hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織培養法を用いた多糖資源海藻の養殖種苗生産とそのシステム開発に関する研究

本研究の目的である組織培養法を用いた多糖資源海藻の養殖種苗生産に最も適した海藻の種類と種苗生産条件に付いてみると、適種はヒロバノムカデノリであり、糸状体形成の好適条件は温度20°C、光量60-100μmol/m^2/sのときにオーキシン系の植物ホルモンをのNAAを0.1μg/ml1μg/mlの範囲で添加した培地、座の形成にはオーキシン系のIAAまたは2,4Dを0.1μg/ml1μg/mlの範囲で添加した培地、直立体の形成にはサイトカイニン系のZEAを0.1μg/ml添加した培地で得られた。一方、これらの条件下で形成されたヒロバノムカデノリの糸状体の増殖好適条件は、温度20°C、光量60-100μmol/m^2/s、BAPを0.1μg/ml10μg/mlの範囲で添加した培地であった。また、このときの糸状体をNAAを0.1μg/ml添加した培地で温度10°C、光量10-20μmol/m^2の条件下に置くと、生長は緩やかであったものの、これを、温度20°C、光量60-100μmol/m^2、BAPを0.1μg/ml10μg/mlに戻すと再び良い増殖を示した。さらに糸状体を温度20°C、光量40-60μmol/m^2条件下移したところ座と直立体の形成が認められた。以上の結果を糸状体作成、糸状体の大量培養、糸状体の種糸付け、種糸に付けた糸状体の座形成、そして直立体形成の各段階に応用することで、ヒロバノムカデノリの大量種苗生産のシステム化を可能にすることが期待できる。そして、これを現場に降ろすことにより本種を大量養殖することができる。今年度は、材料には多糖類資源の寒天海藻としてムカデノリを用いた。組織培養培地はPES培地を基本に、これに植物ホルモンとしてオーキシン系の2,4-D、IAA、NAAを、サイトカイニン系のカイネチンを添加した。その濃度は0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/Lの3段階とした。藻体はそれぞれ約1mmの長さの切片にして培養に用いた。培養の温度条件は8°C、15°C、20°Cとし、日長条件は12時間:12時間の中日条件とし、1)培養による組織形態の変化過程、2)培養条件、3)直立体形成条件、4)基質付着条件等について検討した。組織を培養すると、各温度条件下で組織の髄糸がまず伸長して、その後分枝して先端細胞で基質に付着する。付着すると先端細胞は分裂して盤状体を形成する。この髄糸先端細胞の分裂と発生様式は、本種の胞子の初期発生と非常に類似しており、所謂、直接盤状型を示した。このとき表層細胞には特別な形態的変化はみられなかった。植物ホルモンは、ホルモン間では有意さはみられなかったが、2,4-Dで高い効果がみられた。髄糸から形成された盤状体を毎秒5-10cmの流速を与えると、直立体の形成がみられた。しかし、流速を与えない条件下では、直立体の形成は殆どみられなかった。

一方、組織培養による養殖種苗の大量生産法の確立を基に、1)ムカデノリ藻体、2)髄糸から形成された盤状体の両者をそれぞれホモジェネートしたものを上記の条件下で培養した所、両者共に直立体を形成した。今年度は、多糖類資源海藻としてムカデノリ属のヒロハノムカデノリ、ヒラムカデ、カタノリ、フダラクの4種を用いた。組織培養培地は昨年の研究結果を基にPES培地を基本にして、これに植物ホルモンのオーキシン系の2,4-D、IAA、NAA、サイトカイニン系のカイネチンとゼアチンを0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/Lの濃度で添加した。藻体は3つの部位に分け、それぞれ約1mmの長さの切片にして培養した。15°C、中日条件でこれらを培養し、1)組織の形態変化と発生、2)直立体形成、3)糸状体の長期保存等について検討した。培養した4種の各部位の組織は何れも先ず、髄細胞の形態が糸状に変化して糸状体を形成した。その後、糸状体は分枝して先端の細胞が基質に付着し、細胞分裂して盤状体を形成した。この髄糸先端細胞の分裂と発生様式は4種とも、胞子の初期発生にみられる直接盤状型という発生過程を示した。植物ホルモンは、糸状体の形成ではオーキシン系の2,4-Dの3濃度で、盤状体の形成にはサイトカイニン系のカイネチンの0.1mg/L、1mg/L濃度で高い効果がみられた。4種の中でもヒロハノムカデノリで効果が顕著だった。本種の場合、盤状体は流速を与えない条件下でも直立体を形成したが、毎秒5-10cmの流速を与えると直立体の形成のみならず生長が良好だった。10°C、低照度の条件下で1年間保存したに糸状体を好適条件に移すと、糸状体は再成長し、直立体を形成した。また、この糸状体をホモジェネートしたものも、同様に糸状体の再生長、盤状体と直立体を形成した。今年度までの結果から、種苗生産システムの基本条件を明らかにすることができた。昨年度の結果から所期の目的に好適な種は、ムカデノリ属のヒロハノムカデノリであることがわかった。今年度は本種の種苗の大量生産法と養殖法に重点を置いて研究を進めた。種苗の大量生産法としては糸状体の長期保存条件、長期保存した糸状体の大量培養条件を、養殖方法としては糸状体の種糸付け条件、盤状体形成条件、直立体形成条件を調べた。これらの結果を基に、本種の種苗生産から養殖までのシステム化について検討した。糸状体の長期保存条件:光量子量は1020μmol・m-2・s-1、明暗12時間:12時間の中日、水温1015°C、KIN+BAPの濃度0.1μg・ml-1または2,4-Dの濃度0.1μg・ml-1、静置条件下で培養した時に糸状体は成長力を失うことなく保存できた。長期保存した糸状体の大量培養条件:光量子量は1040μmol・m-2・s-1、明暗14時間:12時間の長日、水温20°C、KIN+BAPの濃度1.1μg・ml-1または2,4-Dの濃度1.0μg・ml-1、通気条件下で培養した時に、糸状体は12ヵ月後に3倍以上に増殖し、最も良い結果が得られた。糸状体の種糸付け条件:光量子量は2040μmol・m-2・s-1、明暗12時間:12時間の中日、水温20°C、KINの濃度1.0μg・ml-1、静置の条件下で種糸にしっかりと付着していた。また、同時に糸状体も増殖していた。盤状体形成条件:光量子量は2060μmol・m-2・s-1、明暗10時間:14時間の短日、水温15°C、KINの濃度0.1μg・ml-1、通気の条件下で座の形成が最もよかった。直立体形成条件:光量子量は2060μmol・m-2・s-1、明暗12時間:12時間の中日から明暗14時間:10時間の長日、水温2025°C、KINの濃度0.1μg・ml-1、通水の条件下で直立体がよく形成された。これらの結果から、糸状体の保存は低光量、短日から中日、水低温、止水条件が、増殖と種糸付着は低光量、中日、やや高めの水温、止水条件が、盤状体と直立体の形成は高光量、2025°Cの条件下にすれば、種苗生産・養殖を最も良い条件下で制御できることがわかった。したがって、これらの条件を目的に応じて組み合わせることにより、多糖資源海藻ヒロハノムカデノリの養殖のシステム化が十分可能であることがわかった。
水流に応答して左右非対称にmRNAが減衰する機構の解明

