hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
燃料電池内部の水分量を適正に動的コントロールできる可変ガス流路の開発

平成23年度は,氷点下環境での発電を想定した燃料電池内部低含水時の起動と発電のためのガス流路の最適な可変タイミングの知見を得るため,格子ガス法による数値解析と実験を行った.なお本年度の実験では,リブを小型アクチュエータで機械的に動かすことでガス流路の任意に変更をできるようにした.まず,各ガス流路における初期水分量と発電特性との関連および起動限界初期水分量を数値解析と実験で調べた.その結果,起動が可能な燃料電池内部の初期含水率は,サーペンタイン型よりもストレート型の方が低いことが分かった.次に,ガス流路の切り替えタイミングであるが,セル(燃料電池)内部の水分量との関連があるセル(燃料電池)抵抗情報が有用であることが分かった.そこで,より低含水率で発電可能なストレート型で起動し,セル内部の適切な水分量をセル抵抗で判断し,サーペンタイン型流路を切替えれば,低保水状態での起動および安定発電が可能となることが分かった.なお,本研究成果は,第49回日本伝熱シンポジウム(2012年:富山)および,3rd International Forum on Heat Transfer 2012(2012年:長崎)で発表予定である.平成24年度は,マイコン制御によるガス流路変更の自動化に成功した.平成23年度の実験において,無加湿,低保水状態で起動した際,発電初期に出口側のガス流路面が生成水によって曇ることが観察されていた.そこで,可視化面の曇りによる赤外線受光量変化を感知する赤外線センサを流路切り替え指標のセンサとし,モータの回転をマイコン制御する可変ガス流路の自動化を試みた.その結果,サーペンタイン型流路で発電しない低含水条件において,保水性の良いストレート型流路で起動すると,赤外線センサが発電初期のMEA内部の水分増加による曇りを感知し,プログラム制御されたマイコンによって,モータを駆動させ,ガス流路をストレート型からサーペンタイン型に変更し,長時間の発電が可能となることが確認できた.また,発電後に膜電極接合体(MEA)を取り出し,赤外線熱画像装置でその熱画像を取ることでMEA内部の水分分布を推測する方法を確立した.これにより発電時の水分挙動の検証が数値解析結果と合わせて行えるようになった.実験に関しては,最適な水分状態を得るためのガス流路選択(切替え)タイミングに対して,これまでの実績から燃料電池内の温度変化の検知がその判定パラメータに成り得るとの結果を得ていたが,平成23年度の実験において,ガス流路の切替えタイミングに燃料電池の抵抗情報が有用であることが新たに判明した.また,平成23年度は流路切替えのためのリブの移動を手動ではなく小型アクチュエータで機械的に行えるようにした.数値解析に関しては,平成23年度に発電モデルを新しくしたことで,従来再現できていたフラッディング・プラッギングによる出力低下だけでなく,膜電極接合体(MEA)の乾燥(ドライアウト)を反映した出力低下を再現できるようになった.ガス流路変更の自動化(実験)◎マイコン制御タイプ:平成25年度は,平成24年度に試作したマイコン制御技術をもとに,ガス流路幅を狭くしたサーペンタイン型ーストレート型切替えタイプやリブの移動でガス流速を局所的に変えることのできるタイプなどの自動化を試みる.また平成24年度に確立したMEA内部の水分分布可視化技術(赤外線熱画像)をもとに,ガス流路の切り替えによるMEA内部の水分分布変化と出力変化の関係を明らかにする.この赤外線熱画像から水分分布を推定する可視化法には,可視化雰囲気の温度と湿度を一定に保つ必要があり,これまでは恒温・恒湿室を使用してきたが,空間が広いため撮影部近傍の細かな温湿度制御が困難であった.
四次元治療計画による呼吸性移動腫瘍の高精度重粒子線治療に関する研究

4DCTを用いた呼吸性移動臓器の動態定量化について、変形フュージョン(レジストレーション)ソフトウェアを利用し、実臨床データを利用できる環境を構築した。また、複数の3DCT画像(4DCT画像)に対して、同一の治療計画条件を用いて一度に線量分布計算が可能となるような治療計画支援ツールを導入した。これにより、異なる体位で撮影されたCT画像同士や、呼吸性移動や変形を伴うCT画像同士の動きを考慮した積算線量分布計算を行い、標的線量評価が可能となった。本研究は、呼吸性移動・変形を伴う臓器(肺)に対する放射線治療(粒子線治療)の精度向上のために、4次元CT画像を用いて臓器動態を定量化し、時間的変動を考慮した線量分布や線量体積ヒストグラム(DVH)等、すなわち4次元治療計画を評価することにより、照射方法の検証及び最適化を行うことを目的としている。本研究では、4DCTを用いた呼吸性移動臓器の動態定量化について、変形フュージョン(レジストレーション)ソフトウェアを利用し、実臨床データを利用できる環境を構築した。また、そのような多くのCT画像上での線量分布計算が可能となるような治療計画支援ツールを導入した。これにより、異なる体位で撮影されたCT画像同士や、呼吸性移動や変形を伴うCT画像同士の動きを追えること、これら移動や変形を考慮した線量分布計算が行えることが確認できた。動きを考慮した線量分布を得るために、10%毎に再構成された4D-CT画像に対して、計画と同条件にて線量分布計算を行った。それら4D-CT各位相で計算された線量分布について、変形レジストレーションソフトを用いて各位相の線量分布を呼吸同期CT画像上に移し、ぞれぞれ単一の位相について、また、いくつかの位相間について積算することでそれぞれの位相や位相範囲内の積算線量分布を求めた。積算線量分布に対してDVHによる確認を行った。積算する位相の範囲をいくつか想定し、それらの標的体積に対する線量カバレージについて調べた。その結果、積算した線量分布では、実際の呼吸ゲートよりも広範囲でゲートをかけたと想定したものでも、標的への線量がカバーされることが示された。これはゲート照射の堅牢性を示しており、現実的に多少の位置ずれや再現性のずれが許容されることがわかった。また、この手法を用いることにより、より長時間のゲートを採用して治療の時間的な効率を上げられる可能性も示唆された。本年度は、4DCTを用いた呼吸性移動臓器の動態定量化について、変形フュージョン(レジストレーション)ソフトウェアを利用し、実臨床データを利用できる環境を構築した。これにより、異なる体位で撮影されたCT画像同士や、呼吸性移動や変形を伴うCT画像同士の動きを追えることが確認できた。研究実施計画では、本年は4DCTを用いた呼吸性移動臓器の動態定量化および、体位移動を考慮した重粒子線治療計画における合成線量分布評価を行うこととしており、実際はそれに加えて時間変動を伴う4DCT画像に対する線量分布の評価まで開始することができたため、概ね順調に進展していると考える。変形レジストレーションソフトウェアを利用することにより、目的とする呼吸性移動や変形といった時間的な変化を考慮した重粒子線の線量分布を評価することが可能となった。ここでは使用するソフトウェアの変形の特徴や精度に依存する。しかしながら、このようなソフトの特徴や精度は、使用するCT画像により異なり、十分には明らかになっていない。そこで、このような変形の特徴や精度を理解した上で、実臨床に用いていくために、様々な画像を用いて変形の特徴や精度を把握する必要がある。今後はそのような目的を含めて実臨床画像を用いた実例数を増やしていく予定である。

