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歯周病原性菌の口腔内定着阻害に関する研究-モノクロナール抗体の利用-

SPFラットの臼歯歯頸部に絹糸を結紮した後、E・corrodens1073を感染させ、絹糸結紮による歯周組織への物理的刺激とE・corrodensの歯周病原性との相乗効果を期待する感染動物モデルを作成し、本菌の歯周局所への定着と歯周組織破壊の程度との関係を検討した。その結果、LSの特異的阻害剤をラットに投与することにより、本菌の歯周局所への定着を阻害できるとともに、歯槽骨破壊の程度を減少できることが示唆された。
哲学的理論における抽象性と具体性-ヘーゲル哲学と看護理論に定位して

1.中心的な成果としては、ソクラティク・ダイアローグ(以下SD)という哲学的グループ対話方法論がもつ哲学的可能性が、理論的側面でも実践的側面でも明らかになった。SDは参加者の具体的・日常的経験にあくまで定位しつつ、それを各自が明晰に定式化し、また他の参加者の発言に耳を傾け、問いかけることによって、経験されたものの普遍的な意味を共同で取り出す。進行役(ファシリテーター)が媒介するその過程で、経験したものの当初の私秘性が公共的な方向へと開かれ、変容していく。発祥地ドイツとは文化的背景を異にする我が国でSDを有効に実践していくためには、進行役を中心としてどのような工夫が必要であるかを、本研究ではいくつかの点で明らかにした。また、参加型テクノロジーアセスメントにSDを応用する研究がEUで進められていることが報告され、日本でも同種の研究を実施する方向でEUのSD関係者と意見交換を行った。2.アフォーダンス理論や生態心理学を援用しつつ、上空飛翔的ではなくマテリアルの次元にしっかり足をつけた理性について検討し、その特徴を明らかにした。すなわちそのような理性とは、現場(看護・介護を含む)の具体性を担保としつつも、その具体性になずみ閉じこもることを避け、適宜抽象化・普遍化の作業を行い、しかもその作業の限界をつねに自覚しているのである。3.ヘーゲル哲学とのかかわりでは、京都学派の哲学、とくに田辺元の「絶対媒介の論理」に取り組み、この論理が現代の差異の論理に先駆しながらも、その実践概念の抽象性・思弁性のゆえに真の現場性をもちえないことを確かめた。1哲学一般との関連で。中国社会科学院において「人為と自然-1920-30年代におけるジョン・デューイと三木清」と題する研究発表を行い(平成12年8月29日)、ジェイムズと並ぶプラグマティズムの代表者であるデューイが中国の「生命哲学」を中国人自身の視点から理解しようとしたこと、その哲学の自然環境に対する謙虚さが西洋文化の過剰な理論的・実践的能動性に歯止めをかける効果がある点を評価したことを明らかにした。2臨床哲学との関連で。(1)中村雄二郎氏の哲学をめぐるシンポジウム(関西学研都市・国際高等研究所、平成12年12月9日)において、同氏の「臨床の知」との対比で、大阪大学を中心に展開中の臨床哲学が徹底的に現場に根ざし、現場と対話する知であることを明らかにしたうえで、それを人間論・行為論・コミュニケーション論の諸点から解明した。(2)ソクラテス哲学協会(ドイツ)主催の「ソクラテス的対話」(平成13年2月23-26日、ヴュルツブルク)に参加し、哲学的権威を持ち出すことなく自分の理性に基づいて思考し、相互に耳を傾けるグループワークの方法論を改めて習得し、また抽象的な原則を事例に適用することを避ける臨床哲学の実践についてドイツ語で報告した。(3)神戸市看護大学で行われたソクラテス的対話に参加し、看護学生たちが他者体験をいかに言語化するかを詳細に知ると同時に、グループワークの中でその言語化にコミットすることができた。3看護理論・看護哲学との関連で。(1)日本赤十字看護大学哲学研究会(平成12年11、12月)に参加し、システム論を中心とする看護の捉え方について哲学的理論の観点からコメントとし、また臨床哲学の現場論・ケア論を紹介して、より看護実践に密着しつつ看護の内部的視点を超える理論の可能性について意見を交換した。(2)兵庫県立看護大学における看護事例検討会(毎月)に参加し、「癒しの哲学」に関する特別講義を行った。1本年度はとりわけソクラティク・ダイアローグ(以下SD)という哲学的グループ対話方法論とそこから出てくる哲学の理論的・実践的可能性の検討に重点をおいた。

2001年2月にドイツ・ヴュルツブルクでのSDに参加し、このおりの意見交換をもとに同年9月のドイツ・ソクラティク哲学協会代表者2名を交えた国際コロキウムを主催した。そのさい先端医療技術をめぐる公共的意思決定プロセス(参加型テクノロジーアセスメント=PTA)にSDを応用する彼らの研究が欧州連合(EU)で採用されたこと、市民のコミュニケーション能力向上をめざしてSDと調停(裁判外紛争処理の1形態)とを統合できる可能性があること、他方SDを導入して医師・患者間のコミュニケーションを改善する試みもなされているがマクロな次元でいくつか問題が指摘できることなどが明らかになった。また、PTAにSDを応用する研究を日本でも実施する方向で検討することが合意された。2単著『臨床的理性批判』を公刊し、その中でアフォーダンス理論や生態心理学を援用しつつ、上空飛翔的ではなくマテリアルの次元にしっかり足をつけた理性を記述するよう試みた。本研究課題の言葉でいえば現場(看護・介護を含む)の「具体性」を担保としつつもその具体性になずみ閉じこもることを避け、適宜抽象化・普遍化の作業(ヘーゲル哲学が1つの範を示した)を行い、しかもその作業の限界をつねに自覚している理性の立場を明らかしようと試みた。3京都学派の哲学とくに田辺元の絶対媒介の論理に取り組み、この論理が現代の差異の論理に先駆しながらも、その実践概念の抽象性のゆえに真の現場性を持ち得ないことを確かめた。4看護理論の哲学的整備に取り組み、既成の哲学理論を演演繹的に適用するのではなく、看護実践の具体性を生かしたインタラクティヴな理論形成をめざすべきであることを確認した。
有機ロジウム基を用いた新規反応によるモリブデン-ロジウムクラスター錯体の合成

Mo_3S_4アクア錯体と有機ロジウム基との反応による金属取込み反応より、単結晶を単離した。この単結晶を用いてX線結晶構造解析を行なった結果、Mo_3RhS_4骨格をもつクラスター錯体が生成することを確認した(図1)。この錯体はキュバン型のMo_3RhS_4骨格が、酸素架橋で結合し、新しいタイプのツインキュバン型骨格を形成していることが明らかになった。紫外、可視、近赤外領域における吸収スペクトルの測定、およびX線光電子スペクトルの測定結果より、錯体の物性に関する知見を得ることに成功した。錯体の反応性について試験したところ、塩化物イオンやチオシアン酸イオンなどを加えることにより、吸収スペクトルに大きな変化が確認された。反応生成物について、微細な結晶を単離したが、その構造など明らかにするには至らなかった。また本錯体と有機小分子との反応についてもいくつかの実験を行ったが、はっきりとした結果を得るに至っていない。
中枢神経系の3次元アトラスとその読影支援への応用に関する研究

