hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リサイクル・リユースを前提とした鋼橋の設計・架設・解体・再構築法に関する研究

豊かで,快適で,便利で,安全で,活力のある社会の持続的発展に力強く対応し,社会情勢の変化に柔軟に順応できる技術開発の仕組みの構築が望まれている.特に,循環型社会形成を目標として,中・長期的視点のもと,既存の環境保全,自然との共生および新たな環境創造の各種技術が21世紀の研究のキーワードでもある.このような社会的要請のもと,建設分野においては,建設リサイクルの推進が緊急課題であり,(1)老朽構造物の解体施工技術,(2)建設廃棄物の再資源化技術に対する取り組みが精力的に行われている.しかし,解体・再資源化・再構築にも配慮した新設構造物の設計法にまで言及してはおらず,本研究では,持続可能な上記架設解体再構築の設計サイクルのあり方について検討することを目的としている.形状記憶合金の機械的性質を調査し,加熱・冷却サイクルで,形態の記憶精度を中心に,ボルト,リベットなどの接合要素として適用性について調査した.特に,静的強度などの弾性物性の品質保証および熱入力サイクルによる強度変化などについて実績調査を行った.ここでは,高分子形状記憶材料およびそれを用いた計算機組立ての実績について参照した.また,閉断面部材に対しては,燃料パイプの接合法として多用されている形状記憶合金の円筒によるかしめ接合の構造継手への適用可能性についても検討した.特に,かしめ接合の構造性能を2重管・膨張モルタル充填鋼管接合部と対比して検証を行った.最後に,鋼床版構造を例に,部品化による構造物の架設解体再構築のサイクルについて調査した.豊かで,快適で,便利で,安全で,活力のある社会の持続的発展に力強く対応し,社会情勢の変化に柔軟に順応できる技術開発の仕組みの構築が望まれている.特に,循環型社会形成を目標として,中・長期的視点のもと,既存の環境保全,自然との共生および新たな環境創造の各種技術が21世紀の研究のキーワードでもある.このような社会的要請のもと,建設分野においては,建設リサイクルの推進が緊急課題であり,(1)老朽構造物の解体施工技術,(2)建設廃棄物の再資源化技術に対する取り組みが精力的に行われている.しかし,解体・再資源化・再構築にも配慮した新設構造物の設計法にまで言及してはおらず,本研究では,持続可能な上記架設解体再構築の設計サイクルのあり方について検討することを目的としている.平成16年度では,形状記憶合金の機械的性質を調査し,加熱・冷却サイクルで,形態の記憶精度を中心に,ボルト,リベットなどの接合要素として適用性について調査した.特に,静的強度などの弾性物性の品質保証および熱入力サイクルによる強度変化などについて実績調査を行った.また,閉断面部材に対しては,燃料パイプの接合法として多用されている形状記憶合金の円筒によるかしめ接合の構造継手への適用可能性についても検討した.ここでは,高分子形状記憶材料およびそれを用いた計算機組立ての実績について参照した.さらに,平成17年度において実施予定の接合部モデル(ボルト接合ならびにかしめ接合)の試設計ならびに載荷実験計画の立案を行った.豊かで,快適で,便利で,安全で,活力のある社会の持続的発展に力強く対応し,社会情勢の変化に柔軟に順応できる技術開発の仕組みの構築が望まれている.特に,循環型社会形成を目標として,中・長期的視点のもと,既存の環境保全,自然との共生および新たな環境創造の各種技術が21世紀の研究のキーワードでもある.このような社会的要請のもと,建設分野においては,建設リサイクルの推進が緊急課題であり,(1)老朽構造物の解体施工技術,(2)建設廃棄物の再資源化技術に対する取り組みが精力的に行われている.しかし,解体・再資源化・再構築にも配慮した新設構造物の設計法にまで言及してはおらず,本研究では,持続可能な上記架設解体再構築の設計サイクルのあり方について検討することを目的としている.形状記憶合金の機械的性質を調査し,加熱・冷却サイクルで,形態の記憶精度を中心に,ボルト,リベットなどの接合要素として適用性について調査した.特に,静的強度などの弾性物性の品質保証および熱入力サイクルによる強度変化などについて実績調査を行った.ここでは,高分子形状記憶材料およびそれを用いた計算機組立ての実績について参照した.また,閉断面部材に対しては,燃料パイプの接合法として多用されている形状記憶合金の円筒によるかしめ接合の構造継手への適用可能性についても検討した.特に,かしめ接合の構造性能を2重管・膨張モルタル充填鋼管接合部と対比して検証を行った.最後に,鋼床版構造を例に,部品化による構造物の架設解体再構築のサイクルについて調査した.
小腸移植における血管茎付き胸腺移植による大動物の免疫寛容誘導に関する研究

小腸は近年の免疫抑制剤(カルシノイリンインヒビッターのFK506、CyA、核酸代謝阻害剤のMMFなど)の発達に加え、種々のモノクローナル抗体(OKT3、抗CD25抗体、抗IL2-R抗体など)やATGやALGなどによるinduction therapyの導入により移植可能な臓器の1つになってきた。しかし他臓器に比べるとその成績はいまだ満足できるものでなく、世界で2005年3月までに約1300例が国際登録されているが、1年生存率は70-75%、2年生存率が60%、5年生存率が50%という現状である。その原因として小腸は粘膜固有層やリンパ節などにリンパ球や単球や樹状細胞などGut Associated Lymphoid Tissue(GALT)と呼ばれる免疫担当細胞の宝庫であり免疫原性が強いため、拒絶反応やGVHDが起きやすいという問題がある。そのため強い免疫抑制が必要となり、感染症が起こりやすいということが挙げられる。また免疫抑制剤の副作用である腎毒性、肝毒性、高血圧、耐糖能異常、中枢神経障害なども長期大量使用では大きな問題点となる。これらの問題点を克服し小腸移植を短腸症候群の治療手段として定着させるには免疫寛容の誘導しか方法がない。肝臓移植では移植後長期生着例では計画的に、またEBウイルスの感染などを契機に非計画的に、免疫抑制剤から離脱できる症例もあり、免疫寛容の状態が得られることが期待できるが、小腸ではそういった可能性は皆無であり、導入の時点から免疫寛容を誘導する手段をこうじなければならない。この研究では生体小腸移植をターゲットにして、実質臓器移植にとって斬新な方法である「血管茎付き胸腺移植」という方法で、ドナー特異的な免疫寛容状態にした状態で、胸腺と同じドナーからの小腸移植を行い、免疫抑制剤なしで生着する方法を確立することが目的である。この研究を進めるにあたり、ミニブタから胸腺を摘出して血管付きグラフトとして採取。グラフトの胸腺動静脈をレシピエントの頚動静脈にそれぞれ端側吻合してみた。10頭行ったが、血管が極めてほそくperfusionが不良であった。縦隔の内胸動脈をグラフトにつけて採取し、同様につないでみたがperfusion不良であった。胸腺を還流する血管が極めて細くしかも多様なため、手技的に胸腺を血管茎付きグラフトとして移植するのは困難であることが判明し、更なる研究の遂行は不可能であった。小腸は近年の免疫抑制剤(カルシノイリンインヒビッターのFK506, CyA、核酸代謝阻害剤のMMFなど)の発達に加え、種々のモノクローナル抗体(OKT3,抗CD25抗体,抗IL2-R抗体など)やATGやALGなどによるinduction therapyの導入により移植可能な臓器の1つになってきた。今年度は、ミニブタから幹細胞を採取する手技として、胸腺を摘出して血管付きグラフトとして採取。グラフトの胸腺動静脈をレシピエントの頚動静脈にそれぞれ端側吻合してみたが、血管が極めてほそくperfusionが不良であった。胸腺を還流する血管が極めて細くしかも多様なため、手技的に困難である。幹細胞の成育する場所を別に作るかどうか手技をさらに検討する必要がある。

