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縄文時代後期における稲作農耕空間の探求

愛媛県松山市文京遺跡の縄文時代後期層の発掘調査を実施し,農耕痕跡の確認と時期の確定を目指す考古学的検討,プラント・オパール分析による栽培植物遺体を確認する農学的検討,農耕空間の地形的条件を明らかにする地理学的検討を行った。相互の検討結果をつきあわせた結果,住居域周辺の谷状地形が埋積する過程で生じた小さな微低地を利用した畠跡が存在する可能性が高いことを指摘できた。愛媛県松山市に所在する文京遺跡で発掘調査(文京遺跡44次調査)を実施した。隣接する31次調査地点の土層堆積の再確認、プラント・オパール分析試料の採取と分析、古地形の復原、検証作業会での土層解析を通じて、縄文時代に堆積が進む黄褐色土層の中位に形成された灰色砂礫土層(IV-2a-(2)層)でイネのプラント・オパールが安定的に出土することを特定できた。灰色砂礫土層は、旧河道への落ち際に形成され、周辺に一定の広がりをもって堆積しており、黄褐色土層の下部に縄文時代後期の縁帯文土器が出土する土壌層があること、黄褐色土層上部からも縄文土器が出土すること、黄褐色土層の最上面に掘り込まれた遺構が刻目凸帯文土器以降のものであることから、縄文時代後期と限定できる。また、調査区西端の幅1mをトレンチ状に掘り下げ、灰色砂礫土層の上面を検出したところ、5条の幅5080cm、高さ47cmの高まり列が出土した。灰色砂礫土層下部でも、土層断面で高さ5cm前後の連続する高まり列と考えられる凹凸を観察できた。しかし、これらが稲作農耕空間に関係するものかは、今年度の調査では確定できなかった。同時に、周辺で出土した縄文時代後期の土器に残された圧痕のレプリカ法による分析では、未同定であるが、植物種子を確認できた。また、調査事例が蓄積されている大韓民国で畠遺構の断面観察と平面調査方法を検討し、関西地区の堆積学や縄文時代弥生時代の考古学の研究者を加えた研究交流会では、今年度の調査・研究のまとめを行い、次年度、堆積土の粒径分析やX線を用いた土層薄片の分析を追加導入し、灰色砂礫土層上面の高まり列の面的調査及び下部の調査を行う具体的方策を整理できた。2010年度に引き続き,田崎・三吉が中心となり,松山市文京遺跡において,縄文時代後期晩期に堆積が進む黄褐色土層群の中でイネのプラント・オパールが出土する灰色砂礫土層の発掘調査を実施した。調査に当たっては,堆積相分析を考古学の研究法として確立するため,土層解析の客観性を高める遠沈管を利用した簡易の粒径観察法を導入した。その結果,南西に向かって落ち込む旧河道内に縄文時代後期中頃後半の遺物包含層が形成された後,自然堆積で旧河道が埋積され,その上部に灰色砂礫土層が堆積し,さらに上層を北に向かって黄褐色砂質シルトが旧河道の微凹地を覆っていき微高地となっていく遺跡形成のプロセスを把握できた。調査結果は外山が進める周辺の発掘調査データに基づく旧地形の復原とも合致する。プラント・オパール分析では,宇田津・外山のクロス・チェック体制で,木の根などによる試料汚染について土層間及び土層内の土壌の比較分析から検討した結果,分析的には安定した灰色砂礫土層に上層からの試料汚染がないことを確認できた。この検討結果を受けて,2010年度に調査区西半部で検出した灰色砂礫土層上面の高まり列の広がりを確認することとした。しかし,調査区東半部には灰色砂礫土層はほとんど分布せず,西半部の高まり列も平面的に不明確で,土層の再観察を行った結果,人為的な遺構ではないと判断した。一方で,調査区西半部の一部で灰色砂礫土層下底面まで掘り下げたところ,平行してのびる3条の小溝群が出土した。地形傾斜と直交すること,ほぼ等間隔に掘られていることから,農耕空間を構成する何らかの遺構と推定できるが,発掘範囲が限られ,研究協力者を含めた検証作業を経ておらず,その性格の確定までには至らなかった。しかし,考古学・地理学・農学相互の分析結果を総合することで縄文時代後期の稲作農耕空間を具体的に調査・解明する仕組みの構築には一定の見通しを得ることができた。松山市文京遺跡において,イネのプラント・オパールが検出された縄文後期晩期のIV-2a層の発掘調査を継続した。遠沈管を利用した簡易の粒径観察,プラント・オパール分析の汚染対策を行いながら,IV-2a層の堆積相解析と考古学的痕跡を明らかにすることを目指した。その結果,IV-2a層は,分級が極めて悪い古土壌で本来の堆積構造を観察できないこと,下半部では下層由来の小塊が混じり,掘削によって土を破砕し攪拌しながら,その場にとどめる所作が一定間隔で列状に連続して繰り返された痕跡(小溝群)を確認できた。

イネの検出状況を加え,IV-2a層は植物栽培のために攪拌(耕耘)された農耕空間である可能性が高い。砂が主体の土層であり湛水の痕跡もないこと,IV-2a層の広がりが限られることから,北東側の微高地上の居住域に隣接する小規模な畠跡の可能性も考えうる。イネのプラント・オパールの検出状況からは,イネを含む混作の可能性も示唆される。下層のIV-5層から縁帯文土器が出土し,周辺ではIV層最上面に縄文晩期末弥生初頭の刻目凸帯文土器段階の土壙が掘り込まれていることから,IV-2a層は縄文晩期後期の時間幅で捉えることができる。上層のIV-1層最下部に縁帯文土器の破片が包含され,縄文後期の可能性もあるが,今後,周辺で調査が進むことを期待したい。ただし,農耕空間の形態については,IV-2a層が繰り返し撹拌を受け,上面がIV-1層の堆積に伴って削られているため,栽培状況を示す畝等の痕跡は明らかにできなかった。以上,考古学,地理学,農学,地質考古学の研究者が協同し,縄文時代の農耕空間を検出し認定する方法論の現状と課題を整理し,その課題への対応を図りながら,縄文時代に遡る農耕空間を具体的に調査・解明する仕組みを構築できた。そこで確認された農耕空間探究のためのコンセプトと方法論によって,今後,事例が増加することが期待できる。プラント・オパール分析では灰色砂礫土層に上層の影響が認められないことを確認でき,地理学的検討でも縄文時代後期晩期の周辺の古地形を復原できている。発掘調査では,灰色砂礫土層の下層に形成された遺物包含層を調査できたことで,遺跡形成の過程を復原できた。ただし,2011年度に出土した灰色砂礫土層下底面付近における小溝群の性格は特定できておらず,現時点では稲作農耕空間の考古学的検討の結論は出せない状況にある。2012年度に追加調査を計画し,2011年度に試料を採取した微細堆積相解析を現在進めており,考古学・地理学・農学に地質学の視点を加えた縄文時代後期の稲作農耕空間を解明する環境はより整備されたと判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで2年間の発掘調査で,イネのプラシト・オパールが集中して出土する灰色砂礫土層が調査区西半部に広がることを把握できた。2011年度に性格が特定できなかった灰色砂礫土層下底面付近で出土した小溝群の考古学的な検討を行うため,2012年度には当初計画を変更して,調査区西半部の追加調査を実施する。さらに,2012年度は本研究期間の最終年度であり,3年間の発掘調査の成果に基づいて,当初計画していた考古学・地理学・農学的検討に,地質学の微細堆積相解析による土壌層の利用痕跡の検討を加えた上で,分担研究者・連携研究者・研究協力者並びに日本・韓国の関連研究分野の研究者が参加する研究交流会で最終的な発掘調査成果と分析成果を確認し,考古学・地理学・農学・地質学の研究分野を横断する総合的な縄文時代後期における稲作農耕空間を解明する本研究の総括を行う。さらに,分析試料の汚染対策,遠沈管を用いた粒径簡易観察の定式化にも一定の目処を付ける予定である。
表現型-遺伝子型不一致の先天色覚異常におけるL/M視物質遺伝子の解析

