hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カイコ繭色遺伝子を利用した選択的脂質輸送機構の分子基盤の解明

体液からベータカロテンを絹糸腺細胞へ移行させるF遺伝子がCD36ファミリーに属する膜タンパク質SCRB15をコードすることを示した。SCRB15はルテインを絹糸腺細胞へ移行させるC遺伝子がコードする膜タンパク質Cameo2の相同分子でもあった。これらの分子が輸送脂質の特異性を生み出している機構を追究することは、病原体の感染成立においても重要であるCD36ファミリーが支配する選択的脂質輸送機構の解明に向けた知見を生み出すであろう。本研究は、鱗翅目昆虫のカイコ体内において、血液から絹糸産生細胞内へ脂溶性カロテノイド色素ルテインを選択的に輸送するC遺伝子と、ベータカロテンを選択的に輸送するF遺伝子の機能を培養細胞で再構成し、その再構成系を用いたキメラ遺伝子の解析等を行うことで、細胞のカロテノイド取込みの選択性が生まれる分子機構を明らかにすることを目標としている。C遺伝子は病原体の感染成立に関与することが知られているCD36遺伝子群に属する膜タンパク質Cameo2をコードすることが明らかとなっている。F遺伝子も同様の膜タンパク質をコードすると予想されていた。F遺伝子と予想された膜タンパク質遺伝子のゲノム配列上の近傍にパラログが4つ見出されたので、それらのパラログについて、F遺伝子の野生型個体と変異体で配列と発現量を解析した。その結果、計5個の遺伝子のうち3個の遺伝子の発育段階を追った発現量変化がベータカロテンの取り込みの度合いと正の相関を示した。また、その3個の遺伝子のうち1個の遺伝子については変異体のゲノム配列に大きな挿入が起きていることを見出した。この1個の遺伝子とCameo2について、培養細胞で強制発現させるための遺伝子導入ベクターの構築を行った。また、培養細胞で機能再構成を行うための実験条件の検討を行った。機能再構成のために共発現が必要となることが予想されるカロテノイド輸送関連因子について、遺伝子配列の詳細を解析し、それらを培養細胞で発現させるための遺伝子導入ベクターの構築を行った。本研究は、鱗翅目昆虫のカイコ体内において、血液(体液)から絹糸産生細胞内へ脂溶性カロテノイド色素ルテインを選択的に輸送するC遺伝子と、ベータカロテンを選択的に輸送するF遺伝子の機能を培養細胞で再構成し、その再構成系を用いたキメラ遺伝子の解析等を行うことで、細胞のカロテノイド取込みの選択性が生まれる分子機構を明らかにすることを目標としている。F遺伝子も同様の膜タンパク質をコードすると予想されている。CD36遺伝子群は哺乳類においてもカロテノイドの輸送に関与することが報告されているので、本研究は昆虫だけでなく哺乳類にも知見を与え得るものと考えている。F遺伝子がコードすると予想されていたCD36遺伝子群に属する膜タンパク質をトランスジェニックの手法でF遺伝子の変異体個体に導入したところ、ベータカロテンの選択的取り込みが促進された。すなわち、F遺伝子がCD36遺伝子群をコードすることについて、強固な証拠が新たに得られた。また、Cameo2を細胞内め特定のタンパク質と共に培養細胞に導入し、精製したカイコの血液リポタンパク質を培養液に加えたところ、培養細胞へのルテインの取り込みが促進される条件を見出した。すなわち、予備的ではあるが、培養細胞でのC遺伝子の機能再構成に成功した。本研究課題は、鱗翅目昆虫のカイコ体内において、血液(体液)から絹糸産生細胞内へ脂溶性カロテノイド色素ルテインを選択的に輸送するC遺伝子と、ベータカロテンを選択的に輸送するF遺伝子の機能を培養細胞で再構成し、その再構成系を用いたキメラ遺伝子の解析等を行うことで、細胞のカロテノイド取込みの選択性が生まれる分子機構を明らかにすることを目標としている。C遺伝子は病原体の感染成立に関与することが知られているCD36遺伝子群に属する膜タンパク質Cameo2をコードすることが明らかとなっていた。F遺伝子も同じくCD36遺伝子群に属する膜タンパク質SCRB15をコードすることが示唆されていた。前年度までにF遺伝子がSCRB15をコードすることが機能的に証明された。Cameo2の再構成については、予備的ではあるがその実験条件を前年度までに見出した。SCRB15の再構成については実験条件をまだ見出せていない。Cameo2とSCRB15の機能を忠実に再構成するには、協調的に働くことが遺伝学的に示されているある因子についての知見が重要と推測し、その因子の同定に向けた作業も行った。その因子であることが示唆される発現パターンを有する遺伝子を一つ見出した。その遺伝子はスプライシングアイソフォームを持ち、発現パターンはスプライシングアイソフォーム間で異なっていた。本研究課題で得られた知見の一部について論文を執筆し、Journal of Lipid Research誌において発表した。本研究の前提となるF遺伝子がCD36遺伝子群をコードしていることについて、新たな実験系から強固な証拠が得られた。

また、本研究が確立を目指しているCD36遺伝子群によるカロテノイド輸送の培養細胞での再構成について、予備的ではあるが、C遺伝子を用いて成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。F遺伝子によるカロテノイド輸送の培養細胞での再構成を目指す。F遺伝子が輸送すると考えられるベータカロテンは、C遺伝子が輸送するルテインと比較して疎水性が高いので、非特異的吸着によってベータカロテンの輸送量が測定できなくならないように実験器具の選定を注意する。
血圧、血糖へのビスファチン、ＲＢＰ４、レプチン、アディポネクチンの縦断的影響評価

