hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
障害児者とその家族の「貧困」に関する研究

知的障害、重度重複障害をもつ子どもの教育、医療、福祉の制度は整備されつつあるが、種々のサービスをより良い形で享受するためには、家族のコーディネートやサポートが必要になる。子ども期のみならず、成人後においても家族が経済的援助を担うことや、子どものケア役割を果たすために母親の就労が制限されるなど、障害児者家族が生活困窮に陥るリスクが高い。一方で、障害者自身の経済的自立は、一般就労、福祉的就労、ともに低賃金であることから困難となり、家族への依存が強まる傾向にある。障害者年金と就労賃金を合算してもなお、離家をしての生活が営めないという実態は、障害児者はもとより、それを支える家族の貧困にもつながる。八尾市で実施した、知的障害者家族の家計調査では、以下のことが明らかになった。一つは、家計の状態は、子どもの年齢、所属によって、特性が窺えたことでる。乳幼児期の医療や訓練費用、学齢期の送迎費用や社会参加に伴う費用、青年期以降の、余暇活動費用、自立生活のための費用等、支出の傾向が表れた。二つ目は、他の家族メンバーの動向が家計に与える影響が大きいことである。すなわち、母親が障害児のサポート役割に従事するために、就労の場から疎外される。また、子どもの学校や医療機関の事情により、父親の就労も制限されることから、家族メンバーが追加的な収入を得ることや、将来を見越した預貯金をすることができにくい。とりわけ、養育者が高齢期になると、子どもの障害者年金と養育者の年金を合わせて家計を維持することになり、子ども自身の収入が生涯を通して低いことが、家計全体の困窮を招くリスクにつながっていた。一方、本調査では、大都市圏のサラリーマン世帯、母子世帯、高齢者世帯という、障害児者のいる世帯という要件以外の要素も大きく影響していることが予想され、分析に当たっては地域的な特徴を鑑みることが必要であった。本年度の研究成果としては、知的障害児を養育する家族が、そのライフステージ全体を通して、子どもの医療・教育・ケア・自立・社会参加に伴う諸費用を支出しているという認識をもつことができた点である。障害当事者の生活を安定させ、QOLを向上するために、種々の公私のサービスや社会資源とのつながりを必要しながらも、その経済的費用を親が担い続けることの負担感が浮き彫りになった。平成26年度は知的障害児者の家族に表れる経済的問題が、親の中でどのように認識され、社会化されてきたのかの究明を研究の中心とした。障害児者親の会の歴史、親の会活動の今日的課題を概観する中で、障害児の養育に伴うコスト、家族の金銭的負担が、これまでどう位置づけられてきたかを検討した。第二次世界大戦後、障害者差別、権利はく奪の解消を目的として、また、それを行政に要求する組織として結成されてきた親の会の運動では、主として教育機会の保障、福祉サービスの拡充などが、活動成果として挙げられている。しかし、近年の経過をみると、障害者年金の在り方、福祉サービスの利用に伴うコスト、いわゆる家族への「手当」の問題なども顕在化してきていることがうかがえる。一方、親の会の高齢化、世代交代、親の会役割の変化などが、各会で指摘される中で、親の会は「セルフヘルプ」的活動にシフトしている一面もあり、障害児者の生活保障につながる運動団体としての性格が希薄化していることも否めない。そうであれば、障害者自身の高齢化に伴い、ライフステージ全体を展望しての経済的課題の把握は、取り残されるというリスクがあることも明らかである。フィンランドでの親の会活動へのインタビュー調査では、親の会組織による、成人後の子どもの居場所づくりが広がりを見せ、それが障害児者問題を社会的責任で担うという運動の成熟化とつながっていることが示唆された。日本の親の会組織とほぼ同じ時期に、同様の問題意識で出発した、両者の活動であるが、成人後の障害者のケア、権利保障、社会参加等々が、公的支援によって担われるフィンランドと、QOLを高めるためには親自身の経済的負担によってサービスを獲得しなければならない日本との、相違点を明らかにすることができた。今年度は、障害児とその家族が貧困に陥る要因について、歴史的、学際的に整理をし、次年度以降の調査の基盤を形成した。特に、知的障害者の「家計」が可視化されないことによって、生活困窮の問題が障害者福祉の中でさえ着目されないことを問題視してきたが、障害者の生活形態が多様化する中で、定位家族との同居もしくは施設入所のみならず、ケアホームやグループホームの利用、地域での単身生活を選択することによって、生活費の規模が拡大することや、当事者以外が生活費を管理していることを踏まえて、その実態を把握する必要があることがわかった。

また、関西、東北、北海道における、障害者施設等への視察を通しては、知的障害者の場合には、福祉的就労、一般就労のどちらであっても低賃金であることを検証した。その結果、生活水準が低いところで抑えられることによって、貧困という問題が顕在しにくいことが明らかになった。学齢児においては、放課後の生活の社会資源不足、成人障害者にとっては、余暇活動や他者との交流の機会不足などの問題は、経済的事情によって派生している面も予測された。こうした問題意識をもって、2011年11月、貧困研究会第4回大会自由討論の部において、藤原、田中はそれぞれ発表を行い、参加者からも関心を示された。一方、2012年3月には、デンマークにて、障害者家族への調査を行った。ここでは、障害当事者の生活が、高水準で社会的に保障されることにより、家族の生活とは経済的に分離されており、そのことが、障害者家族の障害観、障害受容にも大きな影響を与えていることが窺えた。ただし、新たな視点として、障害者の生活を社会保障の中で高位に保つことと、優生思想の問題が浮上した。すなわち、障害者の生活を国が経済的に保障することと、障害児の誕生を「予防」することとのジレンマを社会的にどう理解できるかという点が課題となった。障害者は就労の制限や福祉的就労の条件などにより、単身では貧困に接近するリスクがあり、貧困から脱することが健常者以上に困難である。しかし、家族との同居や、貧困と障害を関連付けることのタブー視により、これまで、経済的困窮の問題を十分に検討してこなかったことに本研究は注視した。平成23年度は研究動向の把握と理論的検討を行い、複合的な困難という視点から、障害児者家族の貧困をみる必要性を明らかにした。障害児の養育に伴い、結果的に親の就労条件が制限されるだけではなく、世帯の生活困窮が、子どもの障害を顕在化させることや、医療・療育からの阻害を招くという構造的な問題が浮かび上がった。平成24年度は、知的障害者を含む世帯の家計簿調査を分析し、本人収支と支出合計のバランスを見ると、家族同居の知的障害者は、平均40224円、グループホーム入居者の場合は、平均30849円が支出超過であることが分かった。平成25年度は、フィンランドでの、知的障害者家族へのインタビュー、機関ヒアリングを行った。そこで得た知見は以下のとおりである。障害者の生活は、国及び地方自治体によって保障され、家族が経済的支援を行うことは見られない。障害者自身の年金によって、日常生活介助、余暇活動、移動支援が保障される。ただし、その生活の質が、健常者である家族のQOLと同質であることに対しては、家族は行政への強い要請を行っている。これは、経済的な保障という側面のみならず、親が障害を持つ子どもの将来を安心して見守ることができるという態勢にも関係していると考察した。平成26年度は、家族によるケア役割の強化が、世帯の貧困を招くリスクについて検討し、障害者自身への直接的なサービス提供により、家族に依存しない「地域生活」の在り方を探る必要があることを明示した。脱施設以降の障害者の地域生活は、家族の経済的負担を高めていることも明らかになった。障害児者福祉調査後のデータ分析、考察が予定以上に時間を要したため。また、比較調査の必要から、地域的な特徴のある新たな地域選定を行っているため。
重症筋無力症に対する脾臓摘出術の効果-実験的自己免疫性重症筋無力症(EAMG)ラットにおける検討-