細胞に加わる機械的刺激は、どのようにして細胞内の遺伝子の発現、翻訳などを制御しているのだろうか。私たちは哺乳類の左右軸決定機構の解明を通して、細胞が水流に応答する機構について新たなモデルを提唱することを目指している。受精後8日目のマウス胚において凹んだノードとよばれる組織ができる。マウスのノードには動く繊毛、動かない繊毛の2種類が存在している。動く繊毛はノードの中心部の細胞群に存在し、時計まわりに回転することで、ノード内に左向きの水流をつくりだす。一方、動かない繊毛はノードの脇に位置する細胞(クラウンセル)群に存在し、繊毛に局在するカルシウムチャネルPkd2を介して水流を感知する機能を持っている。水流が起こると、最初に左側のクラウンセル特異的にNodalのアンタゴニストであるCerl2 (Cerberus-like protein 2)と呼ばれる遺伝子のmRNAが減衰していく。しかし、そのメカニズムは不明である。私達は、この減衰が転写後のCerl2遺伝子の3'-UTRを介したmRNAの分解であることに着目して本研究を計画した。私達はds (destabilized)VenusのORFにCerl2の3'-UTRの配列をつなげた遺伝子をクラウンセルに特異的に発現させたトランスジェニック(Tg)マウス胚(dsVesus-3'-UTR)を作製した。このTg胚のクラウンセルでは左右非対称な蛍光が観察された。さらに、予備実験において、3'-UTRの約200bp配列内にmRNAを分解するのに必要な配列が含まれていることを明らかにした。本研究において、私たちは3'-UTR内の水流に応答する最小配列を特定し、その配列に結合する「RNA結合タンパク」あるいは「microRNA」を同定することで、水流依存的にCerl2のmRNAが分解される機構を明らかにすることを目標にしている。dsVenus-3'-UTRのTgの実験系を用いて、iv変異マウス胚(ノード流が消失する変異マウス)および、カルシウムチャネルを欠損するPkd2-/-においては、Venusのシグナルの左右差が消失することがわかった(左=右)。さらに、iv変異マウス胚に対して人工的に右向きの水流をかけた場合、Venusのシグナルの左右差が逆になった。これらの結果からCerl2 3'-UTRがPkd2を介して水流に応答することを明らかにした。さらに、3'-UTR内の水流に応答する最小配列を特定するためにマッピンングを行うとともに、予備実験で明らかになった3'-UTRの約200bp配列を欠失した変異マウスを作製中である。また、Cerl2 3'-UTRに結合する因子の有力な候補因子(RNA結合タンパク質)をみつけ、Tg (dsVesus-3'-UTR)を用いて、その候補因子の変異マウス胚でのクラウンセルでの蛍光パターンを観察したところ、bilaterally equalになることがわかった。Cerl2 3'-UTRに結合する因子の有力な候補因子(RNA結合タンパク質)に対して、Tgマウス、ノックアウトマウスを用いた実験に加え、in vitroの実験も行うことで、候補因子が、マッピングで明らかになったCerl2 3'UTR内の200bpの領域に直接結合し、Cerl2 mRNAを分解することができるか検討する。さらに、この候補因子の関連因子がいくつか報告されており、私たちの予備実験からもノードにおいても発現していることが示されている。また、並行して、MicroRNAの関与についても検証する。加えて、MS2-MCPシステムを用いたCerl2 mRNAの可視化も行う予定である。最終的に、左右非対称性の理解を通して、細胞が水流に応答する機構について新たなモデルを国内外に発表する予定である。

本研究において、私たちは3'-UTR内の水流に応答する最小配列を特定し、その配列に結合する「RNA結合タンパク」あるいは「microRNA」を同定することで、水流依存的にCerl2のmRNAが分解される機構を明らかにすることを目標にしている。dsVenus-3'-UTRのTgの実験系を用いて、iv変異マウス胚(ノード流が消失する変異マウス)および、カルシウムチャネルを欠損するPkd2-/-においては、Venusのシグナルの左右差が消失することがわかった(左=右)。さらに、iv変異マウス胚に対して人工的に右向きの水流をかけた場合、Venusのシグナルの左右差が逆になった。これらの結果からCerl2 3'-UTRがPkd2を介して水流に応答することを明らかにした。さらに、3'-UTR内の水流に応答する最小配列を特定するためにマッピンングを行うとともに、予備実験で明らかになった3'-UTRの約200bp配列を欠失した変異マウスを作製中である。また、Cerl2 3'-UTRに結合する因子の有力な候補因子(RNA結合タンパク質)をみつけ、Tg (dsVesus-3'-UTR)を用いて、その候補因子の変異マウス胚でのクラウンセルでの蛍光パターンを観察したところ、bilaterally equalになることがわかった。Cerl2 3'-UTRに結合する因子の有力な候補因子(RNA結合タンパク質)に対して、Tgマウス、ノックアウトマウスを用いた実験に加え、in vitroの実験も行うことで、候補因子が、マッピングで明らかになったCerl2 3'UTR内の200bpの領域に直接結合し、Cerl2 mRNAを分解することができるか検討する。さらに、この候補因子の関連因子がいくつか報告されており、私たちの予備実験からもノードにおいても発現していることが示されている。また、並行して、MicroRNAの関与についても検証する。加えて、MS2-MCPシステムを用いたCerl2 mRNAの可視化も行う予定である。最終的に、左右非対称性の理解を通して、細胞が水流に応答する機構について新たなモデルを国内外に発表する予定である。
尿路上皮癌における抗がん剤耐性獲得下の微小環境とユビキチンシステムの解明

