hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞による血液細胞産生のメカニズム

造血幹細胞の分化系譜の研究は細胞特異的な表面マーカーとフローサイトメトリーを用いた細胞の同定分離方法の確立によって飛躍的に進歩した。一方、神経系の細胞系譜の研究には、このような方法論が十分確立されていない。我々は、神経系の幹細胞・ニューロン前駆細胞・ドーパミンニューロンなどに強く発現する遺伝子のプロモーターの制御下で蛍光蛋白質を発現するトランスジェニック動物を用いて、これらの細胞を生きたまま同定分離することに成功した。個体の様々な組織には幹細胞が存在し、何らかの理由により失われた細胞を補充して恒常性を維持している。これらの幹細胞は各々の組織を構成する細胞のみを産み出すものと考えられてきたが、近年幹細胞が他の組織の細胞にも分化する能力を有することが明らかになりつつある。我々は、試験管内で増殖させた神経幹細胞を血液中に移植し、神経幹細胞から血液細胞が産生されるかどうか検討を行った。B6Ly5.1マウスに致死量の放射線を照射して造血能を失わせた後で、B6Ly5.2マウス由来の神経幹細胞100万個をレシピエントマウスの生存を保証するためのB6Ly5.1由来骨髄細胞20万個と共に、そのマウスに移植した。その後、血液中の細胞をフローサイトメトリーを用いて長期間に渡って解析したが神経幹細胞(B6Ly5.2由来)から血液細胞が分化したことを示すデータは得られなかった。海外の研究者によって、ある実験的条件下においては神経幹細胞が血液細胞を産生することが報告されている。造血幹細胞は、造血疾患の治療のための重要な材料であるが、試験管内で増殖させる技術が確立されていないため確保が困難である。一方神経幹細胞は、試験管内で比較的容易に増殖させることが可能である。従って、今後更に検討を加えて、神経幹細胞から血液細胞を産生させることが可能になれば、白血病などの治療に役立つものと考えられる。
マイクロバブルを利用した超音波による腫瘍凝固壊死機器の開発

(1)温度センサーつきの強力集束超音波(HIFU)発信装置の開発臨床での使用を考慮してポータブル・タイプの超音波発信装置を開発した。さらに焼灼中に、焼灼範囲局所での温度上昇をリアルタイムに計測するため、温度計測をin vitroとin vivoの双方で測定可能な装置を開発した。この装置では、焼灼中に0.1秒単位での温度計測が可能であり、マイクロバブルの有無によって、さまざまな時間帯での温度上昇曲線が得られた。これらの検討により、最適な周波数は2MHz、出力は10-20W、至適焦点距離は7-10mm及び至適口径は4cmと決定することが可能となった。(2)肝臓癌モデルratでの腫瘍凝固壊死条件の検討肺臓癌モデルratを樹立した。まず、RatにDiethylnitrosamin(発癌誘発剤)を連日投与し、2週間ごとにratに麻酔して、体重測定を行い、エコー機器で発癌の有無をチェックし、約3ヶ月で発癌を認めた。この肝臓癌モデルratに強力集束超音波を照射したところ、十分な腫瘍凝固壊死が認められた。(3)至適マイクロバブルを用いた肝臓癌モデルratの焼灼実験様々な種類のマイクロバブルを用いて焼灼実験を行い、腫瘍壊死に最適なマイクロバブルについて検討したところ、1つのマイクロバフル(Levovist)が最大の発生熱量増大作用があることを確認した。このマイクロバブルを用いて、投与濃度の比較、投与ルートの比較を行った。投与濃度としては、300ng/ml、投与ルートとしては経静脈的投与で良好な焼灼体積が得られた。マイクロバブルの有無で比較すると、マイクロバブル有の条件で4.6倍(275.3±120.0 vs. 60.1±23.6,P<0.001)の焼灼体積増加が確認できた。HIFU照射後、焼灼部位の病理組織では、マイクロバブルの有無では、質的な差は認めなかった。HIFU焦点部位は、implosion cystsと著明な細胞障害があり、その周辺部位にも細胞壁の損失、あるいは、細胞核の消失がみられ、照射部位全体に出血が認められた。(1)強力集束超音波発信装置の開発発信器の出力及び口径と、焼灼範囲との相関関係を検証した。同時に臨床での使用を考慮してポータブル・タイプの超音波発信装置を開発した。これは、保持者にも安全であり、振動も受けないタイプの発信装置である。さらに焼灼中に、焼灼範囲局所での温度上昇をリアルタイムに計測するため、温度センサつきの超音波発信装置を開発した。この装置により、最適な周波数は2MHz、出力は10-20W、至適焦点距離は10mm及び至適口径は8cmと決定することが可能となった。また、マイクロバブル注入後10-25秒の時間帯での温度上昇が最大であった。(2)至適マイクロバブルを用いた焼灼実験マイクロバブルには、内部気体の種類・マイクロバブルを覆う膜の種類の違い等により、様々な種類のものがある。そこで、様々な種類のマイクロバブルを用いて焼灼実験を行い、腫瘍壊死に最適なマイクロバブルについて検討したところ、1つのマイクロバブル(パルミチン酸含有)がきわめて高度の発生熱量増大作用があることを確認した。

このマイクロバブルを用いて、投与濃度の比較、投与ルートの比較を行った。投与濃度としては、300ng/mlもしくは600ng/ml、投与ルートとしては経門脈的投与で良好な焼灼体積が得られていた。マイクロバブルの有無で比較すると、マイクロバブル有で経門脈的投与の条件で3.4倍の温度上昇と3.2倍の焼灼体積増加が確認できた。(1)温度センサつきの強力集束超音波発信装置の開発発信器の出力及び口径と、焼灼範囲との相関関係を検証した。同時に臨床での使用を考慮してポータブル・タイプの超音波発信装置を開発した。これは、保持者にも安全であり、振動も受けないタイプの発信装置である。さらに焼灼中に、焼灼範囲局所での温度上昇をリアルタイムに計測するため、温度センサつきの超音波発信装置を開発した。さらに、温度計測をin vitroとin vivoの双方で測定可能な装置を開発した。この装置では、焼灼中に0.1秒単位での温度計測が可能であり、マイクロバブルの有無によって、さまざまな時間帯での温度上昇曲線が得られた。これらの検討により、最適な周波数は2MHz、出力は10-20W、至適焦点距離は7-10mm及び至適口径は4cmと決定することが可能となった。(2)肝臓癌モデルratでの腫瘍凝固壊死条件の検討肝臓癌モデルratを樹立した。まず、RatにDiethylnitrosamin(発癌誘発剤)を連日投与し、2週間ごとにratに麻酔して、体重測定を行い、エコー機器で発癌の有無をチェックし、約3ヶ月で発癌を認めた。(3)至適マイクロバブルを用いた肝臓癌モデルratの焼灼実験マイクロバブルには、内部気体の種類・マイクロバブルを覆う膜の種類の違い等により、様々な種類のものがある。そこで、様々な種類のマイクロバブルを用いて焼灼実験を行い、腫瘍壊死に最適なマイクロバブルについて検討したところ、1つのマイクロバブル(パルミチン酸含有)がきわめて高度の発生熱量増大作用があることを確認した。投与濃度としては、300ng/ml、投与ルートとしては経門脈的投与で良好な焼灼体積が得られた。マイクロバブルの有無で比較すると、マイクロバブル有の条件で4.6倍の焼灼体積増加が確認できた。肝臓癌モデルratにマイクロバブルを用いて焼灼実験を行ったところ、焼灼部位の病理組織では、microbubbleの有無では、質的な差は認めなかった。HIFU焦点部位は、implosion cystsと著明な細胞障害があり、その周辺部位にも細胞壁の損失、あるいは、細胞核の消失がみられ、照射部位全体に出血が認められた。
「呼びかけイントネーション」に関する萌芽的研究

