hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パウダーフローポリッシング法の提案と歯ブラシ法に代わる口腔内清掃システムへの適用

本研究の最終目的は過去数世紀にもわたって全世界で使用されてきた歯ブラシを用いた口腔清掃を一新し,容易で効果的な口腔内清掃システムを開発することにある.本年度は,昨年度に試作したパウダーフローポリッシング(PFP)装置を用いて,その加工特性(除去特性)について実験的に検討した.本PFP法は,研磨粒子による工作物垂直方向への作用力が微小であるため,工作物に与えるダメージが小さい.さらに研磨砥粒の水車方向への速度が大きいため,能率的に材料除去ができる.また,現存する噴射加工では噴射砥粒と除去された材料は空間中に放出されるため,それらの回収工程が必要であったのに対し,PFP法ではそれらが管内から放出されることがないため,回収工程が必要ない,等の特徴を有する.加工実験には,研磨粒子として植物の繊維を造粒した口腔用結晶性セルロース(メジアン径33μm)を用いた.これは化学的に安定で多量に摂取しても人体に対して全く危害がない.また歯面に付着した歯垢を模擬し,ガラス板に塗布した油性塗料を使用した.加工結果は,除去領域の面積(以下,加工面積と記す)と最大深さ(以下,加工深さと記す)で評価した.その結果,加工時間,平均流速,チューブ押し込み量が増えるほど加工面積,加工深さが増加することがわかった.このことより,本PFP法を用いた清掃システムは,口腔内においても十分な歯垢除去能力を有することが明らかになった.本研究の最終目的は過去数世紀にもわたって全世界で使用されてきた歯ブラシを用いた口腔清掃を一新し,容易で効果的な口腔内清掃システムを開発することにある.そのため最初に,研磨粒子を高速で運動させ,粒子の飛散がほとんどないパウダーフローポリッシング装置を製作しなければならない.そしてPFP法の基本的な加工特性と,口腔内清掃に適用した場合のプラークの除去特性,歯面に与える影響を調べる。次に,口腔内清掃装置専用のマウスピースを試作し,除去特性への影響を検討する.本年度は本研究で使用する口腔用パウダーフローポリッシング装置を設計,試作した.研磨粒子としては,申請者らが開発した口腔用結晶性セルロースを使用する.これは植物の繊維を造粒したものであり,化学的に安定で多量に摂取しても人体に対して全く為害性がない.医薬品や食品の添加剤としても使用されているものである.またこの研磨粒子を供給する方法として次の2つを検討した。一つは申請者がすでに開発したアブレイシブジェット加工用微量供給装置を用いる方法,もう一つは微粒子用流動床を使用する方法である.その結果,流動床を使用する方法の装置を試作した.しかし,装置を樹脂製で製作したため,摩擦帯電の影響が大きく,放電することが確認された.現在その対策を行っているところである.来年度は,装置の改良後に,実際の歯面清掃実験を行う予定である.本研究の最終目的は過去数世紀にもわたって全世界で使用されてきた歯ブラシを用いた口腔清掃を一新し,容易で効果的な口腔内清掃システムを開発することにある.本年度は,昨年度に試作したパウダーフローポリッシング(PFP)装置を用いて,その加工特性(除去特性)について実験的に検討した.本PFP法は,研磨粒子による工作物垂直方向への作用力が微小であるため,工作物に与えるダメージが小さい.さらに研磨砥粒の水車方向への速度が大きいため,能率的に材料除去ができる.また,現存する噴射加工では噴射砥粒と除去された材料は空間中に放出されるため,それらの回収工程が必要であったのに対し,PFP法ではそれらが管内から放出されることがないため,回収工程が必要ない,等の特徴を有する.加工実験には,研磨粒子として植物の繊維を造粒した口腔用結晶性セルロース(メジアン径33μm)を用いた.これは化学的に安定で多量に摂取しても人体に対して全く危害がない.また歯面に付着した歯垢を模擬し,ガラス板に塗布した油性塗料を使用した.加工結果は,除去領域の面積(以下,加工面積と記す)と最大深さ(以下,加工深さと記す)で評価した.その結果,加工時間,平均流速,チューブ押し込み量が増えるほど加工面積,加工深さが増加することがわかった.このことより,本PFP法を用いた清掃システムは,口腔内においても十分な歯垢除去能力を有することが明らかになった.
真核生物におけるDNA複製複合体の分子構築と機能解析

酵母および哺乳動物細胞を用いて真核生物におけるDNA複製複合体の分子構築とその作用機序を解明するために、以下の4つの方向から研究を進めてきた。1.分裂酵母のRfc3:我々が最近開発に成功した重差分化法という新たな技術を用いて数多くクローン化した分裂酵母の減数分裂前DNA合成開始制御に関わる遺伝子群の中に、出芽酵母のReplication Factor Cの3番目のサブユニット(Rfc3)に酷似した構造を持つ遺伝子が見つかった。その機能解析をした結果、この遺伝子はmitosisにおけるDNA複製に重要な働きをしているRfc3そのものであることが示唆された。このRfcはDNA複製のみでなく、DNA複製チェックポイントやDNA傷害チェックポイントにも密接に絡んでいることが分かったので、それらの点について詳しく解析した。2.哺乳動物細胞E2FのS期開始制御機構:哺乳動物細胞のG1/S期での転写誘導に重要な役割を果たすE2F蛋白質について、その制御機構を解析した。特にDNA複製開始制御に関わるHsMCM遺伝子の転写制御機構を詳しく解析した。3.哺乳動物のMCM/Pl蛋白質:哺乳動物細胞のDNA複製開始制御に関わる碓類のHsMcm2-7蛋白質に対して作製した抗体や、バキュロウイルス系を用いて純化したHsMCM蛋白質を用いて、免沈や電顕などによりHsMcm2-7複合体全体の構造と機能を解析した。4.出芽酵母のNiklのS期開始制御:発現がG1/S期でピークを持つ細胞周期性振動を繰り返すNIKIは、G2/M期遷移の制御のみでなく、S期開始制御も行うことを我々は新たに見出したので、その分子制御機構を詳しく解析した。
極低放射能技術の最先端宇宙素粒子研究への応用

本研究では、本領域「地下宇宙」が成功するために優先して進めるべき次の4つのテーマを、他の計画研究班と連携しながら進める。1.世界初の中性子バックグラウンドの体系的理解(計画研究A02、B01、B02班と連携)2.水やキセノンガス中からのラドン除去(計画研究A01、B01、B02、C01班と連携)3.低バックグラウンド材料の選定(計画研究A01、A02、B01、B02、C01、D02班と連携)4.データベースを用いた測定結果の国内外への発信本研究では、本領域「地下宇宙」が成功するために優先して進めるべき次の4つのテーマを、他の計画研究班と連携しながら進める。1.世界初の中性子バックグラウンドの体系的理解(計画研究A02、B01、B02班と連携)2.水やキセノンガス中からのラドン除去(計画研究A01、B01、B02、C01班と連携)3.低バックグラウンド材料の選定(計画研究A01、A02、B01、B02、C01、D02班と連携)4.データベースを用いた測定結果の国内外への発信
ヌードマウス移植固型腫瘍に対するインターロイキン2の抗腫癌効果

