hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳特異タンパク質で新規に見出されたミリスチル化によるタンパク質間相互作用の制御

脳に特異的に発現しているNAP22と細胞内シグナル伝達系の主要因子カルモジュリンとの相互作用がミリスチル化により制御される新規のタンパク質間相互作用であることを見い出し、その分子機構を^1H-NMR、溶液X線小角散乱、CD、蛍光スペクトルの実験データをもとにしたバイオインフォマティックスにより解析している。これまでにこの相互作用が、1)ミリスチル基依存的であること、2)リン酸化により抑制されること、3)モル比が2:1の複合体を形成すること、また、複合体形成時に、4)カルモジュリン結合部位が既知の複合体で見られるようなαヘリックスを形成していないこと、5)慣性半径が既知のそれよりも大きいこと、などを明らかにした。現在は、NAP22とカルモジュリンの相互作用が脳内におけるシグナル伝達系の制御にどのように関与しているのかに着目して研究を進めている。また、srcがん遺伝子産物とHIV nef遺伝子産物では実験的にミリスチル化が示されているが、両者に関してもNAP22と同様の機能制御が存在することを見い出し、その分子機構、および生理作用、特に細胞がん化とエイズの発症の分子機構の解明を念頭に、研究を進めている。さらに、ゲノムデータを用いたバイオインフォマティックスにより生体内でミリスチル化が予測されるタンパク質をリストアップし、実際にそれらのタンパク質がカルモジュリンと相互作用するかについての網羅的解析を開始した(Bioinformatics Group, Institute of Molecular Pathology(Austria)との共同研究)。思考や記憶などの脳の高次機能に関与していることが示唆されている脳特異タンパク質NAP22とカルモジュリンとの間に新たに見い出した、翻訳後修飾の一つであるミリスチル化に依存するタンパク質間相互作用の分子機構の解析を進めている。既に、1)NAP22-カルモジュリン間相互作用がミリスチル基依存的であること、2)その相互作用がプロテインキナーゼCによるリン酸化により抑制されること、3)これまではカルモジュリンとの相互作用に必須だと考えられていたαヘリックスをNAP22は形成していないこと、等を明らかにし、NAP22の同一部位でカルモジュリンの関与するシグナル伝達系とプロテインキナーゼCの関与するシグナル伝達系がクロストークしていることを示している。カルモジュンがNAP22のカルモジュリン結合部位に相当するミリスチル化ペプチドと複合体を形成する際の構造変化を溶液X線小角散乱法とNMRにより解析した結果、4)モル比がNAP22:カルモジュリン=2:1の複合体を形成すること、5)複合体の慣性半径が既知のカルモジュリン-標的タンパク質複合体のそれよりも大きいこと、等、が明らかになった。カルモジュリンが認識する分子は全て特定の空間配置内での両親媒性を有しており、この共通の性質によってカルモジュリンに認識されると考えているが、NAP22以外にもがん遺伝子産物やHIV遺伝子産物など、ミリスチル化領域近傍に両親媒性を示すための塩基性アミノ酸残基と、さらには同時にプロテインキナーゼCによるリン酸化部位を持つものも多数存在する。実際にHIV nef遺伝子産物がカルモジュリンとミリスチル化依存的に相互作用する事を実験的に確認した。
移民・難民選別システムの重層的再編成――9ヶ国の国際比較と越境的構造分析

2018年度は、一方でこれまでの研究成果の集約とともに、他方で2018年春よりの入管法改定に向けての動きに対応する方向での調査を進行させ、また成果の国際的発信を行った。2017年度の調査を受けて、イタリアに関しては、緊張の高まる地中海のランペドゥーサ島の調査を通じての境界領域としてのローカルな歴史の重層性と現在のEU規模での管理強化と排斥運動の影響の交差が明らかにされ、またドイツに関しては難民による女性への「性暴力事件」が、実は同国の固定的イスラム認識に基づく報道により社会的に構築される過程が分析されるなど、EUにおける難民危機を巡る実相に迫る成果が上がってきた。他方、急激に変動した日本の政策状況については、担当官庁等への聞き取りを通して、これまでの政策との外面的整合性を保つことが政権中枢から担当官庁に求められる傾向や、新規カテゴリーに関しても日系南米人に対する新政策とのバランスが図られるなど、急激な政策の中で正統性の確保に揺れる実情が浮かびあがってきた。夏以降は、国際シンポジウム「トランスナショナル化と国境/境界規制ー北米・EU・日本の比較」を共同研究者とともに準備し、本プロジェクトの関心の焦点を巡って、ビーレフェルト大学のT.ファイスト教授、北米パネルのニューヨーク市立大学のR.C.スミス教授等をはじめ、海外第一線の国際移民研究者を招聘したうえで、10月末に実施した。各地域の代表的研究者と本プロジェクトの共同研究者を組み合わせる構成を図り、日米欧三地域の移民難民政策に関してパネルディスカッションを行い、これを踏まえて総括的に国際的なトレンドの中で進行中の日本の入管法改定の持つ意義について検討することができた。現状における日本の政策的諸問題を発信し、国際的研究者の視点からの示唆に富む論評を得ることができた。全国的に多数の研究者が参加し、国内外ともに高い評価を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2016年度は、申請時に急激に進行したシリア等からの難民をめぐるEUにおける外部国境の管理と域内に受け入れた庇護申請者たちへの対応をプロジェクトの最大課題として取り組み、他の地域における調査に関しては、準備段階としての最新政策の動向の資料収集や予備調査の実施を行った。まず、EU共通外部国境管理の中心機関であるワルシャワのFRONTEXに小井土・柄谷・堀井・久保山の4名で、2日間にわたりリスク分析担当、緊急出動統括、人権機関との調整担当などの9名の担当官を対象に聞き取りを実施した。大量の難民の流入時における緊急的対処と加盟国間の実際の調整機能の理解と同時に、ヨーロッパ国境沿岸警備隊という実行部隊が形成されることでFRONTEXはその状況分析と戦略策定部門として機能していくという転換期にあることが分かった。堀井は、ブリュッセル、ハーグ、マルタを訪問しユーロポール、EU理事会・EU庇護支援機構(EASO)対する聞き取りで、移民送出し国・中継国との連携による難民・非正規移民のEUへの流入の抑制、難民の受け入れに関する分担金をめぐる対立の深刻化、国境管理と難民キャンプの運営に関するNGOとEU/加盟国の間の摩擦、という現状を明らかにした。また、小井土は、3月にハンガリー・クロアチア・スロヴェニアのEU外部国境3ヵ国のUNHCR支部及び各国の研究者・NGOsを対象に調査することで、これらの国家のEU参加時期と条件が国境管理政策に対する態度に微妙な差異を生み出していること、ユーゴ内戦の経験・記憶に影響された各国の対応、密入国斡旋組織のネットワークの内戦後の発達、が具体的な難民の移動経路を規定することが明らかになってきた。久保山は、ドイツに焦点を当て、難民支援のNGO、などを訪問し、難民の統合策についての自治体レベルの対応について調査を進め、受け入れの地域での実情の解明を試みた。当初から重視していたEUにおける大量難民への共通外部国境における対応と域内加盟各国における対応の分析に関して、統合EUの主要機関や国際機関での調査が順調に協力を得られ実施することができ、複数の参加者によって現地で知見が共有できたこと、さらにこれを研究会において全体に共有できたことは、本共同研究の最も重要な目的を果たしたといえる。特に、FRONTEXにおける長時間で詳細な聞き取りに加えて複数のEU機関でその方針が聞き取れたことは重要だろう。また、昔農、久保山のドイツ調査も順調で、自治体、NGOsなどによる難民統合の実践的な対応状況とその課題についてのデータも着実に獲得できた。加えて、外部国境各国における難民に関する対応については、第1にUNHCRのワルシャワ支部を起点に、ブダペシュト、ザグレブ、リュブリャーナを加えた4支部で聞き取りができ、規制機関FRONTEXとの緊張関係のみならず、国境の各加盟国との協力と緊張関係が浮き彫りにできた。第2に、クロアチア、スロヴェニアの研究者の研究者の協力を得ることで、ユーゴ内戦にさかのぼる歴史的な文脈の中で各国の国境政策が規定されていることや、「難民危機」以前からの密入国ビジネスの発達の問題まで射程に入れることができた。この両面で外部国境地帯でのフィールド調査は、当初の目標以上のものとなった。他方、飯尾が都合により研究に参加できない期間があり、アメリカ側の規制強化のメキシコ側での影響に関する調査は当初予定より遅れることとなった。また、上林の本務校での時間的制約により海外調査は縮小せざるを得なかった。これらの課題は一時的なものであり、今後十分克服しこれらの側面でも当初計画に次年度以降目的の達成は可能だと考える。

