hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生軸索成長円錐からシナプスへの機能分化に伴う小胞関連蛋白の発現ーシナプトフィジン等とCキナーゼを中心として

ラットの坐骨神経を損傷し、近位部のランヴィエ絞輪から出る再生芽とそれが再生軸索となってシュワン細胞あるいはシュワン細胞の基底膜に沿って遠位方向に伸びる場合の成長円錐を用いた。またこれとは別にマウスの胎児からとった脊髄神経節から培養した神経細胞をも用いた。これは知覚神経ではあるが小胞関連蛋白に関する限り、in vivoの成長円錐の場合と違いはなかった。成長円錐が標的(骨格筋)においてシナプスを形成すると、小胞はシナプス小胞として神経の興奮によってアクティブゾーンから開口分泌されるという特殊な機能を担うようになるが、標的に達するまでの成長円錐では伸長機構が主体であると考えられる。成長円錐の形成初期から小胞関連蛋白が発現していることはこれらの小胞関連蛋白がシナプス小胞に分化する以前に、小胞と表面膜との融合機構に関与しているものと考えられる。すなわち小胞関連蛋白がシナプスのみならず広く再生神経の伸長にも関与していることが明らかとなった。細胞内情報伝達系のひとつとして蛋白キナーゼC(PKC)の発現を調べた。PKCは損傷されていない正常な軸索内の微細管や神経細線維の集合部には少なく、細胞質部に多く存在する。再生軸索では細胞質に瀰漫生に現れるのが特徴である。特に膜に限局している所見はない。これまで調べたCa^<2+>依存型のサブタイプであるα、β、γおよびCa^<2+>非依存型サブタイプであるδ、ε、ζの6サブタイプである。強弱の差はあるがいずれも上記のような発現パターンを示した。PKCは多くの細胞内情報伝達系に関係しているためこのように成長円錐において多くのサブタイプがあり細胞質内に広く分布しているものと考えられる。本研究の目的は再生軸索成長円錐における(1)シナプス小胞膜関連蛋白質の局在(2)情報伝達系蛋白質の局在を電顕レベルの免疫組織化学で調べ、成長円錐の伸長のメカニズムを解明しようとするものである。(1)については、シナプトフィジン、シナプシンI、シナプトタグミンの局在を明らかに出来た。すなわち、シナプトフィジンとシナプシンIは小胞膜と細胞質に、シナプトタグミンは主に小胞膜に限局して局在していた。これらはいずれも成長円錐に高濃度に存在しており、小胞と表面膜との融合、つまり開口分泌様式によって膜が供給される可能性を示している。この他にRab3A、ラブフィリンの局在を免疫金コロイド法で明らかにした。(2)については、プロティンキナーゼC(PKC)のそれぞれのサブタイプの局在を明らかにした。PKCの局在は細胞質にビ慢性にあり、かつ成長円錐に高濃度に存在していた。このことはPKCが成長円錐の機能に重要な働きをしていることを示している。再生神経の成長円錐における小胞関連蛋白であるシナプトフィジン、シナプシンI、シナプトタグミン、及び情報伝達蛋白であるCキナーゼのサブタイプのうちCa^<2+>非依存性サブタイプであるδ,ε,ζの局在を調べた。さらに培養神経の成長円錐においてシナプトブレビンとCキナーゼのCa^<2+>依存性サブタイプであるα、β、γサブタイプの局在をいずれも免疫組織化学的に調べた。再生芽はランヴィエの絞輪から出て、基底膜とシュワン細胞との間隙を再生軸索となって伸び、その先端は成長円錐という特殊な構造を呈している。1.シナプトフィジンは正常の有髄線維には少ないが、そこから出る再生軸索の成長円錐には非常に強く陽性となり、その反応は成長円錐の細胞質にビ慢性に広がっていた。2.シナプシンIもほぼ同様に再生軸索の成長円錐にビ慢性に陽性であるが、小胞周囲により強い傾向にあった。

