hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コンクリートの耐凍害性改善のための不凍多糖の応用

まず、有効な条件の絞り込みについてコンクリートに対して耐凍害性効果を発揮する不凍多糖濃度を見極めることを試みたが、使用した不凍多糖が保存期間中に品質劣化を生じていることがわかり、結果として昨年度の結果よりも高い濃度を必要とすることとなり、不凍多糖の保存方法の改善が必要であることが明らかとなった。また、塗布型の適用方法については、凍結融解試験(JIS A 1148A法)を実施し、糖濃度180μg/mlの条件(不凍多糖II液)とプレーンコンクリート(N)で比較を行った結果、180μg/mlの条件において、Nより約60サイクル分、内部劣化に対する抵抗性を示し、質量減少をNの約50%に抑制することができた。さらに、凍結防止剤としての検討においては、使用材料として、NaCl、CaCl2、尿素、CMA、不凍多糖2種類(II液とIII液)および過冷却促進物質を使用し、不凍多糖は過冷却促進物質と組み合わせた条件でも検討を行った。試験としては,「凍結防止性能」、「融氷性能」、「腐食防止性能」、「植生への影響」について試験を行った。その結果、「腐食防止性能」では不凍多糖単独の場合が優れた結果を示し、「植生への影響」では、不凍多糖単独および過冷却促進物質と組み合わせた場合が優れた結果を示した。しかし、「腐食防止性能」および「植生への影響」では、不凍多糖および過冷却促進物質の場合には優れた結果を得ることができず、従来の凍結防止剤の方が優れた結果を示した。以上の検討から、新たな課題が明確となり、それを踏まえた形での不凍多糖の適用量の明確化が必要となること、凍結防止剤の検討においては、不凍多糖濃度の増加や従来型の凍結防止剤と不凍多糖の混合使用なども検討する必要性が明らかとなった。使用材料の品質劣化の発生(保存方法の問題)や試験機の故障、他のテーマとの重複により試験機が十分に使用できなかったことにより、進捗が遅れてしまったため今年度の結果より、コンクリートの耐凍害効果を示す糖濃度がおよそ明確になったので、それを踏まえて追加検討や活性度のより高いB液を使用した試験を行う予定である。また、凍結防止剤としての効果についても、過冷却促進物質と併用する形で検討を行うことに変更して、当初の計画と同様の比較試験を行うことを考えている。上記の検討をできるだけ順調に進めて、既設構造物に対する対応に対しても取り組んでいきたいと考えている。平成30年度は、使用材料の保存方法の改善、不凍多糖のコンクリートへの耐凍害性付与に有効な適用量の絞り込み、さらには凍結防止剤としての不凍多糖の有効性の解明を行い、当初の目的以上の成果を得ることを目指す。そのために、凍結融解試験機の優先的使用や学生の担当強化、新たな試験機を取り入れた使用材料の品質評価などを行っていく予定である。以上の推進方策を加えて、本課題の目的達成を果たすべく研究計画を再構成して、検討を強化推進していく予定である。予想よりも凍結融解試験に時間を要したことに加え、数多くの小片凍結融解試験を行い、効果を発揮する不凍多糖の添加量を見出すことに時間を要したため、計画していたいくつかの検討が実施できずに、試験や分析に対する経費支出ができなかった。試験機の故障や想定していなかった課題の発生、他のテーマとの重複による試験機使用の制約などが発生し、計画していた試験の実施が遅れてしまったことから、次年度使用額が生じてしまった。
融合蛋白質バンクの作成とそれを用いた蛋白質間相互作用の研究

三種の融合蛋白質を作る為のベクターにcDNAライブラリーを導入して融合蛋白質バンクを作成する準備として、これらのベクターにあるマーカーとなる蛋白質の性質を調ベた。GSTは発〓効率がよく、最も抗度がなく使われるが蛋白質によっては、切られることがある。ヒハチジンのtagはそのチャージのよりマイナスチャージを保つDNAや蛋白質とはくっつく性質があること、三つめのMalE蛋白は最も安定しているが分子量が大きいことなどそれぞれに長所、短所がある。従って一時に蛋白質バンクを作る為には、融合バンクを作った後にプロテアーゼで切り本来の蛋白質にする必要がある。その経験から、我々はMalEにくっつけてマウス肝細胞由来のcDNAライブラリーを〓〓した。出来たライブラリーを積製して、世界で始めての蛋白質ライブラリーを作成した。これらのライブラリーの性質や、目的する酵素活性があるかどうかについては目下のところ検討中である。将来的にはこれらのライブラリーの中から、必要に従ってある酵素活性を調べる〓〓〓のラッセイ法を確立し、〓〓した後に、元のライブラリーにもどってその酵素活性を持つクローンを固定するシステムを完成したいと考えている。
Cre/loxpアデノウイルスによる細胞特異的発現システムの中枢神経再生への応用

中枢神経が損傷されると、炎症応答によって損傷部位でアストロサイトが増殖・瘢痕化し、神経突起の再生が阻害され、ニューロンを細胞死にいたらしめると考えられている。そこで、本研究ではアデノウィルスベクターを用いて、このグリア瘢痕を効率的に取り除き、損傷中枢神経機能再建を目指すアプローチを遂行した。中枢神経損傷モデルとして脊髄損傷動物を用い、その損傷部位にCre/loxP誘導性のアデノウィルスを感染させ、アストロサイト特異的GFAPプロモーターで自殺遺伝子(チミジンキナーゼ:TK)を発現させ、増殖アストロサイトを細胞死にいたらしめ、グリア瘢痕を効率的に取り除く。一方、このウィルスベクターは、アストロサイト以外の細胞(特にニューロン)に生存・再生促進因子であるBDNFを発現する。平成14年度は既に作成済みのアストロサイト特異的Cre発現アデノウィルス、及びBDNFをスタッファー配列に持つTK発現loxPアデノウィルスを大脳皮質ニューロングリアの共培養の系で感染させTKがアストロサイトで、BDNFがニューロンやオリゴデンドロサイトに特異的に発現することの確認を前年度に引き続き行った。さらに、その共培養の系でBDNFがニューロンに対して生存・突起伸展活性を持ち、一方でアストロサイトが細胞死に陥ることを確認した。さらに現在、平成13年度までに確立済みの脊髄損傷モデル(赤核脊髄路損傷ラット)損傷部位へのウィルスベクター投与を進めており、ウィルス感染ラットでグリア瘢痕の除去や損傷ニューロンの再生軸索の形態的変化等を組織学的な手法で解析し、更には行動評価によって機能的回復を評価する事によって神経再生への効果を詳細に検討中である。本研究では、アデノウィルスベクター用い、中枢神経損傷時に神経再生の障壁になっていると考えられているグリア瘢痕を効率的に除去するアプローチを遂行している。神経損傷部位にCre/loxPアデノウィルスを2重感染させ、アストロサイト特異的GFAPプロモーターで自殺遺伝子(チミジンキナーゼ,TK)を発現させグリア瘢痕を取り除く。一方、このウィルスベクターはCre/loxPの組み換えが起こらない損傷ニューロンを含む周囲正常細胞に対しては神経再生促進因子であるBDNFを発現する。以上のようなベクターにより、損傷中枢神経の再生を誘起し、機能再建までを目指す。当初の計画では、神経再生促進因子Aktを発現させる予定であったが、さらなる再生促進効果を狙うためBDNFに変更した。本年度は中枢神経損傷モデルとして、赤核脊髄路を切断した脊髄損傷ラットの作成を確立した。また、赤核ニューロンにトレーサーとしてビオチン・デキストランを注入し神経再生端の可視化を可能とし、神経再生アッセイ系の確立を行った。一方、アデノウィルスに関してはアストロサイト特異的GFAPプロモーターで誘導されるCre発現ウィルス、BDNFとTKといった相反分子を発現するウィルスの作成はすでに完了している。さらに、これらウィルスをニューロン・グリアの共培養系に感染させるとニューロンに傷害を与えず、アストロサイトのみに細胞死を誘導する事が確認出来た。現在、このウィルスベクターを用いて脊髄損傷モデルラットに感染させ、神経再生への効果を検討中である。
精神生理的エビデンスに基づいた「さわやかな朝」のインタラクションデザイン

