hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミセル形成能を利用するデンドリマー型不斉触媒の創製

デンドリマーは核分子から樹状に側鎖が伸びた球状構造を有する高分子である。最近、その表層に機能性部位を導入した球状マテリアルの開発が盛んに行われている。その一つにデンドリマー担持型固定化触媒が挙げられる。均一系触媒を固定化することで、簡便な操作で触媒と生成物の分離、及び、触媒の再利用が可能となり、資源の有効利用につながる。しかし、デンドリマーの合成には多段階の工程を必要とするため、実用性に難があった。そこで界面活性モノマーが水中で形成する球状ミセルを、重合反応により不可逆的に固定化することで、デンドリマーと類似した機能性球状粒子を効率的に合成することを計画した。本手法を用いれば、デンドリマー担持型固定化触媒のようにポリマー表層に触媒サイトが露出した、高活性な固定化触媒が容易に構築できると考えられる。不斉触媒能を有する球状粒子としてBINOL担持型高分子について二つの構築法を検討した。1)親水性部位にBINOL誘導体を有する光学活性な界面活性モノマーを合成して、重合反応によりBINOL担持型球状粒子を得る手法と、2)ミセル形成能を利用して得られた球状粒子に、後からBINOL誘導体を担持して、BINOL担持型球状粒子を得る手法である。合成した球状ポリマーから光学活性チタン触媒を調製して、アルキル亜鉛を用いるベンズアルデヒドとの不斉アルキル化反応を行った。その結果、手法2)より得られたポリマーを用いた場合、収率80%、不斉収率85%で生成物を得た。有機溶媒中で合成した直鎖型ポリマーを用いた固定化触媒よりも高活性であり、ミセルポリマーの有用性が明らかとなった。また、他の手法により固定化した触媒との活性、及び、固定化効率についても比較検討した。機能性物質創製の鍵化合物であるデンドリマーと界面活性剤の自己分子集合体である球状ミセルはマクロな視点からは同一形状と見なせる。そこで水中での重合反応により球状ミセルを不可逆的に固定化するデンドリマー類似型触媒の効率的構築法開発とその応用研究を行った。まず、新規な界面活性モノマーを合成した。これらモノマーの界面活性能は臨界ミセル濃度(CMC)を測定することで確認した。合成した界面活性モノマーの水中での重合反応を検討した結果、ラジカル開始剤として、トリエチルボラン、ペルオキソ2硫酸カリウムを用いた場合に、平均分子量5010万程度のポリマーが得られた。得られたポリマーの形状を走査型トンネル顕微鏡(STM)、及び原子間力顕微鏡(AFM)を用い観察したところ、直鎖のポリエチレン部位から構成される平均分子量50万のポリマーは、大きさが80nm以下のロッド状ポリマーであることが確認された。ビナフトール誘導体から構成される平均分子量18万のポリマーは、大きさが15nm以下の球状ナノ粒子であることが確認された。さらに得られた球状ポリマーを不斉Hetero Diels-Alder反応に適用したところ、化学収率99%、光学収率39%で環化生成物が得られたことから、本法により合成した光学活性ポリマーは生成物の光学収率には不満があるものの不斉触媒として機能することが分かった。現在、光学収率の向上、他の不斉反応への適用、及び再利用システムの構築等を検討している。
「多体量子効果」による分子・金属ナノ構造の光学特性制御に向けた理論体系の構築

本年度は、分子吸着表面からの走査トンネル顕微鏡(STM)発光に関する研究を行った。STMの探針/真空/基板の界面近傍に局在する界面プラズモンの特性を調べるため、マクスウェル方程式からプラズモンモードを決定し、各モードのエネルギーが探針の曲率の増加および探針-基板間距離の減少に伴って低エネルギー側にシフトすることを示した。またプラズモンの励起に伴って生じる高強度の電場は、探針直下から基板平行方向の数ナノメートルにわたり分布しうることを明らかにした。これをもとに、STMの探針を分子から基板平行方向に数ナノメートル程度離した場合にも、分子のエネルギー吸収により界面プラズモンの発光スペクトルが変化しうることを明らかにした。さらに、プラズモンの第2量子化を行い、有効模型を構築した。また、分子励起子とプラズモンの結合の結果生じる2つの結合モードの干渉が、系の発光特性に与える影響を調べた。その結果、2つの結合モードの間のエネルギー領域では、干渉によりプラズモンの発光強度が強く抑制され、分子励起子の発光強度が増強されることがわかった。これらの成果をまとめた論文を1報投稿するとともに、American Physical Society (APS) March Meeting 2015など4件の国際学会と3件の国内学会にて成果発表を行った。また国際学会The 7th International Symposium on Surface ScienceにてBest Poster Awardを受賞した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
関数空間の位相・代数的構造の研究

科研費をいただき本研究では、上記の論文で引用したExample2について、上記の成果をさらにくわしく研究し、二、三の結果を得たのでそれをまとめて発表したいと考えている。さらに上記の論文の結果を一般の強対数絶対値環に拡張することについて少し結果を得ているがまだ発表する段階でないので更に研究を続けたいと考えている。
反実在論的科学哲学の思想史的背景と論理的基礎

クーン、ファイヤーベント以降、現在に至る科学哲学を対象として。1.われわれはまず、そこに於て用いられる「実在論」及び「反実在論」という概念の意味の厳密化に努めた。その結果、これらの概念が存在論的意味、認識論的意味、及び意味論的(semantical)意味という3の意味を持つこと、実在論-反実在論論争においてこれら3つの意味を常に区別すべきこと、及び通説に反し存在論的意味が基本的なものであること、を知り得た。2.次に現在の主要な3つの反実在論の論理的基礎を検討して、以下の成果を得た。第1に直観主義論理学を採るダメットの反実在論は認識論的には極端な検証主義に立脚するものである。同時にこの反実在論は、意味論的には2値原理の拒否に立つが故に、かつてアインシュタインが量子力学を批判する際に採った「実在論即2値原理」という前提と全く同じ考えに立脚するものである。第2にファン・フラーセンの構成的経験主義は科学的には反実在論であるが常識的には実在論である。第3にパットナムの内在的実在論はクーンらの相対主義的科学観の再現に外ならない。3.クーン、ファイヤーベントの弱い反実在論は、後期ウィットゲンシュタインの言論ゲーム論を継承し、歴史的に相対化されたカント主義的認識論の一種である。パースのプラグマティズムは、客観的真理の存在を極限概念として要請するゆえに、これらの相対主義とは似て非なるものである。4.以上の歴史的・批判的検討を通じてわれわれの得た一応の成果は、ひとつの世界観として反実在論は人間認識の有限性の確認に立脚するという注目すべき性格を有するものではあるが、応々にして「全き相対主義」に陥る危検をはらんでいる、ということである。相対主義に陥らない反実在論は如何にして可能かということが、今後われわれが探求すべき重要な課題として残されている。
インジュリン/HGFシステムによる器官再生並びに器官恒常性維持の分子機構

