hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗がん剤投与ラットにおけるユビキノールの口腔粘膜炎予防効果の検討

または生理食塩水を腹腔内投与した。また、3日目には、50%酢酸を直径3mmのろ紙に浸透させ、30秒間舌下面に貼付した。その後、舌下面の状態を経時的に観察した。実験群のうち2匹では、5日目に潰瘍を伴う口腔粘膜炎が発生した。一方、コントロール群ではいずれのラットにおいても、5日目においても潰瘍を伴う口腔粘膜炎が発生しなかった。このことから、5-FUの腹腔内投与と舌下面への酢酸の貼付により、5日目に潰瘍を伴うことが確認されたが、再現性のある口腔粘膜炎モデルを確立するためには、酢酸の貼付時間を延長するなどの検討が必要である。化学療法に伴う口腔粘膜炎のラットモデルの確立に時間を要したため平成28年度では、抗がん剤による口腔粘膜への影響について検討した。8週齢Wistar系ラットを「生理食塩水投与+ワセリン塗布」群と「抗がん剤投与+ワセリン塗布」群の2群に分け、1日1回、5日間、吸入麻酔下で生理食塩水または抗がん剤(5-フルオロウラシル:5-FU)(20mg/kg)を腹腔内投与し、ワセリンを5分間舌下面に塗布した。その結果、抗がん剤投与群の白血球数は、生理食塩水投与群と比べ有意に低くなり、5-FUの奏功が確認された。一方、舌の組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色および、免疫染色(8-OHdG、NF-κB、およびIL-1β)を行った。5-FUの腹腔内投与により、舌下面の酸化ストレス・転写因子・炎症性サイトカインの増加することが確認された。平成29年度では、抗がん剤投与ラットにおける口腔粘膜炎モデルを確立することを目的とした。8週齢Wistar系ラットを「抗がん剤投与+50%酢酸貼付」群と「生理食塩水投与+50%酢酸貼付」群の2群に分けた。吸入麻酔下で5-FU(1日目:100mg/kg、3日目:65mg/kg)または生理食塩水を腹腔内投与した。また、3日目には、50%酢酸を浸漬させた濾紙を、30秒間舌下面に貼付した。5日目に舌下面の潰瘍を認めたが、再現性のある口腔粘膜炎モデルの再検討が必要であると考えられた。平成30年度では、再現性のある口腔粘膜炎モデルの検討を目的とした。8週齢Wistar系ラットを「抗がん剤投与+50%酢酸30秒貼付」群(30秒群)、「抗がん剤投与+50%酢酸1分貼付」群(1分群)、「抗がん剤投与+50%酢酸3分貼付」群(3分群)、「抗がん剤投与+50%酢酸5分貼付」群(5分群)の4群に分け前年度と同様の実験手順で、再現性の検討を行った。その結果、50%酢酸の1分以上の貼薬によって舌下面に口腔粘膜炎が発症されることが分かった。炎症性細胞浸潤や潰瘍の形成など、口腔粘膜炎が著明に発生するモデルを検討する。酢酸の貼付時間を延長し、再現性のある口腔粘膜炎モデルを確立する。口腔粘膜炎モデルが確立できていないため、平成29年度予定していた軟膏に配合するユビキノール濃度の決定に関する実験を行っておらず、次年度使用額が生じた。今後は、酢酸の貼付時間を延長し、再現性のある口腔粘膜炎モデルを確立するための動物実験を行う。また、口腔粘膜炎モデルが確立されたら、軟膏に配合するユビキノール濃度の決定に関する動物実験、および口腔粘膜炎に対するユビキノール配合軟膏塗布の効果の検討を行うための動物実験を行う。
ＣＸＣＲ４－βａｒｒｅｓｔｉｎ２－ＥＲＫ経路を利用した膀胱癌早期診断治療法の開発

本研究はレドックス関連因子であるTXNIPならびにERK経路の膀胱発癌におけるクロストークの解明を目的とした。膀胱発癌モデルマウスや膀胱癌細胞株におけるCXCR4-ERK経路、TXNIP-ARRB2経路の遺伝子、タンパク発現の結果からTXNIPはCXCR4-ERK活性を抑制することで膀胱発癌抑制に寄与していることが明らかとなり、TXNIPは今後、膀胱癌の早期診断、治療のための新規標的マーカーとなりうる可能性が示唆された。“CXCR4-βarrestin2-ERK経路を利用した尿路上皮癌に対する早期診断治療法の開発"という課題に対し、まずβarrestin2ならびにそのco factorとされるTXNIPの膀胱癌発癌における機能解析を計画した。予備実験としてlipofectamineでのtransfectionによるTXNIP強制発現膀胱癌細胞株の樹立を試みたがtransfectionを得られなかった。これに対しては共同研究施設である京都大学よりレンチベクターを用いたtransfection技術を習得し、今後再度実験予定である。別の予備実験として、以前、京都大学より供与をうけたTXNIP knock out mouseについて代表的な上皮間葉転換(EMT)関連マーカーであるE cadherinの発現を免疫染色で検討したところTXNIPknockout mouseではwild typeと比較して膀胱尿路上皮、膣上皮、直腸上皮において発現が低下しているという結果を得た。さらに追加実験としてwestern blotを行い、やはりタンパクレベルにおいてもTXNIP knockout mouseで発現低下を確認した。以上より、これまでの実験結果から我々は、尿路上皮癌においてTXNIPならびにβarrestin2がEMTに関連しているのではないかという新たな仮説を得た。尿路上皮癌におけるTXNIP, βarrestin2のEMT制御機構に関する報告は国内外を通じて存在せず、今後独創性の高い研究結果が得られると予想される。また、EMT制御機構を検討するうえで、従来から報告のあるTGFβ-smad経路とは別の経路によるEMT制御の解明の可能性につながり、ほかの癌種においても応用可能であると考えられる。βarrestin2を中心としたCXCR4-ERK経路とTXNIPレドックス関連経路のクロストークの解明が尿路上皮初期発癌機構の解明につながりその知見をもとに新規治療、診断法の確立を目的として本研究は始まった。先行研究では、細胞癌化シグナルとして重要なERKの上流分子であるCXCR4が上皮内癌を含めた高悪性度の膀胱癌で高発現していること、膀胱癌細胞株においてCXCR4アゴニストであるSDF1によってERKが活性化する一方、アンタゴ二ストであるTF14016によりERKが抑制されることからCXCR4-ERK経路が膀胱発癌において重要な役割を果たしていることが見いだされた。本研究ではこれに加え、臨床検体ではTXNIPの発現が高悪性度の膀胱癌において低下しており、マウス膀胱化学発癌系においてTXNIP KOマウスではWTと比較して早期に高悪性度の膀胱癌を認められた。また、膀胱癌細胞株ではTXNIPの強制発現によりERK活性が抑制されており、SDF1によっても抑制され続けること、TXNIP KOマウスの組織検体ではERKが亢進していることから、TXNIPはCXCR4-ERK経路に対し抑制的に作用し、膀胱発癌早期における役割が明らかとなり、膀胱癌の早期診断、治療標的になりうる可能性が示唆された。また、TXNIP KOマウスではEMT関連マーカーであるE-cadherinの発現が低下していることが見いだされ、CXCR4-ERK経路とTXNIPレドックス関連経路のクロストークがEMTに作用する可能性も示唆された。TXNIPによるβ-arrestin2発現調節機構の解明β-arestin2を中心としたCXCR4-ERK経路とTXNIPレドックス関連経路のクロストークの解明が尿路上皮初期発癌機構の解明につながり、その知見をもとに新規の治療・診断法を確立できるのではないか、という着想から今回の研究は始まっている。TXNIPがβ-arrestin2を制御することは既に見出しているが、その制御機構については未だ分かっていない。そこで、細胞株(TXNIP非発現細胞株およびTXNIP強制発現細胞株)およびマウス発癌モデル(WTマウスおよびTXNIP-KOモデル)を用い、β-arrestin2の遺伝子発現レベル・蛋白レベルでの調節機構を明らかにする。まず、β-arrestin2を介したCXCR4-ERK活性化による膀胱発癌機序の解明するために、β-arrestin2に対するsiRNAおよび強制発現細胞株を樹立し、「β-arrestin2を介したCXCR4-ERK活性化膀胱発癌機序」を明らかにする。また、TXNIPがβ-arrestin2を制御することは既に見出しており、細胞株(TXNIP非発現細胞株およびTXNIP強制発現細胞株)およびマウス発癌モデル(WTマウスおよびTXNIP-KOモデル)を用い、β-arrestin2の遺伝子発現レベル・蛋白レベルでの調節機構を明らかにする。TXNIPノックアウト

