hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中高年女性の「健康統御力」の形成過程とソーシャルキャピタルの影響に関する研究

本調査は、中高年女性の健康を維持する力に着目し、ストレス対処力、健康状態、地域の繋がりとの関連性を明らかにすることを目的とした。調査方法には、質問紙調査法とインタビュー法を用いた。質問紙調査では中高年女性のストレス対処力はQOLや更年期症状の自覚、ソーシャルキャピタルの一つである近隣への信頼と関連を認め、女性が状況を把握する力やマネジメント力の重要性が示唆された。インタビューでは女性は過去の体験を意味づけして対処感覚をコントロールしていることが抽出され、調査結果をもとに今後の地域での中高年女性を対象とした健康プログラムに必要な要素を検討した。目的:本年度は、中高年女性に特有の健康統御力の構成要素を抽出すること、健康へ関連するソーシャルキャピタルの構成要素を抽出することを目標とした。方法:前向き調査の開始年度としてベースライン調査を実施した。(1)調査内容の精査:既存研究から健康統御力の構成要素をSOC(sense of coherence)に集約して項目を設定した。ライフスタイルや不定愁訴との関連性についても国内外から広く情報収集し、肥満と更年期症状の項目を設定した。ソーシャルキャピタルについては家族や近隣との絆について項目を設定した。(2)実施:年齢が30歳60歳までの男女1,000名の就労者を対象にアンケート調査を実施し、性別、年齢別に健康の自覚症状とSOCの差異を比較分析した。結果:回収率は24.8%であった。年齢構成比は、30歳39歳が21.8%、40歳49歳が30.9%、50歳59歳が30.8%、60歳が16.5%であった。男女比は、男性が58.4%、女性が41.6%となった。不定愁訴の頻度は、女性が男性に比較して有意に高かった。SOCについては、50歳59歳で女性が男性に比べて得点が有意に低い(p<0.001)ことが示唆された。ソーシャルキャピタルとした「家族の絆」や「近隣の絆」は性差や年齢差を認めず、SOCとも関連を認めなかった。50歳代の女性でSOC得点が低かったことは、中高年女性に特有の変化が生じている可能性があり、中高年女性の健康統御力としてSOCは重要な構成要素ではないかと推測する。何故、中高年女性のSOCが低かったかという背景については、調査対象者が少なく調査の限界があったため、症状やソーシャルキャピタルとの関連性を明らかにするには至らなかった。今後、調査対象者数を増員してベースライン調査を補完すると同時に定性調査を通じて、検討を継続する。本年度は調査2年目に該当し、昨年度の定量調査では把握できなかった中高年女性に特有の健康統御力にはどのような内容があるかを明らかにし、プログラムの基盤づくりを目的とした。目標には、(1)定性調査によって中高年女性に特有の健康統御力の構成要素を抽出すること、(2)健康プログラムの試案を作成すること、(3)定量調査における調査協力者の拡充の3点を設定した。定性調査に重点を置き、40歳代50歳代の女性、現在、自分は健康だと自覚している女性に調査協力を依頼し、インタビュー調査を実施した。インタビューの内容は、昨年度に定量調査で用いたSence of Coherenceの下位概念である把握可能感、処理可能感、有意味感の3要素をもとに、半構成質問法を用いて行った。定性調査から、自らの健康をコントロールできていると感じている女性に共通していた内容は、自分なりのペースを維持していることだった。自分のペースとは、家事と仕事のバランス、気分転換と仕事のバランス、家族と自分のバランスであった。健康のコントロール感覚には、過去の育児や病気などの辛かった体験を活かす力、自分だけに特有な体調変化の前兆を把握する力、一人で抱え込まずに周囲の力を活かしてマネジメントする力、他者と協働する力、他者との信頼関係を維持する力が導き出された。人生を楽しむことに意義を感じ、期待した状況にならない場合には良い方向へ捉え直そうとする力、悪化した事態にのめり込まない力も導き出された。本結果から中高年女性の健康統御力には、過去の体験を活かす力、公私にかかわらず周囲と協働する力の影響が窺えたことから、マネジメント力の形成とソーシャルキャピタルの紐帯形成を重点化したプログラム内容を作成し、検討中である。今後は、更に内容を精査するとともに、初年度調査と異なる地域での調査協力者の募集を継続する。研究目的:本年度は、量的調査においては中高年女性の健康状態と健康統御力、ソーシャルキャピタルとの関連性を明らかにすること、介入調査においては健康プログラムの内容の修正を行い、RCTによるプログラムの第一次評価を実施することであった。

研究計画:量的調査においては、特にソーシャルキャピタルの影響を明らかにするために、地域の繋がりがどのように関連するかを分析するために、対象地域を拡大して、対象者を募集し分析することを本年度の計画とした。介入調査においては、昨年度に作成した健康プログラムの内容を精錬させて、対象者へのRCTを開始することを計画とした。具体的内容:量的調査においては、対象者の拡充がすすまず、研究協力者数が減少しているため分析に至っておらず、現在も対象募集と調査を継続中である。介入調査では、健康プログラムの内容について、昨年度に追加したプログラム(尿失禁予防と骨盤底筋群体操を重点化した内容)について、開発段階において、DVDの内容を理解しづらい、対象者が個々で実施可能なセルフケアへと結びつきづらいという課題が明らかになり、本年度はプログラム内容を修正し、内容の理解しやすさと女性が一人でも自分のペースに応じて実施できるという課題を解決した。本年度は、介入調査について健康プログラムを対象にとって実行可能な内容へと精錬することに一定の成果があったが、プログラムの期待する効果として、女性の自己コントロール感覚を向上するという主目的には達していず、現在、CBTプログラムと同時進行にて女性の健康に対する自己コントロール感覚を向上するための内容を更に修正中である。次年度はRCTにてプログラムの評価修正すすめる予定である。量的調査については、対象者の確保が予定よりも遅延している現状にあるため、今後は対象者の地域や更年期医療を受診されている女性へ対象を拡大して募集し分析をすすめる予定である。目的:本年度は5カ年計画の中間評価に該当し、健康プログラムの介入調査の開始年度と第2次追跡調査年度に該当した。介入調査においては中高年女性の健康統御力を発揮できるプログラム内容を明らかにすることを目的とし、追跡調査では、中高年女性の健康状態の変化においてどのような影響要因があるかを明らかにすることを目的とした。方法:介入調査については、昨年度までの調査をもとに、中高年女性の健康統御力の構成要素として、更年期に生じやすい心身の変化に対する健康の状況把握力、健康に対する自己コントロール感覚を設定し、2つの構成要素を発揮しやすいと想定されるプログラムを作成した。当初は、リラクセーションやメンタルヘルスを重点化した内容を準備したが、調査依頼をした中高年女性の皆様のニーズにあった内容ではなかったことから、プログラムの内容を大幅に修正した。プログラム内容の修正点は、女性のニーズがある健康課題であること、女性が自身の健康状況の変化を把握しやすい内容であること、健康課題について自己コントロール方法が簡易であること、女性が効果を感じやすいこととし、これらの条件をもとに、新規に、尿失禁予防と骨盤底筋群体操を重点化したプログラムを作成した。内容は、女性が自分のからだの変化を把握するためのメカニズム、症状に対する自己コントロール方法、自己評価法を設定した。同時に、女性がいつでどこでもアクセスが可能となるようにタブレット端末を用いたプログラムの提供方法を工夫した。結果:介入調査、追跡調査ともに、現在もプログラムの進行中である。調査協力者数が統計的分析に可能な数を確保できていないため、今後も介入調査、追跡調査を継続して、データー解析へすすめるとともに、現在の個人評価の質的解析をすすめる予定である。
脊柱側弯検診及び経過観察用体表計測機材の比較研究ーX線撮影の代用としての意義

