hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リハビリテーション運動療法と酸化ストレス抑制療法の併用の有効性の機序解明

活性酸素種の中で、H_2O_2が高血圧自然発症ラット(SHR)の腎nitric oxide(NO)産生やNO合成酵素(NOS)発現を増強し、さらに糸球体濾過量も調節していることを明らかにした。EXはNOS発現とNO産生を増強させ、このEXによるNOS発現の増強効果にはH_2O_2が関与していることを明らかにした。SOD類似薬tempolはEXによる降圧や糸球体濾過量増加、NOS発現増強効果を促進する薬剤であることを示した。高血圧自然発症ラット(SHR)の血圧調節にはnitric oxide(NO)や酸化ストレスが関与している。高血圧自然発症ラット(SHR)の腎では、対照のWistar-Kyotoラット(WKY)に比べて酸化ストレスとnitric oxide合成酵素(NOS)発現が増強しているが、SHRの腎NOS発現増強の機序は明らかでない。酸化ストレスとNOS発現の関連を明らかにするため、NADPH oxidase阻害薬apocyninとsuperoxide dismutase(SOD)類似薬tempolによる腎NOS発現への影響を比較検討した。5週齢の雄SHRを対照群、tempol群、apocynin群の3群に分け、両治療群には飲水中にtempol(2 mmol/l)もしくはapocynin(2 mmol/l)を溶解し、8週間投与した。腎NADPH oxidase活性、血漿と尿中H_2O_2量を測定し、腎皮質と髄質における内皮型と神経型NOS(eNOS, nNOS)の蛋白発現をウェスタンブロット法で検討した。対照群に比べて、収縮期血圧は両治療群で有意に低下し、血漿クレアチニンはtempol群でのみ有意に低下した。腎NADPH oxidase活性は両治療群で低下したが、血漿と尿中H_2O_2量はapocynin群で減少した一方、tempol群では増加した。腎皮質と髄質におけるeNOSとnNOS発現はapocynin群で減弱した一方、tempol群では増強した。以上の結果から、酸化ストレス、特にH_2O_2がSHRの腎NOS発現を増強し、さらに糸球体濾過量も調節していると考えられ、長期的運動とtempolの併用療法の有効性が示唆された。長期的運動(EX)の腎内酸化ストレスとNO産生系への効果を検討した。高血圧自然発症ラット(SHR)とWistar-Kyotoラット(WKY)を対照群とEX群に分け、EX群にはトレッドミル運動を8週間実施した。血漿と尿中のH_2O_2、NO_2+NO_3(NO_x)、腎NADPHoxidase活性を測定し、腎皮質と髄質における内皮型と神経型NOS(eNOS,nNOS)の蛋白発現をイムノブロット法で検討した。EXにより、血圧はSHRでは低下したが、WKYでは影響されなかった。腎NADPH oxidase活性はSHRで低下したが、WKYでは増加した。血漿と尿中のH_2O_2とNOx、腎皮質と髄質におけるeNOSとnNOS発現は両系ラットで増加した。以上から、SHRとWKYにおいて、EXは腎NOS発現とNO産生を増強させ、このEXによる腎NOS発現の増強効果にはH_2O_2が関与していることが明らかになった。肥満モデルであるZucker fattyラットの肝脂肪化への長期的運動の効果を検討した。雄Zucker fattyラットを対照群と運動群に分け、運動群にはトレッドミル運動を10週間実施した。対照群に比べて、運動群では摂食量は有意な差がなかったが、体重、血漿脂質・グルコース、肝トリグリセライド含有量は有意に低下し、肝組織の脂肪染色も減弱していた。運動群の肝臓では脂肪酸合成系酵素であるfatty acid synthase(FAS)とacetyl CoAcarboxylase(ACC)発現が低下していたが、脂肪酸酸化系酵素の発現には有意な変化は認められなかった。以上から、長期的運動は肝脂肪化を抑制し、その機序として、長期的運動が脂肪酸酸化系酵素の発現を低下させることなく、脂肪酸合成系酵素の発現のみを低下させることが関与していることが明らかになった。長期的運動(EX)の降圧や腎保護効果の機序を明らかにするため、NO産生系へのEXの効果、さらにEXとsuperoxide dismutase(SOD)類似薬Tempolとの併用効果を検討した。5週齢の雄性高血圧自然発症ラット(SHR)とWistar-Kyotoラット(WKY)をそれぞれ対照群、EX群、Tempol群、併用群に分け、EX群と併用群にはトッレドミル運動を実施し、Tempol群と併用群にはtempol(2mmol/L)を飲水投与した。8週後、血漿と尿パラメーターを測定し、腎と大動脈における内皮型と神経型NO産生酵素(eNOS,nNOS)の蛋白発現をイムノブロット法で検討した。Exおよびtempolは、SHRでは血圧を低下、クレアチニンクリアランスを増加させ、その併用は相加効果を認めたが、WKYでは影響しなかった。

EXは、両系ラットデ血漿と尿中H_2O_2とNO_2+NO_3(NOx)、eNOSとnNOS発現を増加させた。tempolは、血漿と尿中H_2O_2とNOx、eNOSとnNOS発現をSHRては増加させたが、WKYでは影響したかった。Exとtempol併用は、血漿と尿中H_2O_2とNOx、eNOSとnNOS発現の増加SHRでは相加効果を認めたが、WKYではEx単独効果と比べて有意な差を認めなかった。以上の結果から、酸化ストレスが亢進しているSHRでは、SOD類似薬はEXによる降圧や糸球体濾過量増加、NOS発現増強効果を促進する薬剤であることが示唆された。
ES/iPS細胞の試験管内分化による遺伝子操作を介さない造血幹細胞誘導法の開発

造血幹細胞をES細胞から試験管内で分化誘導することは極めて困難であり未だに実現していない。そこで、遺伝子操作を介さない定義付けられた条件下でマウスES細胞から造血幹細胞を分化誘導する培養システムの確立を試みた。ES細胞から多能性血液前駆細胞を無血清条件下で分化誘導することができた。しかし、この多能性血液前駆細胞を放射線照射マウスに移植したが、Bリンパ球造血を含む骨髄造血再構築能は確認されなかった。多能性と自己複製能を持つ正常な造血幹細胞をES細胞から試験管内で誘導することは極めて困難であり未だに実現されていない。ES細胞もしくはiPS細胞から造血幹細胞を誘導できれば、造血幹細胞の発生機序を解明する優れた実験ツールとなる。また、骨髄に代わる新たな造血幹細胞の供給源として血液疾患の病態解明や移植医療においても重要な技術である。本研究は、遺伝子強制発現などの遺伝子操作を介さずに、マウスES細胞およびiPS細胞から多能性と自己複製能を持つ正常な造血幹細胞を試験管内で分化誘導する培養システムを開発することを目標とした。まず、C57BL/6(Ly5.2)×CBA(Ly5.2)F1マウス由来のKTPU8ES細胞株を、IV型コラーゲンでコートした培養シャーレを用いて培養し、中胚葉細胞を分化誘導した。次に、VEGFR2の発現を指標にしてautoMACSにより純化した中胚葉細胞をIV型コラーゲン培養シャーレの中で無血清培養し、血管内皮細胞とCD41+前駆細胞を誘導した。このとき、VEGF、BMP4、一酸化窒素ドナー、GSK3β阻害剤、カテコールアミン等を様々な組み合わせで無血清培養液に添加した。誘導された血管内皮細胞とCD41+前駆細胞をFACSによりそれぞれ純化し、TPOとSCFを添加した無血清培養液中で培養し、血液前駆細胞の発生とその増殖を促した。一部の培養は低酸素分圧下で行った。誘導した血液前駆細胞の長期骨髄再建能を確認するために、放射線照射したC57BL/6(Ly5.1)×CBA(Ly5.2)F1マウス成獣に、ホストと同系のマウス骨髄細胞と共に移植したが、13ヶ月後の末梢血の解析において、いずれの条件においてもES細胞由来の血球(Ly5.2/Ly5.2)は検出されておらず、引き続き検討が必要である。
骨格筋細胞の糖輸送におけるATP感受性カリウム(K_<ATP>)チャネルの生理的意義

