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閉経とエストロゲン補充療法が女性の脳血流に及ぼす影響について

研究課題I.閉経が脳血流に及ぼす影響:4350歳の閉経後女性(閉経群)22名(平均年齢±SD:47.3±2.4歳)と閉経前女性(非閉経群)17名(平均年齢:47.4±2.4歳)の脳血流量を、^<99m>Tc-ECDとSPECTを用いて測定して比較した。閉経群と非閉経群の平均大脳血流量(CBF)は、それぞれ43.7±4.1と48.0±2.4ml/100g/minであり、平均小脳血流量(C_<bl>BF)は、それぞれ47.5±4.7と54.5±4.9ml/100g/minであった。いずれの血流量も、閉経群の方が有意に低値であった(p<0.001、p<0.0001)。閉経により卵巣からのエストロゲン分泌が消失すると、脳血流量は大脳、小脳とも低下することを初めて明らかにした。研究課題II.エストロゲン補充療法が脳血流に及ぼす影響1.エストロゲン単独投与の影響:当院更年期外来受診中の閉経後女性に、結合型エストロゲン(CEE)0.625mg/日(n=15)または1.25mg/日(n=15)を3週間投与して、CEE投与前後の脳血流量を^<99m>Tc-ECD法で測定して比較した。両群のCBFは、いずれも有意に増加し(p<0.001)、平均増加率は7.4±5.4%と7.7±5.4%で、コントロール群(n=11)に比べていずれも有意に高値を示した(p<0.001)。平均局所脳血流量(rCBF)は、CEE 0.625mg/日群の極く一部を除き、すべて有意に増加した。3週間のCEE投与に続いて、HRTを1年以上(平均13.7±2.0月)行った後に、同じ方法で脳血流量を測定した14名のCBFの平均増加率は、6.4±6.3%であった。2.CEEにMPAの順次投与(CEE・MPA):別の14名の閉経後女性では、3週間のCEE投与の後半812日間(平均9.6±1.1日)酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)510mg/日を併用投与すると、CBFは有意に増加し(p<0.001),平均増加率は7.7±5.4%であった。また、1と2の各群のC_<bl>BFもCBFと同様に有意に増加した。以上のことから、一般の閉経後女性に短期及び長期のERT/HRTを行うと、脳血流量(大脳、小脳及び局所脳血流)は有意に増加することを、初めて明らかにした。ERTに黄体ホルモンを短期間併用しても,脳血流の増加率は,ERT単独の場合と同じであった。2.CEEにMPAの順次投与(CEE・MPA):別の14名の閉経後女性では、3週間のCEE投与の後半812日間(平均9.6±1.1日)

酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)510mg/日を併用投与すると、CBFは有意に増加し(p<0.001),平均増加率は7.7±5.4%であった。また、1と2の各群のC_<bl>BFもCBFと同様に有意に増加した。以上のことから、一般の閉経後女性に短期及び長期のERT/HRTを行うと、脳血流量(大脳、小脳及び局所脳血流)は有意に増加することを、初めて明らかにした。ERTに黄体ホルモンを短期間併用しても,脳血流の増加率は,ERT単独の場合と同じであった。研究課題1.閉経が脳血流に及ぼす影響:4450歳の非閉経群10名(平均年齢±SE:46.7±0.6歳)と閉経群10名(46.9±0.6歳)の大脳の平均血流量(CBF)を^<ggm>Tc-ECD法で測定して比較した。CBF(m1/100g/min)は、非閉経群47.1±0.6(SE)で、閉経群44.0±1.1より有意に大きかった。(p<0.05)。50歳以下及び51歳以上についても例数を増やして更に検討する予定である。研究課題2.使用量のエストロゲン補充療法(ERT)が脳血流に及ぼす亜急性の効果:自然閉経女性12名(平均年齢±SE:51.7±1.4歳)に結合型エストロゲン(CEE)0.625mg/日を3週間投与して、その前後に大脳血流量(CBF)、小脳血流量(C_<b1>BF)、局所脳血流量(rCBF)を測定した。CEE投与により、CBF(m1/100g/min)は44.0±1.5(SE)から46.8±1.4(平均増加率±SE:6.4±1.4%)に、C_<b1>BFは48.2±1.8から50.6±1.7(平均増加率±SE:5.2±1.3%)に、有意に増加した(p<0.01とp<0.02)。rCBFも、左右の前頭部、側頭部、頭頂部、運動野で有意に増加した。5名のコントロール群では、CBF,C_<b1>,rCBFのいずれでも有意な変化はなかった。研究課題3.比較的高用量のERTが脳血流に及ぼす影響:以前、大藏らが行った報告では、対象が早期閉経と手術による閉経症例が多く、平均年齢も43.7歳で若かった。しかも、HRTを4週間中断してからERTを再開し、脳血流量の平均増加率は約30%に達した。今回新たに自然閉経症例10名(平均年齢±SE:53.3±1.2歳)にCEE1.25mg/日を3週間投与して再検討した。CBF(m1/100g/min)は43.9±1.5(SE)から46.7±1.7に有意に増加したが、平均増加率は6.4±2.0(SE)%で、低用量の増加率と同じであった。低用量CEE投与時の血中エストラジオール濃度(約50pg/ml)があれば脳血流は有意に増加し、倍量投与しても効果は同じであった。研究課題4.慢性、長期投与の効果:HRTを1年以上行った5例についてCEE0.625mg/日を3週間投与して脳血流を測定した。2.の亜急性の効果と同じ程度に脳血流量は増加した。研究課題1.閉経が脳血流に及ぼす影響:44-50歳の非閉経群11名(平均年齢±SD:46.6±1.9歳)と閉経群19名(47.4±2.2歳)の大脳の平気血流量(CBF)を^<99m>Tc-ECD法で測定して比較した。CBF(ml/100g/min)は、非閉経群47.7±2.1(SD)で、閉経群43.8±4.5より有意に大きかった(p<0.02)。非閉経群の症例数を追加して更に検討する。昨年度報告した研究課題2.(低用量)と研究課題3.(比較的高用量)のエストロゲン補充療法(ERT)が脳血流に及ぼす影響、及びその対照群で、それぞれ症例を追加して計13名、14名、10名とした。大脳血流量(CBF)と小脳血流量(C_<b1>BF)の平均増加率(±SD)は、課題2:CBF 7.1±4.6%、C_bBF6.8±4.9%、課題3:CBF.7.9±5.8%、C_<b1>BF6.3±4.7%、でいずれも昨年と同程度であった。また、対照群では有意な変化は認められなかった。研究課題4.長期ERT/HRTの効果:1年以上(平均13.7±1.5カ月)ERT/HRTを行った9名(54.2±2.4歳)について、CEE 0.625mg/日を3週間投与して脳血流量を測定した。CBFとC_

<b1>BFの増加率は、それぞれ8.0±5.4(SD)%(p<0.001)と7.3±7.0%(p<0.01)で、短期ERTの増加率と同じ程度で、短期効果と長期効果との間に有意差はなかった。
12角形原子コラムを含む配位多面体構造および近似結晶構造の特徴

