hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
iPS細胞より誘導された象牙芽細胞による新規修復治療の開発

本研究課題では、iPS細胞を象牙芽細胞へと分化・誘導させ、生体内で象牙質を形成させることを目的とした。iPS細胞から象牙芽細胞へ誘導するため、胚葉体(EB)を作製し、レチノイン酸とBMP-4にて誘導を行ったところ、象牙芽細胞に誘導されたことが示唆された。また、共SOX11をノックダウンすると、象牙芽細胞への分化が優位に低下することが明らかとなった。誘導象牙芽細胞をマウス生体内に移植したところ、骨様硬組織の形成はみられたが、明らかな象牙質形成を認めなかった。本研究より、SOX11は象牙芽細胞誘導において重要な役割を示すことが考えられた。平成27年度では研究実施計画に従って実施し、以下の研究成果を得た。1. iPS細胞から象牙芽細胞への分化誘導の確立:iPS細胞から象牙芽細胞へ効率良く誘導する方法の確立するため、サイトカインや培養方法を検討した。iPS細胞から胚葉体(EB)を作製し、レチノイン酸とBMP-4を用いて誘導をおこなったところ、DSPP mRNAの発現が上昇した。誘導細胞に対して免疫組織化学染色を行ったところ、NestinおよびDSPPに陽性を認め、象牙細胞様の細胞であることが示唆された。以上の結果から、iPS細胞から象牙芽細胞様の細胞への分化誘導方法を確立した。2.誘導象牙芽細胞の遺伝子発現解析:誘導象牙芽細胞において、マイクロアレイ解析を行った。歯髄細胞と比較したところ、共通する遺伝子がいくつか発見され、象牙座細胞分化に重要な遺伝子であることが考えられた。また、共通する遺伝子の一つをノックダウンすると、象牙芽細胞への分化が優位に低下することを実証した。4.誘導象牙芽細胞の生体内移植方法の確立:誘導象牙芽細胞の集塊を、シリコンチューブを用いて歯髄環境を模してマウス腎臓被膜下に移植を行った。移植後の組織では、明らかな象牙質の形成は観察されず、口腔内など別部位への移植を平成28年度に行う。平成27年度において、項目1. iPS細胞から象牙芽細胞への分化誘導の確立は達成し、項目2.誘導象牙芽細胞の遺伝子発現解析においては当初の予定以上進展した。項目4.誘導象牙芽細胞の生体内移植方法の確立においても移植を開始している。項目3.誘導象牙芽細胞の硬組織形成能の解析においては少々遅れているが、平成28年度に達成可能と考える。以上より、本研究課題の進捗状況は、順調と判断される。平成28年度では研究実施計画に従って実施し、以下の研究成果を得た。2.誘導象牙芽細胞の遺伝子発現解析:平成27年度に達成しているが、遺伝子をノックダウンさせた細胞においてサンプル数を増やし、より強固なデータを取得した。3.誘導象牙芽細胞の硬組織形成能の解析:誘導した細胞は、in vivo実験を優先して実施したため、実施していない。4.誘導象牙芽細胞の生体内移植方法の確立:平成27年度に引き続き、誘導象牙芽細胞の集塊をシリコンチューブ内部に入れることにより、歯髄環境を模してマウス腎臓被膜下に移植を行った。移植後、腎臓周囲に充実性の腫瘤が形成された。5.再生象牙質の組織解析:上記4の組織解析を行った結果、腫瘤の大部分には奇形腫(テラトーマ)が形成されており、一部に骨様の硬組織の形成を認めた。形成された硬組織は、分化させずに移植して形成されたテラトーマ内に形成されたものと遜色がなく、象牙質と断定するには根拠に乏しいと考えた。成27年度において、項目1および2は達成し、4についても、予定通り取り組むことが可能であった。平成28年度においては、引き続き項目4を重点的に推進し、項目5の組織解析を行う。また、項目2において、象牙芽細胞分化に必要と思われる遺伝子のノックダウンを行い、より深く解析する予定とした。これらの研究により、iPS細胞から象牙芽細胞へ分化させ、生体内での象牙質の形成を実証する。医歯薬学旅費の使用額が計画よりも低く、次年度使用額が生じた。余剰金額については、物品費として計上する予定である。
ヒスイ生成の謎に迫る：ストロンチウム・バリウム含有鉱物の合成実験からのアプローチ

ヒスイ輝石に共生する鉱物の合成実験から、ヒスイの生成条件をさらに絞り込もうというのが当初の目的であったが、試行錯誤を繰り返したあげくに合成実験が成功せず、結局は天然のヒスイの産状から生成環境を考察することに切り替えた。天然試料の観察においては、特に脈状ヒスイに着目して研究を行った。国内外各地からヒスイやその関連岩を切るヒスイ脈が報告されており、ヒスイの熱水起源説の根拠の一つとされている。これらのヒスイ脈では、ヒスイ輝石は脈の壁に対して垂直に伸長していることが共通の特徴であったが、兵庫県大屋地域から、脈に平行に伸長したヒスイ輝石結晶からなる脈状ヒスイを新たに見出し、その詳細な観察を行った。ヒスイ輝石を主要な構成鉱物とするヒスイ輝石岩(ヒスイ)の中で、ヒスイ輝石と共生する鉱物を特定して、その鉱物の安定条件および共生関係からヒスイの生成環境に制約を付けることが本研究の目的である。そのためにヒスイ輝石岩および関連岩中のSrやBaを含有する鉱物種をターゲットとしている。ただし、ヒスイ中には石英に代表されるようなシリカ鉱物は存在しないーすなわち、ヒスイ中に低温高圧変成作用の指標となる「ヒスイ輝石+石英」の共生がみられないーことが本研究の立案・推進の大前提となっていたが、1長野県北方の栂池地域から一時産出した脈状ヒスイ中にヒスイ輝石と石英との共存が報告されている(茅原,1987)こと、および2前年度の糸魚川地域のヒスイ調査により、周辺の岩体からシリカ鉱物が新たに発見されたことから、これらの石英やその類縁シリカ鉱物の存在・関連を検証することが緊急事案として浮上していた。そこで、国立科学博物館・フォッサマグナミュージアム・益富地学会館・東北大を巻き込んでの合同調査を行うこととなり、平成25年度だけでも合計4回の合同調査を行った。その結果、1に関しては誤報であること(申請者自身最近になって知ったことであるが、発表者自ら数年後に訂正したとのこと)が確かめられたとともに、実際に試料を入手して観察・分析した結果からも石英との平衡な共存はなさそうであることが追認できた。また、2のシリカ類塩鉱物に関してはヒスイの生成との関連がないことが確認された。とくに、2に関しては、本研究課題のテーマとは外れるものの、世界で2例目の千葉石の発見といった大きな成果が上がった。そうした別の展開もあって、当初計画にあった天然試料中のSr・Baに富む鉱物種の特定作業やその合成実験に関しては遅れ気味である。特に後者の合成実験においては、現段階でも試行錯誤の状態が続いているのが実情である。ヒスイ輝石岩(ヒスイ)の中からヒスイ輝石と共生する鉱物を特定して、その鉱物の安定関係および共生関係からヒスイの生成環境に制約を付けることが本研究の目的であった。そのために当初の計画段階ではヒスイ輝石岩および関連岩中のSrやBaを含有する鉱物種をターゲットとしていた。しかし、本年度の糸魚川地域のヒスイ調査により、周辺の岩体から含水の硫酸塩鉱物やある特徴を有するシリカ鉱物が新たに発見された(後者に関しては未公表:平成25年秋に発表予定)。特に後者は、糸魚川地域のヒスイ中には石英に代表されるようなシリカ鉱物は存在しないーすなわち、ヒスイ中に低温高圧変成作用の指標となるヒスイ輝石+石英の共生がみられないーことが本研究の立案・推進の大前提となっていたため、そのシリカ鉱物の存在・関連を検証することが緊急事案として浮上してきた。そのために急遽、国立科学博物館・フォッサマグナミュージアム・益富地学会館・東北大を巻き込んでの合同調査を行うこととなり、平成24年秋に2回の合同調査を行った。平成25年度も継続して調査を行う予定である。そういった新たな展開もあって、当初計画にあった天然試料中のSr・Baに富む鉱物種の特定作業やその合成実験に関しては遅れ気味である。特に後者の合成実験においては、後述のように予期せぬ装置のトラブルなどが生じて、現段階でも試行錯誤の状態が続いている。ただし、糸魚川地域の天然ヒスイ試料からは、いままでに注目していなかったSr含有鉱物を新たに見出しており、現在その詳細を詰めるべく分析試料の準備中である。ヒスイ輝石を主要な構成鉱物とするヒスイ輝石岩(通称“翡翠")には、相応な量の石英が含まれていないことが多く、必ずしも全ての“翡翠"が高圧低温変成作用の指標である「アルバイト→ヒスイ輝石+石英」の反応を経て生成したとは考えにくい。そこで、“翡翠"中のヒスイ輝石と共生する鉱物の中からキーとなる鉱物を特定して、その鉱物の安定条件や共存関係から“翡翠"の生成環境を絞り込むことが本研究の目的であった。そのために特に、各地のヒスイ輝石岩および関連岩(アルビタイトやロディン岩など)中のSrやBaを含有する鉱物種を主なターゲットとしてきた。本年度は新潟県糸魚川地域(長野県の栂池地域も含む)だけでなく、兵庫県の大屋地域や九州の長崎地域・肥後地域のヒスイ試料も取り扱った(ただし、後二者はいずれもヒスイ輝石を含むものの“翡翠"とは言えず、石英の共存が確認されたことから、対象からは外した)。糸魚川地域の“翡翠"の中からSrに富む「糸魚川石」や「松原石」を含むものを入手できたので研究試料とした。

