hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化と義歯撤去時間との関連

義歯撤去時間の長さが,持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化に対して与える影響に関しては,義歯床下組織を保全するうえで重要な情報であるにもかかわらず,詳細な検討は行われていない.本研究は,義歯床下組織の保全に関する検討の一環として,義歯撤去時間と持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化との関連について検討することを目的とした.実験動物には15週齢のWistar系雄性ラット125匹(25匹×5群)を用いた.各動物の臼歯部口蓋の左側には,義歯床下組織に対して持続的圧力を加える可撤性義歯床を装着し,右側には義歯床を装着することなく経過させた.持続的圧力の初期設定値は,破骨細胞による骨吸収を惹起することが確認されている6.86kPaとした.可撤性義歯床は,観察期間を通じて毎日定時に撤去して,義歯床下組織ならびに義歯床の清掃を行った.5群のうちの1群の動物には,清掃後直ちに義歯床を再装着し,残る4群の動物には,清掃後にそれぞれ4,6,8または12時間の義歯撤去時間を設け,撤去時間終了後に義歯を再装着した.義歯の初回装着時から2,4,7,10および14日後の義歯撤去時間終了時に,各実験群の5匹ずつから口蓋組織を採取した.採取した組織は,通法に従って固定,脱灰の後にパラフィン包埋し,第一臼歯部において前頭的に4μmの厚さに薄切し,H-E染色を施して光顕下で観察した.その結果,義歯撤去時間の増加は,持続的圧力下の義歯床下組織に生じる病理組織学的変化を軽減した.また,持続的圧力によって上皮組織ならびに粘膜固有層に惹起される組織変化の防止に要する義歯撤去時間は,骨組織における組織変化の防止に要するそれに比べて長いことが示唆された.本実験の成果は,昨年度第104回日本補綴学会において発表し,その一部はJ Oral Rehabilにaccceptされ印刷待ちの状態である.義歯撤去時間の長さが,持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化に対して与える影響に関しては,義歯床下組織を保全するうえで重要な情報であるにもかかわらず,詳細な検討は行われていない.本研究は,義歯床下組織の保全に関する検討の一環として,義歯撤去時間と持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化との関連について検討することを目的とした.実験動物には15週齢のWistar系雄性ラット125匹(25匹×5群)を用いた.各動物の臼歯部口蓋の左側には,義歯床下組織に対して持続的圧力を加える可撤性義歯床を装着し,右側には義歯床を装着することなく経過させた.持続的圧力の初期設定値は,破骨細胞による骨吸収を惹起することが確認されている6.86kPaとした.可撤性義歯床は,観察期間を通じて毎日定時に撤去して,義歯床下組織ならびに義歯床の清掃を行った.5群のうちの1群の動物には,清掃後直ちに義歯床を再装着し(非撤去群),残る4群の動物には,清掃後にそれぞれ4,6,8または12時間の義歯撤去時間を設け,撤去時間終了後に義歯を再装着した(4,6,8および12時間撤去群).義歯の初回装着時から2,4,7,10および14日後の義歯撤去時間終了時に,各実験群の5匹ずつから口蓋組織を採取した.採取した組織は,通法に従って固定,脱灰の後にパラフィン包埋し,第一臼歯部において前頭的に4μmの厚さに薄切し,ヘマトキシリン-エオジン染色を施して光学顕微鏡下で観察した.その結果,義歯撤去時間の増加は,持続的圧力下の義歯床下組織に生じる病理組織学的変化を軽減した.また,持続的圧力によって上皮組織ならびに粘膜固有層に惹起される組織変化の防止に要する義歯撤去時間は,骨組織における組織変化の防止に要するそれに比べて長いことが示唆された.現在,各群の匹数を揃えるための追加実験を行うとともに,論文作成中である.義歯撤去時間の長さが,持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化に対して与える影響に関しては,義歯床下組織を保全するうえで重要な情報であるにもかかわらず,詳細な検討は行われていない.本研究は,義歯床下組織の保全に関する検討の一環として,義歯撤去時間と持続的圧力下の義歯床下組織における病理組織学的変化との関連について検討することを目的とした.実験動物には15週齢のWistar系雄性ラット125匹(25匹×5群)を用いた.各動物の臼歯部口蓋の左側には,義歯床下組織に対して持続的圧力を加える可撤性義歯床を装着し,右側には義歯床を装着することなく経過させた.持続的圧力の初期設定値は,破骨細胞による骨吸収を惹起することが確認されている6.86kPaとした.可撤性義歯床は,観察期間を通じて毎日定時に撤去して,義歯床下組織ならびに義歯床の清掃を行った.5群のうちの1群の動物には,清掃後直ちに義歯床を再装着し,残る4群の動物には,清掃後にそれぞれ4,6,8または12時間の義歯撤去時間を設け,撤去時間終了後に義歯を再装着した.義歯の初回装着時から2,4,7,10および14日後の義歯撤去時間終了時に,各実験群の5匹ずつから口蓋組織を採取した.採取した組織は,通法に従って固定,脱灰の後にパラフィン包埋し,第一臼歯部において前頭的に4μmの厚さに薄切し,H-E染色を施して光顕下で観察した.

その結果,義歯撤去時間の増加は,持続的圧力下の義歯床下組織に生じる病理組織学的変化を軽減した.また,持続的圧力によって上皮組織ならびに粘膜固有層に惹起される組織変化の防止に要する義歯撤去時間は,骨組織における組織変化の防止に要するそれに比べて長いことが示唆された.本実験の成果は,昨年度第104回日本補綴学会において発表し,その一部はJ Oral Rehabilにaccceptされ印刷待ちの状態である.
アレルギー性鼻炎におけるILC2sを介した好酸球遊走調節機構の解明

