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インビトロ毒性試験における計画法と解析法の標準化の研究

本研究では毒性試験として,(ア)Mouse lymphoma assay,(イ)代謝協同阻害試験,(ウ)細胞転換試験,のそれぞれについて,バリデーション研究での統計解析法を提案し,かつそれに基づいた解析を行った.代謝協同試験と細胞転換試験については,バリデーション研究に取り入れるべき化学物質の種類とそれが持つべき特徴について検討した.このうち,(ア)については大森崇,林真,本間正充(国立医薬品食品衛生研究所)と併せて4人の共著論文を作成し,2001年3月にサンディエゴで行われたワークショップで口頭発表を行った.そこでの討論結果にもとづいて内容を再整理し,Mutation Research誌に投稿する予定である.(イ)については岩瀬裕美子(三菱東京製薬)らと共に新たなバリデーション研究の試験計画を作成した.このバリデーション研究は現在も進行中である.(ウ)については実験に供すべき化学物質の選択法を提案し,結果として得られたデータの解析を行った.研究結果として,土屋敏行(昭和電工)を第1著者とした論文を公刊した.薬理試験では,データを単純な検定で解析するのでなく,モデルを設定して解析することを提案し,研究成果を山田俊介(現,山之内製薬)の修士論文としてまとめた.また,内分泌攪乱物質に関する実験の計画と解析に寄与をして,松永信人(現,協和発酵)菅野純(国立医薬品食品衛生研究所)と3人共著の学会発表を本年4月に,日本計量生物学会で行う予定である.さらに,個体差に混合模型を想定した解析について,吉田哲(東京理科大学)が修士論文をまとめた.本研究では毒性試験として,(ア)Mouse lymphoma assay,(イ)代謝協同阻害試験,(ウ)細胞転換試験,のそれぞれについて,バリデーション研究での統計解析法を提案し,かつそれに基づいた解析を行った.代謝協同試験と細胞転換試験については,バリデーション研究に取り入れるべき化学物質の種類とそれが持つべき特徴について検討した.このうち,(ア)については大森崇,林真,本間正充(国立医薬品食品衛生研究所)と併せて4人の共著論文を作成し,2001年3月にサンディエゴで行われたワークショップで口頭発表を行った.そこでの討論結果にもとづいて内容を再整理し,Mutation Research誌に投稿する予定である.(イ)については岩瀬裕美子(三菱東京製薬)らと共に新たなバリデーション研究の試験計画を作成した.このバリデーション研究は現在も進行中である.(ウ)については実験に供すべき化学物質の選択法を提案し,結果として得られたデータの解析を行った.研究結果として,土屋敏行(昭和電工)を第1著者とした論文を公刊した.薬理試験では,データを単純な検定で解析するのでなく,モデルを設定して解析することを提案し,研究成果を山田俊介(現,山之内製薬)の修士論文としてまとめた.また,内分泌攪乱物質に関する実験の計画と解析に寄与をして,松永信人(現,協和発酵)菅野純(国立医薬品食品衛生研究所)と3人共著の学会発表を本年4月に,日本計量生物学会で行う予定である.さらに,個体差に混合模型を想定した解析について,吉田哲(東京理科大学)が修士論文をまとめた.1999年3月の国際変異原学会の集まりで取り上げられた課題を中心にして次のような研究を行った。(1)用量反応における頭打ち現象を考慮に入れた解析法として、最大対比法にMargolin流の第1段検定方式を加味した検定法を考慮した。その性能評価を現在進めている。(2)第1種の過誤と第2種の過誤を考慮に入れた代替性能の評価基準を設けた場合に、バリデーションでの採用すべき化学物質の毒性の分布と数についての見当をシミュレーションで吟味した。これもまだ研究が継続中である。(3)複数の物質の相乗的毒性を評価する際に、毒性試験の分野と疫学の分野で異なったモデルが採用されている。その両者に共通に同じ評価法を適用できるような評価法を工夫した。すなわち、単独暴露あるいはそれに近い場合について、用量反応関係の線形化を行った上で加法性が成り立つときの反応局面を推定する。この反応局面と同時暴露での反応の程度とを比較し、両者に有意な差があるかどうかを検定する手法である。こうして考案した方法を実際の事例に適用して結果を実験かと討論し、ある程度の有効性があることを確かめた。さらに、シミュレーションで性能評価を行ない、等分散性が成り立たないときに第1種の過誤の上昇があることを確かめた。以上の研究はいずれも継続中であるが、研究成果の一部は、1999年9月にドイツのハイデルベルグ市で開催された国際ワークショップ等で報告されている。本年度は毒性試験として,(ア)Mouselymphoma assay,(イ)代謝協同阻害試験,(ウ)細胞転換試験,のそれぞれについて,バリデーション研究での統計解析法を提案し,かつそれに基づいた解析を行った.代謝協同試験と細胞転換試験については,バリデーション研究に取り入れるべき化学物質の種類とそれが持つべき特徴についても検討した.

このうちの(ア)での提案は,英国変異原学会からの提案と異なる実験法にたいするデータ解析法の提案であったため,これを世界の標準にして良いかどうかが2001年3月のサンディエゴ・ワークショップで最大の論点となった.3月の時点では,これについての最終結論が出ず,7月のノッチンガム・ワークショップを経て,11月の静岡・ワークショップで最終結論を出すことが確認された.提案者としての感触では,提案手法の有効性については問題がなく,英国の提案と並列的に標準手法とするか,英国の提案より有効と判断するかだけが,今後のワークショップでの焦点になると思われる.(イ)(ウ)においては,毒性検出法のバリデーション研究では,毒性の明らかな物質ばかりでなく,毒性の認められない物質をも被験物質に含めるべきことを,実験計画上の注意点として明らかにした.そうしないと,第1種の過誤確率が大きくなる危険があることを指摘したものである.これは実験家に見逃されやすい実験計画上の重要視点であり,これを実験家に納得してもらったことが,共同研究の一つの成果である.これは今後の日本の細胞毒性試験バリデーション研究の質を向上させるものと言える.
合金の粗大化過程に対する統計力学的手法と計算機実験

