hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子組換え酵母の生育能回復試験を用いた抗腫瘍性海洋天然物の探索と創製

有用物質探索で重要な点は、ハイスループットなin vitroの試験をいかにして細胞を用いた試験系での生理活性に結びつけるかという点である。吉田らが提唱している、遺伝子過剰発現により生育に異常をきたす酵母の生育を正常に戻すことを指標とする試験系は、ハイスループットな点と細胞に対して効果を示すことの両者を同時に満たす優れた試験系である。海産無脊椎動物抽出液をこの試験系で調べ、カイメンTheonellaswinhoeiからチアミンの生合成中間体を2種類得た。ついで、別種の未同定種カイメンから3種のステロイド配糖体を得た。本研究は、以下の6項目の実験を組み合わせて繰り返し実施することにより、海産無脊椎動物由来の化合物を母核とした抗腫瘍物質のリード化合物の創製を企図するものである。(1)組換え酵母の生育回復を指標とした、海産無脊椎動物抽出物のスクリーニング(2)スクリーニングにおける「ヒット」検体からの「活性物質」およびその類縁化合物の網羅的単離ならびに構造決定(天然物ライブラリーの作成)(3)活性物質のインビトロ酵素阻害試験ならびにがん細胞を用いた生物活性の評価による「有効物質」の選定、(4)有効物質を母核とした化合物ライブラリー(化学ライブラリー)の作成(5)天然物ライブラリーと化学ライブラリーの生物活性評価による構造活性相関の解明(6)構造活性相関情報に基づくリード化合物の創出。吉田らは、約5000種類の分裂酵母遺伝子を1つずつ導入した組み換え株を作成し、当該遺伝子の発現に伴う生育能について観察を行った。大多数の遺伝子は過剰発現しても酵母の生育に影響を及ぼさなかったが,169種類の遺伝子を過剰発現させると酵母の生育が阻害された。さらに.これらの遣伝子産物の機能阻害物質が存在すると過剰発現による生育停止が解消されることが明らかにされたため、生育の回復を指標とすることによって遺伝子産物の機能を阻害する化合物の探索ができることが示された。この169種類の遺伝子にはヒトのがん化関連遺伝子のホモ口グが多数含まれているため、これらの遺伝子産物の阻害剤は抗がん剤のリード化合物となることが期待される。1997年から2005年にかけて採集された659種類の海洋無脊椎動物抽出物ライブラリーを用いて、5種の組み換え酵母を用いて生育回復試験を行った。288サンプルに活性が認められたbそのうち187サンプルがすべての株に共通して生育回復活性を示した。導入された遺伝子はnmtlの制限下にあるため、このプロモーターに作用して転写を調節する作用を持つ化合物が多<の海洋無脊椎動物に含まれることがわかっか。また、多くのサンプルにおいて生育阻止が観察されたため、野生株の酵母を用いて抗真菌活性の評価を行ったところ、62サンプルが野生株の生育を阻害することがわかった。スクリーニングで強い抗真菌活性が認められた鹿児島県奄美大島産未同定種海綿S97-0131こ含まれる沃件成分の蛍離,横浩決宇券試みか。吉田らが確立した、約5000種類の分裂酵母遺伝子を1つずつ導入した組み換え酵母株において、遺伝子の過剰発現において生育が阻害された169株の遺伝子の機能を調べたところ、ヒトのがん化関連遺伝子のホモログが多数含まれていた。そこで、これらからその阻害によって抗がん剤のリード化合物となることが期待される遺伝子が導入された株5種を選抜した。2006年から2008年にかけて採集された海洋無脊椎動物抽出物ライブラリーを用いて、これら5種の組み換え酵母に対する生育回復試験を行った。多数のサンプルに活性が認められたが、そのうち大多数のサンプルがすべての株に共通して生育回復活性を示した。導入された遺伝子はnmt1の制限下にあるため、このプロモーターに作用して転写を調節する作用を持つ化合物が多くの海洋無脊椎動物に含まれることが、前年度に続き顕在化した。なお、多くのサンプルにおいて酵母に対する生育の阻害が観察された。そこで、生育回復に加え、生育阻害物質の検索も並行して実施した。前年度のスクリーニングで強い生育阻害活性が認められた鹿児島県奄美大島産未同定種カイメンS97-013に含まれる活性成分の単離、構造決定を進めた。すなわち、カイメンをエタノールで抽出し、抽出物をクロロホルムと水で二層分配に付した。クロロホルム層をさらに90%メタノールとヘキサンで二層分配を行い、含水アルコール層をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーに付して、2種類の活性物質を単離した。それらの構造解析を進めている。

そこで、これらからその阻害によって抗がん剤のリード化合物となることが期待される遺伝子が導入された株5種を選抜した。本年度は前年度に引き続き、2009年に採集された海洋無脊椎動物抽出物ライブラリーを用いて、これら5種の組み換え酵母に対する生育回復試験を行った。多数のサンプルに活性が認められたが、そのうち大多数のサンプルがすべての株に共通して生育回復活性を示した。導入された遺伝子はnmt1の制限下にあるため、このプロモーターに作用して転写を調節する作用を持つ化合物が多くの海洋無脊椎動物に含まれることが、わかっている。抽出液に生育回復活性が観察されたカイメン。そこで、生育回復に加え、生育阻害物質の検索も並行して実施することとした。前年度までのスクリーニングで強い生育阻害活性が認められた鹿児島県奄美大島産未同定種カイメンS97-013から2種類の活性物質を単離した。それらの構造解析を核磁気共鳴や質量分析などの機器分析を用いて行った。ひとつめの化合物は分子式がC34H56N2で、二重結合を4つ含み、2つ存在する窒素原子はいずれも互いに結合したテトラヒドロピリジン環中にあり、それぞれが3つのメチレン炭素と結合していた。4つの二重結合は2つの環をつなぐアルキル鎖中に認められた。2つめの化合物は1つめの化合物とより1つのアルキル鎖の長さが短く二重結合も2つだけ存在した。現在、立体配置を検討している。前年度までの研究により、カイメンなどの海洋生物には組換え酵母の生育回復活性を示すものが多数あることがわかった。しかし、導入された遺伝子が異なる5つの株を用いて、並行して実験を行うと、全ての株の生育を回復されるものがほとんどすべての活性検体について認められた。一般に、カイメンには多種多様な共生微生物が含まれるが、そのような微生物がチアミンおよびその生合成前駆体を生産していて、そのような化合物が本アッセイ系を撹乱していることが推察された。そこで、特定の株に対してのみ活性を占める検体を選抜して活性成分の探索を行うことが必須であることが判明した。しかし、そのような試料は大変稀なため、生育阻害物質についても探索を行ってきた。このような背景の下、本年度はゴン曽根産未同定種カイメンに含まれる生育阻害物質の探索を行った。まず、カイメンをメタノールで抽出し、抽出物をクロロホルムと水で二層分配に付した。水層をさらにブタノールで抽出し、ブタノール層を逆相カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーに付して、4種類の活性物質を単離した。それらの構造解析を行ったところ、2置換インドール、2置換ベンゼン環に加え多数のアミド基由来のNHが観察された。詳細に2次元NMRデータを解析したところ、カイメンから見いだされてミクロスクレロダーミン類とよく似ていることが判明した。現在、立体化学を含めた構造解析を進めている。真核生物の細胞の、染色体の末端には単純な反復配列からなるテロメアが存在する。細胞分裂を繰り返すごとにテロメアは短くなり、一定の長さに達すると細胞は老化を迎え、それ以上細胞分裂を行うことができなくなる。
