hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セラミドキナーゼ結合蛋白質の網羅的探索を基盤とした中枢神経系機能調節機構の解明

セラミドキナーゼはセラミドを基質としてセラミド-1-リン酸を産生する酵素である。本研究では中枢神経系機能におけるセラミドキナーゼの役割を解析することを目的として研究を行った。その結果、1)セラミドキナーゼはフィロポディアの形成を調節すること、2) PC12細胞においてNGFはセラミド-1-リン酸の産生を促進すること、3)セラミドキナーゼは神経伝達物質の放出を調節することが明らかとなった。セラミドキナーゼに結合する蛋白質を網羅的に探索した。まず、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を融合したセラミドキナーゼを大腸菌に発現させるためのプラスミドベクター、及びビオチン化したセラミドキナーゼを培養細胞に発現させるためのプラスミドベクターを作製した。その後、まず大腸菌にGST融合セラミドキナーゼを発現させ、グルタチオンビーズを用いてセラミドキナーゼを精製した。この精製蛋白質を細胞溶解液とインキュベートし、グルタチオンビーズを用いてGST融合セラミドキナーゼをプルダウンした。サンプルをSDS-PAGEにより分離し、トリプシン消化した後に質量分析装置を用いてセラミドキナーゼに結合する蛋白質を同定した。また、培養細胞にビオチン化したセラミドキナーゼを一過性発現させ、その細胞溶解液からストレプトアビジンビーズを用いてビオチン化セラミドキナーゼをプルダウンした。その後、同様に質量分析装置を用いてセラミドキナーゼに結合する蛋白質を同定した。その結果、セラミドキナーゼに結合する蛋白質を複数同定することに成功した。同定された蛋白質のうち、中枢神経系機能の調節に重要な蛋白質Aまたは蛋白質Bを培養細胞に一過性発現させたところ、フィロポディアの形成が観察され、それはセラミドキナーゼを阻害することで抑制された。従って、セラミドキナーゼは蛋白質Aや蛋白質Bと協調してフィロポディアの形成を調節する可能性が示唆された。PC12細胞(ラット副腎髄質由来褐色細胞腫)は神経成長因子NGFで処理すると突起を形成することから、神経細胞のモデルとして幅広く用いられている。本年度はPC12細胞を用いて、神経突起形成におけるセラミドキナーゼの役割を解析した。まず、レトロウイルスによる遺伝子導入システムを用いて、セラミドキナーゼ安定発現株を作製した。この細胞にNGFを処理したところ、コントロール細胞に比べて突起伸長が促進し、この促進作用はセラミドキナーゼ阻害剤の処理により抑制された。従って、セラミドキナーゼにより産生されたセラミド-1-リン酸がNGF刺激による突起伸長を正に制御する可能性が示唆された。続いて、NGF刺激がセラミド-1-リン酸の産生に与える影響を解析した。その結果、NGF刺激はセラミドキナーゼを活性化し、セラミド-1-リン酸の産生を促進することが明らかとなった。NGF刺激はセラミドキナーゼの発現量には影響しなかった。また、セラミドキナーゼの細胞内局在を観察するため、緑色蛍光蛋白質GFPを融合したセラミドキナーゼを一過性発現させた。その結果、無刺激時にはエンドソームに局在しているセラミドキナーゼが、NGF刺激により突起先端部へと移行する様子が観察された。これらの結果から、PC12細胞においてNGFはセラミドキナーゼの活性化および突起先端部への局在変化を誘導し、産生されたセラミド-1-リン酸が突起伸長を正に制御することが明らかとなった。セラミドキナーゼが神経突起の伸長を正に制御することを明らかにすることができた前年度に引き続き、PC12細胞を用いてNGF刺激による突起伸長作用におけるセラミドキナーゼの関与を解析した。まず、セラミドキナーゼに対するshRNA発現ベクターをレトロウイルスにより遺伝子導入し、セラミドキナーゼを安定的にノックダウンするPC12細胞を樹立した。緑色蛍光基NBDを付加したセラミドを細胞に取り込ませ、総脂質を抽出後、薄層クロマトグラフィーでセラミド代謝物を分離し、NBDの蛍光を検出することでNBD-セラミド-1-リン酸の産生量を対照細胞と比較した。その結果、セラミドキナーゼのノックダウンはNBD-セラミド-1-リン酸の産生量を70%程度抑制した。本細胞を用いてNGF刺激による突起伸長作用を対照細胞と比較したところ、セラミドキナーゼのノックダウンは突起伸長作用に影響しなかった。そこで、神経伝達物質の放出におけるセラミドキナーゼの関与を解析した。3Hで放射標識されたノルアドレナリンを細胞に取り込ませ、カルシウムイオノフォアA23187の刺激により細胞外に放出されたノルアドレナリンの量を計測した。その結果、セラミドキナーゼのノックダウンはA23187によるノルアドレナリンの放出を有意に抑制した。一方、セラミドキナーゼの過剰発現により、A23187によるノルアドレナリンの放出は有意に促進された。これらの結果から、セラミドキナーゼは神経伝達物質の放出に重要な役割を担っていることが明らかになった。セラミドキナーゼに結合する蛋白質を同定することに成功した。また、セラミドキナーゼが中枢神経系機能を調節する可能性を示唆することができた。

1)セラミドキナーゼをノックダウンした細胞株を作製し、NGF刺激による突起伸長作用を観察する2)セラミド-1-リン酸が突起伸長を制御するメカニズムを解明する3)神経突起伸長におけるセラミドキナーゼの役割をPC12細胞以外の細胞や個体を用いて解析する薬理学、脂質生化学セラミドキナーゼとセラミドキナーゼに結合する蛋白質との関連性を詳細に解析する予定である。
高周波機械衝撃処理を施した溶接継手の疲労強度ならびに板厚効果に及ぼす応力比の影響