「さわやかな朝」の概念を精神生理学的に検討し、「さわやかな朝」につながる寝室環境をデザインするために、起床前漸増光によって起床時眠気を低減する要件を明確化した。その結果、「さわやかな朝」にかかわる主観的睡眠感は、起床時眠気だけでなく、入眠の円滑さや熟眠度合いも含む睡眠全体の満足度によってもたらされ、一定の寝具環境条件でもその印象は日々変化していることが示唆された。また、起床前漸増光の受光要件では、一定程度の受光量が必要なことと起床直前の睡眠状態の影響を受けていることが示唆され、使用条件や使用者属性などヒトにかかわる要件もみとめられた。まず、睡眠に関わる先行研究調査およびこれまでに蓄積した睡眠計測データの再分析をもとに、「さわやかな朝」の概念を検討した。その結果、個人に適した睡眠時間の確保を前提とした正常睡眠の範囲内であっても日々起床時の睡眠感は変動を示し、「さわやかな朝」の感覚は、起床時目覚め感だけでなく、入眠の円滑さや熟眠度合いも含む睡眠全体の満足感によってもたらされ、睡眠全体の生理的構造(脳波などが示す睡眠段階や体温など自律系変動)によっても影響を受けることが示唆された。次に、考察した「さわやかな朝」の概念に基づき、蓄積した睡眠計測データ(起床前漸増光照射有無)に加え、新たに計測した10夜/同一被験者(n=3)データを用いて、起床時の主観的睡眠感と睡眠中の生体信号(脳波、眼球運動、心電図、深部体温、体動など)および起床前受光量との関係性について解析を実施した。その結果、「さわやかな朝」につながる環境条件として、起床前の漸増光が有効に作用するためには、一定以上の受光量確保が必要であることが示された一方、起床直前の睡眠状態として、急速眼球運動が頻発するREM睡眠の最中では光の覚醒作用が有効に発揮されないことが示唆された。また、総合的睡眠感のうち入眠についての評価では、主観評価と客観評価とで関係性のある項目は異なり、入眠期は環境や心理的な影響を受けても変化し、主観と客観で差が生じることのある不明瞭なウトウトした状態であると考えられ、自覚もコントロールも難しいことが示唆された。さらに、光環境を設計する上で、白熱電球以外に蛍光ランプやLEDを用いる場合、分光分布要件の重要性が指摘されているが、ヒトに好ましい覚醒作用をもたらす分光分布要件について、日中の覚醒・緊張方向の作用を中心に、励起光(青・紫)や演色性による影響の差異を明らかにした。「さわやかな朝」の概念を定義するにあたり、単に起床時の目覚め感にとどまらず、総合的な睡眠満足度や生理的な睡眠構造も考慮する必要性を示唆できたが、睡眠を構成する各要素との関係性について、定量的解析はまだ途中段階である。一方、覚醒作用をもたらす光環境についての研究は当初予定よりも進んでおり、起床前に必要な受光量を一定程度定量化できたことに加え、従来から用いていた白熱電球に加え、LEDを光源として活用する場合の分光分布特性を評価する手がかりを得ることができた。以上の進捗状況を総合的に評価した結果、概ね順調であるとした。昨年度に考察した「さわやかな朝」の概念(起床時目覚め感だけでなく、入眠の円滑さや熟眠度合いも含む睡眠全体の満足感によってもたらされ、睡眠全体の生理的構造にもっても影響を受ける感覚)に基づいて、昨年度に引き続き計測した正常睡眠(10夜/同一被験者)の計測数を10名に増やし、起床時の主観的睡眠感と睡眠中の生体信号(脳波、眼球運動、心電図、深部体温、体動など)および睡眠環境全般との関係性について、解析を実施した。今年度は、入眠期の状態と起床時睡眠感との関係性に特に着目して解析を実施した。また、昨年度の成果から、起床前漸増光の受光要件について概要を明らかにできたので、今年度は、睡眠環境要件のうち、入眠期から睡眠全体に関わる寝具環境の印象評価に着目して解析を実施した。その結果、起床時の睡眠全体の満足感(主観的睡眠満足度、自覚症のだるさ)は、脳波などから判定される入眠までの客観的長さより、寝つくまでの時間を主観的にどう感じていたかと関係性があり、就寝前眠気の強弱や寝返り回数の多さ、最大静止時間などの終夜の状態とも関係性がみられた。また、10夜の計測で同じ寝具環境を用いたにもかかわらず、寝具印象は全般的に日々変動がみられ、睡眠の満足度と有意な相関を示す印象項目として、「安心なー不安な」という気分にかかわる項目だけでなく、「柔らかいー硬い」といった物理的印象も日々変動して睡眠満足度と相関を示した。さらに、目覚めのよさに関わる寝具印象として「明るいー暗い」という項目が関わる可能性が示唆された。起床前の光環境については、昨年度に一定の成果を得たので、今年度は、「さわやかな朝」の概念をさらに明確化することを目的として、昨年よりも10夜睡眠計測の被験者数を増やし、目覚め感だけでなく睡眠全体の満足度と睡眠を構成する各要素や寝具環境などとの関係性を検討し、特に入眠期の状態や寝具印象などとの関係性を明らかにできた。ただ、入眠期以外の睡眠全般の状態との客観的要素との関係性の検討がまだ途中段階であり、引き続き検討を要する。新しく示された知見により、当初の方向性と少し異なる検討事項に力点をおくことになっているが、全体として、概ね順調であるとした。

