hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植免疫反応と血管内皮の多様性：臓器間格差のメカニズムとグリコキャリックスの役割

平成30年度は,1実験動物の血管内グリコキャリックス(GCX)の可視化法とCLEM法(光電子相関顕微鏡法)への応用2培養内皮細胞のGCXの評価と内皮細胞傷害モデルの作成を中心に検討した.1健常マウスを安楽死後,アルシアン青(ALB)やランタン(LA)を加えた固定液で潅流固定し,腎臓などの血管GCXを光学・蛍光顕微鏡,透過型電子顕微鏡(TEM),LVSEMで観察しCLEM法を試みた.TEMではオスミウム後固定によりGCXは高電子密度に染色された.ALBはFFPE切片に対してPAM(過ヨウ素酸メセナミン銀)染色を行うと銀増感により明瞭に検出され,GCXの評価が可能であった.GCXの厚さや増感銀粒子の密度は,糸球体毛細血管や小細動脈で高く,尿細管周囲毛細血管や静脈では低かった.SEM画像を光学顕微鏡像に相関させるCLEM法は,GCXの描出や性状の解析に有用であるが,光顕像の解像度や増感銀粒子の検出に課題を残した.2培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の細胞表面上のGCXをFITC標識小麦胚芽アグルチニン(WGA)で検出し,CD31(PECAM)との関係を共焦点レーザー顕微鏡で観察した.また細胞のviabilityをMTTアッセイで評価し形態像を合わせて検討した.内皮傷害型の副作用が報告されている抗癌剤Gemcitabinを培養内皮細胞に添加して,内皮細胞のviabilityやGCX,CD31分子の状態の変化を評価した.Gemcitabine濃度を上げるとCell viabilityや細胞形態,GCX, CD31分子発現に変化が見られるが,至適薬剤濃度やGCX定量化法について検討する必要がある.本研究の目標は「臓器移植における免疫反応と血管内皮の多様性」を,血管内皮面のGCXを中心に明らかにすることである,これまで,in vivoならびにin vitroのモデルで,内皮面のGCXを光顕・電顕的に可視化する方法を検討し、一定の成果を得ている.しかし,臓器移植免疫反応のin vivoもしくはin vitroのモデルに応用する必要があるが,現在それらのモデル作成が十分になされていない.マウス骨髄移植後GVHDモデルの作成については,研究者の時間的な余裕がなかったため,昨年度までの課題抽出の段階で停滞している.その課題としては,尾静脈からの骨髄細胞を移植する際の、移植骨髄細胞の肺塞栓による呼吸不全があり,骨髄組織の移植法(経静脈的投与法の検討、骨髄腔への直接注入)について検討する必要がある.研究期間を延長し,最終年度は動物モデルの作成を完成させ,臓器間や臓器内血管レベル間のGCXの量や性状について検討を加えたい.さらにin vitroの実験系として、今年度は抗癌剤(Gemcitabine)による内皮傷害をモデルとして,GCXと内皮細胞機能との関連性について検討を始めているが,未だ十分な進展が得られていない.本来移植免疫反応においては,補体や抗体あるいは炎症細胞による内皮傷害が問題でなり,最終的にそのためのモデル作成も必要であるが,まずはよりシンプルな内皮傷害モデルを作成し,HUVECとヒト糸球体培養内皮細胞と比較することで,内皮の臓器間多様性の要因を探りたいと考えている.2019年度は引続き,1マウス骨髄移植後GVHDモデルの確立と解析,2培養内皮細胞のin vitroモデルを用いた検討を中心に行う.具体的な研究推進方策は以下の通りである.1昨年度検討を行えなかった骨髄移植の方法は,投与する骨髄細胞の浮遊液にヘパリンを添加して肺塞栓を予防する他,骨髄内移植法も検討する.骨髄内移植はTakakiらの方法(J Autoimmunity ,31: 408-415, 2008)を参考にする.誘発された急性GVHD反応を,肺・腎・肝・小腸・皮膚を中心に病理学的に評価し,血管内皮面の変化(GCXや補体活性化、細胞接着分子の発現など)を明らかにする.血管GCXの糖鎖構成分の多様性を、種々のレクチンを利用して免疫組織学、免疫電顕法、光学電子顕微鏡相関(CLEM)法で解析する。GVHDが惹起された臓器や血管レベルの特性を組織学的に評価し,臓器間格差や血管レベルに応じた特性をGCXの性状の変化の観点で解析する.2薬剤性ならびに免疫反応性の内皮傷害モデルを作成し、GCXと内皮機能の関係を解析する.また,細胞をHUVECの他にヒト糸球体内皮細胞(HGEC)に応用し,両者の反応性やGCXの変化の差異から臓器間血管内皮の多様性について考察する.また,移植免疫反応のin vitroモデルとしては、抗内皮抗体や未非働化血清による補体活性化,活性化した単球の共培養などで内皮細胞の刺激などを試みて、内皮の形態やGCX,内皮細胞の機能的変化について解析する。初年度は、1マウス骨髄移植後GVHDモデルの作成と2グリコキャリックスの可視化手技を検討した。さらに、腎血管内皮の多様性を形態的にとらえる目的で、3ホルマリン固定・パラフィン包埋切片の厚切り(10&micro;m)標本を低真空走査電顕(LV-SEM)で観察する手法を検討した。1マウス骨髄移植後GVHDモデルの作成については、Lee ESらの報告を参考に行った。レシピエントであるBalb/c (H-2d)マウスに全身放射線照射後翌日に、ドナーであるC57BL/6 (H-2b)

