hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異嗅症モデルマウスを用いた嗅細胞の投射異常と継時的修復メカニズムに関する研究

また、セマフォリン3Aは胎生期に嗅細胞軸索の投射先を決定する軸索ガイダンス因子の一つであると同時に神経忌避因子でもある。セマフォリン3Aを吸着させたビーズを嗅球前方に設置したが、軸索切断6週間後に再生嗅細胞軸索の伸長が阻害されていため、成人期のマウスにおいてセマフォリン3Aは神経忌避因子としての機能が強く出ていると考えられ、これを用いて再生嗅細胞軸索を所定の位置に誘導することで,投射異常による異嗅覚症が改善する可能性が示唆された。本年度はセマフォリン投与による嗅覚再生の寄与を検討予定であった。研究員の出産、育児に伴い、研究が一時中断していたが、当学男女共同参画室による研究補助員支援制度を活用し、研究活動を継続可能となった。遺伝子組み換えマウスの系等維持と組み換え遺伝子の発現確認が主となったこと、セマフォリン3Aが成人期のマウスにおいては軸索ガイダンス因子としてではなく、神経忌避因子としての性質を強く持つことが明らかになってきたため遅れているが、本年度の研究によりセマフォリンの作用を阻害した方が嗅覚再生を促進するのではないかという仮説の元、現在新規薬剤投与を検討中である。本年度は変異マウスの繁殖と系の確立が中心となったため次年度は本年度予定した検討を行うとともに新生嗅細胞軸索の継時的変化の観察を加え、投射異常の修復のメカニズムの検討を行う。本年度の研究によりWlds変異は嗅覚再生に寄与しないこと、セマフォリン3Aは阻害するほうが、神経の再生に有効であるのではないかと考えられる。嗅覚細胞を特異的に蛍光標識する他の遺伝子組み換えマウスをもちいて、外傷性嗅覚障害モデルマウスを作製し、セマフォリン阻害薬が外傷性嗅覚障害の治療薬となりえるか、行動実験や組織学的検討を介して嗅覚再生の寄与について検討を行う。代表者の休業により一部計画を次年度に繰越したため残額が生じた。使用残額は試薬などの消耗品費購入のために使用する予定である。物品を購入する際に業者間比較を十分に行ったことなどにより、予定額よりも購入額を抑えることが可能であったため、次年度使用額が発生した。
口腔扁平上皮がん細胞の上皮増殖因子による増殖調節機構の解明

本研究の目的は、口腔扁平上皮癌細胞(HST-1)および摘出がん組織における上皮増殖因子(EGF)受容体と浸透圧感受性クロライドチャネルとの細胞内シグナル伝達系を介した制御機構の解明である。以前よりVSORは細胞増殖に関係し、VSORを抑制することによりアポトーシスが誘導されることやVSORに対するEGF受容体の関与が報告されていた。我々の電気生理実験の結果においてもVSORのEGF受容体による制御が確認されていたが、その後の生化学的実験により、VSORの活性化および抑制のいずれの場合もEGF受容体のリン酸化およびその下流のAktおよびErkの両者のリン酸化が起きていることが判明した。詳細としては、低浸透圧刺激(245mOsM)時には一時的な(数十分単位)AktおよびErkの活性化が起き、細胞増殖が促進されたのに対し、阻害薬投与時にも、同様に一時的なAktおよびErkの活性化が起き、一度不活性化した後にアポトーシスが起きてくる日単位(24時間以降)より再活性化が起きることが判明した。このことは、HST-1細胞において、VSORによるEGF受容体下流のAktおよびErkの活性化が細胞増殖および細胞死の両者に関係していることが示唆された。一方で、VSORの分子実体を発見すべくTMEM16Aに焦点を絞り、RNA干渉により効果を観察し、電流としての減弱は確認されたものの、TMEM16Aの新規特異的阻害薬の投与によっても細胞死は起こらなかった。以上の結果から、TMEM16Aは浸透圧制御に一部関わっているものの、VSORの分子実体そのものではないことが判明した。今後、VSORの分子実体が解明され、そのことが口腔扁平上皮がん治療の一助となることが望まれる。本年度は、口腔扁平上皮癌細胞(HST-1)における1)上皮増殖因子(EGF)受容体による浸透圧感受性クロライドチャネル(VSOR)へのシグナル伝達機構の解明、2)EGF受容体活性化による細胞内シグナル伝達系及びVSORによる細胞増殖への効果、3)VSOR分子実体の解明、4)口腔扁平上皮がん組織でのVSORの発現及び分布の検討、を目標に実験を遂行した。ウエスタンブロット法により、EGF受容体はEGF刺激だけでなく、浸透圧刺激だけでもリン酸化することが判明し、その下流としてAktおよびERK(MAPK)の両者が時間的な差はあるもののリン酸化されることが判明した。VSOR阻害薬であるDCPIB存在下では、浸透圧刺激のみに比してERKのリン酸化は顕著であったことから、EGF受容体とVSORの間でのシグナル伝達機構には、主にERK(MAPK)が関与していることが示唆された。さらに、興味深いことにDCPIB(>30microM)投与により、培養下にHST-1は顕著な細胞死が観察された。またVSORの分子実体と考えられるTMEM16AおよびClC-3のsiRNAを用いてをノックダウンしたところ、パッチクランプ法により、TMEM16Aの場合のみVSOR電流の顕著な抑制が観察された。以上の結果の一部は第53回歯科基礎医学会にて発表した。従って、1)3)に関してはかなりの成果が得られたと自負している。4)に関しては、現在、免疫染色の条件を検討しているところである。口腔扁平がん細胞におけるEGF受容体ーVSOR調節機構の大まかな全容は知ることができた上に、VSORの分子実体も概ね明らかにすることができた。以上のことから、本研究は概ね順調に進んでいると判断した。昨年度にやり残していた組織免染の実験を進めるとともに、本年度より、EGF受容体及びVSORの口腔扁平上皮がん組織での発現及び分布の悪性度を含めた検討も追加項目とし、実験を進める。

尚、現在まで明らかとなった事項に関しては、積極的に学会発表および論文投稿を行う。本年度の研究費は、主に消耗品費、機器借用費として使用する。便宜、必要があれば主要な学会にて発表するための旅費として使用する。
寄生植物コシオガマにおける吸器発生メカニズムの解明

