hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構

本研究は、新規H^+/CΓシンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポトーシス誘導機構を、オートファジーに注目して解明、動物細胞オートファジー関連遺伝子の同定を目指し、(2)CHO細胞を用いてオートファジー突然変異体を単離、(3)酵母オートファジー関連遺伝子の動物細胞ホモローグを単離、(4)オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白資を同定。動物細胞オートファジー関連遺伝子が単離された暁には、(5)アポトーシスに伴うオートファジー関連遺伝子の動態を解明、(6)アポトーシスにおけるオートファジー関連遺伝子機能を、トランスフェクタント(ドミナント・ネガティブ体の強制発現等を含む)作成を通じて解明。平行して、(7)各種癌細胞に対する、H^+/Γシンポーターのアボトーシス誘導型制癌剤の可能性を追及、した。先ず、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、Wortmannin,3-methyladenine他の各種選択的阻害剤を用いて解明する系を確立した。次に"プロジギオシン類H^+/CΓシンポーターの、オートファジー・アポトーシス制御における働きを、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、蛍光を指標として生化学的・細胞生物学的に解析した。同時に、細胞内pH測定を通じて、H^+/Cγシンポーターのどのような活性が関与するかを解析した。その結果、PC12細胞の分化誘導とアポトーシス誘導にはオートファジー自体は関与していないことが示唆された(日本薬学会発表)。また、体細胞分子遺伝学的にオートファジー変異体の単離を目指して、CHO細胞を用いて実験系を確立した。今後、(毒素等を利用した)細胞生存率と、強制発現させたGFP蛋白質の分解異常を指標とし、フローサイトメトリー・セルソーター法を主に使い、動物細胞のオートファジー変異体を選択したい。リソソーム膜融合反応に必要なシンタキシン・ホモローグの単離・同定には成功しているが、それがオートファゴソームとリソソームの膜融合に必須であるか否かは決定出来ていない。酵母遺伝子のヒトホモログ釣りは成功し、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いてドミナントネガテイブ体を作成し、その遺伝子産物の動物細胞オートファジーにおける役割を解明した(投稿準備中)。また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/CΓシンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/CΓシンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。

また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/CΓシンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/CΓシンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。本研究は、新規H^+/Cl^-シンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとするものである。1.PC12細胞やCHO細胞では、3-メチルアデニン(オートファジー阻害剤)は血清非存在下では細胞死を促進したが、血清存在下では促進しなかったので、アポトーシス誘導がオートファジー阻害による可能性は低いものと思われる。2.バフィロマイシンやブロジギオシン類によるアポトーシス誘導の情報伝達経路は、神経細胞様突起進展(NOG)誘導のそれと異なっていることが判明した。新たなRNA及び蛋白質合成を必要とし、K-252aやA-キナーゼ非依存性、MAPキナーゼ依存性であるが、セリン-スレオニンホスファターゼ、チロシンキナーゼ、チロシンホスファターゼに非依存性であった。3.プロジギオシン類によるPC12細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導は、NH_4Cl、クロロキン、イミダゾール等で全く阻害されないことより、細胞内pH以外の機構によると推察された。4.プロジギオシン類のH^+/Cl^-シンポート活性には最低2個のピロール環の存在が必須であることが明らかになった。ベラパミルに弱い活性が見られたものの、H^+/Cl^-シンポーター活性を有する新規化合物は見出されていない。5.プロジギオシン以外のH^+/Cl^-シンポーターの、ヌードマウス移植膵癌細胞の増殖抑制効果を検討中である。6.GFPタンパク質遺伝子を導入したCHO細胞を作成した。現在、フローサイトメトリーにより栄養饑餓状態でGFPを分解できないオートファジー突然変異体を単離する方法の確立に向けて条件検討を行っている。7.オートファジー関連遺伝子のヒトホモローグをHeLa細胞より単離することに成功した。現在その機能を、アポトーシスに伴う動態検討と、ドミナント・ネガティブ体のトランスフェクタント作成して、細胞培養系で検討している。8.オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白質を、ディファレンシャイルサブトラクション法とMultipohoreII二次元電気泳動とで探索している。現在、栄養饑餓状態で発現が誘導されるタンパク質を複数検出した。本研究ば、新規H^+/Cl^-シンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとするものである。これまでに、3-メチルアデニン(オートファジー阻害剤)は血清非存在下では細胞死を促進したが、血清存在下では促進しなかった。このことより、アポトーシス誘導に対するオートファジー阻害の役割は低いものと思われる。
Wntシグナルによる神経系・中胚葉共通前駆体細胞の制御

脊椎動物の体幹部は、発生の進行と共に産み出される。この過程において、Wntシグナルは体幹部を形成する細胞の分化決定に重要であることが示唆されている。本研究では、体の胴部では神経系と中胚葉とが共通の前駆体「体軸幹細胞」から産まれること、そして、そのいずれになるのかは神経系の発生を指令するSOX2と中胚葉への発生を指令するTBX6という2つの転写因子の力関係で決まることを示した。そして、これらの2つの因子の発現にWntシグナルが関与していることを明らかにした。原条周辺領域には神経系原基細胞と中胚葉細胞を生みだす共通前駆体細胞(体軸幹細胞)が存在し、胴部体軸の細胞供給源として機能していることが、細胞系譜の実験から示されている。しかしながら、体軸幹細胞の維持機構や、分化を制御する分子機構は全く分かっていない。私は、転写制御因子TBX6によるSox2遺伝子発現制御が、体軸幹細胞の神経系と中胚葉系への発生運命を決めることを明らかにした。Sox2遺伝子エンハンサーN1は、原条周辺の胚盤葉上層の細胞群で活性化され、上層にとどまる細胞でのSox2遺伝子発現を開始させる。また、上層側から原条を通過して中胚葉領域に移動した細胞群では活性が消失する。ところが、Tbx6遺伝子変異マウス胚では、中胚葉領域に移動した細胞群でもエンハンサーN1の活性化が維持される。その結果、Sox2遺伝子が中胚葉領域で発現し、異所神経管を形成する。エンハンサーN1をゲノム上から欠失させると、異所神経管形成が起こらなくなる。また、正常胚の体節中胚葉領域において、Sox2を異所発現させると異所的な神経管が形成された。このような結果から、転写制御因子TBX6によるSox2遺伝子発現制御が、体軸幹細胞から中胚葉系への発生運命を決めることに必須であると結論づけた。また、Sox2遺伝子、Tbx6遺伝子のいずれの発現制御にもWntシグナルが関わっていることを明らかにした。Wntシグナルを可視化するマウスを作成し、胚のライブイメージングを行った。脊椎動物の発生において、頸部より尾側の組織(体幹部組織)は、発生の進行と共に産み出される。この過程において、胚の尾端に存在する原条領域や、尾側は体幹部組織への細胞供給元として振る舞うことが知られている。最近の研究では、原条周辺領域には神経系原基細胞と中胚葉細胞を生みだす共通前駆体細胞(体軸幹細胞)が存在し、胴部体軸の細胞供給源として機能していることが、細胞系譜の実験から示されている。平成22年度に行った研究で、体軸幹細胞から神経系原基細胞、中胚葉細胞への分化は、それぞれSOX2とTBX6という2つの転写制御因子によって制御されていることを明らかにした。そこで、これら2つの遺伝子がどういった制御によって発現が規定されているのかを明らかにすることを目指した。特に、Tbx6遺伝子の発現制御機構の解析を行った。Tbx6遺伝子を含むゲノム領域を細分化し、細分化されたゲノム断片がエンハンサー活性を示すかを、トラセスジェニックマウス胚の作成、および、エレクトロポレーション法によるニワトリ胚への遺伝子導入によって解析した。原条領域におけるTbx6の発現開始を担うエンハンサーを見出した。詳細なエンハンサー解析を行い、Tbx6遺伝子の発現を制御する上流の転写因子の同定を行った。
題詠史の再構築