2色覚の表現型で異常3色覚の遺伝子型は30例あった。正常遺伝子型の色覚異常は85例あり、表現型-遺伝子型不一致は全725例中計115例であった。82例は-71A→Cの塩基置換を持ち、これが当該視物質遺伝子の非発現低発現を引き起こしているものと推定された。エキソン内の変異は11例であった。エキソン3の特殊なハプロタイプにより、スプライシングにおいて当該エキソンの完全なスキップの起こる例が2あった。本研究は、日本人の先天色覚異常について、色覚表現型とL/M視物質の遺伝子型との関係を明らかにするものである。本研究計画申請時にすでに400例以上解析していたが、その後現在までに53例追加解析できた。53例の内訳は次の通りである。1型2色覚は14例(うち3色覚の遺伝子型が8例で、その4例が後続L遺伝子に-71A→Cの塩基置換を持っていた)、1型3色覚は11例(うち正常遺伝子型が2例で、片方はL遺伝子にHis300Tyrの変異を持っており、他方はL遺伝子の全領域をシーケンシングしたが変異はなかった)、2型2色覚は13例(表現型-遺伝子型不一致例はなかった)、2型3色覚は15例(うち正常遺伝子型は6例で、1例はM遺伝子にPro307Leuの変異を持ち、他の5例はM遺伝子のプロモーターに-71A→Cの塩基置換を持っていた)であった。後続遺伝子プロモーターにおける-71A→Cの塩基置換は、上記のように表現型-遺伝子型不一致例では高頻度(53例中9例、約17%)で見つかった。同塩基置換は、日本人、中国人やタイ人では頻繁に見つかる一方、欧米人やアフリカンアメリカンでは殆ど見つからないことをすでに報告していた(Ueyamaら、PNAS(2003))。今回、南アメリカ、アフリカ、東ヨーロッパ、アラブ、インド・パキスタン、カンボジア、オセアニア、台湾原住民などに範囲を拡げて解析したところ、同塩基置換はカンボジアと台湾原住民だけに見出され、-71A→Cが日本や中国、台湾を含む東南アジアに特異な塩基置換であることが明らかになった。従って、当該塩基置換による色覚異常は東南アジアにだけ分布する可能性が示された。ミスセンス変異のうち、His300Tyrは新規な変異であり、Pro307LeuはS錐体1色覚のL/M視物質遺伝子で報告されてはいるが、先天L/M色覚異常では初めての検出である。L/M視物質遺伝子アレーにおける遺伝子の並びが正常(先頭がL、後続がM)な先天色覚異常は78例(692例中)に達した。今年度は、変異では説明できない例を中心に解析した。1.新たな変異としては、L遺伝子のTyr194STOP、Pro187Leu、M遺伝子のHis300Tyr、Pro307Leuを見出した。視物質再構成実験を行いいずれも吸収が認められないことを確認した。2.これら以外の例に関しては、遺伝子全体を発現ベクターにクローニングし、培養細胞にトランスフェクション、RNAを抽出してスプライシングに異常がないか検討した。ノーザンブロットでは、1型2色覚のL遺伝子において、全長よりもやや小さいmRNAのみが認められた。RT-PCRとシーケンシングでさらに解析したところ、このやや小さいmRNAはエキソン3を欠失したものであることが分かった。3.1型2色覚のL遺伝子のBbsI断片(エキソン2の途中からエキソン4の途中までを含む)を、野生型LオプシンcDNAのBbsIサイト間にクローニングしミニジーンを作製した。培養細胞にトランスフェクションし、RNAを抽出、RT-PCRで解析したところ、エキソン3を欠失したmRNAだけが認められた。正常産物を作るミニジーンとの間でのイントロン交換実験の結果、この欠失はエキソン3の違いによることが判明した。4.正常産物を生じるミニジーンと、エキソン3(-)の産物をつくるミニジーンとの間には7か所の塩基の違いがあったが、すべて多型の範囲内のものであった。様々な塩基置換を導入して解析した結果、1型2色覚のL遺伝子が持つハプロタイプでのみエキソン3の完全欠失がみられた。従って、この1型2色覚では、エキソン3の特殊なハプロタイプによりスプライシングにおけるエキソン3の完全欠失が起こり、これが当該L遺伝子非発現の原因になっているものと推定された。本年度は主に次の2つを行った。1日本人の先天色覚異常の新規36例におけるL/M遺伝子アレーの解析:正常遺伝子型(LーMの遺伝子の並び)は5例であった。1型色覚(L錐体が欠損)の1例はL遺伝子にW177Xのナンセンス変異(これまで報告例はない)を持っていた。

