hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉緑体内タンパク質分解の幼苗期での役割

これまでの変異体の解析により、OsClpP5遺伝子の発現は幼苗期(juvenile phase)で高く、生育に従って(adult phase)低下し、pyl変異体の緑化の時期と発現が一致していることが判明した。OsClpP5プロテアーゼの機能として、標的タンパク質の置き換えや分解されてできたアミノ酸の再利用などが予想されるが、その生育ステージにおける標的タンパク質やゲノム解析から判明した複数存在するパラログとの役割分担は未解明なままであるので、安定なpyl-stb変異体を育成できる培養系を大いに利用して上記の問題を解明することを目指した。GFPと融合したOsClpP5タンパク質は葉緑体へ局在化しており、juvenile phaseのpyl-stb変異体の葉緑体を観察してみるとグラナがほとんど層化していないが、adult phaseでは層化している様子が観察できるので、これらの観察からOsClpP5プロテアーゼの役割は、クロロフィルの蓄積だけでなく葉緑体の形態形成にも係わっていることが判明した。さらに、発現の低下したadult phaseでもOsClpP5遺伝子は乾燥ストレスやABAによって誘導されることも判明した。このadult phaseでのOsClpP5プロテアーゼの役割として、標的タンパク質分解によるストレスへの応答と適応が主な機能と考えられるが、別の標的タンパク質が存在するのか、それとも標的タンパク質の役割が変わるのかについても全く解明されていないので、解析を行なう必要がある。しかしながら、生育やストレスには標的タンパク質以外にも複数の因子の変化が予想されるので、イネに少なくとも5コピー存在するOsClpP5パラログの発現解析をおこなったところ、変異体で発現が上昇しているパラロクを見つけることができたので、今後は変異体とパラログとの発現の変化と役割分担について詳細に検討を行なう予定である。幼苗期は光合成を開始しタンパク質合成の活発な時期であるが,この時期に葉緑体でのタンパク質分解がどのような役割を担っているのかは,未解明な部分が多く残されている.植物の葉緑体には、FtsH・DegP・SppAやClpなどの各種プロテアーゼが存在していることが判明しているが、Clpの機能は解明されていない。イネのOsClpP5遺伝子の欠損変異を持つpyl変異体は、自然栽培条件下では黄色い葉を持ち幼苗期で致死となり、その遺伝子の機能が幼苗期に必須であることを明らかにした。このpyl変異は、イネの新規DNAトランスポゾンnDartの挿入が原因であることから、nDartの脱離によって正常型に復帰した細胞をキメラ状に持つことで生存することができ、黄色の葉も生育にしたがって緑色に回復することから、生育ステージによって他の遺伝子によって機能相補されることが予想される。Race法により完全長mRNAを決定したところ、pyl変異体のOsClpP5遺伝子の転写開始点はnDartの挿入により後ろにずれ、正常なORFを取ることができないことが分かったので、pyl変異体は完全な機能欠損変異体であると思われる。そこで、イネのゲノムデーターベースの解析からアノテーションした7つのClpPホモログ遺伝子の細胞内の局在予測や機能ドメインの分析をおこない、系統関係からOsClpP5遺伝子の機能相補の可能性を評価した。これらOsClpP5ホモログのpyl変異体での発現を解析したところ、2つの遺伝子の発現が上昇していることを明らかにした。平行してOsClpP5遺伝子の発現様式を詳細に解析するためのコンストラクトを作成し、イネへ形質転換を試みた。
正常上皮細胞と変異細胞間に生じる細胞競合の分子メカニズムの解明

本研究は新学術領域班において、正常上皮細胞と変異細胞間に生じる細胞競合の分子メカニズムの解明を担当し、異なる細胞間の境界で特異的に機能する分子群を様々な手法にて同定・解析することを大きな目的としている。平成30年度は以下の研究プロジェクトについて大きく研究が進展し、論文発表準備中である。哺乳類培養細胞系とゼブラフィッシュのin vivoモデルを用いて、正常上皮細胞に囲まれたRasV12変異細胞が管腔側に逸脱するapical extrusionという現象におけるカルシウムの機能的役割について調べた。すると、apical extrusionの開始時に、変異細胞から周囲の正常細胞に向かって、細胞内カルシウムの上昇が波のように伝わり(calcium waveと命名)、それがapical extrusionを誘起していることが明らかになった。また、このcalcium waveはapical extrusionを正に制御していることも分かった。Calcium waveの発生は、stretch-activated calcium channelであるTRPC1とIP3レセプターによって制御されていることも示した。さらに、このcalcium waveの伝播によって、周囲の正常上皮細胞がアピカル惻に排除された変異細胞の後のスペースを埋めるために、細胞運動を亢進させるプロセスをコントロールしていることが分かった。このように、カルシウムが細胞競合現象に伴う細胞運動に関与しているという、新規性の高い知見を得ることができた。この他にも、マウス体内の様々な上皮組織にがん原性の変異をタモキシフェン投与によってモザイク様に誘導することのできる新たな細胞競合マウスモデルを用いて解析したところ、肺上皮層において、基底膜側に逸脱したRasV12変異細胞の周辺において、免疫細胞や線維芽細胞の集積、隣接する上皮細胞の過増殖といういわゆるがん微小環境様の構造を観察することができた。ガン微小環境がこのような発がんの超初期段階から発生しうることを示唆する興味深い知見である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。さらに、申請者が確立した細胞競合マウスモデルシステムを用いて、スクリーニングで同定された分子の機能を解析することを目指している。平成26年度は特に、正常上皮細胞に隣接する変異細胞に細胞非自律的に起こる変化にフォーカスを当てて解析を行った。まず、生化学的なスクリーニングによって、VASPとEPLINという二つの分子が正常上皮細胞に囲まれた変異細胞で活性や発現が亢進し、変異細胞の正常上皮細胞層からの排除に関与していることを見出した(Anton et al., 2014, JCS; Ohoka et al., 2015, JCS)。さらに、正常上皮細胞に囲まれたRas変異細胞において、ミトコンドリアの活性低下と解糖経路の活性化が生じていることが分かった。これはがんの超初期段階において、Warburug効果が生じていることを示唆しており、またその発生に細胞競合が関与していることを示している(投稿準備中)。さらに、低容量のタモキシフェンを投与することによって、腸管上皮層にモザイク様にがん原性変異を誘導することのできる世界初の細胞競合マウスモデルシステムを確立することに成功した。実際にこのシステムを用いて、正常上皮細胞に囲まれたRas変異細胞が管腔側に排除されることを確認している。このように平成26年度は順調に研究が進展し、研究期間中に多くの知見を得るための基盤を築くことができた。特に、本研究では正常上皮細胞に隣接する変異細胞側に生じる細胞非自律的な変化に焦点を当てて解析を進めている。平成27年度は変異細胞に生じる2つのプロセスについて大きく研究が進展した。まず、正常上皮細胞に囲まれたRas変異細胞において、Rab5が細胞非自律的に集積し、またクラスリン依存性エンドサイトーシスが亢進していることを見出した。さらに、この変異細胞におけるエンドサイトーシスの亢進が、変異細胞の上皮細胞層からの排除に重要な働きを果たしていることが分かった。それに加えて、正常上皮細胞との細胞間接着部位においてE-カドヘリンのエンドサイトーシスが亢進していること、エンドサイトーシスの亢進が変異細胞内における細胞骨格タンパク質EPLINの集積を誘起していることも明らかにした。これらの知見については現在PNAS誌においてリバイス中である。またミトコンドリアの活性低下はPDKの発現上昇によってもたらされていることを突き止めた。さらに、PDK阻害剤の添加によって、Ras変異細胞の上皮層からの排除が抑制されることが明らかになった。これらのデータは、がんの超初期段階においてWarburg効果様の代謝変化が生じ、またその発生に細胞競合が関与していることを示している。これらの知見については、現在Nature誌においてリバイス中である。

