hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人間の健康防御機構に及ぼす対人援助機能に関する総合研究

ストレス状況にある人間の心身の健康防御に対して、対人援助(ソーシャル・サポート)がどのように作用するかを4つの側面から捉え、対人援助機能の総合的な解明を行った。1)生理・免疫アプローチ:唾液分泌型IgAが、ストレスに対する生体の免疫反応性の指標として、他の生理的指標(瞬目率、心拍数)と同様に有効であることを確認した。即ち、騒音ストレス負荷実験において、ストレス負荷により分泌型IgA値は増加した。ついで、ソーシャル・サポートが分泌型IgAに影響を与えることが判明した。即ち、ストレス負荷(騒音と精神作業の負荷)時において、低いサポート資源の持ち主は、高いサポート資源の持ち主に比べ分泌型IgA値が有意に低かった。2)心理行動アプローチ:対人的状況要因(サポートの受け手の評価懸念や主体性)がストレス反応へのサポート効果にどのような影響を及ぼすかを実験的に検討した。まず、被験者に評価懸念をもたらさないやり方による友人サポート供与が、被験者の不安度を低減させることを明らかにした。ついで、サポートの受け手の主体性を尊重するやり方による友人サポート供与が、自律性を尊重しない押しつけ的な友人サポート供与に比べ、心理的、生理的不安反応を軽減させることを確認した。3)臨床心理アプローチ:初発手術で入院したがん患者の不安度は、家族や主治医・看護婦のサポートを知覚するほど低いことが見いだされた。さらに高不安のがん患者に対する医師・看護婦によるサポート介入(情緒的焦点、情報焦点)は、患者の心理的不安を軽減した。4)地域臨床アプローチ:地方都市在住の既婚女性のサポート・ネットワーク特性と健康感の関連を追跡調査した。知覚的ネットワーク指標が健康感に有効であることを確認した。ストレス状況にある人間の心身の健康防御に対して、対人援助(ソーシャル・サポート)がどのように作用するか4班に分かれて実験・調査を実施した。その結果(1)生理・免疫班:ストレス反応の免疫指標として、分泌型IgAが有効であることが確認できた。即ち、騒音ストレス負荷実験を行った結果、ストレス負荷により、分泌型IgA値は増加した。分泌型IgAが、実験場面におけるストレス反応の指標になりうることは一応確認できたが、ストレッサー消失後の回復過程までは十分確認することはできなかった。その点を次の実験で補強する必要がある。(2)心理・行動班:友人供与によるサポートと評価懸念の関連実験は、評価懸念をもたらさない友人サポートが被験者の不安度を低減させ、予測と一致した。(3)心理臨床班:国立がんセンターに初発手術で入院したがん患者の不安度(入院直後から退院直後までの6期継続調査)は、家族や主治医・看護婦からのサポートを知覚するほど低いことが見いだされた。不安とサポートの関連は、肺がん患者については予測通り負の相関が見られたが、胃がん患者については見られなかった。また肺がん患者の相関も時期によってバラツキがあり、時期、サポート源、および介入法について次年度の検討課題とする。(4)地域臨床班:平成5年10月に、岡山市の主婦700人を対象に面接調査を実施し、398票を回収した。サポートネットワーク特性でネットワークサイズが大きい方が精神的健康度(生活満足度)が高いことが明らかとなった。ストレス状況にある人間の心理の健康防御に対して、対人援助(ソーシャル・サポート)がどのような過程を通じて作用するかを4つの側面からとらえ、対人援助機能の総合的な解明を行った。研究は次の4班に分かれて実施し、班相互の有機的な関係(ミクロとマクロ)について討議しながら、逐次、研究代表者が各班の研究過程に介在し、相互の関係調査を行った。(1)生理・免疫班サポートの免疫能IgAへの効果を実験的に確認した。(1)被験者:健常者男女各20名。(2)ストレス負荷:12時間にわたる騒音条件下で精神作業を負荷した。

(3)測度:負荷の前後の唾液分泌型IgA値、分泌量、瞬目率ならびに心拍率を測定した。採取した唾液成分の分析は、検査機関へ委託した。ほかの生理指標は、現有の生体ポリグラフで測定した。(2)心理・行動班友人によるサポートの与え方とサポート種類が及ぼす心理・行動ストレインへの効果を確認した。被験者:大学生60名。(2)要因計画:2(友人サポートの種類)×2(受け手の自律性の高低)。(3)測度:認知的干渉・不安度・課題遂行量。(3)心理臨床研究班医療従事者によるサポートの計画的介入効果の検討を行った。(1)被験者:高不安がん患者を対象。(2)介入実験:平成5年度の結果をもとに、医療従事者(医師・看護婦)によるサポート介入(情緒的焦点/情報焦点)を行い、不安軽減効果を確認した。(3)測度:心理的不安度。(4)地域臨床研究班住民の援助ネットワーク特性と健康感の関連の追跡調査。平成5年に得た資料を対象に、健康指標について追跡調査をし、援助ネットワーク特性と健康感、生活満足、ストレス耐性との関連を時系列分析し、知覚的ネットワーク指標が健康感等に有効であることを確認した。(5)4つの班の研究成果をまとめ、研究成果報告書の作成を行った。
メタロイド・クラスターの電子状態と固体中での機能

ホウ素やケイ素などのメタロイド元素は,結晶中でダイマー,鎖状,層状などのクラスターを形成することは古くから知られている。とくにホウ素の場合は,共有結合半径が80pmと小さいためユニークな原子配列をとり,これに基づいた特徴的な機能が発現する。例えばBが層状となるMgB_2,AlB_2,TiB_2などは固くて高融点であり,電気伝導度は単体金属よりも高い。類似の複雑な化合物であるLaNiBC化合物は最近高温超伝導を示すことが報告された。高い3次元構造を持つものには,CaB_6,LaB_6のように正八面体ホウ素クラスターB_6と金属元素が塩化セシウム型構造を持ったものや,YB_<12>やAlB_<12>のように正20面体ホウ素クラスターB_<12>と金属元素が岩塩型構造を持ったものがあり,LaB_6の熱電子放出特性はすでに実用化されている。このような多彩な性質にかかわらず,いままでに定量的な議論が可能となるような電子状態計算は一部の代表的な化合物を除いてはほとんど行われてこなかった。その最大の理由は,これらの化合物の持つ複雑な結晶構造にある。端単位格子中に数10個の原子を含む結晶の制度の高いバンド計算はそれ自身多大な計算量を要求するものであるし,最密充填構造を持たないこれらの化合物の近似計算には,常に系統的な誤謬がつきまとう。本研究では平成10年度より2年間,主に理論計算に基づいて,その電子状態と化学結合状態を系統的に明らかにし,機能発現の起源についての議論を行った。主として採用した手法は原子数100個程度のモデルクラスターを用いたDV-X_α法分子軌道計算法である。ホウ素やケイ素などのメタロイド元素は,結晶中でダイマー,鎖状,層状などのクラスターを形成することは古くから知られており興味深いが,いままでに定量的な議論が可能となるような電子状態計算は,一部の代表的な化合物を除いてはほとんど行われてこなかった.本研究では原子数100個程度のモデルクラスターを構築して第一原理分子軌道計算法を行い,まず第一にその電子状態と化学結合状態を系統的に明らかにし,データベース化する.次に,そのデータベースをもとに,望みの特性を最適化するための組成や構造を選び出す.本年度は,金属とメタロイドが1:1や1:2のような単純組成の化合物について,系統的な電子構造計算をおこない,結果をデータベース化した.とくに単位格子中に数10個の原子を含み,最密充填構造を持たない結晶については,従来の報告に系統的な誤謬があり,これを重点的に調べた.実験結果と,熱力学的諸値,分光学的データなどとの対応を系統的に調査した.その結果,炭化物や窒化物,酸化物とは異なり,ホウ化物ではホウ素間のBond overlappopulationで代表される共有結合が強く,その構造を支配していることが定量的に理解することができた.理論計算は,DV-Xα法による第一原理分子軌道計算を原子数100前後のモデルクラスターについて,本予算で購入したスーパーパーソナルコンピュータによって挙行した.これは特に本研究のために選んだ高速・大容量のものである.また並列計算を将来的に実行するための模擬システムも構築途上にある.ホウ素やケイ素などのメタロイド元素は,結晶中でダイマー,鎖状,層状などのクラスターを形成することは古くから知られている。

