hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高LET重イオン飛跡構造に基づく微視的及び動径線量評価と生物効果モデルへの応用

本研究の目的は1.重イオン+水分子衝突による二次電子生成二重微分断面積(DDCS)の系統的測定とそれを用いた飛跡構造の取得2.マイクロドジメトリ測定系の構築による飛跡構造の実験的検証3. Chatterjeeモデルの検証と飛跡構造の生物効果モデルへの応用の3つである。初年度に引き続き、放医研930AVFサイクロトロンにより加速された重イオンビームを用いて、これまでのブラッグピーク領域のHe2+, C6+入射に続いて等速のC4+, O8+, O5+, Ne10+, Ne6+入射でDDCSを広範囲に系統的に測定した。歪波ボルン近似による理論計算(CDW-EIS)、H+入射における半経験的解析式(Ruddモデル)のZ2スケーリング(xZ2, Zは入射イオン電荷)と比較したところ、CDW-EISとは特に低エネルギー領域(<100 eV)で良く一致した一方、Ruddモデルスケーリングとは一致せず高Zイオン入射ではボルン近似が過大であることが分かった。続いて、DDCS実験値とCTMCによるDDCS理論計算との比較、それらを組み込んだ重イオントラックコードを開発し、動径線量分布と線エネルギー、比エネルギーといったマイクロドジメトリ量を計算した。動径線量分布とChatterjeeモデルとの比較ではChatterjeeモデルの特徴である「コア領域の一様高線量密度」、「コア領域とペナンブラ領域とでLETが等分配されるエネルギー等分配則」が成り立たないことが分かった。現在まで、飛跡構造の実験的検証と生物効果モデルへの応用についてはまだ達成できていない。今後、放射性同位元素総合センターにて組織等価型比例計数管(TEPC)を用いてRIからの放射線による予備実験を進める予定である。本研究は、3カ年の計画で進め、二次電子生成断面積やマイクロドジメトリ測定といった基礎データの積み上けから、最終的に粒子線治療における生物効果モデルや細胞致死確率の再評価を目指すものである。初年度に実施した具体的な内容は以下の3点になる。1.重イオン+水分子衝突による二次電子生成二重微分断面積の系統的測定:放医研930AVFサイクロトロンにより加速された重イオンビームを用いて、これまでのブラッグピーク領域(6.0-15.0 MeV/u)のHe2+, C6+入射に続いて、等速のO5+, O8+入射で二次電子生成二重微分断面積を電子エネルギー1 eV-10 keV、電子放出角度20-160°に渡って広範囲に系統的に測定した。さらに、歪波ボルン近似による理論計算(CDW-EIS)、H+入射における半経験的解析式(Ruddモデル)のZ2スケーリング(xZ2, Zは入射イオン電荷)と比較することで、高Zイオン入射でそれらの有効性を検証した。2.飛跡構造解析:カロリンスカ研究所にて在外研究を行い、この分野の世界的権威であるNikjoo教授のもと重イオントラックコードの開発に取り組んだ。当初の目的は、測定断面積データを自作したコードに組み込み完成させるだったが、議論を重ねるうち、測定データを説明できる理論計算(CTMC)を組み込むほうがより汎用性の高いコードになるとの指摘を受け、その理論計算の理解と実験データとの整合性を検証した。3.マイクロドジメトリ測定系の構築:組織等価型比例計数管(TEPC)を用いたマイクロドジメトリ測定系を構築し、モンテカルロシミュレーションによる飛跡構造解析から得られたマイクロドジメトリ量と比較することで飛跡構造を実験的に検証するものであるが、TEPCを調達できておらず、当初の計画からやや遅れている。電子回路系とビームラインへの取付支持架台の準備はほぼ完了している。

今後、放射性同位元素総合センターにて組織等価型比例計数管(TEPC)を用いてRIからの放射線による予備実験を進める予定である。上述の「3.マイクロドジメトリ測定系の構築」において組織等価型比例計数管を調達できておらず、当初の計画からやや遅れている。当初の研究計画に沿って、Ne6+, Ne10+, H+入射で二次電子生成断面積を測定する。続いて、モンテカルロシミュレーションにより飛跡構造を解析した後、線エネルギー、比エネルギーといったマイクロドジメトリ量を計算し、組織等価型比例計数管による測定結果と比較することで飛跡構造を計算と実験の両面から評価・検証できるシステムの確立を目指す。得られた飛跡構造から動径線量分布を計算し、Chatterjeeモデルとの差異を入射イオン種(Z)の依存性の観点から調べる。特に、Chatterjeeモデルの特徴である「コア領域の一様高線量密度」、「コア領域とペナンブラ領域とでLETが等分配されるエネルギー等分配則」が高Zイオン入射においてどのようにズレるかを調べる。続いて、得られた動径線量分布を生物効果モデルへ入力情報として適用し細胞致死確率がどのように変わるか評価する。特に、コア領域で不一致であれば、粒子線治療における臨床線量計算の見直しを要請するものと期待される。組織等価型比例計数管としてFar West Technology社製の球形型TEPC(LET-1/2, 0.5")の購入を検討していたが、検出器内部にエネルギー校正用としてアルファ線源(Cm-244,約11 kBq)が含まれており、そのままでは調達できないことが判明したため。線源なしで購入し、放射性同位元素総合センターにて校正用アルファ線源を組み込むことでエネルギー校正可能か検討している。
卵巣摘出動物骨折後のTGF-βおよびBGPについて

高齢者の増加にともない、高齢者の外科的処置の頻度も増えてきている。特に女性においては骨粗鬆症に罹患している人も多く見受けられる。創傷治癒を比較すると、骨粗鬆症に罹患している患者は、一般的に悪い傾向にあり、高齢者の社会復帰を考える上で重要である。近年、骨組織には、骨芽細胞の機能を調節するtransforming growthfactor- β(TGF- β)や骨のリモデリングに関与しているとされているbone gla protein(BGP)が存在することが明らかにされている。したがって、卵巣摘出動物を実験的に骨折させ、骨折後のTGF-βおよびBGPを測定することは、骨粗鬆症罹患者の骨折あるいは抜歯窩の治癒を考える上で重要である。そこで、骨折後の骨組織中のTGF-βおよびBGPの変化を経時的調べ健常動物との比較検討を行った。12週令のラットを2つに分け卵巣摘出術(OVX)を施すOVX群と何も施さないN群に分け、その後3か月間通常飼育する。そしてそれぞれのラット大腿部(片側)を人工的に骨折させ、0、3、7、12、17、22、28、34日にそれぞれ屠殺する。直ちに、両側の大腿部を取り出し、骨組織中のTGF-β,BGPを測定する。また一部は標本を作成して組織学的検索を行った。TGF-βおよびBGPの測定は摘出した大腿骨を脱水、脱脂し、粉砕して骨粉を作成する。この骨粉を0.5N塩酸グアニジンで抽出しこれを酸に溶解し、TGF-βはTGF-β_1 ELISA、BGPはRIA法を用いて測定した。その結果、TGF-βはNおよびOVX群ともに骨折後7日目から上昇し22日目よりプラトーになった。OVX群ではその値が低値を示した。BGPはOVX群はN群に比べ低値を示した。組織学的には、N群では28日目にはほとんど骨折部が接合していたのに対しOVX群では、偽関節を形成しているものが3割程度認められ、全体的に骨形成の程度が低かった。これらのことから、骨形成にはTGF-βおよびBGPの関与がうかがわれた。今後さらにほかの因子について検索を行う予定である。
光音響顕微鏡の3次元高速画像化の研究

