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アオウキクサ(Lemna)を用いた水環境汚染物質リサイクルの研究

水中溶解物質を迅速に吸収蓄積しかつ高い感受性を示すアオウキクサを,水環境汚染物質の除去回収に役立て,更に水汚染指標生物として用いる為の総合的検討を行い,これを用いて汚染物質の生体系における動態を解明することが本研究の主要な目的である.1.重金属のアオウキクサへの吸収:重金属吸収はアオウキクサ生育環境要因により大きく影響を受け,かつ共存(培養液中に)する他種重金属の種類・濃度にも左右されることが示された.他種重金属の吸収を抑制する傾向は銅において見られ,一方マンガンは他種重金属吸収を全く妨げない金属であった.又鉄の培養液中の有無は,銅,カドミウム等の吸収に影響を与え(鉄の存在により吸収抑制)逆に鉄の吸収は銅の共存により著しく促進されることが示された.これらは,重金属生体内動態研究の新たな知見である.2.鉄のアオウキクサへの吸収と催花作用:鉄吸収の増大がアオウキクサの催花の条件の一つであることが明らかとなった.生体内でのその生理作用は未解明であるが花芽の成長と関わりがあるものと思われる.他の重金属との関連で更に検討することによりアオウキクサの汚染指標としての利用に示唆が得られるものと考える.3.アオウキクサにおける重金属耐性獲得:増殖,生育阻害をもたらさない低濃度のカドミウムを含む培養液で長期にわたり培養した場合,そして,或る程度の増殖阻害を生じる濃度で短期間培養した場合のいずれにおいても,アオウキクサのカドミウム及び銅に対する感受性の低下することが明らかとなった.他の金属による前培養ではこの現象は見られず,カドミウム吸収により特異的に獲得される耐性と思われる.今後,生態系中のアオウキクサの重金属感受性を検討することにより,その水域の重金属汚染状態を推定し得る様な方策を検討してゆく.水中溶解物質を迅速に吸収蓄積しかつ高い感受性を示すアオウキクサを,水環境汚染物質の除去回収に役立て,更に水汚染指標生物として用いる為の総合的検討を行い,これを用いて汚染物質の生体系における動態を解明することが本研究の主要な目的である.1.重金属のアオウキクサへの吸収:重金属吸収はアオウキクサ生育環境要因により大きく影響を受け,かつ共存(培養液中に)する他種重金属の種類・濃度にも左右されることが示された.他種重金属の吸収を抑制する傾向は銅において見られ,一方マンガンは他種重金属吸収を全く妨げない金属であった.又鉄の培養液中の有無は,銅,カドミウム等の吸収に影響を与え(鉄の存在により吸収抑制)逆に鉄の吸収は銅の共存により著しく促進されることが示された.これらは,重金属生体内動態研究の新たな知見である.2.鉄のアオウキクサへの吸収と催花作用:鉄吸収の増大がアオウキクサの催花の条件の一つであることが明らかとなった.生体内でのその生理作用は未解明であるが花芽の成長と関わりがあるものと思われる.他の重金属との関連で更に検討することによりアオウキクサの汚染指標としての利用に示唆が得られるものと考える.3.アオウキクサにおける重金属耐性獲得:増殖,生育阻害をもたらさない低濃度のカドミウムを含む培養液で長期にわたり培養した場合,そして,或る程度の増殖阻害を生じる濃度で短期間培養した場合のいずれにおいても,アオウキクサのカドミウム及び銅に対する感受性の低下することが明らかとなった.他の金属による前培養ではこの現象は見られず,カドミウム吸収により特異的に獲得される耐性と思われる.今後,生態系中のアオウキクサの重金属感受性を検討することにより,その水域の重金属汚染状態を推定し得る様な方策を検討してゆく.アオウキクサは古くから、数々の利点を持つ実験用植物として、植物生理,生態,分類学の各面での研究が進んでおり基礎データが完備しているので、公衆衛生・環境衛生学への応用が最も容易な材料のひとつである。本研究は重金属をはじめとする水環境汚染物質のアオウキクサによる濃縮蓄積とそれによるアオウキクサの増殖能・形態形成変化を観察し、汚染物質貯留タンクとしての植物の役割、生物指標としての役割を明らかにし、併せて各種汚染物質のリサイクル及び生体内動態に関する知見を得ることを目的とする。1.重金属のアオウキクサへの吸収と蓄積:昨年度に引き続き、鉄が他種重金属吸収蓄積において果たす役割を検討し、鉄吸収が十分行なわれているか否かが、アオウキクサ増殖・生長・形態形成を左右していることが示された。アオウキクサに毒性を発揮する重金属の多く(銅を除く)は、鉄吸収を阻害する働きをしていることも明らかとなった。2.アオウキクサの重金属耐性獲得:アオウキクサに増殖阻害をもたらさないような低濃度の銅又はカドミウム(約0.01ppm)で長期間培養したアオウキクサの、銅,カドミウムに対する感受性を調べた処、カドミウム前培養によって、銅,カドミウムへの感受性が著しく低下することが示された。銅前培養ではこの現象は見られず、又、カドミウム,銅の体内濃度は双方共同じであることから、カドミウムにより特異的に生体内で重金属無毒化の機構が形成されるものと推察される。(Sattellite Symposium of the IVthInternational Congress of Toxicologyにて発表。)3.その他汚染物質のアオウキクサにおける毒性発現:農薬類,有機溶剤類は種類によって異なるが1-100ppmの濃度でアオウキクサを枯死せしめる。
知覚としての意図――より広い「意図」概念を用いた新しい行為の哲学の構築にむけて

行為とは何かということは、哲学だけでなく様々な領域で問題になる。この問題に答えるために、本研究は、行為の構成要素である「意図」に注目する。従来の哲学は、意識的な行為などにこだわり、意図概念を狭める傾向にあった。一方、野矢茂樹は意図を知覚として捉えるというアイデアを示した。このアイデアを使えば、無意識の知覚とパラレルに、無意識の行為を行為としてうまく説明できるかもしれない。そこで、本研究は、野矢のアイデアの内実を明らかにし、そのアイデアをもとに無意識の行為なども行為として説明できることを示す。
光励起法によるゼオライト中の窒素特異吸着サイトの状態解析

