hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病に対する細胞免疫療法の最適化に向けて- T細胞ネットワークを輸注する-

我々は、白血病抗原WT1をモデルにHLAクラスI拘束性TCR遺伝子を導入したCD4+T細胞を作成して、遺伝子改変CD8+T細胞のメモリーT細胞化を促進する白血病特異的ヘルパーCD4+T細胞として機能する事を報告した(Fujiwara H et al. Leukemia,2016)。必然的に、白血病幹細胞を傷害するHLAクラスI拘束性TCR遺伝子をCD4+T細胞に導入すれば、より白血病抑制効果の高い遺伝子改変ヘルパーCD4+T細胞が得られる可能性がある。AURKA特異的siTCR-T細胞を作成して我々はこの可能性を示した(英文原著5)。また、我々は、既存の抗体を抗原認識に用いて抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を発揮するエフェクター細胞である、FcγRIIIa-CD3ζキメラ遺伝子を導入したCD16ζCAR-T細胞を開発したが、この遺伝子導入CD4+T細胞も強力な抗腫瘍性ヘルパーT細胞として機能した(英文原著6)。並行して、我々は、白血病幹細胞が持つIDH1R132H遺伝子変異(driver mutation)由来のHLAクラスII拘束性ネオ・アンチゲンエピトープの探索を進め、汎用性の高い遺伝子改変ヘルパーCD4+T細胞の作製を検討している。さらに、我々は、治療抵抗性多発性骨髄腫を対象に、TCRとCARのハイブリッドである腫瘍抗原エピトープ・HLA複合体を認識するCAR遺伝子を、がん・精巣抗原NY-ESO-1/HLA-A2複合体を認識するCARをモデルに作成しヘルパーCD4+CAR-T細胞の機能を検討している。その際、幾つかの問題点が確認された。そこで、体外で作成したCD4、CD8+T細胞ネットワークを輸注する方式と並行して、患者末梢血中のCD4、CD8+T細胞に同時に治療抗原特異性を付与出来るbispecific抗体も合わせて作成し、その有効性を比較検討している。我々は難治性急性骨髄性白血病(AML)に対する腫瘍抗原特異的T細胞受容体(TCR)遺伝子改変T細胞(TCR-T細胞)を用いた有効な養子免疫療法の開発を目指して、様々なTCR-T細胞ネットワーク輸注療法の可能性を検討した。第一に、本来HLA class 2拘束性に抗原を認識するCD4 T細胞に内因性TCR抑制下にHLA class 1のHLA-A24拘束性白血病抗原WT1特異的TCR遺伝子を導入したhelperT細胞(WT1-siTCR/CD4 T細胞)を作製して、WT1特異的CD4-CD8 T細胞輸注(混合比2:1)が本治療法の有効性を高めることを示した。並行して、難治性AMLに対してWT1-siTCR-T細胞を用いる臨床試験(UMIN 0001159)を実施し報告した。加えて、本研究の奏効例で新たな白血病抗原KIF2cタンパクを認識するCD4 helperT細胞を確認した(投稿準備中)。また、WT1特異的TCR遺伝子を導入した造血幹細胞移植の有効性も報告した。単一抗原特異的TCR-
メダカを用いた、配偶者選択行動の神経系動作原理の解明と展開

採用1年目、2年目でメダカの配偶者選択行動の結果、メダカメスは見知ったオスを好んで配偶相手として受け入れることを見出し、その意思決定段階に終神経GnRH3ニューロンが関わることを明らかにしたが、この「個体の記憶に基づく意志決定のシステム」の進化的保存性については未知な部分が多い。そこで、一般化するためMIT利根川研究室においてマウスを用いた個体記憶に関する行動定量システムを独自に考案した。このシステムとオプトジェネティクスの手法を組み合わせて海馬での個体記憶を担う領域を同定した。まず初めに、マウスの個体記憶をアッセイする行動実験系として、社会性識別テスト(social discrimination test)と侵入者テスト(resident-intruder test)の行動実験系を立ち上げた。社会性識別テストは、マウスが新規な個体に強く接近することをアッセイするテストであり、テストチャンバーのなかに新規個体と既知個体を入れたペンシルホルダーを設置すると、マウスは新規個体の周囲を好み、積極的に匂いを嗅ぐ。テストマウスの動きをチャンバーの上から録画した後、行動解析ソフトでマウスの鼻の位置をトラッキングし、鼻がsniffing areaの中にいた時間を自動で検出したところ、確かに有意に新規個体へと接近することを確認した。さらに、緑光刺激依存的に神経興奮を阻害するeArchT3.0タンパクを用いて、個体記憶を担う脳領域の探索を行った。AAVrh8-CamK2:eArchT-EYFPを顕微注入したマウスを用いて、社会性識別テストと侵入者テストを行った結果、海馬の小領域の神経興奮を阻害したマウスは社会性識別テストと侵入者テストに異常を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究の中で、メスの配偶行動の拒絶と受け入れという二相的な制御を終神経GnRHニューロンから放出されるGnRH3ペプチドが担うことが示唆されていた。ドワーフグラミーを用いた研究では、神経興奮の増加と共にGnRH3ペプチドが自己分泌され、終神経GnRHニューロンに曝露されることで自発発火頻度を増加させるという正のフィードバックモデルが提唱されていたが、メダカでも同様の機構が成立しているかについては不明であった。そこで、ルースセルパッチクランプ法を用いて、メダカ終神経GnRHニューロンの自発発火を計測しているもとで、GnRH3ペプチドを人工的に曝露したところ、自発発火頻度上昇が観察され、自己分泌経路がメダカでも機能していることが示唆された。更に、配偶者選択行動を司る神経基盤を終神経GnRHニューロン以外に網羅的に探索することを目的として、神経新生を利用した新たな脳領域スクリーニング法の確立を試みた。まず、神経前駆細胞で発現するHuC遺伝子のプロモーターを用いて、Creの発現依存的な組み替えによりタンパク質の発現変化をするトランスジェニック系統を作成した(HuC : 10xp-DsRed-10xp-GFP)。本系統に微少量のCre mRNAを顕微注入したところ、終脳の非常に少数の細胞でのみ偶発的に組み替えが生じることを見出した。また、熱ショックタンパク質プロモーター下流でCreを発現するトランスジェニック系統(HSP : Cre)と本系統とを掛け合わせた上で、近赤外光レーザーで熱ショックを与えたところ、標的とした少数の細胞で組み替えを起こすことにも成功した。上記の方法により、「遺伝子レベルではなく、神経細胞レベル」で、脳全体にランダムに組み替えを起こす順遺伝学的アプローチ、及び、標的神経細胞のみを修飾する逆遺伝学的アプローチの確立に成功し、新たな関連神経細胞の探索基盤が出来た。本研究をScience誌に掲載する際に要求されたリバイス実験を行った。主に終神経GnRH3ニューロンがメスの受け入れ制御にのみ関わっているのかという特異性が争点となっていたために、gnrh3変異体、および、CXCR7変異体を用いて、視運動反応、群れ反応、ミラーアプローチング行動を用いて、運動性や同種個体認識の観点から解析を行ったところ、野生型との間に有為な差異は観察されず、性行動への特異性が示唆された。また、研究モデルのなかで終神経GnRH3ニューロンがオスの求愛を拒絶するためのメカニズムとして、NPFFペプチドを示唆したところ、gnrh3とNPFFの局在についての議論を求められたため、二重in situハイブリダイゼージョン法によって共局在を示した。本実験は大久保範聡准教授(東大・院農)との共同実験として行った。終神経GnRH3ニューロンの視覚系への関与について指摘されたため、成体メダカを用いてGnRH3ペプチドの免疫染色、および、二光子顕微鏡を用いてgnrh3-gfpトランスジェニック系統におけるGFP陽性繊維の観察を行ったところ、終神経GnRH3ニューロンの神経繊維が確かに視蓋に投射しており、編み目状になっていることを見出した。この投射はcxcr7、cxcr4変異体で異常を示すことが期待されたが、野生型との間に差異は見られなかった。本実験は野中茂紀准教授(基生研)との共同実験として行った。以上の実験の結果、本研究は2014年11月にScience誌にアクセプトされた。

