hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
在日留学生の変容と日本での生活・対人関係・就活：中韓以外の学生の増加と長期滞在化

日本企業に就職が内定した中国人男性1名に対する半構造化インタビューを実施して、前年度に収集したベトナム人留学生4名(男性1名、女性3名)と中国人留学生3名(男性1名、女性1名)のデータと合わせて分析をおこない、その結果を日本コミュニケーション学会年次大会(2018年6月9日)で発表した。具体的には、(1)日本での就職を希望した時期・理由、(2)就職活動に関する情報源、(3)就職活動での困難・日本人学生との違い、(4)課外活動・日本人との対人関係などについて、ベトナム人留学生と中国人留学生の間での比較分析をおこなった(一部、学部生と大学院生の比較を含む)。本研究の実施期間の間に生じた在日留学生の日本での就職に関わる大きな変化として、2018年12月8日に「出入力管理及び難民認定法」が改正され、「特定技能」の1号と2号という新たな就労目的の在留資格が設置されたことがある。今回の改正が在日留学生の日本での就職活動にどのような変化をもたらすのかについてまとめた内容を日本コミュニケーション学会関西支部大会(2019年3月23日)で発表した。具体的には、本来「労働者」ではない留学生が、日本の多くの現場(コンビニ、居酒屋、弁当工場、清掃など)でなくてはならない労働力となっている現状(コンビニ大手3社だけで5万2千人(全従業員の58%)が留学生)について考察した上で、卒業・修了後に引き続き日本に滞在し続けることを志望する外国人留学生が増加(全体の63.6%)しているのに対して、実際に日本で就職できている留学生は全体の30.1%であり、この数を将来的に50%に上げることを目指す動きに伴って、今後どのような変化が生じるのかについて考察した。2018年度は、(1)前年度より実施してきた留学生を対象とするインタビュー調査を継続するとともに、(2)前年度に実施した留学生の就職支援をおこなっている学校職員へのインタビュー調査の結果と(1)のデータを基にして、質問紙調査に使用する質問紙(ベトナム語、ネパール語、ミャンマー語、クメール語(カンボジア)、中国語(簡略字・繁体字)、韓国語、英語を予定)の作成と調査の実施を目標とした。(1)の留学生を対象とするインタビュー調査については、日本企業に就職が内定した複数の留学生に対する調査を実施することができた。調査結果については、日本コミュニケーション学会年次大会(2018年6月9日)で発表した。また、同様のインタビュー調査を年度をまたいで引き続き実施中である。しかし、(2)の質問紙調査に向けての質問紙の作成と調査の実施については、完遂することができなかった。そのため、来年度の早い段階で質問紙調査を終える必要があると考えている。これに対して、2018年12月8日に「出入力管理及び難民認定法」が改正され、「特定技能」の1号と2号という新たな就労目的の在留資格が設置されたことに伴う変化について、日本コミュニケーション学会関西支部大会(2019年3月23日)で発表をすることができたことは、予定になかった成果であった。2017年度より継続的におこなってきたインタビュー調査データに対してより詳細な分析(テキストアナリシスならびにM-GTA:修正版グラウンデッドセオリーアプローチを用いた分析)を実施し、研究成果として口頭発表をおこなうとともに、論文にまとめ、投稿をおこなう。2018年度に実施できなかった、複数言語(ベトナム語、ネパール語、ミャンマー語、クメール語:カンボジア人用、中国語簡略字:大陸出身者用、中国語繁体字:台湾出身者用、韓国語を予定)の質問紙の完成と3大都市圏(関東、中部、関西)に留学している学生に対する質問紙調査を実施する。具体的には、日本語学校、専門学校、大学・大学院で質問紙の配布・回収・データの入力・分析を実施する。質問紙調査の実施が1年ずれ込んだことから、2019年度末に研究期間を1年間延長する手続きをおこない、2020年度に上記の質的なデータと量的なデータを融合した説明モデルの構築などの作業をおこなう必要があると考える。具体的には、2019年度に収集したデータに対してより高度な量的分析(多母集団分析をともなう共分散構造分析等)を用いて、出身国や留学生が持つ個人特性(性別、出身国、母語、日本語運用能力、学校種、留学期間、留学の目的など)が、日本での就職への意識や日本人との友人関係の形成、日本文化への適応、留学満足度などとどのように関連しているのかについて統計的な解析をもとに明らかにする。加えて、質的なインタビュー調査と量的な調査結果と対比しながら検証して、質的・量的双方のデータの妥当性を明らかにするとともに、全体をよりよく説明するモデルの構築をおこなう。そして、それらを成果としてまとめて口頭発表をおこなうとともに、論文にまとめて投稿をおこなう。日本企業に就職が内定したベトナム人留学生4名(男性1名、女性3名)と中国人留学生2名(男性1名、女性1名)を対象に、半構造化インタビューを実施した。その結果、日本で就職を希望した時期・理由については、両者の間に比較的共通する結果が得られた。就職活動に関する情報源についても比較的共通していたが、自国人との情報交換が中国人の間ではあまり見られないという違いが見られた。このほか、就職活動での困難・日本人学生との違いについては、中国人が日本人と比較的同じように就職活動ができることが、逆に日本人学生と対等に競争しなければならないことにつながり、ベトナム人とは異なる中国人独特の困難や日本人との違いの意識を生んでいることが明らかとなった。

これら調査結果については、平成30年6月開催の日本コミュニケーション学会年次大会で発表を予定している。大学・専門学校の就職支援室に勤務する4名(男性1名、女性3名)の職員に対して、約2時間の半構造化インタビューを実施した。その結果、日本での就職を希望している学生のうち、日本でずっと働きたいと考えているのは6割程度で、残りの4割の学生は日本での経験を積んだのちに帰国をしたいと考えている。性別に関しては、男子学生の方が女子学生よりも日本での就職を希望する率が高い。出身国別では、日本での就職希望の割合が高いのは中国からの留学生で、近年になってベトナムからの留学生の就職希望が増えてきている。しかし、中国からの留学生については、帰国希望の割合がかつての2割から約3割に増加している。希望する職種については、教育機関や貿易会社の通訳、翻訳通訳業務などへの就職を希望することが多く、母国との間で母語と日本語を使った仕事に携わることを希望することが多いことなどが明らかとなった。これら調査結果については、平成29年9月開催の多文化関係学会年次大会で発表をおこなった。平成29年度は、(1)既に先行して実施してきた留学生を対象とするインタビュー調査を継続するとともに、(2)留学生の就職支援をおこなっている学校職員へのインタビュー調査を実施し、(3)それら質的なデータの蓄積を基にして、次年度に実施する質問紙調査に向けての質問項目の精査などの作業をおこなうことを目標とした。(1)の留学生を対象とするインタビュー調査については、日本企業に就職が内定した複数の留学生に対する調査を実施することができた。調査対象者についても、これまでも比較的多かった中国人の留学生と近年増加傾向にあるベトナム人を対象に調査することができ、中国人とベトナム人の間の違いについても検討することができた。調査結果については、学会での口頭発表のかたちにまとめることができた。また、同様のインタビュー調査を年度をまたいで引き続き実施中である。(2)の留学生の就職支援をおこなっている学校職員へのインタビュー調査についても、就職支援室に勤務する複数の職員に対して、半構造化インタビューを実施することができた。それら調査結果については、学会での口頭発表のかたちにまとめることができた。これに対して(3)の次年度に実施する質問紙調査に向けての質問項目の精査などの作業については、必ずしも十分な成果を得ることができなかった。(1)および(2)がいずれもインタビュー調査であるため、調査協力者との面接日程の調整等に時間がかかるなど、(1)と(2)の実施を優先したためであるが、来年度の早い段階で質問紙調査に向けての質問項目の精査などの作業を終える必要があると考えている。日本企業に就職が内定した中国人男性1名に対する半構造化インタビューを実施して、前年度に収集したベトナム人留学生4名(男性1名、女性3名)と中国人留学生3名(男性1名、女性1名)のデータと合わせて分析をおこない、その結果を日本コミュニケーション学会年次大会(2018年6月9日)で発表した。具体的には、(1)日本での就職を希望した時期・理由、(2)就職活動に関する情報源、(3)就職活動での困難・日本人学生との違い、(4)課外活動
植物遺伝子発現の作用スペクトルに関する研究

