hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大規模EST情報からの遺伝子発現パターンを利用した有用遺伝子の探索手法の開発

研究代表者(矢野健太郎)および研究分担者(清水顕史、山根京子)による研究体制で研究を行った。昨年度に構築した解析手法に基づき、解析結果を視覚化する方法を研究代表者(矢野健太郎)および研究分担者(清水顕史、山根京子)が協力して開発した。ここでは、特に、コンピューター・マウスやキーボードの操作によって、コンピューター・モニター上で三次元プロット図の拡大、縮小、平行移動や回転を可能とした。本年度は、さらに、統計学の専門知識をもつ矢野および清水が独立して、対応分析を用いたEST情報からの遺伝子発現パターン解析手法の開発などを行った。この個別の作業により、両者の結果の一致性を検証し、開発手法の頑健性の向上を図ることができた。そして、例題データセットを用いた解析と手法の有用性の評価を行った。また、昨年度に収集した公開データベースからのヒトや植物のEST情報から、植物遺伝の専門知識をもつ山根が、cDNAの由来や遺伝子機能に関する詳細情報の収集と整理を実施した。それらのデータに対して、矢野がESTのアセンブル解析を行い、発現遺伝子の配列と生物学的機能を推定した。次いで、矢野、清水、山根により、開発した手法を上記の実データに対して適用し、開発手法を評価・修正することによって、大規模EST情報からの有用遺伝子の探索手法を確立した。さらに、簡便な操作で解析と視覚化を可能とするJava言語に基づくソフトウェア開発を行った。本研究は、研究代表者(矢野健太郎・東京大学)および研究分担者(清水顕史・滋賀県立大学、山根京子・大阪府立大学)による研究体制で実施しており、ESTのアセンブルより得られる遺伝子発現プロファイルを用いて、有用な遺伝子を探索するための統計解析手法とその視覚化法の開発を行っている。平成19年度には、有用遺伝子の探索に用いるEST情報の収集、EST情報に基づく有用遺伝子発見のための統計解析手法の構築、三次元ビューワーの開発などを進めた。解析に用いるESTとして、これまでに、トマトやカキの果実登熟過程などに関わるESTやヒトの疾患に関連するcDNAライブラリー由来のESTなどを収集している。また、統計学の専門知識をもつ矢野および清水が独立して解析手法の開発を進め、両者の手法と結果を比較検討することで、より頑健性の高い統計手法の構築を行った。そして、例題データセットを用いた解析から、構築した手法の有用性評価を行った。三次元ビューワーの構築では、コンピューター言語Java3Dを用い、マウスやキーボードの操作によって、モニター上で三次元プロット図の拡大、縮小、平行移動や回転を可能とする視覚化法の開発を進めており、現時点までに、各遺伝子の発現プロファイルを簡便に把握し得る視覚化法の構築に成功している。平成20年度には、統計解析手法と視覚化法の開発を継続して行う。統計解析手法の開発では、平成19年度に収集したEST情報を用いて、実データからの遺伝子発見を可能とする、より実用性の高い手法の確立を目指す。また、解析した結果に対して、有用遺伝子を容易に識別し得る検索システムを備えた三次元ビューワーの開発を行う。
リアルタイム解析法を用いたインスリンによる糖輸送促進機構の解析

インスリンによる糖輸送促進は細胞内の糖輸送担体GLUT4を細胞膜で働くように呼び出すトランスロケーション機構によるが、糖尿病患者ではインスリンからGLUT4へのシグナル伝達が障害され、細胞膜にGLUT4が十分動員されない。本研究ではこの分子機構を明らかにすることを目的としている。研究のひとつは、インスリン受容体から下流へのアプローチである。PI3kinaseの活性化が重要なことにはコンセンサスが得られているが、その下流については意見が分かれている。PKCの中から、PKCα(conventional PKC)、PKCδ(novel PKC)、PKCλとζ(atypical PKC)を取り上げ、その常時活性型、あるいはdominant negative型を作製し、3T3-L1脂肪細胞に導入発現させ、インスリンによる糖輸送促進効果を検討した。その結果、いずれのPKCアイソフォームでも、インスリンによる糖輸送促進効果には明確な影響はなく、少なくとも3T3-L1脂肪細胞におけるインスリンによる糖輸送促進機構では、いずれのPKC isoformも重要な役割を果たしてはいないと結論した。また、PI3kinaseの下流の分子として注目されているPDK1についても、そのdominant negative型の発現ではインスリンによる糖輸送促進効果を抑制できなかった。研究のもうひとつの成果は、GLUT4を含む細胞内小胞の細胞膜への移動・融合というトランスロケーション・ステップに焦点を当て、GLUT4小胞蛋白IRAP(insulin responsive aminopeptidase,別名gp165)のdi-leucineモチーフを含むN端部分と結合する蛋白として、acyl-coenzyme A dehydrogenaseを同定したことである。これが、"GLUT4 retension protein"であるかの解析をさらに進めた。また、GLUT4C端に蛍光シグナル(eGFP)を付与した分子を3T3-L1細胞内に発現させ、リアルタイムで追跡した。その結果、GLUT4の細胞内プールである核周囲部位から細胞膜まで直線的に同じ速度で動くのではなく、途中で一時的に静止して方向を変えることが観察された。これは、GLUT4がインスリンによる細胞膜への移動において、細胞骨格を「乗り換える」ことを示唆している。

研究のもうひとつの成果は、GLUT4を含む細胞内小胞の細胞膜への移動・融合というトランスロケーション・ステップに焦点を当て、GLUT4小胞蛋白IRAP(insulin responsive aminopeptidase,別名gp165)のdi-leucineモチーフを含むN端部分と結合する蛋白として、acyl-coenzyme A dehydrogenaseを同定したことである。これが、"GLUT4 retension protein"であるかの解析をさらに進めた。また、GLUT4C端に蛍光シグナル(eGFP)を付与した分子を3T3-L1細胞内に発現させ、リアルタイムで追跡した。その結果、GLUT4の細胞内プールである核周囲部位から細胞膜まで直線的に同じ速度で動くのではなく、途中で一時的に静止して方向を変えることが観察された。これは、GLUT4がインスリンによる細胞膜への移動において、細胞骨格を「乗り換える」ことを示唆している。
1分子イメージング法による神経成長円錐ガイダンス機構の解明