本研究では、これまで、平安時代には日常生活の情趣化のために、当季・属目の景物が詠歌の対象となっていたが、十一世紀頃より題詠が中心となり、本意が確立し、現実の「場」から離れた虚構詩として詠歌されるようになったと捉えられていた和歌史の検証を目指したものである。そのような題詠方法が確立する記念碑的行事として『堀河百首』があると指摘されているが、それ以降の詠歌においても「場」と関わりの強い題詠は実は数としては大変多く残っている。その詠歌の実際を、1院政期、2後鳥羽院歌壇と時代により区分して検討し、また、現実の場との関係で注意される3名所題詠について通史的に見ることとした。まず、院政期に注目される詠歌の場として歌林苑があるが、そこに関わる源頼政の家集の題詠を検討した。また、同時代の藤原重家の家集は、詠作時期や詠歌の場のい明確な題詠が多いが、それもあわせて検討した。そうした検討結果から見えてきたのは、その和歌行事の主催者、規模(歌人数と歌題数)、性格、歌会か歌合かの別、素題か複合題かの別により、詠歌の「場」に密着する度合いが異なってくるということである。当座の歌会は詠歌の場に密着しやすいことが予想されるが、兼題であっても歌題数が少なく、複合題で、その「場」が大きな意味を持つ場合(社寺への奉納や権貴の邸宅での詠歌など)は、「場」への密着度が高いことが明らかになる。複合題は、題そのものの構成方法が句題詩の影響と言われているが、詠歌内容にも場を重視する句題詩の影響が認められる。また、このような傾向は、後鳥羽院歌壇でも基本的に保持され、御幸時の詠歌や、後鳥羽院の離宮での詠歌、奉納する詠歌の場合、「場」を意識した当季で属目の景に関わる設題がされ、「場」に密着した詠歌が見られる。新古今時代は、題詠方法が深化し、当座性を消去し、虚構詩としての和歌が基本的に詠まれたと捉えられてきたが、そうした見方を変更すべきであることが明らかとなった。以上のような検討や、ここに触れなかった名所題詠についての検討も、まだ継続中で、平成20年度中に学会発表など公表は僅かだが、21年度以降、順次、発表する予定である。
層状薄膜の熱物性値測定法に関する研究

半導体製品や金属とセラミックスとの圧接材など母材の上に薄い膜状物質を形成する複合材が多く使用されているが、これら複合材の熱伝導率や比熱などの熱物性値は適切な測定法が確立されていないため、ほとんどデータがない。集積度の高い電子部品はその冷却法が切実な問題となっている。本研究は、このような層状複合材の熱拡散率を測定する方法を開発し、熱移動解析に必要な熱物性値を得ることを目的としている。得られた研究成果は下記の通りである。1.一層から三層までの層状試料の表面をステップ状あるいはパルス状に加熱したときの裏面の温度応答から未知の層の熱拡散率を求めるための測定理論を確立した。2.測定現場で未知の熱拡散率を算出できるようにパソコン用計算プログラムを作成した。3.上記のプログラムを用いて熱拡散率を計算する場合の問題点について種々検討した。たとえば、熱物性値が非常に異なる物質を層状に組合せた場合、熱拡散率の大きさによっては計算が不可能となる領域があることが分った。4.また、ステップ状あるいはパルス状のふく射エネルギを試料表面で吸収するために表面にカーボン等を薄く塗布するが、それによる熱拡散率への影響を定量的に求めることが出来るようになった。5.層状試料の表面をステップ状あるいはパルス状に加熱した場合の裏面の温度応答から試料全体を単層とみなしたときの熱拡散率が算出できる。この値と各層の熱拡散率との関係および単層とみなしたときの熱伝導率と各層の熱伝導率との間の関係について整理し、検討を加えた。6.ステップ状加熱法およびパルス状加熱法の原理に基づいた測定装置により、二層および三層試料の熱拡散率を測定した。半導体製品や金属とセラミックスとの圧接材など母材の上に薄い膜状物質を形成する複合材が多く使用されているが,これら複合材の熱伝導率や比熱などの熱物性値は適切な測定法が確立されていないため,ほとんどデータがない.集積度の高い電子部品はその冷却法が切実な問題となっている.本研究は,このような層状複合材の熱拡散率を測定する方法を開発し,さらに比熱と密度のデータから熱伝導率を求め,層状物体の熱移動解析に必要な熱物性値を得ることを目的として研究を進め,下記のような成果が得られた.1.一層から三層までの層状試料の表面をステップ状に加熱したときの裏面の温度応答から未知の層の熱拡散率を求めるための測定理論を確立した.すなわち,温度応答の理論解を解析的に導びき,ある時間とその2倍時間における応答温度比から熱拡散率を求める方法を確立した.2.パルス状加熱法を層状物質に適用できるようにし,未知の層の熱拡散率を求めるための計算プログラム(パソコン用)を作成した.3.上記のプログラムを用いて熱拡散率を計算する場合の問題点について種々検討した.たとえば,熱物性値が非常に異なる物質を層状に組み合せた場合に熱拡散率の大きい物質が未知であるとすれば,誤差が非常に大きくなり,計算が不可能になる.そのような領域を定量的に求めた.4.非常に薄い単層の試料の一部をステップ状,パルス状,周期状に加熱したときの加熱部からlだけ離れた位置における温度応答を解析的に求め,熱拡散率を得るための方法について比較検討した.以上,本年度は理論的検討が主となった. 63年度は測定装置の製作および測定実験に重点を置いて研究を進めたい.半導体製品や金属とセラミックスとの圧接材てど母材の上に薄い膜状物質を形成する複合材が多く使用されているが、これら複合材の熱伝導率や比熱などの熱物性値は適切な測定法が確立されていないため、ほとんどデータがない。