本科研費を使用した研究により、合金の粗大化過程に関する以下のような成果を得た:(1)粗大化指数のクロス・オーバー:相変態の中期過程においてもスケール則が存在することを指摘した。(2)様々な律速機構による粗大化過程の研究:溶質の体積拡散律速型の粗大化過程(オストワルド成長)の研究を基に、界面拡散律速や粒界拡散律速型の粗大化過程の研究を行った。それぞれの過程に関して、折出相半径に対する界面方程式を導き、数値計算の行い、オストワルド成長とは異なるスケール則・分布関数を求めた。以上の研究により、非平衡状態にある系のように巨視的構造(パターン)が現れる現象の機構を解明するために境界の運動に着目することは非常に有用であるとが確認された。我々は、とくに、相変態の後期段階で現れるスケール則を説明するために,共存する二相領域を隔てる界面の運動に着目し、多数の界面が相互作用しあっている状況に対し、界面多体系の統計力学とも呼べる手法を確立した。さらに、時空間パターンが現れる現象に対するモデル方程式のプログラム開発などシミュレーション技法も蓄積してきた。このような研究法は、世界的にみても独創的で、他の追随を許しておらず、現象の機構解明をはじめ、新たな知見を与え得る等の多くの成果を期待できる。とくに、相変態の研究は、非平衡系でのパターンの動力学という純理論的興味の他に、多機能材料開発という応用上の観点からも興味深い。
外科手術用ロボット(da Vinci)を用いた新たな胃内手術方法の開発

【はじめに】手術支援ロボット(da Vinci surgical system)は,3次元的な空間の把握が可能であり,従来の腹腔鏡手術の問題点の1つであった手術野の立体的な認識を可能にしている.また,実際に手術を施行するアームが7自由度を有し,様々な方向からの病変へのアプローチが可能である.そのため,外科医が意図する手技をより忠実に再現可能であり,習熟に訓練を要した腹腔内での縫合などの手技が簡便に施行可能である.欧米では様々な術式でロボットを使用した報告が見られるが,腹腔鏡下胃内手術にロボットを使用した報告はない.今回我々は,ブタの臓器を使用した独自の胃内手術モデルを作成し,ロボットを使用した胃内手術の有用性に関して検討を行った.【対象および方法】Turbingen Trainerに食道断端より送気用のチューブを挿入、固定したブタの胃を固定した.十二指腸側断端は縫合閉鎖し、食道より挿入したチューブより室内空気を注入し胃内手術モデルを作成した.このモデルを使用し,腹腔鏡下胃内手術に準じて手術支援ロボット(da Vinci surgical system)を使用し,2例で仮想病変を含めた胃の粘膜切除を行った.また,胃粘膜切除後の欠損部の閉鎖および意図的に作成した胃穿孔の縫合も行った.【結果】施行した2例ともに一括切除が可能であった。摘出胃粘膜の大きさは平均約6cmで、手術時間は約12分間であった。また、胃穿孔部の縫合および胃粘膜切除後の粘膜欠損部の閉鎖ともに特に問題なく簡便に施行可能であった【考察】手術支援ロボットを使用することで,胃内病変の粘膜切除や,穿孔部位の縫合手技が簡便かつ安全に施行可能であることを世界で初めて検証した.【はじめに】手術支援ロボット(da Vinci surgical system)は,3次元的な空間の把握が可能であり,従来の腹腔鏡手術の問題点の1つであった手術野の立体的な認識を可能にしている.また,実際に手術を施行するアームが7自由度を有し,様々な方向からの病変へのアプローチが可能である.そのため,外科医が意図する手技をより忠実に再現可能であり,習熟に訓練を要した腹腔内での縫合などの手技が簡便に施行可能である.欧米では様々な術式でロボットを使用した報告が見られるが,腹腔鏡下胃内手術にロボットを使用した報告はない.今回我々は,ブタの臓器を使用した独自の胃内手術モデルを作成し,ロボットを使用した胃内手術の有用性に関して検討を行った.【対象および方法】Turbingen Trainerに食道断端より送気用のチューブを挿入、固定したブタの胃を固定した.十二指腸側断端は縫合閉鎖し、食道より挿入したチューブより室内空気を注入し胃内手術モデルを作成した.このモデルを使用し,腹腔鏡下胃内手術に準じて手術支援ロボット(da Vinci surgical system)を使用し,2例で仮想病変を含めた胃の粘膜切除を行った.また,胃粘膜切除後の欠損部の閉鎖および意図的に作成した胃穿孔の縫合も行った.【結果】施行した2例ともに一括切除が可能であった。また、胃穿孔部の縫合および胃粘膜切除後の粘膜欠損部の閉鎖ともに特に問題なく簡便に施行可能であった.【考察】手術支援ロボットを使用することで,胃内病変の粘膜切除や,穿孔部位の縫合手技が簡便かつ安全に施行可能であることを世界で初めて検証した.【はじめに】手術支援ロボット(da Vinci surgical system)は,3次元的な空間の把握が可能であり,従来の腹腔鏡手術の問題点の1つであった手術野の立体的な認識を可能にしている.また,実際に手術を施行するアームが7自由度を有し,様々な方向からの病変へのアプローチが可能である.そのため,外科医が意図する手技をより忠実に再現可能であり,習熟に訓練を要した腹腔内での縫合などの手技が簡便に施行可能である.欧米では様々な術式でロボットを使用した報告が見られるが,腹腔鏡下胃内手術にロボットを使用した報告はない.今回我々は,ブタの臓器を使用した独自の胃内手術モデルを作成し,ロボットを使用した胃内手術の有用性に関して検討を行った.【対象および方法】Turbingen Trainerに食道断端より送気用のチューブを挿入、固定したブタの胃を固定した.十二指腸側断端は縫合閉鎖し、食道より挿入したチューブより室内空気を注入し胃内手術モデルを作成した.このモデルを使用し,腹腔鏡下胃内手術に準じて手術支援ロボット(da Vinci surgical system)を使用し,2例で仮想病変を含めた胃の粘膜切除を行った.また,胃粘膜切除後の欠損部の閉鎖および意図的に作成した胃穿孔の縫合も行った.【結果】施行した2例ともに一括切除が可能であった。また、胃穿孔部の縫合および胃粘膜切除後の粘膜欠損部の閉鎖ともに特に問題なく簡便に施行可能であった【考察】手術支援ロボットを使用することで,胃内病変の粘膜切除や,穿孔部位の縫合手技が簡便かつ安全に施行可能であることを世界で初めて検証した.
関節軟骨へのレーサー照射による軟骨修復及び変性予防の研究

