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分子シャペロンによる慢性骨髄性白血病原因遺伝子産物(BCR/ABL)の分解制御

慢性骨髄性白血病原因分子BCR/ABLは、強力なチロシンキナーゼ活性を持ち、細胞の増殖を促進、アポトーシスを抑制する。近年、BCR-ABL分子標的薬であるイマチニブ、耐性機序の一つとして、BCR-ABL蛋白質の発現増加が指摘されているが、これに対して、BCR-ABL蛋白分解促進作用を有するHsp90阻害薬の開発が注目されている。しかし、BCR-ABL蛋白の安定化および分解機序についての詳細は、まだ明らかにされていない。本研究では、分子シャペロンによるBCR-ABLタンパク質の分解制御機構について詳細な検討を行い、下記について明らかにした。1.BCR/ABLタンパク質は、ユビキチン連結酵素であるcarboxyl terminus of the Hsc70-interacting protein(CHIP)およびc-Cblにより、ユビキチン化され、プロテアゾームおよびリソゾーム系で分解されることを明らかにした。3.CHIPおよびc-CblによるBCR/ABLの分解に必須の領域を明らかにした。4.BCR/ABL分子標的薬イマチニブとHsp90阻害薬の相互作用について明らかにした。5.N-acetyl-cysteineによるBCR/ABL依存性細胞増殖促進作用に対するHsp90阻害薬の拮抗作用の分子機序を明らかにした。2.BCR/ABL依存性Ba/F3細胞の増殖は、CHIPおよびc-Cblの過剰発現により特異的に阻害されることを明らかにした。BCR/ABL遺伝子は、慢性骨髄性白血病の95%以上の患者に認められる9番染色体長腕と22番染色体長腕の相互転座の結果生ずる遺伝子である。BCR/ABL遺伝子産物は、強力なチロシンキナーゼ活性を持ち、細胞の増殖を促進、アポトーシスを抑制する。本研究では、分子シャペロンによるBCR/ABLタンパク質の分解制御について研究を行い、以下のことを明らかにした。1.BCR/ABLタンパク質は、ユビキチン連結酵素であるcarboxyl terminus of the Hsc70-interacting protein (CHIP)およびc-Cblにより、ユビキチン化され、プロテアゾームおよびリソゾーム系で分解される。CHIPおよびc-Cblによる分解制御機構は異なり、c-Cblは、BCR/ABLのリン酸化依存性に、一方、CHIPはタンパク質の構造異常を認識することによって、BCR-ABLの成熟型、未成熟型、リン酸化型いずれの分解にも関与する。Hsp90およびHsc70は、これらの分解系制御機構において重要な役割を持つ。2.分子標的薬であるイマチニブおよび現在抗癌薬として開発中であるHsp90阻害薬を用い、BCR/ABLの分解および安定化における薬物相互作用について明らかにした。現在、BCR/ABLの分解に関与する分子領域について、さらに詳細な検討を進めている。3.N-acetyl-cysteineによるBCR/ABL依存性細胞増殖促進作用に対するHsp90阻害薬の拮抗作用の分子機序を明らかにした。慢性骨髄性白血病原因分子BCR/ABLの分解制御機構に分子シャペロンと相互作用して働くユビキチン連結酵素CHIPおよびc-Cblが、関与していることを昨年度の研究において既に明らかにした。本年度の研究では、さらに以下のことを明らかにした。1.BCR/ABLで形質転換したBa/F3細胞を用い、テトラサイクリン依存性にCHIPまたはc-Cblを発現する細胞株を樹立した。BCR/ABL依存性Ba/F3細胞の増殖は、CHIPおよびc-Cblの過剰発現により特異的に阻害されることを明らかにした。2.種々のBCR/ABL分子内領域(4量体形成領域、SH2結合領域、SH2、SH3、キナーゼ領域等)欠失変異体を作製してタンパク質の分解を検討した。Hsp90阻害薬、CHIPおよびc-CblによるBCR/ABLの分解に必須の領域は、それぞれ異なることを明らかにした。さらにこれらの分子内領域の相互作用によるタンパク質の安定化および分解制御機構について明らかにした。3.CHIPおよびc-Cblは、Hsp90阻害薬によるBCR/ABLの分解を増強することを明らかにした。

5.BCR/ABLの安定化と分解に対する分子シャペロン(Hsp90,Hsc70,Hsc54)の役割を明らかにした。現在、さらに詳細について検討中である。慢性骨髄性白血病原因分子BCR/ABLの分解制御機構における分子シャペロンの役割を明らかにするために、本年度の研究では、主としてキナーゼ領域依存性の分解機序について詳細な検討を行い、下記のことを明らかにした。2)キナーゼ領域のみの分解について検討したところ、Hsp90阻害薬による蛋白質の分解は、キナーゼ活性依存性であり、イマチニブにより抑制された。しかしイマチニブが結合しないイマチニブ耐性変異体(T3151)では、抑制を認めなかった。またCHIPは、キナーゼ領域の分解を促進したが、c-Cblは影響しなかった。3)キナーゼ領域を欠失したBCR/ABL変異体では、CHIPによる分解を認めたがHsp90阻害薬およびc-Cb1は影響しなかった。4)BCR/ABLを安定化するHsc70は、SH2一キナーゼ領域のみに対しても安定化作用が認められた。6)イマチニブによるBCR/ABLの分解抑制作用は、4量体形成領域を欠失した変異体では認められなかった。以上の結果から、BCR/ABLキナーゼが、恒常的に活性化することにより、その構造の変化依存性にCHIPは分解を促進、Hsc70は安定化を促進し、一方、リン酸化依存性にHsp90阻害薬およびc-CblはBCR/ABLの分解を促進することが示唆される。さらにBCR/ABLの安定化には、4量体の形成が関与すると考えられる。
スラヴ諸語の音韻体系における最新実態の解明

本研究の目的は、スラヴ諸語における最新の音韻的メカニズムを明らかにすることである。実在言語には音韻的要因以外の様々な要因が関連するため、一般の辞書に記述されている実在語の分析だけでなく、近年出現した新語・俗語や外来語の観察や、無意味語を用いた実験を実施する。さらに得られたデータについて、先行研究で解明されてきた通言語的な音韻的原理や類型論を考慮した上で、理論的一般化・定式化を行う。
面間トンネルスペクトロスコピーによる高温超伝導銅酸化物の擬ギャップ相の研究

