hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮質脊髄路側枝形成に関与するリガンド受容体シグナリングの解明

まず、これら分子の側枝形成領域への局在を調べる為、タグを付加したベクターを皮質脊髄路神経細胞に導入し、側枝形成途中である生後2日目で組織免疫染色を行った。その結果、受容体#13、リガンド共に皮質脊髄路軸索に局在が見られ、分岐した軸索側枝にも局在することを確認した。大脳皮質・橋核・小脳において受容体#13とリガンドを発現する細胞群は相補的な配置を示し、橋核では通常、吻側と尾側に受容体#13とリガンドを発現する細胞がそれぞれ位置するが、受容体#13ノックアウトマウスではリガンドを発現する細胞群が吻側にも配置していた。このことは、菱脳唇より腹側へと移動する橋核神経細胞の吻尾方向の配置にこれら分子の発現が関与する可能性を示しており、これら分子を皮質脊髄路起始細胞でノックダウンすると橋核への軸索側枝はそれぞれの結合相手の発現する橋核領域へと進入するというこれまでのデータをふまえると、その適切な配置によって、大脳皮質と橋核のトポグラフィックな軸索側枝の投射領域の調節が行われていると考えられる。本研究を通して、これまで不明であった側枝形成に関与する受容体及びそのリガンドを同定し、これらの分子の発現パターンが側枝の投射領域の調節に関与する事を明らかに出来たことは大変意義深い。大脳皮質からの主要な出力路である皮質脊髄路は主軸索より複数の神経核に軸索側枝を伸ばし、脳神経活動の協調性を可能としている。この側枝形成を制御する分子機構を明らかとするべく、我々は、これまでにスクリーニングで得た側枝形成に関与する候補受容体とそのリガンドについて解析を進めた。すると、それら分子が皮質と橋核それぞれで相補的に発現し、その発現パターンが軸索側枝の投射領域の調節に関与する事が明らかとなった。さらに、脳傷害時の代償機構を担う側枝形成に関しても共通の受容体が関与することを示した。このことは、側枝形成現象の共通分子基盤の解明や、神経機能回復への応用などを考える上で、大変意義深い。1.受容体候補分子のKOマウス作成及び、軸索側枝への影響を検証する我々がこれまでに行ったスクリーニングより側枝形成に影響を与える候補受容体を得ている。そこで、これら受容体遺伝子に関して、2受容体遺伝子のKOマウス、1受容体遺伝子のKOマウスの脳組織を国内外の研究施設から取り寄せた。また、3受容体遺伝子に関してはCRISPR/Cas9技術を利用して迅速なKOマウスの作成を行い、ゲノムシーケンスによってフレームシフトにより翻訳停止となること、若しくは翻訳開始ATGが欠失していることを確認した。さらに、皮質脊髄路側枝の変化をWTと比較するため、DiIトレーサーを大脳皮質運動野に入れ、皮質脊髄路をラベルした後、矢状断切片を観察した。その中で、KDによって側枝伸長促進効果の観察された受容体のKOマウスにおいて同様に側枝伸長が促進される傾向が見られた。現在他のKOマウスとともに定量解析を進めている。2.受容体候補分子およびリガンドの発現時期、細胞内局在・脳内分布の詳細な解析KD実験で皮質脊髄路への関与が示唆された受容体に対して、in situ hybridization法および、免疫組織化学法によりその脳内分布を調べた。特に、リガンドが既知の場合はリガンドの局在も同様に調べた。その結果、1.で述べたKDおよびKOマウスで側枝伸長促進効果の観察された受容体は大脳皮質領野特異的な発現様式を示し、その受容体に対するリガンドは橋核の特定領域に偏った発現パターンを示すことが分かった。このことより、皮質領野特異的な軸索側枝の刈り込みや橋核特定領域への軸索側枝の投射パターン制御にこの受容体とリガンドが関与している可能性が示唆された。
マット運動の再構築

研究目的は、中学校段階ですでに技能及び関心・意欲の差が大きいと言われるマット運動において、生徒がデジタルビデオやiPadなどのICT機器を積極的に活用することによって、マット運動に対する生徒の技能や意識の変化、ICT機器の効果などを調べ、指導方法の改善を行うことを目的とした。研究方法は、次の(1)(5)で行った。(1)個人技では、基本技については一斉指導を行い、条件を変えてレベルを細かく上げていく技について自らの課題として取り組ませる。技の見本についてはDVD映像を活用する。(2)24人での組み合わせ技を発表させる。(3)生徒には79人グループにデジタルビデオカメラとiPadを1台ずつ自由に使用させ、毎時間、技の分析および自らの課題を考えさせる。(4)学習カードを活用して技の達成度を毎時間、自己評価させる。(5)単元開始前に中学時の取組状況と意識を調べる「マット運動事前アンケート」、個人技終了時と組み合わせ技終了時に「技能アンケート」と「意欲、関心などの意識アンケート」の2種類のアンケートを実施する。研究成果として、ICT機器を用いて自らの技を分析して課題をもって取り組ませたことにより、中学時代と比較して、約8割の生徒がマット運動を好意的にとらえ、技能の向上を感じている。技能の向上については、基本的な技である前転や後転に技能向上を感じた生徒が多かった。これまでできていると感じても、客観的に自らの技を分析すると課題がみつかり、この課題を解決することで技能の向上を感じたという意見が多かった。また、難度の高い伸膝前転において約4分の1の生徒が技能向上を感じたことは、難度の高い技についても効果があっだと考えられている。ICT機器の活用は、技の理解度と技能向上に一定の効果はあった。しかし、理解度は深まったが技能向上へつながっていないと感じる生徒も多い。これらの生徒は、自らのイメージと実際の動きに違いを感じており、今後の指導課題と言える。
グローバル人材育成を目指した大学留学プログラム構築：韓国長期留学の質的観察から

