hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規p53発現腫瘍融解アデノウイルスがもたらす化学療法・放射線療法ブースト効果

骨・軟部肉腫に対する治療は大きな進歩を遂げているが、化学療法や放射線療法に抵抗性で予後不良となる症例が存在する。我々はp53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)が骨肉腫に対して強力な抗腫瘍効果を示すことを既に明らかにした。本研究では、骨・軟部肉腫に対するOBP-702と化学療法・放射線療法との併用効果を評価した。OBP-702を化学療法・放射線療法と併用することにより抗腫瘍効果の増強を示した。In vitroにおいてp53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)を用いて、骨肉腫細胞株(HOS, MNNG/HOS, 143B, U2OS, SaOS-2)、ヒト正常線維芽細胞株(NHLF)に対する細胞障害活性をXTTアッセイにて検討を行った。ウイルス製剤は時間・用量依存的に全ての骨肉腫細胞株に抗腫瘍効果を示したが、NHLFに対しては細胞障害活性を殆ど認めなかった。緑色蛍光タンパク(GFP)を導入したMNNG/HOS(MNNG/HOS-GFP)を樹立し、MNNG/HOS-GFPとNHLFの共培養下にウイルス製剤を感染させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて経時的な観察を行ったところ、72時間後にほぼ全てのMNNG/HOS-GFPは丸く形態変化して細胞障害が観察されたが、NHLFは変化を示さなかった。また、MNNG/HOS, SaOS-2を用い、その抗腫瘍効果メカニズムを、アポトーシス、オートファジーに関して解析を行った。ウイルス製剤感染後、用量依存的にWestern blotでCleaved-PARPの増加を認め、FACS assayではactive-caspase 3の発現増加、Sub-G1期の細胞割合の増加が確認できた事から、ウイルス製剤はアポトーシスを強力に誘導することが示唆された。また、p53を有しない腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301)はオートファジー細胞死を誘導することが明らかとなっているが、Western blotでLC3、p62に関して検討を行った結果、p53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤はOBP-301と比較して、より少ないウイルス量でも強力にオートファジーも誘導することも明らかとなった。化学療法との併用効果検討のために、比較対象としてOBP-301を用い抗がん剤(DOX, CDDP)との併用効果検討を行ったところ、ウイルス蛋白であるE1Aを介して相加相乗効果を起こすことが明らかとなった。in vitroにおいて、4つの骨肉腫細胞株、U2OS (p53 wild-type)、MNNG/HOS(p53 mutant)、143B(p53 mutant)、SaOS2 (p53 null)を用いて無治療群、抗がん剤(doxorubicin)単独、p53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)単独、doxorubicinとOBP-702の併用の各群に分け、それぞれ細胞株を処理した。無治療群に対するrelative cell viabilityをXTT assayにより算出して抗腫瘍効果を比較検討した。また、CalcuSyn software (BioSoft)を用いてcombination indexを算出することにより、併用治療の相乗効果を評価した。併用治療のプロトコールとしては、昨年度、抗がん剤とp53非発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301)との併用によって、ウイルス投与48時間後に抗がん剤投与を行う事が最も抗腫瘍効果を高める事が明らかになっている。まずOBP-702においても同様にOBP-702処理後48時間でdoxorubicin処理を行った場合により相乗的な効果が得られるかを確認した。そこで、各骨肉腫細胞株に対して、OBP-702処理を行い、その48時間後にdoxorubicin処理を行った。そしてOBP-702処理後72時間でXTT assayにより細胞活性を評価した。いずれの骨肉腫細胞株においても、単独治療では濃度依存的な抗腫瘍効果の増強がみられ、併用治療により相乗的な抗腫瘍効果が確認された。抗がん剤(doxorubicin)単独・p53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)単独・併用治療による骨肉腫細胞(U2OS)におけるアポトーシスをC-PARPの発現により評価した。doxorubicin単独・OBP-702単独ではいずれも濃度依存的にアポトーシスが増強した。また、併用治療によりアポトーシスの増強を認めた。in vitroにおいて、4つの軟部肉腫細胞株、HT1080(線維肉腫)、SW684(線維肉腫)、NMS-2(悪性末梢神経鞘腫)、SYO-1(滑膜肉腫)を用いてOBP-702単独投与による治療効果を検討した。XTT assayによりrelative cell viabilityを算出し、抗腫瘍効果を比較検討した。OBP-702単独治療群ではSW684、NMS-2、SYO-1に対して用量依存的・時間依存的に増強する抗腫瘍効果が認められた.HT1080に対しては、高用量で処理した場合に抗腫瘍効果が得られた.上記の結果を踏まえて、SW684、HT1080に対してOBP702+放射線治療併用処理を行った。CalcuSyn software (BioSoft)を用いてcombination indexを算出することにより、併用治療の相乗効果を評価した。SW684ではOBP-702が低濃度でも放射線治療は奏功し、HT1080に関しても併用治療による相乗効果を認めた。

我々はp53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)が骨肉腫に対して強力な抗腫瘍効果を示すことを既に明らかにした。本研究では、骨・軟部肉腫に対するOBP-702と化学療法・放射線療法との併用効果を評価した。OBP-702を化学療法・放射線療法と併用することにより抗腫瘍効果の増強を示した。以下テーマ毎に記載する1.骨肉腫細胞に対して、抗がん剤とp53発現腫瘍融解アデノウイルスの単独使用時におけるin vitroでの細胞障害活性を検討。昨年度の結果に加えて、骨肉腫細胞株U2OS(p53 wild-type)における、抗がん剤(doxorubicin, cisplatin)およびOBP-702の抗腫瘍効果を測定した。50%抑制濃度を算出し、それぞれの骨肉腫細胞株に対する、抗がん剤とOBP-702の併用効果の検討を行うための処理濃度を決定した。2.骨肉腫細胞に対する抗がん剤とp53発現腫瘍融解アデノウイルスの併用使用時におけるin vitroの細胞障害活性を検討。doxorubicinとOBP-702の併用処理により、相乗的な抗腫瘍効果が確認された。OBP-702処理後48時間のタイミングでdoxorubicin処理を行った場合にもっとも強い相乗的な効果が得られた。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨軟部腫瘍今年度は、in vitroにおいてOBP-702とdoxorubicinの併用により相乗的な抗腫瘍効果が得られることを確認した。今後は抗がん剤単独処理とOBP-702との併用処理におけるアポトーシスやオートファジー細胞死と関連シグナルについて比較検討行う。また、薬剤耐性克服のメカニズムの解析を進めていく予定である。また骨肉腫細胞株を用いて同所性あるいは異所性腫瘍マウスモデルを作成し、無治療群・抗がん剤単独投与群・ウイルス製剤単独投与群・抗がん剤とウイルス製剤併用群の4群に分けて、腫瘍体積、マウス体重を計測し、腫瘍増殖変化について検討する。また腫瘍組織を用いることによる細胞死関連シグナルについての確認も行う。さらに、骨・軟部肉腫細胞株に対するOBP-702と放射線治療との併用効果についてXTT assayを用いて細胞活性を比較し、その相乗効果についても検討を行う。In vitroにおいてp53発現腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-702)を用いて、骨肉腫細胞株(HOS, MNNG/HOS, 143B, U2OS, SaOS-2)、ヒト正常線維芽細胞株(NHLF)に対する細胞障害活性をXTTアッセイにて検討を行った。ウイルス製剤は時間・用量依存的に全ての骨肉腫細胞株に抗腫瘍効果を示したが、NHLFに対しては細胞障害活性を殆ど認めなかった。緑色蛍光タンパク(GFP)を導入したMNNG/HOS(MNNG/HOS-GFP)を樹立し、MNNG/HOS-GFPとNHLFの共培養下にウイルス製剤を感染させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて経時的な観察を行ったところ、72時間後にほぼ全てのMNNG/HOS-GFPは丸く形態変化して細胞障害が観察されたが、NHLFは変化を示さなかった。また、MNNG/HOS, SaOS-2を用い、その抗腫瘍効果メカニズムを、アポトーシス、オートファジーに関して解析を行った。
遺伝子導入SIシロイヌナズナを利用した自家不和合性自他認識下流因子の網羅的解析

