hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物葉における光呼吸窒素循環系からの窒素の利用に関する研究

光呼吸代謝過程で、ミトコンドリアで放出されるNH_4^+は、理論上2モルのグリシンからノモルNH_4^+とされる。このNH_4^+の一部は、グルタミン酸脱水素酵素(GDH)の触媒でミトコンドリア内でグルタミン酸に同化され、系外で利用されるモデルを提案した。しかし、ミトコンドリアにはNH_4^+プールや他の系由来のNH_4^+があり、グルタミン酸合成の化学量論的解析はされていなかった。本年度は、エンドウ葉からミトコンドリアを単離し、^<15>Nグリシン(99atom%excess)を与え、生成する^<15>NH_4^+を測定して2^<14>+NH_4^+による重窒素の希釈を検討した。生成した^<15>NH_4^+は、コンウェイ微量拡散装置で回収し、牛肝GDHでグルタミン酸に変換後、ガスクロマトグラフ-質量分析装置で^<15>N濃度を測定した。その結果、約10%の^<15>NH_4^+が内在性の^<14>NH_4^+で希釈されているたとが判明した。従って、以前求められた^<15>Nグリシン由来の^<15>Nグルタミン酸合成量は、約10%低く見積もられていたことになる。また、この系にα-ケトグルタル酸を加えると、約8倍グルタミン酸合成量が増加することも明らかとなった。今後、さらにミトコンドリアによるグリシン/セリンの変換の化学量論的な解析を、詳細に調べ光呼吸系からの窒素利用を明らかにする予定である。他方、放出されるNH_4^+の再同化を分子生物学的に解析するため、同化酵素のGDHとグルタミン合成酵素(GS)をそれぞれ均一に生成し、ウサギに免疫後、抗血清を得た。GS抗血清を用いた検討によると、水稲葉では2個、根では4個のアイソザイムの存在が、二次元電気泳動とウエスタンブロッティングにより確認された。また葉のGSは、in vitro翻訳系を用いた所、分子量のやや大きいプレカーサーとして合成されていた。今後、GSとGDHの発現を、抗体を利用して、蛋白とmRNAに着目して検討する予定である。
ガスハイドレートの自己保存性の発現機構の解明

ガスハイドレートの自己保存性発現機構を解明するため、結晶構造がI型のメタンハイドレートとエタンハイドレート、II型であるクリプトンハイドレートの分解速度に対する電解質の効果を検討した。いずれのハイドレートも、電解質と氷との共晶点温度直下では分解が強く抑制され、電解質濃度が比較的大きい場合は、共晶点温度を超えたところで一時的に分解が加速した。自己保存性はガスハイドレート表面に生成した氷膜によって起こり、電解質による氷膜の欠陥修復や局所溶解などによる拡散パスの増減が分解速度を支配していることを明らかにした。ガスハイドレートによる天然ガス輸送の鍵を握る、ガスハイドレートの自己保存性(大気圧における平衡温度193Kから遠く離れた260K近傍での分解速度が非常に小さい現象)について、分解速度の温度・圧力依存性と微細構造変化の観察により、その発現機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、分解速度の圧力依存性を検討するため高圧熱天秤を導入した。ガスハイドレートの分解によりハイドレート試料の質量が減少するので、これを捉える装置である。本装置により、メタンハイドレートの分解速度が実験圧力に依存することを確認し、またその圧力依存性は温度によって異なることも確認した。平衡圧力自体が温度によって変化するため、大気圧下のみでの検討では不可能であった、自己保存性に対する分解推進力(平衡圧力と実験圧力の差)の効果と、温度の効果とを分離して評価できるようになった。来年度以降は調書記載の計画通り、すでに大気圧において自己保存性に影響を与えることを報告している微量の塩添加系と、メタンハイドレートとは平衡圧力や結晶構造の異なるメタン以外のガスハイドレートについて順次、各圧力における分解速度の測定を実施していく。微細構造観察については、分解進行に伴う微細構造変化は明らかにしているが、実験条件ごとの違いはまだ確認されていない。今後は分解速度測定により自己保存性に大きな差のある条件を見出した後に、それらの条件を中心に実施する計画である。以上述べたように、初年度である本年度は自己保存性に対する、ハイドレートの種類、温度、圧力、塩添加の効果の知見を蓄積する段階であり、成果発表には至っていないが、引き続き計画通り研究を進め、研究期間内に自己保存性の発現機構の解明を目指す。氷点以下の不安定条件に置かれたガスハイドレートの分解速度が異常に小さくなる現象である自己保存性は、ガスハイドレートを用いた天然ガスの貯蔵・輸送など、多くの応用が期待されることから重要な性質である。その発現機構にはガスハイドレートの分解により生成する氷がガスハイドレートの周りを覆うことが関係していると言われているが、温度・ガス種・添加物によって分解速度が複雑に変化することを説明できる、自己保存性の発現機構はまだ与えられていない。今年度はエタンハイドレートについて実験を行い、原料水への微量電解質の添加が分解速度に影響を与えることを確認した。共晶点温度直下では分解が強く抑制され、これは電解質結晶の周りに生じる準安定な、移動度の高い水が氷膜の欠陥修復を促進するためと考えられる。一方、電解質濃度が比較的大きい場合は、共晶点温度を超えたところで一時的に速い分解が起こり、これは安定な電解質溶液が生成し、これは氷膜の一部を溶解して拡散経路を生み出すためと考えられる。メタンおよびエタンハイドレートはいずれもこの共晶点温度近傍での分解抑制と促進を示すが、これらは構造I型の結晶構造を持つガスハイドレートである。そこで、構造II型であるクリプトンハイドレートについても実験を行ったところ、全く同じ共晶点温度近傍での異常性を確認できた。さらに、高圧天秤を用いて異なる圧力での分解速度を測定し、共晶点温度近傍での異常性は圧力にも依存しないことを確認した。以上のことから、ガスハイドレートの自己保存性はガスハイドレート表面に生成した氷膜によって起こり、電解質による欠陥の修復や局所溶解などによる拡散パスの増減が分解速度を支配していることが明らかになった。(1)メタンハイドレートの分解速度測定当初の計画通り、各種の微量添加物を含有する原料水から製造したメタンハイドレートの分解速度測定を、0.1から1.0 MPaの圧力範囲、243から273 Kの温度範囲で実施し、添加した電解質と水との共晶点温度付近で分解が強く抑制されることと、電解質の濃度が高い場合は共晶点温度にて突然急激に分解することを明らかにした。特に後者の温度は圧力には依存しなかった。(2)メタン以外のハイドレートの分解速度測定天然ガスの第二成分であるエタンのハイドレートについて、メタンハイドレートと同様の検討を進めている。製造の課題は解決し、順次測定を進めている段階である。次年度も引き続き実施する。(3)自己保存性の発現機構解明と強化手法の探索共晶点温度直下における強い自己保存性の発現は、移動度の高い水によってガスハイドレート表面を覆う氷の焼結が促進されるためと推定された。一方、高い濃度における分解の促進は安定な水溶液の発生がこの氷の一部を融解するためと考えられた。これらについて学会および論文にて報告した。

