hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物における倍数性進化の分子遺伝学的基礎

倍数種とその祖先型低倍数種の核ゲノムの差異を分子遺伝学的手法を用いて研究し,倍数性進化の分子的基礎を明らかにするため,パンコムギとその祖先種を用いて,次の4項目の研究を実施した。A)基盤的研究:パンコムギのゲノミックDNAライブラリーを構築し,それより選抜したプローブとして適切な約200クローンを用いて,パンコムギとスペルタコムギのF_2系統66のサザン分析を行い,普通系コムギの21種染色体に対応するRFLP座位の21連鎖群を解立した。B)ゲノムレベルの研究:核ゲノム構成がAA,AABB,AAGG,AABBDDである4群のコムギの多数系統について,上記Aの研究において多型性が認められたクローン・酵素組合せを用いてサザン分析を行い,群内・群間の核ゲノムの変異性を定量化し,全系統を含む系統樹を作成した。C)染色体レベルの研究:パンコムギの第24同祖群に属する9染色体の多数の末端欠失系統について,上記RFLPクローンをプローブとするサザン分析を行い,各染色体のCバンド法を用いて作成された細胞学的地図と上記Aで作成したRFLP座位の分子地図との対応関係を確立した。D)遺伝子レベルの研究:ヒストンタンパク質遺伝子,そのうちのH_3遺伝子の調節タンパク質遺伝子(以上核遺伝子),rbcL,atpA,atpE(以上葉緑体遺伝子),cox3,atp6(以上ミトコンドリア遺伝子)の構造解析などを行い,倍数種と祖先低倍種間の分子的差違を明らかにした。以上の研究成果の総括から,4倍性及び6倍性コムギの核ゲノムの遺伝的多様度は,それらの祖先2倍種の遺伝的多様度の1/3以下であって,極めて遺伝的均一性が高いこと,及びオルガネラゲノムの変異性は,同じく2倍性レベルにおいて大きいものの,核ゲノムに比較するとその差異は小さく,オルガネラゲノムの進化的保存性が証明された。倍数種とその祖先型低倍数種の核ゲノムの差異を分子遺伝学的手法を用いて調べ,倍数性進化の分子的基盤を明らかにするため,パンコムギとその祖先種を用い,次の4項目の研究を実施することを計画している。それぞれの項目について得られた成果は次のとおりである。<A)基盤的研究>___ーパンコムギ品種Chinese Spring(以下CS)の核DNAのEcoRI,HindIII及びPstI断片のうち,大きさが0.52.0kbpのものを選んで,ベクタ-pUC119に組み込み,約850のクロ-ンを得た。このうちの約50%が半数核当りのコピ-数が10前後のユニ-クコピ-と見なせるものであった。<B)ゲノムレベルの研究>___ー6倍性である普通系コムギ(8系統),4倍性である二粒系コムギ(33系統)とチモフェ-ビ系コムギ(25系統),それに2倍性である一粒系コムギ(7系統)とAegilops squarrosa(5系統)より核DNAを抽出し,(A)で作成したクロ-ンをプロ-ブに用いて,サザン分析を行い,核ゲノムの分化の程度を推定した。その結果,各系内の系統分化,及び倍数種の成立に関与した低倍数種の特定に成功した。<C)染色体レベルの研究>___

ー上記CSの核DNAのクロ-ンを用い,CSとスペルタコムギのF_2雑種66個体について,両親間にみられるRFLP座位の連鎖分析を行うとともに,CSの20系統のナリテトラソミックスを用いて各連鎖群を代表する座位の座乘染色体を決定した。その結果,パンコムギの21染色体のすべてに対応する連鎖群が特定できた。これには119のRFLP座位と,347の非RFLP座位が含まれている。<D)遺伝子レベルの研究>___ー(A)(C)の研究に重点を置いたため,この項の研究はまだ準備段階にある。ユニ-クコピ-に近いグルタミン酸合成酵素の遺伝子及び重複遺伝子族に属するαーアミラ-ゼ遺伝子のクロ-ンを入手し,これをプロ-ブにコムギ遺伝子の探索を行う準備をしている。倍数種とその祖先型低倍数種の核ゲノムの差異を分子遺伝学的手法を用いて調べ,倍数性進化の分子的基礎を明らかにするため,パンコムギとその祖先種を用い,次の4項目について研究を進めている。それぞれの項目について本年度得られた結果は次のとおりである。A)基盤的研究ー2つの研究を行った。始めにパンコムギ品種CSの40の単腕染色体系統を用い,Liu・Tsunewaki(1991)がRFLP連鎖地図上に同定した座位のうち130座位の座乘染色体腕を決定した。その結果,12染色体についてRFLP地図上の動原体の位置を特定した。次に同じCSの第24同祖群染色体の部分欠失系統48を用い,これら9染色体の細胞学的地図とRFLP地図の対応関係を決定した。B)ゲノムレベルの研究ー上記の研究に用いたゲノミックDNAクロ-ンの中から58を選んでプロ-ブとし,2倍性コムギ3種3系統,4倍性コムギ13種33系統,6倍性コムギ6種11系統の核DNAのRFLP分析を行い,倍数種とその低倍数性祖先種の間のゲノムの相同性を推定し,これらの間の系統関係を確立した。C)染色体レベルの研究ーcDNAクロ-ンをプロ-ブとするRFLP分析によって,同祖染色体の機能的相同性を探るための研究に着手した。現在までに,ヒストンタンパク質遺伝子4,ヒストン遺伝子結合タンパク質遺伝子5のクロ-ンをプロ-ブに用いて異数体分析を行い,5種のヒストン遺伝子結合タンパク質の遺伝子はそれぞれ同一同祖群に属する3本の染色体のすべてに保存されていることが判明した。ヒストンタンパク質遺伝子については,ヒストン1遺伝子のみ第5同祖群の3本の染色体すベてにみられたが,他ヒストンタンパク質の遺伝子はすべて多数の染色体に分散して存在していた。D)遺伝子レベルの研究ー現在まだ準備段階にある。倍数種とその祖先型低倍数種の核ゲノムの差異を分子遺伝学的手法を用いて調べ、倍数性進化の分子的基礎を明らかにするため、パンコムギとその祖先種を用い、次の4項目について研究を進めている。A)基盤的研究--前年度作成したパンコムギの21染色体のRFLP地図の拡充と、Map Makerを用いた再検討を行い、総計199座位、1869cMからなるRFLP座位の連鎖地図を作成し、うち12染色体の連鎖地図については、動原体の位置を決定した。B)ゲノムレベルの研究--核のゲノム構成がAA,AABB,AAGG,AABBDDである4群のコムギの多数の系統について、パンコムギ核DNAのクローンをプローブとするサザンハイブリダイゼーションを行い、群内・群間の核ゲノムの変異性を定量的に分析・評価した。C)染色体レベルの研究--パンコムギの第24の3同祖群に属する9染色体の末端欠失系統64のDNAを用い、これら染色体のRFLPマーカーであるDNAクローンをプローブにしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
海産無脊椎動物からの細胞分裂の特異的阻害剤の開発

