hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
冷温帯林における積雪下でのリター分解菌類群集の組成とその分解酵素活性

北海道の森林において、積雪下におけるリター(落葉)分解とリター分解菌類相を調べ、低温下における菌類の分解酵素活性を調べた。リターは積雪下でも重量減少が起こり、その間に特有の菌類の出現あるいは増加がみられた。積雪下のリターから分離された菌には0°Cにおいて菌糸を伸長させ、リグニン分解能力を示すものが存在した。こうした菌類は積雪下のリター葉分解に大きく寄与しているものと考えられた。本研究では、積雪時の低温下において特有の土壌微生物群集のなかでも重要なリター分解に関わる菌類はどのような種によって構成されるのか、またそれらが低温に適応した生長特性や分解酵素の特性を明らかにすることを目的としている。そこで、初年度は研究実施計画に従って、リター層が凍結するかしないか(0°C)が、リター分解に関わる菌類群集とその活性に与える影響を検討するために、冷温帯林の広がる北海道で積雪の深さが異なる調査地を選定し、リターバッグを設定した。調査地は多雪地域として、名寄および小樽、少雪地域として、苫小牧および足寄の合計4カ所。さらに中間的な積雪量の地域として富良野に決定した。各調査地には温度計と積雪・土壌凍結深棒を設置した。北海道の主要な樹種であるミズナラとトドマツのリター(落葉)を2009年10月に集め、リターバッグに封入したものを10月下旬に各調査地に設置し、2010年の12月と3月に雪中から回収した。この間に各調査地の積雪量と土壌凍結深の調査を行ったところ、多雪地域では土壌凍結は起こらず、少雪地域では数cmから20cm以上の深さまで土壌凍結することが明らかになった。また、研究実施計画に従って回収したリターを実験室で表面殺菌し、シャーレ内の培地上に接種し、5°Cの低温で培養した。その数は各調査地から回収したミズナラとトドマツのリターについて4080繰り返し行った。現在、これらから約900シャーレの培養が進行中であり、既に200以上の純粋菌株が得られた。今後は次年度からの研究実施計画に従って、さらにリターバッグの回収と菌株収集し、顕微鏡による形態観察と、DNA解析によって種同定および種の推定を行う。本研究では、積雪時の低温下においてリター分解に関わる菌類はどのような種によって構成されるのか、またそれらが低温に適応した生長特性や分解酵素の特性をらかにすることを目的としている。そこで、多雪地の調査地で早春に積雪下の地表よりミズナラのリターを回収した。リターには本来の褐色が漂白された部分が多数観察されたため、漂白部分と非漂白部分から菌の分離を行い、DNAのITS領域について塩基配列を解析し、BLAST検索により菌の分類群の推定を行った。その結果、得られた菌は担子菌の7分類群と子のう菌の28分類群に区分されたが、種名を特定できたものは限られていた。これらの菌について、0°Cに保った恒温器で培養し、生長とリグニン分解に関わるphonoleoxidaseの産生能を調べたところ、ほとんどの菌は0°Cでも生長することが可能であり、漂白部分から分離された菌の50%、非漂白部分から分離された菌の8.2%が0°Cでphenoleoxidaseの産生能を有していた。リターの漂白は積雪下で菌の活動によるリグニン分解と関連があるものと推測された。調査地間でリター分解速度を比較すると、冬期のリターの重量減少率は名寄>小樽>苫小牧>足寄の順で高かった。積雪下の地表温度については、多雪地の名寄と小樽は常にほぼ0°Cで安定しているのに対し、雪の少ない苫小牧と足寄は不規則に氷点下に降下を繰り返していた。多雪地の積雪下でリター分解が比較的速く進む理由の一つが、0°Cでリグニン分解酵素を産生することができる多数の子のう菌類の存在によるものである可能性が示された。この他にも研究実施計画に従って、冬期と夏期のリター分解に関わる菌類群集とその分解活の違いを検討するために、調査地4カ所において、融雪後に新たなリターバッグを設置した。回収したミズナラとトドマツのリターから菌類の分離を行い、3500株が得られた。本研究は積雪時の低温下において特有の土壌微生物群集のなかでも重要なリター(落葉)分解に関わる菌類はどのような種によって構成されるのか、またそれらが低温に適応した生長特性や分解酵素の産生能を明らかにすることを目的とした。本年度は、積雪時に土壌が凍結せず0°Cで安定した環境から、氷点下となる頻度が高くなり凍結深が増加するように環境勾配のある北海道内4カ所の森林で調査したリター分解と分離菌の種構成や酵素産生能の有無について解析を行なった。積雪下のリターの分解はいずれの調査地でも認められたが、地表温度が0°Cで安定した環境でより速く進む傾向が認められた。

また、落葉中のN含有量についてもより多く増加していた。これは0°Cでは氷点の環境と比べ活発にリター分解活動を行なう菌類のバイオマスが増加していることを示している。さらに落葉がパッチ状に白く脱色された部分が多く観察され、落葉の主要成分中で最も難分解性であるリグニン様の物質の分解が起きていたと考えられた。各調査地のリターから分離された菌類の種組成は冬期と夏期では大きく異なった。また、積雪開始後の12月と3月の菌類相を比較した場合と、地域間の菌類相を比較した場合にも違いが認められた。落葉から分離された菌類の多くは子のう菌類に属したが、分生子などの形態的特徴やDNA情報が乏しく分類学的に未報告の種がほとんどであった。分離された菌類の中には0°Cで菌糸伸長し、フェノールオキシダーゼの産生能を示すものが存在した。以上から森林の積雪下には分類学的に未解明な種が多く含まれる独特な菌類相がみられ、0°Cで落葉中のリグニン様成分の分解に関わる酵素を産生する能力を備えた種が存在することが明らかにされた。こうした菌類の働きは多雪地域における積雪下のリター分解に寄与しているものと考えられる。
膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化の解析