不透明材料の内部傷やクラック等を光音響顕微鏡を使って3次元画像化計測する場合、解決しなければならない問題点として画像化までの時間が非常に長いことが挙げられる。そのため、光音響研究に従事してきた研究者の多くは意識的に3次元画像化研究を避けてきたように思われる。しかし、この顕微鏡を実用化し、企業で使用できるレベルにするためには画像化時間の短縮は避けて通れない問題点である。この問題点を解決する方法の一つとして私達は同時多周波数計測法を考案し、検討を試みてきた。その成果を第16回超音波エレクトロニクスシンポジウムで発表した。この方法の長所は高速フーリェ変換法と逆高速フーリェ変換法を融合して、一回の測定で同時に多くの周波数成分を分析することができることである。レーザ変調光の変調周波数を10100Hzまで変化して測定した黒鉛からの光音響信号振幅の周波数依存性は同時多周波数計測法を使うことでロックイン増幅器を使う従来の計測法に比べて約1/5の計測処理時間でほぼ同一のデータを得ることができた。この成果をJpn.J.Appl.Phys.に発表した。それらの実験成果を基礎として、同時多周波数計測法を用いて、黒鉛表面下の人工的に付けられた内部エンドミル傷の3次元画像化を試み、従来の方法に比べて約1/5以下の時間で傷断層像の鮮明な画像化に成功した。その成果を電子情報通信学会の超音波研究会で発表した。また傷断層像化に際しては光音響信号の振幅を使うより、位相を使った方が傷の正確かつ鮮明な画像が得られることを実験的に明らかにした。
トリクロロエチレンによる重症薬疹様皮膚・肝障害の発症リスク評価バッテリーの開発

トリクロロエチレンは、金属部品やプリント基板その他工業製品の脱脂洗浄剤等として、世界的に大量に使用されている有機溶剤である。これを原因物質とする重症薬疹に酷似する全身性皮膚・肝障害が、中国で1990年代末以降多発している。本研究は、この疾患の発症・重症化リスクを明らかにする目的で実施した。曝露量、個人の感受性要因に加え、潜伏感染しているヒトヘルペスウイルス6型の再活性化のバイオマーカーを検討した。従来の職場衛生基準では発症の完全予防は困難であり、新たな基準を提言した。有機溶剤トリクロロエチレンによる、重症薬疹に酷似し生命に危険が及ぶ全身性皮膚・肝障害が中国で多発している。従来の労働衛生対策では発症の完全予防は困難で、個人の発症・重症化リスクをより正確に評価できる方法の確立が求められている。そのために、感受性遺伝子多型の有無と、(1)TRI曝露量、(2)TRI感作の有無、(3)予後を左右するHHV6再活性化の有無との関係を解明するのが本研究の目的である。平成24年度は以下の検討を行った。感受性遺伝子多型とされるHLA-B*1301の有無を、全身性皮膚・肝障害患者40名と曝露対照者92人について分析した。患者40名のうちHLA-B*1301多型保持者は26名(65%)、曝露対照者92人のうち同多型保持者は20名(22%)で、オッズ比は5.7(95%信頼区間2.6-12.4)であった。このうち、多型と尿中代謝物トリクロロ酢酸の濃度情報とが共にある患者28人、対照者81人について、多型の有無とトリクロロ酢酸濃度との関係を解析した。患者群,対照群ともに多型の有無別の代謝物トリクロロ酢酸の濃度の有意差はみとめられなかった。また、非曝露対照者として、患者が発生している中国広東省の火力発電所で働く作業者89名(男45名、女44名、年齢46.7土7.1歳)を対象に、血液、尿を採取した。尿中のトリクロロ酢酸、トリクロロエタノール濃度は同僚作業者全員検出下限値以下であった。血清中TNFαおよびIL-10の幾何平均(幾何標準偏差)濃度はそれぞれ、19.9(3.8)pg/ml、4.1(1.3)pg/mlであり、ALT、AST値が100U/Lを超える者は見られなかった。3月初旬には、これまでに得られた結果とこれからの研究実施計画について、海外共同研究者、研究分担者、連携研究者、研究協力者とともに討論を行った。トリクロロエチレンによる、重症薬疹に酷似し生命に危険が及ぶ全身性皮膚・肝障害が中国で多発している。発症率は作業者数百人から千人に1人であり、患者は発熱や好酸球増多を伴い、曝露開始から発症までの期間は約1か月、ヒトヘルペスウイルス6型が再活性化することが多い等の特徴を呈する。平成25年度にはこれまでに得られたデータの検証と不十分であった情報の取得、前年度までに明らかになっていた課題への取組を行った。発症者の皮膚病型分類について再評価を行い、重症薬疹としての過敏症症候群との比較可能性が担保された。発症者の曝露量との関連については前年度に引き続き解析を進めた。その結果、属性情報と解析に必要な情報がそろった患者29名(年齢24.3±6.5歳、男性19名、女性10名)、曝露対照者79名(年齢24.1±6.0歳)について、HLA-B*13:01遺伝子多型非保持者で作業終了時の尿中トリクロロ酢酸(TCA)濃度が50mg/L未満を参照カテゴリーとした場合のオッズ比(OR)は、「多型あり」かつ「TCA50mg/L未満」でOR8.5(95%CI 1.4-51.2)、「多型なし」かつ「TCA50mg/L以上」でOR24.1(95%CI 4.2-137)、「多型あり」かつ「TCA50mg/L以上」でOR147(95%CI 22.5-955)であった。また、曝露対照者、非曝露対照者について血清IL-10およびTNF-αの測定を行ったほか、患者と曝露対照者の血清を使用して、抗CYP2E1抗体の免疫沈降法による検出を試みた。これらの結果と今後の研究実施計画について、海外共同研究者、研究分担者、連携研究者、研究協力者とともに討論を行った。有機溶剤トリクロロエチレン(TRI)による、重症薬疹に酷似し生命に危険が及ぶ全身性皮膚・肝障害が中国で多発している。これまでの研究で、患者の予後を左右するヒトヘルペスウイルス6型の再活性化と、炎症性サイトカインのプロファイルとの関連が明らかになっている。血中サイトカイン濃度に関して、TRIに3か月以上曝露しても全身性皮膚・肝障害を発症しない作業者96名と、職場でTRIを使用しない非曝露作業者51名でTNF-alphaおよびIL-10を測定した。