2型色覚(M錐体が欠損)の4例は全て、M遺伝子のプロモーターにー71A→Cの塩基置換を持っており、これ以外の変異はなかった。2正常遺伝子型の1型2色覚の解析:1型2色覚はこれまで129例解析し、正常遺伝子型は6例であった。2例はミスセンス変異(P231L、P187L)、2例はナンセンス変異(Y194Xと上記のW177X)で説明できたが、残る2例(A376とA642)は全く変異を持っておらず、当該L遺伝子非発現の原因が不明であった。そこで、A376のL遺伝子全体を発現ベクターにクローニングし、培養細胞にトランスフェクトしてmRNAを調べた。A376のL遺伝子からは正常よりもやや短いmRNAだけが作られていた。詳しく調べるとスプライシングにおいてエキソン3が除かれていた。このエキソンスキッピングをさらに詳しく調べたところ、エキソン3の特殊なハプロタイプによることが分かった。すなわち、コドン番号で表すと、151ー153ー155ー171ー174ー178ー180がGーCーGーAーTーCーGーGのときのみ、エキソン3が完全にスキップされることが明らかになった。このハプロタイプは上記の2例(A376とA642)だけが持っており、発現が明らかな458個のL/M遺伝子では皆無であった。ハプロタイプを構成するそれぞれの多型は正常のバリエーションであるが、その組み合わせによってはスプライシングに影響する場合があることを示した。色覚異常の理解のみならず、他の遺伝性の表現型の理解に役立つ重要な視点を明らかにしたものと考えている。正常な並びの遺伝子アレーを持つ先天色覚異常では、当該L遺伝子あるいは当該M遺伝子のミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、プロモーター変異、スプライシング変異などが考えうる。しかし、われわれの研究で、エキソン内の単なる多型と考えられるものが、その組み合わせ(=ハプロタイプ)によってはスプライシングに重大な影響を与える場合のあることが明らかになった。これは、先天色覚異常のみならず、他の遺伝性の表現型を理解する上で役に立つ視点を見出したものである。24年度が最終年度であるため、記入しない。エキソン内のハプロタイプによりスプライシングに重大な影響が出ることが判明したので、(1)その詳細な機序を明らかにする、(2)正常なスプライシングを誘導する手段を模索する、などの今後の研究の方向が考えられる。プロモーターの塩基置換(これは今年度は力を入れなかった)に関しても同様の、(1)転写効率低下の詳細な機序を明らかにする、(2)転写効率を上げる方策を追求する、などの今後の研究方向が考えられる。
生きた細胞や生体内での免疫シグナル伝達因子の可視化とその経時的変化の解析

生体内の免疫システムは複雑かつ巧妙なネットワークから形成される細胞内シグナル伝達により制御されている。この複雑なネットワークは厳密に調整される必要があるが、その制御メカニズムの根幹はシグナル伝達分子の時空間的制御にあると考えられる。従来の静的な観測に基づくシグナル伝達の解析に対し、本研究では生きた細胞と生きた個体における分子の活性化や分子間相互作用に関する時空間的情報を得ることにより、細胞内のIFN/IRFsシグナル伝達の時空間的ダイナミクスを解明するという点において、これまでの研究手法と決定的に異なっている。FRETを起こすドナーとアクセプターの組み合わせが複数であることに着目し、分子内と分子間FRETを併用することによって一連のシグナル伝達の動きを解析しようとしている点が他の先行研究と違いであり、独創的な点であると考える。本研究は生きている細胞や個体中での免疫システムに関連する分子の活性化や分子間相互作用をリアルタイムで観測し、動的制御メカニズムの解析という点では最先端の研究であると考えられる。さらに、本研究で用いた手法が免疫系のみならず、他のシグナル伝達系の研究にも応用できると考えられるので、非常に有意義で基礎となる研究であると考えられる。これまでに細胞内に進入するDNAを感知するタンパク分子DAIを発見し、生きた細胞内でのDNAとの結合の様子を観測することに成功した。また、DAIのDNAを認識し、免疫シグナル伝達を活性化する作用機構を明らかにした。
好中球細胞外トラップ（NETs）の臨床検査医学的評価法の確立

好中球細胞外トラップ(NETs)は、抗菌作用の他に組織傷害や敗血症、血栓症、がんの転移、動脈硬化など多彩な作用を示す。我々はヘミンのNET作用について検討し、短時間でNETを誘導すること、酸化ストレスの存在により増強されることを見出した。さらにdeferasirox、アセテートがNETを抑制することも確認した。またNET形成の必要条件である好中球の活性化を、空胞形成を指標として自動血球係数装置で定量観察可能であることを見出した。臨床応用が期待される。好中球細胞外トラップ(NETs)現象の観察法につき検討している。NET形成は種々の重症病態における臓器障害と関連していることが示されており、簡便計測法の確立は重症病態診断の一助になるものと期待される。(1)簡便計測法として期待しているのは、フローサイトメトリーを用いたNET形成細胞の検出法であるが、細胞処理に用いる界面活性剤や浸透圧の影響について検討した。その結果、特定の浸透圧条件では、フォルボールエステル誘導性NET形成細胞が、特定の細胞集団を形成することが判明し、定量化が可能であると考えられる。さらに、種々の刺激で形成されたNETの比較検討が必要と思われる。確立されたNET観察法である、蛍光顕微鏡による観察、免疫染色法による観察と並行して臨床的有用性について検討していきたい。さらに汎用フローサイトメトリのみならず、自動血球計数器での観察、すなはちNET形成細胞の自動計測、が可能となるよう、条件設定を試みたい。(2)In vitro検討に用いることができるNET定量法として、Sytox Greenを用いた定量法(プレート法)を確立し、これまでの研究の継続であるヘミンによるNET形成に関わる機序の解明などに向け検討を継続中である。NET形成にかかわる活性酸素種産生にかかわるミトコンドリアの関与や、刺激伝達メカニズムが、フォルボールエステルで誘導される場合と異なる可能性が示唆されている。(3)トロンボモジュリン製剤は、播種性血管内凝固症候群(DIC)の新しい治療薬として期待されている。種々の炎症を抑制する効果が、これまでの抗DIC薬との大きな相違と考えれる。われわれは、本剤が好中球機能にも影響するのではないかと考え、NET形成を含む種々の好中球機能に及ぼす影響を検討したが、活性酸素種産生やNET形成には影響しないことが明らかとなった。好中球細胞外トラップ(NETs)現象のin vitro検出法として、蛍光顕微鏡による観察、二本鎖DNA定量による定量的NETs観察法を併用しながら、フローサイトメトリーによるNETs検出を検討した。その結果、現在までは、フォルボールエステルによるNET形成条件での検討ではあるが、現在使用中の浸透圧、および界面活性剤を用いて検出できる細胞集団は、NETs形成中の細胞である可能性が高いと考えられる。なお、浸透圧条件については20以上、界面活性剤については種々の濃度で5種類以上の試薬の有用性について検討した。ヘミンにより生成されるNETsは、フォルボールエステルによるものとは異なるものである可能性が高い。その理由は、形態学的な相違、抗酸化剤、ことにMito-TEMPOに対する動態、に大きな相違が存在するからである。従って、フォルーボールエステルでのみ有用な方法であっても臨床的な価値は無いので、様々な条件での検討が必要であると考えられる。しかしながら、フォルボールエステルでの経験から、同様の検討により条件を設定できるのではないかと期待している。好中球細胞外トラップ現象(NETs)は、強力な抗菌作用以外に、肺を始めとした組織障害や敗血症、血栓症、腫瘍の転移、動脈硬化等、多岐にわたり影響を及ぼす。この現象の発現を、動的にとらえることは臨床的な意義が大きいと考えられるが、適切な臨床検査法は確立されていない。そこで、in vitroおよびin vivo検討を通して、臨床検査として応用可能な方法の確立について検討することを目的としている。In vitro検討では、純化好中球にNETsを誘導し、その上清中に含まれる放出DNAを、ヌクレアーゼ処理後に定量する方法を確立した。この方法を用いて、陽性コントロールとして用いられるPMA(フォルボールエステル)に加え、これまで検討して来たヘミン(三価鉄含有ヘム)の効果を検討した。いずれも定量的に観察可能であり、さらに少量の過酸化水素の存在で、ヘミンの場合はNET形成能が格段に増強されることを確認した。マウスのin vivo検討、エンドトキシン肺障害モデル、では、血漿中のヒストンおよびミエロペロキシダーゼ定量を用い検討した。血液検体での変化は捉え難いが、肺洗浄液ではNET形成に応じて増加することが確認できた。ヒトにおける臨床検査としての可能性をを考え、フローサイトメーターを用いた定量法を検討している。浸透圧変化を応用し、NET形成後の好中球を集団として捉える可能性について詳細に検討中である。速報はすでに2016年日本血液学会において報告した。今後、自動血球計数装置への応用を視野に検討の予定である。鉄キレート剤(デフェラシロックス)が、in vitro検討では、活性酸素種やNET形成を抑制することを報告してきた。肺障害マウスモデルでのNETを伴う障害が、鉄キレート剤(デフェラシロックス)前処理により明らかに改善することが確認できた。2017年6月の日本血栓止血学会において報告可能である。論文化が可能な状況となっている。In vitroNET形成の定量法確立については、Sytox Greenを用いたプレート法で可能であることを確認し、ヘミンによるNET形成が酸化ストレスの存在で増強することが確認された。

