hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳児と養育者の唱和にみる音楽の発達的起源

生後18ヶ月・24ヶ月児における他者との唱和(本研究では互いの声を積極的に重複させることを唱和とする)について、前年度に引き続き実験をおこなった。自由遊びの中で大人が乳幼児に声を重複させる条件と交替で応答する条件を設定し、それぞれの条件における乳幼児の発声パターンと表出された行動を分析した。重複条件では、音楽的要素を含む行動(リズミカルな反復・バンギングなど)が多くみられた。交代条件では、社会的働きかけ(リーチング、共同注意の乳幼児による開始、言語発話等)が多くみられた。4ヶ月児・12ヶ月児ではそのような条件の有意差はみられず、生後18ヶ月以降に現れる特徴と考えられた。生後18ヶ月以降に重複を許容する音声コミュニケーションの形式を理解する可能性が示唆された。次に保育施設において、唱和に類するコミュニケーションの観察をおこなった。多人数の乳幼児が過ごす保育施設では音環境にばらつきがあり、唱和のような音声コミュニケーションが音環境に関連する可能性が考えられた。そこで、音環境の詳細な評価と、それぞれの環境における唱和等の音声コミュニケーションの関連に焦点を当てて調査をおこなった。騒音計を用いて保育活動中の保育室の音圧レベルを測定し、音圧が特に高くなった場合におこなわれていた音声コミュニケーションを録音から分析した。その結果、複数の園で、音圧レベルが110回を上回る場合があり、その回数には園によって差があった。音圧レベルの高い音は高頻度で「多人数混在音声」によるものであり、唱和のような音声コミュニケーションが難しい状況であった。音環境により、利用可能な音声コミュニケーションの種類が異なる可能性が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。人が声を重ね合わせることには、集団のむすびつきを強める効果があるとされ、音楽との関わりも示唆されている。乳児と養育者との間では、しばしば声の重複が生じるが、これまでの解釈は主として会話分析の視点からなされることが多く、音楽との積極的な関わりについて実証的な研究は多くはない。また音楽的とされる音には、テンポラルなリズムだけでなく、音の重なりによるハーモニーという要素があるが、重なりのもたらす効果についても十分な検討はなされていない。先行研究で、共同で音楽創りに従事した4歳児は、協力的行動を顕著に多くみせた(Tomasello, 2010)。本研究では、言語獲得以前および獲得期にある乳幼児を対象に、乳幼児と大人の声が重複する状況を実験条件として設定し、それぞれの条件における乳児の発声パターンを探った。参加者:生後4ヶ月・12ヶ月・18ヶ月・24ヶ月の乳幼児。手続き:ぬいぐるみ等のある乳幼児調査室において、乳児と調査者が下記の二条件で各10分間の自由遊びをおこない、その音声と行動を記録した。1重複条件:調査者が子どもの発声に対し即時応答で声を重ねる。2交替条件:調査者が子どもの発声に対して適当な間を取りターンテイキングの形で応答する。結果: 18ヶ月児・24ヶ月児において、重複条件で音楽的要素を含む行動(リズミカルな反復・バンギング等)が多くみられ、交替条件で社会的働きかけ(リーチング、乳幼児からの共同注意の自発、言語発話等)が多くみられた。4ヶ月児では、そのような条件差はみられなかった。12ヶ月児のデータは現在分析中である。これらの結果から、言語獲得およびコミュニケーション形式の理解が進む過程で、重複するコミュニケーション形式への理解と利用が起きている可能性、また重複の形式で音楽的要素に関連する可能性が示唆された。生後4ヶ月から24ヶ月の乳幼児を対象に、自由遊びの中で大人が乳幼児に音声を重複させる条件および交替させて応答する条件を設定し、それぞれの条件における乳幼児の発声パターンを探った。参加者:生後4ヶ月・12ヶ月・18ヶ月・24ヶ月の乳幼児、各18名。手続き:ぬいぐるみ・積み木などの玩具のある乳幼児調査室において、乳児と調査者が下記の二条件で各10分間の自由遊びをおこない、その際の乳幼児の音声と行動をビデオで記録した。重複条件では、調査者が子どもの発声に対し即時応答で声を重ねた。交替条件では、調査者が子どもの発声に対して適当な間を取りターンテイキングの形で応答した。どちらの条件でも、大人の発声内容は、対象児の直前の発声を模したものとした。各条件の順序は被験者間でカウンターバランスをとった。結果: 18ヶ月児・24ヶ月児において、重複条件で音楽的要素を含む行動(リズミカルな反復・バンギング等)が多くみられた。また交替条件では、社会的働きかけ(リーチング、乳幼児からの共同注意の自発、言語発話等)が多くみられた。一方、より低月齢の4ヶ月児と12ヶ月児では、そのような条件の差は有意ではなかった。これらの結果から、12ヶ月から18ヶ月の間の、言語獲得およびコミュニケーション形式の理解が進む過程において、音声が重複するコミュニケーション形式への理解が発達している可能性、また重複の形式が音楽的要素の発生に関連する可能性が示唆された。1.生後24ヶ月の乳幼児20名を対象に、唱和に関する実験を実施した。手続き:乳幼児調査室において、乳児と調査者が下記の二条件で各10分間の自由遊びをおこない、その際の乳幼児の音声と行動をビデオで記録した。重複条件:調査者が子どもの発声に対し即時応答で声を重ねた。

