hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノウイルスベクターによる新生児を対象とした遺伝子治療の検討

血友病A患者が欠損している血液凝固第8因子(FVIII)は血中半減期が約12時間と短いことが知られている。そこで免疫グロブリンGのFc領域との融合によりFVIIIの血中半減期を向上させることで、遺伝子治療効果が向上すると期待して、Fc融合FVIIIを構築した。さらに、Fc融合FVIIIを搭載したAd-E4-122aTを構築し、血友病A成体マウスに投与することで、融合タンパク質が血液凝固活性を示すか検討した。その結果、マウスの止血能を正常レベルにまで回復させることに成功し、Fc領域との融合によりFVIIIの活性が損なわれないことを確認した。これまでの知見をもとに、Adベクターの改良や新たな先天性遺伝子疾患である血友病Aに対する遺伝子治療を試みた。期待通りの結果が得られず、難航する場面がみられたものの、粘り強く課題を解決しながら、改良型Adベクターの作製や、改良型FVIII遺伝子の作製を成し遂げた。また、基礎検討ではあるものの、改良型FVIII搭載Ad-E4-122aTを用いて成体マウスに対する遺伝子治療効果を検討することができ、本年度の目標を達成できた。本研究では、遺伝子導入用ベクターとして優れた特長を有するアデノウイルス(Ad)ベクターを用いて、新生児に適した新規遺伝子治療薬を開発することを目的としている。これまでにAdベクターは新生児マウスにおいても高い遺伝子導入効率を示すものの、わずかにAdタンパク質が発現することで組織障害が誘導されることを明らかとしている。そこで、当研究室で独自に開発した肝臓特異的なmicroRNAであるmiR-122aを利用して、Ad遺伝子の発現を抑制可能な改良型Adベクター(Ad-E4-122aT)を用いて検討を行うこととした。本年度はまず、血友病Aに対する遺伝子治療を試みた。血友病A患者が欠損している血液凝固第VIII因子(FVIII)は血中半減期が約12時間と短い。そこで、免疫グロブリンGのFc領域との融合によりFVIIIの血中半減期を向上させることで遺伝子治療効果が向上すると期待し、Fc融合FVIII(FVIIIFc)を発現するAd-E4-122aTを血友病Aモデル新生児マウスへと投与した。しかしながら、FVIIIFc発現Ad-E4-122aT投与群と、Fc領域を融合していないFVIIIを発現するAd-E4-122aT投与群で血中FVIII活性値は同程度であり、治療効果は増強されなかった。次に、血友病B胎児に対する治療を試みた。血友病B患者が欠損している血液凝固第IX因子(FIX)にFc領域を融合することでFIXに胎盤透過性を付与し、母体から胎児へとFIXを送達可能と考えた。そこで、Fc融合FIX(FIXFc)を発現するAd-E4-122aTを血友病Bモデル妊娠マウスへと投与し、生後0日の新生児マウス血中におけるFIX濃度を測定した。その結果、治療域の血中FIX濃度が新生児マウスから検出され、母体にて発現させたFIXFcにより、血友病B胎児を治療することに成功した。本年度の研究成果をもとに、次年度は新たな対象疾患である血友病Aに対する遺伝子治療を試みる。
岩石透水実験から推察する沈み込み帯での流体循環

蛇紋岩はかんらん岩に比べ著しく遅い弾性波速度や高いポアソン比を持つため,沈み込み帯でみられる地震波低速度層や高ポアソン比領域の原因として注目されている。しかしながら,関東下や西南日本のプレート境界で報告されるポアソン比0.31は,蛇紋岩(アンチゴライト0.28)の存在だけでは説明がつかず,その領域には蛇紋岩に加え流体が共存している可能性が高い。そこで,本研究では間隙流体圧下における弾性波速度の測定システムの開発を行い,蛇紋岩の弾性波速度に対する間隙水圧の効果を定量的に検証することを試みた。実験結果より,間隙水圧を上昇させると蛇紋岩の弾性波速度は遅くなり,ポアソン比は高くなることが分かったが,その変化幅は非常に小さい。間隙水圧を10MPaから100MPaに変化させた場合,ポアソン比は0.278から0.281に上昇し,その変化幅は0.003である。沈み込み帯でみられる高ポアソン比領域は0.31であることから,蛇紋岩に比べ約0.03のポアソン比の上昇が必要であるが,今回測定したような空隙率の低い蛇紋岩ではいくら間隙水圧を増加させてもそのような高ポアソン比を発生することは難しい。このことは,沈み込み帯でみられる高ポアソン比領域では,岩石が破壊することにより空隙率が上昇し,そのような空隙を流体が充填しポアソン比が異常に高くなっていると予想される。25年度が最終年度であるため、記入しない。沈み込み帯でみられる火山や地震活動は地球内部での流体循環と密接に関わっており,スロー地震も例外ではない。その震源域は高ポアソン比で特徴づけられること,また有効垂直応力が低いことなどから,スロー地震の発生域には流体の存在が示唆されている。沈み込み帯での流体循環は,これまで含水鉱物の安定関係により議論されてきたが,本研究では岩石中の粒界やクラックを移動する浸透流が沈み込み帯での水循環に影響を及ぼすとの新しいモデルを検証した。沈み込むプレートからマントルへ放出された水は浮力のため直上に移動すると考えられているが,蛇紋岩のように片理が発達した岩石では浸透率に異方性が生じ,流体移動が面構造に制約される可能性がある。室内実験により蛇紋岩の浸透率を測定したところ,片理に平行な方向で浸透率が2桁ほど高く,流体が面構造に平行な方向に流れやすいことが分かった(Kawano et al. 2011)。蛇紋岩化がみられるプレート境界では,沈み込みによる剪断変形のためプレート境界に平行な面構造が発達していることが期待される。その場合,脱水反応によりマントルへ放出された流体は蛇紋岩の面構造に沿いプレート境界方向に選択的に移動することが予想される。プレート境界での流体速度を蛇紋岩の浸透率をもとに計算すると,プレート境界方向では7 cm/yearとなる。西南日本では流体速度がフィリピン海プレートの沈み込み速度(4 cm/year)より速いため,マントルウェッジ内を流体は上方に移動すると期待される。一方,東北日本では太平洋プレートの沈み込み速度(10 cm/year)が流体速度より速いため,マントルウェッジへ吐き出された水は上方へ移動するのではなく,コナーフローによりさらに深部へ運び込まれる。このような沈み込み帯での流体循環の違いが,日本列島における火山や地震の地域性の一端を担っているのかもしれない。ほぼ計画どおり研究が進んでいる。岩石中の粒界に流体が存在すると地震波速度が著しく減少する。また、地震波速度は流体の形態や形状に依存するとも報告されている。蛇紋岩はマントルへの水の浸透により起きるが,そのような蛇紋岩化の最前線では自由な流体が岩石中を移動していると考えられる。