2017年度は、アメリカ合衆国に関しては、トランプ政権の不明確で一貫性のない政策が与える影響について、7ー8月に小井土・飯尾で高学歴非正規移民層の若者(ドリーマー)に対し彼らのライフヒストリーについての聞き取りを18人に実施するとともに彼らの組織集会を参与観察した。また、小井土は並行して数年前に就労現場で検挙された非正規移民のその後の生存戦略の変化を調査した。さらに、3月には強制送還からの「一時的保護身分」(TPS)が現政権で廃止されることへの中米系移民を中心とした反対運動を調査した。堀井は、2017年春の調査結果の分析に集中し、EUにおいて2015年度に到着した難民に関する共通振り分け政策EU relocation schemeは、2017年度現在実効性を失い、振り分けに応じた国とこれを拒否をした加盟国間での緊張が高まり続けていることを明らかにした。昔農は、ケルンを中心に聞き取りを行い、同市で起こった「難民」の婦女暴行事件が関係機関や市民にどのような影響を与え、世論空間の変動を生み出したかを調査した。秦泉寺は、地中海ランペドゥーサ島における難民収容施設をはじめとする関係機関を訪問し、また島の居住者への聞き取りを通じて、島自体の観光地化と難民漂着の増加という矛盾した状況を作る社会的緊張を分析した。宣は、韓国安山地区の自治体、雇用安定センター、支援団体を中心に聞き取りを行い、特例雇用許可制度の形がい化や多文化政策と住民の疎隔について確認した。恵羅は、ホーチミン市で建設労働を中心とする人材送り出し機関を訪問し、3月には、上林とともにハノイ市において実習生訓練機関を視察し、その運営について調査する中で高度人材資格の利用が拡大している趨勢を発見し、その変化を分析した。鈴木は、人口減少の進行する山陰地方における移民定住化のための就労と住宅についての施策の現状を島根・広島県で調査した。2017年度の調査はおおむね良好に進捗した。アメリカ合衆国の調査においては、短期間のうちに支援団体や関係諸機関だけでなく、通常接触することが困難な多数の非正規移民本人やその家族に直接聞き取りが可能となり、厳しい政治環境下にもかかわらず用意した質問事項への回答を得ることができた。ドイツにおける難民政策においても、現在日本国内ではケルン事件への関心が低下している中、接近の難しい住民へのインタビューも含めて実現できたことは極めて意義があったと考える。イタリア・ランペドゥーサ島での現地調査も、現地の多くの漂着箇所や難民犠牲者の記念物を視察しつつ生の声を拾い上げることで、漂流の映像化されたイメージのみに照準した議論を超えるその後の受け入れの実情への接近を可能にした。また、韓国調査では、ソウルの南西の工業都市安山の諸組織からの情報により、職場の間の異動と定着性の低さが課題として浮き上がってきた。一方、日本に関連する調査では、ベトナムにまで足を延ばし、オリンピック・ブーム下の建設現場の背後にある、日本側業者により設立された訓練施設の機能を実際に確認できた。
腎臓再生における慢性腎不全患者由来iPS細胞の有用性の検証

