hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
健康的日本食の構築を目指した食物・栄養と動脈硬化性疾患に関するコホート研究

地域住民コホート研究において食事パターンと冠動脈疾患・脳卒中の罹患・死亡リスクとの関連を検討した。対象は平成1619年の基礎調査に参加した約13,000名である。5年後2次調査と死因調査により罹患症例を把握した。主成分分析により健康的食事パターン、動物性食事パターン、洋朝食パターンの3つが同定された。いずれの食事パターンも冠動脈イベント、脳卒中イベント、冠動脈死亡とは関連していなかった。動物性食事パターン、肉類、緑茶が脳卒中死亡リスクの低下と関連していた。日本人の健康な食事の構成要素としては、野菜、果物、きのこ、海藻、大豆製品、魚、緑茶に加えて、適度の肉摂取を考慮する必要がある。平成26年度は、わが国に特有な食品である大豆食品、緑茶等に注目して、食品群・栄養素の摂取と動脈硬化性疾患リスクとの関連を明らかにする計画を立てた。動脈硬化性疾患としては、心筋梗塞、冠動脈再建術施行および脳卒中を対象とした。前者2つを冠動脈疾患イベントとしてまとめた。コホート参加者は49ー76歳の男女12,948名である。ベースライン時点で解析対象疾患の既往を有していた者、血清クレアチニンが2 mg/dLを超えていた者、性別・年齢5歳階級別のエネルギー摂取量が上下各1%の者および調整要因が欠損値であった者を除外した。解析対象は合計で11,491名であった。冠動脈疾患イベントと脳卒中イベントはそれぞれ352例と249例であった。食品群摂取量およびエネルギー調整栄養素摂取量の4等分位で4群に分け、イベント発生リスクを比較した。性別、年齢5歳階級、喫煙(4分類)、飲酒(5分類)、BMI(4分類)、仕事の身体活動(性別4等分類)、余暇の運動(性別4等分類)及びエネルギー摂取量(性別4等分類)を統計学的に調整した。食品・食品群として、米飯、大豆製品、野菜、果物、魚、緑茶及びコーヒーとの関連を検討した。栄養素ではビタミンB群(B6、B12および葉酸)ならびにビタミンD摂取量との関連を検討した。冠動脈疾患イベント、脳卒中イベントおよび両者を合わせた動脈硬化性疾患イベントをアウトカム変数とした。検討した食品群および栄養素のいずれもアウトカム変数と統計学的に有意な関連を示さなかった。性別と年齢以外の調整要因のうち、喫煙、肥満は冠動脈疾患イベントのリスク増加と関連し、飲酒はリスク低下と関連していた。脳卒中イベントについても喫煙と肥満はリスク増加と関連していたが、飲酒とは関連がみられなかった。個別食品単独の影響は小さいと考えられる。食品の組み合わせ(食事パターン)との関連に関心がもたれる。本研究の目的は、地域住民コホート研究において、栄養素・食品群摂取および食パターンと動脈硬化性疾患リスクとの関連を系統的に検討し、健康的日本食の概念を構築することである。福岡市東区在住の49ー76歳の男女12948名が参加した九州大学福岡コホート研究の2次調査データを活用して、食事パターンと冠動脈疾患イベント及び脳血管疾患イベントとの関連を検討した。ベースライン時点で解析対象疾患の既往を有していた者等を除外し、解析対象は約11,500名であった。平均5.3年の追跡期間の冠動脈疾患イベントは350例余り、脳血管疾患イベントは250例であった。統計解析では性別、年齢5歳階級、エネルギー摂取量(性別4等分類)等を調整した。29の食品群の主成分分析では3つの食事パターンが同定された。第1パターンは、野菜、果物、海藻、きのこ、大豆製品、魚および緑茶の高摂取で特徴づけられる食事パターン(健康食パターン)であった。第2パターンは、牛肉・豚肉、肉加工品、鶏肉、卵などの動物性食品の高摂取で特徴づけられた(高脂肪食パターン)。第3パターンは、パン、緑黄色野菜、野菜ジュース、果物ジュースおよびヨーグルトの高摂取で特徴づけられた(洋朝食パターン)。しかし、いずれの食事パターンも冠動脈イベントあるいは脳血管疾患イベントとの関連を示さなかった。もう一つの手法であるreduced rank regression(RRR)解析では、血圧、血清non-HDLコレステロールおよびHbA1cをリスク予測指標(応答変数)とした。最大で3つの因子が抽出されることになるが、これら3因子による変動の説明割合は食品群摂取に対して12%、応答変数に対して2%であった。応答変数に対する寄与度が小さく、各食品群の影響度もはっきりしなかったので、RRR抽出食事パターンと疾患リスクとの関連は検討を控えた。計画どおりに食事パターン解析をおこない、動脈硬化性疾患リスクとの関連を検討した。主成分分析で同定された3つの食事パターンはいずれも冠動脈疾患リスクあるいは脳血管疾患リスクと関連していなかったが、野菜、果物、海藻、きのこ、大豆製品、魚および緑茶の高摂取で特徴づけられた食事パターンは日本人の健康的な食事パターンとして注目される。RRRの解析結果を含め、論文投稿の準備を進めている。平成28年度は、主成分分析食事パターンと冠動脈死亡リスクおよび脳卒中死亡リスクとの関連を検討した。コホート参加者は49ー76歳の男女12948名であるが、性別・年齢5歳階級別のエネルギー摂取量が上下各1%の者および調整要因が欠損値であった者を除外し、12668名を解析対象とした。国外移住の6名を除き、全員について2013年12月末現在の消息が確認された。2013年12月末までの死亡は合計641例であった。

