、今後ヒトへの投与を考慮し、更に研究を発展させる予定である。
オートファジーの集学的研究：分子基盤から疾患まで

本新学術領域研究は、オートファジーの研究を推進するために、無細胞系構成生物学、構造生物学、細胞生物学、マウス等モデル生物学、ヒト遺伝学、疾患研究を有機的に連携させた集学的研究体制を構築することを目的として設置された。本総括班では、領域における計画研究および公募研究の推進(企画調整)と支援を行うとともに、班会議・シンポジウムの開催、領域活動の成果の発信、「Autophagy Forum」の開設と運営、プロトコール集公開などを行った。オートファジーの包括的研究体制を構築すべく、本年度は計画研究を中心としてオートファジーに関する研究の推進と、領域に関連する情報の収集・発信・交換等を行った。採択後直ちにホームページを設置し、領域内の情報の交換の場として有効に活用した。また、班員の成果およびオートファジーに関連した論文を紹介するオートファジーフォーラムを開設した。平成26年3月31日現在20報の論文が紹介され、領域内の情報交換に寄与した。今度も活発な討論がなされることが期待される。第1回班会議は平成25年12月19日21日に静岡県掛川市で行った。これはオートファジー研究会と合同で行い、170名を超える参加があった。また、この間第1回総括班会議を開催し、本年度事業の報告と来年度の計画を協議した。領域全体の効率的な研究支援としては、本領域で共有する設備である高解像度4Dイメージシステム、リアルタイムコンフォーカル顕微鏡(ニポウディスク顕微鏡ユニット)を購入し、東京大学・医学系研究科に設置した。これらは順調に運営、使用されている。創薬等支援技術基盤プラットフォーム情報拠点で扱われている、オートファジーデータベースと連携し、データベースの充実化に貢献した。本年度は6件の計画研究に加えて21件の公募研究が加わり、オートファジーの集学的研究体制を整えた。本総括班では、昨年に引き続き、オートファジーに関する研究の推進と、領域に関連する情報の収集・発信・交換等を行い、班会議やHPを通じて領域内の交流の活発化を図った。また、公募班員を含めた班員名簿を作成した。ホームページでは、領域内のニュースや求人情報などを発信した。昨年開設したオートファジーフォーラムは班員の成果およびオートファジーに関連した論文の紹介サイトとして順調に運営されている。紹介された論文数は平成27年3月31日現在45報となり、領域内の情報交換に寄与している。また、本年度は新たにホームページにオートファジープロトコール集をアップロードした。これは班員が手分けして作製したもので、班内外の研究者がオートファジー研究を行う際に大きな助けとなると考えられる。た、昨年度から継続して、創薬等支援技術基盤プラットフォーム情報拠点のオートファジーデータベースと連携し、データベースの充実化に貢献した。第2回班会議は平成26年11月9日11日に北海道札幌市で行った。これはオートファジー研究会と合同で行い、161名の参加があった。初日の9日は大学院生やポスドクによって企画・発表された「若手の会」とし、若手の育成を図った。また、この間第2回総括班会議を開催し、本年度事業の報告と来年度以降の計画を協議した。本領域で共有する設備である顕微鏡システムは順調に運営され、計画班員、公募班員によって使用されている。本年度は6件の計画研究と20件の公募研究(1件は他の新学術領域との重複のため廃止)に加えて、11月からは国際活動支援班が加わった構成となった。領域のホームページでは、これまでどおり領域内のニュースや求人情報などを発信した。Webベースのオートファジーフォーラムでは班員の論文等が発表され、平成28年3月31日時点で67報となり、領域内の活発な情報交換に寄与している。平成26年度に公開したオートファジープロトコール集は国内外のオートファジーコミュニティーから参照されている。さらに、創薬等支援技術基盤プラットフォーム情報拠点のオートファジーデータベースと連携し、データベースの充実化に貢献した。これらの活動を行うことで、オートファジー研究の集学的センターとして機能している。第3回班会議は平成27年11月15日17日に兵庫県淡路市の淡路夢舞台国際会議場で行った。これはオートファジー研究会と合同で行い、176名の参加があった。口頭発表数39件、ポスター発表60件であった。初日の15日は大学院生やポスドクによって企画・発表された「若手の会」とし、18名の若手の口頭発表があった。また、17日には第3回総括班会議を開催し、本年度事業の報告と来年度以降の計画を協議した。日本分子生物学会・日本生化学会合同年会(BMB2015)ではオートファジーに関する共催シンポジウムを開催した。本年度予定していた、班会議・オートファジー研究会開催、若手の会開催、総括班会議開催は予定通り遂行した。プロトコール集掲載、オートファジーフォーラムの継続、オートファジーデータベースとの連携などによってホームページの充実化も図った。顕微鏡共有による研究支援も順調に行えた。その他の領域内共同研究も活発に行われている。