12角形準結晶の原子配列中には、12角形原子コラムや12角形構造ユニットの存在を見て取ることができる。本研究課題では、これら構造単位を結晶構造に含む、Mn-Si-V合金での近似結晶Hとν相、および金属間化合物σ相を取り上げて、(σ→H)構造変化の結晶学的特徴およびν相とH相の結晶学的相関について、主に透過型電子顕微鏡を用いて、その詳細を明らかにした。その結果、Hおよびν相の結晶構造中には12角形原子コラムおよび12角形構造ユニットを構造単位とする階層性が存在すること、これら近似結晶での階層性は12角形準結晶が示す自己相似性に直接関係することが示された。12角形準結晶に存在が指摘される12角形原子コラムおよびユニットに関係して、Mn-Si-V合金系に存在するH、ν、およびσ相の結晶構造、すなわちH、ν、およびσ構造を取り上げ、作製した試料の結晶学的特徴を主に透過型電子顕微鏡を用いて調べた。ここで、H、ν、およびσ構造中には共通して12角形原子コラムの存在を見て取ることができ、Hおよびν構造中には、さらに、12角形原子ユニットの存在をも見て取ることができる。結果として、以下の興味深い研究成果が得られた。(1) H構造に関して、溶体化試料中に、12角形原子コラムが残存した特徴的な構造欠陥が観察され、このことから12角形原子ユニットの安定性が示唆された。さらに、別の組成の熱処理試料中には、12角形原子コラムの新しい長方形配列が観察された。この結果を含む実験結果の解析から、(σ→H)構造変化は、実際、12角形原子コラムの再配列としてとらえることができること、また、その再配列の際には、上述の12角形原子コラムの長方形配列により特徴づけられる準安定状態を経由することが明らかになった。また、構造変化の各段階における12角形原子コラムの再配列は、大きな原子変位を必要とせず、12角形原子コラムの殻から中心、および中心から殻へと役割を入れ替える、わずかな原子変位により説明可能であることが示された。(2) H構造とν構造の共存試料において、H構造が、上の場合とは異なる、12角形原子ユニットのユニット軸方向の位相シフトによって特徴づけられる構造欠陥を含みやすいことがわかった。この構造欠陥に起因する暗い線状のコントラストと同様のコントラストが、高分解能像中の共存するν構造領域全面にわたり観察された。この結果を含む実験結果の解析から、ν構造は、H構造に対して、12角形原子コラムのユニット軸方向の位相シフトを連続的に導入した構造であると結論された。本研究課題では、12角形準結晶の近似結晶であるH相を中心に、その結晶構造中に12角形原子コラムおよび12角形ユニットの存在を見て取ることができる、ν相やσ相等の金属間化合物相に注目している。ここで、本研究課題における具体的な関心は大きく分けて、112角形原子コラム形成の起源、212角形原子コラムの再配列によって形成される12角形原子ユニットに関する特徴、および312角形原子コラムおよびユニットの安定性の3点である。現在までに、当初の予定とは順番が前後してしまったものの、2と3に関係して、前述の「研究実績の概要」に示したような興味深い結果を得たため、本研究課題の進捗状況はおおむね順調であると判断した。前年度に引き続き、12角形準結晶の近似結晶相であるH(Mn7Si2V)相の特徴を理解するため、Mn-Si-V合金試料におけるH相および(σ→H)反応の結晶学的特徴の詳細について、主に透過型電子顕微鏡を用いて調べた。得られた結果から、H相の結晶構造、すなわちH構造において、原子、14配位多面体、12角形原子コラム、ならびに19個の12角形原子コラムから成る12角形構造ユニットをそれぞれ構造単位とするような、4つの階層の存在が示唆された。このためH構造は、12角形構造ユニットの、6回対称性を有する周期的な配列として特徴づけられることが分かった。また、前年度に存在が確認されたH構造の欠陥については、2つの12角形ユニットが6個の12角形原子コラムを共有した侵入型構造ユニットが、特に代表的な構造欠陥の1つとして理解された。興味深い特徴として、実際、(σ→H)反応において、侵入型構造ユニットの長方形配列(RAPU)を持った領域が初期状態としてσ母相に出現し、その後、H領域がRAPU領域に接してσ母相から核生成・成長することによりH状態へと構造変化することが明らかとなった。さらに、近年10角形準結晶に対して提案したモデルを背景にして、H構造における原子位置、および12角形準結晶における原子位置とタイリングモデルを、物理的起源を考慮しない平面波モデルを用いて議論した。得られた結果は、高分子等で見出されている12角形準結晶に関する実験結果を充分に再現するものであった。本年度は、12角形準結晶の近似結晶相であるH(Mn7Si2V)相に注目し、(σ→σ+H)反応における(σ→H)構造変化を通して、12角形原子コラムを含む配位多面体σ構造から近似結晶H構造への構造変化について、その結晶学的特徴を明らかにする計画であった。実際、得られた反応は(σ→σ+H)反応ではなく(σ→H)反応であったものの、「研究実績の概要」で述べたような、(σ→H)

構造変化における12角形原子コラムの再配列に関する詳細が明らかになったため。合金における準結晶の原子配列は、自己相似性を有する準周期格子点に位置する原子コラムや巨大原子クラスターの存在によって特徴付けられ、従来3d遷移金属を含む金属間化合物相で見出されている結晶構造の階層性との密接な関係が予想される。本研究課題では、12角形準結晶の原子配列に含まれる、14配位多面体が1次元的に連なった12角形原子コラム、および12角形原子コラムの集合として特徴付けられる12角形構造ユニットをそれぞれ異なる階層における構造単位と仮定し、これら構造単位の形成や再配列という観点から、Mn-Si-V合金系に存在する近似結晶Hおよびν相、そしてσ相を取り上げ、H相の結晶学的特徴、(σ→H)構造変化、ならびにHおよびν相の結晶学的相関について、主に透過型電子顕微鏡を用いて検討した。結果として、例えば、(σ→H)構造変化において、12角形構造ユニットが互いに侵入する形で長方形配列した準安定領域の出現が重要な役割を果たしていること、また、νおよびH相の結晶学的相関に関して、ν構造が、H構造に対する、12角形原子コラムから10角形原子コラムへの変換を伴う波状の反位相境界の周期的な導入により特徴付けられることが明らかになった。さらに、逆空間での立場から、H構造の原子配列を再現する単純な平面波モデルにより、12回対称性および無理数Ω= 2cos15°= (√3+1)/√2 1.932によって特徴付けられる自己相似性を持った準周期格子が得られることが示され、同時に12角形準結晶の原子配列が提案された。これらの結果は、近似結晶H相の結晶構造が、実際、12角形原子コラムや12角形構造ユニットをそれぞれ構造単位とするような異なる階層を有すること、また、この階層性と12角形準結晶の原子配列が有する自己相似性に関して、逆空間での単純な対応が存在することを意味している。12角形準結晶の原子配列中には、12角形原子コラムや12角形構造ユニットの存在を見て取ることができる。本研究課題では、これら構造単位を結晶構造に含む、Mn-Si-V合金での近似結晶Hとν相、および金属間化合物σ相を取り上げて、(σ→H)構造変化の結晶学的特徴およびν相とH相の結晶学的相関について、主に透過型電子顕微鏡を用いて、その詳細を明らかにした。その結果、Hおよびν相の結晶構造中には12角形原子コラムおよび12角形構造ユニットを構造単位とする階層性が存在すること、これら近似結晶での階層性は12角形準結晶が示す自己相似性に直接関係することが示された。今後の推進方策は大きく分けて2つある。まず1つは、12角形原子コラム形成の起源に関する検討課題を遂行することである。すなわち、Mn-Si-V合金系に存在するRおよびν相の結晶構造、すなわちRおよびν構造を対象にして、両者の結晶学的相関および(R→ν)構造変化の特徴を調査し、ν構造が含む12角形原子コラムについて、その出現の起源を検討する。具体的な手順としては、(1)試料作製と評価による適切な合金組成および熱処理の選定、(2)作製した試料の透過型電子顕微鏡による観察、および(3)得られたデータの解析を予定している。もう1つは、分子軌道法による電子状態計算である。電子状態計算により、12角形準結晶の出現に直接関係する、12角形原子コラムおよび12角形原子ユニットの安定性を検討する。今後の推進方策としては、当初の研究計画通り、まず、12角形原子コラムおよび12角形構造ユニットの安定性について、分子軌道法による電子状態計算を用いて検討する。
マウス内臓錯位症候群における刺激伝導系の発生過程の解析

