hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＥＳ細胞由来神経前駆細胞を用いた、脳血管障害の神経再生療法への挑戦

虚血性脳血管障害に対して、神経再生療法が有効かどうかを検討するために、マウスES細胞から分化誘導して作成した大脳皮質前駆細胞をマウス脳虚血領域に移植し、その効果を検討した。その結果open fieldを用いた行動評価では、未治療群に比して治療群で有意な改善効果を認めた。さらに組織学的検討で障害半球における視床での神経の虚血性2次変性が治療群では有意に改善した。この結果は移植したES細胞由来神経幹細胞が、脳血管障害のモデル動物での神経障害を改善することを示唆しており、虚血性神経細胞障害に対するES細胞を用いた神経再生療法の有用性が示唆された。近年胚性幹細胞(= ES細胞)から神経細胞への分化誘導法が著しく発達し、SFEB法(serum-free floating culture of embryoidbody-like aggregate)を用いると、効率良く神経前駆細胞(= NP)に分化誘導できるようになった。更には大脳皮質になることが運命づけられた大脳皮質神経前駆細胞(= CNP)を分化誘導することも可能となってきた。そこで本研究ではES細胞由来CNPを用いて、脳血管障害に対する革新的な神経再生治療法の開発を目的としている。研究1年目の本年は、まずES細胞から作製したCNPを大脳皮質のみに脳梗塞を起こす脳虚血モデルマウスに移植し、神経再生療法としての有効性を検討した。まずマウス中大脳動脈閉塞モデルを用いて、閉塞直後、閉塞後3日目、閉塞後10目にCNPを移植した。その結果、中大脳動脈閉塞後3日目に移植したマウスは全例3日以内に死亡した。中大脳動脈閉塞直後、と中大脳動脈閉塞後10日目にCNPを移植した群で1ヶ月後にCNPが生着しているかどうかを検討した所、中大脳動脈閉塞後10日目に移植した群で有意に生着CNPの量が多かった。幹細胞の自己増殖能と多分化能、栄養因子分泌能などの機能は、虚血性脳血管障害の治療に有用と考えられている。例えばES細胞や神経幹細胞の脳梗塞巣への移植が脳虚血障害の治療に有効(Brain 129:3238-48, 2006)であることが報告されている。各種幹細胞のなかで、ES細胞やiPS細胞は発癌性という問題を抱えているが、組織幹細胞とは異なり、十分な量を確保することが可能である。従って、ES細胞やiPS細胞から神経前駆細胞(= NP)への分化誘導を確実に行い、発癌性を完全に制御することが可能になれば、両者は臨床上きわめて有用な幹細胞と考えられる。近年胚性幹細胞(= ES細胞)から神経細胞への分化誘導法が著しく発達し、SFEB法(serum-free floating culture of embryoid bodylike aggregate)を用いると、効率良く神経前駆細胞(= NP)に分化誘導できるようになった。前年度の研究ではCNPを中大脳動脈閉塞直後、閉塞後3日目、10日目に移植した場合、10日目に移植すると生着するCNPが最も多いことを報告した。そこで研究2年目の本年は、ES細胞から作製したCNPを大脳皮質のみに脳梗塞を起こす脳虚血モデルマウスに移植し、神経再生療法としての有効性を検討した。まずマウス中大脳動脈閉塞モデルを用いて、閉塞後10目にCNPを移植した。中大脳動脈閉塞後10日目にCNPを移植した群ではコントロール群に比して優位に虚血半球の萎縮が抑制されることが明らかとなった。現在その脳虚血保護機構の解明を目指して検討を行っている。今回、脳虚血後10日目にES細胞由来神経前駆細胞を移植してやると、脳虚血後の虚血脳半球萎縮を優位に抑制できることが明らかとなった。我々はこの神経保護効果は新たに移植した神経前駆細胞が既存の神経組織と神経連絡をすることで、脳虚血後の2次変性を抑制するという仮説を立てている。そこで組織学的に移植神経組織と既存組織とに投射経路ができあがっていることを確認しようと試みているが、明らかなシナプス結合を組織学的には証明できていない。現在免疫電顕法を用いて詳細な検討を繰り返している最中である。このため全体計画としてはやや遅れている。

更には大脳皮質になることが運命づけられた大脳皮質神経前駆細胞(= CNP)を分化誘導することも可能となってきた。そこで本研究ではES細胞由来CNPを用いて、脳血管障害に対する革新的な神経再生治療法の開発を目的としている。前年度の研究ではCNPを中大脳動脈閉塞直後、閉塞後3日目、10日目に移植した場合、10日目に移植すると生着するCNPが最も多いことを報告した。そこで研究2年目の本年は、ES細胞から作製したCNPを大脳皮質のみに脳梗塞を起こす脳虚血モデルマウスに移植し、神経再生療法としての有効性を検討した。まずマウス中大脳動脈閉塞モデルを用いて、閉塞後10目にCNPを移植した。中大脳動脈閉塞後10日目にCNPを移植した群ではコントロール群に比して優位に虚血半球の萎縮が抑制されることが明らかとなった。虚血性脳血管障害に対して、神経再生療法が有効かどうかを検討するために、マウスES細胞から分化誘導して作成した大脳皮質前駆細胞をマウス脳虚血領域に移植し、その効果を検討した。その結果open fieldを用いた行動評価では、未治療群に比して治療群で有意な改善効果を認めた。さらに組織学的検討で障害半球における視床での神経の虚血性2次変性が治療群では有意に改善した。この結果は移植したES細胞由来神経幹細胞が、脳血管障害のモデル動物での神経障害を改善することを示唆しており、虚血性神経細胞障害に対するES細胞を用いた神経再生療法の有用性が示唆された。実験を行っているうちに、より詳細な検討を行う為には、新たな機器の購入が必要であることが明らかとなった。このため、一部の実験に遅れが生じた。2年目の研究成果としてES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞を脳虚血10日目に脳移植すると明らかな虚血脳保護効果があることを明らかとした。研究3年目にあたる本年はこの虚血保護効果の詳細を検討する。具体的には移植されたES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞と既存の脳領域とに神経投射(シナプス結合)があるかどうかを検討する。神経投射の有無は免疫電顕法やトレーサー法を用いて検討を行う。神経科学研究2年目にあたる本年は脳梗塞作成後10目にES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞を脳移植する。その際、移植する神経前駆細胞の量を変えることで、ES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞に脳虚血に対する神経保護効果があるかどうか評価する。「現在までの進捗状況」の項でも記述した様に、ES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞と既存の脳領域とに神経投射(シナプス結合)があるかどうかの検討を現在続けている。この検討は投射を確認できればすぐに終了するが、明らかな投射が見られない場合には、本当にないのか、それても検討が十分でないかの見極めに時間がかかっている。従って研究進捗状況はやや停滞しており、使用額に予定より若干誤差が生じた。1年目は、実験を行いデータを解析してみた所、より詳細な検討が必要であることがわかった。このため新たな機器の購入が必要となった。これにより一部の実験で、十分には研究を進めることが出来なかった。本年度は必要な実験機器を購入し、計画の遅れを取り返す予定である。移植されたES細胞由来大脳皮質神経前駆細胞と既存の脳領域とに神経投射(シナプス結合)があるかどうかを検討を行っているが、現在の所明らかなシナプス結合を組織学的には証明できていない。
心筋細胞での脂肪酸結合蛋白(FABP)の機能