本研究では、膜電位依存的に内耳有毛細胞の長さを変えるのに寄与しているモーター蛋白プレスチンの膜電位依存的な構造変化を、全反射照明下FRET法により解析した。まず、サブユニット間のC末端間のみならず、サブユニット内のNおよびC末端間、さらに、サブユニット間のNおよびC末端間においても、高K+液の還流による脱分極時にFRETが減少することを明らかにした。次に、より定量的な情報を得るために、膜電位をパッチクランプ法により厳密にコントロールしながら、同時にFRET変化を測定する実験を行った。プレスチンの構造変化が顕著に起こる膜電位レンジは、先行するnon-linear capacitanceの解析により予想されている。そこで、FRETの変化がどの膜電位レンジで大きくなるかを定量的に解析したところ、nodinear capacitanceとよく類似した膜電位依存性を示すことが明らかになった。この結果は、本研究で検出したFRETの変化が、プレスチンの構造変化を正しく捉えているものであることを強く支持する。さらに、本研究で確立した全反射照明下FRET法による構造変化の解析手法を、GABAB受容体にも適用し解析を行った。GABAB受容体は、GABABR1aと、GABABR2の異なる二つのサブユニットでなるヘテロ二量体である。各々の様々な部位に蛍光蛋白を付加したコンストラクトを作成して解析を行った結果、リガンド投与時に、二サブユニット間の相対的配置の非対称な変化が起きていること、各々のサブユニット内での構造変化はあまり顕著でないことが明らかになった。今年度、以下の成果を得た。(1)膜電位依存的なプレスチンの構造変化の、FRET法によるさらに詳細な解析を行った。すなわち、サブユニット間のC末端間のみならず、サブユニット内のNおよびC末端間、さらに、サブユニット間のNおよびC末端間においても、高K+液の還流による脱分極時にFRETが減少する傾向があることを明らかにした。また、FRETの変化が、非線形性容量電流をブロックするサリチル酸ナトリウムによりブロックされること、また、非線形性容量電流が見られなくなる変異体においては失われることを観察し、記録したFRET変化がアーチファクトではなく確かにプレスチンの構造変化によるものであることを確定した。また、より定量的な情報を得るために、膜電位をパッチクランプ法によりコントロールしながら、同時にFRET変化を測定する実験を開始した。(2)プレスチンの示す非線形容量電流が細胞内Cl-依存的であるため、プレスチンの構造変化はCl-依存的で、Cl-存在下と非存在下で、その構造は異なると予想される。昨年度、Baculo virus Sf9細胞発現系を用いてFLAG tagを付加したプレスチン全蛋白を発現させ、C1-存在下で精製しその単粒子構造解析を行ったが、今年度は、Cl-依存的構造変化を明らかにするために、Cl-非存在下でのレコンビナント蛋白の精製を試みた。凝集傾向が強かったため、detergentの種類を変える等の各種の条件検討を行った。
堆積盆地構造の地盤特性が地震動に及ぼす影響と災害リスクの軽減に関する研究

メキシコシティー盆地の地盤は、水の流れが非常に緩やかな淡水環境下に堆積したことが明らかとなった。また、メキシコシティーの地盤は、振動に対して減衰しにくい性質を持っており、地震時には地震動が長く継続されることを示した。メキシコシティー盆地で実施した振動調査結果から、基盤深さと揺れやすさには、密接な関係のあることがわかったことから、対象位置が盆地部のどこに存在するのかがわかれば揺れ具合を推定できる。堆積盆地構造の地盤特性と振動特性とを把握する目的でメキシコシティー盆地縁部において物理探査,土のサンプリングおよび原位置試験を行った。現地との打合せの結果,H20に実施する予定であった盆地中央部の調査とH21で実施する予定であった盆地縁部の調査を入れ替えた。物理探査は,表面波探査と微動アレイ探査を行い,調査地点の地層構成と基盤層の傾斜を確認した。基盤深度の違いによって振動特性に大きな違いのあることも認められた。また,堆積土の工学的特性を解明するために,サンプリング,静的コーン貫入試験および原位置ベーンせん断試験を行った。サンプリング試料に対しては物理試験,室内ベーンせん断試験,一面せん断試験および圧密試験を行った。さらに,メキシコシティー粘土の堆積環境を明らかにするため,年代測定,珪藻分析,X線回折試験,塩化物含有量試験や強熱減量試験などを行った。本実験からも土の間隙比が6を越す試料が認められた。室内試験から得られた知見を以下に述べる。1)メキシコシティー粘土の主要鉱物はガラス質の非結晶物質であり,粘土鉱物はほとんど存在せず,有機物によって上の粘性が発揮されている。2)メキシコシティー粘土は,珪藻分析から水の流れが非常に緩やかな環境で堆積したことが明らかとかっか。3)メキシコシティー粘土は,過圧密履歴を受けた粘土とは異なり,二次圧密やセメンテーションによる年代効果で過圧密を示す擬似過圧密粘土である。現地調査の結果,メキシコシティー盆地における土地造成は,盆地内の地下水位を下げることによってなされてきていることから,現在も地盤沈下が継続して生じている。このことから,地盤調査結果の解釈には時系列による評価が重要である。H21の作業はメキシコシティー盆地中央部において地盤調査を実施し,堆積環境を考慮した地盤特性の把握を行い,盆地中央部および盆地縁部の工学的物性の違いを明らかにすることである。特に,変形特性試験において,剛性率および減衰定数のひずみ依存性を明らかにする。H21の地盤調査はメキシコシティー盆地中央部において,表面波探査,常時微動測定および微動アレイ探査を行うとともに,土のサンプリング,静的コーン貫入試験および原位置ベーンせん断試験を行った。サンプリング試料に対して,土の物理試験,室内ベーンせん断試験,一面せん断試験,三軸試験および圧密試験を行った。また,堆積環境を明らかにするために,年代測定,珪藻分析,X線回折試験,塩化物含有量試験や強熱減量試験を行った。室内試験の結果,メキシコシテー盆地中央部の土質特性は,塩分濃度が59%と海水の約23倍あること,間隙比が10以上あること,pHは9.510あること,有機炭素含有量が5%程度あり,メキシコシティー盆地縁部で行った調査結果と大きく異なっており,同じメキシコシテー盆地の中でも場所によって土質特性が大きく異なっていることが分かった。盆地中央部の土の堆積環境は,珪藻分析結果から淡水に堆積したことが分かっているが,土の塩分濃度が海水よりも高い理由として,灌漑による人為的な条件と強烈な乾燥条件のもとで,土中の水分が失われ塩分濃度が高くなっていったものと判断される。次に,メキシコシティー粘土の剛性率は,ひずみレベルが1×E-01になっても85%程度にしか減少していないことが分かった。また,減衰定数についても同様なひずみレベルにおける値が2%でしかない。同ひずみレベルにおける我が国の海成粘性土の剛性率は5%程度に減少し,その減衰定数は20%程度であることを考えると,メキシコシティー粘土の動的特性は,我が国のそれと比較すると大きく異なっていることが分かる。この結果から,メキシコシティー粘土は減衰しにくい土であり,地震時には地震動の影響が長く続くことが示唆される。H22の作業は追加試験を行うため,メキシコシティー盆地中央部においてメキシコ式サンプリング方法によって試料採取を行った.サンプリングした試料は,残留有効応力測定試験,一軸圧縮試験,一面せん断試験,三軸試験および圧密試験を行った.また,メキシコシティー粘土の間隙比は10以上あっても安定的に存在していることを明らかにするため,沈降実験において微生物を使い炭酸カルシウムを生成させることによって粘性土を固化させる状況を観察した.振動調査は,高知市において常時微動測定を行い,メキシコシティーで得られた基盤深さと固有周期との関係との比較および検討を行った.