その原因として小腸は粘膜固有層やリンパ節などにリンパ球や単球や樹状細胞などGut Associated Lymphoid Tissue(GALT)と呼ばれる免疫担当細胞の宝庫であり免疫原性が強いため、拒絶反応やGVHDが起きやすいという問題がある。そのため強い免疫抑制が必要となり、感染症が起こりやすいということが挙げられる。また免疫抑制剤の副作用である腎毒性、肝毒性、高血圧、耐糖能異常、中枢神経障害なども長期大量使用では大きな問題点となる。これらの問題点を克服し小腸移植を短腸症候群の治療手段として定着させるには免疫寛容の誘導しか方法がない。肝臓移植では移植後長期生着例では計画的に、またEBウイルスの感染などを契機に非計画的に、免疫抑制剤から離脱できる症例もあり、免疫寛容の状態が得られることが期待できるが、小腸ではそういった可能性は皆無であり、導入の時点から免疫寛容を誘導する手段をこうじなければならない。この研究では生体小腸移植をターゲットにして、実質臓器移植にとって斬新な方法である「血管茎付き胸腺移植」という方法で、ドナー特異的な免疫寛容状態にした状態で、胸腺と同じドナーからの小腸移植を行い、免疫抑制剤なしで生着する方法を確立することが目的である。この研究を進めるにあたり、ミニブタから胸腺を摘出して血管付きグラフトとして採取。グラフトの胸腺動静脈をレシピエントの頚動静脈にそれぞれ端側吻合してみた。10頭行ったが、血管が極めてほそくperfusionが不良であった。縦隔の内胸動脈をグラフトにつけて採取し、同様につないでみたがperfusion不良であった。胸腺を還流する血管が極めて細くしかも多様なため、手技的に胸腺を血管茎付きグラフトとして移植するのは困難であることが判明し、更なる研究の遂行は不可能であった。
悪性黒色腫の転移促進因子インテグリンαvβ3の機能解析と治療制御に関する検討

悪性黒色腫の進展、治療応答性を調節する因子としてのインテグリンαvβ3の重要性を検証した。抗がん剤、B-RAFキナーゼ阻害剤への治療抵抗性を獲得した腫瘍細胞は、インテグリンαvβ3発現が亢進しており、樹状細胞上のリガンドと結合することで免疫寛容を惹起すること、この抗腫瘍免疫応答障害が治療抵抗性獲得に関連することを明らかとした。以上は、悪性黒色腫の治療抵抗性と免疫応答抑制との分子連関を明らかにした点で重要な成果である。マウス、ヒト悪性黒色腫のインテグリンαvβ3とそのリガンド発現をFlow cytometry、定量的PCR法にて検討した。興味深いことに、95%の悪性黒色腫はインテグリンαv、およびMFG-E8発現を認めていた。In vitroでの腫瘍生物学的特性に与える検討を、腫瘍細胞へのsiKNA導入、阻害抗体投与にて検討した。MFG-E8、インテグリンαvは腫瘍増殖能に対して関与を認めなかったが、一部の腫瘍細胞では抗癌剤に対する抵抗性に強く寄与していることを発見した。さらに、腫瘍細胞のプロフィールを詳細に検討すると、抗癌講不応にある進行期で得られた腫瘍細胞、特にCD133、ABCB陽性分画でSTICなど抗癌剤、MEK1-kinase阻害剤などの分子標的剤に対する治療抵抗性に大きく寄与していた。CD133やABCB5は悪性黒色腫において癌幹細胞に特異的に発現するマーカーであると報告されている背景より、インテグリンαvβ3が悪性黒色腫の幹細胞形質を修飾し、抗腫瘍剤に対する治療感受性を負に調節する可能性が考えられた。さらにin vivoによる検討で、インテグリンαvβ3およびMFG-E8阻害抗体により、DTIC、分子標的剤による治療反応を優位に換算することが可能であった。以上の検討より、インテグリンαvβ3が腫瘍幹細胞形質、機能に及ぼす分子メカニズムについて、現在解析を進めているところである。本研究課題では悪性黒色種の進展や治療抵抗性にインテグリンαvβ3、およびそのリガンド群が果たす役割についての機能解析、およびその治療的制御法の開発を視野に入れて研究を展開し、インテグリンαvβ3リガンドMFG-E8が、抗がん剤投与に伴う宿主免疫応答抑制に寄与する因子であることや、メラノーマ幹細胞における治療抵抗性にインテグリンαvβ3発現細胞が寄与することを明らかとしてきた(Jinushi M, J Exp Med, 2009 : PNAS, 2011)。さらに、申請者はメラノーマ細胞が新規分子標的剤Bイ笛Fキナーゼ阻害剤に対する耐性を獲得することで、慢性恒常的なATMを介したDNA損傷経路活性やNF-κB炎症シグナル活性を介して、インテグリンαvβ3が誘導されることを明らかとした。さらにB-RAFキナーゼ阻害剤不応性のメラノーマ細胞は、インテグリンαvβ3を介した樹状細胞による細胞貪食を促進することで、抗原特異的な抗腫瘍免疫応答を負に制御することを明らかとした。以上より、メラノーマ細胞のB-RAFキナーゼ阻害剤耐性機構として通常知られているMAPキナーゼ経路の遺伝子変異に加えて、DNA修復応答活性を介したインテグリンαvβ3発現誘導と腫瘍免疫抑制を介したあらたな腫瘍進展メカニズムの存在を明らかとした。
ヒトと動物の宗教関係:日本・ジャワ・バリ・アボリジニの日常生活 を通して比較する

