hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管特異的ノックアウトマウスを用いた血管及びリンパ管発生におけるSTAT3の役割

(1)Tie2-Cre STAT3^<-/->は出生するものの、出生3週後以降、成長はTie2-Cre STAT3^<+/->に比べて抑制されることが見出された。すなわち、Tie2-Cre STAT3^<-/->は個体として小さいことが明らかとなった。従って、平成19年度はTie2-Cre STAT3^<-/->における成長抑制因子を評価し、詳細に検討する予定である。特に、四肢末梢の皮膚が蒼白であることから、脈管築異常に起因する循環障害や造血系障害の可能性を考え、STAT3破壊による組織機構の病態を明らかにし、生体におけるSTAT3の組織特異的役割の解明を試みた。造血器の評価:末梢血における血球及び骨髄の組織学的検討を行った。(2)培養ヒト皮膚由来リンパ管内皮細胞におけるSTAT3による細胞制御機構の解明VEGFファミリーによる細胞遊走能:「VEGFファミリーによる細胞遊走及び管腔形成能がSTAT3を介する。」この仮説を立証するため、Boyden chamberを用いた走化性試験を行った。VEGF-Aによるリン酸化STAT3の核内移行を、STAT3抑制作用を持つdominant negativeSTAT3を発現するアデノウイルスベクター(Dn STAT3 Adex)を用いて検討した。さらに、VEGF-A受容体に対する中和抗体を用いて、STAT3の核内移行の抑制を検討した。管腔形成に関しては、VEGF-A存在下Matrigelを用いてリンパ管内皮細胞の管腔形成を評価し、Dn STAT3 AdexまたVEGF-A受容体に対する中和抗体を用いて管腔形成の抑制効果を検討した。本年度は、Cre-loxPシステムを用いた血管特異的STAT3コンディショナル・ノックアウトマウスの作製を行った。Tie2プロモーターは、マウス胎生期8.5日で活性化し、血管特異的に発現する。このステージ以後、循環系の形態発生は著しく変化する。すなわち、血管網の再構築<リモデリング>が起き、さらに血管からはリンパ管が発生する。従って、血管を制御する遺伝子の働きを検討する上で、Tie2プロモーターを用いる遺伝子操作は極めて合目的である。今回、Cre-loxPシステムを用いたTie2プロモーターによる血管特異的コンディショナルノックアウトマウスの作製に着手した。これは、Tie2プロモーターにより発現したCre-recombinase活性により、あらかじめloxP siteを挿入したSTAT3を、DNAレベルで破壊,除去するものである。Tie2-Cre STAT3^<-/->及びTie2-Cre STAT3^<+/->を得るために、二世代にわたる交配を施行した。Tie2-Creマウスは大阪大学高倉伸幸博士から、またloxP-flanked STAT3マウス(STAT3^<flox/+>)は大阪大学審良静男博士から供与されたものである。交配の結果、メンデルの法則に従ってTie2-Cre STAT3^<-/->は出生することが明らかとなった。しかしながら、出生3週後よりTie2-Cre STAT^<3-/->の成長はTie2-Cre STAT^<3+/->に比べて抑制されることが見出された。従って、平成19年度はTie2-Cre STAT^<3-/->における成長抑制因子を評価し、詳細に検討する予定である。特に、四肢末梢の皮膚が蒼白であることから、リンパ管を含めた脈管構築異常に起因する循環障害や造血系障害の可能性を考え、STAT3破壊による組織制御機構の病態を明らかにし、生体におけるSTAT3の組織特異的役割の解明を目指す。
iPS細胞技術及び患者リソースを用いた精神疾患の分子とヒト病態を結ぶ多階層解析

本研究では、病態に直結すると期待されるCNV変異やde novo変異等を持つ患者iPS神経細胞を用いた細胞生物学的手法や電気生理学的手法による神経機能解析、及びトランスオミクス解析などの分子神経科学的手法による解析やヒトと同じ変異を導入したマウスを駆使し、患者iPS神経細胞の機能異常、及びその原因となる分子基盤を明らかにする。さらに、臨床情報を保持する患者バイオリソースを用いて、明らかにした精神疾患の発症機構や分子基盤の妥当性を検証し、当該分子基盤と精神疾患の発症、及び患者に共通してみられる認知機能障害や社会機能異常との因果関係にせまる。
都市環境シミュレーターを用いた住民参加型都市計画手法の教育・実践プログラム開発

本研究は、まちづくりの新しい目標とする市街地像を住民と地権者、そして専門家や行政が共有し、合意を形成するための科学的な方法論を市街地環境形成シミュレーションシステムを用いて開発し、都市環境シミュレーターを用いた住民参加型都市計画手法に関する教育・実践プログラムを提示した。研究期間内の本研究の研究内容と成果は以下の通りである。(1)都市環境シミュレーションシステムの充実都市景観模型と可動小型CCDカメラによる景観シミュレーション映像の評価特性の把握と景観イメージの合意形成手法の有効性を検証し、都市環境をシミュレーションするシステムを構築した。さらに、都市景観模型より簡易なツールを開発し、映像を媒体とした対話型シミュレーション手法を構築した。(2)デザインゲームの開発と応用一般住民が模型と小型CCDカメラによる映像を通して環境を視覚的に認識することにより、生活像をイメージしながら具体的空間像を作成する「建替えデザインゲーム」を開発した。そして、開発したデザインゲームが地区レベルでの空間像について具体的かつ効果的に議論するために有用であることを検証した。さらに、デザインゲームで議論されたイメージやアイデアが具体的な計画やガイドラインへ展開する可能性を有することを検証した。(3)都市計画実験プログラムの開発現行の都市計画規制のもとで想定されるまちづくりの過程と都市環境の形成過程をシミュレートし、その評価をもとに新たなまちの将来像の提案を行う都市計画実験プログラムを開発した。さらに、まちの将来像の提案を行う際に本システムを用いた環境シミュレーションによる評価を取り入れることで、より客観的な評価と具体的な提案を可能にすることを確認した。また、遠隔地間でテレビ電話、インターネットを併用した都市計画教育プログラムを実践した。本年度の成果は以下の3点である。(1)都市環境シミュレーション・システムの充実まず、都市景観模型と可動小型CCDカメラによる景観シミュレーション映像の評価特性の把握と景観イメージの合意形成手法の有効性の検証を行った。つぎに、日照・通風シミュレーションシステムの開発と環境条件のプロトタイプ化をすすめ、建築の建替えによって街並み景観や日照・通風が変化することが予測されるケースを取り上げて、新しい建築の必要機能を満たす条件のもとで、高さ(階数)、容積(ブロック)、壁面線(ブロック)の3点をパラメーターとして建て替え後の都市環境をシミュレーションするシステムを構築した。(2)デザインゲームの開発成立基盤条件の異なる地区(城下町基盤、宿場町基盤、農村基盤はか)を事例とし、建替えの単位をアーキタイプとして類型化し、これをもとに、オペレータが都市環境シミュレーター上で、既成市街における建て替えやまちづくりの進行過程をシミュレーションするデザインゲームを開発した。この結果、建て替えの進行手順をモデル化し、まちづくりの最適プロセスを求めることが可能となった。(3)都市計画実験プログラムの開発まちづくりの過程と環境形成を同時にシミュレーションすることが可能なこのシステムの特徴を活かし、都市計画職能教育への応用をめざして教育プログラムの開発を行った。本年度の研究成果は以下の3点である。(1)映像を媒体とするコミュニケーションツールの開発(対話型シミュレーションの充実)まず、江戸時代より伝わる「起こし絵図」に着想を得て、昨年報告した都市景観模型より簡易なツールとして「街並み起こし絵図」を開発した。次に、街並み起こし絵図と小型CCDカメラによる景観シミュレーション映像の評価特性の把握と、映像を媒体とするコミュニケーションツールとしての有用性の検証を行った。さらに、街並み起こし絵図を用いたワークショップを実施し、映像を媒体とした対話型シミュレーション手法を構築した。(2)視覚的認識によるデザインゲームの開発(デザインゲームの開発)旧街道沿いの町をケーススタディとして、一般住民が模型と小型CCDカメラによる映像を通して環境を視覚的に認識することにより、生活像をイメージしながら具体的空間像を作成する「建替えデザインゲーム」の開発を行った。その結果、「建替えデザインゲーム」は地区レベルでの合意形成手法として(1)建替えのシミュレート、(2)目標空間像の設定、に関して具体的かつ効果的に討議することができることを検証した。