1.YAGおよびアルゴン・ダイレーザーは近可視光および可視光のため半月や関節軟骨の乳白色視、射体では反射してレーザーの効果は発揮しない。炭酸ガスレーザーは遠赤外線のため対象物の色調に関係なく作用、面吸収型のため熱による変性が表面に限局され深部に到達しない。10W程度でOレーザーの焦点を絞れば0.10.5mm程度の影響であるために障害された軟骨を処置し周囲に影響を起さない。レーザーは人工とはいえ光であり300500mWの低出力レーザーは光の有する多彩な光化学作用も利用できる。2.ウサギおよびビーグルを用いた動物実験では、熱変性を起こす程の高出力で炭酸ガスレーザーを関節軟骨に照射すると影響は12W後も遺残していた。照射出力は500mW前後が適当である。照射後の関節軟骨は肉眼的にも、病理学的に時間が経過しても変性変化か出現することはなかった。前十字靭帯を切離した実験的変形性関節症では低出力炭酸ガスレーザーの照射によって変性進行をコントロールを歓声軟骨に照射して歓声鏡視で経持的観察では歓声軟骨に変化なく、病理学的にも変性所見は認められなかった。3.臨床的には関節鏡視下炭酸ガスレーザー半月切除時に、炭酸ガスレーザー10W出力が関節軟骨に誤射され関節軟骨に熱変性を生じ、肉眼的にも関節軟骨は変性したが、1年後の関節鏡視では色調は周囲非照射軟骨と差がなく、軽度の軟骨軟化を認めたのみであった。X線上にも照射部位に変性性変化等の所見は認めなかった。1.炭酸ガス, YAG,アルゴン・ダイの3種レーザーをウサギの膝関節軟骨に照射すると可視光のアルゴン・ダイレーザーおよび近赤外線であるYAGレーザーは白色系の関節軟骨に照射しても反射し関節軟骨に変化を及ぼさないが,炭酸ガスレーザーは遠赤外線であり,対象物の色調に区別なく表面的に吸収されて熱損傷を及ぼす.つまり,炭酸ガスレーザーのみが関節軟骨の照射した場合,レーザーの焦点を絞れば線状に関節軟骨が切開され,レーザーを散乱させると出力が大きいと関節軟骨は熱変性を起こし,出力が小さいと短時間照射では肉眼的にも,病理学的にも関節軟骨に変化は起こらないが,長時間照射では出力が小さくても熱損傷を関節軟骨に発生させる.レーザーによる関節軟骨を強化する実験では13Wの炭酸ガスレーザーを5-10秒間照射してレーザーの効果を観察した.2.低出力・短時間炭酸ガスレーザー照射直後の肉眼的変化,病理的変化は認められなかった.ウサギの膝関節を開放し,大腿骨関節軟骨に1W, 3Wの炭酸ガスレーザーを10秒間照射し, 1週後, 2週後, 3週後, 4週後に関節を摘出し,病理学的に検討したが,各週間に著明な変化は認められなかった.3.ウサギ膝関節を開放し,前十字靭帯を切離した後に大腿骨関節面に, 1W, 3Wの炭酸ガスレーザーを10秒間照射し,レーザー照射を行わない群と関節軟骨の変化を比較した.1, 2, 3週後はレーザー照射群とレーザー非照射群との間に大きな差は肉眼上,病理学上に差を認めなかったが, 4週後群ではレーザー照射群はレーザー非照射群に比較し変性の程度が,病理学上軽度であった.1.関節軟骨および繊維軟骨である半月に照射し軟骨の修復変性を予防可能なレーザーは炭酸ガスレーザーであり、出力は3W以下の低出力である。3Wではレーザー照射時間により熱損傷を惹起する場合があるために、1W以下300500mWが適当であった。2.ウサギおよびビーグル犬の膝関節を用いた動物実験を行った。ウサギは膝関節を切開し、関節軟骨に1Wの炭酸ガスレーザー照射を行い、同時に半月炭酸ガスレーザー焼却を出力5Wで行った。

関節縫合後、412Wで膝関節をとり出した。半月の焼却部は変性もなく辺縫も平滑であった。関節軟骨照射部位は周辺とほぼ同一であった。病理学的にも炭酸ガスレーザー照射は半月および関節軟骨に熱損傷変性を認めなかった。ビーグル犬では関節切開し、関節軟骨に低出力炭酸ガスレーザー照射し、半月焼却も行った後関節縫合し、1ヶ月おきに関節鏡視により関節内観察を6ヶ月間施行した。関節軟骨は肉眼的に変化が認められず、半月は術後1ヶ月で修復されていた術後6ヶ月目に膝関節をとり出し病理学的検討を行ったが、半月関節軟骨ともにレーザー照射による熱変性は認めず、非照射部位との間に差を認めなかった。3.臨床的には、半月レーザー焼却後に膝関節大腿骨内顆に3-10Wのレーザー誤射が起り、熱変性所見を示した。1年後に同膝に関節鏡視を行ったが、半月焼却部は変性を認めたが、関節軟骨レーザー照射部は軽度変性所見を遺残させるものの色調は非照射部位と変化がなかった。X線上にも変化を認めなかった。4.低出力炭酸ガスレーザーの関節軟骨への照射は関節軟骨に経時的変化を起こさず、X線上の変化も認めなかった。
染色体構造タンパク質の相互作用ネットワーク解析

