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カプサイシンによる角膜混濁の発現 機構解明に関する薬理学的研究

カプサイシンはサブスタンスPを伝達物質とする知覚一次ニューロンを破壊することが知られている。新生仔マウスへのカプサイシンのたった1回の皮下注射によって、比較的長い潜時のあとに高率に混濁を含む角膜の変化が発現したるこの角膜の混濁はカプサイシンの投与後約1カ月間は徐々に進行増悪し、その後しだいに軽減して6カ月後には高用量投与群(50-100mg/kg)でも約50%のマウスにしか認められなくなる。同様な角膜混濁はカプサイシンを新生仔ラットに投与した場合にも認められた。このようなカプサイシンによる角膜の混濁は三又神経の破壊によって発現する可能性が示唆された。このカプサイシンのマウスへの皮下注射によっておこる角膜混濁に対する化学的交感神経切除の影響を観察した。生後1および2日目あるいは14および15日目に6ヒドロキシドパミン(60HDA)を皮下注射するとカプサイシンによる角膜の混濁は著明に抑制された。この抑制効果はカプサイシンの後に60HDAを与えても観察された。60HDAの脳室内投与は一時的かつ軽度な抑制しか示さなかった。交感神経を強力に抑制するDSP4によっても60HDAの抑制効果と似た抑制を示した。頭部組織中のカプサイシン濃度は60HDA処置によって変化しなかった。前眼部のサブスタンスP量はカプサイシンの投与量に依存して減少した。新生仔への60HDA投与によって、カプサイシンによるサブスタンスP減少を抑制したが、この60HDAの効果は混濁発現を抑制する作用を説明できるほど著明ではなかった。眼球内ノルエピネフリン量は60HDA処置により減少したがカプサイシンによっては減少しなかった。これらの結果からカプサイシンによる角膜混濁の発現は末梢での交感神経機能の低下により著しく抑えられることが明らかとなった。マウスに赤トウガラシの辛味成分であるカプサイシンを1回皮下注射すると,比較的長い潜時の後に角膜の混濁が発現する.本年度の研究はこのカプサイシンによる角膜混濁の発現に及ぼす6ーヒドロキシドパミンによる化学的交感神経切除の影響を観察した. ddYマウスの生後1日目と2日目に6ーヒドロキシドパミン100mg/kgを皮下注射し, 2日目の5時間後にカプサイシンを投与した.カプサイシンの単独投与群では投与23日目に混濁の発現率は100%に達した.混濁強度は平均1.8を50日以上維持した. 6ーヒドロキシドパミンの併用群では,角膜混濁の発現率は約20%で,その強度も著しく抑制した.カプサイシン投与2ヵ月後の前眼部のサブスタンスP量は,カプサイシンの投与量に依存して減少していた.6ーヒドロキシドパミンとの併用群でもサブスタンスP量は減少したが,カプサイシン単独投与群ほどではなかった.6ーヒドロキシドパミンとカプサイシン50mg/kgの併用群では,前眼部のサブスタンスP量が正常の26%に減少しているにもかかわらず角膜の混濁はカプサイシン12.5mg/kg単独投与群(サブスタンスP量77%)よりも軽度であった.また6ーヒドロキシドパミンを脳室内に投与した群では,上記の皮下注射した群と異なり角膜混濁の抑制はほとんど発現しなかった.

このようにカプサイシンの皮下注射によって発現する角膜の混濁はサブスタンスPを含有する神経が変性したために起こると考えられるが,化学的交感神経切除によってノルエピネフリンを同時に減少させると混濁が軽減されることが明らかとなった.以上のことからカプサイシンによる角膜混濁の発現にはサブスタンスPを含有する求心性一次ニューロンの機能低下と,これに伴う交感神経の相対的機能亢進が大きく関与しているものと考えられる.カプサイシンは細い求心性一次ニューロンを変性させることが知られているが、われわれはこのカプサイシンをマウスやラットに皮下注射することによって、角膜に混濁が発現することを報告した。本年度の研究では、このカプサイシンによる角膜混濁に及ぼす化学的交感神経切除の影響についてマウスを用いて観察した。交感神経終末を変性させることが知られている6ヒドロキシドパミン(6OHDA)を生後1日および2日目のマウスに皮下注射し、その5時間後にカプサイシンを与えると角膜混濁の発現は著明に抑制された。また生後14日および15日目に6OHDAを投与し、16日目にカプサイシンを与えたマウスでも混濁は明らかに抑制された。この抑制効果はカプサイシンを投与したあとに60HDAを与えた場合にも認められた。しかし6OHDAを脳室内に投与し中枢神経内のカテコールアミンを減少させたマウスでは、混濁の抑制は一時的で軽度であった。6OHDAと同様に交感神経終末を変性させるDSP4の前投与によってもカプサイシンによる角膜混濁は抑制された。頭部組織中のカプサイシン濃度は6OHDA処置では変化なかった。前眼部のサブスタンスP量はカプサイシンの投与量に依存して減少した。幼若時6OHDA投与はカプサイシンによるサブスタンスP量の低下を抑制した。しかしながら、角膜混濁は6OHDAを前処置しないカプサイシンの少量投与と比べて6OHDA処置後のカプサイシン大量投与の方が軽度であり、それに反して前眼部のサブスタンスP量はカプサイシン少量単独投与の方が低かった。このことより6OHDAによるサブスタンスP減少の抑制から角膜混濁の抑制効果を説明することはむつかしい。本研究から、カプサイシンによる角膜混濁は末梢での交感神経活性の低下により著しく抑えられることが示唆された。
幼児の認知スタイルの変容に関する教育心理学的保育実践研究

