hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
尾索動物ミトコンドリアゲノムの遺伝子構成・配置多様性の進化と尾索動物の進化

動物内の種間(配列間)での進化速度が極端に異なることから、配列間の進化速度の差の影響をどのようにして少なくするのか、その検討を行う必要がある。そこで、進化モデルとして、座位間での進化速度の差の影響が少ないことが報告されているmixed modelや、系統間で進化モデルまたは進化速度が異なることが許容される系統樹作成法を用いて、オタマボヤ綱を除く尾索動物内の系統関係を再検討した。その結果、タリア綱が、腸性目特に管鰓亜目の内群であることが示唆された。また、管鰓亜目ディアゾナ科のRhopalaea sp.は無管亜目の群内群になること、タリア綱が管鰓亜目の群内群になることから、管鰓亜目は、多系統群であると考えられる。よって、無管亜目と管鰓亜目からなる腸性目の分類体系の再検討が必要であると考えられる。分子進化学尾索動物ミトコンドリアtRNA遺伝子に関して、我々の決定したタリア綱のものを含め、再検討を行った。特に、ホヤ綱壁性目のマボヤHalocynthiaroretziのtRNAについては、引き続きtRNAそのものの解析も進めている。既にマボヤミトコンドリアtRNAに見られる転写後修飾については報告を行っているが、未解析のtRNAについても、解析を始めている。ミトコンドリアゲノムの構造変化(遺伝子配置の変化)には、tRNA遺伝子の重要性が以前から唱えられており、tRNA遺伝子の発現を確認しつつ、ゲノム構造の進化との関連を議論することは重要である。また、尾索動物ミトコンドリアゲノムでの最も進化速度が速く、ゲノム構造が大きく変化しているオタマボヤ綱のミトコンドリアゲノムの解析を引き続き行い、他の後生動物ミトコンドリアゲノムには見出されていない特徴的な構造を見出している。尾索動物ミトコンドリア(mt) tRNAに関しては、先ず既存のデータの再確認を行った。マボヤmt tRNAに関しては、現在進行中のマボヤゲノムのドラフト解析データの検討により、mt genomeの配列の再解析を行っており、それに基づいてtRNA遺伝子とその産物との対応を再解析する準備を行った。また、オタマボヤ綱については、mt genomeの配列の新規決定を進めると共に既存データの再検討を行った。ミトコンドリアゲノムの解析に関しては、尾索動物mt genomeの中でも最も問題点の多いオタマボヤ綱の解析を進めることができた。オタマボヤ綱mt genomeは、ゲノムサイズが小さい、コードされている遺伝子の数が非常に減少している、進化速度が極めて速い、等の問題がある。公開されている範囲でのOikopleuradioicaのmt genomeの情報は非常に限られており、解析を進める上での問題点となっている。尾索動物ミトコンドリアゲノムの解析に関しては、引き続き次世代シーケンサによる配列決定を交えて、解析を進める。尾索
アフリカ産油国の経済構造に関する2つのパラドックスの検証

本研究では天然資源開発に依存して成長するサハラ以南アフリカ諸国では,資源収入の増大が見られる一方で資本を国外へ押し出す圧力も非常に強く,資本が逃避・流出している可能性を示した。またナイジェリアについての分析より,産油国では不安定な資源収入に支えられた輸入依存が構造的となり定着し,政府にとって輸入依存によって国内への生活必需品を安価で供給し,国内市場と社会の安定化を図ることが政策上有効なツールとして定着しつつあることが示された。本研究は,近年天然資源の開発によって急速に経済成長しているアフリカ産油国の経済構造に関する二つの逆説的な問題点を分析することを目的としている.H25年度の研究では,アフリカ産油国では外国直接投資の増加が経済成長を牽引しているが、他方で資本の逃避や流出も多いという点について,資本逃避額の推計とその規定要因の分析を進めた.天然資源に依存する発展途上国のデータを用いた分析より,資源国からの資本逃避は1980年代のように慢性的ではなく,むしろ突発的であることが示された.また,資源収入が増加すると資本逃避も増加することが示され,資源収入の一部が国外へ流出していることを示唆する結果となった.ただし,外国からの借入が資本逃避と最も強い相関を持つという構図は1980年代から不変であることも示された.加えて,アフリカの資源国からの資本逃避は他地域の資源国に比べると少ない,という結果も得られた.この分析に関連し,アフリカ産油国を含む天然資源依存の途上国経済の貯蓄率と国内投資の関連性についても別個の分析も行った.計量分析の結果からは,天然資源に依存する途上国では,貯蓄が国内投資に振り向けられず国外へ流出していること,その一方で国内投資を国外からの直接投資に非常に強く依存していることが示唆された.以上一連の分析より,天然資源(原油)に依存する発展途上国の経済では資源収入の増大が見られる一方で,資本を国外へ押し出す圧力も非常に強い状況にある可能性が示された.特にアフリカの産油国では,資源開発産業以外への投資は未だ少なく,貧困や経済インフラの未整備などの問題が多く残るにも拘らず資源収入が国内へ投資されていないという問題点が明らかになった.さらに,資源開発向け直接投資は国際資源価格に大きく影響されることから,現在のアフリカ産湯国の経済成長は国際資源価格の変動に依存しているというリスクも明らかになった.本研究は天然資源の開発によって成長するアフリカの経済構造に関する二つの逆説的な問題点を分析することを目的としている。H26年度の研究では,産油国ナイジェリアでは原油を産出するにも拘らずガソリンなどの石油製品を輸入に依存せざるを得ず,外貨が流出している点を低所得産油国のパラドックスと捉えて分析対象とした。しかし石油製品輸入に関しては当初想定していた以上にデータ上の制約があり,特に計量分析は計画通りに進まなかった。そのため,石油製品やエネルギー関連支出についての分析と並行して,ナイジェリアの食糧輸入について分析を行った。資源輸出への依存に伴う農業生産の停滞により,ナイジェリアでは食糧の輸入が増大しているが,この輸入量は原油輸出の増大と比例しており,外貨流出要因として問題となっている。資源輸出の増大に伴って産業が衰退したという点で,ナイジェリアにおける石油精製を含む製造業と食糧生産を含む農業の問題は共通しており,深刻である。またその結果,本来は国内生産で需要を満たせるはずの財を輸入に依存するようになったという点でも共通している。分析の結果,ナイジェリアでは石油輸出の増大とともに,伝統的には生産・消費されてこなかった種類の食糧がアメリカなどから大量に輸入されるようになっていることが見えてきた。これは産油国において,不安定な資源収入に支えられた輸入依存が構造的となり定着していることを示している。また産油国政府にとって,輸入依存によって国内への生活必需品を安価で供給し,国内市場と社会の安定化を図ることが政策上有効なツールとして定着しつつあると見ることもでき,政府支出が国際資源価格の変動や原油産出などの変動に対して従循環的(pro-cyclical)となる構造を持つという問題点が一層明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。アフリカ経済マクロ経済26年度が最終年度であるため、記入しない。H25年度は,当初計画していた研究目的に関し分析を行い,日本アフリカ学会やその他の国内研究会で報告を行うことで議論を深め,得られたコメントにより精度を高めることができた.またその分析結果をEconomics Bulletin (2014, Vol.34, Issue2)および神戸大学経済経営学会の『国民経済雑誌』(2014年第209巻第6号)に投稿・発表することができ,研究計画をある程度達成できている.しかし当初はアフリカ資源国から流出する資本については,個人が国外の銀行へと預金を移す行動に代表されるような資本逃避と,事業の利益などが国内へ再投資されるのではなく個人や企業などの主体によって国外へと持ち出される資本流出の二つを想定して分析を進めていた.