また、ガスハイドレートを貯蔵・輸送したい温度域に応じ、適切な共晶点温度を示す電解質を添加することで自己保存性を強化できることを明らかにし、特許出願を行った。本年度検討項目のうち、高圧熱天秤による分解速度測定は予定通り進捗しており、メタンハイドレートの分解速度の圧力依存性が明らかになった。一方、ハイドレートの微細構造観察においては、自己保存性の強い条件と弱い条件での微細構造の違いを見出すには至っていない。実際に違いが小さい可能性もあるため、分解速度の検討を優先して進めている。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は以下の三項目の実施を計画していた。(1)メタンハイドレートの分解速度測定当初の計画通り、各種の微量添加物を含有する原料水から製造したメタンハイドレートの分解速度測定を、0.1から1.0 MPaの圧力範囲、243から273 Kの温度範囲で実施し、添加した電解質と水との共晶点温度付近で分解が強く抑制されることと、電解質の濃度が高い場合は共晶点温度にて突然急激に分解することを明らかにした。特に後者の温度は圧力には依存しなかった。本項目は論文報告を持って完了した。(2)メタン以外のハイドレートの分解速度測定エタンハイドレートの分解測定を進めている。現在半分程度の進捗であり、残された一年で十分完了すると考えている。(3)自己保存性の発現機構解明と強化手法の探索共晶点温度直下における強い自己保存性の発現は、移動度の高い水によってガスハイドレート表面を覆う氷の焼結が促進されるためと推定された。一方、高い濃度における分解の促進は安定な水溶液の発生がこの氷の一部を融解するためと考えられた。これらについて学会および論文にて報告した。本項目は当初計画より一年早く、最小限の目標をクリアできたと考えている。以上のように、1項目はやや遅れているが、他の項目は計画通りや計画以上に進行している。本年度購入した高圧熱天秤は予期したとおり機能し、分解速度に対する温度・圧力の効果が明らかになりつつある。当初計画通り、引き続きメタンハイドレートの分解速度測定を行うとともに、メタン以外のガスハイドレートについても検討する。そして自己保存性の発現機構の解明を目指す。一方、微細構造観察については、実験条件による微細構造の差が小さい可能性が高いため、その差が最も現れやすいと考えられる、小さな条件の変化で分解速度が大きく変化する領域を明らかにし、その領域内にて実施することとする。そのため、しばらくは分解速度測定を優先して実施する。電解質を添加したメタンハイドレートの分解速度測定により、ガスハイドレートの自己保存性には氷の焼結が重大な役割を持ち、移動度の高い水がこれを促進する一方、安定な液体相の発生は氷の融解を引き起こして分解を促進することを明らかにした。
自己免疫疾患発症を抑制する胸腺上皮細胞の機能を制御する新規転写因子の解析

1.転写因子Xを胸腺上皮特異的に欠損するマウスの作成:全身で転写因子Xを欠損するマウスは胎生致死であるため、胸腺上皮細胞特異的にCreを発現するFoxn1-Creマウスと交配させ、胸腺上皮細胞特異的にXを欠損するマウス(以下、胸腺上皮特異的X欠損マウス)を作成した。2 .胸腺構成細胞の分化における転写因子Xの機能解析:胸腺上皮特異的X欠損マウス由来の胸腺を、常法に従い(コラゲナーゼ処理で分散して単細胞とし、フローサイトメーターで解析した。その結果、転写因子Xを胸腺上皮細胞で欠損すると、CD80の発現が低い胸腺髄質上皮細胞の画分が約半分に減少した。一方で、CD80の発現が高い髄質上皮細胞や皮質上皮細胞には有意な変化は見られなかった。3.転写因子Xを発現する髄質上皮細胞の同定:髄質上皮細胞をCD80の発現が高い画分と低い画分に分けてセルソートし、胸腺上皮細胞のどの画分に発現するのか検討した。その結果、CD80の発現が低い髄質上皮細胞で高く発現し、CD80高発現髄質上皮細胞での発現は低かった。また皮質上皮細胞では、ほとんど発現していなかった。4.転写因子X依存的に髄質上皮細胞で発現する組織特異的遺伝子の同定:胸腺特異的なX欠損マウスの胸腺をコラゲナーゼで単細胞とし、CD80高発現髄質上皮細胞、CD80低発現髄質上皮細胞、皮質上皮細胞を各々のマーカーによりセルソーターで分取した。分取した細胞の遺伝子発現をRNA-seq解析し、転写因子X依存的に発現する組織特異的遺伝子を同定した。一方で、AireやFezf2の欠損マウスから同様に胸腺上皮細胞を分取しAireとFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子を決定した。両者を比較したところ、転写因子Xに依存する組織特異的遺伝子は、AireやFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子とは大きく異なることが判明した。本年度は1.転写因子Xを胸腺上皮特異的に欠損するマウスの作成、2 .胸腺構成細胞の分化における転写因子Xの機能解析、3.転写因子Xを発現する髄質上皮細胞の同定、4.転写因子X依存的に髄質上皮細胞で発現する組織特異的遺伝子の同定、を目指した。FloxマウスとFoxn1-Creマウスを用いて、全胸腺上皮細胞特異的にXを欠損するマウス(以下、胸腺上皮特異的X欠損マウス)の作成は順調に行えた。その後、実験2において、胸腺上皮特異的X欠損マウスの胸腺上皮細胞をフローサイトメーターで解析したところ、予想外なことにCD80の発現が低い胸腺髄質上皮細胞の画分が約半分に減少することが判明し、続く遺伝子発現解析に約2ヶ月の遅れが生じた。ついでセルソーティングによる転写因子X遺伝子の発現解析も順調に進んだ。一方で、免疫組織による発現解析は、抗体の選定に予想外の時間を要したが、最終的には、年度内に終了できた。さらに胸腺上皮特異的X欠損マウス由来の胸腺上皮細胞について、遺伝子発現をRNA-seqにより解析し、転写因子X依存的に発現する組織特異的遺伝子を同定した。一方で、AireやFezf2の欠損マウスを準備し、同じプラットフォームで組織特異的遺伝子の発現プロファイルを比較したところ、転写因子Xに依存する組織特異的遺伝子は、AireやFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子とは大きく異なることが判明しており、これまでの因子とは異なる機能を持つことが明らかとなった点で、今後の展開が期待できる結果となった。平成29年度には予想外の知見から、一部に遅れが生じたが、それらの遅れは既にほぼ取り戻している。またRNA-seq解析から、新たな発見が生じており、到達目標の一つを既に達成した。また得られた結果も、当初の仮説にほぼ合致しており、現在の研究推進の予定に問題はない。以上の状況から引き続き、以下を行っている、計画4.転写因子Xの欠損による自己免疫疾患発症の検討、計画5.髄質上皮細胞において転写因子Xが結合するゲノムDNA領域の同定、計画6.転写因子Xに依存した髄質上皮細胞のエピゲノム変化の検討、計画7.転写因子Xに結合するタンパク質複合体の同定1.転写因子Xを胸腺上皮特異的に欠損するマウスの作成:全身で転写因子Xを欠損するマウスは胎生致死であるため、胸腺上皮細胞特異的にCreを発現するFoxn1-Creマウスと交配させ、胸腺上皮細胞特異的にXを欠損するマウス(以下、胸腺上皮特異的X欠損マウス)を作成した。一方で、CD80の発現が高い髄質上皮細胞や皮質