ヒト固型腫瘍の発育,増殖に会するインターロイキン2の抗腫瘍効果をヌードマウスをモデル動物として検討することを目的として本研究を開始した.無菌的に手術的に摘出されたヒト固型腫瘍し主に乳癌)をヌードマウスの背部皮下に移植し,継代移植可能なものを選出することから研究に着手したが,継代移植可能な腫瘍がなかなか得られず,ヌードマウスの死亡率も高度であった.これには当施設に於いては完全な無菌室が使用できず,そのために細菌汚染による死亡が多いものと考えられた.以上の事情によりヌードマウスの使用を断念し,モデル動物をラットに変更して化学発癌の初期におけるインターロイチン2の抗発癌作用を検討することに研究を変更した.現在,ウィスター系ラット40匹を用いて, 1群:無処置群10匹, 2群:ジメチルヒドラジン20mg/kg,週1回投与16週,及びインターロイキン皮下注1回/日, 16週, 3群:ジメチルヒドラジン20mg/kg週1回投与16週及び,インターロイキン2皮下注, 9週目より1回/日8週間, 4群:ジメチルヒドラジン20mg/kg週1回投与, 16週のスケジュールで化学発癌に対するインターロイキン2の効果を検討中である.実験終了時まで結果が分らないため現時点では結果を示すことはできないが,ジメチルヒドラジン投与によりラットの大腸に高率に発癌がみられることより,第2群及び3群のラットで発癌率の低下が認められれば,発癌の初期の時点に於て,インターロイキン2が,その発癌の抑制作用を有することが示唆されるではないかと考えている.また実験終了時には種々の免疫学的アッセイ及び病理組織学的検討を加える予定である.ヒト固型腫瘍の発育,増殖に会するインターロイキン2の抗腫瘍効果をヌードマウスをモデル動物として検討することを目的として本研究を開始した.無菌的に手術的に摘出されたヒト固型腫瘍し主に乳癌)をヌードマウスの背部皮下に移植し,継代移植可能なものを選出することから研究に着手したが,継代移植可能な腫瘍がなかなか得られず,ヌードマウスの死亡率も高度であった.これには当施設に於いては完全な無菌室が使用できず,そのために細菌汚染による死亡が多いものと考えられた.以上の事情によりヌードマウスの使用を断念し,モデル動物をラットに変更して化学発癌の初期におけるインターロイチン2の抗発癌作用を検討することに研究を変更した.現在,ウィスター系ラット40匹を用いて, 1群:無処置群10匹, 2群:ジメチルヒドラジン20mg/kg,週1回投与16週,及びインターロイキン皮下注1回/日, 16週, 3群:ジメチルヒドラジン20mg/kg週1回投与16週及び,インターロイキン2皮下注, 9週目より1回/日8週間, 4群:ジメチルヒドラジン20mg/kg週1回投与, 16週のスケジュールで化学発癌に対するインターロイキン2の効果を検討中である.実験終了時まで結果が分らないため現時点では結果を示すことはできないが,ジメチルヒドラジン投与によりラットの大腸に高率に発癌がみられることより,第2群及び3群のラットで発癌率の低下が認められれば,発癌の初期の時点に於て,インターロイキン2が,その発癌の抑制作用を有することが示唆されるではないかと考えている.また実験終了時には種々の免疫学的アッセイ及び病理組織学的検討を加える予定である.
酵母の多様なチトクロームP450遺伝子を利用する炭化水素鎖末端酸化化合物の生産

本研究計画では、申請者らの単離した炭化水素鎖を酸化する酵母の多様なチトクロームP450の遺伝子を必要に応じてその還元酵素とともに、異種酵母あるいは細胞壁の安定なコリネ型細菌に導入し、長鎖ジカルボン酸(DCA)を含む末端酸化炭化水素鎖化合物の新しい生産系を確立することを目的とした。Saccharomyces cerevisiae YPH500株をはじめとする標準的酵母宿主に、GAL1遺伝子あるいはADH1のプロモーターの下流にCandida maltosaの各種チトクロームP450ALK(以下P450ALK)をコードするALK遺伝子を繋いだYEpプラスミド(pYPR-ALK1他)を導入した。これは既に、ALK1、ALK2、ALK3、ALK5、ALK7、ALK8について完成した。この結果、それぞれの遺伝子産物の気質特異性が明らかになり、Alk1pはn-alkaneにのみ作用し、Alk3pはn-alkaneと脂肪酸の両方に、しかしよりn-alkaneをよく酸化し、Alk5pはn-alkaneと脂肪酸両方でもより脂肪酸に、Alk7pとAlk8pはn-alkaneはほとんど酸化せず、専ら脂肪酸のω酸化を行うことが明らかになった。従って、それぞれの基質特異性を利用すれば、DCAの生産が効率よく行われるものと考えられた。一方,Yarrowia lipolyticaの8種のチトクロームP450ALKについて遺伝子ヌクレオチド配列から構造を推定したところ、それらは新たなCYP52サブファミリーをなす事が明らかとなった。うち、Alk1pがn-decaneの酸化に最も重要であった。Alk2pはヘキサデカンの酸化にある程度働くことも明らかになった。残念ながら、新たなDCA生産菌の構築は達成困難であったが、各種P450ALKにつき、利用できる可能性を示すことができ、ある程度の成果を得ることができた。本研究計画では、申請者らの単離した炭化水素鎖を酸化する酵母の多様なチトクロームP450の遺伝子を必要に応じてその還元酵素とともに、異種酵母あるいは細胞壁の安定なコリネ型細菌に導入し、長鎖ジカルボン酸を含む末端酸化炭化水素鎖化合物の新しい生産系を確立することを目的とする。本年度の計画ではSaccharomyces cerevisiaeYPH500株をはじめとする標準的酵母宿主に、GAL1遺伝子あるいはADH1のプロモーターの下流にCandida maltosaの各種チトクロームP450ALK(以下P450ALK)をコードするALK遺伝子を繋いだYEpプラスミド(pYPR-ALK1他)を導入する。これは既に,ALK1,ALK2,ALK3,ALK5,ALK7,ALK8について完成した。一方,Yarrowia lipolyticaの8種のチトクロームP450ALKについても同様のものを作成中である。また、P450ALKの還元酵素遺伝子についても、C.maltosa由来のもの及びYarrowia lipolytica由来のもののそれぞれについてクローン化したものについて、P450ALKとの共発現系を作成し、S.cerevisiae株に導入する計画であった。これは既にSchunckらのグループで同種のものが作製されているので入手を検討している。また,最近工業用ジカルボン酸生産菌はC.maltosaの一種であることが判明し,この高生産菌のP450ALK生産を調べたところ,いくつかのP450遺伝子について高い発現が見られた。その発現機構を調べ,ジカルボン酸生産への寄与を検討中である。

