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上皮間葉移行は側頭骨原発扁平上皮癌の予後を決定するか

側頭骨原発扁平上皮癌において、上皮間葉移行がその骨浸潤に相関することを明らかにした。しかし上皮間葉移行は直接側頭骨扁平上皮癌の予後とは相関しなかった。また、ビメンチン、TGFβ、SnailおよびTWISTと予後の相関関係についても統計的には相関がみられないという結果を得た。これらの結果はそれぞれ単独の因子では側頭骨原発扁平上皮癌の予後を左右せず、他の因子を介して間接的に影響を及ぼしている可能性があることを示唆する。側頭骨原発扁平上皮癌における骨浸潤のメカニズムについて解析した。癌細胞はさまざまなサイトカインを産生することにより骨髄に常在する細胞の分化や機能に影響を及ぼす。そのなかにはTGFβも含まれるが、これらの因子は破骨細胞に直接作用するのではなく、まず骨芽細胞、骨髄ストローマ細胞に作用してRANKL(receptor activator of NF-κB ligand)産生を促進し、間接的に破骨細胞の分化、機能に影響することがわかっている。平成24年度は、EMTが発現していて、かつ骨浸潤巣を含む組織切片を抽出し、TGFβとRANKおよびRANKLとの関連について解析した。扁平上皮癌の骨浸潤巣を含む組織の新鮮凍結切片を材料に、網羅的にRANKおよびRANKLおよびその関連因子の遺伝子発現を解析した。RANKおよびRANKLが遺伝子発現しているかどうか確認した。確認後RANKおよびRANKLの発現パターンがTGFβと相関するかどうかを解析した。側頭骨原発扁平上皮癌の骨浸潤巣を含む手術標本を用いてRANKおよびRANKLの発現を免疫組織学的に解析した。RANK、RANKL、OPGの発現パターンがTGFβと相関するかどうかを解析した。また、(1)にて解析した遺伝子発現の結果と比較検討した。RANKおよびRANKLの発現と予後について解析した。次に術前診断にて同病期の患者を2症例抽出し、EMTが起こっている症例と起こっていない症例に分類し、それぞれの予後について解析した。CT所見をもとに病期分類しその予後をレトロスペクティブに解析した。扁平上皮がん細胞が骨細胞におよぼす影響について解析した。骨由来細胞株(A)、軟骨由来細胞株(B)、線維芽細胞由来細胞株(C)、正常上皮由来細胞株(D)、皮膚扁平上皮がん由来細胞株(E)を用い、A,B,CとD,Eの2群にわけた。A,B,Cのうち一つの細胞株とD,Eののうちの一つの細胞株をそれぞれ共培養し、その変化を検討した。1、形態学的変化、2,遊走能、3,TGFβの自己産生能、4,TGFβの添加による12の変化5,Snail,Twist,RANK/RANKLの変化を検討した。a.皮膚扁平上皮がん由来細胞株をヌードマウスの1.皮下2.外耳道(骨直上)3.耳介(軟骨上)に移植し、移植部位による違いを検討した。b.皮膚扁平上皮がん由来細胞株にTGFβ、Snail,Twistの発現ベクターを遺伝子導入したのち1.皮下2.外耳道(骨直上)3.耳介(軟骨上)に移植し、EMTの発現および骨浸潤について解析した。aと比較し、骨浸潤の速度および範囲に違いができるか検討した。EMTが誘導されている扁平上皮癌組織をもつ症例の予後が悪いことがわかれば、術前の生検組織を解析しそのEMT発現をみることにより、よりよい治療計画を立てることが可能となる。このため、術前診断にて同病期の患者を2症例抽出し、EMTが起こっている症例と起こっていない症例に分類し、それぞれの予後について解析した。側頭骨原発扁平上皮癌の手術標本において、上皮間葉移行が誘導される機構について解析した。本年度は側頭骨原発扁平上皮癌の新鮮凍結切片を用い、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に側頭骨原発扁平上皮癌患者の上皮間葉移行およびその関連因子の遺伝子発現を解析する準備を行った。また、TGFβ、Snail、TWISTと上皮間葉移行のマーカーであるビメンチンとを二重免疫染色にて解析し、それぞれの局在について解析した。そしてTGFβとビメンチンが、同じ側頭骨内扁平上皮癌組織の切片において同一部位に局在していることを明らかにした。この結果は上皮間葉移行が起きている細胞がTGFβを自己産生し、それによりさらに上皮間葉移行を促進させている可能性を示すものである。TGFβ、SnailおよびTWISTの発現と予後について解析した。ビメンチンと予後について解析をおこない、統計的には相関がみられないという結果を得ている。TGFβ、SnailおよびTWISTと予後の相関関係について解析したが、こちらも相関関係がみられていない。

これらの結果はそれぞれ単独の因子では側頭骨原発扁平上皮癌の予後を左右せず、他の因子を介して間接的に影響を及ぼしている可能性があることを示唆する。DNAマイクロアレイを用いて網羅的に側頭骨原発扁平上皮癌患者の上皮間葉移行およびその関連因子の遺伝子発現を解析する準備を行うことができた。またTGFβ、SnailおよびTWISTの発現と予後については解析がすすんだ。以上から、研究実施計画どおりとはいえないが、おおむね研究実績を残せているため。次年度も予定通り研究をすすめる。25年度には扁平上皮がん細胞が骨細胞におよぼす影響について解析する。骨由来細胞株(A)、軟骨由来細胞株(B)、線維芽細胞由来細胞株(C)、正常上皮由来細胞株(D)、皮膚扁平上皮がん由来細胞株(E)を用い、A,B,CとD,Eの2群にわける。A,B,Cのうち一つの細胞株とD,Eののうちの一つの細胞株をそれぞれ共培養し、その変化を検討する。検討内容としては、1、形態学的変化、2,遊走能、3,TGFβの自己産生能、4,TGFβの添加による12の変化5,Snail,Twist,RANK/RANKLの変化である。そして、このデータを臨床的データとの相関を統計学的に解析する。a.皮膚扁平上皮がん由来細胞株をヌードマウスの1.皮下2.外耳道(骨直上)3.耳介(軟骨上)に移植し、移植部位による違いを確認する。外耳道(骨直上)に移植したものでEMTを認めるものでは骨浸潤がすすむことが予想される。b.皮膚扁平上皮がん由来細胞株にTGFβ、Snail,Twistの発現ベクターを遺伝子導入したのち1.皮下2.外耳道(骨直上)3.耳介(軟骨上)に移植し、EMTの発現および骨浸潤について解析する。aと比較し、骨浸潤の速度および範囲に違いができるか検討する。次年度以降も予定通り研究をすすめる。24年度には、上皮間葉移行が発現していてかつ骨浸潤巣を含む組織切片を抽出し、TGFβとRANK/RANKLとの関連について解析する。平成25年度も研究をすすめるため、予定通り研究費を要する見込みである。具体的には、細胞株の購入、ヌードマウスの購入、各抗体などを購入する予定である。またその結果を学会などで発表するための旅費が必要となる見込みである。繰越金発生理由:効率的な予算執行により端数が生じたため。本年度は当該研究費により、研究のための物品の購入や結果発表のための旅行が可能となり、結果的に研究が進んだ。次年度以降も物品や研究成果発表のための旅費が必要であり、予定通りの研究費を要する見込みである。
観光施策に基づく都市建設構想と都市基盤形成の近代的展開

