hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳幼児期の母子コミュニケーション成立に関わる母親のことばかけの縦断的発達

乳幼児と母親は,どのようにコミュニケーションを成立させているのであろうか。乳幼児は,ことばを獲得する以前から,母親や身近なおとなとのやりとりを成立させている。そのひとつの形式として,本研究では,母親による子どもの「代弁」に着目した。母親は,前言語期の乳児に対して,乳児の意図や行為を「代弁」することで,コミュニケーションを成り立たせている。これまでの研究において,母親の発話を4つの代弁形式および非代弁に整理し,月齢推移との関連で,検討を行ってきた。今年度は,本課題の最終年度であり,いままでに分析を行ってきたケースに加え,さらに分析ケースを増やし,生後0ヶ月15ヶ月までの「代弁」の発達的変化をまとめる作業に取り組んだ。その結果,母親の用いる代弁の,月齢推移は,母親自身がコントロールしているとより,子どもの主にコミュニケーションの発達によって,変化がもたらされていることが示唆された。母親の用いる代弁は,個人差は大きいものの,おおよそ生後0ヶ月から9ヶ月までは徐々に増加する。そして,生後12ヶ月,および,15ヶ月では,大幅な減少を示すケースが見られた。この減少の契機としては,子どもの指さしの増加,理解語の増加,表出語の出現との関連が示唆された。子どものコミュニケーション発達との関連は,今後,ますます検討が必要であろう。また,代弁は,発話主体をあいまいにしている日本語の持つ性質に依存している面も考えられる。今後は,日本語以外の言語におけるやりとりの分析をも検討する必要があるだろう。これまでの研究において,母親の発話を4つの代弁形および非代弁に整理し,生後09ヶ月までの代弁の頻度の変化について検討してきた。今年度は,発話の形式だけでなく,機能にも着目した。先行研究では,母親の発話の機能を分析するための適当なカテゴリが見いだせなかったため,まずは,発話の機能についてのカテゴリ生成をめざした。母親の代弁について分析した同じデータ(生後6ヶ月の母子)を用いて,母親の発話の機能の側面から,KJ法を用いて整理した。その結果,4水準の樹形図が得られた。最上位水準は,"非伝達"-"伝達"という2つのカテゴリから構成され,第二水準は,"独り言","あやし"(以上,"非伝達"の下位),および,"問いかけ","応答","方向付け","促進"(以上,"伝達"の下位)の6カテゴリから構成された。さらに,これまで分析を行ってきた"代弁"と,今回分析を行った"機能"との関連を検討した。対象となったのは,生後6ヶ月の1組の母子のコミュニケーションである。その結果,今回の母親の発話では,"非伝達"にあてはまるデータが少なく,分析に耐えられるものではなかったが,"伝達"については,とくに,"促進"において,母親は代弁を多く用いることが見いだされた。ここから,代弁かどうかという発話の形式は,発話の機能と関連があることが示唆された。ただし,事例的分析であったので,来年度以降,他事例および他月齢についてデータの分析を進めていきたい。これまでの研究において,母親の発話を4つの代弁形式および非代弁に整理し,生後09ヶ月までの代弁の頻度の変化について検討してきた。今年度は,さらに分析を進め,生後15ヶ月までの母子のやりとりにおける「代弁」の発達的変化について検討した。とくに,12ヶ月から15ヶ月への変化は顕著であり,それまで増加傾向にあった母親の代弁が減少する。そして,その背景には,子どものコミュニケーションの発達があることが見いだされた。具体的には,(1)指さしが対象を指し示す機能を持つようになる,(2)自分では発語できなくとも,ことばを言われて理解できる理解語が増加する,(3)共同注視の成立場面が増加する,(4)やりとりのタイミングにあった発声が増加するなどの点で,子どもの変化が観察された。ここから,子どもがやりとりを理解しているように見えることによって,母親子どもを「やりとりの相手」として捉えるようになったのではないかと推測される。それゆえ,代弁が減少したのではないだろうか。来年度以降,他事例および他月齢についてデータの分析を進めていきたい。

今年度は,本課題の最終年度であり,いままでに分析を行ってきたケースに加え,さらに分析ケースを増やし,生後0ヶ月15ヶ月までの「代弁」の発達的変化をまとめる作業に取り組んだ。その結果,母親の用いる代弁の,月齢推移は,母親自身がコントロールしているとより,子どもの主にコミュニケーションの発達によって,変化がもたらされていることが示唆された。母親の用いる代弁は,個人差は大きいものの,おおよそ生後0ヶ月から9ヶ月までは徐々に増加する。そして,生後12ヶ月,および,15ヶ月では,大幅な減少を示すケースが見られた。この減少の契機としては,子どもの指さしの増加,理解語の増加,表出語の出現との関連が示唆された。子どものコミュニケーション発達との関連は,今後,ますます検討が必要であろう。また,代弁は,発話主体をあいまいにしている日本語の持つ性質に依存している面も考えられる。今後は,日本語以外の言語におけるやりとりの分析をも検討する必要があるだろう。
光信号伝達における表層細胞骨格構造変化の生体染色による解析

植物の光形態形成反応は植物における環境情報応答として重要なものであるが、色素による光吸収後の信号伝達過程はほとんどわかっていない。多様な光形態形成反応を示すシダ原糸体細胞では、光受容色素であるフィトクロム、青色光吸収色素がともに、細胞内で少なくとも二つの存在状態で示すこと、細胞膜近辺に配向した受容体に制御される光反応においては、光受容部位と近接する細胞表層部の細胞骨格、特にアクチン繊維構造が変化すること、微小管構造はアクチンに追随して変化するか、あるいは変化しないことがわかっている。そこで本研究では蛍光ラベルのファロイディンによる生細胞のアクチン染色を行ない、アクチン繊維構造の光誘導変化を詳細に調べることを目的とした。アクチン繊維の特異的プローブであるローダミンファロイディンをエレクトロポレーション、マイクロインジェクションにより細胞に導入することを試みたが、成功にいたらなかった。しかし、この溶液中に細胞を沈め、減圧処理することで、ローダミンファロイディンが導入され、アクチンが生体染色されることがわかった。ただ、この方法では細胞へのダメージが大きく、アクチンの動態を追跡するにはいたっていない。今後、この方法を改良し、光反応に伴うアクチン構造の変化を調べる所存である。また、この試みの中で、次のような事実が発見された。原糸体亜先端部は光屈性反応の光受容部であり、表層には微小管とアクチン繊維からなるリング構造が存在する。この構造は光屈性に先立ち変化し、信号伝達に役割を負うと考えられている。高濃度のNaCl溶液で処理すると原糸体は急速に原形質分離するが、リング構造の部位では細胞壁と原形質膜が強固に接着していて分離しないこと、さらに、この接着はアクチンではなく、微小管のリング構造に依存することが明らかになった。この事実は、原形質膜を通して微小管と細胞壁を結ぶ何らかの構造が亜先端部に存在ことを示している。
筋肉における糖吸収の運動による促進機構:筋収縮によるグルコース輸送担体の細胞表面への動員機構.