3.シナプトタグミンはやはり正常の有髄神経軸索には陰性であるが、成長円錐には陽性で、特に小胞の集積部分に強く陽性であった。4.Cキナーゼのδ,ε,ζはいずれも再生軸索と成長円錐にビ慢性に陽性であった。5.培養神経の成長円錐にはシナプトブレビンが特に強く陽性で、電子顕微鏡では一部の小胞の境界膜にほぼ一致して金粒子が局在していた。6.培養神経の成長円錐にはCキナーゼのα,β,γが強陽性であった。
ナタネ生産及びバイオ燃料利用の持続可能性に関する実証的研究

環境に配慮した資源循環型社会の構築を目的として、油糧作物生産が地域経済・環境負荷に及ぼす影響の計測及びバイオ燃料生産における政策・制度の役割に関する国際比較を実施した。1.我が国における油糧作物生産の経済効果に関する地域産業連関分析及び環境影響評価に関するLCAを実施し、収量水準が欧州に比べ低いためにいずれの効果が限定的であることを示した。2.環境先進国とされるドイツにおいてもバイオ燃料生産は助成に依存しており、中小企業ほど政策変更の影響を強く受けている実態を明らかにした。3.ディーゼルエンジンにおけるナタネ油の長時間燃焼実験を実施し、概ね軽油同様に利用可能であることを示した。1.バイオディーゼル生産の先進国であるドイツを対象に現地調査を実施した。バイオ燃料の栽培から加工販売まで実施しているバイエルン州の生産者を訪問し、ナタネ栽培上の課題及び政策変更の影響を調査した。ナタネ生産補助金の削減により栽培面積が減少していること、バイオディーゼルへの助成削減により中小のバイオ燃料生産工場数が激減していること等が明らかとなった。またバイエルン州農業研究所ではストレートオイル利用上の技術的課題について意見交換を行い、次年度以降も研究交流を継続することを確認した。なお、本実態調査については平成26年度に学会報告予定である。2.ナタネ油の1500時間のディーゼル供試実証を行い、結果を論文として公表した。効率的選別のために大豆用ベルト選別機を利用する方式について、ナタネ油の食用品質とともに燃料品質の分析を行った。整粒品質の向上の確認とともに低品質粒由来のナタネ油はCa, Mg, Pの含量が高いとの知見を得て、国際学会にて発表した。またナタネ油の燃料品質向上のため、ドイツ現地調査結果を踏まえ活性白土による濾過試験を開始した。3.未利用バイオマス資源の有効利用に関し、木質バイオマスを対象に環境影響評価を実施した。リンゴ剪定枝は収集作業に労力を要するため現在そのほとんどが未利用であるが、たい肥化により化学肥料の使用が削減可能となり、温暖化ガス等の環境負荷を軽減することを明らかにした。但し、収集した剪定枝の保管場所の確保等において課題が残されている。1.国内ナタネ生産の流通実態は、統計調査の中止等の要因により必ずしも明らかにされてこなかった。そこでナタネ生産・加工・流通に関するデータを収集し、現在のナタネ市場が寡占的であり競争的でない実態を解明した。あわせてわが国におけるナタネ生産の歴史的背景・品種育成の現状・農村経済的意義を総論的に整理した。2.近年の資源価格高騰を受け、耕作放棄地を活用したエネルギー作物生産が取り組まれている。ナタネ栽培による耕作放棄地再生の実証データをもとに、エネルギー投入産出効率に関するLCAを実施し、10年以上の長期間放置された農地では耕作再開にかかるエネルギーが大きく、これをナタネ生産で回収することは困難であることを示した。3.ナタネの選別プロセスでは色彩選別機も一部では導入されているが、小規模産地ではコスト面で導入が困難である。このため、無選別の地域では低品質ナタネが混在したまま搾油・食用油化するケースが多く、品質に問題が発生している。大豆選別機をベースに改良を加えることで、比較的安価(30万円程度)に低品質ナタネを選別する試作機を開発した。