本研究は、2年間にわたって、(1)基本査定、(2)保育実践、(3)効果査定の三段階によって行われた。対象児は、広島地区では、保育園3園、幼稚園4園、関東地区では、幼稚園10園、九州地区では、保育園4園、幼稚園5園で、全体として保育園7園、幼稚園19園の合計26園であった。基本査定としては、ケ-ガン式MFFテストと各協力園自作のMFFテスト、さらに日常の保育場面の中の特定の活動や課題が実施された。基本査定の結果からタ-ゲット児としての衝動型児を選んだ。次いで数か月にわたって教師・保母による保育実践を行った。この期間、特定の保育実践の指導案に沿って保育が行われ、その都度、タ-ゲット児の行動と態度について観察記録がとられた。保育実践は、いわゆる実験室的なものではなくて、日常の保育場面であるが、タ-ゲット児に対しては特に認知スタイルの面で注目し、教師・保母が、(1)何故かかわったか、(2)どのようにかかわったか、(3)かかわった時どのような行動と態度をとったか等について観察記録をとった。なお保育実践の期間中、随時、タ-ゲット児に対しては上記(1)(2)(3)の視点から保育実践を行うと共に、時折教師・保母による行動設定や発達的特徴(所見)についても記録をとった。効果査定としては、両MFFテストを再度実施した。保育実践の効果を見るため、まず基本査定時と効果査定時のMFFテストの結果を比較した。各地区各園によって多少の差異はあるが、概して、タ-ゲット児の反応時間と誤数が減少し、熟慮的方向へ変化する傾向がみられた。また対象児は、落着いて物事に当る、話をきちんと聞く、物事をがまん強くやりとげる、自ら行動しようとする、などの行動や態度がみられた。全体的にみて、保育実践が認知スタイルの変容に促進的効果を及ぼすことがほぼ認められたといってよかろう。第1年次の本年度は、まず、第1段階として、本研究の対象児となる幼稚園と保育園の協力をとりつけることから始まった。この種の保育実践研究は一般に協力が得られにくい点があるが、幸い、研究代表者・各分担者と幼稚園や保育園との平素の研究上のつきあいから、全面的な協力をとりつけることができた。幼保合わせて広島地区では8園、長崎地区では4園、東日本地区では1園、鹿児島地区では2園、佐賀地区では2園、福岡地区では3園、宮崎地区では1園の計21園である。各分担者がそれぞれの地区で、協力園に幾度も足を運んで本研究の趣旨を話し、本研究の意義について現場の教諭・保母の理解を得るようにつとめ、また各分担者は現場の保育実践についての理解を深めるようにつとめた。この点は容易ならざるものであったが幸い両者の努力によってその目標に到達することができた。次いで、行動型や熟慮型のスタイルを持つ幼児を抽出する認知スタイルの基本査定の段階に移った。基本査定としては、(1)日常の保育場面の中の特定の活動・課題と、(2)ケーガン流および各協力園自作のMFFテストとの両者から成り立っている。現在、21園中20園は、ほぼ基本査定を終了し、上記(1)と(2)に基づく総合評定を行いつつある。新学年度の平成元年4月からはこの基本査定の結果に基づく保育実践を行う予定である。協力園の人事異動や学級編成の変動等もいくらか予想されているが、平成元年度(第2年次)の研究を推進していくのに支障は全くない。

なお、当初教師や保母の認知スタイルとの関係についても検討する予定であったが、この点について要因計画法による研究は、実施上やや困難があるので、それ以外の方法を考えて検討したいと考えている。第2年次は、第1年次に引き続き、(1)基本査定、(2)保育実践、(3)効果査定の三段階から構成された。対象児は、広島地区では、保育園3園、幼稚園4園、関東地区では、幼稚園10園、九州地区では、保育園4園、幼稚園5園で、全体として保育園7園、幼稚園19園の合計26園であった。まずケ-ガン式および各協力園自作のMFFテストと、日常の保育場面の中の特定の活動・課題から基本査定を行い、タ-ゲット児として衝動型児を選んだ。次いで数か月にわたって教師・保母による保育実践を行った。この期間、特定の保育実践の指導案に沿った保育が行われ、その都度、タ-ゲット児の行動・態度について観察・記録がとられた。保育実践は、いわゆる実験室的なものではなくて、日常の保育場面であるが、タ-ゲット児に対しては特に認知スタイルの面で注目し、教師・保母が(1)なぜかかわったか、(2)どのようにかかわったか、(3)かかわった時どのような行動・態度をとったか等について観察・記録をとった。なお保育実践の期間中、随時、タ-ゲット児に対しては上記(1)(2)(3)の視点から保育実践を行うと共に、時折教師・保母による行動評定や発達的特徴(所見)についても記録をとった。効果査定としては、両MFFテストを再度実施した。保育実践の効果を見るため、まず基本査定時と効果査定時のMFFテストの結果を比較した。各地区各園によって多少の差異はあるが、概してタ-ゲット児の反応時間と誤数が減少し、熟慮的方向へ変化する傾向がみられた。また子どもたちは、落着いて物事に当る、話をきちんと聞く、物事をがまん強くやりとげる、自ら行動しようとする、などの行動態度的特徴がみられた。これらのことから、保育実践の認知スタイルの変容に及ぼす効果はほぼ認められたといってよかろう。
最重安定元素ビスマスを基盤とした高放射線吸収性・高屈折性プラスチックの開発

最重安定元素であるビスマスは、高い原子屈折率と優れた放射線吸収性を有する。そのため、柔軟性と透明性を有する有機ポリマーと分子レベルで安定に複合することができれば、高屈折性・放射線吸収性などの特性を有する機能性透明材料の開発が期待できる。そこで、ビスマス含有ポリマーの合成を目的として以下の研究を行った。まず、ビスマス含有モノマーの選定としてビニル基、アリル基などのラジカル重合性官能基を有する化合物の合成を行った。各種化合物の合成を検討したところ、ジアリルアミノ基を有するビスマスージチオカルバメート錯体(モノマー1)と、トリスチリルビスマス(モノマー2)の二種類のモノマーが安定に単離できた。次にこれらのモノマーの重合性を評価した。今回は単独ラジカル重合とチオール類とのエンチオール反応に基づく重合の二種類を検討した。その結果、モノマー1はいずれの重合反応も進行しなかったが、モノマー2は良好な重合反応性を有することを見出した。さらに、モノマー2の重合によるフィルムの作成を検討したところ、透明なフィルムを得ることができた。得られたフィルムの屈折率を評価したところ、1.641.70程度の高い屈折率を有していた。すなわち、ビスマスとポリマーを複合することで、想定していた通りに高屈折率な光学材料を設計できることが明らかになった。現在、各種汎用ラジカル重合性モノマーとの共重合について検討中である。本材料が発展すれば、優れた高屈折性光学材料などを開発できる。平成30年度の研究成果は、そのための重要な基礎的知見を与えたものであり、今後の材料設計の大きな指針となった。計画していたモノマーの合成を行い、安定性と重合性の評価をすることができた。特に一部のモノマーは良好なラジカル重合性を有していたため、透明フィルムの作成にも成功した。このフィルムの屈折率を評価したところ、高い屈折率を示したので、ビスマスが屈折率の向上に寄与することを明らかにできた。以上のことから、ほとんど当初の計画通りに研究が推進できており、興味深い成果が得られるに至っていると判断できる。まずは、さらなるモノマー構造の最適化を行い、より屈折率の高い材料の開発を目指す。また、ビスマスモノマーと各種汎用モノマーとの共重合を行うことで、材料としての利用に欠かせない柔軟性や強度を有する透明フィルムを開発する。さらに、現在評価に至っていない放射線遮蔽性についても透過型のX線分析装置などを活用して評価を行い、材料としての価値をさらに明確にする予定である。購入を予定していた紫外可視分光光度計について、メーカーがキャンペーン中であったため申請時の見積よりも50万円程度安く購入できた。また、参加を予定していた第67回高分子討論会(札幌)が大地震により中止になったため旅費を使用できなかった。一年間の研究を通して、ポリマーフィルムを精密に成形するためには、用いる基板や型の材質についても詳細な検討が不可欠であるということが分かった。
線条体特異的NMDA受容体ノックアウトの運動学習への影響