慢性腎臓病(Chronic kidney disease, CKD)に対する根本的な治療法は存在しない。唯一の治療方法は腎移植であるが、ドナーが不足しており、根本的な解決法には現時点ではなりえない。加えて、移植後には生涯にわたる免疫抑制剤の内服が必要となるため、移植後に健常人と同等のQOLを保つことができるとは言い難い。患者幹細胞から腎臓を再生することで、ドナー不足、拒絶反応の問題を解決することができると考えており、腎臓再生におけるCKD患者由来幹細胞の有用性の検証を行うことを本研究の目的とする。慢性腎臓病(Chronic kidney disease, CKD)に対する新規治療法として腎臓再生療法が注目を集めている.特にinduced pluripotent stem cells (iPS細胞)はCKD患者自身から樹立可能であり,患者由来の腎臓再生を可能にする.CKDの主な原因は糖尿病や腎炎などの後天的疾患であり.これらの疾患によるCKD患者が腎臓再生療法の主たるターゲットとなる.本研究では「後天的疾患によりCKDに至った患者由来のiPS細胞」と「健常者由来iPS細胞」の,ネフロン前駆細胞への分化能ならびにネフロン前駆細胞の機能の比較を行い,腎臓再生におけるCKD患者由iPS細胞の有用性を検証する.その有用性が示されれば,申請者らが開発した「ネフロン前駆細胞を用いた腎臓再生法」および「再生腎臓から尿を排泄する方法」と組み合わせることで、CKD患者のiPS細胞から尿排泄能を持った腎臓を再生することができると考える.現在3名の血液透析をうけている患者由来iPS細胞の樹立ならびに,ネフロン前駆細胞,ネフロンへの分化誘導に成功した.3名の健常者由来iPS細胞と比較し,ネフロン前駆細胞,ネフロンへの分化誘導効率が同等であることを示した.透析患者,健常者iPS細胞由来ネフロン前駆細胞,ネフロンの遺伝子発現量の比較,ネフロンに含まれる糸球体の血管誘導能を比較した結果,両群間で明らかな差がないことを示した.この結果は,血液透析患者由来iPS細胞が腎臓再生の有用なツールとなることを示すものである.血液透析患者由来iPS細胞の樹立効率ならびにネフロン前駆細胞・ネフロンへの分化誘導効率は健常者と同等であり,研究はおおむね順調に進展している.透析に至っていない保存期腎不全患者由来iPS細胞の樹立を目指す.我々のネフロン前駆細胞除去モデルに実際に健常者ならびに透析患者iPS細胞由来ネフロン前駆細胞の移植を行い,解析を行う.慢性腎臓病(Chronic kidney disease, CKD)に対する根本的な治療法は存在しない。慢性腎臓病(Chronic kidney disease, CKD)に対する新規治療法として腎臓再生療法が注目を集めている.特にinduced pluripotent stem cells (iPS細胞)はCKD患者自身から樹立可能であり,患者由来の腎臓再生を可能にする.CKDの主な原因は糖尿病や腎炎などの後天的疾患であり.これらの疾患によるCKD患者が腎臓再生療法の主たるターゲットとなる.本研究では「後天的疾患によりCKDに至った患者由来のiPS細胞」と「健常者由来iPS細胞」の,ネフロン前駆細胞への分化能ならびにネフロン前駆細胞の機能の比較を行い,腎臓再生におけるCKD患者由iPS細胞の有用性を検証する.その有用性が示されれば,申請者らが開発した「ネフロン前駆細胞を用いた腎臓再生法」および「再生腎臓から尿を排泄する方法」と組み合わせることで、CKD患者のiPS細胞から尿排泄能を持った腎臓を再生することができると考える.現在3名の血液透析をうけている患者由来iPS細胞の樹立ならびに,ネフロン前駆細胞,ネフロンへの分化誘導に成功した.3名の健常者由来iPS細胞と比較し,ネフロン前駆細胞,ネフロンへの分化誘導効率が同等であることを示した.透析患者,健常者iPS細胞由来ネフロン前駆細胞,ネフロンの遺伝子発現量の比較,ネフロンに含まれる糸球体の血管誘導能を比較した結果,両群間で明らかな差がないことを示した.この結果は,血液透析患者由来iPS細胞が腎臓再生の有用なツールとなることを示すものである.血液透析患者由来iPS細胞の樹立効率ならびにネフロン前駆細胞・ネフロンへの分化誘導効率は健常者と同等であり,研究はおおむね順調に進展している.透析に至っていない保存期腎不全患者由来iPS細胞の樹立を目指す.我々のネフロン前駆細胞除去モデルに実際に健常者ならびに透析患者iPS細胞由来ネフロン前駆細胞の移植を行い,解析を行う.
温度生物学を基盤とした新規神経治療パラダイムの創成

非焦点部位の脳冷却でてんかん発作を抑制することで、冷却がてんかん波の発生だけでなく伝搬も抑制できるかを調べた。雄SDラットの腹腔内にビククリンメチオダイドを投与し、焦点不明、または多焦点と考えられるモデルを作成した。発作出現後、脳表温度を15、10、5°Cとし、10分間持続した。スパイク回数は15、10、5°Cではそれぞれ有意に減少した。スパイク数の減少は非冷却側でも観察された。ただし発作が完全に抑制された期間は冷却した10分間のうち、15、10、5°Cでそれぞれ4.1分、4.3分、5.9分だった。以上から、非焦点部位に行う局所脳冷却での十分な発作抑制は5°Cで得られ、焦点部位の冷却で効果が現れる15°Cよりも強度の冷却が必要であることが判明した。神経細胞の活動電位に与える冷却の影響を調べた。てんかん患者の側頭葉からの標本を25°C、15°C、35°Cに調整し、脱分極頻度を測定した。電流刺激を強めるに従い、35°Cと25°Cとでは脱分極の頻度が増加したが、15°Cでは電流刺激を強めても脱分極頻度が上昇しなかった。スパイク幅が25°Cでは1.85 ms、15°Cでは6.55 msへと有意に広くなっていたことから、冷却によって再分極が遅延したことが分かった。皮質焦点型てんかんモデルを作製し、TRPM8およびTRPA1作動薬であるイシリン(0.3, 1.0, 3.0 mM)を投与した。イシリンは用量依存的にてんかん様異常脳波を抑制した。特に,3 mMのイシリン投与はPG誘発性てんかん様異常脳波のスパイク振幅、持続時間、発火頻度をいずれも抑制した。これらのイシリンの抑制効果はTRPM8拮抗薬であるAMTB投与によって消失した。以上により温度感受性TRP channel制御による抗てんかん作用を検出することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。脳温による脳損傷の差をマウスの頭部外傷モデルで調べた。脳表をペルチェ装置で25、30、35、37、40°Cで3時間冷却または加温し1週間後に脳挫傷体積を測定した。挫傷サイズは温度依存性に増大し、25°Cと40°C、30°Cと40°Cの間でそれぞれ有意差が認められた。Microgliaの活性化率は40°C>35°C>30°Cの順であった。脳冷却が脳保護効果を示すことが、頭部外傷モデルで再現された。TRPKOマウスでの脳損傷縮小効果をWild typeマウスおよび2種のTRPノックアウトマウス(TRPM2 KO、TRPV4 KO)で調べた。頭部外傷モデルを作成し脳表温度は35°Cにした。1週間後に固定し脳挫傷体積を測定した。脳挫傷領域はTRPM2 KOマウス、TRPV4 KOマウスともwild typeマウスよりも有意に小さい体積を示した。TRPM2、TRPV4の作動温度はそれぞれ33ー48°C、30ー47°Cであり、その温度帯でCa2+が細胞内に流入し、神経活動が亢進する。従ってこれらのKOマウスは脳温度が33°C以下、30°C以下に調節されたWild typeマウスに相当する。両KOマウスにおいて脳保護効果が見られたことは、TRPM2、TRPV4の阻害剤が脳冷却療法の代替療法になる可能性が示唆された。脳切片を用いて神経細胞活動電位の温度による変化を調べた。てんかん2症例の側頭葉皮質から標本を摘出し神経細胞の静止膜電位と脱分極頻度を測定した。測定中、チャンバー温度を25°C、15°C、25°Cと変化させた。25°Cでのヒト神経細胞の静止膜電位は-75.0-67.5mVであった。15°Cで静止膜電位は-60.0-56.0mVとなり、より脱分極しやすい状態に変化した。最大脱分極回数は冷却前の平均5.5回から冷却中は1.0回に減少した。冷却によって神経細胞の脱分極頻度が減少することが確認された。脳温による脳損傷の差をマウスの頭部外傷モデルで調べることができ、脳冷却が脳保護効果を示すことが、頭部外傷モデルで再現された。効果は温度依存性であり、30°C以下では効果がプラトーになる可能性が示唆された。効果に変曲点があることは、TRPの影響があることを示唆する好ましい初見と考えている。同様にTRPKOマウスでの脳損傷縮小効果をWild typeマウスおよび2種のTRPノックアウトマウス(TRPM2 KO、TRPV4 KO)で調べることができた。脳挫傷領域はTRPM2 KOマウス、TRPV4 KOマウスともwild typeマウスよりも有意に小さい体積を示したことからTRPM2、TRPV4の阻害剤が脳冷却療法の代替療法になる可能性が示唆された。脳切片を用いて神経細胞活動電位の温度による変化を、てんかん2症例の側頭葉皮質から標本を摘出し調べることができた。神経細胞の静止膜電位と脱分極頻度が測定でき、冷却によって神経細胞の脱分極頻度が減少することが確認された。

