hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味細胞‐味神経間の伝達物質の解明

味細胞から神経への伝達物質についてはその候補物質がいくつか提案されているものの、ある味質を受容する細胞とその細胞から分泌される神経伝達物質の関係は、T1Rsで受容される甘味とうま味、そして苦味受容のII型味細胞からATPが分泌されるということ以外は明らかになっていなかった。そこで未解明の伝達物質について明らかにすることが本研究課題の目的である。前年度までに、アミロライド非感受性塩味応答についてはserotonin、T1Rsが関与するうま味(グルタミン酸)応答についてはGLP-1、キニーネ、デナトニウムといった苦味応答に関してはCCKが、味細胞から味神経への伝達物質である可能性が示唆された。免疫組織化学法による組織の検索では、GLP-1発現味細胞のうち50ー53%がT1R3を発現し、T1R3発現味細胞のうち25-28%がGLP-1を発現することが明らかになった。また、CCKはII型味細胞マーカーであるα-gustducin、PLCβ2と共発現していた。CCK発現味細胞のうち約3割はT1R3と共発現していたが、それ以外の7割の細胞に関して苦味受容体と共発現する可能性が高いと考えられる。脂肪酸の味覚に関して最近、他の味とは独立して伝える神経が鼓索神経味覚線維において約2割弱の割合で存在することを代表者らは報告した。同時に甘味・うま味応答神経の中の半数以上が脂肪酸に応答したが、これらの鼓索神経線維群もGLP-1の血中投与に応答した。これは消化管における脂肪酸センシング機構と類似性が高いと考えられる。CCKもGLP-1もII型細胞から分泌すると考えられるが、これらとATPとの関連は明らかになっておらず今後の課題と言える。味細胞から神経への伝達物質についてはその候補物質がいくつか提案されているものの、ある味質を受容する細胞とその細胞から分泌される神経伝達物質の関係はATPに関するもの以外は明らかになっていない。そこで脂肪酸の味、塩味、そしてうま味の伝達物質について、神経生理学的手法を用いて明らかにすることが本研究課題の目的である。当該年度において試薬テストとして、マウス鼓索神経全線維束の血管経由伝達物質に対する応答を記録した。試験に用いた物質と投与量はserotonin: 10-200μg/kg、NPY: 50, 100μg/kg、GLP-1: 10-40μg/kg、ATP: 0.01-2mg/kgで、このうち自発発火電位と薬物投与後の電位を計測したところ、serotonin: 100, 200μg/kg、NPY: 50, 100μg/kg、GLP-1: 20-40μg/kg、ATP: 0.3-2mg/kg投与により有意な電位の上昇が見られた。研究計画では平成27年度には、機器準備と鼓索神経全線維束応答による伝達物質候補試薬のテストを行うことになっていた。これに関しこれらの物質が鼓索神経を刺激する有効な投与濃度を検討し、この濃度ではマウスの呼吸など安定していることも確認できた。さらに次年度からの予定である鼓索神経単一神経の応答記録(平成28ー29年度)もスタートしており、各物質あたり少なくとも1匹ずつの動物の単一神経の記録もできている。従って、予定通りに進行していると言える。そのためこの評価にした。そこで脂肪酸の味、塩味、そしてうま味の伝達物質について明らかにすることが本研究課題の目的である。当該年度において、単一神経応答を記録しながら、基本味のうちどれに応答するかプロファイルを見た後、大腿動脈に設置するカニューレより試薬を静脈投与し、伝達物質は何の味を伝えるかを調べた。その結果、鼓索神経線維のうちHClに最も高いインパルス頻度を示す神経(E-type)を記録中にマウス大腿静脈より100μg/kgのSerotoninを投与したところ、およそ75%の神経が投与開始約63秒後に有意な応答(刺激時のインパルス頻度>無刺激時インパルス頻度+2SD)を見せた。一方NaClに特異性が高く、アミロライドによって抑制を受ける線維群(N-type)では現在Serotoninに応答する線維は見いだせない。うま味に関しては、記録したグルタミン酸に最も高い応答を示す線維(M-type)のうち約50%(14本中7本)の神経が静脈投与した20μg/kgのGLP-1に有意な応答を示した。次にGLP-1に応答を示す神経線維が結合する味細胞にはT1R1+T1R3、mGluR1、mGluR4のいずれが発現し機能しているかを調べるために、MPGにmGluR1、mGluR4のアンタゴニストであるAIDAとCPPGをそれぞれ1mM添加し舌を刺激したところ、これらのアンタゴニストにより抑制を受けない神経がGLP-1に応答を示した。この結果から、mGluR1, mGluR4以外のうま味受容体であるT1R1+T1R3もしくはそのどちらかが発現する味細胞の神経伝達物質はGLP-1であることが示唆された。研究計画では平成28年度には、27年度に行った伝達物質候補試薬のテストの結果に基づき、マウス鼓索神経単一神経の応答記録を行う予定となっていた。

脂肪酸の味、塩味、そしてうま味の伝達物質の中でうま味(M-type)と塩味(E-typeとN-type)に関する結果から、受容機構が違うと伝達物質も違なることを発見した。従ってこれら以外の味覚に関しても受容ー神経伝達の対応関係があり得るという仮説が得られた。さらに今年度において甘味受容システムと脂肪酸受容伝達システムに関し新たな分子および神経伝達の可能性が浮上しており、本課題とそれらの発見を結びつけることで、より詳細な受容と神経伝達のルートが明らかになる可能性が出てきた。その発展性と重要性からこの評価とした。味細胞から神経への伝達物質についてはその候補物質がいくつか提案されているものの、ある味質を受容する細胞とその細胞から分泌される神経伝達物質の関係は、T1Rsで受容される甘味とうま味、そして苦味受容のII型味細胞からATPが分泌されるということ以外は明らかになっていなかった。そこで未解明の伝達物質について明らかにすることが本研究課題の目的である。前年度ではアミロライド非感受性塩味応答へのserotonin、T1Rsが関与するうま味(グルタミン酸)応答へのGLP-1の関与が示唆されたが、今年度はCCKについて味細胞からの伝達物質の可能性を詳細に検証した。鼓索神経全線維束の積分波形を記録しながらマウス大腿静脈より0.1-100μg/kgのCCK-8を投与したところ、濃度依存的に相対応答値が上昇した。CCK-A受容体、CCK-B受容体knockoutマウスの鼓索神経および舌咽神経全線維束応答では、HCl、NaCl、MPG、ショ糖応答は正常型(WT)マウスと比べ有意な差は無かったが、キニーネ、デナトニウムに関しては有意に小さかった。20mMキニーネHClに対し最も高い応答頻度を示す鼓索神経線維群がCCK-8の静脈内投与に対し有意な応答を見せた。免疫組織化学法による組織の検索では、CCKはII型味細胞マーカーであるα-gustducin、PLCβ2と共発現しており、CCK発現味細胞のうち約3割はT1R3と共発現していた。これらの結果から、CCKが苦味情報を味細胞から味神経へ伝える伝達物質であることが示唆された。研究計画ではマウス鼓索神経単一神経の応答記録を行いつつ、関連分子発現の検索を行う予定となっていた。本年度はII型味細胞ではATPに加え、GLP-1そしてCCKが伝達物質として確定的となったが、味質に対する特異性という点でGLP-1とCCKはATPよりも高く、味質の情報を正確に脳に伝えるためにこの特異性は重要である可能性が見出された。また、免疫組織化学法にてCCKの味蕾細胞における検索を行った。使用可能な抗体の組み合わせで今回II型味細胞にCCKが発現し、大部分は嗜好性の味覚を受容するT1R3を発現しない味細胞であると確認できた。これらの進捗からこの評価とした。前年度までに、アミロライド非感受性塩味応答についてはserotonin、T1Rsが関与するうま味(グルタミン酸)応答についてはGLP-
ゴードン・W・プランゲ文庫所蔵検閲史料によるGHQ医療・看護制度の実態の評価