そこで、一般化するためMIT利根川研究室においてマウスを用いた個体記憶に関する行動定量システムを独自に考案した。このシステムとオプトジェネティクスの手法を組み合わせて海馬での個体記憶を担う領域を同定した。まず初めに、マウスの個体記憶をアッセイする行動実験系として、社会性識別テスト(social discrimination test)と侵入者テスト(resident-intruder test)の行動実験系を立ち上げた。社会性識別テストは、マウスが新規な個体に強く接近することをアッセイするテストであり、テストチャンバーのなかに新規個体と既知個体を入れたペンシルホルダーを設置すると、マウスは新規個体の周囲を好み、積極的に匂いを嗅ぐ。テストマウスの動きをチャンバーの上から録画した後、行動解析ソフトでマウスの鼻の位置をトラッキングし、鼻がsniffing areaの中にいた時間を自動で検出したところ、確かに有意に新規個体へと接近することを確認した。さらに、緑光刺激依存的に神経興奮を阻害するeArchT3.0タンパクを用いて、個体記憶を担う脳領域の探索を行った。AAVrh8-CamK2:eArchT-EYFPを顕微注入したマウスを用いて、社会性識別テストと侵入者テストを行った結果、海馬の小領域の神経興奮を阻害したマウスは社会性識別テストと侵入者テストに異常を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題を論文として通すことに成功した。また、並行して行っていたリコンビネーション特異的な脳領域の新しい修飾方法の開発にも成功した。具体的には、熱ショックタンパクプロモーター下流でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックラインに対して、領域特異的に近赤外光レーザーを照射することで領域特異的な神経修飾法を考案し、PLOS Oneに投稿していた。本実験に対し、成体において修飾された細胞の分布がどのようになっているかが争点となりリバイス実験を要求されたため、切片を用いて詳細な観察を行ったところ、表層に位置する神経幹細胞は分裂の後、内部へと移動することが明らかになった。以上の実験の結果、本研究は2013年5月にPLOS One誌にアクセプトされた。本研究においてメス個体はオス個体を記憶し、求愛受け入れを制御していることが示されたが、一方でどのようにして個体を記憶しているのか、またどのようにして終神経GnRH3ニューロンへとその情報を伝えているかについて不明な部分は多く残っている。そこでマウスにおける個体認識テストであるスリーチャンバーテストを用いて、海馬内のどの神経回路が個体記憶に関与しているかの探索を行う。また、この実験を通して、更なる解析のためのオプトジェネティクスを習得する。配偶行動、配偶者選択行動の解析のために新規な脳領域を同定するための方法の開発に成功したため。標的候補脳領域を増やす事によって、薬理学的アプローチのターゲットが増えるだけではなく、それらの相互作用関係を考えることにより新たな研究領域が得られると期待できる。
アストロサイトによる体温調節機序の解明

体温調節に関与する神経回路に比べ、アストロサイト回路の研究は少ない。我々は、最近、intersectional approachを用い、特定脳領域のアストロサイトのみの細胞内Ca2+濃度を人工リガンドで増加できるツールを開発した。このツールを用い、体温調節に関与するアストロサイトの局在を解析した。視索前野・視床下部背内側部と中隔のアストロサイトのみ(Nkx2.1-Cre)、視床より尾側のアストロサイト(視索前野のアストロサイトは含まないが視床下部背内側部・淡蒼縫線核・脊髄のアストロサイトは含む、foxb1-Cre)のみに、Creが発現しているCreラインとMlc1-tTAマウス(アストロサイト特異的にtTAを発現)及びtetO-FLEX-hM3Dqマウスを交配し、脳部位特異的にhM3Dqをアストロサイトに発現させるマウスを作製した。両マウスの系統にsalineおよびCNO(3mg/kg)を腹腔投与し、投与後の体温変化を測定した。Nkx2.1-Cre/Mlc1-tTA/tetO-FLEX-hM3DqマウスにCNOを投与した時にのみ、体温が約1.5度上昇した。これらの結果は、視索前野(POA)のアストロサイトの活性化が、体温の上昇をもたらすことを示している。さらに、体温上昇を起こしたマウス脳の組織学的解析により、アストロサイトのCa2+濃度上昇によりPOAの抑制性神経細胞および吻側淡蒼縫線核(rRPa)の神経細胞が活性化されていることを見出した。また、これらの領域は、寒冷環境に暴露したマウスにおいて活性化される神経細胞の局在する領域と一致した。本研究の結果は、アストロサイトを介した体温調節の新たなメカニズムの存在を示唆するとともに、体温上昇を司るPOAの神経細胞を同定する大きな足がかりとなる。29年度が最終年度であるため、記入しない。近年、アストロサイトが主体的に体温調整に関与していることが報告された。しかし、どの脳部位のアストロサイトが、どのような機序で体温調節に関与しているのか、不明である。申請者は、最近、intersectional approachを用い、特定の脳領域のアストロサイトのみの細胞内カルシウムイオン濃度を人工リガンドで増加できるツールを開発した。本研究では、まず、このツールを用い、どの脳部位のアストロサイト内カルシウムイオン濃度の上昇が体温調節に関与するのかを明らかにする。次に、同定した脳部位にマイクロダイアリシスプローブを置き、その部位のアストロサイト内カルシウムイオン濃度を上昇させた際にアストロサイトから放出されるグリア伝達物質を同定し、それが作用する神経細胞を明らかにする。本年度は、どの脳部位のアストロサイトが体温調節に関与しているかを明らかにするため、視索前野・視床下部背内側部と中隔のアストロサイトのみ(Nkx2.1-Cre)、視床より尾側のアストロサイト(視索前野・視床下部背内側部のアストロサイトは含まないが淡蒼縫線核・脊髄のアストロサイトは含む、foxb1-Cre)のみに、Creが発現しているCreマウスとMlc1-tTAマウス(アストロサイト特異的にtTAを発現)及びtetO-FLEX-hM3Dqマウスを交配し、脳部位特異的にhM3Dqをアストロサイトに発現させるマウスを作製した。上記2系統のマウスに人工リガンドCNO(3 mg/kg)を投与したところ、foxb1由来のアストロサイトを活性化しても体温に変化は見られなかったが、Nkx2.1由来のアストロサイトを活性化すると、体温の上昇が観察された。体温調節に関与するアストロサイトの脳部位を、視索前野と同定することに成功したので。

