hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生鱗をモデルとしたコラーゲン配向機構の解明-魚コラーゲンから生体修復材料を造る

解析:キンギョI型コラーゲンのa1、a2、a3サブユニット鎖mRNAの定量PCR系を確立した。ウロコを含む各種臓器における発現量を比較したところ,3つのサブユニットの発現量の比率が大きく異なっていた。このことは臓器によりコラーゲンのa鎖組成が異なり,結果として変性温度などコラーゲンの生化学的性質が異なる可能性を示す。今後タンパクレベルで各臓器のコラーゲンのa鎖組成とその生化学的性質を比較する。1鱗細胞に発現するRunx2, SPARC, Osteocalcin mRNAの鱗再生時の発現変化の定量と,発現部位の再生過程による変化を確定するとともに分裂細胞を特定した。これにより,再生過程において鱗形成細胞の前駆細胞がどこに存在し,どのような段階を経て分化するか,分化に果たす上記因子の機能の推定が可能になった。ウロコ細胞培養系を確立する重要な基礎的知見を得た。2ウロコ線維層板から抽出した非コラーゲン性タンパク質画分のうち,コラーゲンとの結合が弱い分子の画分からsid4を同定した。sid4はゼブラフィッシュで同定され,発生過程において細胞外基質とインタラクションして組織のパターニンングと器官形成に関与することが想定されている分子であるが,成体組織における分布や機能はまったく不明である。今後詳細にその機能を調べる必要がある。3キンギョ各臓器からコラーゲンを抽出しSDS-PAGE像を比較したところ,浮き袋・皮膚ではウロコ・筋肉・腸に比べてα2鎖の分子量が少し小さかった。α2鎖が小さい臓器では変性温度が数度高かったことから, α鎖の翻訳後修飾とコラーゲン変性温度に強い関連があることが予想された。魚類コラーゲンの変性温度とコラーゲン分子の修飾の関係を示唆した最初の結果である。4強磁場下におけるコラーゲン再線維化ゲルの線維配向と磁場強度との関係の研究を進め,磁場強度を12テスラと6テスラにて3時間照射しだ場合,どちらも線維がある程度配向し,両者に違いが無かった。また,創出したコラーゲン配向ゲルの引っ張り強度は, 6テスラにて配向させたゲルは約60MPa,磁場を用いない無秩序配向ゲルでは約70MPaであった。粘弾性特性は12テスラで作製したゲルより, 6テスラで作製したゲルの方が高かった。このように,配向により各種物理特性が変化することを明らかにした。今後,線維方向による引っ張り強度や粘弾性強度に関して検討を行う必要がある。
オルタナティブな学習施設の実態に関する調査研究:フリースクールを中心に

本研究では、全国のオルタナティブな学習施設を対象に、質問紙調査を実施した。第一条校以外のオルタナティブな教育活動を実践している学習施設を各々の代表者による自己規定にもとづき、次の六つに分類した。(1)「フリースクール」、(2)「フリースペース」、(3)「補習塾」、(4)「進学塾:進学塾・予備校・サポート校等」、(5)「親の会」、(6)「その他」。(「その他」には、カウンセリング施設や心理臨床クリニック等の民間相談機関、適応指導機関、専門学校や通信制高校、夜間学級等の学校施設、児童福祉施設、自己啓発施設、子ども会等のサークル等々の「学び舎」が含まれる。)調査結果の分析では、上の(1)(5)を主な分析対象とした。対象として選定された学習施設の総数は359箇所で、最終的な回収率は40.0%であった。主な質問内容には、(1)基本的特性、(2)空間特性、(3)学習活動、(4)運営方法、(5)受け入れ状況、(6)スタッフ、(7)活動評価、(8)自由記述、が含まれる。以上の調査の結果、不登校児童・生徒の急増に伴い、特に1980年代以降、多様な学び舎が誕生していること、特にフリースクールとフリースペースが近年急増していること、それらの中には、保護者や子どもの参画など、従来の学校教育とは異なる形で新たな公共性を構築しようとする芽生えが見出されること、その一方で財政難等の共通問題を抱えている施設が少なくないこと等が明らかになった。今後の課題は、自記式質問紙調査に基づく量的な分析のみならず、質的な分析をできるだけ広範囲に実施することである。平成10年度は、1)フリースクール関連の文献、特に、当該分野において日本より多くの知見が蓄積されている欧米の文献および国内のフリースクールに関する最新の資料の収集し、2)国内のフリースクールの実態に関する量的把握のための、自記式質問形式による郵送調査質問項目の作成、集計・分析方法や分析カテゴリーの大要を決定し、同時に、3)調査対象の名簿の作成・データの入力作業を完了し、さらに、4)フリースクール関係者に対する聴き取り調査を実施した。調査対象の選定に当たっては、最近、出版された市販のガイドブック等を参照した。計画当初はフリースクールやフリースペース等のオルタナティブな学習施設のみを考えていたが、現在の現象をより包括的に把握する必要性を痛感し、サポート校などの近年急増しているタイプのオルタナティブ・スクールをも含めることにした。質問項゙目としては、学習者数・年齢、設立者の形態(元教員、カウンセラー、学習塾、不登校児童・生徒の親、自治体など)、職員数、教員資格の有無、教育理念・方針、学習方法・環境、カリキュラム、評価方法、卒業(修了)生の進路、地域の学校との交流等が挙げられる。これらの現状把握の項白に加えて、さらに各代表者の意識調査をも行うことにし、具体・的な質問を作成した。以上の作業の他、国内のフリースクール等を訪問し、実践家や専門家によるレビューも受けた。また、自由の森学園(埼玉県)関係者をはじめ、カウンセリング関係者などによって詳細に上記質問項目を検討して頂いた。なお、当初、予定していた国外におけるレビューはスケジュール調整がうまく合わず、来年度に実施することにした。
社会科学分野の高度人材育成に係る大学院プログラムの質保証に関する実証的研究