光は光合成や色素合成などに関与する遺伝子の発現を制御している。この仕組みを明らかにするため、我々は、エンドウ黄化実生を用い光合成に関与する遺伝子について、発現の作用スペクトルを測定してきた。その結果赤色光だけではなく、緑、紫色光もmRNA量を増加させること、葉緑体遺伝子も光応答することを確認した。本研究では、上記の成果を踏まえ、1.光量を変え赤色光の効果を経時的に測定し、その遺伝子間の差を調べること、2.葉緑体遺伝子の光応答に関与する調節遺伝子を探すことを目的とした。1.赤色光光量のmRNA量に及ぼす影響赤色光照射後各mRNAは光量に応じ増加したが、増加曲線は遺伝子により少し異なった。葉緑体ゲノムの遺伝子のタイムコ-スはよく似ていたが、核ゲノムの遺伝子は必ずしも似ていなかった。4種類の遺伝子はVery Low Fluence域(10^<-1>-110^<-3>μmol m^<-2>)でも増加した。Cabは2段階で増加するタイムコ-スを示し光量依存性が他と少し異なった。2.葉緑体遺伝子の光応答に関する遺伝子の探索約20種類のDNA断片を用い、特殊なmRNA量の変動を示すDNAを探したところ、petAオペロンがこれに該当した。エンドウpetAオペロンにzincfinger motifを持つ遺伝子があった。zincfinger motifを持つ蛋白質は一般にDNAに結合し転写因子として機能しているものが多いので、この未知遺伝子をzfpAと命名し、転写因子の候補と考えた。zfpAをE.coliで発現させ、蛋白質を精製し、ポリクロナ-ル抗体を得た。抗体を用い、エンドウ葉緑体抽出液にzfp A蛋白質が存在することを確認した。zfpAの転写産物は、光照射により少し増加し、蛋白質合成を阻害した状態でも増加し、primaryに応答した。
原発と村落社会の法社会学的研究-下北半島を中心としてー

青森県東通原発建設は完成までに約40年を費やした。立地地区の白糠漁協内で原発をめぐる対立が続いたのだ。本研究ではこの対立がどういう経緯を経て収束したのか、収束にむかう契機は何であったのかを検証する。他方で山口県祝島では原発反対運動が現在も続いている。この両者の比較から、その差異を指摘するだけでなく、共通項も抽出する。すなわち、原発という外的要因への対応は異なっても、白糠、祝島というムラがそれを「受容」したという点は同じである。本年度は9月に東通原発立地である青森券東通村白糠で以下の点についての聞き取り調査を行った。(1)白糠地区の自治会組織と同地区での民俗慣行、(2)白糠漁協の現況と東通原発建設をめぐる紛争の発生時の様子。(1)については白糠自治会長と自治会書記(事務局)からの聞き取り調査をおこない、自治会の運営の実態把握につとめた。(2)については、当時の漁協職員である現参事から、漁協内での対立状況についての聞き取り調査を行い、現在の水揚げ高や組合員数、漁業形態についての資料収集も行った。白糠漁協は隣接する小田野沢漁協とともに一つの共同漁業権の免許を受けており、その実態について調査した。当地区での東通原発建設による漁業形態への影響の一つは、サケ小型定置網の2ヶ統減少であるという。この調査時の宿泊地であるむつ市において、福島県内の様子を含めた調査結果についての検討会を行い、今後の予定を話し合った。そのなかで、当初予定していた沖縄電力での調査や大間原発についての調査よりも、山口県上関原発と祝島の調査、及びそれと東通村白糠との比較の必要性が指摘された。3月に山口県上関原発に反対している祝島住民や「上関の自然を守る会」代表からの聞き取り調査を行った。それによると3.11後に中国電力が申請していた上関原発予定地での公有水面埋め立て免許延長が認められないかのような知事発言があったが、その後その延長の可否判断が延期されそうだという(4月5日の中国新聞によると、知事が延期すると発言したようだ)。「上関の自然を守る会」では内外のボランティアの参加もあり、いくつかの調査を行うだけでなく、魚の産直販売なども手がけ、原発に依存しない地域社会の形成を目指しているとのことであった。我々としては来年度(平成26年度)以降もこの上関や祝島での調査を続行する予定である。本年度は下北半島の東通原発の立地である東通村白糠での聞き取り調査と東京電力福島第一原発事故による被害状況、復興状況についての聞き取り調査を実施した。前者については白糠地区の自治会長と白糠漁協の理事2名から聞き取り調査を行った。その結果、当該地区での東通原発建設以前と以後の大きな違いの一つが「出稼ぎ」の減少であることが判明したが、このこと自体は当該地区住民自身も最初からそういった「効果」があると予想していたわけではないとのことである。当時の原発をめぐる漁協内での対立は専業漁家と非専業漁家との対立の様相を帯びていたと言われていたが、必ずしもそうでないようだ。今後は原発建設による漁業の影響という観点からだけでなく、漁村・漁民への影響という観点からの考察も必要であろう。福島県の聞き取り調査ではNPO法人「相馬はらがま朝市クラブ」理事長、「浮舟の里」理事長からの聞きとり調査を行い、常磐線の小高駅とその付近の見学を行った。特に無人化した小高駅周辺に花を植えている元住民の姿が印象的であった。「朝市クラブ」の活動は注目されるが、今後はその活動を被災住民がどう受け取っているかの調査も必要であろう。また、調査に先立って、福島大学で研究会を行い、分担研究者の二名が執筆した著書を題材として、今後の福島のあり方についての討論を行った。青森県東通原発についての白糠漁協内での対立・収束過程を、当漁協内の「対策委員会」議事録の精査、当時から在職している漁協参事からの聞き取り調査によって検証した。すなわち、昭和51年の東京・東北電力による海象調査の説明申し入れから、最終的に漁業補償が妥結し、補償金の分配が終わるまでに18年かかったが、この間の「対策委員会」を舞台とした対立から収束にむかう過程を整理した。特にチェルノブイリ原発事故後は、反対派の組合員が「対策委員会」の委員長になったこともあり、具体的な議事は進行しなかった。しかし、その場合でも東北電力との「交渉打ち切り」にはならず、交渉が「中断」したにすぎない。なぜなら、「絶対反対」は少なく、「条件付き」の反対や賛成の立場の者が多かったからである。専業漁家には「絶対反対」が多かったが、組合員のなかでは少数派であり、青森県知事の二度の斡旋によって東北電力が補償額を増額させると、行政からの説得もあって、やがて賛成派が主導権を握った。他方で、山口県祝島では住民の相当数から構成される「島民の会」は一貫して上関原発に反対の立場を維持している。その中心となる運営委員達は「産直センター」でのひじき採補・加工などで生業を維持しており、原発に依存する必要を感じていない。福島原発事故後の福島県内での対応に関しては、いくつかの事例を検証した。

