hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個体における遺伝子操作を用いた神経芽腫原因遺伝子の同定と治療への応用

我々は本研究テーマでコンディショナル・ジーンターゲティング法を用いて、神経芽腫の発生母地である神経堤細胞の分化発生過程におけるWnt signalの役割とその制御機構について解析を行ってきた。これまでに、神経堤細胞特異的にAPCを欠損したマウス胎仔では、骨・軟骨や心血管流出部に分化する神経堤細胞由来組織にアポトーシスが誘導され、その結果頭頚部異常や心血管異常がみられることを報告している。(Proc Natl Acad Sci USA 2002Jan 8;99(1):297-302)今年度はWntシグナルでAPCの下流で作用しているβカテニンの関与について、神経堤細胞特異的な活性型変異βカテニン発現マウス、βカテニン単独欠損マウス、APC/βカテニン二重欠損マウスを作製してより詳細な解析を行った。活性型変異βカテニン発現マウスでは胎生中期でも第一鯉弓以外の部位(頭部腹側、心血管流出路)でAPC欠損マウスと同様なβカテニンの蓄積とアポトーシスの誘導がみられ、その結果頭頚部異常・骨軟骨形成不全・心血管異常が確認された。従って、過剰なβカテニンの蓄積によってアポトーシスが誘導されること、神経堤細胞由来組織の大部分ではAPCはβカテニンの唯一の抑制因子になっているが、第一鯉弓においてはAPC以外の負の調節因子が積極的に関与していることが示唆された。APCαβカテニン二重欠損マウスではAPC欠損マウスの表現型が一部消失することが分かり、Wnt signalの異常な活性化がAPC欠損マウスの表現型に深く関与していることを強調する結果となった。また、βカテニン単独欠損マウスでは胎生中期で神経堤細胞の増殖能障害・アポトーシスの増加がみられ、出生時に頭頚部異常・骨軟骨形成不全を呈することが確認された。しかし、明瞭な心血管異常は確認できなかったことから、頭部神経堤細胞の発生分化過程においてβカテニンが必須であるが、心臓神経堤細胞の心血管流出路への発生分化過程においてβカテニンは必須ではないことが今回初めて明らかとなった。我々は本研究課題でコンディシヨナル・ジーンターゲティング法を用いて、神経芽腫の発生母地である神経堤細胞の分化発生過程におけるWnt signalの役割とその制御機構について解析を行ってきた。神経堤細胞特異的なAPC欠損マウスや活性型変異βカテニン発現マウスでは、重篤な頭頚部異常・骨軟骨形成不全や心血管異常(心室中隔欠損、総動脈幹)が観察され、両者がほぼ同様な表現型を呈することが判明した。また、発生過程においても両者とも頭部腹側、第一鰓弓、心血管流出路といった神経堤細胞由来組織へのβカテニン蓄積とアポトーシスの誘導が確認されたことから、過剰なβカテニンの蓄積によってアポトーシスが誘導されること、APCはβカテニンの唯一の抑制因子になっていることが示唆された。さらに、APC/p53二重欠損マウスや活性型変異βカテニン発現/p53欠損マウスを作製し、野生型p53をもつ変異マウスとそれぞれ比較検討した結果、このアポトーシスはp53非依存性であることが確認された。一方、Wntシグナルが不活化されている神経堤細胞由来組織特異的βカテニン単独欠損マウスでは頭頚部異常・骨軟骨形成不全が観察された。その原因は胎生中期の神経堤細胞の増殖能障害、アポトーシスの増加であることが示唆され、頭部神経堤細胞の発生分化過程においてβカテニンが必須であると考えられた。しがしながら、明らかな心血管異常は確認されなかったことから、心臓神経堤細胞の心血管流出路への発生分化過程においてβカテニンは必須ではないことが今回初めて明らかとなった。我々はこれまでにマウス胎仔の神経堤細胞特異的にAPCをノックアウトし、Wnt signalを活性化させることによって神経堤細胞にアポトーシスが誘導されることを見いだしている。(投稿改訂中)神経堤細胞の発生・分化に対するWnt signalの関与をより詳細に知るため、今年度は神経堤細胞特異的にβカテニンをノックアウトし、Wnt signalを不活化することによる影響を解析した。この解析もコンディショナル・ジーンターゲティング法を用いて行った。神経堤細胞特異的にβカテニンをノックアウトされたマウス胎仔(以下、P0βcat.マウス)は胎生致死ではないものの、顔面形成不全・頭頸部骨格形成不全等の異常をきたすことが確認された。これからWnt signalが神経堤細胞の発生・分化に不可欠であることが確かめられた。顔面形成不全・頭頸部骨格形成不全等の異常は外見上APCを神経堤細胞特異的にノックアウトされた胎仔(以下、P0APCマウス)に類似している。しかし、P0APCマウスの胎生中期にみられた鯉弓中央部、心大血管流出部でのアポトーシスの亢進はPOβcat.マウスではみられず、異なったメカニズムで異常が生じていると考えられた。今後、P0βcat.マウスの神経堤細胞が増殖・遊走・分化いずれの段階で異常をきたしているのか詳細に検討し、神経堤細胞におけるβカテニンやWnt signalの機能解析を進めてゆく予定である。我々はこれまでにコンディショナル・ノックアウト法を用いて、マウス胎仔の神経堤細胞特異的にAPCをノックアウトし、Wnt signalを活性化させることによって、主に骨・軟骨に分化する神経堤細胞にアポトーシスが誘導されることを発表した。(Proc Natl Acad Sci U S A 2002Jan 8 ; 99(1 ; 297-302)

