hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋梗塞モデルマウスへの幹細胞移植後の生着に対する加齢と運動の影響

高齢者の心疾患は死因の最上位にあり、重症化することで治療の選択肢が限られる。この解決のための一手段が幹細胞移植による心筋再生による治療法の確立であるといえる。そこで本研究では、この課題に取り組むための疾患モデル動物を作製し、評価することで、ヒトの心疾患病態での幹細胞移植の安全性・有効性の適切性につなげていくことを目指している。これまで、若齢、老齢マウスに心筋梗塞を作製し、超音波評価などによる評価系をほぼ確立した。一方で、心筋梗塞部位への幹細胞移植のソースとしての幹細胞の樹立・培養に関しては単離、培養ともに順調に開始し、問題なく進めている。今後は疾患モデルへの移植を進めていく。高齢者において心疾患は死因の最上位にあるが、これはその多くは急性期から慢性期に移行し重症化することで治療の選択肢が限られてしまうことが一因である。この課題に取り組む研究のためには適切な疾患モデル動物が求められるが、これまでの心筋梗塞モデルは若齢動物を用いたものがほとんどである。そこで適切なモデルを構築し評価していくことを目的とした。まず比較対象となるデータを習得するため若齢心筋梗塞モデルマウスを作成したが、ここでは老齢マウスでの梗塞モデル作成を念頭にした手術負荷を最小限とし再現性のよい手技を試みた。その結果梗塞2カ月後まで形態的な心肥大が確認されるとともに、マウス生存率を向上させることが可能となった。また、心組織再生の動向をモニターする技術として組織形態学的評価に加え、切片から糖たんぱく質糖鎖のプロファイリングが得られることが示された。現在心筋梗塞後2週、4週、8週(各n=35)でこれら技術を用いた評価を検討しており、細胞を切片化し、解析を進めている。今後は経時的効果を長期評価することを実現するため、超音波検査などの生理学的な評価を用いることを検討していく。高齢者において心疾患は死因の最上位にあり、急性期から慢性期に移行し重症化することで治療の選択肢が限られてしまうが、この解決のための一手段が幹細胞移植による心筋再生による治療法の確立であるといえる。現在の進捗は、若齢、老齢マウスに心筋梗塞を作製し、超音波評価などによる評価系をほぼ確立した。本実験で得られたデータを蓄積しているところであるが、心筋梗塞後の心機能低下を確認するとともに、継時的な肉眼的評価においては、梗塞層がほぼ完全に確認された。さらに、マウスの個体差や結紮部位の微妙な違いにより梗塞層の範囲が左右される可能性も示された。今後、蓄積されたデータの解析を行うことで、心不全状態を適切にコントロールしてヒト病態に近い疾患モデルにしていく。さらに移植後の経時的効果を長期評価することを実現するため、超音波検査などの生理学的な評価についての初期データの取得を検討していく。心筋梗塞モデルマウス作製の精度を保持しつつ、全体の研究進行の再確認を行い、若齢、老齢マウスでの疾患モデルにおける病態の比較や幹細胞移植による細胞の生着率、その後の効果、また運動等のリハビリテーションによる効果を比較する際の実験に関する具体的実験を開始した。具体的には、若年マウスからのトライアルを開始しているが、ほぼ順調に進んでいる。また、心筋梗塞部位に移植するための細胞単離・培養を開始し、細胞培養はかなり順調に進んでいる。また、幹細胞移植治療の最適化に向けた影響要因の探索、及び具体的細胞生着率向上につながるようなアイディアについても検討していく。高齢者において心疾患は直接死因の最上位にある。重症化した心疾患に対する治療の選択肢の一手段として期待されているのが幹細胞移植による心筋再生治療法の確立であるといえる。そこで、本研究では、この課題に取り組むための疾患モデル動物を作製し、評価することで、ヒトの心疾患病態での幹細胞移植の安全性・有効性の適切性につなげていくことを目指してきた。現在の進捗は、ヒト疾患における適正なモデル動物作製を目指し若齢、老齢マウスに心筋梗塞を作製した。超音波評価等による評価を行ったところ(Sham、心筋梗塞、心筋梗塞+salineで14匹/群)、老齢マウスは若齢マウスに比較し、心筋梗塞後の体重の回復は緩やかとなっていた。また、組織学的な検討では、老齢マウスの方が若齢に比べて前壁の拡大が顕著に認められた。現在、本実験で得られたデータを蓄積、解析しているところである。心筋梗塞後の心機能低下や経時的な肉眼的評価においては、梗塞層がほぼ完全に確認されており、超音波評価にて心機能低下(1週間後に左室駆出率の低下)が確認された。施術による生存率は90%以上を保っている。さらに、マウスの個体差や結紮部位はほぼ安定してきており、幹細胞移植実験に向けて準備が着々と進んでいる。一方で、心筋梗塞部位への幹細胞移植のソースとしての幹細胞の樹立・培養に関しては単離、培養ともに順調に開始し、継代が進み、使用細胞が発現してきたのでいったん凍結を行った。現在、疾患モデル動物の作製の検証を進めており、今後は疾患モデルへの移植群を含めて実験を進めていく。

高齢者の心疾患は死因の最上位にあり、重症化することで治療の選択肢が限られる。この解決のための一手段が幹細胞移植による心筋再生による治療法の確立であるといえる。そこで本研究では、この課題に取り組むための疾患モデル動物を作製し、評価することで、ヒトの心疾患病態での幹細胞移植の安全性・有効性の適切性につなげていくことを目指している。これまで、若齢、老齢マウスに心筋梗塞を作製し、超音波評価などによる評価系をほぼ確立した。一方で、心筋梗塞部位への幹細胞移植のソースとしての幹細胞の樹立・培養に関しては単離、培養ともに順調に開始し、問題なく進めている。今後は疾患モデルへの移植を進めていく。心筋梗塞モデルマウス作成において、負荷を最小限として再現性のよい技術をほぼ確立できた。さらに梗塞後の組織再生の動向をモニターする技術基盤を確立し、いくつかの評価について検討することができた。特に今後、若齢、高齢マウスとの比較やリハビリテーションによる効果を比較する際の実験を進行するのに、重要な技術であるため、技術基盤づくりが進んでいることは一つの成果といえる。今後生理学的な評価を加えることで、多角的な面で適切な疾患モデルを構築していくとともに、幹細胞移植治療の最適化にむけた細胞生着率向上につながる研究へと進めていく。若齢マウス、老齢マウスともに梗塞モデルマウスの作製は、生理学的評価をすることによって客観的にその精度を再現よく実施できるようになりほぼ確立した状況にあり、現在進行している実験を円滑に進めるよう引き続き継続してデータ収集にあたる。特にモデルマウスの作製後、組織再生の違いに関する比較・検討についても、分析を進める予定である。幹細胞移植を行う上で、移植する最適な環境を評価する上で重要であると考え、その評価法を含めて検討を進めていく。実験開始以降は、心筋梗塞モデルマウス作製、細胞培養ともに円滑に進んでいることから、精度の高い実験を継続する。看護学今回確立した手法を用いて若齢マウスでの梗塞モデルマウスにおける基本データを取得していく。これをもとに老齢マウスによる疾患モデルを作成し、若齢との比較を行っていく。特にモデルマウスの作成後、組織再生の違いを検討するとともに、運動を伴うリハビリテーションによる効果に関する実験を展開したいと考えている。また、細胞移植後の生理学的評価を経時的に行うために、超音波を用いた評価技術を確立するとともに、組織学的評価を行いながら、細胞移植のタイミングや移植法などを検討していく。本年度中に実験が開始したが、実験動物及び試薬等の購入を行った際に、試薬の廃版等があり、新たな試薬の使用内容などを確認しながら購入を進め、残額が生じた。初年度ということもあり、第一に心筋梗塞モデルマウスを作成する技術基盤を成立する必要性があったことから、形態的評価などを行いながら慎重に進めたので、費用をすべて使用せずに遂行した。また、段階的に組織評価すべき切片を切り出し、糖たんぱく質レベルで評価できるかの検討を先に手がけているため従来の実施計画とは、異なる経過となり、本年度予定から来年度への費用移行すべき部分が生じた。次年度にも引き続き実験動物及び試薬等の追加購入を行う必要性があり、これらの購入等及び従来の予算用途内容の執行にあてる予定である。
ＰｉｒＢ関連マルチリガンドによる新しい免疫抑制

