hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能性誘電体薄膜の高温電気特性に及ぼす微構造の影響

本研究では、薄膜状誘電体の特性評価、特に温度変化に対する誘電率等の変化を再現性良く行うために必要と考えられる測定セルを作製し、予備的な実験を行った。例えば、Ta/Nb比が電気的,光学的諸性質に大きな影響を与えるKTN(KTa_xNb_<1-x>O_3)薄膜の場合には、特に低温条件からの測定が重要であるが、本研究では、ゾル-ゲル法によって合成した薄膜について測定を行った。この測定によってTa量をx=0.35,0.50,0.65のように変化させた場合に、明らかに試料の持つ分極と印加電場との関係に違いが見られた。x=0.65の組成については、通常室温以下では自発分極を有する強誘電体と考えられているが、今回調製した試料では、菱面体晶として安定であると考えられるおよそ50Kの極低温まで冷却を行うことによって、強誘電性の特徴であるヒステリシスループを観察することが可能となった。しかし誘電率の温度依存性などを見た場合、薄膜ではバルクのサンプルとは異なり、基板からの影響を無視できないことも明かとなった。基板の選択は、配向性などの制御には重要な因子であるが、物性の面からは、成膜温度及び室温でのマッチングの状態により生ずる薄膜への応力が、相転移温度などに大きく影響を与えていると考えられる知見を得た。即ち熱膨張などは、薄膜と比較して明らかに厚みの大きい基板によって決定され、特にエピタキシャル的に薄膜が成長した場合には、基板が薄膜の格子を歪ませる作用も大きくなるものと考えられる。現在は、X線的手法や電子顕微鏡観察を用いて応力の影響を評価し、検討を続けている。今後はさらに温度を上昇させた場合や他の系などへの応用を進めるとともに、誘電体だけでなく半導体などにもこの手法を試みたい。
代謝をターゲットとした自己免疫疾患の新規治療法の開発

グルタミン代謝阻害薬による関節炎抑制効果、さらには同阻害薬に薬効の異なる薬剤を併用した場合の併用効果について検討を行った。今年度は、グルタミン代謝阻害薬である6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンと、mTOR阻害薬であるラパマイシンに着目した。まずin vitroの解析により、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンおよびラパマイシンは、それぞれ単独でCD4陽性T細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに両者を併用すると、単剤の場合と比較して有意に強い増殖抑制効果を示すことを明らかにした。また、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンおよびラパマイシンは、Th17細胞分化を抑制することも発見した。両薬剤の骨髄細胞への影響についても検討を行った。その結果、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンはラパマイシンよりも強く樹状細胞およびマクロファージへの分化を抑制し、骨髄由来抑制細胞(MDSC)への分化を促進した。一方、ラパマイシン投与によりMDSCはより強いT細胞抑制能を獲得した。最後に、両薬剤のマウス関節炎抑制効果について検討した。その結果、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンとラパマイシンの併用により、相加的にマウス関節炎が抑制されることを証明した。その効果はリンパ球への影響が主体であったが、骨髄系細胞および滑膜細胞への影響も示唆された。。以上、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンとラパマイシンの併用は、マウス関節炎を相加的に抑制することを明らかにした。6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンとラパマイシンの併用により、マウス関節炎が強く抑制されることを明らかにしたため。さらに、代謝阻害薬と他剤の併用効果についての検討を続けてゆく。特に、グルタミン代謝阻害薬とオートファジー阻害薬の併用による関節炎抑制効果について解析を進める予定である。。
ヘムオキシゲナーゼの反応中間体の立体構造に基づく特異的反応の解明

ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解系の主要な酵素であり、酸素と還元力を用いてヘムのα-位を特異的に開裂し、ビリベルジンIXα、CO、鉄へと分解する。3段階のHO反応の各ステップで、O_2を一分子消費し、2段階目でCOを生成する。一般にヘムおよびそのアナログにはO_2よりもCOがはるかに強く結合することから、HO中ではO_2とCOが厳密に識別されている。本研究では、ラット由来HOを用いて、heme-HO複合体のCO結合型に極低温でレーザー光を照射させ、光解離するCOの挙動を結晶学的に追跡した。この結果、HOには疎水性小分子をトラップする部位があることを明確に示した。これらの結果から、HOの生成物による阻害の回避の分子機構を明らかにした。一方、HOは光合成生物では光合成色素の合成にかかわる酵素として重要である。紅藻やラン藻では、ビリン化合物を結合したフィコビリソームという複合体を持ち、ここで吸収された光エネルギーは高い効率で光化学系IIの反応中心に伝達される。ここで用いられている色素は、HOによりヘムからビリベルジンIXα(BV)へ、さらに幾つかのフェレドキシン依存性ビリン還元酵素によって、多様なビリン化合物に代謝される。本研究では、ラン藻Synechocystis sp.PCC6803由来の二つのHO(Syn HO-1とSyn HO-2)の結晶構造を解析した。Syn HO-1のヘム複合体の構造は他のheme-HOのそれと似ていたが、分子表面の正電荷が狭い領域に限られていた。このことは、電子供与体のサイズの違いを反映していると考えられた。Syn HO-2のヘム複合体(酸化型、還元型)およびNO結合型の結晶構造から、Syn heme-HO-2でも、NOがヘム鉄の遠位側にヘムのα-meso炭素方向に屈曲して配位していた。Syn heme-HO-2の特徴は、2量体を形成していたことで、これはヘムの結合に応じて変化することが示唆された。HOは基質であるヘムを結合してヘムタンパク質様の性質を示し、ヘムを補酵素のように使って酸素を活性化するという特徴がある。HOの主な生理学的役割は、哺乳類ではヘムの無毒化と鉄の再利用であるが、ラン藻などの光合成生物では光合成色素の合成である。ラン藻の一種であるSynechocystissp.PCC 6803は2つのHO(Syn HO-1とSyn HO-2)を持っている。Syn HO-1とヘムとの複合体の結晶構造を2.5Å分解能で決定し、rat HO-1と基本的に同じフォールディングを有することを明らかにした。しかし、分子表面の電荷分布に大きな違いが見られ、Syn HO-1ではプラスに荷電した領域が、rat HO-1よりもずっと狭い範囲に限られていた。この結果から、rat HO-1はNADPH-cytochrome P450 reductase(77KDa)で還元されるのに対し、Syn HO-1は酸性小タンパク質であるフェレドキシン(11KDa)で還元されるということに対して構造基盤を与えた。さらに、Syn HO-2とヘムとの複合体およびそのNO体の結晶構造をも決定した。

