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江戸中期の「復古」思潮と中国観の変容に関する研究

後者の論文は、朱子学との比較をあえて行わず、徂徠学を論理を内在的に解明する方法を用いた。古文辞受容に注目した『絶句解』の研究は前年度から継続しており、『徂徠集序類』の訳注作業を通じて得られた知見を踏まえつつ、分析を進めている。(3)古賀トウ庵の対外認識の研究:『良将達徳鈔』などに見られる古賀トウ庵の「尚武」の思想について検討することで、開明的思想家という従来の評価とは異なるトウ庵像を浮かび上がらせた。対外認識に関しても、トウ庵が「尚武」という尺度から漢人を文弱とみなして侮蔑する一方で、マンジュ人に「尚武」の気風を見出し、彼ら高く評価していることを明らかにした(これまで、漢人とマンジュ人に対するトウ庵の評価の違いには十分に注意が払われておらず、中国認識として一括りに扱われることが多かった)。この成果は「『良将達徳鈔』をめぐってー尚武の思想家としての古賀トウ庵」として発表した。平成27年度の研究に基づきながら、朱舜水を中心とした江戸時代前期の中国文化受容と古賀トウ庵に注目した江戸後期の対外認識について着実に研究を進め、シンポジウムで研究成果を発表し、複数の論文を公刊した。研究は順調に進展しているといえる。(1)林家の明朝文化受容の研究:林鵞峰の詩文を通じて、林家の日本・中国認識について検討した。林鵞峰の文章に特徴的な文体である問答体は、『本朝文粋』所収作品から材料を得るだけでなく、鄧志謨の「争奇シリーズ」と呼ばれる明末の著作から影響を受けている。林家の問答体については、国際東方学者会議で報告し、論文(「林鵞峰の問答体」)を発表した。また、「日本」的なるものの象徴として扱われる「桜」に関する鵞峰の作品を分析して、報告した。(2)水戸徳川家の喪祭礼の研究:水戸徳川家の喪祭礼と『文公家礼』の関係については引き続き調査を進めており、祭祀で用いられる供物などについて新資料に基づき、検討を行なった。(3)『絶句解』と中心とした徂徠の明朝文化の研究:継続して『絶句解』の注釈作成を行なっている。明代の古文辞派には見られない、徂徠学派独自の典拠表現の展開について新たな知見を得た。(4)古賀トウ庵の中国認識の研究:昨年度に引き続き、トウ庵の対外認識を分析し、論文(「暴君と「士風」ー古賀トウ庵再論ー」)を発表した。金の海陵王について独特の評価を下している文章を中心に、彼の対外認識に表れる「士風」振起に対する関心を、寛政改革期から明治期に至る思想の流れの中に位置づけた。「復古」と中国認識の問題が、「接人」から「振気」へという思想史の展開と連動していることへの展望が得られたので、これについては政治思想学会で報告する予定になっている。本研究では、以下の事柄が明らかになった。(1)古代中国と明代中国の違いに江戸期の学者は自覚的であり、明代文化の受容の際には、明代の学芸の「復古」的な手法を選択的に摂取していることがある。(2)18世紀には、徂徠学などの「復古」的な思想により、後代の中国に対する評価は下がる。また、「人情」理解と人柄の柔和さを重視する思潮がこの時期に広く見られ、本居宣長の「漢心」批判もこのような思想の流れに連なっている。(3)古賀トウ庵は、「武」を重視し、文弱である中国よりも、「武」に秀でた満洲人などを高く評価する。トウ庵は、古代中国をもはや理想時代と考えておらず、「復古」思想からも脱却している。江戸前中期の中国認識について多角的に研究を進め、その成果を論考及び公開の調査報告会・ワークショップで公表することができた。これらの機会を通じて、隣接領域の研究者から貴重な教示を得ることもでき、今後の研究方針についても新たな知見を得た。当初は、研究の初期段階においては資料の分析に多くの時間がかかると考えていたため、初年度から複数の成果を公刊・発表できたのは予想以上の進展であったといえる。江戸中期の中国認識については、一定の研究水準に到達したので、今後は以下の三つの方向からの研究を考えている。(1)『絶句解』を手がかりにして古文辞派の文学の研究をより進展させ、江戸前期の林家の文学と比較しながら、江戸期の漢文学における「明風」の意味について考えたい。(2)朱舜水の学問と水戸徳川家の儀礼の関係について、墓制や喪礼を中心に検討を進めたい。
プロテオミクスによるウイルス関連脳症の病態特異的バイオマーカーの探索

小児のウイルス関連脳症は非特異的な急性中枢神経症状で発症するため、検査所見で急性脳症を診断し、重症度を評価することは臨床的に重要である。我々は急性脳症患者と熱性けいれん重積を含めた非脳症患者より採取された髄液検体を用いて、液体クロマトグラフ質量分析を実施し、6個の分画を選出した。各分画での急性脳症群の信号値は対照群よりも有意に高く、多変量解析でも分画の信号値のみで対照群と判別可能であることが示された。また、分画3の信号値は最も検出力が高く、入院時検査値よりも検出力高いことが示された。ただし、分画の信号値と病型や病原体などの臨床的特徴の関連は明らかでなく、病態特異性は示されなかった。小児のウイルス関連脳症は、けいれんや意識障害などの非特異的な急性中枢神経症状で発症することから、検査所見によって熱性けいれんや熱せん妄を鑑別し、発症早期に急性脳症の重症度の評価することは臨床的に重要である。我々は、小児のウイルス関連脳症のバイオマーカーを検索するために、急性脳症患者と、熱性けいれん重積例を含めた非脳症患者より採取された髄液検体(急性脳症15例対照15例)を用いて、液体クロマトグラフ質量分析を実施した。なお、高速液体クロマトグラフは、Agilent 1200 Series(Agilent Technologies社)を用い、質量分析はesquire 6000(Bruker社)を用いた。得られたスペクトルに対しては以下の手順で検討を行った。1各急性脳症検体でそれぞれ10-15個のmajor fragmentを決定。2各検体のmajor fragmentsのうち、3個以上の急性脳症検体で認められたfragmentを選別。3選ばれたfragmentsのうち、全対照群での最大値の2倍以上のintensityを示す検体が3個以上あるfragmentを抽出。この結果、最終的に6個のfragments (F1-F6; m/z=1156.2, 1239.2, 1300.0, 1330.0, 1343.9, 1421.4 )を抽出した。F1 (m/z=1156.2)は、急性脳症群7例(47%)で、F2 (1239.2)は3例、F3 (1300.0)は5例、F4 (1330.0)は4例、F5 (1343.9)は5例、F6 (1421.4)は3例で、対照群と比較して明らかな高値を示した。本結果は、急性脳症に関連した髄液バイオマーカーの存在を示すものと考えられる。今後、測定検体を増やすと同時に、病態を含めた詳細な解析が必要である。我々は小児のウイルス関連脳症のバイオマーカーを検索するために、急性脳症患者15例と熱性けいれん重積例を含めた非脳症患者16例より採取された髄液検体を用いて、液体クロマトグラフ質量分析を実施した。高速液体クロマトグラフは、Agilent 1200 Seriesを用い、質量分析はesquire 6000を用いた。得られたスペクトルに対し、以下の手順で検討を行った。3選ばれたfragmentsのうち、全対照群での最大値の2倍以上の信号値を示す検体が3個以上あるfragmentを抽出。この結果、最終的に6個のfragments (F-F6; m/z=1156.2, 1239.2, 1300.0, 1330.0, 1343.9, 1421.4: retention time = 8.1-8.4)を選出した。選出した各fragmentにおいて急性脳症群の信号値は対照群よりも有意に高く(p = 0.001-0.008)、研究初年度で報告した入院時検査値(単項目)で比較した場合よりも相違は明確で、多変量解析でもfragmentの信号値のみで判別可能であることが示された。また、各fragmentの信号値は正の相関を認め、ROC解析の結果、fragment 3の信号値が最も検出力が高く、入院時検査値よりも検出力高いことが示された(感度0.80特異度0.81)。ただし、fragmentの信号値と病型や病原体などの臨床的特徴の関連は明らかでなく、病態特異性は示されなかった。