免疫系細胞におけるNogoやMHC-IなどのPirB(ヒトのLILRB)リガンドによる免疫制御の機構を解明し,免疫疾患の治療方法の開発に応用する計画を進めた。その結果,NogoはGRAMD4と会合し,PirBとは独立にTLR9を制御することを発見し,またヒトB1細胞として報告があったCD43+B細胞はそのLILRB発現プロファイル解析,サイトカインや抗体産生解析,転写因子解析などからB1細胞と考えるよりもMemory B細胞とプラズマブラストの中間的な性質を持つ,プレプラズマブラスト様の細胞と考えられ,ヒトB細胞の分化過程に新規な細胞を位置付けることができた。我々は免疫抑制受容体PirBを発見しこれがMHCをリガンドとして免疫疾患の発症を制御することなどを報告してきた。最近PirBが神経軸索伸長の抑制をも担い,神経系リガンドとして新たに三種のタンパク,Nogo,MAG,OMgpが報告された。よってこれらマルチリガンド(ML)は多様な免疫系の情報を,PirBを含めて二三の受容体に集約させるネットワークを構築すると想定され,我々は実際に免疫系にも上記の新リガンドが発現することを突き止めた。本研究はMLの視点から,PirBが担当するものと協調,あるいは独立に機能する複数の新しい免疫制御経路を探索しそれを同定することを目的として研究を行っている。平成25年度はNogo欠損マウスの表現型を解析し,PirB欠損,MHCI欠損との整合性を評価した。またヒト末梢血単核細胞中のとりわけB細胞に発現するPirBヒト相同分子であるLILRBの発現解析,ならびに抗体産生に関わるプラズマブラストなどへの分化段階をこのLILRBの発現プロファイルなどから追跡できるか否かについて検討を加えた。その結果,Nogo欠損マウスではとりわけマクロファージのトル様受容体の制御にPirBとは独立にNogoによる調節システムが存在することが明らかとなり,現在その分子機構を解析中である。またヒト末梢血中のB細胞の解析においては,自己抗体産生の活性があると指摘されたCD19+CD20+CD27+CD43+のB細胞画分自体は同定されたものの,この表面マーカー的な性質は極めてメモリーB細胞に近似し,また抗体産生活性は有しないことが明らかとなり,マウスB1細胞様の集団とされた報告は正しくなく,メモリーB細胞と極めて近似した集団であると結論付けた。平成24年度はNogo欠損マウス,MAG欠損マウスの表現型を解析し,PirB欠損,MHCI欠損との整合性を評価する計画を立てた。さらにB,T,樹状細胞の分化と抗体クラススイッチ制御,自己抗体産生,アレルギー,自己免疫疾患を中心にした解析を行い,これらB/T/樹状細胞関連の制御についてMLによる新しい機構の存在を明確にする試みを行った。その結果,Nogo欠損マウスでは骨髄プレプロB,プレB,および成熟B細胞の有意な増加が見られ,さらに胚中心の形成が野生型マウスと比べて亢進しているデータが得られた。これを支持する観察として胚中心B細胞とプラズマ細胞の増加傾向が見られた。これらの観察結果に基づきPirB欠損マウスのこれら項目におけるデータとの比較を行っており,とりわけB細胞の分化制御にPirBとNogoがそれぞれ独立に,あるいは部分的に共通の経路を介して影響を及ぼしていることが示唆され,そのシグナル伝達経路などに関する更なる解析を行っている。レティキュロンファミリータンパクであるNogoや膜タンパクであるMHC-Iなど多様な免疫系の情報をPirBがいかに集約させているのかを解析し,またNogoの免疫系における役割を解析することで疾患制御に結びつく成果を目指した。A)実際に免疫系にもNogoが発現することを突き止めた。さらにT細胞やB細胞よりもマクロファージでの発現が顕著であった。Nogoの細胞内局在は圧倒的に小胞体に集中しており,細胞膜上にそのほとんどが発現しているPirBとは異なるものであった。したがってNogoがPirBを介さずに自然免疫応答を制御するか否かにその解析の主眼を移し,主に核酸認識系のTLR受容体の制御におけるNogoの役割を検討した。