本研究の目的は、起床困難性(朝楽に起きられない、さわやかな朝を迎えられない)を低減できるよう、覚醒移行期のヒトの状態を光環境制御によって最適化することで、「さわやかな朝」を無理なく迎えることができる寝室光環境を精神生理的エビデンスにもとづいてデザインすることであった。この目的を達成するため、生体信号に基づく睡眠状態計測評価および主観的睡眠感評価により精神生理的エビデンスを得ることとし、光の生理的覚醒作用を応用した起床前漸増光の受光にかかわる要件や、起床時睡眠感を構成する要素について検討し、それらの一端を明らかにしてきた。まず、睡眠にかかわる先行研究調査およびこれまでに蓄積した終夜睡眠計測データの再分析をもとに、「さわやかな朝」の概念を検討し、次に、起床前漸増光有無を検討した既計測データに加え、新たに、被験者一人につき10夜の正常睡眠終夜計測(漸増光無し条件)を年度ごとに計測例を増やして実施し、入眠期を含む睡眠全体の状態と起床時の睡眠感(寝具印象を含む)との関係性を検討した。前年度までの成果として、起床前漸増光の受光要件では一定程度の受光量が必要なことと起床直前の睡眠状態の影響を受けていること、また、起床時の主観的睡眠感は入眠期を含む睡眠全体の状態と関連があり、一定の寝具環境条件でもその印象は日々変化していることを明らかにしてきた。H29年度は、終夜計測データをさらに蓄積(累計15名)して起床時睡眠感の解析を実施するとともに、他機関での先行フィールド調査結果を共同再解析して、起床前漸増光を受光するヒトにかかわる要件を検討した。その結果、寝具環境の「安心感」と「睡眠満足度」との間に中等度の有意な相関があること、起床前漸増光による起床時眠気や日中気分の改善は、相対的に睡眠習慣が良好でない属性の対象でより明瞭となることが示され、寝室環境をデザインするうえで、さらなる成果を得た。「さわやかな朝」の概念を精神生理学的に検討し、「さわやかな朝」につながる寝室環境をデザインするために、起床前漸増光によって起床時眠気を低減する要件を明確化した。その結果、「さわやかな朝」にかかわる主観的睡眠感は、起床時眠気だけでなく、入眠の円滑さや熟眠度合いも含む睡眠全体の満足度によってもたらされ、一定の寝具環境条件でもその印象は日々変化していることが示唆された。また、起床前漸増光の受光要件では、一定程度の受光量が必要なことと起床直前の睡眠状態の影響を受けていることが示唆され、使用条件や使用者属性などヒトにかかわる要件もみとめられた。「さわやかな朝」をもたらす覚醒移行期の生理状態変動を明確化するため、起床時睡眠感や覚醒移行期の生理状態、睡眠全体の構造、入眠期評価などの項目間の関係性の定量的評価を進める。さらに、「710夜/同一被験者」という終夜睡眠計測例数を増やし、個人内変動に加えて個人間変動の解析を進める。漸増光照射を用いて「さわやかな朝」をもたらす覚醒移行期の生理状態変動を再現することができるよう、照明装置に生体信号からのフィードバック制御を可能にするシステムを試作する。これにより、例えばREM睡眠の最中にアラーム刺激が発生する確率を下げることが期待できる。さらに、照明装置の制御パラメータとして、照射タイミング・照度・分光分布を制御できることができる照明システムを相関色温度や励起光の異なるLEDを組み合わせて試作し、実験室での終夜睡眠計測により、制御パラメータを比較評価する。「さわやかな朝」をもたらす睡眠全体の状態変動を明確化するため、さらに複数夜計測の被験者を増やすとともに、入眠期だけでなく睡眠全体の構成要素との関係性の解析を進める。
アセタール型塩化学種を利用する有機合成化学

A)ピリジニウム型塩化学種を利用する有機合成化学:これまでの研究で、ピリジニウム型塩化学種の生成はNMR実験並びに質量分析により証明し、その後の変換反応を明らかにしたが、アセタールからピリジニウム型塩化学種生成の過程は不明であった。今回、その過程を明らかにした。即ち、アセタールからピリジニウム型塩化学種生成の真の活性種は、TMSOTfとピリジン塩基からなる嵩高い複合体で有ることを証明した。次に本複合体を、立体識別的アセタールの脱保護に利用した。即ち、アセタールの隣の炭素の置換様式が異なるアセタールの脱保護を検討し、より置換基が少ないアセタールの選択的脱保護に成功した。従来のオキソニウムイオン中間体を経る脱保護では、より安定なオキソニウムイオン中間体を経る脱保護が速く進行するため、隣の炭素の電子供与性が大きい、すなわちより多くの置換基を持つ炭素原子を持つアセタールの脱保護がより速く進行する。一方、我々の手法では嵩高い酸活性種が働くため、より立体的な混みあいの小さいアセタールで選択的に脱保護が進行する。従来法とは逆の反応性を持つアセタールの脱保護法を開発できた。B)ホスホニウム塩化学種を利用する有機合成化学: In situ protection法を用いて、エノンとα,β-不飽和エステルを併せ持つ鎖状化合物から環状エーテル化合物をone-potで合成する効率的な手法を開発し、次に不斉合成への展開の鍵反応として不斉ジヒドロキシ化を用いたが、一般に用いられる市販されているAD-ミックス触媒を用いられず、化学量論量の不斉触媒を用いる必要があった。本年度は、更に検討を重ね、我々のin situ protection法に用いるホスフィンの種類を変えることにより、触媒量のAD-ミックス触媒を用いて不斉合成を行う、より簡便な手法を確立した。これまで不明であったアセタールからのピリジニウム塩化学種生成の真の活性種が、R3SiOTfとピリジン塩基の複合体で有ることを明らかにした。さらにこの結果を利用して、アセタールの立体識別的脱保護を達成できた。本成果は、本研究の塩化学種を用いる有機合成化学のより基礎的な研究であり、今後の更なる研究の展開を約束するものである。本年度の研究により、ピリジニウム塩化学種生成の真の活性種が、R3SiOTfとピリジン塩基の複合体で有るという、より基礎的な知見や経験を得ることが出来たので、官能基選択的反応への更なる展開を図る。またin situ protection法を利用した効率的な環状エーテル合成法の不斉合成への展開で、市販のAD-mixを触媒量用いる、より簡便な手法を確立できたので、光学活性環状エーテル構造を含む生物活性天然物合成への応用を検討する。

