hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体ストレス病としての関節リウマチ研究

ストレスによって誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス作用を介して、滑膜細胞の過増殖、すなわち関節症の発症・重篤化を制御していることを遺伝子改変マウスで証明することに成功した(Genes Dev 2003 17 : 2436-49)。さらにこの成果をもとに、RAとはシノビオリンを介したERストレスに対する過剰な応答により引き起こされるという疾患モデルを提唱した。本研究では、この疾患モデルの妥当性を検証することを主目的とし、最終的にシノビオリンを標的としたRA治療の戦略の構築を目指している。これまでに作製したシノビオリン遺伝子プロモーター領域にβ-ガラクトシダーゼを融合させた遺伝子の過剰発現マウスを用いて、シノビオリンの発現制御を明らかにすることを試みた。その結果、下記に示す成果を得ることに成功した(Mol Cell Biol 2005)。(1)シノビオリンの転写活性化にはプロモーター上のEBS(Ets binding site)がコアエレメントとなる。(2)EBSにはGABPα/β転写複合体が結合し、シノビオリンの転写活性化を担っている。(3)EBSデコイ核酸によりRA滑膜細胞増殖が制御される。これらの知見を生かし、ERストレスによるシノビオリン発現誘導機構を解明し、ストレス源を同定することでRA新規治療標的の発見へと発展させていく予定である。われわれはすでに新規E3ユビキチンリガーゼシノビオリンを同定し、RAの原因遺伝子であることを報告した(参考文献1-5)。今年度は、その基質を探索することを目的とした。シノビオリン遺伝子欠損マウス由来のmouse embryonic fibroblasts(MEFs)とその比較対象である同腹の野生型マウス由来のMEFsよりタンパク質を抽出し、二次元電気泳動法によりプロテオミクス解析を行った。とくに本研究ではシノビオリン欠損MEFsにて蓄積している分子に関して同定した。その結果、驚くべきことにアンチオンコ遺伝子産物p53がシノビオリンによりユビキチン化され、かつ同分子の量と質の両面での制御にシノビオリンが細胞質、とりわけ小胞体でかかわっていることが世界で初めて明らかとなった。さらに、ショウジョウバエを用いた遺伝学的解析により、本調節機構は生体内でp53による細胞の増殖・死に関与することが証明された。以上の結果から、RAの滑膜細胞anti-apoptotic分子であるシノビオリンがERストレスとともにp53のシグナルを介してRAを引き起こすという斬新なモデルを提唱することとなった。また、本モデルはRAに留まらず、がん・動脈硬化などの増殖性疾患に一般に展開可能であることは自明である。また、蛋白分解の基盤研究の面でもシノビオリンの双方向的シグナル調節機構は今後、多大なる貢献を予想させる発見であろう。われわれのシノビオリンという独自にクローニングした分子の研究成果は、ついにRAのみならず、がんなどへの大きな展開を見せることとなった。さらに、同分子を標的とすることにより革新的RA治療が可能となることの理論構築がなされた。
プラズマプロセスにおけるサブナノ粒子のその場測定法の開発

プロセスプラズマ中に発生する微粒子の抑制および微粒子の有効利用の観点から,発生直後からの微粒子の成長過程を明らかにすることは極めて重要な課題となっている.しかし,10nm程度以下の微粒子の有効な計測法が無かったことから,本研究では,プロセスプラズマ中に発生するnm領域およびサブnm領域の微粒子のサイズと密度のその場測定法として,それぞれフォトンカウンティングレーザ散乱法(PCLLS法),および閾値光電子放出法とマイクロ波干渉法を組み合わせた方法(TPE-MI法)と開発した.PCLLS法は1nm程度以上のサイズ,10^6cm^<-3>程度以上の密度の微粒子のサイズと密度のその場測定が,TPE-MI法はSi_5H_m程度以上のサイズ,10^9cm^<-3>程度以上の密度の微粒子に対して適用可能である.さらに,これらの方法を用い,高周波シランガス放電プラズマ中の微粒子の初期成長過程に関して,1)デバイスクオリティのa-Si:H薄膜が作製できる条件の下でも,サブnm領域の微粒子密度は,プラズマの正イオン密度よりも1桁以上高く,微粒子の殆どは電気的に中性であること、2)微粒子は,ラジカル発生が盛んなプラズマ/シース境界領域で初期成長すること,3)微粒子の初期成長は短寿命中性ラジカルSiH_2に起因して発生した小さなクラスターの寄与によっていること,等の多くの新しい知見が得られた.プロセスプラズマ中に発生する微粒子の抑制および微粒子の有効利用の観点から,発生直後からの微粒子の成長過程を明らかにすることは極めて重要な課題となっている.しかし,10nm程度以下の微粒子の有効な計測法が無かったことから,本研究では,プロセスプラズマ中に発生するnm領域およびサブnm領域の微粒子のサイズと密度のその場測定法として,それぞれフォトンカウンティングレーザ散乱法(PCLLS法),および閾値光電子放出法とマイクロ波干渉法を組み合わせた方法(TPE-MI法)と開発した.PCLLS法は1nm程度以上のサイズ,10^6cm^<-3>程度以上の密度の微粒子のサイズと密度のその場測定が,TPE-MI法はSi_5H_m程度以上のサイズ,10^9cm^<-3>程度以上の密度の微粒子に対して適用可能である.さらに,これらの方法を用い,高周波シランガス放電プラズマ中の微粒子の初期成長過程に関して,1)デバイスクオリティのa-Si:H薄膜が作製できる条件の下でも,サブnm領域の微粒子密度は,プラズマの正イオン密度よりも1桁以上高く,微粒子の殆どは電気的に中性であること、2)微粒子は,ラジカル発生が盛んなプラズマ/シース境界領域で初期成長すること,3)微粒子の初期成長は短寿命中性ラジカルSiH_2に起因して発生した小さなクラスターの寄与によっていること,等の多くの新しい知見が得られた.半導体デバイスの高集積化に伴い,デバイス特性の劣化と歩留まり低下の原因となるプロセシングプラズマ中微粒子のサイズも小さくなり,ナノ微粒子の発生を抑制する手法の開発が望まれている.このため,発生直後のサブナノメータサイズ以下の微粒子の計測法を開発する必要がある.本年度,本研究では,光脱離,光電離の閾値がクラスタのサイズに依存することを用いて,クラスタのサイズ,密度のその場測定法(閾値光脱離・電離レーザ分光法)を考案し,サイズ別に負および中性Siクラスタ密度の時空間分布を得ることに成功した.その結果,核形成期にSiクラスタの9割近くが中性であることが明らかになった.また,静電プローブ法を応用したクラスタのサイズのその場測定法を考案し,Si微粒子は,プラズマシースの境界領域で発生することがわかった.現在,本手法の適用領域はSi_nH_x(n<10,n<200,n>20)であるが,次年度はさらに光パラメトリック発振器(OPO)を改良して精度を上げて発生直後のサブナノ微粒子の計測をより詳しく行い,微粒子の発生・成長機構を明らかにして行く予定である.半導体デバイスの高集積化に伴い,デバイス特性の劣化と歩留まり低下の原因となるプロセシングプラズマ中微粒子のサイズも小さくなり,ナノ微粒子の発生を抑制する手法の開発が望まれている.このため,本研究では発生直後のサブナノメータサイズの微粒子の計測法の開発を行っている.本年度までに,光脱離および光電離エネルギーの閾値がクラスタのサイズに依存することを用いたクラスタのサイズと密度のその場測定法(閾値光電子放出法)を考案し,サイズ別に負帯電および中性Siクラスタの密度の時空間分布を得ることに初めて成功した.この方法と申請者が独自に開発した再現性の良いクラスター生成法であるパルス高周波放電法を組み合わせることにより,サブnmから約2nmのSiクラスタ(微粒子)の発生・成長機構を系統的に調べた.その結果,シランプラズマ中では核形成からnmサイズに至る初期成長期には中性のSiクラスタが極めて多く存在し,これらが基板にまで達する可能性があることが初めて明らかにした.プロセスプラズマ中に発生する微粒子の抑制および微粒子の有効利用の観点から,発生直後からの微粒子の成長過程を明らかにすることは極めて重要な課題となっている.