1.器官再生因子としてのHGFの機能解明:HGFがin vivoにおいて肝線維症、肝硬変ならびに脂肪肝といった慢性肝傷害に伴う肝疾患の発症を抑え、慢性肝疾患の病態を著しく改善させることを明らかにした。また、HGFは急性腎不全、急性肺障傷に対しても臓器の再生を促進することを見い出し、HGFは器官再生因子として機能することを明らかにした。HGFは慢性肝疾患、腎不全、肺疾患などに対し新しい治療薬となることが期待される。2.HGFは神経栄養因子である:HGFは初代培養ニューロンに対しNGFに匹敵する神経生存促進を有し、さらにHGFの投与により神経細胞死が防止されることを明らかにした。上皮一間葉相互作用のメディエータとしてのHGFの機能解明:HGFは腎臓、肺において上皮形態形成を誘導する他、四肢等の骨格形成、歯の発生に関与することを明らかにした。また、HGFは両生類に至るまで肝臓の形成には必須の因子であることを明らかにした。4.HGFからみた癌一間質相互作用の分子的理解とHGFアンタゴニストによる癌浸潤阻止:多くの癌細胞が正常間質細胞に対しHGF誘導因子を産生する一方、HGFは間質由来の浸潤促進因子であることを明らかにした。また、リコンビナントHGFのプロテアーゼ消化物からHGFの作用をブロックするHGFアンタゴニストを分離することに成功した。5.HGF誘導因子(インジュリン)の実体解明:組織抽出液からHGF誘導因子の精製を進めIL-1,PDGF,bFGFが組織由来のインジュリンであることを明らかにした。一方、TGF-β、グルココルチコイドはHGFの発現を抑制するブレーキとしての機能をもつことを見い出した。また、癌細胞由来のインジュリンはIL-1、bFGF、PDGFなどであり、MMTマウス乳癌細胞は既知因子と異なるインジュリンを産生していることを見い出した。HGFは私達が肝再生因子の実体として発見した増殖因子であるが、HGFは主に増殖制御や細胞運動の促進、形態形成の誘導などの機能を有するpleiotropic factorであり、肝臓や腎臓、肺など多くの組織・器官の形成や再生を担うorganotropic factorである。本年度はインジュリンの精製を進めるとともに,HGFの発現を調節するサイトカインの同定,HGFのさらに多様な働きが明らかになるとともに、HGF/インジュリンシステムからみた癌と宿主の相互作用の理解に貢献できる研究成果が得られた。(1)インジュリンの精製とHGF発現調節ブタ肺からインジュリンの精製を進める過程でインジュリン活性を示す数種の画分を得た。そのうち2つの画分について精製すると、1つはIL-1であり、他の1つはヘパリンであることが明らかになり、ヘパリンやIL-1がHGF誘導活性を持つことを明らかにした。さらにインジュリンの逆作用を持つHGF発現抑制因子としてTGF-β1やグルココルチコイドが明らかになり、HGF発現がアクセルとブレーキにより巧妙に調節されていることが考えられた。現在さらに未知のタンパク質性のインジュリン活性の精製を進めている。(2)新たに明らかになったHGFの生物活性HGFは間葉に由来し上皮に働きかける因子と考えられてきたが、HGFが間葉組織由来細胞にも生物活性を発揮することを明らかにした。その1つは造血幹細胞の増殖促進作用ならびに血小板増加作用である。2つ目は前破骨細胞の増殖促進と破骨細胞への分化促進作用である。すなわちHGFにbone-remodeling作用があるという結果である。

3つ目は関節軟骨の増殖と分化を強く促す作用である。(3)インジュリン発現を介するがん細胞と宿主細胞との相互作用がん細胞の増殖能や浸潤転移能が宿主細胞の影響を強く受けていることは古くから知られている。このがん細胞と宿主細胞の相互作用をメディエートする液性因子の1つがHGFであることを明らかにした。がん細胞の中にHGF誘導因子(インジュリン様因子)を分泌するものが高頻度で検出された。がん細胞がインジュリン様因子を産生して宿主ストロマー細胞のHGF産生を促し、このHGFによりがん細胞の増殖能や浸潤能、線腔形成能が高まる可能性がある。HGFとそのインデュサーであるインジュリンをメディエーターとしてがんの増殖、悪性化などがん-宿主相関についての分子レベルの理解ができると考えている。ブタ肺からインジュリン(HGF発現誘導因子)の精製を進めると、インジュリン活性を示す複数の分画に分離された。これら複数の分画の精製を進め、その性質を解析したところ、これらはPDGF、bFGF、IL-1であることを明らかにした。実際リコンビナントPDGFは線維芽細胞のHGFmRNAの発現を誘導し、HGFの産生を促進した。PDGFは血小板に豊富に存在しており、障害にともない血小板が活性化されると速やかに分泌される。したがって、組織傷害により血小板から分泌されるPDGFは線維芽細胞などの間質の細胞の増殖を促す一方、そのHGF産生を高め、HGFは主に上皮組織の再生を担うと考えられる。すなわち、PDGF→HGFはHGF/インジュリアンシステムの一つとして組織・器官の再生を担うネットワークの一つである。一方、bFGFに加え、aFGF,HST-1/FGF-4などFGFファミリーのいくつかはHGFの発現を誘導するHGFのup-regulatorであることを明らかにした。上記のようにHGFは上皮-間葉相互作用のメディエーターとして、肝臓、腎臓、肺などの器官形成、形態形成を担うことが明らかになってきたが、このような発生過程におけるHGFの発現誘導にはFGFファミリーに属する増殖因子が関与する可能性がある。その他、EGF、TGF-α、HB-EGF(heparin-binding EGFj-like growth factor)などのEGFレセプターのリガンド、プロスタグランジンも強力なHGF誘導因子であることを明らかにした。プロスタグランジンは傷害にもとない局所で産生され、炎症反応を誘起すchemical mediatorとして知られているが、おそらくプロスタグランジンは炎症反応を引き起こす一方でHGFの発現を誘導し、組織再生にも関与していると考えられる。HGFは上皮-間葉相互作用のメディエーターとして器官や組織の形成や再生に重要な役割を担っていることをこれまで肝臓や腎臓の形成や再生を対象に明らかにしてきた。本年度は肺や歯の発生におけるHGFの機能についてin situハイブリダイゼーション法やアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた解析を行った。ラット胎児肺においては活発に枝分れを繰り返す気管支上皮組織においてc-met/HGFレセプターが、他方HGFはその周辺の間葉組織で発現することが明らかになった。
Ni基超合金の弾性歪測定によるタービン翼寿命予測