多くのデータを処理するための計算機やソフトウェア、結果を報告するための国内外学会の参加費、論文投稿にかかる費用に使用する予定である。上記計算機やソフトウェアは前年度購入予定であったが、未購入のため次年度購入予定である。
ニューラルネットワーク型非線形システムの設計及び実装に関する研究

本年度は、主に以下の二つの研究を行った。一つは、非線形回帰のための効率的分割法の収束性解析である。大量の訓練サンプルを扱う場合、Support Vector Machine(SVM)では大規模な凸2次計画問題を解かねばならず、これが学習時間の増大を招き、最悪の場合、求解すら困難になってしまう。この問題を解決するために、分割法が広く用いられている。分割法では、大規模凸二次計画問題が一連の小規模凸二次計画問題に分割され、各小規模問題は元の問題よりもずっと高速に解けるため、全体の計算時間も短くなる。去年の研究では、非線形回帰問題に対するSequential Minimal Optimization (SMO)という分割法の開発と収束性証明をした。今年は、一般的な分割法を考え、伝統的な大域収束定理により、FlakeとLawrenceによって定式化された凸二次計画問題に対する分割法が有限回の反復で停止することを証明した。もう一つは、SVMの分割法におけるWorking Setの選択である。分割法では、小規模最適化問題を繰り返し解くことによって、元の最適化問題の解を求める。元の最適化問題の変数の一部を取り、ほかの変数を固定するのはWorking Setの選択という。分割法の収束のスピードがWorking Setの選び方に大変依存する。従来は、最急降下法に基づいて選択する。これは、解の収束が遅いという欠点がある。本研究では、この欠点を克服するために生まれた共役勾配法を使っていた。理論的には全ての探索方向が直交するので、制約なしの最小化問題を解く際、探索空間の次元数の繰り返しで最小値を求めることができるという利点がある。実験では、大規模なデータを使い、共役勾配法の有効性を検証した。本年度は、主に以下の二つの研究テーマを行った。1.SVMの識別関数簡単化のための学習アルゴリズムの構築Support vector machine(SVM)では、不必要に多数のサポートベクトル(Support Vector,以下SV)が生じることがある。SVが多ければ識別関数が複雑になり、テストサンプルの識別速度が遅くなってしまう。本研究では、識別超平面を大きく変化させることなく、できるだけ多くのSVを削除する学習アルゴリズムの構築を行った。具体的には、VapnikとChapelleが提案したスパンという概念を利用して各SVの識別超平面に対する影響度を評価し、影響度の小さいSVから順に削除するという方法である。本研究では、アルゴリズムの定式化、動作解析、実装、数値実験による有効性の検証を行った。2.非線形回帰のためのSVMの分割型学習アルゴリズムの開発大量の訓練サンプルを扱う場合、SVMでは大規模な凸2次計画問題を解かねばならず、これが学習時間の増大を招き、最悪の場合、求解すら困難になってしまう。本研究では、非線形回帰に対するSVMの分割型学習アルゴリズムの一種であるSequential Minimal Optimization(SMO)アルゴリズムについて、新しいアルゴリズムの提案とその収束性解析を行った。提案法の特徴は、部分最適化問題を常に厳密に解くのではなく、場合により近似解を求める点である。提案したSMOアルゴリズムに対して理論的に厳密な解析を行い、有限回の反復で任意精度の近似解に到達することを証明した。非線形回帰に対するSMOアルゴリズムはこれまでにいくつか提案されているが、大域収束性が厳密に証明されたのは本研究が初めてである。さらに、提案したSMOアルゴリズムを計算機上に実装し、大規模なデータを使い、有効性を検証した。
小胞輸送に必要な酵母ゴルジ体構成要素の分子解析

ゲノム全塩基配列が1996年に公表された酵母Saccharomyces cerevisiaeの遺伝子の中には、機能未知のものがまだ多数存在している。遺伝子破壊実験から、生育に必須であることが判明しており、かつ膜タンパク質であると予想されるものについて、タグ標識タンパク質を発現させてその局在を調べた。YBR070cの遺伝子産物は、237アミノ酸からなるタンパク質だが、3つの膜貫通領域をもつと予想された。タグ標識したタンパク質は、破壊株で発現するとその致死性を回避することができることから、タグを付加しても正常な機能を失っていないことを確認した。細胞を破砕してそれを遠心分画すると、タグ標識タンパク質は沈殿画分に回収され、その電気泳動試料を煮沸するとタグ標識タンパク質がゲル内に泳動されないという、膜タンパク質固有の特徴を示した。免疫蛍光染色による観察では細胞内に斑点状の像が認められた。このことは、Ybr070cタンパク質がゴルジ体に存在することを強く示唆している。データベース上には、Ybr070cタンパク質がYg1047wというやはり生育に必須で機能未知のタンパク質と結合することが記載されている。Yg1047wは、Atp7,Clc1,Mrpl13,Tub1,Tub3,Ydj1,Gpi17,Tlg1,Las17,Ygr117cなどと結合し、これらの中には小胞輸送の後期と関わりの深いものがあることから、Ybr070cは、ゴルジ体において、小胞輸送の未知の必須な機能をはたしていることが強く示唆される。その機能を明らかにするために、本遺伝子の変異株の取得を試みた。PCRでランダムな塩基置換を遺伝子内に導入させ、プラスミドで遺伝子破壊株中の野生型遺伝子と置換した。約4000の形質転換体のなかから、30°Cでは生育するが37°Cでコロニーを作れない温度感受性株を2つ取得することに成功した。小胞輸送において、ゴルジ体はタンパク質の修飾・成熟化と輸送先の仕分けを行っている。この機能に関わるタンパク質や脂質を明らかにするために、出芽酵母を材料にして生化学的・遺伝学的研究を行った。酵母細胞壁のグルカンのリモデリングに関与しているGas1タンパク質の欠損は、グルカン合成に関わるKre6タンパク質や、輸送されるタンパク質のプロセシングに関わるKex2プロテアーゼの欠損と合成致死性を示し、またスフィンゴ糖脂質の糖転移に関わると予想されるIpt1,Sur1の欠損とは高浸透圧感受性の形質を示した。これらのGas1との同時欠損により形質を示すタンパク質は、酵母細胞を破壊し、ゴルジ体マーカータンパク質を指標に免疫沈降して得られる、ゴルジ由来小胞に含まれるタンパク質の解析、および、タグ標識されたタンパク質を生産する細胞の間接免疫蛍光染色顕微鏡解析から、ゴルジ体に局在することが確認された。一連の変異株のスクリーニングの過程で取得された、gas1欠損変異と合成致死性を示す未知遺伝子をもつNo.725株は、マンノシダーゼ関連遺伝子DFG5の多コピー導入によって抑制され生育可能になるが、これと54%同じアミノ酸配列を持つ相同なDCW1によっては抑制されないという興味深い性質を示した。前述のタンパク質と同様に、No.725株の変異遺伝子産物はゴルジ体の機能に関わると予想されるので、その同定をめざした。形質確認後、No.725株に野生株遺伝子ライブラリーを導入して回復するものを取得し、塩基配列を決定することにより、原因遺伝子の同定を進めている。
腸内菌による薬剤性潰瘍の抑制機序の解明