占領期に日本で発行された刊行物のすべてはGHQの検閲を受けた.占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物とその検閲結果は,米国メリーランド大学図書館ゴードン・W・プランゲ文庫(Gordon W.Prange Collection;以下,プランゲ文庫)に所蔵されている.本研究の目的は,プランゲ文庫に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し,GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&W Records)には表わされていない医療および看護に関わるGHQの方針と実態,および出版物の発行状況を明らかにすることである.プランゲ文庫の現地調査により,占領期の検閲史料(単行本,雑誌,それらの検閲文書)を分析し,以下のことを明らかにした.1.公衆衛生福祉局(PH&W)は,看護系雑誌の発行において民間検閲支隊(CCD)とは異なる独自の検閲を行っていた.2.検閲文書の分析よりGHQの関心は占領の段階(時期)により変化していた.3.日本側には記録が残されていない看護系雑誌の発行数および発行頻度の実態.4.占領期には日本看護協会の支部機関誌が発行されたが単発で終わっていた.5.現存するプランゲ文庫図書と"Book Lists""Pamphlet Lists"(プランゲ文庫所蔵の図書及びパンフレットのリスト)が整合していない可能性がある.占領期に日本で発行された刊行物のすべてはGHQの検閲を受けた.占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物とその検閲結果は,米国メリーランド大学図書館ゴードン・W・プランゲ文庫(Gordon W.Prange Collection;以下,プランゲ文庫)に所蔵されている.本研究の目的は,プランゲ文庫に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し,GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&W Records)には表わされていない医療および看護に関わるGHQの方針と実態,および出版物の発行状況を明らかにすることである.プランゲ文庫の現地調査により,占領期の検閲史料(単行本,雑誌,それらの検閲文書)を分析し,以下のことを明らかにした.1.公衆衛生福祉局(PH&W)は,看護系雑誌の発行において民間検閲支隊(CCD)とは異なる独自の検閲を行っていた.2.検閲文書の分析よりGHQの関心は占領の段階(時期)により変化していた.3.日本側には記録が残されていない看護系雑誌の発行数および発行頻度の実態.4.占領期には日本看護協会の支部機関誌が発行されたが単発で終わっていた.5.現存するプランゲ文庫図書と"Book Lists""Pamphlet Lists"(プランゲ文庫所蔵の図書及びパンフレットのリスト)が整合していない可能性がある.本研究の目標は、米国メリーランド大学図書館ゴードン・W・プランゲ文庫(以下、プランゲ文庫)に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し、GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&W Records)には表わされていない医療および看護に関わるGHQの方針と実態、および出版物の発行状況を明らかにすることである。本年度は、全研究期間4年の初年度にあたり、以下のことを順次行った。1)占領期雑誌記事情報データベース化プロジェクト委員会(代表・山本武利氏、早稲田大学政治経済学部)が公開しているプランゲ文庫の雑誌データベースを活用し、医学および看護に関する雑誌タイトル検索を行い、タイトル数と検閲箇所を把握した。2)国立国会図書館憲政資料室所蔵のプランゲ文庫のマイクロフィッシュで看護に関する記事を調査した。3)メリーランド大学図書館のプランゲ文庫史料を調査し、国会図書館で収集した史料の補完、雑誌表紙および検閲官の書き込みがある箇所の撮影を行った。これらより、プランゲ文庫所有の「看護師」「保健師」「助産師」に関する雑誌記事の内容と掲載雑誌名、プランゲ文庫での保管状況、検閲の有無が把握できた。『看護学雑誌』『保健婦事業』『看護』の3雑誌については、検閲文書を分析した。その結果、検閲内容、雑誌に対するGHQの評価が明らかになった。さらに、日本側の記録で不明であった発行状況が明らかになった。本研究の目標は、米国メリーランド大学図書館ゴードン・W・プランゲ文庫(Gordon W.Prange Collection;以下、プランゲ文庫)に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し、GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&W Records)には表わされていない医療および看護に関わるGHQの方針と実態、および出版物の発行状況を明らかにすることである。本年度は、全研究期間4年の2年度にあたり、以下のことを順次行った。1)国立国会図書館図書蔵書検索、国立保健医療科学院研究情報センター図書館蔵書検索、国立情報学研究所・情報資料センター綜合目録データベース検索、国立看護大学校図書館蔵書検索を行い、1945年から1949年に日本国内で発行された「看護」に関する図書リストを作成した。2)メリーランド大学図書館のプランゲ文庫史料を調査し、(1)日本国内で発行され、現在日本国内に実在する図書とプランゲ文庫に所蔵されている図書の照合およびリスト作成、(2)日本国内に実在しない図書のリスト作成と撮影、(3)プランゲ文庫所蔵図書の検閲文書の撮影、を行った。