その結果,Nogoは小胞体においてTLR9がエンドリソソームに移行する輸送経路において何らかの調節を行うことでTLR9応答を支援していることが分かった。Nogoが欠損するとTLR9応答は顕著に低下した。B)次にNogoに小胞体において会合するタンパク質分子を網羅的に探索した結果,いくつかの候補分子がピックアップされたが,その中でも機能が未知なGRAMD4が明確にNogoと会合しており,TLR9の経路を複合体として制御していることが見出された。これらの成果はTLR9経路の制御について新しい分子と知見を提供しており,最近論文発表も完了し,自然免疫応答の理解に貢献することができた。C)ヒト免疫系でのPirB(ヒトではLILRBと呼ばれる)制御の解析により治療への展開に途を拓く目的で,ヒト末梢血B細胞上に発現するLILRBのプロファイルを解析した。その結果,新たなB細胞サブセットとして注目されたCD43+B細胞はLILRBや転写因子の発現パターンから,メモリーB細胞とプラズマブラストの中間に位置づけられる細胞集団であることを解明し,論文発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学(免疫学)26年度が最終年度であるため、記入しない。PirBのマルチリガンド(ML)的な性質を分子レベルで解明し,その応用としてヒト疾患につながる成果を得る目的の一連の過程において,当初の計画どおり順調に成果が得られていると考える。計画どおりNogo欠損マウス,MAG欠損マウスの解析を開始し,そのうちNogo欠損マウスにおいて当初の期待どおりB細胞などに興味深い表現型が得られることが明確になったため。さらにMAGについては神経系ではPirBのリガンドとなる報告があるものの,免疫系,とりわけB細胞や樹状細胞の解析結果ではMAG欠損マウスについて特段の表現型を認めず,Nogoとの違いが明確になったためである。OMgp欠損マウスについては入手先の同意が得られず解析については中断しており,これは計画を見直す必要があった。以上のようにNogoについてPirBの制御経路との共通部分と相違部分が明確になる道筋が見え,今後の研究成果が期待される。最終年度である平成26年度は,明確かつ次期につながる成果を得て取りまとめるため,とりわけ注力する課題として,PirBのヒト相同分子であるLILRBの,B細胞をはじめとした白血球上での発現やMHCI,Nogo,さらには未知リガンドなどを生理学的,病理学的な側面から解析,同定することで自己免疫疾患患者の新規治療に結びつく技術開発を進め,自己免疫疾患の制御を目指す。現在,材料は準備できており,推進に滞ることはないと考える。当初の計画どおり平成25年度はアレルギーおよび自己免疫疾患におけるPirB, Nogoの役割に関する解析を欠損マウスを用いて進める予定である。とりわけ自己免疫疾患における胚中心の役割とその構成B細胞,T細胞の相互作用の研究は重要であり,このポイントを特に推進したいと考える。
HIRAーヒストン複合体の立体構造解析に基づいたヌクレオソーム構造変換機構の解明

真核細胞生物のゲノムDNAは、数種類のピストンとの複合体であるヌクレオソーム構造を形成して核内にコンパクトに収納されている。このヌクレオソーム構造は、物理的、化学的損傷からDNAを保護する一方で、転写などのDNA上で起こる反応を抑制している。従って、生体内には遺伝子発現の要不要に応じて、特定の領域のヌクレオソーム構造を破壊したり再形成させたりする分子機構が存在する。しかし、その分子機構の詳細は未だ不明である。本研究では、ヒストンシャペロンHIRAがCIAと協調的に機能してヌクレオソームの再形成に関与するという知見に基づいてmRA一ヒストンーCIA複合体の立体構造を明らかにし、クロマチン構造変換の分子機構の解明を目指す。昨年度の研究から田RAを大腸菌で発現することができることがわかったので、本格的にHIRAの大量発現、精製系の確立に取り掛かった。その結果、ニッケルカラムとイオン交換カラムを用いることで、かなり高純度のmRAを2Lの大腸菌培養液からmgのレベルで精製することに成功した。次に、HIRAとピストンH3.3/H3.1などとの複合体の構造解析を行う上で必要なヒト由来ピストンH3.31H3.1などの大量発現系の確立を行った。発現は大腸菌で行った。この際、大腸菌における低頻度コドンを高頻度コドンに置換し効率のよい発現を目指した。H3.1-H4およびH3.3-H4の共発現系をそれぞれ作成しタグ精製を行ったところ、両者ともに複合体を精製することができた。以上述べた通り、田RAに加えピストンH3.1-H4,H3.3-H4複合体の精製に成功したので、今後はこれらの複合体をさらに組み合わせて結晶化をはじめとする物理化学解析を行っていく予定である。真核細胞生物のゲノムDNAは、ヒストンとDNAにより構成されるヌクレオソーム構造を形成して折り畳まれており、転写などのDNA上で起こる反応は抑制されている。従って、生体内には遺伝子発現の要不要に応じて、特定の領域のヌクレオソーム構造を離合集散させる分子機構が存在するが、その分子機構の詳細は未だ不明である。本研究では、ヒストンシャペロンHIRAがCIAと協調的に機能するという知見に基づいてHIRA-ヒストン-CIA複合体の立体構造を明らかにし、クロマチン構造変換の分子機構のさらなる解明を目指す。HIRA-ヒストン-CIA複合体の立体構造を明らかにするにあたって、HIRA・ヒストン・CIAの精製蛋白質が大量に必要である。ヒストン及びCIA蛋白質については既に大量発現系が確立していたので、本年度はHIRA蛋白質の大量調製系の立ち上げに集中した。様々な大腸菌発現用ベクターを試みた結果、pCold系ベクターにHIRAを組み込んで発現を行なった場合に最も良好な発現が観察された。ここで得られた発現蛋白質については、現在、大量発現・大量精製を進めている。なお、HIRAは分子量が大きいことから、大腸菌での発現よりもバキュロウィルスでの発現が良好であることが想定されたが、実際には大腸菌による発現の方が良好な結果であった。次年度は精製したHIRA蛋白質を用いて、HIRA-ヒストン複合体またはHIRA-ヒストン-CIA複合体の結晶化、X線結晶構造解析に取り組む予定である。
拡散性シグナル因子ホモセリンラクトンの大腸菌における合成系と作用系の解析

グラム陰性細菌の一部で、動植物への浸入、感染の初期過程にみられる菌体濃度依存的転写誘導は、拡散性化学シグナルとLuxRファミリーによる細胞間情報伝達系によって制御されている。大腸菌からも、LuxRホモローグSdiAが細胞分裂装置遺伝子ftsQAZに特異的な正の転写因子として報告されている。我々はSdiAがftsQAZ以外の何らかの酵素の発現も制御しているのではないかと考えた。そしてSdiAの過剰発現によって細胞内に27kDaのタンパク質が顕著に蓄積することをみつけた。アミノ酸配列を決定したところ、このタンパク質は一次胆汁酸脱水素酵素7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることが明らかとなった。そこでこの酵素の構造遺伝子hdhAを小原ライブラリーよりクローン化し、hdhA-lacZフュージョンによる解析とノーザン解析を行った。その結果、hdhAの総転写量は対数増殖期から定常期への増殖相移行に伴って2030倍に増加し、しかもhdhAの転写誘導はSdiAだけでなく増殖定常期特異的σ因子(σ38)にも依存していることが明らかとなった。さらにプライマー伸長法により、両因子は互いに34bp離れたプロモーターから別々に転写を制御し、対数増殖期にはSdiA依存的な転写が増加し続け、定常期突入直前で急速に減少、かわってσ38依存性の転写が一過的に起こっていることが示唆された。SdiA自身の発現はσ38に全く依存しないが、rpoS欠失株では対数増殖期のSdiA依存的なhdhAの転写量が増加した。化学シグナルの存在証拠は得られなかったが、SdiAとσ38による転写の独立二重制御はftsQAZでも機能しており、細胞分裂装置と二次胆汁酸合成酵素の発現が、増殖相の移行、もしくは細胞濃度上昇によって同様に転写制御されていると思われ、腸内環境における適応応答系の一例であることが期待される。今後、転写活性化の分子機構と二重制御の生理的意義についてさらに解析を進めたい。
ニューサービス契約の特質と法律関係の明確化