目的:in vivoにおける骨格筋の糖取り込みにATP感受性Kチャンネル(KC)の関与が示唆されているが、細胞レベルでの研究はみられない。ヒト骨格筋培養細胞を用いこの点を検討した。方法:ヒト骨格筋細胞株(Clonetics社)を増殖、分化させた筋管細胞を用い、インスリン(Ins)1μMおよび高糖(G)25mM存在下の^3H-2DG、^3H-3OMGの取り込みに及ぼすKC開口薬PCO-400、nicorandil(N)と抑制薬glibenclamide(GB)、gliclazide(GC)の効果を検討した。さらにその作用機序に関して、PKCの役割を検討した。結果:Insおよび高G(Ins非存在下)による糖取り込み促進(各130%、168%)はいずれもPCO-400(10-100μM)、N(100-600μM)の添加により用量反応的に抑制された。一方、これらの抑制効果はGB(30-100μM)、GC(3000μM)の前処置で拮抗された。PMA(phorbol ester)の添加は膜分画PKCを4倍増加させ、PCO-400による糖取り込み抑制を用量反応的に解除した。しかし、Ins刺激下およびPCO-400抑制下においてPKCの変動は見られなかった。結論:骨格筋の糖取り込みは、KCの閉鎖により促進、開口により抑制された。PMAの効果は,PKCがKCを抑制的に調節するとする既報の成績とも一致し、糖取り込みにおけるKCの関与をさらに支持する結果であった。しかしIns、PCO-400の添加においては膜分画PKCは有意な変動を示さなかったことから、PKCは糖取り込みに対するKCのmodulationに直接関与しないと想定される。虚血性心臓病を有する2型糖尿病患者に、冠拡張薬nicorandil(N)を投与すると、血糖コントロールが悪化することを観察した。NはKチャネル開口薬(KCO)であることから、インスリン(In)分泌障害によると想定されたが、In分泌には影響なく、In抵抗性を来たす結果であることが明らかになった(Taro Wasada et al. Metabolism 48:432,1999).そこで、[目的]in vitroにおいて、骨格筋の糖取り込みにおけるKCの関与を検討した。[方法]ヒト骨格筋細胞株(Clonetics社)を増殖,分化させた筋管細胞を用い,In(1μM)および高糖G(25mM)存在下の^3H-2DG,^3H-3OMGの取り込み率に及ぼすKCO:PCO-400,Nとその抑制薬glibenclamide(GB),gliclazaide(GC)の効果を検討した。[結果]Inおよび高G(In非存在下)による糖取り込み促進(130%,168%)はいずれもPCO-400(10-100μM),N(100-600μM)の添加により用量反応的に抑制された。一方,これらの抑制効果はGB(30-100μM),GC(3000μM)の前処置で拮抗された。[総括]骨格筋への糖取り込みは,KCの閉鎖により促進,開口により抑制された。この結果は,臨床的にNの投与により耐糖能とIn感受性の低下を示した先の我々のin vivoの成績と一致する。一方,高GはInと同様の影響を受けたことから,KCは両者に共通するシグナル伝達ステップ(細胞内Ca濃度あるいはPKC活性化以降?)を調節する可能性が示唆され、さらに研究を進めている。

方法:ヒト骨格筋細胞株(Clonetics社)を増殖、分化させた筋管細胞を用い、インスリン(Ins)1μMおよび高糖(G)25mM存在下の^3H-2DG、^3H-3OMGの取り込みに及ぼすKC開口薬PCO-400、nicorandil(N)と抑制薬glibenclamide(GB)、gliclazide(GC)の効果を検討した。さらにその作用機序に関して、PKCの役割を検討した。結果:Insおよび高G(Ins非存在下)による糖取り込み促進(各130%、168%)はいずれもPCO-400(10-100μM)、N(100-600μM)の添加により用量反応的に抑制された。一方、これらの抑制効果はGB(30-100μM)、GC(へ3000μM)の前処置で拮抗された。PMA(phorbol ester)の添加は膜分画PKCを4倍増加させ、PCO-400による糖取り込み抑制を用量反応的に解除した。しかし、Ins刺激下およびPCO-400抑制下においてPKCの変動は見られなかった。結論:骨格筋の糖取り込みは、KCの閉鎖により促進、開口により抑制された。PMAの効果は,PKCがKCを抑制的に調節するとする既報の成績とも一致し、糖取り込みにおけるKCの関与をさらに支持する結果であった。しかしIns、PCO-400の添加においては膜分画PKCは有意な変動を示さなかったことから、PKCは糖取り込みに対するKCのmodulationに直接関与しないと想定される。
中米・グァテマラ〜エルサルバドル地域における巨大噴火のテフロクロノロジー