擬ギャップ相は高温超伝導銅酸化物の複雑な超伝導相図を特徴づける電子相として注目されている。本研究では、集束イオンビームで微細加工された銅酸化物単結晶の微小接合素子に対する面間微分伝導度スペクトル測定を行い、擬ギャップ的挙動の観測とスペクトルへの影響が問題となった自己発熱効果の低減に取り組んだ。接合面積が1平方マイクロメートルかつ接合数が10個以下の微小な少数接合素子を集束イオンビーム加工のみで作製することに成功し、微分伝導度スペクトルの温度変化から擬ギャップの観測に成功した。さらに、ギャップサイズの精密測定に向けて微分伝導度測定の短パルス化を検討し、1桁以上短縮できる見通しを得た。集束イオンビーム加工により、固有ジョセフソン接合の接合部を約1μm四方に微細加工し、接合数を10接合にまで削減した微小接合素子の作製方法と短パルス法による電流電圧特性評価を報告する研究論文を執筆した(投稿中)。次に、接合数が約20の微小接合素子のスイッチング電流確率分布測定を高次スイッチング事象領域まで拡大して行った。絶対温度10K以下で観測される巨視的量子トンネル現象的挙動を位相再補足効果を取り入れた新しい解析モデルで検証し、有限電圧状態における散逸効果が、自己発熱効果よりも位相再補足事象の増大に寄与することを見出した。さらに、マイクロ波照射実験から高次スイッチング事象における共鳴スイッチング現象を初めて観測した。これらの研究成果は、固有ジョセフソン接合系の高次スイッチング事象においても、低温で巨視的量子トンネル現象が発現していることを強く示唆するものと考えられる。次に、CaサイトをYで20%置換したBi2Sr2Ca0.8Y0.2Cu2Oy単結晶を作製し、Y置換量10%の単結晶と特性を比較した結果、超伝導転移温度の変化は系統的であるものの、結晶部位によるY濃度の不均一性が予想以上に大きいことが判明した。また、短パルス法で得られた固有ジョセフソン接合素子の電流電圧特性から微分電気伝導度スペクトルを求め、超伝導ギャップを定量的に評価した結果、従来より小さい値となる傾向が判明し、短パルス法による自己発熱効果の低減が未だ不十分との結論を得た。このため、マイクロ波伝送用の同軸ケーブルを搭載した短パルス測定用のインサートプローブを開発した。最後に、固有ジョセフソン接合素子の接合数制御に用いる新技術として、アルゴンイオン照射による微細加工に取り組んだが、イオン照射時の発熱の影響が著しく、イオン加速電圧の増大などの改良が必要なことが分かった。銅酸化物高温超伝導体の固有ジョセフソン接合系を用いた面間トンネルスペクトロスコピーから超伝導ギャップおよび擬ギャップを観測するための測定手法と素子構造を検討した。測定手法については、短パルス法で得られる電流電圧特性の数値フィッティングから微分電気伝導度スペクトルを求める手法が、ギャップ構造観測に有効なことを確認した。素子構造については、接合部の面積を約1平方マイクロメートルに微細加工するだけでなく接合数を10接合以下に抑えることが、自己発熱効果を低減してギャップ構造を精密に得るために、非常に重要なことを見出した。これらの研究成果に基づき、Bi2Sr2CaCu2Oy単結晶を微細加工して10接合以下の固有ジョセフソン接合素子を作製し、短パルス法による電流電圧特性の測定から超伝導ギャップ及び擬ギャップに起因する微分電気伝導スペクトル変化の観測に成功した。次に、キャリアドープ量の変化に伴うスペクトル変化の観測に向け、Bi2212のCaサイトをYで10%置換したBi2Sr2Ca0.9Y0.1Cu2Oy単結晶を作製した。得られた単結晶の超伝導転移温度の変化は予想よりも小さかったが、電子線元素分析(EPMA)による組成分析からY置換量が仕込み量と一致することを確認した。この単結晶試料を微細加工して固有ジョセフソン接合素子を作製し、その電流電圧特性を測定したが、キャリアドープ量の変化に伴うトンネルスペクトルの系統的変化を検出するには至らなかった。当初、予定していた他の測定手法(ロックイン検出法と直流法)の検討と直流法に用いる精密電流源の購入については以下の2つの理由で断念した。(1)短パルス法の有効性を実証するために超伝導ギャップおよび擬ギャップの観測実験を優先した。(2)低温実験に不可欠なヘリウム再凝縮装置に冷却水漏れ事故が発生し、その対策にチラーを導入する必要が生じた。前年度に研究が大きく進展した固有ジョセフソン接合系の高次スイッチ事象における巨視的量子トンネル的挙動の起源解明に向けて、6個の接合しか含まない微小固有ジョセフソン接合素子を作製し、マイクロ波照射に伴う共鳴スイッチ現象の実験を続けた。第2スイッチと第3スイッチで各々異なる振舞いを示す共鳴ダブルピーク構造を観測し、第2スイッチで観測された共鳴現象が巨視的量子トンネル状態で期待される離散化量子準位の形成を強く示唆する結果であることを確認した。

また、Fistulらが提唱した単一接合モデルに基づいた従来理論では実験結果を完全には再現できないことから固有ジョセフソン接合系に特有な接合間相互作用の寄与を見出した。さらに、マイクロ波照射と共に各接合が同時にスイッチしやすくなる振舞いを観測し、接合間の電磁的結合が従来考えられてきた電磁誘導的結合よりもむしろ静電容量的結合を支持する結果を得た。以上の研究成果を基に現在、投稿論文の執筆準備中である。一方、当初、計画していた面間トンネルスペクトロスコピーについては、Bi系固有ジョセフソン接合素子の実験で懸念されてきた自己発熱効果の低減に必要な短パルス測定法について再度検討を行った。その結果、従来用いてきた差動増幅器を外し4Ch入力のデジタルオシロスコープを用いると数マイクロ秒の短パルス化が達成できることを見出した。また、市販の10倍プローブと同等な回路の挿入もパルスの立ち上がり特性向上に有効なことを見出した。予定していた反強磁性秩序組成のY置換Bi2212の単結晶育成にも成功し、自己発熱効果の低減に有効なもう一つの方法である固有接合素子の接合数低減技術についても目途が立ったことから、ようやく本格的な面間トンネルスペクトロスコピー実験を開始できる段階に到達した。物性物理、特に超伝導の基礎と応用前年度の研究成果の一部を投稿論文にまとめることができた点、および当初予定していなかった固有ジョセフソン接合系における高次スイッチング事象の位相ダイナミクス解明に関して大きな進展が得られた点については、順調な進展状況と判断できる。しかしながら、前年度の研究で一定の目途がついたと判断していたキャリアドープ量を変えた単結晶の育成や面間トンネルスペクトロスコピーの測定手法に新たな問題点が見つかった。すでに、問題点の克服に向けた対策を検討し、一部は実施中であるが、本研究計画の根幹部分に関わる部分であるため、全体としての達成度はやや遅れている状況と判断される。超伝導ギャップや擬ギャップを観測するための測定手法や素子構造については部分的な検討しか実施できなかったが、短パルス法による測定手法と小面積かつ少数接合の素子構造による超伝導ギャップや擬ギャップの観測に一定の目処が付いたこと、およびBi2212のCaサイトをYで置換した単結晶試料の作製とその評価を着実に実施できたことから、研究計画は順調に進展していると判断される。前年度、研究が大きく進展した固有ジョセフソン接合系の高次スイッチング事象については、巨視的量子トンネル現象発現の確証を得るため、マイクロ波照射に伴う共鳴スイッチング現象の起源解明を中心に実験を続ける。また、固有ジョセフソン接合素子による面間トンネルスペクトロスコピーについては、(1)前年度完成させた短パルス測定専用のインサートプローブを用い、素子形状とパルス波形の伝送特性との相関を検証するほか、超高速応答測定に向けた測定回路系の最適化に取り組む。(2)自己発熱効果の低減に本質的に重要と考えられる固有ジョセフソン接合素子の接合数制御に関しては、従来の集束イオンビーム加工による接合数制御技術の確立を目指し、精度向上と再現性向上に取り組む。
大腸菌アンモニア同化の代謝・遺伝子制御ネットワークのシステムバイオロジー