実験的自己免疫性重症筋無力症(EAMG)ラットに対する脾臓摘出の効果の評価項目を増やして(前年度までの項目は、血清中およびリンパ球培養上清中の抗AchR抗体価,リンパ球幼若化試験)検討し、以下の結果を得た。実験は6週齢雌ルイスラットを用いてEAMGを発症させ、これらに対し、シャム手術(SHAM)、脾臓摘出(SX)、脾臓および胸腺摘出(SX+TX)、胸腺摘出(TX)を行い、下記の項目で比較検討した。1)体重増加:SHAM群に対しSX群およびSX+TX群は術後2週、4週共に有意の高値を認めた。TX群も高値をとる傾向はあったが有意ではなかった。体重増加は餌の経口摂取量を反映しており、脾臓摘出はEAMGにより低下する経口摂取を改善すると考えられた。2)走力:SHAM群に対しSX群およびSX+TX群は有意に速く、またTX群も速い傾向を示したが有意ではなかった。走力は筋力低下の回復そのものを反映しており、MG治療法としての脾臓摘出術の意義を示すものと思われた。3)末梢血中リンパ球サブセット:SHAM群に対しSX群およびSX+TX群では、CD4(+)CD8(+)細胞高値、CD4(+)CD8(-)細胞低値、CD4(-)CD8(+)細胞高値、CD4(-)CD8(-)細胞高値、CD/4/CD8比低値、CD5(+)細胞低値、CD5(+)B細胞低値、CD5(+)B細胞/B細胞比低値という結果を有意に認めた。またTX群でも同様の経口を認めたが、有意差は一部にのみ認められた。この結果から、脾臓摘出術はEAMGにより変化したリンパ球サブセットを補正し、自己免疫機序を抑制する方向に働いたことが示唆された。胸腺摘出術では補正の傾向はあるものの有意差はなかった。この原因としては、EAMGにおいては胸腺を介さずに発症する機転が考えられた。平成4年度の研究計画に沿い実際に実施された研究の成果を報告する。1.シビレエイ(Torpedo californica)の電気器官よりAchRを抽出し、6週齢雌性ラットに免疫してEAMGを作成した。2.EAMGラットの胸腺及び脾臓のH-E染色標本を鏡顕的に検討したが組織学的な著変を認めなかった。3.EAMGラットを3群にわけ胸腺摘出群、脾臓摘出群、偽(sham)手術群とし、それぞれの手術を免疫後1週にて施行した。術後4週にて、屠殺し、以下の検討を加えた。(1)術前後の抗Torpedo-AchR抗体価を測定した。各手術群とも術後4週にて抗体価の上昇を認めたが、手術群間で差はなかった。(2)術前後の抗ラット骨格筋-AchR抗体価を測定した。各手術群とも術後4週にて抗体価の上昇を認め、脾摘群及び胸摘群はsham群に較べ有意に抗体価の上昇が低かった。(3)屠殺時にラット腹腔内リンパ節を採取し、リンパ球幼弱化試験を行った。mitogenとしてTorpedo-AchR、PHA、LPSを用いたが、LPSにて脾摘群及び胸摘群は有意にリンパ球応答が抑制されていた。また他の2つのmitogenにおいても、低値を取る傾向にあった。

以上の結果により、EAMGにおける胸腺摘出術及び脾臓摘出術の有効性が示唆された。しかし組織所見の結果より、EAMG動物の重症筋無力症発症機転の特殊性が考えられる。今後この点も含め、検討数の充実、臨床所見の検討、リンパ球サブセットの検討等を加えていくつもりである。シビレエイよりアクチルコリン受容体(AchR)を抽出し,これを用いてラットに実験的自己免疫性重症筋無力症(EAMG)発症させた。EAMGにおける脾臓および胸腺の鏡検的観察においては特徴的な知見は得られなかった。EAMGラットに対する脾臓摘出の免疫学的な効果を検討する目的にて各種パラメータの測定を行い,Sham手術群との比較を行った。抗AchR抗体価の術後経時的変化は,抗Torpedo-AchRおよび抗-ラット骨格筋AchRのいずれに対する抗体価も,脾摘群において有意に低値をとった。また術後4週にて採取したリンパ節リンパ球培養上清中の抗Torpedo-AchR抗体価は,脾摘群にて有意に低値をとった。同じ時期に採取したリンパ球を用いたリンパ節幼若化試験においては,マイトジェンとしてAchR,PTH,LPSいずれに対する応答も脾摘群にて有意に抑制された。胸腺摘出術も同時に施行群を設定し同様にパラメータの測定を行ったが,脾摘群と同様の傾向は認められたものの有意差は認められなかった。これは,鏡検の結果より考えると,胸腺を介さないEAMGの発症機転に起因するものと考えられた。よって胸腺摘出術と脾臓摘出術の相乗効果の評価は出来なかった。EAMGにおける脾臓摘出術の免疫学的効果が有意に認められたが,今後はその臨床的(生理学的)効果の検討,およびリンパ球表面マーカーの測定によるリンパ球修飾を明らかにすることによりEAMG病態に対する脾臓摘出術の作用機序を検討する予定である。実験的自己免疫性重症筋無力症(EAMG)ラットに対する脾臓摘出の効果の評価項目を増やして(前年度までの項目は、血清中およびリンパ球培養上清中の抗AchR抗体価,リンパ球幼若化試験)検討し、以下の結果を得た。実験は6週齢雌ルイスラットを用いてEAMGを発症させ、これらに対し、シャム手術(SHAM)、脾臓摘出(SX)、脾臓および胸腺摘出(SX+TX)、胸腺摘出(TX)を行い、下記の項目で比較検討した。1)体重増加:SHAM群に対しSX群およびSX+TX′は術後2週、4週共に有意の高値を認めた。TX群も高値をとる傾向はあったが有意ではなかった。体重増加は餌の経口摂取量を反映しており、脾臓摘出はEAMGによ低下する経口摂取を改善すると考えられた。2)走力:SHAM群に対しSX群およびSX+TX群は有意に速く、またTX群も速い傾向を示したが有意ではなかった。走力は筋力低下の回復そのものを反映しており、MG治療法としての脾臓摘出術の意義を示すものと思われた。3)末梢血中リンパ球サブセット:SHAM群に対しSX群およびSX+TX群では、CD4(+)CD8(+)細胞高値、CD4(+)CD8(-)細胞低値、CD4(-)CD8(+)細胞高値、CD4(-)CD8(-)細胞高値、CD4/CD8比低値、CD5(+)細胞低値、CD5(+)B細胞低値、CD5(+)B細胞/B細胞比低値という結果を有意に認めた。またTX群でも同様の経口を認めたが、有意差は一部にのみ認められた。この結果から、脾臓摘出術はEAMGにより変化したリンパ球サブセットを補正し、自己免疫機序を抑制する方向に働いたことが示唆された。胸腺摘出術では補正の傾向はあるものの有意差はなかった。
非球形状プロジェクタイルによる超高速衝突損傷の評価と新バンパーシールドの開発