平均観察年数は8年であった。動脈疾患による死亡は19例、脳卒中による死亡は38例であった。食事パターンスコアあるいは食品群摂取量の4等分位で4群に分け、ハザード比を比較した。性別、年齢5歳階級、喫煙(4分類)、飲酒(5分類)、肥満度(4分類)、仕事の身体活動(性別4等分類)、余暇の運動(性別4等分類)及びエネルギー摂取量(性別4等分類)を統計学的に調整した。また、冠動脈疾患、脳卒中およびがんの既往の有無を調整要因として加えた。29の食品・食品群の摂取量に基づき主成分分析を実施し、3つの食事パターンが同定された。第1成分は、大豆製品、野菜、果物、きのこ、海藻、魚および緑茶の高摂取で特徴づけられる食事パターンで、健康的食事パターンと解釈された。第2成分は、牛肉・豚肉、肉加工品、鶏肉、卵などの高摂取で特徴づけられ、動物性食事パターンと解釈された。第3成分は洋朝食パターンであり、パン、緑黄色野菜、野菜ジュース、果物ジュースおよびヨーグルトの高摂取で特徴づけられた。これらの食事パターンのいずれも冠動脈死亡リスクとの関連を示さなかった。脳卒中死亡リスクは動物性食事パターンのスコアが高いほど低下していた。米飯、大豆製品、野菜、果物、魚、肉類、牛乳、緑茶およびコーヒーとの関連を個別に検討したところ、肉類および緑茶飲用と関連した脳卒中死亡リスクの低下が観察された。地域住民コホート研究において食事パターンと冠動脈疾患・脳卒中の罹患・死亡リスクとの関連を検討した。対象は平成1619年の基礎調査に参加した約13,000名である。5年後2次調査と死因調査により罹患症例を把握した。主成分分析により健康的食事パターン、動物性食事パターン、洋朝食パターンの3つが同定された。いずれの食事パターンも冠動脈イベント、脳卒中イベント、冠動脈死亡とは関連していなかった。動物性食事パターン、肉類、緑茶が脳卒中死亡リスクの低下と関連していた。日本人の健康な食事の構成要素としては、野菜、果物、きのこ、海藻、大豆製品、魚、緑茶に加えて、適度の肉摂取を考慮する必要がある。平成26年度は、わが国に特有な食品である大豆食品、緑茶等に注目して、栄養素・食品摂取と動脈硬化性疾患リスクとの関連を検討する計画を立てた。統計解析の方法を確定し、解析を終了したが、論文投稿に至っていない。食事パターンと動脈硬化性疾患リスクに関する学術論文を完成させ、学術誌掲載の作業を進める。本研究において示された健康的食事パターンの構成食品は、これまでにわが国において報告されている健康的食事パターンの構成食品に近いものであり、日本人の健康な食事の構築に資するものである。本研究の結果だけから、日本人の健康的食事パターンが動脈硬化性疾患リスクに関与していないと結論することは困難である。他の研究結果等を参考にして、最終的な結論を出す。平成28年度には、食事パターンと死亡リスクとの関連を検討する計画である。28年度が最終年度であるため、記入しない。疫学・公衆衛生食品群・栄養素と動脈硬化性疾患リスクに関する学術論文を完成させ、学術誌掲載の作業を進める。
受動免疫によるう蝕予防を目的とし大S.mutans 卵黄抗体の開発

S.mutansのう蝕原性の発現に際し,S.mutansに特有な菌体結合性でかつ非水溶性グルカン合成能を有するグルコシルトランスフェラ-ゼ(CA-GTase)の作用を調べるため,CAーGTaseに対する卵黄抗体を作製し,同抗体によるう蝕抑制効果をinvitroおよびラット実験う蝕系で調べた。CAーGTose,水容性グルカン合成酵素(CFーGTase),およびS.mutans全菌体(WC)に対する卵黄特異抗体は、各々の抗原を18週齢のニワトリの胸筋にフロイントの完全アシュバントと共に免疫して行った。被免疫ニワトリの卵を集め,卵黄をクロロホルム処理による脱脂後,IgGを含む水溶性タンパク画分を凍結乾燥したものを実験に供した。in vitro試験には、この粗標品を硫安分画とDEAEーSephacelのカラムで精製したIgG画分を用いた。SPFのSDラットに,S,mutans MT8148R株を成染させ,同時に乾燥卵黄特異抗体を配合したう蝕誘発性飼料2000を自由に摂取させた。S.mulans感染55日後にラットを屠殺し,プラ-ク指数とう蝕スコアを算出した。その結果,CAーGTase活性は抗CAーGTase,抗WC抗体により著明に阻害された。グルカンを介じたS.mutans菌体の試験管壁への付着は,抗CAーGTase,抗WC抗体により顕著に阻害された。またCAーGTase,GFーGTase,およびWCに特異的な抗体を含む飼料をS.mutans感染ラットに投与すると、抗CAーGTase抗体配合群のみが対照群に比べ、プラ-ク指数,う蝕スコアともに有意に低下した。次に抗CAーGTase抗体の最少有効量を調べるため,0.025%から1%までの濃度で飼料に配合したと,3,0.1%以上の抗体を配合した群において,プラ-ク指数および蝕スコアの有意の低下が認められた。以上の結果は、抗CAーGTase卵黄特異抗体による経口受動免疫が、う蝕の与防に有効方な手段となりうる可能性を示唆している。鶏に免疫を行うと卵黄内に抗体が濃縮生成される現象に着目し、う蝕原性細胞Streptococeus mutansに対する卵黄抗体のう蝕抑制作用をin vitroの実験系で調べた。S.mutansの全菌体、菌体表層タンパク抗原(SAI/II)、菌体結合型グルコシルトランスフェラ-ゼ(CA-GTase)および菌体遊離型GTase(CF-GTase)をフロインドの完全アジュバンドとともに産卵鶏に免役すると、卵黄中に各抗原に対する特異的な抗体が検出された。この卵黄をクロロホルム処理することにより脂質を除去し、水容性画分(WSF)標品をえた。このWSF標品を硫酸アンモニウムで塩析し、イオン交換クロマトクラフィ-によって精製したものを、精製卵黄抗体(IgY)とした。非免疫鶏卵により調製したWSFおよびVIgY標品は、二種類のGTasesによるスクロ-スからのグルカノ合抑を阻害せず、むしろ促進した。しかしCA-GTaseとCF-GTaseに対するWSFおよびIgYは、ともに明瞭なグルカノ合成阻害作用を示した。またS.mutans菌体のスクロ-ス依存性付着に対しても、CA-GTaesおよび全菌体に対するWSFは、強い抑制作用を示した。

これらの所見は、卵黄抗体、特にCA-GTaseに対する抗体が、S.mutansのう蝕原性をになうGTasesによるグルカノ合成と、それに伴うS.mutans菌体の平滑面付着を効果的に阻害し、う蝕に対する受動免疫法として利用できる可能性が高いことを示している。S.mutansのう蝕原性の発現に際し,S.mutansに特有な菌体結合性でかつ非水溶性グルカン合成能を有するグルコシルトランスフェラ-セ(CAーGTase)の作用を調べるため,CAーGTaseに対する卵黄抗体を作製し,同抗体によるう蝕抑制効果をラット実験う蝕系で調べた。CAーGTase,水溶性グルカン合成酵素(CFーGTase)およびS.mutans全菌体(WC)に対する卵黄特異抗体は,各々の抗原を18週齢のニワトリの胸筋にフロイントの完全アシュバントと共に免疫して行った。被免疫ニワトリの卵を集め,卵黄をクロロホルム処理による脱脂後,IgGを含む水溶性タンパク画分を凍結乾燥したものを実験に供した。SPFのSDラットに,S.mutans MT8148R株を感染させ,同時に乾燥卵黄特異抗体を01%配合したう蝕誘発性飼料2000を自由に摂取させた。S.mutans感染55日後にラットを屠殺し,プラ-ク指数とう蝕スコアを算出した。その結果,CAーGTase,CFーGTaseおよびWCに特異的な抗体を含む飼料をS.mutans感染ラットに投与すると,抗CAーGTase抗体配合群のみが対照群に比べ,プラ-ク指数,う蝕スコアともに有意に値下した。次に抗CAーGTase抗体の最少有効量を決定するために,0.025%から1%までの濃度で飼料に配合し,そのう蝕抑制効果を検討した。その結果,01%以上の抗体を配合した群において,プラ-ク指数,う蝕スコアの有意の低下が認められた。以上の結果は,抗CAーGTase卵黄特異抗体による経口受動免疫が,う蝕の予防に有効な手段となりうる可能性を示唆している。
高齢世帯の防犯安全環境の研究