上皮細胞には有意な変化は見られなかった。3.転写因子Xを発現する髄質上皮細胞の同定:髄質上皮細胞をCD80の発現が高い画分と低い画分に分けてセルソートし、胸腺上皮細胞のどの画分に発現するのか検討した。その結果、CD80の発現が低い髄質上皮細胞で高く発現し、CD80高発現髄質上皮細胞での発現は低かった。また皮質上皮細胞では、ほとんど発現していなかった。4.転写因子X依存的に髄質上皮細胞で発現する組織特異的遺伝子の同定:胸腺特異的なX欠損マウスの胸腺をコラゲナーゼで単細胞とし、CD80高発現髄質上皮細胞、CD80低発現髄質上皮細胞、皮質上皮細胞を各々のマーカーによりセルソーターで分取した。分取した細胞の遺伝子発現をRNA-seq解析し、転写因子X依存的に発現する組織特異的遺伝子を同定した。一方で、AireやFezf2の欠損マウスから同様に胸腺上皮細胞を分取しAireとFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子を決定した。両者を比較したところ、転写因子Xに依存する組織特異的遺伝子は、AireやFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子とは大きく異なることが判明した。本年度は1.転写因子Xを胸腺上皮特異的に欠損するマウスの作成、2 .胸腺構成細胞の分化における転写因子Xの機能解析、3.転写因子Xを発現する髄質上皮細胞の同定、4.転写因子X依存的に髄質上皮細胞で発現する組織特異的遺伝子の同定、を目指した。FloxマウスとFoxn1-Creマウスを用いて、全胸腺上皮細胞特異的にXを欠損するマウス(以下、胸腺上皮特異的X欠損マウス)の作成は順調に行えた。その後、実験2において、胸腺上皮特異的X欠損マウスの胸腺上皮細胞をフローサイトメーターで解析したところ、予想外なことにCD80の発現が低い胸腺髄質上皮細胞の画分が約半分に減少することが判明し、続く遺伝子発現解析に約2ヶ月の遅れが生じた。ついでセルソーティングによる転写因子X遺伝子の発現解析も順調に進んだ。一方で、免疫組織による発現解析は、抗体の選定に予想外の時間を要したが、最終的には、年度内に終了できた。さらに胸腺上皮特異的X欠損マウス由来の胸腺上皮細胞について、遺伝子発現をRNA-seqにより解析し、転写因子X依存的に発現する組織特異的遺伝子を同定した。一方で、AireやFezf2の欠損マウスを準備し、同じプラットフォームで組織特異的遺伝子の発現プロファイルを比較したところ、転写因子Xに依存する組織特異的遺伝子は、AireやFezf2に依存して発現する組織特異的遺伝子とは大きく異なることが判明しており、これまでの因子とは異なる機能を持つことが明らかとなった点で、今後の展開が期待できる結果となった。平成29年度には予想外の知見から、一部に遅れが生じたが、それらの遅れは既にほぼ取り戻している。またRNA-seq解析から、新たな発見が生じており、到達目標の一つを既に達成した。また得られた結果も、当初の仮説にほぼ合致しており、現在の研究推進の予定に問題はない。以上の状況から引き続き、以下を行っている、計画4.転写因子Xの欠損による自己免疫疾患発症の検討、計画5.髄質上皮細胞において転写因子Xが結合するゲノムDNA領域の同定、計画6.転写因子Xに依存した髄質
羊膜由来幹細胞の大いなる可能性～理想的な乳房再建を目指して

脂肪移植術において、脂肪由来間葉系幹細胞を添加した脂肪では移植脂肪の生着率が向上することが知られている。しかし、脂肪以外を由来とする間葉系幹細胞が脂肪移植術に与える影響についての報告はほとんどない。我々は、羊膜由来間葉系幹細胞(Amnion-derived mesenchymal stem cell: AMSC)に着目し、AMSCによる移植脂肪の生着率向上効果についての検証を研究目的とする。また、放射線照射を行なった母床に対しても、AMSCの移植脂肪の生着向上効果を検証する。これまでに、AMSCの採取、培養方法について検討を行ない、移植脂肪に添加するAMSCの調整が可能であることを確認した。マウス鼠径部のfat padを摘出、細分化し移植脂肪とする同種移植モデルでの評価を予定していたが、予備実験で十分量の脂肪の採取が困難であることが確認されたため、手術時の余剰検体として生じたヒト脂肪を免疫不全マウスの背部に移植する異種移植モデルにて検討を行うこととした。0.5gの脂肪にAMSCを添加して病理組織学的に評価し、AMSCと脂肪組織が十分に混和されていることを確認した。モデルの確立までに予定よりもやや時間を要したが、ヒト脂肪を免疫不全マウスの背部に移植する異種移植モデルを確立することができた。また、AMSCの培養、調整、脂肪組織への混和方法についても既に検討を行っており、AMSC添加脂肪を移植する準備は整っている。ヒト脂肪にAMSCを添加したものをマウス背部皮下に注入し、継時的にその重量、体積の測定を行う。また、病理組織学的にも評価を行い、脂肪の性状、壊死の有無について検討する。また、脂肪組織内の血管増生や間葉系幹細胞の分布についても組織学的に検討を行う。放射線照射を行った母床に対しても同様に、AMSCの移植脂肪の生着率向上効果を検証する。
次世代の機動的海底広帯域地震観測に向けた試験研究

