hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線治療における臓器位置不確定性を考慮した新規有害事象予測モデルの包括研究

次にビームフルエンスに患者の呼吸性移動に相当するシフト量を加味し、治療計画時のフルエンスとの誤差を解析した。この誤差を三次元線量分布に乗算することにより、Interplay effectsの程度を予測するシステムを開発した。肺・肝臓に対する定位放射線治療では、このInterplay effectsの影響を少なくするために小セグメントのStep-and-shoot IMRTという技術を用いて臨床で治療を行っているが、本研究で開発した手法を用いて呼吸性移動が線量分布に及ぼす影響を評価し、実際に腫瘍に照射される線量の変動が小さいことを確認することができた。またその線量計算の精度に大きく関わるビームデータ測定の精度担保を評価するシステムを開発した。肺がんや肝臓がんは呼吸により位置や形状が変化する。がんの放射線治療において、臓器が動くことにより投与される放射線の分布が悪化する事がある。本研究では呼吸性移動を伴う臓器に放射線治療を行う際に投与される線量分布を予測するシステムを開発した。まずMRIのシネ画像から腫瘍の3次元的な動きを解析する手法を開発した。次に、その動く臓器を追いかけて放射線を照射する追尾照射の精度を計測するシステムを開発した。さらに、腫瘍の動きと放射線照射の両方が時間とともに変化する場合に起こる影響を解析する方法を開発した。これらにより、臨床で用いられる手法で精度良く放射線を照射できるか予測することが可能になった。本課題研究における初年度の実施計画では、臓器の生理的運動による移動・回転に対応した線量評価技術の開発である。本内容は、(i)生理的運動により位置が変化する臓器を追跡するアルゴリズムの開発、そして(ii)臓器の運動を加味した線量分布の解析方法の開発、という2つの過程より構成される。私は臓器の運動・回転についてシネMRIを用いて解析する方法を確立し、またその精度が十分であることを確認した。解析アルゴリズムは完成し、学会、英語論文を通して発表を行った。次に線量分布の評価法について、我々はSBRTにおける線量分布変動を解析する技術を開発した。またその成果も次年度の学会で発表予定である。以上より、初年度について本課題研究は当初の予定通りに進行していると考えられる。最終年度はこれまでに開発した手法の統合、臨床例での解析、そして成果報告を予定としている。臓器の生理的運動がビーム照射に与える影響を評価し、その結果を患者体内への線量分布計算にフィードバックする必要がある。このフィードバックについては利用可能な商用ソフトウェアShioRIS2.0の機能を利用可能であると考えられるが、状況によっては自身で開発を行う。さらに一般的に広く用いられる従来のリニアックを用いた治療にも対応できる手法を考案する。
鋳鉄ボンドダイヤモンド砥石へのファイバーと高圧処理効果

ダイヤモンド砥石はセラミックスに代表される高硬度、難切削材料の研削および研磨に用いられる工具として最も有効である。ダイヤモンド砥石においるボンド材の適否は研削能率、研削比の優劣や工作物の精度に影響を及ぼし砥石製作上の重要な要素である。本研究では、鋳鉄ファイバーをボンド材としたダイヤモンド砥石へのファイバーと高圧処理効果について検討した。高圧処理としてカプセルを用いないカプセルフリーHIP処理による焼結挙動および窒化ケイ素に対する研磨特性について研究した。その結果、次のことが明らかになった。ダイヤモンド砥石およびボンド材単一試料の成形体の相対密度は銅添加量が増大するほど高くなった。1173Kでの真空中予備焼結ではいずれの試料においても相対密度の上昇が見られなかった。1173Kでの真空焼結により相対密度は高くなったがCFHIP焼結では変化はなかった。しかし、1323KでのCFHIP焼結では膨張した。CFHIP焼結による銅添加した鋳鉄ファイバーボンドダイヤモンド砥石の硬度は真空焼結体に比べ硬くなった。本研究で作成した鋳鉄ファイバーボンドダイヤモンド砥石の窒化ケイ素に対する摩耗速度、研磨速度および研削比は次のように砥石の硬度で総括的にまとめることができた。すなわち、摩耗速度はファイバーの素材である鋳鉄の硬度に相当するHRB87付近まで徐々に減少し、その後硬度が高くなると摩耗速度は大きくなった。研磨速度は硬度が高くなるに従い大きくなり母材の硬度付近でピークとなり、その後減少した。研削比は硬度が高くなるに従い増大し母材の硬度付近でピークとなり、その後減した。近年、セラミックスに代表される高硬度難切削材料の研削・研磨に用いられるダイヤモンド砥石において、結合材の適否は重要な問題である。最近、鋳鉄を結合材としたダイヤモンド砥石が開発され、従来のメタルボンドダイヤモンド砥石が大きく改善されてきている。本研究室では鋳鉄粉末に替え鋳鉄ファイバーを用いたときの研削性能向上について基礎的に解明を進め、また、HIP処理による高圧処理効果を検討している。本年度の研究においては、鋳鉄ファイバーを用いることによるダイヤモンド砥粒の脱落防止向上への期待をより効果的な作用とするために、銅粉末を添加しダイヤモンド砥石にHIP処理を施し研削性能向上を企てた。その結果、次のようなことが明らかとなった。鋳鉄ファイバーとして直径φ30μm長さ0.5mmを用い、5wt%から20wt%の範囲で銅粉末を添加し、1173Kで真空焼結した後、HIP処理を1273Kで1時間の120MPaアルゴン雰囲気下で行うと、窒化ケイ素セラミックスに対する研削性能(ITO式研磨試験機)は、銅の添加量が多いほど大きくなった。また、同一温度処理条件で真空処理したダイヤモンド砥石試料に比べHIP処理したダイヤモンド砥石の研削性能は向上した。研削試験後の表面をマイクロビデオスコープにより表面観察から、銅の添加量が多いほどダイヤモンド砥粒砥と鋳鉄ファイバーとの界面がより密になりよりダイヤモンドの欠落防止が行えると思われる。セラミックスに代表される高硬度、難切削材料の研磨に有効なダイヤモンド砥石において、結合材は重要な因子であり、その性質を解明することは重要な課題のひとつである。従来の金属ボンド材を鋳鉄に換えたダイヤモンド砥石はその研削性能の向上がまた鋳鉄ファイバーによるネットワーク作用によるダイヤモンド砥粒の脱落防止が期待できる。そこで本研究では、銅粉末を5%から20%添加した鋳鉄ファイバーボンドダイヤモンド砥石を真空中と120MPaのアルゴンガス雰囲気下のCFHIPで1173Kおよび1323Kで1時間焼結を行いこの挙動およびこれらボンド材単一の硬度と窒化ケイ素に対する研磨特性との関係について検討した。その結果、つぎのことが明らかとなった。ダンヤモンド砥石およびボンド材

