hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規ラジカル生成法の確立と立体制御

本研究課題で平成10年度から平成12年度の間に得られた成果を以下に示す。1.トリフリルゲルマンのアセチレンへの付加反応・・・トリエチルボランをラジカル開始剤としてトリフリルゲルマンを末端アセチレンに付加させるとE体のゲルミルアルケンが選択的に得られた。またトリアルキルスタナンでは反応が進行しないアルケンへの付加反応が進行することが明らかとなった。2.グリニャール反応剤によるラジカル反応・・・ヨウ化アルキルとグリニャール反応剤からラジカル種が生成することを見いだした。このことを利用してアリールマグネシウムのテトラヒドロフラニル化反応やラジカル的シクロペンチルメチルマグネシウムの新規生成法を開発した。3.次亜リン酸を用いたラジカル反応と簡便なラジカル的重水素化反応の開発・・・ο-ヨードフェノールのクロチルエーテルのエタノール溶液に次亜リン酸水溶液と炭酸水素ナトリウムならびにラジカル開始剤としてAIBNを加える。これを5時間加熱還流すると還元体が高収率で得られた。一方ホスフィン酸ナトリウム-水和物を重水に溶かし、ここへ重塩酸を加え溶液を酸性にし3時間撹拌する。炭酸カリウムを加えて塩基性とした後、基質としてヨード安息香酸を加える。さらにラジカル開始剤を加え加熱すると、重水素化体が得られた。有毒な有機スズ化合物を用いない新規ラジカル反応を開発することができた。4.ジルコノセンジクロリドを触媒とするラジカル還元反応の開発・・・トリエチルボランをラジカル開始剤としてアルミニウムヒドリドに触媒としてジルコノセンジクロリドを加えたラジカル還元反応を開発した。5.電子移動場で発生するビニルラジカルあるいはビニルアニオン種について、移行電子数の規制あるいは電解で発生する金属イオンの配位などを利用することによって立体化学を制御し、それらを立体選択的な合成反応に応用することができた。新規ラジカル生成法の確立と立体制御について交付申請書に記載した研究計画に従って研究を行い次の3つの成果を得た。1.トリエチルポランをラジカル開始剤として水中でのラジカル反応を検討した。その結果、α-ヨード-γ-ラクトンとフェニルアセチレンやアリルアルコールをトリエチルボラン存在下、水中で反応させると原子移動型のラジカル付加反応が進行することが明らかとなった。α-ヨードラクトンの代わりにプロモトリクロロメタンやヨウ化ベルフルオロアルキルも同様にアセチレンやオレフィン結合に付加する。2.ハロゲン化ビニルあるいはビニルトリフラートの電解力ルポキシル化反応を行い、移行電子数の規制による立体化学の制御について検討を行った。その結果、(E)-β-ブロモスチレンを、逐次的な1電子還元が行われて中間にビニルラジカルを経由するような条件下で電解を行うと、熱力学的に不安定な(Z)-ケイ皮酸が選択的に得られることを見いだした。一方、Ni触媒を添加して2電子還元が一段階で行われてビニルアニオンが生成される条件を用いることにより、(E)-ケイ皮酸のみを立体選択的に得ることができた。3.二ヨウ化サマリウムと有機ハロゲン化物との反応における電子移動過程および有機二亜鉛種と他の金属との交換反応における電子移動過程、この二つの過程における立体制御を行うために、α-へテロ原子置換有機サマリウム反応剤に関する研究を行った。α-クロロアルキルスルフィドに対して二ヨウ化サマリウムを作用したところ熱的に安定な有機サマリウム種が得られた。このサマリウム種はその立体配置が安定であることが明らかになった。

1)ラジカル反応における動的立体制御は、一般的な有機金属を用いるものと反応機構が異なるので、極めて特異的になると考えられる。しかし、問題となるのは、何をラジカル供給源にするかである。スズヒドリドを用いるのが一般的ではあるが、毒性・価格を考えると、決して使用しやすいとはいえない。本年度、我々はラジカル源としてトリフリルゲルマンを用いた。トリフリルゲルマンは、極めて容易にラジカルを生成し、ヒドロゲルミル化を行うことができた。2)ラジカル反応においてヘテロ原子ラジカルを利用できれば、ヘテロ原子の直接導入法が開発できるがこれまであまり例がない。今回不飽和アミンから生成するアミニルラジカルが環化反応に利用でき、極めて高い立体選択性を有することをみいだした。本法により、種々のアルカロイド合成が可能になった。3)gem-二亜鉛種の構造に関する研究を行った。EXAFSの測定による本種のSchlenk平衡の存在と制御の可能性を明らかにした。1.Schwartz反応剤による有機ハロゲン化物の還元THF中、室温でヨードアセタールに、3当量のSchwartz反応剤と1当量のトリエチルボランを加え3時間撹拌すると、ヒドロジルコニウム化反応に先んじてラジカル環化反応が進行し、対応する環化体が高収率で得られた。トリエチルボランを加えないと反応が進行しないことから反応はラジカル的に進行していると考えている。ブロモアセタールを用いても同様に収率よく反応は進行する。このSchwartz反応剤を用いたラジカル環化反応は、塩化メチレン中では全く進行しない。塩化メチレン中ではオレフィンに対するヒドロジルコニウム化反応のみが進行する。THFを溶媒とし、トリエチルボランと組み合わせて用いた場合にはラジカル環化反応、塩化メチレン中ではヒドロジルコニウム化反応、というようにこの両反応を完全に制御することに成功した。二塩化ジルコノセンの量を触媒量に減じることも可能である。THF中、室温で触媒量の二塩化ジルコノセンと1.5当量のRedalを混合し、1時間撹拌する。ここに、ヨードアセタールならびにトリエチルボランを加え、さらに3時間撹拌すると、この場合にも対応する環化体が高収率で得られた。2.グリニャール反応剤によるラジカル反応THF中ヨウ化ネオペンチルの共存下、アリールグリニャール反応剤にエチルグリニャール反応剤THF溶液を加えると、テトラヒドロフランのアリール化が進行した。エチルラジカルによるTHFからの水素引抜きにより生成したテトラヒドロフリルラジカルが関与しているものと考えている。ヨウ化アルキルとエチルグリニャール反応剤からのラジカル種の生成を、ラジカル環化に応用した。溶媒としてDMEを用い、ヨードアセタールに対してエチルグリニャール反応剤を作用させると、ラジカル環化が効率良く進行しアルキルマグネシウム種が高立体選択的に生成することが明らかとなった。このものに対して種々の求電子剤を作用させると対応する生成物が収率よく得られた。
ビスホスフォネートを用いた悪性骨軟部腫瘍に対する治療戦略

