hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素を区別する人工補酵素の開発と次世代型基質－補酵素複合体医薬品開発への応用

生体内のビタミンである補酵素NADは様々な働きをもっています。そのため色々な酵素に結合し、NADを改良した薬を開発する際には、目的の酵素以外の酵素にも結合するため、副作用となります。この研究では、NADが酵素の中に入った時の形の変化と酵素の種類の関係を新しく見出し、それをもとに、目的の酵素と他の酵素を区別できるかどうか確かめる実験をしました。NADの形を固定することで、酵素を区別できることを明らかにしました。将来的には、これが可能になると、薬を開発する段階で、副作用を軽減できるようにする工夫が施せるようになり、最終段階で毒性のために医薬品となれない薬を減らすことができると考えられます。平成24年度は、23年度に作成した阻害剤を一般的なアルコール脱水素酵素以外に、創薬ターゲットと考えられるアルドースリダクターゼやグルタチオンリダクターゼに対し、検討を行った。その結果、アルドースリダクターゼはNADP依存酵素であるため、我々のNAD型の阻害剤はほとんど効果がなかった。しかしながら、グルタチオンリダクターゼには強い阻害作用を示した。この作用機序はユニークでFADとNADP結合部位の2か所に我々の阻害剤が作用するということが確認できた。また、FADは一般に、強力に酵素に結合することが知られており、酵素から外れないとさえ思われている。しかしながら、私たちの阻害剤は、FADのKmには及ばないが約0.027mMという補酵素修飾阻害剤にしては強力な結合を示した。グルタチオンは血管新生阻害や寄生生物に対する創薬ターゲットであることが知られており、我々の化合物はこの濃度では、細胞毒性が全く示さないことが現在明らかになりつつあることから有効なグルタチオンリダクターゼ阻害剤であると考えられる。このように、私たちが提唱するNADの立体配座を基盤とする酵素分類を基盤として、有効な化合物と創薬ターゲットを見いだせたことは、有意義である。また、アルドースリダクターゼに対する補酵素ー基質複合型阻害剤の合成に着手している。化合物の水溶性が高く、クリックケミストリーを利用した方法では、原料との分離が困難であったため、反応の検討を行い、水溶性化合物に対する改良法を開発した私たちの方法は無機塩を活性化に利用する方法で、アミンを利用する方法よりも化合物の分離が容易である点が優れている。この方法を利用することで、アルドースリダクターゼに対する補酵素ー基質複合型阻害剤の効率的な合成が可能になった。今後、これらの阻害作用の検討を進めていく。プロテインデータバンク(PDB)から約3600個NAD依存酵素の配座の調査を行い、NADの二リン酸部位の立体配座が酵素のファミリーと関連があることを突き止めた。アルコール脱水素酵素のような一般的な酸化還元酵素では、指標に用いた二リン酸のOPPO二面角がー60度という角を持つが、同じファミリーに属するが触媒反応の異なる二重結合還元酵素では、-20度の角度を持っていた。FAD依存酸化還元酵素や、ADPリボシル化酵素では、NADの配座は約180度の角を持ち、NADキナーゼやNAD環化酵素では+60度の角を持つことが確認できた。このように、補酵素の立体配座から酵素のファミリー分類を行う研究はこれまでのところ報告例はなく画期的な結果であると考えられる。次に、この分類によって、酵素を区別する化合物の合成を行った。光学活性なシクロヘキサンカルボン酸等を用いて、二リン酸部分の二面角を固定した化合物(TAD-(-60),TAD-180,TAD(+60))の合成を行った。一般的な酸化還元酵素(乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素)では、二面角に近い角度をもつTAD-(-60)が最も高い親和性を持つことが分かった。グルタチオン還元酵素は、直線的な配座を持つ酵素であり、TAD-180に対して、高い親和性があった。NADキナーゼに対してはTAD-(+60)が最も高い親和性が観測された。本研究にで明らかにした酵素分類は、化合物の設計段階で、酵素選択性を化合物に持たせることが可能になり、創薬に有用であることを示すことができた。この応用として、アルドース還元酵素に対する阻害剤の開発を試みたが、NADP依存酵素には2'位にリン酸が必須であるため、高い選択性を持つ化合物の合成には成功しなかった。また、人口補酵素の合成も行ったが、化合物は合成できたが、精製に問題が残る結果となった。23年度は、本研究全体の基盤となる補酵素NAD修飾阻害剤の合成を行った。

具体的にはNADのピリジン環をチアゾールに置き換えた阻害剤TADに対し二リン酸の代わりにシクロヘキサンジカルボン酸(二面角60度)二種類とフマル酸(180度)、コハク酸(自由回転可能)のような炭素官能基に変換した阻害剤を合成した。合成した阻害剤に対する5種のアルコール脱水素酵素に対する阻害作用(Ki)を測定し、二リン酸部位を化学修飾のNAD依存酵素に対する選択性を評価した。その結果、酵素の立体構造から予想されたように(R,R)-シクロヘキサンジカルボン酸で固定した化合物が最も強い阻害作用を示した。また、その強さも、NADに対するKm値の1/4程度で、二リン酸とは全く極性や電荷の異なる化合物でもかなり強力に結合することが示された。この結果より、NADの二リン酸部位の役割として、アデノシンとニコチンアミドヌクレオシドの配座を固定する役割があることが強く示唆され、酵素選択性をもつ化合物の構築の可能性が高いものになった。同時に、NAD依存酵素の結晶構造中におけるNADの立体配座の調査を行い、補酵素の立体配座による酵素分類を行った。NAD依存酵素のうち、多くの酸化還元酵素が折れ曲がり構造をとっているが、アルドースリダクターゼは直線的な立体配座をもっていることがわかり、糖尿病治療薬の創薬ターゲットであるアルドースリダクターゼが、我々の研究における創薬研究のターゲットになりうることが分かった。引き続き、人口補酵素の合成を行っているが、化合物自体が不安定なため、現在のところ、その合成には至っていない。引き続き、合成ルートを変更して合成を目指している。我々が提唱した新しい概念が創薬に使えるということが示された点は、本研究の核心的な部分が達成されたことになり、今後はその応用ということになる。また、新しい創薬ターゲットが見つかったので結果としては満足が行くものである。人口補酵素に関しては安定性に問題があるが合成ができるということが確認できた。しかしながら、化合物の活性を示すための有効な酵素の選定ができていない。こちらに関しては、進展がやや遅れている。したがって、当初の予定どおりではないが、新しい展開が生まれて発展していると考えれば至って順調である。予定していた研究のうち、阻害剤の合成に関しては、予定以上に進み、24年度に予定していた酵素に対する阻害作用まで調べることまでできた。しかしながら、人口補酵素に対しては、合成に問題があり、予定通りには進まなかった。予め想定できた問題であり、計画通り進まなかった場合の通りの対応になっており、当初の計画、目的に対してなんら支障はない。25年度は、酵素分類における第3のカテゴリーに属する酵素NADキナーゼおよびNAD環化酵素に対して阻害活性の測定を行う。また、NADー基質複合型阻害剤の作成に取り組む。引き続き、人口補酵素の作成を行うと同時に、基質ー補酵素複合型阻害剤の合成を行う。ターゲットは、今回の詳細な研究で、より良いターゲットとして見つかったアルドースリダクターゼにする。また、アルドースリダクターゼに対する作成した阻害剤の阻害作用についても詳しく調べる。酵素の活性測定に必要な消耗品並びに、結果の公表に必要な論文作成経費などに使用する予定である。主として高価なアルドースリダクターゼの購入と、溶媒や試薬の購入に当てる。
胎児型横紋筋肉腫における新規原因遺伝子の同定と分子機構の解明