呼びかけイントネーションとは、相手の名前を使って呼びかける際に使われるイントネーション(音の高さの変動)である。英語など一部の言語については体系的な研究があるが、日本語についてはほとんど検討されてこなかったテーマである。標準語(東京方言)、鹿児島方言、甑島方言(鹿児島県)などの方言について現地調査を行い、体系ごとのイントネーションを分析したところ、(1)方言によってそのパターンが異なること、(2)親しさや呼びかける距離(近い、遠い)などの要因によって複数のパターンが化可能であること、(3)方言差にも関わらず、基本的に語末(文末)下降によってあらわされることが多い、以上の3点を明らかにした。調査語彙リストを含めた調査方法について検討を行い、鹿児島方言について予備調査の追試を行った。調査から得られたデータを次の各項目に注目して分析した。(1)呼びかけイントネーションの基本形は下降調か、上昇調か?語末母音(音節の)伸長化を伴うか、伴わないか?(2)呼びかけイントネーションによって、単語のアクセント型が変容を受けるか?受ける場合には、この特徴(ピッチ上昇、下降等)がどのように変容するか?(3)アクセント型の中和を引き起こすか?(4)方言ごとに定まっている音調付与の基本単位(音節、拍)が守られるか?(5)疑問文のイントネーションパターンと区別されるか?(6)インフォーマントの年齢、性別によって、呼びかけイントネーションのパターンがどのような変容を見せるか?以上の点に着眼して調査データを分析し、その結果を海外の研究集会において発表し、英文論文を海外の専門誌に投稿した。東京方言については、「かっとばせえ○○○!」や「○○ちゃん、遊ぼう!」といった言い回し・構文において、起伏式アクセント(直子、達也、静他)と平板式アクセント(直美、達男、望他)の対立が失われるか否かを分析し、対立が保持されるという結論を得た。一部のインフォーマントは先行研究が述べているように対立を失っているが、大多数のインフォーマントは先行研究の記述に反して、アクセントの対立が保持されるという明確な言語直感を持っているが明らかになった。鹿児島方言の疑問イントネーションと呼びかけイントネーションについてさらに分析を進めた。特殊な事情(「現在までの進捗状況」の欄参照)により、十分な現地調査を行うことができず、また海外での発表も困難であったが、分析の方は比較的順調に進んだ。特に、(1)疑問イントネーションと呼びかけイントネーションにより、アクセント型がどのように変わるか、(2)とりわけアクセント型の対立(A型、B型)が保持されるかどうか、(3)疑問イントネーションのアクセント型と呼びかけイントネーションのアクセント型が区別できるか否か、以上の3点について考察を進めた結果、(1)についてはB型アクセントがA型アクセントと同様に下降調で現れるようになることと、呼びかけイントネーションにA型もB型も二通りの音調パターン(I型とII型)が現れることを明らかにした。(2)については、疑問・呼びかけのいずれにおいても、アクセント型の対立が無くなる(中和が起こる)が、その条件は疑問イントネーションの場合がはるかに厳しく、呼びかけイントネーションではかなり自由に中和が起こることがわかった。また(3)については、方言インフォーマントを対象にした簡単な聴覚テストにより、呼びかけイントネーションと疑問イントネーションの音調パターンが聴覚的に区別がつかないことが多いことを明らかにした。さらに、これらの分析結果を東京方言に関する予備調査の結果と比較したところ、(1)のうち呼びかけイントネーションに見られる下降調は東京方言にも見られるようであるが、疑問イントネーションの下降調は同方言に見られないこと、また、(2)と(3)はいずれも東京方言には見らない特徴であるという知見が得られた。日本言語学会の会長に選出されたことなどにより、数回計画していた方言調査を1回しか行えず、また海外の学会における発表も実施できなかった。その一方で、すでに得られていたデータの分析と、論文の執筆は予定通り行うことができた。九州の二型アクセント方言(鹿児島方言、甑島方言)と一型アクセント方言(宮崎県・小林方言)について(i)呼びかけイントネーションの音声特徴と、(ii)呼びかけと疑問のイントネーションの異同について調査研究を行った。鹿児島方言については、呼びかけイントネーションが文末(人名末)のピッチ下降を伴い、それによりピッチ下降を伴わないアクセント型(B型)の語ももう一つのアクセント型(A型)と同じ特徴を持つようになることと、呼びかけ文においてA型とB型のアクセント対立がしばしば失われ中和してしますこと、さらには疑問文イントネーションとほぼ同じパターンを示すことが明らかとなった。甑島方言については、もともと二つのピッチの山を持つ重起伏型アクセントを有することが知られていたが、B型の語彙においては二つ目のピッチの山が消えることによって呼びかけ文となることが明らかとなった。A型の語彙については調査データが不十分であるために、呼びかけ文でアクセント型の対立が失われるかどうかはまだわからない。また疑問イントネーションとの詳細な異同も未解明である。アクセントの型が一つしかない小林方言においても、呼びかけ文は文末下降を伴うという観察が得られた。つまり、平叙文では最後の音節(シラブル)が高くなるという語アクセント型に対して、最後の音節内でピッチ下降が起こることによって呼びかけイントネーションとなることがわかった(これは鹿児島方言のB型語彙に見られる呼びかけイントネーションとほぼ同じである)。