世界のグローバル化に伴い,様々な目的で世界各地に留学する大学生が存在する。どのような過程を経てグローバルに活躍できる人材としての資質・態度・知識が備わっていくのかを観察することは,多文化・多言語社会で活躍が期待される人材育成の役割を担う大学教育にとって非常に重要である。本研究は,1年間の韓国留学を体験した学生らの異文化間のトラブル・誤解・摩擦の発生と解消の過程,自己の気づきの変容を質的に観察・分析し,留学の意義や学生の学びなどを実証的に研究することにより、グローバル人材の普遍的要素を解明することを目的としている。今後、複言語・複文化主義を取り入れた異文化コミュニケーション育成や大学グローバル人材育成プログラムの構築、ルーブリックの開発にも貢献する基礎研究としての意義があると考える。平成28年度の調査研究および発表内容は以下のとおりである。1)Web公開情報の収集による国内の長期留学制度・学びの評価に関する調査を実施した。韓国以外のプログラムについては現在も継続調査中である。2)近畿大学国際学部国際学科東アジア専攻韓国語コースに所属する学生を対象に、出発前アンケート調査と留学レポートの2種類のテキスを用いた定性的調査を行い、キーワードの推移および自己変容の分析の観察を行った。H28年度出発の留学1期生を対象のパイロットスタディの結果に、H29出発の留学2期生の帰国後アンケートとテキストデータ分析からの情報を追加し、NVivoおよびインタビューを用いた分析と考察を行った。3)調査,分析方法の再検討をし、留学3期生への出発前アンケートを実施した。4)異文化間教育学会での論文発表、国際理解教育学会、グローバル人材育成教育学会、国際韓国語教育学会で中間発表を行った。また、留学の学びと継続性をテーマに平成28年度グローバル人材育成教育学会関西支部大会を共催した。当初の計画どおり、韓国への長期留学生を対象に調査を行っている。ただし、データ量が膨大なため、データ整理・分析およびそれらを基にしたインタビューの調整・実施をスムーズに行うことが課題である。留学3期生への帰国後アンケートやインタビュー、留学4期生への出発前アンケートや留学レポートの収集など、調査を継続する。また、主に2期生・3期生を対象とし、帰国前・留学中・帰国後の学生の学びを分析し、今後のプログラム構築の基礎研究とする。留学中の学生へや現地の担当教員へのインタビューも行う予定である。中間成果報告は、国内外の学会発表および学会誌で行う予定である。共同研究者4名での学会参加を予定していたが、複数の各々の学会時に公務の関係で参加できないメンバーがいた。また東京で発表を予定していた学会の関西支部大会を共催することになったため、発表場所を関西に変更したことにより、旅費が予定より少額になったことなどが挙げられる。
西岸境界流による惑星波動の放射および海底斜面上の循環形成のメカニズム

黒潮続流に代表されるような海洋中のジェットから発生する惑星波が、大規模な循環や海底地形と相互作用する力学的なしくみについて、次のことが明らかとなった。すなわち、1点目に惑星波はジェットの幅を広げ、海洋内部の緩やかな流れにつなげる。2点目に海洋深層で赤道向きの渦位フラックスと再循環を発生させる。3点目に海山や海溝などの斜面上において、海底、海面の両方に捕捉された循環を駆動する。海洋の循環は、非常に弱い流れが存在し、循環全体の大部分の領域を占める内部領域と、強い流れが存在する西岸境界域の2つの特徴的な領域の循環に分けられる。黒潮やメキシコ湾流の続流域は、これらの西岸境界域から内部領域へ向かう流れが存在する場所にあたり、2つの領域を接続する遷移的な領域であり、その過程では渦や波動など大きな変動が発生し、散逸されている。しかしながら、その詳細な仕組みについては、これまで十分には理解されていない。本研究ではまずこの遷移領域において典型的に見られる波動と再循環に着目し、それらが内部領域、西岸境界域の2つを接続する際に果たす役割、その力学的なしくみについて、理想的な条件で数値実験を行うことによって調べた。実験結果に対する渦位収支の解析から波動は内部領域と西岸域の間の渦位の差を解消し、両方を接続する上で中心的な役割を果たすことが示された。さらに実験条件を変化させた所、(1)内部領域の流れの幅、渦位分布、(2)波動の強さ、(3)波動の発生源である表層再循環の強さ、の3者が互いに依存し合うことが分かり、このことは内部領域の性質が変化してもそれに追従して波動の強さが調節され、常に西岸領域との間が適切に接続される様な自己調節機構が存在することを示している。またこれらの波動が遠方の海嶺上で散逸される際に平均的な循環を形成する様子についても調べ、平均流による波動の反射、透過によって強流帯のコアが2つ出来るなど、先行研究で指摘されているよりも変化に富んだ構造を持つ流れが形成されることが分かった。海洋表層の全球的な循環である風成循環においては、風によって注入された渦位やエネルギーが西岸境界流域と続流域で散逸されている。この散逸過程では平均流、渦、惑星波動(ロスビー波)が複難に非線形相互作用を起こし、海底地形の影響を受けるが、その詳細なしくみはこれまで十分には明らかにされていない。本研究ではこれらの非線形過程におけるロスビー波と海底地形の役割を調べることを目的とする。前年度までの研究では、理想化された設定における数値実験を行うことによって、(1)ロスビー波は西岸境界、続流域の再循環中を移流される渦によって放射される、(2)ロスビー波は西岸境界、続流域と、内部領域に存在する流れを接続するために重要な役割を果たす、ことが示されて来た。本年度は、(1)の過程を理論的に検証するため、解析モデルを構築した。前年度までに得られた解は順圧モデルの場合に限られていたが、2層モデルに拡張された解析解を得ることによって数値実験との直接的な比較を可能にした。ロスビー波の伝播速度など主要な特徴は、数値実験結果と解析解でよく一致し、(1)で示されたロスビー波の放射のしくみが支持された。また数値実験のパラメータをより広範囲に変化させることで、(1)、(2)をさらに支持する結果を得た。以上の実験では海底が平坦であるのに対し、現実の黒潮続流は伊豆海嶺の影響を受け、定常的に蛇行する。この様な場合について数値実験を行った所、ロスビー波の放射のされ方の南北対称性が崩れ、続流流軸を横切って伝播する場合が存在する様に見えることが示された。この様な擾乱は最近の係留観測でも指摘されており、今後詳しい解析を行う。またロスビー波による渦位収束は蛇行を強化する傾向がある。西岸境界流の続流域では強いジェット状の流れが中規模渦や惑星波動による非線形作用によって弱められ、弱い内部領域の流れへと接続されている。前年度までの研究から続流域から放射される惑星波動の強さが内部領域の流れの分布に依存し、惑星波動がジェットと内部領域の流れの接続に寄与することを示唆された。しかしジェット中の不安定擾乱による寄与はないのか、惑星波動はジェットでなく内部領域の側の分布の違いにのみ関与するのかといった点は十分明らかでない。この点を確かめるため本年度はジェットの幅と最大流速を変化させる数値実験を行った。不安定擾乱のためにジェットの東部分ではポテンシャル渦度の南北勾配が小さくなり、内部領域の流れよりも小なくなる。惑星波動は不安定擾乱によって小さくなり過ぎたポテンシャル渦位の勾配を内部領域と同じ値まで強める。ジェットの流量を一定に保ったまま最大流速を小さくすると、ジェットの不安定が弱まることに対応してジェットの東部分でのポテンシャル渦度勾配の減少の仕方が弱まる。