以上は当初の計画と一部異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。脳が低温になるとてんかん発作が止まること、高熱でてんかん発作が起こることが知られている。この理由を調べることが本年度の目的である。ヒトおよびラットの皮質神経細胞の活動電位における温度の影響を調べた。皮質スライスは3例の内側側頭葉てんかんの正常の外側皮質、1例の髄膜腫の正常の外側皮質、および3例の皮質形成異常症I型(FCD type I)の病変部皮質であった。全例抗てんかん剤としてNaチャネルブロッカーを内服していた。てんかん手術中に直径10mm、厚さ8mmの切片を切り出し、カレントクランプ法を行った。測定中の室温25°Cを正常温とし、15°Cの冷却状態および35°Cの高温状態でも測定を行った。15°Cでは静止膜電位が高くなり、閾値は変わらなかった。これにより初回の脱分極は起こりやすくなったが、再分極に時間がかかるようになったためスパイク幅が広がり、単位時間当たりのスパイク数は減少した。スパイク頻度は与える電流量を増加させても変わらなかった。35°Cでは静止膜電位は変わらず、閾値が上昇した。これによって初回の脱分極は起こりにくくなったが、再分極の時間はかからなくなったためスパイク幅が狭くなり、単位時間当たりのスパイク数は、与える電流量の増加とともに増加した。これらの変化は正常皮質とFCDとで同じであった。また正常ラットの脳切片で同様の実験を行い、同様の結果を得た。冷却による静止膜電位の上昇は細胞膜ナトリウムポンプのエネルギー不足によるものと推測される。これは高温時には発生しない現象である。冷却時の再分極の遅延は多種あるカリウムチャネルの機能不全と推測している。ただし原因となるカリウムチャネルは同定できていない。脳冷却によっててんかん発作が止まる機序として、脳代謝、血流、神経伝達物質など、神経細胞周囲で生じている変化はこれまで調べてきたが、今年度得られた結果によって神経細胞への効果が解明された。これは3年間の研究計画の柱ともいえる最も大きな部分が達成されたことを表す。さらに、高温によって発作が生じる場合と発作が抑制される場合の、相反する2つの現象が起こることの原因の一つも示すことができた。これは当初の研究計画にはなかったことである。現在論文を投稿し、査読結果を待っている段階である。一方TRPに関する研究は本年度は進まなかった。以上が本研究をおおむね順調に進展していると自己評価した理由である。非焦点部位の脳冷却でてんかん発作を抑制することで、冷却がてんかん波の発生だけでなく伝搬も抑制できるかを調べた。雄SDラットの腹腔内にビククリンメチオダイドを投与し、焦点不明、または多焦点と考えられるモデルを作成した。発作出現後、脳表温度を15、10、5°Cとし、10分間持続した。スパイク回数は15、10、5°Cではそれぞれ有意に減少した。スパイク数の減少は非冷却側でも観察された。ただし発作が完全に抑制された期間は冷却した10分間のうち、15、10、5°Cでそれぞれ4.1分、4.3分、5.9分だった。以上から、非焦点部位に行う局所脳冷却での十分な発作抑制は5°Cで得られ、焦点部位の冷却で効果が現れる15°Cよりも強度の冷却が必要であることが判明した。神経細胞の活動電位に与える冷却の影響を調べた。てんかん患者の側頭葉からの標本を25°C、15°C、35°Cに調整し、脱分極頻度を測定した。電流刺激を強めるに従い、35°Cと25°Cとでは脱分極の頻度が増加したが、15°Cでは電流刺激を強めても脱分極頻度が上昇しなかった。
虚血性神経疾患に伴うミクログリア機能亢進と神経細胞死～ｐＨ感知性受容体の役割