心筋H-FABPの蛋白化学的性状,機能特性及び組織分布について肝L-FABPと比較検討した. 1.蛋白化学的性状:ネズミ心筋上清より精製したH-FABPは,分子量15KDaのsingla polypeptideでpI及びpeptide map上からをL-FABPとは明らかに異なる蛋白でL-FABPに特徴的なCysを検出できず,またL-FABPに検出されないTrpを検出できるなどアミノ酸側からをH-FABPとL-FABPの違いが確認された. 2.機能特性:同一の結合能測定条件下でligandとして遊離のパルミチン酸,ステアリン酸,オレイン酸,リノール酸及びアラキドン酸を用いた場合H-FABPとL-FABPの間に結合親和性で大きな差異は認めなかったが,オレイン酸CoAに対する結合能はL-FABPが飽和性の高親和性であるのに対しH-FABPでは直線的な低親和性を示した.ミクロソーム及びミトコンドリアを酵素材にacylCoA合成酵素活性に対するL-FABPとH-FABPの添加効果では,基質としてPCのunilamellar uesiclas中の脂肪酸では影響ないのに対しmultila mellar uesiclesでとくにL-FABPによる活性増加を認めた.H-FABPは心筋の顆粒を酵素材としたとき促進した.vesiclesとは異なりFABPと脂肪酸の複合体を基質にした場合肝及び心の顆粒酵素系ではそれぞれL-FABP, H-FABPの対応する臓器に一致してよい基質となる傾向がみられた.3.組織分布:免親組織化学的検索でL-FABPは胎児から成人の肝,十二指腸から下行結腸に至る繊毛上皮細胞に分布し,胎児肝ではacini全体に成人ではpeniportalに主に分布又電顕上グリコーゲン顆粒に濃く,これは飢餓と共に消〓した.gldset cellを除く上皮細胞に分布したL-FABPはcryptで検出されなかったが,飢餓によりcrypt上半分のcellが陽性となり再食〓により消失した.上皮細胞ではbasolateralよりもapicalportionの染色が強い. L-FABPは飢餓及び〓〓で分布と溜疫が変化すると推定され, H-FABPの組織化学的検索を目下準備中である.心筋H-FABPの蛋白化学的性状,機能特性及び組織分布について肝L-FABPと比較検討した. 1.蛋白化学的性状:ネズミ心筋上清より精製したH-FABPは,分子量15KDaのsingla polypeptideでpI及びpeptide map上からをL-FABPとは明らかに異なる蛋白でL-FABPに特徴的なCysを検出できず,またL-FABPに検出されないTrpを検出できるなどアミノ酸側からをH-FABPとL-FABPの違いが確認された. 2.機能特性:同一の結合能測定条件下でligandとして遊離のパルミチン酸,ステアリン酸,オレイン酸,リノール酸及びアラキドン酸を用いた場合H-FABPとL-FABPの間に結合親和性で大きな差異は認めなかったが,オレイン酸CoAに対する結合能はL-FABPが飽和性の高親和性であるのに対しH-FABPでは直線的な低親和性を示した.ミクロソーム及びミトコンドリアを酵素材にacylCoA合成酵素活性に対するL-FABPとH-FABPの添加効果では,基質としてPCのunilamellar uesiclas中の脂肪酸では影響ないのに対しmultila mellar uesiclesでとくにL-FABPによる活性増加を認めた.H-FABPは心筋の顆粒を酵素材としたとき促進した.vesiclesとは異なりFABPと脂肪酸の複合体を基質にした場合肝及び心の顆粒酵素系ではそれぞれL-FABP, H-FABPの対応する臓器に一致してよい基質となる傾向がみられた.3.組織分布:免親組織化学的検索でL-FABPは胎児から成人の肝,十二指腸から下行結腸に至る繊毛上皮細胞に分布し,胎児肝ではacini全体に成人ではpeniportalに主に分布又電顕上グリコーゲン顆粒に濃く,これは飢餓と共に消〓した.gldset cellを除く上皮細胞に分布したL-FABPはcryptで検出されなかったが,飢餓によりcrypt上半分のcellが陽性となり再食〓により消失した.上皮細胞ではbasolateralよりもapicalportionの染色が強い. L-FABPは飢餓及び〓〓で分布と溜疫が変化すると推定され, H-FABPの組織化学的検索を目下準備中である.
家畜牛類及び近縁野性種の1個体毎のサテライトDNA情報による遺伝分化測定と系統史

アジア、特に東南アジアの家畜牛の成立過程において、地域によって北方系牛(肩峰のない牛)、インド系牛(肩峰牛)及びバンテング(Bos javanicus)の3種の遺伝子給源から種々の程度の遺伝的影響があったことが本研究グループ外によって明らかにされたくアジアにおける家畜牛の多元的家畜化起源)。同様に、家畜水牛も少なくても亜種レベルに分化した2つの野生種グループに起源を発していることが明らかにされた。そこで、1個体毎のレベルで異なる遺伝子給源に由来する遺伝子の相対量を効率よく推定できる方法の確立を目指した。染色体セントロメア領域に持異的なDNA反復配列は、牛類ゲノムの約4%を占めるので大きな情報量を持ち、かつ、相同染色体の問で交叉も起きるので、交雑の程度を推定するための有効な指標となる。家畜水牛において、サテライトDNA反復記列の検出を試みた。結果、2種の反復単位が確認された。これらが染色体C-バンド領域にあることはFISH法で確かめた。サテライト-I(S-1)の反復単位の大きさは制限酵素Bam HIで1400bp(Stu Iで800bp+600bp)、同-II(S-II)はBam HIで700bp(Stu Iで400bp+300bp)であった。S-Iの靴は偶然S-II反復配列単位の2倍の大きさであったが、染色体によって含まれる量は両者で一致せず、相互に異なる反復配列であった。また、牛のそれらとのホモロジーを調べた結果、S-Iで79%、S-IIで81%であった。異なる牛種問(品種間)でS-I及びS-IIの反復単位内部の配列を比較し、切断位置が異なる制限酵素を採用すれば1個体毎のサテライトDNA反復配列全体の遺伝的構成を極めて容易かつ安価に推定できる方法となるはずである。本研究はこの方法に必須の基礎情報を与えた。本年度は海外共同研究者の協力により、交配歴が明らかな家畜牛よび家畜水牛、すなわち、ゼブ系統牛とヨーロッパ品種との交雑牛、河川型水牛(ムラー種)と沼沢水牛(東南アジア在来水牛の交雑水牛のDNA試料を得ること、そしてこれらのモデル試料を用いて、サテライトDNAのAFLPの検出に適した分析方法を確立することを目的とした。同時に、過去30年来蓄積しているアジアを中心とする在来牛、及び水牛の保存DNA試料を分析可能な状態への調整を進めた。具体的には本格的解析のために以下の準備を進めた。1)家系が明らかな交雑牛及び交雑水牛のDNA試料の採取と精製を海外研究協力者に依頼し、目的の試料が得られつつある。2)既に保存試料として蓄積されているアジア産在来牛、在来水牛及び現生牛亜科野生種のDNAの整理し、本研究での分析に適した試料とするための調整を行った。一方、これらの試料は既に他の方法による系統解析が一定程度進められて公表論文等としてまとめられているので、これらの結果に関する資料を収集整理した。3)水牛で既に得ている2種類のサテライトDNAプローブの有効性を各種の牛品種で確認した。4)異なる牛及び水牛の系統間で明確なAFLPを示す制限酵素の検索と選択を進めた。本研究は家畜牛、家畜水牛の多元起源説に基づく系統遺伝学的来歴の推定を行う手法の技術開発とそれによる家畜遺伝資源の効率的な評価法の確立を目的として、来歴の明らかな交雑牛、交雑水牛のモデル試料を用いてサテライトDNAのAFLPの検出に適した分析方法を開発することにある。

