hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真壁木造の耐久性向上のための雨水浸入の抑制および浸入雨水の挙動制御に関する研究

平成29年度は、主にモルタル真壁を対象に、壁面を構成する材料の吸水・浸透に関する材料物性を測定したが、重力に対する吸水・浸透の方向を考慮した測定方法の考案に予想外の時間を要してしまった。小舞壁では、壁面を構成する壁土自体が耐水性に劣るため、壁土への適用を考慮したことも、測定方法の考案に時間を要した理由である。本研究では、真壁が風雨を受けた際の浸入雨水の挙動を明らかにし、そのうえで真壁に施す雨仕舞による雨水浸入の抑制効果を確かめる。本年度は、下記を行った。1)真壁を構成する材料の吸水特性の把握昨年度はモルタル真壁のみを対象としたが、本年度は小舞土壁も対象とした。関東土荒壁、関東土中塗り、関西土荒壁、関西土中塗り、普通モルタル、軽量モルタル、砂漆喰、上塗り漆喰のそれぞれを用いて、吸水方向や吸水面にかかる圧力を変えて一面吸水試験を行った。吸水試験においては、所定の時間間隔で試験体の質量を測定し、試験前の試験体質量を引いて吸水量を算出した。吸水方向としては、鉛直上向き、鉛直下向き、水平方向の3種類(砂漆喰、上塗り漆喰では鉛直上向きのみ)を検討した。また,吸水面にかかる圧力は水頭圧が2mmの場合と10mmの場合を検討した。その結果、普通モルタルや軽量モルタルでは、試験体による個体差が大きかったため、吸水量の時間変化に対する吸水方向および吸水面にかかる圧力の影響に明確な傾向は認められなかった。関東土荒壁、関東土中塗り、関西土荒壁、関西土中塗りは吸水試験中に試験体が軟化し、正確な吸水量を測定することができなかった。2)真壁が風雨を受けた際の浸入雨水の挙動モデルの検討吸水試験によって得られた材料物性を用い、真壁が風雨を受けた際の浸入雨水の挙動モデル(以下、吸水モデルと呼ぶ)を検討した。吸水モデルにおける水分移動の駆動力は、壁内では含水率の差、壁面と軸組との取合い部では壁体内外の圧力差とした。その結果、過去に行った散水試験の結果を概ね再現できたが、さらに精度を高めるためには、上記の吸水試験方法の改良も含め、より実現象に近い吸水モデルに改良する必要があり、最終年度に実施する。当初の予定は、平成29年度に、真壁において雨水浸入の弱点となる部分の要素試験体に対し散水実験を行い、典型的な降雨条件下における浸入雨水の挙動や雨水浸入に対する雨仕舞等の抑制効果を確かめ、平成30年度に浸入した雨水の乾燥性状を把握し、平成31年度に真壁を構成する材料の物性試験を行い、散水実験および乾燥実験の結果を解析的に検証する予定であった。しかし、真壁において屋外に露出した木材の軸組に、相当な長時間にわたり降雨が継続しても、木材はあまり吸水しないことが試行的に行った実験で見当がついたため、平成30年に予定されていた乾燥実験を後回しにすることにした。むしろ、雨水の室内への漏出や内壁面への滲出しの問題の解決が先決と考え、最終年度に予定されていた材料物性試験と順番を入れ替えた。平成30年度のできるだけ早期に材料物性の測定方法を改良して材料物性の測定を行い、後半から最終年度にかけ、要素試験体による散水実験を行う。上記の計画変更に伴い、最終年度は、課題として残された物性試験方法と数値解析手法の改良に加え、解析モデルを検証するための要素試験体による散水実験を並行して行い、材料物性の影響や雨仕舞等による雨水浸入の抑制効果を明らかにしていく。[理由]平成29年度に計上した予算の大部分は要素試験体による散水実験に関係するもので、試験体の作製費、計測機器およびその他の設備備品などである。前述の通り、平成29年度と平成30年度の実施計画を入れ替えたため、もともと材料物性の測定に要する費用は、ほとんどが材料費であり、少額である。
機能水のデンチャープラークコントロール効果