グラフィックスプロセッサを用いた磁気回転不安定性の非線形シミュレーション

銀河などの降着円盤において,観測される物質の降着率が古典的な理論では説明できないほど速いという問題があった.1991年に提案された磁気回転不安定性は,磁場の影響を考慮することで電磁流体的な不安定性を引き起こして乱流を発生させるという点で画期的であった.しかし電磁流体的な解析では局所熱平衡を仮定しており,低衝突の極限でやはり観測に合わないという指摘がある.本研究ではこの問題を解決するため,局所熱平衡を仮定しない運動論による理論・数値シミュレーション研究に取り組んだ.数値計算には近年計算能力進歩の著しいグラフィックスプロッセッサを用いることとし,数理モデルの開発も同時に行った.グラフィックスプロセッサ(GPU)には、グラフィックスカード内のグローバルメモリに加え、コンスタントメモリ、テクスチャメモリ、またプロセッサ上のコア間で共有できる共有メモリなど、メモリに階層構造がある。これまでの研究から、グローバルメモリを用いるだけでも数十倍程度の高速化が可能であることがわかっているが、メモリの階層性を考慮に入れ、更なる高速化の可能性を探った。これまでに得られたFFTや積分計算の性能には満足しているので、今回は衝突項などに適用を検討している差分法を対象とし、高速化には、コアから近くアクセス速度の速い共有メモリをできるだけ活用することを指針とした。各コアで時間発展計算を担当するグリッドよりも多めにグローバルメモリから関数値を共有メモリにコピーし、共有メモリ内で10数10回程度の時間発展を行う。アクセス速度の遅いグローバルメモリへのアクセスを、毎時間ステップから数10回に一度へと減らすことで、高速化が実現できると考えたわけである。またCUDA Visual Profilerを用いてコアレッシング、バンクコンフリクト、ダイバージェント分岐などの遅延要素を一つずつ解消するような地道な作業を行った。1次元問題への適用は期待通りに働き、すべての計算をグローバルメモリ上で行ったときと比べて2倍程度の高速化に成功した。しかし多次元問題では効率が落ちて数%程度の高速化にとどまった。本研究の予備実験として、磁化プラズマにおける2次元静電乱流の運動論的な解析を行った。2次元配位では2つの無衝突保存量が存在するが、それらが互いに逆方向にスケール間を移動する、双カスケードが起こる。自由減衰乱流の大規模数値シミュレーションを行ったところ、これらの量は時間について代数的に減衰するが、これは2つの量のカスケードによってうまく説明できることを示し、論文にまとめた。運動論コードでは、粒子の速度分布関数を速度空間について積分することから、密度や電流などの場の量が求まるため、速度空間積分に対応する総和計算を繰り返し行う必要がある。この総和計算は、多数の数から一つの数を導き出すという、原理的に並列化が困難な計算であり、並列計算においてもよく取り上げられる操作である。この計算について、グラフィックスプロセッサに適したアルゴリズムを検討し、実装した。NVIDIAが開発したグラフィックスプロセッサ用のプログラミング言語CUDAは、それだけでは複数マシンにまたがる並列計算をサポートしない。したがって、この目的に合致した、Message Passing Interface (MPI)などのマシン間の通信を利用するには、MPIに対応した他の言語との混在プログラミングが求められる。本研究では、並列プログラミングにはc++を使用し、CUDAとの混在プログラミングが可能であることを実証した。また、磁気回転不安定性で用いられる剪断的境界条件を、擬スペクトル法で実現するアルゴリズムを考案し、実装した。大雑把に言えば、Kelvin卿が19世紀に用いた、剪断流の系に乗った座標系で非線形計算を行い、引き伸ばしが系の長さに達したところで離散的な座標変換をする、というものである。磁気回転不安定性の元となる、剪断流のある平衡について考察を行った。銀河などの降着円盤は、ケプラー回転(回転角速度の逆数が半径の3/2乗に比例)することで中心天体の重力とつり合い、定常的に回っていると考えられる。そういった力学的平衡の流体的な表現は古くから知られており、Navier-Stokes方程式の定常解となっているが、運動論による記述を用いる場合、Vlasov方程式の定常解としてケプラー回転する平衡を見つけるのは容易ではない。一般的な楕円軌道を含む運動論平衡を作ることは困難であるが、構成粒子がほぼ円軌道を取ると仮定して、近似的にケプラー回転を示す解析解を求めることに成功した。さらに時間発展を記述するVlasov方程式を、上で述べた仮定を用いて簡約化した。運動論方程式を大域的にシミュレーションするには、グラフィックスプロセッサ(GPU)を用いたとしても現在のコンピュータでは性能が足りないため、何らかの仮定をおく必要がある。本研究では、粒子軌道が円軌道から大きく外れないと仮定し、降着円盤の一部を切り取ることとした。平衡軌道のまわりを回転しながら、差動回転によって変形する局所的なデカルト座標を考え、その座標系でのVlasov方程式を導出した。電場や磁場についても、相対性理論の小速度極限としてのGalilei変換性を満たすよう変換することで、理論的に整合するものが導けた。開発中の数値コードについて、プロファイリングツールnvprofを用いて解析をおこなった。グラフィックスボードではメモリの割当と開放にCPUよりも時間がかかることがあり、従来のコードのボトルネックとなっていることがわかった。メモリの割当を最適化することで、約6倍の高速化が実現できた。これらの研究成果をまとめ、米国物理学会でポスター発表を行った。本研究は、グラフィックスプロセッサを用いた数値シミュレーションを行うという情報科学的側面と、銀河の膠着円盤についての解析を行うという物理学的な側面の2つにおいて、運動論に基づいたモデルを用いるという新しい試みを行うものである。