しかし,後者の企業などを通じた資本の流出についてはデータの制約と情報不足のために十分な分析を加えることが出来ず,分析の枠組みから削ることを余儀なくされた.この点については将来的に新たな手法や切り口で分析することが課題として残った.また,計量分析上の問題として,同じくデータ制約からアフリカの産油国のみに対象を絞ることが出来ず,他地域および他の天然資源輸出国も分析に含めることとなった.分析上の工夫によりある程度,アフリカ産油国の特性についても分析は行うことが出来たが,アフリカ産油国の経済に特有の問題点についても分析は今後の課題である.更に,H25においてH26年度の研究へ向けてデータ蒐集・整理をし,予備的な分析を行う予定であったが,3月末の段階で準備は十分ではなく,H26年度の早い時点で集中的に進める必要がある.H26年度は,計画どおりアフリカ産油国の経済構造におけるパラドックスの二つ目である,産油国による石油製品などエネルギー輸入による経済への影響についての分析を進める.特にH25年度までの分析の中では,アフリカ産油国の収入が国際資源価格に強く依存し,従循環的(pro-cyclical)な構造を持つことが明らかになっており,同じく国際資源価格により影響を受けるエネルギーを輸入に依存することにより,経済の不安定度が増すことが予測される.このような問題点について計量分析を行うことで,天然資源に依存した経済が抱えるリスクとアフリカ産油国の経済成長への問題点を明らかにする.この点に関し,H25年度の研究の中で,原油や天然ガスの産出国であるインドネシアやマレーシアの経験から興味深い示唆を得る機会があった.これらの国々はエネルギー資源を他国へ輸出する一方で,自国内の経済成長に伴うエネルギー需要の高まりといった問題を抱えている.本年度の研究は,特にこれらのアジア諸国を含めた他地域の資源産出国とアフリカ産油国との比較も行いながら進めたい.ただし,H25年度に分析を行ったアフリカ産油国からの資本流出と海外直接投資の流入に関連し,海外直接投資の「質」,すなわち資源採取産業への投資か,あるいはそれ以外の製造業分野などへの投資かによって,経済への影響に差異があるのではないかという,更なる分析の発展可能性が考えられるようになった.このため,H25年度の研究の発展・継続も視野に入れて分析を進めたいと考えている.
キャッチ結合組織の遍在性

キャッチ結合組織がウミユリの巻枝靱帯およびウニの歯根膜に存在することを明らかにした。ウミユリの巻枝の電子顕微鏡による観察の結果、巻枝靱帯はコラーゲン性の結合組織でできており、靱帯にもその他の部分にも、力を発生しそうな細胞は観察されなかった。靱帯の振動試験を行い、靱帯の硬さを測定した。硬さは電気刺激によって軟らかくなった。また高濃度にカリウムイオンを含む人工海水やアセチルコリンの投与によっても硬さは顕著に減少した。軟らかくなった靱帯は、しばらく海水中におくことにより、また硬さを回復した。これらの結果は、巻枝靱帯がキャッチ結合組織であることを示している。ウミユリは巻枝のキャッチ結合組織を硬くすることにより、体を海底の基盤上に保持していると考えられる。ウニの歯は顎の骨に歯根膜と呼ばれる結合組織で結びつけられている。歯根膜の電子顕微鏡による観察の結果、歯根膜はコラーゲン性の結合組織でできており、歯根膜にもその近くの歯や顎の内部にも、力を発生しそうな細胞は観察されなかった。歯根膜のクリープ試験を行った結果、歯根膜は高濃度にカリウムイオンを含む人工海水やアセチルコリンの投与によって軟らかくなった。軟らかくなった靱帯は、しばらく海水で洗浄することにより、また硬さを回復した。これらの結果は、歯根膜がキャッチ結合組であることを示している。ウニの歯は先端部が磨耗する。歯には後端部で炭酸カルシウムが付け足される。そのため、歯は先端部に向かって移動する必要がある。この移動の際、歯根膜は軟らかくなって移動を可能にし、摂食時には歯根膜は硬くなって歯を骨にしっかりと繋いでいるものと思われる。このようにキャッチ結合組織は棘皮動物の体全体の姿勢の保持のみならず、体の部分同士の可逆的な結合にも働いていることが明らかになった。
脳血管内治療支援ロボットの開発

前回の研究期間内では主として動作再現性の検証を行ったが、ジョイスティックによるマスター側の操作は忠実に反映されていたものの、スレーブ側の起動に数ミリ秒の遅れが生じることと、動作スピードは慎重な動きを行なうためと、高速操作でのスリップを防ぐため、実際の治療における操作よりはかなり遅く設定せざるを得なかった。また、現在有線でのコントロールとなっているため、ガイドワイヤーの回転角度に制限が生じていること、実臨床において使用するには装置全体がまだ大きく(特にカテーテル駆動部とガイドワイヤー駆動部の位置など)、それぞれの機器の相互作用(反発、追従など)や滅菌方法などまだ改善すべき点が残っていた。今回の研究期間では、回転ドラムの無線化に成功して、360°の自由な回転が可能となり、それに重ない、操作の遅れややり直しなどの問題がある程度解消した。また、実際の血管撮影装置による透視下の環境で、血管モデルを用いたシミュレーション手術実験を行った。この時多少のスレーブサイドの遅れはあるもののほぼ忠実なマスター側の動きの再現が可能であった。またガイドワイヤー挿入における挿入抵抗もほぼ正しく表示することに成功した。この成果を元に、有線環境でのロボットによるリモートコントロールによるカテーテル及びガイドワイヤーのコンビネーション手技をロボット化し、さらに感覚フィードバック機能も兼ね備えた世界に類のないサポートロボットシステムとし学会で紹介し、論文化した。今回の実験において、ガイドワイヤーを捻る時の回転ローラーが滑って十分なひねりを与えるのにかなり時間を要したという問題があった。この対策としてローラー部分の摩擦抵抗および密着性を大きくし、またモーター出力をあげるなどの改善を行うのに時間を要した。ロボットのハードウェアにおける各パーツについては、精密な設計図をもとに3Dプリンターなどを用いて制作しているが、接触部分における動作の受け渡しにおいて、まだ無駄な動きがあったり、動作の追加が必要となったりすることがあるので、さらなる改善が必要と思われる。また微細な動きが要求される機器であるため、滅菌作業後に機器の調節障害が生じ、動作の不具合が発生しないかについて検証する必要がある。今回の研究期間内では、なるべく臨床現場での実施における再現性や安全性および問題点や不具合の抽出に注力したが、今後は無線化により、さらに離れた場所からの動作コントロールを実現し、テレメディシンによる遠隔治療を可能にすることを主眼とした研究を行っていく。今後も、安全かつ正確なカテーテル治療支援ロボットを完成させ、遠隔治療も含めた脳血管内治療の可能性の拡大と、術者負担の軽減のためにロボット治療の臨床での早期実現化を目指す。実験の遅れに伴う聞きこ運輸の遅れによる。
小脳におけるニューロン/グリア相互依存的発達とその分子機構に関する研究