非球形状プロジェクタイルとして回転楕円体を取り上げ、回転楕円体を秒速24kmに加速し、Al6061板に超高速衝突させた際に発生する二次デブリ雲の質量分布、飛散角度分布、速度分布をフラッシュX線等を用いて計測し、同質量の球形状プロジェクタイルの場合との相違について検討を行った。前年度まではカメラパラータを実測することで求めていたが、参照物体を事前に写し込むことでDirect Linear Transformation法を用いてカメラパラメータを推定することで、二次テブリ雲中の破片の計測位置精度の向上を計った。また、前年度まではヨー角の大きい場合の実験結果しか得られなかったが、本年度はヨー角が小さい場合のデータも取得し、球形状飛翔体との相違について議論を行った。基本的には衝突方向への飛翔体の投影面積が球よりも小さいときは貫通能力が球よりも高く、通常言われている防御性能が低下することが分かった。また、昨年度から自己シール機能に加えてヘルスモニタリング機能についても検討を行い、本年度はこれらを統合した新バンパーシールドを提案した。本バンパーシールドではさらに発泡アルミニウムを採用することで、同面密度下における防御性能を向上させている。それでも防御できない場合は、自己シール機能により急激な圧力低下を防止し、ある程度の退避時間が確保できるようにしている。また、損傷箇所の特定と損傷程度の把握を容易にするために、抵抗膜を利用したヘルスモニタリング機能を考案し、実装させている。国際宇宙ステーションの全表面積を考えると、約30ヶ所で電圧測定用のピックアップ部を設ければ良いことになり、他のアコースティック・エミッションやマイクロ波を利用した同定法よりも運用が容易なシステムとなっている。では、以上のように非球形状飛翔体による損傷の定量化ならびに自己シールドとヘルスモニタ機能を有する新バンパーシールドの提案を行った。(1)Titan祉製フラッシュX線装置を新たに導入し,ソフトX線を用いて二次デブリ雲を撮影を試みた.トリガーパルスの発生タイミングに問題があるものの,複数の破片を3方向から撮影することに成功した.この撮影データをもとに3次元データを再構築するためのソフトを開発中である.また,この二次デブリ雲の発生メカニズムを考察するために,Smoothed Particle Hydrodynamics(SPH)法に基づく3次元衝突解析コードを開発するとともに,Century Dynamics社製のAutoDyn-2D&3Dの導入を図った.これらの解析結果と二次デブリ雲の質量分布/飛散角度分布/速度分布などを比較検討する予定である.(2)新たに小型旋盤を導入し,サボの製作ならびにサボ分離機構の開発を行った.サボ分離区間が1m弱と短いにも拘わらず,今回開発した分離機構ではサボとプロジェクタイルとを十分に分離できることを確認した.また,このサボにネジ形状のプロジェクタイルを装着し,非球形状プロジェクタイルヘの適合性の確認実験を行った.(3)有形の自己シールド材を1枚目バンパーの後方に複数配置するような自己シールド構造を開発し,直径10mmの超高速飛翔体との衝突に対しても,十分に自己シールド機能を有することを実験的に確認した.今後は,バンパーシールドと自己シールドとの適合性を検討しながら,総合的に耐衝撃性能に優れたバンパーシールドを開発していく予定である.(4)二段式軽ガス銃において軽ガスをヘリウムから水素に変更する実験を行い,飛翔体速度が約1.2倍に増加することを確認した.本研究では,フラッシュX線を用いて衝突時に発生する多数の破片を3方向から撮影し,個々の破片の3次元座標ならびに速度を測定し,速度と飛散角度との関係を明らかにした.さらに,別途軟回収によって集めた破片の質量を測定を行い,これをもとに運動エネルギと飛散角度との関係も明らかにした.

また,同時並行に,昨年度開発したサボ分離機構を再検討し,加工性の向上ならびに分離信頼性の向上を図った.この再検討したサボに回転楕円体(a=b≠c)を取付け,超高速で打ち出す実験を行い,衝突直前の回転楕円体の姿勢のフラッシュX線撮影ならびに衝突後のデブリ雲の撮影を行った.一方,自己シールド機能の開発として,昨年度まで配置していたシールド材の位置を,実際の国際宇宙ステーションのバンパー構造に近い構造の中間に配置するように変更を行った.その結果,自己シールド材の熱損傷が著しく低下し,シールド性能が大幅に向上することが確認された.また,シールド性能を評価する指標として圧力低下の時間歴を測定していたが,これをもとに自己シールド材でシールドされていない領域を等価貫通直径に換算することで,実験条件等によらない統一性の高い評価方法を提案した.さらに,二段式軽ガス銃の高性能化を図るにあたり,昨年度までは軽ガスにヘリウムガスを用いていたが,秒速4km以上の衝突実験においては水素を用いるように変更した.その結果,最高速度を昨年度までの秒速4.98kmから秒速5.91kmまで更新することができた.非球形状プロジェクタイルとして回転楕円体を取り上げ、回転楕円体用にサボの改良を行った。このサボを用いて回転楕円体を秒速24kmに加速し、A16061板に超高速衝突させた際に発生する二次デブリ雲の質量分布、飛散角度分布、速度分布をフラッシュX線等を用いて計測し、同質量の球形状プロジェクタイルの場合との相違について検討を行った。今回の実験では、ヨー角が50度前後と大きな値となってしまったため、非球形状プロジェクタイルの場合の方が球形状プロジェクタイルよりもデブリ雲が広がるという結果が得られた。次年度はサボ分離機構を見直すことでヨー角が小さい場合の実験を行えるようにする予定である。また、自己シール機能を向上させるために新しいシール材の開発を行った。円形形状貫通孔に対しては従来のシール材に比べて性能が劣るものの、非円形形状貫通孔に対しては従来のシール材に比べて格段のシール性能を発揮することを確認した。宇宙ごみの大半はいびつな形状をしていることを考慮すると、今回開発したシール材の方が実際の宇宙環境での使用に適しているものと考えられる。また、自己シール機能の延長線上のものとして新たにヘルスモニタリング機能についても検討を行った。現状の国際宇宙ステーションでは宇宙ごみがどこに衝突したのかをリアルタイムでモニターする機能が備わっていない。このため、マニュピレータに取り付けたカメラで表面をスキャンするか、または、宇宙飛行士の船外活動により検査を実施するしか手段がないのが現状である。大きな宇宙ごみが衝突した場合はその被害箇所からすぐに特定が可能であるが、弾道限界曲線よりわずかに上回る大きさの宇宙ごみが衝突した場合はどこに貫通孔を生じたのかが特定することができない。そこで衝突箇所を迅速に特定できるヘルスモニタリング機能はバンパー構造の部として付加することは非常に重要である。
進化医学が拓く新たな人類学：ヒト集団で広範にみられる解毒酵素欠損多型の進化的背景