本研究は、近代都市計画と観光施策に基づく都市形成が急速に進んだ大正・昭和初期において、「観光」を都市戦略として掲げ、景勝地開発に取り組んだ都市を対象として、観光地形成の成立過程とそのメカニズム、都市基盤整備の具体的内容を明らかにした。具体的には、神戸背山の山地開発と風致保護の顛末、奈良・山辺の道における道の形成と観光形態の成立、堺大濱における海浜リゾート開発とその経緯について明らかにした。これにより、戦前の観光地形成における、鉄道や道路などのインフラ整備の影響、観光施策上の公園緑地の戦略的拠点性、その整備における行政や民間の各主体が果たした役割を明らかにした。本年度は、奈良「山辺の道」におけるルートの形成過程とその社会的背景、ならびに古代景観のイメージの発達とその特徴について明らかにした。具体的に明らかにした内容は以下の通りである。1「山の辺の道」の成立とその背景明治から昭和にかけての名所めぐりの実態とその観光経路を、複数の観光案内記書や紀行文、旅行雑誌、地方誌等から明らかにし、「山の辺の道」のルートの形成過程を示した。また、「山の辺の道」について初めて詳細に記述した観光案内書『山の邊の道』(1941、関西急行鉄道)の成立背景について、主に奈良県と大阪電氣軌道(関西急行鉄道)による観光施策との関連から考察し、その意図と戦略について考察した。2景観イメージの形成と景観保全施策への影響『山の邊の道』(1941、関西急行鉄道)をはじめとして、観光案内書にみる風景記述分析を通じて、風景の構成要素とイメージと、そのイメージのルーツについて考察し、「山の辺の道」の景観と、古代のイメージ・歌のイメージとの結びつけ、および景観評価の発達過程について明らかにした。また、実際の景観保全、すなわち「山の辺風致地区」(1966-68)や歴史的風土(特別)保全地区(1967-68)等の指定や、国定公園(1970)・東海自然歩道(1973)の指定および整備における、「山の辺の道」の景観上の価値づけを整理した上で、都市計画関連の決定書類(国立公文書館所蔵)や歴史的風土審議会の議事録、『大和青垣国定公園計画調査報告書』(1971)等の行政書類等をもとに、「山辺の道」の景観保全・整備をめぐる景観保全思想を明らかにした。本研究の成果の一部は、既に論文原稿を提出しており、平成25年度に発表予定である。本年度の実績は以下の通りである。・昨年度から継続して、奈良「山辺の道」の形成過程に関する研究を進め、以下の論文を発表した。1)「近代における奈良・山辺の道の形成とその背景」(山口敬太:ランドスケープ研究(オンライン論文集), Vol.6, pp.25-32, 2013)、2)「奈良・山辺の道における景観保全の展開とその保全思想」(山口敬太,繁田いづみ,川﨑雅史:ランドスケープ研究(オンライン論文集), Vol.7, pp.1-8, 2014)これらの研究を通じて、奈良「山辺の道」における戦前および戦後の景観表象の形成過程、1960年代以降の景観保全施策の展開過程と、その背後にある景観保全思想を明らかにした。・神戸の河川沿緑地の形成過程ならびに、戦前の大阪の公園道路の計画思想に関する研究を行い、以下の論文を執筆・発表した。3)「神戸市河川沿緑地の形成とその構想の起源-古宇田實の水害復興構想とその戦災復興への影響-」(山口敬太,西野康弘:都市計画論文集(一般研究論文), Vol.49, No.1, 2014(2014年4月掲載予定))、4)「戦前期大阪における公園道路の計画思想:南大阪公園道路網と桃ヶ池公園道路を中心に」(八尾修司,山口敬太,川崎雅史,土木史研究講演集Vol.33,pp.287-296,2013年)これらの研究を通じて、戦前の都市公園緑地計画の計画思想ならびに計画の実態を明らかにした。本研究は、近代都市計画と観光施策に基づく都市形成が急速に進んだ大正・昭和初期において、観光を都市戦略として掲げ、景勝地開発および宣伝に取り組んだ都市を対象として、開発構想と都市基盤整備の具体的内容とその経緯、ならびに観光地のイメージ形成とその要因としての観光事業・戦略について明らかにすることを目的とする。平成23年度中には、大正・昭和初期の神戸背山・六甲山を対象地として取り上げ、山地開発計画の立案過程と事業化の経緯と、それに対する風致保護論争について調査を重ねた。神戸の市街地と隣接する六甲山においては、大正初期頃から市民による登山が非常に盛んになるなど、国内においても山地でのレクリエーションが最も初期の段階に発達し、それにともない景観に対する評価も高まりをみせた。

それに伴い、大正期から昭和初期にかけて住宅地開発や山林公園の建設、外客誘致のための観光地の開発など、神戸市を中心とする様々な主体による開発構想が活発に議論され、道路建設が進む。その一方、風致の維持や災害防止の観点から開発のあり方をめぐる活発な論争が起った。この過程の詳細を、行政資料や各種調査委員会の報告書、戦前の市会の議事録、新聞等を史料として用いて明らかにし、どういう主体(市会や市の理事者、技術者ら)が、どのような都市像を構想し、当時の事業ならびに制度の枠組みのなかで、どのように都市整備を行ったか(行おうとしたか)、という側面から考察した。本研究成果については、次年度に発表の予定である。本研究は、近代都市計画と観光施策に基づく都市形成が急速に進んだ大正・昭和初期において、「観光」を都市戦略として掲げ、景勝地開発に取り組んだ都市を対象として、その開発構想ならびに都市基盤整備の具体的内容とその経緯を明らかにすることを目的としている。平成26年度中には、堺大濱の海浜リゾート地ならびに大津の湖岸を中心とする都市空間を対象として研究を進めた。前者については、「近代の堺大濱における海浜リゾートの形成過程」と題して、土木学会論文集D2に刊行が予定されている。明らかにした内容は以下の通りである。堺大濱では、明治半ば以降、堺市および阪堺電気軌道株式会社による公園地経営が進められてきた。本研究では文献資料をもとに、これらの主体による堺市大濱公園の管理と経営の変遷、さらにはそれによって作り出された海浜リゾート空間の形成過程を明らかにした。具体的には、堺市による官有地を借り受けての遊園地としての経営、内国勧業博覧会を契機とする施設整備の充実、堺市の財源不足と鉄道会社間の競合関係を背景とする阪堺電気軌道の公園経営への参画、市と阪堺電気軌道の考えの相違による契約解消、などの大濱における公園地経営の経緯を明らかにし、海浜リゾートとしての空間形成の実態を明らかにした。さらに、大津の湖岸の都市形成史についても、その研究成果の一部は平成27年度中に論文として発表の予定である。都市形成史平成24年度中には,平成23年度中に行った神戸背山・六甲山における産地開発計画の立案過程と事業化の経緯ならびに風致保護論争について論文執筆を進め、論文の成果を発表した。(山口敬太「昭和初期の神戸背山における開発と風致保護:山地開発論争と風致地区指定問題の顛末」建築学会計画系論文集,第77巻第682号,P.2771-2780,2012)さらに奈良「山辺の道」の形成経緯についての資料収集と考察を進めた。本研究成果の一部は論文として既に執筆がほぼ完了している。現在論文審査中であり,発表は次年度に行う予定である。平成24年度と25年度の実施計画に一部前後の変更があるものの本研究期間全体における研究の予定からみれば、順調に進展している。本年度中には奈良「山辺の道」の形成過程に関する研究を遂行し、その成果は論文として発表した。また、新たに神戸の河川沿緑地の形成過程ならびに、戦前の大阪の公園道路の計画思想に関する研究を行い、これらの成果も論文として(後者は講演論文として)発表した。なお、大津の都市形成に関する研究は現在進捗中であり、来年度に発表を予定している。平成23年度中には、大正・昭和初期の神戸背山・六甲山を対象地として取り上げ、山地開発計画の立案過程と事業化の経緯と、それに対する風致保護論争について研究を重ねた。
弾性表面波定在波の合成によるＭＨｚ帯域の微小振幅超音波接合装置の開発