寄生植物の寄生に必須である吸器という器官の発生と機能を理解するには、吸器がどのような細胞群から構成されているのかを理解する必要がある。しかし、分子生物学的な知見はこれまでのところ報告されていない。当該年度では、吸器発生過程において細胞系譜を追跡できるコンストラクトを作成した。このシステムを用いて皮層細胞の系譜を吸器発生過程で追跡した結果、吸器中心付近の皮層細胞は最終的に維管束幹細胞様の細胞へと分化している様子が観察された。他の解析も併せると、吸器の中心に発達する維管束幹細胞様の細胞は、皮層や内皮などから分化してきたものであることが示された。以上の解析より明らかになった細胞分化のダイナミクスとパターニングを理解するために、植物器官発生に重要な役割を果たすオーキシンについての研究を進めた。オーキシン応答性プロモーターであるDR5の発現パターンを、吸器発生過程で解析したところ、初期では吸器発生部位の表皮、吸器の頂端部、そして発生後期では道管細胞が分化する箇所でオーキシン応答が起こっていることが分かった。トランスクリプトーム解析から吸器発生初期では、オーキシンの主要生合成経路で働く酵素であるYUCCAの発現が表皮特異的に上昇することが明らかとなった。この遺伝子について解析を進め、表皮局所的なオーキシン生合成が吸器発生初期で重要な役割を担っていることが明らかとなった。さらに、オーキシン輸送体について解析を進め、吸器内部の道管細胞分化のパターンは、オーキシン輸送ネットワークによるダイナミックなオーキシン濃度勾配の形成により制御されていることが示唆された。特にオーキシン流出担体は宿主植物との間の連絡を確立するのに決定的な役割を果たすことが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。宿主植物の組織に侵入する細胞で発現する遺伝子を同定するために、組織特異的なトランスクリプトームを行った。レーザーマイクロダイセクションを用いた組織の単離、RNAの抽出・cDNAの増幅、ライブラリ作製という作業過程を経て最終的には、Illumina Miseqでのシーケンスを行なった。このシーケンスで1億2千万リードを得て、これを用いて以降の解析を行った。宿主組織に侵入している組織とその他の組織のトランスクリプトームデータを比較し、発現変動解析を行った結果、有意に発現が変動している約2600遺伝子を同定することに成功した。この2600遺伝子のうち宿主に侵入している組織で発現が上昇している遺伝子の中から、他の組織での発現がみられないことと、発現上昇の度合いが大きいことの2つを指標にいくつかの遺伝子を選び、その発現パターンを解析した。その結果、宿主植物の組織と隣接している細胞でのみ発現するパターンを示す遺伝子を複数得ることができた。これらの遺伝子の発現パターンは特異性が非常に高く、細胞マーカーとして十分に使えるものである。またCRISPR/Cas9のシステムがコシオガマでも有効であることが確認できたので、逆遺伝学的に遺伝子の機能解析をすることが可能となった。モデル植物のシロイヌナズナで得られている知見を参考に、コシオガマの根における、表皮、根毛、皮層、内皮、前形成層のマーカーを確立した。加えて、上述した寄生植物特異的な細胞種類のマーカーも確立した。これらのマーカーの挙動を時空間的に追うことで、寄生植物がどのように根の組織を改編して吸器を形成するかを明らかにする予定である。寄生植物が宿主植物に寄生する際に発達させる「吸器」の発生について研究を進めている。吸器の発達過程では、一度ある細胞種に分化した細胞が別の細胞種に再分化している可能性を示唆するデータを得ている。前年度には、この発生過程を理解するために、植物の根の細胞種特異的に発現するマーカーを作成した。今年度はこれらのマーカーの吸器発生過程での発現動態をライブイメージングの手法を用いて解析した。吸器の中心部分では維管束始原細胞のマーカーと考えられる遺伝子の発現が上昇していることが分かった。一度、皮層細胞や、内皮細胞に分化した細胞が吸器の発生過程中に維管束様の細胞へと再分化していることが示唆された。また、この再分化には植物ホルモンのオーキシンが関わっていると推測されたので、オーキシン応答性プロモーターの発現パターンの解析を行った。オーキシン応答性プロモーターの発現は、のちに道管細胞が分化する領域と重なることがわかった。前年度に行った組織特異的なトランスクリプトーム解析から、寄生植物と宿主植物の境界で発現する遺伝子を多数同定した。現在これらの遺伝子のうち特に発現の上昇率が高いものについて、CRISPR/Cas9を用いた逆遺伝学的手法を用いて機能解析を進めている。当研究室で得られた、もう一つのトランスクリプトームデータと合わせて、クラスタリング解析やネットワーク解析も進め、重要遺伝子の同定を進めている。当初の計画通り、前年度に確立したマーカー遺伝子の発現パターンを確認し終えることができた。植物ホルモンのオーキシンの濃度勾配の動態の解析は、付加的な実験であったが、組織の細胞パターンと合致する結果が得られており、その点で計画以上の進展である。CRISPR/Cas9を用いた逆遺伝学解析については、ノックアウトの効率が高くなく系の改良にやや時間を要したが、現在は順調に進んでいる。

しかし、分子生物学的な知見はこれまでのところ報告されていない。当該年度では、吸器発生過程において細胞系譜を追跡できるコンストラクトを作成した。このシステムを用いて皮層細胞の系譜を吸器発生過程で追跡した結果、吸器中心付近の皮層細胞は最終的に維管束幹細胞様の細胞へと分化している様子が観察された。他の解析も併せると、吸器の中心に発達する維管束幹細胞様の細胞は、皮層や内皮などから分化してきたものであることが示された。以上の解析より明らかになった細胞分化のダイナミクスとパターニングを理解するために、植物器官発生に重要な役割を果たすオーキシンについての研究を進めた。オーキシン応答性プロモーターであるDR5の発現パターンを、吸器発生過程で解析したところ、初期では吸器発生部位の表皮、吸器の頂端部、そして発生後期では道管細胞が分化する箇所でオーキシン応答が起こっていることが分かった。トランスクリプトーム解析から吸器発生初期では、オーキシンの主要生合成経路で働く酵素であるYUCCAの発現が表皮特異的に上昇することが明らかとなった。この遺伝子について解析を進め、表皮局所的なオーキシン生合成が吸器発生初期で重要な役割を担っていることが明らかとなった。さらに、オーキシン輸送体について解析を進め、吸器内部の道管細胞分化のパターンは、オーキシン輸送ネットワークによるダイナミックなオーキシン濃度勾配の形成により制御されていることが示唆された。特にオーキシン流出担体は宿主植物との間の連絡を確立するのに決定的な役割を果たすことが分かった。トランスクリプトームのデータを用いて発現変動遺伝子を同定することができたのは大きな成果である。いくつかの遺伝子については発現パターンの解析まで進むことができた。それらの結果はトランスクリプトームの結果をよく反映しており、トランスクリプトーム解析のクオリティを確認することができた。CRISPR/Cas9や細胞種マーカーなどのツールの確立も順調に進んでいるので、次の解析にスムーズに移行できるだろう。側根発生との比較から、内鞘細胞がどれだけ吸器の発生に寄与しているかのデータが重要になると考えられる。クローナルな解析を加え、より正確なFate mapを描けるように解析を進める。オーキシンについては輸送体の発現を解析し、濃度勾配をつくる分子実体を明らかにする。CRISPR/Cas9を用いた逆遺伝学解析については、表現型が得られた遺伝子について解析を進める。遺伝学的解析をできないが、これまでに確立してきたマーカー遺伝子の発現を見ることで、発生過程のどの部分に関わっているかの推測が行える。28年度が最終年度であるため、記入しない。トランスクリプトーム解析によって同定した、吸器特異的に発現している遺伝子については、CRISPR/Cas9システムを用いた逆遺伝学的アプローチにより機能解析を行う予定である。確立してきた細胞種マーカーを、共焦点顕微鏡で継時観察し細胞分化のダイナミクスを明らかにする。
PC3 を用いたラットラセン神経節細胞の分化・成熟の誘導

