hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞膜糖鎖ドメインの形成と機能の動的機構の解明

【研究内容】細胞膜ドメインと呼ばれる細胞膜に一過的に形成される分子の集合体に関する研究を行った。特に細胞膜ドメインの主要分子である糖脂質(糖鎖と脂質が結合した分子)に注目し、細胞膜ドメインが形成される際の糖脂質の振舞いを1分子観察という高精細な可視化技術によって解析することを目的とした。【成果】合成化学の手法により、天然分子と同様な性質を維持した蛍光標識した糖脂質分子を世界で初めて開発した(11種類)。この蛍光糖脂質分子を細胞膜に挿入し、1分子ごとの細胞膜での振舞いを解析することにより、「脂質ラフト」「糖脂質ドメイン」と呼ばれるドメイン形成の基礎となる分子間相互作用を見出すことができた。本年度は、ガングリオシドが細胞膜において自発的にホモダイマーを形成する機構について精査するため、哺乳動物の細胞膜に存在するガンリオシドの蛍光プローブの合成および構造修飾したガングリオシドGM3類縁体の蛍光プローブの合成を実施した。哺乳動物ガングリオシドの蛍光プローブの合成では、新たにGalNAc-GD1a、asialo-GM2、asialo-GM3(Lac-Cer)、GT1b、GQ1bの蛍光標識体の合成に成功した。また、GM3類縁体の蛍光プローブの合成では、脂質部を構成する脂肪酸の炭素鎖長に関する類縁体を6種類合成した。これらの合成プローブを用いて、連携研究者の鈴木博士の協力の下、1分子イメージングによる生細胞膜中での動態解析を行った結果、天然型のガンリオシドは全てホモダイマー形成を自発的に行うことが明らかとなった。また、脂質修飾したGM3類縁体の動態解析では、ホモダイマー寿命に脂肪酸の鎖長が大きく影響することが明らかとなった。また、擬似糖鎖ドメインの創製研究では、上記の実験によりLacCerもホモダイマーを形成することが明らかとなったため、合成の簡便性を踏まえてLacCerの化学修飾体(ジアジリン体、ビオチン体、蛍光体)の合成を実施し、光架橋反応による糖鎖ドメイン創製を健闘することとした。本年では、ジアジリン体および蛍光体の合成を完了することが出来た。本年度計画したガングリオシド類縁体の合成をほぼ完了することが出来、また、1分子イメージングによる動態解析においては見込み以上の重要な成果が得られた。擬似糖鎖ドメインの創製研究では、若干の遅れが見られるが、対象分子をより単純化することが出来たため、次年度に予定通りの成果が見込める。以上の理由により上記の評価とした。昨年度のGM3ホモダイマー形成の機構解明の研究において、脂質部分であるセラミドを構成する脂肪酸の炭素鎖長がホモダイマーの寿命に大きく影響することが明らかとなった。本年度は、GM3の糖鎖部分のダイマー形成における影響を精査するため、GM3の糖鎖を構成するシアル酸の部分修飾体(C1位還元体、C5位デアミノ体)およびガラクトースの部分修飾体(C6位デオキシ体)を有するGM3蛍光プローブを合成し、1分子観察により生細胞膜でのホモダイマー形成時間を測定した。その結果、シアル酸5位デアミノ体のダイマー寿命が著しく低下することが明らかとなった。一方で、シアル酸C1位還元体では、形成寿命の若干の増加が見られた。また、ガラクトースC6位デオキシ体では、形成寿命の変化は微小であった。このことから、糖鎖間での官能基レベルでの相互作用がダイマー形成の重要な形成因であり、中でもシアル酸5位アセトアミド基による水素結合が重要であるとの知見が新たに見出された。擬似糖鎖ドメインの創製研究では、昨年度合成した光反応性LacCerを用いた細胞膜モデルでの光架橋実験を実施した。LacCer単分子膜(BL膜)を用いた架橋実験で、脂質間で二量体が優位に形成されることを確認した後、リポソーム中での光架橋を試みたところ、同じくホモダイマーが優位に形成されることを確認した。リポソーム中でのダイマー形成はコレステロールの含有率に依存したことから、Lo-Ldの相分離下で、Lo相中に局在するLacCerがホモダイマー形成を頻繁に繰り返していることが示唆された。本実験により、モデル膜中でLacCerの架橋部位を脂質部位に限定する制御条件を見出すことが出来た。糖鎖ドメインの形成機構の解明研究では、GM3の類縁体プローブを用いた実験が計画通り進行し、一定の成果を収めることが出来た。擬似糖鎖ドメインの創製研究では、対象分子をLacCerに単純化したことにより、昨年度までの遅れを挽回することができ、最終年度には予定した成果が見込める。前年度までのGM3ホモダイマー形成の機構解明の研究において、脂質部分および糖鎖部分の構造が形成寿命の長短に影響し、脂質ー脂質間の相互作用、糖鎖ー糖鎖間の相互作用の相加的な結果として、形成寿命が規定されている可能性を見出した。最終年度となる本年度では、糖鎖相互作用の寄与を詳解するため、単糖を糖部分として有するグルコシルセラミド(Glc-Cer)と糖部分を欠くセラミド(Cer)の蛍光プローブの合成と一分子イメージングによる細胞膜動態解析を行った。これまでの蛍光ガングリオシドプローブの設計指針に基づいて蛍光色素と分子本体を適切な鎖長を有するスペーサーによって隔てた蛍光Glc-Cerおよび蛍光Cerを合成し、DRM分配ならびLo-Ld分配により、各蛍光体がラフト親和性を維持していることを確認した。

