hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
化学プローブを駆使した活性酸素シグナルの制御機構解明

このことはニトローcGMPがタンパク質分解系に関与する事を示唆している。蛍光プローブと結合したタンパク質を切り出してin-gel酵素消化し、これをマススペクトルで分析して、アミノ酸配列の解析を開始した。一方、同位体プローブを活用して、ニトロcGMP代謝経路の研究を進めた。ニトロ基がアミノ基へ還元される経路の存在を明らかにした。本年度は以下の3項目について研究を進めた。1.8ーニトロアデノシン誘導体の生体内存在の探索;2.8ーニトロcGMPが結合する標的タンパク質の解明;3.S-グアニル化シグナルをOFFにする機構の解明このうち、1については、既に合成した各種の8-ニトロアデノシン誘導体をもとにしてポリクローナル抗体を作成し、細胞免疫化学やウェスタンブロットを利用して、生体内存在を調べた。存在が示唆される結果を得ているが、微量物質であるため、更なる検証が必要と考えられた。2については、蛍光標識プローブを作製して電気泳動ゲル上に標的タンパク質を見出し、質量分析を行ったが、完全な同定にはいたらなかった。蛍光プローブを認識する特異的抗体が有用と考えられたので、作成を試みたが充分な特異性をもつ抗体が得られていない。3については、酸素の安定同位体を含む8ーニトロcGMPを化学合成し、これを培養細胞に投与して代謝物を解析した。その結果、細胞内に過剰に存在する8ーニトロcGMPは、還元を受けて8-アミノ-cGMPへと変換されることがわかった。8-アミノ-cGMPは、合成化合物として以前報告があったが、内因性物質としての存在が確認されたのは、これが始めてである。この8-アミノ-cGMPは、炎症を起こした細胞のなかでは更に代謝され、cGMPへと変換されることも判明した。ニトロ化ヌクレオチドが、無修飾のヌクレオチドへ戻され再利用される過程を明らかにしたもので大変価値が高いと考えている。本研究課題は、活性酸素シグナルのうち、特に一酸化窒素に起因する二次的なシグナル分子に注目して研究を進めて来た。8ーニトロcGMPは、領域代表の赤池教授を中心に見出された一酸化窒素の二次シグナル分子である。本研究課題においては、8ーニトロcGMPの代謝機構や、細胞内のグアニンニトロ化反応について明らかにしてきた。化学プローブの駆使が、アイデアの根幹であり、蛍光および同位体で標識された各種のプローブ分子を合成した。本年度は、研究費繰り越しの原因となった8ーニトロ-cGMPがマクロファージ細胞における内因性のオートファジー誘導因子であることを明らかにして論文発表をおこなった。すなわち、炎症や細菌感染などで細胞内に一酸化窒素と活性酸素が同時に産生されると、グアニン塩基のニトロ化が進行し、細胞内に8ーニトロcGMPが生じる。この8ーニトロcGMPは、オートファジーを亢進させる作用があり、例えば、A群連鎖球菌のマクロファージ細胞への感染では細菌排除に重要な役割を果たしていた。内因性の8ーニトロcGMP生成を阻害すると細菌排除は遅延し、外部から8ーニトロcGMPを投与すると細菌排除、オートファゴソーム形成が促進された。
音素認識と話者適応に基づく不特定話者文節音声認識システムの研究開発

2年間に亘る研究成果の概要は次の通りである.1.音素認識音素認識は,単語や文節音の大分類の結果として選択された候補の正当性を検討するための構造解析に重要な役割を果す.そこで,音素認識の精度を上げる研究に重点を置いた.その結果,特に母音,鼻音,破裂性子音の認識率を向上させることができた.母音については,母音間相対関係を利用した母音認識手法を開発し,従来より高い認識率を達成した.2.単語音声認識単語音声を認識する強力な手法を開発した.本手法は2つの部分からなる.第1の部分は,我々が文字認識で開発した連想整合法と呼んでいるパターン整合法を音声認識に適用したもので,単語音声を高精度で大分類することを可能にしたものである.第2の部分は,音素認識を基にした単語音声の構造解析を行うもので,大分類の結果として得られた候補単語の検証に効果的である.3.話者適応同一話者が発生した日本語5母音の特徴空間における相対的な位置の間には,話者によらないと見なし得る2項関係が存在することを見出し,この関係を基にして上述の1.で述べた母音認識手法を開発した.話者の個人性はより多く母音にに反映されるので,この母音認識手法を用いることにより,話に依存しない母音認識,つまり話者適応が可能となった.4.認識実験上述の単語音声認識手法を男性10名が発声した212単語に適用し,従来にない高精度の認識を達成した.即ち, 1位認識率は98.2%であり, 2位までの累積認識率は99.6%である.この結果は単語音声の大分類として30位までの累積認識率99.86%が得られたのに対し,母音認識とDP法を併用した構造解析によって達成されたものであって,計算量の多いDP法の代りに子音を含めた音素認識のみによって構造解析を行うことが今後の課題である.2年間に亘る研究成果の概要は次の通りである.1.音素認識音素認識は,単語や文節音の大分類の結果として選択された候補の正当性を検討するための構造解析に重要な役割を果す.そこで,音素認識の精度を上げる研究に重点を置いた.その結果,特に母音,鼻音,破裂性子音の認識率を向上させることができた.母音については,母音間相対関係を利用した母音認識手法を開発し,従来より高い認識率を達成した.2.単語音声認識単語音声を認識する強力な手法を開発した.本手法は2つの部分からなる.第1の部分は,我々が文字認識で開発した連想整合法と呼んでいるパターン整合法を音声認識に適用したもので,単語音声を高精度で大分類することを可能にしたものである.第2の部分は,音素認識を基にした単語音声の構造解析を行うもので,大分類の結果として得られた候補単語の検証に効果的である.3.話者適応同一話者が発生した日本語5母音の特徴空間における相対的な位置の間には,話者によらないと見なし得る2項関係が存在することを見出し,この関係を基にして上述の1.で述べた母音認識手法を開発した.話者の個人性はより多く母音にに反映されるので,この母音認識手法を用いることにより,話に依存しない母音認識,つまり話者適応が可能となった.4.認識実験上述の単語音声認識手法を男性10名が発声した212単語に適用し,従来にない高精度の認識を達成した.即ち, 1位認識率は98.2%であり, 2位までの累積認識率は99.6%である.この結果は単語音声の大分類として30位までの累積認識率99.86%が得られたのに対し,母音認識とDP法を併用した構造解析によって達成されたものであって,計算量の多いDP法の代りに子音を含めた音素認識のみによって構造解析を行うことが今後の課題である.音素認識と話者適応を2つの柱として、不特定話者の文節音声認識を実現することを目指して研究を行った。その概要は次の通りである。(1)計算機システムの整備本研究を効率よく推進するための計算機システムとして、小型機A-30(富士通製)2台を核とする音声情報処理システムを整備し、これを用いて、音声認識実験、認識アルゴリズムの設計、ソフトウェアの開発などを進めている。(2)手法【I】と【II】の統合音素認識手法【I】と話者適応の手法【II】とを相互補間的に統合するためのシステム構成について検討した。その結果、音素認識における付加及び脱落が文節音声認識の大きな障害となることを明確にし、この問題の解決策について検討を進めている。(3)認識手法の開発1)単語の大分類音素認識における付加及び脱落の問題を基本的に解決するための手法として、単語の部分情報を活用し高速かつ高精度で単語音声の大分類を行う手法の開発を行い、有用な手掛りを得た。その成果は近く発表する予定である。2)単語認識(細分類)単語の大分類と音素認識を結合し、音素をキーとする単語の構造に関する知識を活用する手法について研究を進めてきた。その結果、音素認識率が70%程度であっても高精度かつ高速の単語認識が実現できる有力な手掛りを得た。3)話者適応話者の個人性はより多く母音に反映されることに着目し、高精度で認識される母音を基にして話者適応を行う方法を考案し、その有効性について実験を主する評価を行っている。

