hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フッ素化アルキルのジアステレオ選択的ラジカル付加反応の研究

本研究では、フッ素化アルキルのジアステレオ選択的ラジカル反応の開発を目指し、γ-アルコキシ-α-メチレンカルボン酸エステルへのトリフルオロメチルラジカルの付加を検討した。その結果、水素化トリブチルスズの存在下にもかかわらず、通常の水素化またはヨウ素化生成物ではなくトリフルオロメチル基と水酸基が導入された生成物を得た。このトリフルオロメチル化-水酸基化におけるジアステレオ選択性は低いものであったが、この新反応に着目し、種々の電子不足オレフィンについて同様の付加を検討した。その結果、α-メチレンエステル、ラクトン類ではこのトリフルオロメチル付加-水酸基化反応が進行することが明らかとなった。また、この水酸基の由来について明らかにするために170によるラベル実験を行い、水に由来することを明らかにした。更に、この現象はトリフルオロメチル基の電子吸引性のためであると考え、付加するラジカルについて電子吸引のものについて検討したところ、ヨウ化エチルアセテートを用いた場合にも同様のラジカル付加-水酸基化が進行することが明らかとなった。本研究では、電子不足オレフィンへの電子不足ラジカルの付加ではラジカル付加-水酸基化が起こることを明らかとした。この新反応は、有機合成において水によるラジカルトラップが観測された初めての例で、新しい発見であり、大きな成果といえる。ここで得られた知見は、水素化トリブチルスズの存在下にもかかわらず水によるラジカルトラップがおこるラジカル中間体の性質の解明といった理学的観点、本反応を利用した有機合成への応用といった工学的観点の双方に今後発展させていく予定である。本研究では、α-メチレン-γ-アルコキシカルボン酸エステルへのトリフルオロメチルラジカルのジアステレオ選択的付加反応についての検討を行った。その結果、通常のラジカル付加生成物であるトリフルオロメチル基と水素、またはヨウ素がオレフィンに付加した生成物ではなく、オレフィンに対してトリフルオロメチル基と水酸基が導入された生成物が得られてきた。また、ジアステレオ選択性については、2対1と高いものではないが、これらのアイソマーはカラムクロマトグラフィーで容易に分離が可能である。これは、オレフィンに対して二つの置換基を同時に導入できる新しい反応といえる。さらに、条件検討を行うことにより、この反応は毒性の高い有機スズ化合物を用いずに、また、溶媒として塩化メチレンに代わりメタノール-水系でも反応が進行することを明らかにし、環境適応型の反応となり得ることを示した。一方、反応機構について、シンプルなα-メチレンエステルを合成しラジカル反応を行うという実験的な側面、中間体ラジカルの半経験的分子軌道計算による計算化学的側面、双方からの考察を行い、水酸基の導入の要因について電子不足オレフィンであることが鍵となることを明らかにした。今後はこの反応の適用限界、天然物への変換について検討する予定である。また、この反応の副生成物としてビストリフルオロメチル体が得られてきていることから、この生成物のジアステレオ選択的合成についても検討していく予定である。
生命始動の遺伝子発現カスケード 〜胚性クロック〜

着床前期胚発生は、受精、胚性ゲノム活性化、コンパクション、胚盤胞腔の形成、内細胞塊と栄養外胚葉への分化および分化全能性の獲得など、生殖生物学及び再生医学において極めて重要な事象を含む。今研究では着床前期胚発生の遺伝子発現制御機構の解明を目指して、遺伝子発現プロファイリング・データの多元的解析およびEST発現頻度を解析することにより、着床前期胚に特異的であり、特徴的な転写因子High mobility group (HMG) boxドメインを持つ新規遺伝子Hmgpをin silicoに抽出した。Hmgpはヒト、ウシにおいてもホモログの存在が示唆されており、種を越えて着床前期胚発生機構に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられる。マウス多組織パネルを用いたノザンブロツトや卵子から胚盤胞までの各ステージあるいは成獣多臓器における逆転写PCRにより詳細な発現解析を行った結果、着床前期特異的な発現を示すことが確認された。機能解析としてSmall interfering RNA (siRNA)を受精卵に注入して胚盤胞に到るまでの発生率を観察したところ、以下予備データではあるが、発生率はコントロールが95%に比して69%まで低下した。siRNAによるHmgp発現の抑制率をReal time Q-PCRで確認したところ、2細胞期から8細胞期における各ステージで、mRNAは30%まで抑制された。従って、新規転写因子Hmgpが受精後の胚性遺伝子活性化の発現制御機構に重要な役割を担うことが示唆された。
10ps時間分解能TOF検出器の開発

ビームテストにおけるデータを元にシミュレーションの改良を行い、再現性のよい結果を出せるようパラメータの調整を行った。それを用いて衝突型加速器実験に使用可能なデザインの最適化を前年度に引き続き行なった。前年度では、現実的なコストで有効範囲を広く取るために、輻射体である石英をタイル状に並べ、その片側面に光を検出する光電子増倍管をつける形状を基準とし、チェレンコフ光の性質を利用することで個々のカウンタの配置を最適化することを行った。結果、どのタイルに対しても最低限20psの時間分解能が達成できるデザインを構築した。衝突点に一番近いタイルの長さを短く、離れるにつれてしだいに長くするようにした。この方式では、タイルを短くすれば時間分解能が向上するが、その場合、全体の光検出器の数が増えコストの増大を招くため、個々のタイルの形状を変更し、サイズを変更しないで時間分解能を向上させることを目指した。タイルTOFでは、光発生時での時間のばらつきは数ps程度と少ないが、伝播の途中で光検出器に対する波面が広く、光の密度が少なくなるため、光子が光検出器に到達する時間に統計的なふらつきが生まれ、時間分解能の向上が制限される。そのため、波面を揃えるように、輻射体を光検出器側が底面となる台形にすることを考案し、シミュレーションによって検証を行った。しかし、荷電粒子に対する有効面積を減らすことのない輻射体では、時間分解能の向上する入射条件が限定的であり、個々のタイルを効率的に並べることができないことが分かった。生産コストを考慮すると、四角形のものが最も現実的であると結論する。また、TOF検出器としての時間分解能の限界を探るため、光検出器正面からの入射に対するビームテストを行った。その結果、石英厚4mmの輻射体のときに約5psの時間分解能が得られた。実現できたTOF検出器としては世界最高性能である。本課題では、主に次の2点について研究を行なった。1)試作器によるシミュレーションパラメータ測定以前に行なったテストカウンタのビームテストに引き続き、別の輻射体・MCP光電子増倍管を用いた試作器を製作しビームテストを行なった。正面から入射する荷電粒子に対する信号出力の時間応答やその角度依存性などのデータを取り、シミュレーションに反映させるパラメータの測定を行なった。2)測定器に搭載可能なデザインでの最適化一連のビームテストにおけるデータを元にシミュレーションの開発を行い、それを用いて衝突型加速器実験のBelle測定器に搭載可能なデザインの最適化を行なった。現実的なコストで有効範囲を広く取るには、輻射体である石英をタイル状に並べ、その片側面に光を検出する光電子増倍管(PMT)をつける形状がほぼ唯一の方法であるが、円錐状に輻射するチェレンコフ光の性質を利用することで個々のカウンタの形状を最適化することができる。測定器内の粒子の発生点が衝突点であるため一定とできることからTOFに対する入射位置と角度に決まった相関がある。このことを利用して、どのタイルに対しても最低限20psの時間分解能が達成できるデザインをシミュレーションによって構築した。デザインした形状は、衝突点に一番近いタイルの長さを短く、離れるにつれてしだいに長くするようにした。一番近いタイルでは入射角度が90度に近く、PMTに到達する光の波面の密度が小さいため、広がる前に光を検出する必要があるため、短くする。一方、入射角度が小さくなると、チェレンコフ光の発生方向がPMTの検出面に向くため、光の波面の密度が大きく、長い伝播距離でも良い時間分解能が得られることが分かった。今後さらに、開発したシミュレーションを利用して最適化を進める。
魚類における摂餌と生殖の内分泌連関