2.総胆管-盲腸バイパス手術により胆汁が回腸部を流れないようにしたラットでは、BFMeT誘発潰瘍数が減少したが、BFMeT非投与の場合には回腸内容物中のグラム陰性桿菌の比率は増加しなかった。BFMeT投与による胆汁分泌量の増加も見られなかった。BFMeTまたはgum arabic投与後72時間までは蠕動運動の指標であるtransit indexには差がなかった。BFMeTまたはgum arabic投与後の回腸内容物の抽出液と大腸菌またはL.acidophilusを混合保温したが、BFMeT群とgum arabic群との間には生菌数の経時的変化の差はなかった。3.diclofenacは用量依存的に腸内菌叢中のグラム陰性桿菌の比率および潰瘍数を増加させた。4.抗酸化作用を持つ高脂血症治療薬fluvastatinはBFMeT誘発小腸潰瘍の形成を抑制した。非ステロイド系抗炎症剤による薬剤性小腸潰瘍の発生に腸管内細菌叢がどのように関与しているのか、また、Lactobacillus acidophilusによる潰瘍形成抑制の機序を解明するために、5-bromo-2-(4-fluorophenyl)-3-(4-methylsulfonylphenyl)thiophene(BFMeT)誘発ラット小腸潰瘍をモデルとして以下の点を明らかにした。1.潰瘍形成を抑制するL.acidophilusの培養上清は、in vitroでt-butylhydroperoxideによる赤血球膜の脂質過酸化を抑制し、抗酸化活性を示した。2.各種の抗酸化剤のBFMeT誘発小腸潰瘍に対する影響を調べたところ、活性化好中球から生成される次亜塩素酸を効率よく失活させるアスコルビン酸が非常によく潰瘍形成を抑制した。3.胆管にカニューレを挿入したラットにBFMeT1000mg/kgまたはアラビアゴム溶液のみを投与し、胆汁分泌量を測定したが、有意な差はなかった。4.総胆管-盲腸バイパス手術により胆汁が小腸内を流れないようにしたラットでは、BFMeT誘発小腸潰瘍形成が抑制され、潰瘍形成時に起こるグラム陰性桿菌の増加も抑制された。5.BFMeT投与後に腸管運動が低下し、盲腸内の菌が逆行してグラム陰性桿菌が増加するのではないかと考え、charcoal法でtransit indexを測定したが、アラビアゴム群との差はなかった。昨年度は5-bromo-2-(4-fluorophenyl)-3-(4-methylsulfonylphenyl)thiophene(BFMeT)誘発ラット小腸潰瘍をモデルとして、L.acidophilusの培養上清の投与によって小腸潰瘍の誘発が抑制されること、抑制効果は培養上清中の抗酸化活性によると考えられることを報告した。本年度は、長期にNSAIDと併用されることの多い高脂血症治療薬のうち抗酸化作用を持つfluvastatinをBFMeT投与3日前から実験終了時まで経口投与すると、BFMeT誘発小腸潰瘍の形成が抑制されることを明らかにした。また臨床的に最もよく使用されているNSAIDであるdiclofenacの場合にもL.acidophilusの培養上清によって潰瘍形成が抑制されるかどうかを検討するために、まずdiclofenacが用量依存的に小腸の潰瘍数を増加させ、BFMeTと同様に腸内菌叢中のグラム陰性桿菌の比率を増加させること、および高用量では回腸部の粘膜における過酸化脂質の有意な増加が認められることを明らかにした。
糖尿病モデルラットにおける運動療法とVitamin Dの骨・骨格筋に対する作用

