hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
北海道における住宅地の雪処理システムに関する研究

3年間の研究活動によって得られた研究成果の概要は以下の通りである。1.住宅地の雪問題の多くは建築計画上の欠陥によるが、建築計画分野における「雪」研究の蓄積は少ない。2.寒冷積雪地域の気象条件は一様ではなく、地域差をもっている。気温が高く降雪量の多い北陸地方、気温が低く降雪量の少ない北海道および両者の中間位置する東北地域の大きく3つのグル-プに分けることができる。その結界、そこで発生する雪問題も異なっており、雪対策の方法も異なっている。3.北海道における地方自治体における雪対策体制は十分ではなく、対処療法的対応が多くみられる。4.札幌市西区に居住する住民は冬季の雪問題を深刻に受け止めている。ことに道路端に積み上げられた雪山や吹きだまりによる交通障害が大きな問題となっている。さらに、除排雪の労力は膨大であり、多くの住民が大変な負担と感じている。それにもかかわらず、住宅取得時の雪対策はきわめて不十分である。5.除雪量に影響を及ぼす要因は、道路位置・駐車スペ-スの形式・屋根形態・窓の位置であり、これらは建築計画上の要因である。このうち、除雪量に最も大きな影響をもつのは駐車スペ-スの形式である。6.敷地に対する住宅の配置の自由度は敷地条件(規模、形状)・道路位置・車庫形態・屋根形態(落雪方向)などに影響される。敷地規模が200m^2を割ると住宅の配置の自由度は急激に小さくなる。無落雪屋根は200m^2以上の敷地条件または200m^2未満で車庫を組み込んだとき有利になる。7.粉体風洞実験により、自然条件下で形成される建物周辺の吹きだまり性状の再現が可能となった。また、吹きだまりに風向・隣棟間隔が大きな影響を及ぼしている。(1)過去30年間にわたる北海道・東北・北陸地方の気象官署における気象データ(降雪量、積雪量、気温、風速、日射)を収集し、整理分析した。北海道は気温が低く強風時に降雪する(従って、乾雪となる)のに対して、北陸地方は気温が高く弱風時に降雪する(従って、湿雪となる)という特徴をもっている。東北地方はちょうど両地域の中間的性格をしめす。さらに、北海道においても細かく分析すると、地域差をもっている。従って、雪問題の発生の仕方やその対応策は各々の地域で異なっていると考えられる。(2)札幌圏に位置する異なるタイプの住宅地を選定し、夏季・冬季の観察調査および住民に対するアンケート調査を実施した。その分析を通して、冬季の雪問題の実態と住民の除雪行動・雪対策などについて明らかにした。その概要は次のとおりである。(1)住民が感じている冬季の最も重大な問題点の第1位は「道路が狭くなり通行が困難」(26.4%)であり、降雪時の道路状況の問題点を指摘している。以下「近くに雪捨て場がない」19.8%、「吹きだまりができる」15.4%、「屋根からの落雪処理が大変」13.2%、「歩道の除雪が行き届いていない」9.9%となっている。このことは、住民にとって大量に降雪した雪とその処理方法に大きな問題を感じていることを示している。(2)雪問題に影響を与える要因として、屋根形態、落雪方向、敷地規模、前面道路の位置、道路幅員、空地の有無などがからんでいる。(3)住宅取得時における住民の雪対策は殆どなされていない。せいぜい屋根形態を考慮した者がやく半数いる程度である。(3)雪害軽減のための建築的装置に関する予備調査を実施し、雪囲い・雁木・土縁などの実例を収集した。

(4)東北・北陸地方の冬季の実態調査は少雪のため実施を延期した。本年度は、住宅地の雪処理シミュレ-ションを中心的に展開し、雪処理量と建築計画との関係を明らかにした。1.対象住宅地(131戸)における雪処理シミュレ-ションの実施結果(1)勾配屋根における落雪形状と窓下端の除雪回数の関係式を求めた。その結果を屋根の水平長さ・窓下端の高さと除雪必要回数の関係として図化した。(2)各住戸ごとの一冬の除雪必要量を算出した。その結果、敷地内で発生する除雪量の平均はアプロ-チ確保のための除雪量が22.3m^3(24%)、車庫前・駐車スペ-ス確保のための除雪量が41.0m^3(43%)、住宅周りの除雪量が31.0m^3(33%)であり、駐車スペ-スに関わる除雪量が大きいことを明らかにした。(3)除雪量に影響を与える建築的要因について明らかにした。アプロ-チ確保のための除雪量に最も大きな影響を与える要因は前面道路の位置であり、駐車スペ-ス確保のための除雪量に影響を与える主要因は駐車スペ-スの形式であり、住宅周りの除雪量に影響を与える主要因は屋根形態・窓下端の高さである。(4)各住戸における敷地内堆積可能量および敷地外への排雪量を計算した。2.除雪量算出の一般化のためのシミュレ-ションの実施結果1.の結果を踏まえながら除雪量の一般解を得るために、【○!1】敷地規模・住宅の建築面積・道路位置・屋根形態を固定し、敷地と住宅の平面形状比を変化させ、住宅および車庫の配置可能範囲を求め、図化する【○!2】固定条件をそれぞれ変化させながら【○!1】の作業を繰り返す【○!3】それぞれの配置可能範囲内で除雪量を求める、の作業を実施した。(1)住宅と車庫の配置可能範囲を求める一般式とその図化方法を求めた。(2)無落雪屋根の場合の住宅・車庫の可能範囲は敷地および建築面積・道路位置により影響を受ける。この結果、無落雪屋根を用いた場合でも、200m^2以上の敷地が確保されないと車庫の配置は困難である。(3)落雪屋根の場合は無落雪屋根より不利になり、特に東西方向に落雪する場合に住宅および車庫の配置条件は厳しくなる。(4)除雪量の計算、分析3.最終年度(平成2年度)の目標過去2年にわたる研究成果をもとに、雪処理に関する設計資料の作成に主要な研究エネルギ-を注ぎたい。1.敷地条件(規模、形状、道路位置)、住宅条件(建築面積、平面形状、屋根形態、落雪方向)、車庫形式を変化させて、敷地に対する住宅配置可能条件を分析し、設計資料として提示した。(1)住宅の配置可能条件は敷地条件・住宅条件・重庫形式の変化に大きく影響を受ける(2)敷地規模が160m^2を割ると、無落雪屋根(車庫組み込み)以外は住宅配置ができない。200m^2を越えると、落雪屋根の場合も配置可能範囲が拡大する。(3)組み込み車庫は独立車庫に比べ敷地が180m^2以下で住宅配置が有利になる。(4)無落雪屋根は落雪屋根に比べ敷地180m^2以下の場合は特に有利ではないが、200m^2以上では横長プランで有利である。落雪屋根のうち、垂直落雪(道路に対して)は平行落雪よりも横長プランで大きく有利である。(5)住宅を敷地の北側に寄せることを前提にすると、南側道路の場合は独立車庫、北側道路の場合は組み込み車庫が有利である。東・西側道路は南・北側道路に比べ同等か有利である。
漢方薬と西洋薬の相互作用をゲノムワイドに探る