骨格筋での運動によるGlut-4動員をシミュレートし得る培養系の開発細胞へのグルコースの取り込みはグルコース輸送担体が行う。骨格筋でのグルコース輸送担体は大部分がインスリンによって細胞内プールから細胞膜表面に移動し、機能を果たすGLUT-4と呼ばれるタイプのものである。同じGLUT-4が発現している脂肪組織と異なり、骨格筋ではインスリンが存在しなくても運動による筋収縮でGLUT-4が細胞表面に移動し、糖取込みを増大させることが知られている。これは糖尿病の運動による改善を説明できる重要な知見であり、そのメカニズムの解明が待たれている。これらの機構を明らかにするためin vitroの系の確立を試みた。培養ディッシュ内にシリコン樹脂を固化させ、その上に生体適合性の膜を敷き、この膜上で細胞を培養する方法を取った。膜はピンで固定するが、成長した組織も同時に固定される。最終的に組織は膜から遊離し、ピンだけで固定された状態になる。この状態は運動を阻害する要因が少なく、骨格筋の培養に適している。このディッシュに電極を設置し、電気刺激によって任意の収縮を引き起こすことが可能な系を開発した。当初、培養筋肉細胞を用いて実験したが、形態・運動性などから判断して分化が進んでいないこと、およびがGLUT-4 mRNAを発現していない事がわかり、新生児骨格筋より調製した細胞を用いて初代培養を行い、同様にGLUT-4 mRNAの発現量を測定している。少量の細胞でGlut-4のトランスロケーションを定量する方法の開発培養細胞系では十分な分化度が得られなかったため、成体筋肉をモデルとして定量法を検討した。これまではGLUTの定量法としてバインディングアッセイを用いていたため、スタートの筋肉として成体ラットの大腿四頭筋と腓腹筋計4個、約4-6gを必要としていた。この定量法をウェスタン解析にした結果、一回の解析に必要な膜タンパク質量が10μgで程度で済むため、スタートの筋肉量は10mgあれば良い。またGLUT-4の細胞膜表面への移動を見るためには、細胞内プールであるミクロソーム画分と形質膜画分を分離する目的でスクロース密度勾配遠心を行わねばならない。数gの筋肉を用いる場合スクロース密度勾配総量として60mlとなるが、10mg程度の筋肉組織であれば、この量の1/10程度までスケールダウンしても2つの画分を分離できることが可能であった。以上のことから、湿組織として数ミリグラムが得られる培養筋肉細胞を用いた実験でもGLUT-4の膜表面への移動が定量可能だと考えられた。
日本中世宗教絵画史料の調査と史料論的研究

絵画そのもの、および付随する文字史料、関連する行事・儀礼について、総合的な調査・研究を実施した。具体的には、研究期間を通じて、東海地方・北陸地方・近畿地方・中国地方での中世・近世宗教絵画史料の調査と、関連する文字史料・行事・儀礼の調査、それらの整理・分析・検討を進めた。さらに、アジア東方の漢訳仏教圏のなかでの日本の仏教、絵画史料の特性を見通すための作業として、平成26年度には、中国山東省の寺院・祠廟・遺跡・博物館等を踏査・調査・見学し、多くの文化財を実見・調査することができ、日本の宗教文化財との関連について貴重な知見を得た。平成25年度は、3年間の研究期間の第2年目として、各地での中世絵画史料の調査と、これらと密接に関わる文字史料、寺院・仏堂・神社での行事・儀礼についての調査を前年度に引き続いて精力的に実施した。また、地方史詩類、博物館等の展示図録、行事・儀礼のDVDなどの収集に努めた。さらに外部の研究者を招聘しての2回の研究会を実施した。これらの調査・研究を実施してゆくなかで、本研究課題の目的の一つである、個々の宗教絵画や付随する文字史料についての時代判定や真偽判定の制度を高めることができたと考えている。また、同朋大学仏教文化研究所の前期展示「聖徳太子信仰の世界」を企画・統括し、多くの絵画・文字・彫刻を展示し、聖徳太子信仰を題材に、これまでの研究成果を一般に公開することができた。研究会では、外部から招聘した研究者の報告に加えて、他の参加者を交えて、有意義な討論を実施することができた。以上の研究成果を各種研究会(神仏習合研究会など)で報告し、北陸地方の調査の成果を踏まえて「北陸道の初期神宮寺」(『同朋大学佛教文化研究所紀要』33)として発表した。「聖徳太子信仰の世界」展については、同展示の図録である『聖徳太子信仰の世界』を編集し、解説の大部分を執筆した。平成24年度は、3年間の研究期間の第一年目として、各地での中世宗教絵画史料の調査と、これらと密接にかかわる文字史料、寺院・仏堂・神社等での行事・儀礼についての調査を精力的に実施した。また、地方史誌類、博物館等の展示図録、行事・儀礼のDVDなどの収集に努めた。さらに外部の研究者を招聘しての2回の研究会を開催した。これらの調査・研究を実施してゆくなかで、個々の宗教絵画や付随する文字史料についての時代判定や真偽判定の精度をさらに向上することができたと考えている。また、日本の歴史的な宗教現象の中核を占める神仏習合についての、教団史や宗派史を超えた、教理や教義からうかがえるものとは異なる姿が、より明確に理解できるようになってきたと考えている。研究会では、外部招聘者の報告に加えて、脊古の報告も実施し、多岐にわたる有意義な議論をおこなうことができた。調査への同行の研究者や訪問先の博物館等の研究者とも、多くの情報交換・議論が実施できた。研究会の開催は当初3回を予定していたが、招聘予定の外部研究者の都合により、1回を次年度に延期することとなった。以上の研究成果を各種研究会(宗教史研究会など)で報告し、行事・儀礼との関係については「滝山寺の鬼祭ー修正の田遊びと鬼会ー」(『同朋大学仏教文化研究所紀要』32)として発表した。日本中世の宗教絵画に関する史料論を確立するために、これまでの宗教絵画史料調査の経験と実績を踏まえて、絵画そのもの、および付随する文字史料、関連する行事・儀礼について、総合的な調査・研究を実施した。地域を限定しての悉皆的調査としては、平成25・26年度には、豊田市史の編纂に伴う愛知県豊田市域の浄土真宗寺院の所蔵品を中心とする絵画史料の悉皆的調査に参加し、『新修豊田市史』美術・工芸に概要を発表した。また、平成25年度には、同朋大学仏教文化研究所の展示事業「聖徳太子信仰の世界」を企画・統括し、聖徳太子信仰に関わる多くの絵画史料および関係する彫刻、文字史料の展示を実施した。さらに、アジア東方の漢訳仏教圏のなかでの日本の仏教、絵画史料の特性を見通すための作業として、平成26年度には、中国山東省の済南市・維坊市・泰安市・済寧市・聊城市の寺院・祠廟・遺跡・博物館等を踏査・調査・見学し、多くの仏教・道教関係の建築・石像・塑像・絵画・碑刻などを実見・調査することができ、日本の宗教文化財との関連について貴重な知見を得た。日本宗教史当初の計画に沿って、絵画史料、文字史料、行事・儀礼の調査を実施してゆくことができており、図書等の収集についても順調に進められている。