このとき内部領域とのポテンシャル渦度勾配の差は縮まり、同時に続流から放射される惑星波動も弱まることが示された。このことは上流側のジェットの条件の違いに対しても不安定擾乱だけでなく惑星波動が整合的に変化することでジェットと内部領域がうまく接続されることを意味する。この系の擾乱成分のエネルギーのうちジェットの流軸近傍で粘性によって散逸される量と惑星波動によってジェットの外へ放射される量はほぼ等しい。これは地衡流乱流においてエネルギーが大きなスケールの運動へカスケードすることと矛盾しない。このことから続流域の循環の維持にジェット中の不安定擾乱だけでなく、惑星波動が寄与するのは自然なことである様に見える。前年度までに西岸境界流の続流ジェットから波が放射されることで表層に極向きの渦位フラックスが生じることが示されたが、深層では逆に赤道向きの渦位フラックスが生じ、そのしくみは未解明であった。そこで、表層にジェットの不安定擾乱を模した一定な振動数を持つ強制を与える数値実験を行った。強制の振幅が十分弱い場合には、三波共鳴により、振動数が外部強制の2倍のharmonicsの波が発生した。harmonicsに対する非線形強制は傾圧性が強く、深層では波を打ち消す方向に働くために、赤道向きの渦位フラックスが生じる。この特徴は強制が強くなっても定性的に変わらず、Rhines and Young (1982)で想定された乱流混合的過程は本質的でない。harmonicsにより4つのセルを持つ平均流が生じ、その向きは再循環と一致する。ジェットを与えた数値実験でも、高周波数の擾乱によって同様の赤道向き渦位フラックスが卓越する。次に、ジェットから放射された波動が海底斜面上に入射し平均循環を作るしくみを斜面の勾配の水平方向が一般的な場合について調べた。波の位相速度の等深線に沿った成分が浅い方を左手に見る場合には、地形波は斜面上に入射できない(Rhines 1970)のに対し、右手に見る場合は、入射した波が屈折によって強く海底に捕捉され散逸される場合と、捕捉されずに反射される場合の2つがあることが理論的に示された。地形上で波が散逸される場合は、浅い方を右手に見る平均流が形成され、平均流は等深線が東西方向であれば、比較的順圧的であるが、等深線が南北に傾くと海底捕捉が強まる。波動が地形上に入射できなかったり、反射される場合は、海面に弱く捕捉された平均流が浅い方を右手、左手交互に見る方向に生じる。これらの波と平均流の特徴は黒潮続流の北にある海膨で観測されたものとよく一致する。惑星波動が関与するのは内部領域の流れなのか、内部領域とジェットの差なのかという問題について答えを得るなど、西岸境界流の続流域の力学は奥深いものがあるが、それついての理解が一歩ずつ着実に進んでおり、概ね順調に進捗していると考える。上に述べた結果はJouranl of Phyisical Oceanographyに掲載されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。エネルギー収支解析によると擾乱の散逸には水平粘性項や海底摩擦項だけでなく鉛直粘性項が寄与していた。これは少し意外な結果であり、鉛直粘性係数を小さくした場合に不安定擾乱や惑星波動が強さや平均流との相互作用がどの様に変化するかは興味深く調べる価値がある。感星波動が海底地形上に形成する流れとそのエネルギー収支についても解析に必要な道具立てが揃ったので詳しい研究を進める。
表皮細胞デスモゾームの分子形態および棘融解発生機序の免疫電顕法を用いた解明

尋常性天疱瘡(PV)はデスモソームに存在するデスモグレイン3(Dsg3)に対する自己抗体により表皮細胞が棘融解をきたす自己免疫性水疱症である。Dsg3自己抗体が抗原に結合してから棘融解が生じるまでの水疱発症機序はいまだ明かではない。今回我々は、正常マウス、PVモデルマウス、Dsg3欠損マウスを用いて、近年開発された超低温免疫電顕法により、in vivoにおける抗原蛋白の分布・局在様式を電顕的に観察し、分子形態学的に棘融解発症機序を検討した。Dsg3欠損マウスでは、DPのみが正常マウスに比して約11nm細胞内側に偏位していた。これはデスモソームにおけるDsg3、DP間の相互作用の存在を示唆している。また、デスモソーム一つあたりの標識数を解析した結果プラコグロビン(PG)のみに有意な分子密度の減少を認め、それ以外の分子は異常を認めなかった。次にPVモデルマウスにおいて検討した。表皮基底細胞の側面ではデスモプラキン(DP)はデスモソームから離れ、ケラチン線維とともに細胞質内側へ大きくシフトしている像を観察された。また、表皮中層のデスモソームではDPのみが24nmと、大きく細胞内側に偏位していたが、1デスモソームあたりの分子密度は有意な変化を示すものを認めなかった。Dsg3-/-マウスではPGの数が減少していることがDPの変位につながると考えられたが、一方、PVモデルマウスではPGの数や位置の変化を伴わずにDPが大きく変位していることから、自己抗体のDsg3への結合のシグナルが、直接結合してない細胞内のDPに伝達され、細胞質内の変化を生じたことが示唆された。以上より、Dsg3-/-マウスとPVモデルマウスのデスモソームで生じている分子変化に差があることが示された。また、自己抗体結合後に細胞質内変化が起こることをin vivoで初めて証明することができた。1デスモグレイン3(Dsg3)欠損マウスにおけるデスモソーム構成蛋白の局在の検討Dsg3欠損マウスは尋常性天疱瘡(PV)類似の皮膚粘膜症状を示すことが知られているが、このマウスおよび正常マウスの皮膚および口腔粘膜を-190°Cの液体プロパンを用いて急速凍結固定、凍結置換し、免疫電顕ブロックを作成した。デスモソーム構成蛋白デスモグレイン1(Dsg1)、デスモグレイン3、デスモコリン1(Dsc1)、デスモコリン3(Dsc3)、デスモプラキン(DP)、プラコグロビン(PG)、プラコフィリン1(Pp1)に対する抗体を用いて、後包埋金コロイド免疫電顕法により、デスモソーム構成蛋白の局在の変化を詳細に定量的に解析した。その結果、Dsg3矢損マウスにおいてDPのみが正常マウスに比して約11nm細胞内側に偏位していた。そのほかの蛋白は局在に有意な変化を認めなかった。この結果は、平成16年3月に開催される日本皮膚科学会東京地方会(研究)及び5月に開催されるSociety for cutaneous ultrastructural research (Rome)にて発表する予定である。(抄録提出済み)2 PVモデルマウスにおけるデスモソーム構成蛋白の局在我々のグループは、継続的に抗Dsg3自己抗体を産生し、PV類似の皮膚、粘膜症状を呈するPVモデルマウスを作成した。