自家和合性系統のQTL解析と乳頭細胞発現遺伝子の網羅的解析の統合で、下流因子候補、耐病性関連遺伝子を同定した。その遺伝子の破壊系統を作出中であり、自家不和合性と耐病性下流因子との共通性が見えつつある。SIシロイヌナズナ系統では、後代でのSI形質不安定性の原因を探索し、当初見出していた第2エキソン内の逆位配列に加え、プロモーター領域の転写活性能の低下にもその原因があることを明らかにした。高速シーケンサーから得られた発現遺伝子断片の塩基配列情報を前処理、リファレンス・ゲノムへマッピング処理で、ゲノムワイドな発現プロファイル情報を整備した。なお、本研究期間中にアウトリーチ活動を358件実施した。アブラナ科植物の自家不和合性におけるS遺伝子下流因子を同定するために、シロイヌナズナだけでなく、自家和合性のアブラナも加えて、比較検討することが有効であると考え、両材料を使って、平行して実験を行った。シロイヌナズナを材料とした場合、より安定な自家不和合性表現型を得るためには、プロモーター、イントロンなどのどの部分が寄与しているかを、決定するために、近縁の自家不和合性種の遺伝子構造と比較し、ゲノム断片を入れ替えた形質転換体を作出することで、決定することを試みた。その結果、自家不和合性に戻すためには、逆位を戻すことが重要であり、発現にはプロモーターが重要ではないかと考えられ、これが遺伝学的にS遺伝子下流を単離するための重要な研究材料になると判断した。一方、アブラナの自家和合性系統の解析面では、自家和合性、自家不和合性系統間でLMDと次世代シークエンサーを組み合わせた手法を用いて、両系統での遺伝子発現の差異などを調査し、10程度の候補遺伝子に絞り込んだ。遺伝子発現、遺伝的位置から考え、この10遺伝子の中に、原因遺伝子があることが考えられた。しかしながら、本解析では、これ以上に絞り込むことは、困難と考え、他の類似現象との共通性なども加味し、どの遺伝子を候補として、形質転換系などで、原因遺伝子とするのかを次年度以降検討することとした。これらの研究活動に加えて、植物を材料として、品種改良、植物多様性、受粉等をテーマとしたアウトリーチ活動も50件程度行い、小中高生並びに、その指導教員の先生方からも高く評価され、次年度も継続してほしいという意見を多く頂いた。シロイヌナズナについては、自家不和合性安定表現型の系統について、近縁野生種の自家不和合性系統との比較から、どの変異が自家和合性となった主要因であるかについて、検討を行った。その結果、第二エクソンの逆位が最も重要であることを明確に示した。さらに、この系統を用いて、変異の誘導を行ったが、期待されたほどの自家和合性系統が表れなかったことから、自家和合性系統との交配によるQTL解析に、解析手法を切り替えて、和合性原因の物理的位置について、ラフに検討を行った。その結果、アブラナ自家和合性系統で想定されているような遺伝子がその領域内に見いだされず、このことは、シロイヌナズナ、アブラナは同じアブラナ科であるが、それぞれの属である、シロイヌナズナ属、アブラナ属によって、S遺伝子下流因子が異なる可能性が示され、独立に実験を行うことが重要であることを示した。また、アブラナの自家和合性系統の解析から、3つの候補遺伝子に絞り込み、柱頭での一過的な発現により、表現型の変化を観察したが、MLPKで機能したような実験系を再現できず、一過的な実験法では、最終的な原因遺伝子を決定できなかった。そこで、自家不和合性系統に遺伝子導入を行うことで、自家和合性に表現型の変化が見られないかを検討している。こうしたことと平行して、アウトリーチ活動をこのテーマである植物、品種改良、多様性、生殖というテーマで行い、小中高生に好評であり、次年度も継続してほしいという意見を頂いた。アブラナ科植物の自家不和合性における花粉と雌ずいの自他識別後のSRK下流因子について、シロイヌナズナ、アブラナを材料として検討を行った。アブラナについては、TSC28系統の候補遺伝子について、遺伝子破壊ベクターを人工的に合成して、植物に遺伝子導入を行った。現在、幼植物を得ており、この植物体の表現型の変化を観察することにより、初期の目的である下流因子を同定できるものと判断する。また、確定次第、論文をオープンアクセスとして公開する予定である。また、別系統のものについては、100個体を超える植物体を展開し、QTLの領域を狭めた。TSC28系統と同様に、研究の継続により、下流因子を同定でき、TSC28系統の下流因子との相互作用も検討可能となる。シロイヌナズナについては、SCシロイヌナズナ系統の表現型が安定せず、候補遺伝子の導入を試みたが、安定した結果を得ることができず、候補遺伝子を絞り込むことが困難であった。昨年度のシロイヌナズナのSCの原因との関連を解き明かすことで、安定化させ、候補なのか、原因遺伝子なのかを明確にできると考えた。本研究活動と並行して、この研究テーマである植物、品種改良、多様性、生殖というキーワードの元にアウトリーチ活動を100件行い、3,802通の児童生徒からの手紙に返事を行い、小中高生、その指導教員から高い評価を得た。本研究の今後の継続とともに、アウトリーチ活動についても継続したい。