神経堤細胞の発生・分化に対するWnt signalの関与をより詳細に知るため、同法を用いて神経堤細胞特異的にβカテニンをノックアウトし、Wnt signalを不活化することによる影響の解析を行った。このマウスでも顔面形成不全・頭頸部骨格形成不全等の異常をきたすことが確認され、Wnt signalが神経堤細胞の発生・分化に不可欠であることが確かめられた。両者のマウスの表現型は一見類似していたが、前者のマウスの胎生中期にみられた第一鰓弓中央部、心大血管流出部でのアポトーシスの亢進は後者ではみられず、異なったメカニズムで異常が生じていると考えられた。分化・遊走・増殖のいずれの段階で異常をきたしているかについて、現在様々な手法を用いて解析中である。今年度はさらに、神経堤特異的な、APCとβカテニンの二重特異マウス、神経堤特異的にβカテニンを過剰発現させたマウスを作製した。これらのマウスでもやはり顔面形成不全・頭頸部骨格形成不全等の異常をきたすことが確認された。今後、これらのマウスの表現型の差異を比較検討することによって、神経堤細胞におけるWnt signalの機能解析をより詳細に進めてゆく予定である。我々は本研究テーマでコンディショナル・ジーンターゲティング法を用いて、神経芽腫の発生母地である神経堤細胞の分化発生過程におけるWnt signalの役割とその制御機構について解析を行ってきた。これまでに、神経堤細胞特異的にAPCを欠損したマウス胎仔では、骨・軟骨や心血管流出部に分化する神経堤細胞由来組織にアポトーシスが誘導され、その結果頭頚部異常や心血管異常がみられることを報告している。(Proc Natl Acad Sci USA 2002Jan 8;99(1):297-302)今年度はWntシグナルでAPCの下流で作用しているβカテニンの関与について、神経堤細胞特異的な活性型変異βカテニン発現マウス、βカテニン単独欠損マウス、APC/βカテニン二重欠損マウスを作製してより詳細な解析を行った。活性型変異βカテニン発現マウスでは胎生中期でも第一鯉弓以外の部位(頭部腹側、心血管流出路)でAPC欠損マウスと同様なβカテニンの蓄積とアポトーシスの誘導がみられ、その結果頭頚部異常・骨軟骨形成不全・心血管異常が確認された。従って、過剰なβカテニンの蓄積によってアポトーシスが誘導されること、神経堤細胞由来組織の大部分ではAPCはβカテニンの唯一の抑制因子になっているが、第一鯉弓においてはAPC以外の負の調節因子が積極的に関与していることが示唆された。APCαβカテニン二重欠損マウスではAPC欠損マウスの表現型が一部消失することが分かり、Wnt signalの異常な活性化がAPC欠損マウスの表現型に深く関与していることを強調する結果となった。また、βカテニン単独欠損マウスでは胎生中期で神経堤細胞の増殖能障害・アポトーシスの増加がみられ、出生時に頭頚部異常・骨軟骨形成不全を呈することが確認された。しかし、明瞭な心血管異常は確認できなかったことから、頭部神経堤細胞の発生分化過程においてβカテニンが必須であるが、心臓神経堤細胞の心血管流出路への発生分化過程においてβカテニンは必須ではないことが今回初めて明らかとなった。
生理活性リゾリン脂質による歯周病態形成制御

血小板より産生される生理活性リゾリン脂質スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の歯周病態形成への関与について検討した。本研究期間においては歯周組織構成細胞である歯肉線維芽細胞(HGF)に及ぼすS1Pの影響を検討した。S1P刺激によりHGFから炎症性サイトカイン(IL-6,IL-8)産生が誘導され、HGF上の接着分子CD54の発現も増大することが明らかとなった。S1Pによる効果はS1P2受容体アンタゴニスト存在下では抑制された。このことからS1Pによって誘導されるHGFの炎症性反応はS1P2受容体を介している可能性が示唆されるとともに、炎症性歯周疾患においてS1Pは炎症性メディエーターとしての役割を果たしている可能性が考えられる。歯肉線維芽細胞におけるS1P受容体の発現をRT-PCR法にて検討したところ、5つのサブタイプを持つS1P受容体のうち、歯肉線維芽細胞はS1P2、S1P3を発現していた。S1P濃度は血漿では約190nM、血清では約480nMであり、炎症部位ではさらに高濃度であることが予想される。そこで歯肉線維芽細胞をS1P100nM20μM存在下で歯周病原性細菌P.gingivalisのLPSにて刺激して、その培養上清を採取した。歯肉線維芽細胞より産生される培養上清中のIL-6をELISA法を用いて検討したところ、歯肉線維芽細胞はS1P濃度依存的にIL-6産生を産生した。特にS1P 10μMの濃度で最もIL-6産生を誘導した。また歯肉線維芽細胞をE.coliのLPSにて刺激したところ、IL-6産生はP.gingivalis LPS刺激時と同様にS1P濃度依存的に増加する傾向を示した。次にIL-6産生にはどのS1P受容体が関与しているかを検討するため、歯肉線維芽細胞にS1P受容体特異的アンタゴニストを30分前処理させた後、S1PとP.gingivalis LPSを共刺激した。S1P受容体特異的アンタゴニストのうち、S1P2受容体特異的アンタゴニストであるJTE013で前処理した歯肉線維芽細胞ではS1PとLPSの共刺激によるIL-6の産生を顕著に抑制した。以上の結果よりS1P刺激によって歯肉線維芽細胞より誘導されるIL-6産生にはS1P2受容体が関与していることが示唆された。S1P濃度は血漿では約190nM、血清では約480nMであり、活性化された血小板より大量のS1Pが産生されることから炎症部位ではさらに高濃度であることが予想される。炎症時、歯肉線維芽細胞は活性化されると細胞表面接着分子であるCD54の発現を誘導する。今年度は歯肉線維芽細胞におけるCD54の発現に及ぼすS1Pの影響を検討した。10microM S1PはP.gingivalis LPSとの共刺激で歯肉線維芽細胞におけるCD54の発現をLPS単独刺激群よりも増強させた。S1Pによって誘導されたCD54発現増強にはどのS1P受容体サブセットが関与しているかを検討するため、歯肉線維芽細胞にS1P受容体サブセット特異的アンタゴニストを30分前処理させた後、S1P 10microMとLPSを共刺激した。S1P受容体サブセット特異的アンタゴニストのうち、S1P2受容体特異的アンタゴニストであるJTEO13で前処理した歯肉線維芽細胞ではS1PとLPSの共刺激によるCD54発現を顕著に抑制した。以上の結果よりS1P刺激によって歯肉線維芽細胞において誘導されるCD54発現にはS1P2受容体が関与していることが示唆された。S1P濃度は血漿では約190nM、血清では約480nMの濃度で存在する。活性化された血小板より大量のS1Pが産生されることから炎症部位ではさらに高濃度であることが予想される。今年度はS1P刺激により歯肉線維芽細胞内にカルシウム流入が引き起こされるか否かについて検討した。歯肉線維芽細胞上のS1P受容体であるS1P1、S1P2、S1P3のアンタゴニストで前処理した上で、S1P刺激を加えると細胞内カルシウム流入の程度は、アンタゴニスト非存在下でS1P刺激した群と比較して低かった。歯肉線維芽細胞におけるI1-6の産生および接着分子であるICAM-

1の発現に及ぼすSIPの影響を検討したところ、10^<-5>M S1Pは歯周病原性細菌であるP.gingivalisのLPSとの共刺激で歯肉線維芽細胞におけるIL-6の産生とICAM-1の発現をLPS単独刺激群よりも増強させた。その効果はS1P2アンタゴニスト前処理群でほぼ抑制された。以上の結果よりS1Pは歯周組織において歯肉線維芽細胞よりIL-6、ICAM-1を発現させることにより歯周病病態形成に関与していることが示唆された。さらにS1P刺激による歯肉線維芽細胞からのIL-6、ICAM-1発現はS1P2を介していることが明らかとなった。現在、歯周病患者における歯肉溝滲出液中のS1P濃度計測のためのサンプリング中である。
すばる望遠鏡による10GeV領域におけるガンマ線天体観測