我が国のサンプリング方法から得られた力学的特性とメキシコで用いられているサンプリング方法から得られたそれとの比較では,ほぼ同等な結果が得られたことから,両国で実施されているサンプリング方法による違いが力学特性に与える影響については考慮する必要のないことがわかった.沈降試験結果から,微生物と栄養塩を粘性土に添加することによって,土粒子間に炭酸カルシウムが生成されていることが確認できた.しかしながら,この炭酸カルシウムは,土粒子と土粒子とを結びつけるまでには至らなかった.なお,この時の土の間隙比は6以上あり,微生物の触媒作用を速やかに行わせることによって,間隙比10以上の地盤を再現できることを示唆する結果を得た.メキシコシティー盆地中央部において実施した常時微動測定および微動アレイ探査の結果を取りまとめた.メキシコシティー盆地中央部では,深度70m程度までS波速度は150m/s以下であり,日本の典型的な沖積平野と比較してはるかに低速度であることがわかった.また,メキシコシティー盆地中央部では,H/Vスペクトルのピーク周波数0.251Hzであり,このピークは深度200m以浅の地盤構造に対応していることがわかった.高知市仁井田地区で実施した常時微動測定結果から,地盤のせん断波速度とH/Vから得られた卓越周期との関係は,概ね1:1に調和していることがわかった.また,基盤深さとH/Vとの関係も概ね調和的であることを示した.
カドミウムの骨障害機序に関する研究(MC3T3-E_1の骨形成過程に及ぼす影響)

カドミウム(Cd)が骨障害を発現することはよく知られているが、その作用機序については不明な点が多い。本研究では、骨形成過程に及ぼすCdの作用機序について明らかにする目的で石灰化能を有する骨芽細胞MC3T3ーE_1をCd存在下で培養した。骨形成の指標と考えられるアルカリホスファタ-ゼ(ALP)活性、コラ-ゲン量としてHydroxyproline量、DNA量等の測定を行ないCdによる各パラメ-タ-の細胞中での活性あるいは含有量の変化を明らかにした。MC3T3-E_1は10%胎児血清含有αーMEM中、5%CO_2下37°Cで3日間preincubationの後、10^<-8>10^<-5>MのCdを添加してさらに7日間培養した。10^<-8>,10^<-7>MCd添加群ではいずれのパラメ-タ-に関してもCdの影響は認められなかった。10^<-6>MCd添加により、Hydroxyproline量、DNA量は対照と同じであったが、ALP活性は80%に低下した。10^<-5>MCdによってALP活性は対照の4%、Hydroxyproline量は10%、DNA量は50%に低下した。以上の結果から3つのパラメ-タ-の中で最も低濃度のCdの影響をうけたのは骨芽細胞の分化の初期のstageで合成されるALPであった。次に、これまでにCdとの相互作用の認められているセレンを共存させるとCdによるALP活性の低下がより増強される傾向にあったが、Znの共存はCdのALP活性阻害作用を軽減した。10^<-5>MCd添加により低下したALP活性、蛋白量、Hydroxyproline量のいずれもが、10^<-4>MZnにより上昇した。形態学的にも、10^<-5>MCdによる液胞の増加、死細胞の増加の認められる像から、Znの共存により対照に近い正常細胞像へと変わりZnの保護効果が観察された。ALPは骨の石灰化に密接に関与していることがこれまでに報告されているが、ALPがCdの作用に最もSensitivityの高いマ-カ-であることが示唆された。今回の結果から、骨芽細胞が長期間低濃度のCdに曝露される事によりALP活性が低下し、骨芽細胞の機能に影響を与えている可能性が示唆された。動物の骨形成過程に及ぼすカドミウム(Cd)の作用機序を明らかにする目的で、石灰化能を有する骨芽細胞MC3T3ーE_1を用い毒性モデル実験を試みた。今年度は、培養法を確立し、骨形成に関連する物質、特にアルカリホスファターゼ(ALP)活性、コラーゲン量、DNA量、DNA合成量、オステオカルシン合成量等の測定法を確立することにより、Cdによる各マーカーの細胞中での活性、或は含有量の低下を明らかにした。

MC3T3ーE_1がconfluentになった時点でCdを添加し、ALP活性の発見の及ぼすCdの影響を検討したところ、Cd10^<-8>M、10^<-7>M、10^<-6>M、10^<-5>M、添加5日後には、A^LP活性値は対照群に比べると各々、100%、40%、40%、10%に低下していることが明らかになった。10^<-8>MCd添加群でも、8日間のCdばくろによっては10%のA^LP活性値の低下が認められた。コラーゲン量、DNA量についても、10^<-5>MCd添加24hr後に低下が見られた。オステオカルシン量の測定に際し、すでに調整ずみのラットオステオカルシン抗体とマウスオステオカルシンの間に交叉性が期待できないので、新たにマウスオスオステオカルシンの抗体の調整が必要である。これまでは10%血清存在下で培養を行ってきたが、約90%のCdイオンが血清蛋白質と結合することが知られているので、遊離Cdの作用量を明らかにするために、無血清培養を検討中であり、骨細胞に影響を及ぼすCd濃度はさらに低下すると考えられる。また来年度実験計画書に沿って、現在、Cdの石灰化への影響を検討するための準備を行っており、5mMβーglyccrophosphate存在下では約20日間の培養により、肉眼的にも石灰沈着が観察できた。X線マイクロアナリシスによる金属分布の検索のためには、培養細胞をシャーレごと樹脂で包埋し、表面分析に供する方法が最適であることがわかったので細胞が長期培養に耐えうる微量のCd添加を行い、石灰化の進展状況を観察する予定である。骨形成過程に及ぼすカドミウム(Cd)の作用機序を明らかにする目的で、石灰化能を有する骨芽細胞MC3T3-E_1を、Cd存在下で培養した。培養法を確立した昨年度にひき続き、骨形成の指標と考えられるアルカリホスファタ-ゼ(ALP)活性、コラ-ゲン量としてHydroxy proline量、DNA量等の測定を行ない、Cdによる各パラメ-タ-の、細胞中での活性あるいは含有量の変化を明らかにした。MC3T3-E_1は10%胎児血清含有α-MEM中、5%CO_2下37°Cで3日間preincubationの後、10^<-8>10^<-5>MのCdを添加してさらに7日間培養した。10^<-8>10^<-7>MCd添加群ではいずれのパラメ-タ-に関してもCdの影響は認められなかった。10^<-6>MCd添加により、Hydroxyproline量、DNA量は対照と同じであったが、ALP活性は80%に低下した。10^<-5>MCdによってALP活性は対照の5%、Hydroxyproline量は60%、DNA量は50%に低下した。以上の結果から3つのパラメ-タ-の中で最も低濃度のCdの影響をうけたのは骨芽細胞分化の初期のstageで合成されるALPであった。次は、これまでにCdとの相互作用が認められている亜鉛(Zn)、銅、セレンを共存させると、CdによるALP活性の低下がより増強される傾向んにあったが、Znの共存はCdのALP活性阻害作用を軽減した。10^<-5>MCd添加により低下したALP活性、蛋白量、Hydroxyproline量のいずれもが、10^<-4>MZn共存により上昇した。形態学的にも、10^<-5>MCdによる液胞の増加、死細胞の増加の認められる像から、Znの共存により対照に近い正常細胞像へと変わり、Znの保護効果が観察された。ALPは骨の石灰化に密接に関与していることがこれまでに報告されているが、ALPがCdの作用の最初のtargetになっている可能性のあることが示唆された。今回の結果から、骨芽細胞が長期間低濃度のCdに曝露される事によりALP活性が低下し、骨芽細胞の機能に影響を与えている可能性が示唆された。
慢性心不全における脳内アンジオテンシン系の役割に関する病態生理学的研究