小脳において既知の分子とは異なるが相同な細胞接着分子を追求する目的で、種々の接着分子の機能領域に対する抗体を作製した。それらの抗体を用いて免疫組織化学的にマウスの脳を染色したところ、その中の一つの抗体が本来その接着分子を有する神経細胞に加え小脳プルキンエ細胞膜を認識し、抗体が認識する分子の分子量が若干異なっていることが判明した。その抗体を用いて抗体スクリーニングを行い、プルキンエ細胞とバーグマングリアとの新規接着分子と考えられる分子のcDNAの単離を試みた。さらに、この抗体の認識アミノ酸配列から既知のタンパク質との相同性検索を行い、相同性の高い分子の脳内分布の解析を試みた。マウス小脳cDNAライブラリーを用いた抗体スクリーニングの結果、いくつかの抗体陽性クローンが得られた。それらのクローンからcDNAを単離しシークエンスを行い塩基配列を決定した。それらの塩基配列と既知のマウス遺伝子との相同性を検索したところ新規分子であることが判明した。その塩基配列をもとに45塩基のDNAオリゴプローブを作成しin situハイブリダイゼーションをマウスの脳で行った。その結果、すべてのプローブで神経細胞に広く分布する発現パターンとなり、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現するクローンは得られなかった。また。アミノ酸配列検索の結果から得られた分子においても小脳プルキンエ細胞に特異的に発現する分子は単離できなかった。今後も、マウス小脳cDNAライブラリーを用いた抗体スクリーニングを行いながら、抗体を用いた脳内タンパクの精製を試み、さらにマウスゲノムでの検索も試み、小脳プルキンエ細胞特異的接着分子を多方面から検索、解析していく予定である。また。
光アシスト高効率水素製造技術の開発

水蒸気電解は高い電解効率で水から水素を得ることができる手法である。しかしながら、電解に用いる電力は主に化石燃料に由来する。そこで本研究では、水蒸気電解に必要なエネルギーのすべてを太陽エネルギーから得ることができる新水蒸気電解システムの開発を目指した。その結果、本システムは、太陽エネルギーのみを用いて、高いエネルギー効率で水から水素を作成できる可能性があることが示された。近年、クリーンなエネルギーキャリアとして水素が注目を集めている。その中で固体酸化物水蒸気電解(SOEC)は、高効率で環境にやさしい水素生成方法の一つとして知られている。また、半導体電極を用いた水の光分解では水の理論分解電圧よりも小さな電圧で水素が生成可能である。そこで本研究では固体酸化物水蒸気電解において、水蒸気の分解反応が行われるカソード電極に光触媒として機能する酸化物半導体材料を用い、そこへ光照射を行うことで、水蒸気の分解反応に対する光照射の効果および水蒸気電解の高効率化の検討を行った。電解質としてLa0.9Sr0.1Ga0.8Mg0.2O3、カソード電極としてCaFe2O4、アノード電極としてBa0.6La0.4CoO3を用いて水蒸気電解を行った。カソード側の水蒸気はArをキャリアガスとして水蒸気を流速で導入し、アノードには空気を用いた。光源としてはXe光(500W)、赤色のレーザー(650nm,100mW)と緑色のレーザー(532nm,100mW)を用いた。500, 600, 700°Cにおいて定電圧を印加した状態でカソード電極へ光照射を行い、その際の電流値の変化を観測した。セルに1.4Vを印加した状態で、赤色と緑色のレーザーを照射した場合、電流値の変化率はいずれの温度においてもおおよそ同じ割合(500°C:1.31.6%、600°C:0.670.7%、700°C:0.40.42%)を示した。Xe光を照射した際には赤色、緑色のレーザーよりも大きな電流値の変化率(500°C:11.9%、600°C:5.3%、700°C:2.2%)を示した。このように、光照射により水蒸気電解の電流値の向上が見られた。水蒸気電解反応はΔSが正であるため、高温ほどTΔSという形で周囲から熱を吸熱し、この熱エネルギー分だけΔG(電解に必要な理論電圧)を低減できる。しかしながら、熱源が無いと動作しないという課題がある。水を理論分解電圧よりも小さな電圧で分解できるその他の方法としては、半導体電極を用いた水の光分解がある。本研究ではCa-Fe系の酸化物を水蒸気電解のカソードに用いた光集光型の水蒸気電解セルを作製し水蒸気電解セルの熱源として太陽光が利用できるか検討した。電解質としてLa0.9Sr0.1Ga0.8Mg0.2O3(LSGM)、カソード電極としてCaFe2O4(CFO)、アノード電極としてBa0.6La0.4CoO3(BLC)を用いて水蒸気電解を行った。光源としてはソーラシュミレータを用いた。ソーラーシュミレータの光を直径約4mm程度に集光(約100SUN)することで、印可電圧1.0V程度から電流が観察され、1.4Vにおける電流は2.5 mA/cm2であった。熱源として100倍集光した太陽光を用いた場合でも電解が可能であることが示された。現在のところ700°C前後が最適な集光条件と考えている。次にCa-Fe系の酸化物がカソード材として機能する機構について検討した。反応後のカソードを分析するとメタルの鉄やFe3O4が生成していることが分かった。しかしながら、メタルの鉄やFe3O4のみをカソードとして使用した場合は800°Cにおいても殆ど電解が進行しなかったことから、本システムにおいてはカルシウムが水の還元に重要な役割を果たしていると考えられる水蒸気電解は高い電解効率で水から水素を得ることができる手法である。本年度はSOECセルに光を照射することで電解電流が増大するかどうかの確認を第一の目的と実施した。その結果、先に示したように、セルに1.4Vを印加した状態で、赤色と緑色の単色光を照射すると電流値が増大し、また同時に水素生成も観察されたことから、1.4Vで水蒸気が分解していることが確認された。つまり、SOECセルに可視光を照射することで電解電流の増大が起こることが明らかとなった。その他、室温の水の理論分解電圧(1.23)Vよりも小さな0.9Vで電解を実施したところ、生成効率は小さかったが水素の生成が確認され、太陽電池を電源に用いることでも水蒸気電解が可能であることが示された。無機材料化学27年度に開発した電解装置を使用して、水蒸気電解の電流密度の向上を目指す予定である。初年度に用いる予定の電解セルでは配線抵抗が30Ωあり、太陽電池を電源として用いて太陽光エネルギー変換効率20%程度を目指す場合、配線抵抗をさらに小さくする必要がある。配線抵抗は技術的に小さくすることが可能であり、すぐにでも対応できると考えている。