体温低下に関与するグリア伝達物質の同定とそれが作用する神経細胞の同定1.体温低下に関与するグリア伝達物質の同定体液のpHの低下は脳幹のアストロサイトで感知され、アストロサイト内のカルシウムイオン濃度を上昇させ、アストロサイトからATPが放出され、周囲の神経細胞を興奮させ、呼吸を促進することが示されている(Science 329:571, 2010)。アストロサイトから放出されるグリア伝達物質としては、グルタミン酸・GABA・ATP・D-セリンが報告されている。人工リガンドの投与により体温低下を示すマウスを用い、平成28年度に同定した体温低下に関与するアストロサイトの局在する脳部位にマイクロダイアリシス用のプローブを置き、CNO投与前後でのグルタミン酸・GABA・ATP・D-セリン濃度を測定し、体温低下に関与するグリア伝達物質を同定する。2.グリア伝達物質が作用し体温低下に関与する神経細胞の同定人工リガンドの投与により体温低下を示すマウスを用い、体温低下に関与するアストロサイトの局在する脳部位のスライス標本を作製し、膜電位感受性色素を用いCNO投与により膜電位変化を示す神経細胞群を同定する。さらに、同定した神経細胞群の膜電位変化が、同定したグリア伝達物質受容体の阻害剤カクテルで、阻害されることを確認する。受容体サブタイプ特異的阻害剤を用いることにより、体温低下に関与する神経細胞に発現する受容体サブタイプを同定する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
対象の親近感に基づく意思決定に関与する神経基盤の解明

本年度は、ヒトの「判断」に関する神経基盤を明らかにするため、1つは前年度に引き続き「親近感」に基づく意思決定の神経基盤、もう1つは合理的判断に関して数量の判断に関する神経基盤について実験、データ解析、論文投稿を行った。「親近感」に基づく意思決定の神経基盤に関しては、前年度行った実験から得られた、閾下提示された顔刺激の観察中に、紡錘状回顔関連領野や、扁桃体などの顔刺激の情報処理に関連する領野の活動が変化するという現象について精査するために、Dynamic Causal Modelingによる、脳領域間の結合に関しての解析を行った。結果、顔刺激を観察している際に、紡錘状回顔関連領野と扁桃体、視覚野間の脳領域結合が、顔刺激の好意度に応じて変化する傾向が見られた。今回明らかになった脳領域間の結合様式は、「親近感」を表象する包括的な脳領域ネットワークの一部を明らかにしたものである。この結果は更に精査を加え、論文にまとめて発表を行う予定である。また、本年度は数量判断課題という実験系から、ヒトが意識せず数量の判断に対する注意を切り替えることを明らかにし、ヒトにおける意識せずに行われる行動の最適化の神経基盤を明らかにした。その内容についてはPLos ONE誌に投稿し、採択されたものである。また、この実験系に関して、ヒトの判断と時間間隔との関係を明らかにすべく、行動実験を行った。結果、数量判断課題を行なっている最中の反応時間が、刺激提示間隔がランダムに変化する際には刺激提示間隔が長くなると反応時間が減少し、1ブロック内でコンスタントに刺激提示が行われる場合には刺激提示間隔が長くなると反応時間が増加するという結果を得た。このデータに関しては現在論文にまとめ、投稿準備中である。本年度は、顔刺激の閾下提示による対象への好意度の変化の様子を測定するため心理実験とそれに引き続きfMRI実験を行い、「親近感」を表象する領域の同定を行うことを目標とした。前期にはfMRI実験を想定した心理実験を行い、重要な実験パラメータである好意度評定の変化を最大化するように刺激条件を設定し、実験手続き上、問題が無いこと、また「親近感」による意思決定の変化を行動データで確認した。後期は予備実験に基づき、被験者18名を対象にfMRI実験を実施し、脳機能画像データの取得、解析を行った。なお、fMRI実験は定藤規弘併任教授の指導の下、自然科学研究機構生理学研究所内のfMRI装置を用いて行った。データ解析の結果、閾下提示された顔刺激の観察中に、紡錘状回顔関連領野や、扁桃体などの顔刺激の情報処理に関連する領野の活動が変化することが明らかになった。この成果は、顔刺激の処理と脳内における「親近感」の表象の結びつきを明らかにするための重要な実験データの一つである。このデータをDynamic causal modelingなどの手法を用いて解析することで、「親近感」を表象する包括的な脳領域ネットワークを明らかにすることが可能になった。その内容について、学会発表、論文の投稿を行い、現在はデータの精査を行っている。
X染色体多型マーカーの血縁鑑定における有用性の評価に関する研究

