hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＦＰＧＡによる高速並列計算型ハイブリッドシミュレーションの実現

多自由度系モデルを用いた地震応答の検証のための実時間ハイブリッドシミュレーションシミュレーションを行うことを目的として、高速動的応答解析を行うための論理回路を設計しFPGAへ実装することで実験制御システムを構築する方法に関する開発検討を行った。演算数および並列化を考慮したFPGAの計算処理能力限界の検討により,消費LE数が計算能力のボトルネックであることと,リソース共有化が限界自由度数の拡大に効果的であることを示した。自由度の大きな構造モデルを用いた実時間ハイブリッドシミュレーションを上記で開発したFPGAベースのシステムで行うための周辺実装技術の検討を行い,実験手法の実現性を確認した。前年度の成果を基に,FPGAベースの実時間ハイブリッドシミュレーションシステムを構築する上で実装に必要な要素技術とその適用法の検討を行った。本システムでは,実験部分において逐次得られる計測値に基づき計算対象の構造モデルの運動方程式の時間積分を実行し,実験装置用の信号を出力する機能が基本となる。実時間性を確保するためには,a.計測信号の取り込みb.同じ時間刻みΔtの数値計算の1ステップの処理c.計算結果に基づく載荷装置の制御信号の出力,の3つのプロセスを数値時間積分の時間刻みΔt以内の時間で完了する必要がある.そこで,地震応答計算の機能については,Operator Splitting法による時間積分のアルゴリズムを,数値演算処理回路を状態遷移に基づく有限オートマトンとして構成することで実装した.高速処理のための同時並列演算の制御と,数値計算精度を確保するための浮動小数点数形式による演算を採用した.外部信号の入出力の機能については,FPGAボードに搭載されているオーディオ・コーデック(WM8731,Wolfson社)を外部インターフェースとして利用し,アナログ電圧信号と24bitリニアPCM形式で符号化されたデジタル信号の間の変換を入力,出力各々2チャンネルについて行い,入力は地震動加速度信号と,実験部分からの計測荷重信号に,出力は実験装置の変位制御信号およびモニタ用信号に用いることができるものとした.FPGAにおいては,上述の浮動小数点数とリニアPCM形式の間の変換を介して,地震応答計算機能に接続される.さらに,実時間性の制御のため,供給される基本クロック信号(18.432MHz)および複数の分周クロック信号を用いて,運動方程式の時間積分演算およびオーディオ・コーデックによる入出力信号の時間制御を行うシステムを構成できた.FPGAベースによる自由度数の大きな構造システムの数値モデルの実時間ハイブリッドシミュレーションシステムを構築する上で実装に必要な要素技術とその適用法の検討を行った。本システムでは、実験部分において逐次得られる計測値に基づき計算対象の構造モデルの運動方程式の時間積分を実行し、実験装置用の信号を出力する機能を基本とし、実時間性を確保するためにa.計測信号の取り込みb.数値計算の1ステップの処理c.載荷装置の制御信号の出力,の3つのプロセスを時間刻み以内で完了するようなシステムを構成する必要がある。そこで、同時並列演算と数値計算精度を確保するための浮動小数点数形式による時間積分の数値演算処理回路を、状態遷移に基づく有限オートマトンとして構成した論理回路を設計した。外部信号の入出力の機能についてはオーディオ・コーデックを用い、アナログ電圧信号、24bitリニアPCM形式デジタル信号、浮動小数点数形式の間の変換により情報を扱うシステムとした。また、動的載荷装置特有の入力信号に対する載荷の時間遅れなどの動特性の補償の機能については、想定される載荷装置の遅れ時間後の載荷加振目標値を外挿式を用いて予測する手法を用いることとし、加算器と乗算器の組み合わせにより実現できることを確認した。現実的な演算速度と実装可能自由度数を得るための演算数および並列化を考慮したFPGAの計算処理能力限界の検討を行った。ロジックエレメント数544,880個で演算を1kHzで行う場合、非線形多自由度モデルの場合1,600自由度程度まで、密行列モデルの場合、100自由度程度まで現実的に対応できることを明らかにしている。以上の結果に基づき、論理回路をFPGAに実装したシステムと動的載荷装置を組み合わせることにより、実時間ハイブリッドシミュレーションの適用範囲の拡大の実現が可能であることを実証的に示した。FPGAにより自由度数の大きな構造システムの数値モデルの高速実時間数値演算を行うためのシステムの構築を行うとともに、現実的な演算速度と実装可能自由度数、および目的とする演算を実現するに当たっての方策に関する検討を行った。その結果、多自由度系モデルの地震応答シミュレーションを高速に行うことが可能である論理回路を設計し,論理回路シミュレーションおよび実機FPGAへの実装による検証を行い、FPGAを高速実時間応答シミュレータとして実現した。この成果を基に、演算数および並列化を考慮したFPGAの計算処理能力限界の検討を行い、消費LE数が自由度数の拡大に際してのボトルネックであることを明らかにした。また、リソース共有化が限界自由度数の拡大に効果的であることが示された。

この場合、ロジックエレメント数544,880個で応答計算及び制御信号の出力を1kHzで行う場合、非線形多自由度モデルの場合1,600自由度程度まで、密行列モデルの場合、100自由度程度まで現実的に対応できることが分かった。以上の結果に基づき、FPGAの計算ハードウェアとしての性能と実時間ハイブリッドシミュレーションの大自由度・非線形構造モデルの計算処理部分としての応用の妥当性を確認したことから、この手法を実時間ハイブリッドシミュレーションにおける数値部分構造の応答シミュレータに適用することで,実時間ハイブリッドシミュレーションの適用範囲の拡大の実現が可能であることを実証的に示した。実時間ハイブリッドシミュレーションのシステムをFPGAで実現するための論理回路を設計し、その論理動作を確認するとともに、その実験制御システムとしての実装に必要な外部インターフェースの確立を確認することができたとともに,実時間高速並列応答計算の結果を用いて外部実験装置の制御に必要な信号の生成が実現可能であることを示したことから、基本的な目標の達成に至ったと考えられる。実時間ハイブリッドシミュレーションのシステムをFPGAで実現するための論理回路を設計し、その論理動作を確認するとともに、実際にFPGAボードシステムに実現することでその動作を検証し、制御処理ボードとして構築したシステムの動作が狙いとした実時間ハイブリッドシミュレーションの数値演算システムとしての要求を満たすか否かを確認するという基本的な目標は、実時間高速並列応答計算の手法が実際に実現可能であることを示したことから、基本的な目標の達成に至ったと考えられる。本年度の成果を踏まえて、実時間応答シミュレーションとそれを用いた実験制御処理システムとしての実現可能性を、実験装置と組み合わせたハイブリッドシミュレーションシステムとして適用し、最低限の試行的実験が行える実験システムの試作や予備的な実験の実施、実験システムとしての性能の確認を行うことを目標とする。本年度の成果を踏まえて、引き続き実時間応答シミュレーションとそれを用いた実験制御処理システムとしての実現可能性を、実験装置と組み合わせたハイブリッドシミュレーションシステムとして適用し、最低限の試行的実験が行える実験システムの試作や予備的な実験の実施、実験システムとしての機能の確認を行う方針とする。実時間応答シミュレーションと載荷装置と組み合わせたハイブリッドシミュレーションシステムとして実現するためのハードウェアの整備のための物品費、システム整備および実験実施のための補助者の謝金、情報収集および成果発表のための旅費などを研究費として計上し使用する計画である。
水溶液中でのホウ素触媒による直接的アミド化反応の開発