例えばBが層状となるMgB_2,AIB_2,TiB_2などは固くて高融点であり,電気伝導度は単体金属よりも高い。類似の複雑な化合物であるLaNiBC化合物は最近高温超伝導を示すことが報告された。高い3次元構造を持つものには,CaB_6,LaB_6のように正八面体ホウ素クラスターB_6と金属元素が塩化セシウム型構造を持ったものや,YB_<12>やAIB_<12>のように正20面体ホウ素クラスターB_<12>と金属元素が岩塩型構造を持ったものがあり,LaB_6の熱電子放出特性はすでに実用化されている。このような多彩な性質にかかわらず,いままでに定量的な議論が可能となるような電子状態計算は一部の代表的な化合物を除いてはほとんど行われてこなかった。その最大の理由は,これらの化合物の持つ複雑な結晶構造にある。端単位格子中に数10個の原子を含む結晶の制度の高いバンド計算はそれ自身多大な計算量を要求するものであるし,最密充填構造を持たないこれらの化合物の近似計算には,常に系統的な誤謬がつきまとう。本研究では平成10年度より2年間,主に理論計算に基づいて,その電子状態と化学結合状態を系統的に明らかにし,機能発現の起源についての議論を行った。主として採用した手法は原子数100個程度のモデルクラスターを用いたDV-Xα法分子軌道計算法である。
空き家と二次的依存解消に向けた問題解決型集住の提案

本研究は、ひとり親世帯の逼迫した住生活問題が空き家活用型と育児・家事分担型の集住によって大きく緩和されるのではないかというスタンスに立ち、我が国において成立しうるひとり親向け「問題解決型」の成立に向けて、その実態把握を行った。具体的には、問題解決型集住の実態を把握するために、全国30カ所の母子シェアハウス(SH)事業者への聞き取り調査を実施した。その内容は運営の実態として1運営母体、2シェアハウス開設の背景、3ハードの取得方法と概要、4家賃額とターゲット、5共益費額と内訳、6集客方法、7NPO等との連携体制の有無、8ケアサービスの有無と採算性、9定員数と設定理由、10入居世帯の類型(母子のみ、あるいは、その他の世帯との混合)とその設定理由ほかを訪ねた。開設後の課題等については、運営者が抱える課題をランダムに回答してもらったほか、3カ所のSHにおいて入居者計10名への聞き取り調査、1カ所のSHにおいて10名を対象に入居時相談を行った。その結果、運営主体は不動産関連企業が多く、居室の規模は最小では7.4m2、最大で34.7m2最大である。最低家賃は3.5万円、最高では10万7千円と幅広く、何らかの生活サービスを提供しているという回答は約6割を占めた。ほとんどが条件により無職でも入居できる物件である。以上より、母子SHは地域的な偏在はあるものの、住宅に困窮する母子世帯の住まいの受け皿となる可能性は充分にあると考えられる。家賃額も幅広く、低所得階層のみならず、幅広い階層に対応しうる点も興味深い。課題は1集客の困難、2人間関係のトラブル等の解決に手間がかかる、更には3DV等入居者が抱える課題解決への知識がなく対応が困難などの意見も聞かれた。こういった課題を解消するために本研究では、全国の母子SH事業者を集め課題を共有ベースに、関連機関との連携、学習会、入居者相談機能の必要性を提示した。母子世帯のシェアハウスニーズに関する調査を実施した。具体的には、1)一般の母子世帯に対する聞き取り調査、2)シェアハウスへの入居を検討する当事者への聞き取り調査、3)実際にシェアハウスに入居をしている当事者への聞き取り調査を実施した。1)については、母子世帯を支援するNPO団体への依頼や母子世帯が参加する自助グループへの働きかけにより対象者を選定した。2)については、2つのシェアハウス事業者の協力を仰いだ。最後に3)については、首都圏にあるシェアハウスAの協力を得た。シェアハウスは、離婚前後の住宅確保に迫られた段階で求められる傾向が高いことが分かった。離婚により婚姻時の住宅を出て、次の行き場としてシェアハウスが選択肢にあがるということである。その中でも、ハウスニーズは1)住宅施策の代替として活用されるケース、2)コミュニティへの帰属のメリットを求めるケースが主要なものとして挙がった。1)については、離婚後に、様々な住宅確保の困難(一時金確保の困難、保証人確保の困難、入居差別等)に躓き、シェアハウスのほかに行き場がなかったというケースである。続いて、2)については、1人での子育てに不安を感じ、誰かと暮らす安心感、ケアの相互補完など集住のメリットに惹かれ、あえてシェアハウスを選択したというケースである。これらのニーズについては、所得階層、それまでの住宅歴や住意識等が強く影響している可能性もあるため、今後は、定量調査を実施し、具体の分析を行うことが必要である。研究計画では、1年目に、一般の母子世帯へのアンケート調査を広く実施する予定であったが、一般世帯のシェアハウス周知度や住意識等について把握したのち、調査票を作成する方が合理的との判断に至り、まずは、一般母子世帯等への聞き取りを優先したため。全国の母子世帯向けシェアハウスの調査を実施し計30カ所の聞き取り調査を終えた。うち、3カ所のシェアハウスにおいて、12名の居住者に対して、インタビュー調査を実施した。事業者は営利企業からの参入が最も多く、更に、不動産業界が7割ほどを占めた。但し、それ以外の業態(有料人材紹介、介護事業者等)も見られ、そのビジネスモデルの確立が予測されるところである。事業者への聞き取りについては、入居者の階層性を示すフィルターとなる家賃額を軸にその傾向を見た。やはり、低家賃中家賃ハウスにおいて、ケアの負担は大きくなっており、その内容も、同伴支援や見守り、相談等多岐に及んだ。他方で、高所得ハウスでは、ゆるやかなコミュニティが出来上がっているとみている事業者が多かった。また、ケアニーズの把握に困難を感じているハウスは多かった。最もスタンダードなケアは、週数回の夕食や育児等を付帯するというものであるが、うち複数のハウスが、入居者から不要との要望が挙がり、保留にしている、廃止したなどの回答が得られた。他方、居住者への聞き取り調査は、低(生活保護レベル)、中(7万円程度)高(10万円強)家賃ハウスで実施した。そのニーズは、低中家賃ハウスでは、他に行き場がなかった、施設入居が難しかったなどの回答が得られた。他方、高家賃ハウスでは、サービスに魅力を感じたという意見が圧倒的に多く、次いで、良好なコミュニティへの帰属への関心と言う回答が挙がった。事業者への聞き取り調査については、建設中のもの、募集予定のものも含めて30カ所と、ほぼ、国内に現存する母子世帯向けシェアハウスすべての対象へのアプローチが実現した。更に、その結果の一部についてを分析し、都市住宅学会研究論文に投稿し、現在、査読回答待ちの状況である。