海綿など海産無脊椎動物は、種々の生理活性物質を豊富に含んでおり、これらは生命科学的な研究を行う上でも格好の試薬として注目されている。本研究は、海綿から得られたウニ卵割の阻害物質を対象に、細胞骨格の主要成分であるアクチンとの相互作用を調べ、細胞質分裂との関連性を検討する目的で行われた。まず、ウニの卵割阻害や細胞毒性を指標に、種々のクロマトグラフイ-を駆使して、いくつかの生理活性物質を海綿の抽出物から単離した。次いで、これら物質を、マウスやラットの線維芽細胞に加えて、10%FCSを含むMEM培地中、5%CO_2下でインキュベートし、細胞の形態変化や細胞質分裂の様相を調べた。さらに、細胞のF-アクチンからなるストレス・ファイバー、および核を染色し、活性物質の影響をみた。その結果、フォスファターゼ阻害剤であるカリキュリンAは、細胞の形態を著しく変化させた。さらに、細胞をシャーレから剥離させ、細胞表面にblebを生じさせたが、ストレス・ファイバーに及ぼす影響については、とくに顕著な傾向はみられなかった。一方、ミカロライドB(MY-B)やビスセオネライドA(BT-A)も細胞の形態を変化させ、ストレス・ファイバーを消失させたが、細胞はシャーレから剥離しなかった。なお、この場合、細胞質分裂が阻害されているにもかかわらず、核分裂は進行した。そこで、MY-BやBT-Aにつき、G-アクチンからF-アクチンへの重合能に及ぼす影響を調べたところ、いずれも強力に阻害することが示された。また、MY-Bにおいては、F-アクチンをG-アクチンに脱重合する作用も認められた。したがって、これら試薬は、細胞性アクチンに作用することにより、培養線維芽細胞の細胞質分裂を阻害することが示唆された。
運動スキルの長期的記憶の神経機構の解明

自転車の乗り方や水泳の動作といった運動スキルの記憶は、ニューロンからニューロンへの情報伝達の場であるシナプスの可塑性を基礎過程としていると考えられている。現在までに、中枢神経系において運動スキルの記憶に重要な役割を果たしている場所としては小脳があり、実際に歩行の適応制御や前庭動眼反射の適応制御に小脳長期抑圧が重要な役割を果たしていることが証明されている。ところで、小脳は歩行や眼球運動などの体性運動の制御のみならず、心臓・血管系をはじめとする自律神経系の制御にも関与している。以前の研究は、ウサギまたはラットを対象に条件刺激として音刺激、無条件刺激として耳あるいは尾への電気刺激の呈示を組み合わせ、数秒間の音刺激呈示中に漸進的に心拍数が低下する徐脈を観察し、この条件付け徐脈反応が小脳虫部の破壊により減弱されることを報告している。本研究では長期抑圧の発現にも深く関わる代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)が条件付け徐脈の発現においてどのように機能しているのか明らかにすることを目的とした。逆進性遺伝学的手法によりmGluR1を欠損させたmGluR1ノックアウトマウス、小脳プルキンエ細胞だけにmGluR1が発現し、他の脳組織には発現していないmGluR1レスキューマウスを用いて、その条件付け徐脈について詳細に調べた。条件刺激(音刺激)と無条件刺激(尾部への電気刺激)を組み合わせた恐怖条件付けパラダイムにより、すべてのマウスにおいて条件付け徐脈の獲得・保持・消去が同様に観察されたが、音刺激呈示中の徐脈において、mGluR1ノックアウトマウスに顕著な特徴が観察された。mGluR1ノックアウトマウスは野生型マウスに比べて著しく大きな徐脈を示した。一方、小脳プルキンエ細胞にのみmGluR1が発現しているmGluR1レスキューマウスは野生型マウスと同様のレベルの徐脈を示した。これらの結果より、小脳プルキンエ細胞におけるmGluR1は、小脳が介在した自律神経系の制御に関与し、条件付け徐脈において、条件刺激に対する心拍応答(徐脈)の大きさの調節に関与していることが結論される。小脳は運動を円滑に行うためのスキルの学習・記憶に重要な役割を持っており、その基礎過程にはプルキンエ細胞におけるシナプス伝達の可塑性(長期抑圧)が機能している。ところで、学習したものを長期的に記憶としてシナプスにおいて保存しておくためには何らかのタンパク合成が必要ではないかと考えられている。そこで、本研究においては、歩行における運動学習として回転棒課題を、さらに心拍条件付け課題をマウスにおいて行い、学習前および学習が成立した保持の時期にタンパク合成阻害剤を小脳皮質に投与する。用いたマウスは6-8週齢のC57BL/6ですべてオスであった。タンパク合成阻害剤としてはアクチノマイシン(actinomycin)およびアニソマイシン(anisomycin)を用い、対照として生理的食塩水を用いた。回転棒課題を行わせるマウスに対しては、あらかじめ阻害剤注入のためのヘッドチャンバーを小脳直上の正中に取り付けておいた。回転棒課題を行う前あるいは10試行以上行い、安定して歩行ができるようになった後に小脳虫部にタンパク合成阻害剤を投与した個体においても、生理的食塩水を投与した個体と差異は観察されなかった。小脳は運動の制御のみならず、心臓・血管系をはじめとする自律神経系の制御にも関与している。ウサギやラットを対象に条件刺激として音刺激、無条件刺激として尾部の電気刺激の呈示を組み合わせ、数秒間の音刺激呈示中に漸進的に心拍数が低下する徐脈反応、すなわち条件付け徐脈に小脳虫部が関与している。そこで、マウスにおいてもこの条件付け徐脈課題を行う実験準備を進めた。この課題におけるタンパク合成阻害剤の投与実験は次年度に行う。

mGluR1ノックアウトマウスは野生型マウスに比べて著しく大きな徐脈を示した。一方、小脳プルキンエ細胞にのみmGluR1が発現しているmGluR1レスキューマウスは野生型マウスと同様のレベルの徐脈を示した。これらの結果より、小脳プルキンエ細胞におけるmGluR1は、小脳が介在した自律神経系の制御に関与し、条件付け徐脈において、条件刺激に対する心拍応答(徐脈)の大きさの調節に関与していることが結論される。
免疫応答におけるインテグリン接着制御の分子メカニズムの解明