本研究では、各種アディポカインが血圧、血糖値、血中脂質値に及ぼす影響の強さを明らかにするとともに、長期的な変動に対する予測がどの程度出来るかを明らかにすることを目的とした。生活習慣の作用を含めて、高血圧、低HDL血症、高LDL血症、高総コレステロール血症、糖尿病の発症や、血圧、血中脂質、HbA1cの検査結果の経年変化について検討を進めた結果、アディポネクチンと高感度CRPがその後の健康状態を予測するマーカーとして有用である可能性が高いことが明らかとなった。本研究は、各種アディポカイン(ビスファチン、RBP4、レプチン、アディポネクチン)が血圧、血糖値に及ぼす影響の強さを明らかにするとともに、長期的な変動に対する予測がどの程度出来るかを明らかにするとともに、さらに、縦断調査において、毎年の問診による生活習慣、勤務時間、職業性ストレスの影響を補正できる、混合線形モデルといわれる近年開発された手法を用いる事で、個人内の変動や測定誤差まで考慮したより妥当性の高い結果を得ることを目的としている。今年度は昨年度から継続して行っている平成19年以降平成23年までの健康診断結果(健康診断個人票・腹囲、血圧、血糖値を含む)の抽出と入力、整理作業を実施した。また、平成24年度に実施した、健康診断結果(健康診断個人票・腹囲、血圧、血糖値を含む)、問診情報(生活習慣要因...年令・睡眠時間・飲酒習慣・喫煙習慣・運動習慣・食事の嗜好・生活環境、労働環境要因...勤務時間・職種・通勤時間・休日日数)、職業性ストレス調査票の結果を抽出して整理し、前述のデータベースに結合した。データに関しては個人が特定できないように匿名化を行った。今後、このベースラインデータを用いて、横断的に4種のアディポカインと血圧、血糖値の間の関連を解析していくための準備を行った。メタボリック症候群の概念の背景にある内臓脂肪の蓄積に関しては、脂肪細胞は単に過剰エネルギーを蓄積するだけの組織と考えられてきたが、脂肪細胞から分泌される生理活性物質であるアディポカインが、肥満に伴うインスリン抵抗性に影響することが解明されつつあり、メタボリック症候群の病態を明らかにする上で重要視されてきている。アディポカインとしてアディポネクチン、レプチン、MCP-1、レジスチンなどが知られ、最近ではビスファチン2)、RBP4(Retinol Binding Protein)3)が同定され、メタボリック症候群、インスリン抵抗性や血圧値との関連が示唆されている。以上の状況から、これらのアディポカインの血圧、血糖値への関与の解明4-6)や、その病態マーカーとしての有用性が非常に注目を集めている。本研究は、アディポカインの生態マーカーとしての役割を疫学的手法を用いて分析し、予防医学的有用性について評価することを目的としている。本年度は研究計画書・研究主旨説明書を作成し、研究計画書・研究主旨説明書を用いて協力事業所(2ヶ所)および産業医を対象に調査内容、調査方法の周知を図った。そして、現在、対象者の基礎データの入力と解析を行っているところである。近年、わが国では生活習慣の変化等による体内エネルギー蓄積の結果、肥満が急増しており、なかでも、内臓脂肪の蓄積を背景としたメタボリック症候群の概念に注目が集まっている。本研究は、健康診断時に一般労働者500人において測定したアディポカインレベル(ビスファチン、RBP4、レプチン、アディポネクチン)と、その後の5年間の健康診断結果データと結合し、生活習慣、勤務時間、職業性ストレス状況を考慮した、アディポカインの血圧、血糖値に対する長期的な影響を縦断的に調査し、これらの指標の、血圧、血糖値の変動を予測する指標としての有用性について疫学的に評価する事である。本年度は、2007年から2013年に健康診断を受診した日本人男性労働者の健康診断データ約7400件について入力し、データ整理を実施し、対象データを抽出した。さらに、高感度CRPの測定を追加した。対象者は男性249人、女性250人で、その後の縦断調査データは合計で女性1229件、男性が930件であった。観察人年は、男性が平均2.88人年、標準偏差2.36人年、女性が平均4.07人年、標準偏差2.13人年、調査回数は、男性が平均3.73回、標準偏差2.31回、女性で平均4.92回、標準偏差2.11回であった。また、年齢を補正した、各アディポカインの、HbA1c、血糖値、LDL、HDL、総コレステロール、中性脂肪、尿酸値への影響を検討した線形混合モデルの結果では、アディポネクチンは男女でHbA1c低下と有意に関連し、RBP4は女でHbA1c低下と有意に関連、レプチンは男でHbA1c上昇と有意に関連、高感度CRPは男女でHbA1c上昇と有意に関連していた。

また、アディポネクチンは女で血糖低下と有意に関連、レプチンは女で血糖上昇と有意に関連、高感度CRPは男女で血糖上昇と有意に関連していた。血圧については今後解析の予定である。社会医学データベースの結合に関して、書式の確認、統一に時間を要したが、まもなく解析に入る予定であり概ね、研究計画通りにすすめている。現在、研究計画書に示した計画に沿ってすすめており、ほぼ予定通りすすんでいる。現在、基礎データの入力をすすめており、ベースラインデータとの結合をすすめていく予定である。今年度も研究計画に沿ってすすめて行く予定である。25年度までのデータベースを追加するとともに、健康診断結果、生活習慣要因、労働環境要因の毎年の変化とアディポカインの変動の関連について、混合線形モデルを用いて解析し、腹囲、肥満度、血圧、血液生化学データの1年間の変動に対するアディポカイン類の関与について、縦断縦断調査による最も敏感、かつ有用である指標としてのアディポカインを明らかにし、アディポカイン類の血圧、血糖値の予測指標としての応用に関する、疫学的モデルを確立する予定である。今後も研究計画書に沿った研究をすすめていく予定である。平成25年度は基礎データの入力、およびベースラインデータとの結合を早期に完遂することをめざし、データの整理を行う。年度の後半には疫学的な解析を実行していく予定である。データの入力作業に関し、アルバイトの雇用が必要なくなり、人件費において未使用額が生じた。統計解析に必要なソフトの更新などに使用予定である。今年度の研究費について、当初計画されていたデータ解析のためのデータ打ち込み作業に必要と考えられる人件費を計上していたが、作業が想定よりも早く終えることができたため、未使用額が生じた。次年度においては、データの解析に必要な物品の購入、調査研究のための旅費を請求する予定である。
インターネット調査による成人男性の性的欲求に関する心理学的研究