昨年度は、小柴胡湯(SST)または大柴胡湯(DST)を1ヶ月にわたって飲水投与したラット、および対照として水を投与したラットの肝臓からmRNAを調製し、これを鋳型としてそれぞれ約3万タグからなるSAGEライブラリーを構築し、各タグの配列から発現遺伝子の頻度を比較した。その結果、SST投与群で対照群と比較して4倍以上に発現頻度が増加している遺伝子として99種を、DST投与群で4倍以上に発現頻度が増加している遺伝子として93種を同定した。また、対照群と比較して4倍以上に発現頻度が低下している遺伝子としてSST投与群で103種、DST投与群で115種を同定した。さらに、これらの遺伝子のうち薬物代謝をはじめとして薬剤感受性に関与する遺伝子を検索した結果、ABCトランスポーター、硫酸抱合酵素、グルクロン酸抱合酵素等のサブファミリーに属する遺伝子を見出した。今年度は、これらのトランスポーターおよび酵素遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、リアルタイムPCR法を用いてそのmRNA量の変動を検証した。その結果、いずれの候補遺伝子に関してもmRNA量の有意な変動は観察されなかった。さらに、SSTおよびDDTを長期投与したラット肝臓からミクロゾームを調製し、そのcytochrome P450活性をいくつかの分子種で測定して比較したが、有意な活性の変動は認められなかった。また、長期投与期間中の尿中代謝産物のHPLCプロファイルにも顕著な変動は見られなかった。これらの結果は、健常動物にSSTやDSTを投与しても遺伝子発現のレベルでは薬物代謝酵素に顕著な影響は及ぼさず、薬物相互作用は全体として問題にならないことを示唆している。本年度は、漢方薬を長期投与したラットの肝臓におけるトランスクリプトームをSAGE(sequential analysis of gene expression)法を用いて対照群と比較し、発現量の変化している遺伝子を網羅的に検索することを目的として研究を実施した。小柴胡湯(SST)または大柴胡湯(DST)を1ヶ月にわたって飲水投与したラット、および対照として水を投与したの肝臓からmRNAを調製し、これを鋳型として約3万タグからなるSAGEライブラリーを構築し、各タグの配列から発現遺伝子の頻度を比較した。その結果、SST投与群で対照群として比較して4倍以上に発現頻度が増加している遺伝子として99種を、DST投与群で4倍以上に発現頻度が増加している遺伝子として93種を同定した。これらの遺伝子のうち薬物代謝をはじめとして薬剤感受性に関与する遺伝子を検索した結果、ABCトランスポーター、硫酸抱合酵素、グルクロン酸抱合酵素等のサブファミリーに属する遺伝子を見出した。来年度は、以上の生化を基礎に、これら遺伝子の発現量の変動をノーザンハイブリダイゼーションによって確認するとともに、実際の薬物代謝酵素活性の変動をSSTまたはDST投与群と対照群とで比較していく予定である。
洋館付加住宅の建築計画史的研究

洋館付加住宅のこれまでの形態・意匠や用途構成の解釈は一面的であり、また、少なからず誤謬があった。このため、全国を渉猟する目視調査と訪問ヒアリングを実施し、近代住宅計画史的に正しく位置づけることとした。平面構成のうえでは、付加された洋館部は必ずしも玄関脇に隣接していない例も確認され、洋館居室の建設時の用途についても、私室や家族共用室として、あるいは、稼業のために設けられるものもあった。応接利用として計画された場合にも、食事・宿泊や多人数接客の際には座敷が用いられることが標準的で、このため、家族生活の飛躍的な改善には至らなかったという、和洋折衷の限界を示唆した。<文献研究>洋館付加住宅の成立のみにとどまらず和洋折衷に関する言説や実例建設の過程および社会文化的背景について、近代住宅・建築様式史、家政学、当時の住宅論や文学(小説・随筆)などの文献によって論点整理を行った。この中での主要な学説として挙げられるのが、洋館の付加(応接室の設置)によってここで来客を食い止めることで家族の日常生活空間が座敷・次の間などの南面化に大きく結びついていったという点である。仮説的にこの見解には強く疑義をもっているが、後述の「住まい方調査」によって、接客本位制は容易には崩れてはいかなかったことを少なからず裏付けつつある。<目視・簡易アンケート調査>25年度においては、北海道・東京都・京都府・兵庫県・山口県・福岡県・佐賀県において、142件の目視調査と28件の簡易アンケート調査により予備的調査にデータを加えた。順次、総合的な形態意匠上(付加された洋館の規模構造・屋根形状・屋根材・外部仕上げなど)の分析と地域的な特性把握の分析を行っているところである。<図面採取・住まい方調査>住宅図面採取の協力者は僅少であるが、25年度は5件の実施と4件の訪問調査アポイントメントをとった。これまでの分析でえられた利用実態と同様に、来客に対する酒食のもてなしについては、例外なく座敷・次の間で行われていること、家族の食事や団らんはこれとは別空間の茶の間で行われており、家族本位の住生活へは容易には移行していなかったことが確認されたが、さらにデータの補完により論拠をかためたい。<文献研究>洋館を付加(応接室の設置)することによって、ここで来客を食い止め、家族の日常生活空間が座敷・次の間などの南面化に大きく結びついていったという従来の学説に対して、申請者は仮説的にこの見解には強く疑義をもっているが、後述の「住まい方調査」によって、接客本位制は容易には崩れてはいかなかったことを裏付けつつあるところである。<目視・簡易アンケート調査>26年度においては、525戸の目視調査データを採取し(兵庫県:15戸、大阪府:178戸、愛知県:258戸、東京都:74戸)、アンケート調査は64件を新規にえた。引き続き、形態意匠上(付加された洋館の規模構造・屋根形状・屋根材・外部仕上げなど)の分析と地域的な特性把握の分析を行っているところである。26年度にえられた特筆事項として、長屋形式の洋館付加住宅が大阪府と愛知県(名古屋市)に数多く現存している点である。これまで限られた地域(福岡県北九州市、兵庫県神戸市)に一部認められたに過ぎなかった長屋形式は、両県あわせて52棟(123戸)にのぼった。おそらくは、戸建てとは異なり、賃貸住宅として供給されたものであると考えられ、このため居住者の入退居も頻繁なためにその形成の背景を明らかにすることはかなり困難ではあるが、新たな課題として加わったことになる。<住まい方訪問調査>住まい方調査は9戸に実施し(福岡県:3戸、兵庫県:5戸、愛知県:1戸)、翌年度調査として19戸のアポイントメントをとったところである。これまでの分析でえられた利用実態と同様に、来客に対する酒食のもてなしについては、例外なく座敷・次の間で行われていること、家族の食事や団らんはこれとは別空間の茶の間で行われており、家族本位の住生活へは容易には移行していなかったことが確認されたが、さらにデータの補完をおこなっている。平成27年度においては、新たに新潟市内の残存する洋館付加住宅21件に加えて、大阪府北摂地域(豊中市、箕面市)44件、和歌山市19件、佐賀市16件の目視調査実施したほか、訪問調査の承諾が得られた東京都区内、名古屋市、大阪市での住まい方インタビューを行い、データを補充した。また昨年度、一棟に複数の洋館付加住宅の並び建つ長屋型の形式が、大阪市及びその近郊と名古屋市に数多く残存していることを確認することができ、その形成過程について踏み込んだ考察を進めることを、本年度の大きな課題のひとつとして目的に掲げることとし、大阪府を対象としてその特徴を分析することとした。これまで残存が確認できていたのは、南大阪地域(大阪市阿倍野区・住吉区・東住吉区・住之江区、堺市、高石市、泉大津市、岸和田市)が中心であった。