また、神仏習合についての絵画史料や行事・儀礼を通じてのあらたな視点の見通しを得ることができた。当初の計画に沿って、絵画史料、文字史料、行事・儀礼の調査を実施してゆくことができており、図書等の収集についても順調に進められている。基本的には当初計画通りに研究を進めてゆく。なるべく多くの調査を実施したい。さらに複数回の研究会を開催し、外部から招聘する研究者、他の研究者との積極的な討論を実施し、研究成果のまとめに向かう予定である。なお、当初平成26年度に予定していた、本研究の成果の一端を示す同朋大学仏教文化研究所での展示事業を、予定より1年早く25年度に「聖徳太子信仰の世界」として実施したので、26年度には、脊古が企画・統括する展示は行わないが、同研究所の前期・後期の展示に絵画史料の面から協力する予定である。当初26年度に予定していた、本研究の成果の一端を示す同朋大学仏教文化研究所での展示事業が、予定より1年早まったので、25年度前期(7月)に「聖徳太子信仰の世界」と題して、絵画史料を中心とした展示を実施する。このため、25年度前期には、この展示に関する研究会を開催する予定である。平成25年度に予定していた外国調査(中国)について、諸般の事情で年度内の実施ができず26年度に延期となったため、海外旅費として予定していた分がくり越しとなった。平成26年度において、25年度に予定していた外国(中国)調査を実施する予定である。当初の研究計画通り、調査旅費、調査にともなう消耗品費、図書費等の物品費、研究会招聘者への謝金、調査の補助や資料整理の為の謝金の支出を予定している。
骨髄細胞から膵β細胞を作る

糖尿病の再生医療を確立するためには、前駆細胞を効率よく分化させて、インスリンを分泌する膵β細胞を数多く作製する必要がある。このためにはどのような前駆細胞を用い、どのようにして数多くの膵β細胞を得るかということが重要である。われわれは骨髄細胞をこの目的に使えないか、さらに骨髄細胞の中でもin vitroで容易に増幅することが可能な骨髄間葉系幹細胞がこの目的に使えないかと考えて本研究を開始した。まず温度依存性にSV40T抗原を発現するトランスジェニックマウスの骨髄から間葉系細胞を得てこれを株化した。この細胞は32度で培養する際にはT抗原を発現し、その結果無限増殖が可能な状熊になる。一方、温渡を37度に変えるとT抗原は消失し、正常の間葉系細胞と同様の形質を発現するとともに、様々な条件で分化能を発揮する。この細胞GFP遺伝子導入によりマーキングし同系マウスに移植したが、無処置のマウスでは膵臓にGFP陽性細胞は出現しなかった。一方、マウスの膵管を結紮し、膵炎を惹起したマウネにマーキングした細胞を移植すると、やがて膵組織にGFP陽性細胞が集積した。その一部は転写因子PDX1や膵前駆細胞のマーカーであるPGP9.5を発現し、一部にインスリンをも発現する細胞が認められた。すなわちin vivoの条件でインスリン産生細胞へと分化しうることが明らかになった。しかし膵管結紮ではなく、膵部分切除を行ったマウスや、ストレプトゾトシンの投与により糖尿病状態にしたたマウスに移植した場合にはこのような分化転換は認めなかった。そこでin vivoの培養系に、膵管結紮を行ったマウス膵臓の抽出液を添加して培養を行ったところ、ごく一部ではあるが、インスリン産生細胞への分化が認められた。今後さらに効率よく分化させる条件を検討していきたい。本研究は骨髄細胞から幹細胞の可塑性を利用して膵β細胞を分化させ、糖尿病の再生医療への新たなる道を開くことを究極の目的にしている。本年度はまず骨髄細胞が果たしてインスリンを産生・分泌する膵β細胞に分化する能力をもつかどうかを動物実験で検討することにした。マウスより骨髄細胞を採取し、レトロウイルスベクターを用いてGFP遺伝子を導入してマーキングを行った。この骨髄細胞を同系のマウスに投与した。同時にマウスに膵管結紮、ストレプトゾトシン、部分膵切除などの膵侵襲を加えた。2週間後に膵臓を採取し、GFP陽性細胞の有無を検索した。その結果、膵管結紮を行ったマウスにおいて、膵導管部にGFP陽性細胞が集簇していることが観察された。それらのGFP陽性細胞はPDX-1を発現しており、また一部の細胞はインスリン陽性であった。したがって骨髄細胞が膵導管部に集まり、そこで膵前駆細胞に分化するなど、膵幹細胞としての機能を発揮したものと考えられた。このような変化は無処置のマウス、ストレプトゾトシン投与マウス、あるいは部分膵切除マウスにおいては観察されなかった。次に、骨髄細胞の中でもっとも増殖能が高く(in vitroで増幅しやすい)また可塑性の高い間葉系幹細胞がインスリン産生細胞に分化するかを検討した。骨髄細胞から間葉系細胞を分離採取し、同様にGFPでマーキングして膵管結紮したマウスに投与した。その結果、効率はやや低いものの、やはりGFPで標識された細胞が膵管周囲に集まり、一部がインスリンを発現した。したがって骨髄間葉系幹細胞もインスリン産生細胞へ分化する能力をもつことが明らかになった。
新規内臓脂肪量マーカーの臨床応用