次に、従来までSOECの熱源には工場や原子炉の排熱が利用されていたが、本年度は排熱に頼らないSOECシステムを検討する予定である。昨年度の研究で太陽光を集光することで電解に必要なセル温度を得れることは確認しているが、集光システムは不十分であるため今年度は集光システムの改善を目指す予定である。セルの問題としては、現状では800°C、1.0Vで200mA/cm2しか電流を流せないが、目標は300mA/cm2を目指している。高出力化に関してはPLD法を用いた電解質薄膜作製を実施する予定である。この製膜方法を用いると、実際、3A/cm2の出力を得ることにも成功しており、本セルにも応用できると考えている。H27年度は上記の改良により、排熱を利用しない光太陽光アシスト高効率水素製造システムの開発を目指す予定である。H27年度は電解セルの加熱方法、セル構造、最適な分析方法をプロトタイプの装置で検討してきたが、年度内に最終的な構造が決定しなかった理由で、必要な物品を購入できなかったために当該事象が発生した。最終的なセル構造や評価方法がH27年度の前半には決定できる予定なので、それに応じた物品や装置を購入する予定である。
男性不妊症における新規原因遺伝子の同定に向けた２方向からのアプローチ

男性不妊症の新規原因遺伝子を同定するため、一般集団の男性と生殖能力が有ると確認された男性を対象として精液パラメータに関連する遺伝子の探索を行った。また、無精子症患者と家系を対象として無精子症関連遺伝子の探索を試みた。その結果、ゲノムワイド関連解析により精子運動率に影響を与える遺伝子座を同定することができた。また、家系を対象としたエクソーム解析から、無精子症の原因であると考えられる候補遺伝子を抽出することができた。さらに、男性不妊症と有意な関連を示すいくつかのSNPを同定することができた。妊娠を望んでいる夫婦の1割が不妊で悩んでおり、その原因の半分は男性側にあるといわれている。しかしながら、その病因、病態は未だ明らかにされていない。そこで本研究では、男性不妊症の原因遺伝子を同定するため、本年度は以下の2項目について検討を行った。1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定:既に集めた一般集団の男性800検体について、イルミナ社のHumanCore v1.0 DNA Analysis Kitを用いて、ゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。タイピング後、解析ソフトであるPLINKを用いて、精子濃度、精液量、精子運動率、総精子数、総運動精子数との関連解析を行った。解析の結果、有意水準10-5以下を満たす複数のSNPが抽出された。今後、これらのSNPについて、他に集めた生殖能力が有ると確認された男性700検体についてタイピングを行い、精液パラメータ値に影響を及ぼす遺伝子の同定を目指す。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定:無精子症原因遺伝子を同定するため、本年度は研究分担者の協力のもと、無精子症患者の検体をおよそ20例収集した。さらに、無精子症患者の家系1組について収集することができた。収集した無精子症患者の家系1組について、次世代シーケンサー(イルミナ社HiSeq2000)を用いて、エクソン領域をターゲットとしたシーケンス解析を行った。参照配列へのマッピング及びvariation解析からゲノム上の変異を抽出した。現在、不妊症患者のみにみられるゲノム上の変異を解析中である。妊娠を望んでいる夫婦の1割が不妊症で悩んでおり、その原因の半分は男性側にあるといわれている。そこで本研究では、男性不妊症の原因遺伝子を同定するため、以下の2項目について検討を行った。精子濃度、精液量、精子運動率、総精子数、総運動精子数との関連解析を行った結果、有意水準10-5以下を満たす複数のSNPを抽出した。このうち精子濃度、精子運動率と関連を示したSNPについて、他に集めた生殖能力が有ると確認された男性700検体を対象にreplication解析を行い、2集団の結果をメタ解析により統合した。その結果、精子運動率に影響を及ぼすSNPを同定した。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定:無精子症原因遺伝子を同定するため、これまでに30例の無精子症患者の検体を採取し、さらに無精子症患者の家系2組について収集することができた。収集した無精子症患者の家系1組について、次世代シーケンサーを用いて全エクソン解析を行い、患者のみにみられる変異を検索した。その結果、複数の候補遺伝子を抽出することができた。また、無精子症患者2例についても全エクソン解析を行った。現在、無精子症患者に共通する変異を探索中である。1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定においては、計画通り、精子濃度、精液量、精子運動率、総精子数、総運動精子数とのGWASを行い、有意水準10-5以下を満たす複数のSNPを抽出することができた。さらに精子濃度、精子運動率に対してreplication解析を行い、精子運動率と関連するSNPを同定することができた。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定においては、無精子症患者1家系と2例の無精子症患者を対象とした全エクソームシーケンスを行うことができた。また、家系解析では患者のみに存在する遺伝子を絞り込むことができた。検体収集については、さらに1家系を採取することができ、順調に進んでいる。男性不妊症原因遺伝子の同定を目指し、以下の研究成果を得た。1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定:一般集団の男性800検体について、ゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。精子運動率と関連解析を行った結果、有意水準10-5以下を満たす複数のSNP (一塩基多型)が確認された。これらのSNPについて、別集団の男性700検体を対象にreplication解析を行い、2集団の結果をメタ解析により統合した。その結果、精子運動率に影響を及ぼす遺伝子座を同定した。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定:無精子症原因遺伝子を同定するため、無精子症患者3名とそれぞれの両親3家系、計9名を対象として、エクソームシーケンスを行い、患者のみで見られる変異および遺伝子の抽出を行った。