1ラット心筋梗塞モデルを用いて、慢性心不全における脳内アンジオテンシン系の病態的意義を明らかにするために、脳室内アンジオテンシン投与により惹起される飲水行動を正常ラットと心不全ラットで比較し、心不全群で有意に飲水行動が強く誘発されることを見出した。また脳室内にアンジオテンシン変換酵素阻害薬であるカプトプリルを持続投与することにより心臓リモデリングが予防されることが明らかになった(Joumal of Cardiac Failure,1998;4:139-14-4)。2心不全時の脳内アンジオテンシン系の機能冗進の機序として圧受容器機能低下が報告されているが、従来の圧受容器機能の評価方法には、重大な欠点があった。圧受容器機能評価のための信頼性の高い方法として、ホワイトノイズ法を新たに開発した(A.merican Joumalof Physiology,1998;274:H358-H365)。3,ラット心不全モデルの心機能評価の新しい方法としてコンダクタンスカテーテル法を開発し、交感神経が収縮性に与える影響を明らかにした(American Journal of Physiology,1998;274:H1429-H1434)。4.ラット心不全モデルの神経性動脈圧制御機構を解明するための新しい実験方法を開発した(American JournaI ofPhysiology,1999;276:H326-H332)。1.ラット心筋梗塞モデルを用いて、慢性心不全における脳内アンジオテンシン系の病態的意義を明らかにするために、脳室内アンジオテンシン投与により惹起される飲水行動を正常ラットと心不全ラットで比較し、心不全群で有意に飲水行動が強く誘発されることを見出した。また脳室内にアンジオテンシン変換酵素阻害薬であるカプトプリルを持続投与することにより心臓リモデリングが予防されることが明らかになった(Journal of Cardiac Failure,1998,in press)。2.心不全時の脳内アンジオテンシン系の機能亢進の機序として圧受容器機能低下が報告されているが、従来の圧受容器機能の評価方法には、重大な欠点があった。圧受容器機能評価のための信頼性の高い方法として、ホワイトノイズ法を新たに開発した(American Journal of Physiology,1998,274 : H358)。3.ラット心不全モデルの心機能評価の新しい方法としてコンダクタンスカテーテル法を開発し、交感神経が収縮性に与える影響を明らかにした(American Journal of Physiology,1998,in press)。
低温貯蔵中におけるメロン果実の「陥没障害」発生機構とその防止技術に関する研究

