hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理活性植物メロテルペノイド生合成酵素の立体構造解明と機能的リデザイン

本研究では大麻のカンナビノイド及びエゾムラサキツツジのダウリクロメン酸(DCA)という代表的な植物有用メロテルペノイドに関し、生合成酵素の立体構造解明および機能的リデザインを目的とする。本年度は特にDCA前駆体のグリフォリン酸(GFA)を生成する芳香族プレニル転移酵素について検討した。まず始めに我々はイソプレノイド経路の代謝阻害実験を行い、その結果GFAのファルネシル基はMEP経路に由来するという予想外の知見を得た。そこでプラスチド局在型のプレニル基転移酵素をスクリーニングし、組換え酵素の活性を確認することにより、GFAを合成する新規プレニル転移酵素(RdPT1)をコードする遺伝子を同定した。既知の二次代謝系プレニル基転移酵素はいずれもDMAPPあるいはGPPに特異的であり、FPPを生理的な基質として認識するのはRdPT1が初めてである。組換え酵素を用いた解析から、RdPT1はオルセリン酸に特異的である一方、プレニル基質に関してはFPPのみならず、GPPやGGPPにも弱いながら活性を示すことを明らかとした。従ってRdPT1は先に同定したDCA synthaseとともに、C10, C15およびC20のイソプレノイド部分を含むメロテルペノイドの生合成に機能すると考えられる。また本酵素が示すユニークな基質特異性の構造基盤について分子モデリング及びdocking studyによる解明を検討し、本酵素はオルセリン酸の結合部位に加え、GGPPまでのプレニル基質を受容可能な疎水性領域を有することを確認した(佐伯ら、Plant Physiol., 2018)。またRdPT1の立体構造を手掛かりとして、これと類似した反応を触媒する大麻プレニル転移酵素をスクリーニングし、カンナビノイド経路のプレニル転移酵素を同定した(棚谷ら、日本農芸化学会2019年度大会)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では大麻のカンナビノイド合成酵素(THCA synthase及びCBDA synthase)及びエゾムラサキツツジのダウリクロメン酸合成酵素(DCA synthase)という代表的な植物有用メロテルペノイド生合成酵素についてX線結晶解析による立体構造解明および、これを基盤とした機能的リデザインの実現を目的とする。平成29年度はメチロトロフ酵母(Pichia pastoris)及びタバコ培養細胞BY-2を宿主とした組み換え酵素の高発現及び精製システムの確立を検討し、タバコ細胞では各酵素45 mg/Lの精製酵素を得ることができた。一方Pichia pastorisでは収量こそ1 mg/L以下であったものの、遺伝子の多重導入により発現量を向上し、またEndo H処理により結晶化の妨げとなる糖鎖を含まない酵素サンプルの調製にも成功した。生合成酵素遺伝子の多重導入に関してはpPICZAベクターに加えて、選択マーカーの異なるpAO815及びpPIC3.5Kに各遺伝子をサブクローニングした後、Pichiaのゲノムに組み込む手法でカンナビノイド合成酵素及びDCA synthaseのいずれも4コピーの重複導入に成功している。また各酵素の精製に関してはいずれもhydroxylapatiteおよびCM-Toyopearlカラムを用いた簡便な手法を確立した。現在連携研究者である富山大学森田洋行教授との共同研究により得られた精製酵素を用いた結晶化を検討中である。また本年度はDCA synthaseに関する原著論文3件を報告し、研究の基盤整備を行うとともに本研究の評価を高めることができたと考えている。平成29年度は各メロテルペノイド生合成酵素の結晶化及び大型放射光施設でのX線回折像の取得を計画していた。現在のところ各酵素とも結晶化条件の確立には至っておらずやや遅れていることは否めないが、構造生物学的研究において律速段階となりえるタンパク試料の調製に関し、簡便なシステムを確立していることから、平成30年度は効率的に研究を進捗させることができると考えている。

またRdPT1の立体構造を手掛かりとして、これと類似した反応を触媒する大麻プレニル転移酵素をスクリーニングし、カンナビノイド経路のプレニル転移酵素を同定した(棚谷ら、日本農芸化学会2019年度大会)。今後は下記項目の達成により各メロテルペノイド合成酵素の機能的リデザインを実現する。1)結晶構造解析:精製したカンナビノイド合成酵素及びDCA synthaseについて結晶化試薬キットを用い最適な結晶化条件を検討し、リガンドのソーキングにより活性中心プローブを含有した結晶を得る。得られた共結晶について大型放射光施設でX線回折像を取得し、既知FAD結合型オキシダーゼを鋳型とした分子置換法により位相を決定することで分子モデルを構築する。2)部位特異的変異:各メロテルペノイド合成酵素の活性部位にはプロトンの引き抜きに関与する塩基性アミノ酸やプレニル基を認識し、これを適切に閉環する疎水ポケットなどの構造因子が予想される。リガンドと結合した形で解析した各酵素の構造比較を基盤として、各酵素反応の特徴を決定付けるアミノ酸残基を推定する。次いでこれらのアミノ酸残基に各種の変異を導入し、酵素活性の変化を測定することで基質認識及び閉環反応における当該アミノ酸の機能を確認する。3)メロテルペノイド構造多様性の拡大:各酵素の基質、即ちプレニル化アルキルレゾルシノールについてシンプルな酸触媒プレニル化反応により合成する手法を確立しているため、これを応用して各種アルキルおよびプレニル側鎖を有する基質アナログを合成する。これら基質アナログを受け入れるよう適切に変異導入した酵素と組み合わせた反応を行うことにより、各種非天然型メロテルペノイドの酵素合成を実現する。酵素機能の改変及び基質アナログの応用により得られる新規化合物についてはその構造をNMR等により解析し、また各種生物活性を検討する。得られた成果について学会発表するとともに学術誌に印刷公表する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
天敵がハダニの離合集散に及ぼす影響