線条体は、自発運動の調節に重要な脳部位である。線条体は、ほぼ全ての大脳皮質からグルタミン酸を伝達物質とする入力を受け、その情報を統合して大脳皮質の活動を調節すると考えられている。この情報の統合に重要な分子として、神経可塑性に重要であるN-methyl-D-aspartate型グルタミン酸受容体(NMDA受容体)がある。しかしながら、NMDA受容体は、神経系全体に発現しており、通常の遺伝子欠損マウスは致死であることから、線条体の運動機能におけるNMDA受容体の役割は明らかでは無い。このため、遺伝子組み換え酵素であるCre recombinaseを線条体優位に発現するGng7^<ncre>マウスと、N-methyl-D-aspartate受容体の必須サブユニットであるGluRζ1の遺伝子にCre recombinaseの認識配列であるloxP配列を組み込んだマウス(GluRζ1^<flox>マウス)を作成し交配させることで、線条体優位にNMDA受容体を欠損させることの出来るGluRζ1^<flox/flox>Gng7^<ncre>マウス(neostriatum-GluRζ1 KO mice)を得た。neostriatum-GluRζ1 KO miceのGluRζ1蛋白質は、免疫組織学的解析から、生後14日までに線条体優位に消失することが分かった。この変異体マウスは、新規環境下において大きな運動量の増加を示した。自発運動量の調節に重要なドーパミンの代謝及びドーパミンD1とD2受容体の発現は、明らかな減少を示しており、自発運動の上昇の原因とは考えられなかった。このため、線条体のNMDA受容体が、通常、新規環境下において運動量を抑制するために作動していると考えられた。この結果は、線条体のNMDA受容体が、新規な外的要因に対して行動を適切に調節するために重要である可能性を示唆する。このため、遺伝子組み換え酵素であるCre recombinaseを線条体優位に発現するGng7^<ncre>マウスと、N-methyl-D-aspartate受容体の必須サブユニットであるGluRζ1の遺伝子にCre recombinaseの認識配列であるloxP配列を組み込んだマウス(GluRζ1^<flox>マウス)を作成し交配させることで、線条体優位にNMDA受容体を欠損させることの出来るGluRζ1^<flox/flox>Gng7^<ncre>マウス(neostriatum GluRζ1 KO mice)を得た。この変異体マウスは、生後2週以降の体重増加が、コントロールマウスに比べて少なく、生後5週までに全ての変異体マウスが死亡した。この増加した死亡率は、餌を生後2週以降床に置いた飼育条件により改善され、全ての個体が生後5週以降まで生存した。この結果は、変異体マウスでは運動機能に異常がある可能性を示唆する。運動の調節に重要なドーパミンの代謝及びドーパミンD1とD2受容体の発現は、8割程度の保持されていたことから、ドーパミン伝達の過度の減少が、neostriatum-GluRζ1 KO miceの死亡率の増加を引き起こしたのでは無いと考えられた。これらの結果は、線条体のNMDA受容体が、線条体依存的な運動機能に重要であることを示唆している。

neostriatum-GluRζ1 KO miceのGluRζ1蛋白質は、免疫組織学的解析から、生後14日までに線条体優位に消失することが分かった。この変異体マウスは、新規環境下において大きな運動量の増加を示した。自発運動量の調節に重要なドーパミンの代謝及びドーパミンD1とD2受容体の発現は、明らかな減少を示しており、自発運動の上昇の原因とは考えられなかった。このため、線条体のNMDA受容体が、通常、新規環境下において運動量を抑制するために作動していると考えられた。この結果は、線条体のNMDA受容体が、新規な外的要因に対して行動を適切に調節するために重要である可能性を示唆する。
歯質-材料ナノ界面の解析とアミノ酸・リン酸・カルボン酸系モノマーの接着機能評価

機能性モノマーのPhenyl-P, 10-MDP, 4-METの人工アパタイト,歯質表面への作用を調べた。10-MDPはアパタイトに吸着し10-MDP分子が2分子向かい合った層状構造のカルシウム塩を形成した。4-METはカルシウム塩形成を認めず、その反応性は10-MDPより著しく劣る。また,象牙質との反応では10-MDPでは層状構造を形成したが, Phenyl-Pでは認められなかった。アミノ酸モノマーについての検討は十分ではないが,これらの結果よりモノマーの分子構造によって歯質との反応は様々であることが示唆された。機能性モノマーとアパタイトとの化学的相互作用を分子レベルで解析すべく、現在の市販歯質接着システムに含有されている機能性モノマーの内,10-MDPおよび4-METについて,アパタイト表面に対しどのように作用するかを検討した。アパタイト粉末と各種機能性モノマーをエタノールと水の混溶媒で反応させたものとエタノールのみの溶媒で一定時間反応させ、反応後の試料を遠心分離した後、エタノールで洗浄した。その後、沈殿した粉体を遠心分離で回収、乾燥後、X線回折(XRD)および固体核磁気共鳴(31P MAS NMR)を用いて分析した。すなわち、粉末XRDにより試料の結晶相の同定を,固体NMRにより試料の分子構造の解析を行った。その結果,10-MDPは反応初期でアパタイトに吸着し,10-MDPのカルシウム塩を形成することが明らかとなった。またその構造は10-MDP分子が2分子向かい合った層状構造をとることが示唆された。一方、4-METは10-MDPと同じ反応時間では、4-METのカルシウム塩の形成は認められなかった。4-METは10-MDP同様、アパタイト表面に強固に吸着することが明らかとなっている。しかしながら、今回の測定結果から、4-METの反応性は10-MDPに比べて著しく劣ることが示唆された。以上の結果は、臨床で用いられている10-MDPおよび4-MET含有市販歯質接着システムと歯質との反応性に共通するものである。このことから、機能性モノマーの基本特性は、他のモノマーや光増感剤などを含有した製品においても変わらず維持されていることが示唆された。本研究では機能性モノマーとアパタイトとの化学的相互作用を分子レベルで検討することで樹脂含浸層の形成メカニズムを明らかにするとともに,樹脂含浸層の超微細構造と接着耐久性との関連性についても検討した。平成20年度は,まず昨年度に引き続き市販歯質接着システムに含有されている機能性モノマーの内,Phenyl-Pおよび10-MDPを用い,歯質表面にどのように作用するか検討した。象牙質とエナメル質には,牛歯下顎切歯を用いた。試験片を15wt%の機能性モノマー溶液と反応させ,薄膜X線回折装置(RINT2500)で測定した。機能性モノマー溶液にエナメル質と象牙質の試験片を浸漬した場合,Phenyl-Pでは層状構造は認められなかったが,10-MDPは昨年度に行った合成アパタイト同様,象牙質との反応により層状の構造物を形成した。一方,エナメル質では層状構造の形成は認められず,単分子の層として吸着することが示唆された。このエナメル質と象牙質の違いから,機能性モノマーの反応は被着体最表面で起こるものであり,溶出したカルシウムイオン等により層状構造が形成されたのではないことが示唆された。また,15wt%の機能性モノマー溶液もエナメル質に塗布した場合は層状構造を形成しており,実際のプライマーのように歯面に塗布することにより,溶液に浸漬するよりも反応が進むことが明らかとなった。次に,アミノ酸系モノマーとしてグリシン系モノマー(N-acryloy Glycine),アスパラギン酸系モノマー(N-acryloyl aspartic acid)を合成し,プライマーとして象牙質接着効果を調べたところ,後者は前者より高い接着性能を示した。これらのモノマーはリン酸系モノマーと異なった挙動を示す可能性があるが,現在は合成での収率が不良で,今後合成経路を見直し大量合成して詳細な検討を行いたい。
安全性と至便性を兼ね備えた新しい排卵誘発法の確立に関する研究