マウスの作成は順調に経過しており、本年度は20匹まで繁殖に成功した。今後これらマウスのBBNを経口摂取させ、膀胱癌を発癌させ、分子生物学的解明を行っていくTXNIPtransfectionの実験系が安定しないためin vitroの実験は遅れているが、TXNIP knockout mouseを用いたin vivoの系ではE cadherinを中心としたEMT関連因子の発現変化をIHCならびにWBにて確認でき、おおむね順調に進んでいるため、全体的には順調に進んでいると考えられる。上皮内癌発生の過程でSDF1のパラクライン作用を受け、上皮内でのCXCR4ーERK経路が重要であるという知見から、「β-arrestin2を中心としたCXCR4-ERK経路とTXNIPレドックス関連経路のクロストークの解明と、その知見をもとにした新規の治療・診断法を確立」を目指す。本研究は以下の3点に重点をおく。1) β-arrestin2による膀胱初期発癌調節機構の解明2) β-arrestin2関連経路を利用した尿路上皮癌早期診断法の確立3) CXCR4-β-arrestin2-ERK経路活性制御による新たな尿路上皮癌治療法の確立現在までに、細胞癌化シグナルとして重要なERKの上流分子であるCXCR4が上皮内癌(cis)を含めた高悪性度の膀胱癌で高発現していること、CXCR4、アンタゴニストTF14016により尿路上皮癌細胞株においてERK活性化が抑制されることから、CXCR4-ERK経路が膀胱発癌において重要な役割を果たしていることを見出している。さらに、今回この経路において重要な調節機構をになうscaffold蛋白β-arrestin2が、癌化機構に密接に関係するといわれるレドックス関連分子TXNIPによって制御をうける可能性を予備実験の結果から得た。また、現在までにTXNIPノックアウトマウスの作成にも成功しており、今後、分子生物学的解明を行っていく。1. In vivoにおけるβarrestin2の発現検討:TXNIP knockout mouseにおけるβarrestin2発現をIHC, WB, RTPCRを用いて検討する。2. TXNIP knock in,実験系の確立ならびにそれらの細胞を用いた実験:レンチウイルスベクターを用いてTXNIPを膀胱癌細胞株に強制発現させ、E cadherinなどのEMT関連マーカーの発現変化についてmRNA,タンパクレベルにおいて検討する。また、それらの細胞を用いてInvasion assayを行い、in vitroにおいてTXNIPの発現変化が細胞浸潤能に影響を及ぼすかどうかについて検討する。3. βarrestin2 knock in, knock down実験系:βarrestin2についても2と同様の実験を行う。4. TXNIP knock
コロニーアッセイ法に基づく腎臓系列前駆細胞のin vitro誘導法確立

腎臓系列の前駆細胞をES細胞からin vitroで分化誘導する際のポジティブコントロールを設定するために、前駆細胞を含む未分化細胞集団に発現する転写因子Osr1の遺伝子座にGFPを組み込んだノックインマウスからOsr1-GFP高発現細胞を単離し、マイクロアレイ解析により腎臓系列の前駆細胞の遺伝子発現プロファイルを得た。一方、Osr1-GFPノックインES細胞を用い、Bmp、アクチビン、レチノイン酸存在下で分化誘導を行った結果、Osr1-GFPの誘導を確認した。しかし、これらのGFP陽性細胞についてマイクロアレイ解析を行ったところ、in vivoにおけるGFP陽性細胞の遺伝子発現プロファイルと完全には一致していなかった。その原因として、GFP陽性細胞集団中に腎臓前駆細胞以外へ分化した細胞が含まれる可能性が考えられるため、in vivo GFP陽性細胞のマイクロアレイ解析から得られた結果に基づき、誘導因子や単離方法を改善してさらに純度を上げる必要がある。平成20年度は、まず腎臓系列の前駆細胞をES細胞からin vitroで分化誘導する際のポジティブコントロールを設定するために、前駆細胞を含む未分化細胞集団に発現する転写因子Osr1 (Odd-skipped related1)の遺伝子座にGFPを組み込んだノックインマウスの胎生8.5日および17.5日胚からOsr1-GFP高発現細胞を単離し、マイクロアレイにより遺伝子発現解析を行った。その結果、4747個および6049個の遺伝子が各ステージのOsr1-GFP陽性細胞で高発現していた。その内3820個の遺伝子は共通して発現上昇しており、これらのリストはin vitro分化誘導系に対するポジティブコントロールとしてのみならず、腎臓系列前駆細胞の表面マーカー候補どしても意義があり、臨床応用の際、遺伝子改変を伴わない前駆細胞の単離に有用である。一方、Osr1-GFPノックインES細胞を用い、Bmp、アクチビン、レチノイン酸存在下で胚様体の形成を経て分化誘導を行った結果、確かにOsr1-GFPが誘導されていることを確認した。Flk-1およびPDGFRαを指標としてフローサイトメトリーにより細胞を分画した結果から、Bmp、アクチビン、レチノイン酸によって中胚葉までの分化が進んでおり、中間中胚葉は沿軸中胚葉から分化する可能性が示唆された。さらにES細胞から誘導したGFP高発現細胞を用いてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行ったところ、in vivoのGFP陽性細胞で高発現する遺伝子の誘導が確認された。今後はコロニーアッセイによる多分化能の検証を進めると同時に、in vivo GFP陽性細胞のマイクロアレイ解析から得られた結果に基づき、誘導因子や単離方法を改善してさらに純度を上げていぐ予定である。腎臓系列の前駆細胞をES細胞からin vitroで分化誘導する際のメルクマールを設定するために、前駆細胞を含む未分化細胞集団に発現する転写因子Osr1 (Odd-skipped related1)の遺伝子座にGFPを組み込んだノックインマウスの胎生8.5日および17.5日胚からOsr1-GFP高発現細胞を単離し、マイクロアレイにより遺伝子発現解析を行った。胎生17.5日胚の腎臓から得たOsr1-GFP高発現細胞ではSall1やSix2などの腎臓前駆細胞に特徴的な遺伝子の発現が確かに上昇しており、Osr1をマーカーとする方法が計画通り動いていることが確かめられた。現在、胎生8.5日胚と17.5日胚のOsr1-GFP高発現細胞における遺伝子発現の比較により、中間中胚葉の前駆細胞と後腎の前駆細胞の共通点および相違点を解析中である。一方、これまでにBmp、アクチビン、レチノイン酸によりOsr1-GFPノックインES細胞を分化誘導し、GFP陽性細胞の出現を確認した。しかし、これらのGFP陽性細胞についてマイクロアレイ解析を行ったところ、中間中胚葉で高発現するいくつかの遺伝子は確かに強い発現を示していたものの、in vivoのGFP陽性細胞の遺伝子発現プロファイルと完全には一致していなかった。その原因として、GFP陽性細胞集団中に腎臓前駆細胞以外へ分化した細胞が含まれる可能性が考えられたため、今後はin vivo GFP陽性細胞のマイクロアレイ解析から得られた結果に基づき、誘導因子や単離方法を改善してさらに純度を上げるとともに、コロニーアッセイによる多分化能の検証を進める予定である。
デスレセプターリモデリングによるアポトーシス抵抗性を応用した異種膵島移植法の確立