横紋筋肉腫は、病理組織学的に胞巣型と胎児型の二病型に大別される。胞巣型においては、2つの病型特異的転座、すなわちt(2;13)(q35;q14)とそのvariantであるt(1;13)(p36;q14)が知られている。これらの転座によりそれぞれ、PAX3-FOX01、PAX7-FOXO1融合遺伝子が形成される。一方、胎児型においては、これまで原因となる融合遺伝子は同定されていなかった。我々は、胎児型において認められた複雑型染色体転座t(2;8;12)をspectral karyotyping(SKY)法で解析し、PAX3遺伝子の局在する2q35バンドが転座切断点であることを明らかにした。そこで、PAX3遺伝子を挟む2つのbacterial artificial chromosome(BAC)クローンをプローブとしてFISH解析を行ったところシグナルの分離を認め、同遺伝子が再構成していることを確認した。次に、PAX3遺伝子のパートナー遺伝子を探索し、8p11切断点からTIF2遺伝子を同定した。さらに、FISH解析によって実際にPAX3-TIF2融合シグナルを検出した。上述したように、胞巣型では病型特異的な原因遺伝子として、PAX3-FOX01、PAX417-FOXO1融合遺伝子が同定されていたが、胎児型ではこれまで原因遺伝子は同定されていなかった。PAX3-TIF2融合遺伝子は、胎児型で初めて見出された原因遺伝子であり、本病型における分子機構を考える上で重要な知見を得た。本研究では残念ながら、PAX3-TIF2融合遺伝子の分子構造を決定するまでには至らなかったが、胎児型においても胞巣型と同じくPAX3の関与する融合遺伝子が見出されたことより、PAX3-TIF2が、PAX3-FOXO1と同じようにPAX3のDNA結合ドメインを保持し、その標的遺伝子を転写し続けるため、筋芽細胞が増殖を止めず、また最終分化も抑制されて横紋筋肉腫を発生させていると考えられた。横紋筋肉腫においてTIF2遺伝子の関与する転座が他に複数存在しないか、横紋筋肉腫細胞株(Rh2, RD, HKBm, RM2, Rh30)を対象にFISH解析で検討したが、同様な転座は認められなかった。胞巣型横紋筋肉腫における特異的転座t(2;13) (q35;q14)によって形成されるPAX3-FKHR融合遺伝子においては、PAX3の転座切断点はintron7の領域に高頻度に認められる。そこで、この領域に複数のprimerを設定し、PCRによる増幅とDigoxigenin標識を同時に行いプローブとした。FISH解析でPAX3-TIF2融合を検出した胎児型横紋筋肉腫症例を対象にして、上記のプローブを用いて、non-RI southern blot解析を行っているが、未だ再構成バンドは検出されていない。今後、さらに領域を広げてプローブを設定し、転座切断点を同定していく予定である。胎児型横紋筋肉腫細胞株RMS-YMはGバンド解析では複雑な染色体異常を呈している。PAX

3転座の有無を調べるためにFISH解析を行ったが、同転座は認められなかった。また、この細胞株は癌遺伝子の高度増幅を示唆する染色体異常所見であるhomogeneously staining region (HSR)が認められていた。このHSRの由来を明らかにするため、spectral karyotyping (SKY)法で解析したところ、12番染色体由来であることが明らかになった。そこで、同染色体(12q15)上に局在する癌遺伝子MDM2の増幅を予想し、この遺伝子を含むBACクローン(RP11-1137N1)をプローブとしてFISH解析を行った。その結果、HSR上で確かにシグナルの集簇を認め、MDM2増幅が確認された。1.胎児型横紋筋肉腫における新規PAX3-TIF2融合遺伝子の同定胎児型横紋筋肉腫ではこれまで原因となる融合遺伝子は同定されていなかった。我々は、同病型において初めてPAX3-TIF2融合遺伝子を同定した。胞巣型においては、PAX3の転座切断点はintron7の領域に高頻度に局在している。新規PAX3-TIF2融合においてもPAX3切断点はintron7の領域に局在していると予想して、昨年度はこの領域にプローブを設定してSouthern blot解析を行ったが、再構成バンドは検出されなかった。今年度はさらに領域を広げてプローブを設定し同様の解析を行ったが、未だ切断点は同定されていない。今後の見通しとしては、切断点の範囲を限局していない状況においては、予想に基づくだけでSouthern blot解析を行ってもなかなかPAX3切断点を同定することは困難であり、もう少し切断点を絞り込む必要があると考えられた。そこで、転座切断点を含むことが明らかなBACクローン(約180kb)よりコスミドクローン(平均長40kb)にサブクローン化し、それらをプローブとしてFISH解析を行い、切断点を絞り込むことを考えている。切断点を含むコスミドクローンがわかれば、切断点は40kb以内に絞り込めたことになる。2.TIF2遺伝子の関与する転座TIF2遺伝子の関与する転座が他に複数存在しないか、横紋筋肉腫細胞株(Rh2,RD,HKBm,RM2,Rh30)を対象にFISH解析で検討したが、同様な転座は認められなかった。3.MDM2遺伝子の増幅FISH解析によって、胎児型横紋筋肉腫細胞株RMS-YMではMDM2遺伝子が高度に増幅していることが明らかになった。今年度はさらに、MDM2の発現量についてもGAPDHを内在性コントロールとしたreal-timePCRによって解析したところ、RMS-YMは他の横紋筋肉腫細胞株(Rh2,Rh4,Rh28,Rh30,Rh41等)に比べて10倍以上に著明に増加していることが確認された。
神経回路網形成過程におけるシグナル伝達分子CRMP/CRAMの機能解析