酸性機能水は,多くの細菌に対して瞬時に殺菌効果を発揮し,しかも使用後は安全な水に戻ることから現在,各分野で盛んに研究が行われている.しかしながら,この酸性機能水が歯科材料に及ぼす影響を検討したものはほとんどない.いかに殺菌効果に優れていて口腔諸領域の治療に応用しようとしても,歯科材料に悪影響を及ぼすものであるならば,使用不可と言わざるを得ない.そこで本研究では,義歯用材料(床用レジン,リライニング用レジン,義歯床用エンジニアリングプラスチック)に対し,機能水(強酸性水および強アルカリ水)が本材料に及ぼす影響について検討を加えることを発案した.その結果,リライニング用レジンは浸漬液に関わらず色差が増加し,強酸性水に浸漬した義歯床用エンジニアリングプラスチックの色差はやや増加した.しかし,表面粗さ,光沢度およびヌープ硬さでは強酸性水の影響はほとんど見られなかった.また,硬質レジン歯,アクリリックレジン歯およびポリスルフォン樹脂レジン歯等の人工歯への強酸性水の影響はヌープ硬さ,表面粗さおよび色調変化に関してほとんど変化がなかった.さらに,磁性アタッチメントおよび粘膜調整材への影響では,強酸性水に浸漬した磁性アタッチメントで,1部光沢が低下したのを除けば大きな変化はなく,以上の歯科材料すべてはデンチャープラークコントロールに使用しても差し支えないと思われた.しかし,実際のチェアーサイドで,酸性水を利用した義歯清掃を行い細菌培養試験を実施したところ,in vitroの結果ほど殺菌されていないことも判明し,今後,より効果的で簡便な清掃方法の検討を行う必要がある.酸性機能水は,多くの細菌に対して瞬時に殺菌効果を発揮し,しかも使用後は安全な水に戻ることから現在,各分野で盛んに研究が行われている.しかしながら,この酸性機能水が歯科材料に及ぼす影響を検討したものはほとんどない.いかに殺菌効果に優れていて口腔諸領域の治療に応用しようとしても,歯科材料に悪影響を及ぼすものであるならば,使用不可と言わざるを得ない.そこで本研究では,義歯用材料に対し,機能水(強酸性水および強アルカリ水)が本材料に及ぼす影響について検討を加えることを発案した.さらに,強酸性水と同時に生成される強アルカリ水は現在のところあまり有効利用されず,破棄されているのが現状である.そこで義歯洗浄効果等の利用方法を探る検討を加える.また,機能水の能力は生成装置によってばらつきがあると思われることから,複数の生成装置を用い,その能力について検討する.現在,当講座はすでに機能水生成装置を有している.98年度はまず,この生成装置を用いて基礎実験を行った.義歯用材料に対していかなる影響を及ぼすのか,あるいは有害な影響は見られないのか.実験項目については主に理工学的な項目を選択した(ヌープ硬さ,曲げ強さ,色調変化等).実験で得られたデータは,今回購入したパーソナルコンピューターで,統計,分析等を行いさらに,必要であると思われる検討項目を増やして実験を進行させていく.義歯床用レジン、リライニングレジン、粘膜調整材、磁性アッタチメントについて酸性水の影響をみたが、磁性アッタチメンとの1部に光沢度が低下したものをのぞけば特に大きな変化はなく、デンチャーブラークコントロールに応用しても差し支えないと思われたまた,99年度には新たな機能水生成装置を購入し,実際の消毒効果を調べる。その際数種類の使用条件を検討しもっとも簡便で効果的な清掃方法を究明し臨床に応用できれば大いに有用な知見になると考える。さらに,アルカリ機能水の利用方法を検討するために,義歯洗浄効果や,細菌,プラークに対する影響も検討する予定である.酸性機能水は,多くの細菌に対して瞬時に殺菌効果を発揮し,しかも使用後は安全な水に戻ることから現在,各分野で盛んに研究が行われている.しかしながら,この酸性機能水が歯科材料に及ぼす影響を検討したものはほとんどない.いかに殺菌効果に優れていて口腔諸領域の治療に応用しようとしても,歯科材料に悪影響を及ぼすものであるならば,使用不可と言わざるを得ない.そこで本研究では,義歯用材料(床用レジン,リライニング用レジン,義歯床用エンジニアリングプラスチック)に対し,機能水(強酸性水および強アルカリ水)が本材料に及ぼす影響について検討を加えることを発案した.その結果,リライニング用レジンは浸漬液に関わらず色差が増加し,強酸性水に浸漬した義歯床用エンジニアリングプラスチックの色差はやや増加した.しかし,表面粗さ,光沢度およびヌープ硬さでは強酸性水の影響はほとんど見られなかった.また,硬質レジン歯,アクリリックレジン歯およびポリスルフォン樹脂レジン歯等の人工歯への強酸性水の影響はヌープ硬さ,表面粗さおよび色調変化に関してほとんど変化がなかった.さらに,磁性アタッチメントおよび粘膜調整材への影響では,強酸性水に浸漬した磁性アタッチメントで,1部光沢が低下したのを除けば大きな変化はなく,以上の歯科材料すべてはデンチャープラークコントロールに使用しても差し支えないと思われた.しかし,実際のチェアーサイドで,酸性水を利用した義歯清掃を行い細菌培養試験を実施したところ,in vitroの結果ほど殺菌されていないことも判明し,今後,より効果的で簡便な清掃方法の検討を行う必要がある.
酸化還元反応を用いた黄銅中の銅の含有量を求める実験の教材化

〈研究の目的と方法〉高等学校理科の新学習指導要領ではこれまで以上に理科と人間生活とのかかわりや科学的な探究方法の習得が強調されている。そこで「化学基礎」において日常生活や社会を支える物質として学習する銅の合金で,高校生にとってもなじみ深い黄銅を用いた定量実験の教材化を本研究の目的とした。具体的には酸化還元滴定であるヨウ素滴定によって黄銅中の銅の含有量を求める実験の教材化を試みた。そのため,まず「化学1」が既習である高等学校第3学年2クラスで試行的に実施した後,修正した教材を第1学年1クラスで酸化還元反応の量的関係を学習した後に実施した。実施後にはアンケート調査等を行った。〈研究の成果〉原理の説明やヨウ素滴定,考察,まとめなどの一連の過程を3時間以内で実施できた。実験では1L中に黄銅6gを含む水溶液10mLに対して,0.1mol/Lのチオ硫酸ナトリウム水溶液で滴定を行った。この濃度では滴下量が6mL程度となり,ヨウ化カリウム水溶液を加えるなどの滴下以外の操作を含むヨウ素滴定をすべてのグループで3回以上行うことができ,実験操作の説明も含めて50分で実施できた。また,アンケート調査の「第1学年の酸化還元反応での教材として使用できる」では82%(第3学年)・91%(第1学年),「酸化還元反応の量的関係に関する理解が高まった」では98%(第3学年)・74%(第1学年)のように他のアンケート項目も含めて教材としておおむね適切であると判断できる肯定的回答が得られた。さらに,黄銅板だけでなく身近な水道パイプを用いることで生徒の興味・関心を高めることもできた。一方で,滴定の終点がわかりにくかったなどの意見もあり,今後実践を積み重ねてより適切な教材へと改善する。
硫黄―窒素三重結合を有する多元素環状化合物の合成と反応性に関する研究

平成14年度の本特定領域研究の研究期間において、チアントレン骨格を有するスルフィルイミンと親電子性フッ素化剤であるSELECTFLUOR^<TM>とを反応させることにより、対応する環状S-フルオロチアザインが得られる方法を見出した。また、得られたフルオロチアザインとモルホリンとの反応により、S-アミノチアザインを複素環化合物としてはじめて合成した。本年度は、[1]イミノやアリール基を有する多元素環状チアザイン類の合成を試みた。まず、イミノ化反応は、10,10-ジオキシチアントレン骨格を有する環状S-フルオロチアザイン1とジフェニルスルフィルイミンとの反応をアセトニトリル中、40°Cで反応を行った結果、対応するジフェニルイミノ基が置換した新規環状チアザイの合成に成功した。次に、環状フルオロチアザイ1とフェニルアニオンとの反応を低温装置を用いて反応を行った。その結果、化合物1とフェニルリチウムとの反応では、複雑な生成物を与えたが、求核剤を臭化フェニルマグネシウムに代えたところ、目的のフェニル置換環状チアザイを得ることが出来た。また、[2]10-オキシ-5-イミノチアントレン(2)をケミカルプローブとして用い、化合物2とSELECTFLUOR^<TM>との反応及び、得られたフルオロ体3とモルホリンとの反応の立体化学について検討した。化合物2のトランス体とSELECTFLUOR^<TM>との反応を低温装置を用いて行ったところ、得られたフルオロ体3の立体化学は、S=0とS≡Nの関係がシス体であることをX線構造解析により明らかにした。またシス体3とモルホリンとの反応では、S=0とS≡Nの関係がトランス体であるモルホリノチアザイが得られることが分かり、これらの反応の立体化学をはじめて明らかにした。先に我々は、5-イミノチアントレンと親電子性フッ素化剤であるSELECTFLUOR^<TM>とを反応させることにより、対応する環状S-フルオロチアザインが得られる方法を見出した。本年度は、10-オキシ、10,10-ジオキシ-チアントレン骨格を有するS-フルオロチアザインの合成とそれらの反応性および、分子構造について検討した。10-オキシ、10,10-ジオキシ-イミノチアントレン1a、bとSELECTFLUOR^<TM>とをアセトニトリル中で低温恒温水槽を用いて反応させたところ、対応するS-フルオロチアザイン2a、bが得られた(2a;75%、2b;65%)。化合物2a、bは、チアントレンS-フルオロチアザインと比較して、加水分解を受けにくく比較的安定な化合物であった。化合物の同定は、各種スペクトルおよび元素分析により行い、化合物2bにおいては、環状S-フルオロチアザインとしてはじめてX線構造解析によりその分子構造を明らかにした。化合物2bのチアントレン骨格は、舟形配座であり、S-N結合がチアントレン骨格に対して擬エカトリアル位、S-F結合は擬アキシャル位に位置していた。S-N結合距離は、1.435(2)ÅとS-N三重結合を有する有機チアザイン類(1.441-1.462Å)の中で最も短い結合距離を示した。また、S-F結合長は、1.584(2)Åであり、S-フルオロ-S-(p-ニトロフェニル)-S-フェニルチアザインの対応する結合長(S-F;1.638(2)Å)よりも若干短くなっていた。次に、化合物2a、bの反応性を調べるため、モルホリンとの反応を試みた。その結果、反応は速やかに進行し、それぞれ対応するS-モルホリノチアザイン3a、bが56、68%の収率で得られた。化合物3a、bの分子構造については、X線構造解析により明らかにした。また、得られた化合物3の電気化学的性質を電気化学測定システムを用いて検討した。化合物2のトランス体とSELECTFLUOR

