hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
性決定カスケードとエクダイソンシグナルのクロストークによる性分化機構の解明

本研究課題では、昆虫の代表的なステロイドホルモンとして知られるエクダイソンが、昆虫の性分化の制御に関与するか、また、関与するのであればその作用機序はいかなるものであるかという点を明らかにすることを目的とする。これまでの研究により、DMドメインをもつ転写因子DMRTの一つdmrt93Bがカイコの精巣で特異的に発現すること、その発現がエクダイソン刺激により増加すること、TALENを用いたG0体細胞モザイク変異解析により精子の成熟や雄の内部生殖器の形成に関わることを明らかにしてきた。平成30年度は、dmrt93Bの機能をより詳細に調べるため、dmrt93Bの欠失変異ホモ系統を複数作製し、その表現型を観察した。その結果、dmrt93Bをホモにもつ個体は全て胚発生の後期(点青期から催青期)に致死することが判明した。この結果から、dmrt93Bは性分化のみならず胚発生にとって必須の役割をもつことが明らかとなった。dmrt93B変異体の致死を避けるため、タンパク質コード領域内の下流付近を標的としたTALENを実施し、新たに変異体を作出することにした。その結果得られたG0体細胞モザイク変異体の表現型は、前回同様雄の内部生殖器の形成不全をもたらし、付属線、貯精嚢、輸精管の欠損が認められた。現在、in-frameで欠失変異をもつ個体のホモ化を行っているところである。一方、dmrt93Bの発現部位をより詳細に調べるため、精巣の凍結切片標本を用いたISHを行った。その結果、dmrt93Bは精巣被膜と精巣内部に見られる無名の組織において強く発現することが明らかとなった。様々な発育時期の精巣の切片標本を作製し、HE染色により観察した結果、この無名の組織は輸精管の原基に相当することが予想された。以上の結果から、dmrt93Bが輸精管の分化に関わると考えられた。平成30年度は、平成29年度の研究において作出した複数のdmrt93B欠失変異系統をホモ化し、それらの表現型を観察することで遺伝子の機能解析を行う予定であった。また、これらホモ変異体の精巣と野生型の精巣におけるトランスクリプトームとプロテオームを比較解析することで、dmrt93Bの標的候補遺伝子やdmrt93Bの制御下で生合成されるペプチド成分を同定する予定であった。しかし、dmrt93B欠失変異ホモ個体はいずれの場合も胚発生の段階で致死することが判明したため、当初予定していたこれらの解析を実施することができなかった。以上の点を踏まえ、平成30年度の研究進捗状況を「やや遅れている」と自己評価した。dmrt93Bは精巣特異的な発現を示すため、そのホモ変異体が胚発生の段階で致死を示すことは予想外の事態であった。この予想外の事態に対応するため、dmrt93B遺伝子のタンパク質コード領域内の下流付近を標的としたTALENを実施し、新たに複数の変異体を作出した。今回はin-frame欠失変異も解析対象に含めることにより、表現型に及ぼす影響がより弱い変異体が得られることを期待している。変異体を用いた解析が進まなかったため、in situ hybridization(ISH)による組織化学的解析を実施することにした。5齢幼虫期の精巣の凍結切片標本を用いたISHにより、dmrt93Bは精巣被膜と精巣内の無名の組織において強く発現することが明らかとなった。生殖器原基の著しい発達が起こる蛹期における精巣を用いて凍結切片標本を作製し、HE染色に供試した結果、この無名の組織が輸精管に分化する様子を捉えることができた。以上、これまでの研究成果をまとめると、dmrt93Bは精巣被膜と輸精管原基で発現し、エクダイソンの刺激により精巣及び輸精管の発達を促進することが明らかとなった。平成30年度の研究により作出したdmrt93B欠失変異系統を交配し、ホモ変異体の作製を成功させる。得られたホモ変異体の精巣と野生型の精巣におけるトランスクリプトームとプロテオームを比較解析することで、dmrt93Bの標的候補遺伝子やdmrt93Bの制御下で生合成されるペプチド成分を同定する。抗DMRT93B抗体を作製し、ChIP-seq解析を行うことにより、dmrt93Bの直接制御下にある遺伝子を特定する。また、平成30年度の研究により発見した輸精管原基の分化がエクダイソンの刺激により誘導されることを確認するため、精巣を用いた組織培養系を構築し、エクダイソン添加/無添加条件下における輸精管の発達の度合を測定する。この組織培養系にdmrt93B欠失ホモ変異体の精巣を供試することにより、エクダイソン刺激による輸精管の発達にdmrt93Bが必要であることを確認する。平成29年度の研究により、精巣におけるdmrt93Bの発現量がエクダイソン刺激により増加すること、これに関連してdmrt93Bの転写開始部位の上流にはエクダイソン応答性シスエレメント(EcRE)様配列が複数存在することがわかったため、dmrt93Bの発現がエクダイソン受容体EcRの直接制御下にあるかどうかを実験的に検証する。このためにカイコ培養細胞を用いたレポーターアッセイや抗EcR抗体を用いたChIP-qPCRを行い、dmrt93B転写開始部位上流に見いだされたEcRE様配列とEcRとの間に相互作用が見られるか確認する。

dmrt93Bを中心とするエクダイソン応答経路と性決定カスケードとの間に遺伝的相互作用があるか否か明らかにするため、dmrt93Bホモ変異体における性決定遺伝子(Masc及びBmdsx)の発現量、並びにMasc過剰発現個体、Bmdsx欠失変異ホモ個体におけるdmrt93Bの発現量を定量する。本研究では、一般に昆虫の脱皮・変態に関わることが知られるエクダイソンが、昆虫の性決定や性分化に関わるか明らかにすることを最終的な目標としている。エクダイソンが性的二型形質の分化促進に関わる例は知られている。たとえば精子の成熟や雄の生殖器原基の分化にはエクダイソンによる刺激が欠かせない。しかし、エクダイソンがどのような分子メカニズムでこのような性分化に加担するのか、全く明らかにされていない。この点を明らかにするためには、エクダイソンの標的因子であり、なおかつ性分化に関わる機能をもつ因子を探索することにした。DMドメインと呼ばれるDNA結合ドメインをもつ転写因子DMRTは多くの動物において雄分化に関与することが知られている。また、昆虫の姉妹群である甲殻類のDMRTであるDMRT93Bは、ミジンコの雄化を誘導する幼若ホルモンの刺激に応じて発現量が増大することが知られている。そこでカイコのdmrt93Bを同定し、TALENによるノックアウトを試みたところ、精巣の萎縮や精子成熟の遅延、雄の内部生殖器の形態的異常を示す個体が得られた。また、dmrt93Bは精巣において特異的に高発現すること、興味深いことにその発現動態はエクダイソン濃度の増減に呼応するかのようなパターンを示すことが明らかになった。そこで精巣におけるdmrt93Bの発現がエクダイソン刺激により増加することを組織培養実験により確認したところ、dmrt93Bの発現量は培地に添加したエクダイソン類縁体(ポナステロンA)の濃度依存的に増加することが判明した。以上の結果から、dmrt93Bがエクダイソン刺激に応じて雄の生殖器官や生殖細胞の性分化に寄与する可能性が示唆された。本研究では、エクダイソンの制御下にあり、なおかつ性分化に関わる因子を同定できるかどうかが鍵となっている。そのような因子を同定するため、当初の予定ではRNA-seqによる雌雄で異なる発現を示す遺伝子を網羅的に同定し、なおかつそれらの中からエクダイソンに応答する遺伝子を探索し、さらにRNAiやCRISPR/Cas9による機能解析を行うことで候補遺伝子の絞り込みを行うことを計画していた。しかし、このようなアプローチは目的とする遺伝子に到達する上で時間をようするばかりでなく、必ずしも目的とする遺伝子の同定には至らない可能性がつきまとう。そこで申請者らは、過去の知見を活かしてあらかじめ候補遺伝子を絞り込み、それらの機能をノックアウト実験により明らかにしておこうと考えた。そこで着目した遺伝子が動物界において雄分化に関わる転写因子として広く保存されているDMRTであった。昆虫のDMRTが性分化に関わることを報じた投稿論文は存在せず、我々がカイコゲノムから同定したDMRTオルソログが性分化に関わるか確信がもてなかったが、3つのDMRTのうちDMRT93Bが精巣の発達や精子の成熟、雄の内部生殖器官の分化に必要であることを明らかにすることができた。しかも、その発現量の推移を調べたところ、体液中のエクダイソン濃度に依存するかのような発現パターンを示したことから、エクダイソンに応答することが期待された。
高圧・超希薄予混合気の自着火燃焼機構研究