本年度は海外共同研究者の協力によりモデルDNA試料を入手し、それをもとに有効なプローブの開発と特異的なAFLPが検出できる制限酵素の組合せの検索を行った。同時に昨年度に引続き、これまでに蓄積された家畜牛類の保存DNA試料の整理と分析可能な状態への調製を進めた。具体的な成果は以下の通りである。1)モデル試料として牛はヨーロッパ品種のホルスタイン種、ゼブ系統のブラーマン種及び交雑牛のホルスタイン種×サヒワール種のF1を、水牛は河川型のムラー種、沼沢型のフィリピン水牛及び交雑水牛としてそれらのF1をそれぞれ1個体ずつフィリピンの共同研究者より入手した。2)水牛で既に得られた2種類のサテライトDNAプローブを上記の試料に用いてその有効性を確認した。3)異なる牛及び水牛の系統間で明確なAFLPを示す制限酵素の検索と2)以外の有効なプローブの開発は現在進行中である。4)保存試料として蓄積されているアジア産在来牛、在来水牛及び牛亜科近縁野生種のDNAは国単位でまとめられているがこれを地域集団ごとに整理し、また、すぐに分析に用いられるよう濃度調製を行った。アジア、特に東南アジアの家畜牛の成立過程において、地域によって北方系牛(肩峰のない牛)、インド系牛(肩峰牛)及びバンテング(Bos javanicus)の3種の遺伝子給源から種々の程度の遺伝的影響があったことが本研究グループ外によって明らかにされた(アジアにおける家畜牛の多元的家畜化起源)。同様に、家畜水牛も少なくても亜種レベルに分化した2つの野生種グループに起源を発していることが明らかにされた。そこで、1個体毎のレベルで異なる遺伝子給源に由来する遺伝子の相対量を効率よく推定できる方法の確立を目指した。染色体セントロメア領域に特異的なDNA反復配列は、牛類ゲノムの約4%を占めるので大きな情報量を持ち、かつ、相同染色体の間で交叉も起きるので、交雑の程度を推定するための有効な指標となる。家畜水牛において、サテライトDNA反復配列の検出を試みた結果、2種の反復単位が確認された。これらが染色体C-バンド領域にあることはFISH法で確かめた。サテライト-I (S-I)の反復単位の大きさは制限酵素Bam HIで1400bp (Stu Iで800bp+600bp)、同-II (S-II)はBam HIで700bp (Stu Iで400bp+300bp)であった。S-Iの単位は偶然S-II反復配列単位の2倍の大きさであったが、染色体によって含まれる量は両者で一致せず、相互に異なる反復配列であった。また、牛のそれらとのホモロジーを調べた結果、S-Iで79%、S-IIで81%であった。異なる牛種間(品種間)でS-I及びS-IIの反復単位内部の配列を比較し、切断位置が異なる制限酵素を採用すれば1個体毎のサテライトDNA反復配列全体の遺伝的構成を極めて容易かつ安価に推定できる方法となるはずである。本研究はこの方法に必須の基礎情報を与えた。
酸化物高温超電導マグネットにおける交流損失の電気的計測法に関する研究

本研究は、酸化物高温超電導マグネットの交流損失の電気的計測法について検討したものである。平成15年度は、主として計測対象の酸化物高温超電導線マグネットの製作を行った。これと並行して、冷却系の構築並びに試作の超電導マグネットの超電導状態の確認などを実施した。平成16年度はこれらに続いて、酸化物高温超電導マグネットの交流損失に関わる位相差計測用の電子回路を重点的に検討し、それらの回路を用いて実際に超電導マグネットの位相差計測を実施した。コイル電圧と電流の位相差を計測して、電気的に交流損失を評価するものであるが、以下に示す(1)(3)の電子回路を検討した。(1)オペアンプを用いた位相差計測:超電導コイルの電圧と電流の位相差は90度に近いため、電圧信号の位相差を90度進め、微小の位相差にして計測する回路を製作した。計測結果はロックインアンプによる結果とも比較的に良く一致し、この回路の精度は十分高いことが認められた。(2)乗算器を用いた位相差計測:電圧と電流信号の乗算を行い、その出力に含まれる2倍周波数成分を低周波のバンドパスフィルターで除去して、直流分のみにする方式である。その直流分の大きさから、位相差を計測するものである。計測結果は比較的良好であった。(3)一部デジタル化した位相差計測回路:(1)の方式とほとんど同じである。しかし、全てアナログ方式であると、内部の信号が最小となるような微調整回路が必要であるため、その微調整を自動化するためにVerilog-HDLを用いたデジタル制御部を設計した。このデジタル制御部の設計回路をFPGAに実装し、位相差計測を実施した。実験では、デジタル部の信号がアナログ部へ雑音として入ったため、測定精度が若干低下した。以上、(1)(3)の位相差計測回路を検討し、一応の成果が得られた。特に、(1)の方式においては、実用的と考えられる結果が得られた。本研究では酸化物超電導コイルの交流損失を電気的に計測することが目的であるため、本年度は計測対象の酸化物超電導コイルの製作と冷却系の構築並びにコイルの超電導状態の確認等を実施した。まず、計画書通り酸化物超電導線材を購入し、その線材でダブルパンケーキコイルを製作した。次に、コイル支持材を設計・製作して、コイルをクライオスタット内部に収納した。その後、数回にわたりコイルを液体窒素に浸し、同時に直流と交流の電圧を加え、コイルの超電導状態の確認を行った。超電導コイルの交流損失分に相当する抵抗値は非常に小さいため、交流励磁の場合には超電導コイル両端の電圧に対して通電電流は90°にかなり近い位相遅れとなることを確認した。製作したコイルは、通電時もクエンチせずに安定して超電導状態を保ち、今後の実験に十分活用できることが分かった。一方、これら超電導コイルの製作実験と並行して、交流損失計測用電子回路を含む計測系の構築も進めた。コイル電圧の信号波形を高精度で90°遅らせて移相すると、コイル電圧と通電電流の信号波形間の位相差は微小となるが、この微小位相差を計測すれば、交流損失の電気的な計測が可能となる。従って、90°の移相回路と微小位相差計測回路を組み合わせて、超電導コイルの交流損失を電気的に計測する方式を本研究では提案している。

