hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮膚粗鬆症における表皮内コルチゾール再活性化酵素（11β-HSD1）の役割

Dermatoporosis(皮膚粗鬆症)におけるメカニズムが解明されていない。本研究では、コルチゾール再活性化酵素である11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1(11β-HSD1)に着目し、Dermatoporosisにおける11β-HSD1の役割を明らかにするために、検討した。培養表皮角化細胞に、ステロイドを添加24時間後・48時間後に、11β-HSD1の発現が増強した。コルチゾール活性化酵素である11β-HSD1の発現増強によって、表皮角化細胞における内因性コルチゾールも増加することが示唆される。また、野生型マウスにおいて、加齢あるいはステロイドを連日外用したマウスは皮膚萎縮が生じ、表皮の11β-HSD1の発現が増強した。野生型と表皮11β-HSD1ノックアウトマウスに不活型ステロイド(プレドニゾン)を外用した。野生型は皮膚萎縮が生じたが、表皮11β-HSD1ノックアウトマウスは皮膚萎縮が生じなかった。Dermatoporosisにおける11β-HSD1の役割を明らかにするには、生体内における解析が重要であり本研究では申請者らが最近作成した。マウス皮膚にステロイド内服、外用を行い、皮膚萎縮を生じさせ、それらに対する皮膚の免疫組織学的変化や細胞増殖能、バリア機能などを野生型マウスとノックアウトマウスで比較することにより、表皮角化細胞の11β-HSD1誘導性のコルチゾールの表皮の分化調節作用と皮膚老化における役割を明らかにする。さらに、加齢あるいはステロイドによる皮膚萎縮をコルチゾール活性化酵素(11β-HSD1)の阻害薬を用いて改善できるかを検討する。系統の樹立はできているが、実験に使うには限られたゲージ数内での、相当の匹数の繁殖が必要である。まず、K5Cre+/+11β-HSD1flox/floxマウスと、11β-HSD1 flox/floxを交配させ、表皮特異的11β-HSD1マウスが作製できるため、交配させるためのそれぞれのマウスを複数作製するのに、時間がかかった。妊娠しにくく、交配後も生存継続数は少ないため、表皮特異的11β-HSD1マウスの大量作製が難しかった。作製されても、実際の実験に使用に適切な月齢数は半年前後のため、(加齢によって11β-HSD1の発現は徐々に増強するため、野生型マウスとの発現差が大きくなる)マウスの実験がすすまない。た。コルチゾール活性化酵素である11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1の発現増強によって、表皮角化細胞における内因性コルチゾールも増加することが示唆される。また、野生型マウスにおいて、加齢あるいはステロイドを連日外用したマウスは皮膚萎縮が生じ、表皮の11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1の発現が増強した。28年度が最終年度であるため、記入しない。
新ナノ微粒子創製用ツインレーザ成膜装置の開発

本研究は,2つの異なる波長(エネルギー)を持つ高出力パルスレーザを用いて、異なる材質の2つのターゲットを同時にアブレートし、それによって作製されたプラズマプルームを気相中で交差、反応させることによりクラスター同士の反応を促進し、新しいナノ新材料を創製することを目的とする。昨年度までにSimCnのアモルファス状薄膜の作製を行ってきた。本年度はこれを微結晶微粒子として作製することを試みた。また、同時にプラズマプルームの成長の様子を詳細に調べた。1)微結晶微粒子の作製:ツイン(デュアル)パルスYAGレーザを用いてSiC薄膜の作製を行い、レーザのパワーや繰り返し周波数を制御することにより、化学量論的組成を持つ結晶性SiC薄膜の作製に成功した。また、この方法により、薄膜状にSimCnの一部結晶性を持つナノ微粒子(ドロップレット状のクラスター)が作製できることを明らかにした。今回は残念ながら、Si_<60>C_<60>と言ったような機能性ナノ微粒子の作製はできなかったが、今後継続した実験を行うことにより上記のような微粒子の作製も可能になると思われる。2)プラズマプルーム観測システムの構築:作戦までに構築した発光分光装置と高速度ICCDカメラを用いて、ツイン(デュアル)パルスレーザデポジション中のプラズマプルームの形状やプルーム中の原子・分子の分布を調べた。その結果、プラズマプルームの発生・成長がそれぞれのレーザのフルエンスや繰り返しのタイミングにより変化することが明らかになった。このことは、プルームを交差させることによりナノクラスターの作製が可能であることを示している。今回は、交差したプルーム内部での反応を明らかにすることはできなかったが、今後継続した実験を行うことにより明らかにできると考えている。本研究は,2つの異なる波長(エネルギー)を持つ高出力パルスレーザを用いて、異なる材質の2つのターゲットを同時にアブレートし、できたプラズマプルームを気相中で交差させ、反応させることによりクラスター同士の反応を促進し、新しいナノ新材料を創製することを目的とする。本年度はその準備段階として、下記の準備を行った。1)装置改良:現有のパルスYAGレーザデポジション装置の上部フランジ部分を改良し、2つのターゲットが設置できるようにした。また、実際に両者によって発生する高クラスター密度かつ高電離度・高反応性のプラズマプルームが空間中で交差するよう微調整を行った。また、これに外部スパッタリング成膜装置を取り付け、「交差空間」に、第3のプラズマが存在するように改良した。2)プラズマプルーム観測システムの構築:発光分光装置と高速度ICCDカメラを購入もしくは改良し、プラズマプルームの形状や電子、イオン密度、発行強度、原子・分子密度を計測できるようにした。上記の装置を用いて、今後は「交差空間」における反応の様子を推測し、作製されたナノクラスタの性質と、プラズマプルームの特性との相関を調べる予定である。また、準備段階として、PLD法によって下記の様々な薄膜を作製し、今年度購入したX線回折装置を用いて、作製した薄膜の分析を行い、以下のことを明らかにした。1)H_2やCH_4などの可燃性ガスセンサに用いられるSnO_2薄膜やNOxガスセンサーとして注目されているWO_3薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法により高い結晶性を持つ薄膜ガスセンサの作製に成功した。これを用いたセンサーの感度は十分に大きく、ガスセンサーとして十分利用できることがわかった。2)光触媒として用いられる2酸化チタン(TiO_2)薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法によりアナターゼ型TiO_2薄膜の作製が可能であり光触媒反応による脱色が可能であることが判った。本研究は,2つの異なる波長(エネルギー)を持つ高出力パルスレーザを用いて、異なる材質の2つのターゲットを同時にアブレートし、それによって作製されたプラズマブルームを気相中で交差、反応させることによりクラスター同士の反応を促進し、新しいナノ新材料を創製することを目的とする。本年度は昨年度作製した装置をもとに微結晶微粒子の作製を試みた。1)微結晶微粒子の作製:2つのパルスYAGレーザを用いた薄膜作製装置による微結晶微粒子及び薄膜の作製を行った。ターゲットにはSiおよびCを用いた。その結果、それぞれのレーザのパワーや繰り返し周波数を制御することにより、薄膜の組成比が制御できることが判った。これにより、どのような圧力条件下でもSi:C=1:1の化学量論的組成を持つ薄膜の作製が可能となる。また、この方法を用いて基板温度800°Cで、結晶性SiC薄膜が作製できた。これは、同じ装置でSiCターゲットを用いた場合よりも50°C以上低温である。2)プラズマブルーム観測システムの構築:発光分光装置と高速度ICCDカメラを購入もしくは改良し、プラズマブルームの形状やブルーム中の原子・分子の分布を調べた。その結果、プラズマブルームの発生・成長はターゲットによらず、ほぼ同様な時間空間的変化を行うことが判った。来年度は、さらに詳細に実験を行い、より低い基板温度で結晶性SiCの作製、及び微結晶化したナノサイズのSiC微粒子作製を行う予定。また、同時にプラズマプルームの成長の様子を詳細に調べる予定である。また、準備段階として、PLD法によって可視光応答型光触媒として用いられる窒素ドープ2酸化チタン(TiO_<2-x>N_x)薄膜の作製を試みた。