単一試料の焼結体の相対密度は鋼添加量が増大するほどは高くなった。真空中予備焼結では相対密度の変化はなかったが、1173Kで真空焼結を行うと相対密度は高くなったがCFHIP焼結では変化はなかった。しかし、1323KでのCFHIP焼結では膨張した。CFHIP焼結体の硬度は真空焼結体に比べ硬くなった。本研究で作成した鋳鉄ファイバーボンドダイヤモンド砥石の窒化ケイ素に対する摩耗速度、研磨速度および研削比はボンド材の硬度に依存していた。摩耗速度は硬度が母材鋳鉄の硬度であるHR87付近まで減少し、その後硬度が高くなると大きくなった。研磨速度は硬度が高くなるに母材鋳鉄の硬度付近まで大きくなり、その後減少した。研削比は硬度が高くなるに従い増大し母材鋳鉄の硬度付近でピークとなり、その後減少した。
神経組織に特異的な膜蛋白の構造と機能の研究

神経組織には神経系の発生、分化、再生に関与する膜蛋白群が見出されている。本研究は神経組織に特異的な膜蛋白群を検出し、それらの分子の構造と機能の研究を行なうことを目的とした。実験方法として、モノクロ-ナル抗体法を用い、免疫組織学的なスクリ-ニング法によって特異的な蛋白の検出を行ない、蛋白の分析を試みた。1.新生動物脳組織の膜画分より、0.25%デオキシコ-ル酸溶液によって、膜蛋白を可溶化し、レンチルレクチンアフィニティ-カラムに吸着する画分を抗原として、モノクロ-ナル抗体の作成を行ない、神経組織に染色性の高い数種のモノクロ-ナル抗体(3G9、2B7、1C11、5H2)を得た。3G9抗体は大脳の灰白質の主に神経細胞の細胞体が染色され、グリア細胞は染色されなかった。一方、2B7抗体は白質で高い染色性が認められた。1C11抗体は大脳の細胞間質に染色性が高く、分泌性の糖質複合体である可能性が示された。5H2抗体は神経細胞および一部のグリア細胞と陽性反応を示した。これらの抗体はラットのみではなく、マウスの神経組織とも類似の反応性を示し、哺乳動物に共通に存在する可能性を示した。ウエスタンブロッチングによる免疫染色では、3G9抗体は成熟ラット脳組織の膜画分の35Kおよび100Kの蛋白と陽性反応を示したが、新生ラットではより低分子の蛋白と反応する傾向が見られた。これらの抗体が反応を示す抗原物質の細胞特異性、細胞内の局在、発生過程における変化などについて検討中である。2.脳組織の細胞核の蛋白画分を抗原として、5E5、2F7、7F10の3種のモノクロ-ナル抗体を作成した。5E5抗体はある種の神経細胞の核内構造物と特異的に反応し、2F7抗体は細胞の核膜を特異的に染色し、反応の強さは神経細胞>グリア細胞>筋細胞の順で、その他の細胞との反応は極めて弱かった。さらにウエスタンブロッチングでは2F7抗体は分子量68Kの蛋白と強い陽性反応を示した。7F10抗体はすべての細胞の核を染色し、ウエスタンブロッチングの結果から、ヒストンの1種に対する抗体であると結論された。さらに免疫電顕などによる検案を行なっている。
産業廃棄物を用いた混合セメント水和物の中性子散乱による構造解析

近年のコンクリート高強度化技術の進歩はめざましく,設計基準強度100MPaを超えるような超高強度コンクリート構造物の施工実績が増えているが,この高強度化にはセメント分散剤である高性能減水剤とフライアシュと同じ人工ポゾラン材である超微粒子のシリカフューム(SF)が必要不可欠である。一般に超高強度コンクリートの水セメント比は極めて低く,SFのポゾラン反応によりケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)が生成され微細空隙を充填するが,各セメント鉱物の水和反応に及ぼすSFの影響や,SFのポゾラン反応におけるC-S-Hの詳細な生成機構については分かっていない。そこで本年度は,SFがセメント水和反応の反応に及ぼす影響さらに生成するC-S-Hのケイ酸アニオン構造(オリゴマーサイズのシロキサン鎖の鎖長)に及ぼす水結合材比の影響について検討を行った。本研究ではセメントは低熱ボルトランドセメントを使用し,SFの添加率はセメントの内割10,20%置換,砂結合材比1.0水結合材比(W/B)は15,22,30%として実験検討を行った。実験結果より以下のことが明らかとなった。セメント鉱物であるエーライト(C_3S)の水和反応率は,SFの置換率に拘わらず材齢7日でW/Bが15%で約60%,20%で約70%,30%で約80%に達しそれ以降の水和は停滞した。一方,ビーライト(C_2S)の水和反応率はSF添加率が10%から20%へ増加すると反応が若干抑制され,W/Bが1530%の範囲では反応率に大きな差異は認められなかった。一例としてW/Bが22%,SF添加率が10%の場合,材齢7日で約1015%,材齢28日で約2030%,91日で約3540%となった。生成されるC-S-H量は,SF添加率の増加により若干増加が認められ,W/Bの低下により減少した。C-S-Hのケイ酸アニオンの鎖長は、W/Bの増加により増加しSFの増加により抑制された。環境負荷低減及びCO_2の発生量削減から,コンクリート工学分野では製鋼過程で発生する鉄鋼スラグや火力発電所から発生する石炭灰さらには一般都市ごみや下水汚泥等の焼却灰のセメントへの使用が増加している。これらのリサイクル材を使用したコンクリートの力学的特性と耐久性に及ぼす材料特性を把握するためには,セメント及び廃棄物からリサイクルされた材料から生成されたセメント水和生成物が形成する微細組織の定量化を行う必要がある。このセメント及び混和材料の水和生成物には,結晶性が低い化合物であるケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)が多くを占めている。したがってこのセメントの強度発現特性や収縮特性を調べるためには,結晶性が低い化合物であるケイ酸カルシウム水和物の分析が必要となる。本年度は,C-S-Hの生成に大きく寄与するセメントの主鉱物であるダイカルシウムシリケート(β-C_2S)の含有量の違いがC-S-Hの主構造を成すケイ酸アニオンの形態に及ぼす影響にについて検討した。その結果,β-C_2Sが増加すると水和初期の水和反応は遅くなるが長期の水和発熱量は増加した。この状況と連動し,初期材齢での細孔径分布は大きくなり,長期材齢になるにつれて小さくなった。これは圧縮強度発現にも関係し,初期材齢では強度発現が遅くなったが,材齢28日以降の強度増加は大きくなった。しかし,C-S-Hのシロキサン結合の平均重合度に大きな違いは認められなかった。さらに,産業廃棄物である鉄鋼スラグの内,脱リンスラグに含有するフッ素アパタイト水和群(Ca_<10>(PO_4)_6F_2)がC-S-Hのシロキサン結合の重合度を促進させることが明らかとなった。セメントは水和反応により水酸化カルシウムやC-S-H系結晶を生成することが知られているが、セメント鉱物や生成するC-S-H系結晶は非晶質を含んでおり、その結晶構造の解明において粉末X線回折手法では限界がある。そこで、本研究は、軽元素の構造決定に有効な高分解能粉末中性子回折装置(HRPD)を用いて、セメント鉱物の結晶構造の解明を行う場合の基礎データの収集を目的とした。今回、使用した試料は、比表面積10000cm2/g程度に乾湿粉砕したポルトランドセメントにCa系混和材を混和したものである。予備実験において、Bragg回折ピークが明瞭であったこと、含水による水素原子からの非干渉性散乱が寄与しバックグラウンドが高いことから、第一モノクロメータを12'、測定波長を1.8234(A)、2θ/°範囲を5150°、検出器移動ステップ角を0.05°、測定時間を1700min、ビーム出射口Cd Slitを15x45mmとして測定した。粉末中性子回折により得られた観測強度データを用いて解析ソフトRietan2000によりリートベルト解析を行った。今回の解析では、観測強度が小さいため各相を単相とみなし解析を実施した。リートベルト解析に用いた各相はC_3S、C_2S、C_3A、C_4AFである。