一分子イメージングによる解析よって、Glc-Cer、Cerのホモダイマー形成時間は、それぞれ58ms、48msであることが分かった。これは、二糖を有するLac-Cerの98msに比べ短く、ホモダイマー形成における糖鎖ー糖鎖相互作用の寄与は、二糖から増大することが明らかとなった。また、これまで調査したスフィンゴ糖脂質(ガングリオ系)とは異なるサブ系列であるグロボ系に属するSSEA-3の蛍光プローブを合成し、同じくホモダイマー形成を観測したところ、115msの形成寿命であることが分かった。これにより、ホモダイマー形成はLac-Cer以降のスフィンゴ糖脂質に普遍的に備わっている性質であることが示唆された。さらに、ガングリオシドのホモダイマーの動態解析では、EGF受容体との相互作用の特異性を調査した。その結果、EGF受容体モノマーはGM3特異的に相互作用し、GM3ホモダイマーがモノマーよりも親和性が高いことが明らかとなった。【研究内容】細胞膜ドメインと呼ばれる細胞膜に一過的に形成される分子の集合体に関する研究を行った。特に細胞膜ドメインの主要分子である糖脂質(糖鎖と脂質が結合した分子)に注目し、細胞膜ドメインが形成される際の糖脂質の振舞いを1分子観察という高精細な可視化技術によって解析することを目的とした。【成果】合成化学の手法により、天然分子と同様な性質を維持した蛍光標識した糖脂質分子を世界で初めて開発した(11種類)。この蛍光糖脂質分子を細胞膜に挿入し、1分子ごとの細胞膜での振舞いを解析することにより、「脂質ラフト」「糖脂質ドメイン」と呼ばれるドメイン形成の基礎となる分子間相互作用を見出すことができた。ガングリオドホモダイマー形成の機構研究では、合成が予定よりも早く進行しており、次年度内での目標達成が見込めるため、擬似糖鎖ドメインの創製研究により注力し、本研究を推進する。今後は、擬似糖鎖ドメインの創製研究に一層注力する。本年度の実験で光反応性官能基としてジアジリンを用いた場合、ホモダイマー以上のオリゴマー形成が確認できなかったことを踏まえて、分子間架橋をより効率的に行うことが出来る官能基の選別を上半期で実施し、その結果を元に下半期でドメイン創製ならびその挙動解明を推進する。29年度が最終年度であるため、記入しない。糖鎖合成化学、生物有機化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
有機伝導体のフェルミ面.磁場中相転移及び伝導機構の研究

最終年度はこれまでの研究成果の整理と発表にあてられ、新たに発見した系の研究を深めることにあてられた.我々の研究によって得られた成果は主に3つの系についてのものである.有機物超伝導体の中でも比較的高い転移温度をもつ系であるが、特にK型と呼ばれる構造を持つ系のフェルミ面について、これまで知られていたものに加えて新たに三種の物質につき報告し、バンド計算との一致が詳細な対称性を含めて議論できることを示した.しかし伝導キャリアの有効質量などは多体効果を考慮しなければならないことがわかった.有名なTMTSF系の類縁物質であるこの系で磁場誘起状態が存在することを発見したが、その後このグループで常圧下で磁場誘起状態を示す系を新たに見い出した。まだこの物質の研究は完結しておらず、理論的にも、磁場誘起状態の内部構造についての研究が進んでいる磁場誘起スピン密度波状態の研究の場として興味深い。超伝導性も関係している.3.DCNQI系上記2つの系とは異り、起伝導性は示さないが伝導にかかわる銅元素の役割が重要であり、XANESの測定により、この系の特徴的な振舞についての情報が得られることを示した.伝導性に多体効果があらわれるという点で1,2と共通の問題があり、最近の重水素化した系の興味深い物性の報告との関連でさらに研究を進める必要がある.以上の結果は平成4年度にスエーデンで開催された国際学会(ICSM92)や日本で開催された学会(XAFS VII)で報告され、論文として印刷中である.また現在、新たに発見されたDMET-TSeF系についての論文を準備中である.最終年度はこれまでの研究成果の整理と発表にあてられ、新たに発見した系の研究を深めることにあてられた.我々の研究によって得られた成果は主に3つの系についてのものである.有機物超伝導体の中でも比較的高い転移温度をもつ系であるが、特にK型と呼ばれる構造を持つ系のフェルミ面について、これまで知られていたものに加えて新たに三種の物質につき報告し、バンド計算との一致が詳細な対称性を含めて議論できることを示した.しかし伝導キャリアの有効質量などは多体効果を考慮しなければならないことがわかった.有名なTMTSF系の類縁物質であるこの系で磁場誘起状態が存在することを発見したが、その後このグループで常圧下で磁場誘起状態を示す系を新たに見い出した。超伝導性も関係している.3.DCNQI系上記2つの系とは異り、起伝導性は示さないが伝導にかかわる銅元素の役割が重要であり、XANESの測定により、この系の特徴的な振舞についての情報が得られることを示した.伝導性に多体効果があらわれるという点で1,2と共通の問題があり、最近の重水素化した系の興味深い物性の報告との関連でさらに研究を進める必要がある.以上の結果は平成4年度にスエーデンで開催された国際学会(ICSM92)や日本で開催された学会(XAFS VII)で報告され、論文として印刷中である.また現在、新たに発見されたDMET-TSeF系についての論文を準備中である.本年度の研究は有機物伝導体のうち、これまでに知られているもののうちからKー(BEDTーTTF)_2Cu(NCS)_2について行った。また新たに発見された物質の中から陰イオンにHg(SCN)_4を含むもの,Ag(SCN)_2を含むものについて研究した。EXAFSの手法を用いて、Cuイオンのまわりの局所的構造を調べた。この結果、伝導性、ホ-ル効果などの報告に対応する構造の微妙な温度変化を見出した。また圧力下でのシュブニコフドハ-ス振動の結果を解析し、構造が本来もっている長周期的な超格子構造が強調されてあらわれてくることを明らかにした。これらの結果は本研究の大きな目標である、サイクロトロン共鳴観測のために必要な予備研究ともなっている。この系は、低温まで金属的であることを、我々が最初に見出した。その後超伝導性を持つ場合(X=NH_4)が発見されている。この系についてシュブニコフドハ-ス効果を観測し、そのフェルミ面の形を確定した。特に量子振動の明白な角度依存性を発見している。この系は、最近見出された有機物超伝導体である(Tc=5K)。この系のフェルミ面をドハ-ス・ファンアルフェン効果で研究し、そのフェルミ面がKー(BEDTーTTF)_2Cu(NCS)_2で知られているものと同じであることを、明らかにした。ただし二次元的な系として、面問の相互作用がより大きいことがわかった。これは、有機物超伝導体の超伝導転移点を決めるメカニズムを理解するうえで、重要な情報である。以上の物質についての高周波伝導特性の研究が準備中であり、特に強磁場中での興味深い結果が期待される。本年度の研究は、これまでの研究の範囲に入る、BEDTーTTF系のフェルミ面の研究,銅を含む塩の局所構造の研究,一次元性の強い系における磁場中相転移の研究を行った。特に大量に試料の必要な系については、独自の試料作製を試み、既存のものとの比較、物性評価を行った。作製した試料は十分な特性をもっていることがわかった.

