hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラットの検索誘導性忘却に関わる神経メカニズムの解明

ヒトの記憶課題において、同じカテゴリーに含まれる単語のうち特定の単語のみを思い出させると、その後の再生テストにおいて残りの単語の再生率が低下する。この現象は“検索誘導性忘却"と呼ばれ,検索過程そのものが忘却を引き起こすという可能性を示唆している。本研究では、動物が既知物体よりも新奇物体をより好んで探索する生得的傾向を利用した自発的物体再認テストを用いて,ラットでも検索誘導性忘却様の現象がみられることを実証した。さらに検索を阻害するとされる薬物投与によって,そのような現象は消失することも明らかになった。本研究の目的は,ラットの検索誘導性忘却に関与する脳部位を特定し,さらにはそれら脳部位でのグルタミン酸NMDA受容体の役割を検討することである。そのためにまず本年度は,ラットの自発的物体再認テストを用いて,検索誘導性忘却が観察できる条件を探索することを目的とした。Long-Evans系雄ラットに対して,見本期で2つの異なる物体(A, B)を提示した60分後に,一方の物体(B)のみを提示する検索期を経験させた。その結果,検索期の60分後および120分後に行われたテスト期において,ラットは検索期で提示されなかった見本物体(A)と新奇物体(C)を弁別することができなかった。以上の結果は,ラットの自発的物体再認テストにおいて検索誘導性忘却現象がみられることを示す初めての証拠である。さらに,記憶を阻害することが知られているグルタミン酸NMDA受容体遮断薬を検索期の直前に投与されたラットでは,その後のテスト期において新奇物体を弁別できたことから,検索誘導性忘却にはグルタミン酸NMDA受容体が関与していることが示唆された。検索誘導性忘却(retrieval-induced forgetting)とは,Andersonら(1994)によって報告された記憶の抑制現象の一つである。Andersonらは,関連する複数個の単語を同時に覚えた後に,そのうちの一部の単語のみを思い出す(検索)ことによって,残りの単語の再生率が低下する現象を見いだした。不要な記憶を抑制することは,必要な記憶をより強固にするための有効な手段であると考えられる。前年度我々は,ラットの自発的物体再認課題を用いて,ヒトで見られる検索誘導性忘却現象を再現することに成功した。そこで本年度は,忘却を促すと想定している検索の直前に,記憶検索を障害することが知られているグルタミン酸NMDA受容体遮断薬のMK-801,あるいは同様に効果を持つアセチルコリン受容体遮断薬のスコポラミンを投与し,検索過程自体によってその後の忘却現象が誘発されているのかどうかを検討した。被験体にはLong-Evans系雄ラットを用いた。自発的物体再認課題の見本期では,2つの異なる見本物体(A,B)をラットに自由に探索させた。見本期から60分後に行った検索期では,見本物体のうちのひとつ(B,B)を置き,ラットに再度探索させた。検索期の20分前に薬物を腹腔内投与した。検索期の120分後に行ったテスト期では,検索期で提示しなかった方の見本物体と新奇物体(A,C)をラットに提示し,各物体に対する探索時間を測定した。結果として,統制群ではテスト期において見本物体と新奇物体を弁別できなかったのに対して,検索期の前にいずれかの薬物を投与されたラットは,テスト期において新奇物体(C)を弁別することができた。したがって,統制群に見られた忘却現象は,正常な検索過程の経験に起因することが示唆された。当初の予定通り,ヒトで知られている検索誘導性忘却現象を,ラットの自発的物体再認テストにおいて再現することに成功した。実験心理学・行動神経科学検索期からテスト期までの遅延時間が比較的長い条件(2時間以上)で検索誘導性忘却が認められたので,当初の計画通り,統制群,検索誘導群において,遅延時間中に灌流固定後ラットの脳を取り出し,クリオスタットで脳切片を作成した後,抗c-Fos抗体を用いてアビジン・ビオチン・コンプレックス法による免疫組織化学を行う。光学顕微鏡下で海馬,歯状回,海馬周辺領域,さらに前頭前野,中脳におけるc-Fos免疫陽性細胞を観察する。これにより,検索誘導性忘却に伴うc-Fos蛋白発現細胞を検索し,c-Fos蛋白発現細胞が顕著にみられた脳領域に対するNMDA受容体遮断薬AP5の局所投与の効果を検討する。
筋骨格系のバイオメカニクスと運動機能に関する研究

リンク機構では、構造と機能が密接に関連しており、筋及び骨格による自由度制約が作業空間の運動機能及び中枢レベルの制御方策に大きな影響を与える。このため、まず以下の観点から、力学的構造と機能の関係を解析した。(1)筋骨格系の直・並列構造の関係をヤコビ行列により記述した。(2)作業、関節、筋空間における運動インピーダンスと表現とそれらの関係を明らかにした。(3)筋の粘弾性、付着位置、筋群の配置と作業空間(例えば、手先)の運動インピーダンス、力、変冷の関係をヤコビ行列を用いて記述した。(4)特に、作業空間から筋空間への変換は、冗長性のため、何らかの付加的な条件を与えない限り一意に定まらない。本年度は、作業空間の目標運動インピーダンスを実現しながら、同時に、冗長性を利用して関節インピーダンスの配分選択、関節レベルの安定性(インピーダンス行列の正定値性)等のサブ・タスクを満たす一般的な変換法を導出した。次に、拘束運動時の上肢インピーダンス解析するため、以下の実験を実施した。ロボット・アームの先端に6軸力センサを取り付ける。ロボット側にあらかじめインピーダンスを設定しておき、被験者にそのハンドを持たせ、直線、回転などの拘束運動制御を行わせる。運動中にロボット・アームを強制的に動かしたときに生じる手先反立から、ヒトが手先に設定しているインピーダンスを同定した。その結果、1)手先慣性行列が力学モデルから計算した手先の等価慣性と一致すること、2)手先スティフネス楕円体の方向はMussa-Lvaldiらの実験結果と一致するず、大きさはかなり小さいこと、3)手先粘性楕円体の方向が手先スティフネスと類似していることを明らかになった。
超薄高誘電率ゲート絶縁膜におけるシリコンとの界面制御の研究