農業害虫のハダニとその捕食者のカブリダニの攻防は、両者が分散できない閉鎖環境で観察されてきた。ハダニの防御網に侵入して捕食するカブリダニは、閉鎖環境ではハダニを必ず皆殺しにするが、ハダニが餌場から分散できる環境では多くのハダニを取り逃がす(昨年度までの成果)。ハダニは1匹からでも大きな個体群を作る増殖力を持つため、カブリダニが餌場から取り逃がすハダニの割合は、ハダニに対する生物的防除の成否を大きく左右する。本年度は、カブリダニがハダニを分散させる割合が1カブリダニの採餌履歴と2カブリダニの種によって異なることを明らかにした。1ケナガカブリダニの雌成虫(ケナガ)は、ハダニの発育段階のうち卵を好んで捕食するが、その理由はハダニの卵の栄養価が高いからと考えられてきた。本年度の実験の結果、現在または過去にハダニの卵を食べたケナガは、他の発育段階のハダニを食べたケナガと比べて、ハダニを餌場から分散させにくいことを発見した。ハダニの卵を食べた(ハダニを逃がしにくい)ケナガは、ハダニを餌場に長く留めて効率よく搾取できるので、ケナガがハダニの卵を好む大きな理由になると考察した。2生物農薬として販売されるチリカブリダニ、土着天敵であり生物農薬でもあるミヤコカブリダニ、土着天敵のケナガカブリダニを比べると「チリ、ミヤコ、ケナガ」の順にハダニを餌場から逃がしにくく、カブリダニの卵についても「チリ、ミヤコ、ケナガ」の順にハダニに気付かれにくいことを発見した。気付かれやすいケナガの卵を洗浄するとチリの卵と同等に気付かれにくくなることから、気付かれやすさはカブリダニの卵表面を覆う物質に裏付けられることが示された。以上の「ハダニに対するステルス性」をカブリダニによるハダニ制御力の新指標として提案したところ(国内学会発表2)、ハダニの生物的防除に携わる現場の研究者から大きな関心を寄せられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。ハダニとその天敵カブリダニの攻防は両者が分散できない閉鎖系で観察されがちだった。本研究では両者が餌場から歩行分散できる装置を用いて、カンザワハダニ雌成虫(ハ雌)のケナガカブリダニ雌成虫(カ雌)に対する捕食回避戦略を調べた。ハ雌は通常は葉面に張った網内で産卵するが、カ雌のいる餌場から安全な餌場に分散したハ雌(過去にカ雌を経験したハ雌)は、その餌場が現在は安全なことを認知していながら産卵場所を葉面から網上に変えた。これは卵(ハ卵)をカ雌の捕食から守るための行動と予想し、カ雌が餌場から歩行分散できる装置を用いて、網上のハ卵が葉面のハ卵よりも圧倒的に食べ残されやすいことを示した。以上より、ハ雌の網上産卵は将来の子の捕食リスクを下げるための適応学習であると結論した。一方、ハ雌はカ雌のいる餌場からより早く遠距離に分散することによってもハ卵の捕食リスクを下げられるはずだが、カ雌を経験してもハ雌の分散性は高まらなかった。網上産卵は、ハ雌にとってコストの大きい餌場間分散を必要最小限に抑えつつ卵を守るための戦略と考えられた。上記の成果は、餌場内の微細環境レベルでの母親の産卵場所選択が卵の捕食回避に役立つことを示す数少ない報告例の一つであり、室内で分散行動を観察しやすいダニの特長を活かしたことで卵が「食べ残される」ことを明確に示した初の報告である。また、ハダニ幼若虫が捕食回避のために分散することを発見した。従来のハダニ個体群の遺伝構造や薬剤抵抗性発達に関する研究は「ハダニ幼若虫は分散せず生まれた餌場内で近親交配する」という天敵不在下で得られた観察を前提としていた。上記の発見により、農業害虫のハダニを化学農薬と天敵カブリダニを併用して抑える総合的害虫管理において、従来の被害予測や薬剤抵抗性発達予測を見直す必要性が示唆された。平成27年度は「分散途中のハダニに天敵が及ぼす即時的影響」の解明に向けて、当初の研究計画に従い、ハダニ個体群内に天敵存在下での分散距離および仲間を追跡する行動に関して遺伝的変異があるかどうかを調べ(人為選抜し)た。非常勤雇用教職員の作業協力を得て、野外の異なる地点から採集した複数のハダニ個体群それぞれに対して4-5世代の人為選抜をおこなったが、いずれの個体群でも遺伝的変異を確認できなかった。同年の12月に、野外からハダニ個体群を採集できなくなったことと、非常勤雇用教職員に対する謝金の支払いが難しくなったことから、当初の研究計画を断念することにした。「研究実績の概要」で述べた成果については、当初の研究計画には含まれなかったが、上記の人為選抜作業と並行しながら研究を進め、2015年9月の第24回日本ダニ学会大会、2016年3月の第63回日本生態学会大会、および同月の第60回日本応用動物昆虫学会大会にて口頭発表を行った。2015年12月には京都大学理学研究科生物多様性コロキウムにて招待講演を行った。さらに、本成果に関する原著論文を執筆して英文誌に投稿した。年度内の論文受理には至らなかったが、現在査読中であり、今年度以降の成果となる見込みである。

以上のように、年度後半に研究計画の変更を伴ったことから、本課題の進捗状況は「やや遅れている」と判断した。今年度は、投稿中の論文受理と研究の発展を目指し、より一層の努力が必要である。農業害虫のハダニとその捕食者のカブリダニの攻防は、両者が分散できない閉鎖環境で観察されてきた。ハダニの防御網に侵入して捕食するカブリダニは、閉鎖環境ではハダニを必ず皆殺しにするが、ハダニが餌場から分散できる環境では多くのハダニを取り逃がす(昨年度までの成果)。ハダニは1匹からでも大きな個体群を作る増殖力を持つため、カブリダニが餌場から取り逃がすハダニの割合は、ハダニに対する生物的防除の成否を大きく左右する。本年度は、カブリダニがハダニを分散させる割合が1カブリダニの採餌履歴と2カブリダニの種によって異なることを明らかにした。1ケナガカブリダニの雌成虫(ケナガ)は、ハダニの発育段階のうち卵を好んで捕食するが、その理由はハダニの卵の栄養価が高いからと考えられてきた。本年度の実験の結果、現在または過去にハダニの卵を食べたケナガは、他の発育段階のハダニを食べたケナガと比べて、ハダニを餌場から分散させにくいことを発見した。ハダニの卵を食べた(ハダニを逃がしにくい)ケナガは、ハダニを餌場に長く留めて効率よく搾取できるので、ケナガがハダニの卵を好む大きな理由になると考察した。2生物農薬として販売されるチリカブリダニ、土着天敵であり生物農薬でもあるミヤコカブリダニ、土着天敵のケナガカブリダニを比べると「チリ、ミヤコ、ケナガ」の順にハダニを餌場から逃がしにくく、カブリダニの卵についても「チリ、ミヤコ、ケナガ」の順にハダニに気付かれにくいことを発見した。気付かれやすいケナガの卵を洗浄するとチリの卵と同等に気付かれにくくなることから、気付かれやすさはカブリダニの卵表面を覆う物質に裏付けられることが示された。以上の「ハダニに対するステルス性」をカブリダニによるハダニ制御力の新指標として提案したところ(国内学会発表2)、ハダニの生物的防除に携わる現場の研究者から大きな関心を寄せられた。当初の研究計画では、平成27年度に人為選抜により個体群内の遺伝的変異を確認したハダニ個体群を用いて「分散途中のハダニに天敵が及ぼす長期(進化)的影響」を検証するはずであったが、「現在までの進捗状況」で述べたように遺伝的変異を確認できるハダニ個体群を入手できなかったため、研究計画を変更する。今年度は「研究実績の概要」で述べた内容を発展させるために、分散できる状況下でのケナガカブリダニ雌成虫(カ雌)の採餌戦略と、捕食回避のために分散したカンザワハダニ幼若虫(ハ幼若虫)の分散過程の詳細について検証する。カ雌の採餌戦略については、カ雌がカンザワハダニ雌成虫(ハ雌)に気付かれずにハダニ卵(ハ卵)を搾取する術を持つか、カ雌が以前に食べた餌の内容(ハ卵、ハ幼若虫、ハ雌、カブリダニ共食い、花粉等の植物由来の代替餌)によってハ雌に気付かれるまでの時間が異なるかを、ハ雌がカ雌から分散するタイミングの違いによって判定する。本研究は、化学情報を活用する被食者と天敵の軍拡競争に関して新たな知見を提供できる可能性がある。ハ幼若虫の分散過程の詳細については、ハ幼若虫が分散途中に出会う仲間の歩行跡(吐糸)を辿って群れるか、その性質が群れて交尾相手を探す必要が大きいと考えられる雄のハ幼若虫でより顕著かどうかを調べる。ハ幼若虫が仲間の歩行跡を辿って群れることが確認できた場合、ハダニの繁殖行動とハダニ個体群の遺伝構造に関する従来の研究成果の再考が促されるだろう。研究成果の公表については、平成27年度の研究成果に関する論文の受理を目指すとともに、今後得られる研究成果を随時英文誌に投稿する予定である。
歯髄炎の病態形成における歯髄細胞の細菌由来因子に対する自然免疫機構の解明