1)BEDTーTTF系新たにドハ-ス・ファンアルフェン効果をKー(BEDTーTTF)_2ーI_3の系で測定し、これまでに我々が報告したKー(BEDTーTTF)_2Cu(NCS)_2とは異ったフェルミ面を持つことを明らかにした.これは2つの系の対称性の違いを反映している。また拡張ヒュッケル法によるバンドの記述がかなり精度のよいこともはっきりした.これにより、いわゆるK型の塩のフェルミ面の研究はすべて我々が最初にしたことになる。同じK型でもKーCu(NCN)_2Brの系はドハ-スの測定ができないことが、わかった.これら銅の存在する塩についてはEXAFSを測定し、国際学会で発表している.特に局所構造と伝導性のが明らかとなり、その原因はBEDTーTTF分子のエチレン基のつくる、水素結合が重要であることがわかった.2)DMETSF系東大の加藤らの作製した新しいドナ-の系を研究し、あるものは、TMTSF系と同様の磁場中カスケ-ド相転移をおこすことを見出した.特にこの現象は、磁場中二次元電子系の問題と密接なかかわりがあり、今後の発展が期待される.有機物の系での、この相転移は超伝導とのつながりが強調されてきた.しかし、我々の研究により、この現象は超伝導を示さない系でも起こりうることを明らかにした点で画期的である.最終年度はこれまでの研究成果の整理と発表にあてられ、新たに発見した系の研究を深めることにあてられた。我々の研究によって得られた成果は主に3つの系についてのものである。1.BEDT-TTF系有機物超伝導体の中でも比較的高い転移温度をもつ系であるが、特にK型と呼ばれる構造を持つ系のフェルミ面について、これまで知られていたものに加えて新たに三種の物質につき報告し、バンド計算との一致が詳細な対称性を含めて議論できることを示した。しかし伝導キャリアの有効質量などは多体効果を考慮しなければならないことがわかった。2.DMET-TSeF系有名なTMTSF系の類縁物質であるこの系で磁場誘起状態が存在することを発見したが、その後このグループで常圧下で磁場誘起状態を示す系を新たに見い出した。まだこの物質の研究は完結しておらず、理論的にも、磁場誘起状態の内部構造についての研究が進んでいる磁場誘起スピン密度波状態の研究の場として興味深い。超伝導性も関係している。3.DCNQI系上記2つの系とは異り、起伝導性は示さないが伝導にかかわる銅元素の役割が重要であり、XANESの測定により、この系の特徴的な振舞についての情報が得られることを示した。伝導性に多体効果があらわれるという点で1、2と共通の問題があり最近の重水素化した系の興味深い物性の報告との関連でさらに研究を進める必要がある。以上の結果は平成4年度にスエーデンで開催された国際学会(ICSM92)や日本で開催された学会(XAFSVII)で報告され、論文として印刷中である。また現在新たに発見されたDMET-TSeF系についての論文を準備中である。
蛍光増白剤のMolecular Markerとしての有用性の評価

本年度は昨年度開発した高感度な分析法を用いて東京湾及びその集水域における2種のスチルベン型の蛍光増白剤DSBPとDAS1の分布と挙動を明らかにした。東京都内の6つの下水処理場で調査した結果、下水処理効率はDSBPが約60%,DAS1が約80%であり、これまで提案されてきたLAS(除去率95%以上)などの水溶性で微生物分解性の良い分子指標に比べ低い除去率であることが明らかになった。下水処理放流水からは8.038μg/Lの蛍光増白剤が検出され、本分析法の定量限界が0.0004μg/Lであることから、下水処理水が環境中で約10000倍に希釈されても検出可能であることが明らかになった。河川水では0.38.0μg/Lが検出され、その90%以上は溶存態で存在した。多くの化学成分が除去作用を受ける河口域でも蛍光増白剤はかなり保存的な挙動を示した。観測結果をMixing diagramを使い解析した結果、除去率はDSBPが40%,DAS1が2.8%と計算された。この除去率も同じ河口域でこれまで観測されてきたLASの除去率に比べると非常に低いものであった。さらに、東京湾においても湾央から湾入口にかけて0.0050.4μg/LのFWAsが検出された。この結果は沿岸海域で陸起源の水塊をトレースする上で蛍光増白剤が有効なマーカーとなることを示している。また、2種の蛍光増白剤の比率DSBP/DAS1 ratioは水塊の海域における滞留時間を考える上で有用な指標であることも明らかになった。それぞれの化合物のcis-trans幾何異性体の比率も蛍光増白剤の吸着や光分解を考える上で有効であることも示唆された。東京湾の柱状堆積物からも蛍光増白剤はその使用の歴史を反映した鉛直分布で検出された。蛍光増白剤の柱状堆積物における鉛直分布(特に検出されはじめ)は沿岸域における堆積年代の推定に利用可能であることが示された。蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ法による蛍光増白剤の分析環境のセットアップを行い、sub-ng/Lオーダーの高感度分析可能な環境を確立した。スチルベン型の蛍光増白剤のDSBP、DAS1,およびBLSを対象とし、下水(1次処理水)の予備的な分析を行った。下水中からDSBPとDAS1が数数十μg/Lの濃度で検出された。この濃度と検出限界濃度から、これらの化合物を用い下水が1万倍に希釈されてもその影響を検知できる可能性が示唆された。この倍率はコプロスタノールやLAS等の既存のmarkersと同レベルであるが、蛍光増白剤の起源特異性と環境中での安定性を考えると、これらの蛍光増白剤のMolecular markersとしての有用性が期待される。来年度は今年度確立した分析手法により多くの環境試料を分析し、また既存のmarkersとの比較も行い、Molecular markersとしての有用性を明らかにしていく予定である。また、全般にDSBPの方がDAS1より高濃度で検出された。