その結果、PLD法によりアナターゼ型TiO_<2-x>N_x薄膜の作製が可能でありこれを用いた可視光による光触媒反応によって脱色が可能であることが判った。本研究は,2つの異なる波長(エネルギー)を持つ高出力パルスレーザを用いて、異なる材質の2つのターゲットを同時にアブレートし、それによって作製されたプラズマプルームを気相中で交差、反応させることによりクラスター同士の反応を促進し、新しいナノ新材料を創製することを目的とする。昨年度までにSimCnのアモルファス状薄膜の作製を行ってきた。本年度はこれを微結晶微粒子として作製することを試みた。また、同時にプラズマプルームの成長の様子を詳細に調べた。1)微結晶微粒子の作製:ツイン(デュアル)パルスYAGレーザを用いてSiC薄膜の作製を行い、レーザのパワーや繰り返し周波数を制御することにより、化学量論的組成を持つ結晶性SiC薄膜の作製に成功した。また、この方法により、薄膜状にSimCnの一部結晶性を持つナノ微粒子(ドロップレット状のクラスター)が作製できることを明らかにした。今回は残念ながら、Si_<60>C_<60>と言ったような機能性ナノ微粒子の作製はできなかったが、今後継続した実験を行うことにより上記のような微粒子の作製も可能になると思われる。2)プラズマプルーム観測システムの構築:作戦までに構築した発光分光装置と高速度ICCDカメラを用いて、ツイン(デュアル)パルスレーザデポジション中のプラズマプルームの形状やプルーム中の原子・分子の分布を調べた。その結果、プラズマプルームの発生・成長がそれぞれのレーザのフルエンスや繰り返しのタイミングにより変化することが明らかになった。このことは、プルームを交差させることによりナノクラスターの作製が可能であることを示している。今回は、交差したプルーム内部での反応を明らかにすることはできなかったが、今後継続した実験を行うことにより明らかにできると考えている。
B細胞応答を司る濾胞ヘルパーT細胞と濾胞制御性T細胞の大腸癌への影響に関する研究

本研究においては大腸癌患者におけるTIL中のTFH, TFRの発現,および末梢血中を循環するcirculating TFH, TFRの発現を解析しその役割を明らかにすることで,発癌や進行,予後との相関,治療効果との関連性を探ることをのみならず, TFH, TFRの分化にかかわるサイトカインなどを明らかにし,新規治療ターゲットとなる可能性についても検討し臨床応用に展開するための基盤となる研究を行うことを目的とする.前述の通り,大腸癌においてはTFRはもちろんTFHについての研究はほとんどなされておらず,本研究は独自性や創造性に富んだ研究と考える.本研究においては大腸癌患者におけるTIL中のTFH, TFRの発現,および末梢血中を循環するcirculating TFH, TFRの発現を解析しその役割を明らかにすることで,発癌や進行,予後との相関,治療効果との関連性を探ることをのみならず, TFH, TFRの分化にかかわるサイトカインなどを明らかにし,新規治療ターゲットとなる可能性についても検討し臨床応用に展開するための基盤となる研究を行うことを目的とする.前述の通り,大腸癌においてはTFRはもちろんTFHについての研究はほとんどなされておらず,本研究は独自性や創造性に富んだ研究と考える.
学習可能な追体験システムの実装に向けた総合的研究

本研究では,体験者が技能の追体験を通じて,その技能を効率的に学習できる追体験システムの開発を目指す.そのために,【研究A】偽運動主体感の生成メカニズムの解明(認知心理学的研究),【研究B】追体験システムとVRの融合(システム実装)の2つのテーマを設定し,相互に補完しあいながら研究を行う.まず,研究Aについて,錯覚刺激を呈示した場合において偽運動主体感が生成するのか検討した.実験では,ダブルフラッシュ錯覚と呼ばれる錯覚を用いた.これは視覚刺激を1度呈示するタイミングに合わせて聴覚刺激を短い時間間隔で二度呈示することで,視覚刺激が2度呈示されたように知覚する錯覚である.これを用いて,必要とされるアクション回数を1度または2度の課題を準備し,ダブルフラッシュ錯覚を使用し,視覚刺激の観察回数を1度または2度になるように準備した.一連の実験の結果として,アクション回数と見かけ上の視覚刺激の観察回数の一致が,行為主体感の変調を引き起こしていることを明らかにした.つまり,自分が行ったアクション回数(例えば2回)と知覚した観察回数(2回)が一致していれば,それは錯覚による知覚であっても行為主体感は高い状態であることを示した.これは,アクションと視覚刺激の知覚処理がなされた後に統合された結果として行為主体感が生成されていることを示唆しているものである.本成果をまとめたものを査読付き国際誌に投稿する予定である.またこれらの認知心理学実験と並行して,追体験のシステム開発も進めており,問題視されていた箇所の改善などを観察することができた.次年度以降もシステム開発を継続する.今年度の研究成果について学会発表を通じて多くのフィードバックを得ることができた.また,現在はその成果を査読付き国際誌に投稿する準備を進めている.したがって,現在までの達成度は,おおむね順調であると思われる.今後も研究成果の発表および論文投稿を行い,新しい認知心理学実験および装置の開発を滞りなく進めていくことで,追体験の実装に向けた知見を蓄積していく.本研究では,体験者が技能の追体験を通じて,その技能を効率的に学習できる追体験システムの開発を目指す.そのために,【研究A】偽運動主体感の生成メカニズムの解明(認知心理学的研究),【研究B】追体験システムとVRの融合(システム実装)の2つのテーマを設定し,相互に補完しあいながら研究を行う.まず,研究Aについて,錯覚刺激を呈示した場合において偽運動主体感が生成するのか検討した.実験では,ダブルフラッシュ錯覚と呼ばれる錯覚を用いた.これは視覚刺激を1度呈示するタイミングに合わせて聴覚刺激を短い時間間隔で二度呈示することで,視覚刺激が2度呈示されたように知覚する錯覚である.これを用いて,必要とされるアクション回数を1度または2度の課題を準備し,ダブルフラッシュ錯覚を使用し,視覚刺激の観察回数を1度または2度になるように準備した.一連の実験の結果として,アクション回数と見かけ上の視覚刺激の観察回数の一致が,行為主体感の変調を引き起こしていることを明らかにした.つまり,自分が行ったアクション回数(例えば2回)と知覚した観察回数(2回)が一致していれば,それは錯覚による知覚であっても行為主体感は高い状態であることを示した.これは,アクションと視覚刺激の知覚処理がなされた後に統合された結果として行為主体感が生成されていることを示唆しているものである.本成果をまとめたものを査読付き国際誌に投稿する予定である.またこれらの認知心理学実験と並行して,追体験のシステム開発も進めており,問題視されていた箇所の改善などを観察することができた.次年度以降もシステム開発を継続する.今年度の研究成果について学会発表を通じて多くのフィードバックを得ることができた.また,現在はその成果を査読付き国際誌に投稿する準備を進めている.したがって,現在までの達成度は,おおむね順調であると思われる.今後も研究成果の発表および論文投稿を行い,新しい認知心理学実験および装置の開発を滞りなく進めていくことで,追体験の実装に向けた知見を蓄積していく.
マウスパ-キンソン病モデル線条体と同生体位におけるド-パのドパミン遊離調節機構