またヘミンによるNET形成は、NADPHオキシダーゼ依存性であること、トル様受容体を介するものではないことなどを明らかにし、2016年の日本臨床検査医学会において報告した。論文化し現在投稿中である。フローサイトメトリー法については、種々のクラスター形成の可能性について検討したが、浸透圧変化を導入する方法に可能性があるとの感触をうけており、上記の定量法との相関等について検討中である。今後は臨床検体での変化の可能性についても検討していくべく、計画中である。好中球細胞外トラップ現象(NET)は、強力な抗菌作用を示す他に、組織傷害や敗血症、血栓症、がんの転移、動脈硬化など多彩な作用を示す。このような現象を増悪させる因子を明らかにすること、より簡便に検出し臨床に応用することは極めて重要である。我々はヘム分子に注目し、本現象との関連について検討してきた。これまでヘミンが直接NETsを誘導すること、鉄キレート剤であるデフェラシロックスが本現象を抑制する可能性のあることなどを報告してきた。デフェラシロックスは、in vitroでの抑制効果に加え、マウス肺障害モデルを用いたin vivo検討においてもその有効性が確認でき、投稿準備中である。その後の検討で、ヘムによるNET形成が、わずかな酸化ストレス(過酸化水素)の存在により増強することを見いだし報告した。また最近腸内細菌ー短鎖脂肪酸による免疫調整作用が注目してされているが、我々はアセテートによる本現象への影響について検討し、腸管内濃度のアセテートは中等度にNETを抑制することを見出し報告した。現在リバイス投稿中である。これらの検討は、in vitroでの形態観察に加え、定量法を用いて行ったものである。また臨床的応用として、NETをフローサイトメトリーで検出することを目指したが、臨床的に適切な方法は見いだし得なかった。一方、NET形成の必須因子である好中球の活性化は、活性酸素の産生と同時に、貪食によらない空胞形成を伴う。共焦点レーザー顕微鏡、電子顕微鏡などによりその存在を確認した。この活性化に伴う空胞形成を指標として定量化できないかと考え、フローサイトメトリーによる検討を経て、自動血球計数機で計測できることを見出し投稿中である。好中球細胞外トラップ(NETs)は、抗菌作用の他に組織傷害や敗血症、血栓症、がんの転移、動脈硬化など多彩な作用を示す。我々はヘミンのNET作用について検討し、短時間でNETを誘導すること、酸化ストレスの存在により増強されることを見出した。さらにdeferasirox、アセテートがNETを抑制することも確認した。またNET形成の必要条件である好中球の活性化を、空胞形成を指標として自動血球係数装置で定量観察可能であることを見出した。臨床応用が期待される。フローサイトメトリーでのNETs検出系確立をめざして、種々の条件でのin vitro NET形成法の結果を比較検討の予定である。
鋳型内チタン湯流れの観察によるスプルー条件と内部欠陥発生との関連性の解明

標識元素溶解法を応用すると鋳型内部のチタン溶湯の流れが明かとなり、これを用いることで鋳造欠陥の原因を解明することができる。今年度の研究によって、スプルー取り付け条件を中心として欠陥と湯流れについて検討した。その結果、これまでは差圧鋳造と遠心鋳造の特徴を比較する場合、層流と乱流という流れに大きく影響する因子が必然的に関連し、しばしばその違いが不明瞭となった。今回は遠心鋳造の場合も特徴が鮮明となり、鋳造方式の如何を問わず、常に流速によって鋳込まれる部分と、圧力差によって鋳込まれる部分が存在することが明かとなった。それぞれの割合は、鋳型空洞の形態、鋳造方式、および層流か乱流かに依存する。たとえば比較的厚い板状空洞の場合は、流動抵抗が小さく圧力が解放されやすいため、差圧鋳造でもいったんスプルーから流出した溶湯は、流速が駆動力となり充満する。また、圧力鋳造で円柱状空洞に鋳込んだ場合にパイプ状になる現象も、一部溶湯が獲得した流速により、鋳型面に凝固層を形成しながら進んだ結果と解釈すれば、自然に理解される。逆に流動抵抗が大きいメッシュパターンのような場合は、スプルーから流出する時点の流速よりも、複雑な空洞内を進んでいる時に後ろから作用している圧力の大きさが重要である。丸穴メッシュパターンに遠心鋳造で鋳込み、しかも層流となった場合は、流速で鋳込まれ部分と圧力で鋳込まれた部分とがかなり明瞭に区別できる。このように差圧鋳造と遠心鋳造の湯回りを比較する場合、鋳型空洞の形態を常に考慮しつつ、流速が重要か圧力が重要かを検討すべきと思われる。純チタンおよびチタン合金は融点が約1700°Cと非常に高く,凝固し易いため,歯科精密鋳造において種々の欠陥が生じ易い.これらの欠陥の発生を少なくするため,鋳型の温度,鋳造力の増強あるいはスプル-取り付け位置の変更など,さまざまな工夫をしている.それら鋳造の諸条件と,欠陥発生との関係には鋳型内の溶湯の動きが不可欠な情報である.本研究は標識元素溶解析により,鋳型内のチタン溶湯の流れを可視化して検討するところに特徴がある.本年度は上顎全部床の鋳造を想定し,厚さ0.45mmのシ-トワックスと市販のリテンションパタ-ンを用いてパタ-ンを作成した.通法により埋没,ワックス消却の後,チタン専用の遠心鋳造機を用いて鋳込んだ.スプル-は4条件とし,パタ-ン中央,およびパタ-ン中央から左右へ少しずらした場合,および中央で,回転方向とパタ-ン面が垂直の場合である.実験の結果スプル-断面積が10×1.4mm極めて小さいが,最後のスプル-タイプがほぼ100%の鋳込み率で,表面に欠陥が認められず,またX線欠陥検査の結果でも内部に欠陥が認められなかった.この場合は溶湯が最もスム-ズに流れていることが湯流れの観察から明らかになった.また最も鋳込み率の悪かったのは,スプル-から流れ込んだ溶湯がすぐに鋳壁にぶつかるタイプであって,鋳込み率が50%に達しなかった.また全体的に欠陥は表面に現れているタイプがほとんどで,内部欠陥はほとんど無かった.これは鋳型内部においても,溶湯に強力な遠心力や,コリオリの力が作用しているためと思われ,遠心鋳造機の場合はこのように外見的に欠陥が無ければ,ほぼ完全な鋳造体と考えて良いことを示している.標識元素溶解説を応用すると鋳型内部のチタン溶湯の流れが明かとなり,これを用いることで鋳造欠陥の原因を解明することができる.今年度の研究によって,スプルー取り付け条件を中心として欠陥と湯流れについて検討した.