これらの複合体は2量体を形成しているという特徴を持つ。興味深いことに、Syn HO-2は単独では単量体であり、ヘムを結合するに伴って2量化する。また、NOがSyn HO-2中のヘム鉄に結合するに伴い、アミノ酸残基の側鎖にコンフォメーション変化が起ることを見つけた。このことから、HO反応に必要なプロトンの供給経路を示した。ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解系の主要な酵素であり、酸素と還元力を用いてヘムのα-位を特異的に開裂し、ビリベルジンIXα(BV)、CO、鉄へと分解する。HOは基質であるヘムを結合してヘムタンパク質様の性質を示し、ヘムを補酵素のように使って酸素を活性化するという特徴がある。HOの主な生理学的役割は、哺乳類ではヘムの無毒化と鉄の再利用であるが、ラン藻などの光合成生物では光合成色素の合成である。ラン藻の一種であるSynechocystissp.PCC 6803では、HOがヘムからBVに変換し、さらにフェレドキシン依存性ビリン還元酵素(PcyA)がBVから光合成色素(ビリン)に変換する。PcyA-BV複合体の結晶構造を1.51Å分解能で決定した。PcyAはα/β/αの三層サンドイッチ構造からなり、BVは中央のβ-シートとC末端α-ヘリックス群の間に、U字型コンフォメーションをとって結合していた。PcyA分子表面の電荷分布から、電子供与体であるフェレドキシンがBV結合部位の表面に結合することが示された。また、PcyAがBVの対称性からのわずかなずれを正確に認識していることが明確になった。本研究の最も注目すべき成果は、PcyAがBVの一見離れた2つの部位を、立体特異的に、しかも順序だった2段階反応で還元するという分子機構を提示したことである。また、本構造情報を基に、機能的に重要と考えられるアミノ酸残基を他のものに置換した変異タンパク質を幾つか調製し、各々の機能を評価した。さらに、PcyAのみの立体構造を2.5Å分解能で決定し、BVの結合に伴うPcyAの構造変化を明らかにした。
強迫性障害患者の病態とPET、fMRI、DTIの相関を評価する研究

臨床的には、SSRI療法に反応しない治療抵抗性の症例に対して新規非定型抗精神病薬であるperospironeおよびquetiaoineによる増強療法が有効性を示す結果が得られつつある。今後は他の非定型抗精神病薬であるrisreridoneやolanzapineとの治療反応性の違いを検討し、強迫性障害患者に対する病態別の薬物選択の有用性について明らかにする。また、認知行動療法においても、定型的な曝露反応妨害法では十分に効果が上がらない症例に対し、新しい認知行動療法であるEMDRを併用し、治療導入をスムーズにし、外傷体験の処理を行うことで、治療の有効性の向上と期間の短縮化を図っている。養育体験やパーソナリティーと強迫症状との関連を明らかにしていくことで、心理療法的アプローチの導入を図っている。同時に、治療経過において、Y-BOCS,PI(Padua Inventory)による強迫症状、SPECTによる脳血流の評価、MRI拡散強調画像(DTI),fMRIによる神経ネットワークについての評価を行っている。SPECTにおける脳血流データをSPM softwareにて比較解析を行い、強迫性障害患者では健常対照者と比較して、頭頂部における血流亢進が認められているという結果が出ている。さらにSPECTとDTIおよび臨床症状との相関について解析・検討を進めている。fMRIにおいては、前頭葉機能を反映する課題遂行中に脳賦活状態の検討を行っている。PETにつては、SPECT、fMRIの結果との相関について評価する検討を行っている。認知機能と臨床的強迫症状の変化と脳機能画像を経時的に多面的・縦断的に評価する検討は、現時点ではほとんどなされておらず、強迫性障害の多様性や治療抵抗性に関する神経ネットワークを解明につながり、より有効な薬物療法や認知行動療法が可能になると期待される。強迫性障害の臨床研究並びに生物学的成因の解明についての臨床研究経過の概要を報告する。まず、臨床的には、従来から有効性が確立しているSSRIに治療抵抗性の症例に対して新規非定形抗精神病薬の一つであるperospironeの付加投与が有効であることを示唆する結果が得られつつある。今後は他の非定型抗精神病薬であるrisperidoneやolanzapineとの比較によりその有効性について検討し、報告する予定である。なお、認知行動療法においても、定型的な曝露反応妨害法に導入困難な症例や効果の不充分な症例に対して、EMDR(Eye Movement Desensitization and Reprocessing)を併用することで治療効果の向上、治療期間の短縮化を図っている。いまだ症例数は少ないが効果はみられており、今後症例を増やし、さらなる検討を行う予定である。
アルファ・シヌクレインの神経毒性及びプリオン様伝播の分子機構の解明とその臨床応用

アルファ・シヌクレイン(α-syn)は、パーキンソン病を含むシヌクレイン病の主要な病理構成成分である。海馬初代培養神経細胞において、α-synは興奮性シナプスマーカーである小胞グルタミン酸トランスポーター1と共局在することを発見した。また、リコンビナントα-syn単量体およびヒト髄液中のα-synを、分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)で分画すると60kDaの大きさを呈するが、変性ゲルでは15kDaを呈した。α-syn二量体やオリゴマーは、SECでより大きなサイズで分画された。よって、髄液中のα-synは、主に単量体で存在することが分かった。本研究の目的は、パーキンソン病(PD)に特徴的な病理所見であるLewy小体の主要な構成成分であるα-シヌクレイン(α-syn)蛋白について、未だ解明されていない神経毒性を有する可溶性α-synオリゴマーの構造及び伝播様式とその分解過程を明らかする。さらに、PD患者における細胞外液中のα-synの構造をPD診断バイオマーカーおよび治療標的として臨床応用するための研究基盤を確立することである。今年度は、精製したα-syn蛋白から高分子α-synを作成し、原子間力顕微鏡にてその構造を視覚的に確認した。また、作成した高分子α-synの分解過程を、培養細胞系を用いて検討した。特に、α-syn封入体の分解に焦点を当てた。方法として、高分子α-synをHEK293細胞に形質導入し、細胞内のα-syn封入体の分解を、オートファジーマーカーであるp62、LC3などを用いて検討した。結果は、1)α-syn封入体は、リン酸化およびユビキチン化されていた。2)α-syn封入体は、アダプター蛋白であるp62/SQSTM1(p62)で取り囲まれており、オートファジー・リソソーム系が働いていた。3)リン酸化α-syn陽性封入体はLC3とmergeしており、オートファゴソームへの取り込みが確認された。4)リン酸化α-syn陽性封入体は24時間で分解され、その分解はバフィロマイシンA1の投与によって減少した。4)Atg5をノックダウンすると、α-syn封入体のオートファゴソームへの取り込み減少が見られ、α-syn封入体のオートファジー分解はp62依存的であった。5)ミトコンドリアのクリアランスに、α-syn封入体の影響は無かった。以上より、α-syn封入体の分解にはp62依存的オートファジーが関与していることが示唆された。本研究の目的は、パーキンソン病(PD)に特徴的な病理所見(Lewy小体)の主要な構成成分であるα-シヌクレイン(α-syn:14,460Da)蛋白について、未だ解明されていない神経毒性を有する可溶性α-synオリゴマーの構造及び伝播様式とその分解過程を明らかにすることである。加えて、PD患者における細胞外液中のα-syn構造をPD診断バイオマーカーおよび治療目的として臨床応用するための研究基盤を確立することにある。今年度は、マウス初代培養細胞(海馬神経細胞)におけるα-synの分布を観察した。結果は、1)α-Synはシナプス前ボタンおよび細胞体に高濃度で存在した。2)α-Synが存在しない神経細胞は、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)、パルブアルブミン、ソマトスタチンで染まる抑制性ニューロンであった。3)α-Syn陽性神経細胞は、興奮性シナプスのマーカーである小胞グルタミン酸輸送体-1と共局在した。4)この局在パターンは海馬神経細胞限定的なものであった。5)作成した高分子α-synを初代神経細胞に添加すると、GAD陽性細胞においては凝集体が形成されなかった。以上より、α-syn発現の調節は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンによって異なる可能性が示唆された。また、精製したα-synおよび髄液(CSF)中のα-synは、分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)にて約60kDa画分に溶出されるが、SDS-PAGEでは15kDaを示すことを観察した。この分画成分を尿素処理しても変化が無いことから、SECで見られる約60kDaのピークはα-syn単量体であることがわかった。当初の計画である高分子α-synucleinを安定的に作成することができ、その分解系について検討し、論文作成にまで至っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。培養細胞を用いて、毒性のあるα-synucleinオリゴマーを同定する。また、ヒトサンプル(髄液、血漿など)による細胞外α-synucleinの構造を同定する。
新規Ｆｃ受容体ＤＣ－ＳＩＧＮ：抗体医薬品の構造特性・機能及び免疫原性との関連