我々は、5名ずつの肥満者・非肥満者での生検内臓・皮下脂肪組織を用いたマイクロアレイ解析により、肥満者の内臓脂肪において特異的に発現が増加する因子CCDC3を新規に同定した。肥満モデルマウスにおける検討でも、内臓脂肪特異的に発現が増加しており、さらに、脂肪生検を行った43名での検討において、内臓脂肪組織における本遺伝子発現量は、BMIおよびウエスト周囲長と有意に相関したが、皮下脂肪組織における発現は相関しなかった。この因子は、シグナルペプチドを有し、実際、培養液に蛋白が分泌されることが確認された。このことから、その血中濃度は、内臓脂肪量を推定するバイオマーカーとなる可能性がある(論文掲載)。我々は、ヒト生検内臓脂肪組織および皮下脂肪組織を用いたマイクロアレイ解析により、肥満者の内臓脂肪において特異的に発現が増加する因子(遺伝子X)を新規に同定した。2種類の肥満モデルマウス(高脂肪食負荷マウスおよびdb/dbマウス)における検討でも、内臓脂肪特異的に発現が増加していることを確認した。さらに、脂肪生検を行った43名での検討において、内臓脂肪組織における遺伝子X mRNA発現量は、BMIおよびウエスト周囲径と有意に正相関したが、皮下脂肪組織における発現は相関しなかった。この因子は、gene ontology解析からシグナルペプチドを有する分泌蛋白であることが予測された。実際、培養細胞にFLAG-tag遺伝子を過剰発現させ、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット法にて、培養液に蛋白が分泌されていた。このことから、その血中濃度は内臓脂肪量を反映する可能性がある。すなわち、内臓脂肪量を推定するバイオマーカーとしての可能性がある。(現在、論文投稿中)さらに、この因子は、in vitroでの検討により、インスリン抵抗性を引きおこすという結果を得ている。マウスにおける検討では、過剰発現により体重増加、血糖値上昇をひきおこした。以上のことから、この因子は、脂肪細胞から分泌される新規のアジポカインである可能性が示唆された。これらのことから、血中濃度測定系の確立、血中濃度と肥満度との相関を検討し、内臓脂肪量を推定するバイオマーカーとしての意義を検討し、ノックアウトマウスの作成とその解析により、この因子の病態的生理的意義についてさらに検討を行う。我々は、5名ずつの肥満者・非肥満者において、生検内臓脂肪組織および皮下脂肪組織を用いたマイクロアレイ解析により、30,500遺伝子の中から、肥満者の内臓脂肪において特異的に発現が増加する因子CCDC3を新規に同定した(内臓脂肪で3.07倍、皮下脂肪で0.89倍)。さらに、脂肪生検を行った43名での検討において、内臓脂肪組織におけるCCDC3遺伝子mRNA発現量は、BMIおよびウエスト周囲長と有意に正相関(r = 0.483, p < 0.001、およびr = 0.364, p < 0.05)したが、皮下脂肪組織における発現は相関しなかった。この因子は、シグナルペプチドを有しており、培養細胞にFLAG-tag遺伝子を過剰発現させ、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット法にて、培養液に蛋白が分泌されていることが確認された。(論文掲載)さらに、この因子は、in vitroでの検討により、インスリン抵抗性を引きおこすという結果を得ている。CCDC3の生理的機能について検討するため、Inducible RNAi knockdownsystemを用いて、ノックダウンマウスを作成した。しかし、2つの異なるシークエンスにより、RNAをノックダウンし、2系統のノックダウンマウスを作成したところ、異なる表現系を呈した。現在、さらにノックアウトマウスを作成して検討中である。この因子は、in vitroでの検討により、インスリン抵抗性を引きおこす。さらに、マウスにおいて、過剰発現により体重増加、血糖値上昇をひきおこす。我々は2つのアプローチでこの因子の病態的生理的意義を検討している。第一は、遺伝子Xのノックアクトマウスを作成して、その表現系を検討すること、第二は、血中濃度測定系を確率し、血中濃度の病態的意義を明らかにすることである。【ノックアウトマウスの作成】Inducible RNAi

knockdownsystemを用いて、ノックアウトマウスを作成した。このシステムでは、ドキシサイクリン(DOX)投与により、遺伝子を後天的に欠失させることが可能である。作成したマウスの遺伝子発現を検討したところ、DOX投与により遺伝子はほぼ完全に欠失させることができた。しかし、DOX非投与下においても、遺伝子発現が約50%低下した。以上の結果から、DOX投与マウスはホモノックアウトモデル、DOX非投与マウスはヘテロノックアウトモデルに相当すると考えられた。来年度は作成したマウスの表現系を検討する。【血中マーカーとしての意義】我々は、ヒトの遺伝子Xの産物の血中濃度を測定できる高感度サンドイッチELISAを作成しており、一般住民を対象にした検討を行った。一般住民男性300名を対象に、遺伝子X遺伝子産物血中濃度と肥満度、内臓脂肪面積との相関を測定した。しかし、それらとの相関は認められなかった。以上の結果から、血中濃度は肥満度や内臓脂肪量脂肪とは相関せず、血中マーカーとしての意義は不明であった。【ノックダウンマウスの作成】Inducible RNAiknockdownsystemを用いて、ノックダウンマウスを作成した。このシステムでは、比較的早くマウスを作成できること、ドキシサイクリン(DOX)投与により、遺伝子を後天的に欠失させることが可能である。2つの異なるシークエンスにより、RNAをノックダウンし、2系統のノックダウンマウスを作成したところ、異なる表現系を呈した。以上のことから、ノックダウンマウスに見られた表現系はオフターゲット効果である可能性が否定できなかった。そこで、ノックアウトマウスを作成することとし、来年度は作成したマウスの表現系を検討する。本研究の根幹は、ノックアクトマウスを作成し、生体内での遺伝子Xの生理的・病態的意義を明らかにすることである。そのノックアウトマウスの作成が最も時間を要すると予想していたが、今年度中に作成に成功した。
転写因子ＮＦ－κＢをターゲットとした創薬