TNF-alphaについては、曝露作業者で定量下限値を超える者はみられなかったが、非曝露作業者では5名(10%)が定量下限値を超え、定量下限値を超えた者が有意に多い結果であった。一方、IL-10濃度は曝露作業者2名(2%)で定量下限値を超え、非曝露作業者で定量下限値以上の者はみられなかった。群間で有意差はみとめられなかった。感受性マーカーであるHLA-B*13:01と曝露マーカー尿中トリクロロ酢酸(TCA)に関して、昨年に引き続き対象者を増やして測定をおこなった。患者と性、年齢をマッチングした曝露作業者を1:3の比で割り付け、曝露と疾患との関連を検討した。HLA-B*13:01がリスク要因であることが改めて確認されるとともに、尿中TCA濃度5 mg/Lをカットオフ値として5 mg/L未満を参照カテゴリーとするオッズ比を計算したところ、5 mg/L以上の群でオッズ比の有意な上昇をみとめた。有機溶剤トリクロロエチレン(TRI)による、重症薬疹に酷似し生命に危険が及ぶ全身性皮膚・肝障害が中国で多発している。従来の労働衛生対策では発症の完全予防は困難で、個人の発症・重症化リスクをより正確に評価できる方法の確立が求められている。これまでの研究で、患者の予後を左右するヒトヘルペスウイルス6型(HHV6)の再活性化が証明され、本疾患の病態は重症薬疹の一種である過敏症症候群そのものであること、また、HHV6再活性化と炎症性サイトカインのプロファイルが関連することが明らかになっている。最終年度は、これまでサンプル数が不十分であった非曝露対照者について追加サンプリングを行うとともに、尿中代謝物濃度及び血中サイトカイン濃度を測定した。また、自己抗体の免疫沈降法による検出の検討を行った。さらに、分担研究者、海外共同研究者及び研究協力者とともに、これまでの成果に関するまとめを行い、今後の研究の方向性についてもディスカッションした。本研究課題による成果の社会への還元として、日本産業衛生学会許容濃度委員会に対し、これまでの研究結果に基づきトリクロロエチレンが皮膚感作性物質としてリストされるよう提案を行った。また、現行の許容濃度25 ppmおよびこれに相当する作業終了時の尿中トリクロロ酢酸濃度の生物学的許容値50 mg/Lでは、本疾患の発症を十分予防できないと考えられたため、両者について引き下げの提案を行った。トリクロロエチレンは、金属部品やプリント基板その他工業製品の脱脂洗浄剤等として、世界的に大量に使用されている有機溶剤である。これを原因物質とする重症薬疹に酷似する全身性皮膚・肝障害が、中国で1990年代末以降多発している。本研究は、この疾患の発症・重症化リスクを明らかにする目的で実施した。曝露量、個人の感受性要因に加え、潜伏感染しているヒトヘルペスウイルス6型の再活性化のバイオマーカーを検討した。従来の職場衛生基準では発症の完全予防は困難であり、新たな基準を提言した。HLA-B*13:01、曝露量と患者発生の関係については、尿中代謝物量に関して当初の予想以上に低い閾値の存在が明らかになった。その一方、曝露とHHV-6再活性化との関係についてははっきりしない点が残っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。産業保健血清中自己抗体の検出をめざすとともに、予防と患者早期発見のためのバイオマーカーの検討を継続する。海外研究協力者と討論しつつ、調査を継続して行う。また、これまでの成果に関して、論文化を積極的に進める。海外共同研究者との間には信頼関係が成立しているが、尖閣諸島問題が勃発し、調査のスムーズな進行に支障が生じた。また、患者発生数が減少していることも進捗がやや遅れていることの理由の1つである。HLA-B*13:01
「恵那の教育」の実践構造に関する総合的研究

1日本の教育実践史のなかで独特の位置を占めてきた「恵那の教育」の生成と展開過程を明らかにする。とりわけ「恵那の教育」の代名詞である生活綴方教育の現代的意義と発展的展開の可能性を明らかにすることである。同時に1980年代以降、「子どもの声を聴き取る」という「治療的実践」の萌芽ともいえる実践枠組みを創出してきたことの意義についても検討することであるが、これらについては次のような進捗状況である。「恵那の教育」を理論的・実践的に牽引した石田和男の言説・著作を網羅した『石田和男教育著作集』(全4巻、花伝社)を刊行したことを契機として、各種学会報告、研究会で報告を行った。そのことを通じて1950年代から現代に至る「恵那の教育」の変遷を辿るとともに、「恵那の教育」が持つ現代的意義について確認することができた。2「恵那の教育」と地域名を冠した事例は、教育実践史上、類を見ない。こうした集団的な教育実践の生成・発展の検討を通じて、教師の協働がもたらす教育実践の質を検討する作業を進めているが、恵那教育研究所において資料探索を行い、いくつか時期区分を行いながらそれぞれの時期の「恵那の教師たち」の集団性を確認することができる発行物、諸資料を確認した。とりわけ、1966年に発足した東濃民主教育研究会の発足準備や定期的な研究会・学習会のための準備資料・レジュメ等の第1次資料を確認し、この時期の恵那の教師たちによる集団的教育実践への志向を確認することができた。3「恵那の教育」の現代的意義に照応する世界の教育実践・思想を比較することによってその独自性と普遍性とは何かを明らかにする作業を進めているが、フレネ教育のなかで今なお重視されている自由テキストによる表現を重視する教育実践のなかに、恵那における生活綴方教育の生活表現を互いに理解し合う取り組みとの共通性を抽出することができた。以下の点は昨年度から継続してる内容であるが、それらも含めて、現時点での達成度は以下の通りである。恵那教育研究所にある、戦後初期の「恵那綴方の会」、1950年代後半「恵那教育会議」、1960年代半ば1980年ごろまでの「東農民主教育研究会」、1970年代の「教育市民会議」1980年以降現在に至る「恵那教育研究所」などの諸資料等の整理を始めることができた。とりわけ、東濃民主教育研究会の発足から日常的な活動に関する第1次資料を確認することを通じて、会の機関誌「みんきょうけん」の主張や、会の存続中に通常は年2回行われていた研究集会における研究動向の意味づけを確認する作業に進む段階に到達することができている。すでに記した戦後初期の「恵那綴方の会」、1950年代後半「恵那教育会議」、1960年代半ば1980年ごろまでの「東農民主教育研究会」、1970年代の「教育市民会議」1980年以降現在に至る「恵那教育研究所」などの諸資料等を整理するとともに、それぞれの時期の恵那の教師の集団的思考の特徴を明らかにしていく。さらに恵那の教育がもっとも注目を浴びた1970年代後半の象徴的実践家となった丹羽徳子関係の諸資料を「発見」・収集することができ、今後、丹羽実践が生み出された背景について恵那の教師たちの集団的思考と関係づけながら検討を深めていく予定である。さらに、フレネ教育やフィンランドの教育との比較研究を通じて「恵那の教育」の普遍性とその現代的意義を明らかにしていく。本研究の3つの柱を最初に確認し、次にそれぞれについての進捗状況を報告する。現在、研究の柱としているのは1日本の教育実践史のなかで独特の位置を占めてきた「恵那の教育」の生成と展開過程を明らかにする。とりわけ「恵那の教育」の代名詞である生活綴方教育の現代的意義と発展的展開の可能性を明らかにする。さらに1980年代以降、「子どもの声を聴き取る」という「治療的実践」の萌芽ともいえる実践枠組みを創出してきたことの意義についても検討する。こうした集団的な教育実践の生成・発展の検討を通じて、教師の協働がもたらす教育実践の質を検討する。3「恵那の教育」の現代的意義に照応する世界の教育実践・思想を比較することによってその独自性と普遍性とは何かを明らかにする。以上の課題に対して、本年度は次のような研究を行った1については、「恵那の教育」を理論的・実践的に牽引した石田和男の言説・著作を網羅した『石田和男教育著作集』(全4巻、花伝社)を編集・刊行して1950年代から現代に至る「恵那の教育」の変遷を辿ることができた。この著作集の編集・刊行を通じて、共同研究者それぞれが、各巻の解説論文を執筆するなどして、「恵那の教育」の特徴を把握した。2については、恵那教育研究所において資料探索を行い、いくつか時期区分を行いながらそれぞれの時期の「恵那の教師たち」の集団性を確認することができる発行物、諸資料を確認した。3については、主として文献上でフィンランドの教育課程改革、フレネ教育に関する基礎的な資料収集を行った。おおむね順調に研究を進めており、現時点で特に問題はない。