また,完全に蛇紋岩化した岩石では水に飽和し,さらに水が供給されても流体は蛇紋岩中を通過すると考えられる。そのように自由な水と共存する蛇紋岩の地震波速度を室内実験により検証する。蛇紋岩はかんらん岩に比べ著しく遅い地震波速度や高いポアソン比で特徴づけられるが,蛇紋岩中に流体が存在する場合はさらなる速度低下やポアソン比の上昇が期待される。関東下などのプレート境界で報告されているポアソン比(0.31)は蛇紋岩の存在(アンチゴライトのポアソン比は0.29)だけでは説明がつかず,蛇紋岩と流体が共存している可能性を示唆する。本年度は蛇紋岩の透水実験中に弾性波速度を測定することにより,水と共存する蛇紋岩の地震波特性を調べ,プレート境界での流体の分布や存在形態を議論したい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞性粘菌のゲノム解析による細胞分化を制御する遺伝子システムの解明

栄養条件下では単細胞アメーバとして分裂増殖するが、飢餓状態では集合して細胞分化を伴う多細胞体を形成するという独特な生活環をもつ細胞性粘菌を材料として、発生分化を制御する遺伝情報を理解するための研究を行った。まず、大規模cDNA解析により、遺伝子リソースを整備した。5種類の発生段階から14種類のcDNAライブラリーを構築し、完全長72,703クローンを含む95,884のcDNAクローンに由来する157,284配列のアセンブルによって、6,790の独立遺伝子を得ることができた。これはゲノム解読結果から予想される12,500遺伝子の約54%である。次に、このリソースを利用して逆遺伝学的・生物情報学的解析を行い、以下のような結果を得た。1.DNAマイクロアレイ解析によって正常発生における遺伝子発現の基本パターンを取得し、細胞の集合が遺伝子発現プロフィールの大規模な変化を誘導すること、脱分化過程を制御する遺伝子群のあることなどを明らかにすることができた。また、イン・シチュハイブリダイゼーションによって予定柄細胞領域内に精巧なパターン形成が行われていることを示した。2.予想転写因子遺伝子約260種を抽出し、そのうちの40種についてリアルタイムPCRによる精密な発現パターンを得るとともに、13種類の遺伝子破壊株を作製・解析した。3.転写因子遺伝子破壊株での遺伝子発現パターンの実データを元にして、S-システムによる計算で遺伝子ネットワークの予測を行った。4.完全長cDNA配列をゲノムにマッピングすることによって転写調節に関わるプロモーター配列を取得し、データベース化するとともに、発生過程における時期特異的遺伝子発現に関わると予想される配列を取得した。最も単純な多細胞体制をもつモデル生物、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumの大規模なcDNA解析を行ない、次の成果を得た。1)cDNA解析として、(1)新たに、増殖期由来のcDNAクローン約8,000個の塩基配列を決定(遺伝研・小原と共同研究)し、解析中であり、(2)増殖期、集合期、移動体期、子実体形成期の細胞由来の完全長cDNAライブラリーを作製(医科研・菅野と共同研究)し、まず、既知遺伝子の情報をもとにライブラリー(141クローンについて)の評価を行ったところ、90%が翻訳開始コドンを持つ高品質のライブラリーであった。現在、遺伝研で塩基配列を決定中である。2)遺伝子発現のプロファイル解析として、(1)約7,000個のクローンについて、米国ベイラー医科大学と共同でマイクロアレイを作製し、発生過程の経時的変化と分化した細胞(予定胞子細胞と予定柄細胞)で行ない、(2)遺伝子の空間的発現を、運動を支えるタンパク質遺伝子とcAMPの生産と制御に関与するタンパク質の遺伝子についてin situハイブリダイゼーション法で解析した。3)効率的でかつREMI法とは異なる挿入突然変異体作製法を開発する目的でポリAトラップ法を粘菌に適用できる条件検討を行ないつつある。4)現在、約2万個の配列をDDBJに登録しているが、Phrapを用いてcontig作製を行ない、移動体期のクローン約15,600(SLシリーズ、SSシリーズ)についてcontigを作製した。また、配列のアノテーションを行なう「カタログ」作成作業をプログラム化した。最も単純な多細胞体制を持ち細胞分化するモデル生物、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumの大規模cDNA解析を行い、次の成果を得た。(1)第2期cDNA解析として、オリゴキャップ方を用いて完全長cDNAライブラリーを作製し、大量の塩基配列情報を蓄積した。現在、Dicty cDBが保有する配列決定数は76,593個で、cDNAコンティグ数は6,427個である。これらの配列情報を整理し一部アノテーションを付けて、コンティグ配列とその関連情報としてホームページに掲載した。(2)転写の制御に関与すると思われる107種の遺伝子を抽出し、そのうち40種についてゲノムDNA配列との対応付けを行った。

その配列情報を参考にして、最近我々が開発したPCRだけで遺伝子破壊用DNAコンストラクトを作製し、37種の遺伝子について形質転換体を得て、現在破壊株かどうかを確認中である。(3)terminator REMI法を用いて27個の変異体を作製し、発生過程の写真撮影、ゲノムDNAへの貼り付け、遺伝子の前後の配列を決定し、整理した。(4)7,385クローンについて、発生過程での遺伝子発現プロファイルを解析した。その結果、「単細胞が集合する時期(発生後6時間目まで)」と「多細胞体を形成する時期」を境に、調べたクローンの1/4の遺伝子が顕著に変化することが分かった。また、細胞型特異的遺伝子を同定し、それら過程での発現の変化もあわせて解析した。(5)これまでに、約100遺伝子の発現パターンの解析により、空間的な発現パターンはダイナミックに変化することと、移動体期には5つの、子実体形成期には7つの発現パターンが存在することを明らかにした。(6)有性生殖期の差分化ライブラリーを作製し、その901クローンの配列を解析したところ、約60%が配偶子特異的で、新奇の配列を100個という高効率で取得することが出来た。最も単純な多細胞体制を持ち細胞分化するモデル生物、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumの大規模なcDNA解析を行い、次の成果を得た。(1)完全長cDNAライブラリーの中で残っていたHシリーズ43,724クローンの配列決定が終わり、計画していた全ての配列決定は終了した。解析した総cDNAクローン数は95,884で、157,284リードから得られたcDNAコンティグの総数は6,718になった。これらの配列情報を整理して1部アノテーションを付けその他の関連情報とともにHPで公開している。(2)染色体2番に存在する遺伝子のcDNAコンティグをGeneSeqrプログラムで染色体にたいして対応付けを行った。(3)40の転写制御関連遺伝子について、遺伝子破壊処理を行い16遺伝子について破壊株を得、また、Real time定量PCRで発現量を定量した。また、機能解析のために、部位特異的に発現する遺伝子のプロモーターとGFPを融合させたベクターを5種作製した。(4)脱分化過程での遺伝子発現プロファイルの解析が進行中で、この過程は3つのphaseを持ち、phaseIIで発現が上昇する遺伝子273個にはG2で発現するものが多かった。(5)細胞周期での遺伝子発現プロファイルの解析が進行中で、この過程には共発現する3つの遺伝子グループが存在することがわかった。(6)約400個の遺伝子についてin situハイブリダイゼーション解析を行い、特に予定柄細胞で発現する遺伝子に注目し、PstA, PstAB, PstO細胞特異的に発現する遺伝子を同定した。また、各発現パターンをデータベースとしてHPに掲載した。1.全cDNA
子宮頸がん予防に関する母親の意思決定を支援するサポート・プログラムの構築