報告者らが行ったヒト染色体プロテオーム解析において染色体高次構造への関与が推定されたBP74をターゲットの一つとして研究を進め、免疫沈降法などにより相互作用タンパク質を網羅的に同定した。また、BP74と相互作用することが分かったHP1との相互作用パラメータを物理化学的手法により決定した。さらに、BP74の立体構造決定と組換ヒト染色体タンパク質を用いた実験から、BP74がクロマチン高次構造形成へと繋がるクロマトソーム構造形成を担っていることが判明した。本研究により染色体プロテオーム解析で同定された染色体を中心とする相互作用ネットワークを明らかとすることに成功した。本年度は実施計画に記載した以下の3つの研究を実施した。(1)単離染色体の切断によるクロマチンブロックの解明。(2)染色体凝縮に関わる蛋白質の抗体作製、及び(3)大きさが異なるクロマチンブロックに含まれる蛋白質の検出、である。(1)については、DNaseやMNase等を用いた染色体切断条件の検討と異なる界面活性剤や超音波処理の利用による切断後染色体の可溶化条件の検討による高い回収率での切断および可溶化に成功した。さらに、密度勾配遠心法の条件を検討し、大きさが異なるクロマチンを分離することに成功した。こうした知見はこれまでには報告されていない。(2)についてはコンデンシンサブユニット5種類それぞれについてC末端ペプチドから抗体を作製し、ウェスタンブロッティングに使用可能であることを確認した。さらに、コンデンシンSMCサブユニットのヒンジ領域の組み換え体の大量発現に成功したため、これを抗原とした抗体作製も行った。得られた抗体が免疫染色やウェスタンブロッティングに使用可能であることを確認した。(3)については、今回作製した抗体を利用して、(1)で分画に成功したクロマチンから蛋白質を抽出、電気泳動後ウェスタンブロッティングにより、コンデンシンが含まれるクロマチンブロックの検出を試みた。同時に染色体スキャフォールド蛋白質として知られているトポイソメラーゼIIも検出を行ったところ、コンデンシンとトポイソメラーゼIIが異なった大きさのクロマチンブロックに含まれており、それぞれの蛋白質が染色体高次構造形成において果たす役割が異なっている可能性が示唆された。以上のように、本年度はこれまで全く分かっていなかった、染色体におけるクロマチンブロックに関する知見を蛋白質との関連から得ることができた。来年度は、これらの蛋白質が他にどんな蛋白質と共にクロマチン高次構造を形成しているかについて質量分析を用いて同定する予定である。本年度は実施計画に記載した以下の4つの研究を実施した。(1)ヒトコンデンシン立体構造解析と相互作用解析、(2)HP1BP74のクロマチン高次構造における役割解明、(3)HPlBP74のin vivoにおける相互作用解析のためのベクター構築、(4)ヒストンシャペロンNAP-1の会合状態解析である。(1)はコンデンシンヒンジ2量体の2量体形成を質量分析装置により確認後・結晶化を行い,良好な結晶化を得ることに成功した。得られた結晶を用いてSPring8において測定を行ったところ、分解能2.5A程度の回折像を得ることに成功した。これまでに報告されている結晶構造を用いての位相決定は不可能であったため、現在、SeMe置換体の作製を行っている。一方、Mycタグを付加したヒンジを細胞内で発現させ、免疫沈降によりコンデンシシ複合体を単離することにより、各サブユニット間の相互作用状態を明らかにすることに成功した。(2)についてはヒト組換ピストンを大量調製し、ヌクレオソーム再構築を行い、そこに組換HPIBP74を添加することにより検討を行った。ピストンHlと同様にクロマトソームが形成されればクロマトソームストップが観察されることとなる。その結果、HPIBP74がピストンHlと同様の位置に結合し、クロマチン高次構造形成に寄与していることが分かった。次に、TAP(Tandem Affinity Purification)システムを用いた(3)HPlBP74の免疫沈降を行うために、TAPベクターの入手、およびHPlBP74の挿入を行った。すでにベクターの構築は完了したため、来年度はTAPシステムによる免疫沈降、質量分析による同定を行い、HPIBP74を中心とした相互作用ネットワークを明らかにする。(4)については、米国の研究者との共同研究により超遠心分析を実施し、これまでに報告されていない会合状態を明かとすることが出来た。本年度は、染色体蛋白質として研究担当者が新規に報告したBP74とRBMXを中心とした相互作用ネットワーク解析を行った。昨年度作製したTAP(Tandem Affinity Purification)融合システムをHEK293細胞にトランスフェクションした。なお、タグに対する免疫染色による発現効率の確認を行い、最大効率となる条件のもとで実験を進めた。

小スケールでの条件検討の後、大スケールでのTAPへと移行し、最終的にSDS-PAGEで確認可能なレベルの複合体精製に成功した。また、ネガティブコントロールとして、GFPにTAPタグを融合したものを用いた。標的蛋白質(BP74とRBMX)およびGFPの双方に確認されるバンドと標的タンパク質に特異的に相互作用するバンドから質量分析を用いた高感度プロテオミクスにより合計約40種類の蛋白質を同定した。同定の結果、BP74はセントロメア蛋白質と相互作用している可能性が見出された。従って、BP74がセントロメア構造の制御に関わっている可能性があるが、これはBP74のRNAiの表現型と一致している。また、BP74、RBMXの双方とも、特定のヒストンバリアントと相互作用していることも判明した。ヒストンバリアントはクロマチン構造形成に直接関わっている蛋白質である。また、BP74とヘテロクロマチン(高度に凝縮したクロマチン)の主要構成タンパク質であるHP1の組換体の大量発現・精製を行い超遠心分析法により相互作用解析を行った。その結果、BP74とHPIは1:2で相互作用することが分かった。以上よりBP74、RBHX、HP1、ピストンおよびこれらの蛋白質と相互作用する蛋白質として同定された複数の蛋白質がネットワークを形成して染色体高次構造を制御していることが分かった。
In situ hybriclization法を用いたC型肝炎(HCV)ウイルス感染の研究

当初の計画ではHCV-RNAの5′非翻訳領域に対するcDNAprobeを用いる予定であったが、検討の結果core領域に対するcDNAprobeを、digoxinの誘導体であるdigoxigeninを標識して肝生検標本上でin situ hybridizationを行った。その結果、HCV抗体陽性患者では約9割に肝組織上陽性細胞(即ちHCV感染細胞)を認めた。RNase消化試験、非標識probeとの競合試験では既に本法の特異性は確認していたが、さらにB型肝炎、自己免疫性肝炎等の非C型肝障害症例を陰性対照として特異性を検証し、特に問題を認めなかった。そこで以下の実験に進んだ。2.cDNAprobeを用いたin situ hybridization法によるHCV感染の解析C型肝炎ウイルス感染細胞の分布状態を、以下の項目につき検討し次の結果を得た。(1)血液中のC型肝炎ウイルス感染マーカーとの関係:血液中HCV-RNA陰性例4/11例に感染肝細胞を検出した。但し、血液中HCV-RNA陽性例では、HCV-RNA量と感染肝細胞の数との間には一定の関係は認められなかった。(2)肝内HCV-RNA量との関係:肝組織中のHCV-RNA量が10^3コピー以下の症例ではin situ hybridization法では感染肝細胞は検出されず、感度の限界が示された。(3)C型肝炎の病型との関係:病型と感染肝細胞の分布様式については、一定の関係は認められなかったものの炎症細胞と感染肝細胞との間には分布上密接な関連のある興味深い知見が得られた。(4)肝細胞癌合併C型肝炎例の癌部、非癌部での差異の有無:癌部では、明かに感染細胞は少数であった。
政治的決定の多元性と政党組織：　ウェストミンスターモデル再考

本研究課題は、「政治的決定の多元性と政党組織」をテーマとしており、政治制度、特に二院制や中央・地方関係と政党組織の関係を検討するものである。本年度は、二院制と政党組織の関係について、理論的な検討とデータの収集、分析を行った。対等な二院制のもとでは、法案成立に両院の合意が必要となり、両院間の交渉が行われる。そして、政権政党の立場からすると、法案成立のための不確実性を低下させようとして、事前に両院の合意を取り付けるべく政党内に政策交渉の場を内部化すると考えられる。そこで、対等な二院制であるオーストラリアと日本の事例を用いて、上院の政治状況と議会政党組織の活動について検討した。日本については、自由民主党政務調査会がかつて発行していた『政策月報』内の「政務調査会日誌」を用い、自由民主党政務調査会部会の活動をデータ化した。その上で、参議院では創設当初から常任委員会の委員長を会派の勢力に応じて比例配分していたことを利用し、野党議員が常任委員会の委員長となった場合に対応する政務調査会部会の活動が活発化するとの仮説を検証した。パネルデータ分析の手法を用いて分析したところ、部会ごとや時期ごとの違いに関わりなく、野党議員が常任委員会の委員長となった場合、対応する部会の活動が盛んになることが明らかになった。この研究成果を2018年5月に行われた日本選挙学会において報告した。そして、学会で得たコメントを反映し修正を行い、2018年12月に発行された日本選挙学会の学会誌である『選挙研究』第34巻2号に掲載した。理論的な検討、資料収集、論文執筆をスムーズに行うことができた。その結果、1件学会発表を行い、学術誌に論文を掲載することができた。それに加えて、博士論文を完成させることができた。次年度は、地方政治と政党組織、また選挙制度と利益代表の関係を中心に検討することを予定している。そして、得られた研究成果を国際学会等で報告することでフィードバックを得て学術誌に掲載することを目指す。
局所体上の代数群の既約許容表現の不変量について