^<TM>との反応を低温装置を用いて行ったところ、得られたフルオロ体3の立体化学は、S=0とS≡Nの関係がシス体であることをX線構造解析により明らかにした。またシス体3とモルホリンとの反応では、S=0とS≡Nの関係がトランス体であるモルホリノチアザイが得られることが分かり、これらの反応の立体化学をはじめて明らかにした。
ソルボサーマル反応による革新的自動車排ガス浄化触媒の創製

ソルボサーマル反応により、セリアジルコニアにカルシウムまたはスズをドープした複合金属酸化物ナノ粒子を合成し、セリアジルコニアより優れた耐熱性と酸素吸蔵能を有することを明らかにまた。また、セリアジルコニアにカルシウムまたはスズをドープした複合金属酸化物ナノ粒子をγアルミナおよびパラジウムと複合化すると優れた自動車排ガス浄化特性を有する三元触媒を創製できることを実証した。さらに、酸化スズがセリアと同様に酸素吸蔵能を有することを明らかにし、ソルボサーマル反応で合成したストロンチウムやバリウムをドープした酸化スズナノ粒子が、セリアジルコニアより優れた耐熱性と酸素吸蔵能を有することを見出した。自動車排ガス浄化には、γアルミナ/セリア/白金族貴金属から構成される三元触媒が使用されており、触媒活性は、助触媒として使用されるセリアの酸素ストレージ機能に依存することが知られており、今後の排ガス浄化規制の強化への対応や、貴重な貴金属使用量の削減が求められていることから、セリア基複合金属酸化物の酸素ストレージ機能の改善による三元触媒の特性向上を図った。セリアへの金属イオンドープによる酸素ストレージ機能への影響について詳細に検討し、セリアにジルコニウムとスズ、ジルコニウムとカルシウムをコドープすると酸素ストレージ機能および耐熱性が向上し、三元触媒の触媒活性を向上できることを明らかにした。また、酸化スズも酸素ストレージ機能を有しており、第一原理計算により、酸化スズにアルカリ土類金属をドープすると酸素ストレージ機能の向上が可能であることが予測されたことから、ソルボサーマル反応によりアルカリ土類金属ドープ酸化スズの合成と形態制御を行った。酸化スズにマグネシウムやカルシウムをドープすると酸素ストレージ機能は低下したが、ストロンチウムやバリウムをドープすると、現在三元触媒に汎用されているセリア-ジルコニア複合金属酸化物より優れた酸素ストレージ機能と耐熱性を示すことを見出した。また、シリカナノ粒子をテンプレートとし、ソルボサーマル反応によりストロンチウムやバリウムをドープしたセリアの多孔質粒子を合成し、酸素ストレージ機能を大幅に向上させることに成功した。ソルボサーマル反応により、化学組成および形態を精密制御したセリア触媒を調製することで現行の自動車排ガス浄化三元触媒の性能を大幅に凌駕する革新的自動車排ガス浄化触媒の創製を図ることを目指して研究を行った。ソルボサーマル反応によりセリア基複合金属酸化物ナノ粒子を合成し、酸素ストレージ機能および耐熱性について検討し、CeO2にCe4+よりイオンサイズの小さなSn4+, Co2+, Co3+, Fe3+, Al3+等の金属イオンを固溶すると酸素ストレージ機能および耐熱性を向上でき、特にZr4+とSn4+やCo3+のコドーピングが効果的であることを明らかにした。また、Ce4+よりイオンサイズの大きなCa2+のみを単独でドーピングすると酸素ストレージ機能が低下するが、イオンサイズの小さなZr4+とコドーピングすると酸素ストレージ機能を大幅に向上できることを明らかにした。本研究で得られた酸素ストレージ機能の優れたセリウムージルコニウムースズ混合酸化物、セリウムージルコニウムーコバルト混合酸化物およびセリウムージルコニウムーカルシウム混合酸化物をガンマアルミナおよびパラジウムと複合化し、三元触媒特性を調べたところ、セリウムージルコニウムーカルシウム混合酸化物が最も優れた三元触媒活性を示し、標準試料より優れた特性を有することが分かった。なお、ソルボサーマル反応により、非セリア酸化物ナノ粒子を合成し、酸素ストレージ機能についても検討したところ、酸化マンガン、酸化コバルト、酸化スズ等が、セリア系混合酸化物よりはるかに優れた酸素ストレージ機能を有することを見出した。ソルボサーマル反応により、化学組成および形態を精密制御したセリア触媒を調製することで現行の自動車排ガス浄化三元触媒の性能を大幅に凌駕する革新的自動車排ガス浄化触媒の創製を図ることを目指して研究を行い、CeO2にCe4+よりイオンサイズの小さなSn4+, Co2+, Co3+, Fe3+, Al3+等の金属イオンを固溶すると酸素ストレージ機能を向上でき、特にZr4+とSn4+やCo3+のコドーピングが効果的であることを明らかにした。また、Ce4+よりイオンサイズの大きなCa2+のみを単独でドーピングすると酸素ストレージ機能が低下するが、イオンサイズの小さなZr4+とコドーピングすると酸素ストレージ機能を大幅に向上できることを見出した。さらに、酸素ストレージ機能の優れたセリウムージルコニウムースズ混合酸化物、セリウムージルコニウムーコバルト混合酸化物およびセリウムージルコニウムーカルシウム混合酸化物をガンマアルミナおよびパラジウムと複合化し、三元触媒特性を調べたところ、セリウムージルコニウムーカルシウム混合酸化物が最も優れた三元触媒活性を示し、標準試料より優れた特性を有することを明らかにしたことより、おおむね順調に研究が進展していると評価できる。