両親どちらにも存在せず、患者のみで見られる変異を絞り込んだが、該当する変異や遺伝子は抽出されなかった。次に母親から受け継いだ変異が無精子症の原因である可能性も考えられることから、父親には存在せず、患者のみに見られる変異と遺伝子の絞り込みを行った。その結果、12個の変異と7個の遺伝子が無精子症原因の候補遺伝子として抽出することができた。3.その他:アロマターゼをコードするCYP19A1遺伝子上のSNP (rs2414095)は血中FSH(卵胞刺激ホルモン)濃度の調節を介して、精子産生に関与していることを明らかにした。また、無精子症や乏精子症と関連を示す9番及び14番染色体に位置する遺伝子座や、精巣の大きさと関連する2番染色体に位置する遺伝座を同定した。以上の成果は、本疾患の病態を解き明かし、より本質的な診断および治療法の開発に繋がると期待される。男性不妊症の新規原因遺伝子を同定するため、一般集団の男性と生殖能力が有ると確認された男性を対象として精液パラメータに関連する遺伝子の探索を行った。また、無精子症患者と家系を対象として無精子症関連遺伝子の探索を試みた。その結果、ゲノムワイド関連解析により精子運動率に影響を与える遺伝子座を同定することができた。また、家系を対象としたエクソーム解析から、無精子症の原因であると考えられる候補遺伝子を抽出することができた。さらに、男性不妊症と有意な関連を示すいくつかのSNPを同定することができた。1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定においては、当初、解析検体数300500人であったが、本年度はそれを上回る800人を対象に全ゲノムSNPジェノタイピングを行うことができた。また、計画通りに精液パラメータ値との関連解析から候補SNPを抽出することができた。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定においては、当初、男性不妊症の検体収集を行うことを中心に計画していたが、本年度は検体収集に加え、次世代シーケンサーを用いた塩基配列の解析まで行うことができた。1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定については、現在までに、精子運動率と関連を示すSNPの同定に至っている。このSNPについては、今後、男性不妊症の検体を用いて関連を示すのか検討を行う。また、他の精液パラメータに対するreplication解析を行い、精液パラメータ関連遺伝子を同定する。2.無精子症患者と家系を対象とした無精子症関連遺伝子の同定については、さらに1家系について全エクソームシーケンスを行い、患者のみにみられるゲノム上の変異を検索する。2家系と別に解析を行った無精子症患者2例から、無精子症患者のみに共通してみられるゲノム変異を検索し、無精子症原因遺伝子を同定する。泌尿器科学1.生殖能力が有ると確認された男性と一般集団の男性を対象とした精液パラメータ関連遺伝子の同定については、精液パラメータと関連性が抽出されたSNPについて、他に集めた生殖能力が有ると確認された男性700検体についてタイピングを行い、再現性の検討を行う。
対話を軸として思考力を育成する社会科単元開発

本研究の目的は,思考力の育成と言語活動を重視する意味で,「対話」を軸として単元を開発することである。そして,「対話」を促すためにタブレット型端末等のICT活用の効果を探ることである。子ども一人ひとりの体験や社会事象にかかわる知識を結び付け,概念形成を支えるものが,言語活動の一部としての「対話」である。子ども自身が書き記し表現したものを基にしながら,それぞれの気付き・考え・思いについて「対話」する活動を重視したい。子どもの内面にあって明確に認識されていない事柄について,対話による言語化を通すことにより,知識・概念として定着させる過程を単元として開発することに本研究の意義がある。本研究の方法は, 1教科書・副読本の分析,他校実践事例の収集・整理, 2本校における実践事例・単元プランの再検討, 31及び2を踏まえた単元の開発である。1, 2, 3の各過程において,タブレット型端末の活用を視点として進める。研究成果としては,タブレット型端末の活用による子どもの新しいコミュニケーションの姿が見られたことである。例えば, iPadに標準装備の「iMessage」を利用することによって,個々のグループが調べて得た情報や意見,考えなどを,その場で他グループに送受信することで,グループでの調べ活動と情報交換が同時に成立していた。このように,タブレット型端末を活用することで新たな対話様式が生まれ,子どもの思考力育成に資する授業形態と単元プランを開発することができた。
新規分子の探索を中心とした核酸認識系TLR応答制御機構の解明

本研究では、Toll-like receptor 7 (TLR7)を中心とした核酸認識系TLRの応答制御機構を解明するために、ファンクショナルクローニングを行ってTLR7の応答を制御する分子の探索を行った。また、TLR7の応答が亢進して自己免疫疾患を発症するマウス(Unc93 homolog B1のD34A変異マウス。以下D34Aマウス)において、その表現型に関与する分子を探索した。その結果、後者のアプローチから、I型インターフェロン受容体のシグナルがD34Aマウスの発症に関わることを明らかにした。また、I型インターフェロンが特定の細胞におけるTLR7発現の維持に関わることを示した。今年度はshRNAライブラリを用いたfunctional cloningによって、TLR7とTLR9の応答バランスを制御する分子の探索を行うと同時に、Unc93B1-D34A変異マウス(D34Aマウス)における遺伝子背景依存的な表現型の調節因子同定を目指した。前者については複数の候補分子が得られ、その候補分子に対するshRNA配列を細胞に導入するとTLR7およびTLR9の応答性に影響を与えたが、オフターゲット効果が散見された。その中で、サイトカイン受容体様分子がTLR7およびTLR9の応答性を負に制御する因子として同定されたため、現在解析中である。また、全くの偶然ながら、ノックダウンされた分子のコンプリメンテーションを行う過程においてクローニングした新規分子をBa/F3細胞に発現させたところ、TLR3、TLR7、TLR9の応答性を亢進させることが明らかとなった。この分子は機能などが全く報告されておらず、また分子名も付けられていないため、便宜上現在は「Peony」と呼んでいる。D34Aマウスの表現型調節因子の解析においては、連鎖解析によって対象を検索中である。現在300匹ほどのマウスを解析したが、特定の遺伝子座がBALB/cのホモアリルになっている場合、D34Aマウスの表現型が抑制される傾向が見いだされている。ただし、B6による表現型の促進については、その原因となる遺伝子座は見つかっていない。また、サイトカインやインターフェロンがD34Aマウスの表現型に与える影響を検討したところ、I型IFN受容体を欠損させたD34Aマウスにおいて表現型が緩和されることから、I型IFNが表現型に影響を与えていることが示唆された。今年度は昨年度に引き続き、以下の解析を行った。これらの結果について、以下に示す。(1)探索を繰り返すことにより、細胞周期の制御因子がTLRの応答性に関わっている可能性が新たに示唆された。また、オフターゲット効果を克服するため、次世代シーケンサーによるRNA-seqを行い、shRNAの配列から予測されるターゲット以外の遺伝子についても発現量の変化を解析中である。(2)B6系統のD34Aマウスについては、penetranceが低いとの結論に至ったことから、連鎖解析を中断した。BALB/c系統はサンプル数を増やすことにより、遺伝子座のLOD scoreを上げることができた。(3)I型IFN受容体であるIFNAR1を欠損させたD34Aマウスでは、B細胞などのTLR7発現量が減少していた。このことから、IFNAR1によるシグナルがTLR7の発現を安定化させ、TLR7依存的な病態に寄与していると考えられた。(4)Peonyは細胞質内領域を欠損させても機能に影響はなく、細胞膜貫通領域、および細胞外領域を欠損させると機能が減弱した。これまでに、10アミノ酸程度まで機能部位を絞り込んでいる。また、トランスジェニックマウスが樹立された。前者に関しては、shRNAライブラリとレポーターアッセイを用いたファンクショナルクローニングによって、TLR7の応答性を抑制する分子の探索を行った。TLR7の応答性を抑制するshRNAの配列が複数得られたものの、これらはオフターゲット効果によるものであった。そこで、使用するライブラリをsgRNAライブラリに変更し、CRISPR/Cas9によるノックアウトに切り替えた。この実験系は非常に効率が良く、TLR7の応答に必要な分子を先行してノックアウトしたところ、既知の分子がすべて同定された。また、ノックアウトすることによってTLR7の応答性を亢進させる分子も同定されてきており、今後の発展が期待される。後者に関しては、全身性の炎症を自然発症するUnc93B1にD34A変異を持つマウス(D34Aマウス)について、C57BL/6系統とBALB/c系統との間で表現系が異なることを利用し、連鎖解析を行った。その結果、BALB/c系統についてはD34Aマウスの応答性を抑制する遺伝子座が示唆された。ただし、関連遺伝子座の領域が広いことから遺伝子を絞り込むことは困難であった。そこで、網羅的な連鎖解析と並行する形で、現在までに関与が示唆されたインターフェロンやサイトカインを欠損させたD34Aマウスの作製を行い、表現系に与える影響を検討した。結果として、I型インターフェロンのシグナルがB細胞や特定の樹状細胞サブセットにおけるTLR7の発現を維持し、D34Aマウスの表現系に関与していることが明らかとなった。これまでにI型インターフェロンがB細胞のTLR7発現に関与していることは知られていたが、樹状細胞に関しては未知であり、新しい知見がもたらされたと考えられる。