切断された神経軸索は神経成長因子(NGF)存在下で再生することが知られている。我々はこれまでに蛍光色素Cy3で標識したNGFを1分子イメージングする技術を使って、成長円錐におけるNGFの受容と成長円錐の運動反応の連関や、NGFと受容体の複合体形成に引き続く細胞内への取り込みの過程を、NGF1分子単位の精度で明らかにしてきた。そこで、本年度は神経軸索の再生過程とNGFの受容、取り込みの関係を調べる実験を開始した。ニワトリ7日胚から脊髄後根神経節を取り出し、ポリリジンコーティングしたカバーガラス上で2pMのNGFを加えて一晩培養した。神経節から多くの神経軸索が伸長する。カバーガラスで作製したガラスナイフでこの神経軸索を一気に数十本切断し、微分干渉顕微鏡で神経軸索の再生を観察した。神経軸索の再生には、NGFの添加が必須であることやRNA合成阻害剤の添加によって再生が阻害されることなどを確認した。次に微小ガラス針を使って神経軸索を一本ずつ切断し詳しく観察した。観察の結果、再生までの過程は切断後30分以内に神経軸索の切断部先端に小さな塊ができ、そこから成長円錐が再生した後に神経軸索の再生、伸長がおこっていることがわかった。神経軸索の再生には成長円錐の再生が不可欠で、成長円錐のNGFを取り込む機能が神経軸索の伸長に重要だと考えられる。このことから、再生に伴い、成長円錐のNGFを取り込む機能がどのように獲得されていくのかが今後の課題である。そこで今後の研究方針としては、蛍光標識したNGFを用いてこれらの再生過程のメカニズムを調べていく予定である。本研究の目的は、微量の神経成長因子やガイダンスキューの分布に応じて、成長円錐がその運動速度や、運動方向の制御をおこなう仕組みを明らかにすることである。この目的のために、ニワトリ胚背根節神経細胞の成長円錐を実験材料として、蛍光色素Cy3によって標識されたNGF(Cy3 NGF)が、成長円錐膜上の受容体と結合する様子を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養溶液からNGFを除くと、成長円錐の前進運動は停止し、活発な前進運動をおこなう成長円錐にみられるラッフル膜も消失した。ここに1nMのCy3 NGFを投与すると、投与から数分でラッフル膜が形成され、成長円錐の前進運動が再開された。運動を再開した成長円錐膜上には多数のCy3 NGFが結合しているが、その分子のふるまいには2種類あることが明らかとなった。ひとつは運動方向に偏りのない、2次元拡散運動で、もうひとつは成長円錐の進行方向と逆の方向に向かう、一方向性の運動である。Cy3 NGFの投与直後には、受容体に結合したCy3 NGFのほとんどが2次元拡散運動をおこなっているが、投与後10分では、それらの多くが一方向性の運動によって成長円錐基部に集積され、集合体を形成していることが観察された。Cy3 NGF分子ひとつひとつの軌跡を追跡した結果、受容体と結合したNGFは、初めに2次元拡散運動をおこなった後に、一方向性運動に移行して、成長円錐と神経軸索との結合部に集められ、ここで細胞内に取り込まれることが示唆された。また、NGFと結合した受容体の2次元拡散運動は、受容体のそれとしては非常に速いことが明らかとなった(拡散係数は上皮成長因子受容体の約10倍)。我々はこれまでに、10-10Mと極めて低濃度で、脊髄後根節神経細胞の発生分化や神経軸索の伸長を誘導する神経成長因子(Nerve Growth Factor、以下NGFと略)を蛍光色素Cy3で標識し、この分子が軸索先端に存在する成長円錐の運動性を活性化する際に、成長円錐内でどのような振る舞いをするのかを、1分子観察・解析してきた。

本年度は、成長円錐におけるNGFのクラスター形成と、エンドサイトーシスを介した細胞内取り込みのプロセスに着目して実験をおこなった。クラスター化した蛍光NGF分子は、成長円錐の中心部にのみ観察される。成長円錐周縁部のラメリポディア上で受容体と結合した蛍光NGF分子を追跡した結果、これらの蛍光NGF受容体複合体は1分子のまま成長円錐の中心部に集められ、そこで分子同土が会合してクラスターが形成されることが明らかとなった。アクチン重合阻害剤Latrunculin Bの投与によって蛍光NGF受容体複合体の輸送が停止することから、この輸送は主として、アクチン重合を原動力とするアクチン骨格系の定常的流動によって担われている可能性が示唆された。成長円錐の中心部に観察される蛍光NGFクラスターの多くは、微分干渉顕微鏡観察で認められる膜小胞と共局在していることから、クラスター形成時かそれ以前に、蛍光NGFのエンドサイトーシスが起こっていると考えられる。そのエンドサイトーシスがどの時点で起こるのかを明らかにするために、酸性環境下で蛍光を発する蛍光色素CypHer5をNGFに標識し、これを成長円錐に投与した。その結果、内部が酸性化したエンドソームに取り込まれているNGFは、成長円錐中心部のみに観察され、ラメリポディア中にはまったく観察されなかった。このことから、ラメリポディアに存在するNGFは、すくなくとも酸性エンドソーム内には取り込まれていないことが示唆された。我々は神経成長因子(NGF)に蛍光色素Cy3を標識し、この蛍光NGFを用いて、NGFが神経末端に存在する成長円錐膜上の受容体と結合し、取りこまれた後に逆行性軸索輸送によって細胞体に送られる過程を解析している。こ昨年までの研究で、NGFは、成長円錐膜上の受容体と結合し、初めラメリポディア膜上で2次元拡散運動をおこし、やがて、細胞内アクチンメッシュワークの動きによって成長円錐の周縁から中心部に向かって集められることが明らかになった。今年度は、受容体と結合したNGFがどのようなプロセスに沿って成長円錐細胞内に取りこまれるのかを、1分子観察を通して明らかにした。NGFと受容体trkAの結合親和性は、酸性環境下によって大きく低下することが知られている。成長円錐の培養液のpHを中性から酸性にすみやかに変化させると、すでにエンドサイトーシスによって細胞内にとりこまれたNGFと受容体の複合体は成長円錐に留まるが、細胞外に露出した受容体と結合するNGFは、成長円錐から解離する。実験の結果、酸性培養液への置換後、成長円錐のラメリポディアに分布していたほとんどのNGFが成長円錐から解離したのに対して、成長円錐の中心部に集積したNGFはほとんど解離しなかった。この結果は、ラメリポディアで観察されるNGFの大部分が、細胞外に露出した受容体と結合していることを示唆している。アクチンの流動にともなってラメリポディアを移動するNGFは、培養液の酸性化にともなって解離するもの(約24%)と、成長円錐に留まるもの(約76%)の2種類が観察されたが、より成長円錐中心部に近づいていたNGFほど、培養液の酸性化後も成長円錐に留まる傾向が多いことが明らかとなった。このことは、アクチン流動にともなうNGF・受容体複合体の輸送途中で、複合体のエンドサイトーシスがおこっている事を示唆している。
大脳皮質層形成機構の解析―移動神経細胞が辺縁帯直下で移動を停止するのは何故か？―