第3世代bisphosphonate(BPs)は骨肉腫細胞に対してin vitroで腫瘍細胞の転移能を抑制することがわかった。また、in vivoでは低濃度のBPsは原発巣よりも肺転巣に対してより強い抑制効果を示した。BPsと放射線の併用では、抗腫瘍効果の増強を認めた。一方、BPsは線維肉腫に対しても抗腫瘍効果を示すことが明らかとなり、S期の細胞比率を増加させ、アポトーシスを誘導することがわかった。さらに、BPsと種々の抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果は増強することが判明した。1.骨肉腫に対する第3世代ビスボスフォネート(BP)のin vivoにおける抗腫瘍効果および転移抑制効果の解明マウス骨肉腫細胞の高肺転移株であるLM8細胞にLuciferase遺伝子を安定導入し(LM8^<Luc>)、マウスを犠牲にすることなく生体内での腫瘍動態を経時的に観察できるIVISを用いてBPの原発巣、肺転移巣の抗腫瘍効果を検討した。結果として原発巣だけでなく、肺からのLuciferase発光度数の低下を認め、BPによる原発巣、転移巣抑制効果を認めた。組織学的検討では治療群で壊死や石灰化を認め、血管内皮細胞数の減少を認めた。BPが腫瘍の転移成立過程における遊走、接着、浸潤を抑制することが明らかとなった。今後骨肉腫患者の予後を改善する新たな治療薬になりうると考えた。2.悪性軟部腫瘍に対する第3世代BPの抗腫瘍効果の検討(in vitro)ヒト悪性線維肉腫細胞株(HT1080)、ヒト滑膜肉腫細胞株(SYO1)などに対するBPのin vitroにおける増殖抑制効果、細胞周期、Ras関連蛋白に関する発現解析を行った。結果として骨肉腫細胞同様、両細胞株に対して低濃度のBPで抗腫瘍効果を示した。細胞周期においてはS期の細胞比率は高値を示さなかったが、Sub-G1期の細胞比率の増加を認めた。さらに、Rap1Aのタンパク発現を認め、時間・濃度依存性にRap1Aのプレニル化を阻害することが判明した。他の軟部肉腫にも抗腫瘍効果を示す可能性があるのではないかと考えられた。1.軟部肉腫に対する第3世代ビスホスフォネートと化学療法の併用効果に関する検討(in vitro)これまでに骨肉腫同様に軟部肉腫細胞株(HT1080)に対してビスホスフォネートによる直接的抗腫瘍効果を示してきた。今回ビスホスフォネートと各種抗癌剤を用いた併用療法によりHT1080に対する相乗効果がえられるかを検討した。各種抗腫瘍薬剤(paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, gemcitabine, cisplatin)とビスホスフォネートの間で併用効果は得られ、特にdocetaxel, etoposideではビスホスフォネート単独投与と比較し有意差を示した。一方、methotrexateでは相加効果も認めなかった。これらの原因を究明するため細胞周期解析を行った。G1-, S-, G2/M-期の変化は単独のビスホスフォネート投与の時と比較し明らかな変化はなかったが、Sub-G1期の細胞比率の増加は認めた。今回の結果から通常の抗腫瘍薬剤では効果が得られにくい悪性軟部腫瘍に対してビスホスフォネートを併用することで直接的な抗腫瘍効果の増強が得られる可能性が示唆された。2.悪性軟部腫瘍に対する第3世代BPsの抗腫瘍効果の検討(in vivo)HT1080細胞をマウスに移植しビスホスフォネートを投与し単独投与による抗腫瘍効果を検討した。これまでに報告した骨肉腫細胞と異なり抗腫瘍効果を得るには高濃度のビスホスフォネートが必要であった。in vivoで効果を得るには併用療法やdrug deliverysystemの開発などの工夫が必要であると考えた。悪性軟部腫瘍に対する第3世代ビスホスフォネートと放射線併用療法の抗腫瘍効果の検討これまでに軟部肉腫細胞株に対してビスホスフォネートによる直接的抗腫瘍効果を報告してきた。今回は線維肉腫細胞株(HT1080)に対して、第3世代ビスホスフォネートと放射線療法との併用による腫瘍増殖抑制に関する相乗効果の有無を検討した。その結果、以前に得られたビスホスフォネート単独投与の時のIC50値よりも低濃度で処理し、低線量の放射線照射を追加することで有意な細胞増殖抑制効果を示すことが判明した。これらの原因を究明するため細胞周期解析を行ったところ、G1-,S-,G2/M-期の変化は単独のビスホスフォネート投与の時と比較し明らかな変化はなかったが、Sub-G1期の細胞比率の増加は顕著に認めた。また、これらの細胞においてcaspase-3,9の発現の上昇を認めた。ビスホスフォネート単独投与したものと放射線併用群とを比較すると、併用群ではSub-G1がより増加し、強い増殖抑制効果を認めており、アポトーシス誘導効果において併用効果があると考えた。

次に、これまでの実験からビスホスフォネートは投与後48時間で細胞周期をS期で停止させることからHT1080に対して、ビスボスフォネート投与48時間後に放射線を照射し、その48時間後での抗腫瘍効果の検討を行った。結果は、薬剤投与と同時照射した群と比較して、細胞周期の変化、増殖抑制効果、Sub-G1の増加ともに有意差を認めず、さらなる検討が必要であると考えた。
脳深部刺激療法と併用したパーキンソン病に対する細胞療法の開発

6-OHDAラットパーキンソン病モデルを用いて、視床下核深部刺激療法が神経保護作用を有することを病理学的及び行動学的に証明した。行動学的には6-OHDAが右線状体に注入後、持続的に視床下核深部刺激を加えると、Apomorphineで誘発される対側の回旋運動は誘発されなかった。これは、行動学的に、黒質の変性脱落が防御できた事を確かめた。次に、tyrosine hydroxylaseで中脳黒質を免疫染色すると、持続刺激群で、実際、有意に変性脱落は減少していた。その作用メカニズムを検討するため、微小透析法などを用いて、興奮性、抑制性アミノ酸などを測定したが、結果が様々な要因に影響を受けるために、研究期間内に信頼しうる一定のデーターをえることには至らなかった。細胞療法は、骨髄間質細胞の培養系を確立した。ラット大腿骨の骨髄を培養し、付着する細胞のみを単離した。その後、ELISAにてBDNF, GDNF, NGFを放出されるかを検討したが、すべて感度以下であった。さらにbFGFを培養上清に添加しても、上記の神経栄養因子の産生が惹起されなかった。また、Human neural stem cell (HNSC)にv-mycを導入し不死化した細胞株を樹立した。経静脈的に細胞を注入すると病変部位に特異的に移行することを確認した。また、NSC lineにbHLH転写因子を導入しneuronやgliaに分化させたり、BDNFやBcl-XLを遺伝子導入した細胞株の作製にも成功した。まず、脊髄損傷モデルにて、移植するとHNSCが2ヵ月後に神経細胞、グリア細胞の療法に分化し、損傷後の機能回復が認められた。したがって、同様の中枢神経の変性疾患であるパーキンソン病にも有効性が期待されるため、実験系を確立している。1、単一神経活動記録誘導による深部電極の視床下核留置ラットを麻酔後、定位装置に頭部を固定して、微小電極により単一神経活動記録した。視床(VPM),Zona Incerta,視床下核(STN)において、特徴的な神経活動(VPM-fine, highfrequent, Zonaincerta-almost silent,STN-highfrequentirregular)が記録され、視床下核が同定された。2、正常ラットにおける視床下核刺激による行動評価正常ラットにおいて、視床下核を刺激すると対側にorofacial(50μA)→forepaw(140μA)→genera(150μA)とひろがるdystonia, dyskinesiaの異常運動を示し、250μAでは対側の回旋運動を示した。3、視床下核深部刺激による神経保護効果を示す行動学的評価A)6-OHDAが右線状体に注入されたのみの未処置群B)右視床下核に深部刺激電極が留置された後、6-OHDAが右線状体に注入されるが、持続電気刺激は施行されない群(一時的深部刺激群)C)右視床下核に深部刺激電極が留置され、その後6-OHDAが右線状体に注入された後、2-4週間後まで慢性的、持続的に深部刺激(80-100μA)が与えられる群(持続的深部刺激群)の3群に大別され、比較検討された。Apomorphine(0.15mg/Kg)を皮下注することで誘発される対側の回旋運動を1分間の回旋数で表し、黒質の変性脱落の程度を評価した。