これらの地域は、1919(大正8)年の市街地建物法および都市計画法の公布により、昭和初期には多数の土地区画整理事業が行われ、1925(大正14)年4月の第二次市域拡張により、現大阪市の南部地区が編入され、宅地開発に拍車がかかったなかで、新しい居住者層としてのサラリーマン向けで、なおかつ伝統的な町家形式を継承しながらも、近代化を志向した洋風化が取り入れられたものと考えられる。また、戦災を免れることができたことも、要因のひとつであるといえる。一方で今年度は、阪急宝塚線・箕面線(旧箕面有馬電気鉄道)沿線の北摂地域に数多く残されていることを新たに確認することができた。いうまでもなく、わが国では先駆的な郊外住宅地である。すなわち、前者の南大阪地域が都市住宅由来であるのに対して、後者は郊外住宅由来ということができ、これが形態意匠の大きな特徴として反映されているのである。同じ大阪府下において、この2つの流れが併存していることを明らかにすることができたことは、大きな成果であると考えている。洋館付加住宅のこれまでの形態・意匠や用途構成の解釈は一面的であり、また、少なからず誤謬があった。このため、全国を渉猟する目視調査と訪問ヒアリングを実施し、近代住宅計画史的に正しく位置づけることとした。平面構成のうえでは、付加された洋館部は必ずしも玄関脇に隣接していない例も確認され、洋館居室の建設時の用途についても、私室や家族共用室として、あるいは、稼業のために設けられるものもあった。応接利用として計画された場合にも、食事・宿泊や多人数接客の際には座敷が用いられることが標準的で、このため、家族生活の飛躍的な改善には至らなかったという、和洋折衷の限界を示唆した。これまでに、文献研究による論点整理と解明すべき課題および実証すべき事項に関する理論の骨格構築はおおむね完了し、上述した調査によっても、これを裏付けつつある。26年度までに、目視調査によるデータ採取は1,054棟(1,134戸)に達し、住まい方訪問調査も54戸に実施することができるなど、順調に進めている。工学分析考察を行うなかで、主として形態意匠の特徴をとらえる上での項目を随時追加してきており、また、分類軸を精査して若干の見直しを行っているため、これまで蓄積しているデータの再編集を行っている。これに27年度実施予定の新規目視調査(佐賀県、和歌山県、新潟県を予定)と、その際における訪問調査の協力依頼と、昨年度において訪問調査がアポイントメント済みの19戸を加えて住まい方調査データの補充を行い、最終年度における研究成果の集約を行う。本研究助成の初年度である25年度において、文献研究による論点整理と解明すべき課題および実証すべき事項に関する理論の骨格構築はおおむね完了した。これを裏付けるためのデータ採取も、ほぼ順調である。消化不能の端数が生じたため。今後の課題は、図面採取と住まい方調査件数の増強である。かかる協力が次第に困難度を増す状況にあるが、研究対象である洋館付加住宅建設の背景や居住実態およびその推移を記憶する居住者が希少となりつつあるので、研究主旨の重要性についての理解を強く求めて、協力要請を強化したい。次年度物品比と合算して使用する。次年度物品費と合算して使用する。
三次元動画像解析による看護技術時の腰部「ひねり」の負荷に関する研究

看護業務は,患者の移送など重量物取り扱い業務に分類され,腰痛発生リスクを伴うものが多い.本研究では,看護技術動作のひねり動作が腰部へおよぼす負荷量を定量的に示し,介助方法別に比較する手法を提案した.看護業務は,患者の移送など重量物取り扱い業務に分類され,腰痛発生リスクを伴うものが多い.本研究では,看護技術動作のひねり動作が腰部へおよぼす負荷量を定量的に示し,介助方法別に比較する手法を提案した.看護業務は,患者の移送など重量物取り扱い業務に分類され腰痛発症のリスクを伴うものが多い。実際の看護職の腰痛経験率は,調査対象により若干異なるが, 7割前後と多く,大勢の看護師が腰痛に悩む現状がある。看護技術は複合的な動作の連続であり,腰痛の原因と言われている, "中腰", "前傾", "ひねり",姿勢を患者を抱えて実施する場面が多くみられる。本研究では,ベッド-車椅子移乗介助時の動作姿勢が腰部に及ぼす影響について,および,ひねり動作基本姿勢について,表面筋電図とひねり角度センサー(ゴニオメータ)を用いて,動作姿勢と腰部被験筋の活動量を計測した。データの計測は, EMGアンプ(SX230, DKH社製)を腰椎L4(脊柱起立筋),外腹斜筋,大殿筋,大腿二頭筋の左右8箇所に,ひねり角度センサー(ゴニオメータ)を脊柱側部に貼付し, TRIASシステム(DKH社製)で,計測分析をした。ひねり動作に関して,腰部をひねる場合と,両足を肩幅に開いた場合で,ひねり角度とひねり角速度にいて,その特徴ををみた。結果,両足を揃えた場合は,ひねり角度が大きい程,腰部の筋肉への負荷が大きくなるのに対し,足を肩幅程度開くと,ひねり角度そのものより,ひねり角速度の方が相関が強く,腰部への影響が大きい傾向を示した。腰痛予防のために,姿勢を基底面を広くし,重心を低くするが,同時に動作スピードにも注意しなければならないことが示唆された。さらに,前傾姿勢とひねり動作に関して,前傾角度が大きい程,ひねり角度が腰部へ及ぼす影響が,有意に変化した(p<0.05)。つまり,前傾姿勢にひねり動作が加わる動作では,前傾角度が大きいほどひねり角度の影響が大きくなるため,少しのひねり角度にも注意が必要であることがわかった。看護業務は,患者の移送など重量物取り扱い業務に分類され腰痛発症のリスクを伴うものが多い。実際の看護職の腰痛経験率は,調査対象により若干異なるが,8割前後と多く,大勢の看護師が腰痛に悩む現状がある。看護技術は複合的な動作の連続であり,腰痛の原因と言われている,"中腰","前傾","ひねり",姿勢を患者を抱えて実施する場面が多くみられる。データの計測は,EMGアンプ(SX230,DKH社製)を腰椎L4(脊柱起立筋),外腹斜筋,大殿筋,大腿二頭筋の左右8箇所に,ひねり角度センサー(ゴニオメータ)を脊柱側部に貼付し,TRIASシステム(DKH社製)で,計測分析をした。看護(介護)従事者の腰痛経験率は8割前後と多く,大勢の看護師が腰痛に悩む現状がある.本研究の目的は,看護基礎教育で学ぶ看護技術や臨床現場で実施されている看護ケアの腰部への負荷を定量化し,より負担の少ない介助方法の検討,腰痛発症リスクの予測,腰痛予防および,その教育へ役立てることである.看護ケアによる腰痛の発症原因の多くは,患者などを抱えての"前屈","中腰","ひねり"動作である.これまでの腰部負荷に関する研究は,看護師の主観的な感覚と,"前屈","中腰"について,ビデオ撮影による体幹,下腿,膝,肘などの関節の角度を,二次元的に計測したものがほとんどであり,"ひねり"について,看護ケア時のひねり角度と腰部への負担の要因は明らかにされていない.