本研究では、エルサルバドル共和国西部グァテマラ南部地域において、各方面の研究に有用な火山灰(テフラ)データベースを構築する上で、まず最初の足がかりとなる巨大噴火によるテフラの層序・分布を明らかにすることを目的とする。平成16年度には、平成14および15年度の成果をふまえ、エルサルバドル中央部西部で巨大噴火を生じた3つのカルデラ火山(イロパンゴ、コアテペケ、コンセプシオン)について、エルサルバドル西部・北部・北西部ならびにグァテマラ共和国南部において、現地踏査ならびに採取したテフラ試料の鉱物組成・化学組成の分析を行い、以下のような成果を得た。1.コアテペケ火山の巨大噴火によって生じたArceテフラ(約7万年前)、Congoテフラ(約6万年前)は、グァテマラ市およびその周辺地域まで広く分布し、エルサルバドル西部グァテマラ南部地域のテフロクロノロジーの研究において極めて有効な指標テフラとなりうる可能性が極めて高いことが明かとなった。2.エルサルバドル西部地域のTBJテフラは、従来の報告より薄く、イロパンゴ火山の最も新しい噴火は、これまでいわれていたよりも噴火規模が小さい可能性が見出された。一方、分布の知られていなかったTB4テフラは、エルサルバドル共和国西部にも分布する可能性が高く、当該地域の重要な指標テフラとなりうる。3.コンセプシオン火山は、複数回(おそらくは34回)の巨大噴火を生じていたことが明らかになった。3年にわたる本研究により、これまで巨大噴火の層序やテフラの分布の詳細が不明であった3つのカルデラ火山について、その一端を明らかにし、本地域のテフラデータベースの基礎となる成果を得た。今後、引き続き、本研究の成果発表に努めるとともに、本研究をより発展させ、各種分野に応用可能な本地域の本格的なテフラデータベースを構築していく機会を得られることを望みたい。本研究では、メソアメリカ地域、ことに、エルサルバドル共和国西部グァテマラ南部地域において、各方面の研究に有用なテフラデータベースを構築する上で、まず最初の足がかりとなる巨大噴火によるテフラの層序・分布を明らかにすることを目的としている。そのため、平成14年度については、以下のような調査・研究を行った。1.東北大学図書館およびエルサルバドル国内の研究所・公団等において、本地域に関する相当数の文献を収集した。また、エルサルバドルの研究者を訪ね、情報を交換した。2.エルサルバドル西部および首都周辺において、巨大噴火によるテフラ(主に軽石ないし白色火山灰)のうち、既に報告のあるテフラ(TBJおよびTB24、Congo、Arce、Empalizada)の層序・分布の調査を行う一方で、未報告の(巨大噴火による)テフラを新たに見いだし、野外観察ならびに層序・分布の調査を行うとともに、分析用試料を採取した。3.本研究費補助金支給以前に得られた成果もあわせて、8月末にエルサルバドル遺産局に中間報告書を提出したほか、斎藤報恩会自然史博物館Research Bulletinに層序の概要を発表し、また、日本火山学会2002年秋季大会にて研究成果を発表した。4.現在、グァテマラ共和国(特に首都)では治安が悪化しており、本年度については、慎重を期して、現地踏査を行わなかったが、グァテマラ地震・火山・気象・水文研究所(INSIVUMEH)を訪問し、地質学的・火山学的情報ならびに安全に関する情報の交換をおこなうとともに、今後の現地踏査での協力を再度確認した。平成15年度以降は、採取した試料の分析をすすめるとともに、エルサルバドル国内で見いだされたテフラをグァテマラ共和国内へ追跡し、巨大噴火のおよんだ範囲を明らかにしていくことが重要である。本研究では、メソアメリカ地域、ことに、エルサルバドル共和国西部グァテマラ南部地域において、各方面の研究に有用な火山灰(テフラ)データベースを構築する上で、まず最初の足がかりとなる巨大噴火によるテフラの層序・分布を明らかにすることを目的としている。そのため、平成14年度には、文献収集、ならびに、エルサルバドル西部地域において、現地踏査および火山灰試料の採取を行ったが、平成15年度については、これをふまえ、以下のような調査・研究を行った。1.エルサルバドル西部地域において追加の現地調査を行った。2.エルサルバドル共和国国土研究所(SNET)の研究者とともに現地討論を行い、エルサルバドル西部地域において、グァテマラ共和国内の火山を起源とするテフラが同地域に分布することを確認した。3.これまで採取されたテフラ試料について、岩石学的特徴について分析を進めた。4.エルサルバドル共和国内の調査において、支援・協力を頂いてエルサルバドル共和国文化省遺産局(CONCULTURA)に対して、これまでに得られた成果について、報告書を提出した(2004年4月印刷予定)。5.グアテマラ共和国領内での現地踏査は、年度の前半、グアテマラ共和国の治安の悪化が伝えられたため、慎重を期して行わなかった。2003年12月の大統領選挙柊了後、治安の回復が伝えられ、また、グアテマラ地震・火山・気象・水文研究所(INSIVUMEH)を訪問した際に、今後の現地踏査への協力を再度確認することができた。平成16年度には、エルサルバドル国内で見いだされたテフラをグァテマラ共和国内へ追跡し、巨大噴火のおよんだ範囲を明らかにするとともに、テフラ試料と分析をすすめていく。

また、得られた成果について、エルサルバドル共和国ならびにグァテマラ共和国の協力機関に報告するとともに、国際誌への発表を行っていく。本研究では、エルサルバドル共和国西部グァテマラ南部地域において、各方面の研究に有用な火山灰(テフラ)データベースを構築する上で、まず最初の足がかりとなる巨大噴火によるテフラの層序・分布を明らかにすることを目的とする。平成16年度には、平成14および15年度の成果をふまえ、エルサルバドル中央部西部で巨大噴火を生じた3つのカルデラ火山(イロパンゴ、コアテペケ、コンセプシオン)について、エルサルバドル西部・北部・北西部ならびにグァテマラ共和国南部において、現地踏査ならびに採取したテフラ試料の鉱物組成・化学組成の分析を行い、以下のような成果を得た。1.コアテペケ火山の巨大噴火によって生じたArceテフラ(約7万年前)、Congoテフラ(約6万年前)は、グァテマラ市およびその周辺地域まで広く分布し、エルサルバドル西部グァテマラ南部地域のテフロクロノロジーの研究において極めて有効な指標テフラとなりうる可能性が極めて高いことが明かとなった。2.エルサルバドル西部地域のTBJテフラは、従来の報告より薄く、イロパンゴ火山の最も新しい噴火は、これまでいわれていたよりも噴火規模が小さい可能性が見出された。一方、分布の知られていなかったTB4テフラは、エルサルバドル共和国西部にも分布する可能性が高く、当該地域の重要な指標テフラとなりうる。3.コンセプシオン火山は、複数回(おそらくは34回)の巨大噴火を生じていたことが明らかになった。3年にわたる本研究により、これまで巨大噴火の層序やテフラの分布の詳細が不明であった3つのカルデラ火山について、その一端を明らかにし、本地域のテフラデータベースの基礎となる成果を得た。今後、引き続き、本研究の成果発表に努めるとともに、本研究をより発展させ、各種分野に応用可能な本地域の本格的なテフラデータベースを構築していく機会を得られることを望みたい。
酸性土壌に対する根の総合的耐性戦略の解明と応用

