hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
溶媒和ダイナミクスの非同期性を考慮した有機反応機構の解析

溶液中で生起する有機化学反応の速度定数は、一般的には遷移状態理論(TST)に従うことが知られている。しかし、励起状態の高速反応や高圧力下での反応は、この一般的原則から外れる例外的な挙動が観測される。本研究では、この興味深い挙動の原因を明らかにするため、分子シミュレーション手法と高圧反応速度測定実験の両面から解析を行った。その結果、溶媒と溶質の間の化学平衡が破綻する度合いが重要な役割を果たしていることを明らかにした。溶液中での化学反応速度挙動は、一般的には遷移状態理論(TST)で解釈される。TSTでは溶質と溶媒を含む全系の熱力学的平衡が化学反応プロセス全体で常に保持されていることを前提としているが、励起状態での高速反応や高圧下での化学反応においてはこの前提は必ずしも成立しない。すなわち、溶質分子のダイナミクスに溶媒分子が追従できない結果、化学平衡の破綻に至り、非化学平衡の下で化学反応が進行する。本研究の目的は、このような「動的溶媒効果」について、分子シミュレーションに基づく理論計算と、高圧下での高粘性溶媒中での化学反応速度測定実験の協力の下に、その本質を解明することである。非化学平衡下における分子間相互作用様相を実験的に直接観測することは極めて困難であるため、分子動力学(MD)法を用いたシミュレーションが有力な解析手法として期待される。これまでの研究で、高粘性溶媒中高圧下における4-ジメチルアミノ-4'-ニトロアゾベンゼン(DNAB)のZ/E異性化反応速度定数の非TST挙動(Kramers turnover)について、加速MD法(aMD)を用いて、ミリ秒秒程度の超長時間MDシミュレーションを必要とする反応速度定数計算を効率的に実行した。さらに、本反応の自由エネルギー面(FES)を溶質寄与(化学反応座標)と溶媒寄与(溶媒和座標)に分離して算出し、反応の溶媒依存性について詳細な知見を得ることができた。本年度は、FES計算の精度向上と速度向上を企図した検討を行った。メタダイナミクス法(MTD)にレプリカ交換法(REM)を組み込んだMD計算を実施し、アンブレラサンプリング法で得られたFESとの比較検証を行った。MTDおよびREMパラメーターに対するFES依存性を検証し、高粘度溶媒に対するFES力場依存性についても検証した。分子シミュレーションとメタダイナミクス法を組み合わせた反応自由エネルギー算出を各種高粘性溶媒中において実施した。動的溶媒効果の本質である溶媒和自由エネルギーと反応自由エネルギーを分離して、両者のカップリング度について定性的に検討した。溶液化学反応における反応速度挙動は、通常の反応条件下では遷移状態理論(TST)に基づき説明される。しかし、励起状態高速反応や高圧下反応では、溶質-溶媒系の化学平衡の破綻が起こり、TST挙動から外れることが実験的に知られている。本研究の目的は、この非TST挙動の原因である「動的溶媒効果」を、計算化学アプローチで解明することである。昨年末時点での計画に基づき、化学反応自由エネルギーを構成する化学座標自由エネルギー(溶質の反応自由エネルギー)と、溶媒和座標自由エネルギー(周辺溶媒の溶媒和自由エネルギー)を分離し、両者の結合度合を表す指標であるカップリング定数をMDシミュレーションで算出し、吸い込み項Fokker-Planck型反応拡散方程式のモデル解析解から得られるカップリング定数との比較考察を行った。古典力学レベルで評価を行う対象として、アゾベンゼン誘導体およびベンジリデンアニリン誘導体を選び、Iterative Steered MD法で求めた反応経路化学座標に沿った自由エネルギーをMDシミュレーションとメタダイナミクス計算を組み合わせて求め、溶媒和状態と溶質のみの自由エネルギーの差から、カップリング定数を求めた。新たな試みとして、クロメン誘導体の熱戻り閉環反応に対して、Reax力場を用いた自由エネルギー計算をを実行し、カップリング定数の算出に成功した。溶媒和自由エネルギーを計算する別手段として、メタダイナミクス法の替わりに自由エネルギー表示法(ERMOD法)を検討した。古典力場MDシミュレーションから第一原理MDシミュレーションへの拡張準備として、CP2Kソフトウエアを用いた予備的計算を行った。結合生成・開裂を伴う反応系への拡張として、Reax力場を用いてクロメン誘導体の熱戻り閉環反応の自由エネルギー計算と化学反応0溶媒和カップリング定数の算出に成功した。本研究の目的は、高圧液相反応などで観測される特異的な反応速度定数挙動を計算化学アプローチで解明することであった。液相反応の速度定数は、通常の反応条件下では、遷移状態理論(TST)に従う。しかし特殊な条件下では、溶質-溶媒間の化学平衡の破綻が起こり、TSTから外れる特異的な挙動が観測される。昨年度までの成果として、全反応自由エネルギーを構成する化学座標自由エネルギー(溶質の反応自由エネルギー)と、溶媒和座標自由エネルギー(周辺溶媒の溶媒和自由エネルギー)を分離し、両者の結合度合を表す指標であるカップリング定数をMDシミュレーションで算出し、吸い込み項Fokker-Planck型反応拡散方程式のモデル解析解から得られるカップリング定数との比較を行った。この手法を、アゾベンゼン・ベンジリデンアニリン誘導体(古典力学レベル)と、クロメン誘導体(Reax力場・第一原理MD)のそれぞれに適用した。最終年度は、溶媒和エネルギー計算の改善法として自由エネルギー表示法(ER法)を採用し、溶媒-溶質カップリング定数の再評価を行った。この方法では、凍結溶媒シェル法による溶媒-溶質間の非平衡効果をあらわに取り込むことができる利点がある。この方法をアゾベンゼン・ベンジリデンアニリン誘導体(古典力学レベル)に適用し、溶媒-溶質カップリング定数の改善を見出すことができた。