そこで,看護ケアにおける腰部のひねり角度を三次元角度センサを用いて測定し,表面筋電図との関係を調べた.三次元角度センサを用いることにより,ひねり角度だけではなく,ひねり角速度,ひねり角加速度といったひねりの変化と表面筋電図の関係も示すことができる.結果,ひねり角度,ひねり角速度,ひねり角加速度と表面筋電図の間には正の相関があることを明らかにした.これらの結果を踏まえ,腰部への負担が大きいとされる車椅子移乗介助を異なる3方法で実施し,各方法の一連の動作を目的別に4動作に分け,各動作中の"ひねり"が腰部に与える影響に関して,介助方法による腰部への負荷量の違いを視覚的に明示する方法を検討した.また,ひねりによる腰部負荷は左右アンバランスな筋活動の持続により増強するといわれていることから,この視覚化の方法を用いて,介助方法による違いと介助時の状況などにより生じる腰部負荷の左右差を示し,移乗介助における,より腰部負荷の少ない条件や注意点を明確にした.今後は実用化に向けた研究を進めたい.
野菜の発癌予防効果のメカニズムに関する研究

発癌の予防には発癌前駆物質がP450による酸化的代謝を受けるのを阻害し,発癌物質の生成を抑えればよい.野菜の成分によるP4501A1,1A2の不活性化を標的とし,酵素のその不活性化機構を蛋白質化学的に解明し,さらにより選択的でより有効なP450不活性化剤を探索開発し,最終的にはそれによる難治性癌の肺癌予防薬開発を目的として研究を進めている.本研究の材料であるP4501A1,1A2の大量調製のために,組換え大腸菌による高発現系を確立した.すなわちP450蛋白質のN末端の膜アンカー部分の約20残基を除き,N末端アミノ酸をアラニンに変えたP450遺伝子をT.7プロモーターを用いる高発現べクターとして構築した.P4501A2については約100nmole/L以上の高収量で酵素を得た.組換えラットP4501A2Δ2-24は,イオン交換カラムクロマトにより精製し,ほぼ単一にまで精製されたことをSDS-PAGE,イムノブロットにより確認した.精製したP4501A2Δ2-24は,エトキシクマリン脱エチル化活性測定により,その酵素活性を維持していることを確認した.さらに,その酵素活性はPhenethyl isothiocyanate(PEITC)により,濃度依存的に阻害されることを確認した.得られた精製P4501A2Δ2-24を用いて,酵素蛋白質化学的にその不活性化機構の解明へと研究を進めている.また,P4501AlについてもPCRと組み合わせることで組換えラットP4501A2Δ2-22の発現プラスミドの構築に成功し,発現をイムノブロットにより確認した.現在,発現効率を高める条件を検討すると共に,これら2つの蛋白質に対するPEITCの阻害効率を比較している.発癌の予防には発癌前駆物質がP450による酸化的代謝を受けるのを阻害し、発癌物質の生成を抑えればよい。野菜の成分によるP4501A1,1A2の不活性化を標的とし、酵素蛋白化学的にその不活性化機構を解明し、さらにより選択的でより有効なP450不活性化剤を探索開発し、最終的にはそれによる難治性癌の肺癌予防薬開発を目的として研究を進めている。本研究の材料であるP4501A1,1A2の大量調製のために、組換え大腸菌による高発現系を確立した。すなわちP450蛋白質のN末端の膜アンカー部分の約20残基を除き、N末端アミノ酸をアラニンに変えたP450遺伝子をT7プロモーターを用いる高発現ベクターとして構築し、約100nmole/L以上の高産生でP4501A2を得た。産生されたラットP4501A2△2-24は、イオン交換カラムクロマトにより精製し、ほぼ単一にまで精製されたことをSDS-PAGE、イムノブロットにより確認した。精製したP4501A2△2-24は、エトキシクマリン脱エチル化活性測定により、その酵素活性を維持していることを確認した。さらに、その酵素活性はPhenethyl isothiocyanate(PEITC)により、濃度依存的に阻害されることを確認した。得られた精製P4501A2△2-24を用いて、酵素蛋白化学的にその不活性化機構の解明へと研究を進めている。発癌の予防には発癌前駆物質がP450による酸化的代謝を受けるのを阻害し,発癌物質の生成を抑えればよい.野菜の成分によるP4501A1,1A2の不活性化を標的とし,酵素のその不活性化機構を蛋白質化学的に解明し,さらにより選択的でより有効なP450不活性化剤を探索開発し,最終的にはそれによる難治性癌の肺癌予防薬開発を目的として研究を進めている.本研究の材料であるP4501A1,1A2の大量調製のために,組換え大腸菌による高発現系を確立した.すなわちP450蛋白質のN末端の膜アンカー部分の約20残基を除き,N末端アミノ酸をアラニンに変えたP450遺伝子をT.7プロモーターを用いる高発現べクターとして構築した.P4501A2については約100nmole/L以上の高収量で酵素を得た.組換えラットP4501A2Δ2-24は,イオン交換カラムクロマトにより精製し,ほぼ単一にまで精製されたことをSDS-PAGE,イムノブロットにより確認した.精製したP4501A2Δ2-24は,エトキシクマリン脱エチル化活性測定により,その酵素活性を維持していることを確認した.さらに,その酵素活性はPhenethyl isothiocyanate(PEITC)により,濃度依存的に阻害されることを確認した.得られた精製P4501A2Δ2-24を用いて,酵素蛋白質化学的にその不活性化機構の解明へと研究を進めている.また,P4501AlについてもPCRと組み合わせることで組換えラットP4501A2Δ2-22の発現プラスミドの構築に成功し,発現をイムノブロットにより確認した.現在,発現効率を高める条件を検討すると共に,これら2つの蛋白質に対するPEITCの阻害効率を比較している.
中枢神経系再構成を目的とした下肢装具併用型電気刺激装置の開発