大腸菌は窒素源として環境中のアンモニアを同化して、グルタミンを合成する。この際に主要な働きを示すのが、グルタミン合成酵素(GS)である。大腸菌のアンモニア同化システムでは、環境中のアンモニア濃度の変化に対応してGSの活性・合成速度を調節し、グルタミンの生成速度を制御している。この大腸菌のアンモニア同化システムの動的挙動と制御構造を調べるため、システムの大規模モデルを作成した。モデルは代謝層、タンパク質相互作用層、遺伝子制御層という3つの生命反応の階層を持ち、22の微分方程式と53の代数方程式から成っている。システムの挙動を左右するパラメタは、遺伝的アルゴリズムを用いることで最適化した。この新たなモデルによるシミュレーションでは、遺伝子ノックアウト実験における挙動も再現することができ、信頼性のある解析を行うことができる。この大規模モデルを用いた感度解析・シミュレーションにより、アンモニア同化システムの制御にポジティブフィードバックが大きな役割を果たしており、アンモニア濃度が一定値以下になるとポジティブフィードバックが働き急激にGSの発現量が増加するという挙動が示された。このシステムの状態遷移は、タンパク質PII、NRI、NRIIに制御されていることがわかった。さらに、実際にアンモニア濃度を変化させて大腸菌を培養し、細胞内のGSのmRNAの増減を測定することで、シミュレーションと同様の結果を得た。この大腸菌のアンモニア同化システムの動的挙動を調べるため、システムの大規模モデルを作成した。モデルは代謝層、タンパク質相互作用層、遺伝子制御層の3つ階層を持ち、27の微分方程式と47の代数方程式からなる。この新たなモデルによるシミュレーションでは、遺伝子ノックアウト実験における挙動も再現することができた。また、大規模モデルを用いた感度解析・シミュレーションにより、アンモニア同化システムの制御にポジティブフィードバックが大きな役割を果たしていることがわかった。すなわち、アンモニア濃度が一定値以下になるトポジティブフィードバックが働き急激にGSの発現量が増加するという挙動が示された。このシミュレーションにおけるGS発現量の変化を実証するために、大腸菌を様々なアンモニア濃度で培養し、各アンモニア濃度に対するGSの発現量をRT-PCRで測定した。アンモニア濃度を通常の1/50以下で培養した大腸菌はGSの発現量が急激に増加していた。これにより大腸菌のアンモニア同化システムにおいて、アンモニア濃度が極端に減少した際にポジティブフィードバックが働くことが示された。大腸菌のアンモニア同化システムでは、環境中のアンモニア濃度の変化に対応してGSの活性・合成速度を調節し、グルタミシの生成速度を制御している。モデルは代謝層、タンパク質相互作用層、遺伝子制御層の3つの階層を持ち、25の微分方程式53の代数方程式からなる。また大規模モデルを用いた感度解析・シミュレーションにより、アンモニア同化システムの制御にポジティブフィードバックが大きな役割を果たしていることがわかった。すなわち、アンモニア濃度が一定値以下になるとポジティブフィードバックが働き急激にGSの発現量が増加するという挙動が示された。さらに、シミュレーションによりアンモニア濃度増加時と減少時のGSの挙動が異なるヒステリシスが予測された。このシミュレーションにおけるGS発現量のヒステリシスを実証するため、大腸菌をアンモニア濃度を変化させながら培養し、アンモニア濃度に対するGSの発現量をRT-PCRで測定した。アンモニア濃度を減少させている際と、増加させている際のGS(mRNA)の発現挙動はシミュレーションの予測を支持するものであり、ヒステリシス挙動が観測された。
金属資源を対象にした国際貿易モニタリングシステムの構築