本研究を通じて、溶質-溶媒間の化学平衡の破綻が生じている非平衡系において、その破綻規模を表現する溶媒-溶質カップリング定数を、調和ポテンシャル下の解析モデル解ではなく、分子シミュレーションに基づく定量的な数値解として求める手法を見出した点が、主要な成果である。溶液中で生起する有機化学反応の速度定数は、一般的には遷移状態理論(TST)に従うことが知られている。しかし、励起状態の高速反応や高圧力下での反応は、この一般的原則から外れる例外的な挙動が観測される。本研究では、この興味深い挙動の原因を明らかにするため、分子シミュレーション手法と高圧反応速度測定実験の両面から解析を行った。その結果、溶媒と溶質の間の化学平衡が破綻する度合いが重要な役割を果たしていることを明らかにした。従来の解析的モデルでは、アプリオリに与えられた反応自由エネルギー面上の解析にとどまっている。本研究を進め、分子シミュレーションで得られた現実的な反応自由エネルギーからKramers反転の分子論的意義の解明を目指す。自由エネルギー算出の計算手法として、メタダイナミクス法以外のenhansed sampling法も検討する。また、結合開裂や組み換えを表現できる力場や第一原理分子シミュレーション法を導入して、より広範な化学反応での動的溶媒効果の理論的解明を目指す。実験では、クロメン誘導体のring openig/closing反応について、その置換基の嵩高さと反応速度定数の相関から動的溶媒効果の解析を進める。非平衡溶媒和自由エネルギーを定量的に算出するための方法として、溶媒和shell凍結法(SUPERMOLECULE法)を開発し、カップリング係数の精度向上を目指す。定量性の高い反応経路化学座標として、Nudged Elastic band法を検討する。溶媒-溶質カップリングが弱い系に適用してきたが、溶媒-溶質カップリングが強い反応系に対して拡張し、両方の系に対する実験と理論の比較を行う。物理有機化学繰越助成額は、購入した計算機部品の価格改定や、外国旅費に関わる為替レート変動、に該当する。繰越助成額は、計算機部品の価格改定や、外国旅費に係る為替レート変動、に該当する。当該繰越額は、物品費(計算機、実験器具類)・論文投稿費・学会旅費等として適切に執行する。当該繰越額は、物品費(計算機部品、実験器具類)・論文投稿費・学会旅費等として適切に執行する。
血管内皮細胞の血流感知・反応機構に関する分子生物学的・生体工学的研究

血流に起因する血行力学的応力が血管内皮細胞の機能を修飾し血管の構造を規定したりあるいは粥状動脈硬化症の発生要因として重要な役割を果たす可能性が推測されている。こうした仮説の証明にアプロ-チする目的で本研究では血管内皮細胞が如何に血流の変化を認識しどの様な細胞応答を起こすのかその内皮の血流感知・応答機構に関し検討を加えた。流体力学的に検討した流れ負荷装置により培養内皮細胞に流れを負荷しその際の細胞内情報伝達系のsecond messengerである細胞内Ca^<++>の動態及び内皮の再生能、DNA合成、コラ-ゲン代謝、内皮由来血管拡張物質(EDRF)の放出などに及ぼす流れの効果をin vitroで検索した。その結果(1)内皮の流れ感知機構:静的状態にあ培養内皮に流れが加わると細胞内Ca^<++>は急速に上昇しpeakを示す、その後下降しcontrolよりも高いplateauを維持するといったCa^<++>反応を呈する。この反応にはATPの存在が必要でありとくに内皮はATP 500nMの濃度においてずり応力0ー42 dyn/cm^2の範囲の連続的・段階的な流れ変化に対応したCa^<++>上昇反応を示すことが観察された。これらのことから内皮はATPの在存かで流れの変化を細胞内情報伝達系のsecond messengerであるカルシウムイオンを介して感知している可能性が示唆された。(2)流れに対する内皮の細胞応答:培養内皮細胞に24ー48時間1ー3 dyn/cmAA2BBの流れを負荷したところ内皮剥離後の内皮細胞の遊走・増殖が刺激された。遊走はとくに流れの下流方向に著明に起こることが示された。この際内皮のDNA合成が亢進しcell cycleの分裂期の細胞の割合が増加することが明らかになった。また流れ刺激は内皮からの平滑筋遊走刺激因子の産生を促し細胞外マトリックスの1つであるコラ-ゲン産生を増加させた。内皮は血小板凝集抑制作用と平滑筋弛緩作用を有するEDRFを産生するがこの機能が流れにより促進されることやこのEDRF放出が流れによるCa^<++>上昇反応と関係することが判明した。本研究は血管内皮細胞の血流感知・応答機構を培養細胞と流れ負荷装置により解明しようとするものである。平成元年度の研究計画に基づき(1)細胞培養法及び流れ負荷装置の整備並びに(2)蛍光測光録画分析システムの確立をめざした。その結果、牛胎児大動脈、成牛頸動脈からの血管内皮細胞の培養が可能となり実験に供することができた。また流れ負荷装置は回転円盤型とチェンバ-型の2種の装置を試作しその流体力学的特性を水素気泡法など流れの可視化により検討し定量的な流れずり応力を定常性あるいは拍動性に細胞に負荷しうることを確認した。また蛍光試薬を用いる各種の細胞機能の計測システムに関し基礎的検討を行った。

蛍光量変化を精度良く測光でき同時にその空間分布の評価を可能とするため超高感度テレビカメラ(SIT管)を用い蛍光分布を画像として撮影し解析する録画分析システムを確立し以後の機能計測に用いた。ついで(3)流れに対する内皮細胞の感知機構、(4)流れ負荷に追随する細胞反応に関し検討を加えた。感知機構は主として細胞内情報伝達因子である自由Ca^<++>の動態から解析した。その結果内皮細胞に流れを負荷すると即座にCa^<++>濃度がpeak&plateau型の上昇反応を示すこと、EGTAで細胞外Ca^<++>をキレ-トしておくとこの反応のplateau部分が消失し、このplateau部分の細胞外Ca^<++>流入はnicardipine、verapamil、diltiagemなどのCa^<++>結抗剤で阻害されること、またpeakの反応は細胞内Ca^<++>貯蔵部からのCa^<++>放出を抑制する作用のあるTMBー8の存在下で抑制されることが判明した。これらの実験結果から内皮細胞にCa^<++>を介して流れを感知する“shearーtransducer"機構の存在することが示唆された。流れ負荷に追随する細胞機能変化としては内皮細胞の遊走・増殖、DNA合成の亢進や平滑筋細胞遊走刺激因子の産生増加、あるいは細胞外マトリックスの1つであるコラ-ゲン産生・分泌の増加等が観察された。本研究は血管内皮細胞の血流感知・応答機構を培養内皮細胞と流れ負荷装置により解明しようとするものである。平成2年度の研究計画に基ずいた実験により下記の結果を得た。(1)。内皮細胞にM199培養液(ATP1.8μM含有)の流れを負荷すると細胞内Ca^<++>の上昇反応が起こることは前年度の実験で示した。この場合ある時間(7秒)以上の流れの休止期をおかないと反復した流れ負荷に反応しなかったりin vivoでの血流に類似した連続した流れの速さの変化に対して反応を示さなかった。今回,ATP500nMを含むハンクス平衡塩類溶液を用いて内皮に流れ負荷を行ったところ連続した段階的な変化に対応したCa^<++>反応が観察された。これらのことから内皮はATPの存在かで流れの変化を細胞内情報伝達系のsecond messengerであるカルシウムイオンを介して感知している可能性が示唆された。(2)。流れに対する内皮の細胞応答に関しては培養内皮細胞に24ー48時間1ー3dyn/cm^2の流れを負荷したところ内皮剥離後の内皮細胞の遊走・増殖が刺激されること、遊走はとくに流れの下流方向に著明に起こることが観察された。この際内皮のDNA合成が亢進しcell cycleの分裂期の細胞の割合が増加することが明らかになった。また流れ刺激は内皮からの平滑筋遊走刺激因子の産生を促し細胞外マトリックスの1つであるコラ-ゲン産生を増加させる。内皮は血小板凝集抑制作用と平滑筋弛緩作用を有するEDRF(endotheliumーderived relaxing factor)を産生するがこの機能が流れによるCa^<++>上昇反応と関係することが判明した。このことは内皮が血流の変化を感知しその変化に対応してEDRFを産生・分泌し血管のト-ヌスの調節を行うと言った機構の存在が示唆された。以上当該年度の成果として内皮の流れ感知機構にATPが関与する可能性と流れにより引き起こされるCa^<++>
筋疾患マウスのM-CK遺伝子発現の解析と疾患遺伝子のマッピングに関する研究