不妊治療による多胎妊娠の発生を抑制し、同時に通院回数を短縮することを目的として、排卵誘発法を開発し、それらの効果と安全性および通院日数について、前方視的crossover法により検討した。F-G法とFSH低用量漸増療法(低用量法)を比較した。F-G法はFSH 150単位を連日投与し、卵胞11mmでGnRHに切り替えた。低用量法ではFSH 75単位を連日投与し適宜漸増した。F-G法と低用量法を比較すると、排卵率(88.9% vs 75.0%)、妊娠率(30.0% vs 25.0%)、発育卵胞数(1.8個vs 1.5個)は同等であり、卵胞発育に要した日数(8.2±1.6日vs 13.7±6.9日、p<0.05)と通院日数(8.8±1.3日vs 17.7±6.6日、p<0.01)ではF-G法が優れていた。2.自己注射によるFSH低用量漸増療法(低用量法)の検討低用量法の最大の欠点である長期通院を解消するため、PCOS 3症例を対象に、通院周期と自己注射周期を比較した。FSH投与日数は、通院周期が16.7±8.0日(平均±標準誤差)、自己注射周期が20.0±9.8日で、hCG投与日までの通院日数は、通院周期が17.7±8.0日、自己注射周期が6.0±1.0日であった(p=0.067)。自己注射は低用量法の普及に寄与すると考えられた。3.PCOSに対するクロミフェン-メトホルミン併用療法(Cl-Met)クロミフェン抵抗性のPCOS患者5例に、クロミフェン150mgの増量法(Cl増量法)とCl-Met法を検討した。Cl-Met法ではクロミッド^【○!R】150mgに加え、メルビン^【○!R】750mgをhCG投与日まで内服投与した。Cl増量法とCl-Met法の排卵率は25%、80%(全て単一卵胞)、妊娠率は0%、40%(すべて単胎)と、Cl-Met法の有用性が示唆された。排卵誘発法の副作用を軽減する排卵誘発法を開発し、不妊治療による多胎妊娠の発生を抑制することを目的として、今年度は多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)に対するFSH-GnRHパルス療法、ゴナドトロピンの自己注射法について検討した。メトホルミン療法については症例を集積中である。1.PCOSに対するFSH-GnRHパルス療法我々の開発したFSH-GnRH療法(F-G法)の効果と安全性および通院日数を、副作用防止効果が高いFSH低用量漸増療法(低用量法)と前方視的crossover法により比較した。F-G法は月経周期の5日目からFSH150単位を連日投与し、卵胞径が11mmに達した後にGnRHを20μg/2時聞でパルス状に皮下投与した。低用量法ではFSH75単位を連日投与し、2週間経過後にFSHの投与量を必要に応じ漸増した。

F-G法と低用量法を比較すると、排卵率(88.9%vs75.0%)、妊娠率30.0%vs25.0%、発育卵胞数(1.8個vs1.5個)は同等で、卵胞発育に要した日数(8.2±1.6日vs13.7±6.9日、P<0.05)と通院日数(8.8±1.3日vs17.7±6.6日、P<0.01)は、F-G法が低用量法に比べ短かった。F-G法は治療日数および通院日数の短い点が優れていると考えられた。2.自己注射による低用量漸増FSH療法の検討副作用の少ないFSH低用量漸増療法(低用量法)の最大の欠点である長期通院を解消するため、自己注射について検討した。PCOS 3症例を対象に、通院注射周期と自己注射周期をcross over法で各症例に1周期ずつ行った。rFSHを30G針付注射器を用いて皮下投与し、初期投与量を50単位として低用量法を行った。通院3周期、自己注射3周期の全周期排卵に至り、いずれの周期も単一卵胞発育であった。FSH投与日数は、通院注射周期が16.7±8.0日(平均±標準誤差)、自己注射周期が20.0±9.8日であり、hCG投与日までの通院日数は、通院注射周期が17.7±8.0日、自己注射周期が6.0±1.0日であった(P=0.067)。FSH製剤の自己注射は病院への通院日数が減ることから低用量法の普及に寄与すると考えられ、今後、導入に向けた検討を行う必要がある。排卵誘発法の副作用を軽減する排卵誘発法を開発し、不妊治療による多胎妊娠の発生を抑制することを目的として、今年度は多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)に対するメトホルミン療法について検討した。PCOSに対する排卵誘発では、ゴナドトロピン療法で副作用が起やすい。したがって、クロミフェンの奏功率をあげ、ゴナドトロピン療法への移行例を減らすことが治療戦略上の要点となる。クロミフェン療法の奏功率を上げる試みとして、近年、欧米でメトホルミンとの併用療法が行われ、高い排卵誘発効果が得られている。メトホルミンは糖尿病治療薬であり、糖代謝やインスリン抵抗性を改善する作用を持つことから、主としてインスリン抵抗性の強い肥満PCOS症例で効果があると考えられる。我々は日本産科婦人科学会の診断基準で診断し、クロミフェン100mgによる排卵誘発に対し2周期以上反応しなかったPCOS患者5例を対象として、クロミフェン150mgの増量法(増量法)とクロミフェン・メトホルミン併用療法(メトホルミン療法)を無作為前方視的なcrossover法で検討した。増量法では月経周期の5日目からクロミッド【○!R】150mgを5日間内服し、メトホルミン療法ではさらにメルビン【○!R】750mgを月経周期の5日目からhCG投与日まで内服した。対象患者5例のうち4例は肥満症例であった。増量法では4周期中1周期のみ排卵し、一方、メトホルミン療法では5周期中4周期(80%)が排卵し2周期で単胎妊娠が成立した。排卵は全て単一卵胞であった。また、メトホルミンによる消化器症状や低血糖などの副作用は認めなかった。以上から、日本においてもクロミフェン抵抗例に対してクロミフェン・メトホルミン併用療法が有用である可能性が示唆され、検討を続ける意義があると考えられる。
シリコン固相エピキシャル成長の基礎的研究