本研究の目的は、超膜高誘電率膜が次世代LSI用CMOSゲート酸化膜に適用可能であるかを材料学的に判断することであった。以下にその成果をまとめる。(1)遠赤外吸収測定により、高誘電率膜それぞれに特徴的なフォノンモードを実験的に提示した。(2)HfO_2にYやSiをドープして高温相へと相変態させ、30に近い比誘電率を実験的に初めて示した。(3)HfO_2にLaをドープすると、誘電率だけでなく結晶化温度が上昇し、900°C以上においてもアモルファスを維持する高誘電率膜が得られることを見出した。(4)マクロ量である誘電率は、ミクロに定義される分子分極率と分子体積により決定されるという基本法則に基づき、得られた誘電率の違いを解析し、高誘電率化のための新しい材料設計指針を構築した。2.シリコン/High-k界面層の成長機構の理解と制御(1)HfO_2/Si界面酸化における基板面方位、時間、温度等の影響を系統的に調べ、Si表面とは反応機構が異なることを定量的に明らかにした。(2)HfO_2/Si界面の酸化種として原子状酸素を考慮することによって、定量的界面酸化モデルを構築し、界面酸化制御のための指針を示した。以上を基に、最終年度にゲートスタック形成を試みた結果、界面特性の最適化を要するものの、EOTで0.8nm以下、リーク電流でSiO_2に比べて約5桁低いMISキャパシターの結果が得られ、数値目標を含めてほぼ本研究の目的を達成できた。さらに、次々世代デバイス材料として期待されるGeを用いたGe/High-k界面の制御へと対象を発展させた。Siの場合とは異なり、High-k材料物性が界面特性に強く影響し、High-k材料制御が一層重要になることを明らかにした。高誘電率絶縁膜とシリコンとの界面をいかに制御していくかという観点で研究をスタートした。初年度である本年は研究基盤を構築すべく以下のように仕事を進めた。1)シリコン上に比較的厚い熱酸化膜(SiO2)を形成し(約15nm)、その上に高誘電率膜(今回はHfO2)をスパッタ法で形成した。これによって、成膜後の熱処理によって界面に熱酸化膜が形成されることを防ぎ、高誘電率膜に対する熱処理効果を明確にすることを試みた。2)高誘電率膜のエッチング過程の表面ポテンシャル変化を観測するという電気化学的手法によって、表面状態の変化を逐次電気的に観測していく手法の開発を試みた。3)新規酸化物薄膜形成装置を導入し成膜を開始した。膜の成長レート、面内均一性、などのデータを取得し、次年度の本格的研究体制の構築をすすめた。1)から、HfO2を堆積するだけで、SiO2中のシリコンがHfO2中に拡散していくことが明瞭にわかった。このことは、界面における相互拡散が極めて強くはたらいていることを示している。2)の結果から、エッチングしながらの表面電位計測はジャスト表面を観測・定量化していく上で有用であることがわかった。また、測定しているポテンシャル(オープンサーキットポテンシャルOCP)の変化の鋭さはエッチング液などに依存することもわかってきたが、膜質の変化を十分追跡できるものであることがわかった。これはほとんどやられていない研究であり、今後、多くの材料に適用していける可能性がでてきた。3)の導入装置はスパッタ装置であるが、ダメージを最小限に抑えるためにサイドから成膜する(オフアクシススパッタ)ものである。

まだ膜質までは測定できていないが、オフアクシス型にもかかわらず膜厚の均一性は5%以内におさまっていることがわかった。以上のように、次年度以降に本格的な研究は持ち込まれるが、十分な下準備と可能性を得ることができた。Si/高誘電率膜界面を高精度に制御するために、本年度は界面層の正確な評価手法の構築を行った。まずは界面を劇的に変化させるために、シリコン結晶の面方位を変え、その上に高誘電率薄膜を形成し、その膜の電気的評価、物理分析的評価を行った。電気的な評価結果からは、面方位の影響としてC-V測定のヒステリシスにわずかな違いが観測されたが、大きな差としては観測されなかった。物理分析に関しては、斜入射X線反射率(GIXR)測定と分光エリプソメトリー(SE)測定を用いた。まず膜密度の変化に極めて敏感なGIXRで高誘電率膜の厚さを正確に求め、その結果をもとにSEを用いて界面層の厚さを二層近似の仮定のもとで求めた。その結果、三種類の面方位に関して酸素熱処理後の界面層の厚さに違いは見られないという興味深い結果が得られた。Siウェハーの酸素熱処理(酸化)も行ったが、この場合には大きな面方位依存性が観測された。さらに、界面層および酸化膜の形成レートも調べたが、高誘電率膜がある場合には、時間の初期には成長は早いが、すぐに飽和傾向を示す。一方、Siウェハーの場合は時間とともに増加する。この事から、界面層形成は単純な酸化過程ではなく、面方位に無関係に界面でほとんど100%の酸化反応が実現されていることがわかる。また、電気的にもほとんど差が無いという結果もこれに符合する。これらの知見をもとに次のステップとして、酸素熱処理で導入される酸素が実際に膜中のどこに分布しているかを調べることを計画している。さらに、異なる手法としてOCP(Open Circuit Potential)法による高誘電率膜のイオン性について、実験的な知見を得ることを続けている。現在、深さ方向のステッププロファイルに関しては本手法によって大きな差として観測されることがわかった。本研究課題実現のために、以下の二点について研究を行った。(1)シリコンと高誘電率絶縁膜の界面制御の研究。高誘電率膜としてHfO2を取り上げ、界面酸化膜(SiO2に近い)の成長機構に関する研究を昨年から引き続いて行った。界面酸化膜の成長に関しては、面方位依存性はない、上層HfO2膜厚依存性はほとんどない、酸素分圧依存性はほとんどない、など多くの興味ある傾向が見つかった。この界面層の赤外吸収を行ったところ、膜厚依存性を含めてほとんど熱酸化膜のストレッチング振動と同一であった。更に、界面制御の研究として、界面にSiO2が成長しない可能性があるY2O3系に関する研究をスタートした。Y203はSiO2と接することで1000°C程度の高温でシリケート化していくことがわかった。ただし、酸素が含まれる条件であると界面SiO2の成長がシリケート化にまさり、SiO2の成長と上層シリケートが同時に起きてしまうことがわかった。今後は、熱処理条件をつめるとともに、電気的な特性として界面がどのように変化するか、使用に耐えられる界面であるかなどを調べることで、サブ1nm等価酸化膜厚実証を進める。(2)バルクHfO2の遠赤外吸収特性の評価。高誘電率膜の高誘電率性は低エネルギーの光学フォノンの存在から来ている場合が多い。そこで、フォノン特性を調べるためには遠赤外の特性を調べる必要がある。HfO2、Y2O3の遠赤外特性を熱処理温度を変えながら詳細に調べた。
機能性コーティング膜の成形における流動解析