これまでに見出した酸素ストレージ機能の優れたセリア基混合金属酸化物ナノ粒子をガンマアルミナおよび貴金属(白金、パラジウム、ロジウム)と複合化し、三元触媒特性を明らかにする。また、ソルボサーマル反応により混合金属酸化物の形態および分散性を制御し、三元触媒特性に及ぼす影響を詳細に検討し、自動車排ガス浄化機能の優れた触媒調製条件を明らかにする。酸化マンガン、酸化コバルト、酸化スズ等の非セリア酸化物は、セリア基複合酸化物より著しく大きな酸素ストレージ機能を有することを見出したことから、これらの酸化物をセリア基混合金属酸化物と複合化し、三元触媒機能の飛躍的な向上を図り、セリウムや貴金属使用量の削減が可能であることを実証する。今年度は、回転式ソルボサーマル反応装置を増設し、迅速に試料作製を行うことを予定し、そのためにに必要なテフロン内貼り耐圧反応容器の購入費を大く計上していたが、回転式ソルボサーマル反応装置の納品が遅れたため、テフロン内貼り耐圧反応容器の消耗が少なく、次年度へ繰り越す研究費が生じた。次年度は、最初から回転式ソルボサーマル反応装置を有効利用できることから、研究費を主にソルボサーマル反応による試料作製に必要なテフロン内貼り耐圧反応容器と試薬および触媒活性評価実験に必要なメノウ乳鉢、ガラス器具等の物品費として使用し、他に、研究発表・調査研究旅費および資料収集旅費として400,000円、研究成果投稿料として100,000円程度使用する予定である。
歯根膜をモデルとした細胞の感圧機構(メカノレセプター)に関する検索

本研究の目的は、従来確立されていなかった、歯根膜に対する力学的応力に対する組織応答検索のための動物実験モデルを確立し、細胞レベルでのたんぱく質の発現やアポトーシスを詳細に検索すること、および咬合圧という物理的ストレスを生化学的な信号に転換する歯根膜細胞の観察を通して、メカノレセプターの存在とそれを担う細胞を推定すること、の2点であった。平成16年度にはラット上顎臼歯に直径約1mmのワイヤーを接着し、固形飼料を与えて咬合性外傷を惹起する実験を行った。これにより、歯根膜組織が破壊過程から再生過程へと転換する時期を詳細に検索でき、過度の咬合力によって歯根膜組織に破壊が起こる時期が確定できた。さらに骨関連蛋白を数種類選定し、これらに対する抗体で免疫組織化学的な検索を行ったところ、破骨細胞でオステオポンチンの発現上昇が認められた。破骨細胞にオステオポンチンの発現を誘導すると考えられているRANKLに対する免疫染色を行ったが、部位や細胞特異的な発現は認められず、特殊なオステオポンチン発現誘導経路が示唆された。平成17年度18年度には咬合力が加わらない条件下での歯根膜の組織変化について検索するために、ラットの下顎臼歯を抜歯し、1日14日間後に上顎におけるオステオポンチンの発現を検索した。実験機器の都合により、機械的な刺激に代わるものとして、温度刺激に注目し、in vivoにおける組織変化を検索した。その結果、温度と機械的刺激との共通点は見出せず、今後は大腿骨や歯根膜に対する熱刺激を使用するモデルを検討する必要がある。平成19年度には歯根膜に対する熱刺激の実験モデル確立の試みを行なったが、簡便な装置による安定した刺激は得られず、これについても今後の課題とした。今後は、軟組織に対する熱刺激と機械刺激に関する実験モデルにおいて、同一条件下で両者の比較をし、実験の簡略化を図りたい。本研究の目的は、従来確立されていなかった、歯根膜に対する力学的応力に対する組織応答検索のための動物実験モデルを確立し、細胞レベルでのたんぱく質の発現やアポトーシスを詳細に検索すること、および咬合圧という物理的ストレスを生化学的な信号に転換する歯根膜細胞の観察を通して、メカノレセプターの存在とそれを担う細胞を推定すること、の2点である。平成16年度はラット上顎臼歯に直径約1mmのワイヤーを接着し、固形飼料を与えて咬合性外傷を惹起する実験を行った。実験期間は1w、2w、4w、8w、12wとし、通法にしたがって組織切片を作製して光学顕微鏡下に観察を行った。この段階で骨関連蛋白を数種類選定し、これらに対する抗体で免疫組織化学的な検索を行ったところ、破骨細胞でオステオポンチンの発現上昇が認められた。通常オステオポンチンは細胞外に分泌される場合が多いが、本実験では細胞内にとどまっていた。そこで、破骨細胞にオステオポンチンの発現を誘導すると考えられているRANKLに対する免疫染色を行ったが、部位や細胞特異的な発現は認められず、本研究の条件下での特殊なオステオポンチン発現誘導経路が示唆された。これらの結果は下記学術雑誌に投稿し掲載されている。咬合力が加わらない条件下での歯根膜の組織変化についても、検討の予定であったが、上記を優先したため、本年度はこれに関する実験は行なっていない。