自家和合性系統のQTL解析と乳頭細胞発現遺伝子の網羅的解析の統合で、下流因子候補、耐病性関連遺伝子を同定した。その遺伝子の破壊系統を作出中であり、自家不和合性と耐病性下流因子との共通性が見えつつある。SIシロイヌナズナ系統では、後代でのSI形質不安定性の原因を探索し、当初見出していた第2エキソン内の逆位配列に加え、プロモーター領域の転写活性能の低下にもその原因があることを明らかにした。高速シーケンサーから得られた発現遺伝子断片の塩基配列情報を前処理、リファレンス・ゲノムへマッピング処理で、ゲノムワイドな発現プロファイル情報を整備した。なお、本研究期間中にアウトリーチ活動を358件実施した。採択が年度半ばであったことから、準備をすることが大変であったが、一部の実験を次年度に継続することで、予定通りの研究を推進できたと考えている。一方で、研究開始時点で、シロイヌナズナに加えて、アブラナの自家和合性系統を解析に加えることで、同じアブラナ科でも、シロイヌナズナとアブラナでのS遺伝子下流因子の共通性などを直接的に証明することが可能となり、この比較が次年度以降の研究の発展に大きく寄与できると考えた。昨年度の採択が年度後半以降であったために、準備が十分でなかったが、シロイヌナズナに加えて、アブラナを材料に加えたことによって、概ね順調に研究は推移している。シロイヌナズナについては、近縁野生種の自家不和合性系統とのゲノム比較からどの因子が重要であるか、判断でき、安定した自家不和合性系統が確立できた。一方で、遺伝面について、若干の不安定性があることは、単純な遺伝的な問題だけなく、エピジェネティックな問題もある可能性を考慮する必要があると判断した。また、自家和合性アブラナ系統も解析することにより、同じアブラナ科であっても、属によって、S遺伝子下流因子が異なる可能性があることが推察され、次年度以降の研究の展開方向に一定の方向性を決めることができたことによる。27年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子育種学シロイヌナズナについては、安定化した自家不和合性系統が得られたので、変異を導入し、どの程度の自家和合性表現型を持ったものが出現するのか、それによって、MutMap法、QTL法のいずれが適切かを判断する。アブラナについては、10程度まで絞り込んだ候補遺伝子のどれが最終的な原因遺伝子であるかを決定し、これまでにMLPK遺伝子で実績のある一過的遺伝子発現法などにより、決定する。今年度、高い評価を受けたアウトリーチ活動についても、継続して行い、国民への科学の還元を行う。シロイヌナズナについては、ゲノム情報と物理的位置を統合することにより、原因遺伝子を単離する。アブラナについては、遺伝子導入個体の表現型の変化から自家不和合性との関連を明らかにする。また、最終年度であることから、この3年間の成果の全てに対して、実験結果を、論文発表することで、世界に情報発信を行う。また、今年度もアウトリーチ活動を平行して行い、国民への科学の還元を行う。
圧力を用いた蛋白質立体構造形成の遷移過程における水分子の寄与の解明

本研究では、水和水の挙動を反映する蛋白質の部分体積に注目し、チトクロムc(Cyt c)の立体構造形成過程の圧力依存性を測定することで、蛋白質立体構造形成における水の挙動について、以下の成果を得た。1.塩酸グアニンジン存在下、天然状態と変性状態の平衡状態にあるCytcについて、その平衡定数の圧力依存性から、部分モル体積の差(ΔV_<UN>)をより正確に求めたところ、天然状態の方が約25ml/mol小さいことが示された。Cyt cの立体構造形成におけるこのような負の体積変化は、疎水性部位からの水和水の解離(脱水和)による体積減少が顕著であることを示しており、その原因として疎水性の高い分子団であるヘム周りからの脱水和の寄与が示唆された。このような脱水和は、大きな正のエントロピー変化を伴い、変性状態から天然状態への立体構造形成に伴うペプチド鎖が失う莫大な構造エントロピーを相殺することで、蛋白質の立体構造形成をエネルギー的に有利にしていると考えられた。2.初期収縮状態(collapsed state)から天然状態への構造形成のための活性化体積、つまりcollapsed stateから遷移状態までの部分体積の差(ΔV^*_<CN>)(-14ml/mol)と1.の結果を比較すると、その体積差は同程度であった。このことは、Cyt cにおいては、その変性状態から天然状態への立体構造形成の全過程で排出される水和水の個数と同程度の個数の水和水が、この遷移状態形成に脱水和することを意味している。つまり、Cyt cにおけるcollapsed stateから天然状態に至る遷移状態の段階で、既に天然状態に近い構造が形成されている可能性を示している。蛋白質の立体構造形成時には、蛋白質と相互作用している水和水の挙動が重要である。しがし、水の挙動を観察することは困難で、現在まで十分な情報は得られてはいない。本研究では、水和水の挙動を反映する蛋白質の部分体積に注目し、チトクロムc (Cyt c)の立体構造形成過程の圧力依存性を測定することで蛋白質立体構造形成における水の挙動について、以下の成果を得た。1.塩酸グアニンジン存在下,天然状態と変性状態の平衡状態にあるCytcについて,その平衡定数の圧力依存性から,部分モル体積(V^〇)は天然状態のほうが約60ml/mol小さいことを明らかにした。天然状態では内部の空隙やアミノ酸残基間の相互作用の形成によりV^〇は増加するが、Cyt cの場合にはその効果よりも疎水性部位からの水和水の解離(脱水和)による体積減少の効果が大きいことが示された。2.1.での体積減少をさらに検討するため、通常の水(^1H_2O)とは脱水和による体積変化が異なる重水(^2H_2O)を用いて同様な実験を行った。その結果、^2H_2O中でのCyt cの立体構造形成に伴うV^〇の減少は約20ml/molと算出され、^1H_2Oの場合より小さく、今回観測されたV^〇の変化は疎水的部位からの脱水和を反映していることが確認された。つまり、Cyt cの構造形成時には疎水性残基やヘムに水和した水が排出されることを実験的に示すことができた。3.光誘起の電子移動反応を利用したCyt cの構造形成速度の圧力依存性から、その遷移状態の体積変化(活性化体積)は構造未形成時に比べて約15ml/mol小さいことが明らかになった。1.2.より、この体積減少も脱水和によるものと考えられ、Cyt cの構造形成のための遷移体形成においても、疎水性残基やヘムから水分子が解離することが必要で、この水和水の解離は構造形成のためのエントロピーを減少させる寄与があることを示唆している。
神経活動依存的な大脳皮質血流調節機構の分子基盤