本研究は,細胞解毒酵素グルタチオン-S-トランスフェラーゼμ(GSTM)1をコードするGSTM1遺伝子欠失多型が人類集団中に維持され,集団によって異なる頻度を示す進化的背景を明らかにすることを目的とした。GSTM1欠失の分布が適応の結果かどうかを検討するため,1000ゲノムプロジェクトのデータ(東アジア,ヨーロッパ,アフリカ集団)を用いて統計的解析をおこなった。まず,解析に用いる,欠失と連鎖した領域を探すため,欠失と周辺SNPのR2を計算したが,欠失近傍でも<0.5程度の低い値しか算出されず,この領域でgene conversionやrecombinationが起きたことが示唆された。0.5程度のR2をもつGSTM1遺伝子の上流及び下流の約10kbをタグ領域と定め,その配列を集団間で比較した。結果,東アジア人とアフリカ人の間で高いFst(上流0.4,下流0.6<)をもつSNPが観察され、それらのSNPは東アジアにおいてのみGSTM1遺伝子欠失と比較的高い連鎖不平衡値(R2)を示した。また,東アジアにおいては,欠失と連鎖しているハプロタイプが高頻度だった。これは,東アジアにおいてこのハプロタイプあるいは欠失が適応的だったことを示唆する。また,本年度はGSTM1欠失をヘテロにもつヒト7個体,チンパンジー7個体の欠失アリルを解読し、参照ゲノムを含めて詳細な比較解析をおこなった。その結果、ヒトとチンパンジーで欠失のbreak pointが非常に近いことが明らかになった。また,ヒトにおいてもチンパンジーにおいても非常に近い部位でgene conversionがおき、それによってGSTM1遺伝子両側の配列の類似性が局所的に非常に高くなり、どちらの系譜においても同じメカニズムでGSTM1遺伝子欠失が起きたと推測された。28年度が最終年度であるため、記入しない。(1)ヒトの集団遺伝学細胞解毒酵素GSTM1およびGSTT1の機能欠損型であるNull型は,世界84の人類集団に普遍的に存在し,異なる地理的分布を示すことを文献のメタ解析より明らかにした。上記のメタ解析では東南アジア・オセアニアのデータが少なかったため,東南アジア・オセアニアの15集団1004人の遺伝子型をコンベンショナルPCR法,ロングレンジPCR法によって明らかにした。上記の文献データと合わせると,GSTT1のnull型の頻度と緯度が相関することが示され,環境適応の影響が示唆された。また,ダイレクトシーケンシング法によって,ヒト一個体のnullアリル13kbの塩基配列を明らかにした。(2)霊長類の比較ゲノムヒトGSTM1遺伝子の両側には,互いに類似性の高い「スキップ配列」が存在するため,染色体の不等交差により欠失が起きる。欠失型対立遺伝子の起源を調べるため,Refseqのデータを用いてin silico比較ゲノム解析を行った。その結果,チンパンジー・オランウータンの系譜でGSTM遺伝子クラスターを含む領域において染色体逆位が起きていた。また、ヒト・オランウータン・ボノボで逆転写によるGSTM2遺伝子の重複が起きていた。さらに,チンパンジー,オランウータンでもヒト同様GSTM1遺伝子の両隣にスキップ配列が存在した。従って,チンパンジー,オランウータンも染色体の不等交差によるGSTM1遺伝子の欠失多型をもつ可能性が示された。昨年度から行っていた解毒代謝酵素遺伝子GSTM1およびGSTT1の,世界中のヒト集団における頻度を,文献調査(81集団)及び実験(19集団)によって明らかにした。低緯度で紫外線照射量の多い東南アジア・オセアニア地域では予想に反し高い頻度のGSTM1欠失多型が観察された。GSTM1遺伝子欠失多型頻度は緯度と相関がなかったことから,紫外線適応とは関連がないと結論づけられた。GSTT1遺伝子欠失多型頻度は緯度と逆相関したため紫外線や気温と何らかの関連がある可能性がある。東南アジアDani族のGSTM1 null alleleプロダクト約13kbの全長をシークエンシングし,参照ゲノムの野生型配列と比較した結果,組み換えが起きた部位が,部分的に報告されていたヨーロッパ人の組み換え部位(Xu et al., 1998)と異なっていた。これにより,組み換えによる欠失アリル創出が人類集団において何度か独立に起きたことがわかった。これについてさらに調べるため,1000ゲノムデータ,および東南アジア・オセアニアのサンプルを用いた実験により,nullアリルの起源と拡散について探究しているところである。GSTM1遺伝子の欠失は,その両隣にある,非常に類似した二つのSegmentalduplication(以下SD)配列の組み換えによって生じたとされる(Xu et al., 1998)。PCR法を用いて非ヒト霊長類におけるGSTM1欠失多型の有無を確かめた結果チンパンジーが欠失多型を持つことが分かった。ヒトとチンパンジーの欠失アリル及び野生型アリル,および祖先形としてRefseq上のオランウータンの野生型アリルの配列を比較した結果,チンパンジーの欠失アリルがヒトの欠失アリルとは独立に生じたことが明らかになった。解毒代謝酵素遺伝子GSTM1の進化過程について、ヒト集団および霊長類の比較ゲノムという二つのスケールから明らかにしつつある。ヒト集団におけるGSTM1遺伝子欠失の分布や、欠失アリル創出が人類集団やほかの霊長類において何度か独立に起きたことが明らかになった。これらの成果は国際学会において受理され、発表された。