また、分画3の信号値は最も検出力が高く、入院時検査値よりも検出力高いことが示された。ただし、分画の信号値と病型や病原体などの臨床的特徴の関連は明らかでなく、病態特異性は示されなかった。小児のウイルス関連脳症は、けいれんや意識障害などの非特異的な急性中枢神経症状で発症することから、臨床的な検査所見によって熱性けいれんや熱せん妄を鑑別し、発症早期に急性脳症の重症度の評価することは臨床的に重要な課題である。我々は、小児のウイルス関連脳症の病態特異的バイオマーカーを検索するために、これまでに熱性けいれん・熱せん妄26例(男15女11、発症年齢中央値20か月)、急性脳症23例(男14女9発症年齢中央値21か月)の集積を行い、臨床データのデータベース化を行った。髄液バイオマーカーを検索するにあたり、予備解析として、得られた臨床データを用いて、初回血液検査値の単変量解析を行ったところ、血清総蛋白値、アルブミン値、尿酸値、AST値、CRP値、血小板数、FDP値、D-dimer値で有意差が認められた。髄液検査での検討では有意な差を示す項目はなかった。多変量解析では、血清アルブミン値、尿酸値、ALT値、WBC、CRP値が判別因子として選択された。有意差を認めた項目から、全身性の炎症の程度に加え、血管内皮障害による血管透過性亢進や血栓産生、さらに臓器障害が、脳症群の特徴であることが示唆され、このことを念頭に置いたバイオマーカーの探索が必要と考えられた。ただし、有意項目の散布図では熱性けいれん群が比較的単一の集団を呈するのに対して、急性脳症群のばらつきが大きいことから、急性脳症群はよりヘテロな集団であることが示唆されるため、バイオマーカーを検討を行う上で、急性脳症群を既存の臨床データに基づいて分類しておくことが必要であると考えられた。本年度は集積した検体を用いて、液体クロマトグラフ質量分析(LC/MS)を行った。LC/MSの条件設定を行った後、各検体の測定を行い、得られたスペクトルから急性脳症と関連するバイオマーカーの存在を示すことができた。本研究での目標の症例数(急性脳症30例と熱性けいれん症例30例)にほぼ近づいている。急性脳症はヘテロな集団であることから、全例をまとめて解析すると明確な結果が得られない可能性があるため、バイオマーカーを検索するにあたり、予備解析として、既存の急性脳症例の臨床データの統計的解析を行い、病態を分類することを行った。検体は未測定であるが、測定の準備はすでにできている。今後は、急性脳症を再分化して解析できるように、研究対象の症例および検体をさらに集積し、質量分析計による髄液検体の測定を行い、スペクトルの詳細な解析と臨床像を含めた多変量解析を行う予定である。最終年度は、引き続き質量分析に必要な消耗品購入、急性脳症の臨床データを得るための補助検査、解析データの発表に研究費を使用する予定である。次年度は、主に質量分析に必要な消耗品購入、急性脳症の臨床データを得るための補助検査、解析データの発表に研究費を使用する予定である。
オスが交尾によって求愛を終了する機構

本研究は昆虫類の交尾行動と性周期の神経機構解明をめざしたものである。雄コオロギは交尾を終了すると,直ちに交尾不応状態に陥り,以後,1時間は雌に求愛せず,むしろ威嚇的となる。そこでまず,この行動切り替えの解発刺激と受容器官を調べたところ,交尾中,雌雄の生殖器が結合し,雄の交接器内の感覚毛が雌の交尾乳頭で圧迫されることによって精包の放出がおこることが明らかとなった。これにより,精包放出を継起として腹部最終神経節で生じる神経活動の変化が交尾不応状態の基礎にあると考えられる。このため,雄の交接器内感覚毛を刺激し,精包放出前後の上行性感覚神経の記録を行うことを試みた。つぎに,不応期維持に関与する神経修飾物質の探索を行った。現在までに明らかになったことは,第1に交尾不応期における上行性ニュ-ロンの自発性スパイク発火が減少すること。おそらく特定のニュ-ロンが発火を停止するためと思われるが,そのタイプはまだ同定できていない。第2に不応期形成に関与する物質として,生体アミンと関連物質を腹腔内に注入( ^<10>M^<ー3>,30ー60μl)した。その結果,セロトニンは不応期を約5分延長させた。つぎに,セロトニン前駆体の5ヒドロキシトリプトファンは逆に約10分短縮させた。他に,紫外線照射セロトニンやセロトニン涸渇剤5ー7デヒドロキシトリプタミンでも同様の短縮をおこした。不応期の短縮は断頭標本でより顕著にみられた。その他,メラトニン,ヒスタミン,また,cAMPやcGMPは効果がなかった。以上より,セロトニンが不応期の形成になんらかの関与をもつことは示唆できるが,それが直接タイマ-機構に作用しているかどうかは未だ不明である。オスコオロギは交尾により精包を放出すると直ちにそれまでの求愛から威嚇行動へと転じる。この行動切り替えの神経機構を明らかにするのが本研究の目的である。そこで,まず精包放出を境にして,これに関わる腹部最終神経節から発する上行性ニュ-ロンの活動がどのように変化するかを調べた。除脳標本の頚部縦連合より細胞外スパイク記録を行ったところ,放出前は多くのニュ-ロンが高頻度の発火をしていたが,放出後約5ー10分間は発火の停止が生じた。その後活動は回復したが,放出前のレベルには達しなかった。したがって,この低レベルとなった上行性の活動が精包放出情報を脳に伝えている可能性は大きい。一方,これら神経活動に影響を与えると思われる生体アミンやアミノ酸の効果をテストした。投与は性周期の各時期1)交尾前,2)交尾後,3)精包準備行動後に行った。オクトパミンは1)と2)の段階のオスの交尾反応を有意に増強させ,セロトニンとGABAは逆の効果を示した。また,後者の2つは3)の段階で投与すると,交尾後約1時間の交尾不応期間を延長させる効果があった。この外にセロトニンニュ-ロンの毒である5ー7DHTを脱皮直後のオスに投与し,セロトニンニュ-ロンが死滅したと思われる10日後に交尾反応性のテストを行ったところ,交尾反応は本来1時間の抑制時期にも65%のオスでみられた。このことはセロトニンが交尾不応期の形成になんらかの関与を行っていることを示唆している。したがって,これら薬物の投与によるニュ-ロン活動の変化を直接記録中に調べてみる必要が生じた。