本研究計画では、申請者らの単離した炭化水素鎖を酸化する酵母の多様なチトクロームP450の遺伝子を必要に応じてその還元酵素とともに、異種酵母あるいは細胞壁の安定なコリネ型細菌に導入し、長鎖ジカルボン酸を含む末端酸化炭化水素鎖化合物の新しい生産系を確立することを目的とする。本年度はSaccharomyces cerevisiaeYPH500株をはじめとする標準的酵母宿主に、GAL1遺伝子あるいはADH1のプロモーターの下流にCandida maltosaの各種チトクロームP450ALK(以下P450ALK)をコードとするALK遺伝子を繋いだYEpプラスミド(pYPR-ALK1他)を導入した。これは既に、ALK1、ALK2、ALK3、ALK5、ALK7、ALK8について完成した。この結果、それぞれの遺伝子産物の気質特異性が明らかになり、Alk1pはn-alkaneにのみ作用し、Alk3pはn-alkaneと脂肪酸の両方に、しかしよりn-alkaneをよく酸化し、Alk5pはn-alkaneと脂肪酸両方でもより脂肪酸に、Alk7pとAlk8pはn-alkaneはほとんど酸化せず、専ら脂肪酸のω酸化を行うことが明らかになった。従って、それぞれの基質特異性を利用すれば、ジカルボン酸の生産が効率よく行われるものと考えられた。一方、Yarrowia lipolyticaの8種のチトクロームP450ALKについて遺伝子ヌクレオチド配列から構造を推定したところ、それらは新たなCYP52サブファミリーをなす事が明らかとなった。うち、Alk1pがn-decaneの酸化に最も重要であった。
小学校におけるプログラミング教育のためのカリキュラムの開発

本年度は、小学校におけるプログラミング学習のカリキュラムの作成と教材の開発を行い、小学校における試行実験を行う予定であった。情報科学・情報工学の視点からの理想的な学習内容、学習方法及び評価点については完成した。しかし、これらを学校側の視点から見た場合、受け入れ可能であるのか、実現可能であるのかを試行実験などの結果を検討したうえで提案しなければ、実際に小学校の授業としての試行実験をお願いすることは難しいと判断した。そこで、本年度は昨年度から実施している本研究で提案している学習内容が小学校の各学年で実施可能かどうかの試行実験の追加実施を行い、それらの結果を小学校の教員に提示して、意見聴取をすることに重点を置いて研究を行った。試行実験として、小学校1・2年生を対象として3回、小学校3・4年生を対象として1回、小学校5・6年生を対象として1回実施した。これらの結果から学年区分の見直しが必要であること、学年区分ごとに適した端末やプログラミング言語などについての知見を得ることができた。更にこれらの知見に対して、12月から2月にかけて、小学校のプログラミングに関する研究授業に訪問した際に聞き取り調査を行ったり、教員向けの研修会などで試行実験についての結果を発表したりすることで、参加者からの感想や意見を収集することを行った。その結果、学修成果の評価方法については、学校教員からの共感を概ね得ることができた。また、カリキュラムについても、学年ごとの学習目標や学習内容について、意見を聴取した結果、学校のICT環境の整備に応じたカリキュラムモデルの提示と、学校でのICT環境の整備目標との関係についても具体的に示す必要性が分かり、一覧表の制作を年度末から実施し、次年度初めにも完成する予定である。本年度は研究協力者による小学校の特定のクラスでの実証実験を行う予定であったが、研究実績の概要でも述べた通り、より小学校での実施を受け入れやすくするために、学校教員からの意見聴取なども実施して、より現実的なカリキュラムの作成を目指し、小学校以下外の場での試行実験を行い、その結果をもって全体の完成度を上げることに重点を置いた。試行実験は、予定通り実施したが、更なる試行実験の必要性も判明した。しかし、試行実験は、対象となる児童の募集、場所、教材等の確保に時間がかかるため、次年度以降も引き続き実施する予定である。小学校での実証実験については、本年度の試行実験を基にした学校教員への意見聴取などの結果から、より現実的なカリキュラムを開発することができたため、次年度には特定のクラスによる実証実験に加えて、学校全体での取り組みとして受け入れてもらえる小学校を確保することができた。また更に、その小学校とは2020年度以降に予定していた、より高度な内容のカリキュラムについても、前倒しして開発及び実証実験を実施することで計画を進めている。したがって、本年度の計画に対する進捗はやや遅れているものの、次年度では一部前倒しで研究計画を実施する予定であり、次年度では全体として予定通りの進捗となることが期待される。小学校以外の場での試行実験に対しては、本年度までの結果から更に実験を行うことで確認が必要な学習内容や、学修教材、教育方法があることが判明したため、引き続き小学校以外の場での試行実験を実施する。これにより、全体の研究成果の向上を図る。教材については、試作品は完成したため、これらを次年度の試行実験・実証実験で使用して、次年度中の完成を目指す。小学校での実証実験としては、特定のクラスで実施するものとして3校、学校全体として実施するものとして1校を確保したため、今年度までの成果を基に、実証実験を開始し、学校教員と協力して分析・評価までを実施する。本年度は、試作したカリキュラムや試行実験の結果については、学校教員からの意見聴取を最重要視したため、学術論文や学会等での成果発表は行わず、学校での研究発表や教員研修の場での発表、書籍による成果発表などに重点を置いてきた。しかし、学術分野での発表も重要であるため、次年度は学術雑誌や国内外での学会において、研究成果を発表し、学術的な評価を得るようにするとともに、Webサイトなどを通じた学校教員向け情報発信を行っていく。これまでに収集・調査した英国の教科「Computing」の情報をもとに,小学校学習指導要領で示された、「プログラミングを体験しながら,コンピュータに意図した処理を行わせるために必要な論理的思考力を身に付けるための学習活動」で修得するスキルに着目してカリキュラムの設計を行った。このカリキュラムに基づき、小学校低学年向けのプログラムと高学年向けの学習プログラムを設計した。設計した学習プログラムの内、低学年向けプログラムを小学校1年生15名、2年生10名に対して平成29年8月に実施した。プログラムは共通した活動課題に対して、体験(アンプラグド)とプログラミングの両方を体験させることにより、コンピュータを使うことの利点を学ばせた。この実践については西日本新聞などでも取り上げられるなど反響が高かった。また、学会でも報告をしたところ、学習内容や配布資料に関する問い合わせが小学校からあり、資料の提供を行った。平成29年10月に教科「Computing」が導入されてから4年目となる英国の小学校3校、教育委員会、企業などを訪問し調査を行った。今回訪問した小学校の内、2校英国内でも先進的に教科「Computing」に取り組んでいる学校で、使用されているハードウエアが以前から変わってきている点や、他の授業でのプログラミング体験学習が良い効果を上げている点などの情報を収集することができ、参考になった。また、もう1校は後進的な学校で、その原因や問題点、今後の展望などの聞き取り調査を行うことができ、先進的な2校と対比することができ、参考になった。