近年、う蝕治療において可能な限り歯髄を保存しようとする機運が高まっており、歯髄がどのような状態であれば保存が可能なのかを正確に知ることは非常に重要な課題となっている。本研究では、免疫系に対して調節作用を有する因子の一つであるインターフェロンγ(IFN-γ)が、歯髄炎における歯髄細胞の生体反応において重要な役割を果たしていることを明らかにした。歯髄炎の病態形成におけるIFN-γの役割が明らかになることで、今後歯髄炎の病態解明だけでなく、歯髄炎の診断や新たな治療法の開発にも応用が期待できる。まず,歯髄細胞のToll-like receptor (TLR)に対するIFN-γの影響を検討するため,歯髄細胞にTLRリガンドとIFN-γを共刺激させ,IL-6およびCXCL10の産生量への影響をELISA法にて解析した。その結果,TLRリガンド刺激した歯髄細胞にIFN-γを共刺激させることで、IL-6およびCXCL10の産生は相乗的に増加し,その相乗効果はIFN-γ濃度依存的に増大した。さらに,Nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)に対するIFN-γの影響を同様に検討し,NODリガンドにて刺激した歯髄細胞にIFN-γを共刺激させることでも、IL-6およびCXCL10の産生が相乗的に増加することが示された。これらの結果より、IFN-γが,初期歯髄炎における歯髄細胞の自然免疫応答において調節的役割を果たしていることが示唆された。近年、可能な限り生活歯髄を保存しようとする機運が高まってきており、どのような歯髄の状態なら歯髄保存が可能なのかを正確に知ることは非常に重要な課題である。本研究では、免疫系に対して調節作用を有する因子の一つであるインターフェロンγ(IFN-γ)に着目し、歯髄組織の自然免疫応答におけるIFN-γの役割について検討を行い、以下のような結果を得た。1.TLRリガンドのみで刺激した歯髄細胞においてIL-6およびCXCL10の産生が認められ、その産生量はIFN-γと共刺激させることで相乗的に増加した。2.NODリガンドのみで刺激した歯髄細胞においてIL-6およびCXCL10の産生は認められなかったが、IFN-γとの共刺激によりIL-6、CXCL10ともに産生が認められ、その効果はIFN-γ濃度に依存して増大した。3.免疫組織化学的解析により、炎症歯髄組織においてIDO陽性細胞の局在が確認された。4.IFN-γで刺激した歯髄細胞において、IDOタンパクの発現が認められ、さらにその発現量はIFN-γとPam3CSK4,LPS,iE-DAP,MDPとを共刺激させることで増強された。5.IFN-γで刺激した歯髄細胞にIDOインヒビターを作用させることで、CXCL10の産生量が濃度に依存して減少した。これらの結果より、IFN-γが歯髄細胞のIDO発現やIL-6 CXCL10産生に影響を与えていることが明らかとなり、IFN-γが歯髄炎における歯髄細胞の生体反応において重要な役割を果たしていることが示唆された。歯科保存学現在までの研究で,IFN-γが歯髄細胞のIL-6,CXCL10産生に影響を与えていることが明らかとなり,IFN-γが歯髄炎における歯髄細胞の生体反応において重要な役割を果たしていることが示唆された。当初の計画からの遅れは無く,研究はおおむね順調に進展していると考える。インドールアミン酸素添加酵素(Indoleamine 2, 3-dioxygenase,以下IDOと略す)は,トリプトファン代謝の初期に発現する酵素で,ヒトの肺,小腸,胎盤など多くの組織に分布し,種々の感染症や炎症性疾患で強く誘導されることが報告されている。また,樹状細胞,マクロファージ,好酸球,線維芽細胞,内皮細胞など幅広い細胞種に発現しており,リウマチなどの炎症性疾患において発現が認められている。IDOは感染細胞や腫瘍細胞内でIFN-γにより100倍酵素活性が上昇し,著明に誘導されることから,歯髄内で産生されるIFN-γと関連し,歯髄炎の進展や制御に重要な役割を果たしている可能性がある。そこで,今後歯髄炎病変局所におけるIDO発現を免疫組織化学的手法により調べるとともに,ヒト培養歯髄細胞において,IFN-γおよびPRRsがIDOタンパク発現に及ぼす影響を検討することにより,歯髄炎の病態形成におけるIFN-γの役割を追求する予定である。

初年度は,歯髄細胞を採取するための抜去歯牙の収集や歯髄細胞の培養・細胞のストック等を主に行っており,IDO発現の解析に使用するウエスタンブロッティング,免疫組織学的解析に用いる試薬など,費用のかかる物品の購入が次年度となったため。歯髄細胞を培養するための試薬やELISAに用いる試薬については,引き続き購入予定である。それに加えて,IDO発現の解析に使用するウエスタンブロッティング,免疫組織学的解析に用いる試薬なども次年度に購入予定である。また,次年度は研究成果を学会や論文等で発表する予定であり,その経費としても使用する予定である。
眼底酸素濃度イメージングのための計測装置およびプローブ分子の開発