本研究では、CANGAROO望遠鏡と同じ機能のカメラ平成10年完成予定の「すばる望遠鏡」の主焦点に取り付けてガンマ線観測を行なうためのシステムを準備を行なった。ガンマ線PMTカメラの集光器の設計は、CANGAROO望遠鏡で進行中の大口径望遠鏡計画で用いるPMTカメラの集光器の設計も兼ねて行なった。集光器の形状を決めるために色々な形状を考え、その集光率をシミュレーションによって計算した。曲面によって反射面を成形するのは困難であるが、比較のため曲面形状による集光率のシミュレーションも行なった。シミュレーションは望遠鏡の口径が7mと10mの場合について行なった。7m口径についての結果はやはり曲面形状のものが集光率75.5%と一番良いが、その曲面を平らな多面で近似したものでも74.0%の集光率が得られ、反射面を容易に成形できる平面タイプで充分なことが判った。次期CANGAROO望遠鏡と同じ口径10mの場合は、鏡からの反射光が大角度でカメラへ入射するため、集光率は60%になる。また3.8m鏡用に開発した集光器を用いて反射材を試験したところ、メッキしたものより、アルミマイラシートを張り付けるほうが、集光力が10%程良いことが判った。コンパクトなデータ収集システムの一部として、32チャンネルのCAMAC・ADCモジュールを購入した。これはガンマ線PMTカメラの読み出し用である。CANGAROO3.8mデータ収集システムも、TKO・KIM・CAMAC・VME(OS9)を用いたものからVME(OS9)の代わりにVME(SUN OS)が導入されたので、このシステムで「すばる望遠鏡」による観測も行なえるように、モジュールのテストなどを行なっている。
日本人喫煙者のたばこ特異的ニトロソアミン尿中代謝物量と喫煙行動との関連性

たばこ主流煙には、発がん物質のたばこ特異的ニトロソアミン(TSNA)が含まれる。4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL)は,TSNAのNNKの代謝物であり、尿中に排泄される。本研究は、3種類の固相抽出法とHILICカラムを使用した高速液体クロマトグラフー質量分析計を組合せて尿中NNAL分析法を開発し、日本人喫煙者の曝露実態を調査した。日本人喫煙者98名の尿中NNAL(pg/mg creatinine)を測定したところ全試料から検出され,平均値は92.5であった。尿中NNAL量は,喫煙行動と各種バイオマーカーと相関関係が認められた。たばこ葉及びたばこ煙中には4種類のTSNAが含まれ,特に,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK)は,国際がん研究機関(IARC)の発がん性リスク一覧においてGroup 1(ヒトに対する発がん性が認められる)に指定されており,喫煙者の健康に影響を与えると懸念されている。このNNKは,生体内で4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol(NNAL)に代謝後,尿中に排泄されることから,尿中NNAL量は,たばこ煙中発がん性物質の曝露指標となると考えられる。そこで本研究では,尿中NNALの測定法を確立することを目的とした。尿中NNALの抽出を目的として3種類のカラム(ケイソウ土カラム,ENVIーCarb,OasisーMCX)を組み合わせた固相抽出法を検討した。各カラムの最適条件は,ケイソウ土カラムの溶出液がジクロロメタン/2ープロパノール溶液(95/5),ENVIーCarbが0.1%酢酸含有50%メタノール溶液,OasisーMCXが2%アンモニア含有メタノール溶液となった。次に,グルクロン酸抱合体の脱抱合処理の検討を酵素βーグルクロニダーゼを用いて行った。その結果,酵素反応は,尿試料2.5 mLに10,000 unitsの酵素を添加し,pH 4.5,37°C,40時間とした。続いて,喫煙者の尿試料を用いて同時再現性測定(3試料,n=5),日間再現性測定(3試料,n=3/日,5日間)を行ったところ,変動係数(CV)は2.8ー6.0%,1.3ー5.1%となり,安定した結果が得られた。さらに,添加回収試験(2試料,n=3)によるNNALの回収率は71.0ー126%であり,本測定法による尿中NNALの定量下限値は,2 pg/mLであった。たばこ煙中には,4種類のたばこ特異的ニトロソアミン(TSNA)が含まれている。なかでも,4-(methylnitrosamino)-1- (3-pyridyl)-1-butanone(NNK)は国際がん研究機関(IARC)発がん性リスクグループ1(ヒトに対する発がん性が認められる)に指定されており,喫煙者に健康影響を与えることが懸念される。このNNKは生体内で4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol(NNAL)に代謝後,尿中に排泄されることから,尿中NNAL量は,喫煙者のたばこ煙中発がん性物質の曝露指標となると考えられる。さらに,ニコチンの代謝物であるコチニン、3-ハイドロキシコチニンよりも生体内半減期が長いことから中期のたばこ特異的なバイオマーカーとされている。本研究は,尿中NNAL分析法を確立し,日本人喫煙者の曝露量を分析し,同時に他のバイオマーカー及び喫煙行動との関連性の調査を目的とした。今年度は,25年度に確立した尿中NNAL分析法を用いて,日本人喫煙者98名中70名の実態調査を行った。次年度では、残り28名についても分析を行い、日本人喫煙者の尿中NNAL値と喫煙行動の関連性について解析を進める。尿中NNAL量(pg/mg creatinine)は,日本人喫煙者98名の全試料から検出され,平均値は92.5±55.1となり,最高値は298,最低値は10.0であった。これらの分析結果は、研究参加者の年齢,1日の喫煙本数,唾液中コチニン(ニコチン代謝物)量,呼気中一酸化炭素濃度,1日の総吸煙量,酸化ストレスマーカーの8-OHdG及び8-isoprostane量と相関関係が認められた(p<0.001)。海外の喫煙者の尿中NNAL量と比較すると日本人喫煙者の尿中NNAL量は低値であった。これは,我々のたばこ主流煙のたばこ特異的ニトロソアミン類(tobacco specific nitrosamines;TSNAs)の先行研究から,国産たばこは、海外産たばこと比較するとNNKが低く抑えられていることと一致する。一方で,国産たばこ主流煙には発がん性のあるTSNAのN'-nitrosonornicotineが多く含まれるため,この代謝物分析法の開発も必要である。本研究は、3種類の固相抽出法とHILICカラムを使用した高速液体クロマトグラフー