1.オレキシン(ORX)ニューロンの脳内分布:メダカとマツカワにおいて,ORX細胞体は視床下部のNPPvに,ORX繊維は終脳から延髄までの広範囲に検出された.2.ニューロンの初期発生:ORXの機能開始時期の推定のためにマツカワ脳内におけるORXニューロンの初期発生を調べた.ORX細胞体は艀化4日後に視床下部に検出され,ORX繊維の分布は孵化28日後には成魚と同様になった.3.ORX,MCHおよびMSHニューロンの脳内ネットワーク:二重免疫組織化学法でマツカワ脳内のORX,MCHおよびMSHニューロンの分布を調べた.ORX繊維はMCH・MSH細胞体と,MCH・MSH線維もORX細胞体に密接していたことから,脳内ネットワークの存在が示唆された.4.MCHとGnRHニューロンの脳内ネットワーク:マツカワを白・黒水槽で7ケ月間飼育すると,脳内MCH濃度は白水槽で高く,GnRH-II濃度は黒水槽で高かった.脳においてMCH細胞体に密接してGnRH-II線維が観察されたことからMCHとGnRHの相互関係が示唆された.5.ORXの時間分解蛍光免疫測定法の確立:ORXの時間分解蛍光免疫測定法を作製した.標準曲線は100ng/ml0.78ng/mlの範囲で描けた.マツカワとメダカの脳抽出物の競合曲線は標準曲線と平行であった.6.メダカORXのcDNAクローニング:メダカオレキシン/ハイボクレチンをコードするHCRT遺伝子をクローニングした.メダカHCRT cDNAの全長は641bpで140個のアミノ酸をコードしていた.メダカHCRT遺伝子は2つのエクソンからなりプロモータ領域にはTATAボックスが存在した.演繹アミノ酸配列は,他動物種と約50%の相同性を示した.7.メダカORX受容体のcDNAクローニング:メダカORX受容体のcDNAクローニングを行った.メダカゲノム上にはHCRTR2のみが見つかった.HCRTR2は7回の膜貫通部位を持つGタンパク共役型受容体であり,膜貫通部位のアミノ酸はよく保存されており,セブラフィッシュHCRTR2と同じ分枝に位置した.1.オレキシン(ORX)ニューロンの脳内分布:メダカとマツカワにおいて,ORX細胞体は視床下部のNPPvに,ORX繊維は終脳から延髄までの広範囲に検出された.2.ニューロンの初期発生:ORXの機能開始時期の推定のためにマツカワ脳内におけるORXニューロンの初期発生を調べた.ORX細胞体は艀化4日後に視床下部に検出され,ORX繊維の分布は孵化28日後には成魚と同様になった.3.ORX,MCHおよびMSHニューロンの脳内ネットワーク:二重免疫組織化学法でマツカワ脳内のORX,MCHおよびMSHニューロンの分布を調べた.ORX繊維はMCH・MSH細胞体と,MCH・MSH線維もORX細胞体に密接していたことから,脳内ネットワークの存在が示唆された.4.MCHとGnRHニューロンの脳内ネットワーク:マツカワを白・黒水槽で7ケ月間飼育すると,脳内MCH濃度は白水槽で高く,GnRH-II濃度は黒水槽で高かった.脳においてMCH細胞体に密接してGnRH-II線維が観察されたことからMCHとGnRHの相互関係が示唆された.5.ORXの時間分解蛍光免疫測定法の確立:ORXの時間分解蛍光免疫測定法を作製した.標準曲線は100ng/ml0.78ng/mlの範囲で描けた.マツカワとメダカの脳抽出物の競合曲線は標準曲線と平行であった.6.メダカORXのcDNAクローニング:メダカオレキシン/ハイボクレチンをコードするHCRT遺伝子をクローニングした.メダカHCRT cDNAの全長は641bpで140個のアミノ酸をコードしていた.メダカHCRT遺伝子は2つのエクソンからなりプロモータ領域にはTATAボックスが存在した.演繹アミノ酸配列は,他動物種と約50%の相同性を示した.7.メダカORX受容体のcDNAクローニング:メダカORX受容体のcDNAクローニングを行った.メダカゲノム上にはHCRTR2のみが見つかった.HCRTR2は7回の膜貫通部位を持つGタンパク共役型受容体であり,膜貫通部位のアミノ酸はよく保存されており,セブラフィッシュHCRTR2と同じ分枝に位置した.1.オレキシンニューロンの脳内分布オレキシン/ハイポクレチンは哺乳類において睡眠・覚醒や食欲制御に関与するペプチドホルモンである.魚類におけるオレキシンの機能解明の基礎として,メダカとサクラマス脳内の分布を免疫組織化学で調べた.両種ともオレキシン免疫陽性細胞体は視床下部に,免疫陽性繊維は嗅球から延髄までの広範囲の脳部位に検出された.以上の結果は,オレキシンが魚類においても睡眠・食欲などに関連した神経修飾作用をもつことを示唆する.2.オレキシンとメラニン凝集ホルモン(MCH)ニューロンの脳内ネットワークオレキシンとMCHニューロンの脳内における作用を解明する端緒として,メダカをモデルとして二重免疫組織化学法で両ニューロンの分布を調べた.その結果,視床下部において一部のオレキシン神経線維がMCH細胞体に,またMCH神経線維がオレキシン細胞体に近接して存在することがわかった.