神経細胞の移動と大脳皮質層形成に必須の分子であるReelinの受容体(ApoER2とVldlr)について、それらの特異抗体を作製して、大脳皮質における局在についての詳細な解析を行った。ApoER2は大脳皮質の深層部の多極性細胞に、Vldlrは表層部の神経細胞の先導突起に局在する傾向がみられ、各々の受容体が特異的な機能を有している可能性が示唆された。Reelinの下流で働くPafah1b1を移動神経細胞で過剰発現すると、通常は辺縁帯の直下で停止するはずの神経細胞が、辺縁帯内に侵入することを発見した。Pafah1b1を過剰発現された神経細胞の一部は本来配置すべき層よりも表層に位置していた。本計画では大脳皮質の“inside-out様式"の層形成において重要な役割を担っている、神経細胞移動の最終段階のターミナルトランスロケーションと呼ばれる過程について研究を行っている。まず、ターミナルトランスロケーションと“inside-out様式"の層形成に必須の分子として知られているReelinの受容体(ApoER2とVldlr)について、それらの特異抗体を作製して、大脳皮質における局在についての詳細な解析を行った。ApoER2とVldlrはターミナルトランスロケーションを行っている神経細胞では辺縁帯内に侵入した先導突起に局在していた。また、大脳皮質を全体としては、ApoER2は大脳皮質の深層部に、Vldlrは表層部に多く局在する傾向がみられ、それぞれの受容体が特異的な機能を有している可能性が示唆された。Reelinのアダプタータンパク質であるDab1を分解するCul5を移動神経細胞でノックダウンすると、神経細胞の細胞体が辺縁帯に侵入する。また、Reelinシグナルの下流で働くとされるLis1を移動神経細胞で過剰発現しても、細胞体が辺縁帯に侵入する。そこで、Cul5のノックダウンやLis1の過剰発現を行った際の神経細胞の挙動、特に早生まれと遅生まれの神経細胞の位置関係に関する経時的解析を行った。その結果、Cul5をノックダウンした場合は、移動神経細胞は時間が経過しても辺縁帯の周辺に留まったままで、遅生まれの細胞に追い抜かれることなく、より表層に存在した。一方で、Lis1を強制発現した移動神経細胞は、しばらくの間辺縁帯周囲に留まっていたが、その後急に深層へと移動し、結果的にはほぼ正常な位置に局在した。従って、Dab1がCul5によって分解されることが、ターミナルトランスロケーションの終了と最終的な層配置に特に重要であると考えられた。大脳皮質の神経細胞は、早生まれの神経細胞ほど深層に、遅生まれの神経細胞ほど浅層に局在するという“inside-out様式"の6層構造を形成している。脳室帯で誕生し、脳表面に向かって移動してきた神経細胞は、必ず辺縁帯直下で移動を停止し、辺縁帯に侵入することは無い。これは神経細胞が辺縁帯に侵入してしまうと、遅生まれの細胞が入るスペースが無くなり、早生まれの細胞を追い抜くことが出来なくなるからではないかと予想される。言い替えれば、辺縁帯に入らないことで遅生まれの細胞がその間に潜り込んで追い抜くための隙間を作っているのではないかと考えられる。Lis1 (Pafah1b1)は滑脳症の原因遺伝子として知られているが、Lis1を過剰発現すると、通常は辺縁帯の直下で停止するはずの神経細胞が、辺縁帯内に侵入することを発見した。Lis1を過剰発現された神経細胞の動態について詳細な解析を行ったところ、辺縁帯に侵入した神経細動は、その後も辺縁帯大脳皮質表層部に位置し続け、最終的に本来配置すべき層よりも表層に位置することが分かった。実際に、1日遅く産まれた神経細胞と位置を比較してみても、それよりも同程度かやや表層に配置する細胞も認められた。以上の結果から、当初の予想通り、辺縁帯に細胞が侵入しないことで遅生まれの細胞がその間に潜り込んで追い抜くための隙間を作っている可能性が示唆された。Lis1を複数コピーもつ人は知的障害を呈することが知られており、Lis1が過剰になることで神経細胞の移動と層形成に異常を生じることが、生後の大脳皮質の機能に大きな影響を与えるものと考えられた。Lis1の過剰発現により神経細胞が辺縁帯の直下で移動を停止することなく、辺縁帯内に侵入し、その結果として本来の位置よりも表層に配置することを示すことができた。この結果は本研究の開始時に立てた仮説を強く支持するものである。

Lis1を過剰発現された神経細胞の動態について詳細な解析を行ったところ、辺縁帯に侵入した神経細動は、その後も辺縁帯大脳皮質表層部に位置し続け、最終的に本来配置すべき層よりも表層に位置することが分かった。実際に、1日遅く産まれた神経細胞と位置を比較してみても、それよりも同程度かやや表層に配置する細胞も認められた。また、Lis1の過剰発現により、本来分布すべき層よりも表層に分布することになった神経細胞は、本来分布すべき層の神経細胞に特有のマーカーではなく分布した層の神経細胞に特有のマーカーを発現するようになるものも認められた。Lis1を複数コピーもつ人は知的障害などの神経・精神系の異常を呈することが知られており、Lis1が過剰になることで神経細胞の移動と層形成に異常を生じることが、生後の大脳皮質の機能に大きな影響を与えるものと考えられた。神経細胞の移動と大脳皮質層形成に必須の分子であるReelinの受容体(ApoER2とVldlr)について、それらの特異抗体を作製して、大脳皮質における局在についての詳細な解析を行った。ApoER2は大脳皮質の深層部の多極性細胞に、Vldlrは表層部の神経細胞の先導突起に局在する傾向がみられ、各々の受容体が特異的な機能を有している可能性が示唆された。Reelinの下流で働くPafah1b1を移動神経細胞で過剰発現すると、通常は辺縁帯の直下で停止するはずの神経細胞が、辺縁帯内に侵入することを発見した。Pafah1b1を過剰発現された神経細胞の一部は本来配置すべき層よりも表層に位置していた。研究期間の途中で所属研究機関が変更となったため、新所属機関での実験計画の承認や、研究環境の整備に時間がかかってしまい、当初の研究計画よりもやや遅れている点は否めない。しかしながら、研究態勢の整備もほぼ終了し、現所属機関でも前所属機関と変わりなく実験を行うことができる状態になったので、今後の研究の進展には何も問題はない。従って、当初の予定通りに研究計画を成し遂げることは十分に可能であると思われる。最近になって「大脳皮質の神経細胞の最終運命は誕生したときに決まっているのではなく、神経細胞を人為的に本来と異なる場所に配置させると、最終運命が変化し、本来の形や性質が異なる別の種類の神経細胞に変化する」という報告がなされたため、Lis1の過剰発現によって本来の層よりも表層に配置するようになった細胞についても、最終運命が変化しているかどうかについて検索を行いたいと考えている。この実験結果を含めて、すべての研究成果をとりまとめ、できるだけ早期に論文として公表する。神経科学移動神経細胞はターミナルトランスロケーションの際に先導突起は辺縁帯に進入し、そこにある基質と結合するが、細胞体は辺縁帯に進入することなく、その直下で移動を停止する。従って、細胞の先導突起と細胞体では細胞表面タンパク質などの分布に関して、明確な分画化がなされていると考えられる。前年度の研究結果から、Reelin受容体のApoER2とVldlrは辺縁帯内にある移動神経細胞の先導突起に局在し、細胞体には分布しないことなど、実際にReelin受容体を含むいくつかの分子が先導突起に限局して局在することが明らかとなっている。本年度はこの細胞内の分画化のメカニズムを重点的に検索する。具体的には、Cul5のノックダウンやLis1の過剰発現によって移動神経細胞が辺縁帯に侵入するようになった際のReelin受容体等の細胞内局在に関する検索を行う。また、Cdc42、Par3/6、aPKCなどの極性形成因子の関与についても検討したいと考えている。
走査電顕マイクロダイセクション法の確立と生物応用