OTAを用いた微小位相差計測回路力は、内部信号の振幅が最小となるような微調整回路が必要であり、その微調整を自動化するためにVerilog-HDLを用いたデジタル制御部を設計したした。また、ゲートレベルでのシミュレーションも実施し、意図した動作を行うことを確認した。このデジタル制御部の設計回路をFPGAに実装し、超電導コイルの交流損失計測への適用を試み、検討を進めている。今後、次年度にまたがり交流損失計測の実験を数多く実施して、データの蓄積を行う予定でいる。本研究では、酸化物超電導コイルの交流損失を電気的に計測することが目的である。平成15年度は、主として計測対象の酸化物超電導コイルの製作と冷却系の構築並びにコイルの超電導状態の確認等を実施した。平成16年度は、これに続いて位相差計測用の電子回路を重点的に検討し、その回路を用いて実際に位相差計測を実施した。コイル電圧と電流の位相差を計測して、電気的に交流損失を評価するものであるが、以下に示す(1)(3)の3種類を検討した。(1)オペアンプを用いた位相差計測:超電導コイルの電圧と電流の位相差は90度に近いため、電流の位相差を90度進めて電圧と電流を微小の位相差にして、計測する回路を作製した。計測結果はロックインアンプによる結果とも比較的に良く一致し、この回路の精度は十分高いことが認められた。(2)乗算器を用いた位相差計測:電圧と電流の乗算を行い、その出力に含まれる2倍周波数成分を低周波のバンドパスフィルターでカットして、直流分のみにする方式である。その直流分の大きさから、位相差を計測するものである。計測結果は比較的良好であった。(3)一部デジタル化した位相差計測回路:(1)の方式とほとんど同じである。しかし、(1)のように完全アナログ方式であると、内部の信号が最小となるような微調整回路が必要であるため、その微調整を自動化するためにVerilog-HDLを用いたデジタル制御部を設計した。このデジタル制御部の設計回路をFPGAに実装し、位相差計測を実施した。実験では、デジタル部の信号がアナログ部へ雑音として入ったため、測定精度が若干低下した。以上、(1)(3)の位相差計測回路を検討したが、特に(1)の方式において、実用的と考えられる成果が得られた。
膜透過性ペプチドを用いた悪性神経膠腫腫瘍幹細胞に対する治療の実現化の研究

悪性神経膠腫のグリオーマ幹細胞(GSC)の存在が化学療法や放射線治療抵抗性の原因であると考え、それに対する膜透過性ペプチドをもちいた治療を実現すべく、薬剤内包ミセルを用いた実験を構築した。ターゲットとするGSCは手術検体より得られた腫瘍細胞を直接ヌードマウスの皮下に植え込み、樹立した。培養実験や動物実験にて膜透過性ペプチドによる腫瘍細胞の細胞死を観察し、それがオートファジーによるものであることを確認した。さらなる動物実験が必要と考えている。本研究は、放射線治療および化学療法に抵抗性を示すグリオーマ癌幹細胞(Glioma stem cell,以下GSCと示す)に効果的な治療法の開発を目的としており、われわれはこれに対して膜透過性ペプチドを用いる方法を選択した。以前までの研究で、フロックスハウスウイルス(FHV)由来の塩基性ペプチドが細胞内導入効率が高いことが明らかになっており、膜透過性ドメインにこのFHVとp53タンパクのC末端ペプチドを結合させた膜透過性ペプチド(以後Pas- FHV-p53C'と示す)を用いていくつかの実験をおこなった。GSCを患者手術サンプルより継代培養して獲得していたが、継代培養を続けることによってGSCの性質変化が認められることがわかった。このため、従来の方法から、手術サンプルを継代培養しないで、そのままヌードマウスの皮下に植え込み腫瘍を増大させてGSCを得るという方法に転換した。この方法によってGSCの性質を保ったままGSCを増やして濃縮することができた。このGSCに対してPas- FHV-p53C'を投与するとGSCにオートファジー細胞死を誘導できることは確認できているが、そのメカニズムはよくわかっていないため、まず細胞死が誘導される時の分子の変化と病理学的変化を観察した。電子顕微鏡にてオートファゴゾームがつぶれたような変性した小胞が多く観察されたことからオートファジー細胞死には間違いないことは確認できたために、この現象をもっと簡便に証明できる分子の変化を捉えるべく、いくつかのオートファジー関連分子の発現の変化を遺伝子発現と蛋白発現レベルで解析をおこなっている。以前として、まだいろいろなシステムを構築している段階であるが、今後は少しずつ実験結果が蓄積されることが期待される。本研究は悪性神経膠腫に対して新規治療法として膜透過性ペプチドを利用し、最終的に臨床応用を目指すことを目的とするものであった。悪性神経膠腫が難治性である原因はその浸潤性発育と、その腫瘍細胞内にわずかに存在するグリオーマ幹細胞(Glioma Stem cell,GSC)が放射線治療や化学療法に抵抗性を示すことによる。このGSCに効果的な治療法として、我々は細胞内に細胞膜透過型ペプチドを導入して、腫瘍細胞の増殖抑制やアポトーシス、オートファジーなどの細胞死を誘導できる方法を開発したので、これを何とか臨床応用まで近づけるための実験をおこなった。このオートファジー細胞死の検証をおこない、そのメカニズムの解明、ペプチドとして、腫瘍抑制遺伝子であるp53のカルボキシル基(C末端)を用いているが、ペプチドスクリーニングを行いさらに効果的に腫瘍細胞に対して細胞死を誘導できるものを探索などをおこなった。細胞死の証明に関しては、アポトーシスの実験、オートファジーの実験などを繰り返しおこなったが、どちらの細胞死も混在しているような印象を受け、条件設定が非常に困難であった。ペプチドに関してもp53のカルボキシル基以外の有効性を示すものもいくつか候補としてピックアップしたが、どれもp53以上の有効性を示すことができなかった。今後もスクリーニングは続行予定である。動物実験モデルとしては非常に安定したものが得られたので、今後の実験にはいろいろな膜透過性ペプチドの有効性を検証するも動物実験には使用可能である。臨床応用にはもう少し検証しなければならない実験が必要である。当初はp53のカルボキシル基のペプチドを用いて悪性神経膠腫のGSCに細胞死を誘導する予定であったが、さらに有効なペプチドのスクリーニングに時間を要した。同時に進行させていた細胞死のメカニズムの解明に関しては、細胞死はオートファジーだけではなくアポトーシスも混在しているという知見が得られたことにより、その検証には追加せざるを得ない細胞死の実験が生じた。動物実験モデルに関しては、ある程度安定して実験に使えるような腫瘍植え込みマウスが使用可能な状態まで完成しているが、肝心の膜透過性ペプチドに関して、もう少し改良が必要な状態である。悪性脳腫瘍の代表として、悪性神経膠腫があるが、その中でも膠芽腫という疾患は非常に予後不良な疾患である。その原因として、膠芽腫において化学療法や放射線治療に耐性である細胞が存在するために、ほとんどの腫瘍が再発する。近年、悪性神経膠腫のグリオーマ幹細胞(GSC)の存在が化学療法や放射線治療抵抗性の原因であると報告された。そこで、我々は、GSCに対する膜透過性ペプチドをもちいた治療を実現すべく、薬剤内包ミセルを用いた実験を構築した。まず、GSCを豊富に使用できるように、手術検体より得られた腫瘍細胞を直接ヌードマウスの皮下に植え込み、継代した。数例のGSCが樹立された。これらの細胞を用いて、膜透過性ペプチドがGSCに対して細胞死を誘導できるかを検証した。培養細胞では培養液に直接ペプチドを投入することで細胞死が観察できた。しかし、生体では膜透過性ペプチドが生体内で吸収されたり、破壊されたりするためか安定した細胞死が観察できなかった。そこで薬剤内包ミセルを用いて、膜透過性ペプチドを内包し、安定した形で生体内において作用するかどうかを検証した。