4)重回帰分析と相対関係を考慮して、高精度の母音認識を実現できる見透しを得た。今後、システム全体として有機的統合と音素及び単語の各レベルの認識精度の向上を計る。
3量体型G蛋白質βγサブユニットによる低分子量G蛋白質の活性化機構

G蛋白質βサブユニット、mycエピトープを融合させたG蛋白質γサブユニット(mycγ)およびムスカリン受容体m2サブタイプを、恒常的に過剰に発現させたCHO細胞株を分離した。この細胞ではムスカリン受容体刺激によるMAPキナーゼ活性化が著しく亢進した。またG蛋白質βサブユニット、mycγサブユニットを一過性に過剰発現させた293細胞においてもMAPキナーゼが活性化された。293細胞に同時にドミナントネガティブrasを発現させるとMAPキナーゼの活性化は抑制された。これらの細胞ではG蛋白質βγサブユニットがrasを介してMAPキナーゼを活性化していると考えられる。この2つの細胞系をもちいてG蛋白質βγサブユニットに結合すると考えられる蛋白質の単離を試みた。G蛋白質βサブユニットおよびmycγサブユニットを大量発現させた細胞株の細胞膜画分を界面活性剤で可溶化したのち抗mycモノクロナール抗体を用いてG蛋白質βγサブユニットを免疫沈降させた。この画分にG蛋白質βγサブユニットに結合する蛋白質が共沈することが期待される。対照としてmycエピトープを持たない野性型のγサブユニットを発現させた細胞を用いた。免疫沈降物の電気泳動像の比較によりG蛋白質βγサブユニットに特異的に結合すると考えられる分子量約12万kDaおよび8万kDaの蛋白質を分離した。その部分アミノ酸配列の解析を行う予定である。その情報が得られればそれをもとにcDNAクローニングを単離する計画である。
北海道の旧石器時代石器群における石器接合資料分析をもとにした学習行動の復元

本研究では、北海道東部の白滝遺跡群から得られた石刃・細石刃剥離にかかわる後期旧石器時代の接合資料を対象として、接合資料をもたらした割り手の技量差の判定を試み、それに基づいて技術の学習過程を明らかにすることを目指した。本年度は、上白滝2遺跡、服部台2遺跡、上白滝8遺跡、旧白滝15遺跡から得られた接合資料の分析に取り組んだ。これまでの研究において割り手の技量差を反映する指標として重視されてきた、石刃剥離過程の諸特徴や資料の出土位置のパターンの分析のみならず、選択された原石形状、石刃・石刃核の遺跡での欠落状況などについても検討をおこない、接合資料間での相対的な技量差を明らかにした。その結果から、上級者による「教育的デモンストレーション」や初級者による「観察学習」が執り行われていたことが推定された。これまでの研究では、一つの石器接合資料をもたらした割り手は一貫して同一であることが前提であった。しかし、旧白滝15遺跡で確認された接合資料の分析に着手した結果、割り手が交替していることを示唆するものが含まれていたことが明らかとなった。分析の結果、剥離過程の途中から割り手の技量が明瞭に変化していることが把握できたため、割り手の交替(上級者→初級者)という推定が導かれることとなった。この事例に関しては、上級者による剥離作業の産物を初心者が練習用の材料としていたことが推定された。以上の成果から、a)旧石器時代において石器製作にかかわる学習行動が執り行われるには、白滝遺跡群のような潤沢な石器石材環境が必要であった、という想定が導かれる。また、b)白滝遺跡群に訪れ、石器製作作業をおこなった一員のなかには、初級者すなわち子供もしくは若年層が含まれていたとの推定から、遊動スケジュールのなかでどのような集団構成が遺跡群の形成にかかわっていたのか、を推測することが可能となった。25年度が最終年度であるため、記入しない。取り組んだ研究項目として第一に、石器製作にかかわる技量差を接合資料の分析からどのように判定するのかという方法論的課題について、国内外の関連する既存の諸研究を集成し、問題点の確認をおこなった。その結果、石器製作が執り行われたコンテクスト、とくに石器製作作業の目的や石器石材環境からの影響が、技量差の判定基準に具体的にどのような影響を与えるのかが重要な問題であることが判明した。コンテクストに応じた技量差の発現形態についてモデルを構築し、それによって議論の進展が可能になるという見通しが得られることになった。第二の研究項目として、旧白滝15遺跡出土の接合資料に関して詳細な分析をおこない、接合資料をもたらした割り手が同一・一貫しているのか、割り手の交替が起こっていたならば、どのような状況でそれが生じていたのか明らかにしようとした。技術的諸特徴の分析を一回の打ち割り作業ごとに実施し、それが時系列でどのように連鎖しているのかを解明していった。その結果、石刃や舟底形石器を製作している接合資料において割り手の交替が起こっていたことが推定されるものがあり、それは上級者→初級者への交替を示唆するものであることを突き止めた。このことは、初心者の練習用の材料として、上級者の剥離作業の産物が利用されていた可能性を示唆するものである。

また、b)白滝遺跡群に訪れ、石器製作作業をおこなった一員のなかには、初級者すなわち子供もしくは若年層が含まれていたとの推定から、遊動スケジュールのなかでどのような集団構成が遺跡群の形成にかかわっていたのか、を推測することが可能となった。研究作業の進行過程で新たな問題が発生し、新たな研究対象を設定する必要性が生じたため、繰越をおこなったが、その結果として、目標としていた資料の分析はすべて終えるとともに、問題の解決もはかることができた。研究成果になついては国際的な学会で発表し、また国際誌への投稿の純後も進めている。以上から、当初の研究目的はほぼ達成されたといえる。25年度が最終年度であるため、記入しない。今回の研究成果を人類学をはじめとする関連諸分野の成果と突き合わせ、人類の学習史を総合的な視野から再構築することが今後の課題である。
大豆イソフラボン由来S-エクオールのアジア人型2型糖尿病予防作用に関する研究

