hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心房性ナトリウム利尿ペプチドの動物体内における分布とその生理作用

発生初期に甲状腺または下垂体の原基を除去してもANPの合成は正常固体と同時期に開始される(免疫組織化学法)(2)成体心筋細胞内には大小2種の果粒があり、いずれもANPを含む。(3)ヒキガエルは繁殖期になると水に入る。繁殖期の固体では、非繁殖期の個体に比べ、心臓、特に心房の心筋細胞の核が著敷く大きく、心筋細胞の示す免疫反応は強く(免疫組織化学法)、血中のANP量が多い(RIA)。これらのことから、繁殖期にANPが水やNaの代謝に何らかの役割を果す可能性が考えられる。1.心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の統計発生。すでに、円口類・魚類・両性類の心房・心室に、ヒトANP様免疫活性(ir-hANP)の存在を確かめたので、本年度は、原索動物頭索類・爬虫類・鳥類について調べた。スッポンの心房にはir-ANPが認められた(免疫組織化学・免疫電顕法)。ウズラではir-ANPが全く認められなかったが、心房・心室筋細胞に分泌顆粒が存在することから、ANPは存在するが、hANP抗体と交叉しないのであろうと考えられる。また、頭索類ナメクデウオでは、ir-ANPを示す組織は体内のどこにも見出せなかった。2.両性類・爬虫類におけるANP個体発生。ヒキガエル、アフリカツメガエル、およびスッポンでは、いずれも心臓博動開始と同時に、心房筋細胞内にir-ANPを含む顆粒が出現する(免疫電顕法)。終生、水中生活をするアフリカツメガエルでは、顆粒数は発生に伴って緩やかに増加するが、ヒキガエルでは変態開始期より、スッポンでは孵化直前に、顆粒数が急激に増加する。ヒキガエルの陸上生活、および、爬虫類の孵化後の生活におけるANPの生理的役割の解明は今後に残された問題である。3.コイの心房抽出物の血圧に及ぼす作用をウズラで調べたところ、(1)心房抽出物は、hANPと同様、降圧作用をもつこと、(2)心房抽出物を抗hANP抗体で吸収すると、降圧作用を示さなくなることを見出した(生物検出法)。このことは、コイの心房に含まれるANP様物質が、哺乳類のANPと同様に、降圧作用をもつことを示唆する。4.ウシガエルで、脳室内にモルヒネを注射すると、心房からのANP分泌が促進されるが、この分泌促進効果は、プロプラノロ-ル前処理によってなくなることから、β-受容体を介していることが示唆された(ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、免疫電顕法)。
廃棄物最終処分場跡地の形質変更における適正施工方法に関する研究

2004年の廃棄物処理法改正において,廃棄物処分場跡地などの廃棄物が地中にある土地で形質変更(土地資源としての活用)を行う場合,生活環境保全上の支障が生じる恐れがある区域においては,施行ガイドラインに従って実施することが義務付けられた。しかし,このガイドラインには不十分な点がみられ,実際の運用に際して跡地利用に伴う環境リスクを適切に管理、制御しうる施工方法、技術的細目を決定する必要があることから、適正な施工方法を決定する根拠となる学術的知見の蓄積,環境リスクを抑制しうる対策工法の確立を図ることを目的に本研究を実施した。得られた成果は以下の通りである。1.廃棄物処分・跡地利用に伴い問題となる重金属,有機塩素化合物といった環境影響質によるリスクを評価するため、処分場内や地盤中での挙動・移動性とそのメカニズムを実験的に評価した。特に,我が国の主要な処分形態である焼却灰海面埋立処分場内部における廃棄物から溶出する重金属の動態を実験的に評価し,処分場内部の化学・生化学条件下では重金属の移動性は抑制され、還元性画分、酸化性画分の形成が主たるメカニズムであることを実証した。2.廃棄物処分場の環境安全性を担保する構造物である遮水工を対象として、供用時から跡地利用時までの長期に渡る健全性の評価を行った。具体的には、跡地利用時に遮水工に杭基礎を打設した場合の杭-粘土層境界面からの漏水量と環境影響の評価、遮水工材料が乾燥や化学物質に暴露された際の耐久性、海面処分場遮水護岸の施工方法の開発と適正構造の検討を行った。3.跡地利用における環境リスクの合理的な低減策として、地中連続遮水壁による原位置封じ込め工法、構造安定性に優れた遮水工の設計手法といった具体の技術を示すとともに、廃棄物の有効利用や廃棄物処分場の跡地利用を含めた広い観点から廃棄物の適正処分方策と環境リスク管理手法を明らかにした。本研究は,廃棄物処分場跡地の形質変更に伴って発生する環境リスクを適正に管理・制御しうる施工方法を確立するために,跡地利用に伴う生化学的雰囲気の変化が埋立廃棄物中の有害物質の挙動に及ぼす影響の評価,跡地利用に伴う掘削・構造物の設置が処分場遮水工の性能に与える影響の評価,跡地利用に伴う環境リスクの評価とその対策工法の体系化,を目的とした研究を実施するものである。本年度の研究実績は以下の通りである。(1)最終処分場跡地形質変更に伴う環境リスクの体系的評価形質変更に伴う環境リスクは,廃棄物の埋立時期,埋立廃棄物の種類,埋立条件,跡地利用の形態によって異なることから,文献・資料調査を中心として,上記の要因毎に跡地利用に伴う処分場覆土や廃棄物層の掘削に伴い発生する環境リスクを体系的に整理するとともに,対策工法の抽出を行った。(2)海面処分場内部における生化学的環境の変化が重金属の動態に及ぼす影響の評価廃棄物処分場の跡地利用において,廃棄物層内の水分量や酸素濃度が変化すると微生物活動に伴う有機物の分解や化学的環境の変化が進行し,浸出水の水質が悪化することが予想される。本研究では焼却灰海面埋立処分場の廃棄物層,底部粘土層における生化学的条件と重金属の存在形態を大型カラム試験によって評価し,跡地利用に伴う環境影響の推定を行った。(3)廃棄物処分場遮水工の構造安定性の評価内陸処分場の底部遮水工,および海面処分場の鋼(管)矢板を用いた遮水性護岸といった廃棄物処分場遮水工を対象として,構造安定性と遮水性を両立する遮水工構造の最適化や跡地利用において許容できる上部荷重の推定を行った。