その結果、リートベルト解析において、観測強度データ結晶構造パラメータから導き出した計算値との整合性を示すS(=Rwp/Re)値がほぼ"1"となり、今回設定モデルの精密化が真値に近いことが分かった。また、同定について以下の留意が必要であることが分かった。(1)リートベルト解析は相同定ツールであることから定量値の標準誤差は若干大きいと考えられるが、特にBragg回折強度が弱い場合は、統計誤差が大きくなる。(2)観測強度データのバックグラウンドが2000count一定であったためBragg回折ピークがバックグラウンドに埋もれ、S/N比が低下した。これはセメントの水吸着(湿気)による散漫散乱の影響と考えられる。近年のコンクリート高強度化技術の進歩はめざましく,設計基準強度100MPaを超えるような超高強度コンクリート構造物の施工実績が増えているが,この高強度化にはセメント分散剤である高性能減水剤とフライアシュと同じ人工ポゾラン材である超微粒子のシリカフューム(SF)が必要不可欠である。一般に超高強度コンクリートの水セメント比は極めて低く,SFのポゾラン反応によりケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)が生成され微細空隙を充填するが,各セメント鉱物の水和反応に及ぼすSFの影響や,SFのポゾラン反応におけるC-S-Hの詳細な生成機構については分かっていない。そこで本年度は,SFがセメント水和反応の反応に及ぼす影響さらに生成するC-S-Hのケイ酸アニオン構造(オリゴマーサイズのシロキサン鎖の鎖長)に及ぼす水結合材比の影響について検討を行った。本研究ではセメントは低熱ボルトランドセメントを使用し,SFの添加率はセメントの内割10,20%置換,砂結合材比1.0水結合材比(W/B)は15,22,30%として実験検討を行った。実験結果より以下のことが明らかとなった。セメント鉱物であるエーライト(C_3S)の水和反応率は,SFの置換率に拘わらず材齢7日でW/Bが15%で約60%,20%で約70%,30%で約80%に達しそれ以降の水和は停滞した。一方,ビーライト(C_2S)の水和反応率はSF添加率が10%から20%へ増加すると反応が若干抑制され,W/Bが1530%の範囲では反応率に大きな差異は認められなかった。一例としてW/Bが22%,SF添加率が10%の場合,材齢7日で約1015%,材齢28日で約2030%,91日で約3540%となった。生成されるC-S-H量は,SF添加率の増加により若干増加が認められ,W/Bの低下により減少した。C-S-Hのケイ酸アニオンの鎖長は、W/Bの増加により増加しSFの増加により抑制された。
一括補償型アクティブフィルタの高調波補償性能の向上と自律分散制御の提案

電源側電流検出のアクティブフィルタにより高調波補償を行う場合において,特に問題となるのは高調波除去用のLCフィルタが並列接続された時に発生する反共振現象である。電源電流検出方式で多く利用される比例制御によりアクティブフィルタを動作させた場合に,アクティブフィルタの動作によりアクティブフィルタ・LCフィルタ及び系統間に反共振が発生する。この反共振問題は,高調波拡大現象と呼ばれる,高調波が系統上でアクティブフィルタ設置以前より増加してしまう現象の一因となる。本研究では,電源側電流検出形アクティブフィルタとLCフィルタ並列接続時の反共振現象による高調波拡大現象について理論解析を行い,比例制御では反共振周波数が変化し,その周波数において高調波が増大する可能性があることを明らかにした。さらに,その問題を解決する一方式として外乱オブザーバを用いたアクティブフィルタの制御方式について研究を行った。外乱オブザーバによる制御は,高調波発生源の電流を推定し,補償するように制御する方式で,個別負荷電流検出方式と等価な動作をするため,反共振の影響を受けず良好に高調波補償を行うことができ,その結果,電源電流検出形アクティブフィルタによって発生する反共振による高調波拡大を抑制でき,かつ,他の高調波成分に対しても大きな補償効果を持つ。本研究では外乱オブザーバを適用したアクティブフィルタの制御方式についての理論と,その効果について検証し,提案する制御により,反共振による高調波拡大現象を抑制し,高調波補償性能が向上することをシミュレーションと三相の系統モデルによる実験の両面から確認し,その有効性を明らかにした。さらに外乱オブザーバのノミナル値の誤差によるロバスト性について検討し,ノミナル値の共振周波数に関わるパラメータの誤差によっては不安定になることを確認した。この問題を回避する対策として外乱オブザーバに改良を加え,それにより外乱オブザーバのロバスト安定性及び,高調波補償性能がさらに向上することを明らかにした。これらの結果により,提案するアクティブフィルタが自律分散的に安定動作し,かつ高い補償性能が得られることが確認された。
免疫抑制的腫瘍微小環境を打破する遺伝子導入Tリンパ球の開発とその機能解析