我々が発見した,銅イオン交換ゼオライトによる窒素吸着特性は,この試料を,窒素の分離,固定,活性化の触媒として利用できる可能性があり,大変興味深い重要な研究テーマであると考える.本研究では紫外線励起を利用した蛍光スペクトル測定,XAFS,IR,ESRスペクトル測定および吸着熱測定によって,窒素を強く物理吸着するイオン交換サイトの状態を明らかにしようとした,特に,窒素の吸着サイトとしてのゼオライト中の銅イオンの構造的・電子的特徴を分子レベルで解析することを目的とした.まず,Cu(I)と選択的に相互作用すると考えられるCOをプローブ分子として用い,Cu(I)の状態を解析した.その結果,この試料を熱処理することによって,ゼオライト中にCu(I)種が形成されることを明らかにした.さらに,1価の銅イオンによる発光スペクトルへの窒素吸着の影響を調べ,窒素の吸着サイトを検討した.窒素の圧力の増加と共に,470と540nmの発光バンドの強度が減少し,同時に540nmのバンドは550nmへシフトする.さらに窒素の圧力を増加(1.18kPa付近で)させると,すべての発光は消光した.この事実は1価の銅イオンが窒素の吸着サイトであることを示している.赤外線吸収スペクトルのデータから,COに対する吸着サイトが3種類存在し,吸着CO種が2151cm^<-1>に吸収バンドを与えるサイトがN_2吸着サイトとして有効であることも明らかにした.銅イオン交換ZSM-5型,モルデナイト(M)型,Y型ゼオライトと窒素分子との結合に関するデータ(吸着熱と波数との関係)から,銅イオン交換ZSM-5,M,およびY型ゼオライトと窒素分子との結合において,σ結合が重要な役割をしていることが推定できた.これらの結果から,ゼオライト中で安定化された1価の銅イオンが特異な吸着性を有すること,ZSM-5中には銅イオンに対する交換サイトが少なくとも3種類あることが明らかになった.さらに,吸着熱と吸着分子の赤外吸収スペクトルのデータから交換イオンと吸着分子の結合状態について重要な知見を得ることができた.我々が発見した,銅イオン交換ゼオライトによる窒素吸着特性は,この試料を,窒素の分離,固定,活性化の触媒として利用できる可能性があり,大変興味深い重要な研究テーマであると考える.本研究では紫外線励起を利用した蛍光スペクトル測定,XAFS,IR,ESRスペクトル測定および吸着熱測定によって,窒素を強く物理吸着するイオン交換サイトの状態を明らかにしようとした,特に,窒素の吸着サイトとしてのゼオライト中の銅イオンの構造的・電子的特徴を分子レベルで解析することを目的とした.まず,Cu(I)と選択的に相互作用すると考えられるCOをプローブ分子として用い,Cu(I)の状態を解析した.その結果,この試料を熱処理することによって,ゼオライト中にCu(I)種が形成されることを明らかにした.さらに,1価の銅イオンによる発光スペクトルへの窒素吸着の影響を調べ,窒素の吸着サイトを検討した.窒素の圧力の増加と共に,470と540nmの発光バンドの強度が減少し,同時に540nmのバンドは550nmへシフトする.さらに窒素の圧力を増加(1.18kPa付近で)させると,すべての発光は消光した.この事実は1価の銅イオンが窒素の吸着サイトであることを示している.赤外線吸収スペクトルのデータから,COに対する吸着サイトが3種類存在し,吸着CO種が2151cm^<-1>に吸収バンドを与えるサイトがN_2吸着サイトとして有効であることも明らかにした.銅イオン交換ZSM-5型,モルデナイト(M)型,Y型ゼオライトと窒素分子との結合に関するデータ(吸着熱と波数との関係)から,銅イオン交換ZSM-5,M,およびY型ゼオライトと窒素分子との結合において,σ結合が重要な役割をしていることが推定できた.これらの結果から,ゼオライト中で安定化された1価の銅イオンが特異な吸着性を有すること,ZSM-5中には銅イオンに対する交換サイトが少なくとも3種類あることが明らかになった.さらに,吸着熱と吸着分子の赤外吸収スペクトルのデータから交換イオンと吸着分子の結合状態について重要な知見を得ることができた.ゼオライト中に存在するナトリウムイオンを銅イオンでイオン交換することができ,その際,化学量論から予想される量より多量の銅イオンでイオン交換した試料を調製することができる.この試料はNO_x分解触媒として有効であることがよく知られている.我々は,この化学量論から予想される値より過剰にイオン交換した銅イオン交換モルデナイトを真空中873Kで処理した試料が,300Kで窒素分子を強く物理吸着することを見いだした.室温で強く窒素分子を吸着する物質はほとんど見いだされていないので,この試料の性質は特筆すべきものである.しかし,その吸着サイトに関する知見はほとんど得られていないのが実状である.このサイトの構造,反応性を明らかにすればより効率的な触媒をデザインできる可能性がある.さらに,室温で窒素を吸着する特性を有するこの試料は,窒素の固定,分離,活性化など(たとえば,アンモニア合成など)の触媒として使用できる可能性もあり,その点からも興味ある物質であると期待できる.本研究では紫外線励起を利用した蛍光スペクトル測定,XAFS,IR,ESRスペクトル測定および熱測定によって,窒素を強く物理吸着するサイトの状態を明らかにしようとした.この際,Cu(I)と選択的に相互作用すると考えられるCOをプローブ分子として用い,Cu(I)の状態を解析した.

その結果,この試料を熱処理することによって,モルデナイト中にCu(I)種が形成されること,しかも,Cu(I)のサイトが二種類存在し,その内の一方が窒素の特異吸着サイトとして有効であることを明らかにした.今後はこれらのCu(I)のサイトの電子状態,構造を分子レベルで明らかにする予定である.我々が発見した,銅イオン交換ゼオライトの窒素吸着特性を利用すると,この物質を窒素の分離,固定,活性化の触媒として使用できる可能性があり,この物質の特性を知ることは大変興味深い重要な問題であると考える.本研究では,窒素の吸着サイトとしてのゼオライト中の銅(I)イオンの構造的・電子的特徴を解析することを目的とした.1価の銅イオンによる発光スペクトルへの窒素吸着の影響を調べ,窒素の吸着サイトを検討した.窒素の圧力の増加と共に,470と540nmのバンド強度が減少し,同時に540nmのバンドは550nmへシフトした.さらに窒素の圧力を増加させ,1.18kPa付近ですべての発光は消光することがわかった.これらの事実は1価の銅イオンが窒素の吸着サイトであることを示している.赤外線吸収スペクトルのデータから,COに対する吸着サイトが3種類あり,吸着CO種が2151cm^<-1>に吸収バンドを与えるサイトがN_2吸着サイトとして有効であることも明らかになった.銅イオン交換ZSM-5型,モルデナイト(M)型,Y型ゼオライトと窒素分子との結合に関するデータ(吸着熱と波数との関係)から,銅イオン交換ZSM-5,M,およびY型ゼオライトと窒素分子との結合において,σ結合が重要な役割をしていることが推定できた.これらの結果から,ゼオライト中で安定化された1価の銅イオンが特異な吸着性を有すること,ZAM-5中には銅イオンに対する交換サイトが少なくとも3種類あることが明らかになった.さらに,吸着熱と吸着分子の赤外吸収スペクトルのデータから交換イオンと吸着分子の結合状態について重要な知見を得ることができた.
腸間膜脂肪織CT濃度上昇の病的意義解釈の為のFDG-PET/CTの有用性の検討