本研究では、正常上皮細胞に囲まれた変異細胞内において生じる細胞非自律的な変化の解明を目指すものである。これまでに研究は当初の計画を越え、順調に進展している。平成26年度にEPLINとVASPという二つの重要な制御因子を同定し、それぞれについて論文で発表した(Anton et al., 2014, JCS; Ohoka et al., 2015, JCS)。さらに、平成27年度は、エンドサイトーシスと代謝変化という二つの細胞プロセスが細胞競合に関与することを突き止め、それぞれ一流誌に論文誌バイス中である(Saitoh et al., PNAS; Kon et al., Nature)。さらに、スクリーニングによって複数の分子の同定に成功しており、これらの機能解析によって正常細胞と変異細胞間に生じる細胞競合の全貌が明らかになることが大いに期待できる。また、最近新たにマウス体内の様々な上皮組織にがん原性の変異をタモキシフェン投与によってモザイク様に誘導することのできる新たな細胞競合マウスモデルを開発することに成功した。このように研究は順調に進展しており、これからの3年間の研究発展が大いに期待できる。本研究は新学術領域班において、正常上皮細胞と変異細胞間に生じる細胞競合の分子メカニズムの解明を担当し、異なる細胞間の境界で特異的に機能する分子群を様々な手法にて同定・解析することを大きな目的としている。さらに、細胞競合マウスモデルシステムを用いて、スクリーニングで同定された分子の機能を解析することを目指している。特に、本研究では正常上皮細胞に隣接する変異細胞側に生じる細胞非自律的な変化に焦点を当てて解析を進めている。平成28年度は変異細胞に生じる2つのプロセスについて大きく研究が進展し、論文として発表することができた。まず、正常上皮細胞に囲まれたRas変異細胞において、Rab5が細胞非自律的に集積し、またクラスリン依存性エンドサイトーシスが亢進していることを見出した。さらに、この変異細胞におけるエンドサイトーシスの亢進が、変異細胞の上皮細胞層からの排除に重要な働きを果たしていることが分かった。それに加えて、正常上皮細胞との細胞間接着部位においてE-カドヘリンのエンドサイトーシスが亢進していること、エンドサイトーシスの亢進が変異細胞内における細胞骨格タンパク質EPLINの集積を誘起していることも明らかにした。これらの知見についてはPNAS誌に発表した。さらに、正常上皮細胞に囲まれたRas変異細胞において、ミトコンドリアの活性低下と解糖経路の活性化が生じていることが分かった。またミトコンドリアの活性低下はPDK4の発現上昇によってもたらされていることを突き止めた。さらに、PDK阻害剤の添加によって、Ras変異細胞の上皮層からの排除が抑制されることが明らかになった。これらのデータは、がんの超初期段階においてWarburg効果様の代謝変化が生じ、またその発生に細胞競合が関与していることを示している。これらの知見については、Nature Cell Biology誌にアクセプトされた。
マイクロ波照射による糖鎖・糖ペプチド合成の新たな展開