更には、NPO法人西山夘三(にしやまうぞう)すまい・まちづくり文庫のブックレットに、その内容をまとめた。入居者側への調査についても、順調に進んでいる。対象も、低、中、高家賃ハウスとバランスよく被験者を集めることができた。なお、本研究では海外事例についても視野に入れており、その実現を3年目に繰り越しているため、やや遅れているという自己評価とした。本研究は、ひとり親世帯の逼迫した住生活問題が空き家活用型と育児・家事分担型の集住によって大きく緩和されるのではないかというスタンスに立ち、我が国において成立しうるひとり親向け「問題解決型」の成立に向けて、その実態把握を行った。具体的には、問題解決型集住の実態を把握するために、全国30カ所の母子シェアハウス(SH)事業者への聞き取り調査を実施した。その内容は運営の実態として1運営母体、2シェアハウス開設の背景、3ハードの取得方法と概要、4家賃額とターゲット、5共益費額と内訳、6集客方法、7NPO等との連携体制の有無、8ケアサービスの有無と採算性、9定員数と設定理由、10入居世帯の類型(母子のみ、あるいは、その他の世帯との混合)とその設定理由ほかを訪ねた。開設後の課題等については、運営者が抱える課題をランダムに回答してもらったほか、3カ所のSHにおいて入居者計10名への聞き取り調査、1カ所のSHにおいて10名を対象に入居時相談を行った。その結果、運営主体は不動産関連企業が多く、居室の規模は最小では7.4m2、最大で34.7m2最大である。最低家賃は3.5万円、最高では10万7千円と幅広く、何らかの生活サービスを提供しているという回答は約6割を占めた。ほとんどが条件により無職でも入居できる物件である。以上より、母子SHは地域的な偏在はあるものの、住宅に困窮する母子世帯の住まいの受け皿となる可能性は充分にあると考えられる。家賃額も幅広く、低所得階層のみならず、幅広い階層に対応しうる点も興味深い。課題は1集客の困難、2人間関係のトラブル等の解決に手間がかかる、更には3DV等入居者が抱える課題解決への知識がなく対応が困難などの意見も聞かれた。こういった課題を解消するために本研究では、全国の母子SH事業者を集め課題を共有ベースに、関連機関との連携、学習会、入居者相談機能の必要性を提示した。第1に、聞き取り調査より把握したニーズは当事者の所得階層や学歴、住宅歴、住意識等に強く影響を受けると考えられるため、今後は、一般母子世帯のシェアハウスニーズの定量調査を実施したい。第2に、諸外国における母子世帯用シェアハウスの実態調査を実施する。現時点では、デンマーク及び米国での調査を予定している。各国でなぜ、母子世帯用シェアハウスが求められ、そこでどのような暮らしがなされ、どの段階で、ハウスを退去するのか。日本における母子世帯向けシェアハウスの実践はまだ始まったばかりであり、課題や将来像など未知な部分も多い。よって、諸外国の事例から学ぶべき点は多いと考えられる。第3に、国内で母子世帯向けシェアハウスを展開するにあたってのガイドラインやマニュアル、ひいては、認定制度の是非について、ハウスを運営する企業、NPO、行政を絡めたワークショップを実施し、その成果について社会にフィードバックする。
マウス受精卵における受精卵呼吸量測定装置を用いた呼吸量測定の安全性の検討

当施設で開発した受精卵呼吸量測定装置(CERMs)の安全性を検証するため、呼吸量測定胚の胚移植を行い、妊孕性を持つ産仔を獲得することができた。次に胚呼吸量と胚の生存性を規定する分子生物学的パラメーターとの相関を検証した。ヒト胚盤胞の大きさに準じた集合キメラ胚を用いた検討では、ATP量、細胞数ともに呼吸量との相関を認めたが、ミトコンドリア遺伝子コピー数との相関は認めなかった。最後に呼吸量測定胚の移植により着床率と流産率の関係を調べたが、マウスモデルにおける相関は認められなかった。研究室への測定機器のセッティングを行い、マウス用にセッティングした胚呼吸装置を用いた測定に成功している。測定時間の短縮を目指し、キャリブレーションにかかる時間の短縮や印可時間、回数の検討等も含め、測定プログラムのアップデートを続けており、より、培養器外での操作時間の短縮を目指している。これまでにソフトウェアの改訂により、一つの測定プレートで5つの胚を連続測定可能となり、測定時間の大幅な短縮ができている。また、得られた生データから酸素消費を計測するソフトも、より簡便な物へとアップデートしている。今年度は、この系をもちいてマウス2細胞期の凍結融解胚を用いたIn Vitroの実験を行ってデータを集めている。マウス胚は、3.5日目での発生段階により、1発生停止群、2胚盤胞到達群、3胚孵化群に分けて胚呼吸量を検討している。現在は、これらの3群それぞれで50個以上の胚の呼吸データを蓄積していくことを目標に行っており、データの蓄積からIn Vitroでの発育の予測に繋がる基準値作製を目指している。また、これら基準値は次年度に予定している移植実験にも実験群の区分に用いる予定である。同時に、より早期の測定開始によって、早期に胚発育を予測することが可能かの検証もめざしており、体外受精による受精卵作製も試みている。また、次年度予定している胚移植実験のために、胚移植系の確立に向け、精管結紮マウスの作製や、移植のシミュレーションなどを行って、スムースに移植実験へ移行できるように準備を進めている。凍結融解胚を用いたIn Vitroの検討は進んでいる。また、次年度の移植実験の準備として胚移植系の確立をめざした準備も行っている。しかしながら、当初予定していた胚呼吸量とミトコンドリアの分子生物学的検討との相関を検証する実験には至っていない。マウス受精卵を用いて受精卵呼吸量測定装置の安全性を確認するため以下の研究テーマを検討した。1《体外受精後3.5日目の受精卵の形態学的評価および呼吸量を計測する》代表的な近交系実験用マウスを用いた。雌マウス由来の卵丘細胞塊と雄マウス由来の新鮮精子を体外受精させ受精卵を獲得して体外培養した。3.5日目に胚盤胞を回収し、倒立顕微鏡にて形態学的評価し、受精卵呼吸量測定装置で呼吸量を計測した。以上を体外受精69周期、胚盤胞251個に対し行った。2《体外受精後3.5日目の受精卵の呼吸量測定と呼吸量に関係するパラメータ(免疫染色による細胞数カウント、ATP測定、DNAコピー数)のとの関係を評価する》細胞数カウントにおいては、呼吸量測定胚30個の細胞数を測定した。呼吸量の高い胚において全細胞数が多い傾向は認めるものの、内細胞塊数、全細胞数ともに呼吸量との有意な相関は認めなかった。ATP測定については胚56個を解析し、呼吸量とATPには有意な相関を認めなかった。この結果より、マウス胚は開発したチップによる胚呼吸量測定には大きさが適合しないか、呼吸量が小さすぎるなどの原因を考えた。そこで、集合キメラ胚15個を作成して再度呼吸量とATP量の相関をみたところ、有意な正の相関を認めた。DNAコピー数については予備実験にて胚10個のDNA抽出をしたが解析に十分量のDNAが得られなかった。3《体外受精後3.5日目の受精卵の呼吸量と出産率の関係を検討する》受精卵呼吸量測定装置による受精卵質評価の安全性を検証するため、偽妊娠レシピエント雌6匹の卵管膨大部に呼吸量測定後の胚盤胞55個を移植した。レシピエント雌2匹から計3匹の出産を確認できたが、いずれもレシピエントによる食殺の跡があり、確認時死亡していたため正確な出産数の把握ができていない。上記の結果をうけ、集合キメラ胚を用いた方法を検討している。本年度の研究により、単一胚由来胚盤胞ではなく集合キメラ胚での評価が好ましいことが明らかとなったため、今後の検討は集合キメラ胚の胚盤胞にて行っていく方針がたっている。呼吸量および呼吸に関するパラメータの計測の手法はすでに確立している。よって、今後キメラ胚に対して本年度単一胚に行った手法をおこなうことで研究は順調に進むと思われる。また、受精卵呼吸量測定装置による受精卵質評価の安全性を検証するための胚移植から産子の獲得の研究手法も確立させたため、今後はキメラ胚で継続することにより目的のデータ取得が可能と考えている。最終年度はC57/B6(B6)マウス雌40匹、雄8匹、B6D2F1(BDF1)マウス雌36匹、雄10匹したIVFによる胚の作成と、ICR雌マウス29匹を使用して20周期の胚移植を行った。昨年度から継続した実験として、CERMsによる受精卵質評価の安全性の検証のため胚移植を行ったレシピエントを満期まで継続させてF1生仔を獲得した。