本年度は、ピリジニウム塩生成の真の活性種が、シリルトリフラートとピリジン塩基との複合体で有るという興味深い知見が得られた。この結果は全体の計画に新たな新規性を加えることができるため、優先的に検討したが、基質や反応剤に関しては、限られた基質や反応剤での検討を行ったため、物品費の繰り越しがあった。次年度は、本年度の知見の天然物合成への応用も目的として研究を行うため、そこでの経費などに充てる。
科学的感性と知の創造を育成するモデル科学実験教材の開発と実践的検証

(1)身近な素材を用いた異分野を効果的に関連・融合させた創造力・独創力開発型の広領域型科学実験教材の開発(教師教育)(2)教育現場・科学体験広場などでの学習効果の高い実践的検証(学校支援・教師教育)(3)学習者(教師)が学習資源を効果的に活用できる大学,公的研究機関,民間企業等と学校現場との連携のための環境整備の推進と提案(1)身近な素材を用いた異分野を効果的に関連・融合させた創造力・独創力開発型の広領域型科学実験教材の開発(教師教育)(2)教育現場・科学体験広場などでの学習効果の高い実践的検証(学校支援・教師教育)(3)学習者(教師)が学習資源を効果的に活用できる大学,公的研究機関,民間企業等と学校現場との連携のための環境整備の推進と提案「科学的感性と知の創造育成するモデル科学実験教材の開発と実践的検証」という研究課題で以下の研究を推進した。1)身近な素材を用いた異分野を効果的に関連・融合させた創造力・独創力開発型の広領域型科学実験教材の開発と実践(1)身近な素材(クミン・イチョウ葉・藍(インジゴ)など)の含有成分を中心に展開(学部生・院生および教師を対象にした教材の開発・・・【代表的な実験方法例】)第一段階:身近な素材に関する調べ学習(学習者の情報教育・ネットワークの構築)第二段階:含有成分の分離・精製技術の習得,構造解析,先端機器(NMR・IR・UV・MS・HPLC)の利用とその原理の習得第三段階:含有成分の化学反応(酸化・還元・錯体・エステル体・エーテル体,計算科学ソフトによる反応機構の解明)高度な科学技術の習得と科学的感性を育成第四段階:含有成分による染色への挑戦(金属との錯体形成),種々の繊維に対する染色効果と染色機構の解明(分子軌道計算科学ソフト・コンピュータの活用)第五段階:ものづくり体験[簡易比色計の作成(抗酸化活性の測定・環境教育への展開)・水蒸気蒸留装置の作成・電気分解装置の開発(ガラス細工の体験)]第六段階:学習評価法の構築(対話型自己評価カード・学びのマップづくり,教師評価・相互評価の作成,レポートの作成),研究発表(知の創造)2)教育現場・科学体験広場(公開講座)などでの学習効果の高い実践的検証実験観察を通し"科学を創る"教育,独自の新しい考えを創る創造的探究力」「創造的変革を生み出す知識力」の育成のを目指した以下のような授業実践を推進した。(1)開発した教材を改良し,高校,大学及び企業の連携による理系を目指す高校生を対象にした「広領域型科学実験の体験講座」を実施した。(SPP, SSH)(2)開発した教材を改良し小学校・中学校・高校の教育現場での実践(出前授業)および公開講座を実施し,科学実験教材としての有効性を確認した。(3)開発した教材を教師研修用プログラムに改良後,教員研修用科学実験実習書を作成し,教員免許更新講習を実施した。「科学的感性と知の創造を育成するモデル科学実験教材の開発と的検証」という研究課題で以下の研究を推進した。1)身近な素材を用いた異分野を効果的に関連・融合させた創造力・独創力開発型の広領域型科学実験教材の開発と実践(1)身近な素材「藍(すくも)・オレンジ・クスノキ・赤と白のワインなど」の含有成分を中心に展開(学部生・院生および教師を対象にした教材の開発...【代表的な実験方法例】)第一段階:身近な素材に関する調べ学習(学習者の情報教育・ネットワークの構築)第二段階:含有成分の分離・精製技術の習得,構造解析,先端機器(NMR・IR・UV・MS・HPLC)の利用とその原理の習得第三段階:含有成分の化学反応(酸化・還元・錯体・エステル体・エーテル体,計算科学ソフトによる反応機構の解明)高度な科学技術の習得と科学的感性を育成第四段階:含有成分による染色への挑戦(金属との錯体形成),種々の繊維に対する染色効果と染色機構の解明(分子軌道計算科学ソフト・コンピュータの活用)第五段階:ものづくり体験[簡易比色計の作成(抗酸化活性の測定・環境教育への展開)・水蒸気蒸留装置の作成・電気分解装置の開発(ガラス細工の体験)]第六段階:学習評価法の構築(対話型自己評価カード・学びのマップづくり,教師評価・相互評価の作成,レポートの作成),研究発表(知の創造)2)教育現場・科学体験広場(公開講座)などでの学習効果の高い実践的検証実験観察を通し"科学を創る"教育,独自の新しい考えを創る創造的探究力」「創造的変革を生み出す知識力」の育成を目指した以下のような授業実践を推進した。(1)開発した教材を改良し,高校,大学及び企業の連携による理系を目指す高校生を対象にした「広領域型科学実験の体験の公開講座の実施(SPP,SSH)」。(2)学習者(教師)が開発した学習資源を効果的に活用できる大学,公的研究機関,民間企業等と学校現場との連携のための環境整備を推進し,教育現場でのそれらの教材の有効性を確認した。(3)教育委員会との連携による教師研修用プログラムに改良し,教員免許更新講習用科学実験実習書を作成し講習会を実施した。科学的感性と知の創造を育成するモデル科学実験教材の開発と実践的検証という研究課題で,23年度は,2122年度の研究のまとめと以下の研究を推進した。