シスプラチン(CDDP)治療後の再燃性尿路上皮癌では上皮間葉転換(EMT)が治療標的となり得る。我々はCDDP耐性尿路上皮癌T24PR・5637PR細胞のアレイ解析から、CDDP耐性下のFBXO32発現低下に注目した。In vitroではFBXO32ノックダウンに伴うEMT誘導が確認され、結果は過剰発現系で検証された。臨床組織ではFBXO32低発現群におけるEMT誘導が確認された。FBXO32発現低下の原因として、T24PR細胞ではFBXO32遺伝子のコード領域でヘテロ接合性消失が確認された。5637PR細胞ではFOXO1/3aの核内発現が低下しており、FBXO32発現抑制の一因と考えられた。難治性である転移・再発性尿路上皮癌の治療には、癌細胞のみならず宿主自身の微小環境制御を介した包括的アプローチが重要である。当教室では、血管新生・上皮間葉転換(epithelial-mesenchymal transition: EMT)を中心としたがん微小環境と泌尿器科癌について検討を重ねてきた。本研究は転移・再発性尿路上皮癌におけるシスプラチン(CDDP)耐性獲得後の微小環境変化として、アレイ解析より抽出したユビキチンリガーゼFBXO32発現低下とEMT誘導に着目した。慶應義塾大学病院における上部尿路上皮癌データベースと臨床検体(N=201)を用いた後ろ向き解析では、FBXO32低発現群におけるEMT関連因子SNAIL高発現とE-カドヘリン低発現が確認された。また病理組織学的因子に加えFBXO32低発現が術後再発・癌死に関連する独立した危険因子であった。CDDP耐性尿路上皮癌細胞株T24PRを用いた検討では、SiRNA法によるFBXO32ノックダウンに伴うEMT誘導とFBXO32過剰発現に伴うがん浸潤能低下が確認され、CDDP耐性下における新規EMT制御因子FBXO32を介したがん微小環境変化の可能性が示唆された。難治性癌である転移・再発性尿路上皮癌の克服を目的として、本年度はシスプラチン(CDDP)耐性下における上皮間葉転換(EMT)誘導の機序解明に焦点を当てた。網羅的アレイ解析から抽出したユビキチンリガーゼFBXO32発現低下に伴うEMT誘導機構として、FBXO32のユビキチン化基質であるMyoD発現が2種のCDDP耐性尿路上皮癌細胞株で上昇しており、EMT誘導の一因と考えられた。SiRNA法によるMyoDノックダウンではがん浸潤能低下を認めた。またCDDP耐性獲得下のFBXO32発現低下の調節分子として、FOXO転写因子であるFOXO1・FOXO3aの核内発現が、CDDP耐性尿路上皮癌細胞株5637PRではAKTリン酸化上昇に併せて低下しており、FBXO32発現低下の原因と考えられた。膀胱癌臨床組織(N=94)を用いた後ろ向き解析では、FBXO32低発現群におけるEMT関連因子SNAILの高発現とE-cadherin低発現が確認され、FBXO32低発現群でのEMT誘導が示唆された。本染色結果を用いた予後解析では、膀胱癌においてFBXO32低発現が術後再発・癌死に関連する危険因子であり、膀胱癌おける予後予測マーカーとしての有用性が示唆された。H27年度は、CDDP耐性下のおけるFBXO32-EMT機構の更なる解明を目的に、まずFBXO32下流カスケード解明に焦点を当てた。FBXO32のユビキチン化基質であるMyoDの発現上昇が、CDDP耐性尿路上皮癌細胞株ではEMT誘導の原因である可能性が示唆された。またFBXO32上流カスケードとして、FOXO転写因子FOXO1・FOXO3aを介したFBXO32発現低下が新たに確認され、昨年報告した染色体レベルでのFBXO32発現抑制とは対照的である、CDDP耐性獲得下のエピジェネティック変化を介したFBXO32発現調節が示唆された。膀胱全摘術が行われた膀胱癌組織を用いた免疫組織学的染色では、FBXO32低発現群におけるSNAILの高発現とE-カドヘリン低発現が確認され、昨年報告した上部尿路上皮癌に加えて、膀胱癌においてもFBXO32低発現群でのEMT誘導が示唆された。また予後解析においては、膀胱癌における予後予測マーカーとしてのFBXO32発現の有用性が示唆された。シスプラチン(CDDP)治療後の再発性尿路上皮癌では、上皮間葉転換(EMT)が重要な治療標的である。本研究ではCDDP耐性尿路上皮癌におけるユビキチンリガーゼFBXO32発現低下を介したEMT誘導機構を明らかにした。本年度は、これまで得られた知見を一般化する基礎・臨床データの集積に加えて、FBXO32発現を介したCDDP耐性獲得機構の同定に焦点を当てた。FBXO32発現低下に伴うEMT誘導の基礎データとして、ヒト尿路上皮癌細胞株5637へのSiRNA法による、FBXO32ノックダウンに伴うEMT誘導を検証した。FBXO32発現低下に伴いE-カドヘリン発現抑制及びEMT関連因子SNAILの発現誘導が確認され、先行研究で得られたヒト尿路上皮癌細胞株T24と同様の結果であった。

また特異的基質であるMyoD発現も、5637細胞より誘導されたCDDP耐性尿路上皮癌細胞株5637PRで上昇が確認され、CDDP耐性下のFBXO32発現低下によるEMT誘導機構がより一般化された。膀胱癌臨床組織を用いたCDDP治療前後の比較検討では、CDDP治療後のFBXO32発現低下及びSNAIL高発現が免疫組織学的に確認され、CDDP治療に伴うFBXO32発現抑制がヒト腫瘍組織で一般化された。術後補助治療としてCDDPが投与された膀胱癌症例に着目した後ろ向き生存解析(n = 35)では、FBXO32低発現群における有意に高い術後死亡率が確認され、化学療法の感受性を予測するバイオマーカーFBXO32の可能性が示唆された。FBXO32遺伝子のCDDP耐性獲得機構への関与を明らかにするため、FBXO32ノックダウン・過剰発現に伴うCDDP感受性変化を検討したところ、CDDP感受性下ではFBXO32発現抑制に伴うCDDP耐性の獲得、CDDP耐性下ではFBXO32発現上昇に伴うCDDP感受性の再誘導が確認された。シスプラチン(CDDP)治療後の再燃性尿路上皮癌では上皮間葉転換(EMT)が治療標的となり得る。我々はCDDP耐性尿路上皮癌T24PR・5637PR細胞のアレイ解析から、CDDP耐性下のFBXO32発現低下に注目した。In vitroではFBXO32ノックダウンに伴うEMT誘導が確認され、結果は過剰発現系で検証された。臨床組織ではFBXO32低発現群におけるEMT誘導が確認された。FBXO32発現低下の原因として、T24PR細胞ではFBXO32遺伝子のコード領域でヘテロ接合性消失が確認された。5637PR細胞ではFOXO1/3aの核内発現が低下しており、FBXO32発現抑制の一因と考えられた。H26年度はまず、慶應義塾大学病院における上部尿路上皮癌データベースを基に、臨床検体を用いた免疫組織学的染色によるFBXO32発現とEMTの関係を検討した。FBXO32低発現群におけるSNAIL高発現とE-カドヘリン低発現が確認され、FBXO32発現低下を介したEMT誘導が示唆された。更に本データベースを用いた上部尿路上皮癌の予後解析においては、上部尿路上皮癌における予後予測マーカーとしてのFBXO32発現の有用性が示唆された。CDDP耐性尿路上皮癌細胞株T24PR細胞を用いたIn vitro解析においても、FBXO32ノックダウンに伴うEMT誘導とFBXO32過剰発現に伴う細胞浸潤能の低下が確認され、新規EMT制御因子FBXO32の可能性が示唆された。またCDDP耐性下におけるFBXO32発現抑制のメカニズム解明として、T24PR細胞を用いたCGHアレイ解析を行い、CDDP耐性株における8番染色体長腕領域のLOHが確認された。本領域はFBXO32遺伝子のコード領域であり、T24PR細胞における染色体レベルでのFBXO32発現抑制が示唆された。1)化学療法治療前後の組織検体を利用した免疫組織学的検討:局所進行性である膀胱癌では術前全身化学療法後に摘出術が行われる。本治療プロセスを利用することにより、化学療法前後の癌組織を比較検討することが可能であり、本研究では同一症例での縦断的なFBXO32・EMT関連因子の発現変化を解析予定である。2)FBXO32発現を介したCDDP耐性獲得機構の同定と癌幹細胞性への関与:FBXO32はヒストンメチル化酵素阻害剤の誘導遺伝子として癌研究では注目された。
新制度学派的アプローチによるわが国人権教育30年の「逆説」に関する検討