人と動物の関係において、もっとも顕著に働いている宗教性の原理は、自然(野生)と文化(都会)の二つの世界のつながりから成り立つ「関係タイプ」である、と見ることができる。こうした関係タイプは、「関係の場」と「関係のかたち」という二つの軸から見ることによって図式化することができる。現代日本・バリ・ジャワ・アボリジニには、いずれのタイプに近いものが、事例として現存するが、こうした図式から見るとことによって個々のケースの特徴を浮き彫りして捉えることができる。研究計画書に従い、22年度は日本国内での研究調査に従事したが、翌年に予定していたインドネシア(ジャワとバリ)での研究調査も、部分的に開始した。以下に、これまでの活動と得られた成果を概略する。【日本】山口県内および福岡県内で、主に、供養、ペットとコンパニオン、従属(競馬)、鑑賞、記号化(アニメ)、共生、に関するヒト・動物関係の各パターンを観察・取材した。【ジャワ】ジョグジャカルタ州内で、主に供犠(イドゥル・アダ/犠牲祭を中心に)、タブーと崇拝、従属と共生に関するヒト・動物関係の各パターンを観察・取材した。【バリ】タバナン県とバンリ県で、摂食(料理)、供犠、共生、鑑賞、従属(闘鶏)、タブーと崇拝に関するヒト・動物関係の各パターンを観察・取材した。これまでのところは、観察と取材を通しての資料収集および現状把握に重点をおいた。まとまった成果として提示するには、さらなる編集と分析が必要だが、現時点で際立った成果(または発見)の可能性として見込むことができるのは、日本における供養(ペット供養)と鑑賞(自然界と公園)、ジャワにおける従属と共生、バリにおける鑑賞と従属、の諸関係パターンが、研究計画当初において仮定していたかたちよりも、濃厚かつ広範囲であることがわかった、という点である。たとえば日本におけるペット供養(動物霊園も含む)には専用のお寺が各地で設けられ、ペットという枠を超え、現代日本の新たな家族体系として見ることができる。また、ジャワにおける使役動物は、バリ以上に、現代においても重要なヒト・動物関係を構成している。一方、バリにおける共生は、かつてほど盛んではなくなったものの、ペット・鑑賞・従属というかたちに置き換えられながら、浸透と普及が見られる。二十三年度の研究は、日本国内を対象にして行った。研究計画にある12パターンのヒト動物・関係のうち、23年度には、「食」「供養」「従属」「観賞」「模倣と接触」「ペットとコンパニオン」「記号化」「共生」の8パターンを、主に山口県内、岡山県内、東京都内において研究調査(観察・取材・インタビューによる実態の把握、記録、整理)をした。以下にその経過と実績を、各々のパターンの要点から説明する。「食」に関しては、主に生魚料理の盛り合わせ方法に焦点を絞った。「供養」に関しては、主に一般家庭によるペット供養、動物実験施設における供養、家畜農家による供養に焦点を絞った。「従属」に関しては、主に乗馬と家畜に焦点を絞った。「観賞」に関しては、街中の蛍と鯉、動物園と水族館における動物観賞に焦点を絞った。「模倣と接触」に関しては、主にファッション(特に革製品)と家屋内のデコレーションに焦点を絞った。「ペットとコンパニオン」に関しては一般家庭や一人暮らしの家のペット(特に犬と猫のケース)に焦点を絞った。「記号化」に関しては、主に若者に人気のアニメと漫画に登場する動物に焦点を絞った。「共生」に関しては、地域のプロジェクトとして行われている野良動物や絶滅の危機に瀕している野生動物の保護活動に注目した。今回の研究調査では、上記のような実際に見られるヒト・動物関係のパターンとその現れが、人と自然・野生の世界を結ぶ媒体(または様式)として機能しているほか、文化・慣習・思想にも根ざす観念的世界の実態にも左右されていることが、重要な論点の一つとして導かれた。本研究は、おもに日本とインドネシア(とりわけジャワとバリ)における「人と動物の関係」を、「生活の中の宗教性」という一定の宗教学的な視点から、比較分析しようとしたものである。当初は、これらの地域が対照的な文化バックグラウンドをもつということから、比較の尺度として、実際の関係の実態から導かれた「関係パターン」を用いることを試みた。25年(最終年)度の研究からは、それぞれの研究地域における人と動物の関係において、もっとも顕著(かつ特徴的)に働いている宗教性の原理は、「関係パターン」よりも、自然(野生)と人間文化(都会)の二つの世界のつながりから成り立つ「関係タイプ」であることがわかった。これによると、人と動物の関係には、「関係の場」(人間界、野生界、中間の世界、移行の世界)と「関係のかたち」(現実、仮想、部分・擬似)の二つの尺度から見て、15のタイプに分けて見ることができる。すなわち1)人間界・現実、2)人間界・仮想、3)人間界・擬似、4)野生界・現実、5)野生界・仮想、6)野生界・擬似、7)中間の世界・現実、8)中間の世界・仮想、9)中間の世界・擬似、10)人間界→

野生界・現実、11)人間界→野生界・仮想、12)人間界→野生界・擬似、13)野生界→人間界・現実、14)野生界→人間界・仮想、15)野生界→人間界・擬似、である。現代日本・バリ・ジャワには、いずれのタイプに近いものが、事例として現存するが、こうした図式から見るとことによって、個々のケースの特徴とその宗教性の本質を、が浮き彫りとらえることができる。当初の研究目的にあるヒト・動物関係の諸パターンを、主要な研究対象の地域(日本)において、7割程度研究調査することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度(最終年度)之しては、これまでの研究調査の記録と映像を編集して活字・映像媒体の作成にとりかかるほか、日本国内、バリ、ジャワでの研究調査を部分的に行う予定である。
2光子励起表面プラズモン共鳴顕微鏡の開発と分子蛍光の高感度検出への応用