持続可能な資源管理には国連の提供する貿易統計サービス(UN comtrade)を活用した金属資源の国際貿易モニタリングシステムが必要である。そこで、UN comtradeから入手可能な鉱石・スクラップの国間貿易量と金属組成の不確実性を考慮した鉱石・スクラップ含有金属の国間フロー量推定手法を確立した。そこで、UN-comtradeから入手可能な主要な鉱石・スクラップの国間貿易量の不確実性を級内相関係数(ICC)を用いて定量的に評価した。さらに、鉱石・スクラップの金属組成の不確実性を既存文献値のメタ分析より定量的に評価した。最終的に、国間貿易量と金属組成の不確実性に対処した国間フロー量を推定した。国連の提供する貿易統計サービス(UN-comtrade)を活用した金属資源の国際貿易モニタリングシステムを構築するため、鉱石・スクラップ貿易量の不確実性を定量評価した。貿易量の不確実性は経済統計学で知られる貿易統計の不整合問題を指す。貿易統計の不整合問題とは、ある国の貿易統計が報告する輸入量と対応する相手国の貿易統計が報告する輸出量が一致しない問題である。国規模の貿易収支分析を目的とする既存不整合研究は、本研究で求められる特定品目、数量単位、国間取引を対象としていない。本研究は鉱石・スクラップを対象に貿易統計の不整合問題を定量的に評価した。UN-comtradeから、15金属元素における鉱石・スクラップを対象に2000年から2010年までの各国が報告する国間輸出量、国間輸入量を入手した。輸出量と輸入量の系統誤差と偶然誤差を定義し、輸出量と輸入量の線形回帰モデルから系統・偶然誤差価指標を開発した。貿易統計と系統・偶然誤差評価指標を用いて、15金属元素における鉱石・スクラップ貿易量の不確実性を明らかにした。亜鉛・クロム・タングステンの鉱石貿易量と、鉄・鉛・クロムのスクラップ貿易量に関して低い不確実性が示された。他の金属元素の鉱石・スクラップ貿易量は高い不確実性が示され、その利用に際して注意が必要であることが分かった。今後は鉱石・スクラップの金属組成に関する不確実性を定量評価する予定である。当初の研究計画どおり、鉱石・スクラップ貿易量に関する不確実性の定量化を終了した。国連の提供する貿易統計サービス(UN-comtrade)を活用した金属資源の国際貿易モニタリングシステムを構築するため、鉱石・スクラップの貿易統計と金属組成に関する不確実性を定量評価した。鉱石・スクラップの貿易統計に関する不確実性評価では、昨年度考慮できなかった経由貿易による貿易統計の不整合を定量化し、その影響が大きいことを明らかにした。同時に、経由貿易の影響を控除するための、貿易統計の純流動変換計算法を新たに開発した。鉱石・スクラップの金属組成に関する不確実性評価では、国内外の文献調査、専門家へのヒアリング調査を通じて、水銀を中心に銅、鉛、亜鉛などの主要な非鉄金属を対象に鉱石・スクラップの金属組成を収集した。さらに、フィリピンを中心に、供給サイドである鉱山と需要サイドである製錬業・精錬業の投入産出フローに関する情報を収集した。以上から得られる鉱石・スクラップ貿易量と収集した供給・需要サイドの投入産出量を物質収支との整合性をとるように金属組成を推定した。さらに文献値との比較・検証も行い、専門家の意見を重視しつつ、鉱石・スクラップの不確実性に対するシナリオを作成し、金属組成の不確実性を定量化した。今後は貿易統計と金属組成の不確実性を考慮した鉱石・スクラップ含有金属の国間フロー量推定手法を確立し、UN comtradeを利用して、主要金属、世界各国、時系列の国間フローデータベースを作成する予定である。当初の研究計画どおり、鉱石・スクラップの金属組成に関する不確実性の定量化を終了した。国連の提供する貿易統計サービス(UN-comtrade)を活用した金属資源の国際貿易モニタリングシステムを構築するため、本研究は鉱石・スクラップの国間貿易量と鉱石・スクラップの金属組成の不確実性を評価し、両不確実性を考慮した鉱石・スクラップ含有金属の国間フロー量推定手法を確立した。平成27年度は鉱石・スクラップの国間貿易量の不確実性を定量的に評価した。この不確実性とは、ある国の貿易統計の輸出報告値と相手国の貿易統計の輸入報告値が一致しない貿易統計の不整合問題と同義である。本研究では、級内相関係数を用いて、28鉱石・スクラップの不整合評価を行い、重金属・レアメタルを中心に高い不確実性を確認した。平成28年度は鉱石・スクラップの金属組成の不確実性を既存文献値のメタ分析より定量的に評価した。また、鉛に関しては各国資源統計、貿易統計より、一次・二次生産量、採掘量、鉱石輸入量、スクラップ輸入量より金属組成を物質収支より計算し、メタ分析結果と比較した。平成29年度は、国間貿易量と金属組成の不確実性に対処した国間フロー量推定手法を開発した。さらに、UN-comtradeから入手可能な主要な金属鉱石、スクラップに適用した。貿易統計の不確実性の対処法として、27年度に採用した級内相関係数を用いて、6個の不確実性要因(外れ値、欠損値、年またぎ集計、品目変更、違法な貿易、過小申告)を識別した。貿易統計の利用されていないデータを駆使して、識別した不確実性を修正する方法を提案した。金属組成の不確実性の対処法として、28年度の既存文献値のメタ分析結果より金属組成の上下限値を設定し、国間フロー量について推定値の上下限値を提示することを提案した。

そこで、UN comtradeから入手可能な鉱石・スクラップの国間貿易量と金属組成の不確実性を考慮した鉱石・スクラップ含有金属の国間フロー量推定手法を確立した。そこで、UN-comtradeから入手可能な主要な鉱石・スクラップの国間貿易量の不確実性を級内相関係数(ICC)を用いて定量的に評価した。さらに、鉱石・スクラップの金属組成の不確実性を既存文献値のメタ分析より定量的に評価した。最終的に、国間貿易量と金属組成の不確実性に対処した国間フロー量を推定した。当初の研究計画どおり、鉱石・スクラップの金属組成に関する不確実性の定量化を行う予定である。当初の研究計画どおり、鉱石・スクラップ含有金属を対象とした国間フロー量推定手法の確立する。土木環境システム円安の影響より貿易統計が当初の予定より高額であったため、次年度の予算を追加して、貿易統計を購入することにした。結果として、予算を繰り越すことになった。次年度使用額の使用計画として、IHS Global社から貿易統計データの購入を計画している。ただし、現在担当者と交渉中であるが、買収の影響からGTI社の前任者との引き継ぎがうまくっておらず、契約成立に不確実性がある。そこで代替手段として、各国の税関HPまたは紙媒体の政府統計から貿易統計データのダウンロードまたはデータ入力作業を委託することも考えている。当初予定にある貿易統計を購入する予定である。
ミトコンドリアDNAのヘテロプラズミー変異解析によるパーキンソン病の遺伝的素因の同定

パーキンソン病では母系遺伝するケースが報告され、また複合体Iの活性低下が知られている。ひとつの細胞には通常変異mtDNAと正常mtDNAとが混在していて、分裂しない神経細胞では1000個のmtDNAのうち1個変異をおこすと一生その変異蛋白質によるダメージを細胞は蓄積し、さらにいろいろな変異によるダメージの蓄積がパーキンソン病発症の原因のひとつになると考えられる。パーキンソン病患者と対照健常人のmtDNAのヘテロプラズミー変異を定量してその差を明らかにし、mtDNAのヘテロプラズミーがパーキンソン病の遺伝的素因であることを明らかにすることを目的として、血液細胞のmtDNAにおいて微量の変異mtDNAを定量する方法を開発した。変異mtDNAの変異塩基に相補的なヌクレオチドをプライマーの3'側に設定する。正常mtDNAにはプライマーの3'側で塩基対合できないので、PCRでは増幅されない。ABI Sequence Detection Systemを用いてPCR産物を定量した。プライマーの設計とPCRの条件を検討することで、0.1%以下の含量の変異mtDNAを検出することが可能となった。臍帯血、20歳代、40-60歳、60歳以上と分けた各年代50-100人の全血から調製された全DNAを試料として調べた結果、老化にともないmtDNAの体細胞変異が蓄積することがわかった。神経細胞においても、老化にともない変異mtDNAが蓄積し、その結果神経細胞の機能が損なわれることが考えられた。
看護情報教育における患者情報の取り扱いに関するガイドラインの研究-学校および継続教育を対象とした-