希薄予混合気の自着燃焼機構を明らかにするため,燃焼室内全域が可視化された機関を用いた実験及び燃焼解析を行った.特に,以下の点を調査した.(1)希薄予混合圧縮着火(HCCI)における急激な燃焼と燃焼室内圧力振動を伴う異常燃焼機構(2)フーリエ変換赤外分光(FT-IR)式ガス分析及び素反応数値解析を用いた,希薄予混合気の自着火燃焼過程.その結果,異常燃焼発生時の,燃焼室内での火炎の発現挙動の特徴を明らかにした.また,自着火燃焼時の反応プロセスとして,各温度場における燃料の消費,中間生成物の生成と消費,最終生成物の生成挙動とその素反応プロセス明らかにした.本研究では,高圧・超希薄予混合気の自着火燃焼メカニズムを解明するために,連続的に急速に可燃混合気を圧縮し,自着火させる装置を用いた実験を行った.<研究内容>(1)燃料と空気の混合割合を変化させた際の自着火燃焼火炎の発現形態観察(2)吸気される混合気の温度を変化させた際の自着火燃焼火炎の発現形態観察(3)自着火炎発現と筒内発光挙動との関係(4)過給機で混合気を加圧して吸入した際の自着火燃焼と,その際の排ガスの多成分分析による反応生成物の調査<研究手法>以下の手法で,高圧場における自着火反応特性を詳細に調べた.(1)高速度カメラを用いた燃焼火炎挙動の高速度撮影(2)分光測定装置を用いた燃焼室内ガスの発光強度解析(3)分光測定装置を用いた燃焼室内ガスの吸光解析<得られた主たる結論とその意義>(1)当量比と吸気温度の変化によって,燃焼室内での自着火燃焼の局所的な発現状況が変化する.それに伴って,燃焼の激しさが変化する事が明らかになった.(2)筒内で,自着火に伴い青色の火炎が観測されると同時に,火炎発光強度の増大が確認される.つまり,発光分光計測の結果と可視化結果が良く対応することを確認した.(3)当量比や吸気温度の増加により,より急激な自着火燃焼が発生する.また,条件によっては燃焼室内に強い圧力波が発生し,燃焼室内を高速で往復する異常燃焼現象が生ずることを明確にした.(4)燃焼の最高温度の変化に応じて,様々な反応生成物が生じるが,そのガス成分を実際に分析することができた.例えば,燃焼温度が低下していくにつれて,CO2がCOに,COがホルムアルデヒド(HCHO)に変化する.このように,燃焼反応により生成物がどのように変化していくのかを明らかにすることができた.以上の結果は,実用燃焼器での燃焼制御,異常燃焼を抑制する設計をするのに有用な知見になると考える.希薄予混合気の自着燃焼機構を明らかにするため,燃焼室内全域が可視化された機関を用いた実験及び燃焼解析を行った.特に,以下の点を調査した.(1)希薄予混合圧縮着火(HCCI)における急激な燃焼と燃焼室内圧力振動を伴う異常燃焼機構(2)フーリエ変換赤外分光(FT-IR)式ガス分析及び素反応数値解析を用いた,希薄予混合気の自着火燃焼過程.その結果,異常燃焼発生時の,燃焼室内での火炎の発現挙動の特徴を明らかにした.また,自着火燃焼時の反応プロセスとして,各温度場における燃料の消費,中間生成物の生成と消費,最終生成物の生成挙動とその素反応プロセス明らかにした.平成24年度は,交付申請書に記載した当該年度の研究目的に従い,連続急速圧縮燃焼装置を用いた超希薄予混合気の自着火燃焼実験を行った.具体的には,以下の実験的研究を行った.<具体的研究内容> (1)当量比を変化させた際の自着火燃焼火炎の発現形態観察(2)吸気温度を変化させた際の自着火燃焼火炎の発現形態観察(3)自着火炎発現と筒内発光挙動との関係(4)急激な燃焼及び失火発生時の燃焼可視化<研究手法>以下の手法で,高圧場における自着火反応特性を詳細に調べた.(1)高速度カメラを用いた燃焼火炎挙動の高速度撮影(2)分光測定装置を用いた燃焼室内ガスの発光強度解析(3)反応数値計算による解析<得られた主たる結論とその意義>(1)当量比と吸気温度の変化によって,燃焼室内での自着火燃焼の局所的な発現状況が変化する.それに伴って,燃焼の激しさが変化する事が明らかになった.(2)筒内で,自着火に伴い青色の火炎が観測されると同時に,火炎発光強度の増大が確認される.つまり,発光分光計測の結果と可視化結果が良く対応することを確認した.(3)当量比や吸気温度の増加により,より急激な自着火燃焼が発生する.また,条件によっては燃焼室内に強い圧力波が発生し,燃焼室内を高速で往復する異常燃焼現象が生ずることを明確にした.以上の結果は,実用燃焼器での異常燃焼抑制設計に有用な知見になると考える.交付申請書において,平成24年度の研究実施計画として掲げたのは以下の点である.連続急速圧縮燃焼装置を用いて高圧場における超希薄予混合気の自着火燃焼実験を行い,以下の項目を調査する.(1)当量比を変化させた際の自着火燃焼火炎の発現形態観察(2)自着火炎発現と筒内発光スペクトル,吸収スペクトルの関係