試作したシステムでは,膜厚55nmの銀薄膜の表面に,開口数1.3の油浸対物レンズを用いてHe-Neレーザー光を集光し,局所的に表面プラズモンを励起する.表面プラズモンが励起されると,銀薄膜での反射光のうち,プラズモンの励起角に対応した部分の反射光が減少し,対物レンズの瞳面に黒いリングが現れる.試作した顕微鏡では,このリングの径を計測することにより,レーザー集光点での試料の屈折率もしくは膜厚を測定することが可能になる.しかし,リングのどの部分の光強度を測定するかによって,得られる像の分解能や検出感度が変化することが昨年度の研究の結果わかっていた.そこで,本年度はこの測定位置と顕微鏡の像特性との関係を調べた.試料として,膜厚55nmの銀薄膜の上に,厚さ400nmのフォトレジストをスピンコーティングし,このレジストに10μm間隔のストライプパターンをパターニングした.そして,このストライプパターンを試作した表面プラズモン顕微鏡で観察し,その特性を調べた.その結果,ストライプと平行な方向で暗リングの変化を観察すると,約1μmの面内分解能が得られたが,垂直な方向で暗リングの変化を測定すると,約58μm程度の分解能しか得られなかった.これは,表面プラズモンの伝搬長が約10μm程度と長いためプラズモンの伝搬方向にはその分解能が低下するという,従来の表面プラズモン顕微鏡と同じ特性によるものと結論できる.しかし今回試作したシステムでは,瞳面上にはあらゆる方向の情報が同時に存在するため,複数の光検出器で,同時にその暗リングの変化を測定し,後ほどコンピュータを用いて再処理することで,表面プラズモンの伝搬長に影響されず,高分解能な計測ができることを確認・実証できた.またアキシコンを用いた光学系の特性についても評価した.表面プラズモンを励起する光学系を組み込んだレーザー走査顕微鏡システムを試作し,その面内分解能の測定を試みた.まず厚さ170μmのカバーガラスに膜厚55nmの銀薄膜を真空蒸着した.コリメートしたHe-Neレーザ光を開口数1.3の油浸対物レンズに入射させ,この銀薄膜にカバーガラス側からレーザー光を集光した.用いた対物レンズの開口数は1.3なので,ガラスの屈折率を考慮するとレーザー光の入射角は59.1°であり,プラズモンの励起角42.9°を充分カバーしている.入射されたレーザー光は,銀薄膜によってそのほとんどが反射されるが,プラズモンの励起角に対応した光のエネルギーはプラズモンに吸収され,結果として反射光が減少する.従って,対物レンズの瞳面を観察すると,プラズモンの励起角に対応した部分のみ,黒いリングが現れる.この光学系の場合プラズモンの励起角は,銀薄膜が接している媒質の屈折率に依存するため,この媒質の屈折率が変わると,黒いリングの半径が変化する.従って,このリングの半径を計測することにより,媒質の屈折率分布をマイクロメートルオーダでかつ高感度に計測できる.実験では,ステップ状のガラス板や直径5μmのポリスチレン微粒子を銀薄膜に密着させて試料とし,試作した表面プラズモン顕微鏡の分解能を測定した.その結果,用いた対物レンズの理論的分解能とほぼ等しい分解能を実現可能であることを確認し,これまで薄膜などの2次元試料の測定にしか用いられなかった表面プラズモン検出法が顕微領域の計測にも利用できることを実証できた.さらに,センサーのS/N比と面内分解能の向上を測るため,アキシコンプリズムを用いてリング状の光を生成する光学系の試作も行った.現在試作したシステムの特性を評価中である.試作したシステムでは,膜厚55nmの銀薄膜の表面に,開口数1.3の油浸対物レンズを用いてHe-Neレーザー光を集光し,局所的に表面プラズモンを励起する.表面プラズモンが励起されると,銀薄膜での反射光のうち,プラズモンの励起角に対応した部分の反射光が減少し,対物レンズの瞳面に黒いリングが現れる.試作した顕微鏡では,このリングの径を計測することにより,レーザー集光点での試料の屈折率もしくは膜厚を測定することが可能になる.しかし,リングのどの部分の光強度を測定するかによって,得られる像の分解能や検出感度が変化することが昨年度の研究の結果わかっていた.そこで,本年度はこの測定位置と顕微鏡の像特性との関係を調べた.試料として,膜厚55nmの銀薄膜の上に,厚さ400nmのフォトレジストをスピンコーティングし,このレジストに10μm間隔のストライプパターンをパターニングした.そして,このストライプパターンを試作した表面プラズモン顕微鏡で観察し,その特性を調べた.その結果,ストライプと平行な方向で暗リングの変化を観察すると,約1μmの面内分解能が得られたが,垂直な方向で暗リングの変化を測定すると,約58μm程度の分解能しか得られなかった.これは,表面プラズモンの伝搬長が約10μm程度と長いためプラズモンの伝搬方向にはその分解能が低下するという,従来の表面プラズモン顕微鏡と同じ特性によるものと結論できる.しかし今回試作したシステムでは,瞳面上にはあらゆる方向の情報が同時に存在するため,複数の光検出器で,同時にその暗リングの変化を測定し,後ほどコンピュータを用いて再処理することで,表面プラズモンの伝搬長に影響されず,高分解能な計測ができることを確認・実証できた.またアキシコンを用いた光学系の特性についても評価した.
クロロフィル代謝研究の基盤整備と新展開に向けた総合的研究

クロロフィルサイクルの未同定な酵素7-ヒドロキシメチルクロロフィルa還元酵素(HCAR)の同定に成功した。この酵素の組み換えタンパク質は、2Fe-2SとFADを持ち、フェレドキシンを必要とし、これはジビニル還元酵素から進化したと考えられる。HCARの基質特異性から、クロロフィルb分解経路を調べたところ、クロロフィルb-7-ヒドロキシメチルクロロフィルa-クロロフィルaの経路で転換することが明らかになった。クロロフィル代謝は、50年以上にわたる研究によってその大まかな経路が決定され、さらにそれを担う多くの酵素遺伝子が同定された。しかし、幾つかの酵素がまだ同定されておらず、さらに代謝経路に関しても、未解明な点が残されている。一方、最近の研究によって、クロロフィル代謝は多様な生理現象と深く関わっていることが明らかになり、さらに農学的応用の可能性も指摘されてきた。このような点を背景に、本研究は、(1)クロロフィル代謝に関わる全遺伝子の同定、(2)代謝経路の確定、(3)調節機構の解明、(4)クロロフィル代謝の多機能の解明、(5)応用研究への展開を目指したものである。本年度は、クロロフィル代謝の応用展開に焦点を当てて研究を行った。クロロフィルb合成に関与するクロロフィリドaオキシゲナーゼ(CAO)は3つのドメイン(A-,B-,C-ドメイン)からなっている。A-ドメインはCAOの活性を負に制御するため、A-ドメインを削除したCAOを導入したシロイヌナズナ(BC株)はクロロフィルbの合成が促進され、集光装置内のクロロフィルbの分布も大きく変わる。このBC株は、強光に弱く光傷害を受けやすいが、一方で、通常の光条件では老化の遅延が見られた。BC株では、光合成関連のタンパク質(RuBPaseやLHCII)の発現が持続し、老化関連のタンパク質(NYC1,SAG12)の発現が抑制された。さらに、転写因子の発現を網羅的に解析したところ、老化関連転写因子の発現が抑制されていた。このことから、BC株では、光化学系が改変されたことにより、転写のリプログラミングが起こり、老化が遅延したと考えられる。これらの成果は、葉緑体の新しい機能を示すと同時に、光合成の農学的応用につながると期待される。クロロフィル代謝は50年以上にわたる研究によって、その大まかな経路が決定され、さらにそれを担う多くの酵素遺伝子が同定された。特に本年度は、未同定な酵素遺伝子の同定に取り組んだ。クロロフィルaとクロロフィルbの相互転換系をクロロフィルサイクルと呼ぶ。クロロフィルサイクルは、クロロフィルaからクロロフィルbを合成するクロロフィリドaオキシゲナーゼ(CAO)、クロロフィルbを還元し7-ヒドロキシメチルクロロフィルaに転換するクロロフィルb還元酵素(CBR)、7-ヒドロキシメチルクロロフィルaをクロロフィルaに転換する7-ヒドロキシメチルクロロフィルa還元酵素(HCAR)の3つの酵素からなっている。CAOとCBRは既に同定されているが、HCARは未同定のまま残されている。我々は、葉緑体に存在する鉄硫黄-フラビンタンパク質を大腸菌で発現させ、精製した後、この組換えタンパク質がHCAR活性を持っているかを調べた。その結果、このタンパク質は還元型フェレドキシンの存在下で、7-ヒドロキシメチルクロロフィルaをクロロフィルaに転換する活性を持っていることが明らかになった。この遺伝子の欠損株は、7-ヒドロキシメチルクロロフィルaを蓄積することも示された。これらの結果により、クロロフィルサイクルの最後の未同定遺伝子HCARを同定することに成功した。本年度は、昨年度行われた7-ヒドロキシメチルクロロフィルa還元酵素(HCAR)の同定を基盤に、HCARの基質特異性を調べることで、クロロフィルbの分解経路の決定を試みた。クロロフィルb分解の最初の過程はクロロフィルb還元酵素(CBR)が触媒する。