触媒的アミド化反応において,二核ホウ素錯体が重要な中間体であること,2種類のボロン酸を組み合わせるとよい結果を与えることが報告されている。そこで,2つのホウ素を連結するリンカー部位,ボロン酸の検討,適切な疎水性空孔などを与えることによって,含水溶媒中もしくは水溶液中にてアミド化反応を行うことのできる触媒を探索する。
新規コレステロール結合プローブを用いた細胞内ラフトの可視化システムの構築

我々は、これまでに、コレステロールに特異的に結合する毒素(θ毒素)を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。さらに、BCθが細胞表面ラフトの可視化に有用であることを明らかにしている。そこで、本研究では、細胞表面及び細胞内ラフトの同時可視化を目指して、細胞内ラフトの可視化系の構築を進めた。まず、θ毒素の構造-機能相関の解析から、毒素のC末端のドメイン(D4)がコレステロールへの結合能を担う部位であること、及びラフトへの選択的結合能を担っていることを明らかにした。この結果をふまえ、次に、D4と緑色蛍光蛋白質(Enhanced green fluorescent protein ; EGFP)との融合蛋白質(EGFP-D4)遺伝子を作製して、大腸菌内でEGFP-D4蛋白質を生合成させ、これを精製してその性質を調べた。その結果、EGFP-D4はコレステロールに対する特異的結合能およびラフトへの選択的結合能を保持していることが確認された。そこで、次に、動物細胞内へのEGFP-D4遺伝子の導入を行った。テトラサイクリンの除去で目的遺伝子の発現が誘導されるように設計されたベクターにEGFP-D4遺伝子を組み込み、マウス線維芽細胞に導入した。薬剤耐性を指標に遺伝子導入細胞を選択的に増殖させ、EGFP-D4蛋白質の発現量の異なる幾つかのクローンを得た。細胞内でのプローブの局在を調べたところ、一部の細胞内小胞に強い染色が認められ、生化学的な解析の結果とあわせて細胞内ラフトへの結合が示唆された。現在、この膜小胞の同定を進めている。この結果をふまえ、次に、D4と緑色蛍光蛋白質(Green fluorescent protein ; GFP)との融合蛋白質(GFP-D4)を作製して、その遺伝子を細胞内で発現させる試みを行った。作製したGFP-D4がD4と同じコレステロールへの結合特異性を保持していることを確認するため、大腸菌内でGFP-D4蛋白質を生合成させ、これを精製してその性質を調べた。その結果、GFP-D4はコレステロールに対する特異的結合能およびラフトへの選択的結合能を保持していることが確認された。そこで、次に、動物細胞内へのGFP-D4遺伝子の導入を行った。テトラサイクリンの除去で目的遺伝子の発現が誘導されるように設計されたベクターにGFP-D4遺伝子を組み込み、MDCK細胞に導入した。薬剤耐性を指標に遺伝子導入細胞を選択的に増殖させ、GFP-D4蛋白質の発現量の異なる幾つかのクローンを得た。現在、これら細胞株の解析を行っている。

さらに、BCθが細胞表面ラフトの可視化に有用であることを明らかにしている。そこで、本研究では、細胞表面及び細胞内ラフトの同時可視化を目指して、細胞内ラフトの可視化系の構築を進めた。昨年度の研究で、毒素のコレステロール結合ドメインであるC末端のドメイン(D4)と緑色蛍光蛋白質(Enhanced green fluorescent protein ; EGFP)との融合蛋白質(EGFP-D4)遺伝子を作製して大腸菌内でEGFP-D4蛋白質を生合成させ、これを精製してその性質を調べた。その結果、EGFP-D4はコレステロールに対する特異的結合能およびラフトへの選択的結合能を保持していることを明らかにしている。そこで、次に、動物細胞内へのEGFP-D4遺伝子の導入を行った。テトラサイクリンの除去で目的遺伝子の発現が誘導されるように設計されたベクターにEGFP-D4遺伝子を組み込み、マウス線維芽細胞に導入した。薬剤耐性を指標に遺伝子導入細胞を選択的に増殖させ、EGFP-D4蛋白質の発現量の異なる幾つかのクローンを得た。細胞内でのプローブの局在を調べたところ、一部の細胞内小胞に強い染色が認められ、生化学的な解析の結果とあわせて細胞内ラフトへの結合が示唆された。
歯周炎患者に対する部分床義歯装着の効果の評価