本研究では,静注用免疫グロブリン(IVIG)製剤に含まれるシアリル化IgGの受容体として機能し,IVIG製剤の抗炎症作用を担う分子である可能性が報告されたDC-SIGNに着目して,抗体医薬品の構造や機能とDC-SIGNの関連を明らかにすることを目的とした.樹立したDC-SIGN発現細胞を用いた結合性解析の他,低親和性の結合も検出できるSPR法による結合性解析等を行ったが,DC-SIGNとシアリル化IgGの結合は検出されず,IVIG製剤の抗炎症作用におけるシアリル化IgG/DC-SIGNの関与については,両者の直接の相互作用ではなく,別の機構が関与していることが示唆された.本研究の主な目的は、免疫グロブリン製剤の抗炎症作用を担うFc受容体として機能する可能性が示唆されているDC-SIGNに着目して、DC-SIGNへの結合/活性化能に関するIgGの構造特性を解明し、シアル酸付加型IgGの抗炎症作用の分子機構を明らかにすることである。本年度は、シアル酸転移酵素(ST3Gal1あるいはST6Gal1)とIgGの共発現によりシアル酸高付加型IgGを調製し、低親和性結合も検出が可能な表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いてFc受容体及びDC-SIGNを含む新規Fc受容体候補タンパク質に関する結合特性の評価を行った。センサーチップにDC-SIGNを固定化し、IgGをアナライトとしてDC-SIGNとの結合及び解離を測定したところ、陽性対象として用いた補体C1qとDC-SIGNの結合は検出されたが、シアル酸高付加型IgGとの結合は検出されなかった。別に、Protein Aを用いたキャプチャー法による結合特性解析系を構築し、IgGをセンサーチップ上に捕捉して、受容体類をアナライトとする解析を進めているが、これまでのところ、DC-SIGN類との結合は検出されていない。次年度は、DC-SIGN結合測定系を改良し、シアル酸高付加型IgGの結合特性の解析を進めると共に、最新の文献情報も参考に、DC-SIGN以外の分子がシアル酸高付加型IgGの抗炎症作用に関与している可能性も考え、B細胞に発現するCD22(Siglec-2)等について、シアル酸高付加型IgGとの結合及び結合に伴う免疫抑制シグナルの惹起について検討し、Fc受容体として機能している可能性を検証する予定である。本研究では,免疫グロブリン製剤の抗炎症作用を担うFc受容体として機能する可能性が報告されたDC-SIGNに着目して,抗体医薬品の構造・機能ならびに免疫原性とDC-SIGNの関連を明らかにすることを目的とした.免疫グロブリン製剤から精製したシアル酸レクチン吸着IgG画分や,シアル酸転移酵素の共発現により調製したIgGを用いて,cell-based assay及びSPR法により,DC-SIGNとの結合性を評価したが,これまでのところ,DC-SIGNとの結合性は検出されていない.免疫グロブリン製剤の抗炎症作用におけるDC-SIGNの関与については,その後,様々な報告があり,仮説を見直す必要が生じている.一方で,DC-SIGNがバイオ医薬品の免疫原性に関わる可能性については,未解明であることから,今後,抗体医薬品等のバイオ医薬品のDC-SIGN結合性,および,免疫原性の関連について,検討を行う予定である.本研究では,静注用免疫グロブリン(IVIG)製剤に含まれるシアリル化IgGの受容体として機能し,IVIG製剤の抗炎症作用を担う分子である可能性が報告されたDC-SIGNに着目して,抗体医薬品の構造や機能とDC-SIGNの関連を明らかにすることを目的とした.樹立したDC-SIGN発現細胞を用いた結合性解析の他,低親和性の結合も検出できるSPR法による結合性解析等を行ったが,DC-SIGNとシアリル化IgGの結合は検出されず,IVIG製剤の抗炎症作用におけるシアリル化IgG/DC-SIGNの関与については,両者の直接の相互作用ではなく,別の機構が関与していることが示唆された.DC-SIGN結合測定系の確立のため以下の実験を行った。1.DC-SIGN発現細胞株の樹立:ヒトDC-SIGN発現プラスミドベクターを構築しJurkat細胞に導入した後、薬剤を用いた選別によりDC-SIGNを安定発現するJurkat細胞株を樹立した。抗DC-SIGN抗体を用いて蛍光免疫染色した細胞をフローサイトメーターで解析することで、樹立した細胞の細胞膜表面におけるDC-SIGNの発現を確認した。2.シアル酸付加型IgGの調製:免疫グロブリン製剤を試料として、シアル酸結合性のSNAレクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、シアル酸付加型IgGを精製した。SNAレクチンを用いたレクチンブロットにより、精製したIgGへのシアル酸の付加を確認した。3.Cell-based bindingassay:1で樹立したDC-SIGNを安定発現するJurkat細胞に対し、2で精製したシアル酸付加型IgGを添加し、蛍光二次抗体で標識した後、フローサイトメーターによる解析を行った。高濃度(100 μg/ml)のIgGの添加でも特異的な結合は検出されず、本実験系ではシアル酸付加型IgGのDC-SIGNに対する結合能を測定することはできなかった。DC-SIGNに対するIgGの結合はFc領域のN結合型糖鎖へのシアル酸の付加が関与するとされているが、本実験で用いた免疫グロブリン製剤中にはFab領域にシアル酸を含む糖鎖が付加されたものが多く存在するため、Fc領域にシアル酸付加型糖鎖を有するIgGが十分に濃縮されていない可能性が考えられる。