ただ、この方言では平叙文もしばしば文末下降を伴って発音されることから、平叙文と呼びかけ文が極めてよく似たイントネーション特徴を示すことになる。両者にどのような違いがあるのか、また疑問文イントネーションとはどのように異なるのか、今後の課題として残った。呼びかけイントネーションとは、相手の名前を使って呼びかける際に使われるイントネーション(音の高さの変動)である。英語など一部の言語については体系的な研究があるが、日本語についてはほとんど検討されてこなかったテーマである。標準語(東京方言)、鹿児島方言、甑島方言(鹿児島県)などの方言について現地調査を行い、体系ごとのイントネーションを分析したところ、(1)方言によってそのパターンが異なること、(2)親しさや呼びかける距離(近い、遠い)などの要因によって複数のパターンが化可能であること、(3)方言差にも関わらず、基本的に語末(文末)下降によってあらわされることが多い、以上の3点を明らかにした。鹿児島方言と東京方言に関する調査が予定通り進み、学会発表も順調に行ったが、成果の取りまとめについては、2年目以降に予定していた英文論文の執筆まで進んだ。今後さらに調査を重ねて、より多くの方言話者からデータを得ると同時に、それらのデータを音響分析することにより、アクセントの中和現象などが音響レベルにおいても起こっていることを実証する。また海外の学会で成果を発表し、さらに論文の執筆を進める。言語学鹿児島方言と東京方言の呼びかけイントネーションについて、構文数と話者数を増やして調査研究を行い、同じ調査を近畿方言や甑島方言に広げて実施する。また東京方言他に関する調査研究を学会発表と論文執筆・投稿の2本立てで成果発表する。計画通り調査を実施し、予定通りのデータを収集した。このデータの分析結果を海外の研究集会において発表し、また英文論文を執筆した。すべて計画通りである。平成27年4月に学会の会長に就任した等の理由によって調査研究や成果の発表が十分にできなかったため、研究期間の延長を申請し認められた。実施した方言調査に対して一部、他の研究資金を使うことができたため。平成28年度においては平成27年度に予定していた調査と成果の発表を行う。鹿児島方言の呼びかけイントネーションについて、疑問イントネーションと同じかどうか定量的な音響実験と知覚実験を行う。また東京方言の呼びかけイントネーションの実態について予備調査を行う。方言調査と成果発表の回数(日数)を増やすことにより対応する予定である。調査旅費と物品費(録音機等)を他の経費から捻出できたため。次年度(平成26年度)に旅費および物品費として使用する予定である。
重症壊死性腸炎に対する希少糖生理作用の解明と新規予防的治療方法への展開

本実験の背景と目的: NEC(壊死性腸炎)は低出生体重児に多く発症し、腸粘膜の虚血性壊死を主病変とする疾患で、NECの発生原因の真のメカニズムについては十分解明されていない。一方、NECになった患児は救命されても腸管が極端に短い短腸症候群になることが多く、消化管が長期間使用できないため栄養障害やそれに付随する肝機能障害(IFALD: Intestinal Failure Associated Liver Dysfunction)を起こし、生命予後のみならず成長障害も引き起こす。本研究はNEC病態に関連の深い短腸症候群ラットモデルに対する希少糖などの細胞増殖因子の影響を調べることを目的とした。短腸症候群ラットモデルの作成:短腸症候群ラットモデルを作成することから本実験はスタートした。ラットを開腹の後、腸管を切断し、そのまま吻合、腹壁を閉腹するいわゆるsham群と空腸回腸を70%切除後腸管を端々吻合する群、とに分類した。さらにそれぞれに対して細胞保護作用のあるguar gumを投与する群を作成した。この4群について本年は腸管粘膜障害とguar gumによる粘膜障害ついて検討した。結果:短腸症候群ラットを用いても実験にて70%切除した群はsham群と比較して有意に吻合部付近の炎症による粘膜脱落所見が残存していた(HE染色およびCD45)。またguar gum投与群ではこの炎症所見が有意に軽減した。それに応じて腸内細菌叢の是正と短鎖脂肪酸の増加傾向が見られたもののguar gumの抗炎症効果が真に腸内細菌叢を通じての変化であることは証明できなかった。考察:本短腸症候群モデルに対するguar gumの効果は炎症性変化を軽減することが分かった。guar gumは腸内細菌叢を是正する、といわれているため今後はguar gumの抗炎症効果が腸内細菌叢を介してのものかどうか検証していく予定である。実験動物モデル作成が安定化傾向にあるため、組織や便などの検体採取が容易になった。また、実験結果も予想以上のものが得られるようになってきた。短腸モデルでは消化管吻合部付近に炎症作用があり、guar gumにて軽減できることがわかったが、腸内細菌叢や短鎖脂肪酸の影響によるものかどうかの検証が必要と考えている。この4群について体重増加、腸内細菌叢と短鎖脂肪酸の変化、腸管の組織学的変化(陰窩深、絨毛長)について検討した。結果:短腸症候群ラットを用いても実験にて70%切除した群はsham群と比較して吻合部付近の炎症作用が残存する傾向が見られた。またguar gum投与群ではこの炎症所見が軽減する傾向が見られた。その反面、腸内細菌叢と短鎖脂肪酸の経時的変化は見られなかった。しかし、その差は軽微であるためさらに条件の厳しいモデル(90 %小腸切除や、回盲部追加切除群など)を作成して腸内フローラや短鎖脂肪酸、腸管粘膜の状態などを観察する必要があるものと思われた。実験開始早期では縫合不全などから実験動物が実験終了までに途中死亡する傾向が見られた。そのためやや実験が遅れ気味であったが、中期では短腸症候群モデルの生存率は安定した。

結果:短腸症候群ラットを用いても実験にて70%切除した群はsham群と比較して有意に吻合部付近の炎症による粘膜脱落所見が残存していた(HE染色およびCD45)。またguar gum投与群ではこの炎症所見が有意に軽減した。それに応じて腸内細菌叢の是正と短鎖脂肪酸の増加傾向が見られたもののguar gumの抗炎症効果が真に腸内細菌叢を通じての変化であることは証明できなかった。考察:本短腸症候群モデルに対するguar gumの効果は炎症性変化を軽減することが分かった。guar gumは腸内細菌叢を是正する、といわれているため今後はguar gumの抗炎症効果が腸内細菌叢を介してのものかどうか検証していく予定である。実験動物モデル作成が安定化傾向にあるため、組織や便などの検体採取が容易になった。また、実験結果も予想以上のものが得られるようになってきた。短腸症候群モデルにおける腸管の炎症作用とguar gumの炎症抑制効果について免疫染色などを行い検証する。また、条件のより厳しいモデル(90 %小腸切除や、回盲部追加切除群など)を作成して腸内フローラや短鎖脂肪酸、腸管粘膜の状態などを観察する予定としている。短腸モデルでは消化管吻合部付近に炎症作用があり、guar gumにて軽減できることがわかったが、腸内細菌叢や短鎖脂肪酸の影響によるものかどうかの検証が必要と考えている。前年度は前々年度に購入した実験動物、血液生かgか雨滴解析、病理学的解析および微生物学的解析にかかる消耗品を使用したため、当該研究費は予定より少額の出費のみとなった。本年度はこれらの継続した実験の費用に充当するため次年度使用額が生じた。本年度は実験動物購入、血液生化学的解析、病理学的解析、微生物学的解析に使用する予定である。ラット短腸モデルにおけるguar gumの抗炎症効果が短鎖脂肪酸や腸内フローラの変化によるものかどうか、確認する必要が生じたため。具体的には70%短腸モデルとsham群、それぞれにguar gumを加えた5匹ずつ4群を作成し、短鎖脂肪酸と腸内フローラの変化状況を調べる。
低ホスファターゼ症モデルマウスの歯髄幹細胞由来骨芽細胞の分析