本研究は,部分床義歯(RPD)を装着した際に支台歯の周囲骨に生じる変化を視覚的に評価するために,エックス線写真を定点撮影し重ね合わせて変化の生じた部位を評価するデジタルサブトラクション法を用いた前向き介入試験である.被験者は,病院初診時に中等度重度歯周炎と診断され,歯周専門医による歯周治療を受けてSPTに移行する段階で,RPDをはじめて製作する部分歯列欠損患者からリクルートを行った.被験者に対するRPD治療は,補綴専門医によって行われた.RPD装着前をBaseline(BL)とし,装着1週間後,1ヶ月後,3ヶ月後,6ヶ月後に,支台歯の歯周組織検査,エックス線写真撮影を行い,咬合圧をデンタルプレスケール(GC)で測定した.BLと各測定日の結果を比較検討した.エックス線写真はオーダーメイドの撮影上ジグを用いて定点撮影を行い,デジタルサブトラクション法を用いてBLと各測定日の写真を重ね合わせ,その濃淡の変化を骨密度の変化として算出した.その結果,RPD装着により支台歯が発揮する咬合圧は増加しても,従来の報告に見られる,RPDの残存歯への為害性は確認できず,歯周組織検査の結果は観察期間を通じて安定した結果が得られた.デジタルサブトラクション法による支台歯周囲骨の経時的評価については,RPD装着後1週間後に支台歯への荷重増加によると考えられるエックス線写真上の変化が認められるものの,その後はベースラインの状態まで概ね改善する傾向が認められた.本研究は,中等度重度の歯周炎と診断された患者が対象であり,通常の補綴治療においてもハイリスクと考えられる患者層を対象としているにも関わらず,RPD装着後6ヶ月までの変化は明らかではなく,安定した結果が得られた.本研究結果から,歯周炎で歯を喪失した患者に対し,適切に設計されたRPDを適用することで,残存歯を健康的に保全できることが示唆された.部分歯列欠損を有する歯周炎罹患者に対して、部分床義歯を装着した際に支台歯の周囲骨に生じる変化を視覚的に評価する為に、エックス線写真を定点撮影し重ね合わせて変化の生じた部位を評価するDigital subtraction法を用いた前向き介入試験を立案し、東京医科歯科大学歯学部倫理審査委員会の承認を得た。本研究では,Digital subtraction法による評価の他に、ポケット深さ、動揺度、クリニカルアタッチメントロスの変化を評価することとした。また,クリニカルアタッチメントロスの計測用のジグを使用することとした。Digital subtraction用ソフトを購入し、支台歯の周囲骨の評価を想定したエックス線写真撮影用ジグのデザインを決定した。ジグのデザイニングに際しては、評価対象歯の大部分が小臼歯であると予想されるため、予備実験として、健常歯列者の上下顎小臼歯を根尖部までコーンカットせず撮影可能となるよう試行錯誤的にデザインの修正を行った。また、不可避な微小の位置ズレに対して、専用ソフトで修正が可能であることを確認した。本実験を遂行する準備が整ったため、被験者のリクルートを開始した。被験者は、東京医科歯科大学歯学部附属病院歯周病外来を受診し、初診時に中等度以上の歯周炎と診断された者のうち、2歯以上の遊離端欠損を有する者とした。文書および口頭でインフォームドコンセントを行い、同意を得られた者についてリクルートを行った。歯周治療中には欠損部を補綴せず、歯周治療終了後に再評価を行い、歯周専門医の診断に従い、メインテナンスへ移行可能となったタイミングで、部分床義歯を製作することとした。目標被験者数は15名とし、評価期間は部分床義歯装着から6ヶ月とした。次年度より、被験者数を増やし、データ採取、解析を進める予定である。当初、本年度は実験デザインの確立およびエックス線写真撮影用ジグのデザイニングを含む、健常者対象の予備実験を行う予定としていた。現状は予備実験を終了し、本実験のための被験者リクルートまで進んでいる。予定よりやや早めの進展であるが、本実験においてはドロップアウトや、義歯装着までにある程度の時間が必要なこと、取込み基準(中等度以上の歯周炎罹患者、2歯以上の遊離端欠損、歯周治療中に義歯を使用していない)を満たす患者の絶対数が少なく、連続サンプリングという形式であることを加味すると、データサンプリング期間が長期化することが予想されるため、このような評価とした.予定以上に進展した理由としては、当初企画していた評価項目をより単純化し、客観的項目のみに絞る事で,準備期間を短縮化したこと、またコントロール群を設定せず、同一被験者内での評価としたこと、が挙げられる。当初の計画では、評価項目が多岐にわたり、各々の評価項目の因果関係を説明すること、予定期間内にデータの解析まで終了することが困難であると同時に、被験者の負担が大きくなってしまうため、倫理審査委員会からの指導も参考に、修正を試みた。前年度に立案した治療計画に従い,被験者をリクルートし予定被験者数にほぼ到達した.本研究は,部分床義歯を装着した際に支台歯の周囲骨に生じる変化を視覚的に評価するために,エックス線写真を定点撮影し重ね合わせて変化の生じた部位を評価するDigital subtraction法を用いた前向き介入試験であり,全データの採取が終了し次第,学会発表および論文作成に入る予定である.

現在,研究の進行は順調に進んでおり,従来の報告に見られる,部分床義歯の残存歯への為害性は確認できず,安定した結果が得られている.Digital subtraction法による支台歯周囲骨の経時的評価については,義歯装着後1週間後に支台歯への荷重増加によると考えられるエックス線写真上の変化が認められるものの,その後はベースラインの状態まで概ね改善する傾向も認められている.本研究は,中等度から重度の歯周炎と診断された患者を対象としており,通常の補綴治療においてもハイリスクと考えられる患者層を対象としているにも関わらず,義歯装着後6ヶ月までの変化は非常に安定している.被験者の同意が得られた場合には,追跡調査を実施し,更に長期の経過を評価することを検討している.また,本研究と平行して,歯周炎に罹患した残存歯の多くに認められる,歯の動揺に対し,部分床義歯を装着することで動揺の抑制が認められる固定効果(二次固定効果)について,現在進行している研究の結果をサポートする研究として立案しているところである.当初の計画では,本年度も引き続き被験者のリクルートを行いつつ,データ採取を進めていく予定であったが,既にリクルートの打ち切りを検討する段階に到達した.また,補足的な研究についても研究の立案がほぼ終了し,本研究と平行して開始する予定であり,計画以上の進展と考えられる.本研究は,部分床義歯を装着した際に支台歯の周囲骨に生じる変化を視覚的に評価するために,エックス線写真を定点撮影し重ね合わせて変化の生じた部位を評価するDigital subtraction法を用いた前向き介入試験であり,全データの採取が終了し,学会発表および論文投稿も完了した.従来の報告に見られる,部分床義歯の残存歯への為害性は確認できず,安定した結果が得られている.Digital subtraction法による支台歯周囲骨の経時的評価については,義歯装着後1週間後に支台歯への荷重増加によると考えられるエックス線写真上の変化が認められるものの,その後はベースラインの状態まで概ね改善する傾向も認められている.本研究は,中等度から重度の歯周炎と診断された患者を対象としており,通常の補綴治療においてもハイリスクと考えられる患者層を対象としているにも関わらず,義歯装着後6ヶ月までの変化は非常に安定している.被験者の同意が得られた場合には,追跡調査を実施し,更に長期の経過を評価することを検討している.また,本研究と平行して,歯周炎に罹患した残存歯の多くに認められる,歯の動揺に対し,部分床義歯を装着することで動揺の抑制が認められる固定効果(二次固定効果)について,模型実験が完了し,学会発表および論文作成を開始している.この研究成果をもとに,固定効果に焦点をしぼった臨床研究をすでに開始しており,当初予定していた以上の成果を得ることが期待できる.当初の計画では,来年度に研究成果をまとめる予定であったが,既に学会発表・論文作成とも完了しており,予定されていた研究成果は既に得られている.余裕のある研究費については,新たな関連研究を立案,遂行しており,この研究費用に充てる予定である.本研究は,部分床義歯(RPD)を装着した際に支台歯の周囲骨に生じる変化を視覚的に評価するために,エックス線写真を定点撮影し重ね合わせて変化の生じた部位を評価するデジタルサブトラクション法を用いた前向き介入試験である.被験者は,病院初診時に中等度重度歯周炎と診断され,歯周専門医による歯周治療を受けてSPTに移行する段階で,RPDをはじめて製作する部分歯列欠損患者からリクルートを行った.被験者に対するRPD治療は,補綴専門医によって行われた.
第一原理に基づく計算科学によるＬＰＳＯ構造の電子論と構造科学の構築