次年度はFc領域の糖鎖にシアル酸が付加したIgGの調製を行うとともに、SPR法などのより高感度に結合測定が可能な実験系の適応可能性について検討し、引き続きDC-SIGN結合測定系の構築を進める予定である。本研究では,免疫グロブリン製剤に含まれるシアリル化IgGの受容体として機能し,免疫グロブリン製剤の抗炎症作用を担う分子である可能性が報告されたDC-SIGNに着目して,抗体医薬品の品質安全性とDC-SIGNの関連を明らかにすることを目的とした.シアリル化IgGとDC-SIGNの結合特性の詳細が明らかにされていなかったため,シアリル化IgGとDC-SIGNの結合親和性の解析,シアリル化IgGにおけるDC-SIGN結合部位の特定,IgGサブクラスによるDC-SIGN結合性違い等の解明を目指し,シアリル化IgGとDC-SIGNの結合性評価を試みてきた.DC-SIGN発現細胞を作製し,シアリル化IgG画分の結合性を解析したが,特異的結合が検出されなかったため,結合・解離が速い低親和性の結合も検出できるSPR法による解析を試みた.シアリル化IgGとして,シアル酸結合性レクチンを用いて免疫グロブリン製剤から精製した画分を用いた他,Fab領域ではなくFc領域の糖鎖にシアル酸が付加したIgGとして,シアル酸転移酵素を共発現させたモノクローナル抗体発現系を用いて調製した組換えヒトIgGを用いた.SPR法による測定条件の最適化を試みたが,DC-SIGNとシアリル化IgGの結合は検出されなかった.これらの結果や,最近の文献情報も考慮すると,免疫グロブリン製剤の抗炎症作用におけるシアリル化IgG/DC-SIGNの関与については,両者の直接の相互作用ではなく,別の機構が関与していることが示唆された.生物薬品学研究を開始した平成23年度は、DC-SIGN安定発現細胞株を樹立してcell-based bindingassay系を構築し、免疫グロブリン製剤(ヒト血液由来IgG)から精製したシアル酸結合性レクチン吸着IgG画分について、DC-SIGN結合性を評価した。しかし、DC-SIGNとの結合は検出されず、Fc領域にシアル酸付加型糖鎖を有するIgGが十分に濃縮されていない可能性が考えられた。そこで、平成24年度は、IgGとシアル酸転移酵素との共発現系を用いて、シアル酸高付加型IgGの調製を行うとともに、低親和性の結合も検出が可能なSPR法を用いた結合特性解析を行うこととした。これまでのところDC-SIGN結合に関わる抗体の特性を解明するには至っていないが、年度当初の計画にしたがって本年度の実験を進めることができており、概ね順調に進展していると考える。まず最初に,DC-SIGN安定発現細胞株を樹立してcell-based bindingassay系を構築した.免疫グロブリン製剤(ヒト血液由来IgG)から精製したシアル酸結合性レクチン吸着IgG画分について,DC-SIGN結合性を評価したが,DC-SIGNとの結合は検出されなかった.次に,IgGとシアル酸転移酵素との共
神経芽腫の新規ディペンデンス受容体の同定および機能解析と治療法開発への応用

独自に作製した神経芽腫cDNA librarykaraから同定した新規依存性受容体UNC5Dについて、機能を解析した。その結果、UNC5DはNGF欠乏による細胞死(プログラム細胞死)やDNA損傷時に活性化されるp53によって発現が誘導され、ガスパーゼによって切断された細胞内断片は核へ移動し、pro-apoptoticなターゲット遺伝子の発現を誘導した。神経芽腫の自然退縮を促進する重要な分子機構と思われた。我々が独自に作製した神経芽腫cDNAライブラリーから同定した神経芽腫関連依存性受容体として、NLRRファミリーとUNC5ファミリー受容体の解析を行った。その結果、以下のことが明らかになった。(1)NLRR1は、これまで既知の受容体シグナルのうち、EGFやIGFなど細胞の増殖を促進するシグナルを増強する機能があることが判明した。一方、分化誘導に関わる受容体シグナルについては、その効果は明らかでなかった。また、NLRR1はMYCNがん遺伝子産物の直接の転写ターゲットであることを明らかにした。NLRR3はNLRR1とは逆に、神経芽腫細胞の分化を誘導し、とくにレチノイン酸による分化誘導の際にはNLRR3が発現上昇し、MYCNが低下した。詳細な解析の結果、MYCNがMiz1を介してNLRR3の転写を直接抑制していることを明らかにした。(2)100例の神経芽腫検体を用いて定量的real-timeRT-PCRを行い、4つのUNC5/Unc5Hファミリー遺伝子の中で、UNC5D/UncsH4のみが神経芽腫の予後の良さと有意に相関していることを明らかにした。このことは、免疫組織化学により、腫瘍中の蛋白質発現についても証明された。一方、リガンドであるNetrin-1に関しては、臨床病期との相関がなく、予後とも無関係であった。また、UNC5Dがp53の直接の転写ターゲットであることを明らかにした。コロニー形成能試験からは、神経芽腫細胞においてはUNC5Dが機能する下流においてもp53が関与していることが示唆された。さらに、UNC5Dの細胞内領域がcaspaseによって切断され、細胞死シグナルを増強していることが明らかになった。UNC5Dノックアウトマウスの作製が成功し、機能的な解析を開始した。我々が作製した神経芽腫cDNAライブラリーから同定した新規ヒト依存性受容体であるNLRRファミリーとUNC5D(UNC5H4)について、解析を進めた。本年度の研究成果は以下のとおりである。(1)NLRR1によるEGFやIGFシグナルの増強効果による細胞増殖の促進には、細胞膜のリピッドラフトの機能が関わっていることが示唆された。また、EGFやIGFシグナルの増強によりMYCNの発現が転写レベルで誘導された。したがって、、MYCNがNLRR1を正に誘導することを考慮すると、MYCN-NLRR1-EGFR/IGFR-MYCNという細胞増殖を促進するポジティブフィードバック系が存在することが明らかになってきた。(2)UNC5Dの機能解析が進み、リガンドのNetrin-1が相対的に欠乏する状況においては、UNC5Dの細胞内ドメインが活性化されたcaspases 2,3,7によって切断され、遊離されたdeath domainを含む細胞内フラグメントが核に移行することが明らかになった。また、そのフラグメントは核内において転写を誘導し、複合体を形成する転写因子のひとつとしてE2F1が存在することを明らかにした。さらに興味深いことは、E2F1の転写ターゲット遺伝子のうち、pro-apoptotic genesのみが選択的に誘導されており、この転写複合体は何らかの機構で標的遺伝子の選択を行っていることが示唆された。一方、Unc5H4のノックアウトマウスを作製した。見かけ上は正常に見えたが、後根神経節細胞のストレスに体する反応性は高まっており、NGF欠乏によるアポトーシス誘導時には細胞が死にやすくなっていた。
ホスファチジルセリンの局在制御を介する新規細胞機能の解明

