hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
犬毛包虫症における自己免疫反応を軸とした分子病態の解明

犬毛包虫症に罹患していた犬より採取した皮膚を3匹のNOD-SCIDマウスに移植することが出来た。3頭の犬(皮膚を採取した犬、毛包虫症に罹患している犬、健常犬)から採取したCD8+リンパ球をマウスに移入した。リンパ球の移入のよる臨床症状は認められなかった。リンパ球移入42日後に皮膚病理組織学的検査を実施したが、表皮、真皮および毛包において炎症は認められなかった。3匹のマウスの病理組織学的所見に差は認められなかった。正常イヌの全血より末梢血単核球を分離した。単球を除去することによって300万個のリンパ球を得た。得られたリンパ球を抗犬CD3モノクローナル抗体固相化プレートにて初期培養した後、IL-2を含む無血清培地で2日間培養した。得られたリンパ球は直ちに細胞保存液を用いてマイナス80度で保存した。この作業を2週間繰り返すことによって、最終的には約3000万個のリンパ球を得た。得られたリンパ球におけるCD8陽性細胞比率を調べたところ約60-80%であった。培養リンパ球から磁気細胞除去によってCD4陽性細胞を除去し、最終的には約100万個のCD8陽性細胞を得た。得られたCD8陽性細胞100万個をSCIDマウスの腹腔内に移入した。移入29日後に、イヌCD8陽性細胞定着の有無をFACSおよびPCRで評価したが、いずれにおいても定着を示す結果は得られなかった。イヌCD8細胞移入マウスが確立していないため。イベルメクチンの投薬によって寛解状態にある汎発性毛包虫症の犬(ボストンテリア、未去勢雄、1歳8ヶ月齢)から皮膚を採取し、3匹のNOD/SCIDマウス(雌、7週齢)に移植した。皮膚移植43日後に、すべてのマウスにおいて、移植皮膚片からの発毛を認めた。また、皮膚移植65日後においては、すべての移植皮膚片で被毛数の増加と伸長を認めたことから、移植皮膚片はマウスに定着したと判断した。移植片の定着を確認後、皮膚を採取した症例(ボストンテリア、未去勢雄、1歳8ヶ月齢)、汎発性毛包虫症を発症している症例(ラブラドール・レトリーバー、避妊雌、12歳3ヶ月齢)、健常犬(ビーグル、未避妊雌、4歳1ヶ月齢)から血液を採取し、抗犬CD3抗体およびIL-2を用いてリンパ球を培養した。3週間の培養によって、それぞれの犬由来の2000-3000万個のCD8陽性リンパ球を得ることができた。リンパ球の生存率は80%以上であり、CD8陽性リンパ球の割合はそれぞれ97.7%、96.7%および99.3%であった。その後、それぞれのCD8陽性リンパ球を3匹の皮膚移植マウスに移入した。CD8陽性リンパ球を移入して42日後に採材した移植皮膚片について、パラフィン切片を作製し、HE染色による組織学的評価を実施した。いずれのNOD-SCIDマウスの移植皮膚片においても、毛包上皮のアポトーシスや毛包構造の破壊像などの組織学的異常所見は認められなかった。また、各NOD-SCIDマウスで組織を比較したが、毛包構造に違いは認められなかった。マウスに移入するイヌCD8細胞数を200万個に増やし、再度移入モデルの確立を目指す。皮膚免疫学
バイオ水素ガス生産の基盤技術となる嫌気性細菌の遺伝子改変技術確立とその応用

水素ガスを高生産するClostridium paraputrificumから遺伝子改変技術により、水素ガスを効率的に生産する菌株の作出を目的として基本的な代謝経路の解明を行った。今までの研究成果より、乳酸を生産する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(LDH)を破壊することで水素ガス生産が増えたことから、この経路と水素ガス生産との関連を詳しく調べた。まず、さまざまな炭素源で培養を行ったところ、LDH破壊株は全ての条件で水素ガスの生産が増加した。この結果は、LDH遺伝子の破壊によって乳酸生産経路が遮断され、水素ガス生産経路であるピルビン酸からアセチルCoAへの代謝の流れが強化された結果であると推測された。また、野生株では乳酸が生育を抑制し水素ガス生産が抑制されているのではないかと考えたが、乳酸添加培地では非添加に比べて約1.5倍多く水素を生産し、乳酸の生産も低下した。さらに、LDH破壊株においても乳酸添加で水素ガス生産が増加したことから、乳酸が影響を与える他の代謝経路の存在も示唆された。本菌の水素ガス生産経路と並列で存在することが予測されるピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素(PFL)の機能解明のためPFL遺伝子の破壊を試みた。LDH遺伝子破壊でも利用したClostron法でいくつかの配列をデザインしたプラスミドの作成を行い、遺伝子破壊を試みたが形質転換体が得られなかったため、PFL遺伝子が生育に必須である可能性が示唆された。植物細胞壁(セルロース)分解能力を持つR. josuiはC. paraputrificumと共培養することでセルロースから直接水素ガスを生産することが可能である。R. josuiの遺伝子工学はセルロース分解を効率的に行うためには必要な技術であることから、本菌の電気穿孔法を用いた形質転換方法を開発することに成功した。C. paraputrificumにおいて、水素ガス生産に非常に重要な意味をもつ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の代謝上の機能について詳細に解明することができた。他の遺伝子についてもほぼ遺伝子破壊が可能な状況となったが、一部の遺伝子については破壊株の取得が困難であることがわかった。R. josuiの形質転換方法を確立することができたことから、今後の遺伝子工学的な解析に道が開けた。C. paraputrificumにおいて、基本的代謝経路上で働く遺伝子を順次破壊することで、どの経路が水素ガス生産にとって重要な役割を果たしているかを明らかにする。一方、遺伝子破壊ができない、すなわち生育に必須の遺伝子がある可能性が示唆されたことから、これらの遺伝子の機能を解明するために、遺伝子の機能を条件的に弱めた株の育種も行う必要があるが、これについてはまだ具体的な対策が見つかっていない。R. josuiの形質転換方法は開発できたが、遺伝子導入効率は低く、遺伝子破壊が可能な状況に持っていく必要があるため、引き続き条件検討を行っていく。

一方、遺伝子破壊ができない、すなわち生育に必須の遺伝子がある可能性が示唆されたことから、これらの遺伝子の機能を解明するために、遺伝子の機能を条件的に弱めた株の育種も行う必要があるが、これについてはまだ具体的な対策が見つかっていない。R. josuiの形質転換方法は開発できたが、遺伝子導入効率は低く、遺伝子破壊が可能な状況に持っていく必要があるため、引き続き条件検討を行っていく。作成予定の遺伝子破壊株のいくつかについて、何度か試みたものの予想に反して破壊株の作出ができなかったため、破壊株の培養と解析にかかる経費について未使用となった。遺伝子破壊条件を変更して、再度実験を行う予定である。
片頭痛病態におけるCGRPの役割解明と核酸医薬による片頭痛治療の可能性