マウスの大腿骨から骨髄細胞(1X106個)と脾細胞(5X106個)を採取し、尾静脈より静注して移植した(n=6)。移植後、マウス体重減少と全身衰弱があり、47日までに大部分のマウスが死亡した。死因として肺水腫や肺出血が見られ、急性GVHDが疑われた。放射線照射と骨髄移植については、すでに実験手技を確認し、この手技で致死的な障害を惹起することが確認できた。しかし、その病的機序の詳細の検討が十分でなく、その病理学的機序と疾患モデルとしての妥当性を今後評価する必要がある。2グリコキャリックスの電子顕微鏡的可視化については、グリコキャリックスに含まれる多糖類に結合する陽性荷電の色素(ルテニウム赤、アルシアン青、キュプロメリック青、ランタンジスプロシウムなど)を固定液に混合して検出する手技の検討を行っている。電子顕微鏡的な観察は行えていないが、試料作製の準備段階にある。3LV-SEMによる腎血管内皮の走査電顕観察では、腎生検の切片を利用して腎血管各レベルにおける血管内皮の超微形態的な特徴を観察し、慢性拒絶反応時に各血管の内皮にどのような変化が惹起されるのかを観察している。本研究の目標である「臓器移植における免疫反応と血管内皮の多様性」を明らかにするため、臓器移植免疫反応のin vivoもしくはin vitroのモデル作成が重要である。さらに、モデル作成に平行して、内皮細胞のグリコキャリックスの変化を電子顕微鏡的に解析する方法の確立も重要である。初年度は、この二つについての研究計画を発展させるための準備を進めてきたが、主として研究者の時間的・労力的な問題で、未だ十分な進展が得られていない。1マウス骨髄移植後GVHDモデルの作成については、放射線照射と骨髄移植はすでに実験手技を確認し可能であり、この手技で致死的な障害を惹起することが確認できた。しかし、その病的機序の詳細の検討が十分でなく、さらなる実験モデルの条件検討が必要である。2のグリコキャリックスの電子顕微鏡的可視化については、今年度は電子顕微鏡試料作成が行えず、準備段階でとどまっている。平成29年度は、1マウス臓器のグリコキャリックス(GCX)の可視化、2培養内皮細胞のGCXの可視化、3ホルマリン固定・パラフィン包埋(FFPE)切片を用いた低真空走査電顕(LV-SEM)観察法などを中心に検討を行った。1臓器血管内皮面のGCXを可視化には陽性荷電色素であるアルシアン青(ALB)とランタン(LA)を用い、潅流固定液に溶解させて試料を作成し、腎や大動脈を透過型電顕(TEM)および走査型電顕(SEM)で観察した。ALBは糸球体毛細血管や細動脈内皮面に染色されたが、TEMならびにSEMでの局在観察は不十分であった。LAはTEMおよびSEMで細顆粒状物質の層として観察されたが、分布に部位による差が見られた。2ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を培養し、細胞表面のGCXをFITC標識小麦胚芽アグルチニン(WGA)で検出し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。検出された薄層はノイラミニダーゼ処理により染色性が失われ、HUVECの表層にWGAの結合するNアセチルグルコサミンとシアル酸が存在することが確認された。この培養細胞層をALBやLAを含む固定液で固定後に樹脂包埋し、超薄切片を作成してTEMで観察したところ、細胞表面に細顆粒状の薄層(GCX)が検出された。3FFPE切片を用いたLV-SEM観察法については、マウス潅流固定標本やヒト腎生検検体を用いて、内皮細胞の超微形態や血管基底膜の変化について観察した。
神経細胞の極性形成機構の解明

生体を構成する種々の細胞はその固有の機能を発揮するために極性を獲得する。具体的な例として、軸索及び樹状突起という極性の異なる突起を有する神経細胞などが挙げられる。しかしながら、これらの細胞がどのようにして極性を獲得するか、その分子機構は現時点ではほとんど理解されていない。以上の状況を踏まえて、本研究では、神経細胞及び上皮系細胞の細胞極性を制御する細胞外シグナルやその伝達メカニズムを明らかにすることを目的とする。神経軸索へのPAR複合体(PAR-3、PAR-6、atypical protein kinase C (aPKC))の局在化が神経細胞の極性形成に重要であることが報告されている。しかしながら、PAR複合体の局在化機構は不明であった。本年度、私共はPAR複合体の軸索への局在化機構として、PAR-3とキネシンモーターの一つKIF3Aの直接結合が重要である事を見出した(Nishimura et al.,Nature Cell Biol.,2004)。さらに、PAR複合体の上流シグナルの探索を行い、神経突起の伸長に先立ち神経突起のうちの1本でPI3-kinaseの産物であるPIP_3が濃縮する事を明らかにしている(Menager et al.,J.Neurochem.,2004)。また、神経突起の伸長を引き起こすラミニンなどの細胞外基質との接着により、PIP3が局所的に生産されることを明らかにしている。従って、細胞外基質-PI3-kinase-PIP_3-RhoファミリーGTP結合蛋白質の活性化-PAR複合体の活性化という経路により神経細胞の極性が制御されているものと考えられた。本年度、CRMP-2による軸索伸長の制御機構の解明を試み、CRMP-2がNumbを介して細胞接着分子であるL1エンドサイトーシスを制御することを明らかした、CRMP-2は微小管の重合を促進するだけではなく、接着分子のリサイクリングにも関与し、細胞骨格と膜輸送の両方に働きかけることで相乗的に軸索伸長を制御し、極性を獲得するもの考えられた(Nishimura et al.,Nature Cell Bio.,2003)。本年度の成果は、細胞の極性形成機構を理解する上で極めて重要である。従って、本年度の研究計画はほぼ達成することができたと考えている。
ゲージ・ストリング理論における双対性の代数的記述と可解統計模型などへの応用