ヒトの内臓心房錯位症候群は、最も重篤な先天性心疾患の一つである。また、本症の心臓の刺激伝導系は、二つの房室結節とこれを連結するsling of conduction tissueが知られている。著者は、この形態が上室性頻拍の旋回回路形成に関与することを電気生理学的に証明し治療した。本症の刺激伝導系の発生を知ることにより形態の理解を深め治療技術の向上めざすことを目的とした。レチノイン酸投与にて誘発した内蔵心房錯位症候群の実験モデル(ラット)の刺激伝導系の発生過程を免疫組織学的手法で解析した。マウス胎仔心の刺激伝導系の染色が困難であったためWistar-Imamichiラット胎仔を用いた。妊娠第8日にレチノイン酸を15mg/体重kgを腹腔内投与し、内臓心房錯位症候群実験モデルを作成した。正常胎仔心では、胎令12日、14日、16日、18日、実験モデル胎仔心では胎令16日の標本を用いた。抗Connexin43(ギャップ結合)抗体、抗HNK-1(ヒトNatural Killer細胞)抗体、抗PGP9.5抗体、抗Desmin抗体を用いて免疫組織化学染色し、実験モデルラットにおける刺激伝導系を正常ラット胎仔と比較した。胎令12日の正常胎仔心では、室間孔の周囲を取り巻く様にHNK-1が発現した。胎令16日までに心室中隔と房室弁は完成し、His束、右脚、左脚と同様の分布で発現した。しかし胎令16日の実験モデル胎仔心では心室中隔と房室弁は完成せず、大きな室間孔と共通房室弁が残存した状態であった。HNK-1は室間孔の下端に沿って発現した。また共通房室弁の後下端と前上端の二箇所にHNK-1の発現を認めた。このHNK-1の分布は正常とは明らかに異なり、二つの房室結節とsling of conduction tissueの分布に類似した。以上の結果は世界で初めて観察された所見である。ヒトの内蔵心房錯位症候群はしばしば上室性頻拍を伴い、治療に苦慮する。刺激伝導系の形態としては、二つの房室結節とsling of conduction tissueの存在が知られ、我々のグループにおいて電気生理学検査と高周波カテーテルアブレーションにより治療に成功したことにより、始めてこの異常な形態が興奮の旋回回路を形成し機能していることが証明された。これにより薬剤抵抗性不整脈治療の選択肢が開けたが、さらに異常な刺激伝導系の発生を調べることにより形態の理解を深め、さらなる治療技術の向上を目指し本研究を計画した。当初、レチノイン酸により誘発した内蔵心房錯位症候群モデルマウスあるいはivミュータントマウスを使用する予定であったが、従来の抗connexin40,43,45抗体ではマウス胎仔の発生過程における刺激伝導系の染色が困難であることが判明した為、本年度は予備実験としてSlc:Wistarラットを用いて、内蔵心房錯位症候群の実験モデルの作成を試みた。また、正常ラット胎仔における刺激伝導系の分布を把握するために、抗HNK-1抗体を用いて実験を行った。最近、マウス胎仔心に反応する抗Connexin43抗体を得ることが出来たため、マウス・ラット両モデルを用いて検索中である。ヒトの内蔵心房錯位症候群における心臓の刺激伝導系は、正常とは異なり組織学的に、二つの房室結節の存在とsling of conduction tissucが知られている。著者は本症候群に合併する上室性頻拍の機序として、二つの房室結節とこれらを連結するsling of conduction tissueが興奮の旋回回路を形成していることを電気生理学検査及び、高周波カテーテルアブレーションを行い治療に成功し、初めて異常な形態が機能しており頻拍発作の原因となることを証明した。形態の把握とカテーテルアブレーションの技術の向上が薬剤抵抗性不整脈治療を可能にしたが、さらに異常な刺激伝導系の発生を知ることにより形態の理解を深め、治療技術の向上につながることを目的とする。レチノイン酸投与により誘発した内臓心房錯位症候群の実験モデル(マウス)あるいはiv/iv mouseの刺激伝導系の発生過程を抗Conncxin 40抗体、抗Conncxin43抗体、抗Conncxin45抗体を用いて解析するが、マウス胎仔の刺激伝導系はラット胎仔と異なり、従来の各種抗Conncxin抗体では染色が困難であることが判明したため、予備実験として、正常ラット胎仔における刺激伝導系の分布を把握するために、抗HNK-1抗体と抗Connexin43抗体を用いてラット胎仔の刺激伝導系の染色を試みた。またSlc:Wistarラットを用いてレチノイン酸を妊娠第8日に腹腔内投与し、内臓心房錯位症候群実験モデルの作成を試みた。マウス胎仔心に反応する抗Conncxin43抗体を得ることができたため、マウスとラットを用いて引きつづき検討する予定である。