本研究の目的は成人男性の性的欲求について心理尺度を作成し,その要因について調査研究することである。成人男性11名に対する半構造化面接から性的欲求に関する質的内容のモデルが作成され,これをもとに247名の成人男性によるインターネット調査から,性的欲求の認知的側面に関する尺度が作成された。性的欲求の認知は,自尊感情や性罪悪感等との関連性が確認できた。今後はさらなるデータの蓄積と,性教育などの実践活動への応用が必要である。初年度の主な目的は,1)一般的な成人男性の性的欲求を測定する尺度を作成し,因子の内容を明らかにし,2)性的欲求を規定する心理的要因や,性生活の状況との関連性を検討することである。初年度は1)は全て完了し,2)の一部が達成できた。具体的には予備的調査としての半構造化面接を7月10月にかけて,予定通り実施した。面接対象者は成人男性11名であり,それぞれ1時間程度の面接を実施した。面接では多様な内容の回答が得られ,これを修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチの手法によって質的に分析し,男性の性的欲求の経験に関するモデルを作成した。次に本調査として,得られた記述から59項目の男性の性的欲求認知を測定する項目を作成した上で,調査会社を通じて匿名によるインターネット調査を2月に実施した。調査対象者は社会人の男性300名(20代40代)である。作成した性的欲求認知の項目の多くは,パートナーとの性行為経験が前提となっているが,300名のうち53名が性行為の経験がなかったので,実際の分析は247名のデータによった。因子分析の結果,19項目から構成される男性版性的欲求認知尺度が作成された。尺度は4因子で因子名を「深い満足」「自己処理」「性的開示」「浮気衝動」と命名した。全ての信頼性係数は十分な値を示した。構成概念妥当性の検討のため,「異性不安」「自尊感情」との相関を検討したところ,「深い満足」と「自尊感情」,「自己処理」と「異性不安」との間で有意な正の相関がみられた。また,3世代(20代・30代・40代)間で各下位尺度の差を検討したところ,「自己処理」は20代で高く,「性的開示」は40代で低いという結果であった。また,性風俗サービスの利用経験者は141名いたが,利用経験がない群に比べて「性的開示」と「浮気衝動」が強いという結果であった。最終年度の目的は,1)初年度に実施した研究結果をもとに関連変数を追加して新たな調査対象者において調査を実施・分析すること,2)国内学会,国際会議において研究成果を発表すること,3)得られた分析結果をまとめて,査読誌等への投稿等によって一般社会への情報発信を行う,の3点であった。1)および2)については計画通り遂行し,3)についても査読誌での論文発表を行っていく予定である。具体的な研究成果としては,第2回のインターネット調査を成人男性390名(20代40代)に対して5月に実施した。調査内容は,初年度に作成した男性版性的欲求認知尺度19項目,性罪悪感,相互独立的ー相互協調的自己観,DV傾向,自己愛傾向,ストレッサーやストレス反応,虚偽尺度であった。分析の結果,初年度のデータと比べると因子構造は4因子のうち3因子は同一のものが現れたが,1つは因子として認められなかった。また,性的欲求認知尺度の中でも「深い満足」因子は,もともと自尊感情とも正の相関が認められ,重要な因子と考えられる。第2回目の調査でも「深い満足」因子は「性罪悪感」と負の相関,文化的自己観と正の相関が認められ,調査対象者が異なってもその重要性が再確認された形となった。本研究の成果を研究期間全体を通じてまとめると,具体的内容については当初の計画通り遂行できたといえる。本研究の意義は,心理学領域で性的欲求や性行動の研究が進んでいない現状から,性教育や性犯罪の予防という観点からも研究の蓄積が必要という点であった。2年間の研究を経て,国内や海外の複数の学会で研究成果の発表したが,本研究の内容に対して関心を示す研究者は少なからずおり,今後の研究の進展において学術的な発展が見込めることが示唆された。教育心理学初年度の研究は,予備調査においては全て達成できているが,男性の性的欲求に関する専攻研究が日本でほとんどないことから調査時に仮説生成が難しく,本調査であるインターネット調査では,まずは男性版性的欲求認知尺度の確定を主目的とした。関連する変数との検討を踏まえた上で,2年目に2度目の本調査を実施することに計画を微修正した。そのため,当初予定していた研究目的のうち,「性的欲求を規定する心理的要因や,性生活の状況との関連性を検討すること」は完全には達成されていない。

しかし,これは実際の予備調査における面接データを分析する中で,当初仮定していた仮説通りにデータの関連性がみられるか慎重に判断する必要性が生じたためであり,インターネット調査を2段階とすることで,以後の研究において,より着実な成果を挙げうる方法をとった。現時点では既に2回目の本調査の調査計画は作成済みで,所属機関の研究倫理審査委員会に承認を受けたため,現在,調査委託業者による2回目のインターネット調査を実施中である。したがって初年度の予定からは少し遅れがあるものの,最終的には予定通りの研究成果が得られる見通しをもっている。2回目の本調査は5月に実施予定である。調査内容は「男性版性的欲求認知尺度」「モッシャー性的罪悪感尺度10項目版」「相互独立的ー相互協調的自己観尺度」「言葉・態度での威嚇項目」「DV加害経験項目」「注目賞賛欲求尺度」「職場ストレッサー尺度」「心理的ストレス反応尺度」「虚偽尺度」である。調査対象者は20代から40代の社会人男性390名を予定し,インターネットで匿名調査を実施する。調査の概要としては,成人男性の性的欲求の認知を規定する要因として,1性的罪悪感と文化的自己観の関連性,2ドメスティックバイオレンスと男性の未熟性の関連性,3ストレス理論との関連性の3点から検討を加える。これらの分析を通じて,男性の性的欲求認知がどのような変数によって説明されるか明らかになるだろう。また,社会生活を送る男性の性的欲求を通じた心理的側面が明らかになることによって,思春期や青年期における男性の性のあり方や性教育の方策等についても,有益な示唆が得られると考えている。第一の理由としては,1年目の調査計画のうち本調査の内容について,2回に分けて慎重に行う必要が出てきたため,1回目の本調査の規模を少し小さくしたので,相対的に費用が少なくなったためである。次に第二の理由は,調査時に情報収集と打合せのため,勤務先まで直接出向く予定をしていた心理学研究者との予定が合わず,実際にはメール等での情報交換となったので,旅費が約半分となっているためである。調査については新たに2回目の本調査を設定したので,当初の予定通りの予算を必要とする見通しである。また旅費については,今後分析によって得られる結果が当初の予定よりも若干多くなる見通しがあり,より多くの国内の学会で研究成果を公表する方針でいるため,こちらも当初の予定通り必要となる見通しをもっている。
ヒドラ刺細胞の分化決定制御機構

未分化細胞から4種刺細胞(A,B,C,D型)への分化決定時期は分化経路中最後の細胞周期のS/G2の境界近傍である。決定を受けた前駆体細胞は細胞質に刺胞の構造を形成しそれが完了すると、個々に触手に移動し、捕食、防御としての機能をする。分化決定から刺胞の完了までの時間は詳細に分かっているので、最後のS/G2境界になるべく近く発現する遺伝子cDNAクロ-ンの選別を行った。方法は刺細胞を含む間細胞系譜の細胞で特異的に発現するcDNAクロ-ンを選別し、その中から決定後出来るだけ早い時期に発現するクロ-ンを更に選別するものである。そのためBUdR連続標識とイン・シチュハイブリダイゼイションの2重標識法を開発し、選別を行ったが、現在のところ最も早い時期に発現するクロ-ンはA型特異的で決定後9時間目からのものである。従って、決定時あたりに発現するクロ-ンを得るためには更に選別を続ける必要がある。この選別過程で副産物としてB型、D型刺細胞特異的に発現するクロ-ンが得られ、現在これらのクロ-ンの解析をも進めている。上記の新たに得られたA型特異的クロ-ンの発現をドットブロット・ハイブリダイゼイション法で簡便に定量する系を確立し、A型分化抑制因子の活性を容易に検出できるようになった。この方法を用いて因子の精製を行った。用いたカラムはセファデックスG10,DEAEセファデックス、バイオゲルP10で約7、000倍の精製である。因子の分子的同定には更なる精製が必要と思われ、現在HPLCによる精製を進めている。
ヘテロ原子置換型炭素材料の電子状態に関する理論的研究