(1)サービス取引法の通則に関する研究として、(1)サービス契約の類型化、(2)類型に応じて当該契約における債務確定の方法、(3)サービス欠陥ないし履行不完全の判定方法、(4)サービス債務の不履行を理由とする債権者の救済手段などを追及した。その研究を通じて、サービス欠陥とこれにあたらない場合とを区別する必要があること。また、債務不履行を判定する基準を従来のように一本化するのではなく、債務の性格ごとに立てていく手法をとることが重要と考えられる。(5)契約当事者については、サービス契約で不合理な差別が生じやすく、その是正について論及した。(2)また、契約交渉前に事業者は相手方に必要な情報を提供すべきか否かという問題は、近時にわかに浮上してきた通則に属する一課題である。そこで、この点についてサービス契約のうち、社会的信用のある事業者による契約と目されている銀行取引と損害保険取引と中心に情報提供(説明)義務の根拠、範囲、違反の効果を明らかにする作業を行なった。基本的には約款を作成した事業者の上に、重要事項について一般的にその事項を相手方が了知できる状態に置くことに加えて、当該サービス商品の危険性などがあるとき特別の説明義務を認めるという二段階方式を採用すべきことを提言した。(3)各論の研究としてはプリペ-ドカードをめぐる法律問題を追及し紛争解決のあり方を明らかにしている。このほか、メディア関連領域で生じた遠隔地取引のトラブルに対し現行法にもとづき評価をくだすとともに現行法の不十分性を指摘し、自己規制の強化および規制立法の必要性を提言した。本年度はニューサービス契約法研究の初年度として、(1)通則的課題一題と(2)各論領域から二題を探究したほか、(1)にかかわるサービス給付の確定に関して判例の検討を行っている。(1)通則的課題として契約当事者にかかわる問題のうち、国籍、性別など先天的事由にもとづく契約拒否がサービス契約において散見されるところから、契約拒否と契約自由の関係および公序良俗則の適用を検討した。サービス契約においてこの種の問題事例が生ずるのは、物売買にあっては当事者双方に物と銭の取得に重点があるのに対して、サービス契約は、給付の性質と当事者の属性に意味をもつ場合が多いということも、本課題をとりあげた理由である。(2)カード関連法のうち、プリペイド・カードに関する法律関係の明確化を追及するため、関係事業者からの聞き取り調査等を実施するとともに、内外の関係図書の収集・検討を進めてきた。今後さらに、これらの作業を進めるとともに、課題についての検討と分析を推し進め、中間総括および成果の取りまとめへとつなげたい。(3)また、近時、社会問題化しているテレマーケティングを通じての契約をとりあげることにしたが、テレマーケティング事業の規制は、産業支援と消費者保護のはざまに位置する問題である。そこで、これをいかに規制するかについては海外の動向を参照しつつ検討を行ったが、訪問販売法の改正による業法的規制が予測されるなかで、民法典の改正を通じて私法的規制を行うことが今後の課題となるものと考えられる。(4)顧客から事務の処理を依頼された専門家が負う債務の範囲をどう確定するか、また、無償契約においては義務が軽減されてよいかという問題を税理士の債務不履行を問題にした判決の検討を通じ明らかにする作業を行った。その研究を通じて、サービス欠陥とこれにあたらない場合とを区別する必要があること、また、債務不履行を判定する基準を従来のように一本化するのではなく、債務の性格ごとに立てていく手法をとることが重要と考えられる。

(2)また、契約交渉前に事業者は相手方に必要な情報を提供すべきか否かという問題は、近時にわかに浮上してきた通則に属する一課題である。そこで、この点についてサービス契約のうち、社会的信用のある事業者による契約と目されている銀行取引と損害保険取引を中心に情報提供(説明)義務の根拠、範囲、違反の効果を明らかにする作業を行なった。基本的には約款を作成した事業者の上に、重要事項について一般的にその事項を相手方が了知できる状態に置くことに加えて、当該サービス商品の危険性などがあるとき特別の説明義務を認めるという二段階方式を採用すべきことを提言した。(3)各論の研究としてはプリペ-ドカードをめぐる法律問題を追及し紛争解決のあり方を明らかにしている。このほか、メディア関連領域で生じた遠隔地取引のトラブルに対し現行法にもとづき評価をくだすとともに現行法の不十分性を指摘し、自己規制の強化および規制立法の必要性を提言した。
サル同種肺移植モデルを用いた安全で確実な拒絶反応モニタリレグ法の開発に関する研究

現在肺移植においては、拒絶反応の早期診断と感染症との鑑別が術後の患者管理上もっとも重要な問題となっており、より確実な診断法が必要とされている。最近、胸部外科の領域では胸腔鏡を利用した内視鏡手術が急速に普及しつつある。この胸腔鏡を用いた場合、開胸手術をせずに移植肺全体像を観察することができ、直視下に十分量の組織標本を採取することができる。また、術後疼痛の程度は小さく呼吸筋機能を温存でき、加えて合併症の頻度は低く入院日数も短いとされていることから移植後急性期の患者のみならず、外来患者にたいしても過大な侵襲を加えずに済む利点がある。このような理由から本研究では、ヒトに近い霊長類であるニホンザルを用いた左肺同種同所性移植実験モデルを作成し、胸腔鏡を用いた拒絶反応の早期診断と進行度の確実な判定の可能性を検討した。今回の実験結果より、ごく初期の拒絶反応は胸部X線写真上の所見及び肺表面の肉眼所見の変化から推定することは困難であり、肺生検による組織診断がもっとも確実であることが示された。しかしながら、肺移植後の急性拒絶反応の進展様式は移植肺全体として均一ではないことが判明し、その診断には移植肺全体の観察が重要であると示唆された。早期の拒絶反応は、適切な治療によりほぼ完全に寛解し得ることから、他の検査法によっても診断が困難であり、臨床的に急を要する場合は、胸腔鏡を使用した移植肺全体の観察と複数部位からの組織標本の採取によって、迅速に拒絶反応と感染症の鑑別及び拒絶反応の進行度の正確な診断を行なうことは、肺移植後の患者管理上において有効な手段となりうる可能性があるものと考えられた。また、胸腔鏡下肺生検操作による気漏及び出血は、胸腔鏡観察下に処理できることから、安全な手技であることが確認された。日本ザル2頭を用いて左肺同種移植実験を行った。移植術後は免疫抑制剤は用いず、拒絶反応の自然経過を観察することとした。また、抗生剤による化学療法を強力に施行して感染を極力抑制した。移植3日後、1週後、10日後、2週後の計4回にわたり胸腔鏡を施行し、移植肺表面の肉眼所見の変化、胸水貯留の有無、および胸腔内の癒着の程度を観察した。観察終了後に移植肺の生検を行い、標本をただちにホルマリン固定して染色標本を作成し、組織学的検討を行った。また、胸腔鏡検査と同時に施行した胸部X線写真所見と移植肺組織所見との相関も検討した。この結果、早期拒絶反応は肺表面の肉眼所見の変化および胸部X線写真上の所見のみから推定することは困難であり、複数部位からの肺生検による診断がもっとも確実であることが示唆された。また、懸念された移植手術および胸腔鏡の施行による胸腔内の癒着は軽度であり、胸腔鏡操作によって十分に剥離できるものであった。これらの実験結果により、肺移植後の急性拒絶反応の進展様式は均一ではないことが判明し、急性拒絶反応の診断には移植肺全体の観察が重要であると考えられるとともに、胸腔鏡を使用した移植肺の観察と胸腔鏡下での移植肺の複数部位からの組織標本の採取は、拒絶反応と感染症の鑑別診断および拒絶反応の進行度の診断上安全で有用な方法であることが確認され、肺移植後の患者管理上極めて意義がある手技であると考えられた。ニホンザル8頭を用い、計4回の左肺同種同所性移植実験を行なった。免疫抑制は特に施行しなかった。