本研究の目的は、従来確立されていなかった、歯根膜に対する力学的応力に対する組織応答検索のための動物実験モデルを確立し、細胞レベルでのたんぱく質の発現やアポトーシスを詳細に検索すること、および咬合圧という物理的ストレスを生化学的な信号に転換する歯根膜細胞の観察を通して、メカノレセプターの存在とそれを担う細胞を推定すること、の2点である。平成16年度はラットを使用した実験モデルの確立と破骨細胞におけるオステオポンチンの発現を検索し、報告した。平成17年度は引き続き同様の動物実験を行ない、破骨細胞にオステオポンチンの発現を誘導すると考えられているRANKLに対する免疫染色を行った。しかしながら、前年度同様に部位や細胞特異的な発現は認めらなかった。今後歯根膜の再生に関連すると思われるペリオスチンやNotch1、CCN3についても検索する予定である。一方、咬合力が加わらない条件下での歯根膜の組織変化について検索するために、ラットの下顎臼歯を抜歯し、3ヶ月固形飼料による飼育をした後に切片を作製し、オステオポンチンの発現を検索中である。なお、当初の計画では今年度に培養細胞に対する機械的負荷をかける装置としてフレクサーセルを購入する予定であったが、配分された経費が不足していたため、これを購入していない。機械的な刺激に代わるものとして、温度刺激に注目し、骨芽細胞系培養細胞に対する温度刺激後のオステオポンチンの発現量の変化を検索した。その結果、一定の条件化ではその発現量が変化した。今後はin vivoにおける変化との関連を中心に検索を続け、温度と機械的刺激との共通点を見出す方向で検討する。平成18年度は咬合力が加わらない条件下での歯根膜の組織変化について検索するために、ラットの下顎臼歯を抜歯し、3ヶ月固形飼料による飼育をした後に切片を作製し、オステオポンチンの発現を検索した。しかしながら、組織や細胞に特異的な発現は特定できなかった。最近メカニカルストレスに対する応答因子としてペリオスチンが注目されているが、現在のところ抗体が入手できておらず、今後は入手次第、各種条件にて行った実験による切片に対し、免疫染色を行う予定である。さらに、機械的な刺激を細胞に加える装置を購入できないことから、これに代わるものとして、温度刺激に注目しラットを用いたinvivoの実験系を確立し、温度刺激と組織変化との関連を中心に検索を行った。実験部位はできるだけ単純化するために頭蓋骨としたが、この部にはほとんど骨髄組織が無く、今までの歯根膜を使った実験系で見られたような、破骨細胞は存在しない。その結果、温度と機械的刺激との共通点は今のところ見出せておらず、今後は実験系を見直し、大腿骨や歯根膜に対する熱刺激を使用するモデルを検討する。本研究の目的は、従来確立されていなかった、歯根膜に対する力学的応力に対する組織応答検索のための動物実験モデルを確立し、細胞レベルでのたんぱく質の発現やアポトーシスを詳細に検索すること、および咬合圧という物理的ストレスを生化学的な信号に変換する歯根膜細胞の観察を通して、メカノレセプターの存在とそれを担う細胞を推定することの2点であった。
網羅的蛋白質解析を利用した膵胆道癌早期診断法の確立とその分子機構解明に向けた挑戦

膵癌組織の癌部、非癌部を2次元電気泳動により比較、癌高発現蛋白として5種類を同定。Cofilin-1は9sample全てで高発現であった。組織免疫染色ではCofilin-1発現は59例の膵癌中44例に高発現を認め、有意に血行性転移が多かった。3人の膵癌切除標本より得られた癌部・非癌部のprotein profileを2-DE(アガロース2次元電気泳動法)及び2D-DIGE(蛍光ディファレンシャル2次元電気泳動法)を行い、それぞれのcaseにて比較検討した。その中で、3症例すべてのcaseにおいて、癌部で非癌部より高発現している蛋白を選び、それらの候補蛋白のgelを切り出し、ゲル内消化を行い、最後に精製・同定を行ったところ候補蛋白が36spot認められた。次に、2-DEで得られた結果の再現性を確認する上で、さらに他の7症例の癌部・非癌部におけるそれらの同定された蛋白発現をWestern blotで確認した。すると、その内、5種類の蛋白が8割以上の症例で癌部の高発現を確認した。その1つの蛋白であるCofilin-1については近年、いくつかの癌種で浸潤や遠隔巣への転移への関わりが報告されている。さらに、膵癌細胞においてはZebrafishを用いた研究によりCofilin pathwayの中でCofilinのリン酸化に関与するLIM kinaseを抑えることにより血管新生および転移に対する抑制効果を示す報告も認められてきている。そこでまず、候補蛋白であるCofilinの癌組織における局在と発現の強度を免疫組織学的に検討し、これらの候補蛋白と臨床病理学的因子との相関を解析し、また転移形式における蛋白の発現差異(局在・強度)があるかを検討した。59例の膵癌切除標本において染色強度Weak 15例、Strong 44例では年齢、性別、分化度、リンパ節転移の有無では有意差を認めないものの、Strong例では有意にstage IV症例が多く、術後の再発形式ではStrong症例ではWeak症例と比較し有意に遠隔転移の率が高かった。1)2-DEによって見出された癌高発現候補蛋白cofilin-1の血中への逸脱による血管内に循環する抗原(候補蛋白)、その抗原に対する自己免疫反応により生成される自己抗体、さらにはそれらの複合体(抗原抗体複合体)をdetectするsandwich ELISAの系をそれぞれ作製し、その測定値が再現性のあるものかを検討した。まず最初に試みた抗原に対するELISA測定系では、再現性の得られる測定系は確立出来ず、自己抗体に対する測定系でも安定した値は得られなかった。それに対し抗原抗体複合体物質に対するsandwich ELISAでは、安定した再現性が得られ実験系を確立した。2)血中の候補蛋白関連物質の存在量測定および血中マーカーとしての感度・特異度の検定。まず候補蛋白関連物質cofilin-1の膵癌と健常人においての測定値の違いを検討した。すると、膵炎患者検体を含めた3群間において、膵癌では健常人、膵炎と比較し、cofilin-1の血清中免疫複合体値は有意に高値であった。さらに、膵癌の進行度が進むにつれて、血清値は上昇し、Kaplan-Meier解析では中央値で高低値群の2群に分けると、高値群では有意に予後不良であった(p=0.039)。昨年度の研究結果に関しては、同定された候補蛋白の同定、validation、および血中の免疫複合体の測定系の確立等、予定されていた研究はおおむね順調に進展していると考えられる。さらにcofilin蛋白の免疫染色法による膵癌組織における蛋白発現の強弱と臨床病理学的特徴との相関を解析した。研究の進捗状況としては現在、膵癌細胞株を用いたcofilin蛋白の機能解析を行っているところである。今後、さらに今年度の研究を計画通り発展させていきたい。さらに外部への情報、成果の発信については、昨年度に癌学会の口演発表を含む2件行った。論文投稿に関しては今年中を目安に海外のjournalへの投稿を予定している。2)組織免疫染色ではCofilin-1発現は59例の膵癌中44例(75%)に高発現を認め、有意に血行性転移が高かった(P=0.0083)。3)2種類の膵癌細胞株でCofilin-1発現を特異的siRNAにより抑制すると、有意に遊走能の低下を認めた。さらに、培養上清中のCofilin-1の発現を確認した。4)Cofilin-1の血中への逸脱による血管内に循環する抗原(候補蛋白)、その抗原に対する自己抗体、さらにはそれらの複合体(抗原抗体複合体:Immune-complex(IC))を検出するsandwichELISAの系をそれぞれ作製し、その測定値が再現性のあるものかを検討した。最初に試みた抗原に対するELISA測定系では、再現性の得られる測定系は確立出来ず、自己抗体に対する測定系でも安定した値は得られなかった。それに対しICに対するELISAでは、安定した再現性が得られ実験系を確立した。5)臨床応用に重要な膵癌の血清biomarkerの確立として、血中のCofilin-1 ICの存在量測定および血中マーカーとしての感度・特異度の検定を行った。まずcofilin-1の膵癌と非癌サンプル(健常人および膵炎)においての測定値の違いを検討した。すると、膵炎患者検体を含めた3群間において、膵癌では健常人、膵炎と比較し、cofilin-1の血清中IC値は有意に高値であった。