反発因子セマフォリンは神経回路形成に重要な役割を果たす。私達はセマフォリンの情報伝達に関与する蛋白質CRMPに注目し、多くの関連シグナル分子の同定と機能解析を行った。その結果、神経回路形成に関連する分子群による新しい情報伝達システムが明らかになりつつある。CRMPは線虫のunc-33の哺乳類相同遺伝子である。unc-33の突然変異は線虫において運動神経の走行異常をおこし、異常行動を起こすが、この事実はunc-33遺伝子ファミリーは神経ガイダンスの重要な分子であることを意味する。CRMPはセマフォリンの細胞内シグナル伝達に関与する分子として想定されているが、その分子メカニズムは不明なところが多い。一方、私たちはCRMPと結合する新規蛋白質CRAM (CRMP Associated Molecule) (CRMP5)を発見している。CRAMはCRMP同様、神経発生過程に特異的に発現するunc-33ファミリーに属する蛋白質である。CRAMは4つのCRMPとは遺伝系統樹的に離れており、CRMPとは異なる機能が推測されていた。今回、我々はCRAMがセマフォリンシグナルを抑制する役割を見出した。さらに興味深いことにはCRAMが成長円錐の形成に必須の役割を果たすことが明らかとなった。我々のグループは神経回路網形成過程における反発因子セマフォリンのシグナルに関与するといわれているCRMPファミリー分子CRAMを同定し、またCRMPに結合するチロシンキナーゼFes/Fps(Mitsui et al 2002, EMBO J)並びに二つの新規GTPase結合分子の同定(Takahashi et al 2003, Genes Cells)に成功し、その機能解析を行ってきた。これらの蛋白質群は、セマフォリンのシグナル伝達のみならず、微小管形成の調節、ミトコンドリアの機能制御などに関わることが予想される結果を得ている。以上の結果は、神経回路網形成過程の仕組みを解明していく上で、新たな展開を呼ぶものであり、その重要性は高いと考えられる。また、これらの蛋白質群と神経変性疾患との関わりを示唆するデーターも得られており、今後の研究の発展が、神経変性疾患の病因解明や治療法の開発につながるもの考えられる。1.CRMP/CRAMに会合するFes/Fpsの同定2.CRMP/CRAMに会合する新規GTPase,ミトコンドリアSeptinの機能解析私たちはCRMP/CRAMに会合する新規GTPase,ミトコンドリアSeptinを同定し、その機能解析を行った(Takahashi et al 2003, Genes Cells)。神経発生過程において伸展中の軸索がセマフォリンなどの反発因子、ネトリンなどの誘因因子に導かれながら最終的に標的細胞とシナプスをつくることにより神経回路網が形成される。また、セマフォリンは受容体であるプレキシンと共に不要になった軸索の除去機構(Axon pruning)にも関与していることが報告されている。加えて、プレキシンと結合し、セマフォリンシグナルに必須の役割をする蛋白質として酸化還元酵素であるMICALが同定され、その役割が注目されている。一方、CRMPはセマフォリンなどの反発性の神経ガイダンス機構に関与する細胞内蛋白質として同定されたが、その機能は未だ不明な点が多い。私達はCRMPと結合する新規のGTPase、CRAG(CRMP-Associated GTPase)を同定した(論文投稿準備中)。CRAGは海馬神経初代培養細胞においてFilopodiaに強い集積が認めれ、RNAiによるCRAGノックダウンによりFilopodia形成が抑制された。また、CRAG欠損海馬初代培養細胞ではセマフォリンによる成長円錐崩壊活性が消失した。さらに、海馬および後根神経節細胞をセマフォリン刺激するとCRAGはCRAMとともに封入体を形成し、細胞外への放出されることが観察された。以上の結果より、1.CRAGはFilopodiaの形成に関与する2.セマフォリンシグナリングにおいて、MICALによる活性酸素種の産生に応答してCRAMと共に封入体を形成し細胞外に放出されることにより、セマフォリンによる軸索消失機構に関与している可能性が推察された。
顔面骨細胞の機械的外力に対する応答特性に関する研究

平成13年度は、骨系細胞の分化程度に着目し、伸展刺激と超音波刺激に対してどのステージで応答するかを調査した。また、どの遺伝子が発現するかを、タイムコースRT-PCRにて観察した。PTH存在下の条件で、PTHの情報伝達経路との関係も観察した。その結果、伸展刺激に対しては骨細胞が応答し、超音波刺激に対しては骨芽細胞の早いステージの細胞が応答した。骨細胞はPTH存在下で伸展刺激に対して、COX-2、OCやIGF-1について相乗効果を示した。骨細胞は超音波刺激に対し、COX-2、C-fosなどの軽度の上昇を見たが、OCやIGF-1に対しては上昇が見られなかった。PTH存在下で骨芽細胞は、超音波刺激に対してほとんど応答を示さなかった。こうした事実から、伸展刺激に対する骨細胞の応答と超音波刺激に対する骨芽細胞の応答の情報伝達には一部の重複が存在し(過去の文献より、PGHS2によるCOX-2の上昇によるOCの上昇と考えられる)、かつまったく異なる2つの伝達系が存在していることが判明した。そのうちのひとつがPTHと連動していることから、カルシュウム流入系からのPKAパスウエイであることが推察された。今後は、骨細胞と骨芽細胞の異なるレセプターについての解明が重要となる。平成14年度は前年の結果を蛋白レベルの発現で確認し、PCRの結果を裏付けることができた。また、超音波刺激では骨芽細胞にはカルシュウム流入の系は働いているかを確認するためにGd2+でブロックを行ったが、OCの上昇は止められなかった。さらに直接のCa2+の流入について、調査したところ超音波刺激ではCa2+の流入は確認されなかった。このことから超音波刺激の標的細胞は骨芽細胞で、骨芽細胞についてはCa2+流入の系を通らない情報伝達系が存在していることが推測された。その系として推測されるのが、Integrinレセプターを介するMAPK Cascade(PKC)である。この途中で、分化・増殖の分かれ目となるPI3Kを阻害すると、オステオカルシンm-RNAの発現は抑制される。増殖の系の途中を阻害してもオステオカルシンm-RNAの発現は抑制されないことから、超音波刺激による分化方向への系がオステオカルシンm-RNAを発現させていることが推測された。さらに、その下流のp-p38について、蛋白レベルでの上昇があるか検討した。その結果、超音波照射した骨芽細胞には上昇が見られ、先の推測を裏付ける結果となった。したがって、超音波照射は骨芽細胞の分化を促進することが示唆された。現在、vitroで得られた結果をもとに、COX2のメカニカルストレス負荷下における行動を中心に、実験を継続している。