本研究では核内転写因子NF-kapapBと特異的に相互作用する核内調節因子を探索し、その相互作用を模した小分子化合物を得ることで、動脈硬化予防へとつながるリード化合物の探索を行うことを最終目的としている。そこでNF-kappaB p65の転写活性化領域をmimicするペプチドプローブの化学合成を試みたが、このペプチドの合成収率が低く改善が見られないため、リコンビナントペプチドをペプチドプローブとして核内調節因子の探索を行った。その結果、ヒト培養細胞核抽出液からNF-kappaB p65のTA2領域と特異的に相互作用する新規タンパク質が同定された。現在、この相互作用のメカニズム解明を行っている。これまでに、転写因子のφXXφφα-ヘリカル転写活性化モチーフを含むペプチドとして、(比較対象郡を含め)ESX、HSF-1、NF-κBp65 TA1, TA2の両領域、ALL1、の化学合成ペプチドの作成と、リンカーとして用いるポリプロリンロッドの合成を終了したが、これらをジスルフィド架橋により結合させる際の条件検討を行った。残念ながら、収量が低かったため、今後も継続して条件検討を行うとともに、これらを「釣竿」としたターゲット分子の探索を行う。また、これら転写活性化領域を含むペプチドをリコンビナントペプチドとして作成するための大腸菌発現プラスミドの作成を行った。いずれのペプチドもリコンビナントタンパク質として精製が可能であったことより、これらをアフィニティビーズに結合し、現在これらと結合する核内調節因子の探索を行っている。本申請研究では、NF-κB転写活性化部位と結合する新規細胞核内因子の探索を行い、その相互作用の詳細な解析を行うことを目的としている。これまでに探索のためのプローブとなるペプチドの化学合成およびリコンビナントペプチドの設計および合成を次に示す2種の方法により行った。1.ペプチドプローブおよびポリプロリンロッドの設計・化学合成NF-κBp65のRNAポリメラーゼ複合体との相互作用部位には、相互作用時にα-へリックス構造を形成するφXXφφモチーフ(φは疎水性、Xは任意のアミノ酸)が2箇所(TA1,TA2)存在している。そこで、細胞核内因子探索のためのプローブとなるNF-κBp65転写活性化領域の上記2種類のペプチドおよびそれらの一部をAlaに置換することで二次構造を形成できないペプチドと、プローブを固相ビーズと結合する際の「スペーサー」となるポリプロリンロッドの5種類のペプチドの設計および化学合成を試みた。ポリプロリンロッドN末端にはビーズとの結合部位としてLys残基を、また、C末端にリガンドとの結合部位としてシステイン残基を導入したペプチドとした。プローブのN末端にシステイン残基を導入し、酸化条件下でポリプロリンロッドと結合することでアフィニティービーズとなるよう設計し、これら各ペプチドのFmoc-固相合成法の最適化を行った。現在、これら各ペプチドの大量合成・精製中である。2.大腸菌発現系によるリコンビナントペプチドプローブの作成化学合成ペプチドプローブと同様の配列を持つ大腸菌リコンビナント発現系の設計を行い、これらペプチドを持つビーズの作成を試みた。NF-κBp65TA1(Ala置換体)を除く残り4種類の発現系を作成し、リコンビナントペプチドの調製を行っている。本研究では、転写因子のφXXφφ、αーらせん転写活性化モチーフと結合する核内転写調節因子を、化学合成ペプチドおよびリコンビナントペプチドを用いることにより探索することを目的としている。昨年度に引き続き、化学合成を行った各転写因子αーらせん転写活性化モチーフとリンカーであるpoly-Prolineロッドとのジスルフィド架橋形成によるヘテロダイマー「釣竿」の大量合成に取り組んだが、核内調節因子探索に必要な収量が得られなかった。リコンビナントペプチドとしてGST融合αーらせん転写活性化モチーフを作製し、これらを釣竿としてJurkat細胞核抽出液と混合し、結合するタンパク質を探索したところ、SDS-PAGEでNF-κBp65TA2領域と特異的に結合する約27KDaのタンパク質が検出された。このバンドを切りだし、MALDI-TOF-MS/MSにより同定を試みたところ、このタンパク質はZNAF2503AS(Zinc-Finger Like Protein)であることが明らかとなった。生物有機化学化学合成ペプチド同士のジスルフィド架橋における条件検討が、当初の想定以上に困難であったため、全体としての進展が遅れている。NF-κBp65とのヘテロダイマー自体は最終生成物として得られているものの、これを用いたリガンド分子の探索は検出限界以下であった。リコンビナント発現系については、比較対象となるいくつかのペプチドの発現郡の作成への着手が遅れたのが単純なる原因である。

本研究の当初計画では、平成24年度中にプローブおよびポリプロリンロッドの化学合成を終了し、アフィニティービーズの作成を完了する予定であったが、ポリプロリンロッドの合成収率が低く、ビーズの作成に至っていない。ポリプロリンはPro残基が9つ連続して結合した配列を持っており、これらのアミノ酸縮合の効率が低く、合成が困難である。そこで、Fmoc-Pro-Pro-Pro-OHをbuilding blockとして合成を試みることとしたが、Fmoc-Pro-Pro-Pro-OHの液相合成に時間がかかったため、結果としてアフィニティービーズの合成に至らなかった。現在、このbuilding blockの合成を行うとともに、ポリプロリンロッドの合成を進めている。今後は、すでに得られたペプチドプローブを元とし、現在継続している細胞核抽出液からの、ターゲット分子の分離を行うとともに、リコンビナントペプチドを用いたペプチドを釣りえさ・釣竿としたターゲット分子探索をメインの方法、化学合成ペプチドを副の方法としてターゲット探索を継続する予定である。化学合成によるプローブの作成が遅れているため、計画調書の「本研究がうまく進まない時の工夫」に記載した大腸菌リコンビナントペプチドプローブの作成を開始している。当初の計画と比較し進行が遅れてはいるが、研究計画調書に記載した通りTA1およびTA2を探索プローブとした化学合成ペプチドおよび大腸菌リコンビナントペプチドの合成を行い、NF-κBp65と相互作用する分子の探索を行う予定である。また、相互作用分子探索において、NF-κBp65のTA領域との特異性のある分子を明確にするため、NF-κBp65のTA領域同様α-へリックス構造を介してRNAポリメラーゼ複合体と相互作用することが知られているESXやALL1、HSF-1などの転写因子の活性化領域も同様に化学合成および大腸菌によるリコンビナントペプチドの合成を行う予定である。これらプローブとの相互作用分子を比較することにより、よりNF-κBp65と特異的に結合する分子の探索が可能となる予定である。なお、これらのペプチドのアミノ酸縮合および脱保護・精製条件はすでに検討済みであり、今後これらの大量合成を行う予定である。また、大腸菌リコンビナントによるペプチド発現系についても、すでに半分は作成済みであり、残りの発現系の作成を行う予定である。昨年度予算としての使用額としては、大きく残額を残してはいないが、次年度使用分については当初より計画分として算出している。探索プローブとしてのペプチドの化学合成にかかる費用など、消耗品費および調査費用や情報収集費用としての学会旅費等を予定している1.化学合成ペプチドプローブの作成(平成24年度の続き):Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH building blockの液相合成を継続し、ポリプロリンロッドの大量合成を行い、NF-κBp65TA1,TA2と結合した探索プローブ持つアフィニティービーズの作成を継続する。また、ESX、ALL1、HSF-1転写活性化領域のα-へリックス形成ペプチドも合成し、これらペプチドを結合した探索プローブを合成する。
マウス精原幹細胞におけるクロマチン結合タンパク質のプロテオーム解析