低分子量Gタンパク質Rap1はLFA-1の接着性を亢進させる細胞内シグナル伝達分子であり、TCRやケモカインで活性化されることを明らかにしてきた。ケモカインによるRap1の活性化はTリンパ球の活発な遊走、LFA-1やVLA-4を介する血管内皮への接着、血管内皮通過やリンパ球細胞極性を誘導する。さらにRap1のこのような機能を伝達するエフェクター分子RAPLを同定した。RAPLはRap1-GTPに特異的に結合する、分子量約3万のタンパク質である。RAPLは脾臓、リンパ節、胸腺に多く発現し、特にリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞に発現している。RAPLはLFA-1の親和性を亢進させるとともに、リンパ球細胞極性を誘導する。ケモカイン刺激するとLFA-1とRAPLは細胞先端に速やかに移行し、両者の局在は良く一致する。RAPLは活性化Rap1の存在でLFA-1と複合体を形成し先端側にLFA-1を集積させ、接着を誘導すると考えられた。RAPL欠損マウスの解析から、ケモカインによるLFA-1/ICAM-1,VLA-4/VCA-1によるリンパ球接着が著しく低下し、細胞極性を持った形態も誘導されない。また2次リンパ組織が低形成になる。これはリンパ球ホーミングが低下していることから起こっていた。さらに胸腺からの成熟胸腺細胞の移出低下、辺縁洞B細胞減少、B細胞成熟不全、樹状細胞の減少と局所リンパ節への遊走低下があり、これらはインテグリン接着低下による細胞遊走や局在異常に基づくと考えられる。したがってRap1-RAPLが生体内において免疫系細胞移動や局在に不可欠の働きをしていることが明らかになった。Rap1がβ2インテグリンLFA-1の接着性を調節する分子であることを見いだし、T細胞抗原受容体刺激によるLFA-1のICAM-1への接着性調節を通して、Tリンパ球の抗原認識を調節し、Tリンパ球の活性化、アポトーシス、アナジーに関連することを明らかにした。さらにRap1はケモカイン刺激によるLFA-1/ICAM-1やVLA-4/VCAM-1接着、細胞移動、細胞極性の誘導に関与し、血管内皮細胞への接着や通過に重要な働きをしていることを見いだした。これらのRap1による接着、脱接着に必要なLFA-1細胞内領域を決定し、Rap1はLFA-1の親和性と凝集の亢進により接着性を制御しており、脱接着はLFA-1のエンドサイトーシスによることを明らかにした。これらの研究は、いままで不明であったRap1の生理的機能が免疫系ではリンパ球の接着、動態制御にあることを明確に示した。さらにRap1に結合し、リンパ球に多く発現している新規エフェクター分子を単離し、この分子がRap1によるインテグリンの接着、遊走、細胞極性調節に重要な役割を果たしていることを明らかにしつつある。この分子はRap1によるリンパ球動態制御を解明する新たな突破口となると考え、個体レベルから分子レベルにわたる詳細な解析を進めている。ケモカインによるRap1の活性化はTリンパ球の活発な遊走を刺激する。またLFA-1やVLA-4を介する血管内皮への接着を生理的還流下に調べ、Rap1の活性化が接着と血管内皮通過を引き起こすことが分かった。

さらにRap1はリンパ球細胞極性を誘導し、先端にケモカイン受容体CXCR4が集積し、後端にCD44が集積するuropodが形成することができることが明らかになった。Rap1のこのような機能を伝達するエフェクター分子RAPLを同定した。RAPLは酵母two-hybrid法にて単離され、Rap1-GTPに特異的に結合する、分子量約3万のタンパク質である。RAPLは脾臓、リンパ節、胸腺に多く発現し、特にTリンパ球、Bリンパ球に発現している。RAPLは過剰発現させるとLFA-1を介するICAM-1への接着を誘導し、N末端を欠失させた変異体はdominant negativeに働き、TCRやケモカインによる接着誘導を阻害した。RAPLはLFA-1の親和性を亢進させるとともに、リンパ球細胞極性を誘導する。ケモカイン刺激するとLFA-1とRAPLは細胞先端に速やかに移行し、両者の局在は良く一致する。また、RAPLは活性化Rap1の存在でLFA-1と複合体を形成することがわかった。以上のことより、RAPLはRap1-GTPと結合すると、細胞極性を誘導し、さらにLFA-1と複合体を形成することによって先端側にLFA-1を集積させ、接着を誘導すると考えられる。低分子量Gタンパク質Rap1はLFA-1の接着性を冗進させる細胞内シグナル伝達分子であり、TCRやケモカインで活性化されることを明らかにしてきた。ケモカインによるRap1の活性化はTリンパ球の活発な遊走、LFA-1やVLA-4を介する血管内皮への接着、血管内皮通過やリンパ球細胞極性を誘導する。さらにRap1のこのような機能を伝達するエフェクター分子RAPLを同定した。RAPLはRap1-GTPに特異的に結合する、分子量約3万のタンパク質である。RAPLは脾臓、リンパ節、胸腺に多く発現し、特にTリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞に発現している。RAPLは活性化Rap1の存在でLFA-1と複合体を形成し先端側にLFA-1を集積させ、接着を誘導すると考えられた。RAPL欠損マウスの解析から、ケモカインによるLFA-1/ICAM-1,VLA-4/VCAM-1によるリンパ球接着が著しく低下し、細胞極性を持った形態も誘導されない。また2次リンパ組織が低形成になる。これはリンパ球ホーミングが低下していることから起こっていた。さらに胸腺からの成熟胸腺細胞の移出低下、辺縁洞B細胞減少、B細胞成熟不全、樹状細胞の減少と局所リンパ節への遊走低下があり、これらはインテグリン接着低下による細胞遊走や局在異常に基づくと考えられる。したがってRap1-RAPLが生体内において免疫系細胞移動や局在に不可欠の働きをしていることが明らかになった。
転写伸長時に必須なクロマチン構造制御の分子メカニズムの解析

真核細胞の染色体DNAはクロマチンと呼ばれる高次に折り畳まれた構造で核内に存在している。このような高次構造は、遺伝子の転写調節において、転写調節因子がDNAに相互作用するのを妨げるので、遺伝情報を必要な時期に必要な量だけ的確に発現させるためには局所的な構造変化(クロマチンリモデリング)が必要となる。本研究では、出芽酵母の生育に必須なロマチンリモデリング複合体RSCが、転写伸長反応においてどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目指した。RSCの欠損は、6-azauracil(6AU)に耐性を示し、転写伸長反応を正に制御するDST1やSPT4の欠損による6AU感受性を抑圧したことから、RSCは転写伸長反応を負に制御する可能性が予想された。そこで、RNAポリメラーゼIIの大サブユニットをリン酸化することにより、グローバルに転写伸長反応を正に制御しているBUR1遺伝子との遺伝学的関係について調べた。その結果、BUR1遺伝子破壊による致死性をRSCの欠損によって抑圧できないことがわかった。従って、RSCは特走の遺伝子の転写伸長反応を負に制御している可能性が考えられた。RSCがIMD遺伝子群の転写調節を介して、6AU存在下におけるヌクレオチド合成の調節に働く可能性については、今後の検討が必要である。真核細胞の染色体DNAはクロマチンと呼ばれる高次に折り畳まれた構造で核内に存在しており、生命システムは、この高次構造を適宜動的に再編すること(クロマチンリモデリング)によって、遺伝子発現をはじめとする諸反応を制御している。本研究では、出芽酵母のATP依存的クロマチンリモデリング因子の一つであるRSC複合体が、転写伸長時に必須なクロマチン制御においてどのような役割を果たしているか明らかにするため、まず、RSC欠損により、どこで、どのようなクロマチン制御異常が生じているかについて調べることにした。これまでの解析により、出芽酵母の分化過程で働くIME2遺伝子の転写量がRSCの欠損によって著しく低下することから、RSCの標的転写領域の候補としてIME2遺伝子に着目した。RSCがIME2遺伝子付近のクロマチンリモデリングに働く可能性を想定し、MNase酵素処理法による詳細な解析を行った結果、RSC依存的にIME2遺伝子上流のTATA配列付近に形成されたクロマチン構造が減数分裂特異的に緩和されることを見出した。また、この緩和は、クロマチン構造を形成するピストン八量体がトランスに解離するのではなく、シスに移動することで起こることが示唆された。この構造変化に伴い、RNAポリメラーゼIIのTATA領域への結合が促進されることをクロマチン免疫沈降法により明らかにした。さらに、RSCは転写活性化因子であるIme1と相互作用し、IME2遺伝子上流のTATA領域にリクルートされることを見出した。以上の結果より、in vivoにおいてRSCの機能が必須な標的転写領域を新たに同定することができた。
金属低次元構造の原子スケール制御と赤外応答制御