主に、GaiottoとRapcakにより提唱されたcorner vertex algebra (CVA)について研究を行った。CVAとは3枚の5次元ブレーンの交叉点(次元的には2次元となる)で定義された無限次元対称性であり、5次元ブレーンと直角に交わる3次元ブレーンの各領域における枚数N,M,LによりY(N,M,L)などと書かれる。この代数では頂点をファインマン図的な組み合わせをすることにより新しい無限次元代数が実現され、ストリング理論や統計模型に関連する新たな代数を無限に構成することが可能となった。CVAは数学的には量子トロイダル代数の特殊な表現となることが知られている。一般的な表現の基底は3次元のヤング図によりラベルされているが、上記の整数N,M,Lに関連するある特定の位置に箱を置けないという制約を加えたものがCVAの表現となる。この意味ではCVAは量子トロイダル代数の新たなreductionとみなすことができる。私の研究では制約をさらに強めた場合に何が起こるのかを詳しく調べた。特にW代数、N=2超共形代数など80年代に詳しく性質が調べられていた代数をCVAとして実現し、さらに強い制約を加えた場合にはこれらの模型のminimal modelが得られることを証明した。また、量子トロイダル代数の特徴的な性質としてストリング理論でも現れる双対性があることが挙げられるが、双対性を表す基底をあからさまに構成し、その性質を調べた。CVAにおけるミニマル模型の分類を図形的に行えることを示せたことは、想定よりも大きな結果であったと考えられる。これまでミニマル模型の構成は量子場を用いてヌル状態を書き表す技術的な設定が必要であったが、それを純粋に幾何学的に行えることになったことにより量子場で書けないようなより多様性がある代数の分類が可能になったと思われる。CVAを組み合わせることにより無限に新たな代数を生成することができるが、それらについてどのようなストリング理論や統計模型への応用ができるか、大変興味深いと考える。また、双対基底の構成についても、非常にあからさまな形を得ることができ、また位相的弦模型の双対性を直接的に書き下すことができるようになったのは技術的な利点である。双対基底と通常の基底の内積は組みひも群に現れるHopfリンク不変量と一致している。組みひもという数学的な対象と、ゲージ理論やストリング理論の双対性が関連することを示せたことは大きな進展であったと考えている。CVAについてはその特殊な組み合わせを用いると超対称共形代数に一致することが予想されている。実際、我々のミニマル模型の研究ではこの予想が正しいことを示している。この方向で興味深い点としては、量子変形が可能であるという点である。これまで超対称性の量子変形が成功した例はないので、具体的に代数を書き下すことに成功すれば、超対称性のq変形の最初の事例となる。超対称性は現在の素粒子理論やストリング理論の根幹なので、そのq変形が正しく行われれば大きなブレークスルーになると考える。また、表現の双対性についてはいろいろ考える課題がある。その一つはCVAに応用したとき双対性がどのような役割を果たすのか、双対ダイアグラムに対応する代数はどのように対応できるのか、などについて調べようと思う。一般に量子トロイダル代数の表現は3次元のヤング図形で記述されるので図形的な対応はある程度見通しやすいが(ダイアグラムの軸の変換など)具体的な表示を行うのにはハードルが多く残されている。また、新たな課題としてはゲージ群がA系列ではない場合の解析に本格的に取り組みたい。この場合、量子トロイダル代数も変更を要求される。この問題は昔からある難問で、インスタントン分配関数の積分表示は存在するものの、それらを図形的に表現することは難しかった。最近、Majoranaフェルミオンを用いた表示、積分表示からのqq-characterの直接的な導出、実トポロジカル頂点、境界状態を用いたQuiverゲージ理論のA型以外への拡張、など新たな技術的なブレークスルーがおこなわれているので、それらの発展をヒントにして量子トロイダル代数の観点から具体的な表示を得ることに挑戦したい。

また、量子トロイダル代数の特徴的な性質としてストリング理論でも現れる双対性があることが挙げられるが、双対性を表す基底をあからさまに構成し、その性質を調べた。CVAにおけるミニマル模型の分類を図形的に行えることを示せたことは、想定よりも大きな結果であったと考えられる。これまでミニマル模型の構成は量子場を用いてヌル状態を書き表す技術的な設定が必要であったが、それを純粋に幾何学的に行えることになったことにより量子場で書けないようなより多様性がある代数の分類が可能になったと思われる。CVAを組み合わせることにより無限に新たな代数を生成することができるが、それらについてどのようなストリング理論や統計模型への応用ができるか、大変興味深いと考える。また、双対基底の構成についても、非常にあからさまな形を得ることができ、また位相的弦模型の双対性を直接的に書き下すことができるようになったのは技術的な利点である。双対基底と通常の基底の内積は組みひも群に現れるHopfリンク不変量と一致している。組みひもという数学的な対象と、ゲージ理論やストリング理論の双対性が関連することを示せたことは大きな進展であったと考えている。CVAについてはその特殊な組み合わせを用いると超対称共形代数に一致することが予想されている。実際、我々のミニマル模型の研究ではこの予想が正しいことを示している。この方向で興味深い点としては、量子変形が可能であるという点である。これまで超対称性の量子変形が成功した例はないので、具体的に代数を書き下すことに成功すれば、超対称性のq変形の最初の事例となる。超対称性は現在の素粒子理論やストリング理論の根幹なので、そのq変形が正しく行われれば大きなブレークスルーになると考える。また、表現の双対性についてはいろいろ考える課題がある。その一つはCVAに応用したとき双対性がどのような役割を果たすのか、双対ダイアグラムに対応する代数はどのように対応できるのか、などについて調べようと思う。一般に量子トロイダル代数の表現は3次元のヤング図形で記述されるので図形的な対応はある程度見通しやすいが(ダイアグラムの軸の変換など)具体的な表示を行うのにはハードルが多く残されている。また、新たな課題としてはゲージ群がA系列ではない場合の解析に本格的に取り組みたい。この場合、量子トロイダル代数も変更を要求される。この問題は昔からある難問で、インスタントン分配関数の積分表示は存在するものの、それらを図形的に表現することは難しかった。最近、Majoranaフェルミオンを用いた表示、積分表示からのqq-characterの直接的な導出、実トポロジカル頂点、境界状態を用いたQuiverゲージ理論のA型以外への拡張、など新たな技術的なブレークスルーがおこなわれているので、それらの発展をヒントにして量子トロイダル代数の観点から具体的な表示を得ることに挑戦したい。使用額の差額はわずかであり大幅な計画の変更はない。本年度に適切に使用する予定。
陽イオン化ゼラチンを用いた新しい遺伝子デリバリー技術の開発と臨床応用への基礎検討