2018年度は、大学生・高校生への健康教育、養護教諭が行う健康教育、母親に対するがん予防健康教育を実施することを予定していた。しかし、2017年から学校教育で「がん教育」を実施することが制度化され、文部科学省の報告では2017年の「がん教育」実施率は56%であった、とされている。これを受けて、本研究課題であるプログラムの再検討が必要と考え、新たに、子どもを子宮頸がんから護る母親への支援プログラムの検討を目的として、行政の保健師、小学校・中学校養護教諭、看護学研究者らによるグループディスカッションを実施した。その結果から、がん予防は学校での「がん教育」を基盤としながら、子どもと子どもをもつ親を対象とした「健康教育」が必要という見解に至った。同時に、学校における「がん教育」の課題も、内容の検討や時間数、担当する教師、依頼する外部講師など課題もいくつか挙げられた。結果は現在分析し、投稿準備をしている。また、先行研究として調査した子どもを持つ母親の子宮頸がん予防に関する認識の経年的変化について、論文投稿した。マスメディアで報道された情報が女児を持つ母親の子宮頸がん予防に対する意思決定に大きく影響していることが明らかとなった。現在投稿中である。グループ・ディスカッションした結果をもとに、サポート・プログラムを実践していく計画であったが、「がん教育」の動向の確認に時間を要したため、まだ実践にはつながっていない。法の改正を受けて、学校で実施する「がん教育」の動向を確認することに時間を要した。2018年10月に文部科学省が発表した報告では、2017年度の実施率は56%程度だったという。「がん教育」を担当する養護教諭への聞き取り調査からは、教育内容や時間数、担当教師や依頼する外部講師など検討課題は多様にあるよう思われた。本研究課題である子宮頸がん予防のためのサポート・プログラムは、大学生・高校生、母親、養護教諭を対象としていたが、「がん教育」が制度化されたことから、現況に合わせてプログラムを検討し直す必要性が生じた。2018年度に実施した研究成果から、学校での「がん教育」を基盤としながら、幼児期からからだといのちの大切さを学び、がん予防につなげていくプログラムを検討していくことが必要と考えている。大学生・高校生を対象としたプログラムについては学校における「がん教育」の成果を評価したうえで、再検討することとした。養護教諭の行う健康教育も同様である。今後は、子どもと子どもの親を対象とした「からだといのちセミナー」による健康教育が必要と考え、プログラムを現在修正している。セミナーのプレとポストとして、子どもへの健康教育とがん予防に対する親の意識調査を実施する。セミナーは数回実施し、参加者の反応から効果について評価していく予定である。セミナー内容は、子宮頸がんを含めたがん予防を基盤にして、幼児とともに参加した親も自分のからだを知り、いのちの大切さを考えるための機会にしたい。結果から、がん予防のための意義を検討していく予定である。平成2427年度科学研究費補助金基盤研究Cの助成を受けて、新しい子宮頸がん予防対策を検討してきた。本研究課題では、子宮頸がん予防ワクチンに関する情勢が激しく変動する中で、女児をもつ母親が子どもとともに、子宮頸がん予防に対して後悔しない意思決定をするためのサポート・プログラムを検討する。平成28年度は、若い女性の子宮頸がん予防に対する認識と行動を明らかにすることと、小学生を対象とした先駆的ながん教育の実際について調査した。女子大学生の子宮頸がん予防に関する認識と予防行動については、アンケート調査を実施した。対象は看護系女子大学生292人、子宮頸がん予防ワクチンの接種率は86.6%であった。最も接種率が低いのは4年生で73.9%であった。子宮がん検診の受診率は10.0%で、先行研究と比較しても極めて高い結果であった。受診率は4年生が最も高く、17.4%であった。4年生を対象に分析していくと、ワクチン接種した人のうち、接種は母親が決定したとするもの52.9%、自分が決定したとするものは45.1%であった。また、ワクチン接種を自分で決めたとしたものは、関連する基礎知識の平均得点が有意に高い、という結果であった。子宮頸がん予防を自らの問題として捉え、必要な知識をもち、自ら後悔しない予防行動がとれるよう、ワクチン接種推奨年齢前から啓発教育をしていく必要性が確認された。小学校でがん教育を実施している養護教諭には半構成的インタビュー調査を実施した。現在分析途中である。母親の意思決定を支えるサポート・プログラムを作成する予定であったが、大学生を対象とした調査を論文投稿したため時間を要し、現在までプログラム作成に至っていない状況である。当初の計画では、女児をもつ母親を対象にアンケート調査を実施する予定であったが、先に平成25年度実施の母親に対するインタビュー調査結果について再分析し、論文投稿の準備を進めた。結果をもとに質問項目を検討する予定だったため、現在まで母親対象のアンケート調査は実施していない。養護教諭にはインタビューをとおして意見をいただき現在分析途中であるし、がん患者会代表からの意見はいただいているので、それらをもとにこれからプログラムを作成していく予定である。29年度は作成したプログラムを実施していく計画である。わが国の20歳代・30歳代女性の子宮頸がん罹患率の急増と、がん検診受診率の低さから、子宮頸がん予防対策の検討をした(平成2427年度科学研究費補助金基盤研究C)。