本研究において、大豆イソフラボンに由来するS-エクオールがGタンパク質共役型受容体(Gαsクラス)を介した作用により膵臓β細胞の増殖の促進、細胞死の抑制、グルコース刺激に応答したインスリン分泌を促進することを明らかにした。さらに、マウスにおいてS-エクオールの摂取がβ細胞を損傷させることによる高血糖の誘発を緩和することが示された。これらの結果から、S-エクオールはβ細胞を標的とした抗糖尿病作用を持つことが示唆された。膵β細胞の減少や細胞あたりのインスリン分泌量の低下は、血中に放出されるインスリン量を減少させるため、2型糖尿病の発症や進行の一因となる。膵β細胞におけるcAMP/protein kinase A (PKA)シグナルを活性化は、細胞の増殖やインスリン分泌量を増加させるため、2型糖尿病の予防に貢献する可能性がある。我々は、大豆イソフラボンであるダイゼインの腸内細菌代謝物であるS-エクオールが、cAMP/PKAシグナルを活性化して、細胞増殖やインスリン分泌を亢進させる機能を持つことを見出している。本研究では、S-エクオールがPKAシグナル活性化機構について検討している。膵β細胞株であるINS-1細胞において、S-エクオールによるcAMP応答配列(CRE)を介した転写に対するアデニル酸シクラーゼ阻害剤の影響について検討した。その結果、S-エクオールによるCRE活性促進は、細胞膜に局在するアデニル酸シクラーゼ阻害剤である2′,5′-dideoxyadenosineによって抑制されたが、細胞質局在型の阻害剤(KH7)の影響は受けなかった。INS-1細胞の細胞膜画分において、S-エクオールはcAMPの産生を誘導した。細胞膜局在型のアデニル酸シクラーゼは、三量体型Gタンパク質のGαsサブユニットにより活性化される。そこで、活性化したGαsの不活化を阻害するコレラ毒素の影響についてCREを介した転写により評価した。その結果、コレラ毒素は、アデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンと相加的に作用したが、S-エクオールとは相乗的な作用を発揮した。これまでの結果から、S-エクオールは細胞膜に局在する因子に相互作用して細胞膜型アデニル酸シクラーゼ活性化を介してPKAシグナルを活性化すると考えられる。膵β細胞におけるS-エクオールのPKA活性化機構について新たな知見を得ることができているため。これまでに、膵β細胞株においてS-エクオールはPKAシグナルを活性化すること、インスリン分泌促進作用、細胞増殖促進作用、細胞死抑制作用を持つことを見出している。本年度は、(1)S-エクオールのインスリン分泌促進作用、増殖促進作用、細胞死抑制作用にGタンパク質共役型受容体が関与するかについて、(2)S-エクオールがマウス膵β細胞に作用するか否かについて検討を行った。(1)膵β細胞株であるINS-1細胞において、GPCRをリン酸化して脱感作作用をもつGPCRキナーゼ(GRK)の関与を検討した結果、siRNAによるGRK3とGRK6のノックダウンにより、S-エクオールによるcAMP応答配列(CRE)を介した転写活性促進が亢進した。siRNAにより三量体Gタンパク質のGαsサブユニットをノックダウンするとS-エクオールによるCREを介した転写活性促進が減少した。さらに、Gαsのノックダウンにより、S-エクオールによるインスリン分泌促進作用、増殖促進作用、細胞死抑制作用は全て消失した。これらの結果から、S-エクオールはGPCRの活性化を介してINS-1細胞機能を亢進させることが示唆された。(2)ICR雄性マウスの単離膵島を用いた検討により、S-エクオールはPKAの基質であるCREB(Ser133)のリン酸化を促進することが判明した。S-エクオール(20 mg/kg)を1日2回、7日間経口投与したICR雄性マウスでは、増殖の指標となるKi67陽性のβ細胞(インスリン陽性細胞)が増加することが判明した。これらの結果から、S-エクオールはin vivoにおいても膵β細胞へ作用することが明らかとなった。S-エクオールの膵β細胞に対する作用に関して、培養細胞レベルで作用機構の解明に進捗がみられ、動物個体レベルでの効果が観察されたため。これまでに、培養細胞や膵β細胞株、マウス個体レベルで、S-エクオールが膵β細胞の増殖促進や機能亢進作用を有することを見出している。この作用機構としてはG他白質共役型受容体(GPCR)を標的とすると考えられた。そこで、本年度は(1)糖尿病発症モデルマウスに対するS-エクオールの作用に関して、(2)エクオールが活性化するGPCRの同定に関して検討を行った。(1)低用量ストレプトゾトシン(40 mg/kg)の5日間連続腹腔内投与による緩やかな膵臓β細胞破壊による糖尿病発症モデルを用いて、S-エクオール摂取の影響について検討した。S-エクオールを経口摂取させたICR雄性マウスにおいて、ストレプトゾトシンによる耐糖能悪化が緩和された。S-エクオール摂取によってβ細胞増殖の亢進と細胞死の抑制によるβ細胞量の減少抑制が観察されたが、インスリン感受性に関しては影響が認められなかった。これらの結果から、S-エクオールはβ細胞への作用を介して糖尿病発症予防作用を発揮することが示唆された。(2)S-エクオールが作用するGPCRを同定するために、258種類のGPCR

発現ベクターを構築して、それぞれを培養細胞にトランスフェクション後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたエクスプレッションスクリーニングを行った。これまでのところ、S-エクオールによって活性化するGPCRの同定には至っていないが、同時にスクリーニングを行った幾つかの食品成分において、特定のGPCRが活性化されることを見出すことができた。本研究において、大豆イソフラボンに由来するS-エクオールがGタンパク質共役型受容体(Gαsクラス)を介した作用により膵臓β細胞の増殖の促進、細胞死の抑制、グルコース刺激に応答したインスリン分泌を促進することを明らかにした。さらに、マウスにおいてS-エクオールの摂取がβ細胞を損傷させることによる高血糖の誘発を緩和することが示された。これらの結果から、S-エクオールはβ細胞を標的とした抗糖尿病作用を持つことが示唆された。標的となる因子を同定するために、考案した幾つかの方法を検討する。S-エクオールが作用するGPCRの同定を試みる。2型糖尿病モデルマウスに対するS-エクオールの効果について検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。代謝栄養学29年度が最終年度であるため、記入しない。
対向概念に基づく親フィンガを有するロボットハンドシステムの構築