膵・膵島移植は1型糖尿病に対する唯一の根治療法であるが,問題点の一つとしてドナー不足が挙げられている.我々はこのドナー不足の解決策として,異種膵島移植の臨床応用に向け研究を進めている.異種膵島移植では,移植された膵島は,特にヒトCD8^+ CTLを介した細胞性免疫により拒絶される.我々は,新規細胞傷害抑制分子であるヒトdecoy Fas及び膜型FasLをブタ血管内皮細胞株(SEC)に過剰発現させることで,レシピエントCTLの異種細胞傷害性を抑制できることを報告してきた.今回,これらのアプローチに加え,ブタcellular FLICE-like inhibitory protein short/long form (c-FLIP_<S/L>)過剰発現による細胞傷害抑制効果を解析した.【方法】ネオマイシン耐性遺伝子を有するpCR3.1ベクターに全長ブタFLIP_<S/L>を組み込んだプラスミドを構築した.リポフェクション法を用いて目的遺伝子をSECに導入,G418にてselectionを施行,single cloneを樹立した.目的分子の発現はRT-PCRおよびWestern blottingにて確認した.健常人末梢血より分離したPBMCを,SECおよびヒトインターロイキン-2で混合培養,計14日間培養し,リンパ球を活性化,この活性化リンパ球より磁気ビーズを用いてCD8^+ CTLのみ分離しeffector cellとして用いた.傷害性は^<51>Cr release assay,アポトーシス細胞はTUNEL染色およびAnnexin染色にて解析した.【結果】RT-PCRおよびWestern blottingにて,高発現株をselectionした.Effector cellのparental SECに対する傷害性は高度であったが,c-FLIP_<S/L> transfectantでは,この傷害性が抑制されていた.また,c-FLIP_Lの方がc-FLIP_Sよりも傷害抑制効果が顕著であった.TUNEL染色およびAnnexin染色では,parental SECよりもtransfectantにおいて,アポトーシス細胞の減少を認めた.【結論】ブタc-FLIP_<S/L>の過剰発現により,ヒトCD8^+ CTL細胞傷害性を抑制できることが示された.これらのアプローチはブタ異種移植における細胞性免疫拒絶反応の制御に寄与できる.膵・膵島移植は1型糖尿病に対する唯一の根治療法であるが,問題点の一つとしてドナー不足が挙げられている.我々はこのドナー不足の解決策として,異種膵島移植の臨床応用に向け研究を進めている.異種膵島移植では,移植された膵島は,特にヒトCD8^+ CTLを介した細胞性免疫により拒絶される.我々は,新規細胞傷害抑制分子であるヒトdecoy Fas及び膜型FasLをブタ血管内皮細胞株(SEC)に過剰発現させることで,レシピエントCTLの異種細胞傷害性を抑制できることを報告してきた.今回,これらのアプローチに加え,ブタcellular FLICE-like inhibitory protein short/long form (c-FLIP_<S/L>)過剰発現による細胞傷害抑制効果を解析した.【方法】ネオマイシン耐性遺伝子を有するpCR3.1ベクターに全長ブタFLIP_<S/L>を組み込んだプラスミドを構築した.リポフェクション法を用いて目的遺伝子をSECに導入,G418にてselectionを施行,single cloneを樹立した.目的分子の発現はRT-PCRおよびWestern blottingにて確認した.健常人末梢血より分離したPBMCを,SECおよびヒトインターロイキン-2で混合培養,計14日間培養し,リンパ球を活性化,この活性化リンパ球より磁気ビーズを用いてCD8^+ CTLのみ分離しeffector cellとして用いた.傷害性は^<51>Cr release assay,アポトーシス細胞はTUNEL染色およびAnnexin染色にて解析した.【結果】RT-PCRおよびWestern blottingにて,高発現株をselectionした.Effector cellのparental SECに対する傷害性は高度であったが,c-FLIP_<S/L> transfectantでは,この傷害性が抑制されていた.また,c-FLIP_Lの方がc-FLIP_Sよりも傷害抑制効果が顕著であった.TUNEL染色およびAnnexin染色では,parental SECよりもtransfectantにおいて,アポトーシス細胞の減少を認めた.【結論】ブタc-FLIP_<S/L>の過剰発現により,ヒトCD8^+ CTL細胞傷害性を抑制できることが示された.これらのアプローチはブタ異種移植における細胞性免疫拒絶反応の制御に寄与できる.
神経細胞虚血耐性現像におけるMAPKカスケードの分子生物学的解析