同時に1980年代以降、「子どもの声を聴き取る」という「治療的実践」の萌芽ともいえる実践枠組みを創出してきたことの意義についても検討することであるが、これらについては次のような進捗状況である。「恵那の教育」を理論的・実践的に牽引した石田和男の言説・著作を網羅した『石田和男教育著作集』(全4巻、花伝社)を刊行したことを契機として、各種学会報告、研究会で報告を行った。そのことを通じて1950年代から現代に至る「恵那の教育」の変遷を辿るとともに、「恵那の教育」が持つ現代的意義について確認することができた。2「恵那の教育」と地域名を冠した事例は、教育実践史上、類を見ない。こうした集団的な教育実践の生成・発展の検討を通じて、教師の協働がもたらす教育実践の質を検討する作業を進めているが、恵那教育研究所において資料探索を行い、いくつか時期区分を行いながらそれぞれの時期の「恵那の教師たち」の集団性を確認することができる発行物、諸資料を確認した。とりわけ、1966年に発足した東濃民主教育研究会の発足準備や定期的な研究会・学習会のための準備資料・レジュメ等の第1次資料を確認し、この時期の恵那の教師たちによる集団的教育実践への志向を確認することができた。3「恵那の教育」の現代的意義に照応する世界の教育実践・思想を比較することによってその独自性と普遍性とは何かを明らかにする作業を進めているが、フレネ教育のなかで今なお重視されている自由テキストによる表現を重視する教育実践のなかに、恵那における生活綴方教育の生活表現を互いに理解し合う取り組みとの共通性を抽出することができた。以下の点は昨年度から継続してる内容であるが、それらも含めて、現時点での達成度は以下の通りである。恵那教育研究所にある、戦後初期の「恵那綴方の会」、1950年代後半「恵那教育会議」、1960年代半ば1980年ごろまでの「東農民主教育研究会」、1970年代の「教育市民会議」1980年以降現在に至る「恵那教育研究所」などの諸資料等の整理を始めることができた。とりわけ、東濃民主教育研究会の発足から日常的な活動に関する第1次資料を確認することを通じて、会の機関誌「みんきょうけん」の主張や、会の存続中に通常は年2回行われていた研究集会における研究動向の意味づけを確認する作業に進む段階に到達することができている。研究の主要な柱である石田和関連の資料は講演メモ、あるいは講演の録音テープ、さらには自筆のメモ、未発表原稿を含めてそのほとんどを入手することができた。この石田関連の諸資料は、今後の「恵那の教育」研究にとって重要な手がかりになる。また、恵那教育研究所にある、戦後初期の「恵那綴方の会」、1950年代後半「恵那教育会議」、1960年代半ば1980年ごろまでの「東農民主教育研究会」、1970年代の「教育市民会議」1980年以降現在に至る「恵那教育研究所」などの諸資料等の整理を始めることができた。今後はそれぞれの時期の恵那の教師の集団的思考の特徴を明らかにしていく。すでに記した戦後初期の「恵那綴方の会」、1950年代後半「恵那教育会議」、1960年代半ば1980年ごろまでの「東農民主教育研究会」、1970年代の「教育市民会議」1980年以降現在に至る「恵那教育研究所」などの諸資料等を整理するとともに、それぞれの時期の恵那の教師の集団的思考の特徴を明らかにしていく。さらに恵那の教育がもっとも注目を浴びた1970年代後半の象徴的実践家となった丹羽徳子関係の諸資料を「発見」・収集することができ、今後、丹羽実践が生み出された背景について恵那の教師たちの集団的思考と関係づけながら検討を深めていく予定である。
Na+/H+交換輸送体によるオートファジーの調節機構