1.教育実践力と科学的素養を高める藍を用いた科学実験教材の開発と実践(1)藍の栽培方法とインジカンを含む藍葉成分の長期保存方法と含有する成分の単離方法を開発藍葉の保存方法(生葉の電子レンジ乾燥及び冷凍保存)を検討し,教育現場で利用できる簡便なインジカン,インジゴ,インジルビンの単離・確認方法を開発した。(2)藍葉によるインジゴの染色原理を理解するモデル化学実験教材の開発藍の生葉中で進行するインジカンからインドキシル経てインジゴ,インジルビンへと変化する生合成経路を化学反応として理解するモデル化学実験教材の開発を行った。(生合成経路を化学的に実証し,実験体験を通して科学的に探究する能力を培う方法を提案)(3)酸化・還元の原理を理解するための藍(すくも)を用いた広領域型科学実験教材の開発と実践身近な素材として徳島にゆかりのある藍(すくも)を用いてすくもの生成過程や藍が布に染まる原理を理解するための実験を通して日常生活において重要な役割をはたしている酸化還元反応を中心に,その原理を段階的に考え論理的思考力を培う科学実験教材を開発し,本学の学生を対象に実践を行いその有効性を確認。2.科学技術力と知的探究心を育む光と色の神秘を探究する科学実験教材の開発と実践(1)オワンクラゲ緑色蛍光蛋白質(GFP)の発色団モデル化合物の合成と構造解析(2)藍(すくも)の成分探索と機能性アゾ色素化合物の合成(両者の発色の違いを学ぶ)(3)発色を追求する化学実験ルミノール反応・生物発光(ホタルの発光を探る)・サイリューム(ケミカルライトの発光を探る)(4)コンピューターを活用した光と色と発色の機構を探る(5)理系を目指す高校生(40名)を対象に4日間の日程で企業技術者,高校教員と連携して実践を行いその有効性を確認した。
電界誘起型マイクロナノバブルインジェクションメスによる機能創発

本研究では指向性電界誘起マイクロバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に試薬や遺伝子を導入するというこれまでにないインジェクション法を達成した.侵襲性は対象物の固さによって異なるが,先端構造を最適化したプローブを使用することにより,これまで困難であった比較的固い植物組織といった固い対象に対してもインジェクションに成功し,ダイナミックレンジの大きい固さを有する対象に対するインジェクション技術を達成した.これまで遺伝子導入等が困難であった対象からの新しい知見が期待されており,今後の様々な対象物に対するインジェクション装置としての実用化及び研究の発展が見込まれる.本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的として研究を遂行している.研究実施計画において平成25年度はMEMS技術を利用した高精度加工のための微細電極製作・同心軸多層管構造を有するインジェクション部加工を行ない安定した微細な気泡生成のための電極構造の最適化を目指す研究を遂行した.その結果従来の同心軸タイプのプローブでなく,加工用メス先を狭窄流路に加工する新しい電極構造についての着想を得るに至り,ホールディングピペットの形状を微細化したものをガラスマイクロ加工技術によって設計製作することに成功した.この狭窄流路タイプの加工プローブをインジェクション用の同心軸ガラス管内に組み込んで作成した新しい電界誘起気泡インジェクションメスは先端のオリフィス径を数μm以下に落とすことができ,かつ強靭性を持った壊れにくいプローブであり,従来タイプに比較して遥かに低侵襲に細胞へ試薬をインジェクションすることに成功した.またインジェクションメス先端より発生する流体の流れは,狭窄流路にすることにより,高速・高圧力噴流にすることが可能であり,幅広いダイナミックレンジの固さの細胞に対応することのできる可能性を持っている.このインジェクションメスを使用することで固い細胞等や距離が離れた箇所からのインジェクション時に気泡がインジェクション対象物に跳ね返ってしまうという従来タイプにみられた欠点を克服することができた.今後はこの改良タイプの安定気泡発生インジェクションメスを使用して幅広い加工対象へのインジェクション技術に挑戦する.本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的として研究を行った.この技術の特徴的な点である高速気泡列(MHz)が対象物に当たる瞬間に気液界面の圧壊現象により加工できる現象を利用し,さらにその気泡の気液界面に存在する付着力を利用し試薬を生体試料に供給することに成功した.今年度はプローブ先端を流線型に加工する工夫をすることで,さらに高精度(1μmオーダー)にアフリカツメカエルの卵母細胞を穿孔することに成功した.さらにバイオ・メディカル産業分野へ向けた早期実用化のために,1点の穿孔のみならず,多筒式インジェクション機構を2次元チップに作りこみ,2次元の広範囲にインジェクションできる新しい機構に成功した.また従来のインジェクション気泡メスの外側外郭部に緩衝構造を作りこみ,インジェクション対象物に押し付けることによって閉空間にのみ試薬を供給できる構造の開発に成功し,空気中であってもあたかも先端のみは従来の液中下でのインジェクション機構になるようになり,格段に用途が広がった.試薬のみならず,m-RNAのインジェクションにも成功しており,気泡を打ち込むことによる遺伝子導入の生体適合性の評価についてもアフリカツメガエルにおいては順調に評価が進んでいる.今後はさらなる高精度・低侵襲インジェクションを目指してウシ卵子のインジェクション技術を完成させる.本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的とした研究を行った.この技術の特徴的な点は高速気泡列が対象物に当たる瞬間に気液界面の圧壊現象により加工できるものであり,さらに気液界面に存在する試薬を加工面のみに供給するというこれまでに存在しなかった技術である.本研究ではMEMS技術による超精密電極加工及びパルス信号制御による高分解能を有しデジタル制御可能なバブル加工・インジェクションを目指し,バイオ・メディカル産業分野へ向けた早期実用化を目指し研究を行った.本プロジェクトにおいては先端が狭窄・肉厚構造を有する強靭かつ低侵襲なプローブを開発するに至り,その気泡噴出のパワーを制御し低侵襲に卵母細胞等を穿孔・インジェクションすることに成功し,幅広い対象へのインジェクション技術の実用化への道筋をつけたと言える.侵襲性は対象物の固さによって異なるが,このプローブを使用することにより,これまでインジェクションすることが困難であった比較的固い植物組織といった固い対象に対してもインジェクション実験に成功し,ダイナミックレンジの大きい固さを有する対象に対するオールマイティなインジェクション技術を達成したといえる.