交替条件:調査者が子どもの発声に対して間を取り応答した。ビデオから、リズミカルな反復、指さし・共同注意などの行動の頻度を分析した。結果:重複条件で音楽的要素を含む行動、交替条件で社会的働きかけが多くみられた。前年度に調査した4ヶ月児と12ヶ月児では、そのような条件の差は有意ではなかった。言語獲得およびコミュニケーション形式の理解が進む過程において、音声が重複するコミュニケーション形式への理解が発達している可能性、また重複の形式が音楽的要素の発生に関連する可能性が示唆された。本研究の結果は、国内学会で発表した他、現在Journal of Behavioral Developmentに投稿中である。2.24ヶ月児と年上のきょうだいの自然なインタラクション場面をもとに、音声重複が積極的に起きる場面を分析した。手続き:小型のビデオカメラ等を用いて、家庭における2歳児と年上のきょうだいの自然なインタラクションを、家族が随時ビデオカメラで撮影した。結果:50%程度の音声重複が継続することが頻繁にみられ、その中では一定の音楽的な特性を共有されていた。今回得られたような持続時間と音楽的展開は、幼いきょうだいとの間に限ってみられた。きょうだいとの間で発声が即興的に音楽的コミュニケーションへと展開しやすいことが示唆された。実験データの取得を完了した。実験結果の成果報告については、予備的なデータに関する論文を投稿したほか、各月齢の発声・行動分析結果をまとめた論文の執筆を進めた。視線計測データは装置の不備・時間的な制限から行動計測を優先したことなどから、十分な数のデータを得られなかったが、行動データから仮説を支持する結果を得ることができた。また、フィールド観察についても順調にデータを収集し、事例分析を進めることができた。以上から、一部のアプローチを除いて、おおむね順調に進展していると言える。生後18ヶ月・24ヶ月児における他者との唱和(本研究では互いの声を積極的に重複させることを唱和とする)について、前年度に引き続き実験をおこなった。自由遊びの中で大人が乳幼児に声を重複させる条件と交替で応答する条件を設定し、それぞれの条件における乳幼児の発声パターンと表出された行動を分析した。重複条件では、音楽的要素を含む行動(リズミカルな反復・バンギングなど)が多くみられた。交代条件では、社会的働きかけ(リーチング、共同注意の乳幼児による開始、言語発話等)が多くみられた。4ヶ月児・12ヶ月児ではそのような条件の有意差はみられず、生後18ヶ月以降に現れる特徴と考えられた。生後18ヶ月以降に重複を許容する音声コミュニケーションの形式を理解する可能性が示唆された。次に保育施設において、唱和に類するコミュニケーションの観察をおこなった。多人数の乳幼児が過ごす保育施設では音環境にばらつきがあり、唱和のような音声コミュニケーションが音環境に関連する可能性が考えられた。そこで、音環境の詳細な評価と、それぞれの環境における唱和等の音声コミュニケーションの関連に焦点を当てて調査をおこなった。騒音計を用いて保育活動中の保育室の音圧レベルを測定し、音圧が特に高くなった場合におこなわれていた音声コミュニケーションを録音から分析した。
野外爆発実験を利用したソニックブーム乱流変調シミュレーション

本研究では、野外爆発実験で発生する衝撃波の背後の圧力変動に対する、人為的に発生させた速度場の乱れの影響についての定量評価データを得るシミュレーション実験手法を開発した。雷薬0.51gを紙筒内に充填し、電気導火線で着火し爆発させることで衝撃波を生成し、送風機、ダクト部、格子から構成される乱流源からの風向きを,衝撃波と対向するように設置した。爆点から6000 mm、格子から爆点側に500 mmの同一平面内にマイクロホンを4台設置し多点測定した結果、乱流による過剰圧ピーク値の変動が±40%以上にも達することが示され、空間的にもランダムな箇所で変調が起こることが実証された。本研究は、野外爆発実験で発生する衝撃波の背後の圧力変動に対する、人為的に発生させた速度場の乱れの影響について、圧力ピーク値のアンサンブル平均および標準偏差を取得することによって、ソニックブームに対する大気乱流の影響についての定量評価データを得るシミュレーション実験手法を確立することを目的として行われた。特徴として、計測地点にてほぼ平面とみなせる衝撃波を対象とすることができるため、小規模実験でできなかった乱流領域伝播距離の影響を調べることができ、しかも実際のソニックブーム条件であり衝撃波管では精密に制御することが困難な、背後過剰圧力が大気圧の1/10001/100程度の弱い衝撃波を対象にすることができた。当初予定していた陸上自衛隊矢臼別演習場での実験は経済産業省の参画許可が下りなかったため、実験は産業技術総合研究所安全科学研究部門(茨城県つくば市)にて実施された。雷薬0.51gを紙筒内に充填し電気導火線で着火し爆発させることで衝撃波を生成し、送風機、ダクト部、格子(10×10 mm2角,間隔50 mm,開口比64%)から構成される乱流源からの風向きを,衝撃波と対向するように設置した。爆点から6000 mm,格子から爆点側に500 mmの同一平面内にマイクロホン(4939-A-011, Brüel & Kjær)を4台(CH1CH4)を対称に設置し、乱流中を伝播してくる衝撃波の圧力波形を多点測定した。その結果、乱流による過剰圧ピーク値の変動が±40%以上にも達することが示され、空間的にもランダムな箇所で変調が起こることが実証された。航空宇宙工学
アミロイドβの毒性発現に係わるメチオニンラジカルの硫黄３３固体ＮＭＲによる研究

33S標識したメチオニンとシステインを33S硫黄単体から有機合成した。さらに、アルツハイマー病因ペプチドであるアミロイドβの35番目のメチオニン残基の硫黄原子を33Sで標識した。合成した33S標識メチオニンの33S固体の核磁気共鳴(NMR)シグナルを初めて観測した。また、メチオニンスルホキシドの33S溶液NMRシグナルを高感度・高分解能で観測することに成功した。アルツハイマー病の原因物質である42残基のアミロイドβ(Aβ42)の神経細胞毒性発現には、35番目のメチオニン残基(Met-35)の硫黄原子のラジカル化が深く関わっている。本研究では、Aβ42凝集体におけるMet-35の硫黄原子の状態を33S固体NMRにより精密に解析し、ラジカル化機構を明らかにすることを目的としている。昨年度、本研究代表者はメチオニンの硫黄原子を33Sで標識することにより、感度が悪いながらも33S固体NMRシグナルを検出することに成功した。本年度は、ラジオ波の照射パワーや繰り返し時間などの測定条件の検討を行ったが、感度と分解能を向上させることができなかった。その原因として、33Sの四極子相互作用が5 MHz程度と極めて強いため、線幅が非常に太くなることが考えられる。現在の固体NMR技術では感度と分解能の更なる改善は望まれないと判断した。そこで、分子運動により線幅が細くなる溶液NMRを用いた研究を行うことにした。まず、モデル化合物として四極子相互作用が比較的弱いメチオニンスルホキシドの33S標識体を化学合成し、33S溶液NMRを測定した。その結果、200 Hz程度の細い線幅のNMRシグナルを得ることに成功した。今後は、33S標識メチオニン、続いて33S標識Aβ42の溶液NMR測定を行う予定である。また、本研究で確立した33S標識法を用いて、含硫アミノ酸であるシステインやシスチンの硫黄を33Sで標識する合成法も確立した。現在、含硫生体分子として知られているタウリンの合成を行っており、これらのアミノ酸の合成法と33S溶液NMRを論文としてまとめる予定である。本研究では、33S固体NMRを用いてAβ42凝集体におけるMet-35の硫黄原子の状態を精密に解析し、ラジカル化機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、Aβ42凝集体の33S固体NMR法の確立を目指した。33Sの天然存在比は0.76%しかないので、Aβ42のMet-35の硫黄原子を33Sで標識することにより、33S-NMRの感度向上を図る。本研究代表者は昨年度に、33S単体からL-メチオニンを合成することに成功している。本年度は、33S標識メチオニンを用いてAβ42の固相ペプチド合成を行った。ポリエチレングリコールをスペーサーとしたポリスチレン樹脂を固相担体とし、HATUを活性化剤として用いたFmoc法を連続フロー型合成機で行うことにより、Aβ42を高収率で合成した。得られたAβ42の粗ペプチドをHPLCにより高純度に精製し、リン酸緩衝液中、37°Cでインキュベーションすることにより、線維状の凝集体であるフィブリルを調製した。合成した33S標識メチオニンを用いて33S固体NMRスペクトルを測定した。33S-NMRの感度を向上させるため、1Hの大きい磁化を33Sに移す偏極移動法を用いた。その結果、感度が非常に悪いながらも、メチオニンの33S固体NMRシグナルを検出することに初めて成功した。測定サンプル、即ち33S標識メチオニンおよびAβ42の合成は完了しているが、33S固体NMRの測定法の確立が難航している。33Sはスピン量子数3/2の四極子核であるため、四極子相互作用により線幅が広くなることが知られている。メチオニンの硫黄原子の四極子相互作用の強度を計算した結果、5MHz程度と予想より遥かに強く、ピークの線幅が極めて広くなることが示唆された。以上の理由から、33S-NMRシグナルを検出することには成功したものの、Aβ42凝集体に適用可能なほどの感度と分解能を達成できなかった。33S固体NMRの感度と分解能が非常に悪いため、解析可能なほどのシグナルを得るのに時間がかかってしまい、十分な測定条件検討が行えていない。そこで、硫黄原子の電子密度の偏りが小さく、四極子相互作用が比較的弱いメチオニンスルホンをモデル化合物として用い、ラジオ波の照射パワーや繰り返し時間などの測定条件の最適化を行う。