複雑流体のコーティング膜作成時の流動現象および膜特性と流体のレオロジー特性との関係を実験および数値シミュレーションにより調べた.ヒドロキシプロピールセルロース水溶液の等方相溶液を用いて,高分子液晶のコーティング膜を成形し,その上で低分子液晶が平行配向することを確認した.そこで,Doiモデルを用いてコーティング流れの数値シミュレーションを行い,コーティング膜表面上で高分子液晶の分子が膜表面と平行に配向し,乾燥時に固定化されることを見出した.さらに,コーティング膜には種々のテクスチャーが見られたので,高分子液晶の流れおよび緩和時に出現するテクスチャーを実験により検討した.単純せん断流れにおけるテクスチャーを調べるために,冷却・加熱せん断装置を用いて,偏光顕微鏡下での観察を行った.その結果,流動中の縞状テクスチャー,緩和時のバンドテクスチャーならびに粗い縞状テクスチャーを観察し,溶液温度,せん断速度,ギャップの大きさなどの影響を解析した.また,平行平板間スリット流れにおける波状テクスチャーの構造と発生原因を,スタートアップ流れの実験により調べ,波状テクスチャーに関する有益な知見を得た.また,高分子流体については引き上げコーティングの実験を行い,板状および円柱形状の物体表面に形成される液膜厚さと流体のレオロジー特性および引き上げ速度の関係を調べた.その結果,せん段粘度のシアシニング性により引き上げ速度の増加に対する膜厚の増加率がニュートン流体の場合よりも小さくなることが分かった.さらに,ガス浸透による高分子流体の円管内コーティングに関する実験を行い,流体のシアシニング粘性は膜厚の減少に,弾性特性は膜厚の増大に寄与することが分かった.複雑流体のコーティング膜作成時の流動現象および膜特性と流体のレオロジー特性との関係を実験および数値シミュレーションにより調べた.ヒドロキシプロピールセルロース水溶液の等方相溶液を用いて,高分子液晶のコーティング膜を成形し,その上で低分子液晶が平行配向することを確認した.そこで,Doiモデルを用いてコーティング流れの数値シミュレーションを行い,コーティング膜表面上で高分子液晶の分子が膜表面と平行に配向し,乾燥時に固定化されることを見出した.さらに,コーティング膜には種々のテクスチャーが見られたので,高分子液晶の流れおよび緩和時に出現するテクスチャーを実験により検討した.単純せん断流れにおけるテクスチャーを調べるために,冷却・加熱せん断装置を用いて,偏光顕微鏡下での観察を行った.その結果,流動中の縞状テクスチャー,緩和時のバンドテクスチャーならびに粗い縞状テクスチャーを観察し,溶液温度,せん断速度,ギャップの大きさなどの影響を解析した.また,平行平板間スリット流れにおける波状テクスチャーの構造と発生原因を,スタートアップ流れの実験により調べ,波状テクスチャーに関する有益な知見を得た.また,高分子流体については引き上げコーティングの実験を行い,板状および円柱形状の物体表面に形成される液膜厚さと流体のレオロジー特性および引き上げ速度の関係を調べた.その結果,せん段粘度のシアシニング性により引き上げ速度の増加に対する膜厚の増加率がニュートン流体の場合よりも小さくなることが分かった.さらに,ガス浸透による高分子流体の円管内コーティングに関する実験を行い,流体のシアシニング粘性は膜厚の減少に,弾性特性は膜厚の増大に寄与することが分かった.複雑流体のコーティング膜作成時の流動現象および膜特性と流体のレオロジー特性との関係を実験および数値シミュレーションにより調べた。ここでは、複雑流体として、液晶高分子、高分子水溶液(粘弾性流体)を使用し、次の3種類のコーティング手法に関する研究を行った。(1)ヒドロキシプロピールセルロース(HPC)の等方相水溶液を用いて、モデルコーティング流れによる液晶配向膜の成形実験を行った。その結果、溶液濃度が高く、コーティング厚が薄く、コーティング速度が大きい場合には、等方相水溶液からでも低分子液晶の配向膜を成形することができることを実証した。また、そのメカニズムを解明するためにDoiモデルによるコーティング流れの数値シミュレーションを行い、流動配向を解析した。(2)高分子溶液の引上げコーティングに及ぼす流体のレオロジー特性の影響を実験により検討した。実験では、CMC水溶液とPAA水溶液を混合させることによって、せん断粘度が同じで第1法線応力差の異なる3種類の高分子溶液を作製し、コーティング膜の膜厚を測定した。その結果、弾性が顕著な流体ほど膜厚が薄くなることを見出した。(3)円管内に充填された高分子溶液に空気を注入することによって作成される円管内表面のコーティング膜における液膜厚さと流体のレオロジー特性(非ニュートン粘性や弾性特性)の関係を調べた。その結果、粘度のshear-thinning性は膜厚の減少に、弾性は膜厚の増大に寄与することが分かった。複雑流体のコーティング膜作成時の流動現象および膜特性と流体のレオロジー特性との関係を実験および数値シミュレーションにより調べた.ヒドロキシプロピールセルロース水溶液の等方相溶液を用いて,高分子液晶のコーティング膜を成形し,その上で低分子液晶が平行配向することを確認した.そこで,Doiモデルを用いてコーティング流れの数値シミュレーションを行い,コーティング膜表面上で高分子液晶の分子が膜表面と平行に配向し,乾燥時に固定化されることを見出した.さらに,コーティング膜には種々のテクスチャーが見られたので,高分子液晶の流れおよび緩和時に出現するテクスチャーを実験により検討した.単純せん断流れにおけるテクスチャーを調べるために,冷却・加熱せん断装置を用いて,偏光顕微鏡下での観察を行った.

その結果,流動中の縞状テクスチャー,緩和時のバンドテクスチャーならびに粗い縞状テクスチャーを観察し,溶液温度,せん断速度,ギャップの大きさなどの影響を解析した.また,平行平板間スリット流れにおける波状テクスチャーの構造と発生原因を,スタートアップ流れの実験により調べ,波状テクスチャーに関する有益な知見を得た.また,高分子流体については引き上げコーティングの実験を行い,板状および円柱形状の物体表面に形成される液膜厚さと流体のレオロジー特性および引き上げ速度の関係を調べた.その結果,せん段粘度のシアシニング性により引き上げ速度の増加に対する膜厚の増加率がニュートン流体の場合よりも小さくなることが分かった.さらに,ガス浸透による高分子流体の円管内コーティングに関する実験を行い,流体のシアシニング粘性は膜厚の減少に,弾性特性は膜厚の増大に寄与することが分かった.
新規スクリーニング法を用いた高効率なターゲティングAdベクター作製法の開発

ファイバー領域を35型アデノウイルス(Ad)由来のものに置換したAdF35ベクターは、ほぼ全ての細胞に発現しているCD46を認識し感染するため広い感染域を持つとともに、一方で肝臓への集積も極めて低いことから、標的細胞指向性を有したターゲティングAdベクター開発に向けた基盤ベクターとして有望である。一方で、ターゲティングAdベクター開発に向けては、標的組織にのみ高い親和性を有する新たな機能性ペプチドを同定し、ファイバー改変AdF35ベクターに搭載させる必要がある。そこで、研究代表者らはファージ表面提示法による機能性ペプチドのスクリーニング手法を改良し、ランダムペプチドを挿入した35型Adファイバーノブ全体をファージ表面に提示させたライブラリ系を用いることとした。しかしながら、十分なライブラリサイズを有するファージの取得が困難であった。そこで、本年度は別のアプローチで、標的組織特異的に遺伝子導入するAdベクターの開発を目指した。すなわち、ファイバー領域をT4ファージ由来のフィブリチンで置換するとともに、ファイバーノブを欠損させたノブレスファイバーを有するノブレスAdベクターに、ヒトフィブロネクチンtypeIIIドメインを基盤とする低分子化抗体様分子であるMonobodyを挿入したMonobody提示Adベクターを開発した。その機能評価の結果、Monobody提示Adベクターは、標的分子に特異的に結合し、効率的に遺伝子導入可能であった。今後、Monobodyを挿入したAdベクターは、標的組織特異的な遺伝子導入を達成するターゲティングAdベクターとしての応用が期待される。本年度は、ランダムな配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて作製したPCR断片を、35型Adファイバーノブ領域をコードしたファージミドベクターに遺伝子工学的に挿入した。これにより、35型Adファイバーノブに多様なペプチド配列を有したライブラリを作製することに成功した。その後、作製したファージミドベクターを大腸菌で増幅し、ファージライブラリを得た。今後は、本ファージライブラリを標的分子に作用させ、濃縮されたファージのゲノムシークエンスを解析することで、提示ペプチドのアミノ酸配列の同定を試みる。本手法で同定したペプチドを35型Adファイバーノブに組み込んでも立体構造の変化が起こることなく、標的細胞特異的に遺伝子導入可能なターゲティングAdベクターを構築できるものと期待される。ファイバー領域を35型アデノウイルス(Ad)由来のものに置換したAdF35ベクターは、ほぼ全ての細胞に発現しているCD46を認識し感染するため広い感染域を持つとともに、一方で肝蔵への集積も極めて低いことから、標的細胞指向性を有したターゲティングAdベクター開発に向けた基盤ベクターとして有望である。昨年度までに、ランダムな配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて作製したPCR断片を、35型Adファイバーノブ領域をコードしたファージミドベクターに遺伝子工学的に挿入した。本年度は、作製したファージミドベクターを大腸菌で増幅し、ファージライブラリを得た。