1.3次元アトラスおよび診断知識データベースの整備既に入力した組織の形状を、医師の評価を受けて改善した。この作業は完了していないが、現状でも臨床応用は十分可能である。2.3次元アトラスと臨床で得られた画像との対応付け手法の開発アトラスと臨床で得られた画像を対応付けして解剖学的な分類を提示するために、遺伝的アルゴリズムを基にした対応付け手法を開発した。本研究では基礎的な評価実験を行い、実用的な手法としての可能性を確認した。3.関連する技術に関する研究(1)読影支援システムの機能分散による処理時間の短縮ネットワーク接続された複数の計算機にに読影支援システムの機能を分散することで、計算機資源の有効利用、処理時間の短縮による使用性の向上などを実現した。(2)組織の形状の3次元表示の高速化3次元的形状を表示する有効な手法であるボリュームレンダリングの高速化を図り、画質を劣化させずに従来の手法よりも高速化できたが、実用化にはまだ不十分であった。(3)階層的な領域分割手法の開発1.における組織の分類の労力軽減と時間短縮のために、領域・エッジ併用法に階層的な領域拡張法を導入して、抽出精度を下げずに処理時間を短縮する手法を開発し、その性能を実験により確認した。(4)3次元位置指示装置の試作1.における3次元位置の指示を容易にするために、立体視のためにカラー眼鏡、位置計測のために超音波を利用した安価な装置を開発した。位置決めの精度にやや問題があるが、アトラスの組織分類、頭部内のナビゲーションなどへの利用が期待できる。以上の成果により、3次元アトラス作成の効率化および読影支援システムの機能向上に必要な技術を大幅に改善できた。今後は残された課題を解決し、読影支援システムの改良、3次元アトラスの有効利用法などを検討したい。
Bacteroidesの多様な表層抗原性を生み出すゲノムシステムの解明

ヒト大腸常在菌であるBacteroides fragilisのゲノム上に存在するinvertible領域のうち、Class I領域は莢膜多糖、II、III、IVおよびVI領域は外膜蛋白質の発現制御に関わっている。昨年度の研究においてClassIV領域のDNA inversionに関与するtyrosine recombinase遺伝子(BF2766)を同定し、この領域が本菌種におけるouter membrane vesicleの形成に関与することを明らかにした。本年度はClass II領域のDNA inversionを制御するrecombinase遺伝子を同定するため、候補遺伝子の破壊株を作成し、Class II領域のDNA inversionが消失する変異株を検索した。その結果、Class V領域の外膜蛋白質SusC/Dshufflon内部に存在するtyrosine recombinase遺伝子(BF0667)の変異株において、10箇所全てのClassII領域でのDNA inversionの消失もしくは逆位頻度の減少が認められた。この変異株にBF0667をプラスミドで相補するとClass II領域におけるDNA inversionが回復したことから、BF0667はグローバルにClass II領域のDNA inversionを制御するtyrosine recombinaseをコードしていると考えられた。さらにBF0667欠損変異株においては外膜蛋白質SusC/DshufflonであるClass VおよびVI領域においてもDNA inversionが消失していた。この結果、BF0667がClass II領域のみならず、他の2箇所の外膜蛋白質SusC/DsbufflonのDNA inversionをも包括的に制御しており、BF0667は配列認識特異性の低いユニークなsite-specificrecombinaseをコードしていると考えられた。さらに、BF0667の欠損変異株を野生株と1対1の菌数になるように混合後、無菌マウスに経口接種し、糞便内での残存率を比較した。その結果、BF0667欠損変異株の糞便内生菌数は野生株の約1%であり、BF0667によるこれら領域の発現制御が腸管への定着に重要な役割を果たしていると考えられる。
ATLにおけるIL-2受容体発現異常の研究

本年度は、1)IL-2受容体を介するシグナル伝達、親和性形成に重要と考えられているが、その構造が不明のIL-2受容体β鎖に対するモノクロナル抗体の作製、2)ATL患者白血病細胞、HTLV-I感染細胞株におけるβ鎖発現、および、3)HTLV-I感染細胞株EDにおけるIL-2依存性増殖より非依存性増殖への移行に伴う細胞内変化の検討、を行った。まず、α鎖(Tac)とは反応せず、IL-2の結合を阻止する2R-B抗体の作製に成功した。この抗体依存下のIL-2結合試験では、高親和性受容体が消失するが、低親和性受容体(α鎖)には影響を与えない。また、抗Tac抗体と共同でIL-2依存性増殖をほぼ完全に阻止することから、2R-B抗体は、IL-2受容体β鎖(P75)を認識していると考えられる。今後、この抗体は、IL-2受容体の構造、発現調節、シグナル伝達機構の研究に、有用な武器となろう。2)に関しては、ATL患者末梢血白血病細胞では、1501,500/細胞の高親和性、1,600/22,700/細胞の低親和性受容体を発現しているが、2R-B抗体でのβ鎖の検出は困難な例が多い(検出感度の問題か)。短期間培養の系では、β鎖発現の増強がみられ、この結果は、α鎖と同様に、β鎖発現とHTLV-I発現の間にも密接な関連性のあることを示唆している。3)IL-2依存性増殖より非依存性増殖への移行に伴っては、IL-2,IL-4、GM・CSFオートクリン増殖は証明されなかった。また、TPA刺激は、依存性株では細胞増殖を引き起こすのに対し、非依存性株では増殖を抑制し、この抑制効果はPDBu高濃度処理により消失した。PDBu結合部位数は、非依存性株は依存性株の約5倍認められた。これらの結果から、高濃度PDBu処理抵抗性の細胞増殖促進性に作用するCカイネースの量的増加、あるいは活性化が,IL-2依存性増殖より非依存性増殖への移行に伴う変化の一つである可能性が考えられた。
湖沼沿岸域修復の生態学的意義