オートファジーは細胞内分解系の一つで、長寿命蛋白や細胞内オルガネラ等の分解除去に寄与し、これによって正常な細胞機能を維持している。したがって、神経系におけるオートファジーの破綻は異常蛋白の凝集や神経変性疾患の原因となる。しかし、神経系におけるオートファジーの制御機構はほとんど知られていない。本研究ではNHEの阻害剤がオートファジーを抑制すること、および細胞膜局在型のNHEの強制発現がポリグルタミンの凝集を顕著に抑制することを見出した。更に、NHE5ノックアウトマウスとハンチントン病モデルマウスを交配させたところ、小脳顆粒細胞において顕著な凝集体の形成を認めた。Na+/H+交換輸送体(NHE)の阻害剤がオートファジーを阻害することから、まず、NHEの強制発現が異常蛋白の凝集を抑制するかどうかを調べた。マウス神経芽細胞株Neuro-2a細胞にポリグルタミン蛋白(polyQ)とNHE1、NHE5、NHE6、およびそれらのイオン輸送活性欠損変異体とをそれぞれ共発現させ、polyQの凝集を観察した。通常の発現ベクターを用いたコトランスフェクションでは結果にばらつきが見られたため、Cre-loxPシステムを用いてNHEの発現後にpolyQの発現を誘導するとNHE1、NHE5、およびNHE1の変異体でpolyQの凝集を顕著に抑制した。これらpolyQの凝集を抑制するNHEを強制発現させた細胞でオートファジーフラックスアッセイを行ったところ、実際にNHE発現細胞においてオートファジーが活性化していることが確認された。これらのことは細胞膜型NHEであるNHE1とNHE5がオートファジーを介して異常蛋白の凝集を阻害することを示唆している。細胞内pHイメージングの結果から細胞膜型NHEを強制発現した細胞では基底レベルの細胞内pHが対照群に対し有意にアルカリ化していたことからNHEを介した細胞内pHの上昇がオートファジーの活性化に関与していると考えられる。一方、NHE1の変異体でも凝集は抑制されることからNHE1においては細胞内pH調節に依存しない凝集抑制機構の存在も考えられる。以上の結果を踏まえ、ポリグルタミン病の一種であるハンチントン病モデルマウスとNHE5 KOマウスの交配を開始した。今後、このモデル動物を用いてin vivoで神経系におけるNHEの生理的役割について検証するとともに、NHEによるオートファジー活性化機構の解明を目指す。昨年度、細胞内pHのホメオスタシスに寄与するNa+/H+交換輸送体(NHE)を阻害することがオートフナジーによる蛋白質分解系を抑制すること、NHEの過剰発現がオートファジーを活性化することを報告した。ハンチントン病などの神経細胞内に異常蛋白の凝集を伴う神経変性疾患のモデル動物においてオートファジーの活性化が病態を改善することが報告されているが、それらの病態と細胞内pHの関連は報告されていない。そこでpH感受性蛍光蛋白を用いた細胞内pHイメージングの系を確立した。これを用いて凝集体の発現した細胞内pHを測定したところ対照群に比べて有意に酸性化していることが明らかとなった。NHEの過剰発現は細胞内pHをアルカリ化させることからNHEの過剰発現によって凝集体を発現する細胞内の酸性化が中和されることが示唆された。実際、アルツハイマー病の原因となるβアミロイドの凝集性は酸性条件下で顕著に増加するとの報告もあることから、NHEの活性化による細胞内のアルカリ化は異常蛋白の凝集性低減とオートファジーの活性化による異常蛋白の除去という二面性に依っていることが示唆された。更に、脳特異的に発現するNHE5のノックアウト(KO)マウスとハンチントン病モデルマウスを交配して組織学的な解析を行ったところ、NHE5KOマウスでは小脳顆粒細胞において対照群に比して有意に凝集体の数が多く、その直径も大きかった。NHE5に対する抗体を用いた免疫組織化学を試みたが染色に使用できる抗体が得られなかったことから野生型マウスの脳を大脳、小脳、脳幹、嗅球の4つの区分に分けてNHE5のmRNAの発現量を定量的RT-PCR法により比較したところ、小脳は他よりも2倍以上多く発現していることが確認された。以上の結果からNHE5は実際にマウスの生体内において小脳顆粒細胞内に起こる異常蛋白質凝集の抑制に寄与していることが示唆された。
肥満細胞に発現する新規抑制性受容体のアレルギー応答における機能解明

Anergin-1がIgEを介した肥満細胞の活性化を抑制することで、アレルギーを抑制する働きをもつことから、肥満細胞上のAllergin-1を刺激し、肥満細胞の活性化を抑制することでアレルギー応答を抑制する治療モデルを検討することを目的として喘息モデルを検討した。これまでに野生型マウス及びAUergin-1遺伝子欠損マウスにチリダニ抽出物(HDM)を週5回、4週間投与し喘息を誘導すると、Allergin-1遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して気管支肺胞洗浄(BAL)液中の好酸球数の増加、血清中のIgE抗体価、気道内圧の上昇が観察されていた。しかし、同様の系を用いて肥満細胞の欠失したマウスに喘息を誘導した場合、喘息を誘導していないマウスと同様に気道内圧の上昇は生じなかったが、野生型と比較してBAL液中の好酸球数、及びIgE抗体価に有意な差はなかった。このことから、Allergin-1は肥満細胞の活性化を抑制することで喘息時の気道内圧の上昇を抑制しているだけでなく、他の細胞を介してTh2応答の抑制に関与していることが示唆された。そのため、肺の細胞上のAllergin-1の発現をフローサイトメトリー法で解析したところ、CD11c陰性、F4/80陽性細胞及びCD11c陽性F4/80陰性樹状細胞上に発現していた。このことからTh2応答の初期にAnergin-1が関与しているとの仮説を立てHDMを5回投与して7日目に所属リンパ節内のTh2細胞の割合を解析した結果、Allergin-1遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較してTh2細胞の割合が有意に増加していた。また、野生型、またはAllergin-1遺伝子欠損マウスの骨髄細胞から分化誘導した樹状細胞(BMDC)をin vitroでHDM刺激し、野生型マウスに経鼻的に移入して喘息を誘導すると、Allergin-1遺伝子欠損BMDCを移入したマウスではBAL中の好酸球の有意な増加が観察された。このことから樹状細胞上のAllergin-1がHDMによる喘息に関与していることが示唆された。アレルギーは肥満細胞がIgE抗体を介して活性化し脱顆粒することで生じるが、肥満細胞の活性化制御機構は不明な点が多い。そのため、肥満細胞の活性化を抑制する新規受容体の機能の解明は、アレルギーの発症機構の解明や治療法の開発に重要である。そこで本研究では肥満細胞に発現し、細胞内領域に抑制性シグナルを伝達するモチーフでありITIM様モチーフを有するAllergin-1の機能を解明し、アレルギーの新規治療法の樹立することを目的とした。Allergin-1が肥満細胞上に高発現していることから、ラット好塩基球性白血病細胞株(RBL-2H3)にAllergin-1(WT)、またはAllergin-1のITIMモチーフ内のチロシン残基の変異体(YF、FY、FF)を強制発現させたトランスフェクタントを作製した。Allergin-1の細胞内のチロシン残基のリン酸化をpervanadateで刺激し、免疫沈降法により検討した。その結果、WTでは細胞内のチロシン残基がリン酸化に伴い脱リン酸化酵素が会合したが、YF、FY、FFには会合しなかった。次にIgE受容体とAllergin-1を抗TNP-IgE抗体とTNP化した抗Allergin-1抗体を用いて共架橋することにより、顆粒放出を抑制するかを検討した。その結果、IgE受容体とAllergin-1を共架橋するとWTでは顆粒放出率が低下したが、YF、FY、FFでは顆粒放出率に変化はなかった。このことから、Allergin-1の2つのITIM様モチーフが抑制シグナルの伝達に必須である。さらに、肥満細胞からの顆粒放出を抑制するかを骨髄細胞から分化誘導した肥満細胞を用いて検討した。その結果、IgE受容体とAllergin-1を共架橋すると、肥満細胞からの顆粒放出率が低下し、Allergin-1が肥満細胞の脱顆粒を抑制する機能を有していることが示唆された。Allergin-1がIgEを介した肥満細胞の活性化を抑制することで、アレルギーを抑制する働きをもつことから、肥満細胞上のIgE受容体とAllergin-1をIgE受容体とAllergin-1の両方に特異性を持つ二価抗体を用いて架橋し、肥満細胞の活性化を抑制することでアレルギー応答を抑制する治療モデルを検討することを目的として喘息モデルを検討した。野生型マウス及びAuergin-1遺伝子欠損マウスにチリダニ抽出物(HDM)を週5回、4週間投与し、最終投与日から2日後に気管支肺胞洗浄(BAL)、及び採血を行なった。その結果、Allefgin-1遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較してBAL液中の総細胞数、及び好酸球数が増加していた。また、喘息を誘導していない野生型マウスとAllergin-1遺伝子欠損マウスの血清中のIgE抗体価はともに検出限界以下であったが、喘息を誘導した群ではAllergin-1遺伝子欠損マウスの血清中に含まれるIgE抗体価は野生型マウスと比較して有意に増加していた。さらに、気道内圧の測定をflexi Ventシステムを用いて行なった。喘息を誘導していない群では野生型とAllergin-1遺伝子欠損マウスの気道内圧は有意差が観察されなかった。一方、喘息を誘導した群においてはAllergin-1遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して気道内圧が高かった。