本研究では、ステレオ走査電子顕微鏡(走査電顕)内で自由に遠隔操作できる高性能のマニピュレータを用いて、細胞や組織の立体微細構造をより詳細にできるためのマイクロダイセクション法を開発しその応用を試みた。その結果、マイクロダイセクションに適した組織の試料作製法を考案し、多様な組織の顕微解剖の可能性を示した。また、針のほかに、マイクロ剪刃やマイクロ鉗子を搭載した2台のマニピュレータを利用することで、より多様なダイセクションが可能になった。真空内で遠隔操作できる高性能のマニピュレータを用いて、走査電顕内で組織を自由に顕微解剖できる新規な「走査電顕マイクロダイセクション法」を確立し、細胞や組織の立体微細構造をより詳細にできるようにする目的で、平成25年度は以下の実験を行った。1)改良したマニピュレータの動作確認マニピュレータを、より人間の手の動作に近い動きにするために、これまでのxyzの3軸に加え、試料回転、ヨーイングを可能にし、マイクロ鉗子やマイクロハサミが利用できるものを研究協力者に作成してもらい、その動作確認を行った。これにより、眼科剪刃や癌か鉗子をマニピュレータにより走査電顕内で利用できるようになった。2)3D走査電顕による改良マニピュレータの利用上記のマニピュレータを用いて、ラット内耳のマイクロダイセクションを行った。固い骨壁はマイクロ鉗子で解剖・除去することが可能になった。またマイクロ剪刃を用いて、軟部組織(前庭膜やらせん靭帯など)を切り取ることが可能になった。マイクロダイセクションを行う過程で、試料の回転や、ヨーイングの動作はきわめて有用であった。また、これにより、骨の中に隠れていたコルチ器の有毛細胞の立体配列を明瞭に剖出することができた。以上、昨年度の成果と今年度の成果により、3D走査電顕内で、生物試料(組織標本)をかなり、自由に遠隔操作によりマイクロダイセクションを行うことが可能になった。このシステムは、多様な組織の立体微細構造解析に利用できることから、今後の普及が期待される。走査電子顕微鏡(走査電顕)内で操作できる高性能のマニピュレータを用いて、走査電顕内で組織を自由に顕微解剖できる新規な「走査電顕マイクロダイセクション法」を確立し、細胞や組織の立体微細構造をより詳細にできるようにする目的で以下の実験を行った。1)3D走査電顕内でのマイクロダイセクションのための試料条件の確立マイクロダイセクションをしやすい組織の試料作製法を検討した結果、一般的な電子顕微鏡の固定方法(たとえばグルタールアルデヒド固定)を用いて固定した標本にKOH処理法(Ushiki and Murakumo, 1991)を施すことでコラーゲン成分が除去され、マイクロダイセクションに適した軟らかさを持つ標本を作ることができた。またそれにタンニン・オスミウム法による導電染色を施してから臨界点乾燥を行うことで、走査電顕内でのマイクロダイセクション時の帯電を防ぐことができることを明らかにした。一方で、マイクロダイセクション時には試料がぐらつく点が問題であったが、これについては2台のマニピュレータを用いて操作することである程度の成果が得られた。なお、マイクロダイセクション用の道具として用いたナノピンセットは、グリップ力が弱いことから、今後の検討が必要である。2)3D走査電顕による成体組織のマイクロダイセクションの検討上記の標本作製法の確立において、腎臓と水晶体を用いて実際にマイクロダイセクションを行った。1)走査電子顕微鏡(走査電顕)内でマイクロダイセクションを行う際の問題点と克服すべき点を整理することができた。また、それに基づいて、基礎となる標本作製法については、確立することができたように思う。その点では、研究の目的のうちで、「1)3D走査電顕内でのマイクロダイセクションのための試料条件の確立」については80%程度の達成度ということができる。2)また、「2)3D走査電顕による成体組織のマイクロダイセクションの検討」においては腎臓と水晶体の解剖を行過程で、実際のマイクロダイセクションを行う際の、装置側の問題点や道具(針やナノピンセットなど)の制約などがより明瞭になってきたため、こちらの達成度は50%程度である。実際のマイクロダイセクションを行う際の、装置側の問題点や道具(針やナノピンセットなど)の制約などがより明瞭になってきたため、より現実的なマイクロダイセクションを行うための試行錯誤が必要と予想される。また、研究の遂行の途中で、現在使用している3D走査電顕の仕様が変更となったため、マニピュレータの適正化が必要となり、現在その作業も行っているが、これに際して、装置そのものの若干の改良も行いたいと考えている。一方で、成体組織よりは胎児や新生児の組織のほうが、マイクロダイセクションに適しているとも考えられることから、マウスないしラットを用いてこのような組織への応用を考えて行く予定である。実際のマイクロダイセクションを行うために、実験動物(おもにラット)の購入が必要である。

また、標本作製のための各種試薬を購入する必要がある。一方で、ダイセクション用の針などの器具も必要である。以上の消耗品のほか、研究の情報収集と発表のために旅費が必要である。また、成果発表のための費用も派生する予定である。
ES細胞より造血幹細胞をex vivoで誘導する試み