〔対象と結果〕1)ISIS(1)初診時にISISを撮影した特発性側彎症29例39カーブにおいて、胸椎部の側彎角と背面非対称係数(LAI)の相関係数は0.75胸腰椎部では0.65であった。(2)経過観察群15例20カーブにおいて、LAI Cobb角とも7°以上の増加を"進行"とするとfalse negative例が10%、false positive例が5%であった。(3)brace治療群15例19カーブにおいて、false negative例が16%、false positive例が21%であった。2)モアレ法(1)側彎角15°以上の86カーブについて側彎角7°以上とハンプ高4mm以上の増加を"進行"と判定すると、true positive群は8.1%、true negative群は70.9%、false negative群は2例2.4%、false positive群は16例18.6%であった。(2)20°以上の特発性側彎症患者100名、正常者200名の脇線の非対称性について分析した結果、脇線三角における陥凹最低部の位置の左右差と陥凹最低点から背面正中にいたる最短距離の差において有意差を認めた。ISISの結果については経過観察期間が平均6カ月弱であり、結論的に述べるのは未だ時期尚早であるが、前述の結果から、LAI、ハンプ高、脇線の非対称等を効果的に組み合わせることにより、側彎の進行を推定し、X線撮影回数を減らすことが可能であると考える。体表面計測機器としてのISISをFM40と比較した場合リアルタイム解析が可能であること、定量的な解析ができるという特徴がある。しかし撮影時間がやや長く高価格といえる。今後、ハード・ソフト両面で改良を加え測定値の安定化と迅速化を図る必要がある。更に側彎症患者の自然経過ブレース治療効果等の解析を効果的に行うためには面像情報を含む総合的なシステムの開発が望まれる。1. Integrated Shape Investigation System(ISIS)による研究:X線を用いず,光投射の原理を用い体表の3次元変形を読み取り,内蔵するコンピューターによって側弯角をリアルタイムで推定して出力する装置である.本装置が設置され稼働を始めた1987年10月以来これまで合計延83名の側弯度との相関係数は0.44で,全体としてみた場合相関静は高いとはいえない.ギャップについて大なるものでー21度(53%)+22度(58%)の差異がみられた.最も差が大きかったものは何れも腰椎部で,測定時のポジション,下肢長差,ブレースによるハンプの低下等が関与すると考えられ,今後の検討を要する.また, X線上の角度よりISISが6度以上高く出たものが32%, 6度以上低く出たものは19%±5度以内は47%であった.ISIS上に表れる変形はX線上のそれと異なって背部の変形の指数であり,患者の主観により近いものといえよう.また,本法の欠点は撮影に一人10分を要することでこの点の改良が望まれる.2.モアレ3次元計測;'87年度は学校検診において285名,側弯症児の経過観察で延520名をフジノンFMMモアレ40を用いて背部変形の計測を行いX線写真上の角度と比較を行った.

われわれの方法は前屈位で計測するもので,より再現性が高いと考える.側弯の進行をX線撮影によらずモアレ法でスクリーニングすることを検討してきたが,ブレース治療でX線上の角度のみならず,背部変形の矯正も証明された.側弯症の経過観察をX線を用いず経過観察に利用するためには,解像力を高めること,モアレ像をリアルタイムで読み取るための解析装置を取り付けることが必要である.昭和62年11月、INTEGRATED SHAPE INVESTIGATIONSYSTEMが搬入され、側弯症外来等において実用され、手技もほぼ一定してきた。同時にこれまで使用していたMOIRE FUJINON FM40とともに,側弯症等脊柱変形患者の背部変形の計測システムをほぼ確立した。平成元年2月迄に延242名の側弯症を調査したが、このうち、初診より観察した29名39弯曲におけるLAI(背面非対称指数)と側弯角との相関性を比較した。胸椎での相関係数は0.75、胸腰椎弯曲では0.65であった。装具治療齢では相関性が低かった。20弯曲で平均8箇月の経過観察を行い、X線像との対比でfalse negative,falsepositive信頼度等、即ちX線写真の代用としての信頼度を検討した。ISISはX線像とは別の外部変形を見ているといえる。変形はリアルタイムで分析ができるが、撮影から結果出力までに1例当り10分を要すること、撮影準備に熟練を要することから今後ハード、ソフトの改良と測定値の安定化と迅速化が求められる。
横紋筋融解症発症モデルマウスにおけるオートファジー異常の分子メカニズム