これらの結果から、Allergin-1遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較して喘息が増悪していると考えられ、Allergin-1が喘息の病態を抑制していることが示唆された。Anergin-1がIgEを介した肥満細胞の活性化を抑制することで、アレルギーを抑制する働きをもつことから、肥満細胞上のAllergin-1を刺激し、肥満細胞の活性化を抑制することでアレルギー応答を抑制する治療モデルを検討することを目的として喘息モデルを検討した。これまでに野生型マウス及びAUergin-1遺伝子欠損マウスにチリダニ抽出物(HDM)を週5回、4週間投与し喘息を誘導すると、Allergin-1遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して気管支肺胞洗浄(BAL)液中の好酸球数の増加、血清中のIgE抗体価、気道内圧の上昇が観察されていた。しかし、同様の系を用いて肥満細胞の欠失したマウスに喘息を誘導した場合、喘息を誘導していないマウスと同様に気道内圧の上昇は生じなかったが、野生型と比較してBAL液中の好酸球数、及びIgE抗体価に有意な差はなかった。このことから、Allergin-1は肥満細胞の活性化を抑制することで喘息時の気道内圧の上昇を抑制しているだけでなく、他の細胞を介してTh2応答の抑制に関与していることが示唆された。そのため、肺の細胞上のAllergin-1の発現をフローサイトメトリー法で解析したところ、CD11c陰性、F4/80陽性細胞及びCD11c陽性F4/80陰性樹状細胞上に発現していた。このことからTh2応答の初期にAnergin-1が関与しているとの仮説を立てHDMを5回投与して7日目に所属リンパ節内のTh2細胞の割合を解析した結果、Allergin-1遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較してTh2細胞の割合が有意に増加していた。また、野生型、またはAllergin-1遺伝子欠損マウスの骨髄細胞から分化誘導した樹状細胞(BMDC)をin vitroでHDM刺激し、野生型マウスに経鼻的に移入して喘息を誘導すると、Allergin-1遺伝子欠損BMDCを移入したマウスではBAL中の好酸球の有意な増加が観察された。このことから樹状細胞上のAllergin-1がHDMによる喘息に関与していることが示唆された。納品された気道内圧測定の機械に不具合が生じたため、トラブルシュートに時間がかかったことと、肥満細胞以外の細胞の関与も示唆されるデータが得られたことから、検討が必要になったため。肥満細胞以外の関与も考えられることから、研究計画を変更し、マクロファージ、樹状細胞をアレルゲンと抗Allergin-1抗体で刺激してAllergin-1がマクロファージ、樹状細胞の活性化を抑制する機能を有するか、活性化マーカーの発現をフローサイトメトリー法で解析すること、及び産生されるサイトカインの量をELISAで測定し、検討する。
幹細胞システムの分子基盤とその制御

幹細胞システムにおける細胞分化機構を解析するために、マウス胚性幹細胞をストロマ細胞OP9上で共生培養することにより血液細胞へと分化誘導する方法(OP9システム)と、コンディショナルな遺伝子発現を組み合わせた方法を用いて、血液細胞の発生・分化に必須であるGATA-1、GATA-2、Runx-1といった転写因子、および、GATA-1のコファクターであるFOG-1の機能解析をおこなった。マクロファージコロニー刺激因子存在下において分化誘導をおこなうと、マクロファージが選択的に増加する。その状態においてGATE-2を強制発現すると、マクロファージへの分化が抑制され、巨核球あるいは赤血球へと分化がスイッチされる。いずれにスイッチが生じるかは、GATE-2をどの分化段階において発現させるかによって決定されていた。ヒピストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加すると、巨核球へのスイッチを赤血球へのスイッチへと変更することができた。また、これらの実験から、転写因子PU.1の発現が、巨核球あるいは赤血球のいずれにスイッチするかを決定している可能性が考えられたので、PU.1の強制発現実験をおこなったところ、PU.1は、巨核球への分化プログラムを赤血球へと変換させる機能のあることが明らかとなった。これらの結果は、転写因子の機能は細胞分化のコンテキスト依存性であること、また、この場合は、PU.1という転写因子がコンテキスト決定において重要な役割を担っていること、が明らかとなった。他の転写因子などについても、解析を進行中である。造血システムと生殖システムという二つの幹細胞システムを用いて、幹細胞の維持ならびに幹細胞からの文化についての研究をおこなった。マウスES細胞から血液細胞への分化誘導過程において、コンディショナルに遺伝子を発現させるシステムの構築をおこなった。この方法を用いて、造血前駆細胞の段階において、未分化な造血細胞において発現するZincfinger型の転写因子であるGATA-2を発現させた。その結果、造血前駆細胞の数が増加すること、また、赤血球、巨核球への分化・増殖が促進されることが明らかとなった。この結果は、従来GATA-2の機能として報告されていた内容と異なるばかりでなく、ほとんど逆の内容であった。この差異は、従来の研究がGATA-2そのものではなく、GATA-2とエストロゲン受容体との融合タンパクを用いていたために生じたものであることを明らかにした。また、GATA-2を発現させることにより、マクロファージへの分化は顕著に障害され、巨核球や赤血球系の細胞へと分化転換することも明らかにした。がん抑制遺伝子PTENの始原生殖細胞分化における機能解析を、生殖細胞特異的PTENノックアウトマウス(ΔPTENマウス)を用いておこなった。その結果、オスのΔPTENマウスでは全例において精巣にテラトーマが出現することを見出した。また、培養実験により、一旦生殖系列へと運命付けられた生殖細胞が脱分化して胚性生殖細胞になる率が、ΔPTENマウスでは著明に亢進していることが明らかとなった。これらの結果は、PTENあるいはPI3キナーゼのシグナルが幹細胞の未分化性維持に重要な機能を持っていることを示している。これらの成果を元に、幹細胞の維持および幹細胞からの分化メカニズムを明らかに、幹細胞の人為的操作法の確立をめざして研究をおこなっている。その状態においてGATA-2を強制発現すると、マクロファージへの分化が抑制され、巨核球あるいは赤血球へと分化がスイッチされる。