諏訪湖沿岸の修復事業を一つのモデルとして、湖沼沿岸修復の生態学的な意義に関しての検討を行った。(1)抽水植物の代表的植物であるヨシを用いた実験圃場での実験結果から、およそ3,500m^2のヨシ群落では5月から12月までの期間に、流入した全窒素と全容存リンが75%、硝酸態窒素では86%が除去され、ヨシ群落での水質浄化機能の高さが確認された。その多くは懸濁態物質がバイオフィルター効果により除去されるもので、窒素、リンの物質収支からの計算によると、ヨシ自身による除去率は窒素で46%、リンでは36%であった。抽水植物群落の生態学的意義は、これら水質浄化機能ばかりでなく、ヨシ群落を構成する動植物の構成、物質循環系としての構造の形成にあることが指摘される。(2)エビモを主とする沈水植物群落での生態系モデルの解析により、沿岸域での物質循環量を計算した結果、沿岸域は沖合に比較して単面積当たりの循環量が炭素では2.4倍、窒素では1.8倍、リンでは2.2倍と高いことが証明された。その内容としては、エビモ自身とエビモに付着する付着藻類の存在が大きく関与しており、沈水植物群落全体の浄化量の窒素では40%、リンでは60%に相当することが分かった。沿岸域は複雑な生態系構造を有し、浄化力の高い場であると共に、多くの生物の生活の場を提供していることでも評価される場である。そのためには沿岸域生態系が複雑な構造を維持し、生態的にも多様な環境が形成されるようなミチゲーション手法が必要となる。ただし、過大な浄化力への期待は禁物で、集水域からの自然負荷に対応する程度と理解することが重要である。
イネ紋枯病菌における菌核分化の制御機構

担子菌の一種、イネ紋枯病菌Rhizoctonia solaniの菌核分化を制御する直鎖DNAプラスミドの構造と機能、ならびにゲノムDNAとの関係について解析し、次の成果をえた。1.本菌のプラスミド保有株は、成長が遅く、菌核を形成せず、病原性が弱く、多量のシュウ酸を産生した。実験条件下ではプラスミド保有とシュウ酸合成、菌核形成の間には相関関係が認められた。成長と菌核形成が低pH培地中で抑制され、pHを5.5以上に調整することによって菌核形成が可能になることから、プラスミド保有株はシュウ酸の産生によるpHの低下により成長と菌核形成を抑制されていることが明らかになった。2.本菌のプラスミドは、27キロベースの直鎖DNAであり、各種制限酵素による切断点の解析から制限地図を作製したところ、大きさの等しい2種のプラスミド,pRS64-1とpRS64-2,からなることが明らかになった。各プラスミドをBamHIで切断し、放射能ラベルした断片をプローブとして相互に雑種分子形成を行ったところ、両プラスミドが相同な塩基配列をもつことがわかった。この結果は両プラスミドが同一の起源をもつことを示唆している。3.本菌のゲノムDNAを制限酵素PstIで切断し、放射能ラベルしたプラスミドと雑種分子形成を行ったところ、ゲノムDNA中にプラスミドDNAと相同な約13キロベースの塩基配列があることを見いだした。この結果はプラスミドがゲノムDNAに組込まれたり切り出されたりする可能性を示すものである。
戦後の障害児教育運動に関する歴史研究ー東京都の全員就学をめぐる運動と政策を中心に

本研究最終年度である本年度は、史料調査を継続しつつ、論文化の作業を行った。1)東京都障害児学校教職員組合の「障害児教育研究集会」が提起した教育実践・理論の内容および水準を、養護学校義務制実施過程に位置づける作業を行うために、日教組全国教研障害児教育分科会ならびに日教組教育制度検討委員会に関する史料の調査・収集を行った。2)重症心身障害児に焦点を当て、障害児の「生存」要求を「教育」の論理で組み替えながら「学校」の機能と基盤を拡張させる様態を「重症児の学校」の展開としておさえ、重症児の発達と生活の現実に即して近代学校の体系を相対化し、重症児教育を構成する理論と実践が組み立てられていく過程を検討し、義務制実施期に作り出された養護学校における教育の内実を明らかにした(「重症心身障害児の「学校」をつくるー教育と生存の場としての学校ー」『教育学研究』85-4,2018)。3)戦後社会における障害児教育問題の歴史認識を検証する作業にも着手した。従来のように「運動と抵抗の主体」のみに焦点を当てるのではなく、障害のある人びとの社会的諸関係とその矛盾の動態をおさえながら、障害のある人びととその家族の要求や生活経験、教育・福祉実践に即して発達保障の仕組みがつくられていく過程を叙述した(『発達保障の道-歴史をつなぐ、社会をつくる』2018)。4)1960年代から70年代の高度成長期の日本社会を、障害のある人びとの権利の要求実現・獲得という側面から平板に描くのではなく、権利の要求として表現される以前の、人びとの生活や実践の相とそこでの矛盾を捉えることを歴史認識の課題として提起した(「発達保障論における社会形成の原理とその論点」『発達保障論の到達と論点』2018)。初年次にあたる本年度は、東京都における不就学をなくす運動の成立・展開と、そこでの障害児の教育要求の生成について検討した。具体的には、1971年から1972年にかけて東京都文京区で取り組まれた「文京区心身障害児実態調査委員会」による運動の展開に即して、不就学の問題性がいかに把握され、福祉や医療に代替されない学校教育への要求がどのように形成されたのかを検証することを課題とした。その際、不就学にまつわる個別の経験を集積しながら、保護者が学校教育への意識や行動を共同化していくプロセスを明らかにするとともに、運動に参加する多様な人びとの主体形成に即して障害児の教育要求が住民自治や地域全体の課題としての正当性を獲得していく社会化の様相を検証した。こうした研究の課題と計画については、心理科学研究会2016年春の研究集会・歴史研究分科会(2016.4.17)において「1970年代の不就学障害児実態調査運動における心理学研究者の自立と主体形成ー「文京区心身障害児実態調査委員会」を中心に」と題して報告した。本年度の具体的な作業としては、調査委員会による報告書『ぼくらにも教育・医療・福祉を』(1972)をはじめ報告書やニュースなどを分析して事実関係を整理するとともに、中村和夫氏(京都橘大学教授)への聞き書きを行った。「文京区心身障害児実態調査委員会」は、1970年代の不就学実態調査運動のひとつの典型をなした。この運動を主導した茂木俊彦(当時・東京大学教育学部助手)を取り上げ、茂木の心理学研究者の主体形成について検討した。茂木の場合、障害のある子どもとの出会いや民間研究運動への参加が、研究者としての生き方や研究方法論の修正を直截もたらしたわけではなく、これらに「規定されつつ、とらえ返す」という主体化の契機・プロセスにおいて心理学研究をめぐる矛盾・葛藤が引き起こされていたことを明らかにした。本年度は、上記したように、東京都文京区を中心に、東京都における不就学をなくす運動の成立・展開に関する資料収集と分析を中心に行い、その研究作業の過程で得られた知見の一部は、以下のようなかたちで発表した。「書評:井原哲人著『「精神薄弱」乳幼児福祉政策の戦後史:権利保障体系の展開と変質』『社会事業史研究』第50号、pp.179-185、2016、「特別支援学校における教育要求の組織化とその今日的課題」『障害者問題研究』第44巻1号、pp.2-9、2016、「『夜明け前の子どもたち』の社会史にむけて」『発達のひかりは時代に充ちたか?ー療育記録映画『夜明け前の子どもたち』に学ぶ』クリエイツかもがわ、pp.170-171、2017。これらと並行して、松本昌介(元・東京都立養護学校教員)の協力をいただきながら、「全員就学」に関する東京都教育委員会ならびに運動側の資料調査・収集を行った。そのなかで、全員就学に向けた教育条件整備として重要な礎石となった、東京都立養護学校の「介助員」制度(1967年)に関する資料を収集することができたことは大きな成果であった。とりわけ都立光明養護学校におけるPTA通信『光明』、母親文集『すべての障害児に教育を』など、保護者・家族の教育要求を分析するうえで不可欠の資料を得ることができた。また、全員就学に向けた運動基盤の形成に大きな役割を果たした「障害をもつ子どものグループ連絡会」に関する資料も収集することができた。これらにより、次年度以降、障害児の教育要求が保護者・住民から立ち上がり、学校・教師、行政職員・政治家がそれらに応答していく様相を分析していくうえで基礎的な環境をつくることができた。