また、教育委員会への訪問では、これまでの教材開発などに重点を置いていた対応から、教員研修の充実に重点を置き始めている様子が見られて、わが国での導入に対して参考となる情報を収集することができた。平成29年度の計画で、実施できなかったものは、小学校高学年向けの試行実験のみである。これは、当初実施を予定してはいたものの、実施先との日程調整がつかなかったことが主な原因である。尚、この平成29年度に実施されなかった高学年向け試行実験については、平成30年7月に実施することが確定している。本年度は、小学校におけるプログラミング学習のカリキュラムの作成と教材の開発を行い、小学校における試行実験を行う予定であった。情報科学・情報工学の視点からの理想的な学習内容、学習方法及び評価点については完成した。しかし、これらを学校側の視点から見た場合、受け入れ可能であるのか、実現可能であるのかを試行実験などの結果を検討したうえで提案しなければ、実際に小学校の授業としての試行実験をお願いすることは難しいと判断した。そこで、本年度は昨年度から実施している本研究で提案している学習内容が小学校の各学年で実施可能かどうかの試行実験の追加実施を行い、それらの結果を小学校の教員に提示して、意見聴取をすることに重点を置いて研究を行った。試行実験として、小学校1・2年生を対象として3回、小学校3・4年生を対象として1回、小学校5・6年生を対象として1回実施した。これらの結果から学年区分の見直しが必要であること、学年区分ごとに適した端末やプログラミング言語などについての知見を得ることができた。更にこれらの知見に対して、12月から2月にかけて、小学校のプログラミングに関する研究授業に訪問した際に聞き取り調査を行ったり、教員向けの研修会などで試行実験についての結果を発表したりすることで、参加者からの感想や意見を収集することを行った。その結果、学修成果の評価方法については、学校教員からの共感を概ね得ることができた。また、カリキュラムについても、学年ごとの学習目標や学習内容について、意見を聴取した結果、学校のICT環境の整備に応じたカリキュラムモデルの提示と、学校でのICT環境の整備目標との関係についても具体的に示す必要性が分かり、一覧表の制作を年度末から実施し、次年度初めにも完成する予定である。本年度は研究協力者による小学校の特定のクラスでの実証実験を行う予定であったが、研究実績の概要でも述べた通り、より小学校での実施を受け入れやすくするために、学校教員からの意見聴取なども実施して、より現実的なカリキュラムの作成を目指し、小学校以下外の場での試行実験を行い、その結果をもって全体の完成度を上げることに重点を置いた。試行実験は、予定通り実施したが、更なる試行実験の必要性も判明した。しかし、試行実験は、対象となる児童の募集、場所、教材等の確保に時間がかかるため、次年度以降も引き続き実施する予定である。
数学科におけるプロセス能力の形成的アセスメントに関する研究

本研究の目的は,数学科において,真正な現実画面の問題とルーブリックを作成し,問題を解決するプロセスに焦点を当て,形成的アセスメントとして授業で活用し,その有効性を実証的に示すことである。そのために,現実場面の問題を扱いながらプロセス能力の育成に焦点を当てた教材であるイギリスのデジタル教材「Bowland Maths.」や「Core Maths」に着目し,その中から日本の文脈に合わせて開発できる教材をいくつか選んだ。また,「Bowland Maths.」のケーススタディで育成されたプロセス能力を評価するために提供されている「Assessment Task(評価課題)」の中から日本の文脈に合わせて開発できる教材をいくつか選び,ルーブリックの有効性を分析した。イギリスで形成的アセスメントを取り入れた授業を実践されている先生方と形成的アセスメントを取り入れた授業の在り方について検討した。形成的アセスメントの方法として以下の方法が有効であることがわかった。一つ目は,自力解決をさせたあと,ルーブリックを与え自己評価させ,その後,グループで,ルーブリックをもとに相互評価させ解決方法を改善させる方法。二つ目は,自力解決をさせたあと,プリントを回収し教師がルーブリックをもとに改善の方針に当たるコメントを生徒にフィードバックし,その後,生徒に自らの解決方法を改善させる方法。これらの方法を課題に応じて実践することで,個々のプロセス能力が徐々に向上していくことがわかった。また,「Bowland Maths.」が始めた,生徒の数学的問題解決能力を測り,その伸長を1年間かけてモニターすることを目的とする調査の日本における実践を行い,イギリスでの調査結果と比較をし,イギリスの研究会において、日本の中学生にみられる特徴について報告した。
新規フォトニクスガラス材料探索のためのコンピュータ支援システムの開発

今までになかった材料を新規に合成していくことは重要なことである。近年、スーパーコンピュータが並列処理機能をもてるようになったことで、その性能は著しく向上し、材料設計にコンピュータシミュレーションを用いて効率化をはかることは、ほぼ確実になってきている。本年度は対象を光機能性材料として非常に有望なニューガラスを用い、コンピュータシミュレーションにより、光機能性を発現する組成探索を行なうことを目的としている。得られた成果は次の通りである。1.長波長光を短波長光に変換する赤外-可視変換ガラスは、光ディスクの高密度化をはかる上で重要になると思われる。それは波長が半分になると読み取り面積が4倍となるので4倍の記録密度をもつことになるからである。これまで種々のガラスが試行錯誤的に作製され、その赤外可視変換効率を調べていくという研究がなされてきたが、その効率はきわめて悪かった。これは、入射赤外光が非輻射緩和するといった熱エネルギー変換をしてしまうからである。そこで非輻射緩和をしないような組成探索シミュレーションを行なった。その結果、酸化物<フッ化物<塩化物<臭化物<ヨウ化物の順で非輻射損失が少なくなることが分かった。そこで塩化物ガラスを作製すると、その変換効率は1%にも達する赤外-可視変換ガラスを作ることができた。2.光ディスクの記録密度を上げるもう一つの方法は、波長多重性を利用して、データを読み取ることである。これをホールバーニングとよぶが、そのためには、蛍光線幅が広いことが必要である。そのために希上類イオンを種々のガラス組成の中へドープしたシミュレーションを行ない、アルカリホウ酸塩ガラスが最もその線幅が広いことが分かった。又、そのレーザー照射により室温でホールが形成されることも分かり、実用化への期待が大きくなっている。
低酸素に着眼した関節リウマチにおける骨破壊の分子機構の解明と治療への応用