本研究は、精子形成を維持する精原幹細胞の自己複製機構と分化の過程を分子レベルで明らかにするために、分化型精原細胞と比較してマウス精原幹細胞特異的に発現する核タンパク質の網羅的な解析を行った。同定したタンパク質は、精子形成との関連性、精原幹細胞の自己複製や分化に関する知見は皆無であったことから、さらなる機能解析により精原幹細胞の自己複製と分化を司る新たな調節機構が明らかにされる可能性がある。近年の幹細胞研究において、クロマチン分画に焦点を絞ったプロテオーム解析は、自己複製調節機構や分化の過程に有益な情報源となっている。本研究では、分化型精原細胞と比較して精原幹細胞特異的に発現する核タンパク質を網羅的に解析することを目的に、本年度は分化型精原幹細胞への分化誘導の検討、並びに精原幹細胞の核分画の濃縮法の検討を行った。(1)精原幹細胞はレチノイン酸によって分化誘導が起きることが報告されている。当研究室で確立した培養系においてレチノイン酸を加えたところ、同条件下で未分化状態の指標となるPOU5F1とZBTB16の発現が抑制されることをウェスタンブロット法によって検出した。従って、分化型精原細胞を得る分化誘導条件が決定した。(2)精原幹細胞の核分画の濃縮法を検討したところ、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (PIERCE社)を使用して得られた核分画には、転写制御因子であるPOU5F1やZBTB16が濃縮されていたため、核分画を効率よく濃縮できることがわかった。次に、この濃縮法を用いて精原幹細胞と分化型精原細胞から得られた核分画をTSK gel G3000SWを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに分画し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、銀染色法によって可視化した。その結果、精原幹細胞に特徴的な核タンパク質のバンドを検出した。現在、このタンパク質の同定を試みている。近年の幹細胞研究において、核分画に焦点を絞ったプロテオーム解析は、自己複製調節機構や分化の過程に有益な情報源となっている。本研究は、精子形成を維持する精原幹細胞の自己複製機構と分化の過程を細胞・分子レベルで明らかにするために、分化型精原細胞と比較してマウス精原幹細胞特異的に発現する核タンパク質を網羅的に解析することを目的としている。昨年度までに、大量培養した精原幹細胞からレチノイン酸刺激によって分化型精原細胞を得る条件を決定した。また、それぞれの細胞集団から核分画を得る濃縮法を検討した。本年度は、得られた核分画をLC-MS/MS法にて解析し、精原幹細胞と分化型精原幹細胞の核分画のタンパク質の同定を試みた。解析の結果、精原幹細胞特異的に発現する25タンパク質と、分化型精原細胞に特異的に発現する6タンパク質を同定することができた。これらのタンパク質の半数は核に局在することが報告されており、核分画が効率よく濃縮されていることが示された。同定した全てのタンパク質は、これまでに精原幹細胞の自己複製や分化に関与することが報告されていない因子であり、その多くはエピジェネティクスを含めた転写調節に関わる因子であった。現在、ウェスタンブロット法により同定したタンパク質の精原幹細胞における発現とその局在について解析を行っている。今後、いくつかの因子については未分化維持や分化誘導能を有するか否かを検討する予定である。精子形成を維持している精原幹細胞は遺伝情報を次世代に継ぐことができるという他の組織幹細胞にはない特徴を持つことから、再生医療のみならず不妊治療や様々な産業動物の遺伝子組換え個体の作成などの多くの分野で応用が期待されている。本研究は、精原幹細胞の自己複製機構と分化の過程を細胞・分子レベルで明らかにするために、分化型精原細胞と比較してマウス精原幹細胞特異的に発現する核タンパク質を網羅的に解析することを目的としている。前年度までに、核プロテオーム解析によって精原幹細胞特異的に発現する25タンパク質と、分化型精原細胞に特異的に発現する6タンパク質を同定した。これらのタンパク質には精子形成への関与を示唆する報告はなく、さらに精原幹細胞の自己複製や分化に関する知見は皆無であった。当該年度はプロテオーム解析により同定したタンパク質について、マウス精原幹細胞の自己複製や分化の過程における機能の解明を試みた。(1)マウス精原幹細胞における発現解析ウェスタンブロット法によって発現解析を試みたが、特異性が高い抗体が得られず検出することができなかった。そこで、定量的RT-PCR法によって同定タンパク質をコードするmRNAの発現量を解析したところ、7種の遺伝子がプロテオーム解析の結果と一致する発現パターンを示した。(2)マウス精原幹細胞への遺伝子導入精原幹細胞で働くことが確認できているEF1aプロモーターを用いて、前述した7種の遺伝子のうちマウス精原幹細胞において特異的に発現することを確認できた2種の遺伝子の発現ベクターをそれぞれ構築した。

現在、この2種の遺伝子を過剰発現する精原幹細胞株を作製している。選択した細胞株が得られた場合には、未分化状態の維持及び分化能について解析することを計画している。
ナノバブルと超音波を用いた新しい表在性膀胱がん遺伝子治療法の開発

本研究では、表在性膀胱がんを標的として、ナノバブルと超音波を用いた新しい遺伝子治療法の開発を目的にしている。これまでの研究で、膀胱内に注入したナノバブルの挙動と衝撃圧の制御を目的に、二重超音波照射法を開発し、マウス膀胱移行上皮に局所的な蛍光分子導入を実現した。また、レポーター遺伝子を導入し、遺伝子が発現することを実証した。一方で、ナノバブルと超音波を用いた腫瘍壊死アルファ(TNF-α)遺伝子のルシフェラーゼ発現性マウス固形腫瘍への局所的分子導入をおこない、腫瘍体積の縮小とルシフェラーゼ発現量の減少を確認した。本年度は、ナノバブルと超音波を用いたTNF-α遺伝子導入による抗腫瘍効果を評価するために、高周波超音波画像診断装置(周波数:25MHz)とソナゾイド(超音波造影剤)を用いて腫瘍内の血管を抽出し、血管密度を定量化した。本分子導入法でTNF-α遺伝子を導入した場合、コントロール(生食投与)群と比較して、腫瘍内血管密度は有意な減少が認められた。real-time PCRによる腫瘍内遺伝子発現の定量化では、コントロール群と比較して、TNF-α遺伝子導入群では、TNF-α遺伝子、caspase3遺伝子およびp53遺伝子の有意な増加が確認された。本手法により腫瘍内にTNF-α遺伝子が導入されることで、p53依存性のアポトーシスが誘導され、血管障害の誘導および腫瘍サイズの減少が認められたと考察される。これまでの研究で、膀胱内のナノバブルの挙動と衝撃圧の制御を目的に強弱超音波照射法を開発し、マウス膀胱移行上皮に局所に効率的に蛍光分子を導入することができた。また、この手法を用いて膀胱移行上皮にレポーター遺伝子を導入し、遺伝子が発現されることを実証した。一方で、ナノバブルと超音波を用いた腫瘍壊死(TNF-alpha)遺伝子の局所導入の有効性を確認するために、マウス固形腫瘍内(ルシフェラーゼ発現EMT6細胞、SCIDマウス)にTNF-alpha遺伝子とナノバブルを投与し、周波数:1MHz,Duty比:20%,照射時間:60sec,200pulse,Intensity:3W/cm^2の条件下で超音波照射した。生体発光法で腫瘍のルシフェラーゼ発光を測定し、発光強度の縮退から抗腫瘍効果を定量化した。TNF-alpha遺伝子の単独投与と比較し、本手法で腫瘍は3分の1に縮退し、抗腫瘍効果が明確に示された。
地域密着型アートプロジェクトを対象とした鑑賞授業実施の可能性に関する調査研究