本研究は,眼底血管内および周辺細胞内の酸素濃度(分圧)を定量的に計測・イメージングするためのりん光プローブ分子および眼底顕微りん光寿命イメージング装置を開発した。りん光プローブ分子(DTTPH-PEG24)はイリジウム錯体を骨格とし,近赤外光りん光を示した。DTTPH-PEG24をウサギに投与し,開発したシステムで眼底部を観察したところ,吸気酸素分圧に依存してりん光寿命が変化した。よって,開発したプローブ分子および寿命イメージングシステムにより,小動物の眼底部の酸素化状態をイメージングできることが明らかとなった。本研究は,眼底虚血疾患における眼底血管内および周辺細胞内の酸素濃度(分圧)を定量的に計測・イメージングするための眼底顕微りん光寿命イメージング装置およびりん光プローブ分子を開発することである。本年度は,眼底顕微りん光寿命イメージング装置および血中滞留型イリジウム錯体の開発を試みた。本装置を開発するために,マクロズーム顕微鏡の購入を行った。小動物の眼底部に焦点を当てるためには,顕微鏡の対物レンズと小動物の間に,前置レンズを置くことが必要であることを明らかにした。また,マクロズーム顕微鏡に,眼底網膜組織を蛍光色素でイメージングするためのCCDカメラと,眼底部に分布するイリジウム錯体の時間分解発光を観測するためのICCDカメラが搭載できるように工夫を行った。一方,血中滞留型イリジウム錯体の開発においては,近赤外りん光を示すイリジウム錯体にポリエチレングリコールを結合させることで,イリジウム錯体が水に溶解することを明らかにした。合成したイリジウム錯体およびフルオレセインをウサギに投与して,マクロズーム顕微鏡でウサギ眼底部を観察したところ,フルオレセインの緑色蛍光から網膜組織の構造をイメージングすることができ,また,水溶性イリジウム錯体の近赤外りん光から,眼底の血管をイメージングすることに成功した。また,ウサギの吸気酸素濃度を変えることで,イリジウム錯体のりん光寿命が変化することが明らかとなった。本年度は,マクロズーム顕微鏡にパルスレーザーを導入するポートおよび2台のCCDカメラを設置するポートを取り付けることで,眼底顕微りん光寿命イメージング装置を開発した。また,眼底部のみを観察するためには,対物レンズと小動物間に前置レンズを置くことが必要であることを明らかにした。血中滞留型イリジウム錯体を開発するために,水に溶けるイリジウム錯体を設計・合成した。水溶性および生体親和性を達成するために,ポリエチレングリコールをイリジウム錯体に結合させた。合成した水溶性イリジウム錯体をウサギに投与して,光を照射したところ,眼底血管からイリジウム錯体の明瞭な発光が観測された。これにより,イリジウム錯体が血管内に滞留していることが明らかとなった。また,イリジウム錯体の時間分解イメージング画像を撮影して,寿命イメージングの構築に成功した。さらに,ウサギに酸素濃度を下げた空気を吸気させて,りん光寿命イメージングを行ったところ,寿命の増加が観測された。以上の結果より,開発した装置とプローブ分子を用いることで,小動物の眼底血管内の酸素レベルを明らかにできることがわかったため,本年度の目標に到達している。現在,本研究成果を学会発表および論文投稿するための準備を進めている。本年度は,小動物の眼底部をイメージングする試薬の開発,および平成27年度に開発した眼底顕微りん光寿命イメージング装置を用いてマウス眼底部のりん光寿命イメージングを実施した。眼底イメージング用試薬は,眼底血管造影剤であるフルオレセインの吸収・蛍光とは異なる波長域に吸収・りん光を示す化合物を合成した。具体的には,532nmのレーザーで励起することができ,かつ710nmの近赤外光領域にりん光を示す化合物である。この化合物の小動物への投与性を向上させるために,ポリエチレングリコールを結合させた。合成した化合物(DTTPHPEG24)の酸素応答性を確認するため,水中アルブミン存在下においてりん光寿命の計測を行った。その結果,DTTPHPEG24はアルブミンに取り込まれ,また,溶存酸素濃度の減少とともにりん光寿命の増加を示した。DTTPHPEG24およびフルオレセインをウサギに投与して,マクロズーム顕微鏡でウサギ眼底部を観察したところ,フルオレセインの緑色蛍光から網膜組織の構造をイメージングすることができ,また,DTTPHPEG24に由来する近赤外りん光が,眼底血管および網膜組織から観測された。また,ウサギの吸気酸素濃度を減少させるとDTTPHPEG24のりん光寿命が増加し,また,元に戻すとりん光寿命が回復した。この現象は,血管だけでなく網膜組織においても観察されたことから,本システムを用いることで,血管と組織の酸素化状態を同時にイメージング出来ることが明らかとなった。

本研究は,眼底血管内および周辺細胞内の酸素濃度(分圧)を定量的に計測・イメージングするためのりん光プローブ分子および眼底顕微りん光寿命イメージング装置を開発した。りん光プローブ分子(DTTPH-PEG24)はイリジウム錯体を骨格とし,近赤外光りん光を示した。DTTPH-PEG24をウサギに投与し,開発したシステムで眼底部を観察したところ,吸気酸素分圧に依存してりん光寿命が変化した。よって,開発したプローブ分子および寿命イメージングシステムにより,小動物の眼底部の酸素化状態をイメージングできることが明らかとなった。本年度開発した装置およびプローブ分子を用いることで,眼底血管内の酸素レベルについて知見が得られることがわかった。平成28年度は,これらの装置とプローブ分子を用いて,眼底酸素分圧の定量化を進める。また,眼底病態は血管周辺の細胞に起因していることが多いため,細胞に移行するプローブ分子の開発を行い,細胞内の酸素レベルについて定量的なイメージング画像を取得することを試みる。平成28年度は,細胞親和性を高めたイリジウム錯体を開発するための試薬や,細胞培養のためのプラスチック類を消耗品費として研究費を使用する。また,研究成果発表のための旅費として研究費を使用する。光化学
超精密ガラスデバイスのナノインプリント成形