研究計画書にあった、FACSを用いて下鼻甲介粘膜におけるILC2を同定・分離し、アレルギー性鼻炎の有無による量的な違いを明らかにする、という項目について検討した。近年、ヒト喘息患者の末梢血中におけるILC2の割合を男女で比較すると、男性よりも女性の方がILC2の頻度が高いことが報告され、性ホルモンがILC2の頻度に影響することが示唆されている。したがって本研究においても男性のサンプルだけを用いて検討したところ、下鼻甲介粘膜におけるILC2の割合は、正常コントロール群と比較し、通年性アレルギー性鼻炎群で有意に高いという結果が得られた。また下鼻甲介粘膜のILC2におけるCysLT1受容体の発現をFACSを用いて検討したところ、正常コントロール群と比較すると、通年性アレルギー性鼻炎群で高い傾向がみられた。アレルギー性鼻炎の初期炎症に関わるメディエーターのなかから、ILC2s活性化に関わる因子を明らかにし、ILC2sを介した好酸球遊走調節機構を解明する、という項目についても検討した。アレルゲン誘発テスト(右下鼻甲介にコントロールディスクを留置し10分後に右鼻腔洗浄液を回収、左下鼻甲介にハウスダストディスクを留置し10分後に左鼻腔洗浄液を回収)を行い、正常コントロールと通年性アレルギー性鼻炎患者の鼻腔洗浄液中の各種ケミカルメディエーターを測定し比較検討した。通年性アレルギー性鼻炎群でtotal nasal symptom scoreが増加し、鼻腔洗浄液中の好酸球が増加した。またメディエーターではプロスタグランジンD2とシステイニルロイコトリエンだけが通年性アレルギー性鼻炎群で有意に増加していたが、IL-33やIL-25、TSLP、Eotaxin-1/-3には有意な増加がみられなかった。研究計画に記載していた項目のうち、複数の内容を検討することができ、またある程度の結果を得ることができた。上記の内容を日本鼻科学会や日本耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会などで発表することができた。平成29年度、平成30年度の結果から、「アレルギー性鼻炎におけるILC2を介した好酸球遊走調節機構」には、プロスタグランジンD2とシステイニルロイコトリエンを介したILC2からのTh2サイトカイン産生が特に重要であることが示唆された。さらに研究を遂行する上での課題として、アレルギーの有無でヒトILC2に質的な差があるか検討する必要がある。正常コントロールと通年性アレルギー性鼻炎から得られた末梢血由来のILC2を、プロスタグランジンD2やシステイニルロイコトリエンなどで刺激し、産生されるTh2サイトカイン量を測定する予定である。研究計画にあった、FACSを用いて下鼻甲介粘膜におけるILC2を同定・分離し、アレルギー性鼻炎の有無による量的な違いを明らかにする、という項目について検討した。その結果、ハウスダストに感作された通年性アレルギー性鼻炎患者の下鼻甲介粘膜にILC2が存在すること、それらはCRTH2とCysLT1を発現していることが確認できた。また下鼻甲介粘膜から分離したILC2は、IL-33とIL-2に反応して、好酸球を遊走するIL-5を産生することも分かった。しかし通年性アレルギー性鼻炎患者群とコントロール群で鼻粘膜中のILC2の割合を検討したが、両群間で有意差はなかった。ヒスタミンやサブスタンスPなどのアレルギー性鼻炎の初期炎症に関わる種々のメディエーターの中から、ILC2sを活性化してIL-5産生を増加させる因子を検索する、という項目についても検討した。ヒト末梢血から分離培養し、増殖させたILC2を用いて、各種メディエーターによる刺激実験を行った結果、ヒスタミン、ニューロキニンA、サブスタンスP、PAF、トロンボキサンA2などはILC2からのIL-5産生を促進させなかったが、プロスタグランジンD2(PGD2)やシステイニルロイコトリエン(cysLTs)、上皮由来のサイトカインであるIL-33、IL-25は、それぞれILC2からのIL-5産生を促進させた。新たなILC2s活性化因子について、その活性化因子に対する阻害抗体、受容体阻害薬などを利用して、ILC2sを介した好酸球遊走調節機構をより詳細に解明する、という項目についても検討した。PGD2の受容体阻害薬であるラマトロバンを用いると、PGD2刺激によるILC2からのIL-5/IL-13産生は抑制された。またcysLTsの受容体阻害薬であるモンテルカストを用いると、cysLTs刺激によるILC2からのIL-5/IL-13産生は抑制された。

また下鼻甲介粘膜のILC2におけるCysLT1受容体の発現をFACSを用いて検討したところ、正常コントロール群と比較すると、通年性アレルギー性鼻炎群で高い傾向がみられた。アレルギー性鼻炎の初期炎症に関わるメディエーターのなかから、ILC2s活性化に関わる因子を明らかにし、ILC2sを介した好酸球遊走調節機構を解明する、という項目についても検討した。アレルゲン誘発テスト(右下鼻甲介にコントロールディスクを留置し10分後に右鼻腔洗浄液を回収、左下鼻甲介にハウスダストディスクを留置し10分後に左鼻腔洗浄液を回収)を行い、正常コントロールと通年性アレルギー性鼻炎患者の鼻腔洗浄液中の各種ケミカルメディエーターを測定し比較検討した。通年性アレルギー性鼻炎群でtotal nasal symptom scoreが増加し、鼻腔洗浄液中の好酸球が増加した。またメディエーターではプロスタグランジンD2とシステイニルロイコトリエンだけが通年性アレルギー性鼻炎群で有意に増加していたが、IL-33やIL-25、TSLP、Eotaxin-1/-3には有意な増加がみられなかった。研究計画に記載していた項目のうち、複数の内容を検討することができ、またある程度の結果を得ることができた。上記の内容を日本鼻科学会や日本耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会などで発表することができた。ヒト鼻粘膜におけるILC2の局在の検討や、アレルギー性鼻炎モデルマウスの検討を行う予定である。平成29年度、平成30年度の結果から、「アレルギー性鼻炎におけるILC2を介した好酸球遊走調節機構」には、プロスタグランジンD2とシステイニルロイコトリエンを介したILC2からのTh2サイトカイン産生が特に重要であることが示唆された。さらに研究を遂行する上での課題として、アレルギーの有無でヒトILC2に質的な差があるか検討する必要がある。正常コントロールと通年性アレルギー性鼻炎から得られた末梢血由来のILC2を、プロスタグランジンD2やシステイニルロイコトリエンなどで刺激し、産生されるTh2サイトカイン量を測定する予定である。
大気圧非平衡プラズマによる有害ガス処理過程のモデリング手法の確立