プランゲ文庫所蔵の図書が多数のため、「看護」および「医学一般」の図書のみを対象にした。これらより、「看護」に関する図書の(1)日本国内に実在しない図書の実態、(2)プランゲ文庫での所蔵状況、(3)検閲の有無が把握できた。プランゲ文庫には、占領中に出版された「看護」に関するすべての図書が所蔵されていなかったこと、「看護」の図書では検閲基準に触れた図書が少数であることが明らかになった。また、平成16年度の調査対象であった『看護学雑誌』『保健婦事業』『看護』の3雑誌については、成果を日本看護歴史学会、日本医史学学会、日本看護科学学会で発表した。本研究の目標は、米国メリーランド大学図書館ゴードン・W・プランゲ文庫Gordon W.Prange Collection;以下、プランゲ文庫)に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し、GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&W Records)には表わされていない医療および護に関わるGHQの方針と実態、および出版物の発行状況を明らがこすることである。本年度は、全研究期間4年の3度にあたり、以下のことを行った。(1)「看護」に関する、日本国内で発行され日本国内に実在する図書とプランゲ文庫に所蔵されている図書の照合およ図書データベース作成(昨年度からの継続)(2)プランゲ文庫の未整理の書架から「看護」に関する図書を探し、作成した図書データベースと照合(3)プランゲ文庫所蔵のポスターおよび壁新聞の中から「看護」および「医療」に関するものを調査今年度の現地調査において、図書の出版に関するGHQの記録である"Book Lists""Pamphlet Lists"がプランゲ庫で所蔵されていることが判明した。"Book Lists""Pamphlet Lists"を調べることにより、占領醐にGHQが入手した「看調に関する図書が現在もプランゲ文庫に所蔵されているかが確認できる可能性がある。"Book Lists""Pamphlet Lists"は計77冊あり、今年度は5冊しか調査することができなかった。占領期に出版された「看護」に関する図書の全貌を解明するためには、"Book Lists""Pamphlet Lists"から収集したデータと作成したデータベースとの照合が必要であり、次年度も調査を継続する。なお、「看護」の雑誌に関する調査結果は、日本看護歴史学会、日本医史学学会、日本看護科学学会で発表した。本研究の目標は,米国メリーランド大学図書館(Gordon W.Prange Collection;以下プランゲ文庫)に所蔵されている占領期の1945年から1949年にかけて日本で出版された刊行物のすべてとその検閲結果を分析し,GHQ/SCAP Recordsの公衆衛生福祉局の文書(PH&WRecords)には表わされていない医療および看護に関わるGHQの方針と実態,および出版物の発行状況を明らかにすることである.本年度は,全研究期間4年の最終年度にあたり,以下のことを行った.
カドミウム曝露によるがん悪性化メカニズムの解析

カドミウムは肺組織においてがん化を誘引する環境汚染物質として知られているが、カドミウムがどのような制御機構でがんの悪性化を亢進させるのか、未だに明らかになっていない。本研究は、肺胞基底上皮腺癌細胞(A549細胞)に対するカドミウム長期曝露の効果とNotch1、HIF-1αおよびPI3K/Akt/ERKシグナル経路の機能について検討した。その結果、カドミウム長期曝露されたA549細胞において、Notch1、HIF-1αおよびPI3K/Akt/ERKシグナル経路が協調的に機能することで、肺癌細胞の悪性化を亢進することを見出した。カドミウムは環境汚染物質であり、主に喫煙や採鉱時に呼吸器を経由して曝露され、その結果、肺、腎臓などの組織において、機能障害やがんを誘引することが報告されている。培養細胞や個体レベルの実験系からも、高濃度カドミウムを急性曝露すると、細胞レベルで細胞死を誘導する一方、長期間カドミウムを曝露すると、細胞のがん化が誘導されることが報告されている。しかしながら、がんの悪性化、特にがんの転移能・浸潤能に対し、カドミウムがどのような影響を与えるのかは未だに明らかにされていない。そこで、本研究においてがん細胞の転移能・浸潤能に対するカドミウムの影響を明らかにすべく、解析を行うことにした。これまでに解析を行った結果、カドミウムを肺胞基底上皮腺がん細胞(A549細胞)に長期曝露すると、細胞移動能を促進する上皮間葉転移(EMT)が惹起されることが観察された。また、ストレスファイバーの形成、細胞移動能の上昇が観察された。これらは、カドミウム曝露によって細胞が浸潤しやすい状態、すなわち悪性度がより高い癌へと移行していることを示唆している。一方、カドミウム長期曝露によって、膜貫通型受容体かつ転写因子であるNotch1シグナルが活性化していることも観察された。さらに、Notch1シグナルを阻害すると、カドミウム曝露依存的なEMTの惹起、ストレスファイバーの形成、細胞移動能の促進がすべて部分的ではあるが、抑制されることが見出された。一方、カドミウム長期曝露依存的にSGK1の発現量の低下とその基質であるNDRG1のリン酸化の低下も確認された。また、SGK1を機能阻害すると、細胞移動能の促進が確認されたことから、SGK1とカドミウム曝露によるEMTの惹起、ストレスファイバーの形成、Notch1シグナルとの間に関連性があるのではないかと考え、SGK1の機能阻害やNDRG1の機能阻害など検討したが、今のところ明確かつ論理的な解釈が可能な結果は得られていない。当初の計画に記載したSGK1の機能解析としては、なかなか困難な状況となっている。しかし、カドミウムに長期曝露されたA549細胞の特性の解析、またそこに関与するNotch1シグナルの解析、さらにNotch1シグナル周辺で機能する新たな因子の探索が順調に進んでいる。そのため、カドミウム曝露による癌悪性化メカニズムの解析という視点で見ると、概ね順調に進捗していると言える。培養細胞や個体レベルの実験系からも、高濃度カドミウムを急性曝露すると、細胞レベルで細胞死を誘導する一方、長期間カドミウムを曝露すると、細胞のがん化を誘導する事が報告されている。昨年度までの解析結果から、カドミウムを肺胞基底上皮腺がん細胞(A549細胞)に長期曝露すると、転写因子Notch1シグナル経路が活性化し、その結果、上皮間葉転移(EMT)が促進され、ストレスファイバーの形成、細胞移動能が上昇することが明らかとなった。今年度は昨年度の研究結果を基に、さらに解析を進め、以下の点を明らかにした。(1)カドミウム長期曝露したA549細胞では、Notch1シグナル経路が活性化し、抗がん剤に対する耐性が上昇する。(2)カドミウム長期曝露したA549細胞では、Notch1シグナル経路が転写因子HIF-1αおよびリン酸化酵素PI3K/Akt経路と協調的に機能し、EMTを誘導する。(3)カドミウム長期曝露によって誘導されたがん細胞の悪性化の形質およびNotch1シグナル経路の活性化は、カドミウムを細胞内から完全に除去しても維持される。このことは、がん細胞の悪性化の形質およびNotch1シグナル経路の活性化の獲得に何らかのepigeneticな変化が関わる可能性を示している。本研究は、肺胞基底上皮腺癌細胞(A549細胞)に対するカドミウム長期曝露の効果とNotch1、HIF-1αおよびPI3K/Akt/ERK

シグナル経路の機能について検討した。その結果、カドミウム長期曝露されたA549細胞において、Notch1、HIF-1αおよびPI3K/Akt/ERKシグナル経路が協調的に機能することで、肺癌細胞の悪性化を亢進することを見出した。次年度以降は、解析が困難な状況にあるSGK1の機能解析を途中ではあるが停止させ、現在順調に進捗している実験について重点的に解析する。具体的には、カドミウムに長期曝露されたA549細胞の抗がん剤に対する感受性の検討、マトリゲルに対する浸潤能力の検討、カドミウム長期曝露を停止したときのA549細胞の質的変化、Notch1周辺で機能する因子の解析を行う予定である。また、カドミウムが影響を及ぼすと考えられている乳がん細胞(MCF7細胞)でもA549細胞と同様の現象が生じるか検討する予定である。加えて、これらの解析が終了次第、論文として投稿する予定である。薬学・毒性学・生物学本年度は、実験の多少の変更に付随して、購入する適切な物品の選択に時間がかかったことなどから、計画よりも研究費使用時期が遅れている。次年度以降は、先に提出した計画から大きな変更なく使用していく予定である。
DNAチップを用いた結核菌の疫学的解析法の開発