従来カテコラミンの前駆物質にすぎないとされてきたド-パが神経活性物質であるとの作業仮説を提起してきた。本研究計画において、パ-キンソン病モデル、MPTP処置C57BLマウスの線条体切片を用い、外来投与のL-ド-パの作用を、対照群と比較検討し以下の知見を得た。1.対照群のC57BLマウス線条体切片において、イソプロテレノ-ル10-300nMは、誘発性ドパミン(DA)遊離をプロプラノロ-ル感受性に増大した。この結果は同部位のDA作動性神経終末にシナプス前β-アドレナリン受容体が存在することを示す。2.MPTP投与マウス線条体切片における誘発性ならびに、自発性DA遊離及びDA含量は対照群に比し、いずれも約50%程度に減少した。対照群マウスの線条体切片において、L-ド-パ0.1-lnMは誘発性DA遊離を増大する傾向を示した。一方、MPTP処置マウス線条体において、L-ド-パ1-3nMはDAの自発性遊離、組織含量の増大を伴わずに誘発性DA遊離を用量依存性に増大した。L-ド-パ3nMによるDA遊離の増大はプロプラノロ-ルにより完全に拮抗された。この結果はパ-キンソン病モデルマウス線条体切片において、L-ド-パの第1義的作用が、シナプス前β-アドレナリン受容体を介するDA遊離の促進作用であることを示し、本研究計画遂行により得られた最も重要な新知見である。3.対照群及びMPTP処置群いずれの線条体切片においても、10nM以上のL-ド-パは用量依存性に自発性DA遊離を増大した。対照群切片において、L-ド-パ1-10μMは用量依存性に誘発性遊離を増大し、10μMはDA含量を増大した。MPTP処置マウス切片において、L-ド-パは誘発性遊離に対し10-30nMにおいて無作用、100nMにおいて再び増大作用を示し、また100nMはDA含量を増大した。同モデル生体位におけるL-ド-パの作用については現在検討中である。
組織工学用材料としての細胞接着性ペプチドの分子設計と人工細胞外マトリックスの構築

これらのRGDSミメテイックペプチドを用いて、血小板凝集阻害実験を行い、IC50を求めることによりミメテイツクペプチドの構造活性相関について検討を加えた。その結果、hRGDSはRGDSの2倍以上の血小板凝集阻害活性が確認できた。RGDSおよびRGDSミメティックペプチドをポリビニルアルコール(PVA)フィルム上に固定化し、マウス由来線維芽細胞L929を用いて細胞接着活性試験を行った。その結果、hRGDS, RNiDSおよびRGDSをPVAフィルム上に無水コハク酸を用いて共有結合法により固定化したところ、未修飾フイルムに比べて両者とも劇的に細胞接着の向上が見られた。以上のことより、アルギニン部分は、アミノ酸を置換し側鎖長などを変化させてもグアニジド基があれば活性発現が見られるが、アスパラギン酸残基は置換することは出来ず側鎖のカルボキシル基の存在の重要性が示唆された。また、グリシン残基部分は、主鎖構造において構造制御可能なアミノ酸であれば、他のアミノ酸に置換しても活性は発現することが判明した。これらに加えて、RGDS配列を有し、特定の2次構造を構築するペプチドを分子設計した。RGDSのN, C両末端にβ-シート構造を有する40残基程度のペプチドを合成したところ、設計通りにβ-シート構造を構築し、さらには水溶液中では不溶化し生体材料として有望であることが明らかになった。また、細胞接着活性も保持されていた。さらに、人工細胞外マトリックス構築のために、アルギン酸を用いたハイドロゲルの設計を行った所、アルギン酸の構造と架橋剤をコントロールすれば種々の含水率のゲルが調製できる事が明らかになった。また、ラットの皮下アルギン酸ハイドロゲルを埋入したところ約7日で分解し、炎症反応も少ないことが明らかになった。これらのRGDSミメティックペプチドを用いて,血小板凝集阻害実験を行い、IC50を求めることによりミメティックペプチドの構造活性相関について検討を加えた。血小板凝集阻害活性実験の結果高活性であった、hRGDSおよびRGDSをポリビニルアルコール(PVA)フィルム上に固定化し、マウス由来線維芽細胞L929を用いて細胞接着活性試験を行った。その結果、hRGDSおよびRGDSをPVAフィルム上に無水コハク酸を用いて共有結合法により固定化したところ、未修飾フィルムに比べて両者とも劇的に細胞接着の向上が見られた。また、ペプチドとPVAフィルム間にスペーサーを導入すると、スペーサーを導入していないものと比較すると培養24時間後には2倍以上の細胞接着が観察された。以上のことが平成12年度の研究で明らかになった主なものである。

その結果、hRGDS, RN7DSおよびRGDSをPVAフィルム上に鉦水コハク酸を用いて共有結合法により固定化したところ、未修飾フィルムに比べて両者とも劇的に細胞接着の向上が見られた。また、ペプチドとPVAフィルム間にスペーサーを導入すると、スペーサーを導入していないものと比較すると培養24時間後には2倍以上の細胞接着が観察された。これらに加えて、RGDS配列を有し、特定の2次構造を構築するペプチドを分子設計した。RGDSのN, C両末端にβ-シート構造を有する40残基程度のペプチドを合成したところ、設計通りにβ-シート構造を構築し、さらには水溶液中では不溶化し生体材料として有望であることが明らかになった。また、細胞接着活性も保持されていた。さらに、人工細胞外マトリックス構築のために、アルギン酸を用いたハイドロゲルの設計を行った所、アルギン酸の構造と架橋剤をコントロールすれば種々の含水率のゲルが調製できる事が明らかになった。また、ラットの皮下アルギン酸ハイドロゲルを埋入したところ約7日で分解し、炎症反応も少ないことが明らかになった。以上のことが平成13年度の研究で明らかになった主なものである。
マルマラ海で発生が予測されている大地震によるイスタンブールでの強震動の予測