内陸処分場遮水工に用いられる材料(粘土ライナー,遮水シート,不織布)間のせん断特性,鋼(管)矢板継ぎ手部の剛性に関する実験を実施し,解析的検討を行うために必要な基礎的データを収集した。本研究は,廃棄物処分場跡地の形質変更に伴って発生する環境リスクを適正に管理・制御しうる施工方法を確立するために,跡地利用に伴う生化学的雰囲気の変化が埋立廃棄物中の有害物質の挙動に及ぼす影響の評価,跡地利用に伴う掘削・構造物の設置が処分場遮水工の性能に与える影響の評価,跡地利用に伴う環境リスクの評価とその対策工法の体系化,を目的とした研究を実施するものである。本年度の研究実績は以下の通りである。(1)海面処分場内部における生化学的環境の変化が重金属の動態に及ぼす影響の評価廃棄物処分場の跡地利用において,廃棄物層内の水分量や酸素濃度が変化すると微生物活動に伴う有機物の分解や化学的環境の変化が進行し,浸出水の水質が悪化することが予想される。今年度は、焼却灰海面埋立処分場の廃棄物層,底部粘土層における生化学的条件と重金属の存在形態を大型カラム試験によって評価し,重金属の処分場内における保持機構を解明した。(2)廃棄物処分場遮水工の構造安定性の評価内陸処分場の底部遮水工を対象として,構造安定性と遮水性を両立する遮水工構造の最適化や跡地利用において許容できる上部荷重の推定を行った。昨年度実施した、内陸処分場遮水工に用いられる材料(粘土ライナー,遮水シート,不織布)間のせん断抵抗特性の実験結果に基づいて、構造安定性の評価のための設計方法を提案するとともに、構造安定性に優れた処分場の遮水工構造を示した。(3)粘土ライナーの遮水性能の評価汚染物質の拡散防止技術として使用されうるソイルベントナイト壁、および海面処分場の底部海底粘土層を対象とした遮水性能の評価試験を実施した。前者については、地盤中に存在する無機汚染物質に曝露された場合の遮水性能、後者については、跡地利用時の構造物建設の基礎工として鋼管杭を粘土地盤に打設した場合の、杭-粘土境界面における漏水が遮水性能に与える影響をそれぞれ定量的に示した。(1)生化学的環境の変化が廃棄物中の有害物質の動態に及ぼす影響の評価廃棄物処分場の跡地利用において,廃棄物層内の水分量や酸素濃度が変化すると微生物活動に伴う有機物の分解や化学的環境の変化が進行し,浸出水の水質が悪化することが予想されることから,処分場内の有害物質の存在形態を把握することが重要となる。今年度は、焼却灰埋立海面処分場を対象として、廃棄物層,底部粘土層を模擬した大型カラム試験を実施した。その結果、処分場内部の重金属の移動性は抑制され、還元性画分、酸化性画分の形成が主たるメカニズムであることを実証した。(2)廃棄物処分場遮水工の構造安定性の評価廃棄物処分場の形質変更に伴う上部荷重の増加や地盤沈下,および地震時に対して廃棄物処分場遮水工の機能を維持するためには,構造安定性の高い遮水工をあらかじめ建設する必要がある。
顎関節退行性変化の発症原因解明に関する研究

研究方法京都大学霊長類研究所に保管されているニホンザル骨標本412体のうちオス80体、メス95体をランダムに抽出し、顎関節部における硬組織変化を肉眼的に調査した。412体の骨標本は性別、死亡時年齢が明らかであり、すべての年齢層から成り立っていた。すべてのニホンザルは生前同施設内で飼育され、死亡後骨標本作製の過程は施設内で行われた。診査前に診査方法、硬組織変化の定義に関して口頭で十分にキャリブレートした3人の観察者により予備診査を行い、その後本診査を行った。本診査では1)下顎頭、側頭骨部における硬組織変化、2)下顎頭、側頭骨部における部位別硬組織変化を調査した。結果1)下顎頭、側頭骨部における硬組織変化顎関節硬組織変化の出現頻度は有意に加齢とともに増加した(p<0.001;χ^2検定)。オスにおいて硬組織変化は顎関節側頭骨部の48.8%に認められ,下顎頭の60.0%に認められた。メスにおいては側頭骨部の32.6%に認められ,下顎頭の54.7%に認められた。下顎頭,側頭骨部どちらにおいてもオスの方が硬組織変化の出現頻度が高く,側頭骨部では性差が認められたが(p=0.030;χ^2検定)下顎頭では認められなかった2)下顎頭,側頭骨部における部位別硬組織変化下顎頭における硬組織変化は後方部(516%)より前方部及び上方部(3140%)に多く認められた。下顎頭前方部及び上方部では加齢にともない硬組織変化の出現頻度は高くなったが,後方部においては認められなかった。側頭骨部において硬組織変化は関節結節(1423%)で発現頻度が高かった。側頭骨部では関節結節において明らかな加齢に伴う出現頻度の増加が認められたが,関節結節以外では認められなかった。下顎頭,側頭骨部ともに硬組織変化の部位による出現頻度の性差は認められなかった。
生体物質の分布状態の可視化と定量を狙った蛍光指紋イメージング技術の開発

分光イメージングと蛍光指紋を組み合わせて、前処理せずにパン生地中のグルテンと澱粉の分布を可視化する手法を開発した。パン生地、グルテン、澱粉の蛍光指紋を63波長条件の蛍光画像の撮像から再構築し、パン生地の各画素において、グルテンおよび澱粉との蛍光指紋の類似度を計算し、その類似度を各成分の存在確率として擬似カラーでマッピングすることにより、パン生地中のグルテンおよび澱粉の分布を可視化することに成功した。励起光は、干渉フィルタが8枚装填できるファイバー型キセノン光源を2台用いた。2台使うことで16枚の干渉フィルタを励起光として使うことができ、また、紫外から可視域までの幅広い波長をカバーすることができる。実際には、2分岐ファイバを製作し、2台の光源を合流させ、ロッドレンズを用いて均一光を試料に照射する。PCで、2台の光源の干渉フィルタの制御を行いながら、順次、指定した波長の励起光を照射できる装置を開発した。一方で、観察側は、やはり、回転ホイール状の円板に干渉フィルタを8枚、または32枚を装着できる分光部と12ビットのモノクロデジタルカメラで蛍光画像を計測できる蛍光指紋イメージング装置を構築した。励起、蛍光(観察側)の両方で干渉フィルタによる分光を採用していることにより、非常に明るい蛍光画像が得られる。一方、励起、蛍光の選択波長が干渉フィルタの枚数で制限されるため、予めターゲットとする情報が得られる波長を選択することが必要となる。そこで、これらの情報は、市販の蛍光分光光度計により予備試験を行なって、あらかじめ必要な波長を決定することにより、イメージングに展開をすることを可能にした。また、最適な露光時間、焦点合わせ、装置関数等は事前に計測しておき、イメージング計測の際には、全て全自動で暗室状態にしてデータが取得できるようにした。対象物質にもよるが、1つのサンプル測定に、数十分の時間で計測が可能となった。これらをもとに、装置の性能を確認するために、小麦デンプン、米デンプン(うるち米由来)、米デンプン(もち米由来)を本イメージング装置で判別できるか実験を行った。上記の方法により選択された波長条件において、蛍光画像を測定し、画素毎に簡易蛍光指紋を再構築するとともに、主成分分析して、その第一主成分でもって可視化することにより、3種類のデンプンを明確に可視化判別することができた。蛍光指紋とは複数波長の励起光における蛍光スペクトルを3次元的に重ね合わせたデータであり、成分特異的なパターンをもつ。本研究では小麦粉生地中のグルテンの分布を可視化の対象とし、グルテンの量が正確に反映されるイメージング手法を開発することを目的とした。グルテン粉末、及び、小麦デンプンを、グルテン割合が0、20、40、60%となるように混ぜ合わせ、蒸留水を加えた生地を作製した。試料を石英窓がついた測定用セルに入れ、蛍光指紋を構成する波長条件(励起波長と蛍光波長の組み合わせ)で撮像した。このデータを一画素に着目して見ると、その点における成分を反映した蛍光指紋となっている。また各試料につき、すべての画素の平均の蛍光指紋はその試料全体としてのグルテン割合を反映したデータとなる。そこで、各試料の蛍光画像を1/9に区切り、各領域の画素の平均蛍光指紋を算出した。この蛍光指紋を説明変数、試料のグルテン割合を目的変数とするPLSRモデルを作成した。すべてのデータをモデル作成に使用した。このモデルを用いることにより、グルテン割合が未知の領域の蛍光指紋から、その領域におけるグルテン割合が推定できることになる。そこで、各画素の蛍光指紋をこのPLSRモデルにあてはめ、その点におけるグルテン割合を推定した。さらに、グルテン割合に応じて、画素に色を割り当てた。その結果、各試料のグルテン割合を反映した疑似カラー画像が得られた。パン生地中のグルテンとデンプンの分布は、生地の物性に影響を与え、製品の食感を左右する。本研究では、パン生地中のグルテンとデンプンの分布を染色せずに、また、両者の存在比を考慮して可視化することを目的とし、蛍光指紋イメージング手法を開発した。蛍光指紋とは、試料に照射する励起光の波長を変化させながら試料が発する自家蛍光のスペクトルを計測し、これらの蛍光スペクトルを三次元的に並べたデータである。自家蛍光を計測するため染色などの前処理工程が不要なこと、蛍光指紋のパターンを解析することによって複数成分の同時可視化や定量が可能なことなどが特長である。画素の大半は、グルテン、もしくはデンプンのどちらかに類似度が高かったが、一部にはグルテン・デンプンの両方との類似度が高いもの、逆にどちらとも類似度が低いものがあった。