その結果,これまでは差圧鋳造と遠心鋳造の特徴を比較する場合,層流と乱流という流れに大きく影響する因子が必然的に関連し,しばしばその違いが不明瞭となった.今回は遠心鋳造の場合も特徴が鮮明となり,鋳造方式の如何を問わず,常に流速によって鋳込まれる部分と,圧力差によって鋳込まれる部分が存在することが明かとなった.それぞれの割合は,鋳型空洞の形態,鋳造方式,および層流か乱流かに依存する.たとえば比較的厚い板状空洞の場合は,流動抵抗が小さく圧力が解放されやすいため,差圧鋳造でもいったんスプルーから流出した溶湯は,流速が駆動力となり充満する.また,圧力鋳造で円柱状空洞に鋳込んだ場合にパイプ状になる現象も,一部溶湯が獲得した流速により,鋳壁面に凝固層を形成しながら進んだ結果と解釈すれば,自然に理解される.逆に流動抵抗が大きいメッシュパターンのような場合は,スプルーから流出する時点の流速よりも,複雑な空洞内を進んでいる時に後ろから作用している圧力の大きさが重要である.丸穴メッシュパターンに遠心鋳造で鋳込み,しかも層流となった場合は,流速で鋳込まれた部分と圧力で鋳込まれた部分とがかなり明瞭に区別できる.このように差圧鋳造と遠心鋳造の湯回りを比較する場合,鋳型空洞の形態を常に考慮しつつ,流速が重要か圧力が重要かを検討すべきと思われる.
臨床応用可能な培養皮膚への遺伝子導入法の開発

遺伝子導入において,アデノウイルスをベクターとして用いた場合,その病原性が臨床応用の際に問題となることが知られている。その反省のもと、新たな遺伝子導入法の開発に取り組み、イオン化ゲルを用いることにより貪食細胞のエンドサイトーシスを利用し、遺伝子を高効率に導入することを確認した。昨年度までに,レポーター遺伝子や各種遺伝子(TIMP : Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase、FGF-4 : fibroblast growthfactor-4やIL-12α、β)を培養細胞に導入する至適条件を確認できたため、本年度では、生体内での遺伝子発現の至適条件と発現期間の検討、抗腫瘍遺伝子導入効果の検討をし、抗腫瘍効果の検討を行うことを目的とした。重症複合型免疫不全症マウス(ヌードSCIDマウス)を用いた。培養皮膚に組み込んだレポーター遺伝子であるGFP、LacZがマウスの生体内で発現しているかを検討するために1)イオン化ゲルとプラスミド遺伝子との複合体を単球(ケラチノサイト)に貪食させた群(n=5)、対照群として、2)レポーター遺伝子のプラスミド遺伝子のみを単球(ケラチノサイト)に貪食させた群(n=5)、および3)アデノウイルスによる遺伝子導入群(n=5)を用いた。蛍光顕微鏡にてGFP、免疫染色にてLacZの発現の確認を試みたが,レポーター遺伝子と異なり,至適条件が若干異なり,培養環境の再度の検討を余儀なくされた。本年度中では,実験中に遺伝子移入の段階での生存率が低く,より至適な条件を検討するにとどまった。次の段階の実験としてのイオン化ゲルが細胞アポトーシスにどの程度関与を検討した。1)イオン化ゲルとプラスミド複合体を単球(ケラチノサイト)に貪食させたものと,2)レポーター遺伝子のプラスミドのみを単球(ケラチノサイト)に貪食させたもの3)イオン化ゲルのみを単球(ケラチノサイト)に貪食させたもの,4)アデノウイルスによる遺伝子導入ものとで検討した。現在研究結果の検討の途中であり,結果については十分に検討を要する状態である。来年度以降も引き続き検討を行っていく予定である。これまでの研究論文において,アデノウイルスをベクターとして用いた場合,その病原性が臨床応用の際に問題となることが知られている。本研究ではその問題を解決するために,ブタ皮膚から作製したイオン化ゲルをベクターとして用いる方法を確立し,培養皮膚への安全かつ効率のよい遺伝子導入法の確立を目的とした。具体的にはイオン化ゲル陽性荷電格子中に陰性荷電しているプラスミドを入れ込み,この複合体を単球に貧食させることによって、貧食細胞中に遺伝子を取り込ませる。遺伝子導入効率はレポーター遺伝子であるGFP、ベータガラクトシダーゼ(LacZ)を用い、蛍光顕微鏡にて培養単球(ケラチノサイト)中のGFP陽性率をアデノウイルスベクターと比較検討した。遺伝子と陽性荷電ゲルとの結合は研究者が以前に確立しており,その結合率は高率で良好あった。さらに,本研究の遺伝子導入細胞であるケラチノサイトの貧食による遺伝子導入は,遺伝子導入率が高率で,既存の方法と同等に効率がよいことを証明するデータが得られた。しかしながら,ケラチノサイトを長期間生存させる培養環境が均一化できず難渋した。そのため,平成17年度も引き続き検討する必要を考えた。遺伝子を導入した単球(ケラチノサイト)の担体である培養皮膚の作成条件の検討を行った。共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元的な構造物を持った遺伝子の担体としての培養皮膚内でのLacZの分布の確認を試みた。
指導困難校における性行動に対する予防開発プログラムの開発