世界で広範に分布している酸性土壌において植物を栽培するためには、pHが低いことで溶出する金属イオンの毒性とリン酸がアルミニウムや鉄と結合するために起こるリン欠乏に対する耐性の改善が必要である。酸性土壌に適応する一部の植物は根から各種物質を分泌することによって、自ら根圏環境を改善して酸性土壌に適応する能力を有する。本研究は、この分泌能力を解明・強化することを目標として実施した。低リン耐性の強いルーピンより得た根分泌性酸性ホスファターゼをタバコに導入した。その結果、本酵素の機能により、土壌中有機態リンを分解・可給化することが可能となり、低リン条件下での生育を改善することに成功した。また、シロイヌナズナのリンゴ酸放出をモデルに難溶性リンを可溶化する有機酸の分泌に関する解析を実施し、リンゴ酸輸送タンパク質の誘導的発現に呼応してリンゴ酸が放出されていることを見出した。これは、根組織内部と根端での発現によるものであり、炭素喪失を最小限に抑制する機構であることがわかった。無機態リン酸獲得を向上するためには、部位特異的に発現制御する必要があると結論した。根から分泌される多糖類ムシラゲのカチオン吸着に関して、Melastoma malabathricumではAlのような三価カチオンに、トウモロコシでは二価カチオンに対する親和性が高いことが示された。M.maalabathricumのムシラゲはAlイオンに対する親和性は高いが、その結合力はトウモロコシのムシラゲと比較すると非常に弱かった。カチオン吸着における性質の違いには、構成糖の組成だけではなく、ウロン酸のメチル化度などが関与していると考えられた。アーバスキュラー菌根における外生菌糸成長促進物質の分離・精製を行った結果、リン欠乏のタマネギの根の浸出物から外生菌糸伸長と2次以降の分岐を促進する画分A2を得ることに成功した。タンパク質分泌のシグナルペプチドの開発を行うため、水耕栽培したイネ根より分泌性タンパク質を高純度に濃縮した。これらのタンパク質を二次元電気泳動で分離し、ペプチドマスをとりデータベースを構築している。分泌制御を行うための発現プロモーターの解析を行うため、酸性土壌耐性に関わる遺伝子を複数単離し、これらの遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析している。さらに、有機酸分泌機能の解析を行っている。根からの有機酸放出は難溶性リン酸からのリン酸獲得及びAl耐性に深く関わる形質である。これに関して、ニンジン変異細胞のモデルを用いた遺伝子発現制御実験により細胞膜プロトンATP加水分解濃酵素が関わることと明らかにすると共に、シロイヌナズナでQTL解析を実施した。植物根分泌性多糖類を分析した。強酸性土壌に生育し、Al耐性の極めて強いAl集積植物であるMelastoma malabathricumとAl耐性が中程度なトウモロコシが根から分泌する粘性多糖類ムシラゲの性質と組成を調べた。M.malabathricumの分泌するムシラゲはAlイオンを選択的に吸着する性質を持ち、多量に吸着されたAlをM.malabathricumは積極的に吸収することが示された。一般に、ムシラゲに含まれるウロン酸のカルボキシル基がイオンを吸着すると考えられているが、M.malabathricumのムシラゲのウロン酸含量はトウモロコシのムシラゲよりも低く、他の物質が吸着に寄与していると理解される。菌根形成の調節機構を解明するためタマネギの根の浸出物に含まれるアーバスキュラー菌根菌の菌糸成長促進物質の分離・精製を行なった。リン欠乏のタマネギの根の浸出物からTLCによりA2画分が回収され、本画分がアーバスキュラー菌根菌Gigaspora margaritaの菌糸伸長と2次以降の分岐を促進することが明らかになった。

酸性土壌において最も顕著な影響を及ぼすリン栄養に関して、モデル植物のイネを中心としたトランスクリプトーム、プロテオーム手法による解析と、根分泌物に関する解析を進めた。トランスクリプトーム、プロテオーム解析では、実際の根が遭遇するであろう局所的なリン栄養の積極的な吸収機構に関与すると予想される現象を解明するために低リン状態においた植物にリンを与えた時の体内の遺伝子の応答を解析した。約100種類の遺伝子が大きく変動しており、リンの吸収のみならず、特に糖代謝系の大きな変動が認められた。また、低リン栄養に対して根から分泌される化合物には有機酸、タンパク質があるが、有機酸の分泌量に対してPEPC遺伝子が関与していることを示した。分泌タンパク質に関する網羅的解析から分泌タンパク質は修飾が多いことが判明した。また、多糖類がストレスに応答して分泌されることから、特に多糖類の分泌能が高い熱帯性の植物を中心としてその役割についての解析を進めた。その結果、植物種により、分泌多糖類の性質が異なり、特にアルミニウムイオンの吸着能に違いが存在することを見いだした。分泌制御を行うための発現プロモーターの解析を行うため、ルーピン根分泌性酸性ホスファターゼのデリーションシリーズを構築して、シロイヌナズナへの形質転換を進めた。また、低リンイネで発現が誘導されるOsPI1遺伝子をReal Time PCRで定量した結果、リン欠乏根で極めて多量に発現しており、強力な発現プロモーターの候補として有望であることを示した。クエン酸チャネルに関しては、ニンジン培養細胞からサブトラクションライブラリーを作成して、細胞膜結合性などを指標に、候補遺伝子を絞り込んだ。次年度に向け、RNA iベクターを作成中である。一方、シロイヌナズナのアルミニウム耐性QTL遺伝子座に見出したリンゴ酸トランスポーターは、発現と耐性の関係を品種間差解析を利用して解析した。無菌的にイネを水耕培養する技術を開発し、イネの分泌性タンパク質を回収した。構成タンパク質の同定を進めた結果、キチナーゼや機能未知のタンパク質リン酸化酵素、未同定のタンパク質が複数得られた。この結果、定常的に植物が根圏に対して働きかける機能の一環として分泌タンパク質が役立つことが明らかになった。ルーピン根分泌性酸性ホスファターゼ導入タバコは、土壌中有機態リンを分解・可給化することにより、低リン条件下での生育が野生株よりも改善することを土耕栽培で示した。シロイヌナズナのリンゴ酸放出をモデルに有機酸放出に関する解析を実施し、リンゴ酸輸送タンパク質の誘導的発現に呼応してリンゴ酸が放出されていることを見出した。これは、根組織内部と根端での発現によるものであり、炭素喪失を最小限に抑制する機構であることがわかった。一方、阻害剤を用いた解析からチャネルの活性化にはリン酸化が関与することがわかった。リン酸獲得の向上では、部位特異的に発現制御する必要があると結論した。植物根分泌性多糖類ムシラゲのカチオン吸着に関して、Melastoma malabathricumではA1のような三価カチオンに、トウモロコシでは二価カチオンに対する親和性が高いことが示された。
青年期における睡眠の質に関連する要因の研究