脳活動を支えるエネルギーは個々の脳領域の活動レベルに応じて局所的に血流が調節されることにより供給される。実際この原理を利用してPETや機能的MRIはヒト高次脳機能の解析に用いられているが、本調節の詳細及び分子機序は明らかでない。本現象の解明にむけて、細胞内代謝レベルを反映して開閉する血管平滑筋型ATP感受性カリウム(K_<ATP>)チャネルのサブユニットKir6.1を欠失させた(KO)マウスを用いた解析を行っている。本年度予想外の展開があった。すなわち血管平滑筋マーカーとして抗αSmooth Muscle Actin(SMA)抗体を用いてイムノブロットを行ったところ、KOマウスの脳は野生型に比しSMA発現量が著しく減少しており、この減少は類縁サブユニットであるKir6.2の欠損マウスでは認められなかった。詳細な免疫組織学的検索により、KOマウスの脳には脳表面の太い動脈はあるが、脳実質に貫入する細動脈、中でも15ミクロン以下の細い細動脈が少ないことが判明した(山田他,日本神経科学大会2005)。この結果はこれまでin vivoで行ってきたレーザードップラー法を用いた血流計測で、KOマウスが短時間ひげ刺激に対し脳血流上昇を示さなかった理由を説明すると同時に、脳実質内部の細い血管の生理的な役割の一端を初めて具体的に示唆したものである。また血管発達へのK_<ATP>チャネルの関与も示唆される。最近SMAは脳毛細血管周囲を取り囲むpericyteにも存在する可能性が示唆された。そこで血管平滑筋型K_<ATP>チャネルの細胞局在の詳細を明らかにすることが今後本現象の解明に必須である。本チャネルにはこれまで有効な抗体がなく、類似構造を持つ膵ベータ細胞型K_<ATP>チャネルとの区別も難しかったが、ごく最近統合脳を通じ強力な共同研究者に恵まれて新たに抗体作成を開始し、現在4回免疫後の採血精製中である。また今後、血管拡張へのK_<ATP>チャネル関与の機序について、急性脳sliceで神経興奮時の血管拡張の精密な可視化を目指し、薬理的手法により解明を試みる。対象血管は3次元的に動き、予想される変化は10ミクロンの数%程度だが、EGFP発現マウスでは血管観察に成功し、来年度夏以降に高速共焦点顕微鏡導入も決定した為、機序の解明にも全力を尽くす。
血清アミロイドA多型の機能的解析

血清アミロイドA蛋白(SAA)の代謝機構の解明のため、種々のSAA親和性物質との結合様式を表面プラズモン解析機種、ビアコアを用いて解析した。親和性物質としてまず、SAAが生体内でアポ蛋白として存在するHDLを用いた。rSAAのセンサーチップへの固定法、HDLの添加条件などの検討に1年を要した。2年目に、定められた条件で3種のSAA1アイソタイプとHDLの親和性を検討したところ、親和性の強さはSAA1.5>SAA1.1=SAA1.3という結果になった。SAA1.5保有者において血中SAA濃度が高くなるという観察が、HDL中で安定であるという今回の実験で裏付けられた(論文印刷中)。3年目は、SAAをチップ上に固相化した実験系で分析物にヒト末梢リンパ球、単球、単球様株化細胞であるTHP-1を使用して検討した。程度の差こそあれ、これら細胞間にSAAへの結合性の差異はなかった。用いたSAAについてはマウスリコンビナントintact SAAとヒト組織から抽出したAA蛋白はこれら細胞への結合性を示したが、ヒトリコンビナントintact SAAはどのアイソタイプでも有意な結合性を示さなかった。SAAのアミロイド線維化において細胞の関与が必須であることから、ヒトSAAが線維化するにはC末端の除去が必要であり、このことはヒト臨床材料のアミロイド組織中にintact SAAが存在せず、マウスアミロイド組織では存在するという事実を裏付けるものである。血清アミロイドA蛋白(SAA)の代謝機構の解明のため、血中で結合しているリボ蛋白HDLとの結合親和性を検討した。方法は、分子間相互作用を解析する表面プラズモン共鳴を利用したビアコアを使用した。本年度は各種SAA遺伝子組換え体の準備、それをビアコアで使われるセンサーチップに固定化する条件、HDLをアナライトとしてアプライする条件、実際の親和解析法、以上を検討した。rSAAは基本的には不港性の蛋白であるため、精製後の凍結乾燥の際にアルカリ溶液で透析するという工夫が必要であった。固定化の際に中性酸性の条件で行うとSMが凝集体として固定化されることが判明し、一旦pH10の緩衝液で溶解後、pH8.5の緩衝液に置換したものを固定化して、モノマーに近い状態でのSAAが固定化された考えた。HDLをアナライトとしてアプライする際、HDLの自己凝集が起こらないよう界面活性剤の添加を要した。本条件ではSMとHDL特異結合が確認されたが、親和性は低く、ビアコアのもつ結合解離の同時解析パターンには適合せず、最大結合量を利用する親和解析の手法をとらざるをえなかった。この条件でHDLへの親和性はSAA1.5>SAA1.1=SAA1.3となり、in vivoのクリアランス検討でクリアランスが遅いとされたSAA1.5がHDLと親和性が高いという矛盾しない成績となった。一方、固定化するSAAの状態、つまりモノマーに近いか凝集体であるかを判断するため、各種モノクロナル抗体との反応性の差を利用できるか検討した。その結果、酸性で凝集したSMに優先的に反応するクローンの存在がわかった。このクローンはSAA凝集をモニターするツールとして期待される。血清アミロイドA蛋白(SAA)の代謝機構の解明のため,種々のSAA親和性物質との結合様式を表面プラズモン解析,機種ビアコアを用いて解析した。昨年度に引き続き,HDLとの結合実験の条件検討を繰り返した。固層に固定化した各種rSAAとHDLとの結合の非特異分の差し引きとしてCNBr処理でN末端20個を除去したrSAAを用いた。このN末端欠如SAAはビアコア上でHDLと結合しないこと,マウスに静注した際のクリアランスが極端に速まることがわかった。