日本在住者747名につき,X染色体上の短鎖縦列反復配列(X-STR)27座位のデータを収集し,多型指標および連鎖不平衡の状態につき検討した。このデータを用いて行ったシミュレーションにより,XーSTRが父娘,および父由来アリルを共有する女性同胞(全同胞・父系半同胞)の鑑別に有用であることが示された。同胞尤度比算出のため,1)遺伝的距離に基づく組み換え価を採用し,座位ごとに順次計算する,2)連鎖不平衡が検出された座位はハプロタイプとして扱う,3)遺伝型に矛盾が生じた場合のみ突然変異を考慮する,としたモデルを考案した。本法は少ない計算量で妥当な同胞尤度比が得られ,法医遺伝学的に有用と考えられた。X染色体STRのポピュレーション・データを収集するため,インフォームドコンセントを得た516人(男性293人,女性223人)のDNAにつき,中村らにより開発された18-plex kit(18座位を同時に増幅・型判定するシステム)により型判定を行った。そのデータから各対立遺伝子頻度を算出し多型性の指標となる各統計値(識別能,多型情報含有値,排除率等)を算出した。各座位の女性における識別能は平均0.829 (0.437-0.979)であり,女性の遺伝子型頻度データについては,いずれの座位もハーディ・ワインバーグ平衡からの乖離はみられなかったが,DXS101, DXS981,DXS6807,DXS7424, DXS9902, GATA31E08の計6座位において,男性の遺伝子頻度データとの間に有意差が認められた。また連鎖の解析において男性ではDXS7424 - DXS101間(距離0.8 Mbp),女性ではDXS981 - DXS7132(同3.4 Mbp)間で統計上連鎖不平衡状態にあるとみなされた。統計指標(p値)は必ずしも座位間の距離と相関せず,局在により組み換え価が相当異なることを反映している可能性も考えられたが,サンプル数が少ないことの影響も無視できず,この点についてはさらに検討を要する。一方,連鎖不平衡を考慮し,仮にハプロタイプとして扱うとしても多型性指標値にはほとんど影響を与えないことが示された。この点についても,個別の事例においては,独立性を想定しない場合,ハプロタイプによっては数値にかなりの影響がありうると予想されるので,多型指標値の評価を含めさらに検討を行う必要があるものと考えられた。なお,今回の一連の検討において,インターアリルDXS6809*26.2を含め,本邦では,または海外を含め,未報告のアリルが数個観察された。昨年に引き続きX染色体STRのポピュレーション・データの収集を行った。新たに140名(女性73名,男性67名)よりインフォームド・コンセントを得て試料採取・DNA抽出を行い中村らにより開発された18-plex kit (18座位を同時に増幅・型判定するシステム)により型判定を行い,計656名(女性296名,男性360名)のデータを得た。さらに長腕に存在し前記18座位の一部と近接する3座位(DXS6799, DXS10103, DXS10147),短腕に互いに近接して存在する3座位(DXS10076, DXS10077, DXS10078),およびセントロメアに存在する3座位(DXS10162, DXS10163, DXS10164)を解析対象に加え計27座位の型のデータを得た。データ数の増加により,女性においてハーディ・ワインバーグ平衡からの甚だしい逸脱を示す座位,あるいは男女間で頻度に有意な差がある座位は認められなくなった。男性のデータにより隣接する座位間における連鎖不平衡の有無について検討したところ,DXS10076-DXS10077,DXS10077-DXS10078,DXS10163-DXS10164間,DXS7424-DXS101の4ペアで連鎖不平衡の存在が認められた。ポピュレーション・データを用いた検討では,linkage groupとされる座位間や,物理的距離の非常に短い座位間,およびセントロメアの座位間など,連鎖不平衡の存在が予想されたにもかかわらず検出されない座位が存在した。また連鎖不平衡が認められた座位の一方を除外し,他の23座位を独立とみなしても,遺伝的距離の短い座位同士をハプロタイプとみなしても,特定個人の識別にかかわる遺伝的多型性指標値には大きな影響を与えないことは前年度に報告したとおりである。一方,上記18座位のアリル頻度データを利用し,遺伝的距離による組み換え価を考慮したコンピュータ・シミュレーションにより父ー娘,母ー娘,全同胞,非血縁者のペアを発生させ,血縁鑑定を行ったところ,非血縁者では父ー娘関係をほぼ確実に否定できることなどが示された。昨年度に引き続き,X染色体STRのポピュレーション・データの収集を行った。

新たに91名(女性27名,男性64名)よりインフォームド・コンセントを得て試料採取・DNA抽出を行い,計747名(女性323名,男性424名)につき,Nakamura et al.が報告した18座位を含むX染色体STR27座位のデータを得た。またこれとは別に,集団間比較のためエジプト国在住者230名(女性107名,男性123名)のサンプルについて,上記18座位につき型判定を行った。サンプル数に差があるが,エジプト国在住者集団の女性においてハーディ・ワインバーグ平衡からの甚だしい逸脱を示す座位,あるいは男女間でアリル頻度に有意な差がある座位を認めなかったため,集団間のアリル頻度の比較を行ったところ,18座位中16座位で有意差を認め,遺伝的多様度も異なるとの結果が得られた。一方,X染色体STRの血縁鑑定における有用性を検証するため,27座位のポピュレーション・データをもとにコンピュータ・シミュレーションを行った。前年度に作成したスクリプトをさらに改良し,組み換え価および突然変異率を組み込んで,父ー娘,全同胞姉妹,半同胞姉妹などのペアを発生させ,非血縁者との尤度比,Identity by state (IBS)数を算出した。その結果父ー娘関係はほぼ確実に判定可能である他,全同胞姉妹ー非血縁者間では97%,異母半同胞姉妹ー非血縁者間では99%鑑別可能であると考えられた。異母半同胞においては,父由来アリルを共有するため,高い識別力が得られる結果となった。今回採用した計算法は比較的単純なモデルで処理を行っているが,連鎖および突然変異を組み込んだ計算用ファイルパッケージとして十分に実用に供しうるものと考えられる。日本在住者747名につき,X染色体上の短鎖縦列反復配列(X-STR)27座位のデータを収集し,多型指標および連鎖不平衡の状態につき検討した。このデータを用いて行ったシミュレーションにより,XーSTRが父娘,および父由来アリルを共有する女性同胞(全同胞・父系半同胞)の鑑別に有用であることが示された。同胞尤度比算出のため,1)遺伝的距離に基づく組み換え価を採用し,座位ごとに順次計算する,2)連鎖不平衡が検出された座位はハプロタイプとして扱う,3)遺伝型に矛盾が生じた場合のみ突然変異を考慮する,としたモデルを考案した。本法は少ない計算量で妥当な同胞尤度比が得られ,法医遺伝学的に有用と考えられた。昨年度までの検討においては,当初目標サンプル数では若干不足していることを示すデータが得られていたが,今年度新たに140サンプルを加え検討したところ,ポビュレーション・データとしてはほぼ満足の行く結果が得られた。また新たに検討対象とした9座位については,ほぼすべてのサンプルについて型判定を実施できており,連鎖不平衡に関する検討を進めることが可能であった。さらに血縁鑑定におけるX染色体STRの確率的評価法についても,コンピュータ・シミュレーションなどによりいくつかの知見を得ることができ,次年度以降のさらなる発展の基礎を築けたものと考える。法医学X染色体STRの特定個人の識別(同一人由来であることの証明)への利用については,常染色体STRとほぼ同様に扱って差し支えないものと考えられたが,実務的にはさらに検証を必要とする点があり,それを課題とする。一方,血縁鑑定への応用については,連鎖あるいは組み換え価の取り扱いについての検討を行い,当初目標とした尤度比等計算用ファイルパッケージ等の開発を試みる。サンプルの採取・収集は順調に行え,男性については当初目標数をほぼ達成し,女性については目標数以上を確保でき,全ての試料について18座位(当初目標は20座位)のPCR増幅,電気泳動,型判定が実施できた。ただし,得られたデータはサンプル数に若干不足があることを示唆しており,次年度以降さらに例数を追加する必要である。このことを除くと,データの解析は予定通り進み,各多型指標値の算出や,データの妥当性について検討が可能であった。一方連鎖不平衡の検討についても着手しているが,これについては今後座位数を追加し,さらに詳細な検討が必要と考える。
有限群およびそのq-類似上の多変数直交多項式