上記の4通りの組み合わせにつき、それぞれに色を対応させ、各画素の類似度の値に応じて色をつけたところ、ミキシング不足、適正、ミキシング過剰の3段階の生地の画像には大きな違いが見られた。特にミキシング過剰の生地では、グルテン・デンプンの両方との類似度が高い、もしくは低い画素が多く、グルテンとデンプンがミキシング工程中に混ざり合う様子が確認できた。本研究では蛍光指紋イメージング手法を用い,染色を行わずにパイ生地中のグルテン,澱粉,およびバターの分布を可視化することを目的とした。蛍光指紋と分光イメージングを組合せることによって,光学的情報に加えてX・Y方向の位置情報を同時に取得することができ,成分の分布を可視化することができる。これまで蛍光指紋イメージングを用い,パン生地中のグルテン蛋白・澱粉を可視化した例があったが,本研究では蛋白・澱粉に加え,食品の構造の重要な要素である脂質(油脂)の可視化を試みた。試料には折りパイ生地,練りパイ生地を用い,それぞれを10μm厚に切片化した。試料に照射する励起波長と観察する蛍光波長の組み合わせを変えながら,CCDカメラで試料の蛍光画像を取得した。蛍光指紋を構成する励起・蛍光波長のすべての組み合わせで撮像したデータを合わせると,すべての画素について,それぞれ点に存在する成分を反映した蛍光指紋が得られる。各画素に存在するグルテン・澱粉・バターの含有率を求めるために,各画素の蛍光指紋を各成分の蛍光指紋および含有率に分解する,拘束条件付スペクトル分解を行った。拘束条件として,蛍光指紋および含有率は非負値であること,および各画素の含有率の和は1以下であること,の2点を付加した。スペクトル分解の段階で,グルテン・澱粉・バターの3成分以外に,小麦粒の種皮成分であるフェルラ酸,およびスライドガラスの蛍光指紋を加えた5成分への分解が最適であると判明した。スペクトル分解により,各画素に存在するグルテン・澱粉・バターの量が求められ,これらの含有率をそれぞれ青・緑・赤のグラデーションで描画し,重ね合わせたところ,練りパイ生地については,3者を明確に可視化した分布図が得られた。さらに,本手法を検証するため,同じ試料を蛋白・油脂の二重染色に供したところ,グルテンの塊や澱粉粒など,分布の一致がみられた。分光イメージングと蛍光指紋を組み合わせて、前処理せずにパン生地中のグルテンと澱粉の分布を可視化する手法を開発した。パン生地、グルテン、澱粉の蛍光指紋を63波長条件の蛍光画像の撮像から再構築し、パン生地の各画素において、グルテンおよび澱粉との蛍光指紋の類似度を計算し、その類似度を各成分の存在確率として擬似カラーでマッピングすることにより、パン生地中のグルテンおよび澱粉の分布を可視化することに成功した。予定どおり、グルテンのみならず、デンプンに対しても可視化ができた。さらに、実際のグルテン、デンプンの存在比をパラメータとして導入することで、より定量性のある可視化を実現した。27年度が最終年度であるため、記入しない。食品工学パン生地に対しては、その主成分であるグルテン、デンプンの可視化ができたが、パン・菓子類では、脂質も重要な成分であるケースも多い。そこで、さらに脂質の可視化も同時に試みる。幅広い波長域の励起光を照射でき、また、その応答を十分な精度を持った蛍光画像として連続撮影出来る装置を構築した。また、その結果として、異種デンプンの違いも可視化できたことから、予定以上の進捗状況である。
モノクローナル抗体結合LAK細胞のヒト腫瘍細胞障害におよぼす温熱負荷の効果