ゼラチンは生体内の酵素で容易に分解されまた化学的修飾、加工が容易であり、数々の薬物、蛋白のキャリアーとして利用されている。今年度、我々は、ゼラチンを陽イオン化させることによりDNAプラスミドと複合体を形成し、種々の細胞に対しin vitroでの遺伝子導入実験を試み、またin vivoでの遺伝子発現についても検討した。【陽イオン化ゼラチン粒子の作製】ゼラチンを陽イオン化し、グルタールアルデヒドにより架橋し、直径10から20μmのゼラチン粒子を作製した。また、陽イオン化ゼラチンを蒸留水に溶解し、ゼラチン水溶液とした。ゼラチン粒子あるいは水溶液をプラスミドDNAと混合し、複合体を作製した。複合体は電化のバランスが最適になるようにゼラチン単位あたりの最適DNA量を決定した。【in vitroでの遺伝子導入】COS-7やNIH3T3細胞およびヒト胃癌細胞株MKN74などの哺乳類動物細胞に陽イオン化ゼラチン水溶液での遺伝子発現を認めた。しかし、ゼラチン粒子ではin vitroでは分解までに時間がかかり、明らかな遺伝子発現を確認できなかった。また遺伝子発現の程度は市販のリポフェクタミンよりはやや劣るものであった。また、ヒト末梢血単球より誘導した樹状細胞に対する遺伝子導入にも成功した。【in vivoでの遺伝子導入】ゼラチン粒子をマウス腹腔内へ投与したところ、大網や腸間膜に分布する乳斑組織に集積することを確認した。そこで、ゼラチン粒子-プラスミドDNA複合体をマウス腹腔内投与し、乳斑における遺伝子発現の有無について検討した。マーカー遺伝子としてGFPを用いたところ、同部位における選択的な遺伝子発現が得られた。現在、腹膜転移治療を想定し、NK4、IL-12などの治療遺伝子を用いた遺伝子発現の検討を行っている。陽イオン化ゼラチンマイクロスフェアと陰性電荷を持つDNAプラスミド(非ウイルスベクター)との複合体を用いて、生細胞に遺伝子導入実験を行うにあたり、今年度はまずゼラチン粒子の作成を行った。粒子は細胞内に取り込まれやすく、また注入しやすさを考え、なるべく小さいものを作成することを試みた。マクロファージなどの貧食系細胞は5μm以下が取り込まれやすいため、まずカチオン化ゼラチンで5μmの粒子の作成を試みた。その結果、このサイズの粒子は生成後の回収率が悪く、また完成しても粒子同士の集塊形成が著しいため、結局的に大きな塊になってしまう傾向が認められ、安定した生成は困難であった。これは、各種Bufferの条件(イオン強度・pH等)を変更して条件検討を行ったが、効果的な対策は見つけられなかった。そこで従来より京都大学再生医学研究所の田畑研で種々の研究に用いられてきた直径20-30?mの陽イオン化ゼラチン粒子を用いてin vitroで遺伝子導入実験を行ったところ、このサイズでもマクロファージ等の貧食系の細胞にはゼラチン粒子の取り込みが確認できた。しかし、繊維芽細胞や血管内皮細胞など貧食能のない細胞には殆ど取り込まれなかった。次に遺伝子の発現について検討したが、ゼラチン粒子が細胞内に取り込まれたマクロファージや樹状細胞などの貧食系細胞では、目的とした遺伝子の発現(?-GALおよびGFP)はほとんど認めなかった。その要因としては、細胞内に取り込まれたゼラチン粒子の分解とそれによる標的遺伝子放出の制御が期待したように行われない可能性のほか、貧食細胞であるがゆえ導入遺伝子が発現する前に、DNase等の作用で分解されてしまう可能性が考えられた。またマウスを用いたin vivoの系(腹腔内投与)では、ゼラチン粒子は主に大網や腸間膜の乳斑組織に集積する像を認めた(投与後3日目に確認)。しかし組織中の遺伝子の解析を試みたが投与後14日めでは既に標的蛋白(?-GAL)の発現はin vitroの系同様確認できなかった、来年度はゼラチン粒子の細胞内での分解を調整する目的で、グルタールアルデヒドでの架橋度の変更などの条件検討を行うとともに、生体内での発現条件を再検討する予定である。【in vivoでの遺伝子導入】

ゼラチン粒子をマウス腹腔内へ投与したところ、大網や腸間膜に分布する乳斑組織に集積することを確認した。そこで、ゼラチン粒子-プラスミドDNA複合体をマウス腹腔内投与し、乳斑における遺伝子発現の有無について検討した。マーカー遺伝子としてGFPを用いたところ、同部位における選択的な遺伝子発現が得られた。現在、腹膜転移治療を想定し、NK4、IL-12などの治療遺伝子を用いた遺伝子発現の検討を行っている。
超冷凍保存法による同種気管粘膜移植(人工気管輪との複合体による気管再建)

雑種成犬の気管を採取、軟骨論を剥離除去した気管粘膜移植片とし、5%HEPES bufferを含んだTC-199を保存液として4°Cで保存後、この保存液に10%DMSOを加えた液内で凍結した。凍結はプログラミングフリーザ-を用い、-4.2°Cまでは-1.0°C/minで、植氷後-40°Cまでは-2.0°C/minで、その後は-30°C/minで-80°Cまで凍結し、液体窒素タンク内で3040日間以上保存した。胸腔内気管を9軟骨輪切除し、40°Cの恒温漕で急速解凍した移植片を用い、切除部位を管状に吻合置換した。外層には人工気管輪(Hydroxyapatite製)をはめ込み、有茎大網片で被覆した。当初、以上の移植実験を4頭に行ったが、術後14日目以後に狭窄が観察され、27および36日目に各1頭が呼吸不全死した。他の2頭の狭窄は中等度であった。病理学的に拒絶反応の関与が示唆された。気管移植でも、凍結による抗原性の低下によって、免疫抑制剤なしでも生着できる点が本研究の前提でありこれを再検証する必要を感じ、対照として通常の同種移植(軟骨非剥離)群を新たに設定した。【結果】軟骨非剥離群は、術後に高度の狭窄をきたし平均25日目に死亡した(n=5)。これは両側吻合部から認められ、狭窄の原因が血行不全だけではなく、拒絶反応にもあることを示唆した。気管粘膜移植(軟骨剥離)群(n=8)は、中等度の狭窄を合併したが60日の長期生存1例がある。しかしこの群も移植片の高度狭窄による死亡3例(平均32日目)があり、他の4例も種々の程度の狭窄を示した。成績としては当初の予測よりは不良と言わざるを得ないが、軟骨非剥離群より良好であることも事実である。他家の報告では、通常の同種凍結保存移植で良好な結果も見られ、凍結のプログラムや保存液による影響も考えられ、今後の検討を要する。
ヒト胎盤血管の収縮・拡張因子の作用機序の解明