その機能評価の結果、Monobody提示Adベクターは、標的分子に特異的に結合し、効率的に遺伝子導入可能であった。今後、Monobodyを挿入したAdベクターは、標的組織特異的な遺伝子導入を達成するターゲティングAdベクターとしての応用が期待される。ファージライブラリを作製し、標的分子に作用させ、結合ファージの溶出を試みたが、標的分子に親和性を有するファージは未だに濃縮されていない。作製したファージライブラリのライブラリサイズが小さいため、再度ファージライブラリを作製する必要がある。ファージミドベクターを大腸菌(TG-1)で増幅し、ファージライブラリを再度作製する。作製したファージライブラリをEpidermal Growth Factor(EGF)受容体やVascular Endothelial Growth Factor(VEGF)受容体を固層化したプレートに作用させ、ELISAによるパンニングを数回行う。濃縮されたファージのゲノムシークエンスを解析し、提示ペプチドのアミノ酸配列を同定する。同定したアミノ酸配列を35型Adファイバーノブ領域のHI loopに挿入することにより、ファイバー改変AdF35ベクターを作製する。
マルチモーダル インターフェースの研究

本研究の目的である音声とジェスチャを組み合わせたマルチモーダルインターフェースの研究として、本年は、これまで研究を進めてきた「歌声による曲検索」および「空中での手書き文字認識」を統一環境で実装可能なOS的なシステムの研究を進めた。また、このシステムを実装した計算機の概念を「コビト計算機」と定義した。コビト計算機は、利用者の肩に搭載して動作する計算機であり、利用者から得られる視聴覚情報(音声、ジェスチャ)を処理し、利用場面に合わせて動作制御できる状態遷移モデルのシステムとして開発した。「歌声による曲検索」を、コビト計算機上に実装したところ、GUIを一切使わずに、音声だけで高速に曲検索が可能なシステムを実現できた。また、本年度は、曲検索を並列・分散処理できるアルゴリズムの手法を開発し、その設計手法を定式化した。この研究結果を2つの国際会議(IWEC2002、WEDELMUSIC2002)で発表を行った。「空中での手書き文字認識」では、コビト計算機上に実装するとともに、これまで行ってきた一連の成果をまとめ、電子情報通信学会論文誌に投稿した。本論文は、採録決定している。さらに、コビト計算機の研究では、視聴覚情報処理と同様に、様々な入力インターフェースを実装することを目的として、音声認識による対話、メールによる動作制御、ジャイロセンサーを使った姿勢に関する加速度の測定、音声ストリーミング通話等の一連の機能を統一環境で扱う手法を明らかにした。
希少チョウザメ類の始原生殖細胞と生殖系列キメラに関する研究

本邦の希少種であるミカドチョウザメを含むチョウザメ類配偶子の微細構造を透過型電子顕微鏡で観察し、他の硬骨魚類とは異なり精子は先体を持ち、卵は複数(10)の卵門を持つことを示した。また、ミカドチョウザメ精子は他種に比べ著しく幅広い波動膜をを持つことを示した。一方、卵子は3層からなる卵膜と最外層のゼリー膜に囲まれていた。卵子の動物極に、多数のミトコンドリアに囲まれ、いわゆるnuageと言われる生殖質様の構造が電子密度の高い10ほどの粒子として見られた。排卵された卵では生殖質様構造は断片化され、植物極側の細胞質に拡散し、nuage-ミトコンドリア複合体としては観察されなかった。また、ミトコンドリアは少なく、ゴルジ体、小胞体も極めて少なかった。受精後の1細胞期から4細胞期の胚の植物極に、ゼブラフィッシュのnosl mRNAの3'UTR(3末端非翻訳領域)と緑色蛍光タンパクGFP遺伝子を結合させた人工mRNAを顕微注射して、始原生殖細胞(PGCs)の可視化を行った。そして、PGCsの位置と移動経路を蛍光顕微鏡下で観察したところ、受精後5日において前腎管と腸管の間にPGCsが見られ、これらの細胞集団は卵黄特区の後端領域に移動した。PGCsの蛍光シグナルが消失する受精後6-13日目では、PGCsは卵黄全体に沿って広がり分布した。単離したPGCsは電子顕微鏡観察のための固定処理を行った。PGCsの顕微移植によるキメラ作出は困難であったことから、精原細胞のみを単離する技法を開発し、将来の移植の準備を整えた。希少チョウザメ類における生殖系列キメラを介した「借り腹生産」実現には、生殖細胞に関する基礎的研究が必要であるが、チョウザメ類は魚体が大きく、成熟に長期を有し、人為的な産卵誘発、人工受精、子孫育成が困難なことから、知見は著しく乏しい。そこで、本研究はチョウザメ類における生殖系列キメラ作成に向けた基礎技術(始原生殖細胞の可視化、顕微胚操作による単離、宿主胚への移植など)を開発するとともに、主に電子顕微鏡による微細構造観察を通して、生殖細胞の基礎知見を得ることを目的とした。平成21年度中に成熟し、産卵可能となったチョウザメ交雑種ベステル(オオチョウザメ雌×コチョウザメ雄)親魚より、2010年3月に成熟卵と精子を得得た。そして、常法により人工受精を行ない、受精卵を水槽に収容した。一部の受精卵について母系mRNAvasaの3'UTR (3末端非翻訳領域)と緑色蛍光タンパクGFP遺伝子を結合させた人工mRNAを顕微注入した。そして、蛍光実体顕微鏡を用いて、発生胚において可視化した始原生殖細胞(PGC)の位置や移動経路について、経時的に観察するとともに適宜採取し、光学顕微鏡および電子顕微鏡観察のための固定処理を行った。また、生検により得た未授精卵母細胞についても同様に固定処理を行った。現在、固定標本からウルトラミクロトームを用いて作製した超薄切片について、電顕観察を実施している。次年度においては、いままでの研究成果を、新年度に産卵と人工受精が期待されるダウリアチョウザメHuso dauricusに応用し、魚類では明確でなかった生殖質germ plasmの構造・機能を明らかにするとともに、生殖系列キメラ作成を試みる。
血管塞栓物質・高吸水性ポリマーを用いた動脈塞栓術による腫瘍性疾患治療の新たな展開