続いて妊孕性の確認のためF1の交配を行いF2産仔も得られることがわかった。これら生仔において、外表奇形や行動異常は見られなかったことから、現時点では受精卵呼吸量測定装置使用による胚の発育や産仔の生殖能力への影響はないと考えている。なお、昨年の検討から集合胚において呼吸測量とATP量は有意な強い相関(P<0.05,相関係数: 0.533)をみとめたため、以後のCERMsによる胚呼吸量の測定は集合キメラ胚で行った。ATP以外の胚の生存性を確認するバイオマーカーとして細胞数カウントをおこなった。胚呼吸量と全細胞数は有意な強い相関(P<0.05,相関係数: 0.549)をみた。内細胞塊数においては有意な相関はみられなかったが、呼吸測量の多い胚は、内細胞塊数が多い傾向にあった(ピアソンの相関係数)。胚呼吸量とミトコンドリア遺伝子コピー数の検討は、ミトコンドリア遺伝子コピー数と胚呼吸量には有意な相関はみられなかった。呼吸量とミトコンドリア膜電位に関しては撮像が終了しており、画像の定量化解析を準備中である。最後に受精卵の呼吸量と着床率の検討に関しては、移植した全てのレシピエントの12.5dpcでの開腹が終了していないが、現在のところ胚呼吸量と着床数、胎児数、流産数(着床痕)の相関は認めていない。当施設で開発した受精卵呼吸量測定装置(CERMs)の安全性を検証するため、呼吸量測定胚の胚移植を行い、妊孕性を持つ産仔を獲得することができた。次に胚呼吸量と胚の生存性を規定する分子生物学的パラメーターとの相関を検証した。ヒト胚盤胞の大きさに準じた集合キメラ胚を用いた検討では、ATP量、細胞数ともに呼吸量との相関を認めたが、ミトコンドリア遺伝子コピー数との相関は認めなかった。最後に呼吸量測定胚の移植により着床率と流産率の関係を調べたが、マウスモデルにおける相関は認められなかった。次年度は移植実験を行い、Vivoのデータとの相関を検証することと、ミトコンドリア機能との相関を検証していく。次世代が得られれば、その妊孕性確認なども順次行っていく。本年度の研究成果を元に、集合キメラ胚胚盤胞の呼吸量測定を行い、各種分子生物学的パラメータとの相関を検証するとともに、呼吸に関するパラメータの計測を行う。また、現在行っていないパラメータの計測も検討中である。また、呼吸量と妊娠、出産などの周産期予後との関連を明らかとし、胚移植から得られた産子の正常性を検討し、また生殖能力についても検討する予定である。東北大学リプロダクションホームページ、研究紹介産婦人科学次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。平成28年度請求額と合わせ、平成28年度の研究遂行に使用する予定である。平成29年度請求額と合わせ平成29年度の研究遂行に使用する予定である。
ヒトのロイコトリエンB_4ω水酸化酵素の発現制御に関する研究

ヒトのロイコトリエンB_4ω水酸化酵素の発現制御について検討を行い、以下のことを明らかにした。ヒトのロイコトリエンB_4ω水酸化酵素はCYP4F遺伝子サブファミリーに属するチトクロームP-450であるが、サザンブロッティング方によりヒトゲノム上にはCYP4Fに関連した遺伝子が57個程度存在し、そのうち好中球の酵素(CYP4F3)の遺伝子及びそれに関係した遺伝子が12個、肝臓の酵素(CYP4F2)に関係した遺伝子は35個あることが分かった。このうち、CYP4F3の遺伝子について解析した結果、本遺伝子の開始コドンはエクソンII上に、終始コドンはエクソンXIIIにあり、エクソンIは49bのリーダ配列をコードしていた。また、CYP4F3とCYP4F2は非常に相同性の高い一次構造を持つものの両者の間で全く異なる配列が一部存在するが、この部分はちょうど一つのエクソンで区切られており、スプライシングサイトが変わったために生じたと考えられた。転写開始点の上流約1kbの範囲にはTATAボックスやGCボックスなどの典型的なプロモーター配列は見られなかったが、転写開始点より129b上流にCACCC結合サイトが見られ、これが本遺伝子のプロモーターであると考えられる。また、この範囲内にはLBP-1結合サイトが3カ所、FIS結合サイトが1カ所、NF-mE1結合サイトが1カ所、そしてTGGCA結合サイト転写開始点より上流約1kbのところに見られる繰り返し配列内に7カ所見られた。本遺伝子の染色体上の位置を蛍光in situハイブリダイゼーション法により検討した結果、本遺伝子は19番染色体上の短碗(19p13.2)にあることが判明した。
腸炎モデルおよびヒト初代培養細胞を用いた菌由来活性物質の腸管保護メカニズムの解析