関節リウマチは滑膜炎を主体に関節破壊を引き起こし、破骨細胞による骨破壊はその直接的な原因である。関節リウマチの滑膜組織においては細胞増殖の亢進、炎症細胞の浸潤に伴い酸素需要が増大し、低酸素状態である。低酸素下では破骨細胞分化が促進されることが知られているが詳細な機序は不明である。低酸素下破骨細胞分化促進を制御する因子を同定し、関節リウマチの骨破壊機構の解明と新たな治療法を探索すべく実験を行った。健常人ボランティアから得た末梢血からフィコールにて末梢血単核球を分離、磁気抗体ビーズを使用してCD14陽性細胞に対してポジティブセレクションを行った。M-CSFを加えて破骨前駆細胞を作成した。申請者が低酸素下破骨細胞分化に関わる分子の探索を行うために行ったRNAシーケンスの結果、破骨細胞分化に関わると予測された転写分子33個のうち、これまでに破骨細胞分化における役割が同定されていないものの1つについて注目した。リアルタイムPCRにて、低酸素刺激あるいはRANKL刺激による破骨前駆細胞におけるmRNAレベルでの変化は認めなかった。しかし、免疫染色を施行したところ、破骨前駆細胞においてこの転写因子は、通常大気下では細胞質、核内に均等に存在するのに対し、低酸素下でRANKL刺激を行うとでは核内に移行することを発見した。これは低酸素およびRANKL刺激下でこの転写因子の活性化を示唆する所見であると考えられた。現在siRNAを用いたノックダウンを行い、この転写因子の役割を解析している。29年度が最終年度であるため、記入しない。
離散極値構造の研究

互いにt点で交差する集合族の測度の積の最大値に関する研究をSang June Lee氏、Mark Siggers氏とおこない、交差族に関するAhlswede--Khachatrianの定理を拡張した。最大値とそれを達成する唯一の構造(極値構造)を決定し、測度の積が最大値に近い場合には、対応する集合族も極値構造に近いこと、すなわち、安定性があることも示した。さらに交差族が二つであることに特有の構造が生じることも明らかにした。結果については論文にまとめ、現在投稿中である。n点集合のa点部分集合族とb点部分集合族が互いに交差するとき、そのサイズの積の最大値が一点を固定する集合族で達成されるためのa,bの条件について考察した。これは、nが2a以上、2b以上の場合にはErdos--Ko--Radoの定理の自然な拡張になることが知られているが、nが小さい場合については未知である。対応する測度版での考察からa,bに関する必要十分条件の予想を立て、その一部について証明した。多重交差族のサイズ評価に関連して得られるある不等式について研究し、加藤満生氏、小須田雅氏と検討した。これはn変数の多項式間の不等式であるが、計算機実験をおこなった結果nが小さいところでは正しいことを確かめた。画像処理に関する文献収集、予備実験等をおこなった。極値集合論の教科書は基本的な結果の新しい証明や、最近の研究成果なども盛り込みつつ、予定通りに出版することができた。また二つの交差する集合族に関して、期待されていた結果や、新しい知見を得ることができ、これまでのところ研究は概ね順調に進んでいる。極値組合せ論に現れるさまざまな問題について、組合せ論的な手法、代数的な手法、確率論的な手法などを適宜用い、さらにこれらの手法を複合的に利用する可能性も追求しながら問題の解決をはかる、という目標にしたがってこれまで通りに研究を続ける。今年度は前年度に引き続きSang June Lee氏とMark Siggers氏との共同研究のとりまとめ、正則化の手法についての整理、再検討を行うほか、これらと並行して応用に関する情報収集等も行いたい。学内業務の都合で予定していた国際学会への出席をとりやめたため残額が生じた。次年度の旅費として利用する予定である。
リボキシゲナーゼ活性操作による豆腐の食味の向上と多様化を図る新育種法の開発

リポキシゲナーゼ(L1,L2,L3)活性は、寒冷地生産の品種が,暖地生産の品種の比べ高い傾向を示した。新丹波黒のpH9でのリポキシゲナーゼ活性(L1)が低い形質は遺伝的支配によることを示した。欠失変異の塩基配列を利用してマーカーの開発を行った。L3のプロモーター領域の変異を利用してL3欠失型検出用と野生型検出用として使える2組のDNAマーカーを開発した。また,L2欠失型の判別は構造遺伝子のSNPを用いてDNAマーカーを開発した。普通品種スズユタカ(L123)、ゆめゆたか(L1)、関東102(L2)、九州119(L3)、いちひめ(全欠)の破砕に伴うオキシリピン代謝について検討した。どの品種でも酸化脂質は遊離脂肪酸画分よりグリセロ脂質画分に多く見いだされた。生成した酸化脂質量は関東102で最も多く、ゆめゆたかといちひめで最も低かった。生しぼり豆腐は加熱しぼり豆腐よりもこく味、甘味が有意に強く感じられた。香気成分のhexanoic acidは生しぼり豆腐で有意に多く存在していた。Lox活性作用によって生成するhexanoic acidは豆腐特有のこく味(風味)に寄与する主要な成分であり甘味も増強することが示唆された。大豆を高温・高湿条件下で保存すると、hexanal、hexanoic acid、maltolの生成量が増加することが認められ、豆腐の味質に影響することが示唆された。以上の結果から、リポキシゲナーゼ反応由来の脂質酸化生成物が豆腐のこく味、甘味に寄与する成分であり、本酵素活性を制御することにより豆腐の味質を多様化できることを示した。今後、リポキシゲナーゼ欠失品種と普通品種とのブレンドや部分欠失性を利用した応用研究が必要であろう。つくば市の作物研究所,北大農学部等で増殖した平成15年度産の多数の大豆品種を対象にリポキシゲナーゼイソ酵素(Lox-1,Lox-2,Lox-3)活性を分析し、Lox-1活性,Lox-2+Lox-3活性が部分的に低下した品種を複数認めた.逆に,コントロールとした普通品種スズユタカよりイソ酵素活性が大幅に増大した品種を複数認めた.本酵素活性,特にLox-2活性は栽培・収穫・保存条件で変化することが知られており,これらの活性差が遺伝的であるかの確認を行っている.また,当初の研究実施計画にはないが,大豆脂質の脂肪酸組成の変異検索を実施し,リポキシゲナーゼの基質となるリノール酸含有率が大幅に低下し,基質とならないオレイン酸含有率が大幅に向上した変異大豆品種を複数認めた.豆腐の風味に寄与する香気成分の生成に及ぼすリポキシゲナーゼアイソザイムの影響について検討した.つくば産のスズユタカ系統の大豆5種[(スズユタカ(Lox-1,Lox-2,Lox-3全有)、ゆめゆたか(Lox-1有)、関東102号(Lox-2有)、九州119号(Lox-3有)、いちひめ(全欠)]から調製した豆腐の香気成分を調べたところ、スズユタカと関東102号(香気の高いグループ)とゆめゆたか、九州119号及びいちひめ(香気の低いグループ)に分かれた.この結果は、Lox-2が豆腐の風味生成に寄与することを示唆した.また,全有と全欠系統の脂肪酸酸化物組成の違いを分析し、その組成に明らかな違いを認めた,現在、各成分の構造決定、また定量を進めている.フレーバー生成に寄与するリポキシゲナーゼ変異体は単離されているが,それ以外の変異による揮発成分組成変異体は知られていない.