本プロジェクトでは、人工的・自己組織化的手法を利用して原子レベルで精緻に制御された"低次元金属ナノ構造物"を実現し、プラズモンの低次元化や閉じ込め効果等を利用し、所望の誘電物性や機能物性の設計・実現へ向けた指導原理を得ることを目指した。真空中での膜成長の実験に並行して、溶液環境で作成したSEIRA活性金属膜の構造制御の研究を行った。具体的には、金コロイド-SiO_2/Si界面で成長させたナノ粒子膜のin situ成長モニター及び制御を行い、作成した膜の赤外・可視光学特性とFE-SEMやAFMで評価した構造情報との関連性を解明した。モニター手法には赤外光そのものを用い、膜のプラズモン共鳴によるスペクトル形状とSEIRA活性度との対応関係、あるいは走査電子顕微鏡のex situ観察とSEIRA活性度との対応関係を詳細に調べた。また、作製したSEIRAセンサー膜の応用に関しては、グループ内ですでに経験を有するDNA試料や外部研究機関から提供された分子を用いて、製作した材料の試験を行った。その結果、単分子層吸着にも拘わらず、20パーセントにも及ぶ赤外吸収強度を実現するSEIRA活性膜を製作することに成功し、特許出願やプレス発表を行った。また、原子スケールプラズモンの研究ではAu原子細線やIn原子細線のEELS研究を進め、パイエルス転移などの金属-絶縁体転移が一次元朝永プラズモンの分散関係に及ぼす影響について、世界で初めての測定を行い、国際会議・依頼セミナーでの講演や学術誌への投稿を行った。以上の成果が契機となり、本年度はドイツ、スペイン、アメリカの大学から共同研究の申し出を受けるなど、世界的にも研究の認知度が高まり、中国・ドイツ・イタリアを中心として追随研究が開始された。本プロジェクトでは、人工的・自己組織化的手法を利用して原子レベルで精緻に制御された"低次元金属ナノ構造物"を実現し、プラズモンの低次元化や閉じ込め効果等を利用し、所望の誘電物性や機能物性の設計・実現へ向けた指導原理を得ることを目指す。研究代表者の金属/誘電体ヘテロエピタクシーの技術をベースに、所属研究機関・部門の微細加工技術、研究協力者の化学的ナノ構造構築手法を複合的に発展させ、数十ナノメートルから原子スケールまでの金属構造物を、溶液環境・真空環境において制御性良く構築する方法を多角的に探索する。本年度は、シリコン表面上(Si(557)表面上)に規則配列させた金-シリコンの原子鎖列に対して、世界最高波数分解能を持つ低速電子回折・分光装置を用い、プラズモン測定を行った。朝永理論でも有名な、一次元プラズモンの分散関係の測定に成功し、このプラズモンが、赤外領域に振動数を分散させる音響波的なモードであることを見出した(長尾)。さらに、量子論を用いた理論解析により、一次元プラズマ振動する電子同士の交換・相関効果が予想以上に大きいこと明らかにした(稲岡)。また、溶液中の金ナノ粒子の表面増強赤外吸収効果を用いて固-液界面での金ナノ粒子膜の膜形成ダイナミクスを詳細に調べ、その形成過程が一次のラングミュア吸着模型で説明可能であることを明らかにした。また、ナノ粒子の脱離に関しても分子レベルの微視的な立場からそのメカニズムを解明した(Enders、長尾)。本年度は真空中での膜成長の実験に並行して、溶液環境で作成したSEIRA活性金属膜の構造制御の研究を開始した(長尾,Enders)。ナノ構造をその場モニター法を用いて精密に規定・制御し、ナノ構造とSEIRA活性度の対応関係について系統的に調べる。

モニター手法には赤外光そのものを用い、膜のプラズモン共鳴によるスペクトル形状とSEIRA活性度との対応関係、あるいは走査電子顕微鏡のex situ観察とSEIRA活性度との対応関係を詳細に調べた。また、作製したSEIRAセンサー膜の応用に関しては、グループ内ですでに経験を有するDNA試料や外部研究機関から提供された分子を用いて、製作した材料の試験を行った。その結果、単分子層吸着にも拘わらず、20パーセントにも及ぶ赤外吸収強度を実現するSEIRA活性膜を製作することに成功し、特許出願やプレス発表を行った。また、原子スケールプラズモンの研究ではAu原子細線やIn原子細線のEELS研究を進め、パイエルス転移などの金属絶縁体転移が一次元朝永プラズモンの分散関係に及ぼす影響について、世界で初めての測定を行い、国際会議・依頼セミナーでの講演や学術誌への投稿を行った(長尾,劉,柳沼)。以上の成果が契機となり、本年度はドイツ、スペイン、アメリカの大学から共同研究の申し出を受けるなど、研究の認知度が高まりつつある。
自律故障補償可能なWSI規模超高速神経回路網の実現とその応用に関する研究