全レシピエントに対し移植後2,4,7,10,14日目の計5回にわたり、全身麻酔下に右側臥位にて胸腔鏡下移植肺観察を施行した。肋間より胸腔内にアプローチしたのち、硬性鏡を挿入し移植肺の肉眼所見の変化、胸水貯留、及び胸腔内の癒着の程度を観察し、併せて肺生検を行った。その結果、第2病日では、全レシピエントにおいて、移植肺表面はほぼ移植直後と同様の状態であった。組織学的には全例早期拒絶反応であるGrade 1であり、小血管周囲の単核球の浸潤を認めるものの肺胞構造は十分保たれていた。第4病日における観察では移植肺表面の小出血斑と島状の色調変化部分が認められた。組織所見では4例中3例でGrade 2となり、小血管周囲の単核球浸潤がより高度となり、肺胞壁への浸潤もみられたが、胸腔鏡下観察にて、色調がより正常に近い他の部位の生検標本の中にはGrade 1のものも証明されるなど、同一肺葉内でも部位により拒絶反応の進行程度に差が認められた。また、全例において胸腔鏡下肺生検施行に伴う出血、気漏などの合併症は特に認められなかった。今回の実験結果より、胸腔鏡手技を用いた場合、開胸手術をせずに移植肺全体像を観察することができ、しかも近距離で光源で照らしながら局所の拡大ができることから、移植肺の詳細な観察と確実な組織標本の採取が可能であることが判明した。また、ごく初期の拒絶反応は胸部X線写真上の所見及び肺表面の肉眼所見の変化から推定することは困難であり、肺生検による組織診断がもっとも確実であることが示された。しかしながら、肺移植後の急性拒絶反応の進展様式は移植肺全体として均一ではないことが判明し、その診断には移植肺全体の観察が重要であると示唆された。
腸内細菌叢は運動と成体海馬神経新生をつなぐミッシングリンクか?

近年、腸内細菌叢が脳機能に関わっていることが認識され、研究が急速に広まっている。興味深いことに、運動に伴って腸内細菌叢の変化が起こることも報告されている。我々は、豊かな環境による成体海馬神経新生の促進には、歯状回のコンドロイチン硫酸の増加が関わっていることを最近の報告で明らかにしたが、そのメカニズムは未解明のままである。これらを踏まえ我々は、マウスを用いた動物実験により、「運動は腸内細菌叢の中間代謝物を介して間接的に神経新生を促進する」との仮説に基づく分野横断的な検討に取り組む。本研究によって、運動による成体海馬神経新生の促進に腸内細菌叢が関与するメカニズムが明らかになると考えられる。
食道原発神経内分泌癌における分子生物学的サブクラスの同定と治療標的分子の探索

日本神経内分泌腫瘍研究会多施設共同プロジェクト研究として「食道原発神経内分泌癌におけるマイクロRNA発現プロファイルを用いた分子生物学的サブクラスの同定と治療効果予測分子マーカーセットの探索」を開始した。これは根治手術が施行され食道原発神経内分泌癌と診断されている症例を対象にFFPEブロックからRNAを抽出しマイクロアレイを用いてマイクロRNA発現を解析する研究である。アンケート調査にてJNETS参加26施設から合計70例の登録見込みとなり、2018年度末時点で13施設の倫理審査委員会で承認され、10施設から合計24症例のサンプルおよびCRFを回収した。24例の年齢(平均±SD)は62±6.6歳、性別(男/女)は18/6例、TNM分類(Stage1/2/3/4)は5/9/7/3例、組織型(smallcell/largecelltype)は21/3例、組織型の混在(なし/SCC/Adeno/SCC+Adeno)は15/6/2/1例、術前化学療法施行5例、術式(食道亜全摘/胃全摘下部食道切除)は23/1例、術後化学療法9例、術後観察期間中央値は35カ月(1-173カ月)、予後(無再発生存/再発生存/原病死/不明)は13/1/9/1例、術後再発までの期間(平均±SD)は9.5±6.4カ月、術後原病死までの期間(平均±SD)は18.1±13.5カ月であった。21例のFFPEブロックを用いて癌部から平均15.1μg、非癌部から3.0μgのRNAを抽出した。多施設共同研究として症例を登録しているが、現時点では当初目標の33.3%の症例登録にとどまっている。引き続き各施設での倫理委員会承認および症例登録を促していくとともに、既に抽出したRNAを用いたマイクロRNA発現解析を進めたい。現時点では当初目標の33.3%の症例登録にとどまっているが、切除後の予後の二極化が確認でき、今後の症例蓄積によって分子生物学的サブクラスの同定が可能になるものと期待される。多施設共同研究としてサンプル収集を進めているが、症例登録が遅れているため、RNA抽出と網羅的遺伝子解析が次年度にずれ込むため、次年度使用額が生じた。
精神神経疾患患者で見いだされたSLITRK1変異体の病態生理的意義の解明