酸性リン脂質の一種であるホスファチジルセリン(PS)は細胞膜とリサイクリングエンドソーム膜に局在する。細胞膜のPSはアポトーシスや細胞内シグナル伝達に、リサイクリングエンドソーム膜のPSは細胞内逆行性輸送や細胞増殖の制御に関与する。一方で、PS合成酵素PSS1/2は、小胞体に局在することが知られており、そもそもどのようにPSが各オルガネラへ局在化し生理機能を発揮するのか、そのメカニズムや局在化の意義についてはいまだに不明な点が多い。この点を明らかにするため、Lenz-Majewski症候群という疾患に着目した。この疾患はPSS1のヘテロ顕性変異により発症することが報告され、皮膚弛緩、骨硬化、骨格形態異常、精神遅滞等の多様な症状を呈する。変異型PSS1では、産生物であるPSによる負のフィードバック制御がかからず、PS合成が過剰に亢進する。興味深いことに、変異型PSS1を細胞に過剰発現するとPSの小胞体への異常な局在が認められる。こうした背景から、PSの局在異常によってこの疾患が生じている可能性が考えられる。そこで、この変異型PSS1を用いて、PSの産生制御機構の破綻およびその局在制御と、生理現象との関連の解析を行った。まず培養細胞において変異型PSS1を安定発現させると、PSおよびPSから作られるホスファチジルエタノールアミン(PE)量が増加した。また細胞内オルガネラの観察から、ゴルジ体やミトコンドリアへの影響が認められた。次に患者の骨硬化の症状に着目し、生体内で骨を分解する主要な細胞である破骨細胞への影響を解析したところ、変異型PSS1の発現により、破骨細胞の分化異常が認められた。現在、変異型PSS1による脂質代謝異常と、破骨細胞の分化異常について、その分子メカニズムの解析を進めている。本研究課題「ホスファチジルセリンの局在制御を介する新規細胞機能の解明」について、PSが関わる現象としてより生体に近い現象に迫るため、本年度はPSS1のヘテロ顕性変異によって生じる疾患に着目して解析を行った。この変異型PSS1を発現すると、PSが過剰に産生される他、PSが小胞体に局在するという異常が見られる。これまでの研究で、こうしたPS動態の変化により、骨を分解する破骨細胞の分化が異常になることが明らかになった。また、破骨細胞の分化異常時に見られる表現型や変異型PSS1による脂質代謝変動の全体像も明らかになりつつある。これまでにLenz-Majewski症候群の発症メカニズムに迫る研究は全くないため、本研究結果は新奇のものであるとともに、骨代謝・リモデリングに重要な破骨細胞においてリン脂質による新たな分化制御機構を示唆するものである。これまでに、PS合成酵素PSS1のヘテロ顕性変異により、破骨細胞の分化が異常になることがわかった。また、培養細胞を用いた解析から、特定のリン脂質代謝経路が変動していることも見出している。今後、破骨細胞でも同様にリン脂質解析を進め、変化しているもののうち分化異常を引き起こす原因脂質の特定を目指す。原因脂質が同定されれば、なぜその脂質代謝がPSS1の変異により変動するのか、分子メカニズムを明らかにする。また、こうしたリン脂質代謝経路の変動が、結果的にPSの局在異常の原因となっている可能性も考え、解析を進める。細胞内ホスファチジルセリン(PS)の細胞内局在の制御機構の解明を目指し研究を行った。PSは生体膜を構成するリン脂質の1種だが、頭部に負電荷を持ち、タンパク質との相互作用を介して様々な生理現象に関与することが知られている。PSが細胞膜に豊富に存在することはよく知られているが、細胞内小胞輸送に関与するリサイクリングエンドソームと呼ばれるオルガネラにもPSが多く、小胞輸送や細胞増殖を制御することをこれまでに当研究室で見出していた。そこで私は、PSがどのようにリサイクリングエンドソームに局在化するか、そのメカニズムの解明を研究目的とした。当該年度は、PS量の変化を鋭敏に感知するPSプローブGFP-EHD1(delta EH)を用いることで、ステロール結合性タンパク質ORPファミリーのORP10が、PSのリサイクリングエンドソーム局在に関与することを見出した。その後の詳細な解析により、ORP10はゴルジ体に局在することを見出した。さらに、ゴルジ体のPI4PがORP10の局在を制御する可能性、さらにゴルジ体のPI4PがPSのリサイクリングエンドソーム局在を制御する可能性を示唆した。さらに、当研究室で作成した2種類のPSプローブを用いて、脂質輸送タンパク質ファミリーの発現抑制による影響を検証したところ、糖脂質代謝に関わるGLTPとCERTの発現抑制によって、PSがリサイクリングエンドソームからリソソームへ局在変化を示すことを見出した。また、リサイクリングエンドソームに局在するPSフリッパーゼATP8A1の翻訳後修飾による活性制御機構の解析を進めた。In vitroの実験結果から、リン酸化はATP8A1の活性に直接に影響せず、結合タンパク質を介して活性を制御する可能性が示された。PSのリサイクリングエンドソームへの局在化制御機構に関して、脂質輸送タンパク質ファミリーに着目した解析から、まずORP10がPSの局在化に関与する可能性を見出した。ORP10に関してはその局在を詳細に解析し、ゴルジ体局在であることを見出した。さらに、ORPファミリー以外の脂質輸送タンパク質のうち、糖脂質代謝に関与するGLTP、CERTがPSの局在に関与する可能性を見出した。