本研究の結果、ヒト胎盤血管における収縮・拡張因子の検討とともに、各々の相互作用やその作用機序についても明らかにすることができた。特にヒト胎盤血管において特徴的なことは、通常の体循環の血管と異なり、神経因子による調節をうけていないことであり、例えば通常は血管収縮因子であるphenylephrineによる収縮を認めなかった。さらに、通常の高血圧ではあまり重要な意味を持たないserotoninが、一酸化窒素(NO)の合成阻害などの条件が重なると強力な血管収縮物質であるendothelin-1(ET-1)とほぼ同濃度でも収縮を認めた。妊婦ではserotoninの血中濃度はET-1よりはるかに高濃度であり、妊婦や胎盤循環での本物質の重要性が示された。また、ethanolが胎児側胎盤循環を障害することも明らかになった。しかし、これまでの検討では不十分であり、本研究結果からさらに検討が必要なことは、(1)ET-1のsynergic effectを胎盤灌流法でも確認すること、(2)胎盤循環に影響を及ぼさない濃度のL-NAMEが、胎盤灌流法においてもserotoninの収縮力を増強するか、(3)estrogenの作用機序を血管リング標本の実験でも検討すること、(4)ethanolによる収縮に他の因子がどのように関連しているかを明らかにすること、などをさらに検討していかなければならない。また、本研究の最終目標であった“妊娠中毒症などの子宮内胎児発育遅延の原因を究明し、その治療法をあきらかにすること。"にはまだほど遠い結果である。今後は、妊娠中毒症患者の胎盤を使用した検討や、各因子の妊婦・臍帯血中濃度などをさらに検討し、胎盤循環障害の原因を明らかにするとともに、その治療法の検討を行っていく予定である。研究機器のセットアップおよび実験条件の設定を完了し、さらに実験終了後の血管標本を抗factor VIII抗体で染色し、血管内皮細胞が保たれていることを確認した。ET-1の5-HTの収縮に対する特異的増強効果が他の部位の血管で報告されているが、胎盤絨毛膜板結果でも同様の増強効果が確認された。一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤であるL-NAME、Cyclooxygenase阻害剤であるIndomethacinの投与によりET-1,5-HTによる収縮は動・静脈とも増強した。このことは、ET-1,5-HTによる血管収縮時に血管内皮細胞より血管弛緩物質であるNOやPGI_2が放出され、血管のトーヌスをコントロールしていることを示している。特に5-HTによる収縮の際にNOやPGI_2の関与が大きく、L-NAME投与によりNO合成を阻害した時の5-HTによる収縮は、ET-1単独投与時の収縮力、反応性と同程度であった。妊娠中毒症時にはET-1,5-HTともに血中濃度が上昇するが、5-HTの濃度の方が高いため、妊娠中毒症のようなNO産生が抑制された状態では、5-HTが高血圧の主因であることが示唆された。昨年度までの結果で,一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤であるL-NAME、Cyclooxygenase阻害剤であるIndomethacinの投与によりET-1,5-HTによる収縮は動・静脈とも増強する事を報告した。特に5-HTによる収縮の際にNOやPGI_2の関与が大きく、L-NAME投与によりNO合成を阻害した時の5-HTによる収縮は、ET-1単独投与時の収縮力、反応性と同程度であり生体内で高濃度である5-HTの影響は大きい。

今年度は、さらに同様な実験で収縮がより増強するのを期待しL-NAMEとIndomethacinを同時投与し5-HTを投与したところ,かえって収縮力が減弱した。このことについては現在検討中であるが,未だ結論は得られていない.EstrogenやProgesteroneが収縮力に与える影響について検討をするためにSteroid hormoneをエタノールに溶解し投与したところ,エタノールそのものが血管に作用することが明らかになった。このためまずエタノールの収縮に及ぼす影響について検討した。preliminaryなデータであるが,低濃度(0.05-0.2%)では血管収縮に働き,高濃度(0.4-1.0%)では血管拡張作用をもっていることが明らかになった。生体内では一般にエタノールは血管拡張に働くとされているが,神経因子の作用も大きく影響しているものと思われ,神経性調節機構を持たない胎盤血管における結果は,胎児性アルコール症候群の兆候の一つである子宮内胎児発育遅延の原因を説明しうるものであろう。今後はさらにSteroid hormoneの影響について検討していく予定である。Estrogenが収縮力に与える影響について検討するためにsteroid hormoneをethanolに溶解し投与したところ,ethanolそのものが血管に作用することが明らかになった。生体内では一般にethanolは血管拡張に働くとされているが,神経因子の作用も大きく影響しているものと思われ,神経性調節機構を持たない胎盤血管に対する影響は,胎児性アルコール症候群の兆候の一つである子宮内胎児発育遅延の原因の究明のためにも重要である。なお収縮の強さは、Krebs-Ringer-Bicarbonate BufferのNaClをKClに置換した溶液による収縮(K^+-拘縮)を100%として表現した。Ethanol(0.24.0%)の添加により胎盤血管は濃度依存性に収縮し,重度酩酊時の血中濃度は0.35から0.45%とされているが,0.4%の時の収縮は,動脈で4.7±2.5%,静脈で3.3±2.5%であった。この収縮力はわれわれが以前検討した,強力な血管収縮物質であるendothelin-1の1nM添加による収縮とほぼ同程度であった。また4%ではそれぞれ48.4±8.8%,43.1±17.8%(mean±SD,n=5)であった。Ethanolによる収縮の一部は、sodium nitroprussideやverapamil、caffeinにより抑制された.また4%ethanolは,K^+-拘縮を59.6±15.0%へと有意に抑制したが、K^+-channel blockerであるtetraethylammonium(TEA)によりK^+-拘縮の抑制作用の一部は阻害された。以上の結果より、ethanolは胎盤絨毛膜盤血管に対しCa^<++>-channelを介した細胞外Ca^<++>の流入とともに、細胞内Ca^<++>の放出により、収縮作用を表すことがわかった。また同時に、TEAの結果より内皮由来過分極因子(EDHF)様の作用も持っていることが示された。今後はこの結果をふまえさらにsteroid hormoneの影響について検討していく予定である。
末梢神経連続パルス磁気刺激を用いた舌骨上筋強化訓練と摂食嚥下障害治療への応用