続発性骨粗鬆症の原因である糖尿病の治療におけるビタミンD製剤のエビデンスは少ない.また運動療法は糖尿病・骨粗鬆症両疾患の治療において重要であり,今回これらの血糖値,骨密度,筋に対する治療効果を動物モデルで検討した.【方法】20週齢雄の糖尿病ratを用い,alfacarcidolを投与したA群,トレッドミルによる運動療法を行ったE群,両者を併用したAE群,vehicle投与のみを行ったC群の4群を設定した.2週,6週間介入後のそれぞれにおける血糖値と大腿骨骨密度,前脛骨筋の筋線維断面積(CSA),筋同化遺伝子,筋異化遺伝子を測定した.【結果】<2週群>血糖値・骨密度は群間に有意差はなかった.CSAはC群に比べA群,E群,AE群で有意に大きく,またAE群でA群,E群と比べ有意に大きかった.同化遺伝子について,AE群でのMyoDの発現量はC群より有意に高かった.また異化遺伝子について,A群でのAtrogin-1、E群とAE群でのMuRF-1の発現量は、C群より有意に低かった.<6週群>血糖値はC群に比べE群,AE群で有意に低値だった.骨密度は,C群とE群に比べA群とAE群で有意に高かった.CSAはA群,E群,AE群がC群に比べ有意に大きかった.同化遺伝子に関して,群間に有意差はなく,異化遺伝子に関して,AE群のREDD-1,A群とAE群のAtrogin-1の発現量は、C群に比べ有意に低かった.【考察】Alfacarcidolと運動療法の併用療法は,筋同化遺伝子の増加と異化遺伝子の抑制により早期から筋萎縮を改善した.また長期に行うことで,血糖値改善・骨密度増加効果に加え,継続した異化遺伝子の抑制により筋萎縮を改善した.以上の結果については平成29年度に国内及び国際学会にて発表しており,今年度に英文論文を投稿しPLos One誌に受理された.研究計画に基づいて,実験を終了し,学会発表及び第一報の論文投稿ができた.研究結果に基づいて,英文論文を一報投稿してpublishされたが,得られたデータから更なる学会発表,論文投稿を行う予定である.骨粗鬆症治療薬のひとつである活性型ビタミンD製剤は骨量のみならず筋力を改善する可能性があり,運動療法は糖尿病の血糖コントロールだけではなく骨量や筋力を維持する可能性が考えられる.しかし,糖尿病モデルラットにおいて活性型ビタミンD製剤と運動療法が,骨量や筋量減少を予防・改善するかは明らかとなっていない.そこで,本研究の目的は,糖尿病モデルラットにおいて活性型ビタミンD製剤と運動療法が,糖尿病による骨質劣化や筋量減少を予防・改善するか,さらに骨や筋への作用の機序を明らかにすることである.平成29年度には,プロトコールに沿って動物実験を実施中であり,糖尿病モデルラット(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty:OLETF)を用い,(1)control群,(2)トレッドミルによる運動療法群,(3)活性型ビタミンD製剤(Alfacarcidol)投与群,(4)両治療の併用群の4群と,糖尿病モデルでないcontrol(LETO)ラットを加えた5群で以下の項目を計測中である.1.骨への効果:骨密度測定や骨形態計測,質劣化に関わるAGEsとして血中ペントシジン,ホモシステインの測定. 2.筋への効果:筋力測定,筋張力計を用いた筋力,筋疲労の評価と,筋組織標本により筋断面積の評価. 3.骨格筋の同化・異化に関わる遺伝子(MyoD, Myogenin, Pax7)の発現を,Polymerase chain reaction (PCR)法を用いて測定し,さらに運動療法,ビタミンD投与に共通した筋力改善に作用すると予想されるp38MAPK,PGC1αをWestern blot法を用いて測定し,活性型ビタミンD製剤と運動療法の筋組織への治療効果の機序を検討している.現在プロトコールを実施中であり,結果の得られたものから順次データを解析中である.続発性骨粗鬆症の原因である糖尿病の治療におけるビタミンD製剤のエビデンスは少ない.また運動療法は糖尿病・骨粗鬆症両疾患の治療において重要であり,今回これらの血糖値,骨密度,筋に対する治療効果を動物モデルで検討した.【方法】20週齢雄の糖尿病ratを用い,alfacarcidolを投与したA群,トレッドミルによる運動療法を行ったE群,両者を併用したAE群,vehicle投与のみを行ったC群の4群を設定した.2週,6週間介入後のそれぞれにおける血糖値と大腿骨骨密度,前脛骨筋の筋線維断面積(CSA),筋同化遺伝子,筋異化遺伝子を測定した.【結果】<2週群>血糖値・骨密度は群間に有意差はなかった.CSAはC群に比べA群,E群,AE群で有意に大きく,またAE群でA群,E群と比べ有意に大きかった.同化遺伝子について,AE群でのMyoDの発現量はC群より有意に高かった.また異化遺伝子について,A群でのAtrogin-1、E群とAE群でのMuRF-1の発現量は、C群より有意に低かった.<6週群>血糖値はC群に比べE群,AE群で有意に低値だった.骨密度は,C群とE群に比べA群とAE群で有意に高かった.

CSAはA群,E群,AE群がC群に比べ有意に大きかった.同化遺伝子に関して,群間に有意差はなく,異化遺伝子に関して,AE群のREDD-1,A群とAE群のAtrogin-1の発現量は、C群に比べ有意に低かった.【考察】Alfacarcidolと運動療法の併用療法は,筋同化遺伝子の増加と異化遺伝子の抑制により早期から筋萎縮を改善した.また長期に行うことで,血糖値改善・骨密度増加効果に加え,継続した異化遺伝子の抑制により筋萎縮を改善した.以上の結果については平成29年度に国内及び国際学会にて発表しており,今年度に英文論文を投稿しPLos One誌に受理された.研究計画に基づいて,実験を終了し,学会発表及び第一報の論文投稿ができた.プロトコールで予定された動物実験をすべて終了させ,得られた試料でのデータ収集を進める.得られたデータを解析し,各介入治療群間の比較を行い,結果の分析を行う.結果が得られたところで,学会発表,論文作成を進める予定である.研究結果に基づいて,英文論文を一報投稿してpublishされたが,得られたデータから更なる学会発表,論文投稿を行う予定である.実験で得られた試料の解析が予定どおりの数が実施されず,特に骨格筋遺伝子の解析などに要する費用が次年度に持ち越して実施する予定のため.実験は終了し,今後学会発表,及び論文投稿費用に充てるため.
適応ノイズキャンセラに有効なFIR適応フィルタの提案

適応ノイズキャンセリングの問題は,強い外乱の存在するシステム同定,つまり,空間パラメータの推定問題としてモデル化でき,その中核はFIR適応ディジタルフィルタである.FIR適応フィルタがノイズキャンセラとして有効に動作するためには,速い収束速度を待つことと,十分な騒音抑圧量が必要になる.十分な騒音抑圧量を得るためには,外乱の影響が少なく精度の高いパラメータ推定を行わなければならない.前者に対しては,ある区間の有限な入力信号を取り出し(ブロック化),それのみを用いて適応フィルタを収束させるようなブロック適応アルゴリズムを適用することにより克服した.但し,そのアルゴリズムは,外乱に対し十分なパラメータ推定精度を得ることができない.本研究の目的は,極めて強い外乱が存在しても,十分なノイズキャンセル効果の得られる新しいFIR適応フィルタを開発することである.この目的を達成するために,各ブロックにおける適応フィルタの最終収束係数を平均化し,パラメータの推定精度を向上する手法を提案した.本手本は,低演算量である上に,精度の向上が信号の有色性に依らないというこれまで提案されていなかった新しい利点を有している.また,平均の長さとパラメータ推定精度の向上との関係を理論的に明らかにした.さらに,提案法を実システムに適用する準備と,従来の適応フィルタのノイズキャンセリング効果を検証するために,今回の科学技術研究費にて購入した装置を用いて模擬実験を行った.今後は,提案アルゴリズムを実システムに適用し,その有効性を検証する必要がある.適応ノイズキャンセリングの問題は,強い外乱の存在するシステム同定,つまり,空間パラメータの推定問題としてモデル化でき,その中核はFIR適応ディジタルフィルタである.FIR適応フィルタがノイズキャンセラとして有効に動作するためには,速い収束速度を待つことと,十分な騒音抑圧量が必要になる.十分な騒音抑圧量を得るためには,外乱の影響が少なく精度の高いパラメータ推定を行わなければならない.前者に対しては,ある区間の有限な入力信号を取り出し(ブロック化),それのみを用いて適応フィルタを収束させるようなブロック適応アルゴリズムを適用することにより克服した.但し,そのアルゴリズムは,外乱に対し十分なパラメータ推定精度を得ることができない.本研究の目的は,極めて強い外乱が存在しても,十分なノイズキャンセル効果の得られる新しいFIR適応フィルタを開発することである.この目的を達成するために,各ブロックにおける適応フィルタの最終収束係数を平均化し,パラメータの推定精度を向上する手法を提案した.本手本は,低演算量である上に,精度の向上が信号の有色性に依らないというこれまで提案されていなかった新しい利点を有している.また,平均の長さとパラメータ推定精度の向上との関係を理論的に明らかにした.さらに,提案法を実システムに適用する準備と,従来の適応フィルタのノイズキャンセリング効果を検証するために,今回の科学技術研究費にて購入した装置を用いて模擬実験を行った.今後は,提案アルゴリズムを実システムに適用し,その有効性を検証する必要がある.
内部摩擦の微小塑性理論による薄膜の力学物性の絶対評価