腫瘍細胞が免疫細胞から逃れるために腫瘍細胞上に発現していると考えられるPD-L1という分子に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとにPD-L1に結合する単鎖抗体を作成し、細胞内ドメインとしてCD28/4-1BB/その両方をもつ分子をつないだ新規の分子を作成した。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、抗原ときちんと結合することが分かった。これをTリンパ球に遺伝子導入し、その働きを試験管内およびマウス生体内で検討した。一方でT細胞が活性化後に発現し、自己に対して抑制的に働くとされるCTLA-4という分子をノックアウトする試みを行った。PD-L1に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとに単鎖抗体可変領域をデザインし、細胞内ドメインとしてCD28/41BB/その両方をもつ分子を作成した。これらをレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った。In vitro/in vivoにおける効果を今後検討していく。Tリンパ球においてCTLA-4をKOするため、当初レンチウイルスベースのシステムの開発を試みたが、遺伝子導入時の細胞傷害性が強く発現しうまくいかなかった。そこでCas9 proteinsystemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。現在CTLA-4 KOが可能であることを示すため、Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討している。作成されたCTLA-4 KO/CD19CAR-Tリンパ球あるいはCTLA-4 KO/TCR遺伝子導入Tリンパ球を用いて、in vitroおよびin vivoにおいてこれら細胞のCTLA-4 KOの効果を今後検討する。目的とする分子の作成は可能であった。今後CSRの機能解析を行うためには、TCRあるいはCARと共発現させたうえで、細胞刺激を行い、その上でシグナルを検討する必要がある。そのため現在CARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系を作成している。CTLA-4 KOはCas9 proteinsystemを用いて行うことによって可能であった。現在遺伝子KOの効率を検討している。遺伝子導入効率としては、CTLA-4発現のフローサイトメトリーによる検討の他に、遺伝子の切断を分子学的に検討する。PD-L1に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとに単鎖抗体可変領域をデザインし、細胞内ドメインとしてCD28/4-1BB/その両方をもつ分子を作成した。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、PD-L1ときちんと結合することが分かった。PD-L1chimeric antigen receptorを作成し、Tリンパ球に遺伝子導入し、PD-L1を発現する標的細胞に対する細胞傷害活性を確認したところ、良好な細胞傷害活性が確認出来た。その後、CD19CAR-Tをモデルとして用いて、PD-L1-CSRを遺伝子導入し、in vitroにおける効果の検討を試みたが、二つの分子を遺伝子導入することがなかなか出来なかった。現在、単一のウイルスベクターによって二つの遺伝子が導入可能なように工夫したウイルスベクターを作成中である。ヒト・プライマリー・Tリンパ球においてCTLA-4をKOするため、Cas9 proteinsystemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討したところ、CTLA-4発現は低下していることが確認出来た。CTLA-4 KO/CD19CARTリンパ球を作成するため、細胞作成の手順を検証している。CD19CARとCTLA-4 KOをどのタイミングで行うのが最も効率が良いのかについて検討を進めている。CSRの機能解析を行うためにCARと共発現させたうえで、細胞刺激を行い、その上でシグナルを検討する必要がある。そのためCARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系の作成を試みたが、2回の遺伝子導入を行うことは困難であった。そのため現在一回の遺伝子導入で両方を遺伝子導入出来る系を確立しようとしている。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、PD-L1抗原ときちんと結合することが分かった。CD19CAR-Tをモデルとして用いて、健常人の末梢血由来のリンパ球にPD-L1-CSRを遺伝子導入し、in vitroにおける効果を検討した。PD-L1-CSRを遺伝子導入すると、PD-L1を持つ標的細胞で刺激をした場合のみ、刺激後の増殖が改善することがわかった。一方でPD-L1発現のない標的細胞で刺激をしても、そういった効果は確認されなかった。PD-L1発現のある腫瘍細胞株に対する反応を検討したが、細胞傷害活性には変化はなかった。サイトカイン産生はPD-L1-CSRを発現しているCTLで改善する傾向が見られた。PD-L1-CSRを発現したCTLはPD-L1発現のある細胞株との共培養において、刺激後増殖が増強することが観察された。これらの結果を検証するため、ヒトの腫瘍細胞株を移植したマウスにおける動物実験を計画している。健常人の末梢血由来Tリンパ球においてCTLA-4をKOするため、Cas9 proteinsystemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。

Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討したところ、CTLA-4発現は低下していることが確認出来た。CTLA-4 KO/CD19CARTリンパ球を作成するため、細胞作成の手順を検証し、CTLA-4 KOリンパ球を作成することは出来ることがわかった。腫瘍細胞が免疫細胞から逃れるために腫瘍細胞上に発現していると考えられるPD-L1という分子に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとにPD-L1に結合する単鎖抗体を作成し、細胞内ドメインとしてCD28/4-1BB/その両方をもつ分子をつないだ新規の分子を作成した。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、抗原ときちんと結合することが分かった。これをTリンパ球に遺伝子導入し、その働きを試験管内およびマウス生体内で検討した。一方でT細胞が活性化後に発現し、自己に対して抑制的に働くとされるCTLA-4という分子をノックアウトする試みを行った。CARとの共発現の系で検討を進める予定としているが、CAR→CSRの順に遺伝子導入し、効率よく純化するために、これまで用いてきたEGFRの遺伝子マーカーに加えて、もう一種類CD20を遺伝子マーカーとして用意するために準備を進めている。CD20とEGFRの2つの遺伝子導入マーカーを用いて順に純化することによって、高い効率でCAR/CSRの両方が遺伝子導入された細胞を得ることが出来る。あるいはどれだけ遺伝子導入されているか明らかになった細胞で実験を進めることが出来る。標的細胞としてもともとPD-L1陰性の細胞株にPD-L1を遺伝子導入して準備する。これを用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。現在行っている実験において遺伝子KO効率が十分高いことが分かれば、その上でそれらの細胞を用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。具体的には繰り返し刺激後の反応の減弱の有無について検討する。CARとの共発現の系で検討を進める予定としている。CARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系の作成を試みたが、2回の遺伝子導入を行うことは困難であった。そのため現在一回の遺伝子導入で両方を遺伝子導入出来る系を確立しようとしている。標的細胞としてもともとPrimary Mediastinal Large B-cellリンパ腫の細胞株が恒常的にPD-L1を発現し手いると報告されているため、これを入手してin vitro/ in vivoの実験を進める。現在行っている実験において細胞調製の手順が決定されれば、その上でそれらの細胞を用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。
ヒューマン・エラーを考慮した 防火・防煙システムの冗長設計と信頼性に関する研究