これまで、情報科学的な側面と物理学的な側面の両方について少しずつ進展があった。ところが昨年度米国物理学会で行った成果発表において、カリフォルニア工科大のBellan教授からモデルの妥当性について質問を受けた。本研究では、従来の電磁流体的モデルに基づく解析で用いられているように、粒子がケプラー回転(回転角速度の逆数が半径の3/2乗に比例)する、という仮定をおいていた。この流体的な力学平衡を運動論に拡張し、膠着円盤の構成粒子がほぼ円軌道を取ると仮定してVlasov方程式の定常解を求めたわけである。これに対しBellan氏の主張は、重力と電磁力の相互作用下における荷電粒子の運動はケプラー運動から大きく外れるため、「ほぼ円軌道」の粒子集団を仮定することは、対象を限定しすぎることになるのではないか、というものである。本年度はこの疑問に答えるために物理学的側面を見直し、Bellan氏から紹介頂いた文献も参照して、新たなモデルによる検討を行った。特殊相対性理論を用いた簡易モデルに基づいて粒子軌道の分類を行った結果、Bellan氏の評価以上に多様な粒子軌道の可能性があることがわかった。現在はこの結果を論文にまとめるため、さらに詳細なモデルを用いて解析を進めているところである。銀河などの降着円盤において,観測される物質の降着率が古典的な理論では説明できないほど速いという問題があった.1991年に提案された磁気回転不安定性は,磁場の影響を考慮することで電磁流体的な不安定性を引き起こして乱流を発生させるという点で画期的であった.しかし電磁流体的な解析では局所熱平衡を仮定しており,低衝突の極限でやはり観測に合わないという指摘がある.本研究ではこの問題を解決するため,局所熱平衡を仮定しない運動論による理論・数値シミュレーション研究に取り組んだ.数値計算には近年計算能力進歩の著しいグラフィックスプロッセッサを用いることとし,数理モデルの開発も同時に行った.当初の計画よりも問題が難しいことが分かった。様々な物理的モデリングについてはようやく決着したので、数値コードの開発に取り組んでいるところである。プラズマ物理現在速度空間の離散化手法について検討しているところである。これが終わり次第数値コードを完成させ、早急にシミュレーションを始められるようにしたい。差分法による偏微分方程式の計算が効率よく高速化できていないため。研究計画には、離散化手法、衝突作用素の決定、境界条件の実装を初年度の計画として挙げていたが、衝突作用素についての検討が終わっていない。それは、研究実績の項に記した総和計算についての検討を行ったからである。研究立案時には、そのような検討が必要なことに気づかなかった。それ以外は比較的順調に進んでいる。
椎間板におけるplasmid vecterを用いたin vivoRNA干渉と応用

SDラット尾椎椎間板を用いた。培養髄核細胞を用いた基礎研究は終了しているので、基本的にin vivo研究を中心に行った。麻酔下にラットの尾椎椎間板を展開し、直視下にplasmid遺伝子とマイクロバブルを混合したものを椎間板内に注入し、直ちに外部より超音波を照射した。定量的実験として、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を同時に椎間板内に導入し、ホタルルシフェラーゼの遺伝子発現抑制のみを目的としたsiRNAをコードするplasmid遺伝子を導入した。経時的に椎間板組織を回収し、組織内のシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。ウミシイタケルシフェラーゼを内因性コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ発現が特異的にどれだけブロックされているかを両者の比を用いて統計学的に検討した(n=7)。Negativecontro1として、siRNAを導入しないものと、RNA干渉は引き起こさないが同様の遺伝子内容(配列は異なる)を含むscramble siRNAをコードするplasmidを用いた。結果として、少なくとも2週間まで、in vivoでのRNAiが観察された。今後さらに長期間の調査を予定している。椎間板内で内因性に発現しているとされる種々の遺伝子抑制を同様の手技を用いて検討した。まずは我々が正常椎間板に発現しているとして世界に先駆けて報告したFas ligandの発現抑制を試みた。基礎実験として、ラットのFas ligand(FasL)発現を抑制するためにデザインされたsiRNAを用いて、in vitroで培養髄核細胞にこれを導入し、後日FasL発現が抑制されているかどうかをウエスターンブロッティングならびに定量PCR法にて確認した。このsiRNAをplasmidに組み込み、plasmidから産生されたsiRNAでも同様にin vitroでFasL発現が抑制できることを確認した。さらに前述の超音波コントラスト法を用いて、ラット尾椎椎間板に対するin vivoでの遺伝子導入を行った。現時点では有意な内因性遺伝子発現のin vivoでの抑制は観察されておらず、条件を変更するなど原因調査中である。(1)外因性Reporter遺伝子(in vivo)を用いた研究SDラット尾椎椎間板を用いた。基礎実験として、培養髄核細胞を用いてsiRNAとsiRNAをコードするplasmid(Vector based siRNA)をリポフェクション法にて遺伝子導入し、遺伝子発現の抑制効果期間を調査した。siRNAと比較して、Vector based siRNAにおいては、有意に長期間の遺伝子発現の抑制効果が得られた。上記の結果をもとに、SDラット尾椎椎間板を用いたin vivo研究を行った。麻酔下にラットの尾椎椎間板を展開し、直視下にplasmid遺伝子とマイクロバブルを混合したものを椎間板内に注入し、直ちに外部より超音波を照射して遺伝子導入を行った(超音波コントラスト法)。定量的実験として、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼのreporter plasmidを同時に椎間板内に導入し、ホタルルシフェラーゼの発現抑制のみを標的としたsiRNAをコードするplasmidを同時導入した。Negative controlとして、siRNAを導入しないものと、RNA干渉は引き起こさないが同様の遺伝子内容(配列は異なる)を含むscramble siRNAをコードするplasmidを用いた。