成果として、娘を持つ母親の意思決定を支えるサポートが必要と考え、本研究に取り組んだ。平成29年度は、前年度に実施した調査結果を分析し、学術誌に論文投稿した。若い女性である看護系女子大学生を対象とした調査結果から、ワクチン接種率73.9%、子宮頸がん検診受診率17.4%と高率であること、公的助成の対象でない年齢や大学入学後にワクチン接種している実態が明らかとなった。「自分」自身でワクチン接種を決定した女性は、「母親」によって決定した女性より基礎知識の保持状況が良好であった。子宮頸がんを自らの問題として捉え、必要な知識を持ち、自ら正しい予防行動がとれるように青年期前の啓発教育の必要性が示唆された。また、情報として、国立がん研究センター「がんに対する意識調査」、文部科学省平成28年度「がん教育総合支援事業成果報告会」、文部科学省「がん教育推進のための教材」、文部科学省「外部講師を用いたがん教育ガイドライン」について検討した。「がん教育」に関して、政府と文部科学省では平成29年度から全国展開を進めている。学校におけるがん教育の目標として、1がんについて正しく理解する、2健康といのちの大切さについて主体的に考える事ができるようにするをあげ、教育の具体的な内容として、がんとは、がんの種類とその経過、わが国のがんの状況、がんの予防、がんの早期発見・がん検診、がんの治療法、がん治療における緩和ケア、がん患者の生活の質、がん患者の理解と共生をあげていた。現在、「女児を持つ母親の子宮頸がんワクチンに対する認識の経年的変化」、養護教諭対象の調査結果について分析、学術誌投稿準備中である。平成27年3月「学校におけるがん教育のあり方について報告」、平成28年4月文部科学省「外部講師を用いたがん教育ガイドライン」、文部科学省「がんの教育総合支援事業成果報告会」というように、厚生労働省のがん対策と並行して、文部科学省から「がん教育」に対する方針が提示され、「がん教育」平成29年度から展開されてきている。現在まで行われてこなかった学童へのがん教育は始まったが、実際の教育の場に立ち会ってみると、教育内容や方法は現在も検討段階と思われた。そういう状況をふまえて、文部科学省の方針など方向性を確認した上で本研究を進めていきたいと考え、動向や実態の確認に時間を要したため、遅れが生じている。2018年度は、大学生・高校生への健康教育、養護教諭が行う健康教育、母親に対するがん予防健康教育を実施することを予定していた。しかし、2017年から学校教育で「がん教育」を実施することが制度化され、文部科学省の報告では2017年の「がん教育」実施率は56%であった、とされている。これを受けて、本研究課題であるプログラムの再検討が必要と考え、新たに、子どもを子宮頸がんから護る母親への支援プログラムの検討を目的として、行政の保健師、小学校・中学校養護教諭、看護学研究者らによるグループディスカッションを実施した。その結果から、がん予防は学校での「がん教育」を基盤としながら、子どもと子どもをもつ親を対象とした「健康教育」が必要という見解に至った。同時に、学校における「がん教育」の課題も、内容の検討や時間数、担当する教師、依頼する外部講師など課題もいくつか挙げられた。
シアノバクテリアの概日時計:kai遺伝子群の発現制御とkai蛋白質の動態

計画に基づき、シアノバクテリアの概日時計を解析し、以下のような成果を得た。1)KaiC蛋白質のリン酸化がKaiA蛋白質により大きく促進されることを明らかにし、この2つの蛋白質が協同してkaiBCの発現を促進していることを示唆した(PNAS,2002)。KaiC蛋白質の主要なリン酸化部位を見出し,質量分析による残基の決定作業も進展している。2)KaiC蛋白質の分布をゲル濾過法で解析し、KaiCが夜間に細胞内で大きな複合体を形成していることを明らかにした(J. Biol. Chem,2003)。3)KaiBはKaiAに拮抗的にKaiCを脱リン酸化を促進することを明らかにした。また,KaiBの細胞内分布パターンに顕著な概日リズムを見出し,3つのKai蛋白質の協働を示唆した(EMBO J印刷中)4)KaiC蛋白質によるゲノム全域にわたる遺伝子発現の抑制を示し、一方、大腸菌由来のプロモーターの制御によるkaiBC発現フィードバックにより概日振動を発生させることが出来た。この2つの成果はシアノバクテリアのこれまでのモデルに大きな変更をもたらすものである(投稿準備中)。5)細胞内の時計蛋白質の分布を調べ、KaiC蛋白質は膜画分と核様体に多く存在することを明らかにし,さらにKaiCのDNA結合能についても詳細な生化学データが蓄積しつつある。
作業場で簡便に実施できる耳栓の装着試験法の開発

騒音職場で,耳栓を選択する際の重要なポイントとして,遮音性能に直接影響する外耳道との密着性があげらる。本研究では,測定に静穏な場所が必要な最小可聴値の上昇を測定するのではなく,工場に隣接した事務室等のように,騒音レベルが比較的大きな音環境下でも実施可能な聴覚試験方法を採用した遮音性能試験法を確立することをめざした。実耳による耳栓の遮音性能の推定法に採用する聴覚試験法として音像定位法をとりあげ,昨年度試作した実験装置に改良を加えながら,実験室内で,従来より実施されている最小可聴値上昇法による測定結果と比較・検討を進めた。その結果,音像定位法による測定値と最小可聴値上昇法によるそれとは,10名の被験者の平均値において有意差は認められなかった。ただし標準偏差は前者の方がやや大きくなる傾向が認められた。さらに暗騒音レベルを上昇させた場合について,音像定位法と最小可聴値上昇法によって5名の被験者の実耳において比較測定したところ,75dBA以上の暗騒音レベルにおいて最小可聴値上昇法の遮音測定値が減少したのに対し,音像定位法では暗騒音レベルの大小によらず安定した測定値を得ることができた。このことにより,音像定位法を用いることにより暗騒音レベルが大きな音環境下においても妥当な遮音性能試験が実施できることが明らかとなった。また,音像定位法で用いる試験音については,純音よりむしろ帯域ノイズの方が,音像の定位がしやすく,測定値のばらつきも小さくなることが確認された。騒音職場において、耳栓を選択する際のポイントは、遮音性能に直接影響する外耳道とのフィットネスであることは多くの研究者が指摘してきたところである。これを耳栓を装着した作業者自身がつぶさに目で見て実感することができれば、聴力保護のための労働衛生教育に大いに役立つことは間違いない。これを実現することを目的として,比較的暗騒音レベルの大きな作業現場周辺においても,容易にチェックすることが可能な耳栓の遮音性能試験器のプロトタイブの装置を開発している。実耳による耳栓の遮音性能の推定法に採用する聴覚試験法としては、暗騒音が大きくても影響が少ない70dB程度のレベルで実施できる音像定位法をとりあげることとした。まず、実験室において上記の聴覚試験法を実施する実験装置を将来現場に持ち込む実用機のプロトタイブとなるべきものとして,試作している。試作装置は,ヘッドセットとして,市販されている最小可聴閾値の上昇を測定するタイプの簡易型耳栓遮音性能チェック装置のものを転用し,左右両耳に入射する音圧レベルを,頭の中央に音像を定位するように被験者に調整させる機能を有している。またへッドセットからの出力をモニターするための機能も備えるように設計している。現在は,数種類の耳栓を用いて,最小閾値の上昇を測定する既存の方法による測定値と,音像定位法による測定値の比較を行うための予備的実験を実施しながら,試作装置に改良を加えている段階である。予備実験の段階では,音像の定位のさせやすさは,試験音の周波数によって異なることが判明してきた。したがって,試験音を純音とするか,狭帯域のノイズとするか,またその周波数構成の選定などが課題として残された。騒音職場で,耳栓を選択する際の重要なポイントとして,遮音性能に直接影響する外耳道との密着性があげられる。