本研究では有限群上あるいはそれに関連した代数上での特殊関数の考察を行った。その結果、環積のなす(ねじれ)ゲルファントペア(S_2n, H_n)の一般化の球関数の完全な記述と、多変数クラウチャック多項式の直交性の必要十分条件、さらに対称群の通常、あるいはモジュラー指標における結果を得た。また、その応用として、有限群の等質空間の確率空間としての取り扱いや、群論の古典的な定理であるフロベニウス・シューアの定理の拡張も与えた。平成21年度はまず、ある環積のねじれゲルファントペアから導かれる指標環と多成分の対称関数環が同型であることを示し、その同型写像による球関数の像が、シューア関数とシューアのQ関数、さらにzonal多項式逹の積になることを示し、プリプントを一編完成させた。この結果によって、環積のなすねじれゲルファントペアの球関数がすべて決定された。また、その際フロベニウスーシューア指数が重要な役割を果なすが、これに関してもある群のペアを考えることにより一般化を得ることができた。フロベニウスーシューア指数は無重複表現と非常に深い関りを持つので、この結果を個々の具体例に応用することで、研究テーマに関して有用な発見がなされるだろうと期待している。また、有限群のゲルファントペアと確率モデルとの関係についても調べた。これは主にDiaconisによって提唱された方法である。簡単に説明すると、ある確率空間に群作用があったとき、その群作用で不変な確率の計算に帯球関数が非常に上手く利用できるというものである。そこで、私は多数の壼とボールのモデルを複素鏡映群のゲルファントペアの等質空間とみなすことで、ボールを取り出し、壼に移し変えるという操作を繰り返したときの確率を明示的に表示した、この際に以前示した帯球関数の表示が本質的な役割を演じた。また、複素鏡映群をワイル群にもつ仮想的な代数群に関する問題に関して、仮想的なゲルファントペアを構成することについて、明海大学の中島逹洋の協力のもとに、問題の設定を済ますことができた。これにより、次年度以降の研究をスムーズに進めることがきるだろうと期待している。環積のゲルファントペアを通じてクラウチャック多項式の多変数版である直交多項式が得られるが、RahmanとGruenbaumがそれらの直交性に関する必要純分条件を4変数かつパラメータに解析的な条件のつく特別な場合に与えた。彼らの手法は解析的でかなり複雑なものであるが、それに対し簡明かつ一般の場合を含む拡張を与えることができた。この一般化はパラメータに制限も無く、変数も任意である。それによってわかったことは、この多項式の直交性を制御するのは単純な行列の関係式だということである。これは群や帯球関数のテーブルが満たす直交関係の拡張であると考えることができる。したがってこれの示唆するところは、本件球の目的である多変数q-直交多項式を得るひとつの方法はこの研究によって得られた行列関係式のq-類似を考えることによって得られるのではないか、ということである。また、近年話題になりつつある代数的統計学との接点に関する研究も行った。プレプリントで単項式多項式の確率論への応用をまとめたが、それに対してDiaconisからの問い合わせがあり、どうやらさらに有効な応用が存在するようである。この研究も直交多項式をとりまく本研究の目然な応用である。また、有限シュバレー群のあるゲルファントペアの球関数の研究もはじめた。これはまだ、進行中であり、十分な結果が得られたわけではないが、本研究を推進する上で重要な役割を演じるはずである。そして、前年度に投稿した環積のねじれゲルファントペアに関する論文が無事採択された。本研究の目的は群論を背景に持つ特殊関数たちの導出であり、さらにそれらが新しい超幾何型の多変数直交関数として得られることである。その関数の"器"の一つとして期待されるのが、青本・ゲルファントの超幾何関数であり、2OO4年に代表者が複素鏡映群の場合にこれを実現している。そして、この場合の代数としての拡張である種々のヘッケ代数を考えることは自然であり、いわゆるq-超幾何型の直交多項式への道筋として正当なものでもある。本年度はまず、前年度より引き続き、エキゾチックなシュバレー群のゲルファントペアの計算を考えた。しかし、この研究の目的は具体的な関数であり、この方法ではなかなか実態が見えてこなかったので、方針を変更し、これらの仮想的な群の表現論の骨組みを与える有木・小池代数より生ずる球関数の導出を試みた、有木と小池の元論文にあるヤングの半正規表現を用いて様々な計算をした結果、岩堀ヘッケ代数からの誘導表現に現れる不変元が明らかになった。この不変元の半正規基底での展開係数は有木・小池代数の作用によって高々パラメーターたちの整数係数の多項式になることも分かった。

ただし、これら不変元を有木・小池代数の岩堀ヘッケ代数による両(相対)不変な関数に持ち上げる際に必要と思われる、表現空間上の計量をうまく定めることはできなかった。しかし、この方針で得られた不変元は、上記の係数の件もあって大変扱いが容易であり、特殊関数の計算に十分に役立つことが予想される。そして、いずれ良い計量を定めることにより、新しい多変数のq-直交多項式が得られるであろう。
超音波駆動によるミリセカンド可変焦点レンズと高速光デバイスへの応用