ガラス製マイクロ・ナノ光学デバイスの熱インプリントに関する成形試験および有限要素シミュレーションを実施した.D263ガラスの熱粘弾性特性は,圧縮クリープ試験により求めた.成形試験には,ライン&スペースおよびマイクロレンズアレイ形状を付与した金型を用い,ガラスへの転写性が最適となる成形温度,成形圧力について調査した.また,有限要素シミュレーションを実施し,成形試験結果と比較することにより,断面形状および転写高さに関して,ほぼ同様の結果が再現可能であることを確認した.さらに一軸引張試験を実施し,ガラスの強度を温度とひずみ速度との関係として求めた.ガラス製マイクロ・ナノ光学デバイスの熱インプリントに関する成形試験および有限要素シミュレーションを実施した.D263ガラスの熱粘弾性特性は,圧縮クリープ試験により求めた.成形試験には,ライン&スペースおよびマイクロレンズアレイ形状を付与した金型を用い,ガラスへの転写性が最適となる成形温度,成形圧力について調査した.また,有限要素シミュレーションを実施し,成形試験結果と比較することにより,断面形状および転写高さに関して,ほぼ同様の結果が再現可能であることを確認した.さらに一軸引張試験を実施し,ガラスの強度を温度とひずみ速度との関係として求めた.今年度はガラス材料の熱粘弾性特性を評価するとともに,得られた熱粘弾性特性を用いて有限要素法シミュレーションを行い,マイクロ成形特性について定量的な評価を行った.熱粘弾性特性は一軸圧縮クリープ試験により評価し,得られた結果に対して畳込積分の定義に基づくLaplace変換・逆変換を適用することによって緩和弾性係数のマスターカーブを作成した.また緩和弾性係数の温度依存性については,粘性流動の活性化エネルギーを用いてアレニウスの式によりシフトファクターとして近似を行った.得られた粘弾性特性のマスターカーブは,一般化Maxwellモデルにより近似し,未知パラメータの同定を行った.ガラス試料としてパイレックスおよびD263を用い,エンジニアリングシステム社製のホットエンボスガラス成形装置によりガラスのマイクロプレス成形試験を実施した.金型にはライン・スペースの溝形状を付与したグラッシーカーボン金型を用い,ガラス転移温度近傍にて成形を実施した.また,実験と同様の条件において,有限要素法ANSYSを用いた成形シミュレーションを実施した.最終的に成形試験により得られた結果と成形シミュレーションにより得られた結果の比較を行い,成形シミュレーション手法ならびにクリープ試験で同定された熱粘弾性特性の妥当性について検証した.矩形の成形形状は成形温度の上昇とともに増加する傾向を示し,これは解析と実験結果においてほぼ一致することを確かめた.パイレックスについては結果にやや差が生じたが,これは成形環境における温度の不均一性に起因するものと考えられ,次年度以降に改善する予定である.申請者らのグループでは,ガラスレンズのプレス成形に関する数値シミュレーションを行い,成形残留応力・残留変形量の予測を試みた.H21年度は,ガラス材料の熱粘弾性特性を一軸圧縮クリープ試験により評価し,Maxwellモデルの諸定数,シフトファクターといった熱粘弾性パラメータを導出するとともに,ガラス材料と金型からなる接触大変形解析を実施して,モールドプレス成形において生じる残留応力およびガラスレンズの成形精度は,ガラスの熱粘弾性特性に起因して,成形圧力や加圧時間,冷却速度といった種々の成形パラメータに強く依存することを見出した.特にシフトファクターの変化に着目し,ガラス転移温度前後における活性化エネルギーの変化が解析結果に与える影響について詳細に調査し,新たにユーザーサブルーチンを作成して,有限要素解析におけるシフトファクターを任意にコントロールすることが可能となった.結果的にシフトファクターの近似精度に起因する成形精度の低下を大幅に低減することが可能となった.矩形パターンのマイクロ金型および球面レンズ形状の金型を用いたプレス成型試験を実施し,それらの結果を数値シミュレーションによる結果と比較することによって,本研究で構築された数値シミュレーション技術の有用性を確認することができた.申請者らのグループでは,これまでにガラスレンズのプレス成形に関する数値シミュレーションを行い,成形残留応力・残留変形量の予測を試みた.H22年度は,昨年度に評価されたガラス材料の熱粘弾性特性をもとに,ナノメートルオーダーのラインアンドスペース金型,およびマイクロレンズアレイ金型を用いたマイクロ・ナノインプリント成形試験を実施した.金型にはアモルファスカーボン金型を使用し,溝幅500nm程度のラインアンドスペース,もしくは直径7μm程度のマイクロレンズアレイ形状を集束イオンビーム加工機にて金型表面に付与した.ガラス材料には,昨年同様D263を使用し,熱粘弾性パラメータの近似には,Maxwellモデルを,シフトファクターの近似には,Narayanaswamyの式を用いた.ホットエンボス装置を用いて,ラインアンドスペース,マイクロレンズアレイを実際に成形し,得られた転写形状を有限要素解析により得られた形状と比較した結果,両者は高精度に一致し,その解析精度は23%と非常に高いものであることが確認された.さらに,マイクロ・ナノインプリント成形において,非常に問題視されている摩擦の問題に関して,摩擦係数を変化させ数値解析を行うことで,高温下での金型-ガラス間の摩擦係数をある程度予測することが可能となった.このように,本研究の成果を利用することにより,試行錯誤的に成形試験をすることなく,数値解析により,マイクロ・ナノインプリント成形の最適成形条件を見積もることが可能となった.さらには,単に成形温度,成形圧力等のパラメータのみから最適条件を評価するのではなく,高温下での摩擦係数,成形中および成形後の内部応力状態等も考慮した最適条件を決定することが可能となった点において,非常に有益な手法であるといえた.
家族性大腸ポリポージスにおける発癌機構の解析

1)家族性大腸ポリポージス(以下FPCと略す)患者より得たポリープおよび大腸癌の短期培養が完全に成功するようになり、短期培養細胞の染色体分析を行った。大腸癌では5gのほか17p、18および22番染色体の消失、ポリープでは7、12、13および20番染色体のトリソミーと10と22番染色体の消失が比較的高頻度で起こっていることが判明した。また構造異常としては1p、5q、10q、17pの欠失が特異的であった。2)同様の現象は多型性DNAプローブを用いた特定遺伝子のヘテロ接合型消失の研究によっても裏付けられ、大腸癌では5q21ーq22、17p12ーp13および18q21ーqterにおけるヘテロ接合型の消失が35%から70%以上に生じていることが明らかにされた。現在までの結果を総合すると、FPC遺伝子のヘテロ接合型の消失、高異型性ポリープにおけるKras遺伝子の活性化、17pの欠失による癌化への転換、18、22qの欠失による癌の進行、さらに付加的染色体変異による癌の促進という機序が考えられる。したがって、FPC患者における大腸癌の発生には、網膜芽細胞腫にみられるような単一の癌抑性遺伝子の消失とは異なり、ポリープ発生から癌化、への進行過程において複数の癌抑制遺伝子の消失が必要であることが示唆された。3)ヒトの5、17、18番染色体をそれぞれ別々に保有するマウスA9細胞株を用いて、微小核融合法により大腸癌細胞に5番染色体を導入し、ヌードマウスに移植したところ、造腫瘍性の低下が認められた。5番染色体に癌抑制遺伝子の存在することが推測できた。4)ヒトの5番染色体をトランスフェクション法によりDT細胞に導入したところ、Alu陽性のフラットリバータントが得られた。第2回目のトランスフェクションでもAlu陽性のクローンが1個得られたので、現在この遺伝子をクローニング中である。
彗星塵の光散乱についての研究