ラセン神経節細胞の発生・分化のメカニズムはこれまで不明であったが、最近我々は増殖抑制遺伝子の一つであるPC3が胎生期の蝸牛ラセン神経節細胞に発現しており、ラセン神経節細胞の分化・成熟に関与している可能性を初めて報告した。本研究は、単離ラセン神経節細胞を用いたPC3発現抑制の効果を見ることにより、PC3のラセン神経節細胞の分化・成熟に対する関与をより明確にすることを目的とした。単離ラセン神経節細胞に対して、PC3.siRNAを導入し3日間培養後にPC3タンパクの発現抑制により生じるラセン神経節細胞の形態変化について検討したが、コントロール群と比べて明らかなラセン神経節細胞の形態変化は認めなかった。ラセン神経節細胞は、蝸牛有毛細胞によって機械的エネルギーから電気的エネルギーへと変換された音情報を脳へと伝達するという聴覚機能において極めて重要な役目を担っている。しかしながら、これまでラセン神経節細胞の発生・分化のメカニズムはこれまで不明であった。最近我々は増殖抑制遺伝子の一つであるPC3が胎生期の蝸牛ラセン神経節細胞に発現しており、ラセン神経節細胞の発生・分化に関与している可能性を初めて報告した。本研究はこの結果をもとにして、単離ラセン神経節細胞を用いたPC3発現抑制と過剰発現の効果を見ることにより、PC3のラセン神経節細胞の発生・分化に対する関与をより明確にすることを目的とした。まず、胎生14日目、胎生16日目、胎生20日目、生後4日目の正常ラットからラセン神経節を採取し、トリプシン処理によって細胞単位に単離し、単離培養ラセン神経節細胞におけるPC3の細胞内局在の確認を行うために、単離直後と1日間37°C、CO_25%の環境下でその局在が変化しないことを確認した。胎生14日目、胎生16日目のラットラセン神経節細胞については、ラセン神経節細胞の採取量が少なく、培養条件が確立するに至らなかったが、E20ではPC3は細胞質に、生後4日目では核にその局在を認め、培養1日後もこの局在に変化はなかった。今後は引き続き、準備してあるpc3.siRNAを導入し、3日間培養後にPC3タンパクの発現抑制により生じるラセン神経節細胞の形態変化について、ネガティブコントロールとなるsiRNAを導入したコントロールと比較検討する、という予定実験を遂行する。本研究はこの結果をもとにして、単離ラセン神経節細胞を用いたPC3発現抑制の効果を見ることにより、PC3のラセン神経節細胞の発生・分化に対する関与をより明確にすることを目的とした。胎生14日目、胎生16日目、胎生20日目、生後4日目の正常ラットからラセン神経節を採取し、トリプシン処理によって細胞単位に単離し、単離培養ラセン神経節細胞におけるPC3の細胞内局在の確認を行うために、単離直後と1日間37°C、CO_25%の環境下でその局在が変化しないことを確認した。平成22年度には胎生20日目ではPC3は細胞質に、生後4日目では核にその局在を認め、培養1日後もこの局在に変化はなかったことを確認できたが、胎生14日目、胎生16日目のラットラセン神経節細胞については、培養条件の確立に至らなかった。本年度も引き続き胎生14日目および16日目のラットラセン神経節細胞の培養を行ったが、培養条件を確立するに至らなかった。今年度は、培養条件が確立している胎生20日目および生後4日目のラセン神経節細胞に対して、PC3.siRNAを導入し、3日間培養後にPC3タンパクの発現抑制により生じるラセン神経節細胞の形態変化について検討する予定である。

本研究はこの結果をもとにして、単離ラセン神経節細胞を用いたPC3発現抑制の効果を見ることにより、PC3のラセン神経節細胞の発生・分化に対する関与をより明確にすることを目的とした。胎生14日目、胎生16日目、胎生20日目、生後4日目の正常ラットからラセン神経節を採取し、トリプシン処理によって細胞単位に単離し、単離培養ラセン神経節細胞におけるPC3の細胞内局在の確認を行うために、単離直後と1日間37°C、CO25%の環境下でその局在が変化しないことを確認した。平成22年度および23年度には胎生20日目ではPC3は細胞質に、生後4日目では核にその局在を認め、培養1日後もこの局在に変化はなかったことを確認できたが、胎生14日目、胎生16日目のラットラセン神経節細胞については、培養条件の確立に至らなかった。平成24年度は、培養条件が確立している胎生20日目および生後4日目のラセン神経節細胞に対して、PC3.siRNAを導入し、3日間培養後にPC3タンパクの発現抑制により生じるラセン神経節細胞の形態変化について検討したが、コントロール群と比べて明らかなラセン神経節細胞の形態変化は認めなかった。現在、PC3およびGFPを組み込んだアデノウイルスベクターを培養液に加えることにより、単離培養ラセン神経節細胞にPC3を導入し、コントロール群と神経突起の長さ、細胞体の大きさを比較検討中である。胎生期のラットラセン神経節細胞の培養については、コンタミネーションや採取細胞数の少なさなどが原因で条件を確立させることが困難であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、すでに培養条件がある程度確立している胎生20日目および生後4日目に対して、PC3.siRNAを導入し、3日間培養後にPC3タンパクの発現抑制により生じるラセン神経節細胞の形態変化について検討する予定である。
大脳新皮質における情報統合の研究:アデノウィルスを用いた形態学的解析とモデル化