特に研究分担者2名は県内の農村等での「地域再生」や「被災者住民の現状」について調査・研究をすすめた。本研究では原発問題と村落社会の関係が主たるテーマであったが、白糠と祝島を比較すると、その村落社会のおかれた状況(立地、生業、出稼ぎ等)とともに住民自身の創意工夫によって、原発への対応のあり方が異なってきている。今後は福島県での事例も参考にしながら、白糠での対立が収束に向かった契機等から当地と祝島の差異を考察していく。青森県東通原発建設は完成までに約40年を費やした。立地地区の白糠漁協内で原発をめぐる対立が続いたのだ。本研究ではこの対立がどういう経緯を経て収束したのか、収束にむかう契機は何であったのかを検証する。他方で山口県祝島では原発反対運動が現在も続いている。この両者の比較から、その差異を指摘するだけでなく、共通項も抽出する。すなわち、原発という外的要因への対応は異なっても、白糠、祝島というムラがそれを「受容」したという点は同じである。当初予定していた東通村白糠地区での原発についての調査がはかどっていない。理由はすでに稼働している原発の建設時の「対立構造とその収束過程」について、十分な聞きとり調査ができないからである。他方で白糠地区の村落構造についての調査は順調に進んでいるが、その調査結果と原発問題との関連を問うための作業仮説の構築に手間取っている。他方で、福島県に関しては、分担研究者による先行調査研究もあり、概ね順調にすすんでおり、その研究成果もでている。法社会学今年度は東通村の白糠地区とともに、近隣の他地区の聞き取り調査をも行う。白糠地区での原発自体に関係する調査がはかどっていないので、当地区や近隣地区での産業や家族・親族慣行、及び村落生活・村落組織の、過去約30年間の変容過程の調査を行うなかで、原発問題に接近するという方法をとる。この変容過程の分析から原発問題がひきおこした当地区内の軋轢・対立が家族・親族慣行や村落生活・村落組織にどういう影響を与えたのかを考察する。他方の福島県の場合は、昨年度に引き続き、南相馬市の小高地区住民の聞き取り調査をすすめるが、その主眼は小高駅前で花を植えていた住民や「語り部」としての役割を担っている住民に焦点をあて、そういったレベルでの新たな「街づくり」の進展状況を考察することになる。当初予定していた東通村役場での「聞き取り調査」が中断している。その理由の一つは研究代表の体調不良であったが、最も大きな理由は、本研究課題が当初予想した以上に微妙な問題を含んでおり、役場担当者の今回の「聞き取り調査」への戸惑いがあったことである。しかし、他方で、地元の白糠地区での自治会や各漁協での「聞き取り調査」は比較的順調であった。山口県上関町や祝島での「聞き取り調査」は、当初は予定していなかったが、研究分担者や研究協力者の助力もあって順調に進んだ。分担研究者に「予定外の仕事」がはいったことと、研究代表者の「個人的事情」によって、毎年9月に実施してる青森県での共同調査を行うことができなかったためである。その代替として研究代表者1人による短期間の調査を2月に行った。今後の東通村での調査では、村役場での調査は一時中断し、地元の白糠地区での調査に限定することになる。特に白糠漁協での当時の意見対立から意見集約までの過程についての「聞き取り調査」を中心にしたい。村役場での「聞き取り調査」が不可能であっても、白糠地区やその隣接地区(老部地区)での「聞き取り調査」が可能であるので、本研究の推進にはさほど影響はないと考えている。
アンモニア菌をモデルとした森林土壌潜在微生物の発現機構に関する研究