精密な金属接合の実現のため、PZT圧電基板を用いたMHz帯域弾性表面波(SAW)による超音波接合法を開発した。PZT基板は振動発生力および耐荷重の高いハード材とした。電極配置は発振器と反射器を組み合わせたファブリペロー共振器型で設計した。その結果から、幅30mm、厚さ20mm、長さ90mmのPZT基板上に、発振器電極16対、反射器電極34対の2.7MHzのSAW素子を製作した。電極位置の振動変位は約40nm(P-P値)であった。さらに充分な変位振幅を得るた、め正八角形基板の表面に45°ずつ角度間隔をあけた4組のSAW共振器を構成してパワー合成を行った結果、金箔接合において接合強度が得られた。本研究では強力超音波発生用MHz帯域弾性表面波(SAW)素子としてPZT基板を用いる。電子部品で多く利用されるニオブ酸リチウム基板など圧電結晶体では、超音波接合時など強力超音波応用時に重荷重に耐えられないからである。そこでPZT基板について、接合用基板としての性能を評価した。PZT基板には、同じ印加電圧に対して変位振幅が大きいソフト材と、力が大きいハード材があるため、双方についてSAW発生用電極を表面に生成して検討した結果、本研究では周波数特性の先鋭度がより急峻なハード材を採用することに決定した。また、予備実験として試行したPZT基板による一方向性SAW素子の霧化実験から、PZT基板によっても接合可能な振動変位振幅は得られることを確認した。以上を踏まえ、接合用素子として充分な振動変位振幅を得るために、SAW発振器とSAW反射器を組み合わせた共振器の構成を採用することとし、理論に基づくシミュレーションプログラムを作成し、最適設計値を求めた。まず、発振器部と反射器部の間隔に関しては、ファブリペロー共振器の構成を参考にし、反射器端部における位相変化を考慮して、往復で(波長/4)+n波長の間隔を採用することにした。この時点でニオブ酸リチウム基板にフォトエッチング法で電極を生成し、周波数特性を測定した結果、従来の設計法および蒸着により電極を生成した基板に対して、共振の先鋭度に大きな改善が見られた。次に、電極対数とメタライゼーションレシオ(電極1対における電極部分と基板部分の長さの比)について検討した結果、幅30mm☓厚さ20mm☓長さ90mmのPZT(富士セラミック:C-213)基板にアルミニウム電極を1μm厚でフォトエッチングにて生成するという条件に対して、電極対数は14対、反射器対数50mmとすることにより、副振動の発生が抑制できることを確認した。電子部品で多く利用されるニオブ酸リチウム基板など圧電結晶体では、超音波接合など強力超音波応用時の重荷重に耐えられないからである。そこでPZT基板について接合用基板としての性能を評価した結果、発生力が大きいハード材を採用することに決定し、電極構成は発振器と反射器を組み合わせたファブリペロー共振器方式とした。以上を踏まえ、接合用素子として充分な振動変位振幅を得るために、最適設計プログラムを作成した。既存のSAW素子の特性とシミュレーション結果はよい一致を示したため、アルミニウム電極を1μm厚でフォトエッチングにて生成するという条件に対して最適設計値を求めた。本年度はその結果を基に、基板端面近傍の電極生成加工の困難さや接合に要する面積の再検討を行い、幅30mm、厚さ20mm、長さ90mmのPZT(富士セラミック:C-213)基板に、発振器電極16対、反射器電極34対の2.7MHzのSAW素子を製作した。電極位置の振動変位測定を行ったところ、従来のニオブ酸リチウム基板と今回の試作素子で同程度の振幅(約40nm:P-P値)が得られたことから金箔接合を試みたところ、微弱な強度ではあったが接合状態を確認した。なお、基板上に滴下した水の噴霧状態はPZT素子の方が劣っているため、SAWの減衰状況を確認し、接合位置において充分な振幅を確保する方法を検討している。平成26年度において、在来の振動解析ソフトによる振動状況の把握だけではなく、電極生成の最適設計プログラム作成の必要性が高まったため、電極の厚さなど詳細にパラメータを設定できるシミュレーションプログラムを新たに開発した。この開発に要した期間分(約2か月)の遅れが生じ、現在までに挽回するに至っていない。なお、本年度に導入したデジタル顕微鏡用自動ステージにより、生成した電極の仕上がりが精査できるようになった。基板端面付近の加工精度の低下などが実際に確認できたため、その位置の加工を避けるなど、今後の設計に適用していく。既存のSAW素子の特性とシミュレーション