本研究課題はおおむね目的を達成した。しかし、より高インパクトファクターの雑誌への投稿も視野にいれ、当初の計画には無かった分子基盤に関する研究を含めることで分子から個体まで一貫した研究成果として発表することを目指している。誌上発表は、2019年度を目標として投稿の準備を進めている。まず、Slitkr1のノルアドレナリン作動性神経の発達に関しては、遺伝子欠損マウスの免疫組織学的解析と子宮内電気穿孔法による皮質への過剰発現系などによりその関与を明らかにした。また、同時に精神疾患の患者由来のミスセンス変異体についてもその機能解析をおこない部分的な機能異常を発見した。ノルアドレナリン作動性神経の生後発達皮質への導入実験でもその機能が野生型と比較して統計学的に有意な異常が検出された。これまでのSlitrk1欠損マウス行動などの知見と併せて、本研究の成果から不安や抑うつなどの気分障害の発症についてノルアドレナリン作動性神経の発達などの点から原因の一つになる可能性が考えられる。本研究の過程で、明らかになったSlitrk1のノルアドレナリン作動性神経の発達に対する作用は、生後発達過程においてきわめて重要な位置を占めていることが推察される。これまでノルアドレナリン作動性神経の脳内での軸索誘導誘導や投射制御に関して知見は少ない。本研究による成果は当初の計画以上に神経発達を解明する上できわめて貴重な発見となった。そこで、安易に発表せず、分子メカニズムに関する実験をおこなったうえで発表することで、より注目度の高い雑誌を狙えるものと考えている。研究はおおむね順調に進んでいる。Slitrk1欠損マウスにおいてノルアドレナリン作動性神経の異常を発見するとともに、ヒトSLITRK1を子宮内電気穿孔法により導入することでも神経発達に異常が生じることを見いだした。しかもこの神経発達の異常は行動異常が顕在化する時期にすでに統計上有意であり、既知の機能であるシナプス形成についての異常が明確になるよりも早期に発現する。既報のノルアドレナリン含量の結果や、薬剤投与による効果なども含めて自発行動を制御する出生後の脳の発達において重要な役割を果たしていると考えられる。現在、ヒト変異体を導入した際の神経発達について野生型と比較する実験をおこなっている。また青斑核を含む領域の初代培養をもちいた系においてもSLITRK1が突起伸展に影響を及ぼす結果を得ている。結合タンパク質の解析からエンドサイトーシスに関与する可能性が考えられたため、とくにクラスリン依存性の小胞の形成について検討をおこない、SLITRK1がクラスリン陽性の小胞形成に関与していることを示す結果を得ている。SLITRKファミリーはその名前の由来から細胞内ドメインがTrk受容体と相同性が高いが、Trkシグナルの受容において活性化するリン酸化ERKについて検討したところ、SLITRK1がこのシグナルの活性化に関与することを示す結果を得ている。一方で、L1ファミリーについても初代培養細胞をもちいた実験によりSLITRK1との結合が突起伸展へ作用することを示唆する結果を得ており、さらなる追究をおこなう予定である。初代培養をもちいた実験についてはほぼ計画通り実施しているが、一部トレース実験については当初から困難が予想されていたが、分解や生理活性などの点で実施を断念している。その一方で、子宮内電気穿孔法をもちいた系に関しては変異体の解析に取りかかっており、予定を繰り上げて実施している。しかし、一部で計画の変更などがあり、専門誌上での発表という成果までは到達していない。その理由として当初の計画を一部変更して実施している点が挙げられる。トレース実験については、困難が予想されていたため実施を断念した一方、電気穿孔法による変異体の機能解析については野生型との違いを発見した。これまでの実験結果などから、神経細胞における変異体の機能解析はおおむね完了している。しかし、不安や抑うつなどの症状にいたるメカニズムを理解するため、Slitrk1欠損マウスの解析をおこなう必要があると考え、実験を追加し、分子基盤の理解を深めるための生化学的な解析についても解析を追加することとしたため、専門誌への投稿という形には至っていない。追加した部分については、症状の顕在化する以前の出生直後の動物を対象に、モノアミン作動性の神経について解析をおこなった。その結果、きわめて強い形態学的な神経発達の異常が観察された。また、変異体の機能異常をもたらす分子基盤として、L1ファミリーとの相互作用の変化を発見しているが、それについてもより生化学的な解析を進めることを計画している。変異体における野生型との機能比較についてはおおむね完了しているが、様々な行動異常につながる神経生理学的な理解に向け、Slitrk1欠損マウスの出生直後のモノアミン作動性神経の解析を追加した。また、Slitrk1とL1ファミリーとの相互作用についてもより精密な生化学的解析をおこなう計画を追加したため、専門誌への発表という目標へはまだ到達していない。しかし、上記の実験は研究の質を高める上で有益であると考えた、本研究課題はおおむね目的を達成した。

また、同時に精神疾患の患者由来のミスセンス変異体についてもその機能解析をおこない部分的な機能異常を発見した。ノルアドレナリン作動性神経の生後発達皮質への導入実験でもその機能が野生型と比較して統計学的に有意な異常が検出された。これまでのSlitrk1欠損マウス行動などの知見と併せて、本研究の成果から不安や抑うつなどの気分障害の発症についてノルアドレナリン作動性神経の発達などの点から原因の一つになる可能性が考えられる。本研究の過程で、明らかになったSlitrk1のノルアドレナリン作動性神経の発達に対する作用は、生後発達過程においてきわめて重要な位置を占めていることが推察される。これまでノルアドレナリン作動性神経の脳内での軸索誘導誘導や投射制御に関して知見は少ない。本研究による成果は当初の計画以上に神経発達を解明する上できわめて貴重な発見となった。そこで、安易に発表せず、分子メカニズムに関する実験をおこなったうえで発表することで、より注目度の高い雑誌を狙えるものと考えている。現状においてSlitrk1の新たな機能であるノルアドレナリン作動性神経の発達に対して生体および試験管内での実験からその作用を示すことができたと考えている。変異体の解析も順調に進んでいることから、可能な限り早期の投稿と論文発表を目指して行きたい。今後はモノアミンについてより詳細な解析をおこなうことで、Slitrk1の機能異常がどのようにして不安や抑うつといった症状につながるのか明らかにする。また、L1ファミリーとの相互作用について生化学的な解析を加えることで分子的な基盤についても記述した論文として当初の計画よりも注目度の高い雑誌への投稿を狙っていく計画である。交付決定が10月であり、予算執行期間が短かったため。交付決定が初年度の10月からであり当初の計画よりも予算の執行開始が遅れたため半年分ほど全体に順送りされている。最終年度は、新たに開始した実験などもあるため、予算の執行が可能であると思われる。今後、抗体やいくつかの高額な試薬を購入する計画があるためその購入に予算を使用する。
未利用微生物資源を探索源とする自然免疫制御物質の創出