薄膜材料の内部摩擦の振幅依存性を解析して、薄膜を基板に積層したままの状態で、微小塑性に基づく力学応答を非破壊で定量的に評価することを目的とする。そのためには、(a)薄膜材料の測定データから薄膜と基板の内部摩擦を分離し、(b)薄膜における内部摩擦の振幅依存性から転位による塑性歪と応力の関係を正確に定量する必要がある。本研究では、これらの理論を整備することにより内部摩擦の解析手法を確立し、シリコン基板上に積層したアルミニウム薄膜の力学物性の評価に応用した。アルミニウム薄膜を積層した材料について、温度を連続的に変化させて内部摩擦の振幅依存性を系統的に測定した。今回、新たに導出した内部摩擦の構成式を適要することにより、薄膜材料の測定データから薄膜のみに起因する内部摩擦を計算できる。その結果、薄膜の内部摩擦はバルクのアルミニウムの実測値と同じオーダーであることを確認した。また、アルミニウム薄膜における内部摩擦の振幅依存性は、バルクと比べて2桁も高い歪領域で観測されており、さらに膜厚が小さいほど振幅に依存する成分は高歪側に移行した。この振幅依存性データを微小塑性理論に基づいて解析することにより、10^<-9>のオーダーの塑性歪を応用の関数として算出できる。これより、膜厚が小さくなると急激に塑性変形しにくくなっており、変形応用の膜厚による変化は低温ほど顕著であることがわかった。さらに、薄膜における結晶粒径の大きさが膜厚と同程度以上の場合、微小塑性領域での変形応力は膜厚に反比例して変化することを見出した。このような膜厚効果は、薄膜表面と薄膜/基板界面で両端を固定された転位が張り出して往復運動することに起因している。以上のように、薄膜材料の内部摩擦を解析する方法は、引張り試験で得られるような応用-歪特性を非破壊で評価するうえで有効である。薄層材料の内部摩擦の歪振幅依存性を解析して、薄膜を基板に積層したままの状態で、微小塑性に基づく力学応答を非破壊で定量的に評価することを目的とする。そのためには、(a)薄層材料の測定データから薄膜と基板の内部摩擦を分離し、(b)薄膜における内部摩擦の歪振幅依存性から転位による塑性歪と応力の関係を正確に定量する必要がある。本研究では、これらの内部摩擦の理論式を明らかにし、シリコン基板上に積層したアルミニウム膜(厚さ:0.22.0μm)の力学物性の評価に応用した。薄膜材料の内部摩擦は、理論的には薄膜と基板の内部摩擦の弾性歪エネルギー分率の和で表される。この場合の弾性歪エネルギーは振動変形中の試料内の歪分布を考慮すれば求められるので、縦振動、横振動およびねじり振動の各振動モードについて内部摩擦に関する構成式を導出した。今回、この構成式を用いて、自由端横振動法により測定した薄層材料のデータからアルミニウム膜のみに起因する内部摩擦を計算した。その結果、薄膜の内部摩擦はバルクの実測値と同じオーダーではあるが、膜厚が小さくなるにしたがって減少していくことがわかった。一方、アルミニウム膜における内部摩擦の歪振幅依存性はバルクと比べて2桁も高い歪領域で観測されており、さらに膜厚が小さいほど振幅に依存する成分は高歪側に移行した。この振幅依存性データを微小塑性理論に基づいて解析することにより、10^<-9>のオーダーの塑性歪を応力の関数として算出した。

これより、膜厚が小さくなると急激に塑性変形しにくくなっており、微小塑性領域における変形応力は膜厚に反比例して変化することを見いだした。このようなアルミニウム膜の変形応力に対する膜厚効果は、基板のたわみ測定から推定された巨視的な降伏強度の変化ともよく対応している。薄膜材料の内部摩擦の振幅依存性を解析して、薄膜を基板に積層したままの状態で、微小塑性に基づく力学応答を非破壊で定量的に評価することを目的とする。そのためには、(a)薄膜材料の測定データから薄膜と基板の内部摩擦を分離し、(b)薄膜における内部摩擦の振幅依存性から転位による塑性歪と応力の関係を正確に定量する必要がある。本研究では、これらの内部摩擦の理論式を明らかにし、シリコン基板上に積層したアルミニウム膜の力学物性の評価に応用した。各種膜厚(0.22.0μm)のアルミニウム膜を積層した材料について180360Kの範囲で温度を連続的に変化させて内部摩擦の振幅依存性を系統的に測定した。内部摩擦の構成式を適用して、薄膜材料の測定データから薄膜のみに起因する内部摩擦を計算した。その結果、薄膜の内部摩擦はバルクの高純度アルミニウムの実測値と同じオーダーではあるが、膜厚が小さくなるにしたがって減少していくことを確認した。また、アルミニウム膜における内部摩擦の振幅依存性は、バルクと比べて2桁も高い歪領域で観測されており、さらに薄膜が小さいほど振幅に依存する成分は高歪側に移行した。この振幅依存性データを微小塑性理論に基ずいて解析することにより、10^<-9>のオーダーの塑性歪を応力の関数として算出した。これより、膜厚が小さくなると急激に塑性変形しにくくなっており、変形応力の膜厚による変化は低温ほど顕著であることがわかった。さらに、薄厚における結晶粒径の大きさが膜厚と同程度か、それよりも大きい場合、微小塑性領域での変形応力は膜厚に反比例して変化することを見出した。このような膜厚効果は、薄膜表面と薄膜/基板界面で両端を固定された転位が張り出して往復運動することに起因している。
脳タンパク質老化の伝播性と感染性を検証する線虫モデルの確立