若年者を対象に、睡眠の質と精神的健康および栄養素等摂取状況との関連について検討した。結果、男子大学生において、睡眠の質が悪い群では、精神的健康度と最近1ヶ月の体調は低値であり、特性不安の指標は高値であった。一方、栄養素摂取状況との関連では、睡眠の質の悪い群ではβ-カロテン当量、レチノール当量、α-トコフェロール、ビタミンK、鉄、ダイゼイン、ゲニステイン、豆類の摂取比率が低値であり、ショ糖、砂糖・甘味料類、嗜好飲料類の摂取比率では高値を示した。本研究の結果は、若年男性の睡眠の質の改善に向けて、どのような食習慣の改善を図るべきかを考慮する上での一助になるものと期待される。睡眠の質の低下は、うつ病などの精神疾患のほか、肥満、高血圧、糖尿病などのリスク因子となる。一方、睡眠の質の低下に関係している要因については不明な点が多い。本研究では、睡眠に問題を抱えやすいとされる若年者を対象に、睡眠習慣の現状を調査し、睡眠の質に関わる要因について検討した。本年度は、1929歳(20.9±0.2歳)の若年日本人183名(男性:82名女性:101名)を対象とした調査を実施した。調査の解析結果として、(1)男女ともにPSQI-Jの合計点(高値ほど睡眠の質が悪い)とGHQ12およびSTAI A-trait(それぞれ高値ほど精神健康度が低く、特性不安が高い)との間に正の相関が認められ、また最近1ヶ月の体調不良とも正の相関を示した。(2)男性において、PSQI-J合計点とエネルギー摂取量および炭水化物摂取量、情動的摂食(DEBQ)との間に正の相関が見られた。以上の調査結果より、若年者の睡眠の質の低下に精神的健康の低下や特性不安が関係しており、体調不良と有意な関連が認められた。また、若年男性の睡眠不良においては、高いエネルギー摂取量や炭水化物摂取量が関係していることが示された。以上より、睡眠の質低下の予防には精神的健康の改善に加え、食習慣の改善を考慮する必要性が示唆された。当初計画の調査対象者数と同程度の対象者に対し、調査を実施することができた。また、解析結果より、先行研究と同様の知見(睡眠の質低下と精神的健康の低下との関連)が得られるとともに、栄養摂取や食行動との相関(炭水化物およびエネルギー摂取と睡眠の質低下との相関、情動的摂食との相関など)については新知見が得られた。本年度は、調査対象者数の拡充を実施し、1929歳(21.0±0.1歳)の若年者278名(男性:135名女性143名)について調査分析を行った。睡眠状況をピッツバーグ睡眠調査票(PSQI)、食習慣を簡易型自記式食事歴法質問票、精神的健康と特製不安をGHQ12とSTAI A-traitによりそれぞれ評価した。また、基礎的事項として、年齢、BMI、運動習慣、喫煙歴、最近1ヶ月の体調を質問紙により調査し、PSQIの各項目との相関を調べた。解析の結果、男女ともにPSQIの合計点(高値ほど睡眠の質が低下)とGHQ12、STAI、最近1ヶ月の体調不良との有意な正の相関がみられた。また、特に男性において、PSQI高値群(6点以上)は低値群(3点以下)と比べて、栄養素別摂取頻度では、β-カロテンやレチノール当量、葉酸、ビタミンK等ビタミンの摂取比率(摂取エネルギー1000kcalあたり)が低値であり、ショ糖の摂取比率は高値を示していた。食品群別では、緑黄色野菜や豆類の摂取比率(摂取エネルギー1000kcalあたり)がPSQI高値群で低値群よりも有意に低く、砂糖・甘味料、嗜好飲料の摂取比率では高値を示していた。以上の結果から、若年者の睡眠の質低下には精神的健康の低下や不安傾向が関連しており、男性においてはビタミンやショ糖の摂取量、食品群では緑黄色野菜や砂糖や嗜好飲料の摂取量と睡眠の質との関連性が示唆された。以上より、睡眠の質低下の改善には、精神的健康に加え、食習慣についても考慮する必要性が示唆された。当初計画通り、調査対象者数の拡充と分析を実施することができた。また、解析結果により、睡眠の質の指標値と栄養素の摂取頻度や食品群の摂取頻度との有意な相関を認めることができた。本年度は、男性135名の睡眠調査結果について多変量解析を実施し、時計遺伝子の遺伝子多型との関連解析を試みた。昨年度に引き続き、睡眠の質をピッツバーグ睡眠調査票(PSQI)で評価し、栄養摂取状況は、半定量食物摂取頻度調査票(BDHQ)にて評価した。基礎的項目として、年齢、BMI、運動習慣、喫煙歴等を専用の調査票により調査し、PSQIとの相関を調べた。PSQIの合計点によって、3群(高値群、低値群、中間群)に分類し、各調査事項との関連解析を実施した。高値群(睡眠不良群)では、低値群(睡眠良好群)と比べ、睡眠時間が約90分間短く、精神的健康度(GHQ12)や特性不安(STAI)のスコアが高値であった。

栄養摂取頻度の関連では、年齢、BMI、運動習慣、GHQ12、STAIで調整して関連解析を実施した結果、脂質(全脂質、飽和脂肪酸、n-6系脂肪酸、n-3系脂肪酸)、β-カロテン、レチノール当量、α-トコフェロール、ビタミンK、鉄、ダイゼイン、ゲニステインの摂取比率が睡眠不良群で良好群と比べて低値であり、ショ糖の摂取比率は高値を示した。食品群の摂取比率では、睡眠不良群で良好群と比べて、豆類の摂取比率が低値を示し、ショ糖・甘味料、嗜好飲料の摂取比率は高値であった。これら関連の認められた栄養素・食品群と睡眠の質との関係のメカニズムの詳細は不明であるが、若年男性の睡眠の質の改善に向けて、どのような食習慣の改善を図るべきかを考慮する上での一助になるものと期待される。現在、時計遺伝子の遺伝子多型(PER3遺伝子など)との関連解析およびこれら研究結果の論文化を進めている。若年者を対象に、睡眠の質と精神的健康および栄養素等摂取状況との関連について検討した。結果、男子大学生において、睡眠の質が悪い群では、精神的健康度と最近1ヶ月の体調は低値であり、特性不安の指標は高値であった。一方、栄養素摂取状況との関連では、睡眠の質の悪い群ではβ-カロテン当量、レチノール当量、α-トコフェロール、ビタミンK、鉄、ダイゼイン、ゲニステイン、豆類の摂取比率が低値であり、ショ糖、砂糖・甘味料類、嗜好飲料類の摂取比率では高値を示した。本研究の結果は、若年男性の睡眠の質の改善に向けて、どのような食習慣の改善を図るべきかを考慮する上での一助になるものと期待される。さらに調査票による調査対象者の拡充を実施するとともに、睡眠計や唾液中ストレス成分の評価、遺伝子解析などを組み合わせ、睡眠の質に関わる因子間の相互作用を考慮した多面的な解析を実施する予定である。これにより、青年期の睡眠の質の関連する要因の抽出と各因子の影響度・相互作用が分かり、睡眠障害の予防の手立てを得ることが期待される。被験者の拡充と同時に、遺伝子解析や睡眠計による睡眠の質の測定を実施する予定である。また、取得したデータの多変量解析を実施し、若年者の睡眠の質に寄与する要因の詳細な分析を行いたい。得られた知見については国内外で論文・学会・その他で発表の予定である。応用健康科学遺伝子解析の対象とする遺伝子多型の選定に遅れが生じたため、その解析に使用する試薬の購入を次年度へ繰り越した。遺伝子解析の対象する遺伝子多型を選別し、その多型解析用の試薬やプローブ購入費用等に充当する。
不飽和脂肪酸－オリゴデンドロサイト前駆細胞の相関による精神疾患の包括的理解