(3)都市計画実験プログラムの開発都市計画職能教育への本システムの応用を目指して昨年開発した教育プログラムの改良を行った。具体的には現行の都市計画規制のもとで想定されるまちづくりの過程と都市環境の形成過程をシミュレートし、その評価をもとに新たなまちの将来像の提案を行う都市計画実験プログラムを開発した。本年度の研究成果は以下の4点である。(1)建替えデザインゲームのまちづくりへの応用前年度開発したデザインゲームを用いて市民参加によるワークショップを行い、街区将来像について合意形成を図った。さらに、参加者が作成した将来像の個々の形態的、機能的特徴を「空間ボキャブラリー」としてまとめることで、住民が描いたイメージに基づく街区レベルのデザインガイドラインへと発展する可能性を持つことを検証した。(2)デザインゲームによる空間イメージ編集プロセスの解明(1)で実際に行ったデザインゲームの結果と参加者を分析し、空間イメージの編集プロセスを解明した。その結果、参加者の関心領域を背景とした個々のアイデアの連関関係がゲームを通じて空間イメージへの編集されていくことを検証した。さらに、これらのイメージやアイデアを活用することにより具体的な計画やガイドラインへ活用しうることを考察した。(3)遠隔地シミュレーションによる都市計画教育プログラムの実施早稲田大学西早稲田キャンパス、理工学部キャンパス、名古屋大学の3箇所間でテレビ電話、インターネットを併用した都市計画教育プログラムを実践した。具体的には学生各自が事前にフィールド調査を行い、結果、考察および提案をWeb上で公開するとともに、テレビ電話を使った遠隔地シミュレーションと議論を行った。(4)都市計画演習プログラムの実施都市計画職能教育への本システムの応用を目指して前年度改良した教育プログラムを精査し、設計実習へ応用した。その結果、現行の都市計画規制に沿った都市環境の形成過程をシミュレートするだけでなく、新たなまちの将来像の提案を行う際も本システムを用いた環境シミュレーションによる評価を取り入れることで、より客観的な評価と具体的な提案を可能にすることを確認した。
タイとミャンマーにおける仏教の制度化とモン派仏教僧団の変遷

平成27年度の最大の成果は研究内容を学会や研究会で発表し投稿論文として形にすることが出来たことである。これまで本研究の目的である少数民族モンの仏教僧団の変遷について調べてきた。なかでも1980年代以降のミャンマーでは国家僧伽機構の新設と同時に、国の教学試験でもビルマ化の動きが見られるなか、モン僧伽はこれに抵抗する形で独自の試験を定期開催して民族的なまとまりを強化してきたことが分かった。平成27年12月には東南アジア学会でこの内容について発表し、また同様の内容をまとめて当学会の学会誌に論文を投稿した。当論文は査読を通過している。さらに同じく1980年代以降のミャンマーでは、モンの在家児童への母語の読み書きを教える夏期講習運動をモン僧が先導し、地域をまたいだ統一試験という形で発展させてきたことが分かった。近年は他地域に先駆けたモン州での公教育における少数言語教育の開始や、モン反政府武装勢力による国家との共存を目指したバイリンガル教育などへの注目が高まっているが、仏教僧の役割は十分に評価されてこなかった。この点、モン語教育にとっても重要な僧伽の動向を明らかに出来たのは意義がある。夏期講習を含めたモン語教育については平成27年4月のビルマ研究会にて発表した。またタイとミャンマーに関するモン語教育とモン僧伽の変遷をまとめたブックレットを執筆中であり今年中に出版予定である。さらに19世紀末から20世紀初頭のタイとミャンマーにおけるモン僧伽の動向について資料の整理や収集を行った。タイ語のマイクロフィルム資料は電子化を外注してパソコンで閲覧可能な状態にした。平成28年1月には英領植民地期のミャンマーにおける仏教教学の内容が収録された教育関連資料を米国の図書館で収集することが出来た。また同年2月にはタイで現地調査を行い、モン僧伽独自の仏教儀礼やモン語教育の新動向について把握することが出来た。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度の成果として、まずミャンマーにおける少数民族モンの僧団がいかに集団としてのまとまりを形成してきたのか、とくに1980年代以降の経緯の詳細を明らかにすることができた。ミャンマーでは、仏教史書などを通して、モン系とされるラーマンニャ王国が上座部仏教の伝来や確立において古くから重要な役割を果たしたと認識されてきた。そのため、モンは少数民族にも関わらず、歴史や文明をもった先住の人々という印象を現在でも与えられている。一方、近代以降におけるモン僧団については研究が少なく、とくに近年の動向については先行研究が皆無である。そこで、これまでの現地調査と資料収集によって得られた結果を整理し、それを踏まえてフィールドで補足調査を行った。その結果、ミャンマーにおけるモンの仏教僧団が3派存在すること、そして、19世紀末にタイのモン僧から輸入され現在はミャンマー政府から公認を受けているダンマユッティ派の成員は実は少数に留まり、大部分のモン僧はラーマンニャ派という非公認の集団を形成していることが明らかになった。この多数派ラーマンニャ派が具体的な集団として凝集性を高めた背景には、ミャンマー政府実施の仏教試験において、英領期以降これまでモン語による受験が少数言語の中で唯一認められてきたこと、そして1980年代、政府仏教試験にミャンマー語能力試験が義務付けられたことを受け、反発したモン僧たちが政府試験をボイコットし、ラーマンニャ派として独自の民間仏教試験への参加という形でまとまりを形成したことが重要である。一方、戒律に厳しい他のモン僧団2派は、このボイコットに加わらず、ラーマンニャ派試験にも参加しないまま、2派それぞれに民間仏教試験を実施するようになり、各自集団として凝集性を高めた。この経緯は、おそらく3派間の対立を背景として、当事者自身による全体像を把握できるような文献すら記されて来なかった。