今年度は、以下の結果を得た。まだ、計算を始めたばかりのものもあり、論文としてまとめることができたのは最初の一つのみである。1.Fの剰余標数が2のときのGL_2(F)の指標公式Fの剰余標数が2のときにGL_2(F)の既約許容表現の指標公式を得た。この場合には今までと違いアニソトロピックトーラスにワイルドな分岐拡大体の乗法群が現われるので全く異なるタイプの結果が得られた。この指標公式が得られたのでその応用としてSL_2(F)の指標公式を導けるはずだが、まだその計算は実行されていない。証明は、以下のように実行された。一般にGL_2(F)の主系列表現、特殊表現については指標公式は既知であるのでFの剰余標数が2のときのGL_2(F)の既約スーパーカスピダル表現について考えればよい。またジャッケ-ラングランズ対応によりGL_2(F)の既約スーパーカスピダル表現とF上の2次の可除代数Dの乗法群の次数が1より大きい既約表現がその指標が-1倍という関係で1対1に対応することが知られているので、D^xの既約表現の指標を計算すればよい。D^xの既約表現の中で今指標を計算したい表現はFのワイルドに分岐した2次拡大体Kの乗法群を含む部分群Hの1次元表現の誘導表現として得られることが分かっているので、それをFの全ての2次拡大体の乗法群に制限して現われる1次元表現を決定し、指標を計算した。ここで現われる1次元表現の重複度は高々1であるという土方の定理を本質的に用いた。但し、体Fが一般の時には結果があまりに複雑なので実際に論文にまとめたのはFがQ_2上不分岐のときのみである。GL_3(F)のスーパーカスピダル表現のホイタッカーモデルをFが1の原始3乗根を含みFの剰余標数が3でないという条件のもとで計算した。ただし、GL_m(F)×GL_n(F)のε-ファクターの計算を行なうには、m=2,n=3のときでも、まだ多くの計算を必要とする。
都市下層における近代的家族の誕生と慈善事業の社会的意義

昨年度に続き、外地(台湾・朝鮮・満洲)における慈善事業及び子どもに関わる事業の研究を行った。国内では、関東、関西、九州の大学図書館、県立図書館、資料館等で資料収集を実施した。また、外地の幼児教育経験者の方々へのインタビュー調査を実施し、個人で保管している当時の資料も多数集めることができた。さらに旧外地での調査として、台湾と韓国で資料収集及びインタビュー調査を行った。台湾では、台北・台中・台南の図書館等をまわり資料を収集し、現存している日本統治時代の幼稚園や慈善事業施設を訪問しインタビュー調査を実施した。韓国では、戦前から保母養成科の設置していた学校の同窓会関係資料を収集した。29年度が最終年度であるため、記入しない。戦前から戦後への慈善事業・社会福祉の連続性を考察するために、本年度はまず、社会事業史においてこれまで取り上げられることの少なかった戦時期の実態について調査をすすめた。戦争遂行のための国策としての戦時託児所を推進する動きと、宗教や社会運動の系譜をもつ託児所の流れが、戦時下においてどのように接続し、また、接続しなかったのかについて分析をした。この成果は、平成28年5月The Asian Conference on Cultural Studies 2016(神戸)にて二葉幼稚園の事例を発表し、10月の日本社会学会にて戦時下における抵抗としての疎開保育園について研究発表をおこなった。平成29年2月東京社会福祉史研究会では、保育史の視点から疎開保育園の事例の分析を発表した。この研究発表で指摘された点について加筆修正した論文を執筆した。平成29年5月に「疎開保育園というアジールー戦時下における『民主的保育』の系譜ー」として『東京社会福祉史研究』第11号に掲載予定である。また、戦前から戦後への連続性を考える上で台湾・朝鮮・「満洲国」という外地を研究対象とする重要性に気づき、内地だけでなく外地の事例まで調査の幅を広げていった。本年度は外地の中でも「満州国」を中心に資料収集、インタビュー調査を実施した。インタビューでは、当時の写真を所有している方もいたため、公共機関には保管されていない貴重な資料も見つかった。また、内地の保母養成課程のあった学校に保管されている資料から、外地に渡った卒業生についても調査を行った。「満洲国」についての研究成果は、平成29年3月にカルチュラル・スタディーズ学会若手研究報告会において、「越境する保母ー満洲における幼児教育の展開ー」として発表した。当初は日本国内の事例の検証と、占領期のアメリカの影響のみを研究対象としていたが、調査を進めていく中で大日本帝国における外地(台湾・朝鮮・「満洲国」)の重要性に気づき、研究の幅が広がった。また、資料分析のみを考えていたが、外地からの引揚者の方々から当時の体験についてインタビュー調査を実施することに決め、収集した資料にも厚みが出た。想定以上に新しい事実がわかり、研究が進展した。今後は、台湾と朝鮮半島の事例の検証をすすめ、最終的には、内地と外地を含めた大日本帝国における家族と幼児教育関連事業の関わりについてまとめていく予定である。日本国内だけでなく、海外でも資料収集を行う計画である。
カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による脳由来神経栄養因子産生の調節機構

脳由来神経栄養因子(BDNF)は脳内に多量に発現しており、神経細胞に対し、強い生存維持活性をもつことが知られている。これまでに電位依存性Ca^<2+>チャネルの開口に伴う神経細胞内へのCa^<2+>の流入がBDNFのmRNAの発現を増加することが報告されていた。今回、本反応にCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素II(CaMキナーゼII)が関与する可能性について検討した。すなわち、モデル系として、CaMキナーゼIIの中で神経細胞の核内に存在するアイソフォームであるアルファBやデルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させた。1.NG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2.定量RT-PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>1チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、IV-BDNFのmRNAが増加した。3.アルファBやデルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加が有意に増強された。核内に移行しないデルタ1の過剰発現では増強効果は認められなかった。4.酵素のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5.ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とし、IV-BDNFのプロモーター活性を検討した。ルシフェラーゼ活性はアルファBやデルタ3の過剰発現により増強された。6.免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にアルファBやデルタ3を過剰発現する細胞のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。今回の結果から、神経細胞内へのCa^<2+>の流入によるBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、神経細胞死の防御への応用を検討する予定である。
下行性鎮痛発現機序における大脳皮質帯状回の役割