MCHが食欲を亢進する作用があることが想定されるので,食欲制御に関連して両ホルモン間にネットワークがあることが示唆された.3.オレキシンのcDNAクローニングオレキシンの遺伝子発現を調べるために,メダカオレキシン/ハイポクレチンをコードするHCRT遺伝子のクローニングを行った.メダカHCRT cDNAの全長は641bpで140個のアミノ酸をコードしていた.メダカHCRT遺伝子は2つのエクソンからなりプロモータ領域にはTATAボックスの存在が確認された.メダカHCRTの演繹アミノ酸配列は,ゼブラフィッシュと53%,ニワトリ,ヒト,イヌと50%,マウス,ラットと46%の相同性を示した.1.オレキシン(ハイボクレチン)の時間分解蛍光免疫測定法の確立ホルモンの機能を解析する上で,組織中の含量を測定することは非常に有効である.そこで,オレキシンの時間分解蛍光免疫測定法を確立した.第2抗体で固相化したマイクロプレートに抗オレキシン抗体,標準試料または未知試料,およびユーロピウム(Eu)標識オレキシンを添加して競合反応させた.最後に増強試薬を加えてEuを遊離させて蛍光強度を測定した.標準曲線は100ng/ml0.78ng/mlの範囲で描くことができた.マツカワとメダカの脳抽出物の競合曲線は標準曲線と平行であった.他ペプチドホルモンとの交差率は0.5%以下であった.2.オレキシンニューロンの初期発生オレキシンの機能開始時期を推定するためにマツカワ脳内におけるオレキシンニューロンの初期発生を調べた.オレキシン免疫陽性反応は艀化日に検出された.免疫陽性細胞体は,艀化4日後には視床下部付近に,14日後には成魚とは異なり外側隆起核上部に検出された.免疫陽性繊維の分布は艀化28日後には成魚と同様になった.以上より,マツカワ脳内において艀化直後にはオレキシンが存在すること,および細胞体は成長に伴ない移動することが示唆された.3.オレキシン受容体のcDNAクローニングメダカのオレキシン受容体のcDNAクローニングを行った.メダカゲノム上にHCRTR1をコードする塩基配列は見出されず,HCRTR2のみが見つかった.HCRTR2は7回の膜貫通部位を持つGタンパク共役型受容体であり,膜貫通部位のアミノ酸はよく保存されていた.また分子系統樹を作成した結果,セブラフィッシュHCRTR2と同じ分枝に位置していることが確認された.HCRTおよびHCRTR2の発現部位をRT-PCRによって解析した結果,脳,網膜などの組織においてHCRTおよびHCRTR2のcDNA断片が増幅された.
溶質ー溶媒間相互作用を考慮した超臨界溶媒中における物質移動過程の解明

超臨界流体中における物質移動について、(1)FTIRによる吸光度測定から溶質ー溶媒間相互作用を明らかにし、(2)超臨界流体中における溶質分子の分子拡散係数をTaylor法により、(3)吸着充填層等の設計に必要な移動パラメーターの一つである超臨界流体中における軸方向有効分散係数をクロマト法によりそれぞれ測定した。さらに、(4)超臨界水中での熱分解および加水分解反応についての速度解析を行った。FTIRの測定結果から臨界点近傍でC=O伸縮振動ピークの吸収強度が濃度に比例せず、極大値をもつ領域があることを見いだした。そして、溶質の吸光度変化より溶質ー溶媒分子のクラスターが形成する温度ー圧力範囲があることを明らかにし、この範囲は分子拡散係数の臨界点異常を引き起こす領域とほぼ一致することがわかった。アセトンを溶媒とした場合の超臨界二酸化炭素中での分子拡散係数について、35°Cでは7.4-8.1MPaで臨界異常を示すが、40°Cでは全く示さなかった。ベンゼンについても40°Cでは異常を示さなかった。分子拡散係数は臨界点異常を示さない項と異常を示す項との線形として表されることがわかった(この結果については論文投稿中)。アセトンおよびベンゼンを溶質とする分子拡散係数を求め、これらの値を圧力あるいは粘度の関数として表した。充填層軸方向有効分散係数は流体の種類によってその値は異なるが、温度、圧力によらずSchmidt数とReynolds数、空隙率、分子拡散係数からなる一つの関数として表すことができた。これは1atmでの有機溶媒の場合についても同様に成り立つことがわかった。軸方向有効分散係数については臨界点異常は確認されなかった。超臨界および亜臨界水中でジベンジルエーテルの分解反応を行い、加水分解と熱分解経路による分解反応モデルにより、生成物収率を精度よく表せた。本年度は臨界点近傍における溶質-溶媒間相互作用を明らかにするため、FTIRを用いて溶媒にCO_2、溶質にアセトンを用いて温度、圧力、アセトン濃度を変化させ、溶媒-溶質間の相互作用に及ぼす影響を調べた。吸収ピーク強度に異常性が認められたのは1725cm^<-1>のC=0伸縮振動ピークのみで、他については全く認められなかった。条件によって1725cm^<-1>付近にいくつか新たなピークが現れるので、バンド分解を行い、各波数における吸収ピーク面積をピーク強度とした。1725cm^<-1>の吸収ピーク強度はアセトン濃度に比例して増加するが、ある条件下では予測値よりも過剰な値を示す。これは超臨界CO_2中でアセトンの溶質-溶質間相互作用(溶質同士がクラスターを形成)と考えられる。一方、1722と1719cm^<-1>の吸収ピークは臨界点近傍のみ現れる。これはC=0伸縮振動吸収に起因するのが溶質のアセトン分子の回りにCO_2分子が会合し、そのため伸縮運動が制限され低波数側にピークがシフトしたと考えられる。これらのピークが存在する条件は極めて狭い条件であり、溶質分子の回りに溶媒分子のクラスターが形成するのはほんの臨界点近傍に限られることがわかった。物質移動パラメターの測定として、本年度はガラス球(細孔なし)を充填した充填層における超臨界条件下での軸方向分散係数D_<ax>を圧力と粒子径を変化させ、また上昇流と下降流についてクロマト法を用いて測定した。また、Taylor法により超臨界CO_2のベンゼンの分子拡散係数を測定した。