この研究を通じ、法曹、会計人、さらには管理職の公務員などの高度専門職業人養成を目的とする大学院教育の質を保証するための我が国の評価の仕組みの現状把握を行った。その上で、そうした質保証の仕組みが未だ十全には機能していない公共政策系大学院分野の質保証システムの充実策の探究を目指し、同分野の欧米の質保証システムの調査と考察を行った。本年度は、書面調査を通じて、複数存在する法科大学院認証評価機関の評価手法の比較調査を行うと共に、会計、経営学系の専門職学位課程の認証評価機関の聴取り調査も実施した。そして、本研究の中軸をなす公共政策系大学院の質保証システムについては、そうした質保証の仕掛け構築に意欲を示している「地域公共人材開発機構」、「大学基準協会」の現時点の動向について詳細な調査研究を実施した。また、本年度は、公共政策系大学院に対する認証評価(アクレディテーション)のシステムが発達している米国調査を意欲的に実施した。まず、当該分野のアクレディテーション実施機関であるNASPAAの評価基準全面改定案の全訳と共に、米国のアクレディテーション団体に対するメタ評価機関(認証評価機関)であるCHEAの認証評価基準の全訳を行うなど、十分な書面調査を行った。この調査研究を踏まえたうえで、アメリカの関係機関・大学に対する訪問調査を行った。その訪問先は、上記のNASPAA、CHEA及び自治体職員管理職者の専門職能団体であるICMA、それにNASPAAのアクレディテーションの受審を目前に控えているバージニア・コモンウェルス大学公共政策大学院プログラムである。本年度の調査研究活動を通じ、社会科学系専門職学位課程の認証評価に係る実施実態をより明確に把握することが出来た。とりわけ、公共政策系大学院については、我が国においてその質保証を行う仕組みが不在であるという現下の状況の下、その構築に向けた関係者の努力を細部に至るまで明確に把握する機会にも恵まれた。さらに、今次の米国訪問調査を通じ、公共政策分野のアクレディテーション・システム改変への動態とそうした動きを惹起させている背景、意義、今後の展望を十分把握することも出来た。こうした調査の成果が、我が国公共政策大学院の質保証システム構築に向けた営みに有効に反映されることが期待される。本年度は、法科大学院に関しては、同分野の認証評価を掌る3つの認証評価機関による評価活動の比較検討を行い、我が国法曹養成教育の質保証に関する機能的有効性について検証した。また、会計学系や経営学系の専門職大学院を対象とした認証評価システムについても、文献調査を通じ、同システムの特質の解明に努めた。本研究の重要な目的のひとつに、公共政策大学院の質保証システム構築に向け、所要の提言を行うことにある。そうした目的達成の一環として、平成21年設立の「地域公共人材開発機構」の公共政策大学院の質保証に向けた活動の調査・分析をした。ここでは、同機構が地域公共人材育成に係る教育プログラムを独立のユニットとして評価する可能性を探ると共に、公共政策分野の大学院の評価に適用できる評価システムの確立可能性の検討も行った。公共政策大学院の質保証システムに係る提言を行うに当り、昨年度に引き続き、米国の実状を、文献調査、実地調査の双方から実施し所要の分析を加えた。具体的には、米国で公共政策大学院のアクレディテーションを掌る「全米公共政策大学院協会(National Association of Schools of Public Affairs and Administration, NASPAA)」が、2009年10月に全面改訂した評価基準を全訳し、同基準の意義とその運用方針を検討した。さらに、今次の米国実地調査では、改定後の新基準によってNASPAAのアクレディテーションの受審を行うことが予定されている西海岸域の公共政策大学院の受審に向けた準備状況の調査を、3校の公共政策専門職大学院を対象に行った。今回の実地調査では、改訂評価基準が、コンピテンシー・ベースに基づくアウトカムズ評価の導入を柱にした規定構成となっていることを踏まえ、こうした評価基準の視座に、各校がどう対応しているかの観察を基軸に調査を進めた。本年度は、まず、社会科学系の我が国専門職大学院の質保証システムの組織・活動について、これまでの検討を基礎に、改めてその再検証を行った。具体的には、会計・経営学系専門職大学院に係る認証評価基準の書面調査を踏まえ、各認証評価機関の評価手法の分析を行った。法科大学院については、認証評価において「否」の判定を受けた法科大学院関係者からの聴取り調査の結果を基に、法科大学院認証評価の有為性と課題を明らかにした。さらに、地域で活躍する高度公共人材を育成する教育プログラムの適格認定の実施を目指す「地域公共人材開発機構」の評価システムの全容を明らかにし、その活動の意義と特質の検証を行った。また本年度は、NASPAAによるアウトカム重視の新たなアクレディテーション・システムの有為性の検証も行った。そして、それらを踏まえ、欧州における公共政策大学院の質保証に係る新たな動向調査を実施した。その一環として、欧州圏の公共政策大学院のアクレディテーション実施の任を担っている「欧州公共行政アクレディテーション委員会(EAPAA)」の現地調査を行った。

さらに、公共政策系教育・研修機関の国際的な会員組織である「行政大学院・行政研修所に係る世界機(IASIA)」に対し、綿密な書面調査を基に所要の聴取り調査を実施した。そして、上記の一連の調査研究の結果を踏まえ、これを総括した後、その成果を本報告書として結実させた。本報告書の結論部分の取りまとめに当り、アウトカムベースでのアクレディテーションに舵を切るきっかけとなったNASPAAの改定評価基準の意義並びに公共政策教育分野の国際アクレディテーションの実施を企図するIASIAの今後の方向性に係る記述を充実させることに意を払った。
システム同定による鋼構造立体架構動力学特性の評価に関する研究

本研究は、鋼構造立体ラ-メン架構が水平2方向地震外乱を同時に受ける場合を対象として、架構の弾塑性性状及び崩壊性状について、実験的に明らかにしようとすることを目的としている。本研究では特に、架構の復元力特性に大きな影響を及ぼす構成材料の歪速度効果や時間的変動を伴う減衰特性に着目して、実験結果にシステム同定手法を用いる点に特色がある。平成元年度の研究では、対象とする鋼構造立体ラ-メン架構を典型的な梁崩壊型と柱崩壊型に分離し、それぞれの模型架構を製作して振動台上に設置し、実地震波を入力して架構の特性について実験的に調べた。平成2年度においては、PーΔ効果が顕著である柱崩壊型架構を新たに製作し、地震時における崩壊挙動について更に詳しく調べる実験を行った。平成3年度の研究では、昨年度までに得られた実験デ-タにシステム同定手法を適用して、立体架構の動力学的特性について評価を加えた。主な研究成果を以下に要約すると、1.梁崩壊型架構の動的応答は、地震波の方向性に特に依存しない。2,柱崩壊型、梁崩壊型に関わらず、地震時における架構の弾性時応答特性は、本研究で用いたシステム同定手法によって、充分な精度で予測できる。3.振動系全体としての減衰特性をスペシフィックダンピングの定義に従って評価すれば、塑性変形を経験する前後の弾性振動時において減衰量が変動する、即ち、塑性変形を経験した後の弾性応答時の減衰量は増加する傾向にある。このことは、系の減衰を粘性減衰型に近似しても一定ではなく、応答履歴に依存することを意味している。本研究では、漸増崩壊型および極低サイクル破壊型という鋼構造架構の耐震安全性を評価する際に考慮すべき重要な2種の崩壊機構に着目しているが、本年度は、低層から高層に至るまでの建築物を想定して1次固有振動数が2、4、6Hzの3種の1層1スパン漸増崩壊型架構試験体を各2体、計6体製作し、振動台を用いてそれぞれに一方向および二方向地震波外乱を与える動的破壊実験を行った。これらの試験体はいずれも典型的な弱柱強梁型立体架構であり、不可避の立体ねじれ振動に伴う崩壊を再現し、加速度応答をならびに柱部材の歪応答を記録した。また、極低サイクル疲労破壊型試験体2体については試験体の設計を終わり、現在、実験準備中である。漸増崩壊型架構による実験では、架構の基本振動特性により応答は異なるものの、柱部材の最大応力発生点において塑性歪が累積される場合、特に立体ねじれ振動を伴う場合には、架構全体の崩壊につながる極めて危険な破壊性状を示すことが実験で観察された。また、二方向地震波外乱を受けた試験体では、一方向地震波外乱を受けた場合よりも相当低い入力地震レベルで架構が崩壊することが確認され、架構の設計において二方向同時に地震力を受ける場合を考慮に入れることの重要性が明らかとなった。今後、これらの実験から得たデ-タを基に、歪速度効果を含む復元力ならびに時間および変位履歴依存を考慮した減衰力をシステム同定手法によりモデル化する予定である。本年度の研究では、架構の崩壊形式を典型的な梁崩壊形と柱崩壊形の2種類に設定し、振動台実験を行って所定の実験資料を得ている。