本研究の目的は、低結晶性炭素材料のLiイオン二次電池用負極材料としての性能をより向上させるためには、どのような元素を低結晶性炭素材料に置換したら良いかを、理論的に予測することである。このため、低結晶性炭素材料をモデル化したグラファイトシ一トの構造と電子状態が元素置換でどのように変化するかを分子軌道計算により解析し、元素置換によるシートへのLi吸着特性の変化を解明する。平成9年度に、ホウ素及び窒素置換の影響を調べ、ホウ素置換によりシートへのLi吸着エネルギーが大幅に増大することを明らかにした。本年度は、イオウを置換した炭素材料のLi吸着特性を解析し、ホウ素及び窒素置換の解析結果との比較により、以下の点を明らかにした。1.ホウ素、窒素置換の場合と同様に、イオウ置換の場合も、シート端の炭素を置換した構造がより安定である。2.シートのC_2pairをSに置換した場合、Sはほぼ平面内で安定化するが、一本のS-C結合が弱くなる。そのため、シートにLiを吸着させた時に、LiがSと置き換わり、SH_2部分がシート平面から大きく押し出され、シートが大きく歪む。3.シートの炭素原子をSに置換した場合、ホウ素、窒素置換の場合と同様に、LiはS周辺の6員環の上下に吸着し、Li吸着によるシート構造の変化は殆ど無い。4.イオウ置換シートのLi吸着エネルギーは、ホウ素置換の場合と比較して小さく、吸着エネルギーの観点では、ホウ素置換がより有効であると思われる。
心筋細胞内CaまたはNaチャンネル機能の細胞工学的および遺伝子工学的研究

筆者らは心筋および血管平滑筋細胞内Ca動態を規定する各種Caチャンネル,CaポンプであるCaATPaseおよびNaCa交換体を遺伝子レヴェルで解析するためその準備を進めているが、まだその結果を供覧する段階に至っていない。本報告では現在並行して行っている血管平滑筋内Caストアの筋小胞体からのCa2+の放出機構の発現機構に関する研究の進展を報告する。この研究の背景には心筋と血管のCa調節系には現在大きな相違は報告されていないので実験結果の解析の容易な血管平滑筋を用いて得られる結果は将来の心筋を用いる研究の重要なヒントとなると予想される。今回血管作動性物質としてエンドセリンー1(ET)を用いた。ごく最近の薬理学実験と遺伝子工学を用いた実験により心筋自身に対しETー1が陽性変力作用と変時作用を示し、また固有の受容体が心筋に発現しており、ETー1が何等かの作用を心にする事は確実であろう。またETは電位依存Caチャンネルに直接作用すると当初考えられたが、その後直接作用は無く、特有の受容体とIP_3による細胞内情報伝達系を介して細胞内Caイオン濃度を変化さると現在考えられている。方法および結果細胞内Caイオンぼ二次元観測法の詳細は既に昨年度報告した。今回は血管平滑筋が細胞増殖や分化の過程でその表現型が変わる事に注目し,(1)細胞分裂を極めて遅くするため0.5%のウシ胎児血清(FCS)を含む培養液、(2)この中の成長因子などを完全に取り除くため、全く血清を含まず、代わりにインシュリン等を含んだ完全無血清培養液、および(3)この系にPDGFを10ng/ml含んだ培養液の3種類の系でエンドセリン(ET)、バゾプレッシン(V)および40mMのK脱分極刺激を行った。なお今回も細胞内Caイオンの筋小胞体(SR)からの放出機構を解析するために前2者では細胞外液に生理的な1mMのCaイオンが存在する場合と、Caを加えず、かつCaイオンを完全にキレ-トするために1mMのEGTAを加えた場合を用いた。K刺激の時には電位依存性Caチャンネルの機能を確認し、かつ一端SRから放出されたCaイオンをSRに再度取り込ませる目的で1mMのCaイオン共存下で行った。結果の要約および考案(1)FCSを0.5%含む培養液で2日間培養後ETには細胞外にCaイオンが存在する時は全ての細胞が反応したが、その様式にはET添加後一過性の細胞内Caイオンの上昇相を示した後、平担な相の2種の反応を呈する群を約半数の細胞が示し、残りの半数の細胞は一過性の相を呈さず、後の平担相のみ呈した。(2)細胞外にCaイオンが存在しない時は一過性の反応のみ呈する約半数の細胞と全く反応しない約半数の細胞とが同一視野内に共存した。次に細胞外に1mMのCaイオンが存在し、かつ電位依存性Caチャンネルの阻害薬であるジルチアゼム30myuuM共存する時は、先の細胞外にCaイオンの存在しない時と全く同様一過性のCaイオンの上昇を示す細胞と示さない無反応の細胞とが共存した。以上から(1)最初の一過性の反応は細胞内のSRから放出されるCaイオンの放出を、(2)次の平担相は、電位依存性Caチャンネルを通過して細胞内に流入するCaイオンを観測していると考えた。そして(3)その両方のCa動員系は約半分の細胞が占め、残りの半数は電位依存性Caチャンネルのみ有していると考えられた。次に細胞の分化の影響を観察するため、完全無血清培養液で細胞分裂を完全に阻止した場合、95%以上の細胞がETに反応し、PDGFを加えて増殖を起こさせた場合は全ての細胞が全く反応しなくなった。この際だった細胞のCa反応はETに対して選択的に示され、その他のK脱分局による電位依存性Caチャンネルによる細胞内へのCa流入の系やETと同じ細胞内信号伝達にIP_3を介すると考えられているVの場合には、こうした細胞周期の影響を全く受けず、無血清培養液でもPDGFの存在する時でも殆ど全ての細胞が反応を呈した。従ってETに対しては無反応でも電位依存性CaチャンネルとIP_3の動員系は完全に保持している事が示された。

今回は血管平滑筋が細胞増殖や分化の過程でその表現型が変わる事に注目し,(1)細胞分裂を極めて遅くするため0.5%のウシ胎児血清(FCS)を含む培養液、(2)この中の成長因子などを完全に取り除くため、全く血清を含まず、代わりにインシュリン等を含んだ完全無血清培養液、および(3)この系にPDGFを10ng/ml含んだ培養液の3種類の系でエンドセリン(ET)、バゾプレッシン(V)および40mMのK脱分極刺激を行った。なお今回も細胞内Caイオンの筋小胞体(SR)からの放出機構を解析するために前2者では細胞外液に生理的な1mMのCaイオンが存在する場合と、Caを加えず、かつCaイオンを完全にキレ-トするために1mMのEGTAを加えた場合を用いた。K刺激の時には電位依存性Caチャンネルの機能を確認し、かつ一端SRから放出されたCaイオンをSRに再度取り込ませる目的で1mMのCaイオン共存下で行った。結果の要約および考案(1)FCSを0.5%含む培養液で2日間培養後ETには細胞外にCaイオンが存在する時は全ての細胞が反応したが、その様式にはET添加後一過性の細胞内Caイオンの上昇相を示した後、平担な相の2種の反応を呈する群を約半数の細胞が示し、残りの半数の細胞は一過性の相を呈さず、後の平担相のみ呈した。(2)細胞外にCaイオンが存在しない時は一過性の反応のみ呈する約半数の細胞と全く反応しない約半数の細胞とが同一視野内に共存した。次に細胞外に1mMのCaイオンが存在し、かつ電位依存性Caチャンネルの阻害薬であるジルチアゼム30myuuM共存する時は、先の細胞外にCaイオンの存在しない時と全く同様一過性のCaイオンの上昇を示す細胞と示さない無反応の細胞とが共存した。以上から(1)最初の一過性の反応は細胞内のSRから放出されるCaイオンの放出を、(2)次の平担相は、電位依存性Caチャンネルを通過して細胞内に流入するCaイオンを観測していると考えた。そして(3)その両方のCa動員系は約半分の細胞が占め、残りの半数は電位依存性Caチャンネルのみ有していると考えられた。次に細胞の分化の影響を観察するため、完全無血清培養液で細胞分裂を完全に阻止した場合、95%以上の細胞がETに反応し、PDGFを加えて増殖を起こさせた場合は全ての細胞が全く反応しなくなった。この際だった細胞のCa反応はETに対して選択的に示され、その他のK脱分局による電位依存性Caチャンネルによる細胞内へのCa流入の系やETと同じ細胞内信号伝達にIP_3を介すると考えられているVの場合には、こうした細胞周期の影響を全く受けず、無血清培養液でもPDGFの存在する時でも殆ど全ての細胞が反応を呈した。従ってETに対しては無反応でも電位依存性CaチャンネルとIP_3の動員系は完全に保持している事が示された。
侵入性病原細菌(赤痢菌)の宿主細胞侵入機構の解析