本17年度の研究は、昨年度に続き事例に密着した記述的アプローチを中心に行った。特に、昨年度に引き続いて高知県における同和教育実践に大きな役割を果たした「福祉教員」に関する現地での資料収集、聞き取り調査を行い、またその事例の相対化かをはかるため、10年遅れで福祉教員制度を導入した隣県の徳島県にまで調査対象を広げた。幸い、高知の場合よりもまとまった形で実践報告集等の資料が得られたので、今後、資料の分析をさらに行い、新制度学派の理論を応用して、教育の病理を教育を持って制すという「合理的神話」がどのように歴史的現実を構成していったかの記述的研究を完成させたいと考える。また、福祉教員に焦点を当てた同和・人権教育再考の試みの中で、家庭-学校関係の編み直しを分析する視座の重要性に気づいた。その中でも特に、宿題という事象を挟んでの学校と家庭(の背後にある部落・地域)との緊張関係が、同和教育実践史の隠れた縦糸となっていることを取り上げ、「<宿題>から見た解放教育:教育総動員体制論序説」を公表した。本論考では高知の事例だけでなく、大阪市の日之出、松原の布忍における放課後の補充学習や子ども会を舞台にした綱引きにも焦点を当て、同和教育運動がどのように教育の拡張的再定義へと向かっていったのかを分析した。また、第10次までの日教組教研集会での同和教育関係の資料を渉猟し、そこに<特殊>という鍵概念のはたらきによって、後の教育の拡張的再定義とは異質な現実構成が見られることを論じた。そうした同和教育に関する研究の一方で、もう一つの軸である在日朝鮮人教育については、現在の在日外国人(朝鮮人)教育実践の基底にあって、これまであまり省みられてこなかった問題を、「日本人性Japaneseness」の概念を用いて説き明かす試みを本年度に行った。在日外国人の子どもに関わる一方で、日本人の子どもが均質なものとして表象、構成されることがその論点である。また、共著論文「おびえる日本社会、凝固化する在日朝鮮人問題:あるビデオドキュメンタリーを素材とした"超・メディア社会学"の試み」では、在日朝鮮人教育の熱心な実践家を共感的に紹介する映像作品の中に、どのような暗黙の前提が忍び込んでいるかを分析した。15年度は、研究の理論的ベースとなるマイヤー新制度学派の教育社会学論文の読み込みを行う一方、わが国人権教育30年の諸事実を資料ならびに関係者からの聞き取りで吟味する中で、どの局面に焦点化することが、新制度学派の理論的インパクトを最大限に引き出し、また他方で同理論に対して拡張ないし修正を迫る契機を最も効果的に提供するかを考察した。その結果、まず新制度学派理論の核心として、(1)教育の拡張=社会の学校化の動態に正面から挑んだ理論である、(2)教育思想、理念(本ケースで言えば、人権思想、ラディカリズム、解放的教育学)によって動態を説明する既存の図式の超克を図ろうとしている、(3)動態の説明の中心に、学校による自己保存機制を位置づけている、の三点を抽出した。次に、わが国人権教育30年の歴史、とりわけ被差別部落の子どもを対象とした同和教育関連の種々の資料、ならびに関係者からの談話を参照した結果、批判的運動としての同和教育が学校社会への子どもの囲い込み(包摂)としての性格を持った「逆説」の背景に、当時の部落における家庭状況の特殊性、つまり、子どもの教育に濃密な関心を示し子ども中心に回転するいわゆる「近代家族」の未成立という事情があることが明らかになった。よってここから、同和教育と部落家庭との接面(インタフェイス)、たとえば徹底した家庭訪問や「池域進出」の諸相が、「逆説」を浮かび上がらせる絶好の観測点であることが明らかとなった。つまり包摂はまずもって、部落家庭への働きかけを通した「家庭の学校化」現象であった。現在この観点から、大同教ならびに全同教の実践報告を分析、検討中である。また在日韓国・朝鮮人教育実践との比較・対照を、今後予定している。他方、同和教育の関連資料の検討ならびに関係者からの聞き取りから、上記の「家庭の学校化」の枠組みで捉えられない、逆に「学校の家庭化」とも呼ぶべき側面も明らかになった。同和教育は、部落の家庭が、近代家族としての教育機能を差別に由来する社会経済的困難ゆえに担いきれないことに鑑み、隣保館等での放課後の宿題指導・学力保障の取り組み、長期休暇や休日まで及ぶ子ども会活動などを通して、教育の力で近代家族を代替的に「保障」しようとする性格も備えていた。いわば「学校の家庭化」の側面である。これは、新制度学派の理論ではカバーできない複雑な現象であり、上記「家庭の学校化」とならび、その記述データを今後蓄積することで、人権教育の「逆説」が立体的に浮き彫りになるものと期待される。本16年度の研究は、事例に密着した記述的アプローチを軸とした。その中でも特に、高知県における同和教育(解放教育)実践に大きな役割を果たした「福祉教員」の存在をクローズアップし、二度にわたる現地での資料収集・聞き取り調査を行い、それらをもとに単なる実証的調査とは異なる、明確な理論的視座からの実践の解釈を行った。その成果は論文「福祉教員制度の成立・展開と教育の<外部>:高知県の事例を手がかりに」(『人権問題研究』5、2005年)にまとめられた。