当初は、発現抑制によりPSプローブの膜局在が完全に消失するものを目的遺伝子として想定していたが、そのような遺伝子は得られなかった。その中で、GLTPやCERTの発現抑制によりPSプローブがリソソームへ局在変化する予想外の結果が得られた。また、リサイクリングエンドソームに局在するPSフリッパーゼATP8A1は、リサイクリングエンドソームの細胞質側脂質層にPSを濃縮することで小胞輸送を制御することをこれまでに当研究室で示している。そこで、ATP8A1が翻訳後修飾により活性制御を受ける可能性を考え、リン酸化に着目した解析を行った。データベースをもとに実際に解析した結果、Ser29がリン酸化されることがわかった。当初、Ser29Alaの変異体において、ATP8A1のATPase活性が低下したことから、リン酸化によりATP8A1の活性が亢進することが期待された。しかしながら、in vitroにおいてATP8A1をホスファターゼ処理によって脱リン酸化し、そののちにATPase活性を調べたところ、活性に差は見られなかった。このことから、ATP8A1のSer29のリン酸化は活性に直接影響せず、Ser29自体またはリン酸化を介した間接的な作用によってATPase活性を調節していることが示唆された。酸性リン脂質の一種であるホスファチジルセリン(PS)は細胞膜とリサイクリングエンドソーム膜に局在する。細胞膜のPSはアポトーシスや細胞内シグナル伝達に、リサイクリングエンドソーム膜のPSは細胞内逆行性輸送や細胞増殖の制御に関与する。一方で、PS合成酵素PSS1/2は、小胞体に局在することが知られており、そもそもどのようにPSが各オルガネラへ局在化し生理機能を発揮するのか、そのメカニズムや局在化の意義についてはいまだに不明な点が多い。この点を明らかにするため、Lenz-Majewski症候群という疾患に着目した。この疾患はPSS1のヘテロ顕性変異により発症することが報告され、皮膚弛緩、骨硬化、骨格形態異常、精神遅滞等の多様な症状を呈する。変異型PSS1では、産生物であるPSによる負のフィードバック制御がかからず、PS合成が過剰に亢進する。興味深いことに、変異型PSS1を細胞に過剰発現するとPSの小胞体への異常な局在が認められる。こうした背景から、PSの局在異常によってこの疾患が生じている可能性が考えられる。そこで、この変異型PSS1を用いて、PSの産生制御機構の破綻およびその局在制御と、生理現象との関連の解析を行った。まず培養細胞において変異型PSS1を安定発現させると、PSおよびPSから作られるホスファチジルエタノールアミン(PE)量が増加した。また細胞内オルガネラの観察から、ゴルジ体やミトコンドリアへの影響が認められた。次に患者の骨硬化の症状に着目し、生体内で骨を分解する主要な細胞である破骨細胞への影響を解析したところ、変異型PSS1の発現により、破骨細胞の分化異常が認められた。現在、変異型PSS1による脂質代謝異常と、破骨細胞の分化異常について、その分子メカニズムの解析を進めている。本研究課題
成熟社会における社会資本整備の方向性と制度改革

本研究は分担者に土木計画学のほか多分野の研究者を集め研究会を組織して研究を推進した。従来の社会資本整備のあり方が世論の批判を受ける中、その批判の論理を分析し、妥当性と矛盾点を検証して、成熟社会にふさわしい社会資本の評価と整備制度の改革方向の追究を主としてこの研究会とシンポジウムを通して推進した。また、新しい価値観と評価軸の探究および社会便益計測技法の拡張・開発に関する課題を各員が分担して設定し、それぞれの研究成果をとりまとめ発表している。本年度は研究初年度として研究代表者竹内より分担者各員に向けて研究目論見書により研究の主旨を周知徹底した上で、3回の研究会を開催した。初回の研究会では元朝日新聞論説委員渡辺斉氏より高速道路を中心とした野放図な大規模社会資本整備の批判論を聴き、各員の分担研究課題を提出、確認した。2・3回の研究会では、各員の研究内容について中間報告を行った。この中で、森川の「名古屋市における交通エコポイント社会実験」の報告は成熟社会の社会資本整備を誘導する新しい価値観の成立を示唆するものと考えられ、今後、評価システムの構築に進むことが期待される。また、富樫の「町並・みち環境整備とまちづくり」の話は、磯部の「里道の研究」と共に、生活空間整備の方策を模索する過程にある。一方、高木・三井・武藤はそれぞれ数理経済的手法によって社会資本整備の社会的効果を計測するためのモデル開発ないしは具体的事例の調査分析を進めている。さらに、竹内は高速道路等の社会資本整備とその制度について世上行われる批判的議論を整理し、体系的論理的議論の欠如等の問題点を指摘し、あるいは公共サービス供給と一体化した社会資本整備の必要性を訴える論説をいくつか執筆し発表した。加藤は竹内と共に、行政関係者との懇談の機会を通じて、本主題に対する行政側の認識の実態を探りつつある。また、これらの研究の中間的成果を行政を中心とする一般社会に公表し、討論することによって、研究の内容を深化させ、行政の具体的情報を収集するために、来る6月22日には公開シンポジウムの開催(名古屋都市センターと共催)を予定している。本研究主題は次の3つの側面から各員分担して研究が進められた。(1)成熟社会における社会資本整備の新たな評価視点・評価軸の考察・開発(2)従来の社会資本整備の社会便益計測技法の改善・拡張と応用(3)従事の社会資本整備事業制度と批判的総括と新たな制度論の構築各研究分担者はそれぞれの観点から研究を進めているが、これらの中間成果交流と行政担当者との意見交流を兼ねて、平成19年6月22日には、公開シンポジウム((財)名古屋都市センターと共催)を行なった。研究報告は富樫(水資源政策批判論)、森川(交通エコポイント論)、磯部(バリアフリー空間整備論)の3編であるが、その後の名古屋市行政経験者と交えてのパネルディスカッション「成熟社会の社会資本整備における新しい価値観と評価の方法」は各分担者にとって極めて効果的かつ刺激的であった。各分担者はこれを参考に、さらに研究を進めており、研究会による意見交流(討論)も数回行なわれている。また、同趣旨の第2回シンポジウムを平成20年5月8日に予定している。本研究主題は次の3つの側面から各連携研究者が分担して研究が進められた。(1)成熟社会における社会資本整備の新たな評価視点・評価軸の考察・開発(2)従来の社会資本整備の社会便益計測技法の改善・拡張と応用(3)従来の社会資本整備事業制度と批判的総括と新たな制度論の構築各連携研究者はそれぞれの観点から研究を進めているが、これらの中間成果交流と行政担当者との意見交流を兼ねて、平成20年5月8日に、公開シンポジウム(財)名古屋都市センターと共催)を行った。研究報告は上記(1)の観点から西村、(2)の観点から奥田、(3)の観点から加藤が行い、他の連携研究者と名古屋市行政担当者を交えて「「生活基盤」に重点をおいた社会資本整備の新たな評価軸を考える」をテーマに討議を行った。また、12月2日には本研究会の研究報告シンポジウムを市民公開で開催し、竹内が総括報告を「いま、どんな社会資本整備が必要なのか」と題して行った(この論旨は日刊建設産業新聞11月13日(木)付紙面に寄稿論文として掲載されている)。ほか、高木が上記(2)について、富樫、加藤が(1)について基調報告を行っている。ここでの討議(全員参加)をまとめ、さらに3年間の研究成果を総括して、230ページに及ぶ研究報告書を印刷公刊した。内容は3部に分かれており、第1部は全11名各員の研究成果とりまとめ、2部が上記シンポジウムの記録であり、第3部に3年間に各員が公表した論文・文章の複写を集成している。これは、関係各方面に送付するとともに各分担者の下において公開される。
旧植民地朝鮮農業に対する日本人の経済進出と地主経営に関する個別事例の実証的研究

