hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
標的ゲノム領域上の蛋白-RNA機能複合体解析に向けた人工染色体の活用

本研究では、選定したタグシステム(LacO/LacI-GFPシステム)を用いて一定サイズのDNA(3.5kb)を安定的に回収することに成功した。LacO/LacI-GFPシステムを用いて巨大なCHO染色体の回収に成功した。これらの研究よりLacO/LacI-GFPのタグシステムの実用性を明らかにした。さらに、複数個の遺伝子を搭載可能な人工染色体上へタグ配列(LacO配列)および本研究において着目したXISTゲノム領域、LIT1/ KCNQ1OT1ゲノム領域、疾患関連反復配列(CGG:100リピート)をそれぞれ搭載した。HACベクターを標識し標的ゲノムローカスを搭載するための第一段階として,HAC回収用のタグ配列(LacO配列)をFRTサイトに導入することを試みた.しかし,Flp酵素を用いた部位特異的組み換えの反応が進まずにタグ配列を挿入できなかった.このような結果から,HACに導入したFRTサイトが機能していない可能性が示唆された.我々は,このシステムが機能しなかったときのバツクアップシステムとして,Multiple Gatewayシステムを搭載したHACベクターを開発し,それを出発資材にシフトすることにした.Multiple Gatewayシステムとは,組み換え酵素であるインテグラーゼにより,attB配列とattP配列で特異的に組み換えを起こし,ベクターに遺伝子を導入するシステムである.これは,複数の遺伝子をHACへ容易に搭載できるためにプロジェクト推進の効率化に寄与する重要なシステムになるものと考えられる.一方,HACレベルの染色体DNAをHACに搭載したタグ配列から安定に回収できるどうかを検討するために,メソトレキセート(MTX)遺伝子増幅システムを利用した.このシステムは,ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)の近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅する特徴を生かしてLacO配列を増幅させる.そこで,dhfr欠損細胞であるCHO細胞へdhfrおよびLacO配列を導入し,MTX処理により遺伝子増幅を試み,25個の細胞クローンを同定した.HA抗体による染色体の回収率は,物理的にサイズが小さい程上がることが予想され,CHO細胞の中で最も小さな染色体にLacO配列が組み込まれた細胞クローンを選択するためにFISH解析を行った.その結果,最も小さな染色体にLacO配列が組み込まれた細胞クローンを同定した.この細胞クローンは,本研究の実用化の有無を検証するための有効な資材になることが期待される.本年度において、巨大なDNAを含むHACをChrIP法で回収できる可能性を検討するためのパイロットスタディとしてCHO-DG44+pLacO/pMMTV-dhfr細胞を用いてLacO-LacIレポーターシステムを評価した。はじめに、CHO細胞(CHO dg44,DHFR-/-)の染色体上にDHFRおよびLacO配列をCHO染色体に導入させ、MTX処理によりLacO配列を増幅させ、FISH解析を行った。その結果、CHO細胞の染色体上にLacO配列が挿入されている細胞クローンを同定した。次に、LacI-GFPレポータープラスミドをLacOが挿入された染色体を含むCHO細胞へ導入し、抗GFP抗体によってこの染色体の回収(ChrIP)を検討した。その結果、10回の超音波処理を行い、GFP抗体によって免疫沈降後に精製したサンプルにおいて、LacOおよびDFHR領域内でPCR産物が確認された。これらのことより、LacO-LacIレポーターシステムが機能しており、LacI-GFP複合体蛋白のGFPをタグとして染色体を回収できる可能性が強く示唆された。ChIP後のPCRの結果からもかなり大きい染色体断片の回収ができたと考えられる。このことからもLacOとLacIの結合力が非常に強く、相当数のLacIがLacOに結合していることが予想された。さらに、巨大なクロマチン回収に必要なタグであるLacOリピート配列(10kbp)をintegraseの利用によりHACに搭載させた。本研究では、LacO-LacIレポーターシステムを利用したChrIP法の有効性と標的ゲノム領域を搭載させるHACを作製した。このように、本研究の目標である特定染色体領域に存在する分子群を同定するための方法の検証およびそのための重要な資材の構築に成功し、極めて重要な成果を得ることができた。本年度において、LacO-LacIレポーターシステムによる免疫沈降からDNA/タンパク複合体のMS解析を実施可能かどうかの先行実験として、タグ配列(LacOリピート)を有するプラスミドの免疫沈降とプラスミドに集積する複合体タンパクのMS解析を行った。LacO/LacIシレポーターステムによる免疫沈降産物をPCRにより評価した結果、LacO/Laclレポーターシステムを用いた免疫沈降産物では非特異的抗体を用いた免疫沈降産物と比較し、明瞭なバンドが確認できた。この結果よりLacO/LacIレポーターシステムによってタグ配列を有するプラスミドを特異的に回収できたことを示唆する。その免疫沈降産物のMS解析を行った結果、タグ配列に特異的に集積するLac/タンパクの検出に成功した。

このことは、MS解析によりプラスミド上のタグ配列に集積したDNA/タンパク複合体を検出したことを示唆し、DNA配列に集積した複合体をLacO/LacIレポーターシステムにより免疫沈降し、MS解析により同定可能であることを示唆する。また並行してChrIP法の解析に用いる資材の構築に成功した。DNA/タンパク1機能性RNA複合体をターゲットとするXISTおいてはXIST RNAをコードしているBAC由来ゲノム領域をintegraseを用いてタグ配列を有する人工染色体上に搭載させた。また疾患由来反復配列をターゲットとするCGGリピートにおいては(CGG)100リピートを保因者DNAよりPCRクローニングし、制限酵素サイトを用いてタンデム化を行ったリピートを(CGG)100x1,x2,x4,x8の4パターンのプラスミドを作製した。その後タグ配列を有する人工染色体上に搭載させた。搭載させたリピート配列はサザンプロットにより確認した。またFISH法により人工染色体の存在を確認した。
リグニン生成反応における立体選択性を規定する因子の解明