本研究は、近い将来にその発生が予測されているトルコのマルマラ海での大地震によるイスタンブールでの強震動の予測を行い、当地での地震災害の軽減に役立てることを目的としている。ある地点での強震動は、震源、伝播経路、地盤特性によって決定される。その内で、地盤特性(サイト特性)が地震災害に大きく影響することはよく知られている。そこで、本研究では、トルコをフィールド(イスタンブールとアダパザール)として、このサイト特性の評価を行った。ここでは、1999年に発生したトルコ・イズミット地震(Mw7.4)の余震による強震動記録に基づく経験的なサイト特性と地盤構造(S波速度構造)に基づく理論的なサイト特性との比較を行い、その評価法の妥当性について検討した。この際に、分担者のOZEL氏は、微動のアレー観測に基づくS波速度構造の推定法及びPropagator Matrix法によるS波増幅特性の理論・計算法をマスターした。また、代表者と分担者は、2003年9月に実際にトルコに出張して微動アレー観測データを取得し、イスタンブールとアザパザールにおけるS波速度構造を推定した。2つのサイト特性評価法による結果は、概ね一致しており、その妥当性が確認できた。これらの成果は、投稿中のもの1つを含め、3つの論文に纏められている。さらに、2003年9月26日に発生した十勝沖地震(Mw8.0)による震災の要因を解明するために、十勝南部地域で微動のアレー観測を行い、S波速度構造に基づくサイト特性を評価した。これに関しては、現在、論文投稿の準備中である。分担者のOZEL氏は、2004年の7月まで外国人特別研究員として北海道大学に滞在することになっており、帰国までには、サイト特性を含んだ強震動予測手法をマスターすることが可能である。1999年8月17日に発生したトルコ,イズミット地震(Mw=7.4)によって,アダパザール市においては、約7000人の死者が出た。このアダパザール市は,300mよりも厚い堆積層に覆われた盆地上に位置している。この大被害の要因を解明するために,大地震の発生後,アダパザール市とその周辺で臨時の強震観測(9点)が行われ,多数のデータが得られている。Ozel氏は,まず,これらのデータの整理を行い,データベースを構築した。次に,アダパザール市の地震波増幅特性を調べるために,同市で得られた記録と近辺の岩盤サイトでの記録の比較を行った。経験的な増幅特性として,市内のS波記録と岩盤サイトのS波記録とのスペクトル比を求めた。その結果,0.5から約5Hzの周波数範囲で25倍ほど市内で増幅されていることがわかった。しかし,それよりも高周波数では,市内では,むしろ減衰されているという結果となった。この一見すると奇異と思われる現象は,このような高周波数では,岩盤サイトでの増幅がより大きいことによると結論づけた。さらに,地震波の増幅に関する理論であるPropagator Matrix法について学んだ。そして,この理論を用いて,経験的な増幅特性を解釈した。その際に,Ozel氏も参加した微動探査法によるS波速度構造を適用した。最後に,アダパザール市で得られた記録に見られる,S波に続く長周期の後続波について解析した。その粒子軌跡の解析から,この波が盆地端部で励起された特殊な波(盆地生成表面波)であることを明らかにした。その結果,1999年のイズミット地震によるアダパザール市での大被害は,S波の大きな増幅に加えて,この特殊な表面波がその要因であると結論づけた。現在,Ozel氏は,これらの研究実績を学術論文に仕上げつつある。

分担者のOZEL氏は、2004年の7月まで外国人特別研究員として北海道大学に滞在することになっており、帰国までには、サイト特性を含んだ強震動予測手法をマスターすることが可能である。
光の量子性を利用した単一微小液滴顕微分光装置の開発と生体分子ゆらぎへの適用