本研究は、このような層状複合材の熱拡散率を測定する方法を開発し、熱移動解析に必要な熱物性値を得ることを目的としている。得られた研究成果は下記の通りである。1.一層から三層までの層状試料の表面をステップ状あるいはパルス状に加熱したときの裏面への温度応答から未知の層の熱拡散率を求めるための測定理論を確立した。2.測定現場で未知の熱拡散率を算出できるようパソコン用計算プログラムを作成した。3.上記のプログラムを用いて熱拡散率を計算する場合の問題点について種々検討した。たとえば、熱物性値が非常に異なる物質を層状に組合わせた場合、熱拡散率の大きさによっては計算が不可能となる領域があることが分った。4.また、ステップ状あるいはパルス状のふく射エネルギを試料表面で吸収するために表面にカーボン等を薄く塗布するが、それによる熱拡散率への影響を定量的に求めることが出来るようになった。5.層状試料の表面をステップ状あるいはパルス状に加熱した場合の裏面への温度応答から試料全体を単層とみなしたときの熱拡散率が算出きる。この値と各層の熱拡散率との関係および単層とみなしたときの熱伝導率と各層の熱伝導率との間の関係について整理し、検討を加えた。6.ステップ状加熱法およびパルス状加熱法の原理に基づいた測定装置により、二層および三層試料の熱拡散率を測定した。
染色体機能調節因子としてのプラスミドの機能メカニズムの解明

プラスミドによる宿主染色体の機能調節のメカニズムを解明するため、“プラスミドを保持すること"の浸透圧ストレスへの影響や特定の遺伝子群の転写誘導/転写抑制について機構解明を行った。また、この現象において重要な役割を果たすプラスミド由来の核様体タンパク質(特に中心的役割を果たすH-NS familyタンパク質)の二量体化・多量体化機構をタンパク質間相互作用の解析と結晶構造を元に解析した。本研究では、カルバゾール分解プラスミドpCAR1を材料に、その存在がどの様に染色体上の多数の遺伝子の転写変動を引き起こすのか、また種々培養条件での生育量をどの様に変化させるのかについて解明することで、"プラスミドを持つ"というシグナルが転写制御を経て染色体機能を制御する機構を解明する。また、これらの現象の少なくとも一部には、pCAR1上の複数の核様体タンパク質(NAPs)が関与することも示唆されているため、主要な役割が予想されるNAPsの機能構造解析と、他のNAPs間での相互作用解析を行うことで、上記シグナル伝達経路でのNAPsの機能メカニズムを解明する。平成24年度は、以前に取得されていた3種のPseudomonas属細菌のpCAR1保持時の転写プロファイルを再検討し、類似した転写プロファイルを示す遺伝子グループに分配した。このグループに含まれる遺伝子(正確にはその遺伝子が含まれる転写ユニット)の転写開始点近傍に、多数の遺伝子の転写変動を制御する事が知られているσ因子(RpoD, RpoS, RpoN)やPvdS, Furの結合配列が存在しないかを探索した。また、pCAR1保持がP.putida特異的に浸透圧ストレス耐性を低下させる機構解明を目指し、ショットガンクローニングによる耐性回復変異株のスクリーニングを開始した。また、pCAR1上にコードされるMvaT様因子(大腸菌H-NSの機能的ホモログ)であるPmrが、H-NSとは異なる多量体形成機構を有している事をクロスリンク法により示した。さらに、表面プラズモン共鳴法を用いてPmrとRputida染色体上由来ホモログ間の結合様式を比較したところ、Pmr-TurB間の結合比が際だって小さい事が示された。Pmrの結晶構造解析については、多量体形成能が低下したR8A変異体で微小結晶が得られ、条件検討を継続している。本研究では、カルバゾール分解プラスミドpCAR1を材料に、その存在がどの様に宿主染色体上の多数の遺伝子の転写変動を引き起こすのか、また種々培養条件での生育量をどの様に変化させるのかについて解明することで、“プラスミドを持つ"というシグナルが転写制御を経て染色体機能を制御する機構を解明する。平成25年度は、pCAR1保持がP. putida特異的に浸透圧ストレス耐性を低下させる機構解明を目指し、ショットガンクローニングによる耐性回復変異株のスクリーニングを継続すると共に、既知の浸透圧ストレス耐性機構の関与などの評価を開始した。また、DNAサンプリング法によるpCAR1上の宿主特異的に転写変動する遺伝子のプロモータ領域に結合する因子の同定に向けて、必要なプラスミドの作成をほぼ終了した。NAPs機能の解析については、pCAR1にコードされるMvaT様因子であるPmrとP. putida染色体由来ホモログTurA, TurB間でのヘテロ二量体形成能について調べ、ヘテロ二量体のなりやすさにホモログ間で違いがあることが明らかになった。さらに、改変ChIP-chip実験の結果の詳細な解析から、PmrとTurBの各結合領域はほとんど同じながらも一部の連続塩基の存在頻度に明確な傾向の違いがあることが示された。現在、この結果の実験的証明を目指して、BIA-COREによる親和力の生化学的計測を試みている。Pmrとホモログの結晶構造解析については、多量体形成能が低下したTurB変異体で結晶が得られる条件を決定できたので、さらに良好な結晶の取得を目指し条件検討を継続している。本研究では、カルバゾール分解プラスミドpCAR1を材料に、“プラスミドを持つ"というシグナルが転写制御を経て染色体機能を制御する機構を解明する。これらの現象の一部には、複数の核様体タンパク質が関与することも示唆されているため、NAPsの機能構造解析と、他のNAPs間での相互作用解析を行うことで、上記シグナル伝達経路でのNAPsの機能メカニズムを解明する。平成26年度は、pCAR1保持が引き起こす宿主の浸透圧ストレス耐性の低下について、耐性が向上したと考えられる大型コロニー株(自然変異株と推定される)が高頻度で高濃度KCl含有プレート上に出現することを見いだした。そこで、方針をショットガンクローニングによる原因遺伝子の取得から、自然変異株の取得と全ゲノム塩基配列決定による変異箇所同定へと転換した。