しかし、この酵素の基質特異性が広いため、クロロフィルbの分解は複数の経路で行われると推論されてきた。しかし、CBRの次の酵素であるHCARは、7-ヒドロキシメチルクロロフィルaのみを基質にし、7-ヒドロキシメチルフェオフォリビドaや7-ヒドロキシメチルフェオフォルビドaは基質にしなかった。これらのことから、クロロフィルbの分解は、クロロフィルb→7-ヒドロキシメチルクロロフィルa→クロロフィルaの経路で進行することが明らかになった。クロロフィルbがこれ以外の経路に入った場合、分解中間体が蓄積し、細胞死が引き起こされることを見出した。また、さまざまな実験から、集光性クロロフィルa/bタンパク質複合体に結合しているクロロフィルbがCBRの基質であることが示された。これらの実験により、本研究で初めてクロロフィルbの分解経路が決定された。
海産無脊椎動物における微環境選好性による種分化機構の解明

海産無脊椎動物では、浮遊幼生期間の長さが遺伝的集団構造の形成に影響を及ぼすことが知られている。しかし、近年では浮遊幼生期間以外にも、潮間帯上での垂直分布や海岸の開放度、分布域の水温などが影響を及ぼしていることが示唆されている。これらの要因による遺伝的集団構造の形成への影響を推定するためには、浮遊幼生期間が同程度で、系統的に近縁な種間での比較が必要である。今回、上記の要件を満たすカサガイ類を用いて、生息環境と遺伝的集団構造の比較を行い、どのような要因が影響を及ぼしているか明らかにすることを目的とした。東アジアに分布するアオガイ類8種から4遺伝子の塩基配列の決定を行った。集団遺伝学的解析には、ハプロタイプネットワークの作成、遺伝的距離の算出、有効集団サイズの推定を行った。生息環境のデータとして、潮間帯上の分布、地形的開放度、採集地点の年間平均水温を用いた。潮間帯上の分布は、5つの県でコドラート調査を行い、垂直分布について調べた。海岸の開放度は、32方位ごとの対岸までの距離を計測し、その距離の合計を用いた。分布域の平均水温は、採集地点付近の年間平均海水温を用いた。潮間帯上の垂直分布と種内の遺伝的距離の比較を行った結果、アオガイ類では潮間帯上部ほど遺伝的集団構造が形成されやすい傾向は確認されなかった。開放度と遺伝的距離の比較を行った結果、逆相関する傾向が明らかになり、遮蔽的な海岸に生息する種ほど遺伝的構造を持ちやすく、開放的な海岸に生息する種では遺伝的構造を持ちにくいことが明らかになった。分布域の平均水温と遺伝的距離は、相関関係は見られなかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。日本列島の潮間帯に生息しているカサガイ類を用いて種分化機構の検証を行った。具体的には、同所的に生息し、産卵時期が殆ど同じであるにも関わらず、それぞれの種が維持されている理由として、微環境選好性による分断化選択の可能性を検討した。そのために以下の4つの課題を検討した。(1)種が同所的に生息しているか、(2)雑種個体の適応度の低下、(3)過去の分布域の推定、(4)単系統性の確認。平成26年度は、(1)と(4)の課題を重点的に行った。それぞれの種の生息状況は、これまで定性的な評価しかなされておらず、生態学的手法を用いて定量的評価を行った。調査地点は、千葉県、神奈川県、静岡県、和歌山県において行った。コドラートを用いて緯度経度を測定し、生息域における分布の重なりを定量的に評価を行った。その結果、それぞれの種の生息環境の選好性が明らかにされた。しかし、それを引き起こす要因(潮位や餌など)については検討中である。単系統性の確認は、アオガイ類9種類から3遺伝子(COI, Cytb, 12S rRNA)の塩基配列の決定を行い、分子系統解析を行った。その結果、アオガイ類の単系統性は確かめられ、生息環境および殻高の高低による分岐が推定された。しかし、それぞれの種間の系統関係については高い支持率を得ることができなかったため、系統推定に用いる遺伝子数を増やす必要がある。今後、残りの課題である雑種個体の適応度の評価と過去の分布域の推定を行う予定である。平成27年度は形態形質と分子系統解析の結果を照合し、分類学的再検討を行った。その結果、本研究で用いているアオガイ類では、これまでの分類体系が分子系統解析の結果からも支持された。系統関係は、殻高の高低により大きく2つのクレードに分かれることが判明した。得られた分子系統樹に形態形質のマッピングを行った結果、殻高以外には系統と対応する形態形質は確認されなかった。むしろ、生息環境と対応すると考えられる形態形質が複数見つかった。例えば、潮間帯上部に生息する種ほど歯舌嚢が長くなり、下部の種ほど短くなる傾向が明らかとなった。和歌山県において野外調査を行った結果、研究対象種の微環境選好性の存在が示唆された。これまでは定性的な調査しか行われていなかったが、本研究では、コドラートを用いて緯度経度を測定し、生息域における分布域の重なりを定量的に評価を行った。その結果、それぞれの種の好む場所が明らかとなった。また、種によって分布のパターンが異なることが明らかとなった。具体的には、ある種では密度は低いものの潮間帯に広域に分布し、別の種では潮間帯の一部に局所的に高密度で分布することが明らかとなった。ただし、今回は生息環境の物理的要因(例えば、水深や水温、餌生物など)はデータを得ることができなかった。今後、それぞれの種が好む生息場所を中心として、生息環境のデータが得られれば、より微環境選好性を明らかにできると考えられる。和歌山における野外調査の結果を和文雑誌に投稿し、現在印刷中である。野外調査中に、浦戸湾で初確認となる外来種を見つけたため、報告を行った。分子系統解析と比較解剖を行い、分類学的再評価を行った研究を国際学術雑誌に投稿した。