そこで,1000種のダイズについて種子破砕時に生成されるフレーバー成分の組成に関する変異体のスクリーニングを行っている.フレーバー成分は固相マイクロ抽出法により分析し,これまでに150種の解析を終え,数種の興味深い変異体を同定した.昨年リポキシゲナーゼ(Lox-1,Lox-2,Lox-3)活性が部分的に低下した品種(エンレイ、すずおとめ、新丹波黒)を認め、今夏、北大圃場内でハウス栽培した。新丹波黒のLox-1活性は、普通品種の1/3程度、Lox-2・Lox-3活性は1/2程度と低いことが確認できた。しかし、エンレイ、すずおとめの活性は、普通品種とほぼ同程度であった。豆腐の風味に及ぼすLox活性の影響を調べるために、15年度産の114品種のLox活性を測定し、この中から活性の高い4品種と低い4品種を選抜した。これらの大豆から調製した豆腐の香気成分量は活性の高い大豆ほど多いという結果は得られなかった。一方、温暖地で栽培された大豆ほどhexanoic acid等の香気成分量が多かったことから、大豆の収穫・保存温度等が香気成分生成に大きく影響すると推察した。生成した脂質過酸化物が豆腐加工時に熱分解を受け、一部は揮発性物質へと変化し、また、一部はアミノ酸等と結合し、種々の呈味成分を生成する可能性がある。そこで、スズユタカ(Lox-1,Lox-2,Lox-3有)、ゆめゆたか(Lox-1有)、関東102号(Lox-2有)、九州119号(Lox-3有)、いちひめ(Lox欠)より磨砕液を調製し、過酸化脂質量を定量した。その結果、関東102号が最も多くの酸化脂質を生成し、Lox-2が酸化脂質生成に大きく貢献すること、また、遊離脂肪酸の酸化物に比べ、グリセロ脂質酸化物が多く、Lox-2はトリアシルグリセロールを直接酸化することが明らかとなった。また一部はヒドロキシ基に還元後、さらに酸化されてカルボニル基へと変換されていた。ゆめゆたか、いちひめでは酸化脂質の生成量が検出限界以下に抑えられていた。こうした酸化脂質生成物の質・量の差が豆腐のこくの違いを反映するのであろう。今後は豆腐の風味の多様化を図るために、Lox組成および活性との関係解明を進めるとともに、Lox選抜のためにDNAマーカーを開発する。昨年確認したリポキシゲナーゼ(Lox)活性が低下した新丹波黒とタマホマレの交雑F_1をガラス温室にて養成し,F_2種子を採種した。F_2種子114粒の酵素活性はほぼ両親の活性範囲に分布し,新丹波黒と同程度の活性を示す低活性種子を認めた。Lox-3のプロモーター領域の変異を利用してLox-3欠失型検出用と野生型検出用として使える2組のDNAマーカーを開発した。また,Lox-2欠失については構造遺伝子の1596番目の塩基の変異を利用して、Lox-2欠失型の検出用DNAマーカーを開発した。豆腐の風味に及ぼすLox活性の影響を調べるために,生しぼりと加熱しぼり豆腐の官能評価及び呈味・香気成分の比較分析を行った。生しぼり豆腐は加熱しぼり豆腐よりもこく味、甘味が有意に強く感じられた。豆腐の甘味成分である遊離糖、不快味成分であるイソフラボンの各量は両豆腐間で差がなかったが,香気成分のhexanoic acidは生しぼり豆腐で有意に多く存在していた。Lox活性作用によって生成するhexanoic acidは豆腐特有のこく味(風味)に寄与する主要な成分であり、甘味も増強する可能性が示唆された。豆腐の風味に関与する揮発性、および不揮発性化合物の生成機構について調査した。
腎疾患におけるオートファジー・リソゾーム系の病態への関与

AutophagyとApoptosisが急性腎障害(AKI)で観察される事を我々は報告しているが、その情報伝達系と病態での役割は不明な点が多い。この研究では尿細管においてAutophagyとMitophagyおよびリソゾーム系が病態の調整に関与するかを検討した。ラットAKIモデルで、BNIP3は近位尿細管細胞で発現が増加した。BNIP3の遺伝子導入はAutophagosomeをミトコンドリアにおいて増加させ、AutophagyとMitophagyを誘導し、さらにApoptosisも亢進させた。BNIP3は酸化ストレスにより尿細管細胞で誘導され、AutophagyとMitophagyを誘導し、AKIの病態における重要な働きが示唆された。現在、末期腎不全により、透析療法に至っている患者数は、全国で28万人を越え、今後、糖尿病性腎症の増加、高齢化も加わり、さらに患者数の増加が予想され抜本的対策が急務である。腎障害には、大きく分けて糖尿病などの慢性的な腎障害と、急性腎障害のように数時間でおこるものがある。慢性腎障害時にはストレスにより酸化した蛋白の分解・清浄化の障害が働いていると考えられ、定常的に機能しているオートファジーの低下による異常蛋白の蓄積と細胞障害が病態に関与している可能性がある。また虚血などによる急性腎不全では、細胞は栄養飢餓状態になり、急速に誘導されるオートファジーの病態への関与が考えられる。しかしながら腎臓病の病態におけるオートファジーの役割については不明であるが、申請者らは、急性腎障害時にオートファジーが、アポトーシスに先行して近位尿細管で起こる事を発表した。すなわちLC3プロモーターにGFPを結合したトランスジェニックマウスの実験系を用いて急性腎障害でのマクロオートファジーを確認し、誘導的オートファジーの急性の腎疾患に関する実験を行い報告した。LC3プロモーターにGFPを結合したプラスミドを安定導入した、腎尿細管細胞を樹立した。さらに申請者らは、特にオートファジー・リソゾーム系について近年のタンパク分解系の分子機構の解明の細胞生物学的研究の発展をふまえて、腎疾患の病態への関与、解明を目指して実験系も確立しつつある。本年度(平成22年度)は、マクロオートファジーに関連した蛋白質のLC3等の動向を腎疾患モデル動物や培養細胞系を用い、Western blotや組織学的検索を通じて検討する。またLC3蛋白にGFPを融合したトランスジェニックマウスやLC3プロモーターにGFPを結合したプラスミドを安定導入した、腎メサンギウム細胞、ポドサイト、腎尿細管細胞を樹立する。東京医科歯科大学の水島昇先生との共同研究としてトランスジェニックマウス(Mizushima N., Mol Biol Cell 2004)、LC3-GFPプラスミドを供与して頂いており、今後も御指導を頂く。これらの実験系を用いてin vivo及びin vitroでの慢性腎障害モデルやネフローゼモデルマウスでのマクロオートファジー及びシャペロン介在性オートファジーの働きを検討する。同様の実験系を用いて急性腎障害でのマクロオートファジーを確認し、誘導的オートファジーの急性の腎疾患に関する実験を行なう。また申請者は、既にPI3Kgammaが欠損したPI3K-Akt pathwayが抑制されたノックアウトマウススとLC3蛋白にGFPを融合したトランスジェニックマウスを交配させる事より、Akt pathwayの抑制がある場合とない場合で、慢性腎障害モデルあるいは、急性腎障害モデルでのオートファジーの関与をGFP-LC3を用いて検出できるin vivoのシステムを作成しつつある。上記内容を学会発表し、下記の論文で発表をした。本年度(平成23年度)は、腎疾患におけるオートファジー・リソゾーム系の病態への関与を更に検討するため、マクロオートファジーに関連した蛋白質のLC3等の動向を腎疾患モデル動物や培養細胞系を用い、Western blotや組織学的検索を通じて検討した。同様の実験系を用いて急性腎障害でのマクロオートファジーを確認し、誘導的オートファジーの急性の腎疾患に関する実験を行なった。