(3)急激な燃焼及び失火発生時の燃焼観察ここで,(1)については,当量比に加えて吸気温度を変化させた際の燃焼可視化と分光測定を行い,緩慢な自着火燃焼と急激な自着火燃焼とでは筒内火炎の局所的な分散度合いが大きく異なることを明白にした.さらに,筒内の未燃部で急速な自着火が起こることによって,筒内圧力振動を伴う異常な燃焼が生ずることと,それによってもたらされる圧力振動の挙動等を定量化することができた.この点に関しては,想定していた結果に加え,さらに掘り下げた新たな研究内容を見出すことができたことから,当初の計画以上の進展と言える.(2)については,主に発光計測を行い,火炎発現挙動と発光挙動の同時計測データを取得した.吸収測定については,優先順位が低いと判断し,十分な実験をしていない.次年度は,自着火前の挙動を含めて,詳しい解析を実施予定である.その際は,吸収測定が必要と考えている. (3)については,特に急激な燃焼発生時の燃焼観測において十分なデータを取得することができた.失火状況では,十分な火炎輝度が得られず,高速度カメラで火炎を捉えるのが困難であることが明らかになった.これについては,今後の課題である.シャドーグラフ法またはシュリーレン法による高速度撮影によって,失火時の燃焼挙動を捉えられると考えている.以上を踏まえ,項目によっては計画以上に進展しているが,総合的には,おおむね順調に研究が進展していると判断した.平成24年度の研究は,主として自着火後の燃焼状態を詳しく解析する事を主目的としており,また,上述の通り,おおむね目標を達成することが出来た.加えて,圧力振動を伴う異常燃焼現象など,当初の想定よりもさらに進んだ内容の研究項目を見出すにいたった.平成25年度は,当初計画していた通り,前年度までの結果を元にフーリエ変換赤外分光法(FTIR)を用いたガス分析により,燃焼室内の中間生成物の生成及び消費挙動を分析する.分光測定データとガス分析結果を比較し,さらに反応動力学数値解析によって素反応レベルでの現象解釈を行うことで,超希薄予混合気の自着火燃焼プロセスを解明する.高圧・希薄予混合自着火燃焼を連続的に実施しつつ,初期温度,吸気量,燃料量などを変化させることで最高到達温度を任意に変化させ,各条件での排ガス成分をFTIRで分析する.それにより,各最高温度毎にどのような化学種が生成されているかを解析する.この方法で,各反応が進行する様子を明らかにすることが出来る.加えて,筒内の発光や吸光の分光測定を同時に実施することで,筒内高速分析データとの対応を明らかにする.さらに,反応動力学数値解析によって,素反応レベルでの反応挙動を解析し,FTIR分析データとの比較検証を行う.これにより,高圧・超希薄予混合気の自着火燃焼機構を素反応レベルで明らかにする.次年度に使用予定の研究費は,平成24年度の研究課題において引き続き検討する必要がある,自着火の可視化実験用として,可視化や分光測定用の石英製観測窓の調達に充てる計画である.平成25年度に請求する研究費は,機器備品として圧力測定器を購入予定である.その他,石英観測窓,燃料,装置消耗部品等に加え,化学反応数値解析ソフトウェアのライセンス料,学会での成果発表,調査費用等に使用する計画である.
アデノシン作動葉による胎児脳低温の導入

本年度はヒツジ胎仔慢性実験モデルを用いて以下の実験を行った.1.妊娠125日前後のヒツジ胎仔の脳内に埋め込み型脳温測定器,頚動脈に採血用カテーテルを装着しヒツジ胎仔慢性実験モデルを作成した.2.術後4日目に胎児頚静脈よりアデノシン輸送阻害剤であるプロペントフィリンを前投与した後,臍帯圧迫による低酸素モデルを作成し,アデノシンの胎児低酸素ストレスに対する脳保護効果について脳温変化から検討した.以上の実験を完成させ,その成果を日本産科婦人科学会雑誌に投稿し受理された.本年度はヒツジ胎仔慢性実験モデルを用いて以下の実験を行った.1.妊娠125日前後のヒツジ胎仔の脳内に埋め込み型脳温測定器,頚動脈に採血用カテーテルを装着しヒツジ胎仔慢性実験モデルを作成した.2.術後4日目に胎児頚静脈よりアデノシン輸送阻害剤であるプロペントフィリンを前投与した後,臍帯圧迫による低酸素モデルを作成し,アデノシンの胎児低酸素ストレスに対する脳保護効果について脳温変化から検討した.以上の実験を完成させ,その成果を日本産科婦人科学会雑誌に投稿し受理された.本年度はヒツジ胎仔慢性実験モデルを用いて以下の実験をおこなった.1)ヒツジ胎仔慢性実験モデルの作成妊娠125日前後のヒツジ胎仔の脳内に埋め込み型脳温測定器,頸動脈に採血時カテーテルを装着しヒツジ胎仔慢性実験モデルを作成した.2)アデノシンtranport阻害剤が脳温に与える影響の検討術後4日目に,胎児珪静脈よりアデノシンtransport阻害剤であるプロペントフィリンを注入した後、臍帯圧迫による低酸素虚血モデルを作成し,アデノシンの低酸素虚血ストレスにたいする脳組織保護効果につき検討した.以上の実験で,アデノシンによって低酸素ストレス中の脳温(脳血流)維持効果が評価された.本年度は,プロペントフィリンが胎児低酸素症における脳温変化におよぼす影響を解析するために以下の実験を行い,その成果を日本産科婦人科学会雑誌に投稿氏,受理された.11頭の妊娠120-127日(term=147日)のヒツジを2%ハロセン麻酔下に手術を行い,胎仔頚動脈を通して上行大動脈に温度センサーと血圧測定および採血用のカテーテルを挿入,プロペントフィリン注入用のカテーテルを胎仔頸静脈に挿入した.さらに胎仔の頭蓋骨を通して2つの温度センサー(IT-23,Physitemp)を左大脳皮質に装着した.実験は,コントロール群(n=6)では,70分の観察の後オクルーダーに生理食塩水を5-8mL急速に注入することによる臍帯圧迫5分間を30分間歇で4回実施,以後,1時間の回復期の観察をおこなった.また,プロペントフィリン群(n=5)では約20分の観察後,プロペントフィリン(0.01mg/kg/min)を38°Cの生理食塩水に溶解し,0.05mL/分のスピードで60分間胎仔頸静脈より注入した.注入終了5分後から前述の5分間臍帯圧迫・30分間解放を4周期実施した.成績として,(1)プロペントフィリン群では1回目の臍帯圧迫ではコントロール群と比較して胎仔核温の上昇が軽度で,また有意差はないものの脳温の軽度上昇を認め,その結果コントロール群のような胎仔脳温・核温差の低下が認められなかった.また,(2)4回目の臍帯圧迫時は両群とも同様の胎仔核温・脳温差の低下を認めたが,圧迫解放後の脳温・核温差の回復時間に差が認められた.
高機能性材料を内包可能な単分散ポリマー微粒子合成法の開発