しかし、近年では浮遊幼生期間以外にも、潮間帯上での垂直分布や海岸の開放度、分布域の水温などが影響を及ぼしていることが示唆されている。これらの要因による遺伝的集団構造の形成への影響を推定するためには、浮遊幼生期間が同程度で、系統的に近縁な種間での比較が必要である。今回、上記の要件を満たすカサガイ類を用いて、生息環境と遺伝的集団構造の比較を行い、どのような要因が影響を及ぼしているか明らかにすることを目的とした。東アジアに分布するアオガイ類8種から4遺伝子の塩基配列の決定を行った。集団遺伝学的解析には、ハプロタイプネットワークの作成、遺伝的距離の算出、有効集団サイズの推定を行った。生息環境のデータとして、潮間帯上の分布、地形的開放度、採集地点の年間平均水温を用いた。潮間帯上の分布は、5つの県でコドラート調査を行い、垂直分布について調べた。海岸の開放度は、32方位ごとの対岸までの距離を計測し、その距離の合計を用いた。分布域の平均水温は、採集地点付近の年間平均海水温を用いた。潮間帯上の垂直分布と種内の遺伝的距離の比較を行った結果、アオガイ類では潮間帯上部ほど遺伝的集団構造が形成されやすい傾向は確認されなかった。開放度と遺伝的距離の比較を行った結果、逆相関する傾向が明らかになり、遮蔽的な海岸に生息する種ほど遺伝的構造を持ちやすく、開放的な海岸に生息する種では遺伝的構造を持ちにくいことが明らかになった。分布域の平均水温と遺伝的距離は、相関関係は見られなかった。野外調査は予定の5地点中4地点において調査が完了した。分子系統解析のために、シーケンス個体および遺伝子数を増やした。発生実験および塩基配列個体の決定を重点的に行う。野外調査で得られたデータの解析を行う。前年度得られた成果を分子生態学関連の国際学術雑誌に投稿を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は発生実験および分布域推定のためのデータセットの作成を精力的に行う。前年度の成果を論文として投稿する。
ミューオン異常磁気能率の計算精度向上に向けたハドロン生成断面積の精密測定

ミューオンの異常磁気能率(g-2)は,理論による計算値と実験による測定値で3σ程度の乖離が見られており,素粒子物理学において新物理の兆候を示すものとして強く期待され精力的に研究がなされている.しかし理論と実験ともに新物理を確定するには十分な精度でないため互いに精度を向上することが不可欠である.実験値に関しては米国フェルミ国立研究所が近年新しい実験を開始し,ここ5年程度で大きな精度向上が見込まれている.一方,理論値はハドロン真空偏極の効果の不定性が支配的な誤差となっており,これは電子陽電子衝突からのハドロン生成断面積測定の精度に由来する.そこで本研究では,世界最高強度の電子陽電子衝突頻度を見込む茨城県つくば市のSuperKEKB加速器を用いたBelle II実験において,始状態放射(ISR)を用いた測定による精度向上のための測定手法について考察を行った.2018年度から試験運転が開始され,少ないデータ量ではあるが実データ解析により系統誤差削減のための解析を行った.前年度に行ってきたシミュレーションを用いた研究結果を実データに当てはめ, ee->pi+pi-やee->pi+pi-pi0の生成断面積が統計の範囲内で予測と実測で一致することを確認した.また, 2019年からの本格運転において大きな系統誤差要因となりうるオンラインでの事象選別(トリガー)効率の評価も行い,測定システムが統計の範囲内で十分に高い効率を有していることを確認した.これらにより今後高統計のデータ取得を行い測定精度向上を進めていく上でBelle II実験が最低限の測定環境を有することが確認でた.ミューオンの異常磁気能率は,現在の実験による測定値と標準理論からの予言値に有意な差が見られており,新物理の兆候として幅広く研究がなされている.しかしながら,観測されているずれに比べて,測定値,予言値の不定性は小さくなく,新物理を確定するには十分な精度ではない.測定に関しては,日米双方でより新しい実験が計画,遂行段階にあり,近い将来,より高精度な測定結果が見込まれている.一方で理論からの予言の精度の向上も同時に必要となる.これは,低エネルギーでのQCDの計算が必要であり,精度の良い計算が原理的に難しいが,低い重心系エネルギー(<2 GeV)に於ける電子陽電子からのハドロン生成断面積のデータを用いて計算可能であることが知られている.現在の理論予言値は世界各地で行われてきた実験データを用いて計算されているが,その精度が理論計算の精度を制限している.そこで本研究は2018年より衝突運転を開始する次世代Bファクトリー実験「Belle II」において,初期状態放射を用いて荷電パイ中間子対が生成する反応断面積を精密に測定することで,ミューオン異常磁気能率の理論値の精度向上を目指す.特にシミュレーションを用いて, Belle II実験のこれまでの実験では成し得なかった大統計のデータと,高性能な新型測定器を生かした解析手法の確立と,初期のデータを用いたその手法の検証を行いう.これにより,大統計のデータが取得され次第,いち早く解析結果を発信できるよう,その基礎を整える.シミュレーションを用いた事象選別効率や,背景事象の評価を行った.特に粒子識別に関わる事象選別の改善を行うことで,高い選別効率を保ちつつ,これにまつわる背景事象を先行研究と同程度に抑えることに成功した.この他データ取得を行なっていく上で最初に重要となるトリガーの選別率に関してもシミュレーションを行い,高い効率でデータ取得が行えることを示した.これらの成果について, 2018年2月に行われたつくば市で行われた国際ワークショップにおいて報告を行った.ミューオンの異常磁気能率(g-2)は,理論による計算値と実験による測定値で3σ程度の乖離が見られており,素粒子物理学において新物理の兆候を示すものとして強く期待され精力的に研究がなされている.しかし理論と実験ともに新物理を確定するには十分な精度でないため互いに精度を向上することが不可欠である.実験値に関しては米国フェルミ国立研究所が近年新しい実験を開始し,ここ5年程度で大きな精度向上が見込まれている.一方,理論値はハドロン真空偏極の効果の不定性が支配的な誤差となっており,これは電子陽電子衝突からのハドロン生成断面積測定の精度に由来する.そこで本研究では,世界最高強度の電子陽電子衝突頻度を見込む茨城県つくば市のSuperKEKB加速器を用いたBelle II実験において,始状態放射(ISR)を用いた測定による精度向上のための測定手法について考察を行った.2018年度から試験運転が開始され,少ないデータ量ではあるが実データ解析により系統誤差削減のための解析を行った.前年度に行ってきたシミュレーションを用いた研究結果を実データに当てはめ, ee->pi+pi-やee->pi+pi-pi0の生成断面積が統計の範囲内で予測と実測で一致することを確認した.また, 2019年からの本格運転において大きな系統誤差要因となりうるオンラインでの事象選別(トリガー)効率の評価も行い,測定システムが統計の範囲内で十分に高い効率を有していることを確認した.これらにより今後高統計のデータ取得を行い測定精度向上を進めていく上でBelle II実験が最低限の測定環境を有することが確認でた.事象選別や解析手順に関して,更に詳細な評価を行い,背景事象の抑制や選別効率の向上を目指す.また,本年度前半より物理データの取得を開始するため,実データに基づいたトリガーの選別効率の事象選別効率を評価し,必要に応じて解析手順の最適化を行う.これにより今後大統計のデータを用いることで高い精度での測定が可能であることを示し,いち早く結果を発信する基礎を確立する.
傾斜機能バイオセラミックス多孔体の試作と生体内反応