1.メチルグリコシド糖供与体を用いた糖と糖のグリコシル化反応研究マイクロ波照射によってメチルグリコシド体のアノマー位アセタール基におけるグリコシド結合が選択的に活性化される知見を基に、オリゴ糖合成への展開、生理活性物質への糖鎖修飾反応の検討などをすすめた。2.低温下でマイクロ波照射したグリコシル化反応の検討ルイスX誘導体合成においてグルコサミン3位に先にフコース誘導体を導入すると4位にガラクトースが導入されにくいことは既に報告されているが、低温下でマイクロ波照射すると本合成戦略でも高収率でかつ副産物の生成を抑えられることを明らかにした。この知見はマイクロ波の非加熱効果の存在を示唆している。3.生理活性物質である様々な糖ペプチドの合成糖ペプチドは多官能基化合物で、主に加熱手段として用いられているマイクロ波は糖ペプチド合成には不向きとされていたが、マイクロ波照射を活用してより簡便に糖ペプチド体が合成されうる基礎知見を得た。MUC1糖タンパクの繰り返し構造である、20残基ペプチドの5箇所にそれぞれ6糖体を持つ糖ペプチド体の合成に成功し、癌エピトープ部分の解明を指向した糖ペプチドフォーカストライブラリーの調製も行った。またp3ペプチド体を合成し、糖鎖認識構造研究をすすめた。これらの知見を生かして、マイクロ波利用糖ペプチド合成装置の開発に着手した。4.固定化試薬の開発化学反応のグリーン化を目指し重金属などの有害物質の環境への排出を防止すべく、重金属触媒を固定化した試薬の開発と、糖鎖連結反応などへの応用研究をすすめた。5.その他加水分解酵素による脱アセチル保護反応などの酵素反応におけるマイクロ波効果の他、関連して難溶性擬似糖脂質に対する酵素反応進行・促進を指向したシクロデキストリン添加効果研究をすすめた。また、マイクロ波照射が効果的な金ナノ粒子を担体とした合成研究も進めた。1)メチルグリコシド糖供与体を用いた糖と糖のグリコシル化反応研究マイクロ波照射によってメチルグリコシド体のアノマー位アセタール基におけるグリコシド結合が選択的に活性化される知見を基に、オリゴ糖合成への展開を計った。糖受容体に酸に強いオクチルグリコシド誘導体を、糖供与体にメチルグリコシド体を用いたが、本条件下では安定なはずのオクチルグリコシド誘導体由来の副産物が多く観察され、2糖体を得ることはできなかった。現在、他の様々な条件を検討中である。2)低温下でマイクロ波照射したグリコシル化反応の検討ルイスX3糖誘導体合成において、グルコサミン誘導体3位に先にフコース誘導体を導入すると、4位にガラクトースが導入されにくいことは既に報告されているが、低温下でマイクロ波照射すると、高収率で本反応が進行することを明らかにした。(Shimizuら、投稿中)3)生理活性物質である様々な糖ペプチド体の合成マイクロ波照射によってより簡便に糖ペプチド体が合成されうる基礎知見をもとに、さらに大きな糖ペプチド体の合成をおこなった。ターゲットとしてMUC1糖タンパクの繰り返し構造である、20残基ペプチドの5箇所にそれぞれ6糖体を持つ糖ペプチド体を設定し、実際に合成に成功した。(Matsushitaら、2006)また、癌エピトープ部分の解明を指向した糖ペプチドフォーカストライブラリーの調製も行った。(Ohyabuら、2006)4)その他合成したオリゴ糖のバリエーションを増やすべく、有効な糖転移酵素の調製をおこなった。微生物由来のN-アセチルグルコサミン転移酵素(GnT)は非常に活性が高く、基質選択性も特異なものであった。

(Naruchiら、2006)。また、マイクロ波は金表面には均一に照射しやすいことが知られている。そこで、金ナノ粒子上での糖鎖伸長反応を検討した。(Shinmizuら、2007)1)メチルグリコシド糖供与体を用いた糖と糖のグリコシル化反応研究昨年度に発表した成果を受けてオリゴ糖への合成を目指したが、良い結果を得ることはできなかった。しかし、今度の創薬シーズ開発への展開を指向して、ステロイドなどの生理活性物質への糖鎖修飾反応の検討をすすめた。2)低温下でマイクロ波照射したグリコシル化反応の検討近年「加熱効果でないマイクロ波存在を否定」する論文がKeppaより発表された。しかし本研究項目に関して昨年度得た知見は、実験的な面でのマイクロ波効果の存在を支持している。この点をより精査し、検討をすすめた。本研究項目はマイクロ波効果の実体に迫るもので、今後のマイクロ波利用合成研究の方向性の指南になると考えている。3)生理活性物質である様々な糖ペプチドの合成糖ペプチドは多官能基化合物で、主に加熱手段として用いられているマイクロ波は糖ペプチド合成には不向きとされこれまで利用されていなかった。昨年度までの糖ペプチド合成の効率化結果を踏まえ、今年度はマイクロ波利用糖ペプチド合成装置の開発に着手した。またp3ペプチド体の糖鎖認識構造研究をすすめ、成果を論文などで報告した。4)固定化試薬の開発とそのマイクロ波を用いたグリコシル化反応への応用化学反応のグリーン化の一環として重金属などの有倍物質の環境への排出を防止すべく、重金属触媒を固定化した試薬の開発と、糖鎖連結反応などへの応用研究をすすめた。今後も精力的にこの研究をすすめている所存である。5)その他酵素反応におけるマイクロ波効果について検討した。マイクロ波照射下、加水分解酵素によるラクトースのアセチル保護体の脱保護反応をすすめ、反応の促進、選択性を研究した。関連して、難溶性擬似糖脂質に対する酵素反応進行・促進のため、シクロデキストリン添加効果研究をすすめ、成果を論文などで報告した。
鉄骨考古学によるイギリス植民地時代バナキュラー建築の年代特定法の研究

植民地期のバナキュラー建築はこれまで見過ごされてきたが、土着の伝統、文化に対する誇りを醸成する上で潜在的に重要である。しかし、個別の建築物に関する文書や文献資料が少ないため、建築年代を詳細に決定する方法がなく、建築史・文化史の構築の妨げになっている。そこで、この研究では、アジアの旧英領植民地の英領期(19世紀後半から20世紀前半)に建てられた建築物を対象として、考古学的手法により建築に使用された鉄骨部材を形状的特徴から編年し、建築物の年代を決定する方法を開発する。
生体膜類似の構造,機能を有する含ポリペプチド高分子膜の情報変換機能

生体膜において、物質輸送、エネルギー変換、情報伝達などの機能を担っているのは膜タンパク質である。我々は、膜タンパク質モデルとしての合成ポリペプチドを膜貫通ドメインとして有する安定な高分子膜を合成し、生体膜類似の優れた情報変換機能の発現を目指して来た。本年度は、この膜の溶質透過における刺激応答性を調べた。膜はポリビニル/ポリペプチドグラフト共重合体から成り、ペプチドとしてポリ(L-グルタミン酸)またはポリ(L-アスパラギン酸)を用いた。ポリペプチド集合体から成るドメインが透過チャンネルとして機能し、ビニルポリマードメインは膜構造の支持安定化に寄与する。この膜の溶質透過性は外部刺激(情報)に応答して著しく変化する。異なるpH緩衝液中でスチレングリコールの透過性を調べたところ、透過性-pH曲線はシグモイド状となり、pH2と7の間での透過速度変化は約20倍に達した。この時、透過チャンネルを形成するポリペプチド鎖が、α-ベリックスからランダムコイルへと高次構造変化を起こしていることが膜のIR測定から確かめられた。膜透過性は2価カチオンという情報にも応答して変化することがわかった。スチレングリコールの透過性は【Ca^(2+)】などの2価カチオンの添加により抑制され、EDTAの添加で可逆的にもとの値に戻った。一方、アンモニウム塩が透過性に与える影響を調べたところ、長鎖アルキル基を有するテトラブチルアンモニウムクロリドがカルボン酸型の膜に対し特異的に溶質透過性を低下させる作用があることが明らかとなった。また、タンパク質の変性剤として知られる尿素によっても、この膜の透過性を制御し得ることがわかった。以上のように、膜中で透過チャンネルを形成しているポリペプチドのコンホメーションを、種々の外部刺激(情報)により変化させ、溶質透過性を制御できることがわかった。これは、神経膜のモデルのひとつとしても興味深いと考えられる。
骨髄異形成症候群における無効造血環境形成の血球動態に基づく基礎的検討