中枢性下肢麻痺者が日常生活の中で中枢神経系の再構成による機能回復を図るための軽量小型電気刺激装置を開発することを目的とした。装置設計のために、脳卒中者2名において、下肢の動作と筋活動を計測した。機器配線による転倒を防止するために、無線の計測系を構築した。1ch筋電位信号により制御される1ch出力の小型電気刺激装置を4台試作し、短下肢装具を装着した健常者の下肢に配置した。各装置が相互干渉せずに動作可能であることを確認した。本研究は、脳卒中や脊髄損傷などの中枢性麻痺による下肢麻痺者に対し、歩行中に中枢神経系の再構成を促す下肢末梢神経および筋肉からの適切な電気刺激方法の検討を行い、下肢麻痺者が常用している下肢装具に電気刺激を併用して、日常生活動作を阻害することなく,中枢神経系の再構成による機能回復を促す装具併用型の軽量小型電気刺激装置の開発を行うことを目的としている。初年度となる平成21年度は、まず、多チャンネルへの拡張性の優れた、1チャンネル筋電位信号により制御される1チャンネル出力の小型電気刺激装置(バッテリーを含め、80x40x10mm)を試作した。本装置は、内臓バッテリーにより、12時間以上の連続駆動が可能であり、チャンネル数を増加させた場合でも、小型で終日使用可能な装置が実現できるものと考えられた。また、本装置の設計の際に必要となる、下肢麻痺者の下腿部の動作パターンと下肢筋群の筋電位発火パターンを計測するために、3軸加速度と3軸角速度、および2chの筋電位を同期して計測できる装置を構築した。現在、低歩行能力者が、計測時に、ワイヤなどのひっかかりによる転倒のリスクを低減するために、本装置では、テレメータ方式にすることを検討している。さらに、中枢神経系の再構成を確認するための評価プログラムを作成した、本プログラムは、試験刺激で誘発される誘発筋電位が、最大3か所の別部位からの電気刺激などの条件刺激により、どのように変動するかを調べることにより、シナプスの結合強度の変化を捉えることが可能である。2年目となる平成22年度は、装置の設計の際に必要となる下肢麻痺者の様々な歩行周期における下腿部の動作パターンと下肢筋群の筋電位発火パターンを計測するために、研究計画を策定し、村山医療センターの倫理審査委員会に研究の申請を行い、数回の修正を加えた後に研究実施の承認を得た。低歩行能力者である下肢麻痺者のワイヤなどのひっかかりによる転倒のリスクを低減するために、ワイヤレスにて、2chの3軸加速度と3軸角速度、および8chの筋電位を同期して計測できる装置を構築した。装置にて、両側の膝蓋骨下部の3軸加速度、角速度、両側の前頸骨筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋、ハムストリングスを同期して、200Hzの標本周波数にて測定可能であり、これまでに、3名の健常者と1名の脳卒中片麻痺者の歩行の計測を行った。さらに、不完全であった中枢神経系の再構成を確認するための評価システムの修正および改良を加えて完成させ、健常者にて動作確認を行った。本システムは、試験刺激で誘発される誘発筋電位が、最大3か所の別部位からの電気刺激などの条件刺激により、どのように変動するかを調べることにより、シナプスの結合強度の変化を捉えることが可能である。本研究は脳卒中等の中枢性麻痺による下肢麻痺看者に対し、歩行中に中枢神経系の再構成を促す下肢末梢神経および筋肉からの適切な電気刺激方法の検討を行い、下肢麻痺者が常用している下肢装具に電気刺激を併用して日常生活動作を阻害することなく、中枢神経系の再構成による機能回復を促す装具併用型の軽量小型電気刺激装置の開発を行うことを目的としている。最終年度となる平成23年度は、研究代表春が転職となったため、研究体制の再構築に時間を要した。脳卒中患者4名と健常者2名の歩行において、両面の前頸骨筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋、大腿二頭筋の筋電位と下腿の3軸角速度・加速度、腫接地、爪先離地を無線で標本周波数200Hzにて同時計測を行った。30190(拍/分)の7種のテンポ音(脳卒中被験者は可能なテンポのみ)を発信し、約8mの平地直線歩行路で各テンポに同調した歩行を施行させた。脳卒中の被験者では各個人特有のパターンが存在したが、テンポに依存しない傾向がみられた。本結果より、当初予定していた4ch筋電検出4ch

電気刺激出力を持つ装置を製作せずに、12時間連続駆動可能な95x37x10mm,43gの電気刺激装置を4台製作し、各筋に独立に装着して収縮を補助する形式とした。本形式により、必要な筋肉数に応じた対応ができ、本体1ヶ所から四方八方に配線されていたコードも排除できる。本装置を健常被験者に適用したところ、相互干渉することなく、各筋の随意筋活動に応じて電気刺激により収縮を補助した。また、装置4台とも片側短下肢装具と大腿部サポータのポケットに配置ならびに収納することができ、コードも各筋肉の近傍に短く配線できた。本装置を装着して歩行することにより、筋活動が増輻してフィードバックされ、中枢神経系の再構成を促す可能性がある。その効果等を検証するために簡易型痙縮評価装置の開発も行った。
細胞がん化過程における染色体のトリソミー化の意義の実験的証明

本研究では、ヒトおよびハムスターの胎児より採取した初代培養細胞をもちい、X線などで誘発した各種がん細胞における細胞変化を、1)軟寒天中におけるコロニー形成能、2)細胞層(Cell mat)上でのコロニー形成能、3)動物移植性、4)染色体の核型変化、5)無限増殖能の獲得、6)がん遺伝子の増量および活性化、などのがん化形質を選びそれぞれのがん化形質の発現と悪性度との関係を検討した。X線照射されたハムスター細胞において、照射直後に線量依存的に起きる変化は形態変化コロニーの出現のみであった。他のがん形質の発現には、照射後かなりの細胞分裂を必要とするのに加え、発現頻度に線量依存性は認められない。形態変化したコロニーが、その時点で本当にがん化しているか否かは疑問であるが、そのコロニーをクローニングすると80%以上が無限増殖能をもち最終的には移植できる細胞に変化するので、形態的変化を起こした時点ですでにがん細胞になる運命を得たと推測される。ついで、ハムスター細胞から作ったがん細胞30種につき、がん化に関連する遺伝子の増量あるいは活性化を調べたが、調べた限りではDNAおよびRNAのいずれのレベルにおいてもがん化と相関した変化はみつからなかった。一方、タンパクレベルでは正常細胞とがん細胞で電気泳動パターンにかなりの相違があることがわかった。特に正常ハムスター細胞で220kd付近に顕著にみられる2本のバンド(220および240kd)が、すべてのがん細胞で一方のバンドがなくなっていることが明確である。この現象の意味はまだ不明であるが、これまでに報告したがん細胞における染色体の数的異常の関与を推測している。しかし、ヒト細胞では、ハムスター細胞で容易に起きる形態変化も、軟寒天中での増殖能獲得も、無限増殖の獲得も容易には起こらなかった。
Ｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ法を用いて抽出した成体幹細胞のマウス耳胞内移植