生体外でES細胞から各種血球細胞を誘導することは可能であるが、造血幹細胞を誘導することはできなかった。しかし、体節の特性を指示するホメオティックセレクター遺伝子であるHoxb4を高発現すると生体外でもES細胞から造血幹細胞を誘導することができる。したがって、Hoxb4は造血幹細胞の発生を指示するセレクター遺伝子である可能性が考えられる。しかし、Hoxb4が造血幹細胞の発生を指示する分子基盤については今のところ全く解っていない。本研究では、造血幹細胞の増幅制御に必須の役割を果たしていることを独自に明らかにしてきたポリコーム遺伝子群(PcG)とHoxb4がともにDNA複製ライセンス化因子Cdt1の阻害因子Gemininと結合することを見つけるとともに、さらにPcGがその構成因子の一つであるScmh1を介してGemininをユビキチン化することによってタンパク質の安定性を制御していることを明らかにした。したがって、DNA複製ライセンス化制御が幹細胞の活性及び発生に重要な役割を果たしていることが解る。そこで、Cdt1を幹細胞に高発現し、DNA複製ライセンス化を誘導することによって造血幹細胞の増幅及びES細胞から造血幹細胞を誘導することを企画したが、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入系では充分な誘導効果が得られなかった。Cdt1はタンパク質のレベルにおいても制御されていることが知られているが、Cdt1の発現量が過剰であるため、再複製を誘導し、チェックポント機構が働いたものと推測された。本研究では造血幹細胞の誘導には至らなかったが、その成果は幹細胞性を指示する分子基盤解明に重要な情報を提供することが期待される。
ヒト膵癌細胞の浸潤・転移に関与する新しい遺伝子の解析

2)AG09B1遺伝子:この遺伝子はTONDU遺伝子(Vaudin, P. et al. Development126:4807-4816,1999)とほぼ同一であることが判明した。彼らはこの遺伝子がショウジョウバエの羽根の形成に重要であることを報告したが、ヒトにおける役割はまったく不明であった。そこで、ヒト癌組織においてその発現をPCRによって検討した結果、乳癌48%(13例/27例)、膵癌50%(1例/2例)および食道癌50%(1例/2例)で発現を確認したが、胃癌(4例)、大腸癌(8例)および肺癌(2例)ではその発現を見なかった。3)癌の浸潤・転移を研究するための培養細胞株の樹立:新しい膵癌培養細胞株(SUIT-4)の樹立とその性格の検討が終了した。また、SUIT-2よりin vivoクローニングにより100%転移する細胞株の樹立も終了した。これらの高転移株ではmatrix metalloproteinase(MMP)活性が極めて高く、また多くの種類のMMPを発現していることを確認し、論文発表した。さらに低転移株や他の細胞株のMMP遺伝子発現やその活性についても検討し、国際学会で発表した。SUIT-2由来のsublineでのP-selectin発現をnorthern blot analysisで検討するとSUIT-2,S2-007,S2-013で強く発現し、S2-028で発現していることがわかったが、高感度のpolymerase chain reaction(PCR)で検討すると、すべての他のsublineおいてもわずかながら発現が確認された。ところで、P-selectin発現はthrombin刺激で誘導されることがわかっていた。しかしthrombin刺激からP-selectin発現までの経路は不明であった。今回、SUIT-2およびsublineではthrombin receptorであるFactor II receptor(proteinase activated receptor 1(PAR1))を有することを確認した。すなわちthrombin刺激からP-selectin発現までの経路のstartが確認された。現在この経路の解明中である。現在ようやくAG09B1遺伝子から推定される蛋白の一次構造から推定したペプチドに対する抗体ができつつあるところである。その後この遺伝子はTONDU遺伝子(Vaudin,P.et al.Development126:4807-4816,1999)とほぼ同一であることが判明した、彼らはこの遺伝子がショウジョウバエの羽根の形成に重要であることを報告したが、ヒトにおける役割はまったく不明である。一方、ヒト癌組織においてその発現PCRによってみると、乳癌、膵癌および食道癌で発現が確認されたが、胃癌、大腸癌および肺癌ではその発現を見なかった。(C)その他、新しい膵癌培養細胞株(SUIT-4)の樹立に成功し、その性格の検討がほぼ終了した。また、SUIT-2よりin vivoクローニングにより100%転移する細胞株の樹立もほぼ終了した。(A)P-selectin遺伝子関連平成12年度までの研究で、SIUT-2由来のすべてのsublineは程度の差があるもののP-selectinを発現していることを確認した。同時にthrombin刺激からP-selectin発現までの経路のstartと考えられるthrombin receptorであるFactor II receptor (proteinase activated receptor 1 (PAR1))を有することを確認した。今年度は、PAR1はSUIT-2以外に検討した他の7つの膵癌細胞株すべてで発現していることも確認した。一方、PAR2遺伝子の発現もPAR1と同様であったが、PAR3遺伝子の発現はさまざまであった。PAR4の発現は検討した膵癌細胞株では検出できなかった。また、PAR1のfull length cDNAをcDNAライブラリーからスクリーニングすることが出来た。これを使いthrombin刺激からP-selectin発現までの経路を明らかにしているところである。電子顕微鏡を使用した免疫組織化学的検討でP-selectinの細胞内局在はmultivesicular bodyであるということを明らかに出来た。(B)AG09B1遺伝子現在ようやくAG09B1遺伝子から推定される蛋白の一次構造から推定したペプチドに対する抗体作製はいまだ完成を見るにいたっていない。(c)転移能を有する膵癌培養細胞株の樹立新しい膵癌培養細胞株(SUIT-4)の樹立とその性格の検討が終了した。

また、SUIT-2よりin vivoクローニングにより100%転移する細胞株の樹立も終了した。これらの高転移株ではmatrixmetalloprotcinase (MMP)活性が極めて高く、また多くの種類のMMPを発現していることを確認し、論文発表した。
固体希ガスを用いたレーザープラズマによるX線レーザーの研究