機動的な広帯域海底地震計(BBOBS)はすでに実用化し、多数の観測実績を挙げてきている。しかし、そのデータを評価すると、解析において重要な長周期の水平動成分でノイズレベルが高い。この問題を解決するため、BBOBSのセンサー部を分離し、小型・低背にすることで堆積物中へ突入させ、底層流の影響を受けない状態にすることが考えられる。この構想の下で新型のセンサーを開発し、実地での試験観測を行った。その結果、ノイズレベルを1/10以下に低減し、陸上観測点並のデータが得られることを確認した。機動性に優れた,次世代の自由落下設置,自己浮上方式広帯域海底地震計の基本デザイン設計,センサー部の耐圧容器製作と耐圧試験,2008年の実地試験に向けた潜水艇利用申請を行った。物品費の殆どを使い,全く新しいセンサー部の耐圧容器(専用品)を製作した。基本的設計は2006年度に行っていたが,最終的な詰めを行いながら実際の製作を進めた。設計上の耐圧安全率は十分にとってあるが,確実を期すために海洋研究開発機構にて実際の使用水深である6000m相当の圧力を実際にかけて問題がないことを確認した。その耐圧容器に収納するセンサー自身についても,消費電力の削減,制御命令の整理などの改修を行い,現実の海底地震観測に見合う性能となった。加えて,そのセンサーと既存のデータレコーダーとを接続するのに必要な制御回路の設計と製作も行っている。2008年に実際の海底での試験観測を開始するため,海洋研究開発機構の深海調査研究公募に応募し,無人潜水艇利用の機会を2度,2008年6月と2009年1月に確保した。無人潜水艇で機器の設置を行う上では重量,寸法の制約があるので,運航チームとの打ち合わせを行い,試験観測を行えるような観測機器の仕様を詰め,具体的設計を進めている。広大な海域での陸上と同等な地震観測を可能とするため、従来の自己浮上型の広帯域海底地震計で問題点であった水平動成分雑音の低減を目的とする、次世代の広帯域海底地震計の基礎開発を進めてきた。これを実現することで、詳細な地球内部構造を知るだけでなく、海底下の地震発生帯で何が起きているかなど、幅広い知見を得ることが期待できる。その最初の段階の試みとして、小型の地震センサーを開発し、その部分をその他の記録部(電源などを含む)から分離させ、海底面へ埋設・押し込むことで海底での水の流れ(底層流)の影響を避け、海底との良い結合状態を得る、ということを行うことにした。H20年度は、2008年6月に無人潜水艇を用いて設置した1号機を、当初年度内の観測航海で回収する予定であった。しかし、研究船運航母体の都合により、2009年1月または3月に設定された航海が、2009年6月の航海へと大幅に延期されてしまったことで、本年度の研究費を繰り越し、1号機の回収を実施した。また、より理想的な設置状態にした2号機を継続して試験観測するために設置した。約半年の観測期間となった1号機では、従来の自己浮上型の広帯域海底地震計や流速計との並行観測を行い、雑音を起こす原因の把握を進める観測データを取得することが出来た。しかし、1号機は無人潜水艇で運搬したため地震センサー部を海底面へ押し込めなかったことからか、従来の広帯域海底地震計と比べ限られた周期帯で雑音が半減した程度で、陸上観測点とはまだ隔たりがある。更なる試験観測とその成果はH21年度の研究において進めており、有意義な結果が得られている。今年度は、2008年6月に設置した1号機を回収、より理想的な設置状態にした2号機の設置を6月に実施した。8月に回収する予定だったが無人潜水艇の故障により12月及び2010年2月に機器の設置回収を行うこととなった。そのため、当初予定していた半年程度の観測期間は1号機以外では確保できなかったが、従来の自己浮上型の広帯域海底地震計との並行観測など、一応の評価を行いうる観測データを年度末にかけてやっと取得することが出来た。のべ、3回の試験観測データからは、興味深い有意義な結果が得られている。無人潜水艇で運搬したため地震センサー部を海底面へ押し込めなかった1号機では、従来の広帯域海底地震計と比べ限られた周期帯で雑音が半減した程度であった。

2号機以降では、この機器開発研究の最終目標である海面からの自由落下設置方法を採ることにより、地震センサー部を海底面の堆積物へ充分突入させることに成功した。これにより、10分の1以上の雑音低減効果が2回の試験観測で共に確認され、陸上観測点並の地震観測を可能とする道筋が得られた。これにより、従来の広帯域海底地震計で10年かかる観測データの取得を1年程度でも可能となることが期待される。
病原体酵素の分子認識に基づくエイズ・マラリアの治療薬開発と薬剤耐性克服研究

我々は基質遷移状態概念に基づいて,アスパラギン酸プロテアーゼに属するHIVプロテアーゼ阻害剤のデザインと合成を行い,理想的な遷移状態ミミックとして独創的なヒドロキシメチルカルボニル(HMC)イソステアを見いだし,さらに低分子化にも成功した.このKNIシリーズの低分子HIVプロテアーゼ阻害剤は、次世代抗HIV薬として期待されている.HIVプロテアーゼ阻害剤は画期的な成果を挙げたが,大量投与が必要であること,また副作用および耐性克服など解決すべき問題点が山積みである.そこで,理想的なHMCを含むジペプチド型HIVプロテアーゼ阻害剤をデザインすることにより,耐性克服可能な組織移行性の高い低用量抗HIV薬を合成した.さらに,ジペプチド型HIVプロテアーゼ阻害剤のO-N分子内転位反応を利用した水溶性プロドラッグをデザインし合成した.一方,地球温暖化の進行によりマラリアが我国にも流行する可能性が憂慮されているが,マラリア原虫の増殖に重要な役割を果たす酵素Plasmepsin IIがHIVプロテアーゼと同じアスパラギン酸プロテアーゼに属することがわかった.現在使用されているマラリア治療薬は耐性が問題となって来ており,新しいタイプの抗マラリア薬の開発が急務の課題となっているので,HIVプロテアーゼ阻害剤開発のノウハウを用いて抗マラリア薬のデザインと合成を行った.そして,ジペプチド誘導体KNI-10006が4種類のPlasmepsin全てに活性を示し,活性部位に柔軟にフィットして高い活性を示す阻害剤でありこれをadaptive inhibitor(適応型阻害剤)と名付けた.このAdaptive inhibitorの概念はScienceでハイライトされ注目されている.我々は基質遷移状態概念に基づいて,アスパラギン酸プロテアーゼに属するHIVプロテアーゼ阻害剤のデザインと合成を行い,理想的な遷移状態ミミックとして独創的なヒドロキシメチルカルボニル(HMC)イソステアを見いだし,さらに低分子化にも成功した.このKNIシリーズの低分子HIVプロテアーゼ阻害剤は、次世代抗HIV薬として期待されている.HIVプロテアーゼ阻害剤は画期的な成果を挙げたが,大量投与が必要であること,また副作用および耐性克服など解決すべき問題点が山積みである.そこで,理想的なHMCを含むジペプチド型HIVプロテアーゼ阻害剤をデザインすることにより,耐性克服可能な組織移行性の高い低用量抗HIV薬を合成した.さらに,ジペプチド型HIVプロテアーゼ阻害剤のO-N分子内転位反応を利用した水溶性プロドラッグをデザインし合成した.一方,地球温暖化の進行によりマラリアが我国にも流行する可能性が憂慮されているが,マラリア原虫の増殖に重要な役割を果たす酵素Plasmepsin IIがHIVプロテアーゼと同じアスパラギン酸プロテアーゼに属することがわかった.現在使用されているマラリア治療薬は耐性が問題となって来ており,新しいタイプの抗マラリア薬の開発が急務の課題となっているので,HIVプロテアーゼ阻害剤開発のノウハウを用いて抗マラリア薬のデザインと合成を行った.そして,ジペプチド誘導体KNI-10006が4種類のPlasmepsin全てに活性を示し,活性部位に柔軟にフィットして高い活性を示す阻害剤でありこれをadaptive inhibitor(適応型阻害剤)と名付けた.このAdaptive inhibitorの概念はScienceでハイライトされ注目されている.
O^6-メチルグアニン修復不能がん細胞の特性