本研究により以下の成果が得られた。・新たな結核菌の迅速型別法であるセルフライゲーションPCRを確立した。・拡張型スペーサーオリゴヌクレオチドDNAチップSPONC96を作成し、従来のスポリゴタイピングでは型別出来なかった菌株の型別を可能にした。・IS6110優先挿入領域(ip1)の塩基配列の解析を行い、我が国の分離株では多様性が乏しいが、DNAチップによる型別には応用できることを見い出した。・DNAジャイレース(gyrA/B)遺伝子の多型の解析を行い我が国の分離株でも2種に分類でき、DNAチップによる型別に応用できることを見い出した。より簡便な型別のための遺伝子増幅法であるIS6110間PCRにより我が国の分離株の約80%が型別できることを見い出した。これはDNAチップによる型別に応用できることを示していた。1)ミックスドリンカーPCR、セルフライゲーションPCRの条件の至適化結核菌標準菌株より抽出したDNAを用いて切断、ライゲーショシ、PCRそれぞれの条件の至適化を行った。得られた条件を用いて臨床分離株の分析を行った。また、結核集団発生より得られた菌株においては両方法とも同一のパターンが得られることが判明し、これらの方法により得られたプローブが有効なものであることが確認された(Kekkaku 76(1)、9-18、2001)。2)プロトタイプ結核菌ゲノムチップの作製結核菌標準菌青山B株の整列遺伝子クローンをポリカルボジイミド樹脂でコートしたスライドグラスにスポットしプロトタイプDNAチップを作成した(スポッティングは外注した)。結核菌標準菌株より作成したプローブを用いてハイブリダイゼーション温度、時間、溶液、ぞれの条件の至適化を行った。シグナルの均一性に改良の余地が残った。3)スペーサーオリゴヌクレオチドチップの作製直位反復配列(ダイレクトリピート)領域に存在するスペーサー配列をポリカルボジイミド樹脂でコートしたスライドグラスにスポットしスペーサーオリゴDNAチップを作成した(スポッティングは外注した)。結核菌より抽出したDNAを鋳型としてダイレクトリピート領域を増幅させた。これをプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い条件の至適化を行った。4)結核菌株の収集およびDNAの抽出約100検体の結核菌DNAを新たに抽出しストックとした。1)拡張型スペーサーオリゴヌクレオチドチップの作製昨年度作成した直位反復配列(ダイレクトリピート)領域に存在するスペーサー配列43をポリカルポジイミド樹脂でコートしたスライドグラスにスポットしたスペーサーオリゴDNAチップ(SPONC43)を用いて臨床分離結核菌48株についてハイブリダイゼーションを行いスポットの検出を行った。しかしながら独立した感染例においても類似したハイブリダイゼーションスポットパターンを示すものが複数見られた。そこでDNAデータベースをサーチすることにより新たに56種類のスペーサー配列をみいだし、拡張型スペーサーオリゴヌクレオチドチップ(SPONC96)を作成し臨床分離結核菌48株についてハイブリダイゼーションを行いスポットの検出を行った。その結果SPONA43では別けることが不可能であった菌株のうちの一部を型別することが可能となった(結核病学会2001、沖縄にて報告)。しかしながらSPONC96でも型別不可能な菌株が存在していたため、新たに2)の実験を行った。2)IS6110優先挿入領域(ipl)オリゴヌクレオチドチップの作製結核菌の染色体上には挿入配列IS6110が優先的に挿入される領域(ipl:約600塩基)がありiplでの挿入位置は菌株ごとに異なっており6種類に分類されることが報告されている。本研究ではIS6110のiplでの挿入位置を特定するためのオリゴヌクレオチドチップのデザインを行いチップの作製を外注した。3)結核菌株の収集およびDNAの抽出122検体の結核菌DNAを新たに抽出しストックとした。1)IS6110優先挿入領域(ipl)の塩基配列の解析昨年度作成した拡張型スペーサーオリゴヌクレオチドチップ(SPONC96)を用いた臨床分離結核菌48株のイブリダイゼーションによる解析ではスポリゴタイピングでは別けることが不可能であった菌株のうちの一部を型別することが可能となった。しかしながらSPONC96でも型別不可能な菌株が存在していた。

結核菌の染色体上には挿入配列IS6110が優先的に挿入される領域(ipl:約600塩基)が存在しておりiplでの挿入位置は菌株ごとに異り、6種類に分類されることが報告されている。本年度の研究では125株の臨床分離より抽出したDNAを鋳型としてPCRを行いipl領域を含むDNA断片の増幅後、塩基配列を決定し、相互に比較した。その結果、我が国の臨床分離株ではイギリスのグループの報告とは異なり、多様性に乏しく、一つのipl型で約80%が占められていることが判明した。この領域を利用することで一部の型別を可能にするキャプチャーオリゴヌクレオチドのデザインがは可能であるものと考えられた。2)DNAジャイレース(gyrA/B)遺伝子の多型の解析242株の臨床分離より抽出したDNAを鋳型としてPCRを行いgyrA/B遺伝子を含むDNA断片の増幅後、塩基配列を決定し、薬剤耐性に関与しない塩基置換の存在頻度の分析を行なった。161株において284番目の塩基がGからCへと置換していた。キャプチャーオリゴヌクレオチドとして使用可能であるものと考えられた。3)結核菌株の収集およびDNAの抽出日本の各地の病院で分離された135検体の結核菌DNAを新たに抽出しストックとした。過去3年間の研究で以下の結果が得られた。セルフライゲーションPCRの条件の至適化ができた。2)拡張型スペーサーオリゴヌクレオチドチップを作成し、スポリゴタイピングより優れていることを確認した。3)我が国の臨床分離株では挿入配列IS6110が優先的に挿入される領域での、挿入位置の多様性が乏しいことが判明した。4)臨床分離株のgyrA/B遺伝子を含むDNA断片の増幅後、塩基配列を決定し、薬剤耐性に関与しない塩基置換により2種にタイピングできることが判明した。以上の結果より、本年度はDNAチップにスポットすべきキャプチャーオリゴヌクレオチドの種類を増やし、タイピング能を向上させるための研究を実施した。多型を検出するためのPCRとしてERIC-PCR、IS6110マルチプレックスPCR、IS6110間PCRの反応条件の指摘化を行った結果、実施した3種の方法のうちで最も良好な結果が得られたのはIS6110間PCRであった。この方法で臨床分離株の約80%を型別できる至適条件の決定ができた。この方法により増幅されるDNA断片の塩基配列の決定を行い、キャプチャーオリゴヌクレオチドとしてDNAチップにスポットし、さらにこれらをプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより再現性の良い結果が得られる可能性が予想された。
異種結合混在系液体・ガラスの構造と電気物性