しかし,10nm程度以下の微粒子の有効な計測法が無かったことから,本研究では,プロセスプラズマ中に発生するnm領域およびサブnm領域の微粒子のサイズと密度のその場測定法として,それぞれフォトンカウンティングレーザ散乱法(PCLLS法),および閾値光電子放出法とマイクロ波干渉法を組み合わせた方法(TPE-MI法)を開発した.PCLLS法は1nm程度以上のサイズ,10^6cm^<-3>程度以上の密度の微粒子のサイズと密度のその場測定が,TPE-MI法はSi_5H_m程度以上のサイズ,10_9cm^<-3>程度以上の密度の微粒子に対して適用可能である.さらに,これらの方法を用い,高周波シランガス放電プラズマ中の微粒子の初期成長過程に関して,l)デバイスクオリティのa-Si:H薄膜が作製できる条件の下でも,サブnm領域の微粒子密度は,プラズマの正イオン密度よりも1桁以上高く,微粒子の殆どは電気的に中性であること,2)微粒子は,ラジカル発生が盛んなプラズマ/シース境界領域で初期成長すること,3)微粒子の初期成長は短寿命中性ラジカルSiH_2に起因して発生した小さなクラスターの寄与によっていること,等の多くの新しい知見が得られた.
テトラヒドロビオプテリン羊水内注入による胎盤血流改善療法の開発

1.これまでの研究で、Tetrahydrobiopterin(BH_4)が胎児側より血流を介して供給されている可能性が高いことが明らかとなった。このSalvage回路において、BH_4と葉酸代謝が競合する可能性がある。そこで、臍帯血中Biopterinと葉酸濃度を測定し、出生体重およびドップラー超音波で計測した臍帯動脈血流との相関を検討した。結果、出生体重および臍帯動脈血流とBiopterinおよび葉酸濃度との間に明らかな相関は認められなかった。このことから、胎盤のSalvage回路活性は、かなりの余裕をもって存在している可能性が示唆された。2. BH_4によって賦活産生される一酸化窒素には血小板凝集抑制作用がある。胎盤機能不全症例の胎盤絨毛の母体側表面には、著明なフィブリン沈着がしばしば認められ、胎児-母体血間の物質交換が阻害される。そこで、血液凝固とBH_4代謝の関連について検討するために、血液凝固制御因子であるProtein Sの母体血レベルを測定し、その胎盤における沈着を免疫組織学的に検討した。その結果、血中Protein Sが低下すること、Protein Sが妊娠中期後期の胎盤絨毛に沈着することが判明した。これらのことから、妊娠中期以後の胎盤絨毛表面において凝固系およびその阻害系が活発に連動していることが判明した。同時期の母体血中Biopterinも有意に低下することから、BH_4需要も高いことが示唆された。胎盤機能維持には、絨毛の母体側表面のBH_4レベルが重要である可能性が考えられた。3. BH_4産生阻害薬を投与したラット子宮内胎児発育遅延モデルを作成した。本モデルの羊水中にBH_4を注入したが、有意な改善傾向が認められなかった。上記2を考慮すると、本モデル下では胎児側のみならず絨毛表面にアクセス可能な母体血経由の投与も同時に必要なのではないかと考えられ、現在検討中である。テトラヒドロビオプテリン(BH_4)は、一酸化窒素合成に不可欠な物質であり、胎児胎盤循環においても重要な物質であると考えられている。胎児発育におけるBH_4の意義を知るために、妊娠ラットにBH_4合成阻害剤である2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジンを妊娠16日目より連続投与し、非投与群と胎児・胎盤重量を比較した。その結果、投与群の胎児体重および胎盤重量は非投与群のそれらに比して有意に低かった。このことから、BH_4が胎児および胎盤組織の発育に重要な作用を有していることが判明した。今後、このBH_4欠乏下子宮内胎児発育遅延モデルを用いて、BH_4補充経路として羊水内注入が有効であるかどうかを検討する。一方、ヒトの胎盤におけるBH_4合成酵素活性の研究から、胎児胎盤系におけるBH_4産生経路としてデヒドロ葉酸還元酵素を介する経路が最も重要であることが判明した。この酵素はBH_4のみならず、活性型葉酸の維持にも不可欠な酵素である。すなわち、BH_4レベルの維持が葉酸を維持する経路と同一の酵素で形成されていることを示す。従って、胎児におけるBH_4を用いた治療法確立のためには、BH_4代謝と葉酸代謝の相関を検討することが不可欠であると考えられた。そこで、臍帯血中のビオプテリンと葉酸の濃度を測定し、両者の相関を解析した。その結果、両者の間には有意な相関は認められなかった。このことは、正常発育ヒト胎児においてはBH_4と葉酸を維持するシステムが共有されているが、共有酵素であるデヒドロ葉酸還元酵素活性が両者のレベルに影響を与えないほどに十分に存在することによると考えられる。しかしながら、実際に治療対象となる胎盤機能不全状態の胎児・胎盤での検討は不十分であり、今後さらに解析する必要があると考えられた。これまでの研究で、胎児胎盤系におけるBH_4産生経路としてデヒドロ葉酸還元酵素を介する経路が最も重要であることが判明した。そこで、正常胎児における臍帯血中ビオプテリン(BH_4代謝産物)と葉酸の濃度の相関を検討した。このことから、正常発育ヒト胎児においてはBH_4と葉酸を維持するシステムが共有されているが、共有酵素であるデヒドロ葉酸還元酵素活性が両者のレベルに影響を与えないほどに十分に存在することによると考えられた。また、ヒト胎児胎盤循環におけるBH_4の意義を検討するために、臍帯動脈血流のResistance index(RI)値を超音波パルス・ドップラー法によって解析し、これを臍帯血中ビオプテリン濃度と比較検討した。また、出生体重、新生児頭囲および胎盤重量を臍帯血中ビオプテリン濃度と比較検討した。