つまりSAAはそのN末端を介して,HDLに結合すること,HDLに結合できないSAAは速やかに循環より排除されることが示された。すなわち,HDLに親和性が低いほど,組織に移行してアミロイド線維になりやすいと考えられた。実際の各rSAA表現多型の親和性は昨年のpreliminaryな検討と同じく,SAA1.5>SAA1.1=SAA1.3となり,濃度が高くなりやすいSAA1.5で親和性が高いこと,少なくとも本邦でアミロイドーシスの危険因子とされているSAA1.3で低いという結果となった。このHDLとビアコア上で反応する様式をSAAの特異的結合とみなし,今度はこれまでに報告されているSAA親和性物質の結合様式が特異的あるか否かの検定を行った。いずれもSAAの固定化量の多い条件で,単球,リンパ球は特異的,好中球,大腸菌は非特異的,な様式を示した。なおマウスrSAAは細胞への結合親和性がヒトrSAAより高く,in vitroの線維化実験でマウスrSAAが線維化し,ヒトrSAAがしないのは細胞への結合の強弱にかかわるのでは,と推察された。今後はマウスSAAとヒトSAAのどの構造の違いが細胞親和性を規定するのか検討する予定である。血清アミロイドA蛋白(SAA)の代謝機構の解明のため、種々のSAA親和性物質との結合様式を表面プラズモン解析、機種ビアコアを用いて解析した。昨年度はSAA1アイソタイプによってHDLへの親和性が異なるという知見を得たが本年度はこの確認の実験を行い、若干の臨床データを加えて国際アミロイドーシス学会会誌に投稿した(審査中)。SAAをチップ上に固相化した実験系で分析物にヒト末梢リパ球、単球、単球様株化細胞であるTHP-1を使用して検討した。程度の差こそあれ、これら細胞間にSAAへの結合性の差異はなかった。用いた、SAAについてはマウスリコンビナントintact SAAとヒト組織から抽出したAA蛋白はこれら細胞への結合性を示したが、ヒトリコンビナントintact SAAはどのアイソタイプでも有意な結合性を示さなかった。SAAのアミロイド線維化において細胞の関与が必須であることから、ヒトSAAが線維化するにはC末端の除去が必要であり、このことはヒト臨床材料のアミロイド組織中にintact SAAが存在せず、マウスアミロイド組織では存在するという事実を裏付けるものである。結論としてはヒトSAAのC末端除去形を実験に供する必要があるが、相当する遺伝子組換え体の発現がうまくいかず難航している。一方、マウスSAAを用いての実験は可能で、細胞としての親和性は単球>リンパ球であることが示された。リンパ球はSAAのキャリア、単球はSAAからアミロイドを生成する主役という説に矛盾しない所見であった。その親和性に影響する因子の研究に応用していきたい。
口腔癌に対する動注化学療法に関する基礎的研究

緒言:当科ではTPP術前動注化学療法について臨床的検討を行い高い奏効率を報告しているが、THP-ADMの先行投与の意義については十分に検討されていない。今回THP-ADMの先行投与が後続薬剤CDDPの組織移行性への影響に関して実験的に検討したので、その概要を報告する。対象および方法:日本白色家兎の足背部に移植したVX2癌にTHP-ADMを先行動注あるいは静注し、CDDP投与時間をTHP-ADM投与後0,5、24、48時間の6群に分け、CDDPの血漿中、腫瘍内およびリンパ節内の濃度を,CDDP単独動注群を対照として検討した。結果:CDDP濃度は、単独動注群(n=4)で腫瘍内濃度2.898±1.213μg/g、リンパ節内濃度1.195±0.818μg/g、血漿中濃度1.785±0.362μg/mlであった。動注0.5時間群(n=4)で、腫瘍内濃度0.815±0.199μg/g、リンパ節内濃度1.375±0.427μg/g、血漿中濃度1.352±0.150μg/mlであった。動注24時間群(n=7)で、腫瘍内濃度1.533±1.973μg/g、リンパ節内濃度3.391±1.991μg/g、血漿中濃度1.793±0.512μg/mlであった。動注48時間群(n=4)で、腫瘍内濃度1.425±1.243μg/g、リンパ節内濃度2.903±1.182μg/g、血漿中濃度2.085±0.706μg/mlであった。血漿中濃度は各群間に有意差なかった。腫瘍内濃度では0.5時間群で他群に比し有意(P<0.05)にCDDP濃度が低値であった。リンパ節内濃度では、24時間群はCDDP単独投与群と0.5時間群より有意(P<0.05)に高値であった。動注24時間群のリンパ節内CDDP濃度は,静注24時間群と比べp<0.05で有意に高値であった。静注群間の腫瘍・リンパ節・血漿内濃度に差はなかった。考察:THP-ADMの先行投与が後続薬剤CDDPの組織移行性に影響を与えていることが示唆され,THP-ADMとCDDPの併用効果に反映したものと考えられた。2剤の併用効果は,Biochemcal Modulationの1つと言える。また,当科でのTPP療法が妥当なレジメンであることが裏付けられた。

また,当科でのTPP療法が妥当なレジメンであることが裏付けられた。従来各種抗腫瘍剤の併用効果は薬剤相互の影響がない前提で薬剤の投与順効果として説明されてきたが、薬剤併用時の組織移行性については検討されていない。今回は、THP-ADMの先行投与がCDDPなどの後続薬剤の組織移行性へ影響しているか否かに関して検討した。平成7年度に、日本白色家兎の足背にVX2腫瘍を移植し、大腿動脈よりTHP-ADMを動注し、投与後30分、24時間および48時間目にCDDPを投与する3群で比較検討した。CDDP投与後30分後に組織を採取し薬剤濃度を測定した。まず、腫瘍、リンパ節、筋肉、腎、肝、心、脳、肺、舌、骨、血漿でCDDPの組織内濃度を比較検討したところ、血漿、筋肉、腎、肝、心、脳、肺、骨および舌に関しては有意差がなかった。そこで、血漿中濃度、腫瘍内濃度およびリンパ節内濃度について検討することとした。CDDP単独投与群(n=3)でのCDDP濃度は、腫瘍内では2.46±1.07μg/g、リンパ節では0.99±0.74μg/g、血漿中濃度では1.87±0.16μg/mlであった。0.5時間群(n=4)でのCDDP濃度は、腫瘍内では0.82±0.04μg/g、リンパ節では1.34±0.18μg/g、血漿中濃度は1.35±0.02μg/mlであった。24時間群(n=7)でのCDDP濃度は、腫瘍内では1.53±3.88μg/g、リンパ節では3.39±3.96μg/g、血漿中濃度は1.79±0.26μg/mlであった。48時間群(n=3)でのCDDP濃度は、腫瘍内では1.16±1.45μg/g、リンパ節では2.35±0.836μg/g、血漿中濃度は1.90±0.32μg/mlであった。以上の結果から、血漿および腫瘍内濃度は各群間に差はなかった。リンパ節内濃度では、24時間群はCDDP単独投与群と0.5時間群より有意(p<0.05)に高値で、0.5時間群はCDDP単独投与群と有意差はないが平均値は1/2以下に低下していた。これらの結果から、THP-ADMの先行投与が後続薬剤CDDPの組織移行性に影響を与えていることが示唆された。緒言:当科ではTPP術前動注化学療法について臨床的検討を行い高い奏効率を報告しているが、THP-ADMの先行投与の意義については十分に検討されていない。今回THP-ADMの先行投与が後続薬剤CDDPの組織移行性への影響に関して実験的に検討したので、その概要を報告する。対象および方法:日本白色家兎の足背部移植したVX2癌にTHP-ADMを先行動注し、CDDP投与時間をTHP-ADM投与後0,5、24、48時間の3群に分け、CDDPの血漿中、腫瘍内およびリンパ節内の濃度を検討した。結果:CDDP濃度は、単独投与群では腫瘍内濃度2.90±1.21μg/g、リンパ節内濃度1.20±0.82μg/g、血漿中濃度1.80±0.36μg/mlであった。0.5時間群では、腫瘍内濃度0.82±0.20μg/g、リンパ節内濃度1.38±0.43μg/g、血漿中濃度1.35±0.15μg/mlであった。24時間群では、腫瘍内濃度1.53±1.97μg/g、リンパ節内濃度3.39±1.99μg/g、血漿中濃度1.79±0.51μg/mlであった。48時間群では、腫瘍内濃度1.43±1.24μg/g、リンパ節内濃度2.90±1.18μg/gおよび血漿中濃度2.09±0.71μg/mlであった。血漿中濃度では各群間に有意差なかった。腫瘍内濃度では0.5時間群で他群に比し有意(P<0.05)にCDDP濃度が低値であった。リンパ節内濃度では24時間群はCDDP単独投与群と0.5時間群より有意(P<0.05)に高値であった。考察:THP-ADMの先行投与が後続薬剤CDDPの組織移行性に影響を与えていることが示唆された。したがって、THP-ADMのCDDPとの併用効果は細胞周期に対する影響と組織移行性への影響とが反映したものと考えられた。
インスリン作用とGTP結合蛋白質