本研究の目的は、リグニンの立体構造を明らかにし、次いでリグニン生成反応において立体選択性を支配する要因(支配因子)を明らかにすることである。β-O-4構造はリグニンの中で最も主要な結合様式であり、これまでにその側鎖立体構造(erythroとthreo体)を分析する手段としてオゾン分解法を改良し、この定量的扱いを可能にしてきた。本研究では昨年度、β-O-4構造の側鎖立体構造(erythro/threo体)と、芳香核骨格構造(syringyl/guaiacyl核)が樹幹内、樹種間で異なる分布を有し、それらが相関を持つことをオゾン分解法とメトキシル基量の結果から示したが、今年度、さらにニトロベンゼン酸化法によって得られるシリンガアルデヒド/全アルデヒド量がerythro/(erythro+threo)と極めて高い相関(R^2=0.989)を示すことが明らかとなり、上記のsyringyl核の増加に伴いeryhtro体が増加していく傾向がより確かなものであることが示された。また本法によって生成するDivanillinの収量が樹種(針葉樹6種、広葉樹15種)によって大きく異なりVanillin収量と同様の傾向を示すことが同時に明らかとなったが、これがビフェニル型構造由来なのか反応中に生成した物なのかについては明らかでないため今後も引き続き検討していく。また、オゾン分解法の反応条件の検討も併せて行った。本方法はリグニンの立体構造を明らかにしていく上で不可欠であると認識されつつあり、その目的分解生成物の収率はモデル化合物(β-O-4構造)で74%と比較的高い値を得ているが、さらなる収率の向上を目指し反応条件(反応溶媒と反応温度)の検討を行ったところ、溶媒組成(酢酸-メタノール-水)の違いによって木粉からの収率が大きく変化することが明らかとなった。本研究の目的は、リグニン構造論の中で最も解明が立ち遅れている立体構造を明らかにし、次いでリグニン生成反応において立体選択性を支配する要因(支配因子)を明らかにすることである。本研究では今年度、β-O-4構造の側鎖立体構造と、芳香核骨格構造(syringylとguaiacyl核)が樹幹内、樹種間で異なる分布を有し、それらが相関を持つことを明らかにした。具体的には、広葉樹あて材に特徴的であるsyringylとguaiacyl核の樹幹内における分布の違いを利用し、あて部から対向部まで樹幹の円周上に沿って木粉を採取し各種化学分析を行った。その結果、β-O-4構造のerythro体の割合は対向部よりもあて材部で高いことから樹幹内で不均一な分布を有することが示され、この分布とsyringyl核の割合の分布とに強い相関が示された。また、21種(針葉樹6種、広葉樹15種)の樹木のリグニンについても同様にerythro体の割合とsyringyl核の割合を調べた。その結果、全ての針葉樹でerythroとthreo体の比は1:1であった。これに対し広葉樹では様々な程度のerythro体優勢が見られ、上記の樹幹内に得られたのと同様の相関が樹種の違いを超えて確認された。このことから広葉樹に見られるerythro体優勢がリグニン生成反応において引き起こされる要因に関して、syringyl核の割合の増加が一つの要因として作用することがリグニン一般について成り立つと示唆された。
不動産ファイナンスの理論と応用

ファイナンス理論の中心的な課題は、資産の期待リターンとリスクとの均衡関係、言い換えるならば、資産価格がリスク・リターンをどう評価するかを検討することにある。不動産ファイナンス研究の世界においてもそのことは例外でない。まず第1に、不動産市場におけるさまざまなリスクをいかに認識し、かつ具体的にどのようにしてリスクの大きさを測定するかを議論した。第2に、認識されたリスクを制御・回避していくために、どのような新しい金融金融資産が必要でありかつ有効であるかを、ファイナンス理論を基礎にし、さらに近年発展の著しい金融工学手法をもちいて議論した。第1の点については、例えば、空室リスク、信用リスク、不動産資産価値の変動リスクなどを取り上げた。これらの不動産リスクの測定にあたっては、株式、債券、為替といった伝統的な金融資産のリスク分析とは異なる視点や統計的推定方法が必要であることをしめした。第2の点においては、そうしたリスクを有する不動産を原資産とする派生証券(デリバティブ)を考え、その価格モデルを提示するとともに、それを用い不動産市場におけるリスクをどのようにして管理できうるかを示した。具体的には、不動産投資信託(REITs)、リバースモーゲージ、不動産価格指数を原証券とするデリバティブズ、空室リスクに関するデリバティブズなどの価格決定モデルを提示すると共に、そうした価格決定モデルを用いたリスクの評価とリスク回避方法をしめした。研究アプローチとして理論と実証を融合させること、さらに、理論モデルであってもそれが実証可能であることを目指した。また、ミクロ経済学、計量経済学、統計学、ファイナンス理論と金融工学などさまざまな分野からの学際的な研究であることに留意して研究を進めた。平成14年度は、不動産学、不動産ファイナンス(Real Estate Finance)研究に関して、金融・不動産市場の規制緩和や情報公開を背景として、次のような分野:1不動産ファイナンス理論と実証方法のサーベ、2不動産インデックス作成方とその応用、不動産証券データベース3不動産を原証券とするデリバティブズ(派生証券)の価格決定モデルについて主に検討した。具体的には、平成14年7月より毎月一回、都心において、この分野における実務家と学会メンバー(毎回約50人程度)が一同に会し、先端的な理論と応用面での研究発表を行う研究会をおこなった。その概要に関しては、http://web.sfc.keio.ac.jp/yyoshida/refa.htmlで毎回報告をおこなっている。特に、平成15年3月には、湘南国際村センターにおいて、11名による中間的な研究発表集会をおこなった。その成果は、不動産証券化、リバース・モーゲージ、空家・空室率、不動産税制、ヘドニック価格指数の理論と応用などにわたり、300ページにわたる予稿集としてまとめられている。また、研究成果のいったんは、不動産金融工学会(JAREF)、日本証券計量工学会(JAFEE)、アジア不動産学会(於シンガポール)、日本FP学会などで学会発表を行った。平成15年度は、これらの成果の学会誌への投稿と、1家計の金融資産保有パネルデータを用いた不動産投資決定、2信金・信組の不動産投資決定モデル、3不動段担保競売データによる不動産価格決定モデル、4新築マンション価格のヘドニックモデル、(5)不完備市場としての不動作市場におけるデリバティブズ価格決定も出る、などについて検討する予定である。本年度は、1)不動産価格のインデックスモデル、2)それを用いたデリバティブズ契約の価格決定モデル、3)不動産リアルオプション分析、の三つの分野に関する研究を行った。不動産価格指数モデルの開発に関しては、まず、首都圏の新築マンション価格データを用いたヘドニック価格モデルの開発をおこない、バブル崩壊以降不動産市場価格の下落傾向は、品質を調整した後でも継続的であることを明らかにした。さらに、不動産価格に影響をあたえる重要な要因として最近注目されている空室率の要因分析を東京圏のオフィス市場について試みた。不動産デリバティブズについては、構築した不動産価格指数、あるいは空室率指数を原証券とするデリバティブズ契約の可能性について、1)制度的な存立可能性と、2)契約の経済的価値の分析をおこなった。