空間捕捉した単一微小液滴の表面にリン脂質などから構成される膜構造を形成し,ここからの発光を高感度に観測することができれば,モデル生体膜のダイナミクスやタンパク質との相互作用を詳細に調査できる可能性がある.そこで本研究では,単一微小液滴におけるモデル生体膜研究として,細胞膜の染色に用いられるシアニン色素に注目し,その発光スペクトルが微小液滴中においてどのような特徴をもつかについて調査した.実験は,自作の単一微小液滴レーザー顕微分光装置を用いて行った.カルボシアニン色素DiIC18(3)およびDiIC18(5)を溶解させた微小液滴に532 nmのCWレーザーを照射し発光スペクトルを観測した.その結果,微小液滴の気液界面における光の全反射に起因するWhispering gallery mode (WGM)が観測された.WGMの解析から,液滴の直径を精密に決定した.また,DiIC18(3)の濃度を固定し,DiIC18(5)の濃度を変化させて微小液滴発光スペクトルを測定したところ,両者の発光強度比に変化が見られた.このことから,DiIC18(3)がドナー分子,DiIC18(5)がアクセプター分子として働き,両者の間で励起エネルギー移動が生じていることが分かった.同様の現象はバルク溶液中でも観測されるが,微小液滴では,バルク溶液で観測される発光強度比と全く異なる結果が得られた.この結果から,微小液滴において,ドナー分子であるDiIC18(3)の発光が微小液滴の共振モードと共鳴し,遠距離にあるアクセプター分子であるDiIC18(5)と共振モードを介して相互作用したこと,つまり共振器共鳴励起エネルギー移動が生じたことが分かった.今年度の研究では,これまでに開発してきた単一微小液滴レーザー顕微分光装置を用い,カルボシアニン色素の両親媒性分子であるDiIC18(3)とDiIC18(5)に注目することで,これらの間に生じる励起エネルギー移動の観測に成功している.また,DiIC18(3)とDiIC18(5)の間に生じる励起エネルギー移動はバルク溶液と異なり,液滴の共振モードを介した共振器共鳴型で進行することを明らかにした.しかしながら,現在観測できている実験データのみからでは,ドナー分子であるDiIC18(3)とアクセプター分子であるDiIC18(5)の間で生じる共振器共鳴型励起エネルギー移動の距離依存性を詳細に明らかにできていないため,追加実験が必要である.そのため,「やや遅れている」と判断した.通常のバルク溶液中では,フェルスター型の励起エネルギー移動が生じることが知られており,エネルギー移動の距離依存性についても詳細に研究されている.一方,微小液滴内で生じる励起エネルギー移動は異なるメカニズム(共振器共鳴型)で生じている.よって,微小液滴内で生じる励起エネルギー移動の距離依存性を明らかにするために,発光スペクトルを測定し,ドナー分子であるDiIC18(3)とアクセプター分子であるDiIC18(5)の濃度変化に伴う発光強度比の変化を詳細に検討する予定である.一方,フェルスター型で励起エネルギー移動が生じる場合,ドナー分子の発光寿命は短くなるが,共振器共鳴型の場合,ドナー分子の発光寿命に変化が生じない可能性がある.このことを明らかにするため,微小液滴に対して,ピコ秒レーザーを用いた時間相関単一光子計数法を適用し,ドナー分子の発光寿命を計測する予定である.空間捕捉された単一微小液滴はミクロな光共振器として働く.自由空間と比べて,微小光共振器の中では電磁場モードの状態密度分布が大きく変化するため,その中におかれた分子の自然放出速度は増強される(Purcell効果).また,空間中に捕捉された単一微小液滴は,表面張力の働きによってほぼ完全な球体を形成するため,共振器の光閉じ込め能力を表わすQuality factor(Q値)が極めて高くなる.よって,微小液滴内に溶存する分子を光ポンピングすると,極めて低いしきい値で,液滴界面近傍からのレーザー発振が観測される.即ち,微小液滴からの超低しきい値レーザー発振やPurcell効果を利用することによって,これまでにない感度で生体分子を検出できる可能性がある.本研究は,光の量子効果を取り入れた新規な高感度単一分子顕微分光法を確立し,これを用いてタンパク質の構造とゆらぎのダイナミクスを解明することを目指している.本年度は1分子レベルの検出感度を達成するために,自作の共焦点レーザー顕微鏡の光学系を改良するとともに,光検出器としてアバランシェフォトダイオードを導入した.テスト計測として,カバーガラス上にスピンコートした蛍光マイクロビーズや蛍光ナノダイヤモンド粒子の1粒子画像の観測を行った.得られた蛍光像を解析することによって,ガラス基板上に分散した蛍光性粒子を1粒子感度で計測できていることがわかった.また,細胞膜染色色素であるシアニン色素を用いて,直径10マイクロメートル程度の微小液滴からの蛍光像を観測することに成功した.本年度は,1分子計測感度を達成することを目指して,自作の共焦点レーザー顕微鏡の改良をおこなった.以前の光路系では,微小液滴を励起するためのレーザー光を3次元イオントラップの横方向から導入していたが,これをイオントラップの上方向から導入するように改良した.これにより,対物レンズを通して励起用レーザー光を効率よく集光することが可能になった.また,微小液滴からの蛍光をビームスプリッターを用いて2方向に分岐し,冷却CCD検出器付きポリクロメータとアバランシェフォトダイオードで同時計測できるようにした.

これにより,微小液滴に溶存した分子の分光情報と位置情報を同時に計測できるようになった.これらの改良による計測感度の向上を評価する目的で,カバーガラス上にスピンコートした蛍光マイクロビーズや蛍光ナノ粒子(量子ドットおよび蛍光ナノダイヤモンド)の1粒子計測を行った.得られた顕微蛍光画像は,離散的な輝点から構成されており,1粒子計測感度を達成できていることを示唆している.3次元イオントラップ内に空間捕捉した単一微小液滴の気液界面にシアニン色素でラベルした界面活性分子を吸着させることで,液滴表面に膜構造を構築した.また,この膜構造を光励起することによって,微小液滴に特徴的なWhispering Gallery mode(WGM)を含む発光スペクトルを観測することに成功した.理論的に算出できる3次元球に対する空洞共振器の共鳴モードとWGMの観測波長を比較することによって,空間捕捉した微小液滴の大きさを正確に評価できるようになった.空間捕捉した単一微小液滴の表面に両親媒性分子などから構成される膜構造を形成し,ここからの発光を高感度に観測することができれば,モデル生体膜のダイナミクスや生体高分子との相互作用を詳細に調査できる可能性がある.そこで本研究では,単一微小液滴におけるモデル生体膜研究の第一歩として,細胞膜の染色に用いられる両親媒性カルボシアニン色素に注目し,その発光スペクトルが微小液滴中においてどのような特徴をもつかについて調査した.両親媒性カルボシアニン色素DiIC18(3)を溶解させた微小液滴に532 nmのCWレーザーを照射したときの発光スペクトルを観測した.DiIC18(3)からの発光が微小液滴の気液界面で全反射すると,界面近傍にWhispering gallery modeと呼ばれる光の定在波が生じる.発光スペクトルに観測された複数のシャープな発光は,微小液滴の界面近傍に生じたWhispering gallery modeに帰属できる.また,DiIC18(3)は分子内に親水基と疎水基をもつ両親媒性分子であることから,微小液滴の気液界面に単分子膜を形成していると考えられる.つまり,発光スペクトルに観測されているWhispering gallery modeは,微小液滴の界面に吸着したDiIC18(3)からの発光に起因していると考えられる.また,古典電磁気学に基づく理論シミュレーションを行い,Whispering gallery modeを与える共振モードの光電場分布を計算した.これを実験結果と比較することによって,光電場の強度が界面から500 nm程度の位置で最大になっていることがわかった.さらに,シアニン骨格の鎖長が長いDiIC18(5)の発光スペクトルにおいても,Whispering gallery modeに帰属できるシャープな発光線が観測できた.これに関しても理論シミュレーションと実験結果の比較を行い,DiIC18(3)のときに得られた結果と矛盾しないことを明らかにした.今年度は微小液滴の気液界面に,色素骨格をもつ両親媒性分子から構成された単分子膜を形成することに成功した.また,単分子膜をレーザー励起することによって,液滴界面からの発光スペクトルが示すWhispering gallery modeを観測した.Whispering gallery modeの理論モデルに基づき,光が界面近傍につくる光電場の空間分布についてシミュレーションした結果は,実験結果をよく再現していた.
自己免疫疾患の出産後発症予測とその予防に関する研究