本研究では,対象作業に応じてロボットハンドのフィンガのいずれかがヒトのおや指の役割を担うことにより、広い動作範囲において他のフィンガやパーム(ロボットの掌)との対向性を実現できるハンドシステムを構築することを目的とした.ハンドの設計の段階で,教示作業効率の観点からは人間形に劣るが,より多様な形状の物体が把持できるとの判断から,ハンドの形態を非人間(対称)形とすることに決定した.さらに,対向性の成立範囲の大小が親フィンガの性能を左右することから,フィンガ表面の被覆に柔軟性を与え,物体と面接触できる機能がとりわけ重要であると考察した.しかし面接触をすると,物体の形状によっては,その特徴点と力ベクトルの作用線との間に明確な対応が得られない場合がしばしば発生し,物体を安定に把持するための力制御則の適用が困難になる.そこで,接触力ベクトルが検出可能な小形の3軸力覚センサ素子を弾性被覆に分布状に配置し,それらの情報を基に被覆の変形を求めて物体の定位を行い,把持安定性を評価することにした.加えて,物体との接触状態の変化をより詳細にモニタできるように,各センサ素子に滑り振動覚機能も与えることにした.まず,ハードウェアとしては,3軸力覚および振動覚を有する動的触覚センサ素子を試作し,柔軟な被覆に分布装備するまでを最終的に実現した.高信頼な素子の開発が容易でなく,センシングノイズが顕在化したため,それらのセンサ情報を直接利用できるまでには至らなかったが,ソフトウェア上は,ノイズの少ないセンサ信号を仮定してさらに研究を進めた.すなわち,センサ信号に基づいて,有限要素法を利用した定位アルゴリズムを得,また,ポテンシャル関数から得られるヘシアン行列の正定性を調べることにより,外乱に対する物体把持の安定性を解析するアルゴリズムを求めた.そして,これらの有用性を実時間性とともに評価した。研究計画初年度の平成7年度は,対向概念に基づいたロボットハンドの実現方法とその利点に関する議論から始め,ハンドが何本のフィンガを必要とするか,さらにハンドの形態を人間型(親フィンガとこれに対向する数本の指で構成するタイプ)にする場合と非人間型(例えば放射状に対称的に配置するタイプ)にする場合の長所・短所,などについて検討を重ねた.その結果,フィンガの数は物体のパーム部での接触を条件して最低3本必要であり,それぞれの表面を柔軟な皮膚で覆う必要があること,また,対象物の接触部の位置姿勢が分からなければならないことが結論として得られた.さらに,人間型は動作の教示の際に有利である反面,様々な形状の対象物を把持するには不利であるとする立場に立って,ハンドの形態を決定することにした.すなわち,非人間型のハンドを志向することとし,4自由度をもつフィンガの製作,および,その表面を柔らかい皮膚で覆った場合に,そこに分布配置された動的触覚センサ素子からの情報に応じて対象物の接触部の位置姿勢を推定する方法の検討を行った.具体的には,いずれのフィンガも親指の役割を担うことができるよう,三角形状のパーム部の各辺に根元(パーム)部に与えた.一方,動的触覚センサおよびその情報処理の開発も平行して行っており,各素子が指先の柔軟皮膚の表面に,非マトリクス状に分布配置できるように,それぞれのセンサ素子を切り離せる構造のための回路集積と配線を行った.

さらに,動的触覚センサ素子から出力される対象物との接触力の3軸成分をもとに逆問題を解くことによって,皮膚表面の変形の度合いを算出する方法を検討した.本研究では,対象作業に応じてロボットハンドのフィンガのいずれかがヒトのおや指の役割を担うことにより,広い動作範囲において他のフィンガやパーム(ロボットの掌)との対向性を実現できるハンドシステムを構築することを目的とした.ハンドの設計の段階で,教示作業効率の観点からは人間形に劣るが,より多様な形状の物体が把持できるとの判断から,ハンドの形態を非人間(対称)形とすることに決定した.さらに,対向性の成立範囲の大小が親フィンガの性能を左右することから,フィンガ表面の被覆に柔軟性を与え,物体と面接触できる機能がとりわけ重要であると考察した.しかし面接触をすると,物体の形状によっては,その特徴点と力ベクトルの作用線との間に明確な対応が得られない場合がしばしば発生し,物体を安定に把持するための力制御則の適用が困難になる.そこで,接触力ベクトルが検出可能な小形の3軸力覚センサ素子を弾性被覆に分布状に配置し,それらの情報を基に被覆の変形を求めて物体の定位を行い,把持安定性を評価することにした.加えて,物体との接触状態の変化をより詳細にモニタできるように,各センサ素子に滑り振動覚機能も与えることにした.まず,ハードウェアとしては,3軸力覚および振動覚を有する動的触覚センサ素子を試作し,柔軟な被覆に分布装備するまでを最終的に実現した.高信頼な素子の開発が容易でなく,センシングノイズが顕在化したため,それらのセンサ情報を直接利用できるまでには至らなかったが,ソフトウェア上は,ノイズの少ないセンサ信号を仮定してさらに研究を進めた.すなわち,センサ信号に基づいて,有限要素法を利用した定位アルゴリズムを得,また,ポテンシャル関数から得られるヘシアン行列の正定性を調べることにより,外乱に対する物体把持の安定性を解析するアルゴリズムを求めた.そして,これらの有用性を実時間性とともに評価した.
EMT関連遺伝子を標的とした新規分子標的薬の開発