研究費の多くを旅費に充て得たお蔭で、資料収集と聞き取りのための調査をほば計画通りの日数で行なうことができた。岡山県邑久郡牛窓町の西服部家の朝鮮関係文書についてはそれが質・量ともに第1級の史料であることを改めて認識した。今回の調査で新たに大正年間の一群の書簡類を発見することができたのは大きな収穫であった。この中には末知の在韓日本人からの不動産情報提供なども含まれており、これらの史料に基づけば、旧稿(大石編『近代日本における地主経営の展開』所収)を更に発展させることによって西服部家の朝鮮進出過程をより豊富な史実に即して再構成できると考えている。また昭和恐慌期の文書群からは貸金と土地集積との関連を示す史料を見出し得たので、植民地大地主としての発展過程を追究するための素地ができたと考えている。西服部家文書と関連して、在韓日本人関係者の方々を探し出し訪問して聞き取りを行なった。岡崎英爾(前島)・金中義雄(和気郡和気町)・岡崎勝男・石井仁治(岡山市)の諸氏である。いずれも朝鮮関係文書は残しておられないとのことであったが、在韓時代の体験を語ってもらい興味深いものであった(殊に石井氏は地主直営地を担当した農場管理人であり朝鮮農業にも詳しく、大変参考になったので、再び聞き取りを行ないたいと思っている)。ただし天久卓夫氏とは連絡はとれたもののお会いできず、石井くに(石井柳三郎の娘)さんには門前払いを受けた。目下、複写して収集した資料の整理と解読に追われているのが実情であり、その本格的な分析は次年(昭和62年)度に始めたい。なお、西服部家文書はあまりに膨大であるため、その閲覧と複写に与想以上の時間を費やすこととなり、溝手家については調査を断念せざるをえなくなった。西服部家文書についても、まだ閲覧と収集を重ねる必要があるので、溝手家文書とあわせて、次の機会を得て再調査を行ないたく強く念じている。
リソソーム障害に着目した慢性腎臓病における糸球体上皮細胞障害機構の解明

リソソーム障害モデルであるαガラクトシダーゼ欠損糸球体上皮細胞を用いて、TFEB過剰発現によるリソソーム生合成亢進のリソソーム障害に対する効果を検討した。その結果、TFEBの過剰発現は、αガラクトシダーゼ欠損糸球体上皮細胞におけるリソソーム障害によるαシヌクレイン発現を減少させなかった。今後は、活性型変異をもつTFEB産生細胞のCRISPR Cas9を用いた作成や、TFEB活性化薬の投与によるリソソーム活性化効果を検証することとする。TFEBの恒常的活性化および不活化変異をもつ培養糸球体上皮細胞を用いてTFEBの核内移行について検討した。簡便な細胞/核蛋白分離法を確立し、TFEB過剰発現細胞ではTFEBの核内移行が亢進することを確認した。さらに、恒常的活性化型TFEB過剰発現糸球体上皮細胞では、TFEBの核内移行が増加し、不活化型TFEB過剰発現細胞では、細胞質TFEB発現は増加するが、核内移行は低いことを確認した。高脂血症や高血圧モデルの疑似試薬による検討においては、飽和脂肪酸であるパルミチン酸の附置により、TFEBの発現および核内移行が増加すること明らかにした。さらに、恒常的活性化TFEB過剰発現細胞ではパルミチン酸附置によって誘導される細胞死を抑制すること、および恒常的不活性化TFEB過剰発現細胞では、細胞死の抑制を認めないことを明らかにした。以上のことから、TFEB活性化による細胞保護効果が明らかとなってきた。これまで、ヒト糸球体上皮細胞を用いて、ヒトTFEB過剰発現やヒトTFEBの点変異ベクターを用いた検討を行ってきた。今後マウスの検討を行ううえで、マウスTFEBによる細胞系を確立し、同様の結果が得られるかを検証する。本年度予定していた培養細胞を用いたTFEB活性化の効果についての可能性の評価を行うことができた。現在、既報のTFEB活性化薬による細胞保護作用について培養細胞および動物モデルを用いた検討を行っている。引き続き、糸球体上皮細胞におけるTFEB活性化/不活化によるリソソーム機能の変化が細胞に及ぼす影響を評価するとともに、遺伝子改変マウス並びに培養細胞を用いた検討を行う。
臨場感を伴う油圧ショベルの遠隔操作システムに関する研究

建設機械の遠隔操作は、建設・土木作業の効率化だけでなく、大深度地下の開発、災害地や危険地域での救援・復旧作業などで望まれている。しかし現在までデモンストレーションとしての事件が行われた程度で、幅広い実用化には至っていない。これは現在使用されているヒューマンインターフェース技術が、遠隔地での作業者に自然に十分な臨場感を与えるまでには完成されていないことが最大の理由であると考えられる。本研究では建設機械の遠隔操作を支援するためのキ-となる要素的ヒューマンインターフェース技術として次のような3つの技術の開発を行った。(1)運動視差を生成する遠隔立体視システム(2)動的な加速度を提示可能な電動モータ駆動パラレルメカニズム(3)パラレルメカニズムの駆動制御のための並列計算法人間は静的な両眼立体視だけでなく、頭部を動かすことによって生じる見え方の変化を利用して空間的認識能力を高めている。(1)ではこのような運動視差を生成する機構を遠隔操作システムに導入して、臨場感を高めるシステムを開発した。(2)では加速度感覚の提示装置として、電動ACモータ(1.3KW)を6個用いたパラレルメカニズム(最大積載荷重70kg、最大加速度2G、動作範囲0.5×0.5×0.3m^3)を開発した。運動学的には東京工業大学の船橋宏明教授のグループで最適設計された構造を採用したものである。パラレルメカニズムの加速度を精密に制御するためにはその動力学を実時間で計算し、考慮することが必要になる。(3)ではパラレルメカニズムを閉ループ制御系によって加速度制御する場合の計算とその並列処理による高速化法を開発した。1.遠隔操作型油圧ショベルのシステム構成本研究では遠隔操作型油圧ショベルを研究室レベルで研究するためにスレーブ側となる油圧ショベルにはコンピュータシミュレーションを用い、姿勢、振動、その他の情報を仮想的に得ることとした。そしてその情報をいかに人間にうまく伝えるための幾つかの臨場感伝達装置を開発、研究を。2.油圧ショベルのシミュレーション実際の油圧ショベルを対象とし、三関節と姿勢変化についてのシミュレーションを行なった。三関節に関するモデリングでは油の圧縮率、外力の影響を考慮した。またそのシミュレーション結果に従ってリアルタイムで1/10模型を駆動することで、油圧ショベルシミュレータを構築して操作性の評価実験などを容易に行なうことが可能となった。そしてその模型に小型CCDカメラを搭載することで遠隔操作型油圧ショベル用の三次元の画像情報を得ることを可能にした。3.臨場感伝達装置の開発まず視覚情報を伝達する手段としてプロジェクタビデオによる立体視を用いた。それによって広い視界と奥行きのある視覚情報が得られるようになった。一方姿勢、振動を伝達する装置であるが、研究段階ではなるべく高い振動数と大きい姿勢変化を操作者に伝達したい。そこで必要な振動数、姿勢変化の値を考慮して新しいACモータ駆動の6自由度体感発生装置を計画し、それに基づき来年度に発注製作を行なう準備を進めた。平成7年度の本研究の成果は以下のようにまとめられる。(1)高精度体感加速度発生用6自由度電動パラレルメカニズムの開発関節構造をもつ6本の脚からなるパラレルメカニズムを設計・試作した。慣性負荷70kg、最大加速度2Gを仕様としている。基礎的なPID制御系をPCをもちいて制御周波数700Hzで実現し、約6Hzまでの運動に良好な追従性を示すこと、2Gの加速度を出すことなどを実験的に確認した。(2)6自由度パラレルメカニズムの加速度を制御するための動的制御法とその並列計算アルゴリズムを開発6自由度のパラレルメカニズムの逆動力学、運転学を一般的に記述したままで高速計算に適したフィードバック制御アルゴリズムを開発した。このアルゴリズムでは各脚の運動学、逆動力学の計算に並列性が見られる。これを利用して並列計算によって制御を行う場合の計算量の評価を行った。