母都市から約40分の私鉄沿線の郊外に約40年前に開発された戸建住宅団地の独居高齢者宅への訪問者の種類や時間帯と訪問客への応対、訪問者の行動、インタホンに写る写真画像などのデータを訪問者のある毎に得、これらのうち、居住者がその度に感じる訪問者に対する不安感と関係がある項目について、決定木(CART)を用いた分析を行った。訪問者に対する不安感では、訪問者に対する「応対/インタホンのみ」「立っている位置/90cm以上インタホンの前から離れている、もしくは、訪問者が見えない」「門扉から玄関までの通路距離/1m-3m」の場合に、独居高齢者の不安感が大きくなることを明らかにした。また、「インタホンの前での立ち位置/90cm以上インタホンの前から離れている、もしくは、訪問者が見えない」から分岐した「門扉から建物までの最短距離」では2mより遠くなると独居高齢者の不安感が大きくなることを明らかにした。いずれも、訪問者の姿が見えにくくなるとの不安感と言える。これとは逆に、「門扉から玄関までの通路距離」の場合、4mより遠くなるほど安心が増えることを明らかにした(門扉から玄関までの距離は、近い方が不安感は大きくなる)。これは、訪問者が玄関に近づきやすくなるとの懸念が不安感を大きくしていると考えられる。この他にも、訪問者の背後に自動車が見えるか否かの項目では、営業以外の自動車がある、もしくは、自動車がない場合、不安が多く、これに対して営業の自動車がある、見えないでは、不安感が少なくなっていることを明らかにした。訪問者の姿の項目は、最終の葉ノードに表れ、「門扉と建物までの最短距離」から分岐した「顔の向き」は、顔が横向き、もしくは見えない、より、顔が正面になっている方は、居住者の安心感が非常に高くなっていた。私鉄沿線の郊外に造成、開発された戸建て住宅団地のうち、開発から約20年(A団地)、30年(B団地)、40年(C団地)を各々経過した計3団地を神戸市北部に選定し、個別の住宅でとっている防犯対策、防犯に関する意識などについてアンケート調査、個別の住宅を訪問してのインタビュー調査を行った(防犯に関するアンケートのため、当該団地からの調査許可が出るまで想定外の長時間を要し、調査実施が12月になった)。調査対象戸数は合計3,293戸、調査票は郵送回収を1月末まで待ち、調査票回収総数738票、回収率は、22.4%となった(55歳以上の回答はA,B団地で各々、170,183。インタビュー協力住戸は2戸)。3月時点でこの基本集計を終えている。次年度はこのデータを用い、多変量解析などの詳細分析を進める予定である。一方で、次年度以降に調査予定の、個別住宅への訪問客の記録、及びそれへの個別の対応とその時々の意識の変化などを記録する機器などの開発を機器開発会社を通じて進めている。アンケートの基本集計では、防犯対策にかけてよいと回答のあった経費では、初期投資、年間経費がともに5千円1万円が最も多く、初期投資ではこれに5万円10万円までが続いていた。また、防犯対策として設置する器具のうち、センサー付きライト、TVモニタ付きインタホンは団地の開発からの年数が経過する事に設置割合が下がっている。前者では設置している住戸の割合は、A団地で30%近くあり、これがC団地では20%に落ちている。後者では同じくA団地で38%がC団地では22%となっていた。居住者の高齢化の進行とともに、防犯機器の設置が進んでいない状況が明らかになった。訪問客への応対でも、経過年数の増加とともに、玄関に出ての応対以上を回答が増えている(C団地で訪問販売への応対で30%)ことなども明らかになった。母都市から30-40分の私鉄沿線の郊外に造成、開発された戸建住宅団地のうち、開発から約20年、30年、40年を経過した3団地の個別の住宅でとっている防犯対策や費用など2005年度に実施した調査で得たデータをもとに、訪問販売への心配、空巣への心配との判断を左右する項目を、決定木(CHAID)を用いて明らかにした。空巣への心配では、「町の防犯安全性」「空巣や盗難などの何らかの被害があるか否か」「緊急時に友人・知人が来るか否か」の判断が、いずれも3度「空巣への心配」の有無での分岐に用いられており、これらの判断が空巣への心配を左右すること、また、交差検証後の正答率もいずれの団地でも高い値を示すことを明らかにした。訪問販売への心配では、「玄関で簡単な話だけ聞いて帰ってもらう、玄関先で長時間話を聞いてしまう」で「訪問販売への心配/有」の割合が非常に大きくなっていることを明らかにした。上記のような応対で、訪問販売への心配の割合が高くなることは容易に想像がつくが、これと日中に長時間いる部屋が居間のある階の個室以外である場合などに、訪問販売への心配の占める割合が、調査対象の全体での割合よりも大きくなっていたことは注目に値する。TVモニタ付インタホンの防犯機器の有無や設置期間、その初期投資金額などは、空巣への心配、訪問販売への心配に対する判断を左右する事項とはなっていなかった。

防犯対策の年間経費を0円より多く支払うグループで、また、センサー付ライトの設置期間では3年より長い場合に、空巣への心配への心配が相対的に多くなることも明らかにした。また、2006年度開始した高齢世帯の住居を訪れる人の種類や時間帯と訪問客への応対、その時々の防犯に対する意識などを継続的に記録する調査のうち、冬に実施したデータの分析(訪問者の種類やその応対と防犯に対する意識との関係)を始めた。これについては2007年度も調査を継続実施し、研究をとりまとめている。母都市から約40分の私鉄沿線の郊外に約40年前に開発された戸建住宅団地の独居高齢者宅への訪問者の種類や時間帯と訪問客への応対、訪問者の行動、インタホンに写る写真画像などのデータを訪問者のある毎に得、これらのうち、居住者がその度に感じる訪問者に対する不安感と関係がある項目について、決定木(CART)を用いた分析を行った。訪問者に対する不安感では、訪問者に対する「応対/インタホンのみ」「立っている位置/90cm以上インタホンの前から離れている、もしくは、訪問者が見えない」「門扉から玄関までの通路距離/1m-3m」の場合に、独居高齢者の不安感が大きくなることを明らかにした。また、「インタホンの前での立ち位置/90cm以上インタホンの前から離れている、もしくは、訪問者が見えない」から分岐した「門扉から建物までの最短距離」では2mより遠くなると独居高齢者の不安感が大きくなることを明らかにした。いずれも、訪問者の姿が見えにくくなるとの不安感と言える。これとは逆に、「門扉から玄関までの通路距離」の場合、4mより遠くなるほど安心が増えることを明らかにした(門扉から玄関までの距離は、近い方が不安感は大きくなる)。これは、訪問者が玄関に近づきやすくなるとの懸念が不安感を大きくしていると考えられる。この他にも、訪問者の背後に自動車が見えるか否かの項目では、営業以外の自動車がある、もしくは、自動車がない場合、不安が多く、これに対して営業の自動車がある、見えないでは、不安感が少なくなっていることを明らかにした。訪問者の姿の項目は、最終の葉ノードに表れ、「門扉と建物までの最短距離」から分岐した「顔の向き」は、顔が横向き、もしくは見えない、より、顔が正面になっている方は、居住者の安心感が非常に高くなっていた。
窒素転流と光合成機能に関わるRubisco分解の分子機構