1、ヒト顔面骨骨系細胞、大腿骨骨系細胞の単離と培養2、骨系細胞に対する機械的外力の負荷機械的外力はフレクサーセル社製の細胞伸張装置を用い(Endocrinology vol.137及びB.B.R.C. vol.264)、培養皿の底のコラーゲンコートしたシリコン膜の上にマトリゲルと細胞を移し、接着培養する独自の方法を採っている。伸張刺激の強度は、細胞の等倍延長をIE(ストレイン)として、0.4%の延長すなわち4000μEとした。これはサイクル数が一定で有ればこのくらいまでの延長では変化率に比例して骨の断面積が増加すること、ヒトなどの運動に伴う生理的な変形は20003000μEであること、骨折レベルの変形は25000μEと大きいことなどを考慮している。また、帝人杜製低出力超音波パルス装置(図2:神奈川歯科大学に設置されている)を用い(B.B.R.C. vol.268)、20分間超音波刺激を与え、刺激前、刺激開始後15分、6時間、24時間後の細胞の応答を観察した。3、骨系細胞に対して機械的外力が及ぼす影響の検討細胞が機械的外力の負荷された状態で示す増殖、基質合成や石灰化の変化は、既に報告した方法(J. Bone Miner. Res. vol.10)で調べた。特に今回は2で示した様々な条件変化を行い、オステオカルシンなどの基質タンパクやIGF-1(インスリン様増殖因子)(B.B.R.C. vol.246)等についてRT-PCR法を用いて、今回申請の泳動器にて電気泳動を行い、発現を比較し、上顎骨、下顎骨と大腿骨の差について検討した。4、結果パルス波である超音波刺激と持続的な力の伸展刺激では目標とする細胞が異なり、前者は未分化な細胞から骨芽細胞への分化に、後者は骨芽細胞と骨細胞のカルシュウムイオン流入に重要な役割を果たしていることが判明しつつあり、両者は経路の重複はあるものの、異なる伝達経路を持つことが予測された(投稿準備中)。また、大腿骨と顔面骨の機械的刺激に対する反応は、臨床的事例を説明できるほどではないものの、異なる反応を見せた。これは骨膜由来の顔面骨系細胞と骨髄由来の大腿骨系細胞を比較したために生じた結果とも考えられ、追試験の上、投稿を検討する。1、骨延長後の骨系細胞の応答とその分布についての検討細胞レベルで得られた結果を基に、骨延長への超音波刺激の効果について、動物実験にて組織学的に検討した。ウサギ下顎骨に装着したマーチン社製創外骨延長装置を用いて実際に骨延長を行い、待機時間を変化させた。その結果、待機時間が短い群において細胞は不整で軟骨細胞の発現が見られたが、超音波刺激を加えCOX-2を非炎症的に増加させると、待機時間を通常通りにした場合と同様の結果が得られた。In vitro、in vivo双方の結果より、COX-2の骨系細胞分化における重要性が示唆された。2、メカノレセプターの同定と、情報伝達機構の解明我々のin vitroの骨細胞での結果(Endocrinology vol.137)が示すように、主に骨芽細胞の増殖によると思われる体液性の伝搬を伴う骨形成と、直接的なミネラルの蓄積のみの増加によるものとが観察されている。第一のメッセンジャーと考えられているCaの流入を分析した結果、分化の程度が進んだ骨系細胞では、細胞内カルシュウム濃度は、伸展刺激後約2時間前後で増加した。
新しいTTF置換磁性金属中性錯体の合成と電気伝導・磁気的性質

局在dスピンと伝導性π電子とが共存・相互作用する金属錯体は、その電気伝導性質や磁気的性質に興味が持たれる。これまでに、2つのTTFジチオレート基が銅およびコバルト原子に結合した中性金属錯体を合成し、それらの電気伝導・磁気的性質を明らかにした。今回、対応する中性マンガン錯体を合成することに成功し、それらの電気伝導・磁気的性質について検討した。この中性マンガン錯体は、ビス(テトラエチルアンモニウム)ビス(2,3-ジエチルチオテトラチアフルバレニル-6,7-ジチオレート)亜鉛錯体と1当量のMnCl_2とをDMF中-40°Cで反応させた後、2当量のヨウ素で酸化することにより、良好な収率で得られた。この錯体の加圧成型試料の室温電気伝導度は、10^<-10>Scm^<-1>以下であった。1.8-300Kの温度範囲での常磁性磁化率(χp・T)の温度依存性は、300-100Kの温度範囲において、Curie-Weiss則に従った。フィッティングにより与えられたCurie定数は2.0emu・K・mol^<-1>、Weiss温度は-115Kであった。得られたCurie定数はMn(IV)(S=3/2)による値(1.8emu・K・mol^<-1>)に近い。一方、100K以下の温度領域では、χp・Tvs.Tプロットは100K以上で成立していたCurie-Weiss則に従わず、χp・T値は温度の低下に伴い30Kまで増大し、その後、減少した。±50kOeの外部磁場下での磁化曲線の温度依存を調べたところ、スピン整列の特異的なS字曲線が観察された。温度低下に伴い飽和磁化が増大し、2Kでの飽和磁化の値は約2,800emu・mol^<-1>に到達する。
外部電場の印加によるタンパク質の動的変化の解明

外部電場の印加に対する生体分子の応答機構を明らかにすることを目的として、電場印加に伴う赤外吸収スペクトル変化を測定するシステム製作などを行った。赤外吸収の電場効果では、溶液中の分子の電場効果を観測することができ、10-6オーダの微小電場変化を検出することができる。溶液中における脂肪酸の赤外吸収スペクトルの電場効果を測定し、C=O伸縮およびC-H伸縮振動バンドにおいて、シュタルク効果に起因する電場印加によるスペクトルのブロードニングを観測することができた。得られた変化をもとに、各振動の非調和性を議論することができる。初年度は,測定系の立ち上げおよび性能評価を行った.外部電場効果の時間分解を行うための測定装置として,ステップ・スキャン型FT-IR分光光度計を用いた.検出器に光起電力型MCT検出器を採用した.マイクロ秒以下の時間分解能で時間分解測定が可能であることを確認した.また,電極ユニットを測定装置に取り付け,分光器内の環境を一定に保ったままでの電場効果の測定を可能にした.空気中の水蒸気や二酸化炭素の妨害が誤差要因となりうるために,環境変化のない条件での測定は微小信号の検出に必須である.試料溶液が循環可能な高電場印加真鍮セルを自作した.赤外光を透過する電極材料としてP型ドープシリコン板(抵抗率:10-20 Ωcm)を用い,シリコン板とリード線の電気的接触のためにIn-Ga合金を用いた.タンパク質の電場効果測定の予備実験として,アルブミンのキャスト乾燥膜に対する電場効果を測定した.現有の電圧発生器と組み合わせて,印加電場強度を約0.1 MV/cmとした.1650 cm-1付近に現れたアミドI(C=O伸縮振動)バンドに注目して,電場変調によるバンド形状の変化を検討している.ベースラインの変動が大きく,ベースラインの変動を除去することを目指して膜形成などの実験条件の最適化を行っている.また,様々なモデルペプチドの合成などを行い,振動スペクトルを用いた生体分子の評価について理論的・実験的検討を行った.前年度製作したステップ・スキャン型電場変調赤外吸収システムと液体電場セルについて、10-6オーダーの微小変化の検出ができるように装置の最適化を行った。さらに、基本的な分子の液体状態における電場変調赤外吸収スペクトルの測定に成功した。オレイン酸については、C=O伸縮振動バンドとC-H伸縮バンドの電場効果の測定に成功した。得られた電場変調赤外吸収スペクトルは、Liptayの式に従い赤外吸収スペクトルのゼロ次、一次、二次微分の線形結合によって再現することができ、各微分形の係数から、官能基の電場による配向変化、振動励起に伴う分子分極率および双極子モーメントの変化について検討した。振動励起に伴う双極子モーメントの変化(Du)は、振動バンドの非調和性に由来するが、C=O伸縮振動バンドについては、報告されている固体中の分子のDuよりも小さな値であった。グリセリンについては、OH伸縮振動バンドの電場効果の観測に成功した。オレイン酸と同様にLiptayの式で再現し、Duの値はC=O伸縮バンドよりも大きな値であった。OH基の高い非調和性を反映していると考えられる。また、スペクトル分解を行わずにブロードなOH伸縮振動バンドの電場効果を再現できたことから、電場効果は水素結合の大きさに顕著に依存しないと考えられる。また同じ振動分光法であるラマン分光法を用いた基本的分子の電場効果を観測するシステムを製作し、タンパク質微結晶のラマンスペクトルの電場変化を検討した。製作したシステムを用いて、外部電場による10-6の赤外吸収の変化を測定することができた。この微小変化検出技術を用いて、生体分子の電場変化および時間分解測定に拡張を行うことができる。また赤外のみではなく、同じ振動分光法であるラマン分光法でもタンパク質微結晶のラマンバンドの電場変化が観測され、最終年度ではあわせて検討する。(1) Step-Scan FT-IRを用いた溶液分子の外部電場効果観測システム製作を引き続き行った。本年度は、電場印加セルの改良を行ない、密閉性を高めて長時間測定が可能になるようにした。またシリコン板ではなくゲルマニウム板をセルの材料として用い、測定波数範囲の拡大も行った。オレイン酸とノナン酸のC=O伸縮振動とCH伸縮振動バンドの赤外シュタルクシフトの比較を行った。電場強度依存性の測定を多数回行い、各電場でのスペクトルを吸収スペクトルのゼロから二次の微分形を用いて解析した。得られた係数を電場の2乗に対してプロットし、直線で近似できることを確認し、振動励起に伴う分子分極率の変化、双極子モーメントの変化(Du)を検討した。C-H伸縮振動バンドについては、バンド分解を行い、メチルおよびメチレンの対称、逆対称伸縮振動などそれぞれの振動での値を求めた。Du値について、C=O伸縮およびC-H伸縮のそれぞれについてオレイン酸のノナン酸で顕著な違いはなく、またC=O伸縮振動のDu値は、CH2逆対称伸縮振動の約1.5倍であった。Du値は振動モードの非調和性に対応し、各振動バンドの倍音との対応関係を検討している。アルコールや水の赤外吸収の電場効果も検討しているが、微少電流による熱効果などを考慮しなければならず絶縁材の選択など更なる工夫が必要である。