このマウス、および正常マウスの皮膚および口腔粘膜を包埋後免疫電顕法にて解析し、現在までに、デスモプラキンの局在を解析討した。PVモデルマウスの基底細胞の側面ではデスモプラキンはデスモソームから離れ、ケラチン線維とともに細胞質内側へ大きくシフトしている像を観察し、ほかのデータとともに論文を作成、受理されている(JID in press)。尋常性天疱瘡(PV)はデスモソームに存在するデスモグレイン3(Dsg3)に対する自己抗体により表皮細胞が棘融解をきたす自己免疫性水疱症である。本研究の目的は、正常マウス、PVモデルマウス、Dsg3ノックアウトマウスを用いて、超低温免疫電顕法により、in vivoにおけるすべてのデスモソーム構成蛋白の分布・局在様式を電顕的に観察し、分子形態学的に棘融解発症機序を解明することである。本年度は,Dsg3ノックアウトマウスのデスモソーム構成蛋白のデスモソームあたりの密度を解析するとともに、PVモデルマウスにおけるデスモソーム構成蛋白の分布、密度の変化を解析し、正常コントロールと比較検討した。その結果Dsg3_<-/->マウスは、プラコグロビン(PG)のみに有意な分子密度の減少を認めた。一方、PVモデルマウスでは、デスモプラキン(DP)のみが24nmと、大きく細胞内側に偏位していたが、1デスモソームあたりの分子密度は有意な変化を示すものを認めなかった。DsgはPGとはDM内で直接強く結合しているが、DPとはPGを介して間接的に結合しているとされている。Dsg3_<-/->マウスでは、昨年までにDPが細胞内にわずかに変位していることが明らかになつたが、Dsg3の欠損によりデスモソーム内に組み込まれるPGの数が減少していることが、DPを保持する力が減少させ、DPが変位したと考えられた。一方、PVモデルマウスではPGの数や位置の変化を伴わずにDPが大きく変位していることから、自己抗体のDsg3への結合のシグナルが、直接結合してない細胞内のDPに伝達されたことが示唆された。以上より、Dsg3_<-/->マウスとPVモデルマウスのデスモソームで生じている分子変化に差があることが初めて分子形態学的に示された。また、棘融解には細胞質内の変化は十分条件ではなく、Dsg3の機能的障害が重要であることが示唆された。
公衆衛生学的に有用な新しい癌体質診断法の開発

1)網膜芽細胞腫遺伝子(RB)プロモーター領域の最も重要な転写因子であるRBF-1の同定私達は以前、遺伝性網膜芽細胞腫家系においてRB遺伝子のSp1部位と思われる部位に点突然変異が存在することを見出した。しかしここにはSp1因子が結合したので、これをRBF-1と名づけた。ダイナビーズを用いてこの転写因子を精製したところ、興味深いことにアデノウイルスE4プロモーターの転写因子であるE4TF1と同一のものであった。このことより、E4TF1がRB遺伝子を活性化する重要な因子である可能性が出てきたので、RB遺伝子でなくE4TF1に突然変異があり失活することにより、RB遺伝子プロモーター並びにRB遺伝子の発現が低下して網膜芽細胞腫を始めとする癌家系になる可能性が示唆された。2)RB遺伝子プロモーター調節因子の検索RBプロモーターを調節する因子を見出すことは、RB遺伝子プロモーターが失活することにより網膜芽細胞腫の低質になっている人に対して癌体質改善への手がかりを与えることになる。そこで私達はマウス筋芽細胞が分化に伴いRBプロモーター活性が著明に増強することを見出したので、これよりプロモーター活性の増強機構を明らかにした。その結果、RBプロモーターのATF結合塩基配列に結合するある種のATFタンパクが未分化の時に抑制的に働き、分化することによりそのタンパクの結合がはずれるためにプロモーターが活性化されることを見出した。現在その抑制的に働くATFタンパクを同定中である。本年度は、代表的癌抑制遺伝子であるRB遺伝子プロモーターの不活性化機構として、過剰メチル化が重要な役割を果たしていることを証明しえた。即ち、RB遺伝子のどの領域にも突然変異がなくとも、プロモーター領域に過剰メチル化が存在することにより、プロモーター活性が著しく減少して、発癌に至るという新しい発癌の可能性が示されたことになる。具体的には、私達は以前、現実のRB腫瘍において、RB遺伝子の突然変異がなくプロモーター領域近傍に過剰メチル化のみが存在することを見出していた。したがって仮に、プロモーター領域の過剰メチル化のみでRB遺伝子が不活性化され発癌に至っているのであれば、実際にRB遺伝子のプロモーターが過剰メチル化により失活することを証明する必要があった。そこで私達は、独自に、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としたプラスミドにおいてRB遺伝子のプロモーターのみをメチル化させる方法を考え出した。それで、RB遺伝子のプロモーター領域のみをメチル化させてみると、コントロールに比して約6%にまでプロモーター活性が低下した。更に、私達が以前報告したRB遺伝子プロモーターを制御する中枢であるRBF-1(私達の見出した新しい転写因子)及びATF結合塩基配列が1個のメチル基によりそれぞれの転写因子に結合できなくなることも見出した。したがって、網膜芽細胞腫の診断、体質診断にプロモーター領域の過剰メチル化の検出が有用であることを示すことができた。この方法論は、他の癌抑制遺伝子においても同様に適用されることと考えられ今後より一般的な悪性腫瘍においても検討されるべきであろう。癌体質を診断するモデルとして、癌抑制遺伝子であるRB遺伝子のプロモーター領域の異常を検出することが有用であることを報告してきたが、本年度は更にRB遺伝子のプロモーター構造を解析した結果、サイレンサー部位を見出すことができた。私達が以前報告したように、RBF-1と名付けられた転写因子の結合する部位とそれに隣接するATF結合塩基配列に点突然変異が存在すると癌体質になることが知られている。今回、そのATF部位の下流に隣接しているE2F部位の作用を検討した。その結果、このE2F部位に点突然変異を入れ、E2Fタンパクが結合できなくなると、全体のRB遺伝子プロモーター活性が2-5倍に上昇することが明らかとなった。これはこのE2F部位が興味深いことにサイレンサーとして機能していることを示している。したがって、可能性として、仮にこの部位に点突然変異が存在する家系が存在した場合、逆に癌に罹患しにくい家系になるのかもしれないが、それは今後の研究を待たなくてはならない(このデータはOncogeneに印刷中)。また、網膜芽細胞腫の患者由来のDNAを更に検討した結果、日本の症例においても、一例腫瘍由来のDNAにRB遺伝子プロモーター領域の過剰メチル化が見られた。更に、肝臓癌由来のDNAを検討したところ、一例にRB遺伝子プロモーター領域の過剰メチル化が見出された。これにより、当初予想したようにRB遺伝子のプロモーター領域の異常は網膜芽細胞腫だけでなく他のより一般的な悪性腫瘍においても存在し、かつそれが発癌に関与している可能性が示唆された。