赤痢菌は経口的にヒトへ感染後回腸に到達し、腸上皮細胞へ自ら食作用を誘発し細胞内へ侵入する。これには本菌の有する大プラスミド上のipaBCDから産生される侵入性蛋白(IpaB,IpaC,IpaD)が深く関っていることが知られているが、その機序は不明であった。そこで本研究ではIpa蛋白の性質と侵入に果す役割を理解する目的で、(i)Ipa蛋白の上皮細胞に対する作用、(ii)Ipa蛋白の菌体外論送機構、(iii)ipaBCD遺伝子の発現調節機構、の以上3つの研究を実施し、以下に列挙する知見を得ることができた。(1)Ipa蛋白は通常菌体表層に発現し結合状態にあるが、菌体から遊離することが細胞侵入に不可欠である。(2)Ipa蛋白の菌体からの遊離には、菌と上皮細胞との接解が必須である。(3)(2)の現像は、菌と細胞外マトリックス(フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンIV)との接解により惹起される。(4)Ipa蛋白の遊離能には、大プラスミド上のSpa遺伝子の1つ、Spa32が関与している。(5)遊離したIpaBとIpaC蛋白は複合体を形成し、IpaDと共に上皮細胞上のレセプター(現在同定中)に結合する。(6)IpaB、IpaC、IpaDの菌体外論送には、大プラスミドのコードするmxi領域と共に、Spa領域が必要である。(7)Spa領域中には8つのSpa遺伝子が存在する。(8)Spa蛋白のアミノ酸一次構造は、動物・植物病原菌に広く存在する蛋白分泌系蛋白と著るしい(2045%)ホモロジーを示し、互いの遺伝子構成も類似している。(9)(8)で認められる蛋白による蛋白論送系は、Sec-依存的蛋白論送系あるいはヘモリジン蛋白論送系とも異なる、第3の蛋白論送系である。(10)ipaBCDの温度依存的な発現調節は、本遺伝子群の正の転写因子、virB、の転写段階で行なわれている。以上の成果は欧米でも注目され、平成6年にはゴ-ドン会議に於て招待講演として発表を行った。赤痢菌はヒト回腸上皮細胞へ自ら食作用を誘発し、これを介して細胞偵内へ侵入後、増殖・拡散を操り返し炎症を引き起こし最終的に血性下痢を惹起する。本研究に先立ち、我々は菌の細胞侵入と拡散に必須な機能が本菌の有する大プラスミド上の8つの遺伝子領域にコードされていることを明らかにした。そこで本研究ではこれらの成果を基盤にして、赤痢菌の上皮細胞侵入の分子機構を明らかにすることを目標に、本現象に係わる菌側の因子を以下3つの側面から解析することを計画した。(1)侵入性蛋白(IpaB,IpaC,IpaD)の生化学的解析、(2)侵入性蛋白の菌体外分泌機構の解析、(3)侵入性蛋白遺伝子(ipaBCD)発現調節機構の解析。(1)に関連して本年度は各Ipa蛋白精製の為、組換えDNAの手法を用いて大腸菌K-12株の高Ipa発現系の作製を実施した。

具体的には各ipaB、ipaC ipaDの遺伝子をtacプロモーターに連結したプラスミド三種類を作り、IPTG添加によるIpa蛋白の産生増加を試みた。この結果いずれもIPTG添加による該蛋白の産主の増加が認められ、現在蛋白精製の条件検討を行っている。(2)に関して、大プラスミド上のビルレンス領域5の遺伝子解析を実施した。具体的には本領域を含む7824塩基対の配列を決定し、11ケの遺伝子が存在していた。現在この11ケの遺伝子のいずれがビルレンスに関与しているかを、主に遺伝学的手法を用いて解析している。(3)に関して侵入性蛋白遺伝子の発現調節を直接行っている大プラスミド上のvirB遺伝子の転写調節機構の解析を実施した。具体的にはvirBのプロモーター領域を決定し、さらに本転写活性に係わる上流のDNA領域を主に欠矢変異株を作製し解析した。その結果転写開始点はvirBの構造遺伝子の5'末端から54塩基対にあり、そこから110塩基対上流が転写に必須であった。赤痢菌は腸管下部に到り腸上皮細胞へ自ら食作用を誘発し,これを介して細胞内に侵入後隣接細胞へ漸次拡散し最終的に血性下痢を惹起する。本菌の細胞侵入は,大プラスミド上にコードされる一群のビルレンス遺伝子群の1つ(ipaBCD)のコードする侵入性蛋白(IpaB,C,D)により行れるが,本蛋白の分泌と侵入性の機序は不明である。又細胞侵入性は本菌の増殖温度(37°C)に依存し発現することが知られているが,その温度調節機構は未だ明らかではない。そこで本年度は以下の3つの研究計画を実施した。(1)侵入性蛋白IpaBとIpaCの精製を行う目的で,ipaBとipaCを各々発現ベクターへクローニング後,弱毒化赤痢菌に入れ各蛋白の高発現を促し精製を実施した。種々の精製法を試みたが,いずれも30%の部分精製しか成功しなかった。そこで本標品と上皮細胞へ加え,本蛋白の細胞表層への結合や形態変化惹起能を調べたが,いずれも有意な結果を得ることはできなかった。(2)侵入性蛋白の菌体外分泌に関わる,大プラスミド上の約7kbの領域-5の遺伝子解析と全塩基配列,および産生蛋白の同定を行った。その結果本領域には8ケのビルレンス遺伝子(spaと命名)が1つのオペロンを形成し,そのいずれのspa遺伝子も侵入性蛋白IpaB,C,Dの菌体外分泌に必須であった。(3)赤痢菌の細胞侵入性温度依存調節は,これまでの研究から大プラスミド上のvirB遺伝子の転写段階に於て行れていることが明らかにされている。そこで今回virBの転写調節に関わる因子の解析を試み以下を明らかにした。virBの転写にはプロモーター領域の上流約100塩基対の領域が必要であった。細胞侵入性を正と負に制御しているVirFとH-NSの蛋白は各々virBプロモーター上流域とプロモーター・オペレーター領域に結合性を有していた。さらにvirB転写が37°Cで促進される為には,VirFの結合と共にDNAの負の超らせん構造が必須であった。本研究の最終年度にあたり,赤り菌の細胞侵入に関わるIpaB,C,D蛋白の上皮細胞侵入に於ける動態,特に菌体外分泌を中心に研究を行うと共に,それら遺伝子発現機構の解析も行い,以下に述べる知見を得た。(1)IpaB,C,D蛋白は赤痢菌表層へ分泌後は,菌体と結合した状態で存在するが,菌を上皮細胞あるいは極性分化した上皮細胞の基底膜側と接触すると,Ipa蛋白は特異的に遊離してくる現象を見い出した。(2)本現象はさらに菌を細胞外マトリックス(フィブロネクチン,ラミニン,コラーゲン)との接触でも認められ,従ってIpa蛋白の遊離と菌の細胞侵入は緊密な関係にあることが強く示唆された。(3)菌体から遊離したIpaBとCは複合体を形成し,IpaDと共に上皮細胞基底膜上のある種のレセプター様物質と,特異的に結合していることを認めた。現在このレセプターの同定を進行している。
転移可能な新規ヘリトロン様トランスポゾンHeliplの構造と転移機構