遺伝子導入後2週間までの結果では約80%の特異的なホタルルシフェラーゼの発現抑制が観察された。発現抑制効果期間については現在調査中である。これらの成果は、日本整形外科学会基礎および国際腰痛学会にて報告した。(1)外因性Reporter遺伝子(in vivo)を用いた研究SDラット尾椎椎間板を用いた。麻酔下にラットの尾椎椎間板を展開し、直視下にplasmid遺伝子とマイクロバブルを混合したものを椎間板内に注入し、直ちに外部より超音波を照射した。定量的実験として、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を同時に椎間板内に導入し、ホタルルシフェラーゼの遺伝子発現抑制のみを目的としたsiRNAをコードするplasmid遺伝子を導入した。経時的に椎間板組織を回収し、組織内のシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。ウミシイタケルシフェラーゼを内因性コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ発現が特異的にどれだけブロックされているかを両者の比を用いて統計学的に検討した(n=7)。Negative controlとして、siRNAを導入しないものと、RNA干渉は引き起こさないが同様の遺伝子内容(配列は異なる)を含むscramble siRNAをコードするplasmidを用いた。結果として、少なくとも2週間まで、in vivoでのRNAiが観察された。椎間板内で内因性に発現しているとされる種々の遺伝子抑制を同様の手技を用いて検討した。まずは我々が正常椎間板に発現しているとして世界に先駆けて報告したFas ligandの発現抑制を試みた。基礎実験として、ラットのFas ligand(FasL)発現を抑制するためにデザインされたsiRNAを用いて、in vitroで培養髄核細胞にこれを導入し、後日FasL発現が抑制されているかどうかをWestern Blottingならびに定量PCR法にて確認した。このsiRNAをplasmidに組み込み、plasmidから産生されたsiRNAでも同様にin vitroでFasL発現が抑制できることを確認した。
DNA複製フォークの修復機構におけるMUS81とRecQの機能の解明

日常生活の中にはDNA複製を阻害する多くの要因が存在し、それに対処するためにDNA複製の修復機構が存在する。本研究はDNA複製の修復機構のメカニズムを解明することを目標として研究を行った。我々は、MUS81-EME1ヌクレアーゼが中断した複製フォークを切断することで2重鎖切断を導入することと、その機能が相同組換えタンパク質(RAD51やRAD54)誘導することでDNA複製の修復が起きていることを明らかにしたが、それに関わる新しい因子としてFBH1を発見し、その機能解析を行った。我々の解析から、FBH1はRAD51の機能を制御することでDNA複製の修復機構に貢献することが明らかになった。平成25年度は、ファンコーニ貧血症患者由来の細胞を用いた解析を行った。MUS81やRecQを中心としたDNA複製フォーク修復機構の活性に関して遺伝子変異細胞を用いて検証した。MUS81の活性に関しては、染色体切断活性の検出を中心とした解析を行った。その他の関連因子(RecQなど)に関しては、免疫蛍光染色法による細胞内局在等の解析を行った。これらの解析を組合わせて、ファンコーニ貧血症の原因遺伝子産物が、DNA複製フォーク修復に関して、どのように貢献しているか検証している。細胞レベルでの知見をより深く理解するために、分子レベル(精製タンパク質レベル)での検証も行った。ファンコーニ貧血症の原因遺伝子の1つであるFANCD2タンパク質を精製して、FANCD2タンパク質が他のDNA修復関連酵素を活性化するか、精製タンパク質を用いて検証した。また、DNA複製の修復に関与するFBH1タンパク質について、デンマークのIan Hicksonのグループとの共同研究で、その生化学的機能を明らかにすることが出来たので、彼らとの共著論文として報告した。また、ダメージを受けたDNA複製フォークの修復に関わる新規の遺伝子を同定するために、染色体不安定性を示す遺伝子疾患を有するヒト患者由来の細胞や、候補遺伝子を人工的に破壊した遺伝子組換えマウスES細胞を入手することに成功した。現在、DNA複製阻害剤を投与してDNA複製フォークにダメージを与えた後、どのような表現型を示すか解析している段階である。DNAダメージにより阻害されたDNA複製を修復するメカニズムを理解することを目標として研究を行っており、MUS81-EME1構造特異的エンドヌクレアーゼとRecQヘリカーゼファミリーの関与について検証を行っている。平成26年度は、関連酵素を精製してその活性の測定を試みた。これまでのところ、候補としてあげていたFANCD2が直接的にMUS81-EME1の活性化に関与している可能性がは低いという結果になっているため、MUS81-EME1の活性化メカニズムを解明するまでに、もう少し時間が必要である。一方、RAD51のユビキチン化がこの修復経路の活性化に必要であることを新規に発見した。この事実は研究計画を作成した際には予想しなかった成果である。今後も、タンパク質レベルでDNA複製の修復機構の解明を行っていく予定である。一方、RecQファミリー遺伝子の機能が正常に作用しないと、早老症や高発癌といった症状を示す遺伝病を引き起こす。この遺伝子ファミリーの産物は、相同組換えを介したDNA複製の修復に関与する可能性が示唆されており、そのような症状を示すヒト遺伝病の患者由来の細胞の原因遺伝子を探索することで、新規のDNA修復因子を発見できる可能性が考えられる。そこで、まず、ウェルナー症候群様の症状を示す患者由来の細胞の責任遺伝子の探索を行い、その解析から既知のDNA修復に関与する遺伝子の変異を発見した。残念ながら、これらはすでにDNA複製の修復に関与していることが知られており、新規性はない。しかし、まだ、変異を同定できていない疾患由来細胞が多数あり、今後も解析を続ける。DNAダメージにより中断したDNA複製フォークの再開始メカニズムを解明することを目標として研究を行っており、特にMUS81-EME1構造特異的エンドヌクレアーゼとRecQヘリカーゼファミリーのDNA複製再開始反応に関わる役割を解明することを目標として研究を行った。今年度の解析で、MUS81-EME1の活性化に関わる因子として以前から関与が指摘されていたDNAヘリカーゼやDNAトランスロケースを中心として、そのメカニズムの解明に関する研究を実施した。関連するタンパク質をバキュロウイルス-昆虫細胞系にて組換えタンパク質を過剰発現させ、そのタンパク質を精製して活性の測定を行った。その結果、幾つかの候補を発見した。現在は、再現性を含め、詳細な検証を行っている。一方、早老症患者からの新規遺伝子の単離に関しては、多くの患者由来の細胞から見つかった因子は、BLMやWRM遺伝子変異であったが、1つ新規の候補が見つかった。まだ、その候補遺伝子が早老症や染色体不安定性に関与するか解明していないが、今後はその遺伝子産物の機能解明を目指したい。MUS81-EME1の活性化に関する生化学的研究がやや計画より遅れている。