EMT関連遺伝子群でクラスタリングを行ったところ、癌肉腫は子宮体癌よりも肉腫と類似性を認めた。また、癌肉腫の癌部および肉腫部でEMT関連遺伝子群の発現を比較したところ、肉腫部でZeb、Twist、SnailなどのEMT誘導転写因子およびそのパスウェイに関与する遺伝子群の高発現を確認した。癌肉腫の癌部においては、子宮体癌と比較してリン酸化SMAD2/3が有意に高発現を示した。一方、癌肉腫の癌部および肉腫部におけるリン酸化SMAD2/3の発現には有意差は認めなかった。子宮体部癌肉腫で活性化されているTGFβシグナル伝達系のEMTへの寄与が示唆された。平成27年度は、子宮体癌の新しいバイオマーカーとなる新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を行った。1)新規EMT関連遺伝子の候補の抽出は、1網羅的発現解析によりEMT誘導転写因子群を抽出、2癌肉腫と体癌を比較して癌肉腫に高発現している遺伝子を抽出することにより行った。子宮体部癌肉腫、子宮体癌および子宮肉腫を対象に網羅的発現解析を実施した。その結果、癌肉腫は子宮体癌(類内膜腺癌)よりも肉腫と類似性を認めた。また39のEMT関連遺伝子群でクラスタリングを行ったところ、癌肉腫における発現パターンは子宮体癌とは全く異なっていた。更にレーザーマイクロダイセクションを用い、癌肉腫の癌部および肉腫部でEMT関連遺伝子群の発現を比較したところ、肉腫部でZeb、Twist、SnailなどのEMT誘導転写因子およびそのパスウェイに関与する遺伝子群の高発現を確認した。2)抽出した遺伝子の機能解析については、癌肉腫細胞株、我々が樹立した体癌高転移株および既知の体癌細胞株を使用し、増殖能、浸潤能への関与を、今後検討していく予定である。3)抽出した遺伝子が予後及び再発のバイオマーカーとなるかの検討においては、癌肉腫および子宮体癌の臨床検体を用いて、リン酸化SMAD2/3の免疫組織化学染色を行いTGF-βシグナル伝達を評価した。癌肉腫の癌部においては、子宮体癌と比較してリン酸化SMAD2/ 3が有意に高発現を示すことが示された。今後、リン酸化SMAD2/ 3の発現と予後について多数例において検討予定である。平成27年度は、網羅的発現解析による新規EMT関連遺伝子候補の抽出に時間を要したため、全体の進捗はやや遅れている。平成28年度までに、子宮体癌のバイオマーカー候補となる新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を行った。1)新規EMT関連遺伝子の候補の抽出は1網羅的発現解析によりEMT誘導転写因子群を抽出、2癌肉腫と体癌を比較して癌肉腫に高発現している遺伝子を抽出することにより行った。その結果、癌肉腫は子宮体癌よりも肉腫と類似性を認めた。また、EMT関連遺伝子群でクラスタリング解析を行ったところ、癌肉腫における発現パターンは子宮体癌とは全く異なっていた。さらにレーザーマイクロダイセクションを用い、癌肉腫の癌部および肉腫部でEMT関連遺伝子群の発現を比較したところ、肉腫部でZeb、Twist、SnailなどのEMT誘導転写因子およびそのパスウェイに関与する遺伝子群の高発現を確認した。2)抽出した遺伝子の機能解析については、癌肉腫細胞株、我々が樹立した体癌高転移株および既知の体癌細胞株を使用し、増殖能、浸潤能への関与に関して検討中である。3)抽出した遺伝子が予後および再発のバイオマーカーとなるかの検討においては、癌肉腫および子宮体癌の臨床検体を用いて、リン酸化SMAD2/3の免疫組織化学染色を行いTGF-βシグナル伝達を評価した。今後、リン酸化SMAD2/3の発現と予後との関連を検討予定である。平成27-28年度は、網羅的発現解析による新規EMT関連遺伝子候補の抽出に時間を要したため、全体の進捗はやや遅れている。平成29年度までに、子宮体癌のバイオマーカー候補となる新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を行った。1.新規EMT関連遺伝子の候補は、1網羅的発現解析によりEMT誘導転写因子群を抽出、2癌肉腫と体癌を比較して癌肉腫に高発現している遺伝子を抽出することにより行った。子宮体部癌肉腫、子宮体癌および子宮肉腫を対象に網羅的発現解析を実施した結果、癌肉腫は子宮体癌よりも肉腫と類似性を認めた。さらにレーザーマイクロダイセクションを用い、癌肉腫の癌部と肉腫部でEMT関連遺伝子群の発現を比較したところ、肉腫部でZeb、Twist、SnailなどのEMT誘導転写因子およびそのパスウェイに関与する遺伝子群の高発現を確認した。2.抽出した遺伝子の機能解析については、癌肉腫細胞株や既知の体癌細胞株を使用し、増殖能、浸潤能への関与を検討中である。3.抽出した遺伝子が予後および再発のバイオマーカーとなるかの検討においては、癌肉腫および子宮体癌の臨床検体を用いて、リン酸化SMAD2/3の免疫組織化学染色を行いTGF-βシグナル伝達系を評価した。癌肉腫の癌部においては、子宮体癌と比較してリン酸化SMAD

2/3が有意に高発現を示した。今後、リン酸化SMAD2/3の発現と予後の関連を検討中である。EMT関連遺伝子群でクラスタリングを行ったところ、癌肉腫は子宮体癌よりも肉腫と類似性を認めた。また、癌肉腫の癌部および肉腫部でEMT関連遺伝子群の発現を比較したところ、肉腫部でZeb、Twist、SnailなどのEMT誘導転写因子およびそのパスウェイに関与する遺伝子群の高発現を確認した。癌肉腫の癌部においては、子宮体癌と比較してリン酸化SMAD2/3が有意に高発現を示した。一方、癌肉腫の癌部および肉腫部におけるリン酸化SMAD2/3の発現には有意差は認めなかった。子宮体部癌肉腫で活性化されているTGFβシグナル伝達系のEMTへの寄与が示唆された。平成27年度に予定していた細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を推進する。その後、平成2829年度に予定されている、化合物アレイを用いた新規分子標的薬候補の抽出を行う予定である。平成28年度までに予定していた細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を推進する。その後、化合物アレイを用いた新規分子標的薬候補の抽出を行う予定である。婦人科腫瘍学平成27年度に計画していた、細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討に着手できなかったため未使用額が生じた。平成27-28年度に計画していた、細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討が遅れていたため、未使用額が生じた。細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を平成28年度に行う研究計画とあわせて実施予定である。これに関する費用として、平成28年度は、細胞培養関連費用約30万円、PCR関連費用40万円、マウス購入・管理費用約20万円を見込んでいる。細胞株を用いた機能解析による新規EMT関連遺伝子の同定に関する検討を、平成29年度に行う研究計画と併せて実施予定である。これに関する費用として細胞培養関連費用約50万円、PCR関連費用約70万円、マウス購入・管理費用約30万円を見込んでいる。
レイリー分裂を利用した噴霧熱分解法によるナノ粒子合成

サイズが揃ったナノサイズの酸化物あるいは金属などの超微粒子を簡便に作製する方法を開発することを目的とした。申請者等はこれまで、噴霧熱分解法にレイリー分裂(Rayleigh fission)を導入して液滴の分裂を制御し、5-20nm程度の粒度がそろったナノサイズの超微粒子を作製する方法を予備的に検討してきた。そこで本研究では特にこの方法によって、サイズと形状の揃ったナノ粒子を作製する方法を開発すると共に、その分裂の過程を調べ、生成する粒子形状とサイズを制御するための指針を明らかにすることを目的とした。金超微粒子を噴霧熱分解法により作製した。噴霧溶液の調製、反応温度、反応圧力、噴霧流量など多くのパラメータを考慮する必要があったが、とくに噴霧溶液については金の前駆体の検討を行った。その結果、ジメチル金アセチルアセトナートがもっとも金超微粒子を作製しやすいことを見出した。また、反応温度は523Kとした。得られた金超微粒子を透過型電子顕微鏡を用いて測定し、その粒度分布と噴霧溶液内の金錯体の濃度との相関性を調べた。金錯体の濃度が低くなるにつれて、より小さな粒子を得られることが分かったが、狭い粒度分布を有した金超微粒子を得ることはできなかった。リチウムイオン二次電池に用いられる酸化物については、同様の方法で狭い粒度分布を有する酸化物微粒子を得ることができた。従って、今後は上述の検討すべき多くのパラメータをより詳細に検討することにより、粒度分布の均一な金超微粒子の作製を検討する。
過敏性腸症候群のストレス反応とその治療

ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案した。独自に負荷刺激の作成に取り組み、機能性MRIのタスクとして特殊なソフトを使用し作成に成功した。健常者、過敏性腸症候群患者に対して、ストレス負荷を施行。健常者では情動の変化は認められず、過敏性腸症候群患者では情動の変化を認め、腹痛、便意の症状が増悪した。Voxel-based Morphometry解析では、健常者よりも過敏性腸症候群患者で、前運動野・補足運動野が有意に賦活していた。拡散テンソル解析では、健常者よりも過敏性腸症候群患者で[38, -46, -2]において有意に繊維束が増強していた。過敏性腸症候群の患者および健常者に対して、より臨床の現場に準じた新たなストレス負荷試験を作成し、その時の脳機能を、functional MRIにて評価するとともに、大腸運動機能評価(大腸バロスタット検査)も同期的に行うことで、脳腸相関(Brain-Gut interaction)をより科学的に明らかな病態として解明することを目的として研究を実行した。本年度はストレス負荷プログラム及び付随システムの構築と、健常者および患者について、検査を施行した。ストレス負荷課題ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案し、独自にコンピュータ・プログラミングにて負荷刺激の作成に取り組み、fMRIのタスクとして特殊なPresentationソフトを使用し、その作成に成功。現在、fMRI装置と、バロスタット装置の同期を確立するべく、バロスタット装置の改造を行っている。改造については、極めて敏感なセーフティシステムが逆に障害となっており、この回路の改善と、より急速な負荷とバッグ内圧の精密な調整目的のため、空気注入のためのブースト装置の開発も進んでいる。バロスタットカテーテルの延長化については、8メートルの延長化が、ほぼ成功し、現在、リークの問題を解決するべく、カテーテルコネクタの改良に取り組んでいるところである。上部消化管についての、同実験システムの構築について、ロンドン大学(英国)、ルーベン大学(ベルギー)のグループも取り組んでおり、両グループと緊密な連絡を取り、技術的問題の解決を目指している。メーカーも改造について、協力しており、その実現化は、近いと考えている。改造については、極めて敏感なセーフティシステムが逆に障害となっており、この回路の改善と、より急速な負荷とバッグ内圧の精密な調整目的のため、空気注入のためのブースト装置を開発。バロスタットカテーテルの延長化については、8メートルの延長化が、ほぼ成功し、現在、リークの問題を解決するべく、カテーテルコネクタの改良に取り組み、その実用化に成功。メーカーも改造について、協力しており、その実現化に成功した。ストレス負荷課題ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案し、独自に負荷刺激の作成に取り組み成功。fMRI装置と、バロスタット装置の同期を確立するためバロスタット装置の改造を行い、東北大学病院MRI検査室のfunctionalMRIで確立された。MRI設備に画像負荷システム、バロスタットシステム、心電図、皮膚電気抵抗システムが、常時設置。ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案し機能性MRIのタスクとして特殊なソフトを使用し作成に成功した。

健常者では情動の変化は認められず、過敏性腸症候群患者では情動の変化を認め、腹痛、便意の症状が増悪した。本画像刺激が、過敏性腸症候群特異的陰性情動尺度であることが実証された。また多様な脳構造画像の撮像も終了し解析を行った。Voxel Based Morphometry解析では、健常者よりも過敏性腸症候群患者で前運動野・補足運動野が有意に賦活していた。さらに、Diffusion Tensor Imaging解析では、健常者よりも過敏性腸症候群患者で、[38,-46,-2:MNI]において有意に繊維束の増強が認められた。また過敏性腸症候群患者よりも健常者で繊維束の有意な増強部位は認めなかった。過敏性腸症候群の患者および健常者に対して、より臨床の現場に準じた新たなストレス負荷試験を作成し、その時の脳機能を、functional MRIにて評価するとともに、大腸運動機能評価(大腸バロスタット検査)も同期的に行うことで、脳腸相関(Brain-Gut interaction)をより科学的に明らかな病態として解明することを目的として研究を実行した。本年度はストレス負荷プログラム及び付随システムの構築と、健常者および患者について、検査を施行した。ストレス負荷課題ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案し、独自にコンピュータ・プログラミングにて負荷刺激の作成に取り組み、fMRIのタスクとして特殊なPresentationソフトを使用し、その作成に成功。現在、fMRI装置と、バロスタット装置の同期を確立するべく、バロスタット装置の改造を行い、その実用化に成功。同実験システムの構築は、東北大学病院MRI検査室のfunctionalMRIで確立された。MRI設備は、すでに十分な運用実績を有し、そこに、画像負荷システム、バロスタットシステム、心電図、皮膚電気抵抗システムが、常時設置。被験者への対応用の部屋や、特発的事態への対応体制も救急カートをはじめとして万全の状態となった。ストレス負荷課題として、過敏性腸症候群特異的陰性情動刺激を考案し機能性MRIのタスクとして特殊なソフトを使用し作成に成功した。健常者、過敏性腸症候群患者に対して、ストレス負荷を施行。また、functionalMRIと画像タスクシステムと、バロスタット検査システム(大腸運動機能測定装置)と、心電図・皮膚電気抵抗検査システムとの同期に世界で初めて成功したfMRI装置と、バロスタット装置の同期を確立するべく、バロスタット装置の改造を行っている。改造については、極めて敏感なセーフティシステムが逆に障害となっており、この回路の改善と、より急速な負荷とバッグ内圧の精密な調整目的のため、空気注入のためのブースト装置を開発。
シナプス形成を制御する新規メカニズムの構造基盤

シナプス形成の新たな分子機構として注目されている3つのタンパク質複合体、1. RPTPの細胞内ホスファターゼドメインとリプリンαとの複合体、2.ニューレキシンとSorCSとの複合体、3. LRRTMと糖鎖との複合体について、結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡を用いた構造生物学的解析を行う。さらに得られた構造情報を元に、機能解析を行い、これらのタンパク質複合体によるシナプス形成のメカニズムを構造と機能の両面から明らかにする。
インフルエンザA型ウイルスノイラミニダーゼの高次構造形成に関する研究

インフルエンザA型ウイルスノイラミニダーゼ(NA)はホモ4量体のウイルス主要膜糖蛋白質であり、その高次構造形成にはアスパラギン結合型糖鎖が重要な役割を担っているとされている。本研究ではNA頭部領域に存在する3カ所の糖鎖結合部位(Asn84,144,398)に糖鎖が結合できない変異NAを作成し、糖鎖の欠失がNAの高次構造形成と機能に及ぼす影響について検討した。RIPの結果、HG-2 NAでは、野生型NAよりも低分子量の特異的バンドが検出され、正常な立体構造をもつNA単量体の存在が認められた。一方、HG-1、HG-3では、特異的なバンドは検出されなかった。酵素活性の測定では、HG-2のみが野生型NAと同様Fetuin,6'-NALに対する活性を示したが、野生型NAと比較してHG-2の6'-NALに対する活性は相対的に低下していた。。以上の結果から、Asn84およびAsn398糖鎖結合配列中のアミノ酸置換により、N8型NA頭部の高次構造形成が阻害されることが示された。一方、Asn144の置換による糖鎖の欠失は、高次構造形成には影響を及ぼさないことが、酵素の基質特異性に影響を与える可能性が示唆された。。
国立公園をモデル区域としたランドスケープ構成要素の変動要因の解明