低ホスファターゼ症(HPP)は、組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNALP)の遺伝子変異を原因とする遺伝子疾患である。本研究では、HPPモデルマウス(KOマウス)骨形態計測を行い骨形成能を分析した。KOマウスにおいて骨量、骨芽細胞数の低下を認めた。また、肥大軟骨層の菲薄化,軟骨細胞数の低下を認め、このことから骨形成能が低下していると考えられた。結果からHPPの石灰化不全の原因は、PPiの蓄積による石灰化障害のみならず、骨芽細胞数の低下や、肥大軟骨の菲薄化によるものであり、これらはTNALP欠乏の影響であると示唆された。本研究では、低ホスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリホスファターゼ遺伝子(TNSALP)をノックアウトさせた、低ホスファターゼ症モデルマウス(Alpl KOマウス)の歯髄由来の体性幹細胞培養し、骨芽細胞を分化誘導して培養する。そこで同様に培養、分化誘導させた野生型の骨芽細胞をコントロールとして、低ホスファターゼ症の骨芽細胞の石灰化能を比較して評価を行う。また、Alpl KOマウスおよび野生型の骨芽細胞から抽出したtotalRNAを用いてマイクロアレイを行い、遺伝子発現解を行うことを検討している。そこでTNSALP遺伝子や石灰化に関与する遺伝子の発現レベルを評価する。Alpl KOマウスと野生型を比較し、どちらのどの遺伝子が多く発現しているか、またはどの遺伝子の発現が少ないか、野生型との遺伝子発現レベルの差異をReal time PCRにて定量し解析する。本研究では、以上のことを期間内に行うことを計画している。本研究において、歯髄細胞を使用した体性幹細胞から、骨芽細胞を分化誘導し培養できることで、遺伝子変異をbackgroundに持つ骨芽細胞の分析が可能となる。このことにより詳細な骨芽細胞の特徴を考察し、今後の低ホスファターゼ症の治療の発展に貢献することを意義とする。この歯髄細胞の分析により、低ホスファターゼ症における未だ明らかにされていない硬組織石灰化不全を解明することが可能と予想される。Alpl KOマウス実験結果をもとにした研究から実際の治療への応用が期待できる。平成28年度AlplKOマウスの作製として、低ホスファターゼ症モデルマウス(Alpl KOマウス)を得るため、Alplヘテロマウスを交配させた。その後、genotypingを行いAlpl KOマウスと野生型(WT)マウスを遺伝型を確認し、Alpl KOマウスと野生型(WT)マウスを得た。Jaebodinらの手法を用い、genotypingで選別した生後4-10のAlpl KOマウスおよびWTマウスの顎骨より歯を取り出し、歯髄を採取する。コラゲナーゼにて酵素処理を行い、得られた細胞懸濁液を遠心分離して細胞を得る方法を行ったところ、細胞の回収量が十分得られず、他の方法を検討した。代替えの方法として、同様のサンプルから顎骨より歯を採取し、歯髄を1mmの長さに切断し培養液にて播種して培養する方法に変更したところ、十分な細胞数が得られるようになったことから、申請時の計画から細胞の培養法を変更して歯髄幹細胞培養を行うこととした。また、培養した歯髄より幹細胞を分離幹細胞のマーカーであるStroI、CD146、CD105を用いフローサイトメトリー法より細胞選別し分取する予定であったが、幹細胞の回収率が低く、十分な細胞数が得られなかったため、継代培養を2ー4回を行う間に得られた細胞を幹細胞として、誘導培地(α-MEM、5%FBS、10mMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロリン酸、1mMカルシトリオール、1%ペニシリンストレプトマイシン)に換え骨芽細胞の培養を行うこととした。本研究では、低ホスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)遺伝子をノックアウトさせた低ホスファターゼ症モデルマウス(Alpl KOマウス)の歯髄由来の体性幹細胞培養した後、骨芽細胞を分化誘導、培養し、低ホスファターゼ症の骨芽細胞の石灰化能を比較して評価を行う。また、Alpl KOマウスおよび野生型の骨芽細胞から抽出したtotalRNAを用いてマイクロアレイを行い、遺伝子発現解を行うことを検討。そこでTNSALP遺伝子や石灰化に関与する遺伝子の発現レベルを評価することを目的としていた。本研究では、以上のことを期間内に行うことを計画していたが、培養した歯髄より幹細胞を分離幹細胞のマーカーであるStroI、CD146、CD105を用いフローサイトメトリー法より細胞選別し分取する過程において、幹細胞の回収率が低く、幹細胞の評価に十分な細胞数が得られなかった。本研究において、歯髄細胞を使用した体性幹細胞から、細胞を分化誘導し培養を行う上で、Alpl KOマウス由来の歯髄細胞の培養細胞は野生型と比較し発育不良であり、十分な細胞数を得ることが困難であった。このことからAlpl KOマウスの骨形成に関係する細胞の、組織学的分析を行うこととした。day10のAlpl KOマウス及び、野生型マウスの骨形態計測を行い比較した結果、骨芽細胞数が有意に減少していたが、破骨細胞数においては有意差を認めなかった。

骨芽細胞数が減少することにより骨形成能が低下し骨の吸収を行う破骨細胞数は減少していないことで低ホスファターゼ症の骨形成が低下していることが考えられた。このことから、低ホスファターゼ症の原因であるTNASLPが骨芽細胞数に関与していることが示唆された。低ホスファターゼ症(HPP)は、組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNALP)の遺伝子変異を原因とする遺伝子疾患である。本研究では、HPPモデルマウス(KOマウス)骨形態計測を行い骨形成能を分析した。KOマウスにおいて骨量、骨芽細胞数の低下を認めた。また、肥大軟骨層の菲薄化,軟骨細胞数の低下を認め、このことから骨形成能が低下していると考えられた。結果からHPPの石灰化不全の原因は、PPiの蓄積による石灰化障害のみならず、骨芽細胞数の低下や、肥大軟骨の菲薄化によるものであり、これらはTNALP欠乏の影響であると示唆された。骨芽細胞の石灰化能分析:Alpl KOマウス幹細胞を骨芽細胞誘導培地にて培養し細胞の石灰化能の分析を行う。12wellプレートに、1.5x103個/wellにて培養細胞を播種し、70%コンフルエントになった時点を0日として、骨芽細胞誘導培地にて21日間培養する。2-3日に1度培地交換を行い、day7,day15で10%中性ホルマリン緩衝液にて固定しALP活性染色を行いALPの活性を評価する。day21で10%中性ホルマリン緩衝液にて固定し、アリザリンレッド染色を行う。アリザリンレッドを用い石灰化した細胞を染色し、その色を数値化し石灰化能の分析を行う。マイクロアレイによる骨芽細胞の分析:Alpl KOマウス幹細胞の培養し、骨芽細胞を得る。12wellプレートに、1.5x103個/wellにて培養細胞を播種し、70%コンフルエントになった時点を0日として、骨芽細胞誘導培地にて7日間培養する。得られたこれらの細胞よりTorizolにてtotalRNAを抽出する。totalRNAよりRT-PCRを行いcDNAを増幅する。cDNAを用いマイクロアレイ(アジレント・テクノロジー社製)をTaKaRaに外注し、WTとTNALP・KO由来の分化細胞における遺伝子発現の比較・分析を行う。WTとTNALP・KOマウスの遺伝子発現を比較して、骨に関わる遺伝子の発現、また発現量の比の差が大きい遺伝子を分析しターゲット遺伝子を決定する。その後の予定として、本研究から得られた石灰化に関与する遺伝子を元に、マイクロRNAにて遺伝子を制御する研究の研究として検討している。生化学病理組織標本を外注したところ、作業中に破損しサンプルの再作成が必要になった。そのため受注業者の好意でサンプル作成代金の割引があった。また、購入予定の遠心分離機の発注が見積り書をとった時から2週間遅れたため、キャンペーンが終了し見積りの値段では購入できないことになった。H29年度の助成金と残額を合算させて、遠心分離機の購入を予定している。
口顎感染症におけるT細胞の分化誘導の基礎研究と治療法の模索