これはDAS1がDSBPに置き換えつつある蛍光増白剤の生産動向を反映している可能性もあるが、今後柱状堆積物の分析により歴史的な変遷を再現することによりこの可能性を検討する必要がある。また、これらの蛍光増白剤は光化学反応によりトランス-シスの異性体化反応が起こる。試料の前処理の間の可視光を遮断できるような暗室を研究室内に設置した。この遮光条件下での分析から、下水に比べ河川水中でシス異性体の割合が高いことが明らかになった。このことは、環境中での数時間から数日のオーダーでの異性体化反応の進行を示唆している。トランス-シスの異性体化の割合は下水あるいは水塊の滞留時間の推定に有用である可能性が示唆された。来年度は光履歴の異なる環境試料の分析から、蛍光増白剤の滞留時間推定指標としての有用性の評価を行う予定である。本年度は昨年度開発した高感度な分析を用いて東京湾及びその集水域における2種のスチルベン型の蛍光増白剤DSBPとDAS1の分布と挙動を明らかにした。東京都内の6つの下水処理場で調査した結果、下水処理効率はDSBPが約60%,DAS1が約80%であり、これまで提案されてきたLAS(除去率95%以上)などの水溶性で微生物分解性の良い分子指標に比べ低い除去率であることが明らかになった。下水処理放流水からは8.038μg/Lの蛍光増白剤が検出され、本分析法の定量限界が0.0004μg/Lであることから、下水処理水が環境中で約10000倍に希釈されても検出可能であることが明らかになった。河川水では0.38.0μg/Lが検出されその90%以上は溶存態で存在した。多くの化学成分が除去作用を受ける河口域でも蛍光増白剤はかなり保存的な挙動を示した。観測結果をMixing diagramを使い解析した結果、除去率はDSBPが40%,DAS1が2.8%と計算された。この除去率も同じ河口域でこれまで観測されてきたLASの除去率に比べると非常に低いものであった。さらに、東京湾においても湾央から湾入口にかけて0.0050.4μg/LのFWAsが検出された。この結果は沿岸海域で陸起源の水塊をトレースする上で蛍光増白剤が有効なマーカーとなることを示している。また、2種の蛍光増白剤の比率DSBP/DAS1 ratioは水塊の海域における滞留時間を考える上で有用な指標であることも明らかになった。それぞれの化合物のcis-trans幾何異性体の比率も蛍光増白剤の吸着や光分解を考える上で有効であることも示唆された。東京湾の柱状堆積物からも蛍光増白剤はその使用の歴史を反映した鉛直分布で検出された。蛍光増白剤の柱状体積物における鉛直分布(特に検出されはじめ)は沿岸域における堆積年代の推定に利用可能であることが示された。
レミフェンタニルの急性耐性と痛覚過敏　―存在の是非と機序の解明―

超短時間作用性μオピオイド受容体刺激薬であるレミフェンタニルの持続投与により鎮痛作用の減弱が報告された。一方で、その様な現象はないとする報告もあり、真偽は依然として判然としない。本研究の目的はレミフェンタニルによる急性耐性および痛覚過敏の発生の有無を行動学的実験によって明らかにすることである。レミフェンタニルを240、180、120 mg/kg/hをマウスに腹腔内持続投与した。Plantartestによる熱刺激による逃避行動の潜時を測定したところ、投与中および投与後の潜時は短縮しなかった。本研究において高用量レミフェンタニル持続投与でも、痛覚過敏および急性耐性は認められなかった。長期増強が耐性および痛覚過敏に関与する可能性がある。感覚神経にどのような影響を及ぼすか解明するために、in vivoで電気生理学的実験を行った。下肢の電極から電気刺激しsomatosensoryevoked potentials(SEP)を測定したところ、潜時13-15 msでspike状の陰性成分のピークが得られた。NMDA受容体アンタゴニストのケタミン(100 mg/kg)腹腔内投与は循環動態の安定が得られたが、静脈投与では異常高血圧をきたした。したがって、オピオイド耐性の減弱作用を検討する場合のケタミンは腹腔内投与が優れていると思われた。本年度は、レミフェンタニルの痛覚過敏および急性耐性の現象の有無を明らかにするために、その実験方法の確立を目的とした。レミフェンタニルをマウスに持続投与するために、吸入麻酔薬セボフルランを吸入させ鎮静する手法をもちいた。しかしながら、セボフルランには鎮痛作用があるため高濃度吸入によって、レミフェンタニルの鎮痛効果を正確に評価できなくなる可能性がある。そのために、レミフェンタニル投与時の行動学的実験に影響を及ぼさないセボフルランの鎮静最低濃度を探求した。その結果、熱刺激による逃避行動においてセボフルラン1.5%は、3時間にわたり鎮痛効果に影響を及ぼすことなく鎮静を維持できることが判明した。さらに、セボフルラン吸入停止後は、速やかにその鎮静効果が失われた。このことから、適切な鎮静下でマウスの苦痛を最小限にしながら、レミフェンタニルを持続投与し、鎮痛効果、痛覚過敏および急性耐性の評価が可能となった。研究背景として、手術中の鎮痛薬として頻用されるμオピオイド受容体刺激薬レミフェンタニルは、持続投与によって効果が減弱するという報告と否定する報告があり、真偽は不明である。本研究の目的は、レミフェンタニルによる急性耐性および痛覚過敏の発生の有無を明らかにすることである。研究成果は周術期の鎮痛管理の向上に寄与するものであり、社会的意義は大きい。研究方法として、週齢814週の雄性マウスを用いて行動学的実験をおこなった。研究成果として、レミフェンタニルを腹腔内持続投与するために、plantartestを施行したところ吸入麻酔薬セボフルランは1.5%atmが鎮痛効果に影響なく鎮静できる濃度であることが明らかになった。最終年度における研究成果として、まず、最大投与量を決定した。高用量レミフェンタニルを腹腔内投与したところ、100 mg/kgでアキネジアを認めた。したがって、これ以上の投与は麻薬性呼吸抑制や鉛管現象などを誘発するため、この量を限界値とした。次に、高用量レミフェンタニルの持続投与による急性耐性および痛覚過敏の発生の有無を調べた。レミフェンタニル240 mg/kg/hを30分間、180 mg/kg/hを30分間、120 mg/kg/hを2時間にわたり持続投与した。cut-off値は10秒と設定し熱傷予防に努めた。Plantartestによる熱刺激を後脚に加えたところ、レミフェンタニル持続投与中の逃避行動の潜時は10秒のまま短縮せず、急性耐性を認めなかった。さらに、レミフェンタニル投与前のコントロール値と比較して、持続投与終了後に潜時は短縮せず、痛覚過敏を認めなかった。本研究において、高用量レミフェンタニルを手術侵襲のないラットに持続投与しても急性耐性および痛覚過敏は発生しなかった。臨床において、効果の減弱を憂慮することなく侵襲に応じた至適投与が可能であると思われる。医歯薬学電気生理学的実験はおおむね順調と思われる。しかしながら、NMDA受容体に関する実験はケタミンの投与方法および投与量の決定に時間を要している。レミフェンタニルの持続投与法が確立された。さらに、Hot plate test等の行動実験にも着手し、成果を得ている。したがって、概ね順調に研究は進展していると判断した。

得られたSEPの潜時および振幅を電気生理学的に解析することで長期増強の機序を解明できるか検討する。レミフェンタニルの単回および持続投与による急性耐性の評価を熱刺激および機械刺激による行動実験を行う。さらに、NMDA受容体拮抗薬であるケタミンをもちいて侵害受容反応の阻害要因の解明をおこなう予定である。今年度の計画として、ケタミンを用いて侵害受容反応の阻害要因の解明を掲げていたが、投与方法による逃避反応の差異を得る事が困難であった。技術的な問題によって研究の遅延が生じたが、解消されつつあるため今年度にその遅延を解消できる予定である。次年度の計画として、ケタミンによる侵害受容反応の阻害要因の解明が終了すると同時に、NMDA受容体epsilon1サブユニット欠損マウスを用いた耐性形成の機序の解明を予定している。ラットおよび試料等の購入費、行動学的実験および解析の諸経費が研究を行うために今後も必要である。さらに、研究成果を社会に発信するために国内外の学会および学術雑誌で発表していく予定である。その為に研究費を使用する予定である。
細胞骨格蛋白質のリン酸化による制御機構と細胞機能の解明