以上のことから、総括班の活動は順調に遂行されていると判断される。新学術領域研究「オートファジーの集学的研究:分子基盤から疾患まで」は、本年度は本総括班、6件の計画研究、今年からスタートした23件の公募研究(A01で9件、A02で14件)、国際活動支援班からなる構成となった。本総括班では、昨年に引き続き、オートファジーに関する研究の推進と、領域に関連する情報の収集・発信・交換等を行い、班会議開催、HPを通じて領域内の交流の活発化を図った。また、新規公募班員を含めた班員名簿を作成した。領域のホームページでは、これまでどおり領域内のニュースや求人情報などを発信した。Webベースのオートファジーフォーラムでは班員の論文等が発表され(平成29年3月31日時点で85報)、領域内の活発な情報交換に寄与した。また、創薬等支援技術基盤プラットフォーム情報拠点のオートファジーデータベースと連携し、データベースの充実化に貢献した。総括班で管理している本領域の共有設備である顕微鏡システムは計画班員、公募班員によって使用されている。第4回班会議は平成28年11月1315日に新潟県越後湯沢で行った。13日午後は若手の会とし、14日15日は第10回オートファジー研究会と兼ねて開催した。オープン形式であるので、企業からも3社の参加があった。参加者は210名と過去最高で、口頭発表42件、ポスター発表80件、若手の会発表22名となり、日本のオートファジー研究の活性化に大きく貢献した考えられる。11月15日には総括班会議を開催し、本年度事業の報告と来年度以降の計画を協議した。さらに、第68回日本細胞生物学会大会(平成28年6月17日、京都)、第89回日本生化学会大会(2016年9月27日、仙台)ではそれぞれ共催シンポジウムを開催した。班会議・オートファジー研究会開催、若手の会開催、総括班会議開催、学会等との共催シンポジウム開催は予定通り遂行した。ホームページについても、オートファジーフォーラムの継続、オートファジーデータベースとの連携などを継続して行った。総括班設備である顕微鏡共有による研究支援も班員に利用されている。その他の領域内共同研究も活発に行われている。領域の最終年度にあたる本年度は6件の計画研究、昨年からスタートした23件の公募研究(A01で9件、A02で14件)、本総括班、国際活動支援班で活動を行った。本総括班では、昨年に引き続き、オートファジーに関する研究の推進と、領域に関連する情報の収集・発信・交換等を行い、国際会議開催、班会議開催、HPによる領域内の交流の活発化を図った。Webベースのオートファジーフォーラムでは班員の論文等が発表され、平成29年3月31日時点で107報となり、領域内の活発な情報交換に寄与している。領域の研究支援としては、総括班で管理している高感度リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡、デコンボルーション顕微鏡の共同利用運用を行い、計画班員、公募班員によって使用された。第5回班会議は平成29年11月1718日に東京都文京区順天堂大学で行った。
機能株群集成長解析を活用した植物有害物質膜輸送体の包括的機能ゲノム解析

植物ゲノムに存在する多数の膜輸送体様タンパク質の分子機能を解明するための新たな方法論を検証した。モデル植物シロイヌナズナの約1,400の膜輸送体候補遺伝子の97%についてクローン化し、酵母過剰発現株を作製した。ストレス下での集団成長解析により、ストレスの原因物質と膜輸送の関連づけることができる。また、系を工夫することでより一般的な化合物を輸送する膜輸送体の評価も可能である。多くの生物のゲノムには、コンピュータで予想したタンパク質の構造的特徴から膜輸送体をコードすると示唆される遺伝子が千を超えて存在する。しかし、分子機能との対応が明らかにされていないものも多く、解明が待たれている。本研究では、モデル植物シロイヌナズナの膜輸送体候補遺伝子群について、「機能株群集成長解析」という新たな手法を活用して、重金属、薬物、植物由来天然物といった有害物質の膜輸送と包括的に関連づけことを目的としている。本年度は、前年度作製したシロイヌナズナ膜輸送体1350種類の酵母遺伝子発現ライブラリとモデル有害物質をもちいた実験結果をもとに、機能株群集成長解析の手法に関するモデル化を進めた。また、宿主の生育に中立的な物質を輸送する膜輸送体についても機能株群集成長解析を適用するために、新たにな酵母順逆両選抜システムを開発した。関連の研究成果も合わせ、学会発表4回を行った。多くの生物ゲノムには膜輸送体様タンパク質をコードする遺伝子が千を超えて存在し、それらの分子機能解明が待たれている。本研究では、「機能株群集成長解析」という新たな手法を活用して、モデル植物シロイヌナズナの膜輸送体候補分子の能力を包括的に解析し、重金属、薬物、植物由来天然物といった有害物質の膜輸送と関連づけことを目的としている。本年度は、解析対象とする膜輸送体遺伝子のクローン化をさらにすすめ、コンピュータ上で予想された1404種の遺伝子のうち、1382種(98%)までカバーする酵母遺伝子発現ライブラリを完成させた。