超臨界流体中における物質移動について、(1)FTIRによる吸光度測定から溶質-溶媒間相互作用を明らかにし、(2)超臨界流体中における溶質分子の分子拡散係数をTaylor法により、(3)吸着充填層等の設計に必要な移動パラメータの一つである超臨界水中における軸方向有効分散係数をクロマト法によりそれぞれ測定した。さらに、(4)超臨界流体中での熱分解および加水分解反応についての速度解析を行った。FTIRの測定結果から臨界点近傍でC=O伸縮振動ピークの吸収強度が濃度に比例せず、極大値をもつ領域があることを見いだした。そして、溶質の吸光度変化より溶質-溶媒分子のクラスターが形成する温度-圧力範囲があることを明らかにし、この範囲は分子拡散係数の臨界点異常を引き起こす領域とほぼ一致することがわかった。アセトンを溶媒とした場合の超臨界二酸化炭素中での分子拡散係数について、35°Cでは7.4-8.1MPaで臨界異常を示すが、40°Cでは全く示さなかった。ベンゼンについても40°Cでは異常を示さなかった。分子拡散係数は臨界点異常を示さない項と異常を表す項との線形の形として表されることがわかった(この結果については論文投稿中)。アセトンおよびベンゼンを溶質とする分子拡散係数を求め、これらの値を圧力あるいは粘度の関数として表した。充填層軸方向有効分散係数は流体の種類によってその値は異なるが、温度、圧力によらずSchmidt数とReynolds数、空隙率、分子拡散係数からなる一つの関数として表すことができた。これは1atmでの有機溶媒の場合についても同様に成り立つことがわかった。軸方向有効分散係数については臨界点異常は確認されなかった。超臨界および亜臨界水中でジベンジルエーテルの分解反応を行い、加水分解と熱分解経路による分解反応モデルにより、生成物収率を精度よく表せた。
神経栄養因子様の活性を有する新規蛋白質p15の作用機序の解析

我々はこれまで糸状菌由来のタンパク質p15がPCl2細胞の分化を誘導し、突起伸長を顕著に促進すること、またpl5が分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)の一種であり、同活性が上記の生物活性に必須であることを明らかにしてきた。本研究期間内においてはpl5の培養マウス小脳顆粒神経細胞(CGN)に対するアポトーシス抑制活性を検討し、sPLA_2が神経栄養因子様の作用を有する可能性について検討した。CGNは生後7日目のマウス小脳より単離し、高カリウム(K^+)培地で培養した。低K^+培地にシフトすることによりアポトーシスを誘導しヘキスト染色を行ったところ、アポトーシス細胞に特徴的な凝集した核形態が観察された。大腸菌で生産した組換えp15を添加した低K^+培地では核凝集が抑制され、またTUNEL陽性細胞も減少したことから、p15にCGNのアポトーシスを抑制する活性があることが分かった。一方、sPLA_2の活性中心と予想されるHD残基をAAに置換した変異型p15では細胞死の抑制が認められなかった。さらに、p15によるCGNからの脂肪酸の遊離と細胞死抑制活性とが相関することを明らかにした。マウスのcDNAライブラリーよりグループIB, IIA, V, X-sPLA_2をクローニングし、COS1細胞に融合タンパク質として発現させた。培養上清をPC12細胞に与えたところ、IB, IIAは突起を伸長しなかったが、V, Xは突起伸長活性を有していた。次に、上記の4つに加えてマウスグループIIEをクローニングし、合わせて合計5種類のマウスsPLA_2について大腸菌で発現させ、S-S結合の再生処理行って活性型の精製タンパク質を得た。これらのマウス小脳顆粒細胞に対する生存維持活性を検討したところ、少なくともXについては生存維持活性が認められ、BDNF・IGF-1による生存維持を増強することが明らかとなった。p15 cDNA配列を発現ベクターpRSETBの6×His-tagの下流につなぎ、融合蛋白質として大腸菌で発現させ、Ni^<2+>-カラムにより精製した。このタグ付きのp15(His_6-p15)の突起伸長誘導作用をPC12細胞で解析したところ、生産菌より精製したp15(native p15)とほぼ同等の活性を有していた。また、native p15と同様にHis_6-p15はL型カルシウムチャネルブロッカー、ニカルジピンによってその突起伸長活性を阻害された。p15のシステイン残基に点変異を導入し、2組のうちどちらか一方のジスルフィド結合を失ったHis_6-p15では活性の著しい低下が認められた。また、N末端、C末端の737アミノ酸を欠失させたHis_6-p15を大腸菌で発現させたが、すべての欠失変異体が突起伸長活性を失ったことから、活性部位の特定には至らなかった。ホモロジー検索の結果、p15が分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)と相同性を有することが明らかとなった。そこで人工基質を用いたアッセイを行ったところ、p15が確かにsPLA_2活性をもつことがわかった。上記の変異体His_6-p15についても同様のアッセイを行ったところ、突起伸長の低下とほぼ相関してsPLA_2活性の低下が認められた。またsPLA_2の活性中心と予想される残基(His57,Asp58)に変異を導入したHis_6-p15HDAAはsPLA_2活性、突起伸長活性ともに失っていた。続いて、p15が培養細胞に対してもsPLA_2活性を示すかどうかを検討した。その結果、His_6-p15により[^3H]-アラキドン酸、[^3H]-オレイン酸の遊離が亢進されることが確認された。さらに上記のp15変異体についても培養細胞からの脂肪酸遊離を測定したところ、人工基質を用いたアッセイの場合よりも高い突起伸長活性との相関が認められた。

マウスのcDNAライブラリーよりグループIB, IIA, V, X-sPLA_2をクローニングし、COS1細胞に融合タンパク質として発現させた。培養上清をPC12細胞に与えたところ、IB, IIAは突起を伸長しなかったが、V, Xは突起伸長活性を有していた。次に、上記の4つに加えてマウスグループIIEをクローニングし、合わせて合計5種類のマウスsPLA_2について大腸菌で発現させ、S-S結合の再生処理行って活性型の精製タンパク質を得た。これらのマウス小脳顆粒細胞に対する生存維持活性を検討したところ、少なくともXについては生存維持活性が認められ、BDNF・IGF-1による生存維持を増強することが明らかとなった。
もやもや病及び類縁疾患に対する新たなバイオマーカーの確立と臨床応用について