脳虚血耐性現象の細胞内機構については今だ解明されていない。本研究では、小動物において虚血耐性モデルを作成し、MAPKsuperfamilyのうち、特にERK、JNK、p38について発現および活性化を検討し、虚血性神経細胞死、虚血耐性現象における関与を分子レベルで解明することを目的とした。虚血耐性モデルとして、マウス・砂ネズミ一過性全脳虚血耐性モデル、ラットミトコンドリア神経毒モデルを用いた。平成11年度においては、砂ネズミ一過性全脳虚血モデルにおいて、海馬領域において虚血後にMAPK familyの活性化が起ることを確認し、特に海馬の遅発性神経細胞死においてはp38の関与が大きいことを証明した(J Neurosci20:4506-4514,2000)。また、ラットミトコンドリア神経毒モデルにおけるMAPKの活性化を証明した(Neurosci Lett278:101-104,2000)。平成12年度では、マウス一過性全脳虚血モデルにおけるJNK、p38およびその活性型酵素の時間的、空間的発現増加を証明し(Neurosci Lett294:117-120,2000)、また、砂ネズミ脳虚血耐性モデルにおいて海馬CA1におけるMAPKの活性化とp38抑制剤による耐性現象抑制効果を証明した(第26回日本脳卒中学会、大阪、2001年3月15日)。以上のことは、脳虚血におけるMAPKカスケードの活性化が神経細胞の生死に何らかの関わりをもつことを示しており、MAPKが脳梗塞治療戦略の1つのターゲットとなることを示唆している。今後さらに上流、下流の分子について検討を加える予定である。脳虚血耐性現象の細胞内機構については、今だ解明されておらず、近年注目されてきたストレス蛋白の関与は否定的である。最近、MAPK superfamilyが真核細胞のストレスならびにアポトーシスのシグナル伝達に重要な役割を果たしていることが明らかとなっており、当研究者も培養神経細胞のグルタミン酸毒性によるアポトーシスにおけるp38の関与を証明した(J Biological Chemistry 272:18518-18521,1997)。本研究では、小動物において虚血耐性モデルを作成し、MAPK superfamilyのうち、特にERK、JNK、p38について発現および活性化を検討し、虚血性神経細胞死、虚血耐性現象における関与を分子レベルで解明することを目的とする。虚血耐性モデルとして、1)ラット3-nitoropropionic acid投与モデル2)ラット・マウス・砂ネズミ一過性全脳虚血モデルを用いる。平成11年度では、これらのモデルにおいて、海馬CA1領域の神経細胞において虚血耐性が獲得されることを確認した。また、耐性獲得した神経細胞において、immunohistochemistry、Western blotting法によりJNK、p38の活性化を証明した(Neurosci Lett 278:101-104,2000)。さらに各燐酸化酵素の阻害剤を用い、神経細胞死、耐性獲得が抑制されることを証明した(投稿準備中)。脳虚血耐性現象の細胞内機構については今だ解明されておらず、脳虚血におけるMAPK superfamilyの関わりについては不明である。本研究では、小動物において虚血耐性モデルを作成し、MAPK superfamilyのうち、特にERK、JNK、p38について発現および活性化を検討し、虚血性神経細胞死、虚血耐性現象における関与を分子レベルで解明することを目的とした。

平成11年度においては、砂ネズミ一過性全脳虚血モデルにおいて、海馬領域において虚血後にMAPK familyの活性化が起ることを確認し、特に海馬の遅発性神経細胞死においてはp38の関与が大きいことを証明した(J Neurosci 20:4506-4514,2000)。また、ラットミトコンドリア神経毒モデルにおけるMAPKの活性化を証明した(Neurosci Lett278:101-104,2000)。平成12年度では、マウス一過性全脳虚血モデルにおけるJNK、p38およびその活性型酵素の時間的、空間的発現増加を証明し(Neurosci Lett294:117-120,2000)、また、砂ネズミ脳虚血耐性モデルにおいて海馬CA1におけるMAPKの活性化とp38抑制剤による耐性現象抑制効果を証明した。以上のことは、脳虚血におけるMAPKカスケードの活性化が神経細胞の生死に何らかの関わりをもつことを示しており、今後さらに上流、下流の分子について検討を加える予定である。
左右非対称形成の解明 ―Hippoシグナルと新規調節因子の同定―

[目的]体軸形成のなかで、左右を決定する機構を解明することを目的とした。哺乳類のノードに相当するゼブラフィッシュのKupffer's vesicle (KV)の形成機構とその後のKV内の繊毛が如何に形成され、引き続く左右の臓器配置の相違を生じる分子メカニズムの解明を目指した研究を行った。[結果]KV形成をモニターするトランスジェニック(Tg)としてTg(sox17:EGFP)を作製し、繊毛形成を可視化できるTg(act1:arl13b-EGFP)を作製した。この両者と交配することにより、KVの形成と引き続くKV内の繊毛の形、数、長さを視ることができた。また、HippoシグナルがKV形成と繊毛形成に必要であるかをYap Tazのノックアウトフィッシュ(KO)を用いて、前期KV繊毛可視化個体で検討した。Yap1単独、Taz単独のKOでは、KVの形成や繊毛の形成には阻害がみられなかった。このためダブルKO個体を用いて調べたところ、有意差はないが、若干繊毛の数が減少し、長さも短縮していることがわかった。ただダブルKO個体は、成熟せず、心臓の形成過程では、左右差が消失する個体も見られたことから、KV形成と繊毛形成の後にHippoシグナル調節系が機能することが予想された。さらにKV内でのCa2+の増減について、Tg(Sox17;GCamP7)を持ちて調べたところ、KVの内腔ができる前のほうが、Ca2+の増減が激しく、従来言われているような、KVの内腔が形成され、繊毛の回転によりCa2+左右差が生じるという古典的繊毛依存性Ca2+左右差による、臓器の左右位置決定機構ではない、左右の配置決定機構が存在することが示唆された。[結論]KV形成と繊毛可視化、Ca2+の増減を調べることで新たな左右差決定機構の存在を示唆るる結果を得た平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Dorsal forrunnercell(DFCs)の移動とKupffer's vesicle形成におけるWwtr1の機能解析を行うことを目的とした。DFC特異的に蛍光を発現するTgフィッシュを作製し、DFCのKVへの移動とKV形成に至るまでの過程を可視化し調べることを計画した。DFCの可視化のために、sox17プロモーター依存性にgreenfluorescent protein (GFP)をはつげんするtransgenic fish (Tg)、Tg(sox17:gfp)を作製して、6 somite stage (ss)からKV形成までのタイムラプス観察を行った。その結果DFCの移動とKVの形成過程をイメージングすることができた。また、Wwtr1遺伝子欠損個体を作製することができた。当初の予測通り(Yap1による機能代償機構が働くことを予想)、Wwtr1個体だけではKV形成に異常を認めかなった。このためにYap1の欠損個体も作製して、Wwtr1/Yap1の両遺伝子欠損個体(Wwtr1/Yap1 DKO)を得ることができた。このWwtr1/Yap1DKO個体は、生後2週間ですべて死亡し、Tg(myl1:gfp)個体との交配により、心筋細胞(心臓)を観察すると心臓が逆位(右側心臓)あるいは、正中位となることから、KV形成あるいは、KVの繊毛形成にWwtr1/Yap1を介した転写が重要であることを示すことができた。当初予定していた左右非対称決定機構におけるHippoシグナル調節の解明として、Hippoシグナルの最終決定転写共役因子であるWwtr1とYap1の遺伝子欠損ゼブラフィッシュを得ることができた。この成果は、Hippoシグナルよる心臓の位置決定機構にHippoシグナルが必須であることを確定する結果となり、今後のKVの移動・形成・成熟機構と引き続くKV内の繊毛形成過程のどこでHippoシグナルがかかわるのかを明らかにするための重要な結果となった。Wwtr1/ Yap1の両遺伝子欠損個体とKVの可視化、繊毛の可視化ができるTgフィッシュを交配することにより、どの過程でのWwtr1 Yap1依存性転写の必要性を今後検討可能となった。実際にKVの2色(GFP, mCherry)のTg個体と全身性に繊毛を可視化できるTg8actb1:arl13b-egfp)の交配をするめることによりKVと繊毛の両者の可視化が可能となったので、遺伝子欠損個体との交配を順調に進めているところまで、進捗している。これは、当初計画よりも進んでいる状況と判断している。さらに繊毛の回転までも観察可能なlight sheet顕微鏡を用いて繊毛の長さや回転の解析も可能でありWwtr1/yap1欠損個体で繊毛とこれらの転写共役因子の機能の関係を証明できる実験系を確立することができた。さらにKVでのCaイメージングを可能とするためにTg(sox17:gal4FF)個体を作製することで、Tg(uas;GCamP7)と交配し、sox17陽性細胞でのCaイメージングができるように、現在交配するところまで順調に進んでいる。Wwtr1 knockout (KO)とYap1 hetero (HT)の個体で、心臓が正中位から右側に位置する個体が多く観察された。