本研究では、dystal myopathy、筋緊張性dystrophy及びカルニチン欠損症型筋萎縮症の疾患モデル動物であるB6CBA/J-cro系統マウスを用いて、これまでの研究によりcroマウスで欠損する蛋白について、アミノ酸配列の解析結果と特異抗体を用いた解析結果からこの蛋白が筋小胞体結合CKM鎖である可能性が強く示唆されているので、この点をさらに追求し、筋疾患発症機序及び、正常筋における筋小胞体結合型CKの生理学的意義について考察するために以下の実験を行ない成果を得た。材料に本講座で系統維持されているB6CBA/J-cro系統、および市販ICR系統マウスを用いた。市販キットのプロトコルを改良してマウス筋、肝組織からmRNAを精製した。ヒトでの既報を参考にセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計し、DDBJのDNAデータベースにて検索、また各種プライマー評価ソフトにより検討した後に決定し使用した。精製したmRNAを用いて既報を参考にRT-PCR条件を検討し、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した後、dye terminator法により全塩基配列を決定した。その結果cro系統は同義置換を1カ所示したが翻訳産物に差はない物と考えられた。また、肝試料からはPCR産物は得られなかった。これらの結果と、生化学的に検討した筋CK活性の変動データ等を考察し、今後筋小胞体微小環境に置けるCKM遺伝子発現の解析を、遺伝子調節領域の解析と供に進める必用が認められた。材料に本講座で系統維持されているB6CBA/J-cro系統、B6CBA/J-++系統および市販ICR系統マウスを用いた。市販キットのプロトコルを改良してマウス筋、肝組織からtotalRNAを精製した。ヒトでの既報を参考にセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと設計し、DDBJのDNAデータベースにて検索、また各種プライマー評価ソフトにより検討した後に決定して発注した。精製したRNAを用いて既報を参考にRT-PCR条件を検討し、PCR産物の直接配列決定を進めた。これらの結果と、生化学的に検討した筋CK活性の変動データ等をもとに、筋小胞体分画におけるCKM欠損に由来するものと考えられる筋CK活性低下と筋収縮時の筋小胞体におけるエネルギー代謝の問題と筋脱力との関連について、および正常筋における筋小胞体結合型CKM鎖の生理学的意義について考察を進めている。
脳機能画像解析と生体生理指標の同時計測による心身相関のメカニズム解明

我々は不安による痛み修飾における海馬の機能と日常の身体愁訴との関係について研究した。機能的MRIを用いて、痛み刺激とそれに先立つ不安のキューへの脳神経の反応を調べ、質問紙によって得られた日常の身体愁訴との関係を分析した。日常の身体愁訴の発現は不安条件を区別する際の海馬の機能不全と関係しており、海馬とそれに関連した脳皮質の反応が弱い不安に対して抑制されることが、日常の身体愁訴の軽減に影響していることがわかった。【目的】最近、痛みに伴う様々な情動や認知の処理の過程で、前帯状回が重要な役割を担っているという報告があるが、ヒトに日常見られる様々な身体愁訴との関係はまだわかっていない。そこで我々は症状チェックリストSCL-90-Rを用いて身体化指標を測定し、予期不安下における痛み刺激の際の脳活動(fMRI)および自律神経指標(皮膚電気抵抗:GSR)との関連を検討した。【方法】対象者は健康な右利きの男性6名、女性12名。視覚的図形を提示した46秒後に、以下の電気的痛み刺激を右下腿前面に加えた;「□」後は常に一定の中等度痛み刺激(Moderate pain low anxiety:MPLA)、「△」後は中等度刺激(Moderate pain high anxiety:MPHA)あるいは強い痛み刺激のどちらかを与えた。上記プロトコール中にfMRIにてBOLD効果を測定した。特に、MPLAとMPHAという2つの条件下における脳賦活の比較により、予期不安で活動が上昇する脳領域を特定し、被験者ごとの身体化指標と、脳のシグナル変化との相関を検討した。【結果】各刺激後にVASにて痛みの主観的な不快感を調べたところ、MPHAはMPLAよりも平均値が有意に高く、不安による痛みの増強を示した。fMRIの結果では、図形提示時、MPHAはMPLAよりも右の島により大きな賦活がみられた。さらに、MPHAとMPLAのシグナル変化と身体化指標とが正の相関をする部位は右の扁桃体だった。また、電気的痛み刺激時、MPHAはMPLAよりも両側の前帯状回が強く賦活していた。さらにMPHAとMPLAのシグナルの変化と身体化指標が正の相関をする部位は右の前帯状回だった。【考察】これらの結果より予期不安下の扁桃体、前帯状回の活動が身体症状の感受性(身体的愁訴)に関わっていることが推測される。GSRのデータは現在分析中である。不安によって痛みが増幅する際の脳の反応と日常の身体症状愁訴の関係について研究した。健康な被験者18名をSymptom Checklist-90-Revised(SCL-90-R)の身体化の指標によって比較的日常の身体症状が多い群(High somatization : HS)9名と少ない群(Low somatization : LS)9名に分けた。数種類の図形を見た後に図形と対応した強さの電気刺激を右足に与えて条件付けしたあと、f MRIによって脳血流の反応を測定しながら、同様の実験をおこなった。不安を喚起する図形を見た際、普段から身体症状が多い群の方が情動の中枢である扁桃体の賦活が大きいことがわかった。また、電流の強さは同じでもより大きな不安を伴った電気刺激を与えた際に、HLよりHSの方が痛みの評価に関わるとされている腹側外側前頭前野の反応が大きかった。このことは不安を伴う痛み刺激の際の脳の反応には個人差があり、普段から身体症状を強く訴える人は情動や痛みの評価に関わる脳の部位がより活発に反応することを示した。また、痛みストレスを評価する脳の反応にどのような個人差があるかということについて予備的な研究を行った。健康な被験者4名に対してf MRIと皮膚の電気抵抗(Galvanic Skin Resistance : GSR)を測定しながら、様々な強さの電気刺激を右足に与えて、各々の痛み刺激の不快感をVisual Analog Scale(VAS)にて評価させた。VASの値を従属変数、GSRの振幅を独立変数とした線形回帰式の決定係数を算出した。その結果、被験者のうち1名は他の3名と比較して回帰式の精度が低かった。その1名は腹側外側前頭前野において他の3名よりも脳活動が低下している領域が存在した。このような脳活動の違いは、急性のストレスの認知または評価に関連し、ストレスコーピングに影響を与えているか可能性がある。今後、被験者数を増やし、詳細に検討することにより、ストレス認知に関わる脳の部位の活動性の個人差とストレスに対する行動様式の関係の解明につながる可能性が示唆された。身体症状の発症・増悪に心理社会的要因が関与する「心身症」とよばれる病態では、一般的な内科的治療で改善せず慢性化するものが多い。こうした病態が存在するとき、身体-脳の相互連関において、情動の処理不全を起こしやすい神経素因があり、心身の緊張状態が持続し身体症状に至る機序が考えられる。海馬は慢性ストレスに対する脆弱性があることがわかっている。