外部磁場応答性をもつマグネタイトナノ粒子をポリマー粒子中に包含した磁性ポリマー複合粒子の作製を行った。複合化に用いるマグネタイト粒子は,ポリマー粒子との親和性を高めるために,シランカップリング剤による表面改質を行った。シランカップリング反応を行う溶媒としては,水やエタノールよりも極性が低く,かつ塩基性触媒としての作用も兼ねそなえたジエチルアミンを用いた。シランカップリング剤(メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン)で表面改質したマグネタイト粒子を,ソープフリー乳化重合によってポリマー粒子が形成されている重合系に添加することにより,サブミクロンサイズの複合粒子を作製できた。磁性ナノ粒子をポリマー粒子に内包した磁性ポリマー複合粒子は、外部磁場応答性をもつことから、タンパク質やDNA、ウィルスなどを分離・分析するための担体としての応用が見込まれている。さらに、高精度定量分析に向けた応用では、磁場に応答するだけでなく、個々の複合粒子が均一に磁場に応答できることも求められている。本研究では、磁性ナノ粒子として粒径10nm程度のマグネタイト(Fe3O4)粒子を用いている。マグネタイト粒子は、その表面にヒドロキシ基を持つため、水との親和性が高い一方で、ポリマー粒子中に包含するためには表面に疎水性の官能基を付与する必要がある。さらに、ポリマー粒子に内包させる過程において、個々のマグネタイト粒子を溶媒あるいはモノマー中で良好に分散させておく必要があり、その方策として、シランカップリング剤によるマグネタイト粒子の表面修飾を検討した。シランカップリング剤は、アルコキシ基の加水分解、続いてマグネタイト粒子表面にあるヒドロキシ基との脱水縮合によって粒子表面へ付与されるが、加水分解および脱水縮合反応を促進するために、塩基性触媒が用いられることが多い。塩基性触媒としては、一般的にはアンモニアが用いられるが、本研究ではルイス塩基であるジエチルアミンを用いた。ジエチルアミン中におけるシランカップリング反応により、マグネタイト粒子表面にフェニル基、ヘキシル基、メタクリロキシ基などの種々の官能基を導入でき、これらの表面修飾マグネタイト粒子はトルエンなどの有機溶媒への分散性が極めて高いことがわかった。今後は、これらのマグネタイト粒子を用いて磁性ポリマー複合粒子を作製し、さらに、複合粒子表面に糖鎖などの機能性物質を導入することを計画している。金属や金属酸化物などの無機材料は、一般に磁性、誘電性、蛍光性など多様な機能を有する。このような無機材料をナノサイズ化した無機ナノ粒子は、そのままの状態では凝集や劣化などを起こしやすいことから、ナノ粒子をポリマー等の粒子に内包して安定な状態で利用することが求められる。本研究では外部磁場応答性をもつ代表的なナノ粒子であるマグネタイト(Fe3O4)粒子をポリマー粒子中に包含した磁性ポリマー複合粒子の作製に関する研究を実施した。複合粒子を作製する際に重要であるのは、無機ナノ粒子とポリマー間の親和性の向上である。その方策として、ジエチルアミン中でのシランカップリング剤によるマグネタイト粒子の表面改質を検討した。ルイス塩基性触媒であるジエチルアミン中におけるシランカップリング反応により、マグネタイト粒子表面にフェニル基、ヘキシル基、メチル基、グリシドキシ基、メタクリロキシ基などの種々の官能基を導入でき、これらの表面修飾マグネタイト粒子を用いて、磁性ポリマー複合粒子の作製に成功した。水溶媒中におけるソープフリー乳化重合系では、メタクリロキシ基を導入したマグネタイト粒子を用いて複合粒子を作製できた。一方、水/メタノール混合溶媒中における分散重合系では、グリシドキシ基を導入したマグネタイト粒子が最も良好に複合化された。さらに、モノマー中に直接マグネタイト粒子を分散させて複合化する場合には、フェニル基のような疎水性が高い基をもつシランカップリング剤処理が有効であった。これまで、ソープフリー乳化重合を用いて、粒径10nm程度の磁性ナノ粒子(マグネタイト粒子)をポリマー微粒子内部に包含した複合粒子を合成してきた。本手法の特長としては、界面活性剤を使わずに、大きさの揃った(単分散)複合粒子をワンポット合成で得ることができる点にある。しかし、これまで本法で合成可能な複合粒子のマグネタイト粒子包含量は限られており、マグネタイト粒子の包含量を増やすことが課題であった。マグネタイト(Fe3O4)粒子は、その表面にOH基を持つため、水との親和性が高い一方で、ポリマー粒子中に包含するためには表面に疎水性の官能基を付与する必要がある。その方策として、様々な有機官能基をもつシランカップリング剤による表面処理を検討した。

シランカップリング剤は、アルコキシ基の加水分解、続いてマグネタイト粒子表面にあるOH基との脱水縮合によって粒子表面へ付与されるが、加水分解および脱水縮合反応を促進するためには、塩基性触媒が用いられることが多い。塩基性触媒としては、一般的にはアンモニアが用いられるが、本研究ではルイス塩基であるジメチルアミンを用いた。ジエチルアミンを塩基性触媒かつ溶媒として利用することで、反応系を極力簡素化することが可能であり、かつ、反応速度を適切に制御可能となるようである。フェニル基をもつシランカップリング剤で表面処理したマグネタイト粒子は、スチレンモノマーへの分散性がよく、バルク重合を試みたところ、マグネタイトが均一に分散したポリスチレンが得られた。さらに、この表面処理の手法は、ナノサイズのシリカ粒子にも適用することができた。マグネタイトと同様、粒子表面にOH基があり親水性であるシリカ粒子を、シランカップリング剤で処理することにより、有機溶媒へ良好に分散させることができた。磁性ポリマー複合粒子の合成法としては、予め作製したポリマー粒子表面に磁性ナノ粒子を付与する手法が主流であるが、この手法では、磁性ナノ粒子が存在するのはポリマー粒子表面のみであり、ナノ粒子含有量の高い複合粒子は期待できない。また粒子表面の磁性ナノ粒子が脱離する可能性もある。一方、磁性ナノ粒子共存下でポリマー粒子を重合する手法では、磁性ナノ粒子はポリマー粒子内部に取り込まれ、ナノ粒子含有率の高い複合粒子の作製が期待できる。ここで、ポリマー粒子重合中に磁性ナノ粒子を取り込ませるには、溶媒およびモノマー中において分散安定な磁性ナノ粒子の作製が必須である。溶媒およびモノマー中への分散のためには、ナノ粒子の表面に疎水性官能基を導入する方法が知られているが、本研究ではトルエンのような無極性溶媒中においても分散安定性が良好な磁性ナノ粒子の作製に成功した。さらに、この表面修飾の手法をシリカナノ粒子などにも適用できることがわかり、磁性ナノ粒子以外の機能性ナノ粒子を内包したポリマー粒子合成へ応用できると考えている。ソープフリー乳化重合では、ポリマー粒子形成機構に基づき、成長過程にある単分散なポリマー粒子にマグネタイト粒子を取り込ませ、その後もポリマー粒子を静電的に安定な状態で成長させることによって、単分散な複合粒子を合成してきた。しかし、ポリマー粒子の成長過程においてマグネタイト粒子を添加可能な時期は限られているため、マグネタイト粒子含有率の向上が難しかった。そこで、スチレンモノマーに予めマグネタイト粒子を分散させておき、それを水溶媒中でサブミクロンサイズ程度まで粉砕したモノマー油滴をそのまま重合する方法によって、マグネタイト粒子の高含有率化および含有率の均一化を検討することを考えた。そのためにまず、フェニル基をもつシランカップリング剤によってマグネタイト粒子の表面処理を行ったところ、マグネタイト粒子をスチレンモノマー中に良好に分散できた。さらに、そのままバルク重合した後も(粒子の形状ではないものの)ポリスチレン中でのマグネタイト粒子の分散性が維持された。
視床下部室傍核CRFニューロンによる交感神経活性化：脳脊髄神経路の同定と機能解析