また、新たな栂池産の脈状ヒスイのサンプルを入手したので昨年度に引き続き観察・分析を行ったが、脈状ヒスイ部からはSrやBaに富む鉱物種は見出せなかった。また、大屋産の“翡翠"からはSrを含むストロナルシ石が報告されているが(宮島他,2000)、今回採集した試料からは見出せなかった。これらのことから、「糸魚川石」の組成variation(すなわち、Sr/Ca比)と温度-圧力条件が鍵になると考え、合成実験のターゲットとした。ただ、合成実験に関しては、当初の計画から大幅に遅れが生じており、最終年度の26年度以内に終えることができなかったため、補助事業期間延長承認申請書を提出して27年度までの延長の承認を受けた。ヒスイの多くが石英をほとんど含まないことから、ヒスイの主な構成鉱物であるヒスイ輝石は、必ずしも全てが曹長石→ヒスイ輝石+石英の低温高圧反応によって生成したとは限らない。そこで、ヒスイ輝石に共生する鉱物の合成実験から、ヒスイの生成条件をさらに絞り込もうというのが本研究の当初の目的であった。しかし、本研究期間中には、試行錯誤を繰り返したあげくに合成実験が成功せず、結局は天然のヒスイの産状から生成環境を考察することとなった。本年度は特に脈状ヒスイに着目して研究を行った。国内外各地からヒスイやその関連岩を切るヒスイ脈が報告されており、ヒスイの熱水起源説の根拠の一つとされている。これらのヒスイ脈では、ヒスイ輝石は脈の壁に対して垂直に伸長していることが共通の特徴であった。それに対して、申請者らの調査によって、兵庫県の大屋地域から、脈に平行に伸長したヒスイ輝石結晶からなる脈状ヒスイが新たに見出された。ヒスイ輝石の結晶と結晶の間、あるいは結晶内にも、脈と概ね平行な方向に無数の亀裂が生じており、それらはNaに富む沸石で充填されている。母岩である曹長岩に応力がかかって亀裂が生じ、その隙間にNa,Al成分に富む流体が浸入し、ヒスイ輝石が結晶化して細脈状ヒスイが生成したと考えられるが、その間ずっと同じ方向の応力を受け続けていたため、ヒスイ輝石が脈に平行に伸長したものと考えられる。ただし、この大屋地域の脈状ヒスイ中からは生成時の温度や圧力などを知るための指標となるSrやBaに富む鉱物は見出すことができなかった。今後も調査を継続してサンプルを増やして、こうした指標鉱物を探索するとともに、合成実験の手法を確立して、再度ヒスイ生成の謎の解明に取り組むすべく、研究計画を練り直して再トライしたいと考えている。ヒスイ輝石に共生する鉱物の合成実験から、ヒスイの生成条件をさらに絞り込もうというのが当初の目的であったが、試行錯誤を繰り返したあげくに合成実験が成功せず、結局は天然のヒスイの産状から生成環境を考察することに切り替えた。天然試料の観察においては、特に脈状ヒスイに着目して研究を行った。これらのヒスイ脈では、ヒスイ輝石は脈の壁に対して垂直に伸長していることが共通の特徴であったが、兵庫県大屋地域から、脈に平行に伸長したヒスイ輝石結晶からなる脈状ヒスイを新たに見出し、その詳細な観察を行った。現地調査に基づいて天然の産状を調べることに偏重し過ぎた感がある。その結果として、副産物としては世界で2例目の「千葉石」(天然ガスを含むシリカ鉱物)の報告といった成果が上がったり、“翡翠"生成の謎を解くキーとなる共生鉱物の一つとして「糸魚川石」を特定したといった進展はあったものの、肝心の合成実験に関しては完全に遅れを取っている。
植物細胞における陰イオン輸送体に関する分子論的研究