高コレステロール血症治療薬であるスタチンの副作用である横紋筋融解症の発症のメカニズムを解明することを目的とした。スタチンの標的であるHMGCRを骨格筋特異的にノックアウトしたマウス(mKO)を作製した。mKOマウスの筋肉細胞では細胞死と再生が頻繁に起こっていた。オートファジーの異常について検討した。オートライソゾームの形成に関与するRab7の機能が障害されているとともに、オートライソゾームの分解も障害されていた。mKOマウスでのオートライソゾームの異常やp62タンパクの増加はオートファジーそのものの異常ではなく,ライソゾームの機能異常に由来するものではと推論した.Human alpha skeletalactin(Acta1)をプロモータとしてCreリコンビナーゼ遺伝子を発現するActa1-Cre TgマウスとHMG-CoA還元酵素(HMGCR) floxedマウスを交配して作成した骨格筋特異的HMGCRノックアウトマウス(mKOマウス)の解析を行った。EGFRにGFPを融合させた蛋白を発現するプラスミドをin vivoにてエレクトロポレーションで遺伝子導入し過剰発現させ,そのライソゾームによる分解能を評価した。しかしながら、対照群とmKO群で差を認めなかった。ライソゾーム酵素の一種であるカテプシンD・Lのウエスタンブロットによる成熟度合いの評価ならびにカテプシンDの酵素活性の測定を行ったところ、対照群と比してmKO群で上昇していた。次に対照群のマウスとmKOマウスの骨格筋から,ライソゾームを単離し,これを用いてカテプシン酵素活性の測定を行った。この解析でもmKO群で上昇していた。タンパク生成後の時間経過に応じて色調の変化する「Timer」蛋白をライソゾームマーカー「Lamp2」と融合させ,in vivoにおいて発現させ,ライソゾームのturn overをマウス前脛骨筋で評価したが,これは特に差を認めなかった。以上より,mKOマウスにおけるライソゾームの機能は低下ではなく,亢進しており、mKOマウスでのオートライソゾームの増加ならびにp62の増加は,オートファジー亢進ならびにアミノ酸の増加によるRagを介したp62の産生亢進によるものであることが明らかになった。HMGCR KOマウスの骨格筋ではオートファジーが誘導されていること、オートライソゾーム形成の増加が確認できている。コレステロール合成系の律速酵素であるHMGCRを骨格筋特異的にノックアウトしたマウス(mKO)を作製した。このマウスでは著しい筋障害を呈した。そこで新たにDoxycycline(Dox) inducible Acta1-Cre TgマウスとHMG-CoA還元酵素(HMGCR)floxedマウスとの交配し、薬剤誘導型骨格筋特異的HMGCR KOマウス(dKOマウス)を作成した。このマウスは薬剤投与によりいつでも筋肉のHMGCRをノックアウトすることができ、HMGCR欠損による筋障害のメカニズムを解明できるマウスである。このマウスを使い、骨格筋特異的HMGCR KOマウスにおける筋障害のタイムコースの評価を行った。このマウスはDoxを投与するとCreの発現が誘導されHMGCRを自由に骨格筋でノックアウトできることを確認した。Doxを投与しHMGCR遺伝子をノックアウトすると、18-21日目にて全てのマウスで筋障害が発生することを確認した。そして,筋障害の発生する直前の検体を解析したところ,通常の胎生期からHMGCRが骨格筋で欠損する骨格筋特異的HMGCR KOマウスで見られた骨格筋でのオートファジー異常とfree-コレステロールの増加がdKOマウスにおいても、同様に認められた。このため、これらの変化は筋障害に先行して既に起きていることが明らかになった。mKOマウスでのオートライソゾームの異常やp62タンパクの増加はオートファジーそのものの異常ではなく,ライソゾームの機能異常に由来するものではと推論した.現在使用しているHMGCR KOマウスは生後すぐからHMGCRを欠損しているため、結果をみているのか、原因を見ているのかが明確でなかった、そのため、今後は時間特異的にHMGCRの発現を制御できるDoxycycline(Dox) inducible Acta1-Cre TgマウスとHMGCR floxマウスを交配する。骨格筋特異的HMGCR KOマウスにおける筋障害のタイムコースを評価する。代謝学
甲殻類（ニセネコゼミジンコ）多世代繁殖試験による環境水の生態リスク評価の深化

2012年8月から16ヶ月間,1月に1回,信濃川水系の3地点の河川水でニセネコゼミジンコ(C. dubia)繁殖試験を実施し河川水の生態毒性を評価した。信濃川本流の河川水Aでは毒性が殆ど検出されなかったが,支流の河川水Bでは致死効果,河川水Cでは産仔数減少が見られることが多かった。TOC,アンモニア性窒素などの一般水質指標と毒性との関連性は見出せなかった。一方,亜鉛が河川水における産仔数減少の一要因となっていると考えられた。さらに,本研究で提案した多世代繁殖試験を実施した結果,一部サンプルにおいて致死は起きなかったが産仔数が有意に減少したことから本試験実施による安全性評価の有用性が示された。ニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)を用いた繁殖試験による環境水の毒性レベル評価は,基本レベルの生態毒性試験の中でも感度が高く,種の保存や水圏環境保全の観点からも非常に重要な試験である。本研究では,多種多様な環境水に対してC. dubia繁殖試験を行い,その毒性レベルを明らかにし,さらに多世代影響を評価するための新規の繁殖試験を提案・実施し,より厳しい観点から水質安全性を評価することを主な目的とする。平成25年度は前年度に確立したC. dubia繁殖試験方法により,河川水の年間を通しての毒性評価を行うとともに,水系への排出水量が多い下水処理施設放流水についても試験を実施した。さらに,多世代繁殖試験の試験法について検討し,対照区において再現性の高い試験結果が得られた。1河川水の年間毒性調査年間を通して1ヶ月に1回,信濃川水系の3地点の河川水の毒性を評価した。河川水Aでは毒性が殆ど検出されない一方,河川水B,Cでは4割程度のサンプルで認められた。毒性は夏季に現れることが多く,また河川水Bでは致死効果,河川水Cでは産仔数減少が主に見られ,毒性の現れ方に特徴が確認できた。TOC,アンモニア性窒素,電気伝導率などと毒性との関連性は全く認められず,毒性要因として農薬や重金属などの微量成分が示唆された。2下水処理放流水の毒性評価当該水系への排出水量が多い排水として2ヶ所の下水処理場の放流水について複数回試験を実施した。その結果,希釈率を考慮した10%濃度の放流水では,いずれも毒性が検出されず,下水処理放流水が河川水の毒性要因になっている可能性は低いと考えられた。甲殻類のニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)を用いた繁殖試験による環境水の毒性レベル評価は,基本レベルの生態毒性試験の中でも感度が高く,種の保存や水圏環境保全の観点からも非常に重要な試験である。本研究では,多種多様な環境水に対してC. dubia繁殖試験を行い,その毒性レベルを明らかにすること,さらに多世代影響を評価するための新規の繁殖試験を提案・実施し,より厳しい観点から水質安全性を評価することを主な目的とする。平成24年度はC. dubia繁殖試験方法を確立した上で,河川水による繁殖試験の実施を中心とした。1 C. dubiaの飼育・繁殖試験方法の確立飼育・繁殖試験は,USEPAのWET試験方法No.1002.0に準拠した方法で行った。C. dubia繁殖試験は,対照区(飼育水)において一定の基準以上でないと成立しないが,安定的に条件を満足することが一般に困難である。研究前半において,飼育・試験時の水の種類,硬度レベル,給餌方法等の検討を行い,試験成立条件を安定的に達成できる方法を確立した。2河川水を試料とした繁殖試験の実施試験方法の確立後,地域近郊の環境基準点等の3ヶ所程度の汚点を選定して,繁殖実験を複数回実施した。繁殖試験は数段階の河川水系列で行い,対照区の結果と比較して産仔数減少効果及び致死効果(EC25,LD25など)を算出して毒性レベルを評価した。一部の河川水サンプルにおいて毒性が確認でき,地点によって毒性の現れ方に特徴がみられた。毒性レベルは,TOC(全有機炭素),アンモニア性窒素,EC(電気伝導率)などの一般的水質指標との関連性は殆どみられなかった。また,試験の感度は試験的に同時に実施したオオミジンコ(D. magna)繁殖試験と同程度であり,短期間で行えるC. dubia繁殖試験の有用性を確認できた。ニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)を用いた繁殖試験による環境水の毒性評価は,基本レベルの生態毒性試験の中でも感度が高く,種の保存や水圏環境保全の観点からも非常に重要な試験である。