一方で脳機能画像研究では、急性ストレスとして痛み刺激を用いた際の不安による痛みの増幅に海馬が重要な役割を果たしていることが報告されている。しかし、この不安によって急性の侵害刺激が増幅するメカニズムが日常の身体愁訴に与える影響については調べられていない。我々は不安による痛み修飾における海馬の機能と日常の身体愁訴との関係について、機能的MRIを用いて調査した。18人の健常人に最近一週間の身体愁訴の程度について質問紙を用いて調べた。そして機能的MRIによって弱い不安のキューとそれに続く痛み、強い不安のキューとそれに続く痛みに対する脳血流反応を分析した。不安のキューの強弱に海馬が反応しており、その海馬の反応は日常の身体愁訴の程度と負の相関をしていた。このことから、海馬の機能不全が日常の身体愁訴の発現に関係していることが示唆された。また、キューを見たときの海馬の反応と痛みを受けた時の下前頭回、中前頭回、海馬の反応に関連がみられ、弱い不安を伴う痛み条件の際のこれらの領域の反応が、日常の身体愁訴の程度と正の相関をしていることがわかった。このことから、これらの部位の活動が弱い不安のもとで抑制されないことが日常の身体愁訴の発現に関係していることが分かった。日常の身体愁訴の発現は不安条件を区別する際の海馬の機能不全と関係しており、海馬とそれに関連した脳皮質の反応が弱い不安に対して抑制されないことが、日常の身体愁訴の増悪に影響している恐れがある。
核融合炉用低放射化バナジウム合金溶接継手の時効効果

平成16年度は、大学共通材料である高純度低放射化V-4Cr-4Ti合金NIFS-HEATの溶接継手の中性子照射材について、溶接金属の照射硬化、脆化を熱処理で回復させるため、400-800°Cで照射後熱処理実験を行った。母材の照射硬化は600°C×1hrの照射後熱処理で、照射前のレベルまで回復したのに対し、溶接金属で照射硬化、脆化が回復するには、より高温の800°C×1hrの照射後熱処理が必要であった。組織観察の結果、溶接金属においても母材と同じサイズ、数密度、タイプの照射欠陥転位ループが形成されているが、これが熱処理によって消滅する温度が溶接金属では母材に比較して高くなっていることが明らかとなった。照射欠陥組織が同じなのにもかかわらず、溶接金属では照射硬化が大きく、その回復にも高温を要するのは、溶接によってTi-C,N,Oが固溶し、そのC,N,O不純物が転位ループに集積して障害物強度因子を大きくし、さらに熱的安定性を高めていることが原因と考えられる。すなわち、照射前に適切な熱処理によって、この不純物C,N,Oを再び析出物として固定させてやれば溶接金属の照射硬化、脆化は回避できると予測される。種々の熱処理条件で再析出をさせて溶接金属の衝撃試験を行い、最適な溶接後熱処理条件として800°C×1hrを得た。以上の成果を含め、3年間の研究のまとめを行い、国内外の学会、科学雑誌にて発表した。平成14年度は、大学共通材料である高純度低放射化V-4Cr-4Ti合金NIFS-HEATの溶接継手を作製し、機械特性の評価及び溶接部の不純物の挙動を解析した。また、短時間における時効の影響も一部評価を終えた。V合金は高温で非常に活性で、空気中で溶接すると窒素、酸素など侵入型不純物を吸収して著しく脆化する。そこで、本研究では大気と遮断して溶接することが可能な雰囲気ボックスを開発した。雰囲気ボックスの中に高純度アルゴンを流し、さらに溶接する板材近くに配置したノズルから噴出されるシールドガスにも高純度アルゴンを用いた。雰囲気ボックス内で溶接することにより、窒素、酸素の汚染を40wppm以下に抑えることに成功した。種々の溶接条件で溶接部材を作製し、ビード断面形状から特徴的なものを選んで、引張、曲げ、衝撃特性を評価したところ、いずれも良好で、V合金は窒素、酸素汚染を避ければ溶接性が良いことが明らかとなった。中でも入熱を抑えた部材で衝撃特性が改善されることが明らかとなった。溶接部の硬さを評価したところ、溶接金属及び熱影響部で硬化が認められた。組織観察によると、この硬化は、溶接前に存在していたTi-C,N,O析出物が溶接によって分解固溶され、マトリクスのC,N,O濃度が上がることにより固溶硬化がおきたためであると考えられる。この硬化量と組織変化は、別途作製したV-4Cr-4Tiモデル合金の熱処理による硬化、組織変化と対応させて理解することができた。時効熱処理を行った場合、10hrまでの熱処理では溶接金属で微細な再析出とそれによる硬化が起こることが明らかになった。以上の成果の一部は、国内学会及び米国で行われた第15回核融合エネルギー技術学会で発表し、他研究者との意見交換を行った。平成15年度は、大学共通材料である高純度低放射化V-4Cr-4Ti合金NIFS-HEATの溶接継手を作製し、溶接後熱処理を400-950°C、1-3000hrの範囲で行った。溶接金属では、溶接によって固溶したTi-C,N,Oが、600°C以上の溶接後熱処理によって再析出する挙動が明らかになった。再析出は、低温、短時間では微細高密度に発生し、熱処理温度、時間とともに成長して数密度は低下した。再析出が微細高密度の場合は、溶接金属が硬化し、それに伴って衝撃特性が劣化(脆化)することが明らかとなった。最も微細高密度な再析出組織、そして顕著な析出硬化と脆化を示したのは600°C×10hrの溶接後熱処理をした場合であった。一方、600°Cでは100hr以上の溶接後熱処理(時効熱処理)をすれば析出物が成長して、溶接金属の硬さと衝撃特性は熱処理時間とともに回復した。さらに、800°Cで1hrの熱処理をした場合に、600°Cで長時間時効したのと同様な組織と、非常に優れた衝撃特性が得られることも明らかとなり、最適な溶接後熱処理条件についての指針が得られた。JMTR(Japan Materials Testing Reactor)を用いて中性子照射も行った結果、溶接後熱処理で再析出を起こさない場合には,溶接金属は母材に比較して大きな照射硬化を示し、衝撃特性も劣化することが明らかとなった。これに対し、600°C以上の溶接後熱処理で再析出をさせれば、溶接金属の照射硬化は母材並みとなり、衝撃特性改善の見こみも得られた。以上の成果の一部は、国内学会及び第11回核融合炉材料国際会議で発表し、他研究者との意見交換を行った。平成16年度は、大学共通材料である高純度低放射化V-4Cr-4