同時に、NMRプローブのコイルを極低温に冷却することにより、絶対感度の向上を目指す。確立した測定条件および測定法を用いて、33S標識メチオニン、続いて33S標識Aβ42の33S固体NMR測定を行う。Aβ42凝集体の高分解能かつ高感度な33S固体NMRスペクトルが得られるようになったら、Aβ42のラジカル化機構の研究を行う。Cu2+やZn2+などの金属イオンがAβ42のラジカル化を促進することが報告されているので、これらの金属イオン存在下で調製した33S標識Aβ42の硫黄原子の状態を33S固体NMRにより解析する。一方で、四極子の影響が弱くなる溶液での33S-NMR測定を計画している。化学合成したメチオニンもしくはメチオニンスルホンを重水に溶解して33S-NMRの測定を行う。将来的には、タンパク質中のメチオニンだけでなく、システイン及びシスチンの硫黄原子の状態の解析を視野に入れているので、33S標識したシステイン及びシスチンの有機合成を行う。33S標識したメチオニンスルホン、システイン、シスチンの有機合成は、東北大学薬学研究科において本研究代表者が行う。33S固体NMRの測定は、共同研究者の竹腰清乃理教授(京都大学理学研究科)が所有する固体高分解能NMR装置(磁場: 14テスラ)とクライオMASプローブを用い、測定・解析は共同で行う。研究経費は、33S標識に用いる33S硫黄単体、ペプチド合成試薬、HPLCカラム、固体NMR用サンプル管の購入に充てる。また、33S固体NMRの共同研究先である京都大学での研究打ち合わせや国内学会での成果発表、関連学会での情報収集のための旅費を計上している。
通所型高齢者施設の施設類型再編成とネットワーク計画に関する研究

本研究は,高齢者デイセンタ,デイサービスセンタ,デイケアセンタなどの各施設系(通所型高齢者施設と総称する)を横断的に対象とし,建築計画と都市計画の専門家が協同して,1)高齢者類型毎に適切な処遇・サービスを受けられるための新たな施設類型の再構築・体系化のための分析を行う,2)最小の移動負担,最適な送迎サービスシステムによって各高齢者が必要とするサービスが受益できるネットワークシステムを立案する,などを具体的な目標に置いて行なったものである.2年間の調査・分析の結果を総合し,次のような研究成果をとりまとめた.(1)デイケア,デイサービス施設の利用者のADL属性を総合的に分析し,その障害の程度等から主要な類型を見いだす分析を行った.(2)デイケア,デイサービス施設利用の実態を終日観察調査の方法で把握し,プログラムへの受動的,能動的参加などの行動特性の観点から通所型高齢者施設利用者の類型化を行った.以上から,デイサービス,デイケアの施設類型の再編成の可能性について,具体的な考察を行った.(3)多摩ニュータウン,東京世田谷区などの特定地域を対象として取り上げ,将来人口推計に基づいて,利用圏分析,施設選択の可能性,最適施設配置のシミュレーションなどを行った.(4)以上から,通所型高齢者施設の施設配置,ネットワーク計画の在り方について,具体的な可能性の検討を行った.本研究は,高齢者デイセンタ,デイサービスセンタ,デイケアセンタなどの各施設系(通所型高齢者施設と総称する)を横断的に対象とし,建築計画と都市計画の専門家が協同して,1)高齢者類型毎に適切な処遇・サービスを受けられるための新たな施設類型の再構築・体系化のための分析を行う,2)最小の移動負担,最適な送迎サービスシステムによって各高齢者が必要とするサービスが受益できるネットワークシステムを立案する,などを具体的な目標に置いて行なったものである.2年間の調査・分析の結果を総合し,次のような研究成果をとりまとめた.(1)デイケア,デイサービス施設の利用者のADL属性を総合的に分析し,その障害の程度等から主要な類型を見いだす分析を行った.(2)デイケア,デイサービス施設利用の実態を終日観察調査の方法で把握し,プログラムへの受動的,能動的参加などの行動特性の観点から通所型高齢者施設利用者の類型化を行った.以上から,デイサービス,デイケアの施設類型の再編成の可能性について,具体的な考察を行った.(3)多摩ニュータウン,東京世田谷区などの特定地域を対象として取り上げ,将来人口推計に基づいて,利用圏分析,施設選択の可能性,最適施設配置のシミュレーションなどを行った.(4)以上から,通所型高齢者施設の施設配置,ネットワーク計画の在り方について,具体的な可能性の検討を行った.本研究は、高齢者デイセンタ,デイサービスセンタ,デイケアセンタなどの各施設系(通所型高齢者施設と総称する)を横断的に対象とし,建築計画と都市計画の専門家が協同して,1)高齢者類型毎に適切な処遇・サービスを受けられるための新たな施設類型の再構築・体系化のための分析を行う,2)最小の移動負担,最適な送迎サービスシステムによって各高齢者が必要とするサービスが受益できるネットワークシステムを立案する,などを具体的な目標に置いて行っているものである.本年度は,2年度継続研究の前段階として,次の2つの視点からの調査・分析を行なった.(1)東京都・台東区,多摩市,熊本県・玉名市,富山県・宇奈月町の計4自治体において,^<1)>デイケア,デイサービス事業の実態を把握するヒアリング調査,^<2)>高齢者通所施設利用者の地域分布に関する資料収集調査,^<3)>デイケア,デイサービス施設における活動内容・運営プログラムに関する観察調査,の3つを行った.(2)東京都多摩市・多摩ニュータウン地域を対象とし,^<1)>小地域ごとの将来25年間の高齢化推計,^<2)>これに基づいた高齢者通所施設の需要量推計,^<3)>施設利用者の施設利用圏分析,^<4)>以上に基づいた21世紀近未来における高齢者通所施設の最適ネットワーク計画の策定と提案,の4つの研究・分析を行った。以上を総括し,都市部における通所型高齢者施設の再編成計画,ネットワーク計画について予備的な知見を整理しつつあるが,後段(次年度)の郊外部,農山村部を対象とした研究方針について立案を行っている.本研究は,高齢者ディセンタ,ディサービスセンタ,ディケアセンタなどの各施設系(通所型高齢者施設と総称する)を横断的に対象とし,建築計画と都市計画の専門家が協同して,1)高齢者類型毎に適切な処遇・サービスを受けられるための新たな施設類型の再構築・体系化のための分析を行う,2)最小の移動負担,最適な送迎サービスシステムによって各高齢者が必要とするサービスが受益できるネットワークシステムを立案する,などを具体的な目標に置いて行なったものである.昨年度の調査・分析結果を踏まえつつ,今年度新たに行った調査・分析の結果と合わせ,次のような研究成果をとりまとめた.(1)ディケア,ディサービス施設の利用者のADL属性を総合的に分析し,その障害の程度等から主要な類型を見いだす分析を行った.(2)ディケア,ディサービス施設利用の実態を終日観察調査の方法で把握し,プログラムへの受動的,能動的参加などの行動特性の観点から通所型高齢者施設利用者の類型化を行った.以上から,ディサービス,ディケアの施設類型の再編成の可能性について,具体的な考察を行った.