船体構造の主要3継手の1つである荷重非伝達型十字継手(付加物の板厚は主板厚と同じで、付加物の長さは主板厚の2倍)を対象(板厚10mmと22mm)に、溶接まま材、棒状グラインダ処理材ならびに超音波ピーニング(HFMI)処理材を供試材として、応力比ー0.3両振り応力条件下において疲労試験を実施した。疲労試験前にシリコンラバー印象材を用いて溶接止端部形状の型取り行い、疲労試験後、この型を用いてき裂発生位置における溶接止端部形状を計測した。得られた計測結果から西田の式を用いて溶接止端部の応力集中係数を算出した。溶接まま材とHFMI処理材については、ASTM E837-13aに準拠した穿孔法により溶接ビード近傍の試験片表面における残留応力の計測を行った。棒状グライダ処理材については、既存のX線応力測定装置で表面の残留応力を測定した。疲労試験結果、応力集中係数ならびに残留応力測定結果を用いて修正MIL=HDBK-5法による整理を行い、二次加工処理法や応力比の相違に依らず、多少バラツキはあるものの等価応力を用いることで、き裂発生寿命と破断寿命を統一的に評価できることを示した。また、応力比-0.3の結果において,HFMI処理材>棒状グラインダ処理材>溶接ままの順で高い疲労強度改善効果を示すことを実験的に確認した。島貫らの提案手法を用いて予想される応力比-0.3の疲労強度は,本研究で取得した実験結果と比較して安全側の評価となることを確認した。なお、上記の結果は、令和元年6月3日4日開催の日本船舶海洋工学会春季講演会にて成果を公表する予定である。板厚40mmと50mmの疲労試験は継続中で、残部を令和元年(最終年度)に実施し、成果を取り纏める予定である。また、国際溶接会議(IIW)へ疲労データを提供し、HFMI処理による溶接継手疲労強度改善に関する指針の素案作成へ貢献する予定である。しばしば現有の疲労試験機に不具合が生じるが、おおむね順調である。計画どおり、研究を推進する。両振り応力条件下における高周波機械衝撃(HFMI)処理による疲労強度改善効果と板厚効果の実験的検証実施するため、荷重非伝達型十字継手の製作を行った。供試材は、SM490A鋼(造船用鋼は市販されていないためAH36相当で、板厚10mm、22mm、40mm、50mmの4種類)とした。試験片形状は、船体構造の主要3継手の1つである荷重非伝達型十字継手であり、付加物の板厚は主板厚と同じで、付加物の長さは主板厚の2倍とした。溶接方法は半自動CO2溶接、溶接脚長は共通構造規則(CSR)B編F2溶接基準に準拠(たとえば、t=50mmの場合、脚長14mm以上)とした。板厚ごとにすべての試験片を切り出せる大きさの試験体を製作した場合、溶接時の熱変形が大きくなることから、2体の試験体を製作し、この試験体から試験片を切り出すこととした。二次加工処理としては、各船級の設計基準にも採用されているグラインダ処理とHFMI処理の1種である超音波ピーニング(UP)処理を選択した。グラインダ処理材は、試験体に処理を施した後、試験片を切出すこととし、UP処理材は、試験片切出しの際に疲労強度改善効果に寄与する要因の一つである圧縮残留応力が開放される恐れがあることから試験片を切出した後、UP処理を施すことにした。UP処理材、溶接まま材ならびにグラインダ処理材の一部(板厚50mm)の試験片切り出しを実施した。UP処理材については、UP処理した溶接止端部の止端半径を歯科印象材を用いて計測し、応力集中係数を算出した。H29年度の予算でUP処理した溶接止端部の残留応力を計測し、最小荷重時に残留応力を加えた応力値が圧縮の降伏応力を下回る条件下(応力比)を決定した後、て疲労試験を実施する。なお、先行研究で実施した応力比0.05の疲労強度データは、今後参照できるよう溶接学会に査読付き論文として投稿し、掲載された。当初、平成28年度は、UP処理材のみ試験片を作成し、残留応力計測ならびに応力集中係数を算出し、最小荷重時に残留応力を加えた応力値が圧縮の降伏応力を下回る条件(応力比)を決定した後、疲労試験を開始する予定であった。しかしながら、予算の関係で、溶接まま材やグラインダ処理材の一部の試験片製作を先行して実施したため、疲労試験が未実施となった。船体構造の主要3継手の1つである荷重非伝達型十字継手(付加物の板厚は主板厚と同じで、付加物の長さは主板厚の2倍)を対象に、溶接まま材(板厚10mmと22mm)、棒状グラインダ処理材(板厚10mm)ならびに超音波ピーニング処理材(板厚10mm)を供試材として、応力比ー0.3両振り応力条件下において疲労試験を実施した。溶接まま材(板厚10mmと22mm)と棒状グラインダ処理材(板厚10mm)については、SーNデータを取得し、200万回疲労強度を特定した。超音波ピーニング処理材(板厚10mm)については、スパッタ部分からの疲労破断や試験システムの不具合により試験を中断し、SーNデータを取得できておらず、平成30年度、再試験する予定である。

また、疲労試験に先立ち、歯科印象材を用いて各供試材の止端半径を計測し、応力集中係数を算出した。板厚50mmの溶接まま材と超音波ピーニング処理材を対象に、塑性変形の影響を考慮した深穴穿孔法(MDHD法)による残留応力測定を実施し、板厚内(1mmピッチ)の残留応力σx、σy、τxyを把握した。また、板厚10mm、22mm、40mmならびに50mmの溶接まま材と超音波ピーニング処理材を対象に、穿孔法(DHD法)による残留応力測定を実施し、表面から1mmまでの板厚内の残留応力σx、σy、τxyを把握した。なお、棒状グライダ処理材については、平成30年度、既存のX線応力測定装置で表面の残留応力を測定する予定である。超音波ピーニング処理材については、スパッタ部分からの破断や試験システムの不具合により試験を中断し、SーNデータを取得できておらず、平成30年度、再試験する予定である。船体構造の主要3継手の1つである荷重非伝達型十字継手(付加物の板厚は主板厚と同じで、付加物の長さは主板厚の2倍)を対象(板厚10mmと22mm)に、溶接まま材、棒状グラインダ処理材ならびに超音波ピーニング(HFMI)処理材を供試材として、応力比ー0.3両振り応力条件下において疲労試験を実施した。疲労試験前にシリコンラバー印象材を用いて溶接止端部形状の型取り行い、疲労試験後、この型を用いてき裂発生位置における溶接止端部形状を計測した。得られた計測結果から西田の式を用いて溶接止端部の応力集中係数を算出した。溶接まま材とHFMI処理材については、ASTM E837-13aに準拠した穿孔法により溶接ビード近傍の試験片表面における残留応力の計測を行った。棒状グライダ処理材については、既存のX線応力測定装置で表面の残留応力を測定した。疲労試験結果、応力集中係数ならびに残留応力測定結果を用いて修正MIL=HDBK-5法による整理を行い、二次加工処理法や応力比の相違に依らず、多少バラツキはあるものの等価応力を用いることで、き裂発生寿命と破断寿命を統一的に評価できることを示した。また、応力比-0.3の結果において,HFMI処理材>棒状グラインダ処理材>溶接ままの順で高い疲労強度改善効果を示すことを実験的に確認した。島貫らの提案手法を用いて予想される応力比-0.3の疲労強度は,本研究で取得した実験結果と比較して安全側の評価となることを確認した。なお、上記の結果は、令和元年6月3日4日開催の日本船舶海洋工学会春季講演会にて成果を公表する予定である。板厚40mmと50mmの疲労試験は継続中で、残部を令和元年(最終年度)に実施し、成果を取り纏める予定である。また、国際溶接会議(IIW)へ疲労データを提供し、HFMI処理による溶接継手疲労強度改善に関する指針の素案作成へ貢献する予定である。しばしば現有の疲労試験機に不具合が生じるが、おおむね順調である。昨年度未実施となった残留応力測定を早急に実施し、試験条件を確定した後、疲労試験を実施する。その他に関しては、計画通り研究を進める予定である。超音波ピーニング処理材の疲労試験の再試験は、試験片を速やかに製作し、実施する。その他に関しては、ほぼ計画通り研究を進める予定である。計画どおり、研究を推進する。
次世代型分子データによる詳細分子生物地理の推定法の開発