船舶火災が発生した場合に、避難や消火活動の時間を確保するためには、煙拡散の状態を把握して煙制御のための防排煙装置を設ける必要がある。また火災区画から他区画への火災伝播が起こらないように、火災伝播の現象解析に基づき抑止効果のある防火構造および消火装置を設けなければならない。さらに、これらは防火・防煙システムとしての極めて高い信頼性が要求される。最近の混乗船の増加傾向に伴う船員の質の低下により、これらの防火・防煙システムにおける誤判断、誤操作などのヒューマン・エラーに起因する重大な火災事故の発生も懸念される。このため、誤判断、誤操作が起こり難い防火・防煙システムの構築が、適切な行動基準(SOP)の策定とともに、不可欠であり、ある程度の過誤までは許容できる冗長性のあるシステム設計を行う必要がある。このため本研究では、まず火災伝播および煙拡散の現象解析の既存の研究と新規に行う研究の成果に基づき、火災発生時の時系列的シナリオをもとに防火・防煙システムを構築した。次にこのシステムを対象に人的因子による過誤と防火、消火、防排煙装置の故障発生確率を類推し、これをもとにFTA(故障の木遡及解析)手法によりシステムの信頼性解析を行った。この結果に基づき、頂上事象の生起確率を低下させるための設計要因の抽質と許容限界を求め、冗長性のある防火・防煙システムの構築を図るための基礎とした。船舶火災が発生した場合に,避難や消火活動の時間を確保するためには,煙拡散の状態を把握して煙制御のための防排煙装置を設ける必要があり,これらは防火・防煙システムとしての極めて高い信頼性が要求される。最近の混乗船の増加傾向に伴う船員の質の低下により,ヒューマン・エラーに起因する重大な火災事故の発生も懸念される。このため,誤判断,誤操作が起こり難い防火・防煙システムの構築が,行動基準(SOP)の策定とともに,冗長性のあるシステム設計を行う必要がある。本研究では,火災伝播および煙拡散の現象解析の既存の研究成果に基づき,火災発生時の時系列的シナリオをもとに防火・防煙システムを構築した。次にこのシステムを対象に人的因子による過誤と防火・消火・防排煙装置の故障発生確率を類推し,これらをもとにFTA(故障の木遡及解析)手法によりシステムの信頼性解析を行った。一般に事故に繋がる基本事象の生起確率は極めて小さくあいまいなものであり,それらを用いて頂上事象の発生頻度を算出しても実際的な信頼度を表わすものとしての意義は疑しい。このため,防火・防煙システムの担当者に対して防火演習時の人的過誤に関する聞き取り調査を行い,これに基づき事故の生起確率を推定する方法が必要となり,ファジィ理論を応用した推定方法を確立した。また,人的過誤に伴う事象の生起に含まれる不可測性を考慮するため,事象生起の事象シーケンス集合を定めて,ファジィ測度を用いて頂上事象生起の確信度を算定する方法を提案した。なお,これらの方法については日本造船学会への論文発表を行った。また火災区画から他区画への火災伝播が起こらないように、火災伝播の現象解析に基づき抑止効果のある防火構造および消化装置を設けなければならない。

次にこのシステムを対象に人的因子による過誤と防火、消火、防排煙装置の故障発生確率を類推し、これをもとにFTA(故障の木遡及解析)手法によりシステムの信頼性解析を行った。この結果に基づき、頂上事象の生起確率を低下させるための設計要因の抽質と許容限界を求め、冗長性のある防火・防煙システムの構築を図るための基礎とした。
英語の統語的融合体の理論的・実証的研究

最後に、『<不思議>に満ちたことばの世界(下)』(高見健一他(編)、開拓社)で「WH融合体」( p.126-130)の特異性について平易に分かりやすく解説した。統語論年度末に、英語論文の添削を業者(Enago)に依頼したが、当初の予定よりも論文の語数が少なく済んだために予算が残ってしまった。残額は、生成文法関係の書籍の購入にあてる予定である。
後方散乱分光法による高温超伝導薄膜の組成分析法の高速化および基板界面反応の制御

1.本研究の目的本研究の目的はHeイオンを用いたラザフォ-ド後方散乱法(RBS)によりBa-Cu-O薄膜と種々の基板との相互拡散および界面反応を調べ、さらに、薄膜と基板との間のバッファ-層の相互拡散および界面反応に及ぼす効果を明らかにすることである。2.実験方法Y-Ba-Cu-O焼結材をタ-ゲットとする高周波マグネトロンスパッタ装置を用いて、反応性スパッタ法により厚さ2000A程度のY-Ba-Cu-O薄膜を作製した。基板にはサファイア、Si、MgO単結晶および石英を用いた。酸素雰囲気中で870-1220Kの温度範囲でアニ-ルを行なつた。RBSはダイナミトロン加速器からの2.7MeVのHeイオンビ-を用いて、また、X線ディフラクトメ-タ-を用いて薄膜の構造を調べた。3.実験結果および考察得られた結果および考察をまとめると、次の通りである。(1)874-1226Kの温度範囲において、基板中へのCu拡散係数およびYBa_2Cu_3Ox薄膜中への基板元素の拡散係数を測定した。(2)YBa_2Cu_3Ox薄膜中の元素で、Cuが最も速く基板中に拡散する。(3)アニ-ル中にBaは薄膜表面付近から蒸発する。(4)Y-Ba-Cu-O薄膜中のCuとSi基板とは、顕著な界面反応を起こし、界面に銅シリサイドを形成する。(5)Si基板上に蒸着したHf、Zrあるいは、それらの酸化物層は良いバッファ-層となることを確認した。
環境騒音の物理的対策と心理的評価の統合に関する研究