骨髄異形成症候群(MDS)は、老化を背景に発症し、無効造血と白血病化を特徴とする造血疾患である。成熟血球が減少するにもかかわらず何故骨髄中の前駆細胞数が保たれるのか、無効造血の機序は不明である。近年、血液中の好中球の骨髄回帰により骨髄環境が変化し、血球前駆細胞が髄外に放出されることが示された。本研究では、筆者らが見出した好中球の骨髄回帰を担うRac1/Cdc42を活性化する蛋白の減少が、好中球回帰を抑制して前駆細胞を骨髄内にとどめて無効造血を成立させる可能性を検証する。本研究の結果は、無効造血の解除を目指した治療標的の探索及びMDS発症機序の解明に資する。
制度と政治社会の相互関係から見たヨーロッパ中世の発展と変容

「追加採択」のため、実質的なスタートが初年度半年ほど遅れたが、2近年の日本の主要著作の合評会の開催(5回)、22000年以降の欧米における当該分野の研究動向の整理と検討(4回)、3各自のテーマに合わせ、近年の動向を踏まえた主要論点の提示(4回)を行い、論集「2017年度刊行予定」の基礎を作ることができた。また、2度にわたり当該分野の優れた研究者を招聘し、講演会を開催し、欧米における最新を動向・論点を明らかにすることができた。「追加採択」のためスタートが遅れたが、この科研の共同研究は基本的に「ヨーロッパ中世史研究会」(1995年結成)をテーマ的にも、メンバー構成においてもベースとしているため、実質的には年度当初から着実に共同研究としての実績を挙げてきたと言える。具体的には、斬新かつ先端的な研究を積極的に推進する観点から、先ず、近年我が国で刊行された本格的な当該分野、特にヨーロッパ中世の権力構造に関する研究書を5点選び、著者を招き評者を二人配し、徹底した質疑・応答を通して、問題の本質と、研究の方向性を見出すことができた。対象地域もフランス、ドイツ、セルビア、イタリアに及び、対象とする時代も中世を広くカバーすることができた。この一連の合評会を通じて基本的に王権・教会・貴族・都市の四つを共同研究の軸に設定するが、政治文化、法文化の面に力点を置きつつ、新しい問題設定、問題視角に基づいて方向付けすることが確認された。また、個人レヴェルでは分担者の約半数は科研費を有効に使用し、現地で各分担分野の実証研究を推進する上で不可欠かつ重要な歴史史料、文献の収集を精力的に行った。他の分担者は本科研プロジェクトの共通課題を念頭に置きつつ、個別研究を推進し、後掲のように一定の成果ー研究論文、研究書の刊行、学会・研究会での報告ーを挙げることができた。本科研プロジェクト研究は基本的に「ヨーロッパ中世史研究会」(1995年結成)を研究課題の面においても、メンバー構成の面においても、ベースとしており、昨年度同様着実に共同研究としての実績を挙げることができた。昨年度(2013年度)は我が国で近年公刊されたヨーロッパ中世の権力構造に関する研究書を5点選び、著者を招き、分担者各二名が評者となって基本的な問題点、課題を明確化し、それらを共有することができた。それを受けて、2014年度は欧米の近年の研究成果に目を向け、政治文化、法文化的な政治史、権力構造的なアプローチについて批判的に検討することとなった。イギリス、ドイツ、フランス、イタリア各学界について分担者が中心となって過去20年間の動向と特徴を紹介し議論し、その有効性と限界を明らかにすることができた。これは各自の個別研究だけでなく、我々の今後の共同研究の方向性を十分示唆するものとなった。その他、分担者1名の個別報告による研究集会、他の分担者による総括報告による研究集会、ベルギーからの著名な研究者の招聘による研究集会も開催した。何れも多くの参席者を得て、活発な質疑・応答がなされ、所期の目標を達成することができた。とりわけ、外国人研究者の招聘による研究集会の開催は2015年度末に予定されている国際シンポジウムの布石となるものである。また、個人レヴェルでは科研費を有効に活用し、重要な歴史史料、主要文献の収集も精力的に行われ、それに基づく研究成果の一端は多様な形で論文、学会報告の形で公刊された。2016年度は過去二年間の実績を踏まえ、最終年度ということで、共同研究の総括に充てることとした。本科研の共同研究は研究課題、メンバー構成において「ヨーロッパ中世史研究会」をベースとしており、その活動との有機的連関を図りつつ実績をあげることができた。本年度も昨年度同様、活動の基本を研究集会におき、隔月の割合で計6回開催することができた。個別報告に加えて、本年度は特に本研究課題と密接に連関させて、その骨格をなす「教会」、「王国・国家」、「都市」の三方向から近年の学界動向を踏まえ各自が最も関心を持つテーマを素材として主要問題を提起する、という形で4回の研究集会が開催された。活発な質疑・応答を通して主要な論点を共有することができた。これは2018年の刊行を目指す論集に結実するものと思われる。また、3年間の活動の総括として当初より「国際シンポジウム」を本年度末に開催することが企画されていたが、相手方の都合により、急遽中止せざるを得なくなったことは誠に残念である。しかし、その代替としてフランス人研究者の来日にあわせて、各地で講演会を主催、共催することができ、日本のヨーロッパ中世史学界の発展に一程度貢献することができた。また、個人レヴェルでは今年度も科研費を有効に活用し、重要な歴史史料、主要文献の収集も精力的に行われ、それに基づく研究成果の一端は後掲のように研究書、雑誌論文を始めとする多様な刊行物、学会報告の形で公表された。