供試菌は,全ての尿素処理土壌での培養で増殖した. H.vinosophyllumの栄養成長に適する土壌は,尿素施与後1.5ヶ月を境としてLF層からHA層に置き変った. H.vinosophyllumの子実体形成量は,尿素施与後2.5ヶ月以降の土壌で急増したが,尿素無処理土壌では極めて低い値を示した.本菌の混合培養での子実体形成は, LF層では供試4菌によって, HA層ではA.botrytisを除く供試3菌によって抑制された.これらの菌によるH.vinosophyllumの子実体形成の抑制率は,全供試土壌において, LF層の方が高い値を示した. HA層の方がLF層よりNH_4-N量,有機態窒素量, pHともに高い値を示した.以上から,自然界では, H.vinosophyllumは他のアンモニア菌との競争によって忌避的にHA層で増殖を始め,しだいに競争力を増大することによって定着するものと推察した. H.vinosophyllumの子実体形成は,遷移前期のアンモニア菌より低pH,低窒素条件で誘起されると推察されるが,他のアンモニア菌との競争力を決定する土壌要因をみいだすに到らなかった.胞子を接種源とする単独培養では,全供試尿素処理土壌で,供試5菌の発芽が確認された.胞子を接種源とした培養では, L.tylicolorを除き,栄養菌糸が接種源とした培養より子実体形成の時期が遅れ,野外の発生時期での対応性も低かった.以上から,野外におけるアンモニア菌の潜在形態の主体は栄養菌糸体と推察した.供試菌は,全ての尿素処理土壌での培養で増殖した. H.vinosophyllumの栄養成長に適する土壌は,尿素施与後1.5ヶ月を境としてLF層からHA層に置き変った. H.vinosophyllumの子実体形成量は,尿素施与後2.5ヶ月以降の土壌で急増したが,尿素無処理土壌では極めて低い値を示した.本菌の混合培養での子実体形成は, LF層では供試4菌によって, HA層ではA.botrytisを除く供試3菌によって抑制された.これらの菌によるH.vinosophyllumの子実体形成の抑制率は,全供試土壌において, LF層の方が高い値を示した. HA層の方がLF層よりNH_4-N量,有機態窒素量, pHともに高い値を示した.以上から,自然界では, H.vinosophyllumは他のアンモニア菌との競争によって忌避的にHA層で増殖を始め,しだいに競争力を増大することによって定着するものと推察した. H.vinosophyllumの子実体形成は,遷移前期のアンモニア菌より低pH,低窒素条件で誘起されると推察されるが,他のアンモニア菌との競争力を決定する土壌要因をみいだすに到らなかった.胞子を接種源とする単独培養では,全供試尿素処理土壌で,供試5菌の発芽が確認された.胞子を接種源とした培養では, L.tylicolorを除き,栄養菌糸が接種源とした培養より子実体形成の時期が遅れ,野外の発生時期での対応性も低かった.以上から,野外におけるアンモニア菌の潜在形態の主体は栄養菌糸体と推察した.2員培養--A.botrytis,A.denudatus,I.tylicolorはいずれも全供試土壌でH.vinosophyllumの子実体形成を抑制した。この3菌によるH.vinosophyllumの子実体形成の抑制は、尿素施与後3ケ月以内の土壌(野外遷移前期のアンモニア菌の発生が終了するまでの期間の土壌)では著しく、施与後3ケ月以後の土壌(野外で遷移後期のアンモニア菌が発生を開始する時期以後の土壌)では緩和された。C.phlyctidosporusは全供試土壌でH.vinosophyllumの子実体形成を完全に阻害した。一方、H.vinosophyllumは、A.denudatusの子実体の成熟を抑制、C.phlyctidosporusの子実体形成を抑制、L.tylicolorの子実体形成を保進したが、A.botrytisの胞子形成には影響を与えなかった。5員培養--尿素施与2週間後の土壌では、L.tylicolorとC.phlyctidosporusのみが発生した。尿素施与後3週間目以後の土壌では遷移前期の供試4菌は野外での遷移順序に対応する順序で生殖器官を形成したが、H.vinosophylumは野外で遷移前期の菌が発生を開始する直前の土壌と遷移後期の菌が発生を開始した時期の土壌でのみ子実体を形成したにすぎなかった。以上の知見から、アンモニア菌の発生・遷移に、アンモニア菌間の相互作用が重要な役割を演じていることが判明した。供試森林土壌中の【NO_3】-N量は尿素無処理区で【10^(-1)】【10^(-2)】mg-N/g乾土、尿素処理区で10【10^(-1)】mg-N/g乾土であった。尿素処理後24週間の土壌は最も高い【NO_3】-N含量を示した。
網羅的メタボローム解析を用いた膵臓癌に関与する代謝反応の解明とその臨床応用

膵臓がんは依然として、難治がんの代表格である。膵臓がん組織(26例)におけるメタボローム解析を、キャピラリー電気泳動ー質量分析装置を用いて行った。がん組織において、グルコース濃度は有意に減少し、乳酸濃度の有意な上昇を認め、グルコースが解糖系により乳酸の産生を来したと考えられた(Warburg効果)。さらに、がん組織において多くのアミノ酸濃度の上昇を認めた。一方で、TCA回路による酸化的リン酸化に関与する代謝物質の減少を認めた。これらの知見をもとに、新規の血液バイオマーカーや画像診断装置の開発に応用する予定である。平成24年度までに、香川大学医学部附属病院で手術で摘出された膵臓癌(癌部と非癌部膵臓)26症例の余剰凍結組織試料を用いて、網羅的メタボローム解析を慶應義塾大学先端生命科学研究所で行った。平成25年度は、まず上記の組織中のメタボローム解析の情報解析を行った。その結果、約220の代謝産物を質量分析計でピークとして認めた。癌組織においてグルコース濃度は有意に減少し、組織における糖代謝の亢進が推察された。一方で癌組織において乳酸濃度の有意な上昇を認め、グルコースが好気性解糖系により乳酸の産生を来したと考えられた。ペントース・リン酸経路は癌組織と非癌部膵組織と比較して有意な差はみられなかった。TCA回路の代謝産物は、いずれも癌部で非癌部膵組織と比較して減少傾向を認めた。アミノ酸解析においては、ほとんどのアミノ酸は、癌部で非癌部膵組織と比較して増加を認めた。さらに膵臓癌の組織に特徴的な低分子の代謝産物、特に中間代謝物を同定中である。本研究のメタボローム解析の結果、膵臓癌において、癌組織においてグルコースの量が著明に減少し、乳酸の著明な上昇を認めたことより、膵臓癌においてもWarburg効果が証明された。さらに臨床的には、糖代謝の亢進を来していた結果は、膵臓癌における18F-FDG-PET検査の有用性を裏付ける結果であった。さらに、これらの代謝反応や代謝産物が膵臓癌患者の血液中でも検出可能か否かについて、国立がん研究センターバイオバンクの研究用血漿(22例)を用いて検討中である。これらの患者の対照として、同時期に国立がん研究センターがん予防・検診研究センターを受診した非癌者を年齢と性別をマッチさせて検討中している。平成24年度は、香川大学医学部附属病院で、手術で摘出された膵臓がん検体の余剰凍結試料(がん部と非がん部膵臓)を対象に研究を行った。研究開始にあたっては、香川大学医学部の倫理委員会の承認を得た(承認番:23-29)。まず、それぞれの試料から凍結組織切片を作成し、それぞれが膵臓がん組織と非がん部膵組織であることを確認した。その結果、26例の膵臓がんを研究試料とし、それぞれの凍結組織(60mg)をビーズ式細胞破砕装置を用いてホモジナイズし、フェノール・メタノール法で組織を前処置した。前処置後のサンプルは、慶應義塾大学・先端生命科学研究所(山形県・鶴岡市)に凍結したまま送付した。同研究所では曽我朋義教授が、高速、高感度のキャピラリー電気泳動・質量分析装置を用いて、網羅的なメタボローム解析を行った。質量分析計では、約200の代謝産物をピークとして認めた。さらに、膵臓がん組織と非がん部膵組織における代謝産物を定量化し、比較した。これらの代謝産物を代謝経路に基づいて、既存のデータベースを用いて代謝マッピングを行っている。糖代謝、アミノ酸代謝、核酸代謝などの低分子代謝産物(未知のものも含む)の解析を進めている。そして、がんの大きさ、分化度、リンパ節転移の有無、術後の経過(生存など)等の臨床・病理学的な因子との比較検討を行っている。術前に18F-FDG-PET検査を行っている膵臓がん症例では、FDGの集積と糖代謝との関連性を、付随研究として検討している。加えて、最近の症例では、術前の血漿を採取しており、組織中の代謝産物と血漿中のそれを比較し、血液中でも検出可能か否かについて解析している。平成24年度に、香川大学の26症例の膵臓がん組織のメタボローム解析が終了した。したがって、研究の進み具合は、概ね順調である。現在は、データ解析中である。これらの研究成果を、さらに多数例の臨床試料を用いて、検討を行う予定である。臨床試料は、現在所属している国立がん研究センターのバイオバンクに保存されている試料を用いる。組織試料を用いて、膵臓がんに特徴的な代謝反応や代謝産物を同定したい。これらの症例における血液の収集を行い、新規の血液バイオマーカー探索や、画像診断装置の開発に応用するための準備を進めている。