大脳皮質前帯状回の刺激により,行動学的な疼痛反応を引きおこし,また,この部位を破壊すると鎮痛作用が発現することが報告されている。組織学的には,前帯状回は,視床正中核群からの投射を密に受け,中脳水道周囲灰白質へ下行性の放射線准を送っていることが示されている。したがって,前帯状回が下行性鎮痛機序に深く関与していることが推定される。本研究では,脊髄に投射する中脳水道周囲灰白質ニューロン活動に対する前帯状回刺激効果をラットを用いて検討することによって,下行性鎮痛発現機序における前帯状回の役割を調べた。実験にはサイアミラール麻酔下のウィスター系ラットを用いた。中脳水道周囲灰白質ニューロン活動の記録にはガラス多連管微小電極を用い,前帯状回の刺激は電気刺激(0.1ms,50150μA,単発)と化学刺激(0.01Mグルタメイト,12μl)を用いた。前帯状回を電気刺激すると,約半数の中脳水道周囲灰白質ニューロンでは,その自発放電活動が減弱された。化学刺激によっては,約65%のニューロンで放電数の減少がみられ,この効果は,GABA_Aレセプターの拮抗薬であるビキュキュリンの局所投与によって拮抗された。これらの刺激効果は,同側の前帯状回刺激の効果の方が大きく,また腹側に位置する中脳水道周囲灰白質ニューロンに対しての方がより強い減弱効果を示した。以上により,大脳皮質前帯状回から下行性の中脳水道周囲灰白質ニューロンに対しては抑制性の作用があり,この効果発現にはGABA_Aレセプターを介するものがあることが示唆された。組織学的には,前帯状回は,視床正中核群からの投射を密に受け,中脳水道周囲灰白質へ下行性の投射線維を送っていることが示されている。大脳皮質前帯状回(Anterior cingulate cortex,ACCX)には、セロトニン含有ニューロン終末が密に分布し、また、セロトニン受容体もV層を中心として存在している。

組織学的データによれば、ACCXは痛覚情報の中継核のひとつである視床髄板内核群からの入力を受け、内因性鎮痛発現に不可欠の中脳水道周囲灰白質(PAG)へ下行性の投射線維を送っていることが明らかにされている。したがって、ACCXは痛覚の情報処理過程に深く関与していることが示唆されるが、ACCXニューロンの侵害受容性応答とACCXに存在する内因性セロトニンの役割については報告がない。そこで、PAGに投射する下行性ACCXニューロンに注目し、機械的刺激にたいする侵害受容性応答を調べセロトニンの作用を検討した.記録したACCXニューロンにはすべて低頻度の自発放電が見られ、そのうち約40%は末梢受容野を有していた。受容野の大きさは、半身以上にわたるものがほとんどであった。機械的刺激に対する応答から、WDRタイプとNSタイプとに大別されLTMタイプニューロンは見られなかった。持続的ピンチ刺激に対し、NSニューロンの約70%では初期興奮性応答ののち、抑制性応答が続く二相性の応答が見られたが、WDRタイプニューロンでは興奮性応答のみが出現した。MSGの投与(20-40nA)によってNSタイプニューロンの抑制性応答は消失したが、興奮性応答はNSおよびWDRニューロン双方において変化を受けなかった。以上により、内因性セロトニンはACCXにおける抑制性の侵害受容性応答発現に関与することが示された。
面不斉有機金属錯体を触媒とする高立体選択的反応の開発

本研究では、金属錯体に特徴的な分子不斉である面不斉に着目し、面不斉Cp錯体を用いて高選択的不斉触媒反応を開発することが目的である。昨年度までに、非対称置換アリル化合物の反応でルテニウム触媒が高い分岐選択性を示すことを利用して、一置換ハロゲン化アリルとフェノール類或いはインドールとの反応について検討し、高収率・高エナンチオ選択的にアリル位置換反応生成物が得られることを報告している。今年度は、弱い求核剤とも反応するルテニウム触媒の特徴を生かし、カルボン酸ナトリウムとの反応について検討した結果、高収率・高エナンチオ選択的にアリル位カルボキシル化が進行することを見出した。高選択的に分岐型生成物を得るためには、基質の物質量比が重要であり、カルボン酸ナトリウムに対して2当量の塩化アリル誘導体を用いる必要があった。本反応は種々の置換基を持つ一置換アリール化合物とカルボン酸ナトリウムとの反応に広く適用でき、分岐型アリルエステルを高選択的に合成することができた。また、二官能性の塩化アリル誘導体である1,4-ジクロロ-2-ブテンとカルボン酸ナトリウムとの反応でも、一方の塩化アリル部位のみが反応して高選択的に分岐型アリルエステルを与えた。昨年度、非対称置換アリル化合物の反応でルテニウム触媒が高い分岐選択性を示すことを利用して、フェノール類と一置換ハロゲン化アリルとの反応にっいて検討し、3mol%の触媒存在下、THF中で塩化シンナミルとo-クレゾールを30°Cで24時間反応させると、91%収率、95%eeで分岐エーテルが生成することを明らかにしている。本年度は、この延長として新たな不斉アリル化反応の開発に取り組み、様々な生理活性物質の骨格となるインドールとの反応を検討した。その結果、インドールの3位に分岐型アリル基が高選択的に導入できることを見出した。反応条件を最適化した結果、分岐型アリル化生成物が79%収率で得られ、エナンチオ選択性も83%eeと高い値を示すことが分かった。本触媒系は幾つかの置換インドールとの反応にも適用できたが、置換基を導入した場合には、無置換インドールとの反応と比較して生成物の収率或いはエナンチオ選択性が低下した。反応機構に関する知見を得るために量論反応についても検討した。中間体と考えられるπ-シンナミル錯体を合成し、インドールを反応させたところ、43%収率、87%eeで分岐型アリル化生成物が得られたことから、本反応もπ-シンナミル錯体を経由して進行していることを明らかにした。
放射線治療中におけるリアルタイム腫瘍追跡システムの実現に向けた研究開発