われわれがこの研究で得た成果は、以下のようにまとめられる。1.金属・非金属系:セシウム・メチルアミン・アンモニア系のCs-133のNMRスペクトルと電気伝導率の測定を行い系の示す金属・非金属転移と濃度ゆらぎなどの溶液構造との関連を明らかにした。またナトリウム・アンモニア系で200MHzのESR測定を行い、バルクの金属化に先立つ電子の非局在化を示唆する結果を得た。また酸化物ガラス中にビスマス、銀のナノサイズ超微粒子を析出させ、その光学吸収、融解温度などの物性の微粒子のサイズ依存性を明らかにした。タリウム・カルコゲン化物系の濃度ゆらぎと系の電気的性質の関係を明らかにした。2.有機・無機超イオン伝導ガラス系:ヨウ化銀と・ヨウ化テトラアルキルアンモニウム系のアルキル基のサイズを変えることにより、さまざまなヨウ化銀の容積分率のガラス試料を作製し、その交流伝導率を測定した。その結果、容積分率0.35付近で、顕著なパコレーション的なイオン導体・絶縁体転移を示すことがわかった。銀イオンと有機塩のプロトンのNMR、中性子錯乱、X線小角散乱などにより、このガラス中のイオンと分子の微視的運動状態についてさらに詳細に調べた。3.無機塩・分子性液体系:硝酸リチウム・グリセロール系では、塩の濃度の増加とともに粘性が増大し、電気伝導率は低下することがわかった。この系のグリセロールの分子運動を中性子の準弾性散乱の測定から調べた。また塩化リチウム濃厚水溶液とそのガラス中の水分子の運動をNMRにより測定し、中性子散乱の結果と比較検討した。これらの系ではイオンを介した低分子物質のネットワーク構造形成が系の物性を支配していることが分かった。これらの結果より、異種結合混在系の液体あるいはガラスでは、異相分離的(同種安定)、もしくは秩序形成的(異種安定)な「局所的ゆらぎ」が、系の電気物性を支配していると結論される。化学結合性が大きく異なる物質の混合系のいくつかについて、広い濃度範囲の溶液をつくり、そのいくつかについてはガラス化を試み、その物性を調べた。平成7年度に得られた研究成果の概要について以下に述べる。1)金属セシウム-アンモニア系:この系が示す金属-非金属転移に注目しつつ、セシウム核のNMRを組成と温度の関数として測定した。伝導電子の非局在化の進行がナイトシフト、スペクトルの線幅にあらわれ、同時に行った電気伝導度の測定結果と良く対応していることが分かった。また伝導電子の非局在化は金属が2モル%付近から始まり、系全体が金属化する濃度(4モル%)にさきがけていることが分かった。2)硝酸リチウム-グリセロール系:この系の濃度溶液にいたる広い濃度範囲にわたって、粘性係数とモル電気伝導度を温度の関数として測定した。両者はVTF理論によって良く表わされ、パラメターTOはガラス転移温度より約50度低いことが見い出された。この系の作るガラスはグリセロール分子の水素結合によるネットワークにイオンが取り込まれて、溶媒分子とイオンの運動が強く結合していることが分かった。このことは中性子準弾性散乱の測定からも確かめられた。3)ヨウ化銀-ヨウ化アルキルアンモニウム塩系:AgI-CsI-(CH_3)4NI系のガラス化試料について中性子準弾性および非弾性散乱の測定を行い、この有機-無機混合系超イオン伝導ガラスの動的性質を調べた。

低温度で銀イオンの運動にもとづく励起状態を観測した。また準弾性散乱スペクトルの線幅より、伝導性の銀イオンの局所的な運動についての知見を得た。以上の結果は、「異質な化学結合が混在する液体・ガラス系における電子とイオンの運動性」の統一的な理解のための基礎をなすものである。われわれは、金属-アルキルミン(アンモニア)系、ヨウ化銀-ヨウ化アルキルアンモニウム系、硫酸リチウム-グリセロール系に代表される混合液体・ガラスを対象に、異種の化学結合の混在が系の電気物性とどのように関わるかを明らかにするため、本研究を実施した。以下にその研究実績の概要を述べる。1)金属-アルキルアミン系:セシウム-メチルアミン-アンモニア系のCs-133のNMRスペクトルと電気伝導率の測定を行い、系の示す金属-非金属転移と濃度ゆらぎなどの溶液構造との関連を調べた。またナトリウム-アンモニア系の低磁場(193MHz)ESRスペクトルの測定より、バルクの金属-非金属転移が起こる前の金属濃度で、局所的領域での金属化が示唆された。2)ヨウ化銀-ヨウ化テトラアルキルアンモニウム系:ヨウ化銀の体積分率を広範囲に変えたガラス試料を作製し、その交流伝導率を測定した結果、体積分率0.35付近で、顕著なイオン伝導体-絶縁体転移が観測された。銀イオンのNMRおよび中性子散乱、X線小角散乱により、このガラス中のイオンと分子の微視的構造と運動状態について調べ、パーコレーション的な転移機構の存在が示唆された。3)硫酸リチウム-グリセロール系:この系の交流電気伝導率と粘性率を濃厚溶液に至る範囲で温度の関数として測定し、両者の相関を調べた。またこの系のグリセロールの分子運動を中性子の準備性散乱の測定から調べた。これらの結果より、イオンを介したネットワーク構造の形成がイオンの運動を支配していることがわかった。これらの結果より、異種結合混在系液体あるいはガラスでは、異種分離的(同種安定)、あるいは秩序形成的(異種安定)な「局所的濃度ゆらぎ」が、系の電気物性を支配していると結論される。
共晶系合金表面の室温での流動性の起源の解明－半導体の新規低温結晶化手法を目指して