当初GSTM1およびGSTT1の二つの遺伝子欠失において研究する計画だったが、GSTM1欠失がほかの霊長類にも共有されていることが明らかになったため、こちらの遺伝子の進化過程を細やかに明らかにすることがより重要だと考え、研究対象をGSTM1のみに絞って、詳しく調べることにした。本研究は,細胞解毒酵素グルタチオン-S-トランスフェラーゼμ(GSTM)1をコードするGSTM1遺伝子欠失多型が人類集団中に維持され,集団によって異なる頻度を示す進化的背景を明らかにすることを目的とした。GSTM1欠失の分布が適応の結果かどうかを検討するため,1000ゲノムプロジェクトのデータ(東アジア,ヨーロッパ,アフリカ集団)を用いて統計的解析をおこなった。まず,解析に用いる,欠失と連鎖した領域を探すため,欠失と周辺SNPのR2を計算したが,欠失近傍でも<0.5程度の低い値しか算出されず,この領域でgene conversionやrecombinationが起きたことが示唆された。0.5程度のR2をもつGSTM1遺伝子の上流及び下流の約10kbをタグ領域と定め,その配列を集団間で比較した。結果,東アジア人とアフリカ人の間で高いFst(上流0.4,下流0.6<)をもつSNPが観察され、それらのSNPは東アジアにおいてのみGSTM1遺伝子欠失と比較的高い連鎖不平衡値(R2)を示した。また,東アジアにおいては,欠失と連鎖しているハプロタイプが高頻度だった。これは,東アジアにおいてこのハプロタイプあるいは欠失が適応的だったことを示唆する。また,本年度はGSTM1欠失をヘテロにもつヒト7個体,チンパンジー7個体の欠失アリルを解読し、参照ゲノムを含めて詳細な比較解析をおこなった。その結果、ヒトとチンパンジーで欠失のbreak pointが非常に近いことが明らかになった。また,ヒトにおいてもチンパンジーにおいても非常に近い部位でgene conversionがおき、それによってGSTM1遺伝子両側の配列の類似性が局所的に非常に高くなり、どちらの系譜においても同じメカニズムでGSTM1遺伝子欠失が起きたと推測された。研究成果の発表に関しては、学会における口頭発表に加え、国際誌に投稿し、受理・公表され、一定の業績を生み出しつつある。ゲノムデータベースを活用とした進化ゲノム解析と実験研究をマージした、新たな取り組みを展開し、新知見の解明の端緒を開いた。人類集団における欠失アリルの創出とヒトの拡散との時間的関係を推測するため、世界各地の集団のゲノムデータ(1000ゲノム)を用いた情報科学的解析を行う。また東南アジア・オセアニア人サンプルを用いた実験を行い、「東南アジア人特異的」欠失がどの程度集団間で共有されているかを調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
強い非線形音波により励起される音響流の分岐と乱流遷移の機構解明

音響流は、長い間、遅い(低レイノルズ数の)流れと考えられてきた。しかし、近年、超強力音波が先端技術で利用されるようになり、強い非線形効果による速い(高レイノルズ数の)音響流とその乱流に対して基礎的な理解を得ることが工学的に重要な課題となっている。決定論的方程式に支配される流体の不規則運動である「乱流」は、決定性と偶然性という矛盾した二側面をもつがゆえに、長い間にわたって流体力学のみならず基礎科学の重要な問題として位置づけられ、その結果多くの優れた成果を生み出してきた。しかしながら、音響流の乱流現象に関しては、ほとんど何も分かっていなかった。本研究では、とくに2次元の長方形の中の流体の大振幅共鳴振動によって生じる音響流の問題に集中的に取り組んだ。この間題に対しては既にRayleighがレイノルズ数が1に比べて小さい定常解を求めている。Rayleighの解は長方形の二つの対称軸に関して対称な流線をもつ。本研究では、高レイノルズ数の音響流の数値シミュレーションを行い、以下の結果を得た。(1)箱の縦横比(<1)に依存するある臨界レイノルズ数において、Rayleighの音響流は新しい定常解の対に分岐する。現段階では、この分岐はサブクリティカルであると予測している。(2)分岐後の音響流は、長方形の横方向の対称軸に関する対称性を失うが、縦方向の対称軸に関する対称性は維持する。(3)分岐によって得られる定常解の対は、横方向の対称軸に関して対称である。すなわち、失われた対称性に対応して解の数が増加している。(4)さらにレイノルズ数を大きくすると、分岐後の解のおのおのがさらに新しい定常解の対に分岐する。(5)二度の分岐によって音響流の流線は対称性を完全に失う。(6)さらに大きいレイノルズ数で、定常解は存在しなくなることが確かめられたが、この非定常解が時間周期解であるかどうかはまだ確認できていない。決定論的方程式に支配される流体の不規則運動である「乱流」は,決定性と偶然性という矛盾した二側面をもつがゆえに,長い間にわたって,流体力学のみならず基礎科学の重要な問題として位置づけられ,その結果,多くの優れた成果を生み出してきた.しかしながら,音響流の乱流現象に関しては,ほとんど手がつけられておらず何も分かっていない.したがって,通常の乱流と同様に,(i)流れの不安定化と分岐を経由して乱流化するのか,(ii)不規則性の中に普遍法則を内包しているのか,それとも,(iii)通常の乱流とは異なる物理的機構によるのか,などの基本的な問題さえ未解明である.本研究は,上述の三点に関して基礎的な理解を得ることを目指すものである.そのために,強い非線形効果によって高レイノルズ数の音響流が現れる典型的な問題として,閉じた音響管内に強い音の定在波が生じているときに,これによって管内に誘起される音響流の問題をとりあげた.管の形状や音波の振幅をさまざまに変えて精密で大規模な数値計算を行った結果,以下のことが明らかになった:(1)音響流の流速のマッハ数は概ね音波による振動速度のマッハ数の2乗程度である.したがって,音波の振幅が小さいときには音響流の流速は非常に小さい.(2)管の形状で決まる固有振動数で音波を励起すると,共鳴振動が生じ,音波の振幅は大振幅となりうる.このとき,音響流のレイノルズ数は大きくなる.(3)音響流のレイノルズ数が比較的大きい(数千程度)場合でも,管の断面方向の長さが定在波の半波長より小さければ,現れる音響流の性質は,古典的な非圧縮定常流と定性的に変わらない.(4)音響流のレイノルズ数が大きく,管の断面方向の長さが定在波の半波長より大きいとき,音響流は非定常化し,渦の"結合"と"分裂"を繰り返しながら時間発展する.平成13年度では,上記の高レイノルズ数の音響流の振る舞いをさらに詳細に調べ,乱流遷移過程の解明に取り組む.音響流は、長い間、遅い(低レイノルズ数の)流れと考えられてきた。