本研究では、屈折率の異なる2液界面が音波の放射力により高速変形する現象を利用した可変焦点レンズを開発した。駆動電圧によって焦点距離を制御可能で、機械式アクチュエータを用いた従来型と比較して一桁程度速い最速応答時間6.7msを得た。焦点位置を周波数1kHzで光軸方向に高速走査することにより、被写界深度の大きい共焦点画像が撮影できた。また、レンズを非軸対称に変形し、3次元的に焦点位置を変化可能な可変焦点レンズを作成した。本研究では,音響放射力を用いた高速応答可能な液体レンズを開発し,その光学的性能と応答速度を評価した.レンズは水,シリコーンオイル,リング型超音波振動子で構成される.水とオイルの屈折率差により,2液界面が光学レンズとして作用し,音響放射力を利用してこれを高速に変形することにより,高速可変焦点レンズとして動作した.レンズ応答をばねー質量ーダンパの一次元振動モデルとして仮定し,その動作速度について理論的に検討した.本理論より,速い応答速度を得るのに最適なオイルの動粘度が存在することを示した.有限要素解析による設計に基づいた試作機を作成した.印加電圧の制御によってレンズは可変焦点レンズとして動作し,最速応答時間6.7 msを得た.この値は機械式アクチュエータを用いた従来の可変焦点レンズや他の液体レンズと比較した場合,およそ一桁程度速く,従来では困難であった画面の奥行き方向に高速移動する物体の観測が可能であることを意味する.またレンズ焦点位置を光軸方向に高速走査し,被写界深度の大きい共焦点画像を撮影可能であることを実験的に証明した.周波数1 kHzで高速走査可能で,例えば通常被写界深度の小さい顕微鏡視野下においても,実時間共焦点撮影が可能となった.レンズ電極を周方向に分割することにより,レンズを非軸対称に変形し,3次元的に焦点位置を変化可能な可変焦点レンズを作成した.前述の駆動方法と組み合わせることにより,3次元的な広視野・共焦点画像を撮影可能となった.2液性液体レンズでは,レンズ内に気泡が発生したり,使用環境温度によって液体の粘性が変化し動作特性に影響を与える等実際使用する際の問題がある.これを改善するため,簡素な構造で小型化可能である温度安定性を有する透明シリコーンゲルを用いた可変焦点レンズを開発した.本研究では、屈折率の異なる2液界面が音波の放射力により高速変形する現象を利用した可変焦点レンズを開発した。本研究では音響放射力を用いた小型で高速応答可能な液体レンズを開発し,その光学的性能と応答速度を評価した.レンズは厚み4 mm,径6 mmであり,水,シリコーンオイル,リング型超音波振動子で構成される.水とオイルの界面が音響放射力により高速に変形し,可変焦点レンズとして作用する.レンズ応答をばねー質量ーダンパの一次元振動モデルとして仮定し,その動作速度について理論的に検討した.本理論より,速い応答速度を得るのに最適なオイルの動粘度が存在することを示した.有限要素解析によってレンズ内の音場解析を行った.またレンズ内により強い音圧が発生する様,最適なレンズ形状を決定した.設計に基づいた試作機を作成し,光線追跡によりレンズの透過光分布を計算した.印加電圧の制御によってレンズは可変焦点レンズとして動作し,最速応答時間6.7 msを得た.この値は機械式アクチュエータを用いた従来の可変焦点レンズや他の液体レンズと比較した場合,およそ一桁程度速く,従来では困難であった画面の奥行き方向に高速移動する物体の観測が可能であることを意味する.またレンズをAM信号で駆動することにより,レンズ焦点位置を光軸方向に高速走査し,被写界深度の大きい共焦点画像を撮影可能であることを実験的に証明した.周波数1 kHzで高速走査可能で,例えば通常被写界深度の小さい顕微鏡視野下においても,実時間共焦点撮影が可能となった.またレンズ電極を周方向に分割することにより,レンズを非軸対称に変形し,3次元的に焦点位置を変化可能な可変焦点レンズを作成した.前述の駆動方法と組み合わせることにより,3次元的な広視野・共焦点画像を撮影可能となった.交付申請書に記載した内容をほぼ計画通り順調に達成出来ている.しかしながらレンズ応答の理論式に関しては,当初は応答のみならず,レンズの変形形状までも理論的に明らかにする予定であったものの実現出来ていない.また応答速度については当初の目標値の1 msにわずかに及ばない.本研究課題で開発した液体レンズについて,今後下記の項目を検討する必要がある.・レンズ応答の高速化:現在の最高応答速度は6.7 msであり,この値は従来の機械式可変焦点レンズのそれと比べて1桁程度速いものの,当初の目標値であった1 msにわずかに及ばない.目標実現のためには,レンズの更なる小型化による最適設計や,オイルの動粘度を最適化する必要がある(今回の実験では理論的最適粘度54 cStのところ,100 cStの既製品オイルを用いた).・ゲルレンズの開発:開発した水・油による2層液体レンズは駆動中にレンズ内部に気泡が発生する場合があり,本レンズの実用化を考えた場合,使用環境温度に依存しない光学的特性が求められる.

新たに提案するゲルレンズは,これまでの水・油の代わりに-50100°Cまでの温度安定性を有する透明ゲルを用いる.本レンズは量産に適しており幅広い使用環境下に耐え得る.簡素な構造であるため小型化が容易であると思われる.・駆動ドライバの開発と省電力化:小型電子機器等に搭載するためには,レンズ駆動のためのドライバおよびレンズの省電力化が必須となる.現在の開発したレンズの消費電力は数10 mWであるが,今後レンズ全体が効率よく共振する様再設計する必要がある.・その他光学素子への応用:本レンズ技術を応用してマイクロレンズアレイを作製し,CCDや映像機器へ利用する.さらにMEMS技術と組み合わせることにより広い応用範囲を検討する.その他光スキャナ,シリンドリカルレンズ,光学ディヒューザ,血管内内視鏡用ヘッドなど新たな光学素子への応用を検討する.・物品費として購入を予定していた光線追跡ソフト,および有限要素解析ソフトは,同じ所属研究機関の他の研究室により貸して頂くことが可能であったため購入を見送り,代わりに光学レンズを購入し差額を次年度に繰り越した.・次年度より所属が東京工業大学(横浜)より同志社大学(京都)へ変更となったため,本年度使用していた光コヒーレンストモグラフィを使用するため,上項差額を利用して東京工業大学への出張(京都から横浜)を月1回の頻度で行う予定である.
インドおよびネパール国の衛生上重要なハエ類の分類、生態、防除に関する研究

1.調査地域の概要ネパール国での調査は、1990年に行なったアンナプルナ山地、テライ平原での調査に続ずき、1992年には、ジリからナムチェ・バザ-ルまでのエベレト街道沿いの地域とテライ平原の東部の地域で行なった。これらの地域でのハエ類の調査研究は、過去に全く行なわれておらず、それぞれの専門分野で貴重な資料が得られた。インドでの調査は、1993年と1994年の2回行なった。1993年には、東部のオリッサ地方とバンガロールを中心とする南インドの数地域で調査した。南インド地方のハエ類は、英国の植民地時代に採集された多数の標本が大英自然史に保管されており、分類学的研究のためには、我々自身での調査が必要であった。1994年には、衛生害虫として、熱帯地域の国で、最も問題となる、イエバエの防除のための基礎資料を得るために、イエバエの殺虫剤抵抗性についての野外実験を行なった。2.分類学的研究岩佐は、インドおよびネパールのツヤホソバエ科について研究し、ネパールからは、これま自身が報告していた8属、25種に加え、新たに1新種と2属7新記録種を記載した。インドからは、1新種と3新記録種を加え、7属18種を記載した。林利彦は、ハヤトビバエ科を担当し、人糞から発生するParalimosia属を調べ、6新種を含む14種を見いだした。上宮は、ネパールのメマトイキモグリバエ属を研究した。本属のハエは、眼病を媒介するハエとして知られている。今回の調査で、ネパールから8種とインドから6種が見いだされた。篠永は、ネパールのイエバエ科のハエを研究し、イエバエ亜科、サシバエ亜科、トゲアシイエバエ亜科をまとめた結果、23属、112種を記録した。このうち、52種を新種として記載した。倉橋は、ネパールのクロバエ科について研究した。その結果、23属、77種を見いだした。この内、10種は新種であり、42種がネパールからの新記録種であった。加納は、ネパールのニクバエ科を担当した。調査の結果、1新種と8未記録種を加え、ネパールから40種記録した。3.イエバエの殺虫剤抵抗性に関する研究。イエバエの殺虫剤抵抗性については、ネパール国内の7カ所から採集したストレインを持ち帰り、それらについて、8種類の薬剤に対する殺虫剤抵抗性を調べた。その結果、ネパールのイエバエは、各種の殺虫剤に対し高い感受性を示した。インドでは、林、篠永、廿日出の3名が、系統を維持しないで直接野外のハエを用いて殺虫剤抵抗性の野外実験をおこなった。その結果、日本では見られないような、高い感受性を示した。今回の結果から、熱帯の諸国では、エバエの系統維持をしないでも、結果にあまり違いが無いことが判明した。4.ハエ類の発生源に関する調査。熱帯地のハエ類は、主に動物糞や人糞、動物の死体などから発生している。防除の対策として発生源対策が必要であるが、熱帯の国では、このような発生源がどこにもあり、発生源対策は困難と考えられる。これまでに調査した、ヒトの生活環境内でのハエ類の発生源については、現在集計中である。5.動物地理学的研究。今回の調査の結果から、ネパールのハエ類について動物地理学的な研究も行なった。例えば、クロバエ科では東洋区系要素が40%をしめ、東洋区-オーストラリア区系要素が13%、固有種が26%と高い割合を占めた。これに反、支那-ヒマラヤ系要素は9%と低かった。