片頭痛は中枢神経系と三叉神経系の機能異常に基づく慢性頭痛疾患である。新規片頭痛治療法としてカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)を標的にした抗体や化合物の有効性と忍容性の高さが脚光を浴びており、特に抗体治療は海外で薬事承認を既に受けている。しかし、片頭痛病態におけるCGRPの役割や発現変化には不明な点が多く、その解明によってCGRPを標的にした治療戦略はさらに進歩することが予想される。本研究では、三叉神経支配領域での痛覚感作誘導と片頭痛前兆の発生閾値にCGRPが与える影響を検討し、病態モデルにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与して、CGRP発現抑制効果と病態改善効果もあわせて検討する。
iQTL-seq; 品種間交雑後代における新規遺伝子単離技術の開発

農業上有用な遺伝子の単離は、農作物における育種を加速するうえで、重要な課題である。本研究は、次世代シーケンサーを用いて品種間の表現型の差異を決定する原因遺伝子を単離する技術「iQTL-seq; identification of the gene in QTL」の開発を試みた。iQTL-seqは、シーケンスdepthを比較し、品種間の差異を決定する遺伝子を同定する手法である。本研究では、実際に構築されたiQTL-seq法のpipelineを適用して、イネ品種間交雑後代におけるイネいもち病に対する耐病性レベルの品種間差異を決定する遺伝子の同定を試みた。パイプラインは、現在公開準備中である。本年度は、構築したパイプラインを用いて、HitomeboreおよびNortaiの品種間交雑後代におけるイネいもち病圃場抵抗性遺伝子同定をメインで実施した。その結果、Nortai由来のイネいもち病圃場抵抗性遺伝子と推察される候補遺伝子の同定に成功している。現在、形質転換技術を用いて候補遺伝子の確認を進めている。現在までにiQTL-seqのパイプライン構築を行い、さらに、実際のイネの品種間交雑後代へ適用を開始しており、計画通りに進んでいる。具体的には、HitomeboreおよびNortaiの交雑後代において、Nortai由来のイネいもち病圃場抵抗性遺伝子の候補遺伝子を同定している。候補遺伝子については、現在、2種類の形質転換体を用いて確認を進めている。一つは、RNAi法による発現抑制を行った形質転換体、もう一方は、nativeプロモーター制御下で候補遺伝子を発現させた形質転換体である。それぞれの形質転換体の作出は、計画通り終了しており、現在、得られた形質転換体において表現型の調査を進めているところである。また、候補遺伝子の圃場レベルでの機能を確認するために、HitomeboreとNortaiの交雑後代をHitomeboreを反復親として連続戻し交配を実施している。よって、Hitomeboreを遺伝背景にもつNortai由来のイネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子領域を有する準同質遺伝子系統の育成も予定通り進行している。当該年度は、昨年度まにiQTL-seq法で同定されたイネ品種「Nortai」由来の圃場抵抗性遺伝子の機能解析に供試する形質転換体の自殖種子の増殖を行なった。また、パイプライン化が終了したiQTL-seq法を用いて、新たにイネ品種「Hitomebore」由来の耐冷性遺伝子同定を行なった。北東北で栽培される耐冷性レベルの高い品種である「Hitomebore」と耐冷性レベルの低い品種である「Sasanishiki」の間で交雑F3世代を育成し、iQTL-seq法により候補遺伝子の同定に成功している。また、出穂期の「Hitomebore」および「Sasanishiki」において、継時的に幼穂からRNAをサンプリングし、RNA-seqによる発現産物の網羅的な比較解析を実施している。さらに、候補遺伝子の機能確認のために「Hitomebore」EMS突然変異系統群のTILLING解析により、候補遺伝子に変異が入っている系統の探索およびCRISPR-Cas9による候補遺伝子のノックアウト形質転換体の作製を行っている。また、iQTL-seq法を用いてイネ品種「Sesia」における太稈性を支配する遺伝子を同定するため、「Sesia」と稈が細い品種である「Hitomebore」間で育成された245系統のRILsにおいて第3節間と第4節間の断面係数を調査した。現在までにバルクシーケンス解析により「Sesia」由来の太稈性を支配する原因遺伝子座を複数同定することに成功している。本年度までに、iQTL-seq法を適用して、イネ品種「Nortai」由来のイネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子および「Hitomebore」由来の耐冷性遺伝子の候補を同定した。「Nortai」由来のイネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子は、候補となる遺伝子の機能確認用形質転換体がすでに作製されている。また、「Nortai」および「Hitomebore」をそれぞれ一回親および反復親として連続戻し交配により準同質遺伝子系統(NIL)を育成している。NILは、全ゲノムシーケンスによる一塩基多型箇所の解析に供試して、95%以上が「Hitomebore」遺伝背景であることが確認されている。また、圃場での形質調査の結果、育成されたNILは、圃場抵抗性レベルは、「Hitomebore」よりも高く、一方、栽培上重要な形質については、「Hitomebore」と有意な差が見られないことが確認されている。また、イネ品種「Hitomebore」由来の耐冷性遺伝子は、候補遺伝子の機能解析のため、約12,000系統のHitomebore EMS突然変異体の中から候補遺伝子に変異が入っている系統の探索を開始している。現在までにナンセンス突然変異体を選抜しており、最終年度に低温室および耐冷性試験圃場において野生型と変異体型の表現型を調査する。また、候補遺伝子の機能解析のためにRNA-seqも実施しており、次年度における詳細な解析により、候補遺伝子の機能の推定を行う。さらに、候補遺伝子の発現部位を調査するため、候補遺伝子のプロモーター制御下でGUS遺伝子を発現させた形質転換体も育成しており、次年度における候補遺伝子発現部位の調査に供試できる体制が整っている。本研究では、まず、iQTL-seqの解析についてのパイプラインの構築を行った。