この表現型が、KV形成異常に起因するものか否かを調べたところ、KVの大きさならびに繊毛の長さ・数にはWwtr1 KO Yap1wild type (WT)の胚との差を認めなかった。この結果はWwtr1, Yap1がKV形成から左右非対称性を生じているのではない可能性が示唆された。心臓のjogging異常が生じるために心筒形成と位置異常が生じるが、そのjoggingには、心筋前駆細胞の遊走が必須であり、この遊走を決定する左右差発現分子の差異が表現型の異常を生じる原因となっていることが考えられた。Yap1KO Wwtr1 HTは、二股心臓が生じやすいことからも、心臓前駆細胞が移動するために、Wwtr1, yap1がどこで機能するかを突き止める必要がある。このために、内胚葉をsox17で追跡してKVだけでなく、もう少し発生の進んだ段階での、内胚葉細胞群の形態異常の有無を検討することが必要であるとの結論となった。研究開始から、左右非対称をモニターリング可能なトランスジェニックゼブラフィッシュを順調に作製してきている。Lefty1, lefty2, Pitx2の発現を調べる個体の作製は完了している。当初Wwtr1のmorphantでの左右非対称性の表現型の異常がみられることから、Hippoシグナル異常がKupffer's vesicleの形成異常が原因であると予想して、本課題を提案していた。しかし、Wwtr1の変異体ではKVの形成に異常を認めなかった。これは、Yap1の発現が補完している可能性もあり、Wwtr1 KO, Yap1HTで心臓逆位がみられることからも左右非対称性にHippoが関係することは確定的となった。しかし、KV形成にHippoが関与しないことから、形態的な問題ではなく、KVの機能的な問題が生じている可能性が強く想定された。このKVの機能異常を証明するために、KVでのCa2+の可視化個体を作製して、Wwtr1 KO,Yap1 HTの個体での観察をするべく同個体を飼育中である。また、繊毛の形態異常はないが、繊毛機能の回転を可視化できる個体の作製も完了しており、Wwtr1 KO/ yap1 HTの個体で繊毛を姜申できるように、順次トランスジェニック個体を準備している状況である。[目的]体軸形成のなかで、左右を決定する機構を解明することを目的とした。哺乳類のノードに相当するゼブラフィッシュのKupffer's vesicle (KV)の形成機構とその後のKV内の繊毛が如何に形成され、引き続く左右の臓器配置の相違を生じる分子メカニズムの解明を目指した研究を行った。[結果]KV形成をモニターするトランスジェニック(Tg)としてTg(sox17:EGFP)を作製し、繊毛形成を可視化できるTg(act1:arl13b-EGFP)を作製した。この両者と交配することにより、KVの形成と引き続くKV内の繊毛の形、数、長さを視ることができた。また、HippoシグナルがKV形成と繊毛形成に必要であるかをYap Tazのノックアウトフィッシュ(KO)を用いて、前期KV繊毛可視化個体で検討した。Yap1単独、Taz単独のKOでは、KVの形成や繊毛の形成には阻害がみられなかった。このためダブルKO個体を用いて調べたところ、有意差はないが、若干繊毛の数が減少し、長さも短縮していることがわかった。
HIFUを用いた栄養血管閉塞による子宮筋腫の無侵襲治療装置の開発と臨床手技の確立

子宮筋腫の栄養血管の同定とその閉塞が可能な子宮筋腫の無侵襲治療装置を開発し、その有効性と安全性を検証し、その臨床手技を確立することを目的とし以下の実験を行った。(1)子宮筋腫の栄養血管数、PSV計測:UAE予定者の栄養血管をangiographyとカラー及びパワードプラで観察して、PSVを計測、血行動態を検討した。(2)血管径と血流速度に関する検討を行った。「方法」(1)UAE予定者の栄養血管をangigraphyとカラー及びパワードプラで観察して、PSVを計測、血行動態を検討した。(2)PZTtransducer(焦点距離30mm)を使用しモングエル犬、(体重約23kg)の子宮動脈を照射対象とした。周波数は3.5MHz、照射時間は5秒とし、超音波強度4000W/cm^2を同一部位に繰り返し照射した(n=5)。収縮期最高血流速度(PSV)と血管径を計測し、それらと血流遮断の有無との関係を分析した。「結果」(1)筋腫の栄養血管は数本(平均3.5本)の主幹が筋腫を取り巻くように走行し、核内に多数の小分枝を出していることが明らかになった。主幹のPSVは58±27cm/sec(mean±SD)(n=31)であり、栄養血管の走行がHIFU照射に適していること及び血流速度が遮断可能な範囲内であることが示された。(2)5秒照射の血流遮断の成功率は子宮動脈の血管径が1.7mm以内で57%(4/7)、それ以上では33%(1/3)であった(P<0.05,x^2検定)。照射血管のPSVは54.8±20.1cm/sec(mean±SD)で、血流速度と遮断成功率との間に関連はなかった。以上より臨床応用可能な超音波周波数・強度で1・7mm以内、PSV80cm/sec程度以下の血流を遮断できることが示された。この数値は子宮筋腫栄養血管の血管径および血行動態の範囲内であり子宮筋腫治療にHIFUを用いた栄養血管遮断による治療の可能性が示された。3.HIFUによる人体への副作用をより軽減させる目的でHIFUの照射強度をより低下させたいとの考えから、超音波造影剤を用いてそれが可能か検討した。超音波造影剤であるmicrobubbleの投与より、より弱いHIFU照射強度によってラット大腿動脈の血流閉塞が可能であることが示され超音波造影剤の超音波増強効果が示された。4.焦点距離5cmの大型プローブを用いたラビット腎臓動脈への体外からのHIFU照射によりfeeding arteryの閉塞によって、動脈支配領域の壊死を誘導することが観察されfeeding arteryを持つ腫瘍への応用可能性を確認した。5.臨床応用のための準備的研究としては、ヒトに於いてmicrobubble投与と超音波間歇送信法による相対的組織血流量の測定を用い、子宮筋腫では筋腫核の血流が正常子宮筋層と比較して著しく低下していること及び、子宮筋腫へのfeeding arteryの数が少ないことを証明し、本研究での新考案である栄養血管閉塞による筋腫治療の有効性を示唆するデータを得た。