自律故障補償可能なWSI規模のハードウェア神経回路網の設計とハードウェア実装を進めた.同時に,提案している部分再学習(PR)法の故障補償能力に大きな影響を与える初期学習の実施方法について,シミュレーテッドアニーリングの考え方を援用したBPA(Back-Propagation with Annealing)法を提案し,BPA法とPR法を組み合わせることで大幅に故障補償率を向上させることを示した.故障補償能力を持つハードウェアニューロンについては,必要となる機能ブロックをVHDLで設計し,動作を検証した.特に論理合成ツール,シミュレーションツールに関しては本研究費でMentor Graphics社によるHigher Education Programに加入し,安価に高性能のツールを導入することができた.また,再学習時に必要となる重みや教師信号をボード上のDRAMに移すことで,回路規模を削減することができた.初期学習法としてBPA法を提案し,BPA法とPR法を組み合わせることで従来のBP法を初期学習法に用いる場合に比べ,リンクの単一断線故障時に約20%,ニューロンの0-スタック故障時に約20%,ニューロンの1-スタック故障時に約10%向上させることができた.これらの成果は現在研究報告としてとりまとめているところである.WSI上に実装した神経回路網を実現するために必要となる自律的な故障補償法として,提案している部分再学習法の評価とVHDLによるハードウェアの設計の準備を進めた.はじめに,部分再学習法を実現する上で必要となる,適切な初期重みの獲得方法についてシミュレーションを行った.部分再学習法は,故障の影響を受ける一部分だけの重みを調整することで故障を隠蔽するため,ある入力を分類するのに必要不可欠な中間ニューロンが初期学習により生成されると,故障補償が困難となる.これを回避するため,耐最悪故障化学習法を適用してある学習パターンの分類を複数の中間ニューロンが分担することを試みた.通常の誤差逆伝搬学習法を比較対象とし,これらの初期学習を適用した後にリンクの断線故障を挿入し,部分再学習法により故障補償を行った.対象問題は入力ニューロン2,中間ニューロン4,出力ニューロン1を用いるXOR問題としたところ,耐最悪故障化学習法では学習が収束しない場合が多く,初期学習法としては不適であることが明らかとなった.この結果は電子情報通信学会の研究会にて,近く発表する予定である.VHDLによるハードウェア設計については,設計用コンピュータと最新のシミュレーションツールを導入し,ニューロンのforward pass部分の実装を始めている.これらのほかに,コンピュータ上でのシミュレーションを高速に行うため,並列シミュレーション環境の構築も行った.複数のコンピュータに対してシミュレーションジョブを効率よく割り当てるジョブスケジューリングアルゴリズムを考案して評価を行った.従来のジョブスケジューリング法に比べ,最大で約50%の処理時間の短縮が可能であることを示し,情報処理学会等で発表を行った.自律故障補償可能なWSI規模のハードウェア神経回路網の設計とハードウェア実装を進めた.同時に,ハードウェア完成後のベンチマーク(遺伝子解析等の大規模問題)用データ収集のため,従来の並列分散環境下で大規模問題を解くためのスケジュール法についても検討した。はじめに,故障補償能力を持つニューロンをフォワード演算部,バックワード演算部,誤差演算部,重み更新部の4つのブロックに分け,それぞれについてVHDLで設計を行った.設計&シミュレーションツール,設計プラットフォーム,対象FPGAを実装した評価ボードともに本研究費で購入し,回路実装後の動作を確認するためにUSB接続の簡易型ロジックアナライザも導入した.特にシミュレーションツールに関しては,Mentor Graphics社によるHigher Education Programに加入し,安価に高性能のツールを導入することができた.これらを用いて,平成十八年度ではフォワード演算部,誤差演算部の設計が完了し,FPGA上に実装してロジックアナライザにより動作を確認した.本成果は電子情報通信学会機能集積情報システム研究会にて発表を行った.今後は,バックワード演算部と重み更新部の設計と実装を進めるが,その際ボード上にあるDRAMを利用して,複数のニューロンをFPGA上に実装し,ネットワークとして動作させることを目標とする.また,ベンチマークデータ収集のため並列分散処理環境の構築を昨年度に引き続き行い,性能の異なる複数の計算機からなる環境でも効率的にジョブを割り当てるスケジューリングアルゴリズムのシミュレーションによる評価を行った.これらの成果は,情報処理学会ハイパフォーマンスコンピューティング研究会(SWoPP),及び宮崎大学工学部紀要にて発表した.自律故障補償可能なWSI規模のハードウェア神経回路網の設計とハードウェア実装を進めた.同時に,提案している部分再学習(PR)法の故障補償能力に大きな影響を与える初期学習の実施方法について,シミュレーテッドアニーリングの考え方を援用したBPA(Back-Propagation with Annealing)法を提案し,BPA法とPR法を組み合わせることで大幅に故障補償率を向上させることを示した.故障補償能力を持つハードウェアニューロンについては,必要となる機能ブロックをVHDLで設計し,動作を検証した.特に論理合成ツール,シミュレーションツールに関しては本研究費でMentor Graphics社によるHigher Education Programに加入し,安価に高性能のツールを導入することができた.また,再学習時に必要となる重みや教師信号をボード上のDRAMに移すことで,回路規模を削減することができた.初期学習法としてBPA法を提案し,BPA法とPR法を組み合わせることで従来のBP法を初期学習法に用いる場合に比べ,リンクの単一断線故障時に約20%,ニューロンの0-スタック故障時に約20%,ニューロンの1-スタック故障時に約10%向上させることができた.これらの成果は現在研究報告としてとりまとめているところである.
血管内皮細胞・周細胞相互陥入部を介した血管新生制御機構の三次元電顕免疫学的研究

血管内皮細胞・周細胞相互陥入部正Endothelialcell and pericyte interdigitation (EPI)は血管新生初期に比較にして血管新生成熟期に有意にその数が増加することを本研究者はラット実験肉芽組識モデルを用いて三次元電顕免疫学的に証明した。さらに、EPIでは血管新生因子の受容体は周細胞側に発現すること、さらに内皮細胞の増殖阻害因子が発現することを三次元電顕免疫学的に証明した。この結果から、EPIが血管新生制御機構に於いて新生血管の増加よりも、新生血管数の選択的維持に関与することを示唆した。また、広く知られている強い血管新生因子であるVascular endothelial growthfactor (VEGF)との関連性を検討した。本研究者は過去N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine(BBN)で誘発される、ラット傍胱癌でVEGFが発現することを報告した(Vet Pathol 36,1999)。そこで、BBN誘発ラット膀胱癌をモデルとしてVEGF中和抗体投与後の新生血管の形態とEPIの関係について検討した。その結果、VEGF中和抗体投与、5分後では有窓型内皮細胞分布率、内皮細胞の有窓数ともに有意に減少していた。これらパラメーターは10分後最低値を示した。しかし、その後、各パラメークーは経時的に増加し、30分後では正常値に復帰した。さらに、毛細血管の形態変化と正相関してEPI数の有意な減少が認められた。このことからEPIが血管新生の促進制御をしていないことが示唆された。さらに、マイクロアレイ解析からEPI数の有意な増加時にアポトーシス関連過伝子群の有意な発現亢進を確認した。EPIはアポトーシスを誘導することで血管新生制御を行うことが示唆された。新生血管に於ける血管内皮細胞・周細胞質相互陥入の出現と、両細胞に於ける血管新生制御に関連した因子及び同因子遺伝子の発現との関連性ついて、三次元電顕免疫学組織化学的・分子生物学的に検討することから、上記構造の形成に関与する因子と、同構造部を関係する血管新生制御因子を検討し、同構造が血管新生抑制をどの様制御しているかについて解明することを目的とした。実験肉芽組織:3週齢C57BLマウスの皮下に、bFGF添加硬化マトリゲル0.5mlを埋込み後、経日的にマトリゲル内の新生毛細血管の血管内皮細胞・周細胞質突起相互陥入の増減を検討したところ、10日後の成熟傾向を示す新生血管で最大値を示した上述したマトリゲルから、poly(Λ+)RNAを抽出しMouse Micro Array用チップにハイブリダイズしAtlas cDNA Expression Arrayを作製し特異的mRNAの発現を検討したところ、CamKIIとTGF-βのmRNAの発現上昇を確認した。しかし、電顕免疫組織化学的検討からら、TGF-βの発現は血管内皮細胞・周細胞では発現が低いことが確認され、血管新生部に遊走してくる多数のマクロファージで、これらの遺伝子が主に発現していることが確認された。現在、血管新生モデルを改め、さらに、アクチン系線維形成関連遺伝子に注目して、血管内皮細胞・周細胞質相互陥入構造の形成に関与する遺伝子を解析している。