シンクロ型LPSO構造の形成・強化メカニズム等の詳細を理解するためには,その原子配列構造を明らかにしその構造科学を構築することが不可欠である.本研究では,第一原理に基づく計算科学手法によって,LPSO構造における溶質原子・クラスターの規則配列化をもたらす主因子をエネルギー論的に原子・電子レベルから特定することに成功した.これにより実験的手法により得られた原子配列モデルの妥当性を理論的側面から支持し,LPSO構造に関する連携研究を支援した.更に,LPSO構造のキンク変形時における底面転位の活動機構ならびにMgの非底面すべり系の活性化に関する機構を第一原理計算に基づいて明らかにした.発足初年度にあたる本年度は,最終目標であるLPSO構造型物質の構造特性設計における指導原理の獲得に向けて,主として手法の構築・検証,計算機コードや計算機環境の整備を実施し,比較的簡単なモデルでそれらの有効性を検証した.具体的な成果は以下の通りである.(1)第一原理計算により,積層の異なるMg母相(hcp/fcc)中の各種添加元素間および添加元素・空孔間の相互作用を予測評価し,エネルギー的に安定となるこれらの点欠陥間の近接関係を明確にした.また,添加元素置換による局所ひずみの影響を評価した.(2)添加元素の偏析・秩序化プロセスにおいて重要となる原子・空孔拡散の素過程を系統的かつ網羅的に解析するための準備として,第一原理計算を活用しながら低い計算負荷で反応経路および活性化障壁を探索する手法を検討し,既存の第一原理計算コードに実装した.また,基礎的な結晶系について動作検証を行った.(3)LPSO構造およびそれを構成する元素・化合物について有限温度における構造の安定性ならびに力学特性の温度依存性を評価するための準備として,格子振動モデルに基づく自由エネルギー評価手法を検討した.また,当該解析を実現するための計算機コードの整備を進めた.(4)第一原理計算によりMgの非線形領域に渡る弾性特性を定量的に予測評価した.また,このアプローチを一般化し,任意の対称性を持つ結晶について高次弾性定数を評価することを可能にした.更に,この関係を構成式として表現する枠組みを構築した.(5)LPSO構造の原子配列に関する知見獲得のための基礎的解析として,実験班から供与された結晶学的知見に基づき,Mg-Zn-Y系およびMg-Al-Gd系のLPSO構造モデル(14H-type)に対する第一原理計算を試行した.同時に,本物質系において適切な解析条件・近似手法について検討した.今年度は,最終目標であるLPSO構造型物質の構造特性設計における指導原理の獲得に向けて,主にMg-M-RE系(M = Zn, Al, Ni, Co; RE = Y, Gd)を対象に,基軸となる手法の構築・検証および計算コードの整備を実施するとともに,実験班から供与されたMg基LPSO構造の基礎的モデルを適宜活用してそれらの有効性を検証した.具体的には,以下の4項目について研究を遂行した.(1) Mg基LPSO相中の溶質原子クラスターの面内規則性を明確にするため,Mg中のI2積層欠陥面内におけるL12型クラスター,ならびにその中心に格子間原子が侵入したE21型クラスター間の相互作用エネルギーを第一原理計算により定量的に評価した.また,得られた第一原理データに基づいて,Mg基LPSO構造中の種々のL12型/E21型溶質原子クラスターを対象とする粗視化粒子モデルを提案し,モンテカルロ法に基づく熱平衡状態計算により当該系における溶質クラスターの規則配列化およびドメイン化(中範囲規則構造)を評価した.(2) LPSO構造を有するMg合金の変形機構を調べるため,第一原理計算により10H型Mg-Ni-Y系LPSO構造の底面すべりにおける一般化積層欠陥エネルギーを評価した.また,LPSO構造のキンク変形時における転位挙動について検討するため,圧縮応力下における転位移動のエネルギー障壁およびパイエルス応力を解析した.(4)溶質原子クラスターの種類と密度が異なる種々のMg-Zn-Y系LPSO単結晶モデルに対して第一原理計算により弾性定数および形成エネルギーを評価した.本年度は,LPSO構造の特異な構造特性発現を引き起こす主因子を原子・電子レベルから特定すること,ならびにLPSO構造における変形基礎特性を明らかにすることを目標に,主にMg-M-RE系(M = Zn, Al, Ni; RE = Y, Gd)を対象にして,昨年度に引き続き基軸となる手法の構築・検証および解析の実行を進めた.また,実験班から供与されたMg基LPSO構造の基礎的モデルを適宜活用してそれらの有効性を確認した.具体的には,以下の4項目について研究を遂行した.(1) 2次元コロイド剛体球系とのアナロジーを用いた粗視化アプローチに基づいて,Mg基LPSO構造における種々の溶質原子クラスターの面内規則性とエネルギー安定性の関係を,第一原理計算に基づく相互作用データを活用しながら定量的に評価した.(2) LPSO構造のキンク変形時における転位の活動機構について検討するため,10H型Mg-Ni-Y系LPSO構造を対象として一軸圧縮力下における底面すべりの一般化積層欠陥エネルギーを第一原理から計算し,転位移動のエネルギー障壁およびパイエルス応力を解析した.(3) LPSO構造において濃化層が周期的に配列する物理的起源を明らかにするため,簡易な1次元ばねモデルを用いて質量変化が周期的に配列した場合のフォノン状態密度および自由エネルギーの変化を評価し,濃化層の周期秩序におけるフォノンの効果を検討した.