SOD1遺伝子変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症(SOD1-ALS)では、ミスフォールド型の変異SOD1タンパク質が病変部位である脊髄運動ニューロンに異常に蓄積する。しかし、ミスフォールド型SOD1の分子構造的特徴や毒性については明らかとなっていない。私たちはこれまでに、変異SOD1がジスルフィド結合でクロスリンクされた「S-Sオリゴマー」が疾患の発症に関わるミスフォールド型SOD1であることを報告してきた(PNAS 2006; JBC 2013)。本研究では、S-Sオリゴマーを特異的に認識する抗体の開発に成功し、病変部位である脊髄前角の運動ニューロンにS-Sオリゴマーが加齢に伴い蓄積することを見いだした(Mol Neurodegener 2017)。一方で、SOD1-ALSの非病変部位である小脳には、S-Sオリゴマーの形成・蓄積は認められなかった。また、SOD1遺伝子に変異を有するALS患者の脊髄には、本課題にて開発したS-Sオリゴマー特異的認識抗体によって検出されるSOD1が蓄積していることを見いだした。よって、病因性変異に伴って、SOD1の構造が不安定化することで、S-S結合の組換え現象が生じ、S-Sオリゴマーが形成することを示すことができた。しかし、S-Sオリゴマーが神経変性に関わる毒性を発揮するのかについては未だ不明のままである。そこで本研究では、S-Sオリゴマーを線虫に投与することでその毒性の評価を行った。その結果、S-Sオリゴマーを添加すると寿命短縮・運動性低下が見られたのに対して、正常型SOD1を投与しても毒性は確認されなかった。以上より、変異SOD1タンパク質はS-Sオリゴマーを形成することで病原性を発揮することを提案する。28年度が最終年度であるため、記入しない。多くの神経変性疾患において、タンパク質線維の異常な蓄積が主要な病理学的変化として観察される。試験管内での実験により、タンパク質は「核形成」と「線維伸長」の二つの過程を通じて線維化し、タンパク質数分子からなる「核」の形成が律速段階であることが知られている。タンパク質線維の興味深い特徴として、それ自体が構造的な鋳型(シード)としてタンパク質線維化を促進する自己複製機能が挙げられる。例えば、タンパク質線維を物理的に剪断し、それらをタンパク質溶液に添加すると、核形成過程がスキップされてタンパク質の線維化が爆発的に進行する。このような自己複製反応は「シーディング」と呼ばれ、神経変性疾患における病態の伝播や感染を制御する分子基盤ではないかと考えられている。本課題では、線虫を利用した新たなシーディングモデルを構築することで、生物間におけるタンパク質線維の感染危険性について、その検証を試みた。まず、筋萎縮性側索硬化症、及び、パーキンソン病の原因タンパク質であるSOD1、及び、α-synuclein(α-Syn)に着目し、各々の線維状凝集体を試験管内にて作製した。また、Ribosomal skippingを利用して、蛍光タンパク質EGFPとSOD1/α-Synを線虫の腸管特異的に発現させたものの、SOD1/α-Synの構造不安定性による分解のためか、その発現量が非常に低いことが分かった。さらに、SOD1/α-Synの線維状凝集体を食餌として与えたものの、線虫内にSOD1/α-Synが不溶性凝集体として蓄積することはなかった。そこで現在は、線虫内でのSOD1/α-Synの発現量、あるいは、発現組織を変化させ、シーディングによる線虫内での凝集促進について検討を進めている。本課題の初年度の研究計画として、SOD1、及び、α-Syn蛋白質を腸管、ならびに、神経系に発現する線虫の作製を予定していたが、各々の蛋白質に対応するcDNAを線虫にマイクロインジェクションする手法・技術を修得し、モデル線虫の作製に成功した。さらに、各タンパク質の凝集体をモデル線虫に食させ、当初の予定通り、シーディングによる凝集体形成についても検討することができた。よって、本課題は概ね順調に進展していると言える。

そこで本研究では、S-Sオリゴマーを線虫に投与することでその毒性の評価を行った。その結果、S-Sオリゴマーを添加すると寿命短縮・運動性低下が見られたのに対して、正常型SOD1を投与しても毒性は確認されなかった。以上より、変異SOD1タンパク質はS-Sオリゴマーを形成することで病原性を発揮することを提案する。初年度にモデル線虫の作製に成功したものの、線虫内に発現させた疾患関連変異型SOD1/α-Syn蛋白質は比較的不安定で、分解されやすいことが考えられた。そこで、疾患関連変異型の中でも比較的熱安定性が高いと考えられている変異体について、それらを発現する線虫を用いて、同様の実験を試みる計画である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
新規線虫病原体の探索