現時点における主な研究成果を以下に要約すると、(1)梁崩壊形架構においては、2方向地震入力の影響は少なく、1方向地震入力の応答結果からその動的特性の予測が可能であり、筆者らが過去に行った、構成材料の歪速度効果や時間的変動を伴う減衰特性に着目した1方向入力時の架構応答特性に関する研究成果を適用できる。(2)柱崩壊形架構においては、耐震設計において通常用いられている各方向独立の最大応答の自乗和の平方根法で応答を予測することは、危険側になる場合がある。即ち、架構の復元力特性や減衰特性については、地震入力時からの時間的変動を考慮に入れる必要がある。などである。次年度の研究では、この成果を踏まえてシステム同定手法を用いた鋼立体架構の適正な動力学モデルの提案を行う予定である。本研究は、鋼構造立体ラ-メン架構が水平2方向地震外乱を同時に受ける場合を対象として、架構の褝塑性性状及び崩壊性状について、実験的に明らかにしようとすることを目的としている。本研究では特に、架構の復元力特性に大きな影響を及ぼす構成材料の歪速度効果や時間的変動を伴う減衰時性に着目して、実験結果にシステム同定手法を用いる点に特色がある。本年度の研究では、昨年度までに得られた実験デ-タにシステム同定手法を適用して、立体架構の動力学的特性について評価を加えた。本手法の主な特徴は、振動系を1質点モデルに抽象化するとともに、復元力特性を等価線形にモデル化して、履歴減衰並びに粘性減衰、ク-ロン減衰を含む減衰モデルを設定している点である。このモデルに、実験で得られた計測デ-タを入力、出力として設定して、振動系のパラメ-タを同定した。主な研究成果を以下に要約すると、1.柱崩壊形、梁崩壊形に関わらず、地震時における架構の禅性時応答特性は、本研究で用いたシステム同定手法によって、充分な精度で予測できる。2.振動系全体としての減衰特性をスペシフィックダンピングの定義に従って評価すれば、塑性変形を経験する前後の弾性振動時において減衰量が変動する、即ち、塑性変形を経験した後の弾性応答時の減衰量は増加する傾向にある。このことは、系の減衰を粘性減衰型に近似しても一定ではなく、応答履歴西に依存することを意味している。
幹細胞の未分化性維持機構の解明

幹細胞の未分化性維持機構を探索するために、(1)ショウジョウバエgerm cell less遺伝子のマウスホモログのクローニングならびに遺伝子ターゲティングマウスの作成、(2)ショウジョウバエpiwi遺伝子のマウスホモログのクローニングならびに遺伝子ターゲティングマウスの作成、(3)がん抑制遺伝子PTENの始原生殖細胞特異的遺伝子ターゲティングマウスの作成、をおこなった。マウスgerm cell less (mgcl-1)ターゲティングマウスでは、始原生殖細胞ならびに卵細胞の発生・分化は正常であったが、精子形成に顕著な異常が認められ、形態異常を呈する精子や生殖能力の低下が認められた。これらの異常は、核膜の構成成分であると考えられるmgcl-1タンパクが欠損することにより、核膜の異常が生じ、その結果、精子形成における核のリモデリングが障害されるために引き起こされるものと考えられた。Piwi遺伝子のマウスホモログの一つであるmili遺伝子のターゲティングマウスを作成し、解析したところ、精細胞において分化が停止し、不妊になることがあきらかとなった。しかし、mili遺伝子の発現が認められる始原生殖細胞の段階では異常が認められなかった。PTENの始原生殖細胞特異的欠損マウスにおいては、オスの新生仔全例において奇形腫の発生が認められた。また、培養系において、始原生殖細胞の増殖能の増加、ならびに、胚性生殖細胞の樹立効率が著しく増加した。メスにおいても低頻度ながら奇形腫の形成が認められた。これら三つの遺伝子は、生殖細胞系列の幹細胞システムにおいて非常に重要な機能を有することがあきらかとなった。幹細胞システムの成立を明らかにするために、始原生殖細胞・生殖幹細胞研究の実験システムを構築すると同時に、いくつかの機能分子の解析をおこなっている。以下にその概略を示す。始原生殖細胞をマーキングするために、始原生殖細胞において特異的に発現するTNAP(tissue non-specific alkaline phosphatase)遺伝子座に、蛍光タンパクであるEGFPをノックインしたマウスを作成した。このマウスは、予想通り始原生殖細胞においてEGFPを発現し、始原生殖細胞研究に有用である。TNAP-Creノックインマウスを用いて、いくつかのfloxedマウスとの交配を行い、始原生殖細胞特異的な遺伝子破壊による、遺伝子機能解析を行なっている。転写因子の一つであるSTAT3、SrcファミリーのキナーゼであるCSKでは始原生殖細胞の動態に変異は認められなかったが、がん抑制遺伝子PTENを始原生殖細胞で特異的に破壊したマウスでは、その移動や成熟に顕著な障害が認められた。(3)gcl遺伝子の機能解析ショウジョウバエの始原生殖細胞の成立に重要な機能を持つgcl遺伝子のマウスホモログの機能を解析するために、遺伝子ターゲティングマウスの作成を行い、現在、その解析を行なっている。また、two hybrid法による結合タンパクの単離を行なっている。ショウジョウバエの生殖幹細胞の成立に重要な機能を持つpiwi遺伝子のマウスホモログmiwi、mili遺伝子を単離し、その発現パターンを解析した。また、これらのタンパクがRNA結合能を有することを明らかにした。幹細胞の未分化性維持機構を探索するために、(1)ショウジョウバエgerm cell less遺伝子のマウスホモログの遺伝子ターゲティングマウスの作成、(2)ショウジョウバエpiwi遺伝子のマウスホモログの遺伝子ターゲティングマウスの作成、(3)がん抑制遺伝子PTENの始原生殖細胞特異的遺伝子ターゲティングマウスの作成、をおこなった。マウスgerm cell less(mgcl-1)ターゲティングマウスでは、始原生殖細胞ならびに卵細胞の発生・分化は正常であったが、精子形成に顕著な異常が認められ、形態異常を呈する精子や生殖能力の低下が認められた。