(2)細胞内のタンパク質の電場効果について、外部電場の印加による構造・環境変化の進行ダイナミクスを直接観測することを目的として、数100 msの時間分解能での不可逆過程を観測するシステム開発を行った。このシステムを用いて、ナノ秒パルス電場の印加に伴う細胞内カルシウムイオン濃度の増加過程を観測することができた。蛍光タンパク質の細胞内外部電場効果などに応用することを計画している。外部電場の印加に対する生体分子の応答機構を明らかにすることを目的として、電場印加に伴う赤外吸収スペクトル変化を測定するシステム製作などを行った。赤外吸収の電場効果では、溶液中の分子の電場効果を観測することができ、10-6オーダの微小電場変化を検出することができる。溶液中における脂肪酸の赤外吸収スペクトルの電場効果を測定し、C=O伸縮およびC-H伸縮振動バンドにおいて、シュタルク効果に起因する電場印加によるスペクトルのブロードニングを観測することができた。得られた変化をもとに、各振動の非調和性を議論することができる。電場印加セルおよび電場ジャンプ赤外吸収測定装置の最適化が年度内に終了しなかったが,研究体制および研究に必要な装置などは十分に整ったために,次年度以降の研究を十分に進めて行くことができると考えている.最終年度は、様々な系への応用と現有のナノ秒パルス電場発生装置を用いた時間分解測定を行う。測定時間内での溶媒の揮発が信号雑音比を低下させており,密閉した高電場印加溶液セルの改良を合わせて進めて行く。赤外用の偏光子と回転ステージの導入も行っており、角度依存性の測定も行う。またラマン分光法でもタンパク質のスペクトル変化が観測され,詳細を検討するとともに、赤外分光法の電場効果との比較を行う。高電場存在下でのポリペプチドの構造変化の理論計算も引き続き検討する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理化学乾燥膜の状態での電場効果の測定を行い,電場ジャンプ赤外吸収測定装置の最適化を行う.次に溶液中のタンパク質に拡張する.細胞の電場効果の測定では,今まで行ってきた方法ではなく,より簡便な電極作成技術を検討する.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
廃シリコーンのリサイクルを目指した炭酸ジアルキルによるシリコーン分解法の開発