ヘリトロン(Helitron)は近年のゲノム研究の進展に伴い、高等生物ゲノムの数パーセントを占めるほど多数存在することが明らかになったトランスポゾンである。しかし、これまでヘリトロンの挿入突然変異体についてはトウモロコシ等、数えるほどしか見つかっておらず転移活性のあるものは知られていない。我々が見いだしたマルバアサガオのFP遺伝子(C機能MADS-box遺伝子)に挿入していたHeliplは稀に体細胞復帰変異を起こすため、この系を用いてヘリトロンの自律性因子を含む構造と、その転移機構を明らかにすることを目的として研究を行っている。マルバアサガオのコスミドベクターライブラリーから得られたヘリトロン間で内部にコードされている遺伝子の構造や塩基配列の違いを解析した。その結果、fp遺伝子に挿入しているHeliplは自律性因子の可能性があることが示されたため、アグロバクテリウムを介した形質転換によってシロイヌナズナに導入し、その転移活性を解析した。導入したHeliplの両側を挟むようなプライマーを用いて、離脱した部位の塩基配列を解析したところ、マルバアサガオ中で見られるような、野生型のゲノム配列には復帰しておらず、数塩基の欠失が見られた。これは独立の復帰クローンにおいて共通に見られたため、何らかの機構が介在する可能性が考えられた。マルバアサガオにおけるHeliplの離脱はもとのゲノム配列と全く同じように離脱するが、独立の復帰イベントに由来する複数のクローンについて、離脱部位の周囲の配列を調べたところ、多くの点塩基置換が導入されていた。これはHeliplが離脱した部位に起こる2重鎖切断を宿主が修復する際に行う誤りがちな修復に由来すると考えられた。今回Helipl自体が自律性かどうかの確証は得ることができなかったが、Hellplファミリーは唯一の転移可能なヘリトロンとして今後のトランスポゾン研究への利用が期待される。しかし、これまでヘリトロンの挿入突然変異体についてはトウモロコシ等、数えるほどしか見つかっていない。また、我々が見いだしたマルバアサガオの花の形態形成変異体かの原因遺伝子(C機能MADS-box遺伝子)に挿入していたHelip1は稀に体細胞復帰変異を起こすため、これまで知られている中で唯一離脱可能なヘリトロンである。そのため、この系を用いて、高等生物に普遍的に存在するヘリトロンの自律性因子を含む構造と、その転移機構を明らかにすることを目的として研究を行っている。マルバアサガオのコスミドベクターを用いたゲノムライブラリーを作製し、Helip1をプローブにして、相同なヘリトロンを多数単離した。これらのヘリトロンの間で構造や塩基配列の違いを解析した結果、塩基置換等の多型に富んでおり、通常のトランスポゾンにもよく観察されるような内部に欠失のあるタイプも多数得られた。これらのヘリトロン(Helip1ファミリー)他の植物のヘリトロンの構造を比較し、内部にコードしているhelicase等のタンパクの配列を検討した結果、fp遺伝子に挿入しているHelip1は自律性因子の可能性があることが示された。そのため、このHelip1の転移能を解析するため、アグロバクテリウムを介した形質転換によつてシロイヌナズナに導入し、現在その転移活性を解析している。
インドネシアにおける復興住宅に係る住宅安全性及び住民のリスク認知の経年変化