これらの異常は、核膜の構成成分であると考えられるmgcl-1タンパクが欠損することにより、核膜の異常が生じ、その結果、精子形成における核のリモデリングが障害されるために引き起こされるものと考えられた。Piwi遺伝子のマウスホモログの一つであるmili遺伝子のターゲティングマウスを作成し、解析したところ、精細胞において分化が停止し、不妊になることがあきらかとなった。しかし、mili遺伝子の発現が認められる始原生殖細胞の段階では異常が認められなかった。PTENの始原生殖細胞特異的欠損マウスにおいては、オスの新生仔全例において奇形腫の発生が認められた。また、培養系において、始原生殖細胞の増殖能の増加、ならびに、胚性生殖細胞の樹立効率が著しく増加した。メスにおいても低頻度ながら奇形腫の形成が認められた。これら三つの遺伝子は、生殖細胞系列の幹細胞システムにおいて非常に重要な機能を有することがあきらかとなった。
拡張型心筋症モデルマウスを用いた心不全の病態の解明

研究代表者の久保田が開発した心筋特異的TNF-α過剰発現マウスを用いて心不全治療の新たな標的分子を明らかにすることが、本研究の目的である。NO、活性酸素種、NF-kB、アンジオテンシンについて検討した。TNF-α過剰発現マウスの心筋ではiNOSの発現が亢進していた。選択的iNOS阻害薬であるONO-1714にてβ刺激時の陽性変力作用が有意に改善された。iNOSノックアウトマウスとの交配によってiNOS遺伝子が欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成したところ、β刺激時の陽性変力作用は有意に改善したが、心筋の肥大や炎症に変化はなく、生存率の改善も得られなかった。炎症性サイトカインによる心筋障害の成因として、NO以外の経路がより重要であることが示唆された。2.活性酸素種TNF-α過剰発現マウスの心筋では活性酸素種の産生が亢進し、ミトコンドリアが障害されていた。シクロフォスファミドによって炎症細胞の浸潤を抑制しても活性酸素種の産生は不変であった。培養心筋細胞にTNF-αを作用させたところ、活性酸素種の産生増加とミトコンドリアDNAの減少が観察された。TNF-αはミトコンドリアを傷害することで活性酸素種の産生を亢進させ、心筋障害をもたらしていることが示唆された。TNF-α過剰発現マウスの心筋ではNF-kBが活性化されていた。NF-kB(p50)ノックアウトマウスとの交配によってNF-kBが欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成したところ、サイトカインの発現や炎症細胞の浸潤に明らかな変化はなかったが、より早期より心不全を発症するオスにおいて生存率の有意な改善が得られた。NF-kBは、炎症だけでなく、心筋の肥大と心不全の発症において重要な働きを担っていることが示唆された。4.アンジオテンシン以上より、心不全治療の新たな標的分子として、活性酸素種とNF-kBの重要性が明らかとなった。初年度である今年度は、NO、活性酸素種、NF-kB、アンジオテンシンについて以下の知見が得られた。TNF-α過剰発現マウスの心筋においてiNOSの発現が亢進していることを、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、シトルリンアッセイ法、および免疫組織化学染色にて確認した。選択的iNOS阻害薬であるONO-1714の急性投与にてβ刺激時の陽性変力作用が有意に改善された。このことは心筋で過剰に産生されたNOが心抑制的に作用していることを示唆している。iNOSを慢性的に阻害することで心不全の発症を阻止することが可能か否か、TNF-α過剰発現マウスとiNOSノックアウトマウスとの交配にてiNOS遺伝子が欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成し、現在解析中である。2.活性酸素種TNF-α過剰発現マウスの心筋では活性酸素種の産生が亢進していた。シクロフォスファミドの投与によって心筋への炎症細胞浸潤を抑制しても電子スピン共鳴法の結果は不変であったことから、活性酸素種は主に心筋細胞において産生されていることが示唆された。

活性酸素種を消去することで心不全の発症を阻止することが可能か否か、TNF-α過剰発現マウスとCu/Zn-SOD過剰発現マウスを交配し、現在解析中である。TNF-α過剰発現マウスの心筋ではNF-kBが活性化されていることをEMSA法にて確認した。NF-kBの活性化は心筋障害と心筋保護の2面性を持っていることが報告されており、現在、NF-kB(P50)ノックアウトマウスとの交配によってNF-kBが欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成し、解析中である。4.アンジオテンシン研究代表者の久保田が開発した心筋特異的TNF-α過剰発現マウスを用いて心不全治療の新たな標的分子を明らかにすることが、本研究の目的である。NO、活性酸素種、NF-kB、アンジオテンシンについて検討した。TNF-α過剰発現マウスの心筋ではiNOSの発現が亢進していた。選択的iNOS阻害薬であるONO-1714にてβ刺激時の陽性変力作用が有意に改善された。iNOSノックアウトマウスとの交配によってiNOS遺伝子が欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成したところ、β刺激時の陽性変力作用は有意に改善したが、心筋の肥大や炎症に変化はなく、生存率の改善も得られなかった。炎症性サイトカインによる心筋障害の成因として、NO以外の経路がより重要であることが示唆された。2.活性酸素種TNF-α過剰発現マウスの心筋では活性酸素種の産生が亢進し、ミトコンドリアが障害されていた。シクロフォスファミドによって炎症細胞の浸潤を抑制しても活性酸素種の産生は不変であった。培養心筋細胞にTNF-αを作用させたところ、活性酸素種の産生増加とミトコンドリアDNAの減少が観察された。TNF-αはミトコンドリアを傷害することで活性酸素種の産生を亢進させ、心筋障害をもたらしていることが示唆された。TNF-α過剰発現マウスの心筋ではNF-kBが活性化されていた。NF-kB(P50)ノックアウトマウスとの交配によってNF-kBが欠損したTNF-α過剰発現マウスを作成したところ、サイトカインの発現や炎症細胞の浸潤に明らかな変化はなかったが、より早期より心不全を発症するオスにおいて生存率の有意な改善が得られた。NF-kBは、炎症だけでなく、心筋の肥大と心不全の発症において重要な働きを担っていることが示唆された。4.アンジオテンシン以上より、心不全治療の新たな標的分子として、活性酸素種とNF-kBの重要性が明らかとなった。
抗がん剤としてのα－ラクトアルブミンの理論的研究