平成28年1月には英領植民地期のミャンマーにおける仏教教学の内容が収録された教育関連資料を米国の図書館で収集することが出来た。また同年2月にはタイで現地調査を行い、モン僧伽独自の仏教儀礼やモン語教育の新動向について把握することが出来た。モン派僧団の変遷については先行研究が少ないため、タイとミャンマーの2国における仏教の制度化と関連付けながら、まずは19世紀末の近代化から現在までのおよそ1世紀における変化について大まかに把握する必要があった。具体的には、現地調査と文献収集によって得られた資料の整理と、補足のフィールド調査を実施し、その結果、両国におけるモン派僧団の変遷にとって重要となる制度化や事件を把握することができた。とくに近年の状況について新たな事実を確認したことが最大の成果といえる。すなわち、ミャンマーについては1980年代以降におけるモン派の集団化の過程を把握できた。また、タイに関しては20世紀初頭以降、制度的に存在しないはずであったモン派僧団の一部が小規模ながらネットワークを有し、2000年代になって初めて正式な組織としてタイ国サンガから認知されなくなったことを確認することができた。これらの成果は、12月13日に開催された東南アジア学会関西例会にて発表し、今後の発展に向けて有意義な助言を受けた。また、その後、現地に補足調査に行くことで、新しい資料を入手することができた。以上が当初の予定通り達成することのできた成果である。一方、反省点として、平成26年度中に査読付き論文という形にまとめられなかったことを第一に挙げなければならない。まずはモン派僧団に関する近年の動態について論文として発表するため、投稿に向けての準備を引き続き進める必要がある。第二に、対象とする地域と時間を広く設定したため、タイおよびミャンマーともに、19世紀末から20世紀初頭における近代化の転換期が重要であることが把握できた一方、この時代に関する具体的な研究を進めることが出来なかった。これは平成27年度の課題としたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず、これまでに把握した、モン派変遷の全体像と、1980年代以降のミャンマーにおけるモン僧の集団化過程について論文としてまとめることを優先する。それに向けて、東南アジア関西例会発表後に入手した未読の資料を含め、論文執筆に向け、改めて資料やフィールドノーツの整理を行う。続いて、タイおよびミャンマーともに、19世紀末から20世紀初頭における近代化の過程が、モン派僧団に与えた影響について文献資料を基に明らかにする必要がある。すなわち、タイでは、この時期、マハー派、タマユット派、そしてモン派の3派が認識され、統治者にとってもモン派は重要視されていたと考えられる証拠があるにも関わらず、モン派のみ公認されず、モン式誦経が中止されるに至った。このことについては2点の先行文献において言及されているものの、記述はそれ程厚くなく、使用する資料も異なっている。そのため、改めて、タイ公文書館の資料や、当時サンガで大きな影響力を有した王族ワチラヤーン比丘の著作を基に、統治者の視点に注目しながら、モン派統合過程の詳細に関する再構成を試みる。また、マイクロフィルムの公文書館
ヒト子宮頚部腺癌の多段階発癌機構解析に基づく診断治療法の開発

子宮頚癌のなかでも稀少な頚部腺癌の臨床材料が比較的入手しやすい本施設の特色を生かし、本腫瘍の新鮮材料をもとにして、細胞遺伝学的手法により発がん過程を解析して、子宮頚部腺癌の本態解明と分子遺伝学的診断および予防治療に応用することを目的とした。臨床材料を収集し、一部は細胞培養に供し新規の頚部腺癌細胞株の樹立を目指した。この結果、頚部腺癌の特殊型(亜型)と考えられているスリガラス細胞癌より、継代可能な培養細胞を得ることに成功し、現在その特性を解析中である。抽出した正常部および腫瘍ゲノムDNAについては、以下の各項の検索を実施した。遺伝的不安定性の有無の検索は、任意の染色体から任意に5つのmicrosatellite markerを選択し、PCR産物の泳動パターンから遺伝的不安定性を判定した。頚部腺癌の遺伝的不安定性は、報告されている子宮体部癌にみられる遺伝的不安定性の頻度よりは低いことが示唆された。遺伝的不安定性の発癌過程における標的遺伝子であるTGF-βType II Receptor遺伝子、SMAD遺伝子、BAX遺伝子、転写因子E2Fの変異の解析を継続している。がん抑制遺伝子として注目されているPTEN遺伝子の変異の有無を、全エクソンのSSCPとダイレクトシークエンスによって解析した。今回解析結果が判明した頚部腺癌症例では、明瞭な変異は検出されなかった。全ゲノム領域の欠失と増幅の解析に威力を発揮するComparative Genomic Hybridization法(CGH法)を、蓄積した頚部腺癌症例に実施中である。全症例に共通の遺伝子コピー数の増減について検討した。子宮頚癌はヒト婦人科腫瘍の中でも多数を占める癌腫であり、進行癌ではしばしば致命的となる。本研究が対象とする子宮頚部腺癌は、ヒト子宮頚癌の大多数を占める扁平上皮癌と較べ、初期での発見が細胞診等では難しく、発見が遅れる傾向にある。また、臨床的に同等の進行度で発見されても扁平上皮癌に較べ予後が著しく悪いため生物学的悪性度が高いと考えられる。本研究は、子宮頚癌のなかでも稀少な頚部腺癌の臨床材料が比較的入手しやすい本施設の特色を生かし、本腫瘍の新鮮材料をもとにして、細胞遺伝学的手法により発がん過程を解析して、子宮頚部腺癌の本態解明と分子遺伝学的診断および予防治療に応用することを目的とする。今回収集した新鮮な臨床材料のうち、一部は細胞培養に供し、新規の頚部腺癌細胞株の樹立を目指している。残りは凍結し-80度C保存とし、必要時にDNAを抽出した。遺伝的不安定性の有無を、任意の染色体から任意に5つのmicrosatellite markerを選択し、PCR産物の泳動パターンから遺伝的不安定性を判定した。遺伝的不安定性の発癌過程における標的遺伝子と考えられるTGF-βType II Receptor遺伝子、SMAD遺伝子、BAX遺伝子、転写因子E2F等の変異分析を実施している。がん抑制遺伝子として注目されているPTEN遺伝子は、子宮体癌を含む他領域での変異分析では全エクソンにわたる種々の変異が報告されている。集積した頚部腺癌において、PTEN遺伝子各エクソンのSSCPを実施し、変異の推定されるエクソンについてダイレクトシークエンスをして全症例で変異の有無を検討している。また全症例で、全染色体の解析に威力を発揮するComparative Genomic Hybridization法(CGH法)を実施している。本研究は、子宮頚癌のなかでも稀少な頚部腺癌の臨床材料が比較的入手しやすい本施設の特色を生かし、本腫瘍の新鮮材料をもとにして、細胞遺伝学的手法により発がん過程を解析して、子宮頚部腺癌の本態解明と分子遺伝学的診断および予防治療に応用することを目的とした。臨床材料の収集を継続し、一部は細胞培養に供し新規の頚部腺癌細胞株の樹立を目指した。