福祉教員とはそもそも、日本敗戦後の混乱期に学制改革が急速になされたことに伴い発生した大量の不就学・長欠問題に対処するべく、高知県が独自に措置した特別な制度である。同和・解放教育を直接の目的としたものではなかったが、その配置は明らかに部落問題を意識したものとなっており、同県における同和教育発展の基礎となったのは当然のことであった。この福祉教員たちの心情と論理を読み解くことで、同和・解放教育(また在日朝鮮人教育など、主要な人権教育)の基底的問題を、教育における<外部>の問題として概念化した。それは、一般に教育実践者が、社会に存在する差別・被差別関係や権力関係のただ中にある子どもの問題に足を踏み入れる際、実践者が行なうことを余儀なくされる現実構成であり、ルーマン・システム論の言うところの「縮減」に相当する。換言すればこれは問題となる現実を、本来教育者が「手を下しようがない」と観念されるものから教育的に「取り扱い可」へと書き換える操作である。この操作は、教育を大きく外部へ開き従来の殻を破る変革的契機であるとともに、他方で「書き換え」のシェマが万能化するとき、教育の手による社会問題や権力関係の矮小化、等閑視につながるという意味で諸刃の剣である。この点で、本研究課題の掲げる「逆説」が、解放教育の実践のなかに内在的にはらまれるさまが鮮明に浮き彫りにできたと考えられる。上掲研究でえられた視座を基本に、1950-60年代の大阪市における公立学校での在日朝鮮人教育(民族学級を除く)の展開を再検討したのが、論文「公立学校における在日朝鮮人教育のリアリズムと公共性:1950-60年代の「朝問協」とりわけ玉津中学校における展開を中心に」である。本論文によって、従来実践史的に「暗黒時代」「空白」と考えられていた60年代に全く新しい光を当てることができた。むろんその内実は、上で言う「逆説」によって鋭く引き裂かれているが、そのこと自体が決して実践の価値を貶めるものでないことが論証できたと考える。本17年度の研究は、昨年度に続き事例に密着した記述的アプローチを中心に行った。特に、昨年度に引き続いて高知県における同和教育実践に大きな役割を果たした「福祉教員」に関する現地での資料収集、聞き取り調査を行い、またその事例の相対化かをはかるため、10年遅れで福祉教員制度を導入した隣県の徳島県にまで調査対象を広げた。幸い、高知の場合よりもまとまった形で実践報告集等の資料が得られたので、今後、資料の分析をさらに行い、新制度学派の理論を応用して、教育の病理を教育を持って制すという「合理的神話」がどのように歴史的現実を構成していったかの記述的研究を完成させたいと考える。また、福祉教員に焦点を当てた同和・人権教育再考の試みの中で、家庭-学校関係の編み直しを分析する視座の重要性に気づいた。その中でも特に、宿題という事象を挟んでの学校と家庭(の背後にある部落・地域)との緊張関係が、同和教育実践史の隠れた縦糸となっていることを取り上げ、「<宿題>から見た解放教育:教育総動員体制論序説」を公表した。本論考では高知の事例だけでなく、大阪市の日之出、松原の布忍における放課後の補充学習や子ども会を舞台にした綱引きにも焦点を当て、同和教育運動がどのように教育の拡張的再定義へと向かっていったのかを分析した。また、第10次までの日教組教研集会での同和教育関係の資料を渉猟し、そこに<特殊>という鍵概念のはたらきによって、後の教育の拡張的再定義とは異質な現実構成が見られることを論じた。
癌細胞によるアポトーシス細胞貪食:分子機構と病理学的意義

口腔扁平上皮癌(SCC)の病理診断において、癌細胞内にアポトーシス癌細胞が存在する所見にしばしば遭遇するが、本現象の病理学的意義は不明である。そこで、「アポトーシス癌細胞は貪食専門細胞によって処理されるだけでなく、同種間貪食によっても処理される」という仮説をたて、アポトーシス細胞貪食に関与する候補分子としてMFG-E8に注目し、以下の検討を行った。口腔SCC手術材料を用いてMFG-E8の発現様式を検索したところ、アポトーシス癌細胞にMFG-E8陽性が強調され、その一部は生活癌細胞の細胞質内に存在していた。また、癌細胞におけるMFG-E8高発現が腫瘍進展に相関することが示された。口腔SCC細胞株を用いた試験管内実験では、SCC細胞株でMFG-E8が高発現しており、アポトーシスを誘導した細胞と共培養すると、SCC細胞はアポトーシス細胞を貪食し、リコンビナントMFG-E8添加により貪食が増強された。また、siRNA法によってMFG-E8発現を抑制すると、アポトーシスの亢進とともに、癌細胞の細胞増殖と浸潤性が低下した。以上の実験結果から、アポトーシスをきたした癌細胞は同種癌細胞によって貪食処理されるが、その貪食にはMFG-E8が関与していることが判明した。さらに、アポトーシス癌細胞を貪食した癌細胞ではMFG-E8の発現が上昇し、その結果、貪食癌細胞の増殖浸潤能が増強されることも確認した。昨年度に引き続き、本年度は以下の実験を行った。1)MFG-E8発現抑制による癌細胞の機能変化解析:口腔扁平上皮癌由来細胞系ZK-1を用いて、siRNA導入によりMFG-E8発現を抑制したところ、細胞増殖能が有意に低下した。細胞周期解析およびアポトーシス解析の結果から、MFG-E8抑制細胞は細胞周期が遅延するだけでなく、アポトーシスが亢進することが明らかとなった。さらに、マトリジェル浸潤試験では、MFG-E8抑制により浸潤能も低下した。2)試験管内アポトーシス細胞貪食実験:紫外線(UV)照射によってアポトーシスを誘導した蛍光標識Jurkat細胞を口腔扁平上皮癌由来細胞系ZK-2に添加して24時間共培養したのち固定・染色を施し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。アポトーシスをきたしたJurkat細胞はZK-2細胞によって積極的に貪食され、その際、MFG-E8が貪食されたアポトーシス細胞周囲に濃縮することが示された。3)リコンビナント(r)MFG-E8添加による貪食亢進:UV照射したJurkat細胞にあらかじめrMFG-E8を添加した。すると、rMFG-E8はUV非照射Jurkat細胞に比べ、UV照射Jurkat細胞により多く結合することがわかった。さらに、これらをZK-2に添加したところ、rMFG-E8を添加したUV照射Jurkat細胞は、より高頻度にZK-2細胞によって貪食されることが明らかとなった。昨年度に行った病理組織標本でのMFG-E8発現解析に加え、本年度施行の培養細胞を用いた実験の結果から、MFG-E8は癌細胞同士のアポトーシス細胞貪食を促進するとともに、癌細胞機能を亢進させる可能性が示された。本年度は以下の実験を行った。1)口腔扁平上皮癌におけるアポトーシス細胞貪食関連分子MFG-E8の免疫組織化学的検索:口腔扁平上皮癌53症例を対象にMFG-E8の発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、全例において非腫瘍部の口腔粘膜上皮はMFG-E8非陽性であったのに対し、44例(83%)で癌細胞にMFG-E8陽性が認められ、浸潤先端部でMFG-E8陽性が強調されていた。