当該年度ではシミュレーションによって放射線治療中におけるリアルタイム腫瘍追跡システムの実現可能性の検討を行った。実臨床を正確に再現するシミュレーションを行うため、先ず治療用X線照射装置に実装可能な対向型PET装置の体系を作成し、既存の動体追跡アルゴリズムを用いて点線源における追跡精度を評価した。その結果対向型PET装置垂直方向における動体追跡のRMS誤差は約3.2 mmという結果が得られ、これは実臨床で要求されている追跡精度(2 mm以下)を満たしていないことが示された。既存の追跡アルゴリズムは検出器を点として扱うLOR(Line of response)解析を利用しており、本研究ではそれが原因で追跡精度が低下していることが明らかになった。したがって検出器サイズと検出効率を考慮したVolume of response (VOR)解析による追跡アルゴリズムを開発した。開発したアルゴリズムを用いた結果、RMS誤差は0.78 mmと大きく向上し実臨床で要求されている追跡精度を満たす結果が得られた。また本研究で開発したVOR解析の方法は動体追跡アルゴリズムだけではなく、一般的なPET装置を用いた画像再構成に利用することで画質の向上を見込める可能性がある。一方、検出器内部における放射線の検出位置が同定可能であるDOI(Depth-of-interaction)検出器を用いることで、既存の追跡アルゴリズムにおいても追跡精度が向上することがシミュレーションによって示された。本研究では異なる時間特性を持つシンチレーション検出器を積層したDOI検出器の研究開発を行い、97%以上の精度で4層を弁別可能なDOI検出器の開発に成功した。開発した4層DOI検出器は対向型PET装置における追跡精度向上だけではなく、一般的な小型PET装置などにも応用可能である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
変形性膝関節症患者の進行予防に向けた運動協調性改善に関する縦断的研究

2018年度は,膝OA患者の歩行時の外部膝関節内転モーメントと運動協調性および適応能力との関連性の検証を継続しつつ,健常若年者を対象に,片脚立位保持時において何をタスクに視覚化することが運動協調性を高めるかを明らかにすることを目的として行った.同じ課題動作において制御するタスク変数を変化させた際に,運動協調性が変化すると考えられるため,下肢に運動機能障害が存在した場合,異常な運動パターンが多く出現するパフォーマンステストである片脚立位を課題動作とした.健常者を対象にして,運動学的データは三次元動作解析システムVicon MX(Vicon Peak社),運動力学的データは床反力計(AMTI社)を用いて計測した.課題動作は片脚立位動作とし,通常条件,鏡によるフィードバック条件,リアルタイムにて体幹角度を視覚化させて一定にする条件,リアルタイムにて身体重心位置を視覚化させて一定にする条件を採用した.各条件とも30秒保持を3施行実施した.得られたデータは数値解析ソフトウェアMatLab(MathWorks社)を用いて,運動協調性を定量化する解析法であるUnControlled Manifold(UCM)解析を行った.タスク変数である左右方向の身体重心位置,遊脚側の足関節中心位置,頭部質量中心位置を要素変数である各関節角度にて算出可能な関係式からヤコビ行列を求めた.そして,UCMの線形近似を行い,タスク達成に影響を与える悪い変動とタスク達成に影響を与えない各関節運動の協調した変動を定量的に求め,各条件の比較・検討を行った.現在,25人程度の計測が終わっており,詳細な解析を行っている.2019年度は,運動協調性を向上する可能性のあるフィードバックプログラムを膝OA患者でも協調性が向上するかを検討する予定である.タスク変数を可視化する運動プログラムの作成を継続中であるため,すぐに膝OA患者に対する介入研究を実施できず,データ収集が少々遅れている.今後は,タスク変数を可視化する運動プログラムの完成後すぐに妥当性を確認し,膝OA患者に対する介入研究を行う予定である.また,これまでに得られた成果をもとに学会発表および論文投稿を行う予定である.平成29年度は,膝OA患者の歩行時の外部膝関節内転モーメントと運動協調性および適応能力との関連性の検証を行うことを目的として行った.変形性膝関節症患者と年齢が変形性膝関節症患者と同様の健常者を対象にして,運動学的データは三次元動作解析システムVicon MX(Vicon Peak社),運動力学的データは床反力計(AMTI社)を用いて計測した.課題動作は被験者が自然と感じるスピードでの歩行動作とし,10試行行った.また,片脚立位動作も計測した.得られたデータはVicon BodyBuilderを用いて,外部膝関節内転モーメントを算出した.また,数値解析ソフトウェアMatLab(マスワークス社)を用いて,運動協調性を定量化する解析方であるUnControlled Manifold(UCM)解析を行った.タスク変数である左右方向の身体重心位置,遊脚側の足関節中心位置,頭部質量中心位置を要素変数である各関節角度にて算出可能な関係式からヤコビ行列を求めた.そして,UCMの線形近似を行い,タスク達成に影響を与える悪い変動とタスク達成に影響を与えない各関節運動の協調した変動を定量的に求めた.そして,外部膝関節内転モーメントと運動協調性との関係性を調べた.現在,追加の実験とデータ解析を行っている.平成30年度は,同じ課題動作において制御するタスク変数を変化させた際に,運動協調性が変化すると考えられるため,下肢に運動機能障害が存在した場合,異常な運動パターンが多く出現するパフォーマンステストである片脚立位を課題動作とし,何をタスクに視覚化することが運動協調性を高めるかを明らかにする予定である.研究を行っている施設での被験者のリクルートが予定よりも少なかったため,データ収集が少々遅れている.そのため,今後も継続してデータ計測を行う予定である.2018年度は,膝OA患者の歩行時の外部膝関節内転モーメントと運動協調性および適応能力との関連性の検証を継続しつつ,健常若年者を対象に,片脚立位保持時において何をタスクに視覚化することが運動協調性を高めるかを明らかにすることを目的として行った.同じ課題動作において制御するタスク変数を変化させた際に,運動協調性が変化すると考えられるため,下肢に運動機能障害が存在した場合,異常な運動パターンが多く出現するパフォーマンステストである片脚立位を課題動作とした.健常者を対象にして,運動学的データは三次元動作解析システムVicon MX(Vicon Peak社),運動力学的データは床反力計(AMTI社)を用いて計測した.課題動作は片脚立位動作とし,通常条件,鏡によるフィードバック条件,リアルタイムにて体幹角度を視覚化させて一定にする条件,リアルタイムにて身体重心位置を視覚化させて一定にする条件を採用した.各条件とも30秒保持を3施行実施した.得られたデータは数値解析ソフトウェアMatLab(MathWorks社)を用いて,運動協調性を定量化する解析法であるUnControlled Manifold(UCM)解析を行った.タスク変数である左右方向の身体重心位置,遊脚側の足関節中心位置,頭部質量中心位置を要素変数である各関節角度にて算出可能な関係式からヤコビ行列を求めた.そして,UCMの線形近似を行い,タスク達成に影響を与える悪い変動とタスク達成に影響を与えない各関節運動の協調した変動を定量的に求め,各条件の比較・検討を行った.現在,25人程度の計測が終わっており,詳細な解析を行っている.