コムギ葉を材料に葉緑体を単離・精製し,その破壊液を用いてRubiscoの分解について調べた。その結果,Rubiscoの大サブユニットが光照射下において37kDa,16kDaのペプチドへと断片化されることを見い出した。同様な図りに依存した分解はホウレンソウ,エンドウ葉から精製した葉緑体を用いた実験においても確認された。さらに単離葉緑体を用いて活性酸素消去系酵素の阻害剤のKCN,NaN_3存在下,光照射したところ同様なRubiscoの分解が見い出された。これらの活性酵素の関与を示唆するデーターを裏ずけるためRbiscoを精製し,注性酸素種の一つであるヒドロキシルラジカルにさらしたところ,葉緑体およびその磨砕液での分解と全て同様に分解された。また切断部位をN末端,C末端分析に供したところ,破砕液で見い出された断片化の部位を精製Rubiscoを活性酸素にさらした場合の部位は完全に一致した。またこの分解がカルボキシレーション反応の中間体アナログCABPにより阻害されることを見い出したコムギ葉を材料に葉緑体を単離・精製し,その破壊液を用いてRubiscoの分解について調べた。またこの分解がカルボキシレーション反応の中間体アナログCABPにより阻害されることを見い出した
相対論的ジェットの内部構造の理論的研究

1.内部構造が非一様性を含む場合、フレア時に放出された光子のエコーが起こりえること、これによりいくつかのブレーザーで観測されたOrphan TeVフレアを説明できることを論じた。2.相対論的ジェットの見かけの構造は輻射の伝播速度とジェットの運動速度にわずかな差しかないことから、ジェットの縦方向および横方向の構造、時間発展に仕方に複雑に依存している。相対論的に運動する有限の大きさをもった輻射領域を考え、電子の冷却時間の差を考慮すると、X線、可視光、電波でのノット位置の系統的なずれを説明できることを示した。3.ジェット中の磁場の向きと観測される偏光ベクトルの向きの関係が相対論的運動によってどう変化するかを解明し、偏光ベクトルの向きが放射領域の固有系での磁場の天球面内成分に垂直であることに基づいて、偏光角の統計的性質を調べ、ジェット固有系においても磁場の向きは運動方向にたいし垂直な成分が優勢でなければならないことを明らかにした。また、ヘリカル磁場モデルに非対称性を加えた場合の偏光角のモデル計算を行った。4.無衝突衝撃波による電子加速過程を検討した。一次元と異なり二次元では波乗り加速が起こらないことを示した。また、イオンビームが存在する状況のもとでのプラズマ不安定を検討し、二次元的なブーネマン不安定やイオン音波不安定の性質を調べ、イオン二流体不安定の成長率が高いことを発見した。5.二つのプラズマ成分が相対速度を持って運動している場合の、クーロン衝突によるエネルギーと運動量の交換率を計算し、数値計算に使用できるような近似式の作成を行い、これを用いてジェット形成のシミュレーションを行った。1.相対論的ジェットの内部構造の基準モデルとして、開口角の大きい準相対論的な流れの中を相対論的速度のジェットが噴出しているというモデルを設定し、以下の検討を開始した。(1)ジェット中の磁場の向きと観測される偏光ベクトルの向きの関係が相対論的運動によってどう変化するか。(2)ジェットの見かけの構造が、ジェットの縦方向および横方向の構造をどう反映するか。この二つの点はこれまでの観測の解釈で深く検討されては来なかったが、いずれも相対論的運動の効果が大きいことが判明した。より検討を進めて、最終年度に取りまとめる。2.内部構造が非一様性を含む場合、フレア時に放出された光子のエコーが起こりえること、これによりいくつかのブレーザーで観測されたOrphan TeVフレアを説明できることを論じた。3.ジェットのX線放射機構としてこれまでシンクロトロン放射と逆コンプトン散乱が考えられてきたが、非常に小さなスケールの磁場が存在するときにはジッター放射も寄与しうることに着目して検討を開始した。4.衝撃波による電子加速過程を検討した。従来の一次元シミュレーションでは波乗り加速が起こるとされてきたが、二次元シミュレーションでは波乗り加速が起こらないことを示した。5.マックスウエル分布をした二つのプラズマ成分が相対速度を持って運動している場合の、クーロン衝突によるエネルギーと運動量の交換率を計算し、ジェットの力学の数値計算に使用できるような近似式の作成を行った。1.相対論的ジェットの見かけの構造は輻射の伝播速度とジェットの運動速度にわずかな差しかないことから、ジェットの縦方向および横方向の構造、時間発展に仕方に複雑に依存している。2.ジェット中の磁場の向きと観測される偏光ベクトルの向きの関係が相対論的運動によってどう変化するかを解明し、偏光ベクトルの向きが放射領域の固有系での磁場の天球面内成分に垂直であることに基づいて、偏光角の統計的性質を調べた。

ジェット軸に沿った偏光角が卓越するためには、ジェット固有系においても磁場の向きは運動方向にたいし垂直な成分が優勢でなければならないことを明らかにした。従来のヘリカル磁場モデルの偏光角にたいする予言は対称性の制限が結果を決めているので、非対称性を加えた場合の偏光角のモデル計算を行った。3.無衝突衝撃波による電子加速過程を検討した。イオンビームが存在する状況のもとでのプラズマ不安定を検討し、二次元的なブーネマン不安定やイオン音波不安定の性質を調べた。電子温度が高い場合には従来調べられてきたイオン音波不安定よりも、イオン二流体不安定の成長率が高いことを発見し、粒子シミュレーションでも確認した。この結果電子の加熱が制限され、従来の電子過加熱問題を回避できることを示した。
胃癌腹腔洗浄液および末梢血中癌細胞の検出と遺伝子解析を用いた術前化学療法薬剤選択