1.人間の心理的応答の程度を表現する場合、言語表現に頼る場合が多いが、これには不可避的にあいまい性が付随している。帯域制限白色雑音のランダム振幅変調音を被験者に提示し、それに対する“騒々しさ"に関する心理的印象を調査した結果、同じ音圧レベル値の騒音刺激に対しても様々な異なる心理的応答が得られた。即ち、人間の感覚的応答には非画一的で再現性の保証されないあいまいさが含まれていることが確認された。心理的応答は騒音刺激がもつ周波数特性にも依存していることが分かった2.上記の騒音刺激-心理的応答の入出力関係をファジィ理論におけるメンバシップ関数を用いて表現すれば有効であることが明らかとなった。3.各帯域制限白色雑音の音響刺激ごとにカテゴリー化された心理的印象のメンバシップ関数を一旦作成しておけば、任意のパワースペクトル形状を有する騒音に対してもそのメンバシップ関数を推定することができる。4.騒音に対する人間の心理的応答は上記のカテゴリー化された心理的印象の出現時間率で捉えるのが合理的であることが分かった。この場合、考察対象である騒音の周波数特性はメンバシップ関数の形状に反映させ、振幅特性はレベル確率分布の形状に反映させることによって系統的に心理的応答を予測できることが確認できた。5.騒音対策の具体例として遮音塀を新たに設置した場合に着目し、遮音塀の設置前後において心理的応答がどのように変化するかを予測して実測データと比較した結果、両者のほぼ良い一致が認められた。即ち、物理的な騒音対策手法の立案段階で心理的応答の事前予測が可能となった。
細菌の細胞外分泌型氷核活性蛋白質の分子クローニングと構造解析

Erwinia uredovoraは小幡らによりイチゴの葉より単離された氷核活性細菌である。この氷核細菌は氷核物質を菌体外に放出する点が既知の氷核細菌とは異なっていた。そこでこの氷核細菌の氷核蛋白質をコードする遺伝子のクローニング及び全塩基配列の決定をした。Erwinia uredovoraゲノムDNAをフェノール法により抽出し、制限酵素Sau3AIにより部分消化した。ファージベクターλEMBL3へ導入しゲノムライブラリーを得た。プローブ作製のため、既に単離・解析されているErwinia ananasの氷核蛋白質の遺伝子であるinaAのNドメイン・Cドメイン領域の配列をもとに、センス・アンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマー(40mer)をそれぞれ合成し、Erwinia uredovoraゲノムDNAを鋳型にPCRによりフラグメントを作製した。これをプローブとして先のゲノムライブラリーをスクリーニングした結果、全長をコードすると思われるλinaU22クローンを得た。このクローンをプラスミドベクターpUC18へサブクローニングし大腸菌に組み込んだところ、その大腸菌は強い氷核活性(T_<50>=-4.5°C)を示し、λina22が氷核蛋白質をコードする遺伝子であることが判明し、この遺伝子をinaUと命名した。そこで全塩基配列の解析をジデオキシターミネーター法により行った。その結果、inaUは3102塩基よりなり、推定されるアミノ酸は1034個であった。氷核細菌に共通に見られるRドメインの繰り返し配列をはじめNドメイン・Cドメインを有し既知の氷核蛋白質と非常に相同性が高いことが明らかとなった。しかしRドメインのアミノ酸残基数は832個と、解析された氷核蛋白質の中で最小であった。
子どもの生活習慣と体温調節機能の発達に関する研究ー熱中症予防の観点からの提案ー

本研究は日本における子どもの熱中症予防対策としての熱中症予防指針を作成するために行った。3年間の研究調査から、以下の2点に焦点を絞って成果が認められた。(1)子どもの夏の遊びやスポーツ活動の時間帯について、過去から気温が高い熱帯地域(沖縄,台湾)では昼の時間帯の子どもの遊びやスポーツ活動が実施されていな傾向を示したことから、気温が最も高くなる時間帯の外遊びやスポーツ活動を避けることの必要性が示された。(2)生活習慣として、スポーツ習慣者は春から夏にかけての発汗機能の向上、即ち暑熱順化が成されているが、非習慣者はこの順化が進みにくいことを示したことから、運動習慣の熱中症予防の効果が示唆された。本研究調査は子どものスポーツ活動時の熱中症予防のために、どのような時間帯にスポーツを行うべきか?また、どのような生活習慣を持つことが熱中症リスク低減させるのかを明らかにすることを目的として計画され、25年度の実施状況は以下のようである。先ず、昨年度に引き続き夏季子どものスポーツ活動時間帯に関する調査を継続して行った。特に今年度は少年サッカーや少年野球の団体指導者を対象として、関東圏、九州沖縄地域を中心に調査した。その結果は、昨年各地域の小学校に依頼し、小学生を中心に実施した子どもへの調査結果と同様に関東地域と九州・沖縄地域間の差はあまり認められなかったが、サッカーと野球の種目特性により違いがみられる傾向を明らかにした。現在、台湾の少年サッカーや少年野球の指導者に対して同様の調査を実施する計画中である。生活習慣からみた熱中症予防リスクの低減を検討するために、温熱負荷時の発汗反応に及ぼす季節変化と生活習慣との関係性に関する調査の室内実験を実施した。大学生の調査から、日常の運動習慣が夏季の発汗機能の亢進に強く影響を及ぼしており、かつ非運動習慣者においては日常の冷房の嗜好性が影響する傾向を示した。このことについては、すでに25年度内に雑誌「発汗学」に一部データを掲載した。以上の実績状況をもとに、25年度末(2月)よりこれらのデーター数を増加させより明らかにすること、小学生(高学年)を中心に、運動習慣による発汗機能の季節変化が大学生の結果と同様なのかを調査は始めており、この夏の9月には室内実験はすべて終了する予定である。本研究は発育期の子どもの熱中症予防を目的に、どのような生活習慣を持つことが熱中症予防につながるのか、また熱帯化している日本の状況から、亜熱帯地域の熱中症予防に関する情報を集め、日本の今後の対策に生かすことを目指して実施した。24年度は、次の研究調査を実施した。1.生活習慣と発汗機能の調査:男子大学生を対象に、1年を通じての熱ストレス時の発汗量の変化を測定した。その結果、運動習慣群(8名)および非運動習慣群(9名)において、発汗量は1年を通じて運動習慣群>非運動習慣群であり、特に7月から9月にかけての変化が非運動群において小さいことが示された。また非運動習慣群において、冷房の嗜好度が強く発汗機能の変化(季節順化)に影響し、運動習慣がなく冷房に頼った生活をしている場合、暑さに対する耐性能力が低く、熱中症になりやすいことが示された。2.日本国内及び台湾における夏季外遊び調査:国内(神奈川県、沖縄県)及び台湾(台北市)の小学生、中学生を対象に夏の外遊びあるいはスポーツ活動に関するアンケート調査を実施した。この調査の主なねらいは、従来から気温の高い地域において、習慣的に子供たちはどのような活動を行っているのかを明らかにすることにある。現状の分析結果では、台湾及び沖縄地域においては、夏季のスポーツ活動は最も気温の高い昼の時間帯を避ける傾向がみられている。今後はさらに調査範囲を広げ、どのような時間帯で活動を行うべきかなどを示せるようにと考えている。3.水分補給温度に関する研究:水分の補給は熱中症の予防に不可欠の要因であり、どのような温度の水分を補給することが最適なのかを明らかにするため、24年度は補給水温と飲水量との関係を調査した。0°C、10度、22°Cの補給水を飲水させた時、補給飲水量は、10°C>0°C>22°Cであり、特に22°Cの補給時には脱水が進行する可能性が示唆された。26年度は研究の最終年度として、以下の実験調査及び3年間のまとめを行った。実験調査としては、過去2年間で実施できなかった子どもの発汗機能の生活習慣、スポーツ種目及び季節変動に関して、小学生を対象に実施した。