クリープ変形を考慮に入れた弾性歪エネルギーの計算をするにあたりこれまでに報告されている実験事実を踏まえ,「クリープ転位が移動するのはγ相内のみでありγ'相内に転位は進入しない」,「[001]引張応力に対して,全ての<101>/{111}すべり系が等価に活動することでクリープ変形が進行する」の2つを仮定した.加えて計算の単純化のために「全てのクリープ変形は転位の移動によって生じた塑性歪である」「ラフト構造は理想的なγ,γ'相の平板の積み重なりである」の2つの仮定を導入した.このような固有歪を持つγ相をγ'相と(クリープ転位を界面に残した状態で)貼り合わせることで格子定数ミスフィットとクリープ歪の両者が存在するときのγ,γ'両相中の平均的な内部応力状態を再現することができる.内部応力状態の計算には完全なラメラ構造を考えた.この構造には周期境界条件を適用し,かつ表面に垂直な応力成分は0に固定した.適当なクリープ変形歪の値に対して,結晶軸方向は固定した状態でラメラ面の面法線方向を変化させ弾性歪エネルギーを計算した.クリープ変形歪が0%の場合,ラメラ法線方向が<100>方向で弾性歪エネルギーが最低になり,外部応力が無い場合はいわゆるcuboidal組織が安定であることが確認された.γ相のクリープ変形歪が0.2,0.4%と大きくなっていくと,ラメラ法線方向が[001]方向の弾性歪エネルギーが急速に低下していくのに対して,[100]方向の弾性歪エネルギーは大きくなる.これは(001)ラフトが弾性的に安定化されていることを示しており,弾塑性論に基くラフト化の機構に関する従来からの報告と一致するものである.しかしながらγ相のクリープ変形歪が0.4%より大きい値(0.6,0.8%)となると,ラメラ法線方向が[001]方向では弾性エネルギーが極大値をとるようになり,[111]方向に大きく傾いた方向で最小値をとるようになる.つまり(001)ラフト構造は弾性的に不安定なものとなることが明らかとなった.クリープ変形を考慮に入れた弾性歪エネルギーの計算をするにあたりこれまでに報告されている実験事実を踏まえ,「クリープ転位が移動するのはγ相内のみでありγ'相内に転位は進入しない」,「[001]引張応力に対して,全ての<101>/{111}すべり系が等価に活動することでクリープ変形が進行する」の2つを仮定した.加えて計算の単純化のために「全てのクリープ変形は転位の移動によって生じた塑性歪である」「ラフト構造は理想的なγ,γ'相の平板の積み重なりである」の2つの仮定を導入した.このような固有歪を持つγ相をγ'相と(クリープ転位を界面に残した状態で)貼り合わせることで格子定数ミスフィットとクリープ歪の両者が存在するときのγ,γ'両相中の平均的な内部応力状態を再現することができる.内部応力状態の計算には完全なラメラ構造を考えた.この構造には周期境界条件を適用し,かつ表面に垂直な応力成分は0に固定した.適当なクリープ変形歪の値に対して,結晶軸方向は固定した状態でラメラ面の面法線方向を変化させ弾性歪エネルギーを計算した.クリープ変形歪が0%の場合,ラメラ法線方向が<100>方向で弾性歪エネルギーが最低になり,外部応力が無い場合はいわゆるcuboidal組織が安定であることが確認された.γ相のクリープ変形歪が0.2,0.4%と大きくなっていくと,ラメラ法線方向が[001]方向の弾性歪エネルギーが急速に低下していくのに対して,[100]方向の弾性歪エネルギーは大きくなる.これは(001)ラフトが弾性的に安定化されていることを示しており,弾塑性論に基くラフト化の機構に関する従来からの報告と一致するものである.しかしながらγ相のクリープ変形歪が0.4%より大きい値(0.6,0.8%)となると,ラメラ法線方向が[001]方向では弾性エネルギーが極大値をとるようになり,[111]方向に大きく傾いた方向で最小値をとるようになる.つまり(001)ラフト構造は弾性的に不安定なものとなることが明らかとなった.Ni基超合金はジェットエンジン,またはガスタービンのタービン翼に用いられている材料であり,この材料の特性がシステム全体の熱効率を大きく左右する.また,単結晶材として用いられ,そのため大変に高価な部材となっている.本研究ではこの材料の寿命を非破壊的な方法で検査する方法を探ることを目的とした.Ni基超合金のクリープ変形に伴う内部弾性歪の変化をX線回折測定により調べた.クリープ試験を45分,4時間,160時間行った中断試験片を用いて内部歪の測定を行った結果,クリープ変形量に対応した内部応力緩和が起こっていることが明らかとなった.この緩和は変形方向に対応して強い異方性を示し,引張軸を面内に含むような結晶面では顕著であるが,垂直な面では全く応力緩和を見ることができない.電子顕微鏡を用いた内部組織の観察結果から,X線で測定された弾性歪の変化はラフト組織と呼ばれる層状組織の層界面に堆積するクリープ転位の密度と配列による応力緩和で説明することができることができることが明らかとなった.すなわち,X線で測定される内部弾性歪は内部に蓄積するクリープ転位の密度を表している.