胃癌患者血中癌細胞(CTC)などの高感度検出法の開発により、腫瘍の悪性度診断、術前化学療法の抗癌剤感受性予測法を確立、臨床応用を目指した。フィルター型CTC分離デバイスを試作、また担がんCTCマウスモデル系を開発した。これらを用いて抗癌剤(パクリタキセル)治療を行った担がんマウスからの血中CTCの測定をしたところ、M期arrestが観察され、腫瘍の薬剤感受性をCTCの形態から評価できる可能性を明らかにした。また臨床研究では本CTC分離デバイスは従来の方法に比べ、より高感度に消化器がん患者の血中CTCを検出できることを明らかにしつつあり、血液による遺伝子解析、薬剤感受性評価の可能性を示唆した。1末梢血中循環がん細胞(CTC)および腹腔洗浄液中がん細胞の検出と一細胞遺伝子解析今年度はサイズ依存性のフィルター型デバイスとして細胞毒性の低い金属パラジウム(Pd)に用いた3D型Pd電鋳フィルターデバイスを試作した。正常血液に培養がん細胞を添加したSpike実験により本フィルター型デバイスは85%以上の回収率を有すること、染色時間を含めてCTC数を迅速(1.5時間)に計測できることを確認した。次に再現性良くCTCをいつでも採取できる担がんマウスCTCモデルを開発した。このマウス血液を上記CTC分離デバイスにアプライしたところ、数個から数十(百)個とばらつきはあるものの、CTCを感度よく検出できた。このCTCマウスモデルを用いて検討した結果、CTC数は転移の進展に伴い増加することが判明し、CTC検出が転移の早期診断に有用である可能性を明らかにした。さらに上記CTC分離デバイスで単離した癌細胞の1(稀少)細胞遺伝子解析法について検討した。Ovation picoRNA増幅法をもちいて1数個の細胞からRNAを抽出、RT-PCR法により5種類程度の遺伝子発現解析に成功した。また、GenomePlex Single Cell WGA Kitを用いて全ゲノムDNAを抽出し、この1数個の細胞からKRAS変異などの解析に成功した。以上の結果から本デバイスを用いてCTCを高感度に検出・分離することにより患者にとって低侵襲に採取できる検体として、いわゆるLiquid biopsyへの応用が期待できる。2 CTCの抗癌剤,分子標的薬感受性の検討上記、CTCマウスモデルを用いて経口フッ化ピリミジン薬を用いた化学療法や抗EGFR薬を用いた分子標的治療により、CTCが治療に反応して減少するか否か,すなわちCTCが治療のモニターになりうるか否かを検証できる前臨床試験モデルを構築した。1.末梢血中循環がん細胞(CTC)および腹腔洗浄液中がん細胞の検出と一細胞遺伝子解析昨年度はスライドグラス型CTC分離デバイスを用いて分離したCTCをマニピュレーターにより回収する方法を検討したが、マニピュレーターを用いた回収では操作に時間がかかり細胞に変性が生じることが明らかとなった。そこで本年度は臨床応用を踏まえ、CTC回収法を白血球の多少のコンタミがあっても迅速確実にスライドグラス上に回収する方法に変更し、そのための転写技術を開発した。これにより細胞診、免疫染色、遺伝子検査が簡便かつ高精度にできるようになった。この技術を用いてヒト胃がんCTCマウスモデルを用いてマウス血液中のCTC検出と回収に成功した。また胃がんではCTCの検出頻度が低いことが予想されたため、肝転移の多い大腸がん症例の末梢血および還流静脈血で予備的な検討を行ったところ、転写したスライドグラス上でCTC様の異型細胞を細胞診で検出できケラチン免疫染色でCTCを確認することもできた。一方、腹腔洗浄液中がん細胞(PTC)分離、回収に関しても、腹腔洗浄液中のPTCを濃縮さえできれば上記方法によりPTCの回収が簡便かつ高精度にできる可能性を示唆しており、今後の改良に期待が持てる結果であった。以上の結果から、本デバイスと新たな転写法と組み合わせることによりCTCを高感度に分離・回収することが可能であり、細胞診、免疫染色、遺伝子検査など、いわゆるLiquid biopsyへの応用が今後十分に期待できる。2.CTCの分子標的薬感受性の検討トリプルネガチィブ乳がん細胞株を用いたCTCマウスモデルでパクリタキセル治療のCTCによる薬剤感受性を検討した。その結果、治療後のマウス血液からM期arrestを起こし、核分裂異常を示すCTCを多数検出することに成功し、CTCによる薬物治療早期の感受性評価の可能性が示唆された。消化器外科学CTC分離フィルター型デバイスを独自に試作、性能評価を行い、ほぼ所期の性能を有することを確認した。またCTCマウスモデルを開発し、それを用いて生体内でのCTCの分離と採取に成功した。さらにCTCの抗癌剤や分子標的治療感受性を検討できるマウスモデルを確立した。

以上、概ね所期の目標を達成したので達成度は70%程度と評価するが、小型化、ディスポ化などの課題は残っており、そのための2次試作機の開発は若干遅れている。平成26年度1末梢血中循環がん細胞(CTC)および腹腔洗浄液中がん細胞の検出と一細胞遺伝子解析26年度は、25年度に開発したCTC分離デバイスおよび一細胞遺伝子解析システムを用い、マウスCTCモデルを用いて、胃癌におけるCTCの体内動態など基礎的検討を行う。さらに実際の胃癌患者検体を用いて、その手法の検出感度を評価すると共に、その遺伝子解析の精度を、切除標本などの遺伝子解析と比較することによりLiquid biopsy足りうるか否かを検討する。2微小癌細胞の抗癌剤感受性予測法の開発26年度は、25年度において確立したCTCマウスモデルを用いて、実際に抗癌剤や分子標的治療に対するCTCの応答性を検討する。この際、単なるCTC数の減少だけでなく、感受性や耐性に関連した遺伝子発現についても検討する。現行のフィルター型CTC分離デバイスは中型で価格が高く,洗浄して再利用できるが、ゴミが付着して自家蛍光が観察の邪魔になるのでクリーンルームの使用が必要だった。そこで実用化のために25年度は現行機を小型、ディスポ化した新規CTC分離デバイスの試作機を設計したが、発注が間に合わなかった。26年度にはこの新規CTC分離デバイスの試作機を発注し、性能評価を行い、実用機開発につなげてゆく予定である。
水挙動に着目した全固体アルカリ燃料電池モデルの構築

本研究では、全固体アルカリ燃料電池(SAFC)の高性能化に向け、SAFCの水挙動、特に電解質膜内の水移動を定量的に理解するための水移動モデルの構築を目指す。研究開発当初は、SAFCにおける水移動モデルを構築し、モデル計算に必要な、アニオン伝導性電解質膜の各種物性値を実験により求める。水移動モデルをSAFC用パラメータを導入した燃料電池モデルに組み込むことで、電池性能の予測を行う。アルカリ型では、酸型のNafionに代表されるような標準膜材料が存在しないが、モデル計算から電解質膜の材料改良方向性を提案することを想定していた。昨年度は、まずアルカリ型に展開する前段階として、作製に成功していた、厚さ6μmの超高分子量ポリエチレン多孔質基材にスルホン酸基容量が市販のNafion 211(厚み25μm)より2倍近く高いEW580パーフルオロスルホン酸(PFSA)ポリマーを充填した細孔フィリング膜が、高温低湿度条件下でも高い電池性能を示すことを確認した。今年度は、実作動条件下における電解質膜の化学耐久性と高い電池性能の要因を明らかにするために膜内水透過性を評価した。電解質膜の化学耐久性では、開放起電力(OCV)保持試験を行い、110 °C、30% RHの高温低湿度条件でにおいて、細孔フィリング薄膜はNafionより薄膜にもかわらず、Nafion膜と同程度のOCV保持性能を示した。これは、細孔フィリング膜ではラジカル耐久性の高いポリエチレン基材を使用したことや、基材の膨潤抑制効果により水素クロスオーバーを抑えたことが要因であると考えられる。また、水透過試験では、細孔フィリング薄膜はNafion膜より水透過度が高く、薄膜化により膜電極接合体全体で適切な水管理を行い、低湿度条件下でも高い電池性能を示していることを実験的に明らかにした。今年度得られた結果および各種評価系の構築は、SAFC用電解質膜を設計・評価する上での基盤になるといえる。SAFCにおける水移動モデルを構築し、モデル計算に必要な、アニオン伝導性電解質膜の各種物性値を実験により求める。アルカリ型では、酸型のNafion&#174;に代表されるような標準膜材料が存在しないが、モデル計算から電解質膜の材料改良方向性を提案する。今年度は、まずアルカリ型に展開する前段階として、作製に成功していた、厚さ6μmの超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)多孔質基材にスルホン酸基容量が市販のNafion 211(厚み25μm)より2倍近く高いEW500パーフルオロスルホン酸(PFSA)ポリマーを充填した細孔フィリング薄膜の電池特性を評価した。細孔フィリング薄膜を用いた場合、Nafion 211と比較して、高温低湿度域で高い電池性能を示した。電池試験と同時に膜抵抗を測定したところ、細孔フィリング薄膜の膜抵抗は、高電流密度領域でも低いことが明らかとなった。また、細孔フィリング薄膜の水素クロスオーバー量は、薄膜であるにもかかわらず、Nafion211と同程度の値を示した。すなわち、薄膜化とスルホン酸基の高密度化により、高温低湿度条件下でも水移動が促進し膜抵抗が低減され、さらに、機械強度の強いUHMWPE基材を用いることで、EW500 PFSAポリマーの膨潤が抑制された結果、水素クロスオーバー量が抑えられたと考えられる。今年度は当初の予定と異なり、酸型の燃料電池用細孔フィリング薄膜の燃料電池特性評価を行った。細孔フィリング薄膜は、高温低湿度条件下でも高い電池性能を示した。これは、薄膜化とスルホン酸の高基密度化により、水移動が促進しかつプロトン伝導度が向上したためであると考えられる。さらに、機械強度の高い基材を用いることで、充填ポリマーの膨潤が抑制され、薄膜であるにもかかわらず水素クロスオーバーが抑制されたと考えられる。今年度得られた電池作製技術及び結果は、SAFCの電解質膜を設計する上で重要な知見となる。