ゲノムデータのコストが急速に縮小しており、今後この傾向はますます強くなっていく。これに伴い集団遺伝の方法論も進化しているが、データの性格の質的な変化に十分に対応できているとは言えない。本研究では特に、詳細な分子生物地理学的な情報を得るための時空間統計モデルと推定手法を開発することを目的とした。プロジェクトでは、アジア・オセアニアに広域に棲息する多食性の重要害虫である、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)について、詳細な空間的集団構造の分析を行った。また、広範囲に混じり合う海洋生物において、水温や塩分などの環境や増養殖に影響されて生成される遺伝的な不均質性の微かなシグナルを高感度に検出する方法を提示し、プログラムパッケージを公開した。さらに、研究を進める中で、分子進化速度が遺伝子に働く機能的な制約の強さと関連していることに注目して、ゲノムと形質の種間比較から生活史の形質の遺伝的背景を明らかにする方法を提案した。最終年度となる本年度は、日本産淡水魚の分子生物地理研究において、種内の置き換わりは無視できない要素であることを主張する論文をまとめた。現在査読中である。また、集団ゲノムと形質、環境のデータを統合し、グラフィカルモデルを通して地域的変異から環境への適応とその遺伝的背景を包括的に捉える方法を開発した。ビッグデータの解析ではベイズの枠組みが中心的な役割を担うが、そこでは実用的な時間内に答えを出すアルゴリズムの開発が最大の課題となる。本研究では近年勃興してきた変分法をゲノム進化の推測に導入し、その有効性を証明した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.密な空間サンプリングと詳細分子生物地理:プロジェクト開始の本年度はカワムツに焦点を当てて、北九州へ侵入した大陸個体が在来個体群を置き換えつつ次第に分布域を広げていくプロセスを、河川間の移動率、侵入魚の置き換わり率で表現するモデルを構築した。シナリオに基づくシミュレーションにより、空間相関と空間分散を表現する要約統計量のサンプルを生成し、核型分布推定により尤度を求めた。これにより確率傾斜法により最尤推定するプログラムを開発した。2.次世代型分子データによる集団ゲノム解析:インド、中国、日本の各地から採集されたハスモンヨトウのSNPデータに基づき、集団ゲノム解析を行った。遺伝的級間分散を遺伝的全分散で除したFSTから、インド南部から中国南部を通して日本へと広域に至る東西方向の遺伝的交流が示唆された。このFST統計量に関して、遺伝子流動の大きい集団においては経験ベイズによる安定化が有効であることを示した。3.分子系統樹の二元配置分散分析と表現型-ゲノム統合解析:本プロジェクトを遂行する過程で偶然、ゲノムの種間比較の新たな方法を着想した。ゲノムの種間比較で観測される分子進化は、集団中に固定した突然変異を物語る。突然変異の大部分は中立あるいは不利であることから、分子進化速度は突然変異率と中立な突然変異の割合の積で近似される。前者を左右する世代の長さや変異原への暴露環境はゲノム全体に影響する。他方、後者は機能的な制約の強さと関係しており、これらの変動要因は遺伝子固有に働く。そこで、遺伝子系統樹に対して、二元配置分散分析型ポアソン回帰を考案した。主効果は分岐年代と突然変異率の頑健推定を可能とし、交互作用は遺伝子ごとの機能的な制約の変動を抽出する。表現型と結び付けることにより、関連遺伝子の探索、祖先形質の復元の新たな方法となる。上記1-2の課題は、ほぼ当初の計画通りに研究を進めている。加えて、上記課題は当初持っていなかった着想であり、本プロジェクトの奥行きを格段に深め、広がりを持たせている。1.密な空間サンプリングと詳細分子生物地理カワムツに焦点を当てて、北九州へ侵入した大陸個体が在来個体群を置き換えつつ次第に分布域を広げていくプロセスを、侵入時期、河川間の移動率、侵入魚の置き換わり率で表現するモデルを構築した。要約統計量として空間自己相関の尺度およびTempletonのクレード間距離・階層クレード距離を用い、近似ベイズ推定(ABC, Approximate Bayesian Computation)によりこれらのパラメータを推定した。その結果、侵入魚の優越性が有意に検出された。2.次世代型分子データによる集団ゲノム解析アジア・オセアニアに広域に棲息する広食性の昆虫である、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)ゲノムプロジェクトのコンソーシアムに参加し、集団ゲノム解析を担当した。FSTと集団構造のモデル分析、および多次元アレル頻度の近似拡散方程式モデルの分析を行い、インド南部から中国南部、日本にまたがり遺伝的に均質であり、本種が恐らくモンスーンに流され広範囲に移動することを強く示唆する結果を得た。3.分子系統樹の二元配置分散分析と表現型-ゲノム統合解析分子進化と表現型の進化を結びつける新たな方法を着想した。多数の遺伝子の分子系統樹について枝・遺伝子の積型二元配置分散分析を行うことにより、遺伝子に働く機能的な制約の強さとその変動を抽出した。これを予測因子にして、最小進化の規準を前提とせずに表現型の祖先形質を復元する方法を開発した。その結果、胎盤哺乳類の祖先は群れを作らず、繁殖には季節性があったこと、昆虫を捕食し夜行性であったと推定された。社会性や一夫一婦制では全般に機能的な制約が緩むこと、社会性については脳や神経系に携わる遺伝子が予測因子として抽出されるなど、行動の遺伝的背景を理解する上でも示唆を与えた結果が得られている。