低温で化学反応性に優れる大気圧非平衡プラズマは,有望な有害ガス処理技術である。本研究では, (1)大気圧非平衡プラズマ(特にストリーマ)の生成, (2)ラジカルを起点とした反応過程を反映したシミュレーションモデルを構築し,窒素酸化物除去過程に適用した。更に,大気圧非平衡プラズマと触媒を組み合わせたハイブリッド装置を対象に触媒反応のモデリングを行った。得られたシミュレーション結果より,反応過程の詳細を議論している。本研究の目的は,放電物理・化学に立脚し,誘電体バリア放電におけるストリーマの生成,及び,これに伴うラジカル生成を評価した有害ガス処理過程のモデリング手法の確立することである。具体的には,プラズマを用いた窒素酸化物除去における反応過程の詳細解明,プラズマ触媒複合プロセスでの触媒反応を考慮したモデル化手法の確立を課題としている。平成19年度は以下のことを行った。1.プラズマを用いた窒素酸化物除去における反応過程の詳細解明誘電体バリア放電のシングルストリーマの進展過程を流体モデルに基づいて計算した。また,このシングルストリーマの成長に伴って生成されるラジカル量をエネルギーの関数として評価した。更に,得られたラジカルを起点としたレート方程式を解くことにより,窒素酸化物除去過程の詳細を調べた。流入ガスの組成,放電環境の温度をパラメータとし,計算から得られたプラズマ処理後の窒素酸化物濃度の特性は,実験結果と定量的にも良い一致を示した。即ち,本研究で示した放電物理・化学に立脚した計算モデルの妥当性と有用性を示す。2.プラズマ触媒複合プロセスでの触媒反応を考慮したモデル化手法の確立炭化水素によるγ-アルミナ触媒上での窒素酸化物の選択接触還元を,脱離/吸着反応,触媒上での表面反応を考慮してモデル化した。200°C以上の温度域において,触媒温度の上昇に伴い窒素酸化物の還元量の増加が確認された。実験結果を定量的に再現できたわけではないが,定性的傾向は一致している。今後,プラズマ化学反応とカップリングして,プラズマ促進触媒反応のモデル化へと繋げる。本研究では,放電物理・化学に立脚した,大気圧非平衡プラズマによる有害ガス処理過程のモデリング手法の確立を目的としている。モデリング手法については,(1)誘電体バリア放電内のストリーマ生成のシミュレーション,及び,これに伴うラジカル生成量の評価,(2)比投入エネルギーの関数としてラジカル生成量を考慮したレート方程式による気相反応シミュレーション,(3)触媒反応のシミュレーション,の階層的なものとして前年度までに確定した。平成20年度は,平成19年度の成果のまとめに加え,以下のことを行った。1.広範な条件下でのプラズマによる窒素酸化物除去過程の詳細解明上記(1)(2)のモデルにより,広範な条件下(放電環境の温度,添加ガスの有無,ガス滞留時間など)においてシミュレーションを実施した。計算結果は実験結果と定量的に一致し,本研究の妥当性を示した上で,反応過程の詳細を調査した。2.触媒反応モデルによるプラズマ触媒複合プロセスのシミュレーション前年度に実施した,γ-アルミナ触媒上での炭化水素による窒素酸化物の選択接触還元のモデルについて,反応過程の再調査と再検討,気相-触媒表面間の粒子輸送について検討し,モデルの改良を行った。また,プラズマと触媒を直列に配したプラズマ触媒複合プロセスについて,触媒リアクタに導入するガス種組成をパラメータとして,触媒反応シミュレーションを実施した。なお,当初計画として,大気圧非平衡プラズマによる揮発性有機溶剤(ベンゼン)の分解も実施する予定であったが,ベンゼンの分解過程に関わる素過程の不足により実施に至らなかった。
小脳変性を来す先天性遺伝子修復異常症の病態、治療法に関する研究

本研究では、ATM、Mre11、NBS1からのシグナルが胎生期の脳形成に重要でありかつ患者における小脳変性にも重要であることが明らかになったことからATM、Mre11、NBS1の共通のターゲットとなる蛋白質を検索しそれらの蛋白質から脳形成や小脳変性を来す重要な蛋白質を同定することを目的としている。また、1本鎖DNA切断修復遺伝子異常が遺伝性脊髄小脳変性症の原因であることが明らかにされ、これらの蛋白質との相互関係を検討し神経細胞死の共通の機序を明らかにすることを目的としている。これらの解析で病態の解明をすすめ早期診断法の開発、治療法の確立を目指している。今年度の研究実績は以下のとおりである。ATMのシグナルを種々の蛋白質に伝えているMre11-NBS1-Rad50複合体に結合する候補蛋白質に関して、これらの蛋白質それぞれについて生理機能および蛋白相互作用について検討をおこない、1年間に以下のことを明らかにした。1)候補蛋白質の生理機能を解析強制発現系を利用しdeletion mutantを発現させると細胞内における局在がどのように変化するか、また会合蛋白質との細胞内での結合の変化、アポトーシス刺激に対する反応の変化等について検討した。主にミスマッチ修復に関する蛋白とNBS1との相互作用について検討をおこなった。またsiRNAを利用した発現抑制による細胞の生理機能の変化についても検討をおこなった。2)候補蛋白質とMre11-NBS1-Rad50蛋白質複合体との結合部位とその立体構造ミスマッチ修復に関わる蛋白質とNBS1との結合部位について、その立体構造について検討し、deletion mutantから得られた情報と、細胞内局在および機能に及ぼす領域について検討を行った。本研究では、ATM、Mrell、NBSlからのシグナルが胎生期の脳形成に重要でありかつ患者における小脳変性にも重要であることが明らかになったことからATM、Mrell、NBSlの共通のターゲットとなる蛋白質を検索しそれらの蛋白質から脳形成や小脳変性を来す重要な蛋白質を同定することを目的としている。ATMのシグナルを種々の蛋白質に伝えているMrell-NBSl-Rad50複合体に結合する蛋白質を検索するため酵母ツーハイブリッド法を利用し候補蛋白質を15個同定し、これらの蛋白質それぞれについて発現ベクターを作製、細胞内で発現させMrell-NBSl-Rad50複合体との結合を免疫沈降法にて調べ、1年間に以下のことを明らかにした。1)候補蛋白質の生理機能を解析細胞内における候補遺伝子の生理的機能を解析するため、強制発現系を利用し細胞内局在の確認、会合蛋白質との細胞内での結合の確認、アポトーシス刺激に対する反応等について検討し、DNA損傷時における候補遺伝子の発現パターン、細胞内局在の変化の有無、結合の状態の変化について検討した。2)候補蛋白質とMrell-NBSl-Rad50蛋白質複合体との結合部位を決定候補蛋白質との結合部位をdeletion mutantを作製し、免疫沈降にて結合を確認した。Deletion mutantの細胞内局在を確認し、局在に影響を与えるドメイン内の結合部位に変異を加えた変異蛋白質を作製し機能解析を詳細に行った。本研究では、ATM、Mrell、NBS1からのシグナルが胎生期の脳形成に重要でありかつ患者における小脳変性にも重要であることが明らかになったことからATM、Mrell、NBS1の共通のターゲットとなる蛋白質を検索しそれらの蛋白質から脳形成や小脳変性を来す重要な蛋白質を同定することを目的としている。また、1本鎖DNA切断修復