現在までに8株の自然変異株を取得し、それらがpCAR1を保持しない宿主よりはストレス下での液体培養で生育が遅延するものの、pCAR1保持株よりは生育が早まることを明らかにした。現在、ゲノム解析を行っており、原因因子が特定され次第、遺伝子破壊株や高発現株を用いた機能解析を開始する予定である。また、dRNA-Seq法によってpCAR1上の転写開始点を網羅的に調べ、転写プロファイルとそのプロモータ配列の特徴の相関を解析した。この情報をもとに、DNAサンプリング法のためのプラスミド作成を終了し、現在、プロモータ領域に結合するタンパク質の網羅的解析を行っている。Pmrとホモログの結晶構造解析については、多量体形成能が低下したTurB変異体(R8A)のN末端側61残基について、2.3オングストロームの分解能で構造を決定することに成功した。これにより、PmrやTurBを含むMvaT様因子の二量体化・多量体化機構において大腸菌H-NSとの相違点と類似点が明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。環境微生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。転写変動プロファイルの違いを生む転写因子の推定は、プロファイリングを改めて行ったため若干遅れ気味であるが、プラスミド保持による生育差を生む原因因子のスクリーニングとMvaT様因子のタンパク質科学的解析は予想より早いペースで進んでおり、全体としては、おおむね順調に進展していると判断している。DNAサンプリング法によるプロモータ結合タンパク質の同定と、浸透圧ストレス変化のメカニズム解明は計画より若干遅れているが、核様体タンパク質のDNA結合領域の好みの違いやヘテロ二量体化・多量体化に関する研究は予想以上のペースで結果が出てきている。全体としては、予想よりも若干早く研究が進捗していると判断できる。おおむね順調に進捗していることとに加え、研究計画立案時から外的状況には目立った変化は認められないため、基本的には研究計画通りに研究を進める予定である。ただし、Pmrホモログの結合位置の解析法は、得られる情報の正確さを考慮して、SELEX法ではなくProtein Binding Microarray法に変更して行いたい。平成26年度では、遅れ気味の課題に新たに大学院生を付け、一層の研究推進を図る。そのほかの研究実施体制は昨年度と同じであるため、全体としての研究体制はより強力な形で進められるものと考えられる。研究全体の進みの中でも、核様体タンパク質のタンパク質としての機能解析は予想以上に解析が進み、従来の予想を覆す実験的成果が出つつある。このままのペースで研究を進めると共に、最終年度である平成26年度ではこの成果の論文執筆につなげたい。平成24年度には、プラスミド保持による生育差を生む条件解明とNAPsの機能解明においてタイリングアレイを用いる解析の一部を後回しにしたため、タイリングアレイ購入の必要がなくなった。当該研究に相当する解析を平成25年度に行う予定であり、残した直接経費次年度使用額はタイリングアレイの贈入に使う予定である。浸透圧耐性の変化
脂質リガンド　リゾホスファチジルセリンとその受容体の相互作用モジュール性の解明

リゾホスファチジルセリン(LysoPS)は細胞膜脂質から生成し、シグナル分子として複数の特異的な膜受容体(Gタンパク質共役型受容体)サブタイプに働く脂質分子である。LysoPSの化学構造は親水性部位と疎水性部位、両者を連結するリンカーというモジュール構造に分けられる。申請者は、LysoPS受容体の機能解明に有用なリガンド(アゴニストやアンタゴニスト)を合理的に創生することを目指し、LysoPSのそれぞれのモジュール構造が受容体とどのように相互作用しているかに着目して、LysoPS誘導体の構造活性相関研究及び誘導体と受容体の1つに対する複合体モデル構築を進めてきた。LysoPS誘導体が受容体に結合した際、誘導体の疎水性モジュール末端は、受容体の外に出て細胞膜脂質と相互作用することが複合体モデルから想定された。また、本結合モデルから、LysoPS誘導体は細胞膜に挿入された後、細胞膜の側方拡散を介して受容体に出入りする経路が示唆された。実際に昨年度、計算機上で受容体モデル構造に結合したLysoPS誘導体を細胞膜方向に引き抜くシミュレーションに成功した。本年度は、LysoPS誘導体の結合・解離経路を検証すべく、昨年度に引き続き、疎水性末端にリンカーを介して親水性基を導入した誘導体の合成・活性評価を行った。結果、LysoPS誘導体が細胞膜の側方拡散を介して受容体に出入りするという仮説と矛盾ない活性結果を得た。現在、上記結果の総括と論文投稿準備を進めている。また、本年度はLysoPSの親水性部位に着目して新規誘導体合成を進め、LysoPS受容体の1つに対して、新規アンタゴニストを創生することに成功した。今後、アンタゴニストの構造活性相関をより詳細に調べ、複合体モデルを用いた分子動力学シミュレーションを組み合わせてリガンドが受容体活性化を阻害する分子機構の解明を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。リゾホスファチジルセリン(LysoPS)は、生体内で特異的な受容体(Gタンパク質共役型受容体:GPCR)に作用する生理活性脂質の一種である。LysoPSは親水性のホスホセリン部位、疎水性の脂肪酸部位、両者を連結するグリセロール部位というモジュール要素からなる。各々のモジュール要素が受容体にどのように認識されるのか、また、受容体活性化や選択性の由来となるモジュール要素がどれなのかは不明である。申請者はこれまでに、LysoPSの脂肪酸部位に着目して誘導体の構造展開を進め、LysoPS誘導体の受容体(LPS1)への結合様式を提案してきた。本年度は、提案した結合様式から着想を得、主に、LysoPS誘導体のホスホセリン部位、受容体外部位に着目してLysoPS誘導体合成を進めた。ホスホセリン部位はその代替構造が見つかっておらず、受容体活性化に対する構造要求性が不明であった。また、ホスホジエステルを切断されにくい代替構造に変換することで、リガンドの安定性向上が期待される。そこで、モジュール要素としてホスホセリン部位に着目し、その代替構造を計算科学的手法及び、バイオアイソスターの考え方により提案し、候補化合物の合成ルートを見出した。LPS1-LysoPS誘導体の複合体モデルにおいて、LysoPS誘導体の構造の中で、膜受容体に結合した時に受容体の外、脂質二重膜内に位置すると予想される部位に親水性基を導入した化合物と、その部位からリンカーを伸ばして、親水性基が膜外に位置するように設計した化合物の誘導体活性を比較することで、受容体の結合ポケットが細胞膜表面からどの程度深いところにあるのか検討している。親水性基が許容されるリンカーの長さを知ることにより、複合体モデルの妥当性を検証すること、及び、化合物の溶解性を向上させるといった修飾が可能な置換基導入部位を知ることを目指している。ホスホセリン部位に着目したLysoPS誘導体合成は、合成ルートが確立されていなかった。そのため、化合物合成に時間がかかり、十分数の化合物の活性評価結果は得られていない。そのため、進捗はやや遅れている。受容体外の部位に着目したLysoPS誘導体合成は、すでに合成ルートが確立されていたが、比較的大きい分子となるために合成ステップ数が多く、1つの化合物を合成するのに時間がかかった。しかし、すでに数個の化合物の活性評価結果を得ており、構造活性相関の傾向をつかみ始めているため、概ね順調に進展しているとの評価とした。リゾホスファチジルセリン(LysoPS)は、膜脂質から生成する生理活性脂質の一種であり、生体内で特異的な膜受容体(G-タンパク質共役型受容体)にアゴニストとして作用する。LysoPSは親水性のホスホセリン部位と、疎水性の脂肪酸部位、両者を連結するリンカーというモジュール構造からなる脂質分子である。申請者はこれまでにそれぞれのモジュール構造が受容体にどのように認識されているのかを分子レベルで解明するため、LysoPS誘導体とその受容体の複合体モデル構造を作成し、構造活性相関研究と組み合わせて複合体モデル構造の検証を行ってきた。本年度は、その成果を学術論文として発表した。また、本年度は昨年度に引き続き、LysoPS誘導体-受容体複合体モデルの受容体外部位に着目して研究を進めた。LysoPS誘導体の疎水性末端は複合体モデルにおいて受容体外の細胞膜領域に位置すると予想された。そこで、誘導体疎水性末端に、親水性を高めるためのアミノ基など、リガンドの性質を変換するための官能基を長いリンカーを介して連結した誘導体の合成を行った。