4.わが国と同様に生産調整制度にナタネを組み入れたドイツを対象に、生産・利用に関する現地調査を実施し、ミュンヘン工科大、バイエルン州農林省・バイエルン農民連盟等の研究者・行政官と意見交換を行った。ナタネを原料としたバイオディーゼル生産は、わが国と同様に助成制度の変更を大きく受けること、無変換のストレートナタネ燃料の利用に対する研究者の関心が高いこと、またLCAの精度向上が課題であること等、従来の文献では必ずしも明確にされていない問題点を明らかにした。本研究は、環境に配慮した資源循環型社会の確立に資することを目的に、油糧作物生産が地域経済に及ぼす効果の計測、制度・政策の役割と影響に関する国際比較、効率的なバイオ燃料生産のための選別技術の開発を行った。最終年度は全体のとりまとめを行った。概要は以下である。1.我が国における油糧作物生産の経済効果を地域産業連関表等により明らかにした。ただ、油糧作物の生産性は諸外国と比較して概して低く、国産油生産は多くの地域で低迷したままであるため、国産油の普及には適切な栽培管理と高収量品種の開発が求められている(Nonaka,Ono(2015))。2.日本とドイツの政策の相違・類似点を現地調査をベースにとりまとめた。バイオ燃料に関する政策は多くがEU(ドイツ)と類似していること、これまでもドイツで生じた問題は数年遅れで日本でも発生していること、それゆえドイツの政策研究が重要であることを指摘した。

また、環境先進国と呼ばれるドイツではあるが、バイオ燃料生産は補助金に依存し、補助金中止が生産中止に直結している。この点に関し、特に中小企業ほど政策変更の影響が深刻であることを、バイエルン州での実態調査から明らかにした(小野ら(2015))。3.バイオ燃料生産では燃料変換工程において多くの資材を必要とし、結果として環境負荷を排出している。これらの負荷を削減するため、ナタネ油を無変換で燃料利用するシステムを検討した。2,250時間のエンジン運転試験を実施し、無変換のナタネ油がバイオディーゼル燃料と同等の品質であることを確認した(金井ら(2015))。農業経済学ナタネを原料としたバイオ燃料生産の国際比較に関してはドイツバイエルン州を調査し、またバイオ燃料利用について新たに実験をスタートさせている。ドイツでの調査結果は26年度に学会報告予定である。国内ナタネの現状に関しては、昨年度に続き栽培から搾油・販売までの包括的把握を実施した。本研究成果をもとに各地の研修会等で積極的に広報活動を実施した。このほかナタネの自給的生産の可能性を経済学説史の視点から整理した論文を和文誌、英文誌(IFあり)に投稿中である。ナタネ油の燃料利用については国内初の1500時間を超える耐用試験を実施し、その成果を論文化した。以上、多くの公表成果をとりまとめており、おおむね順調に進展していると判断する。国内ナタネの現状に関しては、栽培から搾油・販売までの包括的把握を研究目的とし、現地調査等により生産・消費双方の隘路について検討・分析を行った。24年度は、論文「制度変更とナタネ価格」「消費者調査による国産ナタネ油(圧搾法)の認知度と受容価格」等を公表した。この他、図書「国産ナタネの現状と展開方向」を公刊し、現代の経済環境下において搾油・販売までを地域内で一貫して行う自給的生産の可能性を経済学説史の視点から整理した。またナタネ一貫生産の事例分析をもとに、当該活動により地域内に発生する所得がナタネ栽培に対する助成額を上回ることを示した。ナタネ栽培のエネルギー利用に関しては、耕作放棄地の再生の意義をLCAの観点から計測し、論文「耕作放棄地におけるナタネ生産の可能性」を公表した。ナタネ生産の国際比較を目的として、政策においてわが国と類似性のあるドイツを調査し、その成果は「ドイツにおけるバイオディーゼル生産の課題」として学会報告した。