我々は、Plk1が、Cdk1によってリン酸化されたビメンチンのセリン(S)55と直接結合し、そのキナーゼ活性を著しく上昇させることを明らかにした。この活性化Plk1は、さらに、ビメンチンのS82をリン酸化することから、Cdk1による分裂期特異的なビメンチンのリン酸化は、Plk1をビメンチンに集積させることを介して、Plk1によるビメンチンのリン酸化を制御していることが判明した。そして、このPlk1によるリン酸化は、細胞質分裂におけるRhoキナーゼやAurora-Bによるビメンチンのリン酸化と協調的に働き、ビメンチンフィラメントの娘細胞への分配に関与していることを明らかにした。また我々は、Cdk1がAurora-Bの結合パートナーであるINCENPのスレオニン(T)59とT388をリン酸化することを明らかにし、Plk1がCdk1によってリン酸化されたT388を認識してINCENPと結合することを見出した。そして、Cdk1はINCENPのリン酸化を通じてPlk1の動原体局在を制御していること、動原体のPlk1は分裂中期から後期の進行に重要な役割を担っていることが判明した。一方、新規のケラチン結合蛋白質として、トリコプレイン(Trichoplein)及びFas binding factor-1(Fbf-1)を同定した。トリコプレイン及びFbf-1は、trichohyalin及びplectinに相同性を示すドメイン(TPHD)をもつ分子で、これらは細胞接着部位にも局在することが認められた。細胞分裂において多くの分裂期キナーゼは、中間径フィラメントの1つであるビメンチンをリン酸化する。今までに我々は、RhoキナーゼやAurora-Bが分裂溝特異的にビメンチンをリン酸化し、細胞質分裂においてビメンチンフィラメントの再構築を調節していることを明らかにしてきた。Cdk1もまた分裂前中期、中期にビメンチンをリン酸化することが分かっているが、その生理的意義は不明のままであった。今回我々は、Cdk1によってリン酸化されたビメンチンSer55lがPlk1(Polo-like kinase 1)と直接結合し、そのキナーゼ活性を著しく上昇させることを明らかにした。活性化PIk1は、さらにビメンチンをリン酸化し、そのリン酸化部位はSer82であった。in vitroの実験により、このリン酸化は、ビメンチンフィラメントの部分的な脱重合を引き起こすことが分かった。ビメンチンSer82のリン酸化を特異的に検出する抗体やRMA干渉法を用いた実験から、Plk1によるビメンチンSer82のリン酸化は、Cdk1によるビメンチンSer55のリン酸化直後の分裂中期から分裂終期まで生じていることが分かった。さらに、このビメンチンSer82のリン酸化は、細胞質分裂におけるRhoキナーゼやAurora-Bによるビメンチンのリン酸化反応と協調的に働き、ビメンチンフィラメントの娘細胞への分配に関与する可能性が示唆される実験結果を得た。また新規ケラチンフィラメント結合蛋白質としてトリコプレイン、Fbf1を同定し、その機能解析を行った。

また我々は、Cdk1がAurora-Bの結合パートナーであるINCENPのスレオニン(T)59とT388をリン酸化することを明らかにし、Plk1がCdk1によってリン酸化されたT388を認識してINCENPと結合することを見出した。そして、Cdk1はINCENPのリン酸化を通じてPlk1の動原体局在を制御していること、動原体のPlk1は分裂中期から後期の進行に重要な役割を担っていることが判明した。一方、新規のケラチン結合蛋白質として、トリコプレイン(Trichoplein)及びFas binding factor-1(Fbf-1)を同定した。トリコプレイン及びFbf-1は、trichohyalin及びplectinに相同性を示すドメイン(TPHD)をもつ分子で、これらは細胞接着部位にも局在することが認められた。
CD4自然欠損マウスにおける原因遺伝子の解明

我々はC57BR純系マウスがリンパ球上のCD4分子を欠如することを発見しその原因遺伝子の同定を行った。CD4遺伝子のDNA配列を調べたところ、エクソン8からイントロン8にかけての14個のヌクレオタイドがサイミジン1個におきかわっていた。この為、mRNAのスプライシング異常がおこり、細胞膜貫通部欠損CD4分子ができ、細胞膜上にCD4がとどまれず、分泌されてしまう。実際、血清中に多量の分泌型CD4分子を検出した。正常マウスとの交配によるF1ではリンパ球上にCD4が検出されることから、このF1をC57BRにバッククロスしたところ約50%の確率でCD4欠損マウスがえられた。従って1つの遺伝子に突然変異がおこり劣性遺伝しCD4欠損がおこると考えられる。CD4遺伝子のイントロン7から8にかけてのDNAに特異的なプライマーを作った。82頭のバッククロスマウスのDNAをこのプライマーを用いPCRで増幅し解析したところ、すべてのCD4欠損マウスより537bpの単一のバンド、CD4発現ウス(F1タイプ)のすべてからは537bp(突然変異型)に加え550bpのバンド(正常型)の2本を検出した。以上より、細胞表面CD4分子欠損マウスは、CD4遺伝子に上記の突然変異がおこったためと解明された(論文投稿中)。これらのマウスにMtv7スーパー抗原を投与したところ、この抗原に反応するV_β6^+T細胞が存在するにもかかわらず、V_β6^+T細胞の活性化による細胞増殖はほとんど認められなかった。今までのところ(生後2年まで)これら欠損マウスに明らかな疾患の発症は認められていない。
アジアのライフサイエンスにおける科学、産業、政策の科学人類学的研究