ネットメロン果実の発育に伴うネット及びクチクラからの蒸散量を測定した.果実成熟期であってもネットの接合部は完全に融合されず,ネットに沿って亀裂が認められた.'ライフ'は果実生長期間が短く,ネットのリグニン化及びスベリン化も抑制された.しかし,果実成熟期におけるネットからの蒸散量は品種間で有意差はなかった.従って,ネットメロンにおける蒸散抑制機能は,ネット融合部にできる亀裂の下までスベリン化が進んでいれば,クチクラからと同程度の蒸散抑制機能を有していることが明らかとなった.ネットメロン果実の発育に伴うネット及びクチクラからの蒸散量を測定した.果実成熟期であってもネットの接合部は完全に融合されず,ネットに沿って亀裂が認められた.'ライフ'は果実生長期間が短く,ネットのリグニン化及びスベリン化も抑制された.しかし,果実成熟期におけるネットからの蒸散量は品種間で有意差はなかった.従って,ネットメロンにおける蒸散抑制機能は,ネット融合部にできる亀裂の下までスベリン化が進んでいれば,クチクラからと同程度の蒸散抑制機能を有していることが明らかとなった.砂丘メロンは,収穫後の低温(2°C前後)貯蔵中に果皮直下の果肉が果実内部に向かい陥没する陥没障害が発生する.特に品種'ライフ'で発生しやすく,果肉の軟化が起こる前に現れる.'ライフ'は山形県で日本で最初に民間育種されたネットメロンであり,主力品種'アンデス'と並ぶ地域特産品種として有望視されている.本研究ではメロン品種'ライフ','グランドール1号'及び'アンデス'を中心に,陥没障害が発生する要因を,(1)果皮と果肉の形態的変化,(2)クチクラ及びネット組成の化学変化及び(3)これらの関連酵素活性の変化,に着目し,陥没障害発生のメカニズムを明らかにすると共に,陥没障害が発生し難い貯蔵条件を確立することを目的として研究を実施している.平成22年度の研究では,ネットの構造と機能について焦点を絞って研究を行った.その結果,陥没障害が出やすい品種では,果実の肥大速度が速く,果皮の亀裂を修復するためのネット形成が不十分なまま成熟を迎える可能性が示唆された.ネットの形成は,亀裂の両端からリグニン状の癒合組織が成長して徐々に亀裂を埋めて行くが,顕微鏡観察の結果では,両端から成長した組織同士が十分に癒合していないケースがあることが明らかとなった.また,クチクラの主要成分である脂質の化学的変化も,果実における水の保持力の違いに影響し,より水が抜けやすい品種ほど陥没症状が起こりやすい傾向があることが明らかとなった.そのため,平成23年度では,クチクラ及びネットの化学成分分析及び関連酵素活性の変化を中心に,果皮表面からの水の損失と陥没障害との関連を明らかにする予定である.ネットメロンの収穫後の低温(2°C前後)貯蔵中に発生する陥没障害について、メロン品種'ライフ'、'アンデス'及び'グランドール'を中心に、陥没障害の発生要因を、(1)果皮と果肉の形態的変化、(2)クチクラ及びネットからの水分の蒸散量の変化、(3)クチクラとネットの構成成分の化学的変化、及び(4)これらの関連酵素活性の変化に着目し、陥没障害発生のメカニズムを明らかにするとともに、陥没障害が発生し難い貯蔵条件を確立することを目的として研究を実施している。(1)果皮の形態的変化については、実体顕微鏡、レーザー蛍光顕微鏡及び電子顕微鏡を用いてネットとクチクラ及び果実の表皮組織の形態的観察を行い、陥没が発生しやすい品種では果実の生長が早く成熟までの期間が短いため、ネット形成が不十分なまま成熟を迎える可能性が示唆された。また、組織化学的観察により、果実の成熟に伴ってネット部分を覆う物質が形成されることが観察された。(2)ネットとクチクラからの水分の蒸散を測定した結果、果実のネット形成期にはネットからの蒸散がクチクラからの蒸散の10倍以上であったが、果実の成熟に伴って、ネットからの蒸散が急速に減少し、収穫期にはクチクラからの蒸散とほぼ同じレベルにまで低下したことから、形成されたネットに蒸散を抑制する物質が集積する可能性が考えられた。(3)ネットとクチクラ層を果実の表皮組織から分離する方法を新規に開発し、ネットとクチクラを分けてそれぞれの成分として脂質、リグニン、スベリンに注目し、まず、脂質の量とその脂肪酸組成の解析を行った。その結果、ネットに特徴的に集積する成分の存在の可能性が示唆された。(4)リグニンやスベリンの生成に関与する酵素として過酸化酵素の定量を行っている。ネットメロンにおけるネットの水保持機能を調べるため,ネットの発達が著しい,アールス系メロンを用い,ネットを剥皮した果実と,部分的にネット表面を削り取った果実とで,蒸散量を比較した.その結果,ネット表面を部分的に削り取った場合には,無処理区に比べ蒸散量が約2倍であったのに対し,ネットを剥皮した果実では蒸散量は10倍以上に増加した.剥皮した場合と削り取った場合のネット構造を電子顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察すると,剥皮した場合はスベリンを含むコルク細胞が完全に失われていたのに対し,削り取った場合はスベリンを含むコルク細胞の一部が残っていたことから,ネットはスベリンを含むコルク細胞の一部が残っていれば,高い水分保持機能を有することが示唆された.

また,こうした処理による水分損失は,主に表皮に接する外果皮細胞から起こっており,外果皮細胞が水を失って収縮を起こすことにより,組織全体が陥没するようになることが明らかとなった.こうした結果を踏まえ,収穫後のネットメロンで生じる陥没症状は,ネットを形成するコルク細胞のスベリン化が十分に進まず,外果皮組織における水分が失われることで,徐々に外果皮全体が収縮し,最終的に陥没症状を引き起こすものと考えられた.さらに,表皮におけるリグニン化やクチクラの脂肪酸組成と蒸散との関係は,メロン以外の果物,特に低温で障害が発生しやすい熱帯性果実でも当てはまることから,メロンと同時に熱帯性果実でも同様の研究を進めた結果,今後の収穫後の流通過程における果実の水分保持機能と品質維持の研究進展に大きく貢献することが出来た.メロン果実表面のクチクラに形成された亀裂及びその癒傷組織であるネットの形態的解析を行い、陥没障害が発生しやすい品種「ライフ」では成熟期になってもネットが十分完成しないことが示唆された。クチクラとネットからの水分の蒸散を測定し、水分の損失が陥没の形成に影響していることが推定された。また、ネットとクチクラの脂肪酸組成の違いを解析中で、ほぼ予定通りの進捗状況である。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度には、果実表面のクチクラとネットの脂肪酸組成の解析を進める。また、陥没と表皮組織の細胞膜の機能を解析するため、果実組織からの細胞質の漏洩を測定する予定である。陥没障害の発生について、クチクラとネットの形態、果実からの蒸散、脂肪酸組成との関連について、科学雑誌に論文を投稿する準備を進めている。さらに、リグニンや関連酵素の変化と陥没障害の関連を研究する。陥没障害が発生し難い貯蔵条件を検討する。現時点までの進行状況からみて研究計画を変更する必要はない。
国際都市の文化戦略―横浜市の「創造都市」政策に関する実証的研究