結果はよい一致を示したため、アルミニウム電極を1μm厚でフォトエッチングにて生成するという条件に対して最適設計値を求めた。昨年度はその結果を基に、基板端面近傍の電極生成加工の困難さや接合に要する面積の再検討を行い、幅30mm、厚さ20mm、長さ90mmのPZT(富士セラミック:C-213)基板に、発振器電極16対、反射器電極34対の2.7MHzのSAW素子を製作した。電極位置の振動変位測定を行ったところ、従来のニオブ酸リチウム基板と今回の試作素子で同程度の振幅(約40nm:P-P値)が得られた。なお、基板上に滴下した水の噴霧状態はPZT素子の方が劣っているため、SAWの減衰状況を確認し、接合位置において充分な振幅を確保する方法を検討することとした。今年度は、接合位置において充分な変位振幅を得るため、正八角形のPZT基板(富士セラミック:C-213)の表面に、45°ずつ角度間隔をあけた4組のSAW共振器を構成し、それぞれのパワーを合成する方式とした。その結果、微弱ではあったが金箔接合において強度が測定できた。ニオブ酸リチウム基板との特性の違いから、さらに高い周波数が必要であるとの認識に至っている。精密な金属接合の実現のため、PZT圧電基板を用いたMHz帯域弾性表面波(SAW)による超音波接合法を開発した。PZT基板は振動発生力および耐荷重の高いハード材とした。電極配置は発振器と反射器を組み合わせたファブリペロー共振器型で設計した。その結果から、幅30mm、厚さ20mm、長さ90mmのPZT基板上に、発振器電極16対、反射器電極34対の2.7MHzのSAW素子を製作した。電極位置の振動変位は約40nm(P-P値)であった。さらに充分な変位振幅を得るた、め正八角形基板の表面に45°ずつ角度間隔をあけた4組のSAW共振器を構成してパワー合成を行った結果、金箔接合において接合強度が得られた。平成26年度において、在来の振動解析ソフトによる振動状況の把握だけではなく、電極生成の最適設計プログラム作成の必要性が高まったため、電極の厚さなど詳細にパラメータを設定できるシミュレーションプログラムを新たに開発した。この開発に要した期間分(約2か月)の遅れが生じた。現在までに、PZT基板においてもニオブ酸リチウム基板と同程度の振動変位振幅が得られることを確認し、金箔の接合実験に至っている。今後は、上記2種類の基板についてSAWの伝搬距離と減衰状態の関係を確認し、接合に必要な振幅を確保できる伝搬長を見積もる。その結果を踏まえて、本研究の目標であるSAW合成方式に用いる素子を設計・試作する。当該素子は現有のデジタル顕微鏡(自動ステージを設置)により、SAW素子の全面について電極加工の精度を迅速に検証する。その後、フリップチップのバンプ接合に適用するための装置構成について検討する。超音波工学現在、上記の最適設計プログラムの機能および設計結果の妥当性を試作実験により検証している。この試作素子が設計通りの性能を満たした時点で、当初の計画進度が回復する。さらに、その設計結果を踏まえ、SAW合成素子についてフォトエッチング法による電極生成を進めていく。同時に、現有のデジタル顕微鏡に自動ステージを装備することにより、製作したSAW素子の全面について、電極加工の精度が迅速に検証できる態勢を整える。電極生成加工について、当初は3ないし4回を予定していたが、前年度の設計による素子を製作して接合実験に供したところ、全く接合状態に至らなかった。
MLL転座型白血病の白血病幹細胞の機能的マーカー探索と治療応用に向けた基礎的研究

MLL融合遺伝子を有する白血病幹細胞の骨髄内での維持・増殖のメカニズムの解明を目指し、MLL融合遺伝子を有するヒト白血病細胞のマウス移植モデルを用いて解析を行った。MLL-AF4陽性白血病細胞において、TWEAK受容体であるFN14 (TNFRSF12A)の両アレルをノックアウトした白血病細胞株を作製した。この白血病細胞株を免疫不全マウスに移植し、骨髄への生着能や増殖能について検討した。FN14ノックアウト白血病細胞はコントロールの白血病細胞と同様に免疫不全マウスの骨髄に生着し、白血病を発症させる能力を保持していた。今後マウス骨髄中でのFN14ノックアウト細胞の局在や、遺伝子発現パターンの変化について検討を行い、MLL融合遺伝子陽性白血病におけるFN14による影響を解析し、治療標的としての可能性を検討したい。またMLL融合遺伝子を有するマウスES細胞から得られた未分化造血細胞を用いて、MLL融合遺伝子が造血前駆細胞を白血病化するために必要な遺伝子変異の同定を試みた。白血病細胞への進展に必要な付加異常を導入するために、MLL融合遺伝子を有するマウスES細胞を未分化造血細胞を含むTie2陽性細胞へ分化させた後、インサートを持たないMSCVレトロウイルスベクターを導入した、ランダムな挿入変異を導入した。免疫不全マウスへの移植により腫瘍の形成が認められ、腫瘍細胞からDNAを抽出し、inverse PCR法によりレトロウイルスの挿入部位を同定した。レトロウイルス挿入部位の多くは遺伝子の上流に位置しており、挿入部位近傍の遺伝子の発現亢進が認められた。これらの結果よりMLL-AF4による細胞の腫瘍化には2nd hitの付加異常が必要であると考えられた。今後挿入部位近傍に存在し、発現上昇が認められた遺伝子の白血病化における意義を検討したい。MLL融合遺伝子を有する白血病幹細胞の骨髄内での維持・増殖のメカニズムを解明するためにヒト白血病細胞のマウス移植モデルを用いて解析を行った。免疫不全マウスにMLL-AF4融合遺伝子を有するヒト白血病(急性リンパ性白血病)より樹立された白血病細胞株を経静脈的に移植し、移植後10ー14日の早期に骨髄に生着したヒト細胞を回収、その表現型や遺伝子発現の特徴を発現アレイ等を用いて検討した。移植後早期に骨髄に生着した細胞はSCLやLMO2等の造血幹細胞で発現を認める転写因子をコードする遺伝子の発現上昇に加えて、インテグリン等の接着因子のシグナル伝達に関与する因子をコードする遺伝子の発現上昇を認めた。またTNFシグナル伝達に関与するTWEAK受容体(TNFRSF12A)の発現上昇も認めた。移植後早期に骨髄に生着した白血病細胞で発現しているこれらの遺伝子は、移植前の白血病細胞あるいは、移植後30ー40日経過した後に移植マウスに生じた白血病から回収された白血病細胞と比較して、有意に高発現しており、初期の骨髄への生着に関与している可能性が示唆された。これらの発現解析の比較により、MLL-AF4陽性の急性リンパ性白血病では、比較的未分化な白血病細胞(白血病幹細胞に相当すると考えられる)がTNFシグナルやインテグリンシグナルに依存して骨髄に生着・進展するものと考えられた。現在TWEAK受容体シグナルに着目して、そのMLL-AF4陽性の白血病細胞における機能解析を行っている。免疫不全マウスへの移植による白血病モデルの作製、遺伝子発現解析など実験系は確立し、概ね順調に進行している。MLL融合遺伝子を有するヒト白血病細胞のマウス移植モデルを用いて解析を行った。免疫不全マウスにMLL-AF4融合遺伝子を有するヒト白血病(急性リンパ性白血病)より樹立された白血病細胞株を経静脈的に移植し、移植後早期に骨髄に生着したヒト細胞を回収、発現アレイ等を用いて検討した。移植後早期に骨髄に生着した白血病細胞では、TWEAK受容体(TNFRSF12A)の発現上昇を認めた。TWEAK受容体シグナルに関連して、MLL-AF4陽性白血病細胞において、TWEAK受容体であるFN14 (TNFRSF12A)のノックアウト細胞を作製し、その増殖能や細胞周期などの解析を行った。CRISPR-Cas9システムを用いてFN14の両アレルをノックアウトした白血病細胞株を作製した。FN14ノックアウト細胞の増殖能は野生型の白血病細胞と比較して有意な差はなく、また細胞周期にも有意な差は認めなかった。現在FN14ノックアウト白血病細胞を免疫不全マウスへ移植して白血病モデルを作製し、骨髄への生着能への影響を検討中である。またMLL融合遺伝子を発現するマウスES細胞を作製し、造血幹細胞より未分化な細胞におけるMLL融合遺伝子の影響を検討するとともに、白血病幹細胞形成のモデルとして、白血病幹細胞への進展に必要な因子の同定を試みた。白血病細胞への進展に必要な付加異常を導入するために、MLL融合遺伝子を有するマウスES細胞へインサートを持たないレトロウイルスベクターを導入し、ランダムな挿入変異を導入した。挿入変異を生じたMLL-AF4陽性マウスES細胞由来の造血細胞はオリゴクローナルに増殖し、免疫不全マウスへの移植で腫瘍の形成が認められた。腫瘍細胞からDNAを抽出し、inverse PCR法によりレトロウイルスの挿入部位を同定した。現在挿入変異による増殖能獲得のメカニズムを解析中である。