53症例をMFG-E8高発現腫瘍・低発現腫瘍の2群に分け、臨床病理学的因子との相関を検討したところ、MFG-E8高発現群は低発現群に比べて腫瘍径・浸潤距離が有意に大きく、術後再発率も高かった。さらに、アポトーシスをきたした癌細胞はMFG-E8強陽性を示し、その一部は生活癌細胞の細胞質内に取り込まれていた。2)口腔扁平上皮癌細胞株におけるMFG-E8の発現解析:口腔扁平上皮癌細胞株(ZK1, ZK2, MK1)におけるMFG-E8発現を検索したところ、いずれの細胞株でもMFG-E8の遺伝子・蛋白質発現が確認された。MFG-E8は主に細胞質および細胞膜表面に局在しており、特に核分裂細胞で強調されていた。さらに、si RNA導入によりMFG-E8発現を抑制すると細胞増殖が低下することが明らかとなった。3)試験管内アポトーシス細胞貪食実験紫外線照射によりアポトーシスを誘導したJurkat細胞を、MFG-E8高発現株ZK2細胞に添加して、ZK2細胞によりアポトーシス細胞が貪食されるかを検討した。24時間の共培養後、ライソゾームマーカーLAMP-1の免疫細胞染色を行った結果、アポトーシス細胞はZK2細胞のライソゾーム内に取り込まれていることが確認された。口腔扁平上皮癌において、貪食されたアポトーシス癌細胞に一致してMGF-E8の発現を確定しえたので、まずは仮説の基本部分の証明ができ、研究計画が妥当であったと評価される。さらに、MFG-E8発現の臨床病理学的意義、とくに癌細胞増殖・進展への関与もできたことから、当初の計画どおりに実験成果を得ている。本年度の成果によって、当初の研究方向性に変更なく、次年度も実験を進めたい。具体的には、MFG-E8が癌細胞同士のアポトーシス細胞貪食に関与する可能性について、直接的な証左を得ることを目標とし、Jurkat細胞を用いた貪食実験系で、MFG-E8発現変動による癌細胞のアポトーシス細胞貪食機能を検定し、さらに、アポトーシス細胞貪食が癌細胞の増殖・遊走・浸潤に及ぼす影響について解析する。次年度の検討は培養細胞実験が主体となるため、細胞培養や遺伝子・蛋白質発現解析に用いる実験試薬、プラスチック器具などの購入に消耗品費として使用する予定である。その他、学会での研究成果公表、学外専門家との研究打ち合わせのために国内旅費も計上している。
リバースＴＲ（橋渡し研究）としての腫瘍内免疫応答の解析とバイオマーカーの検索

革新的な免疫細胞治療法を開発するために、東大病院で実施された橋渡し研究で得られた患者検体と臨床情報をフィードバックして、治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析と機能的に統合し、免疫細胞治療に於ける症例選択と治療効果判定に重要なバイオマーカーの同定を試みた。がんワクチン治療、樹状細胞治療、γδT細胞移入治療のTRにおいて、臨床効果が得られた症例を経験する一方で、抗腫瘍免疫応答が誘導されたにもかかわらず、十分な治療効果が得られない症例も数多く存在する。B16メラノーマ担癌マウスの免疫治療モデルでは、腫瘍に対する免疫応答が、免疫抑制性の環境を誘導しており、その制御が重要であることを明らかにした。1臨床試験で得られた検体の解析胃がんによる癌性腹膜炎のため腹水が貯留している7名の患者に対して、末梢血中のγδT細胞をゾレドロン酸とIL-2を用いて選択的に培養増殖させ、得られたγδT細胞を腹腔内に投与し(試験名:腹水貯留胃癌に対するγδT細胞治療、臨床試験審査委員会:P201019-11Z、UMIN-CTR:UMIN000004130)その結果をCancer Med誌に報告した(Wada et al. Cancer Med 2014Feb 7.doi: 10.1002/cam4.196)。投与したγδT細胞は免疫抑制分子Tim-3を強発現していた。Tim-3のリガンドであるガレクチンの血清中の濃度は、癌患者では健常者より上昇しており(3.3±1.4 ng/ml vs 0.8±0.4 ng/ml)、腹腔内のガレクチン濃度は更に高値(7.8±5.3 ng/ml)であった。癌性腹膜炎患者の腹腔内(腹水中)は、免疫抑制性の環境であり、ガレクチン/Tim-3を制御することで更なる抗腫瘍効果が得られる可能性が示唆された。2免疫細胞治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析革新的な免疫細胞治療法を開発するために、東大病院で実施された橋渡し研究で得られた患者検体と臨床情報をフィードバックして、治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析と機能的に統合し、免疫細胞治療に於ける症例選択と治療効果判定に重要なバイオマーカーの同定を試みた。1本年度は、NY-ESO-1fペプチドワクチン1例、HSP105樹状細胞ワクチン8例、腫瘍ライセート樹状細胞ワクチン(腎癌3例、食道癌1例)、γδT細胞治療(膵癌13例、胆管がん4例、胃がん3例、食道癌11例、肺癌2例)合計46例の癌患者に対して240回の免疫治療を実施した。治療経過中に末梢血を採取しリンパ球と血漿・血清を採取して免疫モニタリングを実施した。特にγδT細胞治療において、投与されたγδT細胞はIL-2の追加投与を受けることなく長期間患者の末梢血に存在し、刺激に対して速やかにIFN-γを産生し、細胞傷害活性のマーカーとなるCD107aを発現することから、エフェクター活性を保持していることを証明した。体内でγδT細胞はIL-2受容体β鎖とγ鎖を発現していることから、生体内でIL-15がγδT細胞の生存に関与していると考えられた。この結果をCytotherapy. 2013 Apr;15(4):481-91 Epub 2013 Feb 5.に報告した。2免疫細胞治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析B16メラノーマ細胞を皮下に接種した担癌マウスに対して、CTLを尾静脈から投与しCTL治療モデルを構築した。投与されたCTLは腫瘍だけでなく全身の臓器にも分布するが、腫瘍内に浸潤したCTLだけが、腫瘍の認識によりCD137分子を発現する。そこで、抗CD137抗体を投与してCTLの活性化を試みたところ、全身に分布するCTLは活性化されず、臓器障害などの有害事象を起こすことなく、腫瘍内のCTLのみが抗CD137抗体で活性化され、IFN-γの産生と細胞傷害活性の増強を認め、抗腫瘍効果を増強することに成功した。この結果をJ Immunother. 2012 Jul;35(6):460-72.に報告した。1がん免疫治療の臨床試験において、免疫動態の解析と治療の効果を予測するバイオマーカーの探索を行った。癌性腹膜炎患者に対して、γδT細胞を腹腔内に投与し(試験名:腹水貯留胃癌に対するγδT細胞治療UMIN-CTR:UMIN000004130)その結果を報告した(Cancer Med. 2014;3(2):362-75.)。