様々な官能基が連結可能な部位を知ることで、LysoPS受容体の機能解明に役立つツール開発がより合理的に行えると考えている。さらに本年度は、受容体にリガンドが結合・解離する経路に着目した。低分子リガンドでは細胞外からリガンドが直接受容体に近づくと考えられているが、LysoPS誘導体-受容体複合体モデルでは、リガンドが一旦細胞膜に挿入された後、膜拡散を介して結合・解離する経路が可能であると考えられた。そこで、膜拡散による解離経路が可能であるか、東京工業大学のスパコン、TSUBAME3.0を用いてシミュレーションを行った。受容体-リガンド複合体構造からリガンドを引き抜く計算を行ったところ、実際にリガンドを引き抜くことができ、膜拡散を介した経路が可能であると考えられた。本年度、LysoPSの疎水性部に着目して行った誘導体の構造活性相関および、複合体モデル構造の検証に関する研究成果を学術論文として発表した。また、LysoPS誘導体の疎水性末端に着目した誘導体合成をさらに進めた。目的化合物は大きい分子であり合成ステップ数が多いが、誘導体合成を完了することができたため、おおむね順調と判断した。LysoPS誘導体の受容体モデル構造からの引き抜きシミュレーションに関しては、本年度、LysoPS誘導体-受容体複合体モデルに対するシミュレーション手法がある程度確立でき、実際に受容体からのリガンド引き抜きが行えたことから、順調に進展しているとの評価とした。リゾホスファチジルセリン(LysoPS)は細胞膜脂質から生成し、シグナル分子として複数の特異的な膜受容体(Gタンパク質共役型受容体)サブタイプに働く脂質分子である。LysoPSの化学構造は親水性部位と疎水性部位、両者を連結するリンカーというモジュール構造に分けられる。申請者は、LysoPS受容体の機能解明に有用なリガンド(アゴニストやアンタゴニスト)を合理的に創生することを目指し、LysoPSのそれぞれのモジュール構造が受容体とどのように相互作用しているかに着目して、LysoPS誘導体の構造活性相関研究及び誘導体と受容体の1つに対する複合体モデル構築を進めてきた。LysoPS誘導体が受容体に結合した際、誘導体の疎水性モジュール末端は、受容体の外に出て細胞膜脂質と相互作用することが複合体モデルから想定された。また、本結合モデルから、LysoPS誘導体は細胞膜に挿入された後、細胞膜の側方拡散を介して受容体に出入りする経路が示唆された。実際に昨年度、計算機上で受容体モデル構造に結合したLysoPS誘導体を細胞膜方向に引き抜くシミュレーションに成功した。本年度は、LysoPS誘導体の結合・解離経路を検証すべく、昨年度に引き続き、疎水性末端にリンカーを介して親水性基を導入した誘導体の合成・活性評価を行った。結果、LysoPS誘導体が細胞膜の側方拡散を介して受容体に出入りするという仮説と矛盾ない活性結果を得た。現在、上記結果の総括と論文投稿準備を進めている。また、本年度はLysoPSの親水性部位に着目して新規誘導体合成を進め、LysoPS受容体の1つに対して、新規アンタゴニストを創生することに成功した。
MPF 活性化におけるMosキナーゼの機能

1.MPF活性化過程におけるMosのシグナル伝達:MosによるMPF活性化(および卵成熟)におけるMAPキナーゼ(MAPK)カスケードの意義について検討するため、Xenopus卵成熟の開始におけるMAPKカスケードの役割について調べた。まず、MAPキナーゼキナーゼの一分子種であるMEKIのcDNAをクロン化すると共に、優性不能型および優性活性型MEKIを発現させるためのmRNA合成ベクターを作製した。優性不能型MEKIのmRNAを注入してXenopus卵のMAPKの活性化を完全に抑制しても、プロゲステロン添加によるMPFの活性化おびGVBDは(有意に遅れるにもかかわらず最終的には)必ず起こることが明らかになった。さらに、MAPKに対する特異的ホスファターゼと考えられているCL100を用いても、基本的に同じ結果が得られた。これらの結果は、卵成熟の誘起においては、MEKI/MAPKカスケードは必ずしも必須でないことを示唆している。このことから、卵成熟においては、Mosの下流経路としてMEKI/MAPKカスケード以外の何らかの経路も介在する可能性が示唆される。02.Mosによる細胞がん化におけるMAPキナーゼの関与:MEKIの各種変異体を駆使することにより、MosによるNIH3T3細胞のがん化には、MEKI/MAPキナーゼカスケードの活性化が必須にして充分であることを明らかにした。その一方で、RafやRasによるがん化には、複数の(MEKI/MAPKおよびそれ以外の)シグナル伝達経路が存在していることを示す結果を得た。
HVJエンベロープ法による脊髄保護因子の蛋白導入を応用した新しい脊髄保護法の開発