植物における陰イオンの取り組み及び排出に関わる蛋白質の同定、更にその構造及び機能につき分子論的解析を行うことにより、植物における無機栄養素、特にリン酸イオンの取り込みの機構並びに海水産植物の耐塩機構と陸上植物における塩害との関連などを解明することを目的として以下のような計画のもとに実験を行い、下記に示す成果を得た。赤血球膜に存在するバンド3蛋白質は最もよく研究されている陰イオン輸送体であるが、近年その類似体が他の多くの組織細胞にも存在することが報告されつつあり、それらは極めて高い相同性を示すと供に、全ての輸送体がスチルベン誘導体により特異的に阻害されることが知られている。スチルベン誘導体は植物における陰イオン輸送をも阻害することが報告されているので、動物の輸送体と類似の蛋白質-少なくとも阻害剤の結合部位が類似する蛋白質が植物細胞にも存在することが予想された。そこで、まず赤血球膜バンド3蛋白質におけるスチルベン誘導体結合部位を同定することより始め、その結果バンド3タンパク質におけるスチルベン誘導体DIDSの結合部位を他に先駆けて初めて直接的に示し、さらにその周辺のアミノ酸配列の種による違いがその機能の違いと関連することを示唆する研究成果を発表した(学術雑誌に掲載された論文2編)。またこの成果を受けて、阻害剤結合部位の構造との相同性を指標とする免疫学的手法を用いた蛋白質レベルでの類似体検索、及びPCR等の分子生物学的手法を用いた遺伝子レベルでの類似体検索の二つの異なる方法で植物細胞における陰イオン輸送体の同定を試みたが、残念なことに本年度内では蛋白質の同定までには至らなかった。
日本中世漢学史の包括的把握への基礎的研究

本年度も資料蒐集・調査・分析に注力した。1清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態を解明するため、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類・田中穣氏旧蔵典籍古文書・高松宮家伝来禁裏本並びにその他同館所蔵資料、国立公文書館、宮内庁書陵部の各所蔵資料などを調査・分析し、データ集積を図った。その成果の一端として、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類の「経光卿改元定記寛元宝治建長」に『修文殿御覧』の新出佚文が引用されること、田中穣氏旧蔵典籍古文書の『元秘抄』の書誌解題、等を提示した。2中世における漢学の実態を解明するため、類書利用について調査・分析し、その成果を活用し、『日本書紀』において利用した類書は『修文殿御覧』の可能性が高いこと提示し、類書受容史の一端を解明した。また、“中国的経学与日本的経学"国際学術研討会にて発表し、清華大学人文学院資深教授彭林氏、蘇州大学文学部講座教授陳鴻森氏、上海交通大学人文学院教授虞万里氏、南京大学文学院教授徐興無氏等に示教を得、その他参加者と情報交換し学術交流した。その他、金沢文庫保管資料を調査・分析した。3中世における『論語義疏』の受容の実態を解明するため、台北故宮博物院図書文献館所蔵『論語義疏』の調査・分析した。昨年度に続き、関連資料の蒐集・調査・分析を進め、順次、研究成果を公表した。1清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態を解明及び2中世における漢学の実態を解明につては、国際研究集会にて発表し、学術雑誌に掲載され、更には商業出版書籍に寄稿した。3中世における『論語義疏』の受容の実態を解明については、台北故宮博物院図書文献館所蔵旧鈔本『論語義疏』を調査し、データ集積した。東京、札幌、台北にて研究者と情報交換し学術交流できた。上記のように、研究計画遂行に必要な資料を調査・蒐集・分析し、成果を公表し、更には海外の研究者と学術交流もできた。従って、おおむね順調に進展していると判断される。昨年度までに蒐集し、調査・分析した資料を用いて、研究論文・国際学術会議等において発表等を行う。本年度は最終年度のため、特に研究成果を国内外に発信して可視化に注力していく。随時、各所蔵機関へ赴き、調査を実施していく。本年度は、本研究の初年度であることから、資料の蒐集・調査・分析に注力した。本研究課題である、清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態を解明するため、京都大学総合博物館所蔵勧修寺家文書、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類並びにその他館蔵資料、国立公文書館内閣文庫所蔵資料を調査した。勧修寺家文書は紙焼き写真、国立歴史民俗博物館及び内閣文庫所蔵資料は原本を実見し、各々蒐集・調査・分析を実施した。これにより、検討する上での資料・データの集積を図った。また、古代に受容された『論語義疏』の例証に『令集解』所引『論語義疏』を選定し、これを室町時代書写の旧鈔本『論語義疏』、鎌倉時代後期から南北朝時代書写の曼殊院門跡所蔵『論語総略』、室町時代末期江戸時代初期書写の慶應義塾図書館(慶應義塾大学三田メディアセンター)所蔵『論語集解叙鈔』と比較検討し、『令集解』所引『論語義疏』の性格、検討諸本・典籍所引『論語義疏』間の相異点とその要因、『論語総略』所引『論語義疏』の特徴などについて解明した。その結果を「日本古代對《論語義疏》的受容管窺ー以《令集解》所引《論語義疏》二條爲例ー」と題して、上海師範大学で開催された国際学術会議「《十三經注疏》研究ー“從本土到海外"國際學術研討會」に於いて発表し、更に同会議の「大會總合討論」にて、古代漢学と中世漢学の相異点・特徴、日本伝存漢籍古鈔本の特徴などについて議題を提起し、討議した。経学、敦煌学・吐魯番学、中国古典文献学を専門とする中国人研究者が出席した同会議に於いて、上記の議題を提起・提唱し、討議したことは意義深い。席上、上海師範大学哲学与法政学院教授石立善教授、浙江大学古籍研究所教授許建平氏、北京大学中国語言文学系講師程蘇東氏等と情報交換と交流し、指教を受け、新知見を得た。勧修寺家・廣橋家並びにその周辺については、京都大学総合博物館所蔵勧修寺家文書、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類、国立公文書館内閣文庫を調査し、顕密僧についてはまず国立歴史民俗博物館所蔵資料を調査し、それぞれ分析している。勧修寺家文書中の改元・年号勘文資料の多くは紙焼き写真を入手済みで、廣橋家旧蔵記録文書典籍類は画像データを入手しつつある。国立歴史民俗博物館所蔵のその他資料及び国立公文書館内閣文庫も、徐々に画像データを入手している。