不動産は本来取引が活発でないという意味で、非完備市場である。したがって、完備市場を前提とするデリバティブズの価格決定モデル、たとえば、ブラック=ショールズモデルをこの分析のために用いることは困難である。そのため、エッシャー変換を用いた不動産デリバティブズの価格決定モデルの可能性を検討した。また、そうした不動産デリバティブズを用いて、不動産の価格変動リスクをヘッジすることが可能であるかどうかをシミュレーション分析によって明らかにした。また、不動産の価値を決定するにあたり最近理論のみならず実務においても注目されているリアルオプション・アプローチを考えるにあたり、それとダイナミックなDCF(割引現在価値法)との関連付けることにより、新しい観点を導入できることを示した。本年は、これまで2年間の研究課題であった以下の3つ課題、つまり、1)不動産デリバティブズの評価、2)不動産価値評価のためのリアルオプション分析、3)新しい不動産資産価格のヘドニック価格分析、等の研究を進めるとともに、さらに本年は、4)アクチュアリアル・サイエンス(保険数理)手法の不動産分析の応用可能性、という新しい課題に取り組んだ。第1の「不動産デリバティブズ」に関して、不動産投資信託(REITs)価格変動特性を実証ファイナンス研究手法でよく使われるイベント研究手法を用いて分析するとともに、米国REITsの信用リスク分析を格付の数量分析と言う観点から分析した。また、新しい不動産デリバティブズの可能性をもつ不動産価格指数に対する先渡しとオプション契約の評価モデルを開発した。第2に、最近、急激な発展を遂げているリアルオプションの不動産分析への応用可能性に関し、数理モデルの開発にとどまらず、実際の適用に関して生じる種々の問題についての分析を試みた。第3に、従来日本では土地や居住用不動産の分析に止まっていたヘドニック価格分析を、商業用不動産や、これまでまったく分析がなされていなかった「ゴルフ会員権」の分析を試みた。また、多数の30年間のゴルフ週次会員権データの分析を通じ、会員権価格にあらわれたバブルの発生とその崩壊過程の分析を試みた。第4に、不動産市場を、非完備市場と考えたときに、その価格決定方法として、大災害や事故、生命や健康といった市場で広く取引がなされていない資産を取り扱う研究方法として確立されているアクチュアリサイエンス手法の不動産分析への適用可能性に関する検討を行い、ある種の手法が不動産分析に有効であることを確認した。
ウイルスケモカインホモログを標的としたヒトサイトメガロウイルス感染モデルの開発

1)マウスサイトメガロウイルス(MCMV)由来ケモカインホモログMCK-2は、後期骨髄細胞をその標的細胞として、当該ウイルスの病原性の増大に寄与している知見を得た2)ヒトヘルペスウイルス潜伏感染/再活性化の動物モデルの構築へむけ、コモンマーモセットにおけるCODEHOP法を用いた内因性ヘルペスウイルスの検出ならびに同定を確立した1)マウスサイトメガロウイルス(MCMV)由来ケモカインホモログMCK-2は、後期骨髄細胞をその標的細胞として、当該ウイルスの病原性の増大に寄与している知見を得た2)ヒトヘルペスウイルス潜伏感染/再活性化の動物モデルの構築へむけ、コモンマーモセットにおけるCODEHOP法を用いた内因性ヘルペスウイルスの検出ならびに同定を確立した目的:MCMV(murine cytomegalovirus)がコードするケモカインホモログMCK-2(murine chemokine-2)は、LMP(late myeloid progenitor)を感染・発現局所に動員する。LMPはCD31^+Mac-1^+Gr-1^<int>のフェノタイプを提示する。本後期未熟骨髄紳胞は、MCMVの格好の標的細胞と推測され、感染個体の病原性の発揮に関与していると考えられている(Noda et al.,Blood,2006)。本研究では、HCMV-IE1プロモーター制御下にGFP(green fluorescence protein)をマーカーに発現するMCMV-mutants(RM4503;MCK-positive virus, RM4511;MCK-negative virus)を用い、(1)LMPがMCMVの感染標的細胞の一つであるのか、(2)MCK動員性LMPの個体病原性発揮への貢献、ならびに(3)Marmoset Herpesvirusesの同定方法(CODEHOP:consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)、について検討を行った。結果:(1)マウスの足裏にRM4503あるいはRM4511を接種2日目に当該肉趾を切除、これをコラゲナーゼ処理にてsingle cell化後、密度勾配遠心法を用いて白血球分画を分離した。同分離細胞を用いて、FACSによるLMPサブセットのウイルス感染率(GFP-positive cells)を検定した。MCK-positive virusにおける感染率が、MCK-negative virusのそれの10倍を提示した。MCK発現によって、感染局所に高率に動員されてくるLMPが、ウイルスの標的細胞群の-サブセットであることが示唆された。(2)上述の結果は、LMPがウイルスの格好のキャリアーであること、かつ、個体のウイルス感染病原性の発揮に、何らかの役割を担っているものと考えられた。LMPは放射線に感受性が高く、同処理によって著明に減少する(Noda and Mocarski, in preparation)。そこで、ウイルス(RM4503あるいはRM4511)を肉趾感染後、ガンマ線処理を施したマウスを用いて、ウイルス標的臓器(脾臓:急性感染期、唾液腺:持続感染期)におけるウイルス価を検定し、MCK動員性LMPについて検討を加えた。結果、いずれの変異ウイルスのマウス標的細胞感染価間でも相違が認められなかった(Smith, Noda, and Mocarski, unpublished data)。放射線処理はLMPに高感受性とはいえ、他の造血系の細胞にも影響があることが推測されるため、細胞移入実験による検討が必要と考えられる。(3)CODEHOPのデザイン設定を完了し、三種のプライマーセットの有効な検出を確認した。(1)細胞移入実験におけるLMPの感性性増悪の役割について:マウスの足裏に変異MCMV(RM4503:GFP-positive mutant)を接種2日目に当該肉趾を切除、これをコラゲナーゼ処理にてsingle cell化後、密度勾配遠心法を用いて白血球分画を分離した。同分離細胞をさらにcell sortingし、本サプセットの増悪性における役割をinvivo細胞移入実験によって検討した。ln vitroでは、同サブセットの他細胞群(上皮細胞、血管内皮細胞などの標的細胞)へのcell-to-cell spreadの動態解析および観察を、変異ウイルスを用いて行った。本解析の結果、LMPsがウイルス伝播の一役割を担っていることが示された。MCK-2による本細胞群を介した病原性増悪のメカニズムを強く補完するものである。(2)MCK-2によるLMP動員におけるCMXR4の機能について:CXCR4遺伝子欠損マウス(CXCR4 KO)におけるLMP動員効率ならびにウイルス病原性の増悪率を分析し、CXCR4のLMP誘導における機能を、同野生型マウスと比較・検討した。結果、同NOマウスと野生株ではLMPsの動員率に大きな差異は認められなかった。MCK-2のLMP動員機序には、構成的に未熟骨髄細胞の動員に関わるとされる本ケモカインレセプターは大きく関与してないことが示唆された。(3)内因性ヘルペスウイルスの検出・同定:種を超えてサイトメガロウイルスの特異的PCR産物を検出可能なCODEHOP法を用い、MarCMVをはじめとする内因性のヘルペスウイルスの同定を試みるとともに、どの程度の割合で本動物に感染しているかについての詳細な解析を行った。その結果、ヘルペスウイルスの標的臓器において、本法によるウイルス特異的なPCR産物を認めた。感染マーモセットの個体による分類は、事後のヒト感染モデル(再活性化、及び胎盤感染)の候補群の選定に不可欠である。