ダイヤモンド粉末を混入させた各種粒度のナフタレンおよびPMMAを作製し(気孔径パターン)、ハイドロキシアパタイト(HAP)粉末と混合したものを乾式加圧成形した。混合成形体を減圧雰囲気で1280°Cまで加熱し、3時間焼成した。その温度での焼成中に減圧雰囲気を解除し、大気圧焼成を行った。その結果、試験片中のダイヤモンド、ナフタレンおよびPMMAは焼成過程で消失し、焼成された多孔体の気孔率はHAP粉末と気孔径パターンの混合比により、5080%の値を得ることができた。気孔径は気孔径パターンの大きさにより、0.11.0mmまで調整することが可能であった。ナフタレンを用いた場合、気孔を形成している焼成体骨格部は比較的、緻密に焼結していたが、PMMAを用いた場合は十分に焼結しない傾向がみられた。焼成体全体の結晶相をX線回折により調べた結果、HAPの回折線以外にαリン酸三カルシウム(αTCP)の回折線が確認できた。さらにXMAおよびFT-IRの測定から組成の傾斜が認められたことにより、表面および気孔表面は大部分がαTCP相で、深さが増すにつれてαTCP相が少なくなってゆき、内部はHAP単独相であるものと考えられた。HAPがαTCPに分解する原因は、焼成中の試験片表面の温度測定からダイヤモンドの燃焼熱が作用しているものと推察された。試作した試験片とHAP多孔体をラットの皮下組織に埋入し、比較検討を行った結果、カーボネイトアパタイトの沈着がHAPの場合より多量にみられることがわかった。さらに試作材料は、気孔内への組織の進入度が高いことが認められた。以上、試作した組成傾斜のリン酸カルシウム多孔体はHAP多孔体の場合より、生体内での活性が高いことを明らかにした。本研究の一部は第16回日本バイオマテリアル学会(平成6年11月)において口頭発表を行ったが、詳細については現在、適切な学術誌に公表準備中である。
頂点作用素代数の表現論にもとづく共形場理論の構成

互いに素な2以上の正の整数の組(p+,p-)に対し、拡大されたW代数と呼ばれる頂点作用素代数を定義し、(1)そのZhu氏による有限性定理を証明し、(2)その既約表現のすべてを構成した。1.sl_2型triplet W-代数W_p, p=2,3,...について、表現の圏W_p-modはW_p-modに付随した共形場理論の存在によりbraid monoidalcategoryになる。また、私は永友氏と共同でabel圏W_p-modはq=e^<πt/p>の場合のsl_2型量子群U_q(sl_2)の有限時限表現のつくるabel圏と同値であることを示した。その後、私はSimon Wood氏と共同でW_p-modにおける単純対象と射影対象の間のfusion tensor積を具体的に計算し、これらの対象のfusion tensor積は単純対象と射影対象の直和であることを示した。このことにより、さらにbraided monoidal category W_p-modはrigidかっribonであることを示した。このことは2011年3月福岡で開かれた国際共同研究集会で報告した(学会発表)。このことは多くの物理学者により観察・予想されていたものである。このことにより、W_p-modにassociate共形場理論における種数1の共形ブロックにおけるsl_2(z)の表現とfusion tensor積の構造定数の間の関係についてのVerlinde型の定理の形が見えてきた。2.A.D.E.型単純リー環gと互いに素な正整数の組(p_+,p_-)に対して格子頂点作用素代数と2p個のscreening作用素を使ってg型のtriplet W-代数Wp_+,p_-(g)を定義し、そのC_2-有限性を証明し、さらに対応するabel圏の構造を解析する。このためには、screening作用素の積の積分に関連してその詳しい性質が必要である。これは複素平面の点の配置空間の局所素数のde Rham積分理論の性質に帰着される。これをFactoriabe sheaveのつくるtensor圏と関連して考察を進めている。1.sl_2型のtriplet W-代数W_p,p=2,3,...は、現在知られているC_2-有限性を満たし、かつその表現のつくるAbel圏が半単純にならない数少ない頂点作用素代数である。W_pに付随して構成されるP^1上の共形場理論におけるfusion tensor積を使ってabel圏W_p-modはbraided monoidalcategoryの構造を持つ。私はSimon Wood氏と共同で単純加群と射影加群の間のfusion tensor積を具体的に計算し、これらが単純加群と射影加群の直和となることを示した。この結果については2011年6月に北京で開かれた国際研究集会で講演を行い報告した。2.さらに、互いに素な正の整数の組(p_+,p_-)に付随して定義される頂点作用素代数Wp_+,p_-についても、Simon Wood氏と共同でこれがC_2-有限性を満たすことを示した。現在これをさらに深めて、単純加群と射影加群の構成問題の解決をしようとしている。このため、W_p-modのabelian categoryとして構造解析を行った。具体的には、W_p-加群についての永友・土屋で用いた方法を自然にWp_+,P_--加群の場合に拡張して、単純加群の構成およびその射影拡張を構成することが出来る。このことにより、Wp_+,p_--modのabel圏の構造が記述される。互いに素な正の整数の組p+,p-に対し、拡大されたW代数と呼ばれる頂点作用素代数Mを定義し、その表現のカテゴリーの解析を行った。この代数は自由場表示とスクリーニング作用素を使って定義される。スクリーニング作用素の積を積分してヴィラゾロ代数のまつわり作用素が得られる。このとき、スクリーニング作用素の積の多価性より生じる1次元射影空間のN点のつくる配置空間上のtwittedな局所係数付きのホモロジー群やコホモロジー群の理論を使って積分する必要がある。しかし、我々の場合はいわゆるresonace現象のため、このホモロジー群は非常に複雑である。我々はこの困難を克服するため、考えているパラメータを複素数体から型式的巾級環内で変動させた。こうすることにより、ホモロジー群やコホモロジー群の消滅定理に成立し、計算が非常に楽になる。こうすると積分は一般に形式的ローラン巾級環に値を取るが、積分とJack多項式の理論を使うことにより、実際には値はこのローラン巾級環に属することが示される。これより、考えている積分が定義できる。このことより色々なまつわり作用素を評価でき、最終的に考えているW代数の頂点作用素代数のC2-有限性やすべての既約表現が構成される。W_pの場合をWp_+,p_-に拡張するための最も重要な論点は、Screening作用素を定義するために必要な局所係数ホモロジー群におけるサイクルを構成することであり、このサイクルによる積分を計算することであった。これは積分をJack多項式の内積公式に還元することによりなされた。24年度が最終年度であるため、記入しない。

Wp_+,p_-のアーベル圏としての構造解析、およびbraided monoidal圏としての構造解析、および1の巾根における量子群の表現論との関係、等の具体的な姿が浮かび上がっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
糸状菌メロテルペノイドの生合成研究