インスリンは標的細胞においてグルコーストランスポータータイプ4(GLUT4)を細胞内の膜分画から細胞膜上にtranslocationすることにより、グルコースの取り込みを促進する。我々が新しく開発した細胞系に、PI3-キナーゼのinhibitorであるワートマニン(50nM)加えると、インスリン刺激によるPI-3キナーゼ活性と共にGLUT4のトランスロケーションも完全に押さえられることからPI-3キナーゼはGLUT4のtranslocationに関与している可能性が高い。さらに、GTP-γ-S添加でGLUT4がtranslocationすることから、GLUT4のtranslocationにはGタンパク質が関与していることは確実と思われるが、その1つとしてrabファミリーが注目されている。そこで、ほとんどのrabファミリーを不活性型にすると考えられているrab GDIを大量に発現しているクローンを確立した。しかし、インスリン刺激によるGLUT4のトランスロケーションには全く影響を与えなかった。このことは通常Exocytosisに広く係わっていると考えられているrabファミリーはGLUT4のトランスロケーションに関与していない可能性が高い。またdominant negativeとpositiveのrasを我々の細胞系に大量に強制発現させてもインスリンによるGLUT4のトランスロケーションには影響を与えないことから、ras及びその下流にあると考えられるMAPキナーゼが関与する可能性も低くなった。そこでGLUT4のトランスロケーションがNaFで引き起こされることから三量体Gタンパクの関与を考える必要が生じてきたと思われる。
染色体複製のライセンス化異常と細胞のガン化

細胞当たりのゲノムサイズを一定に維持する制御機構として、一細胞周期に染色体の複製を一回に保証する"複製のライセンス化制御"が知られている。研究代表者は、分裂酵母において、cdc18とcdt1を高発現させると過剰複製が誘導されたことから、両遺伝子がライセンス化制御において中心的役割を担っていることを明らかにした。本研究では、その成果を高等動物細胞に発展させ、ガン細胞における染色体数の増加と過剰複製の関連を調べるべく、ヒトCdt1遺伝子のクローニングを行った。ショウジョウバエと分裂酵母のcdt1遺伝子をもとに、ヒトESTデータベースより相同性のあるクローンを見つけ、ラムダファージライブラリーより全長を含むcDNAをクローニングした。同時に、大腸菌に発現させたタンパク質を用い抗体の作製を行った。ウエスタン法で、ヒトHeLaおよびKB細胞で65kDaのバンドを認識した。得られたヒトCdt1cDNAをCos7細胞に発現させると65kDaのタンパク質が高発現されたので、全長のヒトCdt1cDNAがクローニングされたと結論した。続いて、細胞周期でのヒトCdt1タンパク質の発現を調べた。ダブルチミジン法により作製した同調培養では、ヒトCdt1タンパク質は、G1期中期にその量がピークとなり、S期開始後は、速やかに消失することが認められた。DNA合成阻害剤であるアフィデイコリンやヒドロキシ尿素でS期初期に止めた状態では、すでにヒトCdt1タンパク質は検出できなかった。ノーザン法では、ヒトCdt1mRNAの発現は細胞周期を通じて検出されたのでヒトCdt1タンパク質は、S期開始後は、速やかに分解されると予想された。以上の結果より、ヒトCdt1タンパク質は、複製のライセンス化が行われるG1期にのみ蓄積し、S期開始後は消失しており、その量は再複製を防止するうえで合目的に制御されていると考えられた。
末梢神経と免疫細胞のクロストーク～皮膚掻痒のメカニズム解析を目指して～

掻痒は生活の質を低下させる身体症状の一つである。特に既存の治療では効果が不十分な事から新規治療法の開発は緊要の課題である。これまでにアトピー性皮膚炎(AD)患者や乾皮症患者では多数の知覚神経線維が表皮内に侵入し、増生する。そこで我々は、皮膚透明化(CUBIC)の手法を用い、様々なマウスアレルギー性皮膚炎モデルにおける皮膚内の末梢神経の動態を観察した。イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルにおいても、病変部の表皮内に神経線維の増生を認めた。また、VEGF-Aが表皮内神経線維の増生を促し、乾癬モデルマウスにおける掻痒の病態形成に関与している可能性が示唆された。掻痒は生活の質(quality of life, QOL)を低下させる症状の一つである。特に難治性の掻痒はQOLを著しく低下させ、既存の治療では効果が不十分な事から新規治療法の開発は緊要の課題である。掻痒を伴う皮膚疾患では、好酸球や好塩基球の著明な細胞浸潤が観察されるが、現在まで免疫担当細胞と末梢神経の関係性については明らかになっていなかった。そこで申請者は、皮膚掻痒時の末梢神経の動態と好酸球や好塩基球を始めとする免疫担当細胞との関係性に着目し、遺伝子改変マウス及び二光子顕微鏡を用いる事で生理的に近い条件での解析を行い、皮膚掻痒の病態解明を目指すこととした。まずはマウス・ヒトサンプルを用い定常状態の神経線維の分布等の評価を行った。これまで神経線維の評価は免疫組織染色を用いることが多かった。しかし、通常の組織染色ではメラニン等の色素の影響で表皮から真皮を含めた広範囲にわたる神経の観察は難しかった。そこで、当研究室では透明化の手法を用い検討した。透明化を用いた検討ではマウス、ヒトともにPGP9.5抗体を用いた末梢神経の染色に成功している。さらに、マウスを用い乾皮症モデル・テープストリッピング、アトピー性皮膚炎モデル等を施行しサンプルを回収し、透明化した後に二光子励起顕微鏡を用いて観察を行った。アトピー性皮膚炎モデルにおいては、定常状態と比較し末梢神経伸長を認め、広範囲かつ三次元的に解析可能となった。掻痒は生活の質(quality of life, QOL)を低下させる身体症状の一つである。表皮内に増生した神経線維は、外的刺激に容易に反応しやすくなり痒み増悪の要因となることが報告されている。そこで我々は、前年度までに確立した皮膚透明化(CUBIC)の手法を用い、様々なマウスアレルギー性皮膚炎モデルにおける皮膚内の末梢神経の動態を観察した。特に、乾癬モデルであるイミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルにおける検証をおこなった。ADモデルの時と同様に、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルにおいても、病変部の表皮内に神経線維の増生を認めた。続いて、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)が乾癬の炎症に関与し、抗VEGF抗体が乾癬の皮膚病変を改善させるとの報告がある。さらに、VEGFには、脊髄後根神経由来神経細胞の神経突起の伸長に関わるとの報告もあり、乾癬の掻痒メカニズムにおける、VEGFの役割について検討した。免疫組織学的解析において、掻痒のある乾癬患者の病変部ではVEGF-Aの産生を認めた。また、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルにおいても、皮膚局所でのVEGF産生が亢進していた。さらに、ケラチノサイト特異的VEGF過剰発現マウスでは、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎は悪化し、表皮内神経線維の増生も認めた。以上のことから、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルにおいて、VEGF-Aが表皮内神経線維の増生を促し、掻痒の病態形成に関与している可能性が示唆された。計画当初、末梢神経に特異的に蛍光を有するThy1-YFPマウスを用いて、さまざまな状況における末梢神経の分布等を観察予定としていた。しかし、今のところ原因は究明されていないが定常状態では十分に神経線維を観察できるものの、炎症状態では神経線維を十分に同定できず、実験進捗状況に遅れをきたしていると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。