実耳による耳栓の遮音性能の推定法に採用する聴覚試験法として音像定位法をとりあげ,昨年度試作した実験装置に改良を加えながら,実験室内で,従来より実施されている最小可聴値上昇法による測定結果と比較・検討を進めた。その結果,音像定位法による測定値と最小可聴値上昇法によるそれとは,10名の被験者の平均値において有意差は認められなかった。ただし標準偏差は前者の方がやや大きくなる傾向が認められた。さらに暗騒音レべルを上昇させた場合について,音像定位法と最小可聴値上昇法によって5名の被験者の実耳において比較測定したところ,75dBA以上の暗騒音レベルにおいて最小可聴値上昇法の遮音測定値が減少したのに対し,音像定位法では暗騒音レベルの大小によらず安定した測定値を得ることができた。このことにより,音像定位法を用いることにより暗騒音レベルが大きな音環境下においても妥当な遮音性能試験が実施できることが明らかとなった。また,音像定位法で用いる試験音については,純音よりむしろ帯域ノイズの方が,音像の定位がしやすく,測定値のばらつきも小さくなることが確認された。今後は,妥当な実験手順の設定,試験音の確定などを進め,測定法の精度をさらに向上させることが課題として残されている。
ユビキチンリガーゼcblと廃用性骨萎縮のメカニズム:増殖因子抵抗性骨芽細胞の出現

ユビキチンリガーゼCbl-b遺伝子欠損マウスを用いた研究(1)骨形成マーカーのmRNA発現坐骨神経切除マウスの大腿骨における骨形成マーカー(アルカリフォスファターゼ、I型コラーゲン、オステオカルシン)の発現はCbl-b遺伝子欠損マウスでは有意な減少は認められなかった。(2)IGF-1シグナル伝達分子の発現坐骨神経切除モデルの大腿骨におけるIGF-1シグナル伝達分子(IRS-1、PI3K、Akt)の発現は、mRNAレベルではいずれも有意な変化は認められなかった。蛋白質レベルでは、IRS-1はCbl-b遺伝子欠損マウスでコントロール群、坐骨神経切除群共に有意な増加を認め、PI3K、Aktは野生型マウスの坐骨神経切除群で有意な減少を認めた。(3)骨芽細胞におけるIGF-1シグナル伝達分子のユビキチン化IGF-1シグナル伝達分子のうち、IRS-1、PI3K、AktそれぞれでCbl-bとの結合が確認されたが、ユビキチン化されていたのはIRS-1、PI3Kであり、またさらに分解が確認されたのはIRS-1のみであった。(4)骨芽細胞のIGF-1に対する応答野生型マウス頭蓋冠由来骨芽細胞にIGF-1を投与したところ、細胞数は約2倍に増殖したが、Cbl-b遺伝子欠損マウス由来骨芽細胞では約3倍に増殖した。一方、骨肉腫由来UMR106細胞にCbl-b遺伝子を過剰発現させたところ、IGF-1を投与しても細胞増加は認められなかった。(5)Cbl-b遺伝子欠損マウスの大腿骨組織切片の骨形態計測では、坐骨神経切除を行っても骨形成及び骨吸収に変化は認められなかった。以上の結果より、様々な骨量減少をきたす病態において、Cbl-bは骨芽細胞のIGF-1シグナルに対する反応性を減少させることにより、骨形成を抑制し骨量の減少をもたらしていると考えられる。(1)骨形成マーカーのmRNA発現坐骨神経切除を行ったマウス大腿骨における骨形成マーカー(アルカリフォスファターゼ、I型コラーゲン、オステオカルシン)の発現は野生型マウスでは減少したが、Cbl-b遺伝子欠損マウスでは有意な減少は認められなかった。(2)IGF-1シグナル伝達分子の発現坐骨神経切除モデルの大腿骨におけるIGF-1シグナル伝達分子(IRS-1、PI3K、Akt)の発現は、mRNAレベルでは有意な変化は認められなかった。(3)骨芽細胞のIGF-1に対する応答野生型マウス頭蓋冠由来骨芽細胞にIGF-1を投与したところ、細胞数は約2倍に増殖したが、Cbl-b遺伝子欠損マウス由来骨芽細胞では約3倍に増殖した。一方、骨芽肉腫由来UMR106細胞にCbl-b遺伝子を過剰発現させたところ、IGF-1を投与してもその細胞数に増加は認められなかった。現在、野生型マウス、Cbl-b遺伝子欠損マウスの坐骨神経切除モデルの大腿骨組織切片を作製し、骨形態計測を依頼中である。2.宇宙フライトラットの骨サンプルのマイクロアレイ解析NASAより提供された宇宙フライトラットの大腿骨サンプルと、尾部懸垂及び坐骨神経切除ラットの大腿骨サンプルのマイクロアレイ解析を行った。結果、宇宙フライトサンプルでは5倍以上増加した遺伝子が14、5倍以上減少した遺伝子が108であった。一方、尾部懸垂サンプルでは増加73、減少2、坐骨神経切除サンプルでは増加20、減少3であった。宇宙フライトでは特に遺伝子発現をコントロールする遺伝子やシグナル伝達を制御する遺伝子の発現の減少が顕著であった。

(5)Cbl-b遺伝子欠損マウスの大腿骨組織切片の骨形態計測では、坐骨神経切除を行っても骨形成及び骨吸収に変化は認められなかった。以上の結果より、様々な骨量減少をきたす病態において、Cbl-bは骨芽細胞のIGF-1シグナルに対する反応性を減少させることにより、骨形成を抑制し骨量の減少をもたらしていると考えられる。
蛍光及び超音波を用いるＤＮＡの可視化と切断