遺伝子異常が遺伝性脊髄小脳変性症の原因であることが明らかにされ、これらの蛋白質との相互関係を検討し神経細胞死の共通の機序を明らかにすることを目的としている。これらの解析で病態の解明をすすめ早期診断法の開発、治療法の確立を目指している。今年度の研究実績は以下のとおりである。ATMのシグナルを種々の蛋白質に伝えているMrell-NBS1-Rad50複合体に結合する候補蛋白質を15個同定し、これらの蛋白質それぞれについて生理機能および蛋白相互作用について検討をおこない、1年間に以下のことを明らかにした。1)候補蛋白質の生理機能を解析強制発現系を利用し細胞内局在の確認、会合蛋白質との細胞内での結合の確認、アポトーシス刺激に対する反応等について検討した。主にミスマッチ修復に関する蛋白とNBS1との相互作用について検討をおこない、DNA損傷時における候補遺伝子の発現パターン、細胞内局在の変化の有無、結合の状態の変化について検討した。2)候補蛋白質とMrell-NBS1-Rad50蛋白質複合体との結合部位を決定ミスマッチ修復に関わる蛋白質とNBS1とのの結合部位についてdeletion mutantを作製し、免疫沈降にて結合を確認しDeletion mutantの細胞内局在および機能解析を詳細に行った。本研究では、ATM、Mre11、NBS1からのシグナルが胎生期の脳形成に重要でありかつ患者における小脳変性にも重要であることが明らかになったことからATM、Mre11、NBS1の共通のターゲットとなる蛋白質を検索しそれらの蛋白質から脳形成や小脳変性を来す重要な蛋白質を同定することを目的としている。また、1本鎖DNA切断修復遺伝子異常が遺伝性脊髄小脳変性症の原因であることが明らかにされ、これらの蛋白質との相互関係を検討し神経細胞死の共通の機序を明らかにすることを目的としている。ATMのシグナルを種々の蛋白質に伝えているMre11-NBS1-Rad50複合体に結合する候補蛋白質に関して、これらの蛋白質それぞれについて生理機能および蛋白相互作用について検討をおこない、1年間に以下のことを明らかにした。1)候補蛋白質の生理機能を解析強制発現系を利用しdeletion mutantを発現させると細胞内における局在がどのように変化するか、また会合蛋白質との細胞内での結合の変化、アポトーシス刺激に対する反応の変化等について検討した。主にミスマッチ修復に関する蛋白とNBS1との相互作用について検討をおこなった。またsiRNAを利用した発現抑制による細胞の生理機能の変化についても検討をおこなった。2)候補蛋白質とMre11-NBS1-Rad50蛋白質複合体との結合部位とその立体構造ミスマッチ修復に関わる蛋白質とNBS1との結合部位について、その立体構造について検討し、deletion mutantから得られた情報と、細胞内局在および機能に及ぼす領域について検討を行った。
慢性疼痛の形成に関与する神経ペプチドの動態と鎮痛薬による変容に関する研究

本研究により,慢性疼痛に関与する神経ペプチドの動態とそれに対する鎮痛薬の作用について,以下の諸点が明らかになった.1)アジュヴァント関節炎ラットを慢性疼痛モデル動物として用した.2)後根神経節中の免疫活性サブスタンスP量は関節炎ラットの方が対照ラットよりも有意に高かった.脊髄後角中のそれは逆に前者の方が低かった.3)軸索輸送阻害薬コルヒチンでサブスタンスPの神経節から終末への輸送を阻害すると,関節炎ラットの神経節では著しいサブスタンスPの蓄積が認められた.4)関節炎ラットの腰髄後角における一次知覚神経終末からのサブスタンスPの自発性遊離な対照ラットのそれよりも有意に増加していた.また,関節炎ラットでは関節部屈伸運動によってサブスタンスPが多量に遊離した.5)モルヒネの全身性投与により一次知覚神経終末からのサブスタンスP遊離を抑制すると,関節炎ラットにおいてのみ脊髄後角中のサブスタンスP量の増加が認められた.6)カルシトニン遺伝子関連ペプラドのラット脊髄くも膜下腔内注射により,対照ラットにおいても機械的圧刺激に対する疼痛閾値は有意に低下したが関節炎ラットにおいては一層顕著な低下が認められた.また,この作用はサブスタンスP拮抗薬で抑制された.以上,アジュヴァント関節炎ラットにおいて,疼痛刺激によりサブスタンスP含有一次知覚神経が持続的に活性化され,サブスタンスPの生合成・軸索輸送・脊髄後角内終末からの遊離の促進など著名な動態の変化が認められ,鎮痛薬はこれら動態の変化を抑制すること,カルシトニン遺伝子関連ペプチドもサブスタンスPと同様に慢性疼痛の伝達に関与することを明らかにした.本研究により,慢性疼痛に関与する神経ペプチドの動態とそれに対する鎮痛薬の作用について,以下の諸点が明らかになった.1)アジュヴァント関節炎ラットを慢性疼痛モデル動物として用した.2)後根神経節中の免疫活性サブスタンスP量は関節炎ラットの方が対照ラットよりも有意に高かった.脊髄後角中のそれは逆に前者の方が低かった.3)軸索輸送阻害薬コルヒチンでサブスタンスPの神経節から終末への輸送を阻害すると,関節炎ラットの神経節では著しいサブスタンスPの蓄積が認められた.4)関節炎ラットの腰髄後角における一次知覚神経終末からのサブスタンスPの自発性遊離な対照ラットのそれよりも有意に増加していた.また,関節炎ラットでは関節部屈伸運動によってサブスタンスPが多量に遊離した.5)モルヒネの全身性投与により一次知覚神経終末からのサブスタンスP遊離を抑制すると,関節炎ラットにおいてのみ脊髄後角中のサブスタンスP量の増加が認められた.6)カルシトニン遺伝子関連ペプラドのラット脊髄くも膜下腔内注射により,対照ラットにおいても機械的圧刺激に対する疼痛閾値は有意に低下したが関節炎ラットにおいては一層顕著な低下が認められた.また,この作用はサブスタンスP拮抗薬で抑制された.以上,アジュヴァント関節炎ラットにおいて,疼痛刺激によりサブスタンスP含有一次知覚神経が持続的に活性化され,サブスタンスPの生合成・軸索輸送・脊髄後角内終末からの遊離の促進など著名な動態の変化が認められ,鎮痛薬はこれら動態の変化を抑制すること,カルシトニン遺伝子関連ペプチドもサブスタンスPと同様に慢性疼痛の伝達に関与することを明らかにした.1.これまで報告のなかったラット脊髄腰膨大部後角組織のinsitu灌流法の確立のため、27ゲージの注射針2本の先端をけずって曲げ、切断面を向かい合わせになるようにして両者を固定したものを考案した。2.対照および慢性疼痛モデル動物:アジュバント関節炎ラットの腰膨大部を局所灌流した灌流液中のサブスタンスPをラジオイムノアッセイ法で定量したところ、アジュバント関節炎ラットでの自発性遊離量は対照ラットのそれに較べて1.34倍と有意に多かった。さらに、対照ラットでは痛み刺激とならない足首関節の屈伸刺激によりサブスタンスP遊離量は変化しなかったが、アジュバント関節炎ラットでは痛み刺激となる当該刺激によりサブスタンスP遊離量は著明かつ有意に増加することが判明した。これらの結果は、アジュバント関節炎時の慢性痛の形成に一次知覚神経中のサブスタンスP含有神経の活動の亢進とそれに伴う脊髄後角における遊離増加が大きく関与していることを明らかにした。3.対照ラットおよびアジュバント関節炎ラットから脊髄後角組織切片を作成し、その組織内サブスタンスP含有量を調べたところ、後者のラット、とくに、最も痛みの感受性が高まっている時期の後角内サブスタンスP含有量は対照ラットのそれよりも減少していた。一方、同時期に後根神経節中のサブスタンスP含有量はアジュバント関節炎ラットの方が有意に多かった。さらに、軸索輸送阻害薬コルヒチンを処理するとアジュバント関節炎ラットの後根神経節中のサブスタンスP含有量の有意な増大が認められた。以上の諸結果により、アジュバント関節炎ラットにおいては疼痛刺激によりサブスタンスP含有一次知覚神経が持続的に活性化され、生合成、軸索輸送、脊髄後角内終末からの遊離促進が起っており、慢性疼痛の形成に重要であることが明らかとなった。
アドリアマイシン誘発心筋ミトコンドリア電子伝達系障害の核医学的検出法の研究