その結果、臍帯血中のビオプテリン濃度は5.0から35.0nMで広く分布したのに対して、臍帯動脈血流のRI値は0.50.7の狭い範囲に分布することが判明した。両者の間には明らかな有意な相関は認められなかった。また、ビオプテリンの広い分布に対して、出生体重、新生児頭囲および胎盤重量の分布も狭い領域に分布していた。このことから、正常発育ヒト胎児においては、ビオプテリン濃度の低い胎児においても、胎盤血流維持および子宮内発育に十分なBH_4産生の予備力が存在することが考えられた。1.これまでの研究で、Tetrahydrobiopterin(BH_4)が胎児側より血流を介して供給されている可能性が高いことが明らかとなった。このSalvage回路において、BH_4と葉酸代謝が競合する可能性がある。そこで、臍帯血中Biopterinと葉酸濃度を測定し、出生体重およびドップラー超音波で計測した臍帯動脈血流との相関を検討した。結果、出生体重および臍帯動脈血流とBiopterinおよび葉酸濃度との間に明らかな相関は認められなかった。このことから、胎盤のSalvage回路活性は、かなりの余裕をもって存在している可能性が示唆された。2. BH_4によって賦活産生される一酸化窒素には血小板凝集抑制作用がある。胎盤機能不全症例の胎盤絨毛の母体側表面には、著明なフィブリン沈着がしばしば認められ、胎児-母体血間の物質交換が阻害される。そこで、血液凝固とBH_4代謝の関連について検討するために、血液凝固制御因子であるProtein Sの母体血レベルを測定し、その胎盤における沈着を免疫組織学的に検討した。その結果、血中Protein Sが低下すること、Protein Sが妊娠中期後期の胎盤絨毛に沈着することが判明した。これらのことから、妊娠中期以後の胎盤絨毛表面において凝固系およびその阻害系が活発に連動していることが判明した。同時期の母体血中Biopterinも有意に低下することから、BH_4需要も高いことが示唆された。胎盤機能維持には、絨毛の母体側表面のBH_4レベルが重要である可能性が考えられた。3. BH_4産生阻害薬を投与したラット子宮内胎児発育遅延モデルを作成した。本モデルの羊水中にBH_4を注入したが、有意な改善傾向が認められなかった。上記2を考慮すると、本モデル下では胎児側のみならず絨毛表面にアクセス可能な母体血経由の投与も同時に必要なのではないかと考えられ、現在検討中である。
血管内血管新生における内皮細胞・平滑筋細胞相互反応に関する分子病理学的研究

血管内皮細胞と平滑筋細胞の相互反応は、血管の生理的機能を維持してゆく上で極めて重要であり、血管病変の成立、進展における両者の形態的、機能的変化とともにこれら相互反応の病態生理学的意義が注目されている。本研究は、動脈硬化巣内に認められる内膜内新生血管に着目し、以下の問題点を明らかにすることを目的としている。即ち、1)ヒト冠状動脈の動脈硬化巣内に認められる新生血管の臨床病理学的特徴、特にそれら血管が内膜、外膜のいずれの血管内皮細胞増生に由来するのか、又、血管増生部の病理形態学的特徴について、2)心筋梗塞の責任冠状動脈に見られる閉塞性血栓形成の原因として注目されている硬化内膜の線維性被膜の破綻における硬化内膜内新生血管の病因論的意義、3)硬化内膜に見られる新生血管の形成機序における血管内皮細胞と、平滑筋細胞、浸潤マクロファ-ジとの相互反応の意義についてである。これらの問題点の解決は、更に動脈栄養血管の新生機序に関する以下の基礎的研課題に発展する。即ち、1)内膜由来血管新生における血栓の意義、2)外膜由来血管新生における血管壁低酸素、pHの変化、その他の代謝産物の血管新生誘導作用の意義、3)動脈内膜内に浸潤したリンパ球、マクロファ-ジと平滑筋細胞相互反応におけるサイトカインを介したネットワ-クの血管新生機序における意義についてである。剖検時に摘出した31心臓(心筋梗塞症例11を含む)の透徹標本を用いて、マイクロフィルにて死後アンジオを行い、三次元的観察により以下の結果を得た。1)内膜内血管新生の多くは区域性に複雑な網目を形成して認められ、これらの多くは、光顕的に連続切片を作製して検索した結果より、外膜由来の新生血管であった。2)一部の新生血管には内腔に近接する巣状の内膜内新生血管を認め、これらの多くには光顕的に内腔に直接、連続する交通血管の存在を認め、内腔由来の血管新生であることを示唆した。3)極めて少数であるが、分枝動脈から壁内で分枝した血管に由来するものも認められた。4)これら新生血管の組織学的特徴として、壁は菲薄で、しばしば蛇行、拡張し不規則な血管網を形成していた。5)血管新生の程度と内膜病変の質的関係を光顕的に検討すると、血管新生は(1)内腔の狭窄度、(2)マクロファ-ジやリンパ球の浸潤の程度、(3)粥腫形成、(4)出血の程度と正の相関を示した。逆に石灰化や硝子化が顕著な部では新生血管の密度は低かった。以上の結果より、内膜内血管新生は動脈硬化発生の原因とは考え難く、寧ろ動脈硬化性障害に対する修復反応の一つと考えたい。又、内腔の狭窄度と血管新生の程度が相関することは、肥厚内膜の深部が低酸素状態にあるとする生理学的研究の結果とも併せて、低酸素状態に陥った内膜内に浸潤、増生したマクロファ-ジや平滑筋細胞由来の血管新生因子がヒト冠状動脈の動脈硬化性病変における血管新生に関与している可能性が考えられる。

5)血管新生の程度と内膜病変の質的関係を光顕的に検討すると、血管新生は(1)内腔の狭窄度、(2)マクロファ-ジやリンパ球の浸潤の程度、(3)粥腫形成、(4)出血の程度と正の相関を示した。逆に石灰化や硝子化が顕著な部では新生血管の密度は低かった。以上の結果より、内膜内血管新生は動脈硬化発生の原因とは考え難く、寧ろ動脈硬化性障害に対する修復反応の一つと考えたい。又、内腔の狭窄度と血管新生の程度が相関することは、肥厚内膜の深部が低酸素状態にあるとする生理学的研究の結果とも併せて、低酸素状態に陥った内膜内に浸潤、増生したマクロファ-ジや平滑筋細胞由来の血管新生因子がヒト冠状動脈の動脈硬化性病変における血管新生に関与している可能性が考えられる。
自然レベル放射性炭素を用いた海洋古細菌による水温決定に関する同位体地球化学的検討