腸間膜脂肪織濃度上昇"Misty mesentery"の病的意義解釈・悪性腫瘍の検出におけるFDG-PET/CTの診断能を明らかにする研究を実施した。平成21-23年に4236検査が当施設で施行され71検査が研究の選択基準を満たし、後方視的な解析には十分な対象者数を得た。本研究の結果、腸間膜内の結節を評価対象病変としたときPET画像で得られる最大SUV値の至適カットオフ値3.0で感度85%・特異度98%、CT画像での最大短径の至適カットオフ値10mmで感度69%・特異度98%であった。両者の何れかを満たせば陽性と判断した場合は感度92%・特異度97%、両者を共に満たせば陽性とすると感度62%・特異度100%となった。ロジスティック解析の結果、双方が互いに独立した悪性予測の為の意義ある指標と確認された。悪性例では背景疾患に関係なく大半が悪性リンパ腫であった。結論としてFDG-PET/CTは"Misty mesentery"内の悪性腫瘍検出に非常に有益な検査であり代謝情報と形態情報の両者を得ることで威力を発揮することが明らかとなった。本結果は論文としてEur J Radiol 2013:82:e380-5(3月受理・8月出版)に掲載された。悪性例の大半が悪性リンパ腫であり付随所見として後腹膜リンパ節腫大が確認された為、追加研究として後腹膜リンパ節を評価対象病変とした場合の成績との比較を行った。この結果こちらは至適カットオフSUV値8.0で感度38%、至適カットオフ短径15mmで感度31%にとどまり、腸間膜内結節を評価対象病変とした方が有意に良い成績が得られた。本結果を第72回日本医学放射線学会学術集会(H25年4月)で報告した。これらをまとめた成果は中日韓核医学会議(同年11月)で公表した。なお当初引き続き予定していた前向き検討は研究代表者異動につき中止となった。
人工光合成モデルデンドリマーを用いた発光素子の開発

次世代のポリマー光ファイバーによる光通信に、相性のよい高分子レーザー素子が望まれている。本研究では、新規高分子レーザー発振媒体として、光増感型デンドリマーに着目し、分子内エネルギー移動によるクロモフォア(発光中心)励起による増幅自然放出光(ASE)について検討を行った。光増感型デンドリマーは、異なる構造のアントラセンユニットとペリレンユニットを予め数種類合成を行い、それぞれのユニットのエーテル化反応により、様々な組み合わせのデンドリマーを合成した。アントラセンユニットを選択的に励起した蛍光測定において、ペリレンの発光が生じたことから、効率のよいエネルギー移動が生じていることが示された。スピンコート法によりガラス基板上に作製したポリスチレン薄膜に、ナノ秒Nd:YAGレーザーの第三高調波(355nm)で励起を行ったところ、アントラセンを内殻に有するデンドリマーにおいては、励起光強度を増加していくと、発光スペクトルの半値幅が狭くなる(FWHM=47mm)ことが観測され、これはASEによるものであることが確認された。一方、デンドリマーの内殻にアントラセンを有しないものは、若干のアントラセンの発光が見られ、発光スペクトルの半値幅は84nmであり、ほとんど先鋭化が見られなかった。これらのことは、デンドリマー内部に有するアントラセンへのエネルギー移動を経由することにより、効率よくデンドリマーコア部のペリレンを励起することができることを示しており、エネルギー移動効率がASEに大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。本研究は、次世代の光通信・光配線に望まれる新規高分子レーザー発振媒体として、人工光合成モデルデンドリマーに着目し、分子内エネルギー移動によるクロモフォア(発光中心)の高効率励起及び濃度消光の抑制により、高分子薄膜中でのレーザー発振を目指すものである。本年度は、新規光増感型デンドリマーの合成及び分子内エネルギー移動にっいて評価を行った。合成したデンドリマーのアントラセンクロモフォアを選択的に励起したところ、アントラセンの蛍光はほとんど消光され、500nm付近にペリレンからの蛍光が観測された。また、観測されたペリレンの極大発光である500nmを観測波長として、励起スペクトルの測定を行ったところ、すべてのデンドリマー分子においてアントラセンの吸収に相当したスペクトルが観測された。これらの結果は、デンドリマー分子内において、アントラセンからペリレンへの効率のよいエネルギー移動が生じていることを示している。一連のデンドリマー分子におけるエネルギー移動効率について評価を行ったところ、いずれも比較的高いエネルギー移動効率を生じていることがわかった。しかしながら、デンドリマー分子の内殻に存在するアントラセンクロモフォアの数において、4個のものと8個のものでは、4個のものの方がエネルギー移動効率を高いことが示唆された。また、外殻に有するアントラセン数は、エネルギー移動効率には、あまり影響を与えないことがわかった。次世代の光通信、光配線に望まれる新規高分子レーザー発振媒体として,光増感型デンドリマーに着目し,分子内エネルギー移動によるクロモフォア(発光中心)の高効率励起及び濃度消光の抑制により,高分子薄膜中でのレーザー発振を目指している。本研究では,この光増感型デンドリマー分子の高次構造がもたらす分子内エネルギー移動及び増幅自然放出光(ASE)について検討を行った。スピンコート法によりガラス基板上に作製したポリスチレン薄膜に,ナノ秒Nd:YAGレーザーの第三高調波(355nm)で励起を行ったところ,ペリレンとアントラセンをモル比1:8の割合で分散した系では,励起光強度を増加しても,ペリレンの発光スペクトルの半値幅は95nmで,ほとんど変化はなかった。それに対し,アントラセンを内殻に有するデンドリマーにおいては,励起光強度を増加していくと,発光スペクトルの半値幅が狭くなる(FWHM=47nm)ことが観測され,これはASEによるものであることが確認された。

一方,デンドリマーの内殻にアントラセンを有しないものは,若干のアントラセンの発光が見られ,発光スペクトルの半値幅は84nmであり,ほとんど先鋭化が見られなかった。これらのことは,デンドリマー内部に有するアントラセンへのエネルギー移動を経由することにより,効率よくデンドリマーコア部のペリレンを励起することができることを示しており,エネルギー移動効率がASEに大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。
時間分解fMRI法による脳賦活の早期応答の検出と脳機能画像化に関する研究