ヒト大腸癌細胞表面蛋白に対する特異抗体chimeric SF-25 monoclonal antibody(SF-25 Mab)をヒトLAK細胞表面に結合させた抗体結合LAK細胞を作製し、ヒト大腸癌移植ヌードマウスに対して、この抗体結合LAK細胞の抗腫瘍効果をみるとともに、ヌードマウスの癌移植局所に43.0°Cの温熱負荷を加えるhyperthermiaを併用することによる抗腫瘍効果増強の有無をあきらかにすることを目的に、以下の実験を行なった。まず、ヒト大腸癌細胞株であるLS180をヌードマウスの皮下に注入して大腸癌移植モデルを作製した。一方、健常人のPBLからLAK細胞を誘導し、LAK細胞とSF-25 Mabを30%PEGで処理することによって抗体結合LAK細胞を作製した。さらに、大腸癌移植ヌードマウスモデルの腫瘍部に赤外線を照射して同部の温度が43.0°Cになるよう腫瘍内に挿入したセンサーでモニターするとともに、対側の皮下にも温度センサーを挿入して体温をモニターし、赤外線照射による温度上昇が癌移植部に限局していることを確認した。以上の予備実験の後、大腸癌移植ヌードマウスモデルをA群:抗体結合LAK細胞投与群、B群:温熱負荷群、C群:抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷(1回)群、D群:抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷(3回)群、E群:コントロール群の5群に分け、治療後の腫瘍の大きさを経時的に測定して、各々の抗腫瘍効果を評価した。その結果、1.抗体結合LAK細胞を投与したA群では75%で腫瘍を認めず、また腫瘍を認めたマウスでも腫瘍増大の経時的変化はコントロール群に比べ小さかった。2.温熱負荷のみを加えたB群では、コントロール群と比べ腫瘍の増大が著しかった。3.抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷を1回行なったC群、3回繰り返したD群ともに、その腫瘍増殖の程度はコントロール群と差がみられなかった。本研究の目的は、腫瘍部への温熱負荷がLAK活性の増強をもたらすかどうかをin vivoの系で実験し、あきらかにすることにある。LAK細胞がin vitroで強い抗腫瘍効果を示すことはこれまで多くの実験であきらかにされているが、一方in vivoで思ったほどの効果がみられず、LAK細胞がin vivoで腫瘍部へ集積しないことが両者のdiscrepansyの主な原因であることを我々は報告した。そして腫瘍特異的モノクローナル抗体を用いることでin vivoでLAK細胞を腫瘍部へ集積させることができることを示した。平成8年度は、in vivoでLAK細胞を腫瘍部へターゲッティングする目的で、ポリエチレングリコールを用いてモノクローナル抗体をLAK細胞表面に結合させるための、至適条件(ポリエチレングリコールのサイズ、濃度、反応時間など)を検討するとともに、LAK細胞表面へのモノクローナル抗体結合をflow cytometryで確認し、また抗体結合LAK細胞の抗腫瘍効果が無処理LAK細胞と変わらないことをあきらかにした。現在、この抗体結合LAK細胞の抗腫瘍効果に対する腫瘍細胞温熱処理の影響について、in vitroの系で検討をおこなっている。またヌードマウスへのヒト腫瘍細胞移植をし、移植部への加温実験を開始している。今後、ヌードマウスの腫瘍細胞移植部の加温により、腫瘍内温度を任意に保つ系を確立し、この系に腫瘍特異的モノクローナル抗体結合LAK細胞を投与して、LAK細胞と温熱負荷との併用による抗腫瘍効果の増強の有無について、検討を行っていく予定である。ヒト大腸癌細胞表面蛋白に対する特異抗体chimeric SF-

25 monoclonal antibody(SF-25 Mab)をヒトLAK細胞表面に結合させた抗体結合LAK細胞を作製し、ヒト大腸癌移植ヌードマウスに対して、この抗体結合LAK細胞の抗腫瘍効果をみるとともに、ヌードマウスの癌移植局所に43.0°Cの温熱負荷を加えるhyperthermiaを併用することによる抗腫瘍効果増強の有無をあきらかにすることを目的に、以下の実験を行なった。まず、ヒト大腸癌細胞株であるLS180をヌードマウスの皮下に注入して大腸癌移植モデルを作製した。一方、健常人のPBLからLAK細胞を誘導し、LAK細胞とSF-25 Mabを30%PEGで処理することによって抗体結合LAK細胞を作製した。さらに、大腸癌移植ヌードマウスモデルの腫瘍部に赤外線を照射して同部の温度が43.0°Cになるよう腫瘍内に挿入したセンサーでモニターするとともに、対側の皮下にも温度センサーを挿入して体温をモニターし、赤外線照射による温度上昇が癌移植部に限局していることを確認した。以上の予備実験の後、大腸癌移植ヌードマウスモデルをA群:抗体結合LAK細胞投与群、B群:温熱負荷群、C群:抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷(1回)群、D群:抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷(3回)群、E群:コントロール群の5群に分け、治療後の腫瘍の大きさを経時的に測定して、各々の抗腫瘍効果を評価した。その結果、1.抗体結合LAK細胞を投与したA群では75%で腫瘍を認めず、また腫瘍を認めたマウスでも腫瘍増大の経時的変化はコントロール群に比べ小さかった。2.温熱負荷のみを加えたB群では、コントロール群と比べ腫瘍の増大が著しかった。3.抗体結合LAK細胞投与+温熱負荷を1回行なったC群、3回繰り返したD群ともに、その腫瘍増殖の程度はコントロール群と差がみられなかった。
指の個性の決定とTbx遺伝子群

昨年度に申請者は後側の指の個性を決定する因子を特定し発表した。そこで本年度は残る前側の指の個性を決定する因子を探索、解析した。この解析をするにあたりアメリカ合衆国University of WisconsinのJohn F.Fallon研で2004年6月8日から2005年3月31日までの間研究を行った。University of WisconsinのXin Sun博士との共同研究でTbx15、Pax9、Lhx9を含む複数の転写因子が指の前側に特異的に発現していることを発見した。現在スクリーニングの段階が終了し、ニワトリを用いた過剰発現を用いてこれらの転写因子の機能を解析中である。また学生とともにニワトリの肢芽で強力に働くRNAiのベクターを開発した。今後はこれらの機能抑制系の実験やノックアウトマウスの作製も合わせて解析していきたい。さらにこれまでの実験で申請者はTbx遺伝子群が指間部でのBMPシグナルを介してその前側の指の個性を特徴づけること示した。そこでさらに申請者はいつどこで指間部でのBMPシグナルが指の個性を決めるのか、そのターゲット組織の探索とメカニズムを解析した。その結果指間部でのBMPシグナルの位置価はそれぞれの指間部の中では等しいが、指の個性の決定に必要な組織はそれぞれの指間部の中の一部の前-遠位部であることが判明した。現在その組織がどのようにして指原器に個性を決定するシグナルを与えているのか解析中である。またこれを解析するにあたり未解明の指原器自身の発生のメカニズムも合わせて解析中である。現在指の個性が決定されるまでにSox9、BMPRIB、TGF-β2、Nogginが順番に発現していることを見いだした。今後はこれらのカスケードと指間部でのBMPシグナルの関わりについて生化学的なアプローチを用いて解析していきたいと考えている。申請した年次計画に基づき1年目に予定した全ての計画を実行し、論文をDevelopmental Cellに発表した。1.第3/4指の個性の決定メカニズムの解析Tbx2をニワトリ胚後肢芽に強制発現させると第3指が第4指に形質転換し後側化した。一方Tbx3を強制発現させると第2指が第3指に形質転換し後側化した。そこでTbx2/Tbx3の変異体を作製し、強制発現させたところ、第4/3指がそれぞれ前側化した。このことからTbx2/Tbx3はそれぞれ第4/3指の個性を決定するために必要十分であることが明らかとなった。また自脚領域におけるHoxD遺伝子群の発現変化を観察したところ、Tbx2/Tbx3はそれぞれHoxD13/HoxD12の発現を正に調節することが分かった。3.レチノイン酸、BMPに対するTbx2/Tbx3遺伝子の応答能の違いの解析レチノイン酸のビーズを肢芽の前側に移植し、新たに過剰指を形成させた時のTbx2/Tbx3の発現パターンを解析した。その結果Tbx2/Tbx3遺伝子はそれぞれ第4/3指が形成される時に発現が誘導されたことから後側の指のマーカー遺伝子として使用できることが明らかとなった。またBMPのビーズ移植の結果からBMPに対する応答能もTbx3の方がTbx2より高いことが判明し、これが肢芽の後側で特徴的にTbx2/Tbx3が発現する仕組みであることが明らかとなった。現在2年目の予定である前側の指の個性を決定する遺伝子の探索を行っている。
酸化ストレスによって誘導される老化現象におけるタンパク質分解経路の役割