また、メタボローム解析に加えて、シークエンス解析やマイクロアレイ解析などの多層オミックス解析も行い、代謝産物の変化のメカニズムについても解明したい。平成25年度は、さらに多数例でメタボローム解析を行うために、研究試料の採取や保存、メタボローム解析やその他の解析のための研究試薬に研究費を使用する予定である。また、慶應義塾大学・先端生命科学研究所の曽我朋義教授との研究打ち合わせのための旅費も必要である。
急性被ばく腸管死を推定できる血液・糞便中microRNAバイオマーカーの探索

平成30年度は前年度に引き続き、高線量放射線被ばくによって誘導した腸管障害モデルマウスの血清と糞便中で発現変化するmiRNAの解析を行った。得られた成果は以下に示す。8週齢のC57BL/6Nオスマウスに高線量X線を照射することによって誘導した腸管障害マウスにおいて腸管組織障害を病理学的に解析したこところ、昨年度同様に実験結果の再現性が確認できた。腸管障害マウスの血清と糞便についてmiRNAマイクロアレイを実施した結果、コントロール群と比較して10Gy照射群において2倍以上発現増加するmiRNAは血清で21種類、糞便で119種類検出された。これらのmiRNAのうち、血清と糞便で共通に検出されるmiRNAは2種類(miR-375-3pとmiR-574-3p)存在した。由来臓器を調べたところmiR-375-3pは膵臓に最も発現が高く、小腸や大腸も高発現であった。それゆえ10Gy被ばく後に血清と糞便で増加するmiR-375-3pには腸管由来のものが含まれることが示唆された。また、miR-375-3pは血清中のエクソソームのような細胞外小胞に内在することが明らかになった。miR-574-3pの由来臓器は現在解析中である。10Gy被ばく後に血清と糞便で増加するmiRNAのパスウェイ解析を実施したこところ、細胞増殖、炎症反応、細胞接着能に関するパスウェイへの影響が予測され、腸管障害を推察できるものであった。これらの研究成果は現在2報論文投稿中である。また腸管障害を推察できるmiRNAを迅速に検出するための最適条件は現在検討中であり、引き続き解析していく予定である。平成29年度は高線量被ばくによる腸管障害などの生体影響と、血清・糞便中で変化するmiRNAの探索を行った。本研究は弘前大学動物実験委員会の承認を得て行われた。得られた成果を以下に示す。18週齢のC57BL/6NJcl雄マウスX線照射(管電圧150 kVp、管電流20 mA、線量率1.0 Gy/min、遮蔽板:Al 0.5 mm + Cu 0.3 mm)を行った。X線7Gy、10Gy照射後の生存解析を行ったところ、50%生存期間は10Gy照射群で9日、7Gy照射で13日で、これらの線量はマウスにとって亜致死/致死線量であった。腸管組織の損傷の程度を調べるために、10Gy曝露マウスの腸管の病理組織学的観察およびTUNEL染色を行った。その結果、10Gy曝露によって腸管上皮の組織損傷が確認された。2腸管損傷を予測できる低侵襲性バイオマーカーとして細胞外miRNAに着目した。血清や糞便中にRNAが存在するか、またそのクオリティーを確認するため、抽出したRNAのバイオアナライザ解析を行った。その結果、血清と糞便には18Sと28SのリボソームRNAのピークは検出されず、25200ヌクレオチドのsmall RNAのピークが検出された。また、動物試料中ではRNAはほとんど検出されなかった。3上記で得られた血清や糞便には腸管損傷によって漏出した細胞外miRNAが含まれることが想定される。そこで、血清や糞便のmiRNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、非照射群と比較して照射群において2倍以上発現が上昇したmiRNAが血清では21種類、糞便では119種類検出された。○高線量被ばくマウスにおける腸管損傷評価(達成度100%)高線量の放射線を曝露したマウスの生存解析や病理組織学的解析により、腸管損傷を誘導するモデルマウスが確認できた。このモデルマウスの血清や糞便を採取し、亜致死/致死線量曝露を予測できるバイオマーカー探索に用いた。○血清・糞便中で増加するmiRNAの網羅的スクリーニング(達成度100%)血清や糞便中にはsmall RNAが多いことが明らかとなった。それらのRNAには腸管上皮細胞由来のmiRNAが多く含まれることが予想される。腸管損傷によって細胞外へ逸脱したmiRNAを網羅的スクリーニングするためにmiRNAマイクロアレイ解析を実施し、発現変化するmiRNAを多数同定した。本解析によって得られた成果は現在原著論文として報告する準備をしている。

それゆえ10Gy被ばく後に血清と糞便で増加するmiR-375-3pには腸管由来のものが含まれることが示唆された。また、miR-375-3pは血清中のエクソソームのような細胞外小胞に内在することが明らかになった。miR-574-3pの由来臓器は現在解析中である。10Gy被ばく後に血清と糞便で増加するmiRNAのパスウェイ解析を実施したこところ、細胞増殖、炎症反応、細胞接着能に関するパスウェイへの影響が予測され、腸管障害を推察できるものであった。これらの研究成果は現在2報論文投稿中である。また腸管障害を推察できるmiRNAを迅速に検出するための最適条件は現在検討中であり、引き続き解析していく予定である。平成30年度は平成29年度の課題を引き続き遂行するとともに、以下の課題を検討する。1リアルタイムPCRによる血清・糞便中miRNA発現を確認する。2これらのmiRNAのうち、腸管上皮細胞由来(可能であれば腸管上皮幹細胞由来)であるものを明らかにする。3迅速に検出するためのリアルタイムPCRの条件検討を行う。4便潜血など腸管被ばくを推察する従来の検出法との比較を行う。今年度得られた研究成果をまとめ、次年度に学会発表と論文投稿を積極的に行う必要があるため、次年度へ使用額を繰り越す必要性が生じた。
内耳色素細胞の分化機構と機能発現-聴覚を保証するメラノサイトの遺伝子発現-