1:心筋症動物モデルの作成アドリアマイシン(ADR)腹腔内投与にて心筋症ラットを作成した。ADR投与終了後より一時的な体重減少や食欲不振をきたしたが、その後は徐々に胸腹水の貯留による体重増加をきたし、心不全状態となった。投与後3週後と6週後の生存率は、それぞれ約80%と60%であった。2:心機能測定ADR投与終了後、3週後、6週後の心臓超音波検査法により算出した左室駆出分画は、それぞれ84%、81%、72%で6週後に有意に低下していた。左室拡張末期容積の拡大も6週後には有意なものとなった。3:心筋脂肪酸代謝測定心筋へのBMIPPの取り込みは、ADR投与終了後を100%とした場合、3週後には87%とやや低下するものの有意ではなく、6週後に69%と有意に集積低下を示した。4:ミトコンドリア複合体I活性測定心筋のミトコンドリア複合体I活性は、ADR投与終了後にコントロールに比してやや低値を示し、3週後の時点ですでに有意な低下を示した。しかも、この低下は一時的なものではなく、6週後まで持続してみられた。5:心筋細胞におけるアポトーシスの発現およびフリーラジカルの発生小動物PETを使用した生体イメージングによるミトコンドリア機能評価の準備と平行して、アポトーシスの発現とフリーラジカルの発生を検討するために、TUNEL染色およびHNE染色をおこなったところ、ADR投与ラットにおいてアポトーシスとフリーラジカルの発生は有意に高度であり、フリーラジカルスカベンジャーにより著明に抑制された。このフリーラジカルの発生はミトコンドリア機能障害に起因すると推察された。小動物PETの導入を待って生体イメージングへの応用にむけた基礎実験を継続する予定である。小動物PETを使用した生体イメージングによるミトコンドリア機能評価の遂行にむけて準備中である。以上の本年度の検討から、ADRによる心障害の早期評価は、心機能や代謝によっても困難であることが推察され、ミトコンドリア機能の評価がその検出に非常に有用である可能性が強く示唆された。次年度におこなうCu-ATSMを用いた生体イメージングの基礎実験にてこの部分が明らかにできるものと考えている。
東南アジア首都圏の開発ガバナンスと国家の役割再編

本研究の目的は、グローバル時代、ASEAN時代に経済成長を続ける東南アジアの首都圏の開発ガバナンスを分析することであった。具体的な調査対象となった首都圏は、マニラ、ジャカルタ、クアラルンプール、バンコクである。本研究の焦点の一つは首都圏開発における国家の役割であった。首都圏の土地にまつわる開発においては、政治体制が権威主義的・集権的であれば国家の役割が強く、民主的・分権的であれば国家の役割が弱いというシンプルな図式ではなく、地方政府の持つ権限、首都圏に存在する地方政府の層・数、政府以外のアクター(デベロッパー、王室など)の位置づけの違いが重要な意味を持つことがわかった。今年度は予定通り、2015年10月にジャカルタ首都圏で、2016年2月にマニラ首都圏で共同調査を実施した。共同調査では、都市開発に関わる国家・地方行政機関、民間開発業者、不動産業界団体、NGO、撤去対象となった住民たちとインタビューを実施した。また、本科研の打ち合わせとあわせて、4回の東南アジア都市政治研究会を実施することができた。アメリカの都市政治研究者、民間の不動産開発業者の方も含め、合計7名(日本人6人、フィリピン人1人)(テーマ:ジャカルタ首都圏:3名、マニラ首都圏3名、アメリカ都市1名)に発表をお願いし、東南アジアの首都圏の政治について極めて貴重な意見交換をすることができた。調査の結果、経済成長が顕著なインドネシア、フィリピンの首都圏では急速に用地開発が再開発としても新規開発としても進んでいること、そして、違法な居住区の再開発にあたっては、かつてのような強制撤去ではなく、国家のスキームも使いながら代替案を提示する形で再開発が進められようとしていることが分かった。東南アジアの調査対象の4首都圏(ジャカルタ、マニラ、クアラルンプール、バンコク)のうち、民主的・分権的な政治体制を取る国家の首都圏ジャカルタとマニラについては、民間セクター、そして、地方自治体の役割が顕著であるが、用地開発に関わる規制権力としての国家の役割、更に、複数の自治体をまたがる開発に果たす国家の役割は依然として重要であることがわかった。ただ、フィリピンとインドネシアを比べると、規制権力の国家という点では、フィリピン国家のほうが、多様な国家機関が用地開発に関わる規制権力を持っており、それが用地開発を時間的・金銭的にコストがかかる要因となっている。また、開発用地面積が小規模になりがちな理由でもあると思われる。共同調査、研究会の実施という点では順調に本研究を進めることができた。とりわけ、接触が困難と思われた民間セクターの開発業者、それから、業界団体関係者とネットワークを構築できた意義は大きい。今後の研究を推進していくうえで有効である。今年度は、予定では6月と8月にバンコクとクアラルンプールで合同調査の予定であった。しかし、6月頃は、タイにおける国王の健康問題もあり、政情が不安定だったため、政府関係者とのインタビューが困難と判断し、年度内での延期を考えたが、国王が10月に崩御したため、平成29年度に合同調査の延期を決定した。クアラルンプールについては、10月下旬に合同調査を実施した。また、9月には台湾の東南アジア学会において、ジャカルタ首都圏の政治についての分科会を設けて発表を行った。国内では、4月に首都政治に極めて重要な意味を持つイスラームとメディアについての研究会、6月にマレーシア都市部の住宅政策に関する研究会を行った。くわえて、2017年2月にクアラルンプールに関連する研究会、3月に都市政治に決定的に重要なオープン・ガバメントに関する研究会に代表者や分担者が企画・参加・発表した。具体的な研究内容での進展は、何よりもクアラルンプールの開発における国家の役割についての理解が進んだことである。当初の仮説においては、首都圏の再開発、外延の開発の両面において国家の役割が顕著だと想定していた。しかし、実態としては、連邦政府直轄のクアラルンプール市においても、連邦政府というより、与党連合BNが影響力を持ち、同市以外の首都圏においては、州政府が土地について権限を持つことから、必ずしも連邦政府が望む開発が進むわけではない。ましてや、野党勢力が州の政権を握っている場合には、連邦政府の役割は制度的には限られてくることから、連邦政府は予算措置などを通じて首都圏にある州の開発に関与するほかない。つまり、マレーシアでは、連邦政府が州に憲法的に与えられた権限を換骨奪胎する形で首都圏開発をする動きが見られ、EU諸国とは対照的な例となっている。タイの政情不安、更には2016年10月の国王崩御という事態があったため、本年度予定していたタイでの合同調査が実施できなかった。そのため、予定に遅れが生じた。ただし、代表者が2017年1月から3ヶ月ほど、タイの首都バンコクに駐在し、来年度の調査のための事前準備を行うことができた。一方、マレーシアのクアラルンプールでの合同調査については、予定より遅れたものの、10月に実施することができ、これまでのマレーシア研究では看過されてきた首都圏での土地開発のポリティクスに関する実態、とりわけ、都市部での野党勢力拡張後のポリティクスの実態が明らかになり、極めて有意義であった。与党連合BNが連邦政府をコントロールする一方、首都圏の州レベルでは野党連合が政権を握るというねじれ現象が起きた結果、土地開発をめぐる地方政治に大きな変容が起きていることがわかった。成果の公表という点では、9月に台湾の東南アジア学会で研究代表者、分担者、インドネシアの研究協力者の合計四名が分科会で発表をすることができた。また、関連する研究会でも代表者や分担者が発表を国内外で行ってきており、順調に推移している。