堆積物に保存されている海洋性古細菌の細胞膜脂質(GDGTs)を用いた水温(TEX86)復元プロキシーの実用化をめざすため、海洋性古細菌のバイオマス量の水深分布や海洋性古細菌の起源を明らかにする。駿河湾内の異なる深度での採水し、海洋性古細菌の微生物生態学的情報と各深度におけるGDGTsの組成、存在量について調査を行った。GDGTsの自然レベル14C含有量(Δ14C)と海水中DIC、DOC、POCのΔ14Cの比較から、現場海域各深度におけるGDGTsの炭素源を明らかにした。水深700mで採取された試料から抽出されたGTGTsのΔ14Cは、約-400‰、年代に換算すると約4000年、それに対し、DIC及びDOCのΔ14Cは、それぞれ-40‰、-700‰となり、GDGTsの値は、現場海水のDIC値と大きく異なっていた。本結果は、GDGTsの起源とする古細菌の生息深度について、多様な水塊で生息していることを考慮する必要性を示すものであった。堆積物に保存されている海洋性古細菌(マリンクレンアーキオータ)細胞膜脂質(GDGTs)を用いた水温(TEX86)復元プロキシーの実用化をめざすため、堆積物コアを採取する現場海域におけるGDGTsを作るマリンクレンアーキオータのバイオマス量の水深分布やクレンアーキオータの起源について明らかにする。すなわち、堆積物コアに保存されるGDGTsがどの水深に生息するクレンアーキオータであるのかを解明する。本申請研究では、CTDによる現場海域における大量採水を実施し、水深ごとのクレンアーキオータの系統解析とGDGTsと各深度別のDICサンプルのΔ^<14>C測定を行うことによりこの問題についての答えを得たい。今年度は、GDGTs抽出法の検討のため、海洋深層水取水施設で実施した10万Lまでの大量濾過により採取された試料(メンブレンフィルター)を用いてGDGTs回収量の検討を行った。大量濾過では、1umから0.2umサイズのフィルターにより回収された。それぞれのフィルターから抽出したGDGTs量は、1umサイズがもっとも多く、微生物のサイズと予想される(0.2-0.5um)よりも大きいサイズの粒状物にGDGTs脂質の多くが補足されていることが明らかとなった。本結果は、今後採取に用いるフィルターサイズを決定する上で重要な知見といえる。本研究では、堆積物に保存されている海洋性古細菌(マリンクレンアーキオータ)細胞膜脂質(GDGTs)を用いた水温(TEX86)復元プロキシーの実用化をめざすため、堆積物コアを採取する現場海域におけるGDGTs有機化合物を作るマリンクレンアーキオータのバイオマス量の水深分布やクレンアーキオータの起源について明らかにすることを目的としている。本年度は、LC/MSによるGDGTs有機化合物の定量の精度向上のため、海外の研究機関との間で、赤道域、温帯、高緯度域で採取された海洋堆積物、土壌試料を用いた比較検討実験を行った。それらの測定結果は、各ラボ間での誤差について統計的に処理が行われ、異なるLC/MS間での測定値の相互比較のための重要な基礎データとなる。さらに、フィルター試料を用いたGDGTsの抽出条件について分析化学的検討を進め、最適な抽出条件を決定することができた。加えて、分取高速液体クロマトグラフによる分離精製条件についても検討を行った。以上の検討に続き、精製されたGDGTs有機化合物の放射性炭素測定の為の試料前処理に検討を始めた。特に分取高速液体クロマトグラフのカラムブリードによる汚染炭素量の把握をするための実験を進めた。その結果、現在想定している分取量(数十マイクログラム炭素)に対して、数マイクログラム相当の汚染があることが分かった。これらの汚染量は、分取で使用する溶媒量に比例しているため、最終的には、マスバランスの関係を用いて補正ができることが確かめられた。これらの条件を用い、現在、静岡県深層水施設で採取したフィルター試料並びに北極海底質試料からのGDGTsの抽出、定量分析も開始した。

堆積物に保存されている海洋性古細菌の細胞膜脂質(GDGTs)を用いた水温(TEX86)復元プロキシーの実用化をめざすため、堆積物コアを採取する現場海域におけるGDGTsを作る海洋性古細菌のバイオマス量の水深分布や海洋性古細菌の起源を明らかにする。北西太平洋域において様々な深度での採水、および表層堆積物から、現場海域における海洋性古細菌の微生物生態学的情報と各深度におけるGDGTsの組成、存在量について調査を行う予定である。これにより、堆積物に保存されているGDGTsから求められるTEX86がどの水深を反映しているのか特定する。これらのGDGTsの自然レベル14C含有量(Δ14C)と海水中DIC、DOC、POCのΔ14Cの比較から、現場海域各深度におけるGDGTsの炭素源を明らかにし、堆積物に記録されるTEX86の有効性を確認する。海洋古細菌の生息深度に関する情報を得るため、古細菌のGDGTsであるエーテル脂質の14C測定を行った。分析条件の検討も含め駿河湾の水深400mの深層水からGDGTsを抽出し、GDGTsの放射性炭素測定を行った。その結果、GTGTsのΔ14Cは、約-400‰、年代に換算すると約4000年、それに対し、DIC及びDOCのΔ14Cは、それぞれ-40‰、-700‰となり、GDGTsの値は、現場海水のDIC値と大きく異なっていることが明らかとなった。GDGTsが表層海水の平均水温を表すとすれば、少なくともGDTsの起源は表層水の炭素を起源としていなくてはならないことから、本結果は、GDGTsの起源とする古細菌の生息深度について、多様な水塊で生息していることを考慮する必要性を示すものであった。静岡県駿河湾において海水の大量濾過を行った。これにより得たフィルター試料からの微生物膜脂質分子(エーテル脂質(古細菌)、脂肪酸(細菌))の抽出法の検討と同定を行った。フィルターは、大容量ソックスレー抽出機により、溶媒可溶脂質成分の全抽出を行い、その後、アルカリけん化処理を行う。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる、中性成分から、古細菌膜脂質GDGTsを分画し、LC/MSにより定量・同定を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。海域各深度におけるGDGTsの炭素源を明らかにし、堆積物に保存されているGDGTsから求められる水温(TEX86)がどの水深を反映しているのか特定し、堆積物に保存されている海洋性古細菌(マリンクレンアーキオータ)細胞膜脂質(GDGTs)を用いた水温(TEX86)復元プロキシーの有効性の確認を行う。
ニホンザルのオスの加齢に伴う性機能と生殖器の変化