質量分析計を組合せて尿中NNAL分析法を開発し、日本人喫煙者の曝露実態を調査した。日本人喫煙者98名の尿中NNAL(pg/mg creatinine)を測定したところ全試料から検出され,平均値は92.5であった。尿中NNAL量は,喫煙行動と各種バイオマーカーと相関関係が認められた。25年度に確立した尿中NNAL分析法を利用して,日本人喫煙者98名中70名の尿中NNAL分析を終了した。衛生学25年度に確立した尿中NNAL分析法を利用して,日本人喫煙者の98名中70名の尿中NNAL分析を終了した。最終年度では,残りの尿中NNAL分析と喫煙行動及び他のバイオマーカーとの関連性について解析を進める計画である。また,海外喫煙者との報告とも比較検討を行い,日本人特有の曝露実態を解明する。予定した日本人喫煙者の尿中NNAL分析がすべて終了しなかった。そのため次年度に残りの分析を行うために、消耗品の購入が必要になるため。今後は,確立した尿中NNAL前処理法とLC/MS/MS分析を組合わせたNNAL測定法を利用し,これまでに申請者が喫煙行動,各種バイオマーカーの測定を行った日本人喫煙者100名の尿試料の測定を行う。また,これまで未測定項目であった尿中ニコチン代謝物(ニコチン,コチニン,3ーハイドロキシコチニン),脂質の酸化ストレスマーカーである8-イソプロスタンの測定も行う。最終年度では,本研究において得られた尿中NNAL量等と,これまで申請者が行ってきた日本人喫煙者の喫煙行動とバイオマーカーとの関係性を評価する。尿中NNAL分析に必要な酵素、前処理カラム、分析用カラム、有機溶媒を購入する予定である。次年度に実施する喫煙者の尿中NNALの分析に必要な数種類の固相抽出カラムとグルクロン酸抱合体と反応させる酵素及びLC/MS/MSの分析用カラムの購入に費用がかかるため。さらに,尿中ニコチン代謝物(ニコチン,コチニン,3ーハイドロキシコチニン),脂質の酸化ストレスマーカーである8-イソプロスタンの分析も行うために消耗品の購入費が必要になるため。酵素反応処理を行った尿試料を珪藻土カラム,ENVI-CarbそしてOasis-MCXの順に固相抽出を行う。その後,得られた抽出液をLC/MS/MSに供する。また,これまで未測定項目であった尿中ニコチン代謝物(ニコチン,コチニン,3ーハイドロキシコチニン),脂質の酸化ストレスマーカーである8-イソプロスタンの分析も行う。
変調光検波方式アイセーフ帯スマートイメージセンサの研究

振り分け転送方式による変調光検波方式イメージセンサにおける画像特性を改善するため,画素回路やイメージセンサの試作・評価を行った.詳細な評価により出力特性劣化の原因を明らかにした.この結果から画素構造,動作タイミングを改良することで,画像特性を改善し良好な変調光成分撮像画像を得ることができた.今後の課題として,変調光撮像画像の画質の一層の改善があげられる.まず,固定パターンノイズの除去については通常のイメージセンサに導入されている相関2重サンプリング回路の導入が望まれる.また,現在の方式では背景光成分も2つの蓄積部に加算蓄積し2つの出力の差分をとることで変調光成分の検出を行っているが,変調光成分のみを加算蓄積していくことができれば,変調光検出の精度を大幅に改善することができると考えられる.またアイセーフ帯への適用を目指して0.8μm SiGe BiCMOSプロセスを用いたイメージセンサの試作を行った.イメージセンサ試作に先立ちPDとPhototransistorをSiGeとSiで作製し各々の受光素子の基本特性の評価を行った.Si受光素子との明確な差は得られなかった.これはGe組成比が0.1程度と低いことに起因すると考えられる。但しデバイスシミュレーションの結果とは異なる点もあり,歪みSiGe薄膜の吸収係数など今後の検討が必要である.試作したイメージセンサは32×32画素を有しており,撮像面内を4分割し各々の受光素子としてSi-PD,Si-PT,SiGe-PD,SiGe-HPTを配置し,基本特性の比較を行った.SiGe BiCMOSプロセスを用いて撮像が可能であることを実験的に示した.振り分け転送方式による変調光検波方式イメージセンサにおける画像特性を改善するため,画素回路やイメージセンサの試作・評価を行った.詳細な評価により出力特性劣化の原因を明らかにした.この結果から画素構造,動作タイミングを改良することで,画像特性を改善し良好な変調光成分撮像画像を得ることができた.今後の課題として,変調光撮像画像の画質の一層の改善があげられる.まず,固定パターンノイズの除去については通常のイメージセンサに導入されている相関2重サンプリング回路の導入が望まれる.また,現在の方式では背景光成分も2つの蓄積部に加算蓄積し2つの出力の差分をとることで変調光成分の検出を行っているが,変調光成分のみを加算蓄積していくことができれば,変調光検出の精度を大幅に改善することができると考えられる.またアイセーフ帯への適用を目指して0.8μm SiGe BiCMOSプロセスを用いたイメージセンサの試作を行った.イメージセンサ試作に先立ちPDとPhototransistorをSiGeとSiで作製し各々の受光素子の基本特性の評価を行った.Si受光素子との明確な差は得られなかった.これはGe組成比が0.1程度と低いことに起因すると考えられる。但しデバイスシミュレーションの結果とは異なる点もあり,歪みSiGe薄膜の吸収係数など今後の検討が必要である.試作したイメージセンサは32×32画素を有しており,撮像面内を4分割し各々の受光素子としてSi-PD,Si-PT,SiGe-PD,SiGe-HPTを配置し,基本特性の比較を行った.SiGe BiCMOSプロセスを用いて撮像が可能であることを実験的に示した.変調光検波方式とは,特定の周波数で強度変調をかけた光源で被写体を照明し,その反射光から変調成分のみを検出するものである.イメージセンサでこれが実現できれば,背景光に依存しない撮像が可能となる.例えば,直射日光が差し込むような照明施設が充分でない環境下での製品検査ラインへの適用や,ITSなど車載関連などのさまざまな分野に応用できると予想される.我々は,CMOSイメージセンサの画素回路に,2つの信号電荷蓄積部を設けることで,変調光を電荷蓄積モードで検波可能にする電荷振り分け転送方式を提案している.この方式は従来の方式に比べ,感度やS/Nの向上,また,画素内にキャパシタを用いないため画素サイズの縮小が可能となる.0.35μm標準CMOSプロセスを用いて試作した25μm□画素回路で,100μW/cm2の定常光の下で5kHzの変調光を入射し,変調光検波動作を確認した.また,0.6μm標準CMOSプロセスを用いて64x64画素の変調光検波方式CMOSイメージセンサを試作し,変調光成分のみの画像出力を確認した.本方式は汎用プロセスで設計したセンサで変調光検波動作をさせるために受光部にフォトゲートを用いている.これは信号電荷をFDに充分転送できるようにするためである.しかし,汎用プロセスの制限でフォトゲートの両サイドに寄生のn-diffが存在するため信号電荷をFDに完全転送できる構造ではないと考えられる.現在はCMOSセンサ用のプロセスで埋め込みPDによる信号電荷完全転送構造などが研究されており,将来これを用いれば変調光をより高精度に検波できると考えられる.本研究では変調光検波方式イメージセンサの出力特性を改善し,良好な変調光撮像画像を得ることを目的とした.そのため,0.35μmや0.6μm CMOSプロセスを用いて画素回路やイメージセンサの試作し評価を行った.まず,出力特性評価用に試作した画素回路について詳細な評価を行い,出力特性の劣化が「寄生N-DIFF」,「拡散キャリア」,「残留電荷」の影響によるものであることを明らかにした.次に,試作した64×64画素の変調光検波方式イメージセンサの評価を行い,変調光成分のみの撮像を確認し,マーカ検出への応用を示した.