上記1-2の課題は、ほぼ当初の計画通りに研究を進めている。加えて、課題3は当初持っていなかった着想であり、本プロジェクトの奥行きを格段に深め、広がりを持たせている。ゲノムデータのコストが急速に縮小しており、今後この傾向はますます強くなっていく。これに伴い集団遺伝の方法論も進化しているが、データの性格の質的な変化に十分に対応できているとは言えない。本研究では特に、詳細な分子生物地理学的な情報を得るための時空間統計モデルと推定手法を開発することを目的とした。プロジェクトでは、アジア・オセアニアに広域に棲息する多食性の重要害虫である、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)について、詳細な空間的集団構造の分析を行った。また、広範囲に混じり合う海洋生物において、水温や塩分などの環境や増養殖に影響されて生成される遺伝的な不均質性の微かなシグナルを高感度に検出する方法を提示し、プログラムパッケージを公開した。さらに、研究を進める中で、分子進化速度が遺伝子に働く機能的な制約の強さと関連していることに注目して、ゲノムと形質の種間比較から生活史の形質の遺伝的背景を明らかにする方法を提案した。最終年度となる本年度は、日本産淡水魚の分子生物地理研究において、種内の置き換わりは無視できない要素であることを主張する論文をまとめた。現在査読中である。また、集団ゲノムと形質、環境のデータを統合し、グラフィカルモデルを通して地域的変異から環境への適応とその遺伝的背景を包括的に捉える方法を開発した。ビッグデータの解析ではベイズの枠組みが中心的な役割を担うが、そこでは実用的な時間内に答えを出すアルゴリズムの開発が最大の課題となる。本研究では近年勃興してきた変分法をゲノム進化の推測に導入し、その有効性を証明した。上記課題1については、プログラムの実装と要約統計量の有効性と収束性能の評価を行い、侵入魚の優越性に関する仮説検定を行う。課題2については、scaffoldのリサンプリング、合体過程のシミュレーションを組み合わせたブートストラップにより推定精度を評価するとともに、集団の履歴を考慮に入れた数理モデルと比較し、要約統計量による探索的アプローチの有効性を評価する。課題3については、哺乳類のゲノムデータと行動データベースを統合分析し、提案手法の有効性を調査する。上記課題1については、学術誌や学会で公表していく。課題2については学術誌での発表が完了している。課題3については、開発プログラムをパッケージとして公開する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
水酸基活性化に基づくグリセリン類の不斉分子変換

グリセリンの余剰問題を解決するために、グリセリンの有効利用法開発が求められている。本課題では、グリセリンを医薬品等の原料となる光学活性化合物への変換法を開発する。具体的には、グリセリンから医薬品や液晶の重要な原料である光学活性グリシジルスルホネートへの変換法、グリセリン酸への酸化法、レシチンやセラミド機能物質への変換法の確立を目指している。ごく少量の触媒を用いてそれら変換反応を達成できる、不斉触媒の開発を行う。
冷戦後世界における国際協力ネットワークの再編・強化の研究

グローバリゼーションという社会現象は、国際法の観点から見た場合、国際協力ネットワークの再編・強化という形で現れていることが、この研究の一環として行われた具体的な現象の分析を通じて明らかになった。入権の普遍的な適用に向けた自由権規約委員会の活動、国際人道法および国際刑事法による戦争犠牲者とりわけ女性の性暴力からの保護が制度的保障を伴って発展していること、国連海洋法条約の規定する紛争解決手続の着実な進展などにみられるように、国際協力ネットワークが、既存の国際法の枠組みとの厳しい緊張関係を伴いながら進歩的・積極的な役割を果たしている。しかし、他方、安全保障理事会による違法な武力行使の追認と疑似「立法」、EU東方拡大過程に例示される民主主義のシンボルとしての機能、WTOにおける地域統合の進展などは、国際協力ネットワークのイデオロギー批判が必要なことを示している。このよう国際協力ネットワークにおいては、個人(法律)専門家の、国際基準の遵守確保のために果たしている役割(紛争解決、違反認定にとどまらず遵守の日常的モニタリング)が大きくなっており、また、人権や民主主義といった従来国内社会で妥当するとされてきたイデオロギーが果たす役割が大きい。このような観点から現在の国際法秩序を通観すると、国際法秩序は、平等な国家間の利害の調整という水平的な秩序に加えて垂直的な構造もあわせもつ、公法的性格を強くもつようになってきていることが分かる。このような性格の変化が国際法の基礎理論に大きな影響を及ぼしていることは、これまでの分析から明らかになってきたが、なおその詳細を明らかにすることは、今後の課題として残されている。本研究の代表者・分担者の大部分が執筆に参加する『国際法』(有斐閣Sシリーズ)は、近現代国際法の構造を基礎としながら、グローバリゼーションの影響を意識して大幅に書き直され、第4版となって2002年4月に刊行された。同書の内容については、重刷の過程等折に触れて引き続き討論がすすめられている。今年度開かれた持続的発展に関する世界サミット(ヨハネスブルグ)およびIMO環境保護委員会(ロンドン)には、分担者を派遣した。その報告によると、概して、単なる国家(グループ)間の利害の一致や対立にとどまらず、NGOや企業が非公式のアクターとして影響力を及ぼしていることが見受けられた。本研究固有の研究会は、11月および3月の二回にわたって開催した。そこでは、上記報告をうけたほか、条約履行確保手続の発展とその相互関係、「国際法における公法的なるもの」、「国際法の政策化」等について議論がなされた。以上の法現象をうけて、これらを国際法の基礎理論レヴェルでどう位置づけるか、という問題意識から、各参加者は旺盛に研究成果の公表に取り組んでいる。たとえば、国連集団安全保障体制の弛緩が国際法の法的性格に及ぼす影響、国連海洋法条約の一体性、国際責任論における国家間処理モデルの限界、さらには、条約解釈規則の法典化がもたらした問題、といった成果であり、これらは来年度のまとめに向けた一里塚ということができる。もちろん、各人において国際法の現段階についてのイメージは、一枚岩ではないが、このような各研究成果を通じて、国際法秩序が、多様なアクターがそれぞれの地位に応じて縦横に活動する重層的なものとなっていること、および、そのなかで秩序維持機能がクローズアップしてきているという方向性については、大筋で合意が得られつつある。人権の普遍的な適用に向けた自由権規約委員会の活動、国際人道法および国際刑事法による戦争犠牲者とりわけ女性の性暴力からの保護が制度的保障を伴って発展していること、国連海洋法条約の規定する紛争解決手続の着実な進展などにみられるように、国際協力ネットワークが、ときには既存の国際法の枠組みとの厳しい緊張関係を伴いながら進歩的・積極的な役割を果たしている。

しかし、他方、安全保障理事会による違法な武力行使の追認と疑似「立法」、EU東方拡大過程に例示される民主主義のシンボルとしての機能、WTOにおける地域統合の進展などは、国際協力ネットワークのイデオロギー批判が必要なことを示している。このような国際協力ネットワークにおいては、形式上第三者たる個人(法律)専門家の、国際基準の遵守確保のために果たしている役割(紛争解決、違反認定にとどまらず遵守の日常的モニタリング)が大きくなっており(いわば「司法化」)また、人権や民主主義といった従来国内社会で妥当するとされてきたイデオロギーが果たす役割が大きい。こうして、国際協力ネットワークの再編・強化という観点から現在の国際法秩序を通観すると、国際法秩序は、平等な国家間の利害の調整という水平的な秩序ではなく垂直的な構造もあわせもつ、公法的構造を強くもつようになってきていることが分かる。このような構造は国際法の基礎理論に大きな影響を及ぼしていることは、これまでの分析から明らかになってきたが、なおその詳細については、今後の課題として残されている。
生体組織内の歪み・応力・含水率を同時断層検出する干渉画像計測シ ステムの構築