電解質膜の化学耐久性では、開放起電力(OCV)保持試験を行い、110 °C、30% RHの高温低湿度条件でにおいて、細孔フィリング薄膜はNafionより薄膜にもかわらず、Nafion膜と同程度のOCV保持性能を示した。これは、細孔フィリング膜ではラジカル耐久性の高いポリエチレン基材を使用したことや、基材の膨潤抑制効果により水素クロスオーバーを抑えたことが要因であると考えられる。また、水透過試験では、細孔フィリング薄膜はNafion膜より水透過度が高く、薄膜化により膜電極接合体全体で適切な水管理を行い、低湿度条件下でも高い電池性能を示していることを実験的に明らかにした。今年度得られた結果および各種評価系の構築は、SAFC用電解質膜を設計・評価する上での基盤になるといえる。平成30年度は、酸型の燃料電池用細孔フィリング薄膜について、各種耐久性試験(乾湿サイクル、OCV保持)を行うことで、実作動条件下での細孔フィリング薄膜の耐久性を評価する。また、電解質ポリマーを充填する基材の空孔率、膜厚、素材などを変化させた時の膜・燃料電池特性を評価し、基材の各種物性が電池性能に与える影響を考察する。また、酸型の電解質膜で得られた知見を元に、当初予定していたSAFC用細孔フィリング膜を作製し、水移動モデルの計算に必要な、アニオン伝導度、水分収着量、水透過係数、電気浸透係数の算出を行う。今年度投稿中の英語論文1報の追加校正分を見越していたが、必要なくなったため、次年度への繰り越しをした。この分は、次年度、別刷り・カバー印刷代と併せて使用していく。
腸の蠕動運動に潜む時計機能の成立メカニズム

腸神経系は「第2の脳」とも呼ばれ、複雑なネットワークを形成して多岐に渡る腸機能を制御する。中でも蠕動(ぜんどう)運動との関わりは深いと考えられている。蠕動運動とは、局所的に起こる腸の収縮が、その後「収縮の振動波」となって前後に伝播する現象であり、まさに「時計機能」を有した高次生体システムである。本研究では、蠕動運動の時計機能とその成立機構を明らかにすべく、特に蠕動運動の発信源(起点)の成立と収縮波の伝播に注目する。蠕動運動時にみられるCaシグナルの可視化や、蠕動・収縮運動を呈するオーガノイドを新たな解析系として用いることによって、起点形成や収縮伝播を制御する細胞相互作用の分子実体にせまる。
サイトカインIL-7によるインスリン抵抗性改善の可能性の検討

インターロイキン7(IL-7)はT細胞の生存維持に必須のサイトカインである。Tregはその他のT細胞とは異なり、生存をIL-2に依存しており、IL-7受容体(IL-7R)の発現が低いことが知られる。そのため、一般的にIL-7R lowはTregを単離するための細胞表面マーカーとして利用されているが、Tregに発現するIL-7Rの機能は明らかになっていない。内臓脂肪に存在するTregは、2型糖尿病に伴うインスリン抵抗性を抑制するという重要な役割を担っている。本研究では、内臓脂肪に存在するTregに着目して、TregにおけるIL-7Rの機能解析を行う。
老化促進モデルマウスにみる老化諸病態の発症機序と発症予防に関する実験的研究

1.系統維持のための日常的業務として(1)生後経時的に老化度判定基準に基き老化度評点をつけ、その加齢に伴う変化の観察(2)平均寿命算定(3)死亡例の病理的検討を行い、SAM-P7系統、SAM-R3系統が順調に維持され、夫々特徴的な老化病態が安定して発現していることが確認された。2.今回新たにR/3系に白内障、P/3系に変形性顎関節症が認められた。前者はselectionにより頻度が上昇したもので、後者は各系統顎関節の系統的な観察により発見されたものである。即ち前者の頻度は生後10ケ月で75%、後者は生後12ケ月で100%に達する。3.このモデル動物にみる特徴的な老化病態とその好発系統を整理すると、老化アミロイド症(SAM-P/1-P/2)、白内障(SAM-R/3、SAM-P/3)、骨粗鬆症(SAM-P/6)、学習・記憶障害(SAM-P/8)、変形性顎関節症(SAM-P/3)、免疫能低下(SAM-P/1-P/2)となる。この間これら各系統を用い、これら各種老化病態の発症機序解明のため多くの実験がなされ、またなされつつあり、一定の成果をあげている。4.私達はすでに食餌摂取量制限が確実に平均寿命を延長、老化アミロイド等の老化病態の軽症化を惹起することを報告したが、今回この効果の機序について検討したところ、これら食餌制限により免疫機能が長期に亘り正常状態に維持され、かつ加齢に伴って進行する自己免疫異常が抑制されることによることが分った。5.今後上記3に示した病態発症機序解明のための実験をより精力的に行なうと共に、これら病態発症を予防しうる有効な手段発見のため上記4の食餌制限以外に栄養素負荷(添加)、あるいは運動負荷等を試みる。1.系統維持のための日常的業務として(1)生後経時的に老化度判定基準に基づき老化度評点をつけ、老化度の加齢に伴う変化の観察(2)平均寿命の算定(4)死亡例の病理組織学的検討を行い、SAM-Pの7系統,SAM-Rの3系統が順調に維持され、夫々の特徴的な老化病態が安定して発現していることが確認された。2.SAM-P/1系肝より抽出・精製した老化アミロイド(【AS_(SAM)】)および正常マウス血清中HD【L_2】の血清中前駆物質apo【SAS_(SAM)】=apo A-【II】の一次構造、そのcDNA塩基配列が明確になった。またアミロイド嫌発SAM-R/1と好発SAM-P/1系にてapo A-【II】の構造を比較したところ、N末端より5番目のアミノ酸が前者がプロリンであるのに対し後者でグルタミンに置換していることが判った。この1つのアミノ酸置換がアミロイド沈着に重要な役割を果している可能性が示唆され、このアミノ酸置換に対応してcDNAの塩基配列はCCA(pro)からCAG(gln)への2塩基置換によるものであることが明らかになった。3.SAM-P/6にみる加齢に伴う骨量減少が、その形態学的特徴、Ca,P,コラーゲン量等の骨の生化学結果を総合すると、この病態が骨軟化症ではなく、老年性の骨粗鬆症であることが判った。一方血清中、Ca,P,PTH,ビタミン【D_3】等の濃度を測定した結果、骨調節ホルモンが一次的にこの病態に関与している結果は得られなかった。