本研究では,多種多様な環境水に対してC. dubia繁殖試験を行い,その毒性レベルを明らかにし,さらに多世代影響を評価するための新規の繁殖試験を提案・実施し,より厳しい観点からの水質安全性評価を主な目的とする。26年度は前年度に引き続き河川水の年間を通しての毒性評価を行うとともにその毒性要因を検討した。さらに,前年度に確立した多世代繁殖試験法に基づいて,河川水の安全性を評価した。研究期間全体の主要な成果を以下に示す。1河川水の年間毒性調査と毒性要因:1年半以上にわたり1ヶ月に1回,信濃川水系3地点の河川水を評価した。河川水Aでは毒性が殆ど検出されない一方,河川水B,Cでは4割程度のサンプルで認められた。毒性は夏季に現れることが多く,また河川水Bでは致死効果,河川水Cでは産仔数減少が主に見られ,毒性の現れ方に特徴が確認できた。毒性削減実験の実施等により毒性要因を検討した結果,多くの場合,河川水Bでは疎水性有機物,河川水Cでは亜鉛イオンの寄与が示唆された。2多世代繁殖試験による評価:河川水B,Cを中心に多世代繁殖試験を実施した。その結果,対照区と有意差がみられないことが多かったが,一部サンプルにおいて致死は起きなかったが産仔数が有意に減少したことから本試験実施による安全性評価の有用性が示された。3下水処理放流水の評価:当該水系への排出水量が多い排水として2ヶ所の下水処理場の放流水について複数回試験を実施した。その結果,希釈率を考慮した10%濃度の放流水では,いずれも毒性が検出されず,下水処理放流水が河川水の毒性要因になっている可能性は低いと考えられた。土木環境システム平成25年度の主な目標は,河川水によるC. dubia繁殖試験を年間を通して実施し河川水の毒性レベルを明らかにすること,及びで水系への排出水量が多い排水の毒性評価の実施であった。また,多世代繁殖試験の試験法について確立することも目的とした。これらの目標に対して,多数の実験を行い,3地点の河川水における毒性の特徴を明らかにすることができ,毒性要因も絞り込めた。これらの成果は国内学会(土木学会環境工学研究フォーラム,土木学会関東支部技術研究発表会)にて公表した。さらに,多世代繁殖試験の試験法についても種々の検討を行えたことから,研究はおおむね順調に進展していると言える。平成24年度の主な目標は,C. dubia繁殖試験方法を確立すること,及び河川水による繁殖試験を実施して河川水の毒性レベルを明らかにすることであった。また,河川水を試料とした場合のオオミジンコ(D. magna)繁殖試験の結果と比較することも目的とした。C. dubia繁殖試験方法の確立に関しては,安定的に試験成立条件を満足することがD. magna繁殖試験よりも一般に困難であるため,飼育・試験時の水の種類,硬度レベル,給餌方法等を検討した。その結果,試験成立条件を安定的に達成できる方法を比較的早い時期に確立できた。また,サンプル数は多くなかったものの,同一河川水サンプルを用いて同時にC. dubia繁殖試験とD. magna繁殖試験を行った結果,両者の感度が概ね等しいことを見出した。河川水での繁殖試験のデータ取得に関しては,試験確立後,地域近郊の代表的な3地点を選定し,定期的にサンプリングを行い,主要水質項目を測定した上で繁殖試験を実施した。毒性が検出される場合は用量-反応関係に正常な傾向が確認でき,信頼性の高い毒性レベルを得るとともに,地点・季節による影響を明らかにした。
神経幹細胞を用いた脊髄損傷の治療法の確立

われわれは、神経幹細胞移植の至適時期を決定するために、損傷脊髄内の種々のサイトカインや神経栄養因子の発現の変化を調べ、至適時期が脊髄損傷後12週であることを報告した。この結果に基づき、ラット脊髄損傷後9日目にラット神経幹細胞移植を行い、移植細胞の良好な生着とニューロン、オリゴデンドロサイトへの分化を認め、さらに運動機能の回復が得られることを報告した。次に、脊髄損傷に対する神経幹細胞移植を臨床応用するためには、霊長類であるサル脊髄損傷に対するヒト神経幹細胞移植の有効性を確認することが重要と考えた。第一段階として、損傷程度の異なるサル脊髄損傷モデルと機能評価法を確立し、この損傷モデルを用いて齧歯類と同様に損傷後9日目にヒト神経幹細胞移植を行い、移植細胞の生着、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトへの分化を認め、さらに移植による有意な運動機能の回復がみられた。これらの結果は近未来における脊髄損傷に対する神経幹細胞移植の臨床応用に向けた大きな一歩であることは言うまでもない。しかし、慢性期脊髄損傷患者への臨床応用を考慮すると、損傷部で軸索伸展を阻害するグリア瘢痕の克服が必須と考えた。そこで、脊髄損傷後に発現の増加が見られるIL-6が内在性及び移植神経幹細胞をアストロサイトへと分化誘導しグリア瘢痕組織を形成する因子であることに着目し、マウス脊髄損傷後にIL-6受容体抗体を腹腔内投与することにより、損傷部周囲の反応性グリア組織と線維性瘢痕組織の有意な縮小、さらには運動機能の有意な回復が得られた。さらにセマフォリン3Aに対する阻害剤をラット胸髄完全切断損傷モデルに投与し、損傷軸索の再生と機能評価を行った。薬剤投与群では損傷部を貫き再生した軸索が数多くみられ、これらはシュワン細胞により髄鞘化されていた。また薬剤投与群で下肢運動機能も有意に良好な回復がみられた。今後はこれまでの研究により有効性が確認できた治療法を組み合わせることにより、我が国発のヒト脊髄損傷に対するヒト幹細胞を用いた世界で初めての治療法を近未来に確立できると考えているわれわれは、神経幹細胞移植の至適時期を決定するために、損傷脊髄内の種々のサイトカインや神経栄養因子の発現の変化を調べ、至適時期が脊髄損傷後12週であることを報告した。今後はこれまでの研究により有効性が確認できた治療法を組み合わせることにより、我が国発のヒト脊髄損傷に対するヒト幹細胞を用いた世界で初めての治療法を近未来に確立できると考えている損傷脊髄の再生を目的とした神経幹細胞移植を確立するために、ラットおよびサルを用いた基礎的研究を行った。これまでのわれわれの損傷脊髄内の微小環境に関する研究より、損傷直後よりも損傷後亜急性期(損傷後12週)のほうが脊髄内の環境は移植に適しているとの考えから、成体ラット脊髄に損傷後9日目にラット胎児由来神経幹細胞を移植した。移植細胞は生存・移動し、ニューロンへと分化することが明らかになった。さらに移植後は有意な上肢運動機能の改善がみられた。これらの結果を踏まえて臨床応用により一歩近づけるために、ヒトと同じ霊長類であるサル損傷脊髄に対するヒト神経幹細胞移植を行った。頚髄損傷モデルは、コモンマーモセットを用いて重錘落下法に準じて作成した。損傷後9日目に、BrdUで標識したヒト胎児由来神経幹細胞を損傷中心部の空洞内に注入した。損傷後の運動機能評価は、赤外線センサーによる三次元的運動量モニタリングと上肢筋力測定を行った。移植後8週に経心臓的還流固定を行い損傷脊髄の組織学的検索を行った。損傷中心部の空洞周囲にはBrdU陽性の移植細胞が多数存在した。