FBH1タンパク質を介したRAD51のユビキチン化がDNA複製の修復に関与していることを発見したことで、MUS81の活性化メカニズムは当初想定していたものと異なる可能性が生じたため、作業仮説を見直したためである。この点を考慮して、今後も慎重に研究を進めていき、来年度には論文として発表したい。一方、MUS81やRecQとは異なる新規のDNA複製修復因子を同定するという目標に対して、FBH1を介した修復経路を発見することに成功したので、研究計画書に示す最終目標の1つを平成26年度内に達成することに成功した。この部分に関しては前向きに評価をしてもいいと思っている。一方、ヒト遺伝病の患者由来の細胞から新規のDNA複製の修復因子を発見するという目標に関して、2つの遺伝子の同定に成功した。1つはMUS81と非常に近い機能を持つ酵素であり、その酵素の精製も既に終了した。今後は、その活性評価を行う予定である。今後の計画としては、疾患遺伝子の特定とその遺伝子産物の生化学的機能解析を行って、その解析結果を基に論文として発表できるようにする予定である。以上の点から、MUS81-EME1の生化学的解析が遅れていることがマイナス要素はあるが、新規の因子を発見できたプラス要素もあることから、概ね順調に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生物学まず、遅れているMUS81-EME1の生化学的解析を終了させる。すでに関連酵素の精製は終わっており、あとは活性を測定するだけであるが、当初想定していたメカニズムと異なる可能性を見出したので、現在、慎重に検証を行っている。平成27年度内には終了できる見込みなので、まず、その解析を終了させる。さらに、これをサポートする細胞生物学的な検証を行い、細胞生物学と生化学を組み合わせた論文として仕上げる予定である。また、さらに多くの因子を発見するために、中断したDNA複製フォークの構造であるY型構造やX型構造の合成オリゴヌクレオチドを作成して、ヒト細胞抽出液から、これらの構造に特異的に結合するタンパク質を同定し、そのタンパク質がDNA複製の修復に関与しているか検証するという点を新しく追加し、検証したい。一方、ヒト遺伝病患者由来の細胞の解析からは、これまでにウェルナー症候様の細胞から2種類、他の疾患から1種類の遺伝子の同定に成功している。まず、これらの性質を細胞生物学的に解析し、報告したい。さらに、変異が未同定の患者由来細胞に関して解析を進め、新規のDNA修復関連遺伝子を発見したい。平成25年度は、まずファンコーニ貧血症患者由来の細胞を用いて、その原因遺伝子産物がDNA修復にどのように関与するか明らかにすることを目標としていたので、その部分に関してはおおむね順調に研究が進んでいる。また、その研究から、当初想定していなかった新規の因子を数種類発見したことから、それらの機能に関しても解析を行うことにした。
ベクトル場の分岐とそれに伴うカオスの発生の研究

本研究ではベクトル場の分岐によるカオスの発生の研究について以下のような成果が得られた.(1)前年度からの研究を引き継いで,ベクトル場の退化特異性からのLorenz型のカオス的アトラクタの発生の研究に一応の完成をみた.これはF. Dumortier, H. Okaとの共著論文として学術雑誌Ergodic Theory and Dynamical Systemsに掲載された.orbit-flipと呼ばれる余次元2のホモクリック軌道の倍分岐が無限回引き続いて起こるような大域的分岐現象を,ある種の区分線型ベクトル場を数学的・数値的に調べることにより見出した.これは周期軌道の周期倍分岐に関するFeigenbaum現象と類似のものであり,カオスに至る新しいシナリオと考えられる.しかし周期倍分岐の場合と異なり,無限回のホモクリニック倍分岐の集積に関するスケール則は,対応する平衡点の固有値に強く依存している.またベクトル場における分岐を数学的に理解するために1次元写像に還元し,その解析も行った.この結果はM. Komuro, H. Okaとの共著論文として学術雑誌International Journal of Bifurcations and Chaosに掲載が決定している.(3)上で述べたホモクリニック倍分岐の集積は完全に大域的な分岐であるためその数学的解析は容易ではないが,状況を余次元3のより退化したホモクリニック軌道の分岐として捉え直すことにより,その少なくともある部分は解析しやすくなると期待される.このような考えに基づいてV. Naudotと共にある種の余次元3のホモクリニック軌道の分岐を解析し,ホモクリニック倍分岐を起こすような余次元2のホモクリニック軌道が余次元3の退化したホモクリニック軌道から無限個分岐することを示した.このことは無限回のホモクリニック倍分岐の集積を直接示したものではないが,それを強く示唆した結果であるといえる.この結果についての論文は学術雑誌Journal of Dynamics and Differential Equationsに投稿中である.本研究ではベクトル場の分岐によるカオスの発生の研究について以下のような成果が得られた.(1)前年度からの研究を引き継いで,ベクトル場の退化特異性からのLorenz型のカオス的アトラクタの発生の研究に一応の完成をみた.これはF. Dumortier, H. Okaとの共著論文として学術雑誌Ergodic Theory and Dynamical Systemsに掲載された.orbit-flipと呼ばれる余次元2のホモクリック軌道の倍分岐が無限回引き続いて起こるような大域的分岐現象を,ある種の区分線型ベクトル場を数学的・数値的に調べることにより見出した.これは周期軌道の周期倍分岐に関するFeigenbaum現象と類似のものであり,カオスに至る新しいシナリオと考えられる.しかし周期倍分岐の場合と異なり,無限回のホモクリニック倍分岐の集積に関するスケール則は,対応する平衡点の固有値に強く依存している.またベクトル場における分岐を数学的に理解するために1次元写像に還元し,その解析も行った.この結果はM. Komuro, H. Okaとの共著論文として学術雑誌International Journal of Bifurcations and Chaosに掲載が決定している.(3)上で述べたホモクリニック倍分岐の集積は完全に大域的な分岐であるためその数学的解析は容易ではないが,状況を余次元3のより退化したホモクリニック軌道の分岐として捉え直すことにより,その少なくともある部分は解析しやすくなると期待される.このような考えに基づいてV. Naudotと共にある種の余次元3のホモクリニック軌道の分岐を解析し,ホモクリニック倍分岐を起こすような余次元2のホモクリニック軌道が余次元3の退化したホモクリニック軌道から無限個分岐することを示した.このことは無限回のホモクリニック倍分岐の集積を直接示したものではないが,それを強く示唆した結果であるといえる.この結果についての論文は学術雑誌Journal of Dynamics and Differential Equationsに投稿中である.