本パイプラインは、新しく操作性およびロバスト性を向上させたQTL-seqパイプラインを用いた原因遺伝子領域の同定、同定された領域にマップされたリードの選抜、選抜リードを用いた親品種特異的配列の構築、親品種特異的配列に対するシーケンスリードのdepthを指標とした候補遺伝子の絞り込みまでの過程を含む。本研究では、構築されたパイプラインを用いて、「Nortai」由来のイネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子の同定を試みた。その結果、Wall-associated kinaseドメインを有する遺伝子を第一候補遺伝子として同定した。実際にその効果を確認するため、1:「Nortai」由来の候補遺伝子をネイティブプロモーター制御下において「ひとめぼれ」に導入した形質転換体、2: RNAi法により候補遺伝子の発現抑制をおこなった「Nortai」形質転換体、3: CRISPRE-CAS9による候補遺伝子のノックアウトをおこなった「Nortai」形質転換体の3種類を育成し圃場抵抗性の比較実験を行った。しかし、候補遺伝子の効果は、形質転換体において確認できなかった。現在、連続戻し交配により、「Nortai」圃場抵抗性遺伝子断片を有する準同質遺伝子系統を育成し、候補遺伝子の絞り込みを再度進めている。また、iQTL-seqにより、「ひとめぼれ」由来高度耐冷性遺伝子の同定を試みた。候補遺伝子を同定し、候補遺伝子のEMS変異体の機能解析を耐冷性圃場において進めている。農業上有用な遺伝子の単離は、農作物における育種を加速するうえで、重要な課題である。本研究は、次世代シーケンサーを用いて品種間の表現型の差異を決定する原因遺伝子を単離する技術「iQTL-seq; identification of the gene in QTL」の開発を試みた。iQTL-seqは、シーケンスdepthを比較し、品種間の差異を決定する遺伝子を同定する手法である。本研究では、実際に構築されたiQTL-seq法のpipelineを適用して、イネ品種間交雑後代におけるイネいもち病に対する耐病性レベルの品種間差異を決定する遺伝子の同定を試みた。パイプラインは、現在公開準備中である。本年度は、構築したiQTL-seqのパイプラインを用いてHitomeboreおよびNortaiの品種間交雑後代におけるイネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子の候補を同定した。候補遺伝子については、その確認を目的とした形質転換体の作出も終了している。次年度以降は、得られた形質転換体において目的の表現型が得られるか試験する。また、その他の形質に関する候補遺伝子の同定もiQTL-seqを用いて、順次行っていく予定である。候補遺伝子を同定後は、順次、形質転換体を育成して確認作業を行っていく。本年度は、さらに、候補遺伝子の圃場レベルでの機能を確認するため、連続戻し交配による準同質遺伝子系統の育成も行った。次年度以降は、育成された準同質遺伝子系統を実際に圃場で栽培し、目的とする形質の付与および不良形質の有無の確認を行う。また、育成されたNILを全ゲノムシーケンスして、NILが有する遺伝背景が戻し交配の反復親と高い相同性を有していることを全ゲノムレベルで確認する。本年度は、これまで同定された候補遺伝子の機能解析を進める。「Nortai」
恐竜-鳥類移行進化における鳥類特有の前肢（翼）筋骨格系の獲得機序の解明

進化において大規模な機能の獲得がどのような移行過程を経て起こりうるものなのかについての理解を進めるためのケーススタディーとして、恐竜(非鳥類恐竜)から鳥類への進化において、筋骨格系、特に、翼の動力部分である筋がどのような移行段階を経て進化したのかを研究する。翼の新規筋形態パターンが何から、どのような変化を経て獲得されたのかを、現生種における前肢筋の発生の比較解析を通じて探り、さらに、化石標本を調査することで、その変化過程を系統図上で復元することを目指す。
インフレータブル構造ロボットシステムの設計論構築

インフレータブル(Inflatable以下IFと記述)構造の数理モデル構築に向けて,対象の実用IF構造を一定範囲に限定するため,モデル指標となるロボット性能を実証した.繰り返し学習制御と時間軸変換による動特性解析では,理論モデル整理,解析,実験システム構築を実施した.IFアクチュエータ/リンク受動要素の設計・製作では,可搬重量増加,リンク/関節での必要な剛性/粘性確保による振動抑制実現のために,駆動力の空気圧を高圧印加可とする高強度ポリオレフィン織布(三井化学より提供)により,製造法を確立した.ロボットアームを構成し,視覚・圧力フィードバックにより高精度位置制御法を提案した.移動台車に搭載し,物品受け渡しタスクを実現した.IFを並べて構成する場合での固定方法や制御方法も検討中である.IFロボット用センサ設計・製作では,(1)ポリウレタン光弾性センサ,(2)高分子応力色変化センサの開発に重点を置いた.(1)は,実用性を高める組成及び構造を最適化した.せん断力の応答性を確保するポリオール成分と芳香族イソシアネートからなるポリウレタンが適することを実験的に示した.(2)は,材料であるキラル液晶エラストマーを大面積かつ均一にする製作法を開発し,ひずみ-反射波長の相関をまとめた.センサの粘弾性設計をポリジメチルシロキサンゴムと組み合わせることで可能なことを示した.IF構造ロボットシステム設計・製作では,(A)ウェアラブルリハビリ装具,(B)ワイヤ駆動,(C)複数IFアクチュエータ/センサの制御を検討した.(A)は,低拘束とする筋電位・前腕変形の計測具をIF基盤で開発した.(B)は,軽量・柔軟な化学繊維ロープにより手先把持力と自重を補償する機構を提案・実証した.(C)は,空気袋内圧利用多軸センサをIFアクチュエータと組み合わせて制御して,マッサージ用途などでの利用を検討した.全体として,個々の基盤技術/システムの構築に取り組み,おおむね順調に進展している.開始時期に全体ミーティングを開催し,本プロジェクトの重要点/各グループの保持技術やこれまでの研究成果などを共有した.以下に各項目の進捗を示す.IF構造の数理モデル構築では,モデル指標となるロボット性能を実証した.繰り返し学習制御と時間軸変換によるセンサ受動要素などの動特性解析では,理論値,解析値,実験値を照合して,妥当な理論モデルを調査中である.IFアクチュエータ/リンク受動要素の設計と製作では,IFにより物品受け渡しタスクを実証した.IFを並べて構成する場合の製作方法と制御を実験的に検証し始めた.IFロボット用センサ設計/製作では,特に(1)ポリウレタン光弾性センサ,(2)高分子応力色変化センサの製作法における基盤を整えた.(1)は,4-シアノ-4ペンチルビフェニル(5CB)等の液晶を数%程度添加,複素光弾性装置の改良によって複素光弾性の広範囲測定が可能となったことにより,安定製造を実現した.(2)は,大面積・均質な安定製造法を確立,ひずみ-反射波長の相関を解明し,おおむね当初の計画通りに進んでいる.次年度,IFロボットへ実装して性能評価を行い,得られた結果に基づき材料物性の最適化をしていく.2018年度に新材料設計の指針もみいだしているので,この指針とこれまで得られた知見を活用することで,期間内に目標を十分に達成できると確信する.IF構造ロボットシステム設計・製作では,(A)ウェアラブルリハビリ装具において,センシング手法をおおまかに確立できた.共同研究者間でリハビリ機器情報を共有して,現状の方向性で問題ないことを確認した.おおむね順調であると判断できる.(C)複数IFアクチュエータ/センサの制御は,目標となるマッサージ運動を測定器により取得して,運動生成は試作機にて実証段階にある.2019年度は,前年度に得られた成果を基盤として最終目標に向かって核心にせまる.2018年度に得られた成果を情報共有し,それを考慮した具体目標を再度決定する.現状での具体的な不足事項,その対応策などを下記に示す.IF構造の数理モデル構築では,2018年度の成果を数理モデルに反映し,数値シミュレータを開発する.同時に,ロボットシステムの問題点を挙げ,並行して改良する.繰り返し学習制御と時間軸変換による動特性解析では,妥当な理論モデルを示し,複数の粘弾性体の計測結果から一定の結論を導く.IFアクチュエータ/リンク受動要素の設計と製作では,より最適なアクチュエータ配置を具体タスクごとに実験的に決定していく.IFロボット用センサ設計/製作では,(1)ポリウレタン光弾性センサは,液晶添加物としてベンチルビヘニル(5B)などによって組成比を変え,応答の高速化を目指す.(2)高分子応力色変化センサは,ひずみ応答性を高感度化するために,原料(液晶モノマー,キラルモノマーなど)の分子構造と比率を最適化する.高分子圧電材料センサの実用に取り掛かり,この瞬間せん断力を測定可とし,ウレタン光弾性センサと組み合わせ,実用性の高いせん断センサ材料を具現化する.これをセンサとして把持実験を通して最適化する.また,特定の方向に高感度なカーボンナノチューブセンサや,接触判定に摩擦帯電センサの利用を検討して有用なセンサフィードバック系を構築する.IF構造ロボットシステム設計・製作では,(A)ウェアラブルリハビリ装具は,センシングを前腕から上腕にかかわる関節角度,曲げ計測まで拡張すること,筋電位や形状変形などの情報と統合してニューラルネットワークより最適な身体情報を算出することを目標とする.(B)ワイヤ駆動は,系のさらなる軽量化を構造最適化解析と炭素繊維3Dプリンタにより実現する.インフレータブル(Inflatable以下IFと記述)構造の数理モデル構築に向けて,対象の実用IF構造を一定範囲に限定するため,モデル指標となるロボット性能を実証した.