IL-10と各種抗生剤が感染症に対して、いかなる免疫生物学的役割や抗菌性を果たすかを明らかにするために、実験を行った。(1)8週齢のBALB/cとC3Hマウスの咬筋部に、S.mitis, S.intermedius,またはS. sanguisにカラゲニンを混合または単独注入し、感染症を誘発した。IL-10と各種抗生剤の単独または併用投与時のマウスの生存率、局所の腫脹径と末梢血の白血球数の変動を計測し、経時的に炎症組織を採取し、RT-PCR法とin situ hybridization法でTh1とTh2の産生サイトカインのmRNAを検索した。(2)経時的に採取した末梢血からリンパ球を分離し、Th細胞の分化度をモノクローナル抗体で検索した。(3)(2)で得たTh細胞のIL-1R陽性率を計測した。(4)各種抗生剤がin vivoとin vitroでTh細胞に及ぼす影響を検索した。これらの実験から、以下の結果を得た。1)IL-10は、これら感染症マウスの腫脹を早期に改善し、致死的経過をたどるマウスの救命に働く可能性を示した。その主作用は、Th細胞のTh1への過剰な分化抑制とTh2への分化誘導であり、Th1への過剰な分化を原因として惹起される種々な疾患に対し、治療薬として応用される可能性のあることが強く示唆された。2)IL-10のTh細胞への影響は、局所に比べ血中で比較的長く残存する。安易な投与は、逆にTh2への過剰な分化を惹起することから、新たな病態を形成する可能性が推測された。3)Th細胞に対するEMの効果を検討し、in vitroでは、短時間でTh細胞をTh2に分化誘導することが判明した。しかし、in vivoにおけるTh細胞への影響は、約2週を要し、IL-10に比し、重症化膿性炎に対して即効性はなく、比較的長期投与の必要なことが推測された。本実験で、IL-10とEMに既存の抗生剤のCCLを加えた群が最も坑腫脹効果を示した。この結果、Th細胞のTh1への過剰な分化を是正するために、IL-10は即効性を発揮し、またEMは遅発的で、かつ持続的にその効果を発現し、さらに既存の細菌スペクトラムに合致した抗生剤の投与によって、重症化膿性炎症に対し、より効果的でかつ早期に改善できる可能性が示された。炎症に対するIL-10の生物学的役割を明らかにするために、カラゲニン誘発の炎症マウスにおける病態分析とIL-10の作用効果を検討し、臨床応用への可能性を模索した。1)8週齢のBALB/cとC3Hマウスの咬筋部皮下に各種濃度のカラゲニンの注入により、発炎させた。経時的に腫脹径、末梢血の白血球数、末梢血のTh細胞の分化を検索し、両マウス群はともにカラゲニンの濃度依存性に腫脹は増大し、2日後に最大となった。また、血中Th細胞をフローサイトメーターで検索し、発炎1日後からIL-1Rは陰性側に移動し、37日後にはその移動量は最大となった。2週後からIL-1Rは陽性側へ移動し、34週後には元の状態に復した。2)カラゲニン注入の12時間後にIL-10の0.05,0.1と0.2μgの各量を投与した結果、発炎3日後の生存率はC3Hマウス群では、IL-10非投与群では68%であったが、IL-10の0.05μg投与群では90%、0.1と0.2μg投与群では100%(P<0.05)で、生存率は上昇した。また、BALB/cでも同様に、生存率が改善した。3)8%カラゲニンで発炎させたC3HとBALB/cマウス群の発炎12時間後にIL-10の0.2μgを投与し、その血中Th細胞のIL-1Rを解析すると、両群ともに発炎3日後からIL-1R強陽性側に細胞集団が発現し、1週後にはその細胞群は増加した。2週後にはほぼ元に復し、また同時に腫脹もほぼ消退した。以上を総合すると、IL-10の投与により発炎時にはTh細胞がTh1への過剰な分化を抑制され、腫脹程度と腫脹期間が有意に縮小や減少することが判明した。

(4)各種抗生剤がin vivoとin vitroでTh細胞に及ぼす影響を検索した。これらの実験から、以下の結果を得た。1)IL-10は、これら感染症マウスの腫脹を早期に改善し、致死的経過をたどるマウスの救命に働く可能性を示した。その主作用は、Th細胞のTh1への過剰な分化抑制とTh2への分化誘導であり、Th1への過剰な分化を原因として惹起される種々な疾患に対し、治療薬として応用される可能性のあることが強く示唆された。2)IL-10のTh細胞への影響は、局所に比べ血中で比較的長く残存する。安易な投与は、逆にTh2への過剰な分化を惹起することから、新たな病態を形成する可能性が推測された。3)Th細胞に対するEMの効果を検討し、in vitroでは、短時間でTh細胞をTh2に分化誘導することが判明した。しかし、in vivoにおけるTh細胞への影響は、約2週を要し、IL-10に比し、重症化膿性炎に対して即効性はなく、比較的長期投与の必要なことが推測された。本実験で、IL-10とEMに既存の抗生剤のCCLを加えた群が最も坑腫脹効果を示した。この結果、Th細胞のTh1への過剰な分化を是正するために、IL-10は即効性を発揮し、またEMは遅発的で、かつ持続的にその効果を発現し、さらに既存の細菌スペクトラムに合致した抗生剤の投与によって、重症化膿性炎症に対し、より効果的でかつ早期に改善できる可能性が示された。
高松宮家蔵書群の形成とその性格に関する総合的研究