1実験動物による脊髄虚血モデルの作成Japanese white rabbit(2.5Kg-3.0Kg)を用いて脊髄虚血モデルを作成した。大腿動脈より4Fr Fogarty catherterを挿入し、腎動脈下でinflationし脊髄虚血にした。15分虚血後reperfusionし、一週間後犠牲死するまで神経学的評価を毎日行い、犠牲死させたあと組織学的評価を行なった。また各蛋白の発現をみるために別にreperfusion後、8hr,24hr,48hr後に犠牲死させた。A)神経学的評価下肢運動評価は肉眼的所見としてJohnson scoreを用いて(0から5点、正常が5点)行った。虚血後2日目の平均scoreは4.4±1.2(n=5)でほぼ正常下肢運動能を保ったが、7日目には2.2±1.3(n=5)であり、遅発性下肢運動麻痺を示した。B)組織学的評価H-E染色にて虚血2日目の生存motor neuron数はsham control群(19.0±1.0),脊髄虚血群(18.0±2.3)と変化はないものの術後7日目には、sham群に比べ60%のmotor neuronが選択的に減少(7.8±3.1:p<0.0001)。15分虚血後motorneuronは2日間生存するが、それ以降選択的に細胞死した。またTUNEL染色にても2日目までにTUNEL陽性細胞を認め、細胞死にapoptosisの関与が示唆された。また免疫染色により虚血後8時間目にstress induce proteinであるHeat shock proteinが発現されていた。また免疫染色によりangiogenic factorであるVEGFの発現は虚血後8時間に認められた。またWestern blotting法にて同様に両蛋白の発現が認められた。luciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれHVJ-Eに封入し実験動物への脊髄へ導入する。導入後luciferase活性を検討し導入効率を定量化し、またVenus遺伝子を導入し組織学的に脊髄の導入される局在を検討した。まずバルーンを腎動脈直下で閉塞させたあと、もう一つのバルーンを大動脈分岐部に位置させて、このバルーン先端よりluciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれ封入したHVJ-Eを注入し、腰動脈より脊髄へ経動脈的にtransfectionを行った。しかし摘出脊髄からはluciferase活性は認められず、また病理学的にもVenusの発現は認めなかった。経動脈的に脊髄へのHVJ-Eを用いた遺伝子導入は困難であり、今後脊髄への直接穿刺による遺伝子導入を行う予定である。
新規遺伝子組換えウサギによるメタボリックシンドロームにおけるPPARの役割

メタボリックシンドロームの病態解析のための新規病態モデルとして,これらの病態に関連すると考えれているヒトPPARγを脂肪組織特異的に過剰発現する遺伝子組換え(Tg)ウサギの作製を行った。作製したTgウサギの表現型解析を行ったところ,導入した遺伝子が脂肪組織特異的に発現していることは確認できたが,明らかな表現型の変化(病態の発症)を見いだすことは出来なかった。今後,発現蛋白活性などのさらに詳細な検討が必要であると考えられた。H19年度は、ヒトPPAR-γ遺伝子導入ウサギの高発現系統を得るため、マイクロインジェクション法による遺伝子組換えウサギの作製実験を継続して行うともに、実験によって得られたヒトPPAR-γ遺伝子導入ウサギ2系統(P57系統、P97系統)について遺伝子解析および表現型解析のためのコロニー拡大を実施した。残念ながら、得られたファウンダーはいずれも雌であったため、実験に必要な数の遺伝子組換えウサギを効率よく得るために、まずはF1ウサギの雄を得てそれぞれの系統のコロニーを拡大する必要があった。得られた2系統のうちP57系統は、ファウンダーウサギを野生型の雄と交配し5回出産させ、合計18匹の仔ウサギについてPCRによる遺伝子解析を行ったが、残念がら導入遺伝子の伝達が確認できずモザイクであったと判断された。そのため、P57系統については、繁殖によるコロニー拡大を断念した。いっぽう、P97系統は、仔ウサギへの導入遺伝子の伝達が確認され、遺伝子組換えウサギのF1雄ウサギを得ることに成功した。現在、このF1雄ウサギを用いて、実験解析のための遺伝子組換えウサギのF2のコロニー拡大を実施している。すでに、数匹のF2ウサギも得られており、これらはF1同様、導入遺伝子の伝達が確認されている。今後の計画として、実験解析に必要な数のF2ウサギを得るため、さらに繁殖を続けるとともに、必要な数の遺伝子組換えウサギが得られ次第、導入遺伝子の発現解析、表現型の解析等の実験を進めて行く予定である。H20年度の研究実施計画に基づき,以下の研究を実施した。まず,H19年度に得られたヒトPPARγ遺伝子導入(Tg)ウサギのP97系統の大規模な交配を実施し,実験に必要な個体数を準備した。繁殖によって得られたF1およびF2個体を用いて,導入遺伝子の発現ならびにTgウサギの表現型について解析を行なった。導入遺伝子の発現は, Tgウサギの各組織から抽出したmRNAを用いNorthem blotを行い,ヒトPPARγ特異的mRNAの発現について検討した。また,脂肪組織におけるPPARγの発現量については,real-time RT-PCRによる検討を行なった。その結果,脂肪組織特異的に導入遺伝子の発現が確認された。導入遺伝子の発現が確認されたことから,次いでTgウサギの表現型について検討を行なった。PPARγTgウサギと同腹のnon-Tgウサギについて体重の推移,血漿脂質値,グルコース値,腹腔内脂肪重量の測定,さらには,静脈内糖負荷試験,インスリン負荷試験を行ない比較検討を行なったが,いずれもPPARγTgウサギと同腹のnon-Tgウサギとの間に有意な差は認められないという結果であった。そのため,現在,いま一度,導入遺伝子の発現についてmRNAレベルだけではなく,蛋白レベルでの発現を再確認する目的でWestern blotによる検討,また,当初の計画にしたがい,表現型が明らかでなかった場合の実験計画として,10%高脂肪食負荷による実験的肥満に対するヒトPPAR-γ過剰発現の影響についての検討を始めている。H21年度は,これらの検討を通して今回我々が開発したヒトPPAR-γTgウサギについて,その特徴を明らかにするとともに,肥満におけるPPAR-γの役割について検討を進めていく予定である。H20年度の検討で,我々は通常食飼育下におけるPPARγTgウサギの表現型解析として,体重,血漿脂質値,グルコース値,腹腔内脂肪重量,静脈内糖負荷試験(IVGTT)およびインスリン負荷試験(IVITT)を実施し,同腹のnon-Tgウサギとの比較検討を行なったが,いずれもPPARγTgウサギとnon-Tgウサギとの間に有意な差は観察されなかった。そこで,H21年度は,PPARγTgウサギに10%高脂肪食を負荷し,実験的肥満誘導下におけるヒトPPARγ過剰発現の影響についての検討を進めた。実験的肥満の誘導として,PPARγTgウサギと同腹のnon-Tgウサギに10%高脂肪食を16週間負荷した。実験的肥満誘導後に体重,血漿脂質値,グルコース値,腹腔内脂肪重量,IVGTTならびにIVITTを実施したが,いずれもPPARγTgウサギとnon-Tgウサギとの間に有意な差は認められなかった。さらに,脂肪組織についても病理組織学的観察を行ったが,脂肪細胞の大きさに差は認められなかった。以上の検討で,PPARγの過剰発現のによる表現型の変化をTgウサギで観察することができなかった。