繰り返し学習制御と時間軸変換による動特性解析では,理論モデル整理,解析,実験システム構築を実施した.IFアクチュエータ/リンク受動要素の設計・製作では,可搬重量増加,リンク/関節での必要な剛性/粘性確保による振動抑制実現のために,駆動力の空気圧を高圧印加可とする高強度ポリオレフィン織布(三井化学より提供)により,製造法を確立した.ロボットアームを構成し,視覚・圧力フィードバックにより高精度位置制御法を提案した.移動台車に搭載し,物品受け渡しタスクを実現した.IFを並べて構成する場合での固定方法や制御方法も検討中である.IFロボット用センサ設計・製作では,(1)ポリウレタン光弾性センサ,(2)高分子応力色変化センサの開発に重点を置いた.(1)は,実用性を高める組成及び構造を最適化した.せん断力の応答性を確保するポリオール成分と芳香族イソシアネートからなるポリウレタンが適することを実験的に示した.(2)は,材料であるキラル液晶エラストマーを大面積かつ均一にする製作法を開発し,ひずみ-反射波長の相関をまとめた.センサの粘弾性設計をポリジメチルシロキサンゴムと組み合わせることで可能なことを示した.IF構造ロボットシステム設計・製作では,(A)ウェアラブルリハビリ装具,(B)ワイヤ駆動,(C)複数IFアクチュエータ/センサの制御を検討した.(A)は,低拘束とする筋電位・前腕変形の計測具をIF基盤で開発した.(B)は,軽量・柔軟な化学繊維ロープにより手先把持力と自重を補償する機構を提案・実証した.(C)は,空気袋内圧利用多軸センサをIFアクチュエータと組み合わせて制御して,マッサージ用途などでの利用を検討した.全体として,個々の基盤技術/システムの構築に取り組み,おおむね順調に進展している.開始時期に全体ミーティングを開催し,本プロジェクトの重要点/各グループの保持技術やこれまでの研究成果などを共有した.以下に各項目の進捗を示す.IF構造の数理モデル構築では,モデル指標となるロボット性能を実証した.繰り返し学習制御と時間軸変換によるセンサ受動要素などの動特性解析では,理論値,解析値,実験値を照合して,妥当な理論モデルを調査中である.IFアクチュエータ/リンク受動要素の設計と製作では,IFにより物品受け渡しタスクを実証した.IFを並べて構成する場合の製作方法と制御を実験的に検証し始めた.IFロボット用センサ設計/製作では,特に(1)ポリウレタン光弾性センサ,(2)高分子応力色変化センサの製作法における基盤を整えた.(1)は,4-シアノ-4ペンチルビフェニル(5CB)等の液晶を数%程度添加,複素光弾性装置の改良によって複素光弾性の広範囲測定が可能となったことにより,安定製造を実現した.(2)は,大面積・均質な安定製造法を確立,ひずみ-反射波長の相関を解明し,おおむね当初の計画通りに進んでいる.次年度,IFロボットへ実装して性能評価を行い,得られた結果に基づき材料物性の最適化をしていく.2018年度に新材料設計の指針もみいだしているので,この指針とこれまで得られた知見を活用することで,期間内に目標を十分に達成できると確信する.IF構造ロボットシステム設計・製作では,(A)ウェアラブルリハビリ装具において,センシング手法をおおまかに確立できた.
ボツリヌス菌が産生するHAの構造と毒素の腸管吸収機構に関する研究

ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)が産生するボツリヌス毒素は、神経毒素タンパク質に4種の無毒タンパク質群が結合した巨大な複合体構造を形成している。無毒タンパク質のうち、血球凝集素(hemagglutinin; HA)は腸管細胞への吸着や透過に重要とされている。また、HAは3種のサブコンポーネントで構成されている。本研究では、HAサブコンポーネント間の相互作用部位やHA構造について研究した。ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は,食中毒の原因ともなる致死性のボツリヌス毒素を産生し,その神経毒素タンパク質(Botulinum neurotoxin; BoNT, 150 kDa)の血清型から,AG型の7型に分類される。通常,BoNTは4種の無毒タンパク質群と結合しタンパク質複合体を形成している。この無毒タンパク質群のうち血球凝集素(Hemagglutinin; HA)は3種のサブユニット(HA-17, HA-33, HA-70)から構成されており,毒素が動物に経口摂取された際に腸管細胞に結合し,毒素の生体内への吸収を促進すると考えられている。申請者らは、HAの複合体構造と機能を解析し,ボツリヌス毒素の構造ならびに毒素の生体内吸収機構を解明することを目的としている。本研究では、培養液上清より精製した毒素複合体から、HA-17/HA-33複合体およびHA-70を分離精製し、HA-70分子上に存在するHA-17/HA-33の結合部位についてFar western blot法で検討した。プロテアーゼで限定分解したHA-70断片へのHA-17/HA-33の結合を実験した結果、623残基で構成されるHA-70のC末端側領域であるTyr329からSer623の範囲内にHA-17/HA-33の結合部位が存在することが明らかとなった。今回の実験結果および既報のデータをもとに、バイオインフォマティクスの手法を用いてHA複合体の立体構造を予測した。この結果は、ボツリヌス毒素の構造と機能を理解する上で、重要な知見になり得ると思われる。ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、食中毒の原因となる非常に強力なボツリヌス毒素を産生する。ボツリヌス毒素は5種のサブユニットが結合したタンパク質複合体であり、毒性本体である神経毒素タンパク質が無毒タンパク質群に結合している。無毒タンパク質群のうち、血球凝集素(Hemagglutinin; HA)は3種のサブユニット(HA-17、HA-33、HA-70)から構成されており、毒素が動物に経口摂取された際に腸管に結合し、毒素の生体内吸収の促進に関与していると考えられている。本研究では、菌の培養液上精中の毒素複合体から単離・精製したHA複合体について、HAサブユニット間の相互作用領域をFar western blot法で検討した。この結果をもとに、HAサブユニットの結合部位変異体を作製するなどして残基レベルでの結合部位同定が期待される。さらに、分子動力学計算等のバイオインフォマティクス的手法を用いて、サブユニット単体時と複合体形成時における構造変化の違いを比較するなどの解析を行っている。これらの結果は、ボツリヌス毒素の構造や生体内吸収メカニズムの理解や医療等への応用のための重要な知見になり得ると思われる。ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は食中毒の原因となる致死性の神経毒素を産生する。毒素は5種類のサブユニットが結合したタンパク質複合体である。毒性の本体である神経毒素は無毒タンパク質群と結合している。無毒タンパク質群のうち、血球凝集素(Hemagglutinin: HA)は3種のサブユニット(HA-70、HA-30、HA-17)から構成されており、毒素が動物に経口摂取された際に小腸上皮細胞に結合して毒素の生体内への吸収を促進していると考えられている。本研究では、毒素の腸管からの吸収機構を明らかにし医療等への応用につなげるために、毒素複合体のサブユニット間相互作用部位の同定を行った。生化学的実験およびバイオインフォマティクス的手法を用いた種々の実験の結果、HAサブユニット間の相互作用部位を明らかに、既報の実験結果なども合わせて毒素複合体の立体構造モデルを提唱した。研究目的の一つであるHA複合体の立体構造に関する知見は得られているが、申請者の所属が変更し、研究環境が整うまでに時間を要したため、計画に遅れが生じている。今後は、遅れを取り戻しながら、HA複合体の構造や機能に関する実験を進め、HAの有効利用に繋がる成果を目指したい。細菌学、生物化学昨年に引き続き、HAサブユニットの組換え発現系を構築し、毒性や細胞への作用などを実験するとともに、バイオインフォマティクス的手法による構造解析を行う。研究目的の一つとして挙げたHA複合体の立体構造解析について、サブユニット間結合部位に関する新たな知見を得て、さらにin vitro実験データに基づいた複合体構造予測を行うことができた。

今後は、HAサブユニットの種々の活性や機能に関する実験を行いながら、構造との相関についても検討していきたい。当初予定よりも安価で購入できたものがあったなどの理由から、全額を使用せずに次年度に持ち越す金額が生じた。次年度請求分と合わせて有効に使用したい。HAサブユニットの組換え発現系を構築し、各サブユニットの毒性や細胞への作用などを含めた種々の活性を実験していく。また、複合体構造データを用いた溶媒中での複合体構造の動的な挙動についても解析していきたい。大腸菌の組換え実験、細胞培養、タンパク質の精製、その他実験で必要となる消耗品の購入に使用する。また、研究協力者との打ち合わせのための旅費や成果発表費用にも使用する。今年度は消耗品等の購入において、当初計画していたよりも安価で購入できたものなどもあり、全額を使用せずに次年度に持ち越す分が生じた。次年度請求分ち合わせ、有効に使用する。大腸菌の組換え実験、タンパク質の精製、細胞培養、その他実験遂行上必要となる消耗品類の購入に使用する。また、学会や研究協力者との打ち合わせのための旅費に使用し、研究成果を発表した際は、その論文投稿料にも使用する。
好塩基球を標的とした難治性皮膚疾患の病態解析とピンポイントな新規治療法の開発

皮感作食物依存性アナフィラキシーモデルマウスを用いた病態解析加水分解小麦の経皮感作による小麦依存性運動誘発性アナフィラキシーなど蛋白抗原の経皮感作によるアナフィラキシーが社会問題になっている。そこで当研究室ではOVAをパッチテストチェンバーで1週間貼付後2週間ごとに3回貼付することを繰り返し後、50mgOVAの経口投与することによりアナフィラキシー反応を誘導するモデルマウスを作成した。OVA抗原の経皮感作をしたBALB/cマウス群では、OVA特異的IgGおよびIgEの上昇を認め、経口抗原投与後に直腸温の急激な低下を認めた。これは、OVAを経腹腔内投与し感作した陽性コントロール群と同程度であり、陰性コントロール群と有意差を認めた。また、好塩基球数に関しては、両群において、皮膚だけでなく腸管組織での増加を認めた。OVA経皮感作群において、皮膚でのTSLPの発現の上昇も認めた。Ba103を惹起前に投与した群では、アナフィラキシー反応の抑制が観察されたが、コントロールIgGを前投与した群においても、部分的に反応の抑制を認めた。さらに、惹起より48時間前にジフテリア毒素(DT)を静注することで好塩基球を末梢血中より選択的に除去したMcpt8-DTRトランスジェニックマウス群においては、部分的にアナフィラキシー反応が抑制された。肥満細胞欠損(KitW-sh/W-sh)マウス群では、アナフィラキシー反応のほぼ完全な抑制を認めた。これらの結果から、惹起相では肥満細胞がない状態ではアナフィラキシー反応が起こらないが、好塩基球がない状態でも、アナフィラキシー反応が減弱することが示された。以上より、アナフィラキシー惹起反応には肥満細胞が必須であること、また好塩基球がアナフィラキシーの惹起反応に対して一部を担うことが示唆された。(1)免疫組織学的解析・末梢好塩基球活性化の解析慢性痒疹・水疱性類天疱瘡などにおける皮膚病変部の好塩基球の浸潤についてモノクローナル抗体を用いて解析。痒疹、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡部に多数浸潤していることを明らかにした。慢性難治性皮膚疾患の反応形成における好塩基球の役割を解析した。また、慢性痒疹、アトピー性皮膚炎の末梢血好塩基球の活性化マーカーであるCD203の発現を解析して皮膚病変の重症度との関連性に関して解析した(Ito Y etal : Basophilrecruitment and activation in inflammatoryskin diseases. Allergy, 66 : 1107, 2011)。水疱性類天疱瘡における病勢と好塩基球のCD203の発現の強さを検討したところ発現のレベルが病勢と一致してることを明らかにした。Ugajin T etal. Br J Dermatol. 2015Apr 27.)(2)抗原特異的IgE遺伝子導入マウスを用いたモデルマウスによる痒疹の病態解析抗原特異的IgE導入マウスを用いて痒疹モデルマウスを作製した。孤立性の角化性丘疹で好塩基球、好酸球、肥満細胞が密に浸潤。このモデルマウスを用いて発症機序、痒疹反応とはサイトカインパターンが類似。好塩基球に特異的モノクローナル抗体を用いて新規治療法の開発。好塩基球特異的モノクローナル抗体を作成しているので、これらの抗体による治療法の可能性を検討した(Ugajin T, J Leukoc Biol,2009, Hashimoto T,J Immunol,2015)。さらにマウスおよびヒト好塩基球において、MTがIL-4産生を制御していることを明らかにした(Ugajin T, Mol Immuno,2014)。現在、抗原特異的IgE導入マウスの背部に大量の抗原を数回皮下投与することにより誘導した痒疹モデルマウスを用いての発症機序、痒疹反応との違いなどに関して各種サイトカイン、ケモカイン、接着因子、Th1,Th2,Th17細胞に関してRT PCT法を用いてmRNAの発現、ELISAにて蛋白レベルでの検討しており痒疹におけるサイトカインパターンと痒疹モデルマウスで一致することが明らかにされた(Hashimoto T,J Immunol in press)。今年度ではSTAT6の役割も解析でき順調に研究は進んでいる。痒疹モデルマウスで好塩基球が産生する大量のIL-4がSTAT6を介してM2マクロファージを誘導でき痒疹反応が抑制できることが明らかになった。機序を解析して抗IgE抗体(オマリズマブを臨床応用する予定であり人を用いた研究でもマウスを用いた研究でも順調に解析が進んでいる。(1)経皮感作食物アレルギーモデルの作成と病態解析水分解小麦の経皮感作による小麦依存性運動誘発性アナフィラキシーなど蛋白抗原の経皮感作によるアナフィラキシーが社会問題になっている。そこで当研究室ではOVAをパッチテストチェンバーで1週間貼付後2週間ごとに3回貼付することを繰り返し後、50mgOVAの経口投与することによりアナフィラキシー反応を誘導するモデルマウスを作成した(図2)。この実験系を用いて肥満細胞、好塩基球の役割を解析する。アナフィラキシーを起こした腸管では肥満細胞、好塩基球ともに増加していることも明らかにしている(Yu R etal,Exp Dermatol, 2017)。(2)亜鉛シグナルの解析好