マウス胎仔心の刺激伝導系の染色が困難であったためWistar-Imamichiラット胎仔を用いた。妊娠第8日にレチノイン酸を15mg/体重kgを腹腔内投与し、内臓心房錯位症候群実験モデルを作成した。正常胎仔心では、胎令12日、14日、16日、18日、実験モデル胎仔心では胎令16日の標本を用いた。抗Connexin43(ギャップ結合)抗体、抗HNK-1(ヒトNatural Killer細胞)抗体、抗PGP9.5抗体、抗Desmin抗体を用いて免疫組織化学染色し、実験モデルラットにおける刺激伝導系を正常ラット胎仔と比較した。胎令12日の正常胎仔心では、室間孔の周囲を取り巻く様にHNK-1が発現した。胎令16日までに心室中隔と房室弁は完成し、His束、右脚、左脚と同様の分布で発現した。しかし胎令16日の実験モデル胎仔心では心室中隔と房室弁は完成せず、大きな室間孔と共通房室弁が残存した状態であった。HNK-1は室間孔の下端に沿って発現した。また共通房室弁の後下端と前上端の二箇所にHNK-1の発現を認めた。このHNK-1の分布は正常とは明らかに異なり、二つの房室結節とsling of conduction tissueの分布に類似した。以上の結果は世界で初めて観察された所見である。
中国大陸における動物原虫感染症の疫学に関する総合調査研究

本研究は、中国における動物の主要原虫感染症の浸潤・流行状況を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを目的として実施した。3ヶ年にわたり得られた主な研究成果は下記の通りである。1.原虫感染症診断用抗原の検索と同定バベシア、トキソプラズマ、ネオスボラ、クリプトスポリジュウム及びトリバノソーマなど主要動物病原原虫のcDNAライブラリーを作製し、イムノスクリーニング法によりそれぞれの主要抗原遺伝子を同定・クローニングし、その性状解析を行った。新しく同定或いは性状解析した抗原遺伝子としてB.equiのEMA-1、EMA-2、P82;B.caballiのP48、P134;B.gibsoniのP18、P29、P50;B.bovisのRAP-1;N.caninumのSAG1、SRS2;T.gondiiのSAG1、SAG2、SRS1、ROP-2;C.parvumのP15、P23などが挙げられる。2.組換えタンパク質を抗原とした血清診断法の確立上記の種々の原虫抗原遺伝子を大腸菌或いは昆虫細胞発現系にて発現させ、得られた組換えタンパク質を抗原としたELISA法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法などを確立した。3.DM診断法の確立上記の一部の原虫遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、特異性と感度の高いPCR法を確立した。4.中国における原虫感染症の疫学調査中国西北地区の新彊自治区、東北地区の吉林省、華北地区の北京市、華南地区の福建省、西南地区のチベット自治区の馬・牛・豚・羊・イヌなど動物のバベシア、トキソプラズマ、ネオスポラ、クリプトスポリジウムなど原虫感染症の疫学調査を行い、数多くの新しい知見を得た。本研究は、中国における動物の主要原虫感染症の浸潤・流行状況を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを最終目的とし、3ケ年にわたり以下の手順で実施される。(1)中国における動物の主要原虫感染症の流行状況に関する聞き取り調査ならびに文献サーベイ;(2)小規模な野外調査地域の設定と予備調査;(3)本格的な野外調査(血清学的診断とDNA診断);(4)各種原虫の培養・分離・同定;(5)分離株の生物学的性状解析;(6)分離株の遺伝子解析;(7)現地に適した診断・予防法の確立;(8)日本の輸入検疫関連機関への適切な助言を行うための報告書の作成。本年度に得られた主な成績は以下の通りである。1)ウマバベシア、ウシバベシア、イヌバベシア、ネオスポラ、トキソプラズマ感染症に対する組換えタンパク質を抗原としたELISA診断法を確立した。2)ウマバベシア、イヌバベシア感染症のDNA(PCR)診断法を確立した。3)中国新疆・吉林両地区の主要産業動物である馬・牛・羊を対象に馬バベシア、牛ネオスポラ・クリプトスポリジウム・住血原虫感染症の発生・被害状況について聞き取り調査を行った。4)血清学診断により新疆・吉林両地方にはウマバベシア感染症が広く浸潤・蔓延していることを明らかにした。5)中国南京・北京両地区から採取した犬の血清について、バベシアギブソニに対する抗体の検出を試みたところ、いずれも陽性検体が認められた。

本研究は、中国における動物の主要原虫感染症の浸潤・流行状況を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを最終目的とし、3ヶ年にわたり以下の手順で実施される。(1)中国における動物の主要原虫感染症の流行状況に関する聞き取り調査ならびに文献サーベイ;(2)小規模な野外調査地域の設定と予備調査;(3)本格的な野外調査(血清学的診断とDNA診断);(4)各種原虫の培養・分離・同定;(5)分離株の生物学的性状解析;(6)分離株の遺伝子解析;(7)現地に適した診断・予防法の確立;(8)日本の輸入検疫関連機関への適切な助言を行うための報告書の作成。本年度に得られた主な成績は以下の通りである。1)ウマバベシア、ウシバベシア、イヌバベシア、ネオスポラ、トキソプラズマ感染症に対する組換えタンパク質を抗原とした血清学診断法を確立した。2)中国チベット・東北両地区の主要産業動物である馬・牛・羊・ヤクを対象に馬バベシア、牛ネオスポラ・クリプトスポリジウム・住血原虫感染症の発生・被害状況について聞き取り調査を行った。3)血清学診断により中国東北地方にウシネオスポラ感染症が広く浸潤・蔓延していることを明らかにした。4)血清学診断により中国黒竜江省地域にウマバベシア感染症が広く浸潤・蔓延していることを明らかにした。(1)中国における動物の主要原虫感染症の流行状況に関する聞き取り調査ならびに文献サーベイ;(2)小規模な野外調査地域の設定と予備調査;(3)本格的な野外調査(血清学的診断とDNA診断);(4)各種原虫の培養・分離・同定;(5)分離株の生物学的性状解析;(6)分離株株の遺伝子解析;(7)現地に適した診断・予防法の確立;(8)日本の輸入検疫関連機関への適切な助言を行うための報告書の作成。2)中国新彊・東北両地区の主要産業動物である馬・牛・羊を対象に馬バベシア、牛ネオスポラ・クリプトスポリジウム・住血原虫感染症について疫学調査を行った。3)中国南京地方におけるイヌバベシア感染症の疫学調査を行った。
複合物理刺激を利用した革新的ヒトiPS細胞培養プロセス創出に関する基盤研究