本研究では、ラット四肢の電気刺激モデルを用いたfMRI法における早期応答に関する基礎的実験およびラット脳室潅流モデルを用いた脳脊髄液潅流測定実験を行い、以下の成果を得た。これまで脳脊髄液の産生速度の測定はウサギやイヌ等の中・大型動物を用いて、色素ラベルしたデキストラン等を使ったventriculocisternal perfusion法によるものが殆どで、ラット等の小動物での測定が困難であったために、脳脊髄液産生に関する研究が少なく、生体内環境の脳脊髄液産生に及ぼす影響に関する情報は極めて限られていた。また、これらの過程を三次元的に可視化、画像化し、定量化した例はない。本研究では、ラット脳室潅流モデルを作成し、MRI法を用いた方法で脳脊髄液潅流過程を空間的に可視化、画像化することにより、髄液産生に対する1)動脈血二酸化炭素分圧(PaCO2)の変化の影響、2)脳室内での炭酸脱水酵素阻害の影響を検討した。今回の実験により、脳脊髄液の産生速度とPaCO2の関係を明らかにすることが出来た。現在、脳の活動の画像化法として広く使われている脳機能画像(fMRI)法は、正のBOLD効果を観測、画像化したものである。しかしながら、MR信号変化(正のBOLD効果)の場所と神経活動の起こった場所との間の厳密な対応関係が確立しているわけではない。とりわけ、比較的大きな静脈におけるinflow効果や大きなdraining veinにおける正のBOLD効果の寄与が問題になる。本研究では、脳賦活の早期に現われるデオキシヘモグロビンの増加現象、即ちinitial dip(負のBOLD効果)に基づくfMRI法を開発し、正のBOLD効果に基づくfMRI法の持つ問題点をすべて解決した、より神経活動に特異的な、しかも高空間分解能を持つ新しい脳機能画像法を確立することを目的にしている。平成12年度の研究成果は、以下の通りである。1)動物実験法の確立:NMR法を用いたラット脳の脳機能研究に不可欠なNMRプローブ内非磁性動物定位固定装置の作製および麻酔法を確立した。2)RF検出コイル・プローブの作製:Bruker BIOSPEC 4.7 Tesla MR装置の高感度化に不可欠なラット大脳皮質用および脳深部用の高感度RF検出コイルの回路設計、製作を行った。ラット脳の面内分解能40-80umの高空間分解能MRI画像を高感度で得ることを可能とした。3)超高速撮像法、EPI法:超高速撮像法のグラディエントエコー型およびスピンエコー型のEPIパルス系列を作成し、4.7テスラ高磁場でのEPI画像測定を行った。EPI画像処理ソフトウエアを作成し、Nyquist ghostのないEPI画像を得った。4)時間分解fMRI法の開発を行った。
肥満細胞による血管新生メカニズムの解明

今年度は以下の研究を行った。1.猫の肥満細胞腫においてSCFを介したKITの活性化が血管新生に関与しているか否かを評価するため、猫の肥満細胞腫において最も多く認められたExon8および9の変異によるKITのリン酸化を評価した。この結果、これらの変異によりSCF非依存性のKITのリン酸化が引き起こされていることが明らかとなった。したがって、猫の肥満細胞腫における血管新生にはSCF非依存性のKITの活性化が重要となっている可能性が考えられた。2.猫の肥満細胞腫症例に対しチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブの投与を行いその治療効果を検討した。この結果、猫の肥満細胞腫においてc-kitに変異を有する症例では、8例中7例においてメシル酸イマチニブによる抗腫瘍効果が認められた。したがって、c-kit変異をスクリーニングすることにより、猫の自然発生した肥満細胞腫がKITの活性化を介した血管新生を評価するための良いモデルとなると考えられた。また、今年度は研究従事機関の変更に伴い血管新生に重要な分子であると考えられるGirdin遺伝子改変マウスの解析を行った。GirdinはセリンスレオニンキナーゼのAktの基質である。GirdinのAktリン酸化部位のセリンをアラニンに置換し、Aktによるリン酸化が起こらない変異マウスを用いて、Aortic ring assayおよびMatrigel assayを行ったところ、野生型マウスと比較して血管新生の程度に若干の差が認められた。今後は、移植腫瘍における血管新生および肥満細胞におけるGirdinの発現を評価していく予定である。1.犬の肥満細胞腫症例に対しチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブの投与を行いその治療効果を検討した。この結果、犬の肥満細胞腫においてc-kitに変異を有する症例では、全ての症例においてメシル酸イマチニブによる抗腫瘍効果が認められた。したがって、c-kit変異をスクリーニングすることにより、犬の自然発生した肥満細胞腫がKITの活性化を介した血管新生を評価するための良いモデルとなると考えられた。2.犬の肥満細胞腫の腫瘤から得られたTotal RNAを用いて、RT-PCR法により肥満細胞におけるチロシンキナーゼ受容体の発現を検討したところ、血小板由来成長因子受容体やRET受容体など数種類の受容体が強く発現している事が明らかとなった。したがって、血管新生にはSCFを介したKITの活性化とともに、肥満細胞内のこれらの受容体の活性化も重要となっている可能性が考えられた。3.猫の肥満細胞腫においてSCFを介したKITの活性化が血管新生に関与しているか否かを評価するため、まず、猫の肥満細胞腫におけるc-kit遺伝子の変異の検索、変異発生率の検討、およびその変異によるKITのリン酸化を評価した。肥満細胞腫の猫60例の腫瘤から得られたTotal RNAおよびGenomic DNAを用いてc-kit遺伝子塩基配列の解析を行ったところ、猫の肥満細胞腫ではc-kit遺伝子のExon8およびExon9に非常に効率に変異が発生している事が明らかとなった。中でも変異の発生が解析した症例の約半数と最も多く認められたExon8の重複配列の挿入変異については、PCR法を用いて変異の有無を簡便にスクリーニングできる系を確立した。今後、KITの活性化と血管新生の程度との相関を検討していく予定である。
生体腎をモデルとした蛋白分離膜の合成と評価