(4)添加元素によるMgの非底面すべり系の活性化に関する機構を検討するため,主に錐面<c+a>らせん転位および双晶界面から交差すべりしたzonal dislocationの芯構造を第一原理計算により直接的に評価した.また,Mg合金の異方的な塑性変形挙動を転位レベルから理解するため,分子動力学法によりMgの圧縮過程における転位と双晶境界の反応の様態を調べた.最終年度である本年度は,LPSO構造の特異な構造特性発現を引き起こす主因子を原子・電子レベルから特定すること,ならびにLPSO構造における変形基礎特性を明らかにすることを目標に,主にMg-M-RE系を対象にしてこれまでに構築した基軸手法を活用しながら解析の実行を進めた.また,実験班から供与されたMg基LPSO構造の基礎的モデルを適宜活用してそれらの有効性を確認した.具体的には,以下の項目について研究を遂行した.(1)母相内の面状溶質ナノクラスターの配列安定性を第一原理計算により解析し,クラスター内およびクラスター間の相互作用エネルギーを定量評価するとともに,クラスターにより誘起される局所変位と相互作用範囲を評価した.(2) LPSO構造のキンク変形時における底面転位の活動機構について検討するため一般化積層欠陥エネルギーを第一原理計算により獲得し,各種底面における転位移動のエネルギー障壁およびパイエルス応力を解析した.また,変形時における局所的な応力集中を想定して,底面に平行に一軸圧縮応力が負荷された状態における底面すべりの一般化積層欠陥エネルギーを評価した.(3) LPSO構造において濃化層が周期的に配列する物理的起源を明らかにするため,簡易な一次元ばねモデルを用いて質量変化が周期的に配列した場合とランダムな場合のフォノンの状態密度を計算し,その自由エネルギーの差を調べることで,濃化層の周期秩序におけるフォノンの効果を検討した.(4) Mgの非底面すべり系の活性化に関する機構を検討するため,錐面<c+a>転位の芯構造およびすべり面を第一原理計算により直接的に評価した.その結果,錐面IIと錐面Iにおける拡張転位芯はほぼ同じエネルギーを持ち,更にひずみ印加によって錐面II上の積層欠陥は局所的な原子のシャッフリングを伴いながら錐面Iに移動し得ることを示した.シンクロ型LPSO構造の形成・強化メカニズム等の詳細を理解するためには,その原子配列構造を明らかにしその構造科学を構築することが不可欠である.本研究では,第一原理に基づく計算科学手法によって,LPSO構造における溶質原子・クラスターの規則配列化をもたらす主因子をエネルギー論的に原子・電子レベルから特定することに成功した.これにより実験的手法により得られた原子配列モデルの妥当性を理論的側面から支持し,LPSO構造に関する連携研究を支援した.
キメラマウス作成技術を用いた細胞非自律的腫瘍形成の証明

タモキシフェン誘導性に変異型Kras/P53を発現し、なおかつPdx1を欠失させるES細胞を、CAG-CAT-EGFPマウスから得たEGFP陽性細胞blastcystに注入してキメラマウスを作成し、タモキシフェンを投与したところ、EGFP陽性細胞が細胞非自律的に腫瘍化し、腫瘍全体の増大と繊維化組織形成を促進した。Pdx1欠失によるミトコンドリアストレスによって惹起されたSASPが癌ニッチ形成のトリガーとして機能した考えている。キメラマウスを用いた細胞非自律的腫瘍化の証明とメカニズム解明:タモキシフェン誘導性に変異型Kras/P53を発現し、なおかつPdx1を欠失させ、Xgal陽性としてlineage traceできるES細胞(Ela1CreER;LSLKrasG12D;LSLTrp53R172H/wt;pdx1flox/flox;ROSA26r)を、すべての細胞がEGFP陽性となるCAG-CAT-EGFPマウス(Kras/P53/Pdx1はすべて正常型)から得た胎盤胞にinjectionしてキメラマウスを作成し、3週令でタモキシフェンを投与した。その結果、EGFP陽性細胞が細胞非自律的にADM, PanINを経てPDACの構成成分となることを証明できた。Pdx1ノックアウトを行わない場合は、上記細胞非自律的腫瘍化はほとんど起こらなかった。マイクロアレイ解析および免疫染色の結果から、ケモカインCLXL13とその受容体であるCXCR5が最初にinitiator cell、次いで周囲のEGFP陽性細胞に発現することをつきとめた。つまり、最初はautocrine機構を介してinitiator cell自身に働きかけ、その後周囲細胞のCXCR5の発現を誘導して増殖的に作用すると考えられる。ここで重要なのは、CXCL13が強力なB cell attractantである点である。実際、免疫細胞が腫瘍に浸潤し、1ヶ月後にはCXCL13以外の複数のケモカイン/サイトカインの発現が上昇するchmokine stormの状態となることが確認された。CXCL13中和抗体投与で、細胞非自律的腫瘍化がほぼ完全に消失したことから、CXCL13-CXCR5 axisが上記現象の責任シグナルであることを証明できた。では、「なぜPdx1欠失がCXCL13-CXCR5 axisの活性化を引き起こすのか?このような細胞非自律的腫瘍化は、Pdx1欠失モデルだけの現象なのか?」が次の問題となる。Pdx1欠失はミトコンドリア障害を引き起こすことが分かっており、現在、薬剤投与によるミトコンドリア障害で同様の現象が起こるかどうかを検証中である。計画した細胞非自律的腫瘍化の証明だけでなく、本モデルにおける細胞非自律的腫瘍化現象のメカニズム解析として、具体的なケモカインシグナルを同定し、(計画を超えて)中和抗体投与実験でそれを証明した。さらに、Pdx1欠失モデルだけでなく、「がん細胞の代謝ストレスが、がん微小環境を改変して細胞非自律的腫瘍化を引き起こすのではないか」と考え、萌芽研究で得られた知見を、癌腫一般における普遍的概念へと高めつつある。目的:本研究では、我々が開発した膵癌キメラマウスモデルを用いて、従来の癌幹細胞理論のみでは説明しきれない細胞非自律的腫瘍形成現象を証明し、不均一な細胞集団からなる癌腫細胞コミュニティー形成機構の解明を目指した。方法と結果:タモキシフェン誘導性に変異型Kras/P53を発現し、なおかつPdx1を欠失させ、Xgal陽性としてlineage traceできるES細胞を、CAG-CAT-EGFPマウス(Kras/P53/Pdx1はすべて正常型)から得たEGFP陽性胎盤胞にinjectionしてキメラマウスを作成した。タモキシフェンを投与するとEGF陰性のinitiator cloneに加えて周囲のEGFP陽性細胞が細胞非自律的に腫瘍の構成成分となった。Pdx1欠失はミトコンドリア障害を引き起こすことが分かっていたので、研究2年目に、Pdx1欠失は行わずタモキシフェン誘導性に変異型Kras/P53を発現し、Xgal陽性となるES細胞とEGFP陽性胎盤胞とのキメラマウスを新たに作成し、L-Lysine投与によるミトコンドリア障害を加えたところ、同様にEGFP陽性細胞の非自律的腫瘍化が観察された。マイクロアレイ解析および免疫染色の結果から、上記2つのキメラマウスモデルの両方で、CLXL13/CXCR5受容体を介した細胞非自律的腫瘍化が起こっており、その下流としてYAPシグナルの持続的活性化を来たしていることが分かり、CXCL13中和抗体、YAP阻害剤の投与で細胞非自律的腫瘍化がほぼ完全に消失した。以上より、がん細胞の代謝ストレスが、がん微小環境を改変して細胞非自律的腫瘍化を引き起こすことが2つのモデルで示された。臨床で行われている化学療法/放射線療法の治療抵抗性には、がん幹細胞クローンの治療抵抗性だけでなく、細胞代謝ストレスによる細胞非自律的腫瘍化の活性化が寄与する可能性を示唆する。