本研究は、大規模な地震・津波被害を受けたインドネシアのアチェ、ジョグジャカルタ、パダンの3都市を対象に、住民参加型手法により住宅再建が実施された地域の1再建住宅の安全性と空間構成、2再建住宅に係る生活形態と生計、3リスク認知と防災行動、の長期的変化を明らかにすることを目的として実施した。専門家や住民へのインタビュー、アンケート、住宅の実測等の詳細な現地調査を行い、住宅再建のプロセスの実態や再建住宅の増改築等による空間的変化と生活形態の変化、再建住宅の耐震安全性、住民参加型の住宅再建が災害リスク認知や防災行動に与えた影響等を明らかにした。本研究は、バンドン工科大学との共同研究として実施した。本研究は、地震及び津波により大きな被害を受けたインドネシアのアチェ、ジョクジャカルタ、パダンの3都市において、防災意識の向上に効果が高いとされる住民参加型手法により災害後の住宅再建が実施された地域の住民を対象として、1住宅再建および生活再建に係る行政対応の実態を明らかにしたうえで、2住宅安全性と空間構成、3生活形態、4リスク認知と防災行動の長期的変化を明らかにすることを目的としている。特に、復興住宅は長期的視点での検証がほとんど行われておらず、災害から6ー10年が経過した3都市において、再建当時採用された再建手法や支援策が住宅や生活の変化にどのような影響を与えたかを検証する必要がある。具体的には、3つの災害における住宅再建及び生活再建に関する行政対応や支援策の文献収集及びヒアリング調査、現地調査による再建住宅の空間構成とその変化に関する実測調査、生活形態の変化に関する聞き取り調査、個人のリスク認知と防災行動に関するアンケート調査を実施し、分析する。平成27年度は初年度であり、まず現地状況を把握した上で、調査対象とした3都市から6地区(各都市2地区)を選定した。これらの地区の復興再建にかかる文献収集を行うとともに、居住者に対して実際の支援策等についてヒアリング調査を行った。さらに、所有者状況調査および住宅実測調査を実施し、再建住宅の所有者変化、住再建時の参加及び支援状況、再建住宅の屋内外の変化について、調査対象地区の全体像を把握した。これらの地図情報、詳細情報、写真データ等の整理も行った。これらの調査は、28年度も引き続き行う。再建住宅居住者のリスク認知・防災行動の変化に関する予備的な聞き取り調査および、プレ・アンケート調査を実施し、アンケート項目の選定・修正、対象者及び調査方法等の選定を行った。研究対象3都市において、調査対象地6地区(1都市2地区)の選定を実施すると共に、6地区を対象とした所有者状況調査、住宅実測調査(ベースライン調査)、および再建住宅居住者のリスク認知・防災行動の変化に関するプレ・アンケート調査を実施した。また、現地インドネシア調査チームと協同し現地調査およびデータ整理を行うなど、海外での調査計画を概ね予定通り実施することができた。本研究は、地震または津波により大きな被害を受けたインドネシアのアチェ、ジョクジャカルタ、パダンの3都市において、防災意識の向上に効果が高いとされる住民参加型手法により災害後の住宅再建が実施された地域の住民を対象として、住宅再建および生活再建に係る行政対応の実態を明らかにしたうえで、1住宅安全性と空間構成、2生活形態、3リスク認知と防災行動の長期的変化を明らかにすることを目的としている。平成27年度は初年度であり、基礎的な文献収集及び現地調査を行った。平成28年度は、9月に3都市6地区の詳細な現地調査を実施した。再建住宅の安全性と空間構成の変化については、再建住宅の増改築や経年劣化などの長期的な変化に関して、質問票や実測などによる詳細な現地調査を行った。再建住宅における生活形態の変化と適応に関しても同様に、生活形態がどのように変化し、住民がどのように適応してきたかについて、ヒアリング調査を実施した。再建住宅居住者のリスク認知・防災行動の変化についても、住民参加型による住宅再建が個人のリスク認知、コミュニティ内の関係や取り組みにどのような影響を与え、それらが長期的にどのように変容したのかについて、質問票による詳細な現地調査を行った。現地調査は、バンドン工科大学のクリシュナ・プリバディ教授を中心としたインドネシア調査チームとの協力・連携により実施した。これらの収集されたデータについて、整理を行い、不明なデータ等について再確認等を行った。その後、データの分析を行い、論文の発表も行った。平成29年3月6日に、バンドン工科大学で本研究に係るセミナーを開催し、暫定的なデータ分析結果について発表を行って、インドネシア専門家と情報を共有するとともに、彼らからの追加的な情報を得ることができた。研究実施計画どおり、調査対象地3都市6地区を対象として、再建住宅の増改築や経年劣化などの長期的な変化に関、再建住宅における生活形態の変化と適応、再建住宅居住者のリスク認知・防災行動の変化について、ヒアリング調査、質問票による調査、実測調査等により、詳細なデータを収集することができた。また平成29年3月に、バンドン工科大学で本研究に係るセミナーを開催し、暫定的なデータ分析結果について発表と情報の共有を行った。平成27年度は初年度であり、基礎的な文献収集及び対象地区選定のための現地調査を行った。

平成28年度は、3都市6地区の現地調査を実施し、再建住宅の増改築や経年劣化、生活形態の変化と適応、居住者のリスク認知・防災行動の変化について、インタビュー、アンケート、実測等により詳細なデータを収集した。平成29年3月に、バンドン工科大学で本研究に係るセミナーを開催した。平成29年度には、収集したデータの整理を進め、9月に不明データの確認・修正及び追加情報収集のため、3都市6地区において詳細な現地調査を実施した。住宅再建のプロセスに関する専門家ヒアリングも行った。また、再建住宅の耐震安全性評価を行うためのデータ収集も行った。平成30年2月に、これまでの分析結果を発表するとともに専門家の意見を反映するため、インドネシアのバンドン工科大学で本研究に係るセミナーを開催した。セミナーには、本研究に参加した専門家、政府関係者や専門家、NGO、学生等が参加した。現地調査及びセミナーは、バンドン工科大学のクリシュナ・プリバディ教授との協力・連携により実施した。本研究の3年間の成果は、英文の報告書(約190ページ)として発行した。本研究は、大規模な地震・津波被害を受けたインドネシアのアチェ、ジョグジャカルタ、パダンの3都市を対象に、住民参加型手法により住宅再建が実施された地域の1再建住宅の安全性と空間構成、2再建住宅に係る生活形態と生計、3リスク認知と防災行動、の長期的変化を明らかにすることを目的として実施した。専門家や住民へのインタビュー、アンケート、住宅の実測等の詳細な現地調査を行い、住宅再建のプロセスの実態や再建住宅の増改築等による空間的変化と生活形態の変化、再建住宅の耐震安全性、住民参加型の住宅再建が災害リスク認知や防災行動に与えた影響等を明らかにした。本研究は、バンドン工科大学との共同研究として実施した。昨年度の現地調査を基に決定したアチェ、ジョクジャカルタ、パダンの3都市6地区において、各研究者がさらなる詳細調査を実施する。各分野の調査結果を総合し、政策・技術・社会的側面および長期的な視点から調査結果を考察することで、参加型による復興住宅の安全性と住民のリスク認知の経年変化とその課題を明らかにする。現地調査はバンドン工科大学の海外共同研究チームとの協力・連携により実施する。各分野の具体的な実施計画は、以下の通りである。1.災害後の住宅再建および生活再建における行政対応および支援対策: 3つの災害において住宅再建及び生活再建に対する行政対応や支援策等について、文献収集やヒアリング調査を行い、得られたデータを整理する。2.再建住宅の安全性と空間構成の変化:調査対象6地区において、再建住宅の増改築や経年劣化などの長期的な変化に関して、実測など詳細な現地調査を行い、得られたデータの整理・分析を行って、課題を明らかにする。3.再建住宅における生活形態の変化と適応:同様に6地区において、再建住宅において生活形態がどのように変化し、住民がどのように適応してきたかについて、ヒアリングなど詳細な現地調査を行い、得られたデータの整理・分析し、長期的変化がもたらした影響を明らかにする。4.再建住宅居住者のリスク認知
ソフトマシンとしてのタンパク質の機能制御