また申請者は、既にPI3Kgammaが欠損したPI3K-Akt pathwayが抑制されたノックアウトマウスとLC3蛋白にGFPを融合したトランスジェニックマウスを交配させる事より、Akt pathwayの抑制がある場合とない場合で、慢性腎障害モデルあるいは、急性腎障害モデルでのオートファジーの関与をGFP-LC3を用いて検出できるin vivoのシステムを作成しつつある。上記内容を学会発表し、下記の論文で発表をした。
A compact coherent x-ray source development using relativistic high-order harmonics from laser-gas jet interactions

解析的手法及びマルチパラメトリックPICシミュレーションを用いて、高強度レーザーによって高濃度プラズマ中に形成される特異点が放出する高次高調波生成について研究する。適合するプラズマプロフィールを用いて、高次高調波生成のコントロールが可能であることを示すことができる。それによって非常に効率の良いパラメータ領域を見出した。最近の実験で、J-KARENレーザーによる高次高調波の発生源が点状であることが観測されたが、このことを、専用シミュレーションによって説明することができた。数物系科学
PETによる腫瘍画像化を目的とした分子標的放射性薬剤の開発

AC7700((Z)-N-[2-methoxy-5-[2-(3',4',5'-trimethoxyphenyl)vinyl]pheny]-L-serineamide hydrochloride)は,チューブリン重合阻害剤のコンブレタスタチンA4誘導体で,腫瘍血管特異的に作用し,強力に腫瘍血流を減少させる効果を示す.AC7700は,抗がん剤として現在欧米でフェーズIの臨床試験が行われており,日本でも臨床試験が予定されている.本研究では,将来的にPETにより臨床でAC7700の薬物動態研究,治療効果判定などに利用することを目的として,[^<11>C]AC7700の開発を行った.まず,AC7700を[^<11>C]CH3で標識するための前駆体として,AC7700の5'-OCH3基をOH基に変換し,そしてセリン骨格のOH基およびNH2基をそれぞれTHP基,Boc基で保護した化合物を新規に合成した.この前駆体を用いて,アセトン中(室温)で,NaOH(2eq)を加え,[^<11>C]CH3OTfによりメチル化反応を行った.続いて,4MHCl/ジオキサン(100eq)を加えて70-80°Cに加熱してTHPおよびBocの脱保護を行った.そして最終的に,逆相HPLCにより目的とする[^<11>C]AC7700の精製を試みた.結果として,構造異性化の起きたE-体の[^<11>C]AC7700も生成も見られたものの,平均43%(3352%)で目的とする[^<11>C]AC7700を標識合成することに成功した.全標識合成時間は約28分,放射化学的純度は99%,比放射能は2.8Ci/μmol(0.454.0Ci/μmol,EOS)となった.この結果から,本研究において,[^<11>C]AC7700の実用的標識合成法が確立されたといえる.以上の成果を踏まえ,今後はこの[^<11>C]AC7700を用いた生物学的評価の研究を進める予定である.マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は,癌の浸潤・転移や腫瘍血管新生に深く関与している細胞外基質分解酵素であり,次世代型抗癌剤開発の重要な分子標的となっている.本研究では,陽電子放出核種のフッ素18標識MMP阻害剤の開発を行い,MMPを標的とするPET用腫瘍イメージング剤としての有用性を検討した.本研究では,フッ素を有するMMP阻害剤として(2R)-2-[4-(6-fluorohex-1-ynyl)-benzenesulfonylamino]-3-methylbutyric acid(SAV03)を新規に設計・合成した.この化合物は,MMP-2に対してIC_<50>値として1.9μMの阻害効果を示した.次に,担癌マウス(Ehrlich皮下移植)に[^<18>F]SAV03を尾静脈投与し,一定時間後における腫瘍組織および各種臓器への集積率を求め,その体内分布を調べた.投与30分後での腫瘍への集積率は,心臓,肺,脾臓,筋肉に比べて,約2.5から4.3倍という高い値になったが,小腸,肝臓へは腫瘍と比べてそれぞれ約20倍と10倍の高い集積率となった.一方,[^<18>F]SAV03のメチルエステル体([^<18>F]SAV03M)をプロドラッグ的に利用したところ,肝臓への集積率は半減し,投与120分後での腫瘍への集積率は,心臓,肺,脾臓,筋肉の集積率に対して,それぞれ7.6,6.6,7.8,14倍という高い値を示した.さらに全身オートラジオグラフィーを行ったところ,[^<18>F]SAV03Mは腫瘍特異的な集積性を示し,画像的に腫瘍を検出することができた.以上の結果から,[^<18>F]SAV03MはMMPを標的とするPET用腫瘍イメージング剤として利用できる可能性が示唆された.今後は,[^<18>F]SAV03Mの集積性とMMPの発現・活性度との関連性を明らかにしていく必要がある.AC7700((Z)-N-[2-methoxy-5-[2-(3',4',5'-trimethoxyphenyl)vinyl]pheny]-L-serineamide hydrochloride)は,チューブリン重合阻害剤のコンブレタスタチンA4誘導体で,腫瘍血管特異的に作用し,強力に腫瘍血流を減少させる効果を示す.AC7700は,抗がん剤として現在欧米でフェーズIの臨床試験が行われており,日本でも臨床試験が予定されている.本研究では,将来的にPETにより臨床でAC7700の薬物動態研究,治療効果判定などに利用することを目的として,[^<11>C]AC7700の開発を行った.まず,AC7700を[^<11>C]CH3で標識するための前駆体として,AC7700の5'-OCH3基をOH基に変換し,そしてセリン骨格のOH基およびNH2基をそれぞれTHP基,Boc基で保護した化合物を新規に合成した.この前駆体を用いて,アセトン中(室温)で,NaOH(2eq)を加え,[^<11>C]CH3OTfによりメチル化反応を行った.