今後この技術を利用することにより,遺伝子工学等の研究分野でこれまで遺伝子導入等が困難であった対象からも新しい知見を得ることができると期待されている.以上の研究成果より,本研究は目的をほぼ達成したと言え,今後の様々な対象物に対するインジェクション装置としての実用化及び研究の発展が見込まれる.本研究では指向性電界誘起マイクロバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に試薬や遺伝子を導入するというこれまでにないインジェクション法を達成した.侵襲性は対象物の固さによって異なるが,先端構造を最適化したプローブを使用することにより,これまで困難であった比較的固い植物組織といった固い対象に対してもインジェクションに成功し,ダイナミックレンジの大きい固さを有する対象に対するインジェクション技術を達成した.これまで遺伝子導入等が困難であった対象からの新しい知見が期待されており,今後の様々な対象物に対するインジェクション装置としての実用化及び研究の発展が見込まれる.本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度(100 nmオーダー)に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的として研究を行っている.この目的において,2次元多筒式インジェクション機構,空気中インジェクション機構と様々な用途に使用できるインジェクションデバイスの開発は順調に進んでいる.高精度・低侵襲化においても現在1μmオーダーの穿孔まで達成している.今後はMEMS技術を用いたより高精度・低侵襲化を目指して研究を進めていく.27年度が最終年度であるため、記入しない。マイクロナノ工学本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度(100 nmオーダー)に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的として研究を行っている.この目的において,2次元多筒式インジェクション機構,空気中インジェクション機構と様々な用途に使用できるインジェクションデバイスの開発は順調に進んでいる.今後はより高精度・低侵襲インジェクションデバイスの実現を目指して,研究を進めウシ卵子のみならず,接着細胞系の癌細胞や皮膚細胞等へのインジェクション等など幅広い対象へのインジェクションデバイスの研究を進めていく.本研究では研究代表者が発見した指向性電界誘起マイクロナノバブル列現象を活用し,細胞・生体組織等を低侵襲・高精度に三次元加工し,同時に気泡の気液界面に封入した試薬や遺伝子を導入するというこれまでにない新しい局所加工・インジェクション法の機能創発を目的として研究を遂行している.従来のインジェクションメス先端のガラス加工部分を改良して開発した狭窄流路タイプのインジェクションメスは,その強靱性や高速・高圧力噴流とともにキャビテーションを発生するという新しい技術によって,これまでにない加工対象へのインジェクションを行うことができる可能性を持っている.平成25年度の研究目的であるインジェクション部の改良と安定微細気泡の生成において改良型メス製作に成功したので,研究は概ね順調に進展しているといえる.今後はこの改良型インジェクションメスを用いて幅広い加工対象への遺伝子導入などに取り組んで行く予定である.
急性肝不全モデル動物におけるMCP-1,ｓSiglec9の有用性

1ConcanavalinA誘発マウス急性肝不全モデルにおいて15mg/kg静注後3時間の時点で2Pro群とPBS(コントロール)群に分けると有意に2Pro群における投与7日目までの生存率が高かった(P=0.0107)。ただし、ピークである投与24時間後ではALT値は両群間では大きな差は見られなかった。炎症の程度に差はないにも関わらず生存率に差が出るのがその後に引き続く肝再生の差なのかどうかのメカニズムについては現在検討中である。CCL4誘発急性肝不全マウスモデルにおいては、2ml/kgのCCL4投与後24時間にて2Pro、もしくはPBSを投与、比較検討を行うと、投与5日目までの生存率はやはり2Pro群で高い傾向にあり(P=0.0539)、ALT値は低い傾向にあった。現在こちらについてもメカニズムについて検討を行っている所である。2D-gal誘発ラット急性肝不全モデルにおいて肝再生マーカーであるFn14, TWEAK, HGF, β-cateninについて検討した。従来の1.2g/kg投与時ではFn14の発現は1日目に、TWEAK,HGF, β-cateninについては2日目にピークを迎えた。興味深いことに半量の0.6g/kg投与ではこれらのピークが1日目にずれることがわかり、壊死が小さい分より早く肝再生機序が発現するものと考えた。またD-gal投与後24時間で2Pro群とPBS群で比較検討すると、2Pro群においてHGF,β-catenin、EpCAMの発現が高いことが示された。今年度においての当初の目標として、(1)すでに証明されているD-galactosamine急性肝不全モデル以外での効果の検証、(2)現象としてははっきりしているものの未だ明らかではない詳細な肝再生メカニズムの検討を行うこととした。他モデルの検討においては、ConcanavalinA、CCL4モデルともMCP-1+sSiglec-9によるコントロール群と比較して有意な生存率の改善傾向を認めたものの、既報にあるConcanavalinA:15mg/kg、CCL4:2ml/kgの投与においては肝障害(ALT上昇)が強すぎたせいか両群において有意な差が認められなかった。そのため当初の仮説であるマクロファージの極性転換→肝再生促進のメカニズムによるものか、あるいはこの2因子が直接肝再生の何らかのステップに作用している可能性の2つが考えられ、検討が必要となっている。現在は投与量、および投与タイミングの再検討を併せて行っている所である。肝再生メカニズムにおいては、real-time PCRの技術的な問題もあり少しデータ収集に一時難渋はしたものの、条件調整の後上記研究実績のようなデータを得ることができた。来年度においてはConcanavalinA、CCL4モデルにおける至適投与量、タイミングの決定と、すでにD-galactosamineモデルにおけるメカニズムとの異同の確認、また、肝再生メカニズムにおける肝内マクロファージ、およびHGFの主要産生細胞である星細胞の役割を明らかにするため、免疫組織染色によるモデル作成後の炎症惹起性、炎症抑制性マクロファージ、および活性化、静止期星細胞の動態、およびin vitroにおける炎症刺激後のマクロファージ、星細胞と初代肝細胞の共培養による肝再生促進メカニズムにつき、肝再生促進の程度と、その詳細な分子メカニズムについて検討を行って行きたい。そのため当初の仮説であるマクロファージの極性転換

→肝再生促進のメカニズムによるものか、あるいはこの2因子が直接肝再生の何らかのステップに作用している可能性の2つが考えられ、検討が必要となっている。現在は投与量、および投与タイミングの再検討を併せて行っている所である。肝再生メカニズムにおいては、real-time PCRの技術的な問題もあり少しデータ収集に一時難渋はしたものの、条件調整の後上記研究実績のようなデータを得ることができた。来年度においてはConcanavalinA、CCL4モデルにおける至適投与量、タイミングの決定と、すでにD-galactosamineモデルにおけるメカニズムとの異同の確認、また、肝再生メカニズムにおける肝内マクロファージ、およびHGFの主要産生細胞である星細胞の役割を明らかにするため、免疫組織染色によるモデル作成後の炎症惹起性、炎症抑制性マクロファージ、および活性化、静止期星細胞の動態、およびin vitroにおける炎症刺激後のマクロファージ、星細胞と初代肝細胞の共培養による肝再生促進メカニズムにつき、肝再生促進の程度と、その詳細な分子メカニズムについて検討を行って行きたい。必要物品購入をしていく過程でどうしても323円という端数の残金が生じてしまい、無理に使用するより次年度に繰り越した方がよいと判断したため。繰り越した残金は次年度に消化する予定である。
〓書きに関する学習困難に対応したeラーニングによる療育とその実証的評価法の〓