本研究は正常な聴覚を保証している内耳色素細胞の機能発現機構を探るために、この細胞の分化機構と内耳血管条でどのような遺伝子発現を行っているのかを解析し、その端緒としようとしたものである。遺伝的聴覚損傷を引き起こす内耳の色素細胞欠損は、不思議なことに色素細胞のアイデンティティーである色素産生そのものは必要がないことがクラシカルな遺伝学でわかっている。この聴覚に関係する色素細胞は体色発現に関わる神経冠由来の色素細胞・メラノサイトである。従って材料とするマウスは、正常個体としてC3H、メラノサイトは分化するがメラニン産生の鍵酵素を分化させられないBALB/c,それからメラノサイトの分化を示さないC3H-mi^<bw>/mi^<bw>マウスを用いて、まず内耳において色素細胞がどのような遺伝子発現を示すかを確かめることにした。それぞれの成体マウス内耳よりRNAを調製し、ディファレンシャルディスプレイ法によりC3H-mi^<bw>/mi^<bw>で発現が見られない遺伝子を特定することにした。BALB/cマウスも材料として選んだのは、聴覚がメラニン産生と直接に関係がないことがわかっていたからである。つまりメラニン産生経路に関わる遺伝子を最初から除外する目的である。現在20種を越えるcDNA断片が得られており、その配列決定と発現量の推定をノザン法により解析中である。内耳よりmRNAの調製が当初予想していたより少量しか用意できなかったこと、また当研究室でしか維持されていないC3H-mi^<bw>/mi^<bw>変異体の繁殖率が非常に悪くサンプル調製に手間取ったため、組織科学的な発現解析の用意が行えるところまでの進展となった。しかしながらすでに発現量に大きな差のある遺伝子が得られていることから、まさに萌芽的な結果が得られたものであり、今後はこの解析をもとに新たな展開を計画している。本研究種目によりサポートされたことを有り難く存じます。
MAGとP75受容体の取り込みによるNGFの生存シグナル伝達の脱感作機構の解明

一旦損傷した中枢神経の軸索は成熟動物では再生不能であるが、その原因としてミエリン由来軸索伸展阻害因子の存在が指摘されており、現在までに3種類の蛋白が単離されている。その一つであるmyelin-associated glycoprotein(MAG)は、中枢神経損傷時に、一回膜貫通型構造の細胞外ドメインがプロテアーゼにより切断され、損傷周囲部に溶出してくることがわかっているが、その詳細な機能は全く不明である。私はIn vitroにおいて免疫染色法にて、MAGがその受容体であるp75NTRと共に、後根神経節細胞の神経軸索内に取り込まれることを見い出した。また、p75NTRを蛍光で標識した後に、神経細胞をMAGで刺激し、蛍光画像を経時的に観察した。蛋白が受容体と共に、軸索からもとりこまれ、軸索から細胞体に運ばれることを証明した。また、MAGの刺激により、smallGTPaseのRap1が活性化され、それが神経細胞の生存維持と深く関わっていることをTUNEL法を用いて証明した。また、HEK293細胞及び、神経細胞を用いた検討により、p75NTRは活性型のRap1と結合することが証明された。また、後根神経節細胞と坐骨神経を一塊にして取り出し、培養することにより、軸索輸送に関して詳細に検討した。In vivoにおいても、p75NTRが軸索輸送され、また、Rap1Aの活性化が神経細胞の生存維持と深く関わっていることを証明した。このことにより、MAGは軸索伸展阻害作用と共に、神経細胞の生存機能に深く関わっていると考えられた。
アピオスの潜在的機能の活用とその可能性の検索

通常の食生活では、大豆およびその加工品以外からのイソフラボン類を摂取することは困難であるとされるが、我々はマメ科植物であるアピオスにイソフラボンが含まれることを明らかにした。本実験では、アピオスをイソフラボンの新たな摂取源として展開するための基盤を確立することとした。塊茎部と茎部に分別し、それぞれのイソフラボン組成の差異について比較検討したところ、食用部となる塊茎部では、大きさによってイソフラボンの組成が異なり、小さいサイズの試料ほど2'-ヒドロキシゲニステインをアグリコンとするイソフラボン配糖体が多いことが示唆された。また、茎部では塊茎部の小さいサイズの組成に近く、2'-ヒドロキシゲニステインをアグリコンとする配糖体の存在が確認された。さらに、2'-ヒドロキシゲニステインはゲニステインに比べ、抗酸化活性が高かった。加工販売される場合、茎部は除去されているが、その処理過程は、大変な時間と労力を要していることからも、茎部の有効利用はアピオスの栽培、加工、販売を考えたとき有益な情報になりうると思われた。アピオスの利用法についても検討した。パンへの利用では、アピオスに含まれるイソフラボンは発酵工程で配糖体からアグリコンへ変換することが明らかとなった。また、パン以外への利用法についても検索し、うどんへの利用では、パンと同様に配糖体からアグリコンへ変換が顕著であった。茎部を利用した場合にも同様の変化が認められたことから、パンおよびうどんへのアピオスの利用は2'-ヒドロキシゲニステインの摂取には効果的であると思われた。以上の成果から、アピオスをパンおよびうどんの材料として配合することで、アピオスのイソフラボン配糖体からアグリコンへの変換がみられたことから、アグリコンとして摂取を期待したときには、有効な利用法のひとつであることが示唆された。通常の食生活では、大豆およびその加工品以外でイソフラボン類を摂取することは困難であるとされるが、マメ科植物であるアピオス(Apios americana Medik)にイソフラボンが含まれることが明らかとなった。さらに部位によるイソフラボン組成の差異について比較検討したところ、通常、食用となる塊茎部と塊茎部の間に位置する茎部に大豆にも見られない2'-ヒドロキシゲニステインが多いことが明らかとなった。また、2'-ヒドロキシゲニステインはゲニステインに比べ、抗酸化活性が高いことも示された。加工販売される場合、茎部は除去されているが、その過程が大変な時間と労力を要していることからも、茎部の有効利用はアピオスの栽培、加工、販売を考えたとき有益な情報になりうると思われた。また、ストレート法と中種法とで、異なる製パン法によるアグリコンへの変換の程度を比較したところ、中種法で顕著にアグリコンが増加することが明らかとなった。茎部を利用した場合にも同様の変化が認められたことから、パンへのアピオスの利用は2'-ヒドロキシゲニステインの摂取には効果的であると思われた。以上のことより、アピオスをパンの材料として配合することで、アピオスのイソフラボン配糖体からアグリコンへの変換がみられたことから、アグリコンとして摂取を期待したときには,有効な利用法のひとつであることが示唆された.今年度までの結果から、茎部におけるイソフラボンについて引き続き検討していくことが必要であると考えられた。加工利用法についても、塊茎部を用いた検討では、有益な情報も得られていることから、茎部においても応用できるものと思われることから、おおむね順調であると考えられる。通常の食生活では、大豆およびその加工品以外でイソフラボン類を摂取することは困難であるとされるが、マメ科植物であるアピオスにイソフラボンが含まれることが明らかとなった。また、通常、食用となる塊茎部と塊茎部の間に位置する茎部におけるイソフラボン組成の差異について比較検討したところ、茎部にも見られない2'-ヒドロキシゲニステインが多いことが明らかとなった。2'-ヒドロキシゲニステインはゲニステインに比べ、抗酸化活性も高いことから、加工販売の際に除去、廃棄されている茎部の有効利用はアピオスの栽培、加工、販売を考えとき有益な情報になりうると考えられた。そこでアピオス塊茎部に加え、茎部の有効な利用法について検索した。アピオス塊茎部および茎部のパンへの利用法についても検討した。アピオスに含まれるイソフラボンは発酵工程で配糖体からアグリコンへ変換することが明らかとなったが、特に中種法で、アグリコンへの変換程度が顕著であった。そのような変化は、塊茎部および茎部といった部位の違いに関わらず見られた。発酵時間についても調査したところ、室温短時間よりも、冷蔵で長時間によってアグリコンが増加することが認められた。また、パン以外での利用法についても検索し、いくつか検討したところ、うどんへの利用では、パンと同様にアグリコンへの変換が確認できた。以上のことより、アピオスをパンおよびうどんの材料として配合することでイソフラボン配糖体からアグリコンへの変換が認められることから、アグリコンとしての摂取を期待したときには、有用な利用法になることが示唆された。今後はさらに、調理加工条件について明らかにしていくことが必要であると思われた。