本研究では、OCTの有するマイクロ断層検出能力を有効活用し、生体組織における様々な機能的情報を抽出する「多機能OCT」システムの開発として、生体機械特性である"歪み"や"応力"をマイクロ断層可視化する「OCSA」と「OCSE」,生化学特性として"含水率"を断層可視化する「OCM」を提案構築した。構築システムの検証を実施すると共に、皮膚組織や軟骨組織へ「OCSA」と「OCM」の適用し、また工業材料へ「OCSE」を適用し、「多機能OCT」が有効であることが分かった。本研究の目的は,皮膚組織のマイクロメカニクス診断を実現課題とし,数マイクロの高分解能及び非侵襲診断能力を有する光干渉断層画像法(OCT)を多機能化し,組織内の歪み断層分布(OCSAシステム)と応力断層分布(OCSEシステム)を検出するマイクロ力学量断層検出システムと,含水量を断層検出する2C-OCMシステムのハイブリッド同時検出システムを構築することである.OCSAでは干渉信号スペックルの変形解析から歪み分布を,更に,OCSEでは偏光特性から光弾性解析を用いて応力分布を同時に断層計測する.2C-OCMでは、水分子の光吸収特性が異なる2波長帯OCTを用い,検出吸収係数から皮膚組織内の含水分布を断層計測する.そのため22年度では,第1到達目標である,偏光OCTと2波長帯OCT(2C-OCM)のハイブリッドシステムの構築を構築した,すなわち,「応力検出用の1300nm帯偏光OCTシステムの構築」と「1300nmと1400nmの波長帯を用いた2C-OCD含水率断層分布検出システムの構築」を実施し,両システムの検証を行った.偏光OCTシステムの検証は,PETフィルムの引張り荷重付加に発生する干渉稿のFFT解析を行い,荷重との相関関係を検討した.干渉稿の断層画像を用いた光弾性解析には,干渉稿画像解析アルゴリズムの再開発が必要であることが判明したため,最新の光弾性解析アルゴリズムの適用を23年度に行う計画を新たに考案した.2波長帯OCT(2C-OCM)は,散乱ナノ粒子を混入した蒸留水と重水の混合液を用いて,含水率の検出精度を検討し,提案OCMシステムでは散乱係数が変化に依存せず,含水率の断層検出を2%程度の誤差に抑えて可能であることを示した.また,提案OCMシステムを皮膚や軟骨のex/in vivo計測に適用し,現システムの問題点を検討した.その結果,生体組織の組織構造が変化する界面(各層と表皮との界面など)における,反射係数の変化が含水率計測に影響を与えるため,反射係数の空間変化を考慮して含水率の検出を行うシステムへ改良する必要があることが分かった.一方,歪み計測のアルゴリズム開発としては,ファントムOCT画像を用いて3次元歪み検出能について検証し,到達目標の20μmの解像度において検出歪み量精度を0.01%の3次元断層歪み分布が取得可能であることを示した.更に,提案システムを皮膚,軟骨,動脈硬化などのex/in vivo計測に適用し,3次元歪みと組織構造との対応を検討した.23年度では,3次元歪み検出アルゴリズムを更に向上させ,ボクセル変形を考慮した変形解析を導入し,更なる検出精度の向上を可能とする計画を考案した.本研究の目的は,皮膚組織のマイクロメカニクス診断を実現課題とし,数マイクロの高分解能及び非侵襲診断能力を有する光干渉断層画像法(OCT)を多機能化し,組織内の歪み断層分布(OCSAシステム)と応力断層分布(OCSEシステム)を検出するマイクロ力学量断層検出システムと,含水量を断層検出する2C-OCMシステムのハイブリッド同時検出システムを構築することである.OCSAでは干渉信号スペックルの変形解析から歪み分布を,更に,OCSEでは偏光特性から光弾性解析を用いて応力分布を同時に断層計測する.2C-OCMでは、水分子の光吸収特性が異なる2波長帯OCTを用い,検出吸収係数から皮膚組織内の含水分布を断層計測する.そのため23年度では,皮膚組織の歪み断層分布を検出するOCSAシステムの構築のため,荷重負荷デバイス(吸引デバイス)とOCTシステムのコンバインを行った.また,歪み検出精度を上げるため,3次元歪み検出アルゴリズムとして,ボリューム変形を考慮したサブピクセル解析法を導入した.そして,構築した吸引OCSAシステムを皮膚のin vivo計測に適用し,吸引負荷による組織変形によって,真皮乳頭と表皮突起の界面付近において剪断歪みの発生が,非侵襲断層計測された.24年度には,この実験結果の検証を念頭に,真皮乳頭の位置を把握するために抹消血管網の可視化を実施する.一方,偏光OCTと2波長帯OCT(2C-OCM)のハイブリッドシステムの構築では,計測の時間分解能を上げるため,ガルバノミラーを導入して光時間分解能化に着手した.更に,偏光OCTシステムによる応力検出の精度を上げるため,ストークスパラメータの導入を試み,ポリエチレン樹脂の引張り荷重付加に発生する干渉稿の画像解析に着手した.

その結果,干渉稿の断層画像を用いた光弾性解析には,干渉稿画像解析アルゴリズムの再開発が必要であることが判明したため,最新の光弾性解析アルゴリズムの適用を24年度に行う計画を新たに考案した.2波長帯OCT(2C-OCM)では,実時間計測システムを完全構築することが24年度の課題である.このため,参照鏡側にもガルバノミラーを導入し,高速にスキャンするシステムを構築する.更に,生体組織の組織構造が変化する界面(各層と表皮との界面など)における,反射係数の変化が含水率計測に影響を与えるため,反射係数の空間変化を考慮した含水率検出アルゴリズムについて検討を行う.本研究における最終目標は,3計測法(歪み断層計測・応力断層計測・含水率断層計測)のハイブリッドシステムを構築することであった.主な内容は,歪み計測の3次元化,吸引圧負荷デバイスを組み込んだOCTプローブの構築,スキンメカニクスの適用,軟骨バイオメカニクスへの適用,光弾性計測(偏光OCT)の干渉光学システム構築,応力断層計測アルゴリズムの構築,含水率計測干渉光学システムの構築,である.以下に.3計測システムの研究実績の概要を述べる.なお,構築システムを生体模擬ファントムに適用し歪み・応力・含水率の定量的検証を行うだけでなく,皮膚組織や軟骨組織などへも適用を行った.1)歪み断層計測: 3次元歪みの算出アルゴリズムを実装化し,歪み検出精度をマイクロストレイン(0.03%)まで向上させた.更に,連続荷重負荷を行うデバイスとの同期システムを実装し,動的断層可視化システムを構築した.本システムを皮膚摸擬試料に適用し粘弾性特性検出の定性的検証を実施した.皮膚組織と軟骨組織にもin/ex vivo適用し,組織粘弾性特性の検討を行った.各組織への適用結果は,毛細血管やコラーゲン組織と粘弾性特性との関係をマイクロ断層可視化することが可能であった.2)応力断層計測: 2偏光波を同時検出する偏光OCT干渉光学システムを構築し,ストークスパラメータマップにおける干渉稿空間周波数変化から応力断層分布を算出するアルゴリズムを構築した.本システムを高分子基材料に適用し応力断層可視化法の妥当性を証明した.3)含水率断層計測: 1400nm帯と1300nm帯の2波長干渉光学系システムを構築し,含水率のマイクロ断層検出が可能であることを確認した.更に,歪みと含水率を同時計測するシステム構築のため,時間分解能と空間分解能を向上させるガルバノスキャニングプローブを導入した.現在その検証中である.本来は24年度に実施予定の,荷重負荷デバイス(吸引デバイス)とOCTシステムのコンバインを実施し,3次元歪みテンソル場の断層計測が実現したため.24年度が最終年度であるため、記入しない。偏光OCTと2波長帯OCT(2C-OCM)のハイブリッドシステムの構築では,計測の時間分解能を上げることが優先されるべきであることが判明し,早期に実時間計測システムの構築が必要である.このため,対物側と参照側にガルバノミラーを導入する必要が出てきた.24年度には,これに着手し,実時間計測システムの構築を遂行する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
古代農耕社会の魚：東アジアにおける養魚の成立