もやもや病患者(MMD)の髄液に対しプロテオミクス解析を行いバイオマーカー候補を発見した。このペプチドはMMDとりわけ小児群において高値を示し、術後の血管新生や血管の狭窄性変化との高い相関関係があった。次にこのペプチドの物質同定を行った。PENK 143-183(uniprotkb: P01210 143-183)であった。Sandwhich ELISAにより、MMD群とcontrol群における髄液中の濃度を測定した。PENK 143-183がMMDの髄液中において有意に上昇しておりMMD診断に有効なバイオマーカーとなり得た。今後さらにPENK 143-183の生理活性を明らかにしたい。平成25年度研究実績:biomarker候補であるタンパク質(4kDa台の2つのタンパク質)に関して,1.髄液の固相抽出。2.有機溶媒耐性のゲルろ過高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて当該分子の溶出される付近(3-7kDa)の分画を回収する。3.凍結乾燥し、再び適切なpHのバッファーに溶解する.4.陰イオン系樹脂を通過させ、結合物を回収する。5.スモールスケールで脱塩操作を行う。6.Nano HPLCをオンライン接続したOrbiTrapタンデム質量分析計(Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japan)で同定する。という手順で精製・同定を行った。採取されるタンパク量がごく少量で物質の同定は困難を極めたが、最終的にはLC-MS-MSを用いた解析により、同物質の分子構造が判明した。次にSandwich ELISAを用いてもやもや病患者および非もやもや病患者の髄液・血清検体について4473Daペプチド濃度の定量を行った。ELISAにおける髄液中の濃度とSELDI-TOF-MSの信号強度については同様の結果が得られたが、血清中の濃度とは相関関係が見られなかった。上記結果からとくに小児もやもや病患者において、髄液中の4473Daペプチドが有用なbiomarkerになり得ると考え、以上の結果をまとめ論文発表準備中である。また平成24年度に引き続き新規もやもや患者の髄液サンプルを収集し、レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(SELDI-TOF MS)を使用しProteinChip上に選択的に捕捉された微量のタンパク質を解析し新たなるバイオマーカー候補も探索中である。すでに論文報告している有力なバイオマーカー候補に対して小児例と成人例で患者群を分け実臨床情報との比較を行った。方法:2009年1月から2012年7月にかけて、脳血管撮影により確定診断した21症例の連続したもやもや病、類もやもや病、片側もやもや病対照群の17症例から髄液を採取した。すべての髄液サンプルはSELDI-TOF-MSにより測定をおこなった。もやもや病群は19歳以下と20歳以上の2群に分け、それぞれ年齢をマッチさせたコントロール群と比較した。追加的な臨床データとして、1術前後の主幹動脈の狭窄閉塞性変化と2血管新生の評価をそれぞれもやもや病グレーディングスコアとMRA TOF画像を用いた方法で点数化した。それぞれの変数についてバイオマーカー候補のペプチドとの相関関係をピアソンの相関係数の検定、スピアマン順位相関係数検定によって調べた。結果:pH5 pH7バッファー条件下において4473Daのペプチドが小児もやもや病、成人もやもや病両方においてで有意差が見られ、小児もやもや病の患者においてより高いピークを示した。4473Daペプチドのピークは年齢依存的な直線的減少を示し、4473Daペプチド-年齢のプロットと術前後のMRA scoreの差-年齢、angiogenesis score-年齢のプロットがそれぞれ高い相関関係が示された。(P=0.0008, P=0.001 R=0.68)結論:もやもや病の髄液検体を使用したSELDI-TOF-MSを用いたプロテオミクス解析において4473Daのペプチドはもやもや病、とりわけ小児群において優位差を持って高いピークを示し、診断バイオマーカーとして用いた場合、高い感度、特異度を示した。4473Daペプチドの分布は術後の血管新生や血管の狭窄性変化との高い相関関係が示されこの物質が有効なバイオマーカー候補であることが確認された。名古屋大学医学部倫理委員会の承認の下、もやもや病患者や類もやもや病患者群及びコントロール群患者(もやもや病、類もやもや病以外の脳脊髄疾患患者)より髄液検体を採取し、適切な前処置を施した後に強力なイオン交換能を備えた官能基を持つProteinChip(Bio-Rad laboratories, Hercules, CA), Q10 /CM 10 arrayにアプライし、レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(ProteinChip System 4000SELDI-TOF mass spectrometer, Enterprise version; Bio-Rad Laboratories)にて選択的に捕捉された微量のタンパク質を解析し、質量4kDaである2つのタンパク質によりもやもや病とコントロールを感度・特異度ともに非常に良好な値を持って識別可能であった。この結果をもとに4473Daペプチドについて、LC-MS-MSを用いた解析により、同物質の分子構造が判明した。またもやもや病患者の髄液サンプルと年齢をマッチングさせた(特に小児例)のコントロール群の髄液について発現タンパクの比較プロファイリングを行った。

biomarkerの値と血行再建術後の臨床経過を脳MRAや脳血管撮影で臨床像との比較検討において、m/z4473とangiogensis scoreに正の相関関係を見出した。この結果より得に小児もやもや病患者において、髄液中の4473Daペプチドが有用なbiomarkerになり得ると考えられた。この結果は論文投稿を行いin pressの段階である。4473Daペプチドの生理活性について、血管内皮細胞への影響をin vitroの実験系にて観察を行っている。生理活性が明らかになれば当物質を応用した実験モデルの作成も行う予定である。もやもや病患者や類もやもや患者群:MMD群及びコントロール群患者(もやもや病、類もやもや病以外の脳脊髄疾患患者):control群より髄液検体を採取しSELDI-TOF-MSによるプロテオミクス解析を行い34個のもやもや病におけるバイオマーカー候補を発見した。その中で質量4kDaであるバイオマーカーを利用してMMD群は19歳以下(小児もやもや病12症例)と20歳以上(成人もやもや病9症例)の2群に分け、それぞれ年齢をマッチさせたcontrol群と比較した。追加的な臨床データとして、1術前後の主幹動脈の狭窄閉塞性変化と2血管新生の評価を行った。統計処理により4473Daのペプチドはもやもや病、とりわけ小児群において優位差を持って高いピークを示し、診断バイオマーカーとして用いた場合、高い感度、特異度を示した。4473Daペプチドの分布は術後の血管新生や血管の狭窄性変化との高い相関関係が示された。次にこの4kDaのペプチドの精製、物質同定を行った。精製、Trypsin消化しLC-MS/MSによりイオンを開裂させ、得られたmass spectrumに対しMS-Tagを用いたデータベース検索を行った。これらはPENK 143-183(uniprotkb: P01210 143-183)を構成するpeptideであった。化学発光基質を用いたSandwhich ELISAにより、MMD群とcontrol群における髄液中のPENK 143-183濃度を測定した。MMD群はcontrol群に比べて有意に上昇していた(P<0.001)。小児(age<18 y.o)および成人(age≧18 y.o)に分けて比較した場合でも、MMD群においてPENK 143-183濃度は有意に上昇しており、小児(P<0.001)の方が成人(P<0.01)より顕著であった。もやもや病患者(MMD)の髄液に対しプロテオミクス解析を行いバイオマーカー候補を発見した。このペプチドはMMDとりわけ小児群において高値を示し、術後の血管新生や血管の狭窄性変化との高い相関関係があった。次にこのペプチドの物質同定を行った。PENK 143-183(uniprotkb: P01210 143-183)であった。
配向制御による酸化セリウムー酸化鉄系自動車排ガス助触媒の性能向上