これまでの研究で、本モデルでは、CXCL13/CXCR5 axisの活性化によって細胞非自律的腫瘍化を引き起こすことが分かった。私たちは、この現象はPdx1欠失モデルだけの特異的な現象ではなく、がん細胞の代謝ストレスががん微小環境を改変することで細胞非自律的腫瘍化を引き起こし得ると考えている。Pdx1欠失はミトコンドリア障害を引き起こすことが分かってきており、現在、膵腺房細胞のミトコンドリア障害を来す薬剤として知られるL-lysine投与モデルで同様の現象が起こるかどうかの検証に入っている。この実験によって、“代謝ストレスによる細胞非自律的腫瘍化"が一つの概念として確立できた場合、臨床で行われている化学療法/放射線療法の抵抗性には、がん幹細胞クローンの治療抵抗性だけでなく、細胞非自律的腫瘍化現象の活性化が寄与する可能性を示唆する。当初計画書の2年目の項目「正常細胞由来であるEGFP細胞が新たな腫瘍造成能を獲得しているか?」と合わせて研究を推進してゆく方針である。幹細胞生物学
ショウジョウバエ複眼原基特異的発現系を用いたDNA複製制御因子の機能解析

複眼原基特異的に酵母の転写因子GAL4を発現する遺伝子導入ハエを樹立した。またGAL4結合サイト(UAS)をもつプロモーターの下流に野性型DREFcDNAを連結し、それを用いて遺伝子導入ハエを樹立した。一方、Drosophila属の中で、melanogasterと、virilis両種で進化的に非常によく保存されている3つの領域CR1(Conserved Region 1),CR2,CR3を同定し、これら3つの領域を含むcDNA断片をUASベクターにクローン化し、それらを用いた遺伝子導入ハエを樹立した。また、PCNA、DNAポリメラーゼαのcDNAを逆方向でGAL4結合サイトに連結し、これら複製関連因子のアンチセンスRNA発現用のコンストラクトも作成し、それらを用いた遺伝子導入ハエを樹立した。上記の系統を利用して野性型DREFを、複眼原基で過剰発現すると、複眼の形態に顕著な異常が見られた。この形態形成の異常は異所的なDNA合成とアポトーシスの誘導によってもたらされる。転写因子E2Fを複眼原基で過剰発現させても異所的なDNA合成を誘導することが報告されていることから、ショウジョウバエE2F遺伝子の変異系統と、DREF過剰発現系統とを交配し、E2F遺伝子のコピー数を半減させると、複眼形態異常が顕著に抑圧されることから、DREF遺伝子はE2F遺伝子の遺伝学的に上位で機能していることがわかった。さらに、ショウジョウバエE2F遺伝子をクローン化し、そのプロモーター領域を解析した結果、転写開始点より、500塩基対上流に3つのDRE様配列が連続して存在していることが明らかとなった。DREFはこれらのDRE様配列にin vitroで強く結合し、またこれらのDRE様配列は正の転写制御エレメントとして働きうることがわかった。これらの結果から、DREFは直接E2F遺伝子プロモーターを活性化しうることが明らかとなった。また、DREFのCR1領域およびCR3領域を過剰発現しても、複眼の形態異常が見られることがわかった。これらの系統では野性型DREFを過剰発現している系統とは対照的に、複眼原基の形態形成溝通過後の同調的なS期への進行が阻害されていることがわかった。これは、CRl領域およびCR3領域がドミナントnegativeな働きで、内在性のDREFの機能を抑制したことによると思われる。一方、PCNAやDNAポリメラーゼαのアンチセンスRNAを複眼原基で発現させても、複眼の形態異常は認められなかった。(1)複眼原基特異的に機能するglass遺伝子のプロモーターに、酵母の転写因子Gal4の遺伝子を連結したP-エレメントプラスミドで、形質転換した遺伝子導入ハエ4系統を樹立した。このうち、X染色体に導入された系統(♯16)以外のものは、Gal4を高発現するだけで、複眼形態に異常をもたらすことがわかった。したがって、以後のGal4-UASシステムを用いた解析には、この♯16という系統を用いることにした。

(2)Gal4結合サイト(UAS)をもつプロモーターの下流に野性型DREFを連結し、遺伝子導入ハエ数系統を樹立した。また、Drosophila属の中で、melanogasterとは比較的遠い種であるvirilisからDREF遺伝子をクローン化した。決定した塩基配列にもとづいたアミノ配列を、両種のDREFで比較することにより、非常によく保存されている3つの領域CR1,CR2,CR3を同定した。これら、3つの領域をUASベクターにクローン化し、それらを用いた遺伝子導入ハエ数系統づつを樹立した。(3)上記の♯16という系統を利用して野生型DREFを、複眼原基で過剰発現すると、複眼の形態に異常が見られた。ブロモデオキシウリジンラベル法で複眼原基細胞のDNA合成パターンを調べた結果、DREFの過剰発現が、本来細胞分裂が終了しているG0/G1期細胞に、異所的なDNA合成を誘導することがわかった。このことは、DREFがS期の誘導に必要十分な因子であることを示唆する。また、TUNEL法により、アポトーシスも異所的に誘導されることがわかった。これらの異所的なDNA合成とアポトーシスの誘導が、形態形成の異常をもたらしたと考えられる。また、DREFのCR1領域を過剰発現しても、複眼の形態異常が見られることがわかった。この場合は何が原因となっているのか、現在解析しつつある。野性型DREFを、複眼原基で過剰発現すると、複眼原基細胞に異所的なDNA合成とアポトーシスを誘導し、複眼の形態に顕著な異常をもたらす。転写因子E2Fを複眼原基で過剰発現させても異所的なDNA合成を誘導することが報告されていることから、ショウジョウバエE2F遺伝子の変異系統を入手し、我々が樹立しているDREF過剰発現系統との遺伝学的交配実験を行った。交配によりE2F遺伝子のコピー数を半減させると、DREF過剰発現により誘導される複眼形態異常が顕著に抑圧されることから、DREF遺伝子はE2F遺伝子の遺伝学的に上位で機能していることがわかった。さらにこの結論を裏づけるため、ショウジョウバエE2F遺伝子をクローン化し、そのプロモーター領域を解析した結果、転写開始点より、500塩基対上流に3つのDRE様配列が連続して存在していることが明らかとなった。DREFはこれらのDRE様配列にin vitroで強く結合し、またこれらのDRE様配列は正の転写制御エレメントとして働きうることがわかった。これらの結果から、DREFは直接E2F遺伝子プロモーターを活性化しうることが明らかとなった。また、DRBFのCR1領域およびCR3領域を過剰発現しても、複眼の形態異常が見られることがわかった。ブロモデオキシウリジンラベル法で複眼原基細胞のDNA合成パターンを調べると、これらの系統では野性型DREFを過剰発現している系統とは対照的に、複眼原基の形態形成溝通過後の同調的なS期への進行が阻害されていることがわかった。これは、CR1領域およびCR3領域がドミナントnegativeな働きで、内在性のDREFの機能を抑制したことによると思われる。
内側側頭葉てんかんの病態病理：パラドクスに挑む