線虫に感染するウイルスを中心に,新規線虫病原体を検出するシステムを構築し,それらの単離・同定を行うことを目的として研究を行った.無菌培養したC. elegansをベイトとして病原体の検出を試みたところ,尾部や陰門の形態的な変化を伴う線虫を検出できたが,病原体による形態的変異であるとは断定できなかった.一方,長鎖二本鎖RNAに注目して線虫のスクリーニングを行った結果,合計で3種類の線虫から長鎖二本鎖RNAを検出し,これらは新規線虫ウイルスである可能性が考えられた.本研究では、昨年に引続きウイルスを中心に新規線虫病原体を検出するシステムを構築し、それらの単離・同定を行うことを目的として研究を行った。土壌中から分離した線虫を観察することによって異常を示す個体の探索を行ったところ、現在のところ病原体によると思われる明らかな異常を示す線虫は見つかっていない。現在も継続して観察するとともに、検出方法の改良を試みている。ベイト法によるウイルスの検出を行うため、C. elegansの無菌培養を行い、野外から採取した線虫の破砕液をフィルター滅菌した後に添加し、昨年度に線虫の尾部が膨らむ現象がみられたが、無菌培地での培養によって脱腸のような状態が引き起こされた結果の可能性が高いことが明らかになった。また、土壌懸濁液中に一定時間接触させたC. elegansをプレート上に移し、形態的変化のみられた個体については、卵巣などに異常がみられたような個体についても次第に回復し、異常が見られなくなった。微生物の感染の有無については、今後、さらに検討する必要がある。ウイルスに対するC. elegansの感受性を高めるため、RNAiの効きにくい変異体rde-1をベイトに用いて、ウイルスのスクリーニングを試みているが、形態的な変化や増殖率が低下するような現象も見られたが、はっきりとした病原体の感染とは判断できず、現在、その原因を検討中である。これまでカビや植物などで,長鎖二本鎖RNAが検出され、それらが新規のウイルスであることが近年明らかになって来ている。そこで線虫を大量培養し、線虫から核酸を抽出し、長鎖二本鎖RNAの検出を試みた。その結果、1種の線虫から抽出した核酸の中に長鎖二本鎖RNAと思われるバンドを電気泳動で検出できた。他の線虫種や系統ではこのようなバンドは検出されないことから、これは新規のウイルスの可能性が考えられた。ベイト法によってウイルスをはじめとする病原体の検出を試みた.無菌培養したC. elegansをベイトとして病原体の検出を試みたところ,尾部や陰門の形態異常が見られた個体が得られたが,その後の再検討の結果,これらの異常は無菌培養の際に引き起こされた生理的要因による可能性が高いと思われた.しかし,病徴が弱い微生物感染の場合,生理状態が悪い場合に病徴が現れることも考えられるので,微生物感染を完全に否定することはできず,今後,感染の有無についてのさらなる明確な指標が必要と考えられた.長鎖二本鎖RNA(dsRNA)に注目して継続してスクリーニングを行った結果,合計で3種の線虫からdsRNAを検出した.そのうちの一分離株から得られたdsRNAについて,塩基配列の決定を行うために抽出液からdsRNAを精製し,新興ウイルスの検出法であるRapid Determination System of Viral RNA Sequences (RDV法)によって遺伝子の増幅を試みたが増幅後のバンドがスメアとなり,塩基配列のためにダイレクトシーケンスに供試ることはできなかった.そのため,単離したdsRNAの逆転写を行った後GenomiPhi V2によってDNA増幅をし,次世代シーケンサーによる解析についても試みたが,塩基配列を決定することができなかった.この理由として,実験に供したdsRNAの量が少ない,または,dsRNAの純度が低かったことが考えられた.現在,より大量に核酸を得るために線虫の大量培養を行っている.また,今回塩基配列決定に供した線虫以外の2種類についても,安定した解析が行えるようなdsRNA量を得られるように,継続して線虫の大量培養を行っている.線虫に感染するウイルスを中心に,新規線虫病原体を検出するシステムを構築し,それらの単離・同定を行うことを目的として研究を行った.無菌培養したC. elegansをベイトとして病原体の検出を試みたところ,尾部や陰門の形態的な変化を伴う線虫を検出できたが,病原体による形態的変異であるとは断定できなかった.一方,長鎖二本鎖RNAに注目して線虫のスクリーニングを行った結果,合計で3種類の線虫から長鎖二本鎖RNAを検出し,これらは新規線虫ウイルスである可能性が考えられた.これまで線虫に感染するウイルスをはじめ、線虫病原体に関する情報は少ない。本研究では、ウイルスや細菌などの微生物を用いた植物寄生性線虫の防除への応用や線虫とこれらの微生物との感染機構の解明、また、これら病原体が線虫相に与える影響を理解するため、ウイルスを中心に新規線虫病原体を検出するシステムを構築し、それらの単離・同定を行うことを目的として研究を行った。1.線虫の形態、行動、生存、増殖に基づく検出。土壌中から分離した線虫を寒天プレート上で培養し、形態、行動、生存、増殖を観察することによって異常を示す個体の探索を行ったところ、現在のところ病原体によると思われる明らかな異常を示す線虫は見つかっていない。2.ベイト法によるウイルスの検出。

C. elegansの無菌培養を行い、野外から採取した線虫の破砕液をフィルター滅菌した後に添加し、線虫に何らかの影響が見られるかを調べたところ、線虫の尾部が膨らむ現象がみられた。この原因について解明するため、培養上清液を新たな健全個体の入った無菌培養液に添加し、その再現性について現在観察を行っている。また、土壌中に存在すると思われる病原体に直接感染させるため、土壌懸濁液中にC. elegansを添加し、一定時間接触させた後、C. elegansをプレート上に移し、形態的変化のみられた個体を1頭ずつ取り上げて新しいプレートに移したところ、腸の色が濃いプレート、卵巣の形態に異常が見られるプレート、死体の多いプレート、細菌のコロニーができることによって線虫の死亡個体がみられるプレートがそれぞれ19、1、5、1プレートみられた。その後の形態および増殖の様子を観察し、その原因の追求を行っている。線虫の形態、行動、生存、増殖のいずれかで異常が観察された線虫について、今のところ病原体かどうかについて結論には至っていないものの、それらの項目を指標に病原体のスクリーニングを行うシステムが大まかに構築できた。一方、生体内には通常は長鎖二本鎖RNAが存在しないことを指標に、大量培養した線虫の一部から長鎖二本鎖RNAが検出され、これはウイルスである可能性が示された。形態的な異常がみられる個体を得ることができたり、また、プレート上で線虫が死亡させる細菌を単離できたため、おおむね順調に研究は進展している。現在行っているスクリーニング方法をさらに改良しながら、引き続きスクリーニングならびに観察を行い、病原体の単離を行っていく。また、表現型の異常がみられたものについては、病原体の有無を線虫の無菌化と再感染実験によって確認するとともに、顕微鏡下での高倍率での観察によって細胞レベルでの変化の詳細に明らかにしていく。また、病原体による感染による異常と確認できた場合は、その病原体の単離を行ない、遺伝子解析を行ない、病原体の同定を行なう。線虫から長鎖二本鎖RNAが検出されたことから、同様に他の線虫種からも二本鎖RNAを指標に新規ウイルスを検出できる可能性がある。そこで様々な線虫種や系統を大量培養し、抽出した核酸中の長鎖二本鎖RNAの有無を指標にウイルスの検出を行なうとともに、今回検出された線虫の長鎖二本鎖RNAについて、遺伝子レベルでの解析を進めていく。現在行っているスクリーニング方法を改良しながら、引き続きスクリーニングならびに観察を行い、さらに病原体の単離を行っていく。また、異常のみられた個体に関してはその原因について検討するとともに、病原体の確認を行い、微生物によるものであれば同定を行っていく。予定よりも消耗品費が必要になりそうであったため,消耗品費を抑えながら人件費も抑えたために当該研究費が生じた.翌年度には主に消耗品費として使用する.本年度はスクリーニング法の検討やスクリーニングを中心に行ったが、観察のための顕微鏡システムをより安く購入することができたため、次年度には、その研究費を得られた病原体の同定などのために活用していく。
小児患者における経口肺高血圧症治療薬のPK/PD研究