固体希ガスターゲットを用いたレーザープラズマによるテーブルトップ型の小型連続繰り返し軟X線(VUV)レーザーの可能性を探っている。電子再結合励起X線レーザーにおいては、そのプラズマを急激に冷却して強い再結合状態にして反転分布を作る必要があり、そのためにプラズマを空間的・時間的に制御して冷却する方法を研究している。今年度は前年度に引き続き、冷却板によるプラズマの空間的制御(閉じ込め効果)で、強制冷却を起こして固体希ガスのレーザープラズマの発光効率を上げられないかを試した。当初想定していたレーザー透過窓型の冷却板はレーザーダメージが避けられないため断念して、レーザー透過穴を設けた銅製の冷却板を試した。固体アルゴン層を形成して、従来通り市販のQスイッチナノ秒レーザーパルスを垂直照射したところ、50nm帯の軟X線発光の増加がみられた。今年度はさらに、レーザー短パルス列を用いたプラズマの時間的制御による強制冷却も試みた。レーザーQスイッチのマルクスバンクをショートパルスモードに変更してパルス幅4nmの短パルス列(34ピーク)を生成した。それを用いて固体アルゴン層を照射した結果、やはり50nm帯の軟X線強度が増加し、それはレーザーピーク強度に比例する事を確認した。以上、今年度は空間的・時間的にプラズマを制御する事により強制冷却が起こっている可能性を示す結果が得られた。そしてそれは、固体アルゴンターゲットにおける50nm帯軟X線発光で有効であるという知見を得た。当初の計画通りプラズマの空間的・時間的制御方法を実施して、固体アルゴンターゲットの50nm帯軟X線の発光増加が得られた。計画通りに研究は進んでいる。これまで概ね計画通りに進んでいるので、今後も当初の計画に沿って進めていく。今年度の研究成果より、固体アルゴンターゲットの50nm帯軟X線発光をレーザー候補として注目して、より詳細にその特性を調べていく。即ち、空間制御法において制御パラメータ(冷却板材料や位置等)を変えて、さらに軟X線増加の詳細を調べる。時間制御法では、より短パルス(或いは高速立ち下がり)で高ピークパワーなレーザーを準備していく。計画時に想定していた(1)レーザーパルス整形による急峻な立ち下がりナノ秒パルスに関しては新アイディアである誘導ブリリアン散乱法やプラズマシャッタ法を試す。また想定していた(2)ピコ秒パルス列に関しても検討し、(1)と(2)の両者を総合的に判断して最も有効と思われるレーザーパルスを準備していく。それを用いたレーザービームを線集光してX線増強度を調べ、プラズマ冷却法によるX線レーザー実現の可能性探査を進めていく。我々が開発して来た固体希ガスターゲットによるレーザープラズマX線源を発展させたテーブルトップ型の連続繰り返し軟X線(VUV)レーザーの実現を目指して、その可能性を探る。電子再結合励起X線レーザーにおいては、そのプラズマを急激に冷却して強い再結合状態にして反転分布を作る必要があり、そのためにプラズマを空間的・時間的に制御して冷却しなければならない。初年度は冷却板によるプラズマの空間的制御(閉じ込め効果)で、強制冷却を起こして固体希ガスのレーザープラズマの発光効率を上げてX線増幅が出来ないか試した。現在用いているレーザープラズマX線源では、極低温化された銅基板表面上にガスを吹き付けてこれを冷凍固体化し上下動させて繰り返しレーザーパルスの集光点に対し常にフレッシュな固体層を供給して連続プラズマ発生を行なっている。自由膨張しているプラズマを閉じ込めるため、固体層の対面に冷却板を取り付ける改造を行った。冷却板はレーザー光に対しては透明窓であり、膨張プラズマにとっては空間制限して強制冷却を行うため石英ガラスを選んだ。ターゲット固体層の接線方向に発生X線ピンホールカメラを設置して、吹き出し方向のプラズマ空間膨張サイズを測定したところ0.8mm(FWHM)であった。これより冷却板と固体層の間隔を1mmに設定した。30Kの極低温のターゲット層表面からわずか1mmの間隔で石英ガラス板を設置したので、これからの輻射熱でターゲット生成に影響が出ることが懸念されたが、従来通りのターゲット連続供給に成功した。ここで従来通り市販のQスイッチナノ秒レーザーパルスを垂直照射したところ、石英ガラス冷却板がレーザーダメージを受けた。その後、レーザー高耐力の冷却板材料(MgF2等)、レーザー強度の最適化を検討したが、ダメージ問題は解決出来ずプラズマ冷却の検証は出来なかった。計画通りプラズマサイズ測定や装置改造は行えたが、レーザー照射による冷却板ダメージの問題が発生して、想定していた形態でのプラズマ空間閉じ込め効果に関するデータ取得が出来なかった。

それを用いて固体アルゴン層を照射した結果、やはり50nm帯の軟X線強度が増加し、それはレーザーピーク強度に比例する事を確認した。以上、今年度は空間的・時間的にプラズマを制御する事により強制冷却が起こっている可能性を示す結果が得られた。そしてそれは、固体アルゴンターゲットにおける50nm帯軟X線発光で有効であるという知見を得た。当初の計画通りプラズマの空間的・時間的制御方法を実施して、固体アルゴンターゲットの50nm帯軟X線の発光増加が得られた。計画通りに研究は進んでいる。初年度の研究より、当初想定していた実用的なレーザー垂直入射方式ではレーザープラズマの空間制御をするのが困難だということが判った。空間制御方式については今後も検討を続けていくが、次年度以降は予定通りプラズマを時間的に制御する方法の研究を行って行く。計画時は(1)レーザーパルス整形による急峻な立ち下がりナノ秒パルスによる時間制御、(2)ピコ秒パルス列による時間制御、の2通りを順番に行う予定であったが、両方を同時的に進め全体計画の前倒し化を図る。即ちは、次年度は必要なレーザーパルス制御方法に重点を置き、時間制御によるプラズマ冷却でX線レーザー実現の可能性を探って行く。これまで概ね計画通りに進んでいるので、今後も当初の計画に沿って進めていく。今年度の研究成果より、固体アルゴンターゲットの50nm帯軟X線発光をレーザー候補として注目して、より詳細にその特性を調べていく。即ち、空間制御法において制御パラメータ(冷却板材料や位置等)を変えて、さらに軟X線増加の詳細を調べる。時間制御法では、より短パルス(或いは高速立ち下がり)で高ピークパワーなレーザーを準備していく。計画時に想定していた(1)レーザーパルス整形による急峻な立ち下がりナノ秒パルスに関しては新アイディアである誘導ブリリアン散乱法やプラズマシャッタ法を試す。また想定していた(2)ピコ秒パルス列に関しても検討し、(1)と(2)の両者を総合的に判断して最も有効と思われるレーザーパルスを準備していく。それを用いたレーザービームを線集光してX線増強度を調べ、プラズマ冷却法によるX線レーザー実現の可能性探査を進めていく。計画では高速EO素子を購入して、Qスイッチナノ秒レーザーパルスを切って高速立ち下がりパルス波形を実現しようと考えていた。しかし、レーザーとこの外部EO素子との時間的ジッターによるタイミングズレが問題になる事が判明して、購入を保留にしたため未使用金が発生した。この金額はそのまま、次年度予定している短パルス・高ピークレーザーの開発にかかる素子の購入費用に充てる。
アーキアの持つプレカルビン回路の発見とその機能解析