2019年度は,運動協調性を向上する可能性のあるフィードバックプログラムを膝OA患者でも協調性が向上するかを検討する予定である.タスク変数を可視化する運動プログラムの作成を継続中であるため,すぐに膝OA患者に対する介入研究を実施できず,データ収集が少々遅れている.今後は,遅れている被験者のリクルートを継続して行い,データ収集を行うとともに,若年者のデータ計測を実施していく.また,これまでに得られた成果をもとに学会発表を行う予定である.今後は,タスク変数を可視化する運動プログラムの完成後すぐに妥当性を確認し,膝OA患者に対する介入研究を行う予定である.また,これまでに得られた成果をもとに学会発表および論文投稿を行う予定である.当初の予定より患者のリクルート並びに計測が遅れているため,消耗品,被験者への謝礼などの支払いが繰り越された.その他は予定通り,計測に用いる消耗品費および研究成果発表のための旅費・論文投稿の費用を予定している.当初の予定より患者のリクルート並びに計測が遅れていたため,消耗品,被験者への謝礼などの支払いが繰り越された.本年度は予定通り,計測に用いる消耗品費および研究成果発表のための旅費・論文投稿の費用を予定している.
ヒト椎間板性腰痛における椎間板変性および椎間板への神経侵入の分子機構

椎間板性腰痛は,組織変性した椎間板内側へ神経線維が侵入することで発症し,椎間板変性には細胞外基質分解酵素が,神経侵入には神経成長因子(NGF)が重要な役割を担う.腰痛保存治療に選択的COX-2阻害剤が汎用されるが,同薬剤の細胞外基質分解酵素およびNGF発現に対する効果は不明であった.本研究は,ヒト椎間板細胞を用いて選択的COX-2阻害剤の細胞外基質分解酵素発現およびNGF発現に対する効果を検討し,同薬剤は細胞外基質分解酵素およびNGF発現ともに増加させること明らかにした.選択的COX-2阻害剤は急性炎症・疼痛には有用であるが椎間板変性と神経侵入をむしろ増悪させる可能性が示唆された.近年,椎間板性腰痛発症の分子機構として,椎間板の変性に伴い疼痛伝達をする神経線維が椎間板内側に侵入し,さらに疼痛感作が行われることが慢性腰痛の病態の1つであることが明らかになってきている.本研究は,椎間板変性を背景とした慢性腰痛に対する非ステロイド性抗炎症薬であるNSAIDsの細胞外基質分解酵素(MMPs)および神経成長因子(NGF)の遺伝子発現調節に対する効果を明らかにし,慢性腰痛予防,慢性腰痛に対する薬学的治療の可能性を探索ことを目的とし検討を行っている.前年度までに,ヒト椎間板細胞において,IL-1により誘導されるNGFおよびMMPsの発現がステロイド(dexamethason)により強力に抑制されたのに対し,選択的COX-2阻害剤はむしろこれら遺伝子発現を増強させることを明らかにしてきた.また選択的COX-2阻害剤による発現増強がPGE2の添加により回復されたことから,PGE2はnegative feedback様にNGFおよびMMPsを制御していることが判明した.昨年度は,PGE2によるこれら遺伝子の発現抑制機構を探るべく,PGE2受容体であるEP1-4の発現および機能について,それぞれの受容体に対する選択的アゴニストを用いて検討を行った.その結果,PGE2によるMMPs発現調節はEP1を介すること,NGFの発現調節はEP2およびEP4を介することが明らかとなった.これら基礎的研究成果は,現在臨床で汎用される選択的COX-2阻害剤による腰痛保存治療が,PGE2産生を抑制し炎症および急性疼痛を緩和する一方で,慢性腰痛に関連するMMPsによる組織変性およびNGFによる神経進入,疼痛感作を増悪させる可能性が示唆された.本研究によるMMPsおよびNGF発現調節の理解は,慢性腰痛の予防および薬物的治療につながる重要な研究であると考えられる.椎間板性腰痛は,組織変性した椎間板内側へ神経線維が侵入することで発症し,椎間板変性には細胞外基質分解酵素が,神経侵入には神経成長因子(NGF)が重要な役割を担う.腰痛保存治療に選択的COX-2阻害剤が汎用されるが,同薬剤の細胞外基質分解酵素およびNGF発現に対する効果は不明であった.本研究は,ヒト椎間板細胞を用いて選択的COX-2阻害剤の細胞外基質分解酵素発現およびNGF発現に対する効果を検討し,同薬剤は細胞外基質分解酵素およびNGF発現ともに増加させること明らかにした.選択的COX-2阻害剤は急性炎症・疼痛には有用であるが椎間板変性と神経侵入をむしろ増悪させる可能性が示唆された.近年,椎間板性腰痛発症の分子機構として,椎間板の変性に伴い,疼痛伝達をする神経線維が椎間板内側に侵入し,さらに疼痛感作が行われることが慢性腰痛の病態の1つであることが明らかになってきている.本研究は,椎間板変性を背景とした慢性腰痛に対する非ステロイド性抗炎症薬であるNSAIDsの細胞外基質分解酵素(MMPsおよびADAMTSs)および神経成長因子(NGF)の遺伝子発現調節に対する効果を明らかにし,慢性腰痛予防、慢性腰痛に対する薬学的治療の可能性について検討することを目的とし検討を行っている.昨年度は,ヒト椎間板細胞の培養法の確立およびヒト椎間板細胞における細胞外基質分解酵素およびNGF発現調節機構の解明を研究計画とした.ヒト椎間板細胞の培養法として,2次元の単層培養法と3次元のalginate beads培養法を試み,炎症性サイトカインによる応答性およびステロイドまたは選択的COX-2阻害剤に対する薬剤反応性を細胞外基質分解酵素およびNGF発現を指標に検討した.その結果,単層培養法およびalginate beads培養法ともに炎症性サイトカインであるIL-1による当該遺伝子発現の誘導が認められ,各種薬剤に対する応答性に違いは観察されなかった.これらの結果より以降の研究には単層培養法を用いて検討を行うこととした.単層培養したヒト椎間板細胞に異なる濃度のIL-1を処理したところ,10 ng/mlのIL-1処理により再現性よく当該遺伝子群発現が誘導されることを確認した.また,継時的な検討を行ったところ,IL-1により誘導されるMMPs発現は24時間後まで時間依存的に増加するのに対し,NGF発現は36時間をピークとして,一過性に増加することが判明した.これら基礎的研究成果は,本年度の研究計画予定である種々の薬剤に対する応答性を評価する上で非常に重要であると考えられる.近年,椎間板性腰痛症の分子機構として,椎間板変性に伴ない疼痛伝達をする神経線維が椎間板内側に侵入し,さらに疼痛感作が行われることが慢性腰痛の病態の一つであることが明らかになってきている.