また高速実時間計算機とPCを並列的に用いて計算するアルゴリズムを実装、評価しこのままで約350Hzの制御周波数が実現できることを確認した。(3)液晶プロジェクタを用いた偏光式両眼立体視スクリーンと運動視差を実現する機構からなる遠隔臨場感発生システムを開発液晶プロジェクタ2台と偏光眼鏡をもちいてスクリーン上に立体視するシステムを開発した。さらに、その上に、操作者が頭を左右に動かす動さをセンサーで検出し、それに応じて遠隔カメラを運動させ運動視差を提示する機能を組み込んだ。運動視差を自然に提示するための光学的設計、遠隔カメラの運動機構の設計に新たな知見を得た。
初期胚パターン形成のプリミティブモデルの開発と応用

動物の初期発生において胚形態やサイズが各種の発生様式の決定に与える影響を明らかにするため、下等脊椎動物の典型的な発生様式に対応するモデルを提案し、関連する実験系を開発して提示した。胞胚期の中胚葉形成に与える細胞密度が関連すること、原腸胚期以後の正常な胴尾部形成には一定の卵黄サイズが必要であること、さらに器官形成期の体節数決定に胚サイズが影響することが示唆され、巨視的な胚空間の役割が生物学的に意義付けられた。胞胚原腸胚期のパターン形成の問題として三胚葉形成に注目した。両生類胚の予定中胚葉は胞胚の中緯度域にあり、この特異化機構には胚誘導と細胞自律性の二つの考え方がある。胚誘導は、動物極側組織と植物極側組織の外植体の接着(Nieuwkoop結合体)から生じうる異所的な中胚葉性組織を根拠としている。細胞自律性は、予定中胚葉域の外植体や関連する細胞質因子の局在から説明されている。これまで研究代表者らは、ある一次元的な反応拡散型のモデルが正常胚と二つの実験群の中胚葉形成を表現できることを示してきた。このモデルの拡散項は空間的に均一だが、反応項は動植物極軸に沿った細胞密度を反映した連続的な勾配をもつ。ただしこのモデルは、中胚葉形成するまでの挙動が初期値により不安定で、特に動物極付近は摂動に弱い印象があった。線形解析により反応項の定性的性質を調べたところ、正常胚モデルは解の振舞いの異なる三つの領域をもち、そのうち中緯度域は鞍点型の、また動物極側は結節型の不安定性を持つことが確認された。中緯度域の不安定性は細胞自律的な中胚葉形成に、また動物極側の不安定性はNieuwkoop結合体の胚誘導に対する反応能に寄与すると思われた。胚誘導と細胞自律性という二つの冗長なメカニズムが、ひとつの連続的な勾配から導き出される点が興味深い。一方、モデルに見られた動物極側の摂動に対する弱さもまた不安定性の帰結として理解できるが、実証的な観点からするとこの不安定性の問題はモデルの弱点である。しかし実際の胞胚が二次元球面に近い形状であることを考慮すると、動物極付近の面積は赤道域に比べ相対的に狭いため過度の不安定性は抑制され、不自然な挙動を解決できる可能性がある。そのため動物極付近の性質は個々のモデルの価値を評価するうえで重要と考えられる。これらの知見をふまえ現在、二次元モデルの準備を継続中である。胞胚期から原腸胚期にかけての胚サイズの形態とサイズが三胚葉の分化に果たす役割を検証する過程で,各胚葉内のパターン形成に関連深い現象を見いだすことができた。下等脊椎動物の胞胚は多くの場合球形に近く,各胚葉の予定原基の相対的な位置関係も似通っている。材料に用いたゼブラダニオは特に細胞の大きさが均一であること,植物極側の大きな卵黄細胞が実質的に胞胚の形状を支配しており,また予定中・内胚葉領域の赤道部境界としても役立っている。卵黄細胞は受精直後から胞胚期にかけて微細なガラス針で一部を非破壊的に取除くことができるが,胞胚期に直径の約3割以上を取除かれた胚は,後の胴尾部の形態形成に異常が生じることぶ明らかとなった。異常胚の胴尾部は本来直線的に伸長すべきところを背側こ反り返った形態となるが,この種の表現型は後期の背腹パターンの異常に起因する可能性溝高い。興味深いことに,卵黄細胞の一部を除去した胚は他の卵黄細胞の再移植(細胞融合)によって卵黄サイズを回復させると容易に救出できることが分かった。移植する卵黄細胞の由来や時期に特に制約は見られない。そのため胞胚期の卵黄細胞と胴尾部形成との関係は,初期卵割期に見られるような特異な細胞質因子による発生学的決定ではなく,物理的な空間サイズによる調節現象と予測するのが理に適っている。現在この仮説の正当性を確認するため,卵黄の栄養的要求などが関与している可能性を排除する実験系を検討している。今後の展開として,同様の手法で胞胚を大型化した場合に逆のタイプの腸尾部異常が生じるか,また原腸形成の過程を詳述し背腹パターンの形成とどのように関係しているかを明らかにする必要がある。さらに初年度の三胚葉形成と合わせて,胞胚表面での簡単なパターン形成モデルとして一貫した解釈を示せるか,それとも細胞運動の要素も考慮すべきか検討したいと考えている。動物の形態形成に対する胚サイズの意義を明らかにするため、胞胚のサイズ変更に伴う原腸形成期前後の形態形成変異の継時的な観察、胚サイズの復元ないし大型化の試み、また原腸胚期以後のその他の形質との関連についてゼブラフィッシュを用い検討した。胞胚か照直径約2030%(体積比で約5065%)分を超える卵黄細胞を取除くと、背中側へ変形した胴尾部が生じることをすでに昨年度確かめた。