ニホンザルの加齢に伴う精子形成と性行動の変化について検討した。精巣標本は、交尾期と非交尾期に、老齢個体(19歳以上)からバイオプシーによって採取した。また、性行動の観察には、老齢オス5頭と対照群として壮年のオス(10歳から15歳)5頭、メス5頭を使用し、交尾期、非交尾期に、それぞれの組み合わせで出会わせて行動を観察した。老齢個体の精巣を組織学的に検討した結果、(1)老齢個体の精巣では、精上皮に精子形成細胞が認められるものの、精上皮の周期が乱れており、周期的な精子形成がもはや行われていない、(2)精子細胞は、先体小胞内にある先体顆粒の小型化、電子密度の低下、欠如、先体形成の遅延など、先体形成が不完全になる加齢に伴う変化が認められた、(3)セルトリ細胞の基底部には、脂肪滴が細胞質に充満し、セルトリ細胞間のtight junctionが見られず、血液精巣関門がすでに破壊されている、(4)精巣標本をTUNEL法によって処理し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、精上皮のアポトシス像を観察した。その結果、各ステージの精子形成細胞、精祖細胞、セルトリ細胞、筋様細胞に、それぞれアポトシスを起こしている細胞が認められた。しかも、必ずしも形態的に変化している細胞に一致しなかった。つまり、形態的には正常に見える細胞の中にも、アポトシスを引き起こしているものがあること、などが明らかになった。また、行動観察の結果からは、(1)交尾の誘い行動交尾行動に、季節変化が認められる、(2)加齢に伴う顕著な性行動の変化が認められないことが示された。これらの結果から、ニホンザルの老齢個体では、精子形成は不活発になっているにもかかわらず、性行動では顕著な変化が認められない。この結果は、性行動の社会的な役割を示唆するものであろう。精巣の老齢化にともなう形態的・機能的な変化を検討するため、個室ケージで飼育中のニホンザルのうち19歳を越える老齢6個体と、対照として10歳から18歳までの個体6個体を対象に分析を加えた。飼育下でも季節変化が認められることから、交尾季(10月-11月)と、非交尾季(3月)において、(1)精巣組織の組織学的な検討、(2)性行動、(3)性ホルモンについて検討すべく計画した。しかし、時期的な関係で非交尾季のサンプル採取をまだ行っておらず、以下の分析は交尾季のデータに限られている。(1)精巣の老化を組織学的に検討する手始めとして、ニホンザル精巣の精子形成についての各種のインデックスをとらえた。老齢ザル5個体から2mm立方ほどの組織をバイオプシーし、パラフォルムアルデヒド・グルタールアルデヒド混液で固定、親水性メタクリル樹脂で包埋後、PASへマトキシリンやHEで染色し光学顕微鏡で観察し、また同時に電子顕微鏡で対比観察した。その結果、精祖細胞の形状、変形した精子形成細胞の比率、クローンである精子形成細胞クラスターが小さいこと、基底膜の陥入が認められること、セルトリ細胞の形態にちがいがあることなど、老齢ザルの精巣の形態的な特徴が認められた。(2)性行動は、オスのメスに対する誘い行動、射精頻度、射精間隔のいずれのインデックスについても、老齢ザルと対照群とのあいだに顕著な差が認められなかった。(3)性ホルモンについては、血中のテストステロンを測定する予定である。アッセイ系を均一化するため、非交尾季におけるサンプルと同時に測定すべく準備中である。

このように、形態的には老化の傾向が顕著であるにも関わらず、行動の上ではその傾向が認められないようである。今後、この乖離の分析を詳細に行う予定である。ニホンザルの加齢にともなう精巣の形態・機能の変化と性行動の変化の関連について検討を加えた。研究には、霊長類研究所で飼育されている老齢ニホンザル(20歳以上)のオス5頭と、対照用のオス5頭(10-15歳)を使用した。血中の男性ホルモン濃度を定量するため、野外の交尾期にあたる11月と、非交尾期にあたる3月に採血し、またメスとペアリングして行動を観察した。また、精巣組織をバイオプシーで採取し、(1)フォルマリン固定、パラフィン包埋、PASヘマトキシリンおよびHE染色による組織標本を光学顕微鏡で観察、(2) TUNEL法によるアポトシスを示す細胞の検出、(3) Hueck法などによるリポフスチンの染色、(4)パラフォルムアルデヒド・グルタルアルデヒド混液で固定、親水性メタクリル樹脂で包埋、PASヘマトキシリンおよびHE染色の標本を光学顕微鏡と電子顕微鏡で対比観察する、などの方法によって分析した。その結果、性行動には季節的変化が認められるものの、年齢階層による顕著な差は認められなかった。また、精巣組織の所見から、(1)老齢個体では、HE染色の標本を光学顕微鏡で観察するかぎり正常に精子形成が行われているが、アポトシスを起こしている精子形成細胞が多いこと、(2)精細管壁のセルトリ細胞の細胞質にリポフスチンが多数認められること、(3)精細管基底膜の肥厚、迂曲、切り込みなどが認められること、(4)精子細胞のアクロゾームの発達が悪いこと、などの特徴が認められた。これらの結果から、老齢個体でも性行動が見られ精子形成も行われているにもかかわらず、精子形成細胞の変形やアポトシスの結果から精子形成能力が低下していることが推定された。ニホンザルで、繁殖機能が低下したのちにも性行動が見られることは、その行動のメカニズムの進化を考察する上で興味深い。今年度は、加齢に伴う精巣の精祖細胞、精子形成細胞、セルトリ細胞の微細形態の変化を、組織化学的に、また、光顕・電顕の同一切片対比観察法によって検討した。精巣標本は、平成6年度に採取したものを使用した。すなわち、交尾期と非交尾期において、ニホンザルの老齢ザル(19歳以上)からバイオプシーによって2x2x2mm程度採取したものである。対比観察法を用いた検討の結果、老齢個体の精巣では、精上皮の周期性が乱れており、周期的な精子形成がもはや行われていないことが示された。精子細胞も加齢に伴う変化を見せており、先体小胞内にある先体顆粒の小型化、電子密度の低下、欠如、先体形成の遅延など、先体形成が不完全になる傾向が示された。セルトリ細胞の基底部には、脂肪滴が細胞質に充満し、セルトリ細胞間のtight junctionが見られず、血液精巣関門がすでに破壊されていることが明らかになった。さらに、精巣標本をTUNEL法によって処理し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、精上皮のアポトシス像を観察した。その結果、各ステージの精子形成細胞、精祖細胞、セルトリ細胞、筋様細胞に、それぞれアポトシスを起こしている細胞が認められた。しかも、必ずしも形態的に変化している細胞に一致しなかった。つまり、形態的には正常に見える細胞の中にも、アポトシスを引き起こしているものがあることが示された。これらの結果から、ニホンザルの老齢個体では、精細管に精子形成細胞が認められる場合でも、精子形成を活発に行う環境にはなっていないものと考えられる。
好熱性バチルス属細菌による低環境負荷型・省エネ型新規乳酸生産プロセスの開発と解析