また、25年度も継続して情報交換を行うこととした。以上、多くの公表成果をとりまとめることができた。とりわけ国内のナタネ生産に関する課題の解明は相当の進捗をみている。最終年度である26年度は予算規模も限られていることから、過去2年間の成果のとりまとめ及び学会報告・論文化を研究の中心とするが、25年度の残額を利用して新たに活性白土に関する試験を行う。また可能であれば3年間の成果をパンフレット化して公刊する。国内ナタネ生産の動向把握、助成政策の影響分析・現地調査を実施し、IFつき雑誌への論文投稿を行う。低品質ナタネの選別・燃料化については、ナタネ燃料使用の発電機に及ぼす影響の試験を実施するとともに現時点までの試験結果は学会報告を行い、査読付き論文投稿を目指す。
同時多発性細気管支肺胞上皮癌の発症機序に関する臨床的ならびに分子生物学的解析

平成18年度は,複数腫瘍組織と近傍の正常組織におけるcDNA microarray解析によるmRNA発現プロファイリングの差違の検討を行なった.2001年から2005年の間に虎の門病院呼吸器センターに受診し,肺癌手術を施行された患者のなかで,少なくとも2個以上のLBACあるいは腺癌が確認された8症例17腫瘍検体(#1-#17)を対象として研究を進めた.腫瘍組織と近傍の正常組織の凍結保存検体を用いて腫瘍組織を正常組織から分離切除し,それぞれの摘出標本からmRNAを抽出した.まず,mRNAの品質検定を行い,以後の検討に適すると判断された2症例のそれぞれ2つの腫瘍(#8および#9,#14および#15)由来のmRNAを逆転写し,cDNAに変換後,Affymetrix社のGeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayを用いて,ヒト遺伝子38,500個を含む転写産物47,000個以上の発現レベルを解析し,mRNA発現プロファイリングを実施した.その結果,2病変のいずれでも正常肺と腫瘍の間でプローブペア蛍光強度が2倍以上の変動を示した遺伝子のなかで,ともにmRNA発現が正常組織より低下していた遺伝子にはmetastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT-1)などが検出された.逆にともにmRNA発現が正常組織より亢進していた遺伝子には,matrix metallopeptidase 7,ATP-binding cassette sub-family C member3,CD24などが含まれていた.以上から,同時多腫瘍発生に共通の分子生物学的背景が存在することが示唆される.多発性のAAH, BACの同時性発症のメカニズムに関し,今後さらに臨床的検討と合わせて,分子レベルで解析していく予定である.平成18年度は,複数腫瘍組織と近傍の正常組織におけるcDNA microarray解析によるmRNA発現プロファイリングの差違の検討を行なった.2001年から2005年の間に虎の門病院呼吸器センターに受診し,肺癌手術を施行された患者のなかで,少なくとも2個以上のLBACあるいは腺癌が確認された8症例17腫瘍検体(#1-#17)を対象として研究を進めた.腫瘍組織と近傍の正常組織の凍結保存検体を用いて腫瘍組織を正常組織から分離切除し,それぞれの摘出標本からmRNAを抽出した.まず,mRNAの品質検定を行い,以後の検討に適すると判断された2症例のそれぞれ2つの腫瘍(#8および#9,#14および#15)由来のmRNAを逆転写し,cDNAに変換後,Affymetrix社のGeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayを用いて,ヒト遺伝子38,500個を含む転写産物47,000個以上の発現レベルを解析し,mRNA発現プロファイリングを実施した.