摂食嚥下障害の大きな原因である舌骨挙上障害に対して行われる電気刺激療法は皮膚の疼痛を生じ,また,電極を皮膚に密着させることが困難などの面から臨床場面での普及は難しかった.磁気刺激は皮膚に存在する侵害受容器を刺激せず刺激コイルを皮膚に密着させる必要がないために電気刺激の代用になり得るが,これまではコイルが大きすぎることから舌骨を挙上させる舌骨上筋の刺激は困難であった.われわれは,舌骨上筋を選択的に磁気刺激可能なコイルを開発し,特許申請を行った.最終年度には,舌骨上筋の強化法としてエビデンスのある頭部挙上訓練法と磁気刺激を用いた舌骨上筋強化訓練の無作為化比較試験を健常成人男性24名に対して週5回2週間行い,その効果を比較した.磁気刺激群の刺激は1回2秒間,1日90回施行した.その結果,2週間後には磁気刺激群では舌骨上筋筋力が有意に増大し,頭部挙上訓練群では増大傾向はみられたものの,有意な増加までは得られなかった.頭部挙上訓練法は通常6週間行われるため,2週間では十分な効果は得られなかったためと考えられた.したがって,舌骨上筋磁気刺激は舌骨上筋の強化法として短期的に効果が得られる新たな治療法として使用可能と考えられた.また,実際に摂食嚥下障害患者に対しても磁気刺激を行い,舌骨上筋強化と筋疲労の改善結果も得られた.研究期間全体の成果としては,舌骨上筋を選択的に磁気刺激可能なコイルを開発して疼痛なく舌骨上筋の刺激を行うことができ,新たな舌骨上筋筋力強化法も確立することができた.摂食嚥下障害では舌骨の挙上が障害されることが多く,舌骨の挙上を行う舌骨上筋の筋力強化訓練が必要である.しかし,選択的な舌骨上筋の筋力強化訓練は容易ではなく,電気刺激療法も現実に用いられているが,電気刺激では皮膚の疼痛が問題になる.本研究では,皮膚に存在する侵害受容器を刺激しない磁気刺激を用いて舌骨上筋の筋力強化訓練を検討した.平成28年度は,健常人に対して末梢磁気刺激装置を用いて舌骨上筋に連続パルス磁気刺激を行い,有効な筋力増強が得られる条件を検討した.最初に,刺激装置に付属しているコイルを用いて磁気刺激を行ったが,コイルが大きいため下歯槽神経も同時に刺激され疼痛を生じた.そのため,刺激部位が絞られるように,より小さいコイルの開発を行った.新しく開発したコイルで刺激を行うことにより,疼痛なく舌骨上筋の刺激が可能になった.有効な筋力増強が得られる条件としては,概ね刺激レベル60以上,周波数30Hz以上,刺激部位は舌骨よりも前方でオトガイよりも後方が最適と考えられた.当大学の倫理委員会の承認を得て,開発したコイルを用いて舌骨上筋に磁気刺激を行い,刺激中の舌骨の動きを透視下に計測した.その結果,刺激中に舌骨は最大で10mm以上の前上方への移動を得ることができた.健常人が液体を嚥下したときとほぼ同等の舌骨移動が疼痛なく得られたため,平成29年度は実際に摂食嚥下障害患者に対して磁気刺激を行っていく予定である.当初は磁気刺激装置に付属しているコイルを用いる予定であったが,舌骨上筋の刺激に用いるには大きすぎたため,実際には使用できなかった.しかし,小型のコイルを新たに開発することができたので,小型コイルを用いてほぼ予定通りの研究を行うことができた.摂食嚥下障害の大きな原因である舌骨挙上障害に対してこれまでに各種の電気刺激が用いられてきたが,いずれも皮膚の疼痛を生じ,また,電極を皮膚に密着させることが困難などの面から臨床場面での普及は難しかった.磁気刺激は皮膚に存在する侵害受容器を刺激せず刺激コイルを皮膚に密着させる必要がないが,これまではコイルが大きすぎることから舌骨を挙上させる舌骨上筋の刺激は困難であった.われわれは,舌骨上筋を選択的に磁気刺激可能なコイルを開発し,特許申請を行った.そのコイルを平均年齢32歳の成人男性11名に使用し,周波数30Hzで疼痛を感じない強度の磁気刺激を行い,透視下に磁気刺激の有無による舌骨の位置を評価し,移動距離をImage J programで計測した.その結果,磁気刺激中に舌骨は前方に10.9±2.8mm,上方に8.3±4.1 mm(平均値±標準偏差)の挙上を得た.Numerical rating scale (NRS)を用いて評価した磁気刺激中の痛みは中央値1であり,疼痛もほぼみられなかった.健常人が液体を嚥下したときと同等の舌骨移動を疼痛なく得ることができ,実用に耐えうる舌骨上筋磁気刺激が可能になった.この成果は論文として投稿し,雑誌Neuromodulationに採用された.磁気刺激により十分な舌骨挙上が得られることがわかり,現在は当大学の倫理委員会の承認を得て舌骨挙上障害のある摂食嚥下障害患者への応用を行っている.また,磁気刺激を週5回2週間行うことにより舌骨上筋の筋力強化が得られるかどうかについて,無作為化比較試験を行っているところである.われわれの開発したコイルを用いて思った以上の舌骨挙上を得ることが可能であった.研究成果も論文投稿後短期間で採用となった.

現在は,摂食嚥下障害患者への応用と,健常人を用いた無作為化比較試験の2つを,当大学の倫理委員会の承認を得て行っている.摂食嚥下障害の大きな原因である舌骨挙上障害に対して行われる電気刺激療法は皮膚の疼痛を生じ,また,電極を皮膚に密着させることが困難などの面から臨床場面での普及は難しかった.磁気刺激は皮膚に存在する侵害受容器を刺激せず刺激コイルを皮膚に密着させる必要がないために電気刺激の代用になり得るが,これまではコイルが大きすぎることから舌骨を挙上させる舌骨上筋の刺激は困難であった.われわれは,舌骨上筋を選択的に磁気刺激可能なコイルを開発し,特許申請を行った.最終年度には,舌骨上筋の強化法としてエビデンスのある頭部挙上訓練法と磁気刺激を用いた舌骨上筋強化訓練の無作為化比較試験を健常成人男性24名に対して週5回2週間行い,その効果を比較した.磁気刺激群の刺激は1回2秒間,1日90回施行した.その結果,2週間後には磁気刺激群では舌骨上筋筋力が有意に増大し,頭部挙上訓練群では増大傾向はみられたものの,有意な増加までは得られなかった.頭部挙上訓練法は通常6週間行われるため,2週間では十分な効果は得られなかったためと考えられた.したがって,舌骨上筋磁気刺激は舌骨上筋の強化法として短期的に効果が得られる新たな治療法として使用可能と考えられた.また,実際に摂食嚥下障害患者に対しても磁気刺激を行い,舌骨上筋強化と筋疲労の改善結果も得られた.研究期間全体の成果としては,舌骨上筋を選択的に磁気刺激可能なコイルを開発して疼痛なく舌骨上筋の刺激を行うことができ,新たな舌骨上筋筋力強化法も確立することができた.今後は,実際の摂食嚥下障害患者の舌骨上筋に連続パルス磁気刺激を行う.刺激前後に反復唾液嚥下テスト,水飲みテスト,嚥下造影検査,嚥下内視鏡検査を行い,嚥下機能の評価を行い,連続パルス磁気刺激を用いた筋力訓練の効果を計測する予定である.今後は,現在行っている2つの研究に加え,摂食嚥下障害患者に対する舌骨上筋磁気刺激の効果を無作為化比較試験で行う予定である.小型のコイルを新たに開発したため,平成28年度は研究成果の発表は行わなかった.開発に成功したため,平成29年度からは研究成果の発表も積極的に行っていく予定である.次年度は研究を継続し,その成果を学会発表や論文を通じて公表していく予定である.日韓ニューロリハビリテーション学会,日本リハビリテーション医学会,European Society for Swallowing Disordersなどで研究成果を積極的に発表していく,また,電気刺激の併用も考慮するため,電極などの消耗品の購入も行っていく.
藤原定家の書写工房と定家監督書写本に関する研究