昨年度に確立した皮質視床投射神経細胞の逆行性標識を用いて、大脳反質各層から皮質投射神経細胞へのシナプス候補ブトンを3次元的にプロットした。さらに、シナプス候補ブトンの分布をコンピュータープログラムを用いて解析した。着眼したのは、軸索を出す細胞体からの距離である。細胞体からの距離に対してシナプス候補ブトン数の相対頻度をプロットしたところ、興奮性細胞の細胞体の位置によりその分布は大きく異なっていた。特に、6層の視床投射神経細胞と4層の興奮性細胞は狭い範囲にブトンを持ち、6層の非視床投射神経細胞は広い範囲にブトンを持っていた。これらの分布に、さらにブトン数、および神経細胞の数を加味して、特定の視床投射神経細胞群に、どれほど離れた各層の神経細胞からどの程度入力があるかを推定したところ、6層の視床投射神経細胞からは半径200μmの円柱内から強い入力があることが分かり、逆に6層の非視床投射神経細胞からは半径200μmの円柱より外から強い入力があることが分かった。また、狭い範囲(半径約30μmの円柱内)の入力を考えると、4層から6層への入力が際立つことが分かった。次に、特定数の神経細胞が活動した場合にどのような範囲からどれほどの入力があるかを推定するため、入力密度に神経細胞の分布密度を加味した推定を行うと、受け手側の6層視床投射神経細胞から水平距離で40μm以内の4層からの入力が最も強いことが分かった。4層からの強い入力の構成をさらに詳細に検討し、シミュレーションした結果、6層視床投射神経細胞の基底樹状突起に入力するシナプス候補ブトンが重要な役割をしていることが推定された。興奮性細胞について大脳皮質の広がりの、ある範囲に限って特異的な結合を報告は少なく、大脳皮質の基本的構成を考える上で重要な結果である。・E/synpromotorの下流で、myr-GFP-LDLRctを発現するアデノウイルスベクターの作成、および調製を行った。・上記ベクターを視床に注入することで、大脳新皮質VI層の大脳新皮質に位置する皮質視床投射神経細胞を逆行性に標識することに成功した。・従来ウイルスベクターによる逆行性標識は効率に問題があったが、上記ベクターによる標識は、伝統的な逆行性標識物質と同様の高い標識効率を実現した。・さらに上記ベクターが発現するmyr-GFP-LDLRctの特性である樹状突起移行性を利用して、棘突起にいたるまで樹状突起の隅々までを標識することに成功した。・上記ベクターを注入した動物から大脳皮質スライスを得て、in vitro細胞内記録と組み合わせることで、皮質単一神経細胞軸索と皮質視床投射神経細胞の樹状突起との同時可視化を確立した。・上述の可視化によって、大脳皮質各層の神経細胞から、皮質視床投射神経細胞への入力を形態学的に解析することが可能となった。・実際に上記の方法にのっとって、大脳皮質各層から皮質視床投射神経細胞への入力を定量した。
ろう者コミュニティの視点による日本手話語彙体系の記録・保存・分析

本研究のもっとも大きな成果は,先行プロジェクトを継承して,多くの人に利用可能な手話言語コーパスの構築を進めたことと,このコーパスを利用しての言語学的な分析を語彙と会話両方において進められたことにある.具体的には,長崎県,福岡県,石川県,富山県の30代から70代まで,計62名のろう者を各地域のろう者団体の協力を得て選出し,インタビュー,語彙誘出課題と課題志向対話の方法で手話表現収録を実施することができた.そして,手話表現を細かく転記することで,日本手話における語彙の共有現象や会話の話者交替現象を分析することが可能となり,手話言語と音声言語の比較研究に広がりが生まれた.平成25年度は,『第1期手話コーパスプロジェクト(群馬県・奈良県)』から『第2期手話コーパスプロジェクト』への移行期間と位置づけ,第1期プロジェクトの手法と結果について,研究者コミュニティとろう者コミュニティの両方よりフィードバックを得て,第2期プロジェクトの手法をデザインする活動に注力した.研究者コミュニティにおいては,第1期プロジェクトで得た語彙データの分析結果を一部「みんぱく手話言語学フェスタ2013」及び「日本手話学会第39回大会」で発表し,国内外の研究者よりフィードバックを得ることができた.また,語彙表出を誘出するための課題にアニメーション手法を導入することについて,手話アニメーション製作専門家と研究協議を実施し,これらの結果を踏まえて第2期プロジェクトに向けて手法の改善を進めることができた.ろう者コミュニティに関しては,第1期プロジェクトで製作後インターネット公開した「日本手話話し言葉コーパス」の語彙篇を,明治時代以降の手話単語集データベースとセットで紹介する活動を展開した.前者が共時的なデータベースであるのに対し,後者は通時的なものと言える.第2期プロジェクトの一環として,京都のろう者コミュニティが昭和34年頃に作成した手話単語集を電子化し,採録される手話単語を再現して動画としてはめ込むデータベースを製作し,インターネット公開を実現した.これらの活動を通して全国のろう者コミュニティと交流をしてきた結果,第2期プロジェクトは北陸地域及び九州地域で手話データの収集を行うことについて該当地域のろう者コミュニティの承諾を得る手続きを終えた.平成26年度は,手話データ収録作業,手話データ分析作業,学会発表,ろう者コミュニティとの対話のすべてをバランスよく進められた一年間であった.手話データ収録作業:九州地域,長崎と福岡において実施した.地域のろう者が学んだ聾学校の分布を参考に,長崎では2地域,福岡では4地域から計16名のろう者を対象として手話データ収録を終えた.手話データ分析作業:研究代表者の大杉豊が所属する筑波技術大学で大学院生を補佐に入れて語彙課題の分析作業を進めることが出来た.研究分担者の坊農真弓が所属する国立情報学研究所でもアシスタントを補佐に入れて会話課題のアノテーション及び分析作業を進めることが出来た.ろう者コミュニティとの対話:手話データ収録作業を実施する際に地域のろう者コミュニティに地域独特の手話データ収録の重要性を啓発し,実際に自主的な取組があった.また,ろう者コミュニティ向けの雑誌「手話・言語・コミュニケーション」に本研究の意義と内容を紹介した.平成27年度は,手話データ収集作業,手話データ分析作業,学会発表,ろう者コミュニティとの対話のすべてをバランスよく進められた一年間であった.手話データ収集作業:北陸地域,石川と富山において実施した.地域のろう者が学んだ聾学校の分布を参考に,石川では1地域から14名,富山では2地域から16名,合計30名のろう者を対象に語彙及び会話の課題を用いて手話データを収集した.手話データ分析作業:研究代表者の大杉豊が所属する筑波大学及び研究分担者の坊農真弓が所属する国立情報学研究所において,語彙課題,会話課題両方のアノテーション及び分析作業を進めた.学会発表:会話課題についてアノテーション手法を含めた分析結果の一部を二つの国際学会で発表し,欧米の研究者よりフィードバックを得ることができた.ろう者コミュニティとの対話:手話データ収集作業の実施に際して,地域のろう者コミュニティに地域の手話データ収集の重要性を啓発し,地域が独自の取組みを始める等波及効果があった.また,ASEAN地域障害と公共政策サイバー大学院の夏季特別講座にて手話言語コーパス研究の意義を啓発した.本研究のもっとも大きな成果は,先行プロジェクトを継承して,多くの人に利用可能な手話言語コーパスの構築を進めたことと,このコーパスを利用しての言語学的な分析を語彙と会話両方において進められたことにある.具体的には,長崎県,福岡県,石川県,富山県の30代から70代まで,計62名のろう者を各地域のろう者団体の協力を得て選出し,インタビュー,語彙誘出課題と課題志向対話の方法で手話表現収録を実施することができた.そして,手話表現を細かく転記することで,日本手話における語彙の共有現象や会話の話者交替現象を分析することが可能となり,手話言語と音声言語の比較研究に広がりが生まれた.手話データの収録が2地域で終了し,最終年度で残る2地域での収録を行う見通しも立っている.また,データ分析も順調に進められており,その成果について国内外での発表が出来ている.27年度が最終年度であるため、記入しない。手話言語学ろう者学残る2地域での手話データ収録を速やかに進める.本学大学院の院生のみならず分担者の坊農真弓氏が所属する国立情報学研究所のリサーチアシスタントも補佐に入ってのデータ分析を進め,国内外の学会での発表及び成果(言語コーパス)のウェブサイト公開も並行して進めるため,本研究は計画に変更を加える必要はない.手話データの収録を実施する地域は確定したが,現地の実施体制及び収録対象者の決定がまだである.