本研究の目的は、グローバル時代、ASEAN時代に経済成長を続ける東南アジアの首都圏の開発ガバナンスを分析することであった。具体的な調査対象となった首都圏は、マニラ、ジャカルタ、クアラルンプール、バンコクであり、この4首都圏すべてについて、科研実施期間中に合同調査を実施することとし、最終年度の平成29年度には、10月にバンコクで合同調査を実施した。チュラロンコーン大学講師、ジェトロ・バンコク事務所アドバイザー、日系デベロッパー、国家住宅局幹部、バンコク首都高級幹部、国家安全保障委員会前メンバーらに聞き取り調査を行った。この調査からわかったことは、バンコクについて言えば、マレーシアのクアラルンプールと同様、ほぼ開発・再開発に伴う立ち退きは大きなイシューとならなくなってきていることである。ただ、バンコクの場合、王室財政管理局が首都圏の土地の所有率が高く、それがなおさら立ち退きが問題化されない要因となっている。また、王室財政管理局が影響力が強いため、首都圏のデベロッパーについてのマクロな情報の入手は極めて困難であることがわかった。研究会としては、5月にインドネシアの国政にも影響をあたるジャカルタ州知事選挙についての国際ワークショップを開催し、6月にはブラウィジャヤ大学の講師を招聘して、首都圏と比較する目的もあり、インドネシアの東ジャワの地方政治に関するワークショップを行った。そして、総仕上げとして、2018年1月に、Metropolitan Politics in Southeast Asiaと題する国際ワークショップを開催し、科研代表者、分担者全員がペーパーを用意して発表した。そして、コメンテーターとして、チュラロンコーン大学の講師、ニューヨーク市立大学の准教授、ジャカルタの都市問題NGO代表を招聘した。今後、これらをまとめて英文雑誌で特集号とする予定である。具体的な調査対象となった首都圏は、マニラ、ジャカルタ、クアラルンプール、バンコクである。本研究の焦点の一つは首都圏開発における国家の役割であった。首都圏の土地にまつわる開発においては、政治体制が権威主義的・集権的であれば国家の役割が強く、民主的・分権的であれば国家の役割が弱いというシンプルな図式ではなく、地方政府の持つ権限、首都圏に存在する地方政府の層・数、政府以外のアクター(デベロッパー、王室など)の位置づけの違いが重要な意味を持つことがわかった。用地開発に関わるアクターに焦点を当てすぎると、地方自治体、民間開発業者、NGOを対象としがちとなってしまう。しかし、本研究の焦点の1つは用地開発に果たす国家の役割であるので、その点をもう少し意識的に調査していく必要があり、国家アクターへの調査を集中的にする必要もある。具体的な調査と情報収集にあたっては、現地の大学や調査機関との提携関係を結ぶ必要があり、インドネシアについては、当初の提携先に加え、首都圏の外延での開発の中心地区の大学との提携を模索している。最終年度である2017年度は、大きく分けて3つの活動を考えている。
難治性疾患に挑む化学生物学研究