本年度においては看護情報教育における倫理的教育の確立を目的とし、看護学生に現職の看護師を対象に加え、患者情報の使用を中心とした看護と情報に関する倫理的諸問題等に関しての調査を行った。島根大学医学部看護学科の平成15年度の1・3年生と附属病院に勤務する全看護師を対象に、看護を含む医療情報の開示・保護・管理及び看護と情報における倫理的諸問題に関するアンケートを作成し自記式にて調査を行った。看護学生128名中、回答者125名(回収率97.7%)、看護師396名中、回答者309名(回収率78.0%)だった。看護学生のアンケートの結果から、用語の認識に関しては、1年生と3年生を比較して「コンピュータウィルス」、「インフォームドコンセント」、「尊厳死」を除くその他の用語について、3年生に「知っている」、「聞いたことがある」と回答した学生が有意に多い傾向が認められた。また、市販のソフトウェアのコピーやソフトウェアのネットワーク上での共有に関して、3年生に「良くない」と回答した学生が有意に多い傾向が認められた。しかし、3年生においても様々な場合を含め「良い」と回答している学生が半数近くを占め、加えて、チェーンメールへの対応では、昨年度の結果と同様に「無視する」と回答した学生がほとんどであった。これらの結果から、用語の認識に関する部分ではある程度、講義の影響があると考えられるが、ソフトウェアの取り扱いやメールの対応などに関しては、講義内容を見直す必要があると考えられる。看護師のアンケート結果からは、ソフトウェアのコピーやチェーンメールへの対応について学生の結果と大きな差は見られず、自己の情報についての認識の甘さは、看護師においても学生と同じ状況であるのではないかと考えられた。継続教育での情報に関する講義の必要性は多くの看護師が認めており、講義への参加希望も高いことが明らかになった。島根医科大学の看護学生に対し、プライバシー権、インフォームドコンセント等、患者情報の使用を中心とした看護と情報に関する倫理的諸問題や看護情報を含む医療情報の開示・保護・管理に対する学生の知識や意識を調査し、講義内容を検討した。加えて、インターネットとその基本的な情報倫理についても意識調査を行った。尚、本年度の3年次の学生に対しては、2年次後期(12月末)病棟実習開始直前に患者情報の使用を中心とした看護と情報に関する倫理的内容について60分の講義を行った。その結果、市販のソフトウェアを複写することについては、「よくないと思う」と33.8%が回答したが、「よいと思う」と回答した学生が8人12.3%存在した。チェーンメールについては、「無視する」が大半で、「システム管理者へ連絡する」としたものは皆無だった。日常生活の中での自己の情報の取り扱いや取り扱われ方について、無防備、無関心であることが伺われた。プライバシー権の認識については、「私事、私的生活に関する情報が他人に知られることを守る権利(守秘的プライバシー権)」87.9%、次に「自己に関する情報の流れをコントロールする権利(自己情報コントロール権)」48.5%(複数回答)であり、プライバシー権を守秘的プライバシー権として捉えている学生が多いことが明らかとなった。患者情報の看護と情報に関する倫理的用語の認識については、「インフォームドコンセント」では100%、「自己情報コントロール権」57%、「カルテ開示」95.4%、「リスボン宣言」89.4%、「Living Will」92.5%、「尊厳死」98.4%であり、昨年度の学生と比較して「自己情報コントロール権」のみ認識が有意に高かった。ネチケットを含めた情報倫理的内容について、いかに学生の理解を深める教育が可能か講義内容や時間数をさらに検討していく必要があると考えられた。

本年度においては看護情報教育における倫理的教育の確立を目的とし、看護学生に現職の看護師を対象に加え、患者情報の使用を中心とした看護と情報に関する倫理的諸問題等に関しての調査を行った。対象者は、島根大学医学部看護学科の平成15年度の1・3年生と附属病院に勤務する全看護師である。結果、看護学生128名中、回答者125名(回収率97.7%)、看護師396名中、回答者309名(回収率78.0%)だった。看護学生のアンケートの結果から、用語の認識に関しては、1年生と3年生を比較して「コンピュータウィルス」、「インフォームドコンセント」、「尊厳死」を除くその他の用語について、3年生に「知っている」、「聞いたことがある」と回答した学生が有意に多い傾向が認められた。また、市販のソフトウェアのコピーやソフトウェアのネットワーク上での共有に関して、3年生に「良くない」と回答した学生が有意に多い傾向が認められた。しかし、3年生においても様々な場合を含め「良い」と回答している学生が半数近くを占め、加えて、チェーンメールへの対応では、昨年度の結果と同様に「無視する」と回答した学生がほとんどであった。昨年度及び本年度の結果から、用語の認識に関する部分ではある程度、講義の影響があると考えられた。しかし、ソフトウェアの取り扱いやメールの対応などに関しては、2年間を通して結果に大きな変化を認められず、講義時間を増やしたものの、内容や方法を今後も見直す必要があると考えられる。看護師のアンケート結果からも学生の結果と大きな差は見られず、自己の情報についての認識の甘さは、学生と同じ状況であると考えられた。継続教育での情報に関する講義の必要性は多くの看護師が認めており、講義への参加希望も高いことが明らかになった。
ゲノム不毛地帯（ＲＣＲＯ）の進化と意義

ゲノムの再造形に積極的に関与する構成ヘテロクロマチン(RCRO)に着目しその内部の分子解剖とそれが関与する生物学的意義について解析を進めた。新たに反復配列の解析法を開発しRCROの構成要素と構造の分析を踏み込んで解析し、特にチンパンジーの進化的意義を推測し、テナガザルとヨザルにおけるアルファサテライトDNAの存在様式とその構造において新知見を得た。1テナガザルのアルファサテライトDNAはセントロメアに留まらずテロメアにも存在する。2ヨザルでは夜行性との関係が推定される。3チンパンジーではRCROが非相同染色体間の組換えを抑止している。等の興味深い染色体と生物の進化の関係の糸口が見えてきた。チンパンジーのRCROが介在する領域VIIq31の染色体断片を、染色体顕微切断法でプローブ化し、原猿からヒトまで20種の霊長類の染色体上の局在部位を解析したところ、その領域は他領域と比べると、有意に安定しいて遺伝子数が少ないにも関わらず、進化的に安定した部位であることが明らかになった。さらにVIIq31のRCROはアフリカ類人猿3種の多くの染色体領域に存在することが観察された。データベース解析による配列比較においても、10種の霊長類においてVIIq31が他領域よりも安定あることをしめした。これらのデータを論文としてまとめた。細胞分裂時に非相同染色体間でDNA断片が移動する現象を可視化するための装置、培養細胞イメージング装置を設置し、分裂動態を観察する方法を確立した。RCROの構成DNAの一員であるsubterminal satellite(StSat)をゲノム配列データベースから配列を抽出し、比較配列解析をおこなったところ、アフリカ類人猿3種において共通祖先から派生したことが明らかになり、ヒトでStSat配列が消失したことを明確にした(論文として出版)。ヒトとチンパンジーの連鎖非平衡ブロックの大きさを比較する目的で、チンパンジーの1塩基多型(SNP)データの蓄積を試みた。チンパンジーゲノムの中で非コーディング領域を中心に20kbの領域を約20カ所無作為に抽出した。それぞれの20kbの領域の中に効果的にPCR用のプライマーを設計し、PCRダイレクトシークエンシング法によりチンパンジー集団中のSNPの多型頻度を求め、連鎖不平衡の程度を推定する事とした。現在チンパンジー24個体についてシークエンス作業中であり、作業後は得られたシークエンスデータを基に連鎖不平衡の程度の推定を行う。チンパンジーの染色体の75%は、端部にRCROと分類されるヘテロクロマチン領域(TCH)をもつ。この領域を解析するために、主たる成分のひとつであるStSat反復配列を標識として、TCHの進化的意義とその機能を分析した。チンパンジー43個体の体細胞染色体を、StSatクローンを用いてFISH解析した。調べた全個体は17対の染色体の両端部あるいは片端部にStSatの大きな塊を持っていた。しかし、幾つかの個体は、常にStSatを持つ17対以外の染色体は、多型的だった。今回解析した個体間比較において、存在様式に幾つかの異なる分布パターンが観察された。これは、減数分裂のパキテン期までに生じるブーケステージ内で「非相同染色体間端部組換え」の結果派生した変異であると推定された。フクロテナガザルのゲノムからアルファサテライト(・)DNAを抽出した。もともと、(・)DNAは、霊長類のセントロメアの主成分となっているヘテロクロマチンであるが、テナガザルではテロメアの領域で大規模に増幅していることがフクロテナガザルで明らかになった。SNV因子とよばれるレトロトランスポゾンを、シロマユテナガザルのゲノムで発見した。この因子はセントロメアのヘテロクロマチンを形成していると考えられ、トランスポゾンが新規のヘテロクロマチンを大量に供給する現象を捉えたものと思われる。チンパンジーのRCRO領域の3D-FISHによる解析を進めるに際し、RCRO領域と相同なヒト染色体7q31.1および13q14.4領域のBACクローンの選定を行った。BACとRCRO彩色プローブを組み合わせることで、チンパンジーのRCRO領域とその周辺部をセットでRCROの3次元核内配置解析、ゲノム解析することが可能となった。H22年度の解析に加え、H23年度はさらにチンパンジーゲノムの中から新たに20カ所の領域(20kb)を抽出し、PCRダイレクトシークエンシング法によりチンパンジー集団中のより多くのSNPの多型頻度を求めた。現在チンパンジー24個体について、塩基配列決定を新規領域について進めている。(1)チンパンジーの減数分裂の解析から次のことが示唆された。