長江流域から日本列島西半部にかけての遺跡からはコイ科魚類遺存体が大量に出土している。本研究では魚類遺存体と漁撈具等の遺物について詳細な分析を行い、農耕社会への移行期における漁撈と稲作の関係を明らかにした。後氷期に食糧資源の転換を迫られた人々は,ヨシ場に産卵にやってくる魚群をみつけ、水辺の資源を利用するようになった。長江流域ではその中に野生イネが含まれ、漁撈とイネ採集のセットが成立、さらに生業活動はイネの栽培やコイの養殖へと発展した。養鯉にともなう水を制御する技術は水田稲作に転用された。江蘇平原などで発達した網漁撈技術は、その後、河南や山東へ広がり、稲作と切り離された漁撈技術として確立していく。中国の遺跡出土の魚類遺存体については、中国社会科学院考古学研究所、湖南省文物考古研究によって発掘され、同研究所などに保管されている魚類遺存体から、咽頭歯遺存体を検出し整理番号をつける作業を行ってきた。これまでにその作業が終わった遺跡は、河南省賈湖遺跡、広西チワン族自治区頂シ山貝塚、湖南省玉蟾岩洞穴、湖南省高廟遺跡などである。これらの内、賈湖遺跡と頂シ山貝塚のコイ科魚類遺存体については記載を行った。賈湖遺跡については中島他(2015)を公表、頂シ山貝塚については、2016年に出版予定の同貝塚研究報告書に掲載予定である。日本の弥生時代の遺跡については、岡山県南方遺跡のコイ科魚類遺存体の調査を行った。岡山市埋蔵文化財センターによって、発掘された動物遺存体の中から、コイ科魚類遺存体を検出する作業を行った。検出されたコイ科魚類遺存体については中島他(2015)を公表した。南方遺跡からコイ属の占める割合が90%近くになることから、脊椎骨と咽頭骨の遺存体で薄片を作り、成長線の観察から、採捕年齢、採捕季節の推定を行う方法を検討している。これまで、コイ科魚類遺存体が多く出土するのは縄文時代早期末からであったが、福井県鳥浜貝塚では草創期遺物出土層(15000-11000年前)からフナ属の脊椎骨遺存体が見つかり、最終氷期にあたる縄文時代草創期においても水環境から資源を得ていたことが明らかにされた。長江流域から日本列島西半部にかけてのコイ科魚類の豊かな地域では淡水魚利用の伝統が歴史的にきわめて長期にわたるものだということが判明してきた。中国の遺跡から出土する漁具については、近年の発掘調査の活発化にともない報告書、調査概報が多く出版されているが、中国考古学では咽頭歯遺存体と同様、漁撈具への関心が低く資料集成もなかった。こうした状況から既存資料の収集と再整理にとりかかった。中国社会科学院考古学研究所に保管されている河南省賈湖遺跡、広西チワン族自治区頂シ山貝塚出土のコイ科魚類遺存体については、平成26年度までに調査が終わり、賈湖遺跡の調査結果は中島他(2015)を公表、頂シ山貝塚については、絶滅種のコイを発見し、それを同貝塚研究報告書に投稿したが、広西考古研究所の作業が遅れていてまで印刷になっていない。賈湖遺跡のコイ科魚類遺存体の詳細分析を行い、養鯉がすでに始まっていたことを明らかにした。東アジアの農耕社会における養魚の起源に深くかかわる淡水魚資源利用の歴史的・文化的背景の解明を目的として、日本列島の遺跡についての調査をした。これまで、日本列島では、淡水漁撈が盛んになる時代が縄文時代早期末からとされていたが、草創期からも魚類遺存体が出土することが分かった。また、コイ科魚類が豊かではない、東北日本の遺跡においても、ウグイやニゴイといったコイ科魚類の利用がみられるが、フナやコイの利用は少ない。これまで主張してきたフナやコイを利用する文化が野生イネの栽培を早くから始めた長江流域から、早くに稲作を受けいれた西日本にかけて分布していたことを示すとともに、フナやコイを対象として淡水漁撈が稲作と深く関わっていることを明らかにした。漁撈具については、中国の考古学では漁撈具への関心が低く、資料の集成もなかった。しかし、近年の発掘調査の増加に伴い多くの報告が出版されてきた。中国(河南省・浙江省など)にても出土遺物の実見し分析データを得た。殷周時代以降の漁撈具資料を収集した。収集漁撈具のうち、網錘については集成をほぼ終え、現段階で出土資料約250点を確認し、基本的な分類作業を行っている。中国社会科学院考古学研究所に保管されている整理済のコイ科魚類遺存体については、調査が終わっている。殷周時代の遺跡から出土するコイ科魚類遺存体については、同研究所の整理が終わっていない。考古学研究所の整理が終わるまで、中国遺跡からコイ科魚類遺存体の調査ができないので、「当初の計画以上に進展している。」とはしなかった。しかし、これまでの中国での調査結果を順次公表してきている。さらに、農耕社会における養魚の起源に深くかかわる淡水魚資源利用の歴史的・文化的背景の解明を目的として、東アジアの中に位置づけて、日本列島の遺跡から出土する遺存体について調査を実施してきた。