これらの研究結果を総合してみると、一般に血管は熱エネルギーを運び去るためHIFUによる焼灼が困難な組織とされていたがmicrobubble投与や至適超音波強度を用いることにより生体に利用可能な超音波強度での体外からの血流の遮断が可能であることが示された。1.前年度の実験で、ラット大腿動脈の血管は、低強度のHIFU照射により機能的収縮を生じ、強度の増加とともに器質的変化が加わり、最終的にこれらの変化により血流遮断が生じることが証明された。2.本年度はより臨床応用する上で重要なHIFU照射後の当該血管の経時的変化および慢性変化を検討した。その結果、1)一定強度以上のHIFU照射を受けた動脈は照射直後収縮するが、組織変化が生じない強度では収縮は約10分でおさまる。2)組織変化が生じる強度では収縮はおさまっても内腔の狭窄は続く。3)組織変化は1週間後には回復傾向を示すことが示された。以上はHIFU治療を実践するに当たり照射回数や間隔を決定する重要な指標となることが解った。3.1.2.の実験で用いたプローブはHIFU照射中は超音波画像が得られなかった。そのため対象血管が体動によりずれた場合HIFU焦点を追随することが不可能であった。臨床応用時は患者の体動は避けられない。そこで今回、コンピュータ制御によりHIFUと診断用超音波ドプラ波の位相をずらすことでHIFU照射中も途切れることなく対象血管描写を可能とする技術を新たに確立した。4.臨床応用に近づける目的で子宮筋腫の栄養血管径により近いイヌの子宮動脈の閉塞実験を行った。開腹下で子宮動脈にHIFU照射を行いラット大腿動脈同様血管の閉塞に成功した。5.患者の同意および倫理委員会承認のもと、子宮筋腫の診断で子宮全摘術予定の患者の開腹時に筋腫栄養血管の描出を試み、栄養血管の描出に成功した。これらの研究結果から、超音波造影剤を併用することにより生体に利用可能な超音波強度で、子宮筋腫栄養血管の血流遮断が可能であり、その灌流領域の筋腫の縮小が期待できることが示された。子宮筋腫の栄養血管の同定とその閉塞が可能な子宮筋腫の無侵襲治療装置を開発し、その有効性と安全性を検証し、その臨床手技を確立することを目的とし以下の実験を行った。(1)子宮筋腫の栄養血管数、PSV計測:UAE予定者の栄養血管をangiographyとカラー及びパワードプラで観察して、PSVを計測、血行動態を検討した。(2)血管径と血流速度に関する検討を行った。「方法」(1)UAE予定者の栄養血管をangiographyとカラー及びパワードプラで観察して、PSVを計測、血行動態を検討した。(2)PZTtransducer(焦点距離30mm)を使用しモングエル犬(体重約23kg)の子宮動脈を照射対象とした。周波数は3.5MHz、照射時間は5秒とし、超音波強度4000W/cm2を同一部位に繰り返し照射した(n=5)。収縮期最高血流速度(PSV)と血管径を計測し、それらと血流遮断の有無との関係を分析した。「結果」(1)筋腫の栄養血管は数本(平均3.5本)の主幹が筋腫を取り巻くように走行し、核内に多数の小分枝を出していることが明らかになった。主幹のPSVは58±27cm/sec(mean±SD)(n=31)であり、栄養血管の走行がHIFU照射に適していること及び血流速度が遮断可能な範囲内であることが示された。(2)5秒照射の血流遮断の成功率は子宮動脈の血管径が1.7mm以内で57%(4/7)、それ以上では33%(1/3)であった(P<0.05,x^2検定)。照射血管のPSVは54.8±20.1cm/sec(mean±SD)で、血流速度と遮断成功率との間に関連はなかった。
癌細胞選択的細胞致死活性を有する天然化合物に関する研究

本研究室で見出した天然化合物、没食子酸、ブリオノール酸、アクテオシドの癌細胞致死活性はアポトーシスにより引き起こされることが明らかになった。そこで、没食子酸に焦点を絞りその作用機序を検討した。没食子酸による細胞致死活性は、細胞内カルシウムキレーターのBAPTA-AM、過酸化水素分解酵素カタラーゼ、細胞内抗酸化剤N-アセチルシステインにより阻害されることより、細胞内Ca^<2+>濃度の上昇と活性酸素の産生が関与することが示唆された。また、細胞内の過酸化水素、脂質過酸化物の産生を2,7-dichlorofluorescein diacetateを用いて測定したところ、没食子酸添加の2分後には活性酵素の産生が観察された。この産生はN-アセチルシステインにより抑制されたが、カタラーゼ、BAPTA-AMでは抑制されず、これらの結果は没食子酸は、まず過酸化水素などの産生を誘導し、それに続き、細胞内カルシウムの上昇が惹起され細胞死へと導かれるものと考えられた。そこで、つぎに、癌治療への応用を考え、マウス肥満細胞腫P-815細胞の肝特異的転移に及ぼす作用を検討した。没食子酸はP-815細胞の静脈内移入の前、あるいは、後より50mg/kgの濃度でi.p.,i.v.投与することにより,肝臓での転移結節数、血清GOT,GPT値の減少、さらに、DBA2マウスで延命効果が観察された。これらの作用は没食子酸の肝障害抑制用、癌細胞接着抑制作用によるものではなく、転移が成立した肝臓での没食子酸による癌細胞選択的致死活性によることが示唆された。さらに、化学発癌モデルで、前癌病変が形成された後から、没食子酸をi.p.投与することにより、前癌病変結節数、病変面積の減少が観察された。これらの結果より、in vitroにおいて癌細胞にアポトーシスを誘導する没食子酸は、in vivoにおいても同様の活性を示し癌治療薬として可能性が示唆された。
確率共鳴理論と集合的記憶概念の接続の試み：身体現象を指標として