地方で開催されるアートプロジェクトは、美術館がない地域において実作品を鑑賞する機会を創出している点と授業では取り扱いが少ない同時代の美術表現に触れる機会であることに価値がある。特に、当該地域を題材とした作品をそこで生活する児童生徒が鑑賞することは、美術で学ぶことを実現することになることから、地域で開催されるアートプロジェクトは学校教育において有意義な地域資源である。授業実施においては、アートプロジェクトの運営体制に教育への貢献の意識が乏しいことが課題として指摘できる。地域の美術館との連携を図ることが学習指導要領に記載されて以降、学校と美術館・博物館の連携は徐々に進み、授業開発も行われるようになってきているが、美術館における専門家の配置不足、図工・美術科の授業時数の減少等の諸問題と相俟って普及するには至っていない。また、授業で利用可能な距離圏内に美術館がないなど、双方の努力では解決し難い要因もある。本研究は、美術館に替わり、全国各地で開催されているアートプロジェクトで展示される作品を題材にした鑑賞授業実施の可能性について調査、研究を行うものであり、具体的には、群馬県吾妻郡中之条町で2年に一度開催される「中之条ビエンナーレ」で展示される作品を当該地域の中学校美術科での鑑賞授業の題材化を試みるものである。平成24年度は、平成23年度に中之条ビエンナーレに参加したことで収集できた情報の整理を行うとともに他地域のアートプロジェクト及び美術館における教育普及事業の調査を行った。特に重視したのは、平成25年度のビエンナーレ開催準備日程の把握であったが、平成24年度に中之条町長の交代に端を発し、中之条ビエンナーレ実行委員会が改組、事業内容の見直しが検討された結果、開催日程に4か月の遅れが生じた。そして、次のことが明らかとなった。1.地域の美術鑑賞題材としての可能性がある地域アートプロジェクトだが、運営主体の動向と事業の継続性が連動しているため、その題材化には流動的な要素が多分に含まれる。2.アートプロジェクト全般において学校教育との連携は不足している。3.平成25年度開催の第4回中之条ビエンナーレ参加作家から協力を得ることができた。美術館等と連携を図ることが学習指導要領に示されて以降、連携が進み、授業開発も行われるようになってきたが、地理的要因によって連携できない地域では成果を享受できない。本研究は、地域で開催されるアートプロジェクトを地域特性、展示作品を地域資源と捉え、これを題材にした鑑賞授業実施の可能性について調査・研究を行うものである。23年度から、群馬県吾妻郡中之条町で2年に一度開催される中之条ビエンナーレを中心に調査を行い、同展への参加・出品を通して具体的な実施計画を把握し、24年度は、収集した情報を分析して25年度の実施計画を作成した。しかし、当該地域の首長交代に伴う運営体制の見直しが行われ、同展の実施計画は大幅に変更、短縮されたため、25年度の研究実施計画を変更せざるをえなくなった。年度当初に展覧会の実施計画が確定しなかったため、学校連携の授業実施は断念したが、二度目の出品および群馬大学教育学部美術教育講座主催の鑑賞ツアーにおいて自作品を対象とした鑑賞活動、他地域で実施されたアートプロジェクトの教育普及活動との比較から次の成果を得ることができた。1.地域に題材がある作品を当該地域の生徒が鑑賞することを通して、生徒が生活する地域≒社会を考察(学習)することは可能である。これは、社会で営まれている美術活動の鑑賞によって育まれる今日的な価値と合致しており、美術科で実践する意義がある。2.地域アートプロジェクトを対象とした鑑賞授業の実践においては、運営主体と学校が生徒の学習にとって意義があることを認め、事業および授業として連携することを確認すること。3.教育普及活動が充実しているアートプロジェクトでは、教育普及専門の担当者が一年以上の時間をかけて周知活動およびボランティア育成をおこなっていることから、運営には当初から学校との連携担当者を置き、授業担当者と検討を重ねることが必要である。「地域の美術館との連携を図る」ことが学習指導要領に記載されて以降、学校と美術館・博物館の連携は徐々に進み、授業開発も行われるようになってきているが、美術館における専門家の配置不足、図工・美術科の授業時数の減少等の諸問題と相俟って普及するには至っていない。平成23年度は、最終年度に実施を予定している授業実践のための基礎情報の収集を自身が出品参加することをとおして行った。その成果として、次のことを把握することができた。

1、作家と中之条ビエンナーレ実行委員会とのやり取り、設置場所の選定、制作、搬入期間、開催期間中の教育普及活動などである。記録によれば、過去には参加作家と学校との個人的な連携例があったものの、実行委員会と教育機関との連携が積極的に図られているわけではない。先の教育普及活動も就学児童向けのものではなく一般向けのものであったが、当該地域の学校には、連携に対する潜在的需要が認められた。2、地域性を重視する当該アートプロジェクトでは、開催地域の特性に着目した作品も多く制作されており、これらを題材化することで在住地域を考える鑑賞授業の開発が可能であることが確認できた。3、今後、出品作品から授業で題材化し得る作品の選定作業が必要になるが、実行委員会から情報を得るための交渉や学校側で行うべき事前学習など解決すべき点が明らかとなった。重視した中之条ビエンナーレ開催準備日程の把握であったが、中之条町長の交代に端を発し、ビエンナーレ開催の是非が検討され、事業内容及び実行委員会の組織改組が行われたうえで開催が決定したのは9月であった。このような経緯があり、平成25年度募集要項の公開が10月となり、前回の日程から4か月の遅れが生じた。これらは単純な遅延ではなく、新たな事業計画の立案から始まるものであり、前年度の日程を踏襲することができなくなった。加えて、実行委員会の改組によって、これまで中心的な役割を担ってきたスタッフの入れ替えや出品作品情報の提供が困難になったことで、独自に出品作家との交渉にあたるなど当初計画からの変更が必要となったことが原因である。他の地域で開催されているアートプロジェクトにおける教育普及状況の調査に不足があるが、題材化を検討している「中之条ビエンナーレ」に関する調査はおおむね行えた。実践を想定している地域における調査の進捗状況から判断して、「おおむね順調に進展している」の評価を行った。ビエンナーレ実行委員会及び当該地域の学校、協力作家との連携を進めることで、遅れが生じている授業及び題材案を作成する。適宜、附属学校教員に協力を要請し、実現可能な授業開発に向けた計画案を当該地域の教員に提示するなどの推進を行う。不足している授業実践予定地域外で開催されるアートプロジェクトにおける教育普及活動の状況調査を進める。同時に、適宜、附属学校教員に協力を要請し実現可能な授業開発に向けた計画案を当該地域の教員に提示し、改善を行う。中之条ビエンナーレの開催準備が遅れていることにともない、実行委員会との打ち合わせが滞っている。繰り越された金額は中之条町への出張約10回分の旅費である(@¥2400)。平成25年度に滞っている打ち合わせのための旅費に使用する予定である。その他請求額の利用計画は、全国で開催されるアートプロジェクトにおける教育普及活動の調査旅費及び資料収集、ビエンナーレに参加することで生じる制作資材費用、授業試案のための教材開発費、記録機材、消耗品、専門知識提供者への謝金等に加え、報告書の作成費用などに使用する予定である。アートプロジェクトが重複したことで調査に赴くことができず、予定していた旅費を使用することができなかった。調査に赴けなかった地域への調査旅費に翌年度使用する。
新しい極微小領域ｐＨセンサの開発