脳梗塞の原因となる脳虚血では低酸素と弱酸性化が伴うことが知られている。また、脳虚血後の病態制御にはミクログリアや炎症性サイトカインの関与が示唆されている。脳神経系の細胞にもプロトン感知性のOGR1ファミリーGタンパク質共役受容体(OGR1、GPR4、TDAG8、pH 8.06.0)が発現しているが、それらの役割は依然不明である。本課題の成果として、ミクログリアにおけるTDAG8の抗炎症性作用と神経系の株細胞におけるOGR1の神経型NOS /cGMP蓄積など機能制御が推測された。このように、脳虚血時のプロトン感知性受容体を介した新しい調節機構が予想され、創薬の可能性が考えられた。中枢神経系のpH変化は神経機能に重篤な影響を及ぼすと考えられるが、そのメカニズムは依然不明である。本研究では、中枢での酸性ストレスに対するプロトン感知性(pH 7.66.0)G蛋白共役型受容体の役割を探索する。また、プロトン感知性受容体が脳虚血や梗塞と関連したミクログリアの活性化に関与しているのか、神経の細胞死や神経機能にどのような影響を与えるのか明らかにするため、プロトン感知性受容体欠損マウスから調整した細胞を用いて検討している。平成25年度では、前年度で未解決の前脳虚血モデルを用いた解析を継続した。さらに、脳虚血や梗塞と関連したミクログリアの活性制御にプロトン感知性受容体であるTDAG8が関与するのか調べるため、細胞外pH低下に伴うミクログリアの炎症性サイトカイン産生制御を解析した。(1)両側総頚動脈の狭窄を施したマウス大脳の炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1β)の発現を解析したところ、野生型マウスに比べTDAG8欠損マウスにおける発現が高い傾向であった。このように、TDAG8は中枢神経系の炎症性サイトカイン産生制御において抑制的に関与していると考えられる。(2)LPS存在下でミクログリアを弱酸性処理すると細胞外へのIL-1β産生抑制が観察される。この応答の一部はTDAG8欠損で回復した。また、細胞外pH低下には、細胞内cAMPの蓄積が伴っており、TDAG8遺伝子の欠損したミクログリアの場合、細胞外pHによる細胞内cAMPの蓄積はほぼ消失していた。PKAやMAPKに対する特異的阻害剤を用いた実験から、細胞外酸性pHによる抑制作用の一部にTDAG8/アデニル酸シクラーゼ/cAMP/プロテインキナーゼA系を介するMAPK活性制御機構の関与が示唆された。このように、弱酸性pHは中枢神経系で抗炎症性の保護作用として機能しているかもしれない。本研究では、中枢での酸性ストレスに対するプロトン感知性(pH 7.66.0)のG蛋白共役型受容体(GPCR)の役割を探索する。また、プロトン感知性受容体が脳虚血や梗塞と関連したミクログリアの活性化に関与しているのか、神経の細胞死や神経機能にどのような影響を与えるのか明らかにするため、プロトン感知性受容体欠損マウスから調整した細胞を用いて解析している。本年度では、主に個体レベルでの解析を中心に酸性ストレスに対するプロトン感知性GPCRの役割を探索した。(1)RT-qPCRで前脳組織におけるプロトン感知性GPCRサブタイプを調べ、OGR1、GPR4とTDAG8の発現を確認した。また、前脳虚血手術を施した後、TUNEL染色にて神経細胞の細胞死や細胞特異的なマーカーにて染色を行いミクログリアの活性化を検出する条件決めを行った。今後、炎症性サイトカインの発現解析と合わせて生体におけるプロトン感知性GPCRの役割を明らかにする。(2)インビボ実験と平行してマウスのミクログリアを調整して細胞外酸性pH応答の作用を調べたところ、酸性pHはLPSによる炎症性サイトカイン(IL-1β)産生を抑制した。一方、N1E115神経細胞において酸性pHによるカルシウム動員や細胞生存活性能の亢進を観察した。今後、これらのメカニズムを解析することによって、プロトン感知性GPCRサブタイプの役割を明らかにする。本研究では、中枢での酸性ストレスに対するプロトン感知性(pH 7.66.0)のG蛋白共役型受容体の役割を探索する。神経細胞の生体膜上で微妙なpHの調節が行われることが示唆されており、細胞外pH低下による神経細胞の機能制御機構が予想された。そこで、平成26年度では、プロトン感知性受容体が脳虚血や梗塞と関連した神経細胞の制御に関与しているのか調べるため、神経細胞に及ぼす細胞外pH低下による直接的な影響とその細胞内シグナル機構の解析を試みた。マウス胎仔の大脳皮質から調製した神経細胞にはプロトン感知性受容体(OGR1、GPR4)が発現していた。発現プロファイルが似ている神経腫細胞株を用いた解析から、細胞外pH低下による神経細胞の機能発現として細胞内Ca2+動員や神経型一酸化窒素合成酵素の活性化が観察された。

受容体分子のsiRNAを用いた結果、これら応答にプロトン感知性受容体の関与が示唆された。このようなプロトン感知性受容体を介する作用が神経細胞の機能調節に関わっていると推測された。一方、マウス胎仔の神経細胞を用いて細胞内Ca2+動員や細胞安定性に対する細胞外pH低下による影響を調べた。今後、この応答の一部にプロトン感知性受容体が関与しているか解析する。中枢神経系のpH変化は神経機能に重篤な影響を及ぼすと考えられるが、そのメカニズムは依然不明である。本研究では、中枢での酸性ストレスに対するプロトン感知性(pH 7.66.0)のG蛋白共役型受容体の役割を探索している。そこで、プロトン感知性受容体が脳虚血や梗塞と関連したミクログリアの活性化に関与しているのか、神経の細胞死や神経機能にどのような影響を与えるのか明らかにするため、プロトン感知性受容体欠損マウスを用いて検討してきた。平成27年度では、期間延長によりミクログリアや神経細胞のプロトン感知性受容体を介したpH低下作用を以下のように解析した。(1)プロトン感知性受容体が脳虚血と関連した神経細胞の制御に関与しているのか、これら分子の欠損マウスの脳虚血実験からプロトン感知性受容体は中枢神経系の炎症性サイトカイン産生制御において抑制的に関与していると推測された。このように、虚血に伴うpH低下が梗塞の拡大に影響を与えていると考えられた。(2)神経細胞の生体膜上で微妙なpHの調節が行われることが示唆されており、細胞外pH低下による神経細胞の機能制御機構が予想された。実際、神経腫細胞株では神経細胞の機能発現として細胞内Ca2+動員や神経型一酸化窒素合成酵素の活性化が観察された。一方、プロトン感知性受容体欠損マウスから調整した神経細胞を用いて酸性ストレスの影響を解析し、低pHによる細胞ダメージや細胞内Ca2+動員シグナルの変動にプロトン感知性受容体の関与が予想された。脳梗塞の原因となる脳虚血では低酸素と弱酸性化が伴うことが知られている。また、脳虚血後の病態制御にはミクログリアや炎症性サイトカインの関与が示唆されている。脳神経系の細胞にもプロトン感知性のOGR1ファミリーGタンパク質共役受容体(OGR1、GPR4、TDAG8、pH 8.06.0)が発現しているが、それらの役割は依然不明である。本課題の成果として、ミクログリアにおけるTDAG8の抗炎症性作用と神経系の株細胞におけるOGR1の神経型NOS /cGMP蓄積など機能制御が推測された。このように、脳虚血時のプロトン感知性受容体を介した新しい調節機構が予想され、創薬の可能性が考えられた。平成24、25年度では、酸性ストレスに対するプロトン感知性受容体の役割を個体レベルでの解析を中心に探索してきた。前脳虚血手術を施した後、RT-qPCRで前脳組織におけるミクログリアの活性化を解析したところ、炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1β)の発現が野生型マウスに比べTDAG8(プロトン感知性受容体)欠損マウスにおける発現が高い傾向であった。また、平成25年度では、LPS存在下でミクログリアを弱酸性処理するとTDAG8を介した細胞外へのIL-1β産生抑制が観察された。このように、中枢神経系ではTDAG8を介した抗炎症性の保護作用が機能しているかもしれない。
接触型線集束探触子による超音波探傷の高精度化