本年度の主要な目標は、1996年以降、台湾における生命科学振興政策である、「生医科技島計画」にフォーカスして、現地で関係者を取材することにあった。当該の計画は、台湾の次世代産業を育成するための、政府による積極的な科学産業支援として特徴的であった。しかし、この計画は2006年までに事実上霧消し、基軸となるDNAデータベース計画を含めて、成果物を残すに至っていない。こうした失敗の背景には、台湾国内で発生した政権交代と、その政権間の経済政策の差異が影響していると考えられる。本計画の最大の目標は、政策と科学、そして産業のインタラクティブな共生産にこそあり、その失敗には力点が置かれていなかった。ここにおいて、研究計画の再検討の必要を認め、研究方針を大きく転換するべく、一時的に研究の中断を判断した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の主要な特徴の一つに、ラトゥール以降の科学人類学の手法の利用がある。本年度の研究は、ミクロな観察・記述法である科学人類学的手法を、実験室だけではなく、よりダイナミックなプロセスに対してどのように適用することができるのかを明らかにした。特に科学政策の研究に当たっては、クノールセティナによる認識文化論やレイヴ、福島らの身体構築の観点を取り入れることが有用である。この手法を用いることで、本論の目標とする科学社会学、政策論的研究によるマクロな文脈の研究と、本研究による科学人類学的研究を接合する役割を十分に果たすものと期待している。理論的研究と併行して、台湾という対象地域の持つ固有の文脈についても調査を行った。結果として、(1)台湾地域の科学政策は、日本における科学政策とはその位置づけが異なっていること、(2)大陸との政治的な関係が政策形成に強く影響すること、(3)国土開発と国家産業育成を科学政策が担っているということの三点が明らかにされた。日本における科学政策、特にゲノム科学政策は、いわゆる「ゲノム敗北」の国際的雪辱のため、基礎研究への投資を中心に進められてきた。科学先進国として、果たすべき国際貢献が念頭に置かれることもしばしばである(タンパク3000など)。一方の台湾では、科学政策は「創新(イノベーション)」政策という位置づけを持っている。これは現在の国内の集積回路産業を実現した新竹のサイエンスパークにおける成功をその背景としている。強力な科学産業によって、島内の経済力を強めることが、大陸に対する外交カードとして重要性をもつのである。それゆえ、次世代の産業拠点の開発をも一体化させた、日本とは異なる形態の科学政策が実施されているのである。このマクロな文脈を、次年度以降ミクロな観察と接合することを試みる。本年度に予定されていた、理論的研究と台湾ローカルな文脈の調査については、概ね当初の目標を達したため。現在の課題は、台湾における科学政策の形成に寄与する因子の特定にある。直接これを明らかにすることは本研究の目標には数えられないが、今後の研究の効率を向上させるためには、台湾の一般的な政策形成プロセスについて深い理解を得る必要がある。まずは現地研究者による報告をあたり、必要があれば現地研究者の協力を仰ぐことを考えている。また、現在、具体的な調査対象とする研究室の選定に難航している。年度末には台湾の政情が不安定であり、現地研究者との交渉を持つことが難しかった。まずは協力関係を維持し、政情を見て確実に現地協力研究者との交渉を持てるようにことを運ぶ。
定量RT-PCR法による乳癌骨髄微小転移の検出

(背景)乳癌の予後因子は現在,リンパ節転移の状態が最強の因子である.しかし,リンパ節転移を認めない症例からも約20%が遠隔転移をきたすという事実から,さらなる予後因子としてさまざまな癌遺伝子,癌抑制遺伝子,血管新生因子等が検討されると同時に骨髄の微小転移を検出する試みがなされてきた.しかし現在広く行われている免疫細胞学的検出方法は骨髄の穿刺個所が多く,煩雑である.そこでこの研究では,乳癌に過剰発現するたんぱくであるMUCImRNAとKeratin 19mRNAを標的として蛍光probeを使った定量RT-PCR法にて乳癌の骨髄微小転移の検出とその予後を検討した.(対象方法)平均経過観察期間3年,対象は遠隔転移を認めない手術患者40名とした.Controlとして健常人10名のMUCImRNAとKeratin 19mRNAの発現量を測定しその平均値+2×漂準偏差をcut-off値とした.術直後片側の前腸骨より骨髄を5ml穿刺吸引し,分離した単核球層から全RNAを抽出した.逆転写後,一つの蛍光probeと二つのprimerを使用して定量PCRを施行した.(結果)検出感度は乳癌細胞株MCF7を使用し,1/10^6であった.乳癌患者の骨髄中においてCut-off値以上の症例はMUCI 53% Keratin19 36%であった.Stage,腫瘍径,リンパ節の有無別にMUCI,Keratin19の定量値を検討すると,病期がすすむごとにそれらの中央値および平均値は上昇するが、分散は有意差を認めなかった.多変量解析にてリンパ節転移,腫瘍径とした従来の予後因子と比較すると微小転移の有無は独立した因子として有意差を認めた.(結論)本方法における微小転移の検出は予後予測に有意義であった.乳癌では再現性のある癌遺伝子や癌抑制遺伝子が未だ特定されていないため組織特異性の高いMUC1mRNAとKeratin19 mRNAを標的にしてRT-PCRを行い,それらの発現量を7700sequence detectorにて解析した.MUC1とKeratin19(K19)は乳癌細胞に多く発現しているが正常の骨髄中には発現の少ない蛋白である.K19は骨髄および血液中の検出はないと報告されていたが,MUC1はリンパ球に発現することもあるとの報告があり,健常者の骨髄11例も検討した.乳癌患者(Stage IIV)39例の骨髄を術直後,上前腸骨棘より6ml穿刺吸引した.骨髄の単核球層を分離しRNAを抽出後,Quantitative RT-PCR法にて解析した.患者検体間のRNA量を均一化するために全症例のβーactin mRNA transcripts(βーactin)を定量しβーactin1 moleculeあたりのMUCI mRNAtranscripts,K19 mRNAtranscriptsを比較検討した.健常骨髄のMUC1およびK19の平均値+標準偏差はそれぞれ0.0096,0.00037であった.乳癌患者39例の平均値はそれぞれ5.15および25.30であったが,各症例で大きな発現量の差を認めた.臨床病期,腫瘍径,リンパ節転移と平均値との関連を比較すると,MUC1,K19とも病期がすすむごとに高値を示す傾向を認め,K19ではリンパ節転移との関連を有意に(p<0.05)認めた.(背景)乳癌の予後因子は現在,リンパ節転移の状態が最強の因子である.しかし,リンパ節転移を認めない症例からも約20%が遠隔転移をきたすという事実から,さらなる予後因子としてさまざまな癌遺伝子,癌抑制遺伝子,血管新生因子等が検討されると同時に骨髄の微小転移を検出する試みがなされてきた.しかし現在広く行われている免疫細胞学的検出方法は骨髄の穿刺個所が多く,煩雑である.そこでこの研究では,乳癌に過剰発現するたんぱくであるMUCImRNAとKeratin 19mRNAを標的として蛍光probeを使った定量RT-PCR法にて乳癌の骨髄微小転移の検出とその予後を検討した.(対象方法)平均経過観察期間3年,対象は遠隔転移を認めない手術患者40名とした.Controlとして健常人10名のMUCImRNAとKeratin 19mRNAの発現量を測定しその平均値+2×漂準偏差をcut-off値とした.術直後片側の前腸骨より骨髄を5ml穿刺吸引し,分離した単核球層から全RNAを抽出した.逆転写後,一つの蛍光probeと二つのprimerを使用して定量PCRを施行した.(結果)検出感度は乳癌細胞株MCF7を使用し,1/10^6であった.乳癌患者の骨髄中においてCut-off値以上の症例はMUCI 53% Keratin19 36%であった.Stage,腫瘍径,リンパ節の有無別にMUCI,Keratin19の定量値を検討すると,病期がすすむごとにそれらの中央値および平均値は上昇するが、分散は有意差を認めなかった.多変量解析にてリンパ節転移,腫瘍径とした従来の予後因子と比較すると微小転移の有無は独立した因子として有意差を認めた.(結論)本方法における微小転移の検出は予後予測に有意義であった.
電子ドープ型磁性共存高温超伝導体の固有トンネル特性に関する研究