Tgウサギにおける導入遺伝子(ヒトPPARγ)の発現については,各組織でのNorthern blot,また,脂肪組織を用いたreal-time RT-PCRによる検討で,脂肪組織特異的に導入遺伝子が発現していることを確認している。しかし,今後,最終的な結論を得るためには,脂肪組織におけるヒトPPARγの発現蛋白量ならびに発現蛋白機能についてより詳細な追加実験の検討が必要であると考えられる。
日本とASEAN諸国における大災害後の公共インフラの再建・整備に関する調達行政

大災害後の復旧・復興において多額の公費が充当されている公共インフラの再建・整備に不可欠な公共工事の調達行政について、国内では主に東日本大震災と西日本豪雨災害を、海外では主に複数のASEAN諸国を取り上げ、比較検討する。そして、日本での大災害後の公共インフラの再建・整備の調達行政における取組みや課題が、分析対象とするASEAN諸国に対してどのように有益で応用可能であるのかを明らかにする。
静電インクジェット現象を利用する電子回路・三次元造形物の直接描画技術の開発

静電インクジェット現象を利用した三次元造形物の直接描画技術の開発およびこの応用展開に関する研究を行った。静電インクジェット現象は、高粘性な液体を高画質で吐出可能であるというメリットを有している。この特長を生かして、薄膜フィルム表面に焼結不要な電子回路の描画を行った。また、新しい応用展開として、細胞やゼラチンなどのパターニングを行い、三次元状の細胞組織を作製可能なことを示した。静電インクジェット現象を利用した三次元造形物の直接描画技術の開発を行った.静電インクジェット現象とは,先端にキャピラリーチューブを設けたシリンジに導電性の液体を満たした液体針電極に高電圧を印加すると,チューブ先端に作用する強い静電力によって微小な液滴が連続的に吐出されることを指す.これまでの研究により,静電インクジェット現象は,市販されているピエゾ方式とサーマル方式のインクジェットプリンタよりも高画質で吐出可能であること,高粘性な液体を吐出可能なことという二つのメリットを有することを把握していた.そこで本年度は,これらの特長を生かして,以下の三次元造形技術への応用を行い,基礎特性の把握を行った.まず,本インクジェット現象を用いてガラスペーストのような粘性の高い材料を吐出させることで,立体造形物の作製が可能なこと,本インクジェット現象を用いて銀ナノパーティクルペーストを吐出させたものを焼結することで,電子回路を直接描画できることを示した.ガラスペースト用のシリンジと銀ナノパーティクルペースト用のシリンジを平行に設置し,両シリンジヘの印加電圧をPCによって制御することで,任意の三次元状の電子回路を直接描画する技術へと応用可能であると考えている.また,静電インクジェット現象によってエッチング液を金属細線や金属薄膜に対して吐出することで,極細線化と膜へのマイクロ穴あけ加工が可能なことを示した.これらの材料は,機械加工によって,さらなるマイクロ化を行うには,加工負荷の関係から困難であり,簡易的な別の加工方法が求められている分野であった.除去メカニズムの詳細の解明および実験パラメータの最適化を行い,実用化を目指す.昨年度に引き続き、静電インクジェット現象を利用した三次元造形物の直接描画技術の開発およびこの応用展開に関する研究を行った。静電インクジェット現象とは、先端にキャピラリーチューブを設けたシリンジに導電性の液体を満たした液体針電極に高電圧を印加すると、チューブ先端に作用する強い静電力によって微小な液滴が連続的に吐出されることを指す。これまでの研究により、静電インクジェット現象は、市販されているピエゾ方式とサーマル方式のインクジェットプリンタよりも高画質で吐出可能であること、高粘性な液体を吐出可能なことという二つのメリットを有することを把握していた。本年度は、これらの特長を生かして、薄膜フィルム表面に焼結不要な電子回路の描画を行った。昨年度は銀ナノパーティクルペーストを利用して電子回路を描画したが、本年度はカーボンペーストを利用することで焼結不要な電子回路を描画した。これにより、耐熱性に難のある薄膜材料表面への電子回路描画を実現した。また、新しい応用展開として、細胞やゼラチンなどのパターニングを行った。高電圧を印加し、細胞を含む液滴を吐出させるが、細胞壁が比較的高抵抗なため、電流は細胞の外側を流れるので細胞が吐出時に死滅しないことを明らかにした。このことを踏まえて、細胞の足場材料(スキャホールド)であるゼラチンの高画質な描画を行った。数マイクロメートルの線幅のゼラチンラインを描画可能であり、細胞の数分の一程度の太さであることから、スキャホールドとして十分に利用可能であることを実証した。この結果を踏まえ、微小な造形物であれば、三次元化が可能なことを示した。
胎盤内分泌機能と協調する薬物の胎盤関門透過性制御の分子基盤