塩基球は、肥満細胞に類似し、高親和性のIgE受容体(FcεRI)を持ち、IgE/Ag刺激により、ケミカルメディエーターのほか、IL-4を多量に分泌する。近年、好塩基球がIL-4を分泌することでTh2細胞分化を誘導し、アレルギー炎症に関与する可能性が報告された。亜鉛(Zn)がシグナル伝達因子としてアレルギー炎症反応に重要な役割を果たすことが明らかにされている。宇賀神君がすでに、亜鉛シグナルによる好塩基球のIL-4産生の制御機構を解析する。マウス好塩基球は、IgE/Ag刺激後に亜鉛結合タンパクであるメタロチオネイン(MT)の発現が誘導された。そこで、MT欠損マウス由来の好塩基球を用い、IgE/Ag依存性のIL4産生をリアルタイムPCRやELISAにより検討したところ、野生型に比べて減弱した。MT欠損マウスにおける細胞内亜鉛濃度を、NewportGreenアッセイにて測定すると、野生型に比べて上昇が見られ、さらに細胞内亜鉛濃度の上昇は、好塩基球のIL-4産生に関与するシグナル分子の活性を抑制することを明らかにした。慢性痒疹、アトピー性皮膚炎の痒疹部および正常人皮膚のクリオ切片を用い、好塩基球特異的抗体(BB1)抗CD4,CD8モノクローナル抗体を用いて病変部のリンパ球、好塩基球の浸潤を解析して痒疹反応形成における好塩基球の役割を解析し痒疹反応部で好塩基球が多数浸潤していることを報告した。(Ito Y etal: Basophilrecruitment and activation in inflammatoryskin diseases., Allergy, 66 : 1107, 2011)現在、抗原特異的IgE導入マウスの背部に大量の抗原を数回皮下投与し誘導した痒疹モデルマウスを用いての発症機序、痒疹反応との相異を各種サイトカイン、ケモカイン、接着因子、Th1,Th2,Th17細胞をRT PCT法を用いてmRNAの発現、ELISAにて蛋白レベルでの検討しており痒疹におけるサイトカインパターンと痒疹モデルマウスで一致することが明らかにされた(Hasimoto T,J Immunol 2015)。今年度ではSTAT6の役割も解析でき順調に研究は進んでいる。痒疹モデルマウスで好塩基球が産生する大量のIL-4がSTAT6を介してM2マクロファージを誘導、痒疹反応が抑制できることが明らかになった。さらにOVAをパッチテストチェンバーで1週間貼付後2週間毎に3回貼付することを繰り返し後、50μgOVAの経口投与することでアナフィラキシー反応を誘導するモデルマウスを作成した。今後、この実験系を用いて肥満細胞、好塩基球の役割を解析する。アナフィラキシーを起こした腸管では肥満細胞、好塩基球ともに増加していることも明らかにしている(Yu R etal,Exp Dermatol, 2017)。現在、亜鉛を用いて食物アナフィラキしーモデルマウスを制御できるか解析している。皮感作食物依存性アナフィラキシーモデルマウスを用いた病態解析加水分解小麦の経皮感作による小麦依存性運動誘発性アナフィラキシーなど蛋白抗原の経皮感作によるアナフィラキシーが社会問題になっている。
可変波長中赤外線レーザーによるレーザーレーダーを用いた火山性ガスの遠隔検知の実現