また,脳の機能を可逆的に遮断できる冷却法を併用し,これによって精包放出後の上向性ニュ-ロンの活動変化を調べる必要がある。これによって交尾反応性の低下に直接関係したスパイク活動を抽出できると考えている。本年度(平成3)は主として前年度得られたデ-タをもとに論文化(J・Insect Physiol1992)に尽力した。本研究は昆虫類の交尾行動と性周期の神経機構解明をめざしている。雄コオロギは交尾を終了すると、直ちに交尾不応状態に陥り、以後、1時間は雌に求愛せず、むしろ威嚇的となる。この行動切り替えのメカニズムはなにか。前年度、この行動切り替えは交尾中、雌雄の生殖器が結合し、雄の交接器内の感覚毛が雌の交尾乳頭で圧迫され、精包の放出がおこり,この際に最終腹部神経節でシグナルが発生すると予想した。したがって,精包放出を継起に生じる神経活動の変化が交尾不応状態の基礎にあると考えられる。このため、雄の交接器内感覚毛を刺激し、精包放出の前後の上行性感覚神経の記録を行うこと,ならびに不応期維持に関与する神経修飾物質を探索することを試みた。現在までに明らかになったことは、第1に交尾不応期における上行性ニュ-ロンの自発性スパイク発火の減少。これについては特定のニュ-ロンが発火をやめるためと思われるがタイプは未同定である。第2に不応期形成に関与する物質としていくつかの生体アミンと関連物質を腹腔内に注入(10^<-3>M.3060μl)してテストした。その結果セロトニン(5HT)では不応期が約5分延長し,この前駆体の5ヒドロキシルトリプトファン(5HPT)では約10分短縮した。抑制性伝達物質のGABAでは不応期の延長,この拮抗剤バイキキュリンでは短縮がおこった。その他メラトニン,ヒスタミン,ノルアドレナリンやアミノ酸,また,CAMPやcGMPのプリン系の物質は効果がなかった。今後、さらに多くの物質でテストを行い不応期に決定的重要性をもつ物質を同定し,上行性ニュ-ロンへの作用を明らかにしたい。
対人不安における情報の利用可能性と認知バイアスに関する研究

自己注目は対人不安特有の認知バイアスであり,不安の維持・増大と関係している。本研究は,対人不安の自己注目時の認知処理について検討した。対人不安者は,社会的状況で自己の内的情報に注意を向けやすくなるだけでなく,注意の方向も不安定になる。情報の処理容量は限られていることから,他者のネガティブな動作に気づきやすい注意バイアスと,否定的に評価しやすくなる解釈バイアスが生じる。その結果,スピーチや会話のパフォーマンスも低下することになる。H18年度は,対人不安者の注意の方向性と解釈バイアスに関する検討を行った。対人不安者は,社会的状況で不安が高まると,自己注目を行い,自分の抱いている否定的な考えや他者から悪く評価されるのではないかという懸念,過剰に興奮している身体の状態といった内的情報に注意が向きやすくなるという特徴がある。そのため外的な情報に注意が向きにくくなると説明されてきた。しかし現実の社会的状況では他者の反応が気になることも多く,内的情報だけでなく外的情報にも注意が向けられていると考えられる。限られた処理リソースの中で多様な情報を扱うために,どのような注意処理が行われているかを検討することで,対人不安者の情報処理の特徴を明らかにすることができる。面接者の前でスピーチをするという不安状況で,対人不安者が内的情報と外的情報にどの程度注意を向けているかについて実験的検討を行った。面接者はうなずく・のけぞるといった決められた動作を行い,対人不安者がそれにどの程度気づくのかを測定した。主な結果は以下の通りである。(1)高対人不安者は低対人不安者よりも,内的情報および他者の示す動作にも注意を向けていたと報告した。(2)面接者の示す動作をどの程度検出できたかについては,高対人不安者と低対人不安者とで違いは認められなかった。しかし,ポジティブ動作の「ほほえみ」の検出が高対人不安者で低かった。(3)注意を内的情報に向けるか外的情報に向けるかの安定性については,スピーチ状況で不安定になりやすいことがわかった。高対人不安者で不安定になりやすいものの,統計的に有意な差は認められなかった。以上の結果から,高対人不安者は,様々な情報に注意を向けようとするものの,実際には低対人不安者よりもポジティブ情報を検出しにくいことから,外的情報の処理にバイアスがかかっているといえる。H19年度は,対人不安者の自己注目とパフォーマンスの関係について,会話場面を用いた検討を行った。対人不安者は,対人状況におかれると,自己のネガティブな考えや生理的変化に注意を向ける自己注目が生じやすく,うまく会話が行えないというパフォーマンス低下を示す。この両者の関係は,処理リソースの観点から説明することができる。自分に関係する内的情報に注意が向けられること(自己注目)で,処理リソースを内的情報が占有するため,外的情報の処理に必要なリソースが減少することになり,結果的にパフォーマンスの低下を引き起こすと考えられる。この点を検討するためには,注意を内的・外的情報に向けるという操作を行うことで,処理リソースを必要とする課題の成績に影響が出るかを調べればよい。そこで本研究では,「ゴミ問題」というテーマのもと,初対面の人と会話をしてもらうという状況を設定し,注意を内的情報・外的情報に向けさせる教示と操作を行い,注意の方向やストレス反応,会話量に及ぼす影響を検討した。その結果,対人不安定群は,注意操作に従って内的・外的情報に注意を向けることができること,外的情報に注意を向けることで自発的会話数が増えることがわかった。それに対して対人不安高群は,注意操作に関係なく,内的情報と外的情報に向けられる注意の主観的評価に違いは認められなかった。しかも,自発的な会話数にも違いは認められなかった。このように,対人不安高群は,外的情報に注意を向けるよう促しても自己注目をしやすく,それが処理リソースを占有し,パフォーマンスの低下と結びついていると考えられる。社会不安者は,社会的状況で自己注目をするために処理リソースが減少し,情報処理が阻害されると考えられる。そのため,外的情報の否定的な側面に偏って取り入れてしまう注意バイアスが生じることが指摘されてきた。社会的相互作用場面では,他者と会話することや人前でスピーチをすることが多いため,話をすることの処理に相当なリソースが必要となるのである。しかし,社会不安者は自己注目や他者の反応へ注意を向けやすいことから,話をするための処理リソースが限られる。これまで検討の中心であったスピーチに比べ会話は,相手に注意を向け,相手の話した内容にあわせて受け答えをしなければならないことから,必要とされる処理容量は多くなると考えられる。そのため,社会不安者の会話量は少なく,認知の歪みと関連していると考えられる。平成20年度は,会話場面をストレス場面として用い,実験協力者の促しが会話量や不安,他者の動作に与える影響について検討することとした。協力者には,訓練された異性の大学院生を用い,15分の会話を行わせた。