【動物実験】家兎臓器(肝、腎、及び大腿)及び各臓器VX2腫瘍に対して新しい塞栓物質・高吸水性ポリマー(200-300μm)の塞栓効果の検証を行った。血管造影上、各臓器及び腫瘍の血管は本材料にて末梢より順次塞栓され良好な血流低下を得た。組織学的塞栓形態として、粒子径相当血管に到達後、血清吸収・膨潤により柔軟に変形し血管形状に一致して血管腔を隙間なく占拠・閉塞した。周囲血管壁は炎症細胞浸潤に乏しく生体刺激性を示すものではなかった。肝・大腿では腫瘍辺縁血管に本粒子が均一に分布し良好な壊死効果を得たと同時に、末梢での限局塞栓により周囲組織を比較的温存することができ、腫瘍の標的塞栓の実現性が示唆された。一方、腎では全腎梗塞に伴いびまん性に分布した腫瘍細胞塊も区別なく壊死を示した。比較群として用いた従来型物質であるPVA粒子(250-300μm)及びゼラチンスポンジ細片(500-1000μm)は粒子径に関らず、粒子凝集及び粒子間血栓形成により近位塞栓傾向を示した。特に肝及び大腿では、塞栓範囲が広くなる傾向がある一方、末梢血管開存による側副血管発達の余地を残すことが示された。【臨床応用】肝細胞癌、子宮筋腫、頭頚部腫瘍、骨腫瘍、血管腫などの多血性腫瘍において、化学療法剤を併用せずに高吸水性ポリマーを用いて塞栓を行った。材料の生体低刺激性及び塞栓の病変選択性を反映して塞栓後痛は軽微な傾向を示した。切除例では術中出血量の十分な低減を得、良好な腫瘍壊死効果並びに周囲組織の反応が乏しいことを病理学的に確認した。非切除例では、合併症なく病変縮小及び疼痛・出血などの症状緩和を得た。高吸水性ポリマーによる多血性腫瘍の標的塞栓は、良好な腫瘍壊死効果だけでなく合併症や抗癌剤量の軽減が図れるなど、治療域と安全域のバランスが良く、今後の腫瘍性疾患に対する塞栓治療に寄与するものと考えられた。動吻実験においては家兎血管を用いて新しい塞栓物質高吸水性ポリマーの塞栓効果の検証を行った。本ボりマーは均一な粒子径の球形樹脂の特徴により、個々の粒子径に相当する末梢血管に到達し血管腔を隙間なく占拠する形で完全な閉塞を果たした。血清吸収による粒子の膨潤は血管壁を圧迫するが血管形状に一致して柔軟に変形し血管壁破綻は認めなかった。粒子周囲血管壁の反応は乏しく生体刺激性を示すものではなかった。特に腎動脈塞栓術においては従来の塞栓物質PVA粒子(250-300μm)、ゼラチンスポンジ片(500-1000μm)との比較を行い、従来群は形状不整や粒子径不揃いのため、互いに凝集し腎動脈本幹レベルで近位部閉塞を示した一方、本ポリマーは弓状小葉間動脈レベルに到達し腎全体に均一な粒子分布を示した。腫瘍モデル作成は、肝は開腹下、腎は経動脈的、大腿は経皮的アプローチにてVX2細胞浮遊液注入により行い、2-3週間後血管造影にて腫瘍血管増生を確認した。臨床応用として、肝細胞癌、頭頚部・骨軟部腫瘍、子宮筋腫を標的として化学療法剤を併川しない本ポリマー単独による塞栓術を行った。塞栓後痛は生体低刺激性を反映して軽微な傾向を示した。結節型肝細胞癌では画像評価及び切除標本においてほぼ完全な腫瘍壊死を確認した。頭頚部・骨軟部腫瘍では術前塞栓術により術中出血量の低減を得たほか、周囲軟部組織の炎症性変化が乏しく手術操作を容易にした。子宮筋腫症例では月経困難症・出血過多など有症状例に子宮動脈塞栓術を行い症状改善及び筋腫の縮小を得るなど、多血性の良・悪性腫瘍性病変における良好な塞栓効果と安全性を確認した。【臨床応用】

肝細胞癌、子宮筋腫、頭頚部腫瘍、骨腫瘍、血管腫などの多血性腫瘍において、化学療法剤を併用せずに高吸水性ポリマーを用いて塞栓を行った。材料の生体低刺激性及び塞栓の病変選択性を反映して塞栓後痛は軽微な傾向を示した。切除例では術中出血量の十分な低減を得、良好な腫瘍壊死効果並びに周囲組織の反応が乏しいことを病理学的に確認した。非切除例では、合併症なく病変縮小及び疼痛・出血などの症状緩和を得た。高吸水性ポリマーによる多血性腫瘍の標的塞栓は、良好な腫瘍壊死効果だけでなく合併症や抗癌剤量の軽減が図れるなど、治療域と安全域のバランスが良く、今後の腫瘍性疾患に対する塞栓治療に寄与するものと考えられた。
沖縄県の都市・農村における「南入-列」型宅地割の形式に関するする基礎的研究

本年度は、糸満市の調査継続とともに、読谷村楚辺と沖縄市泡瀬の詳細調査や本土の類似事例の調査を実施した。その調査結果の概要は、以下のとおりである。1.楚辺地区は、ヒヤリングの結果、伝統的・農村的な「南入一列型」に倣って新しい市街地型の「南入一列型」の宅地を造成したことが明確になった。2.泡瀬地区は、当初は「本土型」の宅地割であったが、希望者が多いために二本の道路の間に小路(スージグァー)を配置したものであることが判明した。従って泡瀬の宅地割が、「沖縄型」から「本土型」への移行形態ではないか、という仮説は否定された。3.鹿児島県串木野市に類似事例があり調査したが、形態は酷似していたが成立過程は全く異なることが判明した。4.広島県尾道市の吉和地区の類似事例の調査も行なったが、造成時期が明治初期のために、成立過程を知る人はすでに居なかったが、今後も調査を続ける予定である。5.しかし、沖縄市泡瀬地区の調査から、新しい興味深い仮説が導かれることとなった。6.それは泡瀬地区は、明治36年に当時の失業士族による家取(ヤードゥイ=失業士族が農業などで生計を立てるために作った小集落)であることが判明したが、沖縄県の市街地型の「南入一列型」の宅地割は、こうした家取の「町型」のものではないか、という仮説であり、この「町型の家取」については、これまで全く究明されていない。7.こうした事例は、那覇市の住吉町や垣花町でも発見されたために、今後とも沖縄県全体と海外事例の調査も含めて究明する予定である。沖縄県の農村部における「南入-列型」宅地割が、沖縄型の風水によるものであることは、多くの研究者によって明らかにされているが、都市部における「南入-列型」の研究は皆無であった。しかし、本年度の調査の結果、糸満市や名護市、石垣市などの市街地においては、すでに200年前頃から「南入-列型」の宅地割が存在していたことが、ほぼ確定的であると思われる。とくに糸満市においては、その後の市街地の拡大部分でも「南入-列型」の宅地割が、終戦直後から日本復帰頃まで実施されてきたことが明らかになった。さらに、読谷村の楚辺地区では、終戦直後の米軍による土地接収により、近辺の土地に新に「南入-列型」宅地割による集落移転が行なわれ、現在でも十分に機能しており、沖縄市の泡瀬地区においては、日本復帰直後に「南入-列型」と「ヤマト型」(いわゆる背割型のもので小路のあいだに二列の宅地が入る)の混合型の大規模な宅地造成が行なわれたことが明らかになった。そして近年では、ほとんどの宅地造成は、「ヤマト型」のものに変化した。今年度は、沖縄県の都市部における概要が把握されたが、他の都市部の事例やその計画の根拠となる思想・理念はまだ解明されていないため、来年度の課題としたい。また本土の事例について、国土地理院や大学図書館において資料収集を行なったが類似事例は見当らなかった。ただし、瀬戸内海の離島や尾道市において、「南入一列型」に近い事例が観察されているので、本土の事例調査も来年度の課題としたい。
腫瘍由来増殖抑制因子の作用メカニズムと一次構造の解析