1)パーキンソン症:これまでまでにMPP+を添加させて形成されるα-synucleinの凝集からなる斑点を阻害する化合物をスクリーニングしてSO286を見いだした. SO286はオートリソソーム形成を促進することでα-synucleinの凝集が分解する.現在12種類のタンパク質をSO286結合タンパク質として同定した.2)がん転移: A431細胞ではEGFによる細胞遊走にはRac1の活性化及びRac1GEFであるTiam1の発現上昇が必須であることを見出した.さらにTiam1はEGF刺激によって転写が活性化することも見いだした.1)パーキンソン症:これまでまでにMPP+を添加させて形成されるα-synucleinの凝集からなる斑点を阻害する化合物をスクリーニングしてSO286を見いだした. SO286はオートリソソーム形成を促進することでα-synucleinの凝集が分解する.現在12種類のタンパク質をSO286結合タンパク質として同定した.2)がん転移: A431細胞ではEGFによる細胞遊走にはRac1の活性化及びRac1GEFであるTiam1の発現上昇が必須であることを見出した.さらにTiam1はEGF刺激によって転写が活性化することも見いだした.EGFによるA431細胞の遊走にはRac1の活性化が重要であることが知られている.CysLT1特異的アンタゴニストは12時間のRac1の活性化を阻害した。このことからCysLT1下流にRac1シグナルがあることが示唆された。一方,この12時間のRac1を活性化させるタンパク質としてTiam1が重要であることを明らかとしたがその発現上昇機構は不明であった.そこでTiam1の発現上昇におけるCysLT1の関与を検討した。TiamlはEGFによって6時間から発現上昇し、CysLT1の特異的アンタゴニストはEGFが誘遵するTiam1の発現量上昇を濃度依存的に抑制した.このことからEGFによるCysLT1の発現上昇誘導によってTiam1/Rac1を介した遊走シグナルを伝えている事が示唆された.一方,シャペロン介在性のオートファジーとは、オートファゴソームを介さずに基質タンパク質が直接リソソームに分解される経路であり,その代表的な基質がα-synucleinである.そこでSO286がシャペロン介在性オートファジーを介してa-synucleinを分解するのかを評価した。α-synculenのhsc70認識配列は95VKKDQ99であるため、DQ配列を欠損した変異体α-synuclein△DQを作製した。野生型、変異型をそれぞれ安定過剰発現した細胞を作製し、SO286によりその発現量に変化があるかを評価した。その結果、野生型α-synucleinはSO286の添加により顕著に分解されたのに対し、変異型α-syncleinΔDQは発現量に変化はなかった。以上よ.り、SO286はシャペロン介在性オートファジーを介してa-synucleinを分解していることを示唆した。本申請課題では難治性疾患のうち「パーキンソン病」と「がん」に焦点を絞り,申請者らが開発した小分子化合物を用いて,その標的タンパク質の同定および作用機構解析を明らかにすることを目的とする.1)パーキンソン症:これまでまでにパーキンソンモデル細胞系であるラット副髄腎質褐色細胞腫PC12D細胞内にMPP+を添加させるとα-synucleinの凝集からなる斑点が形成されることを見いだし,この斑点を阻害する化合物をスクリーニングしてSO286を見いだした.この機構を解析した結果,SO286を添加するとオートリソソーム形成が促進されα-synucleinの凝集が分解され,その結果細胞死が抑制されることを明らかにした.そこでSO286固定化ビーズを用いたプルダウン法によりSO286の結合タンパク質を取得するための種々条件検討を行った.細胞抽出液とSO286固定化ビーズとの反応時間,反応溶液中の界面活性剤等の条件検討を行ったがSO286ビーズ選択的に結合するタンパク質は得られなかった.そこでSO286の活性に影響を与えない部位にビオチンを付加したビオチン化SO286を用いた標的タンパク質の同定を試みている.2)がん転移:ヒト扁平上皮がん細胞A431細胞においてEGF依存的細胞遊走を5-リポキシゲナーゼ阻害剤が抑制した.これまでにEGFによる細胞遊走にはRac1の活性化及びRac1GEFであるTiam1の発現上昇が必須であることが見出した.さらにTiam1はEGF刺激によって転写が活性化する一方で,翻訳ご修飾によってもその発現量が変化することも見いだしている.そこで,ロイコトリエンシグナルによってTiam1プロモーター領域に結合する転写因子を明らかにし,さらに細胞内情報伝達系阻害剤を用いて転写因子を活性化させるシグナル伝達機構を明らかにする.本年度は難治性疾患のうち「パーキンソン病」と「がん」に焦点を絞り,申請者らが開発した小分子化合物を用いて,その標的タンパク質の同定および作用機構解析を明らかにすることを目的とした.1)パーキンソン症:パーキンソン病(PD)とは,中脳黒質のドーパミン産生細胞中に凝集タンパク質が蓄積することで神経細胞死が誘導される疾患である.

我々はPD治療薬のリード化合物としてSO286を見出した.SO286はオートファジーを誘導することで細胞内に蓄積した凝集タンパク質を分解することが示唆されたが,その詳細な作用機序は不明であった.そこで本研究ではSO286の標的タンパク質の同定を目的とした.PC12D細胞にNGFを48時間処理して神経様細胞様に分化させたあとMPP+を添加し回収することで,細胞抽出液を得た.この細胞抽出液にSO286ビオチン標識体を添加し, pull down assayおよびSDS-PAGEさらにTOF/MS解析により計12種類のSO286結合タンパク質候補を同定した.2)がん転移:細胞遊走はがん転移に必須な段階である.これまでに我々はヒト扁平上皮がんA431細胞のEGF刺激依存的細胞遊走において,EGF刺激12時間後に細胞遊走に必須なRac1の活性化が誘導されること見出してきた.このRac1の活性化にはEGF刺激によるTiam1の発現誘導が必要であることを示した.さらにCysLT1の選択的阻害剤であるMK-571及びMontelukastおよびCysLT1のノックダウン実験によって,A431細胞の遊走過程において,EGF刺激による5-リポキシゲナーゼの活性化を介したCysLT1シグナルがTiam1の発現を誘導し,その結果Rac1の活性化を制御していることが示唆された.パーキンソンモデル細胞でのSO286の細胞生物学手法による作用機構解析やがん細胞の遊走機構におけるCysLT1シグナリングの重要さを示す結果な当初の計画以上に進んでいるが,反面,SO286の標的分子同定については更に結合条件検討等を行う必要がある.24年度が最終年度であるため、記入しない。1)パーキンソン症:SO286の誘導体に対してα-synuclein凝集阻害活性評価を行ない,構造活性相関解析をすることでSO286の活性部位を特定する.さらにSO286ビオチン体を用いて標的タンパク質の同定および機能解析を行なう.2)がん転移:EGFによる細胞遊走にはRac1GEFであるTiam1の発現上昇が必須であることが見出されてきた.さらにTiam1はEGF刺激によって転写が活性化することからロイコトリエンシグナルによってTiam1プロモーター領域に結合する転写因子を明らかにし,さらに細胞内情報伝達系阻害剤を用いて転写因子を活性化させるシグナル伝達機構を明らかにする。24年度が最終年度であるため、記入しない。
相同組換え遺伝子導入による発癌機構の研究