そこで私達はマウス筋芽細胞が分化に伴いRBプロモーター活性が著明に増強することを見出したので、これよりプロモーター活性の増強機構を明らかにした。その結果、RBプロモーターのATF結合塩基配列に結合するある種のATFタンパクが未分化の時に抑制的に働き、分化することによりそのタンパクの結合がはずれるためにプロモーターが活性化されることを見出した。現在その抑制的に働くATFタンパクを同定中である。
千島列島・アリューシャン列島付近潮汐混合の実態解明と北太平洋海洋・気候変動

淡青丸KT-08-7次研究航海(2008年4月23日5月7日)において、伝導度-水温-水深プロファイラ(CTD)、垂下式超音波流速計(LADCP)、および鉛直微細構造プロファイラ(乱流計)等を用い、房総半島沖合の親潮系低塩分水が貫入した直後の黒潮続流域において2000mまでのグリッド観測を実施した(安田一郎・伊藤幸彦)。この研究航海ではまた、鉛直方向に詳細な硝酸分布が取得できる硝酸塩連続プロファイラをレンタルして使用した。硝酸計データと乱流計データと組み合わせると硝酸の鉛直フラックスが算出でき、これにより本研究における栄養塩・生態系観測研究の基礎が構築されつつある。2009年に予定されている白鳳丸アリューシャン・ベーリング海観測を行うために、5/22-23にシンポジウムを開催し観測計画のとりまとめを行った。2006/2007ロシア船観測によって千島列島海域で得られた観測データの解析を進め、密度逆転からの乱流強度評価手法の開発(院生D1:八木雅宏)、千島列島付近での乱流による栄養塩鉛直輸送の評価(院生D1:金子)を行った。鉄分布観測データの検討(西岡純)、化学トレーサ観測データの解析(渡辺豊)を行った。海洋観測長期データを用いた解析(院生D3:長船哲史)により潮汐18.6年振動がベーリング海にも現れることを明らかにした千島列島付近の潮汐混合を変動させた大気・海洋・海氷結合モデルを開発し、エルニーニョ・南方振動(ENSO)を通じて気候にも影響を与えうることが明らかにされた(羽角・安田・建部)。
角化症モデルの作製と治療法の開発,皮膚特異的なレチノイン酸受容体欠損マウス

魚鱗癬、乾癬は、角化症および炎症性角化症の代表的皮膚疾患である。しかし現在まで、典型的な動物モデルは存在しない。更に、これらの治療には、ビタミンA誘導体が用いられているが、レチノイドの効果を正しく評価できる動物モデルは存在しない。本研究の目的は、マウス表皮に角化症のモデルを作製することにある。我々は、ドミナント.ネガティブの形質を呈する点突然変異を持つレチノイン酸アルファ受容体をK14プロモーターに連結し、皮膚表皮細胞に特異的に発現させることにより、他臓器の影響を全く遮断した、皮膚特異的レチノイン酸不応状態を呈する持つトランスジェニックマウス(以下モデルマウスと略す)の作製に成功した。この皮膚病変について、形態学的には肉眼的所見および組織所見、電顕による観察を行ない、また、皮膚の角化を中心に、皮膚成熟を胎生期皮膚の発達と比較する目的で分化マーカーを観察した。また本モデルで最も重要と考えられる皮膚の成熟化と分化に関しては、各々のマーカーであるケラチンを、精製ににより発現量を、特異抗体で染色することにより、その分布を観察した。モデルマウス皮膚の全ケラチンを尿素を用いた再重合法により精製し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分化マーカーであるケラチンの発現の変化を調べたところ、コントロールマウスにあってはケラチン1、5、10、14の発現が認められ、一方モデルマウスにあってはケラチン1、5、6、10、14、16の発現があり、これは尋常性乾癬の病態に近い。発現の調整は蛍光抗体法による発現の局在決定を通じて観察した結果、ケラチン1、10の発現が基底細胞より1層うえから始まっていることが明かとなり、これも尋常性乾癬の病態に近い。しかし、形態学的観察では皮膚はむしろ菲薄化しており、これらの所見は、現在まで知られている角化症、炎症性角化症と異なるものであった。魚鱗癬、乾癬は、角化症および炎症性角化症の代表的皮膚疾患であり、患者数は角化症の中で最も多く、かつ重要な病変である。角化症・炎症性角化症の研究には主として患者皮膚を用いた培養系の実験がおこなわれているが、これらの研究の典型的な動物モデルは存在しない。我々の研究目的はドミナント・メガテイブな形質を呈するレチノイン酸受容体を導入したトランスジェニックマウスを作製し、マウス表皮に角化症のモデルを作製することにある。本年度は、計画に基いて、ドミナントネガテイブの形質をもつアルファ型レチノイン酸レセプター(RAR)cDNAを作製し、これが内在性の全レチノイン酸レセプターすなわち、アルファ・ベータ・ガンマの三種のレチノイン酸レセプター全てに対して阻害的に働くことを確認した。これは、点突然変異型RARとレチノイン酸受容体応答配列を持つレポータープラスミドを細胞に遺伝子導入して、本RARが内在性RARの機能を阻害することを検定することにより証明した。この結果得られた点突然変異体RARに対して表皮細胞の中に本RARを発現させることを目的として臓器特異的プロモーターであるケラチン14プロモーターをつなぎ、本RARを表皮に特異的に発現させた。コントロール実験として、このケラチン14プロモーターにベータガラクトシダーゼをつなぎ表皮特異的発現を確認した。以上のように計画は全て達成され、その以降の計画も順調に準備されつつある。平成8年度の目的は以下のようであった。