本研究では,構造部材の非破壊評価法の一つである超音波探傷法の精度・効率の向上を図るために,従来にない構造・特性を有する接触型線集束探触子を開発し,その高性能化を図るとともに,この探触子を利用した新しい超音波探傷法を確立することを目的とした.開発した探触子は,従来の探触子に比べて,薄板のLamb波,コーティング層の一般化Lamb波,バルク材の円筒面波,およびバルク材のRayleigh波などが容易に励起・検出できるという特徴を有する.本研究の結果,次に示す成果を得た.1.接触型線集束探触子の試作・改良を行い,超音波振動子の材質を従来の圧電高分子から圧電セラミックス,さらには圧電コンポジット材料に変更することにより,探触子の感度を格段に向上させた.2.開発した探触子を用いて,TOFD法によるき裂の非破壊評価に関する実験を行い,従来に比べてより小さなき裂の検出および寸法評価が可能であることを確認した.3.縦波型の探触子に加えてSH波型の探触子を試作し,その可能性を検討した.本研究では,構造部材の非破壊評価法の一つである超音波探傷法の精度・効率の向上を図るために,従来にない構造・特性を有する接触型線集束探触子を開発し,その高性能化を図るとともに,この探触子を利用した新しい超音波探傷法を確立することを目的とした.開発した探触子は,従来の探触子に比べて,薄板のLamb波,コーティング層の一般化Lamb波,バルク材の円筒面波,およびバルク材のRayleigh波などが容易に励起・検出できるという特徴を有する.本研究の結果,次に示す成果を得た.1.接触型線集束探触子の試作・改良を行い,超音波振動子の材質を従来の圧電高分子から圧電セラミックス,さらには圧電コンポジット材料に変更することにより,探触子の感度を格段に向上させた.2.開発した探触子を用いて,TOFD法によるき裂の非破壊評価に関する実験を行い,従来に比べてより小さなき裂の検出および寸法評価が可能であることを確認した.3.縦波型の探触子に加えてSH波型の探触子を試作し,その可能性を検討した.本研究では,構造部材の非破壊評価法の一つである超音波探傷法の精度・効率の向上を図るために,従来にない構造・特性を有する接触型線集束探触子を開発し,その高性能化を図るとともに,この探触子を利用した新しい超音波探傷法を確立することを目的とした.開発した探触子は,従来の探触子に比べて,薄板のLamb波,コーティング層の一般化Lamb波,バルク材の円筒面波,およびバルク材のRayleigh波などが容易に励起・検出できるという特徴を有する.本年度の研究の結果,次に示す成果を得た.1.前年度までの研究成果を踏まえ,超音波伝播解析専用のソフトウェアによるシミュレーションを行って,探触子の高性能化を図るための指針を得た.2.接触型線集束探触子の改良・試作を繰り返し,超音波振動子の材質を従来の圧電高分子から圧電セラミックス,さらには圧電コンポジット材料に変更することにより,探触子の感度を飛躍的に向上させた.3.前項の改良型探触子を用いて,TOFD法によるき裂の非破壊評価に関する実験を行い,従来に比べてより小さなき裂の検出および寸法評価が可能であることを確認した.4.炭素繊維複合材料製の薄板に対してLamb波の励起・検出を行う実験を行い,改良型探触子によって,より高強度の超音波が送受信可能であることを確認した.なお,以上の成果の一部は,東京ビッグサイトにて開催された「非破壊評価総合展2005」で公表した.今後は,応力腐食割れ等の実損傷部材を対象として,開発・改良した探触子の性能を市販の各種探触子と比較して詳細に評価するとともに,国際会議等において成果を公表する予定である.本研究では,構造部材の非破壊評価法の一つである超音波探傷法の精度・効率の向上を図るために,従来にない構造・特性を有する接触型線集束探触子を開発し,その高性能化を図るとともに,この探触子を利用した新しい超音波探傷法を確立することを目的とした.開発した探触子は,従来の探触子に比べて,薄板のLamb波,コーティング層の一般化Lamb波,バルク材の円筒面波,およびバルク材のRayleigh波などが容易に励起・検出できるという特徴を有する.本研究の結果,次に示す成果を得た.1.接触型線集束探触子の改良・試作を繰り返し,超音波振動子の材質を従来の圧電高分子から圧電セラミックス,さらには圧電コンポジット材料に変更することにより,探触子の感度を格段に向上させた.2.開発した探触子を用いて,TOFD法によるき裂の非破壊評価に関する実験を行い,従来に比べてより小さなき裂の検出および寸法評価が可能であることを確認した.3.縦波型の探触子に加えて新たにSH波型の探触子を試作し,その指向性を詳細に調べるとともに,SH波を用いたTOFD法によるき裂の非破壊評価の可能性を検討した.
最短経路問題を解く自己安定アルゴリズム

従来の計算幾何学の分野で扱われている最短経路問題では,出発地点と目的地点が1対1もしくは1対多である場合が多い.また,一般的には、障害物などの状況はアルゴリズムを実行中は変化しないと仮定され,動的に変化する状況を仮定したアルゴリズムの研究は,ほとんど行なわれていない.しかし,刻一刻と道路の状況,天候,事故情報などが変化する自動車会社における交通網に,従来の最短経路を求めるアルゴリズムを当てはめようとすると1.求めたい出発地点と目的地点の組合せが,多対多であるために複数の同じプログラムを同時に実行しなければならない.そのため他のプログラムの計算結果を利用することができない.2.最短経路を求めている間に道路状況が変化すると,せっかく求めた解が意味をもたなくなる.などの問題が生じる.そこで,本研究では,このような問題を解決するために分散アルゴリズムの1分野である自己安定(self-stabilizing)分散アルゴリズムの考え方を計算幾何学の分野に導入することとした.自己安定分散アルゴリズムは,状況が変化しても十分に時間がたてば解が求まるのが特徴である.つまり,状況が変化するまでの時間よりも解の収束が速ければ,最短経路を常に求めることができる.しかし,自己安定アルゴリズムを利用するにあたり,次のような問題点が明らかになった.1.自己安定アルゴリズムは,いつ解が収束したのか判定が難しい.2.解の収束が遅く,たとえ自己安定アルゴリズムが開発されても,現実社会では利用しにくい.今後は,自己安定アルゴリズムより収束が速い実時間システムと呼ばれる手法の導入を考えている.従来の計算幾何学の分野で扱われている最短経路問題では,出発地点と目的地点が1対1もしくは1対多である場合が多い.また,一般的には、障害物などの状況はアルゴリズムを実行中は変化しないと仮定され,動的に変化する状況を仮定したアルゴリズムの研究は,ほとんど行なわれていない.しかし,刻一刻と道路の状況,天候,事故情報などが変化する自動車会社における交通網に,従来の最短経路を求めるアルゴリズムを当てはめようとすると1.求めたい出発地点と目的地点の組合せが,多対多であるために複数の同じプログラムを同時に実行しなければならない.そのため他のプログラムの計算結果を利用することができない.2.最短経路を求めている間に道路状況が変化すると,せっかく求めた解が意味をもたなくなる.などの問題が生じる.そこで,本研究では,このような問題を解決するために分散アルゴリズムの1分野である自己安定(self-stabilizing)分散アルゴリズムの考え方を計算幾何学の分野に導入することとした.自己安定分散アルゴリズムは,状況が変化しても十分に時間がたてば解が求まるのが特徴である.つまり,状況が変化するまでの時間よりも解の収束が速ければ,最短経路を常に求めることができる.しかし,自己安定アルゴリズムを利用するにあたり,次のような問題点が明らかになった.1.自己安定アルゴリズムは,いつ解が収束したのか判定が難しい.2.解の収束が遅く,たとえ自己安定アルゴリズムが開発されても,現実社会では利用しにくい.今後は,自己安定アルゴリズムより収束が速い実時間システムと呼ばれる手法の導入を考えている.
シェーグレン症候群でのM3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体に対する免疫応答