また,研究倫理上の手続きを完了できていないことにより,若干の遅れが生じているため.27年度が最終年度であるため、記入しない。2地域での手話データ収録作業を実施したが,この手話データを分析する作業及びウェブサイトに公開する作業が完了していない状況である.そのための人件費・謝金等が次年度使用額となった.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は研究代表者の大杉が所属する筑波技術大学に大学院が新設されたことにより,院生らがデータ収録コーディネート及びデータ分析の補佐に入る研究実施体制が実現する.また,分担者の坊農真弓氏が所属する国立情報学研究所においてポスドク研究者らとのデータ処理を進める体制も整えられている.よって,本研究は計画に変更を加える必要は無く,現在生じている「若干の遅れ」は平成26年度中に解消する見通しである.平成27年度前半期に手話データの分析作業及びウェブサイト公開作業を実施し,次年度使用額はその経費に充てる予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。手話データの収録を実施する地域は確定したが,現地の実施体制及び収録対象者の決定がまだであるために,現地での事前打合せ等をまだ実施できない状況であった.そのための旅費等が次年度使用額となった.平成26年8月までに手話データの収録を実施する地域での事前打合せ等を実施し,次年度使用額はその経費に充てる予定である.
カオス・フラクタル理論を利用した結晶粒成長過程の体系化

結晶粒成長過程の多様性を解明するために、Al-Mg合金の粒成長過程の詳細な観察とカオス・フラクタル理論の応用によるデータ解析を行うことを目的として研究を行った。Al-Mg合金を溶解鋳造した後に、熱間および冷間圧延工程を経て1mm厚の板材とした。この板材より熱処理用試験片を切り出し、773Kで再結晶焼鈍を施して平均結晶粒径を20μm前後に調整し、粒成長実験用の初期組織とした。粒成長実験は773Kのソルトバス内で行い、組織観察には主として光学顕微鏡を用いた。結晶粒方位の同定にはSEM-ECP法を利用し、結晶粒界の性格解析には対応粒界理論で用いられるΣ値を採用し、この値は結晶粒界両側の二つの結晶粒の結晶方位関係を解析することにより決定した。次に、結晶粒組織の発達過程をシミュレートするために、Vertexモデルによる粒成長計算プログラムを自作し、実際に観察した組織を計算領域内に取り込んで、粒界エネルギーと粒界移動速度を種々に変化させて組織変化を計算した。Al-Mg合金の粒成長過程は結晶方位の集積度が一度増加した後に減少するという複雑な挙動を示した。この一連の組織変化様式は、初期状態で、Σ1粒界を間に持つ結晶粒が群を形成していることに起因して生じたものであることが実験的に明らかになった。この結果は、局所的な組織状態が全体の組織変化を支配するというカオス的な様相が粒成長現象に現れていることを示唆するものである。この実験結果をより体系的に整理するために計算機シミュレーションを行った結果、カオス的な組織変化において、局所粒界性格分布および局所結晶粒度分布の2者が重要因子であることが明らかになった。本研究で得られた基礎的知見をもとにして結晶粒組織の形成過程がさらに詳細に理解できるようになった。
成人T細胞白血病の研究

ATL、HAM/TSPおよびHTLVーI保有者(キャリア)は日本のみならず、カリブ海沿岸地域、アフリカの一部に多発地域が存在することは既に知られていることであるが、その詳細は不明であった。われわれはこの3年間、国際学術研究プロジェクトの援助により主に疫学調査を中心として多くの成果を挙げることができた。まず、Londonのカトフスキ-教授との共同研究で英国在住のカリビアンATLおよびカリビアンTSP症例をreviewする機会があり、日本人ATL、HAM/TSPとの比較を行った。その結果、リンパ筋腫脹、肝脾腫、皮膚症状、高カルシウム血症の出現頻度、ATLのsubtype、化学療法の反応性、ATL細胞表面マ-カ-、50%生存期間は日本人とカリビアンATLとの間に差異は認められなかった。唯一の違いは発症年齢で、カリビアンATLは平均43歳(1962歳)、日本人の56歳(2782歳)に比し若年であった。検索し得た21例のカリビアンATL患者中3例に糞線虫症の合併、1例にHIVーIIの同時感染を認めた。また、TSPに関しては、1987年末までに18例の黒人患者が把握されており、1例をのぞき女性であった。カリビアンATLとの発症年齢の違いは、平均寿命が若干異なることを考慮したとしても興味深いことである。HTLVーIの感染時期が幼少時期だとすると、カリビアンATLあるいはアフリカ人のATLで発症が早いということに何らかの因子が介在するとの推定も成り立つ。今後の検討課題の一つであろう。さらに、メキシコ・ユカタン半島の抗体陽性率を検討した。対象はユカタン州立大学野口英世研究所で集められた一般健康人および献血者1820名(平均年齢26忙)、患者222名(白血病、リンパ腫、その他の血液疾患93名(35歳)、その他の内科疾患36名(53歳)、他臓器癌患者72名(53歳)、AIDS患者22名(31歳)、男性同性愛者26名(26歳)、売春婦168名(28歳)、計2236名である。スクリ-ニングとしてPA法を用い、WB法で陽性のものを最終的に陽性とした。その結果、一般健康人および献血者1820名中6名(0.33%)、患者222名中3名(1.35%)、内訳は白血病およびリンパ腫患者2名、他臓器癌患者1名、売春婦168名中6名(3.57%)が陽性である。ユカタン半島ではモンゴロイド系と考えられるマヤ族が現在も居住しており、一般献血者におけるHTLVーI抗体陽性率0.33%は興味深い数字である。今回の調査で血液標本その他の所見から83歳の菌状息肉症と診断されていた患者で、ATLと思われる一例を発見した。その後、売春婦6名の陽性者を更に詳細に検討した結果、これらのうち3名はHTLVーIIに感染していることが判明した。HTLVーIIは現時点では疾患との関係は不明であるがHTLVーIに近いウィルスとして世界的に研究されているウィルスであり、感染経路、病原性などについて今後の検討が待たれる。研究プロジェクト2年目は、これまで全く調査のなされていなかったキュ-バについて共同調査を行ったが、きわめて少数例のキャリアしか見出すことができなかった。近接する黒人国家ジャマイカが九州並みの高い陽性率を示すのと対照的であった。キュ-バもアフリカからの移住所が多く住んでいるにもかかわらず、陽性率が極端に異なるのはアフリカの出身地の違い、あるいは混血度の違いなどが考えられる。3年目は、主にタイ、パプアニュ-ギニア、ブラジルで疫学調査を行った。タイでは極く少数のキャリアしか見出しえなかったが、パプアニュ-ギニアの血清では高い陽性率を示した。しかしこの地域からは最近HTLVーI変異株の報告もあり、われわれが見出しているウィルスも今後、遺伝子レベルで検索する予定である。さらに、ブラジル全土で約60万人から100万人のキャリアが存在し、年間300名のATL患者の発症が推定された。これまでの日本のATL、HTLVーIの研究成果が広く世界中に還元できたことは本プロジェクトの最大の成果である。