直接投与するより細胞死の増加は観察できたものの、比較的抵抗性を示すGSCも観察された。この膜透過性ペプチドによる腫瘍細胞の細胞死はオートファジーによるものであることは報告されており、それに関しては実験にて確認できた。p53蛋白のC末端のペプチドを用いたが、それ以外のペプチドも合成し試す必要があると考えられた。生体内での安定した細胞死を誘導するためにはさらなる薬剤内包ミセルの改良も必要と思われる。悪性神経膠腫のグリオーマ幹細胞(GSC)の存在が化学療法や放射線治療抵抗性の原因であると考え、それに対する膜透過性ペプチドをもちいた治療を実現すべく、薬剤内包ミセルを用いた実験を構築した。ターゲットとするGSCは手術検体より得られた腫瘍細胞を直接ヌードマウスの皮下に植え込み、樹立した。培養実験や動物実験にて膜透過性ペプチドによる腫瘍細胞の細胞死を観察し、それがオートファジーによるものであることを確認した。さらなる動物実験が必要と考えている。本研究は今後も推進していく予定である。現在使用しているp53のカルボキシル基のペプチドは有効性を示すが、さらに有効なペプチドの探索も継続して行う予定である。しかし、細胞死のメカニズムの解明に関しては、非常に経費と時間を要しており、ある程度の段階で切り上げる必要があると思われる。課題としては細胞死のメカニズムが複雑であるがゆえにその解明を完璧に行うことに無理が生じているとの見方である。研究計画の大きな変更点はないが、細胞死のメカニズムの解明に使用するエネルギーを他の部分に使うことで本研究を推進したいと考えている。いくつかの面白い知見得られており、それらの部分に関しては追求する部分が出てくる可能性がある。一言に細胞死といっても、それがどのようなメカニズムで起こっているかということを証明することは比較的難しい。主に、培養細胞にての実験が主体であるために細胞死が起こった場合、本当に我々が使用している膜透過性ペプチドの効果なのかどうかを判断するシステムの構築に時間を費やした。培養細胞は培養条件によってその生存が左右されやすく、毎回の実験で同じ結果が出ないことが起こる。その原因を克服しつつ、コントロールと比較して明らかに目的とする細胞死の誘導条件の確立が整ってきている。またグリオーマ幹細胞(GSC)の樹立も比較的困難であり、現在はすべて手術検体から得られた腫瘍サンプルをヌードマウスを使って濃縮する方法に変換した。この方法は、ある程度安定したGSCを細胞死の実験に使用するまでにかなりの時間を要する。本研究の実験に関して、予定通り進まず遅延したために、もう少し追加の実験が必要であり、それらの経費がかかる可能性があることと、それらの成果報告の費用を要するため追加する実験にかかる経費及び、それらの研究成果の論文発表や学会発表の旅費に使用するオートファジー細胞死の再現性のある実験システムの構築が、まず課題であるが徐々に安定した結果を得られるようになってきている。このシステムは今後の研究の根幹部分であるために、より簡便の確認できるシステムとしておきたいので、更なる効率よいシステム構築を平行して行う計画である。
位置価に基づく葉形・サイズのホロニック制御機構の解明

(1) RTFLファミリーの位置価決定機構の解析:ゼニゴケでのホモログの発現解析を進めた。またイネRTFLの、シロイヌナズナでの表現型を解析した(Guo et al. 2015)。(2)細胞分裂過程と細胞伸長過程との間のホロニック制御:an3での補償作用を打ち消すxs変異の原因遺伝子の1つをクローニングした。(3)複葉形成の方向性の解析:ケシ科における複葉形成の方向の多様性について新解釈を提示した(Ikeuchi et al. 2013, 2014)。(4)捕虫葉の形成メカニズム:ムラサキヘイシソウの袋状葉の形成メカニズムに新たな仕組みを提唱した(Fukushima et al. 2015)。(1)RTFLファミリーの位置価決定機構の解析:ゼニゴケにおける過剰発現体と、ターゲティングラインとを作成することに成功した。またプロモーター下にCitrineを結合させたものの発現体を得ることもできた。加えてシロイヌナズナにおける過剰発現体を作成したほか、イネのRTFLのシロイヌナズナにおける過剰発現体の表現型を確認した。以上の成果の一部はすでに、日本植物生理学会大会において口頭発表をしたほか、論文原稿を準備中である。(2)細胞分裂過程と細胞伸長過程との間のホロニック制御のメカニズムの解明:an3での補償作用を打ち消すxs変異体の原因遺伝子のうち1つをポジショナルクローニングで同定した。またもう1つについては次世代シークエンサーによる解析を進めた。AN3のキメラ発現体については、後期葉における表現型を詳細に解析するための、実験系の整備を進めた。また補償作用を発揮するfas1変異体について、細胞分裂能の低下の原因についてATM依存的なDNAダメージの側面から解析を進め、原著論文1本を発表した。さらにKRP2の過剰発現による補償作用の要因として、V-ATPaseの活性調節があることを見いだし、これも原著論文1本並びに短報1本として発表した。加えて、補償作用に付随して葉緑体の数が変化することを見いだし、原著論文1本として発表した。(3)平面成長に関する位置価因子の同定:単面葉の平面成長性に関する変異体をコウガイゼキショウから単離・樹立した。(4)複葉における小葉決定位置の解析:ケシ科における小葉決定位置機構について、クサノオウおよびハナビシソウで遺伝子発現パターンおよびin vitro培養系を用いて解析を行ない、成果を2本の原著論文として発表した。(1)RTFLファミリーの位置価決定機構の解析ゼニゴケにおけるRTFLをクローニングし、その過剰発現体と、ターゲティングライン、プロモーター:マーカーラインを作成する準備を進めた。またイネのRTFLの1つ、OsRTFL3のシロイヌナズナにおける過剰発現体を作成した。(2)細胞分裂過程と細胞伸長過程との間のホロニック制御のメカニズムの解明an3変異体で発現する補償作用を打ち消すxs変異体について、その原因遺伝子をポジショナルクローニングで解析した。またAN3のキメラ発現体について、後期葉における表現型を解析するための短日条件での栽培・およびキメラ誘導条件を確立した。さらにレーザーによる単一細胞誘導系の条件検討を進めた。(3)胚発生時の葉のアイデンティティー決定因子の解析hanとan3の二重変異体は、それぞれの単一劣勢変異では見られない劇的な表現型として、胚の頂端側に葉のアイデンティティーではなく、根のアイデンティティーが与えられることを先に見いだしている。しかしこれは胚のアイデンティティを攪乱してadult化することで見られなくなることが、平成24年度に判明した。そこでadultのSAMにおいてhanとan3の二重欠損状態を誘導する試みを行なった。(5)複葉の小葉形成の位置決定メカニズムケシ科における複葉形成の方向性について、求頂的な種類と求基的な種類を選び、それぞれの小葉の分化段階の指標となる遺伝子の発現と成長勾配とを解析し、従来の仮説が間違っていることを見いだした(Ikeuchi et al. 2014)。(1)RTFLファミリーの位置価決定機構の解析:ゼニゴケにおける過剰発現体と、ターゲティングラインとを作成し、プロモーター下にCitrineを結合させたものの発現体も得た。また陸上植物におけるこのファミリーの構造多様性を明らかにし、イネのRTFLのシロイヌナズナにおける過剰発現体の表現型を確認して論文として発表した(Guo et al. in press)。(2)細胞分裂過程と細胞伸長過程との間のホロニック制御のメカニズムの解明:

これについては、fas1, fugu5,またKRP2o/xにおける細胞異常肥大の分子背景をそれぞれ明らかにし、3本の論文として発表した(Hisanaga et al. 2013; Ferjani et al. 2013a, 2013b )。AN3のキメラ発現体については、後期葉における詳細な解析の実験系が樹立できた。(3)平面成長に関する位置価因子の同定:単面葉の平面成長性に関する候補遺伝子クローンをイグサ属から単離した。また葉原基における細胞分裂パターンを可視化するEdU改法を開発した。(4)胚発生時の葉のアイデンティティー決定因子の解析:hanとan3の二重変異体は、それぞれ単一劣勢変異では見られない劇的な表現型として、胚の頂端側に葉のアイデンティティーではなく、根のアイデンティティーが与えられる。この分子メカニズムについては共同研究を進めたので、近く論文化する。(5)食虫植物の捕虫葉の形成機構:基生研・長谷部研究室との共同研究により、サラセニアの袋型の葉の形成メカニズムについて、従来言われてきたような背腹性の位置価のずれが原因かどうかをin situ解析で調べたところ、予想外なデータを得、従来の解釈を否定し、全く新しいメカニズムに依っていることを報告した(Fukushima et al. 2015)。26年度が最終年度であるため、記入しない。ポスドクの手当て等の遅れがあったが、当初計画以上の進展が合ったテーマとして、ケシ科植物における複葉の小葉形成の方向性の問題がある。これについて、昨年度のIkeuchi et al. (2013)に加え、Ikeuchi et al. (2014)の2本目の論文発表に至った。当初計画していた解析テーマについても、順調に進行した。植物の発生・分子遺伝学ここまでの成果を研究基盤として、最終ゴールに向けて研究を加速する。特に長軸方向の位置価として有力な候補因子であるRTFLの機能について論文化を進める。特にRTFLファミリーの解析については、ゼニゴケという新しいモデル計の利点を活かすことで、今までシロイヌナズナの実験系では想定しなかったレベルの解析が可能となった。また補償作用に関連した解析で、想定外の発見が相次ぎ、原著論文として発表できた。(1)RTFLファミリーの位置価決定機構の解析:ゼニゴケにおける解析を完了させ、論文原稿を投稿する。(2)細胞分裂過程と細胞伸長過程との間のホロニック制御のメカニズムの解明:an3での補償作用を打ち消すxs変異体の原因遺伝子について詳細な解析を進める。AN3のキメラ発現体については、後期葉における表現型を詳細に解析し、ホロニック菜制御の影響する範囲を正確に見積もることを進める。(3)平面成長に関する位置価因子の同定:単面葉の平面成長性に関する変異体について、分子遺伝学的・発生生物学的解析を進める。
アルキル化DNA修復機構の三次元構造レベルでの解明

大量生産の系が確立している大腸菌由来の3ーメチルアデニンDNAグリコシラーゼII(alkA遺伝子産物)を対象としたが、本酵素は、alkA遺伝子を組込んだプラスミドをもつ大腸菌から純度よく分離・精製した。結晶化は、蒸気平衡法を用い、沈澱剤、温度、緩衝溶液等の条件を検討したところ、沈澱剤としてポリエチレングリコール6000を含むTris緩衝溶液(pH8.5、10°C)から板状結晶(3.5×0.5×0,2mm)が得られた。結晶学的データは、強力X線発生装置(40KV、250mA)を用いたプレセッション写真と自動四軸型X線回折計データから、単斜晶系、空間群:C2、格子定数:a=56.8〓,b=76.8〓、c=62.2〓、beta=110.3°と決定した。非対称単位に1分子存在すると仮定すると、Vm=2.1〓/daltonという妥当な値を示し、静止写真から2.7〓以上の分解能をもつことがわかったので、この結晶はX線構造解析に適しているといえる。次に自動四軸型X線回折計で2個の単結晶を用いて3.2〓分解能までの7235反射のX線回折強度データを測定し、損傷と吸収の補正後、スケーリング、平均化を行ない、独立な2667反射データを得た。結晶間や対称で関係づけられる反射データの一致度を示す指標RmとRs値が、それぞれ0.04と0.05であったことは、X線強度として妥当なデータを得たものと考える。本酵素の場合、重原子同型置換法によるX線構造解析を行なう必要があるので、種々の重原子誘導体結晶の調製を行なったが、いまだに良好な重原子誘導体結晶は得られていないが、引続き探索を進める予定である。なお、本酵素の溶液学的性質については、円偏光二色性(CD)スペクトルをもとに、二次構造の含量を推定してみたところ、alphaーヘリックス:35%、betaー構造:16%であることが示され、これはアミノ酸配列からの予測とよく一致している。
ショウジョウバエPCNA/DNAポリメラ-ゼδ補助タンパク遺伝子の機能と発現調節