1.種々の非晶質シリコン膜の加熱による構造緩和過程の測定イオン注入、高真空分子線堆積、気相化学反応堆積法により作った非晶質膜に、種々の熱処理を加え、ラマン散乱スペクトルを測定し、そのTOフォノンピ-クの半値半幅から原子間結合角の変化を測定して構造緩和現象の目安とした。その結果、(a)構造緩和は熱処理温度に依存し、熱処理後の準平衡値までの変化は熱処理温度の高い方が早いが、平衡値自体は不純物を含まぬ非晶質Siの場合、ラマンスペクトルのTOフォノンピ-ク位置及びその半値半幅から見る限り試料による差は小さい。原子結合角結晶値(109゚)からの偏差は、初期値の11゚から、500580°Cアニ-ル後の準平衡状態では、78゚に減少した。(b)不純物を含まぬ非晶質Siの構造緩和の進行は、室温イオン注入で作った試料が最も早く、次いで低温イオン注入、高真空中の堆積法で作った試料の順に緩やかになった。(c)Geを高濃度に注入して作った非晶質Siでは、熱処理によるTOピ-クの移動は不純物を含まぬ場合とは逆向きに起こり、原子結合角も増大する傾向を示した。2.Siイオン注入による単結晶Si基板表面層の非晶質化過程の検討Si^+イオン注入時の基板温度を23ー200°Cの範囲で変えて作った非晶質Si試料、及び室温中でド-ズ量を1E141E15cm^<ー2>と変化して作った試料について、原子結合角の偏差を測定した。その結果、ド-ズ量を増加すると結合角偏差は6゚から11゚に増加し、また基板温度が低い程偏差角が大きく、これは非晶質層はその製作法により非晶質状態に差があることを示している。3.計算機シミュレ-ションシリコン単結晶の中に空格子点を導入したモデルをつくり、シミュレ-ションにより構造緩和の過程を調べた。原子間力としてTersoff Potentialを用い、216個のSi原子の中に16個の空格子点を導入したモデルを用い、空格子点がdivacancy及びquadravacancyを形成した場合の原子間結合角度の分布、動径分布関数を算出し、上記実験事実の解釈を試みたた。4.フォノン状態密度の計算不規則系の電子状態計算法として、Haydock等により考案されたリカ-ジョン法を応用したシリコンのフォノン状態密度を計算するプログラムを開発した。この結果を用いてラマン散乱スペクトルから非晶質の構造に関する知見を得る方法を検討した。本年度は、非晶質リシコン膜を加熱した時、結晶化に先んじて起こる構造緩和の過程を、ラマン散乱スペクトルの変化から光学的に測定した。測定試料は、単結晶Si及びSiO_2膜上に、マイクロ波プラズマ・デボジション法により非晶質Si膜を形成したもので、Geを不純物として10%まで混入した。形成温度は300°C前後である。

また、イオン注入法でSi単結晶基板に2.5×10^<16>ion/cm^2迄のGeを注入して、非晶質化とGeド-プを同時に行なった試料も用い、非晶質膜の形成法が構造緩和に及ぼす効果を調べた。10^<15>ion/cm^2迄のド-ズで、且つ160keVの高エネルギ-イオン注入試料では、構造緩和は、不純物を含まぬ非晶質Siについて従来報告されている振舞に近く、ラマンスペクトルのTOピ-クは、熱処理により初期値の460cm^<-1>から480cm^<-1>に移動し、スペクトルの半値幅は45→30cm^<-1>と減少した。これは非晶質構造の原子結合角θのばらつきΔθの減少に対応している。プラズマ法で作ったGeを含まぬ試料では、TOピ-クは初期値の470以下から480cm^<-1>前後に移動し、半値幅は40cm^<-1>以下へと減少し、上記とほぼ同様の挙動を示した。一方、Ge濃度の高い、50keV、2.5×10^<16>注入の試料では、TOピ-クのシフトや半値幅の変化は熱処理に対して変化が少なく、更に10%のGeを含むプラズマ形成膜ではTOピ-クは470→460cm^<-1>と逆向きにシフトし、半値幅は徐々に増加した。これらの結果は、非晶質Si膜の加熱による構造緩和が、非晶質膜中の不純物濃度に依存し、且つ非晶質膜の形成法にもよることを示している。計算の面では、ラマンスペクトル解析用に、フォノンスペクトルの計算プログラムを開発中である。リカ-ジョン法を用いボルン力を仮定してダイナミカルマトリックスを求め、結晶Siのフォノンスペクトルを計算し、プログラムの有効性を確認した。Si-Ge混晶、非晶質Si等のフォノンスペクトルの計算、結晶Siと非晶質Siの界面における電子状態の解析についても、現在進行中である。今年度は次の項目について研究を行った。1.形成法の異なる非晶質シリコン膜の加熱による構造緩和過程の測定。非晶質シリコン形成法としては、シリコン単結晶基板表面層へのSiイオン打ち込み法、超高真空分子線堆積法を用いた。構造緩和現象はラマン散乱スペクトルを測定し、そのTOフォノンピ-クの半値半幅から求められる原子間結合角の変化を目安とした。その結果次のことが分かった。(a)構造緩和はアニ-ル温度に依存し、準平衡値までの変化はアニ-ル温度の高い方が早いが、平衡値自体はラマンスペクトルのTOフォノンピ-ク位置及びその半値半幅から見る限り試料による差は小さい。原子結合角の結晶値(109°)からの偏差は、初期値の11°から、500580°Cアニ-ル後の準平衡状態では、78°に減少した。(b)構造緩和の進行は、室温イオン注入で作った非晶質シリコン試料が最も早く、次いで低温イオン注入、高真空中の堆積法で作った試料の順に緩やかになった。2.Siイオン注入による単結晶Si基板表面層の非晶質化過程の検討。イオン注入時の基板温度を23-200°Cの範囲で変えて作った非晶質Si試料、及び室温中でド-ズ量を1E141E15cm^<-2>と変化して作った試料について、原子結合角の偏差を測定した。その結果、ド-ズ量を増加すると結合次偏差は6°から11°に増加し、また基板温度が低い程偏差角が大きく、非晶質状態に差があることが分かった。3.計算シミュレ-ションシリコン単結晶の中に空格子点を導入したモデルをつくり、シミュレ-ションにより構造緩和の過程を調べた。
無ガンマグロブリン血症におけるT細胞機能の解析