免疫二重染色の結果、これら移植細胞が損傷脊髄内の微小環境に応じてニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトに分化することが明らかになった。運動機能評価でも、移植群で有意な自発運動量の増加と上肢筋力の改善がみられた。損傷脊髄の再生を目的とした神経幹細胞移植療法を確立するために、齧歯類(マウス、ラット)霊長類(サル)を用いた基礎的研究を行っている。昨年度は、1)神経幹細胞移植の時期の検討、2)サル脊髄損傷モデルの確立、3)サル脊髄損傷に対する神経幹細胞移植の有効性を報告した。今年度は、これらをさらに臨床応用に一歩近づけるために、1)移植方法の改良(細胞外基質の併用)、2)損傷脊髄内の微小環境の修飾(IL-6受容体抗体の併用)、3)軸索伸展阻害因子であるセマホリン3A阻害剤の併用などの研究を行い、神経幹細胞移植法の改良を試みた。1)細胞外基質の併用:先ず、collagen type Iを用いたラット神経幹細胞の3次元培養システムを確立した(至適コラーゲン濃度、細胞密度の決定)、次にラット脊髄損傷後9日にcollagen type Iとともに神経幹細胞移植を行ったところ、より良好な移植細胞の生着と運動機能の回復がみられた。2)脊髄損傷後に発現の増加が見られるIL-6やCNTF等のgp130を介したsignalが内在性及び移植神経幹細胞をアストロサイトへと分化誘導する因子の一つと考え、損傷脊髄にIL-6受容体抗体を投与したところ、損傷部周囲のグリア組織の有意な縮小と運動機能の回復がみられた。3)グリア瘢痕組織内に存在し軸索伸展を阻害するセマフォリン3Aに対する阻害剤を用いて、損傷軸索の再生と機能評価を行った。薬剤投与群では、損傷部を貫き再生した軸索が数多くみられ、運動機能も有意に良好な回復がみられた。今後これらの治療法と神経幹細胞移植を組み合わせて行っていく予定である。損傷脊髄の再生を目的とした神経幹細胞移植療法を確立するために、齧歯類(マウス、ラット)霊長類(サル)を用いて、1)細胞外基質を併用した神経幹細胞移植の検討、2)前脳および脊髄由来神経幹細胞移植の比較検討、3)損傷脊髄内の微小環境の修飾(IL-6受容体抗体の併用)、4)軸索伸展阻害因子(セマフォリン3A)に対する阻害剤の検討を行った。1)細胞外基質の併用:ラット胸髄損傷モデルを作製し、9日後にコラーゲンタイプ1ゲルとともに神経幹細胞を移植した。コラーゲンにより良好な移植細胞の生着と損傷部空洞の縮小、さらに運動機能の回復がみられた。2)脊髄由来神経幹細胞は前脳由来神経幹細胞と比較して増殖能が低いため、今後の臨床応用に向けた大量細胞供給は困難が予想される。そこでこれまでわれわれが行ってきた損傷脊髄に対する脊髄由来神経幹細胞移植と同様に前脳由来神経幹細胞移植でも同様な有効性が得られるかを検討した。移植後の細胞の生着に違いはみられなかったが、分化した細胞は前脳由来ではニューロン、脊髄由来ではオリゴデンドロサイトが多数見られた。運動機能は両郡とも非移植群よりも有意な回復が得られた。3)脊髄損傷後に発現の増加が見られるIL-6やCNTF等のgp130を介したsignalが内在性及び移植神経幹細胞をアストロサイトへと分化誘導する因子の一つと考え、脊髄損傷後に腹腔内に抗IL-6受容体抗体を投与した。損傷部周囲のグリア組織と線維性瘢痕の有意な縮小と運動機能の回復がみられた。4)グリア瘢痕組織内に存在し軸索伸展を阻害するセマフォリン3Aに対する阻害剤を用いて、損傷軸索の再生と機能評価を行った。
成長に伴い口径を拡張させ得る小児用人工血管の開発

小児用人工血管はその成長の過程が個人や成長時期によって、大動脈の口径の成長度がまちまちであるため、その開発は困難であった。今回、我々は経皮的血管形成術を用いて対外から人工血管内腔に圧力を加えることにより口径を拡大させ得る人工血管を開発した。その原理は人工血管をポリエステル繊維を平織りにして作成する。そしてその構成は縦の捻糸(繊維群)と横の捻糸とで形成される。つまり縦の捻糸は通常の強度のポリエステル繊維を用いるが、横の捻糸は2種類のポリエステル繊維で形成するように作成した。そして強度の強い捻糸群を螺旋状にし、その中心に強度の弱いポリエステル繊維群を置き全体として横の捻糸ができ弱い捻糸群が最初の口径を規定することになる。そして口径の拡張する必要が生じた時内腔を加圧して弱い捻糸に緊張をかけ、弱い捻糸を切断されれば強度の強い螺旋状の捻糸群が引き延ばされて口径が拡大するという設計で作成した。この人工血管をex vivoの実験と伴に雑種成犬を用いたin vivoの実験で人工血管の口径が拡張されるかを検討し良好に機能を果たせる確信を得た小児用人工血管はその成長の過程が個人や成長時期によって、大動脈の口径の成長度がまちまちであるため、その開発は困難であった。この人工血管をex vivoの実験と伴に雑種成犬を用いたin vivoの実験で人工血管の口径が拡張されるかを検討し良好に機能を果たせる確信を得た経皮的血管形成術で拡大できる小児用人工血管小児の成長に伴い口径が拡大できる人工血管の開発を行ってきたが、今回経皮的血管形成術(PTA)で口径を小児の成長にあわせていつでも拡大できる人工血管を開発しつつある。それは人工血管の横の捻糸を二種類とし強度の弱いポリエステルの回りを強度が強くて長いポリエステルを螺旋状に巻き全体として〓つの横の捻糸を形成する。この横の捻糸と一般の縦の捻糸で平織りの人工血管を作成する。そして横の捻糸の弱いポリエステル繊維がPTA切断されれば強くて長いポリエステル繊維が進展され人工血管の口径が拡大されるというものである。ex vivoでの実験でPTAバルーンを10気圧の加圧することにより口径は6mmが、9mm、8mmが1.4mmと1.5倍に拡大した。さらに雑種成犬胸部大動脈を使用した動物実験で人工血管置換後3カ月の時点でPTAすることにより内膜が亀裂を生じ口径が拡大している所見が得られた。さらにこれを血管造影で確認した。またPTAにより外膜側に形成されることを危惧された血腫は存在するものの少量であり、問題とはならなかった。これらの実験により生体内で拡張できる人工血管の第一段階は終了したと思われるこの我々の小児用人工血管について平成5年度の人工臓器学会、平成6年度の心臓血管外科学会で発表した。さらに平成6年度のアメリカ人工臓器学会で報告する予定である。小児の成長に伴い口径が拡大できる人工血管の開発を行ってきたが。今回経皮的血管形成術(PTA)で口径を小児の成長にあわせていつでも拡大できる人工血管を開発しつつある。それは人工血管の横の捻糸を二種類とし強度の弱いポリエステルの回りを強度が強くて長いポリエステルを螺旋状に巻き全体として一つの横の捻糸を形成する。そして横の捻糸の弱いポリエステル繊維がPTAで切断されれば強くて長いポリエステル繊維が伸展され人工血管の口径が拡大されるというものである。ex vivoでの実験でPTAバルーンを10気圧の加圧することにより口径は6mmが9mm、8mmが1.4mmと1.5倍に拡大した。さらに雑種成犬胸部大動脈を使用した動物実験で人工血管置換後3カ月の時点でPTAすることにより人工血管の内膜が亀裂を生じ口径が拡大している所見が得られた(肉眼的、血管造影で)。またPTAにより人工血管の外膜側に形成されることを危惧された血腫は存在するものの少量であり、量的には問題とはならなかった。さらに平成6年度はサンフランシスコで行われた第40回アメリカ人工臓器学会で報告し反響を得た。小児用人工血管はその成長の過程が個人や成長時期によって大動脈の口径の成長度がまちまちであるためその開発は困難であった。今回我々は経皮的血管形成術を用いて体外から人工血管内腔に圧力を加えることにより口径を拡大させ得る人工血管を開発した。