Ti合金NIFS-HEATの溶接継手の中性子照射材について、溶接金属の照射硬化、脆化を熱処理で回復させるため、400-800°Cで照射後熱処理実験を行った。母材の照射硬化は600°C×1hrの照射後熱処理で、照射前のレベルまで回復したのに対し、溶接金属で照射硬化、脆化が回復するには、より高温の800°C×1hrの照射後熱処理が必要であった。組織観察の結果、溶接金属においても母材と同じサイズ、数密度、タイプの照射欠陥転位ループが形成されているが、これが熱処理によって消滅する温度が溶接金属では母材に比較して高くなっていることが明らかとなった。照射欠陥組織が同じなのにもかかわらず、溶接金属では照射硬化が大きく、その回復にも高温を要するのは、溶接によってTi-C,N,Oが固溶し、そのC,N,O不純物が転位ループに集積して障害物強度因子を大きくし、さらに熱的安定性を高めていることが原因と考えられる。すなわち、照射前に適切な熱処理によって、この不純物C,N,Oを再び析出物として固定させてやれば溶接金属の照射硬化、脆化は回避できると予測される。種々の熱処理条件で再析出をさせて溶接金属の衝撃試験を行い、最適な溶接後熱処理条件として800°C×1hrを得た。以上の成果を含め、3年間の研究のまとめを行い、国内外の学会、科学雑誌にて発表した。
森と人間の文化史-伝承文学研究とエコロジー教育の接点-

『メルヒェン集』、『伝説集』の森の特性を検証しつつ、グリム兄弟の「理念としての森」の意義を、「生の連続性」という観点から明らかにした。言語、歴史、文学、文化における「古いにしえのもの」の喪失を森林破壊プロセスにたとえ、「古いにしえのもの」の再評価の重要性を説く彼らの自然観および詩ポエジー観は、19世紀エコロジー運動の理念における先駆的地位を担いうる。伝承文芸に必要な想像力の豊かさとは、心情としての内面的「自然」を豊かにする「癒し」の力を有する意味で、現代社会における「心のエコロジー」にも繋がりうる。本研究の第一の目的は、グリム・メルヒェンにおける「森」が、グリム兄弟の「根源的なもの」の総体として、理念的かつ普遍的に捉えられることを、兄弟の学術著書全体を精査する総合研究「グリム文献学」の見地より実証することにある。グリム兄弟の「森」あるいは自然への思念は、自然を支配する当時のキリスト教文化圏にありながら、環境としての「自然」のみならず、己自身あるいは民の根源としての「自然」の価値を説くものであり、それは、「自然(森)との共生」のあり方を理念的側面から支える意味で、現代社会にも通ずるものがある。第二の目的は、「自然との共生」教育に、畏敬の対象あるいは異界としての森という精神文化史的観点を導入し、伝承文学(グリム研究を含む)を用いた「森のエコロジー」教育の提案と実践を試みることにある。平成18年度は、ドイツのハルツ山地を訪ね、現代における「魔女伝説」との関わり方を見聞した(18年8月)。ドイツ再統一以降、ハルツの森(山)は、魔女伝説ゆえの観光地化が進んでいる。しかしながら、それは同時に、魔女伝説を育んだ森を守るという意識にも繋がっていることは、伝承が自然との共生に精神的に貢献している意義深い側面といえる。次年度は本研究の一部を、「<魔女一森一自然>との共生」という形で発展させるつもりである。・口頭発表「魔法の眠りと時間の喪失-グリム・メルヒェン<茨姫>についての一考察-」(18年10月、於九州産業大学、日本独文学会シンポジウム「グリム・メルヒェン研究」)、「グリム・メルヒェンと森」(19年、2月、比較民話研究会、於奈良教育大学)など。・公開講座「グリムの森・ドイツの森(2)-『ドイツ伝説集』を中心に-」(18年11月、於名古屋市生涯学習推進センター)。・講義「<魔女>像の比較文化研究」、「グリム伝説の<森>研究」(18年度、於愛知教育大学)など。【本研究は、人文社会科学振興プロジェクト「豊かな人間像の獲得」の、「伝承の現場からの考察」グループ研究とも密接に関わっている】本研究の第一の目的は、グリム兄弟が収集刊行した『メルヒェン集』、『ドイツ伝説集』のみならず、彼等の文学、民俗学、言語学、法学等の学際的研究業績にも目を配り、彼等の理念としての「森」の意義を、「生の連続性」という観点より明らかにすることにある。平成19年度は、本研究前半の成果として、研究書『黒い森のグリム-ドイツ的なフォークロア-』(単著)を郁文堂から出版した。彼等の文献学研究の根本理念は、「ドイツ的なもの」、「いにしえのもの」、「土着のもの」、「自然的なもの」、「詩的なもの」そして「ニーベルンゲン的なもの」という六つの普遍概念の総体にあり、それらは「森」という表象に結晶化している。本研究のような「グリム兄弟の業績全体を精査して、再びメルヒェンの素材へと回帰する」方法論は、「グリム研究=メルヒェン研究」という先入観に捕われている日本にはまだ少ないが、「国際民間伝承文芸学会第14回タルトゥ会議」(平成17年8月、於エストニア・タルトゥ大学)等では高い評価を得ている。グリム兄弟の「森」あるいは自然への思念は、環境としての「自然」のみならず、己自身あるいは民族の根源としての「自然」の価値を説くものである。本研究第二の目的は、現代日本における「自然(森)との共生」教育に、畏敬の対象あるいは異界としての森という精神文化史的観点を導入し、伝承文学(グリム研究を含む)を用いた「森のエコロジー」教育の提案と実践を試みることにある。前年度に引き続き本年度も、講義「〈魔女〉像の比較文化研究」(東洋大学)において、西洋キリスト教文化における「魔女」像の変容の軌跡を辿りながら、一方で受講生には、「魔女」の存在の是非について、この表象の拠り所としての自然(森)の「異界性」の重要性について考察してもらった。これらの資料分析を続行し、「〈魔女-森-自然〉との共生」という形での、伝承文学研究を用いたエコロジー教育の意義を考察し提言とすることが、次年度の課題である。