プロバイオティクス由来のCSFおよびポリリン酸は腸管バリア機能の改善作用を持つことを報告してきた。本研究ではその作用機序について検討した結果、CSFは有機イオントランスポーターにより上皮細胞に取り込まれ、炎症下の上皮細胞で過剰に発現するIL-6、7、CXCL-1などの炎症関連サイトカインを抑制した。ポリリン酸は腸管上皮のインテグリンβ1、カベオリン-1と複合体を形成しエンドサイトーシスにて細胞内へとりこまれ、p38 MAPK経路を活性化して腸管バリア機能を増強すると考えられた。これらの研究成果により、プロバイオティクス由来物質を用いた新規治療薬開発の基盤的成果が得られた。1. CSFおよびポリリン酸の腸上皮細胞への直接作用とそのメカニズムの解析腸管上皮細胞株、正常マウス、DSS腸炎マウスの腸管にポリリン酸を投与し、細胞および組織中の遺伝子発現の変化について、高速半導体シークエンサーIon Protonを用いて検討した。その結果、炎症関連メディエーターや上皮細胞のエンドサイトーシス関連分子を含む約40種類のmRNA発現に変化が認められた。さらに、ポリリン酸を蛍光染色し腸管上皮細胞株に投与した結果、1時間後に細胞質内に取り込まれた。これは、アイソトープ標識したポリリン酸を用いた実験でも証明された。さらに、脂質ラフツを介したエンドサイトーシスの阻害剤およびその関連分子のsiRNAを投与することで、上皮細胞内へのポリリン酸の取り込みは阻害され、腸管保護活性は減弱した。また、マウス腸管組織にポリリン酸を投与した結果、約120種類のマイクロRNAに変化をきたした。現在、これらのマイクロRNAの発現について検討中である。2. CSFおよびポリリン酸による腸内細菌叢の制御と腸管組織への作用解析正常および腸炎モデルマウスの便、盲腸内容物を採取し、フェノール・クロロホルム法にて細菌DNAを回収した。16s-rRNA領域DNAをユニバーサルプライマーを用いてPCRで増幅させ、制限酵素(MspI)を用い断片化し電気泳動パターンから数値化(T-RFLP法)した結果、ポリリン酸投与によって泳動パターンは大きく変化した。現在、次世代シークエンサーを用いて各サンプルの塩基配列を読みとり、変化をきたした菌属、菌種の同定を行っている。1.ポリリン酸の腸上皮への直接作用とそのメカニズム解析:前年度の研究成果から腸管上皮細胞にポリリン酸を投与すると炎症関連メディエーターおよびエンドサイトーシス関連分子の発現が変化すること、エンドサイトーシスを阻害するとポリリン酸の腸管保護作用が減弱することを明らかにした。そこで本年度はポリリン酸がエンドサイトーシスにより取り込まれる過程で発現が変化するmRNAを網羅的に解析した。その結果、154個のmRNA発現が有意に変化し、中でも腸管バリア機能に関係があるTNFAIP3、TMSβ4、DUSP2の3分子の発現が有意に上昇していることが明らかにした。さらに、ポリリン酸の投与によりTNFAIP3蛋白の発現も有意に増加していること、エンドサイトーシスの抑制によりこのTNFAIP3の発現誘導は阻害されることも明らかにした。今後さらに詳細なメカニズム解析を行うとともに成果の公表に努めていく予定である。2.ポリリン酸による腸内細菌叢の制御と腸管組織への作用解析:昨年に引き続き、正常および腸炎モデルマウスの便中や腸管内容物内の細菌DNAシークエンスについて解析を継続している。3.初代培養腸細胞に対するCSFおよびポリリン酸の作用とメカニズム解析:マウス腸管組織から採取した上皮細胞をconditional reprogramming法を用いて培養し、正常腸管上皮の初代培養細胞を得た。これにポリリン酸を投与した結果、異常な細胞増殖の変化や細胞死の誘導は認められなかった。一方、大腸癌由来SW620細胞株に対して、ポリリン酸は強い増殖抑制効果、細胞死誘導作用を発揮した。今後は、ポリリン酸の抗腫瘍メカニズムの解析や他臓器癌への効果を検証し、臨床応用へ向けての基盤的な成果を積み重ねていく予定である。以下の各検討事項について、ほぼ計画通り進展しており、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。1.ポリリン酸の腸上皮への直接作用とそのメカニズム解析:前年度の研究成果に加え、1ポリリン酸がエンドサイトーシスにより取り込まれる過程で発現が変化する154個のmRNAを同定し、2その中で腸管バリア機能に関係があるTNFAIP3、TMSβ4、DUSP2の3分子の発現が有意に上昇していること、3ポリリン酸の投与によりTNFAIP3の蛋白発現も有意に増加していること、4エンドサイトーシスの抑制によりこのTNFAIP3の発現誘導は阻害されることも明らかにした。2.ポリリン酸による腸内細菌叢の制御と腸管組織への作用解析:昨年に引き続き解析を継続している。3.初代培養腸細胞に対するCSFおよびポリリン酸の作用とメカニズム解析:1conditional reprogramming法を用いてマウス正常腸管上皮の初代培養細胞を樹立し、2ポリリン酸が正常上皮初代培養細胞に異常な細胞増殖の変化や細胞死の誘導を引き起こさないこと、3ポリリン酸は大腸癌由来SW620細胞株に対して強い増殖抑制効果と細胞死誘導作用を発揮することを明らかにした。

1.ポリリン酸の腸上皮への直接作用とそのメカニズム解析:前年度までに、腸管上皮細胞にポリリン酸を投与すると炎症関連メディエーターおよびエンドサイトーシス関連分子の発現が変化すること、エンドサイトーシスを阻害するとポリリン酸の腸管保護作用が減弱すること、ポリリン酸がエンドサイトーシスにより取り込なれる過程で154個のmRNA発現が有意に変化していることが明らかにした。本年度は、この中のTNFAIP3の発現が、ポリリン酸の投与により増加することを確認した。また、ポリリン酸の取り込み機構はカベオリン依存性エンドサイトーシスであり、その抑制によりTNFAIP3の発現誘導は阻害されることも明らかにした。今後はメカニズム解析を継続するとともに、成果の公表を行う予定である。2.ポリリン酸による腸内細菌叢の制御と腸管組織への作用解析:昨年に引き続き、正常および腸炎モデルマウスの便中や腸管内容物内の細菌DNAシークエンスについて解析を継続している。3.初代培養腸細胞に対するポリリン酸の作用とメカニズム解析:前年度までに、マウス腸管上皮細胞から得た初代培養細胞にポリリン酸を投与しても異常な細胞増殖や細胞死の誘導は認められなかったこと、大腸癌由来SW620細胞株に対しては強い増殖抑制効果、細胞死誘導作用を発揮することを明らかにした。本年度は、ポリリン酸の抗腫瘍メカニズムとして各種シグナル伝達系の活性化について検証し、ERKシグナルの活性化が本剤の抗腫瘍作用に関係していることを明らかにした。今後はメカニズム解析を継続する予定である。また、ポリリン酸と同様の菌由来抗腫瘍分子を探索した結果、乳酸菌由来のフェリクロームに強い抗腫瘍作用があることを同定した。今後、この抗腫瘍メカニズムについても検討していく予定である。以下の各検討事項について、ほぼ計画通り進展しており、本研究はおおむね順調に進展している。今後は、これまでの結果の検証と公表のため次年度も継続することとした。1.ポリリン酸の腸上皮への直接作用とそのメカニズム解析:前年度の研究成果に加え、1ポリリン酸のエンドサイトーシスによる取り込みはカベオリン依存性であること、2ポリリン酸の腸管バリア機能増強作用にTNFAIP3の発現が関係している事、3カベオリン依存性エンドサイトーシスの抑制により、ポリリン酸のバリア増強作用、TNFAIP3の発現誘導は減弱することを明らかにした。2.ポリリン酸による腸内細菌叢の制御と腸管組織への作用解析:昨年に引き続き解析を継続している。3.初代培養腸細胞に対するCSFおよびポリリン酸の作用とメカニズム解析:これまでに、マウス腸管上皮細胞から得た初代培養細胞にポリリン酸を投与した際、異常な細胞増殖や細胞死の誘導は認められないこと、大腸癌由来SW620細胞株に対しては強い増殖抑制効果、細胞死誘導作用を発揮すること、抗腫瘍メカニズムとしてERKシグナルの活性化が関係していることを明らかにした。また、ポリリン酸と同様に抗腫瘍効果を持つ菌由来物質の探索を行い、乳酸菌由来のフェリクロームに強い抗腫瘍作用があることを同定した。研究実績の概要1.ポリリン酸の腸上皮への直接作用とそのメカニズム
ヒト疾患糞便移植マウスモデルを用いた炎症性腸疾患ディスバイオーシスの解明