この結果、頚部腺癌の特殊型(亜型)と考えられているスリガラス細胞癌より、継代可能な培養細胞を得ることに成功し、現在その特性を解析中である。抽出した正常部および腫瘍ゲノムDNAにっいては、以下の各項の検索を実施した。遺伝的不安定性の有無の検索は、任意の染色体から任意に5つのmicrosatellite markerを選択し、PCR産物の泳動パターンから遺伝的不安定性を判定した。頚部腺癌の遺伝的不安定性は、報告されている子宮体部癌にみられる遺伝的不安定性の頻度よりは低いことが示唆された。遺伝的不安定性の発癌過程における標的遺伝子であるTGF-βType II Receptor遺伝子、SMAD遺伝子、BAX遺伝子、転写因子E2Fの変異は、現在解析中である。がん抑制遺伝子として注目されでいるPTEN遺伝子め変異の有無を、全エクソンのSSCPとダイレクトシークエンスによって解析した。子宮体癌を含む他領域の腺癌では、高頻度に種々の変異が報告されている。今回解析結果が判明した頚部腺癌10症例では、明瞭な変異の存在はない。PTEN遺伝子の変異分析をさらに継続する必要がある。全ゲノム領域の欠失と増幅の解析に威力を発揮するComparative Genomic Hybridization法(CGH法)を、蓄積した頚部腺癌症例に実施中であるが、まだまとまった解析結果に至っていない。
ヒゲクジラ類の進化における多様化と懸隔化の速度と様式

南半球のみに分布が知られるコセミクジラと北半球の後期中新世(およそ1000500万年前)から化石種として知られるケトテリウム類の顎関節部分を機能形態学的に詳細に検討したところ,両者に共通の形態の特殊化が認められ,絶滅したケトテリウム類も吸引食(suction feeding)であったことが示唆されたことから,彼らがその祖先において同様の食性を有していたことが推定された.このことは,両系統群が祖先を共有していた可能性を論じたMarx and Fordyce (2015)の見解とも矛盾しない.なお,これら標本の比較検討の過程で,オランダ・ロッテルダム自然博物館が所蔵する上部中新統産髭鯨類頭蓋化石をケトテリウム類の新種として記載した(Marx et al., 2016).さらに,日本産の原始的な髭鯨類を記載する過程で,北米ワシントン州の下部漸新統(3200万年前)産の原始的な髭鯨類の頭蓋形態を比較研究し,これも新種として記載した(Marx et al., 2015).髭鯨類は,最初の化石記録が南極の3400万年前から知られているが,それ以降は北半球の2800万年前まで確実な化石が欠如していたことから,本新種は髭鯨類の時代的・地理的な空白を大幅に埋めることとなった.日本産の髭鯨類化石に関しては,宮崎県総合博物館が所蔵する鯨類の上腕骨化石を詳細に記載すると共に,他の標本と数量形態学的な比較を行なった結果,これが歯鯨類と髭鯨類の分化直後の原始的な形態を残す新鯨類のものであることが明らかとなった(森ほか, 2015).これについては,2015年6月に開催された日本古生物学会2015年年会にて発表すると共に,現在同一著者により記載論文を投稿中である.また,2016年3月にはWiley&Blackwell社から鯨類進化に関する総説「Cetacean Paleobiology」を出版した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。ヒゲクジラ類の系統進化過程における多様化の速度と様式を明らかにするため,今年度中に記載された2属2種(Balaenoptera bertae, Herpetocetus morrowi)をも含む鬚鯨類90種について, 273の形態形質と共に37,646の塩基配列データを用いて,コンピューターソフトウェアTNTとMrBayesを用いて最節約法とベイズ法により分岐パターンの解析を行なった.また,日本産ヒゲクジラ類化石の既知種および未記載標本が保管されている群馬県立自然史博館および大阪市立自然史博物館に赴いて,ヒゲクジラ類の骨格および頭蓋化石について形態観察を行ない,未記載種(沖縄県宮古島産)については標本の記載と写真撮影,予備的な系統解析を実施した.また,標本の頭蓋内部に保存されていた耳周骨の形態と構造を明らかにするため,国立科学博物館にてマイクロCT撮影を行なった.これらの系統研究と並行して,南半球に孤立して分布するコセミクジラの系統関係を推定するにあたって化石コラーゲンを用いた方法を導入すべく,現在までに現生種3属3種と化石種1属1種のコラーゲン分析を始めている.なお,日本産化石鬚鯨類を含めて行なった系統解析で得られた予察的成果については, 2012年12月にニュージーランドで開催された国際会議「Biennial Conference of the Society for Marine Mammalogy」において講演すると共に,研究分担者が世話人のひとりを務めた同会議ワークショップ「Structural-functional shifts in marine mammals presentand past」でも講演を行なった.また,兵庫県で開催された第163回日本古生物学会例会においても,ヒゲクジラ類の日本における研究の重要性についてを指摘する講演を行なった.ヒゲクジラ類の系統進化過程における多様化の速度と様式を明らかにするため,これまでに記載のなされた現生種と化石種90種について,273の形態形質と共に37,646の塩基配列データを用いて,コンピューターソフトウェアTNTとMrBayesを用いて最節約法とベイズ法により分岐パターンの解析を行なった結果を公表した(Marx and Fordyce, 2015).この研究の結果,ヒゲクジラ類はおよそ3800万年前頃に分化したことが推定され,さらに3600-3000万年前に初期の多様化が起こり,3000-2300万年前ごろに濾し取り型の食性を進化させたことが推定された.また,1000万年前以降に体躯の懸隔化と巨大化が顕著となり,300万年前以降になると古環境変動に伴う形態進化は認められなくなることも明らかとなった.日本産ヒゲクジラ類化石に関しては,沖縄県宮古島市総合博物館所蔵の鬚鯨類の頭蓋化石の記載と予備的な系統解析を行ない,これがナガスクジラ類の絶滅種であることを明らかにした(木村,Marx,甲能ほか3名,2015).また,蒲郡市生命の海科学館が所蔵するペルーの中新統産ヒゲクジラ類全身骨格