最終年度は、転移性腎がん患者に対して、スニチニブと樹状細胞ワクチン治療の併用治療の臨床試験(試験名:腎細胞がんに対する樹状細胞ワクチン治療の安全性と有効性の評価UMIN-CTR:UMIN000002136)の検体を詳細に解析し、スニチニブにより末梢血中の骨髄性抑制細胞や抑制性T細胞が減少し、腫瘍反応性のT細胞が誘導されることを報告した(J Immunother Cancer. 2014;19;2:30)。12の課題において、臨床試験と動物モデルを通じて、がん免疫治療における免疫制御の解明に貢献できた。腫瘍免疫学本研究は、東大病院において実施しているTRで得られた患者検体と臨床情報をフィードバックした解析と、治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析を機能的に統合し、免疫細胞治療に於ける症例選択と治療効果判定に重要なバイオマーカーを同定することが目的である。まず、ヒトがん免疫治療の臨床試験を実施して患者の検体を採取し免疫モニタリングをおこなうことを重要であるが、本年度は、7例の胃がんによる癌性腹膜炎患者に対してγδT細胞の腹腔内投与を実施した。末梢血および腹水を採取して詳細な免疫動態解析を実施することができた。特にγδT細胞が腹腔内でがん細胞を認識して結合し、IFN-γやTNF-αの産生を確認したことは、γδT細胞の抗腫瘍効果を初めて直接証明した非常に意義深いものである。腹腔内の免疫抑制性分子であるガレクチンが大量に存在することが明らかになったことから、今後その制御法の開発が望まれる。モデルマウスにおいても、CTL治療による腫瘍内での免疫応答の詳細な解析により、CTLは、強い抗腫瘍活性と持つとともに(アクセル)、免疫抑制性の細胞であるMDSCを大量に腫瘍内に呼び寄せる(ブレーキ)作用を持つことが明らかになった。抑制性T細胞(Treg)に加えて、MDSCの制御、あるいはMDSCが産生する抑制性の分子であるROS、NO、Arginase等の分子の制御により、CTLの持つ抗腫瘍効果を更にたかめることが可能であると期待される。また、MDSCはCCR2受容体を発現しており、CTLが産生するIFN-γにより腫瘍内に産生されるCCR2リガンドにより腫瘍内へ浸潤することから、CCR2およびそのリガンドも腫瘍内の免疫応答の制御分子となりうる。腫瘍内での免疫応答の解析により、免疫抑制性の環境を形成している分子を同定することができた。以上のことから、本研究は概ね順調に進展している。本研究の目的は、「リバースTR(橋渡し研究)としての腫瘍内免疫応答の解析とバイオマーカーの検索」を実施して、革新的な免疫細胞治療法を開発することである。東大病院において実施しているTRで得られた患者検体と臨床情報をフィードバックした解析と、治療モデルマウスを用いた免疫動態の解析を機能的に統合し、免疫細胞治療に於ける症例選択と治療効果判定に重要なバイオマーカーを同定することが目的である。まず、ヒトがん免疫治療の臨床試験を実施して患者の検体を採取し免疫モニタリングをおこなうことを重要であるが、本年度は、46例の患者に対して240回の免疫治療を実施した。末梢血を採取してリンパ球と血清・血漿を採取して、詳細な免疫動態解析を実施することができた。特に肺がんに対するγδT細胞治療は先進医療として承認され、より臨床効果の検証が求められるが、そのためにも、本研究で実施したγδT細胞の体内動態に関する免疫モニタリングは意義深いものである。モデルマウスにおいても、CTLの体内動態と抗原認識に基づく細胞マーカー(CD137分子)の発現に着目した革新的な抗体治療法の開発をおこなうことができた。抗CD137抗体治療は、その強い免疫活性化作用に着目し、がん治療への応用が期待されながら、全身投与により、非特異的なT細胞の活性化による重篤な肝障害を誘発するため、臨床応用が困難であった。我々は抗体治療にCTL治療を併用することで、非特異的なT細胞の活性化に必要な抗体量より低容量で選択的に、腫瘍内で腫瘍を認識して腫瘍を攻撃するCTLだけを活性化することが可能であることを証明した。
ボーズ凝縮・フェルミ縮退したイッテルビウム原子を用いた次世代光周波数標準の開発

本研究では、光格子中に捕獲された、ボーズ凝縮またはフェルミ縮退したイッテルビウム原子を用いて、全く新しい光周波数標準を開発することを目的として、研究を進めてきた。光格子中に捕獲された原子団は量子縮退程度まで冷却されると格子間でホッピングや近接原子との相互作用などが一般的に無視できなくなり、ボーズハバードモデル、もしくはハバードモデルにより記述されると考えられる。その際は、固体中での電子系のように相関の無視できない多体問題の物理現象を引き起こす。光格子中に捕獲された原子を分光などの手段を用いて、光周波数標準に応用するためには、このような物理を十分理解することが必要である。これらは本研究の遂行にはとても重要な鍵となるものであるが、世界的にみてもこれら研究はまだ始まったばかりであり、その物理は十分に解明されていない。そこで光格子中に捕獲された原子団の振る舞いを研究するために、非常に優れた実験装置を持っているスイス連邦工科大学チューリッヒ校に滞在し、Tilman Esslinger教授らと共同で三次元光格子に捕獲された原子団の研究を行った。その結果、フェルミ縮退領域まで十分冷やされたカリウム原子のフェルミ同位体を用いた実験において、相互作用を変化させることにより、光格子中に捕獲された原子の動的振る舞いを変化させることに成功した。これには多体問題としての原子相関が寄与していると可能性があり、非常に興味深い。本研究は、ボーズ凝縮またはフェルミ縮退したイッテルビウム原子を用いて高精度の光周波数標準を開発することを目的としている。そのためには、ボーズ凝縮したボゾン同位体、もしくはフェルミ縮退したフェルミオン同位体を光格子中に導入することが必要である。平成16年度では、レーザー冷却し、その後に蒸発冷却されたイッテルビウム原子を光格子中に捕獲することに成功した。特に実空間において1次元を格子状にした1次元光格子だけでなく、2次元光格子、3次元光格子それぞれを用いて、ボゾン同位体、フェルミオン同位体各々の原子団の捕獲にも成功した。フェルミオン同位体は統計性によりボゾン同位体と比べて低温では蒸発冷却の効率が著しく悪くなることが知られている。そこで、フェルミオン同位体の効率的な冷却を目的として、ボゾン同位体とフェルミオン同位体の同時捕獲の実験を行い、成功した。その結果、フェルミオン同位体はボゾン同位体との相互作用により効率よく冷却されるが、ボゾン同位体の原子数が急激に減少してしまうため、蒸発冷却が停止してしまうことを発見した。また、量子縮退した原子団の光格子による捕獲についても研究をすすめた。これらは光格子中での蒸発冷却、もしくは光格子中への量子縮退原子の導入により行った。その結果、ボゾン同位体を用いた場合はボーズ凝縮体を、フェルミオン同位体を用いた場合はほぼフェルミ温度と等しい温度の原子団の光格子に捕獲することにそれぞれ成功した。そのためには、ボーズ凝縮したボゾン同位体、もしくはフェルミ縮退したフェルミ同位体を光格子中に導入することが必要である。平成17年度では、レーザー冷却し、その後に光双極子トラップ中に捕獲されたフェルミオン同位体原子の蒸発冷却を主に行った。2つあるフェルミオン同位体のうち、熱平衡が十分早い同位体を用いて蒸発冷却を行った。その結果、フェルミ温度の0.6倍程度まで冷却することに成功した。また、フェルミ縮退に起因すると思われる、蒸発冷却の効率の低下を観測することに成功した。これらから、我々がフェルミ縮退までほぼ冷却に成功したと考えられ、非常に興味深い。特に、希薄原子気体のフェルミ縮退では今までにリチウム原子とカリウム原子の2つのアルカリ金属原子を用いた実験でのみ実現しており、イッテルビウムという全く異なる原子を用いてのフェルミ縮退実現は非常に意義のある成果と考えられる。また、別のフェルミオン同位体を用いての蒸発冷却実験も行った。この場合は、熱平衡化が十分早くないため、熱平衡が十分速い別のボゾン同位体とともに同時に1つの双極子トラップに捕獲し、その2つの同位体間の原子衝突による共同冷却を行った。ボゾン同位体の原子数を増加させるなどの改善を行い、その結果、フェルミ温度とほぼ同じ程度まで冷却することに成功した。