昨年の検討から、アクチン系線維形成関連遺伝子の発現と、血管内皮細胞・周細胞質相互陥入の出現の間に相関関係が考えられた。年次計画にそって本年度は、実験肉芽組織をラットで作製した。作成法は過去の本研究者によって報告されているWakui et al.:Microvascular Research 46 19-27 (1993)。実験肉芽組織内の新生毛細血管の血管内皮細胞・周細胞質突起相互陥入の増減を検討したところ、10日後の成熟傾向を示す新生血管で最大値を示した。上述した肉芽組織は、シリコンスポンジの空間に新生毛細血管とマクロファージのみで構成されていた。この肉芽組織から、poly(A+)RNAを抽出しRat Micro Array用チップにハイブリダイズしAtlas cDNA Expression Arrayを作製し特異的mRNAの発現を検討したところ、幾つかの遺伝子種の発現が血管内皮細胞・周細胞質相互陥入の出現上昇期に認められた。そのなかから、Gammer-ActinとMyosin light chain 3に注目して、RT-PCR、Real time PCRで両者のmRNAの発現を確認したところ、特にGammer-Actinで有意な発現上昇が観察された。しかし、7日後、14日後の肉芽組織では発現は減少していた。現在、アクチン系線維形成関タンパクに対する抗体を作製が終了したので、分子生物学的検討から得られた情報と、三次元電顕免疫学組織化学的検討からの情報を解析している。本研究者は、一貫して、新生血管内皮細胞と周細胞との間の細胞質突起相互陥入構造の超微形態とその機能について、三次元電顕免疫組織化学的・分子細胞生物学的な検討を行ってきた。血管新生なくして腫瘍の進展、増大は認められない。すなわち、血管新生を人為的に制御することができれば、癌を含めた多くの疾患の脅威から生体を解放することができる。過去の検討から、新生血管内皮細胞と周細胞との間の細胞質突起相互陥入が、血管新生制御機構で特に血管新生抑制に深く関係するという新仮説を提唱した。新生血管に於ける血管内皮細胞・周細胞質相互陥入(Endothelial-Pericyte Interdigitation(EPI)の出現と、両細胞に於ける血管新生制御に関連した因子及び同因子遺伝子の発現との関連性ついて、三次元電顕免疫学組織化学的・分子生物学的に検討することから、EPIの形成に関与する因子と血管新生制御因子を検討し、EPIが血管新生抑制をどの様に制御しているかについて解明することを目的とした。ラット実験肉芽組織、実験腫瘍組織を対象にEPI増加時に発現する遣伝子をMicroArray法で検出後、同タンパクの発現及びmRNAの発現を三次元電顕免疫組織化学法とISH法とで検討した。その結果、血管新生因子(VEGF,bDGF,PDGF)、血管新生抑制因子(TGFβ)、細胞骨格形成因子(CamKll,Cathepsin,γactin等)36遺伝子の解析を行ったが、TGFβのみがEPIと関連したが、他は全てNegative dataであった。
グルカンの緩やかな螺旋を活用する動的センシング

グルカン-水溶性ポリチオフェン(PyPT)錯体の錯形成挙動について詳細な検討を行ったところ、グルカンとPyPTの錯形成においては静電相互作用が働き、ポリイオン錯体が形成していることが明らかとなった。また、そのポリイオン錯体の存在量は溶液のpH,温度に依存していることが示唆され、グルカンとPyPTの錯形成を支配する諸因子を明らかとした。そしてグルカン-PyPT錯体は、強固な異種三重鎖と非常に螺旋構造が緩い異種二重鎖として存在していることが分光結果から実証された。これらの成果については現在論文に投稿中である(Fukuhara, G. et al. submitted.)。本研究の目的は、多糖であるグルカンの中でもカードラン、シゾフィラン、アクアβを基盤とする革新的な超分子センシングの構築である。これらグルカンの中でも、既に研究代表者が高いポテンシャルを見出しているカードランに着目し、これにリポーターであるジメチルアミノベンゾエートを修飾したDABz-Curをホストとするモノテルペン類のキラル認識を行った。この結果、緩い超構造がゲストにフィットしたため、非常に高いエナンチオ選択性を示した。また面白いことに、緩い螺旋と思われていたが、AFM測定からその超構造を明らかにできた。本研究では、β-(1→3)結合の多糖であるグルカンの中でもカードランおよびシゾフィランを用いる革新的な超分子キラリティーセンサーの開発を目的として研究をスタートさせた。代表者が見出したグルカンとカチオン性ポリチオフェンとの錯形成挙動を支配する因子に想を得て、「induced-fit型」の螺旋空孔を与えてくれるカードラン(Cur)をキラルホスト、リポーターとしてジメチルアミノベンゾエート(DABz)を結合させたDABz-Curを用いるキラリティーセンサーの構築を行った。60%DMSO水溶液中でモノテルペン類のキラル認識能の検討を円二色性(CD)スペクトルの楕円率の変化量をゲスト濃度に対してプロットし評価した。モノテルペン類に関しては実験的に最もゲストを加えたときの励起子カップリングの変化量(Δθlimit)から、エナンチオ選択性を見積もった。リモネンでは2.8となり今まで報告されているリモネンの認識能の報告例(S/R = 3.9)と比べても比較的良好なエナンチオ選択性を示した。現在この成果をChemical Communication誌に投稿準備中である。さらにグルカンと水溶性ポリチオフェン(PyPT)からなる高感度in situセンサーの構築を行っている際に、非常に興味深い現象を見出した。Cur-PyPT錯体の錯形成挙動について基底および励起状態において詳細な検討を行ったところ、CurとPyPTの錯形成においては静電相互作用が働き、ポリイオン錯体が形成していることが明らかとなった。また、そのポリイオン錯体の存在量は溶液のpH,温度に依存していることが示唆され、CurとPyPTの錯形成を支配する諸因子を明らかとした。そしてCur-PyPT錯体は、強固な三重鎖と非常に螺旋構造がゆるい二重鎖として存在していることが分光結果から実証された。現在この成果については、Journal of The American Chemical Societyに投稿中である。上述したグルカンをホストとするモノテルペン類のキラルセンシングを平成26年度の目標と定めており、計画通りに達成でき現在論文に投稿準備中である。また、これらの成果が認められPolymer JournalのFocus Reviewに投稿する運びとなった。この中で、新たに超分子アロステリックシグナル増幅センシングについて言及し、そのイニシアティブをとっている。従って、概ね順調に進展していると言える。高分子化学平成26年度の成果を踏まえ、次年度はより困難とされている水中でのオリゴ糖センシングに発展させる。これまで、グルカンのなかでも高い性能をしめしたカードランをホストにするオリゴ糖センシングの超高感度化を目指し、蛍光センシングを予定している。この目的のために、AIEを示すテトラフェニルエチレンやACQを示すローダミンをリポーターとしてカードランに修飾し、オリゴ糖を取り込んだ時の構造変化による蛍光消光および増幅により、選択的センシングを目指す。
パルマ藻をモデルとした寒冷海域におけるピコ藻類の生残戦略の解明