各種自己抗体を妊娠初期に測定し、関連した自己免疫疾患の出産後発症予測を検討した。さらに発症予測可能な症例につき、その発症予防を試みた。1.潜在性自己免疫疾患の把握:血中自己抗体測定により、少なくとも自己免疫性甲状腺疾患の潜在病型が診断できることが確立された。慢性関節リウマチも確率は低いがリウマチ因子により把握可能と考えられた。他の自己免疫疾患も、同様の考え方が出来る可能性が示唆された。2.妊娠初期における各種自己抗体の出現率:初期妊婦を対象に7種の自己抗体を測定した。出現率はミトコンドリア抗体が0.08%と低く、甲状腺マイクロゾーム抗体は10.6%の頻度を示し、自己免疫疾患予備群がかなり存在することが確認された。3.橋本病・甲状腺機能低下症の出産後発症予測:妊娠初期の抗甲状腺マイクロゾーム抗体価が2万倍以上の高値を示す例は、出産後甲状腺機能低下症が発症した。また機能低下症発生直前に破壊性甲状腺中毒症も発生することが明らかとなった。これらの変化の90%以上は一過性であったが、出産後女性の500人に1人に永続性甲状腺機能低下症が発生することも明らかにされた。4.バセドウ病の出産後発症予測:妊娠初期にマイクロゾーム抗体を測定し、抗体陽性例を対象にTSH受容体抗体(TSAb)を高感度法で測定した。TSAb陽性の7割で出産後バセドウ病の発症が見られ、一般妊婦の200人に1人と高頻度であった。5.慢性関節リウマチの出産後発症予測:リウマチ因子(RA及びRAHA)陽性の62.5%に出産後関節痛が発生し、25%で慢性関節リウマチが発生し、一般出産後婦人の1400人に1人の頻度であった。6.出産後自己免疫疾患の発症・増悪の予防:出産直後よりの短期少量ステロイド治療で発症予測された甲状腺機能低下症の発症予防が可能となった。7.自己免疫疾患の出産後発症機作:妊娠中の免疫抑制状態が出産により急速に消失し、出産後その反跳現象で免疫亢進が起こることが明らかにされた。今後ほとんどの自己免疫疾患の出産後発症予測が可能となると同時に、その予防が実現されるものと考えられる。女性に多い自己免疫疾患を将来半減させる可能性が強く示唆された。1.出産後自己免疫性甲状腺症候群の大規模スクリーニン:大阪府下の主要な産科12施設と協力したスクリーニングによって、13023例の初期妊婦中958例(6.4%)の潜在性自己免疫性甲状腺炎と126例(0.97%)の顕性機能異常例を発見した。潜在性自己免疫性甲状腺炎のうち出産後機能異常を発症したものも発見されたが、出産後のフォローアップが不可能であった例も多く、出産後のフォローアップ体制の検討が今後の課題である。2.出産後慢性関節リウマチ発症の疫学的検討:慢性関節リウマチ患者にたいするレトロスペクティブな研究によって、出産の経験ある慢性関節リウマチ患者における発症時期は出産後2年以内に集中しており(27%)、慢性関節リウマチのような全身性の自己免疫疾患においても出産が発症のつよい引き金となりうる事が確認された。3.出産後自己免疫性肝炎、出産後自己免疫性心筋炎診断法の開発a)抗チトクロームP450自己抗体検出系の開発:ヒトチトクロームP450 IID6、IIC9遺伝子を酵母に組み込み、ヒトリコンビナントチトクロームP450 IID6、IIC9を大量発現させ、そのマイクロゾーム分画を得た。これをプレートに固相化して、患者血清中の抗ヒトチトクロームP450自己抗体検出のためのELISA系をセットアップした。さらに、系の基礎検討をおこなったが、健常者血清で酵母の構成蛋白に対する抗体が高率に検出されるために疑陽性が多いことが分かった。そのため、リコンビナントチトクロームP450の精製を進めた系をセットアップ中である。b)抗心筋ミオシン自己抗体検出系の開発:ヒト心筋ミオシン重鎖遺伝子の一部を大腸菌に発現させたリコンビナント蛋白を大量発現させた。これをプレートに固相化して、患者血清中の抗ヒト心筋ミオシン自己抗体検出のためのELISA系をセットアップした。さらに心筋ミオシンの全体を得るために重鎖遺伝子の全長をカバーする6クローンを得た。これらのELISA、Western blotでは、産褥心筋症患者の一部に高力価の自己抗体を検出した。しかし、健常者にもミオシン抗体が検出される例が多く、診断特異性をあげるためには、病因的意義のある抗原決定基を調べ、その検出に特化した検出系が必要であると考えられた。

3.橋本病・甲状腺機能低下症の出産後発症予測:妊娠初期の抗甲状腺マイクロゾーム抗体価が2万倍以上の高値を示す例は、出産後甲状腺機能低下症が発症した。また機能低下症発生直前に破壊性甲状腺中毒症も発生することが明らかとなった。これらの変化の90%以上は一過性であったが、出産後女性の500人に1人に永続性甲状腺機能低下症が発生することも明らかにされた。4.バセドウ病の出産後発症予測:妊娠初期にマイクロゾーム抗体を測定し、抗体陽性例を対象にTSH受容体抗体(TSAb)を高感度法で測定した。TSAb陽性の7割で出産後バセドウ病の発症が見られ、一般妊婦の200人に1人と高頻度であった。5.慢性関節リウマチの出産後発症予測:リウマチ因子(RA及びRAHA)陽性の62.5%に出産後関節痛が発生し、25%で慢性関節リウマチが発生し、一般出産後婦人の1400人に1人の頻度であった。6.出産後自己免疫疾患の発症・増悪の予防:出産直後よりの短期少量ステロイド治療で発症予測された甲状腺機能低下症の発症予防が可能となった。7.自己免疫疾患の出産後発症機作:妊娠中の免疫抑制状態が出産により急速に消失し、出産後その反跳現象で免疫亢進が起こることが明らかにされた。今後ほとんどの自己免疫疾患の出産後発症予測が可能となると同時に、その予防が実現されるものと考えられる。女性に多い自己免疫疾患を将来半減させる可能性が強く示唆された。各種自己抗体を妊娠初期に測定し、関連した自己免疫疾患の出産後発症予測を検討した。さらに発症予測可能な症例につき、その発症予防を試みた。1.潜在性自己免疫疾患の把握:血中自己抗体測定により、少なくとも自己免疫性甲状腺疾患の潜在病型が診断できることが確立された。慢性関節リウマチも確率は低いがリウマチ因子により把握可能と考えられた。他の自己免疫疾患も、同様の考え方が出来る可能性が示唆された。2.妊娠初期における各種自己抗体の出現率:初期妊婦を対象に7種の自己抗体を測定した。出現率はミトコンドリア抗体が0.08%と低く、甲状腺マイクロゾーム抗体は10.6%の頻度を示し、自己免疫疾患予備群がかなり存在することが確認された。
ニューロメジンB受容体の機能解析