本研究の対象である高松宮家蔵書群(以下、高松宮本と略称)は、国立歴史民俗博物館所蔵「高松宮家伝来禁裏本」の総体を指している。高松宮本は、かつて禁裏の蔵書群(以下、禁裏本と略称)の一角を占めていた典籍群が中心であり、これらは近世前期を中心に旧有栖川宮家に贈与されたものであるが、贈与の時点で、有栖川宮家旧来の蔵書と禁裏本の区別が不明確になったと見られる。1913年(大正2)、大正天皇第3皇子・宣仁親王が有栖川宮家の祭祀を継承し高松宮の称号を受けたことで、これらの蔵書も高松宮家に継承された。その後、1965年(昭和40)に宮内庁書陵部がこれらの蔵書群を禁裏本と有栖川宮家旧来の蔵書に分類したが、時間的制約があったため、万全の分類にはならなかった。ここでの分類による禁裏本が後に国(文化庁)に譲渡され、さらに国立歴史民俗博物館に移管された。本研究では、高松宮本の個別研究を重ねつつ、禁裏本の本体である京都御所東山御文庫本等との関係を追究するとともに、上述のような伝来の経緯を持つ高松宮本の形成過程を追跡した。また他の宮家や公家諸家、さらには金沢藩前田家の蔵書群をはじめとする武家の文庫についても一部検討を加えた。なお本研究は、内容上密接に関連する二つの共同研究と並行して実施した。すなわち(A)国立歴史民俗博物館共同研究「「高松宮家伝来禁裏本」の基礎研究」(研究代表者:国立歴史民俗博物館教授・吉岡眞之。20032008年)、(B)人間文化研究機構連携研究「中世近世の禁裏の蔵書と古典学の研究-高松宮家伝来禁裏本を中心として-」(研究代表者:同上。20052008年度)がそれである。いずれも高松宮本を研究対象とし、それぞれ異なった視点から研究を行っているが、それぞれの課題の成果は相互に吸収しつつ進めてきた。そのため、本研究の成果についても(B)の成果報告書である「中世近世の禁裏の蔵書と古典学の研究-高松宮家伝来禁裏本を中心として-研究調査報告」1(2007年3月刊)、「同」2(2008年3月刊)に反映されている。本研究の主眼である高松宮家伝来の蔵書群の形成とその性格の解明には、禁裏・宮家・公家・武家・寺社等の蔵書群とその形成過程、およびそれらと高松宮家蔵書群との関連の検討が不可欠である。この観点から今年度は、高松宮家蔵書群の形成の重要な画期である近世前期の公家日記の紙焼写真を購入し、宮廷・公家社会を中心として展開された典籍の書写活動に関する史料を収集した。収集史料の本格的な分析は次年度以降に行う予定であるが、この分析により、近世前期における宮廷を中心とする公家社会の文化的ネットワークのあり方、"知の集積"のプロセスを解明することができると考える。

このことについては、平成15年度から開始した国立歴史民俗博物館の共同研究「『高松宮家伝来禁裏本』の基礎研究」(研究代表者:吉岡眞之)において行っている個々の典籍の書誌データの収集とその分析を通じて、一定の見通しを得ており、公家日記の収集と分析は、この見通しを実証するために不可欠の階梯である。2005年1011月に国文学研究資料館と共同で人間文化研究機構連携展示「うたのちから-和歌の時代史-」(展示プロジェクト代表:吉岡眞之)を開催した。この展示においては高松宮家蔵書群を中心に展示したが、展示の一部を割いて、本研究および前記共同研究の成果の一端として禁裏文庫および高松宮家蔵書群の形成過程についての見通しを提示した。これについては本研究の研究協力者・酒井茂幸(国立歴史民俗博物館外来研究員)によって展示図録『うたのちから-和歌の時代史-』(2005年、国立歴史民俗博物館発行)に示されている。この展示の準備過程での研究により、中世後期にさかのぼって禁裏の蔵書の集積過程とその意図を解明することが、高松宮家蔵書群の性格の解明にも重要な影響を及ぼすであろうことが推定されるにいたった。この点の具体化が次年度以降の新たな課題として提起されている。国立歴史民俗博物館所蔵「高松宮家伝来禁裏本」(以下、高松宮本と略す)は、主として近世前期に旧有栖川宮家(高松宮家の前身)に贈与された禁裏本を主体とする蔵書群である。禁裏本が旧有栖川宮家の蔵書に組み込まれた時点で、禁裏本と本来の有栖川宮家本の区別が不明確となっていたため、1965年に宮内庁書陵部が調査を実施し、両者の区別を試みたが、時間の制約もあって、必ずしも正確な区別とはならなかった。この時の区別に従って、禁裏本は後に文化庁を経て国立歴史民俗博物館に入り、旧有栖川宮家本は宮内庁書陵部に納まったが、両者の関係については精査すべき課題が残されている。本研究はこの課題に取り組むため、高松宮本の個別史料の調査・検討を実施し、禁裏本の形態的特徴に関するデータの収集と整理を行った。同時に、禁裏本形成の重要な時期に相当する近世前期の公家日記の検討を通じて、禁裏本の形成過程に関するデータの収集を行った。なお、本研究課題は、並行して実施中の(1)国立歴史民俗博物館共同研究「『高松宮家伝来禁裏本』の基礎研究」(平成1520年度)、および(2)人間文化研究機構連携研究「中世近世の禁裏の蔵書と古典学の研究-高松宮家伝来禁裏本を中心として-」(平成1820年度)と密接な関連を有しているため、収集データの相互利用など、研究成果を共有することによって効率的に研究を進めることができた。本研究の対象である高松宮家蔵書群(以下、高松宮本と略称)は、国立歴史民俗博物館所蔵「高松宮家伝来禁裏本」の総体を指している。高松宮本は、かつて禁裏の蔵書群(以下、禁裏本と略称)の一角を占めていた典籍群が中心であり、これらは近世前期を中心に旧有栖川宮家に贈与されたものであるが、贈与の時点で、有栖川宮家旧来の蔵書と禁裏本の区別が不明確になったと見られる。1913年(大正2)、大正天皇第3皇子・宣仁親王が有栖川宮家の祭祀を継承し高松宮の称号を受けたことで、これらの蔵書も高松宮家に継承された。その後、1965年(昭和40)に宮内庁書陵部がこれらの蔵書群を禁裏本と有栖川宮家旧来の蔵書に分類したが、時間的制約があったため、万全の分類にはならなかった。ここでの分類による禁裏本が後に国(文化庁)に譲渡され、さらに国立歴史民俗博物館に移管された。本研究では、高松宮本の個別研究を重ねつつ、禁裏本の本体である京都御所東山御文庫本等との関係を追究するとともに、上述のような伝来の経緯を持つ高松宮本の形成過程を追跡した。また他の宮家や公家諸家、さらには金沢藩前田家の蔵書群をはじめとする武家の文庫についても一部検討を加えた。なお本研究は、内容上密接に関連する二つの共同研究と並行して実施した。すなわち(A)国立歴史民俗博物館共同研究「「高松宮家伝来禁裏本」の基礎研究」(研究代表者:国立歴史民俗博物館教授・吉岡眞之。20032008年)、(B)人間文化研究機構連携研究
読む目的の違いによる国語科の指導の工夫,改善