また、2度にわたり当該分野の優れた研究者を招聘し、講演会を開催し、欧米における最新を動向・論点を明らかにすることができた。二年目に当たる26年度は当初より、「研究計画書」に基づいた、共同研究遂行のための、より具体的な計画案を策定し、上述のように、予定通り、7回にわたる研究集会を開催することができた。各回とも分担者以外のヨーロッパ中世史関係の研究者にも呼びかけ、報告者或は討論への参席者として加わって頂き、より一層意義深いものとすることができた。それにより、最終年度にあたる27年度における各自の個別研究の具体的な方向性、国際シンポジウムの企画と目標が鮮明となった。これらは本研究課題の当初の主要な研究目的として設定されたものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。フランス中世権力構造論27年度は過去2年間の共同研究の蓄積を生かして、また収集した歴史史料の分析、基本的な研究文献の批判的検討に基づいて、各自が本格的に研究を推進し、各分野・領域で優れた成果を生み出すことが期待される。これらの成果は29年度に論集の形で刊行することが目指されている。また27年度末にはこれまでの国内外における政治文化、法文化的な政治史、権力構造論に関する批判的な検討を踏まえた形で欧米から複数の中堅研究者を招聘して国際シンポジウムを開催する予定であり、そのための準備を進めているところである。この企画により、日欧の研究者の対話を通じて、政治史、権力構造研究の新機軸が明らかになることが十分期待される。「追加採択」のため年度当初に「研究計画書」に基づいた、本共同研究遂行の為の具体的かつ綿密な2013年度の計画案を策定することができなかったが、分担者全員が私が代表を務める「ヨーロッパ中世史研究会」のメンバーであることもあり、その活動を通して2013年度は実質的に本科研の初期の目標を達成できたと言うことができる。即ち「追加採択」が確定した11月以降、分担者の約半数は急遽計画を立て、第一年度の主要計画のひとつである「文献・史料収集」を効果的に遂行することができた。また、斬新な共同研究を遂行するための「意見交換・共同討議」も多くのメンバーが参加しコンスタントに開催され、それを通じて2014、2015年度の方向性も明らかとなった。上述のように1年目に当たる2013年度は11月「追加採択」後、分担者の約半数は、科研費を有効に使用して各自の分担研究に必要な史料・文献を海外で精力的に収集し、2014年度以降の研究の基盤を確保することができた。他の約半数の分担者はその間、これまでの各自の研究視角を再検討し、主要な欧米の近刊書を科研費を使用して入手することができた。2014年度は前者は収集した史料の分析を進め、後者は自己の研究課題に対応した史料・文献の収集に努めることになる。また、全体としては2014年度は1990年以降の欧米における研究動向を各学界ごとに概括し、特に政治文化、法文化の側面からの中世における政治・権力構造の研究視角を明確にすることを目指したい。また、それと関連して2014年度には、中堅の欧米研究者を招き、教示を得、2015年度にはその成果を反映させる形で国際シンポジウムを共同で開催する予定である。
スターベーション法によるブタ精子の先体反応誘起機序の解明に関する研究

研究代表者が考案したスターベーション(以下SVと略記)法は、精子を代謝基質と酸素が不足する状態に置いてATPを枯渇させることで先体反応を誘起させる方法で、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒトおよびグレビーシマウマで有効性を確認している。本研究では、SV法による先体反応誘起機序を解明する目的で、精子内外のCa^<2+>の関わりについてブタを材料として調べた。すなわち、妊孕能が明らかな3頭の成熟雄から得た新鮮射出精子を材料とし、精子内外のCa^<2+>が欠乏または充足する条件下で5時間までSV処理(精子を代謝基質を含まない媒液に10億/ml以上の濃度で浮遊して密閉容器内において40°Cで加温)を行った後に、先体反応誘起の程度をトリパンブルー・ギムザ染色法と透明帯除去ブタ卵子を用いた配偶子融合試験により経時的に調べた。なお、Ca^<2+>充足条件下と外欠乏条件下でのSV処理では、媒液にそれぞれ2 mM CaCl2と1 mMEGTAを添加したNaCl/TES緩衝液を使用した。また内欠乏条件下では、SV処理に先だって精子にBAPTA/AMをpre-loadした。まず精子内ATP量(n mol/10億精子)をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定してSV状態の確認を行ったところ、新鮮射出精子のATP量は130前後であったが、いずれの条件下でもSV処理後1時間以内に0近くまで激減していた。またSV処理開始直後には、いずれの条件下でもacrosomal exocytosis(以下aeと略記)を起こした精子はほとんどいなかったが、Ca^<2+>充足条件下では2時間のSV処理で約4割の精子がaeを起こし、供試卵子1個当たり平均4個以上の精子が卵子原形質膜と融合した。一方、精子内外のCa^<2+>を欠乏させた場合には、SV処理5時間後でもaeを起こした精子は1割前後と低く、卵子原形質膜と融合する精子もほとんどなかった。以上の実験結果から、SV法による先体反応誘起に精子内外のCa^<2+>が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
僧帽弁輪縫縮術式の改良に関する研究

雑種成犬を用い,体外循環下に弁輪縫縮を行い,弁輪に縫着した鉛玉の動きを記録して弁輪部形状や弁輪各部分の長さの変動を計測している.De Vega法に準じた後弁尖弁輪全長縫縮犬では,心臓収縮により後尖弁輪の短縮がおこるが,弁輪縫縮をおこなっていない場合に比し,変化はすくない.詳細を更に検討中である.後交連側後尖弁輪縫縮についても検討をおこなっている.雑種成犬を用い,体外循環下に弁輪縫縮を行い,弁輪に縫着した鉛玉の動きを記録して弁輪部形状や弁輪各部分の長さの変動を計測している.De Vega法に準じた後弁尖弁輪全長縫縮犬では,心臓収縮により後尖弁輪の短縮がおこるが,弁輪縫縮をおこなっていない場合に比し,変化はすくない.詳細を更に検討中である.後交連側後尖弁輪縫縮についても検討をおこなっている.
非小細胞肺癌における新規バイオマーカーの同定と機能解析