生体内において、細胞は多様な物理刺激を常に受けている。例えば血流によって、血管内皮細胞には剪断応力刺激が負荷される。呼吸によって、肺細胞には伸展刺激が負荷される。細胞はこれら多様な物理刺激を生化学的なシグナルへと変換して細胞内に伝達し、それに対して応答する(メカノトランスダクション)。細胞は物理刺激に応答することで、本来の機能を維持していることが徐々に明らかになってきている。申請者らはこの物理刺激を、再生医療の細胞源として期待されているヒトiPS細胞の培養プロセスに応用すべく、ヒトiPS細胞の増殖と遺伝子発現が培養面の硬さ依存的に変化することを見出した。さらに、この培養面の硬さの違いによってヒトiPS細胞に対して未分化維持に必要なシグナル伝達を誘導することが明らかとなり、ヒトiPS細胞培養コスト増加の大きな要因の一つであるbFGFを添加することなく培養することが可能であることが明らかとなってきた。また熱による刺激によって、ヒトiPS細胞の挙動を操作するために、マグネタイトを脂質膜で包埋したマグネチックカチオニックリポソーム(MCL)を作成し、ヒトiPS細胞への取り込み量を定量した。さらに通常は磁場照射によって発熱するマグネタイトが、850 nm程度の近赤外光を用いることで発熱させ得ることを発見し、より簡便に細胞内から熱刺激を付与する系の確率に成功した。流れによる刺激(剪断応力)を付与するために、流路デバイスを作成し、デバイス内で細胞が培養できうることを確認した。当初申請において提案していた、ヒトiPS細胞に対して複数の物理刺激を付与し評価するための系の確率を着実に進めている。さらに最終年度において、複数の物理刺激を付与し液性因子を添加することなく分化誘導を達成し、バイオリアクター創出の基盤とすべく、デバイスの作成にも取り掛かり一定の成果をあげつつあるため。現在進めている培養面の硬さ依存的なヒトiPS細胞の挙動評価を、未分化および分化状態において行い、硬さによってどの程度挙動を操作できるかを明らかにする。また熱、流れによる挙動評価を進めるとともに、水圧や伸展刺激による挙動評価も開始するため、申請において提案していたデバイス設計に基づいて作成を始めていく。
小児脳腫瘍の遺伝子治療に関する研究

未分化神経細胞に起源を発する小児期脳腫瘍は小児固形腫瘍中、最も多くかつ予後不良の疾患である。我々は未分化神経細胞の分化・誘導・維持に必須のシグナル伝達系である神経成長因子(NGF)およびその受容体(NGRR)から成るカスケード(NGF/NGFRカスケード)に着目し、このカスケードを遺伝子工学的手法にて人為的に腫瘍細胞内に導入し、腫瘍細胞をDNA合成停止を伴う最終分化へ導くという新たなる分化誘導療法(遺伝子治療)を開発することを目的として研究を計画した。我々の研究では下記の新たなる知見を得た。1.内因性のNGF受容体を発現しない未分化神経内に人為的に導入されたtrkAcDNAは低親和性NGF受容体gp75^<NGFR>の非存在下においても細胞表面上に機能的NGFRを構築した。2.発現したtrkA受容体はNGF投与に伴ってチロシンりん酸化をきたした。また、シグナル伝多路中間体として知られているPLC-γ1,ERK-1,ERK-2も同時に活性化された。4.トランスフェクタントへのNGF長期投与は増殖抑制・DNA合成停止を伴うin vitroおよびin vivoでのトランスフェクタントの形態学的、分子生物学的分化を誘導した。5.この際、過剰発現していた内因性のN-myc遺伝子はその発現が抑制された。しかし、N-mycの持続強制発現はNGF/NGFRカスケードを介する未分化神経細胞の分化誘導をimmediate- early resonse遺伝子の発現以降の段階で妨げた。6.trkAトランスフェクタントの神経栄養因子に対する生物学的反応はNGFのみならず、NT-3,NT-4/5でも同様に認められた。しかし、BDNF投与後にはこれらの反応は見られなかった。以上の結果は神経細胞内に導入されたtrkAcDNAがそれ単独で、すなわちgp75^<NGFR>の非存在下においても機能的NGF/NGFRカスケードを構築し、未分化神経細胞をin vivoにおいても分化誘導することを意味する。同時にこれは小児脳腫瘍の新たなる遺伝子導入療法への道を開くものである。神経成長因子(以下NGFと略す)および、その受容体(NGFR)から成るシグナル伝達系は発達期の神経細胞の分化・成長に重要な役割を果たす。今回、我々は小児固型腫瘍中、最も頻度が高く、かつ神経系細胞の分化・増殖異常に基づくと考えられる脳腫瘍に着目し、NGF/NGFRカスケードを利用した.脳腫瘍に対する遺伝子治療の可能性を探ることを目的に実験を行った。平成4年度は、内因性の機能的NGF/NGFRカスケードを有しないラット中枢神経系神経芽細胞腫株B104内ヘ、高親和性NGFR蛋白をコードするプロトオンコジーンtrk発現ベクターをトランスフェクションし、得られたトランスフェクタントB104-trkの生物学的動態を解析した。結果:(1)ラットB104細胞およびトランスフエクタントB104-trkは.ともに内因性の低親和性NGFRを発現していた。(2)B104-trkは.モノクローナル抗体によるFACS解析から、ほぼ100%の細胞が.その表面上にTRKを発現していることが確認された。(3)トランスフェクタントのNGF短期間処置はimmediate early responseとしてのS-fosの発現を引き起こした。

(4)NGF長期投与はトランスフェクタントをlate response gemeとしての神経特異的遺伝子の発現を伴う形態学的分化へと導いた。以上の結果はプロトオンコジーンtrkのコードする蛋白が内因性の低親和性NGF受容体とともに機能的NGF/NGFRカスケードの構築に関与することを意味し、さらに神経細胞内に人為的に構築されたNGF/NGFRカスケードがinvitroにおいて脳腫瘍を分化誘導しうることを明らかにするものである。本年度は、ラット中枢神経系神経芽細胞腫B104細胞内に、高親和性の神経成長因子受容体をコードすることが推定されているプロトオンコジーンtrkA cDNAをトランスフェクションし、得られたトランスフェクタントB104-trkA細胞がin vitroでNGF投与に反応して、腫瘍の増殖抑制を伴う分化誘導を受けるか否かを検討した。以上の結果は、導入されたtrkA cDNAが神経芽細胞内において機能的NGF/NGFRカスケードを構築し、NGF投与にひきつづいて、未分化神経芽細胞を増殖抑制を伴う分化へと誘導しうることを示すものである。また、N-mycの持続発現がNGF/trkAによる、神経細胞の分化誘導機構をブロックすることも明らかにした。神経成長因子(NGF)およびその受容体(NGFR)から成るカスケード(NGF/NGFRカスケード)は神経細胞の分化・成長・維持に必須の栄養因子である。我々は未分化神経細胞に由来する小児期脳腫瘍の神経栄養因子による新たなる分化誘導療法の開発を目指してきた。本年度は神経細胞表面上に人為的に構築したNGF受容体がNGF以外の神経栄養因子に対しても反応し、未分化神経細胞を分化誘導するか否かを検討した。1.内因性のNGFRを全く発現しないヒト由来の未分化神経細胞株HTLA230細胞へのtrkAcDNAのトランスフェクションは細胞表面上に機能的NGFRを構築した。得られたトランスフェクタントのin vitro及びin vivoでのNGF投与は未分化神経細胞を最終分化段階へと誘導した。2.構築されたtrkA受容体はNGFのみならず、ニューロトロフィン-3(NT-3)およびニューロトロフィン-4/5(NT-4)に対しても活性化された。3.トランスフェクタントにおいては、NGF/NGFRカスケードのシグナル伝達路中間体として知られているPLC-γ1,ERK-1,ERK-2はNGF,NT-3,NT4/5いずれの投与後にも等しく活性化された。4.trkAトランスフェクタントのNGF,NT-3,NT-4/5短時間処置はいずれの投与後においてもEgr-1遺伝子の一過性の発現増加を認めた。5.トランスフェクタントへのNGF,NT-3,NT-4/5の長時間投与は形態学的分化を誘導した。6.上記の各種神経栄養因子に対するtrkAトランスフェクタントの反応はBDNF投与後には全く認められなかった。これらの結果は、未分化神経細胞に導入され、人為的に構築されたtrkA受容体はNGF,NT-3,NT4/5投与に反応して未分化神経細胞を分化誘導することを意味する。
脳死、および臓器提供における家族間意思疎通に関する研究