生体内では酸化ストレスによって生成された酸化物が細胞老化を引き起こしていると考えられます。本研究を通じて魚類モデルを用いた研究から,酸化ストレスによって生成される酸化タンパク質がオートファジーと呼ばれるタンパク質分解系において除去されることが分かりました。さらに,オートファジーを起こすことが出来ない魚類モデルでは,酸化ストレスによる細胞老化が促進されました。以上から,オートファジーは酸化ストレスから生体を防御し,老化を抑制する働きがあることが分かりました。酸化ストレスは生体内に酸化タンパク質を蓄積させ,細胞老化および個体死を誘導することから,生物の寿命を規定する主要因と考えられている。この酸化タンパク質の分解と老化細胞の除去機構に着目して,タンパク質分解経路における抗老化作用を解明する。老化におけるオートファジー(自食作用)の役割を解明するために活性酸素によるオートファジーの誘導性及び生物影響を調べた。ゼブラフィッシュ仔魚及び成魚への活性酸素の投与によって,成魚では脳,眼,腎臓,肝臓および筋肉に酸化タンパク質の蓄積が確認された。筋肉には正常個体でも多くの酸化タンパク質が蓄積していた。さらに,活性酸素を投与することによってオートファジーが誘導されることを明らかにした。仔魚では脳で,成魚では特に,脳,眼,次いで肝臓,腎臓で強くオートファジーが誘導されたが,筋肉および消化管では見られなかった。以上から,活性酸素に対する感受性およびオートファジー活性化には組織特異性があることが分かった。本申請課題は,タンパク質分解経路であるオートファジーに着目し,酸化タンパク質の除去作用,老化細胞および変性細胞への細胞死誘導による除去作用を伴う老化に対する新しい防御機構を提唱を目指している。オートファジーの抗老化作用が明らかになることによって,オートファジー活性が老化のバイオマーカーとなるだけでなく,オートファジー可視化魚を用いた抗老化作用を持つ新規薬剤および食品成分の検索が可能となる。酸化ストレスは寿命を決定する要因の一つであり,酸化されたタンパク質の蓄積は老化過程において細胞老化を引き起こすと考えられる。酸化タンパク質の分解機構を解明するために,ゼブラフィッシュ胚及び成体を用いて酸化ストレス条件下においてオートファジーの誘導性を調べ,酸化タンパク質の分解及び細胞老化におけるオートファジーの役割を調べた。ゼブラフィッシュにおいてオートファジーの誘導を観察するために,微小管結合タンパク質(MAP1-LC3B:LC3)と緑色蛍光タンパク質(GFP)を連結した発現系を導入したトランスジェニックフィッシュ(GFP-LC3)を用いた。Hydrogen peroxide及びtert-butyl hydroperoxideをゼブラフィッシュ胚及び成体に浸漬し,LC3の発現をウエスタンブロット法で検出した。酸化タンパク質はカルボニル化及びジチロシン化されたタンパク質を検出した。オートファジーを阻害するために,ATG5及びATG7に対するアンチセンスオリゴを胚に注入し,酸化ストレスによる細胞老化の誘導をSenescence-Associated-β-Galactosidase染色を用いて調べた。酸化ストレスによってゼブラフィッシュ胚でオートファジーが誘導された。GFP-LC3胚を用いると,後脳,目,体節でGFPが観察された。成体では脳,目,腎臓,肝膵臓でオートファジーが誘導され,筋肉と皮膚では誘導されなかった。ゼブラフィッシュ胚においてATG5及びATG7の翻訳を阻害すると,酸化ストレス条件下では発生遅延及び胚致死となることが分かった。酸化ストレスによって誘導される細胞老化はオートファジーの欠損によって促進した。これらの結果から,ゼブラフィッシュモデルにおいて,オートファジーは酸化ストレスによって生成された酸化タンパク質を分解する働きがあり,抗老化作用に必須であることが分かった。
新規細胞間相互作用機構である膜ナノチューブ構造によるＭ細胞分化誘導機構の解明

腸管リンパ濾胞上皮に存在するM細胞は管腔内の抗原を取り込む細胞である。この細胞の分化には上皮基底膜下のストローマ細胞が重要である。しかし、基底膜を隔てたM細胞とストローマ細胞の相互作用機構は不明である。本研究ではM細胞に発現するM-Secが細胞間相互作用を仲介する膜ナノチューブ構造の形成分子であることに着目した。その結果M細胞には基底膜側に突出した膜突起が存在し、基底膜を越えてストローマ細胞と接していた。一方でM-Sec欠損マウスでもこの突起形成、そしてM細胞分化に大きな変化は認められなかった。従って細胞膜突起形成にはM-Secの他に複数の分子が関与する可能性が示唆された。育児休暇中のため当該年度は研究を実施していない。小腸パイエル板は管腔内の抗原を取り込みIgA産生を制御することで粘膜免疫応答の調節を行う。その過程には濾胞被蓋上皮層のM細胞が重要な役割を担う。M細胞の分化と成熟は通常の腸管上皮細胞とは異なり、上皮下の細胞との相互作用が重要であると言われているが、その実態は不明である。申請者らのこれまでの研究から、膜突起構造の形成に関わる分子であるM-SecがM細胞に発現していることが明らかになっている。この構造が細胞間相互作用を仲介する新規の構造であることに注目し、本研究計画ではM-Secの機能を解析することで、M細胞分化における細胞間相互作用機構を分子レベルで解明することを目的とした。パイエル板におけるM細胞の形態をM細胞特異的分子Gp2とM-Sec抗体を用いて観察したところ、M細胞の基底膜側には膜突起が存在し、基底膜を通過していることを明らかにした。パイエル板上皮下の間質系細胞はM細胞分化を制御するRANKLを発現している。その受容体であるRANKは腸管上皮細胞の側基底面に発現している。M細胞の場合はさらに基底膜突起上にもRANKの発現が認められ、RANKを発現する間質系細胞と接していることを明らかにした。しかしながらM-Secノックアウトマウスでもこの突起形成は正常であり、M細胞分化にも大きな変化は認められなかった。RANK-RANKLシグナルがM細胞分化に十分であることはすでに知られている。しかしながら、その制御機構は明らかになっていない。受容体RANKはパイエル板上皮全体に発現しているがM細胞になるのはそのうちの一部である。基底膜下の間質系細胞と接する膜突起構造の発見は、この構造を介して直接RANK-RANKLシグナルを受け取ることがM細胞分化に重要であることを示唆している。これは上皮と間質系細胞との新たな相互作用機構の可能性がある。今後、突起形成の分子機構を明らかにしていく。この構造が細胞間相互作用を仲介する新規の構造であることに注目し、本研究計画ではM-Secの機能を解析することで、M細胞分化における細胞間相互作用機構を分子レベルで解明することを目的としている。初年度に報告したM-Secが局在するM細胞基底膜側の突起構造について、電子顕微鏡による微細構造の観察を行った。その結果、この突起構造は基底膜の孔を通り、基底膜下の細胞と接していることが確認できた。M細胞の分化にはこの基底膜下の細胞が発現するRANKLが重要である。そこで、M細胞に発現する受容体RANKと基底膜下細胞のRANKLが膜突起を介して直接相互作用する可能性を検証した。免疫電子顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察によって基底膜下の膜突起にRANKが局在しているのを確認できた。これらのことから、M細胞分化におけるRANKL-RANKのシグナル伝達は基底膜下の物理的な相互作用機構で起こっていることが示唆された。これは膜突起構造の生体内での機能を示唆する初めての報告である。しかしながら、初年度のM-Secノックアウト細胞の解析ではM細胞分化に大きな影響は認められず、膜突起構造の形成にも影響は認められなかった。以上のことからM-Secの機能を補うような分子が存在すると想定し、今後M-Sec相互作用分子の解析を進めることで、膜突起形成機構を解明していきたい。組織学育児休業のため当該年度は研究を遂行していない。免疫組織化学染色、免疫電子顕微鏡観察など複数の方法によってM細胞基底面の膜突起を確認できた。