メチルニトロソグアニジン(MNNG)などのアルキル化剤によって作られるDNA損傷のなかで、細胞の致死や突然変異の誘発に主要な役割を演じると考えられている【O^6】-メチルグアニン(【O^6】-MeG)は、メチル転移酵素によって修復される。欧米における研究によれば、樹立されたヒト腫瘍細胞株のなかで、約20%の株は【O^6】-MeGを修復できないMe【r^-】株であると報告されている。本年度はこれらのMe【r^-】細胞に関して、以下のような研究成果を得ることができた。1.大腸菌のメチル転移酵素遺伝子のヒト修復欠損細胞内での発現【O^6】-MeGがヒト細胞にとって真に有害なDNA損傷であることを直接証明するために、大腸菌のメチル転移酵素遺伝子(ada遺伝子)をMe【r^-】のヒト細胞に導入して、アルキル化剤に対する反応を調べた。ada遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の両方を持ったプラスミドDNAを、Me【r^-】のヒト細胞HeLaMRにトランスフェクトして、ネオマイシンとアルキル化剤であるACNUの両方で選抜を行った。得られた形質転換クローン細胞においては、非常に高いメチル転移酵素の活性が見られ、これらの細胞の染色体DNAにはada遺伝子が安定に組み込まれており、mRNAが活発に発現されていた。これらの形質転換クローンは親株のHeLaMR細胞よりも、MNNGに対して数十倍も抵抗性になっていた。また、MNNGによる姉妹染色分体交換も全く生じなかった。以上より、細胞の致死や染色体異常の原因となっているのは、やはり【O^6】-MeGだと考えられる。2.日本人腫瘍細胞株におけるMe【r^-】株の頻度種々の臓器の腫瘍に由来する細胞株40株について、直接メチル転移酵素の活性を調べたところ、このうち5株が酵素活性のないMe【r^-】株であることが分った。
ランダムサイトコドン変異法による非天然アミノ酸導入蛋白質の作製

非天然アミノ酸の蛋白質への部位特異的導入は、蛋白質に新たな機能を付与するための有用な方法である。この変異法は1989年にShultzらにより、アンバーコドンを非天然アミノ酸に対応させる方法として発表された。我々の研究室では、新しく4塩基や5塩コドンを非天然アミノ酸に対応させることで、非天然アミノ酸の導入効率を改善し、さらには2個の非天然アミノ酸を導入して蛋白内の電子移動を観測することにも成功している(J.A.C.S. 2002)。しかし、非天然アミノ酸でアシル化されたtRNAの作成が非常に複雑であるため、その応用には限界があるのも事実である。本年度は、アミノアシルtRNAの簡便な作成法を開発するべく、ニュヨーク州立大学の菅裕明教授との共同研究を行った。菅裕明教授は、tRNAをアミノアシル化する様々なリボザイム(RNA触媒)を、進化工学的手法を用いて得ている。このうち、r24と名付けられたリボザイムは、カルボキシル基を弱く活性化したアミノ酸を基質としtRNAの3'末端を特異的にアミノアシル化する。しかし、r24はtRNAと強く結合し、生成物であるアミノアシルtRNAを解離することができず、結果として1ターンオーバーの触媒となる。この問題点を逆手に取り、r24をレジンに固定化することで効率良くアミノアシルtRNAを作成し精製することに成功した。実際には、r24の3'末端にpolyAを付加し、この3'末端を酸化してジアルデヒドを作成し、これをヒドラジドを表面にもつレジンに固定化した。このr24を固定化したレジンにtRNAとアミノ酸を含む水溶液を加え、アミノアシル化反応を行った。反応後、レジンを洗浄し、尿素を含む溶出液でr24を変性させることで、アミノアシルtRNAが回収できた。さらに、r24を固定化したレジンは、水で洗浄するだけで簡単に再生でき、複数回の再利用が可能であった。本結果は本年度の(H. M. et al. JA.CS. 2002)に発表した。今後、本方法が「ランダム挿入削除変異法(ランダムサイトコドン変異法)」を含む様々な方法に応用されるものと考えられる。
シンクロトロン放射光を利用したX線像撮影システムの構築

シンクロトロン放射光を利用したX線像撮影として、1次元的放射光ビームスキャンと2次元検出器による電子スキャンを組み合わせた撮影法(「スキャニングスリット撮影」)を考案し、その基礎研究を行った。得られた成果を以下にまとめる。1模擬的な撮影システムの開発X線管から発生した2次元的X線を鉛スリットとステージ機構を用いてビームスキャンを可能にした。被写体を透過したX線は、II(X線蛍光増倍管)、光学的に接合したテレビジョンカメラ(CCD)、および画像処理により電子スキャンを可能にした。これらの同調により、スキャニングスリット撮影のX線像撮影システムを開発した。2取得画像の評価1で開発した撮影システムを用いて、画質評価と被曝線量評価を行った。その結果、いずれの評価においてもスキャニングスリット撮影法がグリッドを用いた面撮影法と同等か、それ以上の良好な成績を示した。3散乱線除去率の算出スキャニングスリット撮影による散乱線除去率は、モンテカルロ計算法を用いて算出した。その結果、1次元的放射光ビーム幅と2次元検出器側の電子スリット幅を狭小化し同調スキャンを行うことにより、散乱線が低減できることを示した。4放射光を用いた撮影高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設にあるトリスタン蓄積リングの偏向電磁石から得られる放射光を利用してファントムの撮影を行った。1次元的放射光ビームスキャンについては分光結晶格子面の角度を変えることで、電子スキャンについては画像処理で模擬した。その結果、1次元的放射光ビーム幅と電子スリット幅を狭小化するほど画像が改善した。これらより、本撮影法がシンクロトロン放射光を利用したX線像撮影に有用な方法であることを示した。征来のX線装置を用いたスキャニングスリット撮影システムの開発,開発した撮影システムによる取得画像の評価および放射光を用いたときの本撮影法における散乱線除去率の算出をおこなった。1撮影システムの開発X線管から発生した2次元のX線を鉛スリットにより1次元的照射野として被写体に照射する。ここで,鉛スリットとは2枚の鉛坂により2次元のX線をスリット状にすることが可能で,マイクロメータによりスリット幅を調整できる器具である。被写体を透過したX線は蛍光増倍管と光学的に接合したテレビジョンカメラ(CCDカメラ)により撮影し,画像処理によりスキャニングスリットが可能な撮影システムを開発した。2取得画像の評価画質評価についてはコントラストと鮮鋭度の客観的評価と,視覚的識別能の主観的評価についておこない,被曝線量評価については,同一コントラストを得たときX線出力線量比で評価した。その結果,いずれの評価においても,スキャニングスリット撮影法がグリッドを用いた面撮影法と同等か,それ以上の良好な成績を示した。したがって,放射光スキャニングスリット撮影法による冠状動脈造影をおこなうことにより,従来のグリッドを用いた面撮影法に比較して低い被曝線量で高画質の画像が得られることを示した。3散乱線除去率の算出モンテカルロ計算法により被写体透過後の2次元点広がり分布を求め,それを2次元的に加算することによって1次線量と散乱線量とを計算して散乱線除去率を算出するという,新しい算出方法で散乱線除去率の算出をおこなった。その結果,放射光スキャニングスリット撮影法では,1次元的放射光ビーム幅と検出器側の電子的スリット幅をできるだけ小さくし同調スキャンをおこなうことによって,散乱線の影響を著しく小さくできることをした。
高齢者腎臓病の予後不良因子、三次リンパ組織を検出する新規バイオマーカーの開発