21世紀に入り、グローバル化・脱工業化によって衰退した都市・地域を再生させる戦略として創造都市戦略が世界的な注目を集めるようになった。本研究では、2004年により創造都市政策を採用した横浜市を事例として、その背景と目的、実施過程を調査し、到達点と課題を評価することを目的としている。横浜市の創造都市政策は、アーティストを誘致し、創造産業クラスターを形成し、都心臨海部の空間形成をめざすものであった。政策実施過程の分析から、この政策の特徴は都市デザインにあり、アーティストの誘致には成功したが、産業政策と市民参加に弱点があること、行政組織の再編によって、空間的視点も弱まりつつあることが明らかとなった。新世紀に入り創造都市戦略に国際的な関心が集まっている。創造都市戦略とは、グローバル化と脱工業化のなかで、文化創造を軸に都市の内発的発展を図ろうとする都市再生戦略である。本研究では、2004年より「文化芸術都市創造事業」に着手し、都心部の再活性化を図っている横浜市を対象として、その現状と課題、政策意図と効果を調査して、日本における自治体政策の展開過程における歴史的位置づけと、東アジアの国際都市との比較というふたつの観点から、創造都市政策の戦略的意義について検証することを目的としている。本年度は、横浜市の創造都市政策の概要を把握することと、海外の研究者の協力を得てソウルと上海の事例について研究報告を受けて海外事例についての理解を深めることのふたつを課題とした。横浜市の創造都市政策の概要については、関係者への聞き取り調査、行政資料、文書資料、先行研究を含む文献資料、Webコンテンツの収集・閲覧などの方法により、共同調査を実施した。その結果、(1)横浜市の創造都市政策は、歴史的建造物、とくに銀行建築の保存・活用策の検討をきっかけとして始まり、検討過程で「創造都市」のコンセプトを得て着想が広がったこと、(2)歴史的建築物を文化芸術活動のために活用するにあたり、民間から運営団体を公募したことが、活性化につながったこと、(3)さらに民間不動産会社が空きビル活用のためにアーティスト・建築家などにスタジオを貸し出す事業が連動することにより、「創造界隈」の形成が促進されたこと、(4)不法風俗営業地帯等旧都心部の再生にも、創造都市政策が適用され、まちづくりに活用されていることなどの概要が明らかとなった。国際比較に関しては、11月22日に于海教授(復旦大学)と張元皓教授(ソウル市立大学)を招いたワークショップを開催し、上海における復元型再開発とソウルのムレドン地区のまちづくりについてそれぞれ報告を受け、討議した。本研究では、2004年より「文化芸術都市創造事業」に着手し、都心部の再活性化を図っている横浜市を対象として、その現状と課題、政策意図と効果を調査して、日本における自治体政策の展開過程における歴史的位置づけと、東アジアの国際都市との比較というふたつの観点から、創造都市政策の意義について検証することを目的としている。本年度は、本研究の第2フェーズとして、横浜市の創造都市政策の戦略的意義について検証するとともに、東アジア諸都市に関する共同研究会を上海市の同済大学(復旦大学、ソウル市立大学共催)にて開催した。横浜市の創造都市政策について、狭義の創造都市政策と広義の創造都市政策に分けて、調査研究を進めた。狭義の創造都市政策としては、平成23年4月横浜市の局再編によって設置された文化観光局所管の事業とし、ヨコハマ・トリエンナーレ2011における市民協働、文化芸術教育プログラム、急な坂スタジオ、アーツコミッションヨコハマ、黄金町エリアマネジメントセンターなどに関して、行政職員、公益財団職員、アートNPO関係者にインタビュー調査を実施した。また前年度に明らかになった概要を文書資料によって裏付ける作業も進めた。広義の創造都市政策としては、磯子区における文化政策について杉田劇場に焦点を当てた聞き取り調査を実施した。結果として、旧都心部においては「創造界隈」形成がNPO主導で進んでいるが、「全市展開」には課題を残していることが明らかとなった。また、同済大学、復旦大学、ソウル市立大学、ユネスコ世界遺産機構と共催で、上海・同済大学において「都市再生過程における都市文化」と題するシンポジウムを開催し、とくに上海における創造産業クラスターの形成や歴史的街区の保存事例(田子坊)について理解を深めた。経済的活力の旺盛な上海の場合、歴史的街区の保存がジェントリフィケーションにつながりやすいことが示唆された。本研究では、2004年より「文化芸術都市創造事業」に着手し、都心部の再活性化を図っている横浜市を対象として、その現状と課題、政策意図と効果を分析することを目的としている。本年度は、研究全体の総括を行い、報告書を作成するとともに、中国と韓国の研究者と東アジア諸都市に関する共同研究会を実施した。横浜市の創造都市政策は、飛鳥田市政以降の「六大事業」「都市デザイン行政」および文化政策の蓄積をもとに、2004年に中田市政のもとで提起された。

その直接的背景は、経済のグローバル化による銀行の統廃合、東京の都市再編による都心部のオフィス需要の低迷、東京へのアクセス改善による都心部でのマンション需要の増加により都心空間の象徴的価値が脅かされていたことによる。そのため、銀行建築の保存・活用をきっかけに文化芸術による都心再生政策として創造都市政策が提起された。横浜市の創造都市政策は、アーティストとクリエーターの集積(創造界隈形成)、創造的産業クラスターの形成、都心臨海部の空間再編の3つの柱からなり、究極的には市民が主導する文化芸術創造都市づくりをめざすものであった。10年が経過し、創造界隈形成には成功したが、創造的産業クラスターの形成にはいたらず、都心臨海部の空間再編は象の鼻パークの整備以降停滞、創造都市政策の全市展開も課題である。創造界隈形成の成功要因は、アートNPOと創造的ビューロクラットの協働が成功したこと、地価の相対的下落により都心部のオフィス空間の文化芸術利用が容易であったことなどによる。しかし、近年では、都市デザインの視点が弱まりつつあり、国のリフレ政策の影響で都心部の地価も上昇に転じた。都市デザインの視点から発想された横浜市の創造都市政策が、都市を巡る政治経済的力学を制御する能力をどのくらい持ちうるのかが問われている。この点で、東アジアの創造都市と共通する課題を抱えている。本研究では、2004年より「文化芸術都市創造事業(クリエイティブシティ・ヨコハマ)」に着手し、都心部の再活性化を図っている横浜市を対象として、その現状と課題、政策意図と効果を調査して、日本における自治体政策の展開過程における歴史的位置づけと、東アジアの国際都市との比較というふたつの観点から、創造都市政策の意義について検証することを目的としている。本年度は、本研究の第2フェーズとして、横浜市の創造都市政策の戦略的意義について検証するとともに、東アジア諸都市に関する共同研究会を韓国のソウル市立大学にて開催した。横浜市の創造都市政策について、狭義の創造都市政策と広義の創造都市政策に分けて、調査研究を進めた。狭義の創造都市政策としては、平成23年4月横浜市の局再編によって設置された文化観光局所管の事業とし、創造界隈形成、ヨコハマ・トリエンナーレ2011における市民協働、黄金町エリアマネジメントセンターなどに関して、行政職員、アート・まちづくりNPO関係者にインタビュー調査を実施した。また政策それじたいの変遷について文書資料によって裏付ける作業も行った。広義の創造都市政策としては、磯子区における文化政策について杉田劇場に焦点を当てた聞き取り調査を実施した。結果として、旧都心部においては「創造界隈」形成がNPO主導で進んでいるが、産業振興と「全市展開」の両面において課題を残していることが明らかとなった。また、同済大学、復旦大学、ソウル市立大学と共催で、ソウル市立大学において「都市再生過程における都市文化」と題するシンポジウムを開催し、とくにソウル市内の衰退しつつある工業地区における創造拠点の形成や歴史的街区の保存事例について理解を深めた。
ゼブラフィッシュを用いた危険ドラッグの網羅的病態解析に関する研究