根本治療は存在しない遺伝難聴の治療法開発を最終目標として研究を行った。本研究においては、高い成体幹細胞活性を示す細胞群がSide population(SP)法にて抽出した細胞のマウス胎生期内耳である耳胞の移植を行い、その正着、細胞分化について検討を行うことを目的とした。結果としてSP法による細胞分離は可能であり、マウス耳胞内への移植も可能であった。しかし、最終的に移植に必要な細胞数を得ることはできず、正着、細胞分化について評価は困難であった。遺伝性性難聴に対する根本的な治療としては、異常な表現型(phenotype)が現れる前に1)内耳の遺伝子を遺伝子治療にて操作する、2)幹細胞移植により正常な機能を有する細胞を分化させる、という2つのアプローチ方法が考えられる。。本研究は、2)幹細胞を用いた治療法開発を目指した研究であり、前述の如く、ターゲットである内耳への治療介入は、異常な表現型が現れる前に行う必要があるため、内耳原基である耳胞をターゲットとする。申請者は、以前より「遺伝性難聴の根本的治療法の開発」を最終目標とした研究を行っており、本研究もその一環として行う。内耳原基である耳胞は、遺伝性難聴の治療法開発のためのターゲットの一つとして極めて重要である。本研究においては、高い成体幹細胞活性を示す細胞群がSide population(SP)法にて抽出可能であることを踏まえ、SP法にてEGFPマウスより抽出した内耳成体幹細胞(SP細胞)を非GFPマウス耳胞内へ微小ガラス管を通して投与し、その後のSP細胞の生着、分化について形態的学的に評価を行うとともに、SP細胞移植による機能障害惹起の有無について評価を行うことを目的とした。H23年度はSP細胞の抽出方法の確立を行った。当初SP細胞の抽出は外部委託で行うことを計画していたが、抽出に必要なフローサイトメーターが学内で使用可能であることが分かったため、実験の効率化のためまず学内の器械を使用してSP細胞の抽出を行うこととした。これまでの研究で、学内の器械を使用して生後3日のマウス採取した蝸牛よりSP細胞の抽出が行えた。しかし、その細胞数は極めて少なく、このまま耳胞内に細胞移植を行うことは不可能と考え細胞培養を計画したが、現在までに実験に必要な十分な数のSP細胞の培養には成功していない。そのため、来年度はiPS細胞を入手し、耳胞内細胞へ細胞移植も並行して行う予定である。遺伝性難聴に対する根本的な治療としては、異常な表現型(phenotype)が現れる前に1)内耳の遺伝子を遺伝子治療にて操作する、2)幹細胞移植により正常な機能を有する細胞を分化させる、という2つのアプローチ方法が考えられる。。しかし、その細胞数は極めて少なく、このまま耳胞内に細胞移植を行うことは不可能と考え細胞培養を計画したが、最終的に実験に必要な十分な数のSP細胞を得ることはできなかった。その解決策として、iPS細胞を入手し、耳胞内細胞へ細胞移植実験を行うべく準備を進めている。先天性難聴は、すべての先天性疾患の中でも発生頻度の高い疾患の一つであり、その50%以上は遺伝子の関与によるものと推測されており、現在までに100以上もの難聴原因遺伝子が同定されている。これらの症例に対しては、現在は対症的に人工内耳埋め込み手術が行われているが、根本的な治療には、異常な表現型(phenotype)が現れる前に1)内耳の遺伝子を操作する、2)幹細胞移植により正常な機能を有する細胞を分化させる、という2つのアプローチ方法が考えられる。

本研究は、2)幹細胞を用いた治療法開発を目指した研究であり、前述の如く、ターゲットである内耳への治療介入は、異常な表現型が現れる前に行う必要があるため、内耳原基である耳胞をターゲットとする。申請者は、以前より「遺伝性難聴の根本的治療法の開発」を最終目標とした研究を行っており、本研究もその一環として行う。内耳原基である耳胞は、遺伝性難聴の治療法開発のためのターゲットの一つとして極めて重要である。本研究においては、高い成体幹細胞活性を示す細胞群がSide population(SP)法にて抽出可能であることを踏まえ、SP法にてEGFPマウスより抽出した内耳成体幹細胞(SP細胞)を非GFPマウス耳胞内へ微小ガラス管を通して投与し、その後のSP細胞の生着、分化について形態的学的に評価を行うとともに、SP細胞移植による機能障害惹起の有無について評価を行うことを目的としている。H23年度はSP細胞の抽出方法の確立を行った。当初SP細胞の抽出は外部委託で行うことを計画していたが、抽出に必要なフローサイトメーターが学内で使用可能であることが分かったため、実験の効率化のためまず学内の器械を使用してSP細胞の抽出を行うこととした。25個体の生後3日のマウス採取した蝸牛よりフローサイトメーターを用いてSP細胞の抽出が行えることを確認した。この器械を使用して生後3日のマウス採取した蝸牛よりSP細胞の抽出が行えた。しかし、その細胞数は極めて少なく、このまま耳胞内に細胞移植を行うことは不可能と考え細胞培養を計画したが、現在までに実験に必要な十分な数のSP細胞の培養には成功していない。これらの問題により実験進行が遅れている。このため実験の進行がおくれた。移植に十分な幹細胞の作成を行うために、細胞培養法の改良に加え、来年度はiPS細胞を入手し、iPS細胞の耳胞内細胞へ細胞移植も並行して行う予定である。学内のフローサイトメーターを用いることにより、当初予定していた外部委託にくらべ、細胞処理からSP細胞の抽出までの時間を短縮できるため、より効率的なSP細胞の抽出が行えるようになると考える。移植に十分な幹細胞の作成を行うために、細胞培養法の改良に加え、来年度はiPS細胞を入手し研究の促進を図る。上記と同様に、学内のフローサイトメーターを用いることにより、当初予定していた外部委託にくらべ、細胞処理からSP細胞の抽出までの時間を短縮できるため、より効率的なSP細胞の抽出が行えるようになると考える。繰り越した研究費は未実施のH23年度の研究の実施に使用する予定である。
疾患特異的iPS細胞を用いた褐色細胞腫に対する新規治療法の開発