会話の前半5分で実験操作を行い,協力者が会話を促す条件と促さない条件を設けた。後半の10分間は,促し量を同程度とし,その時の会話量や相手への印象を測定した。その結果,主観的な不安は促しに関係なく低減するものの,生理的覚醒は促し高条件で低減することがわかった。高不安者は,促し高条件で自発的発言が増加する傾向が認められた。実験協力者の示す動作に対する評価は,ポジティブ動作に社会不安高・低の違いは認められなかったが,ネガティブ動作に対しては社会不安高群で否定的な評価をすることが示された。これらの結果から,社会不安者にとって会話の促しは,自発的発言につながるものの,相手の動作に対する認知的歪みの修整には至っていないことがわかった。
医療・介護に関する事前指示書オンライン登録システムの開発と有効性の評価

本研究では,終末期における医療・介護に関する事前指示(アドバンス・ケア・プランニング:以下ACP)をオンライン・クラウド型の事前指示書に記載し,それを多施設で情報共有する為のシステムを試験的に構築し,評価することを目的とするものである.初年度の計画では,これらのシステム構築を図る事を目標とし,第1段階として,ACPに関する事前指示書をオンラインで登録できるよう,Webシステムの開発を目指した.本システムの主たる利用者は一般者であるが,予備的なアンケート調査において,ACP全般についての理解が十分進んでいないことが判明した.このため,本システムを利用する際には,ACPそのものの趣旨や意義についても理解が得られるよう,内容を平易な表現で解説し,追加資料などの閲覧により補助できるようなwebコンテンツが必要と考えられた.初年度は,試験的にwebコンテンツを開発し,複数の医療機関の医療関係者によりチェックを受けた後,その後複数の病院を訪問中の一般者を無作為に選出し,試験的に閲覧した後のアンケート調査を実施した.計43名分のアンケート結果が得られ,解析を行った.2年度についてはこれを元に,改良型のwebシステムを調整中であり,今後これをオンライン・クラウド型のwebシステムに拡張予定であったが,本webシステム利用者の認証確認システムやアクセス制限の管理,さらに保存される個人情報の保管・保全に関する検証などを行ったが,安全性の確立などに時間を要しており,正式なシステム運用開始が遅れている.現在,より安全性の高いクラウド型webシステム構築を行う為にweb製作業者を選定中であり,選定が済み次第,作成を依頼する予定となっている.また,本システムは,医療・福祉関係者による情報利用の共有がテーマであるが,本研究に協力して頂ける医療・福祉施設の選定を勧めており,次年度の試験運用に向けて準備を始めている.研究計画では,2年度までにACPのオンライン・クラウド型登録システムを開発し,運用システムまで構築完了する予定であったが,現時点ではまだ開発途中であり,構築にまでには至っていない.一方,本研究において最も重要と考えられるwebコンテンツの作成については,内容面では一定の目処が立っているものの,個人情報の保存や利用を目的とする内容であるために,セキュリティ管理や利用者および利用内容のアクセス権限などの管理がより高い精度で求められることが判明した.このため,webシステムの運用が稼働できていないために,研究の進捗が遅延している.一方,本研究に必要な,アドバンス・ケア・プランニングのweb利用者の選定や,その情報を利用する予定の医療・福祉施設側については,協力施設やその責任者の選定を済ませ,webシステムの稼働と同時に利用開始が可能な様に調整を行った.初年度に開発・実施したACPに関するwebページの調整を行うと同時に,2年度中に検証した本システムの安全性の検証とアクセス制限方法などについての検討を元にして,本年度中にアドバンス・ケア・プランニングに関するオンライン・クラウド型登録システムの開発を終了し,1次試験運用を行う予定である.本システムを主に利用する一般利用者については,名古屋市立大学病院総合内科・総合診療科に入院される高齢者を主な対象として選定を行う為,IRB申請を行って,利用が可能な環境整備を行う予定である.また登録情報を利用する医療・福祉施設については選定を終了しており,webシステムの運用開始と同時に登録し,試験利用が可能な様に準備をしている.3年度には,1次試験運用の速やかな開始を図り,さらに,2次的試験運用を開始するために,更に対象者や対象施設の拡大を可能にできるよう,その選定などの準備を平行して始める予定である.本研究では,終末期における医療・介護に関する事前指示(アドバンス・ケア・プランニング:以下ACP)をオンライン・クラウド型の事前指示書に記載し,それを多施設で情報共有する為のシステムを試験的に構築し,評価することを目的とするものである.初年度の計画では,これらのシステム構築を図る事を目標とし,第1段階として,ACPに関する事前指示書をオンラインで登録できるよう,Webシステムの開発を目指した.本システムの主たる利用者は一般者であるが,予備的なアンケート調査において,ACP全般についての理解が十分進んでいないことが判明した.このため,本システムを利用する際には,ACPそのものの趣旨や意義についても理解が得られるよう,内容を平易な表現で解説し,追加資料などの閲覧により補助できるようなwebコンテンツが必要と考えられた.初年度は,こうした経緯を踏まえ,試験的にwebコンテンツを開発し,それが本研究において使用に耐えうるものになるかどうかまずは検証することになった.試験的なwebコンテンツは,複数の医療機関の医療関係者によりチェックを受けた後,その後複数の病院を訪問中の一般者を無作為に選出し,試験的に閲覧した後のアンケート調査を実施した.計43名分のアンケート結果が得られ,解析を行った.得られた意見を元に改良を加えたwebシステムを調整中であり,今後これをオンライン・クラウド型のwebシステムに拡張予定である.現在,システム拡張を行う為のweb製作業者を選定中であり,選定が済み次第,作成を依頼する予定となっている.また,本システムは,医療・福祉関係者による情報利用の共有がテーマであるが,本研究に協力して頂ける医療・福祉施設の選定を勧めており,次年度の試験運用に向けて準備を始めている.研究計画では,初年度にACPのオンライン・クラウド型登録システムを開発し,運用システムまで構築完了する予定であったが,現時点ではまだ開発途中であり,構築にまでには至っていない.