統合失調症の病因仮説である、「脳発達期にかけての神経発達障害が発症脆弱性を形成する」という説を、マウスを用いて脳発達期の多価不飽和脂肪酸(PUFA: polyunsaturated fatty acid)欠乏という環境要因からアプローチした。PUFA欠乏食で育てたマウスは、薬理行動上は「統合失調症の前駆状態」の表現型、遺伝子発現ではオリゴデンドロサイト関連の遺伝子群の発現レベルが低下しており、その原因として上記遺伝子をドライブする転写因子TF-AとTF-Bのプロモーター領域のDNAメチル化亢進による、転写因子発現量の低下が考えられた。1.平成23年度の実施計画の根幹である以下の動物の準備を行った:Fabp7と結合力の強いアラキドン酸(ARA)/ドコサヘキサエン酸(DHA)の含有量を調整した以下の4種類の食餌を用意した。上記のうち、ARA(+)/DHA(+)群がPUFA欠乏群の対照群と考えている。これらの餌を、交配2週間前から出生後離乳(3週齢)まで(ヒトの胎児期思春期前に相当)C57BL/6マウスに投与した。3.組織脂肪酸含量測定:興味深いことに、最近統合失調症で報告されたように、3週齢のマウス脳でPUFA欠乏群でネルボン酸の低下、ステアリン酸の上昇が認められた。4.当初は平成24年度に行う予定であった組織学的解析を進めており、現在オリゴデンドロサイト、GABA含有細胞の数、形態を観察中である。5.ヒト遺伝学的解析の一部を前倒しで行い、脂質関連分子も含んだ(全)ゲノム解析を行った。昨年度までの研究から、マウスにおいて脳発達期の必須脂肪酸という栄養素の不足は、ヒトに置き換えた場合、神経薬理行動、脳画像、遺伝子発現の面で精神疾患脆弱性基盤形成の1つの因子となり得る、という知見を得てきた。さらに、マウス前頭葉でのオリゴデンドロサイト系遺伝子の網羅的発現低下の上流の分子メカニズムを解明すべく、発現低下を示した遺伝子の発現制御を担う転写因子(TF-AおよびTF-B)の発現を検討した結果、それらの遺伝子の発現も低下していた。そこで、当該転写因子をコードする各遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化状態をバイサルファイト法で定量したところ、遺伝子発現低下とDNAメチル化の増加が相関していた。平成25年度は、これまでin vitroで得られてきた知見をin vitroで掘り下げる実験を行った。具体的には、1、OLP6というラットオリゴデンドロサイト由来の培養細胞を、TF-AおよびTF-Bのリガンド共に培養し、リガンドの量、および培養時間を振った。結果は、TF-AおよびTF-Bのリガンド添加によって、Olig2, Cldn11, Mal, Mbp-longといったオリゴ系の遺伝子発現の増加が観察された。2、免疫組織化学的方法によって、TF-AおよびTF-BがOlig2陽性細胞(オリゴデンドロサイトの前駆細胞)に共発現していることが確かめられた。よって、一連の現象の間には未だブラックボックスがあるが、転写因子作動薬は、精神病の顕在発症を抑制することができるかも知れない。本研究は、妊娠中の母親が一時的に飢饉にさらされると子供の将来の統合失調症発症率が2倍に高まる(Susser et al, 1992; St Clair et al, 2005)という疫学データを、動物実験からサポートし、その分子メカニズムの一端をエピジェネティクスの観点から明らかにしたと考える。昨年度までの研究で、必須脂肪酸であるアラキドン酸(AA)とドコサヘキサエン酸(DHA)を、マウスにおいて受精2週間前から、離乳までの間不足させると、マウスが成体になったとき、統合失調症用行動テストバッテリーの一部で異常を示すことが判明した。これはヒトに置き換えると、ARMS (At Risk Mental State)と考えることも出来る。つまり、脳発達期の必須脂肪酸という栄養素の不足は、動物で精神疾患脆弱性基盤形成の1つの因子となり得ると解釈でき、この事実は、近年の大規模な疫学調査で判明したオランダと中国における2つの大飢饉の事例、つまり妊娠中の母親が一時的に飢饉にさらされると子供の将来の統合失調症発症率が2倍に高まる(Susser et al., Arch Gen Psychiat, 1992; St Clair et al., JAMA, 2005)という疫学データと対応可能と思われる。上記ARMS様マウスの脳内変化をこれまでいろいろ調べてきたが、興味深いのは、前頭葉でのGABA系関連遺伝子およびオリゴデンドロサイト系遺伝子の網羅的発現低下であった。これは、統合失調症死後脳での所見と一致する。平成24年度は、さらに上流の分子メカニズムを解明すべく、発現低下を示した遺伝子の発現制御を行う転写因子の発現を検討した。結果は、それらの遺伝子の発現も低下していた。

そこで、当該転写因子をコードする各遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化状態をバイサルファイト法で定量した。結果は、遺伝子発現低下とDNAメチル化の増加が相関しており、栄養という環境要因が転写因子遺伝子にエピジェネティクな変化を引き起こしたことが判明した。平成23年度で計画していたマンガン造影MRI(MnMRI)は、すでに施行したY maze後以外は行わなかった。PUEA欠乏群のマウスを観察していると、ヒトに置き換えると統合失調症の前駆状態に近いと考えられたが、prepulse inhibition(PPI)で有意差がなかったので、PPI後のMn-MRIを行う意義がなくなった。また、予定していたMSイメージングは行ったが、情報量が少なかったため、論文作成においてはSupplementary dataとして利用する予定である。前倒しで一部行ったものもあるが、おおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。マウス前頭葉でのGABA系関連遺伝子およびオリゴデンドロサイト系遺伝子の網羅的発現低下が観察されたため、当初はセルソーターを用いてGABA含有細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞を分離して、細胞種毎に詳細に遺伝子発現変化、およびDNAメチル化変動を調べる予定であったが、必須脂肪酸不足食餌を使い切ってしまって無くなってしまった。新に作成を依頼しようとしたが、以前注文した業者がもう食餌を作るのをやめてしまったので、新たな食餌の調達が不可能になり、計画していた実験の一部が実行できなくなり、このことは残念であった。今後の大まかな推進方策として、今後PUFA欠乏による遺伝子発現変化、その原因となる上流遺伝子のDNAメチル化解析を行っていく。また、PUFA欠乏によるGABA含有ニューロンとオリゴデンドロサイトの挙動に注目しているため、セルソーターでそれらの細胞群を分別収集し、個体レベルだけでなく細胞レベルでの「脳発達期の必須脂肪酸欠乏」の影響の詳細を調べて行く予定である。これまで得たデータを詳細に検討し、整理して論理的な解釈を導き、論文化することに注力する。また、得られたデータよりパテント申請できるものを検討する。
奄美における芸能文化の〈メディア媒介的復興〉と自尊意識再生の文化生産論的研究