内側側頭葉てんかんの発作は海馬から起こる。しかしながら、外科治療として摘出された海馬組織においては、海馬における神経細胞脱落が観察され、海馬硬化症と呼ばれている。我々は、内側側頭葉てんかん患者から切除された海馬組織を培養し、このてんかん原性を解析した。フラビン蛍光イメージング法と局所電場電位測定により、海馬支脚から発作が起始することを見出した。更に、海馬支脚においては、内向き整流性K+チャネル(Kir4.1)の発現が低下したアストロサイトが認められた。このことから、内側側頭葉てんかんのてんかん原性の獲得には海馬支脚の細胞外腔におけるK+恒常性の破綻が関与している可能性が示唆された。神経細胞が高度に脱落する病態でありながら,なぜ異常な神経興奮が惹起され得るのか?内側側頭葉てんかん患者の代表的病態である海馬硬化症においては,この命題はいわば古典的パラドクスとでも呼ぶべきなぞであった.本研究は,この命題に対する明確な“解"を提供し,本症候群に対する新たな外科的治療戦略の開発に向けた重要な基礎的知見を提供することを目的とする.その研究ストラテジーの柱は,外科的に切除された生鮮脳組織を培養し光学的イメージング法でみる時空間的興奮動態の解析である.内側側頭葉てんかん患者に対する外科手術により採取された海馬を対象とした.生鮮脳スライス標本を作製し,生理学的解析(フラビン蛍光イメージング,細胞外電場電位測定)を行い,神経興奮の時空間的伝播パターンを解析した.また組織学的解析(Timm染色,免疫組織化学)を行い,生理学的知見と関連する神経回路網やシナプスの異常についての解析を進めた.当該年度に実施した研究により、我々は、海馬硬化症ではその進行度によって異なる2つのてんかん原性機序が存在することを見出した。すなわち、Watson Grade IV相当以上の重度の海馬硬化症では、歯状回顆粒細胞において苔上線維の異常発芽による反響回路の形成が生じていることが示唆された。一方、Watson Grade 0-III相当の比較的軽度(早期)の海馬硬化症では、海馬支脚における神経細胞の興奮性増強が主体となっていると思われた。神経細胞が高度に脱落する病態でありながら、なぜ異常な神経興奮が惹起されうるのか?内側側頭葉てんかん患者の代表的病態である海馬硬化症においては、この命題はいわば古典的パラドクスとでも呼ぶべきなぞであった。本研究は、この命題に対する明確な“解"を提供し、本症候群に対する新たな外科的治療戦略の開発に向けた重要な基礎的知見を提供することを目的とする。その研究ストラテジーの柱は、外科的に切除された生鮮脳組織を培養し光学的イメージング法でみる時空間的興奮動態の解析である。実験予定日は手術日に規定されることから、当該年度も前年度に引き続き、同様の体制と内容で研究を進めた。すなわち、内側側頭葉てんかん患者に対する外科的焦点切除術により採取された海馬組織を対象とした。手術室から実験室に組織を搬送し、生鮮脳スライス標本を作製し、生理学的解析:すなわちフラビン蛍光イメージングと細胞外電場電位測定を行い、神経興奮の時空間的伝播パターンを解析した。同時に、生理学的解析を行った組織を固定し、組織学的解析:すなわちTimm染色や免疫組織化学染色を行い、生理学的知見と関連する神経回路網やシナプスの異常についての解析を進めた。当該年度までに実施した研究により、海馬硬化症においては病変の程度に応じて異なった2つのてんかん原性機序が存在することが明らかとなった。そこでは、海馬歯状回における神経細胞の新生と反響回路形成が重要な役割を担う可能性が考えられた。すなわち、歯状回顆粒細胞においては苔状線維の異常発芽による反響回路が形成されていることが明らかとなった。その際、顆粒細胞層では新たな神経細胞が産出し、分子層へ移動することから、組織学的表現型としての顆粒細胞分散が生じるものと考えられた。一方、軽度の神経細胞脱落を示す海馬では、海馬支脚における神経細胞の興奮増強が生じているものと考えられた。神経細胞が高度に脱落した病態でありながら、なぜ異常な神経興奮が惹起され得るのか?内側側頭葉てんかん患者の代表的病態である海馬硬化症においては、この命題はいわば古典的パラドクスとでも呼ぶべき謎であった。本研究は、この命題に対する明瞭な"解"を提供し、本症候群に対する新たな外科的治療戦略の開発に向けた重要な基礎的知見を提供することを目的とする。その研究ストラテジーの柱は、外科的に切除された生鮮脳組織を培養し、光学的イメージング法で見る時空間的興奮動態の解析である。実験予定日は手術日に規定されることから、当該年度も前年度までに引き続き、同様の体制と内容で研究を進めた。即ち、内側側頭葉てんかん患者に対する外科的焦点切除術により採取された海馬組織を対象とした。次に、上記の生理学的解析を行った組織をホルマリンで固定し、組織学的解析:即ち一般組織染色、免疫組織化学染色を行い、生理学的知見と関連する神経回路網やシナプスの異常についての解析を進めた。当該年度までに実施した解析結果から、海馬硬化症においては2つの異なったてんかん原性機序が存在することを明らかにした。