そしてその構成は縦の捻糸(繊維群)と横の捻糸とで形成される。つまり縦の捻糸は通常の強度のポリエステル繊維を用いるが横の捻糸は2種類のポリエステル繊維で形成するように作成した。そして強度の強い捻糸群を螺旋状にしその中心に強度の弱いポリエステル繊維群を置き全体として横の捻糸ができ弱い捻糸群が最初の口径を規定することになる。そして口径の拡張する必要が生じた時内腔を加圧して弱い捻糸に緊張をかけ、弱い捻糸を切断されれば強度の弱い螺旋状の捻糸群が引き延ばされて口径が拡大するという設計で作成した。この人工血管をex vivoの実験と伴に雑種成犬を用いたin vivoの実験で人工血管の口径が拡張されるかを検討し良好に機能を果たせる確信を得た
脊髄損傷における骨髄間質細胞を用いた再生医療の確立

本研究は、自然発症の脊髄損傷の動物に自己の骨髄間質細胞(BMSCs)を移植して、脊髄を修復および再生させ、自立歩行を可能とすることを最終目標とした極めて臨床的で実際的な研究である。3ヵ年にわたり1)犬のBMSCsの培養方法の確立、2)犬のBMSCsの多分化能の検討、3)犬のBMSCsのニューロンへの分化、4)犬のBMSCsのシュワン細胞への分化、5)犬のBMSCsの自己血清を用いた培養法の検討、6)犬のBMSCsの凍結保存法の検討7)本治療法の実症例への臨床応用と治療効果の検討の順で実施した。本年度は、犬の骨髄間質細胞(BMSCs)のニューロンおよびシュワン細胞への分化の可能性について検討したので、その成果の一部を報告する。犬のBMSCsの培養は、以前に申請者が確立した方法で行った。まず、犬のBMSCsのニューロンへの分化に関する検討を行った。BMSCsをβ-mercaptoethanolを含むDMEMを用い、24時間培養した。次いで、DMSOおよびBHAを含むDMEMで培養し、ニューロンへの分化誘導を試みた。犬のBMSCsは、約65%でニューロン様の形態へと変化し、その全ての細胞でNSEおよびneurofilamentが陽性であった。これらの細胞を走査型電子顕微鏡で観察したところ、細胞体の核周囲には細胞小器官が密に集合し、細胞体辺縁ではフィラメントの走行が認められた。細胞体から伸長する樹状突起や軸索も観察できた。これらの突起の先端部分では、シナプス結合部や成長円錐と思われる構造も観察できた。これらの結果は、犬のBMSCsがニューロンへと分化する能力を有していることが示唆された。次いで、犬のBMSCsのシュワン細胞への分化に関する検討を行った。犬のBMSCsをβ-mercaptoethanolを含むDMEMを用い24時間培養した後に、bFGF、Neurogulin、Forskolinなどを含む培養液用いて、シュワン細胞への分化誘導を試みた。BMSCsから誘導された細胞の形態は、他品種における報告のシュワン細胞と類似していた。ほぼ全ての細胞がシュワン細胞様の形態へと変化し、GFAP陽性率は約95%であった。これらの結果は、犬のBMSCsもシュワン細胞へと分化する能力を有している可能性が示唆された。本研究では、犬のBMSCsの培養法を確立し、さらにBMSCsのニューロンおよびシュワン細胞への分化を確認した。今後、さらに分子生物学的手法を用いて分化の過程を検討して行く予定である。また、in vivoにおいて犬のBMSCs移植における脊髄再生医療の有用性についても検討していく予定である。本年度の検討内容は、第143回日本獣医学会学術集会で報告し、現在、論文作成中である。本年度は、犬の骨髄間質細胞(BMSCs)の多分化能と、牛胎子血清(FBS)を用いない培養方法の確立を試みた。また、自然発症脊髄損傷の犬および猫で、飼い主の同意の得られた数例においてBMSCsの移植を行い、その臨床効果について検討したので、その成果の一部を報告する。犬のBMSCsを1回継代後に、他動物種で行われている方法に順じ、脂肪、軟骨、骨への分化を試みた。分化誘導後に、その形態の観察および特殊染色を行い検討したところ、犬のBMSCsも他の動物種と同様に脂肪、軟骨、骨への分化能を示し多分化能を有する可能性が明らかになった。現在、臨床応用するにあたり培養過程におけるFBSの使用が問題視されている。そこで、犬のBMSCsを自己血清(AS)添加培地で培養し、その増殖能およびニューロンへの分化能を検討した。AS添加培地を用いて培養しても、犬のBMSCsはFBSを用いた時と同等の増殖能とニューロンへの分化能を有していた。また、犬のBMSCsをASを用いて培養するときには10%が至適濃度であることが、本研究から示唆された。自然発症脊髄損傷の犬および猫において、BMSCsの移植効果を検討した。現在までに、5例行っていて経過観察中であるが、全例ではないが何らかの神経機能の改善が認められた。しかし、歩行可能となるまで改善した症例は無く、今後の課題となった。本年度の検討内容は、第143回日本獣医学会学術集会、第45回日本大学獣医学会で報告し、日本獣医師会誌においても研究の一部を誌上で公表した。現在は、これらのデータをまとめて論文作成中である。本年度は、犬の骨髄間質細胞(BMSCs)の長期の保存法として、凍結保存法に関する検討を行った。また、自然発症脊髄損傷の犬および猫で、飼い主の同意の得られた症例においてBMSCsの移植を行い、その臨床効果についても検討した。