このクリープ転位の密度は直接この材料のクリープ寿命に関係している.つまり,あまりにも転位密度が大きくなったときにクリープ変形を抑えているラフト組織が崩壊し,急速に破断に至るとされている.したがって,X線を用いてクリープ転位密度を知ることができるということは,これまで破壊的な試料作りを行わないと分からないとされてきた内部組織の変化を非破壊検査によって知ることができることを示している.Ni基超合金はジェットエンジン,またはガスタービンのタービン翼に用いられている材料であり,この材料の特性がシステム全体の熱効率を大きく左右する.また,単結晶材として用いられ,そのため大変に高価な部材となっている.本研究ではこの材料の寿命を非破壊的な方法で検査する方法を探ることを目的とした.昨年度に引き続きNi基超合金のクリープ変形に伴う内部弾性歪の変化をX線回折測定により調べた.昨年度行った2θスキャンに加えて本年度はロッキングカーブの測定をあわせて行った.電子顕微鏡における収束電子線回折測定法を用いて試料内部の応力分布の状態を調べた.この結果はX線のプロファイルと矛盾しないものであり,X線で測定され,理論モデルによって予測される応力分布が現実のものと一致していることが明らかとなった.昨年度は内部組織変化に対してX線回折の2θプロファイルが対応することを示したが,寿命予測においてより重要なクリープ変形後期に対してはロッキングカーブがより敏感に対応することが明らかとなった.この変化について,昨年度構築した理論モデルの発展型のモデルによって内部組織との対応がつけられることが明らかとなった.Ni基超合金はジェットエンジン,またはガスタービンのタービン翼に用いられている材料であり,この材料の特性がシステム全体の熱効率を大きく左右する.また,単結晶材として用いられ,そのため大変に高価な部材となっている.本研究ではこの材料の寿命を非破壊的な方法で検査する方法を探ることを目的とした.昨年度に引き続きNi基超合金のクリープ変形に伴う内部弾性歪の変化をX線回折測定により調べた.本年度はロッキングカーブのクリープ変形量依存性の詳細な測定を行った.その結果,ロッキングカーブはクリープ変形後期で敏感に変化するが,その変化は予想と異なりラフト構造が崩壊し,急激にクリープ変形が進行するようになって初めて現れることが示された.したがって,非破壊検査には2θプロファイルを用いるほうがより簡便であることが明らかとなった.計算機シミュレーションでは,これまでに構築した理論モデルをさらに発展させることによって,ラフト組織の崩壊を示すことができ,クリープ変形に伴う組織変化を初期から終期まで再現することが可能であることが示された.高応力で変形した試料についても,メカニズムは幾分異なるものの低応力の場合と同じ理論モデルを用いることが可能であり,同じくシミュレーションによって内部組織変化の過程を予測することが可能であることが示された.クリープ変形を考慮に入れた弾性歪エネルギーの計算をするにあたりこれまでに報告されている実験事実を踏まえ,「クリープ転位が移動するのはγ相内のみでありγ'相内に転位は進入しない」,「[001]引張応力に対して,全ての<101>/{111}すべり系が等価に活動することでクリープ変形が進行する」の2つを仮定した.加えて計算の単純化のために「全てのクリープ変形は転位の移動によって生じた塑性歪である」「ラフト構造は理想的なγ,γ'相の平板の積み重なりである」の2つの仮定を導入した.このような固有歪を持つγ相をγ'相と(クリープ転位を界面に残した状態で)貼り合わせることで格子定数ミスフィットとクリープ歪の両者が存在するときのγ,γ'両相中の平均的な内部応力状態を再現することができる.内部応力状態の計算には完全なラメラ構造を考えた.
Islet like clusterに与えるIGF-lの影響

ラット新生児の膵臓から得られる膵島細胞塊(ICC)を用いて,IGF-1を加えた培養がICCの形態,インスリン分泌に与える影響をIGF-1の濃度,培養の期間を変化させ検討した.1.分離1日目のICCをマイクロカプセル化し、培養液のIGF-1の濃度を100,200,300,400μg/mlに設定し培養7日目と14日目のICC数を検討すると、control群は培養開始日と比較し7日目で4%減少(n=8),14日目で6%減少した.IGF-1添加群ではICC数は510%増加(n=8)したがIGF-1の濃度を変えても有意差は認めず,control群と比較しても有意差は認めなかった.2.Staticincubation testで内分泌機能を評価した.Control群のインスリン量は分離1日目が0.25μg/ICCで7日目は0.45μgで1.7倍に増加したが,14日培養しても1.6倍のままで増加しなかった.そこで培養7,14日目においてIGF-1投与群の内分泌機能を評価した.IFG-1の濃度が100μg/mlで0.37±0.21μg/ICC,200μg/mlで0.28±0.18μg/ICC,300μg/mlで0.21±0.16μg/ICC,400μg/mlで0.19±0.20μg/ICCであった.100μg/mlの濃度が最も高く,濃度を上げると低下傾向にあった.Stimulationindexは4.3±1.5で濃度による差はなかった.培養14日目のtestでは,いずれの濃度においても分泌量は僅かに減少し400μg/mlの濃度が最も低値であった.3.培養7日目のICCを用いてH-E染色と,インスリン染色で比較したが,細胞構築,β細胞の割合に差は認めなかった.検討数を増やした検討が必要であるが,今回の検討ではIGF-1の至適濃度は100μg/ml前後で,通常の血清濃度であった.IGF-1を投与してもControlとの比較で内分泌機能に差が認められず,今回はラットへの移植実験は行わなかった.今回の実験では、分離後早期におけるICCの分化、成長にIGF-1の直接的関与は少ないと推測された.膵島B細胞にもインスリンレセプターとIGF-1レセプター(IGF-IR)が存在し、細胞の分化誘導とインスリン産生に関与していることが分かっており、アポトーシス抑制にも関与していると思われる。ラット胎仔の膵臓から得られる膵島細胞塊(ICC)を用いて、IGF-1を加えた培養により膵島の細胞構築の形態、インスリン分泌(static incubation test)に与える影響をin vitroで検討した。IGF-1の濃度,培養の期間を変化させ、至適濃度、培養期間を明確にする。続いて、凍結保存したICCに対しても効果が得られるか検討した。ICCをマイクロカプセル化し、培養液のIGF-1の濃度を100,200,300,400μg/mlに設定し培養7日目と14日目のICC数を検討すると、control群は培養期間延長に伴い約20%減少したが、IGF-1を添加したICCは1120%増加したがIGF-1の濃度では差は認めなかった。Staticincubation testでは、IGF-1の濃度に関わらずICCあたりのインスリン分泌量に差はなく、培養期間が延長すると分泌量は約20%まで減少した。次に凍結保存されたICCについてIGF-1の効果を検討した。解凍後7日間の培養ではIGF-1投与群、非投与群ともに数の減少は認めないが小さくなる傾向にあった。インスリン分泌能は非凍結時の約1/10に低下し、IGF-1を添加しても分泌能の改善は認められなかった。高グルコース+テオフィリンの刺激で反応しラ島としての機能は認められるがIGF-1の効果は認められなかった。今後、IGF-1の濃度を800μg/mlまで上昇させ至適濃度を検討しラットへの移植に与える効果も検討する。ラット新生児の膵臓から得られる膵島細胞塊(ICC)を用いて,IGF-1を加えた培養がICCの形態,インスリン分泌に与える影響をIGF-1の濃度,培養の期間を変化させ検討した.1.分離1日目のICCをマイクロカプセル化し、培養液のIGF-1の濃度を100,200,300,400μg/mlに設定し培養7日目と14日目のICC数を検討すると、control群は培養開始日と比較し7日目で4%減少(n=8),14日目で6%減少した.IGF-1添加群ではICC数は510%増加(n=8)したがIGF-1の濃度を変えても有意差は認めず,control群と比較しても有意差は認めなかった.2.Staticincubation testで内分泌機能を評価した.Control群のインスリン量は分離1日目が0.25μg/ICCで7日目は0.45μgで1.7倍に増加したが,14日培養しても1.6倍のままで増加しなかった.そこで培養7,14日目においてIGF-