藤原定家の監督書写本に私家集が多いのは、歌の家として勅撰和歌集の撰集資料として備えるためと指摘がある。しかし、私家集以外にも監督書写本が存在することとの意義について、私家集が多く存在することと重ねて考えることで、定家監督書写本の本当の意義が見えてきた。すなわち、定家は和歌集のみならず広く古典を研究し、歌学や作歌に反映していくその原点となる資料を監督書写によって製作していたのであり、歌学書や『源氏物語』など様々な内容の写本が現存するのはむしろ当然なのである。これによって定家監督書写本は定家の古典研究の様子や歌についての考えを知るためには真跡資料に劣らず貴重な資料であるということが判明した。藤原定家による監督書写についての定義は、冷泉家時雨亭文庫の私家集が多く公開される中で行われたものであった。しかし、藤原定家の監督書写本は早く他家へ出たものや切られて出たものなどもあり、こうした写本も総合して、写本間に見られる共通点や類似点を分析・分類した。調査する写本は私家集から始まったが、私家集の範囲を越えて歌物語や歌学書など定家が書写に関わったことが確認できるものを広く扱った。その結果、定家監督書写本私家集の特徴と定義づけられていた事柄は多くの古典籍にも同様に見ることができ、定家の書写活動においては様々な古典籍を区別なく書写していたことが判明した。しかも、家中の者を用いて書写を完成させた写本のうち歌学書では、内容に対する定家の疑問点や考察を行間や余白部分に書き入れた箇所が見られた。また、私家集の書写に見られる筆によって抜書きさせた資料をもとに定家が覚え書きのようなものを書き継ぐような形で残る写本などもあった。定家監督書写本には定家が勘物や奥書を加えたり本文の訂正を書き入れたりすることはこれまでにも知られていたが、歌学書等に見られる定家の書入れは、単に本文を訂正するものではない。これらの書入れは定家の和歌や古典の研究そのものと言えるものであり、監督書写した写本をもとに研究をおこなっていたということがわかる。これらの報告とその意味づけについて、「定家監督書写本私家集の周辺」と題して口頭発表を行った。藤原定家の関わった書写から考察する書写活動が、私家集に留まるものでなくさまざまな古典籍に見られることは前年度明らかにしたとおりで、これらの資料がどのようなものとして定家のもとで扱われていたのかということを引き続き考察した。私家集の場合などは定家の書き入れが、文字の修正をわずかに施すばかりのものも少なくないので、定家の書き入れがほとんど無いように思われるものもある。しかし、『源氏物語奥入』などは『源氏物語』の理解に必要な和歌や漢詩その他の事柄を、他資料から引用したと思われる一節について疑問を呈したり、判明する都度書き入れたりする様子のうかがえるもので、定家が時間をかけて研究を重ねた資料であると見ることができる。そのような資料であるがゆえに定家筆による部分が大半を占める中に、側近による書写が一部含まれる。その他にも同様に定家の『源氏物語』への関心や研究の様子がうかがえる資料、また『源氏物語』に限らず他にもそうした側近による写本に定家の見解がみられるものが複数あることを確認した。これにより、定家の側近たちによる書写というものが、私家集の写本を製作するためだけの単純なものではなく、定家の古典研究に深く関わる、いわば基盤となって研究を支えていたものであるということが見えてきた。これらの報告とその意味づけについて、「藤原定家の和歌研究と監督書写」と題して和歌文学会第六〇回全国大会で口頭発表を行った。藤原定家の監督書写本が私家集に多く、その他にも少ないながら存在することの意味について考察し、まとめをおこなった。私家集が多いことについては、歌の家として勅撰和歌集を撰集せよという下命のあった際に備えその資料とするべくできるだけ多くの私家集を書写し収集していたことは、これまでにも指摘されていたところで、このことに定家の写本が自らの筆ではなく側近に書写させたものであることを照らし合わせて見たとき、権門からの依頼によって書写するような外に提出するものではなく家に蔵するものとしてあるので、側近の書写で充分であったことに符号する。しかし、同じ側近たちが勅撰和歌集の撰歌資料とはなりえない歌学書や物語なども少なからず書写していることは、どのような意味があるのか。このことについて、撰歌資料とはなり得ないもののうちに見える定家の関わりを丁寧に検討することで考察を加えた。例えば、『俊頼髄脳』に見える定家の奥書からは、定家がこれを何かの時のために謂わばコレクションのような蔵書としておくために所持していたのではなく、自ら読みその内容を研究していた様子が見えている。『源氏物語奥入』には、定家が何度もこの『源氏物語』を読み、奥入を何段階にも渡って書き加え続けていた証が残されている。これらのことから定家による監督書写は定家の古典研究そのものであり、その結果として歌の家の大切な蔵書となっていったものであるということが見えた。これらうち、『源氏物語』については「定家監督書写の源氏物語」として、また『源氏物語』以外の写本については本研究全体のまとめとなるべく「藤原定家の監督書写と和歌研究」として論文にまとめた。藤原定家の監督

書写本に私家集が多いのは、歌の家として勅撰和歌集の撰集資料として備えるためと指摘がある。しかし、私家集以外にも監督書写本が存在することとの意義について、私家集が多く存在することと重ねて考えることで、定家監督書写本の本当の意義が見えてきた。すなわち、定家は和歌集のみならず広く古典を研究し、歌学や作歌に反映していくその原点となる資料を監督書写によって製作していたのであり、歌学書や『源氏物語』など様々な内容の写本が現存するのはむしろ当然なのである。これによって定家監督書写本は定家の古典研究の様子や歌についての考えを知るためには真跡資料に劣らず貴重な資料であるということが判明した。私家集以外の資料についての分析と考察を深め、その意義について学会に発表することができた。また、発展させるべき方向性も得ることができたと思えるので、順調と言えるものである。日本文学資料の性質や書かれていることの意味に注目することはこれまでも行ってきたが不十分であったので、このことにより意味を見出して考察の対象にくわえる。また、最終年度に当たるので、過去の内容もあわせて研究のまとめもおこなう。私家集の分類をより充実させていくとともに、私家集以外の資料についての分析と考察を行うことができた。私家集以外の資料について、当初の計画では予備調査に留め翌年に分析を行う扱う予定であったが、予備調査の中で私家集との関係が深いと考えられる特徴を多く見出すことができたためである。また、その意義も併せて一定の考察を加え口頭発表を行ったので、順調と言えるものである。口頭発表のまとめをする期間には調査を実施しなかったため。当初の計画どおり、私家集以外の資料についての考察をさらに深めていく。具体的には、資料ごとに異なる作品の性質を書誌的特徴併せながら定家の書写活動の様子を明らかにし、多くの古典籍に広く適応させることのできるあたらしい定義をおこなうことをめざす。昨年実施しなかった調査を実施するとともに、研究のまとめを行うために使用する予定。私家集を中心とした研究はこれまでにも行ってきたものであり比較的資料も整備されていたが、あらたに私家集以外の資料へと範囲を拡大していくため、これまでのものとは別に作品ごとの基本図書等の整備が必要となるため。当初の計画通り進行する予定であり、伝本調査のための旅費、文献複写費、物品購入費のほか、データ入力作業の委託を予定している。ただし、上記理由のとおり物品購入費については当初の計画よりも増額することとなる。
ホソヘリカメムシのビリベルディン結合蛋白質レセプターの同定とホルモンによる調節