CeO_2は、酸素吸放出能に優れることから、自動車排ガス浄化三元触媒の助触媒材料として期待され、大きな比表面積を有する羽毛状組織および高反応効率の結晶面(100)に配向した膜が求められる。CeO_2に小さな遷移金属イオン(Fe^<3+> : 0. 078nm)を固溶することによって酸素吸放出能の向上が期待される。そこで、本研究では、レーザーCVD法を用いてCe_<1-x> Fe_xO_<2-δ>固溶体膜を合成し、結晶配向、微細組織および成膜速度に及ぼすレーザー出力(P_L)および反応室内全圧(P_<tot>)の影響を調べた。P_<tot>=0. 8 kPa、P_L=0-50 WではCe_<1-x>Fe_xO_<2-δ>固溶体膜が無配向であったが、P_L=50-150Wでは(100)配向したCe_<1-x>Fe_xO_<2-δ>固溶体膜が得られた。Ce_<1-x>Fe_xO_<2-δ>膜におけるFe_2O_3の固溶限は0. 15であった。成膜速度は最大で約100μm/hであった。(100)配向したCe_<1-x>Fe_xO_<2-δ>固溶体膜は羽毛状構造を有し、大きな比表面積を有することが示唆される。自動車排ガスに含まれる有害ガスのCO、HCおよびNO_Xを同時に効率よく浄化するために、三元触媒の貴金属触媒近傍の雰囲気変動を精密に制御しなければならない。CeO_2は、蛍石型構造であり、価数を容易に変化できることから、酸素吸放出能に優れ、自動車排ガス浄化助触媒材料として期待される。触媒反応の高効率化のためには、羽毛状組織などの大きな比表面積を有し、高反応効率の結晶面(100)に配向したCeO_2膜が求められる。そこで、本研究では、微細構造制御に優れ、成膜速度の速いレーザーCVD法を用いてCeO_2膜の高速合成を試み、結晶配向、微細組織および成膜速度に及ぼすレーザー出力(P_L)、成膜温度(T_<dep>)、予熱温度(T_<pre>)および反応室内全圧(P_<tot>)などの成膜条件の影響を調べた。レーザーCVD装置(半導体レーザー、波長808nm)を用い、Ce(dpm)_4有機金属錯体によりCeO_2膜を合成した。P_<tot>=0.8kPaでは(100)配向した膜は、広い成膜条件下で得られた。しかし、T_<pre>=673873K、P_L=0Wの条件下においてもCeO_2単相膜が得られたが、膜の結晶性が低く、無配向であり、カリフラワ状の微細組織を示した。従って、レーザー照射は高結晶性膜の作製に効果があり、また膜の配向制御に優れることがわかった。P_<tot>=0.8kPa、T_<pre>=673K、P_L=50Wで合成した膜の断面SEM写真を示す。ピラミッド状のファセットが生成し、最も顕著な羽毛状組織を有する柱状晶膜が生成した。P_<tot>=0.40.8kPaいずれの場合でも、T_<pre>およびP_Lの上昇につれてCeO_2膜は柱状晶から緻密膜へと変化した。P_<tot>の減少につれて、(100)に配向した膜はより高いP_LおよびT_<pre>の条件下で生成した。P_<tot>の減少につれて多様に配向した膜が得られた。

自動車排ガス浄化触媒は、一般に6001200Kの高温域で使用されるため、羽毛状組織の熱的安定性を調査した。羽毛状組織は、T=8731073K、50hの熱処理後においても変化は見られなかった。自動車排ガスに含まれる有害ガスのCO、HCおよびNO_xを同時に効率よく浄化するために、三元触媒の貴金属触媒近傍の雰囲気変動を精密に制御しなければならない。CeO_2は、蛍石型構造であり、価数を容易に変化できることから、酸素吸放出能に優れ、自動車排ガス浄化助触媒材料として期待される。触媒反応の高効率化のためには、羽毛状組織などの大きな比表面積を有し、高反応効率の結晶面(100)に配向したCeO_2膜が求められる。CeO_2-ZrO_2固溶体中では、Ce^<4+>近傍にイオン半径の小さいZr^<4+>(8配位のZr^<4+>:0.084nm)が存在するため、格子が拡張しやすくなり、原子価変化が起きやすくなることは知られている。CeO_2にさらに小さな遷移金属イオン(8配位のFe^<3+>:0.078nm)を固溶することによってCeイオンの原子価がさらに変化しやすくなると期待される。Feなどの遷移金属イオンの原子価は変化できることから、CeO_2-Fe_2O_3固溶体はCeO_2-ZrO_2固溶体よりも高いOSC能を有することが期待される。そこで、本研究では、レーザーCVD法を用いてCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜の高速合成を試み、結晶配向、微細組織および成膜速度に及ぼすレーザー出力(P_L)、成膜温度(T_<dep>)および反応室内全圧(P_<tot>)などの成膜条件の影響を調べた。レーザーCVD装置を用い、Ce(dpm)_4およびFe(dpm)_3有機金属錯体によりCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜を合成した。P_<tot>=0.8kPa、P_L=0-50WではCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜が無配向であったが、P_L=50-150Wでは(100)配向したCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜が得られた。P_L=200Wでは、膜はまた無配向になった。成膜速度は最大で約100μm/hであった。(100)配向したCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜は羽毛状構造を有し、大きな比表面積を有することが示唆される。そこで、本研究では、微細構造制御に優れ、成膜速度の速いレーザーCVD法を用いてCeO_2-Fe_2O_3固溶体膜の高速合成を試み、結晶配向、微細組織および成膜速度に及ぼすレーザー出力(P_L)、成膜温度(T_<dep>)、予熱温度(T_<pre>)および反応室内全圧(P_<tot>)などの成膜条件の影響を調べた。レーザーCVD装置(半導体レーザー、波長808nm)を用い、Ce(dpm)_4およびFe(dpm)_3有機金属錯体によりCeO_2-Fe_2O_3固溶体(Ce_<1-x>Fe_xO_<2-δ>)膜を合成した。
膵島ニッチ障害シグナルネットワークの理解に基づいた糖尿病治療への挑戦