奥日光地域を対象に過去50年の土地被覆区分、気象や植生に関する自然環境に関する情報や社会基盤に関する情報等をもとにランドスケープ構造とその変動要因を分析した。特に戦場ヶ原と小田代ヶ原の湿原面積の変化は顕著であり、戦場ヶ原の消失速度はほぼ一定で1.2ha/年と推定された。湿原の消失には、短時間雨量の増加による土砂供給が影響すると考えられるほか、小田代ヶ原では1950.1960年代の森林伐採とその放置が大きく影響したと考えられた。ランドスケープの変動を評価にあたっては、人為影響だけではなく、自然環境下での変動を定量的に評価することも必要である。自然保護区域における動植物相およびその生息環境の変化、ならびに社会経済的変化に伴って変化するランドスケープとその構成要素の変貌を明らかにして、自然環境保全区域におけるランドスケープ機能の評価手法を解明することを目的とする。今年度の分析対象区域である日光国立公園の地形、気象、植生に関する情報を収集し、次年度以降の解析に必要なデータベース化のためのデータ分析と整理を中心に作業を進めた。国立公園のランドスケープ構成要素の変動を考える上で、周辺地域の関連情報を如何に収集し、また現在だけではなく過去数十年にわたる情報の分析が不可欠である。そこで日光国立公園の周辺地域である日光市、鹿沼市、今市市を中心に、社会基盤情報として人口推移、市町村別の総生産や所得なども収集し、過去の地形図等から道路整備と主要地点における交通量の推移についても分析を開始した。また自然環境に関するデータについては、植生図や気象データ(降水量、日射量、気温等)を出来るだけ過去に遡って収集した。今市市での1970年代の人口増加に対して、日光市では逆に減少しているが、交通量は日光自動車道の開通とともに日光周辺で増加していることなどが読み取れる。日光国立公園に隣接する群馬県片品村では、1990年代前半のバブル崩壊によって一時的に交通量が激減していること、あるいは日経平均株価の推移を経済活動の指標として日光国立公園の利用者数の変遷と併せて、いろは坂の無料開放やリゾート法の施行、奥日光の自動車乗り入れ規制等の制度面の効果について検討しうる情報が収集できた。本年度は、日光国立公園内の戦場ケ原を中心とする奥日光地域を対象に、1952年から2000年までの地形図および航空写真から土地被覆区分図を作成した。土地被覆区分ごとに、その面積や空間配置を年次ごとにGISソフトウエア(Arc GIS,ESRI)を用いて解析した。今回解析対象とした戦場ヶ原および小田代ケ原を中心とする湿原面積は1952年には約244haであったが(ラムサール条約登録時(2005年)の「奥日光湿原」面積は260.1ha)、その面積は年々減少して2000年時点には約144haとなり40%がすでに消失していた。小田代ケ原の湿原はもともと面積が狭く、1950年頃に隣接する上流域が皆伐されたことに伴う土砂流入が原因と考えられるが、湿原面積が顕著に減少していた。奥日光地域では戦鋒の農地開拓やカラマツ林の拡大造林による影響が相まって、湿原面積の減少速度は平均約2.1ha/年に及び、21世紀中には消失する可能性がある。特に、面積が小さい小田代ケ原ではかなり早い段階で湿原が失われる可能性が高い。消失した湿原は地表面の乾燥化が進行するため、二次草原や樹林地へと変化する。なお、奥日光における過去の気象データを見る限り、地球温暖化や乾燥化の兆しは確認されていない。奥日光地域を対象に1952年以降の土地被覆区分、気象や植生に関する自然環境に関する情報、周辺市町村の人口推移や道路建設等を含めた社会生活基盤に関する情報、国立公園への入園者数、狩猟頭数などの情報を収集し、対象ランドスケープの変動を分析した。社会経済情報を含め収集情報が多岐に及ぶので解析は未了だが、湿原面積の変化とその要因を中心に取りまとめた。ラムサール条約登録湿地となった2005年時点の奥日光湿原面積は260.1haである。本研究で得た土地被覆区分では、1952年の244haから、2000年には144haに減少した。ある程度まで湿原面積が縮小すると、乾燥化が加速して早期に(今世紀末)湿原が消失する可能性もある。その原因として地球温暖化等による乾燥化の進行を危惧する論調の報告もあるが、気象データからはそうした傾向は認められない。ただ、降水パターンは1960年代以降特徴的な傾向があった。

年降水量は2200mm前後で推移するが、日最大降水量は増加傾向にあり、10年ごとに300500mmを記録する年が出現した。戦場ヶ原および小田代ヶ原は湯川を中心とする集水域にあり、その集水面積51km2および年平均降水量2248mから湯川の平均流量を推定すると1.3m3/sとなる。しかし日降水量から類推すると流量はその数十倍に及ぶこともあり、短時間雨量の増加は上流あるいは上部山地から湿原域への土砂供給を促進するであろう。特に小田代ヶ原の上部では、1950年代から1960年代にかけて40ha以上の皆伐の後、10年以上に及ぶ放置状態が継続していたことが小田代ヶ原の急減に影響したと考えられる。奥日光での戦後の農地開拓、カラマツ植林、道路整備等は湿原の消長に直接関与するとは考えにくいが、それに付随して設置された排水溝は湿原減少に少なからず影響したであろう。
多様な土壌炭素の分解反応に及ぼすプライミング効果の定量的評価