その結果,2病変のいずれでも正常肺と腫瘍の間でプローブペア蛍光強度が2倍以上の変動を示した遺伝子のなかで,ともにmRNA発現が正常組織より低下していた遺伝子にはmetastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT-1)などが検出された.逆にともにmRNA発現が正常組織より亢進していた遺伝子には,matrix metallopeptidase 7,ATP-binding cassette sub-family C member3,CD24などが含まれていた.以上から,同時多腫瘍発生に共通の分子生物学的背景が存在することが示唆される.多発性のAAH, BACの同時性発症のメカニズムに関し,今後さらに臨床的検討と合わせて,分子レベルで解析していく予定である.平成16年度は,主に同時多発性細気管支肺胞上皮癌(BAC)患者の実態調査,症例抽出および一部患者の組織検体の採取を行った.まず,胸部X線あるいはCTを用いた検診で肺内に異常影を指摘され,虎の門病院呼吸器センター内科に紹介受診した患者のなかで,高解像度CT(HRCT)スキャンにて,長径10mm以下のスリガラス陰影(GGO)が確認された20歳以上の成人38症例を対象とし,臨床的背景(性別,年齢,喫煙歴,悪性腫瘍の既往歴,家族内の悪性腫瘍の集積の有無),胸部CT所見画像の特徴,病理組織学的所見を検討した.摘出腫瘍44病変の組織型では,腺癌が32病変で最も多く,野口分類によるその組織亜型は,type A 12病変,type B 13病変とA,Bで半数以上を占めた.さらに,異型度の低い異型性腺種様過形成(AAH)が8病変認められた.

一方,対象症例中約8%を占める3例で多発病変を呈し,4重癌1例,重複癌+AAH 1例であった.また,その後の症例のうち,複数のBACないしAAHの存在が強く疑われた2症例で全病変を摘出し保存した.すなわち,開胸術あるいは胸腔鏡下手術による外科的治療の適用を厳密に検討し,すべての腫瘤病変の摘出が可能と判断されたため,手術および末梢血・摘出病理組織検体を用いた分子生物学的検討に関する説明・同意のインフォームドコンセントを得た上で,合計手術時の摘出組織を一部新鮮凍結保存し,以後の検討に供することとした.すなわち,1)患者の末梢血細胞中のDNA抽出とそれに用いたp53遺伝子変異の有無の検索によるLi-Fraumeni症候群の判定,2)摘出した複数腫瘍組織と近傍の正常組織におけるcDNA microarray解析によるmRNA発現プロファイリングの差違の検討,3)複数の腫瘍組織と近傍の正常組織におけるP53蛋白等の発現状況の免疫組織化学的検討,4)腫瘍内でのmRNA発現プロファイリングの差違のみられる遺伝子に関する腫瘍内遺伝子差異の検索,などを今後の検討課題としている.このような解析から,多発性のAAH,BACの同時性(synchronous)発症のメカニズムに関し,原発性肺癌の肺内多発性転移,あるいはgerm lineレベルでの主要癌抑制遺伝子異常の存在等に的を絞り,同時多発性肺癌の発症機序を臨床面と合わせて分子レベルで解析していく予定である.平成17年度は,昨年度に引き続き,同時多発性細気管支肺胞上皮癌(BAC)患者の実態調査,症例抽出および一部患者の組織検体の採取を行った.さらに,今年度にはこれまで経験した先端肥大症と多発性BAC症例2例において,その癌発生の機序に関する検討を加えた.症例1はすでにHardy手術を受けながら,残存下垂体腫瘍のために血中のIGF-Iが異常な高値をとる例であり,血痰を主訴に受診した際の胸部CTスキャンにて,両肺に長径10mm以下のスリガラス陰影(GGO)が複数確認された.