さらに、膵癌の進行度が進むにつれて、血清IC値は上昇し、Kaplan-Meier解析では中央値で高低値群の2群に分けると、高値群では有意に予後不良であった(p=0.039)。膵癌組織の癌部、非癌部を2次元電気泳動により比較、癌高発現蛋白として5種類を同定。Cofilin-1は9sample全てで高発現であった。組織免疫染色ではCofilin-1発現は59例の膵癌中44例に高発現を認め、有意に血行性転移が多かった。昨年度の実験に関しては、主に候補蛋白の同定、validation、さらにcofilin蛋白の免疫染色法による膵癌組織における蛋白発現の強弱と臨床病理学的特徴との相関を解析した。研究の進捗状況としては候補蛋白の選定、免疫染色、および今年度の主要な実権系である血中の免疫複合体の測定系の確立は既に行っており、予定されていた研究や準備が行われているため、おおむね順調に進展していると考えられる。今後、さらに今年度、次年度を通じ、研究を計画通り発展させていきたい。さらに免疫染色に関しては現在の症例数からさらに増やし、臨床での薬剤耐性との関連も追加検討していく予定である。外部への情報、成果の発信については、現在まで少しずつ積み上げてきたデーターをまとめ、今年の日本消化器病学会をはじめとして、様々な学会報告を開始していく予定である。論文投稿に関しては今年度の終盤を目安に海外のjournalへ投稿を予定している。1)原発巣血管内循環遠隔巣に対する転移メカニズムへのアプローチ。現在有望な候補と思われるCofilinについては近年、いくつかの癌種で浸潤や遠隔巣への転移への関わりが報告されている。さらに、膵癌細胞においてはZebrafishを用いた研究によりCofilin pathwayの中でCofilinのリン酸化に関与するLIM kinaseを抑えることにより血管新生および転移に対する抑制効果を示す報告も認められてきている。これらの背景をもとに膵癌細胞株を用いて特異的siRNAおよびLIM kinaseの阻害剤を用いることでCofilinの膵癌細胞におけるin vitroでの機能解析(invasion assay, soft agar assay, pancreatosphere assay等)を行い、浸潤、転移巣への生着、転移巣でのself-renewal capacityおよび増殖能についての検討を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科1)癌高発現候補蛋白(抗原)に対する自己免疫反応により生成される自己抗体、さらにはそれらの複合体(抗原抗体複合体)をdetectするsandwichELISAの系を作製し、その測定値が再現性のあるものかを確認する。2)血中の候補蛋白関連物質の存在量測定および血中マーカーとしての感度・特異度の検定。まず候補蛋白関連物質の膵癌と健常人においての測定値の違いを検討する。さらに、膵炎患者検体を含めた3群間において検討し、膵癌特異的なマーカーとして感度、特異度について注目していく。3)血中の候補蛋白関連物質測定値と臨床病理学的因子、転移形式、予後との関連についての検討。
細胞質ダイニンが一方向性を獲得するための要因の決定

本研究課題は,高等生物の細胞内において小胞の輸送,細胞分裂,細胞運動などの種々の事象に関与している生体分子モーター,細胞質ダイニンが1方向性を獲得する機構を明らかにすることを目的としている.前年度までの研究から,拡散的な挙動を示すダイニンが一方向的な運動を行う要因として,負荷の存在による力学的摂動が重要な役割を果たしている可能性が示唆されていた.そこで,本年度では,細胞質ダイニンに内在する力学応答性を光ピンセットによって直接計測する実験を行った.また,合わせてダイニンの挙動と分子の形態の間の関係を電子顕微鏡によつて観察し,力学的摂動がダイニン分子に及ぼす影響について,構造的見地からも研究を行った.【細胞質ダイニンに対する力学的摂動の効果の評価】ダイニン分子のレール(微小管)に対する結合親和性が力学的摂動によって変化するかどうか,光ピンセットを用いて観察した.具体的には,ダイニン分子が結合したビーズをトラップし,微小管上で瞬間的に負荷をかけた際の破断時間を測定し,負荷の大きさと破断時間の関係を見た.その結果,ダイニンの結合時間には負荷の方向に対する依存性(Ratchet-like property)が存在し,同時に負荷が大きくなるほど結合が強くなる性質(Catch-bond mechanism)が内在していることがわかり,この性質を利用して負荷依存的な一方向性の顕在化が起こっている可能性が示唆された.【細胞質ダイニンの形態と運動様式の関連に対する構造的アプローチ】ダイニンの振る舞いと形態の間の関係を探るために,種々のヌクレオチド条件におけるダイニンの形態の違いを電子顕微鏡で観察した.その結果,微小管との結合親和性に応じてダイニンが異なる形態をとつていることが明らかとなり,ダイニンは無負荷状態では弱結合状態に特異的な形態にトラップされ,拡散的な振る舞いに陥っているという自己阻害モデルを確立することが出来た.(抄録なし)哺乳類細胞質ダイニンが一方向性の運動を示す要因を探るため,ダイニンの一方向性の獲得においては,荷物となる物質の結合や負荷の存在が必要であるという仮説を立て,DNAの自己集合を利用した構造体(DNA-Origami:直径6nm,長さ410nmのチューブ構造)を負荷としてダイニンに結合させた際の運動を観察した.その結果,DNA-Origamiを荷物として結合させたダイニンは一方向性の運動を示し,ダイニンが運動の一方向性を獲得する要因として負荷が重要であることが示された.上記の結果を受けて,ダイニン分子に対して負荷がどのような影響を与えているのかを調べるために,光ピンセットによってダイニン分子に負荷を与えた際の微小管との結合力の変化を調べた.これは現在進行中の実験および解析であるが,ダイニンモーターヘッドが負荷が強くなるほど微小管から解離しにくくなる傾向が既に観察されている.通常のタンパク質間相互作用においては,外部負荷の存在は解離を促進する方向に働くのに対し,ダイニンが示すこの特異な負荷応答性は,負荷の存在に応じて運動の様式を拡散から一方向性のものへ変化させるダイニンの運動機構の理解に直結するものと予想される.また,全長の細胞質ダイニンに対する負荷の影響の観察と並行して,組換え体の発現技術を用いた運動様式の変化についても実験を行った.現在までに,モータードメイン以外のフレキシブルな部分が長くなるほど運動が拡散的になるという傾向が観察されており,頭部間に働く張力が運動に影響を与えるという可能性を示唆している.前年度においては,細胞質ダイニンが一方向に運動を開始するためにはモーター分子に対して働く負荷の存在が重要な役割を果たしていることが明らかとされた.この結果を受け,24年度においては負荷によってダイニン分子にどのような影響が及ぼされているのかを調べるため,光ピンセットを用いて様々な溶液条件において,負荷がかかった際のダイニン分子の微小管からの破断現象を観察した.その結果,負荷の存在によってダイニン分子のATP加水分解サイクルにおけるリン酸の放出が加速してされている可能性が示唆された.また,電子顕微鏡を用いた観察によって,無負荷状態の細胞質ダイニンは2つのモータードメインが重なりあった構造をとっており,さらにこれはリン酸状態に特異的な構造であることも明らかとなった.上記の結果から,ダイニンは無負荷状態ではATP加水分解サイクル中のリン酸状態にトラップされるような形になっているため一方向に連続的に運動することができず,負荷が作用することでリン酸状態から脱出してサイクルの回転が促進されるために一方向への運動が現出するという形で,"負荷による一方向性の現出"という描像をより具体的にすることができた.これは,哺乳類の細胞質ダイニンのメカニズムおよび先行研究における細胞内・細胞外での観察結果の乖離という問題に対しても大きな理解の前進をもたらす結果であると言える.本研究課題は,高等生物の細胞内において小胞の輸送,細胞分裂,細胞運動などの種々の事象に関与している生体分子モーター,細胞質ダイニンが1方向性を獲得する機構を明らかにすることを目的としている.前年度までの研究から,拡散的な挙動を示すダイニンが一方向的な運動を行う要因として,負荷の存在による力学的摂動が重要な役割を果たしている可能性が示唆されていた.そこで,本年度では,細胞質ダイニンに内在する力学応答性を光ピンセットによって直接計測する実験を行った.また,合わせてダイニンの挙動と分子の形態の間の関係を電子顕微鏡によつて観察し,力学的摂動がダイニン分子に及ぼす影響について,構造的見地からも研究を行った.【細胞質ダイニンに対する力学的摂動の効果の評価】