さらに膜突起に受容体RANKの存在、膜突起がRANKLを発現する間質系細胞に接していることを明らかにすることができた。さらに、M細胞で特異的に発現する2つの分子M-SecとGp2の発現分布を我々が開発したホールマウント染色法で解析したところ、蛍光ビーズの取込み能を持つ成熟したM細胞はGp2とM-Secを両方発現するが、Gp2を発現せずM-Secだけを発現するM細胞は取込み能が低く、未成熟なM細胞であることを明らかにしている。これらは研究計画どおりに進め、予想通りの成果を挙げることができた。一方で、強制発現によって培養細胞に膜突起形成を誘導するM-Secは、M細胞特異的に発現しているが、ノックアウトマウスではM細胞の膜突起形成、M細胞分化は一見正常であった。今後、M-SecとM細胞膜突起形成の関係を明らかにしていく必要がある。M-Secは培養細胞で過剰発現させることで膜突起形成を誘導する。しかしながら生体における、その機能は明らかではない。これまでの申請者らの研究からM-Secはマウスの腸管上皮M細胞において高発現していることが明らかになっている。形態的観察を行ったところ、M細胞は基底膜側に膜突起状の構造を持ち、そこにM-Secが局在していることを見出している。M細胞分化と維持には基底膜下の間質細胞が発現するRANKLが必要であることが報告されており、M細胞膜突起にはRANKLの受容体RANKが発現していた。これらの結果からM細胞の膜突起は物理的に基底膜下の間質細胞と接触することでM細胞分化維持に関わると予測された。しかしながら、M-Sec KOマウスではM細胞マーカーであるGP2の発現に大きな変化は認められなかった。M細胞の膜突起を観察するためには現在のところM-Sec抗体で免疫染色を行う。そのためM-Sec KOマウスでは膜突起形成に影響がでているかどうかを明らかにすることが難しい。他のM細胞発現分子で膜突起に局在する分子を探索する。II型膜蛋白質であるRANKLは間質細胞の細胞膜上で機能する一方で、膜上で切断を受けた可溶性RANKLが存在する。マウス個体に大腸菌で作成した可溶性RANKLを投与するとM細胞分化が誘導されることから可溶性RANKLでも十分に機能すると考えられる。切断に関与するプロテアーゼMMP14の阻害剤をM-Sec KOマウスに処理し、可溶性RANKLを減らした状態でのM細胞分化への影響をしらべる。M細胞の膜突起で実際にRANK-RANKLの相互作用が起きているかを明らかにする。まず、膜突起における受容体RANKの局在を免疫電子顕微鏡観察に用いて、RANKLを発現する間質系細胞と接している部分を詳細に観察する。RANKL抗体を投与することでM細胞分化は抑制される、この時膜突起形成に変化が起きているかを明らかにすることで、膜突起形成と維持にRANK-RANKLの相互作用が関与しているかを明らかにすることを目指す。基底膜への膜突起の形状はマクロファージや癌細胞などに見られる浸潤突起によく似ている。浸潤突起形成に間夜するWASPなどの分子の局在を調べることで突起形成の分子機構を明らかにする。
活性酸素による近位直尿細管細胞障害の発生機序とその予防

我々は、cis-Diamminedichloroplatium(CDDP;シスプラチン)をウサギの皮質部集合尿細管(CCD)管腔側から投与すると、1)K channelを抑制することにより管腔内電位を過分極させる、2)潅流液からアミノ酸を除去するとCDDPにより管腔内電位は脱分極を起こす、3)管腔側CDDPはK channelと同時にNa channleも抑制する、4)AlanineはCDDPによるNa channel抑制に対し保護的に働いていることを明らかにした。さらに、CDDPを浴液(血管側)に加えると形態的変化を伴って細胞障害を起こすことがわかり、10-5M10-3MまでのCDDPを血管側に投与すると濃度依存性にCCDの細胞障害とその後の細胞死を起こした。しかし、灌流液にGlycine、Alanineなどのアミノ酸やtripeptideであるGluthatione(GSH)を加えるとCDDPによる細胞障害は抑制され、これらの物質はCDDPによる尿細管障害に保護的に働くことも明らかにした。今年度は、GSHおよびGlycineの保護作用の詳細を検討した。GSH synthesis inhibitorであるL-buthionine-S,R-sulfoximine(BSO)、γ-transpeptidase inhibitorであるacivicineを用いた。その結果、1)CDDPによる細胞障害は、GSHおよびGlycineにより完全に抑制される、2)その保護作用に対してBSOは保護作用に影響を与えなかった、3)acivicineはGSHの持つ保護作用を解除したが、Glycineの保護作用には影響を与えないことが明らかとなった。このことから、GSHおよびGlyはCDDPが惹起するCCD障害に対して保護的に作用するが、その機序として、細胞内へのGlycineの取り込みと蓄積が重要であるが、GSHの保護作用は細胞内でGSHがGlycineに変換されて発現することが明らかとなった。本年は、薬剤による腎毒性について、皮質部集合尿細管(CCD)を用いて実験した。本題の近位尿細管でなくCCDを選択した理由は、薬剤としてcis-Diamminedichloroplatinum II(CDDP;シスプラチン)を選択したためである。CDDPの尿細管への影響を検討した報告がAllenらによりなされており(Kidney Int 27:842,1985)、これがin vivo microperfusion法で遠位尿細管において施行されていたためである。その結果、ウサギCCDにおいて、管腔側よりCDDPを加えると、10^<-5>Mから10^<-3>Mにかけて用量依存性に管腔内電位(V_T)を過分極し、Allenらの報告と合致した。管腔内に10^<-4>M Amiloride(Na channel blocker)、あるいは浴液に10^<-5>M ouabain(Na-K ATPase inhibitor)を投与するとV_Tは脱分極し、ここにCDDP10^<-3>を投与してもV_T変化は起こらなかった。管腔内に2mM BaCl_2(K channel blocker)を投与するとV_Tは過分極するが、ここにCDDP 10^<-3>Mを投与してもV_T変化は起こらなかった。そこで、^<22>Naを用いてNa fluxを測定したところ、CDDP 10^<-3>MはNaの再吸収量は変化させなかった。一方、K分泌量は著明に減少させた。このことは、Allenらが直接Na再吸収量を測定せずに結論を下したことが誤りで、実際はCDDPは管腔側からはK channelを抑制して、結果的にV_Tを過分極させているためであることが明かとなった(Kidney International.under submission)。その後の実験では、灌流液にGlycineなどのアミノ酸を加えないで同様の実験を行うと、CDDPはK channelを抑制すると同時にNa channleを抑制することも明らかとなった。このことは、Glycineなどのアミノ酸がCDDPによるNa channel抑制作用を抑制していることを示唆している。現在、この点について検討中である。