無菌マウスに潰瘍性大腸炎(UC)と原発性硬化性胆管炎(PSC)合併患者便を移植した。PSC/UC患者便移植マウスで肝臓Th17細胞が増加した。PSC/UC患者便にKlebsiella pneumonia(Kp)を始め3菌が高い頻度で検出された。3菌を無菌マウスに移植する(PSCマウス)と肝臓にTh17細胞の誘導を認めた。PSCマウスは胆管炎モデルで肝機能が増悪することが判明した。Kpとヒト大腸上皮細胞との共培養系において、Kpが上皮細胞のアポトーシスを誘導した。PSCの病態に、Kpが腸管上皮細胞を破壊し、"leaky gut"を誘導するという新規メカニズムを明らかとした。ヒト共生生命体である腸内細菌が、健康長寿や慢性免疫疾患の病態にとって極めて重要な「臓器」として注目を集め、健康人の糞便を移植する治療まで行なわれるようになってきた。また、世界一の長寿国家である日本が誇る“日本食"が、日本人独自の腸内細菌叢を構築していることも知られており、申請者のグループは日本人に適合した最初の糞便微生物移植開発の臨床試験を開始している。本研究課題では、我が国で急増する免疫難病&#8226;炎症性腸疾患における腸内細菌叢の役割を、ヒト疾患糞便を無菌マウスに移植する“ヒト糞便化マウス"というユニークな手法により解明する。日本人初の糞便微生物移植を実施したグループとして、本“ヒト糞便化マウス"モデルを用いて、腸内細菌叢形成、既存腸内細菌によるcolonization resistanceのメカニズムを明らかにし、より効率の優れたヒト糞便微生物移植法の確立を目指す。平成27年度は、善玉菌、悪玉菌のライブラリーを作製するにあたり、独創的なモデルを確立した。すなわち、潰瘍性大腸炎(UC)に原発性硬化性胆管炎(PSC)を合併した患者に焦点を当てた。その背景に、腸管での腸内細菌の悪玉菌/善玉菌バランスの乱れ(dysbiosis)が結果として、腸管外で表現系(肝臓胆管障害)を有するモデルとして最適であることに着目した。まず、無菌マウスの腸管内へUC+PSC合併患者糞便を移植した。コントロールとして健常人糞便を同様に移植した。結果、UC+PSC糞便移植マウスでは肝臓内にIL-17陽性のTh17細胞が著明に増加することを見出した。UCの日常臨床において治療難治の患者に対して、メトロニダゾール(商品名;フラジール)をしばしば用いるが、メトロニダゾール投与後の糞便を移植したマウスでは肝臓内Th17細胞が著明に健常人糞便移植マウスレベルまで減少することを見出した。したがって、メトロニダゾール投与前後の糞便を詳細に検討することで、ヒト疾患に直接関与する悪玉菌の同定に格好のモデルを確立した。現在、メトロニダゾール投与前後の糞便をさまざまな嫌気性培養条件にて培養を試み、さまざまなコロニーをバンキングしている。前後でのサブトラクションにて、肝臓内Th17細胞誘導悪玉菌の同定を行なっている。また、もう一つの仮説として、肝臓内Th17細胞誘導悪玉菌は腸管外の肝臓へ移行するという仮説を立て、UC+PSC糞便移植マウスの肝臓を無菌的に採取し嫌気性培養を試みている。この他、付随する発見として、UC+PSC合併患者糞便細菌にはIL-1bをマクロファージから強く誘導することを見出した。以上、平成27年度は残り2年のための基盤となる極めてユニークなモデルを確立した。炎症性腸疾患の発症予防、治療における食餌を中心とした栄養に関しては、エビデンスに乏しく経験に基づいたものであるのが現状である。この点を明らかとする目的で、健常人(HC)、潰瘍性大腸炎(UC)患者、原発性硬化性胆管炎合併潰瘍性大腸炎(PSC/UC)患者糞便を無菌マウスへ移植したヒト糞便化マウス(HCマウス、UCマウス、PSC/UCマウス)を作成した。驚くべきことに、PSC/UCマウスでは肝臓内Th17細胞の集積を認めた。また、PSC/UCマウスでTh17細胞の移入に関与しうるserum amyloid Aの発現亢進も確認した。この現象はHCマウス、UCマウスでは認めなかった。このことは、腸管外合併症としてのPSC免疫現象に腸内細菌が関与する証拠であり、次に、責任腸内細菌を同定する目的で、我々は腸管ではなく腸間膜リンパ節が腸管外免疫反応の責任部位と仮説を立て、同部位の嫌気性培養を実施したところ、PSC/UCマウスのみでKlebsiella pneumoniaの同定培養に成功した。これまでのmetagenomicsは包括的に腸内細菌の理解には重要なツールとして広く用いいられてきたが、マイナーな腸内細菌の定量には困難であり、我々の解析でもKlebsiella pneumoniaを定量することはできなかった。しかし、Q-PCR法にて解析したところ、PSC/UC患者に高頻度にKlebsiella pneumoniaが検出されることを確認した。次年度は、Klebsiella pneumoniaにフォーカスを当てさらなる解析、結論を見いだす予定である。ノトバイオートシステムの構築はすでに完成し、コンタミネーションもなく研究体制が出来上がった。本年は、食餌の影響についての追求が乏しかった反面、予想外に腸管外免疫現象(PSC肝臓Th17反応)に関与しうる腸内細菌を同定することができた。