本研究の目的は、高等学校における性に関する教育を効果的なものにするため、性感染症を身近な問題として感じるためにどのような内容が効果的かを探ることであった。方法として、講義とワークショップを交えた2時間程度の性教育プログラムを2学年5クラスに実施した後、質問紙調査を実施した。性感染症を「とても身近に感じる」と答えたのは男子20.0%、女子41.8%だったのに対し、「身近に感じない」と答えたのは男子32.9%、女子24.0%であり、女子に比べ男子は性感染症に関心や危機感を感じていなかった。性感染症を身近な問題として感じられたかどうかをプログラムごとに検討したところ、「感染者数などの統計資料から性感染症の現状を知る」では男女差が見られなかったが、「ビデオ教材で実際にクラミジア感染症に感染した人の体験談を聞く」、「感染が広がる様子を擬似的に体験するゲームに参加する」の効果は、女子が男子に比べて有意に高かった。つまり、性別によって受け止め方が異なり、教育効果も異なることが示唆された。学校で性に関する指導を行う際、クラスまたは学年単位で行われることが多いが、この場合教育効果に男女差が生じる可能性がある。五十嵐(2002)は、男子は周りの人との比較によって性交を行おうとする傾向が強いこと、また斎藤ら(2006)は男子高校生の購読頻度が高い雑誌の性に関する記述が、女性誌に比べ医学的信憑性が低く興味本位な描写が多いという結果を報告している。このような現状を踏まえた男女別のプログラムを実施するか、またはプログラムに男子に対する動機付けを高める内容を組み入れるなどの工夫が必要であることが示唆された。今後は前述の工夫を施した予防プログラムの実施と評価が課題である。
オハイアット・ヌートカ語のドキュメンテーション研究およびコーパス構築

本研究では、消滅の危機に瀕し研究も未開発であるオハイアット・ヌートカ語(カナダ、ブリティッシュコロンビア州)において、のべ3か月の現地調査を通じて、文法パターンのみに注意を払う狭い意味での文法記述ではなく、自然な言語使用の観察に基づいて文法のみならずコミュニケーションスタイルや言語コミュニケーションを取り巻く文化・社会的背景をも含め総合的に記録する「ドキュメンテーション研究」を行い、学術的および人類の知的資産の保持に貢献する言語データベース・コーパスの構築を行った。研究初年度である本年度は、本研究の目的であるオハイアット・ヌートカ語のドキュメンテーション研究および言語総合データベース構築のための基盤作りを中心に行った。8月には3日から29日の27日間にわたり、カナダ、ビリティッシュ・コロンビア州バンクーバー島ポートアルバーニにおいて現地調査を行った。現地では、母語話者の協力を得ての語彙調査、ヌートカ語共同体における文化的・社会的背景に関する聞き取り調査とそのビデオ・ICレコーダによる記録および書き起こし、またオハイアット部族評議会内にある言語保持・再生委員会との協力体制や言語データの保存の仕様・有効活用の方法などについての協議を行った。収集された音声・映像データはコンピュータに取り込み、光学メディア(CD,DVD)に焼き込み、保管を行った。また文字化されたデータを用い、コーパスの構築を始めた。3月には21日から31日の11日間にわたり、ハワイ大学ヒロ校、マノア校において、少数言語保持プログラムの視察と少数言語の保持・活性化に関する資料調査および研究打ち合わせを行った。ヒロ校では言語保持プログラムの設立に初期から携わった担当教官らと、先住民言語のドキュメンテーション、コーパス記録、保持プログラムおよび教材開発についての方法・問題点などについての意見交換を行った。さらに言語保持プログラム(イマージョンスクール)の視察を行った。マノア校では言語ドキュメンテーション研究担当教官と今後の研究協力関係についての協議を行った。研究2年目である本年度は、本研究の目的であるオハイアット・ヌートカ語のドキュメンテーション研究および言語総合データベース構築のためのデータの拡充を中心に行った。7月31日から27日の28日間にわたり、カナダ、ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー島ポートアルバーニにおいて現地調査を行った。現地では、昨年度に引き続き母語話者の協力を得ての語彙調査、ヌートカ語共同体における文化的・社会的背景に関する聞き取り調査とそのビデオ・ICレコーダによる記録および書き起こしを行った。またオハイアット部族評議会内にある言語保持・再生委員会との協力関係のもとに言語データの保存作業・有効活用の方法などについての協議を行った。収集された音声・映像データはコンピュータに取り込み、光学メディア(CD, DVD)に焼き込み、保管を行った。またコーパスの拡充に向けて、データの文字化をすすめた。また、3月7日から16日の10日間にわたり、ハワイ大学マノア校において、少数言語のドキュメンテーション・保持に関するワークショップおよび学会に参加し、各国より集まった研究者たちと意見交換、研究打ち合わせおよび研究協力体制についての協議を行った。本研究では、消滅の危機に瀕し研究も未開発であるオハイアット・ヌートカ語において、コミュニケーションスタイルや言語コミュニケーションを取り巻く文化・社会的背景をも含め総合的に記録する「ドキュメンテーション研究」を目指し、言語データベースの構築を行った。研究3年目、最終年度である23年度は、オハイアット・ヌートカ語の言語総合データベース構築のためのデータのさらなる拡充および整理を行った。7月29日から8月30日の32日間にわたり、カナダ、ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー島ポートアルバーニにおいて現地調査を行った。現地では、昨年度に引き続き母語話者との面談・インタビューを重ね、語彙調査やヌートカ語共同体における文化的・社会的背景に関する聞き取り調査を行った。面談の内容はビデオ・ICレコーダによって記録し、さらにその記録をもとに母語話者の協力を得ての情報の整理、オハイアット・ヌートカ語の語彙・テキストデータの書き起こしを行った。またコーパスの拡充に向けてデータの文字化をすすめ、同時に文法分析を加えて、語彙・テキストデータベースとして、研究の次段階での利用をめざし汎用性の高い共通フォーマットによる蓄積を行った。
コンソミックマウスを用いた下顎角の大きさを規定する遺伝要因の検討