結果、A)郡6.11±1.19回/分B)群off 5.23±1.10回/分on -0.51±0.27回/分C)群on 0.54±0.26回/分,off 0.61±0.28回/分であった。慢性刺激により、回旋運動が観察されなかったことは、黒質の変性脱落が防御されたと考えられた。平成16年度において、脳深部刺激療法による神経保護効果が実証されたため、平成17年度は、主に細胞療法の開発に取り組んだ。まず、骨髄間質細胞の培養系を確立した。ラット大腿骨の骨髄を培養し、付着する細胞のみを単離した。その後、ELISAにてBDNF,GDNF,NGFを放出されるかを検討したが、すべて感度以下であった。さらにbFGFを培養上清に添加しても、上記の神経栄養因子の産生が惹起されなかった。次に、我々はHuman neural stem cell(HNSC)にv-mycを導入し不死化した細胞株を樹立し、様々な中枢神経系疾患モデル動物に応用している。これまで我々は経静脈的に細胞を注入することによって脳腫瘍や脳梗塞病変部位に特異的に移行することを確認しており、移行したNSCがneuronやgliaに分化することによって神経機能の回復が望まれる。我々はNSC lineにbHLH転写因子を導入しneuronやgliaに分化させることを認めた。またBDNFやBcl-XLを遺伝子導入した細胞株の作製にも成功しており今後研究への応用も可能である。そこでパーキンソン病の研究の予備実験として、中枢神経系の変性病態として系が確立されている脊髄損傷モデルにて、移植されたHNSCが2ヵ月後に神経細胞、グリア細胞の療法に分化し、損傷後の機能回復が認められた。したがって、同様の中枢神経の変性疾患であるパーキンソン病にも有効性が期待されるため、実験系を確立しているところであるが、研究期間内に有意なデータを得るには至っていない。
麻酔薬は記憶形成を阻害するか?

麻酔薬のなかには"逆行性健忘"と呼ばれる現象を起こすものがある。麻酔薬による記憶障害や健忘が、シナプスレベルでの可塑的変化とどう関連するのだろうか?今回私達は、ラット海馬スライス標本CA1領域で興奮性シナプスの長期増強現象(Long-term potentiation : LTP)を観察し、それに対するセボフルランの影響を調べることを研究目的とした。【方法】深麻酔下のSDラット(60-80g)から脳を取り出し、500microのスライス標本を作製した。海馬CA1領域でSchaffer-collateral-commissural (SCC) fibersに0.1Hz程度のテスト刺激を加え、記録が安定したところで条件刺激(100Hzの高頻度テタヌス刺激)を用いてLTPを誘導し記録した。セボフルランは酸素化したACSFとともに条件刺激の約30分前から投与した。臨床使用濃度と低濃度のセボフルランを用いてその影響を観察した。【結果】臨床使用濃度セボフルランはLTPの誘導、維持ともに抑制した。低濃度セボフルランは部分的にLTPの誘導を抑制した。そこで、GABA受容体拮抗薬であるBicuculline、NMDA受容体拮抗薬であるMK-801存在下で同様の実験を行った。10μM Bicuculline存在下で低濃度セボフルランによるLTPの抑制は起きなかった。臨床使用濃度セボフルランではLTPは部分的に誘導されたが、維持は抑制されたままだった。1μM MK-801存在下で、LTPは誘導されセボフルランによる影響に違いは見られなかった。【結論】セボフルランはLTPを抑制する。低濃度の場合はGABA作動性ニューロン活性化が関与し、臨床使用濃度になると興奮性ニューロン抑制作用も加わってLTPを抑制したものと思われる。揮発性麻酔薬は、主に興奮性シナプス伝達の抑制、抑制性シナプス伝達増強作用によって可逆的に中枢神経に作用する。しかし最近、一部の麻酔薬は神経細胞死を引き起こし、さらに記憶や学習能力まで障害させるという注目すべきデータが報告された(Journal of Neuroscience 2003;23:876-82)。この結果は、可逆的であると考えられる全身麻酔薬が、中枢神経細胞に対して非可逆的な作用があるかもしれないことを示唆している。しかし、麻酔薬の記憶や学習など脳高次機能の修飾に関しては、基礎的実験報告が極めて少ない。研究目的は、ラットの海馬スライス標本で神経細胞間でのシナプス可塑性(LTP)を誘導し、脳高次機能に対する揮発性麻酔薬の効果について検証することである。LTPの誘導:CA3領域細胞の軸索(Schaffer側枝)を電極刺激して、CA3領域の錐体細胞層で細胞外記録法を用いて興奮性シナプス電圧(field EPSP)を記録した。条件刺激(100Hz)を行った後、持続的にシナプス電位の振幅が長時間にわたって上昇し、1時間以上にわたってコントロール伝達の150%以上上昇した場合にLTPの誘導がおこったものとした。条件刺激の前に揮発性麻酔薬(20分間)をあらかじめかん流投与してLTP誘導を試みると、電圧の振幅は有意に減少した。この結果は、臨床濃度の揮発性麻酔薬が存在した場合、麻酔薬による抑制シナプスの増強かあるいは興奮性シナプス抑制作用が、可塑性誘導機構(の少なくとも一部)を阻害することを示唆している。次年度は、このメカニズムを解明するために、glutamate receptor blocker,GABA receptor blockerの存在下でどうなるか、またLTPの維持には麻酔薬はどう影響するかを検討する必要がある。
RUNX3異常による胃発癌の分子メカニズムの検討