一定温熱刺激時の発汗量を体重変化より春季及び夏季の2階層検定を行い、その結果、発汗量の季節差は、サッカークラブ所属の子どもたちは顕著に夏季増加を示したが、水泳クラブ所属群及び非運動習慣群は春季と比して発汗量増加は見られなかった。この結果は、昨年度までに実施した成人の結果を反映するとともに、新しい発汗反応の季節変化の知見を示すものであった。すなわち、運動習慣群は非運動習慣群よりも春季から夏季における発汗量の増大は大きいことが成人調査から明らかにされ、サッカークラブの子どもにおいて同様の傾向が示されたが、成人で調査対象としなかった水泳運動習慣群で下記の発汗量の増加がみられなかったことは、発汗量の季節変動にスポーツ種目差が存在する可能性を示唆するもので、新しい知見ととらえられる。今後、成人においてこの発汗反応の季節変動に関するスポーツ種目差について新たに調査を計画したいと考えている。24年度から実施してきた調査研究のまとめとして、「発汗量の季節差」と「夏季運動時刻に関する調査」の結果を、学会発表および研究論文としてまとめた。今後は、さらに、これらの成果を一般に広めることを目的として、熱中症予防に関する講演活動を行う予定である。環境生理学当初の計画では子どもの発汗機能に関する調査を25年度内に実施終了予定であったが、大学生を対象とした調査が延びてしまったため、25年度内に終了できなかった。すでに26年2月より子どもの調査はスタートしているため、予定より半年遅れの26年9月にはすべての実験が終了する予定である。24年度の計画では、夏季の生活に関わる調査として、国内アンケート調査、生活暴露温度調査を計画し、国内アンケートは実施でき、さらには台湾の一部地域の調査も実施できた、しかし生活暴露調査に関してはその準備段階にとどまった。また、実験室内の調査においては、発汗機能の測定実験は予定通り終わることができた。以上より、24年度の自己評価としては、ほぼ予定通りの進展と評価した。26年度は研究の最終年度となる。研究実績の概要でも記述したように、次の2つの項目について実施する。(1)台湾における少年スポーツクラブ(主にサッカー、野球)の指導者に対する活動時間帯の調査を行い、日本との比較を行う。すでに、小学生個別の調査では、日本国内よりも台湾で小学生のほうが、スポーツや外遊びの時間帯について、なるべく気温が高い昼間の時間帯には実施しない傾向を示したので、同様の傾向がみられるのか明らかにする。もし、予想された結果となった場合は、国内のスポーツ活動に関する熱中症予防のための時間に対する配慮について、示したい。(2)子どもの生活習慣と発汗機能の変化について、すでに春の測定は済んでおり、8,9月の調査を実施し、子供の熱中症予防としてどのような生活習慣を持つべきか明らかにする。24年度の進行状況をふまえ、次年度以降の研究については以下のように考えている。1.夏季の生活に関わる調査:アンケート調査については、さらに国内外の調査地域数を増やす。生活暴露温度調査に関しては、小学生から大学生までの調査を実施し、どのような温度環境の中で生活しているのかを明らかにする。また、この調査に関しては可能であれば、台湾においても実施したいと考えている。2.室内実験調査:24年度は大学生で実施した発汗機能の測定を小学生を対象に実施する。測定目標数は運動習慣群、非運動習慣群各5名以上とする。以上の調査及び実験測定から、夏季の子どもの熱中症予防に関する、生活・運動指針を羅谷作成し、提案する。25年度の調査報告のための旅費や被験者への謝金などが予定より実施が遅れ少なかったため、26年度に残された。
ポストゲノミクスを基盤としたペルオキシソーム分裂装置の構造と分子機構の解明