独自に構築した自然免疫の活性化を検出するための評価系を用いて,未利用微生物を中心とした天然資源についてスクリーニングを行った.その結果,terresterolおよびTM-DIF-1といった自然免疫制御物質を得ることができた.また,これまでの研究で得られていたgonytolide Aおよびaspergillicin Fといった自然免疫制御物質について,その合成法を確立するとともに,各種誘導体の合成も行った.さらに,自然免疫抑制物質celastramycinについて,そのビオチンラベル化体を利用した標的分子の同定を試みた.1.天然資源からの自然免疫制御物質の探索ショウジョウバエを利用した自然免疫活性の評価系を用いて,未利用微生物を中心とした各種天然資源についてスクリーニングをおこなった.今年度は特に,未利用微生物・細胞性粘菌の分化誘導因子として知られている化合物DIF-1とその誘導体に対してスクリーニングを行った.その結果,DIF-1には選択的な作用はみられなかったが,そのフェノール性水酸基をメチル化した誘導体TM-DIF-1に濃度依存的かつ選択的な自然免疫抑制作用を見出した.2.単離した化合物を基盤とした活性誘導体の創製と活性化合物の自然免疫制御機構の解明以前の研究で自然免疫増強作用を示す糸状菌由来化合物gonytolide Aが得られている.この構造を基盤としてさらに多くの誘導体の合成を行い,その自然免疫に対する作用を検討した.その結果,不斉中心を分子中に含まないように設計したビスクロモン型化合物ならびにビスフラボン型化合物が,gonytolide Aとほぼ同程度の自然免疫増強作用を示すことが明らかとなった.強力な自然免疫抑制作用を示す放線菌由来化合物celastramycin Aについて,ビオチン-ストレプトアビジン間の強力な相互作用を利用した標的分子の同定を目的として,ビオチン化された誘導体の合成をおこなった.この化合物をショウジョウバエ由来S2細胞に作用させ,その細胞の溶解液をストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズによって精製した.得られた精製後タンパク質の電気泳動を行った結果,ビオチン化された誘導体を作用させた場合でのみ検出されるバンドが60 kDa付近に得られた.このバンドがcelastramycin Aの標的タンパク質に相当すると考えられる.独自に構築した自然免疫の活性化を検出するための評価系を用いて,未利用微生物を中心とした天然資源についてスクリーニングを行った.その結果,terresterolおよびTM-DIF-1といった自然免疫制御物質を得ることができた.また,これまでの研究で得られていたgonytolide Aおよびaspergillicin Fといった自然免疫制御物質について,その合成法を確立するとともに,各種誘導体の合成も行った.さらに,自然免疫抑制物質celastramycinについて,そのビオチンラベル化体を利用した標的分子の同定を試みた.1.天然資源からの自然免疫制御物質の探索ショウジョウバエを利用した自然免疫活性の評価系を用いて,昆虫寄生糸状菌・卵菌・ツボカビなどの未利用微生物を中心とした各種天然資源についてスクリーニングをおこなった.その結果,卵菌の一種Saprolegnia terrestrisより新規ラノスタン型化合物terresterolを自然免疫応答増強物質として単離した.本化合物の構造は,絶対構造も含め,各種スペクトルデータと化学構造変換により決定した.Terresterolは10 μg/mL以上で濃度依存的に自然免疫増強作用を示すことが明らかとなった.2.単離した化合物を基盤とした活性誘導体の創製以前の研究で,糸状菌由来環状デプシペプチドaspergillicin Eを自然免疫応答増強物質として同定していた.そこで,種々の生化学実験を行うのに必要な量を確保するとともに,種々の誘導体合成への展開を目指し全合成を行うことにした.その結果,aspergillicin Eの合成を達成したが,合成品と天然物の1H NMRスペクトルを比較したところ,L-allo-isoleucineに対応するシグナルの化学シフトにわずかな違いが見られた.したがって,天然より得られた化合物はaspergillicin Eではなくその立体異性体であることが推測された.一方,強力な自然免疫応答抑制作用を示す放線菌由来化合物celastramycin Aについて,各種誘導体の合成を行った結果,ベンゼン環上の塩素原子をメチル基に変換した化合物CeAMeがより強力な作用を示すことが明らかとなった.研究実績の項で記したように,研究目的の一つである「天然資源からの自然免疫制御物質の探索」に関しては,未利用微生物である卵菌の一種から自然免疫応答増強作用を有する新規化合物を同定することができた.また,「単離した化合物を基盤とした活性誘導体の創製」に関しても,これまでに得られた自然免疫応答制御物質の全合成,ならびに誘導体合成を実施することができた.したがって,本研究は当初の予定通り順調に進展していると言える.今後も,本研究の目的が達成できるよう,研究計画にもとづいて推進していく予定である.特に,今年度も実施していた研究目的である「天然資源からの自然免疫制御物質の探索」と「単離した化合物を基盤とした活性誘導体の創製」に加えて,「活性化合物の自然免疫制御機構の解明」についても実施し,これまでに得られた自然免疫応答制御物質の標的分子の解明等をおこなっていく予定である.次年度使用額は,今年度の研究を効率的に推進したことにより発生した未使用額であり,平成24年度請求額と合わせて次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である.
S.cerevisiaeのポリガラクツロナーゼ生産突然変異体の解析