養護学校義務制実施の歴史的意義を検証するうえで、地域や家族の現実に即して、障害児の教育要求が養護学校の実践や制度として形成されていく過程が明らかにされる必要がある。昨年度は、東京都文京区を対象として、当該地域の不就学をなくす運動の成立・展開と、そこでの障害児の教育要求の生成のプロセスを検証した。これを受けて本年度は、教師による教育実践の構築、行政の制度運用技術が絡み合いながら、障害児の学校教育制度が確立してくるプロセスを明らかにすることをめざした。具体的な作業としては、教育行政サイドが「学校に行きたい」という要求と「学校に受け入れる」という条件の間に存在した葛藤や矛盾をどのように調整しようとしたのかを明らかにするために、東京都教育委員会が「全員就学」政策の体系づくりにむけて設置した「東京都心身障害教育検討委員会」の議論を中心に検討した。1973年2月の東京都議会において都知事と教育長が不就学障害児をなくす旨を答弁し、3月には「障害児教育確立に関する意見書」が採択された。これを受けて東京都教育委員会は、1974年度からの障害児希望者全員就学の実施に備え、「東京都心身障害教育施策体系」(1973年6月)を策定し、9月に「東京都心身障害教育検討委員会」および「心身障害教育連絡協議会」を発足させた。これらのプロセスをたどっていくと、教育行政が子ども・保護者の教育の「要求」と「必要」に直接触れていくなかで、それらの「必要」と「要求」に即して政策・実践を立ち上げる契機が確認された。就学指導の原理として「選別」から「必要」への転換がなされたが、そこには学籍問題をふくめた「教育」形態の多様化と就学猶予・免除の撤廃への認識があり、教育行政の論理が「条件に子どもを合わせる」ことから「子どもに条件を合わせる」ことへとスライドしていく様相がうかがえた。本年度は、資料調査の進展状況をふまえて、当初3年次に予定していた、教育行政が教育要求や教育実践の蓄積を受けとめて「全員就学」を実現させていくプロセスを検討した。日本教育学会第76回ラウンドテーブル「東京都の障害児「全員就学」(1974年)をめぐる歴史的評価」において「戦後障害児教育における東京都障害児希望者「全員就学」の位置と評価」とのタイトルで中間的な報告を行った。ここでは、全員就学以前の時期に、親のねがいを受けとめ障害の重い子どもの発達を保障する教育がいかに蓄積されてきたのかにかかわって、1960年代における重度・重複障害児教育の形成過程についても情報を得ることができた。これらの情報と議論に示唆を受けて、都立養護学校ならびに区立小学校・中学校特殊学級、区教育委員会に関する資料調査を進めることで、全員就学の全体的な政策の構造と過程を検討するための準備が進んだ。また、教育目標・評価学会第28回大会公開シンポジウム「障害のある人々の学卒後の生活・労働の現状から、教育を考える」に参加し、「特別支援教育制度のもとでの学校から社会への移行」とのタイトルで報告を行い、後期中等教育における職業教育や社会的な自立・移行が大きな争点とされてきた知的障害養護学校(特別支援学校)高等部の歴史的変遷に即して、障害のある場合の学校から社会への移行に関する課題について歴史的に整理し、義務制以降の養護学校の展開についても考察をした。なお、不就学をなくす運動に関する資料調査を継続するなかで、あらたに大田区、渋谷区、練馬区における不就学実態調査運動に関するまとまった資料を収集するとともに、これに関係した地域の障害児サークルに関する資料も収集することができたが、不就学にまつわる個別の経験から学校教育への要求を共同的に組織化していくプロセスについては次年度さらに検証していく。
半導体超微粒子の量子サイズ効果を利用した光電変換機能の磁場制御

本研究では半導体の粒径を数十Åまで小さくした半導体超微粒子を作成した。作成した超微粒子を分子組織化した膜に担持させた修飾電極を作成した。半導体超微粒子修飾電極の光電変換機能に対する磁場の影響を観察し量子サイズ効果を利用した光電変換機能の磁場制御を実現するとともに、磁性イオン添加した希釈磁性半導体を用いることで磁場の影響の増大を図った。具体的には以下の研究を行った。1.CdS超微粒子をAOT逆ミセル法を用いて調整した。CdS超微粒子を金電極にSAMを利用して固定化し、修飾電極を作成した。トリエタノールアミンを添加し、光照射するとアノード方向に光電流が観測された。修飾電極のアクションスペクトルとCdS超微粒子の吸収スペクトルが一致した。光電流はCdS超微粒子の光励起により起こっている事がわかった。さらに、磁場(0.7T)の印加すると光電流の減少(3.0%)が観測された。ここで、超微粒子ではないCdSを修飾した電極では磁場効果は観測されなかった。従って、磁場効果は量子サイズ効果が原因と考えられる。2.次に、CdS超微粒子と同様にAOT逆ミセルを用いてII-VII族半導体のカチオンの部分をMn,2価の磁性イオンに置換した混晶、すなわち希釈磁性半導体(Cd_<1-x>Mn_xS)を超微粒子化した。1と同様に修飾電極を作成し、光電流に対する磁場効果を検討した。Cd^<1-x>XMn_xS(X=0.2)の修飾電極では磁場(0.7T)の印加すると光電流の減少(8.0%)が観測された。この様に磁性イオンを添加することで磁場効果が大きくなった。よって、電子の閉じ込め効果と伝導電子(バンド電子)と含有する磁性イオンとの磁気的な相互作用(交換相互作用)によって磁場効果が増大したと考えられる。3.磁場効果は電子一正孔対における一重項一三重項変換が磁場によって抑制されるために起こると考えられた。さらに、超微粒子化の効果は電子一正孔対の閉じ込め効果によって発現していると考えられた。半導体超微粒子修飾電極の光電変換機能に対する磁場の影響を観察し、量子サイズ効果を利用した光電変換機能の磁場制御を実現するとともに、磁性イオン添加した半磁性半導体を用いることで磁場の影響の増大を図った。1. CdS超微粒子をAOT逆ミセル法を用いて調整した。次に、CdS超微粒子と同様にAOT逆ミセルを用いてII-VII族半導体のカチオンの部分をMn,2価の磁性イオンに置換した混晶、すなわち半磁性半導体(Cd_<1-X>Mn_XS)を超微粒子化した。Cd_<1-X>Mn_XS(X=0.2)の修飾電極では磁場(0.7T)の印加すると光電流の減少(8.0%)が観測された。