視床下部室傍核(PVH)に存在するコルチコトロピン放出因子(CRF)産生ニューロンは視床下部-下垂体-副腎(HPA)系のみならず及び交感神経系を活性化しストレスから生体を防御する.最近我々は,PVHのCRFニューロンが正中隆起以外にも複数の脳内領域に直接投射することを発見した.本研究ではCRF遺伝子ターゲティング法により開発されたマウスと光遺伝学の手法を用い,CRFニューロンー交感神経系神経路の同定や交感神経活動への関与を検討する。さらにCRF受容体1型・2型のいずれが上記に関与するかを検討する。これらの研究によりストレス性高血圧発症・増悪のメカニズムを解明し新たな治療法開発の基礎を築く.視床下部室傍核(PVH)に存在するコルチコトロピン放出因子(CRF)産生ニューロンは視床下部-下垂体-副腎(HPA)系のみならず及び交感神経系を活性化しストレスから生体を防御する.最近我々は,PVHのCRFニューロンが正中隆起以外にも複数の脳内領域に直接投射することを発見した.本研究ではCRF遺伝子ターゲティング法により開発されたマウスと光遺伝学の手法を用い,CRFニューロンー交感神経系神経路の同定や交感神経活動への関与を検討する。これらの研究によりストレス性高血圧発症・増悪のメカニズムを解明し新たな治療法開発の基礎を築く.
深海底微生物によるセレン、テルルオキサニオンの単体元素化回収

セレン・テルルはレアエレメントとしての希少性があり、廃液、廃棄物中からの有効な再資源化手法の確立が望まれている。毒性の高いセレン・テルル酸化物を常温・常圧下のマイルドな条件での変換・回収が期待されている。本研究では、深海底由来の微生物による効率的なセレン・テルル回収法の開発を目的として、深海底からセレン・テルル還元能を有する微生物を探索した。また、得られた分離株の同定、培養特性の調査、ナノ微粒子の形成可能性、更には形成微粒子に対する観察、元素分析などを実施した。分離株は元素体セレン・テルル形成が可能であり、銀などのレアエレメントの微粒子の合成にも利用できることが示唆された。昨年度、新規の微生物株の獲得など良好な結果が得られたため三陸沖の日本海溝6千メートル級の深海底からセレン・テルルオキサニオン還元能を有する微生物の探索について、昨年度から継続して研究を継続した。これと平行して、特に、本年では深海底のみならず浅海の海洋泥や生物試料などから新たに目的微生物株の探索を実施した。昨年度、好気的にセレン・テルルオキサニオンが還元できる分離株の存在が判明した事実を受けて、同化的なプロセスによるカルコゲン元素の還元可能性について新たに着想した。その結果、好気的な条件でセレン(テルル)オキサニオンを還元できる多くの分離株が獲得でき、TEM/EDS観察・分析によってセレン・テルルナノ微粒子の合成・変換が確認できた。この結果から、ほぼすべての微生物によるセレン・テルルナノ微粒子の合成・変換の可能性が示唆されるものであり、異化代謝によってセレンオキサニオンを還元する(従来の)既存株とは異なり、硫黄やセレンの同化代謝によって高効率かつ簡便にセレンオキサニオンを還元できる可能性が明らかになった当該研究の進展の必要性があると思われた。なお、当初の得られた分離株に対するキャラクタリゼーション、培養特性、形成されたナノ微粒子の観察、元素分析も引き続き実施した。また、本年度、優先的に行われたバイオリアクターの作製では連続・循環型の他に、(バフッル用いた)バッチ方式についても検討し、セレンの回収が可能であることが明らかにした。さらに、得られたセレン・テルルオキサニオン還元に関与する分子種の特定、還元機構の解明に向けた研究については、16SrDNA一部の分離株がShewanella属に属する新種の微生物種であることが判明した。これらの分離株による銀、パラジウムなど貴金属元素の単体ナノ微粒子への変換についても研究を行い、銀微粒子の形成が示唆される結果を得ることができている。セレン・テルルはその元素材料としての重要性からレアエレメントとしての希少性があり、廃液、廃棄物中からの有効な回収、再資源化手法の確立がのぞまれている。とりわけ、生物的手法は微生物の酸化還元による手法では、毒性の高いセレン・テルルの酸化物(セレン・テルルオキサニオン)を常温・常圧下のマイルドな条件で元素体のセレン・テルルにまで変換できる。そこで、微生物による効率的なセレン・テルル回収法の開発を目的として、三陸沖の日本海溝6千から7千メートルの深海底からセレン・テルルオキサニオン還元能を有する微生物を探索し、得られた分離株に対するキャラクタリゼーション、培養特性、形成されたナノ微粒子の観察、元素分析を実施した。これらの研究結果を通じて、6千から7千メートルの深海底からセレン・テルルオキサニオンを還元しながら生育できる微生物であることが明らかとなった。得られた分離株は亜セレン、もしくはテルル酸を嫌気、好気の両条件で還元しながら増殖し、菌体内や菌体近傍に電子密度の高いナノ微粒子を形成することが透過型電子顕微鏡(TEM)によって明らかにされた。形成されたナノ微粒子は亜セレン酸還元性の分離株では、球状で50から200nmの大きさを有しており、エネルギー分散型元素分析装置(EDX)による元素分析によってほぼセレンのみで構成されていた。これに対してテルル酸還元性分離株の場合では、TEM観察EDX解析によって、ほぼテルルで構成されている幅が数ナノメートルで10から200nmの長さを持つ針状微粒子の形成が判明した。これらの結果から深海底からの分離株が毒性の高いセレン・テルルオキサニオンをそれぞれ元素体のセレン・テルルに変換できることが明らかとなった。昨年度から継続して行ってきたバイオリアクターの作製では連続・循環型の他に、(バフッルなどの振盪条件での)好気条件におけるバッチ方式のバイオリアクタの構築についても検討し、同システムによるあらかじめ培養した菌体を用いたセレンの回収が可能であることを明らかにした。