カリビアンATLとの発症年齢の違いは、平均寿命が若干異なることを考慮したとしても興味深いことである。HTLVーIの感染時期が幼少時期だとすると、カリビアンATLあるいはアフリカ人のATLで発症が早いということに何らかの因子が介在するとの推定も成り立つ。今後の検討課題の一つであろう。さらに、メキシコ・ユカタン半島の抗体陽性率を検討した。対象はユカタン州立大学野口英世研究所で集められた一般健康人および献血者1820名(平均年齢26忙)、患者222名(白血病、リンパ腫、その他の血液疾患93名(35歳)、その他の内科疾患36名(53歳)、他臓器癌患者72名(53歳)、AIDS患者22名(31歳)、男性同性愛者26名(26歳)、売春婦168名(28歳)、計2236名である。スクリ-ニングとしてPA法を用い、WB法で陽性のものを最終的に陽性とした。その結果、一般健康人および献血者1820名中6名(0.33%)、患者222名中3名(1.35%)、内訳は白血病およびリンパ腫患者2名、他臓器癌患者1名、売春婦168名中6名(3.57%)が陽性である。ユカタン半島ではモンゴロイド系と考えられるマヤ族が現在も居住しており、一般献血者におけるHTLVーI抗体陽性率0.33%は興味深い数字である。今回の調査で血液標本その他の所見から83歳の菌状息肉症と診断されていた患者で、ATLと思われる一例を発見した。その後、売春婦6名の陽性者を更に詳細に検討した結果、これらのうち3名はHTLVーIIに感染していることが判明した。HTLVーIIは現時点では疾患との関係は不明であるがHTLVーIに近いウィルスとして世界的に研究されているウィルスであり、感染経路、病原性などについて今後の検討が待たれる。研究プロジェクト2年目は、これまで全く調査のなされていなかったキュ-バについて共同調査を行ったが、きわめて少数例のキャリアしか見出すことができなかった。近接する黒人国家ジャマイカが九州並みの高い陽性率を示すのと対照的であった。キュ-バもアフリカからの移住所が多く住んでいるにもかかわらず、陽性率が極端に異なるのはアフリカの出身地の違い、あるいは混血度の違いなどが考えられる。3年目は、主にタイ、パプアニュ-ギニア、ブラジルで疫学調査を行った。タイでは極く少数のキャリアしか見出しえなかったが、パプアニュ-ギニアの血清では高い陽性率を示した。しかしこの地域からは最近HTLVーI変異株の報告もあり、われわれが見出しているウィルスも今後、遺伝子レベルで検索する予定である。さらに、ブラジル全土で約60万人から100万人のキャリアが存在し、年間300名のATL患者の発症が推定された。これまでの日本のATL、HTLVーIの研究成果が広く世界中に還元できたことは本プロジェクトの最大の成果である。日本側研究組織(高月、山口、清川)は、ジャマイカ,キュ-バ,ガ-ナ,フランス,ドイツを訪問した。ジャマイカ,キュ-バ,ガ-ナでは、それぞれのHTLVーI陽性率についての調査を終了した。その結果、同じカリブ海でありながら、HTLVーI陽性率はキュ-バで0.04%、ジャマイカは6%と二つの国がきわめて近い距離にあるにもかかわらず、きわだって異なっていることを明らかにした。特にキュ-バでの調査は、これまで全く報告がなかっただけに注目される。ジャマイカではミシェル、グリ-ンを中心としたウエストインディ大学の全面的な協力を得た。アフリカ、ガ-ナでの調査は多くの因難があったにもかかわらず2500サンプルについて調査を終えた。現在デ-タの分析中である。
活性酸素産生遺伝子NOX1による発がんの制御機構の解明

本研究の目的は、ヒト発癌における活性酸素(ROS)産生遺伝子Noxファミリーの機能的役割を解明し、癌診断・予防・治療の開発に資することにある。我々は、Ras発癌モデルを用い、Nox1の産生するROSが情報伝達分子として増殖、及びVEGFの産生やMMP-9の誘導と細胞遊走能(Oncogene, 2009)を高めて、Ras癌組織の浸潤と転移に寄与することを解明してきた。ヒト癌との関連では、Nox1が大腸癌、Nox4が膵癌のcell survival活性の維持、メラノーマの細胞周期(G_2/Mチェックポイント)の調節(Cancer Res,2009)に関与することを明らかにした。従って、Noxファミリーは癌化過程の重要な律速因子と考えられる。本研究では、1)GATA-6によるNox1の転写機構、2)TLR5-Nox1によるcell survivalの誘導機構、3)T-cell白血病におけるNox5の機能的役割の研究、4)セネセンスにおけるNox1の意義について研究の進展があった。項目1:Ras-ERKによりGATA-6がリン酸化されると、Nox1プロモーターへのDNA結合能が増し、Nox1の転写が誘導されることが判った。項目2:TLR5・NFkBシグナルにより、Nox1発現がde nuvoに誘導されることを見出した。項目3:Nox5が白血病T-cellの増殖とcell swvivalを媒介することを発見した。項目4:Oncogenic Rasによって誘導される。セネセンスをNox1が媒介することが示唆された。本科学研究費の支援によって、活性酸素を介した発癌過程の分子機構がさらに解明されたものと考える。本研究の目的は、多段階発癌における活性酸素(ROS)産生遺伝子Noxファミリーの機能的役割を解明し、癌診断・予防・治療の基礎を確立することにある。既に、我々は、Ras発癌遺伝子により、ERK経路を介してNox1が誘導され、Nox1の産生するROSが情報伝達分子として、多様な癌形質の発現を媒介し、Ras発癌に寄与することを解明した。また、Nox1の転写因子GATA-6も同定した。ヒト癌との関連では、Nox1が大腸癌に、Nox4が膵癌に高発現し、cell survival活性に寄与することを明らかにしてきた。この諸結果から、Noxファミリーは、癌化過程に、重要な役割を果たしているものと考えられる。本研究では、1)Nox1を介したTLR5依存、cell survivalの誘導機構、2)Rasによる腫瘍血管造成におけるNox1の役割、3)GATA-6による転写機構、4)Nox5によるメラノーマの増殖制御機構の解明において、大きな進展があった。項目1 :大腸癌細胞で、Nox1がTLR5細胞質ドメインと相互作用し、Nox1がTLR5-NFkBシグナル伝達を媒介することが判った。項目2 : Ras-ERKによってSp1がリン酸化される際に、Nox1はこのERK活性を恒常的に維持して、VEGF発現に寄与することが示された(positive feed back regulation)(Oncogene, 2008)。また、Nox1は、angiogenesis及び大腸癌細胞のVEGF産生を媒介することを見出した。項目3 : Ras-ERKシグナルによってリン酸化された転写因子GATA-6がNox1遺伝子発現を高めると同時に(Oncogene, 2008)、GATA-6のリン酸化がDNAへの結合能力を顕著に増強することを見出し、リン酸化修節の化学量論的考察に成功した。項目4 : Nox5によるメラノーマ細胞の細胞周期(G_2/M遷移)調節の分子機構を明らかにした(Cancer Res. 2009)。
領域横断型PBL演習授業のための自己診断に基づくフィードバックシステムの開発