PSCは高脂血症薬の一定の効果が期待でき、PSC/UCノトバイオートマウスでの高脂肪食によるPSC症状の悪化を今後は見てみたい。また、食餌に関しては“多様性"ある腸内細菌構築には多様性ある食物繊維(マルチプルファイバー)の開発に着手したので、ノトバイオートシステムと関連した研究の準備が整ったといえる。原発性硬化性胆管炎(PSC)患者糞便中に健常者と比較しKlebsiella pneumonia, Proteus mirabillus, Enterococcus gallineumが検出された。人より分取した三菌を無菌マウスに移植すると(PSCマウス)、腸管にTh17細胞の増加を認め、肝臓にもpathogenic Th17細胞の誘導を認めた。さらにSSAの発現の肝臓内での優位な上昇を認めた。PSCマウスはPSC様の胆管炎を自然発症することはなかったが、DDC胆管炎モデルにおいてPSCマウスはSPFマウスと比較し肝機能の増悪を認め、本研究でPSC患者より分取した3菌を無菌マウスに使用することで新たなPSC-likeモデルの開発に成功した。PSCマウスの大腸局所でのFISHでの検討では、三菌の粘膜内への侵入、大腸粘膜内への侵入を観察し、腸管透過性の亢進を確認した。免疫難病とこれまで考えられていたPSCの病態に、Proteobacteria属のKlebsiella pneumonia菌が、"leaky gut"を誘導するという新規のメカニズムを明らかとした。また、PSCの病的なKlebsiella pneumonia菌は腸管から腸管膜リンパ節へ移動し、全身の免疫反応に関与することを明らかとした。今後は、腸間膜リンパ節という司令塔がいかに肝臓免疫を惹起するのかを明らかとする必要がある。このように、本研究は、免疫抑制療法が無効という矛盾した免疫難病であるPSCが自己免疫疾患ではなく、細菌による慢性感染症という新たな概念につながる発見と位置づけている。さらにヒト疾患より分取した便を無菌マウスに移植し、さらに適切なモデルとすることで、ヒト疾患の病態解明につながる動物モデルが作成できることが明らかとなった。無菌マウスに潰瘍性大腸炎(UC)と原発性硬化性胆管炎(PSC)合併患者便を移植した。PSC/UC患者便移植マウスで肝臓Th17細胞が増加した。PSC/UC患者便にKlebsiella pneumonia(Kp)を始め3菌が高い頻度で検出された。3菌を無菌マウスに移植する(PSCマウス)と肝臓にTh17細胞の誘導を認めた。PSCマウスは胆管炎モデルで肝機能が増悪することが判明した。Kpとヒト大腸上皮細胞との共培養系において、Kpが上皮細胞のアポトーシスを誘導した。PSCの病態に、Kpが腸管上皮細胞を破壊し、"leaky gut"を誘導するという新規メカニズムを明らかとした。我々が平成27年度に見出した無菌マウスの腸管内へのUC+PSC合併患者糞便移植の独創的なモデルは肝臓内Th17細胞を誘導する。平成28&#12316;29年度は比較的ストレートフォワードな手法を用いて、肝臓内Th17細胞を誘導する悪玉腸内細菌の同定を行なう。
移民地川柳に見る日本性の展開とエスニシティの生成 -アメリカ合衆国の川柳の場合-

平成14年度はワシントン大学に所蔵されている『北米時事』新聞の川柳欄を閲覧コピーし、川柳をコンピュータに入力、平成15年度は『加州毎日』新聞の川柳欄を閲覧コピーし、川柳を同様に入力した。さらに『ユタ日報』の川柳欄の川柳も収集、コンピュータに入力した。両年とも、日系コミュニティでの人脈を通じて、戦前・戦中の川柳人と接触し、個人所蔵資料の閲覧コピー、面談聞き取りを行った。戦時中ジェローム強制収容所で発行された川柳しがらみ吟社の「しがらみ」、ツールレーク隔離収容所の「怒涛」などを収集した。平成16年度は、戦時中の収容所で発行された文学誌のなかの川柳を入力した。同年では、入力した川柳15000句を分析し、2004年度アメリカ学会(アトランタ)で、戦前の川柳に関する学会発表を行った。この発表で、日本アメリカ学会の英文ジャーナル誌への寄稿を依頼された。また、サバティカルで滞在中のハーバード大学ロングフェロー研究所の教授から、ドイツのアメリカ学会誌への寄稿を依頼された。(現在、入校中、発行は2005年度)。さらに補足的研究のために平成17年3月にシアトルとロサンゼルスで調査を行った。また平成16年6月にはアイダホ州ミネドカ強制収容所跡地を見学した。アメリカの川柳は、いわゆる狂句とは異なり、季語のない俳句ともいえる。川柳人の社会階層は、日本人会幹部から、季節労働者、年齢的には「老人」から10代の若者、性別も男性が多いものの、主婦や未婚女性も交じっている。一つの句は短いが、万単位で残る膨大な量を分析することで、記録を持たないと思われた一般庶民のさまざまな声が聞こえてくる。アメリカ移民の「人生の記録であり、心情の詩」である。研究の経過報告海外での調査(2002年7月25日から8月7日)○北米川柳の収集アメリカ合衆国ワシントン大学図書館マイクロフイルム室:戦前期北米時事新聞の川柳および関連記事のコピー。東アジア図書館分室:戦前および第二次大戦中に作成された川柳集(私家版、ガリ刷り)のコピー。○面接シアトル市およびその近辺において戦前北米川柳社の柳人であった人物およびその子孫に面接し、当時の状況を聴取するとともに私蔵の資料をコピーした。日本における調査シアトル市での面接から戦前期北米川柳社柳人(東京周辺在住)の情報を得、面接、当時の状況を聴取し、私蔵の資料を一部譲り受け、他はコピーした。ロサンゼルス市周辺居住の日系人の情報から、戦時中の川柳社の柳人(ロサンゼルス市在住)と国際電話インタヴューを行い、2003年夏に面接する約束をつけた。以上の調査によって得られた川柳を入力した。7月22日8月10日にはハワイ大学、UCLA、全米日系博物館、ワシントン大学図書館所蔵の川柳句集を閲覧コピーした。またそれぞれの図書館の東アジア図書館司書から当該地区の日本人移民関係図書に関する情報を収集した。ロサンゼルスとシアトルでは、川柳作家と面談、個人所属資料を閲覧コピーした。8月8日と9日はシアトル市で開催されたAsian Pacific American Historyの集会に出席、アメリカ及びカナダのアジア系エスニック研究者の知己を得、それぞれのエスニック集団の現状を学んだ。強制収容所で詠まれた川柳の入力「川柳で読む在米日本人の食の世界」(白百合女子大学言語文学研究所ブックレット、2004年3月予定)では川柳に詠まれた食の内容に着目し、分析した。日本人移民は日本の伝統行事とそれにかかわる食を維持することに腐心しつつも、食のアメリカ化が進行したこと、そのアメリカ化とはさまざまなエスニック集団の食の混合であり、主流社会の食の模倣ではなかったこと、日本人移民の食がアメリカ化するとともに、他のエスニック集団の食も日本食を取り入れる動きがあったこと、双方向的な混合があったことを指摘した。

一つの句は短いが、万単位で残る膨大な量を分析することで、記録を持たないと思われた一般庶民のさまざまな声が聞こえてくる。アメリカ移民の「人生の記録であり、心情の詩」である。
CD44バリアント陽性胃がん幹細胞を特異的に検出するPET診断の開発