MLL-AF4陽性白血病細胞において、TWEAK受容体であるFN14 (TNFRSF12A)の両アレルをノックアウトした白血病細胞株を作製した。この白血病細胞株を免疫不全マウスに移植し、骨髄への生着能や増殖能について検討した。FN14ノックアウト白血病細胞はコントロールの白血病細胞と同様に免疫不全マウスの骨髄に生着し、白血病を発症させる能力を保持していた。今後マウス骨髄中でのFN14ノックアウト細胞の局在や、遺伝子発現パターンの変化について検討を行い、MLL融合遺伝子陽性白血病におけるFN14による影響を解析し、治療標的としての可能性を検討したい。またMLL融合遺伝子を有するマウスES細胞から得られた未分化造血細胞を用いて、MLL融合遺伝子が造血前駆細胞を白血病化するために必要な遺伝子変異の同定を試みた。白血病細胞への進展に必要な付加異常を導入するために、MLL融合遺伝子を有するマウスES細胞を未分化造血細胞を含むTie2陽性細胞へ分化させた後、インサートを持たないMSCVレトロウイルスベクターを導入した、ランダムな挿入変異を導入した。免疫不全マウスへの移植により腫瘍の形成が認められ、腫瘍細胞からDNAを抽出し、inverse PCR法によりレトロウイルスの挿入部位を同定した。レトロウイルス挿入部位の多くは遺伝子の上流に位置しており、挿入部位近傍の遺伝子の発現亢進が認められた。これらの結果よりMLL-AF4による細胞の腫瘍化には2nd hitの付加異常が必要であると考えられた。今後挿入部位近傍に存在し、発現上昇が認められた遺伝子の白血病化における意義を検討したい。MLL融合遺伝子を有する白血病幹細胞の骨髄内での維持・増殖のメカニズムの解明に関して、28年度に得られた結果を基に研究を進めていく。TWEAK受容体シグナルに関連して、MLL-AF4陽性白血病細胞において、TWEAK受容体であるFN14 (TNFRSF12A)のノックアウト細胞を作製し、その増殖能や細胞周期などの解析を行う。また免疫不全マウスへの移植による骨髄への生着能が影響を受けるかどうかを検討する。さらにMLL融合遺伝子を発現するマウスES細胞を用いた白血病のモデルを作製し、白血病への進展に必要な因子の同定を試みる。マウスES細胞を間葉系および造血系の細胞へ分化させ、in vitroおよびin vivoで造血細胞への分化能と白血病細胞の形成能を検討する。白血病細胞への進展に必要な付加異常を導入するために、MLL融合遺伝子を有するマウスES細胞へインサートを持たないレトロウイルスベクターを導入し、ランダムな挿入変異を起こさせる。挿入変異を生じたMLL-AF4陽性マウスES細胞を各種サイトカイン(IL7やSCF、FLT3リガンド等)とin vitroで共培養することにより、造血細胞(特にBリンパ球)への分化能と腫瘍化能を検討する。同時に免疫不全マウスへ移植し、Bリンパ球を含む造血細胞への分化能・造腫瘍能を検討する。
多段階癌血管新生シグナル伝達制御による特異的遺伝子治療の開発

癌進展には血管新生が必要不可欠であることが従来より指摘されてきたが、その成立には様々な分子が関与していることが知られている。線維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor : FGF)ファミリーは血管新生作用を示すことが知られているが、我々はアンドロゲン感受性株からアンドロゲン誘導遺伝子としてFGF8 variant : FGF8fを登録した(GenBank登録AB014615)。FGF8fは食道癌組織で非癌部より高発現し、その高発現群は予後が悪いことを見い出した(Tanaka et al. Dig Dis Sci 2001)。さらに我々は新規血管新生関連因子CCNファミリーに属する新しい癌特異的遺伝子WISP1vを臨床検体からクローニングした(GenBank登録AB034122)。CCNファミリー蛋白はIGF結合ドメイン、von Willebrand factor type C(VWC)ドメイン、thrombospondinドメイン、cysteine knotドメインから構成されているが、WISP1vはVWCドメインを完全に欠損していた。遺伝子導入細胞の解析により、WISP1vが細胞浸潤能を増強することを見い出している(Tanaka et al. Oncogene 2001)。さらに、同じファミリーに属するWISP3にドメイン欠損体があることを見い出し(GenBank登録AB075040)、現在その解析を進めている。本研究により臨床検体から新たな血管新生因子群を同定し、そのシグナル伝達抑制はtumor domancyを誘導することが明らかとなり、癌治療への応用を示す重要な成果が得られた。癌進展には血管新生が必要不可欠であることが従来より指摘されてきたが、各癌種におけるのターゲット分子の解明が必要である。我々は多血管性肝癌の高発現遺伝子としてTie2リガンドAngiopoietin-2をクローニングし、動物モデルを用いてその血管新生への関与を証明した(Tanaka et al.J Clin Invest1999)。本研究では、まずTie2を発現している血管内皮細胞HUVECにAngiopoietin-2発現ベクターを導入し、Ang2-HUVEC細胞を作製した。Ang2-HUVEC細胞ではTie2が恒常的にリン酸化され、Tie2とp85PI3K,Grb7との結合が増強していた。さらにAng2-HUVEC細胞は空ベクターを導入したmock-HUVEC細胞に比べ、細胞増殖能には変化がなかったがアポトーシス抵抗性を獲得していた。Ang2シグナル伝達系はsoluble Tie2遺伝子導入により抑制された。さらにsoluble Tie2は肝細胞癌のin vivo増殖を強力に抑制することが示された。次に、我々は新規血管新生関連因子CCNファミリーに属する新しい癌特異的遺伝子CCN-Vをクローニングし(GenBank登録AB034122)、CCN-VがHUVEC細胞の浸潤能を増強することを見い出している(投稿準備中)。現在、このCCN-Vのdominant negative mutantを作製し、血管新生への抑制効果を解析している。本研究により血管内皮細胞におけるシグナル伝達の制御メカニズムを明らかとする重要な成果が得られた。本研究により臨床検体から新たな血管新生因子群を同定し、そのシグナル伝達抑制はtumor dormancyを誘導することが明らかとなり、癌治療への応用を示す重要な成果が得られた。
歴史的遺伝的隔離と創始者効果に基づく連鎖遺伝子座の決定法の確立