今年度の成果として次のような結果が得られている。1.電子ドープ型高温超伝導体Sm_<2-χ>Ce_χCuO_<4-δ>(SCCO)単結晶上に作製した寸法2μm角、厚さ36nmの微小メサ構造において、電子ドープ型高温超伝導体で初めて固有ジョセフソン接合特性を観察することに成功した。この微小メサにおいては、電流電圧特性に微小メサの層数に対応する本数の電圧分枝が観察され、それがSCCOの結晶構造がトンネル型固有ジョセフソン接合を内包することを示している。作製したメサ(超伝導転移温度T_c=16-23K)の4.2Kにおける最大ジョセフソン電流密度J_cは5-8kA/cm^2であり、ヒステリシスの深さは最大で約10%であった。また、J_cとT_cがキャリアドープと共に減少するという傾向が明らかとなった。複数本の電圧分枝は、メサの面積が10μm^2以下でのみ観測され、その原因が接合内における電流分布にある可能性を示した。さらに、J_cの実験値が理論値に比べて1桁小さいことや、フラウンホーファー干渉パターンが明瞭に観測されないといった異常が観測され、電子ドープ型高温超伝導体においてもホールドープ型高温超伝導体と同様に超伝導の不均一性の存在が示唆された。2.Ce量χの異なる微小メサの層間伝導特性を解析した結果、擬ギャップ温度がキャリアドープに伴い直線的に減少する一方で、超伝導転移温度よりも高い値を示し続けるという傾向が明らかとなった。反強磁性-超伝導相境界に近接した組成(χ0.140)においても擬ギャップ温度は48Kと低い値であった。さらに、SCCOの伝導特性は過剰ドープ領域のホールドープ型高温超伝導体と類似していることもわかった。これに加えて、酸素欠損量を考慮してSCCO微小メサの実効的なキャリア濃度を見積もった結果、ホールドープ型高温超伝導体における重過剰ドープ領域に対応していることがわかった。これらの結果は、超伝導領域に限定すれば、電子ドープ型高温超伝導体がホールドープ型高温超伝導体と類似の電子相図を有する可能性を示唆している。1.電子ドープ型高温超伝導体Sm_<2-x>Ce_xCuO_4単結晶をフラックス法により作製し、フラックスフリーかつ平坦な表面をもつ不足ドープ領域(x=0.14)単結晶の育成に成功した。その単結晶を用いて4端子微小メサ構造(面積8x12μm^2、高さ約300Å)の作製を行った。作製プロセスの最適化により、電極部分の接触抵抗は現在までに、5×10^<-5>Ωm^2程度まで低減されている。2.得られたメサ構造を用いて、層間(c軸)伝導特性を測定した。抵抗率は零磁場において約21Kで鋭い転移を示しており、測定領域においてキャリア濃度はほぼ均一であると考えられる。また、磁場印加により超伝導を抑制することで、低温領域で半導体的な抵抗率の上昇、およびそれを抑制する負の磁気抵抗が現れた。これらの現象はバルク単結晶で観測されるよりも顕著かつ系統的であり、電子ドープ型高温超伝導体の物性研究におけるメサ構造の有用性を示唆している。3.電流-電圧特性においては、明瞭な超伝導電流および僅かなヒステリシスが確認できた。臨界電流値の温度依存性はAmbegaokar-Baratoff理論で予測される挙動に近いことから、電子ドープ型高温超伝導体が内包するジョセフソン接合はトンネル接合的であると考えられる。しかし、電極形成等のプロセスに関する問題も明らかとなったため、メサ形状を含めて再検討が必要である。また、ジョセフソン接合特性の評価には、発熱の問題などから3端子メサ構造が適していると考えられるため、更なる接触抵抗の低減は今後の重要な検討課題である。4.現在まで、Sm原子の反強磁性転移に伴う伝導特性の変化は見出されていない。1.フラックス法により育成した電子ドープ型高温超伝導体Sm_<2-x>Ce_xCuO_4(SCCO,x=0.14)単結晶上に4端子微小メサ構造(面積8×12μm^2、高さ約300Å)を作製し、層間(c軸)伝導特性を測定した。磁場で超伝導を抑制することにより、半導体的な挙動が顕在化し、その半導体的な部分で負の磁気抵抗が顕著に観測された。この特徴は、正孔ドープ型における擬ギャップ領域の振る舞いと定性的に一致しており、電子ドープ型高温超伝導体における擬ギャップの存在を示唆している。また、磁場印加に伴い転移温度は低下し、転移幅が比較的低磁場で飽和するという挙動は、正孔ドープ型の過剰ドープ領域と類似している。2.SCCOバルク単結晶の超高磁場下(45Tまで)c軸伝導特性を測定し、磁場印加により消失する抵抗成分の存在を明らかにした。この抵抗成分は微小メサで観測された負の磁気抵抗に対応しており、SCCOで観測される磁気抵抗はこの負の磁気抵抗成分と磁場の2乗に比例する正の磁気抵抗成分との和で説明されることがわかった。