2.次に、CdS超微粒子と同様にAOT逆ミセルを用いてII-VII族半導体のカチオンの部分をMn,2価の磁性イオンに置換した混晶、すなわち希釈磁性半導体(Cd_<1-x>Mn_xS)を超微粒子化した。1と同様に修飾電極を作成し、光電流に対する磁場効果を検討した。Cd^<1-x>XMn_xS(X=0.2)の修飾電極では磁場(0.7T)の印加すると光電流の減少(8.0%)が観測された。この様に磁性イオンを添加することで磁場効果が大きくなった。よって、電子の閉じ込め効果と伝導電子(バンド電子)と含有する磁性イオンとの磁気的な相互作用(交換相互作用)によって磁場効果が増大したと考えられる。3.磁場効果は電子一正孔対における一重項一三重項変換が磁場によって抑制されるために起こると考えられた。さらに、超微粒子化の効果は電子一正孔対の閉じ込め効果によって発現していると考えられた。
抑制性アダプター蛋白質Lnkによる造血制御機構の解析と免疫系再構築への応用

Lnk欠損マウスは正常マウスに比して5倍の血小板数を示す。巨核球前駆細胞から血小板産生に至る過程におけるLnkの作用点及び作用機構を検討した。Lnk欠損マウスでは巨核球前駆細胞が増加し、トロンボポイエチンに対する反応性も亢進していた。骨髄より調製した巨核球を用いてトロンボポイエチンシグナルを解析した結果、Erkの活性化がLnk欠損巨核球で助長していた。トロンボポイエチンとインテグリンリガンドの一つVCAM-1による共刺激は、野生型巨核球においてトロンボポイエチン刺激によるStat5のリン酸化を低下させる一方でErk及びp38の活性化を増強した。Lnk欠損巨核球ではいずれの活性化もBSA刺激と比べ変化が見られなかった。BSA上ではともに類似した血小板産生形態変化を示したが、VCAM-1上での野生型巨核球は平たい細胞体からより分岐した血小板前駆体を形成するのに対し、Lnk欠損巨核球は辺縁のみならず細胞体からも血小板前駆体を放出した。以上の結果よりLnkがトロンボポイエチンシグナルを負に制御することにより巨核球成熟を抑制しているだけでなく、インテグリン刺激による血小板放出機構にも関与していることが示唆された。さらに、成熟血小板機能におけるLnkの役割を検討した。Lnk欠損により血餅退縮に異常が見られた。インテグリンα2bβ3のシグナルを解析した結果、c-Src及びFynがインテグリン刺激依存性にLnkに会合することが分かった。また、Lnk欠損血小板ではインテグリン刺激によるβ3のリン酸化が減弱しており、刺激依存性に見られるFynのインテグリンβ3への会合も見られなかった。インテグリンを介した骨格制御におけるLnkの機能及び血栓形成におけるLnk依存性経路の重要性が示された。N末端富プロリン領域、PH、SH2ドメイン、C末端チロシンリン酸化部位を持つLnkに、一アミノ酸置換や欠失を導入し種々の変異体を作製した。これらを用いSH2ドメインが増殖抑制に必須の役割を担うこと、SH2ドメイン変異体群はドミナントネガティブ変異体(DN-Lnk)として機能しうることを明らかにした。またN末端欠失により多量体形成能が消失し、DN-Lnk変異体の効果が消失することから、DN-Lnk変異体はN末端を介して多量体を形成し野生型Lnkを競合阻害することが推察された。レトロウイルスを用いてDN-Lnkを野生型マウスの造血幹細胞・前駆細胞に感染導入し移植実験を行った。DN-Lnkの移植群はコントロール移植群に比べて高い造血能を示しことから、DN-Lnkは造血幹細胞・前駆細胞に内在性に発現するLnkの機能を阻害できることが分かった。エレクトロポレーション法による一過性発現でも効果を示し、骨髄非破壌的前処置を施した免疫不全マウスへの高効率な生着など造血幹細胞及び前駆細胞の移植後早期の生着能を促進すると考えられた。Lnk欠損マウス骨髄に存在する巨核球前駆細胞をコロニーアッセイにより解析したところ、数の増加のみならずTPO反応性の亢進が観察された。また、多くの核数を持つより成熟した巨核球の占める割合が増加していた。TPO存在下で骨髄細胞を培養することで得られる巨核球を用いて、Lnkにより制御されるTPOシグナル伝達経路の生化学的解析を行った。TPO刺激依存性に誘導されるStat3、Stat5、Akt及びp38のリン酸化は変化なかったが、Erk1及びErk2のリン酸化のみがLnk欠損巨核球で亢進していた。TPOシグナル伝達経路におけるLnkの作用点がErk1及びErk2のリン酸化に至る経路であることを明らかにした。

また、Lnk欠損血小板ではインテグリン刺激によるβ3のリン酸化が減弱しており、刺激依存性に見られるFynのインテグリンβ3への会合も見られなかった。インテグリンを介した骨格制御におけるLnkの機能及び血栓形成におけるLnk依存性経路の重要性が示された。
プリオン病初期病変形成機序の解析