【目的】経口肺高血圧症治療薬は1999年にプロスタグランジン製剤が初めて承認されて以降、2005年にはエンドセリン受容体拮抗薬、2008年にはPDE-5阻害薬が承認され、これら治療薬に関するエビデンスの集積が急務とされている。小児において肺高血圧症治療薬は、主に先天性心疾患に伴い発症する肺動脈性肺高血圧症を有する患児に対して投与されている。しかし、小児における有効性および安全性に関する情報は少なく、特に小児においては発達・成長を伴う複雑な背景により体内動態の個人差は大きくなると考えられる。そこで、適切な投与量設定を行うためにPharmacokinetics(PK)とPharmacodynamics(PD)を個別に解析し、薬効および副作用との関係を総合的に評価することは有用であると考えた。本研究は小児の肺高血圧症治療薬服用患者を対象とし、薬物体内動態と薬効および副作用からPK/PD解析を行い、投与量との関係を評価することを目的とした。【結果'・考察】LC/MS/MSにより検出したambrisentan、tadalafil、sildenafilおよびbosentanの保持時間はそれぞれ2.1、2.8、3.5および4.5分であった。全薬物の血漿中濃度の定量限界は2ng/mLであり、検量線はそれぞれ2-1000ng/mLの範囲で良好な直線性を示し、各濃度におけるCV値は15%以内であった。本迅速微量測定法では、4種薬物の5分以内での同時測定が可能であり、また必要とする検体量も微量なため、採血等小児患者への負担を最小限に抑えることができると考えられる。今後、患者検体の血漿中濃度測定を完了し、効果との関係を評価する。
担癌マウスにおける免疫抑制状態の解析とその回避による腫瘍ワクチン増強効果の検討

陽性に帯電するペプチド群(cationic polypeptide)を含有するタンパク質は、陰性に帯電する細胞膜に素早く結合した後endocytosis,macropinocytosisとして高効率に細胞内に導入される。この特性を利用し、我々は細胞内導入高率の最も高いとされるnonaarginine(R9)を融合させたタンパク抗原を用いた腫瘍ワクチン療法の基礎研究を行ってきた。ワクチン療法の原理は、腫瘍細胞に免疫原性の高い抗原が発現しておりMHC class I上に提示されることと、宿主にその抗原に対する強力なTc1, Th1の誘導より成り立っている。我々は、R9含有OVAタンパクを皮内接種すると、強力なOVA特異的Tc1, Th1, IgG2抗体が誘導されると共に、接種皮膚組織のMHC class I上にOVAエピトープが発現され強力な炎症性免疫反応が誘導されることを明らかにした。そこでOVA発現腫瘍細胞をマウスに接種し、担癌状態の腫瘍内にR9-OVAを接種すると完全拒絶を含む著明な抗腫瘍効果が確認された。この効果はCD8陽性細胞除去、免疫不全マウスでは認められないことより、細胞毒性による効果ではなく、抗原特異的免疫反応による効果であることが示唆された。また、このin vivoでの抗腫瘍効果は樹状細胞を用いた免疫療法より優れていた。その理由としては、腫瘍局所に認められる免疫抑制状態が、強力な炎症作用により回避されたか、免疫抑制を誘導させている細胞が破壊されたことによる可能性が示唆された。また、この免疫療法は樹状細胞等を培養する必要がなく、安価で特別な施設を必要としない。しかも局所での強力な炎症反応以外の大きな副作用が認められないことより、ヒトにおける癌、感染症に対するより強力なワクチン療法として、臨床応用が期待できる。陽性に帯電するペプチド群(cationic polypeptide)を含有するタンパク質は、陰性に帯電する細胞膜に素早く結合した後endocytosis, macropinocytosisとして高効率に細胞内に導入される。過去我々はこの原理を利用し、抗原タンパクにcationic polypeptide (polyarginine ; R9)を含有させた融合タンパクを作製しex vivoで樹状細胞に導入させることで抗原エピトープをMHC class I, class II上に提示させこれを皮内接種することで強力な抗原特異的免疫反応を誘導させるワクチン療法の有用性を報告した。その際、担癌状態の宿主では、正常な免疫反応の誘導が起こり難いこと、特にCD4陽性T細胞の活性化抑制が関与することを同定した。以上の結果は担癌宿主の免疫抑制にはCD4陽性細胞が関与しており、これを強力に活性化することで免疫抑制を転換させうる可能性を示唆している。一方、R9含有OVA融合タンパクを担癌状態のマウス皮内に直接接種し、樹状細胞によるワクチン効果と比較検討したところ、タンパク直接接種群のほうがより高い抗腫瘍効果を認めた。この機序につき解析したところ、抗原特異的CTL活性化能は樹状細胞を用いた場合より低いものの、CD4陽性T細胞活性は非常に高くなること、活性化されたT細胞はTh1型であることが判明した。さらにR9含有OVAをnaive miceに皮内接種した場合、接種部位へ長時間高濃度を維持したまま滞在すること、また同部位の細胞MHC class I上に抗原エピトープを発現させることが明らかとなった。また、この反応はCD8陽性細胞を除去することで完全に消失することより、非特異的な炎症反応によるものでないことを明らかとした。これらの結果は、R9含有タンパク質を皮内接種すると接種局所の細胞内に導入されること、また接種する抗原の免疫原性が高い場合、接種部位を反応の場とする強い免疫反応が誘導され組織が破壊されることを示している。

この特性を利用し、我々は細胞内導入高率の最も高いとされるnonaarginine(R9)を融合させたタンパク抗原を用いた腫瘍ワクチン療法の基礎研究を行ってきた。ワクチン療法の原理は、腫瘍細胞に免疫原性の高い抗原が発現しておりMHC classI上に提示されることと、宿主にその抗原に対する強力なTc1, Th1の誘導より成り立っている。我々は、R9含有OVAタンパクを皮内接種すると、強力なOVA特異的Tc1, Th1, IgG2抗体が誘導されると共に、接種皮膚組織のMHC classI上にOVAエピトープが発現され強力な炎症性免疫反応が誘導されることを明らかにした。そこでOVA発現腫瘍細胞をマウスに接種し、担癌状態の腫瘍内にR9-OVAを接種すると完全拒絶を含む著明な抗腫瘍効果が確認された。この効果はCD8陽性細胞除去、免疫不全マウスでは認められないことより、細胞毒性による効果ではなく、抗原特異的免疫反応による効果であることが示唆された。また、このin vivoでの抗腫瘍効果は樹状細胞を用いた免疫療法より優れていた。その理由としては、腫瘍局所に認められる免疫抑制状態が、強力な炎症作用により回避されたか、免疫抑制を誘導させている細胞が破壊されたことによる可能性が示唆された。また、この免疫療法は局所での強力な炎症反応以外の大きな副作用が認められないことより、ヒトにおける癌、感染症に対するより強力なワクチン療法として、臨床応用が期待できる。