氷の昇華、小さな構成グレイン上への粒子の破壊、吸収、複素屈折率、そして光の波長程度のサイズを持つ不規則形状粒子による光散乱における充填密度の影響に関して研究を行なった。ダストを形成している彗星ジェットとcircumnuclear haloesの物理パラメーターを明らかにする事を目的に得られた結果を彗星へ適用した。これまで、彗星から放出された固体微粒子による太陽光の散乱が、その固体微粒子の体積充填率(もしくは空隙率)、典型的なサイズ、および可視光の吸収率にどのように依存しているのかということを同僚と共同研究して調べてきた。この研究で得られた主要な結果は、次のとおり2つに要約することができる。1.彗星ジェットと呼ばれる束状の固体微粒子の集合体は、太陽光を後方散乱する方向の近くで負の偏光が存在しない理由は、一般に、そこに小さな微粒子が凝集してできたと思われるふわふわとした構造をした固体微粒子の存在を意味するものではない。より適切な説明は、ジェットが極端にはふわふわしていない大きい固体微粒子から成っているということである。そのような固体微粒子が可視光を良く吸収するという仮定の下では、固体微粒子サイズは5ミクロンより大きいと推定される。一方、あまり可視光を吸収しない固体微粒子の場合(即ち、マグネシウムに富むケイ酸塩からなる固体微粒子や水氷からなる固体微粒子)には、固体微粒子サイズが810ミクロンより大きくなければならない。2.有機物の複素屈折率についてのこれまでの共通意見は、有機物は虚部の大きい複素屈折率を持っていることである。われわれの数値シミュレーションでは、そのような複素屈折率を持っている有機物が彗星ジェットにかなりの量あると結論できるが、彗星核を囲むハロー状の固体微粒子の雲にはないということを示した。彗星から射出されたダストの光散乱過程について研究を進めた。その結果以下の成果を得た。1.彗星を取りまくハローの内部に存在するダスト粒子は、比較的コンパクトな形状をしている。空隙率は、75%以下である。またダスト粒子の構成要素は、0.3ミクロンよりも大きいことが判明した。これは、従来言われていた0.1ミクロンという値に対しての修正をせまるものである。2.またダスト粒子の化学組成として、屈折率(の実部)は1.5から1.6、吸収率(屈折率の虚数部)は0.02以下である。これは、ダストの生成に関して大きな制約となりうる。3.非球形粒子の光散乱過程を計算する手法discretedipole approximation(DDA)法の適用限界について調べ、従来より、より大きな粒子に対して、また従来よりもより大きな吸収率を持つ物質(金属など)に対しても、DDA法が適用可能な場合のあることを示した。4.また、DDA法の誤差要因に関しての研究を行った。境界面上では、主にDDAではなく、離散化したダイポールの大きさが、過大評価となり、全体の光学特性を過大評価してしまう傾向があったが、これは、理論から来るものではなく、境界表面を荒いメッシュで計算するという数値的な粒子の境界の取り扱いが問題であったことがわかった。これにより、境界面の粒子の配置の仕方を工夫することで、散乱計算の精度を向上させる可能性があることなどがこの研究から示唆された。これは、従来計算機の資源の問題から不可能であったと考えられるような大きな粒子(サイズパラメータで100以上)の散乱計算の可能性につながるもので、ミー領域から幾何光学近似にまでの理論的な橋渡しをすることにつながるという大きな成果であると言える。
ヒスタミンは脂質酸化物の関与で生成するか？

水産物の食中毒の原因物質の一つとして知られているヒスタミンは、ヒスチジンにヒスタミン産生菌が持つ脱炭酸酵素が作用し、ヒスタミンに変換されることによって生成される。一方、最近の研究で、ヒスタミンの生成は本酵素の作用だけではなく、ヒスチジンが脂質酸化物との非酵素的反応により生成される可能性が示唆されている。しかし、詳細な反応機構は不明である。特に水産物は不飽和脂肪酸を多く含むため脂質酸化物を生成しやすいことから、脂質酸化物とヒスチジンによるヒスタミンの生成についても注目すべきである。また、ヒスタミンだけではなく、水産物の品質劣化に伴い脱炭酸によってアミノ酸のチロシンからチラミン、リジンからカダベリン、オルニチンからプトレシン等の生体アミン類がそれぞれ生成される。これらチラミン、カダベリン、およびプトレシンは腐敗臭を伴うだけではなく、ヒスタミンの解毒作用を阻害するため、ヒスタミンの作用が持続・増強される。従って、食品の品質・衛生の観点からヒスタミンと同様にチラミン、カダベリン、およびプトレシンの生成についても着目すべきである。本年度の研究実績は、食品の品質に関与するヒスタミンおよびその他の生体アミン類の生成機構を明らかにするために、食品中に存在するヒスタミンをはじめとした生体アミン類の一斉分析法の開発を行った。ヒスタミンのみの分析方法は多く知られているが、食品の品質に関与する生体アミン類の一斉分析法は少ない。そこで、連続分析に対応できる高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)-カラムスイッチング法を利用した一斉分析法の開発を行い、水産物に限らず、様々な食品における生体アミン類を分析することにより、食品の品質劣化に伴う生体アミン類の挙動を明らかにした。本年度は、食品の品質に関与するヒスタミンおよびその他の生体アミン類の生成機構を明らかにするために、高速液体クロマトグラフィー法-カラムスイッチング法を利用した食品中に存在するヒスタミンをはじめとした生体アミン類の一斉分析法の開発を行った。本法を利用し、水産物に限らず、様々な食品における生体アミン類を分析することにより、食品の品質劣化に伴う生体アミン類の挙動を明らかにした。本研究については、査読付き国際雑誌に掲載された。また、ヒスタミン生成に関わるヒスチジンに着目した場合、ヒスチジンを構造式に持つイミダゾールジペプチド(IDP)についても着目するべきである。特に大型回遊魚にはIDPが多く存在することから、水産物の品質劣化に伴うIDPの挙動とヒスタミンおよびその他の生体アミン類の生成についても検証する必要がある。そこで、本年度は、食品中に含まれるIDPの一斉分析法の開発を行い、様々な食品におけるIDPの評価を行った。本研究についても、査読付き国際雑誌に掲載された。生体アミン類の分析法およびイミダゾールジペプチド(IDP)の分析法を利用して、脂質酸化由来のアルデヒドとアミノ酸およびIDPの反応性について検証を行う。また、反応生成物について構造解析などを行い、ヒスタミンおよび生体アミン類の生成を確認する。

特に大型回遊魚にはIDPが多く存在することから、水産物の品質劣化に伴うIDPの挙動とヒスタミンおよびその他の生体アミン類の生成についても検証する必要がある。そこで、本年度は、食品中に含まれるIDPの一斉分析法の開発を行い、様々な食品におけるIDPの評価を行った。本研究についても、査読付き国際雑誌に掲載された。生体アミン類の分析法およびイミダゾールジペプチド(IDP)の分析法を利用して、脂質酸化由来のアルデヒドとアミノ酸およびIDPの反応性について検証を行う。また、反応生成物について構造解析などを行い、ヒスタミンおよび生体アミン類の生成を確認する。2019年5月に国際学会への参加が決定しているが、その旅費が予定以上の金額となり、本年度の予算の一部を次年度に繰り越し合わせて使用するため。
画像からの幾何学的推定のための超精度くりこみ法の確立