我々のグループは酵母Saccharomyces cerevisiaeのほとんどの株で発現が抑制されているポリガラクツロナーゼの生産突然変異体を単離している。本研究課題では、このポリガラクツロナーゼ遺伝子発現抑制機構解明のため生産突然変異株の解析した。昨年度は突然変異株のポリガラクツロナーゼ遺伝子の解析と四分子解析による遺伝学的解析から、ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現抑制因子についての情報を得た。本年度はこの因子についての解析を進め、次のような成果を得た。(1)ポリガラクツロナーゼ遺伝子発現抑制に関与する遺伝子のクローニングにおいて、欠損変異相補クローニングでネガティブスクリーニングとなることを回避するため、まずポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現制御領域とlacZ遺伝子の融合遺伝子(PSM1-p:lacZ)を構築した。この融合遺伝子を変異株および野生型株に形質転換し、変異株では青コロニーを、野生型株では白コロニーを生じることを確認した。これによりlacZ遺伝子を指標した発現抑制因子の遺伝子クローニングを行うポジティブスクリーニング系が確立できた。(2)比較検討のためS.cerevisiae以外の酵母についてポリガラクツロナーゼ遺伝子を検索し、kluyveromyces属酵母2種より遺伝子をクローン化した。これらの遺伝子について塩基配列を決定し、S.cerevisiaeの遺伝子と比較すると、構造遺伝子の領域では約60%の相同性が認められたが、プロモーターを含む発現制御領域では相同性が少なく、Kluyveromycesのポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現制御機構はS.cerevisiaeのそれとは異なることが示唆された。今後、両ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現制御領域の機能的な差異を検討する必要がある。1.我々のグループは、酵母Saccharomyces cerevisiaeが元々ポリガラクツロナーゼ産生能を有するにもかかわらず、ほとんどの株でホリガラクツロナーゼ遺伝子の発現が抑制されていると考え、S.cerevisiaeのポリガラクツロナーゼ生産突然変異体を単離した。本研究は、単離されたポリガラクツロナーゼ産生突然変異体の分子遺伝学的解析によりS.cerevisiae内で休止状態にあるポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現機構を解明する事を目的とする。本年度は次のような成果を得た。(1)ポリガラクツロナーゼ発現突然変異体はすでに1株単離されているが、遺伝解析のためにより多くの突然変異体の単離を試みた。アルキル化剤を用いた変異誘導により新たに4株のポリガラクツロナーゼ発現変異体を単離した。変異体の中には温度感受性のものがあり、その培養のため、備品として低温恒温器を購入した。得られた突然変異体と親株のポリガラクツロナーゼ遺伝子を比較したところ、両者は完全に一致した。このことからポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現変異はトランスに作用する因子に起こっていることが示唆された。(2)得られたポリガラクツロナーゼ生産突然変異体の遺伝解析を行った。申請ではテトラッド顕微鏡を備品として購入するとしたが、交付額が申請額より減額されたためテトラッド顕微鏡の購入が不可能になった。そこで四分子(テトラッド)解析は、大阪市立大学理学部においてテトラッド顕微鏡を借用して行った。その結果、ポリガラクツロナーゼ遺伝子を発現させる変異は、単一の劣性変異に起因することが示唆された。現在この変異を持つ遺伝子のクローニングに着手している。(3)休止したポリガラクツロナーゼ遺伝子がS.cerevisiaeだけでなく、その他の酵母菌にも存在するかどうかを検索した。その結果、Kluveromyces属の酵母2種よりポリガラクツロナーゼ遺伝子を単離した。現在その解析と、S,cerevisiaeのものとの比較を行い、ポリガラクツロナーゼ遺伝子発現機構のより詳細な解析を行っている。
ヒメツリガネゴケのジテルペン型新奇生長ホルモンの同定と生合成に関する研究

本研究はヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のジテルペン型生長制御物質の生合成経路とその生理機能解明を目的としている。ヒメツリガネゴケは、顕花植物のもつジテルペン型植物ホルモンであるジベレリン類(GA)を生合成していない。しかしゲノムデータベースからGA生合成関連遺伝子ホモログが単離・機能同定され、生合成初期のGGDPからent-カウレンへの変換反応は多機能型環化酵素(PpCPS/KS)が触媒していること、PpCPS/KS欠損変異体(A74株)では原糸体成長に異常が見られること、ent-カウレン酸まで顕花植物と同様な経路を持つことなどが報告されている。これらのことを総合すると、ent-カウレン酸以降コケ特有な酵素・経路によりジテルペン型新奇生長制御物質を生合成していることが強く示唆されている。本年度はジテルペン型新奇生長制御物質生合成に関わる酵素遺伝子の発現調節機構と光形態形成に関して研究を進めた。赤色光、青色光下でのヒメツリガネゴケの生育に関する報告はあるが、ジテルペン型新奇生長制御物質が関与する光形態形成の制御機構に関する知見は無い。そこで、ヒメツリガネゴケ野生株とA74株の原糸体を各種光条件で培養を行い表現型と発現量を解析した。その結果、青色光を照射した場合は野生株で観察される原糸体の忌避応答がA74株では確認されなかった。この忌避応答はent-カウレン酸の投与により野生株と同様の応答に回復した。さらに、qRT-PCRを用いてWTにおけるPpCPS/KSの発現解析を行ったところ、PpCPS/KSの発現量は青色光処理で顕著に増加した。これらの結果は、ヒメツリガネゴケにおいてGA様新奇成長制御物質がent-カウレン合成の段階で光による制御を受け、特に青色光下での忌避反応に関与していることを示唆している。以上の結果をまとめ、植物科学系国際誌のPlantaに投稿し,掲載可となった。(抄録なし)本研究はヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のジテルペン型生長制御物質の生合成経路とその生理機能解明を目的としている。しかしゲノムデータベースからGA生合成関連遺伝子ホモログが単離・機能同定され、生合成初期のGGDPからent-カウレンへの変換反応は多機能型環化酵素(PpCPS/KS)が触媒していること、PpCPS/KS欠損変異体では原糸体成長に異常が見られること、ent-カウレン酸まで顕花植物と同様な経路を持つことを報告している。ent-カウレン酸以降コケ特有な酵素・経路によりジテルペン型新奇生長制御物質を生合成していることが強く示唆されている。本年度はまず、ent-カウレン酸を基質とする酵素遺伝子の同定を目標とした。生長制御物質の生合成に関わる酵素遺伝子を、ヒメツリガネゴケ野生株とPpCPS/KS欠損変異体のcDNAを用いたトランスクリプトーム解析で絞り込んだところ、候補遺伝子群として考えていたP450酵素ファミリーに属するいくつかの酵素遺伝子を絞り込み、全ての遺伝子をクローニングした。これら全ての遺伝子に関して、Pichia pastorisを用いた異種発現で組換え酵素を調製し、ent-カウレン酸を基質として酵素反応に供したが、GC・MSでの酵素変換生成物の同定は誘導体化や爽雑物の影響等で困難であった。そこで、酵素と基質の結合を分析できる実験系を立ち上げた。すなわち、酵素と基質の結合による酵素の構造変化を吸光度の変化で検出するものである。予備実験からスペクトル変化を観察することに成功した。現在入手が困難な基質化合物であるent-カウレン酸を酵素反応で調製しており、順次候補組換え酵素との結合を解析し、目的の酵素遺伝子をスクリーニングする。

さらに、qRT-PCRを用いてWTにおけるPpCPS/KSの発現解析を行ったところ、PpCPS/KSの発現量は青色光処理で顕著に増加した。これらの結果は、ヒメツリガネゴケにおいてGA様新奇成長制御物質がent-カウレン合成の段階で光による制御を受け、特に青色光下での忌避反応に関与していることを示唆している。以上の結果をまとめ、植物科学系国際誌のPlantaに投稿し,掲載可となった。次世代シーケンサによるバイオインフォマティックスの手法と、生化学的および植物分子生理学的な新しい研究手法を取り入れて研究を進めた。ent-カウレン酸を基質とする候補遺伝子も絞りこみつつある。候補遺伝子を決定できれば、その後の研究手法は確立されており、順調に展開できると考えている。現在までにent-カウレン酸を基質とする酵素の候補遺伝子として複数のP450酵素をクローニングし、組換え酵素を調製した。今後は基質化合物とP450酵素の特異的な結合を観察する実験系を確立したので、ent-カウレン酸を基質とする酵素のスクリーニングを行い、生成物の構造決定、生合成酵素欠損株への相補実験、加えて目的酵素遺伝子のノックアウトも行う予定である。(抄録なし)