本属のハエは、眼病を媒介するハエとして知られている。今回の調査で、ネパールから8種とインドから6種が見いだされた。篠永は、ネパールのイエバエ科のハエを研究し、イエバエ亜科、サシバエ亜科、トゲアシイエバエ亜科をまとめた結果、23属、112種を記録した。このうち、52種を新種として記載した。倉橋は、ネパールのクロバエ科について研究した。その結果、23属、77種を見いだした。この内、10種は新種であり、42種がネパールからの新記録種であった。加納は、ネパールのニクバエ科を担当した。調査の結果、1新種と8未記録種を加え、ネパールから40種記録した。3.イエバエの殺虫剤抵抗性に関する研究。イエバエの殺虫剤抵抗性については、ネパール国内の7カ所から採集したストレインを持ち帰り、それらについて、8種類の薬剤に対する殺虫剤抵抗性を調べた。その結果、ネパールのイエバエは、各種の殺虫剤に対し高い感受性を示した。インドでは、林、篠永、廿日出の3名が、系統を維持しないで直接野外のハエを用いて殺虫剤抵抗性の野外実験をおこなった。その結果、日本では見られないような、高い感受性を示した。今回の結果から、熱帯の諸国では、エバエの系統維持をしないでも、結果にあまり違いが無いことが判明した。4.ハエ類の発生源に関する調査。熱帯地のハエ類は、主に動物糞や人糞、動物の死体などから発生している。防除の対策として発生源対策が必要であるが、熱帯の国では、このような発生源がどこにもあり、発生源対策は困難と考えられる。これまでに調査した、ヒトの生活環境内でのハエ類の発生源については、現在集計中である。5.動物地理学的研究。今回の調査の結果から、ネパールのハエ類について動物地理学的な研究も行なった。例えば、クロバエ科では東洋区系要素が40%をしめ、東洋区-オーストラリア区系要素が13%、固有種が26%と高い割合を占めた。これに反、支那-ヒマラヤ系要素は9%と低かった。平成4年度は、ネパール国における調査を主とし、インドについては、篠永と倉橋がアラハバッド大学を訪問してカウル教授と次年度の研究打合せを行った。ネパール国での調査は、78月と1011月の異なった季節に分けて行なった。最初の調査は、ジリからナムチェ・バザールの間、標高にして1600mから4000mの間とビラトナガール周辺のインドとの国境地域の低地で調査を行った。1011月には、ジリからロールワリンの標高約4000m辺りまでとインド国境の低地で調査を行った。また、カトマンズに滯在中は、周辺の林落や山地でも調査した。野外調査は、まず各自が専問としているハエのグループ(科)について、分類学的研究のための採集と標本作製、それらの発生源と垂直分布の調査、衛生上の重要性の検討などについて行った。分類学的研究では、イエバエ科(篠永)、ニクバエ科(加納)、クロバエ科(倉橋)、ヤドリバエ科(嶌)、ツヤホソバエ科(岩佐)、ハヤトビバエ科(林)の6科を主として、他にも多数の標本の収集を行い、それぞれの専問家に研究を依頼している。発生源の調査では、トイレのないネパールの生活とハエの発生の関連について調査を行い、屋外での人糞や家畜糞から発生するハエ類とそれらの衛生上の重要性について検討している。衛生害虫としてのハエ類のうち、最も問題となるのはイエバエである。今回の調査では、ネパール各地とくに高山地でのイエバエの殺虫剤に対する感学性を調べるのを一つの目的として、各地で採集して系統を保存している。今回の調査でイエバエを採集した最高の標高は2400mであった。これらいついては、現在感受性のテストを行っている。本年度の調査は、雨季明けの9月20日から1ヵ月間、南インドのタミール・ナド州を中心に行なった。調査は、それぞれの専門分野である、イエバエ科(篠永)、
ストレスによる生体リズム破壊の神経機構

生体リズムに及ぼすストレスの影響を脳内神経機構レベルで明らかにするため以下の研究を行った。(1)ストレスを個々のラットのCircadian Time(CT)の6ポイント(CT2、CT6、CT10、CT14、CT18、CT22)に60分間負荷し、時計機構が局在する視交叉上核(SCN)を含む視床下部およびSCNと神経連絡をもつ扁桃核、海馬、青斑核部のノルアドレナリン(NA)ニューロン活動性リズムに対する影響とこれらの部位の相互関係について検討した。その結果、視床下部、扁桃核及び海馬ではストレスに対するNAニューロンの反応性は活動期の終わりに最高となり、非活動期のはじめで最低となる日内変動を示した。一方、NAの細胞体である青斑核部ではCT1O及びCT22にそれぞれピークをもつ二峰性の日内変動を示した。(2)生体リズム、特に行動リズムの位相及び周期に対するストレスの影響について検討した。その結果、ストレスによる位相変位は、活動期の中期から後期に最大の位相前進(CT22)を示し、休止期の後半で最大の位相後退(CT10)を示す位相反応曲線が得られた。フリーラン周期はCT6、CT10、CT22でストレス負荷前に比べ有意に延長した。(3)ストレスによる脳内変化及び効果と同等の作用をもつとされるNAα2前受容体拮抗薬であるYohimbineを投与し、生体リズムに及ぼす影響を検討した。その結果、YohimbineはCT11及びCT19で行動リズムの位相や周期を変化させる作用を有していることが示された。以上のことから、ストレスは行動リズムの位相や周期を変化させる作用を有しており、ストレスによる最大の位相の前進もしくは後退が認めらる時刻に一致して、青斑核部のNA放出が高まること、またNA作動薬が生体リズムに直接影響をあたえることからストレスによってもたらされる生体リズムの影響の神経機構に青斑核部のNAニューロン活動が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。ストレスは脳内モノアミン特にノルアドレナリン(NA)の代謝回転を亢進することが知られている。また、自律振動体である視交叉上核(SCN)の周辺にはNAの細胞体が集まる青班核(LC)から線維連絡を受けていることも知られている。そこで今回、ストレスのラット行動リズムに及ぼす影響について観察を行い、LC部におけるNAニューロン活動との関連性について検討を行った。「方法」「結果」ストレスによる位相変位は、活動期の中期から後期に最大の位相前進(CT22)を示し、休止期の後半で最大の位相後退(CT10)を示す位相反応曲線が得られた。フリーラン周期はCT6,CT10,CT22でストレス負荷前に比べ有意に延長した。次に、LC部のストレスによるNA放出はCT10及びCT22にそれぞれピークをもつ二峰性の日内変動を示した。「考察と結論」以上のことから、ストレスは行動リズムの位相や周期を変化させる作用を有しており、ストレスによる最大の位相の前進もしくは後退が認めらる時刻に一到して、LC部のNA放出が高まることからストレスによる位相変位作用にLC部のNAニューロン活動がなんらかの影響を及ぼしている可能性が示唆された。ストレスと生体リズムとの関係について検討することは、ストレスが発症の一つの誘因であるとされるうつ病をはじめ、ストレスによってもたらされる心身の変化をリズム障害という観点から考える上で重要な情報を与える。そこでラット行動リズムに及ぼすストレスの影響について観察を行い、更に自律振動体である視交叉