コンポストより好熱性を示す新規なデンプン資化性L-乳酸生産菌Bacillus MC-07株を分離・同定し,Bacillus thermoamylovorans LMG 18084Tと99.2 %の相同性を示すものの,異なる種であった.また,蒸煮デンプン(加熱してデンプン粉末を溶解したもの)12時間ごとにpH振動制御による直接乳酸発酵試験(糖化工程を伴わない)では,MC-07株の方が高い乳酸生産能を示した.さらに,無蒸煮デンプン(加熱せずに粉末状のデンプン)からも直接乳酸生産プロセスの開発に成功した.本研究では、好熱性Bacillus属細菌を用いた高温乳酸発酵プロセスの開発を目的としている。平成26年度に実施した主な研究内容は下記の通りである。1.デンプン資化性好熱性乳酸生産Bacillus属細菌の分離、同定および性状解析コンポストより、デンプン加水分解せずに乳酸に変換できるMC-07株を分離した。16S rRNA遺伝子解析の結果、Bacillus thermoamylovorans LMG 18084Tと99.2 %の相同性を示したが、糖類発酵性の違いが大きく、Bacillus sp. MC-07株と同定した。MC-07株は内生胞子形成、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性で50°C-62°Cで活発に増殖する好熱性菌であった。発酵温度50°Cにて、窒素分を0.001%しか含まず、炭素源をデンプンとする培地で両菌株を用いて嫌気的に直接乳酸発酵試験を行った。発酵液のpHを6.0、6.5、7.0、7.5、8.0でそれぞれ12時間ごとに振動制御した。その結果、両菌株ともpH7.0で最大菌体濃度、最大乳酸生産濃度、最大乳酸生産性、最大乳酸選択性を示し、いずれのpHでもL-乳酸光学純度は100%であった。また、MC-07株はLMG18084株よりも高い乳酸生産濃度、乳酸生産性、乳酸収率、乳酸選択性を示した。本成果は、デンプンからの直接乳酸発酵に関する報告の中で、最小窒素源濃度、最高発酵温度、L-乳酸光学純度、乳酸収率となった。本研究では、好熱性Bacillus属細菌を用いた高温乳酸発酵プロセスの開発を目的としている。平成27年度に実施した主な研究内容は「デンプン資化性好熱性乳酸生産Bacillus属細菌を用いた無蒸煮デンプンからの直接乳酸発酵法の開発」である.安価で低有機窒素源から成るミネラル培地を用いて無蒸煮デンプンを発酵基質として用いた場合にも,デンプンから光学活性L-乳酸を生産することができた.また,培地組成,ヒートショックの有無,振とう速度,デンプンの種類を検討した.その結果,これまでに無蒸煮デンプンからの直接乳酸発酵の報告は二例あるが,既報と比較して最高温度50°Cにおける直接乳酸発酵に成功し,乳酸対有機窒素源収率138 g-乳酸/g-有機窒素源は最高であり,低コストL-乳酸生産プロセスの実現に寄与した.さらに研究期間全体を通じて実施した主な研究成果は以下の通りである.1コンポストより耐熱性デンプン分解性L-乳酸生産Bacillus MC-07株を分離・同定した.2既報の中でも最高温度50°Cで蒸煮デンプンを用いて最高L-乳酸光学活性,最高乳酸収率,最小有機窒素源濃度を示す直接L-乳酸生産プロセスを開発した.3無蒸煮デンプンを用いて最高発酵温度および最高乳酸対有機窒素源収率を示す直接L-乳酸生産プロセスを開発した.本成果は,デンプンを糖化処理せずにL-乳酸に変換する発酵プロセスの中では,最高温度・最高L-乳酸光学活性を示すものであり,学術的に非常に価値が高く,産業界に寄与するものである.コンポストより好熱性を示す新規なデンプン資化性L-乳酸生産菌Bacillus MC-07株を分離・同定し,Bacillus thermoamylovorans LMG 18084Tと99.2 %の相同性を示すものの,異なる種であった.また,蒸煮デンプン(加熱してデンプン粉末を溶解したもの)12時間ごとにpH振動制御による直接乳酸発酵試験(糖化工程を伴わない)では,MC-07株の方が高い乳酸生産能を示した.さらに,無蒸煮デンプン(加熱せずに粉末状のデンプン)からも直接乳酸生産プロセスの開発に成功した.上記で述べた研究概要は、平成26年度に実施し、すでに論文および産業財産権として特許出願しており、学術および産業の両面からも優れた研究成果である。環境微生物学申請した研究方針に従い、平成27年度には、1生デンプンを用いた直接高温乳酸発酵プロセスの開発、2キー酵素となる酵素活性・転写量測定、3混合糖からの高温乳酸発酵プロセスの開発、4発酵プロセスの環境評価、を行う予定である。
脂肪由来幹細胞の免疫制御作用を用いた、静脈性潰瘍の新しい治療方法の開発

本研究では脂肪由来幹細胞(ADSC)が局所の炎症を抑えることが可能かにつきラットの静脈潰瘍モデルを用いて研究を行った。今回作成したモデルでは下大静脈、総腸骨静脈、大腿静脈をそれぞれ結紮し、静脈うっ滞をより強くしたところ、CVI群において静脈圧の有意な上昇、潰瘍の治癒遅延を認めた。さらに、ブラジキニンを足底に投与することにより(CVI+BK群)重篤なCVIを作成することに成功した。CVI+BK群では足底の腫脹、疼痛閾値の低下が見られた。また、ラットよりADSCの抽出を行いフローサイトメトリーにて確認を行った。現在ADSCの炎症細胞に対する影響を調査するとともに、潰瘍モデルへの処置を進めている。平成25年度はまず、ラット慢性静脈不全(CVI)モデルを再現することを試みた。Lalkaらの報告に記載されている通り下大、総腸骨、大腿静脈をそれぞれ結紮することにより約3週間程度、下肢静脈圧の上昇が見られた(2週間時点ではCVI: 11.8vscontrol: 1.72 mmHg、p < 0.05)。組織学的には皮膚や皮下組織に大きな違いは認めず、静脈圧上昇のみでは自然に潰瘍を形成することはないと考えられた。そこで、このラットCVIモデルを用いてCVI作成後7日後に皮膚欠損を下肢に作成することにより、静脈性潰瘍モデルとすることができるかどうかを検討した。皮膚欠損のみに対しCVI+皮膚欠損では創傷治癒の遷延が起こることが示された(10日目の創面積14.1±2.0 vs 8.0±2.0 %、14日目の創面積2.7±0.8 vs 1.0 ±0.5 %)また、治癒した瘢痕の組織学的評価ではCVI群において瘢痕コラーゲン等の膠原繊維の沈着が減少し、炎症細胞浸潤が多く、小血栓の形成が多く見られた。しかし、本研究の目的である静脈性潰瘍に対する脂肪由来幹細胞の治癒効果を見るためにはCVIによるさらに大きな創傷治癒遅延が必要であると考え、CVI作成時に炎症惹起物質であるブラジキニン(BK)を足底に投与することにより、より重篤なCVIを作成することを試みた。これにより、CVIのみでは見られなかった一過性の足底の腫脹や疼痛閾値の低下が見られた。平成25年度の研究では、ラットCVIモデルの下肢に皮膚欠損を作成することにより創傷治癒遅延が見られることが観察され、静脈性潰瘍モデルとすることができることが示された。また、これをより重篤なモデルにするために炎症惹起物質を足底に投与することにより臨床でも見られる下肢の腫脹や疼痛閾値の低下が観察され、より難治性静脈潰瘍として臨床に即したモデルが作成されたと考えられた。平成26年度は昨年に引き続き、ラットCVIモデルを過去の報告に従って作成し、通常の創に比べて治癒遅延が起こることを証明し、また組織学的な特徴についても調査を行った。さらに、より重篤なCVIモデルを作成するためにブラジキニン(BK)を足底に注射したのちに同様の処置を行い、創治癒遅延が起こることを観察した。(10日目の創面積27.7 vs 10.4%、14日目の創面積17.1 vs 3.5%)また、新たな評価として臨床症状と直結する痛覚閾値(Von Frey test)、足容積を加えた。痛覚閾値はコントロールに比べて痛覚の鈍化が遷延する傾向を示し(14日目にて111.5 vs 40.25 g/cm2)、足部容積は治癒が起こる10日目頃まではコントロールに比べて優位に増大する(1日目1.6 vs 1.45 cm3、3日目1.63 vs 1.45)ことを観察した。これらの所見(疼痛閾値の変化、下肢の浮腫)は下肢鬱滞性潰瘍の臨床所見と類似しており、臨床に即したモデルとなっていると考えられた。平成27年度は昨年作成したラットCVIモデルの安定化を行った。報告にあるCVIモデルを少し改変し、下大静脈、総腸骨静脈、大腿静脈、浅下腹壁静脈をそれぞれ結紮処理、その上BK(ブラジキニン)を足底に局注することにより、より重篤なCVIモデルの作成に成功している。また、作成した潰瘍部の状態を均一にするために創部の保護具を作成し、モデルの安定化を行った。これらの改善点により、静脈圧が28日程度持続して上昇していることが確認された。また、CVI作成後より下肢の体積の増加、痛覚の過敏または鈍磨、創傷治癒遅延が14日程度継続した。これは静脈不全患者において見られる静脈圧の上昇、浮腫、疼痛または知覚鈍麻、創傷治癒遅延、などの症状と同様のものと考えられた。またCVI状態にあるモデルラットより採血を行い、炎症などの生体反応についての検討を行っている。ラット皮下および大網より脂肪組織を採取し、脂肪由来幹細胞の抽出を行っている。脂肪幹細胞であることを確認する表面抗原としては一般に多く用いられているCD44+/CD90+/CD31-/CD45-とし、フローサイトメトリーにて確認を行った。