前年度では公共データベースを用いて、非小細胞肺癌のバイオマーカー候補として抽出した遺伝子(CRIP1)が肺癌特異的に発現するものの、強いoncogenic functionは有していないことが分かったため、別の候補遺伝子を検索した。その結果、その発現量が予後および病期と相関する、ある低分子GTP結合タンパク質を見出した。当研究室と連携しているスウェーデンのウプサラ大学病理学教室が有する肺癌検体のRNA-seqデータでも同様に、遺伝子高発現と不良な予後との相関が見られ、肺がんのバイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。さらに、遺伝子発現とDNAのメチル化との関連も示された。当研究室が有している多数の非小細胞肺癌細胞株を用いてqRT-PCRを行った結果、正常気道/肺胞上皮細胞株にはその遺伝子はほとんど発現していないものの、一部の肺癌細胞株では高発現であることが分かった。しかし、複数の種類の抗体でウエスタンブロットを行ったが、mRNAレベルで高発現していると考えられる細胞株でも特異的なバンドは得られず、今後タンパク実験や肺癌組織での免疫染色を見据え、良質な抗体を模索していく。次に、2種類の肺癌細胞株を用いて、siRNAで遺伝子発現をノックダウンし、細胞増殖能を調べた結果、コントロール群とノックダウン群とで増殖能に有意差は認めなかった。現在、浸潤能、遊走能の解析をすでに始めている。また、レンチウイルスベクターで細胞株に同遺伝子を強制発現させる系がほぼ完成したため、同様に増殖・遊走・浸潤能など、癌細胞の機能・悪性度が変化するか解析する予定である。バイオインフォマティクスを用いて、肺がんのバイオマーカー候補となる遺伝子が得られたが、レンチウイルスベクターの作成や細胞浸潤・遊走能を評価する実験系の最適化に時間がかかり、in vitroでの実験に遅れが生じた。既に良好なノックダウン効率を有するsiRNAは得ており、レンチウイルスベクターによる強制発現の系と共に、loss of function、gain of function両者で、肺癌細胞株を用いた細胞増殖、遊走、浸潤能の解析、in vivoでヌードマウスへの皮下注射による腫瘍形成能を解析する。免疫組織染色が可能な良質な抗体が入手できたら、肺癌の組織マイクロアレイを用いて、予後解析などを行う。公共データベースを用いて、非小細胞肺癌のバイオマーカー候補を複数抽出した。その一つとしてCRIP1(Cysteine-Rich Instestinal Protein 1)に注目した。CRIP1はLIM/double-zincfingerタンパクファミリーに属するタンパクであり、actin cytoskeletonと相互作用するアダプター分子として機能し、細胞の増殖や分化にも関与すると言われているがその機能はほとんど分かっていない。一部の癌種で過剰発現や予後との関連が示されているが肺癌での研究はなされていない。まずCRIP1発現をRNAおよびタンパクレベルで解析したところ、正常気道/肺胞上皮細胞ではほとんど発現しておらず、一部の非小細胞肺癌細胞株で高発現していた。H358、H1437という2種類のヒト肺癌細胞株を用いてCRIP1をsiRNAでノックダウンし、細胞増殖アッセイを行ったところ、CRIP1ノックダウン群で細胞増殖が抑制された。細胞周期解析・アポトーシスアッセイでは有意差が見られなかった。次に、CRIP1 miRNA発現ベクターを作成し、恒常的にノックダウンする系を確立し、colony formation assayを行ったが、ノックダウン群でコロニー形成が抑制される傾向があったが有意差は認めなかった。また、306サンプルからなる肺癌の組織マイクロアレイを用いて、CRIP1の免疫染色を行ったところ、低発現から高発現まで様々な発現パターンを示し、組織ごとでは扁平上皮癌や大細胞癌よりも腺癌で発現が高かった。正常肺の肺胞上皮では発現を認めなかった。喫煙歴や肺癌のステージごとの発現差はなく、また生存解析でも高発現群と低発現群とで有意差を認めなかった。以上よりCRIP1は肺癌特異的に発現するバイオマーカーとなりえるが、強いoncogenic functionは有していないと考えられた。当初肺癌のバイオマーカー候補として挙げた遺伝子がそれほど強いoncogenic functionを有していないことが分かり、現在他の候補遺伝子を解析中である。

現在、浸潤能、遊走能の解析をすでに始めている。また、レンチウイルスベクターで細胞株に同遺伝子を強制発現させる系がほぼ完成したため、同様に増殖・遊走・浸潤能など、癌細胞の機能・悪性度が変化するか解析する予定である。バイオインフォマティクスを用いて、肺がんのバイオマーカー候補となる遺伝子が得られたが、レンチウイルスベクターの作成や細胞浸潤・遊走能を評価する実験系の最適化に時間がかかり、in vitroでの実験に遅れが生じた。公共データベースを用いて、非小細胞肺癌の新規バイオマーカー候補が他にも複数抽出されており、それらの機能解析を今後行っていく方針。具体的にはsiRNAまたはmiRNAを用いたloss of functionモデルで、肺癌細胞株で細胞増殖、遊走、浸潤の解析、in vivoではヌードマウスへの皮下注射、尾静脈注射で腫瘍形成能、転移能を評価する。また組織マイクロアレイを用いて、候補遺伝子のタンパク発現レベルと臨床病理学的パラメータとの相関、生存解析を行う。既に良好なノックダウン効率を有するsiRNAは得ており、レンチウイルスベクターによる強制発現の系と共に、loss of function、gain of function両者で、肺癌細胞株を用いた細胞増殖、遊走、浸潤能の解析、in vivoでヌードマウスへの皮下注射による腫瘍形成能を解析する。免疫組織染色が可能な良質な抗体が入手できたら、肺癌の組織マイクロアレイを用いて、予後解析などを行う。有意な実験結果が得られず、当初予想していたin vitroおよびマウス実験を行うことができなかったためため、次年度以降に繰り越す。研究の進捗がやや遅れたため。細胞株を使った実験やマウス実験、肺癌組織の免疫染色に使用する。
経細胞膜輸送の分子機構