(3)多摩ニュータウン,東京世田谷区などの特定地域を対象として取り上げ,将来人口推計に基づいて,利用圏分析,施設選択の可能性,最適施設配置のシミュレーションなどを行った.(4)以上から,通所型高齢者施設の施設配置,ネットワーク計画の在り方について,具体的な可能性の検討を行った.
糖鎖の細胞認識能を利用した制癌剤の選択的配送システムの開発

細胞膜上に存在する糖鎖レセプターの認識を利用した薬物の標的細胞への選択的運搬を期待して、糖鎖を導入した高分子プロドラッグに関する研究を行った。まず、ポリリンゴ酸やポリエチレングリコール(PEG)をキャリヤ-として、制癌剤アドリアマイシン(ADR)と共に細胞認識能を有する糖鎖を担持したコンジュゲートおよび多糖をキャリヤ-としたコンジュゲートの合成を行い、1)ポリリンゴ酸、およびPEGにADRと糖鎖を担持したコンジュゲート、2)リソソーム酵素感受性ペプチドスペーサーを介してADRを担持したCM-キチンおよびCM-N-アセチル-a-1,4-ポリガラクトサミンコンジュゲート、を得た。続いて合成されたコンジュゲートからの薬物放出挙動および制癌活性を評価し、高分子プロドラッグという手法による糖鎖の細胞認識能を利用した制癌剤の選択的薬物配送システムについての基礎的検討を行ない以下の様な結果を得た。1)各種高分子プロドラッグの水溶液中でのでの分子状態を光散乱法などにより解析したが、分子集合体などの形成は認められなかった。2)非酵素的、酵素的条件下での高分子プロドラッグからの薬物放出挙動をHPLC法で解析した。特にオリゴペプチドスペーサーを介してADRを担持したコンジュゲートでは、リソソーム酵素存在下でのみ薬物の効果的な放出が確認された。3)糖鎖を有する高分子プロドラッグの種々の腫瘍細胞に対する細胞毒性を検討したところ、ガラクトースを有するコンジュゲートでは、ガラクトースレセプターを有するヒト肝癌細胞に対する選択的な細胞障害活性が発現することが確認され、糖鎖認識を介した選択的な取り込みが起こっていることが示唆された。4)マウスなどを用いた動物実験における制癌活性は現在検討中である。細胞はその膜上に特定の糖鎖に対するレセプターを有している。例えば肝実質細胞にはガラクトースレセプターが存在する。従って、この糖鎖の細胞認識能を利用すれば、糖鎖を薬物の標的細胞への選択的運搬のための認識素子としての応用が期待できる。低分子薬物をキャリヤーポリマーに担持させて高分子プロドラッグとすることで制癌剤の副作用が抑制されることが期待できる。本研究では、この高分子プロドラッグに糖鎖による細胞認識能を賦与し、標的細胞へのより効果的な薬物運搬を達成することを目的とする。平成5年度は、生体内分解吸収性高分子であるポリリンゴ酸や6-O-カルボキシメチル-N-アセチル-alpha-1,4-ポリガラクトサミンおよびポリエチレングリコール(PEG)をキャリヤーとして、制癌剤アドリアマイシン(ADR)と共に細胞認識能を有する各種の糖鎖をこれら高分子に担持したコンジュゲートの合成を試みた。その結果、以下に示すような高分子/ADR・コンジュゲートの合成に成功している。1)ポリリンゴ酸にADRと糖鎖を担持したコンジュゲート2)片末端にADRを、もう片末端に糖鎖をもつPEGコンジュゲート3)リンソーム酵素感受性ペプチドスペーサーを介してADRを担持したマ-6-O-カルボキシメチル-N-アセチル-alpha-1,4-ポリガラクトサミン・コンジュゲートなお、これら合成コンジュゲートはいずれも水溶性であり、静注が可能な高分子プロドラッグへの展開が期待できる。平成5年度に合成された糖鎖と制癌剤アドリアマイシン(ADR)とを同時に担持した高分子コンジュゲート、および多糖にADRを担持したコンジュゲートからの薬物放出挙動を調べ、更にそれらの制癌活性を評価することにより、高分子プロドラッグという手法による糖鎖の細胞認識能を利用した制癌剤の選択的デリバリー・システムについての基礎的研究を行なった。1)各種高分子プロドラッグの水溶液中でのでの分子形態・会合状態を光散乱法および蛍光法により解析したが、他の報告にあるような分子集合体などの形成は認められなかった。

2)非酵素的、酵素的条件下での高分子プロドラッグからの薬物放出挙動をHPLC法で解析した。特にオリゴペプチドスペーサーを介してADRを担持したCM-キチン/ADR・コンジュゲートにおいては、リソソーム酵素存在下でのみ薬物の効果的な放出が確認され、特定の酵素に応答した薬物放出が可能であることが示唆された。また、薬物結合様式をアミド、エステル、シッフ塩基結合と変化させることで、pH感受型のリリースパターンが得られることが分かった。3)糖鎖を有する高分子プロドラッグの種々の腫瘍細胞に対する細胞毒性をin vitroで検討したところ、ガラクトースを有するポリリンゴ酸/ADR/ガラクトース・コンジュゲートおよびPEG/ADR/ガラクトース・コンジュゲートでは、ガラクトースレセプターを有するヒト肝癌細胞HLEに対する選択的な細胞障害活性が発現することが確認され、糖鎖認識を介した選択的な取り込みが起こっていることが示唆された。4)合成した各種高分子プロドラッグのin vivoでの制癌活性については、マウスを使用した動物実験の系で現在検討を行っているところである。
古気候・古環境の変動機構に関する研究計画立案