最終年度(H20年度)は、H8ならびにH19年度成果をふまえ、(1)LMPの動員にindispensableなMCK-2リガンドの同定、ならびに(2)MCK-2誘導LMPの動員及び病原性増悪の抑制性因子について検討した。(1)LMPの動員にindispensableなMCK-2リガンドの同定:米国スタンフォード大学との共同研究により実施された。マウスサイトメガロウイルスがコードしているケモカインホモログMCK-2のrecombinant fusion proteinsを用いて、現在迄に同定されているヒト及びマウスのケモカインレセプターについてavidity analysisを検討した。結果、既存の同レセプターへの親和性は検出されなかった。この事実は、MCK-2が未知のリガンドに結合し、LMP動員のキーファクターとなっていることを示唆するものである。(2)MCK-2誘導LMPの動員及び病原性増悪の抑制性因子の探索:申請者らは、微生物の重複感染あるいは生体内定住によって、免疫学的機能を修飾する因子について従来研究を担ってきた(Tanaka et al, J.lmmunol.2007)。そこで、当該ヒト感染動物モデルにおける将来的な治療基盤の初端として、本病原性の増悪抑制のための微生物因子の検索についての検討を実施した。結果、バチラス属の細菌の一つが同ウイルス感染で惹起される病原性を抑制することを見いだした。現在報告論文を作成中であるとともに、LMPとの関連性について検討をくわえている。
全能性細胞の核構築原理

受精卵の全能性を支える核、即ち「全能性核」は、初期発生の特定の時期のみ存在する。全能性核の構築機構の解明は、全能性獲得の本質を理解する上で重要で、さらには全能性を有する核の再構築へとつながる。しかし、全能性核のどのような性質が他の分化した核と異なるかについての知見は極めて乏しい。そこで本研究では、1全能性核の形成過程を詳細に調べ、核形成に必要な因子を同定する。さらに、2全能性核のみが有する機械的特性を明らかにする。3これらの解析を通じ、最終的には全能性核の再構築を試みる。
時間分解分光測定によるIV族元素クラスターの表面反応と相転移の研究

レーザー・アブレーションとパルス・ガス吹き付けを併用した手法、及び希ガス中でのレーザーアブレーション法により創製するSiのクラスター及び超微粒子(総称してナノクラスターと呼ぶ)について次のような研究を行った。(1)HeおよびAガス雰囲気でのSiのレーザーアブレーションを行い、レーザー照射後100nsから2550nsの間に起こるクラスター化の動的機構の研究、並びに、(2)ポリカーボネイト薄膜上にレーザーアブレーション/堆積したSiのナノクラスターに着目して、酸素ガス導入によるクラスター表面反応についての研究、である。手段として、二つの時間分解測定法(レーザープラズマ軟X線吸収分光(LAPXS)法とICCDによる発光スペクトル・発光粒子空間分布測定法)を用い、Siナノクラスター形成の動的過程を調べた。さらに、薄膜上に堆積させたSiナノクラスターの短時間に起こる表面反応、相転移の動的過程をレーザープラズマ軟X線吸収分光法により、その場診断した。その結果、(1)については、2550nsまでに顕著なクラスター化は起こっていないことを示した。(2)次に、ポリカーボネイト薄膜上に堆積したSiのクラスターのL_<II,III>吸収端スペクトルに着目して、反応性ガスである酸素ガスを導入して、5mTorrで60秒の間、反応させ、酸化の様子を時間分解レーザープラズマ軟X線分光測定(LAPXS)法でその場診断して調べた。その結果、AFMで観測して、平均20nmの粒径にSiナノクラスターが形成されている場合に於いても、完全にSiO_2になっていることを明らかにした。これは、Siナノクラスターの反応性が極めて高いか、または、Siナノクラスターの生成量/Si原子・イオンの量が極めて低いか、このどちらかによっていると考えられる。
下水道網を利用した静脈産業創出のための基盤技術開発