アーキアが持つカルビン回路鍵酵素、ホスホリブロキナーゼ(PRK)の酵素特性を調べるために、リン酸供与体への基質特異性を調べた。これまで報告されている酸素発生型光合成PRKは、リン酸供与体としてATP以外のヌクレオチド三リン酸への特異性が著しく低く、活性も低い。そこで、アーキアPRKがATP以外のヌクレオチド三リン酸(CTP, UTP, GTP)をリン酸供与体として利用できるかを調べた。その結果、興味深いことに、アーキアPRKはATP以外のヌクレオチド三リン酸もリン酸供与体として利用できることを明らかにした。これは、これまで報告されているPRKでは見られなかった現象であり、アーキア型PRKの特徴のひとつだと考えられる。また、プレカルビン回路の証明のために、メタボローム解析を行い、代謝産物の同定を行っている。現在までに主要な代謝産物が検出されており、今後は13CO2を取り込ませたトレース解析により、プレカルビン回路の証明を行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の申請時までに、非光合成生物であるアーキアMethanospirillum hungateiが有するPRKホモログが、PRK活性を示すことを明らかにしていた。今年度は反応産物の同定を行った。M. hungatei PRKのRu5PとATPからの反応生成物が、光合成PRKと同様にRuBPであるか検証するために、反応生成物の質量分析を行った。その結果、MS解析によってRuBPに相当するピークが観察された。酵素を添加していないネガティブコントロールでは、このピークは見られず、M. hungatei PRKの反応由来であると判断した。また、このピークを更にMS/MS解析したところ、フラグメンテーションパターンがコントロールRuBPと一致した。これらの結果からM. hungatei PRKのRu5PとATPからの反応産物はRuBPであり、アーキア型PRKは、真のPRKであることが証明された。アーキアにおけるPRKの普及性の解析アーキアが持つカルビン回路鍵酵素、ホスホリブロキナーゼ(PRK)の酵素特性を調べるために、リン酸供与体への基質特異性を調べた。今年度、本課題研究をまとめるために必要な実験データを数多く取ることに成功した。質量解析による反応産物の同定は、アーキア型PRKの存在を確固たるものにした。また、M. hungateiを含む計5種のアーキアが有するアーキア型PRKが活性を有し、これまで光合成生物のみが有すると考えられていたPRKに、非光合成生物であるアーキア型PRKという新しいグループを生み出すに至った。本研究では非光合成生物であるアーキアにおいて、光合成カルビン回路の鍵酵素が働く、新規炭素代謝経路を予想し、その証明を目指してきた。これまでin vitroの実験系で予想回路のF6PからPGAまで反応が進むことを明らかにしてきた。現在、アーキアの菌体粗酵素溶液を用いることで、in vivoに相当する解析を行っている。この実験結果を含め、年内に論文投稿を予定している。
不純物準位による電子構造改質を用いた電子物性制御手法の確立と高性能熱電材料の創製

本研究では,高性能熱電材料を開発するための革新的技術として,元素置換により創製される不純物準位を用いた電子物性の最適化方法を確立する.これにより,申請者が提案し,かつ,その有効性を実験的に検証してきた熱電材料設計指針を高度化する.さらに,非調和格子振動により1Wm-1K-1以下の著しく小さな格子熱伝導度を示す材料群に対して,高度化した熱電材料設計指針を適用することで,多結晶状態でZT > 4.0を示す新しい熱電材料を創製することを目指す.上記の研究を推進する上で,対象材料としてSi-Ge系ナノ結晶バルク材料と,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料を選択した.前者は,ナノ構造により1Wm-1K-1程度の熱伝導度を示す.さらに,熱電材料として比較的広いエネルギーギャップを有することから,電子構造の予測と変調を比較的容易に行うことができる.後者については,非調和格子振動の影響で,0.5Wm-1K-1の格子熱伝導度を示し,かつ.半導体的に電子構造を有している.前者に対して.第一原理計算(バンド計算とクラスター計算)を駆使することで,n型材料ではFeを,p型材料ではNiあるいはAuを導入することが望ましいことを見出した.それぞれに対して適切な不純物元素濃度を電子構造計算から特定した後に,その量のFeあるいはAuを含む材料を作製した.その結果,n型材料でZT = 1.88を,p型材料でZT = 1.63を得るに至った.次に,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料であるが,カルコゲンサイトの組成を調整することで,100°C以下の低温で,容易にZT = 0.5を得ることに成功した.元素置換による電子構造の制御と,キャリア濃度の最適化により,さらなる高性能化が見込まれる.研究実績の概要に示した通り,本研究を提案した最に想定していた方法で,着実に高性能熱電材料を開発できている.また,本研究の目標とする性能を示すバルク材料を既に開発しており,現在,論文としてまとめている.これらの結果から,不純物準位による電子構造改質を用いた電子物性制御手法が極めて有効な熱電材料開発手法であることを示したとともに,実用化に著しく近い材料を創製できたと考えている.「不純物準位による電子構造改質を用いた電子物性制御手法」が極めて有効な熱電材料開発手法であることを示す為には,より多くの材料系で高性能熱電材料を創製することが望ましい.現状では,Si-Ge系材料,Mn-Si系材料,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料で研究を進め,それぞれにおいて,良い成果を得ることができている.本手法を広く普及させる為には,開発事例を増やす必要があることから,上述した系意外で高性能熱電材料の創製を目指す.実用化の観点から,特に,より安価で,より環境に優しい系で,実用化に耐える熱電材料を創製することを目標とする.さらに,より需要の多い,100°C以下の廃熱を利用できる高性能材料の創製を目指す.上記の目的を達成する為に,現在,フォノン分散,フォノン散乱の解析を進めている.3フォノンプロセスにおける有無クラップ散乱の確率を上げる材料設計指針を構築し,それも利用することを検討している.特に,フォノンによる熱伝導の波長依存性および自由行程依存性を解析することが重要である.超格子薄膜などの作製と時間領域サーモリフレクタンス報を利用した熱伝導度の測定や,第一原理計算と3フォノンプロセス計算の併用などにより,上記の解析が可能になる.これらを駆使することで,既存材料の性能を凌駕する材料の創製を行う計画である.本研究では,高性能熱電材料を開発するための革新的技術として,元素置換により創製される不純物準位を用いた電子物性の最適化方法を確立する.これにより,申請者が提案し,かつ,その有効性を実験的に検証してきた熱電材料設計指針を高度化する.さらに,非調和格子振動により1Wm-1K-1以下の著しく小さな格子熱伝導度を示す材料群に対して,高度化した熱電材料設計指針を適用することで,多結晶状態でZT > 4.0を示す新しい熱電材料を創製することを目指す.上記の研究を推進する上で,対象材料としてSi-Ge系ナノ結晶バルク材料と,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料を選択した.前者は,ナノ構造により1Wm-1K-1程度の熱伝導度を示す.さらに,熱電材料として比較的広いエネルギーギャップを有することから,電子構造の予測と変調を比較的容易に行うことができる.後者については,非調和格子振動の影響で,0.5Wm-1K-1の格子熱伝導度を示し,かつ.半導体的に電子構造を有している.前者に対して.第一原理計算(バンド計算とクラスター計算)を駆使することで,n型材料ではFeを,p型材料ではNiあるいはAuを導入することが望ましいことを見出した.それぞれに対して適切な不純物元素濃度を電子構造計算から特定した後に,その量のFeあるいはAuを含む材料を作製した.その結果,n型材料でZT = 1.88を,p型材料でZT = 1.63を得るに至った.