化石について記載報告の許可を得て,予備的な記載と計測を行なった結果,これもナガスクジラ類の絶滅種であることが明らかとなり,現在記載論文を準備中である.これらの研究と並行して,化石コラーゲンを用いた近縁関係推定法により,現生種1属1種と化石種1属1種のコラーゲン分析を行なった.なお,これらの成果については,2014年6月に米国バージニア州で開催された2年ごとの国際会議「7th Secondary Adaptation of Tetrapods to Life in Water」において講演すると共に,2015年1月に豊橋市自然史博物館で開催された日本古生物学会第164回例会でも講演を行なった.南半球のみに分布が知られるコセミクジラと北半球の後期中新世(およそ1000500万年前)から化石種として知られるケトテリウム類の顎関節部分を機能形態学的に詳細に検討したところ,両者に共通の形態の特殊化が認められ,絶滅したケトテリウム類も吸引食(suction feeding)であったことが示唆されたことから,彼らがその祖先において同様の食性を有していたことが推定された.このことは,両系統群が祖先を共有していた可能性を論じたMarx and Fordyce (2015)の見解とも矛盾しない.なお,これら標本の比較検討の過程で,オランダ・ロッテルダム自然博物館が所蔵する上部中新統産髭鯨類頭蓋化石をケトテリウム類の新種として記載した(Marx et al., 2016).さらに,日本産の原始的な髭鯨類を記載する過程で,北米ワシントン州の下部漸新統(3200万年前)産の原始的な髭鯨類の頭蓋形態を比較研究し,これも新種として記載した(Marx et al., 2015).髭鯨類は,最初の化石記録が南極の3400万年前から知られているが,それ以降は北半球の2800万年前まで確実な化石が欠如していたことから,本新種は髭鯨類の時代的・地理的な空白を大幅に埋めることとなった.日本産の髭鯨類化石に関しては,宮崎県総合博物館が所蔵する鯨類の上腕骨化石を詳細に記載すると共に,他の標本と数量形態学的な比較を行なった結果,これが歯鯨類と髭鯨類の分化直後の原始的な形態を残す新鯨類のものであることが明らかとなった(森ほか, 2015).これについては,2015年6月に開催された日本古生物学会2015年年会にて発表すると共に,現在同一著者により記載論文を投稿中である.また,2016年3月にはWiley&Blackwell社から鯨類進化に関する総説「Cetacean Paleobiology」を出版した.当該研究は,ヒゲクジラ類の進化過程における多様化と懸隔化の速度と様式を明らかにする上で日本産の化石を詳しく検討することが重要であることを指摘し,そうした標本の記載を進めつつ一部の標本についてはすでに論文を出版している.また,それらに加えて他の国内外の標本についても記載の上で系統解析に加えて検討を始めているので,研究計画としておおむね順調に進展していると判断する.27年度が最終年度であるため、記入しない。一連の研究において,日本の博物館等の研究機関には多くの未記載のヒゲクジラ類化石が所蔵されていることを把握したので,これらについて現在可能な限りの標本の記載を進めている.
神経性やせ症の治療にピアサポーターが与える効果とピアサポーター自身の回復について

【目的】神経性やせ症(Anorexia Nervosa;AN)の患者は日本で増加しており、治療法の確立は喫緊の課題だが、世界的に見ても有効な心理療法は確立されていない。治療者が提供する従来のモデルには限界があり、新しいアプローチが求められている。近年、様々な分野で疾患や障害を抱える当事者が支援に加わるピアサポート活動が注目されている。ピアサポーターは当事者に変化の希望を与える重要な存在であり、統合失調症や依存症の支援では広く活躍している。しかし、AN治療におけるピアサポーターの有効性や、活動を通じたピアサポーター自身の変化についての報告はない。そこで、本研究は、以下の2つを研究目的とする。1. AN患者に対するピアサポーターと協同したグループセラピーの効果検討(研究1)2.ピアサポート活動がサポーター自身の回復に与える効果についての検討(研究2)研究1及び2を通じ、AN治療に有効な新たなアプローチの提言を目指す。【2018年度の進捗】上記の研究計画について、浜松医科大学臨床研究倫理委員会の審査を受け、承認を得た。その後、研究対象者(ピアサポーター・AN患者)のリクルートを開始し、現在ピアサポーター5名、AN患者3名から研究参加の同意を得た。同意を得られたピアサポーターとAN患者には各種評価を実施し、ピアサポーターと協働したグループセラピーも開始し、現在4セッションが終了した。この他にピアサポーターには家族交流会等の活動にも参加しており、定期的な評価を継続している。また、県内3ヵ所で単発のAN当事者のグループをピアサポーターと協働した形で行い、本研究の予備調査的データも収集した。ピアサポーター、AN患者共に当初の予定よりもリクルート出来ている数が少ない。ピアサポーターの回復についての継続評価が、ピアサポーターの事情等により、定期的に実施出来なかった。今後は郵送等の方法をとって定期的な実施に向けた修正を行っていく。また、AN患者のリクルートが予想より進んでいないため、今後は対象患者の枠を広げることを検討している。ピアサポーターの都合により、活動出来ない日が発生したため、その日に支払われる予定であった交通費と謝金が余ったため。余った分は、次年度でのピアサポーターの交通費、謝金として使用する予定である。
法および社会規範の系統学的研究