一方,本研究において最も重要と考えられるwebコンテンツの作成については,その内容については一定の目処が立っており,主な利用者である一般者の意見も得ながら改良を行ったりしていることから,一定の進展を得ており,次年度に向けて準備を進めることができているものと考えられる.また,ACPのオンライン・クラウド型登録システムを構築するにあたっては,医療・福祉施設側による登録内容の試験的な共用利用も必要となるが,協力施設やその責任者を個々に選定する必要があるが,次年度の運用に必要な施設などを既に選定し,調整が終了している.本研究では,終末期における医療・介護に関する事前指示(アドバンス・ケア・プランニング:以下ACP)をオンライン・クラウド型の事前指示書に記載し,それを多施設で情報共有する為のシステムを試験的に構築し,評価することを目的とするものである.初年度の計画では,これらのシステム構築を図る事を目標とし,第1段階として,ACPに関する事前指示書をオンラインで登録できるよう,Webシステムの開発を目指した.本システムの主たる利用者は一般者であるが,予備的なアンケート調査において,ACP全般についての理解が十分進んでいないことが判明した.このため,本システムを利用する際には,ACPそのものの趣旨や意義についても理解が得られるよう,内容を平易な表現で解説し,追加資料などの閲覧により補助できるようなwebコンテンツが必要と考えられた.初年度は,試験的にwebコンテンツを開発し,複数の医療機関の医療関係者によりチェックを受けた後,その後複数の病院を訪問中の一般者を無作為に選出し,試験的に閲覧した後のアンケート調査を実施した.計43名分のアンケート結果が得られ,解析を行った.2年度についてはこれを元に,改良型のwebシステムを調整中であり,今後これをオンライン・クラウド型のwebシステムに拡張予定であったが,本webシステム利用者の認証確認システムやアクセス制限の管理,さらに保存される個人情報の保管・保全に関する検証などを行ったが,安全性の確立などに時間を要しており,正式なシステム運用開始が遅れている.現在,より安全性の高いクラウド型webシステム構築を行う為にweb製作業者を選定中であり,選定が済み次第,作成を依頼する予定となっている.また,本システムは,医療・福祉関係者による情報利用の共有がテーマであるが,本研究に協力して頂ける医療・福祉施設の選定を勧めており,次年度の試験運用に向けて準備を始めている.研究計画では,2年度までにACPのオンライン・クラウド型登録システムを開発し,運用システムまで構築完了する予定であったが,現時点ではまだ開発途中であり,構築にまでには至っていない.一方,本研究において最も重要と考えられるwebコンテンツの作成については,内容面では一定の目処が立っているものの,個人情報の保存や利用を目的とする内容であるために,セキュリティ管理や利用者および利用内容のアクセス権限などの管理がより高い精度で求められることが判明した.このため,webシステムの運用が稼働できていないために,研究の進捗が遅延している.
環境変異源によるDNA二重鎖切断の発生と発がん過程

ヒストンH2AXリン酸化を指標として、電離放射線に加えて紫外線やDNA鎖架橋剤などの環境変異原によってもDNA二重鎖切断が誘発されることが示された。これらのDNA損傷部位には修復蛋白NBS1が集積して、H2AXのリン酸化ならびに損傷乗り越え合成とその結果誘導される突然変異の発生に関わっている事を明らかにした。また、NBS1はクロマチンリモデリングの制御をおこなっており、環境変異原に対する細胞の修復過程と損傷応答機構によりゲノム安定化(発がん抑制)に重要な役割を演じている事が判明した。(1)研究の目的: DNA二重鎖切断はかって電離放射線照射により誘発される特殊なDNA損傷と思われていた。しかし、ATM/ATRキナ-ゼによるリン酸化を受けるヒストンH2AXのリン酸化抗体を用いた最新技術では、従来の生化学的方法の数百倍-数千倍の感度増加により、細胞内に発生したわずかなDNA二重鎖切断も検出可能になった。この結果、紫外線やDNA鎖架橋剤などの環境変異原もDNA二重鎖切断を誘発することが我々や他の研究者により次第に明らかとなった。そこで、本研究は各種の環境変異原によるDNA二重鎖切断発生の検証と防御機構の破綻によるゲノム不安定性、その解析結果を変異原性の検出と予防に資することを目的とする。(2)研究の方法:(1)生理学的濃度の電離放射線、紫外線(UVC, UVA)、多環芳香族化合物(1-ニトロピレン、1.8-ジニトロピレン、ベンゾ「a」ピレン、3-ニトロベンズアントロン、4-アミノビフェニル)トポイソメレ-ス阻害剤(ゲニステン、エトポシド)、DNA架橋剤(ソラ-レン、マイトマイシンC)、アスベスト(クリソタイル)等で処理後、細胞周期依存性を確認するためにH2AXリン酸化抗体を用いて免疫染色を行った。また、BrdUとの二重染色を行う。(2)環境変異原処理後の損傷乗り越え合成を酵素Pol etaのフォ-カス形成能および本研究で開発された損傷乗り越え合成アッセイ系を用いて測定する。また、ゲノムDNAシ-クエンスによる遺伝子突然変異の性質を検討する。(3)環境変異原処理後のSMC1経由チェックポイントを検討する。(4)ヒストンH2AXやH2Bの化学的修飾と相同組み換え能との関係を検討する。初めにDNA二重鎖切断が電離放射線以外でも誘導されるかを検討した。DNA二重鎖切断の検出には、最も感度の高いと言われるピストンH2AXのリン酸化抗体を用いた免疫染色法とウエスタンブロット法によった。その結果、電離放射線はもとより、紫外線UVC、DNA鎖架橋剤ソラーレン、多環芳香族炭化水素付加体ベンゾ(a)ピレン、トポイソメレース阻害剤カンプトテシンのいずれでもH2AXのリン酸化が起る事が確認された。続いて、これらのDNA二重鎖切断が電離放射線の場合と同じかどうかを細胞が紫外線照射された時のDNA二重鎖切断に結合する蛋白NBS1の変異体を用いて解析した。その結果、電離放射線の場合にはNBS1のFHA/BRCTドメインが損傷部位へのリクルートには必須であるが、紫外線などの環境変異原の場合にはこのドメインは必ずしも必要でなく両者の損傷応答機構の違いが示された。また、紫外線照射の場合にはDNA複製フォークのPCNA蛋白とNBS1が共局在する事から、複製阻害が二重鎖切断の原因と思われた。電離放射線による損傷にはATMキナーゼ、そして複製阻害による損傷にはATR蛋白が関与する事が知られている。そこで、NBS1とこれらキナーゼ蛋白の関係を検討した結果、ATMはNBS1のC末側で結合するのに対して、ATRはNBS1のN末側で結合してATRキナーゼを活性化する事が明らかとなった。このように電離放射線によるDNA二重鎖切断と他の環境変原によるDNA二重鎖切断との比較により、後者の特異性とそのゲノム安定化機構解析の促進が期待される。各種の環境変異原によるDNA二重鎖切断発生の検証と防御機構の破綻によるゲノム不安定性化機構を解析するために、紫外線および豆類に含まれるゲニステイン(トポイソメラーゼII阻害剤)、アスベスト被爆後のヒストンH2AXのリン酸化とNBS1の損傷部位でのフォーカス形成を測定した。この結果、いずれの処理でもフォーカスが形成され二重鎖切断が発生していることが示された。さらに、Nbs1ノックアウト細胞を用いて、トポイソメラーゼI阻害剤であるカンプトテシン(CPT)感受性を調べた結果、Nbs1欠損細胞はCPTに高感受性であることがわかり、DNA複製阻害からの修復にNbs1が制御する二重鎖切断の相同組換え修復が関わっていることが明らかとなった。また、この修復機構としてDNA損傷メディエーター蛋白質TopBP1がATRの活性化因子であることが示され、TopBP1がDNA損傷シグナルをNBS1からATRへ介在することで、相同組換え修復を促進している可能性を明らかにした。