廃シリコーンのリサイクル方法は,シリコーンの使用量が増加しているにもかかわらず,確立されていない.本研究では,炭酸ジアルキルを分解剤に用いたモノマーへの分解よるリサイクル方法の開発を行った.前年度において,シリコーンの熱分解により容易に生成する環状オリゴシロキサンの分解には,アルミナ担持フッ化カリウム触媒が有効であることを見出した.本年度では,廃シリコーンをポリマーから直接分解しモノマーに転化する方法を検討した.これまでシリコーンの分解剤には塩化水素やアミンが報告されている.これらは腐食性や毒性を有するという点で,リサイクルには適していない.メタノールや炭酸ジメチルも分解剤として報告されているが,触媒に硫酸を用いるなど問題がある.オリゴシロキサンの分解に有効であったフッ化カリウムを触媒に用い,炭酸ジメチルを分解剤に用いてジメチルシリコーンの分解を行った.しかし,モノマーはほとんど得られなかった.メタノールを共存させて反応を行うことにより,ほぼ完全に分解できることを見出した.また,塩化ナトリウムなどの安価なアルカリ金属塩でも,フッ化カリウムや塩基であるアルカリ金属水酸化物と全く同じ触媒活性を示すことがわかった.反応経路について検討したところ,まずメタノールとシリコーンとの反応によりモノマーが生成することがわかった.このとき副生する水が炭酸ジメチルと反応し,二酸化炭素とメタノールが生成する.メタノールの生成量はシリコーンの分解で用いられたメタノールの量と等しいため,全体の反応としては,炭酸ジメチルとシリコーンとの反応によりメトキシシランモノマーが生成することになる.この反応は,腐食性や毒性の低い分解剤を用い,廃酸処理などの問題がない安価な塩を触媒に用いられることから,廃シリコーンのリサイクルにおける有効な方法として期待できる.ポリジメチルシロキサンなどのシリコーンは,塩基触媒存在下において容易に熱分解を起こし,シクロテトラシロキサンやシクロペンタシロキサンなどの環状オリゴシロキサンが生成することが知られている.これらは沸点が比較的低いため,気体として容易に取り出すことができる.そこで,シリコーンのリサイクルを目指して,シリコーンの熱分解により生成する環状オリゴシロキサンを,モノマーに分解する反応を検討した.アルミナ担持フッ化カリウム触媒を用いて,炭酸ジメチルによる環状トリ,テトラ,ペンタシロキサンの分解を気相流通系反応装置で行った.すべての環状シロキサンの分解において,モノマーであるジメチルジメトキシシランが収率90%以上で得られた.しかし,テトラおよびペンタシロキサンでは,触媒の失活が見られた.炭酸ジメチルに少量のメタノールを添加した結果,失活を抑制し,高収率を維持することができた.以上のことから,炭酸ジメチルを分解剤に用い,少量のメタノールを添加することによって,環状シロキサンからモノマーに分解するシリコーンのリサイクル法が構築できることを見出した.次に,廃シリコーンを直接分解し,モノマーに転化する方法を検討した.シリコーンの分解剤には塩化水素やアミンが報告されている.これらは腐食性や毒性を有するという点で,リサイクルには適していない.メタノールや炭酸ジメチルも分解剤として報告されているが,触媒に硫酸を用いるなど問題がある.酸塩基以外の触媒であるフッ化カリウムを用い,炭酸ジメチルを分解剤に用いてジメチルシリコーンの分解を行った.しかし,モノマーはほとんど得られなかった.メタノールを共存させて反応を行うことにより,ほぼ完全に分解できることを見出した.この反応は,腐食性や毒性の低い分解剤を用い,廃酸処理などの問題もないことから,廃シリコーンのリサイクルにおける有効な方法として期待できる.廃シリコーンのリサイクル方法は,シリコーンの使用量が増加しているにもかかわらず,確立されていない.本研究では,炭酸ジアルキルを分解剤に用いたモノマーへの分解よるリサイクル方法の開発を行った.前年度において,シリコーンの熱分解により容易に生成する環状オリゴシロキサンの分解には,アルミナ担持フッ化カリウム触媒が有効であることを見出した.本年度では,廃シリコーンをポリマーから直接分解しモノマーに転化する方法を検討した.これまでシリコーンの分解剤には塩化水素やアミンが報告されている.これらは腐食性や毒性を有するという点で,リサイクルには適していない.メタノールや炭酸ジメチルも分解剤として報告されているが,触媒に硫酸を用いるなど問題がある.オリゴシロキサンの分解に有効であったフッ化カリウムを触媒に用い,炭酸ジメチルを分解剤に用いてジメチルシリコーンの分解を行った.しかし,モノマーはほとんど得られなかった.メタノールを共存させて反応を行うことにより,ほぼ完全に分解できることを見出した.また,塩化ナトリウムなどの安価なアルカリ金属塩でも,フッ化カリウムや塩基であるアルカリ金属水酸化物と全く同じ触媒活性を示すことがわかった.反応経路について検討したところ,まずメタノールとシリコーンとの反応によりモノマーが生成することがわかった.このとき副生する水が炭酸ジメチルと反応し,二酸化炭素とメタノールが生成する.メタノールの生成量はシリコーンの分解で用いられたメタノールの量と等しいため,全体の反応としては,炭酸ジメチルとシリコーンとの反応によりメトキシシランモノマーが生成することになる.この反応は,腐食性や毒性の低い分解剤を用い,廃酸処理などの問題がない安価な塩を触媒に用いられることから,廃シリコーンのリサイクルにおける有効な方法として期待できる.
足温熱療法による心不全改善効果:自宅で簡単に出来る新しい心不全治療の開発

うっ血性心不全の既往のある心機能障害患者を対象(拡張障害も含)とし、まず足温熱療法の心不全に対する急性効果と安全性の検討を13症例を対象に行った。足温熱前に比べて後では脱水や心不全増悪などのadverse effectsが生じた症例は認められず安全性については問題無いと考えられた。血圧・脈拍・深部体温などのバイタルサイン、発汗量、血管内皮機能(FMD)、交感神経活性(心拍変動)、血液・尿生化学的変化(神経体液性因子、炎症・酸化ストレスマーカーなど)についての検討では、脈拍数変化は-2.3±3.7/分と若干低下傾向、血圧変化は+4.6±7.1と若干の増加傾向を認めたが共に統計学的に有意差は認められなかった。一方、深部体温は+0.2±0.2°Cと有意な全身性の体温上昇が認められた。FMDは7人で有意な改善が認められた。心拍変動解析ではやや交感神経優位になるものの有意差は認めなかった。採血および採尿による生化学的解析では、hs-CRP、PAI-1、hANPは低下傾向を認めたが統計学的に有意差は認められなかった。また尿中カテコラミン3分画についても低下傾向を認めたが有意差はなかった。酸化ストレスマーカーについては抗酸化ストレスマーカーであるチオールの産生の有意な増加が認められた。またスワンガンツカテーテルでの検討では心拍出量増加、肺血管抵抗減少が示された。以上の結果から足温熱療法の急性効果として副交感神経賦活化効果、血管内皮機能、心機能改善、および抗酸化ストレス効果が示唆された。うっ血性心不全の既往のある心機能障害患者を対象(拡張障害も含)とし、まず足温熱療法の心不全に対する急性効果と安全性の検討を12症例を対象に行った。血圧・脈拍・深部体温などのバイタルサイン、発汗量、血管内皮機能(FMD)、交感神経活性(心拍変動)、血液・尿生化学的変化(神経体液性因子、炎症・酸化ストレスマーカーなど)についての検討では、脈拍数変化は-2.4±2.4/分、血圧変化は-13±-15mmHgと共に低下傾向を認めたが統計学的に有意差は認められなかった。一方、深部体温は+0,4+0.2°Cと有意な全身性の体温上昇が認められた。FMDは7人で有意な改善が認められ、心拍変動解析では8人に有意な交感神経活性抑制効果が認められた。採血および採尿による生化学的解析では、hs-CRP、PAI-1、hANPは低下傾向を認めたが統計学的に有意差は認められなかったが、尿中カテコラミン3分画では有意な低下傾向を認めた。酸化ストレスマーカーについては現在検査中である。また3症例でスワンガンツカテーテル留置下での足温熱効果の検討が行え、2症例にて心拍出量増加、肺血管抵抗減少が示されました(1症例は有意変化なし)。以上の結果から足温熱療法の急性効果として副交感神経賦活化効果、血管内皮機能および心機能改善効果が示唆された。来年度は約1-3ヶ月間足温熱療法を継続し慢性効果の検討を行う予定である。さらに上記評価項目に加え、心胸郭比、心エコーによる心腔サイズ・左心室収縮力、運動耐容能などの評価を行っていく予定としている。