糸状菌Aspergillusfumigatusより単離され、高いACAT阻害活性を有し、動脈硬化予防薬として応用が期待されるピリピロペンに着目し、その生合成クラスターに含まれる個々の酵素の触媒機構や立体構造の解明を目指した。酵素群において最初の触媒反応を担うCoA ligase, Pyr1はニコチン酸を開始基質としてATP存在下でAMP中間体を生成した後、CoASHと反応させる事で、最終的にニコチン酸CoAエステルを生成すると予想された。Pyr1の詳細な触媒メカニズムを調べるため、in vitroにおける機能解析を行った。全長560アミノ酸残基を有するPyr1を大腸菌発現ベクターであるpCold vectorへと組み込みIPTGで誘導培養後、Niキレートカラムを用いてアフィニティー精製を行った。得られた精製酵素を用いてニコチン酸、CoASH,ATPと共に酵素反応を行ったが、予想された生成物であるニコチン酸CoAエステルは検出できなかった。一方、CoASHの部分構造であるMアセチルシステアミン(NAC)を用いた場合、酵素反応に特異的なピークが見られた。有機合成により合成したニコチン酸NACエステルを標品として酵素反応生成物と比較した結果、リテンションタイム、MS、及びMS/MSが一致した。本研究結果から、Pyr1は従来のCoA ligaseの基質であるCoASHではなくNACを基質とするCoA ligaseであることが判明した。今後、立体構造などの情報から変異導入を行う事で基質特異性を拡大できれば、ピリピロペン骨格を有した新規化合物を生産できる可能性を示唆している。現在、ゲノム解析が終了している糸状菌の一種である麹菌(Aspergillus oryzae)より見いだされたPax/Atmクラスターに含まれる酸化酵素(FMO,BAE63217)及び環化酵素(CYC,BAE63218)の機能解析に取り組んでいる。最初に、in vitroによるFMOの機能解析を目的として、酵母及び大腸菌を宿主とした発現系の構築系確立を試みた。麹菌よりgDNAを抽出後、overlap PCR法を用いて予測されたイントロン領域を除去した後、目的遺伝子を酵母発現ベクターpESC-Ura vector及び大腸菌発現用ベクターpET22bへと組み込んだ。pESC-FMOプラスミドをGIL77株及びINVSc2株へと形質転換した後、誘導培養した酵母から粗酵素抽出液を得た。粗酵素、及び基質と予想されるgeranylgeranyl-indoleを補酵素(FAD or FMN,NADPH or NADH)と共に酵素反応を行ったが、基質が酸化された化合物の検出は現在至っていない。大腸菌発現系においては、C末にHis-tagを付加した融合タンパクとして発現させた後、Niキレートカラムを用いたアフィニティー精製を行った結果、確かに本酵素の発現を確認できたものの、その発現量は微量であった。大腸菌発現系から得られた精製酵素を用いて上記同様の手法でFMOのin vitro解析を試みたが、酵母発現系と同様、酸化化合物の検出には至っていない。これらの原因として、FMOの膜ドメイン領域が考えられた。蛋白構造予測ソフトを用いてFMOの構造を予測した結果、N末とC末の一部で疎水性領域が見られ、その部位が膜に結合していると予想された。その結果、酵母や大腸菌などの異種発現では酵素本来のコンフォメーションを形成できていない可能性が示唆された。初年度の到達目標として、(1)酸化酵素の加幅加系による機能解析、(2)部位特異的変異導入による酵素反応機構の解明を計画していた。実際に酵母及び大腸菌を宿主とした異種発現により酵素発現系の確立には成功したものの、酵素機能を解析するには至っていない。膜ドメインを有するタンパクであることから当初から困難は予想されたが、次年度における目標を達成できるものと考えている。

本研究では、糸状菌メロテルペノイド、特にインドールジテルペンの生合成に普遍的に関与するフラビン依存性酸化酵素、FMOの立体構造解析を目的としている。その為、タンパクの結晶化を視野に入れたin vitro系の確立を試みたが、結果は芳しくない。そこで既に構築したin vitro系による酵素機能解析と同時に、糸状菌を宿主とした発現系の構築を試みる。本研究室では既に、Aspergillus oryzae M-2-3株及びNSAR1株を宿主としてpyripyropene,terretonin生合成クラスターの機能解析に成功しており、本研究対象であるAspergillus oryzae由来paxilline生合成クラスターにも適応可能と推測される。本手法を適応すれば、生合成に必要な遺伝子をクラスター全体を宿主へと組込むことで物質生産の観点からも有望である。
雲南地域の植物性抗がん剤に関する研究

研究目的国際協力により、中国の気候条件の異なる広い地域にわたって植物を採集し、組織的に制がん活性を示す新規物質を検索する。研究成果1.中国雲南省および四川省地方を中心とした植物採集および粗抽出1995年7月に植物に茎葉部を、また10月には根茎部を中心に約100種類の植物を採集した。採集された植物はそれぞれ、水またはエタノールで加熱抽出を行った後、濃縮、凍結乾燥により粗抽出物を得た。2.生物活性の評価採集した植物の粗抽出物は、次の3種の生物活性について評価を行った。(1)培養細胞に対する細胞毒性各粗抽出物は、10μg/ml、1μg/mlの濃度で、マウス白血病P388/ADMおよびヒト白血病K562/ADM培養細胞に対する細胞毒性をしらべた。数種の植物粗抽出に強い細胞毒性が認められた。(2)細胞周期に影響をおよぼす物質の検索マウス乳がん細胞tsFT210細胞を用いて、細胞周期におよぼす各粗抽出物の影響をフローサイトメトリー法で測定した。G2-M期を低濃度で阻止する粗抽出物が数種類認められた。(3)BRM活性を有する物質の検索マウス脾細胞幼若化、腹腔マクロファージの貧食能および細胞傷害T細胞の細胞傷害過程に作用する物質の検索を行った。数種の粗抽出物にBRM活性を示す物質が認められた。3.植物抽出物から有効物質の単離精製各植物抽出物から、溶媒抽出、シリカゲル、セファデクスLH-20などを用いたカラムクロマトグラフィー、HPLC等によって有効物質を単離精製し、機器分析等によって化学構造の同定を行った。(1)中国南部の薬草Panax gensengの抽出物から、細胞毒性を示す数種の活性物質が単離された。(2)Trichosanthes Kiriolowii(カロコン)の抽出物より細胞毒性を示す有効物質が数種存在することが、単離精製の過程でわかっている。そのうちの1つは物理化学的性質からcucurbitacin Dと同定された。(3)Saussurea lappa Clarke(モツコウ)の抽出物より、細胞傷害性T細胞クローンOE4の肥満細胞腫細胞P815に対する細胞傷害活性を抑制する物質を単離した。物理化学的性質の解析からcostunolideおよびdehydrocostus lactoneと同定された。両成分について細胞傷害性における効果を検討したところ、両成分ともに1μg/ml濃度で約50%の阻害を示した。またT細胞と標的細胞を本物質で前処理した後の細胞傷害活性の発現を検討したところ、標的細胞を処理したものでは効果がないが、T細胞を処理したものでは細胞傷害活性の阻害が認められた。このことから、本物質はT細胞の障害活性発現過程を特異的に阻害していると考えられる。4.今後の研究課題と展望(1)採集した多くの植物の抽出物より有効物質の単離精製(2)有効物質の構造研究(3)抗がん剤としての基礎的研究(4)新規な構造を有する有効成分の化学変換を行い、制がん剤として開発する。(5)いわゆる「民族植物学」といわれる小数民族独自の薬用植物について調査を進める。