皮膚科掻痒時の免疫担当細胞の動態、機能評価のために、好酸球欠損ウスもしくは好塩基球特異的除去マウスなどの各種免疫担当細胞欠損マウスを使用し、起痒物質投与時や当研究室でこれまで実施してきた乾皮症モデル、アトピー性皮膚炎モデル、尋常性乾癬モデルなどを施行し、末梢神経の動態を免疫組織学的、および二光子励起顕微鏡を用いてin vivoで観察する。免疫担当細胞欠損マウスだけでなく、近年掻痒に関連する事が新たに報告されたTymic stromal lymphopoietin (TSLP)ノックアウトマウス等や病態に関与するサイトカインノックアウトマウスなども用いて、さまざまな状態における末梢神経の動態評価を行う。また、ヒト皮膚疾患での評価のために実際のアトピー性皮膚炎患者や痒疹、水疱性類天疱瘡、皮膚T細胞リンパ腫など強い掻痒を伴う疾患患者の皮膚サンプルや血液サンプルにて確認することにより、病態の詳細な解明と新規治療の開発に向けた応用基盤を形成する。具体的には皮膚標本は、神経線維や浸潤細胞の免疫組織学的染色、表皮と真皮に分離した後、定量性PCRによるサイトカイン・ケモカイン発現を解析する。血液解析は、フローサイトメーターを用いた血球の表面マーカーの解析や細胞内サイトカインの解析、血清に関しては血清中のサイトカイン・ケモカイン濃度(特にTSLPやIL-31など新規起痒物質を中心に)ELISAにて測定していく予定である。申請者は既に、好塩基球の新規活性化マーカーであるIL-33受容体が、強い掻痒を伴う皮膚T細胞リンパ腫患者の末梢血において発現上昇していることを見出している(未発表データ)。同様にCD63, CD69,もしくはCD203cといった好塩基球の活性化マーカーに関して各疾患で発現を確認し、かゆみもしくはTSLPやIL-31などの起痒物質との相関関係を検討する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
IFALDの病態解明に基づく大建中湯を用いた新規治療法の開発

小児外科疾患である多発小腸閉鎖や中腸軸捻転、壊死性腸炎等により大量小腸切除を余儀なくされた短腸症候群患児らは、長期絶食下での完全静脈栄養(TPN)による術後管理が必要になる。TPN管理下におかれた患児では腸管不全関連肝障害(IFALD)を発症し、予後に大きな影響を与えることがあるが、IFALDの発症に関しては全体が明らかにされていない。一方、大建中湯は、一般的にイレウスの治療に用いられている漢方薬で、近年その下部消化管運動促進作用以外に、血流増加作用と炎症性サイトカインの抑制に働くことが示されつつある。本研究では消化管に様々な効果的作用をもつ大建中湯を用いて、短腸症候群モデルラットにより短腸症候群・長期絶食におけるIFALDの発症機序を明らかにするとともに、IFALDの予防的治療法を開発することを目的とする。本年は、7週齢の雄性SDラットを本研究のモデル動物とし、ヒトの平均寿命と68歳(WHO2012)ラットの平均寿命は725日を比較検討しヒトの約1年間に相当する14日間をモデルラットの長期絶食期間として設定し観察を行った。モデルラットの作成は、吸入麻酔下に右外頸静脈から右上大静脈起始部に中心静脈カテーテルを留置し、皮下を通して背部に導出し頸静脈栄養ルートを確保する方法で行った。大建中湯は、日局カンキョウ、日局サンショウ、日局ニンジンの乾燥エキスが5:2:3の比率で配合されているツムラ大建中湯エキス顆粒(株式会社ツムラ)を用いた。ヒトに対し使用される大建中湯の量は一般的に15gであるため、成人体重50kgで換算し1日投与量を0.3g/kgとして、胃内に投与した。Control群には同量の乳糖を投与した。14日間飼育した後、様々な項目で評価を行った。実験手技や管理方法の習得に時間を有したものの、動物実験モデルの確立とサンプルの確保は一定数行えた。我々の先行研究で2週間の絶食TPNでPNALDを発症することが確認されているが、病理組織学的に大建中湯投与モデルでPNALD発症が抑制できる傾向がみられている。同様に小腸粘膜の萎縮も改善できる傾向がみられている。炎症性サイトカインの解析を行い、さらに大建中湯がもたらすPNALDに対する効果について検討を加えていくと同時に、大量腸管切除モデルも確立させ、大建中湯の投与により、IFALDの病態発生メカニズム解明のための検討を行っていく。
中国チベット南部地熱地域の構造と熱水系の関する研究