DNAマイクロアレイ法を用いて、プリオン感染早期から発現が変動する宿主遺伝子の探索を行い、発現がプリオン感染早期から上昇する遺伝子の病態機序への関与を解析した。その結果、LPSレセプターとして知られるCd14分子が病態進行に関与すること、神経保護作用を有するケモカインとして知られるCxcl10が病気の進行に抑制的に働くことを明らかにした。また、ミクログリアの活性化が病態進行に抑制的に働くことが示唆された。プリオン病の有効な治療法はなく、その確立が希求されている。プリオン感染における神経変性機序の解析は病変形成機序の理解につながり、ひいてはプリオン病の予防・治療法の開発に重要な知見を提供する。本研究では、プリオン病の予防・治療法、および診断法の開発に貢献するために、プリオン病における神経変性機序の解析を目的とする。プリオン病の臨床期中期病末期では神経変性の初期過程から末期過程までが混在しているため、神経変性を引き起こす変化と、神経変性後の代償性変化を区別することが難しい。そこで、プリオン感染の初期過程を解析の標的として、病変形成・神経変性に伴い変動する宿主因子を網羅的解析により特定する。そのような宿主因子の神経変性への関与を細胞レベル、組織レベルおよび動物レベルで検証する。これらの解析、検証を通じて、PrPScの存在だけでは説明できない神経変性機構を、組織レベルおよび細胞レベルで明らかにする。プリオン病に罹患した動物の神経組織では異常型プリオン蛋白質(Prp^<Sc>)が蓄積し神経変性が生じるが、神経変性機序は"Prp^<Sc>の存在=神経変性の原因"だけでは説明できない。Prp^<Sc>の増幅過程で生じる宿主細胞の変化に加えて、アストロサイト、ミクログリアなどの神経細胞以外の神経組織を構築する細胞の関与も注視する必要がある。そこで.プリオン感染の初期過程を解析の標的として、病変形成・神経変性に伴い変動する宿主因子を網羅的解析した。マウス順化Obihiro株、Chandler株感染マウスを、プリオン接種後60、74、および90日目に安楽殺し脳を採材した。陰性対照として、正常マウス脳乳剤を接種したマウスを用いた。実体顕微鏡下で、視床背外側、扁桃体、視床下部および延髄前庭核の領域を採材した。Total RNAを向収し、GeneChip Mouse430_2(Affymetrix)を使用してDNAマイクロアレイ解析を実施した。Obihiro株、Chandler株では発症(接種後約120日)および病末期(接種後約150日)に至る期間に差はないが、遺伝子発現を比較するとChandler株感染マウスで、Obihiro株より早期に宿主反応が起こっていた。特に前庭核では接種後60日の時点ですでに、cxc11Oやcxc113などのケモカインの発現増加、ノルアドレナリンの合成に関与する酵素遺伝子の発現が低下していた。来年度もDNAマイクロアレイ解析を継続するとともに、感染初期に変動が認められる遺伝子とプリオン病病態形成の関係を、これらの欠損マウス、抗体、あるいは阻害剤等を用いて調べる予定である。プリオン病の神経病変形成を理解するためには、異常型プリオン蛋白質(PrP^<Sc>)の増幅過程で生じる宿主細胞自身の変化に加えて、アストロサイト、ミクログリアなどの神経細胞以外の神経組織を構築する細胞の変化を知る必要がある。そこで、昨年に引き続き、プリオン感染の初期過程を解析の標的として、PrP^<Sc>蓄積と病変形成に伴い変動する宿主因子を網羅的に解析した。Total PrP量でPrP^<Sc>の蓄積を評価した結果、Chandler株感染マウスの脳では、Obihiro株よりも早期からPrP^<Sc>の蓄積が起こることが明らかとなった。この結果は、Chandler株感染マウスでObihiro株よりも早くから宿主応答が起こることと一致した。DNAマイクロアレイ解析の結果から、cxc110、cxc113、CD14,CD44、CD52、CD68などのケモカインあるいは免疫系に関連する遺伝子の発現が感染早期から上昇することが判明した。この中で神経保護作用が報告されているcxc110に着目し、cxc110遺伝子欠損マウスにプリオンを接種して病態の変化を調べた。その結果、cxc110遺伝子欠損マウスでは野生型マウス比べ潜伏期が短くなることから、cxc110はプリオンの病態進行を抑える働きがあることが示唆された。一方、供試マウス数は十分ではないが、Cd14欠損マウスでは、野生型マウスと比較して潜伏期が延長することを見出した。これらマウスにおける詳細な病態解析は次年度実施する予定である。なお、マウスの感染試験が長期間を要することから、平成19年度は研究費を繰越して、感染実験を継続した。プリオン感染動物の中枢神経系組織では、プリオンの増殖に伴い、ミクログリアおよびアストロサイトが増生する。

プリオンの増殖に反応して増生するグリア細胞から放出される種々のサイトカインやケモカインは病態の進行に促進的あるいは抑制的に働くと予測されるが、その実態は明らかではない。特に感染初期に起こる応答は病気の進行に抑制的に働くことが予測される。そこで、昨年に引き続き、DNAマイクロアレイ法により、感染後早期の遺伝子発現の変化を網羅的に解析した。接種後60日から90日にかけて発現が増加した遺伝子群のなかで、文献的にミクログリアで発現する遺伝子を選択したことろ、Cc15, Cc19, Cxc110, Fogr1, T1r2などモノサイト/マクロファージのM1-typeの活性化のマーカーとなるケモカイン等の発現が優勢であった。M2-typeの活性化の指標となる分子(Cd14, Fcgr2b)も発現上昇が認められているが、M1-tpyeの反応が亢進している傾向にあると考えられた。また、プリオン接種後60日から発現が上昇していたCd14の遺伝子欠損マウスを用いてプリオン感染実験を実施して病態を詳細に解析した。その結果、Cd14欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、異常型プリオン蛋白質の蓄積が遅れ、潜伏期が有意に延長した。しかし病末期における病理組織学的変化はCD14欠損マウスと野生型マウスで顕著な差は認められなかった。Cd14分子を介するシグナル伝達は病気の進行に促進的に働くことが示唆された。プリオン感染マウスの神経組織における網羅的遺伝子発現解析から、感染後早期から脳で発現が上昇する遺伝子群を絞り込んできた。その中で、本年はLPSレセプターとして知られミクログリアの活性化に関与するCD14遺伝子に着目し、CD14遺伝子欠損(CD14^<-/->)マウスを用いてプリオン感染実験を行った。プリオンChandler株およびObihiro株を接種した場合、CD14^<-/->マウスではWTマウスと比較して生存期間が延長したことから、CD14分子は病態の進行を促進する方向に働くことが示唆された。抗Iba1抗体による免疫組織化学では、CD14^<-/->マウスでWTマウスよりもミクログリアが活性している傾向が認められ、ミクログリアの数もCD14^<-/->マウスで多かった。またCD14^<-/->マウスでは、CD11b,CD45,CD68,F4/80などの活性化ミクログリアのマーカー分子の発現も亢進していた。従って、ミクログリアの活性化亢進は、プリオン病の病態に対して神経保護に作用する可能性が示唆された。一方、別の活性化ミクログリアのマーカーであるMac-2分子の発現は、WTとCD14^<-/->マウスで顕著な差は認められなかった。この結果から、WTマウスとCD14^<-/->マウスで、一部のミクログリアは活性化状態が異なることが示唆された。CD14^<-/->マウスではWTマウスに比べ、より早期から抗炎症性サイトカインであるTGF-βやIL-10の発現が亢進していたことから、活性化ミクログリアから放出される抗炎症性サイトカインが病態進行に対して抑制的に作用した結果、プリオン感染CD14^<-/->マウスの潜伏期が延長した可能性がある。
アルコール代謝遺伝子多型と飲酒量が頭頸部癌症例の血清マグネシウム濃度に与える影響