末端RCROはパキテン期で集合体を作り染色体間で組換えを起こし、RCROの伝播や均質化を生じその結果として反復配列の協調進化を引き起こす。さらに、それらのことが競合して末端RCROの上流部の遺伝子領域の組換えにヒトとチンパンジーの間で偏向をもたらすことである(未発表)。ヒト科4種を染色体レベルで比較し、先行研究のヒトの染色体端部領域間の高頻度の組換え率のデータと比較するとチンパンジーとゴリラではヒトと同じ領域に相当する領域ではまったく非相同間組換えが生じていないことが示唆された。(2)類似の末端RCROを有する小型類人猿のSymphalangus属(シアマン)では、通常セントロメアに局在するアルファサテライトDNA(AS)が末端のテロメア領域に大量に存在することが明らかになった。すなわちセントロメアからテロメアにASが転移し増幅したことになる。小型類人猿のASはその4属(Symphalangus, Nomascus, Hylobates, Hoolock)ごとに異なる局在性を示した。その概要はSymphalangus属(a)とNomascus属(b)はセントロメアとテロメアにASを持ち、Hylobates属(c)とHoolock属(d)はセントロメアだけにASを持つことである。この特性を利用してテナガザル類の属間雑種個体の解析をおこない、染色体で明確に混合したゲノムを判定できることを示した。(3)染色体数変異とアルファサテライトDNAの関係ヨザルにおいて染色体数の異なる種の間で雑種を形成した場合に染色変異を誘発する可能性を示唆するデータが得られた。X染色体のトリソミー、相互転座、相互転座変異の一個体内キメラが観察されたものである。これらのデータは染色体彩色プルーブおよびY反復配列プローブを用いて明らかになったものであるが、アルファサテライトDNAも染色体再配列の機構を解析することに有効であることが示された。(発表準備中)(1)ヒトには存在せず、チンパンジー(PTR)特異的に存在するRCROの遺伝子多様性および遺伝子発現に及ぼす影響を調べるために、PTR親子トリオ3個体の全ゲノム解析、親子トリオを含むその他9個体のエキソーム解析を行った。現在、PTR7番染色体(7q31.1領域)に特異的に挿入されたRCROが、その周辺領域の遺伝子多様性および発現多様性に及ぼした効果について解析中である。(2)PTRの7q31.1領域の組み換えの頻度が低いという予測から、当該領域では連鎖不平衡の減衰が緩やかである事が期待される。ゲノム中の非コーディング領域から約20カ所の20kbの領域を抽出し、一塩基多型を解析した。PCRダイレクトシーケンシング法により、12個体について塩基配列決定をおこない、一塩基多型の暫定的な結果を得た。結果は、当初の予測とは異なる事が示唆された。(3)PTRの染色体末端にあるRCROの減数分裂での影響を推測するために、Traskのグループが2005年に提示したデータと、チンパンジー末端RCROの存在部位と比較したところ、PTRではその周辺に組換えが起こらないことが示唆された(論文執筆中)。(4)ヨザルには特異な形状の大規模へテロクロマチン(HTC)がある。単独でアクロセントリック(A)染色体の短碗を構成しており、RCROの一形態といえる構造物である。
生殖腺によって制御される嗅覚行動の分子基盤と神経回路における情報処理機構の解析