本研究に置いて、我々はペルオキシソーム分裂装置(POD machinery)の主要構造であるDB ringのsemi-in vivo再構築系を開発し、ringの形成起点Dynamin-based ring organizing center (DOC)を同定することに成功した。mCherry-tagged Dnm1の細胞内局在解析によって、新規合成されたGTP結合型のDnm1が細胞質からDB ring上に局在化することが分かった。GTP結合型Dnm1はDB ring上に一ヵ所存在するDOCを起点としてGTP濃度依存的に一方向へ伸長した。従ってDB ringは微小管同様に方向性を持つ構造であることが予測される。興味深いことにDOCは直径500nm未満、すなわち膜分断の最終段階においてはDB ring上に二箇所形成されることが分かった。各DOCからはそれぞれ独立したDB ringが形成されていることから、包膜の分断においてはより強い収縮力を発揮するため二重構造のDB ringが必要である可能性が考えられる。この仮説は、in vivoにおいて高電子密度のリング幅が増加すること、in vitroにおいてDnm1-ringの脂質膜へ接触面の増加がより顕著な脂質膜の変形を引き起こすという過去の研究結果と一致している。以上の結果をまとめ、Journal of Cell science誌に発表し当該号のHighlight articleに選ばれた。また、ミトコンドリア分裂装置上においてもDOC様構造の存在が強く示唆されているため(投稿準備中)、本研究で同定されたDOCは普遍性を持つ構造であると考えられる。この成果に加え、プロテオーム解析を基盤とした手法によってPOD machineryの構成タンパク質同定にも成功しており、装置の形成機構、分子構造の解明に大きな進展を得られている。28年度が最終年度であるため、記入しない。ペルオキシソームは脂質代謝と活性酸素分解を担う、全真核生物の生存に必須な単膜系オルガネラである。ペルオキシソームは分裂によって増殖し、その異常は神経性疾患など重篤な表現型を示すことが知られている。これまでに我々は、モデル真核生物シゾン使って、直径500 nmのリング構造の分裂装置Peroxisome-dividing (POD) machineryの収縮により、ペルオキシソーム分裂面の形成と膜の分断が行われることを明らかにしてきた。しかし、POD machineryの真核生物界における構造の普遍性と、収縮機構は全く明らかになっていない。1)に関しては、CHO細胞より分裂期のペルオキシソーム、さらにはミトコンドリアを形態学的に無傷に単離分画することに成功した。この画分を両性イオン性界面活性剤で処理することで、直径500 nmのリング構造を蛍光顕微鏡レベルで見出し、哺乳動物にも分裂リングが存在する可能性を示唆した。2)に関しては、POD machinery及びミトコンドリア分裂装置(MD machinery)からDnm1 richな画分を精製する方法を開発した。この画分を質量分析(LC-MS/MS)によって解析し、数種類のGTPaseDnm1結合タンパク質候補遺伝子を同定した。さらにこの中から、POD・MD machineryの収縮に重要な新規分裂因子Mitofuelin1 (MIF1)を同定することに成功した。シゾンと哺乳動物培養細胞で詳細な機能解析を行い、現在論文投稿準備中である。本年度は、昨年度に引き続き1)装置の形成機構、2)装置の収縮機構の2点について解析を行ってきた。1)装置の形成機構2)装置の収縮機構昨年度行ったPOD ring収縮因子候補遺伝子の探索により候補遺伝子MIF1を得ている。MIF1は核酸代謝ドメインを持つ15kDaのタンパク質であり、その酵素活性を調べるためESI-MS/MS解析を行った。大腸菌から精製したMIF1タンパク質はATPとGDPの添加によりGTPを、ADPとGTPの添加によりGDPを生成することが分かった。MIF1の抗体を作製し、細胞内局在解析を行った結果、MIF1は間期には細胞質に局在し、M期ではミトコンドリア分裂面とペルオキシソーム分裂面に局在することが分かった。この局在は分裂装置に含まれていたDnm1と一致していることから、MIF1は分裂装置に収縮力のエネルギー源であるGTPを供給する機能があるのではないかと考えられる。1)に関しては、Semi-in vivoでPOD ringの主要構造であるDynamin-based (DB) ringを再構築する系を開発し、DB ringの形成起点を同定することに成功した。さらにDB ringが微小管のように形成起点から一定の方向にDnm1分子を重合することで伸長することを明らかにした。この機構はGTP濃度に依存していたが、GTP加水分解非依存的であった(論文投稿中)。2)に関しては、昨年度すでに新規分裂タンパク質を同定することに成功しており、本年度ではその機能解析を進めた。新規分裂タンパク質の酵素活性、抗体をもちいた局在解析をおこない、その結果POD ringとMD ringの収縮活性を促進する機能を持つことを明らかにすることが出来た。よって本年度の特別研究員の研究課題は期待以上の進展があったと言える。

GTP結合型Dnm1はDB ring上に一ヵ所存在するDOCを起点としてGTP濃度依存的に一方向へ伸長した。従ってDB ringは微小管同様に方向性を持つ構造であることが予測される。興味深いことにDOCは直径500nm未満、すなわち膜分断の最終段階においてはDB ring上に二箇所形成されることが分かった。各DOCからはそれぞれ独立したDB ringが形成されていることから、包膜の分断においてはより強い収縮力を発揮するため二重構造のDB ringが必要である可能性が考えられる。この仮説は、in vivoにおいて高電子密度のリング幅が増加すること、in vitroにおいてDnm1-ringの脂質膜へ接触面の増加がより顕著な脂質膜の変形を引き起こすという過去の研究結果と一致している。以上の結果をまとめ、Journal of Cell science誌に発表し当該号のHighlight articleに選ばれた。また、ミトコンドリア分裂装置上においてもDOC様構造の存在が強く示唆されているため(投稿準備中)、本研究で同定されたDOCは普遍性を持つ構造であると考えられる。この成果に加え、プロテオーム解析を基盤とした手法によってPOD machineryの構成タンパク質同定にも成功しており、装置の形成機構、分子構造の解明に大きな進展を得られている。CHO細胞を用いて、ペルオキシソームのみならず、分裂期のミトコンドリアの無傷単離に成功し、免疫蛍光顕微鏡レベルで単離したリングの観察に成功している。シゾンを用いた系では、LC MS/MSによってDnm1に結合する候補因子を絞り込み、さらにはこれらの中から新規分裂因子としてMIF1の同定・機能解析にまで進展させ、当初の計画以上に進展している。MIF1がATP、GDP依存的にGTPを生成する酵素であることは明らかになったが、細胞内における実際の機能は不明な点が多い。そこで、MIF1の酵素活性部位をアミノ酸置換によって非活性化したドミナントネガティブ変異体発現によって、GTP生成能がPOD machineryの形成・収縮に及ぼす影響を検証する。また、semi-in vivo assay for DB ring formationによってMIF1がDB ringの形成に及ぼす影響を、DB ringの伸長能、伸長速度の面など多角的な検討を加える。28年度が最終年度であるため、記入しない。1)哺乳動物細胞におけるペルオキシソーム分裂POD machineryの構造探索リング構造の単離は可能になったが、その微細構造は不明である。そこで、単離したリング画分を抗DLP1(ダイナミン様タンパク質)抗体と抗Mff(DLP1受容体)抗体を用いた免疫電子顕微鏡観察により微細構造を観察する。