土壌炭素分解メカニズムの解明に向けて、多様な土壌炭素の分解反応に及ぼすプライミング効果(グルコースやセルロースなどの易分解性有機物の混入による土壌炭素分解促進効果)を定量的に評価した。プライミング効果による土壌炭素分解量は土壌タイプや層位によって多様であることや、特に土壌中の軽比重画分炭素量(比較的新鮮な植物リターが多く占める)や中比重画分炭素量(鉱物や団粒化によってより高比重化したリターが主体)と関係が深いことが明らかとなった。地球温暖化問題を背景に土壌炭素の分解規定因子の解明が課題となっている。現在のところ現存している土壌炭素の質(化学構造特性)や存在形態(有機ー無機複合体)によって分解反応は規定されるという考えがコンセンサスを得ているが、近年それを覆す規定因子(グルコースやセルロースによる正のプライミング効果)が報告され話題となった。ただし、プライミング効果による土壌炭素分解が多様な質に関係なく普遍的に生じるかは不明であり、他の規定因子との関係も曖昧である。本研究は多様な土壌炭素の質や存在形態に対するプライミング効果を定量的に評価することを目的としている。本年度は質や存在形態が互いに大きく異なる複数の土壌試料を採取し科学的な特徴付けを行うことを主目的として行ってきた。具体的には採取した土壌の色味や13C NMRスペクトル解析にて質を評価し、物理分画法や選択溶解法にて存在形態を定量化した。その結果、色味や化学構造特性、存在形態が互いに大きく異なる土壌を各4種ずつ取得した。現在は多様な質や存在形態を有する土壌試料に対し、プライミング効果実験(培養法)の最適化を試みている。具体的には3つの主要な培養条件因子(水分、温度、セルロース量)をそれぞれ段階的に制御し、平均的にプライミング効果が最もよく現れる条件を見いだす。今後は確立した最適実験法を用いて本年度に取得した土壌試料に適用し、多様な土壌炭素に対するプライミング効果を定量的に評価していく予定である。現在は現存している土壌炭素の質によって分解反応は規定されるという考えがコンセンサスを得ているが、近年それを覆す規定因子(グルコースやセルロースによるプライミング効果)が報告され話題となった。本研究は土壌炭素の質が大きく異なる複数の試料に対し、プライミング効果による分解反応の有無を定量的に評価することを主目的としている。本年度は昨年度明らかにした化学構造特性や存在形態(比重)の異なる黒色土、褐色土、赤黄色土を用いてプライミング効果実験(培養法)を試みた。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)表層0-10cmの土壌ではすべての土壌でプライミング効果が生じることが確認され、その程度は赤黄色土<褐色土<黒色土の順に高いことが明らかとなった。(2)下層60-70cmの土壌では褐色土ではプライミング効果が認められなかったが、黒色土および赤黄色土では認められた。その程度は黒色土<赤黄色土の順に高かった。(3)表層土と下層土を比較すると赤黄色土のみ下層土でのプライミング効果の程度が高いことが示された。さらに、各土壌炭素の質的特性(化学構造特性および比重)とプライミング効果の関係について解析した結果、表層の土壌炭素では化学構造特性との間に有意な相関関係は認められなかったが、比重1.6g cm-3以下の軽比重の土壌炭素(主に易分解性有機物)が多いほどプライミング効果が生じ難い関係が見出された。下層土では土壌炭素の質的特性とプライミング効果の間に有意な関係は認められなかった。土壌学実験計画書ではH25年度中に培養実験の最適化を確立しておく予定であったが、現在進行中である。現在進行中の培養法の最適化はほぼ確立されてきたので、近々この手法を用いて多様な土壌試料に適用していく予定である。また、微生物バイオマス量についても並行して調べる予定である。昨年の11月から新天地への移動により予算が使用できない期間が数ヶ月間存在したため、予定していた予算使用が計画通り進行できなかった。次年度分と合わせて予定していて購入できなかった物品費用等に使用させていただく計画である。
三次元前立腺培養における間質細胞ホルモン細胞増殖因子の増殖分化に与える影響

前立腺組織の増殖、分化、維持には各種マトリックスが重要な役割を演じており、上皮細胞間、間質細胞間、両者相互間の作用が重要であることが知られている。我々はこれを裏づける研究として前立腺単離細胞をコラーゲンおよび間質細胞存在下に培養し前立腺のacinus like structureを構築することに成功した。今回これを進展させ以下の結果を得た。1.上記培養系では腺管の分化度が低く、かつ培養寿命が短い傾向にあることが判明した。そこで前立腺の細切組織片培養を行い、経日的に観察したところ、組織の再構築は単離細胞のそれと近似したprocessをとり、かつ分化の高いしかも長寿命の培養系が得られるなど、実験モデルとしてより優れていることが分かった。2.これに間質細胞として脂肪細胞を加えて培養すると増殖能、分化度共に増加する結果が得られた。In-vivoにおいて、前立腺内外に脂肪細胞があることを考えると、この事実は極めて興味ある現象と考えられた。3.脂肪細胞を加えた培養系でDihydrotestosterone,Estrogenを加えると前者では増殖、分化とも増加し、後者では間質細胞の増殖が見られるなど興味ある結果が得られた。4.ヒト前立腺癌のcell lineを使って、同様の培養を行い、形態を観察したところ脂肪細胞の存在は前立腺癌腺腔の分化傾向を促進する一方、細胞が紡錘化して増殖する結果を得た。この機構を調べるためには更に検討が必要と考えられた。【今年度の実績】ラット前立腺上皮細胞を単細胞に単離し、コラーゲン・ゲル三次元培養により、腺房様構造形成を観察してきた。ところが、単離細胞より再構築された腺管では分化度が低く、また腺管の寿命も短い傾向があった。そこで次のごとく同組織の組織片培養を行った。生後9週の前立腺腹側葉組織を微細に細切し、コラーゲン・ゲル内に包埋・培養するとともに、副睾丸周囲脂肪細胞と混合培養し、一種のfeederlayerとして脂肪細胞が産生する生理活性物質(adipocytokine)の影響を検討した。培養3日目から組織片周囲に上皮細胞と前立腺間質細胞が増殖し、腺房様の腺管構造を形成した。脂肪細胞との混合培養では粘液産生を有する大型の腺管が形成された。ラット前立腺背側葉に特異的な蛋白であるDP-1を免疫染色すると、単離細胞より再構築された腺房様構造ではDP-1は発現しなかったのに対して、今回の組織片培養群、特に脂肪細胞と混合培養を行った群ではDP-1の発現が見られた。すなわち、前立腺組織の組織片培養及び、脂肪細胞との混合培養は、単里細胞培養に比べてより良好な培養条件を獲得できると考えられる。この条件下でdihydroteststerone(DHT)等の男性ホルモンは前立腺上皮の増殖と分化を促進させた。前立腺肥大症患者より単離した細胞の三次元培養を行ったところ、ラットのそれに比べ、異なる腺管構造が形成され、例えば導管様構造が優位であった。またヒト癌細胞株(cell line)の培養では不完全な腺管構造を作り、細胞の極性を欠く傾向が認められた。これらの違いが如何なるメカニズムによって起こるかは未だ解明できず今後に研究続行予定である。ラットの組織片培養コラーゲン・ゲルマトリックス内で上皮と間質細胞及び細胞外マトリックスを同時に含む前立腺の組織片を培養し、更に脂肪細胞を間質として混合培養し、核が基底層に配列し、かつ明調な細胞質を有する分化の良好な腺房様構造を形成した。組織片単独培養群を対照群とし、脂肪細胞との混合培養群、及びdihydroteststerone(DHT),estrogen(EST)添加群につき再構築腺房様構造及び周囲の間質細胞の増殖・分化に関し、新たな検討を加えた。1増殖能の検討。(培養2週間後のウリジンの取り込み率)1上皮細胞の増殖能脂肪細胞混合培養+DHT+EST群が最も高い取込み率を維持していた。2問質細胞の増殖能EST投与群に正の相関傾向が見られた。2分化の検討。1いずれの培養群でも明瞭な基底膜を形成した。