シェーグレン症候群(SS)におけるM3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体(M3R)に対する自己免疫応答の病態的意義を明らかにするため2)SS患者におけるM3R反応性T細胞の検出を行った。1)疾患コントロールとして、関節リウマチ(RA)21例、全身性エリテマトーデス(SLE)21例、原発性胆汁性肝硬変(PBC)84例、後天性無汗症12例の血清を用いて、M3R合成ペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)を抗原としたELISAにより、抗M3R抗体を測定した。N末端に対する抗M3R抗体は、RAで42.9%、SLE28.6%、PBC90.5%、後天性無汗症16.7%の陽性率であった。第1細胞外ループは、それぞれ、33.3%、28.6%、72.6%、0%の陽性率であった。第2細胞外ループは、33.3%、57.1%、76.2%、0%の陽性率であった。第3細胞外ループは、33.3%、28.6%、69.0%、0%の陽性率であった。2)SS3例、健常人3例のPBMCを単離し、M3R混合ペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)で刺激し、IFNγMACS cytokine secretion assayを用いて、IFNγ産生CD4陽性T細胞を検出した。SS患者のうち、1例では、M3R混合ペプチドに対して特異的にIFNγを産生するCD4陽性T細胞が検出された。一方健常人では検出されなかった。以上より抗M3R抗体のSSにおける疾患特異性は示せなかった。SS患者でM3R反応性T細胞の存在が明らかとなった。【目的】シェーグレン症候群(SS)において、近年注目されている自己抗原であるM3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体(M3R)に対するT細胞免疫応答を明らかにする。【結果】HCでは、M3R混合ペプチドに対して特異的にIFNγを産生するCD4陽性T細胞は検出されなかった。一方、3例のSS患者のうち、1例では、M3R混合ペプチドに対して特異的にIFNγを産生するCD4陽性T細胞が検出された。【結論】3例中1例のSS患者PBMC中に、M3R反応性T細胞が検出された。【目的】シェーグレン症候群(SS)において、近年注目されている自己抗原であるM3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体(M3R)に対する免疫応答を明らかにする。1)抗M3R抗体SSの疾患特異性を明らかにする。2)M3R反応性T細胞SS患者の末梢血中において、M3R反応性T細胞の存在を明らかにする。【方法】1)抗M3R抗体疾患コントロールとして、関節リウマチ(RA)21例、全身性エリテマトーデス(SLE)21例、原発性胆汁性肝硬変(PBC)84例、後天性無汗症12例の血清を用いて、M3R合成ペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)を抗原としたELISAにより、抗M3R抗体を測定した。2)M3R反応性T細胞抗M3R抗体陽性SS患者のうち、PBMCの採取が可能な患者を抽出した。【結果】

1)抗M3R抗体N末端に対する抗M3R抗体は、RAで42.9%(9/21例)、SLE28.6%(6/21例)、PBC90.5%(76/84例)、後天性無汗症16.7%(2/12例)の陽性率であった。第1細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3%(7/21例)、28.6%(6/21例)、72.6%(61/84例)、0%(0/12例)の陽性率であった。第2細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3%(7/21例)、57.1%(11/21例)、76.2%(64/84例)、0%(0/12例)の陽性率であった。第3細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3%(7/21例)、28.6%(6/21例)、69.0%(58/84例)、0%(0/12例)の陽性率であった。2)M3R反応性T細胞3例のSSが抽出された。【結論】RA、SLE、PBCにおいても抗M3R抗体が検出され、特にPBCでは高い陽性率であった。一方で後天性無汗症では抗M3R抗体は検出されなかった。抗M3R抗体の疾患特異性の検討については、順調に疾患コントロールの血清採取が進み、抗M3R抗体の測定を行うことができた。一方で、抗M3R抗体の機能解析に関しては、次年度での検討が必要である。また、より多数例のSSで抗M3R抗体を測定し、抗体の有無と臨床像との関連の解析を進める。また、M3R反応性T細胞の解析に関しては、現時点では解析対象SS患者の抽出と、PBMCからIFNγおよびIL-17産生細胞をMACS cytokine secretion assayを用いて検出・分離する系の条件設定の段階である。次年度SS患者PBMC中のM3R反応性T細胞を単離し、TCRのレパトア解析、CDR3領域のsequenceを行い、クローナリティーの解析を行う予定である。1)抗M3R抗体多数例のSSで抗M3R抗体をM3R合成ペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)を抗原としたELISAで測定し、抗体の有無と臨床像(唾液・涙液分泌、角結膜障害、M3Rアゴニストに対する反応性)との関連を解析する。また、ヒト唾液腺(HSG)細胞株を抗M3R抗体陽性および陰性SS、健常人のIgGと共培養し、HSG細胞株表面のM3R発現を免疫蛍光法・Western Blot法で比較する。2)M3R反応性T細胞抗M3R抗体陽性および陰性SS患者のPBMCをM3R合成ペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)で刺激し、M3Rに反応してIFNγおよびIL-17を産生するM3R反応性T細胞をMACS cytokine secretion assay(IFNγ、IL-17)を用いて単離し、TCRのレパトア解析、CDR3領域のsequenceを行い、クローナリティーの解析を行う。ELISAの抗原、PBMCの刺激抗原として用いるM3Rペプチド(N末端、第1・2・3細胞外ループ)を、それぞれ10mg合成する。また、MACS cytokine secretion assay(IFNγ、IL-17)に必要なキット、細胞分離に必要なMACSカラムを購入する予定である。
遺伝子改変オルガノイドを用いたドライバー変異による正常胃粘膜の初期変化の解析