本研究は、集団が伝承や伝統を通して暗黙裡に共有する記憶という「集合的記憶」の概念を、数理物理学から生まれた「確率共鳴」理論や神経科学における身体の内受容感覚モデルを応用し、世代を超えた「記憶の共有」という現象を、「共振・共鳴」という身体現象を指標として考察してきた。集合的記憶が問題となるのは、たとえば戦争の記憶やその継承におけるように、集団における記憶の共有が共同性の礎をつくるのか、それとも共同性が記憶の共有を可能とするのかという問いを提起するからである。私たちは、自分が生い育った文化的空間の中で、無自覚のうちに多くの記憶を背負っている。そのために、心理的のみならず、身体的な観点からも、共鳴という現象を考察する必要があるのである。身体受容感覚におけるモデルや確立共鳴理論は、イデオロギーや「民族」という概念とは別に、記憶の伝播・感染を論じるという点で、新しい視座を開拓するものであった。今年度は、三度研究会を開催し、それぞれの知見を交換しあうと共に、それぞれの領域において、公開シンポジウム(代表者企画)、国内学会における成果発表(10回、国際研究集会における成果発表(11回)、国際ジャーナルにおける発表(7本)、国内ジャーナル(2本)、など、成果を公表した。メンバーの一人は国際研究集会でBest Paper Awardを受賞し、また、メンバーの共著者がYoung Author Awardを受賞、さらに別のメンバーも共著者が学術大会特別優秀発表賞を受賞した。また、代表者が編者となって論集を刊行した。さらにメンバーの一人は、共編著の論集を刊行した。これらと並行して、これまでの成果を踏まえて、今後のさらなる展開に向けて、問題設定や視野の拡大の可能性についても論じ合った。それを受けて、後継プロジェクトとして新たな研究課題を設定し、企画することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。28年度には研究会を、公開として分担者以外の研究者や院生らにも参加を呼びかけ、計五回の開催した。まず第一回には、このプロジェクトの趣旨の確認と研究の進め方、研究テーマの射程について話し合い、年間のスケジュールなどを策定した。第二回には、他大学の心理学関係の研究者との合同研究会とし、集合的記憶概念の成立した背景やその後の受容などを代表者から説明し、そもそもこの企画の趣旨を改めて確認しつつ、今後の研究計画について話し合った。そして分担者からは、確率共鳴理論について、この理論が置かれている縁やその応用の可能性の射程などについて、報告があり、それを元に、人文学、応用数学、心理学、科学哲学の分野におけるリンク点を探った。第三回には、他大学の研究者と合同の研究会を開催し、第二回の研究会における議論に対する補遺と、生理心理学における確率共鳴理論の応用可能性と説明力についての報告があった。それらをうけて、メンバーそれぞれがこの間の展開を報告した。第四回の研究会には、院生たち若手研究者の参加を呼びかけ、応用数学で生まれた確率共鳴という概念が人文学やそれ以外の分野でいかに幅広く応用可能かを議論した上で、集合的記憶という概念との接点について論じた。また、こうした議論は、人工知能の展開など来るべき社会に向けて、集合的記憶の概念がどのように有効でありうるかを考える足がかりとなった。それ以外にも、メールにて、互の研究成果や知見などを交換し合い、メンバーがそれぞれに研究成果をまとめ、発表した。代表者としては、シンポジウムでの口頭発表、雑誌論文として成果を公表した。年度当初の計画通り、研究会を開催し、それと併行して、メンバーがこのテーマに関連してそれぞれ成果を発表することができた。また、その都度、これらの情報を交換し合い、研究会開催時以外にも、さまざまな知見を共有することができた。この一年間の議論を経て、既に当初の計画以上に、互いの研究とプロジェクトの問題設定に対する理解が深まり、予想以上に共同研究を遂行することができた。平成29年度には第一回研究会を6月に開催し、招聘した研究者とメンバー二人から、それぞれ確率共鳴に関連づけて、物理現象としての同期現象、心理現象としての同期現象、さらには、対面的な場合の心理現象と集団的な場合の同期現象などについての報告をしてもらった。そのあと、それぞれの研究の進捗状況を報告し合った。研究会は公開とし、院生を含め若手研究者らに声をかけて参加してもらった。その後、メールなどで議論を継続しつつ、第二回の研究会を2月に開催した。この会にはメンバー以外の若手研究者を招聘し、集合的記憶の考察に向けて、戦後の芸術作品の作製理念と受容の方向性について報告してもらった。ここでは言語圏も分野も異なる多彩な顔ぶれとなり、幅広い射程で議論をすることができた。このときにも研究会を公開とし、院生をはじめ若手研究者らに声をかけ、多数の参加があった。今年度は、メンバーがこのプロジェクトによる研究成果をそれぞれの分野の国際研究集会や海外に招聘されて行った公開セミナー、また、国内における一般向けの公開セミナーなどの機会を利用して発表している。その際の議論を受けて、フィードバックする形で、研究会で成果報告を行った。また、分担者の一人は成果を国際会議に投稿したところ、最優秀論文賞を受賞した。こうした交流を経て、実験研究、応用数学、情報学などの方法論を、人文学の分野でいかに活かすかについての議論を重ねた。これらの議論を踏まえて、これまでに招聘した研究者や若手研究者らを含めて、論集を企画構想し、成果発表に向けての準備を進めている。

メンバーを中心とし、関連する研究者らに毎回研究会への参加を呼びかけて、院生から中堅まで、幅広い年齢層の参加者による議論を展開している。メンバーやこれら若手研究者を含めて論集を企画しその準備が順調に進んでいる。本研究は、集団が伝承や伝統を通して暗黙裡に共有する記憶という「集合的記憶」の概念を、数理物理学から生まれた「確率共鳴」理論や神経科学における身体の内受容感覚モデルを応用し、世代を超えた「記憶の共有」という現象を、「共振・共鳴」という身体現象を指標として考察してきた。集合的記憶が問題となるのは、たとえば戦争の記憶やその継承におけるように、集団における記憶の共有が共同性の礎をつくるのか、それとも共同性が記憶の共有を可能とするのかという問いを提起するからである。私たちは、自分が生い育った文化的空間の中で、無自覚のうちに多くの記憶を背負っている。そのために、心理的のみならず、身体的な観点からも、共鳴という現象を考察する必要があるのである。身体受容感覚におけるモデルや確立共鳴理論は、イデオロギーや「民族」という概念とは別に、記憶の伝播・感染を論じるという点で、新しい視座を開拓するものであった。今年度は、三度研究会を開催し、それぞれの知見を交換しあうと共に、それぞれの領域において、公開シンポジウム(代表者企画)、国内学会における成果発表(10回、国際研究集会における成果発表(11回)、国際ジャーナルにおける発表(7本)、国内ジャーナル(2本)、など、成果を公表した。メンバーの一人は国際研究集会でBest Paper Awardを受賞し、また、メンバーの共著者がYoung Author Awardを受賞、さらに別のメンバーも共著者が学術大会特別優秀発表賞を受賞した。また、代表者が編者となって論集を刊行した。さらにメンバーの一人は、共編著の論集を刊行した。これらと並行して、これまでの成果を踏まえて、今後のさらなる展開に向けて、問題設定や視野の拡大の可能性についても論じ合った。それを受けて、後継プロジェクトとして新たな研究課題を設定し、企画することができた。今年度も、まずは定期的に研究会を開催し、メンバーそれぞれが一度ずつ主題設定を担当して、必要に応じてメンバー以外の講師を招聘し、さらに知見を深める。これらはそれぞれに己の研究に活かし、成果を共有し合うことによってさらに、共通テーマを絞っていく。30年度は最終年度となるため、年度の前半に集中して研究集会を開催し、各自の研究報告を行うと共に、引き続き若手研究者らの参加を促し、論集として、研究成果の発表についてさらに準備を進める。また、次年度以降の研究の継続についても議論を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ナノ構造情報のフロンティア開拓-材料科学の新展開