理論と実験の協力により、柔らかいダイナミックな構造変化を伴いながら高い機能を発揮する、ソフトマシンとしてのタンパク質の動作原理を探るため、今年度は以下のような研究を行った。1)アロステリック構造転移を記述する粗視化動力学モデルの整備を進めた。2)時計タンパク質であるKaiABC系に構造転移理論を適用し、転移の柔らかいダイナミクスがKaiABC系の安定な概日振動をもたらす機構について仮説を提案した。3)ミオシンVIのアクチン繊維上の運動を記述する動的ランドスケープ理論を展開し、ミオシンVIが長距離のステップ歩行をするために必要な分子構造条件を理論的に明らかにした。4)核内のタンパク質とクロマチンの相互作用をモデル化し、クロマチン運動を解析した。5)アルカン合成酵素(アルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ、ADO)とジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の動的ランドスケープを特徴づけるために、複数の緩和時間を測るマルチスケールNMR測定を行った。ADOについては分子動力学シミュレーションを行い、実験と理論の結果を比較検討した。6)構造揺らぎを制御することで酵素活性を制御する新しいタンパク質工学技術の開拓を目指した研究を行った。ADOとDHFRの動的ランドスケープについての知見を用いることにより、酵素活性を向上させた変異体の創出に成功した。7)動的エネルギーランドスケープを理論的に描くことのできるWSMEモデルの改良を行った。8)そのほか、様々なタンパク質の構造ダイナミクスの測定や、機能を向上させるためのタンパク質デザインを行った。こうして、粗視化モデル、統計力学的モデル、マルチスケールNMR測定、網羅的変異解析など革新的な手法を総合して、タンパク質の構造変化を支配する動的エネルギーランドスケープを解析し、タンパク質の運動と機能、およびタンパク質工学技術について研究を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。新しい粗視化動力学モデルとしてカメレオンモデルの開発を進め、とくにNtrC、およびアデニル酸キナーゼに適用して、実験と整合性のある転移経路が計算を可能とするために必要な条件を解析した。とりわけ、ドメイン間の相互作用における水和効果を粗視化モデルでうまく表現することの必要性が明らかにされ、ポテンシャルの改良を行った。また、ミオシンVIの分子モーターとしての運動を解析するための粗視化動力学モデルの計算を行い、動的エネルギーランドスケープの方法論を発展させた。実験と理論の共通の対象として、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の解析を行った。実験では、大腸菌を用いて15N標識されたタンパク質を大量発現し、NMRスペクトルを測定した。その結果、ピークの分離も良くシグナル強度も高いスペクトルが得られる条件を見出すことができた。さらに、ラン藻由来のアルカン合成酵素(アルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ、ADO)についてNMRスペクトルをを解析した。ADOは、鉄原子を2個結合するためシグナル強度が低かったが、クライオプローブ付きの高磁場NMR装置を用いて測定することで改善された。また、ADOタンパク質は多形構造を有することが示唆された。以上の研究と並行して、構造揺らぎを設計して機能を制御する新しいタンパク質工学技術の開拓を目指した研究も開始した。とりわけ、ラン藻由来のアルカン合成関連酵素(アシルACP還元酵素、AAR)のアミノ酸配列を変えると、酵素活性と基質特異性の両方を制御可能であることを見出し、酵素AARの構造揺らぎを制御するアミノ酸部位の探索に成功した。さらに、AARとADOについての網羅的変異解析や、両者の相互作用解析なども行った。カメレオンモデルの開発はおおむね順調である。NtrCの動的エネルギーランドスケープ解析が進んでいるほか、アデニル酸キナーゼの動的エネルギーランドスケープ解析のための必要条件が明瞭にされてきた。また、ミオシン分子モーターの動作解析に動的エネルギーランドスケープの方法を応用する新しい道筋を明らかにした。DHFRのNMR測定はおおむね順調である。ADOについては現在、単一構造をとる溶媒条件を検討中である。また、構造揺らぎを設計して機能を制御する新しいタンパク質工学技術の開拓を目指した研究も開始している。新しい粗視化モデルであるカメレオンモデルの開発整備を進め, NtrC,アデニレートキナーゼなどの構造変化ダイナミクスの分析を行った。また,ミオシンVIとアクチン線維の相互作用を表す動的エネルギーランドスケープを計算し,ミオシンVIがアクチン線維を通常のミオシンとは逆向きに運動する機構について,新しい仮説を提案するための基礎となる結果を得た。さらに,タンパク質相互作用とATP加水分解反応によって振動する生化学反応系の振動機構を理論的に分析した。アルカン合成酵素(アルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ, AADO)の動的ランドスケープを特徴付けるために, ADO単独と, ADOに基質アナログを添加した場合の2つについてマルチスケールNMR測定実験と分子動力学法による理論計算を行った。マルチスケールNMR法により,ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の高活性型DHFR変異体の動的ランドスケープの特徴付けを行った。特に,触媒反応サイクルにおける律速段階である生成物解離反応をR2緩和分散NMR法で測定した。構造揺らぎを設計して機能を制御する新しいタンパク質工学技術の開拓を目指した研究を行った。とりわけ,ラン藻由来のアルカン合成関連酵素(アシルACP還元酵素、AAR)の酵素活性を向上させた変異体の構築に成功した。また,動的エネルギーランドスケープを理論的に描くことのできるWSMEモデルをジスルフィド結合含有タンパク質に拡張する方法の開発を進めた。

さらに,様々なタンパク質の構造ダイナミクスの測定も行った。粗視化モデルにより動的エネルギーランドスケープの描写を行う方法整備を進展させている。DHFRとADOのマルチスケールNMR実験はおおむね順調である。また, ADOについては分子動力学シミュレーションも行った。アクトミオシン系についての粗視化動力学計算により,分子モーターの新しい動作機構の解明が進展している。さらに,構造揺らぎの制御を目指した研究や,動的エネルギーランドスケープを描くための理論モデルの拡張も行った。理論と実験の協力により、柔らかいダイナミックな構造変化を伴いながら高い機能を発揮する、ソフトマシンとしてのタンパク質の動作原理を探るため、今年度は以下のような研究を行った。1)アロステリック構造転移を記述する粗視化動力学モデルの整備を進めた。2)時計タンパク質であるKaiABC系に構造転移理論を適用し、転移の柔らかいダイナミクスがKaiABC系の安定な概日振動をもたらす機構について仮説を提案した。3)ミオシンVIのアクチン繊維上の運動を記述する動的ランドスケープ理論を展開し、ミオシンVIが長距離のステップ歩行をするために必要な分子構造条件を理論的に明らかにした。4)核内のタンパク質とクロマチンの相互作用をモデル化し、クロマチン運動を解析した。5)アルカン合成酵素(アルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ、ADO)とジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の動的ランドスケープを特徴づけるために、複数の緩和時間を測るマルチスケールNMR測定を行った。ADOについては分子動力学シミュレーションを行い、実験と理論の結果を比較検討した。6)構造揺らぎを制御することで酵素活性を制御する新しいタンパク質工学技術の開拓を目指した研究を行った。ADOとDHFRの動的ランドスケープについての知見を用いることにより、酵素活性を向上させた変異体の創出に成功した。7)動的エネルギーランドスケープを理論的に描くことのできるWSMEモデルの改良を行った。8)そのほか、様々なタンパク質の構造ダイナミクスの測定や、機能を向上させるためのタンパク質デザインを行った。こうして、粗視化モデル、統計力学的モデル、マルチスケールNMR測定、網羅的変異解析など革新的な手法を総合して、タンパク質の構造変化を支配する動的エネルギーランドスケープを解析し、タンパク質の運動と機能、およびタンパク質工学技術について研究を行った。カメレオンモデルについて開発を進め、複数のタンパク質の構造転移を統一的に説明する方法として整備する。動的エネルギーランドスケープの方法がとくに有効と思われるミオシン分子モーターについても解析を進める。DHFRについては、カメレオンモデルによる理論計算とマルチスケールNMR法を用いた実験測定を進め、動的ランドスケープの解析を行う。