2型糖尿病の発症あるいは重篤化には、血糖や血中遊離脂肪酸による膵島障害による膵島ホメオスタシス機能の低下が寄与すると考えられている。本研究では、膵島障害シグナルネットワークの形成を細胞相互間作用の変化に着目して理解するための研究基盤の構築を行った。その結果、「in vitro β細胞培養系を用いた過栄養ストレスシグナルの実際」「膵島様高次構造形成の最適化」「蛍光タンパク質標識による細胞起源追尾が可能かつテトラサイクリン制御性で遺伝子発現調節が可能なβ細胞株の樹立のためのプラスミドベクター作成」「糖尿病関連ペプチドホルモンのWestern blottingの感度改善」といった研究成果を得た。2型糖尿病の発症あるいは重篤化には、膵島の老化や血糖や血中遊離脂肪酸による膵島障害による膵島ホメオスタシス機能の低下が寄与すると考えられている。本研究では、膵島の高次細胞凝集塊としての微小環境(膵島ニッチ)の重要性に着目し、各膵島構成細胞、特に血糖調節に重要なα細胞及びβ細胞が膵島ニッチとして、どのような障害シグナルネットワークを形成するのかを膵島の老化に伴う細胞相互間作用の変化に着目して、主に培養細胞を用いて解析を行っていく。今年度の主要な研究計画は蛍光タンパク質標識による細胞起源追尾可能な外来遺伝子テトラサイクリン制御型β細胞株の樹立を完了し、各種解析を開始することであった。しかしながら、移籍に伴う研究環境の変化により、保有機器との整合性を確認した結果、使用する蛍光タンパク質の変更が必要となった。まず、所属研究機関の設備仕様に適合すると判断されたmEGFP、mVenus、E2-crimson、tdTomatoといった蛍光タンパク質をコードするプラスミドベクターを収集した。また、安定的な追尾を可能にするために必要なクロマチンインスレーター配列IS2を人工遺伝子合成受託によって取得した。現在これらのソースを用いてプラスミドベクターの作成をほぼ終えた。また現在、膵島様高次構造形成条件の最適化も行っており、細胞外マトリックスコートデッシュ、リン脂質コートディッシュ、浮遊細胞用ディッシュ等を用いて本研究への適正を評価中である。1)蛍光タンパク質標識による細胞起源追尾可能な外来遺伝子テトラサイクリン制御型β細胞株の樹立のためのプラスミドベクター作成:mEGFP、mVenus、E2-crimson、tdTomatoといった蛍光タンパク質のcDNA及び、安定的な追尾を可能にするために必要なクロマチンインスレーター配列を遺伝子工学的手法を用いて種々のプラスミドベクターを作成した。2)培地中添加物のコントロールによるβ細胞株の糖尿病様病態の模倣:マウスβ細胞株MIN6亜株において、低グルコース状態に比して高グルコース状態下での細胞内Insulinの減少、及びそれに伴うProinsluin/Insulin比(P/I比)の減少、さらに培地中へのグルコース刺激性インスリン分泌の低下といった生理応答を確認した。このことは、MIN6亜株がin vitroにおける適切なストレス感受性を有していること及び適切な培養条件の設定によって、in vitroにおいてβ細胞に対する糖尿病病態の模倣が可能である可能性を示唆する結果である。今後はInsulinだけでなく周辺関連因子の動向も解析する必要がある。3)InsulinのWestern blottingの感度改善:Proinsulinと比較してInsulinのWBの感度が悪いことがこれまでの実験から判明しており、適切なProinsulin/Insulinの評価の妨げとなっていたので、原因の究明とプロトコールの変更による改善を試みた。結果、適切な改変プロトコールを作成することに成功したので、現在、当該技術に関する用途特許の仮出願及び、学術論文の投稿準備中である。I培地中グルコース及び脂肪酸濃度のコントロールによるβ細胞株の糖尿病様病態の模倣本年度は、MIN6c4の高糖培養下あるいは高脂肪酸培養下での、直接的なストレスマーカー(最終糖化産物、過酸化脂質等)やInsulin以外の種々の糖尿病関連因子のタンパク質発現レベル、局在変化等について検証を行った。その結果、タンパク質-最終糖化産物複合体やタンパク質-過酸化脂質複合体に関しては、少なくともWBレベルでは高糖あるいは高脂肪酸状態での培養においても顕著な増加は認められなかった。その一方で、ストレスシグナル因子に関しては、糖毒性及び脂肪毒性いずれにおいても共通して反応するストレス応答因子がほとんどであった。今後は、共培養系や三次元培養を用いたストレスシグナルに関しての知見を蓄積していく予定である。IIInsulinのWestern blottingの感度改善昨年度までに、InsulinのWestern blottingによる定量検出における問題点について明らかにした。本年度は、当該問題点に関してさらなる検証を行った(方法の詳細は特許出願前のため省略)。その結果、Proinsulinに関しては2倍程度、Insulinに関しては10-30倍の感度を上昇させることに成功し、ProinsulinとInsulinのタンパク量(mol)比と化学発光シグナル比は1:1で安定的に検出が可能となった。また、本法はInsulinアナログ、Glucagon、GLP1、Somatostatin、Pancreatic polypeptide、Ghrelin等、その他の糖尿病関連ペプチドホルモンにも適応可能であることも実験的に証明した。その結果、「in vitro β細胞培養系を用いた過栄養ストレスシグナルの実際」