そこで光格子中に捕獲された原子団の振る舞いを研究するために、非常に優れた実験装置を持っているスイス連邦工科大学チューリッヒ校に滞在し、Tilman Esslinger教授らと共同で三次元光格子に捕獲された原子団の研究を行った。その結果、フェルミ縮退領域まで十分冷やされたカリウム原子のフェルミ同位体を用いた実験において、相互作用を変化させることにより、光格子中に捕獲された原子の動的振る舞いを変化させることに成功した。これには多体問題としての原子相関が寄与していると可能性があり、非常に興味深い。
離乳期におけるラクターゼ発現低下への非コードＲＮＡの関与

ラクターゼは哺乳動物の小腸に発現し、母乳中の唯一の糖質である乳糖を加水分解する酵素である。この活性は哺乳期には高く離乳期に至るまで著名に発現低下するが、その低下機構は未だ明らかにされていない。本研究では低分子RNA(microRNA; miRNA)がラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているという仮説に基づき検証を行った。miRNAを3D-Gene&reg; miRNAOligo chipを用い網羅的に解析すると哺乳期より離乳期以後で発現の高い複数の低分子RNAが存在した。しかし、候補miRNAとラクターゼmRNA、ラクターゼの転写活性化因子mRNAと比較しても相補性ではなかった。ラクターゼーフロリジン加水分解酵素(ラクターゼ)は、哺乳動物の小腸粘膜細胞に存在し、母乳中に含まれる唯一の炭水化物源であるラクトースを加水分解する。ラクターゼは胎生期後半より発現し、出生時を頂点として離乳期に至るまで著明に発現低下することが知られているがその低下機構は未だ明らかにされていない。従来の発現機構解析は、主に遺伝子配列とその結合タンパク質の解析から進められてきたが、現在までにラクターゼの発現低下機構を解明した報告はない。近年、細胞内で発現しているRNAの中にタンパク質をコードしていないが、低分子RNA自身が遺伝子発現をmRNAレベルで抑制することが示されてきている。また、クロマチン構造変化も視野に入れた解析方法によりラクターゼ発現低下の機構の解析を進める。本研究では低分子RNAがラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているのではないかと仮説を立てて、その検証を行う。今年度は、Sprague-Dawley系ラット10日齢と10週齢の小腸上部1/4の部位よりmiRNA画分を含む総RNAを抽出し、mRNA解析は3D-Gene®全遺伝子型DNA chip、miRNA解析は3D-Gene®miRNA Oligo chipを用いた解析を東レ株式会社に依頼した。解析結果より10日齢と10週齢で有意に10週齢で発現の高いmiRNAが25種類あった。これらについて遺伝子配列よりラクターゼとその発現に関連する転写因子であるOct1、HNF1&#61537;&#61472;mRNAの3'非翻訳領域に結合の有無を検索したが、完全に一致するものはなかった。現在、それぞれについての経時的変化の確認を行っている。本研究では低分子RNAがラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているのではないかと仮説を立て、その検証を行う。今年度は、ラクターゼーフロリジン加水分解酵素(ラクターゼ)の出生時を頂点として離乳期に至るまで活性低下機構解析に関しては、生後2、5、10、14、21日目のWistar系ラットの小腸上部より総RNAとタンパク質を調製し、リアルタイムPCR法、Westernブロット法により、mRNA定量法、タンパク質定量法を検討し、報告通り、ラクターゼmRNA量、タンパク質量が低下することを確認した。さらに、総RNA抽出と異なる方法で低分子RNAも調製し、網羅的な解析を試みる予定である。東レ株式会社の全遺伝子型DNAチップ解析、miRNAチップ解析を行うためのサンプルを調製し、解析依頼の打ち合わせを行った。ラクターゼは胎生期後半より発現し、出生を頂点として離乳期に至るまで著名に発現低下することが知られているがその低下機構は未だ明らかにされていない。従来の発現機構解析は、主に遺伝子配列とその結合タンパク質の解析から進められてきたが、現在までにその発現低下機構を解明した報告はない。近年、細胞内で発現しているRNAの中にタンパク質をコードしていないが、低分子RNA(miRNA)自身が遺伝子発現をmRNAレベルで抑制することが示されてきている。また、クロマチンの構造変化も視野に入れた解析方法によりラクターゼ発現低下の機構の解析を進める。本研究では低分子RNAがラクターゼ遺伝子の転写レベルの抑制にはたらいているのではないかという仮説を立てて、その検証を行う。Sprague-Dawley系ラット10日齢と10週齢の小腸上部1/4の部位よりmiRNA画分を含む総RNAを抽出し、mRNA解析は3D-Gene®全遺伝子型DNA chip、miRNA解析は3D-Gene®miRNA Oligo chipを用いた解析を東レ株式会社に依頼しおこなった。3D-Gene®全遺伝子型DNA chipを用いたmRNA解析では、10日齢の方が10週齢より有意に発現量が高いものが16遺伝子あり、この中にラクターゼ遺伝子も含まれた。