本研究では、Toll-like receptor 7 (TLR7)を中心とした核酸認識系TLRの応答制御機構を解明するために、ファンクショナルクローニングを行ってTLR7の応答を制御する分子の探索を行った。また、TLR7の応答が亢進して自己免疫疾患を発症するマウス(Unc93 homolog B1のD34A変異マウス。以下D34Aマウス)において、その表現型に関与する分子を探索した。その結果、後者のアプローチから、I型インターフェロン受容体のシグナルがD34Aマウスの発症に関わることを明らかにした。また、I型インターフェロンが特定の細胞におけるTLR7発現の維持に関わることを示した。本研究の主要な目的である「核酸認識系Toll-like receptorの応答を制御する新規分子の探索」という点については、shRNAライブラリによる探索などによって新規分子が実際に同定されているため、おおむね順調に進展していると考えて良いのではないかと思われる。TLR7の過剰な応答による炎症と、系統依存的な表現系とを結ぶ因子の探索については、片側の系統(C57BL/6系統)の解析を断念する結果となったが、もう一方の系統(BALB/c系統)では探索を続けられる可能性が残っている。また、制御分子の解析という点においても「実績の概要」に示したような分子において解析が進んでおり、「解明」に向けての足がかりができていると考えられる。免疫学「実績の概要」に対応させて、今後は以下の点を中心に研究を進める。また、これまでは「探索」に重点を置いていたが、今後は「解析」へと徐々にシフトさせる予定である。(1)shRNAライブラリによるファンクショナルクローニングについては、CRISPR/Cas9システムによるgRNAライブラリなども使用して幅を広げる。また、RNA-seqによって解析された候補分子が実際に制御分子として機能するかを検討し、オフターゲット効果を無視できるような探索系の構築を目指す。(2・3)I型インターフェロンとUnc93B1-D34Aマウスの表現系との解析については、現在論文のreviseを行っており、近いうちに完了する予定である。連鎖解析については、次世代シーケンシングなどによってfine mappingに進みたい。(4)新規分子Peonyはトランスジェニックマウスの解析を行う。なお、コンディショナルノックアウトマウスの作製が遅れているので、こちらはgRNAのインジェクションなどによって樹立を加速する。shRNAライブラリによるスクリーニングについては想定していたよりもオフターゲット効果が強く、当初の目的であるTLR7を選択的に抑制する分子を同定するには至らなかった。しかし、目的こそ異なれど、機能などが全く不明である新規分子を同定し、その機能が核酸認識系TLRの応答性を亢進させるものであることを見いだした結果は大きいと考えている。また、連鎖解析についても表現型に影響を与える可能性のある染色体領域が同定されつつあり、今後の展開が期待される。連鎖解析によらない表現型調節因子についてもI型インターフェロンが候補として見出されるなど、一定の進捗がある。shRNA
遺伝子クローニングのための染色体工学システムの開発

遺伝子のクローニングシステム作りのための第一段階として、放射線照射により得られた種々の長さの欠失をもった1番染色体を作製した。1q31-telのSTSマーカーでスクリーニングした後有用な1番染色体長腕断片を得た。これらの微少核融合を用いて子宮内膜癌細胞株(HHUA)に導入した。その結果、1q32-41の領域にHHUAを老化に導く活性が存在することが判明した。この放射線照射により得られた染色体断片(STFs)は数10数100Mbの大きさであり、遺伝子クローニングの第一段階として有用であることが判明した。さらに、テロメア-繰り返し配列を1Kbもったベクターにこの領域内に存在するSTSマーカーをプライマーとして増幅したDNA断片(510Kb)を組み込み、ヒト1番染色体にターゲッティングすることにより、特定のSTSマーカーより遠位側の欠失をもった1番染色体断片を作製し(Tel-STFs)、HHUAへ移入し増殖ないしテロメレースの変化を分析する試みを行った。結果としては有用なTel-STFsは少数しか得られず、今後効率を上げることを検討課題とした。chromosome pulverizationに関しての基礎的検討ではpulverizationを起こした後のA9細胞などへのキャリアー細胞への移入が効率良く行えず、この点も再検討することとした。この遺伝子座領域をさらに限局する他の方法として、内膜癌症例60例の検体を用いて、1q32-41内のSTSマーカーにより、ヘテロ接合性消失の検討を行った結果子宮内膜癌抑制遺伝子は、このD1S459225の領域に存在することが明らかとなった。D1S459及び225陽性YACクローンをGenethon社から得、細胞死誘導活性を検討した結果やはり細胞死が誘導された。さらにBACライブラリーをスクリーニングし、748H11に含まれるBACクローンを得、同様にHHUAに導入すると、そのひとつにより、やはり同程度の細胞死が誘導された。現在このBACクローンより遺伝子の単離を試みている。本研究では疾患の原因遺伝子のクローニングシステムの開発として、1番染色体長腕上の子宮内膜癌抑制遺伝子の単離をモデルとして検討を行った。微小染色体融合で染色体を同定し、さらに当該染色体の断片であるSTFを作製し染色体の位置を機能的に解析することは、目的の遺伝子座の狭小化に極めて有用であった。これよりさらに領域を特定し1Mb程度に絞り込むことにより従来のYAC,BACテクノロジーが応用でき、遺伝子単離が可能となった。この領域の特定に今回は精密なSTFマッピングを用いたが今回基礎的検討を行ったtel-STFなども今後応用が期待される。ヒト1番染色体上の子宮内膜癌増殖抑制遺伝子座を明らかにする目的で、まず始めにヒト