すなわち、既に得られているドミナント.ネガティブの形質を呈する点突然変異を持つレチノイン酸アルファ受容体(RAR-アルファMと略す)を用いてトランスジェニックマウスを作製する。レチノイン酸受容体は生体の各臓器に発現しており、またレチノイン酸の過多や減少は胎児の発生に強い影響を及ぼすため、臓器特異的に発現するプロモーターを用いて臓器特異的にRAR-アルファMを発現させる。この目的で表皮細胞の基底膜にのみ発現するケラチン14プロモーターを使用する。またRAR-アルファMは、ドミナントネガティブの形質となるように作製する(垣塚)。同時に同じプロモーターにベータガラクトシターゼ遺伝子をつないでコントロールとする。これを用いてトランスジェニックマウスでベータ-ガラクトシダーゼの発現が皮膚のみに特異的であり、他の臓器では発現しないことを確認し(田中)RARアルファMのトランスジェニックマウスを作製する(須貝、米澤)。すなわち、K14プロモーター自体の効果により皮膚の変化を生じないことを確認するためにK14プロモーター_-ベータガラクトシターゼトランスジェニックマウスを、RARの過剰発現により皮膚の変化を生じないことを検証するためにK14プロモーター_-RARトランスジェニックマウスを、更に、RARと二量体を形成するRARの消耗により皮膚に変化を生じないことを調べるためにK14プロモーターサイロイドレセプタートランスジェニックマウスを作製し、これらの影響が全くないことを確認する。以上を目的として実験を行った結果、これらの目的はすべて達成されドミナント-ネガチィブな形質をもつマウスの作製に成功した。このマウスは肉眼的に明らかな皮膚変化を持つものであり、したがって計画どうり、これらの皮膚変化を平成9年度には詳細に検討する。魚鱗癬、乾癬は、角化症および炎症性角化症の代表的皮膚疾患である。しかし現在まで、典型的な動物モデルは存在しない。更に、角化症、炎症性角化症の治療には、ビタミンA誘導体(レチノイド)が用いられているが、レチノイドの効果を正しく評価できる動物モデルは存在しない。本研究の目的は、ドミナントネガティブの形質を呈するレチノイン酸受容体の遺伝子を表皮細胞のみで特異的に発現させ、マウス表皮に角化症のモデルを作製することにある。平成9年度は、これに先立つ2年間の成果であるところの、ドミナント.ネガティブの形質を呈する点突然変異を持つレチノイン酸アルファ受容体を持つトランスジェニックマウス(以下モデルマウスと略す)の皮膚病変について、病変解析を行なった。形態学的には肉眼的所見および組織所見、電顕による観察を行ない、特に皮膚の角化を中心にした、皮膚成熟を胎生期皮膚の発達と比較する目的で観察した。また本モデルで最も重要と考えられる皮膚の成熟化と分化に関しては、各々のマーカーであるケラチンを、精製により発現量を、特異抗体で染色することにより、その分布を観察した。モデルマウス皮膚の全ケラチンを尿素を用いた再重合法により精製し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分化マーカーであるケラチンの発現の変化を調べたところ、コントロールマウスにあってはケラチン1、5、10、14の発現が認められ、一方モデルマウスにあってはケラチン1、5、6、10、14、16の発現があり、これは尋常性乾癬の病態に近い。発現の調整は蛍光抗体法による発現の局在決定を通じて観察した結果、ケラチン1、10の発現が基底細胞より1層うえから始まっていることが明かとなり、これも尋常性乾癬の病態に近い。
新生児低酸素性虚血性脳症に対する脳低温療法におけるグリアに注目した新規脳保護療法

新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)に対して現在まで報告されている有効な治療法としては、低体温療法のみである。本研究ではHIEに対する低体温療法によるグリア機能制御による脳内の微小環境改善を視野に入れた検討を行った。培養アストロサイト、ミクログリアにおいて低酸素負荷を行い、これらの細胞を低温状態(32-34°C)にすることにより、iNOS、炎症性サイトカインの発現が抑制されることを明らかにした。さらに神経保護作用を有するEryhtropoieitnは低温状態により、高発現が持続することを明らかにした。本研究により、現在もなお予後不良疾患であるHIEの病因および治療法の開発に貢献できるものと考える。新生児低酸素性虚血脳症(HIE)は在胎36週以降の成熟児に発症し、新生児脳障害の主たる原因となる重篤な疾患である。近年、HIEに対する脳低温療法の有効性が報告されているが、その治療効果は十分ではないのが現状である。本研究ではHIEに対する脳低温療法による脳保護メカニズムの解明とさらなる治療成績の向上のための新規治療法の提案を目指す。特に、グリア機能制御による脳内の微小環境改善を視野にいれた脳低温療法を補完する新しい治療法の確立を目指す。培養アストロサイト、ミクログリアに低酸素負荷を行い、iNOS/Erythropoietinが誘導されることを明らかにした。またこれらの細胞を低温状態(34°C、72時間)にさらすと、Erythropietinの発現が遺伝子レベルでアストロサイトにおいて誘導された。またミクログリア、アストロサイトにおいて低温状態は遺伝子レベルで、iNOSの誘導が抑制された。今後は低温状態がアストロサイト、ミクログリアのErythropietin, iNOSのタンパクレベルでの発現に与える影響、シグナル、さらに脳保護作用のメカニズムに関しても検討していく予定である。HIEの病態ならびに脳低温療法による脳保護の詳細なメカニズムはいまだ不明なままである。また、これまでにグリアの機能に着目し、分子生物学的な手法を用いて検討した報告はほとんどない。当初の予定どおり、低酸素負荷を加えた培養アストロサイト、ミクログリアにおいてErythropoieitn、iNOSが誘導されることを明らかにした。さらにこれらの誘導は低温状態によりErythropoietinはさらに誘導、iNOSは抑制されることが明らかになった。新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)は在胎36週以降に発症し、新生児脳障害の主たる原因となる重篤な疾患である。現在まで報告されている有効な治療法としては、低体温療法のみである。しかしながらその治療効果は十分ではない。本研究ではHIEに対する低体温療法による脳保護メカニズムの解明と治療成績向上のための新規治療法の提案を目指す。特にグリア機能制御による脳内の微小環境改善を視野に入れた低体温療法を補完する新しい治療法の確立を目指す。培養アストロサイト、ミクログリアにおいて低酸素負荷を行い、iNOS/Erythopoietin、各種炎症性サイトカインが誘導されることを、遺伝子・タンパクレベルでの発現で確認した。さらにこれらの細胞を低温状態(32-34°C)にすることにより、iNOS、炎症性サイトカインの発現が抑制されることを明らかにした。今後はこれらの発現量の変化についてシグナルの解析、さらにニューロン、in vivoにおける検討を進めていく予定である。HIEの病態ならびに低体温療法における脳保護のメカニズムはいまだ不明である。またこれまでにグリアの機能に着目した基礎研究の報告はほとんどない。当初の仮説どおり、低酸素負荷により培養グリア細胞で各種のiNOS/Erhthropoietin/炎症性サイトカインが誘導されることを遺伝子・タンパクレベルで確認した。さらにこれらの発現は低温状態におくことで、発現が抑制されることを明らかにした。現在これらのマーカーの発現の変化について、そのメカニズム、シグナルについて検討中である。これらの検討終了後に研究成果の学会発表、論文発表を予定している。