本研究では、生体腎の糸球体基底膜をモデルとして効率の良い蛋白分離システムを構築することをめざし、荷電グラフト鎖を有する構造明確な高分子膜素材を合成し、併せて多相高分子表面および界面における環境応答挙動について分子レベルでの検討を行った。1.グラフト型多相膜を用いるモデル界面の構築と蛋白分離への応用膜材料として好適な素材である親水性(ポリビニルアルコ-ル)、および疎水性(ポリウレタン)高分子を幹成分とし、一方グラフト成分として(i)極めてフレキシブルかつ疎水性のポリシロキサン、(ii)体温付近に融点を示すポリTHF、および(iii)正荷電を持つポリモ-ブチルアジリジン鎖を持つグラフト型多相高分子を合成した。ここでグラフト鎖長はリビング重合法を利用したマクロモノマ-法により厳密に制御可能である。こうして得られたグラフト共重合体膜は、キャスト法による製膜によって低表面エネルギ-成分の表面濃縮層を形成することが認められ、この厚さのコントロ-ルが可能となった。さらにこれらグラフト共重合体膜を水中に浸漬し、空気泡に対する接触角を追跡することによって多相膜表面が著しい環境応答を示すことを認めた。2.ポリアクリロニトリル系荷電型限外濾過膜の合成と評価臭素化ポリアクリロニトリルに光グラフト重合することにより、四級アミノ基を側鎖に有する正荷電型およびスルホン酸基を有する負荷電型グラフト修飾ポリアクリロニトリルを合成した。これらを用い多孔構造を有する限外濾過膜を作成し、血漿蛋白であるアルブミンおよびαーグロブリンの透過実験を行った。さらに膜の分画特性と荷電の効果について検討するためデキストランスルフェ-トを用いて透通実験を行った。この結果、透過高分子の荷電の影響が透過速度に明瞭に反映し、蛋白吸着等の課題を克服すれば実用に耐える蛋白分離膜となると期待される。
育児期の女性における不安・抑うつに関する精神医学的研究

アンケートによる調査を行い解析した結果、育児期女性の抑うつ、育児不安の背景因子や特徴に関して以下の知見を得ることができた。(1)産後うつ病は実際には幼児虐待の直接的な危険因子とは言えず、これまでこれらが関連すると言及していた報告については両者に共通の背景としてボンディング困難が存在している可能性が明らかになった。(2)育児不安や虐待恐怖の高さと実際の虐待行動は関係していなかった。このことから幼児虐待への注意喚起は、実際には虐待を行う危険性の少ない母親の不安をあおることにならないよう注意する必要性が挙げられた。育児を行なっている女性2群(児月齢3,4か月群、10ヶ月群)各1,000例に対し心理テストを中心としたアンケートによる調査をおこない、1年後に追跡調査を行うものである。作成したアンケート原案を平成18年8月23日当大学倫理委員会に提出、同年12月12日に承認された。それと並行して京都府、滋賀県の数箇所の自治体にアンケートの配布を依頼し、平成19年1月滋賀県大津市より乳児検診時における配布を承認され、同年2月から配布を開始した。さらに同年3月に京都府助産師会、京都府綾部市、同舞鶴市でも配布を開始しており、現在アンケートの回収、解析作業中である。同年8月までに目標の2000部の配布を終了する予定である。これらの解析により、2群における不安・抑うつ、育児ストレス状況の比較、育児期の不安・抑うつと養育体験、共依存傾向、自我脆弱性や分裂対象関係などのボーダーライン傾向の関連性を明らかにすることができ、さらに追跡調査を通じて虐待行動のリスクファクターを多面的に解明することが期待される。この研究と関連して、外傷的養育体験により形成されるアダルトチルドレン・共依存について行なった研究結果を次項論文として発表した。育児期女性の不安・抑うつに関するアンケート調査を実施し,423例の回答を得,これらのアンケート結果の解析を行った。Zung抑うつスケールの結果から中等度抑うつ以上群は14.7%であり,従来の研究結果と一致した。また共分散構造分析では,手島による育児不安尺度の下位尺度である中核的育児不安尺度,育児感情尺度ともに抑うつへの影響を認めたが,「虐待的行動」に影響したのは育児感情尺度のみであった。さらにPBI(Parenting Bonding Instrument)の下位尺度である母養護因子得点は育児感情尺度に対して最大の影響を及ぼしていた。これらの結果より,育児期の精神医学的問題は,育児する上での過度の心配や責任感から不安,抑うつに至る<心配過剩モデル>と,母自身の母親からの養護が乏しく,子供に対する温かい感情を持てず,不安が強く虐待のリスクを有する〈育児感情不良モデル>の2モデルの存在が推測された。〈心配過剰モデル〉に対しては,従来の訪問相談による傾聴,保証,過剰すぎない適切な情報提供,環境調整によって対応が可能と考えられるが,<育児感情不良モデル>に対してはより専門的な精神医学的アプローチが必要と考えられた。これらの成果に関して、平成19年11月29日大津市役所において母子保健に従事する職員を対象に「育児期女性の不安と抑うつについて」という標題にて講演を行った。また、以下の関係学会での発表に応募し受理された。1)第104回日本精神神経学会総会平成20年5月また,これらの結果について現在論文執筆中である。また,アンケート調査において同意を得られた380例に対して現在追跡調査を施行しており,回答を回収次第解析,発表を行う予定である。育児期女性の不安・抑うつに関するアンケート調査を実施し、平成19年度に得た426例の回答結果についてひきつづき解析を行った。Zung抑うつスケールの結果から中等度抑うつ以上群は14.5%であり、従来の研究結果と一致した。共分散構造分析にて産後うつと虐待行動はともにボンディング困難の影響を受けていたが、ボンディング困難が虐待行動に直接及ぼす影響を除外した条件下においては産後うつは虐待行動に影響を及ぼすとは言えなかった。この結果はこれまでの産後うつが虐待行動の危険因子であるといういくつかの報告による指摘とは異なっており、それらの報告結果がボンディング困難の見えざる影響下におけるものである可能性を示唆することができた。これらの成果に関して、以下の関係学会にて報告発表を行った。1)第104回日本精神神経学会総会平成20年5月また、これらの結果について以下の論文をPsychiatry and Clinical Neuroscience誌に投稿した。また、アンケート調査において同意を得られた380例に対して追跡調査を施行、初回調査を児の3, 4ヶ月において施行した群に対しては平成21年1月から第2回追跡調査を施行し、現在も回答を回収中である。回収次第解析、発表を行う予定である。
チミジン枯渇ストレスを利用した哺乳類cdc-ts変異株の単離

真核生物の細胞周期制御機構の研究は酵母cdc変異株を用いた研究によるところが大きい。一方哺乳類細胞は2倍体細胞であること、また変異株の濃縮が困難なことから多数の変異株を得られていない状況である。それ故多数のcdc変異株の単離には、従来の方法より効率が良い方法が望まれている。そこでチミジル酸合成酵素欠損、DNApolα+、E1+-CHO細胞を親株に多数のts変異株を得ることを試みた。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からチミジル酸合成酵素欠損細胞とマウス細胞で用いられた方法(SomaticCell Genetics7,523)で単離することを試み、10^7の細胞にMNNG処理したところ合成酵素欠損1クローンが得られた。その細胞にgpt遺伝子を持つSRαプロモーターベクターにつないだE1遺伝子を導入し、安定にE1を発現するクローンの単離を試みた。が、このクローンは得られなかった。E1の安定多発現クローンは致死的ではないかと予想される。さらに同じベクターにつないだDNAポリメラーゼαを細胞に移入しこの安定発現クローンを単離中である。またチミジル酸合成酵素欠損細胞をチミジン存在下33°CでMNNG処理したのち39°Cで培養。39°Cで培養の際チミジンを培地から除去し39°Cで細胞増殖が止まらない細胞を死滅させた。39°Cの処理は16時間行った。この処理を3回繰り返した後33°Cでコロニーを形成させた。現在生じたコロニーを拾いts性を調べる段階にきている。今後はDNAポリメラーゼα発現クローンをもちいてこの単離をおこなう。
脳内アンギオテンシンによる交感神経修飾作用のメカニズム