本研究の目的は腎予後不良因子である三次リンパ組織を検出するバイオマーカーを同定することであるが、それにはマウスおよびヒトにおける三次リンパ組織の性質を明らかにすることが必須である。前年度の解析でヒトおよびマウスの三次リンパ組織は質的な多様性があることが明らかになった。今年度はヒトおよびマウスの三次リンパ組織の性質によって大きく3つのstageに分類できること(stage1 -3)、障害の強さに応じてstageが上昇することをマウスで示した。このことはこの三次リンパ組織のステージ分類が障害・炎症を反映する新規形態マーカーになる可能性を示すものである。さらに三次リンパ組織と単なる炎症細胞浸潤の違いをB細胞/T細胞比を取ることで差別化できる可能性があることを見出した(本比率が高いほどTLTの可能性が高い)。本知見は三次リンパ組織を反映するバイオマーカーを考案する際に腎臓におけるB細胞の存在に着目することで他の病態と区別できる可能性を示唆するものである。さらに既存の免疫抑制剤によって三次リンパ組織に可塑性があることも見出した。このことは三次リンパ組織を反映するバイオマーカーは治療反応性の評価にも有用である可能性を支持するものである。現在これらの多様性に応じた三次リンパ組織の分子基盤解析を行い、昨年絞り込んだ候補分子のELISAも行なっている。マウスおよびヒトにおける三次リンパ組織の重要な性質を複数明らかにすることができた。これらの知見はバイオマーカー探索にとどまらず三次リンパ組織を標的とした創薬にも重要な知見と考えられるため。ヒトにおける三次リンパ組織の意義について明らかにし、三次リンパ組織の各ステージごとの構成細胞および分子の探索を行いバイオマーカー探索を継続する。本研究は高齢者腎臓病の予後不良因子、三次リンパ組織を検出するバイオマーカーを同定することである。マウスの解析では三次リンパ組織形成に伴い変動する分子群を同定する目的でSham operationと急性腎障害モデルである虚血再灌流障害をそれぞれ施した若齢・高齢マウスの腎臓の合計4群間でGene Chipを用いて遺伝子発現の網羅的解析を行い、若齢でも高齢でも障害に応じて上昇する遺伝子、高齢マウスにおいて障害で上昇する遺伝子を同定した。さらに両群間でオーバーラップする遺伝子を対象としてパスウェイ解析を施行し、分泌因子関連の遺伝子を同定した。これらの腎三次リンパ組織を含む腎臓に加えて脾臓およびリンパ節のcDNAパネルを作成し、上記分子の発現解析を行い腎臓で特異的に発現している候補分子の絞り込みを行った。ヒトので解析ではマウスで同定した候補分子の染色を行ったことに加えて、ヒト腎臓三次リンパ組織の多様性を解析する目的でヒト複雑性腎盂腎炎のサンプルを入手・解析を行った(ドイツ・アーヘン工科大学との国際共同研究)。複雑性腎盂腎炎は腎三次リンパ組織の強力な誘導因子であること、複雑性腎盂腎炎で誘導される三次リンパ組織の構成分子および細胞は加齢に伴い誘導される三次リンパ組織と同等であることを見出し、ヒトにおける三次リンパ組織形成は基礎疾患の種類を問わず同じ分子および細胞を用いて多段階的に誘導されることを見出した。このことは本研究課題で探索しているバイオマーカーが三次リンパ組織を誘導する様々な慢性腎臓病に対し適応可能である可能性を示唆するものである。本研究課題については計画した通りに実験を遂行した。テーマ2においては当初計画していた京都大学の高齢者腎臓のヒト腎臓サンプルは三次リンパ組織の数が限られており、より詳細な検討を行うためにはより三次リンパ組織が多く含まれるヒト腎臓サンプルでの解析が必要と考えられたため、ドイツ・アーヘン工科大学との国際共同研究を開始しヒト複雑性腎盂腎炎の解析に着手した。これまでヒトの複雑性腎盂腎炎の三次リンパ組織の既報は存在しなかったが、我々は初めてヒト複雑性腎盂腎炎が腎臓における三次リンパ組織の強力な誘導因子であることを見出した(現在までの進捗状況参照)。その他にもヒト複雑性腎盂腎炎では多彩な成熟段階の三次リンパ組織が共存しており、現在それらの臨床的意義に関する解析を進めており新規知見が得られつつある。

これらの知見はバイオマーカー探索にとどまらず三次リンパ組織を標的とした創薬にも重要な知見と考えられるため。マウスでは継続して候補分子の探索を行うとともに得られた候補分子のELISAでの解析を血清で行い、ヒトでの解析では引き続きヒト三次リンパ組織の多様性とその臨床的意義の解析を行う。これらの解析から得られた候補分子でパネルを作成した後にヒトサンプルを用いた解析に着手する方針とする。ヒトにおける三次リンパ組織の意義について明らかにし、三次リンパ組織の各ステージごとの構成細胞および分子の探索を行いバイオマーカー探索を継続する。高齢マウスの調達の制限があり一部サンプルの制限ができてしまったために解析できなかったものがあり、次年度には高齢マウス注文を増やし、対応する方針とした。網羅的解析のためのサンプル回収中であったため。2018年4月第55回日本臨床分子医学会学術集会学術奨励賞2018年6月第61回日本腎臓学会学術総会Best English Presentation Award2018年12月日本抗加齢医学学会研究奨励賞(2018年度)
水産加工残滓のゼロエミッション化―日本型フードシステムの経済性・先進性の検証―