一方、HeLa細胞にニトロ芳香族炭化水素(nitro-PAH:3-nitrobenzoanthrone、N-hydroxyaminobenzanthrone、1-nitoropyrene、1,8-dinitropyrene)、etoposide、camptothecine、UV、X線を10%生存率を与える容量(線量)処理し、1時間後のH2AXのリン酸化量を蛍光抗体法で測定した結果、DNA二重鎖切断を起こすと考えられるetoposideとX線はS期および間期に、DNA塩基付加体・二量体を形成するのに対して、nitro-PAHおよびcamptothecinはS期特異的に、H2AXリン酸化が起こることがわかった。またこれらは100μM Wartmaninによって抑制されることから、上記の機構が支持された。DNA二重鎖切断はかって電離放射線照射により誘発される特殊なDNA損傷と思われていた。しかし、従来の生化学的方法方法よりも数百倍-数千倍の高感度なDNA二重鎖切断の検出が可能になった結果、環境変異原もDNA二重鎖切断を誘発することが次第に明らかとなった。本年度に我々が調べた紫外線、多環芳香族化合物(ベンゾ「a」ピレンなど)、ゲニステン(8-12μg/ml),エトポシド(5-20μg/ml),アスベスト、ソラーレンなどほとんど全ての環境変異原によるヒストンH2AXリン酸化が観測され、これらは環境変異原性の指標として有効である可能性が示された。また、興味深いことに、これらのフォーカス形成はS期に特異的に発生してDNA複製フォークの停止と重なっていることが示された。また、ソラーレンのDNAへの結合には紫外線が必要であり、複合的な組み合わせによる環境変異原性の増加の可能性も示唆された。DNA複製停止の結果として損傷乗り越え合成が誘導され、その誤りがちなDNA合成のポリメラーゼηによるG:C→T:Aトランスバージョン突然変異がゲノム不安定化の原因であることが示された。一方、染色体異常の誘発にはさらにChk1やSMC1などのチェックポイント蛋白が関与している。特に、SMC1は放射線照射後に形成される複合体BRCA1/NBS1の破綻が染色体異常を誘発する事が示された。これらの環境変異原の細胞応答にはヒストンH2AXのリン酸化やユビキチン化が必要であり、その破綻がゲノム不安定化の原因となることも示された。前年度に我々が調べた紫外線、多環芳香族化合物、ゲニステン,エトポシド,アスベスト、ソラーレンなどほとんど全ての環境変異原によるヒストンH2AXリン酸化が観測され、DNA二重鎖切断あるいはそれに類似した現象が確認された。興味深いことに、H2AXリン酸化はS期特異的に起こりDNA二重鎖切断のもう一つの指標であるNBS1と共局在した。これは、放射線によるDNA二重鎖切断が全細胞周期を通じてH2AXリン酸化およびNBS1との共局在が起こることと対照的であり、両者のDNA二重鎖切断に違いがあることを示唆した。
磁性粉を含むゲル担体に固定化した酵素を用いた磁場による反応速度制御

保磁力400Oeの磁性粉としてγ-酸化鉄,それに酵素,β-ガラクトシダーゼを一緒にポリ-N-イソプロピルアクリルアミドゲル中に固定化した.径1mm,長さ120mmのゲルを用いて2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドのガラクトースと2-ニトロフェノールへの加水分解反応を行なった.変動磁場(840Oe,2.3kHz)を印加すると,γ-酸化鉄のヒステリシス損によりゲルを磁気加熱することができた.ポリ-N-イソロピルアクリルアミドゲルは加熱すると収縮し,冷やすと膨潤する性質がある.その転移点が34°C付近にある.そこで磁気加熱により2038°Cの範囲で温度変化させた.その結果,ゲルの収縮膨潤に伴い酵素のみかけ活性の変化が認められた.保持力2.000OeのSr-Baフェライト粉(径0.4μm)を含むポリアクリルアミドゲル(径2mm,長さ10mm)を調製した.このゲルを1.4T静磁場におくと,磁性粉はゲル内で配向し,ゲル自身は磁気異方性を示すようになった.この磁気異方性ゲルは,200Oe,100Hz以下の変動磁場内におくと,振動したり,回転したりする.磁場がこれより強くなると,ゲル自体は運動しない.しかし,ゲル内の磁性粉は運動しているものと推察している.Sr-Baフェライトとともに酵素,β-ガラクトシダーゼ,をゲルに固定化し,また磁気異方性化したこの固定化酵素を用いて,いろいろの変動磁場の条件下で2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドの加水分解を行なったところ,酵素のみかけ活性は最大3倍にもなった.ゲル内の基質や生成物の拡散速度が,同じゲル内の磁性粉の運動により促進される結果,ゲル表面を通して移動速度が速くなるためと推察している.保磁力400Oeの磁性粉としてγ-酸化鉄,それに酵素,β-ガラクトシダーゼを一緒にポリ-N-イソプロピルアクリルアミドゲル中に固定化した.径1mm,長さ120mmのゲルを用いて2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドのガラクトースと2-ニトロフェノールへの加水分解反応を行なった.変動磁場(840Oe,2.3kHz)を印加すると,γ-酸化鉄のヒステリシス損によりゲルを磁気加熱することができた.ポリ-N-イソロピルアクリルアミドゲルは加熱すると収縮し,冷やすと膨潤する性質がある.その転移点が34°C付近にある.そこで磁気加熱により2038°Cの範囲で温度変化させた.その結果,ゲルの収縮膨潤に伴い酵素のみかけ活性の変化が認められた.保持力2.000OeのSr-Baフェライト粉(径0.4μm)を含むポリアクリルアミドゲル(径2mm,長さ10mm)を調製した.このゲルを1.4T静磁場におくと,磁性粉はゲル内で配向し,ゲル自身は磁気異方性を示すようになった.この磁気異方性ゲルは,200Oe,100Hz以下の変動磁場内におくと,振動したり,回転したりする.磁場がこれより強くなると,ゲル自体は運動しない.しかし,ゲル内の磁性粉は運動しているものと推察している.Sr-Baフェライトとともに酵素,β-ガラクトシダーゼ,をゲルに固定化し,また磁気異方性化したこの固定化酵素を用いて,いろいろの変動磁場の条件下で2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドの加水分解を行なったところ,酵素のみかけ活性は最大3倍にもなった.ゲル内の基質や生成物の拡散速度が,同じゲル内の磁性粉の運動により促進される結果,ゲル表面を通して移動速度が速くなるためと推察している.本研究の目的は磁場を用いて固定化酵素の活性を磁気制御するための基礎的知見を積み上げることである。ポリアクリルアミドゲルに磁性粉としてSr-Ba-フェライト、酵素としてβ-D-ガラクトシダーゼを包括固定化し、カラムに充填して、基質溶液を流しながら外部から交番磁場を印加した。そのときのカラム反応液中の反応生成物濃度変化を調べた。現在までのところ、本研究で提案した固定化酵素の磁気的な活性制御のシステムは今までにない大きな活性増加の効果が得られることが分かった。いかに述べる、ここまでの結果をまとめて、現在、Biotechnology and Bioengineeringに投稿中である。(1)強磁性粉を20%50%含む固定化酵素ゲルを交番磁場にさらすと、みかけ酵素活性が磁場を印加する前に比べて、最大3倍以上に増加することが分かった。(2)活性の変化は磁場を印加すると速やかに増加し、磁場印加を中止すると、再び速やかにもとの活性まで戻るので、制御が容易である。(3)活性増加させるための投入エネルギーは実験装置程度の規模の場合で1W以下と省エネルギーである。(4)固定化酵素担体のアクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド濃度を変えて、ゲルの硬さを変化させたところ、架橋度の小さいゲルのほうが、磁場の制御が容易であった。一方で、ゲルの固さの影響は小さい。(5)外部交番磁場周波数および磁場強度のいずれを変化させても、酵素活性の増加率を変えることができた。(6)ゲルは見かけ動かないので、ゲル自身の回転などによる磨耗が原因となるゲルの劣化は起こらなかった。