1.遺伝的背景がC57BL/6系統に近いNMB-Rホモ欠損型マウスを得た。このマウスの脳では正常型NMB-Rの発現がないこと、さらに、リガンドが結合しないこと、すなわちNMB-Rの機能が不活性化していることを確認した。2.欠損マウスでは、血糖値、インスリン、プロラクチン、ガストリンなど各種ホルモンの血中濃度は、正常マウスと変わらなかった。3.各種反射、運動、感覚、知覚能力は正常であった。4.正常マウスでNMB-Rの発現が見られる、脳と消化管組織の組織を通常染色によって調べた限りでは、特に際だった異常は検出できなかった。また、抗体を用いた脳切片の免疫組織学的解析では、ACTH放出ホルモン(CRF)、オキシトシン、アルギニンバソプレッシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、ガストリン放出ペプチド(GRP)、ニューロペプチドY、チロシン水酸化酵素、ソマトスタチン、アセチルコリン、エンケファリン、サブスタンスPの発現には変化がなかった。5.NMB-R欠損マウスでは、背側縫線核におけるセロトニン発現の昂進が認められた。また拘束ストレス後では、欠損マウスは正常マウスに比べ、同核でのセロトニン発現量の増加が少ないことから、ストレスに対する反応が変化していることが示唆された。さらに、視床下部傍室核でのc-Fos発現細胞数も、非ストレス条件下における欠損マウスでは増加していることが明らかになった。強制水泳においては、欠損マウスで不動時間の増大がみられるなど、生理的ストレスに対して敏感に反応することが行動学的にも認められた。6.ノックアウトマウスにin vivoで、あるいは単離した組織にNMBやGRPを作用させた結果、NMB/NMB-R系は、体温調節には重要な役割を担っているが、胃の平滑筋の収縮や摂食抑制にはほとんど関与していないことが示唆された。1.ニューロメジンB受容体(NMB-R)欠損マウスの作出と遺伝子欠損の確認:NMB-Rヘテロ欠損型をC57BL/6系統のマウスにバッククロスすることにより遺伝的背景のより等しいNMB-Rヘテロ欠損型マウスを得たので、さらにこれらのマウスを交配して、NMB-Rホモ欠損型マウスを得た。このマウスの脳よりRNAを抽出し、RT-PCR法を用いて正常型NMB-Rの発現がないこと、さらに、脳切片を用いたバインディングアッセイによってリガンドが結合しないことを確認した。2.ノックアウトマウスの各種反射、運動、感覚、知覚の解析:行動のスクリーニング的解析を行った結果では、反射、運動、感覚、知覚能力といった比較的単純なものは正常であった。しかし、生理的ストレスに対して敏感に反応することが認められたので、これについては来年度も引き続き解析していく。3.ノックアウトマウスの組織解析:正常マウスでNMB-Rの発現が見られる、脳と消化管組織の組織を通常染色によって調べた限りでは、特に際だった異常は見られていない。今後、抗体染色を用いて解析を続ける。4.血液の生化学的解析:血糖値、インスリン、プロラクチン、ガストリンなど各種ホルモンの血中濃度は、正常マウスと変わらなかったが、生理的ストレスを与えると、血糖値が正常マウスよりも上昇することが分かったので、詳細な解析を続行中である。5.NMBとGRPの役割分担について。:ノックアウトマウスにin vivoで、あるいは単離した組織にNMBやGRPを作用させた結果、NMB/NMB-R系は、体温調節には重要な役割を担っているが、胃の平滑筋の収縮や摂食抑制にはほとんど関与していないことが示唆された。

このマウスの脳では正常型NMB-Rの発現がないこと、さらに、リガンドが結合しないこと、すなわちNMB-Rの機能が不活性化していることを確認した。2.欠損マウスでは、血糖値、インスリン、プロラクチン、ガストリンなど各種ホルモンの血中濃度は、正常マウスと変わらなかった。3.各種反射、運動、感覚、知覚能力は正常であった。4.正常マウスでNMB-Rの発現が見られる、脳と消化管組織の組織を通常染色によって調べた限りでは、特に際だった異常は検出できなかった。また、抗体を用いた脳切片の免疫組織学的解析では、ACTH放出ホルモン(CRF)、オキシトシン、アルギニンバソプレッシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、ガストリン放出ペプチド(GRP)、ニューロペプチドY、チロシン水酸化酵素、ソマトスタチン、アセチルコリン、エンケファリン、サブスタンスPの発現には変化がなかった。5.NMB-R欠損マウスでは、背側縫線核におけるセロトニン発現の昂進が認められた。また拘束ストレス後では、欠損マウスは正常マウスに比べ、同核でのセロトニン発現量の増加が少ないことから、ストレスに対する反応が変化していることが示唆された。さらに、視床下部傍室核でのc-Fos発現細胞数も、非ストレス条件下における欠損マウスでは増加していることが明らかになった。強制水泳においては、欠損マウスで不動時間の増大がみられるなど、生理的ストレスに対して敏感に反応することが行動学的にも認められた。6.ノックアウトマウスにin vivoで、あるいは単離した組織にNMBやGRPを作用させた結果、NMB/NMB-R系は、体温調節には重要な役割を担っているが、胃の平滑筋の収縮や摂食抑制にはほとんど関与していないことが示唆された。
甲状腺未分化癌の治療法確立に向けて(SLE関連遺伝子Ifi202の治療への応用)

本研究はSLE関連遺伝子でIL12の発現を促進させる働きを持つと我々が報告したIfi202のヒトホモログであるIfi16をがん治療に応用することを目的として行った。IL12の発現を促進することで、Th1細胞が誘導され抗腫瘍効果の増強が期待される。当初の計画では悪性度が高く治療困難である甲状腺未分化癌での解析を目的としたが、甲状腺未分化は頻度が低く症例数が限られるためまずは中咽頭扁平上皮癌(SCC)におけるIfi16の役割について検討した。頭頸部SCCにおいてIfi16高発現群そしてヒト乳頭腫ウィルス(HPV)感染群では予後が良好であるという先行研究があり、また近年HPV陽性中咽頭SCC症例は治療反応性であり予後が良好であるという多数の報告がされており、まずはHPV陽性群が予後良好である要因としてIfi16が関与しているという仮説を立てそれについて検討した。未治療中咽頭SCCの切除標本を用いて、免疫染色でHPV感染のマーカーであるp16タンパクとIfi16タンパクの発現を調べ、それらと治療予後との関連について検討した。過去の報告のとおりHPV陽性(p16陽性)群では陰性群と比較して予後が良好である結果が得られたが、Ifi16の発現の有無によって予後の違いは見られなかった。またp16の発現とIfi16の発現の有無に相関は見られなかった。先行研究の結果と異なりIfi16発現による予後の違いがみられなかった原因としてHPVE6/E7タンパクとがん抑制遺伝子であるpRbタンパクの関与の可能性が考えられた。今後、中咽頭SCCにおけるIfi16とE6/E7タンパク、pRbタンパクとの関わり、また甲状腺未分化癌におけるIfi16の関与についての検討を行う必要があるが、海外の研究機関に採用されるため、平成25年3月で現在の職を辞職することとなり、中途で補助事業を廃止承認申請することとなった。平成23年度に当初予定していた研究内容は、甲状腺未分化癌細胞株の樹立と、その細胞株におけるサイトカイン等分子の発現の解析であったが、当院で治療を行った甲状腺未分化癌症例は無く、甲状腺未分化癌細胞株の樹立はできなかった。並行してIFI16タンパク(p202タンパクのヒトアナログ)の甲状腺未分化癌における機能解析を行う予定であったが、細胞株が樹立できていないため、予備実験として、未治療頭頸部癌(下咽頭癌細胞株、中咽頭側壁癌切除標本)を用いて、IFI16(p202タンパクのヒトアナログ)の発現と治療反応性、予後に関する検討を行っている。また中咽頭側壁癌は近年、ヒト乳頭腫ウィルス(HPV)関連の場合に予後が良好であるということが注目されており、その分子メカニズムにIFI16タンパクが関与しているかについての検討を行っている。下咽頭癌細胞株において、IFI16mRNAの発現がみられることをRT-PCR法にて確認した。また、中咽頭側壁癌切除標本において、免疫組織学的な検討を行ったところ、発現のみられない症例から弱く発現するもの、比較的強く発現している症例とがあることが判明した。HPV感染との関連を検討するためにHPV感染によって発現が上昇するp16タンパクの発現を同様に検討したところ、発現のみられる症例とみられない症例とがあった。現在、症例数を増やして発現量の検討しているところであり、臨床的な治療反応性や予後との関連を検討する予定である。