第四脳室(4V)カテーテルを用いてアンギオテンシンII(Ang II)を家兎の延髄表面に投与すると,交感神経血圧反射が著明に促進されることが知られている。本研究では,この現象におけるAng IIの作用部位を同定するとともに,その作用メカニズムについて検討した。1.作用部位の同定Ang II(10 pmol/min)の4V投与によって引き起こされる腎交感神経血圧反射促進作用は,両側の吻側延髄腹外側野(RVLM)にAng II受容体阻害剤(Sarile,10pmol)をあらかじめ投与しておくことによって完全に消失した。この結果より,RVLMがAng IIの血圧反射促進作用における主要な作用部位であることが強く示唆された。2.ユニット記録システムの開発RVLM心血管運動ニューロンの血圧感受性に対するAng IIの効果を検討するため,血圧を大きく変動させても安定してRVLMニューロンの単一ユニット記録が可能な記録システムを開発した。同システムは,レーザー距離計を用いて記録中の脳の変位を計測し,この情報に基づいて記録電極の刺入位置を自動補正するものである。3.作用メカニズムの検討RVLM心血管運動ニューロンの血圧-発火頻度関係に対するAng IIの効果を解析した。その結果,約半数の心血管運動ニューロンにおいて,Ang IIは血圧-発火頻度関係のupper plateau(血圧低下に反応して発火頻度が増加する反応の上限)を有意に増加させることが明らかになった。個々のニューロンより得られたAng II投与前後の血圧-発火頻度関係の加算平均曲線を求めると,Ang II投与前後の交感神経血圧反射特性ときわめて類似した曲線が得られた。この結果より,Ang IIの交感神経血圧反射修飾作用が,RVLM心血管運動ニューロンの血圧感受性の変化によってもたらされていることが示唆された。アンギオテンシンII(ANG II)を第四脳室内に投与すると,交感神経血圧反射が著明に増強する。吻側延髄腹外側野(RVLM)へのANG II投与により同様な変化が惹起されるため,この作用の発現にRVLMが重要な役割を演じている可能性がある。本研究では,ANG II脳室内投与による血圧反射増強作用の作用部位を同定し,また作用発現のメカニズムについてニューロンレベルで検討した。1.作用部位の同定(1)ANG II脳室内投与によって引き起こされる血圧上昇と交感神経活動の亢進は,両側RVLMのANG II受容体阻害によって有意に減弱したが,完全には消失しなかった。この結果より,base-lineの血圧および交感神経活動に対するANG IIの作用には,RVLMを含む複数の領域が関与していることが示された。(2)ANG II脳室内投与によって引き起こされる交感神経血圧反射の増強作用は,両側RVLMのANG II受容体阻害によって完全に消失した。この結果より,血圧反射増強作用においては,RVLMのANG II受容体の活性化が必須であることが示された。2.メカニズムの検討(1)微小研磨器(本補助金にて購入)等を用いて,血圧変動下においてもRVLMの神経活動を長時間安定して記録可能なカーボンファイバー製記録電極を開発した。(2)同電極を用いて,RVLMニューロンレベルでの血圧反射特性の記録,及び血圧反射特性に対するANG IIの作用を検討した。その結果,ANG IIの交感神経血圧反射特性の修飾作用は,RVLM血管運動ニューロンの入出力特性に対する作用によって説明可能であることが明らかとなった。1.延髄心血管運動ニューロン記録電極用自動追従システムの開発前年度の研究においてニューロン活動記録用の浮動型複合電極を開発したが,今年度は,同電極を用いたユニット記録の安定性を更に高めることを目標として,新たに自動制御型の電極追従システムを開発した。

予備実験の結果,家兎の延髄脳表は,呼吸周期に同期して約50μmの変位を示すと共に,幅100mmHgの人為的血圧変動に対して約400μmの変位を示すことが明らかとなった。そこで,この変位をレーザー変位計(空間分解能3μm,時間分解能8msec)にて検出し,この信号を元に電極位置の新たな設定点をリアルタイムで算出することとした。電極の制御は,油圧マニピュレータのシリンジをパルスモータにて直接駆動することによって実現した。本システムを用いて心血管運動ニューロンの細胞外記録を行った結果,血圧反射実験に必要な幅広い血圧領域において,安定した細胞外記録を実現することが可能となった。また,本システムによって,従来非常に困難とされていた同ニューロンのiv vivo細胞内記録を実現することも可能となった。2.延髄心血管運動ニューロン血圧反射特性に対するアンギオテンシンIIの作用フェニレフリンおよびニトログリセリン静脈内投与によって血圧を人為的に変動させ,その際に引き起こされる延髄腹外側野心血管運動ニューロン活動の応答を記録した。また,この応答に対するアンギオテンシンIIの作用を検討した。アンギオテンシンIIは、複合電極のマイクロピペットを通して電気泳動的に記録ニューロン周囲に投与した。その結果,アンギオテンシンIIは,血圧が非常に低下した際に引き起こされる心血管運動ニューロンの逆説的な抑制現象(hypotensive reversal現象)を有意に抑え,このような低血圧領域においても,血圧反射を有効に維持させる効果のあることが明らかとなった。
Na^+駆動型細菌べん毛モーターの回転機構

V.alginolyticusのNa^+駆動型べん毛モーターのトルク発生には回転子であるFliGと固定子であるPomAの相互作用が必要であると考えられている。H^+駆動型モーターではPomAの相同因子MotAの荷電アミノ酸残基と回転子構成因子FliGの荷電残基間での静電的相互作用がトルク発生に関与しているというモデルが提唱されている。これらの残基はNa^+駆動型べん毛モーターのPomA、FliGにも保存されているが、これまでに私はPomAの荷電残基はトルク発生に必須ではないことを示した。そこでNa^+駆動型べん毛モーターFliGの荷電残基への変異導入を行い、トルク発生モデルのさらなる検証を試みた。FliGのK284、R301、D308、D309、R317をそれぞれAlaに置換した。大腸菌FliGの場合と同様に、変異をそれぞれ単独で持つFliGを発現している菌体は運動能を保持していた。次にこれらの変異を組み合わせ二重変異をPomAに導入したが大腸菌FliGで完全に機能を失うR301A/D308A、R301A/D309Aだけでなくすべての二重変異FliGを発現する菌体が野生型と同レベルの遊泳能を保持した。大腸菌FliGで静電的相互作用に関わる最小単位であると推定されいる3つの残基に関する変異体R301A/D308A/D309A、R301A/D309N/D309Nでもswarm能の低下は見られたが遊泳能は野生型と同レベルであった。以上の結果より、共通であると考えられていたH^+駆動型べん毛モーターとNa^+駆動型モーターのトルク発生機構であるが、H^+駆動型モーターの回転子の推定トルク発生領域中の荷電残基がNa^+駆動型モーターではトルク発生に必須ではないことが示唆された。
腸管出血性大腸菌重症化阻止薬の作用機構の解明