環境維持に不可欠な静脈産業の基盤技術を創出するために、微生物のもつ浄化と生産機能を従来の数十倍数百倍の効率で利用できる社会システムを構築してゆくことで、日常生活の消費活動にともない環境が浄化されるような物質変換技術を確立することを目的に研究に取り組んでいる。これまでに、食品加工廃棄物である廃糖密を原料として、嫌気性細菌によるクリーンエネルギー源としての水素の生産、生分解性プラスチックの原料としての乳酸の生産、さらに、発酵副産物として生成した有機性廃液を原料として光合成細菌により水素を生産する方法と、廃水処理菌群により生分解性プラスチック原料(ポリ-β-ヒドロキシ酪酸:PHB)を生産する方法、および培養に伴い発生する炭酸ガスを光合成微生物により固定する方法を検討した。いずれの培養系においても、反応速度を高めるために培養槽内の菌体濃度を高めることを目的に、セラミック精密濾過膜を内装したバイオリアクターを利用した灌流培養システムを用いた。灌流培養システムでは、菌体を槽内に留め徐々に濃縮するとともに、培養上澄み液を連続濾過交換することで、原料廃水の浄化処理と目的物質生産を並行して行うことができる。その結果、廃糖蜜からの連続水素生産では従来法の生産性を5倍近く上回ることが可能となり、また、廃糖密からの連続乳酸生産も高速で行うことが可能となった。さらに、廃水処理と並行したPHB生産も実現可能であることを実証した。一方、光合成菌による水素生産や炭酸ガス固定反応系でも灌流培養法により従来法を上回る反応効率を達成できることが明かとなったが、菌体濃度を過剰に高めた場合には、培養液中の光の透過性が低下するために反応効率が低下することが判明した。これらの結果に基づき、環境有用微生物の共役的反応システムの開発を進めている。
音のパターンを記憶・想起する聴覚野メカニズム：二光子顕微鏡による解析

和音は構成音の周波数が整数比になる音である。和音を聞くと、基音(F0)が含まれていなくともF0を知覚する。我々はこの現象の神経回路的メカニズムを解析するため、二光子イメージングとフラビン蛋白蛍光イメージングを用いてマウス一次聴覚野を観察した。その結果、一次聴覚野が、聞いた音の組合せを保持する記憶連想回路と記述できることを明らかにし、F0現象が記憶連想回路から作られる一部の成分である可能性を示した。二光子イメージングを用いて、和音を聞いた際マウス一次聴覚野ニューロンがどのように活動するかを観察した。和音を聞くと、構成音の最大公約数の音も聞こえてくることが知られている(ピッチ:missing fundamental)。マウスに20+25 kHzの和音を聞かせると、最大公約数に相当する5 kHz領域にも神経活動が起こることはフラビン蛋白蛍光イメージングを用いた過去の実験から明らかになっている。マウス5 kHz領域にGCaMP3を発現させて単一ニューロン活動を観察した所、20+25 kHzの和音に対して5 kHzニューロンも応ずる傾向があることが判った。この事実は和音を聞くと、最大公約数に相当する周波数ニューロンも活動することで、missing fundamentalのピッチが聞こえてくることを示唆している。聴覚野ベルト領域の一つであるUFは比較的ゆっくりした傾きのFMの方向を処理している。22週齢程度の加齢C57BL/6マウスは聴覚野UFのFMに対する応答が減弱することが判った。UFが内側膝状体背側核(MGd)から投射を受けていることは判っている。そこでUFに逆行性トレーサーを注入し、UFに投射するMGdニューロンを可視化した。その結果、22週齢の加齢マウスでは、MGdのUFへの投射ニューロン数が減少することが判った。これまで末梢性の聴覚障害が良く注目されてきたが、この事実は、中枢の病理的変化に起因する聴覚加齢性障害が起こり得ることを示唆している。本年度は、聴覚野の複雑な研究を行う上で必要となる基礎的な知見を得ることに成功した。フラビン蛋白蛍光イメージングでC57BL/6マウス一次聴覚野(AI)を観察すると、20 kHz以上の音に応ずる高周波領域が腹側・背側の2つの亜領域に分離されることが判った。ある種の生化学的マーカーを用いてこの2つの高周波亜領域と低周波領域を染色すると、腹側領域とAI 5 kHz領域の細胞構築像が同じ像を示し、背側部が全く異なる像を示した。この事は背側部に新たな亜領域が存在することを示している。この亜領域も後腹側から前背側にかけてトノトピー構造があることが二光子イメージングを用いて判った。一方、AIのトノトピーは後背側から前腹側にかけて存在することも判った。マウス聴覚野が再編されることは、正しい聴覚機能を得る基盤を整えることに繋がるものである。さらに、聴覚野内神経回路を可視化する予備的実験で、内側膝状体(MG)と聴覚野の詳細な投射構造を明らかにした。聴覚野には、主要な領域として前聴覚野(AAF)とAIが存在する。C57BL/6マウスのそれぞれにbiotinylated dextran amine(BDA)を電気的に微量注入した所、AAFに投射する視床核はMG腹側核内の内側部であり、AIに投射する部位はMG腹側核の外側部であり、2つのコンパートメント構造になっていることが判った。AAFとAIは音の高さによって活動する部位が異なるトノトピー構造を有する。MG腹側核内のそれぞれのコンパートメント構造内のトノトピー軸を可視化するため、AAFとAIのトノトピーに沿ってBDAを複数個所注入した所、腹側核内側部では内側から外側に向かって、腹側核外側部では背側から腹側に向かってトノトピーがあることが判った。この事実は、聴覚野亜領域が独立した視床入力を受けていることを示すものである。我々は一次聴覚野(AI)において二光子イメージングを行い、複合音依存的神経回路を研究する予定である。このためには、AIの正しい位置は基礎的かつ極めて重要な知識である。本年度に行った実験により、これまで考えられてきたマウスAIの地図を大幅に見直す必要があることが判った。即ち、これまでAI高周波領域と考えられてきた部位は、AIでない異なる亜領域であることが判った。マウスは多細胞機能イメージングを行う上で必要不可欠な動物であり、今後もマウス聴覚野を用いて多くの神経回路研究がおこなわれるはずである。しかし間違った聴覚野地図の知識の上に実験を行っても、聴覚野機能の正しい知見が得られるはずがない。その意味で、本年度に得られた知見は、今後の聴覚野研究の基礎となるものである。得られた正しい聴覚野地図を用いて、本課題を遂行していく予定である。一次聴覚野(AI)は音の高さごとに応答する領域が並んだ構造を有する。