甲状腺未分化癌症例が平成23年度内に当院で診断されなかったため、別の頭頸部癌(中咽頭側壁癌)における検討を行っているため甲状腺未分化癌における解析については進んでいない。そのため、他の頭頸部癌における予備実験を進めており、今後甲状腺未分化癌細胞、組織が得られた場合に速やかに検討を進める予定である。甲状腺未分化癌細胞、組織が得られたら、細胞株を樹立しサイトカイン等の免疫分子の発現を解析する。また、現在行っている中咽頭側壁癌におけるIFI16の機能の解析を進める。またHPV感染中咽頭癌が予後良好となっている分子メカニズムにIFI16がどのように関与しているのかについて検討を行う予定である。癌細胞株における検討を行うための細胞培養、RNA抽出、PCR、遺伝子導入試薬の購入。免疫染色を行うための試薬の購入。研究成果発表のための旅費、参加費。
高血圧腎障害における凝固線溶系の変化と繊維化の機序の解明及びそれに基づく新たな治療法の探索

レニン・アンジオテンシンシステム(RA系)の障害は、高血圧性腎不全および鬱血心不全の病態生理学に深く関わっている。また、RA系は、凝固線溶システムおよび組織の繊維化において重要な役割を果たすplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)を誘導する。本研究では、RA系の亢進が腎臓の固有細胞に与える影響をPAI-1に注目して検討し、更に高血圧腎障害動物モデルを用いて腎障害におけるPAI-1の役割を検討し、高血圧性腎疾患の発症機序を分子レベルで解明し、それに基づく合理的かつ革新的治療法に向けての研究を行うことを目的とする。不死化したラット尿細管細胞株(IRPTC)及びマウスメサンギウムアンジオテンシンIIレセプター1のwild typeとknockout type細胞を培養していた。Angiotensin II receptor blocker(ARB)の一つであるtelmisartanを上記細胞培養液に投与し、24時間後蛍光プローブCM2DCFH-DAで標識し、フローサイトメトリー(FACScan)及び蛍光microplate readerにより測定した。Ang IIの投与により細胞内過酸化物の増加が見られた一方、knockoutメサンギウム細胞内過酸化物の増加は見られなかった。よって、angiotensin IIに誘導される酸化ストレスのレセプター依存性とドーズ依存性が認められた。更に、細胞内PAI-1、酸化酵素catalase、glutathione peroxidaseの遺伝子の発現は、real-time PCR法より調べた。Angiotensin II及び外因性H_2O_2により誘導された酸化ストレスとPAI-1 mRNA発現の増加が、wild typeとknockout細胞のいずれもtelmisartanの投与により抑制された。以上telmisartanの作用はアンジオテンシン・レセプターの非依存性を強く認めた。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法よりtelmisartanの細胞内濃度を測定し、高い脂溶性を持つことを実証した。また、angiotensin II持続投与高血圧腎障害ラットを作製し、ARB及び開発中のPAI-1阻害剤Aの投与により、腎障害の各指標は明らかに改善されたことを認めた。結論として、酸化ストレスの改善とPAI-1発現の阻害は高血圧腎障害疾患の治療に重要な機転だと示唆された。レニン・アンジオテンシンシステム(RA系)は高血圧症における世界的研究の中心となってきた。このシステムは、血圧及び水、電解質の平衡など、様々な腎機能を調節する際に重大な役割を果たしている。RA系は、凝血線溶システム及び組織の繊維化において重要な役割を果たすplasminogenactivator inhibitor-1(PAI-1)を誘導する。本年度の研究では、RA系の亢進が腎臓の固有細胞に与える影響をPAI-1に注目して検討した。上記の実験と同じく、IRPTC培養液でtelmisartan(組織親和性の良いARB)また化合物A(PAI-1阻害剤の1つ)10^<-5>Mを添加し、24時間37度で培養した細胞のPAI-1 mRNA発現は、正常細胞に比べて、2^<10.6>また2^<8.8>倍増加したが、angiotensin IIの単一刺激により、PAI-1 mRNAの発現は減少した。3.マウスメサンギウム細胞におけるangiotensin IIの酸化ストレス作用4.動物生体内の予備実験Angiotensin II持続投与高血圧腎障害モデルを、浸透圧ポンプをラット皮下に埋め込むことにより作製し、経時的に血圧、腎機能、蛋白尿、組織学的解析を行った。免疫組織学的解析によりAngiotensin II投与した動物の尿細管間質におけるPAI-1の増加を明らかにした。今後、angiotensin IIによりPAI-1亢進と酸化ストレスの関連について、より詳しい機序の解明を目指している。また、PAI-1阻害剤及び既知のARBにより、高血圧腎障害疾患の改善機転を検討する。このシステムは、血圧および水、電解質の平衡など、様々な腎機能を調節する際に重大な役割を果たしているRA系は、凝血線溶システムおよび組織の繊維化において重要な役割を果たすplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)を誘導する。RA系の亢進が腎臓の固有細胞(IRPTC)に与える影響をPAI-1に注目して検討した。本年度の研究では、angiotensin IIによりPAI-1の亢進と酸化ストレスの関連について、調べてみた。アンジオテンシン・レセプター・wild typeとknockoutマウスのメサンギウム細胞を培養し、24時間各濃度angiotensin II(10^<-8>M10^<-5>M)の刺激により、CM2DCFH-DA標識した細胞内過酸化物を定性的(フローサイトメトリーにより)および定量的(蛍光96-well microplate readerにより)検出した。また、wild typeメサンギウム細胞で酸化ストレスの増加は10^<-5>M angiotensinの刺激で最も大きいと見られた。細胞内過酸化物の増加が見られた一方、knockoutマウスメサンギウム細胞内過酸化物の増加は見られなかった。さらに、angiotensin IIの刺激により細胞内PAI-1 mRNAの発現について、knockoutマウスメサンギウム細胞で有意な増加が見られなかった。