劣性表現を持つ癌抑制遺伝子の機能の検証は細胞が持つ一対の相同染色体の両側において当該遺伝子を欠損させなければならないが、それを可能にしたのが、マウス培養胚幹細胞(ES細胞)における相同組換えである。これにより正常遺伝子を欠損導入遺伝子と取替えることができる。そして、この相同組換え胚細胞由来のマウスの交配により両側の当該遺伝子を欠損させたマウスを得、劣性表現を示す当該遺伝子の機能を探る方法の効率化を検討する。そして、ES細胞における相同組換えを利用して個々に特徴ある発癌に関連する遺伝子、特にがん抑制遺伝子の生物個体における機能を解析することを目的としたものである。まず、キメラ形成能の高いES細胞系の樹立では、井川は、相沢らの協力で、正常3日胚(これまでは4日胚を用いた)からの樹立で、これに成功した。また、城石はMHC領域に高頻度組換えを起こすマウス系B10ーA(R209)のES細胞株ESR209.1を樹立しキメラ形成能を確認した。また、中辻はC57BL/6よりES細胞系を樹立し、その生殖系列キメラ形成能を確認した。また、卵原細胞を体外で培養し、雌マウスに移入し、操作された生殖細胞由来の子孫を得た。ES細胞系における相同組換えの高率化では、井川が、相沢らの協力で、ジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子をネガティブ選択に用いることで成功し、実際に、ES細胞系でp53など3つの遺伝子の欠損導入を果たした。木村は、CーHaーrasに偽遺伝子がないことを確かめ、相同組換え用の同遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化した。高橋は、マウスHox3.5遺伝子を組換え用に構築した。若杉は、山村と共同で、相同組換えで欠損させるマウスNFー1遺伝子を単離した。また、野田(哲)は、マウスにおいてWTー1対応遺伝子を単離し、ES細胞系の同遺伝子に相同組換えで欠損を導入した。
転写制御における基本転写因子TFIIDサブユニット(TAFs)の分子機能

コアプロモーター構造を認識する基本転写因子TFIIDは、TATAボックス結合タンパク質(TBP)と14種類のTBP随伴因子(TAF1-14)から構成される巨大なタンパク質複合体であり、転写調節因子から受け取った信号を転写量の増減へと変換する上で中心的な役割を果たす。TAF1のN末端に存在するTAND(TAF N-terminal domain)は、TBPに強く結合する性質を持ち、転写調節因子の存在下においてTBPをTATAボックスに向けて放出する役割を担うと考えられている。上記モデルを検証するべくTANDの異所移植を試みたところ、TANDは機能を保持したまま、ほぼ全てのTAFのN,C両末端に移植可能であることが示された。一方、移植が不可能なケースとして、(1)TAF3/8のN末端では活性が弱く、TAF6のC末端では全く機能できない、(2)TAF11のC末端ではTANDのTBP結合能依存的にTAF11自身の機能が損なわれる、(3)TAF13のN末端ではTAF1がTANDを有する場合にのみ、TBP結合能の有無によらずTAF13自身の機能が損なわれる等の興味深い事実も明らかとなった。このうち(2)についてはTAF1/6/8/9のみが選択的にTFIID複合体から脱離するためであることが判明したが、(1)(3)の原因は不明である。そこで現在、TFIIDへの取り込みが阻害されるTAFの有無やその特定を含め、TFIID機能が阻害される原因に関して詳細な検討を進めている。今年度はさらに広い範囲でTAND機能の自律性を検証するべく、TAF6,TAF10,TAF12,TAF13,TAF14のN, C両末端への異所移植を行い、移植が可能である部位とそうではない部位(移植によってTFIIDの機能が阻害される部位)が存在することを見出した。現在、共免疫沈除法を用いて、TFIIDへの取り込みが阻害されるTAFの有無やその特定を含め、TFIID機能が阻害される原因に関して詳細な検討を進めている。一方、第三、四、五、六染色体を約200bpの高解像度で網羅したタイリングアレイを用いて、TFIIDの全サブユニット及び基本転写因子群,NC2,SAGAの一部のサブユニットなどについてChIP-chip解析を行い、複数の興味深い新たな知見を得た。
口蓋裂患者における鼻咽腔閉鎖率分析-VPIに対する治療基準の確立を目指して-

期間中に来院した口蓋裂患者の中から本研究の目的を理解し賛同する者を被験者とするため、被験者のリストの作成を図った(但し、未成年で保護者の同意が得られない者、発達障害を有する者、多動性障害を有する者、MRI撮像により障害を被る可能性のある者、言語評価が得られない者、従来の鼻咽腔閉鎖機能の評価が行えない者は除外する)。データ採得を行う時期として、口唇裂・口蓋裂総合治療センターで通常診療時、音声言語評価および鼻咽腔閉鎖機能を評価する時期と設定した(不必要な検査を行うことはない)。すなわち、データ採得時期は初診時、治療前、(軟口蓋挙上装置の使用の場合治療中も)、および治療後とした。鼻咽腔形態の撮像に際しては、被験者に仰臥位で、設定した専用プロトコルに従い発声を指示し、60秒間MRI movieを撮像するため、撮像装置としてMRI(3.0T Magnetom Verio, Siemens, Erlangen, Germany)を用い、Gradient Echo sequenceにより撮影を行うよう研究プロトコルを検討した。音声言語の評価としては、現在日本で広く実施されている2種類の聴覚判定法(遠城寺式・乳幼児分析発達検査表(九州大学小児歯科改訂版)、新版発音検査(千葉テストセンター))を用いて岡山大学病院口唇裂・口蓋裂総合治療センター検査室にて評価した。そして、鼻咽腔閉鎖機能の評価には、従来より定量可能な検査法であるセファログラムとナゾメータ検査を行うこととした。そのため、ナゾメータを新たに購入し、検査体制を整えた。
ヌクレオソーム形成過程のリアルタイム1分子観察

1)アフリカツメガエル卵母細胞抽出液から超遠心によりヌクレオソーム形成に必要な、ヒストン等のタンパク質因子を含んでいるフラクションを調製した。DNAおよびATP産生系を加えた反応生成物をヌクレオソームで消化したところ、l50bpから180bpの長さのヌクレオタイドが生成した。これは、クロマチンをヌクレオソームで消化したときの生成フラグメントと一致し、アフリカツメガエル卵母細胞抽出液フラクションがヒストンにDNAを巻き付けたヌクレオソームを形成していることを示唆する。この系を用いて、DNA1分子上でのヌクレオソーム形成過程を観察ることにした。2)両端を微小ポリスチレンビーズで固定したDNA1分子を2スポットの光ピンセットで保持しながら、上記の卵母細胞抽出液フラクションを導入するために、フローセルの作成を行った。フローセルを用いて保持したDNAに蛍光色素YOYO-1を作用させ、色素が結合することによりDNAの分子長が1.5倍長くなることを観察した。3) YOYO-1存在下でDNAに張力を加えたときのDNA分子長を測定し、張力-分子長の関係をプロットしたところ、張力を増加させていったときと、減少させていったときのカーブに違いがあった。この違いを詳細に検討した結果、DNAの伸びは張力のかける速さに依存する、すなわち速く引っ張ると、伸びが少ないことが分かった。これはYOYO-1がDNAに結合する様式が複数あり、その間の転移に時間を要することを示唆している。