本研究は下顎角の大きさの異なるマウスを用いて,下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について検討することを目的として行った。マウスのDNAを抽出し,B6,C3H系統間で多型のあるDNAマーカーを設定し分析したところ,D13Mit76の近傍に大きさを規定する遺伝子の存在する可能性が示唆された。コンソミックマウスの下顎角の大きさを測定した結果,13番染色体が関わっている可能性が示唆された。環境要因が与える影響について検討するため,ラット上顎臼歯を5週齢で抜歯し粉末飼料で飼育し,マイクロCTで経時的に下顎角の大きさを計測した。抜歯群は720週齢までコントロール群よりも有意に大きかった。本研究は下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について検討し,さらにコンソミックマウスを用いて,その染色体が下顎角の大きさにどのような影響を与えているかを明確にすることを目的として行っている。まず,下顎角の大きさが異なる2系統の近交系マウス(下顎角の角度の大きいC57BL/6系統および角度の小さいC3H系統マウス)を交配し,F1マウスを得て,さらにF1マウス同士を交配させF2マウス30匹を得た。これらマウスの下顎骨を3か月齢にて摘出し,下顎角の大きさを測定した結果(85度99度)に分布した。またこれらマウスのDNAを腎臓より抽出し,第119番染色体それぞれにC57BL/6系統およびC3H系統間で多型のあるDNAマーカーを設定し,PCR-電気泳動法にて各F2マウスの遺伝子型を分析している。現時点においてD13Mit76プライマーを用い,PCRで増幅し遺伝子型の判定をしたところ,下顎角の角度が小さいマウスはC3Hホモ型およびヘテロ型を示したのに対し,角度が大きいマウスは1匹を除いてB6ホモ型およびヘテロ型を示した。このことから,このマーカーの近傍に下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する可能性が示唆された。次に,B6-Chr13MSMコンソミックマウスの下顎角の大きさを3か月齢にて測定した結果,C57BL/6系統よりも小さかったことから,13番染色体が下顎角の大きさの規定に関わっている可能性が示唆された。一部研究計画を変更しラットの上顎臼歯を抜歯し粉末飼料にて飼育を行い,下顎角を開大させ,次世代以降にどう影響を与えるかについて検討したところ,13世代に比較し4世代でさらに開大することが示唆された。下顎角の大きさと遺伝要因との関連性が少しずつ解明されており,小児歯科臨床においても,顎顔面領域の成長予測に応用することが期待され意義があると考える。本研究は下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について検討し,さらにコンソミックマウスを用いて,その染色体が下顎角の大きさにどのような影響を与えているかを明確にすることを目的として行った。まず下顎角の大きさが異なる2系統の近交系マウスを交配しF1マウスを得て,さらにF1マウス同士を交配させ,F2マウスを得た。これらマウスの下顎骨を3か月齢にて摘出し下顎角の大きさを測定した結果,8599度に分布した。またこれらマウスのDNAを抽出し,第119番染色体それぞれにB6,C3H系統間で多型のあるDNAマーカーを設定し,PCR-電気泳動法にて各F2マウスの遺伝子型を分析したところ,D13Mit76の近傍に下顎角の大きさを規定する遺伝子の存在する可能性が示唆された。次にB6-Chr13MSMコンソミックマウスの下顎角の大きさを3か月齢にて測定した結果,B6系統よりも小さかったことから,13番染色体が下顎角の大きさの規定に関わっている可能性が示唆された。一部研究計画を変更し環境要因が下顎角に与える影響について検討するため,wistar系ラットの上顎臼歯を5週齢で抜歯し粉末飼料にて飼育し,マイクロCTを用いて、経時的に下顎角の大きさを計測した。抜歯群,コントロール群ともに520週齢にかけ徐々に小さくなり,抜歯群は720週齢までコントロール群よりも有意に大きかった。TRI/3D-BONで解析したところ,下顎骨の体積,骨塩量,骨密度,骨の厚さ,すべてにおいて抜歯群は有意に低値を示した。またこのラットの下顎骨で非脱灰薄切標本を作製し骨形態計測を行ったところ,下顎頭の軟骨細胞の配列のみだれや静止,増殖,肥大細胞の比率の変化が認められた。下顎角の大きさと遺伝・環境要因との関連性が少しずつ解明されており,臨床においても顎顔面領域の成長予測に応用することが期待され意義があると考える。

環境要因が与える影響について検討するため,ラット上顎臼歯を5週齢で抜歯し粉末飼料で飼育し,マイクロCTで経時的に下顎角の大きさを計測した。抜歯群は720週齢までコントロール群よりも有意に大きかった。本研究は下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について検討し,さらにコンソミックマウスを用いて,その染色体が下顎角の大きさにどのような影響を与えているかを明確にすることを目的として行っている。まず,下顎角の大きさが異なる2系統の近交系マウス(下顎角の角度の大きいC57BL/6系統および角度の小さいC3H系統マウス)を交配し,F1マウスを得て,さらにF1マウス同士を交配させF2マウス30匹を得た。これらマウスの下顎骨を3か月齢にて摘出し,下顎角の大きさを測定した結果(85度99度)に分布した。またこれらマウスのDNAを腎臓より抽出し,第119番染色体それぞれにC57BL/6系統およびC3H系統間で多型のあるDNAマーカーを設定し,PCR-電気泳動法にて各F2マウスの遺伝子型を分析している。現在分析中であるが,現時点においてD13Mit76プライマーを用い,PCRで増幅し遺伝子型の判定をしたところ,下顎角の角度が小さいマウスはC3Hホモ型およびヘテロ型を示したのに対し、角度が大きいマウスは1匹を除いてB6ホモ型およびヘテロ型を示した。このことから,このマーカーの近傍に下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する可能性が示唆された。次に,B6-Chr13MSMコンソミックマウスの下顎骨を3か月齢にて摘出し,下顎角の大きさを測定した結果,C57BL/6系統よりも小さかったことから,13番染色体が下顎角の大きさの規定に関わっている可能性が示唆された。現時点において下顎角の大きさと遺伝要因との関連性が少しずつ解明されており,小児歯科臨床においても,顎顔面領域の成長予測に応用することが期待され,意義があると考える。コンソミックマウスの下顎角を測定するため、交配を行っているが、匹数を増やすのに時間がかかるため。現時点において,下顎角の大きさと遺伝要因との関連性が少しずつ解明されているので,おおむね順調に進展しているものと考える。ただ下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について全染色体を網羅的に検討していきたいので、より一層の努力が必要である。しかしながらコンソミックマウスの交配に時間を要するため,その対応策として研究計画を一部変更し,wistar系ラットを用いて上顎臼歯を5週齢にて抜歯し粉末飼料にて20週齢まで飼育することにより下顎角を開大させ,これが次世代以降にどのように影響していくのかについても検討している。また,マイクロCTを用いた下顎角の経時的変化の検討や骨形態計測も行っている。今後については,下顎角の大きさが異なる2系統の近交系マウスを交配して得られたF2マウスのDNAを,第119番染色体それぞれに設定したDNAマーカーを用いて,各F2マウスの遺伝子型を分析することにより,下顎角の大きさを規定する遺伝子が存在する染色体領域について全染色体を網羅的に検討していきたい。また現時点でコンソミックマウスはB6-Chr13MSMコンソミックマウスのみの検討しか行っていないが,その他の染色体が置き換わっているコンソミックマウスの下顎角の大きさについても測定していきたい。該当なし次年度においてはコンソミックマウスの購入や遺伝子解析に用いる消耗品,学会発表等に使用する計画である。
がん細胞の特性を決定する細胞骨格異常の生化学的解析