ダイニン分子のレール(微小管)に対する結合親和性が力学的摂動によって変化するかどうか,光ピンセットを用いて観察した.具体的には,ダイニン分子が結合したビーズをトラップし,微小管上で瞬間的に負荷をかけた際の破断時間を測定し,負荷の大きさと破断時間の関係を見た.その結果,ダイニンの結合時間には負荷の方向に対する依存性(Ratchet-like property)が存在し,同時に負荷が大きくなるほど結合が強くなる性質(Catch-bond mechanism)が内在していることがわかり,この性質を利用して負荷依存的な一方向性の顕在化が起こっている可能性が示唆された.【細胞質ダイニンの形態と運動様式の関連に対する構造的アプローチ】ダイニンの振る舞いと形態の間の関係を探るために,種々のヌクレオチド条件におけるダイニンの形態の違いを電子顕微鏡で観察した.その結果,微小管との結合親和性に応じてダイニンが異なる形態をとつていることが明らかとなり,ダイニンは無負荷状態では弱結合状態に特異的な形態にトラップされ,拡散的な振る舞いに陥っているという自己阻害モデルを確立することが出来た.細胞質ダイニンが運動の一方向性を獲得するためには外部負荷が必要であることがほぼ確定的であることが示されたほか,負荷による微小管との結合力の増加という具体的なメカニズムから一方向性の獲得という現象を説明できる可能性の示唆という段階まで初年度で到達できたことから,研究は当初の計画以上に進展していると言える.細胞質ダイニンの運動様式の変化という事象に関して整合的な描像を組み立てることができ,雑誌論文への投稿準備という段階まで到達することができ,"細胞質ダイニンが一方向性を獲得するための要因の決定"という研究課題に対して,課題年度内における解決の見通しを立てることができたため.ダイニンへの負荷の大きさと微小管との結合力の関係に関する実験を更にすすめ,定量的な関係を得ることを目指す.また,得られた関係を用いることで,ダイニンの負荷依存的な一方向性の運動の現出という事象に関する定量的な議論を構築し,シミュレーションも併用することで,最終的にはダイニンの運動メカニズム全体に関する統一的な描像を得ることを目標とする.これまでに得られた一分子運動観察,光ピンセット,電顕による構造解析などの結果をさらに精緻化すると共に,確立したモデルに基づいた計算機シミュレーションも援用することで,得られたモデルの妥当性をさらに強固なものとしていく.(抄録なし)
TNF受容体関連周期性疾患の疾患モデル細胞・モデルマウス作成と病態解析

本研究では1型TNF受容体の遺伝子変異により生じるTNF受容体関連周期性症候群(TNF-receptor associated periodic syndrome; TRAPS)の病態解明を行ない、新規治療戦略の探索を行なう。本研究ではゲノム編集技術を用いてTRAPS変異を有するヒト不死化細胞株およびTRAPS変異マウスを作成する。同疾患モデル細胞・マウスを用いて、炎症惹起因子・小胞体ストレス・炎症反応などTRAPSの病態解析を行なう。本研究はTRAPSのみならずTNF-TNFRシグナルを介する種々の炎症性疾患および他の自己炎症性疾患の病態理解や新規治療戦略の展開につながるものと考える。
アルツハイマー病モデルサル、脳におけるヒト変異型ＡＰＰ強制発現と老人斑形成