有機物質の経細胞膜輸送を司るトランスポーターの機能の特徴は-トランスポーター分子により輸送される基質の数が複数種類あって、その分子機構は未だ不明である。トランスポータータンパク質の結晶化による三次元解析の成功が待たれるものの、困難が予測される.而るに、本研究ではトランスポータータンパクと基質の関係について、基質分子構造と輸送の関係について検討した。中性アミノ酸トランスポーターLAT1はL型アミノ酸の他に諸種薬物をも輸送する。まずヒトLAT1遺伝子の安定発現系をマウス腎由来株化培養細胞S2への導入を行った。これにより得られた細胞への放射性標識フェニールアラニンの取り込みに影響を与える各種薬物の阻害効果を解析した。その結果、この取り込みはL-dopa,α-methyldopa, molphalan, triodothyroninc, throxine等の芳香族アミノ酸類似物質により競合的に抑制された。他方、phenylalanine methyl ester, N-methyl phenylalanine, dopamineなどはこの輸送に影響を与えなかった.これらのLAT1による基質認識性をコンピューターにより解析した結果、LAT1による認識には、芳香族アミノ酸に加え、遊離のカルボキシル基とアミノ基が重要である事が判明した。この種の解析はトランスポーターによる基質認識の分子機序解明に有用である事が明らかにされた。薬物の体内動態は吸収、分布、代謝、排泄の4ステップに分けられる。薬物の細胞膜輸送はこれら全てに関連をもつが、生体内に投与される薬物の多くは脂溶性が高いので、前2者のステップは脂質二重層膜を非特異的に通過する可能性が高い。しかし肝を中心として薬物代謝によって極性基が付与されて水溶性になった薬物の代謝物が肝の実質細胞から排出される過程以後のプロセスには特異的な薬物トランスポーターが必要である。本研究において主要に扱うステップは従って上記の後2者、即ち代謝(後のステップ)、排泄の分子機構の研究である初年度は研究代表者の日本側研究者らは有機陰イオントランスポーター(organic anion transporter;OATと略す)の第4のアイソフォームであるヒト由来OAT4の分子クローニングを行った。OAT4はアミノ酸550個より成る膜12回貫通型の糖タンパクで、既に本研究代表者らによりクローニングされたOAT13と3840%のアミノ酸組成に相同性を認めた。OAT4のmRNAはヒトの胎盤と腎に強い発現が認められ、エストロン硫酸、デビドロエピアンドロステロン硫酸、オクラトキシンA等を高親和性(Km=0.631.01μM)に輸送することが明らかにされた。米国ロチェスター大学の研究者らは日本側研究者によりクローニングされたOAT1,2,3,4の機能の特異性を明らかにするための有機物質抱合体、特に市販品としては入手できないシステイン抱合体を有機合成し、日本側研究者に供与した。この国際共同研究によりOAT1による放射標識パラアミノ馬尿酸並びにOAT3による標識エストロン硫酸の細胞内への取り込みをシステイン抱合体が強く抑制することを明らかにすることができた。必須アミノ酸を含むアミノ酸の細胞膜輸送の分子機序について検討した。輸送系L(system L)は、Na+非依存的に中性アミノ酸を輸送するアミノ酸輸送系であり、細胞への栄養素としてのアミノ酸を供給する他、血液・脳関門や胎盤関門に存在し、そこでのアミノ酸の透過を担当する。輸送系Lは、基質選択性が広く、L-ドーパをはじめとするアミノ酸類似薬物並びにメチル水銀システイン抱合体などをも輸送し、それら薬物等の血液・脳関門透過の経路となると考えられてきた。本研究では、輸送系Lに相当するアミノ酸トランスポーターをクローニングし、それが12回膜貫通型のトランスポーターの本体(LAT1:L-type amino acidtransporter1)と1回膜貫通型の補助因子(4F2hc:4F2heavy chain)のへテロダイマーとして形成されるユニークなタンパク質であることを明らかにした。LAT1は、Na^+非依存的に分枝アミノ酸及び芳香族アミノ酸を輸送する他、L-ドーパ及びα-メチルドーパを輸送基質として受け入れ、その上、アメリカの共同研究者らにより合成されたメチル水銀システィンも輸送し、血液・脳関門で記述された輸送系Lと類似の基質選択性を示した。

LAT1及びその補助因子4F2hcの血液・脳関門での存在を検討するために、ラットLAT1及びラット4F2hcのC-末端領域に相当する合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を作製し、8週令雄性SDラット脳の免疫組織化学的検索を行った。その結果、LAT1、4F2hcともに、脳毛細血管内皮細胞に染色像が得られ、その染色の特異性は吸収試験により確認された。また、内皮細胞における染色は血管内腔側と脳側の両側に認められた。本研究により、LAT1及び4F2hcが、血液・脳関門の主要構成要素である脳毛細血管内皮細胞の細胞膜に共存することが示され、血液・脳関門輸送系Lとしてそこでのアミノ酸輸送を担当することが明らかにされた。また、LAT1が、L-ドーパを含むアミノ酸類似薬物や生体異物を輸送することから、それらの血液・脳関門透過の経路となることが示唆された。有機物質の経細胞膜輸送を司るトランスポーターの機能の特徴は一トランスポーター分子により輸送される基質の数が複数種類あって、その分子機構は未だ不明である。トランスポータータンパク質の結晶化による三次元解析の成功が待たれるものの、困難が予測される。而るに、本研究ではトランスポータータンパクと基質の関係について、基質分子構造と輸送の関係について検討した。中性アミノ酸トランスポーターLAT1はL型アミノ酸の他に諸種薬物をも輸送する。まずヒトLAT1遺子の安定発現系をマウス腎由来株化培養細胞S2への導入を行った。これにより得られた細胞への放射性標識フェニールアラニンの取り込みに影響を与える各種薬物の阻害効果を解析した。その結果、この取り込みはL-dopa,α-methyldopa, melphalan, triodothyronine, thyroxine等の芳香族アミノ酸類似物質により競合的に抑制された。他方、phenylalanine methyl ester, N-methyl phenylalanine, dopamineなどはこの輸送に影響を与えなかった。これらのLATlによる基質認識性をコンピューターにより解析した結果、LAT1による認識には、芳香族アミノ酸に加え、遊離のカルポキシル基とアミノ基が重要である事が判明した。この種の解析はトランスポーターによる基質認識の分子機序解明に有用である事が明らかにされた。
地層中におけるアクチニドコロイド形成・移行メカニズム―実験と第一原理による解明―