1投与群の内分泌機能を評価した.IFG-1の濃度が100μg/mlで0.37±0.21μg/ICC,200μg/mlで0.28±0.18μg/ICC,300μg/mlで0.21±0.16μg/ICC,400μg/mlで0.19±0.20μg/ICCであった.100μg/mlの濃度が最も高く,濃度を上げると低下傾向にあった.Stimulationindexは4.3±1.5で濃度による差はなかった.培養14日目のtestでは,いずれの濃度においても分泌量は僅かに減少し400μg/mlの濃度が最も低値であった.3.培養7日目のICCを用いてH-E染色と,インスリン染色で比較したが,細胞構築,β細胞の割合に差は認めなかった.検討数を増やした検討が必要であるが,今回の検討ではIGF-1の至適濃度は100μg/ml前後で,通常の血清濃度であった.IGF-1を投与してもControlとの比較で内分泌機能に差が認められず,今回はラットへの移植実験は行わなかった.今回の実験では、分離後早期におけるICCの分化、成長にIGF-1の直接的関与は少ないと推測された.
日本における家庭電化製品の受容とその特徴

家庭電化製品の普及については、1950年代後半より内閣府によって調査が行われて統計化されている。しかし、それは家庭における使用率を単に示しただけで、具体的な使用場面について言及しているわけでもない。また、家電製品の技術革新について触れているわけでもない。本研究においては、戦後に製作された映画の家電製品に関する使用場面を通して、技術革新をどのように生活者が受容したかを探ることを主たる目的としている。使用したVHS、DVDの映画は400本程度である。特に、洗濯機、扇風機、テレビといった大衆の必需品となっている製品を中心に、映画の中から使用場面を摘出した。こうした使用場面を時系列に整理し、使用場面の増減について統計処理を行った。次に、過去の文献史料、フィールド調査等で得た日本の家電史のデータと比較し、技術革新と製品の形態、製品の変化生活での対応という点を考察した。その結果、電気洗濯機は自動化が進み、乾燥まで含めた完全自動化を生活者も望んでいることが読み取れた。扇風機は脚の短い台置き型から、脚の長さを可変するタイプに一部移行するが、それほど大きな変化がないと読み取れた。テレビについては、技術革新が最も顕著に見られ、ブラウン管の変化から液晶、プラズマと変化する中で、テレビの形態も大きく変化している。しかしながら、居間にて家族がテレビを観るという家族での行為は、現在も継承され、一種のコミュニケーションの場になっている。すなわちテレビも含め、家庭用電化製品の技術革新は、常にユーザーの受容があって、成り立っているということになる。映画の場面は、著作権の問題があり、論文を紙媒体で扱う場合は、著作権法32条の引用で対応可能ですが、電子ジャーナル化には許諾が必要になります。この許諾には高額な費用がかかることから、現状では電子ジャーナルへの掲載は極めて難しいようです。本研究の対象は、電気洗濯機、電気掃除機、テレビジョンの3種類とする。アメリカでの文献史料収集、日本国内での文献史料収集から、以下の内容が明らかになった。(1)電気洗濯機の開発と発達アメリカのワシントン国立公文書館、ニューヨークの州立図書館の史料より、アメリカにおける電気洗濯機の開発は、Martag社が比較的早く、電気洗濯機の専門メーカーとして1920年代に一つの地位を確立している。日本の電気洗濯機開発に大きな影響を与えたとされるThor社は、Maytag社に比較して規模が小さく、1920年代後半になって電気洗濯機の開発が進む。芝浦製作所がThor社の電気洗濯機を参考にした理由は、重電主体のメーカーであったGE社がThor社にモータを供給しており、またThor社製電気洗濯機にGE社のロゴマークを付けるなど、販売にまで関与していたことと関係があると想定される。1930年代のGE社カタログサプライに、Thor社製電気洗濯機が掲載されていることがその論拠となる。芝浦製作所がGE社と技術提携を行っており、GE社からThor社の電気洗濯機を参考にするよう指示があった可能性もある。(2)電気掃除機の開発と発達日本における電気掃除機は、1931年あたりに芝浦製作所が開発したとされている。その際参考にしたのは、GE社製電気掃除機であったとされている。この検証に際しては、アメリカの国立公文書館が所蔵するGE社19201930年代のカタログを参考にした。電気掃除機上部の集塵袋の意匠、またロゴマーク自体もGE社と殆ど同じであり、疑う余地のない事実あることがわかった。日本の電気掃除機は第二次大戦後においてもアメリカの製品の影響を強く受けており、独自の意匠を展開するのは1960年代に入ってからである。(3)テレビジョンの初期意匠本年度から開始したテーマで、19501960年代に日本で流行した取り外し可能な4本脚は、アメリカで普及していたデンマーク家具の脚に影響を受けていることが文献史料を通して確認できた。

映画の場面は、著作権の問題があり、論文を紙媒体で扱う場合は、著作権法32条の引用で対応可能ですが、電子ジャーナル化には許諾が必要になります。この許諾には高額な費用がかかることから、現状では電子ジャーナルへの掲載は極めて難しいようです。
現代日本における高齢者の死生観とケア・ニーズに関する研究