○研究目的今まで教科書の文章を批判の対象にしたことがなく,指導する側もされる側も「教科書にあるから」で納得してしまい「何のために読むのか」という目的を掘り下げてこなかったことに問題意識を持っていた。そこで,「教科書にはいいことが書いてあるんだからだまって読め」ではなくて,学習者が目的を持って読む学習を追求する。○研究内容「読む目的」の違いによって言語技能を育成する方向で国語科を改変する。当然ながらこの場合の目的とは学習者のものでなければならないが,一方で,目標は指導者が設定するものであるから,指導者がしっかり持っていなければならない。そこで,学習の前後で学習者に自分の言葉で自分の課題を言語化させ,それを比較,分析して指導法の工夫改善を提案する。○研究成果まず,これまでの国語科の学習指導を振り返ってみると,「読む対象」の違いによる言語活動・言語能力の育成が中心だったことが改めてわかった。「読む目的」の違いによる言語活動としては,「知るための読み方」「調べるための読み方」「考えを深めるための読み方」「楽しむための読み方」などを想定した。これらの実践から,話したり書いたりする目的に合わせて読んだり聞いたりすることこそが,社会生活との関連を重視にすることに他ならないという確信を得た。先の,読む目的の違いの内,「読むことを楽しむ」はそれ自体が目的となるより他ないが,この部分は「読書領域」として取り上げるという結論に達した。具体的には,読書紹介やブックトークなどの言語活動を行った。そして,これを教科横断的な国語力の基礎として位置づけ,課題図書を設定するなどして読書活動を推進した。また,本校国語科において,「読読(よんどく)36」として1学年12冊の必読書を定め,期間を定めて一斉に配付(回収)する読書活動を実施した。
学習障害児を対象とした早期支援プログラムの開発に関する調査研究

学習障害を対象とした研究はこれまで多く行われているが、近年、学校場面における学習困難を対象とした支援においては、「学習困難が疑われた段階でいかに早期に効果的な支援を行えるか」という点に焦点が当てられるようになってきている。その背景として、これまでの実践では、学習困難が重篤化してから支援が開始されることが多く,既に学習に対する苦手意識が固まっているなど、二次的な問題が状態を複雑化させてしまっていると指摘されていた。そこで、本研究では、児童に対する学習困難リスクを早期に評価し、支援につなげる包括的なシステムの開発ならびに、その効果を実際的に検証することとした。2018年度は研究最終年度であり、石塚ら(2012)や石塚ら(2013)で用いた就学後早期の算数困難スクリーニング法、読み障害と対象とした小枝ら(2011)の研究手続きを多層指導モデルに適用した上での効果及び課題についての検討を継続した。また、参加者のアセスメント情報とそれに対応した支援の状況、学校場面における教師の指導法・支援行動、学校場面における行動や学力成績の変容等についてデータ収集を行い、早期支援プログラムの開発につなげた。加えて、発達相談センター等の協力を得た上で、学習障害ハイリスク児における詳細な調査データの収集、課題を一部修正した上で就学前児を対象とした早期支援プログラムを試験的に実施し、その効果について予備的な検討を行った。学習障害児のうち、読み困難、算数困難が疑われる児童は、通常学級に在籍する児童の約4.5%に上ると報告され、特別支援教育の枠組みを超えて学校教育全体の大きな課題となっている。しかし、実際のところ学習困難児への指導については、既に研究における蓄積が進められており、近年、学校場面において「学習困難が疑われた段階でいかに早期に効果的な支援を行えるか」という点に焦点が当てられている。これまでの実践では、学習困難が重篤化してから支援が開始されるため,既に学習に対する苦手意識が固まっているなど、二次的な問題が状態を複雑化させていると指摘されていた。そこで、本研究が目的とするのは、児童に対する学習困難リスクを早期に評価し、支援につなげる包括的なシステムの開発ならびに、その効果を実際的に検証することである。2016年度は初年度であり、石塚ら(2012)や石塚ら(2013)で用いた就学後早期の算数困難スクリーニング法、読み障害と対象とした小枝ら(2011)の研究手続きを多層指導モデルに適用し、包括的な学習障害の早期支援プログラムを適用する上での課題を明らかにすると共に、学習障害のハイリスク児を対象とした調査を行った。なお、学校場面における行動記録データ収集を各ステージで確認し、数値判断課題の課題成績、1年生修了時の児童の学習成績、参加者のアセスメント情報とそれに対応して作成する支援計画、学校場面における教師の指導法・支援行動の実態及びその変容、対象児童の学習時の行動の実態及び変容について主に検討課題を明らかにした。本介入を小学校1年生に適用し予備的な検討を行ったが、早期発見につながるスクリーニング課題について検討を行い、就学後初期の児童の実施データが得られた。石塚ら(2012)や石塚ら(2013)で用いた就学後早期の算数困難スクリーニング法、読み障害と対象とした小枝ら(2011)の研究手続きを多層指導モデルに適用し、包括的な学習障害の早期支援プログラムを適用する上での課題を明らかにしたという点でおおむね順調に進展しているといえる。一方で、就学前の幼稚園在学後期の児童の数の認知に関する参考データが得られたという点で、当初の計画以上に進展しているといえる。本研究の目的は、児童に対する学習困難リスクを早期に評価し、支援につなげる包括的なシステムの開発ならびに、その効果を実際的に検証することである。本年度は研究実施2年目であり、石塚ら(2012)や石塚ら(2013)で用いた就学後早期の算数困難スクリーニング法、読み障害と対象とした小枝ら(2011)の研究手続きを多層指導モデルに適用し、包括的な学習障害の早期支援プログラムを適用する上での課題についての検討を継続した。特に、学校場面における行動記録データ収集及び、読み・算数に関するアセスメントと1年生修了時の児童の学習成績、学校場面における教師の指導法・支援行動の実態及びその変容について主に検討している。また、新たに小学校1校の児童を対象とした実践を始めたが、小学校に実施する中で、学級内で実施しやすいアセスメントの形態が特に望まれていたことから、実施を行う上での課題等について、学級担任等にインタビュー等を通して検討した。また、読み障害の児童に関しては、これまで特異的な困難さとワーキングメモリの関連(野内, 2016)、視覚性語彙形成についての研究なども進んでいる(後藤ら,2011)。そのため、学習障害、主に読み障害の疑いがある1年性の児童を対象とした事例研究を行い、児童に対する多面的なアセスメントの結果、実態に応じて実施した指導における効果、それらをアセスメント課題として取り入れる上での課題について予備的に検討した。本介入を小学校1年生に適用し検討することで、早期発見につながるスクリーニング課題について就学後初期の児童の実施データが得られた。