平成19年度に出版した研究書『黒い森のグリムードイツ的なフォークロアー』(単著、郁文堂)をもとに、本年度は特に、森に住まう「魔女」と「自然観」との関連(「魔女-森-自然」)から、伝承文学がエコロジー意識に寄与しうる可能性を検証した。国際的な成果公開としては、2008年8月27日、アジア地区国際ゲルマニスト会議2008金沢大会(Asiatische Germanistische Tagung2008Kanazawa)で、"Das Majo(魔女)-bzw. Hexenbild im gegenwartigen Japan. Ein Praxisbericht uber die Vorlesungen an zwei Universitaten"という題目で研究発表をした。現代日本人が描く「魔女」像が、いかなる影響のもとに形成されているのか、現在では精神的な「癒し」の存在とも見なされる「魔女」と、その周辺を取り巻く薬草や占い等の「自然」との関わり、「魔女」の存在に欠かせないファンタジー(創造力)の重要性を説いた。「有機体とその環境の間の諸関係の科学」という19世紀「エコロジー」の初期定義(ヘッケル)を機軸に、外界としての自然保護のみならず、心象風景としての自然とそこに住まう「癒し」の象徴としての「魔女」の現代におけるエコロジカルな意義の可能性を提案した。また、ヘルダーの思想を受容したとされるグリム兄弟の「自然」と「人為」との対比をテーマに、2009年4月末をめどに論文を作成中。グリム兄弟の論文書簡等に表れる、森林破壊に喩えられた、言語、歴史、文学文化各方面における「古のもの」の喪失プロセスと、それらの現代における再評価の重要性を説く彼らの自然観およびポエジー観が、ロマン派思潮とも共鳴し、19世紀ドイツエコロジー運動の先駆的ポジションを担いうることを説き、彼らの収集『子どもと家庭のメルヒェン集』(グリム童話)の森に託された、「自然」との有機的連関と精神的な関わりに関するメッセージを明示する。
バイオイメージングとメタボローム解析を利用した胆汁うっ滞の生態情報包括解析

肝細胞から総胆管に至るリアルタイムな病態生理学的情報と肝組織の経時的な代謝反応情報を包括的に収集解析し、各種病態における胆汁鬱滞機構を解明することを目的として本研究を施行中である。現在、脂肪肝における生体内異物解毒機構の視覚化に取り込んでいる。Carboxyfluoresceinを用いた蛍光強度の経時的変化をみることで、MRP2(multidrug resistance protein 2)の肝細胞における排泄イメージングが可能であり、毛細胆管イメージングと、類洞血流動態イメージング、総胆管胆汁成分リアルタイム分析の網羅的解析を同時に行うことを目的とした。結果は以下の通りである。1.胆汁中CF蛍光分析法の確立と手技の安定化。各灌流時間におけるMRP2肝細胞内分布の免疫組織学的検討はほぼ確立した。2.肝細胞毛細胆管膜上のMRP2および毛細胆管腔のイメージングに必要なラット肝分離灌流モデルの樹立と手技はほぼ安定化してきたが、3Dに再合成に役立つVCTとの融合システム構築は未解決である。3.肝細胞の経時的蛍光強度の分析だけではブリッジングによる影響を無視でいないため、安定した蛍光強度の確保のために幾つかの対応策を用意した。これらはOLYMPUSのDSUunitを用いた解析で解決できた。以上より、課題はまだ多く残されているものの、それぞれのイメージングは独立には施行できるが、これらの情報に、組織の代謝反応情報の解析が加われば、3Dリアルタイムイメージングのターミノロジーを確立可能と考えられる。視覚化にはCarboxyfluoresceinを用いた蛍光強度を現在施行中であるが3D化には、Volume CT(VCT)の利用も視野に入れている。具体的なtargetはMRP2(multidrug resistance protein 2)の肝細胞における排泄イメージングとし、VCTを基軸にして毛細胆管イメージング、類洞血流動態イメージング、総胆管胆汁成分リアルタイム分析の網羅的解析を肉付けする。以下に各行状況を示す。2.肝細胞毛細胆管膜上のMRP2および毛細胆管腔のイメージングに必要なラット肝分離灌流モデルの樹立と手技はほぼ安定化してきたが、3Dに再合成に役立つVCTとの融合システム構築のために若干の解決課題があり、幾つかの解決策を講じている。これらは近日中に解決できると考えている。4.脂肪肝の肝組織メタボローム解析システムの開発は独立して行っている。
大脳皮質味覚野における情報処理機構

ラット大脳皮質味覚ニューロンはグルタミン酸感受性をもっていることは以前我々が報告した。一方、P物質やカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRPを含有するニューロンが舌から大脳皮質に至る味覚伝導路に沿って分布し、殊にCGRP含有繊維は味覚野腹側部DI野に多く、CGRP結合ニューロンは背側部GI野に多いことが知られている。本研究では、ウレタンで麻酔したラットの大脳皮質味覚野から多連微小電極でニューロンを記録し、種々の薬物を微小電気泳動的に記録ニューロンに与え、次のことを調べた。味覚入力を受けるグルタミン酸受容体はAP-5で遮断されるNMDA型か、あるいはCNQXで遮断されるnon-NMDA型か。皮質味覚野ニューロンのP物質-CGRP感受性ニューロンの分布と味覚情報処理に対するこれらペプチドの作用について、の2点である。結果は以下の通りである。1.大脳皮質味覚ニューロンの70%はAP-5とCNQXの両者で味応答が消失し、20%はいずれか一方で、10%は両者とも無効であった。このことは、グルタミン酸が味覚入力の伝達物質として使用され、NMDAおよびnon-NMDA両型が関与していることを示している。2.P物質は短潜時で立ち上がりの早い応答を生じ、CGRPは長潜時で緩やかな応答を示した。P物質に対し味覚ニューロンの約50-60%、非味覚ニューロンの約40%がGI野、DI野の区別無く感受性をもち、その90%は興奮性であった。CGRPに対してはGI野、DI野とも非味覚ニューロンの約35%、味覚ニューロンはGI野で60%、DI野で20%が興奮性に応答した。P物質含有ニューロンの分布とP物質感受性ニューロンの分布、CGRP感受性ニューロンの分布とCGRP結合ニューロンの分布は一致した。P物質CGRP投与で四基本味に対する味応答プロフィールが変化するニューロンが見られ、味覚野に於ける情報処理を修飾する所見が得られた。
δ-,ε-,ζ-Protein Kinase C群の構造、機能とその病態