本研究課題で開発を行ってきた密度汎関数強束縛(DFTB)法を基とした,量子・古典混合計算手法をアミロイドβの1番目から16番目の残基(Aβ(1-16))からなる分子とZnを含む系に対して適用した。Aβ繊維はアルツハイマー病の原因物質と考えられているが,CuやZnなどの金属イオンの存在下で,その凝集が促進されることが実験により知られている。この際,Aβ(1-16)分子のHisやTyrが金属イオンと結合すると考えられている。この系に対してDFTB法を用いることで実験結果のサポートができると考えられる。昨年度はシミュレーション中のスナップショットから得られた結果を解析したが,本年度は計算を進め統計的な解析を行った。その結果,古典MDでも示されたGlu,Aspの負に帯電した残基,さらにHis13がZnに多く接近した。一方,His6,His14やTyrはほとんど接近しないことが分かった。次に,His13が選択的にZnと接触した理由を解析するために,隣り合う残基の二面角を求めた。本シミュレーションの結果では隣接残基の側鎖はほとんどの場合で90度以上ずれていた。このことから,たとえば負の電荷を持つAsp7にZnが引き寄せられた場合,隣接するHis6の側鎖はAsp7の側鎖との立体反発により,Znと結合できないということが考えられる。一方,His13に関しては負電荷を持つGlu11との間にVal12を挟むために,Glu11が引き寄せたZnと結合できる確率が高くなると考えられる。このように,実験ではどのHisにZnが接近しているという詳細な情報は得られていなかったが,今回の結果によりHis13が選択的にZnと結合しているという予測を行うことができた。本手法は安価に量子効果を含んだシミュレーションを行うことができるため,多くの生体分子や材料に対して詳細な解析が可能になることが見込まれる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。現在,本研究で対象としているα-ラクトアルブミンに対して,カルシウムイオンを含む場合と含まない場合で古典分子動力学(MD)計算を行っている。このシミュレーションの結果から,モルテン・グロビュール(MG)状態を決定する予定である。また,MG状態を決定した後に行うオレイン酸複合体の計算を行うために,オレイン酸の力場パラメータも作成した。さらに,MDプログラムの高速化も併せて行った。本プログラムにより,多数の計算機を利用することで高速な古典MD計算が可能となった。また,次年度以降に行う計画である量子・古典混合(QM/MM)計算に関して理論開発も行った。生体分子計算では周期境界条件が課されることが多いが,この条件下でのQM/MM計算では計算コスト上の問題が生じる。そこで,律速となっていたCoulomb項を高速に計算する手法を提案した。本研究で開発した手法をアミロイドβタンパク質の1番目から16番目からなる残基(Aβ(1-16))と亜鉛イオンを含む系に対して適用した。本手法により,Coulomb項の計算時間を166.5倍,力の計算を257.7倍高速化することに成功した。また,従来法との誤差は0.001 kcal/mol以下であり,充分な精度で求められていることが確認された。本研究により大規模な生体分子に対するMD計算が可能となった。現在,本理論を用いたMD計算をAβ(1-16)分子と金属を含んだ系に対して適用している。対象としている系は,実験によりAβ(1-16)分子と亜鉛イオンとが結合することが知られている。今後,実験で詳細の知られていない系を対象とする上で,本手法の信頼性を実験と照らし合わせて検証することは重要である。また,Aβ繊維はアルツハイマー病の原因物質と考えられており,広く実験が行われている。本研究は実験結果のサポートをするものであり,それ自体にも意義があると考えられる。数値計算に関しては当初の計画通り,古典分子動力学(MD)計算を実行している。本年度末にはモルテン・グロビュール(MG)状態を決定できる見込みであったが,シミュレーションが当初の見込みよりやや遅れていること,実験で測定されていない系に対してMG状態を決定する手法が確立していないことなどが原因で,MG状態の決定は現状できていない。次年度ではMG状態を決定する手法を考案し,現在も進行中であるシミュレーションの結果から,MG状態の同定を試みる。また,プログラム開発に関しては順調に進行している。古典MD計算の高速化,並列化を行い,量子・古典混合計算を高速に計算する理論の開発を行った。α-ラクトアルブミンのシミュレーション中に,受入研究室で研究が盛んに行われているアミロイドβ分子に対して本理論を適用している。平成28年度に開発を行った密度汎関数強束縛(DFTB)法を基とした,量子・古典混合(QM/MM)計算手法をアミロイドβの1番目から16番目の残基(Aβ(1-16))からなる分子と亜鉛イオンを含む系に対して適用した。Aβ繊維はアルツハイマー病の原因物質と考えられているが,その中でもAβ(1-16)はアミロイド繊維の核生成過程で重要であることが報告されている。Aβタンパク質は銅や亜鉛などの金属イオンの存在下で,その凝集が促進されることが実験により知られており,ヒスチジン残基やチロシン残基が金属イオンと結合すると考えられている。

計算を用いた検討もなされているが,あらかじめ実験結果を再現するようなパラメーターを用いた検証に限られている。この系に対して本研究課題で開発した手法を用いることで実験結果のサポートをし,Aβ繊維形成に関してより深い知見を得ることが可能になると考えられる。また実験結果の再現を行うことが可能であるとすれば,本手法が生体分子への適用に対して妥当なものであるかどうかを確認することが可能であると考えられる。この系に対して,MM法,QM/MM法に基づくMDシミュレーションを用いて検討を行った。MM-MDシミュレーションでは,実験で報告されているヒスチジン残基やチロシン残基は亜鉛イオンとの相互作用による安定化はほとんど得られなかった。一方,本研究課題で開発したQM/MM法に基づくMD計算では亜鉛イオンとヒスチジン残基の接近を確認できた。またDFTB法で得られる電荷分布を確認すると,これらが結合していることが分かった。これは実験でも観測されている亜鉛イオンとヒスチジン残基(またはチロシン残基)が結合しているという事実と一致しており,本手法が生体分子の化学反応を伴うシミュレーションおいて,有用であるということを示すことができたと考えられる。数値計算に関しては当初の計画であったα-ラクトアルブミン(α-LA)分子への適用がまだ行われていない。本研究課題で開発している理論は生体分子への適用例がなく,本手法で得られるものがどの程度信頼を得られるものかを初めに検証する必要がある。したがって,計算により得られた結果と比較することができないα-LA分子への適用は現状行うことができない。そこで,本理論の信頼性を検証するために,受入研究室で研究が盛んに行われているアミロイドβ分子に対して適用を行っている。本理論を計算結果と照らし合わせて得られた知見は,未知の系への適用を行う際に有用であると考えられる。本研究に関しては,現在論文投稿の準備中である。また,プログラム開発に関しては順調に進行している。平成28年度に開発した量子・古典混合計算を高速に計算する手法を用いて,分子動力学計算を行えるようにした。対象とした分子は原子数が大きく,従来の量子化学理論では取り扱いが困難であったが,短い時間でシミュレーションを完了することができるようになった。本研究課題で開発を行ってきた密度汎関数強束縛(DFTB)法を基とした,量子・古典混合計算手法をアミロイドβの1番目から16番目の残基(Aβ(1-16))からなる分子とZnを含む系に対して適用した。Aβ繊維はアルツハイマー病の原因物質と考えられているが,CuやZnなどの金属イオンの存在下で,その凝集が促進されることが実験により知られている。この際,Aβ(1-16)分子のHisやTyrが金属イオンと結合すると考えられている。この系に対してDFTB法を用いることで実験結果のサポートができると考えられる。昨年度はシミュレーション中のスナップショットから得られた結果を解析したが,本年度は計算を進め統計的な解析を行った。その結果,古典MDでも示されたGlu,Aspの負に帯電した残基,さらにHis13がZnに多く接近した。一方,His6,His14やTyrはほとんど接近しないことが分かった。
プロスタグランディンD合成酵素が受精に及ぼす影響の解析