本年度も昨年度に引き続き、京都大学こころの未来研究センターにおいて40名弱の発達障害児を対象に学習支援研究を継続して行った。去年度より広島市教育委員会の要請を受け、今年も引き続き、対象となった広島市内の小学校の特別支援学級においてeラーニングソフトの導入を行った。各小学校にて対象児に、学習介入の事前事後の評価として、読み書きスクリーニング検査などのアセスメントを実施した。また各小学校からの使用状況をヒアリングするとともに、教員側から要望を聞き、その都度、教材のブラッシュアップに努めた。また、上記したような形で教育現場からのフィードバックを受け、作成していったeラーニングソフト課題については、第20回日本LD学会にて自主シンポジウムで発表する場を設け、その場で教材紹介を行った。また並行して、自閉症児の論理演算の認知について調べる基礎実験を行った。これまで認知科学的なアプローチにおいては、自閉症がどういった原因で生じるのかについての機序は解明されていない。そのため、この自閉症の認知的な機序を探るため、論理演算を含めた論理パズルを実験に組み込んだ。自閉症者は視覚探索課題において細部に注目が行きやすい傾向があるとされるが、今回はその探索鼓動に論理演算を含んだルールを入れ、それを理解できるかを問う課題であった。その細部への注意の行き方がどのように大局的な論理演算の理解に影響があるのかを確認した。自閉症者の探索行動における苦手さを、より具体的に検討できる点で新しい課題であった。本課題は継続中の課題であり、早急に論文にまとめていくこととする。臨床研究としての発達障害児の読み書きに関しての学習支援を実施した。当該年度においては,京都大学こころの未来研究センターにおいて,発達障害児の読み書きの学習支援研究を実施した。こころの未来研究センターにおいて研究室を借り,応募があった発達障害児童とその保護者の方から同意を取り,4月から実施した。毎週,一人につき1時間程度で,20人程度の小学生を対象に学習支援を行った。主なトレーニング課題として,パソコンで読み書きが学習できる教材を作成した。児童には療育前後において,WISC-IIIや絵画語彙発達検査,小学生のための読み書きスクリーニング検査,フロスティッグ視知覚発達検査など標準化された検査を実施し,児童の認知特性を評価した。また検査結果に関してはすべて保護者の方にも説明し,今後の学校等での学習に活かしてもらうようにした。本研究は特別支援教育においての指導方法提案に貢献した。また、当該年度においては,読み書きの苦手さを測定するための評価課題を作成することを目的とした実験を行った。当該年度は,まず健常な大人を対象として各課題との相関関係を見る実験とした。また,LD学会誌においてdyslexia(ディスレクシア)に関するレビューを書いた。また,某県の母子支援施設(父からの虐待にあった母子が入居できるシェルター)において学習支援を継続して行っている児童3名を対象として,京都大学医学部付属病院にて,保護者と本人の同意(同意書などの申請は京都大学医学部の倫理委員会を通したものを使用)のもと,児童のMRI計測を実施した。本年度も昨年度に引き続き,京都大学こころの未来研究センターにおいて31名の発達障害児を対象に学習支援研究を継続して行った。本年度は、去年度使用した読み書きに関してのeラーニングソフトのプログラム(ひらがなやカタカナの単語や文章をキーボード入力し、読み書き学習をしていく課題)をさらに発達障害児に合った形式に改良することを主として行った。発達障害児では、視覚優位、または聴覚過敏といった特性が個人間によって違う。そのため課題における刺激提示の仕方や強化子(対象児童にとってその学習の外発的な動機づけになるような報酬)などについて、それぞれのニーズに合わせたトレーニングが組めるよう工夫が必要であった。そのプログラムのブラッシュアップを行った。また、本年度は広島市教育委員会の要請により、市内の8校の小学校においてそれぞれの特別支援学級、通級指導教室、難聴指導学級でのeラーニングソフトの導入を行った。各小学校にて対象児に、学習介入の事前事後の評価としてレーヴン色彩マトリックス検査、PVT-R絵画語い発達検査、読み書きスクリーニング検査などの知能検査、発達検査を実施した。これらアセスメントの結果は広島市教育委員会を通し、各小学校に開示、提供した。また各小学校を月に一度訪問し、使用状況をヒアリングするとともに、発達障害児への授業方法について応用行動分析に基づいたアドバイスを行った。また教育現場でのeラーニングソフト活用中、教員側から要望を聞き、その都度、教材のブラッシュアップに努めた。本年度は、実際に教育現場における活用という実践的支援ができたことに重要な意義があった。また並行して、自閉症児に関して排他的論理和課題の認知を調べる基礎実験を行った。これらはすべて継続中の課題であり、平成23年度中に随時まとめて発表していく予定である。

これまで認知科学的なアプローチにおいては、自閉症がどういった原因で生じるのかについての機序は解明されていない。そのため、この自閉症の認知的な機序を探るため、論理演算を含めた論理パズルを実験に組み込んだ。自閉症者は視覚探索課題において細部に注目が行きやすい傾向があるとされるが、今回はその探索鼓動に論理演算を含んだルールを入れ、それを理解できるかを問う課題であった。その細部への注意の行き方がどのように大局的な論理演算の理解に影響があるのかを確認した。自閉症者の探索行動における苦手さを、より具体的に検討できる点で新しい課題であった。本課題は継続中の課題であり、早急に論文にまとめていくこととする。
ゲノム編集によるスギの新たな育種技術の基盤の構築