グルタミン酸トランスポーター機能異常によるてんかん発症機序の解析

てんかん発作は、焦点性発作(部分発作)と全般性発作に大別され、各々の発作発現機構は異なると考えられている。焦点性発作の発現機序には、興奮性および抑制性神経系のバランス異常が重要な役割を果たしている。グルタミン酸トランスポーターは、哺乳類中枢神経系において主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸を細胞外から取り除き、興奮性および抑制性神経系のバランス維持に重要な役割を果たしている。本研究では、脳に存在する4種類のグルタミン酸トランスポーター(GLT1,GLAST,EAAC1,EAAT4)欠損マウスを用い、各サブタイプのてんかん発作発生における役割を解析した。GLT1欠損マウスは、致死性の自発てんかん発作により、12週齢までに約80%が死亡してしまう。てんかんの発作パターンはNMDAを皮下注した時に観察される発作と類似しており、突然ケージの中を走り回り反弓緊張様姿勢をとり、パタッと死んでしまう。GLAST欠損マウスは、GLT1欠損マウスと違い、自発てんかん発作は認められなかった。しかし、GLAST欠損マウスに焦点性発作の二次性全般化発作の実験モデルである扁桃核キンドリングを適応し解析した結果、GLASTがてんかん焦点の形成には関与していないが、発作の二次性全般化には重要であることがわかった。さらに、GLAST欠損マウスではPTZ誘発性てんかんに対する感受性が亢進しており、GLASTの機能異常は、自発性てんかん発作を起こすことはないが、一次性および二次性の全般性発作に対する感受性を亢進させることが明らかになった。EAAC1,EAAT4欠損マウスでは、自発性てんかん発作・PTZ誘発性てんかんに対する感受性の亢進は、認められなかった。以上の解析から、グリア細胞に存在するGLT1,GLASTがてんかん発作の発現、部分発作の二次性全般化に重要な役割を果たしていることがわかった。研究成果ダリア型グルタミン酸トランスポーターGLTl,GLASTを欠損したマウスを作成し、その生理学的・病態生理学的役割を解析した。GLTl(大脳・海馬のグリア細胞に多量に存在するタイプ)欠損マウスは生後3週齢頃から致死性のてんかん発作を示し、12週齢頃までに80%が死亡した。てんかん発作の行動パターンは、NMDAを皮下注した時に起きる発作パターンと類似しており、突然すごい勢いで走り回り反弓緊張様姿勢をとり死亡する。GLTl欠損マウスではシナプス間隙でのグルタミン酸のクリアランスが障害されており、NMDA受容体による興奮性シナプス後電流(EPSC)の成分が増大していた。これらが、GLTl欠損マウスで見られるてんかん発作の原因の一部だと考えられる。また、ペンチレンテトラゾールにより誘発されるてんかん発作の閾値が減少していた。GLAST(小脳のバーグマングリアに大量に存在するタイプ)欠損マウスでは、登状線維のプルキンエ細胞多重支配による軽度の運動障害と視細胞-双極細胞間シナプス伝達障害による視覚障害が認められた。しかし、GLTl欠損マウスで観察されるような自発性のてんかん発作は観察されなかった。GLAST欠損マウスでもペンチレンテトラゾールにより誘発されるてんかん発作の閾値が減少していた。また、カイニン酸注入によりてんかん発作を誘発させるとGLASTの転写が増強されることを見つけた。以上の結果は、重篤なてんかん発作の原因の一つとしてGLTlの機能異常が、軽度なてんかん発作の原因の一つとしてGLASTの機能異常が考えられることを示している。今年度はてんかん発作におけるグリア型グルタミン酸トランスポーターGLASTの役割を中心に解析した。

そこで我々は、GLAST欠損マウスの実験てんかんモデルに対する感受性を調べた。焦点性発作の二次性全般化発作の実験モデルとして、扁桃核キンドリング、全般性発作の実験モデルとして、PTZ誘発性てんかんモデルを用いた。扁桃核キンドリングは、マウス脳の扁桃核に、慢性深部電極を通して微弱な電気刺激を加えて後発射を反復して誘発することによって形成される。初期には、刺激脳部位に特異的な部分発作のみが出現するが、刺激の反復につれて安定した二次性全般化発作が出現する。キンドリングモデルを作成する時の最初の電気刺激の後発射閾値・後発射持続時間およびキンドリングが完成するまでに必要な電気刺激の回数は、欠損マウスと野生型で差はなかった。また、二次性全般化発作出現時の後発射持続時間・潜時も、野生型と差はなかった。しかし、二次性全般化発作の持続時間が、欠損マウスで優位に延長していた。これらの結果は、GLASTがてんかん焦点の形成には関与していないが、発作の二次性全般化に重要な役割を果たしていることを示している。さらに、GLAST欠損マウスではPTZ誘発性てんかんに対する感受性が亢進しており、PTZ注入により起こるてんかんの重症度が悪化し、発作発生までの潜時が短くなっていた。以上の結果から、GLASTの機能異常は、自発性てんかん発作を起こすことはないが、一次性および二次性の全般性発作に対する感受性を亢進させる。今年度は、てんかん発作におけるグリア型グルタミン酸トランスポーターGLT1、神経型グルタミン酸トランスポーターEAAT4の役割を中心に解析した。1)GLT1欠損マウス、致死性の自発てんかん発作により、12週齢までに約80%が死亡してしまう。てんかんの発作パターンはNMDAを皮下注した時に観察される発作と類似しており、突然ケージの中を走り回り反弓緊張様姿勢をとり、パタッと死んでしまう。この致死性てんかん発作の発生機序を解析するため、海馬スライス標本を用いて、グルタミン酸シナプス伝達を電気生理学的に調べた。海馬のCA1錐体細胞で記録されるシェーファー側枝による興奮性シナプス後電流(EPSC)には、AMPA受容体を介するEPSCとNMDA受容体を介するEPSCの2種類がある。各々の成分の時間経過を欠損マウスで調べたところ、野生型と差はなかった。また、EPSCのNMDA受容体を介する成分とAMPA受容体を介する成分の振幅の比を調べると、野生型に比べ欠損マウスではNMDA受容体を介する成分が増大していた。さらにGLT1欠損マウスでは、静止時細胞外グルタミン酸濃度が上昇しており、長期抑制は正常であるが、長期増強が起こりにくくなっていることがわかった。以上のことから、GLT1欠損マウス海馬のグルタミン酸作動性シナプスにおいて、EPSCのカイネティクスに変化はないが、シナプス間隙からのグルタミン酸除去能が低下しており、静止時細胞外グルタミン酸濃度が上昇し、EPSCのNMDA成分が増大・長期増強の誘導阻害が起こっていることがわかった。これらのシナプス伝達異常が、どのように致死性・自発性てんかん発作
発電機能を有する液晶流体軸受けの開発