これまで分離株におけるセレン・テルルの異化的代謝を利用したセレン・テルル回収の可能性について検討してきたが、それとは異なる硫黄代謝などの同化的プロセスと連携したセレン・テルルオキサニオンの元素体セレン・テルルへの変換・回収が可能であることが判明した。この手法を用いることで嫌気処理を必要としないセレン(テルル)オキサニオンの変換・還元によるセレン(テルル)の元素の回収が達成できた。更に、元素解析、電子顕微鏡観察などの結果から回収されたセレン・テルル元素は異化的代謝に基づいて形成されたものと同じ粒径、形状、元素構成であることが明らかされた。この結果を利用して、コウジカビ(アスペルギルス)や糸状菌などの培養菌体を用いた場合でも同様に同化的な代謝プロセスと思われるセレン・テルル回収が可能であることが確かめられた。また、同菌種を用いて簡易的な循環型リアクターを作製した。その結果、これらの培養菌体をそのまま用いた場合でもセレン・テルル回収が達成され、本研究の派生効果が認められた。次に、分離株による銀、パラジウムなど貴金属元素(レアメタル)の単体ナノ微粒子への変換についての研究を実施したところ、菌体活性による銀イオンの沈澱化が確認された。この結果から銀微粒子の形成が予想されたが、Shewanella algaの場合にみられるような、銀イオン添加後、数分以内での急激な沈殿物の形成はみられず、その形成は数日を要するものであることが確認されたが、分離株におけるレアエレメント金属イオンの生物還元については可能であることが明らかにされた。応用微生物学当該年度おける研究目標としては、分離株を用いた元素回収用バイオリアクターの構築、セレン・テルルナノ微粒子合成の反応に関与する遺伝子の想定について開始していなければならないことを考えれば、進展度は十分とは言えない状況である。しかしながら、新種株の同定や同化代謝と考えれる好気的なセレン・テルルナノ微粒子の変換・合成の可能性と分離株についての研究結果を得ることができたことや新種株による銀ナノ微粒子への同時変換回収の可能性についても研究結果を得ることができている。今後、分離株のII-IV化合物半導体の生物素材として活用可能性などの派生研究が期待されるものとなっている。当該年度おける研究目標としては、分離株の純化をはじめ、研究に供する分離株のキャラクタリゼーション、培養特性の把握、カルコゲンオキサニオンの変換可能性について明らかにすることが主要なものであったことから、これらの研究課題の遂行はほぼ達成されたと考えられた。また、現在、16SrDNA配列に基づく分離株の分子系統分類についても着手しており、既にいくつかの分離株についても種属の同定が済んでいる。これらの結果からはShewanella属に属することが明になりつつあり、元素回収のみならず微生物電池の生物素材としても利用できる可能性が示されている。また、分離株を用いた元素回収用バイオリアクターの構築にも着手できる状態となっている。本年度からは特に遺伝子・分子生物学的手法を用いたセレン・テルルオキサニオン還元に関与する分子種の特定、還元機構の解明に向けた研究を実施する。本研究については嫌気呼吸によるセレン還元のみならず同化代謝に基づく還元分子種の特定についても研究をすすめる。また、分離株のII-IV化合物半導体の生物素材として活用可能性などの派生研究も視野に入れた研究を計画研究とともに実施したい。最終年度として、得られた微生物による材料合成、資源回収の有用性について明らかにしていく。
わが国の電力取引所における市場支配力および価格変動リスクの評価に関する研究

本研究では、JEPXにおけるスポット取引の価格変動リスクの大きさ、および発電事業者による市場支配力の大きさを利用可能な公開データのもとで評価することを試みた。欧米の電力取引所と比較した結果、JEPXにおいては価格変動および電力市場に特有な価格スパイクのリスクの双方が相対的に小さいことがわかった。JEPXが任意参加型市場であることから、市場支配力の行使については明確な結論は得られなかった。1.電力スポット市場における潜在的な市場支配力の推定2.JEPX(日本卸電力取引所)の流動性についてJEPXは2005年4月から全国大の一日前スポット市場と先渡定型市場を運営しているが、いずれの市場における流動性も欧米の電力取引所と比較すると低い水準にとどまっている。欧米の取引所に上場された電力商品でも流動性の確保に失敗した事例も数多く存在するため、それらの経験から取引ルールと流動性の関係、および電力産業の市場構造と流動性の関係を考察した。その結果、電力産業における垂直統合の程度と長期相対契約による電力調達が卸電力市場の流動性に大きな影響を与えていること、および電力先物商品(電力先渡商品)の最終決済方法を物理的な送電(Physical Settlement)とするか現金決済(Cash Settlement)とするかが流動性に影響を与えていることが示唆された。JEPXの先渡市場の流動性が低い原因についても、わが国における垂直統合の程度、長期相対契約による電力調達率および物理的な送受電を前提とする先渡商品の仕様に求めることができると考えられる。1.JEPX(日本卸電力取引所)における流動性確保策の検討JEPXは全国大の一日前市場と先渡市場を運営しているが、両市場の流動性は低い水準にある。昨年度の研究において、流動性が低い原因は期間(先渡)契約の仕様とわが国の電力産業構造に求められることを考察したが、今年度は二つの流動性確保策を案出した。一つは、部分小売自由化が行われている現状をふまえ、非自由化対象の需要家に小売供給をする事業者に電力の経済的調達義務を課すという政策である。この政策は、卸電力市場の「小売事業者が低価格な電力を広域的に調達する場」という役割を活性化させ、非自由化対象の小売料金の低減にも資するという二重の長所を持つ。具体的には、市場価格と対象事業者の稼動電源の可変発電コストを事後的に比較すれば良い(従って、安定供給に必要な原子力発電にも親和的な政策である)。もう一つは、電気事業分科会報告(2003)に基づいてJEPXは自らを「現物としての電気を取引する場」と定めているが、連係線容量の管理に与える影響を考慮しつつ、この考え方を見直すことである(例えば、Cash Settlementによる電力先物の導入を検討する)。電力の期間契約は、原油やガス等の先物契約と異なり、本質的に流動性不足に陥りやすい性質を内包しているので、流動性を向上させる仕様を意図的に用いるのである。詳しくは、国際公共経済研究17号の「電力取引所の現状と課題-流動性の確保をめぐって-(松田、2006)」を参照のこと。2.JEPXの一日前市場にSFEを適用するための理論的基礎の検討JEPXの一日前市場にSFEを適用するための理論的基礎を検討した。Klemperer & Meyer (1989)が導入した供給関数ナッシュ均衡解(Supply Function Equilibrium : SFE)は潜在的な市場支配力を評価する方法の一つである。Klemperer & Meyer (1989)は、需要関数およびコスト関数がそれぞれ二階微分可能であることを仮定したうえで、SFEを導いた。しかし、現実の電力市場をより正確に再現しようとした時、コスト関数や総需要曲線が区分的に滑らか(piecewise smooth)であることしか想定できないことがしばしば起こる(Baldick, Grant, and Kahn (2004)等を参照)。そこで、本研究では、コスト関数や総需要曲線が区分的に滑らかである場合にSFEが満たす方程式(必要条件)を導出した。Klemperer & Meyer (1989)によると、コスト関数が二階微分可能であり、更にconcaveであれば、価格を変数として単調増加なSFEが存在する。しかし、コスト関数や需要関数が区分的に滑らかであることしか想定できない場合、単調増加なSFEが常に存在するとは限らないことが判明した。新しい仮定のもとで単調増加なSFEが存在するための条件も本研究では検討している。わが国のJEPXを含む先進諸国(ドイツ、フランス、ベルギー、イタリア、オーストリア、オーストラリア)の電力スポット市場における価格変動を標準的なジャンプ平均回帰方程式(Jump-Diffusion Process)で表示した。推定方法は最尤法によった。ジャンプ平均回帰方程式のパラメータ値の推定結果から、上記の電力スポット市場群は価格スパイクリスクが比較的に大きい市場と小さい市場に分類された。わが国のJEPXは後者に属する。現段階では、価格スパイクリスクが大小に分かれる市場構造的な背景要因は十分に明らかになっていない。