グルタチオン(GSH)増強薬投与ではMKN28の5-FU感受性は有意に抑制された。また、CD44v9-MKN28では5-FU耐性を示した。5-FU投与下でCD44s-MKN28では濃度依存性にROS誘導・GSH減少が起こったがCD44v9-MKN28では抑制された。xCT阻害物質sulfasalazine投与でCD44v9-MKN28でも5-FUによるROS誘導・GSH減少を認め、CD44v9-xCT系による抗酸化能が5-FU耐性に寄与すると考えられた。NOGマウスの皮下腫瘍の検討では、CD44s-MKN28では5-FU投与で縮小したがCD44v9-MKN28では縮小しなかった。しかし、5-FU+sulfasalazineでCD44v9-MKN28は有意に縮小した。さらに上記細胞をCagA陽性ピロリ菌に曝露したHp-CD44-MKN28細胞では有意に遊走能、浸潤能が亢進し、さらにHp-CD44v9-MKN28でより強い浸潤傾向を認めた。一方で、sulfasalazine処理Hp-CD44v9-MKN28では浸潤傾向を認めなかった。これらの細胞のNOGマウス背部移植では、CD44v9-MKN28の腫瘍体積はHp群で有意に増加した。HER2陽性のNCI-N87ではtrastuzumab用量依存性に細胞生存率は低下しROS蓄積を認めたが、CD44v9発現vectorをHER2陽性胃高分化型腺癌細胞NCI-N87に形質転換したCD44v9-NCI-N87では生存率は低下せず、ROS蓄積も認めなかった。CD44v9-NCI-N87ではMnSOD発現が上昇しHER2レベルは低下した。CD44v9陽性胃癌幹細胞の薬物(S-1, trastuzumab)に対する耐性機序を示し、CD44v9発現・xCTの安定化によるシスチン増加・細胞内GSH蓄積とROS抵抗性による耐性機序の寄与度を、これら2剤で明らかにした。5-FU耐性にはxCT増強の寄与度は高いが、trastuzumabの場合は必ずしも本系だけでなく、MnSOD量もCD44v9-NCI-N87で上昇しており、それによるROS抵抗性とHER2シグナル系の抑制作用が薬剤耐性を発揮していると考えられた。本機序の詳細を明らかにしたことで、今後CD44v9陽性胃癌幹細胞のアミノ酸代謝を標的したPET/CT診断のプローブ開発に応用できる可能性が示唆された。CD44v9陽性細胞に、xCT依存性と非依存性の酸化ストレス耐性機序があることが明確になり、当初の仮説のようにxCTの性質のみで本細胞の性質の全てを説明できないことがわかってきた。そのため、単一のアミノ酸の取り込みという細胞代謝の一過程を応用した標識法では充分な標識ができないこと、また、脾臓への細胞塊注入による肝転移モデルの検討から、転移した癌腫で、CD44v9陽性細胞のxCTの安定化という性質が変化することもわかり、必ずしも転移部でCD44v9が陽性にならないことから、さらなる安定的な標的分子を探索する必要がでてきたため、この点に的をしぼった基盤的研究に重点を置いているため27年度が最終年度であるため、記入しない。消化器内科学細胞膜表面のxCT依存性機序に加え、MnSODなどのミトコンドリアでのxCT非依存性の酸化ストレス耐性機序も明確化し、多面的にCD44v9を標的する方法論(直接的・間接的標的を含む)を確立する。腫瘍ニッチを探索できる生体イメージングに適した細胞標識法を開発する。CD44v9陽性胃がん幹細胞の抗がん療法(S-1, trastuzumab)に対する耐性の分子機序を詳細に検討し、CD44v9発現によるシスチントランスポーターであるxCTの安定化によるシスチン取り込み、細胞内グルタチオン(GSH)蓄積とそれによる細胞内ROS抵抗性による、薬剤耐性機序の寄与について、胃がん化学療法の主翼を担う2剤で明らかにすることができた。S-1,つまりその代謝物である5-FUの耐性機序は本トランスポーター増強の寄与度は高いものの、trastuzumabの場合は、必ずしも本系だけではないという結果が得られてきており、薬剤によりその耐性を担う細胞形質が若干異なると考えられた。つまり、trastuzumabの場合は、細胞内GSH濃度の増強だけでなく、ミトコンドリアに存在する抗酸化酵素MnSOD量もCD44v9-NCI-N87で、NCI-N87に比し上昇しており、HER2陽性細胞のtrastuzumab耐性機序にはxCTに依存度の高いGSH増強によるROS抵抗性ばかりでなく、MnSOD誘導によるROS抵抗性も獲得することで薬剤耐性を発揮している可能性が考えられた。このため、本機序の詳細をin vitroでさらに明らかにした上で、in vivoあるいはPET/CT診断検査への応用が必要であると考えられ、この段階の基礎的検討を行う必要が生じた。27年度が最終年度であるため、記入しない。前年度までに実施できなかった、CD44v9陽性細胞の標識技術の開発、免疫不全NOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスを用いた生体内イメージングを次年度(平成27年度)に実施することとしたため、そのための消耗品、動物飼育管理費として次年度使用額が生じた。

HER2陽性肝転移胃高分化型腺癌細胞株NCI-N87ではtrastuzumab用量依存的に細胞生存率は低下し、細胞内ROS蓄積を認めたものの、CD44v9-NCI-N87ではtrastuzumab投与でも生存率は低下せず、ROS蓄積亢進も認めなかったことから、HER2発現細胞でも、CD44v9発現によりtrastuzumab耐性を獲得することが示されたが、この機序はxCT依存性のGSH蓄積性ばかりでなく、ミトコンドリア内でのMnSOD誘導も重要であることがわかったため、まずは、この機序を詳細に検討する。これらの知見の確認ができた上で、in vitroでの細胞標識実験を実施し、さらにNOGマウスを用いた担がん動物でのがん腫の悪性化、さらには標識細胞の検出技術に応用し、CD44v9陽性胃がん幹細胞のアミノ酸代謝を標的した新規診断法開発の基盤構築を実施する予定である。xCT依存性と非依存性の酸化ストレス耐性機序を明確化し、CD44v9を直接標的する方法論を確立する。CD44v9発現HER2陽性高分化型胃がん細胞株NCI-N87(CD44v9-NCI-N87細胞)、CD44s発現CD44s-NCI-N87細胞を用い、薬剤耐性機序を追跡しxCT活性あるいはシスチン集積性を検討するとともに、sulfasalazine等によるxCT依存性の耐性解除標的に加え、ミトコンドリアに存在するMn-SODなどのxCT非依存性の耐性機転やその解除標的も検討する。CD44v9陽性細胞などから腫瘍ニッチを探索できる生体イメージング応用も試みる。このためにNOGマウスを用い、上記で作製した各胃がん細胞株を背部皮下に注射し、腫瘍移植モデルを作製する。本動物を用い、移植腫瘍塊のサイズ評価と代謝的検討、さらには病理組織学的検討も行った上で、CD44v9を標識することで生体内細胞イメージングを実施する。27年度が最終年度であるため、記入しない。