Protein kinase Cは多くの遺伝子に由来する分子ファミリーであり、本酵素群の関与する生理現象、病態、は多岐にわたると考えられる。本年度の研究は、初年度に引き続きprotein kinase C分子種のうち、δ,ε,ζ分子種について酵素学的性質および生理機能の検討を行なった。δ,ε分子種については初年度にラット脳組織から各種のカラムクロマトグラフィーによる精製方法を確立したが、本年度はこれらの酵素標品を用いて活性調節機構の解析を行い、その結果、δ,ε分子種はいわゆるconventional protein kinase Cと性質が異なるのみならず、それぞれが特徴的な活性調節を受けることが示された。すなわち、両分子種ともその活性化にジアシルグリセロールならびにリン脂質を必要とすることが示されていたが、ε分子種はこれらの活性化因子の他に脂肪酸により強くその酵素活性が増強されることが示され、これに対してδ分子種はかえって抑制を受けることが明らかになった。また、これらのprotein kinase C分子種の生理機能の解析のため、それぞれの分子種の高発現細胞を構築し検討を行ったところ、δ分子種高発現細胞では増殖抑制が観察され、本分子種が細胞増殖制御において特異的な機能を持つことが示唆された。一方、ζ分子種については、ラット組織からの精製を試みたが、その分解産物と推定される触媒作用をもつフラグメントを除去することが困難であるためζ分子種自身の性質を検討することには成功していない。そこでバキュロウィルス系による産生を試み、現在Sf9細胞抽出液からの精製を試みている。また、δ,ε分子種についても同様に産生を行っており、これらの産生標品を抗原としてδ,ε,ζ分子種に対する強力なポリクローナル抗体を作成し、免疫化学的検討を行うことを計画している。Protein kinase Cは多くの遺伝子に由来する分子種群でありProtein kinase Cの関与する生理現象、病態は多岐にわたると考えられる。本研究はProtein kinase Cの分子種のなかで、cDNAの解析からその存在が予想されていたδ,ε,ζ各分子種の酵素学的蛋白学的解析およびこれらの分子種に対する特異的抗体の作成を計画した。δ,εの2分子種についてはラット脳組織よりそれぞれ単一標存に精製し、精製標品を用いてその活性調節因子、基質蛋白質、触媒機能の解析を行った。これらの分子種はその活性化にジアルシルグリセロ-ルならびにリン脂質を必要としたが、カルシウムイオンには依存せず、従来、解析が行われてきたα,βI,βII,γ分子種とは明らかに異なる性質を示した。また、分子種に特徴的な部分アミノ酸配列を用いて合成したペプチドを抗原として特異的ポリクロナ-ル抗体を作成した。現在、これらの特異抗体による免疫化学的解析を行っている。一方、ζ分子種についてもその精製および抗体作成を試みているが、精製過程で複数の酵素活性ピ-クを示し、翻訳後修飾あるいは複数の遺伝子に由来すると推定される当初予想していた以上の多様性が示唆される。まだ単一標品は得られていないが、部分精製標品を用いた検討結果から、ζ分子種はδ,ε分子種とも異なる酵素的性質を持つ可能性があり検討中である。常年度は引続き各種の組織、細胞におけるδ,ε,ζ分子種の発現とその特異的基質蛋白質の検討を行い、これらのProtein kinase C分子種の特異的生理機能の解析を行うことを計画している。Protein Kinase Cは多くの遺伝子に由来する分子ファミリーであり、本酵素群の関与する生理現象、病態、は多岐にわたると考えられる。本研究では、protein kinase C分子種のうち、cDNAクローニングにより存在が明かにされたδ,ε,ζ分子種について酵素学的性質および生理機能の検討を行なった。δ,ε分子種についてはにラット脳組織から各種のカラムクロマトグラフィーによる精製方法を確立し、これらの酵素標品を用いて活性調節機構の解析を行った。

その結果、δ,ε分子種はいわゆるconventional protein kinase Cと性質が異なり、その活性化にジアシルグリセロールならびにリン脂質を必要とするが、カルシウムイオンには依存せず、また、それぞれが特徴的な活性調節を受け、ε分子種はこれらの活性化因子の他に脂肪酸により強くその酵素活性が増強されるが、δ分子種はかえって抑制を受けることが明らかになった。また、これらのprotein kinase C分子種の生理機能の解析のため、それぞれの分子種の高発現細胞を構築し検討を行ったところ、δ分子種高発現細胞では増殖抑制が観察され、本分子種が細胞増殖制御において特異的な機能を持つことが示唆された。一方、ζ分子種については、ラット組織からの精製を試みたが、その分解産物と推定される触媒作用をもつフラグメントを除去することが因難であるため、バキュロウイルス系による産生を試み、現在Sf9細胞抽出液からの精製を試みている。また、δ,ε分子種についても同様に産生を行っており、これらの産生標品を抗原としてδ,ε,ζ分子種に対する強力なポリクローナル抗体を作成し、今後、免疫化学的解析等を通じてprotein kinase C分子種の生理機能の検討を進展することを計画している。
CFDによる船殻工場における溶接ヒュームの拡散制御に関する研究

本研究では造船所の船殻加工・組立工場において工作時に溶接・切断により発生したヒュームの拡散状態を把握して,高効率の換気システムの設計に応用するために,2相流問題に関するCFD(数値流体力学)方法を開発してきた。本年度は本研究の最終年度で以下のような研究成果が得られた。(1)前年度に完成した2流体モデルに基づく三次元乱流熱流体に関する数値計算プログラムについて改良を行った。そして改良したプログラムを使ってある内業工場において実状況に対応する数値シミュレーションを行い,現場計測した数点の温度・ヒューム濃度と比べて,プログラムのチューニングを行い,本数値計算法を将来に実際の内業工場換気設計に応用する計算を行うための検証を行った。(2)実際の内業工場に対する三次元CFDシミュレーションを行う際,計算機の能力の制限で計算格子の数が多く取れず,ヒューム移動の計算精度を上げるために対流計算に対して数値拡散の少ない高精度のスキームが望ましいことが分った。従って,本年度では高精度の対流計算スキームと知られるCIP法に対して多相流問題への応用についての研究を行い,このスキームの有効性を確認したと共に,本研究で開発したヒューム拡散の数値計算方法への応用も可能であることが分った。本研究ではCFD(数値流体力学)によるシミュレーションを行い,造船所の船殻加工・組立工場において工作時に溶接・切断により発生したヒュームの拡散状態を把握して,高効率の換気システムの設計に応用することを目的としている。本年度は以下のような研究成果が得られた。(a)ヒュームの物理特性に関する公表された資料を収集してヒューム粒子の化学成分,幾何形状,サイズなどを調査した。その結果,造船所の場合は鋼板の切断や溶接作業時に発生する金属ヒュームはサイズ0.110μm程度の不定形の粒子となるが,その中に肺に堆積し健康被害を及ぼす恐れがあるのは0,55μmの極微細粒子で,換気流や熱対流による拡散・移流性が高く,その移動性状の把握は低濃度の場合は気相流として扱えることが分かった。(b)造船場内業工場内における労働安全上強く問題視される極微細粒子の拡散現象を数値解析する差分法計算プログラムを作成した。数値解析対象は非定常三次元乱流熱流体で,ヒュームは気相として扱い,相間の運動量やエネルギーの厳密な交換は考慮しない2流体モデルを用い,乱流モデルはk一εモデルを使用した。この計算法によって,自動切断機力稼動中のある内業工場において天井部の換気ファン駆動の他にブロック搬送ドアの開閉と工場側壁の窓を開放した場合について換気流の数値シミュレーションを行い,換気効率について調べた。なお,溶接機・切断機近傍のヒュームの詳細な流動様相の解明については,ヒューム粒子に関するLagrange形の粒子運動方程式を解く必要があり,DynamicSGSモデルを応用する固気混相乱流の数値解析方法に関する研究は来年度以降に行う予定である。
トリプレットリピート伸展疾患の遺伝子診断法の確立、病態解析、新たな疾患遺伝子同定