無ガンマグロブリン血症およびT細胞機能不全をしめすaly/alymouseをもちいて、T細胞機能を検討した。Aly/alyマウスは、alyと名ずけられた遺伝子の突然変異により原発性免疫不全をしめすが、今だ不明な点が多い。始めに、本マウスの免疫担当臓器および無ガンマグロブリン血症の病態を明らかにするために、免疫組織学的検討をおこなった。本マウスの胸腺、脾臓、骨髄において、免疫産生細胞はわずかにIgM産生細胞を認めるのみで、IgA.IgG産生細胞は認められなかった。また胸腺においては皮質と髄質の境界が明らかでなく、脾臓においては瀘胞の形成が低下していた。血清のELISA解析で、IgA,,IgGは見られず、IgMは正常マウスの1/3程度であった。FACSによるリンパ球の解析ではT/B細胞比率は変化ないが、脾臓は小さく、全リンパ球数は低下していた。CD3およびPMAによりT細胞を刺激したがコロニー形成が著しく低下していた。また、DNP-HAS抗原刺激にも抗体産生は認められなかった。T細胞の産生するサイト力インをRT-PCR法で検討し、INFγ,IL-6,IL-5、TNFα,TGFβの産生に異常はなかったが、lL-2産生が欠如していた。FACS解析ではIL-2レセプターは正常であった。異常の結果から、本マウスにおいてIL-2産生の欠如が病因のひとつであることが明らかになった。次いでIL-2プローモーター領域の解析をおこなったが、異常は認められなかった。また本マウスのIL-2遺伝子解析およびシグナル伝達機構を継続して検討している。無ガンマグロブリン血症を示すaly/alyマウスに、抗原を投与して抗原提示からT/B細胞による抗体産生誘導のどのステップが障害されているかを検索して、aly/alyマウスにおけるグロブリン産生障害のメカニズムを明らかにすることを目的に実験を行った。1、免疫組織学的検討:cholera toxinとbovine serum albuminを経口投与後に脾臓および肝臓と腸管、唾液腺、肺のリンパ球を免疫組織学的に検討した結果、表面抗原の解析からT細胞(Thy-1^+、CD4^+CD8^+)が浸潤が主体で、B細胞や抗体産生細胞は少なかった。さらに抗原を足踵や腹腔内に投与したが同様の結果であった。2、FACS解析:免疫後、脾細胞を回収し、各T/B細胞の表面抗原マーカーを用いて、非免疫マウスと比較した処、T/B細胞比率、各マーカーの発現頻度に大差はみられなかった。3、リンパ球増殖能の検討:CD3とPNAの刺激により、Tymidineの取り込みを指標として、細胞増殖能を検索したところ、正常マウスとコロニー形成能が著しく弱く、増殖能の低下がみられた。4、サイトカイン産生のRT-PCRによる解析:免疫後の脾細胞および肺から回収したリンパ球を用いてIL1.IL2,IL3,IL4,IL5,IL6,TGFβの各サイトカイン産生能を検討した結果、免疫後においてもIL2-mRNA産生が著しく低下していた。我々は免疫グロブリン欠損症について、IgGおよびIgA産生を欠如しているaly/alyマウスを用いて検索を進めている。本研究でaly/alyマウス免疫グロブリンの産生障害には、T細胞におけるIL-2産生の欠如が病因として考えられることを明らかにした。1)抗原刺激に対するリンパ球の活性化のreconstruction実験本年度はリンパ球の活性化について、reconstruction実験により、aly/alyマウスのT細胞機能異常を検索した。

正常マウスT細胞およびマクロファージとの混合培養により、aly/alyマウスの抗体産生は一部回復した。またIL-2の添加により、抗体産生はさらに上昇した。しかし、正常マウスと比べると抗体産生量は有意に低下していた。このことから、aly/alyマウスにおいてはB細胞にも機能異常があることが考えられた。抗原刺激後にaly/alyマウス脾リンパ球からのTh1/Th2 cell分化について、刺激後リンパ球からmRNAを抽出しRT-PCRを行いcytokine profileを検討した結果、IL-2産生は低値で、Th1細胞への分化が乏しいことを明らかにした。しかしINFγの産生は正常マウスと同程度に認められた。表面抗原の解析でα/β,γ/δ陽性細胞の比率は正常マウスと同程度であった。
肺肥満細胞/好塩基球の増殖・分化と機能に関する研究

1.回虫抗原感作により作成した遅発型喘息モルモットモデルを用いて、漢方製剤である紫朴湯の効果を検討した。紫朴湯は遅発型喘息反応を抑えるとともに、肺組織中への肥満細胞/好塩基球や好酸球の集積を抑制した。また、肺組織中のTNF-αやIL-1α、β、GM-CSFの発現を免疫組織化学的に検討したところ、紫朴湯の前処理によりこれら炎症性サイトカインの発現が抑制された。2.気管支喘息患者から生検により肺組織を採取し、好酸球の集積に関与する接着因子の発現を検討した。対照疾患と比較して、好酸球,肥満細胞/好塩基球などの炎症細胞上のMac-1,LFA-1,VLA-4の発現が著明に上昇していた。それらのligandであるICAM-1,VCAM-1,E-selectinは血管内皮細胞や気道上皮細胞上に強く発現されていた。4.大気汚染による喘息の原因の一つとして注目されている二酸化窒素(NO2)2ppmをモルモットに12時間吸入させたところ、ヒスタミンに対する気道過敏反応が亢進し、ヒスタミン分解期酵素の一つであるHMTの気道組織における活性およびmRNAレベルが低下していた。このことから、NO2による気道過敏性の亢進は、少なくとも一部分、ヒスタミン代謝の障害によることが示唆された。5.気管支喘息および慢性気管支炎患者からの喀痰中細胞の分画と炎症性サイトカイン発現を検討した。その結果、気管支喘息では好酸球とGM-CSFが、慢性気管支炎では好中球とIL-8がそれぞれ主細胞と主サイトカインであり、サイトカイン発現の違いが浸潤細胞の違いをもたらすことが示唆された。6.気管支喘息や鼻ポリ-プでは基底膜肥厚や平滑筋肥大の所見が観察されるところから、これら細胞の増殖因子であるPDGFの発見を検討した。その結果、正常と比較してPDGF mRNAおよび蛋白レベルが上昇しており、その産生源は好酸球であることが分かった。1.回虫抗原感作により作成した遅発型喘息モルモットモデルを用いて、漢方製剤である柴朴湯の効果を検討した。柴朴湯は遅発型喘息反応を抑えるとともに、肺組織への肥満細胞/好塩基球や好酸球の集積を抑制した。また、肺組織中のTumor necrosis factor-αやInterleukin-1α、β、Graunlocyte-macrophagecolony stimulatingfactorの発現を免疫組織化学的に検討したところ、柴朴湯の前処理によりれら炎症性サイトカインの発現が抑制された。それらのligandであるICAN-1,VCAM-1,E-selectinは血管内皮細胞や気道上皮細胞上に強く発現されていた。柴朴湯は遅発型喘息反応を抑えるとともに、肺組織中への肥満細胞/好塩基球や好酸球の集積を抑制した。