抜き出し試験より、膜輸送体候補分子の発現を確認したほか、上記発現菌株集団とモデル有害物質をもちいて、機能株群集成長解析の実施方法を検討した。また、研究を効率よく進めるための技術開発を行った。それらの成果について、学会発表4回を行った。モデル植物シロイヌナズナのゲノムには、膜輸送体と思われるタンパク質をコードする遺伝子が約1400種類存在し、それらの分子機能解明が待たれている。本研究はこれら膜輸送体の候補分子の能力を包括的に解析し、重金属、薬物、植物由来天然物といった有害物質の膜輸送と関連づけことを目的としている。昨年度までに、候補分子をコードする遺伝子群の95%のクローニングに成功し、酵母、動物細胞、植物それぞれに導入したライブラリの作出に成功している。本年度は、モデル植物シロイヌナズナを用いた膜輸送体過剰発現発現ライブラリから得た新たな機能獲得株のうち、本研究課題に関連して重金属と関わりが示された株について、原因遺伝子の特定と、遺伝子機能の解析を進めた。また、それらの成果について、学会発表を行った。重金属である銅、亜鉛、ニッケル、またはカドミウムに対する感受性が変化した4つの候補株について、各株の重金属に対する耐性スペクトルを明らかにした。また責任遺伝子を同定するため、過剰発現ベクターにタグされた遺伝子を特定し、それらを再度シロイヌナズナに導入して、機能獲得の再現性を調べた。一方、植物の液胞内金属濃度を反映すると考えられる植物色素アントシアニンの発色に着目した研究では、膜輸送体候補分子過剰発現ライブラリの親株に用いたpap1Dと比べ、青みが増した候補株に焦点を当て、金属含量の分析と責任分子の解析を進めた。並行して、アントシアニンの色変化能を評価するため、レタス着色プロトプラストを用いた新規実験系の開発を行った。その結果、これまで報告例のない新たなタイプの輸送体が液胞膜にあり、アントシアニンの青色化を促進する因子となりうることを明らかにした。植物分子生物学、膜輸送25年度には植物膜輸送体を発現させた酵母ライブラリの生育に有害物質が与える影響を評価し、成果発表する予定であった。しかし、24年度において、一部の植物膜輸送体遺伝子の取り扱いが予想以上に困難であったことから、酵母ライブラリの作出に手間取り、全体的に計画が1年程度遅延している。本年度は、本来前年度に行う予定であったモデル有害物質を用いたモデル化試験を行った。また、研究の過程であらたに植物細胞にとって中立的な物質の膜輸送に関しても機能株群集成長解析を適用する着想が得られたため、研究実施内容を修正した。結果として本来計画の遅れの一因となったが、本研究の一般性を広げる上で有益な研究成果が得られたと考えている。植物膜輸送体遺伝子のクローニングにおいて、一部の対象遺伝子の取り扱いが困難であったことから、酵母機能株発現ライブラリの作出に手間取った。

しかし、結果的にモデル植物膜輸送体遺伝子の98%を含む機能株ライブラリとして完成したので、今後の機能群集成長解析をより緻密に行うことが出来るようになり、機能ゲノム解析につきものの、もれが少なくなったと評価している。平成26年度においては、本来25年度計画にあるモデル有害物質以外の化学物質による酵母ライブラリの群生育試験と、その統計解析、データベース化、論文・学会発表を次年度に行う。また、25年度に開発した酵母逆選抜システムをもちいて、中立的な物質についても追加の機能株群集成長解析をおこない、研究成果がより一般的であることを明らかにする。これらの目的で、研究費未使用額を繰り越したので、当初予定の実験を実施したり、成果発表をおこない、その経費に充てることとしたい。モデル有害化学物質に関する機能株群集成長解析を、より詳細に検討した上で、一般の有害物質に適用し、有害物質と膜輸送体分子の関連づけマップを作成する。さらに、強い関連性が示された一部の組み合わせについては、生化学的・生理的機能解析を行い、該当有害物質に対する耐性が強化された機能性植物の作出につながるか調べる。以上の研究成果をとりまとめ、論文・学会発表を行う。また、研究成果を公開するためのデータベースを作成したい。25年度に、植物膜輸送体を発現させた酵母ライブラリの生育に有害物質が与える影響を評価し、成果発表する予定であった。しかし、24年度において、一部の植物膜輸送体遺伝子の取り扱いが予想以上に困難であったことから、酵母ライブラリの作出に手間取り、全体的に計画が1年程度遅延している。実験系のモデル試験(25年度)、有害物質群の評価(26年度)と計画を順次後倒ししたため、未使用額が生じた。このため、モデル有害物質以外の化学物質による酵母ライブラリの群生育試験と、その統計解析、データベース化、論文・学会発表を次年度に行うこととし、未使用額をその経費に充てることとしたい。当初予定の実験のための消耗品費、成果発表のための旅費、謝金、その他に用いる。初年度の実験実施計画が若干遅れたため、約60万円を繰り越した。次年度において当初予定の実験を行うため、主に消耗品費として使用する。