金属触媒を用いた半導体薄膜の低温結晶化挙動の機構を解明することを目的として、微量のSiを蒸着したAg(111)表面を走査トンネル顕微鏡により観察した。加熱したSi/Ag(111)表面を室温で観察するとステップ形状が分単位で変形する流動的な相の形成が認められた。Ge/Au(111)においては、室温でGeを蒸着すると直ちにGe原子がAu層内へ拡散し、Si/Agと同様の流動相が認められた。これらの流動相は金属触媒に誘起された低温結晶化現象に関与していることが示唆される。申請者等は、一原子層以下のSiを蒸着したAg(111)表面を加熱すると、室温において液相のような流動的な表面層が形成されることを見出した。AgとSiは室温ではほとんど固溶しないが、この結果はナノ領域における共晶系合金の複雑な挙動を示している。AgとSiの薄膜を積層した構造を加熱すると、Siの結晶化が促進されることが知られており、本研究では、これらの流動層が形成されるメカニズムについて考察し、金属触媒を用いたSiやGeなどの半導体の低温結晶化技術を開発するための知見を得ることを目的とする。Au(111)表面上に微量のGeを蒸着した表面を走査トンネル顕微鏡で観察したところ、Si/Ag(111)と同様に、室温で流動する表面層を観察することに成功した。この結果は、この現象が半導体と金属の共晶系合金に共通する性質であることを示唆しているが、Ge/Au(111)の場合には、アニール処理が不要で、Geを蒸着しただけでこのような流動層が確認出来る。これは、GeがAu内に容易に拡散し、合金を形成することを示唆している。このような流動層の存在は、原子が低温でも高速に拡散することを示しており、結晶化の反応を促進させる可能性があり、今後、流動層の挙動、形成機構について調べる。また、AuとGeを加熱基板上に同時に供給すると、Geの結晶化が効率的に進むことを見出しており、流動層の形成との関連について詳細な検討を行う。Au(111)面上に微量のGeを蒸着し、走査トンネル顕微鏡で観察したところ、Si/Ag(111)と同様の流動層を観察することに成功した。しかも、Ge/Au(111)の場合は、アニール処理が不要で、容易に表面に合金層が形成されることが示唆される。また、AuとGeを同時に加熱基板上に供給すると、Geの結晶化が促進されることも見出した。液晶、有機ELパネル用の薄膜トランジスタや薄膜太陽電池は主としてシリコンを用いて作製されているが、低温での結晶化が難しいことからアモルファスの状態で利用されることが多い。結晶化を促す触媒として金属を利用した、金属誘起結晶化法は簡便な手法により低温でシリコンやゲルマニウムなどの半導体を結晶化する方法として期待されている。結晶化を促す金属としては、半導体元素と共晶合金を形成するものが有効であることが指摘されているが、申請者等は金属誘起結晶化の起源を解明することを目的として、金属表面上に微量のシリコンやゲルマニウムを蒸着し、表面の挙動を走査トンネル顕微鏡により観察した。すでに、Ag(111)表面上にSiを蒸着すると、室温においてステップの変形が観察されることを報告したが、今回、Au(111)表面上にGeを蒸着した場合も、同様の現象が観察された。しかも、Si/Ag系の場合はSiの蒸着後のアニールが必要であるが、Ge/Au系では室温で蒸着しただけで、流動層の存在を確認できた。蒸着後の表面観察ではGeの存在が確認できず、XPSによる分析の結果、GeはAu内に拡散していることが判明した。これは、Au表面のGeが室温で容易にAu層の内部へ拡散できることを示している。この現象は、室温での流動層の存在と合わせて、金属誘起結晶化法におけるGeの低温結晶化の機構と関連している可能性がある。流動性のある表面相はAuで構成されているが、ステップの高さは純粋なAuのそれよりも大きくなっており、格子の膨張が流動性の原因となっていることが示唆される。さらに、Ge/Au(111)表面の挙動を走査トンネル顕微鏡を用いて調べることで、流動層の構造、形成機構を明らかにする。また、AuとGeを同時に加熱基板上に供給する新規結晶化手法についても研究を進め、結晶化機構の解明、結晶化を効率的に進めるためのプロセスの改善に取り組む。材料物性当初の想定に比べて旅費の支出が少なかったため、次年度使用額が生じた。今年度は実験のための消耗品を中心に支出を行う計画である。
脊椎動物における繊毛運動パターン制御の分子基盤

脊椎動物の細胞には繊毛と呼ばれる突出した構造が存在している。中でも運動性を持つ繊毛は様々な器官の発生や機能に重要であり、その運動性は軸糸ダイニンという巨大タンパク質複合体によって駆動される。我々が報告したKtuを含むPIHドメインを持つタンパク質ファミリー(PIHタンパク質)は脊椎動物からクラミドモナスまで広く保存されており、様々な種で軸糸ダイニンの複合体形成を介して繊毛の運動性に関わることが示唆されている。しかし、脊椎動物に存在する4種のPIHタンパク質(Ktu, Pih1d1, Pih1d2, Pih1d3/Twister)が全て繊毛の運動性に関わるのかについては不明であった。我々はゼブラフィッシュを用い、これまでに繊毛運動性への寄与についての報告がなかったPih1d1およびPih1d2についてTALEN法により変異体を作製した。さらに、KtuおよびTwisterについてもモルフォリノオリゴを用いた機能阻害を行い、繊毛運動性について解析を行った。平成26年度は高速度カメラを購入し、クッペル胞上皮細胞の繊毛運動を詳細に解析した(1000コマ/秒)。その結果、Ktuの機能阻害胚では100%の細胞で繊毛が不動となった。一方Twisterの機能阻害胚では約50%の細胞で繊毛が不動となり残りの細胞においても運動性が著しく低下していた。さらに、Pih1d1変異体では運動の速度が40%程度低下すること、Pih1d2変異体では不動(約20%)、不規則な運動性(約25%)、運動性の低下(約55%)の表現型を示すことを明らかにした。したがって、本研究で初めて明らかとなったPih1d1, Pih1d2を含む脊椎動物の4種のPIHタンパク質は全て繊毛の運動性に必要であり、その寄与は遺伝子ごとに異なることが示された。本研究は繊毛不動症候群の原因解明のための重要な知見を提供するものと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。脊椎動物の様々な器官において細胞には繊毛と呼ばれる突出した構造が存在する。中でも運動性繊毛は器官特異的なパターンで運動することで異物の除去や物質の輸送などを行っており、運動性の異常は水頭症・内臓逆位などの複合症(繊毛不動症候群)を引き起こす。しかし、運動性を生み出すモーター分子の軸糸ダイニン(重鎖・中間鎖・軽鎖からなる)が巨大複合体を形成するメカニズムや、器官特異的運動性を生み出す仕組みについては不明である。我々は、運動性繊毛を持つ生物に保存され、軸糸ダイニンの複合体形成を制御するKtuの属するPIHタンパク質ファミリーに注目する。ヒトと同様4種のPIHタンパク質(Pih1d1, Pih1d2, Ktu, Twister)を持つゼブラフィッシュを用い、軸糸ダイニン複合体形成機構の全体像と組織特異的な運動パターンを生み出す分子基盤の解明を目指す。平成25年度は、PIHタンパク質をコードするPIH遺伝子についてアンチセンスオリゴを用いた機能阻害を行い、発生過程で最も早く運動性繊毛が現れるクッペル胞における繊毛の運動性を解析した。その結果いずれの遺伝子の機能阻害胚でも繊毛の運動性に顕著な欠損を示した。また、軸糸ダイニンのうち、外腕ダイニン重鎖の一つDnah9について免疫染色を行ったところ全ての機能阻害胚で繊毛局在が消失していた。したがって、ゼブラフィッシュにおいて4つのPIHタンパク質はいずれも軸糸ダイニンの制御を介して繊毛の運動性に重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、胚発生期におけるPIH遺伝子の発現パターンを詳細に解析した結果、いずれもクッペル胞、尿細管、脳室などの運動性繊毛器官において発現が検出されたが、発現の強さやタイミングについては遺伝子ごとに違いが見られた。今後は各器官におけるPIH遺伝子の発現パターンと機能阻害胚における表現型との関連を探る予定である。