画像データからの高精度な幾何学的な推定(直線や楕円の当てはめ,複数画像間の対応の関係式の計算)には従来から最尤推定が用いられていたが,それより精度が高い「超精度くりこみ法」を導出し,さまざまな実際的な問題に応用した.同時に最尤推定解を補正する「超精度補正」の精密化を行い,同程度の精度が達成できることを実証した.また未知数間に拘束条件がある場合にも最適な推定ができる「拡張FNS法」の新しい定式化を示し,東日本大地震のGPSによる地盤変形データの解析に適用した画像データからの高精度な幾何学的な推定(直線や楕円の当てはめ,複数画像間の対応の関係式の計算)には従来から最尤推定が用いられていたが,それより精度が高い「超精度くりこみ法」を導出し,さまざまな実際的な問題に応用した.同時に最尤推定解を補正する「超精度補正」の精密化を行い,同程度の精度が達成できることを実証した.また未知数間に拘束条件がある場合にも最適な推定ができる「拡張FNS法」の新しい定式化を示し,東日本大地震のGPSによる地盤変形データの解析に適用した1.本研究に先立って,画像データからの幾何学的な推定を行う精度が高い方法として「超精度最小二乗法」とよぶ手法を確立したが,それをさらに高精度化した「超精度くりこみ法」と命名した提案手法をシミュレーションおよび実画像を用いて実験し,予想通りの高精度を達成することを検証した.2.その過程から最尤推定解を補正する「超精度補正」を精密化すれば同程度の精度が達成できることも発見された.3.超精度くりこみ法を応用した楕円当てはめの新しい方法を考案し,シミュレーションおよび実画像を用いて実験して,従来の方法より精度が高いことを確認した.4.未知数間に拘束条件がある場合にも最適な推定ができる「拡張FNS法」の新しい定式化を行い,幾何学的モデル選択に適用した.そして,シミュレーションによってその有効性を確認するとともに,東日本大地震のGPSによる地盤変形データの解析に適用した.5.画像からの3次元形状復元は,何らかの初期推定から出発して反復的に洗練するのが通常の方法であるが,3画像から何の初期推定値なしに直接に3次元形状を計算する計算手法を開発し,腸管画像をから3次元形状を復元する医用応用を行った.5.さまざまの関連する応用を行い,その有効性を確認した:高精度の魚眼レンズカメラの校正,3次元センサーやGPSデータに対する相似変換の最適計算,複数の運動の分離.
一酸化炭素をエフェクターとする転写調節因子の一酸化炭素応答およびDNA認識機構

CooAの機能発現には、CooA分子中に含まれるヘムが重要な役割を果たしている。本研究では、ヘム周辺部に変異を導入した各種変異体を調製し、それらの活性構造相関を明らかにすることにより、CooAの機能発現におけるヘムの役割を解明することを目的とした。野生型、および各種変異型CooAを用い、それらのEXAFS、NMR、EPR、共鳴ラマンスペクトル等の各種分光学的測定、さらにin vivoレポーター系をもちいた活性評価を行ない、CooA中に含まれるヘムによるCOセンシング機構、ヘム配位構造の解明に成功した。また、各種変異型CooAおよび変異型プロモータを組合せ、それらの転写活性化能を比較検討することにより、CooAの標的DNAに対するターゲッティング機能制御機構の解明を行なった。その結果、CooAの標的DNAに対するターゲッティング機能は、CooA分子中に存在するヘリックス・ターン・ヘリックス中の三つのアミノ酸残基(Arg177,Gln178,Ser181)によってコントロールされていることが明かとなった。また、CooAの標的DNAは、TGTCA......CGACAで示される配列を有しており、本配列中の下線で示した部分の塩基が、CooAによる認識塩基であることが分かった。さらに、エフェクターセンシングドメインがCRP、DNA認識ドメインがCooA由来の、新規な機能性キメラタンパクの調製に成功し、本キメラ中で転写活性化能発現に関与しているアミノ酸残基を同定した。これらのアミノ酸残基は、RNAポリメラーゼと直接相互作用していると考えられる。
大脳皮質局所神経回路の抑制性シナプスの機能的解析

大脳新皮質には、基本的な単位である局所神経回路が多数存在し、それらの活動が基となって、高次脳機能が具現する事がこれまでの研究で明らかである。本研究では、その構成要素の中の抑制性シナプスの機能に関する解析を行う。本年度は、引き続き、ラットの皮質のスライス標本を用いて、皮質の錐体細胞にシナプス結合するFSバスケット細胞の抑制性シナプスの位置やそのPSDの大きさ等を、ペア電気生理記録法と電子顕微鏡による観察を組み合わせて行った。錐体細胞の細胞体から40μmより遠くのみに神経終末がコンタクトするFSバスケット細胞は、発火しても錐体細胞の細胞体からの電気記録でipscは検出できないことを認めた。さらに、その結合部分が本当にシナプス形成しているかどうかを電子顕微鏡で観察した結果、シナプスを形成していることを確認することができた。この結果は、抑制性信号は、40μmよりは遠くに伝導しないことの確証であると考えている。本年は、ラットの皮質のスライス標本を用いて、皮質の錐体細胞にシナプス結合するFSバスケット細胞の抑制性シナプスの位置やそのPSDの大きさ等を、ペア電気生理記録法と電子顕微鏡による観察を組み合わせて行った。その結果、錐体細胞の細胞体から40μmより遠くにシナプス入力するFSバスケット細胞の抑制性シナプスによるipscは細胞体では検出できない事がわかった。また、そのシナプス結合部分を電子顕微鏡で観察し、シナプス結合を一部で確認したが、細胞体付近ではシナプス結合は比較的大きな面積であったが、細胞体から遠くにあるシナプスは小さい面積での結合が認められた。来年度は、解析事例を増やしてデータを堅固なものに仕上げたいと考えている。
ＲＮＡの編集、化学修飾情報の１分子レベル解析技術の開発