なお、この分析を通じて、標準的なジャンプ平均回帰方程式を電力価格変動に適用すると、peak時間帯の価格回帰水準がdaytime時間帯のそれよりも低く推定されることが多いという欠点があることがわかった。この現象には、同方程式を用いるとジャンプ頻度が高く推定されること(Clewlow & Strickland, 2000)が大きく影響していると考えられる(一日に約一度以上の頻度でジャンプが起こると推定される場合が殆どである)。電力スポット価格変動を対象とした適合度の高いモデルは現在も模索されている段階であるが、ジャンプ頻度にロジスティック回帰を繰りこむことにより、適合度がやや改善されることがわかった。(抄録なし)
心臓M２型マクロファージによる心筋梗塞発症後の組織修復メカニズムの解明

心臓再生医療における主たる目標は、心筋梗塞発症後にいかにして心筋細胞の修復を増強させ、心不全患者の心機能を維持することである。心筋梗塞による組織障害を最小限にとどめ、心線維芽細胞による適切な心臓修復を促進させることにより予後の改善を図ることが重要と考えられてきている。本研究の目的は心筋梗塞発症後の心筋細胞及び線維芽細胞の障害を最小限に留め、細胞死と細胞老化を抑制することで心筋梗塞の予後を改善する新たな治療法を開発することである。本年度に得られた結果は以下の3点である。1.マウス心筋梗塞モデルにおける細胞障害の評価:心筋梗塞発症後のマウス心臓の組織切片を観察すると、心筋梗塞発症後に線維芽細胞が集積し、膠原線維の生成により梗塞領域の組織修復が行われていた。しかしながら、組織修復のために梗塞領域に集積した心線維芽細胞は障害を受けていることを確認した。2.障害を受けた線維芽細胞の救済を担う分泌蛋白を特定:正常心筋及び心筋梗塞発症後のマウス心臓からマクロファージをFACSで単離した。マイクロアレイ法によりマクロファージの遺伝子発現の違いを2群間で網羅的に解析し、組織修復分子メカニズム及びシグナル伝達経路に関与する遺伝子の特定を行った。3.In vitroでマクロファージによる線維芽細胞救済を評価:正常心筋及から線維芽細胞を回収し、1.健常な線維芽細胞, 2. DNA障害を与えた線維芽細胞, 3.マクロファージと共培養したDNA障害を与えた線維芽細胞、4.マクロファージと共培養したDNA障害を与えた線維芽細胞に実験2で特定したタンパク質の中和抗体を加えた4群を作成した。線維芽細胞のアポトーシス、遊走、細胞分裂及び活性化を免疫染色で評価した。実験の経過から、当初予定していなかった実験を追加することを検討しているが、概ね順調に進展している。概ね予定通りに進展しており、結果がまとまり次第、学会発表・論文作成を行う。本年度の行わなかった学会発表により旅費を使用しなかったこと、および予定した実験を次年度に変更したことから繰越金が生じたが、次年度に発表による旅費、実験の物品費用として使用する予定である。
ブラックホール連星の可視光短時間変動の研究

本年度は、昨年度導入された40cm赤道儀式の常時設置型の望遠鏡の自動化をすすめ、専用の広視野高感度CCDカメラ(SBIG ST8XME)、専用分光器(SBIG SGS)を導入した。新たに広視野の同時観測が可能になったため、新望遠鏡に対応した自動解析システムの改良も行った。望遠鏡と観測装置は期待通りの性能を発揮し、19-20等の限界等級の天体の連続観測が可能になった。本年度は夏・秋の天候が異常で連続観測は不利であったが、それでもチリで観測を行った分担者植村のデータと合わせ、ブラックホール連星V4641Sgrの可視光短時間変動の検出に成功した。このデータは出版準備中であるが、本研究組織による同天体の2003年活動期の包括的な研究成果が本年度に論文として出版された。また、本研究組織が世界に先駆けて光学同定に成功したブラックホール連星KV UMa (XTEJ1118+480)の予期せぬ光学活動現象の観測に成功し、可視光・X線とも低光度であったにもかかわらず光学短時間変動が極めて小さい、軌道運動を反映すると思われる変動を高精度で捉えるなど、ブラックホール連星の従来の知見から予期されぬ結果が得られた。この結果は論文出版に向けて現在解析・検討中である。ガンマ線バーストではGRB 041006の連続測光に成功した。また、ブラックホール連星と関係の深いWZ Sge型矮新星と類似天体の包括的な研究を進め、出版済みのGO Comの特異なアウトバースト、TV Crvのスーパーハンプの特異な挙動の他、再増光を示すASAS 002511+1217.2など多くの新しい知見を得て論文出版を準備中である。研究分担者の石岡はすばる望遠鏡による矮新星の食現象観測から降着円盤の速度場を求める研究を行い、本研究組織の共著で論文にまとめた。本年度は、京都大学への観測機器の導入と観測システムの構築を行うとともに、ブラックホール突発天体や倭新星などの関連降着円盤現象、HETE-2衛星のアラートを受けたガンマ線バーストの光学追跡観測を行った。まず、京都大学には40cm赤道儀式の常時設置型の望遠鏡を導入した。この望遠鏡は京都大学現有の屋上ドームとともに自動駆動が可能であり、従来の京都大学の設備では実行が困難であった、長時間積分を要する天体の測光観測を可能にするものである。本年度は試験観測および制御ソフトウエアの開発を中心に運用を行った。翌年度導入予定の分光装置も含め、常時観測可能な専用望遠鏡として国内では最大のものになり、今後の調整によって高い科学的価値の成果が期待できる。これに並行して、京都大学屋上現有の観測装置、京都大学飛騨天文台の60cm望遠鏡を利用したブラックホール突発天体や矮新星などの観測を行った。特にブラックホール連星V4641Sgrは本年度も期待通りの活動期を示し、京都大学やVSNETチームの国際共同観測によってその驚くべき変動が明らかにされた。またこの現象はマスメディアの関心も呼び、「ブラックホールの縁が可視光で見える可能性がある」という従来想像もされなかった衝撃的なニュースとして報道されることになった。この天体は活動性が極めて激しく、そのような現象を実際に観測するには即時の通報が欠かせないが、我々の開発したインターネットと携帯電話を利用したサービスによって、多くの人がこの情報を実際に受信することを可能にした。なお、これらの結果は日本天文学会欧文報告誌における初めての単独特集の増刊号となる、VSNET特集号(平成16年3月25日刊行)などに出版され、我々の研究成果を幅広く公開するものとなった。
遺伝子改変インスリン抵抗性マウス脂肪細胞のホスホジエステラーゼ3B遺伝子発現調節