プロスタグランディンD合成酵素が受精卵輸送および受精に及ぼす影響を解析するため、まず女性生殖器でのプロスタグランディンD合成酵素(PGDS)の発現部位について検討を加えた。月経周期を有する女性の子宮内膜、卵管および卵巣を用いてノーザンブロット法でPGDS mRNAの発現を調べたところ、子宮内膜および卵管にPGDS mRNAの発現が認められた。次に、免疫組織染色法を用いてPGDS mRNAの発現が認められた子宮内膜および卵管でのPGDSの局在を調べた。子宮では子宮内膜腺上皮にPGDSの局在が認められ、子宮筋層には認められなかった。また、卵管においては卵管上皮にPGDSの存在が確認された。受精の場である卵管さらに着床の場である子宮内膜にPGDSの局在が確認されたことよりPGDSが受精、着床に影響を及ぼしている可能性がある。受精、着床が正常に行われるためには女性ホルモンによる周期的な子宮内膜の変化が必要である。そこで女性ホルモンがPGDSの発現に影響があるかどうかを検討するため、内因性エストロゲンを抑制する作用のあるゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト(GnRH agonist)投与中の子宮内膜、卵管でのPGDSの発現について免疫組織染色法を用いて実験を行った。GnRH agonist投与中女性の子宮内膜および卵管ではPGDSの発現は認められなかった。この実験結果よりPGDSの発現にエストロゲンが関与していることが明らかとなった。次いで月経周期で女性血中PGDS濃度に変化があるかどうかをELISA法を用いて検討した。排卵前の女性血中PGDS濃度は0.514±0.069μg/mlであり、排卵後の女性血中PGDS濃度は0.540±0.081069μg/mlであった。この結果は統計学的には有意であったが臨床的意義があるかどうかは今後の研究課題である。月経周期を有する女性の子宮内膜、卵管および卵巣を用いてノーザンプロット法でPGDS mRNAの発現を調べたところ、子宮内膜および卵管にPGDS mRNAの発現が認められた。現在約40症例の測定が終了しているが現時点では明らかな変化を認めていない。

今後症例数を増やして検討していく予定である。プロスタグランディンD合成酵素が受精卵輸送および受精に及ぼす影響を解析するため、まず女性生殖器でのプロスタグランディンD合成酵素(PGDS)の発現部位について検討を加えた。月経周期を有する女性の子宮内膜、卵管および卵巣を用いてノーザンブロット法でPGDSmRNAの発現を調べたところ、子宮内膜および卵管にPGDSmRNAの発現が認められた。次に、免疫組織染色法を用いてPGDSmRNAの発現が認められた子宮内膜および卵管でのPGDSの局在を調べた。子宮では子宮内膜腺上皮にPGDSの局在が認められ、子宮筋層には認められなかった。また、卵管においては卵管上皮にPGDSの存在が確認された。受精の場である卵管さらに着床の場である子宮内膜にPGDSの局在が確認されたことよりPGDSが受精、着床に影響を及ぼしている可能性がある。受精、着床が正常に行われるためには女性ホルモンによる周期的な子宮内膜の変化が必要である。そこで女性ホルモンがPGDSの発現に影響があるかどうかを検討するため、内因性エストロゲンを抑制する作用のあるゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト(GnRH agonist)投与中の子宮内膜、卵管でのPGDSの発現について免疫組織染色法を用いて実験を行った。GnRH agonist投与中女性の子宮内膜および卵管ではPGDSの発現は認められなかった。この実験結果よりPGDSの発現にエストロゲンが関与していることが明らかとなった。次いで月経周期では女性血中PGDS濃度に変化があるかどうかをELISA法を用いて検討した。排卵前の女性血中PGDS濃度は0.514±0.069μg/□であり、排卵後の女性血中PGDS濃度は0.540±0.081069μg/□であった。この結果は統計学的には有意であったが臨床的意義があるかどうかは今後の研究課題である。
エストロゲン及びSERMの組織特異的作用を担う標的遺伝子の解析と病態における意義