いずれにスイッチが生じるかは、GATA-2をどの分化段階において発現させるかによって決定されていた。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加すると、巨核球へのスイッチを赤血球へのスイッチへと変更することができた。また、これらの実験から、転写因子PU.1の発現が、巨核球あるいは赤血球のいずれにスイッチするかを決定している可能性が考えられたので、PU.1の強制発現実験をおこなったところ、PU.1は、巨核球への分化プログラムを赤血球へと変換させる機能のあることが明らかとなった。これらの結果は、転写因子の機能は細胞分化のコンテキスト依存性であること、また、この場合は、PU.1という転写因子がコンテキスト決定において重要な役割を担っていることが明らかとなった。
婦人科悪性腫瘍の転移を制御するシグナル伝達経路の解析

乳癌の浸潤、転移においてはSDF1/CXCR4/Ga13/Rhoシグナル経路が重要な役割を果たしていることを、これまで我々は報告した。本研究においては子宮頸癌、卵巣癌などの婦人科領域の悪性腫瘍の浸潤、転移におけるCXCR4を中心としたGPCRシグナル経路の役割について解析を行った。浸潤能が高い子宮頸癌細胞株においては、乳癌の場合と異なり、SDF1/CXCR4/Gai/Racシグナル経路の活性化が細胞浸潤を制御していること、さらにSDF1/CXCR4/Gaiシグナル経路はp38の活性化を介して、リンパ管新生を誘導するVEGF-Cの発現を制御していることが示された。乳癌の浸潤、転移においては、SDF1/CXCR4/Ga13/Rhoシグナル経路の活性化が重要な役割を果たしていることを、これまでに我々は報告した。本研究では子宮頸癌、卵巣癌などの婦人科領域の悪性腫瘍の浸潤、転移におけるCXCR4を中心としたGPCRシグナル経路の役割について解析を行った。転移、浸潤能の高い子宮頸癌細胞株においては、乳癌の場合と異なり、SDF-1/CXCR4/Gai/Racシグナル経路の活性化が細胞浸潤を制御していることが、in vitroの実験で示された。さらに、SDF-1/CXCR4/Gaiシグナル経路はp38の活性化を介して、リンパ管新生を誘導するVEGF-cの発現を制御していることが示された。卵巣癌においては、SDF1/CXCR4/Ga13/Rhoシグナル経路の活性化が細胞浸潤ではなく細胞増殖を制御していることが示された。今後はさらにRhoシグナルの下流のシグナル伝達経路について解析を行っていく予定である。癌の増殖、進展の様々な過程にCXCR4を含む様々なGPCRが関与していることや、現在の市場における治療薬の25%以上がGPCRを標的としていることを考慮すると、あるひとつのGPCRにより制御される複数のシグナルのうちの特定の経路のみを選択的に阻害するというコンセプトはシグナル選択的なGPCR阻害剤やGPCRの構造変化を促すアロステリックタンパク質といった新たな治療薬の開発にもつながると期待される。本研究では子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌を含む婦人科領域の癌の浸潤、転移におけるCXCR4の役割について解析を行ってきた。卵巣癌においては、乳癌の場合と同様にSDF1/CXCR4/Ga13/Rhoシグナル経路が細胞浸潤を制御していると考えられた。卵巣癌細胞の浸潤能はGa13の発現量に依存してることが予備実験の結果から示唆された。癌の増殖、進展の様々な過程にCXCR4を含む様々なGPCRが関与していることや、現在の市場における治療薬の50%以上がGPCRを標的としていることを考慮すると、あるひとつのGPCRにより制御される複数のシグナルのうちの特定の経路のみを選択的に阻害するというコンセプトはシグナル選択的なGPCR阻害剤やGPCRの構造変化を促すアロステリックタンパク質といった新たな治療薬の開発にもつながると期待される。子宮頸癌、卵巣癌細胞株の浸潤を制御するCXCR4下流のシグナル伝達経路の解析は順調に進行しているが、子宮体癌細胞株を用いた解析が不十分である。免疫不全マウスを用いた、in vivoでの造腫瘍能、転移能の解析に関しては、実験条件の検討に時間がかかったため、予定よりも遅れている。子宮体癌の浸潤を制御するCXCR4下流のシグナル伝達経路の解析を行った上で、卵巣癌、子宮頸癌細胞株を含めてin vivoにおける浸潤能、転移能の解析を行う。特に転移能の高い細胞株を選択し、CXCR4によるリンパ管誘導因子VEGF-Cの発現制御機構の解析を行う。具体的には、VEGF-Cの発現制御が転写調節によるものか、mRNAの安定化によるものなのかを解析する。設備物品費実験器具:400,000円、試薬:500,000円、実験動物:700,000円、血清培地:200,000円旅費等外国旅費:150,000円、国内旅費:60,000円
B細胞最終分化系譜における非コードRNA発現制御機構の解析