足温熱前に比べて後では脱水や心不全増悪などのadverse effectsが生じた症例は認められず安全性にっいては問題無いと考えられた。血圧・脈拍・深部体温などのバイタルサイン、発汗量、血管内皮機能(FMD)、交感神経活性(心拍変動)、血液・尿生化学的変化(神経体液性因子、炎症・酸化ストレスマーカーなど)についての検討では、脈拍数変化は-2.3±3.7/分と若干低下傾向、血圧変化は+4.6±7.1と若干の増加傾向を認めたが共に統計学的に有意差は認められなかった。一方、深部体温は+0.2±0.2°Cと有意な全身性の体温上昇が認められた。FMDは7人で有意な改善が認められた。心拍変動解析ではやや交感神経優位になるものの有意差は認めなかった。採血および採尿による生化学的解析では、hs-CRP、PAI-1、hANPは低下傾向を認めたが統計学的に有意差は認められなかった。また尿中カテコラミン3分画についても低下傾向を認めたが有意差はなかった。酸化ストレスマーカーについては抗酸化ストレスマーカーであるチオールの産生の有意な増加が認められた。またスワンガンツカテーテルでの検討では心拍出量増加、肺動脈楔入圧の改善が示された。以上の結果から足温熱療法の急性効果として血管内皮機能、心機能改善、および抗酸化ストレス効果が示唆された。引き続き心不全に対する足温熱療法の慢性効果の検討を継続していく予定である。
食事成分による腸内細菌の二次胆汁酸生成酵素7α-デヒドロキシラーゼの制御

動物の消化管に常在している細菌は、宿主に有害・有益な代謝を行い宿主の健康に大きな影響を及ぼすことが知られている。本研究では、脂質代謝や発ガンへの影響が示唆されている二次胆汁酸を一次胆汁酸から生成させる腸内細菌由来の酵素7α-デヒドロキシラーゼに関する知見の収集とその代謝制御を目的として研究を行った。これまで本酵素生産菌としてEubacterium sp. strain VPI 12708などが知られ、比較的菌数の低い強い酵素活性を有する菌が主として生産していると考えられてきた。我々は、これまで胆汁酸分析に一般に用いられてきたTLC、HPLC、GPCより感度が高いELISA法を用いて本酵素生産菌の探索を行った結果、総菌数の110パーセント程度の多くの菌株が低い本酵素生産能を有することを確認した。その中でもEubactrium spと考えられる比較的酵素生産能の高い数菌株を用いて酵素精製を試みたが、継代培養を繰り返すにしたがって生産性が低下し精製することができなかった。本酵素活性の食品成分による制御を目的として酒粕粉末をラットに投与した結果、胆汁酸排泄量が有意に増加、二次胆汁酸の排泄が減少した。また、コレステロール吸収に重要なコール酸及びデオキシコール酸の排出が増加した。さらにパスタに難消化性澱粉素材である湿熱処理ハイアミロースコーンスターチを添加してヒトヘ投与した結果、胆汁酸排泄の増加とコール酸とケノデオキシコール酸の増加、デオキシコール酸とリトコール酸の減少を示し、食品成分によって胆汁酸排泄と7α-デヒドロキシル化を制御できることがわかった。動物の大腸内に常在している細菌は、様々な宿主にとって有害・有益な民論をおこなっていることが知られている。今回、脂質代謝や発ガンへの影響が示唆され一次胆汁酸を二次胆汁酸に変換する7α-デヒドロキシラーゼ生産腸内細菌のスクリーニングをおこなった。また、食事成分によって糞中胆汁酸がどのような変動を示すか、食物成分として酒粕粉末と難消化性澱粉を用いてラットとヒトについて検討し、以下の知見を得た。1.これまで用いられてきたGLCやHPLCに較べ簡単で高感度な抗デオキシコール酸抗体を用いたELISA法を開発し、7α-デヒドロキシラーゼ生産菌のスクリーニングをおこなった結果、これまで報告にない多くの生産菌が見つかった。現在、この分離菌を用いて酵素の性質を調べており、今後、簡便な活性測定条件の確立や本酵素の単離精製の取りかかる予定である。2.腸内環境へ影響を与える成分として食物繊維に着目し、ハイアミロースコーンスターチに湿熱処理をおこなった難消化性澱粉と酒粕粉末をラットとヒトに投与して、その消化性・腸内細菌による分解性・代謝産物・腸内細菌叢の構成の変化・胆汁酸の排泄量の変化・胆汁酸組成の変化を検討した。湿熱処理澱粉は、食物繊維含量が70%で大部分が消化吸収されずに盲腸・大腸に達し、常在する腸内細菌によって資化され一部が糞中に排泄されることがわかり、短鎖脂肪酸の生産によりpHが低下、胆汁酸の排泄量が増加し、二次胆汁酸の割合が減少することがわかった。また、酒粕粉末もラットの糞量を著しく増加し、胆汁酸の排泄量が増加、二次胆汁酸の比率を低下させることがわかった。
小児の骨髄異形成症候群(MDS)の細胞学的特性に関する研究

小児および成人のMDSの赤芽球系、顆粒球系、巨核球系について、電子顕微鏡的、および細胞化学的に検討を行った。対象症例は小児のMDS、成人、二次性MDSなど合計43例であった。顆粒球系にみられる異常としては、nuclear pocketが多く、特にダウン症候群に伴う小児のMDSでは7例中4例にみられた。その他、顆粒球では核の変形、アウエル小体様長形顆粒、Chediak-Higashi様巨大顆粒などがみられた。赤芽球形では核のスポンジ様変化が小児例で多かった。その他、多核赤芽球、変形核赤芽球などがみられた。巨核球・血小板系ではmicromegakaryocyte,巨大血小板などがみられたが頻度は少なかった。病型別にみるとrefractory anemia (RA)では赤芽球系に電子顕微鏡的な異常が多く、特に、担鉄ミトコンドリアは11例中5例にみられ、スポンジ様核は11例中4例にみられた。RAEB-in transformation(RAEB-T)では顆粒球系の異常が最も高くnuclear pocktetは11例中8例にみられた。顆粒球系の異常に比べ、赤芽球系の異常は少なかった。アポトーシスは顆粒球系、赤芽球系の両系統にみられた。電子顕微鏡細胞科学的にペルオキシダーゼ反応を観察すると、ミエロペルオキシダーゼ陽性顆粒の少ない症例がみられた。血小板ペルオキシダーゼ反応は陽性を示す幼若細胞があり、巨核芽球系の増殖が示唆される症例があった。電子顕微鏡形態学、細胞化学的にみると、MDSの細胞は光学顕微鏡では知り得ない異常が明らかとなった。また、小児例は成人例と比べて、形態的に異なるものがあり、小児でのMDSは成人と同一レベルではないことが分かった。小児および成人のMDSにおける各種血液細胞について電子顕微鏡学的に比較検討を行った。今年度は小児19例、成人7例、合計26例を対象とした。病型別ではRefractory anemiaは6例、RAEBは8例、EAEB-Tは10例、CMMoLは1例、分類不能1例であった。電子顕微鏡形態学的にみると、小児のMDSでは、骨髄の顆粒球系細胞はnuclear pocketを持つ細胞の頻度が高く、成人ではこのような細胞の頻度は少なかった。小児、成人共に、顆粒球系細胞の異常としては、顆粒の少ない細胞、淡い濃度の異常顆粒を持つ細胞などが見られた。アウエル小体は頻度が少なかったが、アウエル小体の不全型を思わせる、小型の棍棒状の顆粒は時にみられた。赤芽球系細胞ではcongenital dyserythropoietic anemia I型でみられるようなスポンジ様の核を持つものの頻度が高く、特に、予後不良例に多くみられた。ミトコンドリアは奇異な形に変形しているものも見られ、MDSのミトコンドリアの変化た担鉄ミトコンドリアのみでないことが分かった。血小板ペルオキシダーゼ反応をみると、small megakaryocyteの他に、芽球でも、これが陽性のものの頻度が高く、巨核球系の芽球が増加する症例が多いことも分かった。特に、小児のダウン症候群に併発する症例にこの傾向が強かった。アポトーシスの形態を有する細胞はまれであった。今年度の研究では、光学顕微鏡では知りえないMDSの細胞の異常のいくつかが電子顕微鏡的形態学、細胞化学で明らかとなった。今年度は昨年度の研究成果を踏まえ、小児および成人のMDSの赤芽球系、顆粒球系、巨核球系について、電子顕微鏡的、および細胞化学的に検討を行った。