保磁力400 Oeの磁性粉としてγ-酸化鉄,それに酵素,β-ガラクトシダーゼを一緒にポリ-N-イソプロピルアクリルアミドゲル中に固定化した.径1mm,長さ120mmのゲルを用いて2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドのガラクトースと2-ニトロフェノールへの加水分解反応を行なった.変動磁場(840 Oe,2.3kHz)を印加すると,γ-酸化鉄のヒステリシス損によりゲルを磁気加熱することができた.ポリ-N-イソロピルアクリルアミドゲルは加熱すると収縮し,冷やすと膨潤する性質がある.その転移点が34°C付近にある.そこで磁気加熱により2038°Cの範囲で温度変化させた.その結果,ゲルの収縮膨潤に伴い酵素のみかけ活性の変化が認められた.保持力2,000 OeのSr-Baフェライト粉(径0.4μm)を含むポリアクリルアミドゲル(径2mm,長さ10mm)を調製した.このゲルを1.4T静磁場におくと,磁性粉はゲル内で配向し,ゲル自身は磁気異方性を示すようになった.この磁気異方性ゲルは,200 Oe,100Hz以下の変動磁場内におくと,振動したり,回転したりする.磁場がこれより強くなると,ゲル自体は運動しない.しかし,ゲル内の磁性粉は運動しているものと推察している.Sr-Baフェライトとともに酵素,β-ガラクトシダーゼ,をゲルに固定化し,また磁気異方性化したこの固定化酵素を用いて,いろいろの変動磁場の条件下で2-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドの加水分解を行なったところ,酵素のみかけ活性は最大3倍にもなった.ゲル内の基質や生成物の拡散速度が,同じゲル内の磁性粉の運動により促進される結果,ゲル表面を通して移動速度が速くなるためと推察している.
骨粗鬆症性椎体骨折・脊柱変形によるロコモティブシンドロームへの影響に関する調査

高齢運動器検診者(50歳以上)に運動指導の介入によるロコモ対策の効果を検討した。2016年の運動器検診受診者から67名を抽出し、2017年9月から四頭筋訓練(左右各10回1日2セット)、片脚起立訓練(左右を各1分間1日3セット)、ハーフスクワット(56回1日3セット)を外来にて1人の整形外科医が指導を開始した。1ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後に外来での再指導およびコンプライアンスの確認を行った。その結果、全対象者において大腿四頭筋筋力および歩行速度は経時的に増加する傾向があり、初診時と6ヶ月後ではそれぞれ平均230 Nから336 N、1.27 m/sから1.36 m/sと有意に増加した(ともにP<0.001)。しかし四肢筋量の経時的な変化は統計学的に有意ではなかった。大腿四頭筋筋力は3ヶ月時から6ヵ月時で平均327 Nから336 Nと統計学的に有意な増加は無かったが(P=0.137)、歩行速度は3ヶ月時から6ヵ月時で平均1.31 m/sから1.36 m/sと有意に増加した(P<0.01)。男性および女性において大腿四頭筋筋力および歩行速度が経時的に増加する傾向があり、初診時と6ヶ月後ではそれぞれ男性では平均313 Nから424 N (P<0.001)、1.22 m/sから1.32 m/s (P=0.005)、女性では平均179 Nから282 N (P<0.001)、1.29 m/sから1.38 m/s (P<0.001)と有意に増加した。しかし四肢筋量は経時的に有意な変化は無かった。これらの結果を2018年日本腰痛学会にて報告し、Journal of spine research、2019年6月号に同報告を論文にしたものの掲載が決定している。学会発表、日本語ではあるが論文作成が完了しているため。今回外来形式で行った介入によって得られたポジティブな結果を基に、今度はより規模を拡大した地域レベルでの介入研究を予定している。【骨粗鬆症性椎体骨折・脊柱変形によるロコモティブシンドロームへの影響とその対策】2012年および2014年の高齢運動器検診において形態的椎体骨折のある群(Genant Grade1以上)では無い群と比較して有意に健康関連QOL(ODI、EQ5D、ロコモ25)が不良で、X線パラメーター(SVA)も有意に不良な傾向があった。また形態的骨折のある群でも2012年で骨折のみられていた既存骨折群と2014年で初めて骨折を認めた新規骨折群では、既存骨折群が2014年の時点で有意にHRQOLの低下を認めた。2016年の運動器検診受診者から67名を抽出し、2017年9月から四頭筋訓練(左右各10回1日2セット)、片脚起立訓練(左右を各1分間1日3セット)、ハーフスクワット(56回1日3セット)を外来にて指導を開始した。指導開始から9ヶ月で2018年度の運動器検診を施行し健康関連QOLの評価を行い、2016年からの変化について検討する方針である。当初の計画通りの予定でほぼ進行しているが、運動指導の介入はロコモの予防という観点からも考えて、椎体骨折の有無や脊柱骨盤アライメントの異常の有無を問わず指導することとしたため。