現在は脂肪由来幹細胞の培養を行い、炎症刺激に対しての反応、および各種炎症関連細胞(T細胞、B細胞、マクロファージ)などとの相互関連、それに伴うサイトカインの量や種類の変化についてデータを採取している。今後はCVIモデルに対する脂肪由来幹細胞の局所投与と、それによる効果(創傷治癒遅延や炎症の改善など)についても順次検討していく予定である。現在、皮下脂肪および大網より採取した脂肪由来幹細胞の特性研究を行っている。細胞表面マーカーの変化や放出されるサイトカインの量や種類の変化など、種々のデータを集めるのに時間がかかっている。慢性静脈不全症(CVI)は罹患率の高い疾患であり、これに伴って生じる静脈性潰瘍はしばしば難治性となる。近年その病態が徐々に解明されつつあり、組織の酸素欠乏だけではなく、局所の炎症が潰瘍の形成や悪化に大きく関係していることが分かってきた。これに対する免疫制御を目的とした治療が期待されているが、臨床応用に至っているものはない。本研究では脂肪由来幹細胞(ADSCs)を用いて、局所の炎症を抑えることが可能かについてラットの静脈潰瘍モデルを用いて研究を行った。動物モデルはSG Lalka.ら(JSR 1999)によるCVIモデルを改変して行っており、下大静脈及び両総腸骨静脈を結紮することにより下肢の浮腫状態を作り出し、さらに大腿部にダーマパンチで創傷を作成することにより静脈潰瘍モデルとしている。これにより、静脈圧が約1ヶ月程度上昇し、潰瘍の治癒が通常の創傷のみのモデルに比べ遅延することが確認され、また病理学的に静脈潰瘍モデルでは局所の炎症が継続していることも確認された。これらの成果により静脈潰瘍モデルが確立できたと考えている。同時にラットから脂肪由来幹細胞の抽出(Ma、Proc Natl Acad Sci U S A. 2012)、炎症細胞としてマクロファージ、末梢血由来単核球の抽出を行い、ADSCのこれらの細胞に及ぼす影響についての検討をフローサイトメトリーを用いて行っている。現在脂肪由来幹細胞の性質研究及び局所への投与による潰瘍の改善については引き続き検討中であるが、静脈潰瘍モデルについての成果をを論文化し、現在英文誌に投稿中である。本研究では脂肪由来幹細胞(ADSC)が局所の炎症を抑えることが可能かにつきラットの静脈潰瘍モデルを用いて研究を行った。今回作成したモデルでは下大静脈、総腸骨静脈、大腿静脈をそれぞれ結紮し、静脈うっ滞をより強くしたところ、CVI群において静脈圧の有意な上昇、潰瘍の治癒遅延を認めた。さらに、ブラジキニンを足底に投与することにより(CVI+BK群)重篤なCVIを作成することに成功した。CVI+BK群では足底の腫脹、疼痛閾値の低下が見られた。また、ラットよりADSCの抽出を行いフローサイトメトリーにて確認を行った。現在ADSCの炎症細胞に対する影響を調査するとともに、潰瘍モデルへの処置を進めている。前年に引き続き静脈性潰瘍モデルの作成および安定化を目指しており、種々の付随データを採取するのに時間がかかっている。脂肪由来幹細胞の特性研究を進め、炎症刺激に対する反応につき検討を行っていく。形成外科ラットの静脈性潰瘍モデルが確立してきたため平成27年度はこれに対して脂肪由来幹細胞を注入して治癒促進効果があるかどうかにつき検討する。また、その際どのような機序で治癒促進が起こっているかについて検討する。さらに、静脈性潰瘍患者より採取した単核球分画を用いて脂肪由来幹細胞が免疫系細胞に与える影響につき引き続き調査する。ラット慢性静脈不全(CVI)モデルに皮膚欠損を加えることにより、静脈性潰瘍モデルとするこができることが示されたが、脂肪由来幹細胞の治療効果を観察するためにより重篤なモデルの作成を試み、コントロール群との差を大きくすることができた。モデルの確立に時間がかかったため予定よりやや遅れた進捗状況となっている。
腸管内胆汁酸代謝に影響を及ぼす食事・生活性因子の解明

習慣的な食事、排便状態や腸内細菌叢などの要因は腸管内胆汁酸代謝に影響する。このことは血清コレステロール低下作用と、大腸癌や胆石症発症リスク増大の両極の可能性が示唆されている。本研究目的は、腸管内胆汁酸代謝に影響を及ぼす、習慣的な生活・食事因子を明らかにすることで、脂質異常症、大腸癌および胆石症の予防と治療のための、新たなアプローチの開発と栄養指導法の構築を目指す。
蜂群崩壊症候群の原因候補ウイルスにおける構成遺伝子の立体構造解析と機能解析