しかし20+25 kHzの和音を聞かせると、5 kHzの音が含まれていないにも関わらず5 kHz領域にも神経活動が及ぶことを、フラビン蛋白蛍光イメージングを用いた以前の研究で発見した。本研究ではAIの個々のニューロンがどのような結合をして、5 kHz領域に活動が及ぶのかを検討する。その為「仮説1:5 kHzニューロンに20、25 kHzニューロンからの投射が収束する」、「仮説2:5 kHz、20 kHz、25 kHzニューロンから複合音に応ずるニューロンに投射が収束する」、「仮説3:抑制性ニューロンの側方抑制が解除される」という3つの作業仮説を挙げた。まず、「仮説1」が誤りであることを証明する。予備的実験により、「仮説1」の様に20、25 kHzニューロンから5 kHzニューロンに収束している可能性は低いことが示されている。この結果の再現性を確かめ、「仮説1」が誤りであることを確定させる。次に、「仮説2」に関し、聴覚野ニューロンの自発活動解析から、結合の有無を推定する。どのニューロン同士の相関が高いかは、音刺激に対するON反応の解析だけではわからないため、自発的カルシウムスパイクによる各ニューロンペアの相関解析、順序解析を行う。視覚野では相関が高いニューロン同士は結合が高いことが示唆されている。これをもとにハーモニーニューロンと各周波数ニューロンの結合を推定する。次に、「仮説3」に関して、抑制性ニューロンネットワークを解析する。二光子イメージングを用いると興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの両方を同時に記録出来る。抑制性ニューロンに特異的にGFPを発現するマウス系統に相関解析を応用し、抑制性ニューロンの結合様式とその役割を解析する。平成25年度に計上した、設備備品費は、研究遂行に必要な知識を得るための関連図書・文献を購入するために必要である。消耗品費に関しては、二光子イメージングを行うために日常的にカルシウム指示薬・ウイルスベクター・蛍光トレーサーなど高価な試薬を購入したり、実験用マウスを購入飼育維持することに必要である。旅費等に関しては、国内外の関連学会で研究発表をするための旅費が必要である。また、まとめの年でもあるので、論文投稿に必要な経費も含まれている。
カオスによる共振の制御-基本機構の解明

カオス振動子を用いて特定の周期外力による共振を抑制することが可能か否かを調べるのが本研究の主要目的であり、簡単な非線形振動子モデルに基づいて基本的な機構を調べた。従来の動的吸振器では、補助的振動子を主振動子系に付加して共振振動数をずらすことによって共振を回避する。これに対し、本研究では共振を起こす主振動子系と周期外力との間に補助的振動子を挟み込んだ「挿入振動子モデル」を考え、共振抑制の機構を理論的に考察した。周期外力がカオスのような幅広いスペクトルをもつ振動に変換されたとき共振が抑制されるのではないかというアイディアを検証するのが研究目的であり、カオスの生成によるエネルギーの拡がりの結果共振が抑制されることが確かめられた。具体的には、(1)周期外力を非線形振動子により変換し主振動子へのモデル、および(2)質量・ばね・減衰器より構成される2自由度挿入非線形振動子入力とするモデルを取り上げ、それらを記述する方程式を種々の条件で数値的に解いて共振振幅や振動のスペクトルなどの性質を調べることによって以下の結論を得た。(1)についでは、挿入非線形振動子による非線形飽和により主振動子の共振振幅が減少すること、周期外力が高調波や分数調波あるいはカオス振動に変換されることにより共振がさらに抑制されることを見出した。(2)については、動的吸振器との差異を明らかにするとともに、挿入振動子の場合には共振周波数のずれが大きくなるので有効に共振を避け得ることに示した。また、挿入振動子の非線形性による共振振幅の減少、さらに、スペクトルの広がりによる付加的な共振振幅の抑制が(1)の場合と同様に起こることを見出した。以上の考察に基づく、より現実的な力学モデルの解析と実現が次段階の研究として望まれる。カオス振動子を用いて特定の周期外力による共振を抑制することが可能か否かを調べるのが本研究の主要目的であり、本年度は簡単な非線形振動子モデルに基づいて基本的な機構を調べた。これに対し、本研究では共振を起こす主振動子系と周期外力との間に補助的振動子を挟み込んだ「挿入振動子モデル」を考え、共振抑制の機構を理論的に考察する。周期外力がカオスのような幅広いスペクトルをもつ振動に変換されたとき共振が抑制されるのではないかというアイディアがこのようなモデルを考察する出発点となっている。具体的には、(1)周期外力を非線形振動子により変換し主振動子への入力とするモデル、および(2)質量・ばね・減衰器より構成される2自由度挿入非線形振動子モデルを取り上げ、それらを記述する方程式を種々の条件で数値的に解いて共振振幅や振動のスペクトルなどの性質を調べることによって以下の結論を得た。(1)については、挿入非線形振動子による非線形飽和により主振動子の共振振幅が減少すること、周期外力が高調波や分数調波あるいはカオス振動に変換されることにより共振がさらに抑制されることを見出した。(2)については、動的吸振器との差異を明らかにするとともに、挿入振動子の場合には共振周波数のずれが大きくなるので有効に共振を避け得ることを示した。以上の考察に基づく、より現実的な力学モデルの解析と実現を次段階の研究として企図している。

カオス振動子を用いて特定の周期外力による共振を抑制することが可能か否かを調べるのが本研究の主要目的であり、簡単な非線形振動子モデルに基づいて基本的な機構を調べた。従来の動的吸振器では、補助的振動子を主振動子系に付加して共振振動数をずらすことによって共振を回避する。これに対し、本研究では共振を起こす主振動子系と周期外力との間に補助的振動子を挟み込んだ「挿入振動子モデル」を考え、共振抑制の機構を理論的に考察した。周期外力がカオスのような幅広いスペクトルをもつ振動に変換されたとき共振が抑制されるのではないかというアイディアを検証するのが研究目的であり、カオスの生成によるエネルギーの拡がりの結果共振が抑制されることが確かめられた。具体的には、(1)周期外力を非線形振動子により変換し主振動子への入力とするモデル、および(2)質量・ばね・減衰器より構成される2自由度挿入非線形振動子モデルを取り上げ、それらを記述する方程式を種々の条件で数値的に解いて共振振幅や振動のスペクトルなどの性質を調べることによって以下の結論を得た。(1)については、挿入非線形振動子による非線形飽和により主振動子の共振振幅が減少すること、周期外力が高調波や分数調波あるいはカオス振動に変換されることにより共振がさらに抑制されることを見出した。(2)については、動的吸振器との差異を明らかにするとともに、挿入振動子の場合には共振周波数のずれが大きくなるので有効に共振を避け得ることを示した。また、挿入振動子の非線形性による共振振幅の減少、さらに、スペクトルの広がりによる付加的な共振振幅の抑制が(1)の場合と同様に起こることを見出した。以上の考察に基づく、より現実的な力学モデルの解析と実現が次段階の研究として望まれる。
^<125>I標識抗c-erbB-2モノクローナル抗体による画像診断