上核から線維連絡を受けている青斑核(LC)部におけるノルアドレナリン(NA)ニューロン活動との関連性について検討を行った。[結果]ストレスによる位相変位は、CT22に最大の位相前進を示し、CT10で位相後退を示す位相反応曲線が得られた。フリーラン周期はCT6,CT10CT22,でストレス負荷前に比べ有意に延長した。次に、LC部のストレスによるNA放出はCT10及びCT22にそれぞれピークをもつ二峰性の日内変動を示した。以上のことから、ストレスは行動リズムの位相や周期を変化させる作用を有しており、ストレスによる最大の位相の前進もしくは後退が認められる時刻に一致して、LC部のNA放出が高まることからストレスによる位相変位作用にLC部のNAニューロン活動がなんらかの影響を及ぼしている可能性が示唆された。ストレスは時計機構が局在する視床下部をはじめ広範な脳部位で脳内モノアミン、特にノルアドレナリンやセロトニンの放出を著名に亢進させることから、時計機構と脳内モノアミンとの間に直接あるいは間接的に密接な関連が存在する可能性が考えられる。そこで盲目ラットに、ノルアドレナリンα2前受容体拮抗薬であるYohimbineとセロトニン作動性後受容体刺激薬である5-methoxydimethyltryptamine(5-MeO-DMT)を投与し、生体リズムに及ぼす影響について検討を行った。「実験方法」実験装置として、回転カゴを用い、回転数を5分間隔で記録し、自発行動リズムを計測した。手続きは、まずWistar系雄性ラット(L:D=12:12)を盲目とした後、個々のラットのCircadian Time(CT)の3ポイント(CT3,CT11,CT19)に、Yohimbine 2mg/kg,5-MeO-DMT 5mg/kg及び生理食塩水を投与し、フリーラン周期及び位相の変化を観察した。「結果と考察」YoHIMBINE投与によりCT11で位相の軽度前進、CT19で位相の後退がみられた。フリーラン周期はCT19で延長が認められた。一方、5-MeO-DMT投与では、CT11で位相の後退、CT19で位相の軽度前進がみられ、フリーラン周期はCT11及びCT19で延長が認められた。生理食塩水投与では、位相及びフリーラン周期に影響はみられなかった。以上のことから、Yohimbine及び5-MeO-DMTは行動リズムの位相や周期を変化させる作用を有していることが示された。さらに位相変位作用の方向性は、Yohimbineでは暗パルス型を示し、5-MeO-DMTでは明パルス型を示した。両薬剤の位相変位作用の方向性の違いは、両薬剤の投与後の行動量の変化の違いに基づいている可能性が推測された。またフリーラン周期に関しては、両薬剤の投与時刻、つまり投与時刻依存性に変化しうるものと考えられた。
リポカリンタンパク質に高度に保存されたＳＳ結合によるβバレル構造安定化機構の解明

本研究は,リポカリンタンパク質に高度に保存されたジスルフィド(SS)結合による,βバレル構造の安定化機構の解明を目的とする。平成29年度は,SS結合がリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)の安定性に与える影響について,主に熱力学的調査を行なった。【L-PGDSおよびSS結合欠損L-PGDSの化学変性実験】PBS(pH 7.4)において示唆走査型熱量計(DSC)を用いた熱変性実験を試みたが,SS結合欠損L-PGDSにおいて高温状態における不可逆な凝集体形成が観察され,解析が困難であった。したがって,代替法として化学変性剤(尿素)を用いた変性実験を行うこととした。はじめに,尿素(8.0 M)を用いてL-PGDS,およびSS結合欠損L-PGDSを変性させた後,透析法により尿素を除去し,各タンパク質のリフォールディング活性を調べた。両タンパク質ともに尿素変性に対する可逆性を示したことから,本変性過程は二状態転移モデルによって説明できることが示された。次に,温度5.0-55°Cにおいて尿素濃度を0-6.0 Mまで変化させ,各タンパク質の220 nmにおける円偏光二色性(CD)強度をプロットし,解析により変性の熱力学的パラメータを決定した。解析の結果,本SS結合は変性状態におけるエントロピー損失だけでなく,天然状態におけるエンタルピー利得によってもL-PGDSの安定性に寄与していることが示された。【研究成果発表】上記の研究成果に関して,The Protein Society 31st Annual Symposium,日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部2017年度合同大阪大会,および第40回日本分子生物学会年会第90回日本生化学会大会合同大会において発表を行った。SS結合欠損L-PGDSの不安定性の高さにより,当初予定していたDSC測定による熱変性実験が困難であったが,代替法として検討した化学変性実験により目的の熱力学的パラメータを決定することに成功した。これにより,計画していた熱力学的な解析を全て達成することができたため,次年度は構造生物学的な研究を集中して行うことができると期待される。以上より,本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。分子動力学(MD)シミュレーションを用いて,SS結合がL-PGDSのコンフォメーションに与える影響について詳細な調査を行い,現在までに得られている熱力学的な知見を構造生物学的に解釈することを目指す。具体的には,GROMACS(ver. 2016.5)を用いて,L-PGDS,およびSS結合欠損L-PGDSのMDシミュレーションを実施する。シミュレーションの初期座標は,Protein Data Bank(PDB)に登録されているL-PGDSの結晶構造を利用する(SS結合欠損L-PGDSは,L-PGDSの座標から作成する)。タンパク質の分子力場にはAmber ff14SB,水モデルにはTIP3Pモデルを適応する予定である。各タンパク質について500 nsのシミュレーションを計3回行い,結果の再現性についても確認を行う。