胎盤関門を形成する胎盤合胞体性栄養膜細胞は母胎間の物質透過を制御するだけでなく、内分泌細胞として妊娠期特有のホルモン制御において主要な役割を果たす。そのため、胎盤内分泌機構と透過制御機構の変動制御は連動している可能性があり、その解明は胎盤機能の個体間、個体内変動を理解する上で重要である。PKAアゴニストは、栄養膜細胞モデル細胞株であるヒト絨毛癌由来JEG-3細胞、JAR細胞においてヒト絨毛性ゴナドトロピンの分泌量を著しく上昇させるなど、胎盤内分泌成熟シグナルとして働く。PKAアゴニストはSLC22A11トランスポーターの発現を誘導するが、JEG-3細胞はSLC22A11基質である硫酸抱合デヒドロエピアンドロステロン存在下でエストラジオール分泌活性を示し、エストラジオール分泌はSLC22A11阻害剤の存在下で阻害されることが示された。このことは、SLC22A11を介した前駆体の取り込みが胎盤性エストラジオールの分泌制御因子として機能していることを示唆している。さらに、PKAシグナルは葉酸トランスポーターSLC19A1の発現も誘導し、基質であるメトトレキサートの取り込みも活性化させることが示された。以上の結果から、胎盤においてPKAシグナルは絨毛性ゴナドトロピンの分泌機能を誘導するだけではなく、様々なトランスポーターの発現量を変化させ、関門透過性に影響を与えていることが示唆された。特に、SLC22A11はステロイド前駆体を基質としているため、SLC22A11の発現はステロイド分泌と協調的に制御を受けている可能性が高い。平成23年度における研究目標は内分泌成熟シグナルが関門透過制御分子に及ぼす影響を体系的に解明し、胎盤内分泌との関連性を見出す点にある。解析の結果、PKAシグナルによる絨毛性ゴナドトロピンの分泌誘導機構は、同時に胎盤関門における数多くのトランスポーター発現を誘導させることを明らかにできた。特に、胎盤関門SLC22A11を介した輸送制御がステロイド分泌と機能連関していることを示すデータが得られたことは予定以上の研究の進展であった。本結果は、胎盤内分泌機能と透過制御機能の協調性を示す重要な知見であり、平成24年度においてプロモーター解析等を通じて転写制御機構の共通性を明らかにし、ヒト胎盤を用いた個体間変動解析を進めていく基盤成果として、十分であると考えている。妊娠期に特に濃度が上昇するエストリオールについて、その前駆体のSLC22A11に対する基質認識性について解析する。さらに、エストリオール前駆体のトランスポーターを介した細胞への取り込みがエストリオール分泌に及ぼす影響について、細胞株を用いた評価に加えて、ヒト満期胎盤ベシクルを用いた発現および機能解析を進める。解析を通じて、胎盤内分泌と胎盤関門透過性制御との関連性を機能面で明確化するとともに、トランスポーター発現量の個体差が、エストリオール分泌量に及ぼす影響について明らかにすることを目指す。内分泌成熟シグナル分子をノックダウンし、SLC22A11やSLC19A1の発現量および薬物透過性に与える影響を解析する。さらに、トランスポーター遺伝子のプロモーター領域を増幅単離し、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポータープラスミドを作製する。プラスミド遺伝子導入後に胎盤内分泌成熟シグナルを活性化し、一定時間経過後のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定する。予想される転写制御配列に変異を加えたプラスミドでの活性と比較解析することで転写制御配列を同定する。以上の解析を通じて、胎盤内分泌機能と輸送機能との協調的制御に関わる分子機構を解明する。平成23年度は効率的に研究を進めることができ、Genechip等にかかる費用を抑えつつ、十分な成果を得ることができた。また、旅費や学会参加費も結果として予定より抑えられ、平成23年度使用額は計画よりも少額となった。そのため、平成24年度使用予定額は増額となるが、試薬購入に充てることとする。理由として、平成23年度の解析の結果から胎盤エストリオール分泌に関わる前駆体輸送機構の重要性が示唆され、平成24年度はさらに解析を進める必要がある。ただし、エストリオール前駆体は高価であり、輸送機構解析には前駆体の放射標識体も入手する必要があり、当初計画よりも試薬購入に必要な金額が増加しているためである。本研究計画に必要な実験設備は学内および研究室内現有施設および機器を使用するため、高額な設備備品購入は必要としない。その他、研究成果発表のための学会参加費、および研究成果を英語論文として発表するための論文校閲費および投稿費としても使用予定である。
PPARγを標的としたB細胞機能活性化による抗原特異的免疫応答増強法の開発

ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ: PPARγ)は、主に脂肪細胞分化と糖代謝に関わると考えられているステロイドホルモン核内受容体スーパーファミリーに属する核内転写因子である。リンパ球にもこの分子が発現しているが、その機能は明確でなかった。我々は、このPPARγ欠損マウスを作成し、そのヘテロ接合体(以下PPARγ+/-)(変異アリルのホモ接合体は致死)脾臓B細胞において、NFκBの核内移行が亢進し、増殖応答亢進、アポトーシス遅延を示すことから、B細胞機能にPPARγが深く関わっていることを見出した。また抗原特異的免疫応答はT細胞増殖試験で8-15倍、特異的抗体価で3-4倍と増強されていた。そこでPPARγ機能を修飾することにより、抗原特異的免疫応答を増強する手法が開発可能であると考えられ、免疫系細胞におけるPPARγの役割を検討することにした。PPARγ+/-由来T細胞は、in vitro抗原刺激培養すると、+/+由来T細胞と比較して、それぞれPPARγ+/+由来脾樹状細胞上においては約2倍、+/-由来上では約5倍のインターフェロンγ(以下IFNγ)を産生することが認められた。なお、IL-2、IL-4産生については明確な変化は認められない。従って、PPARγ発現量の減少は、T細胞においてINFγの誘導を増強することが明かとなった。現在、今後IFNγレセプター信号伝達系にPPARγが及ぼす影響を中心に解析を進めていく。以上の結果は、細胞障害性T細胞誘導も期待できるTh1型免疫応答で、かつ抗体産生も増強されるという、感染症に対するかなり理想に近い抗原特異的免疫応答増強法が、PPARγという一つの分子を標的にすることで、達成可能であることを示唆すると考えられる。
単純ヘルペスウイルスによる非筋ミオシンII利用のメカニズムと意義

単純ヘルペスウイルス(HSV)はさまざまな疾患の原因となるが、その予防や完治を行う方法が確立されておらず、先進国においても重大な感染症の一つといえる。これまで申請者らは、Non-muscle myosin(NM)-IIAが、HSVによる細胞侵入過程において重要な役割を持ち、抗ヘルペスウイルス予防薬の魅力的なターゲットであることを示してきた。NM-IIAはHSVの初感染および再起感染において重要なターゲットである上皮細胞に強く発現しているが、一方ではNM-IIAの発現が低い、ないしほとんどない細胞も存在する。特にHSVは神経細胞において潜伏し、また神経細胞での増殖は致死的な脳炎の原因として知られているが、神経細胞においてはM-IIAの発現が低いことが知られていた。そこで研究代表者らは、NM-IIAと相同性を持ち、神経細胞において強く発現することが知られているNM-IIBに注目し、HSVとNM-IIBとの関係を解析した。アフリカミドリザル由来のCos細胞は、NM-IIAを発現せず、NM-IIBを発現することが知られており、HSVに感受性のある細胞である。Cos細胞へのHSV侵入時において、NM-IIBはHSVの細胞侵入に必須の糖タンパク質gBと結合していた。さらにCos細胞へのHSV侵入およびHSV糖タンパク質による膜融合はNM-IIBを阻害することで低下した。またHSVへの感受性の低い細胞であるIC21へのNM-IIBの過剰発現は、HSV感受性を増加させることができた。すなわち、HSVはNM-IIBを介して細胞に侵入することができることが明らかになった。これらの結果は、J Virol. 2015Feb;89(3):1879-88.において公表されている。26年度が最終年度であるため、記入しない。