トリ肉腫ウィルスがん遺伝子産物pp60^<vー<src>___ー>はその機能部位である細胞膜内側に運ばれるまでは、熱ショックタンパク質HSP90およびpp50と3者複合体を形成しているが、このHSP90の性質を解析した。HSP90は生理的条件下でα/αおよびβ/βホモダイマ-として存在し、アクチンに結合する。同時にかなりのβモノマ-が存在し、上記pp60^<vー<src>___ー>との複合体形成に関与すると考えられる。トリ肉腫ウィルスRSVによってがん化した細胞では、正常細胞より多量のカドヘリンが合成されているにもかかわらず、カドヘリン依存性の細胞凝集が起こらないことを見出した。RSVでがん化した細胞では、カドヘリンおよびカドヘリン結合タンパク質カテニンがチロシンリン酸化を受けていることが明らかになった。RSV各種変異株を用いて、これらのタンパク質のチロシンリン酸化と細胞がん化の関係を調べた。バナデ-ト存在下に調べると、正常靜止期細胞中のチロシンリン酸化されたタンパク質は、増殖している細胞と比較しても、必しも低くない。しかしバナデ-トを除くと、チロシンリン酸化されたタンパク質のレベルは急速に下る。したがって、正常靜止期細胞では、チロシンキナ-ゼと共にチロシンフォスファタ-ゼも同時に活性化されていることが明らかになった。AJに存在する細胞型がん遺伝子産物(チロシンキナ-ゼ活性を有する)によってチロシンリン酸化を受けるタンパク質として、アクチン結合タンパク質ラディキシンを同定した。マウス骨髄性白血病細胞M1では中間フィラメントタンパク質ビメンチンは分解を受けやすいが、分化した細胞では分解が抑制されていることを見出した。増殖刺激により活性化されるMAPキナ-ゼは、cdc2キナ-ゼの下流で作用し、微小管サイクルの調節に関与することを明らかにした。
ショウジョウバエ神経回路形成に関わるslitのマウスホモログの同定と解析

我々は今回ヒトLRR部分cDNAをプローブとし胎生15日のマウスbrain cDNAlibraryをスクリーニングした。プローブとしては、アメリカNIHのヒトbrain cDNA library sequencenceing prject(M.D.Adams etal.Nature Genetics 4,373-380,1993)で報告された、LRR蛋白スーパーファミリーに属するSLITと、50%のホモロジーを持つクローン(EST06184)をプローブとし緩徐な条件下でプラークハイブリゼイションにて一次及び二次スクリーニングを行った。このファミリーに属する2つの独立したクローンA,Bが得られ塩基配列を決定したところそれぞれLRR構造を持つことが確認された。またクローンAに関しては全長cDNAの解析を行いこのクローンが膜貫通型で、細胞外に11個のLRRを持つ接着因子様構造を有することが明かとなった。クローンAをプローブとしたadult臓器別のNorthen blottingでは約4Kbの位置に単一のバンドが認められ、脳に強く発現しその他の臓器では肺と腎臓に弱いシグナルを認めるのみであった。得られた部分cDNAを鋳型としcRNAプローブを合成、胎生13,15,17,19日のマウス胎児およびadult brainにてmRNAの分布をRI in situ hybridizationで検討したところ2つのクローンとも主に胎生期の神経系(脳、脊髄、dorsa root ganglion)および軟骨組織などに特異的に発現しており、クローンAは胎生13日に最も強く発現し、発現量および発現部位は徐々に縮小しadult brainでは海馬を中心に発現が見られるのみである。また、クローンBにおいては胎生13,15,17,19日で脳、脊髄にその発現が同じ程度見られ、adult brainでは海馬を中心に発現が見られた。
咽喉頭電気刺激による嚥下および呼吸中枢の協調性の改善に関する研究

咽頭喉頭電気刺激による嚥下および呼吸中枢への作用と嚥下と呼吸の協調性に関する制御機構を解明するため、嚥下中枢と呼吸中枢が共有される領域を検討した。まず、呼吸中枢のなかで、呼気調節に重要な領域である傍顔面神経核呼吸ニューロン群に注目し、その嚥下生成および制御への関与を検討した。そこで、この領域は嚥下制御にも貢献していることが示された。また、咽頭喉頭電気刺激による嚥下、呼吸中枢制御を検討するため、経皮的頸部電気刺激による呼吸リズム、嚥下惹起性への影響を検討した。通常嚥下に関与する筋群の多くは呼吸性活動を呈している。そして一旦嚥下が惹起されると、安静時呼吸のリズムが劇的に変化し、パターン化された嚥下活動を行う。このパターン化された嚥下生成を行う中枢は脳幹に存在する。そして嚥下生成神経ネットワークが呼吸中枢に影響を与える、あるいは呼吸中枢自体が嚥下のための準備をしたり、嚥下制御自体に貢献することで嚥下が正しく行われることが予想される。このように嚥下と呼吸が正確に制御されることで誤嚥を防ぐことが出来るのであるが、この嚥下と呼吸の協調性の成因を探るには呼吸中枢の嚥下における制御機構を検討する必要がある。従ってどの領域の呼吸ニューロンがその相互関係に重要かを解明するために、呼吸中枢の嚥下時活動解析を行った。我々は以前の研究で呼吸中枢の嚥下時解析を行い、嚥下時の延髄腹側呼吸ニューロン群の活動変化を解析した。そこで、そのより吻側に存在する傍顔面神経核呼吸ニューロン群における嚥下時活動解析を行った。その結果、傍顔面神経核呼吸ニューロン群の様々な呼吸ニューロンはそれぞれのタイプ毎に嚥下時に特徴的な活動性変化を生じ、嚥下活動制御に影響を与えていることが示された。この結果により、延髄の多くの呼吸ニューロンは何らかの形で嚥下生成および制御に関与していると考えられた。また、傍顔面神経核呼吸ニューロン群の尾側レベルで脳幹を切断しても嚥下反射が生じることから、この領域は嚥下活動の制御に何らかの関与を示す可能性はあるが、嚥下リズム生成自体への関与は乏しいことも示唆される結果となった。嚥下と呼吸の協調性について検討するために、呼吸中枢の嚥下への関与を検討した。そこで、呼吸中枢のなかで、呼気調節に重要な領域である傍顔面神経核呼吸ニューロン群に注目し、その嚥下生成および制御への関与を検討した。この研究により延髄呼吸中枢の嚥下制御機構の一端が解明されることとなり、呼吸神経ネットワークの機能の一端が明らかになった。呼吸中枢における嚥下の制御様式の全貌が解明されたわけではないので、嚥下と呼吸の相互関係に最も重要な役割を担っている領域の特定には至っていないが、傍顔面神経核呼吸ニューロン群より尾側の領域で嚥下リズム生成が行われている可能性は示唆された。また、嚥下と呼吸の協調性は内因的な要素だけでなく、周囲の環境変化を含む外的要因によっても修飾されるはずである。したがって、次に外的刺激よる嚥下中枢および呼吸中枢に及ぼす影響を検討した。経皮的電気刺激法を用いて、刺激中の呼吸の変化および嚥下惹起性の変化を検討した。また、刺激中の嚥下中枢への情報伝達様式を検討するために、刺激に対する嚥下関連ニューロンの活動性の変化を解析した。