多くの生物種は成長段階に応じて行動様式を変化させるが、そのような変化を担う神経回路や分子機構は不明な点が多い。線虫C. elegansは、幼虫期と成虫期で匂いの好みが変化する。幼虫期に増殖する生殖細胞を人為的に取り除くと成虫になっても幼虫期とよく似た匂いの好みを示すことから、生殖細胞からのシグナルが行動を制御していると考えられる。変異体解析やRNAiライブラリーによる網羅的遺伝子解析により、生殖細胞の増殖による化学走性の調節には、幼虫期の個体のエネルギー状態が関わっていることが示唆された。正常に生殖細胞が増殖した線虫と生殖細胞の増殖が妨げられた線虫では、匂いへの誘引行動に違いが見られる。このことから生殖細胞の増殖にともなって出されるなんらかのシグナルにより走性制御に関わる神経回路が調節を受けていると予想された。これは性的成熟にともなう行動変化のひとつの基盤となっている可能性が高い。もしそのような機構があるとすると、生殖細胞の増殖を妨げられた成虫と生殖細胞がまだ増殖していない時期の幼虫は走性行動の特徴が共通しているはずである。そこで、幼虫期の線虫の匂いへの走性を調べた。幼虫期の線虫を用いた行動測定は未開拓の分野であり、成虫に比較して運動能力が低いため幼虫に最適化した化学走性のアッセイ系を工夫する必要があった。幼虫の行動測定系の確立により、生殖細胞の未増殖な幼虫は生殖細胞を持たない成虫と同様に特定の匂いに対する走性の低下が見られることが分かった。これは生殖細胞の増殖により成虫期の線虫の行動パターンを変化させる機構が存在することを強く裏付ける結果である。そこで、幼虫期から成虫期の行動変化を引き起こすのに働く分子機構を明らかにするため、幼虫期にも関わらず成虫と同様の走性行動パターンを示す変異体の単離を試みた。スクリーニングの結果、複数の候補変異体を得たので、現在、表現型の確認を行っている。また、昨年度までの解析からミトコンドリアの働きがこの制御に関わっていることが示されているので、FRETプローブATeamを用いて生きた線虫の各組織での細胞内ATPレベルの可視化を試みている。いまのところ、生殖細胞の有無でATPレベルが変化するような組織を見いだすことができていないが、今後、さらに詳細な解析を行う予定である。<2013年度の成果>線虫C. elegansの成虫は生殖細胞を欠損すると、匂いの好みに変化が生じる。これまでに生殖細胞を失っても匂いの好みが変化しない変異体(D'4-13-7株)を得ていた。2013年度は染色体マッピングおよび全ゲノムシークエンス解析を行い、この変異体の原因遺伝子が咽頭筋で働くミオシンをコードしている事を明らかにした。咽頭筋を詳しく観察したところ、この変異体では咽頭筋の摂食運動が低下していることも分かった。咽頭筋の摂食運動が低下していることが知られている別の変異体において生殖細胞を欠損させたところ、D'4-13-7株と同様に匂いの好みに変化が見られないことが分かった。これらの結果から、生殖細胞欠損によって匂いの好みに変化が起こるには、十分な餌の摂食が必要であることが示唆された。<研究期間を通じた成果>本研究課題において、生殖細胞の増殖がどのようにして個体の行動パターンの変化を引き起こすのか、そのメカニズムについて解析を行った。その結果、全く予想していなかった個体のエネルギー状態との関連が明らかになった。本研究期間中の成果として、順遺伝学的及び逆遺伝学的解析から、生殖細胞欠損時の匂いの好み変化には、ミトコンドリアでの正常なATP合成と正常な餌の摂食が必要であることを示すことができた。このことから、生殖細胞の増殖をともなう個体の性的成熟により、体内ではエネルギー状態の低下が起こり、それにより神経回路の改変が起きて匂いの好みが変化しているのではないかと考えられた。今後、体内の栄養状態の変化がどのように神経回路とその機能に作用するのか、その分子機構を明らかにしたいと考えている。線虫は生殖細胞の有無により特定の匂いに対する誘因行動が変化する。本研究課題は、この現象をモデル系として個体の内的状態が感覚行動に及ぼす影響とその分子および神経メカニズムを明らかにすることをめざすものである。すでに、RNAiによる網羅的な機能分子の探索によってミトコンドリアの関与が示唆されていたため、まずその時期的および場所的な関わりを解析した。生殖細胞を失った成虫は正常な成虫に比べて匂い物質ジアセチルへの走性が低下する。これはミトコンドリアの機能分子、例えば電子伝達系のcco-1遺伝子のRNAiによる発現阻害で回復する。体の様々な組織においてそれぞれ特異的にcco-1遺伝子の発現阻害を行ったところ、神経系での阻害によって最も強くジアセチルへの走性回復が見られた。

また、発生の様々な時期にcco-1遺伝子の発現阻害を行ったところ、幼虫期の発現阻害が最も強くジアセチルへの走性回復を引き起こした。つまり、生殖細胞が盛んに増殖しているはずの幼虫期に生殖細胞が正常に増殖しないと、この時期の神経系のミトコンドリアの働きを介して、将来成虫になった際にジアセチルへの走性が低下すると考えられた。ミトコンドリアのどういった機能がこのような制御を可能にしているのか、まず、ミトコンドリアの活性をモニターするため神経細胞でのATPレベルの可視化を試みた。線虫にATP感受性FRETプローブATeamを導入したところ、神経細胞での発現を確認できた。さらに電子伝達系の阻害剤の投与により、生きた線虫の神経細胞内でのATPレベルの低下を確認することができた。現在、このツールを利用して、生殖細胞の有無によるATPレベルの変化を詳細に調べているところである。生殖腺による嗅覚行動の制御機構においてミトコンドリアがどのように関わっているのか、FRETプローブを用いて組織ごとのATPレベルの可視化と生殖腺の有無によるその変化を解析する予定だったが、現在のところ、はっきりとした結果を得ることが出来ていない。その一つの理由は、培養温度や発生段階(幼虫と成虫)の違いによってATPレベルにそもそも大きな違いがあることが分かってきたからである。今後、これらの影響を勘考した上で生きた個体の中での組織ごとのATPレベルを計測する技術基盤を確立し、生殖腺の有無が与える影響を解析する予定である。一方、幼虫期の線虫は生殖腺のない成虫と同様の嗅覚行動パターンを示すことが本年度の解析から明らかにすることができた。これは、個体のライフサイクルにともなう行動パターンの変化に生殖腺シグナルが大事な役割を果たしている可能性を裏付けるものである。生殖腺からの制御を受ける感覚行動について、発生初期の神経系でのミトコンドリアの関与を明らかにできたことは評価できると考えている。一方で、神経系のミトコンドリアの関与をさらに詳しく調べるために、線虫の持つ300個の神経細胞のうち特にどの神経が大事な役割を果たしているのか、様々な神経細胞セットでのcco-1阻害実験を行ったが、結局、そのような強い効果をもつ神経細胞セットを特定することが出来なかった。そもそも限局された神経細胞の機能ではない可能性も高いが、結果として神経回路を細胞レベルで解析できる線虫ならではの特性を活かすことができず比較的時間をかけて行った実験だけに、研究計画における時間配分に悔いが残った。生きた個体の中での組織ごとのATPレベルを計測する技術基盤を確立し、生殖腺の有無が与える影響を解析する。また、幼虫期の線虫を用いて成虫同様の嗅覚行動パターンを示す変異体候補をスクリーニングで得たのでこれを解析し、有望な変異体については全塩基配列の決定をして原因遺伝子を同定する。さらに以前、生殖細胞を持たない変異体を用いて正常な成虫と同様の走性パターンを示す抑圧変異体を単離しているので、これについても原因遺伝子を同定する。ATeamを用いたイメージング解析を進める。また、実施計画で述べた順遺伝学的解析も進行しており、生殖細胞がないにも関わらずジアセチルへの走性低下を示さない変異体の単離および染色体マッピング、whole genome sequenceによる候補原因遺伝子のリストアップまで既に進んでいる。
施設高齢者の尿路感染症を減少させるケアプログラムの開発