様々な非対称型インドリルマレイミド誘導体が合成され、その光学特性が明らにされた。いくつかのインドリルマレイミド誘導体は、大きいストークスシフト及び550 nm以上の蛍光発光極大波長を有した。二本鎖DNA存在下、インドリルマレイミド誘導体の蛍光が測定された。N-メチルキノリンを有するインドリルマレイミド誘導体の蛍光強度は、二本鎖DNA存在下、増加した。24年度、15種の非対称型蛍光性インドリルマレイミド(IM)誘導体の分子設計及び合成を達成した。グリニヤール反応と鈴木カップリングによる非常に簡便な合成法によりIM誘導体の合成はなされた。IM誘導体のマレイミド部位の炭素ー炭素二重結合の一方の炭素にフェニル基、ビニル基、ナフチル基及びピレンを含め様々な芳香族化合物を導入可能であった。インドールのNH基へのBoc基の導入も行った。更に、ウィッティヒーホルナー反応を用いてπ-共役の延長にも試みた。ジメチルホルムアルデヒド及びアセトニトリル溶液中、合成したIM誘導体の蛍光測定を終了した。その結果、ストークスシフトが100 nm以上かつ550 nm以上の長波長蛍光発光を有する多くの非対称型IM誘導体を見出した。ジメチルホルムアルデヒド中、合成したIM誘導体は、蛍光極大波長が520 nmから600 nmの範囲のマルチカラー蛍光を示した。マルチカラー蛍光を有する非対称型IM誘導体の開発を達成できたことは、今後のIM誘導体の分子設計において意義ある情報を提供している。IM誘導体のマレイミド部位の炭素ー炭素二重結合からのπ-共役の延長による吸収極大波長及び蛍光極大波長の増加が明らかに見られた。化合物の構造と蛍光発光特性との関連に少しずつではあるが理論性が見出されている。合成したIM誘導体中、いくつかの化合物は特定のタンパクとの親和性が期待され、新たな研究展開が期待される。(1)数十個の非対称型インドリルマレイミド(IM)誘導体を比較的容易に合成した。ジメチルホルムアミド中、ほとんどの化合物の吸収極大波長は、430 nm以上であった。検討した化合物中、ビチオフェンを有するIM誘導体の吸収極大波長は、約500 nmであり最も長い。ベンゼン、ナフタレン、スチリルベンゼン及びビチオフェンの導入により蛍光発光極大波長は長波長側にシフトしている。ストークスシフトが100 nm以上の化合物が見出された。様々な蛍光発光波長を有する非対称型IM誘導体を開発した。(2)二本鎖DNA存在下、検討した化合物のほとんどが蛍光変化を示さなかった。キノリンのNーメチル化された構造を有するIM誘導体の蛍光励起波長は470 nm以上と長く、蛍光発光波長も570 nmと長波長であった。これらの化合物は、二本鎖DNA存在下、DNAの塩基数の増加とともに蛍光強度は増加した。キノリン部位のN-メチル化が二本鎖DNAへの親和性を増加させたことが予測される。Boc基を導入したIM誘導体は、二本鎖DNA存在下、蛍光変化が見られなかった。(3)合成したいくつかのIM誘導体をアミロイド検出に適用した。アミロイドの組織染色に用いられているCongo Redと比較した。フェニル基を有するIM誘導体がアミロイドに対し親和性及び感度ともに良好であった。非対称型IM誘導体がアミロイドに親和性を有することを見出した。DNAに親和性を有する蛍光化合物の基本構造として、分子内にインドールとマレイミドを有するIndolylmaleimide誘導体を選択し、その対称型及び非対称型の合成を企画した。本年度、長波長蛍光発光(550 nm以上)を有する非対称型Indolylmaleimide誘導体の合成を目的とした。分子設計として、マレイミド部位のC=C結合からのπ-共役の延長に着眼した。N-メチル化されたIndolylmaleimideのブロム体に鈴木-宮浦カップリングを用いて、各種ボロン酸誘導体によりbiphenyl、bisthiophene及びpyreneの導入を行った。これらのIndolylmaleimide誘導体の極大蛍光発光波長は、全て550 nm以上であり、ストークスシフトは106 nm以上であった。プロトン性溶媒であるメタノール及びエタノール中、それらの蛍光強度は明らかに減少した。合成したIndolylmaleimide誘導体の量子収率は0.13以下と低かった。そこで、新たにcarbazoleを導入したところ、アセトニトリル中で量子収率は0.5となった。更に、Indolylmaleimide誘導体のインドール部位のNH基へのクマリンの導入も行った。最も極大蛍光発光波長(597 nm)の大きい3-bithiophene-4-(1H-indol-3-yl)-2,5-dihydro-1-methyl-2,5-pyrroledione(BDMP)の分子科学計算(MS-CASPT2, cc-pVDZ)結果より、HOMOはインドール部位に、LUMOはマレイミド部位に局在した。

このことから、BDMPは、分子内電荷移動(Intramolecular charge transfer, ICT)が生じていることが示唆された。現在までに、予定したすべての非対称型インドリルマレイミド(IM)誘導体の合成を達成した。マレイミド部位の炭素ー炭素二重結合の一方の炭素に様々な芳香族化合物を導入可能であった。蛍光測定の結果、ストークスシフトが100 nm以上かつ長波長蛍光発光(550 nm以上)を有する非対称型IM誘導体を見出した。蛍光極大波長が520 nmから600 nmの範囲のマルチカラー蛍光を示した。マルチカラー蛍光性の非対称型IM誘導体の報告は今までにない実験結果であろう。この結果は実験計画時には予測できなかったことであるが、蛍光性IM誘導体の合成において意義深い情報を提供している。現在のところ、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度は、プローブ合成に取り組んだ。企画していた非対称型Indolylmaleimide誘導体の簡便な合成法をほぼ確立できた。他の誘導体も本合成法で合成可能と考えられる。合成した化合物の蛍光量子収率はさほど高くはなかった。更に合成した化合物の中で最も蛍光発光波長の大きい分子について分子科学計算も行うことができた。今後、サケ由来DNA(シグマ社)を購入し、様々なDNA濃度での二本鎖形成のアニーリングの最適化を行う。合成したIM誘導体のDNAとの蛍光応答を評価する。その結果により、DNAとの親和性が明らかになるとと考えられる。十分な親和性が得られなっかた場合、DNAとの親和性を強固にするためにIM誘導体にアミジノ基を導入することも予定している。DNAとの親和性のあるIM誘導体に関し、超音波処置後の溶液をHPLCで分取後、MALDI-TOF MS測定を行い、DNA切断能の評価を行う。DNA切断が見られた場合には、選択性があるか否かが判明すると考えられる。現在までに対称型及び非対称型を含め多くのIM誘導体を合成しており、DNAとの親和性と構造相関が明らかとなると予測される。現在までに、対称型及び非対称型を含め数十種のIndolylmaleimide誘導体を合成している。DNAとの親和性を向上させるために、アミジノ基を有したIndolylmaleimide誘導体を合成する予定である。DNAとの親和性評価は、ポリA、ポリGを含めた様々な配列を有した15塩基対(二本鎖を形成するに必要な塩基対)のDNAを用いる(市販購入が可能)。緩衝液中(pH 7)、アニーリング(急激に温度(約90°C)を上昇させ、ゆっくり室温にもどす(約3時間))により調製した二本鎖DNAを石英セルに入れ、緩衝液に溶解した化合物を加え蛍光変化を測定する。DNAとの蛍光応答が得られた化合物につき、生細胞でのイメージングを評価する予定である。Indolylmaleimide誘導体は細胞透過性は高いと考えている。合成またはHPLC測定に使用する薬品費が支出される。現在までに合成及び蛍光発光特性に関し、いくつかの意義ある実験結果を得ている。そこで、国際及び国内学会で発表する予定であり、学会発表に要する参加費及び旅費が発生する。
融雪洪水の地域特性に関する研究