次に,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料であるが,カルコゲンサイトの組成を調整することで,100°C以下の低温で,容易にZT = 0.5を得ることに成功した.元素置換による電子構造の制御と,キャリア濃度の最適化により,さらなる高性能化が見込まれる.研究実績の概要に示した通り,本研究を提案した最に想定していた方法で,着実に高性能熱電材料を開発できている.また,本研究の目標とする性能を示すバルク材料を既に開発しており,現在,論文としてまとめている.これらの結果から,不純物準位による電子構造改質を用いた電子物性制御手法が極めて有効な熱電材料開発手法であることを示したとともに,実用化に著しく近い材料を創製できたと考えている.「不純物準位による電子構造改質を用いた電子物性制御手法」が極めて有効な熱電材料開発手法であることを示す為には,より多くの材料系で高性能熱電材料を創製することが望ましい.現状では,Si-Ge系材料,Mn-Si系材料,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)系材料で研究を進め,それぞれにおいて,良い成果を得ることができている.本手法を広く普及させる為には,開発事例を増やす必要があることから,上述した系意外で高性能熱電材料の創製を目指す.実用化の観点から,特に,より安価で,より環境に優しい系で,実用化に耐える熱電材料を創製することを目標とする.さらに,より需要の多い,100°C以下の廃熱を利用できる高性能材料の創製を目指す.上記の目的を達成する為に,現在,フォノン分散,フォノン散乱の解析を進めている.3フォノンプロセスにおける有無クラップ散乱の確率を上げる材料設計指針を構築し,それも利用することを検討している.特に,フォノンによる熱伝導の波長依存性および自由行程依存性を解析することが重要である.超格子薄膜などの作製と時間領域サーモリフレクタンス報を利用した熱伝導度の測定や,第一原理計算と3フォノンプロセス計算の併用などにより,上記の解析が可能になる.これらを駆使することで,既存材料の性能を凌駕する材料の創製を行う計画である.
口腔微生物由来TLRリガンドによる糖尿病性正常圧水頭症の発症機構

この研究で、糖尿病マウスの脳室におけるP-cadherinとpodoplaninの発現が減少すること、P-cadherinとpodoplaninの抗体を定期的に腹腔投与した糖尿病マウスがhumane endpointに達することを見出しました。P-cadherinとpodoplaninはN-cadherinなどと協調して細胞接着と細胞骨格形成に寄与する分子です。糖尿病では脳のP-cadherinやpodoplaninが減少することで細胞同士の接着機能が低下し、脳脊髄液脳関門のバリア形成機能が低下することによって、水頭症などの原因となる可能性が考えられました。歯周病原細菌由来のTLRリガンドが脈絡叢のpodoplaninとコラーゲンの過剰発現を誘導することで脈絡叢硬化が起こり、脳室透過障害による水頭症が発症する可能性を検討するために、糖尿病マウスを作成し、脈絡叢の毛細血管内皮細胞におけるTLRの発現を光学顕微鏡にて確認した。また、歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis由来LPS(クルードではTLR2とTLR4のリガンド)を定期的に投与した糖尿病モデルマウスでは、脳室脈絡叢にTLR発現が見られ、podoplaninとコラーゲンの発現が増大することを確認した。本年度は、糖尿病環境下の脈絡叢上皮および毛細血管内皮細胞はCML誘導性にTLR2・4を発現することで、Porphyromonas gingivalisリポ多糖など歯周病原菌由来TLRリガンドが脈絡叢細胞にTLRを介して認識され、podoplanin過剰発現、ならびにTGF産生が起こり、脈絡叢線維芽細胞のコラーゲン産生が誘導される可能性を検索した。Streptozotocin投与による膵ランゲルハンス島破壊型1型糖尿病マウスを作製し、TLR4リガンドのグラム陰性菌リポ多糖(Porphyromonas gingivalis)を投与、投与群の寿命を生存曲線によって検定し、マウス脳室の組織像、および白血球と炎症性サイトカイン、脈絡叢上皮で物質透過制御に関わるpodoplaninについて、これらの過剰発現を免疫染色で検索した。この結果、糖尿病マウス脈絡叢ではTLR2・4の発現、podoplanin過剰発現、ならびにコラーゲン過剰産生が誘導される可能性が見出され、現在、追試を重ねている。これらの培養細胞を応用したin vitro検索で証明するため、市販の培養脈絡叢血管内皮細胞と上皮細胞(Primary Cell)に対して、CML(Toronto Research Chemicals)によるTLR2と4の発現、炎症性サイトカインとpodoplaninの過剰発現を免疫染色で確認し、現在、追試を重ねている。申請書に記載した研究計画はほぼ順調に遂行されている。免疫染色を主とした組織検索がデータ的には大きなウェイトを占めるため、共焦点レーザー顕微鏡を駆使した組織検索に基づいたデータ収集を行っている。また、予定としていた最も大きな懸念材料は頭頚部podoplaninコンディショナルKOマウス(研究代表者はpodoplaninが脈絡叢上皮で物質透過制御に関わる可能性を報告している。全身のpodoplanin KOマウスは胚性致死である)の完成であるが、現在、ラインを完成し、その糖尿病マウスを作製する段階に入ったことから、概ね順調であると自己評価した。しかし、CMLを投与した糖尿病マウス脳室と脈絡叢の形態解析、また脳脊髄液から調整したタンパク溶解液、およびリンパ球・貪食細胞浮遊液の生化学・FACS解析は未だできておらず。平成28年度は、糖尿病マウスにTLRリガンドとTLR4アンタゴニストEritoran(Eisai Inc. USA)を同時投与し脳室病変と生存率を検討する。本研究はエーザイUSAの支援でEritoranを無償供給される(83142-1:2013-0162: E5564)。また現在、完成している頭頚部podoplaninコンディショナルKOマウス(通常のpodoplanin KOマウスは胚性致死)について、Streptozotocin(STZ)投与による膵ランゲルハンス島破壊型1型糖尿病マウスを作製し、TLR4リガンドのグラム陰性菌リポ多糖(Porphyromonas gingivalis)を投与、投与群の寿命を生存曲線によって検定し、マウス脳室の組織像、および白血球と炎症性サイトカイン、脈絡叢上皮で物質透過制御に関わるpodoplaninの産生、脳室拡大と生存率を検討していく。障害者歯科学糖尿病マウスのin vivo検索で、脈絡叢毛細血管のTLR発現が血液脳脊髄液関門の障害に寄与することをTLRリガンドとCML投与マウス脈絡叢ならびに脳室の形態解析、脳脊髄液から調整したリンパ球・貧食細胞数のFACS分析によって証明する。研究は順調で予期しない消耗品の出費がなかったため、試薬購入予定金が若干次年度に繰り越すこととなった。購入希望商品購入後、次なるステップ研究まで至らず、助成金の余りが生じた。