(3)分岐によって得られる定常解の対は、横方向の対称軸に関して対称である。すなわち、失われた対称性に対応して解の数が増加している。(4)さらにレイノルズ数を大きくすると、分岐後の解のおのおのがさらに新しい定常解の対に分岐する。(5)二度の分岐によって音響流の流線は対称性を完全に失う。(6)さらに大きいレイノルズ数で、定常解は存在しなくなることが確かめられたが、この非定常解が時間周期解であるかどうかはまだ確認できていない。
遺伝子導入セルチップの高機能化を実現するソフト界面の構築

本研究課題では、「固相リバーストランスフェクション(固相界面から細胞への遺伝子導入;Reverse Transfection: RTF)」のメカニズムを明らかにし、これに基づいた「高性能ソフト界面」を作製し、固相から様々な細胞株への遺伝子導入を可能にする高機能化セルチップを開発する事を目的とする。平成24年度は、前年度までの成果に基づき、次に示す研究成果を達成した。1固相リバーストランスフェクション(RTF)の効率を上げるソフト界面の作製:様々なRTFを上昇させる物質を検討し、適切なECMの種類と濃度、細胞適合性、カチオン性ポリマーを選定した。ポリエチレングリコール表面へのECMの重層法を確立し、マイクロスポット上の細胞移動を防ぐ表面作製法を確立した。2様々な細胞へのRTFを可能にするソフト界面の作製:異なる特徴を持つ細胞種に対して、RTFを試みた。それぞれの細胞における適切なECMの種類と濃度を検討した。以上のRTF用表面作製法の特許を取得した(特開2012-187072)。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、「固相リバーストランスフェクション(固相界面から細胞への遺伝子導入;Reverse Transfection:RTF)」のメカニズムを明らかにし、これに基づいた「高性能ソフト界面」を作製し、固相から様々な細胞株への遺伝子導入を可能にする高機能化セルチップを開発する事を目的とする。現状では、(i)様々な細胞種へのセルチップの適用、(ii)遺伝子導入効率の改善、(iii)アレイ状のスポット間の遺伝子混合の防止、(iv)徐放性の制御、(v)アレイ化されたスポット上の細胞運動の制御、が不十分であり、基板ソフト界面の化合物の制御による、本チップの高機能化が求められていた。平成23年度の研究成果において、(1)ポリアミンデンドロンの固相化が遺伝子導入効率の上昇に有効であること、(2)フィブロネクチンやタイプIコラーゲンなどのECMの固相濃度が、遺伝子の徐放性のコントロールに重要であり、細胞への遺伝子導入効率や局所的な遺伝子導入に影響する事、(3)細胞運動をコントロールする上で、ポリエチレングリコール(PEG)を用いた基板界面の親水性コーティングとフィブロネクチン又はコラーゲンタイプIによるアレイスポットの形成が非常に有効である事を見出した。最適なECM固相条件でアレイを構築することにより、スポット径が100μm以下の細胞接着及び遺伝子導入領域を作製し、スポット当たりの細胞数が数個になるような「世界最高密度のTCM基板」を開発に成功した。本成果の基盤となる技術は、現在研究成果を学術誌に投稿中である。本成果により、セルアレイデバイスを用いた細胞への遺伝子導入技術に対して、有効な界面材料を提供し、細胞を用いた生命現象の大規模解析を加速するためのデバイス開発や普及を促進できると考える。次年度の目標を一部前倒しで達成した一方で、今年度の目標であるリバーストランスフェクションにおける細胞への遺伝子取り込みメカニズムの解明が不十分である。昨年度に達成すべき「固相リバーストランスフェクション(RTF)における細胞への遺伝子取り込みメカニズムの解明」を進める。この結果に基づき、RTFの効率をより高めたソフト界面を作成し、様々な細胞への遺伝子導入が可能な高機能セルチップを開発する。
芳香族炭化水素受容体によるダイオキシン認識の構造基盤の解明

ダイオキシン受容体として知られる芳香族炭化水素受容体(AhR)の構造生物学的研究を進めた。核移行前複合体の調製を試みたが成功しなかった。AhR抑制複合体であるAhRR/ARNT複合体の結晶化を進め、その結晶構造を明らかにした。転写活性化複合体であるAhR/ARNT複合体の構造解析に向けて、種々の生物種由来のAhR/ARNT複合体の調製や、様々な変異体の発現と精製を試みた。環境中に広く存在するダイオキシンなどの芳香族炭化水素は,生体中ではAryl hydrocarbon receptor (AhR)(ダイオキシン受容体)により認識されている。AhRは転写調節因子であり,ダイオキシンに応答して薬物代謝酵素の誘導を促進させる。本申請課題では,AhRによるダイオキシンの認識と転写活性化機構をX線結晶構造解析により原子分解能で明らかにする。AhRは,発がんや催奇形性,自己免疫疾患,メタボリックシンドロームなど種々の病態に関与しており,これらの治療薬のターゲットとなることが期待されており,本研究はその構造基盤を与えるものである。本申請課題では,AhRによるダイオキシン認識と転写活性化の中核であるAhR(リガンド)/ARNTヘテロ2量体とDNA(XRE配列)の4者複合体の構造解析を目指す。これより,AhRによるリガンドの認識,AhRとARNTとの相互作用,AhR/ARNTによるDNA認識機構を原子レベルで明らかにする。これまでの研究により、AhR/ARNT複合体の精製試料はプロテアーゼにより分解されやすいことが明らかになっていた。また、得られた試料を用いて結晶化を行ったが結晶は得られていない。そこで、蛋白質表面に存在すると予想されるループ領域を欠損させた変異体を複数作成し、その発現量、性状などを調べた。また、精製方法を検討することで純度の向上が見られた。現在得られた試料を用いて結晶化を行っている。結晶化に適したサンプル調製に成功した。本申請課題では,AhRによるダイオキシンの認識と転写活性化機構をX線結晶構造解析により原子分解能で明らかにすることを目的とする。これまでの研究により、蛋白質表面に存在すると予想されるループ領域を欠損させた変異体を複数作成し結晶化を試みてきた。今年度はさらに結晶化に有利となるように一部のドメインを欠損させたAhR/ARNTを複数種類作成した。そのうちでPAS-Bドメインを欠損させたAhRとARNT複合体試料についてDNAとの複合体結晶を得ることに成功した。また、ARNTとヘテロ2量体を形成することでAhRとARNTの複合体形成を阻害するAhRRに関して、AhRR/ARNT複合体の結晶構造解析に成功した。引き続き結晶化を進める。構造生物学
食材の機能性活用をめざすフラボノイドの調理種別変化と摂取後の生体内炎症指標の検討