進行胃癌のうち低分化腺癌は未だ予後不良の疾患であり、新規診断マーカー・治療標的の同定が急務となっている。本研究の目的は、RHOA、CDH1の変異により特異的に発現が誘導される遺伝子を同定し、胃癌の病態解明を通して新規診断マーカー・治療開発に資することである。本年度は胃癌細胞株を材料にスフェロイドを作成し、胃癌の癌幹細胞関連遺伝子の同定を行った。スフェロイドは幹細胞を含むことが知られており、幹細胞の研究にしばしば用いられる。細胞が接着した状態と比較し、スフェロイドを形成した状態では、QPRT、CST2、ANKRD45遺伝子が特に発現が上昇していた。胃癌組織を材料に定量的RT-PCRで遺伝子発現を測定した結果、QPRTは80%、CST2は40%、ANKRD45は20%の胃癌組織で高発現していた。QPRT遺伝子は、quinolinate phosphoribosyltransferaseをコードする遺伝子であり、トリプトファンからのNADの合成に関わる分子である。癌における文献を検索すると、甲状腺濾胞腺腫と癌との鑑別に有効であったとの報告があるが、消化管癌を含むその他の悪性腫瘍における報告は認められない。そこで胃癌組織を材料にQPRTの発現を免疫染色で解析したところ、138例中47例(34%)の症例で陽性像を認めた。臨床病理学的遺伝子との関連を解析した結果、QPRT陽性例は有意に深達度が深く、遠隔転移例が多く、またステージも進行していた。予後との関連を解析したが予後との関連はなかった。以上の結果から、QPRT遺伝子は胃癌の癌幹細胞に重要な役割を担っている可能性があり、今後は胃癌の癌幹細胞における機能解析を行う。細胞が接着した状態と比較し、スフェロイドを形成した状態では、QPRT、CST2、ANKRD45遺伝子が特に発現が上昇していることを見出した。これらの3個の遺伝子以外にも多数の癌幹細胞に関連する遺伝子を同定している。本研究の目的は胃癌の病態解明を通して新規診断マーカー・治療開発に資することである。癌幹細胞は癌細胞のもととなる細胞と考えられており、これらの遺伝子は癌の新規治診断マーカーとして有用である。さらに機能解析の結果、癌幹細胞の維持に重要な役割を有している場合、治療標的となる可能性がある。QPRTの機能解析は現在進行中であるが、癌幹細胞に関連していれば治療標的となるものであり、現在までの進歩状況としては順調といえる。今後はQPRTの機能解析を進めていくとともに、CST2、ANKRD45遺伝子の発現解析を行う。発現が胃癌において上昇していた場合、さらに機能解析を行う。機能解析の方法として、胃癌細胞株を材料にRNAiを用いてノックダウンし、細胞増殖能をMTTアッセイで、浸潤能をInvasionアッセイを用いて解析する。またスフェロイド形成能をスフェロイドフォーメーションアッセイで解析する。さらに外科的に切除された胃癌組織を材料に免疫染色で、発現・局在を解析する。発現と臨床病理学的因子、予後との関連を明らかにする。これらに加え、外科的に切除された胃癌の非癌部胃粘膜を材料にオルガノイドを作成する。非癌部胃粘膜のオルガノイドを材料に、上記遺伝子の変異をCRISPER-Cas9システムを用いて導入し、GeneChipを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。胃癌細胞株のデータと合わせて変異株で発現が上昇している遺伝子のリストを作成し、文献検索を行い細胞表面に局在する蛋白質をコードする遺伝子を抽出する。さらに変異株において発現が上昇していた細胞表面蛋白質の免疫染色を行い、変異株のオルガノイドにおいてどのような細胞が染色されてくるのかを解析し、HE染色(ヘマトキシリン・エオジン染色)上で形態学的特徴を明らかにする。

予後との関連を解析したが予後との関連はなかった。以上の結果から、QPRT遺伝子は胃癌の癌幹細胞に重要な役割を担っている可能性があり、今後は胃癌の癌幹細胞における機能解析を行う。本年度は胃癌細胞株を材料にスフェロイドを作成し、胃癌の癌幹細胞関連遺伝子の同定を行った。細胞が接着した状態と比較し、スフェロイドを形成した状態では、QPRT、CST2、ANKRD45遺伝子が特に発現が上昇していることを見出した。これらの3個の遺伝子以外にも多数の癌幹細胞に関連する遺伝子を同定している。本研究の目的は胃癌の病態解明を通して新規診断マーカー・治療開発に資することである。癌幹細胞は癌細胞のもととなる細胞と考えられており、これらの遺伝子は癌の新規治診断マーカーとして有用である。さらに機能解析の結果、癌幹細胞の維持に重要な役割を有している場合、治療標的となる可能性がある。QPRTの機能解析は現在進行中であるが、癌幹細胞に関連していれば治療標的となるものであり、現在までの進歩状況としては順調といえる。今後はQPRTの機能解析を進めていくとともに、CST2、ANKRD45遺伝子の発現解析を行う。発現が胃癌において上昇していた場合、さらに機能解析を行う。機能解析の方法として、胃癌細胞株を材料にRNAiを用いてノックダウンし、細胞増殖能をMTTアッセイで、浸潤能をInvasionアッセイを用いて解析する。またスフェロイド形成能をスフェロイドフォーメーションアッセイで解析する。さらに外科的に切除された胃癌組織を材料に免疫染色で、発現・局在を解析する。発現と臨床病理学的因子、予後との関連を明らかにする。これらに加え、外科的に切除された胃癌の非癌部胃粘膜を材料にオルガノイドを作成する。非癌部胃粘膜のオルガノイドを材料に、上記遺伝子の変異をCRISPER-Cas9システムを用いて導入し、GeneChipを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。胃癌細胞株のデータと合わせて変異株で発現が上昇している遺伝子のリストを作成し、文献検索を行い細胞表面に局在する蛋白質をコードする遺伝子を抽出する。さらに変異株において発現が上昇していた細胞表面蛋白質の免疫染色を行い、変異株のオルガノイドにおいてどのような細胞が染色されてくるのかを解析し、HE染色(ヘマトキシリン・エオジン染色)上で形態学的特徴を明らかにする。
グラフとII_1型因子環

超有限連続有限型因子環の部分因子環で、Jones指数が有限なものの構造を決定する(拡大環に於ける相対可換子環の)搭は、その主要部分が、プリンシパル・グラフと呼ばれる2色グラフになるダイアグラムにより、完全に記述される。ここでは、部分因子環の構造決定に重要な役割を果たす、エンドモルフィズムを、グラフとの関係に於いて研究した。以前の研究に於いて、エンドモルフィズムにたいする不変量として、エントロピイを定義し部分因子環の指数、及び相対エントロピイとの関係を決定した。これら3者の関係を最もきちんとした形で決定し、しかも部分因子環の構造に大きく関わるものとして、Longo-Ocneanuのキャノニカルシフトがある。しかしキャノニカルシフトは、2-シフトであって、部分因子環にたいする情報としては、ひとつ飛びの情報しか与えることが、できない。最もよく部分因子環の構造を反映するのは、キャノニカルシフトの平方根にあたるものである。指数とプリンシパルグラフ及び相対プリンシパルグラフによりキャノニカルシフトが、何時平方根を持つことが出来るかを決定し、指数が、4以下の時には、キャノニカルシフトの平方根が存在し、その平方根が、唯一であるか否かは、相対プリンシパルグラフの形から判定出来る事等を、得た。更に、因子環一部分因子環の共通な自己同型写像による同時接合積をとった後に表れる4つの因子環の相互関係を研究し、それらの関係に対するプリンシパルグラフ及び相対プリンシパルグラフと元のものとの関係を調べそれらの関係を、最も顕著に、表現する自己同型写像の特質を求め、因子環一部分因子環のプリンシパルグラフによるその特質の簡単な判別条件を得た。これらの研究の続きとして、指数RのII型の部分因子環を与えるエンドモルフィズムに対して、III型(但しr=1/R)因子環の構成することに成功した。この結果は、Jonesの予想に対する解を、与えたことなり、この仕事は、現在発展しつつある。