アピオスの素材としての利用について検索するとともに、新たな機能性の検索についても行い、さらなる展開の可能性についても模索することができた。塊茎部だけでなく、茎部の利用も十分に利用、さらには応用できるという結果も一部見られたことから、おおむね順調に進展しているものと考えられる。通常の食生活では、大豆およびその加工品以外からのイソフラボン類を摂取することは困難であるとされるが、我々はマメ科植物であるアピオスにイソフラボンが含まれることを明らかにした。本実験では、アピオスをイソフラボンの新たな摂取源として展開するための基盤を確立することとした。塊茎部と茎部に分別し、それぞれのイソフラボン組成の差異について比較検討したところ、食用部となる塊茎部では、大きさによってイソフラボンの組成が異なり、小さいサイズの試料ほど2'-ヒドロキシゲニステインをアグリコンとするイソフラボン配糖体が多いことが示唆された。また、茎部では塊茎部の小さいサイズの組成に近く、2'-ヒドロキシゲニステインをアグリコンとする配糖体の存在が確認された。さらに、2'-ヒドロキシゲニステインはゲニステインに比べ、抗酸化活性が高かった。加工販売される場合、茎部は除去されているが、その処理過程は、大変な時間と労力を要していることからも、茎部の有効利用はアピオスの栽培、加工、販売を考えたとき有益な情報になりうると思われた。アピオスの利用法についても検討した。パンへの利用では、アピオスに含まれるイソフラボンは発酵工程で配糖体からアグリコンへ変換することが明らかとなった。また、パン以外への利用法についても検索し、うどんへの利用では、パンと同様に配糖体からアグリコンへ変換が顕著であった。茎部を利用した場合にも同様の変化が認められたことから、パンおよびうどんへのアピオスの利用は2'-ヒドロキシゲニステインの摂取には効果的であると思われた。以上の成果から、アピオスをパンおよびうどんの材料として配合することで、アピオスのイソフラボン配糖体からアグリコンへの変換がみられたことから、アグリコンとして摂取を期待したときには、有効な利用法のひとつであることが示唆された。今年度までの結果をさらに発展させ、アピオスに含まれるイソフラボン類の詳細について明らかにしていくとともに、より効果的な摂取方法についても検討し、イソフラボンの新たな摂取源として可能性について検索していきたい。また、生理機能の解析も必要であると思われることから、生体内挙動評価モデルの構築およびそれを用いた評価も併せて進めていきたい。今年度までの結果をさらに発展させ、アピオス塊茎部および茎部に含まれるイソフラボン類の詳細について明らかにしていくとともに、調理加工における量的および質的な変化を十分に理解する。また、新たな生理機能についても明らかにしていくことで、より効果的な摂取方法についても考察していきたい。今年度計画していた成分分析は順調に進めることができた。一方で、新たに機能性の検討を必要とする成分も明らかになってきた。共同研究者と協議し、新たな成分について十分に明らかにしたうえで、機能性の解析を行うことが必要であると判断したことから、機能性解析のために使用予定であった予算において未使用額が生じた。今年度の計画は予定通り順調に進めることが出来た。
Filamin Aの骨格組織における役割

核内転写因子Runx2の結合因子として見いだしたFilamin Aは細胞質に存在し,Runx2とではなくCbfbと直接相互作用することがわかった.またFilamin AはRunx2の転写活性に影響を与えることなく,軟骨細胞分化を抑制することがわかった.核内転写因子Runx2の結合因子として見いだしたFilamin Aは細胞質に存在し,Runx2とではなくCbfbと直接相互作用することがわかった.またFilamin AはRunx2の転写活性に影響を与えることなく,軟骨細胞分化を抑制することがわかった.Runx2結合因子の1つとして同定したfilamn A (Flna)の骨格における生理的役割解明を目的として解析を行った。Filamin AとRuxn2との相互作用は、Flag-Runx2を強制発現させた細胞を用いた条件で解析を行った結果、これらの2つの因子の相互作用は検出された。また、GST-Runx2,を用いたcell-freeの条件では検出されなかったことから、直接的な相互作用ではないことがわかった。一方、GST-Cbfbを用いた検討から、Filamin AはRunx2の共役因子であるCbfbと相互作用することがわかった。免疫細胞化学的解析等の解析から、FilaminAが細胞質に局在し、GFP-CbfbおよびRunx2は核内に局在することがわかった。また、GFP-Cbfbの局在は、未分化なC3H10T1/2やC2C12、さらにはHEK293においても同様に核において検出された。これらの成績から、細胞質でのFilamin AとCbfbの相互作用はごく短時間であり、複合体が形成されると速やかに核に局在化すると考えられた。Filamin Aに対するshRNAを用いてノックダウン解析を行ったところ、Runx2およびCbfbの局在は変わらず、これらのタンパク発現量も影響されなかった。また、p60SE2-lucを用いたRunx依存的なレポーター解析においても、Filamin Aノックダウンは影響を及ぼさなかった。Cbfbノックアウトマウスの解析においてRunx2ノックアウトマウスと同程度の骨形成の欠落が認められなかったことや奇形性を認めなかったことを踏まえ、ヒトにおいて認められているFilamin Aの変異による骨格組織異常の原因をFilamin Aの共役因子から詳しく検討する必要があると考えられ、このための準備を始めた。
２種類の次世代高速シーケンサーを用いたＢ型肝炎慢性化阻止法の開発