このことから、GSHおよびGlyはCDDPが惹起するCCD障害に対して保護的に作用するが、その機序として、細胞内へのGlycineの取り込みと蓄積が重要であるが、GSHの保護作用は細胞内でGSHがGlycineに変換されて発現することが明らかとなった。昨年度は、cis-Diamminedichloroplatinum(CDDP;シスプラチン)をウサギの皮質部集合尿細管(CCD)管腔側から投与するとKchannelを抑制することにより管腔内電位を過分極させることを明らかにした。このときは、灌流液にアミノ酸が加えられていた。しかし、あるとき間違えてアミノ酸を加えない灌流液で行ったところ脱分極が起こった。そこで本年度は、この実験を追試した。灌流液からAlanineを除去して管腔側からCDDP10^<-3>Mを加えると管腔内電位はAlanine存在下とは逆に有意な脱分極を起こした。ここで管腔内に2mMBaCl2(Kchannel blocker)を加えるとAlanine存在下ではCDDPによる過分極を完全に抑制したが、Alanine非存在下ではCDDPによる脱分極をさらに増強した。一方、Alanine非存在下ではCCDP10^<-3>Mを管腔内に投与するとK分泌量を抑制すると同時にNa fluxも低下することが確認され、K channelと同時にNa channleも抑制されていることが明らかになった。このことは、AlanineがCDDPによるNa channel抑制に対し保護的に働いていることを示唆している。次に、CDDPを溶液(血管側)に加えると形態的変化をともなって細胞障害を起こす。10^<-5>M10^<-3>MまでのCDDPを血管側に投与すると濃度依存性にCDDの細胞障害とその後の細胞死を起こした。しかし、灌流液にGlycine、Alanineなどのアミノ酸やtripeptideであるGluthationeを加えるとCDDPによる細胞障害は抑制され、これらの物質はCDDPによる尿細管障害に保護的に働くことが明らかとなり、現在活性酸素の関与も含めその障害発生およびアミノ酸の保護作用の機序を検討中である。我々は、cis-Diamminedichloroplatinum(CDDP);シスプラチン)をウサギの皮質部集合尿細管(CCD)管腔側から投与すると、1)K channelを抑制することにより管腔内電位を過分極させる、2)灌流液からアミノ酸を除去するとCDDPにより管腔内電位は脱分極を起こす、3)管腔側CDDPはK channelと同時にNa channleも抑制する、4)AlanineはCDDPによるNa channel抑制に対し保護的に働いていることを明らかにした。さらに、CDDP浴液(血管側)に加えると形態的変化を伴って細胞障害を起こすことがわかり、10^<-5>M10^<-3>MまでのCDDPを血管側に投与すると濃度依存性にCCDの細胞障害とその後の細胞死を起こした。
脳卒中急性期におけるATMTを用いた高濃度酸素吸入下遂行機能賦活

(1)30%酸素吸入による認知機能変化発症15日以内の脳梗塞・脳出血患者において30%酸素と室内気吸入時の記銘力を比較し,左病巣群で高濃度酸素による言語性記銘増強効果を認めた.増強効果が大きい群では両側脳血流が低下していた.(2)iPadによるATMT訓練とWiiによる全般認知訓練発症10日以内の脳梗塞、脳出血患者において2週間のiPadによるATMT訓練群、Wiiによる全般認知訓練群のTMT-AとMMSEの変化を調べた。対照群に比しiPad群ではTMT-AのみならずMMSEも有意に改善し、効果は限定的でなく般化する可能性が示唆された。【目的】注意を要するタスクの頻回負荷により実際の注意力を向上させるAttention Process Training (APT)は汎化されないという意見もある。しかし脳卒中発症早期のような刺激の少ない受動的環境では、注意責任部位を賦活し前頭葉神経ネットワークを維持することだけでも意味があり、その後の改善に影響を及ぼすと考えられる。我々はTouch Panel Pc式のAdvanced Trail Making Test (ATMT)を用いて、従来のTrail Making Test(TMT)-A様課題を脳卒中発症早期の患者に頻回負荷し、それが領域特異的でなく他の前頭葉系テスト成績にも影響を及ぼすかどうか調査した。【対象】脳卒中発症2週間以内の意識清明で失語症状がなく指示に従える患者35名。【方法】全対象に従来のTMT-A/B、Word Fluency Test (WFT)、Stroop Testを施行。その後対象を無作為にAPT施行群20名と対照群15名に分け、APT施行群には通常のリハビリに加え週5日ATMTを施行。1週間後、再び全対象にTMT-A/B、WFT、Stroop Testを施行し、二群間で成績改善率に差があるか検討した。【結果】ATMTはTMT-Aに類似したタスクであるにも関わらず、APT施行群ではTMT-Aのみならず他の全てのテストの成績改善率が高く、特にStroop Test誤反応数については高い有意差をもって改善を認めた。【考察】Touch PanelPCを用いたATMTは利き手や麻痺側に関係なく施行可能であり、出題はランダムであるため従来の紙ベースTMTと違い連続使用も可能である。TMT-A以外の前頭葉系テスト成績改善を認めたのは本負荷によるAPTが領域特異的効果だけではない可能性を示唆する。今後のゲーム性も高く短時間で施行可能で、扱いも簡便であるため、脳卒中急性期におけるAPTに適していると考えられた。研究は2段階に分けて行った。まず若年健常者において高濃度酸素吸入により認知機能が増強されることが報告されているが脳卒中対象の研究報告はなかったため、亜急性期の脳卒中患者を対象に高濃度酸素吸入下の認知機能について調査した。対象は発症15日以内の初発の片側大脳脳梗塞、脳出血患者21名。室内気吸入時と30%濃度酸素吸入時の三宅式有関係対語検査を用いた言語性記憶とATMT脳年齢計を用いた非言語性記憶の成績を比較し、脳血流量と成績改善率の関係を調査した。その結果、脳卒中の病巣が左大脳の場合には高濃度酸素吸入時の言語性記憶の増強効果が統計的に有意であり、その増強効果が高い群では脳血流量が低い傾向を認めた。左大脳病巣の脳卒中患者においては高濃度酸素吸入時の認知機能が増強する可能性が示唆された。次に、脳トレーニングゲームの効果については健常若年者では否定されているものの、急性期脳卒中対象の報告はないため、急性期脳卒中患者に対してコンピューターを用いた脳トレーニングゲームを連日施行し、その効果の有無や、効果が訓練したスキルだけに留まらず般化するかどうかについて調べた。対象は発症10日以内の脳梗塞、脳出血患者44名。対象をランダムにアップル社iPadを用いたATMT訓練群(iPad群)と任天堂Wiiを用いた全般的な認知訓練群(Wii群)、何もしない対照群(C群)の3群にふりわけ、2週間の訓練前後のTMT-AとMMSEの成績の変化について調べた。結果は、3群ともTMT-A・MMSEの成績の有意な改善を認めたものの、TMT-Aの成績改善率はC群に比しiPad群で有意に高く、MMSEの成績改善率はiPad群・Wii群ともにC群に比し有意に高かった。急性期脳卒中患者に対する脳トレーニングゲームは有効であり、ATMTの訓練のみ施行したiPad群でも全般性認知のスクリーニング検査であるMMSE得点の成績改善率は有意に高いことから、効果は訓練したスキルに留まらず般化する可能性が示唆された。
安定同位体標識ぶどう糖をもちいたミニマルモデル法による糖代謝の解析