漁獲・養殖された魚介類は主として食用に供されるが、その歩留り率は53.9%(水産庁調べ)と低い。すなわち、我が国の漁業生産量384万t(2016年)と輸入水産物385万t(同年)のうち丸魚で輸入されたもの約半分、暫定推定値336万tが、毎年残滓として排出されている。家庭ごみとなる残滓は15%程度で、残り85%が家庭以外で排出された水産加工残滓である。そこで本研究では水産加工残滓を有効かつ効率的に利用し尽し、かつそこから最大の経済的利益を上げるために最適なフードシステム・モデルを導く。この基準に照らして日本の加工残滓利用技術やその利用実態が諸外国と比べて先進性を有するかを検証する。
生胚内分子動態解析に基づくクローン胚発生条件の検索

個体発生率が低いクローン胚および凍結乾燥精子顕微授精胚をライブセルイメージングに解析したところ、大部分で染色体分配異常がみられ、クローン胚ではドナー核注入後の時間経過により微小前核を形成し、これが染色体分配異常の原因であることが示唆された。さらにクローンになりやすい細胞を探したところ、海馬CA1領域に抑制的ヒストン修飾が低い細胞が存在することを見出した。この細胞を用いてクローンマウス作製を試みたところ、10%と高い効率でクローン作製が可能なことが明らかとなり、世界で初めて成体マウス脳神経細胞からクローンマウスを作製することに成功した。平成25年度は、クローン胚において第一から第二分割期の染色体異常が産仔率に大きく影響していることに基づき、クローン胚と同様に産仔率が著しく低い凍結乾燥精子の顕微授精胚の発生停止原因をライブセルイメージングによって解析した。その結果、新鮮精子を用いた顕微授精胚では第一分割における染色体分配異常が7%であったのに対して、凍結乾燥精子の顕微授精胚では80%程度と非常に多いこと、また発生速度も凍結乾燥精子では遅れていることも明らかとなった。発生速度は人為的に卵子に活性化刺激を付与することにより改善されたが、染色体分配異常の発生率は改善が見られなかった。今後、サンプル数を増やして解析を行うとともに、受精後のメチル化状態変化についても解析を行う予定である。前年度クローン作出が可能なエピジェネティック修飾状態の異なる細胞として見出したマウス海馬由来の脳神経細胞から、初めてクローンマウス作出に成功した。今年度は海馬細胞のクローン作出の例数を増やした。さらに、小脳プルキンエ細胞で抑制的ヒストンメチル化が低いことを発見し、プルキンエ細胞を用いた核移植を試みた。その結果メスマウスプルキンエ細胞からクローンマウス作出に成功した。また、海馬細胞由来クローン胚、プルキンエ細胞由来クローン胚をそれぞれマイクロアレイ解析に供し、遺伝子発現解析を行い、セルトリ細胞、卵丘細胞由来クローン胚との比較を行った。その結果、オス海馬細胞由来クローン胚では、X染色体の不活化に関わるXist遺伝子の発現が、セルトリ細胞クローン胚と比べて低いことが明らかとなった。クローン胚のイメージング解析を行い、個体発生可能な胚の条件を検索する本研究において、確実にクローン個体が作成できるドナー細胞を用いることは重要である。そこで平成24年度はまず本研究室でクローンマウスからクローンマウスを作出する再クローニングが25世代以上も可能であったBDF1×129マウスに着目した。クローンマウスが生まれやすいドナー細胞を用いた場合のクローン胚の染色体動態を解析するため、ヒストンH2Bおよびチューブリンをプローブとしてイメージング解析を行った。ドナー細胞として上述のBDF1×129マウスおよび対照としてBDF1マウス卵丘細胞を用いた。どちらのドナー細胞を用いた場合でもクローン胚はイメージング解析下で胚盤胞期まで発生した。染色体解析の結果、第一卵割では染色体異常を起こした胚の比率はどちらのドナーを用いた場合でも同様に約30%であった。今後、BDF1×129マウスクローン胚で第二、第三卵割において染色体異常が起きているか解析し、胚移植実験も同時に行っていく予定である。また、X染色体不活化を指標としたクローン胚の解析としてmacroH2Aを指標としたクローン胚のX染色体不活化の解析をmacroH2A-GFPトランスジェニックマウス卵丘細胞をドナー核としたクローン胚のイメージング解析を行った。クローン胚においても、macroH2Bのシグナルが解析可能となるのは通常受精卵と同様に4細胞期後期からであった。シグナルは検出できたものの、同一クローン胚内でも各割球でシグナルの数、強度がばらばらであり胚発生の指標とするためには、今後さらに詳細な解析が必要である。さらにクローン作出が可能なエピジェネティック修飾状態の異なる細胞を検索し、抑制的ヒストンメチル化が低い脳神経細胞を見出し、ここからクローン個体を得ることに成功した。平成26年度は前年度に作出に成功した成体マウス脳神経細胞由来クローンの論文をまとめるために、海馬細胞由来クローン胚、プルキンエ細胞由来クローン胚を作出し、胚移植実験、ライブセルイメージング解析さらにマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を行った。その結果、これらの細胞由来のクローン胚ではこれまで用いられていた卵丘細胞やセルトリ細胞に由来するクローン胚よりも遺伝子発現が改善されており、ドナー細胞の抑制的ヒストン修飾(H3K9me2)はクローン胚盤胞の遺伝子発現と相関があることがが示唆された(Mizutani et al. Biol. Reprod 2015)。凍結乾燥精子については前年度に引き続き顕微授精胚のライブセルイメージング解析を凍結乾燥精子のサンプル数を増やして行った。受精後のメチル化状態変化についてもイメージング解析をすすめている。