石川県能登地区で訪問看護師を対象に、在宅における終末期高齢者が表出した死生観に関する聞き取り調査を実施した。表出された死生観を含む言語はデータとしてコード化し、それらを質的に分析、分類した。分析結果を宗教学的視点から考察した結論として、(1)訪問看護師等の研修に死生観教育を取り入れることの意義、(2)地域における宗教文化の継承が死の準備教育としての機能を担っていること、の二点が示唆された。在宅での終末期療養は、病院・施設とは異なって、日常生活の延長上にある死への過程(生の過程)であり、ほぼ高齢者のそれまでの生活習慣や環境が持続されている。特に、能登のような地域では、伝統的な宗教的伝統や儀礼などを身近に意識しながら、在宅療養者は自然な死への過程を辿っていく。そこでは在宅医療関係者の献身的な努力とともに、現在も伝統的な宗教的・習俗的な死生観が高齢者の望む終末期を演出する一つの装置として機能している。石川県中能登町における「在宅終末期医療の実態と住民の意識」に関する調査研究を実施した。中能登町における在宅死割合は近年減少傾向ではあるが、全国や石川県と比較すると在宅死割合の高い町である。また、住民の約4割が「終末期に最後まで療養したい場所」を「自宅」と回答している。そうした実態を支えている最大要因は「住み慣れた場所で、最期まで好きなように過ごしたい」という住民意識である。対して、「家族に囲まれて」や「出来るだけ長生きして」という伝統的死生観に依拠する在宅死希望は減少しつつある。こうした調査結果を踏まえると、地域中核病院をもたない中能登町で在宅終末期医療を充実させるためには、(1)在宅療養支援診療所の増加、(2)町内の診療所、訪問看護ステーション等の連携強化、(3)地域包括支援センターの在宅終末期医療に関する啓発活動と相談機能の強化が当面の課題となる。1研究目的石川県内在住の高齢者の死生観を把握し、それを基礎資料として現代日本の高齢者の死生観に基づいてケア・ニーズを把握し、高齢者ケア、ターミナルケア等の現状と問題点を宗教学的、看護学的に検討する。2研究方法(1)公開研究会の開催16年度は7回、石川県内を中心に死にゆく人々を看とっている医療者、国内外からターミナルケア、スピリチュアルケアと関わる研究者を招いて公開研究会を実施し、ターミナル、高齢者ケアの現状と課題を探求した。この一部を「死生観の諸相と高齢者ケア-石川の看取りの現場から-」(北陸宗教文化第17号)、「在宅高齢者へのターミナルケアのあり方-「死生観とケア」公開研究会を通して-」(石川看護雑誌第2巻)等で公表した。(本研究会の講師謝礼は部分的に石川県立看護大学地域ケアセンターからの助成金も使用している。)(2)調査研究石川県内、特に能登地区でターミナルケアの経験をもつ訪問看護師に対して、終末期患者が表出したスピリチュアルペイン、死生観の聞き取り調査を実施しており、今年度中に約100件の聞き取りを終え、テープおこしを行っており、17年度にはそれを整理分析する予定である。(3)関連研究学外の共同研究者たちは島岩「ビハーラ運動と死生観の研究」、清水邦彦は「水子供養と死生観の研究」に取り組んでおり、また、研究代表者は同時に哲学文献から現代人の死生観とケア・ニーズをも探求している。1研究目的

石川県内在住の高齢者の死生観を把握し、それを基礎資料として現代日本の高齢者の死生観に基づいてケア・ニーズを把握し、高齢者ケア、ターミナルケア等の現状と問題点を宗教学的、看護学的に検討する。2研究方法(1)公開研究会の開催17年度は5回、石川県内外を中心に死にゆく人々を看とっている医療者、国内外からターミナルケア、スピリチュアルケアと関わる研究者を招いて公開研究会を実施し、ターミナル、高齢者ケアの現状と課題を探求した。(2)調査研究16年度で石川県内、特に能登地区でターミナルケアの経験をもつ訪問看護師に対して、終末期患者が表出したスピリチュアルペイン、死生観の聞き取り調査を実施し、17年度中に事例103件テープおこしを行い、現在それを整理分析する予定である。(3)関連研究学外の共同研究者たち(金沢大学所属)が「寺院を活用したデイケア施設の研究」に取り組んでおり、また、研究代表者は同時に哲学文献から現代人の死生観とケア・ニーズをも探求している。また、石川県立看護大学所属の研究者たちは「人口現象地域における在宅ターミナルケア」の研究も始めている。主に2つの調査研究を実施したので、それらの要旨は以下のようである。(1)石川県能登地区で訪問看護師を対象に、在宅における終末期高齢者が表出した死生観に関する聞き取り調査を実施した。表出された死生観を含む言語はデータとしてコード化し、それらを質的に分析、分類した。分析結果を宗教学的視点から考察した結論として、(1)訪問看護師等の研修に死生観教育を取り入れることの意義、(2)地域における宗教文化の継承が死の準備教育としての機能を担っていること、の二点が示唆された。在宅での終末期療養は、病院・施設とは異なって、日常生活の延長上にある死への過程(生の過程)であり、ほぼ高齢者のそれまでの生活習慣や環境が持続されている。特に、能登のようなで地域では、伝統的な宗教的伝統や儀礼などを身近に意識しながら、在宅療養者は自然な死への過程を辿っていく。そこでは在宅医療関係者の献身的な努力とともに、現在も伝統的な宗教的・習俗的な死生観が高齢者の望む終末期を演出する一つの装置として機能している。(2)石川県中能登町における「在宅終末期医療の実態と住民の意識」に関する調査研究を実施した。中能登町における在宅死割合は近年減少傾向ではあるが、全国や石川県と比較すると在宅死割合の高い町である。また、住民の約4割が「終末期に最後まで療養したい場所」を「自宅」と回答している。そうした実態を支えている最大要因は「住み慣れた場所で、最期まで好きなように過ごしたい」という住民意識である。対して、「家族に囲まれて」や「出来るだけ長生きして」という伝統的死生観に依拠する在宅死希望は減少しつつある。こうした調査結果を踏まえると、地域中核病院をもたない中能登町で在宅終末期医療を充実させるためには、(1)在宅療養支援診療所の増加、(2)町内の診療所、訪問看護ステーション等の連携強化、(3)地域包括支援センターの在宅終末期医療に関する啓発活動と相談機能の強化が当面の課題となる。また、「死生観とケア」公開研究を5回、タイでのエイズ施設とターミナルケアの視察を行った。
談話標識とフィラーの多重生起による複合的手続きと対話形成に関する認知語用論的研究