18年度実績1.Runx3とKu70の結合の生理的意義の解明Runx3とKu70の結合の生理的意義をさらに検討するために、Runxの結合配列を持つレポーター及びp21のレポーターを用いたレシフェラーゼ・アッセイ及びRunx3の下流遺伝子の発現解析でKu70/80のRunx3転写活性化能に及ぼす影響を調べたが、Ku70がRunx3の転写を活性化する傾向はあるものの、明らかな有意差は認めなかった。また細胞株に抗癌剤(ブレオマイシン)でDNA Double Strand Breakを誘導しEu70/80を活性化した状態でのRunx3の転写活性化能についてもレポーターアッセイを用いて検討したが、同様の傾向が認められた。一方で、Runx3と結合することによるKu70/80を介したDNA結合能及び修復能に及ぼす変化に関してGel Shift Assayを用いて解析中である。2.Runx3活性制御機構の解析3.臨床検体の解析慢性胃炎から胃粘膜萎縮、腸上皮化生を経て、胃発癌に至るという過程にRunx3がどの段階で関与しているのかを調べるため、各段階の臨床検体を用いて、免疫組織化学的検討を行なった。17年度実績1.Runx3とKu70の結合の生理的意義の解明Runx3のレポーターを用いて、Ku70/80のRunx3転写活性化能に及ぼす影響を調べた。また、Ku70のknockout mouse由来の細胞や、RNAiによりKu70をKnocktdownした細胞において、Ku70の機能が失われた状態でのRunx3の転写活性化能をp21のレポーターを用いて検討した。さらにRunx3の細胞周期への影響をFACSにて解析し、Ku70の細胞周期への影響を検討している。一方、Runx3と結合することによるKu70/80を介したDNA修復能に及ぼされる変化につき、胃癌細胞株を用いて解析している。2.Runx3活性制御機構の解析3.臨床検体の解析胃発癌に関しては、慢性胃炎から胃粘膜萎縮、腸上皮化生を経て、発癌に至るという過程が想定されている。RUNX3が胃発癌のどの過程で関わるのかを調べるため、各段階の臨床検体を用いて、免疫組織化学的および分子生物学的検討を開始した。また細胞株に抗癌剤(ブレオマイシン)でDNA Double Strand Breakを誘導しKu70/80を活1生化した状態でのRunx3の転写活性化能についてもレポーターアッセイを用いて検討したが、同様の傾向が認められた。
オルガノイドを用いた小腸潰瘍性疾患の包括的検討

H30年度はバルーン内視鏡で診断した小腸潰瘍性疾患からのオルガノイドの作成を行った。今年度にダブルバルーン内視鏡を施行した小腸潰瘍性疾患症例は12例であった。クローン病6例、薬剤性小腸潰瘍疑い3例、小腸癌1例、原因不明小腸潰瘍性疾患2例であった。これらの症例のデータを用いて、出血、再出血のリスクの判定法について他施設での検討を行い、有用な初期治療法を探索した。潰瘍発生メカニズムの検討のためにクローン病2例、薬剤性小腸潰瘍1例、小腸癌1例よりオルガノイドを作成した。原因不明小腸潰瘍性疾患の2例は、マトリゲル内での培養が困難であり、現時点ではオルガノイドの作成ができていない。これらのオルガノイドの増殖能について通常の培養条件においてマトリゲル内でのオルガノイドのサイズとCell counting kitによる呈色反応によって細胞増殖能を検討した。小腸癌由来のオルガノイドは他疾患のオルガノイドより有意に細胞増殖能の更新が見られた。また小腸癌由来のオルガノイドは通常の培養条件よりEGFを除いても増殖可能でありEGF-Kras-MAPKシグナルの活性化が示唆された。小腸潰瘍性疾患の発生メカニズムの解析目的で、マウス正常小腸細胞からオルガノイドを作成し、炎症細胞との共培養におけるマウス小腸上皮細胞の変化を検討した。骨髄細胞から樹状細胞を分化培養し、オルガノイドと共培養を行った。共培養によってオルガノイドの形態異常が誘導された。また免疫染色を行い共培養オルガノイドにおいてUEA1染色反応の低下が見られた。すなわち上皮細胞と免疫細胞の共培養によってUEA1陽性の杯細胞が減少することが示唆された。現在上皮細胞の分化の異常のメカニズムを検討中である。出血をきたす小腸潰瘍症の臨床像を解析して治療戦略の提案を行った。ヒト小腸潰瘍からオルガノイドの作成に成功し、数クローンの潰瘍性疾患小腸オルガノイドライブラリーを作成している。またマウスの小腸オルガノイドについては再現性をもって作成され、共培養による検討を開始している。現在マウス小腸オルガノイドの変形および分化異常に関連する機序を検討している。また本研究と関連した臨床研究結果をまとめて学会発表を行っている。樹状細胞との共培養によるオルガノイドの分化の変化について解析を継続する。また肥満、喫煙などの生活習慣による小腸傷害のモデルについて検討するためにマウス正常小腸細胞から作成したオルガノイド培養に脂肪酸やニコチンなどを添加し、その影響を検討する。また臨床検体からのオルガノイド樹立を継続するとともに免疫染色などによって個々のオルガノイドの上皮の違いを解明する。

また臨床検体からのオルガノイド樹立を継続するとともに免疫染色などによって個々のオルガノイドの上皮の違いを解明する。今年度共同研究者に予定していた物品費が一部実験予定の変更のために請求されなかった。当該研究については次年度に施行する予定としている。
中山間地域における超高齢化と集落の福祉機能の変動に関する比較調査研究