1番染色体短腕のみを持つGM1173と長腕のq12からq31までの欠損をもつAqD1Q細胞を子宮内膜癌細胞株HHUAに微小核融合し、増殖抑制を観察した。その結果GN1173では増殖抑制はみられなかったが、A9D1Q細胞の移入では、ほとんどの細胞で細胞死が観察された。これは子宮内膜増殖遺伝子がヒト1番染色体長腕のq31より遠位に存在することを示すものであった。つぎにさらに詳細にこの遺伝子座を同定するために、ヒト1番染色体に1000-3000radの放射線照射を行い様々な長さのSTFsを作製した。10・50Mbの長さのq31・telの領域内に存在するSTFsがおよそ30種類得られ、この中から有用である5つのクローンを選択しHHUAに微小核融合を行った。この結果子宮内膜癌増殖遺伝子座がヒト1番染色体長腕遠位部の、q31・41の間に存在することが明らかになった。より詳細な位置を決定するために(1)テロメアベクターに、この領域内に存在するマーカーであるD1S103からbubble PCRで得られたDNA断片を組み込みA9D1Qにターゲティングし、D1S103より遠位が欠損した染色体の作製を試みた。現在のところ目的のクローンは得られておらず、手法の改良などを検討している。(2)q32・41間のSTSマーカーを用い、60例の臨床癌検体についてLOH解析を行った。約50%の症例がD1S225-D1S459の間に異常をもつことが明らかとなった。この領域をカバーするYACクローンを得、HHUAに導入したところ1番染色体の微小核融合の場合と同じく細胞死が誘導され、親細胞のもつ高いテロメラーゼ活性も抑制されていた。これらのことよりこのYACクローンがもつゲノム領域(約1Mb)に子宮内膜癌増殖抑制遺伝子が存在すると考えられた。ヒト1番染色体上の老化誘導遺伝子のクローニングをモデルとして、遺伝子クローニングのための染色体工学システムの開発を本年度も継続している。当初の予定のうち、テロメアベクターによるターゲッテイングを用いた欠損染色体の作製であるが、A9D1QにD1S103からBubble PCRで得られたDNA断片を移入しD1S103から遠位が欠損した染色体の作製を試みた。100以上のクローンをとり解析したが、目的のクローンは得られなかった。細胞側の問題と考え、今後高率に相同組み換えを起こしやすいDT40などの受容細胞に1番染色体を移入したものを用いて検討を続ける予定である。現在のところ以下の手順がクローニングシステムとして成功している。(1)染色体上に大きな欠損を有する染色体を癌細胞に導入し、その細胞死誘導活性の有無より100Mb単位で遺伝子座を決定する。(2)放射線照射により得られた微小染色体(STF)を癌細胞に導入し同様に10Mb単位まで遺伝子座を狭める。(3)この狭めた領域に対しSTSマーカーを1.2Mb毎に設定し臨床検体での欠失を検討することで数Mb以内に領域を限走できる。(4)この領域をカバーするYACクローンを癌細胞に導入しその活性を確認する。YACの導入についてはリポゾームを用いて効率よく導入する方法を確立した。
腎薬物トランスポータ遺伝子多型に基づいた炭酸リチウム副作用発現予測

本研究は,日本人における薬物輸送トランスポータ遺伝子多型が炭酸リチウム血中濃度に与える影響ならびに副作用発現との関連を明らかにし,個々の患者に応じたより安全で有益な薬物治療を構築することを目的に以下の研究を遂行した。はじめに,研究実施計画に基づき,本研究では炭酸リチウム服用患者を対象として,本剤の体内動態解析を行うため,炭酸リチウム血中濃度測定を行った。得られた血中濃度と年齢,体重,臨床検査値などの患者背景ならびに副作用発現の状況について情報を収集し,解析を行った。次に,秋田大学医学部附属病院薬剤部所有の機器を用いて,腎臓に発現する薬物輸送トランスポータであるP糖たんぱく質(P-gp)ならびに有機アニオントランスポータ(OATs)の遺伝子変異検出系の構築を行った。PCR-RFLP法を用いて,以下の各種遺伝子多型の検出系を確立した。[P-gp(ABCB1), OAT1(SLC22A6), OAT3(SLC22A8),organic cation/carnitine transporter (OCTN2 : SLC22A5), Sodium-phosphate cotransporter(NaPi : SLC34As)]予定の症例数が集まらず,やや遅れているが,これら遺伝子変異検出系を使用して,被験者の炭酸リチウム体内動態を腎薬物トランスポータ遺伝子多型別に比較し,副作用発現との関係について解析を継続して行う。また,本研究の成果は症例を随時追加し,今年度(平成29年度)の第27回日本臨床精神神経薬理学会年会においてポスター発表する予定である。
虚血による心筋細胞肥大の分子的機序-細胞内イオン濃度の変化と早期遺伝子発現の変化の対比-