我々はV79癌細胞の増殖がin vitroにおいて3種類の増殖制御因子により制御されていることを見いだし(Cancer Res.46:4431,1986)、一つは分子量2,000のオリゴペプチドで、正常・悪性を問わず細胞の増殖制御に係わるオリゴペプチド前駆体であることが示唆され(Cancer Res.48:3737,1988)、もう一つはチミヂンと同定され、チミヂンキナーゼ欠損株を用いた実験で、チミヂンは密度阻止の状態で細胞内より移行し高濃度となり、最終的にはV79の増殖を阻害することを示した(BBA 1094:263,1991)、残りの分子量約13kDの制御因子は、残念ながらまだ純化できていないが、腫瘍増殖抑制作用のあるTGF-β、TNF-α、IL-1αと生物学的性状及び物理学的性状も異なり、しかもヒト線維芽細胞には全く効果は無いが種々のヒト癌細胞に対して著明な抑制作用を示すため、腫瘍増殖抑制因子(TGIF)と命名した。このTGIFは、熱・酸・トリプシンに安定なシングルチェインのポリペプチドであり、その作用はPDGF、EGFにより阻害されない等を報告してきた(In Vitro Cell.Devel.Biol;1993,in press)以上よりこのTGIFは癌増殖に密接に関連した新しいタイプのサイトカインの可能性が強い。TGIFが培地中に分泌される密度阻止の時期には、腫瘍抑制遺伝子であるp53のmRNAの発現が異常に高まっている。正常のハムスター由来の線維芽細胞では密度阻止の状態では逆に低下している。このことは核蛋白であるp53と細胞からの遊離因子であるTGIFとの関連を考える上で非常に興味深い。考えられる仮説としては、TGIFは細胞の悪性化に伴って変化したp53産物に由来する増殖制御活性物質の一部の可能性と、あるいはTGIFは癌細胞特異的にp53の誘導を起こす制御物質の可能性等が考えられる。現在、このV79細胞のp53遺伝子が正常なp53遺伝子かどうかをPCR法で解析している。TGIFは今だ部分精製の段階であるが、今後p53蛋白とTGIFの関連を抗体等を使用して更に検討する。我々は造腫瘍性のあるV79細胞の密度阻止された培養上清中に、3種類の増殖制御因子を見いだし(Cancer Res.46:4431,1986),これらの因子の単離と性状解析に取り組んできた。一つは分子量2,000のオリゴペプチドで,正常・悪性を問わず効果があるので、これらに共通した増殖制御プロセスに働くオリゴペプチド前駆体であることが示唆された(Cancer Res.48:3737,1988).もう一つはチミヂンと同定され,チミヂンキナ-ゼ欠損株を用いた実験でチミヂンは密度阻止の状態で細胞内より移行し高濃度となり,最終的にはV79の増殖を阻害することが判明した(BBA 1094:263,1991).一方、分子量約13kDの制御因子は、TGFーβ、腫瘍壊死因子(TNFーα)、Interleukinーlαと生物学的性状及び物理学的性状も異なり、しかもヒト線維芽細胞には全く効果は無いが、種々のヒト癌細胞に対して抑制的に働くため腫瘍増殖抑制因子(TGIF)と命名した.このTGIFは、熱・酸・トリプシンに安定なシングルチェインのポリペプチドであり、その作用はPDGF,EGFにより阻害されない等を報告してきた(J.Cell.Biochem.,in press)。以上よりこのTGIFはいままで報告のない癌増殖に密接に関連した全く新しいタイプのサイトカインであることが明らかになった.またこのTGIFは,癌遺伝子であるHーrasとcーmycのmRNAの発現には影響しないが,腫瘍抑制遺伝子であるp53とRBは逆に増加させる(upーregulation)ことが判明した,このことは核蛋白であるp53蛋白及びRB蛋白と,細胞からの遊離蛋白であるTGIFとの関連を考える上でで非常に興味深い,現在,このV79細胞のp53遺伝子が正常なp53遺伝子かどうかをPCR法を用いた遺伝子解析を行い検討している.また,これらの腫瘍抑制遺伝子の蛋白レベルでの発現量にTGIFが及ぼす影響を検討している.我々はV79癌細胞の増殖がin vitroにおいて3種類の増殖制御因子により制御されていることを見いだし(Cancer Res.46:4431,1986)、一つは分子量2,000のオリゴペプチドで、正常・悪性を問わず細胞の増殖制御に係わるオリゴペプチド前駆体であることが示唆され(Cancer Res.48:3737,1988)、もう一つはチミヂンと同定され、チミヂンキナーゼ欠損株を用いた実験で、チミヂンは密度阻止の状態で細胞内より移行し高濃度となり、最終的にはV79の増殖を阻害することを示した(BBA 1094:263,1991)、残りの分子量約13kDの制御因子は、残念ながらまだ純化できていないが、腫瘍増殖抑制作用のあるTGF-β、TNF-α、IL-1αと生物学的性状及び物理学的性状も異なり、しかもヒト線維芽細胞には全く効果は無いが種々のヒト癌細胞に対して著明な抑制作用を示すため、腫瘍増殖抑制因子(TGIF)と命名した。

このTGIFは、熱・酸・トリプシンに安定なシングルチェインのポリペプチドであり、その作用はPDGF、EGFにより阻害されない等を報告してきた(In Vitro Cell.Devel.Biol;1993,in press)以上よりこのTGIFは癌増殖に密接に関連した新しいタイプのサイトカインの可能性が強い。TGIFが培地中に分泌される密度阻止の時期には、腫瘍抑制遺伝子であるp53のmRNAの発現が異常に高まっている。正常のハムスター由来の線維芽細胞では密度阻止の状態では逆に低下している。このことは核蛋白であるp53と細胞からの遊離因子であるTGIFとの関連を考える上で非常に興味深い。考えられる仮説としては、TGIFは細胞の悪性化に伴って変化したp53産物に由来する増殖制御活性物質の一部の可能性と、あるいはTGIFは癌細胞特異的にp53の誘導を起こす制御物質の可能性等が考えられる。現在、このV79細胞のp53遺伝子が正常なp53遺伝子かどうかをPCR法で解析している。TGIFは今だ部分精製の段階であるが、今後p53蛋白とTGIFの関連を抗体等を使用して更に検討する。
不死化RPE細胞マーカーIRM1の機能解析