サル類のアルツハイマー病関連病変は形成に20年以上を要するため、人為的作製モデルが必要である。そこでヒトでの発症に強く関わる遺伝子(スウェーデン型APP)をウイルスベクターに組換え、3ヶ月間マウス脳に強制的に発現させたところ、ベクター投与群は対照群に比べ、導入遺伝子産物であるアミロイドβ(Aβ)1ー40が多く検出された。この組換えウイルスベクターは、確かにアルツハイマー病の原因物質であるAβを強制的に作る能力を持っているので、サルに接種して効果を確認しているところである。アルツハイマー病(AD)モデル動物としての高齢サルの問題点を克服するため、ヒトの家族性ADの原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク(APP)をウイルスベクターで組み換えたコンストラクトをサルの脳内に接種し、強制発現させ、老人斑が形成されるようになることを目的とする。実験的かつ計画的に、明確な時間内にサル類でAD関連病変をつくれるようになれば、AD研究に大きく貢献できる。昨年度は脳組織へ導入するアデノ随伴ウイルス(AAV)-2(AAV-2)ベクターに組換える目的遺伝子を作製した。先ず病態を引き起こすためのswAPP(変異型APP、病因遺伝子)をFLAG(標識遺伝子)と結合させた。さらにAAV-2ベクターへ導入するために必要なAAV-2 in verted terminal repeat (AAV-2への導入遺伝子)とswAPPおよびFLAGが結合したコンストラクトを作製した。そして、これら3種の遺伝子が結合したコンストラクトを含むプラスミドを、大腸菌の多量の培養によって増殖させ、目的遺伝子を搭載したAAV-2を作製するために必要十分なプラスミドを精製した(Qiagen, Gigakit)。動物の体内に接種するために必要な量の飴V-2を産生するためには、1)上記で作製した遺伝子を持つプラスミド、2)AAV-2の骨格を形成する遺伝子(AAV-2 rep,AAV-2 cap)を持つプラスミド、3)AAV-2の複製に関わるAdeno virusの遺伝子(adeno E2A,adeno E4)を持つプラスミドが、それぞれ多量に必要で、それらをAdeno virus由来遺伝子(Adeno E1A, Adeno E1B)が導入されたHEK293細胞(AAV293細胞:ヒト胎児腎由来)へトランスフェクトすると、AAV293細胞内で目的遺伝子を搭載したAAV-2が完成する。1)の多量のプラスミド精製はすでに行われたので、次年度は2)と3)の多量のプラスミド精製を行う。またこれらのトランスフェクトからAAV-2の産生はその分野の専門家である国立精神・神経医療研究センター研究所の岡田尚巳博士の協力を得る。アデノ随伴ウイルス(AAV)-2にアルツハイマー病関連遺伝子のスウェーデン型(sw)アミロイド前駆体蛋白(APP)(swAPP)を組換え、HEK293細胞へのIn vitro感染を行ったところ、適切な導入効果が得られなかった。そこで他の血清型であるAAV-1を元にしてswAPPと人工タグ蛋白であるFLAGを組換え、コンポーネントを作り直した。HEK293細胞に導入した結果、細胞抽出蛋白を用いたウェスタンブロットでAPPの上昇、swAPPとFLAGの発現を確認した。また培養上清でELISAを行いswAPPからの分泌産生物であるアミロイドβ蛋白(Aβ)の分子種、Aβ40およびAβ42の上昇が認められた。新生仔および成齢マウスへの脳内接種を試み、ともに3ヶ月後に実験死とした。脳に肉眼的な変化はなかった。ウェスタンブロットでコントロール群に対して実験群はAPPの上昇とFLAGの発現を確認した。一方、両群ともにswAPPの明確なバンドは得られなかった。摘出蛋白を可溶および不溶分画にわけてELISAによるAβ40、Aβ42およびoligomer Aβを計測したところ、コントロール群に対して実験群は可溶分画のAβ40、Aβ42の上昇が見られたが、可溶分画のoligomer Aβ、不溶分画のすべてのAβ分子種に両群の差は見られなかった。PFA固定パラフィン包埋材料を用いた免疫染色で、コントロール群に対して実験群は、多数のAβ40、Aβ42陽性神経細胞が見られた。APPの陽性像に両群の差は見られず、swAPPおよびFLAGは陽性像が見られなかった。免疫染色で導入遺伝子産物であるswAPPとFLAGが見られなかったのは、組織材料のプロセスで変性した蛋白質に抗体の反応しなかったためと思われるが、ウェスタンブロットでFLAGが確認できたことにより、動物への導入は成功したと考えた。変異型アミロイド前駆体タンパク(swAPP)とタグタンパクのFLAGを組換えたAAVを作製した。当初、血清型はAAV-2を予定していたが、神経系全体への親和性の良いAAV-1への変更を行った。1)swAPP+FLAG

遺伝子を持つプラスミド、2)AAV-1の骨格遺伝子(AAV-1 rep, AAV-1 cap)を持つプラスミド、3)AAVの複製に関わるAdeno virusの遺伝子(adeno E2A, adeno E4)を持つプラスミド、これらを多量に培養、さらにAdeno virus由来遺伝子(Adeno E1A, Adeno E1B)が導入されたHEK293細胞(ヒト胎児腎由来)へトランスフェクトし、swAPP+FLAG+AAV-1が完成した。swAPP+FLAG+AAV-1を乳のみマウス10匹、PBSを10匹に接種して、3ヶ月後に解剖した。各群5例を組織学的検索用としパラフィン切片を作製、5匹をタンパク質の検出用とし、可溶性分画と不溶性分画とに分けて抽出した。パラフィン切片を用いて、抗APP抗体、抗swAPP抗体および抗アミロイドβタンパク(Aβ)抗体の免疫染色を行ったが両軍の間に差は無かった。swAPP+FLAG+AAV-1が接種された群に抗FLAG抗体の陽性像は見られなかった。免疫染色と同じ各抗体を用いたウェスタンブロットでも両群の間には差が見られず、swAPP+FLAG+AAV-1接種群に抗FLAG抗体の陽性像が確認できなかった。Aβの分子種、Aβ40およびAβ42に対するELISAを行ったが、両群の間には差が無かった。接種法や評価法を含めて、再検討しているところである。昨年度、変異型アミロイド前駆体タンパク(swAPP)とタグであるFLAGを組換えたアデノ随伴ウイルス-1(AAV-1)、swAPP+FLAG+AAV-1を作製した。HEK293細胞へのトランスフェクトし、感染性と目的の産物を確認したが、マウスへの脳内接種では目的の産物が確認できなかった。今年度は接種する力価を上げ、新生子マウス各群5匹に3X10Λ12/ml swAPP+FLAG+AAV-1、5X10Λ12/ml swAPP+FLAG+AAV-1、PBSを各1μl接種した。さらに5週のマウス各群5匹に5X10Λ12/ml swAPP+FLAG+AAV-1、PBSを10μl脳定位固定装置で接種した。3か月後に安楽死とし、脳を摘出、一部は可溶性分画と不溶性分画とに分けてタンパクを抽出、他の一部はパラフィン切片を作製した。抗FLAG抗体、抗APP抗体、抗swAPP抗体および抗アミロイドβタンパク(Aβ)抗体に対するウェスタンブロットと免疫染色、Aβに対するELISAを行った。5X10Λ12/ml接種された群ではウェスタンブロットで抗FLAG抗体に対する特異バンドと免疫染色で神経細胞一部のアストログリアに陽性像を認めた。3X10Λ12/ml接種された群では、5X10Λ12/ml群よりも弱い抗FLAG抗体に対するウェスタンブロットの陽性バンド、少数の免疫染色陽性像を認めた。抗APP抗体の陽性像は各群、差はなかった。抗Aβ抗体および抗swAPP抗体では陽性像は見られなかった。FLAG陽性細胞には目的の遺伝子が導入できたと考えられた。ELISAでは5X10Λ12/ml群で高濃度のAβが検出された。カニクイザル各群3例の脳幹部に5X10Λ12/