本年度は、映画のスクリプトにおける談話標識とフィラーの組み合わせ現象を収集し分析を行った。結果としては、昨年度のBNCおよびWordbanksの場合と同じような組み合わせの傾向が見られた。本結果は、“In Other Words and I Mean: Reformulation and Metarepresentation"というタイトルで、2018年7月に4th International American Pragmatics Conference (Albany, New York) (Presenter Abstracts https://www.albany.edu/ampra/88242.php)にて口頭発表を行った。in other words(談話標識)とI mean(フィラー)は類似の談話機能を持つため、BNCやWordbanks、映画のスクリプトを調べてみても、組み合わせの例はほとんど見られない。しかしながら、in other words発話はI mean発話で多くの場合言い換えることが可能であるのに対して、その逆はほとんど不可能である。これは、2つの手続き的表現が異なる手続き的制約を符号化しているためであり、I meanにより言い換えた発話は先行発話のthoughtの表示であり、in other wordsで言い換えた発話は先行発話の解釈であることを明示していると言える。さらに、昨年度と今年度の言語コーパスの分析から観察された談話標識とフィラーの組み合わせの順序について、関連性理論にて提唱されているmassive modularity(広範囲のモジュール性)という概念により、語用論モジュール内の階層によるものであると考えることが可能であろう。言語コーパスの例に基づく論理的説明は平成31年度(最終年度)にて行いたい。本年度の研究をもとに、最終年度の研究では以下の課題に取り組む予定である。(1)談話標識・フィラーの4つの組み合わせパターンとパターン内での個々の組み合わせ(多重生起)をもとに、発話者の意図した発話解釈への指図と対人機能について、会話(対話)などにおける使用状況別にリスト(ガイドブック)を作成する。(2)massive modularity(広範囲のモジュール性)の観点から、第一次談話標識と第二次談話標識およびフィラーの組み合わせの順序の傾向と語用論モジュールの階層性の関係について認知語用論的説明を行う。本研究は、英語の談話標識とフィラーの組合せが符号化する複合的手続き的制約を言語コーパスを用いて例証するものである。BNCとWordbanks、およびSanta Barbara Corpus of Spoken American Englishにおける2語からなる組合せの言語データを調べてみると、第一次談話標識は発話解釈の方向性を決め、第二次談話標識とフィラーはその方向性の調整を行うことがわかった。加えて、「一次的談話標識+フィラー」、「フィラー+フィラー」という共起順序は聞き手の推論への誘導、発話態度の緩和、思考の忠実な表現といったコミュニケーションにおける優先事項と深く関わっている。複合的手続き的制約は大きく分けて2つのタイプが観察される。1つは、2つの言語表現の組合せが意図された解釈を特定化する場合、一方は発話の推論過程を調整する場合である。これは組合せ現象が関連性の伝達原則を反映しており、談話標識とフィラーが共起する場合、その順序や共起の数は最適な関連性の見込みに合致しているからだと言えよう。組合せによる認知効果が処理労力により相殺されない場合は、談話標識やフィラーは必ずしも一つの発話で多様に組み合わされることはない。研究開始当初はBNCとWordbanksからの組み合わせのデータの収集と分析を平成29年と平成30年にやり終える予定であったが、BNCとWordbanksのデータについては整理と分析が平成29年度にほぼ終了し、新たな分析対象とした言語コーパスSanta Barbara Corpus of Spoken American Englishについても、収集と整理を終えることができた。また、平成29年度に談話標識および談話標識とフィラーの組み合わせに関して論文を4本執筆し、学会発表1件を行なっており、途中段階での研究成果の公開も順調に進んでいる。さらに、平成30年度と平成31年度に収集と分析の対象となる言語コーパスはCOCAと映画のスクリプトのみとなり、平成30年度内に両者のコーパスからの組み合わせデータの収集と分析を終えることができると予測され、当初の予定どおり、平成31年度は談話標識とフィラーの組み合わせが符号化する複合的手続き的制約や対人機能の学習リストの作成に費やすことが可能である。

さらに、昨年度と今年度の言語コーパスの分析から観察された談話標識とフィラーの組み合わせの順序について、関連性理論にて提唱されているmassive modularity(広範囲のモジュール性)という概念により、語用論モジュール内の階層によるものであると考えることが可能であろう。言語コーパスの例に基づく論理的説明は平成31年度(最終年度)にて行いたい。本年度の研究をもとに、今後2年間の研究では以下の課題に取り組む予定である。(1)平成30年度の研究の推進方策COCAおよび映画のスクリプトから、第一次・第二次談話標識とフィラーの組合せのデータを収集し、それらを組み合わせのタイプ別に整理し、組み合わせが符号化する複合的手続き的制約を分析する。これまでと同様に、「第一次談話標識+第二次談話標識」「第一次談話標識+フィラー」「第二次談話標識+フィラー」「フィラー+フィラー」の4つのパターンに加えて、3語および4語からなる組み合わせについても分類を行なう。収集に関しては学部生および大学院生に研究補助を依頼する。さらに、11月1日3日に開催される国際学会(第4回アメリカ語用論国際学会)での口頭発表、および学術論文執筆などにより、途中段階における研究成果を公開する。また、2年目を終えるにあたり、研究計画遂行の確認とシミュレーションを行い、最終年度の研究計画の遂行の実現可能性について検討する。(2)平成31年度の研究の推進方策それぞれの組み合わせパターンをもとに、会話における使用状況別に、組み合わせの複合的手続き的制約、対話形成に必要な対人機能などを解説したガイドブックを作成する。研究成果は国内外での学会発表および学術論文執筆などにより公開する。なお、計画どおりに研究が終了しない場合、収集する言語データの種類と数を減らして分析を行なう等の対応をとる予定である。本年度の研究をもとに、最終年度の研究では以下の課題に取り組む予定である。(1)談話標識・フィラーの4つの組み合わせパターンとパターン内での個々の組み合わせ(多重生起)をもとに、発話者の意図した発話解釈への指図と対人機能について、会話(対話)などにおける使用状況別にリスト(ガイドブック)を作成する。(2)massive modularity(広範囲のモジュール性)の観点から、第一次談話標識と第二次談話標識およびフィラーの組み合わせの順序の傾向と語用論モジュールの階層性の関係について認知語用論的説明を行う。次年度使用額が生じた理由は、本年度研究期間中に当該研究を発展させるために、およそひと月間の海外渡航を行なったことによる。
モデルマウスによるUCP1発現細胞の非侵襲的イメージング解析