1.健常者ボランテイア(8名)、2型糖尿病患者(11名)を対象に、安定同位体標識ぶどう糖を用いた経静脈糖負荷試験を施行し、血糖値、インスリン濃度から従来のミニマルモデル解析によるSi(インスリン感受性指数)、Sg(glucose effectiveness、glucose効果)(それぞれ末梢組織への糖取り込み促進と、肝臓での糖放出抑制の両者を合わせた指標)を求めた。また安定同位体ぶどう糖濃度(ガスクロマトグラフィー質量分析法)、インスリン濃度からtwo-compartment modelをもちいて、末梢組織への糖取り組み促進の特異的指標Si^<2*>、Sg^<2*>を求める方法、及びdeconvolution法により糖負荷試験中のendogenous glucose production(EGP)の経時的変化を求める方法を確立した。2.2型糖尿病患者においてSi×10^4=6.7±0.8[(μU/ml)^<-1>・min^<-1>](Mean±SE)、Sg=0.0132±0.0015(min^<-1>)であり、健常者の11.8±2.6および0.0203±0.0022よりそれぞれ有意に低値であった。一方糖尿病患者のSi^<2*>×10^4=6.2±0.7は、健常者の11.0±1.9より有意に低値であったが、Sg^<2*>=0.0070±0.0012は、健常者の0.0055±0.0016と有意差を認めなかった。従って2型糖尿病におけるSgの低下には、肝臓での糖放出抑制にかかわるglucose作用の低下が関与している可能性が示唆された。3.EGPの基礎値は糖尿病で1.77±0.09(mg・kg^<-1>・min^<-1>)と健常者の1.43±0.17より高い傾向を認めた。負荷試験中の経時的変化では、糖負荷後20分までは両群ともEGPは急速に抑制され、この抑制はglucoseの直接作用と考えられた。糖尿病でHbA1cが高値の5名では、この初期の抑制はあきらかに不良であった。2型糖尿病におけるSgの低下には、EGPの抑制不良が関与している可能性が示唆された。1.市販の安定同位体ぶどう糖(6,6-d_2-glucose)と通常の50%ぶどう糖注射液を混合し、フィルター処理・オートクレーブ滅菌、バイアルへの封入を行い、薬局法に基づくエンドトキシンの定量を行い、注射液の作製、安全性の確保に関する事項を確立した。2.健常者ボランティア(8名)、2型糖尿病患者(11名)を対象に上記ぶどう糖を用いた負荷試験を開始し、注射液の安全性には臨床的にも問題を認めなかった。3.血糖値、安定同位体ぶどう糖濃度(ガスクロマトグラフィー質量分析法)、インスリン濃度(ラジオイムノアッセイ法)を測定し、血糖値、インスリン濃度から従来のミニマルモデル解析によるSi(インスリン感受性指数)、Sg(glucose effectiveness)(末梢組織、肝臓両者を含む指標)を求めた。また安定同位体ぶどう糖濃度、インスリン濃度から末梢組織におけるSi^*、Sg^*を求めた。4. 2型糖尿病患者においてSi×10^4=6.2±0.7[(μU/ml)^<-1>・min^<-1>](Mean±SE)、Sg=0.0132±0.0015(min^<-1>)であり、健常者の11.8±2.6および0.0203±0.0022よりそれぞれ有意に低値であった。一方、糖尿病におけるSi^*×10^4=6.2±0.7は、健常者の11.0±1.9より有意に低値であったが、Sg^*=0.0069±0.0004は、健常者の0.0079±0.0006と有意差を認めなかった。したがって2型糖尿病におけるSgの低下には、肝臓におけるglucose effectivenessの低下が関与している可能性が示唆された。5.上記負荷試験中の内因性ぶどう糖産生を推定するため、負荷試験のデータをもちいてtwo compartmentミニマルモデル解析による内因性糖産生の解析を進め、また症例数を増やしている段階である。

一方糖尿病患者のSi^<2*>×10^4=6.2±0.7は、健常者の11.0±1.9より有意に低値であったが、Sg^<2*>=0.0070±0.0012は、健常者の0.0055±0.0016と有意差を認めなかった。従って2型糖尿病におけるSgの低下には、肝臓での糖放出抑制にかかわるglucose作用の低下が関与している可能性が示唆された。3.EGPの基礎値は糖尿病で1.77±0.09(mg・kg^<-1>・min^<-1>)と健常者の1.43±0.17より高い傾向を認めた。負荷試験中の経時的変化では、糖負荷後20分までは両群ともEGPは急速に抑制され、この抑制はglucoseの直接作用と考えられた。糖尿病でHbA1cが高値の5名では、この初期の抑制はあきらかに不良であった。2型糖尿病におけるSgの低下には、EGPの抑制不良が関与している可能性が示唆された。