また、肺組織中のTNF-αやIL-1α、β、GM-CSFの発現を免疫組織化学的に検討したところ、柴朴湯の前処理によりこれら炎症性サイトカインの発現が抑制された。2.気管支喘息患者から生検により肺組織を採取し、好酸球の集積に関与する接着因子の発現を検討した。対照疾患と比較して、好酸球,肥満細胞/好塩基球などの炎症細胞上のMac-1,LFA-1,VLA-4の発現が著明に上昇していた。それらのligandであるICAM-1,VCAM-1,E-selectinは血管内皮細胞や気道上皮細胞上に強く発現されていた。4.大気汚染による喘息の原因の一つとして注目されている二酸化窒素(NO2)2ppmをモルモットに12時間吸入させたところ、ヒスタミンに対する気道過敏反応が亢進し、ヒスタミン分解酵素の一つであるHMTの気道組織における活性およびmRNAレベルが低下していた。このことから、NO2による気道過敏性の亢進は、少なくとも一部分、ヒスタミン代謝の障害によることが示唆された。53.気管支喘息および慢性気管支炎患者からの喀痰中細胞の分画と炎症性サイトカイン発現を検討した。その結果、気管支喘息では好酸球とGM-CSFが、慢性気管支炎では好中球とIL-8がそれぞれ主細胞と主サイトカインであり、サイトカイン発現の違いが浸潤細胞の違いをもたらすことが示唆された。6.気管支喘息や鼻ポリ-プでは基底膜肥厚や平滑筋肥大の所見が観察されるところから、これら細胞の増殖因子であるPDGFの発現を検討した。その結果、正常と比較してPDGF mRNAおよび蛋白レベルが上昇しており、その産生源は好酸球であることが分かった。
沿岸域における有機炭素隔離能力を決定付けるキープロセスの解明

本研究は、大気中の二酸化炭素濃度上昇の緩衝作用を果たしている海洋沿岸域の有機炭素隔離機構において、隔離能力を決定付けるキープロセスと考えられる「有機炭素分解者の制約による溶存態有機物の残存仮説」を検証することを目的としている。長崎県沿岸域における溶存態有機炭素の濃度や質的情報、分布や分解性に関する情報は極めて限られているため、本年度はまずそれらの基礎的な情報を集めることを目標とした。有明海奥部海域において、2018年5月から8月にかけて採水し、溶存態有機炭素濃度、質的情報および分解性について調査を行った。溶存態有機炭素濃度は、他海域の報告値と比べて高かった。また、溶存態有機炭素濃度は月ごとに違いが見られ、5月は濃度が最も低く、7月および8月は同程度であった。質的な評価については、三次元励起蛍光スペクトル法を用いた。その結果、易分解性有機物とされるタンパク質(様物質)濃度は他海域での報告値と同程度であった。一方で、難分解性有機物とされるフミン酸(様物質)濃度は、調査期間を通じて他の海域の報告値よりも著しく高かった。このことは、有明海の水柱には難分解性有機物が大量に存在していることを示しており、炭素隔離能力が高い海域であることが示唆された。溶存態有機炭素の分解性に関しては、培養実験により評価した。その結果、数日中に分解される易分解性画分の有機炭素は、全有機炭素の2.8-7.6%程度であることが明らかとなった。この結果は、有明海の水柱中において難分解とされるフミン酸様物質が極めて高濃度で存在していることと整合的である。本研究の成果は、既に責任著者として論文を公表している(内野ら,印刷中,水環境学会誌)。本実験に必要となる長崎県沿岸域における溶存態有機炭素の濃度や質的情報、分布や分解性といった基礎的情報の収集に関しては、年度内に概ね完了し、その結果を論文として公表した点を考慮すると、研究自体の進展は概ね順調であると言える。しかし、当初予定していた有機炭素の分解に及ぼす栄養塩添加の影響を調べる培養実験を初年度は行うことができなかった。そのため、進捗状況を「やや遅れている」の区分に相当すると考えている。当初の計画通り、有機炭素の分解に及ぼす栄養塩添加の影響を調べる培養実験を、情報の揃った有明海の試料を用いて実施する。初年度に行った調査により、有明海は大潮時に栄養塩類が枯渇することが明らかとなり、この時に有機炭素分解が栄養塩制限を受けている可能性があるため、培養実験に大潮時の試料を用いることが適当であると判断し、実験に用いる予定である。実施時期としては、季節を考慮し、5月、8月、10月に実験を行い、実験終了後、直ちに分析と解析を行い、その成果を日本海洋学会において発表する。また、実験結果を年度内に論文にまとめ、国際学術誌に投稿する。

初年度に行った調査により、有明海は大潮時に栄養塩類が枯渇することが明らかとなり、この時に有機炭素分解が栄養塩制限を受けている可能性があるため、培養実験に大潮時の試料を用いることが適当であると判断し、実験に用いる予定である。実施時期としては、季節を考慮し、5月、8月、10月に実験を行い、実験終了後、直ちに分析と解析を行い、その成果を日本海洋学会において発表する。また、実験結果を年度内に論文にまとめ、国際学術誌に投稿する。
新規ｓｈＲＮＡライブラリーによる多能性幹細胞のゆらぎの分子機構同定