また、古代に受容された『論語義疏』と中世に受容された『論語義疏』の相異点について検討し、国際学術会議に於いて発表した。このように、研究計画遂行に必要な資料を蒐集しつつあり、また随時、調査・分析を行い、更に国際学術会議にて発表したことから、おおむね順調に進展していると判断した。本年度も資料の蒐集・調査・分析に注力した。1清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態を解明するため、京都大学総合博物館所蔵勧修寺家文書、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類並びにその同館所蔵資料、国立公文書館内閣文庫所蔵資料を調査・分析し、データ集積を図った。その成果の一端を上海師範大学で開催された国際学術会議「古寫本經典的整理與研究國際學術研討会」にて発表した。2日本中世に於ける漢学の実態を解明するため、日本古代中世に於ける類書利用について調査・分析した。3日本中世に於ける『論語義疏』の受容の実態を解明するため、精力的に日本古典籍所引『論語義疏』を蒐集し、それらと旧鈔本『論語義疏』等とを比較検討した。その成果の一端は国際学術雑誌『域外漢籍研究集刊』に投稿し、掲載された。また、台北へ出張し、台北故宮博物院図書文献館にて旧鈔本『論語義疏』を調査し、国家図書館にて関連資料を蒐集した。1の成果を中国哲学、経学、敦煌本・吐魯番学、中国古典文献学、仏教文献学などを専門とする日中学者が出席した上記国際学術会議にて発表し、また同国際学術会議の「總合討論」にて、日本伝存漢籍旧鈔本・古鈔本、日本古典籍所引漢籍の特徴・意義について提起し、討議できたことは大きな成果である。席上、上海師範大学哲学与法政学院教授石立善氏、浙江大学古籍研究所教授許建平氏、南京師範大学文学院副教授蘇ホン(艸+凡,peng)氏、等と情報交換し学術交流した。3に関して、同上国際学術会議にて『論語義疏』についての発表のコメンテーターを務めた。また台北故宮博物院図書文献館にて、同館の諸氏と情報交換し学術交流した。上記のように、上海の国際学術会議にて研究発表と討議し、海外に発信でき、上海と台北にて海外の研究者と情報交換し、学術交流できた。この成果は学術ネットワークの基礎を築く一歩を踏み出すことになると言える。昨年度に引き続き、資料の蒐集・調査・分析を進め、順次、研究成果を公表に努めた。1清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態の解明については、調査・分析を更に進め、国際学術会議に於いて発表した。2日本中世に於ける漢学の実態を解明については、その重要な位置を占めると考えられる類書受容について調査・分析した一端を論文化した。近く公表する予定である。3日本中世に於ける『論語義疏』の受容の実態を解明については、その前提となる古代に於ける『論語義疏』受容に関する論文を国際学術雑誌で(中国の核心期刊)に投稿し、掲載された。また、台北故宮博物院図書文献館にて旧鈔本『論語義疏』を調査した。更に、上海、台北にて、研究者との情報交換し学術交流もできた。以上のように、研究計画遂行に必要な資料を調査・蒐集し、随時、分析を行い、研究成果を公表し、更には学術交流もできたため、おおむね順調に進展していると判断される。本年度も資料蒐集・調査・分析に注力した。1清原家以外の公家・官人層、顕密僧の漢学実態を解明するため、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類・田中穣氏旧蔵典籍古文書・高松宮家伝来禁裏本並びにその他同館所蔵資料、国立公文書館、宮内庁書陵部の各所蔵資料などを調査・分析し、データ集積を図った。その成果の一端として、国立歴史民俗博物館所蔵の廣橋家旧蔵記録文書典籍類の「経光卿改元定記寛元宝治建長」に『修文殿御覧』の新出佚文が引用されること、田中穣氏旧蔵典籍古文書の『元秘抄』の書誌解題、等を提示した。
呼吸器感染症状に関するセルフモニタリング促進プログラムの精練

「呼吸器感染症状に関するセルフモニタリング促進プログラム」の効果を検討することを目的とした。対象者は急性増悪で入院した慢性閉塞性肺疾患患者20名で、介入群10名、コントロール群10名に割りつけた。呼吸器感染に関する知識の提供、呼吸器感染症状の観察・測定・記録、定期的なサポートにより、呼吸器感染症状へのセルフモニタリングが促進され、呼吸器感染症状の行動に影響を及ぼすと考えられた。しかし、急性増悪による再入院の減少や、QOLの改善には影響を及ぼさなかった。1.研究目的呼吸器感染による急性増悪を繰り返すCOPD患者に対する、呼吸器感染に関する知識の提供、呼吸器感染症状の測定・記録に関する技術の提供、定期的なサポートを含むセルフモニタリング促進プログラムの予備的研究結果をふまえてプログラムを再考する。再考したうえで、プログラムの検証を行う。2.研究内容予備的研究の結果、退院2週間後は活動範囲が広がっていく時期であり、無理をすることで再度急性増悪に至る可能性があると考えられたため、電話でなく面談での介入とすることに変更した。その上で、プログラムの検証を行うために、Randomized Controlled Trial (RCT)の研究デザインで介入群とコントロール群を振り分け、10の評価指標によりプログラムの評価を行っている。3.成果対象者数は介入群2名、コントロール群3名である。介入群は男性1名、女性1名で、年齢は70代1名、60代1名、コントロール群は男性2名、女性1名で、年齢は70代1名、60代1名、40代正名である。まだ6ヶ月後までのデータがとれていないが、介入群においては、呼吸器感染に関する知識の提供を行うことで、加齢とともに免疫機能が低下し肺炎になっても熱が出ない場合があること、痰の色の意味についての新しい知識を得ることができ、日誌に記載しているその日の自分の状態と照らしあわせながら、自分の健康状態についての認識が高まってきている。また、日誌をつけていく中で、自分の体温が1日でも変化があることに気づき、継続して体温をつけていこうという行動の変化がみられている。1.研究目的呼吸器感染による急性増悪を繰り返すCOPD患者に対して、呼吸器感染に関する知識、呼吸器感染症状の測定・記録に関する技術の提供、定期的なサポートを含むセルフモニタリング促進プログラムを実施し、効果を検討した。2.研究内容呼吸器感染症状に関するセルフモニタリング促進プログラムは、呼吸器感染悪化予防の重要性、呼吸器感染悪化に影響する行動についての知識や、アクションプラン、呼吸器感染症状の観察・記録方法についての技術を提供し、退院2週間後、1.5ヶ月後、2.5ヶ月後に対象者が測定、観察、記録したことについて定期的にサポートをすることで、呼吸器感染症状に対する認識の過程を促進し、呼吸器感染症状への気付きを高めることをねらいとしたプログラムである。Randomized Controlled Trial(RCT)の研究デザインで介入群10名、コントロール群10名に実施した。プログラムの効果は、呼吸器感染症状の認知の改善、呼吸器感染症状に関する行動の改善、呼吸器感染による急性増悪の予防、QOLの改善で評価した。3.成果呼吸器感染に関する知識の提供、呼吸器感染症状の観察・測定・記録、定期的なサポートにより、呼吸器感染症状へのセルフモニタリングが促進され、呼吸器感染症状の認知、行動を向上させる効果があると考えられた。また、呼吸器感染症状の測定・観察・記録を行うことで、自分の身体の状態がわかるようになり、自分の身体の症状を記録することができるという自己効力感の向上にも効果を及ぼしたと考えられた。しかし、急性増悪による再入院の減少をもたらすことはなく、QOLの改善にも影響を及ぼさなかった。1.研究目的平成22年度までに、「呼吸器感染症状に関するセルフモニタリング促進プログラム」を介入群10名、コントロール群10名に実施し、効果を検討した。得られた結果を踏まえて、プログラムを精練する。2.成果データ収集に際し協力を得た病院に研究結果を報告するとともに、明らかになったプログラムの課題についての意見を伺った。また、慢性疾患看護専門看護師、呼吸器疾患に関する研究を行っている研究者にも意見を伺いながら、プログラムの検討を行った。1)知識の提供について呼吸器感染症状に関する知識の提供、呼吸器感染悪化に影響する行動に関する知識の提供を行うことで呼吸器感染症状の認識の改善、行動の改善に影響を及ぼすことができたため、これらの知識を提供することは重要である。しかし、プログラムの実施に際し、十分な時間をかけて説明ができない状況があった。対象者の多くは高齢者であるため、知識提供のための時間設定を十分に行うことが重要である。2)定期的サポートについて呼吸器感染症状の観察・測定、療養日誌への記載を退院後2.5ヵ月間実施してもらい、その間外来等で3回サボートを行った。しかし、退院後45ヵ月後位に再入院があったことから、6か月以上の介入が必要であると考えられた。