1.熱収支法による融雪モデルをi)岩手県和賀川の湯田ダム、ii)福島県只見川の奥只見ダム・田子倉ダムの各域について適用し、融雪出水量の計算値とダムへの流入量の比較を行なった。湯田ダムと田子倉ダムに関しては、流出量をよく再現できた。また、奥只見ダムについては、日射や初期積雪水量分布の局地性を考慮したところ、ほぼ満足のいく結果が得られた。2.熱収支法を広域に適用する上で重要となる日射量と下向き大気放射量をアメダスのデータなどから推定する方法を考案した。また積雪面アルベードを降雪後の日数と平均気温から推定できるようにした。3.森林の熱収支モデル(2層モデル)と融雪モデルを組み合わせることにより、森林地帯での融雪量を求められるようにした。結果として、一般には植生が密になると融雪量は減ることがわかった。しかし、特殊な条件、たとえば積雪面がきれいで風が弱い場合などには、植生が密なときの方が融雪量が多くなることが示された。4.気象要素(日平均気温、日気温振幅、日照率、風速、湿度)や積雪のパラメータ(アルベード、最大含水率、熱伝導率)に融雪量がどのように依存するかを調べた。その結果、低温では日照率やアルベードが融雪量を支配することがわかった。一方、高温では風速や湿度の影響が大きくなる。また、含水率や熱伝導率に対する融雪量の依存性はあまり大きくない。
RNAによるタンパク質相転移の制御系開発

本年度は、前年度に整備した磁気ビーズにRNAをコンジュゲートさせ、ビーズ周辺にRNAが高濃度で存在する「環境」を形成させることによるin vitroLLPS系を用いて、NEAT1におけるLLPS誘導活性のあるRNA機能ドメインの検討を実施した。特にこれまでin vivoにおけるCRISPR/Cas9による変異解析によって同定したパラスペックル形成を担うCドメイン中のC1, C2サブドメイン由来のRNAをin vitroで合成したものを、上記in vitroLLPS系に加えることによって磁気ビーズの凝集がみとめられた。またLLPSに対して阻害的に作用する1,6-hexanediol(1,6-HD)処理によって凝集が阻害されることが明らかになった。一方で、C1, C2 RNA上には、プリオン様RNA結合タンパク質のNONO, SFPQがヘテロダイマーとして結合しており、さらにこの因子を核抽出液から除去すると、in vitro LLPSが著しく阻害されることが明らかになった。さらに2つのLLPS誘導機能を持つRNA結合タンパク質がNONO, SFPQに依存してC1, C2 RNA上にリクルートされてくることが明らかになった。NONO, SFPQはNOPSドメインを用いてヘテロダイマーを形成し、さらにcoiled-coil領域間でオリゴマーを形成してパラスペックル形成の基盤を作っていることが明らかになっていたが、この基盤構造は、さらに強いLLPS活性を持つ他のRNA結合タンパク質の集約するのに重要な役割を果たしていることが示唆された。今後C1, C2というRNA領域を起点としたLLPSを実際に担っているタンパク質とその認識RNA配列を同定する必要がある。本年度は、in vitroにおいて、RNAによって液体相転移(LLPS)が効率よく誘導できる系の改良を第一の目標として研究に取り組んだ。RNAの効果を効率よく発揮させるために、磁気ビーズにRNAをコンジュゲートさせ、ビーズ周辺にRNAが高濃度で存在する「環境」を形成させることによって、細胞内の核内構造体形成環境を模すことにした。用いるRNAとしては、in vivoにおいて、LLPSを介した核内構造体形成を担うNEAT1 lncRNAの機能ドメインとして実施者が同定した領域由来のRNA断片とそのアンチセンスRNA断片を用いた。これらのRNAをビオチン化しビーズ上に固定化したものを用意し、そこにHeLa細胞核抽出液と混合した。その結果、機能ドメイン由来のRNAを用いた場合、多数のビーズ同士が集合した大きな凝集壊が形成された。この結果は、RNAビーズ周辺で誘発されたLLPS様相転移によって凝集壊が作られたことを意味している。またこの凝集壊は、アンチセンスRNAでは形成されず、またLLPSに対して阻害的に作用する1,6-hexanediol(1,6-HD)処理によって解離することが明らかになった。一方で、LLPS誘導条件下で、ビーズ上のRNAに結合しているタンパク質を検出したところ、複数のプリオン様RNA結合タンパク質が結合していることが明らかになった。これによって、ビーズ上のRNA環境を利用したin vitro LLPS様相転移誘導系をセットアップすることができたと考えられる。今後、この系を利用して様々なLLPS関連解析に展開していく予定である。LLPSを誘導するRNAの作用機構とそのエフェクター配列を明らかにするために必要であったin vitroで安定してLLPSを誘導できる系を、RNAをビーズ上に固定しRNAが濃縮した環境を作り出すことによって可能にした。これによって、当初計画していたRNAの作用機構解析、配列特性の解析などを効率よくかつ信憑性高く実施することが可能になると考えられる。in vitroにおけるLLPS誘導は、in vivoにおいてLLPS構造体の形成に必須な領域として、実施者が同定した領域に由来したRNAを用いており、in vivoでの機能配列をin vitroでも機能させられたことが示唆される。さらに同時に、アンチセンスRNAに誘導活性がないことや1,6-HDによってLLPSが解消されることなど、重要なコントロール実験の条件至適化にも成功した点も重要な成果と言える。一方で、LLPSが誘導されている条件下で、複数のプリオン様タンパク質がRNAに結合していることを確認しており、タンパク質因子の側からもLLPS誘導機構についてアプローチできる準備が整った。