地層中の代表的な無機系コロイドである鉄酸化物系コロイドとして、マグネタイト系微粒子およびヘマタイト系微粒子を取り上げた。それらが、長期にわたる放射線的毒性を支配するネプツニウム(Np)とどのように結合するのか、結合するときに還元反応を伴うのかについて、実験的に解明を行った。実験では、大気開放系における吸着量のpH依存性やイオン強度依存性、脱酸素雰囲気下における吸着量のpH依存性を取得するとともに、吸着のキネティックスや温度依存性、微粒子表面のXPS測定などを実施するとともに、脱離実験と脱離後の溶液の溶媒抽出実験などを行った。その結果、とくにマグネタイト系微粒子とNp(V)が脱酸素雰囲気下で擬似コロイドを形成する場合には、マグネタイト中のFe(II)とNp(V)の間での酸化還元反応が誘起され、NpはNp(IV)としてマグネタイト系微粒子と結合することを明らかにした。また、地層中の代表的な有機系コロイドである腐植酸(フミン酸)コロイドとウラン(U)との相互作用を明らかにするために、本研究ではフミン酸のモデル物質としてサリチル酸を取り上げ、サリチル酸とU(VI)との結合構造について、第一原理計算による解明を試みた。その結果、Uとサリチル酸は1:2錯体を形成することを明らかにするとともに、最適な構造も特定した。同時に、Uとサリチル酸の錯体上のフロンティア電子軌道密度から、この錯体が岩石や鉱物との相互作用を起こしにくくなっていることも明らかにした。地下水コロイドとして、マグネタイト微粒子ならびにヘマタイト微粒子を取り上げるとともに、アクチニドとして長期的な放射線的毒性を支配するネプツニウム(Np)を取り上げ、Np(V)の各コロイド微粒子への結合について検討を行った。とくに本年度は、雰囲気制御系における実験手法の確立、各コロイド微粒子とNpの相互作用の解明、第一原理計算として分子軌道法を取り上げて、それを適用するための系の設定を中心に研究を行った。本研究では、低酸素(Arガス)雰囲気下と大気開放系において、Npの吸着実験および脱離実験を行った。マグネタイト微粒子とヘマタイト微粒子への吸着、脱離挙動のAr雰囲気下と大気開放系における違いから、Np(V)のFe(II)によるNp(IV)への還元反応を伴う吸着反応が生じている可能性を明らかにした。また、液相におけるNp(V)イオンとFe(II)イオンの液中酸化還元反応実験から、Np(V)の還元反応が微粒子と液相との固液界面で起こっている可能性が大きいことも示した。さらに、大気開放系でのマグネタイト微粒子へのNpの吸着挙動の温度依存性を、25°C、40°C、60°Cで求め、さらに塩化カリウム、シュウ酸カリウムを用いた脱離実験を行った。マグネタイト微粒子表面における吸着、脱離の温度依存特性から、マグネタイト表面におけるNpに対する吸着サイトについての考察を行った。分光実験に関しては、文献調査を行った。文献に記載されているマグネタイトならびにヘマタイトの結晶構造から、分子軌道法で使用するための各表面クラスターの設定に関して検討を行った。大気開放下とAr雰囲気下で収着量の経時変化を調べ、その差からNp(V)からNp(IV)への還元速度を見積もることを試みた。実験では、PFAテフロン容器(180ml)にマグネタイトを3g加えさらに150mlの0.1M NaNO3溶液を加えた。HNO_3あるいはNaOHで液相のpHを5.7に調整した。合計3時間以上のバブリングの後、試料は雰囲気制御グローブボックスに持ち込まれ、さらに液中の酸素を排除するため収着実験まで約7日間雰囲気制御グローブボックス内に静置された。

さらに、大気開放下とAr雰囲気下における収着量の経時変化の差がNp(V)の還元によるものであることを確認するために、Ar雰囲気下においてNp(V)溶液と5時間、1日、2日、7日接触した後のマグネタイトからTTA/xyleneを用いた抽出法により収着したNpの価数を決定することを試みた。50mlのテフロン容器を用いて、上記の収着実験と同様の液性で、固液比が1g/40mlのサンプルを準備した。上記の所定の時間経過後に固液を分離し、マグネタイトに2.0M硝酸20mlと0.5M TTA/xylene溶液を加えて収着したNpの溶出とTTAによる抽出を行った。大気開放下における収着は1時間以内で平衡に達しているのに対し、Ar雰囲気下では2日間ほどの間、収着量が増加し続けることがわかった。Ar雰囲気下においてNp(V)溶液と5時間、1日、2日、7日接触した後のマグネタイトからTTA/xyleneによる抽出法を用いた実験の結果、Np(IV)として抽出される割合とAr雰囲気下でのNpの収着量の経時変化には相関があることがわかった。つまり、収着量の増加する挙動とNp(IV)として抽出される割合が増加する挙動は一致していることが分かった。このことから、Ar雰囲気下における収着量の経時変化について、1時間以降の収着量の増加はNp(V)が還元されてNp(IV)になる速度であると考えられた。このような結果に対して、一次反応を仮定した場合の見かけの速度定数を評価した。大気開放下、およびArガス雰囲気下におけるマグネタイトへの吸着量の経時変化を測定した。大気開放下では吸着量が1時間で平衡に達しているのに対し、Arガス雰囲気下での2時間以降も吸着量が上昇した。Np(V)とマグネタイトが1週間共存した場合、大気開放下においてはNpはほとんどがNp(V)として吸着し、Arガス雰囲気下ではほとんどがNp(IV)として吸着していた。このことから大気開放下、およびArガス雰囲気下での吸着速度の差異はNp(V)がNp(IV)に還元されるために生じたと考えられる。大気開放下におけるNp(V)の吸着が1時間で平衡に達していることから、2時間以降のArガス雰囲気下での吸着量の上昇はマグネタイトが共存した水溶液におけるNp(V)の還元速度を示すものであると考えることができ、このことは吸着したNpのうちNp(IV)をTTAにより抽出し、吸着量の増加とNp(IV)として吸着されるNpの割合の増加の傾向が一致していることから確認した。上記の考えに基づき、Arガス雰囲気下における吸着量と大気開放下における吸着量の経時変化から、マグネタイトが共存した水溶液において、Np(V)に対する1次反応を仮定し、下記のような吸着速度を得た。これは水溶液中における還元速度に比べて著しく大きいものであることから、Np(V)の還元反応が水溶液中ではなく、マグネタイト固液界面における反応であることが示唆された。