本年度は,前年度の5月,7月,10月,1月に親潮域で得た試料を用いて,パルマ藻の現存量と種組成の解析を進めると共に,現場群集の疑似現場培養実験試料を解析した.密度成層の発達期にあった5月,7月,10月は表層では細胞密度が低く,水深30-50 mの亜表層にパルマ藻の現存量極大があった.一方,1月は水深0-100 mにわたり100000 cells/l以上の高密度で分布しており,冬季鉛直混合に伴いパルマ藻群集の現存量が顕著に増加することが示された.パルマ藻群集は新規1品種を含む2属8種15品種から構成されおり,5月と7月にはTriparma strigataとTriparma laevis f. inornataが現存量極大の17-90%を占めた。一方,10月表層および1月の水深0-100 mにはTriparma columacea f. convexaが全体の40-73%を占める優占種となった.この結果は,パルマ藻の種間で増殖に適した時期および水深に違いがあることを示唆している.船上培養実験の結果,5月は水深30 mにパルマ藻の現存量極大があったにも関わらず,捕食者を除去した培養区では,水深10 m区で増殖速度が最も高かった.これは,春季表層のパルマ藻群集は実際には活発な増殖期にあるものの,それを上回る高い捕食圧により現存量が低く抑えられていることを示唆している.現場試料の走査型電子顕微鏡観察では,パルマ藻の捕食者となり得る小型の渦鞭毛藻や微小鞭毛虫,繊毛虫が分布していることが確認された他,多くの動物プランクトン糞粒中にパルマ藻細胞が観察された.特に小型(<10 μm)の糞粒中では珪藻等の他の植物プランクトンよりもパルマ藻が優占するケースがあった.これは,微小動物プランクトンのパルマ藻に対する選択的な捕食圧が現存量を制御する因子として重要である可能性を示している.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。近年の環境DNA解析により,基礎生産力の高い高緯度海域に,細胞直径5 μm未満のピコ藻類が当初考えられていたよりも多く存在することが明らかになってきた.しかし,増殖や休眠,死滅といった生理状態に関する理解は進んでおらず,高緯度海域特有の季節的な環境変化の下でピコ藻類が個体群を維持する機構には不明な点が多い.本研究では,高緯度海域の代表的なピコ藻類であるパルマ藻をモデルとして,電子顕微鏡の活用により細胞壁の特徴からパルマ藻の種を識別しながら,現存量,増殖速度,細胞内構造を評価し,その経年的な変化を明らかにすることを試みている.平成29年度は2017年5月,7月,10月,2018年1月の計4回,親潮域のモニタリングサイトA-lineにおける調査を実施し,増殖・死滅速度を評価するために,船上水槽にて現場個体群の培養実験を行った.2017年5月には,既報3属23タイプのパルマ藻の内,2属9タイプが検出された.パルマ藻全体の細胞密度は全層(0ー150 m)で10000cell/l以上あり,水深20ー40 mでは100000cell/lを超えた.水深0ー30 mではTriparma strigataが,水深50 m以深ではTriparma laevis f. inornataが全体の半数以上を占める優占種となり,鉛直的な優占種の違いが見出された.パルマ藻群集の平均比増殖速度μは,光強度が表層の1ー10%程度となる水深40 m付近までの有光層内では0.1ー0.3/dayと,増殖期にあることが示されたが,光強度が表層の0.1%程度となる水深50 m以深では全ての種で細胞密度の減少が進行していることが示された.したがって水深50 m以深の薄光層に存在したパルマ藻個体群は,優占したT. laevis f. inornataを含め,有光層で増殖し沈降してきた個体群であると推察された.本研究では高緯度海域におけるピコ藻類の個体群維持特性を理解するため,寒冷海域の代表的なピコ藻類であるパルマ藻をモデルとして,現場群集の経年的な個体群密度,生理状態変化を明らかにし,その現場群集の動態を室内実験に基づいて生理学的に理解することを目指している.今年度は,当初の予定通り年4回の調査を実施し,全ての調査で現場個体群の船上培養実験を遂行した.その結果,一部のサンプルの解析結果ではあるものの,光強度が表層の0.1%以下となる薄光層の個体群が,有光層で増殖した個体群が下層へ沈降したものである可能性を見出すなど,増殖活性を評価することで初めて明らかになる知見が得られている.また,これまで培養株の無かったTetraparma属の単離培養に成功し,次年度の室内生理解析に向けた準備も進行した.平成29年度中に解析を進める予定であった現場細胞の透過型電子顕微鏡解析は,当初計画していた遠心分離法では解析に十分な量の細胞ペレット形成が困難で解析が停滞していたが,細胞凝集剤の使用により細胞ペレット形成が可能であることを確認した.