地球環境の変化が社会問題となっているが、このような環境変化は、過去にもさまざまな時間尺度や空間規模でおこっており、氷床、堆積物、樹木年輪等に記録されている。古環境の変遷の研究体制づくりを行うため、平成元年12月1415日、研究分担者が一同に会し、名古屋大学水圏科学研究所において、シンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、氷床、植生、堆積物等の自然の記録の解読、人間が残した記録の解析、古環境の数値モデリング等の現状をレビュ-し、今後の研究課題について検討した。特に、過去2000年および氷期一間氷期サイクルに焦点を合わせて、今後の研究体制を議論した。日本学術会議における地球圏一生物圏国際協同研究計画(IGBP)の検討に留意しながら、さらに1年間かけて研究体制づくりを行い、本研究を実施に移したい。シンポジウムの成果は、報告書として出版した。報告書では、氷床コアの年代測定、微量温室気体ガス濃度変化、同位体比変化、化学物質変化等に視点を置き、氷期一間氷期サイクルと環境変化との関係を明らかにした。植生の変化では、日本における年輪年代学の可能性について、木曽ヒノキを例にとり詳しく検討した。また、花粉分析による日本列島における植生変化史について概観した。深海堆積物による古海洋については、海洋における炭素循環を中心にして問題点をレビュ-した。日本の史料にもとづく歴史天候デ-タベ-スの現状と、それを用いた古気候復元の成果と問題点を探った。古気候のシュミレ-ションでは、欧米の数値モデルの紹介とその成果について概観し、日本における数値モデリングの現状と問題点について触れた。
軽運動および温熱処置が不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性に及ぼす影響

身体不活動の環境下では、筋の活動量が減少し、インスリン抵抗性が生じる。本研究では、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止・改善する手段として、AMPK活性化作用を有する軽運動と温熱刺激の効果を検証した。検証の結果、ギプス固定によって生じる筋のインスリン抵抗性を防止するには、ある一定レベル以上にAMPKを活性化させる必要があることが示唆された。不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性の防止には、不活動に陥る以前に、筋細胞内エネルギー不足(ATPやCrPの減少)によって活性化されるAMP依存性プロテインキナーゼ(AMPK)を活性化させることが有効である。しかしながら、AMPK薬理的活性化剤をヒトに投与することは現実的な処方ではない。そこで、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止するためにAMPK活性化作用を有する運動に着目した。本研究では、高齢者や身体障害者など不活動を余儀なくされる人々にも活用できることを考えて、より強度が低く時間が短い軽運動による不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性防止効果について検討することを目的とした。ラットに分速18mの速度で90分間の走行運動を負荷したところ、その後24時間のギプス固定によって不活動筋に生じるはずのインスリン抵抗性が防止できた。次に、分速18mの速度で45分間の走行運動を負荷して運動時間を短縮したところ、90分間の場合と同程度の効果が観察された。しかし、分速9mの速度で90分間の走行運動を負荷して運動強度を低く設定したところ、不活動誘発性インスリン抵抗性防止効果は観察できなかった。分速18mは分速9mの速度に比べてAMPK活性化レベルが高いと考えられることから、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性の防止には、不活動に陥る前に、ある一定レベル以上にAMPKを活性化させる必要があることが示唆された。現在、防止効果のあった運動条件においてその分子機序を検討している。分子機序のひとつとして、不活動によって生じた細胞内インスリン情報伝達酵素AktおよびAS160のリン酸化レベル低下が事前の運動によって抑制されているかどうか、引き続き調べていく。さらに、運動と同様にAMPK活性化作用を有する温熱刺激についても同様の検討を行っていく予定である。申請者は、現在までに筋細胞内のエネルギー不足(ATPやCrPの減少)を感知して活性化するAMP依存性プロテインキナーゼ(AMPK)の薬理的活性化剤(AICAR)を動物に投与すると、不活動誘発性の骨格筋インスリン抵抗性を防止できることを明らかにしている。そこで、本研究では、AMPK活性化作用を有する温熱刺激が不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止する可能性について検討を行うことを目的とした。ラットの後肢両側を水温42度の恒温槽中で30分間加温した後、後肢片側のみをギプスで固定し、その24時間後にヒラメ筋を摘出した(温熱処置群)。一方、対照群は水温を36度に設定し、その他の処置については温熱処置群と同様に行った(対照群)。インスリン非刺激時の糖取り込み速度を測定した結果、温熱処置群におけるギプス固定側の糖取り込み速度は対側に比べて82%減少し、対照群においても67%減少した。また、インスリン刺激時の糖取り込み速度については、温熱処置群におけるギプス固定側の糖取り込み速度が対側に比べて86%減少し、対照群は84%減少した。これらの結果から、ギプス固定によって筋活動量が減少したヒラメ筋には不活動誘発性のインスリン抵抗性が生じるが、たとえ、ギプス固定前の温熱刺激によってAMPKを活性化させても、ヒラメ筋に生じた不活動誘発性のインスリン抵抗性を防止することはできないことが示された。本研究では、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止する運動条件について、分速18mの速度では45分間の走行運動でその防止効果を観察することができた。一方、分速9mの速度では時間を長くしても防止効果を観察できなかった。これらの結果は、不活動誘発性インスリン抵抗性を防止するには、不活動に陥る前に、事前にある一定のレベル以上にAMPKを活性化させておくことが必要である可能性を示唆している。さらに現在、不活動に陥る以前に行うこれらの運動がどのような分子機序で防止効果を発揮するのか、ウェスタンブロッティングを用いて細胞内インスリン情報伝達酵素の活性を評価し、検討を進めている。このように、2012年度の主課題であった、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止する軽運動条件の検討を終え、その分子機序についても実験に着手していることから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。現在、不活動誘発性骨格筋インスリン抵抗性を防止する運動条件を絞り、その分子機序を明らかにする実験にも着手している。今後の研究では、分子機序解明のために、防止効果が確実に得られている運動条件において、細胞内インスリン情報伝達酵素AktおよびAS160リン酸化レベル低下が抑制されているかどうか、引き続き検討を進める。

また、運動と同様にAMPK活性化作用を有する温熱処置に着目し、不活動に陥る前に、事前に温熱刺激を加えることが、その後の不活動によって生じる骨格筋インスリン抵抗性を防止できるかどうか検討を行う。また、防止効果が得られた条件において、ウェスタンブロッティングを用いて細胞内インスリン情報伝達酵素の活性を評価し、その分子機序についても検討を行う予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
著明な骨量減少をきたすNedd4遺伝子欠損マウスの機能解析