先行研究および諸調査の報告によれば、我が国では自分の死後の臓器提供について、移植医療がより一般的に行われている欧米諸国と比較してほぼ同様に肯定的であるが、実際に提供される臓器の数は遙に少ない。また我が国では、故人の意思が明示されているいないを問わず、遺族の承諾が臓器摘出の要件とされており、故人の代理者として遺族に大きな役割を与えている。本研究の目的は、1.家族間で死後の臓器提供についての意思疎通がどの程度行われており、2.現行の遺族による故人の代理者としての臓器摘出の同意または拒否が、正当性を持ちうるものか否かを、明らかにすることにある。茨城県下の高校生460名とその父兄を対象に、1993年8月に調査票調査が行われた。405名(86.2%)の学生、320名(68.1%)の父兄から回答が得られた。自分の死後の臓器提供については、学生の44.8%、父兄の34.3%が賛成すると回答した。学生と父兄の両方から回答の得られた246例をもちいたクロス分析では、死後の臓器提供について自分の意思を賛成・反対の形で表明した168人の学生に対して、その父兄のうち31.0%が学生の意思を正しく推測したに過ぎなかった。本調査により、1.家族が故人の臓器提供の希望について知っている情報は比較的少なく、2.家族が行う故人を代理しての臓器提供するか否かの意思決定は必ずしも故人の意思を反映していないこと、3.臓器提供において故人の任意性を担保するためには、ドナーカードのような故人の意思を直接に表すような意思表示手段の普及が優先されるべきことが示唆された。
固体材料を用いたボロンの多価イオン生成に関する研究.

本研究では高融点材料であるボロンを蒸気化してECRイオン源(2.45GHz)に導入し,その多価イオンを生成することを目的とする.安全な固体材料からボロン多価イオンを生成する際,スパッター法に比べ蒸発法による導入の方が電離効率は高い.イオン源の動作ガス圧と同程度の蒸気圧を得る為には温度は約1500°C程度が要求される.純ボロンパウダーを入れた蒸発源はボロンナイトライド(BN)のルツボを用い,タンタルヒーター(0.8mmφ,50cm)にDC電源又はリングトランスにより電流を通電し加熱を行う.非接触放射温度計により温度測定を行なった.熱輻射を抑える為にタンタル箔による2重シールドした構造とした.ルツボ製作に当たりイオン源とは独立な真空装置により予備実験を行なった.水晶発振式の蒸着モニター及びシリコン基板への堆積膜のオージェ分光による組成分析でボロンの蒸発を確認した.ルツボに対して要求される電力は約400Wであった.次にECRイオン源においてボロン多価イオン生成を行なった.ルツボはイオン引き出し電極と対向するエンドプレートからミラー磁場の軸上に沿って挿入した.ミラーのボトムに形成したECR共鳴点から約15cmの位置である.プラズマ生成の為のマイクロ波入射電力約100W,圧力約5×10^<-4>Pa(N_2),引き出し電圧10kVの実験条件でイオン電流の価数分布の分析を行なった.その結果,ボロンイオンは3価まで観測された.スパッタリング法(40mmφLaB_6ターゲット)の場合と比較して,本実験ではボロン原子のフラックス量が少ない(約1/4)にもかかわらず,1価電流では同程度,2,3価では10倍以上に飛躍的に増大した.今後の課題としては焼結されたBNルツボから加熱により窒素ガスが放出されることと,ルツボの加熱効率が悪いことである.これらはそれぞれパイロリックBNの使用と形状を小さくすることで改良されると考えられる.本研究では高融点材料であるボロンを蒸気化してECRイオン源(2.45GHz)に導入し,その多価イオンを生成することを目的とする.安全な固体材料からボロン多価イオンを生成する際,スパッター法に比べ蒸発法による導入の方が電離効率は高い.イオン源の動作ガス圧と同程度の蒸気圧を得る為には温度は約1500°C程度が要求される.純ボロンパウダーを入れた蒸発源はボロンナイトライド(BN)のルツボを用い,タンタルヒーター(0.8mmφ,50cm)にDC電源又はリングトランスにより電流を通電し加熱を行う.非接触放射温度計により温度測定を行なった.熱輻射を抑える為にタンタル箔による2重シールドした構造とした.ルツボ製作に当たりイオン源とは独立な真空装置により予備実験を行なった.水晶発振式の蒸着モニター及びシリコン基板への堆積膜のオージェ分光による組成分析でボロンの蒸発を確認した.ルツボに対して要求される電力は約400Wであった.次にECRイオン源においてボロン多価イオン生成を行なった.ルツボはイオン引き出し電極と対向するエンドプレートからミラー磁場の軸上に沿って挿入した.ミラーのボトムに形成したECR共鳴点から約15cmの位置である.プラズマ生成の為のマイクロ波入射電力約100W,圧力約5×10^<-4>Pa(N_2),引き出し電圧10kVの実験条件でイオン電流の価数分布の分析を行なった.その結果,ボロンイオンは3価まで観測された.スパッタリング法(40mmφLaB_6ターゲット)の場合と比較して,本実験ではボロン原子のフラックス量が少ない(約1/4)にもかかわらず,1価電流では同程度,2,3価では10倍以上に飛躍的に増大した.今後の課題としては焼結されたBNルツボから加熱により窒素ガスが放出されることと,ルツボの加熱効率が悪いことである.これらはそれぞれパイロリックBNの使用と形状を小さくすることで改良されると考えられる.
マイクロ・ロボットによる各種放射計測の自動化