(1)研究成果解説書の活用:領域メンバーが中心となって英文で執筆したNanoinfomatics(Springer社,平成30年3月オープンアクセス刊行)を様々な学会や講演会の機会に紹介して有効活用した。(2)公開シンポジウム開催:領域研究全体の最終成果報告会(平成31年1月18日,東京)を開催し,領域関係者はもとより,研究者・専門家のみならず,一般市民に向けて広く研究成果の発信を行った。(3)研究内容紹介ホームページ発信:領域全体の研究成果について,より詳細な内容を含めるために,専用ホームページを構築した。また本領域の国際活動支援班で,国際共同研究や国際的な広報活動にも注力してきたこともあり,日本語と併せて英語版も構築した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
びまん性肺疾患における疾患特異的自己抗体の検索

外科的肺生検を必要とする現在の特発性間質性肺炎(IIPs)診断基準は、患者負担が大きい。またIIPsは経過中、膠原病等の背景疾患が顕在化し、診断が変わるケースもしばしばである。私たちは、5-10年間の経過観察で正真正銘のIIPsを選定し、蛋白アレイ法(約8,000種の自己抗体をスクリーニングする方法)で抗MX1抗体に辿りついた。抗MX1抗体は、IIPs中、予後良好の一群患者(約17%)で陽性になった。現在のIIPs診断基準は、分子病態的観点に基づくバイオマーカーによって補完する必要がある。特発性非特異的間質性肺炎(INSIP)8例、特発性肺線維症(IPF)10例、自己免疫性肺胞蛋白症(aPAP)10例、サルコイドーシス(SAR)10例、正常人10例の血清自己抗体を、蛋白アレイ法を用いて網羅的に測定した。疾患毎に自己抗体スコア化を行い、自己抗体を序列化した結果、INSIP、IPF、aPAP、SARの疾患特異的自己抗体を特定した。INSIPは自己免疫的機序が関与する疾患であることが示唆されているが、疾患特異的な自己抗体の報告はない。最初にINSIP特異的自己抗体に着目し、蛋白アレイより抽出した51個のINSIP特異的自己抗体から抗myxovirus resistance protein-1 (Mx1)抗体に着目し、INSIP診断マーカーとしての有用性を検討した。免疫組織化学を用いた検討で、Mx1は正常肺においてクララ細胞、II型肺胞上皮細胞、肺胞マクロファージに発現していた。さらにINSIPやIPFにおいては過形成II型上皮細胞や気腔内集簇した肺胞マクロファージに高発現していた。Mx1全長配列とグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)融合蛋白発現ベクター(バキュロウイルス)を作成し、昆虫細胞(Sf9細胞)にトランスフェクトし、リコンビナント蛋白を精製した。リコンビナントMx1蛋白を用いた、抗Mx1抗体測定用Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)法を開発した。INSIP 15例、IPF 20例を対象に、血清抗Mx1抗体をELISA法で測定し、INSIPとIPF鑑別診断を目的とした閾値を設定すると、特異度100%、感度26%で鑑別可能であった。開発したELISAを用いて特発性間質性肺炎103例、膠原病47例(内35例は間質性肺炎合併)、肺結核23例、細菌性肺炎15例、健常人10例の血清抗Mx1抗体を測定した。抗Mx1抗体高値はIPF以外の特発性間質性肺炎と間質性肺炎合併膠原病において認められた。抗Mx1抗体価と間質性肺炎の臨床経過との関連を調べるために大阪大学医学部附属病院に通院中の間質性肺炎患者コホート(現時点で100名弱)を作成中である。抗myxovirus resistance protein-1 (Mx1)抗体測定ELISA改良に取り組んだ。His-tag sequence付加したMx1全長蛋白発現ベクター(バキュロウイルス)を再作成し、Hi-5細胞にトランスフェクトし、リコンビナント蛋白を精製した。抗Mx1抗体はIgG型、IgA型、IgM型をそれぞれ測定した。カットオフ値は、健常人の平均+6SDに設定した。昨年度より開始した当院間質性肺炎患者コホート(現在172例)中、抗Mx1抗体測定を完了した特発性間質性肺炎(IIPs)は116例、内20例(17% )が抗Mx1抗体(IgG型、IgA型、IgM型いずれか)陽性であった。外科的肺生検による組織学的UIP及びATS/ERS/JRS/ALAT 2011分類に基づく画像的UIPパターン(胸部放射線科医3名による診断)を有する患者をIPFとし(20例)、その他をnon-IPFとし(96例)、2群を比較すると、抗Mx1抗体高値はnon-IPF群にのみ検出された。抗Mx1抗体陽性IIPs(20例)と抗Mx1抗体陰性IIPs(96例)間で比較すると、抗Mx1抗体陽性IIPsは女性が多く(p = 0.0144)、HRCT所見で下肺野優位分布(p = 0,002)、末梢優位分布(p = 0.002)が抗Mx1陰性IIPsに多く見られた。IIPs患者に一定の割合で存在する抗ARS抗体陽性IIPsと抗Mx1陽性IIPsはほぼ完全に排他的であった。他のINSIP特異的自己抗体として、抗NINJ2抗体を検討した。抗NINJ2抗体測定ELISAを作成したが、抗NINJ2抗体は一部健常人にも存在し、間質性肺炎特異的自己抗体としての検討は一旦中断した。サルコイドーシス特異的マーカーを探索するために、サルコイドーシス患者コホート作成(目標100例前後)を開始し症例を集積中である。抗MX1抗体陽性慢性線維化性IIPsの予後を明らかにするため、共同研究施設である近畿中央胸部疾患センターにて、20052009年にかけて登録された慢性線維化性IIPs連続155症例のコホートを検討した。同コホート中、IPF診断確定例は71例、IPF診断が確定しなかったnon-IPFは84例であった。