超高齢化が進行する中山間地域の集落自治会への住民の期待と参加意識は高いが、限られた地域資源と人材不足から、軽度の見守りやサロン活動等は、広くおこなわれているが、集落の共同事業とは異なる性質を有する個別援助活動は広がっていない。伝統的家族規範が支配的な中で、集落自治会の福祉的機能を高めるためには、ローカル・ガバナンスの視点に立った、地域福祉のメインシステムとサブシステムの連結を図る「新たな公共」の創出が不可欠である。(1)集落機能の変化に関する基礎自治会アンケート調査を、福島県昭和村、三島町および比較対照群である島根県太田市において実施し、あわせて行政、自治会に対して詳細なヒアリング調査を実施した。自治会の担い手の減少、生活維持・防衛の個別責任化が進む中でも、過疎山村においては、市町村合併の動きと相俟って、むしろ客観的にも、住民の意識としてもサブシステムとしての集落への期待が強まっていることがわかった。(2)住民の集住形態が散居型である島根県では、「限界集落」化が進み、住民の危機意識が高く、比較的集落規模が大きく集合性が高い福島、岩手ではやや低いという結果がみられた。また、集落での具体的な地域活性化の取り組みは、地域条件よりも地域リーダーの考え方、リーダーシップに負うところが大きいという傾向がみられた。(3)市長村合併の影響という点では、合併後の自治体においては、とりわけ吸収合併においては、自治会連合の大規模化や中間組織(旧町村単位)での再組織化とも相俟って、いわゆる集落構造の「縁辺化」が進み、中心から遠隔になるほど、危機感や閉塞感が強まっている。(4)合併前もふくめて、比較的早くから高齢化が進んだ自治体においては、行政の集落支援が行われており、それが現在の集落活動の活性化につながっていると考えられる。(1)西和賀町と対照地である島根県大田市(441)、岩手県岩泉町において、集落自治会に対する自治会活動に関する悉皆調査を行った。合併は、それぞれ、対等合併(31自治会)、吸収合併(441自治会)、非合併自治体(101自治会)である。また西和賀町長'瀬野地区と岩泉町鼠入地区において詳細聞き取り調査を行った。前者は、昭和47年に集団移転した新集落自治会、後者は高地/過疎/小規模集落である。これらと並行して前年の補充として国勢調査/町丁別集計による当該市町村の分析を補充的に行った。(2)合併の影響は、住民の集住形態が散居型である島根県では、「限界集落」化が進み、住民の危機意識が高く、比較的集落規模が大きく、集合性が高い岩手ではやや低いという結果がみられた。また、積雪と交通の利便性が低い集落ほど大きいという傾向が見られた。(3)集落での具体的な地域活性化の取り組みは、地域条件よりも地域リーダーの考え方、リーダーシップに負うところが大きいという傾向がみられた。(4)集落の福祉的機能という点では、全体として、過疎化、高齢化、共働き化などにより集落のまとまりや活動力が低下してきているが、市街地よりは農村部、全般的な自治会活動が活発であるほど果たす役割が大きいという結果が見られた。(5)住民一役員の意識は高いが、福祉的活動は、他の活動と異なる受け止め方をしており、その支えとして、何らかの公的な支援、助言を強く求めていることがわかった。(6)伝統型ではない集落自治会の福祉的機能の転換には、住民の主体性だけではなく、活動形態やその母体にあり方も含め、価値意識の転換が求められていると言える。
形状保持機能を利用した可変形状ビームの提案と衛星外観検査への応用

本研究では従来の多関節型ロボットアームとは異なるシステムとしてMorphable Beam Device (MBD)を提案し、柔軟性・形状保持性を持つチューブをビームとして用い、根元に集中したアクチュエータにより先端位置を制御することで、システムの小型化、単純化が容易で様々な用途への応用が考えられる。今年度は、ビーム変形に関する基礎的な特性を解析してモデル化を行い、先行研究にて製作されたMBD試作機を改良して解析モデルの検証実験、ビーム先端位置の方向指定制御と調整法について実験的な検討を行った。具体的には、ビーム変形機構におけるローラとビームとの間の隙間を考慮し、変形部入口においてビーム接線が鉛直上方を向くという仮定を設けて変形モデルを導出することにより、ビーム変形が意図した方向と逆転する転移現象が説明でき、ビーム曲率半径(制御出力)と変形機構の変位(制御入力)の関係を求めた。MBD試作機では、変形部上下段の高さの差とビームとローラの隙間をパラメータとして変更可能なように設計して、伸展されるビーム曲率半径と変形部変位の関係を計測し、提案したモデルと定性的には一致することを示した。さらに、先端接線方向指定制御実験を行い、変形部変位と先端接線方向角との関係を求め、指定できる先端接線方向角の上限値も求めた。微小な範囲内であれば、先端位置を各軸方向に制御可能で3次元的に任意の方向へ変位できること、ビーム変形部のガタおよび局所的なビーム形状による影響を確認した。以上により、MBDの変形メカニズムについて重要な知見が得られた。今年度は、まず、ビーム自身の形状変形・保持性を利用した形状制御、および、集中配置アクチュエーターによる変形・伸縮制御を利用した収納展開・形状制御機構を改良して、小型・軽量・省電力化の検討を行った。ビームの長大化を図るために、かなり低剛性なビーム材料を選定し、極座標型テーブル機構、ドラム収納、ワインディング機構の採用、機器配置の再構成などの各種工夫を施して、5mの収納展開を持ちながら、容積、重量、電力ともに小型化に成功した。そして、ビーム形状の幾何学的性質を用いた定曲率曲線生成法、可変曲率曲線生成法、それを拡張した逐次定曲率曲線生成法を提案した。MATLABを用いた統合的なシミュレータを開発して、基礎的な数値解析を実施し、ビーム形状の生成、先端の位置および姿勢の稼動範囲の特定、運動学の定式化などを行い、基本的な特徴を明確化した。そして、形状生成アルゴリズムの計算時間に難点があることなどの課題も明らかになった。ついで、試作した機構を用いた基礎的な実験を行った。3次元位置計測装置を用いて0.5mm程度の誤差範囲で形状位置の計測を実施した結果、ほぼ予想どおりにビーム形状制御ができることを示した。ビーム長さを1m以上伸ばした場合、重力下の実験のために、低剛性ビーム材料がそれ自身の自重で形状が変形する問題が生じる点などが明らかになった。そのため、2次元に制約した形状変形実験を行い、基本特性を取得した。今年度得られた成果により、新しい概念である形状保持機能を利用した可変形状ビーム装置(MBD)が基本的に実現可能であることが示された。
歯周病原細菌の病原タンパク質分泌機構の解明