本研究は、ダニオビジョンという装置を用いて、ゼブラフィッシュ(Zf)を、多数・同時・迅速に薬物の効果を確認できるシステムを確立し、多種多様な危険ドラッグのスクリーニングシステムを確立することを目的とした。私達自身の、突然死事例の報告を基に、ダニオビジョンを用い、Zf幼魚の透明性を利用して、新規危険ドラッグ25B-NBOMeが、セロトニン2A (5HT2A)受容体依存性に横紋筋融解症を誘発することを見出し、従来なかった致死性横紋筋融解症モデルを確立した。さらに、類似他為25D-NBOMeが5HT2A受容体遺伝子を誘導する結果、横紋筋融解症を惹起することを見つけた。行動異常に基づく交通事故等が社会問題となっているカンナビノイド(CB)系危険ドラッグの1つAB-CHMINACAの突然死事件例を基に、上記Zfモデルで行動を観察したが、未だ、有効な情報を得ることができていないが、入手できたMDMB-CHMICAの、刺激により誘発される特異な行動異常を(想定されていない)ダニオビジョンを用いて解析できた。AB-CHMINACA等のCB系薬物は、迅速な代謝、脂肪組織移行により、摂取後速やかに血中から消失する上、突然死する事例が少なくないため、死因究明が極めて難しい。法規制が難しいため入手困難なAB-CHMINACA, AB-PINACAを入手できた。まず、CB系薬粒による行動異常の陽性対象として、haloperidolやアルコール投与後、光や音刺激による特異な行動異常を記録でき、論文作成準備中である。今後、ダニオビジョンを用いて、AB-CHMINACA, AB-PINACAによるZfの行動異常、ラットの行動異常と、薬物代謝動態を分析することで、"CB系危険ドラッグによる死の謎"に迫る予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Zebrafish (Zf)幼魚は、ヒトとの遺伝的類似性、透明性(生体における臓器形態の観察)、低コスト、単位時間当たり情報処理可能性、低コスト、短寿命、高生殖率等の利点を利用して、中毒研究に導入され始めている。私達は、新しいデザイナードラッグである25B-NBOMeによる致死的横紋筋融解症事例の解剖を経験した。Zf幼魚に25B-NBOMeを作用させると、骨格筋の複屈折低下、筋膜beta-dystroglycan、筋原線維myosinの免疫染色性低下を惹起し、横紋筋融解症を反映していると考えられた。4種類のserotonin (5-HT)受容体拮抗剤の効果より、5-HT2A受容体が横紋筋融解に寄与していることが確認された。横紋筋融解症は、従来、ラットに複数のserotonin作動薬を投与し、体温上昇や筋酵素血中逸脱を指標に研究されてきたが、形態異常を指標とした研究はなかった。Zfの25B-NBOMe処理による横紋筋融解症モデルは、簡単に再現性よく横紋筋融解症を作成できる極めて優れた疾患動物モデルである。近時、頻発しているMDMB-CHMICAによる突然死の機序は未解明である。ラットにMDMB-CHMICAを投与すると、すぐに徐脈を惹起し、続けて血圧上昇を認めた。また、重力に対して受動的体位を維持する"カタレプシー“に続き、把持により"のたうち運動“が惹起された。これらの行動異常は、cannabinoid系薬物使用者に多い危険運転の原因である可能性が推定される。これらの現象をZfで再現し、突然死と行動異常の分子機構の解明を目指したい。25B-NBOMeによるゼブラフィッシュ横紋筋融解症モデルは、生体のまま簡単に形態異常を再現性よく惹起できる。従来のモデルにはない利点を要する極めて有用な動物モデルである。その研究成果は、既に、Forensic toxicologyに受理されていて、横紋筋融解症の病態・分子機構の解明に大きく貢献することが期待されている。カンナビノイド系薬物であるMDMB-CHMICA投与ラットの心血管系変化と行動異常に関する論文も、投稿中である、いっぽう、ゼブラフィッシュの多数同時行動観察できる実験系を用いたMDMB-CHMICAによる病態・分子機構の解明に着手している。これら2つの薬物に限らず、確立しつつある実験系を用いて、多くの薬物による病態の再現と分子機構の解明が進むことが期待できる。ゼブラフィッシュ(Zf)は、ヒトと遺伝的類似性、透明性、低コスト、短時間当たり情報処理可能性、短寿命、高生殖率等の利点を利用して中毒研究に導入され始めている。私達は、危険ドラッグの1つである25B-NBOMeが、Zf幼魚に、骨格筋複屈折の低下、筋膜蛋白βージストロフィン、筋原線維ミオシンの免疫染色性の低下を惹起することから、横紋筋融解症を惹起すること、これが、セロトニン受容体の1つ5-HT2Aに依存することを見出し、Forensic toxicologyに論文を発表し、法中毒学会、国際法医学セミナー(ジュッセルドルフ)にて発表した。一方、欧州で死亡例が多発していたMDMB-CHMICAをラットに投与し、徐脈とそれに続く血圧上昇、カタレプシー(受動的体位の維持)を生じることを確かめ、Forensic toxicologyに発表した。

次に、MDMB-CHMICA、私達が突然死例の症例報告をしたAB-CHMINACA等について、Zfで致死濃度、異常行動、死のメカニズムを究明するため、Zfを96穴ウェルに入れて、種々の薬物種・濃度における死亡率、行動の経時的変化をモニターする自動追跡・解析用ビデオ・トラッキング・システム“ダニオビジョン"を導入し、25B-NBOMe, MDMB-CHMINCAなどの危険ドラッグの致死濃度、異常行動をモニターできる条件を確立した。まず、カタレプシーを惹起することが確立しているハロペリドールにて、異常行動に関する観察条件をほぼ把握したので、危険ドラッグについて、順次、異常行動、致死濃度、そして、死亡のメカニズムについて検討する予定である。危険ドラッグは、入手が極めて難しい。当教室で、解剖に当たり、共同研究者が薬物を分析した薬物から、研究対象を選び、薬物取り扱いの資格を得た上で、東京都等に授受を申請し、許可を受けた上で、保有している共同研究者から、薬物を実際に入手するのに時間がかかった。大学院生をトレーニングしながら、ゼブラフィッシュを研究室内で恒常的に繁殖させるようにできるのに、予想外の時間がかかった。ゼブラフィッシュの行動、死亡率を観察する装置の習熟に予想外の時間がかかった。しかしながら、ほぼ、上記の問題を克服できたので、今後、研究の進展が望まれる。本研究は、ダニオビジョンという装置を用いて、ゼブラフィッシュ(Zf)を、多数・同時・迅速に薬物の効果を確認できるシステムを確立し、多種多様な危険ドラッグのスクリーニングシステムを確立することを目的とした。私達自身の、突然死事例の報告を基に、ダニオビジョンを用い、Zf幼魚の透明性を利用して、新規危険ドラッグ25B-NBOMeが、セロトニン2A (5HT2A)受容体依存性に横紋筋融解症を誘発することを見出し、従来なかった致死性横紋筋融解症モデルを確立した。さらに、類似他為25D-NBOMeが5HT2A受容体遺伝子を誘導する結果、横紋筋融解症を惹起することを見つけた。行動異常に基づく交通事故等が社会問題となっているカンナビノイド(CB)系危険ドラッグの1つAB-CHMINACAの突然死事件例を基に、上記Zfモデルで行動を観察したが、未だ、有効な情報を得ることができていないが、入手できたMDMB-CHMICAの、刺激により誘発される特異な行動異常を(想定されていない)ダニオビジョンを用いて解析できた。AB-CHMINACA等のCB系薬物は、迅速な代謝、脂肪組織移行により、摂取後速やかに血中から消失する上、突然死する事例が少なくないため、死因究明が極めて難しい。法規制が難しいため入手困難なAB-CHMINACA, AB-PINACAを入手できた。まず、CB系薬粒による行動異常の陽性対象として、haloperidolやアルコール投与後、光や音刺激による特異な行動異常を記録でき、論文作成準備中である。今後、ダニオビジョンを用いて、AB-CHMINACA, AB-PINACAによるZfの行動異常、ラットの行動異常と、薬物代謝動態を分析することで、"CB系危険ドラッグによる死の謎"に迫る予定である。ゼブラフィッシュを用いた25B-NBOMe誘発横紋筋融解症モデルを用いて、種々のカルシウムチャネル、カルシウム依存性プロテアーゼ(カルパイン)の寄与を解明する。また、成魚の骨格筋に注射することで、25B-NBOMeが骨格筋のセロトニン5-HT2A受容体に直接作用しているか、中枢に作用しているかを明らかにする。従来、横紋筋融解症を惹起することが知られているMDMA,その他の薬物について、横紋筋融解症を惹起するか?
臓器移植における再生間葉系肝幹細胞門脈内投与による新たな免疫寛容誘導法の確立