われわれは光量子放射化分析およびすべての放射化法に適用可能な、新内標準法による放射化分析の開発研究を鋭意実施している。これらの研究においては様々な半減期核種を測定することを余儀なくされ、夜間・休日といわず精力的にそれら放射能を測定し続けねばならない。それ故、これら測定作業にはかなりの過剰労働が強いられ、これが研究能率低下の大きな原因となっていた。そこで、1982年末国内電気メーカーによってマイクロ・ロボットが市販されるにおよび、早速それとパーソナル・コンピュータ、放射線計測器を組合わせた、上記放射能測定の自動化を独自に開発完成させ、翌春から上記研究遂行に参加実用化させることに成功した。しかし、このロボットおよびコンピュータによる自動化は、ロボット自身が自動原点復帰機能を持っていなかったこと、およびコンピュータのメモリ容量不足で機能的にとても満足できる代物とはいえなかった。しかし、1984年末になると、上記欠点を補う両改良製品が相ついで市販されるようになり、相変らず全国どの研究室でも放射能測定に過剰労働が強いられている現状をふまえ、早速安価でより普及化しやすい各種放射線計測完全自動化システムの実現を図ることにした。このシステムは、多種多数試料自動変換ホルダーの製作、パーソナル・コンピュータと半導体検出器、シンチレーション検出器、G-M検出器、多重波高分析器および各種計測器の接続、ロボットの制御プログラムの開発、またデータの転送・計算処理プログラムの開発によって完成実現されたが、これはかなりの長期にわたる作動テストにおいて十分満足すべき機能をはたすことが確められた。そこで日常における研究ラインに早速活用することによって、ラボラトリー・オートメーション化を達成し、広く所属研究施設共同利用に開放することによって諸研究の発展にも役だたせることにした。
リンパ管腫に対する各種薬剤の治療効果の検討と作用機序の解析

現在リンパ管腫の治療に対して、有効性が期待される各種薬剤(OK432、Rapamycin、β-blocker、bleomycin, etc)の治療効果と作用機序についての検討を行った。続いて、HL-LECに対するOK-432の直接効果の機序を検討した。治療についての研究結果、OK-432, bleomycin, rapamycin, propranololはin vitroでHL-LECに直接作用する。OK-432はエンドサイトーシスによってHL-LECに取り込まれ、免疫反応を介さずに細胞死を惹起することが分かった。我々は現在までにリンパ管腫由来内皮細胞株(HL-LEC)及び不死化細胞株を樹立している(投稿中)。昨年度は不死化細胞株に対してin vitroで各種薬剤を加えて、それぞれの薬剤の直接効果を生物学的に比較検討してきた。結果,OK-432とbleomycinとpropranololはin vitroで不死化細胞株に直接作用してcontrolと比べて生細胞数を減少させることが分かった。特にOK-432やbleomycinは臨床で有用とされているが、詳細な機序はわかっていないのが現状である。我々は、OK-432の作用機序を検討した。その結果、形態学的に濃度依存性に変化する事、免疫染色でOK-432が細胞質内に取り込まれる事、取り込まれてHL-LECが死滅した後もOK-432は残存する事がわかった。apoptosisかどうかを検証したが明らかにapoptosisを示唆する所見は認めていない。HL-LECに対してin vitroで各種薬剤を加えて、それぞれの薬剤の直接効果を生物学的に比較検討した。薬剤としては現在までに有効性の報告があったOK-432、bleomycin、propranolol、sildenafil、dexamethasone、rapamycinの効果を検討した。薬剤の濃度は過去の文献を参考にし、実際に臨床で用いられている用量で設定し、72時間培養した。結果は、OK-432は統計学的優位差をもって濃度依存性に生細胞数の減少を認めた。bleomycinでは生細胞数は優位に減少した。propranololではOK-432と同様に統計学的優位差をもって濃度依存性に生細胞数の減少を認めた。Rapamycinは濃度依存性に生細胞数の減少を認めなかった。Sildenafilは生細胞数を減少させる効果はみられなかった。dexamethazoneは生細胞数を減少させたが、優位差は認めなかった。まとめとして、OK-432とbleomycinとpropranololはin vitroでHL-LECに直接作用してcontrolと比べて生細胞数を減少させた。これらは臨床で有用となりうるが、詳細な機序はわかっていないため、更なる検討と作用機序の解明が必要と考えた。我々はヒトリンパ管腫由来リンパ管内皮細胞の培養の確立を行いモデル動物の作成・遺伝子解析・薬物効果の検証を目標に行っている。既にヒトリンパ管腫由来リンパ管内皮細胞HL-LECの培養法は確立されている。HL-LECに対して、有効と言われている各種薬剤の直接効果を検討した。HL-LECを各種薬剤と共培養して生細胞数を計測。OK432は濃度依存性に優位差をもって減少した。ブレオマイシンは優位差をもって減少した。プロプラノロールは濃度依存性に優位差をもって減少した。ラパマイシンは優位差をもって減少した。その他の薬剤は有効性が示すことができなかった。続いて、特に有効とされているHL-LECに対するOK-432の直接効果の機序を検討した。形態学的にHL-LECは縮小し、dishからはがれていくことがわかりました。OK432は核の周囲に位置しており、内皮細胞に直接取り込まれることがわかった。核の周囲にある事からEndocytosisによって取り込まれている可能性が示されている。現在のところ、アポトーシスが関与しているという証拠はない。同時に動物モデルを作成して薬剤の直接効果を検証した。HL-LECはin vitroで正常なリンパ管のマーカーを発現し、内皮細胞の特性を示すが、in vivoでは正常リンパ管内皮細胞と異なりリンパ管を形成せずに、リンパ嚢胞を形成することが分かった。in vivoでの効果検証のためにも、これらの細胞を不死化して蛍光を発する細胞を作成し、蛍光リンパ管腫モデルマウスを作成中である。小児外科学ヒトリンパ管種由来リンパ管内皮細胞の不死化細胞株に対して現在までに有効性が報告されている薬剤のin vitroにおける有効な薬剤の直接効果は確認できた。特に最も文献が多く、有用とされているOK-432についてより詳細に検討を行っている。

一方で不死化細胞株でない、ヒトリンパ管種由来リンパ管内皮細胞(HL-LEC)に対して薬剤のin vitroにおける有効な薬剤の直接効果およびin vitroの蛋白レベルでの変化を解析する必要がある。しかし、HL-LECの増力能が低いことと、新たな細胞株の樹立が少し難しいこともあり、研究が予定通りに進捗していない原因となっている。その次のステップとしては動物モデルを作成し、動物モデルを用いてin vivoでの作用を検討する。大きさや形状変化を経時的に観察し、harvestした組織の遺伝子発現をgenetipにて解析すると同時に、蛋白レベルでの変化を免疫組織学的に判定する。動物モデルは藤野らの研究で作成中であるために成果を待っているところである。ヒトリンパ管種由来リンパ管内皮細胞(HL-LEC)に対して現在までに有効性が報告されている薬剤のin vitroにおける有効な薬剤の直接効果は確認できた。しかし、これらの詳細な作用機序は解明できていない。最も文献が多く、有用とされているOK-432についてより詳細に検討していきたい。また、今回有用であったpropranololとbleomycinについても検討が必要だ。我々は現在までにOK-432がendocytosisによりリンパ管内皮細胞の細胞質に取り込まれることを確認しており、PI3K/AKT系の下流のシグナル伝達に作用し、apoptosisを誘導するのではないかと予想している。OK-432はいかに細胞内に取り込まれるのかを免疫染色を用いて、またendocytosis後の細胞死への経路をシグナル伝達系を中心に検証する。一方で不死化細胞株でない、ヒトリンパ管種由来リンパ管内皮細胞(HL-LEC)に対して薬剤のin vitroにおける有効な薬剤の直接効果およびi蛋白レベルでの変化を解析する必要がある。動物モデルは現在藤野が作成中である。蛍光蛋白で標識されたリンパ管腫動物モデルを作成し、In vivoでの薬剤の動態と治療効果を組織を用いて検証する。これにより、有効な投与方法や有効濃度などが明らかになる。投与方法としては腫瘍への直接投与や経静脈投与などを濃度を変えて投与する。我々は、同時にリンパ管腫症由来リンパ管内皮細胞株およびリンパ管腫症モデル動物を樹立すべく研究中であるが、世界的に症例数も少ない上に検体を摘出することも稀である。
口腔癌に対するiNOS遺伝子導入と放射線治療との併用療法の開発