胸腔鏡下に左右肺のGGOを可及的に摘出したところ,画像上可視であったものを含め,乳頭状腺癌を1個,BAC7個,前癌病変である異型腺腫様過形成(AAH)11個を確認した.これら腫瘍組織を抗IGF-1受容体抗体で染色したところ,すべてのBACで腫瘍細胞が高度に染まり,AAHでは中等度の陽性を示した.症例2は睡眠時無呼吸症候群を合併した先端肥大症であり,同様に血中のIGF-1が高値で,胸部CTではGGOが1つ認められた.胸腔鏡下の腫瘍摘出術を行なったところ,GGO病変はBACであったが,さらに小さいBACをもう1つ確認した.これら2つのBACを抗IGF-1受容体抗体で染めたところ,ともに腫瘍細胞が陽性に染まった.このように,IGF-1とIGF-1受容体系の過剰発現がBACの同時性多発性発症に関わり持つ可能性があると推測されるため,現在prospective研究を計画中である.今後も,開胸術あるいは胸腔鏡下手術により摘出された手術検体および末梢血検体を用いた分子生物学的検討に関するインフォームドコンセントを得た上で,手術時の摘出組織を一部新鮮凍結保存し,検討に供する予定である.とくに,複数腫瘍組織と近傍の正常組織におけるcDNA microarray解析によるmRNA発現プロファイリングの差違の検討から,発症に関わる遺伝子群を類推し,これらの遺伝子の腫瘍内遺伝子変異の検索などを,さらなる検討課題としている.このような解析から,多発性のAAH,BACの同時性発症のメカニズムに関し,臨床面と合わせてさらに分子レベルで解析していく予定である.平成18年度は,複数腫瘍組織と近傍の正常組織におけるcDNA microarray解析によるmRNA発現プロファイリングの差違の検討を行なった.2001年から2005年の間に虎の門病院呼吸器センターに受診し,肺癌手術を施行された患者のなかで,少なくとも2個以上のLBACあるいは腺癌が確認された8症例17腫瘍検体(#1-#17)を対象として研究を進めた.腫瘍組織と近傍の正常組織の凍結保存検体を用いて腫瘍組織を正常組織から分離切除し,それぞれの摘出標本からmRNAを抽出した.
活性型小型肝細胞と骨髄細胞とによる全肝再生置換細胞移植方法の確立

これまでの肝細胞移植では新鮮肝細胞が使用されてきた。小型肝細胞は培養条件下においても増殖可能であり、ヒトからも分離可能であるため将来の肝細胞移植の移植細胞源として有力な候補である。今回、小型肝細胞と新鮮肝細胞を比較し、放射線照射による肝再生置換モデルを使用し、移植効率やアルブミンで評価した蛋白合成機能に関して検討した。50Gyの肝臓放射線照射により新鮮肝細胞を使用したモデルでは部分的な肝再生置換に成功した。また、2/6匹においては完全に近い肝再生置換を観察した。一方、培養小型肝細胞を使用したモデルにおいては、新鮮肝細胞に比べ肝臓での移植細胞は低率であったが、経過中は漸増傾向にあった。脾臓においては、新鮮肝細胞群で早期に移植細胞が漸減するのにくらべ培養小型肝細胞においては移植細胞がとどまる傾向が見られた。とくに、培養小型肝細胞群の移植後3ヶ月での脾臓においては類肝組織や胆管構造の再構築が見られた。そこで、小型肝細胞による肝細胞移植を肝機能補助の観点から検討した。無アルブミンラットを用いた実験を行った。これには、免疫抑制剤を使用し、よりヒト臨床に近いモデルで行った。血清アルブミン値では両群間に統計学的有意差を認めず、12週では2.5mg/dlと改善した。肝臓におけるアルブミンの発現にはmRNAレベルおよび蛋白レベルで両群間に有意差を認めなかったが、脾臓においては小型肝細胞群において有意に発現を認めた。肝臓ではアルブミン陽性細胞を両群において肝細胞に認めたが、新鮮肝細胞群では散在性に見られるのに対して培養小型肝細胞群においては集団塊を形成しコロニー様の構造を呈していた。