ホソヘリカメムシの体液と卵に存在するビリベルディン結合蛋白質(CP-1,CP-2,CP-3,CP-4)の発育・変態に伴う挙動変化についてリガンドとレセプターの両面から研究を行い以下の知見を得た。1.CP-1(α_6)とCP-4(β_6)を精製し、^<125>Iでラベルし、種々の発育段階の虫に注入する事により(1)5令末期にはCP-4がCP-1の7倍の速度で脂肪体に取り込まれる、(2)羽化直後の成虫では両者とも新生したクチクラに取り込まれる、(3)成虫期にはCP-1のみが卵巣に活発に取り込まれることを明かにした。以上から脂肪体と卵巣でのリガンド特異性の異なるCPレセプターの存在が示唆された。2.卵巣・脂肪体からの細胞膜画分の調製法が確立した。モジナイズで得た比較的大きめの膜断片をCa^<++>存在下で遠心により回収する方法が簡便で、結合実験にも用い易いことがわかった。3.リガンドブロット法については調製した膜画分をもちいて試みているが、バックグラウンドのバンドが多く、泳動の際に低温・非還元条件下で行ない、ゲルを8M尿素中で震とうし、ブロッティングはメタノール非存在下で短時間行なう等の改良により改善された結果が得られるようになった。3.リガンドのCPについてはα、βのcDNA、ゲノムDNAの全塩基配列とコードされるアミノ酸配列を決定した。両サブユニット間のアミノ酸レベルでの相同性は約70%であり、αは4カ所、βは3カ所のN-glycosilation siteをもち、うち3カ所は共通であった。また遺伝子DNAの配列解析により両遺伝子とも11のエクソンに分割されていることが明らかとなった。4.αとβの糖鎖についてビオチン化レクチンを用いて解析した。両者ともCon Aとは強く反応したが、MAMとSSAについてはCP-4が強く反応し、糖鎖末端でのシアル酸の存在が示唆された。それに起因するCP-4表面の陰電荷の存在がおそらくCP-4の卵巣レセプターへの結合阻害に関与していると思われる。現在までに以下の知見を得た。1.卵巣・脂肪体からの細胞膜画分の調製法がほぼ確立した。当初は超遠心を用いたミクロゾーム画分の調製なども検討したが、最終的にはホモジナイズで得た比較的大きめの膜断片をCa^<++>存在下で遠心により回収する方法を簡便で、結合実験にも用い易いことがわかった。2.リガンドブロット法については調製した膜画分をもちいて数回試みているが、バックグラウンドのバンドが多く、現在、膜タンパクを泳動する際に低温・非還元条件下で行ない、ゲルを8M尿素中で震とうし、SDSによる変性を回復させる、ブロッティングはメタノール非存在下で短時間行なう等の改良により改善された結果が得られるようになった。3.各発育ステージの虫から卵巣に入るべきCP-1を精製し、^<125>Iでラベルしてin vivoでの取り込みを調べたところ、非休眠雌成虫のCP-1のみが取り込まれた。

また、幼虫期の脂肪体mRNAを解析したところ、in vitro翻訳産物中としてはanti-CP-1とクロスするが、northern解析ではCP-1(A subunit)cDNA probeとはクロスしないmRNAが存在しており、同じCP-1でも生殖期のものとそれ以外の時期のものとは性質が一部異なっていることを示唆している。4.リ.ガンドであるCP-1とCP-4の糖鎖について各種ビオチン化レクチンを用いて解析した。両者ともCon Aとは強く反応したが、シアル酸特異的なMAMとSSAについてはCP-4が強く反応し、糖鎖末端でのシアル酸の存在が示唆された。それに起因するCP-4表面の陰電荷の存在がおそらくCP-4の卵巣レセプターへの結合阻害に関与していると思われる。5.卵巣からのRNA抽出法を確立した。卵巣はタンパクや多糖を多量に含み、従来の超遠心法やAGPC法ではなかなかきれいなRNAを得ることができなかったが、AGPC法でのアルコール沈澱のステップにアクリル系のキャリアを加え、室温で沈澱させることにより多糖の共沈をおさえ、翻訳活性のあるRNAが得られるようになった。ホソヘリカメムシの体液と卵に存在するビリベルディン結合蛋白質(CP-1,CP-2,CP-3,CP-4)の発育・変態に伴う挙動変化についてリガンドとレセプターの両面から研究を行い以下の知見を得た。1.CP-1(α_б)とCP-4(β_б)を精製し、^<125>Iでラベルし、種々の発育段階の虫に注入する事により(1)5令末期にはCP-4がCP-1の7倍の速度で脂肪体に取り込まれる、(2)羽化直後の成虫では両者とも新生したクチクラに取り込まれる、(3)成虫期にはCP-1のみが卵巣に活発に取り込まれることを明らかにした。以上から脂肪体と卵巣でのリガンド特異性の異なるCPレセプターの存在が示唆された。2.卵巣・脂肪体からの細胞膜画分の調製法が確立した。ホモジナイズで得た比較的大きめの膜断片をCa^<++>存在下で遠心により回収する方法が簡便で、結合実験にも用い易いことがわかった。3.リガンドブロット法については調製した膜画分をもちいて試みているが、バックグラウンドのバンドが多く、泳動の際に低温・非還元条件下で行ない、ゲルを8M尿素中で震とうし、ブロッティングはメタノール非存在下で短時間行なう等の改良により改善された結果が得られるようになった。3.リガンドのCPについてはα、βのcDNA、ゲノムDNAの全塩基配列とコードされるアミノ酸配列を決定した。両サブユニット間のアミノ酸レベルでの相同性は約70%であり、αは4カ所、βは3カ所のN-glycosilation siteをもち、うち3カ所は共通であった。また遺伝子DNAの配列解析により両遺伝子とも11のエクソンに分割されていることが明らかとなった。4.αとβの糖鎖についてビオチン化レクチンを用いて解析した。両者ともConAとは強く反応したが、MAMとSSAについてはCP-4が強く反応し、糖鎖末端でのシアル酸の存在が示唆された。