本研究では,卵細胞への穿刺を目的とし,作用電極と比較電極を同心円状に配置した筒型マイクロpHセンサの創製を行い,標準液に対しての電圧測定実験を行った.具体的には,直径125 umの銅線の先端に対して電解研磨法を用いてのテーパ面の付加を行い,その後Sb2O3薄膜の成膜,さらに先端部分マスキング後にSiO2薄膜,Ag/AgIO3薄膜の成膜を行い,最後にマスキングを除去することで針型マイクロpHセンサの創製を行い,センサの先端直径が34.5 umの同心円状のpHセンサを世界に先駆けて完成させた.その結果,魚卵細胞への穿刺が可能な針型マイクロpHセンサが創製されたことを確認した.既存のpHセンサは0.05 mm程度のガラス薄膜,ガラス電極,比較電極の二つの内部電極などが必要であるために大型であり,ビーカ内の試料全体のマクロなpHを測定している.そのため,約10-30 μmの大きさである細胞などのミクロのpHを測定するためにはμmサイズまで小型化したpHセンサが必要である.本研究では,蚊の口並みの極細管開発で培った極細管創製技術を用いて,外径50μm以下の見かけ上1電極である「新しい微小領域pHセンサの開発」を目的とする.今年度は外径50μm以下の「新しい極微小領域pHセンサ」の開発を目的とし,RFマグネトロンスパッタリング法を用いて,極細銅基材上にターゲット材である固体Ag/AgIO3電極およびSb/Sb2O3を成膜した.特に直径50 μmの銅線上にSb2O3薄膜,SiO2薄膜,Ag/AgIO3薄膜を成膜することでマイクロpHセンサの創製を行い,見かけ上1電極となるpHセンサを作製した.また,創製したpHセンサを用いて校正実験を行うことでpHと電圧の関係性の確認を行った.その結果,4種類の標準pH溶液を用いた校正実験の結果より高い相関性を確認し,その場合の決定係数は0.98を示した.それ故,創製した新たなpHセンサを用いて安定したpH測定が可能であることを確認した.今後は,マイクロpHセンサの表面積が測定結果に与える影響の確認し,マイクロpHセンサの先端形状の加工手法の確立が課題となる.本研究では,卵細胞への穿刺を目的とし,作用電極と比較電極を同心円状に配置した筒型マイクロpHセンサの創製を行い,標準液に対しての電圧測定実験を行った.具体的には,直径125 umの銅線の先端に対して電解研磨法を用いてのテーパ面の付加を行い,その後Sb2O3薄膜の成膜,さらに先端部分マスキング後にSiO2薄膜,Ag/AgIO3薄膜の成膜を行い,最後にマスキングを除去することで針型マイクロpHセンサの創製を行い,センサの先端直径が34.5 umの同心円状のpHセンサを世界に先駆けて完成させた.その結果,魚卵細胞への穿刺が可能な針型マイクロpHセンサが創製されたことを確認した.様々な工業界にて使用されているpHセンサは,巨視的環境でのいわばビーカー等のマクロな平均値としてのpH観察のみ測定可能であった.しかし科学の進歩により,化学反応等の微視的なin-situのpH変化観察が急務となった現在でも,既存のpHセンサは,Ag/AgCl電極がKCl溶液中に浸漬されたガラス管構造を有するガラス電極が主流であることから,その要求に応えるすべが存在しないことが新たな課題として浮き彫りとなった.そこで本研究では,蚊の口並みの極細管開発で培った極細管創製技術を用いて,外径50μm以下の見かけ上1電極である「新しい微小領域pHセンサの開発」を目的とする.今年度は外径50μm以下の「新しい極微小領域pHセンサ」の開発を目的とし,(1)固体Ag/AgIO3電極およびSb/Sb2O3を,見かけ上1電極として,その有効性の確認を行う.(2)蚊の口並みの極細管の開発で培った極細管創製技術を用いて,AgとSiO2の薄膜の剥離を防止するために生体適合性,熱膨張率,電気抵抗率を考慮したバッファ層の選定とその成膜条件の探索を行った.その結果,Sb/Sb2O3を,見かけ上1電極とした場合,出力電圧とpH標準液との間に高い相関性を確認した.またRFマグネトロンスパッタリング法で成膜した結果,Tiがバッファ層材料として有効であることをFIB-SEM観察により確認した.同センサは,細胞内での化学反応等の微視的なin-situの極微小領域pH変化の連続モニタリング測定を可能にする.既存のpHセンサは0.05 mm程度のガラス薄膜,ガラス電極,比較電極の二つの内部電極などが必要であるために大型であり,ビーカ内の試料全体のマクロなpHを測定している.そのため,約10-30 μmの大きさである細胞などのミクロのpHを測定するためにはμmサイズまで小型化したpHセンサが必要である.本研究では,蚊の口並みの極細管開発で培った極細管創製技術を用いて,外径50μm以下の見かけ上1電極である「新しい微小領域pHセンサの開発」を目的とする.今年度は外径50μm以下の「新しい極微小領域pHセンサ」の開発を目的とし,RFマグネトロンスパッタリング法を用いた極細管創製手法を用い,回転している極細銅基材上にターゲット材である電極材料を成膜することで遂行する.