本研究では中国チベット羊八井地熱地域の地熱系に関する研究を行った。チベット地域を含む長さ3000km,幅150kmのヒマラヤ地熱地帯には多くの地熱地域が存在するが、この羊八井地熱地域はその代表的な地熱地域の1つであり、またヒマラヤ地熱地帯の中でも最も調査研究が進んでいる地域でもある。従って、羊八井地熱地域に関してはすでに多くのことが明らかにされ、それらの成果をもとに、すでに合計24MWに達する2つの地熱発電所が稼働されている。しかしながら、熱源など基本的な問題も含め、まだまだ未解明な点も多い。それらのうちの1つが羊八井地熱地域を含めた「ヒマラヤ地熱地帯の熱源は何か」ということであり、また羊八井地熱地域固有の問題として「熱水系形成のメカニズムは何か」ということである。本研究ではこれらの問題に対して、現地での既存資料の収集、現地での各種調査の実施とその解析、そして、それらのデータを総合化して数値的な熱構造モデリングを行った。調査の内容としては、比較的浅部の地下構造解明のためのAMT探査、深部地下構造解明のためのULFMT探査を行った。この探査結果に対し、1次元解析さらには2次元インバージョン解析を行い地下比抵抗断面図を作成した。その結果、地殻浅部(数km深)に異常に低い低比抵抗ゾーンが検出され、本地域の地熱活動の熱源として貫入岩体の存在が推定された。また、深部からの熱水の上昇ゾーンを特定するため、浅層地温探査および地化学探査(土壌水銀中の水銀およびCO_2濃度測定)を行った。その結果、地温調査および地化学探査結果ともに、本地熱地域の北部地域に深部からの熱水の上昇の可能性が強いことを明らかにした。さらに、地表から流出している温泉水の化学分析や熱水変質土壌のX線回析分析を行い、本地熱地域が火山性である可能性が強く示唆された。これらの調査結果および従来同地域で得られている調査結果を総合化し、まずはじめに本地熱系の概念モデルを作り、つぎにこれに基づいて、コンピュータによる数値モデリングを行った。その結果、地熱活動を維持する熱源に関しては、地表には新しい火山活動は見られないが、地殻浅部(5km深程度)に存在するであろう貫入岩体的(冷却が進んだものではなく、現在でも溶融状態に近い高温状態が維持されているものと推定される)なものが推定された。広範囲にわたる高地殻熱流量の存在を考えると、地殻中部(10-15km深)にはヒマラヤ地熱地帯の幅に相当する150km程度の範囲に普遍的に浅部貫入岩のオリジンすなわち花崗岩質岩石の溶融層があるのではないかと推定される。このように考えると、ヒマラヤ地熱地帯の地熱活動の熱源は深部火山活動起源と考えられる。しかし、ヒマラヤ地熱地帯では、プレートの沈み込み地域やプレート生産地域のように、何故に地表に火山活動が見られないかという問題が生じる。これに関しては深部から供給される熱量には大きな差はないが、応力場の違いから(張力場ではなく圧縮場にある)、マグマが地表近くまで到達できなかったことが考えられる。一方、羊八井地熱地域の熱水系に関しては以下のように考えられる。北部地域のいずれかの場所に深部の花崗岩の基盤中の断裂を通って熱水が上昇し、それが側方流動に転じ、透水性のよい厚さ500m程度の氷河堆積物中を南方に向かって流動している。そして、開発前には、水理学的環境からその大部分は地表に流出し、活発な地熱活動を呈していた。しかしながら、開発の進展に伴い、最終的には流動する熱水のほとんど大部分を生産したため、地熱活動はほとんど消失してしまった。このような事情を考慮すると本地域における地熱流体の生産を今後増加させることには困難があると考えられる。むしろ、高い地殻熱流量にもたらされている花崗岩質高温岩体の熱エネルギー利用に将来性があるのではないかと考えられる。

また、深部からの熱水の上昇ゾーンを特定するため、浅層地温探査および地化学探査(土壌水銀中の水銀およびCO_2濃度測定)を行った。その結果、地温調査および地化学探査結果ともに、本地熱地域の北部地域に深部からの熱水の上昇の可能性が強いことを明らかにした。さらに、地表から流出している温泉水の化学分析や熱水変質土壌のX線回析分析を行い、本地熱地域が火山性である可能性が強く示唆された。これらの調査結果および従来同地域で得られている調査結果を総合化し、まずはじめに本地熱系の概念モデルを作り、つぎにこれに基づいて、コンピュータによる数値モデリングを行った。その結果、地熱活動を維持する熱源に関しては、地表には新しい火山活動は見られないが、地殻浅部(5km深程度)に存在するであろう貫入岩体的(冷却が進んだものではなく、現在でも溶融状態に近い高温状態が維持されているものと推定される)なものが推定された。広範囲にわたる高地殻熱流量の存在を考えると、地殻中部(10-15km深)にはヒマラヤ地熱地帯の幅に相当する150km程度の範囲に普遍的に浅部貫入岩のオリジンすなわち花崗岩質岩石の溶融層があるのではないかと推定される。このように考えると、ヒマラヤ地熱地帯の地熱活動の熱源は深部火山活動起源と考えられる。しかし、ヒマラヤ地熱地帯では、プレートの沈み込み地域やプレート生産地域のように、何故に地表に火山活動が見られないかという問題が生じる。これに関しては深部から供給される熱量には大きな差はないが、応力場の違いから(張力場ではなく圧縮場にある)、マグマが地表近くまで到達できなかったことが考えられる。一方、羊八井地熱地域の熱水系に関しては以下のように考えられる。北部地域のいずれかの場所に深部の花崗岩の基盤中の断裂を通って熱水が上昇し、それが側方流動に転じ、透水性のよい厚さ500m程度の氷河堆積物中を南方に向かって流動している。そして、開発前には、水理学的環境からその大部分は地表に流出し、活発な地熱活動を呈していた。しかしながら、開発の進展に伴い、最終的には流動する熱水のほとんど大部分を生産したため、地熱活動はほとんど消失してしまった。このような事情を考慮すると本地域における地熱流体の生産を今後増加させることには困難があると考えられる。むしろ、高い地殻熱流量にもたらされている花崗岩質高温岩体の熱エネルギー利用に将来性があるのではないかと考えられる。チベット南部の地熱地域のうち、代表的な地熱地域である羊八井地熱地域において、地表面温度、1m深地温調査,AMT探査、土壌水銀探査および変質帯の調査を行った。1.地表面温度調査の結果、変質地域に最高温度20.6°C(バックグラウンド温度11°C)の高温地域があり、一部地域に噴気あるいは流体の流出が認められた。2.1m深地温分布の高温異常は浅層地熱流体の流動を反映していると判断される。また、水銀濃度異常は地温分布と正の相関関係にある。3.AMT探査の結果、浅層地熱流体の存在を示すと考えられる30オーム・m以下の低比抵抗ゾーンが100m以浅で確認された。4.変質地域中心部の深度500m以深にも低比抵抗ゾーンが確認された。以上の結果、当該地域北部において、深部から高温地熱流体が上昇し、それが側方流動に転じ、南方に流下するような初期概念モデルが立てられた。特に、当該北部地域の変質帯の中心部では弱いながらも噴気活動が存在することが確認された。