今後C1, C2というRNA領域を起点としたLLPSを実際に担っているタンパク質とその認識RNA配列を同定する必要がある。今回セットアップしたin vitroLLPS様相転移誘導系を利用して、様々なarcRNA由来のRNA断片を用いたLLPS誘導実験を行い、LLPS誘導性RNAを選別していく。さらにLLPSに関わるタンパク質因子を同定し、それらがどの様にLLPSを誘導するのか、またRNAがどの様な役割を果たしているのかを明らかにする。一方で、こうして同定されたタンパク質のCLIP-seqデータから、これらのタンパク質の結合RNAを明らかにし、その結合配列を持つRNAを用いてLLPS誘導能を検討する。最終的に最も効率良いLLPSを誘導できるRNA配列ルールを確立する。今年度は、in vitroにおけるLLPS誘導系の開発に注力し、新たに磁気ビーズにコンジュゲートさせたRNAと細胞核抽出液を混合させることによってビーズが凝集する様子を観察する系を開発することができた。これによって、in vitro反応系のスケールが当初予定したものよりも小さくてすみ、またRNAの蛍光標識なども必要なくなったために、これらに計上していた試薬費が次年度に繰り越された。次年度は、この様に開発された簡便かつ鋭敏なin vitro LLPS誘導システムを活用して、LLPS誘導活性のあるRNA断片を選別する実験を計画している。このためには、様々なRNA配列を大量に合成する必要があり、そのために多くの消耗品費が必要となるため、今年度繰り越した予算をそこに充てる予定である。
テチス海東域で生じた中古生代の海洋底無酸素事変に伴う絶滅から回復イベント

テチス海東域における海洋生物の絶滅やその後の回復から放散の過程を解明することを研究の目的として,ベトナムのデボン系石炭系とペルム系三畳系を調査した.本研究ではコノドントなどの化石と安定炭素同位体比などの分析データを用いて,詳細な地質年代を明らかにし,大量絶滅や海洋無酸素事変などのイベント層を特定した.さらに堆積相解析を用いて,堆積環境を復元し,化石の記載や化石群集の識別および生息域の復元などを行なってデボン紀ー石炭紀境界と前期三畳紀のインデュアンーオレネキアン境界,スミシアンースパシアン境界などで生じた地質・古生物学的なイベントや堆積環境,海生動物群集の変遷などについて報告した.本研究計画の申請に先駆けて北部ベトナムで実施した予備調査と本研究の初年度前半の研究成果を複数の学術誌に投稿した.このうち下部三畳系バックテゥイ層から得られた二枚貝とアンモナイトの産出報告については,古生物学分野の国際誌「Paleontological Research」に掲載され,バックテゥイ層の堆積環境やスミシアンとスパシアンの境界層(S-S境界)の報告については,地質・堆積学分野の「Sedimentary Geology」に受理された.上記の研究では,S-S境界で汎世界的に生じた可能性がある海洋無酸素事変について,テチス海東域で生じていたベトナムの事例をもとに報告し,この影響下で生息していた二枚貝やアンモナイトについて記載した.さらにランソン省の様々な地域に露出しているバックテゥイ層の総括的な研究を進めて,前期スミシアン前期スパシアンのアンモナイト,巻貝,二枚貝とコノドント,放散虫,オストラコーダなどの分類学的な研究を行ない,その成果を国立科学博物館のモノグラフとして出版する準備を進めている(印刷中).このモノグラフでは,アンモナイトとコノドント生層序によってS-S境界を含む地質年代を厳密に検討した上で,様々な分類群を用いて,前期スミシアン前期スパシアンの生物相の変遷や群集構成について検討した.その結果,少なくともアンモナイトとコノドントはスミシアン末期に種の多様性が著しく低下していることや,スパシアン末期の放散虫化石群集は“古生代型"の放散虫からなっていること,スパシアン末期の海洋無酸素事変を記録した層準から産出するアンモナイトと二枚貝,コノドント,オストラコーダは,単一の種や属が優占的な群集構成を成していることなどが明らかになった.2013年までに実施した北部ベトナムの下部三畳系の調査結果を300ページ以上に達するモノグラフとして国立科学博物館から出版した(2013年受理後2014年出版).2014年度はこれらのデータに加えて,インデュアンーオレネキアン境界の特定やスミシアンースパシアン境界を中心に安定炭素同位体比の分析や有機炭素量の測定などを行ない,これらの時代境界で海洋無酸素事変が生じていたことやコノドントやアンモナイトなどの分類群で絶滅事変が起こっていた可能性を明らかにした.これらの成果は,すでに複数の論文としてまとめており,その一部はすでに当該分野の学術誌に投稿中である.また,これらの研究成果については,日本古生物学会のシンポジウムや一般講演でも公表した.なお,デボン紀ー石炭紀境界やデボン紀末の海洋無酸素事変に関する研究も2013年までの研究成果を論文として公表した.2014年度の地質調査は,2014年5月,7月,10月,12月と2015年3月などに北部と中部ベトナムに分布するデボン系や三畳系で実施した(このうち数回の調査は私費で実施).三畳系の地質調査は,予定通り進み,ベトナム各地の下部三畳系からコノドントやオストラコーダなどの微化石やアンモナイト,二枚貝などの化石を多数採取することができた.さらに研究が進んでいなかったハノイ近郊の中生界の調査も予察的に実施した結果,上部三畳系の非海成層浅海層が分布し,植物化石や二枚貝,アンモナイトなどが産出することが明らかになった.しかし,フランスニアンーファーメニアン境界を含む上部デボン系の研究では,地質年代を決める上で重要なコノドント化石の産出量が少なかったため,追加試料の採取が必要となった.上部デボン系の調査は,2015年度の課題である.2015年度は,研究成果の報告に重点を置き,ベトナムでの地質調査はデータの確認や不足データの採取,今後の研究の継続や発展を想定した予備調査などを目的として実施した.これまでの研究成果の一部は,ベトナム国立自然博物館から3月に出版された論文・要旨集に5編を掲載し,この他にもPalaeontological Researchなどに複数の論文が受理および掲載されている.また,上記以外に2編の論文を投稿中である.論文・要旨集に掲載された内容は,ランソン省に分布するランソン層とバックテゥイ層のインデュアンーオレネキアン境界やスミシアンースパシアン境界,コノドント生層序などに関わるものが3編,北部ベトナム南部の三畳系から産出した介形虫,中部ベトナムとラオスに分布するジュラ系の国際対比,北部ベトナム西部の白亜系から産出した生痕化石と古環境などに関するものが各1編である.投稿中の論文は,下部三畳系バックテゥイ層のスミシアンースパシアン境界を中心に安定炭素同位体比の分析や有機炭素量の測定などを行ない,これらの時代境界で海洋無酸素事変が生じていたことやコノドントやアンモナイトなどの分類群で絶滅事変が起こっていた可能性を指摘した内容である.