4.SAM-P/8を用いた学習・記憶障害に関する研究では、受仂的回避反応テストにより、生後2ケ月頃より加齢に伴って障害の程度が増強することを認め、また神経病理学的検討の結果、海馬,梨状野,小脳皮質等のPAS陽性顆粒状構造の出現,脳幹部の海綿状病変,ほぼ全脳にみられるアストログリア細胞の増生,海馬錐体細胞basal dendriteスパイン密度の減少等がみられ、上記学習・記憶障害と脳病変部位との関連が更に具体的に追究される段階になった。1.系統維持のための日常的業務として(1)生後経時的に老化度判定基準に基づき老化度評点をつけ,その加齢に伴う変化の観察(2)平均寿命の算定(3)死亡例の病理学的検討を行い,SAMーPの7系統,SAMーRの3系統が順調に維持され,夫々の特徴的な老化病態が安定して発現していることが確認された.2.^<125>Iでラベルされた老化アミロイド前駆物質apoAーIIをR/1系およびP/1系マウスの静脈内に投与しその代謝動態(クリアランス)を調べたところ,促進老化系のP/1においてapoAーIIクリアランスの加齢に伴う特異的亢進が認められ,apoAーIIの構造の違い(P/1はpro^5ーapoAーII,P/1はgln^5ーapoAーII)とクリアランスとの間には直接の関連はみられなかった. 3.骨粗髪症系P/6の低骨量の成因にCa代謝の異常が関与しているか否かを探るために血中Ca,無機燐,副甲状腺ホルモン,VitD_3誘導体の濃度を測定したが,これらから低骨量を裏づけるデーターは得られなかった.このことはCa調節ホルモン以外に何らかの重安な要因が存在することを示唆する. 4.P/1系を用いてIn vitroの研究結果は加齢に伴ってみられる急速な免疫機能の低下,中でも特に抗ヒツジ赤血球一次抗体産生能が2ヶ月齢という早期に著しく低下していることが明かとなり,この機能低下がヘルパーT細胞系の異常に関連があることが示唆された.5.学習・記憶障害P/8系の行動薬理学的研究と更に詳細に行い,記憶成立過程のどの過程に障害が生じているかを検討したところ,記憶保持機能にはほとんど異常なく,むしろ獲得過程に障害があることが判った.次に脳を16ヶに細切し,各部位のモノアミン含量を測定したところ,ドーパミン,セロトニンに関してはP/8系で正常のR/1系に比しほぼ全部位で高値を示した.ノルエピネフリンも全般に同様の傾向を示したが海馬,視床はむしろ有意に低値し,P/8系で,学習・記憶障害に重要な大脳辺縁系においてノルエピネフリン系の機能低下が存在することを示唆する.1.系統維持のための日常的業務として(1)生後経時的に老化度判定基準に基づき老化度評点をつけ、その加齢に伴う変化の観察(2)平均寿命算定(3)死亡例の病理的検討を行い、SAMーP7系統、SAMーR3系統が順調に維持され、夫々特徴的な老化病態が安定して発現していることが確認された。2.老化アミロイド症の病態解明の有力な手段としてアミロイドの生化学的定量法の開発が強く期待されてきたが、漸く私達の研究によりこの難関が突破された。即ちThioflavin Tなる蛍光色素を用い線維状となったアミロイドが(前駆体は反応しない)この色素と結合する特性を利用したngレベルで検出可能な微量定量法である。3.骨粗鬆症モデルP/6系を用い病態解明の一連の研究が行われ(1)P/6系と正常骨量P/2系とのF_1雑種を作製し2ケ月齢の骨髄細胞をP/6系新生仔に静注し、生後齢に屠殺、骨量を検討したところP/6の骨量が有意に増加した。なおP/6系の細胞がP/6系の中で生存即ちキメラが形成されていることが確認された。(2)テトラサイクリン標識により骨形成能を検討したところ、生長期大腿骨のendosteal formationがP/6系で有意に正常骨量P/2、R/1系に比し低いことが分った。(1)(2)の事実はP/6の低骨量状態を理解する上で重要なデーターと考える。
ミュラー筋(上眼瞼内平滑筋)と眼窩内平滑筋群との連続性の証明とその相互作用の解明