6か月以上呼吸器感染症状を観察・測定し、記録することの継続可能性について検討したが、看護師、医師が患者の体調を共有していくことや、日誌に記載された内容が治療に反映されることなどが継続につながると考えられるため、退院後のフォローアップの仕組みを作っていくことが重要である。
低侵襲人工内耳手術が前庭機能に及ぼす影響に関する研究

人工内耳手術の適応となりうる遺伝性難聴患者のめまい随伴症状の有無や前庭機能を評価し、人工内耳手術における内耳保護手技がどの程度前庭機能に好影響を及ぼすかを究明することを目的とした。原因遺伝子が特定できた遺伝性難聴症例の前庭機能を評価した結果、およそ半数の症例で何らかの前庭機能障害を示した。人工内耳手術症例においては、低侵襲手術における前庭機能の比較検討では、いずれの検査においても低侵襲手術による良好な前庭機能温存が可能であることが示された。平成27年度は、人工内耳手術症例の術前後の平衡機能の評価を行うことにより内耳保護のための手術方法や電極が末梢前庭器の保護のとなりうるかを評価、検討を行った。特に今年度は、人工内耳適応症例に対してocular VEMP(o-VEMP)を用いて検討を行った。oVEMPは主に卵形嚢機能を反映すると考えられ、近年、臨床検査として応用されてきている。過去に我々は、人工内耳症例における術前後の温度眼振検査およびcervical VEMP (c-VEMP)による、術前後の前庭機能について検討し、蝸牛に低侵襲な電極および術式が術後の前庭機能低下を防ぐことが可能であることを報告してきた(Tsukada et al. 2013)。しかし、人工内耳症例における卵形嚢の術前後の変化を検討している報告はなく、人工内耳手術における卵形嚢機能を評価することは人工内耳に関わる手術において非常に重要であると考えられる。そのため今年度は、人工内耳の適応となる重度難聴患者あるいは高音急墜型感音難聴症例における術前後のo-VEMPを評価し、人工内耳手術症例における卵形嚢機能を評価した。対象は、人工内耳適応症例の術前後にoVEMPを比較できた9例について検討した。o-VEMPはmini-Shekerを用いた骨導刺激を用い、術前および人工内耳手術後1か月以上経過した後の振幅(n10-p15)の変化を検討した。術前のo-VEMPを検討したところ、9例中6例は両側で反応を認め、残りの3例は両側とも無反応であった。術前に反応を認めた6例について術前後のn10-p15の振幅を比較したところ、検討した6例全例で人工内耳側において明らかな低下を示した症例は認めなかった。人工内耳手術における低侵襲手術は、卵形嚢機能に関して術後機能を保存できる可能性が考えられた。当初計画どおりに人工内耳症例の平衡機能解析を実施できている平成28年度は、人工内耳手術症例の平衡機能の評価を行うことにより内耳保護のための手術方法や電極の改良が末梢前庭器の保護のとなりうるかに関して評価、検討を行った。特に今年度は、小児人工内耳症例における術後の平衡機能を検討した。人工内耳は、先天性高度難聴小児の言語獲得に非常に有用であることは既知の事実である。小児においては音声言語の獲得や音声によるコミュニケーションをよりよくするために、早期より人工内耳を装用することが重要であり、両耳装用が望ましい。人工内耳手術においては前庭機能障害に注意が必要であり、特に小児の場合、両耳装用を行う症例が多いため、平衡機能を把握および保存することは非常に重要である。幼小児では術前に平衡機能を検索するのは困難であるのが実情だが、同時に人工内耳術後の小児がどのような平衡機能を有しているか把握することも重要であると考えられる。今回、我々は小児期に人工内耳手術を行った症例の前庭機能について評価し、過去の人工内耳手術後がどの程度前庭機能に影響を及ぼしたかを検討した。具体的には、6歳以下で人工内耳手術を行った20例に対して術後前庭機能を温度眼振検査、cVEMP、oVEMPを用いて評価を行った。その結果、温度眼振検査およびoVEMPでは人工内耳側のみの明らかな機能低下を認める症例はそれぞれ1例に認めるのみであったが、cVEMPでは半数以上に反応の喪失もしくは減弱を認め、特にcochleostomyを行った症例はRound windowapproachを行った症例と比較し有意に機能低下を示した症例が多かった。これらの結果を踏まえ両耳装用を基本とする小児に対しては、特に機能温存を考慮した低侵襲手術の重要性が明らかとなった。小児、成人共に人工内耳装用前および人工内耳装用後の前提機能検査(温度眼振検査、cVEMP、oVEMP)データ集積は順調に進んでおり、今後さらに解析を続けていく予定である。平成29年度は、人工内耳手術症例の平衡機能の評価を行うことにより内耳保護のための手術方法や電極が末梢前庭器の保護となりうるかを評価、検討を行った。近年、高速度カメラと加速度センサーを備えたvideo head impulse test(vHIT)が開発され、注目されてきており、比較的簡便かつ侵襲なく半規管機能を推定することが可能となっている。特に今年度は、人工内耳術前後のvHITを用いた前庭動眼反射(VOR)の変化について検討を行った。vHITの利点としては、短時間に苦痛が少なく検査が行うことができ、温度眼振検査やVEMPと比較しても術後早期でも検査ができるため、人工内耳術後の早期の前庭機能障害を評価できると考えられる。今回、人工内耳手術において低侵襲手術(Round window approachおよび柔らかい電極を使用した人工内耳挿入)を行った10例について、術前および術後のvHITによる外側半規管のVORを測定した。

今回検討した10例のうち術前に明らかな外側半規管のVORgainの低下を認めた症例は存在しなかったが、2例(1例は両側、1例は一側)に病的眼球運動(catch up saccad,CUS)を認めた。術後においては、術後早期(手術後2週間以内)と術後後期(3から6か月後)に再度vHITによる外側半規管の評価を行った結果、術後早期および術後後期ともに外側半規管の明らかなVORgainの低下や新たなCUSが出現した症例はなく、外側半規管機能は特に術後早期でも低侵襲手術により障害されず、保存されていることが確認された。温度眼振検査やVEMPでは比較的患者の苦痛が強く頻回に行うことが検査であるが、vHITは比較的侵襲が少なく、頻回に検査ができるため、術後早期の前庭機能の評価に有用であり、今後症例数を重ね、術後超早期(翌日から1週間以内)の評価も検討し、術後の前庭機能の評価を行いたい。人工内耳手術の適応となりうる遺伝性難聴患者のめまい随伴症状の有無や前庭機能を評価し、人工内耳手術における内耳保護手技がどの程度前庭機能に好影響を及ぼすかを究明することを目的とした。原因遺伝子が特定できた遺伝性難聴症例の前庭機能を評価した結果、およそ半数の症例で何らかの前庭機能障害を示した。人工内耳手術症例においては、低侵襲手術における前庭機能の比較検討では、いずれの検査においても低侵襲手術による良好な前庭機能温存が可能であることが示された。前年度までの研究を継続して行うとともに、人工内耳症例を対象に、半規管機能としてカロリック検査、vHIT、球形嚢検査としてcVEMP、卵形嚢検査としてoVEMP、体平衡検査としてイクイテストを行い、術前および術後に平衡機能検査を行う。また、人工内耳手術後にも同様の検査を行い、平衡機能に及ぼす影響に関して総合的に検討を行う。また、人工内耳装用症例を対象に難聴の遺伝子解析を実施し難聴の原因を明らかにするとともに、難聴の原因の種類ごとに半規管機能、球形嚢機能、卵形嚢機能との間の相違について詳細に検討を行い、めまい症状の特徴およびメカニズムについて検証を行う。本年度までの検討により人工内耳装用前、装用後のデータ集積がなされており、手術手技(cochleostomyかRound window approachか)、電極の種類、難聴の原因毎に比較検討を行う。また、小児の術前の前庭機能検査についていかにして評価をするかを検討する必要があり、その方策について検索中である。耳鼻咽喉科学めまい平衡医学耳科学
創薬シーズとしての性ホルモン核外作用特異的リガンドのスクリーニング系の創製と応用