犬のBMSCsを本研究室で確立した方法に順じ分離した。BMSCsを分離後、1×10^6cells/mLの濃度となるように、細胞凍結保存液(Cellvation^<TM>)に混じ-80°Cで長期間凍結保存した。一定期間の保存後に解凍を行い、再度BMSCsを培養し、その形態の観察や増殖能、ニューロン分化能を比較した。凍結保存後は、全例で紡錘形で線維芽細胞様の凍結前と同様の細胞の増殖が観察された。凍結保存後の増殖能は凍結前とほとんど差は無く、全例でニューロン様細胞への形態の変化も観察された。その時のニューロン分化率は75±7.0%、NSE陽性率は88±5.6%であった。これらの結果は、Cellvation[○!R]を用いた犬BMSCsの凍結保存が有効であることが実証された。前年度に引き続き、自然発症脊髄損傷の犬および猫においてBMSCsの移植効果を検討した。現在までに移植を行った8例について検討を行った。BMSCsの移植を行った、75%(6/8)で麻痺肢の随意運動が認められた。また、37.5%(3/8)で自力歩行が可能となった。これらの成績は、従来の治療法に比較して極めて良好な結果であった。移植細胞数が多く、損傷部位に移植を行うことができた症例において、成績が優れている傾向が認められた。一方で、損傷位置や移植までの期間は、治療成績に影響を及ぼさなかった。本年度までの検討内容は、第5回日本獣医内科学アカデミー、第145回日本獣医学会学術集会、第46回日本大学獣医学会など種々の学会で報告した。現在は、これらのデータをまとめて論文作成中である。
凝縮系における量子ビーム誘起超高速電荷移動過程の研究

フェムト秒パルスラジオリシスの測定波長を近赤外から紫外領域まで拡張し、代表的な非極性液体であるドデカン中でジェミネートイオン再結合の詳細な測定を行った。その結果、イオン化で最初に生成する励起ラジカルカチオンの間接的証拠を得た。芳香族捕捉剤により励起ラジカルカチオンの高い反応性を解明し、これまで困難だったラジカルカチオンのモル吸光係数を13950M-1cm-1、G値を2.5,初期イオン化G値を4.5と解明した。紫外領域で7 psのアルキルラジカル生成過程を観測した。ドデカンの放射線分解に、励起ラジカルカチオンが直接関与している可能性が高いことを見出し、放射線化学分野の重要な知見を得た。平成25年度は、ドデカンの放射線分解過程と放射線化学初期過程の関係を明らかにするために、これまで困難だった紫外フェムト秒パルスラジオリシスシステムを開発し、それを用いて、ドデカン中のアルキルラジカル生成過程を研究した。結果7 psの非常に速い生成を観測した。その結果ドデカンの放射線分解に、励起ラジカルカチオンが直接的に関与している可能性が高いことを見出し、放射線化学分野の重要な新しい知見を得た。以下に詳細を示す。1紫外フェムト秒パルスラジオリシスシステムの開発:紫外域240 nmで観測されるアルキルラジカルを測定するために、紫外用の光学系、検出器、ファイバ等を導入し、フェムト秒パルスラジオリシスの測定波長領域を240 nmまで拡張した。2パルスラジオリシスシステムの安定化と測定手法の高度化:ノイズ源の切り離し、検出器の遮蔽等のノイズ対策を行うとともに、積算回数のみならず、測定回数を大幅に増やす等の統計処理により従来の1/10以下の強度(1 mO.D.以下)の過渡吸収が観測可能となった。3ドデカン中のアルキルラジカル生成過程の研究:核燃料再処理における溶媒の放射線分解や、次世代量子ビームナノファブリケーションでパターン形成の基礎過程となる鎖切断で生じるアルキルラジカルの生成過程をドデカン中で研究した結果、7 psの非常に速い生成を観測した。その結果ドデカンの放射線分解に、励起ラジカルカチオンが直接的に関与している可能性が高いことを見出した。4水中のヒドロキシラジカル直接観測の開拓:放射線治療において重要な活性種であるける水中のヒドロキシラジカルをフェムト秒で測定する環境が整った事により、ヒドロキシラジカルの反応挙動の直接観測に道を拓いた。平成24年度は、フェムト秒パルスラジオリシスシステムの測定波長を拡張し、代表的な非極性液体であるドデカン中でジェミネートイオン再結合の詳細な測定を行った結果、励起ラジカルカチオンの間接的証拠を得て、カチオン捕捉剤および芳香族捕捉剤による励起ラジカルカチオンの反応性を解明し、これまで非常に困難であったドデカンのラジカルカチオン及び初期イオン化G値を決定した。励起ラジカルカチオンの間接的証拠:代表的な非極性溶媒であるドデカンで、近赤外領域の800 nmでラジカルカチオンを測定し、1200 nmで余剰電子の時間挙動を詳細に測定した結果、長時間領域では再結合による同じ減衰挙動を示し、初期過程は全く異なる挙動を示した。このことは観測しているラジカルカチオンが、従来モデルにおけるジェミネートイオン再結合していることを確認したと共に、前駆体である励起ラジカルカチオンから生成することを示した。励起ラジカルカチオンの反応性を解明:ドデカンラジカルカチオンの時間挙動のトリエチルアミン(TEA)等のカチオン捕捉剤、ビフェニル(Bp)等の芳香族(両)捕捉剤の濃度依存性を測定し、モデルに基づいてモンテカルロシミュレーションを行った結果、励起ラジカルカチオンが3×1011[M-1s-1]に達する高い反応性を持つことが明らかとなった。ドデカンのラジカルカチオン及び初期イオン化G値を決定:芳香族捕捉剤(ビフェニル)の濃度依存性を測定した結果からドデカンラジカルカチオンとビフェニルラジカルカチオンの比を得て、ドデカンラジカルカチオンのモル吸光係数を決定し、G値を求めた。励起ラジカルカチオンを含んだモデルとの比較により、これまで困難だったドデカンの初期イオン化G値を決定した。本研究は、阪大産研で開発されたフェムト秒パルスラジオリシスシステムを活用するのみならず、新機能付与など発展することにより、代表的な非極性液体であるドデカン等の凝縮相中での量子ビーム誘起電荷移動過程解明を推進している。様々な種類の活性種を測定するために、まず測定波長領域の拡張を図った。