さらに,変調光撮像画像の高画質化を目指し,ソフトウェア処理による固定パターンノイズの抑制によりノイズを1/27に抑制することができた.また,解像度向上のため試作した128×128画素の変調光検波方式イメージセンサでの変調光成分画像の撮像を確認した.次に,出力特性劣化の原因として明らかになった「寄生N-DIFF」,「拡散キャリア」,「残留電荷」のそれぞれの影響について詳細に検討し改善を試みた.「寄生N-DIFF」の影響により少量電荷が転送されず,光量の低照度側で出力がでない問題については,寄生N-DIFFの電位をリセットすることで解決した.また,「拡散キャリア」・「残留電荷」の影響により,電荷を転送していない側の電荷蓄積部の電位が減少するため,出力が正常な飽和特性を示さずに減少していく問題があった.これらの影響については,オーバーフロードレインの導入により拡散キャリアの影響を約1/12に,残留電荷掃き出し動作によって残留電荷の影響を約1/30に抑制することができ,正常な出力特性を得ることができた.これらの改良を加えた画素回路で新たに64×64画素のイメージセンサを試作し評価を行った結果,画像特性改善の効果が確認でき,良好な変調光成分撮像画像を得ることができた.振り分け転送方式による変調光検波方式イメージセンサにおける画像特性を改善するため,画素回路やイメージセンサの試作・評価を行った.詳細な評価により出力特性劣化の原因を明らかにした.この結果から画素構造,動作タイミングを改良することで,画像特性を改善し良好な変調光成分撮像画像を得ることができた.今後の課題として,変調光撮像画像の画質の一層の改善があげられる.まず,固定パターンノイズの除去については通常のイメージセンサに導入されている相関2重サンプリング回路の導入が望まれる.また,現在の方式では背景光成分も2つの蓄積部に加算蓄積し2つの出力の差分をとることで変調光成分の検出を行っているが,変調光成分のみを加算蓄積していくことができれば,変調光検出の精度を大幅に改善することができると考えられる.またアイセーフ帯への適用を目指して0.8μm SiGe BiCMOSプロセスを用いたイメージセンサの試作を行った.イメージセンサ試作に先立ちPDとPhototransistorをSiGeとSiで作製し各々の受光素子の基本特性の評価を行った。Si受光素子との明確な差は得られなかった.これはGe組成比が0.1程度と低いことに起因すると考えられる.但しデバイスシミュレーションの結果とは異なる点もあり,歪みSiGe薄膜の吸収係数など今後の検討が必要である.試作したイメージセンサは32×32画素を有しており,撮像面内を4分割し各々の受光素子としてSi-PD, Si-PT, SiGe-PD, SiGe-HPTを配置し,基本特性の比較を行った.SiGe BiCMOSプロセスを用いて撮像が可能であることを実験的に示した.
双性イオン型求核触媒活性種を活用するエステル不斉塩基加水分解反応の開発

光学活性カルボン酸は有用な医薬中間体であり、その効率的合成法の開発は重要である。酵素によるエステル不斉加水分解は光学活性カルボン酸の優れた合成法であるが、比活性が低い等の問題を抱えている。その一方で、人工触媒を用いた手法では合成化学的に有用な触媒系の開発には至っていない。本研究では、キラル四級アンモニウムアルコールを触媒としたアミノ酸エステル類の不斉塩基加水分解反応の開発に取り組んだ。検討の結果、嵩高い置換基をもつN-保護アミノ酸エステルに対し高立体選択的に反応が進行することを見出した。また、関連するエステル塩基加水分解を伴う不斉プロトン化に有効な新規触媒系の開発にも成功したので報告する。28年度の研究では、新規四級アンモニウムアルコキシドの合成を検討したが、最終段階である三級アミンのアルキル化の段階が容易に進行せず、触媒合成が難航している。また、一部、新たに合成できた四級アンモニウムアルコキシドもあるが、アミノ酸エステルおよびエノールエステル類の不斉塩基加水分解反応では、触媒作用は示したものの、高い立体選択性の発現には至らなかった。その一方で、関連するシンコナアルカロイド由来の相間移動触媒を用いたアミノ酸エステル類の不斉加水分解反応において、詳細な触媒および反応条件検討を行ったところ、N-ベンゾイル-tert-ロイシン由来のラセミ体アミノ酸エステルを基質とした際に、高収率かつ高立体選択的に不斉塩基加水分解が進行する系を見出した(最大97%収率、91% ee)。また、ほぼ反応が完結した状態でも目的成生物が高い光学純度で得られていることから、本反応系は、基質のラセミ化を伴いながら反応が進行する動的速度論分割型の反応であることがわかる。また、基質N上の保護基が立体選択性に与える影響を調べるため、N上の保護基として、ベンゾイル基の代わりにピバロイル基、Boc基を有する基質で反応の検討を行ったところ、Boc基を有する基質では立体選択性が大きく低下することがわかった。さらに、基質α位の置換基効果を確認するため、α位にメチル、ベンジル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル基を有する基質を合成し、検討を行ったところ、立体障害が大きくなるほど高い選択性で反応が進行することが明らかになった。28年度の研究では、アンモニウムアルコール触媒の合成については、合成の最終段階であるアルキル化反応が進行しづらく現在難航しているものの、関連するアミノ酸エステルの不斉塩基加水分解において、シンコナアルカロイド由来の不斉相間移動触媒を用いた系を最適化した結果、高収率かつ高立体選択的(最大97%、91%ee)に進行することを見出すことに成功している。また、本反応の基質窒素原子上の保護基、およびα位の置換基が反応性、立体選択性に与える影響についても検討し、N-ベンゾイル保護を有するアミノ酸エステルが最も高い選択性を与えることがわかった。また、α位の置換基としては、メチル、ベンジル、イソプロピル、フェニル、t-ブチル基を検討し、立体的に嵩高いほど高い選択性を与えることが明らかになった。また、触媒の構造として、シンコナアルカロイドのキヌクリジン窒素原子上にオルトシアノベンジル基を有するものが高い選択性を発現する。また、オルト位にシアノ基の代わりにフェニル基を有する触媒でも良好な選択性を示すが、その一方で2,6-ジシアノベンジル基を有する触媒では選択性が大きく低下することから、シアノ基の官能基としての性質よりもオルト位への置換基導入による立体的影響が選択性発現に関してより大きく寄与していることがわかる。また、アンモニウムアルコール触媒以外に、新たにホスホニウム-チオウレア二官能性相間移動触媒を合成し、エノールエステル類の不斉加水分解反応において良好な選択性を示すことがわかった。シンコナアルカロイド由来のキラル相間移動触媒を用いたアミノ酸エステル類の不斉加水分解を検討したところ、高収率かつ高立体選択的に不斉塩基加水分解が進行する系を見出した。また、様々な基質を用いて検討を行ったところα位に嵩高いアルキル置換基を有するもので特に高い立体選択性が発現することがわかった(最大96:4 er)。さらに、実験化学的な手法による反応機構解析を行ったところ、エステル基質のラセミ化は、系中でのアズラクトンの生成と続く、アズラクトンのラセミ化、アルコールによる開環反応を経由することで生じることが示唆される結果が得られた。また、研究協力者の蒲池准教授が開発した、ConFinderプログラムを用いる擬似遷移状態探索手法を利用して本触媒系における立体選択性の発現機構の解明を試みた。その結果、実験結果と良い一致を示す遷移状態構造の特定に成功した。また、この遷移状態構造の解析により、基質-触媒間のπ-π相互作用や非古典的水素結合が選択性の発現において重要であることが示唆された。また、キラルな四級ホスホニウム塩触媒を用いてエノールエステル類の加水分解的不斉プロトン化反応を検討したところ、アミノ酸由来の四級ホスホニウムチオウレア触媒を用いることで、環状ケトン類から誘導したエノールエステル類の不斉プロトン化が、極めて高い立体選択性で進行することが見出された。触媒スクリーニングの結果から触媒上のチオウレア基、四級ホスホニウム基それぞれが立体選択性発現において必須であることが示唆される結果が得られている。基質適用範囲も広く、68員環の環状ケトンから誘導したエノールエステル基質において高い選択性が発現することを確認している(9097% ee)。