また、擬ギャップの現れる温度と消失する磁場の間には、正孔ドープ型Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+δ>と同様の関係が成り立っており、正孔ドープ型と起源を同じくする擬ギャップの存在が強く示唆された。さらに、高温超伝導体で観測される負の磁気抵抗成分の大きさに関して、キャリアの種類によらない実験式を示した。3.現在まで、Sm原子の反強磁性転移に伴う伝導特性の大きな変化は見出されていない。今年度の成果として次のような結果が得られている。1.電子ドープ型高温超伝導体Sm_<2-χ>Ce_χCuO_<4-δ>(SCCO)単結晶上に作製した寸法2μm角、厚さ36nmの微小メサ構造において、電子ドープ型高温超伝導体で初めて固有ジョセフソン接合特性を観察することに成功した。この微小メサにおいては、電流電圧特性に微小メサの層数に対応する本数の電圧分枝が観察され、それがSCCOの結晶構造がトンネル型固有ジョセフソン接合を内包することを示している。作製したメサ(超伝導転移温度T_c=16-23K)の4.2Kにおける最大ジョセフソン電流密度J_cは5-8kA/cm^2であり、ヒステリシスの深さは最大で約10%であった。また、J_cとT_cがキャリアドープと共に減少するという傾向が明らかとなった。複数本の電圧分枝は、メサの面積が10μm^2以下でのみ観測され、その原因が接合内における電流分布にある可能性を示した。さらに、J_cの実験値が理論値に比べて1桁小さいことや、フラウンホーファー干渉パターンが明瞭に観測されないといった異常が観測され、電子ドープ型高温超伝導体においてもホールドープ型高温超伝導体と同様に超伝導の不均一性の存在が示唆された。2.Ce量χの異なる微小メサの層間伝導特性を解析した結果、擬ギャップ温度がキャリアドープに伴い直線的に減少する一方で、超伝導転移温度よりも高い値を示し続けるという傾向が明らかとなった。反強磁性-超伝導相境界に近接した組成(χ0.140)においても擬ギャップ温度は48Kと低い値であった。さらに、SCCOの伝導特性は過剰ドープ領域のホールドープ型高温超伝導体と類似していることもわかった。これに加えて、酸素欠損量を考慮してSCCO微小メサの実効的なキャリア濃度を見積もった結果、ホールドープ型高温超伝導体における重過剰ドープ領域に対応していることがわかった。これらの結果は、超伝導領域に限定すれば、電子ドープ型高温超伝導体がホールドープ型高温超伝導体と類似の電子相図を有する可能性を示唆している。
線虫C.elegansの神経特異的な新規MAPキナーゼカスケードの解析

MAPキナーゼカスケードは、酵母から動物細胞に至るまで高度に保存されているシグナル伝達系で、細胞増殖や分化、ストレス応答および細胞死(アポトーシス)などにに関与することが培養細胞などの系で示されているが、このタイプのMAPKカスケードは未だ全容が明らかになっておらず、その機能や役割についても不明の部分が多い。我々はMAPキナーゼカスケードがどのような機能を果たしているのか個体レベルで明らかにする目的で、線虫C.elegansをモデル動物としてそれを解析している。これまでに線虫の新規のMAPKであるjnk-1 (前遺伝子名sak-1)と、新規のMAPKKであるjkk-1 (前遺伝子名sek-2)遺伝子を単離している。また、それらの遺伝子がそれぞれ神経細胞で特異的に発現をしていることも確認している。今年度は、jnk-1遺伝子の周辺で作用する因子を単離、同定する目的で、酵母を用いてjnk-1を活性化する因子の探索を新たに行った。方法としては、線虫jnk-1を発現している酵母pbs2株に酵母で発現用ベクターに線虫cDNAライブラリーを導入し、pbs2株の表現型を抑圧するもののうち、その抑圧がjnk-1依存的であるものを単離することにより行った。その結果、酵母内でjnk-1依存的にpbs2破壊株の表現型を抑圧する因子として、これまでに単離されているsek-1、jkk-1以外に新たに2種類の遺伝子が単離された。これらの遺伝子はnovelであり、またMAPKKではないことから、jnk-1に結合してその活性をMAPKK非依存的に活性化する因子か、jnk-1に対して抑制的に働く酵母内の因子(ホスファターゼなど)に対して抑制的に働くものである可能性がある。今後、これらの遺伝子の発現パターンの解析や、jnk-1との結合の有無について詳細に解析する予定である。MAPキナーゼカスケードは、酵母から動物細胞に至るまで高度に保存されているシグナル伝達系で、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)、MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)、MAPキナーゼ(MAPK)よりなる。近年、動物細胞において新しいタイプのMAPキナーゼカスケード(SAPK/JNKカスケード、p38カスケード)の存在が明らかになっており、これがストレス応答や細胞死(アポトーシス)に関与することが培養細胞などの系で示されているが、このタイプのMAPKカスケードは未だ全容が明らかになっておらず、その機能や役割についても不明の部分が多い。我々はこの新しいタイプのMAPキナーゼカスケードがどのような機能を果たしているのか個体レベルで明らかにする目的で、線虫をモデル動物としてそれを解析することを試みた。まず、SAPKの線虫C.elegansのホモログであるsak-1と、それを特異的に活性化するMAPKKであるsek-2を単離した。つぎに、sak-1およびsek-2遺伝子が線虫のどこで発現しているかについてGFPを用いて調べたところ、どちらの遺伝子もほぼすべての神経細胞で特異的に発現が観察された。つぎに、sek-2遺伝子の機能をあきらかにする目的で、トランスポゾンを用いてsek-2破壊株を作製してその表現型を観察したところ、sek-2破壊株は運動異常の表現型を示し、プレート上をまっすぐ前進できないことが明らかになった。また、線虫はプレート上ではサインカーブを描いて前進・後退するが、sek-2破壊株は通常の野生株と比べて約2倍の振幅のサインカーブを描いて前進.後退した。sek-2破壊株の上記のような表現型は、sek-2遺伝子をsek-2破壊株に導入することにより抑圧された。ここで、sek-2破壊株の運動異常が、神経系の発生・分化などの異常によるのか、それとも神経の機能の異常によるものかについて、ヒートショックプロモーターの下流にsek-2を組み込んだ遺伝子を用いて解析したところ、sek-2破壊株の運動異常が神経の機能の異常によることが明らかになった。以上の結果から、線虫ではsak-1およびsek-2よりなる神経特異的なMAPキナーゼカスケードが存在し、正常な運動機能に必須の役割を果たしていることが明らかになった。

その結果、酵母内でjnk-1依存的にpbs2破壊株の表現型を抑圧する因子として、これまでに単離されているsek-1、jkk-1以外に新たに2種類の遺伝子が単離された。これらの遺伝子はnovelであり、またMAPKKではないことから、jnk-1に結合してその活性をMAPKK非依存的に活性化する因子か、jnk-1に対して抑制的に働く酵母内の因子(ホスファターゼなど)に対して抑制的に働くものである可能性がある。今後、これらの遺伝子の発現パターンの解析や、jnk-1との結合の有無について詳細に解析する予定である。