本研究の目的は,領域横断型PBL演習授業受講者のための自己診断に基づくフィードバック機能を備えたポートフォリオシステムを構築することである.受講者が簡単に自身のチームワークについて診断できる機能を備え,自身の成果物やチームワークに対する評価をいつでも確認することができるシステムであり,また講師は,負担を増やすことなく受講者へチームワークに対する評価を含む適切なフィードバックを与えることが可能となる.本研究の目的は,領域横断型PBL演習授業受講者のための自己診断に基づくフィードバック機能を備えたポートフォリオシステムを構築することである.受講者が簡単に自身のチームワークについて診断できる機能を備え,自身の成果物やチームワークに対する評価をいつでも確認することができるシステムであり,また講師は,負担を増やすことなく受講者へチームワークに対する評価を含む適切なフィードバックを与えることが可能となる.
琵琶湖における鉄(II)の動的濃度変化を支配する環境因子の解明

琵琶湖において生物の一次生産に寄与するFe(II)について、その鉛直分布を取り、有機物、光との関係について考察した。求められるFe(II)の濃度は、比色法、化学発光法により大きく異なり、Fe(II)の錯生成を示唆した。また、水温躍層下では、腐植物質とFe(II)濃度に正の相間が見られた。Fe(II)の酸化実験を行ったところ、腐植物質の共存下で、酸かが抑制されることが示された。琵琶湖表層、琵琶湖流入河川におけるFe(II)の形態、現存量を測定した結果、相当量の鉄(II)が溶存していることが明らかになった。溶存するFe(II)の濃度は一般に過小評価になっており、その生態系への影響を考慮するうえで、正確な濃度の決定と存在形態を把握し、生物に利用可能な形態を決定することが目的である。このためFe(II)の詳細な測定を行うとともに存在要因について考察した。平成19年度において夏期の表層においてFe(II)の濃度を測定したところ、昨年度予備調査を行ったときと同様にlm以浅でFe(II)の極大が認められた。表層におけるFe(II)の光還元生成は、腐植様物質を介している可能性が高いが、関与する構造、錯生成の影響は明らかではない。また、昨年末より琵琶湖湖水の年一回循環の時期になっても全層循環が起こらず、溶存酸素の低下に伴うFe(II)の溶出が見込まれたため、全層における採水とFe(II)の測定も合わせて行った。その結果、11月後半には湖底付近での酸素濃度は最低1.5mg/Lまで低下し、Mn2+の溶出には寄与したが、Fe(II)濃度の上昇には結びつかなかった。湖底の酸化還元電位を考慮すると、溶出したFe(II)は、最終的にFe(III)へと酸化されることは明らかである。一方で水温躍層下から水深70mあたりまでの溶存鉄のスペシエーションを考えるとその相当部分がFe(II)で占められることが明らかになった。今後、溶存態の鉄に対する配位子としての腐植物質の機能が、Fe(II)生成に与える効果のうち、どの過程が主要なのかを特定する。湖底付近におけるFe(II)の存在についても配位子の影響は無視できないので、琵琶湖全層における腐植様物質の化学的性質を比較する。また高密度サンプリングとスペシエーションのため、化学発光法を併用しながら研究を継続する。琵琶湖表層、琵琶湖流入河川に溶存している鉄(II)濃度は手法によって異なる可能性があり、Fe(II)の化学種を推定する鍵になると考えられる。溶存Fe(II)濃度は一般に過小評価であり、その生態系への影響を考慮するために正確な濃度と存在形態を把握し、生物利用可能な形態を決定することを目的とした。結果を以下に述べる。I:昨年度に引き続き、琵琶湖におけるFe(II)の測定を季節毎に採取した。琵琶湖最表層(0.5-1m)では、夏季に直下の深度と比べてFe(II)濃度が高く、同深度の腐植物質濃度と併せると、有機物を介した光分解が起きていることが示唆された。また試水を6時間程度放置しても、検出されるFe(II)濃度はほとんど変化しなかったことから、錯生成など安定化機構の存在が示唆された。なお、湖底付近におけるFe(II)の溶出は顕著ではなかった。II:比較対象となる中栄養湖として、人為的影響が少なく、光反応の影響を強く受けると考えられる、池田湖・鰻池での調査を行った。池田湖表層において、Fe(II)の濃度変化が観察され、鹿児島地方の日射量に応じた変化を示していた。III:本研究ではPDTS-Fe(II)錯体を固相抽出により濃縮して測定を行っているが、海洋研究者はその低濃度故に化学発光法を用いることが多い。両者の定量値をについて犬上川河川水を用いて比較したところ、PDTSでは10nmo1L^<-1>であったのに対し、化学発光では0.6nmo1L^<-1>となった。PDTS法については錯生成時にFeの酸化あるいは還元が起こる可能性を指摘されているが、今回用いた試薬のpHは6.8であり、還元が起こるとされるpH4よりもかなり高く、定量値の違いは、Fe(II)のスペシエーションによるものと考えられる。平成21年度は琵琶湖において水試料を採取し、本研究で用いているフェロジン比色法とルミノール化学発光法を用いて、鉄(II)の測定を同時におこなった。両方法の測定結果は大きく異なり、フェロジン比色法の方が一桁ほど高い値を示した。これらの二つの方法は、鉄(II)のうち異なる化学種を測定している可能性があり、分析法による違いを今後詳細に検討する必要があることが明らかになった。