心血管系における性ホルモン核外作用の検討を行い、エストロゲン・テストステロン・プロゲステロン受容体では古典的な核内受容体ではなく、その交換スプライシングによる短縮型が核外作用を特異的に担う受容体であることが判明した。古典的な核内受容体は、アミノ末端からAF-1(activation factor-1)、DBD(DNA-binding domain)、LBD(ligand-binding domain)、AF-2(activation factor-2)のドメイン構造を有するが、今回同定された核外作用特異的受容体はAF-1が欠損したアイソフォームであった。そこでまず同受容体のクローニングを行い組織発現の検討を行ったところ、心筋細胞、血管内皮細胞では古典的受容体に比べて短縮型受容体が豊富に発現することが判明した。そこで古典的受容体および短縮型受容体と蛍光タンパク質GFPの融合タンパク質を作成し、性ホルモンによる細胞内動態を検討したところ、古典的受容体は予想通りリガンド刺激により核内への移行が起こったが、短縮型受容体は線維芽細胞では古典的受容体同様核内移行が見られたが、心筋細胞・血管内皮細胞においてはリガンド刺激によっても全く核内移行は見られなかった。また短縮型受容体を発現させると、核外作用特異的な生化学的変化が見られることも確認された。以上より、同システムは心血管系における性ホルモン核外作用特異的リガンドのスクリーニング系として応用できるものと考えられる。性ホルモン核外作用特異的リガンドのスクリーニング系の創製が目的であり、当初は核外作用の受容体も報告されているように核内受容体と同じ物を想定して、これとc-Srcの相互作用を利用した一分子Fluorescent Resonance Energy Transfer(FRET)プローブの作成を試みた。ところが、研究の過程で性ホルモン核外作用の受容体は少なくとも心筋細胞においてはエストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体ともN末端欠損型の受容体であることが判明した。エストロゲン受容体に関しては、同アイソフォームが核外作用特異的受容体であることは、血管内皮細胞で既に明らかにされているが、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体では新知見である。スクロース密度勾配遠心分画法を用いた検討から、これらが細胞膜特殊構造であるカベオラに局在することも判明した。更に、リガンドが結合した時のみPI3キナーゼの調節因子であるp85が結合することが判明し、これを利用することにより核外作用特異的リガンドのスクリーニング系の創製が可能であることが判明した。すなわち、核外作用特異的受容体とp85の相互作用をFRETで検出することを利用する。そこで、次のステップとして、N末端欠損型の核外作用特異的受容体のN末端にCFP、p85のN末端にYFPを結合した融合タンパクの作成に入っており、次年度はこの相互作用の検出を予定している。
発生過程においた転写活性化因子の消失後も持続する特異的遺伝子転写の分子機構

ショウジョウバエの消化管発生では,後腸を決定するT-box遺伝子brachyenteron(byn)や,内胚葉の決定に関与するGATA因子遺伝子srpなどが重用な遺伝子として知られている.器官の決定や,器官を構成する細胞の分化状態は極めて安定に保たれているが,これには分化の決定や維持に関与する遺伝子の発現制御を安定化する仕組みが存在することを示唆している.本研究ではショウジョウバエ後腸の決定遺伝子あるbyn,後腸の背側区画の分化に関与するen,それに内胚葉決定遺伝子srpの標的遺伝子で,内胚葉の形質発現に必須なdGATAeに関して,その発現制御経路と機能の解析を行い,以下の成果を得た.1)ショウジョウバエ後期内胚葉で発現するdGATAe遺伝子の発現制御と機能解析srpの内胚葉特異的な標的遺伝子としてdGATAeを同定・クローニングし,発現制御経路を解析.dGATAeが内胚葉の機能に関わる遺伝子の活性化に必須であることを示した.2)ショウジョウバエ後期内胚葉で発現するマーカー遺伝子群のdGATAe依存性の解析dGATAeが内胚葉でどのような遺伝子制御に関わっているかを,分化した内胚葉のマーカー遺伝子群を対象に網羅的に解析した.3)byn遺伝子の発現に関わるエピジェネティックな制御機構の存在とエンハンサー解析bynの発現制御に関わるエンハンサー解析を行い,後腸特異的なエンハンサー領域を同定した.4)ショウジョウバエTbx6ホモログDoc1/2/3による後腸の背腹パターン化後腸の背側区画の分化を決定するenの発現制御におけるDoc1/2/3の役割を示した.ショウジョウバエの消化管発生では,後腸を決定するT-box遺伝子brachyenteron(byn)や,内胚葉の決定に関与するGATA因子遺伝子srpなどが重用な遺伝子として知られている.器官の決定や,器官を構成する細胞の分化状態は極めて安定に保たれているが,これには分化の決定や維持に関与する遺伝子の発現制御を安定化する仕組みが存在することを示唆している.本研究ではショウジョウバエ後腸の決定遺伝子あるbyn,後腸の背側区画の分化に関与するen,それに内胚葉決定遺伝子srpの標的遺伝子で,内胚葉の形質発現に必須なdGATAeに関して,その発現制御経路と機能の解析を行い,以下の成果を得た.1)ショウジョウバエ後期内胚葉で発現するdGATAe遺伝子の発現制御と機能解析srpの内胚葉特異的な標的遺伝子としてdGATAeを同定・クローニングし,発現制御経路を解析.dGATAeが内胚葉の機能に関わる遺伝子の活性化に必須であることを示した.2)ショウジョウバエ後期内胚葉で発現するマーカー遺伝子群のdGATAe依存性の解析dGATAeが内胚葉でどのような遺伝子制御に関わっているかを,分化した内胚葉のマーカー遺伝子群を対象に網羅的に解析した.3)byn遺伝子の発現に関わるエピジェネティックな制御機構の存在とエンハンサー解析bynの発現制御に関わるエンハンサー解析を行い,後腸特異的なエンハンサー領域を同定した.4)ショウジョウバエTbx6ホモログDoc1/2/3による後腸の背腹パターン化後腸の背側区画の分化を決定するenの発現制御におけるDoc1/2/3の役割を示した.1.ショウジョウバエ後腸のマスター遺伝子bynの発現制御機構の解析Brachyuryオーソログであるbynは,後腸の発生・分化を引き起こすマスター遺伝子である.bynの発現はギャップ遺伝子taillessによって活性化され,GATA因子遺伝子serpentで抑制される,taillessの後腸予定域での発現は発生初期で消えるが,byn発現は後腸の発生・分化を終えた幼虫や成虫の後腸でも発現が持続する.byn遺伝子のエンハンサー活性を示すエンハンサートラップ系統の解析の結果,byn遺伝子は自己活性化能を示さないことが判明し,bynの発現持続はエピジェネティックな制御によるものであると考えられる.tll強制発現を胚全体に対して行ったところbynが初期胚の広い領域で発現誘導されるが,嚢胚形成とともに急速に消失した.これは転写活性化因子の共存下でbyn遺伝子の制御を行う仕組みの存在を示しており,転写活性化とともにエピジェネティックな制御によるものと考えられる.byn遺伝子の発現持続に関わる主な制御領域を含むとゲノム断片をクローニングしているが,従来の方法でのプロモータ解析はトランスジェニック系統の作製に長い期間を要することから,より簡便な手法を検討した.その結果,トランスジェニック系統作製に用いるベクターを受精卵に微量注入し,発生中期以降に固定・染色を行うことで短時間でプロモータ解析の予備データが得られることがわかった.この手法解析を進めている.2.ショウジョウバエ内胚葉の形質発現を引き起こすdGATAe遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構dGATAeの遺伝子発現はsrpによって引き起こされるが,bynの場合と同じくsrp消失後もdGATAe発現が持続することがわかり,今後当初の研究計画に加えdGATAeの発現維持機構の解析も同時に進める.ショウジョウバエの後腸は,T-box遺伝子であるbrachyenteron (byn)によって決定される.bynは初期胞胚で発現するギャップ遺伝子のひとつt11によって転写活性化されるが,bynの発現はt11が消失した後も持続し、分化が完了した幼虫や成虫でも発現していることを見い出した。