液晶を利用した発電可能な軸受けの開発のための基礎研究として,ネマティック液晶の二重円筒間せん断流れの実験及び数値解析を行った.本研究では,内円筒が回転することによる液晶流動によって誘起される内外円筒間の巨視的分極の計測に成功した.また,実験および数値解析結果より,流動中の液晶分子配向分布に線状の不規則な組織が現れるため,内外円筒間に誘起される分極値が不規則となることを明らかにした.さらに,内円筒の回転速度が大きいほど線状組織の空間密度が大きくなる.従来の研究成果において,液晶を流動させることにより液晶分子の配向場に歪を発生させ,液晶材料に巨視的な分極を発生させることが可能であることを見出した.本研究では,流動条件による液晶分極値の制御方法の最適化と液晶発電デバイスのプロトタイプの作成を通して,これまでにない全く新しい液晶デバイスを世に送り出すことを目的とする.液晶発電デバイスの最終形態として,発電機能を付与した液晶流体軸受けの開発を計画しており,昨今のエネルギー事情も鑑みて,実現の暁には広範囲な用途が期待できる.本研究計画全体を通して,液晶発電システムの実用化にターゲットを絞って研究を行う.具体的には,回転軸の軸受けに液晶材料を用いた潤滑と発電を同時もしくは切り換えて行えるようなデバイスの開発を最終目的とする.その第一段階として,平成24年度はまず,2重円筒間液晶せん断流れのシミュレータの開発およびデータの収集を行った.得られた結果より,2重円筒間の液晶圧電効果の時間および空間スケールの解明を行い,実験装置の設計指針を得た.その後,2重円筒間液晶せん断流れ実験装置の設計および流路部分の試作を行った.平成25年度は,上述の実験装置全体を完成させ,2重円筒の内筒を回転させることによって液晶にせん断流れを与えた.さらに,液晶が流動しているときの内外円筒間の電圧を測定することによって,流動による液晶に生じる巨視的分極の実測に成功した.液晶を利用した発電可能な軸受けの開発のための基礎研究として,ネマティック液晶の二重円筒間せん断流れの実験及び数値解析を行った.本研究では,内円筒が回転することによる液晶流動によって誘起される内外円筒間の巨視的分極の計測に成功した.また,実験および数値解析結果より,流動中の液晶分子配向分布に線状の不規則な組織が現れるため,内外円筒間に誘起される分極値が不規則となることを明らかにした.さらに,内円筒の回転速度が大きいほど線状組織の空間密度が大きくなる.従来の研究成果において,液晶を流動させることにより液晶分子の配向場に歪を発生させ,液晶材料に巨視的な分極を発生させることが可能であることを見出した.本研究では,流動条件による液晶分極値の制御方法の最適化と液晶発電デバイスのプロトタイプの作成を通して,これまでにない全く新しい液晶デバイスを世に送り出すことを目的とする.液晶発電デバイスの最終形態として,発電機能を付与した液晶流体軸受けの開発を計画しており,昨今のエネルギー事情も鑑みて,実現の暁には広範囲な用途が期待できる.本研究計画全体を通して,液晶発電システムの実用化にターゲットを絞って研究を行う.具体的には,回転軸の軸受けに液晶材料を用いた潤滑と発電を同時もしくは切り換えて行えるようなデバイスの開発を最終目的とする.その第一段階として,平成24年度はまず,2重円筒間液晶せん断流れのシミュレータの開発およびデータの収集を行った.得られた結果より,2重円筒間の液晶圧電効果の時間および空間スケールの解明を行い,実験装置の設計指針を得た.その後,2重円筒間液晶せん断流れ実験装置の設計および流路部分の試作を行った.この実験装置を用いて,平成25年度以降の研究を行う.従来の研究成果において,液晶を流動させることにより液晶分子の配向場に歪を発生させ,液晶材料に巨視的な分極を発生させることが可能であることを見出した.本研究では,流動条件による液晶分極値の制御方法の最適化と液晶発電デバイスのプロトタイプの作成を通して,これまでにない全く新しい液晶デバイスを世に送り出すことを目的とする.液晶発電デバイスの最終形態として,発電機能を付与した液晶流体軸受けの開発を計画しており,昨今のエネルギー事情も鑑みて,実現の暁には広範囲な用途が期待できる.本研究計画全体を通して,液晶発電システムの実用化にターゲットを絞って研究を行う.具体的には,回転軸の軸受けに液晶材料を用いた潤滑と発電を同時もしくは切り換えて行えるようなデバイスの開発を最終目的とする.その第一段階として,平成24年度はまず,2重円筒間液晶せん断流れのシミュレータの開発およびデータの収集を行った.得られた結果より,2重円筒間の液晶圧電効果の時間および空間スケールの解明を行い,実験装置の設計指針を得た.その後,2重円筒間液晶せん断流れ実験装置の設計および流路部分の試作を行った.平成25年度は,上述の実験装置全体を完成させ,2重円筒の内筒を回転させることによって液晶にせん断流れを与えた.さらに,液晶が流動しているときの内外円筒間の電圧を測定することによって,流動による液晶に生じる巨視的分極の実測に成功した.平成26年度は,前年の実験をさらに発展させ,実際の軸受けを想定し,軸の回転速度に対する分極電圧の精密測定を行い,約40mVの最大電圧が得られることを明らかにした.さらに,軸の回転速度が0.2rpmで最大電圧が得られるという液晶発電デバイス特性を明らかにした.

流体工学初年度はLeslie-Ericksen理論を用いた2重円筒間液晶せん断流れのシミュレータの開発を行い,液晶材料の物性値,2重円筒形状(円筒曲率および円筒間隔),せん断速度および円筒壁面における液晶分子の配向処理強度をパラメータとして,平行平板間せん断流れによる巨視的分極についての数値シミュレーションを行った.また,シミュレーション結果を基にして,実験装置および液晶材料の仕様の設計および2重円筒間液晶せん断流動発生装置の試作を行った.試作した2重円筒間液晶せん断流動発生装置を用いて,液晶流動実験及び巨視的分極値の計測を行ってみたところ,円筒を回転させるのに用いたモータや円筒の保持に用いたベアリングの摩擦等により,電気的ノイズが発生してしまい,本来の液晶による分極値が計測できないことが明らかとなった.そこで,本年度は,実験装置のノイズ対策を徹底して行うとともに,実験データからノイズを差し引けるように,実験装置の改良を行うことから始めた.すなわち,液晶を充填した2重円筒と空の2重円筒の同時計測を行い,電圧の差分を求めることで,液晶が発生する巨視的分極値の測定に成功した.しかし,実験装置の改良に時間を費やしてしまったため,液晶材料の違いによる発電特性および潤滑特性の解明には至らなかった.当初の計画通り,Leslie-Ericksen理論を用いた2重円筒間液晶せん断流れのシミュレータの開発を行い,液晶材料の物性値,2重円筒形状(円筒曲率および円筒間隔),せん断速度および円筒壁面における液晶分子の配向処理強度をパラメータとして,平行平板間せん断流れによる巨視的分極についての数値シミュレーションを行った.また,シミュレータには,GPU(Graphics Processing Unit)を用いた並列計算プログラムを用い,演算に要する時間の大幅な軽減に成功した.また,シミュレーション結果を基にして,実験装置および液晶材料の仕様の設計および2重円筒間液晶せん断流動発生装置の試作を行った.試作した2重円筒間液晶せん断流動発生装置を用いて,液晶流動実験及び巨視的分極値の計測を行ってみたところ,円筒を回転させるのに用いたモータや円筒の保持に用いたベアリングの摩擦等により,電気的ノイズが発生してしまい,本来の液晶による分極値が計測できないことが明らかとなった.25年度の成果により,2重円筒間液晶流動装置が完成し,実際に巨視的分極値の測定に成功した.しかし,これまでに2種類の液晶材料についてのみの実験しか行えていない.そこで,液晶材料の違いが巨視的分極値の関係に及ぼす影響を明らかにする.この実験結果と初年度に開発したシミュレータの計算結果を総合して液晶材料の発電特性および潤滑特性を最適にする利用条件(軸受け形状,流動条件,温度条件,液晶材料の物性)の同定を行う.その後,発電機能を有する液晶流体軸受けの設計および試作を行い,その性能評価を行う予定である.24年度の研究成果より,実験装置における電気的ノイズの問題が明らかとなったため,25年度は実験装置のノイズ対策から行う.具体的には,円筒を駆動するためのモータをファラデーケージで遮蔽すること考えているが,場合によっては,装置全体の見直しも視野に入れる必要がある.装置の完成後は,当初の計画通り,先ずは2重円筒間液晶せん断流れデータ収集を行う.