グラム陰性菌Porphyromonas gingivaliは様々な病原因子をもつ.特に、システインプロテアーゼであるジンジパインは宿主の組織破壊に関わるとともにP. gingivalisの病原因子の成熟化にも関わることから重要な病原因子として考えられる.ジンジパインを分泌するPor分泌装置が、どのようなタンパク質を分泌するのか明らかにした.Por分泌装置はP. gingivalisのC-terminal domainをコードしているタンパク質、赤血球凝集素、凝集素、病原因子の分泌に関わっていた.歯周病は種々の細菌による混合感染であり、これらの菌が産生する病原因子により、歯周組織が破壊される疾患である.これまで、歯周病細菌が分泌する病原因子が宿主に与える影響については、宿主側を視点として、数多くの報告がある.一方、病原因子が分泌される仕組みについては殆ど分かっていなかった.そこで、遺伝学的手法を用いて病原因子分泌に必須な分子を探索したところ、病原因子は10分子が関わる分泌装置(PorSS)によって分泌されることが分かった。この分泌装置はバクテロイデーテス・フィラムに属する種々の歯周病細菌に保存され、これまで知られる多くの病原因子の分泌および成熟化に関わる.目的)歯周病細菌のPorSSがどのように分泌タンパク質を認識、そして分泌しているのかを理解するため、まずは、どのようなタンパク質がPorSSによって分泌されるのか、また分泌タンパク質はどのような共通性をもつのか調べる.方法)PorSSが機能する菌と、しない菌で、PorSS分泌タンパク質を比較する.各々の菌から培養上清を回収し、上清タンパク質をTCA沈殿し、2次元電気泳動に展開した.さらに、得られたスポットについて、質量分析をおこなってタンパク質同定をおこなった.結果)2次元電気泳動の結果より、PorSSが機能する菌からは、PorSSが機能しない菌と比較して、13スポット多くのスポットが得られた.歯周病菌の病原因子として知られるプロテアーゼの他、菌体表層タンパク質が含まれていた.これらを並べて比較すると、PorSSによって分泌されるタンパク質は、C末端配列に共通する約80アミノ酸配列をコードしていることが分かった.考察)分泌タンパク質の約80アミノ酸のC末端ドメインが、PorSSの認識、識別に関わっていることが示唆される.グラム陰性菌Porphyromonas gingivaliは様々な病原因子をもつ.特に、システインプロテアーゼであるジンジパインは宿主の組織破壊に関わるとともにP. gingivalisの病原因子の成熟化にも関わることから重要な病原因子として考えられる.ジンジパインを分泌するPor分泌装置が、どのようなタンパク質を分泌するのか明らかにした.Por分泌装置はP. gingivalisのC-terminal domainをコードしているタンパク質、赤血球凝集素、凝集素、病原因子の分泌に関わっていた.歯周病原細菌Porpyromonas gingivalisの病原タンパク質分泌機構について、分泌装置(Por分泌装置)がどのような仕組みで分泌タンパク質を認識、識別、分泌するのか、分泌する側およびされる側の両因子から解明を進めている。これまで、本菌の最も重要な病原因子であるプロテアーゼ、ジンジパインを分泌される側の対象として解析を行ってきた。ジンジパイン以外にも、Por分泌装置によって分泌されるタンパク質があるのか、分泌装置が機能する株と、しない株の培養上清のタンパク質を2次元電気泳動に展開し、質量分析にてタンパク質を同定したのち、比較した。その結果、ジンジパインを含め、少なくとも13のタンパク質がこの分泌装置によって分泌されていることが分かった。この中には、これまでに病原性に関わると報告されるタンパク質も含まれていた。さらに、これら13のタンパク質のアミノ酸配列を比較したところ、分泌される側のタンパク質のC末端領域には共通した配列が存在し、Por分泌装置で分泌されるためにはC末端領域の認識が重要であることが予測された。さらに、遺伝子操作により、このC末端領域を一部欠失させると分泌されるなくなることから、C末端領域は分泌装置の認識に重要であることがわかった。一方、分泌する側の装置については、平成24年度の計画に向け、P. gingivalis内で分泌装置の解析を可能にするツールの作成をおこなった。分泌装置タンパク質にタグをつけた融合タンパク質を、機能を維持したままP. gingivalis内で発現することができた。また、大腸菌で分泌装置の各々のリコンビナントタンパク質を発現させ、これらの特異的抗体も得ることができた。これらを用いて菌体内での局在を観察する予定である。平成23年度の主な「研究の目的」は分泌装置(Por分泌装置)がどのようなタンパク質を分泌しているか、ということである。分泌されるタンパク質を明らかにするとともに、そのアミノ酸配列から、分泌タンパク質に共通した領域を見いだすこともできている。また、平成24年度に向けた準備も進んでいることから、おおむね順調に進展しているといえる。平成24年度は交付申請書に記載した通りに進めていく。申請者が所属する研究機関では進めることが難しい解析においては、共同研究をお願いする。研究費は薬品、ガラス器具、プラスチック器具等の消耗品に使用するとともに、共同研究先への出張旅費としても申請する。
外部労働市場の市場整備に向けた、民営職業紹介機関のマッチング研究

職業紹介機関のマッチング業務の現状と問題点を明らかにするため、営職業紹介会社から業務データを取得し、分析を行った。具体的には、候補者の仕事への応募と応募後の選考通過の各段階で、どのような要因がそれぞれの確率を高めているかについて、求人に記載された情報、求職者のレジュメに記載される情報、どちらにも記載されず人材紹介会社が独自に流通させている情報、の影響をプロビット分析によって検討した。分析の結果、「求人企業の社風情報」といった人材紹介会社が独自に用意し、一般的な求人票や求職者のレジュメには記載がないような情報が、応募確率や選考通過確率にも影響していた。これは求人・求職当事者の個別の質の違いをしめすような情報の整備、しかも第三者的に評価構築された情報を流通させることがマッチングの効率を高めることに繋がるであろうことを示唆する。また一般的な求人広告では、求人に年齢制限を置くことが禁じられているが、より求人内容や求人企業にマッチしやすい推奨年齢層が人材紹介会社独自の情報として整備されており、その影響も選考通過に重要な影響を与えていた。やはり求人によりマッチした年齢層と応募者の年齢層が近いということが、マッチ結果に重要であると考えられる。その他にも業界経験・職種経験・語学力といった変数の影響を確認したが、これらのようなスキルレベルを示す情報はあまり重大な影響を示しておらず、必ずしも求人業界や職種の経験者が採用されているわけではなかった。この結果は同じく民間人材紹介会社のデータを分析した阿部(2001)とも整合的な結果であった。
ピロリ菌病原因子CagAによる限定的脱分化を介した胃発がん分子機構の解析