外来における術後乳癌患者の経過観察加療の臨床経験をもとに、早期における乳癌術後再発予知を可能とするモノクローナル抗体シンチグラフィー(radio-immunodetection、RID)を行なった。標的には高分化腺癌に特徴的に発現しているレセプター型蛋白、プロトオンコジーンc-erbB-2産物を使用した。c-erbB-2発現が確認されているヒト乳癌由来の細胞株YMB-1(JCRBより供与、フローサイトメトリーにて発現を確認)を培養し、ヌードマウスに移植、担癌マウスを作製した。クロラミンT法による^<125>I標識c-erbB-2抗体を担癌マウスに静注後、全身オートラジオグラフィーによりYMB-1腫瘍へのRI集積度を経時的に観察した。抗体投与後3時間では、肝臓、腎臓への集積が著明であったが、時間の経過とともに減少し、18時間後において背部に移植した腫瘍への良好な集積が観察された。また、同時に施行した腫瘍組織の抗c-erbB-2モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、細胞膜を中心にc-erbB-2染色陽性を確認した。これらの事より、^<125>I標識抗c-erbB-2モノクローナル抗体による免疫シンチグラフィーの有用性が良好な腫瘍描出により確認され、新しい乳癌画像診断としての臨床応用が期待された。この研究の学術的特色は、これまでに癌のImmuno Imagingへの試みとして最も安定した腫瘍マーカーともいえるCEAを始め、いくつかの腫瘍抗原が用いられ報告されてはいるが、特に乳癌に特異的で高い発現率をみるc-erbB-2蛋白を用いたRI標識モノクローナル抗体による画像診断の検索は未だ行なわれていない点である。とりわけc-erbB-2蛋白を腫瘍抗原として用いる点で、今までの骨シンチグラフィーとは異なる腫瘍抗原の分布を確認し、骨粗鬆症との鑑別を可能とする事である。担癌マウスにRI標識抗体静注後、麻酔死させ解剖、各臓器単位体積あたりのRI集積度を裏付けとすべく測定し、さらに放射性核種標識(^<125>I)によりモノクローナル抗体の免疫活性(IR)が低下しない事を、hydroxylapatite高速液体クロマトグラフィーによる分離・精製したIRの異なる抗体を用いた実験を考案、これを証明して直ちに投稿を予定している。乳癌免疫シンチグラフィーの臨床応用を念頭において高分化腺癌の特徴的に発現しているレセプター型蛋白,プロトオンコジーンc-erbB-2産物を標的としたモノクローナル抗体シンチグラフィーを行った。まず、c-erbB-2発現が確認されているヒト乳癌由来の細胞株YMB-1(JCRBより供与)を培養し、ヌードマウスに移植,担癌マウスを作成した。クロラミンT法による^<125>I標識抗c-erbB-2抗体を担癌マウスに静注後、全身オートラジオグラフィーによりYMB-1腫瘍へのRI集積度を経時的に観察した。

抗体投与後30分では、肝臓、腎臓への集積が著名であったが、時間の経過とともに減少し、8時間後において背部に移植した腫瘍への良好な集積が観察された。また、同時に施行した腫瘍組織の抗c-erbB-2モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、細胞膜にc-erbB-2染色陽性を確認した。これらの事より、^<125>I標識抗c-erbB-2モノクローナル抗体による免疫シンチグラフィーの有用性が良好な腫瘍描出により確認され新しい乳癌画像診断としての臨床応用が期待された。さらに、放射性核種標識(^<125>I)によるモノクローナル抗体の免疫活性(IR)が低下しない事を確認すべく、現在hydroxylapatite高速液体クロマトグラフィーにによる分離・精製された、IRの異なる抗体を用いた実験を考案し、これを証明して直ちに投稿を予定している。外来における術後乳癌患者の経過観察加療の臨床経験をもとに、早期における乳癌術後再発予知を可能とするモノクローナル抗体シンチグラフィー(radio-immunodetection、RID)を行なった。標的には高分化腺癌に特徴的に発現しているレセプター型蛋白、プロトオンコジーンc-erbB-2産物を使用した。c-erbB-2発現が確認されているヒト乳癌由来の細胞株YMB-1(JCRBより供与、フローサイトメトリーにて発現を確認)を培養し、ヌードマウスに移植、担癌マウスを作製した。クロラミンT法による^<125>I標識c-erbB-2抗体を担癌マウスに静注後、全身オートラジオグラフィーによりYMB-1腫瘍へのRI集積度を経時的に観察した。抗体投与後3時間では、肝臓、腎臓への集積が著明であったが、腎時間の経過とともに減少し、18時間後において背部に移植した腫瘍への良好な集積が観察された。また、同時に施行した腫瘍組織の抗c-erbB-2モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、細胞膜を中心にc-erbB-2染色陽性を確認した。これらの事より、^<125>I標識抗c-erbB-2モノクローナル抗体による免疫シンチグラフィーの有用性が良好な腫瘍描出により確認され、新しい乳癌画像診断としての臨床応用が期待された。この研究の学術的特色は、これまでに癌のImmuno Imagingへの試みとして最も安定した腫瘍マーカーともいえるCEAを始め、いくつかの腫瘍抗原が用いられ報告されてはいるが、特に乳癌に特異的で高い発現率をみるc-erbB-2蛋白を用いたRI標識モノクローナル抗体による画像診断の検索は未だ行なわれていない点である。とりわけc-crbB-2蛋白を腫瘍抗原として用いる点で、今までの骨シンチグラフィーとは異なる腫瘍抗原の分布を確認し、骨粗鬆症との鑑別を可能とする事である。担癌マウスにRI標識抗体静注後、麻酔死させ解剖、各臓器単位体積あたりのRI集積度を裏付けとすべく測定し、さらに放射性核種標識(^<125>I)によりモノクローナル抗体の免疫活性(IR)が低下しない事を、hydroxylapatite高速液体クロマトグラフィーによる分離・精製したIRの異なる抗体を用いた実験を考案、これを証明して直ちに投稿を予定している。
細網内皮系貧食能賦活による急性肝不全の治療