平成27年度は、縄文時代草創期遺跡から前期にかえての鳥浜遺跡、東日本の縄文晩期の秋田県中山遺跡、宮城県北小松遺跡からのコイ科魚類遺存体の調査し、西日本の遺跡との比較を行った。農耕社会が始まる弥生時代の岡山県南方遺跡出土のコイ科魚類遺存体について調査を実施してきた。縄文時代草創期から弥生時代、西日本と東日本の遺跡からの資料を比較することができるようになった。中国の新石器時代、殷周時代出土漁撈具についての報告が増加している。これらの報告に基づいて、出土漁撈具を実見し、その分類作業をおこなっている。河南省賈湖遺跡の咽頭歯遺存体の概要は中島他(2015a)で報告。賈湖遺跡の3つの文化期の中で、第3文化期にコイについて養鯉が始まっていたことを明らかにした。この結果の公表については、投稿雑誌のレフリーとのやりとりが継続中で公表にいたっていない。広西チワン族自治区から出土した絶滅種のコイについての報告は、中国側の都合でまだ報告書が出版されていない。養殖の根拠の1つとして魚の採捕季節を推定する必要がある。そこで、現生のコイについて、脊椎骨、咽頭骨の冬輪を観察し、その本数、間隔から年齢および採捕季節を推定する方法を確立した。その結果を遺存体に利用できないかを検討している。漁具についての研究は、中国殷周時代以降の漁撈具資料をひきつづき収集するとともに、近年刊行された発掘調査報告書から、新出の資料を収集した。また浙江省、南京市、江蘇省で出土資料の調査を行った。さらに大陸と日本列島との関連を探るべく、日本の関係資料の収集と出土資料調査を行っている。東アジアの農耕社会における淡水漁撈および養魚の起源にかかわる歴史的・文化的背景を解明するため、日本列島の縄文時代草創期からの魚類遺存体の調査を継続するとともに、新石器時代のヨーロッパ内陸部での淡水漁撈の調査も実施した。28年度は、欧州アルプス地域(チロル地方およびスロベニア)で調査を実施し、漁撈文化について基礎的資料を収集した。結果として、ドナウ水系はコイ科・マス類が豊富であり、当該地域社会にとって、漁撈は新石器時代以来、重要な生業であること、中世から近世には修道院等でコイの畜養池が広くみられ、冬至祭などで食されたことなどが判明した。淡水漁撈や養殖は、東アジアに限らず、内陸部では需要な生業であることが明らかになった。しかし、農耕と淡水漁撈との結びつきがあるのは、稲作を発達させた東アジアの特徴であることが明らかにされた。これまで、中国新石器時代の遺跡から出土するコイ科魚類遺存体の研究成果は順次公表してきた。また、農耕社会における養魚の起源にかかわる淡水資源利用の歴史的、文化的背景の解明を目的に、日本列島の縄文・弥生時代遺跡から出土するコイ科魚類遺存体の調査を実施し、西日本と東日本との違いを示してきた。また、比較のためにヨーロッパ内陸部の淡水漁撈や養魚についての資料収集、調査を実施した。漁撈は新石器時代以来、重要な生業であること、中世から近世には修道院等でコイの畜養池が広くみられ、冬至祭などで食されたことなどが判明した。しかし、農耕とのかかわりは、稲作地域である長江流域、早くに稲作を受容した西日本では密接で、稲作の受容が遅れた東日本や稲作がなかったヨーロッパでは結びつきが希薄であることが明らかになった。中国の殷周時代のコイ科魚類遺存体の調査ができなかったので、おおむね順調に進展しているとした。長江流域から日本列島西半部にかけての地域はコイ科魚類が豊かで、その利用は後氷期になって盛んになる。イネが自生していた長江流域では、イネ遺存体に随伴してコイ科魚類遺存体が出土しているにも拘わらず、研究はあまり行われていなかった。
遺伝子発現抑制薬ピロール－イミダゾールポリアミドの構造－薬物動態相関モデルの構築

ピロール-イミダゾール(PI)ポリアミドは任意の二本鎖DNAに入り込み、遺伝子の発現を制御する化合物群である。任意の遺伝子の発現を制御するため、様々な疾患の治療薬開発が可能と期待される。本研究では、PIポリアミドによる創薬開発の基板として、PIポリアミドの薬物体内動態と分子構造の関係を調べた。PIポリアミドの分布容積および血漿タンパク結合率は分子構造から予測できる可能性が示唆された。クリアランスと分子構造の関係は、検出されなかった。より詳細な検討を行うため、さらにPIポリアミドの体内動態情報を集積する必要がある。ピロール-イミダゾール(PI)ポリアミドはN-メチルイミダゾールとN-メチルピロールより合成され、任意の二本鎖DNAに入り込み、塩基対特異的に結合することにより、遺伝子の発現を制御する化合物群である。本研究では、PIポリアミドによる創薬開発の基板として、ラットにおけるPIポリアミドの薬物動態と分子構造の関係を調べた。PIポリアミド7化合物について、化合物の薬物動態学的特徴を表す分布容積、クリアランス、血漿タンパク結合率を算出した。それぞれのPIポリアミドの分子構造から、ADMET物性予測ソフトウェアADMET Predictorを用い、分子構造の特徴を表す分子記述子を算出した。分布容積、クリアランス、血漿タンパク結合率を従属変数、分子記述子を独立変数とし、パワーモデルを当てはめた。PIポリアミドの分布容積は、電子密度に関する分子記述子であるPi_Q6と強い関係が認められた。血漿タンパク結合率は、分子幾何構造に関係する分子記述子であるT_Radc,原子反応に関する分子記述子であるEEM_F6, Pi_FPL3と強い関係が認められた。クリアランスと関係がある分子記述子は認められなかった。このことにより、PIポリアミドのラットにおける分布容積および血漿タンパク結合率は、分子構造の設計段階から予測することができると考えられる。ピロールーイミダゾールポリアミド(PIポリアミド)はNーメチルピロールとNーメチルイミダゾールから構成されている化合物である。PIポリアミドはDNAの二重らせん構造に存在するminor grooveに高い親和性を持ち、エンハンサーや転写因子結合部位のプロモーター領域をPIポリアミド結合標的とすることにより、任意の遺伝子発現を抑制する。PIポリアミドは様々な薬効薬理が報告され、遺伝子発現抑制薬としての医薬品開発が望まれている。本研究は、分子構造が異なる様々なPIポリアミドのラットにおける薬物体内動態の特徴を調べ、PIポリアミドの分子構造と薬物体内動態の相関関係および、分子構造から薬物体内動態を予測する構造-薬物体内動態相関モデルを構築する計画である。薬物体内動態を調べるためには、生体試料中化合物濃度の測定が必須である。平成24年度は、高速液体クロマトグラフィーを用い、血液中および肝ミクロソーム中PIポリアミド濃度測定法を検討した。高速液体クロマトグラフィーによる血中濃度測定系が確立されたPIポリアミドについては、化合物の薬物動態学的特徴を表す薬物動態パラメータの一つである血漿タンパク結合率を測定した。血漿タンパク結合率は、超遠心によりタンパク結合型PIポリアミドと、遊離型PIポリアミドを分離する超遠心法により測定した。さらに物性予測ソフトウェアを用い分子構造の特徴を表す分子記述子を発生させた。発生させた分子記述子と血漿タンパク結合率の相関関係を調べた。研究計画時に想定していた種類のPIポリアミドを入手することができず、当初の計画に比べやや遅れている。PIポリアミドの大量合成法が未だ見出されていないため、動物実験およびin vitro代謝実験に用いるPIポリアミドの入手が困難な状況である。そのため、PIポリアミドに加え、PIポリアミドと分子構造が類似している化合物も含め体内動態を調べている。さらに、文献等により報告されている化合物の体内動態データも併せて解析し、構造ー体内動態相関モデルを構築する。PIポリアミドの入手が研究計画当初に比べ困難であるため、PIポリアミドに加え、ピロールまたはイミダゾールを含む分子構造の化合物も体内動態検討対象に含め構造-体内動態相関モデルを構築する。また、動物実験の迅速化・効率化のため、化合物の投与および採血に使用するカニューレ挿入処置済みラットを購入する。PIポリアミドの入手が困難なため、当初計画していた実験計画通りに進捗せず次年度使用額が生じた。次年度使用となった研究費は、カニュレーション処置済みラットの購入、試薬の購入等、消耗品購入に使用する。
ヘリコバクター・ピロリCagAタンパク質の発がん活性を規定する分子構造基盤