性ステロイドホルモンであるエストロゲンは女性生殖系臓器の発達、機能調節に重要な働きを担っている他に、乳癌や子宮内膜癌の増殖、骨粗鬆症の予防効果などを有し、様々な疾患に関わると考えられている。エストロゲン剤および抗エストロゲン剤(SERM)が臨床応用されているが、組織によっては抗エストロゲン剤がエストロゲン様の活性を有することが問題となっており、そのメカニズムの解明が望まれている。本研究は転写因子であるエストロゲン受容体(ERα,ERβ)の活性調節機構ならびにエストロゲン応答遺伝子の機能を明らかにすることによってエストロゲンやSERMの組織特異的な作用機構を解明することを目的とした。本研究において、細胞増殖因子の刺激によってリン酸化されるERαの118番目のセリン残基の脱リン酸化酵素としてPP5を始めて同定し、PP5によるERαの負の制御機構を明らかにした(Mol.Endocrinol.18:1131-43,2004)。また、本年度においては、エストロゲン応答遺伝子として単離されたCOX7RPが子宮内膜癌由来のlshikawa細胞においてエストロゲン誘導性の発現を示し、同時にSERMであるタモキシフェンによっても発現誘導されることを見出した。一方、COX7RPタンパクはミトコンドリアに局在することを明らかにした。これらの結果より、COX7RPはERによって直接制御される応答遺伝子であり、ミトコンドリアの機能に関与することが示唆された。本研究によってERの脱リン酸化による新たな機能調節機構ならびにエストロゲン応答遺伝子COX7RPの制御を解明できたことは、エストロゲンが関与する疾患・癌におけるPP5とCOX7RPの新たな役割を示唆することができたと考えられた。性ステロイドホルモンであるエストロゲンは女性生殖系臓器の発達、機能調節に重要な働きを担っている他に、乳癌や子宮内膜癌の増殖、骨粗鬆症の予防効果を有し、動脈硬化、心疾患、痴呆などの疾患にも関与していると考えられている。エストロゲン剤および抗エストロゲン剤が臨床応用されているが、組織によっては抗エストロゲン剤がエストロゲン様の活性を有することが問題となっており、そのメカニズムの解明が望まれている。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体(ERα,ERβ)を介して標的遺伝子の発現量を直接制御することによりその機能を発揮する。従って、エストロゲン応答遺伝子の機能と制御を明らかにすることによってエストロゲンやSERMの組織特異的な作用機構が明らかになり、疾患・癌における新たな治療法や予防法を開発できると考えられる。本研究において、エストロゲン応答遺伝子として単離されたCOX7RPは子宮内膜癌由来のIshikawa細胞においてエストロゲン誘導性の発現を示すことを明らかにした。また、COX7RP遺伝子の第1イントロンに存在するエストロゲン応答配列がCOX7RP遺伝子プロモーターのエストロゲン応答性に関与することを示した。さらに、COX7RPタンパクはミトコンドリアに局在することを示し、COX7RPをIshikawa細胞において過剰発現させると細胞増殖を促進することが明らかになった。これらの結果より、COX7RPはERによって直接制御される応答遺伝子であり、ミトコンドリアの機能に関与し、細胞増殖を促進することが示唆された。本研究によってエストロゲンシグナルにおけるCOX7RPの機能を解明できたことは、エストロゲンが関与する疾患・癌における新たな分子標的としてのCOX7RPの可能性を示唆することができたと考えられる。
絨毛癌発生の分子機構

1)ヒト7番染色体上の絨毛癌抑制遺伝子:我々はヒト正常細胞由来7番染色体の絨毛癌細胞への単一移入及び絨毛癌DNAにおける欠失の解析により、絨毛癌抑制遺伝子は7q11.22領域に存在することを明らかにした。本領域を含むBACクローンを得、絨毛癌細胞株へ導入した結果、絨毛癌細胞の増殖特性及び造腫瘍性を抑制するクローンが得られた。同クローンからcDNAを得、絨毛癌細胞へ遺伝子導入を行い候補遺伝子の単離を行っている。複数の候補遺伝子はいずれも絨毛癌細胞で両側アリルが欠失している領域に存在することが判明している。2)正常絨毛cDNA及び絨毛癌cDNA間でPCR-サブトラクションを行った。絨毛癌でのみ発現消失を示す複製のクローンを得、全塩基配列を決定した。SMAP31は、歯肉、脳での発現が報告されているESTであるが、正常絨毛でも高い発現を示すことが確認された。SMAP31は絨毛癌で両側アリルの欠失が示された。SMAP31の導入により、絨毛癌細胞の増殖特性は抑制された。増殖特性の抑制は細胞接着の障害を介していることが示唆された。SMAP31の一次構造の解析から蛋白へ翻訳されることなくRNAとして機能する遺伝子であることが予想されている。3)RLGS法を用い、正常絨毛及び胞状奇胎間でDNAメチレーションに差を示すZAC/PLAG1遺伝子を単離した。本遺伝子はインプリントによる発現制御をうけ、一過性新生児糖尿病の原因遺伝子であることが示唆された。1)インドネシア・パジャジャラン大学との協同研究を円滑に推進し、絨毛癌発生の分子機構を解明するため、平成10年5月8日6月6日及び9月5日10月3日の2回にわたり、共同研究者であるパジャジャラン医科大学ヌルハリム・シャヒブ教授を招聘した。DNA、RNA及び蛋白抽出法並びに分子生物学的解析技術を修得した。さらに加藤秀則が12月9日12月15日、松田貴雄・上岡陽亮(研究協力者)が3月19日3月22日までパジャジャラン医科大学を訪問し、絨毛癌及び胞状奇胎の発生状況の把握及びサンプル収集を行った。2)我々はヒト正常細胞由来単一染色体を絨毛癌細胞へ移入し、顕著な細胞形態変化、細胞増殖特性及び造腫瘍性の抑制が誘導されることを明らかにしている。このため、絨毛癌抑制遺伝子が7番染色体上に存在すると推定している。このため、正常妊娠或いは胞状奇胎に由来する絨毛癌組織DNAを用い、DNA、の変化の有無を解析した結果、7q11.22領域に両側アリルの欠失が高頻度におこっていることが判明した。7q11.22をカバーするBACコンティグを作成し、絨毛癌細胞へ導入し、ヒト7番染色体単一移入時と同様の変化を示すリバータントを現在回収している。これらの研究を通して絨毛癌細胞の造腫瘍性を抑制するBACクローンを既に同定した。3)正常妊娠絨毛及び胞状奇胎からDNAを抽出し、RLGSを行った結果、父親由来特異的にメチル化をうけ、胞状奇胎の表現型形成に関与する遺伝子の部分的構造を明らかにした。
オフアクシス・ニュートリノビーム実験に於ける崩壊領域ビームダンプ系の開発