新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)に対して現在まで報告されている有効な治療法としては、低体温療法のみである。本研究ではHIEに対する低体温療法によるグリア機能制御による脳内の微小環境改善を視野に入れた検討を行った。培養アストロサイト、ミクログリアにおいて低酸素負荷を行い、これらの細胞を低温状態(32-34°C)にすることにより、iNOS、炎症性サイトカインの発現が抑制されることを明らかにした。さらに神経保護作用を有するEryhtropoieitnは低温状態により、高発現が持続することを明らかにした。本研究により、現在もなお予後不良疾患であるHIEの病因および治療法の開発に貢献できるものと考える。低温状態が与える影響を培養細胞においてさらに検討する。さらにこれらの変化がニューロンに与える影響についても検討する予定である。これらの細胞レベルでの検討をもとに、血液脳関門モデル、モデルマウスにおいても低温状態が与える影響について明らかにしていく。低温状態が与える影響についてさらに検討する。低温状態により発現が抑制されるiNOS/Erhthropoietin/炎症性サイトカインのシグナルについて検討する。さらにこれらの変化がニューロンに与える影響について検討する。さらに細胞レベルでの検討をもとにin vivoモデル、血液脳関門モデルにおいても低温状態が与える影響について検討する。新生児学細胞培養による解析、遺伝子発現の解析が順調にいったため、当初予定よりも購入ラット、試薬購入数が少なかったため、次年度使用額が生じた。細胞培養による解析が順調にいったため、当初予定より購入ラット、試薬購入数が少なかったため、次年度使用額が発生した。本年度はタンパク量の解析やin vivoでの解析を行っていく予定であり、本研究計画の内容から、ラットの購入、細胞培養用の器具、培地類の購入、遺伝子やタンパク発現の解析に使用する分子生物学用の試薬の購入が多くなると考えており、次年度使用額はそれに補填していく予定である。本年度は培養ニューロンやin vivoでの解析を行っていく予定である。本年度の計画内容から、ラットの購入、試薬購入が多くなると考えており、次年度使用額はそれに補填していく予定である。
電気絶縁材料に及ぼす放射線照射効果ミクロダイナミクスの研究

直径10mmφ、厚さ0.05-0.5mmの高純度サファイア円板(京セラ製)の両面中央に金蒸着電極を取り付けた照射試料を作成した。この試料を中性子で照射しながらバイアス電圧と中性子誘起電流の関係を測定した。実験結果から、以下のことが分かった。[1]中性子照射開始直後に大きな過渡電流が流れ、照射停止後の誘起電流の減少には非常に遅い成分がある。また、再度の照射時の過渡電流は最初程大きくない。この結果は試料内での分極効果を含む電荷の蓄積の影響が顕れていると考えられる。[2]中性子誘起平衡電流は、一定バイアス電圧下では中性子フラックスに比例し、一定中性子フラックス下ではバイアス電圧と1次関数の関係にある。14MeV中性子誘起電流増加係数は、1×10^<-10>/Ω/m/Gy/Sであった。この結果は、中性子核反応によって試料内に生成された電荷キャリア(電子及び正孔)のドリフトが電界によって制御され、中性子誘起電流の主要因であることを意味していると考えられる。[3]OVバイアス電圧下においても正の中性子誘起電流が生じる。この結果は信号電極近傍の試料中に正電荷の蓄積があることを意味している。そして、中性子誘起電流の実測値は、サファイア内で発生する核反応電荷粒子による全電離量(飽和電流)の計算値の約1万分の1であった。この事は試料内で生成された電子及び正孔が直ぐに捕獲されるか再結合することを意味している。そして、信号電極に変位電流を誘起する実効的な電荷ドリフト長は数十nmと推定される。この値の妥当性は試料中のキャリア輸送の問題として更に詳しくチェックされる必要がある。中性子照射下での絶縁材料の電気的特性の変化を正確に評価する為には、キャリア電荷の正確な輸送モデルに基づいたポアソン方程式の数値計算解との比較考察が必要である。14MeV中性子源及び^<60>Cor線源を用いてセラミック電気絶縁材料の放射線誘起電気伝導について調べた。円板状アルミナ試料への印加電圧を変化させて,放射線照射中のAl_2O_3に流れる電流を測定した。また,放射線フラックスを時間的に変化させた場合のAl_2O_3中を流れる電流の応答についても調べた。14MeV中性子及び^<60>Cor線源照射下のセラミックス試料の電気伝導度は,中性子,γ線フラックスに依存したが,放射線誘起電気伝導度への放射線の線質の違いによる影響は小さい事が分かった。また,試料への印加電圧がOVにおいても試料中に電流が流れ,高線量率照射実験においては電流値の飽和傾向が見られた。この事から,試料内での電荷蓄積や空間電荷効果の影響が現れていると考えられる。放射線フラックスの時間的変化に対するセラミックス中を流れる電流の応答は非常に遅く,電離による生成電荷がセラミックス中を非常に遅い速度で移動している事が考えられる。セラミックス中の電離電子の挙動を基にした応答のシュミレーション計算との比較から,セラミックス中を流れる電流の応答が送れる要因として,トラップ欠陥による電子の捕獲・再放出現象が大きく関わっている事が分かった。電離,再結合,電子捕獲・再放出及び拡散という要素を基に放射線誘起電気伝導モデルを考えたが,セラミックスの放射線通気電気伝導の機構を正確に解明する為には,これらの個々の効果について,更に詳細に考察して行く必要がある。

直径10mmφ、厚さ0.05-0.5mmの高純度サファイア円板(京セラ製)の両面中央に金蒸着電極を取り付けた照射試料を作成した。この試料を中性子で照射しながらバイアス電圧と中性子誘起電流の関係を測定した。実験結果から、以下のことがわかった。[1]中性子照射開始直後に大きな過渡電流が流れ、照射停止後の誘起電流の減少には非常に遅い成分がある。また、再度の照射時の過渡電流は最初程大きくない。この結果は試料内での分極効果を含む電荷の蓄積の影響が顕れていると考えられる。[2]中性子誘起平衡電流は、一定バイアス電圧下では中性子フラックスに比例し、一定中性子フラックスではバイアス電圧と1次関数の関係にある。14MeV中性子誘起電流増加係数は、1×10^<-10>/Ω/m/Gy/sであった。この結果は、中性子核反応によって試料内に生成された電荷キャリア(電子及び正孔)のドリフトが電界によって制御され、中性子誘起電流の主要因であることを意味していると考えられる。[3]OVバイアス電圧下においても正の中性子誘起電流が生じる。この結果は信号電極近傍の試料中に正電荷の蓄積があることを意味している。そして、中性子誘起電流の実測値は、サファイア内で発生する核反応荷電粒子による全電離量(飽和電流)の計算値の約1万分の1であった。この事は、試料内で生成された電子及び正孔が直ぐに捕獲されるか再結合することを意味している。そして、信号電極に変位電流を誘起する実効的な電荷ドリフト長は数十nmと推定される。この値の妥当性は試料中のキャリア輸送の問題として更に詳しくチェックされる必要がある。中性子照射下での絶縁材料の電気的特性の変化を正確に評価する為には、キャリア電荷の正確な輸送モデルに基づいたポアソン方程式の数値計算解との比較考察が必要である。
細胞バンク登録株(ヒト)から分離したナノバクテリアの効率的培養法の開発とその利用