本研究によって、中赤外線光源および遠隔検知システムを開発を推進した。本課題の研究期間中に以下の点が示された。(1)中赤外線レーザーによって、気相体の吸収スペクトルを検出可能である。(2)共焦点光学系・冷却空間フィルターによって雑音・熱雑音・検出空間の限定により感度の向上が可能である。(3)ファンアウト構造のPPMgSLT結晶の使用で励起光の入射位置を掃引し、3-4μmの波長掃引能を有する中赤外線レーザーが作成可能である。(4)車載可搬型レーザーレーダーにより1km遠方の山体からの散乱光が検出可能である。検出された散乱信号から具に山体表面の状態などが判明する。平成25年度の達成目標は『可変波長中赤外線レーザーの開発』である。これは所属する光量子制御技術特別開発チームにて開発済みである波長可変レーザーシステムの出力に対してZnGeP2(ZGP)結晶の利用した光パラメトリック発振(OPO)を行い、火山性ガスの分光計測が可能な26μmの可変領域の実現するものである。しかし、予算、納期に折り合いがあわず結晶の入手が困難であった。このため、使用する非線形光学結晶、共振器用の鏡の再検討を行う必要があった。非線形光学用結晶の再検討にあたり最重要となる波長も検討する必要があった。本研究の目的は火山活動に密接であると考えられる火山性ガスを継続的に捕捉することを火山活動メカニズム等を解明するための装置開発である。そこで、火山ガス中における最重要と考えられる成分のみに捕捉対象限定する必要があった。これまでの火山ガス計測における報告では、対象となる火山によって噴火と相関のある成分は異なっている。しかし、近年の研究において、火山ガス中の重水と水の混合比を測定することで、火口のマグマ温度の正確な計測や火山ガス中の水蒸気の起源を同定が示唆されている。よって、ガス内の水蒸気中における重水と水の計測を第一目標とした。重水と水の吸収特性は酷似しているが、3.0μmと3.5μmでの計測により定量的な計測が可能である。よって両波長を含む3.03.7μmの発振を可能とするPPLN結晶を採用を決定した。上記の再検討と同時進行にて所属研究室で既に保有していたZGP結晶を使用したレーザーにおけるOPO部も開発を行った。この結晶は目標波長用に設計されたものではないが、結晶角を調整することによって目標波長の一部である4.56.0μmの波長域での出力に成功している。また、平成26年度の達成目標である『受光検出器の開発』における検出器の選定・最適化を先行して行った。平成26年度の実施計画は『受光検出器の開発』である。計画は四段階に分かれている(1:赤外線検出器の選定、2:受光システムの開発、3:較正システムの開発、4:検出試験)。1:赤外線検出器の選定。中赤外線領域において極めて高感度である量子型のHgCdTe(MCT)を採用した。常温でも熱輻射として発生する中赤外線の検出では検出器冷却による熱雑音の除去が高感度化において極めて重要である。代表的な冷却方法は液体窒素と電子冷却によるものがある。取り扱いの平易さや安全性から電子冷却方式を採用した。これは、昨年度末に先行しており入手している。2:受光システムの開発。受光部は検出部と並んで本年度の重要な開発項目であった。受光部の口径の大きさが直接的に受光効率へ影響するためである。このため、微小な光信号を検出する際には可能な限り大きな口径であることが望ましい。また、望遠鏡にはレンズを利用した屈折型と鏡を利用した反射型があるが、波長による検出効率依存性の小さい反射式望遠鏡であるシュミットカセグレン望遠鏡を採用した。検出器サイズが1mmに対して望遠鏡の出力側の口径は40mmである。このためレンズによる集光システムの開発を行い、実験室レベルにて300倍の集光効率を実現した。3:較正システムの開発。本開発のようにレーザーを使用したアクティブセンサー(LIDAR)においては発信側であるレーザーの出力の変動を計測し、解析時に補正(較正)することによってより精度を高めることが可能となる。レーザーの出力モニタとして焦電型の検出器を採用した。4:検出試験。開発した受光部にて遠隔による光検出試験を行った。観測域の確保、試験時の安全性、機器の運搬を考慮し大学の体育館を実施地とした。最終目標である1kmには及ばないが、対象物に照射されたレーザー光の散乱の検出に成功している。本年度の計画は、『1:レーザー遠隔検知性能の実証』『2:中赤外線光源の開発』『3:ガス選別性能の実証』の3要素で構成していた。『1:レーザー遠隔検知性能の実証』本研究の最終的な目標は中赤外線レーザーを用いた火山ガスの能動的な遠隔検知である。このため火山噴火現場まで観測システムを迅速に搬送し観測を開始する必要がある。送信系であるレーザー部と受信系である望遠鏡・検出器を台車へ搭載することによって、システムに可搬性能を付加した。

装置開発との同時進行であったために送信機や望遠鏡には代替機を使用し、拠点となる信州大学工学部より約30kmに位置する長野県小川村の『星と緑のロマン館』までシステムを車載で運び込み、遠方にある山体を観測することでレーザー遠隔検知性能を試験した。観測現場は山間にありシステムが実用配備された想定の観測に可能な限り近づけた。貨物用ワゴン車によってシステムを運搬し、1km遠方の山体からの戻り光の検出に成功し、遠隔検知性能・運搬性能は実証された。『2:中赤外線光源の開発』この要素は昨年度からの繰り越しとなる課題である。昨年度までに、Nd:YAGレーザー、共振器用鏡、光学定盤の調達など開発環境の構築は達成しており、本年度より種光となるレーザーをOPO結晶へ入射させ中赤外線レーザー発振の実験を推進した。レーザー発振は結晶の予備がないことや開発者にとって初の試みであり慎重を要する。これまでに0.5mJのレーザーを入射させているが発振には至っていない。結晶の損傷には至っていないので、今後も開発を継続する計画となっている。『3:ガス選別性能の実証』光源の開発に遅れがあったために、セラミックヒーターの熱輻射を光源として利用した実験を行った。共焦点光学系を導入し直径1mmの小型の検出器への集光効率を高めて、検出効率を向上させた。これまでにH2Oによる中赤外線の吸収を確認している。本研究によって、中赤外線光源および遠隔検知システムを開発を推進した。本課題の研究期間中に以下の点が示された。(1)中赤外線レーザーによって、気相体の吸収スペクトルを検出可能である。(2)共焦点光学系・冷却空間フィルターによって雑音・熱雑音・検出空間の限定により感度の向上が可能である。(3)ファンアウト構造のPPMgSLT結晶の使用で励起光の入射位置を掃引し、3-4μmの波長掃引能を有する中赤外線レーザーが作成可能である。(4)車載可搬型レーザーレーダーにより1km遠方の山体からの散乱光が検出可能である。検出された散乱信号から具に山体表面の状態などが判明する。前年度において中赤外線レーザーに使用するOPO結晶に変更があり、該当部に少々遅れが生じていた。前年度にいては検出部の選定を先行することで補ったが、本年度は所属組織を理化学研究所から信州大学へ変更したことにより、実験施設の環境や開発済みの項目を一から構築することを余儀なくされた。このため、前組織において常設されていたレーザーシステム開発用の光学定盤や励起用レーザーの新規確保に時間を要し積み残し部分が未解決である。既に光学定盤および励起用レーザーは確保されており開発を再開推進しているが、前述のように使用予定であった前組織で保有していた物品の代替品が光学ミラー等の様々な箇所で影響があり、その都度に選定および予算の都合の必要があり遅れがあることは否めない。一方で、本年度予定の受光検出器の開発は順調に推進できている。これは受光検出器の光学特性等は実験施設の環境依存が少なく、独立した開発が可能である点に起因していると考える。受光検出部の開発は計画に則した推進状況であるのに対して、実験施設の変更に伴う影響を大きく受けるレーザーシステムは一からの開発に一時的にではあるが大きく後退している。よって、現行の推進状況のみで評価するならば、極めて残念ではあるが『(3)やや遅れている。』とせざるを得ない。しかしながら、新規環境において実験施設の環境は既に構築できており、開発を再開している点を推進状況とは別に評価すべきと考えている。レーザーセンシング平成27年度は本予算の計画における最終年度となる。
スフィンゴ脂質代謝酵素による細胞増殖・生存の制御機構の解明