cagA陽性ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)の慢性感染は、胃炎・化生・がんなどの胃粘膜病変発症と関連する。本研究では、マウス胃体部において、ピロリ菌病原因子CagAが幽門腺化生(SPEM)と定義される前がん粘膜病変を引き起こすことを明らかにした。また、胃上皮細胞において、CagAがE-cadherinの細胞内ドメインのリン酸化状態を異常に制御していることを明らかにした。これまでの研究から、ピロリ菌病原因子CagA発現に依存的なbeta-cateninの細胞核移行の原因として、CagAが引き起こすタイトジャンクション破壊の関与が推察されていた。そこで、正常な細胞極性を形成する培養細胞株であるイヌ腎尿細管上皮由来MDCK細胞株を用いてレンチウイルスの共感染実験系の樹立を目指しているが、現在までのところ感染効率が低く結論には至っていない。一方、胃上皮細胞においてbeta-cateninを細胞膜近傍に留め置くE-cadherinの修飾がCagA発現に伴い変化している現象を見出した。現在、この現象とbeta-catenin細胞核移行の関与について解析中である。タモキシフェン処理によりピロリ菌がんタンパク質CagAを誘導発現できるトランスジェニックマウス(CagA-Tgマウス)を用い、CagAを2か月誘導発現したマウス胃粘膜上皮を観察した。その結果、CagA発現が免疫組織染色により確認された胃体部周辺の上皮組織に化生性の変化が起きていることが明らかになった。この病変部はAlucian Blue染色陽性で、さらにTff2発現細胞が存在したことから、幽門腺化生(SPEM: spasmolytic polypeptide expressing metaplasia)であると判断した。マウス胃上皮では幽門腺化生から腸上皮化生への進展が報告されており、今後引き続きタモキシフェン処理後のCagA-Tgマウスの胃上皮を段階的に観察することで、ピロリ菌CagAに起因する多段階発がんの様子が解析できると期待している。現在、CagA依存的なCdx1異所性発現の有無、並びにCdx1による胃上皮細胞の限定的脱分化機構の解析を、CagA-Tgマウスの胃上皮組織を用いて進めている。昨年度までの研究で、ピロリ菌病原因子CagAを発現した胃上皮細胞株において、E-cadherinのリン酸化状態が著しく変化していることを明らかにした。そこで本年度は、そのリン酸化量の変化を引き起こす分子メカニズムを明らかにするため、種々のCagA変異体を用いて解析を行った。その結果、CagA依存的なE-cadherinのリン酸化量変化は、内因性ホスファターゼおよびキナーゼ両者の活性がCagAにより異常に調節されることで引き起こされていることが明らかになった。さらに、E-cadherinの変異体を用いた解析からは、CagA依存的にリン酸化状態が変化しているE-cadherin内のアミノ酸を複数同定することに成功した。それらのアミノ酸が位置する配列周辺は、E-cadherinの働きに重要な分子が結合するために必須な領域であり、そのリン酸化量の変化がE-cadherinと他分子との結合力、さらにはE-cadherinの働きに影響を及ぼすことが推察された。本研究を通して、胃発がんとの関連が強く示唆される分子であるE-cadherinの機能に重要なアミノ酸のリン酸化状態がピロリ菌病原因子CagAにより異常に調節されることを示した。この結果は、CagAを起点とした未知の胃発がんメカニズムの解明につながる可能性があり、今後さらに解析を進める予定である。また、CagAを誘導発現できるトランスジェニックマウスを用いた研究からは、CagAが胃上皮に前がん病変と考えられる化生性変化をもたらす能力を持つことをin vivoで明らかにした。この成果は今後、胃の多段階発がんの経過と分子機構を解明する上で重要な知見の一つになると考える。交付申請時に設定した平成26年度の研究計画2項目において、それぞれ当初の予定とは方策が少し変更になったが、本研究課題の最終目的達成に向けほぼ順調に進展し新たな知見が得られているため。分子腫瘍学CagAによるbeta-cateninの細胞核移行の分子機構解明を目指し、現在までに得られた新たな知見をもとにさらなる解析を行う。また、CagA発現依存的に幽門腺化生を引き起こすトランスジェニックマウスを用いてゲノム網羅的な解析を行い、本研究課題の最終目的達成を目指す。
高輝度放射光X線による三次元結晶方位解析手法の開発

金属をはじめとした多結晶材料の変形・破壊挙動解析のために,非破壊で試料内部の結晶方位を測定する手法の開発を行った。ヨーロッパと日本の放射光施設で実験することで,アルミニウム合金の結晶方位を測定した。三次元的な結晶方位分布と試料変形後のひずみを比較し,結晶方位による変形の不均一性を確認した。本研究では,三次元で金属材料の変形・破壊メカニズムを明らかにするために,高輝度な放射光を使ったコンピュータトモグラフィー(CT)と併用できる三次元結晶方位解析法を確立することが目的である。これまで三次元で結晶方位情報を含めて金属材料の変形・破壊を評価することは誰もできていない。本年度の具体的な研究実施事項は以下の通りである。日本の放射光施設SPring-8でAl-5wt%Cu合金のCTと共にX線回折実験を行った。通常CTに用いられている回転ステージやディテクター等で実際に回折実験が可能なことを確認した。得られたデータを元に, SPring-8における回折実験の画像データをハンドリング,実験結果を表示するソフトウエア群を開発準備した。7月から,豊橋技術科学大学若手研究者育成プログラムで,デンマークのRiso National Laboratoryに滞在した。この間に,研究協力者であるRiso National LaboratoryのD. J. Jensen氏とH. F. Poulsen氏の協力により,ヨーロッパEUの放射光施設ESRFのX線回折用ビームラインにて, SPring-8でCTした試料をX線回折実験した。ESRFにて先行開発されている結晶方位解析法を使い結晶方位マップを測定し,初めて同一試料でCTスライス像と結晶方位マップの対応を得た。さらに,金属材料学的に基本的な変形調査を可能とする試料(Al-2wt%Pb合金とAl-4wt%Pb合金)を作成し,放射光X線回折実験を行った。これらの試料は次年度にSPring-8で再び回折実験およびCT観察をしながら引張変形させる予定である。そのために放射光実験を計画,課題申請し,次年度のSPring-8のビームタイムを確保した。7月に日本の放射光施設SPring-8においてX線CTと3D-XRDの実験を実施した。3D-XRDは,前回の予備実験よりも高速スキャンが可能となるように実験条件やセットアップの最適化をおこなった。また,単結晶のアルミニウムワイヤーを用い,以前よりも高精度な位置合わせを試みた。試料のサイズやその位置,X線ビームの形状を変えて撮像を行う基礎的な実験も行った。多結晶材料の変形解析用に,数ミクロンサイズのPb粒子を含んだアルミニウム合金を作製し,3D-XRDとCTの実験を行った。得られたデータは,本研究で開発した解析ソフトウエアおよびヨーロッパの放射光施設ESRFで利用されている解析ソフトウエアを利用して処理し,そして,明瞭なX線回折スポットが得られた限られた結晶粒だけではあるが,結晶方位を導出した。ひずみ分布や結晶方位等を画像で示すソフトウエア開発も行い,データ処理環境の充実も図った。X線CTによるひずみマップと比較し,不均一変形の様子を観察した。本研究に関して,日本鉄鋼協会材料の組織と特性部会,軽金属学会秋季講演大会,SPring-8金属材料評価研究会で講演を行った。
単一中枢シナプスにおける伝達制御機構の解析