その結果、240 1600 nmの波長領域での測定に既に成功し、過渡吸収時間挙動と過渡吸収スペクトル変化を得た。測定波長の拡張により可能となった、ドデカンのラジカルカチオンとイオン化によって生じた余剰電子のジェミネーとイオン再結合を詳細に測定し、モデルに基づいたシミュレーションを行ったことにより、これまで非常に困難であったドデカンのラジカルカチオンおよびドデカンの初期イオン化G値を決定することに成功した。本研究の進捗状況は順調である。現在は特に紫外領域に着目しており、ドデカンの分解および水素発生に関係しているアルキルラジカルの挙動について、新しい知見が得られつつある。現段階でも革新的な成果が数多く得られており、今後も予定以上の成果が見込まれる。平成25年度は、現在進行中のドデカンの分解および水素発生に関係しているアルキルラジカルの生成・反応挙動を解明し、設計した温度可変セルホルダーを用いて温度を変化させた場合の電子捕捉反応速度定数やカチオン(ホール)捕捉反応速度定数を測定し、高反応性活性種の特性や反応機構を解明する。消耗品として、試料など化学薬品、試料調整のためのガラス器具、パルスラジオリシス測定のための特注光学研磨薄板石英セル、紫外光用ミラー、光学部品保持器具等を購入する。温度制御セルホルダーおよびコントローラーの高度化により精度を向上する。他に研究成果の論文投稿費や、国内・国際会議での成果発表の旅費として使用する。
Wntシグナル経路を介したCdh1による大腸癌浸潤・転移の制御

Cdh1の生体での役割を検討するために、Cdh1の9つのリン酸化部位をすべて変異させたマウスを作製した。Cdh1は非リン酸化により活性化する性質があるため、ホモ変異マウスは生体すべてにおいてCdh1活性化状態にあると考えられる。また、コントロールマウスとしては、通常の野生型B6マウスでは厳密なコントロールマウスとは言えず、同じ遺伝子操作を経て作り出した野生型マウスを用意する必要があった。そして、その野生型コントロールマウスの作製にも成功した。これらのマウスに大腸癌発癌モデルであるAOM-DSS実験を行った。すなわち発癌物質であるAOMを腹腔内投与し、その1週間後2週間後に炎症作用のあるDSSを飲水させた。その結果、コントロールマウス、Cdh1活性型マウスともに短期間の下血が見られ、その後は一時的に減少した体重も回復し始めた。さらに10週以上の経過観察期間ののち、まずコントロールマウスについて開腹し、大腸について調べたところ、肛門に近い大腸にポリープを数個形成しており、本マウスにおいてもAOM-DSSの実験系が機能していることを確認した。現在、Cdh1ホモ活性型マウスについてはまだ経過観察期間中であり、大腸の解析ができていないが、コントロールマウスと比較すると体重減少率が大きいという結果が得られている。この結果より、コントロールよりも多くの大腸ポリープを形成している可能性が考えられる。一方、in vitro実験では、アレイ結果に基づいてCdh1発現を変化させた大腸癌細胞株における実際のWntファミリーの発現をqPCRで解析した。古典的Wnt経路であるWnt 3A、9Aの発現が上昇していることを確認した。Cdh1ヘテロ変異マウスの同士の交配により、ホモ変異マウスの作製を行った。しかし、産仔が生まれる確率が低く、さらに雄のCdh1ホモ変異型マウスには妊孕性がないことが判明した。これらの解析に時間を要したが、途中からホモ変異型の雌とヘテロ変異型の雄を交配することで、ホモ変異型産仔を得る確率を上げることができた。また、大腸癌発癌実験系であるAOM-DSSを行ったが、適切なDSS濃度を定めることに時間を要した。すなわち、一般的に用いられている2%DSSを飲水させたところ、早期にマウスが死亡し、本実験で使用するマウスにおいてはDSSの濃度が濃すぎる結果であった。その後、条件検討を行い、1.5%DSSであればマウスが死亡することなく腸炎を起こし、大腸腫瘍を形成することを確認した。Cdh1ホモ変異型マウスと、コントロールとなるマウスを得る方法を確立したため、現在、順調に大腸癌発癌実験が進行中である。今後は、解析数を増やすことで、Cdh1の活性化が大腸癌発癌に及ぼす影響が明らかになることが予想される。Cdh1の活性化により大腸腫瘍の発生が増加するという結果が確かになった場合、その理由を明らかにする必要がある。予備実験によりWntの関与が示唆されていることから、今後はWntの阻害剤を用いたin vitro、in vivo両方の解析を行っていく予定である。必要があれば、Cdh1ホモ変異型胎児より胎児線維芽細胞(MEF)を樹立することで、in vitroとin vivoの実験で得られた結果をつなぐ検討を進める。本研究では、大腸癌の浸潤・転移におけるCdh1の役割を明らかにすることを目的としており、まず上皮間葉転換(EMT)について検討した。Cdh1をsiRNAで抑制した大腸癌細胞を用いて、wound healing assay、transwell migration assayによる細胞の運動能・浸潤能を評価したが、コントロールと比較して有意な差が見られなかった。そこで、それらの細胞よりRNAを抽出し、qPCRによりSnail、Slug、Zeb1、Zeb2などのEMTで変化する転写因子の発現を確認した。その結果、Cdh1抑制によりSnailの発現だけが有意に亢進し、他の転写因子では有意な差を認めなかった。この結果は、Cdh1が大腸癌におけるEMTに関与しているとするには不十分であり、再実験に加え、今回検討しなかった転写因子についても解析する必要があると思われる。また、予備実験の結果から、特にWntシグナル経路を介したCdh1の働きに着目おり、Cdh1抑制大腸癌細胞のRNA用いて、Wnt1, 3, 3A, 6, 9A, 9B, 10A, 10BなどのqPCRを行った。現時点では十分に評価できる結果ではなかったため、実験条件について検討を行っている。一方、動物実験では、Cdh1のリン酸化抑制型変異マウスで大腸癌発癌実験(AOM-DSS)を予定しており、現在、ヘテロマウスの作製が終了した。ホモ変異型マウスを得るために、ヘテロマウス同士の交配、遺伝子型決定を進めている。以前、解析に用いたCdh1の発現を抑制したマウスは、系統の維持が困難となり一度飼育を終了していたため、新たにマウスを作製する必要があった。そこで今回は、よりCdh1の機能に迫るべく、単なるCdh1発現抑制マウスではなく、Cdh1のリン酸化だけを抑制した変異マウスを用いる方針とした。このマウスは胚の状態で当大学の動物資源開発研究施設に保存してあり、胚より個体を作製する必要があった。この手続きに想定していた以上の時間を要し、当初予想した進捗には至らなかった。現在は、Cdh1のリン酸化抑制型ヘテロ変異マウスが誕生している。