本研究ではES細胞やiPS細胞の持つ多能性の分子機構の一端を解明するために、piggyBacトランスポゾンベクターを用いた全ゲノム規模のshRNAライブラリー構築を行った。作成したpiggyBac shRNAライブラリーについては次世代シーケンサーを用い、数万のshRNAが無事にクローニングされていることを確認した。このpiggyBac shRNAライブラリーはウイルスを使用しないスクリーニング手法として、多能性幹細胞を含めた多くの細胞種で有用なツールとなることが期待できる。本研究では、新規のトランスポゾンベクターを利用した全ゲノム規模shRNAライブラリーを構築し、多能性幹細胞におけるNanog発現ゆらぎの分子機構を明らかにすることである。既存のshRNAライブラリーはほぼすべてウイルスをベースとしたものであり、多能性幹細胞への導入効率が低かった。そこで我々は、piggyBacトランスポゾンベクターを用いたshRNAライブラリーを構築し、その抑制機能評価を行った。ライブラリー中に含まれるshRNAの多様性を確認するために、高速シーケンサーMiSeqを用いて多数のshRNAの配列解析を行った。その結果、一つのshRNAライブラリー中に少なくとも2万種類以上のshRNAが含まれる事を確認した。次に、マウスiPS細胞へのpiggyBacベクター導入条件検討を行い、60%以上の高い効率で導入可能であることを確認した。これは、私の知る限り、初めてのDNAトランスポゾンベースのゲノム規模shRNAライブラリーである。このshRNAライブラリーを、Nanog-GFPを発現するマウスiPS細胞へ導入した所、残念ながら発現パターンに品著な変化は見られなかった。一方、導入したトランスポゾンベクターが発現抑制を受けているマウスES細胞にshRNAライブラリーを導入した所、一部の細胞において発現抑制の解除が観察され、GFP陽性細胞群をソートして含まれているshRNA配列をサンガーシーケンスおよびMiSeqにて確認した。現在は、ES細胞における遺伝子抑制機構に関与するであろう、候補shRNA群について詳細な解析を進めている所である。本研究の最終目標としては、トランスポゾンベクターを利用した全ゲノム規模shRNAライブラリーを構築し、Nanog発現ゆらぎの分子機構を明らかにすることである。当該年度研究では、shRNAライブラリーの構築と、その抑制機能評価を行った。まず、市販のレンチウイルスをベースとしたゲノム規模shRNAライブラリーからshRNAの部分だけを切り出し、我々の構築したトランスポゾンベクターへクローニングを行った。クローニングによるバイアスを最小限とするために、PCR増幅は行わず、ライゲーション後の大腸菌培養も、軟寒天培養を用いたコロニー浮遊培養を行った。また、なるべく多くのshRNAをクローニングするため、このクローニングを4回繰り返して行った。作製したshRNAライブラリーを確認するために、高速シーケンサーMiSeqを用いた解析を行った。MiSeqでDNA断片を解析するためには、ブリッジPCR反応を行うためのアダプターを付加する必要があるが、市販のPCR産物へアダプター付加可能なキット(TruSeq)は、平滑末端にT塩基を付加してアダプターをライゲーションする方式であるため、操作が煩雑である。そこで我々は、2回のPCR反応でアダプター配列を付加する方法を確立し、shRNAの配列解析を行った。本研究では、新規のトランスポゾンベクターを利用した全ゲノム規模のshRNAライブラリーを構築し、発現制御に関わるエピジェネティック制御因子や転写因子群に対するshRNAを多数同定するに至った。当初予定していたNanogの発現ゆらぎについては期待していた結果が得られなかったが、スクリーニング系を外来遺伝子の転写抑制解除に変更してスクリーニングを行ったことで、複数の新規転写因子群が同定された。現在、論文を執筆中である。幹細胞遺伝子工学当初の計画通り、shRNAライブラリーの構築についてはほぼ順調に推移した。ライブラリーの調整を4回行い、各ライブラリー産物を高速シーケンサーMiSeqにて確認し、各プレップに数万種類のshRNAが含まれていることを確認した。一方、Nanogの発現ゆらぎについては、shRNAを導入しても品著な変化が見られず、再現性のある結果を得る為にはさらなる解析が必要である。しかし、マウスES細胞での発現抑制を解除し得るshRNA群を多数同定しており、現在はそちらの解析に力を入れている。当初の計画通り、shRNAライブラリーの構築についてはほぼ順調に推移している。我々の構築したshRNAライブラリーは簡便に全ゲノム規模のスクリーニングへ応用できることから、広く遺伝子機能をスクリーニングする実験系への応用が期待できる。今回はSBI社より購入したshRNAをベースにライブラリの構築を行ったが、元のshRNAの品質があまり良くなく、この点については改善が必要である。しかしながら、発現抑制を解除するshRNA群については転写関連因子が多数含まれており、今後はそれら候補shRNAについての個別解析に加え、ネットワーク的な解析にも挑戦して行きたい。

初年度で構築したトランスポゾンshRNAライブラリーを用いて、実際に細胞でのスクリーニングを行う。細胞へ導入されたshRNAの配列、および目的の表現系を示した細胞に導入されたshRNAの配列に関しても、初年度に開発したMiSeq解析用アダプター付加法が利用可能である。shRNAライブラリー導入実験において、当初予定していたNanog-GFP細胞にて謙虚な発現変動が観察できなかったため、ターゲット細胞を変更して実験を行う必要が生じた。このため、全体として研究計画に遅れが出て、一部研究費の繰り越しが必要となった。繰り越した研究費は、引き続き個別shRNA導入による確認実験や、細胞の機能解析実験に使用する。引き続き、DNAクローニング関連、次世代シーケンサー関連、および細胞培養関連の消耗品が必要である。
筋シナジーを形成する脳内機構を解明する

随意運動制御の神経機構を理解する上で最も困難な問題が、生体の筋骨格系の有する高度冗長自由度である。例えば、ヒトの手の運動には39種類の骨格筋が関わつているが、脳がこの冗長自由度を処理する機構については明らかにされていない。筋シナジーを用いることによって、膨大であった自由度を脳によって制御可能なレベルに減少させているという考え方が有力であるが、筋シナジーを生成する具体的な神経機構については全く明らかにされていない。そこで、本研究では「脊髄神経回路が随意運動時の筋シナジーを生成する基盤である」という仮説を検証する事を目的とした。そのために、特に高度な冗長自由度の制御が必要な把握運動をサル行わせ、1.手指の筋活動、2.脊髄介在神経の活動を同時に記録し、3.介在神経-筋間の結合様式と介在神経の活動様式との関係を主成分分析によって調べることにより、脊髄介在神経が把握運動における筋シナジーの発生にどのように貢献しているのかを検討した。その結果、記録された大半(約80%)の脊髄ニューロンは把握運動の課題依存性変化を示し、脊髄介在ニューロンの筋フィールドは主に手内在筋または手内在筋-手外在筋の中に存在しているとわかった。また、脊髄ニューロンの筋フィールドは平均2.3個から形成されており、本研究において記録されたPreM-INsの多くは興奮性ニューロンであった一方、筋フィールドを持つ抑制性ニューロンは少なかった。今後も同様な神経生理学的実験を行うことによって、これまで知られていなかった脊髄の随意運動への貢献が説明できると思っている。把握運動制御装置の開発:申請者らはすでに、バネ式負荷を用いた、マカクサル用把握運動制御装置を開発し日常的に用いている。しかし、当該装置ではサルの手に力刺激や振動刺激を与えることが困難であり、さらに多種類のオブジェクトを神経活動記録中に提示することも不可能である。そこで、バーチャルリアリティ環境を用いて、サルに主に末梢感覚をフィードバックする装置を開発し、主に皮膚感覚受容器への刺激を行った。それに適したサルの訓練方法を確立した。また多種類のオブジェクトを有する新たなマニピュランダムについても、その機械部分がほぼ整備された。運動課題の設定とサルの訓練:上記制御装置を利用したサルの行動訓練が進行している。行動制御にはReflective Computing社のTempoを用い、オペラント学習の進行を促進した。外科的手術技術の確立(1)頭部の動きを制限するための固定具、(2)筋電図電極、(3)脊髄からニューロン活動を記録するためのチェインバー、をそれぞれ外科的手術によってそれぞれ装着する必要がある。当該実験技術の多くはこれまでの研究によってほぼ確立した。本年度は特に、手内・手外筋から筋電図活動を記録する方法を工夫し、より多くの筋にワイヤー電極を埋め込む事が可能になった。さらに、新しくガイドチューブを用いた記録が行えるように、チェインバーやマイクロドライブの規格を改良し、制作を終了した。