本研究の主目的は、法や社会規範などの社会的ルール(特に共同体における協力規範・取引ルール・組織ルール)がどのような系譜を辿って形作られてきたかを、系統学の方法を用いながら明らかにすることにある。過去および現在の社会的ルールを広く収集したうえで類縁関係と系統分化の過程を推定し、社会的ルールの普及または消滅の軌跡を示す。最終的には、ルールの発達や変容の過程を経験的に探究するための土台となりうる理論を構築することを目指す。研究の2年目にあたる2017年度は、(1)各地の無尽講・頼母子講の調査を継続するとともに、(2)そこで得られたルールのデータを整理し、(3)企業や組織を取り巻くルールの伝播・変遷に関する調査の準備を開始した。具体的には下記の通りである。(1)東北・近畿・中国・九州の各地域で無尽講・頼母子講に関係する資料の収集および調査を実施し、実際に古文書も複数件入手して読解を進めた。あわせて、各地の図書館や史料館で調査を行っている。(2)本研究1年目にルールの変化の原因となりうる要素の候補を特定していたので、それに基づいて(1)で得られた無尽講・頼母子講のデータを逐次整理し、データベース化しているところである。これをもとに、2018年度に系統樹の推定を行う予定となっている。(3)予備的研究として、組織が従っているルールの伝播過程(大学の倫理憲章、組織における制定法の解釈など)の調査を進めている。さらに、企業が規制法を解釈する際にどのような内部ルールを用いているかに関する調査の準備にも着手した。本年度の研究活動によって得られた情報は、ルールの発生・伝播・変容に関する基礎資料となるものである。特に、経済状況や市場が変動する中で人々がどのようなルールを採り入れ、そしていかにしてルールを変えてきたか、という問題を解明するために活用していく。ほぼ予定通りに進行している。相互救済を目的とする制度や慣習についてさらに調査を継続したいと考えている。現在のところ、計画の遂行に支障をきたしうる問題は存在しない。2018年度は、(1)無尽講・頼母子講の分析を論文としてまとめ、(2)取引ルールおよび企業の組織ルールに関する調査を実施する。特定の業界を選定したうえで取引ルールの内容を示す資料・史料を収集し、それと並行して、企業の組織ルールについての資料やデータも集めて分析する予定である。この研究の主目的は、法や社会規範などのルール(特に共同体における協力規範、取引ルール、組織ルール)がどのような系譜を辿って形作られてきたかを、系統学の方法を用いながら解明することにある。本年度予定されていたのは、(1)関連分野の文献と資料の収集、(2)無尽講関連資料の整理および読解、調査のデザイン、さらに(3)第一次国内調査であった。(1)については、文化系統学に関連する国内外の文献、無尽講・頼母子講に関する過去の研究や現況を示す資料、社会規範や法制度を精査するうえで参照すべき近年の諸研究など、広範な文献や資料を収集することができた。また、幸いにも系統学の最近の議論を俯瞰するのに有用な文献もいくつか入手することもでき、理論的検討が円滑に進んだ。(2)上記の作業と並行して、無尽講・頼母子講に関する資料を整理・読解する作業を進めた。特に、資料の中からルールを抽出し、社会環境や時代によってどのようにルールが変化していったかを跡づける作業を数ヵ月にわたって行った。現代の経済が直面する問題と関係する(したがって政策上の含意に結びつきうる)部分が当初の想定よりも意外と多い、ということが認識できたのは大きな収穫であった。引き続き、重要な変数となりうる要素を特定する作業を進めていく予定である。(3)福岡県で資料の収集を行ったが(平成29年3月)、その他の地域における国内調査は平成29年度前半に行うことにした。1年目は理論的研究が中心であったが、2年目以降はフィールドワークを積極的に実施していく。本研究1年目にあたる平成28年度は、系統学の理論と方法の考察・検討、および、無尽講・頼母子講の実態等に関する資料やデータの収集に取り組んだ。可能であれば国内調査を複数の箇所で実施したいところであったが、1箇所のみにとどまった。2年目前半は比較的時間の余裕があるため、東日本を中心に調査を進めていく予定である。

(2)本研究1年目にルールの変化の原因となりうる要素の候補を特定していたので、それに基づいて(1)で得られた無尽講・頼母子講のデータを逐次整理し、データベース化しているところである。これをもとに、2018年度に系統樹の推定を行う予定となっている。(3)予備的研究として、組織が従っているルールの伝播過程(大学の倫理憲章、組織における制定法の解釈など)の調査を進めている。さらに、企業が規制法を解釈する際にどのような内部ルールを用いているかに関する調査の準備にも着手した。本年度の研究活動によって得られた情報は、ルールの発生・伝播・変容に関する基礎資料となるものである。特に、経済状況や市場が変動する中で人々がどのようなルールを採り入れ、そしていかにしてルールを変えてきたか、という問題を解明するために活用していく。ほぼ予定通りに進行している。相互救済を目的とする制度や慣習についてさらに調査を継続したいと考えている。現在のところ、計画の遂行に支障をきたしうる問題は存在しない。平成29年度前半に国内調査を行い、データの収集と整理を平成28年度に続き実施する(平成28年度中に行う予定だった国内調査は、本年度前半に実施する)。その後必要であれば調査のデザインを見直し、さらにデータを収集していく。さらに、無尽講・頼母子講のデータは今年度中(712月)に数度に分けて分析し、結果の一部をまとめて論文の形にする予定である。平成29年度後半からは本研究の第二段階、すなわち取引ルールを対象とした研究に取り組むことになる。冬ごろから取引ルールに関する資料・データを順次収集し、年度末までに整理と分析を開始する(必要に応じ、海外研究機関での資料・情報の収集も並行して実施する)。平成30年以降は、取引ルール・組織ルールについての資料・データ収集、およびそれらの系統学的分析を行う。2018年度は、(1)無尽講・頼母子講の分析を論文としてまとめ、(2)取引ルールおよび企業の組織ルールに関する調査を実施する。特定の業界を選定したうえで取引ルールの内容を示す資料・史料を収集し、それと並行して、企業の組織ルールについての資料やデータも集めて分析する予定である。組織ルールの伝播過程に関する大規模なインターネット調査を実施するため(2018年度夏ごろ実施予定)、2017年度の海外出張費として確保していた分を充てることとした。
肝癌浸潤性増殖へのSLUGの関与:細胞間接着と増殖に与えるインパクト

SNAILfamilyの一つであるSLUGはE-カドヘリンのリプレッサーとして機能するばかりでなく,Tight junction構成蛋白の発現までも抑制し細胞間接着装置形成を強く阻害することが知られている。我々はMDCK細胞にSLUGを恒常的に強発現させた細胞株を用いて主に細胞増殖能について検討した。最も興味深い所見としてSLUG強発現MDCK細胞は通常培養時には増殖能が低下しているが、一旦コラーゲンなどの基質に接すると飛躍的に増殖能が亢進した。この際、注目すべき分子として、G2/M期の細胞増殖抑制の作用を持つWee1という蛋白の増減が関与していることが分かった。その後、コラーゲンとの接触の際、Wee1以外にどのような分子により増殖能が上がるのか検討した。一般的には基質と触れた場合にインテグリンファミリーが関与することが知られているが、今回の実験ではインテグリンβ1、インテグリンαVβ3ともに蛋白の増減はなく、関与は薄いと判断した。しかし、同様に1型コラーゲンの受容体として知られているDDRについて検討してみたところ、DDR1は不変であったにもかかわらずDDR2に関しては通常培養では発現が見られていなかったものが、SLUG強発現MDCK細胞では基質に触れた際に蛋白の強発現を認めた。また、それに伴いMMP-2,)の発現も誘導されたことを確認している。このように今回の検討ではSLUGを強発現させた細胞ではインテグリンを介してではなく、DDR2を介して細胞増殖のシグナルが伝達されていることが分かった。今後は、G2/M期に関与する蛋白であるWee1とDDR2との関係、またSLUG導入により消失していた細胞間接着装置を薬剤により回復させ、その上で細胞増殖能の変化があるか否か検討することにより細胞浸潤性増殖へのSLUGの関与がより明確になるよう検討を重ねている。SNAILfamilyのSLUGはE-カドヘリンのリプレッサーとして機能するばかりでなく、Tight junction構成蛋白の発現までも抑制し細胞間接着装置の形成を強く阻害することが知られている。我々は、MDCK細胞にSLUGを恒常的に強発現させたSLUG-MDCK細胞を作製した。次にそのSLUG-MDCK細胞を用いてMDCK細胞との増殖能の違いについて検討した。増殖能については、細胞数の変化、細胞周期および細胞間の接着に関連する分子マーカーについて検討した。細胞数の変化においては、MDCK細胞が増殖能が高いのに比べ、SLUG-MDCK細胞は増殖能が劣っている事が判明した。しかし、培養の条件を変える事にSLUG-MDCK細胞の増殖能が飛躍的に上昇することが分かった。この現象を細胞周期について検討してみたところ、注目すべき分子として、G2/M期において細胞増殖抑制の作用をWeelという蛋白がSLUG-MOCK細胞において、通常培養時には貯留していたものが培養条件を変更したところ速やかに減少し、それに伴い細胞増殖能が上昇することが分かった。また、そのほかにもいくつかのG2/M期に作用する蛋白の変動が観察されている。しかし、Weelの増減のみがこの現象に関与しているとは考えがたく、そのほかに種々の細胞間のシグナル伝達が関与していると考えている。特に培養条件の変更が培養皿の差異(基質の違い)にあり、細胞間の接着に関する蛋白の関与が示唆される。特に細胞と基質との関わりについて検討する必要があると考えた。そのため今後はインテグリン等いくつかの分子がどのようにWeelと関係してくるかについても検討していく予定である。
RAGEによる視床下部の炎症調節機構とそれに伴う摂食、代謝への影響の解明