ラマン分光法によるＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病凝集タンパク質の定量的測定技術の開発

1.ラマン分光法を用いた振動スペクトル測定装置の構築(i).レーザー光源安定性の向上:本研究では、レーザーラマン分光顕微鏡の光源として、ECDL(external cavity diode laser)モジュールを自作し、レーザー発振を安定化させるために必要な定電流ドライバおよびレーザーダイオード温度コントローラを自作した。レーザーダイオード(LD)の温度を一定に保つことで、ラマンスペクトル測定の際の測定基準となる光源波長を固定することが可能である。今年度は温度安定化のためのPID制御機構を達成するマイコンプログラムの改良を進めており、±0.3°CであったLDの温度変動を±0.12°C程度まで安定化できるようになった。(ii).レーザーラマン分光顕微鏡の製作:可視光用の冷却CMOSを用いた昨年度までの検出系では、微量な生体サンプル・薄い病理切片の観測には測定感度が十分でないことが判明し、近赤外用の冷却CCDを新たに導入し、市販のレーザーラマン分光顕微鏡とほぼ同等のS/N比での測定が可能となりつつある。2.組織中での振動スペクトル測定技術の開発:ヒト剖検脳中での老人斑の振動スペクトル取得のためには、非染色試料で振動スペクトル画像取得後、免疫染色を行い老人斑を同定し、老人斑のある画素での振動スペクトルを同定する。振動スペクトル測定と免疫染色画像の撮影の間に、免疫染色操作が入るため、二つの測定を同じタイミングで連続して行うことはできない。この解決のためには、先に振動スペクトル測定した部位と同じ標本上の場所を、免疫染色後に定位するための位置あわせ技術が必要になる。本研究では、明視野画像から自動で検出した細胞の輪郭を免疫染色前後で比較し、互いにsuperimposeすることで、免疫染色後にはじめて確認できる老人斑の位置を、振動スペクトル画像上で特定する画像処理プログラムを製作した。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.指紋領域振動スペクトル測定系の開発:自作の自発ラマン散乱顕微鏡を製作した.488nmの連続波レーザーを対物レンズで試料に集光し,試料からの反射光からdichroic mirrorとlong pass filterを用いて光源波長を除去したのちに,分光器で散乱光のスペクトルを観測する.試料は自動XYステージの上に載せ,ラスタースキャンによる画像取得ができるようにした.488nm光源波長を用いた測定系のスペクトルはまだS/N比が悪く,測定感度を上げるために,光源レーザーのパワーを上げる改造や,フィルターの特性を最適化する作業を行っている.2.凝集タンパク質の振動スペクトル測定とデータベースの構築:in vitroでアミロイドβ42ペプチド(Aβ42)をincubationすることによりアミロイドβ凝集体を生成する系を新たに立ち上げた.このin vitroで生成したアミロイドβ凝集体について自発ラマン顕微分光装置を用いた振動スペクトル測定を行った.その結果,アミロイドβ凝集体が特徴的なスペクトル波形によって二種類に分類できることや,凝集体内の特定部位にのみ局在する分子振動の存在を発見した.これはアミロイドβ凝集体内部の化学結合組成に空間的な不均質性が存在することを示しており,従来,概念的に一通りの存在として扱われてきたタンパク質凝集体が,実際には複数の状態の間を遷移するダイナミックな存在である可能性を示唆している.ここで測定した振動スペクトルに認められるラマンシフトは,理論的にはアミロイドβタンパク質の分子内の化学結合に一対一対応するはずである.測定したラマンシフトに対応する化学結合および分子振動を推定するには,量子化学計算を用いた振動解析を行う必要がある.そこで,市販の量子化学計算パッケージであるGaussianを組み込んだラマンスペクトルの理論予測ソフトウェアをPython言語およびC言語を用いて自作した.1.振動スペクトル測定装置の構築:分光装置の光源として、新たに785nmのECDL(external cavity diode laser)モジュールを自作した。また、レーザー発振を安定化させるために必要な定電流ドライバおよび温度コントローラを自作した。製作したECDL光源を顕微鏡に組み込み、レーザーラマン分光顕微鏡を製作した。光源から出た連続波レーザーを対物レンズでサンプルに集光した後、フィルターで光源波長をカット、長波長側のラマン散乱光のみを冷却CMOS付分光器に導き、ラマンスペクトルを測定する。2.アルツハイマー病剖検脳の振動スペクトル測定系の構築:アルツハイマー病剖検脳の凍結切片を抗アミロイドβマウスモノクローナル抗体で免疫染色し、染色性を認めた部位(老人斑)での振動スペクトル測定系を構築した。in vitroのAβ凝集体で特徴的だった1449cm-1, 1656cm-1のピークは剖検脳中の老人斑では目立たなかった。抗Aβ抗体で染色性を認める老人斑と、染色性を認めない脳組織のスペクトルの比較からは、1473cm-1のピーク(点線矢印)が老人斑に特徴的な可能性が考えられた。3.組織中での振動スペクトル測定技術の開発:測定した免疫染色試料上の老人斑の振動スペクトルは、in vitroのAβ凝集体のスペクトルと異なる。この原因として、免疫染色後の試料の自家蛍光が、相対的に弱いラマン散乱光のスペクトル構造の観測を困難にしている可能性が考えられた。この可能性を排除するためには、非染色試料の振動スペクトル測定後に免疫染色を行い、老人斑のある画素でのスペクトルを確認する必要がある。現在、染色操作前後に標本上の同じ場所を定位するための位置あわせの画像処理プログラムを製作している。