続いて,4MHCl/ジオキサン(100eq)を加えて70-80°Cに加熱してTHPおよびBocの脱保護を行った.そして最終的に,逆相HPLCにより目的とする[^<11>C]AC7700の精製を試みた.結果として,構造異性化の起きたE-体の[^<11>C]AC7700も生成も見られたものの,平均43%(3352%)で目的とする[^<11>C]AC7700を標識合成することに成功した.全標識合成時間は約28分,放射化学的純度は99%,比放射能は2.8Ci/μmol(0.454.0Ci/μmol,EOS)となった.この結果から,本研究において,[^<11>C]AC7700の実用的標識合成法が確立されたといえる.以上の成果を踏まえ,今後はこの[^<11>C]AC7700を用いた生物学的評価の研究を進める予定である.
内分泌細胞におけるDiminuto遺伝子の発現調節とその翻訳産物の機能

我々は、Diminuto遺伝子を、コルチゾル産生副腎腺腫において発現が増大する遺伝子の一つとしてクローニングした。その発現が減弱している正常副腎組織では細胞のアポトーシスが認められた。この結果からDiminutoの発現がアポトーシスの抑制を介して腺腫の発症に重要な役割を果たしていることが示唆された。最近、Diminutoが、コレステロール生合成系の最終段階Ianosterolからコレステロールへの合成を司る酵素の1つ3β-hydroxysterol-Δ24-reductase (DHCR24)であることが示された。したがって、Diminutoはコレステロール生合成系の酵素であるとともに、1細胞のアポトーシスにも関与する多機能蛋白質であることが示唆されるが、その機能の詳細は不明である。そこで、本研究ではDiminuto-/-マウス(dim-/-)の胎児繊維芽細胞(mouse embryonicfibroblasts, MEF)を用いて、Diminuto遺伝子の喪失が細胞の増殖やアポトーシスに及ぼす影響を検討した。dim+/-は正常に発育し交配可能であるが、dim-/-はそのほとんどが出生直後に死亡した。そこでdim+/-同士を交配し、胎齢14、15日の胎児から、野生型(wild type, WT)、ホモ(dim-/-)のMEFを作成した。10%FBS存在下ではWT-MEFとdim-/-MEFの増殖に顕著な差異を認めなかったが、血清非存在下では培養後9時間以内にdim-/-MEFにおいて細胞死の著明な増加が観察された。この細胞死はDNAの断片化を伴っており、血清除去がdim-/-MEFのアポトーシスを引き起こすことが示唆された。この血清除去によるアポトーシスは、インスリン添加あるいはcyclodextrinを用いたコレステロールの培養液中への添加により、抑制された。こうした結果から、血清除去により細胞外からのコレステロール供給が遮断されると、自身の生合成経路を持たないdim-/-MEFにおいては、細胞内のコレステロールが不足し、それに伴ってインスリン作用が減弱し、アポトーシスが誘導されると考えられた。現在このdim-/-MEFに見られたインスリン作用不全の分子機序を検討している。我々は、コルチゾル産生副腎腺腫において発現が増大する遺伝子をRepresentational Difference Analysis法を用いてスクリーニングし、植物DiminutoのヒトホモログhDiminutoをクローニングした。更に、hDiminuto遺伝子の発現が内分泌細胞においてホルモンやサイトカインあるいは細胞の腫瘍化により調節されていること、またその高発現がanti-apoptoticに働くことを示してきた。こうした結果から、hDiminutoが内分泌細胞において極めて重要な働きを果たしていると考えられるが、その機能は不明な点が多い。そこで、未知のhDiminutoの機能を探る端緒として、酵母two hybrid systemを用いて、hDiminuto蛋白と結合する蛋白の同定を試みた。Matchmaker two hybrid system 3(米国Clontech社)を用い、baitとしてhDiminutoを用いて、pretransformed human cDNA library(Clontech社)の1.6x10^7個のcloneをスクリーニングし、hDiminuto蛋白と結合する蛋白を発現すると考えられる52個の酵母clone得た。このcloneをX-α-Gal添加培地で青色/白色選別を行い、青色を呈したcloneからプラスミドを精製し、塩基配列を決定した。

この配列をBlast Searchにより検索すると、3つのcloneはミトコンアドリアの酵素に関係する蛋白のcDNAの配列と一致した。またcAMPを介する細胞内シグナル伝達系に存在する蛋白や機能不明な蛋白のcDNAの配列と一致した。hDiminutoはステロイド/コレステロール合成に関与する酵素である可能性とapoptosisを抑制する可能性が示唆されている。ミトコンアドリアはステロイド合成やapoptosisの制御に重要な細胞内オルガネラであり、現在、同定した蛋白とhDiminutoの相互作用を更に詳細に検討している>我々は、Diminuto遺伝子を、コルチゾル産生副腎腺腫において発現が増大する遺伝子の一つとしてクローニングした。その発現が減弱している正常副腎組織では細胞のアポトーシスが認められた。この結果からDiminutoの発現がアポトーシスの抑制を介して腺腫の発症に重要な役割を果たしていることが示唆された。最近、Diminutoが、コレステロール生合成系の最終段階Ianosterolからコレステロールへの合成を司る酵素の1つ3β-hydroxysterol-Δ^<24>-reductase (DHCR24)であることが示された。したがって、Diminutoはコレステロール生合成系の酵素であるとともに、細胞のアポトーシスにも関与する多機能蛋白質であることが示唆されるが、その機能の詳細は不明である。そこで、本研究ではDiminuto^<-/->マウス(dim^<-/->)の胎児繊維芽細胞(mouse embryonicfibroblasts, MEF)を用いて、Diminuto遺伝子の喪失が細胞の増殖やアポトーシスに及ぼす影響を検討した。dim^<+/->は正常に発育し交配可能であるが、dim^<-/->はそのほとんどが出生直後に死亡した。そこでdim^<+/->同士を交配し、胎齢14、15日の胎児から、野生型(wild type, WT)、ホモ(dim^<-/->)のMEFを作成した。10%FBS存在下ではWT-MEFとdim^<-/->-MEFの増殖に顕著な差異を認めなかったが、血清非存在下では培養後9時間以内にdim^<-/->-MEFにおいて細胞死の著明な増加が観察された。この細胞死はDNAの断片化を伴っており、血清除去がdim^<-/->-MEFのアポトーシスを引き起こすことが示唆された。この血清除去によるアポトーシスは、インスリン添加あるいはcyclodextrinを用いたコレステロールの培養液中への添加により、抑制された。