本申請者が在籍する研究室ではPPGLの代表的な病因遺伝子であるRET(MEN2B)にgermline mutationを有する患者からのiPSC樹立に既に成功している。同細胞をPPGLの発生母地となる交感神経細胞であるクロム親和性細胞へと分化誘導し世界初となるヒト細胞株を樹立、同細胞を用いて化合物スクリーニングを行い新規薬剤の開発に繋げる。また分化誘導した細胞を免疫不全マウスの腎被膜下に同所移植し疾患再現も同時に行いin vivoでの治療評価も可能とする。
LIUVFを用いた希薄気体流の可視化および計測

イメージインテンシファイア,紫外光用レンズをCCDカメラの組み合わせ,ArFエキシマレーザの照射によってO_2から発せられる紫外けい光(LIUVF)の観測を可能にした.ArFエキシマレーザ(193nm)はO_2のSchuamnn-Runge吸収線(X→B)に対応し、このレーザ光により220400nmの範囲のけい光を発する.ただし,常温以下では,ArFエキシマレーザ光をO_<>が吸収しにくく非常に微弱なけい光強度しか得られない.そのため,けい光の光路中にN_2ガスを流し大気中のO_2によるけい光の減衰を防ぐ等の工夫を行っている.現在までに,CCDカメラの露光時間を長くすることで,このけい光を捉えることを可能にした.また,超音速自由噴流の流れ場に本手法を適応し,可視化および温度計測を行った.その結果,可視化では従来から得られているヨウ素を用いた手法ほど鮮明な画像が得られず,温度計測でも低温域において誤差の大きい結果となった.これらは,けい光が非常に微弱であることに起因しているものと考えられ,今後もけい光強度を増加させる検出系の改善を目指す予定である.一方,ヨウ素を用いた希薄気体流の温度計測については,その計測精度を向上させるための吸収線の選択方法を提案し,(0,43)バンドを用いた際の最適な吸収線を明らかにした.さらに,超音速自由噴流が干渉した流れ場構造の解明にもけい光を利用した可視化技術を導入し,その有効性を確認した.イメージインテンシファイア,紫外光用レンズをCCDカメラの組み合わせ,ArFエキシマレーザの照射によってO_2から発せられる紫外けい光(LIUVF)の観測を可能にした.ArFエキシマレーザ(193nm)はO_2のSchuamnn-Runge吸収線(X→B)に対応し、このレーザ光により220400nmの範囲のけい光を発する.ただし,常温以下では,ArFエキシマレーザ光をO_<>が吸収しにくく非常に微弱なけい光強度しか得られない.そのため,けい光の光路中にN_2ガスを流し大気中のO_2によるけい光の減衰を防ぐ等の工夫を行っている.現在までに,CCDカメラの露光時間を長くすることで,このけい光を捉えることを可能にした.また,超音速自由噴流の流れ場に本手法を適応し,可視化および温度計測を行った.その結果,可視化では従来から得られているヨウ素を用いた手法ほど鮮明な画像が得られず,温度計測でも低温域において誤差の大きい結果となった.これらは,けい光が非常に微弱であることに起因しているものと考えられ,今後もけい光強度を増加させる検出系の改善を目指す予定である.一方,ヨウ素を用いた希薄気体流の温度計測については,その計測精度を向上させるための吸収線の選択方法を提案し,(0,43)バンドを用いた際の最適な吸収線を明らかにした.さらに,超音速自由噴流が干渉した流れ場構造の解明にもけい光を利用した可視化技術を導入し,その有効性を確認した.現有のエキシマレ-ザが故障し,ArFによる発振が不可能となったため,O_2の可視化,計測の実験が大幅に遅れることとなった。これには,他のエキシマレ-ザを手配することで対処した。現在までに,イメ-ジインテンシファイア,紫外光用レンズを購入し,現有のCCDカメラに組み合わせた。これにより,紫外けい光の観察が可能となる。O_2の可視化に用いるエキシマレ-ザ光(193nm)がレ-ザの経路中に存在するO_2によって吸収されるため,測定室中ヘレ-ザ光を導くための真空の経路を製作中である。また,予備実験としてよう素を用いた流れ場のCCDカメラによる観察,および計測を行った。その結果,CCDカメラにより徴弱なけい光を捉えることができ,希薄気体流の流れ場構造を解析できること,また照射レ-ザ光の波長を変えて撮像した2枚の画像から温度が計測できることを明らかにした。平成4年度には,LIUVFを用いた希薄気体流の温度・密度計測に関する実験,および二次元温度・密度場の可視化と計測システムを確立し,本計測システムを用いて種々の流れ場の二次元的な温度・密度場の可視化・計測を行い,本研究で提唱した温度・密度計測法を従来から得られている結果との比較から評価する。さらに,レ-ザシ-トの移動により,流り場の三次元的な温度および密度場を解析するソフトウェアも開発する。また,本システムを希薄気体流のみでなく,超音速風洞等へも適用し,その有効性,汎用性を高めることも計画している。新しいArF発振のエキシマレーザを手配し,イメージインテンシファイア,紫外光用レンズをCCDカメラに組み合わせ,O_2から発せられる紫外けい光(LIUVF)の観測を可能にした。ArFエキシマレーザ(193nm)はO_2のSchumann-Runge吸収線(X→B)に対応し,このレーザ光により220400nmの範囲のけい光を発する。ただし,常温以下では,ArFエキシマレーザ光をO_2が吸収しにくく非常に微弱なけい光強度しか得られない。そのため,けい光の光路中にN_2ガスを流し,大気中のO_2によるけい光の減衰を防ぐ等の工夫を行っている。現在までに,CCDカメラの露光時間を長くすることで,このけい光を捉えることを可能にした。

また,超音速自由噴流の流れ場に本手法を適応し,可視化および温度計測を行った。その結果,可視化では,従来から得られているヨウ素を用いた手法ほど鮮明な画像が得られず,温度計測でも低温域において誤差の大きい結果となった。これらは,けい光が非常に微弱であることに起因しているものと考えられ,今後もけい光強度を増加させる検出系の改善を目指す予定である。一方ヨウ素を用いた希薄気体流の温度計測については,その計測精度を向上させるための吸収線の選択方法を提案し,(0,43)バンドを用いた際の最適な吸収線を明らかにした。さらに,超音速自由噴流が干渉した流れ場構造の解明にもけい光を利用した可視化技術を導入し,その有効性を確認した。
太陽エネルギー利用の研究