本研究の目的はシスプラチン投与を受ける我が国の頭頸部癌症例において、アルコール代謝関連遺伝子の多型と飲酒量の低マグネシウム血症への寄与を定量することである。シスプラチンは頭頸部癌の標準治療薬であり、用量制限毒性は腎毒性である。従って腎機能は頭頸部癌における一種の予後規定因子と考えることが出来る。研究代表者は平成28年度に頭頸部癌患者においてマグネシウムを補充することでシスプラチン投与量を有意に多く維持可能であることを論文報告した。低マグネシウム血症は一般的には飲酒、下痢、低栄養、プロトンポンプ阻害剤などが原因とされているが、これら因子の寄与割合については不明である。一方、飲酒による発癌性は遺伝子多型によって大きく異なることなり、中でもアルコール代謝に関わるALDH2/ADH1遺伝子多型の影響が大きいことが知られている。自験例ではアルコール依存症など大量飲酒例が高度な低マグネシウム血症を来していた。以上から「低マグネシウム血症もALDH2/ADH1遺伝子多型や飲酒量の影響を受ける。」と仮設を発案するに至った。本研究の先行研究はないため、必要なサンプルサイズを見積もるためのパイロットスタディを行った。まず主要評価項目である遺伝子多型と飲酒量による低マグネシウム血症発生頻度について調査を行った。報告書記載時点で20例ほど遺伝子検査を行っているが、アウトカム(イベント発生)である低マグネシウム血症の症例数が66例中2例と平成28年度に報告した前施設のデータより少なくパイロットスタディを終了できていない。あと数例低マグネシウム血症症例が追加されればパイロットスタディを終了し、サンプルサイズを算出して多施設共同研究を行う予定である。現状ではシスプラチン投与量や他治療との併用など対象症例の条件を厳しく設定しているが、対象症例を増やすために条件設定の見直しも検討中である。現在は検証的な研究実施に必要なサンプルサイズを見積もるパイロットスタディの段階である。当院では2016年まで化学放射線療法症例の血中マグネシウム濃度を測定していなかったため、対象となる症例は2016年以後のものに限定される。順次症例を積み重ねており、2019年5月16日現在66例において治療前の血中マグネシウム濃度の測定がなされており、現在までに19例に遺伝子検査を施行している。症例集積スピードが当初予想していたものより遅くなっている。また、これらのうち本研究の主なアウトカム(イベント)である治療前低マグネシウム血症を来していた症例は2例のみであり、これも当初の予想よりやや少ない。そのために主な目的である遺伝子多型と飲酒量の影響を見積もるに未だ至っていない。今後も同様に症例集積を重ねていくことでイベント数も増えてくるため、症例が集積した時点で必要サンプルサイズを計算して検討的な研究を実施する。その際にサンプルサイズが多くなった場合は当院だけで研究を遂行することは難しい。関連施設である都立駒込病院、埼玉県立がんセンター、群馬県立がんセンターなどとの多施設共同研究を検討する。H30年度は対象症例を化学放射線療法に限って集積している。治療法による結果の交絡を防ぐためである。しかし今後も症例集積スピードが望ましくない場合は、少なくともパイロットスタディの段階では全身化学療法単独治療や手術治療などの症例も含めて検討することを検討している。またはイベント発生の基準(低マグネシウム血症の基準)を変更するなどしてイベント数を増やすことにするなど、試験デザインについて再度検討を行う。

順次症例を積み重ねており、2019年5月16日現在66例において治療前の血中マグネシウム濃度の測定がなされており、現在までに19例に遺伝子検査を施行している。症例集積スピードが当初予想していたものより遅くなっている。また、これらのうち本研究の主なアウトカム(イベント)である治療前低マグネシウム血症を来していた症例は2例のみであり、これも当初の予想よりやや少ない。そのために主な目的である遺伝子多型と飲酒量の影響を見積もるに未だ至っていない。今後も同様に症例集積を重ねていくことでイベント数も増えてくるため、症例が集積した時点で必要サンプルサイズを計算して検討的な研究を実施する。その際にサンプルサイズが多くなった場合は当院だけで研究を遂行することは難しい。関連施設である都立駒込病院、埼玉県立がんセンター、群馬県立がんセンターなどとの多施設共同研究を検討する。H30年度は対象症例を化学放射線療法に限って集積している。治療法による結果の交絡を防ぐためである。しかし今後も症例集積スピードが望ましくない場合は、少なくともパイロットスタディの段階では全身化学療法単独治療や手術治療などの症例も含めて検討することを検討している。またはイベント発生の基準(低マグネシウム血症の基準)を変更するなどしてイベント数を増やすことにするなど、試験デザインについて再度検討を行う。進行状況に記載したとおり研究がやや遅れているため。
アンチセンスVEGFを用いた悪性グリオーマの遺伝子治療(血管新生阻止療法)