目的:本研究は、ミュラー筋の水平方向の延長と眼球周囲平滑筋との連続性を調べることを目的とした。使用標本:10%ホルマリンで固定された日本人の20眼窩(右10眼窩、左10眼窩)。男性8例、女性8例で、年齢は61歳から93歳、平均年齢は78.4歳であった。方法:眼窩縁を360度切開し、骨膜を眼窩先端部まで剥離する。神経、血管や鼻涙管などの骨壁から出ている構造を切開する。眼窩外側壁をはずし、眼窩縁から3cm後方までの眼窩組織を取り出す。その眼窩組織を上眼瞼縁から15mm上方と眼球の3時、9時を含む面で切る。作成された標本は脱水の後、パラフィン処理し、7μmの厚さで切り、マッソントリクロームで染色した。Masson Trichrome.結果:全ての標本でミュラー筋は内側、外側へ伸びていた。内側では、平滑筋を含む内直筋のプリーへ連続していた。外側では、涙腺眼瞼部の被膜を経由して、外直筋のプリーへ連続していたが、12標本では後部で直接に外直筋のプリーへ連続していた。結論:ミュラー筋は内側、外側へ延びて、眼球周囲平滑筋ネットワークに連続していた。本研究によって、ミュラー筋は上眼瞼での独立した構造ではなく、眼球周囲平滑筋ネットワークの一構成要素であることが明らかになった。眼窩内の4つの直筋と下斜筋は、眼球赤道部付近に「滑車構造」をもちますが、これらは同じ層に含まれ、平滑筋線維を含む線維組織によって互いに連結されています。下直筋、下斜筋の「滑車構造」は、眼瞼の側からみると「下瞼板筋」といわれており、これは上眼瞼のミュラー筋と相同と考えられています。下瞼板筋は下眼瞼を後下方に牽引し、また、ミュラー筋は、下瞼板筋とは対照的に、上眼瞼を後上方に牽引します。しかし、ミュラー筋は平滑筋であるため、上眼瞼の長軸方向だけではなく、横方向からも牽引されなくては、その緊張を維持することはできません。そこで我々は、ミュラー筋と下瞼板筋の「相同性」という事実に着目し、ミュラー筋が4直筋や下斜筋の「滑車構造」と同一の層にあり、直接的な線維連絡をもっているのではないかと推測しました。この関係を明らかにし、かつ、その相互作用を解明するために本研究を行いました。その結果、推測したとおり、ミュラー筋は4直筋や下斜筋の「滑車構造」と同一の層にあり、直接的な線維連絡をもっていることが明らかになりました。本研究の成果はOphthalmology誌に受理されました。本研究の結果によって、上眼瞼は眼球とは独立して存在している構造ではなく、横方向への平滑筋線維の連絡によって、その緊張が自立的にも調節されている可能性があることが示唆されました。また、眼瞼下垂に付随して生じると考えられている自律神経症状は、本研究の結果に基づくと、ミュラー筋単独から生じる反応ではなく、眼窩内に存在する平滑筋線維群全体の反応を考慮する必要がある推測されます。平成21年度の研究成果によって、ミュラー筋が4直筋や下斜筋の「滑車構造」と同一の層にあり、直接的な線維連絡をもつことが明らかになり、その成果はOphthalmology誌に受理されました。本研究の成果によって、上眼瞼は眼球とは独立して存在する構造ではなく、横方向への平滑筋線維の連絡によって、その緊張が自立的にも調節されている可能性が示唆されました。また、上眼瞼下垂に付随して生じると考えられている自律神経症状は、本研究の結果に基づくと、ミュラー筋単独から生じる反応ではなく、眼窩内に存在する平滑筋線維群全体の反応を考慮する必要があると推測されました。

今後の眼瞼自律神経反応の研究では、単一眼瞼からの反応だけではなく、複数眼瞼、ないしは、外眼筋の反応まで含めて結果を考慮しなければならない可能性が示唆されました。逆に、外眼筋の自律神経反応の研究を行う場合、眼瞼の反応も考慮する必要があることも推測されました。平成22年度は標本数をさらに6例増やして、平成21年度の成果を確認し、同様の結果が得られました。しかし、内直筋、外直筋への線維性連絡の様相には個人差があり、特に、その厚みにヴァリエーションがみられました。この結果から、本連絡線維も他の眼窩内組織と同様に退行性の変化を生じ、上眼瞼は内直筋や外直筋との相互影響力が加齢に伴って小さくなってゆくことが考えられました。本年度は、ドイツ、中国、韓国、オーストラリアで、当該研究成果の発表を積極的に行い、広く世界中の研究者に本研究の成果を周知できたと考えます。
新規核内RNAノックダウン法の確立

前年度に引き続きヒトの培養細胞に合成キメラオリゴヌクレオチドを導入することによって、核内RNAを特異的にノックダウンする実験系の条件至適化などを行った。ノックダウン用のアンチセンス・キメラオリゴヌクレオチドの標的特異性を実験的に証明するために、標的とのミスマッチを1塩基ずつ増やしたオリゴヌクレオチドを用いてノックダウン効率を測定したところ、非常に特異性が高く標的RNAを認識し分解できることが示された。ノックダウンを標的核内ノンコーディングRNAに対して引き続き試行し、新たに10種類以上の新しいncRNA種のノックダウンに成功した。一方で、マイナースプライセオソームを構成するU11,U12,U4atac,U6atacは、ノックダウンの効率が著しく低い事も同時に明らかになった。これらのsnRNPは非常にコンパクトなRNA-タンパク質複合体であるので、結合蛋白質によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が阻害された可能性が高い。この他にノックダウン効果による細胞表現型の変化をU7 snRNAと核内構造体に局在するMENαとMENε/βについて解析した。その結果U7 snRNAのノックダウンでは、昨年度報告した異常なヒストンmRNAの蓄積と細胞周期の遅延、さらに新たにS期外でのヒストンmRNAの異常な蓄積が観察された。MENαのA549細胞でのノックダウンでは、近傍のMENε/βncRNAの蓄積量が減少することが示された。MENε/βのノックダウンでは、このRNAの局在場部位である構造体が消失することが明らかになった。こうして2年間に渡る解析によって、アンチセンスキメラオリゴヌクレオチドによる核内ノックダウンの実験系は、その効率、特異性、更に引き起こされる効果の確実性などにおいて解析系として有用である事が示された(論文をminor revision中)。ヒトの培養細胞に合成キメラオリゴヌクレオチドを導入することによって、核内RNAを特異的にノックダウンする実験系の条件検討を行なった。これまで機能不明のオーファンsnoRNAであるU84 snoRNAをモデルにして一本鎖領域に対して相補的なキメラオリゴを設計し電気的に細胞内に導入した結果、これまでの遺伝子導入試薬による導入効率に比べて飛躍的に効率化が認められた。この実験系で今年度は、ノックダウン特異性の検討、持続性の検討、他の核内non-coding RNAへの拡張、他の培養細胞への拡張を試みた。特異性については、標的配列が20塩基中たった3塩基のミスマッチを有するU83 snoRNAに対してU84ノックダウンオリゴを試したところ効果がなかったことから、このオリゴは3塩基のミスマッチを識別して作用していることが証明された。持続性については、導入オリゴの濃度に依存することが明らかになり400pmo 1の導入オリゴを用いた場合、96時間後までく10%程度のノックダウン効果を維持できることが明らかになった。この方法を他の核内non-coding RNAのノックダウンに拡張した。これまでデータベースに登録されている100種類程度の機能未知のオーファンsnoRNAの中から、18種類のboxC/DおよびboxH/ACA snoRNAに対してノックダウンオリゴを設計し、効率よくノックダウンできることを確認した。さらに核質に局在するU7snRNA、テロメラーゼRNAについても効率よくノックダウンすることに成功した。上記の核内ノックダウン実験は、すべてHeLa細胞を用いて行なったものである。そこでこの核内ノックダウンが他の培養細胞においても有効化どうかを明らかにするために、ヒトの癌細胞株のHEK293,MCF7,T24,Jurkat,HPB-ALL,A549,LNCap、ヒト繊維芽細胞のMRC5、マウス培養細胞のNIH3T3において効率よく核内non-coding RNAのノックダウンが確認されたことから、この手法は汎用性の高いものであることが示された。最後に核内ノックダウン法によって、特定の核内non-coding RNAをノックダウンした際にどのような表現型変化を引き起こすかについて、U7 snRNAを例に解析を行なった。その結果、U7 snRNAのノックダウンによって、通常見られないpolyA鎖をもつmRNA種が出現し、細胞周期がS期において著しく遅延する表現型を観察した。以上のことから、核内non-coding RNAを標的としたノックダウン解析法は、以上に特異的で高効率で、かつ汎用性が高いこと、さらに表現型変化を引き起こすことなどを示すことができ、非常にパワフルな解析法であることが示された。