光学活性カルボン酸は有用な医薬中間体であり、その効率的合成法の開発は重要である。酵素によるエステル不斉加水分解は光学活性カルボン酸の優れた合成法であるが、比活性が低い等の問題を抱えている。その一方で、人工触媒を用いた手法では合成化学的に有用な触媒系の開発には至っていない。本研究では、キラル四級アンモニウムアルコールを触媒としたアミノ酸エステル類の不斉塩基加水分解反応の開発に取り組んだ。検討の結果、嵩高い置換基をもつN-保護アミノ酸エステルに対し高立体選択的に反応が進行することを見出した。また、関連するエステル塩基加水分解を伴う不斉プロトン化に有効な新規触媒系の開発にも成功したので報告する。前年度の研究において、新規四級アンモニウムアルコキシドの合成を検討したが、最終段階である三級アミンのアルキル化の段階が容易に進行せず、合成が難航している。また、新たに合成できた触媒もあるが、エステルの不斉塩基加水分解反応における高い選択性の発現には至らなかった。その一方で、関連するシンコナアルカロイド由来の相間移動触媒を用いたアミノ酸エステル類の不斉加水分解を検討したところ高収率かつ高立体選択的に不斉塩基加水分解が進行する系を見出した。これらの経緯を踏まえ、本年度の研究計画を以下に示す。【基質適用範囲の検討および反応機構解析についての取り組み】前年度の研究成果として、シンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩を用いたα-キラルアミノ酸エステルの動的速度論分割型不斉加水分解反応において、高選択的に反応が進行する系を見出している(最大91% ee)。この触媒系における基質適用範囲を調べるため、様々なα-アルキル、アリールアミノ酸エステルを合成および反応検討を実施する。また、本反応の反応機構についての知見を得るため、光学活性な基質を用いた反応の検討および反応系中に生じる副生成物の同定を行う。【ホスホニウム塩型相間移動触媒を用いた加水分解反応検討】計画した四級アンモニウムアルコールの合成が難航しているため、別の触媒候補として、四級ホスホニウム塩/水素結合ドナー2官能性相間移動触媒についても合成し、不斉加水分解反応を検討する。基質としては、アミノ酸エステル類、アリールプロパン酸エステル類に加えて、エノールエステル類についても検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。有機合成29年度が最終年度であるため、記入しない。
フェルラ酸誘導体FAD012は虚血性脳血管障害に対する予防的治療薬となり得るか？

脳梗塞発作は、突発的に生じ、処置が遅れるほど予後不良となることから、発症前からの予防的投与によって発作時の脳保護にはたらく新たな予防的治療薬が必要であると考えられる。天然化合物であるフェルラ酸(FA)の誘導体FAD012は、慢性予防投与によって脳梗塞モデルの脳血流低下を顕著に抑制して梗塞巣形成を縮小するが、その作用メカニズムは明らかではない。そこで本研究では、FAD012の虚血時脳血流維持作用に寄与する分子機構を培養細胞を用いて解明することを目的とした。さらに、FAD012の臨床応用を想定し、組織プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)療法との併用に関する検証を行うこととした。
サンゴの成長輪(日輪・月輪・年輪)に関する基礎的研究

古生代の四放サンゴ及び中生代以降に知られる六放サンゴには、骨格外側にしわをきざんでいる種属がある。このしわは一般に成長輪と呼ばれ、日輪、月輪、年輪が知られている。このサンゴの成長輪によって、一年の日数は地質時代が若くなるにつれて少なくなってきた、という解釈が現在の定説となっている。本研究の目的は、この定説の基礎となっている日輪等を再検討することである。研究試料として第四系琉球層群産の単体サンゴTruncatoflabellum formosumと、群体サンゴTrachy-phyllia geoffroiを用い、SEMによって成長輪の幅、数を調べ、あわせて骨格の酸素安定同位体比によって年間成長率を測定した。T.farmosumの成長輪幅は0.050.20mmで、年間成長率は3.03.8mm(平均33mm)である。これは一年に平均24の成長輪が発達していることを示し、一つひとつの成長輪は日輪ではないと考えられる。一方T.geoffroiの成長輪幅は520μmに集中し、年間成長率は二つのサンゴ体で、それぞれ4.04.8mm、2.03.1mmであった。この場合、成長輪を日輪とすると、年間成長率とよく符号する。またこの成長輪幅は他の研究で求められた日輪幅とほゞ一致している。四放サンゴの成長輪幅は50μmあるいはそれ以上で、六放サンゴの日輪幅よりかなり大きく、もしこれを日輪とすれば、年間成長率はきわめて高いものとなり、薄片等によって推定されてきた成長率と大きく異っている。以上の結果、(1)六放サンゴには2種類の成長輪が認められ、一つは日輪、もう一つは2週間に1つできる成長輪である。後者の幅は四放サンゴのそれにほゞ一致する。この事実は、従来の定説の基礎となった成長輪形成の基本的解釈に誤りがあると結論され、旧来の一年の日数の経年変化は再検討されるべきことを示している。これまでに得られた研究要旨は以下の通りである。成長輪には二種類あって、一つは日輪と考えられる幅1020ミクロンの成長輪、もう一つは幅50200ミクロンの二週間に一本がきざまれる成長輪である。前者は造礁性群体サンゴのもので、後者は非造礁性単体サンゴに観察される。この事実は共生藻類をもたないサンゴの成長輪は、浅海に生息し一日の光合成リズムをもつ成長輪とは全く異なる原因によって形成されることを示唆している。この二週間のリズムは現在のところサンゴの食餌サイクルに関連しているものと考えている。海洋表層の植物プランクトン生産には1215日のリズムがあり、これが食物連鎖によってサンゴの成長輪形成に関与しているものと推定される。一方これまで四放サンゴに観察される幅50200ミクロンの成長輪を日輪と解釈してきた旧来の見解ではサンゴの成長速度に矛盾があることを指摘したが、さらにこれを検討するため、今迄に測定された四放サンゴ、六放サンゴの年輪幅を検討した。その結果は以下の通りである。(1)現生六放サンゴ