A.トリプレットリピート配列伸展疾患のうち、(CGG/GGC)n疾患について、遺伝子診断スクリーニング法に関する検討をおこなった。(1)脆弱X症候群A,Eについてのスクリーニングを行い、PCR-サザン法にて、検出率100%の方法を確立した。PCRは男児について、正常-異常の判定を行い、Puf1ポリメラーゼ使用にて、100%の検出率を得た。これにより、正常バンドが検出できない例は、患者であることが判明し、スクリーニング法として優れていた。精神遅滞施設における患者スクリーニングでは、1例の脆弱X症候群Aが診断された。(2)尿における脆弱X症候群A,Eの遺伝子スクリーニング:血液と同様にPuflポリメラーゼを使用したPCRスクリーニングをおこなった。正常フラグメントの検出率は小児において低く(80%)、沈渣細胞の量、塩濃度などが影響すると思われた。B.小脳変性症、片頭痛を合併する大家系において、(CAG)n伸展を解析した。リピート伸展は検出されず、塩基置換、または、小欠失である可能性があり、全塩基配列を解析している。塩基配列異常が検出されることで、遺伝子発現異常の分子病態を明らかに出来ると考えられる。トリプレットリピート配列伸展疾患のうち、(CGG/GGC)n疾患について、遺伝子診断法の検討を行った。(1)脆弱X症候群の遺伝子診断に関して、PCRサザン法で100%可能であることを確認した。(2)より簡便なスクリーニング法として、尿検体を使用したPCR法を検討した。健常児におけるPCR産物検出率は約80%であり、これは、小児における尿沈渣の細胞数の少なさと関連すると考えられた。現在さらにPCR条件の検討中であり採血の不要な方法の確立により、より大きな集団でのスクリーニングが可能になると思われる。(3)家族性精神遅滞における脆弱X症候群の頻度を明らかにする目的で、精神遅滞の同胞、親子例、70例について、脆弱X症候群A,Eの遺伝子スクリーニングを行った。脆弱X症候群Aは1例、Eは0例であった。従って、家族性精神遅滞の中でも、脆弱X症候群の割合は約1-2%と少ないことが推定され、日本の家族性精神遅滞の殆どは、未知の遺伝子異常によるものであると判明した。(4)脊髄小脳変性症のうち、片頭痛を伴う家系に関して、(CAG)n伸展を解析中である。1995年に報告された新たな(CAG)n伸展疾患であり、片頭痛との合併が病態状興味のある病型であるが、我々の家系では配列伸展は検出されず、新たな点変異の可能性が示された。点変異を明らかにすることで、遺伝子発現異常の病態を明らかにすることが可能であると推定され、解析中である。
再生医療用細胞足場としての圧縮成型ケラチン多孔体の研究

本研究は、再生医療用細胞足揚としての使用を目指し、足場内部への細胞侵入と栄養供給が可能となる孔径の大きなケラチン3次元多孔体の作製を目標とし行った。以下に得られた成果を列挙する。1.圧縮成型とNaClリーチング法を組合せた孔径調節可能な多孔体調製法を考案した。本法は、使用するNaCl粒子の大きさにより孔径を変えられることを特質とする。本研究では、多孔体内部まで細胞が入りやすいように、孔径300500μmのケラチン多孔体(空隙率90%)を作製し以降の研究に用いた。2.1で作製した多孔体を用いマウス線維芽細胞株L929の培養を試みた。平底遠心管中で多孔体と細胞懸濁液を遠心する新しい細胞播種法により、多孔体内部まで細胞を播種することが可能になった。しかし、遠心法で細胞を播種した多孔体を静置培養すると、多孔体表面近傍では良好に細胞は増殖したが、多孔体内部では細胞は増殖しなかった。多孔体内部への栄養補給に問題があると考察された。3.乾燥アルギン酸カルシウムビーズ存在下でケラチン水溶液を凍結乾燥し、その後EDTA処理によりアルギン酸カルシウムを除くという方法で、静置培養でも内部へ栄養供給が可能になるような、空隙率の高い(99%)多孔体の作製法を確立した。4.遠心法で細胞を播種した多孔体を、スピナーフラスコ中の回転子に固定させ、培地を強制的に多孔体内部に入れる方法での培養を行った。その結果、多孔体内部でも、良好な細胞の伸展・増殖が認められた。5.モルモットでのケラチン多孔体の抗原性評価を、臨床使用されている止血用コラーゲンスポンジを対照として行った。その結果、ケラチン多孔体と市販止血用コラーゲンスポンジの抗原性はほぼ同等であることが判明した。細胞足場としての使用を目指し、足場内部への細胞の侵入と栄養分の補給が可能な、孔径の大きなケラチン多孔体を作製するため、圧縮成型とNaClリーチング法を組み合わせた多孔体作製法を試み以下のような成果を得た。羊毛を尿素、SDS、2-MEを含む水溶液で処理し、還元型ケラチン水溶液を得た。これを噴霧乾燥しケラチン粉末を調製した。ケラチン粉末と100-300μmに粒径を揃えたNaCl粒子を1:15の割合で混合し、ケラチンのガラス転移点が20-150°Cであることから、140-170°C、20MPaで10分圧縮成型した。その後、水中でNaClを溶出しケラチン多孔体を作製することを試みた。しかしながら、得られた多孔体は水に不溶ではあったがケラチンマトリックスが粉状不均一で極めてもろいものであった。そこでケラチン粉末の2倍量の尿素を添加し、圧縮成型を行ったところ、尿素の融点(約138°C)以下の成型温度では、尿素不添加の場合と同様であったが、140°Cでケラチンマトリックスがなめらかで強度に優れたケラチン多孔体を得ることができた。そこでNaClの粒径を変化させ多孔体を作製したところ、得られた多孔体の孔径はNaClの粒径と完全に一致した。また、ケラチン粉末に対するNaCl粒子の添加量を変化させることで、多孔体の空隙率を調整できることがわかった。