我々は、Genotype Aによる成人のB型急性肝炎は、他のgenotypeでは慢性化率1%以下と低率なのに対して、7-8%が慢性化することを明らかにした(Ito K et al. Hepatlogy, 2014)。このように他のgenotypeと比較して慢性化しやすいgenotype Aの増加は、成人感染後の肝硬変、肝癌の難治性疾患の増加を引き起こすため対策が重要である。本研究では、次世代シーケンサーを用いたウイルス側と宿主側の双方からのアプローチにより、genotype Aによる急性肝炎の慢性化成立機序に関わる新しい知見を発見し、今後の治療法開発の基礎とした。我々は、これまでの多施設共同研究により本邦のB型急性肝炎において、欧米型であるgenotype Aの占める割合が年々増加していることを明らかにしてきた。また、Genotype Aによる成人のB型急性肝炎においては、他のgenotypeで慢性化率1%以下と低率なのに対して、7-8%が慢性化することを明らかにした(Ito K et al. 2014 Hepatlogy)。続いて実施したB型慢性肝炎の全国調査の結果によると、B型慢性肝炎におけるgenotype Aの割合が、20002001年の調査では1.7%、20052006年には3.5%であったのに対して、20102011年には4.1%に増加していた。このように他のgenotypeと比較して慢性化しやすいgenotype Aの増加は、B型肝炎ウイルスによる成人初感染後の肝硬変、肝癌の難治性疾患の増加を引き起こすため対策が重要である。本研究では、ウイルス側と宿主側の双方からのアプローチにより、genotype Aによる急性肝炎の慢性化成立機序を明らかにし、今後の慢性化予防、新規治療薬開発の基礎とすることを目的として研究を施行した。ウイルス側の要因として、B型急性肝炎発症後のHBs抗原陽性期からHBs抗原陰性期にかけてのシリーズ血清を用いてlong read typeの次世代シーケンサーを使用して解析を行った。その結果、HBs抗原が消失する時期に一時的に特徴的な変異の出現を認め、慢性化への関与が疑われた。我々は、これまでの多施設共同研究により本邦のB型急性肝炎において欧米型であるgenotype Aの占める割合が急速に増加していること、GenotypeAによる成人のB型急性肝炎は、他のgenotypeでは慢性化率1%以下と低率なのに対して約7-8%が慢性化することを明らかにしてきた。慢性化しやすいgenotype Aの増加は、成人感染後の肝硬変、肝癌の難治性疾患の増加を引き起こすため対策が重要である。本研究では、ウイルス側と宿主側の双方からのアプローチにより、genotype Aによる急性肝炎の慢性化成立機序を明らかにし、今後の慢性化予防、新規治療薬開発の基礎とすることを目的とした。慢性化成立機序に関連するウイルス側因子を解析するため、B型急性肝炎発症からの1-2か月毎のシリーズ血清を用いて、long read typeの次世代高速シーケンサーにより解析を行った。その結果、B型急性肝炎1症例においてHBs抗原陽性の時期に認められなかったpreS1領域に存在するstop codonを、HBs抗原消失後にmajor cloneとして認めた。このため、急性肝炎感染初期に宿主の免疫応答を受けることにより、quasispeciesの結果変異株が残存するだけではなく、新たにウイルスが変異を獲得するということが明らかとなった。Aによる急性肝炎の慢性化との関連を調査したが、現在のところ慢性化とこれら2つのSNPsとの関連は認められなかった。我々は、Genotype Aによる成人のB型急性肝炎は、他のgenotypeでは慢性化率1%以下と低率なのに対して、7-8%が慢性化することを明らかにしてきた(Ito K et al. 2014 Hepatlogy)。ウイルス側の要因として、B型急性肝炎発症後のHBs抗原陽性期からHBs抗原陰性期にかけてのシリーズ血清を用いてlong read typeの次世代シーケンサーにより解析を行った。その結果、発症後の時期により一時的に特徴的な変異の出現を認め慢性化への関与が疑われた。以上のように宿主側とウイルス側で遺伝子要因を解析したことにより双方から有意義な結果が得られた。これらのデータを組み合わせることにより今後は慢性化のハイリスク群を囲い込むことにより、より徹底したフォローアップもしくは早期に核酸アナログ製剤を投与する等の対策を考えることができる。肝臓病学これまでの全国規模での他施設共同研究により、成人のB型急性肝炎症例1088例(1988年2011年)の収集を終了した。

また、B型慢性肝炎においても4,000例程度の症例の収集を終了した。宿主側要因に関しては、genotype AによるB型急性肝炎のgenome 81例に関してHLA-DPの解析を終了した。Genotype AによるB型慢性肝炎症例に関しては、80症例のgenome収集を終了した。今後さらにgenomeの収集を進めていき、順次解析を行っていく予定である。これまでにB型急性肝炎の感染初期のシリーズ血清を用いてウイルス側の因子をlong read typeの次世代シーケンサーを用いて解析を行った結果、HBs抗原消失の時期にpreS1 regionに遺伝子変異を認め、preS1の途中でstop codonとなる変異がmajor cloneとなる特徴的な現象を認めた。PreS1がstop codonになることによりHBsAgの分泌が低下することがこれまでの基礎実験から知られており、この特徴的な現象がB型急性肝炎の経過中のHBsAg消失に関与した可能性が示唆された。以上のようにlong read typeの次世代シーケンサーを用いたウイルス側要因の解析に関しては特徴的な結果を得ることができ、今後さらに症例を増やして解析を行う予定である。また、宿主側の要因を解析するための症例の蓄積も進んでおり、おおむね予定通り研究は進展している。これまでに全国の共同研究施設より、成人のB型急性肝炎症例1088例(1988年2011年)の収集を終了した。これまでに特にB型急性肝炎のシリーズ血清を用いてウイルス側の因子をlong read typeの次世代シーケンサーを用いて解析を行い特徴的な所見を得た。また、宿主側要因に関してはgenotype AによるB型急性肝炎症例の血液より抽出したDNA81検体に関してHLA-DPの解析を終了した。Genotype AによるB型慢性肝炎症例に関しては、未解析であるが80症例の血液よりDNAの抽出を終了し収集が進行している。今後さらにgenome収集を進めていき、順次解析を行っていく予定である。以上のように症例は順調に集積しており、すでに一部の症例では解析を終了しており、これまでおおむね予定通り研究は進展している。今後もGenotype AによるB型急性肝炎の慢性化に関連する因子をウイルス側と宿主側の双方からアプローチを続ける。ウイルス側の要因に関しては、さらに数症例のシリーズ血清を対象としてlong read typeの次世代シーケンサーによる解析を進める。また、宿主側の因子に関しては、B型慢性肝炎症例に関してもHLA-DP領域の解析を進め、可能であればSNP arrayによるgenome-wide association studyを進める。成人感染によるB型急性肝炎の慢性化症例においても肝硬変、肝癌といった難治性肝疾患に進行する症例が認められる。