また、昨年度研究対象であった症例についてもさらに詳細な検討を加えた。対象症例は小児のMDS、成人、二次性MDSなど合計43例であった。顆粒球系にみられる異常としては、nuclear pocketが多く、特にダウン症候群に伴う小児のMDSでは7例中4例にみられた。赤芽球形では核のスポンジ様変化が小児例で多かった。巨核球・血小板系の異常は少なかった。病型別にみるとrefractory anemia(RA)では赤芽球系では電子顕微鏡的に異常が多く、特に、担鉄ミトコンドリアは11例中5例にみられ、スポンジ様核は11例中4例にみられた。RAEB-in transformation(RAEB-T)では顆粒球系の異常が最も高くnuclear pocktetは11例中8例にみられた。顆粒球系の異常に比べ、赤芽球系の異常は少なかった。アポトーシスは顆粒球系、赤芽球系の両系統にみられた。電子顕微鏡細胞科学的にペルオキシダーゼ反応を観察すると、ミエロペルオキシダーゼ陽性顆粒の少ない症例がみられた。血小板ペルオキシダーゼ反応は陽性を示す幼若細胞があり、巨核芽球系の増殖が示唆される症例があった。電子顕微鏡形態学、細胞化学的にみると、MDSの細胞は光学顕微鏡では知り得ない異常が明らかとなった。
効率的かつ公平な医療資源配分方法の確立に関する基礎的研究

【課題1】費用効果分析に用いる効用値の理論的意義の明確化と信頼性向上:プロファイル型尺度で測定したQOLスコアから効用値に変換する手法(マッピング)のガイダンス2つ、即ち、MAPS Reporting Statement、ISPOR Task Force Reportの翻訳と解説を作成。前者は保健医療科学67巻に掲載、後者は投稿準備中。また、前立腺癌患者のQOL(FACT-P)と効用値(EQ-5D-5L, EQ-VAS)の横断調査の結果をQual Life Res(online、2019年4月)に掲載した。380人が登録。EQ-5Dの平均値(SD)は、局所、局所再発、遠隔転移、去勢抵抗性遠隔転移(CRPC)で各々0.87(0.15)、0.86(0.15)、0.85(0.18)、0.84(0.17)であった。効用値はPSと有意に関連し、EQ-5DとFACT-Pの相関は高かった。【課題2】生産性損失と【課題3】費用対効果のモデル分析に使うデータソースの検討は、2019年度に検討する。【課題4】医療資源配分への多基準意思決定分析(MCDA)の応用:直ちに命に係らない疾患の治療薬の償還可否に関わる基準選定と重みづけ調査。まずweb panelの986人(一般人606、医師138、看護師119、薬剤師123)に、26個の基準に7-point scaleで重みをつけてもらった。各職種の上位をカバーする7基準として、自己負担額、副作用、症状緩和、費用対効果、生産性損失、生存期間延長、社会的イノベーションが明らかになった。次に同じ対象に100点を7基準に配分してもらい相対的重要性を明らかにした。回答者は852人。一般人と看護師が症状緩和を、医師と薬剤師が費用対効果を重視した。この結果は昨年度の命に係る疾患の結果と同様であった。この成果はISPOR Europe 2018で発表した。課題1と4は、事前予想以上に作業が進んでいるが、課題2(生産性損失)と課題3(real world dataの有用性)の研究は遅れている。課題2は、生産性損失の具体的調査方法、特に介護保険料を含めた算定と、QOLやコストの重複算定の解決が滞っている、課題3では、national databaseの使用手続きが容易ではないこともあり、遅れている。残り1年となったことから、今後は、すでに進捗が進み、現在も研究が順調に継続しつつある、課題1と4に特に注力したい。課題1では、マッピングに関するISPOR Task Forceのレポートを投稿し、日本に紹介することにより、マッピング手法の標準化を図るとともに、様々な臨床試験におけるQOLや効用値調査を推進する。課題4では、国際的なグループが開発したEVIDEMフレームワークが、日本の医療資源配分政策応用に使用可能かどうか、その信頼性と妥当性を検討中であり、成果を積み上げたい。遅れている課題2と3についても、課題解決に尽力する予定である。[課題1] QOL値(効用値)の理論的意義の明確化と信頼性向上当初、H29年度以降に開始する予定であった課題4を先行して開始した。MCDAの医療資源配分への応用研究のsystematic reviewを行い、MCDAで重視すべき医学的・社会人口統計学的要因を抽出し、それらを基に日本の医療専門職(医師、薬剤師)と一般人を対象としたweb調査を行った。命に関わる疾患(例えばがんのような病気)の治療薬について、国が公的医療保険や税金で費用を負担するかどうかについて判断する場合、どのような要素をより重視すべきかについて、2段階の調査を行った。Phase 1では719人を対象に調査を行い、職種別に要因の優先順位を明らかにした。Phase 2では、同一対象者に対し、Phase 1で絞り込まれた要因について、相対的重要性を明らかにした。詳細は現在分析中である。[課題2]と[課題3]はH29年以降に開始する予定。[課題1](QOL値)、[課題4](MCDA)はむしろ前倒しで進んでいるが、当初初年度に進める予定であった、[課題2](生産性損失),[課題3](real world dataの有用性)の研究の開始が遅れている。[課題1](効用値の理論的意義の明確化と信頼性向上)MCDAの医療資源配分への政策応用に関する研究の系統的レビューを行い、意思決定において考慮すべきcategoryをまとめ、さらに研究者間での合意を経て26個のcategoryを選択した。次に、医療用webパネルを用いたインターネット調査を行った。「命にかかわる疾患(がんなど)(Life-threatening disease)」の治療薬の償還可否に関わるcriteriaの選定と重みづけ調査(一般、医師、薬剤師、看護師を対象)を行った。各criteriaの重みを7件法でまず調査した。共通して優先度が高かった8つのcriteriaは、「症状緩和」「自己負担額」「費用対効果」「生産性損失」「副作用」「社会的イノベーション」「予算影響」「期待生命予後」であった。次に、同様のwebパネルを用いて、8つのcriteriaに100点を割り振る方法で、相対的な重みづけ調査を行った。その結果、一般人と医療専門家の間で結果が有意に異なったcriteriaは、「自己負担額」「費用対効果」「副作用」の3つであった。