各民族における集団遺伝学的特性は、遺伝性疾患の疫学的プロファイルを変容させる。この要因として社会的隔離、地理的隔離や通婚圏による制限、ポトルネック現象やGenetic driftが挙げられる。我国は、単一の民族により形成され遺伝的に均質であると考えられてきたが、本研究で明らかにするように中世から近世にかけての封建制による社会隔離による遺伝的影響は極めて大きく地域的な遺伝的浮動を生み出した。この結果地域毎に遺伝的隔離が成立し、劣性疾患遺伝子については、創始者変異が認められることが本研究によって証明された。しかし、この一方、優性疾患では地域的な偏りはあるもののこうした創始者効果では証明できないことも明らかになった。したがって劣性疾患ではわが国においては患者が認められる地域では極めて効率よく遺伝子座の決定ができることが実際の例で証明された。一方、遺伝疫学的な展開により地域に特異的な遺伝子変異が認められると考えられるが、こうした遺伝子変異あるいは多型の評価は困難を極める。我々は糖尿病に関わる遺伝子変化について蛋白の構造解析から機能障害を予測することを試みた。歴史的、文化的な隔離により多くの遺伝性疾患の頻度は大きく異なる。今後、わが国における遺伝疫学の展開とともに、遺伝子群の突然変異の結果生じる蛋白質における構造異常と病態の関連の解明が望まれる。疾患における責任遺伝子座の位置の決定はヒューマンゲノムプロジェクトが完了しつつ有る現状では場所の特定で候補遺伝子はほぼ確定する。そのため責任遺伝子の存在場所の決定は必要性をますます増しつつある。我が国においては希な疾患の発症者は、地域内では同祖的遺伝子を有する場合が多い。本研究は、我が国固有の文化的歴史的背景に着目し、1)新しい遺伝子座の決定、2)創始者効果の検証、3)モデル疾患のマススクリーニングの3点を行う。1)原因不明の地域特異的甲状腺腫:同一の形質を示す同一地域に在住する2家系について、全ゲノムについて連鎖解析を行い新たな遺伝子座を見いだした。現在候補遺伝子の配列決定を行いつつある。2)Plucystic Kidney:関西地域における8家系の17名の協力を得て遺伝子異常の検出を試みている。その結果現在までに5家系において変異を認めている。これら変異には創始者変異と思われるものは見いだせなかった。3)創始者効果の検討:Osler-Rendu-Weberは東北地域において地域クラスターが存在するため、創始者変異について検索した。7家系23名の参加を得て連鎖解析および変異の探索を行った。その結果、5家系に4つの変異を認めた。創始者変異は認められなかった。4)マススクリーニング:岩手県東北部においてヘテロ保因者のマススクリーニングを行いR410Xの変異の頻度を求めたところ、約1%と高頻度にヘテロ保因者を見いだした。y+/LAT1ヘテロ保因者の創始者変異が高頻度に認められたため、単一の遺伝子変異の検出でよく費用は約80円と廉価である。岩手県東北部では4万人に1名の割合でLPIを持った新生児が生まれると考えられるため、約320万円で1名の患者を早期発見でき極めて効率のよい方法である。この要因として、社会的隔離,地理的隔離や通婚圏による制限、ボトルネック現象やGenetic driftが挙げられる。我国は、単一の民族により形成され遺伝的に均質であると考えられてきたが、本研究で明らかにするように中世から近世にかけての封建制による社会的隔離による遺伝的影響は極めて大きく地域的な遺伝的浮動を生み出した。

我々は糖尿病に関わる遺伝子変化について蛋白の構造解析から機能障害を予測することを試みた。歴史的、文化的な隔離により多くの遺伝性疾患の頻度は大きく異なる。今後、わが国における遺伝疫学の展開とともに、遺伝子群の突然変異の結果生じる蛋白質における構造異常と病態の関連の解明が望まれる。
北河内地域の脱石油文明への行程図表に関する研究

世界の石油生産量が、年毎の増加から年毎の減少に転じる時期が、楽観的に見て2035年に到来する。それに備えて生活形態を石油文明から脱石油文明へと転換させる準備を始めねばならない。私たちの生活形態をどのように、また何年までに変えていくかについて北河内地域の人口減少を考えに入れると、学童と成人に対する農的環境教育を、少なくとも2015年までに始めることが必要であることを行程図表で示した。脱石油文明の思想的背景として、「私」を自我と自己に分化して考えることが一般的であるが、今年度は、それらの分化以前、私以前にまで戻って考えることを行った。このことにより、「私」の行為に関する既存モデルの不十分さを補完する着想、つまり現象をモデル化することにより抜け落ちるものがより少ない複合的モデルの着想が得られたことは意義深い。脱石油文明における産業活動の計画的予測を操作可能にするための都市力動的モデル(urban dynamics model)の骨組みが方程式化された。このことにより景観というある意味で質的な計画に対して数量的な裏打ちができる可能性が高まったことは本研究にとって重要である。北河内地域所在の都市の景観計画の分析を通じて、地域東部に位置する生駒連峰について、その眺望性を実態的にとらえる作業がなされたが、このことは北河内地域の脱石油的文明における地域景観を作図する際の背景データとして働くものであり、脱石油文明への道筋に地域を挙げて載ることについて、北河内地域の人々による合意形成の議論を収れんさせる包括的環境指標としての北河内地域の経年的景観図の変遷を図表化する本研究の最終目的の遂行にとって大いに資する。石油文明以前は、地域の歴史を受け継ぐことすなわち日常的な生活サイクルを受け継ぐことと等価であったが、石油文明における地域の歴史は、ある面環境破壊を受け継ぐことになりかねないことから、新しい歴史を始めるという視点に立って地域の身近な文化遺産の評価のあり方を変え、またその存続・活用の方法などについて再考することにより、北河内地域の脱石油文明にふくらみをもたせることができるという知見を得たことは、研究を立体化し、北河内地域の魅力的な景観図を提供することができる。昨年度脱石油文明の思想的背景として、「私」を自我と自己に分化して考える立場に対して、それらの分化以前、「私」以前にまで戻って考えることを行い、今年度は「私」の行為に関する既存モデルの不十分さを補完するモデル、つまり現象をモデル化することにより抜け落ちるものがより少ない複合的モデルの着想を、より具体化するため、文化普及(cultural dissemination)という視点を導入し、枚方市の脱石油文明への歩みをシミュレートする構成的モデル(景観デザイン計算書)を構築した。地域の歴史を受け継ぐことは、日常的な生活サイクルを受け継ぐことと等価であるが、石油文明における生活を受け継ぐことは、ある面環境破壊を受け継ぐことになりかねないことから、新しい歴史を始めるという視点に立ち、環境問題の史的考察を踏まえつつ、地域の身近な文化遺産(含伝統的な民家・町並み)の評価・存続・活用の方法などについて再考し、北河内地域の脱石油文明への移行過程を実体験させる世界遺産として整備することに収束させるための北河内地域の固有性の再調査・再評価を進める。北河内地域の景観の背景的ランドマークである生駒山について、その眺望性を実態的にとらえる作業を行い、北河内地域の景観における固有なランドクマーク性を明らかにした。また大東市の竹林を巡る地元住民の活動をトレースし、どうすればどう動くかを記録することにより、脱石油文明への軌道に地域を挙げて載るための北河内地域の人々の環境的行動パターンに関する知見を得た。都市活動の視知覚的側面としての景観を計画予測的に操作可能にするため、都市活動推移の動的モデル(urban dynamics model)を利用し、景観指標という観点から、その評価関数の定立に取り組んだ。このことにより景観というある意味で質的なものについて北河内地域の景観図の変遷を、数量的に「最適制御」するという大胆な研究方向を見透した。