奄美地域の芸能文化・生活世界内文化が、メディアと結びつくことで、現代的復興をとげ、それが人びとの自文化への覚醒と自尊意識の醸成につながることを、文化年表の作成等を通じて明らかにする。対象としては、島唄、新民謡・新歌謡、ポピュラー音楽までのうたにかかわる文化生産領域と、余興文化、身体表現系芸能を対象とする。同時に、地域の伝統芸能・生活世界文化が、メディアを媒介として新たな地域文化として創生されていく螺旋的なプロセスを抽象化して、文化生成に関わるより一般的な理論を構築する。こうした研究を通じて、芸能研究、民俗学研究とメディア学などの知をクロスさせる〈文化のメディア学〉の地平の開拓をめざす。
GDP Nowcasting

2018年度が本研究の3年目で最終年度であったが、「F-14補助事業期間延長承認申請書」(2019年3月に承認)で述べた通り、2018年8月以降、家庭の事情により、学務以外に時間が割けなくなり、研究は滞った。しかし8月までは研究は順調に進んだ。前年度の「研究実績の概要」で述べた通り、2017年度にコンピュータープログラムの開発は終わった。当初2018年度は、(a)そのプログラムを使ってGDP Nowcastingに関する推定値を出し、(b)その結果に基づいて論文を作成し学術雑誌に投稿し、(c)推定結果はホームページで公開する、というステップを予定していたが、(a)は6月までに終わり、国際学会で推定結果を発表した。2018年3月に承認された「F-14補助事業期間延長承認申請書」で述べたように、家庭の事情により、2018年8月以降、研究に使える時間がほとんどなくなった。1年間の延長をいただいたので、上記「研究結果の概要」で述べた、ステップ(b)と(c)を完成させたい。Nowcastingで用いられる標準的な手法であるDFM (dynamic factor model)では、Kalman filterやEM algorithmといったアルゴリズムを利用した最尤法によるモデル推定がなされる。これら一連の手法(予測モデル、モデルの推定方法、推定の際のアルゴリズム)に関するかなり膨大な文献を読んだ。ニューヨーク連銀は、DFMに基づいたNowcastingを昨年から公表し始めたが、その責任者であるDomenico Giannnone博士をニューヨーク連銀に訪れ、詳細について議論した。特に有益な知見は、月次系列がすでに入力されていれば、日次や週次の系列は、予測値にあまり影響を及ぼさない事であった。ニューヨーク連銀のNowcastは、月次・四半期・年次のデータしか利用しないとはいえ、それらのデータが公表されるのは、期末とは限らないため、Nowcastは、データが公表されるごとにアップデートされる。プログラミングが本研究の中心になるが、今年度は、当初計画通り、入力系列が月次のみの場合にGDPの月次予測を行うプログラムを開発した。さらに、実際のデータではなく人工的に発生させたデータを使って、最尤法を試みた。最尤推定値は、データを発生させたモデルのパラメーターにかなり近い値になったが、この値に収束するまで、かなり時間がかかるので、プログラムの改良が必要だと思われる。プログラムで使った言語はMatlabであるが、次年度は、これをRに移植する事を予定している。当初計画では、初年度は文献のサーベイと月次モデルのプログラミングだったが、それらをほぼ達成できた。前年度(平成28年度)の実施状況報告書(様式F-7-1)で述べたとおり、平成28年度は、GDP Nowcastingに用いるデータは月次と四半期データに限り、日次や週次データは用いないことにし、人工的に発生させたデータで最優推定法を実行した。今年度(平成29年度)は、研究協力者の舘祐太氏の助力をあおいで、real-time dataの収集をした。real-time dataとは、GDPを例にとると、任意の時点(例えば2016年4月末)において、その時に利用可能なGDPの系列である。その系列が2015年の第4四半期までだとしよう。より最近の別の時点(例えば2018年2月)で利用可能なGDPの系列は、2017年第3四半期だとしよう。この系列の2015年の第4四半期までの値は、2016年4月末に利用可能な系列の値と一致するとは限らない。その理由は二つある。第一に、季節調整は最も期近のデータを使って行われる。第二に、過去の系列の値は、定期的に改訂される。今年度は、20を超えるreal-timedataを収集した。また、毎年定期的に発表される、民間のエコノミストのGDP予想値について、2000年代後半からの値を収集した。我々のGDP nowcastingとこの民間の予想値のどちらが誤差の少ないGDP Nowcastになるかを検証したいためである。こうして得られたreal-timedataを用いた最尤推定を年度末ごろから開始した。使用するプログラムは、Matlabからよりユーザーベースが広いと思われるRに変更した。申請当初の計画では、平成29年度に月次GDPのNowcastの推計を行うとしていたが、そのためにはreal-time dataの収集が必要であることが判明し、その収集を終えた。前年度の実施状況報告書で述べたように、その時予定していた、プログラムのRへの移植は完了した。

2018年3月に承認された「F-14補助事業期間延長承認申請書」で述べたように、家庭の事情により、2018年8月以降、研究に使える時間がほとんどなくなった。当初計画の第2年度の作業を行うが、当初計画になかった作業も行う。初年度では、月次モデルをプログラムしたが、それはMatlabで行った。まずやることは、それをRという言語に移植する。Rに移る理由は、それが無料で利用可能である、ユーザーベースがより広いためである。それが終わり次第、当初計画通り、月次よりもより頻繁な頻度のデータ(週次、日時など)を利用して月次のGDPを予測するプログラムをRで書く。残された課題は、real-time dataを用いた予測モデルの最尤法による推定を終えることと、その推定値を使ったGDP Nowcastの推計を行うこと、そして推計の手続きを詳細に述べた論文を執筆することである。1年間の延長をいただいたので、上記「研究結果の概要」で述べた、ステップ(b)と(c)を完成させたい。今年度(平成29年度)は、海外の学会への出席をしなかったので、旅費が予定していた額を下回った。来年度(平成30年度)は、2回の海外の学会出席を予定している。「(F-14)補助事業期間延長承認申請書」で具体的に述べたように、ある家庭の事情により、学務以外に使える時間がほとんどなくなり、研究の進展が2018年8月以降は難しくなった。
自己形成量子リングを用いた励起子アハロノフ・ボーム効果の検証