「膵島様高次構造形成の最適化」「蛍光タンパク質標識による細胞起源追尾が可能かつテトラサイクリン制御性で遺伝子発現調節が可能なβ細胞株の樹立のためのプラスミドベクター作成」「糖尿病関連ペプチドホルモンのWestern blottingの感度改善」といった研究成果を得た。本年度は当初最終年度の予定であり、計画通り安定発現細胞の樹立を行い、各種解析を行っていく予定であった。しかし、使用している株化細胞の糖尿病様の表現型を示す培養条件を最適化していく過程において、通常学術論文等で推奨されてきた培養条件が適さないことが判明し、最適条件の設定を行う必要があった。本年度末までに最適条件を見い出し、いくつかの科学的根拠も収集できた。さらに、その過程で派生した重要な科学的発見についての検討を行い、当該テーマに関しての特許及び学術論文の投稿の目処に結びつけた。以上の理由より、1年間の延長申請を行い、承認された。分子代謝制御学当初の申請計画通り、培地添加物のコントロールによるβ細胞株の糖尿病様病態を多面的に評価するとともに、tetracyclin制御性安定発現細胞株の樹立を行う。移籍に伴う研究環境の変化により、当初の計画書に記載の使用予定蛍光タンパク質が使用不適となり、ベクター設計の再考を余儀なくされたため、研究材料の収集等に時間がかかった。科研費申請課題の研究の過程で派生した科学的発見についての検討を行ったため、年度途中より当該実験の遂行に注力し、当該実験の遂行には、所属機関からの基盤研究費を使用した。以上の理由より、1年間の研究機関延長申請を行い、次年度に当初の計画を再開することにしたため。所属移籍に伴う軌道修正は完了したので、今年度は計画通り蛍光タンパク質標識による細胞起源追尾可能な外来遺伝子テトラサイクリン制御型β細胞株の樹立と共に、培養細胞の糖尿病環境の模倣条件や膵島様構造形成の最適化等を行っていく。当初の予定通り、消耗品費に充てる予定である。研究の進捗状況次第で学会発表費用にも使用する。所属移籍に伴う研究計画の変更に伴い、研究の進捗が若干遅れているため、執行額が当初より少なくなった。残額と本年度の助成金は予定通り、そのほとんどを研究用試薬、器具代に使用する。
プロトン性部位を有する金属錯体を用いた窒素分子変換反応の開発

本年度は、電子供与性骨格を有するとともに、窒素固定酵素ニトロゲナーゼの鍵金属である鉄への配位が比較的容易と考えられるビス(ピラゾリルイミノ)イソインドリン配位子を新たに設計・合成し、その錯形成ならびに錯体の反応性について調べた。さらに、昨年度得られたジホスフィン配位子によって架橋された多プロトン応答型二核錯体について、その性質や反応性を詳細に検討した。合成したイソインドリン鉄錯体と一酸化炭素との反応で得られたカルボニル錯体のCO伸縮振動波数は類似の構造を有するピリジン錯体と比べて低波数側に観測され、イソインドリン骨格の導入によって中心金属の電子密度や逆供与能が向上していることがわかった。このイソインドリン錯体は六員環キレート構造を有しているものの、広がった共役系をもつためにピンサー配位子の平面性が保たれ、以前に合成した六員環キレート構造を有するNHC錯体で見られたような逆供与能の低下を抑制することができたと考えられる。一方、多プロトン応答型二核錯体については、架橋窒素配位子への電子供与をより強くするために、ビス(ピラゾール)ービス(ピラゾラト)型窒素架橋二核錯体の脱プロトン化反応をおこなった。その結果、一段階の脱プロトン化によって生じるモノアニオン性窒素錯体のラマンスペクトルでは、無電荷錯体と比べてNN伸縮振動波数が大きく低波数シフトした。また、塩基の量を二当量にすると、対応するジアニオン性窒素錯体が得られた。このジアニオン性窒素錯体のNN伸縮振動は、先に述べたモノアニオン性窒素錯体よりもさらに低波数シフトして観測され、これまでに報告されているルテニウム二価錯体の中で最も活性化された窒素錯体であることが明らかとなった。これらの結果は、プロトン応答部位を集積した二核構造によって、窒素配位子への電子移動が効果的に起こることを裏付ける結果といえる。29年度が最終年度であるため、記入しない。窒素分子への多プロトン/多電子移動を円滑に進行させる金属錯体の創製を目指し、本年度は当初の研究実施計画に沿って、中心金属から窒素分子への逆供与能の向上を期待し、配位子の中央部位にフェニル基やN-ヘテロ環状カルベン(NHC)部位など、高い電子供与性をもつ骨格を導入したルテニウム錯体を合成し、それらの性質を精査した。また、ルテニウム以外の金属錯体への展開も並行して取り組んだ。NHC骨格を導入したプロティックなピンサー型ビス(ピラゾール)ルテニウム錯体については、電気化学測定の結果、従来の錯体と比べて酸化波が負側に観測され、期待したように中心金属の電子密度が向上していることがわかった。また、合成した錯体に対して、一酸化炭素雰囲気で脱プロトン化を行うと、ビス(ピラゾラト)カルボニル錯体が得られた。赤外スペクトル測定ではカルボニル配位子の吸収が、従来の錯体と比べて高波数側に観測され、金属からカルボニル配位子への逆供与が十分働いていないことがわかった。DFT計算の結果、ピンサー配位子のねじれの影響で逆供与能が低下していることが示唆された。また、分子内にσ供与性の大きなフェニル基を導入したNCNピンサー型錯体については、汎用性の高い合成法の開発を目的として、炭素ー臭素結合をもつ配位子を新たに合成し、酸化的付加によるシクロメタル化を検討した。その結果、[Ni(cod)2]への酸化的付加が進行し、平面四配位型のプロティックなNCNピンサー型ニッケル錯体が得られた。同様に、[Ru(cod)(cot)]への酸化的付加も進行し、対応するルテニウム錯体が得られたことから、この方法が一般に適用可能であることがわかった。窒素分子の還元的変換を達成するためには、金属から配位窒素分子への強い逆供与による十分な活性化を行う必要がある。現在までに、フェニル基やNHC部位など高い電子供与性をもつ骨格を導入した錯体の合成に取り組み、フェニル基やNHC部位の導入により中心金属の電子密度が向上することを明らかにしている。また、キレート環の拡大にともなってピンサー骨格がねじれ、その結果、金属からの逆供与能が低下することも見出している。これらの結果は、窒素分子の還元的変換を目指す上で重要な知見であり、当該研究は順調に遂行できていると言える。昨年度に引き続き、本年度は窒素分子への多プロトン/多電子移動が円滑に進行する錯体の探索として、ピンサー配位子の中央部位にピリミジン由来の6員環NHC骨格を導入したビス(ピラゾール)錯体の合成を行った。昨年度合成した5員環NHC骨格をもつ錯体ではトリフェニルホスフィンが2分子配位した錯体が得られていたのに対して、6員環NHC錯体ではトリフェニルホスフィンが1分子のみ配位した錯体が得られたことがわかった。両者の結晶構造の比較から、6員環NHC錯体では中央のNHC骨格の環拡大に伴ってピンサー骨格全体のねじれが大きくなっていることがわかった。すなわち、このねじれによる立体障害の増加によって、トリフェニルホスフィン配位子の解離が促進されていることが明らかとなった。さらに、窒素分子への多プロトン/多電子移動を促進するために、これまでに合成したプロティックなピンサー型錯体をジホスフィン配位子によって集積化し、多プロトン応答型二核反応場の構築にも取り組んだ。