本研究の目的は、心筋細胞の虚血よりの回復過程において、いわゆるImmediate-early genes(IEG)、プロテイン・キナーゼ系、細胞内Ca^<2+>がいかなる役割を果たしているかについて検討を加えることであった。10日ニワトリ胚由来の培養心室筋細胞を無血清培地にて培養した後に、1 mM NaCN +20 mM 2-deoxy-d-glucoseを含む培養液を投与して代謝阻害を加え、in vitroの虚血モデルとし、代謝阻害中および回復期におけるIEGのひとつであるc-jun発現、Ca^<2+>indicatordyeであるindo-1を用いて測定した細胞内Ca^<2+>濃度、mitogen-activated protein(MAP)キナーゼ活性の変化について検討を加えた。RNAブロット解析の結果では、c-jun mRNAの発現レベルは30-120分の代謝阻害中には有意に変化しなかったが、30分間の代謝阻害からの回復期においては、回復期30分にて有意に上昇を開始し、60分にて最大値(代謝阻害前コントロールの4.7±0.03倍、p<0.01、n=3)となった。この代謝阻害よりの回復期におけるc-junの発現レベルの上昇は、プロテイン・キナーゼCの阻害薬であるH-7(100μM)の前投与により著明(約95%)抑制された。心筋細胞内Ca^<2+>濃度は代謝阻害中に徐々に増加し、正常収縮時のピーク・レベルを越える程度まで上昇した(代謝阻害開始5分後:314±28 nM、30分後1658±289 nM、n=3)が、代謝阻害からの回復期には速やかに正常化した。EGTA(2 mM)の前投与により細胞外Ca^<2+>濃度を低下させると、代謝阻害による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇はほぼ完全に抑制され、細胞内Ca^<2+>濃度は低いレベルに保たれた(代謝阻害開始5分後:168±25 nM、30分後184±26 nM、n=3)が、回復期におけるc-junの発現レベルの上昇はEGTA非投与群に比して有意に(約42%)抑制された。MAPキナーゼ活性も代謝阻害中には不変で、代謝阻害からの回復早期(ピークは10分後でコントロールの4.1±0.8倍、p<0.05、n=4)に有意に上昇した。本研究の目的は,心筋虚血時あるいはそれからの回復時に,いわゆる早期遺伝子(Immediate-early genes)の発現が変化するか否かを検討し,その変化と心筋細胞内イオン濃度を対比することであった。さらには,心筋虚血からの回復期に実際に心筋細胞が肥大するか否かを検討することをも目的としていた。本年度は特に,ニワトリ胚由来の培養心室筋細胞を用いて,代謝阻害(Metabalic Inhibition)によって虚血時のエネルギー代謝障害を再現し,1.細胞内Ca^<2+>濃度の測定,2.早期遺伝子発現の解析,3.心筋細胞肥大度の測定を行った。以下,得られた結果の概要を示す。

1.心筋細胞の培養および代謝阻害:10日目のニワトリ胚より単離した心室筋細胞を単離し,無血清培地にて培養した後に,培養液を1mMNaCN並びに20mM 2-deoxyglucoseを含有するものに取り換え,代謝阻害を行った。代謝阻害開始後一定時間(15120分)にて培養液を通常の無血清培地に戻し,培養心室筋細胞を回復させた。従来の報告と同様に,Ca^<2+> dyeであるindo-1を用いて測定した心筋細胞内Ca^<2+>濃度は,代謝阻害により徐々に上昇し,回復期には次第に低下した。2.早期遺伝子発現の変化:培養心筋細胞より全RNAを抽出し,早期遺伝子の1つであるc-junに特異的なDNAプローブを用いて,ノーザン・ブロット解析を行った。c-junの発現レベルは30分間の代謝阻害中には変化しなかったが,代謝阻害中止後60分に著明な(10倍以上)上昇を観察した。3.心筋細胞肥大度の測定:まず一定時間(15120分)の代謝阻害より回復後48時間の時点におけるRNA並びにタンパク含量を測定したが,1530分の代謝阻害後にやや増加する傾向が認められた。さらに,[^3H]ーフェニルアラニンの取り込み率に関しても同様の傾向が見られたが,この点についてはさらに検討を加える予定である。本研究の目的は、心筋細胞の虚血及び回復期において、いわゆるImmediate-early genesの一つであるc-junの発現レベルの変化を観察し、その変化に対する細胞内Ca^<2+>濃度の変化やプロテイン・キナーゼ活性化の意義について検討を加えることであった。10日ニワトリ胚由来の培養心室筋細胞を無血清培地にて培養した後に、1mM NaCN+20mM 2-deoxy-d-glucoseを含む培養液を投与して代謝阻害(1時間)を加え、in vitroの虚血モデルとした。Ca^<2+> indicatordyeであるindo-1を用いて測定した細胞内Ca^<2+>濃度は、代謝阻害中に徐々に上昇し、通常の培養液に戻した後(回復期)には次第に低下した。培養心筋細胞より抽出した全RNAと特異的なcDNAプローブを用いて行ったRNAブロット解析の結果では、c-junの発現レベルは代謝阻害中には有意に変化しなかったが、回復期30分にて有意に上昇を開始し、60分にて最大値(コントロールの4.7倍)となった。この代謝阻害よりの回復期におけるc-junの発現レベルの上昇は、プロテイン・キナーゼCの阻害薬であるH-7(100μM)の前投与によりほぼ完全に抑制されたが、プロテイン・キナーゼAの阻害薬であるH-89(30μM)の投与によっては影響を受けなかった。EGTA(1mM)の前投与により細胞外Ca^<2+>濃度を低下させると、代謝阻害による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇はほぼ完全に抑制されたが、回復期におけるc-junの発現レベルはEGTA非投与群と同様のレベルまで上昇した。
プリオン蛋白(PrP)結合ペプチドの同定とそのプリオン病治療への応用

異常プリオン蛋白との蛋白-蛋白相互作用に基づく正常プリオン蛋白の異常型への変換が、プリオン病の実態であると考えられている。したがってプリオン蛋白変換の制御が可能となればプリオン病の発症予防法開発に繋がるものと考えられる。本研究では、プリオン蛋白変換制御機構解明のための武器ならびに制御候補分子としてプリオン蛋白結合ぺプチドを取り上げた。ランダム12 merペプチドライブラリよりリコンビナントPrP(121-231)への結合活性を有するファージを4roundsのパニングにより濃縮し、ランダムに72プラークをクローニングした。塩基配列決定によりこれらは各々独立した6種類のファージよりなることが判った。EIAにより5/6に特異的結合が確認された。そのうちwest-western法により陽性バンドが検出されたのは1種類のファージのみであった。しかしながら、相応する合成ぺプチドを用いた解析では、3種類のぺプチドがそれぞれのファージのPrPへの結合を容量依存的に特異的に抑制することが判明し、またIAsys cuvette systemを用いた解析によりこれら3種類の合成ペプチドのPrPへの結合を直接証明することができた。今後、ぺプチドおよびPrP121-231双方の結合エピトープをさらに細かく決定する予定である。その上で、ペプチド結合のPrP立体構造およびPrPC→PrPSc変換へ及ぼす影響を検討する。また、ペプチド側結合モチーフを手がかりにして異常プリオン蛋白生成制御に関わる未同定の正常細胞蛋白(protein X)の同定作業も可能となるものと考えられる。