その際、海馬歯状回における神経細胞の新生と反響回路形成が重要な役割を担うものと考えられた。即ち、歯状回顆粒細胞においては苔状線維の異常発芽による反響回路が形成されることを明らかにした。その場合、顆粒細胞層では、新たな顆粒細胞が産出し、分子層へ移動することから、組織学的表現型である顆粒細胞分散が生じるものと考えられた。一方、軽度の神経細胞脱落を示す海馬においては、これとは機序が異なり、海馬支脚における神経細胞の興奮増強が生じているものと考えられた。実験予定日は手術日に規定されることから、当該年度においても前年度までに引き続き、同様の体制と内容で研究を進めた。即ち、内側側頭葉てんかん患者に対する外科手術により採取された海馬を対象に、生鮮脳スライス標本を作製し、生理学的解析(フラビン蛍光イメージングと細胞外電場電位測定)を行い、神経興奮の時空間的伝播特性の解析を進めた。海馬硬化症においては、海馬支脚から神経活動が開始され、歯状回を巻き込んだ異常回路網が形成されることを見出した。症例数を増やし、この知見の恒常性を確認した。症例の蓄積によるデータ取得とその解析は、概ね順調に推移している。方法論的にも特段に困難な状況は生じていないことから、「おおむね順調に進展している」と評価した。神経細胞が高度に脱落した病態でありながら、なぜ異常な神経興奮が惹起され得るのか?内側側頭葉てんかん患者の代表的な病態である海馬硬化症においては、この命題はいわば古典的パラドクスとでも呼ぶべき謎であった。本研究は、この命題に対する明瞭な"解"を提供し、本症候群に対する新たな外科的治療戦略の開発に向けた重要な基礎的知見を提供することを目的とする。その研究ストラテジーの柱は、外科的に切除された生鮮脳組織を培養し、光学的イメージング法で見る時空間的興奮動態の解析である。生鮮脳スライスを用いる本研究では、実験日は手術日に規定される。当該年度も前年度までと同様の体制と内容で研究を進めた。即ち、内側側頭葉てんかん患者に対する外科的焦点切除術により採取された海馬組織を対象とした。手術室から実験室に組織を搬送し、生鮮脳スライス標本を作製し、生理学的解析:即ちフラビン蛍光イメージングと細胞外電場電位測定を行い、神経興奮の時空間的伝播パターンを解析した。次に、上記の生理学的解析を行った組織をホルマリン固定し、組織学的解析:即ち一般組織染色、免疫組織化学染色、ゴルジ染色を行い、生理学的知見と関連した神経回路網やシナプスの異常についての解析を進めた。その結果、海馬硬化症においては2つのことなったてんかん原性機序が存在することを明らかにした。即ち、海馬歯状回顆粒細胞においては、苔状線維の異常発芽による反響回路が形成されることを明らかにした。その際、顆粒細胞層では新たな顆粒細胞が産出し、分子層へ移動することから、組織学的表現型である顆粒細胞分散が生じるものと考えられた。一方、軽度の神経細胞脱落を示す海馬においては、これとは機序が異なり、海馬支脚における神経細胞の異常興奮が生じていることを明らかにした。内側側頭葉てんかんの発作は海馬から起こる。
アデノウイルスベクターによる新生児を対象とした遺伝子治療の検討

本研究では、遺伝子導入用ベクターとして優れた特長を有するアデノウイルス(Ad)ベクターを用いて、新生児に適した新規遺伝子治療薬を開発することを目的としている。これまでにAdベクターは新生児マウスにおいても高い遺伝子導入効率を示すものの、わずかにAdタンパク質が発現することで組織障害が誘導されることを明らかとしている。そこで、当研究室で独自に開発した肝臓特異的なmicroRNAであるmiR-122aを利用して、Ad遺伝子の発現を抑制可能な改良型Adベクター(Ad-E4-122aT)を用いて検討を行うこととした。本年度はまず、血友病Aに対する遺伝子治療を試みた。血友病A患者が欠損している血液凝固第VIII因子(FVIII)は血中半減期が約12時間と短い。そこで、免疫グロブリンGのFc領域との融合によりFVIIIの血中半減期を向上させることで遺伝子治療効果が向上すると期待し、Fc融合FVIII(FVIIIFc)を発現するAd-E4-122aTを血友病Aモデル新生児マウスへと投与した。しかしながら、FVIIIFc発現Ad-E4-122aT投与群と、Fc領域を融合していないFVIIIを発現するAd-E4-122aT投与群で血中FVIII活性値は同程度であり、治療効果は増強されなかった。次に、血友病B胎児に対する治療を試みた。血友病B患者が欠損している血液凝固第IX因子(FIX)にFc領域を融合することでFIXに胎盤透過性を付与し、母体から胎児へとFIXを送達可能と考えた。そこで、Fc融合FIX(FIXFc)を発現するAd-E4-122aTを血友病Bモデル妊娠マウスへと投与し、生後0日の新生児マウス血中におけるFIX濃度を測定した。その結果、治療域の血中FIX濃度が新生児マウスから検出され、母体にて発現させたFIXFcにより、血友病B胎児を治療することに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、遺伝子導入用ベクターとして優れた特長を有するアデノウイルス(Ad)ベクターを用いて、先天性遺伝子疾患に対して新生児期から遺伝子治療を行うことを目的としている。これまでに、Adベクターは新生マウスにおいても高い遺伝子導入効率を示すものの、搭載遺伝子の発現が徐々に低下することを明らかとしている。この原因として、Adベクター投与後にわずかに発現するAdタンパク質により、組織障害が誘導されたことが原因であると考えられた。そこで、当研究室で独自に開発された肝臓特異的なmicroRNAであるmiR-122aを利用して、肝臓におけるAd遺伝子の発現を抑制可能な改良型Adベクター(Ad-E4-122aT)を用いて、新生児に対する遺伝子治療を行うことを目指した。まず、Ad-E4-122aTが新生仔マウス肝臓においてもAd遺伝子の発現を抑制可能であるか検討したところ、従来型Adベクター投与群と比較して、Ad遺伝子の発現は1/10以下に抑制されていた。さらに、Ad遺伝子の発現を抑制することで、肝障害が抑制され、Ad-E4-122aTは従来型Adベクターと比較して搭載遺伝子をより長期的かつ高効率に発現させることが可能であることを明らかとした。次に、血友病Bの治療遺伝子である血液凝固第9因子(FIX)遺伝子を搭載したAd-E4-122aTを作製し、血友病Bモデル新生仔マウスに対する遺伝子治療効果を検討した。その結果、治療域を示すFIX発現が投与後200日以上観察され、またphenotypeの有意な改善が認められた。さらに、FIX発現Ad-E4-122aTを繰り返し投与することで治療効果が増強され、血友病Bマウスのphenotypeを野生型マウスと同程度にまで回復させることに成功した。上記の結果により、Ad-E4-122aTの血友病B新生児に対する有効性が示された。これまでに得られた知見をもとに、改良型Adベクターを用いて新生児に対する遺伝子治療が可能であるか検討を行った。本年度はAd-E4-122aTの新生仔マウスにおける遺伝子導入特性を明らかとすることを目標としたものの、順調に研究が進み、次年度の大きな目標の一つであった、血友病Bモデル新生仔マウスへの遺伝子治療を同時並行して進めることが可能となった。これまでにAdベクターは新生マウスにおいても高い遺伝子導入効率を示すものの、Adベクター投与後にわずかにAdタンパク質が発現することで組織障害が誘導されることを明らかとしている。本年度は、Ad-E4-122aTにさらなる改良を加えることで、より高効率な遺伝子導入が可能であるか検討するとともに、血友病Aに対する遺伝子治療薬の開発を試みた。当研究室ではこれまでに、AdベクターのファイバーノブC末端にリシン残基を7個付与することで、成体マウスにおける肝臓への遺伝子導入効率の向上に成功している。そこで、同様の改変をAd-E4-122aTに施こした。しかしながら、新生児マウス肝臓への遺伝子導入効率の向上は見られず、これ以上の検討は断念することとした。次に、血友病Aに対する遺伝子治療を試みた。