ヒトiPS細胞由来移植細胞の安全性において最も懸念される問題は、移植細胞の腫瘍化である。移植細胞が腫瘍化する原因として、(1)未分化細胞の残存、(2)形質転換細胞によるコンタミネーション、(3)製造工程中または、移植後における形質転換細胞の発生が考えられる。そこで我々は製品中に含まれる形質転換細胞を検出するため、すべてのがん細胞に共通する形質の一つである「不死化」に着目し、ヒトiPS細胞由来移植細胞に混入する不死化細胞検出法の開発を行ってきた。これまでに網膜色素上皮(RPE)細胞をモデルとして、不死化RPE細胞マーカーIRM1(Immortalized RPE cell marker 1)遺伝子を同定し、IRM1 mRNAをqRT-PCRで測定することにより不死化RPE細胞を迅速に検出する試験法を開発している。今回、IRM1と不死化との関連を調べるため、IRM1の機能解析を行った。その結果、IRM1は卵巣がん等の幾つかの腫瘍組織で高発現していることが示され、また、IRM1の過剰発現株の解析から、IRM1はアクチンフィラメントの重合を促進し、細胞遊走の亢進に寄与する事が示された。以前の報告から、IRM1は骨格筋細胞に発現し筋収縮に重要な遺伝子であることが知られていたが、今回の研究により、卵巣がん等の他のがん細胞マーカーとしても有用であること、また、細胞遊走との関連が新たに示唆された。ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、体細胞へ特定の遺伝子(山中4因子など)を導入することにより、あらゆる細胞へ分化できる多分化能と無限に増殖できる自己複製能を併せ持つ細胞である。その特徴から、再生医療への応用が期待されているヒトiPS細胞由来移植細胞の安全性において最も懸念される問題は、移植細胞の腫瘍化である。IRM1は卵巣がん組織においても有意に高発現していることが報告されており、不死化と機能的に関与している可能性が予想される。しかしながら、IRM1がどのようなメカニズムで不死化と関連しているのかは、不明のままである。本研究の目的は、不死化RPE細胞におけるIRM1の機能を明らかにし、RPE細胞の不死化メカニズムを明らかにすることである。まず初めに、不死化RPE細胞株においてIRM1のノックアウト株を作成し、不死化への影響を調べることを試みた。IRM1は卵巣がん組織でも有意に高発現していることが近年報告されている(Sharmila et al. Cancer Res., 70, p4809-4819, 2010)。このことから、IRM1がRPE以外の細胞、組織においても不死化と関連している可能性が高いと考えられる。そこで、TissueScan Cancer and Normal Tissue cDNA Array(Origene)と呼ばれるcDNAのキットを用いてIRM1のがん組織における発現量を網羅的に調べ、RPE細胞以外の細胞における、不死化細胞マーカーとして汎用性を検証した。その結果、IRM1は18種類のガン組織のうち、卵巣ガンを含む5種類のがん組織(子宮頸部、結腸、肺、卵巣、および精巣)において、各正常組織と比べ有意に発現が上昇していることとが分かった。また、IRM1が不死化に機能的に関与している事を調べるため、Zinc Finger Nuclease (ZFN)技術によるゲノム編集を用いて不死化RPE細胞IRM1をノックアウトし、不死化能への影響を、細胞増殖、細胞周期、テロメラーゼ活性において検証する事を試みた。その結果、IRM1のKO株を複数クローン得ることに成功した。そのうちの1株において、細胞増殖の遅延が観察された。しかしながら、IRM1の再導入によりレスキュー効果を確認した所、細胞の成育に回復が見られなかったことから、このIRM1 KO株の成育欠損は、オフターゲット効果が原因であること可能性が高いことが分かった。ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、体細胞へ特定の遺伝子(OCT3/4,SOX2,NANOG,KLF4等)を導入することにより、あらゆる細胞へ分化できる多分化能と無限に増殖できる自己複製能を併せ持つ細胞である。移植細胞が腫瘍化する原因として、(1)未分化細胞の残存、(2)形質転換細胞によるコンタミネーション、(3)製造工程または、移植後における形質転換細胞の発生が考えられる。そこで我々は製品中に含まれる形質転換細胞を検出するため、全てのがん細胞に共通する形質の一つである「不死化」に着目し、ヒトiPS細胞由来移植細胞に混入する不死化細胞検出法の開発を行ってきた。これまでに網膜色素上皮(RPE)細胞をモデルとして、不死化

RPE細胞マーカーIRM1(Immortalized RPE cell marker 1)遺伝子を同定し、IRM1 mRNAをqRT-PCRで測定することにより不死化RPE細胞を迅速に検出する試験法を開発している。IRM1は卵巣がん組織においても有意に高発現していることが報告されており、不死化と機能的に関与している可能性が予想できた。しかしながら、IRM1がどのようなメカニズムで不死化と関連しているのかは不明のままである。不死化RPE細胞株においてIRM1の過剰発現株を作成し、不死化への影響を調べた。その結果、IRM1過剰発現細胞では、細胞増殖、細胞周期、テロメラーゼ活性については変化が見られなかったが、細胞遊走能が有意に促進することが分かった。また、IRM1過剰発現細胞ではアクチン重合が促進していることも確認出来たことから、IRM1の過剰発現がアクチンフィラメントの再構成と関連を持つことが示唆された。IRM1は卵巣がん組織でも有意に高発現していることが報告されている。このことから、IRM1がRPE以外の細胞、組織においても不死化と関連している可能性が高いと考えられる。そこで、TissueScan Cancer and Normal Tissue cDNA Array (Origene)と呼ばれるcDNAキットを用いてIRM1のがん組織における発現量を網羅的に調べ、RPE細胞以外の細胞における、不死化マーカーとしての汎用性を検証した。その結果、IRM1は18種類のガン組織のうち、卵巣がんを含む5種類のがん組織(子宮頸部,結腸,肺,卵巣,精巣)において、各正常細胞と比べ有意に発現が上昇していることが分かった。また、IRM1の機能的を調べるため、不死化RPE細胞を用いてIRM1過剰発現株(CMV promoter)を作成し、細胞増殖、細胞周期、テロメラーゼ活性、細胞遊走能の変化を検証した。これまでの研究から、当初計画していたIRM1と不死化の直接的な関係性は示すことができなかったが、細胞遊走との関連性を新たな知見として得ることができた。従って、IRM1の機能解析研究としては概ね順調に進展していると考えている。ヒトiPS細胞由来移植細胞の安全性において最も懸念される問題は、移植細胞の腫瘍化である。移植細胞が腫瘍化する原因として、(1)未分化細胞の残存、(2)形質転換細胞によるコンタミネーション、(3)製造工程中または、移植後における形質転換細胞の発生が考えられる。そこで我々は製品中に含まれる形質転換細胞を検出するため、すべてのがん細胞に共通する形質の一つである「不死化」に着目し、ヒトiPS細胞由来移植細胞に混入する不死化細胞検出法の開発を行ってきた。これまでに網膜色素上皮(RPE)細胞をモデルとして、不死化
脂質過酸化初期反応生成物によるアミノリン脂質修飾機構の解明