脱石油文明の実現について文化普及(cultural dissemination)という視点を導入したマルチエージェント・シミュレーションモデルを構築し、枚方市の脱石油文明への歩みを、環境的なパイロット地区を体験することにより、それを真似るまちづくりを志向するという仮定の下に、枚方市を事例としてどのように人々の環境的心性が普及していき、市域全体の環境的心性の変化していくかを見た結果、パイロット地区の個数や市域における配置分布などにより、収束するステップ数と文化的多様性が変化することを明らかにした。地域の歴史を受け継ぐことは、日常的な生活サイクルの中にそれを組み込むことを意味するが、石油文明における生活サイクルのままでは、環境破壊を受け継ぐことになりかねないことから、新しい歴史に向かって事を始めるという視点に立ち、地域の身近な文化遺産(含伝統的な民家・町並み)の評価・存続・活用の方法などについて再考し、北河内地域文化の石油文明から脱石油文明への移行過程を再現的に体験させることにより、この地域を環境教育的な場として整備する知見を深めた。
地方圏における新たな工業都市形成に関する地理学的研究-雇用の流動化との関連-

本研究は地方圏への大規模工場の新規立地によって形成された新たな工業都市の特質を,とくに工業労働者の移動・定着状況や工業労働者の居住特性に焦点を当てて検討した.三重県亀山市では大規模液晶工場の誘致により,雇用や税収が大幅に増加し,量的な面での経済効果は大きかった.その一方で,労働者は非正規労働者が多く,広域から吸引されており,定住意志は弱い.雇用の流動化は企業と立地地域との結びつきを希薄化している.本研究は地方圏への大規模工場の新規立地によって形成された新たな工業都市の特質を,とくに工業労働者の移動・定着状況や工業労働者の居住特性に焦点を当てて検討した.三重県亀山市では大規模液晶工場の誘致により,雇用や税収が大幅に増加し,量的な面での経済効果は大きかった.その一方で,労働者は非正規労働者が多く,広域から吸引されており,定住意志は弱い.雇用の流動化は企業と立地地域との結びつきを希薄化している.第1に,三重県亀山市を調査対象地域として,2000年代前半の液晶企業の立地を契機とする工業都市化の過程を多角的に検討した.亀山市に液晶企業が立地した経緯を,企業の立地戦略と地元自治体側の誘致活動の両面から検討したうえで,企業立地に伴う地域への影響について,雇用,関連産業の集積,従業員の居住,税収等の面から論じた.その結果,液晶企業の誘致により,雇用や税収の数量的な面での数量的な効果が認められる一方で,労働力構造(非正規雇用の比重の高さ,地元採用の少なさ,市内定住者の少なさなど)や産業構造(域内リンケージの弱さなど)の問題を抱えていることが判明した.加えて,2008年のリーマンショック後の非正規労働者の削減が大きく,市内で民間賃貸住宅の空室が増加するなどの影響が生じていることも伺うことができた.これらの結果は,国際学会で発表し,論文にとりまとめた第2に,亀山市において,工業労働者の定着過程と居住状況に関する実態調査に着手した.前者については,過去に行われた労働者に対する実態調査結果のデータ整理を実施した.後者については,工業労働者を主たる顧客と想定した民間賃貸住宅が近年大量に建設されて都市景観が変化していることから,民間賃貸住宅の分布変化を公的データや地図から検討した第3に,地域間比較のため,2000年代前半に自動車組立工場が立地した大分県中津市での資料収集を行った第1に,三重県亀山市を対象に,大規模工場の立地前後に実施された工場労働者に対する大規模なアンケート調査の結果を比較検討することを通して,工業労働力の定着過程とその変化の分析を進めた.主に使用したデータは,2003年,05年,07年の3回にわたり亀山市内の工場労働者を対象に行われたアンケート調査結果である.まず大規模工場の立地直前(03年)の状況を検討した/労働者の調達は採用時期と職種によって異なること,一旦採用された労働者は職種や出身地を問わず比較的定着しているが,生活環境への不満などから必ずしも市内には居住していないことなどが判明した.次に,大規模工場の立地後の変化を検討した.7千人規模の雇用が創出されたが,転勤や,人材派遣業を通じて広域から調達された非正規雇用の増加が大半で,市内に定住意志を持つ者は少数であった.また社宅が未整備のため,行政の積極的な関与もあり主として単身者向けの民間賃貸住宅がスプロール的に多数建設された.しかし定住意志を持つ者は家族向け物件が多く生活環境の良好な近隣都市に居住する傾向にあった.第2に,同じく亀山市を対象として,現在の居住と就業状況を詳細に把握するために,住民アンケート調査を実施した.市内の工業就業者の多い3地区を選定し,合計3,000世帯に対して調査票を配布し,約23%の世帯から調査票を回収した.この結果については現在鋭意分析を進めている.第3に,亀山市を含む三重県地域の就業状況の変動を計量的に分析した.具体的には,産業構成や地域産業の生産性が相互に作用する多様な成長パターンの地域的差異が,どのような要因によって決定づけられるのかについて,シフトシェア回帰モデルを適用して実証分析を行った.その結果,成長産業の誘致政策が既存の産業集積地である三重県北部から中部では効果を上げたが,県南部では機能していないことなどが明らかとなった.第1に,前年度に引き続き,三重県亀山市を事例に,工業労働者の流入の特性と居住特性を分析し,論文として公表した.その際に,工場従業員を対象にして複数回実施された大規模なアンケート調査を活用した.その結果,(1)シャープ立地直前の状況は,労働者の調達は採用時期と職種によって異なり,現業労働者は,1970年代頃までは広域から吸引していたが,近年は地元依存が主となっていた.(2)シャープ立地後の変化としては,大規模な雇用創出は転勤や,人材派遣業を通じて広域から調達された非正規雇用の増加が大半で,市内に定住意志を持つ者は少数であった.(3)社宅が未整備のため,行政の積極的な関与もあり主として単身者向けの民間賃貸住宅がスプロール的に多数建設された.(4)しかし定住意志を持つ者は家族向け物件が多く生活環境の良好な近隣都市に居住する傾向にあった.(5)リーマンショック後は「派遣切り」に伴う賃貸住宅の空室の大量発生などの問題が顕在化した.