哺乳類中枢神経系内シナプスの機能と形態の性質およびそれらの相関を単一シナプスレベルで解明することをめざし、海馬錐体細胞と小脳プルキンエ細胞上に形成されるグルタミン酸作動性興奮性ミナプスを比較研究した。海馬のシナプスにおいては、シナプス応答の強さとシナプス後部スパインの大きさが相関し、小脳シナプスにおいてはシナプス前膨大とシナプス後スパインの大きさが相関するなど、両シナプスの違いが明らかになった。本研究では、哺乳類中枢神経系の単一シナプスの機能と形態の動態を明らかにし、その制御機構の解明をめざしている。中枢シナプスのはたらきは、その使用状況により維持・強化・減弱されるが、個々のシナプスレベルで何が起こっているかは明らかになっていない。シナプスを形成する一対の培養神経細胞に異なる波長の蛍光色素を導入し、高解像度のレーザー顕微鏡によるシナプス前後部両者の形態観察と電気生理学計測を組み合わせ、各シナプスが無刺激・高頻度刺激等の様々な状況に応じて、その機能および形態をいかなる時間経過でどのように変化させるのか解析している。本研究では、細胞種の同定が容易な小脳の顆粒細胞とプルキンエ細胞間のシナプスに注目し、顆粒細胞には蛍光蛋白質のGFPを発現させ、シナプス後プルキンエ細胞にはAlexa594をガラス電極より注入し、シナプスを形成している一対の神経細胞を可視化した。軸索での活動電位発生をテトロドトキシンで抑えた状況で顆粒細胞シナプス前終末付近を局所電気刺激することにより、少数シナプスでの伝達を記録できた。また、高頻度刺激によりシナプス伝達の長期増強を引き起こした。シナプス後部があるプルキンエ細胞のスパイン形態が、刺激によりいかなる形態変化をするかも解析し、神経刺激によりスパインの動きが変化することを観察した。また、シナプス後部において伝達制御に関わるタンパク質リン酸化酵素のPKCαの動態を調べ、PKCαが神経刺激によりカルシウムイオン依存的に細胞膜へ移行すること等を論文報告した。シナプスを形成する一対の培養神経細胞に異なる波長の蛍光色素を導入し、高解像度のレーザー顕微鏡によるシナプス前後部両者の形態観察と電気生理学計測を組み合わせ、各シナプスが無刺激・高頻度刺激等の様々な状況に応じて、その機能および形態をいかなる時間経過でどのように変化させるのかを解析している。本研究では、細胞種の同定が容易な小脳の顆粒細胞とプルキンエ細胞間のシナプスに特に注目した。顆粒細胞には蛍光蛋白質のGFPを発現させ、またシナプス後プルキンエ細胞にはAlexa594をガラス電極より注入し、シナプスを形成している一対の神経細胞を可視化した。軸索での活動電位発生をテトロドトキシンで抑えた状況で、顆粒細胞シナプス前終末付近を局所電気刺激することにより、少数シナプスで発生したシナプス電流を記録できた。同じ刺激を何回も繰り返してシナプス応答を多数回記録して、シナプス応答のユニットを求めた。そうしたところ、単一シナプス小胞により引き起こされたと考えられる単位シナプス応答の大きさおよび時間経過が、シナプスごとでかなりばらつくことが判明した。シナプス応答の特徴とシナプスの位置・形態との相関を調べることにより、シナプス応答の多様性の原因の解析を行っている。また、プルキンエ細胞上に形成される抑制性シナプスでの伝達制御に、GABA受容体および微小管形成タンパク質であるチュブリンと結合するGABARAP、および代謝型グルタミン酸受容体mGluRlが関与すること等、も明らかにした。哺乳類中枢神経系の単一シナプスの機能と形態の動態を明らかにして、その制御機構を解明することをめざした。中枢神経系内の個々のシナプスレベルでの多様性の実状は明らかになっていない。シナプスを形成する一対の培養神経細胞に異なる波長の蛍光色素を導入し、高解像度のレーザー顕微鏡によるシナプス前後部両者の形態観察と電気生理学計測を組み合わせ、各シナプス応答の多様性とその機能および形態制御を解析した。まず、細胞種の同定が容易な小脳の顆粒細胞とプルキンエ細胞間のシナプスに注目した。軸索での活動電位発生をテトロドトキシンで抑えた状況で、顆粒細胞シナプス前終末付近を局所電気刺激することにより、少数シナプスで発生したシナプス電流を記録した。そして、シナプス応答の特性とシナプス形態の解析を行った。

各シナプス応答の特徴とシナプスの位置・形態との相関を調べた。また、海馬の興奮性シナプスに関しても同様の解析を行った。小脳と海馬の興奮性シナプスの比較により、海馬ではシナプス応答の大きさとシナプス後部のスパイン構造の大きさに相関が認められたが、小脳の顆粒細胞・プルキンエ細胞間シナプスではそうした相関が認められないこと等が明らかになった。
脳卒中後疼痛の発症機序の解明と治療戦略の開発

脳卒中患者の約14%に発症する難治性の後遺症である脳卒中後疼痛に対する新規治療法の提案を目的として研究を行っている。脳卒中後疼痛は、神経障害性疼痛の一つとして分類され、神経障害性疼痛治療ガイドラインに準じた薬物治療や外科的治療が行われているが、根治させることは困難である。そこで、我々が確立した脳卒中後疼痛を評価するモデル動物を用い、発症機序に関する因子の探索を行っている。
異種細胞質の導入によるナス雄性不稔系統の育成

ナスは主要品種の多くが一代雑種であるので、雄性不稔の利用は品種育成に多大な貢献をするものと考えられるが,現在までに実用化可能な優れた雄性不稔系統は育成されていない.本研究では,ナスの細胞質雄性不稔系統を育成することを目的として,該置換法および細胞融合法などの細胞工学的手法を用いて近縁野性種の細胞質のナスへの導入を試みるとともに,異種細胞質の雄性不稔関連の形質への影響も調査した.複数のナス近縁野生種を用いて異質細胞質系統の作出を試みた結果,Solanum indicum L.を種子親とし,栽培ナスS,。melongena L.'Uttara'を反復親(花粉親)として作出した戻し交雑第1代(B_1)の約50実生の中で雄性不稔性でかつ雌性可稔性の系統を1個体(以下MS1と記す)見い出した.MS1の雄性不稔性は,稔性花粉を生産するが葯の奇形のために花粉が放出されないものであった.一般に葯の奇形に起因する雄性不稔性は環境条件などに影響される不安定なものである場合が多い.しかし,MS1の雄性不稔性は長期にわたって安定した発現を示したことから,この雄性不稔性の実用価値がきわめて高いことが判明した.本研究によって,ナスの実用的な雄性不稔系統の育成のための育種素材としてきわめて貴重であると考えられる個体MS1を作出することができたとともに,MS1を利用したナスの雄性不稔系統育成への道が開かれた.ナスは主要品種の多くが一代雑種であるので、雄性不稔の利用は品種育成に多大な貢献をするものと考えられるが,現在までに実用化可能な優れた雄性不稔系統は育成されていない.本研究では,ナスの細胞質雄性不稔系統を育成することを目的として,該置換法および細胞融合法などの細胞工学的手法を用いて近縁野性種の細胞質のナスへの導入を試みるとともに,異種細胞質の雄性不稔関連の形質への影響も調査した.複数のナス近縁野生種を用いて異質細胞質系統の作出を試みた結果,Solanum indicum L.を種子親とし,栽培ナスS,。melongena L.'Uttara'を反復親(花粉親)として作出した戻し交雑第1代(B_1)の約50実生の中で雄性不稔性でかつ雌性可稔性の系統を1個体(以下MS1と記す)見い出した.MS1の雄性不稔性は,稔性花粉を生産するが葯の奇形のために花粉が放出されないものであった.一般に葯の奇形に起因する雄性不稔性は環境条件などに影響される不安定なものである場合が多い.しかし,MS1の雄性不稔性は長期にわたって安定した発現を示したことから,この雄性不稔性の実用価値がきわめて高いことが判明した.本研究によって,ナスの実用的な雄性不稔系統の育成のための育種素材としてきわめて貴重であると考えられる個体MS1を作出することができたとともに,MS1を利用したナスの雄性不稔系統育成への道が開かれた.