我々は骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因病態解明のために、可変型遺伝子トラップ法により樹立したNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、Nedd4の骨代謝における機能を解析した。Nedd4欠損ホモマウスでは、μCT解析、骨形態計測、骨力学試験にて有意に骨量、骨強度の低下を認めた。骨組織像では1次海綿骨量の減少を認め、骨芽細胞は細胞質が少なく扁平な細胞形態を示し、ALP活性が低かった。遺伝子発現解析では骨芽細胞関連の発現が低下傾向にあった。培養骨芽細胞では、明らかに石灰化能が低下していた。したがって、Nedd4遺伝子は骨芽細胞機能制御において重要な機能を担っている可能性が考えられた。我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因・病態解明のために、『可変型遺伝子トラップ法』により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをデータベース『EGTC』(Database for the Exchangeable Gene Trap Clones, http://egtc.jp)に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築中である。現在このEGTCデータベースに登録したクローンから、特に骨軟骨にトラップした遺伝子の発現のみられるクローンを選別し、その遺伝子欠損マウスを作製して骨軟骨表現型および遺伝子機能を解析している。そのライブラリーマウスの中で、Nedd4 (neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene4)遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて著明な骨表現型異常を呈していた。しかしながら、これまでにNedd4遺伝子においてin vivoで骨代謝について報告例はない。ユビキチンリガーゼNedd4は多くの組織で発現している。これまで神経細胞、軟骨細胞の分化などに関与していることが報告されており、運動器全般の細胞分化や機能発現に関わっている可能性がある。今回我々が可変型遺伝子トラップ法で作製したNedd4トラップマウスは、体が小さく、マイクロCT検査では骨量の減少を認め、骨代謝にも関与している可能性が非常に高い。本研究ではNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能解析を目的としている。これまでの1次・2次スクリーニングの結果では、Nedd4は骨代謝において重要な機能を担っている可能性が考えられる。今回我々が可変型遺伝子トラップ法で作製したNedd4トラップマウスは体が小さく、マイクロCT検査では骨量の減少を認め、骨代謝にも関与している可能性が非常に高い。昨年度の結果から、Nedd4は骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。今年度は昨年度に引き続きNedd4欠損トラップマウス解析を施行し、2次スクリーニング(マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析)を個体数や計測時期を増やして解析を行った。現在我々は『可変型遺伝子トラップ法』によって単離されたトラップクローンを用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子群の効率的なスクリーニングによる骨軟骨疾患モデルマウスライブラリー構築に取り組んでいる。前述のEGTCデータベースを用いてそのライブラリーマウスの骨/骨髄組織に発現する遺伝子を検索したところ、Nedd4遺伝子でESTプロファイルが高スコア(Nedd4:835:bone 557, bone marrow 278)を示した為、Nedd4遺伝子トラップクローンからホモ・ヘテロ接合体マウスを作製し、骨軟骨表現型をスクリーニングしている。昨年度は、Nedd4欠損トラップマウスにおけるvector insertion point解析、ゲノム構造解析、導入遺伝子の組織発現(X-gal染色)解析、マウス個体の遺伝子型解析、出生率、体重、生存日数調査、大腿骨のマイクロCT解析の結果から、Nedd4は骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。Nedd4欠損トラップマウス表現型解析における結果は、ホモマウスはμCTにて著明な骨量減少を認め、骨形態計測では骨塩量、皮質骨厚や海綿骨厚、骨梁数が有意に減少し、骨力学試験でも有意に骨強度(最大点試験力)の低下を認めた。リアルタイムPCRではOsxやCol1a1、ALP、OCNの発現が有意に低値であった。大腿骨HE染色では1次海綿骨の減少を認め、骨芽細胞は細胞質が少なく扁平な細胞形態を示し、ALP染色を行うとALP活性が低かった。

今回のNedd4欠損マウスの解析により、Nedd4は骨芽細胞の機能発現に重要な機能を担っている可能性が高いと考えられた。我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因病態解明のために、可変型遺伝子トラップ法により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子群探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをEGTCデータベース(http://egtc.jp)に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築して、骨関節疾患に関与する新規遺伝子群の単離同定および機能解析を行っている。そのライブラリーマウスの中で、Nedd4遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて明らかな骨表現型異常を呈していた。これまでにNedd4遺伝子においてin vivoで骨代謝について報告例はないため、本研究ではNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能を解析した。Nedd4欠損ホモマウスでは、μCT解析、組織解析にて骨量減少を示す骨表現型を呈していた。骨形態計測では皮質骨厚や海綿骨厚が有意に減少し、骨力学試験でも有意に骨強度の低下を認めた。リアルタイムPCRではBMP2やRunx2、ALPなどの発現が有意に低値であった。組織像ではホモマウスにおいて、アリザリンレッド染色で1次海綿骨の減少を認めた。HE染色でも1次海綿骨の減少を認め、骨芽細胞は細胞質が少なく扁平な細胞形態を示し、ALP染色を行うとALP活性が低かった。マイクロアレイ解析結果は、Col1a1、Runx2の発現が低下していた。骨芽細胞培養解析においては、4W培養mRNAでは、Runx2、Col1a1、ALP、OCNの発現が低下傾向にあった。培養骨芽細胞のアリザリンレッド染色では、明らかに石灰化が低下していた。したがって、Nedd4遺伝子は骨芽細胞機能制御において重要な機能を担っている可能性が考えられた。我々は骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因病態解明のために、可変型遺伝子トラップ法により樹立したNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、Nedd4の骨代謝における機能を解析した。Nedd4欠損ホモマウスでは、μCT解析、骨形態計測、骨力学試験にて有意に骨量、骨強度の低下を認めた。骨組織像では1次海綿骨量の減少を認め、骨芽細胞は細胞質が少なく扁平な細胞形態を示し、ALP活性が低かった。遺伝子発現解析では骨芽細胞関連の発現が低下傾向にあった。培養骨芽細胞では、明らかに石灰化能が低下していた。
ヘパラナーゼの局在化によるヘパラン硫酸分解活性の制御と生体内の細胞交通の制御