1.ヒト口腔扁平上皮癌細胞(B88)にiNOS遺伝子を導入し過剰発現させた細胞では、in vitro及びヌードマウスでの増殖は有意に抑制され、NOの産生を検出した。また、放射線照射を行うと、更に有意に細胞増殖が抑制され、アポトーシスの誘導が検出された。一方、B88細胞におけるiNOS遺伝子のdown-regulationは、細胞増殖を有意に増強した。2.B88ヌードマウス腫瘍にiNOS遺伝子を導入した場合、bystander effectの誘導が検出された。この場合、腫瘍組織に浸潤している炎症細胞に、iNOSの発現が免疫染色により検出された。3.我々はすでに、口腔癌に対してOK-432+UFT+放射線の同時併用療法の有効性を報告している。この場合、治療前生検組織において、癌胞巣に一致してiNOSの発現を認めるが、治癒した時点での生検組織では、上皮の再構築がなされ上皮下間葉組織にはiNOSを強く発現する炎症細胞の浸潤を多数認めた。4.OK-432よりリポタイコ酸関連分子(OK-PSA)を調製した。OK-FSAは強力なTh1-タイプサイトカインを誘導することを明らかにした。5.ヒト唾液腺癌(HSG)を担うヌードマウスにおいて、OK-PSAを腫瘍周囲に投与して治療すると、IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12,IL-18等のTh1-タイプサイトカイン及びNOの産生が検出された。また、放射線治療を併用すると上記のサイトカインとNOの産生が増強された。6.ヒト末梢血単核球、U937細胞、ヒト歯肉線維芽細胞、ヒト口腔扁平上皮癌細胞(BHY)をin vitroでOK-PSAで処理すると、NO2^-の産生が培養液中に検出された。7.B88細胞をNO donor(NOC18:0.01-1mg/ml)存在下で培養すると、高度なアポトーシスの誘導を検出した。1.転移性(HNT)及び非転移性(BHY)ヒト口腔扁平上皮癌細胞並びにヒト口腔小唾液腺由来腺扁平上皮癌細胞(TYS)にiNOS遺伝子をリポフェクチン試薬を用いて遺伝子導入した。iNOS遺伝子を過剰発現させた上記の口腔癌細胞(HT,BHY及びTYS)をin vitroで培養すると、NOの産生がGriess反応を用いて亜硝酸塩(nitrite:NO_2-)の産生を測定することにより検出された。この場合、口腔癌細胞の増殖抑制を認め、放射線照射を行うと、更に有意に細胞増殖が抑制され、著明なアポトーシスの誘導が検出された。2.口腔癌細胞(HNT,BHY及びTYS)をヌードマウスに移植して発生した腫瘍に、iNOS遺伝子を遺伝子銃をを用いて導入した。iNOS遺伝子の発現はin situ hybridizationにより検出された。その結果、iNOS遺伝子が導入されたすべての腫瘍において、有意な増殖・転移抑制を認めた。また、iNOS遺伝子を導入した腫瘍では著明なアポトーシスの誘導が、TUNEL法により検出された。3.HNT,BHY或いはTYSヌードマウス腫瘍にiNOS遺伝子を導入した場合、iNOS遺伝子が検出されない領域に存在する腫瘍細胞にも、アポトーシスの誘導が観察され、即ちbystander effectが検出された。この場合、腫瘍組織に浸潤している炎症細胞に、iNOSの強度の発現が、免疫染色により検出された。なお、iNOS遺伝子導入に伴う副作用は認められなかった。

1.口腔癌の生検及び手術材料における内因性iNOSの発現をin situ hybridization,免疫染色により検索した。更に、iNOSの発現と治療効果或いは予後との関連性を検討した。その結果、口腔癌の生検材料で腫瘍浸潤リンパ球[(Tumor infiltrating lymphocytes (TIL)]でiNOSmRNA及びタンパクの発現が高度である程、放射線治療及び免疫化学療法(OK-432+UFT)に対する感受性が有意に高く、予後良好であることを示唆する知見を得た。また、手術材料においてもiNOS発現誘導を高度に認めるTILが多数存在する程、予後良好であった。2.OK-432よりリポタイコ酸関連分子OK-PSAを調製した。OK-PSAは強力なTh1-タイプサイトカイン誘導分子であることを明らかにした。ヒト唾液腺癌(HSG)を担うヌードマウスにおいて、OK-PSAを腫瘍周囲に投与して治療すると、IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12,IL-18等のTh1-タイプサイトカイン及びnitrite/nitrateを血清中に著明に産生した。また、OK-PSAは、TIL,所属リンパ節細胞及び脾細胞の殺細胞活性を上昇した。更に、OK-PSAは腫瘍組織へのリンパ球浸潤、主にNK細胞の浸潤を誘導した。また、OK-PSAは腫瘍増殖を有意に抑制し、OK-PSAの抗腫瘍効果は抗アシアロGM1抗体の投与により消失した。3.iNOS遺伝子を導入したヒト口腔癌細胞をヌードマウスに移植して調整した腫瘍組織には、TIL,マクロファージ,NK細胞の浸潤を認めた。また、口腔癌細胞におけるNOの産生は、p27^<kip1>,p21^<Waf1>のup-regulationを誘導した。1.OK-432よりリポタイコ酸関連分子(OK-PSA)を調製した。ヒト唾液腺癌(HSG)を担うヌードマウスにおいて、OK-PSAを腫瘍周囲に投与して治療すると、interferon-γ,tumor necrosis factor-α,interleukin (IL)-2,IL-12,IL-18等のTh1-タイプサイトカイン及びnitrite/nitrateの産生が血液中に検出された。また、OK-PSAは腫瘍浸潤リンパ球、所属リンパ節細胞及び脾細胞の殺細胞活性を上昇した。加えて、OK-PSAは腫瘍組織へのリンパ球浸潤、主にNK細胞の浸潤を誘導した。更に、放射線治療を併用すると腫瘍組織における抗腫瘍に働く樹状細胞等のエフェクター細胞の浸潤が有意に増強した。