これらの理由から,研究の進捗はおおむね順調であると評価した.本年度は,前年度の5月,7月,10月,1月に親潮域で得た試料を用いて,パルマ藻の現存量と種組成の解析を進めると共に,現場群集の疑似現場培養実験試料を解析した.密度成層の発達期にあった5月,7月,10月は表層では細胞密度が低く,水深30-50 mの亜表層にパルマ藻の現存量極大があった.一方,1月は水深0-100 mにわたり100000 cells/l以上の高密度で分布しており,冬季鉛直混合に伴いパルマ藻群集の現存量が顕著に増加することが示された.パルマ藻群集は新規1品種を含む2属8種15品種から構成されおり,5月と7月にはTriparma strigataとTriparma laevis f. inornataが現存量極大の17-90%を占めた。一方,10月表層および1月の水深0-100 mにはTriparma columacea f. convexaが全体の40-73%を占める優占種となった.この結果は,パルマ藻の種間で増殖に適した時期および水深に違いがあることを示唆している.船上培養実験の結果,5月は水深30 mにパルマ藻の現存量極大があったにも関わらず,捕食者を除去した培養区では,水深10 m区で増殖速度が最も高かった.これは,春季表層のパルマ藻群集は実際には活発な増殖期にあるものの,それを上回る高い捕食圧により現存量が低く抑えられていることを示唆している.現場試料の走査型電子顕微鏡観察では,パルマ藻の捕食者となり得る小型の渦鞭毛藻や微小鞭毛虫,繊毛虫が分布していることが確認された他,多くの動物プランクトン糞粒中にパルマ藻細胞が観察された.特に小型(<10 μm)の糞粒中では珪藻等の他の植物プランクトンよりもパルマ藻が優占するケースがあった.これは,微小動物プランクトンのパルマ藻に対する選択的な捕食圧が現存量を制御する因子として重要である可能性を示している.平成29年度に,環境の異なる4シーズンのサンプルが全て取得されたことから,平成30年度は前年度に取得した現場サンプルの室内解析を中心に進め,季節間でのパルマ藻群集の種組成,鉛直分布,増殖活性の違いを明らかにしていく.また現場細胞の透過型電子顕微鏡解析を,新たに導入した細胞凝集剤を用いた細胞ペレット形成法を活用して進めていく.さらに,これまでのデータ解析からTriparma属とTetraparma属の最適増殖環境に違いがある可能性が示されていることから,平成29年度に確立したTetraparma属の培養株を用いた増殖生理特性解析を進め,既に解析が進んでいるTriparma属の生理特性との比較を試みる.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
密閉ボイド内群小部分放電とそれによる絶縁劣化に関する研究

本研究は「1.群小部分放電(以下SPMDと略称)の物理(現象とその機構)を調べる研究」と「2.部分放電劣化(以下PD劣化と略称)を放電化学作用から調べる研究」とに大別される。これを別添研究成果報告書として次のようにまとめた。本章は密閉ボイド中PD劣化で、(1)PDが通常のPDから、時間とともに群小部分放電に移行する原因,(2)密閉ボイド中では劣化の主役と考えられる【O_2】が材料の酸化に消費され、その後は酸素不足の状態となると考えられるにも拘らず、劣化が進行する原因,の2つの項目を追及している。研究の結果次の結論を得た。(1)密閉ボイド部分放電の経時変化における群小部分放電への移行は、【O_2】が絶縁物の酸化に消費されることによる、ボイド内【O_2】濃度の低下が主な原因と考えられる。(2)ボイド内の【O_2】は絶縁物の酸化に消費され減少しても、その後絶縁物の分解ガスとして生じる。【CO_2】,【H_2】Oが再びPDにたたかれて解離することによって【O_2】が再生し、ボイド空間に供給されるため【O_2】は消費し尽くされない。その結果絶縁物の酸化劣化は停止することなく、破壊に至るまで継続しておこる。
核磁気共鳴法によるカルサイクリンとアネキシンXI分子の高次構造解析

カルシウム結合蛋白質は生化学、分子生物学的研究から非常に多くの分子種の存在が報告されている。カルシウム結合蛋白質はカルシウム結合部位の構造から1)EF-hand、2)エンドネキシンフォールド、3)C2-domainの大きく3つに分類される。本国際学術研究では、この中のEF-hand構造を二つもつS100蛋白ファミリーのカルサイクリンと、そのリガンドであり、かつエンドネキシンフォールドをもつカルシウム・リン脂質結合蛋白質のアネキシンXIに着目し、これらの高次構造とその相互作用を核磁気共鳴法(以下NMR法)を用いて解析し、これらの生体内機能の解明に迫るものである。S100カルシウム結合蛋白質はカルシウムによる細胞内情報伝達機構のなかでエフェクターとして機能している。S100蛋白の多くは二単量体を形成して生体内で機能していることが示唆されてきたが、その二量体形成の機序は明らかではなかった。本研究ではS100蛋白のカルサイクリンの3次元構造をNMR法により解析した。その結果、カルサイクリンはカルシウム結合蛋白質の中では特異な左右対照のホモダイマー構造をとることが示された。この二量体は他の蛋白によく見られるSS結合によるものではなく、疎水性残基同士の相互作用により形成されていた。一方、カルビンディンD_<9k>はカルサイクリンと同じくS100蛋白に属するが、N末端、C末端のアミノ酸がそれぞれ一部欠損しており、C末端のアミノ酸の欠損が二量体形成に重要なヘリックスIVの構造に変化を与え、そのため二量体を形成しえず、単量体としてのみ存在していることが示された。本研究で示されたカルサイクリンの二量体構造は今後の他のカルシウム結合蛋白質の高次構造研究に多大な影響を与えるものと思われる。カルサイクリンのリガンドであるアネキシンXIはアネキシンファミリーの中で最長の制御ドメインをもち、細胞内で核局在を示し、さらにリン酸化によりその局在を変化させるなどアネキシンファミリーの中で特異な性質をもつ。本研究ではこれらの性質がアネキシンXIに特異な制御ドメインに依存していると考え、アネキシンXIの制御ドメインの解析を分子生物学的手法を用いて行った。その結果、アネキシンXIはこの制御ドメインを核移行シグナルとして核に局在すること、アネキシンXIの核局在は全ての細胞に普遍的なものではなく、細胞種や細胞の分化、増殖期により異なることが示された。アネキシンXIにはこの制御ドメインのスプライシングによる2種類のアイソフォーム(annexin XI-A,B)が存在する。アネキシンXIのアイソフォームを哺乳類細胞、昆虫細胞に発現させ細胞内分布を検討した結果、annexin XI-Aは核、細胞質、annexin XI-Bは核、細胞膜に分布し、細胞内分布が異なることが示された。カルサイクリン-アネキシンXI複合体の高次構造を解明するためには、まずアネキシンXIのカルサイクリン結合部位を正確に同定することが重要である。そこで、種々のアネキシンXIのアミノ酸配列とGST蛋白との融合蛋白を分子生物学的手法を用いて作成し、カルサイクリン分子との相互作用を検討した。その結果、カルサイクリンはアネキシンXIのGln49からThr62の領域に結合することが示された。この領域はα-ヘリックス構造をとり、この領域内の疎水性残基とカルサイクリンの疎水性残基が相互作用を起こすことにより、アネキシンXIがカルサイクリンと結合することが示された。この結合様式は最近他のアネキシンとS100蛋白でも報告され、アネキシン-S100の相互作用に普遍的な機構であることが示唆された。また、このカルサイクリン結合部位を含む合成ペプチドを作成し、このペプチドがアネキシンXIとカルサイクリンの相互作用を阻害すること、すなわちカルサイクリンに結合することを示した。現在、カルサイクリンにこの合成ペプチドを反応させたときのカルサイクリン分子の高次構造をNMR法を用いて解析し、本研究の最終目的であるカルサイクリン-アネキシンXI複合体の高次構造を解析中である。本研究で得られた成果はカルシウム結合蛋白の高次構造研究ばかりでなく、さまざまな蛋白-蛋白相互作用の研究に寄与するものである。