免疫細胞におけるヘパラン硫酸、ヘパリンなどグリコサミノグリカンの分解は、血管外浸潤の調節、生理活性物質の切り出しや貯蔵などを通じて生物現象の制御に関与すると考えられるが、その詳細はわかっていない。ヘパラナーゼの多様な分子種とその活性に着目し、主にマスト細胞を題材にその細胞内分布と機能を検討した。マスト細胞にヘパラナーゼが高発現することを昨年度に見出した。今年度は種々のマスト細胞について発現を検討した。結合組織型マスト細胞には共通して強い発現が認められたが、粘膜型マスト細胞には検出されなかった。これはin vitroのマスト細胞の分化誘導培養系でも確認された。結合組織型マスト細胞はヘパリンを合成、蓄積するが、ヘパラナーゼの発現がこのヘパリンの発現に相関すると考えられた。マスト細胞株が外因性の前駆体ヘパラナーゼを取り込み顆粒内に蓄積すること、この過程でプロセシングによりヘパラナーゼを活1生型に変換すること、この結果生じる顆粒内ヘパリンの低分子化が顆粒内プロテアーゼの活性増強と相関することを見出した。ヘパラナーゼが顆粒内プロテアーゼの調節因子であるヘパリンを低分子化することにより、その活性調節に関与すること、つまりマスト細胞が顆粒内に保持する個々のエフェクター分子の活性を転写非依存的かつ包括的に支配する可能性のある分子であることを示した。ヘパラナーゼのプロセシングを細胞内で検出する系の確立を目指した。昨年度の抗ヘパラナーゼモノクローナル抗体のエピトープ解析結果を受け、種々の細胞における内在性ヘパラナーゼの細胞内分布を検討した。マスト細胞などの免疫細胞とメラノーマ、大腸がん細胞などのがん細胞の間で、複数のモノクローナル抗体に対する反応性の強弱が異なることを見出した。両細胞が異なる分子種を含む可能性を考え、生化学的な裏付けを試みている。免疫細胞によるヘパラン硫酸、ヘパリンなどグリコサミノグリカンの分解は、炎症時の血管外浸潤に伴う基底膜の通過、細胞外マトリクスに保持された生理活性物質の切り出し、さらに顆粒内における生理活性物質の貯蔵などに関与するものと考えられる。これらグリコサミノグリカンの分解を司る酵素としてヘパラナーゼに着目し、その細胞内分布と活性調節、病態への関与を検討した。昨年度に確立したマウスヘパラナーゼに対するモノクローナル抗体16種類の性状解析を行った。プロ型ヘパラナーゼを免疫原に用いたにも関わらず、確立された抗体はすべてプロ型・成熟型ヘパラナーゼの両方に結合した。また酵素活性の発現に重要なN末端側の(α/β)_8 TIM barrel構造に結合する抗体、C末端側に結合する抗体が見出され、少なくとも2種類のエピトープの存在が示された。得られた抗体による免疫組織染色の結果、マウスでは正常皮膚の真皮内にヘパラナーゼ高発現細胞が散在することを見出した。この皮膚の細胞は、細胞内に顆粒を有すること、toluidine blueによって染色されることから、皮膚に常在する結合組織型のマスト細胞であることが示された。腹腔常在性の細胞から取得したマスト細胞も同様にヘパラナーゼを高発現しており、特にその顆粒内に分布していた。これらの細胞が外因性のヘパラナーゼを効率よく取り込むことを見出した。ヘパラナーゼの発現抑制系として、GFP-ヘパラナーゼ蛋白質の発現抑制を指標として、ヘパラナーゼ発現を効率的に抑制するsiRNA配列の決定に成功した。骨髄細胞からサイトカイン依存的に分化させて調製したマスト細胞、もしくはマスト細胞株におけるヘパラナーゼの発現抑制を達成し、細胞内におけるヘパリンの断片化や顆粒内への生理活性物質の貯蔵、細胞の浸潤や生体内での体内動態などに対する影響を検討する予定である。

マスト細胞などの免疫細胞とメラノーマ、大腸がん細胞などのがん細胞の間で、複数のモノクローナル抗体に対する反応性の強弱が異なることを見出した。両細胞が異なる分子種を含む可能性を考え、生化学的な裏付けを試みている。
包括的地域保健データに基づく歯周病と全身疾患の関連に関する研究

歯周病の慢性化に関わる要因,および歯周病と全身疾患との関連を地域保健データに基づいて探索し,歯周病治療が全身疾患の病態の改善や医療費の削減に効果的であるか検証する。本研究の解析対象として,母子保健,学校保健,歯周疾患検診,特定健診および健康保険診療報酬明細を統合した包括的な地域保健データを構築する。対象地域は歯科医師会と医師会が研究会を組織した長野県松本市,そして信州大学医学部と地域連携協定を締結した長野県北安曇郡松川村と同東筑摩郡麻績村とする。医科歯科診療連携により歯周病の慢性化要因の解明と全身疾患との関連,歯周病治療による全身疾患の予防が可能か検証し,先進的な予防医療の立案と提言を目指す。
沖縄産マングローブ5樹種の組織培養に係る器官再分化法の検討

研究代表者と研究分担者は密接な連携を保ちながら研究計画に基づき研究を遂行し、次のような概要の結果を得た。1.沖縄県内に産するヒルギ科のオヒルギ、メヒルギ、ヤエヤマヒルギ、ミソハギ科のミズガンピ、アオイ科のオオハマボウの5樹種を研究材料に用いた。2.組織培養に用いた主な器官はオヒルギ、メヒルギ、ヤエヤマヒルギでは散布体(胎生種子)であり、胎生種子を形成しないミズガンピとオオハマボウでは種子を無菌的に発芽させた無菌苗であった。3.すべての供試樹種でカルスが誘導され、そのカルスは継代培養可能であった。4.ヒルギ科3樹種では継代培養後のカルスの増殖が遅く、器官分化培地上で細胞が緑色を呈し細胞内に葉緑素を生産させることは可能となったが、器官を分化させるまでには至らなかった。5.器官分化に至らなかったヒルギ科3樹種では植物ホルモン濃度を変えて、器官分化の検討が繰り返されている。6.ミズガンピでは日長時間が16時間(3,000lux)でオーキシンとしての2.4-Dが0.04mg/l以下、サイトカイニンとしてのベンジルアミノプリンが0.1mg/l以下の添加量で根及び葉が分化した。7.オオハマボウでは日長時間が14時間(4,000lux)で2.4-Dが0.20mg/l以下、サイトカイニンとしてのカイネチンが0.1mg/l以下の添加量で根と葉が分化した。7.根と葉の分化がみられたミズガンピとオオハマボウの一部では、その後試験管内でほぼ完全な幼植物にまで発達するものもみられた。8.試験管内で発達したミズガンピとオオハマボウの幼植物は試験管内から取り出され、ガラス室内での馴化培養に移された。9.器官分化とそれからの幼植物の馴化までの報告がなかったマングローブ植物の中で、本研究ではミズガンピとオオハマボウで幼植物までの発達と、ガラス室内での幼植物の馴化というこれまでに報告されたことのない新たな知見が得られた。
口腔および腸内細菌叢の関連性の探索