本研究ではミツバチ失踪(蜂群崩壊症候群)の原因の一つと考えられるウイルスIAPVに着目し,ウイルスを構成する殻タンパク質とRNA合成酵素の組換えタンパク質を合成して,機能解析と立体構造解析を目的とした.殻タンパク質を構成する4種類のサブユニットのうち,複数種のタンパク質の組み合わせの共発現により,水溶性タンパク質として得ることができた.これらのタンパク質を用いて,殻タンパク質と相互作用するミツバチ由来因子の探索を行った結果,ミツバチの脳に含まれる55kDaと100kDaのタンパク質,および消化管に含まれる100kDaのタンパク質が検出され,IAPVの殻タンパク質と結合する候補因子であると予想された.RNA合成酵素は6分割した部分組換えタンパク質の発現を行った.その結果,2つの部分組換えタンパク質を溶出させることに成功した.今後はこの部分組換えタンパク質と相互作用するミツバチ由来因子を探索する.最近世界中でミツバチの原因不明の失踪(蜂群崩壊症候群)が相次いで報告されている.本研究ではミツバチ失踪の原因の一つと考えられるウイルスIAPVに着目し,ウイルスを構成する殻タンパク質とRNA合成酵素の,機能解析と立体構造解析を目的としている.始めに,殻タンパク質とRNA合成酵素の組換えタンパク質を作製した.殻タンパク質はCP1からCP4まで4種類のサブユニットの組換えタンパク質を別個に発現させた.しかし,どのサブユニットも十分な発現量は得られたが,不溶性画分として沈殿した.そこで,CP1-CP2-CP3,CP1-CP3,およびCP2-CP3の組み合わせで共発現させたところ,全てのサブユニットが溶出画分に検出された.これは複数のサブユニットが相互作用したことで可溶性が高まった結果であると考えられる.次に,これらのタンパク質溶液を用いてFar Western blottingを行い,殻タンパク質と相互作用するミツバチ由来因子の探索を行った結果,ミツバチの脳に含まれる55 kDaと100 kDaのタンパク質,および消化管に含まれる100 kDaのタンパク質が検出され,IAPVの殻タンパク質と結合する候補因子であると予想された.RNA合成酵素は6分割した部分組換えタンパク質の発現を行った.その結果,2つの部分組換えタンパク質を溶出させることに成功した.今後はこの部分組換えタンパク質の精製を行い,Far Western blottingを行って相互作用するミツバチ由来因子を探索する.また,LC-MS/MSによって,殻タンパク質とRNA合成酵素と相互作用したタンパク質の同定を行う.通常のSDS-PAGEではバンドがタイトであり,反応のあったバンドの同定が困難であるため,二次元電気泳動で分離を行う.さらに,充分量の組換えタンパク質の発現・精製・結晶化を行い,立体構造解析を目指す.本研究ではミツバチ失踪(蜂群崩壊症候群)の原因の一つと考えられるウイルスIAPVに着目し,ウイルスを構成する殻タンパク質とRNA合成酵素の組換えタンパク質を合成して,機能解析と立体構造解析を目的とした.殻タンパク質を構成する4種類のサブユニットのうち,複数種のタンパク質の組み合わせの共発現により,水溶性タンパク質として得ることができた.これらのタンパク質を用いて,殻タンパク質と相互作用するミツバチ由来因子の探索を行った結果,ミツバチの脳に含まれる55kDaと100kDaのタンパク質,および消化管に含まれる100kDaのタンパク質が検出され,IAPVの殻タンパク質と結合する候補因子であると予想された.RNA合成酵素は6分割した部分組換えタンパク質の発現を行った.その結果,2つの部分組換えタンパク質を溶出させることに成功した.今後はこの部分組換えタンパク質と相互作用するミツバチ由来因子を探索する.最近世界中でミツバチの原因不明の失踪(蜂群崩壊症候群,CCD)が相次いで報告されている.ミツバチは農作物の受粉に必要不可欠であり,今後これらの収穫に甚大な被害を及ぼすことが懸念される.本研究ではミツバチ失踪の原因の一つと考えられるウイルスIAPVに着目し,ウイルスを構成する殻タンパク質,およびIAPVのゲノム複製や転写に関与するRNA合成酵素の,機能解析と立体構造解析を目的としている.上記の目的を達成するために,殻タンパク質とRNA合成酵素の組換えタンパク質を作製した.殻タンパク質はCP1からCP4まで4種類のサブユニットの組換えタンパク質を別個に発現させた.しかし,どのサブユニットも十分な発現量は得られたが,可溶性画分には含まれなかった.そこで,CP1,CP2,CP3の3種類を共発現させたところ,全てのサブユニットが溶出画分に検出された.これは3つのサブユニットが相互作用したことで可溶性が高まった結果であると考えられる.次に,このタンパク質溶液を用いてFar Western blottingを行い,殻タンパク質と相互作用するミツバチ由来因子の探索を行った結果,ミツバチの脳と消化管に含まれるそれぞれ55 kDaと80 kDaのタンパク質が検出され,IAPVの殻タンパク質と結合する候補因子であると予想された.今後はFar Western blottingで検出されたタンパク質をLC-MSで同定する.RNA合成酵素は大腸菌で発現できるサイズに6分割した部分組換えタンパク質の発現を行った.その結果,2つの部分組換えタンパク質を溶出させることに成功した.今後はこの部分組換えタンパク質の精製を行い,Far Western blottingを行って相互作用するミツバチ由来因子を探索する.また,充分量の組換えタンパク質の発現・精製・結晶化を行い,立体構造解析を目指す.平成23年度はIAPVの殻タンパク質およびRNA合成酵素の組換えタンパク質を合成し,そのX線結晶構造解析と酵素活性を定量することが目的であった.大腸菌および昆虫細胞を用いて行った現在までの組換えタンパク質発現では,大半のタンパク質が凝集体を形成して沈殿してしまったため,十分な高純度の可溶化組換えタンパク質

は得られず,上記の実験は行うことができなかった.しかし,4種類の殻タンパク質構成サブユニットのうち,3種類のサブユニットの共発現により,Far Western blottingを行うには十分な可溶化タンパク質を得ることができたことから,平成24年度に実施予定の,IAPVのタンパク質と相互作用するミツバチ由来タンパク質の探索を前倒しで開始した.その結果,ミツバチの脳と消化管からIAPVの殻タンパク質と相互作用する因子と考えられるタンパク質を単離することに成功した.そして,RNA合成酵素も6分割したうちの2つの部分組換えタンパク質の可溶化に成功し,既に,殻タンパク質同様,Far Western blottingにより相互作用するタンパク質の探索に着手している.以上のことから,本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した.本研究課題の達成目標には,IAPVの殻タンパク質およびRNA合成酵素のX線結晶構造解析,および組換えタンパク質のミツバチへのインジェクションに伴うミツバチの生理的・病理的変化の解析が含まれている.しかし,これまで得られた組換えタンパク質は大半が不溶化してしまうため,上記の実験を行うのに充分量かつ高い純度の組換えタンパク質を得られていない.そこで,今後は,タンパク質発現の誘導剤を加える濃度や時間,共発現させるサブユニットの組み合わせなどを検討し,より大量の組換えタンパク質を高純度で精製できる条件を検討する.次年度も引き続き,組換えタンパク質の発現・精製を行う試薬やプラスチック用品などの消耗品の購入に支出する.また,新しいミツバチのコロニーの購入も検討中である.