Acroporaには年成長率10cmを超えるものがあるが、これは一つ一つの枝の成長を意味し、単に数値によって比較するのは問題である。(2)化石・現生六放サンゴの中でセリオイド、ファセロイド、プロコイド型の塊状のサンゴの年間成長率は数ミリから数cmのオーダーで、Trachyphylliaの日成長率と矛盾しない。(3)上のデータは四放サンゴの幅50200ミクロンの成長輪を日輪とするには無理があり、これと同じ成長率をもつ六放サンゴは存在しない。(1)T.formosumでは成長輪の幅は平均50ミクロンで、前回測定した個体の幅とほぼ一致する。この値は、あわせて測定したデボン紀の単体サンゴの成長輪幅ときわめて近い、(2)T.geoffroiでは、成長輪の幅は4-20ミクロンと変化するが、平均8.3ミクロンである。これは従来六放サンゴに知られる日輪幅とよく一致する、ことが明らかとなった。また、T.geoffroiの酸素安定同位体比から求めた年間成長率は、2.0-3.1mmで、前回検討した個体よりやや低い値を示すが、変異の範疇にあるものと考えられ、日輪幅と年間成長率との相関はきわめて高いことを示している。ただ、今回測定した標本の成長輪は連続性にとぼしく、年間に発達する成長輪数を直接数えることはできなかった。(3)本研究では、従来薄片などで報告されてきた四放サンゴと六放サンゴの年輪に基づく年間成長率を編集し、本研究成果との比較を行った。四放サンゴの年間成長率は、標本によってかなりばらつきが認められるが、多くは5-15mmに集中し、20mmを越えるものは少ない。また六放サンゴの年間成長率も塊状のものでは、四放サンゴと近い成長率を示している。これらの数値は、本研究結果と一致し、これまでの四放サンゴの一つひとつの成長輪を日輪とした解釈と大きく矛盾している。従って、サンゴの成長輪に基づく一年の日数の地質時代における経年変化の解釈は再検討を要することが明らかとなった。
抗ノロウイルス卵黄抗体を用いた牡蠣中腸腺内ノロウイルスの不活化に関する検討

実験用小型水槽内で牡蠣にネコカリシウイルス(Feline calicivirus;FCV)を取り込ませる条件を検討した。WDB環境バイオ研究所(徳島県)より試験用マガキ(Crassostrea gigas)を購入し、小型水槽(人工海水、水温20°C)に投入し約6時間回復させた後、呼吸や排泄が確認できた個体を試験に供した。試験水槽(円柱型ポリカーボネート、人工海水25L、大気通気攪拌、水温20°C)に牡蠣68個ずつ分配した後、FCV 107TCDI50/mLウイルス液25mLを加え水槽全体が均一になるよう軽く混ぜたのち18時間蓄養してウイルスを取り込ませた後、新しい人工海水に全換水し、さらに22時間蓄養した後開殻し中腸腺を摘出した。摘出した中腸腺は、細胞破砕機(Micro Smash、トミー精工,MS- 100)で4,500 rpm、15秒間の破砕を2回実施した。中腸腺破砕液の遠心上清(10,000 x g, 10分)を0.45μmの滅菌フィルターでろ過後、ウイルス量を測定した。ウイルス量はCRFK細胞(ネコ腎細胞)を用いた50%培養細胞感染価(50% Tissue Infectious Dose;TCID50)およびTaqMan probeを用いたリアルタイムPCR法によるネコカリシウイルス遺伝子コピー数の測定を行なった。その結果、培養細胞感染価で102103TCID50/中腸腺が検出され、リアルタイムPCR法では102103コピーのウイルス遺伝子が検出された。この条件を牡蠣へFCV等を取り込ませる条件とした。今後、22時間蓄養時に海水中に卵黄抗体(IgY)を添加し牡蠣中腸腺中のウイルスに結合できるか検討する。FCVの取り込み条件と同様に、ノロウイルスVLPを牡蠣に取り込ませた。22時間蓄養し中腸腺を摘出し、中腸腺破砕液を作成しELISA法でノロウイルスVLPの定量を試みたが検出限界以下であったが、中腸腺破砕液を市販のノロウイルス迅速検出キット(クイックナビノロ2、デンカ生研)を用いたところノロウイルス抗原が検出できたことから、ノロウイルスVLPを取り込ませることができたと考えた。ウイルス等添加せずに処理した後、22時間蓄養時に人工海水に正常産卵鶏由来卵黄抗体(control IgY)を添加し、同様に中腸腺破砕液を作製し、ELISA法でIgY量を測定したが、検出限界以下であったが、IgYは水溶性であるため牡蠣に取り込まれても中腸腺に蓄積しないと考えられた。ホルマリン不活化FCVとオイルアジュバントを等量混和し免疫原として、産卵鶏を免疫し、集卵し卵黄より抗FCV IgYを粗精製し凍結乾燥した後、10mg/mL(総IgY)となるようPBSに溶解後、0.45μmのフィルターでろ過滅菌し、抗FCV IgY溶液として使用時まで-20°Cで保管した(イーダブル・ニュートリション・ジャパン、岐阜県)。抗FCVIgY溶液のFCV(200 TCID50/0.1mL)の中和抗体価は640倍であった。平成30年度に確立した牡蠣へウイルス等を取り込ませる条件で以下の実験を行い中腸腺内で抗原抗体反応が起こっていること確認する。FCVを取り込ませた後、抗FCVIgY添加人工海水中で蓄養し、FCVの不活化を検討するため、中腸腺破砕液中のFCVの培養細胞感染価およびウイルス遺伝子コピー数の測定を行う。ノロウイルスVLPを取り込ませた後、抗ノロウイルスIgY添加人工海水中で蓄養し、ノロウイルスVLP-抗ノロウイルスIgYの検出を行う。また、次年度に向けて中腸腺内で抗原抗体反応を直接的に証明できる蛍光抗体法あるいは免疫沈降法等の方法を模索する。さらに、実際の牡蠣浄化水槽を用いた試験に協力していただける牡蠣養殖業者の策定を行う。その結果、培養細胞感染価で102103