細胞バンクに純粋株として登録されている、ヒト由来急性骨髄性白血病細胞からナノバクテリアを分離した。分離したナノバクテリアの培養諸特性を解析し、最適な培地を設定した。最適培地を用いてナノバクテリアを模擬微小重力培養し、最適化した結果、ナノバクテリアを高濃度に培養することが可能となった。本法はナノバクテリアの迅速検出法としても活用可能であった。本研究で用いたナノバクテリアはナノバクテリア様結晶と異なる諸特性を示した。医学分野でナノバクテリアは各種疾患との関連が示唆され注目されているが、生物であるか無生物であるか確定されておらず、未解明な部分が多い。本研究では申請者が独自に見出した、各種細胞バンク登録株中に共存している数百nmのサイズを有するナノバクテリアを研究対象に、培養特性の解析、高濃度大量培養法の開発を試みた。ナノバクテリアを動物細胞用培地[RPMI 1640培地+10% FBS]で培養した結果、緩やかな増殖が確認され、継代培養が可能であった。SEMによりナノバクテリアは直径が数百nmの球桿菌状の形態を有する事、また、X線回折とFTIR分析によりNBPの表層はHydroxyapatiteを主成分としている事、が明らかとなった。様々な培地を使用し、NBPの培養を行った結果、昆虫細胞培養用のSchneider's培地を用いた場合、最もナノバクテリアの増殖が促進された。また、ナノバクテリアの増殖には培地成分と血清成分の両方が必須であることも示唆された。種々検討した結果、NBPの最適培地(Schneider's培地+10%ヒト血清+20%擬似体液)を設定した。最適培地を用いて細胞回転培養システムを使用し、最適培地でナノバクテリアの微小重力培養を行った結果、[RPMI1640培地+10% FBS]で静置培養した場合の約15倍の増殖量を示した。さらに、微小重力培養の過程で最適培地を用いて培地交換を行った結果、培養12日目のナノバクテリアの増殖量は[RPMI1640培地+10% FBS]で静置培養を行った場合の約40倍を示した。本研究で開発したナノバクテリアの効率的培養法は、今後、ナノバクテリアの諸特性の解析を行う上で重要性が高いと考えられる。医学分野でナノバクテリアは各種疾患との関連が示唆され注目されているが、生物であるか無生物(結晶)であるか確定されておらず、未解明な部分が多い。しかしながら近年、ナノバクテリアはタンパク質と無機物の相互作用により生成した結晶(NBC)であるという報告(1)がなされ、現在、結晶説が有力視されている。本研究では申請者が独自に見出した、細胞バンク登録株中に共存している数百nmのサイズを有するナノバクテリア(NBP)を研究対象に、NBCとの比較を含め、培養特性の解析と高濃度培養法の開発を試みた。既報(1)に従いNBCを作成した結果、NBPと類似した形態、成分を有していた。しかし、継代培養を繰り返すとNBPは単体で増殖したが、NBCは数十μmの集塊を形成した。NBCとNBPを種々比較した結果、(a)NBCにない生物構造がNBP内部で観察された、(b)血清等培地成分の違いによりNBPの増殖が促進されたが、NBCは増加量が変化しなかった、(c)模擬微小重力培養により、NBPは増殖が促進されたが、NBCの増加量は変化しなかった、(d)NBPとNBCで、抗生物質に対するMIC値が異なった、など両者は異なる性質を有しており、結晶説ではNBPを十分に説明できない事が示された。両者の特性の違いを活用することで、NBPとNBCが混合した状態で、個々の濃度の推算が可能となった。また、NBPの長期間保存法と迅速検出法を開発した。国内外のナノバクテリア研究で用いられている試料には、NBPとNBCが混在したものがあるのではないかと考え、NBPとNBCの混合培養を検討した結果、NBPの増殖が抑えられ、NBCが優先化して増加することが明らかとなった。本研究で得られた種々の知見は、今後、ナノバクテリアの諸特性の解析を行う上で重要性が高い。(1) PNAS, 105, 5549 (2008).
交雑個体が検出されたハナシノブの自生地3カ所における追跡調査

平成20年度は、雑種と思われる個体が検出された4カ所の自生地の内3カ所(1カ所は環境省九州地区自然保護事務所により調査済み)について全個体を対象にした追跡調査を行った。実験方法は、複葉2枚程度からCTAB法による核DNAの抽出を行い、その後RAPD分析およびITS領域によるPCR-RFLP分析を行った。供試材料は、高森町河原上玉来産152個体、高森町河原中大道産78個体、高森町野尻祭場産6個体、人工交配種6個体、北海道の園芸業者から購入した苗26個体(エゾハナシノブ14個体、カラフトハナシノブ4個体、クシロハナシノブ4個体、ヒダカハナシノブ4個体)の合計268個体である。実験の結果、RAPD分析では、高森町河原上玉来産で16個体、高森町河原中大道産で2個体、高森町野尻祭場産で1個体の雑種と思われる個体を検出することができた。次にPCR-RFLP分析では、セイヨウハナシノブにのみみられるDNAバンドは調査を行ったハナシノブからは1個体も検出されなかった。今回のRAPDプライマーによる雑種判定に用いたDNAバンドは、ハナシノブの種内変異を検出している可能性も考えられることから、日本大学と共同で新たにプライマーの開発を行った。その結果、エゾハナシノブ、カラフトハナシノブ、クシロハナシノブ、ヒダカハナシノブ、セイヨウハナシノブの5種に共通したDNAバンドを出現させるプライマー(26塩基)を開発することができた。この開発したプライマーは、RAPDプライマーと比較し、より的確に雑種個体の検出が期待できる。平成21年度は、このプライマーを用い再度ハナシノブの全自生地において調査を行いたいと考えている。※供試材料については、環境省九州地区自然保護事務所野生生物課および熊本県環境生活部自然保護課に採取許可を得ている。