最近、非典型的なLEE-negative腸管出血性大腸菌(EHEC) (O157型以外)感染による重症化例が世界的に増加傾向にある。このLEE-negative EHECは2型志賀毒素に加え、小胞体ストレス誘導毒素Subtilase cytotoxin (SubAB)を産生する。SubABは、細胞内に侵入後、シャペロンタンパク質であるGRP78/BiPを特異的に切断することで、小胞体ストレスセンサータンパク質PERKを活性化し、アポトーシスを誘導する。臨床で使用、またはトライアル中の薬剤の中で、SubABの細胞障害性を阻害する薬剤として、PKC活性化剤(bryostatin 1, ingenol-3-angelate)がBax/Bakの構造変化を阻害し、SubABやStx2によるアポトーシスを抑制することを明らかにした。また、デキサメタゾンなどのステロイド剤が、宿主細胞内のステロイド受容体を介して抗アポトーシスタンパク質Bcl-xLの発現増強を促し、SubABによるアポトーシスを阻害することを見いだした。これらの薬剤は、マウス腸管オルガノイドでは、毒素の細胞致死活性阻害を示さなかった。薬剤に対するヒトとマウスの応答反応の違いが原因と推察された。また、ERストレス阻害剤であるPBAは、SubABの細胞致死活性を阻害しなかった。更に、CRISPER/CAS9 KO細胞による、SubAB細胞致死耐性細胞スクリーニング解析から、糖鎖修飾酵素欠失細胞が耐性であることが明らかになり、SubABの受容体が糖鎖である裏付けが取れた。他に、新規な細胞内蛋白質が細胞致死に関与することも明にした。これらの結果をまとめ、現在、投稿中である。腸管出血性大腸菌(EHEC)は、経口感染により腸管に達し、定着・増殖に伴う毒素(志賀毒素、サブチラーゼ毒素等)産生し、下痢症、溶血性尿毒症症候群等を引き起こし、致死に至る場合もある。重篤なEHEC感染症に対する治療は統一された処置法が確立されていない。これまでの病原細菌を対象にした感染症治療は、抗生剤を用いたものが多く、耐性菌の出現は今日でも大きな治療上の問題となっている。中でも、EHECは前述のように抗生剤による溶菌は強毒な毒素の放出が伴うなどの問題も多い。本研究は、これからも頻発することが予想されるEHEC感染症の重症化にドラックリポジショニングを利用した新たな治療法の確立を目指すことに特色と意義がある。即ち、ドラックリポジショニング「ヒトでの安全性・体内動態が十分の証明されている既承認薬と一部の開発中止(途中)品の新しい薬理効果を発見し、この薬剤を別の疾患治療薬として適応拡大する」の立場は、本研究遂行の最大の利点であり、本手法を使うことで、薬剤の研究開発費・リスクの軽減と開発期間の短縮、臨床利用へのハードルを下げることができる。本年度、計画していた種々の薬剤を用い、毒素の阻害活性に対するスクリーニングを行い、毒素の細胞致死活性を阻害する薬剤を数種見出した。抗癌剤として使用されているPKC活性化剤は、SubABの活性だけでなく、志賀毒素の活性も阻害することを見出した。更に、SubABの活性を阻害する他の薬剤Aは、抗アポトーシスに働くタンパク質を誘導し、毒性を抑制していることが明らかとなった。本年度、スクリーニングにより数種類の抗毒素効果を持つ薬剤を見出した。いずれの薬剤も、毒素本来の宿主細胞への結合、その活性を阻害するのではなく、下流の細胞致死阻害に機能する機構を活性化し、細胞致死から回避していることが明らかとなった。また、これら薬剤には、抗菌活性がないことから耐性菌の出現を危惧する必要はない。細菌感染症に対する治療は、抗菌薬によるものが主である。しかし、昨今、世界的に多くの薬剤耐性菌が蔓延しており、難治性の重症化に至る傾向が認められる。また、これら抗菌薬の使用が更なる耐性菌の出現を助長することが危惧されている。毎年、約3千人の感染者が見られる、O157型に代表される腸管出血性大腸菌(EHEC)は、経口感染により腸管に達し、定着・増殖に伴う毒素(志賀毒素、サブチラーゼ毒素等)産生により、急性の下痢症を惹起する。腹痛、血性下痢を伴う出血性腸炎を引き起こし、重症化した場合には、溶血性尿毒症症候群(HUS)、脳症等の病態を引き起こす。小児や老人が重症化した場合には死に至るケースも多く認められる。最近は、非典型的なLEE-negative EHEC (O157型以外)感染による重症化例が世界的に増加傾向にある。また、マウス腹腔への投与は、著明な腸管出血による致死に至る。これまで、SubABの細胞傷害機構に、ミトコンドリアを介したカスパーゼの活性化、DAP1タンパク質の関与を明らかにしている。また、細菌毒素では初めて、ストレスグラニュール形成をPKCの抑制により誘導することを明らかにしている。本年度は、昨年度見出したSubAB細胞傷害を抑制するPKC活性化剤,ステロイド剤の阻害作用機序を詳細に解析した。