細菌叢構成を比較したところ,自立高齢者に比べ要介護高齢者では唾液細菌叢に占めるActinobacteria, Firmicutes(門レベル)の割合が高く,Bacteroidetes, Fusobacteriaの割合が低かった.要介護高齢者では,自立高齢者に比べて門レベルにおける多様性が小さく,細菌叢の多様性が低下していた.一方,属レベルでの多様性指数の比較において両群に差は認められなかった.過去には,胃瘻者の口腔細菌叢の多様性が経口摂取者と比較して低いことが報告されており,本結果と所見が一致している.また,主成分による判別分析から,両者が互いに特徴的なクラスターを形成していることが示された.口腔内には,700種類以上の微生物が口腔に固有の細菌叢を構成するといわれており,多数の微生物同士が複雑なネットワークを形成している.また,一度形成された細菌叢は口腔内環境の変化に応じて刻々とその姿を変えると推察される.口腔に生存する微生物は,口腔内疾患のみならず種々の全身疾患を引き起こすことが報告されている.これまで我々は高齢者が口腔内に保有する肺炎原性微生物を調査し,口腔状態との関連について報告してきた.しかし,全身の健康状態や加齢,薬剤服用などに伴う細菌叢の変化,また口腔清掃が及ぼす細菌叢への影響などについては未だ不明な点が多く,口腔内細菌叢に影響を及ぼす宿主および環境因子の解明が急務である.近年,環境中に形成されるバイオフィルムなどの微生物塊に対して,微生物叢を固有の集団ととらえ群衆として解析を行うマイクロバイオーム研究が注目されている.この分野において特に研究が進んでいるのが腸内細菌叢の領域であり,食習慣などのライフスタイルや民族,年齢などの宿主生理的要因,アレルギー,肥満,糖尿病,炎症性腸疾患などの各種疾患が腸内細菌叢の構成と何らかの関連を示すことが明らかになってきている.多くの腸内微生物は口腔を経由して腸内に到達し定着すると考えられ,また口腔は全身の健康に直接的に影響する器官のひとつでもある.口腔と腸内とは環境が大きく異なるため,口腔には固有のマイクロバイオームが形成されているが,口腔と腸内の細菌叢との関連を示した報告はみられない.これまでに,口腔と腸内の細菌叢の関連性はほとんど着目されておらず,特に口腔領域のマイクロバイオーム研究にとって大変意義深い知見が得られると考えられる.そこで本研究は,口腔および腸内細菌叢の変動が比較的少ないと考えられている青年期から壮年期の成人を研究対象とし,今後,さらに規模の大きな研究へ発展させるための基礎的データの蓄積を目指す.本研究は2ヵ年で実施予定の計画であり,研究初年度は,口腔ならびに腸内細菌叢の解析における条件検討を行い,細菌叢解析系の確立を目指し,細菌叢解析に適したサンプル採取,採得条件を決定した.また次年度は,確立した解析法を応用し,対象者から採取した口腔サンプルおよび腸内サンプルの解析を行う.腸内細菌叢との関連が報告されている摂取食品の分析も同時に行うことで,摂取食品が口腔細菌叢へ与える影響を評価する.さらに,全身状態や歯科・栄養学的因子が口腔細菌叢へ与える影響を統計学的に分析する予定である.腸内と口腔の細菌叢は互いに影響を及ぼすのか,また影響があるとすればどのような影響なのかなど,解明すべき課題は多い.本研究では,自立高齢者と要介護高齢者の口腔細菌叢を解析し,比較した.自立高齢者16名,要介護高齢者15名から唾液を採取した.唾液から菌DNAを抽出し,次世代シークエンサーによるメタ16S rRNA解析を行った.また,食事記録をもとに摂取栄養素を算出し,両群間で比較した.細菌叢構成を比較したところ,自立高齢者に比べ要介護高齢者では唾液細菌叢に占めるActinobacteria, Firmicutes(門レベル)の割合が高く,Bacteroidetes, Fusobacteriaの割合が低かった.要介護高齢者では,自立高齢者に比べて門レベルにおける多様性指数(Shannon diversity index)が小さく,細菌叢の多様性が低下していた.一方,属レベルでの多様性指数の比較において両群に差は認められなかった.また,主成分による判別分析(orthogonal partial least square method with discriminant analysis; OPLS-DA)から,両者が互いに特徴的なクラスターを形成していることが示された.摂取エネルギーあたりの摂取栄養素を比較した結果,自立高齢者に比べて要介護高齢者の各種ビタミン類(ビタミンA,B5,B9,B12,C,D,K),コレステロール,飽和脂肪酸(パルミチン酸,アラキジン酸)の摂取量が少なかった.腸内細菌の研究分野では,食習慣により腸内細菌叢のプロファイルが異なることが報告されている.口腔細菌叢と摂取栄養素との関連を示す明確なデータはないが,摂取栄養素が口腔細菌叢の構成に影響を与えている可能性が得られた結果より示唆された.細菌叢構成を比較したところ,自立高齢者に比べ要介護高齢者では唾液細菌叢に占めるActinobacteria, Firmicutes(門レベル)の割合が高く,Bacteroidetes, Fusobacteriaの割合が低かった.要介護高齢者では,自立高齢者に比べて門レベルにおける多様性が小さく,細菌叢の多様性が低下していた.一方,属レベルでの多様性指数の比較において両群に差は認められなかった.過去には,胃瘻者の口腔細菌叢の多様性が経口摂取者と比較して低いことが報告されており,本結果と所見が一致している.また,主成分による判別分析から,両者が互いに特徴的なクラスターを形成していることが示された.

口腔細菌叢ならびに腸内細菌叢の解析:対象者の口腔,および腸内サンプルを採取し,細菌叢解析を行う.口腔サンプルは,唾液を専用容器に採取する.また,腸内サンプルは対象者に各自で糞便1 gを滅菌した専用のヘラを用いてスクリューキャップ式の専用容器に採取してもらう.口腔,および腸内サンプルの採取は同日もしくは一両日中に行う.すべてのサンプルは,個別の専用容器に採取し,冷凍保管する.採取した口腔および腸内サンプルから菌DNAを抽出・精製し,16S rRNAシークエンス解析を行う.シークエンス解析は専門の分析会社へ依頼する.さらに,得られた結果を解析し,口腔と腸内細菌叢の関連性を解析する.解析においては,1口腔細菌叢に影響を及ぼす因子,2既知の腸内細菌叢に影響を与える因子が口腔細菌叢へ及ぼす影響,3口腔細菌叢と腸内細菌叢の関連性を評価する.食品・栄養摂取の評価:簡易型自記式食事歴法質問票5,6による食品・栄養摂取評価を行う.これは,過去1か月間の各食品の摂取頻度,摂取量,普段の食行動,調理方法を回答する質問票であり,日本人の食事摂取基準に基づいて開発された専用の栄養価計算プログラムにより,15種類の食品群と各種の栄養素の摂取量を算出することができる.摂取食品と腸内細菌叢との関連は以前より指摘されており,口腔細菌叢との関連を解析する必要がある.統計学的分析:統計学的分析には,歯科および栄養疫学調査の各項目と口腔の細菌叢との二変量間の関連,次いで多変量解析を用い,多数の口腔機能および食品・栄養摂取と身体計測,血液検査,全身状態の中から,口腔細菌叢のパラメータに有意な関連を持つ項目を抽出する.高齢者歯科実験に使用する汎用性消耗品類を研究室の資金(奨学寄附金)で一括購入したため,購入予定であった物品を一部購入しなかった.次年度使用額については,受託解析費用として使用する予定である.