糖尿病患者では心筋梗塞、脳梗塞などの血管合併症が予後に大きく影響する。持続する高血糖が血管合併症の病因に深く関与することが推定されているが、その分子機序は明らかではない。本研究では、高血糖による細胞障害(糖毒性)にかかわる血管内皮の受容体receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)が血管内皮の炎症を惹起し、またその炎症はRAGEの切断が誘導されるネガティブフィードバック系が存在すること、さらにその分子機序を初めて明らかにした。FASEB J. 2019Mar;33(3):3575-3589.上記研究ではアデノウイルスを用いた血管内皮へのRAGEの過剰発現により、炎症性サイトカインtumornecrosis factor-α(TNF-α)による炎症シグナルは亢進し、炎症機転が増幅された。一方血管内皮特異的にRAGEを過剰発現したトランスジェニックマウスにおいて、TNF-αなどによる炎症誘導は、RAGEの切断(shedding)を誘導した。TNF-αによるRAGEsheddingはJNK活性化によるマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)9と、小胞体ストレスにかかわるactivation transcription factor(ATF)4によるADAM10誘導により引き起こされることが明らかとなった。これらの結果は、持続する高血糖刺激が血管炎症を惹起し血管合併症発症に関与すること、さらに血管の炎症増幅がRAGE切断・放出により高血糖と炎症の悪循環にブレーキをかける仕組みが存在することとその詳細なメカニズムを示した成果で、極めて重要な知見と考えている。本校では教育研究棟の建設及び施設移動のため、全講座において、約6か月間、動物実験を停止せざる負えなかった。その後、2018年4月より動物実験が再開となったが、モデルマウスは、凍結胚を起こすところから始めなければならなかった。まずは、実験群の作成(遺伝子的にホモのマウスの抽出)から行わなければならず、実験計画は計画より遅れている状況にある。準備実験により、高脂肪食飼育時にRAGE Tg/Tgマウスでは野生型と比較して、摂餌量が低下し視床下部領域のミクログリア活性化が抑制されることを見出している。実験群作成後、この再現実験を行った。野生型またはRAGE Tg/Tgマウスを通常食または高脂肪食により既報(Monden M, Koyama H, et al: Diabetes 62: 478-489, 2013)に基づいて飼育し、摂餌量、体重の測定と、PFA灌流固定後に脳組織を採取し、弓状核を中心とした視床下部領域の免疫組織学的解析を行った。視床下部領域におけるミクログリア(Iba1)の活性化を評価した。血管内皮にRAGEを過剰発現させたRAGE Tg/Tgマウスでは、野生型マウスと比較し、高脂肪食負荷による視床下部の炎症(ミクログリアの活性化)が抑制されていることを再確認できた。体重及び、摂餌量に関しては、計測はしているが、実施した群の数が少なく、現段階では、統計学的解析には至っていない。2RAGE-/-マウスにおける高脂肪食負荷時の視床下部炎症の評価RAGE発現のないRAGE-/-マウスを用いて、視床下部領域におけるミクログリア(Iba1)の活性化を評価した。血RAGE-/-マウスでは、野生型マウスと比較し、高脂肪食負荷による視床下部の炎症(ミクログリアの活性化)が抑制されていることを見出した。RAGE Tg/Tgマウス及び、RAGE-/-マウスにおいて、野生型と比較した摂餌量、体重の推移に関する統計学的解析ができていないため、実験群を増やし、データを収集していく。また、免疫組織学的解析では、アストロサイト(GFAP)、RAGE、炎症性リガンド(TNFα、M-CSFなど)、炎症シグナル(p-JNK, c-Jun)について追加検討することで、モデルマウスごとの視床下部領域における炎症を評価する。さらに、摂食調節にかかわるPOMC・AgRPニューロンについても検討することで、RAGEによる視床下部の炎症の調節と摂食の関連性を検討していく予定である。