獲得免疫を担う抗体は、多様な抗原に対してレパートリーを備えている。抗体産生B細胞は、胚中心B細胞を起点に記憶B細胞あるいはプラズマ細胞へと分化するが、どのような仕組みで抗体産生能を長期維持しているのかは明らかではない。この過程では、成熟B細胞で特異的発現する活性型シチジン脱アミノ化酵素(AID)を介した分子制御機構が必須である。研究では、AIDのcofactorとしてタンパク質、DNA、RNAレベルで関連するGANPに着目し、GANPのアクセスゲノム領域と結合RNA群を明らかにすることができた。本研究の成果より、GANPによって制御を受ける細胞内RNAに関する分子基盤を開示することができた。AIDのcofactorとして機能するGANPは、タンパク質、DNA、RNAレベルでAIDを起点とした分子機構に関与することが示唆される。本研究では、GANPのRNA認識モチーフに着目して、どのような仕組みでB細胞最終分化系譜においてmiRNA/mRNAの発現変化を引き起こすのか、なぜ選択的miRNA/mRNAの発現と核外輸送が行なわれているのかという分子基盤の解明を目指す。今年度は、「ゲノム支援」によって次世代シークエンス解析を中心に行ない、GANPと結合するゲノム配列及びRNA配列の情報を得ることができた。獲得免疫で中心的な役割を担う抗体は、多様な抗原に対するレパートリーを備えている。抗体産生細胞B細胞は、胚中心B細胞を起点に記憶B細胞あるいはプラズマ細胞へと分化する。しかしながらどのような仕組みで抗体産生能を維持しているのかは明らかではない。この過程では、成熟B細胞のステージで発現する活性型シチジン脱アミノ化酵素(AID)を介した分子制御機構が必須である。AIDのco-factorとして位置づけられる胚中心関連核タンパク質GANPは、AIDとタンパク質レベル、抗体遺伝子座、RNA結合能において関連することが示唆されている。本研究ではGANPのRNA認識モチーフに着目し、どのような仕組みでB細胞最終分化系譜においてmiRNA/mRNAの発現変化を引き起こすのか、なぜ選択的miRNA/mRNAの発現と核外輸送が行われているのかという分子基盤の解明を目指す。今年度は、ヒトRamos B細胞株を用いたChIP-seqとRIP-seqの解析を進めた。N末及びC末に対する抗GANP抗体によるChIP-seqでは、それぞれ78%、10%のカバレッジであった。C末抗体のChIP-seq解析の結果、4つの番染色体上に有意に、GANPと結合性を示す配列がenrichmentしていることが認められた。すなわちC末抗体によるGANPのゲノムアクセス領域に何らかの選択性があることが示唆された。一方、同じくRIP-seqではユニークヒットは約1%であった。RPKM値50以上では、N末抗体で約45遺伝子、C末抗体で約65遺伝子であり、ほぼ共通の遺伝子がヒットしていた。その多くは非コードRNAやmiRNAであった。次世代シーケンスを用いて得られた配列情報の有意性について、バイオインフォマティクス解析を展開するとともに、個別遺伝子を絞って検証を進めている。次世代シークエンス解析から、標的となる遺伝子群が予想以上に多く存在することが示唆されている。その生物学的意義について解析を進めている。また、本年度は、熊本大学から大阪大学に移動に伴い、遺伝子改変マウスを用いた実験に取り組めず、細胞株での研究となった。多様な抗原に対する抗体のレパートリーを産み出す抗体産生細胞は、胚中心B細胞を起点に記憶B細胞あるいはプラズマ細胞へと分化する。しかしながらどのような仕組みによって抗体産生能を維持しているのかは明らかではない。AID-のco-factorとして位置づけられる胚中心関連核タンパク質GANPは、AIDとタンパク質レベル、抗体遺伝子座、RNA結合能において関連することを明らかとしてきた。本研究では、GANPのRNA認識モチーフに着目し、どのような仕組みでB細胞最終分化系譜においてmiRNA/mRNAの発現変化を引き起こすのか、なぜ選択的miRNA/mRNAの発現と核外輸送が行なわれているのかという分子基盤の解明を目指す。昨年度に引続き、ChIP-seq及びRNA-seq、RIP(RNA immunoprecipitation)-seqを行なった。さらに、結合RNAを直接同定するHITS-CLIP(High-throughput sequencing together with UV-crosslinking and immunoprecipitation)法のシステムを構築した。次世代シークエンスとともに、バイオインフォマティクス解析を進めることによって、これまで推測されていた事象以上に複雑多岐におよぶRNA代謝制御機構の一端を見出だすことができた。得られた配列情報の生物学的意義と有意性について、さらなる検証を進めている。また、AID/APOBECおよびRNA結合関連分子に関連する多くの知見を得られることができた。

研究では、AIDのcofactorとしてタンパク質、DNA、RNAレベルで関連するGANPに着目し、GANPのアクセスゲノム領域と結合RNA群を明らかにすることができた。本研究の成果より、GANPによって制御を受ける細胞内RNAに関する分子基盤を開示することができた。次世代シークエンスによる解析を介して、標的配列の全容に迫ることかできる段階になった。次年度は、遺伝子改変マウスB細胞を用いた実験によって生理的意義と生物学的意義が繋がる解析を進展することを計画する。免疫学今後は、さらに正常ヒト及びマウスB細胞などを用いて、より生理的意義が得られるようにデータ解析を推進することを計画している。一年目から二年目への繰り越しが反映されると共に、熊本大学から大阪大学への移動があったため。平成26年度は、「ゲノム支援」に採択され、次世代シークエンス解析の援助に恵まれたため、試料標本の評定に係る経費を抑えることができた。解析精度を向上して研究推進を図るため、シークエンス解析の経費として最終年度に使用する予定。平成27年度の使用計画としては、分子生物学的手法やタンパク質精製に用いる研究試薬、キットなどの物品費、学会発表や共同研究に係る旅費、論文投稿に係る英文校正代や機器整備、データ解析係る諸経費を予定している。また、5月より他機関への移動があるため、その他の経費として計上する。
大腸癌の肝転移機序に関する研究

「目的」ラミニンは細胞基底膜に存在する糖蛋白で、基底膜より遊離したラミニンが癌の浸潤や転移に重要な役割を担っているといわれている。そこで我々は、血行性転移予知因子としてラミニンについて、組織染色ラミニンおよび血中ラミニン濃度の2点より検討を加えた。「結果」A)組織染色:1)大腸癌組織のラミニン染色の固定法を、ホルマリン固定、凍結切片、アルコール固定の3者で57例の標本を使用し比較検討したところ、ホルマリン固定に比べ、凍結切片、アルコール固定が安定しており、後2者を使用することとした。2)57例の組織ラミニン染色を検討すると、染色性の低い症例程、肝転移が高率にあった。3)ラミニン染色に対して、染色陰性を1、染色強陽性を4とし、その間を2、3とスコア化して評価し、200例の組織ラミニン染色(1989.5.-1992.4.)を再発の有無等で検討した。再発のない治癒切除症例(n=145)のスコアは2.68±1.06,同時性肝転移症例(n=28)は1.64±0.72、異時性血行性転移症例(n=12)は1.58±0.76となり、血行性転移症例は同時性、異時性ともに転移のない症例より数値が低い、すなわちラミニン染色性が低かった(P<0.001)。よって組織染色は異時性血行性転移の予知にも有用であると思われた。B)血清ラミニン:再発のない治癒切除症例(n=145)は179.93±42.62ng/ml,同時性肝転移症例(n=28)は212.56±48.73ng/ml,異時性血行性転移症例(n=12)は183.77±33.64ng/mlとなり、同時性肝転移症例は血清ラミニン値が高かったが、異時性肝転移症例では非肝転移例と有意差を認めなかった。血清ラミニン値の肝転移予知に関する有用性は症例の蓄積により再度検討したいと思う。「まとめ」組織および血清ラミニンの大腸癌血行性転移の予知因子としての有用性が示唆された。1)組織染色:1.大腸癌組織を3種類の方法で固定し、酵素抗体法によりラミニン染色を行なった。凍結切片による固定が最も安定し,アルコ-ル固定がそれに近い安定性を示し,信頼度が高かった。ホルマリン固定は,最も不安定で,信頼性が低かった。3.57例の凍結切片によるラミニン染色でみると,染色性の低い症例13例中7例(53.8%)に肝転移を認め,染色性の高い症例44例中3例(6.8%)よりも有意に高率であった。2)血清ラミニン値:大腸癌症例の末梢血150例(肝転移:28例),門脈血49例(肝転移8例)を用いて,RIA法にて測定した。【結果】