さらに、Pih1d1変異体では運動の速度が40%程度低下すること、Pih1d2変異体では不動(約20%)、不規則な運動性(約25%)、運動性の低下(約55%)の表現型を示すことを明らかにした。したがって、本研究で初めて明らかとなったPih1d1, Pih1d2を含む脊椎動物の4種のPIHタンパク質は全て繊毛の運動性に必要であり、その寄与は遺伝子ごとに異なることが示された。本研究は繊毛不動症候群の原因解明のための重要な知見を提供するものと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、アンチセンスオリゴを用いた機能阻害により、ゼブラフィッシュにおける4種のPIHタンパク質全てが繊毛の運動性に関わることを明らかにすることができた。さらに、外腕ダイニンと呼ばれる軸糸ダイニンの重笹部ユニットの一つであるDnah9について、いずれの機能阻害胚においても繊毛局在が消失していた。繊毛へのタンパク質などの輸送に異常が生じた場合、繊毛そのものが短小化したり欠損することが知られているが、PIH遺伝子の機能阻害胚においては繊毛の長さや密度には異常がなかった。この表現型は既知の軸糸ダイニン複合体形成変異体と類似しており、PIHタンパク質が軸糸ダイニンの複合体形成に寄与することが示唆される。また、各PIH遺伝子の発現パターンの解析から、各運動性繊毛器官においてPIH遺伝子の発現強度やタイミングに違いがあることも見出している。平成25年度には外腕ダイニンの他の重鎖や7種類存在する内腕ダイニンについての局在解析や、クッペル胞以外の運動性繊毛器官におけるPIHタンパク質の役割については研究を行えなかったが、平成26年度にそれらの解析を推進するための解析法の検討などはすでに開始しており、さらにゲノム編集技術を活用したpih1d1およびpih1d2の変異体の作製も完了したことから、初年度の結果としてはおおむね順調であると考えられる。下記13の研究を通じ、PIHタンパク質を介した軸糸ダイニン複合体形成機構と器官特異的運動パターンの制御機構の解明を目指す。1それぞれのPIHタンパク質が制御する軸糸ダイニンの同定:各PIHタンパク質が制御する軸糸ダイニンの種類を明らかにするために、その他の軸糸ダイニンの重鎖に対する抗体作製を継続する。これまでは組換えタンパク質を用いたポリクローナル抗体の作製を行ってきたが、今年度はペプチド抗体の作製も行い、各PIHタンパク質の機能阻害下での局在パターンを解析する。さらに、複数種の軸糸ダイニンにおいて共通している中間鎖や軽鎖にも着目し、タグ付きコンストラクトの強制発現系などをも用いて解析する。まずは昨年度の解析からすべてのPIHタンパク質が運動性に関わることが明らかとなったクッペル胞に着目し、アンチセンスオリゴを用いたノックダウン胚に加えて、TALEN法を用いて作製したpih1d1およびpih1d2の変異体の解析も進める。2PIHタンパク質を介した軸糸ダイニン複合体形成制御機構の理解:現在作製中の各PIHタンパク質に対する抗体を用い、ゼブラフィッシュ胚における免疫染色を行う。細胞骨格や中心体マーカーとの共染色を行うことで、細胞内での軸糸ダイニン複合体形成の場を探索する。3様々な組織におけるPIHタンパク質の繊毛運動性への寄与の解析:各種機能阻害胚や変異体において、クッペル胞・尿細管・神経管・嗅上皮・耳胞などの組織において繊毛の運動性を詳細に観察する。
環境汚染物質の神経毒性に関する生化学的研究

神経系に毒性を有する各種薬物は,その主な作用部位により幾つかのグループに分けることができる.各群の代表的な薬物につきモデル系を作成し,その作用機構をin vivoで解析して来たが,本年度はこれらのうち特にニューロフィラメント蛋白の輸送機構の解析とβ, β'-イミノジプロピオニトリル(IDPN)の作用メカニズムについて得られた結果を中心として報告する.1.ニューロフィラメント蛋白の軸索内輸送機構軸索内のニューロフィラメントは従来,重合したままの形で輸送されると考えられてきた.その主な根拠は視神経軸索内のニューロフィラメント蛋白には脱重合した部分が見出せないことと,ニューロフィラメントは蛋白の輸送パターンが時間が経過しても殆ど変化しないことなどによっていた.このような考えに対して, ^<32P->-オルト燐酸でニューロフィラメント蛋白を標識した実験を行ってみると,脱重合していると思われる可溶性分画がかなり大量に得られ,また坐骨神経運動繊維を用いた長い時間経過の解析からニューロフィラメント蛋白の輸送パターンも,時間の経過にともなって幅が広がり高さが低くなることを見出した.これらのことから軸索内のニューロフィラメント蛋白は重合・脱重合を繰り返していて,脱重合された形で輸送されるという仮説を提出した.2.β, β'-イミノデプロピオニトリル(IDPN)の作用メカニズム^<32P->-オルト燐酸でニューロフィラメント蛋白を標識してみると,通常のスピードで輸送される部分以外に,それよりずっとはやい速度で移動する部分が見出される.この部分の輸送はIDPNによって全く阻害を受けない.通常の速度で輸送される部分も, IDPNによる阻害効果ははるかに弱い.これらの結果からIDPNの作用点は,ニューロフィラメント重合・脱重合変換の阻害にあると考え,実験を進めている.神経系に毒性を有する各種薬物は,その主な作用部位により幾つかのグループに分けることができる.各群の代表的な薬物につきモデル系を作成し,その作用機構をin vivoで解析して来たが,本年度はこれらのうち特にニューロフィラメント蛋白の輸送機構の解析とβ, β'-イミノジプロピオニトリル(IDPN)の作用メカニズムについて得られた結果を中心として報告する.1.ニューロフィラメント蛋白の軸索内輸送機構軸索内のニューロフィラメントは従来,重合したままの形で輸送されると考えられてきた.その主な根拠は視神経軸索内のニューロフィラメント蛋白には脱重合した部分が見出せないことと,ニューロフィラメントは蛋白の輸送パターンが時間が経過しても殆ど変化しないことなどによっていた.このような考えに対して, ^<32P->-オルト燐酸でニューロフィラメント蛋白を標識した実験を行ってみると,脱重合していると思われる可溶性分画がかなり大量に得られ,また坐骨神経運動繊維を用いた長い時間経過の解析からニューロフィラメント蛋白の輸送パターンも,時間の経過にともなって幅が広がり高さが低くなることを見出した.これらのことから軸索内のニューロフィラメント蛋白は重合・脱重合を繰り返していて,脱重合された形で輸送されるという仮説を提出した.2.β, β'-イミノデプロピオニトリル(IDPN)の作用メカニズム^<32P->-オルト燐酸でニューロフィラメント蛋白を標識してみると,通常のスピードで輸送される部分以外に,それよりずっとはやい速度で移動する部分が見出される.この部分の輸送はIDPNによって全く阻害を受けない.通常の速度で輸送される部分も, IDPNによる阻害効果ははるかに弱い.これらの結果からIDPNの作用点は,ニューロフィラメント重合・脱重合変換の阻害にあると考え,実験を進めている.
“スマート”ナノファイバーを用いたアミノ酸再吸収能を示す透析膜の開発