CRISPR/Cas9などのゲノム編集技術は任意の狙った遺伝子に塩基の欠失などの変異を加えることができる遺伝子の編集技術であり、新しい育種技術として注目されている。本研究の目的は、従来型の林木育種で作製されたエリートツリーなどスギの優良品種に、ゲノム編集により無花粉や木材強度増強などの有用形質を付与するための基盤技術構築である。当年度はスギの無花粉化のために、雄花形成に関与する候補遺伝子をゲノム編集により遺伝子破壊することに着手した。すなわち、雄花や花粉の形成に関与すると予想される遺伝子をターゲットとし、CRISPR/Cas9システムにより遺伝子破棄するためのベクターを作成した。ターゲット遺伝子としてはスギの雄花における発現量が高い8遺伝子とした。作成したベクターをアグロバクテリウム法によりスギの不定胚形成細胞に導入し、カナマイシン添加培地で選抜することにより形質転換細胞を得た。形質転換細胞をヘテロ二本鎖移動度分析により分析した結果、これまでに合計50イベントのゲノム編集系統が得られた。今後、不定胚を誘導し、個体再生を試みる。スギ培養細胞のバイオリソース充実のためには、2017年度にスギのエリートツリー(6クローン)を交配親とする人工交配(9組合せ)により得られた未成熟種子由来の不定胚形成細胞から不定胚誘導能力の高いと評価した10系統を液体窒素中で超低温保存した。2018年度もエリートツリーの人工交配家系(16組み合わせ)から新たに不定胚形成細胞を誘導し、今後、不定胚誘導能力を評価後に液体窒素中で超低温保存する。ゲノム編集によりスギに無花粉形質を付与するために候補となる遺伝子をターゲットとしたCRISPR/Cas9システムによる遺伝子破棄のためのベクターを作成し、スギに形質転換してゲノム編集系統が得られているため。ゲノム編集個体の表現型解析のために、雄花や花粉の形成に関与すると予想される遺伝子を破壊するためのCRISPR/Cas9ベクターを導入した不定胚形成細胞から不定胚を経て個体再生を行う。また、バイオリソースの整理では前年度に引き続き、スギのエリートツリー由来の不定胚形成細胞の液体窒素保存を行い、スギ培養細胞のバイオリソースを完成させる。ゲノム編集により従来型育種で作製されたスギのエリートツリーに花粉抑制や強度増強形質を付与するための基盤技術構築が本研究の目的である。そのため本年度は、スギのゲノム編集技術の確立のために最初に、モデル植物で用いられているCRISPR/Cas9ベクターを導入したスギの不定胚形成細胞におけるゲノム編集の有無を調べたところゲノム編集はみられなかった。RT-PCR解析によりCas9の発現が認められたことから、ガイドRNAの発現量が低いことがゲノム編集が起こらないことの原因と推察した。また、ガイドRNAの転写に用いられているPolIII型プロモーターは種の特異性が高いことが知られており、今回のベクターで用いられているイネ由来PolIII型プロモーターがスギでは機能していないことが考えられた。そこで、スギからPolIII型プロモーターであるU6 snRNAプロモーターの単離を試み、11のプロモーター断片を取得した。これらのプロモーター活性をリアルタイムPCRにより評価したところ、高い活性を有するプロモーターが見いだされた。現在これらプロモーターを用いたゲノム編集の評価を行っている。また、無花粉化の標的遺伝子の同定のために、スギ雄花のマイクロアレイ解析と雌花のRNA-seq解析から雄花で特異的に発現し、花粉形成に関与すると推定される8個の遺伝子を特定した。ゲノム編集のターゲットとするスギのバイオリソース整理のためには、スギのエリートツリー等優良品種を交配親とする人工交配(16組合せ)を行い、未成熟種子から不定胚形成細胞を誘導した。得られた不定胚形成細胞の系統別に不定胚の誘導能力を評価し、不定胚形成能力の高い系統は液体窒素を用いて超低温保存を行なった。モデル植物で用いられているゲノム編集ベクターがスギで機能しない原因が解り、それを解決するため、ガイドRNAの転写を活性化するためのU6 snRNAプロモーターをスギから単離することができ、これを用いてスギのゲノム編集が可能である見込みができた。そこで、広い植物種で成功例が報告されているゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムのスギへの応用の試みとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)を導入したスギ不定胚形成細胞におけるGFP遺伝子の破壊試験を行った。DNA切断酵素Cas9の発現にはスギで効率的に機能するパセリ由来のPcUbiプロモーターを用いた。ガイドRNAの発現に機能するU6プロモーターについて、スギ由来の11、シロイヌナズナ由来の1、イネ由来の1、計13を用いた。GFP遺伝子の破壊によるGFP蛍光の消光及び塩基配列解析により、標的領域におけるindelが確認され、ゲノム編集に成功したことが確認された。また、スギから単離した11のU6プロモーターにおける、ガイドRNAの転写効率には大きな違いがあり、GFP遺伝子破壊効率は3.3から37.9%と大きく異なった。この試験結果から、スギで効率よく機能するU6プロモーターを選定した。バイオリソース整理のためには、前年度に誘導したスギの優良品種(特定母樹7クローンとエリートツリー1クローン)を交配親とする人工交配(16組合せ)で得られた未成熟種子由来の不定胚形成細胞から不定胚誘導能力の高いと判断した27系統を液体窒素中で超低温保存した。また、今年度も新たに不定胚形成細胞を誘導した。

木質形成に関わる遺伝子として、モデル植物で導管形成を負に制御するとされる遺伝子と相同な遺伝子をトウヒから見出そうとしたが、機能が類似すると推定される遺伝子は見られなかった。緑色蛍光タンパク質(GFP)を導入したスギ不定胚形成細胞におけるGFP遺伝子の破壊試験を行ったところ、緑色蛍光が消失し、スギにおいてゲノム編集が起こっていることを確認できたため。CRISPR/Cas9などのゲノム編集技術は任意の狙った遺伝子に塩基の欠失などの変異を加えることができる遺伝子の編集技術であり、新しい育種技術として注目されている。本研究の目的は、従来型の林木育種で作製されたエリートツリーなどスギの優良品種に、ゲノム編集により無花粉や木材強度増強などの有用形質を付与するための基盤技術構築である。当年度はスギの無花粉化のために、雄花形成に関与する候補遺伝子をゲノム編集により遺伝子破壊することに着手した。すなわち、雄花や花粉の形成に関与すると予想される遺伝子をターゲットとし、CRISPR/Cas9システムにより遺伝子破棄するためのベクターを作成した。ターゲット遺伝子としてはスギの雄花における発現量が高い8遺伝子とした。作成したベクターをアグロバクテリウム法によりスギの不定胚形成細胞に導入し、カナマイシン添加培地で選抜することにより形質転換細胞を得た。形質転換細胞をヘテロ二本鎖移動度分析により分析した結果、これまでに合計50イベントのゲノム編集系統が得られた。今後、不定胚を誘導し、個体再生を試みる。スギ培養細胞のバイオリソース充実のためには、2017年度にスギのエリートツリー(6クローン)を交配親とする人工交配(9組合せ)により得られた未成熟種子由来の不定胚形成細胞から不定胚誘導能力の高いと評価した10系統を液体窒素中で超低温保存した。2018年度もエリートツリーの人工交配家系(16組み合わせ)から新たに不定胚形成細胞を誘導し、今後、不定胚誘導能力を評価後に液体窒素中で超低温保存する。ゲノム編集によりスギに無花粉形質を付与するために候補となる遺伝子をターゲットとしたCRISPR/Cas9システムによる遺伝子破棄のためのベクターを作成し、スギに形質転換してゲノム編集系統が得られているため。当初計画に従い、スギのゲノム編集技術の確立を進める。前年度までに緑色蛍光タンパク質遺伝子をターゲットとしたゲノム編集が可能であることが明らかになった。今後は、花粉形成に関係すると予想される遺伝子をターゲットにしたベクターを作成し、ゲノム編集個体の作成を試みる。また、針葉樹の木質形成に関与する遺伝子の解析を引き続き行う。ゲノム編集の材料とする優良なスギのバイオリソースの充実も行う。ゲノム編集個体の表現型解析のために、雄花や花粉の形成に関与すると予想される遺伝子を破壊するためのCRISPR/Cas9ベクターを導入した不定胚形成細胞から不定胚を経て個体再生を行う。また、バイオリソースの整理では前年度に引き続き、スギのエリートツリー由来の不定胚形成細胞の液体窒素保存を行い、スギ培養細胞のバイオリソースを完成させる。