一方で、1年性の学習障害が疑われる児童の多面的なアセスメントデータ、児童に対する指導の成果を事例的に検討し、学習障害の早期支援プログラムにおける参考データが得られたという点で、当初の計画以上に進展しているといえる。学習障害を対象とした研究はこれまで多く行われているが、近年、学校場面における学習困難を対象とした支援においては、「学習困難が疑われた段階でいかに早期に効果的な支援を行えるか」という点に焦点が当てられるようになってきている。その背景として、これまでの実践では、学習困難が重篤化してから支援が開始されることが多く,既に学習に対する苦手意識が固まっているなど、二次的な問題が状態を複雑化させてしまっていると指摘されていた。そこで、本研究では、児童に対する学習困難リスクを早期に評価し、支援につなげる包括的なシステムの開発ならびに、その効果を実際的に検証することとした。2018年度は研究最終年度であり、石塚ら(2012)や石塚ら(2013)で用いた就学後早期の算数困難スクリーニング法、読み障害と対象とした小枝ら(2011)の研究手続きを多層指導モデルに適用した上での効果及び課題についての検討を継続した。また、参加者のアセスメント情報とそれに対応した支援の状況、学校場面における教師の指導法・支援行動、学校場面における行動や学力成績の変容等についてデータ収集を行い、早期支援プログラムの開発につなげた。加えて、発達相談センター等の協力を得た上で、学習障害ハイリスク児における詳細な調査データの収集、課題を一部修正した上で就学前児を対象とした早期支援プログラムを試験的に実施し、その効果について予備的な検討を行った。算数・国語は多領域で構成されており、様々な認知能力が寄与するといわれている。そのため、スクリーニング課題の精度を上げるため、テストバッテリーを組む必要がある。本研究では、学習障害の早期スクリーニングを読み困難と算数困難について検討しているが、課題間の関連について検討するため、数値判断課題の課題成績と音読課題成績の関連について検討することが必要であり、データを増やし分析を進める予定である。また、1年生修了時の児童の学習成績、参加者のアセスメント情報とそれに対応して作成する支援計画については、読み・算数困難リスクが高い児童の発達検査等の結果から、詳細なプロフィール分析を行い、それらの結果を参考にして、プログラムの修正を行うことを検討しており、その調査依頼を行っているところである。そのため、学習障害が疑われる児童に対して実施した多面的なアセスメント・詳細なプロフィールの分析を行い、それらの結果を参考にして、プログラムの修正を行う予定である。特に、本プログラムを実施したことでの効果、実施に際しての課題については、これまでのデータを詳細に検討し、その知見を学習障害の早期支援プログラムに活かすことを検討している。また、あわせて、これまで本早期支援プログラムを実施した児童については、追調査を継続することを予定している。
咽頭における薬剤耐性遺伝子プールの解明とその病原細菌耐性化との関連

非病原性で咽頭に常在する咽頭由来ナイセリア属菌のなかに、セフトリアキソン耐性菌が存在することを示した。淋菌のセフトリアキソン耐性株(H041)の耐性遺伝子penA (H041)との比較から、咽頭由来ナイセリア属菌の耐性遺伝子はpenA (H041)と類似していることを示した。また、共通に存在する特異的なアミノ酸配列が耐性に重要であることが示された。リアルタイムPCR法を用いたセフトリアキソン耐性遺伝子penA (H041)を特異的に検出するアッセイ系を確立した。セフトリアキソンによる淋菌治療後に非病原性ナイセリア属菌の耐性株が選択されるか検討したが、そのような現象は観察されなかった。多彩な薬剤耐性菌の出現が社会的問題となっている。従来の日和見病原細菌、院内感染のみならず市中感染における病原菌の薬剤耐性化は今後さらに治療戦略上大きな問題となることが危惧されている。本研究では薬剤耐性遺伝子がどのように形成され、どのように拡散していくのかを理解することを目的とした。咽頭由来ナイセリア属菌に存在する薬剤耐性遺伝子データベースの構築:協力STIクリニックにおいて菌種同定および薬剤感受性試験を行い、それらの結果を整理した。アジスロマイシンおよびセフトリアキソン耐性菌の存在を示した。さらに、セフトリアキソン耐性遺伝子の同定を行い、セフトリアキソン耐性淋菌H041のpenA遺伝子との比較検討から、セフトリアキソン耐性に必要なアミノ酸置換を推定した。感受性淋菌株の自然形質転換を利用したPCR産物導入実験を行い、上記のセフトリアキソン耐性遺伝子が耐性に関与していることを示した。セフトリアキソン耐性遺伝子の定量的PCR法(TaqManプローブ法)を開発し、実際の咽頭由来菌株に関して使用した。H041型のpenA遺伝子を特異的に増幅可能だが、常在ナイセリア属細菌のセフトリアキソン耐性に関与するpenA遺伝子の検出は出来ないことが示された。アジスロマイシン耐性遺伝子の同定を試みたが、見いだすことができなかった。連携研究者である保科クリニックにおいて、淋菌感染症患者のセフトリアキソン投与における口腔内非病原性ナイセリア属菌におけるセフトリアキソン耐性菌(低感受性菌)の選択が行なわれるか検討を行なったが、短期間において耐性菌の増加は認められなかった。本研究では薬剤耐性遺伝子がどのように形成され、どのように拡散していくのかを理解することを目的として実施している。特に、人体環境に適応してきた病原細菌の薬剤耐性遺伝子の形成過程に着目し、淋菌とナイセリア属菌とにおける薬剤耐性遺伝子プールに焦点をあてる。非病原性ナイセリア属菌の薬剤耐性に関する知見は乏しいため、今年度は、咽頭由来ナイセリア属菌に存在する薬剤耐性遺伝子のレパートリーと咽頭由来ナイセリア属菌の薬剤耐性遺伝子が淋菌において耐性化に関与するか、について検討した。非病原性ナイセリア属菌コレクションの菌株を拡充させた(n = 135)。これらの菌株の同定を生化学性状をもとに行ない、薬剤感受性試験をおこなった。セフトリアキソン耐性を示す4株が見いだした。これらの株はそれぞれ異なる菌種であることが16Sリボゾーム遺伝子配列の比較からも確認された。淋菌の広域セファロスポリン剤耐性は遺伝子penA遺伝子(PBP2,penicillin-binding protein 2をコードする)が関与しているとされる。本研究で収集した感受性株、耐性株のpenA遺伝子の決定を行った(N= 84)。耐性株penA遺伝子は感受性株のセフトリアキソンに対するMICを親株と同程度に上昇させることが確認できた。つまり、セフトリアキソン耐性遺伝子であることが確認された。世界で初めて分離されたセフトリアキソン耐性淋菌H041のpenA遺伝子、あるいは各菌種の感受性株のpenA配列との比較検討を行うことで、4つのアミノ酸がセフトリアキソン耐性に関与している可能性が示唆された。本研究では平成24年度において2つの項目に分けて研究を進めた。その一つ「A咽頭由来ナイセリア属菌に存在する薬剤耐性遺伝子データベースの構築」においては、「A-1咽頭由来ナイセリア属菌の菌株コレクションの拡充」および「A-2セフトリアキソン耐性遺伝子の同定」についてはほぼ予定通り進展した。セフトリアキソン耐性に関与するアミノ酸が複数存在することがしめされ、その耐性にあたえる寄与度について現在検証中であり、セフトリアキソン耐性遺伝子の定量的PCR法の開発にはいたっていない。咽頭由来ナイセリア属菌の種の同定が生化学的性状を基に行なう従来法と、16Sリボゾーム遺伝子配列をもとにした系統解析とで一致しないことを見いだした。