TCID50/中腸腺が検出され、リアルタイムPCR法では102103コピーのウイルス遺伝子が検出された。この条件を牡蠣へFCV等を取り込ませる条件とした。今後、22時間蓄養時に海水中に卵黄抗体(IgY)を添加し牡蠣中腸腺中のウイルスに結合できるか検討する。FCVの取り込み条件と同様に、ノロウイルスVLPを牡蠣に取り込ませた。22時間蓄養し中腸腺を摘出し、中腸腺破砕液を作成しELISA法でノロウイルスVLPの定量を試みたが検出限界以下であったが、中腸腺破砕液を市販のノロウイルス迅速検出キット(クイックナビノロ2、デンカ生研)を用いたところノロウイルス抗原が検出できたことから、ノロウイルスVLPを取り込ませることができたと考えた。ウイルス等添加せずに処理した後、22時間蓄養時に人工海水に正常産卵鶏由来卵黄抗体(control IgY)を添加し、同様に中腸腺破砕液を作製し、ELISA法でIgY量を測定したが、検出限界以下であったが、IgYは水溶性であるため牡蠣に取り込まれても中腸腺に蓄積しないと考えられた。ホルマリン不活化FCVとオイルアジュバントを等量混和し免疫原として、産卵鶏を免疫し、集卵し卵黄より抗FCV IgYを粗精製し凍結乾燥した後、10mg/mL(総IgY)となるようPBSに溶解後、0.45μmのフィルターでろ過滅菌し、抗FCV IgY溶液として使用時まで-20°Cで保管した(イーダブル・ニュートリション・ジャパン、岐阜県)。抗FCVIgY溶液のFCV(200 TCID50/0.1mL)の中和抗体価は640倍であった。平成30年度に確立した牡蠣へウイルス等を取り込ませる条件で以下の実験を行い中腸腺内で抗原抗体反応が起こっていること確認する。FCVを取り込ませた後、抗FCVIgY添加人工海水中で蓄養し、FCVの不活化を検討するため、中腸腺破砕液中のFCVの培養細胞感染価およびウイルス遺伝子コピー数の測定を行う。ノロウイルスVLPを取り込ませた後、抗ノロウイルスIgY添加人工海水中で蓄養し、ノロウイルスVLP-抗ノロウイルスIgYの検出を行う。また、次年度に向けて中腸腺内で抗原抗体反応を直接的に証明できる蛍光抗体法あるいは免疫沈降法等の方法を模索する。さらに、実際の牡蠣浄化水槽を用いた試験に協力していただける牡蠣養殖業者の策定を行う。2018年度に宿泊を伴う東京で開催される学会への参加を計画していたが、京都(宿泊無し)で開催された日本ウイルス学会総会に参加したため、旅費に余剰金が発生した。余剰金については2019年度に物品費として実験用プラスチック器具等消耗品購入に充てる予定である。
骨髄間葉系幹細胞の移植による脳梗塞・脊髄損傷の治療に関する基礎的研究

マウスおよびラット大腿骨より骨髄間葉系細胞(BMSC)を分離し、マウス脳梗塞あるいは脊髄損傷モデルに移植する実験系を確立し、Neuropathology誌(2003)、Brain Res Protoc誌(2004)に掲載された。GFPトランスジェニック・マウスからBMSCを採取してマウス脳梗塞あるいはラット脊髄損傷モデルに移植した。移植した細胞が脳や脊髄の中を病変部に向かって遊走する様子を動物が生きたままの状態で観察する実験系を確立した。Brain Res Protoc誌で2004)、J Neurotrauma誌(2005)に掲載された。移植されたBMSCが神経細胞に特異的に存在する受容体を保護するかどうかを、マウス脳梗塞モデル、ラット脊髄損傷モデルを用いてautoradiographyにより解析した。細胞移植が病変周囲における神経受容体を保持する役割を有していることが判明した。J Nucl Med誌(2006)に掲載された。さらにJ Neurotrauma誌に投稿中である。移植されたBMSCが神経回路網を再構築する様子を生体内で観察する目的で、MRIによるマウス脳梗塞モデル、ラット脊髄損傷モデルの画像化システムを確立した。移植されたBMSCが中枢神経内部で活発な細胞分裂を繰り返しながら生着することを明らかとした。Brain Res誌(2005)に掲載された。仔ラット脊髄スライスにBMSCを移植して長期間観察する実験系を確立した。BMSCが軸策伸長に寄与することを明らかとした。J Neurosurg誌に投稿中である。BMSCの神経細胞への分化メカニズムをDNAマイクロアレイにより解明した。Brain Res誌に受理されている。ラット脳凍結損傷モデル、脊髄半切モデルを用いて、細胞移植を促進するためのバイオ・マテリアルの開発を行なった。その結果、フィブリンが有用な素材となり得ることを明らかとした。現在、2編の論文を作成中である。中枢神経に移植されたBMSCが病変部に遊走するメカニズムをマウス脳梗塞モデルを用いて解明した。現在、Stroke誌に投稿中である。本年度の研究計画に沿って、以下の研究を実施した。すなわち、マウス大腿骨より骨髄液を無菌的に採取し、培養皿上で骨髄間葉系細胞のみを分離し、継代培養する系を確立した。フローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの検索により、これらの細胞はCD34(-),CD45(±),CD90(+),Sca-1(+)であることが判明した。動物実験室にクリーンベンチ、定位脳固定装置、マイクロインジェクターを設置したのち、これらの細胞の核をbis-benzimideで蛍光染色し、マウス脳・脊髄へ定位的に移植したところ、4週間後にこれらの細胞は生着し、それぞれneuronやastrocyteへの分化が生じていることが免疫染色により明らかとなった。さらに、これらの細胞をマウス脳梗塞モデルあるいは脊髄損傷モデルに移植したところ、移植された細胞は病変の周辺部へ遊走し神経系細胞への分化が確認された。この結果をまとめた論文は、Neuropathologyに投稿し受理されている。また、GFP遺伝子を発現したトランスジェニック・マウスから、同様の手技で骨髄間葉系細胞を採取し継代培養を確立した。継代培養を重ねてもこれらの細胞がGFPの蛍光を発することを倒立型蛍光顕微鏡で確認した。この細胞を脳梗塞あるいは脊髄損傷モデルに移植し、同様に生着、遊走、分化することを確認した。脊髄に移植されたGFP発現骨髄間葉系細胞を生体にままイメージングする方法論を確立することもできた。