液滴エピタキシー成長手法を用いることで回転対称性のよいガリウム砒素量子リング構造を作製できる。我々は孤立した1個の量子リングに対し、10テスラまでの磁気発光スペクトルを観測し、その結果、6テスラ程度の磁場領域で、顕著な発光強度の減衰が見出された。中性励起子状態のアハロノフ・ボーム効果に由来すると考えられる。本研究では最近申請者らが作製方法を確立した、半導体リング状ナノ結晶(量子リング)を対象に、単一の量子リングにおける磁気光学応答を観測し、励起子状態のアハロノブ・ボーム(AB)効果の検証を行うことを目的とする。計画段階においては、物材機構の大型磁石を使い、強磁場環境で駆動する顕微分光システムを組み立てることが最初の課題であったが、運良く、フランスの研究機関が所有する当該装置(磁場強度10T)を使用する機会を与えられたので、そちらで実験を遂行した。当該機関への滞在期間は5ケ月である(機構の在外派遣制度を利用)。移動に先立ち、共同研究者の間野にリング径が体系的に異なる試料系列を準備してもらい、それら高品質の量子リングを携えて実験に着手した。まず、先方の分光装置が赤外域の光検出に最適化してあったところを、可視域の実験に対応できるように、各種構成部品を交換し、組み立て直し、装置評価が終えるまでに3ケ月を費やした。新しい量子リング試料において顕微発光スペクトルを観測したところ、単一の量子リング由来の発光信号が再現よく現れることを確認した。比較的半径が小さな2重量子リングの試料において、狭線幅のスペクトルが観測出来たので、これを対象に磁場実験を実施した。磁束侵入を促すファラデー配置において、単一量子リング発光の磁揚依存性を観測した。円偏光成分を分解してスペクトルを取得すると、6Tの磁場強度を境に、ゼーマン下準位からの発光強度がおおむね20%程度、減少することを見いだした。パルス励起下で発光寿命の測定を実施したが、寿命の変化に優位な差は見られなかった。実験結果は、励起子AB効果の出現と似合っているが、確度の高い判断には数値シミュレーションによる定量比較が必要であり、次年度に実施する予定である。先方の分光装置が赤外域の光検出に最適化してあったところを、可視域の実験に対応できるように、各種構成部品を交換し、組み立て直し、装置評価が終えるまでに3ヶ月を費やした。磁束侵入を促すファラデー配置において、単一量子リング発光の磁場依存性を観測した。実験結果は、励起子AB効果の出現と似合っているが、確度の高い判断には数値シミュレーションによる定量比較が必要である。実験結果について、学会発表ならびに論文発表を行った。
犬猫の可溶性CTLA-4検索と自己免疫疾患診断マーカーへの応用

犬の可溶性CTLA-4の検索を行うため、犬PBMCから作成したcDNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、膜貫通ドメインであるエクソン3が欠損したスプライシングバリアントが検出された。健常犬の血清を用いて免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行ったところ、23kDa付近にバンドが検出され、これは塩基配列から予想されたバンド長と同一であった。次に、自己免疫疾患罹患犬における可溶性CTLA-4の発現を評価するためELISAキットを用いて血清中の可溶性CTLA-4の測定を行ったが、健常犬と比較し自己免疫疾患罹患犬における可溶性CTLA-4の有意な上昇は認められなかった。健康犬より末梢血を採取し、PBMCを分離後、常法に従いmRNAを抽出、cDNAを作成した。その後、犬CTLA-4の遺伝子配列からプライマーを作成し、RT-PCRを行った。その結果、100bp程度長さの異なる2本のバンドが確認された。PCR産物をクローニングし、その配列をシーケンス解析したところ、長いほうのバンドは犬CTLA-4と100%一致する塩基配列であった。もう一方の短いバンドは犬CTLA-4の塩基配列のうち、膜貫通領域であるExon3が欠損したものであったことから、可溶性CTLA-4であると思われた。犬においてもヒトと同様の機序で可溶性CTLA-4が作られているものと思われた。また、犬可溶性CTLA-4のアミノ酸配列を確認したところ、cytoplasmic tailのC末端の3アミノ酸が欠損しており、これまで可溶性CTLA-4の存在が知られている、ヒト、マウス、ラットでは見られない変異であった。同様の手技を複数の健常犬で行ったところ、全て同一の結果が得られた。次に健常犬の血清を用いて、mouse-抗ヒトCTLA-4mAbを用い免疫沈降を行ったのち、Western blottingを行った。その結果、25kDa付近に蛋白発現を認め、ヒト可溶性CTLA-4と同一の分子量であることから犬においても血清中に可溶性CTLA-4が存在し、血清中に分泌されているものと思われた。また、診断マーカーとしての有用性を評価するため、臨床例(とくに自己免疫疾患)の血清サンプルを収集中である。犬においては計画通り可溶性CTLA-4の発現を確認できており、計画通りに推移しているものと思われる。健常犬における可溶性CTLA-4(以下sCTLA-4)の存在を明らかにするため、健常犬より末梢血液を採取し、PBMCを分離、RNAを抽出した後、犬CTLA-4に対するプライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたPCR産物はTA Cloningの後、シークエンス解析により塩基配列を決定した。RT-PCRでは750、650bp付近に2本のバンドが確認され、750bpは犬CTLA-4のmRNAと100%一致する配列であり、650bpは犬CTLA-4のExon3が欠損したsplicing variantであった。これは170aaから構成され、ヒトsCTLA-4のアミノ酸配列と82.9%の相同性であった。興味深いことに、ヒトやマウスで報告されている配列と比較し、犬のsCTLA-4のcytoplasmic tailはsplicingによって起こったフレームシフトにより3アミノ酸が末端で欠損していた。これは他の健常犬で行った実験でも確認されている。次に健常犬の血清を用い、抗ヒトCTLA-4抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロット(以下WB)により犬sCTLA-4の発現を確認した。WBでは23kDa付近にバンドが確認され、これはヒトで報告されたsCTLA-4蛋白の分子量と同一であった。また、同様の検討を他の健常犬2頭で行ったが同様の結果であった。自己免疫疾患症例犬の来院が少なく、サンプル数がまだ十分量に達していない。そのため、少数例で可溶性CTLA-4の発現をELISAで確認したが、どの自己免疫疾患で有意な上昇がみられるかなどはまだ検討できていない。自己免疫疾患罹患犬における可溶性CTLA-4の発現を評価するため、ELISAキットを用いて血清中の可溶性CTLA-4測定を行った。自己免疫疾患(39頭:SLE・天疱瘡様疾患:3頭、免疫介在性血小板減少症:11頭、免疫介在性溶血疾患:13頭、自己免疫性脳炎:6頭、自己免疫性関節炎:6頭)、健常犬13頭を用いた。その結果、可溶性CTLA-4濃度は自己免疫疾患で4.8±19.8、健常犬で7.6±18.2となり有意な差は認められなかった。可溶性CTLA-4が検出されたのはSLE・天疱瘡様疾患:0/3頭、免疫介在性血小板減少症:4/11頭、免疫介在性溶血疾患:1/13頭、自己免疫性脳炎:1/6頭、自己免疫性関節炎:1/6頭、健常犬5/13頭であった。一部の症例で治療経過との比較も行ったが、有意な変動は認められなかった。これまでの検討により、人同様、犬CTLA-4のmRNAにおいてスプライシングにより可溶性CTLA-4が形成されること、さらに健常犬血清中において可溶性CTLA-4が存在することが明らかとなった。しかし、自己免疫疾患のマーカーとしての役割は明らかとはならなかった。