近年の研究からピロリ菌cagA遺伝子陽性株感染と胃がんとの密接な関連が明らかとなり、胃がん発症機序への理解や胃がん治療への応用にCagAの発がん活性発現における分子機構の解明が重要な意義を持つものと期待されている。これまでに、CagAを介する胃がんの発症においてCagA-SHP2複合体形成によるSHP2チロシンホスファターゼの機能的脱制御が重要な役割を果たすことが示されている。本研究ではX線結晶構造解析によりCagA-SHP2複合体の立体構造を解析することで、CagAによるSHP2活性化の分子基盤を解明することを目的としている。本年度は研究実施計画として初めに予定していたチロシンリン酸化CagAペプチド-SHP2複合体の結晶構造解析を行なった。まず、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体の結晶化スクリーニングから開始した。嫌気チャンバー内でのスクリーニングの結果、結晶が得られる条件が見つかったが、得られた結晶は非常に脆くX線回折実験に用いることができなかった。また、結晶化の再現性が非常に低く、安定的に結晶が得られる条件は見つかっていない。そこで、CagAの別の宿主細胞内標的分子であるPAR1キナーゼを加えたCagA-SHP2-PAR1三者複合体を形成させることでCagA-SHP2間の結合が安定化するということが示唆されていたため、次に、当初の計画を変更してCagAのEPIYA-DセグメントならびにCagAのPAR1結合部位であるCM配列を模したペプチド(EPIYA-D-CMペプチド)とSHP2およびPAR1との三者複合体の結晶化に着手した。この複合体を用いて結晶化スクリーニングを行なったが、複合体の結晶は得られていない。今後は、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を開始する予定である。当初の計画では初年度までにX線回折実験を行う予定であったが、現時点では結晶化条件のスクリーニングを行っている段階である。しかし、回折実験に用いるには質的に不十分ではあるが、結晶が得られる結晶化条件が見つかっているため、その条件を基に結晶化条件の最適化を行うことで回折データを収集できる結晶が得られると考えている。以上のように当初の計画からは多少の遅れがあるが、結晶が得られる条件の決定が本研究における最も大きな障壁であると考えられるため、現状としては大きな遅れではないと考えている。今後はまず、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を行う。それぞれの複合体がより安定化する条件が決定したら、その条件において結晶化スクリーニングを開始する。複合体の安定性解析と並行してEPIYA-DペプチドとSHP2との複合体の結晶化条件の最適化を行う。結晶化条件が決定した場合、その条件を基に他のCagAペプチドを用いたSHP2とのまたはPAR1を含めた三者での共結晶化を行う。さらに、全長CagAを用いて同様の結晶化条件における結晶化を行う。なお、それぞれの結晶化の際には最初に得られた複合体の結晶を用いたヘテロマイクロシーディングも試みる。結晶が得られた場合には随時X線回折実験を行う。回折データが収集でき次第、各種複合体の結晶構造の決定を目指す。結晶構造解析により立体構造情報が得られた場合、当初の計画通り、CagA-SHP2複合体形成ならびにCagA-SHP2-PAR1複合体形成を阻害するCagA変異体分子の作製および立体構造解析により得られたCagA変異体分子の生物学的機能の解析を開始する。今後は、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-

D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を開始する予定である。当初の計画では初年度までにX線回折実験を行う予定であったが、現時点では結晶化条件のスクリーニングを行っている段階である。しかし、回折実験に用いるには質的に不十分ではあるが、結晶が得られる結晶化条件が見つかっているため、その条件を基に結晶化条件の最適化を行うことで回折データを収集できる結晶が得られると考えている。以上のように当初の計画からは多少の遅れがあるが、結晶が得られる条件の決定が本研究における最も大きな障壁であると考えられるため、現状としては大きな遅れではないと考えている。今後はまず、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を行う。それぞれの複合体がより安定化する条件が決定したら、その条件において結晶化スクリーニングを開始する。複合体の安定性解析と並行してEPIYA-DペプチドとSHP2との複合体の結晶化条件の最適化を行う。結晶化条件が決定した場合、その条件を基に他のCagAペプチドを用いたSHP2とのまたはPAR1を含めた三者での共結晶化を行う。さらに、全長CagAを用いて同様の結晶化条件における結晶化を行う。なお、それぞれの結晶化の際には最初に得られた複合体の結晶を用いたヘテロマイクロシーディングも試みる。結晶が得られた場合には随時X線回折実験を行う。回折データが収集でき次第、各種複合体の結晶構造の決定を目指す。結晶構造解析により立体構造情報が得られた場合、当初の計画通り、CagA-SHP2複合体形成ならびにCagA-SHP2-PAR1複合体形成を阻害するCagA変異体分子の作製および立体構造解析により得られたCagA変異体分子の生物学的機能の解析を開始する。本年度の研究計画では結晶化から回折データの取得、さらに構造解析を行う予定であった。しかし、現状として結晶化条件のスクリーニングを行っている段階であり、やや遅れが生じている。従って、研究の遅れに伴い本年度使用額が次年度に持ち越された。以上の事由から次年度使用額が発生した。しかし、次年度の早い段階で結晶が得られ、回折データが収集できる見通しである。従って、本年度に計上していた解析用PCも早い段階で購入する予定である。さらに、現段階では1種類のペプチドを用いて結晶化スクリーニングを行っているが、結晶化条件が決定し次第すぐに複数種類のペプチドを購入する予定である。実験の進行に伴い、本年度に使用する予定であった試薬も購入する。それ以降は2年目の研究計画通りに進行すると考えられるため、次年度使用計画に従って使用していく。