複数回の琵琶湖観測結果から、光化学反応の影響を受けないと考えられる水深10m以深においてFe(II)/Fe(III)が腐植様物質と正の相関を示し、腐植様物質によるFe(II)の安定化が示唆された。これに関して人工琵琶湖水を用いてこれにFe(II)と琵琶湖深水層水より抽出した溶存腐植物質を添加し、定温実験においてFe(II)の酸化速度を評価した。その結果、腐植物質が存在することによりFe(II)の酸化が遅くなることが示された。同様に腐植物質に加えてFe(III)を添加した場合もFe(II)の酸化が抑制された。琵琶湖の腐植物質はFe(II)とある程度強力な錯形成能をもち、Fe(II)の酸化を抑制すると推測される。一方で太陽光による光化学反応の影響を受ける水深0-5mにおいてはFe(II)とFe(II)/Fe(III)は腐植様物質と負の相関を示した。溶存有機物の光分解にともなうFe(III)の還元によるものと考えられるが、鉄-腐植様物質の錯生成が反応に関与するのであれば、むしろ正の相間を示すものと考えられる。このことから、琵琶湖表層におけるFe(II)生成量は、紫外線による直接還元、あるいはヒドロキシラジカルの生成量に依存し、同様の因子による腐植様物質の蛍光発色団の構造変化が同時に起きているものと考えられる。
ＮＫレセプターリガンド群の機能多様性による免疫制御機構の解明

炎症性疾患である日本人潰瘍性大腸炎、クローン病、高安病の各患者についてMICA分子のNKG2Dとのコンタクト部位である129番アミノ酸残基V129Mに対応する一塩基多型タイピングを実施し、潰瘍性大腸炎および高安病患者集団においてMIC129Vホモ接合体頻度の有意な増加、V/M頻度の有意な減少を見出した。一方、クローン病患者では有意な頻度変化を認めなかった。また、NFKBIL1をコードするIkBL遺伝子については、インド人HIV-1感染者ではIkBLp*01アレル頻度が有意に増加していた。IkBLp*01は低発現アレルであることから、IkBLはHIV-1感染抵抗性と関連すると考えられた。本研究では、NK細胞受容体NKG2DのリガンドであるULBP遺伝子群に着目し、遺伝子領域のゲノム多様性および遺伝子多型とHIV/AIDS感受性・SIV免疫応答性との関連、また、遺伝子多型と自己免疫疾患・慢性炎症性疾患との関連、さらにULBP遺伝子群の多型がNK受容体機能に及ぼす影響を明らかにすることで、NK細胞による免疫制御機構の維持とその破綻に関わる要因を解明し、それらの知見に基づく免疫応答機能制御法開発への糸口を得ることを目的とした。ULBP領域とHIV/AIDSおよびSIV免疫応答との関連について、SIVワクチン接種個体におけるULBP領域のゲノム多様性を検討するため、旧世界ザルであるアカゲザルのULBP5遺伝子群の多様性を決定した。旧世界ザルではULBP5遺伝子の重複が知られているが、アカゲザルにおいても2種類のULBP5遺伝子(5.1、5.2)が存在し、それぞれ10種および11種のアリルの存在が明らかにされた。ULBP5.1においては第3エクソンの1塩基挿入によるフレームシフト型アリル1種が検出され、推定されるアミノ酸残基は99残基と通常分子の182残基より短いことから、今後NKG2Dとの結合能への影響を検討することとした。一方、自己免疫疾患におけるULBP領域の関与を検討するため、炎症性腸疾患患者DNA(潰瘍性大腸炎109件、クローン病93件)について、ULBPと共にNKG2DのリガンドであるMICA分子の、各疾患への感受性・抵抗性とULBP領域ゲノム多様性との関連を検討した。MICA分子129番残基はNKG2D活性を制御する重要な結合部位であることが最近報告されたことから、アミノ酸を構成する非同義置換多型G/Aについて解析を行ったところ、潰瘍性大腸炎患者におけるG/G(Val/Val)の有意な増加(Pc>0.0028)とクローン病患者におけるG/A(Val/Met)の有意な減少(Pc>0.025)を認めた。現在までの達成度SIVワクチン接種個体におけるULBP領域のゲノム多様性の検討は順調に進んでいる。炎症性腸疾患を対象とした関連解析では、潰瘍性大腸炎患者とクローン病患者のMICA129多型との間に異なる関連傾向を見出した。この傾向はこれまでの他の免疫関連遺伝子解析における結果と同様である。今後さらに解析患者数を増やし、関連を確認するとともに、病態との関連を検討する予定である。本研究は、NK細胞受容体NKG2DのリガンドであるULBP遺伝子群に着目し、遺伝子領域のゲノム多様性と個々の遺伝子の発現性との関連、遺伝子多型とHIV/AIDS感受性・SIV免疫応答性との関連、また、遺伝子多型と自己免疫疾患・慢性炎症性疾患との関連、さらにアイソフォーム発現の多様性とHIV/AIDSおよびヒト疾患との関連を検討し、ULBP遺伝子群の多型がNK受容体機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。本年度は以下の成果を得た。霊長類ULBP遺伝子群の進化学的検討は、ヒトにおけるULBP遺伝子群の構造と機能的意義に関する示唆を与えるため、これまでに解析したULBP遺伝子群多型についての情報を整理し、進化学的に分析した。旧世界ザルであるアカゲザルやカニクイザルにおいては、ULBP遺伝子群は特徴的な進化がみられるため、昨年度SIVワクチン接収個体アカゲザルにおいてみいだしたULBP5遺伝子の重複(5.1、5.2)についてカニクイザルでの多様性を検討したところ、同様の重複遺伝子が存在し、第3エクソンにおける1塩基挿入によるフレームシフト型アリルも同定された。一方、自己免疫疾患においては、すでに収集している高安病患者血液由来DNA試料について、ULBPと共にNKG2Dのリガンドであることが知られているMICAの多型を検討した。MICA分子129番残基はNKG2D活性を制御する重要な結合部位であることが最近相次いで報告されたことから、当該多型(G/A)について解析を行ったところ、高安病患者におけるG/G(Val/Val)型頻度の有意な増加(Pc<0.001)を認めた。現在までの達成度SIVワクチン接収個体におけるULBP領域のゲノム多様性の検討は順調に進んでいる。炎症性疾患を対象とした関連解析では、高安病患者においてMICA多型との関連を見出した。現在、潰瘍性大腸炎やクローン病との関連解析を進めている。本研究は、NK細胞受容体NKG2DのリガンドであるULBP遺伝子群に着目し、遺伝子領域のゲノム多様性と個々の遺伝子の発現性との関連、遺伝子多型とHIV/AIDS感受性・SIV免疫応答性との関連、また、遺伝子多型と自己免疫疾患・慢性疾患との関連を検討し、ULBP遺伝子群の多型がNK受容体機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的としており、本年度は以下の成果を得た。