急性肝不全の病態の進展、とくに多臓器不全の合併や重症感染症発症の病態生理における細網内皮系(RES)貧食能低下の重要性に着目し、RES機能改善を介しての急性肝不全の治療成績を改善する方法の確立を目指し、研究を行った。基礎的研究としては、ラットにガラクトースアミンを投与することにより急性肝不全を作製し、RES貧食能、及びRES貧食能を左右する因子としての肝細胞ミトコンドリア機能を動脈血中ケトン体比を用い測定し、さらにオプソニン蛋白としてのフィブロネクチン濃度及びオプソニン活性を測定した。肝不全ラットにおいてはこのいずれも低下しており、急性肝不全の治療におけるRES貧食能賦活の重要性が示唆された。そこでこれら急性肝不全ラットに、肝ミトコンドリア機能の改善を意図してのATP-Mg、さらに非特異的免疫賦活剤であるOK-432の投与を行ったところ、ATP-Mgにて動脈血中ケトン体比の上昇をともなったRES貧食能の改善、OK-432投与によりオプソニン蛋白濃度及びオプソニン活性の改善をともなったRES貧食能の改善が観察され、それらにより急性肝不全ラットの生存率も改善した。かかる基礎的研究結果をもとに、急性肝不全症例にてRES貧食能オプソニン蛋白濃度を測定したが、いずれも対照群に比較し、有意に低下していた。そこでこれら症例において血漿交換、血液吸着等の人工肝補助療法とともに、オプソニン蛋白の補充を意図しての新鮮凍結血漿の連日大量投与、OK-432の投与を施行したところ、動脈血中ケトン体比の改善、C_3、C_4、フィブロネクチン等のオプソニン蛋白濃度の上昇が観察され、救命率も従来より改善傾向を示した。以上より、急性肝不全の病態においてRES貧食能低下は重要な意義があること、そしてRES貧食能を改善することにより急性肝不全の治療成績が改善する可能性があることが示唆された。1.ラットにガラクトースアミンを投与することにより急性肝不全モデルを作製した。肝機能検査等より本モデルは臨床における急性肝不全の病態をある程度再現していることが確認された。同急性肝不全ラットにおいて細網内皮系(以下RES)貧食能を【I^(131)】リピッドエマルジョン法により測定したが急性肝不全ラットにおいてはRES貧食能は正常肝ラットを比較し、有意に低下していた。これらの結果は、急性肝不全の病態、例えばいわゆるextrahepatic manifestationの発症機序のひとつとして、RES貧食能低下があることを示唆するものである。2.次にこれら急性肝不全ラットにおけるRES貧食能低下の機序を検討する目的で、RES貧食能に影響を与える因子、すなわちKupffer細胞活性(リバースライスバイオアッセイ法)、オプソニン量及び活性(免疫拡散法及びリバースライスバイオアッセイ法)、肝血流量(ガラクトース法)を測定検討した。その結果急性肝不全ラットにおいては、このいずれの因子も低下しており、これらの結果から、急性肝不全ラットにおけるRES貧食能低下には、上記の全ての因子の低下が関与していることが示唆された。3.以上の結果より、急性肝不全ラットの病態のひとつとしてRES貧食能低下があり、この機能低下は、種々の機序を介して発生しているので、その治療的アプローチも多種多様の方法によらなければいけないとの結語を得た。次年度は、これらのことをふまえて、急性肝不全ラットにおけるRES貧食能低下に対する治療に関する研究を行う予定である。1ガラクトースアミンによる急性肝不全ラットにおいては,細網内皮系(RES)貧食能に関与する各因子の低下によりRES貧食能は低下しているとの昭和61年度の研究成果をふまえ,急性肝不全ラットにおけるRES貧食能低下に関与する各因子に対する治療法を試みた.

2これら急性肝不全ラットにKupffer細胞をふくむ肝細胞内ミトコンドリア機能改善の目的でATP-MgCl_2を投与し,肝細胞内ミトコンドリア機能の指標である動脈血中ケトン体比(AKBR)の変化を検討したところ, AKBRの改善がみられ, RES貧食能も改善された.3またこれら急性肝不全ラットに非特異的免疫賦活剤であるOK-432を投与すると, RES貧食能は改善された.かかるOK-432の有効性の機序としては,我々の現在までの研究成績より考えて, OK-432によるKupffer細胞自体の賦活,及びopsonin蛋白の量的,質的改善が考えられた.4以上のごとく, ATP-MgCl_2及びOK-432の投与により,急性肝不全ラットにおけるRES貧食能は改善され,また救命率も改善された.したがって急性肝不全における全身状態の増悪の機序のひとつとして, RES貧食能低下による感染症の併発力, spillover現象による多臓器不全(MOR)が考えられることにより,各種の血液浄化法による人工肝補助装置による治療を行うとともに, PES機能賦活を行うことは有効であることが示唆された.これらの結果をもとに,未だ低い救命率を改善すべく,急性肝不線及び肝硬変急性増悪例において, ATP-MgCl_2及びOK-432によるRES機能賦活療法を試みる予定である.昭和61年度及び62年度の動物実験により、急性肝不全ラットにおいては、細網内皮系(RES)貧食能は低下しており、RES貧食能を改善することにより救命率を改善しうるとの結果をえた。この結果をもとに、ウイルス性ないし薬物性の急性肝不全症例及び一部では肝硬変急性増悪例において、RES貧食能をリピットエマルジョン法で、クッパー細胞をふくむ肝細胞ミトコンドリア機能を動脈血中ケトン体比法で測定し、さらにオプソニン蛋白としてのC_3、フィブロネクチン及びIgGの血中濃度も測定した。まずRES貧食能は、急性肝不全症例及び肝硬変急性増悪例において、対照群と比較して有意に低下していた。そしてこれらの症例においては、動脈血中ケトン体比、C_3、フィブロネクチン濃度も低下していた。これに対し急性腎不全症例においては、RES貧食能は軽度低下しているのみであり、しかもオプソニン蛋白の低下はみられるものの動脈血中ケトン体比は低下していなかった。これらの結果をもとに急性肝不全症例4例において、血漿交換、血液吸着等の人工肝補助療法を行うとともに、オプソニン蛋白の補充を意図しての新鮮凍結血漿の連日大量投与、非特異的免疫賦活剤であるOK-432の投与を施行した。そして4例中3例を救命した。経過中動脈血中ケトン体比やオプソニン蛋白濃度の変化を測定しえた症例では、上記の治療法により、動脈血中ケトン体比の改善、C_3、C_4、フィブロネクチン血中濃度の上昇等が観察された。まだ臨床例の例数が少なく、結論を出すにはいたっていないが、これらの結果は、急性肝不全症例の病態の進展には、RES貧食能低下が関与している可能性が極めて強いこと、およびRES貧食能を賦活することは急性肝不全の治療法のひとつとして有効性を期待しうることを示唆するものである。