本研究は、当機構と日本原子力研究開発機構とが共同で建設中の大強度陽子加速器(J-PARC)に於けるニュートリノビームラインのビームダンプコアに用いられるグラファイトコアの冷却に関する研究である。本年度は、平成17年度に当該科研費にて製作したヘリウム試験用チャンバーを用い、ビームダンプコアモデルの冷却試験を行った。これは、ヘリウムを充填したチェンバー内で、ミニチュアモデルに冷却モジュールを実機に対して考案されている幾つかの方法で固定した状態で行うもので、ブロックの発熱はヒーターによって再現し、冷却量は冷却モジュールに流す水量によってコントロールする。各所の温度は全て熱電対によって測定する。それらの温度上昇の様子をANSYSによる熱解析と比較することによって、諸量の定量的な解析を行う。ヘリウム雰囲気で試験することによって、より実際の使用環境に近い条件で試験出来る他、空気雰囲気中ではグラファイトの酸化のために試験出来なかった高温領域での測定が可能となった。また、実機に於ける冷却システムの取り回し等、実装についてもこの容器を用いて研究した。具体的には、冷却モジュールをグラファイトブロックへ効果的に固定する方法、冷却水流量のコントロール方法、グラファイトブロック同士の最も効率的な設置方法等を研究し、実機の詳細設計が可能な段階まで詰めた。当該研究により、ヘリウム環境下でのグラファイトの冷却に関する広い知見を得ることが出来、その成果を実機の設計に充分に反映させることが出来た。ニュートリノ有限質量の証拠を検証するために行われたKEK・神岡間長基線ニュートリノ振動実験(K2K)を拡大した、大強度陽子加速器施設(J-PARC)・神岡間の長基線ニュートリノ振動実験(T2K)に於いては、そのビーム強度が100倍となり、また、実験の感度を最大限に高めるためにオフ・アクシス法を用いるため、そのビームラインに於いては、多くの要素を全く新たに研究・開発し直さなければならない。本研究では、そのビームラインの内、未反応の陽子ビームを止めるビームダンプの開発が対象となる。ビームダンプはグラファイトコアとそれを冷却するアルミニウムモジュール、及び銅コアとからなるが、本研究では、グラファイトコアとアルミニウムモジュールのミニチュアモデルを製作し、それらを実機と同じヘリウム雰囲気中に設置して冷却試験を行い、実機の実装する上での様々なデータを得る。平成17年度は、ミニチュア試験用のグラファイトブロックとアルミニウムモジュールを製作し、それらの大気環境下での試験を行い、また、ヘリウム雰囲気下での試験を行うため、真空置換式のヘリウムチェンバーの製作、並びにそれらの試験用備品を調達した。ところが、そこで、グラファイトの高温での酸化消耗の問題が生じたため、急遽、ヘリウム環境下での試験を中断し、酸化消耗率の測定を行うこととなった。得られた酸化消耗率のデータから、実機の設置の際の満たすべき諸条件を決めることが出来た。平成18年度は、平成17年度にやり残したヘリウム環境下での冷却試験を行い、実機実装上必要な知見を得る。
網膜ミューラー細胞における脂肪酸β酸化系の存在意義に関する研究

本研究は、網膜ミュラー細胞・神経節細胞の2種の培養細胞の栄養代謝能を、脂肪酸β酸化を中心に調べることを目的とした。ミュラー細胞の初代培養系の確立に時間を要したが、ほぼ純粋な培養系を確立できた。遺伝子発現解析、酵素蛋白検出といった実験により、ミュラー細胞に脂肪酸β酸化能とケトン体代謝能が存在することが示された。神経節細胞の純粋培養は困難で、代替として大脳神経細胞の初代培養系を用いて特性を調べた結果、神経細胞は極わずかの脂肪酸β酸化能を持つことが確かめられた。これらの結果は、網膜のエネルギー産生機構について新しい知見を提示できると考えている。論文として発表準備中である。目的:脂肪酸の代謝系である脂肪酸β酸化系は、エネルギー産生に加え脂肪酸の細胞傷害に対する解毒機能としても重要である。網膜は全身組織の中で例外的に、脂肪酸β酸化能がないと言われてきた。本研究では「ミュラー細胞はエネルギー源として脂肪酸を代謝する。その代謝産物を網膜神経細胞に渡し養う。」この仮説を証明することを目的としている。計画:網膜ミュラー細胞、神経節細胞の2種の培養細胞の栄養代謝能を、脂肪酸β酸化能を中心に調べる。さらに、2種の細胞の栄養代謝における相互作用を調べる。初代培養細胞を用いて解析を行い各細胞の特性を調べるとともに、不死化細胞を作製し、細胞間の相互作用を調べる計画である。成果:ミュラー細胞の初代培養系の確立に時間を要したが、ほぼ純粋なミュラー細胞の培養系を確立できた。脂肪酸代謝能の解析は研究協力者の協力により順調に進み、遺伝子発現解析、酵素蛋白検出、in vitroprobe assayといったミュラー細胞の脂肪酸β酸化能を証明する実験により、ミュラー細胞に脂肪酸β酸化能が存在することが示された。また、ケトン体代謝酵素の存在も確認でき、ケトン体代謝能も持つことが確かめられた。細胞の不死化については十分な結果が得られなかったため、継続して実験中である。網膜神経節細胞の純粋培養は困難であったため、代替として大脳の神経細胞の初代培養系を用いて神経細胞の特性を調べた。培養ミュラー細胞と同様の解析を行った結果、神経細胞は極わずかの脂肪酸β酸化能を持つことが確かめられた。ミュラー細胞と神経細胞の脂肪酸β酸化能とケトン体代謝能の特性について論文として発表準備中である。平成23年度は初代培養細胞を用いて解析を行い、各細胞の特性を調べるとともに、不死化細胞を作製する。24年度は前年度に作製した不死化細胞を中心に用いて、細胞間の相互作用を調べる計画である。成果:ミュラー細胞の脂肪酸代謝能の解析は、研究協力者、臼田、山口の協力により順調に進んでいる。初代培養細胞を用いた遺伝子発現解析、酵素蛋白検出、in vitro probe assay(脂肪酸代謝によって生じる培養培地中のアシルカルニチンを、質量分析装置により網羅的に測定する方法)により、ミュラー細胞の脂肪酸β酸化能を証明する実験はほぼ終了し、ミュラー細胞に脂肪酸β酸化能が存在することが示された。この結果は、網膜のエネルギー産生機構について新しい知見を提示できると考えている。現在は、脂肪酸代謝とブドウ糖代謝の相互関係を調べるために、それらの代謝産物であるケトン体、ピルビン酸、乳酸の分泌について解析を進めている。遅れている細胞の不死化実験も開始している。神経節細胞の単独培養については方法に困難さがあり未だ確立できていないが、神経節細胞の単独培養、ミュラー細胞との混合培養、両細胞の不死化については予備実験を進めている。平成23年度の実験結果は、研究全体の核心部分について陽性の結果であると判断している。そのため、23年度の現在までの達成度を「やや遅れている」と自己評価した。研究実績の概要欄に記載したように、ミュラー細胞については脂肪酸β酸化能の存在を示すことが終了して、代謝産物の解析へと研究は着実に進んでいる。しかし、やや遅れていると判断する理由は次の2点である。問題点1:神経節細胞について解析が進んでいない。問題点2:不死化技術の確立が遅れている。全体としては変更無く遂行可能であると考えている。

平成24年度は特に、現在までの達成度欄に示した2つの問題点を解決することが急務である。問題点1の解決のためには、現在方法が確立している脳の海馬初代培養細胞をモデルとして神経細胞の培養法を工夫したい。問題点2の解決のためには、細胞工学を中心として行っている研究協力者、土方、深澤の更なる協力を得て進めていきたい。次年度使用額が生じた主な理由は、培養細胞の不死化などの細胞工学的実験の遅れが原因である。平成24年度の計画においては細胞工学に必要な試薬に対してさらに補充して使用する予定である。なお、平成23年度終盤に超低温フリーザー(84万円)が必要になり既に購入したが、納品が次年度になったため、23年度使用額には含まれていない。