スフィンゴミエリンの代謝産物は細胞の生と死の調節に重要であることが知られている。スフィンゴミエリナーゼ(SMase)により産生されるセラミドは、細胞死誘導に関与し、また、スフィンゴシンキナーゼ(SPHK)により産生されるスフィンゴシン1-リン酸(S1P)は、細胞外に分泌されG蛋白共役型受容体(Edg/S1Pファミリー一)を介して様々な細胞にアゴニストとして作用し、細胞増殖・生存や細胞運動に重要な役割を果たすことが示されているが、その詳細なメカニズムは明らかでない。本申請課題では、SPHK/S1P系と他の細胞内シグナル伝達系とのクロストークについて検討し、S1P受容体シグナルがホスホリパーゼD(PLD)、PI3K/Akt系の生存シグナル系を活性化し、アポトーシス抑制に関与することを初めて示唆した。SPHKアイソザイムの特異的抗体を用いて細胞内局在や組織内分布を検討し、精子の先端に特異的に局在することを見いだした。白血病細胞HL60の好中球への分化誘導過程におけるSPHK1の関与を明らかにした。また、SPHKの細胞機能における役割を明らかにするために、免疫系細胞における細胞死との関連性を検討し、SPHK1の過剰発現により細胞死が抑制されることを見いだした。さらに、抗がん剤耐性とSPHK1活性の高発現の関連性を明らかにするために、前立腺がん細胞や白血病細胞で抗がん剤処理による細胞死誘導に抵抗性を示す細胞と非抵抗性細胞におけるSPHKの活性を比較検討したところ、SPHK1の高発現と抗がん剤耐性の関連性が示唆された。さらに、抗がん剤に対するIC_<50>の高いがん細胞ではセラミド産生が低く、抗がん剤による細胞死に抵抗性を示した。一方、IC_<50>の低いがん細胞は、抗がん剤処理によりセラミド産生が高くS1P量の著しい低下がみられた。これらの結果から、セラミド産生とS1P量の変化はケモテラピーの指標になることが示唆された。また、SPHK1のsiRNA処理により細胞死が促進されたことから、SPHK1が抗がん剤のターゲットになることが示唆された。スフィンゴミエリンのスフィンゴミエリナーゼ(SMase)により産生されるセラミドやスフィンゴシンは、細胞死誘導に関与し、また、スフィンゴシンキナーゼ(SPHK)により産生されるスフィンゴシン1-リン酸(S1P)は、細胞外に分泌されG蛋白共役型受容体(Edg/S1Pファミリー)を介して様々な細胞にアゴニストとして作用し、細胞増殖・生存や細胞運動に重要な役割を果たすことが示されているが、その詳細なメカニズムは明らかでない。申請者らは、SPHK/S1P系と他の細胞内シグナル伝達系とのクロストークについて検討し、S1P受容体シグナルがホスホリパーゼD(PLD)、PI3K/Akt系の生存シグナル系を活性化し、アポトーシス抑制に関与することを初めて示唆した。本年度はSPHKの細胞内機能を調べるために、SPHKアイソザイムの特異的抗体を用いて細胞内局在や組織内分布を検討し、SPHK1が腫瘍細胞に高発現していることや精子の先端に特異的に局在することを見いだし、SPHKの特異的生理作用を示唆する結果を得た。

さらに、SPHK/S1Pシグナル伝達系の制御機構を明らかにするために、白血病細胞HL60を用いて好中球への分化誘導過程におけるSPHK1の役割を検討した。HL60細胞の好中球への分化過程は、SPHK1の阻害剤DMSやERKの阻害剤によって抑制された。また、DMSはERKの活性化を抑制したが、p38MAPKの活性化には影響しなかった。また、不活性型SPHK1であるDNSPHK1を過剰発現させるとERKの活性化と好中球への分化の抑制がみられた。これらの結果から、SPHK1は白血病細胞の分化にERKの活性化を介して重要な役割を演じることを示唆した。一方、S1P刺激によるPLDの活性化が生存シグナル(PI3K,AKT)の活性化に関与することを示唆した。この機構を明らかにするために、PC12細胞を用いて酸化ストレスに対する系について検討した。PC12細胞は、酸化ストレスに応答してPLDの活性化とPYK2,AKTの活性化を引き起こすが、PLD2の活性化により生じるPAが、PYK2/SRCの活性化を介して、PI3K/AKTの生存シグナルの活性化に関与することを初めて明らかにした。スフィンゴミエリンのスフィンゴミエリナーゼ(SMase)により産生されるセラミドやスフィンゴシンは、細胞死誘導に関与し、また、スフィンゴシンキナーゼ(SPHK)により産生されるスフィンゴシン1一リン酸(SIP)は、細胞外に分泌されG蛋白共役型受容体(Edg/SIPファミリー)を介して様々な細胞にアゴニストとして作用し、細胞増殖・生存や細胞運動に重要な役割を果たすことが示されているが、その詳細なメカニズムは明らかでない。申請者らは、SPHK/SIP系と他の細胞内シグナル伝達系とのクロストークについて検討し、SIP受容体シグナルがホスホリパーゼD(PLD)、PI3K/Akt系の生存シグナル系を活性化し、アポトーシス抑制に関与することを初めて示唆した。SPHKアイソザイムの特異的抗体を用いて細胞内局在や組織内分布を検討し、精子の先端に特異的に局在することを見いだした。白血病細胞HL60の好中球への分化誘導過程におけるSPHK1の関与を明らかにした。今年度は、さらにSPIIKの細胞機能における役割を明らかにするために、免疫系細胞における細胞死との関連性を検討し、SPHK1の過剰発現により細胞死が抑制されることを見いだした。さらに、抗がん剤耐性とSPHK1活性の高発現の関連性を明らかにするために、前立腺がん細胞や白血病細胞で抗がん剤処理による細胞死誘導に抵抗性を示す細胞と非抵抗性細胞におけるセラミド産生とSIP量の変化を比較検討した。SPHK1の高発現を示すがん細胞はセラミド産生が低く、SIP量の変化も少なく抗がん剤に対するIC_<50>も高く、抗がん剤による細胞死に抵抗性を示した。一方、IC_<50>の低いがん細胞は、抗がん剤処理によりセラミド産生の高くSIP量の著しい低下がみられた。これらの結果から、セラミド産生とSIP量の変化はケモテラピーの指標に役立つことが示唆された。