bynの転写制御には,転写活性化因子や抑制因子とは別に,クロマチンレベルでのエピジェネティックな機構が関わるものと予想される.本研究の目的はbyn遺伝子の転写状態の固定化をもたらすエピジェネティックな調節メカニズムの解明であり,本年度はbynの転写制御に関わるシスエレメントと転写因子の同定を中心に解析を行い,以下の成果を得た.1)bynの転写開始位置の5'上流の約3.7kbのゲノム断片を細分化し,lacZをレポーター遺伝子とするエンハンサー検出ベクターpWHNZ250にサブクローニングし,受精卵への直接注入および,トランスジェニック系統作製によって,後腸での発現に関わるエンハンサー活性を検出した.その結果,中期胚以降の後腸での発現に関わるシスエレメントを2箇所で同定することができた.2)上記シスエレメントは,本来bynが発現しない前腸の一部でも発現を引き起こすことから,前腸での発現抑制に関わるシスエレメントが,3.7kbの範囲外に存在することがわかった.前腸での発現パターンはポリコームグループの突然変異の表現型と同一だった.3)上記シスエレメントはbyn自身によって活性化されることが,bynの強制発現実験によって示された.これらの結果から,bynの後腸での発現持続にはbyn自身による自己活性化による可能性が高いことが判明した.また,後腸以外での発現抑制にはエピジェネティックなサイレンシング機構が関わることが示唆された.
温度に応じて金属錯体を着脱する固定化触媒の開発

触媒成分の担体への吸着と液相への脱離(溶出)を温度によって制御することが可能な触媒の開発を行った。溶液中の触媒成分のUV吸収を観察することで、反応温度(100°C)では触媒成分が担体から溶出し、室温(20°C)では担体に吸着されることを確認した。さらに、ハロゲン交換反応を例に、本触媒が濾過操作によって回収でき、活性の低下がほとんど無く触媒のリサイクルが可能であることを示した。【具体的内容】金属錯体の担体への吸着と液相への脱離(溶出)を温度によって制御することで、均一系触媒と同等の性能(活性・選択性)を有するリサイクル可能な触媒の開発を検討した。平成24年度は、種々の分子量の感温性ポリマーを有する配位子モデルと担体の合成、及び配位子モデルの温度に対する溶出挙動について検討を行い、シリカゲル表面を極性の有機基で修飾した担体を用いることで、配位子モデルの加熱時の溶出量が室温時の10倍以上になること等を見いだしている。平成25年度は、この知見をもとに、実際の触媒反応において本触媒の機能評価を行った。具体的には、クラウンエーテル、ホスホニウム塩、またはフェナントロリンに感温性ポリマーをつけた化合物等を合成し、これを極性の有機基で修飾したシリカ表面にそれぞれ吸着して触媒とした。これらの触媒のうちフェナントロリン誘導体の場合には、室温と加熱時の溶出量の差があまり見られなかったが、クラウンエーテル誘導体の場合には10倍程度の差が見られた。このクラウンエーテル誘導体の触媒を用いて、ハロゲン交換反応を試みると、触媒を用いない場合反応がほとんど進行しないのに対し、本触媒を用いた場合良好な収率で生成物が得られることがわかった。また、室温で濾過することにより容易に触媒が分離可能であり、分離回収した触媒を用いた反応でも、未使用の触媒を用いた反応と同程度の収率で生成物が得られることが確認できた。今後この成果を広く発表するとともに、企業との共同研究等を模索していく。【意義・重要性】まだ反応例が少なく、どの程度の触媒反応まで適応できるか今後さらに検討が必要であるが、触媒種の担体への吸着と液相への脱離(溶出)を温度によって制御することが可能であることを実証し、触媒リサイクルも可能であることを示しており、今後の触媒開発の一つの可能性を示せた点で重要である。【具体的内容】金属錯体の担体への吸着と液相への脱離(溶出)を温度によって制御することで、均一系触媒と同等の性能(活性・選択性)を有するリサイクル可能な触媒の開発を行うため、平成24年度は、配位子モデルと担体の合成、及び配位子モデルの温度に対する溶出挙動に対する検討を行った。配位子モデルとして、ナフチル骨格に温度依存性部位としてのポリマー鎖を導入したものを合成した。ポリマー鎖長に関しては、繰り返し単位nがおよそ3、7、12、16、45の5種類を用いた。担体表面から溶液相への配位子モデルの溶出量は、溶液のUV吸収を測定して定量した。担体にシリカゲルを用いた場合、配位子モデルの加熱時の溶出量は室温時の1 5倍程度であった。また、溶出量に与える溶媒の影響についても検討を行った。溶媒にヘキサン、トルエン、ジクロロエタン、ジオキサンの4種類を用いて検討を行うと、トルエンが最もよい結果を与えた。さらに、担体にシリカゲル表面を極性の有機基で修飾したものを用い、配位子モデル中のポリマーの繰り返し単位n、及び担体と配位子モデルの量比を最適化すると、加熱時の溶出量が室温時の10.6倍となり、今年度目標10倍以上を達成した。【意義・重要性】平成24年度は、配位子モデルの温度依存性部位と担体の表面構造の組み合わせについて検討を行い、配位子モデルの加熱時の溶出量が室温時の10倍以上になる組み合わせを見出すとともに、種々のパラメーターが溶出量に与える影響の傾向を把握した。この組み合わせと傾向は、実際の触媒や反応系を設計する上で重要な知見となる。当該年度の目標を達成しており、おおむね順調に研究が進展していると考える。平成24年度に得られた成果をいかして、担体への吸着と液相への脱離(溶出)を温度によって制御することができる触媒を合成し、性能の評価を行う。また、それらの工業的所有権を獲得すると共に、広く外部発信を行っていく。平成24年度、実験補助員を1名雇用する予定であったが、適任者がおらず雇用にいたらなかったため、次年度使用額が生じた。平成25年度は、その額も考慮して実験補助員を雇用し研究をいっそう加速する。
mRNA医薬による脳梗塞後遺症機能再生-皮質機能局在可塑性の強制発現-