〔1〕無塩式ソーラーポンドの性能向上に関し、ポリマーゲル水溶液の光物性値,熱伝導率,粘性係数を求める実験を行い、日射のある場合の伝熱解析及び蓄熱効率に関するシミュレーションを行つた(国友)。〔2〕太陽熱顕熱システムの最適化に関して蓄熱槽効率推定表の作製及びバランス温度成層型蓄熱槽の影響因子の効果検討が行われた(中原)。潜熱蓄熱の最高性能化の研究は、金属伝熱面により純水を上方から冷却するときの凝固開始過冷却度が伝熱面の材質と表面の性質に依存する状況を明らかにした(斎藤)。〔3〕太陽放射を受ける建築物の調湿機構に関する研究では、自然条件下特に太陽放射のある場合の建築材料の吸放湿特性を実験室内及び屋外模型家屋で実験を行い検討を行つた(宮野)。選択放射と水分蒸発による冷却効果を利用した外断熱壁体については、二重外被方式の効果について屋外比較実験により検証してその高性能化への研究を進めた(浦野)。太陽熱による空気の自然循環と室内温度調節に関する研究では、模型による屋外比較実験により圧力分布と熱交換の定性的特性を明らかにしてクールチューブの最適設計の数値解析を行い、実験室内模型により加熱条件と換気速度・流動パターン特性を検討した(藤井)。〔4〕半地下居室に対する太陽エネルギーの最適利用技術に関する研究では、実大試験家屋で地中に水平に施す断熱材の有無が半地下居室の熱的性能に及ぼす影響について検討し、更にシミュレーションにより地中の壁周囲に施す断熱方法を各種検討を行つた(吉野)。湿つた地盤等の有効利用法に関する研究では、地盤の大容量・長期蓄熱体として利用するために含有水分の挙動の影響について検討し、常水面が存在し、かつ降雨が存在する場合の解析手法を示した(松本)。
新規作用機序を有する肺がん幹細胞選択的リポソーム製剤の構築

本研究の目的は、新規作用機序を有する肺がん幹細胞選択的抗がん剤を構築することである。薬物キャリアであるリポソームに、肺がん幹細胞リガンドである葉酸を修飾した葉酸修飾リポソームを調製し、肺がん幹細胞選択的薬物キャリアを構築することである。種々の検討結果より、葉酸修飾リポソームは、葉酸レセプターを介して細胞内に取り込まれた後、オートファジー誘導剤であるラパマイシンの抗腫瘍効果を増強させることが示唆された。さらに、ラットへ経肺投与後、優れた肺内滞留性を有することが明らかとなった。以上の結果より、葉酸修飾リポソームは、肺がん幹細胞選択的経肺投与製剤キャリアとして優れた性質を有することが示唆された。近年がん細胞の転移や再発に、抗がん剤や放射線療法後に残存したがん幹細胞の関与が明らかとなってきており、がん幹細胞をターゲットとした研究が多く行われている。さらに、アポトーシス以外の細胞死であるオートファジーは、腫瘍細胞の発生・進展との関与が徐々に明らかとなってきており、抗がん剤の新規ターゲットとして注目されている。本申請課題では、肺がん幹細胞のリガンドを修飾したリポソームにオートファジー誘導剤を封入し、経肺投与可能な抗がん剤を開発する。本年度は、まず、リポソーム自身の物性が吸入特性に与える影響を検討し、経肺投与製剤として最適なリポソーム組成を検討した。相転移温度の異なる種々の脂質を用いてリポソームを調製し、ネブライザー噴霧後のリポソームの粒子径を指標に吸入特性に与える検討した結果、脂質組成が吸入特性に与える影響は確認されなかった。一方、調製したリポソームの平均粒子径が増大するにつれ、肺内到達量は減少し、ネブライザー内に残存するリポソーム量が増大した。このことから、平均粒子径100 nm程度のリポソームが最も経肺投与製剤として適していることが示された。次に、モデル薬物封入リポソームのネブライザー噴霧時および噴霧後の安定性を評価した。その結果、粒子径が400600 nm以上のリポソームではネブライザー噴霧後に薬物漏出が認められたが、平均粒子径を100 nmに調整したリポソームでは薬物の漏出が抑制された。さらに、平均粒子径を100 nm程度に制御することで、内封薬物量を増加させた場合においても、漏出は抑制されることが示された。今後、実際のオートファジー誘導剤を用いて薬物封入葉酸修飾リポソームを調製し、その吸入特性ならびに抗腫瘍活性を検討する必要がある。吸入特性評価装置としてアンダーセンカスケードインパクター、エアロダイナミックパーティクルサイザー、レーザー回折式粒度分布測定装置等のいくつかの機器を用いてリポソーム自身の組成が吸入特性に与える影響を検討した。その結果、予想以上に測定に時間を要したため、実製剤封入リポソームを用いた検討ができていない。次年度は、実製剤封入リポソームを調製し、吸入特性ならびに抗腫瘍活性評価を行いたい。細胞死の一種であるオートファジーは、近年、腫瘍細胞の発生・進展との関与が徐々に明らかとなってきており、抗がん剤の新規ターゲットとして注目されている。本年度は、これまでの検討において良好な吸入特性を有する脂質組成からなるリポソームに各種オートファジー誘導剤または阻害剤を封入し、細胞障害活性、細胞内取り込み、オートファジー誘導能およびラットへ経肺投与後の肺内動態を観察した。オートファジー誘導剤として二クロスアミド、ラパマイシン、オートファジー阻害剤として3-メチルアデニン、ウォルトマンニンを選択した。葉酸を0.3 mol%修飾した葉酸修飾リポソームに各種薬物を内封し、葉酸レセプター(FR)高発現細胞および低発現細胞を用いて抗腫瘍活性を評価した。その結果、いずれの薬物を用いた場合においても、FR低発現細胞では、未修飾リポソームと同等の抗腫瘍活性を示したのに対し、FR高発現細胞では他のサンプル群と比較して有意に高い抗腫瘍活性を示した。次に、その高い抗腫瘍活性がFRを介した細胞内取り込みによるものか否かを検討するため、細胞内取り込みを評価したところ、葉酸修飾リポソームは、薬物単独または未修飾リポソームと比較して高い細胞内取り込みを示し、さらにFR競合阻害剤である葉酸を添加することでその取り込みは抑制された。また、オートファジー誘導剤封入リポソームでは、薬物単独投与と比較してオートファジー誘導能を向上させることが明らかとなった。これらの結果から、葉酸修飾リポソームは、FRを介して細胞内に積極的に取り込まれることで、オートファジー誘導による抗腫瘍活性を示したものと考えられる。最後に、ラットに経肺投与後の肺内動態を観察したところ、未修飾リポソームと比較して若干の滞留性の向上が観察された。

種々の検討結果より、葉酸修飾リポソームは、葉酸レセプターを介して細胞内に取り込まれた後、オートファジー誘導剤であるラパマイシンの抗腫瘍効果を増強させることが示唆された。さらに、ラットへ経肺投与後、優れた肺内滞留性を有することが明らかとなった。以上の結果より、葉酸修飾リポソームは、肺がん幹細胞選択的経肺投与製剤キャリアとして優れた性質を有することが示唆された。本年度の結果を踏まえ、平均粒子径を100 nm程度に制御した肺がん幹細胞標的リガンド修飾リポソームを調製し、その吸入特性ならびに噴霧安定性を評価する。さらに、実際のオートファジー誘導剤を封入し、薬物の封入率、抗腫瘍活性評価を行う予定である。医歯薬学