これらの結果を2018年日本腰痛学会にて報告し、Journal of spine research、2019年6月号に同報告を論文にしたものの掲載が決定している。学会発表、日本語ではあるが論文作成が完了しているため。2018年10月ころまでには2018年度の運動器検診が完了し、同年12月までにはデータの整理、必要なパラメーター等の計測を行っていく方針とする。今回外来形式で行った介入によって得られたポジティブな結果を基に、今度はより規模を拡大した地域レベルでの介入研究を予定している。
勤勉に関する日本的倫理観とその心理的基礎：認知的・動機的・文化的諸過程の解明

近年の道徳心理学研究研究によって明らかになった「道徳基盤」に加えて、「勤勉」もまた道徳判断の重要な根拠となる可能性と、それが日本社会において顕著である可能性を検証するため、社会心理学的・文化心理学的方法を用いた実証的研究を行う。特に、勤勉に関わる倫理的価値意識の基礎をなす、認知過程と動機過程、そして文化的特質の解明に焦点を当てる。併せて、これらの心理的諸過程の相互関係を理解するための理論的枠組みの構築を目指す。さらに、本研究の知見をもとに、勤労をめぐる現実的な社会問題の解決策に関する論考を行う。以上を達成するために、応用倫理学の観点と心理学研究の方法を総合した学際的な試みを行う。
コリン作動性ニュ-ロンの発生と分化に関する組織化学的および分子遺伝学的研究

コリン作動性ニュ-ロンの発生と分化を組織化学的に解析するため、(1)本ニュ-ロンの特異的指標であるコリン・アセチル基転移酵素(ChAT)のcDNAを大腸菌に組込みChAT蛋白を発現させ、これを抗原とした抗血清の作成および免疫組織化学の確立と、(2)ChATのRNAプロ-ブをcDNAから作製し、組織切片上で遺伝子発現を捉えるin situ hybridizationの確立を行った。両手法を用い、ラットとヒト胎児で以下のことを明らかにした。1.ラット新皮質VI層には、生後1日目からChAT免疫強陽性細胞が存在するが、13日目には免疫陽性は全く消失する。この現象を解析した結果、細胞死や移動ではなく、表現型の変換であることが強く示唆された。2.ラットの中枢神経系におけるコリン作動性ニュ-ロンの生後発生を両手法で解析し、前脳から脊髄に至る多くの部位で、生後1日目から本ニュ-ロンが検出できるが、多くは移動途上にあり、14ー21日目にほぼ成体と同様の分布がみられることを明らかにした。しかし、胎生期のおける本ニュ-ロンの発生学的解析に関しては、種々の技術的困難さがありまだ完成していないが、諸条件の設定を終え、早急に完了する予定である。3.ヒトのChATのcDNAをクロ-ニングし、ISHにより、ヒト胎児12ー20週の脊髄で運動ニュ-ロンを検出し得た。一方、コリン作動性ニュ-ロンの分子遺伝学的解析により、以下のことを明らかにした。1.ラットとマウスにおいて、それぞれ1種類のcDNAをクロ-ニングし、その構造を決定したが、これらとは異なる構造を持つcDNAがさらにクロ-ニングされた。従って、ChATのmRNAは単一ではないことが示唆された。2.マウスのChATのcDNAを用い、その遺伝子DNAをクロ-ニングし、プロモ-タ-およびエンハンサ-領域を明らかにした。1.コリン作動性ニュ-ロンの発生と分化を組織化学的に解析するため、(1)本ニュ-ロンの特異的指標であるコリン・アセチル基転移酵素(ChAT)に対する抗血清の作成と、(2)ラットのChATのcRNAプロ-ブを用い、組織切片上で遺伝子発現を捉えるin situ hybridization(ISH)を行った。(1)では、ラットのChATのcRNAを大腸菌に組込みChAT蛋白を発現させ、これを抗原として抗血清を作成した。この抗血清は、特異性が高く、クリオスタット切片でも免疫組織化学ができ、従来用いてきた単クロ-ン抗体より利用範囲が広い。次年度はこれを用い、ラット前脳におけるコリン作動性ニュ-ロンの胎生期および生後発生を蛋白レベルで解析する。(2)では、ラット前脳のコリン作動性ニュ-ロンの生後発生を遺伝子レベルで解析し終えた。次年度は、胎生期における本ニュ-ロンの発生と分化を明らかにする。2.また、コリン作動性ニュ-ロンからの投射を受けるニュ-ロンの発生を解析するため、ムスカリン性アセチルコリン受容体のcRNAプロ-ブを用いたISHを確立した。次年度は、このニュ-ロンの胎生期および生後発生を解析する。さらに、1.および2.で得られた知見を対比し、コリン作動性ニュ-ロンの発生と分化およびその神経回路網形成の時間的、空間的関連性を解析する。3.ヒトのChATの遺伝子DNAをクロ-ニングし、ChAT蛋白を全てコ-ドするクロ-ンを得た。次年度は、その全塩基配列を決定するとともに、ISHによりヒト胎児におけるコリン作動性ニュ-ロンの発生と分化を解析する。

4.マウスのChATのプロモ-タ-DNAに、標識蛋白であるクロラムフェニコ-ル・アセチル基転移酵素の遺伝子を結合したのち、種々の神経細胞株に導入し、ChAT遺伝子が発現されることを明らかにした。1.前年度作成した、コリン作動性ニュ-ロンの特異的なマ-カ-であるコリン・アセチル基転移酵素(ChAT)に対する抗血清を用い、ラットの中枢神経系におけるコリン作動性ニュ-ロンの生後発生を解析した。前脳基底部では、生後1日目からChAT免疫強陽性細胞が存在するが、約14日目まで移動が観察される。新線条体では、免疫強陽性ニュ-ロンが外側部にのみ存在し、14日目までは内側への移動がみられた。内側手綱核では、生後1日目で核が形成されている。脳神経運動核および脊髄前角では、出生直後に運動ニュ-ロンがみられ、14ー21日目まで免疫陽性が増え続け、成体と同一レベルに達する。胎生期におけるコリン作動性ニュ-ロンに関しては種々の技術的困難さがあり、まだ完了していない。しかし、8ー10時間浸漬固定すればよいこと等の結果を得ており、今後早急に解析を進める予定である。2.ヒトのChATのcDNAをクロ-ニングし、このcDNAからRNAプロ-ブを作製し、ヒト胎児12ー20週の脊髄において運動ニュ-ロンを検出することに成功した。今後ヒト胎児のおける運動ニュ-ロンの発生と分化に関する研究を続行したいと考えている。3.マウスのChATのcDNAを用い、マウスのChAT遺伝子をクロ-ニングした。この遺伝子の下流にreported遺伝子を結合し、培養細胞に導入しその発現を調べた。この遺伝子は、神経細胞由来の培養細胞で発現されるが、非神経細胞由来のものでは発現されないことがわかった。さらに、この遺伝子を部分欠損させ発現実験を行い、プロモ-タ-およびエンハンサ-領域を明らかにした。4.ヒトのChATのcDNAの構造を明らかにした。ラット、マウスやブタとは異なり、108アミノ酸残基長いChAT蛋白が合成されることが示唆された。