脳梗塞後、定着した神経学的後遺症を改善する治療法は存在しない。本研究の概要は、脳梗塞モデル動物を用いて、脳梗塞発症早期リハビリテーションによる神経機能障害の改善をもたらす発現遺伝子を同定した上で、得られた遺伝子を、独自のmRNAデリバリー技術を用いて強制発現することで、定着した神経学的後遺症の機能改善を図ることである。mRNA医薬により、神経機能再生をもたらす新たな治療法開発を目的とした研究である。
イネ穎花における花粉の発達と退化の機構に関する組織細胞学的研究

1.イネ穎花の葯内における花粉細胞の発達過程をグリコ-ルメタアクリル樹脂準超薄切片法によって試料調製し、光学顕微鏡下で観察した。(1)小胞子母細胞の形成、(2)減数分裂の経過、(3)四分子から小胞子に至る細胞の変化、(4)小胞子細胞の活性化、(5)液胞化花粉細胞の形成、(6)生殖細胞の形成と分裂、(7)花粉細胞の充実および(8)成熟花粉の様相についていくつかの知見を得ることができた。2.葯および花粉の細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、葯壁の発達、花粉外殻の形成および受粉と花粉発芽の様子を明らかにした。3.凍結割断法を用いて葯の内部構造を走査電子顕微鏡下で観察した。母細胞、小胞子および花粉の細胞は常に葯室の周縁部に存在しタペ-ト層と接近した位置関係を保持していることを明確にした。また葯室内には小胞子後期まで葯液が存在し、その後この液が急速に失われることを明らかにした。4.耐冷性の比較的弱い品種農林20号を早期にポット栽培したところ、冷温によると思われる稔実率の著しい低下を認めた。この作物体の穂ばらみ期の穎花を上記と同様に光学顕微鏡および蛍光顕微鏡下で観察し、母細胞、小胞子および花粉の細胞の退化を認めた。これらの退化には、タペ-ト肥大を伴う場合と伴わない場合があり、とくにこれを伴う場合において小胞子の退化が著しいことを明らかにした。このことから冷温障害におけるタペ-ト肥大の指標としての有用性を確認するとともに、この障害の際の小胞子の退化がすべてタペ-ト肥大にもとずくものあるとは言い難いことも確認した。またこれまでの研究成果を総合することによって、タペ-ト肥大を伴う小胞子の退化における、小胞子細胞とタペ-ト層の相互関係について、新しい見解を持つに至った。この見解をさらに明確なものにすつ目的で、さらに詳細な研究を行っている。
三次元組織光造形法の開発

我々の研究グループは簡便に光分解性ゲルを形成できる架橋剤として、活性エステル型光開裂性架橋剤の開発を行っている。本研究ではこの簡便な架橋剤を利用して調製した光分解性ゲルを用いて、新たな細胞操作・組織工学手法の開発を進めている。平成25年度はゲルの弾性率制御に関する検討と三次元組織の灌流培養手法に関する検討を行った。ゲルの弾性率制御を行うために、光開裂性架橋剤NHS-PC-4armPEGと非開裂性架橋剤NHS-4armPEGを所定の比率で混合し、amino-4armPEG溶液と反応させることで光照射に応じて部分的に分解するゲルを作成した。光開裂性架橋剤の混合比の増加に伴い、光照射前後の弾性率が共に低下する傾向が確認された。また、マイクロパターン光照射と組み合わせることで、その弾性率をマイクロオーダーで3次元的に制御できることが明らかとなった。本研究はA03班の水谷グループとの共同研究の成果である。三次元組織を長期培養するためには、三次元組織に培養液を灌流しながら培養することが必要であると考えられる。今年度は光分解性ゲルに細胞を内包して作製した三次元組織体をマイクロ流体デバイスに組み込むことにより、作製した三次元組織の灌流培養を行う手法を確立した。モデルケースとしてゼラチンと光開裂性架橋剤NHS-PC-4armPEGを混合して作製した光分解性ゲルにヒト肝癌由来のHepG2細胞を内包し、マイクロパターン光照射により、所定の三次元構造を有する組織体を得た。マイクロ流体デバイスはポリジメチルシロキサンを用いてソフトリソグラフィー法により作製した。開閉型のマイクロチャンバーを有するマイクロ流体デバイスを採用することで、三次元組織体の構造を破壊することなく、培養チャンバーに作製した三次元組織体を組み込むことができ、三次元組織体に培養液を流しながら培養できることを確認した。25年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度は基礎的検討として、価数の異なる光分解性架橋剤の合成や、架橋密度や化学組成の異なる光分解性ゲルの合成を行い、応用研究としてゲルの微細構造の加工、三次元培養系における細胞操作、およびゲルの粘弾性パターンニングに関する検討を行った。これらの中で、本報告書では、ゲルの微細構造の加工と三次元培養系における細胞操作に焦点を絞って報告する。1.ゲルの微細構造の加工2.5mMgelatin溶液および5mM amino-4arm PEG溶液より合成した光分解性ゲルのXY平面分解能は、直径20 μmまで平面高分解能を有することが明らかとなった。また5mM amino-4arm PEG溶液より合成した光分解性ゲルのZ軸分解能について同様の検討を行った結果、光照射強度に応じてゲル内部150μm(膨潤後271μm)まで分解可能なことが明らかとなった。以上の検討結果より、今回作成した光分解性ゲルは、将来的に細胞の時空的制御を行う上で有用な新規マテリアルである可能性が示唆された。2.三次元培養系における細胞操作細胞を一定数混合した状態でゲル作成条件を変化させてLIVE/DEAD染色を行った。今回検討した条件の中で1.25%gelatin溶液を用いたゲル中の細胞生存率は、NHS/NH2 = 42.7-128 mol%において7492%であり低毒性であることを確認した。この条件で光照射による細胞摘出を行った。また、摘出細胞が生存し、細胞分裂が可能か検討するために摘出細胞を新しいディッシュに移動して培養を行った。