現在行われている慢性腎不全に対する透析療法は透過性の高い透析膜を使用しているために栄養物質の多くが体外へ漏出してしまい、患者の低栄養が課題であった。本申請課題では、慢性腎不全患者の低栄養状態を改善するための新規透析膜の開発に取り組んだ。特に、毒素/栄養素を選択的に吸着させるナノファイバーを作製することで、有用なアミノ酸漏出を阻止し、かつ優れた尿毒素除去性能を示す透析膜の開発を行った。本課題では、慢性腎不全患者の低栄養状態を改善するための新規医用材料の開発に取り組む。特に、血中からのアミノ酸の喪失を抑制し、さらに再吸収させることを優先課題として、血液透析施行時にアミノ酸を特異的に吸着し、返血時にアミノ酸を放出する“スマート"ナノファイバーを組み込んだアミノ酸再吸収型透析膜を開発する。平成26年度は、母体となるナノファイバーの最適な作製法を検討した。ナノファイバーのベースとなる材料として、血液適合性を有し人工材料であるエチレンビニルアルコール共重合体(EVOH)と生体由来材料であるヒト血清アルブミン(HSA)を用い、電界紡糸法によって製膜した。電界紡糸時に高電圧(28 kV以上)をかけることで、細くて機械的強度に優れたEVOHナノファイバーおよびEVOHとHSAを混合したコンポジットファイバーを作製できた。このコンポジット中のHSAの配合比率は最大で20%までは安定に存在できることを確認した。さらに、HSAと11-mercapto-1-undecanolをヘキサフルオロイソプロパノール:水混合溶液に溶解させた紡糸原液を用いることで、HSA単体からなるナノファイバーを製膜できることが明らかになった。HSAナノファイバーをウシ血清中への浸漬実験の結果、血清中でも分解せず安定に存在し、副次効果として、血清中のタンパク結合性尿毒素であるインドキシル硫酸を吸着することが明らかになった。本研究課題では、慢性腎不全患者の低栄養状態を改善するための新規医用材料の開発に取り組む。特に血中からのアミノ酸の喪失を抑制し、人体への再吸収させることを優先課題として、血液透析施工時にアミノ酸を特異的に吸着し、返血時にアミノ酸を放出するスマートナノフィバーを組み込んだアミノ酸再吸収型透析膜を開発する。これまで母体となるナノファイバーの製膜条件を詳細に検討してきた。平成27年度では、ターゲットとなるアミノ酸の吸着能を検討した。ナノファイバーのベースとなる材料として、血液適合性材料であるエチレンビニルアルコール共重合体(EVOH)を使用した。アミノ酸や尿毒素の吸着剤として、1生体由来材料のタンパク質、2無機のゼオライト、3有機材料からなるマレイン酸反応物、をそれぞれ検討した。ナノファイバーの製膜には電界紡糸法を用いた。電界紡糸時の濃度と電圧を制御することによって、外径1000nm未満でかつ機械的強度に優れたナノファイバーが製膜できた。また、生体由来材料ではタンパク結合性尿毒素、無機材料では水溶性尿毒素、有機材料では低分子タンパク質の吸着が可能であった。一方、アミノ酸吸着能に関しては、除去能は不十分であったが有機材料が有望と考えられた。今後は有機材料で詳細に検討する。初年度ではナノファイバーの製膜を、次年度では様々なリガンドに対する尿毒素・栄養素の吸着に関する知見を得ることができた。当初の計画通り推移している。今後は特に有機材料をリガンドとしてアミノ酸吸着の特異度を高めた材料合成を検討していく。慢性腎不全患者は低栄養状態になりやすく、その原因の一つとして1透析治療中での血中アミノ酸喪失(1回の治療につき515 g程度)2タンパク結合性尿毒素を中心とする透析不足、が挙げられている。そこで本研究課題では、慢性腎不全患者の低栄養状態を改善するための新規医用材料の開発に取り組んだ。特にアミノ酸や尿毒素等を選択的に吸着/脱着する機能を持つスマートナノファイバーの開発を行った。ナノファイバーの母体となるポリマーにはエチレンビニルアルコール共重合体などの生体適合性高分子を用いた。エレクトロスピニング法によりナノファイバーを製膜した。製膜時に吸着材を適切な条件で混合することで、ファイバー内にほぼ均一に配合できることが明らかになった。親疎水性や極性の有無など多種多様なアミノ酸/尿毒素への吸着を可能とするため、様々な無機粒子・高分子粒子をナノファイバー中に導入した。ゼオライトや活性炭といった無機粒子は製膜が容易であり、ファイバー中でも優れた吸着性能を示すことが明らかになった。また、ファイバー自身に機能を持たせる観点から、優れたタンパク質結合性尿毒素への吸着能を示すアルブミンを用いてナノファイバーの製膜を試みた。エレクトロスピニング法を用いた製膜後に適切な架橋剤を用いることでアルブミンを原料とするナノファイバーの製膜に成功した。本手法によりナノファイバーを精密設計することで、様々な血中物質への吸着剤としての応用が期待できる。初年度の基礎検討においてナノファイバーの製膜に関する知見を得ることができ、当初の計画通り推移している。今後は、アミノ酸を特異的に吸着・脱着するスマートナノ粒子の合成法について検討していく。有機材料からなるアミノ酸特異的リガンドを作製する。

特に1マレイン酸を母体とする材料、2カルボキシイソプロピルアクリルアミドを母体とする材料、3オリゴエチレングリコールメタクリレートを母体とする材料の三種類で検討する。作製したリガンドをエチレンビニルアルコール共重合体(EVOH)ナノファイバーに加工し、アミノ酸吸着・脱着ナノファイバーを作製、性能を検討する。生体医工学アミノ酸吸着ナノ粒子を温度応答性高分子から合成する。まず様々な官能基を側鎖に有する、1N-イソプロピルアクリルアミド型と2オリゴエチレングリコールメタクリレート型の二種類のモノマーを合成する。得られたモノマーと架橋剤、アミノ酸を混合し、沈殿重合によりナノゲル粒子を作製する。対象とするアミノ酸としてグルタミン酸、トリプトファン、ロイシンを用いる。得られたナノ粒子は、TEMやAFM、DLS等で構造や粒径、温度応答性、アミノ酸吸着特性を網羅的に評価する。