(1)ショウジョウバエPCNA遺伝子の塩基配列の解析から5′上流域にホメオドメインタンパクの結合コンセンサス配列が存在していることを明らかにした。またプライマ-伸長法により転写開始点を決定した。プロモ-タ-領域にはTATAボックスやCAATポックスは存在せず、哺乳動物遺伝子に見られるGCボックスに類似の配列が存在している。(2)大腸菌におい合成したショウジョウバエホメオドメインタンパクがin vitroで実際に上記の配列に結合することをフットプリント法を用いて明らかにした。(3)PCNA遺伝子5′上流域をクロラムフェニコ-ル(CAT)遺伝子に連結し、ショウジョウバエ培養細胞kc細胞に導入すると、CATの強い発現がみられた。一方、ショウジョウバエホメオドメインタンパクのひとつであるzerknulltタンパク発現プラスミドを同時導入するとCAT発現の抑制がみられた。(4)胚から成虫に至るまで、PCNAmRNAは存在しているが、特に初期胚で高く発現し、また、未受精卵にも高いことから、主に母性mRNAとして蓄えられていることを、ノ-ザン法により明らかにした。以上本年度は主にPCNA遺伝子発現調節について種々の知見を得た。特に(1)(3)の知見は、形態形成をつかさどるホメオボックス遺伝子が、分化形質遺伝子のみならずPCNA遺伝子のようなDNA複製に関与する遺伝子の発現も制御している可能性を示し、分化と増殖の関係を考えるうえで示唆深い。
皮膚老化ホルモンの同定と機能解析

マウス培養細胞を用いた実験により、長寿遺伝子であるSIRT1により発現が抑制され、老化で増加する分子としてPrl2c3を同定した。Prl2c3は老齢マウスで増えており、皮膚の表皮細胞に限局して発現していた。ヒトの皮膚でもマウスと同じ部位で発現していたが、ヒトではPrl2c3に一致する遺伝子は存在しない。このため、ヒトのPrl2c3に相当する分子を同定し、その分子の老化への作用と作用機序を調べる。
禁煙後の体重増加における食欲抑制系ホルモンとAMPK、オステオポンチンの作用

団塊世代が後期高齢者となる2025年が迫る中、超高齢化社会を迎え骨粗鬆症による骨折は生活の質を落とす大きな問題であり、喫煙は骨粗鬆症のリスクを上昇させる危険因子である。今回、喫煙が骨粗鬆症に与える影響を、禁煙治療の前後で骨代謝マーカーを測定・評価した。評価項目としてTRACP-5b、ucOC、オステオポンチン、RANKLなどを測定した。結果、禁煙後早期にucOC、TRACP-5b、オステオポンチンが増加し、RANKLが減少に転じた。BAP、NTXは不変だった。喫煙が骨形成・骨吸収系マーカーを介して、骨粗鬆症の発症に関係していることが示唆された。今回の研究で食欲中枢抑制ホルモンの下流にある、レプチンの受容体を有し、肺気腫の病態に大きな役割を果たしていると考えられている「オステオポンチン」とメタボリック・センサーともいわれる細胞内シグナル「アデノシン-1ーリン酸活性化プロテインキナーゼ(AMPK)」に着目し、レプチンやGLP-1の作用点を明らかにしたいと考えた。禁煙外来を受診した患者のうち、ニコチン依存症と診断され、本研究に自由意志で参加してくれた被験者について、禁煙治療(バニクレイン(商品名:チャンピックス)ないしはニコチネルTTS(商品名:ニコチンパッチ))を行った。それぞれについて禁煙前、禁煙後1、2か月後に食欲、体重変化、検体採取を行った。平成27年12月1日から平成28年3月31日までの4ヶ月でエントリー数は14例、2例が不適格例となり、12名から同意をえることができた。途中、重篤な疾患が判明し治療が中断した者、転勤に伴いうち治療が中断した者など脱落例が4例、8例が計画通りに治療を終えることができた。禁煙の結果、体重増加量は平均してプラス1.6kgの増加を認めた。また症例毎に得られた検体は凍結保存して、後日まとめて解析を行えるよう準備している。今後症例が一定数確保できた段階で各種、食欲抑制ホルモン「レプチン」、骨粗鬆症のマーカー「オステオポン」について測定する予定である。AMPKの測定が困難になったことから、さらにGLP-2、メラニン凝集ホルモン(melanin-concentrating-hormone;MCH)などを検討項目に加えるか検討する予定である。4ヶ月でにエントリー数は12例、完遂数は9例を確保しており、予定数の半分しか数を確保できていないが、研究を施設を追加することでエントリー数を確保すること目処がたった。脱落者が3例と思いの外、多かったことが挙げられるが、その原因として、途中で悪性腫瘍が発見され、その検査、治療が優先されたもの、職場の都合で居住地が遠方になり通院できなくなったものなどが挙げられる。測定項目である、食欲中枢関連ホルモンであるレプチンや骨粗鬆症に関わるマーカーなどについては採血ごとに測定できているが、オステオポンチンやAMPKについては測定するのに足りる検体数がなく、試料の保存を行うにとどまっている。これらは検体数が確保できた時点で測定を行うこととしている。特にAMPKについては追加した施設では検体処理が困難なことが判明したため、今後測定項目項目として再検討する必要がある。今回の研究で当初、食欲中枢抑制ホルモンの下流にある、レプチンの受容体を有し、肺気腫の病態に大きな役割を果たしていると考えられている「オステオポンチン」とメタボリック・センサーともいわれる細胞内シグナル「アデノシンー1ーリン酸活性化プロテインキナーゼ(AMPK)」に着目し、レプチンやGLPー1の作用点を明らかにしたいと考えていたが、AMPKが測定困難となったことから、レプチンやGLP-1の測定は行わず、肺気腫と骨粗鬆症と喫煙の関係を明らかにすることへと方針を変更した。禁煙外来を受診した患者のうち、ニコチン依存症と診断され、本研究に自由意志で参加してくれた被験者について、禁煙治療(バニクレイン(商品名:チャンピックス)ないしはニコチネルTTS(商品名:ニコチンパッチ)を行った。平成28年4月1日から平成29年3月31日までの12ヶ月でリクルート数は30例、うち5例が不適格例となり、25例から同意を得ることができた。途中、重篤な疾患が判明し治療が中断した者、転勤に伴いうち治療が中断した者など脱落例が3例、22例が計画通りに治療を終えることができた。禁煙の結果、体重増加量は平均してプラス1.7Kgの増加を認めた。また症例毎に得られた検体は凍結保存して、順次測定を行なっている。肺気腫の病態に関係する「オステオポンチン」、血清骨吸収マーカーである「TRACP-5b、血清NTX」、骨形成マーカーである「骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)」、骨マトリッックス・マーカーである「低カルボキシル化オステオカルシン(ucOC)」などを測定した。研究協力施設を追加したことで、エントリー数の確保に目処がたった。これまでに16ヶ月で42例をリクルートし、うちエントリーできたのは34例であり、これまでに20例が禁煙治療を完遂できた。予定数の8割強をリクルートできたが、8例が不適格であり、治療成功例が20例程度にとどまっている。