ターゲットRNAとプローブDNAのハイブリダイゼーションに加え、形成されるDNA/RNAハイブリッド構造の物性、すなわち、電荷移動特性を利用した1分子レベルRNA分析・診断法を開発した。電荷移動、電荷分離過程が蛍光の点滅(blinking)として観測されうることに着目し、暗状態の時間の長さ(OFF time)が、DNAの電荷移動特性を反映した電荷分離寿命(τ)と一致することを利用し、1分子レベルでDNA/RNAハイブリッドの電荷移動特性を調べ、RNA分析・診断へと応用した。RNAは転写後、アデニン(A)のイノシン(1)への編集、そしてシトシン(C)やAのメチル化(6mA)など、100種類以上の化学修飾を受けている。これらRNAのエピジェネティックな化学修飾は、様々な生命現象を制御していることが明らかになりつつあり、細胞内で発現している極微量のRNAから、そのエピジェネティックな化学修飾を検出・定量する新技術の開発が望まれている。極微量しか発現されないRNAの編集や化学修飾を解析するためには、通常cDNAへの逆転写、PCRによる情報増幅が不可欠となるが、多くのエピジェネティックな情報はこれら過程で失われてしまい、RNAの転写後の編集・化学修飾を解析することは困難であった。本研究課題では、ターゲットRNAを1分子レベルで解析し、極微量のRNAからエピジェネティックな情報を失うことなくそのまま迅速に読み出す新技術の開発を目指す。24年度の研究においては、より安価で取り扱いやすいDNAを用いて電荷移動可能な配列を拡張し、得られた系をRNA配列に適応することを試みた。人B型肝炎ウイルス(HBV)由来のDNA配列、および、HBV配列中の一塩基置換や一塩基欠損などの点変異を電荷移動速度の違いとして読み出す系の構築に成功した。このように新規に種々のDNA配列の読出しが可能になったが、当初計画していたDNA/DNA二本鎖における電荷移動測定が可能な配列の大幅な拡張は達成できなかった。RNAは転写後、アデニン(A)のイノシン(I)への編集、そしてシトシン(C)やAのメチル化など、100種類以上の化学修飾を受けていることが知られる。非常に小さな構造の違いを読み出すため、申請者はDNA/RNAハイブリッドの電荷移動特性に着目し、1分子レベルでの電荷移動速度の測定からRNAのエピジェネティックな化学修飾の読み出しを達成する。24年度の研究では、主にDNA/DNA二本鎖中の電荷移動測定の配列拡張について研究した。25年度の研究では、DNA/DNA二本鎖において、DNAの一塩基多型と関わるミスマッチや一塩基欠損、そして化学修飾などの一塩基違いを1分子レベル電荷移動測定により読み出せることを示した。次に、蛍光分子修飾DNAプローブを用いて、相補鎖RNA間で生じるDNA/RNA二本鎖中での電荷移動測定を達成した。さらに、電荷移動速度が、RNAの編集や化学修飾に応じて変化することを見出した。26年度の研究では、蛍光分子を修飾したDNAをプローブとして用いて、発ガンに深く関わるRNA配列中の点変異を極微量のRNAをターゲットとして測定可能とした。DNA配列の改変により、100マイクロ秒を超える長い時間のoff timeを有するblinking系の構築に成功し、蛍光分子修飾DNAプローブの改良により、より高感度にターゲットRNAを検出可能であることを示唆する結果を得た。アデニン(A)のイノシン(I)への編集、そしてシトシン(C)やAのメチル化など、RNAは転写後100種類以上の化学修飾を受けていることが知られる。非常に小さな構造の違いを読み出すため、DNA/RNAの電荷移動特性が、配列、および、核酸の化学修飾により変化することに注目した。

一つ一つのDNA鎖に注目すると、蛍光分子は通常、光を吸収し蛍光を放つ明状態(ON状態)にあるが、近傍の核酸塩基と電子移動が進行すると一電子還元された状態となり、光を吸収しても光らない暗状態(OFF状態)へと移行する。DNA二本鎖中に注入された正電荷は、DNA内電荷移動を経て、最終的に電荷再結合が進行し、再びON状態へと戻る。ここで、暗状態の時間の長さ(OFF time)が、DNAの電荷移動特性を反映した電荷分離寿命(τ)と一致する。本系をRNAへと発展し、RNAの配列、および、化学修飾をblinkingにより1分子レベルで検出する手法開発を目指した。26年度までの研究により、蛍光分子を修飾したDNAをプローブとして用いて、DNA発ガンに深く関わるRNA配列中の点変異を極微量のRNAをターゲットとして測定可能とした。27年度は、プローブDNA配列の改変により、種々のoff timeを有するblinking系の構築に成功し、より高感度にターゲットRNAを検出可能となった。ターゲットRNAとプローブDNAのハイブリダイゼーションに加え、形成されるDNA/RNAハイブリッド構造の物性、すなわち、電荷移動特性を利用した1分子レベルRNA分析・診断法を開発した。電荷移動、電荷分離過程が蛍光の点滅(blinking)として観測されうることに着目し、暗状態の時間の長さ(OFF time)が、DNAの電荷移動特性を反映した電荷分離寿命(τ)と一致することを利用し、1分子レベルでDNA/RNAハイブリッドの電荷移動特性を調べ、RNA分析・診断へと応用した。理由)平成26年度の研究において、RNA1分子レベル解析のための蛍光分子修飾プローブ設計の過程で、当初予定していたより遅い点滅間隔でプローブが機能し、より高感度な検出が可能になるという新たな知見の発見があった。検出限界の向上のため、蛍光分子修飾プローブの設計・評価を再度行う必要が生じた。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物有機化学、光化学、核酸化学改良した蛍光分子修飾DNAプローブを用いて、発ガンに深く関わるRNA配列中の点変異をより高感度で検出できる系の構築を目指す。24年度の研究においては、より安価で取り扱いやすいDNAを用いて電荷移動可能な配列を拡張し、得られた系をRNA配列に適応することを試みたが、DNAIDNA二本鎖における電荷移動測定が可能な配列の大幅な拡張は達成できなかったため。25年度の研究において、蛍光分子修飾DNAプローブを用いて、相補鎖RNA間で生じるDNA/RNA二本鎖中での電荷移動測定を達成した。また、電荷移動速度が、RNAの化学修飾に応じて変化することを見出した。平成26年6月、RNA1分子レベル解析のための蛍光分子修飾プローブ設計の過程で、当初予定していたより遅い点滅間隔でプローブが機能し、より高感度な検出が可能になるという新たな知見の発見があった。
電動発電機の積極的な損失増加制御による水素燃料電池自動車の航続距離延長

近年の燃費改善によりガソリン車の航続距離は1000kmに達しているが,水素燃料電池自動車ではその約半分の600km程度に留まっており,これが普及に向けた大きな課題の1つとなっている。現在,試みられている航続距離改善技術(車体軽量化,水素タンク高圧圧縮等)では約10%延長に留まると予想されている。そこで本研究は走行用電動発電機損失をあえて増加させることにより主要部品のかさ張る放電抵抗器を不要とし,航続距離50%増のブレークスルーを目指している。本研究の成果は航続距離改善のみに留まらず,広く電動発電機関わる回転機器のブレーキ機能安全性向上にも応用可能な為,非常に大きな波及効果が期待出来る。
慢性創傷に対する免疫療法の開発～CLRsを介したアクセル・ブレーキ理論の応用～

褥瘡など慢性創傷は炎症が遷延する病態であり、免疫が深く関与するが、免疫チェックポイントは明らかではない。創傷では、炎症と抗炎症のバランスが鍵を握り、制御性T細胞(Treg)/ Th17バランスが注目されているが、制御機構は不明である。本研究では慢性創傷チェックポイント分子として、Treg/ Th17バランスを制御するC型レクチン受容体に注目し「アクセル・ブレーキ理論を応用した免疫療法」確立を目指す。申請者らは、世界初、創傷治癒のブレーキ役Dectin-2による炎症遷延機序を解明しており、アクセル役として治癒促進に働くDectin-1に着目する。