本研究は、ドラッグリポジショニングによる新たな治療法を目指し、既に臨床利用或いはトライアル中の薬剤を用いて、SubABの毒性阻害薬を見出すことを目的とした。その結果、ステロイド剤、PKC活性化剤(Bryostatin I,Ingenol-3-angelate)にSubABの細胞傷害性を阻害することを見出した。ステロイド剤の抗毒性は、宿主細胞のステロイド受容体を介した抗アポトーシスタンパク質Bcl-xLの発現誘導によるものであることが明らかとなった。しかし、2型志賀毒素(Stx2)を共添加した場合には、細胞傷害性を阻害できなかった。一方、PKC活性化剤は、初期の細胞死を抑制することはできたが、長時間の添加では薬剤の細胞傷害性が認められた。Stx2の共添加でも、初期において細胞死を抑制することができた。次に、マウスにおいて抗毒性を評価するため、まず、マウス腸管オルガノイドを作成した。本手法は、動物愛護の点からも非常に有効な手法である。蛍光ラベルしたSubABを腸管オルガノイドに添加した所、頭頂部に非常に良く結合していた。ステロイド、PKC活性化剤を共添加して、SubABの細胞傷害性を評価したところ、予期しないことに、これらの薬剤は全くSubABの活性を阻害しなかった。これは、マウスとヒトの薬剤に対する感受性の違いによるものと推察された。以上の結果は、Cell Death Dicoveryに受理・掲載された。最近、非典型的なLEE-negative腸管出血性大腸菌(EHEC) (O157型以外)感染による重症化例が世界的に増加傾向にある。このLEE-negative EHECは2型志賀毒素に加え、小胞体ストレス誘導毒素Subtilase cytotoxin (SubAB)を産生する。SubABは、細胞内に侵入後、シャペロンタンパク質であるGRP78/BiPを特異的に切断することで、小胞体ストレスセンサータンパク質PERKを活性化し、アポトーシスを誘導する。臨床で使用、またはトライアル中の薬剤の中で、SubABの細胞障害性を阻害する薬剤として、PKC活性化剤(bryostatin 1, ingenol-3-angelate)がBax/Bakの構造変化を阻害し、SubABやStx2によるアポトーシスを抑制することを明らかにした。また、デキサメタゾンなどのステロイド剤が、宿主細胞内のステロイド受容体を介して抗アポトーシスタンパク質Bcl-xLの発現増強を促し、SubABによるアポトーシスを阻害することを見いだした。これらの薬剤は、マウス腸管オルガノイドでは、毒素の細胞致死活性阻害を示さなかった。薬剤に対するヒトとマウスの応答反応の違いが原因と推察された。また、ERストレス阻害剤であるPBAは、SubABの細胞致死活性を阻害しなかった。更に、CRISPER/CAS9 KO細胞による、SubAB細胞致死耐性細胞スクリーニング解析から、糖鎖修飾酵素欠失細胞が耐性であることが明らかになり、SubABの受容体が糖鎖である裏付けが取れた。他に、新規な細胞内蛋白質が細胞致死に関与することも明にした。これらの結果をまとめ、現在、投稿中である。抗毒素活性を有する薬剤は、抗癌剤などで使用されているものもあり、長時間の株化された培養細胞への添加は、薬剤だけで細胞障害性を引き起こす。
Light UP：うつと不安に対する診断横断的低強度認知行動療法の開発

本研究は、高強度療法を実施する前に、うつや不安の問題に対して幅広く使えるような、シンプルな認知行動療法をステップドケアに照らして開発することを目標とした。具体的には、感情障害に対する診断横断的治療のための統一プロトコルのこれまでの研究実績を踏まえて、(1)統一プロトコルを低強度版にした“Light UP"のコンテンツを日本文化・臨床現場に合う形で開発し、(2)Light UPの実施可能性と有効性を検証する臨床試験の実施を目的としていた。平成30年度は、(1)については、既存の研究で収集してきた臨床データを多角的に二次解析して発表し(Bartel et al.,2018, Gomez et al., 2018)、さらに次年度以降の発表準備を進めた。これらの二次解析では、日本人の社交不安患者の社交不安症状に対して本来感が媒介的な影響を持つことを明らかにしたり(Bartel et al., 2018)、マインドフルネス傾向の特徴によってうつや不安の重症度が異なることが示された(Gomez et al., 2018)。目的(2)については、前年度の成果を踏まえつつ、インターネットを通した治療や、読書療法によるセルフヘルプへの拡張性を考慮した、UPの内容をわかりやすくつたえるワークブックの開発を進めた。前年度に引き続き、ワークブックの暫定版を用いて、日本国内の臨床家や訓練生20名以上からのヒアリングを得て、ワークブックのブラッシュアップを行った。ワークブックでは、イラストやイメージを多用し、想定する読者(うつや不安の問題を持つ幅広い対象)に受け入れられやすいよう体裁の工夫を施した。本研究は、高強度療法を実施する前に、うつや不安の問題に対して幅広く使えるような、シンプルな認知行動療法をステップドケアモデルに照らして開発することを目標とした。本年度は、(1)の目的に照らして、統一プロトコルの低強度版の開発を検討し進めた。当初は、高強度版の要素を単純に短くした、5セッション程度からなる個人・集団療法として利用出来るプログラムを開発する予定であった。研究開始にあたって、ステップドケアモデルを改めて重視するとともに、これまでの研究データを用いて、日本人にとって最も重要な要素を再検討した(Curtiss et al., 2017,竹林ら, 2017)。また、インターネットを通した治療や、セルフヘルプとして使える読書療法などの可能性も再検討した。そのうえで、セルフヘルプとしても、セラピストのサポートを得た個人・集団療法のマテリアルとしても使えるような、簡易的なワークブックの作成することした。また、米国ボストン大学でも類似の試みがあるという情報を得て、それらのコンテンツを参照した。ワークブックにおいては、統一プロトコルのさまざまな治療モジュールで実施される心理教育部分について、イラストを多用した分かりやすい提示法を検討した。高強度版の用紙類を全面的に見直し、なるべくシンプルなかたちの用紙に変更する作業を続けた。本年度は、ワークブック全体をデザインし、全9章の構成を整え、第4章までを試作した。当初は、高強度の統一プロトコルの内容をシンプルにして、日本文化に合わせた表現や呈示法に整えることで、低強度の統一プロトコルであるLight UPを開発し、その臨床試験を進めることを目的としていた。しかし、低強度版を開発する上で、高強度の統一プロトコルに取り組んだ過去の症例や研究データを入念に検討し直した。さらに、米国の研究者とのやり取りを通して、米国においても内容を簡易にした統一プロトコルを開発している情報を入手し、それらとの比較照合などを行った。これらの作業に時間を要したために、コンテンツの作成に当初予定したよりも入念に取り組むことになった。なお、当初予定していた計画に照らすとやや遅れている進捗状況の評価となるが、本研究を進めていく上で、過去の研究データの二次解析から重要な知見が得られ、ひとつはJournal of Affective Disordersに採択され、ひとつは不安症学会のポスター発表において若手優秀演題賞を受賞している。昨年度までに、(1)については、既存の研究で収集してきた臨床データを多角的に二次解析して発表するとともに(Curtiss et al., 2017, Conroy et al., 2017)、次年度以降の発表準備を進めた。これらの二次解析は、日本人のうつ病や不安症患者において、どのような要素に留意することでどのような介入の効果が高まりやすいかを検討するものや、うつや不安症状ネットワークが時間経過のなかでどのように変化するかを検討した。これら結果を踏まえつつ、統一プロトコルの低強度版の開発を進めるとともに、低強度版として最適な形式のマテリアルや、治療構造を検討した。