●脂質過酸化の初期産物である「脂質ヒドロペルオキシド」はリン脂質のエタノールアミン部分と反応して「ヘキサノイルエタノールアミン(HEEA)」を生成すると推測し、その生成及び生理作用について検討を行ってきた。●生体内では、HEEAはリン脂質に結合した状態で存在すると考えられる。フォスファチジルエタノールアミン(PE)の場合、アミン部分への付加により「N-Hexanoyl-PE(NHPE)」が生じる。このNHPEを簡便に検出するため、サルモネラ・ミネソタ菌体をキャリアーとしたNHPE含有免疫源を用い、マウス脾臓に直接免疫して抗NHPEモノクローナル抗体を作製した。得られた抗体は1種類であり、タイプはIgMであった。エライザ法による特異性解析の結果、PEよりも、NHPEに結合することが明らかとなった。しかしながら各種のリン脂質との反応性について解析したところ非特異的な結合が認められたため、有用ではないと考えられた。●NHPEは脂肪酸側鎖の種類にバリエーションがあるため、単一物質としての検出定量は困難である。そこで部分構造であるHEEAに着目し、化学的な検出定量法について検討を行った。まず酸化LDLからNHPEをTLCにより粗分画し、phospholipase D処理を行った。この後、ジルコニウム沈殿によりリン脂質を除去し、HEEAを得て、これを四重極型HPLC-MS/MSにより分析した。合成HEEA標品と一致する溶出位置にHEEA構造に由来すると考えられる160.2/62のMS/MSフラグメントが検出された。現在、生体試料としてヒトの尿や血液、あるいは四塩化炭素投与した動物の臓器におけるHEEAの蓄積及びその検出について検討中である。1.脂質ヒドロペルオキシドはリン脂質のエタノールアミンの部分と反応して「ヘキサノイルエタノールアミン(HEEA)」を生成すると推測し、その生成について検討を行った。2.無水ヘキサン酸とエタノールアミンを反応させて、標品HEEAを調製した。また、フォスファチジルエタノールアミン(PE)を無水ヘキサン酸と反応させ、N-ヘキサノイルフォスファチジルエタノールアミン(NHPE)の合成を行った。HEEAは逆相HPLCにより、NHPEはTLCにより精製した。3.NHPEを簡便に検出するため、抗NHPE抗体の作製を検討した。脂質抗原であることから、サルモネラ・ミネソタ菌体をキャリアーとした免疫源を用い、これをマウス脾臓に直接免疫してモノクローナル抗体の作製を検討した。陽性ハイブリドーマが1株得られ、抗体のタイプはlgMであることがわかった。現在、特異性解析などを行っている。4.NHPEは脂肪酸側鎮の種類にバリエーションがあるため、化学的に単一な分子種として検出定量することは困難である。そこで部分構造であるHEEAに若目し、この化学的な定量法について検討を行った。四重極型のHPLC-MS/MSにより合成HEEAを分析したところ、160.2/62のMS/MSフラグメントが検出され、0.1ng/mlという低濃度でも充分に測定できることがわかった。今後は、生体からの微量検出を試みる予定である。5.NHPE生成による生体への影響を調べるため、培養細胞(HL60)を用い、NHPE投与によるアポトーシス誘導能(コメットアッセイ)に着目して検討した。数十mMという高浪度では、PEに比べてアポトーシス誘導能がある可能性が予備的な検討により認められたが、生体レベルで存在すると推測されるNHPEの濃度を考えるとN-ヘキサノイル体にはアポトーシス誘導能が無いと考えられた。
光ラセミ化-優先晶出による新規絶体不斉合成法の開発

アキラルな基質を溶液中で光照射すると二量化反応の進行に伴い結晶性の良い二量体が光学活性体として得られる現象を見出し,新しい絶対不斉合成の手法を開発した。この現象は光反応によるC2対称化合物が選択的に生じる反応であること,結晶がコングロメレートであり優先晶出が起こったこと,さらに,光反応による戻りの反応で見かけ上の二量体のラセミ化が進行したことによる。紫外線ランプでは80%eeを太陽光照射で50%eeの不斉合成を達成した。外的不斉源を用いない絶対不斉合成として,円偏光を用いる手法や結晶のキラリティーを利用する方法がある。これらの反応は,不斉源を用いずに光学活性化合物を提供できる理想的な合成法であるが,用いることのできる反応には制限があり,新しい反応の開発が強く求められている。我々は,クマリン(α-ピロン)の位置異性体であるクロモン(γ-ピロン)のカルボン酸誘導体(エステル,アミド,ニトリルなど)が溶液中の光反応により,C2対称の二量体を高効率,高収率,高選択的に生成することを初めて見出した。クロモンは,様々な天然物の色素成分として含まれるフラボノイドやカテキン,ビタミンPなどの基本骨格であり,これまで研究例が全くなかったのは奇跡的である。一般的にこのような芳香環を含む極性化合物の光二量化反応は,複数の立体異性体の混合物になるか,または,対称性の高いメソ体の二量体を与える。ところが,このクロモンカルボン酸誘導体の光照射により得られる生成物は,キラルなC2対称二量体の一種類であり,様々な反応への有効利用が可能な化合物である。生成物の物性を調査する中で,二量体がコングロメレートを与えるものを見出した。さらにこの二量体は同じ波長の光照射により原料のモノマーに選択的に開裂することで,二量体のラセミ化が同時に進行することになる。二量体はモノマーに比べ溶解度が低く光照射中に晶出してくる。この際に優先晶出が起こることで反応系全体が不斉増幅される,全く新しい反応系を見出した。21年度は二量化反応の効率,生成物の結晶構造解析,複数の基質での再現性の検証を行い,本手法の一般性と有効性を明らかにすることができた。Br基を有するエチルエステルの二量体の他にCl基を有する基質もコングロメレートを与えることを見出した。光反応を結晶化の条件を種々検討したところ,-40°Cでの光照射で80%eeの不斉発現と増幅反応に成功した。この際に優先晶出が起こることで反応系全体が不斉増幅される,全く新しい絶対不斉反応系を見出した。21年度には二量化反応の効率,生成物の結晶構造解析,複数の基質での再現性の検証を行い,本手法の一般性と有効性を明らかにすることができた。22年度は前年度の結果を受けて,CIETの条件検討を行い,太陽光照射で50%eeの不斉発現と増幅反応に成功した。さらに本手法をジアステレオ選択的反応に展開し,アミド側鎖に光学活性なフェネチル基を導入し,結晶化を伴いながらの光照射により,約80%deの動的エピ化を伴う優先的結晶化を実現した。