インスリンにより活性化されたホスホジエステラーゼ3B(PDE)は細胞内cAMPを低下させ脂肪分解を抑制する結果、血中遊離脂肪酸(FFA)を低下させる。FFAの上昇は骨格筋や肝臓におけるインスリン抵抗性をきたすことより、脂肪細胞でのPDE活性の低下は血中FFAを上昇させインスリン抵抗性を惹起することが予想される。実際、自然発症の肥満インスリン抵抗性糖尿病モデルの一つであるKKAyマウスの脂肪細胞ではPDE遺伝子発現が低下し、血中FFAが上昇し、インスリン感受性が低下していることが報告されている。そこで本研究ではインスリン受容体基質-1(IRS-1)ノックアウトマウス(IRS-1 KO)を用い、PDE蛋白量及びmRNA量、さらには脂肪細胞を単離しインスリン刺激によるPDE活性を検討した。IRS-1の単一遺伝子変異によるインスリン抵抗性モデルマウスを用いることにより、IRS-1がPDE遺伝子の発現ならびにインスリンによる活性化に特異的に関与しているか否かが、またPDEがKKAyマウスで見られたインスリン抵抗性に一義的に関与するか否かが明確になる。IRS-1 KOでは対照マウスC57BL/6Jに比しPDE蛋白が1.2倍、mRNAが1.4倍に増加していた。また単離脂肪細胞ではインスリン刺激によるPDE活性化(インスリン刺激後/前)は対照の1.7倍に比し1.35倍と低下していることが観察された。現在、PDE遺伝子発現調節へのIRS-1の関与の詳細をさらに解析中である。
FMO法による体内揺らぎを考慮した相互作用法の構築とプリオンタンパクへの応用

本研究の目的は、生体分子内の相互作用を量子化学的に解析するための手法を構築し、それをプリオンタンパク質と薬剤候補化合物の相互作用解析に応用することである。研究期間を通じて、自身が開発しているFMO計算プログラム「PAICS」に相互作用を高速に計算するルーチンを導入し、少ない時間で複数構造に対し相互作用解析を行うことが可能となった。これらの計算結果を平均的に取り扱うことで、体内揺らぎを考慮しかつ量子化学的に相互作用を議論することができた。平成20年度は、最初に、タンパク質と低分子化合物の相互作用エネルギーの計算に特化したスキームを作成し、申請者が独自に開発しているFMO計算パッケージ「PAICS」に実装した。これにより、全体のエネルギー計算に要する10分の1程度の時間で、相互作用エネルギーの計算を行うことが可能となった。また、より正確な相互作用エネルギーを得るために、基底関数の重なり誤差を除外する手法を実装した。次に、本研究で開発したプログラムを、プリオン病の原因物質と考えられているプリオンタンパク質と薬理効果を持つ低分子化合物(GN8)の相互作用解析に応用した。この際、MDシミュレーションのトラジェクトリーから抜き出した20点の構造に対してFMO計算を実行し、得られた結果を平均的に取り扱うことで、体内温度における生体分子の構造揺らぎの影響を考慮した。これまでは、このような複数の構造における生体分子の量子化学計算は、多くの計算時間を要するため実行困難であったが、相互作用エネルギーに特化したスキームを開発することで、これが可能となった。得られた結果から、GN8のどの部位がタンパク質との相互作用に重要であるか、どのアミノ酸残基がGN8と大きな相互作用を持つかを調べることに成功した。これらの情報は、今後、GN8を薬理効果の高い化合物へ最適化する際に有効に利用されると期待している。また、我々が開発したプログラムは、プリオンタンパク質に限らず、様々なタンパク質と低分子化合物の複合体に応用かのうである。平成21年度は、さらに計算を高速化するために、RI(Resolution of the Identity)MP2法のプログラムを作成し「PAICS」に実装した。これにより、これまで計算時間を最も多くついやしていたMP2計算を1/10程度の時間で実行することが可能となり、全体の計算時間も1/3程度まで減らすことができた。また、ダイナミックアップデート法の導入により、モノマーSCC計算にかかる時間を半分程度に減らすことに成功した。これらの高速化により、最終的に、PAICSを用いると、プリオンタンパク質とリガンド分子の相互作用解析が、通常のクラスターマシン(8coreのみ使用)上で、数時間で実行することが可能となった。また、プリオンタンパク質全体に関して量子化学計算を実行し、タンパク質の構造維持に重要に寄与する残基間相互作用を調べた。プリオン病は、正常型の構造から異常型の構造に変異することで発症すると考えられており、このような相互作用を解析することは、今後、プリオン病のメカニズムを解明する上で役に立つと期待できる。本研究を通じて開発された、各プログラムモジュールは「PAICS」の一部として公開されることになっており、多くの研究者がここで開発されたタンパク質リガンド間の相互作用解析スキームを利用し、様々な生体分子に応用していくことが期待される。
プリン作動性化学伝達の遮断による慢性疼痛の抑制メカニズムの解明と薬学的応用

慢性疼痛は、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、心因性疼痛の3つに大きく分類される。このうち、神経障害性疼痛は癌、糖尿病などによる神経障害、炎症性疼痛は癌、リウマチなどによる末梢の炎症が原因となる耐え難い慢性疼痛である。このように慢性疼痛にはそれぞれ原因に応じた治療が必要であるが、その発症メカニズムの詳細が不明なため、副作用の少ない、効果的な鎮痛薬がこれまで存在しなかった。慢性疼痛の発症にはプリン作動性化学伝達が関与することが知られている。プリン作動性化学伝達では、小胞型ヌクレオチドトランスポーター(VNUT)によりATPが分泌小胞内に蓄積され、開口放出される。開口放出されたATPがポストシナプス側のプリン受容体に結合することでシグナルが下流に伝達される。本研究ではVNUTに着目し、VNUT特異的阻害剤を同定し、VNUTを阻害することによる鎮痛効果の適応範囲を明らかにする。さらには、その発症メカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度は、新たに慢性疼痛モデルマウスの系を確立し、VNUT阻害剤にて鎮痛効果を検証し、有効であることを明らかにした。疼痛刺激後の野生型、VNUTノックアウトマウスの組織を用いて2D-DIGEを行い、発現に変動が見られたタンパク質を見出した。また、大腸菌にて大量発現させ、精製したVNUTを用いて阻害剤を新たに同定した。VNUT阻害剤が新たに確立した慢性疼痛モデルマウスについて鎮痛効果を示し、VNUT阻害剤の疼痛への適応範囲が明らかになった。さらに、このモデルでの疼痛刺激後の野生型、VNUTノックアウトマウス間で発現変動が見られたタンパク質を見出したことから、本研究課題の目的である発症メカニズムの解明へ向けておおむね順調に進展していると考えている。慢性疼痛の発症メカニズムを明らかにするために、2D-DIGEにより発現に変動が見られたタンパク質の解析を質量分析装置を用いて進める。また、同時に、新たに同定したVNUT阻害剤のタンパク質レベルでのVNUT阻害様式や細胞レベルにおけるATP放出抑制効果などを検証していく予定である。