本研究の全体構想は、これまでの臨床研究の成果を基に、臨床生体臓器移植におけるOperational Toleranceを誘導するメカニズムを解析しさらに肝幹細胞を中心とした再生医療を応用したスーパードナー抗原による新たな方法論を確立することである。基礎的検討としては、ヒト肝組織特に障害肝のductularreactionの存在する領域にCD133+NCAM+ human hepatic stem/progenitor細胞の存在が確認された。特に障害の程度が高い程、その存在は明らかであった。しかし正常肝組織での肝幹細胞の確認はできなかった。やはり肝幹細胞は肝に何らかの障害がもたらされて初めて誘導されるものと考えられた。ドナー抗原の門脈内投与の免疫学的検討においては、免疫寛容誘導症例でFoxP3^+/CD4^+CD25^+調節性T細胞の割合が有意に増加しており、免疫寛容に関与していることが判明した。また肝障害度(MELDスコアー)別に移植前後の免疫学的検討を行ったが、MELDスコアー20以上の症例では、調節性T細胞が有意となっており肝障害度別に免疫状態を把握する事により移植後免疫抑制剤の使用方法を調整できることが判明した。基礎的検討としては、ヒト肝組織、特に障害肝においてhepatic stem/progenitor細胞markerであるCD133とNCAMを用い、その存在を検討した。障害肝のductular reactionの存在する領域にhepatic stem/progenitor細胞の存在が確認された。特に障害の程度が高い程、その存在は明らかであった(Hepatology Research2009)。今後正常ドナー肝組織で確認できるかが、検討課題である。また臨床においてはこれまで行ってきたドナー分できるかが、検討課題である。また臨床においてはこれまで行ってきたドナー分離白血球の門脈内投与の免疫学的検討を行った。これまで免疫抑制剤プログラフが0.5mg/1週間以下の症例(Almost tolerance)と連日投与症例を検討すると、Almost tolerance症例で調節性T細胞であるFoxP3+CD4+CD25+細胞が有意に多く存在していた。これらを国内国際学会で報告した。また臓器移植においては、肝膵移植における拒絶反応の診断は一つの課題である。拒絶反応が発症した場合血管抵抗が増加するが、その計測を非侵襲的に行うために、ソナゾイド造影エコーを用いたソフト開発を行っている。今後は障害肝のhepatic stem/progenitor細胞だけではなく、正常肝におけるhepatic stem/progenitor細胞の抽出、さらにこれまで行ってきているドナー特異的抗原門脈内投与の免疫学的解析をさらに進めていく予定である。

本研究の全体槽想は、これまでの臨床研究の成果を基に、臨床生体臓器移植におけるOperational Toleranceを誘導するメカニズムを解析しさらに肝幹細胞を中心とした再生医療を応用したスーパードナー抗原による新たな方法論を確立することである。基礎的検討としては、ヒト肝組織、特に障害肝においてhepatic stem/progenitor細胞markerであるCD133とNCAMを用い、その存在を検討した。障害肝のductular reactionの存在する領域にhepatic stem/progenitor細胞の存在が確認された。特に障害の程度が高い程、その存在は明らかであった(Hepatology Research2009)。正常ドナー肝組織で確認できるかが、検討課題であったが、正常肝組織からの肝幹細胞からの同定は困難であった。また臨床においてはこれまで行ってきたドナー分離白血球の門脈内投与の免疫学的検討を行った。これまで免疫抑制剤プログラフが0.5mg/1週間以下の症例(Almost tolerance or tolerance)と連日投与症例を検討すると、Almost tolerance or Tolerance症例で調節性T細胞であるFoxP3+CD4+CD25+細胞が有意に多く存在していた。これらTranplant Proc2012;44に掲載された。また間葉系幹細胞を加えて24時間保存腎のラット移植実験では、グラフト腎の再灌流障害に対する改善効果はあったが、免疫寛容誘導効果は認めなかった。今後は障害肝のhepatic stem/progenitor細胞だけではなく、正常肝におけるhepatic stem/progenitor細胞の抽出、さらにこれまで行ってきているドナー特具的抗原門脈内投与の免疫学的解析をさらに進めていく予定である。また幹紳胞の免疫学的寛容効果が困難な可能性もあり、ドナーとレシピエント共培養により抑制性T細胞を誘導し、門脈内投与することにより、より免疫寛容を誘導できるレジメの開発を進める。本研究の全体構想は、これまでの臨床研究の成果を基に、臨床生体臓器移植におけるOperational Toleranceを誘導するメカニズムを解析しさらに肝幹細胞を中心とした再生医療を応用したスーパードナー抗原による新たな方法論を確立することである。基礎的検討としては、ヒト肝組織特に障害肝のductular reactionの存在する領域にCD133+ NCAM+ human hepatic stem/progenitor細胞の存在が確認された。特に障害の程度が高い程、その存在は明らかであった。