これらの結果は、持続する高血糖刺激が血管炎症を惹起し血管合併症発症に関与すること、さらに血管の炎症増幅がRAGE切断・放出により高血糖と炎症の悪循環にブレーキをかける仕組みが存在することとその詳細なメカニズムを示した成果で、極めて重要な知見と考えている。本校では教育研究棟の建設及び施設移動のため、全講座において、約6か月間、動物実験を停止せざる負えなかった。その後、2018年4月より動物実験が再開となったが、モデルマウスは、凍結胚を起こすところから始めなければならなかった。まずは、実験群の作成(遺伝子的にホモのマウスの抽出)から行わなければならず、実験計画は計画より遅れている状況にある。準備実験により、高脂肪食飼育時にRAGE Tg/Tgマウスでは野生型と比較して、摂餌量が低下し視床下部領域のミクログリア活性化が抑制されることを見出している。実験群作成後、この再現実験を行った。野生型またはRAGE Tg/Tgマウスを通常食または高脂肪食により既報(Monden M, Koyama H, et al: Diabetes 62: 478-489, 2013)に基づいて飼育し、摂餌量、体重の測定と、PFA灌流固定後に脳組織を採取し、弓状核を中心とした視床下部領域の免疫組織学的解析を行った。視床下部領域におけるミクログリア(Iba1)の活性化を評価した。血管内皮にRAGEを過剰発現させたRAGE Tg/Tgマウスでは、野生型マウスと比較し、高脂肪食負荷による視床下部の炎症(ミクログリアの活性化)が抑制されていることを再確認できた。体重及び、摂餌量に関しては、計測はしているが、実施した群の数が少なく、現段階では、統計学的解析には至っていない。2RAGE-/-マウスにおける高脂肪食負荷時の視床下部炎症の評価RAGE発現のないRAGE-/-マウスを用いて、視床下部領域におけるミクログリア(Iba1)の活性化を評価した。血RAGE-/-マウスでは、野生型マウスと比較し、高脂肪食負荷による視床下部の炎症(ミクログリアの活性化)が抑制されていることを見出した。RAGE Tg/Tgマウス及び、RAGE-/-マウスにおいて、野生型と比較した摂餌量、体重の推移に関する統計学的解析ができていないため、実験群を増やし、データを収集していく。また、免疫組織学的解析では、アストロサイト(GFAP)、RAGE、炎症性リガンド(TNFα、M-CSFなど)、炎症シグナル(p-JNK, c-Jun)について追加検討することで、モデルマウスごとの視床下部領域における炎症を評価する。さらに、摂食調節にかかわるPOMC・AgRPニューロンについても検討することで、RAGEによる視床下部の炎症の調節と摂食の関連性を検討していく予定である。
バイオリサイクルを考慮した過剰埋伏歯由来iPS細胞の樹立効率の検討

一般的にES細胞/iPS細胞の樹立・維持にはfeeder細胞が必要とされる。MEFs細胞とSTO細胞は広くfeeder細胞として使用されている。本研究の目的は、ヒト乳歯(HDDPCs)と過剰歯(SNT)からiPS細胞を樹立することである。HDDPCsとSNT歯髄から初代培養細胞を得て、OCT3/4、SOX2/KLF4、LMYC/LIN28(マーカーとしてpmaxGFPを使用)をNeonRTransfectionsystemを使用して遺伝子導入した。ES培地にて15日間培養し、mitomycinC処理したMEFs細胞とSTO細胞上に播種した。コロニーは26継代まで培養維持した。この期間において、ES細胞様形態を有しているかどうか、またアルカリフォスファターゼ活性があるかどうかを評価した。HDDPCs由来iPS細胞では、MEFs細胞上では樹立・維持が可能であったが、STO細胞上では維持ができなかった。本結果から、HDDPCsは初期化因子により初期することができ、STO細胞よりもMEFs細胞の方が、HDDPCs由来iPS細胞の樹立・維持には良いことが示唆され、feeder細胞の選択は、効果的なiPS細胞の樹立に重要な要素であることが示唆された。近年の再生医療技術の進歩は目覚ましく、中でもバイオリサイクルの観点から乳歯は歯髄幹細胞の有効な細胞供給元として注目されている。特に2003年にヒト乳歯歯髄幹細胞(SHED)の存在が報告されて以降、その性質がいくつか明らかにされたが、まだ不明な点が多く残る。アルカリフォスファターゼ(ALP)は幹細胞マーカーの一つとして広く用いられており、ALP活性の高い細胞は他の幹細胞特異的遺伝子も発現する可能性が考えられることから、乳歯歯髄細胞における遺伝子発現について検討した。交換期障害のために抜歯された健全乳歯のうち、本研究目的について患児および保護者から同意を得られた5名の乳歯から採取した。結果として、ALP活性が高い乳歯歯髄細胞では、他の幹細胞特異的遺伝子の発現も認め、歯髄細胞からiPS細胞を樹立する場合、複数の幹細胞特異的遺伝子を発現する乳歯歯髄細胞を選択することの重要性が示唆された。iPS細胞の樹立にはfeeder細胞をしばしば用いるが、このfeeder細胞の特性によりiPS樹立、培養維持に影響があるかどうかの検討を行った。feeder細胞としては、MEF細胞とSTO細胞を用いた。ヒト由来のOCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYCの4因子を乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入し、feeder細胞上に播種し、iPS細胞を樹立した。MEF細胞上では、20継代以上培養維持が可能であった。しかしiPS細胞樹立後STO細胞では45継代まででクローンは消滅した。また、このiPS細胞を10継代維持した後にSTO細胞上に播種したところ、20継代まで培養維持が可能であった。今後、feeder細胞の与える影響について検討するとともに、他の組織との樹立効率についても検討を行う予定である。本研究は過剰歯歯髄からiPS細胞を樹立することを目的に、まず、遺伝子導入のためのプラスミドの増幅を行った。ヒト由来のOCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYCについて、E.coli内に導入してLB Brothで1214時間培養後、バクテリアを回収しプラスミドを精製し、制限酵素にて永動確認を行い、DNAシーケンスにて確認を行った。続いて患者から採取した歯髄細胞を、コラゲナーゼを用いて初代培養し、30日間培養維持した。口腔内の由来の細菌などのコンタミンの可能性があるため、20%FBS/α-MEM培地に複数の抗生剤を組み合わせて、ほぼ確実な初代培養が行えるようになった。十分量の細胞数を確保できたので、その歯髄細胞に4因子(OCT3/4, SOX, KLF4, L-MYC)のプラスミドベクターを導入した。当初の予定とは異なるが、効率性を考慮し、electroporation systemにて導入作業を行った。導入効率としては、6割程度に蛍光遺伝子の導入が確認できた。約1か月後にiPS細胞を樹立後、シングルセルクローニングを行い、形態的に良好なクローンをピックアップした。

さらに、RT-PCRにてcDNAを作製し、ヒトES細胞に関連する遺伝子発現があることを確認した。また、アルカリフォスファターゼに対し、ポジティブであった。現在、免疫不全マウスに樹立iPS細胞を移植し、移植後約1か月経過しており、奇形腫の生成を確認している。当初の研究計画では、lipofectionにより遺伝子導入を行う予定であったが、導入効率を考慮し、electroporation systemにて遺伝子導入を行った。iPS細胞が順当に樹立できたため、当初の予定より早くに次の計画に移行することができた。今後は遺伝子発現など樹立細胞の特徴を確認し、結果発表の準備を行う予定である。その後、iPS細胞をヌードマウスの大腿部に移植し、三胚葉性の様々な組織に分化した奇形腫が形成されるか否かを確認する。プレパラート上にて奇形腫を観察し、三胚葉性の組織が確認できれば、iPS細胞は胚性幹細胞と同様の分化能を持つ可能性が高いと考えられる。平成24年度の研究費は、物品費として、試薬等の消耗品の購入を予定している。また旅費として、国際学会(IADR)での成果発表を予定している。研究打ち合わせのための旅費も予定している。人件費・謝金として、英語論文作成ならびに英語発表原稿校閲の費用を予定している。その他として、学会参加費の支出を予定している。