このように,雇用の流動化は,立地企業とローカルな地域との雇用や居住面での結びつきを希薄化していることを明らかにした.第2に,同じく亀山市を対象として,現在の居住と就業状況を詳細に把握するために前年度実施した住民アンケート調査について,分析を進め,論文として発表する準備を進めた.第3に,亀山市とは対照的に比較的古い企業城下町である宮崎県延岡市における雇用と居住の現状について,現地で資料収集や観察を実施した.これらを通して新興工業都市の一つである三重県亀山市の実態への理解を深めることができた.亀山市におけるこれまでの調査結果の成果を学会発表するとともに,亀山市住民に対するアンケート調査を実施した点は計画通りである.さらに就業状況の変動を計量分析し,その成果を学会誌に掲載できた点は当初計画を上回っている.他方,住宅供給者に対する実態調査はやや後手に回ったが,総合的にはおおむね順調と考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度が最終年度であるので,成果を取りまとめることに重点を置く.まず,23年度に実施した亀山市におけるアンケート調査結果の分析を進めるとともに,土地利用や景観の変化についての実態を把握する。これらをふまえて,亀山市における調査結果の分析と考察を行う.並行して,亀山市以外の類似の工業都市を対象として,企業立地の過程と,それに対する地方自治体の対応等についての情報収集と分析を進める.これによって,亀山市の調査から得られた知見の相対化・一般化を推進する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
健常人コホートを基礎としたヒト老化関連Ｔ細胞の同定と機能解析

京大ながはまコホートに属する200人の抹消血の免疫細胞のデータを取得し、現在さまざまな臨床パラメーターとの相関を検証している。また、T細胞老化を加速させるマウスモデルを用いて、加齢に伴い増加するT細胞サブセットとして、CXCR3陽性ナイーブ型CD8 T細胞を新たに同定した。また、同等の細胞がヒトにも存在することを確認した。加齢に伴う免疫応答能の低下や自己寛容維持機構の劣化、炎症性素因の増大などによって特徴づけられる「免疫老化」は、感染症、癌、自己免疫病など高齢化社会の主要疾患の発症に大きく寄与している。免疫老化には多くの免疫担当細胞が関与するが、中でも胸腺退縮により成人期以降新たな産生が激減するT細胞の加齢変化の影響が最も大きいとされる。しかしながら、その実態や全身性の免疫システムの緩徐な劣化や応答様式の変容との関連性は必ずしもよく理解されていない。本研究は、健常人コホートを利用してヒト老化関連T細胞の同定とその機能解析を行うことにより、中年期以降増加する様々なヒト疾患の発症に共通した基盤となるヒト免疫老化の実態を包括的に理解し、その克服と制御方法の開発に資することを目指すものである。本年度は、ながはまコホート200人分の検体をフローサイトメトリーにより解析し、その結果の統計解析を行った。また、マウスモデルを用いた解析により、ヒト老化関連T細胞を同定する新たなマーカーの絞り込みを行った。マウスモデルを用いて、ヒト加齢関連T細胞を同定する新たな候補分子を同定することができた加齢に伴う免疫応答能の低下や自己寛容維持機構の劣化、炎症性素因の増大(免疫老化)は、感染症、癌、自己免疫病など高齢化社会の主要疾患の発症に大きく寄与している。本研究は、健常人コホートを利用してヒト老化関連T細胞の同定とその機能解析を行うことにより、中年期以降増加する様々なヒト疾患の発症に共通した基盤となるヒト免疫老化の実態を包括的に理解し、その克服と制御方法の開発に資することを目的とする。具体的には、1)京大ながはま0次コホートの健常人末梢血を用い、免疫老化を定義する約20種類の候補分子で染色し、フローサイトメトリ(FCM)データを得る。2) FCMデータをもとにSPADE解析を行い、T細胞集団を多次元にクラスタリングする。3)ヒトの加齢に伴い増加する細胞集団(老化関連T細胞)を同定する。4)同定された老化関連T細胞を分離回収して機能的な特徴を明らかにする。5)臨床検査データや加齢に伴い増加する各種疾患と、老化関連T細胞との関係性を検証する。本研究の成果は、ヒト個々人の免疫老化・免疫状態を知る新たな指標の確立につながるとともに、将来的にはヒト代謝性疾患など免疫老化関連疾患の予防あるいは治療戦略の開発に大きく貢献することが期待される。これまでに、CD28陽性T細胞集団の割合が、特にCD8T細胞で加齢に伴い上昇する、CD56陽性、CD57陽性細胞の割合が、加齢に伴い上昇するという報告がある。そこで、長浜市の各地域の健診で採取される末梢血約100uLを用いて、まずこれらの分子パラメーターをポジティブコントロールとして、約250人分のデータを取得た。FCM解析には、フィルターとコンペンセーションにより特定の蛍光の漏れ込を引き算する従前の装置ではなく、スペクトル型(フィルターレス)セルアナライザー(SONY社製SP6800)を用い、各蛍光色素による蛍光の絶対量をバイアスなく測定した。これにより、よりSPADE解析に適したデータを得ることができる。以上の解析により、少量の末梢血からSPADE解析に適した質のデータが得られること、本コホートを用いて既知の報告が再現できることを確認できた。また、マウスで同定していた老化関連T細胞と同じマーカーを用いて解析を行うことにより、新規老化関連T細胞が存在する可能性が示唆された。加齢に伴う免疫応答能の低下や自己寛容維持機構の劣化、炎症性素因の増大(免疫老化)は、感染症、癌、自己免疫病など高齢化社会の主要疾患の発症に大きく寄与している。本研究は、健常人コホートを利用してヒト老化関連T細胞の同定とその機能解析を行うことにより、中年期以降増加する様々なヒト疾患の発症に共通した基盤となるヒト免疫老化の実態を包括的に理解し、その克服と制御方法の開発に資することを目的としている。これまで、京大長浜コホートの実施する健康診断システムを用い、約250人の健常人末梢血について免疫老化のマーカー分子の発現をフローサイトメトリを用いて解析し、現在様々な臨床検査値データとの相関解析を行っている。今年度はさらに、胸腺摘出によりT細胞老化を促進するマウスモデルを確立し、この系を用いて新たな老化T細胞マーカーの探索と新規老化T細胞分画の同定を試みた。