我々は、実験脳腫瘍、特に悪性グリオーマにおける血管新生阻止(anti-angiogenic therapy)を目的として治療実験を行ってきた。血管新生に最も重要とされるVEGF/VEGFRparacrine loopをいくつかの分子生物学的手法を用いて種々の段階でブロックを試み、その抗腫瘍効果を探ってきた、アンチセンスVEGF遺伝子治療を筆頭に、血管内皮前駆細胞の利用、HIF-1デコイ、Flk-1 specific kinase inhibitor、siRNA ; VEGFなどを用いたストラテジーを展開し、実験系を構築し、その治療効果を調べた。その結果、アンチセンスVEGFはレトロウイルスベクターを用いることで腫瘍細胞に選択的に導入可能で、動物実験に於いて強い抗血管新生効果および抗腫瘍効果を認め、有効かつ安全な治療法であることを証明した。また、Flk-1 specific kinase inhibitorも同様な効果を認め、現在、合成分子標的薬として米国でphase II studyが行われている。siRNAはまだ新しい技術で確立された手法ではないが、VEGFに特異的なsiRNAがVEGFの発現を有意に抑制可能であることをin vitroの系で証明した。アンチセンスVEGF遺伝子治療の臨床レベルヘの応用は、より導入効率の高いベクターの開発が鍵を握っていると思われ、今後の研究が期待される、最後に、これらのストラテジーを用いた複合治療(従来の抗癌剤や放射線治療との併用療法)についても今後の精力的な研究が必要であると思われる。我々は実験脳腫瘍、特に悪性グリオーマにおける血管新生阻止(anti-angiogenic therapy)を目的としてアンチセンスVEGFを用いて治療実験を行ってきた。本年は、アンチセンスVEGFを搭載したレトロウイルスを、恒常的に産生するヘルパーフリーのウイルス産生細胞株を樹立し、これを供給源としてレトロウイルス液を濃縮精製、あるいは産生細胞自体を腫瘍組織内に移植することで、アンチセンスVEGFの導入が可能であることを証明し、その抗腫瘍効果の評価を行った。その結果、濃縮レトロウイルスを用いたアンチセンスVEGF療法では、通常のウイルス力価の約1000倍の感染効率をもつウイルスを得ることができ、皮下移植および脳内移植モデルにおいてVEGF分泌抑制による有為な血管新生抑制効果および抗腫瘍効果を認めた。また、これらのアンチセンスVEGF導入動物において、明らかな副作用が認められなかったことから、このストラテジーの安全性も確認できた。あるいは、グリオーマ細胞株C6細胞にアンチセンスVEGFを導入した得たstable transfectantを用いて、VEGFが腫瘍浸潤にも関与していることを明らかにした(Goldbrunnerら)。さらに、従来のベクターの欠点を補うべく、新しいアンチセンスVEGFのベクターとして、血管内皮前駆細胞を末梢血から精製分離し、in Vitroで増殖させた後、VEGFその他の増殖因子を用いて血管内皮細胞まで成熟させた。現在、この細胞にex vivoで遺伝子を導入し、細胞ベクターとしての可能性を検討中である。その他アンチセンスVEGF療法との併用療法として、最近発見された低酸素誘導転写因子であるHIF-1(hypoxia-inducible factor-1)のデコイ(おとり遺伝子)を作製し、VEGFの転写レベルでの制御を試み、まだin vitroの実験系であるが、VEGF発現の制御が可能であることを初めて証明した。(1)血管新生依存性腫瘍である悪性グリオーマに対するアンチセンスVEGF療法に関して、その安全性および治療効果について研究を進めている。本年度は、昨年度に当研究室にて樹立したアンチセンスVEGF搭載レトロウイルス産生細胞の遺伝子導入効率の向上をはかるためベクターの改良を計画すると共に、レトロウイルスの混入、レトロウイルスおよび産生細胞に対する宿主の抗体産生など安全性の面をより詳しく検討した。遺伝子導入効率の向上のために、ウイルス産生細胞の培養条件を改善し、より感染効率の良い濃縮ウイルスの作成が可能となった。また、動物実験においてレトロウイルスによる抗体価の上昇を認めず、PCRでもウイルス遺伝子の他臓器への迷入は認めず、このストラテジーの安全性を確かめた。(2)VEGFの発現制御に関連して、低酸素誘導転写因子であるHIF-1のデコイ(おとり遺伝子)を用いた実験において、in vitroのみならず動物実験においてもVEGF発現抑制効果を認め、抗腫瘍効果についても現在検討中である。

核酸医薬品として取り扱い可能なデコイを用いて、転写レベルでの腫瘍細胞のVEGF発現をコントロールできれば、新しい血管新生阻止療法のアプローチヘの道が開かれるものと思われる。(3)現在、血管新生阻止療法と他の治療法との併用療法についての研究を発展させているが、アンチセンスVEGF療法と重粒子線(炭素線)との併用による悪性グリオーマの治療を新しい実験系を用いて検討中である。通常のX線と比較して生物学的作用が強く選択的な照射を可能とする炭素線は、腫瘍の局所制御率が高く、血管新生阻止療法との併用は、特に悪性グリオーマの治療において、相補的な抗腫瘍効果を期待できる兵庫県粒子センターにおける炭素線照射実験を鋭意準備中である。我々は、以前から悪性グリオーマに対する抗血管新生療法を研究してきた。VEGFは、腫瘍血管新生に最も関連する血管内皮特異的な増殖因子とされ、標的分子治療のターゲットとして有望と考えられる。本研究においてはVEGFを介した腫瘍血管と血管内皮細胞からなるパラクラインループを遮断し、抗腫瘍効果をえるストラテジーの開発を目的とし、主にアンチセンスVEGFを搭載したレトロウイルスを腫瘍細胞に導入することで腫瘍細胞からのVEGFの分泌を低下させ、腫瘍血管新生の制御をはかった。初年度はレトロウイルスの構築、次年度はin vitro及びin vivo実験において抗血管新生および抗腫瘍効果を報告し、更にその安全性、導入効率の改善や他の治療(HIF-1デコイ、重粒子線)との併用療法についても検討を行った。本年度は、新しいVEGFのsilencing toolとしてRNA干渉(RNAi)を用いてVEGFの制御を試み、アンチセンスVEGF療法との比較を行った。VEGF特異的な21ntのsmallinterfering RNA(siRNA)を用いることで、アンチセンスVEGFに比べ、より少量のsiRNAによって同等の効果を得られ、効果の持続期間も長いことがわかった。まだin vitro実験での結果のみであり、抗血管新生および抗腫瘍効果についてin vivo実験を計画している。アンチセンスVEGF療法は、血管新生の分子標的治療として、安全で有用な方法であるが、効率改善をはかりながら、他の治療法との併用を考えると共に、関連した新たなストラテジーの模索も必要になってくると思われる。今後、機会が与えられれば、アンチセンスVEGF療法の臨床応用を目指して、ベクターの改良、大動物を用いた安全性の確認などを行う予定である。
血管成熟化シグナルによる難治性網膜血管障害疾患の治療戦略

申請者は、網膜血管新生における血管内皮細胞とアストロサイトの相互関係をさらに明らかにすべく、血管発生期のアストロサイトに発現する遺伝子の網羅的探索を行った。血管が旺盛に発達をする生後3日と網膜内層の血管新生が完了する生後9日のPDGFRα陽性アストロサイトをフローサイトメトリー法にて単離した。DNAマイクロアレイ法を用いてトランスクリプトーム解析を行い、候補遺伝子を定量的PCR法にて確認したところ、生理活性ペプチドであるアドレノメデュリン(ADM)の発現上昇を血管発生期に認めた。そのため、本ペプチドと眼内新生血管病との関連を探るべく、レーザー誘導型脈絡膜新生血管(CNV)モデルにおける解析を行った。レーザー照射により、受容体構成因子であるCRLRやRAMPの発現は変化がなかったが、ADMの発現は照射後4日をピークに上昇していた。またin vitroの系でも網膜色素上皮細胞、マクロファージや血管内皮細胞は炎症性サイトカインの刺激によりADMの発現は上昇した。ADMの阻害剤および抗体によってCNVは縮小し、眼内血管新生病におけるADMの関与が明らかとなった。