これまでに引き続き、フラボノイドの供給源となる食材について、各調理方法による調理後のフラボノイド含有量、総ポリフェノール量および抗酸化活性を測定、データを収集し、これを食品加工、食事の設計に活用できるよう整理する。また、食事(開発済みのフラボノイド低減食+フラボノイド含有量の多い食品1品)として摂取した際のフラボノイドの体内動態を摂取後9時間まで追い、傾向を明らかにする。さらに、高フラボノイド食の短期継続摂取による血中炎症マーカーへの影響を、酸化ストレス状態にあると想定される肥満の被験者への介入試験で明らかにする。
九州シンクロトロン放射光のエレクトロニクス応用研究に関する調査研究

九州シンクロトロン放射光施設は、福岡県を中心として、大学、公立研究所、民間会社を含めたいわゆる第3セクター方式で計画が立案されている。そこでは分析・解析部会、微細加工部会、新素材応用部会、生命部会に分かれて研究の立案がされているが、本研究は、これらの部会を横断する立場で、付加価値の付けやすいエレクトロニクス応用について、シンクロトロン放射光の技術開発・ニーズについて調査した。まず、現在までの放射光のエレクトロニクス応用について、分析、リソグラフィ、エッチング、成膜、表面改質、LIGAという項目で文献検索を行った。反応素過程などの分析を伴う基礎研究やプロトタイプの試作など可能性を探る研究が中心で、生産的なものとはまだどの分野もなっていない。また、福岡県の調査からも九州地区では一部の大学の研究者を除いて、放射光研究にはなじみの無い状況である。応用分野では、結晶引き上げの研究や品質管理、LSIプロセスの品質管理と改善のための研究、等倍露光のマスク材料開発、縮小投影露光における、光学部品・機能性材料の開発、LIGAを用いたマイクロマシン、特に光通信技術との結合などで将来性のある応用分野が拓け、また、X線マイクロ光学素子が開発されれば、新しい応用が拓けることが分かった。さらに、これらの技術開発を行う点で解決しなければならない技術課題も調査した。この調査をもとに、新しく文部省科学研究補助金の申請を3グループから行ない、さらに1グループは他の補助金を申請する運びとなった。また、学内研究プロジェクトとして2件の提案を行った。さらにドイツのIMMとの研究協力が成立し、今後LIGAの学内研究プロジェクトをスタートする。
光合成遺伝子発現に異常をきたした変異体の単離

研究課題を遂行するために,activationタギング用のベクターとして,カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーターのエンハンサーを,選択マーカー遺伝子にスルフォニルウレア耐性のアセトラクテート合成酵素遺伝子を,そしてRiプラスミドの複製起点をもつプラスミドを構築した.このバイナリーベクターを用い,すでに光合成遺伝子の発現を容易に検出するために作製した,光合成遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とのキメラ遺伝子を持つシロイヌナズナに,vacuum infiltration法にてT-DNA領域を導入することを試みた.これまでに,100個体を超える独立した形質転換シロイヌナズナを得ることができた.得られた形質転換体の中から,目的とする変異植物体を,レポーター遺伝子の発現を指標として選抜を行った.その結果,いくつかの候補を得ることができた.今後さらに詳細な検討をする予定である.また,シロイヌナズナの一過性発現系を利用して,酵母の部位特異的組換え反応は,熱ショックタンパク質遺伝子プロモーターと組み合わせることで,温度により制御可能であることを見いだした.そこで,染色体上に組み込まれた状態でも同様な制御が可能かどうかを検討する目的で,バイナリーベクターを構築した.得られたベクターをアグロバクテリアに導入後,形質転換シロイヌナズナを作成した.得られた形質転換体の解析結果から,染色体上に組み込まれた状態でも,目的とする反応が期待どおりおこることが確認された.さらに,この系をより発展させるために,green fluprescent protein(GFP)およびその改変型GFPの高等植物での利用を検討した.その結果,改変型GFPの有用性を示すことに成功した.研究課題を遂行するために,activationタギング用のベクターとして,カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーターのエンハンサーを,選択マーカー遺伝子にスルフォニルウレア耐性のアセトラクテート合成酵素遺伝子を,そしてRiプラスミドの複製起点をもつプラスミドを構築した.このバイナリーベクターを用い,すでに光合成遺伝子の発現を容易に検出するために作製した,光合成遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とのキメラ遺伝子を持つシロイヌナズナに,vacuum infiltration法にてT-DNA領域を導入することを試みた.これまでに,100個体を超える独立した形質転換シロイヌナズナを得ることができた.得られた形質転換体の中から,目的とする変異植物体を,レポーター遺伝子の発現を指標として選抜を行った.その結果,いくつかの候補を得ることができた.今後さらに詳細な検討をする予定である.また,シロイヌナズナの一過性発現系を利用して,酵母の部位特異的組換え反応は,熱ショックタンパク質遺伝子プロモーターと組み合わせることで,温度により制御可能であることを見いだした.そこで,染色体上に組み込まれた状態でも同様な制御が可能かどうかを検討する目的で,バイナリーベクターを構築した.得られたベクターをアグロバクテリアに導入後,形質転換シロイヌナズナを作成した.得られた形質転換体の解析結果から,染色体上に組み込まれた状態でも,目的とする反応が期待どおりおこることが確認された.さらに,この系をより発展させるために,green fluprescent protein(GFP)およびその改変型GFPの高等植物での利用を検討した.その結果,改変型GFPの有用性を示すことに成功した.
血管は神経の働きかけにどう応答するか？血管形成におけるＪｕｎＢの新しい役割の解明