エントリー時に断られたこと、脱落者が8例と思いの外、多かったことが原因として挙げられる。その原因として、途中で悪性腫瘍が発見され、その結果治療が優先されたもの、職場の異動や多忙が理由で通院ができなくなったもの、などが挙げられる。また測定試料入手の困難からAMPKの測定を諦めたことから、当初の予定を変更して、オステオポンチンと血清TRACP-5、NTX、BAP、ucOCなどを測定する方向に切り替えた。測定項目を再検討するのに時間がかかったことから、若干、測定スケジュールに遅れが出ている。これまでの研究で禁煙後の体重増加において、食欲中枢抑制ホルモンレプチンが重要な働きを果たしていることを明らかにした。今回はレプチンの受容体を有し、肺気腫の病態に大きな役割を果たしていると考えられている「オステオポンチン」に着目した。当初予定した、レプチンにより活性化されるAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)は、測定系を構築できなかったことから検討項目から除外し研究の方針を転換した。肺気腫患者において骨粗鬆症の合併率が有意に多いことから、喫煙が骨形成・骨吸収に与える影響について検討することした。検討項目として、骨芽細胞から分泌されるオステオポンチンの他に骨形成マーカーとしてI型プロコラーゲン-N-プロペプチド(P1NP)、骨吸収マーカーとして酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP-5b)、骨マトリックス(基質)マーカーとして低カルボキシル化オステオカルシン(ucOC)とさらに破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へと分化誘導するサイトカインであるReceptor activator of NF-κB ligand(RANKL)を測定した。RANKLはInterleukin-8(IL-8)の分泌を刺激することが知られており、肺気腫患者の喀痰中にIL-8が多く分泌されていることが知られている。平成27年度から29年度にかけて、本研究に63名のニコチン依存症患者をリクルートし、この内研究参加の同意が得られた37名のエントリーを得た。治療終了時の禁煙成功率は約74%だった。脱落した7例を除く、30例について各種マーカーを測定することができた。最終年度は上記マーカーのうち、オステオポンチンとRANKLについて測定を行った。現在、各種マーカーについて統計的解析を行っている。団塊世代が後期高齢者となる2025年が迫る中、超高齢化社会を迎え骨粗鬆症による骨折は生活の質を落とす大きな問題であり、喫煙は骨粗鬆症のリスクを上昇させる危険因子である。今回、喫煙が骨粗鬆症に与える影響を、禁煙治療の前後で骨代謝マーカーを測定・評価した。評価項目としてTRACP-5b、ucOC、オステオポンチン、RANKLなどを測定した。結果、禁煙後早期にucOC、TRACP-5b、オステオポンチンが増加し、RANKLが減少に転じた。BAP、NTXは不変だった。喫煙が骨形成・骨吸収系マーカーを介して、骨粗鬆症の発症に関係していることが示唆された。脱落者は想定の範囲外の事由でだったことから、新しく施設を追加したことから、今後もエントリーを確保できる目処がついた。特に大学病院内でのエントリー数が伸び悩んでいることから、今後も研究関連施設でのエントリー数を増やす予定である。測定系においてAMPKの測定にあたり、検体処理の中で細胞培養などの処理を必要とすることから、新規施設では時間的・技術的に困難なことが判明した。今後もAMPK検体の確保が難しいことから、代替となるべき別の細胞内シグナルや骨粗鬆症のマーカーとなるものを再度、選定中である。
亜鉛バクテリオクロロフィルを持つ細菌の検索と系統分類学的評価

光合成系には、中心金属としてMgが結合した光合成色素であるクロロフィル(Chl)及びバクテリオクロロフィル(BChl)が不可欠と考えられていた。しかし、ある種の好酸性好気性従属栄養細菌(Acidiphilium属)には、Znを有するバクテリオクロロフィル(Zn-BChla)が存在し正常に機能することが発見された。本研究では、光合成色素(Mg-BChlとZn-BChl)を持つ細菌を自然界に広く検索し、分類学的検討を行うことを目的とした。自然界の酸性環境由来の試料(水、土壌、バイオマットなど)を対象に、有機溶媒で直接光合成色素の抽出と分析を行ったが、明確な結果は得られなかった。光合成遺伝子群の一つであるpuf遺伝子を、既知プーブでPCR増幅することにより検出した。光合成遺伝子の自然界における存在が示唆されが、信頼しうる結果は得られなかった。3.好酸性好気性細菌の単離とMg-BChl・Zn-BChlの解析酸性鉱山水や酸性温泉、バイオマットなど種々の酸性自然環境を対象に、好酸性好気性従属栄養細菌を多数単離し、細胞内色素を抽出・分析した。その結果、分離菌群には比較的多くのMg-BChl含有菌が含まれていたが、Zn-BChl含有菌の分離頻度は極めて低かった。光合成系には、中心金属として"Mg"が結合した光合成色素であるクロロフィル(Ch1)及びバクテリオクロロフィル(BChl)が不可欠と考えられていた。しかし、ある種の好酸性好気性従属栄養細菌(Acidiphilium属)には、"Zn"を有するバクテリオクロロフィル(Zn-BChl)が存在し正常に機能することが発見された。本研究では、このような新規光合成色素を持つ細菌を自然界に広く検索し、分類学的検討を行うことを目的とする。1.自然環境からのZn-BChlの直接検出自然界の酸性環境由来の試料(水、土壌、バイオマットなど)を対象に、有機溶媒で直接光合成色素の抽出と分析を行ったが、明確な結果は得られなかった。2.自然環境におけるZn-BChlの遺伝子解析による検出細菌の光合成遺伝子群の一つであるpuf遺伝子を既知プローブでPCR増幅することにより検出した。その結果、光合成遺伝子の自然界における存在が示唆された。3.好酸性好気性細菌の単離とZn-BChlの解析酸性鉱山水や酸性温泉、バイオマットなど種々の酸性自然環境から、好酸性好気性細菌を多数単離し、細胞内色素を抽出・分析した。その結果、分離菌群にはAcidiphilium rubrum型のZn-BChl含有菌と分類学的に未知のMg-BChl含有菌が含まれていた。4.今後も好酸性好気性細菌の単離と光合成色素の分析、さらに色素含有菌の系統解析を行う。従来、天然界の光合成系には、中心金属としてMgを有する光合成色素であるクロロフィル(Chl)あるいはバクテリオクロロフィル(BChl)が不可欠であると考えられていた。しかし、好酸性好気性従属栄養性のAcidiphilium属細菌には、Znを持つバクテリオクロロフィル(Zn-BChl)が存在し正常に機能していることが発見された。本研究では、この新規光合成色素を持つ好酸性好気性細菌を酸性自然環境で検索し、分類学的検討を行うことを目的とした。1.自然環境からのZn-BChlの直接検出:自然界の酸性環境由来の試料(水、土壌、バイオマット)を対象に有機溶媒による光合成色素の直接抽出を追試したが、最終的に明確な結果は得られなかった。2.自然環境におけるZn-BChlの遺伝子解析:細菌の光合成遺伝子群の一つであるpuf遺伝子の自然界における分布をPCR法で検出したが、信頼できうる結果は得られなかった。