さらに、クローン胚の大部分で起きている染色体分配異常(ACS)が起きる原因を探るため、注入直後のクローン胚のライブセルイメージング解析を行ったところ、ドナー核注入から時間が経過すると、微小前核を形成することがわかった。さらに微小前核を形成したクローン胚の80%近くがその後の分割でACSを起こしていることが明らかとなり、微小前核形成がクローン胚の染色体異常の一因となっていることが示唆された。これらについては論文発表の準備を進めている。また、イメージング解析後のクローン胚からのntES細胞の樹立をすすめて、初期発生過程で起きた異常がntES細胞の性質に与える影響についても明らかにしていく予定である。発生工学今年度は前年度の遅れの影響が多少残る形となり、クローン胚のイメージング解析が予定していたほど進まなかったため、やや遅れているという評価とした。また、年度途中で本研究の中心となるライブセルイメージングシステムのレーザー照射装置に不具合が生じたため、修理期間中ライブセルイメージング解析を行うことができなかったことも理由の一つである。しかしながらエピジェネティック修飾状態の異なる細胞からのクローン作出および解析、凍結乾燥精子顕微授精胚の解析を進めることにより、個体発生条件を検索するという本研究テーマにおいて有用なデータを出すことができている。当該年度において、mRNA注入法およびトランスジェニックマウスを用いたクローン胚のイメージング解析を行い、染色体動態およびX染色体不活化を指標としたクローン胚の発生解析を行うことができた。クローン胚の胚移植実験まで行い個体発生能を比較する予定であったがそこまで至らなかった。理由としては研究代表者が年度途中で異動となり、それに伴う引っ越し作業などで研究を一時的に中断せざるを得ない状況となったためである。現在は新たな所属先で実験機器のセットアップも完了し核移植実験も滞りなく進められる上に、クローンになりやすいマウス系統を用いて行っていくことで今後は順調に研究計画が遂行できるものと考えている。今後はクローン胚のライブセルイメージング解析を進めるとともに、胚移植実験、遺伝子発現解析も合わせて行っていく。さらに、初期発生過程で起きた異常がntES細胞の樹立成績や性質に与える影響を、イメージング解析後のクローン胚を用いて行っていく。この際、ntES細胞樹立率、核型、遺伝子発現、分化能検証さらにキメラ形成能を調べる。また、凍結乾燥精子顕微授精胚についても解析を進め、顕微授精胚、クローン胚に共通する個体発生に関わる要因を明らかにする。加えて最終年度であるため、これまでのデータをまとめて、論文執筆を行い国際誌に発表する予定である。今後、染色体動態およびX染色体不活化を指標としたクローン胚の胚移植実験をすすめ、またマイクロアレイによる遺伝子発現解析も行っていく。さらに初期発生過程での異常がntES細胞の樹立成績や性質にどう影響しているのかをイメージング解析後のクローン胚からのntES細胞樹立によって調べる。
観光・商業・伝統産業等の連携による京都ブランド・マーケティング戦略

本研究の研究成果は、地域ブランドの構築は企業ブランドと同様に社会構成的にとらえられるべきであるとともに、企業ブランドと異なって主要なコントロール主体があいまいで、ステイクホルダーが多数であることを元にしたモデリングをすすめた点にある。このようなモデルにもとづいて、観光におけるアンビバレントな関係性、京都商業の二面性、伝統の擁護と否定、地域生協の組合員参加の革新、ソーシャルメディアによるアイデンティティの強化について検討した。なお、これらの研究成果は書籍出版に向けてとりまとめをすすめている(未刊)。平成22年度の研究実績についてはおもに2点である。(1)「京都市商業ビジョン2004」施策の到達点と課題についての調査研究京都市の商業政策である「おいでやす京の商い京都市商業ビジョン2004」は平成16年度から平成22年度までに取り組む京都市の商業振興の方向性などを示したものであり、平成22年度はその最終年度にも当たるので、この6年間の成果、京都の商業の変化、そして京都の発展における都市商業の課題について明らかにするよう、資料収集や関係者インタビューをすすめた。その成果の一部として、商店街組合を単位とするのではなく地域を単位として都市機能としての商業を推進すること、情報化を基礎に商業者が共同することでの商業機能を高度化すること、これらの挑戦とその意義について、流通学会全国大会で研究報告を行った。(2)伝統産業、とくにキモノの流通についての調査研究キモノの需要は連続的に現象の一途をたどっており、このような厳しい経営環境に対応して、呉服小売業がいかなる戦略を展開しているか、専門呉服店、チェーン店、百貨店などの多様な業態について訪問調査を実施した。その成果はまだ公表していないが、過量販売等で傷つけた呉服小売に対して消費者の信頼を取り戻すための努力が共通してすすめている点、キモノを買う需要を創造するためにキモノを楽しむ機会をつくる点、などが発見された。今後、まとめていきたい。平成23年度の実績報告の第1は、伝統産業、とくにキモノの流通についての調査研究についてである。キモノ小売についての調査をすすめ、その分析結果について流通学会全国大会で報告した。また、東京ですすめられた京都市のキモノ振興事業に関連して、首都圏の消費者調査を実施し、その分析をすすめた。キモノのヘビーユーザー、愛好者が一定の規模で存在し、高頻度で積極的にキモノを楽しんでいるのに対し、多数派はキモノを着たいという気持ちは強いものの、きっかけがない、自分で着ることができない、キモノのコーディネートがわからない、キモノの相談にのってくれるお店を知らない、などのバリアがあることが明らかとなった。京都市伝統産業活性化推進計画(第2期)の策定に関与することを通じて伝統産業の現状と課題についての検討をすすめた。第2に、観光については、京都市の観光調査の分析に加えて、奈良市の観光基本統計調査の分析検討をはじめた。第3に、「京都市商業ビジョン」「京都市商業ビジョンアクションプラン2011」を中心に京都商業についての中間的なまとめをすすめ、論文作成をすすめた(未発表)。第4に、ソーシャルメディアを活用したマーケティングについて、まず、これまでのマーケティングとソーシャルメディアがどのように係わるか、その共犯関係に注目した研究を行い論文として講評した。つぎに、購買行動における高関与・低関与がいかにソーシャルメディアなどのメディア接触・活用に影響を与えるか、消費者の情報利用行動についての仮説を立て、実証研究を行った。機能的関与と感情的関与が統計的に区別され、かつ、それのメディア利用行動への影響も異なることが明らかとなった(現在発表準備中)。平成25年度は、おもに(1)京都ブランドのマーケティングに関する書籍の執筆に取り組んできた(未刊)。本書の構成としては、ブランドを地域に当てはめる上での論点整理、京都というブランドの特異性、京都ブランドの担い手・構成要素としての観光・伝統産業・商業・まちづくり、ブランドを再生するイノベーションの意義、ブランドをコントロールする行政の役割、などである。その一環として、(2)京都府住宅公社堀川団地再生ならびに堀川団地商店街協同組合の活性化についての調査研究をすすめた。堀川団地は戦後直後の公営近代化団地であって耐震補強の必要はあるものの近代建築物として歴史的価値が認められている。堀川通りに面する堀川団地をいかに活用して当該地域の活性化・地域社会づくりに貢献するか、その担い手としての堀川団地商店街の再生を図るか、高齢者、障害者、子どもにやさしいまちづくりをいかにすすめるか、という観点から検討がすすめられている。ソーシャルメディア研究としては、(3)生活協同組合コープネット事業連合のネットコミュニティ利用データ等にもとづく実証研究をすすめ「オンライン・コミュニティにおける組合員のコミュニケーションと自己実現」(玉置了・若林靖永・堀川宣和)(『生協総研賞第10回助成事業研究論文集』2014年1月)にその研究成果をまとめた。まちづくり等への関与という観点から、(4)大きく変容する生協事業に対応して生協のアイデンティティである組合員参加のあり方も変わらざるをえないことを展望した論考