UCP1(uncoupling protein1)は褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞のミトコンドリアに多く発現し、熱産生によるエネルギー消費機能を有する。このため、UCP1発現脂肪細胞の増加は肥満の軽減に繋がる可能性があり、多くの注目を集めている。しかし、生体でのUCP1発現脂肪細胞の増減を非侵襲的に検出できる動物モデルがこれまでなく、同一個体における継続的な解析が困難であった。当研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて、Ucp1遺伝子座に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挿入し、UCP1発現脂肪細胞を蛍光シグナルによって非侵襲的に検出できるマウスを作製した。以前に報告したように、Ucp1遺伝子に対する複数のガイドRNAを設計し、最も効率の良いgRNAを選択した。また、そのgRNAを用いてin vitroで褐色脂肪前駆細胞への薬剤耐性遺伝子ノックインを試みたところ、目的のノックイン細胞を得ることができた。この結果から、当研究で構築したCas9/gRNA発現ベクターおよびドナーベクターが目的のゲノム編集において機能したことが示された。次に、このCas9/gRNA発現ベクターおよび蛍光タンパク質遺伝子を含むドナーベクターをマウス受精卵に導入し、Ucp1遺伝子座への蛍光タンパク質遺伝子のノックインを試みた。得られたマウスのゲノムPCRの結果、複数のマウスにおいてUcp1遺伝子座への蛍光タンパク質遺伝子のノックインが検出され、さらに次世代にも引き継がれたことを確認した。IVIS (In Vivo Imaging System)を用いて得られたマウスの褐色脂肪組織を観察したところ、強い蛍光シグナルを検出した。概ね計画通りに進行していると思われるため。得られたUcp1イメージングマウスと野生型マウスの交配を重ね、ノックイン領域以外のゲノム背景をできるだけ野生型に近いものにする。また、Ucp1ヘテロノックインマウスを用いて褐色脂肪組織やベージュ脂肪組織の誘導解析を行う。まず、ベージュ脂肪細胞を誘導することが知られているアドレナリンβ3受容体アゴニストCL316,423や、PPARγアゴニストのロシグリタゾンなどを用いて、鼠径部の白色脂肪組織内でのベージュ脂肪細胞の誘導を蛍光シグナルによって検出できるかどうか調べる。また、マウスの脂肪組織を取り出し、HE染色で組織切片像の変化を観察すると共に、UCP1 mRNAおよびタンパク質量の変化についても確認する。さらに、Ucp1イメージングマウスの脂肪組織から脂肪前駆細胞を含むSVF (stroma vascular fraction)を採取し、in vitroでの培養および分化系を確立する。特に、褐色脂肪組織やベージュ脂肪組織由来のSVFをin vitroで脂肪細胞へ分化させた後、UCP1の誘導とともに蛍光タンパク質の発現誘導が見られるかどうかを確認する。UCP1イメージングマウス由来SVFによるin vitroでの脂肪細胞分化系ができればUCP1発現脂肪細胞の分化促進あるいは分化抑制効果をもつ薬剤のスクリーニングに有用である。褐色脂肪前駆細胞のUCP1遺伝子座へ蛍光タンパク質EGFP遺伝子をノックインするため、ドナーベクターを構築した。ドナーベクターにはUCP1遺伝子の-3.9kから+4.5kを挿入し、さらに翻訳開始部位にEGFP遺伝子を挿入した。Cas9およびガイドRNAの発現ベクターをドナーベクターとともに細胞に導入したが、組換え効率が低かったため、薬剤耐性遺伝子を用いて2段階で遺伝子挿入を行うことにした。まず始めにピューロマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼの融合遺伝子(PacTK)を含むドナーベクターを構築してUcp1遺伝子座へのノックインを行い、その後、PacTKをEGFP遺伝子で置き換える。EGFPに置換されずPacTKを有したままの細胞は、TK(チミジンキナーゼ)で毒性化するガンシクロビルを用いることで除去できる。Cas9、ガイドRNAおよびPacTKを含むドナーベクターを褐色脂肪前駆細胞に導入し、ピューロマイシンによる薬剤選択を行ったところ、ガイドRNA依存的な組換えが起きていることが伺える結果が得られた。また、ピューロマイシン存在下で増殖した細胞のゲノムDNAを単離してPCRによる解析を行ったところ、Ucp1遺伝子座にPacTK遺伝子が挿入されていることが明らかになった。しかし、PCR産物のサイズが期待したサイズよりやや小さく、DNA配列を確認した結果、ガイドRNAの標的配列周辺の約400bpが欠失していることがわかった。これはドナーベクターにガイドRNAの標的配列が含まれていたために起こったものと考えられたため、ガイドRNAの標的配列をドナーベクターから除去したものを構築し、再度ノックインを行った。その結果、ゲノムPCRにより目的の遺伝子座にPacTKが挿入され、大きな欠失も見られないことを確認した。現在、目的のノックイン細胞を得るため、クローニングを行っている。褐色脂肪前駆細胞におけるCRISPR/Cas9システムを用いたノックイン効率が低く、Ucp1遺伝子座に直接EGFP遺伝子をノックンすることは困難と判断した。この可能性は本研究の計画段階である程度予想していたため、すぐに薬剤耐性遺伝子を使用する方法に切り替えた。しかし、薬剤耐性遺伝子を含むドナーベクターを構築してゲノム編集を行ったところ、ガイドRNA依存的なゲノム編集は見られたが、ガイドRNAの標的配列付近が大きく欠失していることが明らかになった。このため、ガイドRNA標的配列を除いたドナーベクターを再構築し、再度ゲノム編集を行った。この結果、問題の欠失は見られなかったが、当初の予定よりやや実験の進行が遅れ気味となった。

このため、UCP1発現脂肪細胞の増加は肥満の軽減に繋がる可能性があり、多くの注目を集めている。しかし、生体でのUCP1発現脂肪細胞の増減を非侵襲的に検出できる動物モデルがこれまでなく、同一個体における継続的な解析が困難であった。当研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて、Ucp1遺伝子座に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挿入し、UCP1発現脂肪細胞を蛍光シグナルによって非侵襲的に検出できるマウスを作製した。以前に報告したように、Ucp1遺伝子に対する複数のガイドRNAを設計し、最も効率の良いgRNAを選択した。また、そのgRNAを用いてin vitroで褐色脂肪前駆細胞への薬剤耐性遺伝子ノックインを試みたところ、目的のノックイン細胞を得ることができた。この結果から、当研究で構築したCas9/gRNA発現ベクターおよびドナーベクターが目的のゲノム編集において機能したことが示された。次に、このCas9/gRNA発現ベクターおよび蛍光タンパク質遺伝子を含むドナーベクターをマウス受精卵に導入し、Ucp1遺伝子座への蛍光タンパク質遺伝子のノックインを試みた。得られたマウスのゲノムPCRの結果、複数のマウスにおいてUcp1遺伝子座への蛍光タンパク質遺伝子のノックインが検出され、さらに次世代にも引き継がれたことを確認した。IVIS (In Vivo Imaging System)を用いて得られたマウスの褐色脂肪組織を観察したところ、強い蛍光シグナルを検出した。概ね計画通りに進行していると思われるため。ひき続き細胞のクローニングを進め、PacTK遺伝子が片側アリルのUcp1遺伝子座にノックインされた細胞を選択する。次に、UCP1-EGFPドナーベクターを用いて再度ノックインを行い、Ucp1遺伝子座のPacTK遺伝子をEGFP遺伝子と入れ替える。HSV TKはガンシクロビルをリン酸化し細胞毒性を強めるため、ノックイン遺伝子がPacTKからEGFPに入れ替わっていない細胞はガンシクロビルの添加により排除できる。こうして最終的にUcp1遺伝子座にEGFP遺伝子がノックインされた褐色脂肪前駆細胞のみを得ることができる。EGFP遺伝子をUCP1遺伝子座に挿入した褐色脂肪前駆細胞を得たら、分化誘導試薬を加えて成熟した褐色脂肪細胞へ分化させ、EGFPの発現誘導を調べる。UCP1は褐色脂肪細胞の分化に伴って誘導されるので、EGFPの発現も分化に伴って増大するはずである。また、既知のUCP1誘導剤であるアドレナリン受容体β3アゴニスト(CL316423)を成熟褐色脂肪細胞に投与し、EGFPが誘導されるか検証する。これらの解析により、褐色脂肪細胞においてUCP1の発現変動をEGFPで検出できることを確認したら、次にマウスの作製を行う。