本研究では神経-血管の直接の相互作用に着目して血管が神経と並走するメカニズムを明らかにすることを目的とし、神経との接触により血管内皮細胞内で活性化される遺伝子JunBを同定した。JunBは血管内皮細胞の細胞形態に影響を及ぼしtip cellへの変換や血管新生を促進すること、shRNA-JunBによるin vivoでのJunBのノックダウンは神経との並走区間の減少を示すことを明らかにした。本研究により神経-血管並走の分子メカニズムの一端が明らかになり、血管関連疾患の応用研究に役立つものと期待される。脊椎動物の血管は体の多くの部分で神経と並走しており、血管ネットワーク形成における神経ー血管相互作用の重要性が指摘されてきている。最近、神経の分泌する可溶性因子VEGFおよびCXCL12が血管に働きかけて血管のリモデリングを誘導することが報告された(Li W et al. Dev Cell. 2013)。しかしながら神経ー血管相互作用によってどのような遺伝子が血管内皮細胞内で活性化され、血管のリモデリングが行われていくのかはまだ全くわかっていない。本研究は、神経ー血管相互作用により血管で活性化される遺伝子JunBに着目して血管ネットワーク形成のメカニズムを明らかにすることを目的としている。24年度に、神経ー血管相互作用の結果、血管内皮細胞内に特に強く誘導される遺伝子としてJunBを同定し、それがin vitroでの血管内皮細胞の増殖や管腔形成に関与することを見いだした。平成25年度は以下の成果が得られた。1.血管新生能をより生体内に近い形で評価するため、3Dコラーゲンゲル血管新生アッセイ系を用いてJunBの機能を解析した。その結果、JunBはコラーゲンゲル内への血管新生に対して促進的に作用することが明らかとなった。2.DNAマイクロアレイを用いてJunBを過剰発現させた血管内皮細胞での遺伝子発現の変化を調べた。Ingenuity IPAを用いて血管内皮細胞でどのような遺伝子群がJunB制御下にあるのかを明らかにした。3.新たに報告された神経ー血管ワイヤリング因子であるCxcl12について、JunBシグナルとの関連性について解析した。末梢神経から分泌されたCxcl12が血管内皮細胞に働きかけてJunBの発現を直接制御するのかどうかをリコンビナントCxcl12および末梢神経細胞のコンディショニングメディウムを用いて検討しその作用を明らかにした。体の隅々まで張り巡らされた血管ネットワークはほとんどの場所で末梢神経と並走した形で形成されている。血管ネットワーク形成の過程には血管内皮細胞と神経との相互作用が存在することが示唆されているがその詳細な仕組みは未だに明らかにされていない。本研究は神経ー血管相互作用により血管内皮細胞内に特に強く発現誘導された転写因子JunBの血管ワイヤリングにおける機能を明らかにすることを目的としている。(1)本年度はまず、血管ネットワーク形成の各過程におけるJunBの発現部位、発現パターンを明らかにするため、マウス胎児の皮下に形成される血管ネットワークに注目して、神経、血管の各発生段階について血管、神経それぞれのマーカー分子およびJunBの発現をマウス胎児の前肢皮膚組織を用いたwhole mount免疫染色によって解析した。その結果、E13.5のマウス皮下に形成された原始血管叢がE17.5までの成熟した血管網へと分化していく過程で特有な血管内皮細胞に特に強くJunBを発現していることが明らかとなった。また、JunBプロモーターのNanoLucレポーターを組み込んだレンチウイルスを作成した。これを用いて今後in vitroおよびin vivoでのJunB発現の経時的発現を解析する。(2)血管内皮細胞でのJunBの機能を明らかにするため、ヒト血管内皮初代培養細胞HMVECおよびその株細胞TIME cellsでJunBを過剰発現/発現抑制し、そのときの細胞機能を解析した。最近、神経細胞と血管内皮細胞の相互作用に関する報告が幾つかなされているが、いまだ、神経ー血管相互作用によってどの様な遺伝子が血管内皮細胞内で活性化され、その結果として血管のリモデリングが行われていくのかということはまだわかっていない。本研究は神経ー血管相互作用により血管で活性化される遺伝子に着目して血管ネットワーク形成のメカニズムを明らかにすることを目的にしている。24年度には神経細胞と血管内皮細胞の共培養下で血管内皮細胞内に活性化される特徴的な遺伝子群を同定した。25年度には注目した遺伝子の血管内皮細胞におけるin vivoでの機能を中心に解析し、JunBが血管新生先端の特有な細胞で強く発現していること、3Dコラーゲンゲルへの血管新生にJunBが促進的に作用することを明らかにした。26年度はJunBの血管内皮細胞における下流パスウェイを探索するとともに既知の分子との関連性について調べた。さらにマウスを用いてJunBのin vivoでの血管新生能(ネットワーク形成等)に焦点を当てて解析した。再生医療をめざした組織の再構築には同時に血管の再構成が必須であり、血管の走行性を決定するメカニズムの解明が待たれている。哺乳類の血管の発生過程は、胎生期にまず原始血管叢が形成されたのち、末梢神経との相互作用により血管内皮細胞の動脈分化および神経に沿った血管のリモデリングが行われ、成熟した血管ネットワークが形成されていく。しかしながら、神経がどのように血管に働きかけて血管のリモデリングを行うのか、またそれを担っている遺伝子等については、まだ十分明らかにされていない。

本研究では、ヒト初代培養毛細血管内皮細胞(HMVEC)とマウス後根神経節初代培養細胞(DRG)との共培養系を用いて、神経との相互作用によってHMVECで活性化される遺伝子に着目し、血管の形成と機能を制御する因子の探索を行った。その結果、神経-血管相互作用により血管内皮細胞でJunBが活性化されることを見出した。マウス胎児皮膚の神経-血管ネットワーク形成期におけるJunBの発現を解析した結果、JunBは神経と近接した一部の血管内皮細胞に強く発現していた。JunBをHMVECで強制発現あるいは発現抑制させて、血管内皮細胞の細胞増殖および3次元コラーゲンゲルへの血管新生能を解析した結果、これらはJunBの発現量と正の相関性を示し、JunBが血管新生に対して促進的に機能することが明らかとなった。また、in vivoで発生期の血管内皮細胞のJunBの発現を抑制すると血管の走行性、神経との並走性に変化が観察され、並走した血管数の減少が見られた。以上の結果から、末梢神経との細胞間相互作用を介したシグナル伝達により血管内皮細胞にJunBの発現が誘導され、その結果として血管新生や血管のリモデリングによる神経との並走が促進されることが示唆された。本研究では神経-血管の直接の相互作用に着目して血管が神経と並走するメカニズムを明らかにすることを目的とし、神経との接触により血管内皮細胞内で活性化される遺伝子JunBを同定した。JunBは血管内皮細胞の細胞形態に影響を及ぼしtip cellへの変換や血管新生を促進すること、shRNA-JunBによるin vivoでのJunBのノックダウンは神経との並走区間の減少を示すことを明らかにした。本研究により神経-血管並走の分子メカニズムの一端が明らかになり、血管関連疾患の応用研究に役立つものと期待される。本研究で計画していたレンチウイルスを用いたin uteroinjection法で、注入部位全てがレンチウイルスに感染するようなパターンを実験計画段階で想定していたが、実験を行った結果、実際には、感染細胞が発生の段階に従ってmigrationしていき、一箇所に集まったようなパターンを示さないことが明らかとなった。そのため、少し実験方法の変更が必要となった。新たな実験方法に必要なin vivo解析系を構築するのに時間を要したが、現在その準備が整っている。細胞生物学新たに導入したレポーターマウスを用いて血管ネットワークを容易に判別できるようにし、さらに、血管内皮細胞のみでshRNAを働かせたり、あるいは働かない様にする系を利用する。27年度にはこのマウス解析系を用いて、これまでにin vitroで明らかにした血管新生におけるJunBの機能をin vivoで確認する。得られたデータをもとに、血管ネットワーク形成能の違い、神経と血管の並走の程度を定量化する方法を構築し、当該遺伝子の機能を明らかにする。遺伝子改変マウスの入手に予定外の時間を要した。そのため実験に必要な数のマウスの繁殖に時間がかかっている。