本年度は、介護施設における効果的な尿路感染症の予防ケアは「尿失禁」と「尿道留置カテーテルおよびおむつの感染」の2つに集約されるという仮説に基づき文献検索と研究対象となる施設において方法や手順の検討を行い、調査のプロトコール作成を進めて来た。また、高度な専門知識や経験、応用力がなくても系統的かつ効率的に尿路感染症を減少させるフローチャート方式のケアプログラムを開発することを目的を本研究の目的としているが、その前段階のケアシステムの情報収集目的で、実際に施設でのオムツ交換にスタッフの一員として作業に入ったり、同時に看護師および介護職員の排尿日誌の記入、扱いの観察、および、看護記録のデータ内容等、本研究の調査票作りのための基礎調査を行い、調査票の試作とスタッフとの検討、修正を重ね、完成したものを研究計画と共に学部倫理審査委員会に提出し、倫理規定に適ったものであるかどうかについて意見をもらい、さらに修正をかけ、3度提出していった。また、施設スタッフと協働し、入居者を交えない段階として、調査手順や必要物品の整備、異常時の対応等について協議を重ね、施設の協力スタッフのみでもエコーによる残尿測定や異常の発見が可能となるよう、研修と練習を繰り返した。その結果、倫理申請書において、調査の何をどこまで誰が担当するか等不明確な点について指摘を受けて修正中であり、近日再提出して承認を受け次第、入居者に対して本調査を実施していく予定である。年度途中において、研究対象施設の一部移転と統合、改修工事等が入ったため、平成30年10月以降、調査準備は中断中である。その間に海外文献を基におむつの感染リスクや感染マネジメントについて文献検討を行い、本研究計画に信頼性、妥当性が認められることを確認した。研究倫理申請審査の長期化および、対象施設の一部移転と統合、改修工事等によって調査が制限されたことによる遅延。研究倫理審査の承認後、研究計画通り調査を実施してデータ収集を進めていく。その結果にさらに文献検討を加え、フローチャート方式のケアプログラムを作成していく。研究倫理審査が未承認であること、対象施設の一部移転と統合、改修工事等のために実調査が遅れていることから、未使用金が生じている。研究者の自身の測定調査結果と施設スタッフとの検討からハンディ型ポータブルエコーで3日間の蓄尿調査が残尿測定値の判断に有効であることが判明したが、現在の1台のエコーでは調査が長期間に及び、エコー機器の性能から、複数データを本体に保存できないため、スタッフの申し出により効率性を重視し、本調査の開始時にもう1台追加購入して運用を図る予定である。
ストレスによる癌進行に対するローズマリー由来成分の効果

本研究の目的は、ローズマリー成分のカルノシン酸が精神的ストレスによるガン進行に与える影響を明らかにすることである。その結果、卵巣腫瘍細胞においてストレスホルモンにより増大した細胞増殖や血管新生促進因子の発現を、カルノシン酸が抑制することが明らかになった。カルノシン酸が、精神的ストレスによるガン進行の重要なターゲットとされている血管新生の抑制を介して、ガン進行を抑えることが示唆された。シソ科ハーブのローズマリーの機能性成分であるカルノシン酸とカルノソールが、ガンの進行に関与している血管新生を抑制することが明らかになっている。本年度は、卵巣腫瘍細胞(SKOV3)に対するローズマリー成分(カルノシン酸、カルノソール、ロスマリン酸、ミルセン)の効果として、ガン進行の因子であるストレスホルモン刺激に対する影響を明らかにすることを目的とした。SKOV3の増殖は、コントロールと比較しカルノシン酸添加により有意に抑制された。同様に、カルノソール添加においてもSKOV3の増殖は抑制された。一方、ロスマリン酸とミルセンは、増殖に影響を与えなかった。また、ストレスホルモン刺激に対する影響については、ノルエピネフリン添加でSKOV3の増殖は増大し、これはカルノシン酸添加により抑制された。また、ストレスホルモン刺激により発現が増大する血管新生関連因子に対するカルノシン酸の影響についても検討した結果、ノルエピネフリン添加により増大したVEGFの発現をカルノシン酸が抑制することを明らかにした。これらの結果より、ローズマリー由来の血管新生抑制成分が、精神的ストレスによるガン進行を抑制する可能性があり、その効果にはVEGF増大抑制が関与していることが示唆された。精神的なストレスががんの発症・進行に関与していることは疫学調査や動物実験により明らかになっている。そのメカニズムは不明な点が多いが、近年、ストレスホルモンによる血管新生促進が影響していることが明らかになった。ハーブのローズマリーは香辛料や飲料として利用され、一般的にリラックス効果によるストレス軽減が知られている。申請者はローズマリー由来の成分が血管新生抑制効果を示すことを見出している。そこで、本研究では、これらのローズマリー由来の血管新生抑制成分が、精神的ストレスによるがん増大に与える影響を明らかにすることを目的とする。現在までに、以下の成果を得ている。がん細胞としては、ストレスホルモンにより増大することが報告されている卵巣腫瘍細胞SK-OV-3を用いた。SK-OV-3にストレスホルモン刺激を与えると、血管新生を促進する因子の発現が増大することが報告されている。興味深いことに、この因子のタンパク質量をELISA法にて定量した結果、ローズマリー由来成分がストレスホルモンによる発現増大を抑制することが明らかになった。この結果より、ローズマリー由来の血管新生抑制成分が、精神的ストレスによるがん増大を抑制する可能性が示唆された。今後は、この因子の遺伝子発現量の定量を行うと共に、他の血管新生・がん増大関連因子への影響も明らかにし、ローズマリー由来成分の効果について分子レベルでの検討をさらに進める予定である。本研究ではカルノシン酸が精神的なストレスによるがん進行に与える影響を明らかにすることを目的とし、検討をおこなった。その結果、以下のことが明らかになった。まず、ストレスホルモン刺激がない条件で、カルノシン酸(25, 50 μM)は卵巣腫瘍細胞の増殖を濃度依存的に有意に抑制した。カルノシン酸と同様にローズマリーの成分であるカルノソール、ロスマリン酸、ミルセンについて、卵巣腫瘍細胞の増殖に与える影響をみると、カルノソールはカルノシン酸と同様に有意な抑制効果を示したが、ロスマリン酸、ミルセンは抑制効果はみられなかった。次に、ストレスホルモン刺激を与えた条件で、カルノシン酸(10, 50 μM)はノルエピネフリン添加により促進された卵巣腫瘍細胞の増殖を抑制した。また、ノルエピネフリン添加で卵巣腫瘍細胞のVEGFの発現が増大することが報告されているが、カルノシン酸はこの増大も遺伝子及びタンパク質レベルで抑制した。ノルエピネフリンはβ受容体に作用しVEGFの発現増大による血管新生促進を引き起こすため、関連する因子の発現に対するカルノシン酸の影響についても遺伝子レベルで検討した。以上の結果からカルノシン酸はVEGF増大による血管新生や細胞増殖増大を抑制することにより、精神的なストレスによるがん進行を抑制する効果を示す可能性があることが明らかになった。本研究より、ハーブ成分の抗がん作用の一つとして、精神的ストレスによるガン進行に対する抑制効果が期待できることが示唆された。食物学計画では、血管内皮細胞を用いた実験も行う予定であったが、他の実験条件の確立に時間と予算を費やしたため、実施することができなかった。しかしながら、対象とするローズマリー成分の範囲を広げた検討を行うことで、一定の成果を得ることはできた。卵巣腫瘍細胞におけるストレスホルモン刺激による血管新生促進因子の発現増大にローズマリー由来成分が与える影響について、研究の基礎となる実験条件の設定を確立し、計画していたタンパク質レベルでの解析が行えた。遺伝子レベルでの解析については現在進行中である。ノルアドレナリン刺激による卵巣腫瘍細胞の浸潤亢進に対するローズマリー成分の影響を浸潤培養システムにより明らかにしたい。