本実験では移植細胞数が培養小型肝細胞群において1/20と少数であったことを考慮すると培養小型肝細胞は肝再生置換効率では新鮮肝細胞とほぼ同等と考えられた。免疫抑制下においては移植細胞の生着が抑制される傾向にあったが、培養小型肝細胞は新鮮肝細胞と同等にアルブミンを補正した。とくに培養小型肝細胞では脾臓において新鮮肝細胞より長期に生着し、類肝組織を形成することから肝臓同様の細胞機能を発現していることが示唆された。これは、移植細胞が肝臓で再生置換される間に十分な機能補助を脾臓での移植肝細胞が補填できる可能性を示唆している。これらの結果より、培養小型肝細胞移植は肝再生置換効率や肝機能補助の点からも新鮮肝細胞移植と同等と考えられた。培養肝細胞を使用し、活性型小型肝細胞を得た。全肝再生置換細胞移植方法として体外放射線照射を行い、これに先の活性型小型肝細胞の移植を行った。さらに高効率化を目指し、選択的門脈結紮術を施行した。コントロールには新鮮分離肝細胞を使用した。現在までに新鮮分離肝細胞を使用した肝細胞移植では3ヶ月後の検討で肝臓の再生置換ならびに脾臓の肝臓化に成功した。残念ながら活性型小型肝細胞による移植では新鮮肝細胞移植のものと比較してこれまでのところ十分な移植効率を得ていない。選択的門脈結紮による肝再生刺激の影響は、必ずしも肝再生置換を促進するような結果を得ていない。本年度では細胞移植方法の確立を行い、その結果、従来言われていた様に肝再生刺激は必ずしも肝再生置換に必要ではない事が判明した。さらに活性型小型肝細胞移植では、ある程度の肝再生置換が可能である事が判明した。現在、この活性型小型肝細胞移植で実際にどの程度の蛋白合成能や代謝機能を発現できるかをアルブミン欠損ラットと高ビリルビン血症ラットを使用し検討中である。さらに詳細な再生置換された肝臓組織を検討するとグリソン領域から再生置換がおきているが一様に肝細胞索に沿った肝細胞増殖が観察され、再生置換できる細胞群が存在し肝臓の幹細胞である可能性が高い。これは活性型小型肝細胞由来であり、性状などの検討を行い細胞分離マーカーを同定するのを次年度の目標にしている。

肝臓ではアルブミン陽性細胞を両群において肝細胞に認めたが、新鮮肝細胞群では散在性に見られるのに対して培養小型肝細胞群においては集団塊を形成しコロニー様の構造を呈していた。本実験では移植細胞数が培養小型肝細胞群において1/20と少数であったことを考慮すると培養小型肝細胞は肝再生置換効率では新鮮肝細胞とほぼ同等と考えられた。免疫抑制下においては移植細胞の生着が抑制される傾向にあったが、培養小型肝細胞は新鮮肝細胞と同等にアルブミンを補正した。とくに培養小型肝細胞では脾臓において新鮮肝細胞より長期に生着し、類肝組織を形成することから肝臓同様の細胞機能を発現していることが示唆された。これは、移植細胞が肝臓で再生置換される間に十分な機能補助を脾臓での移植肝細胞が補填できる可能性を示唆している。これらの結果より、培養小型肝細胞移植は肝再生置換効率や肝機能補助の点からも新鮮肝細胞移植と同等と考えられた。
小規模臨床試験における割付手法及びスクリーニング検査の比較手法に関する研究

本研究の目的と、各目的について本研究で明らかにすべき主題は以下の通りである。(目的1)小規模臨床試験における割付手法の選択に関する実用的なガイダンスの提案:1治療効果を連続値とした場合、2治療効果を2値とした場合、3治療効果を生存時間とした場合(目的2)小規模臨床試験におけるスクリーニング検査法の比較のための推奨される解析手法の提案:1既存の手法の性能比較、2正確検定法の開発、3優越性の検定と非劣性の検定を同時に行うデザイン目的1については、1小規模臨床試験における、治療効果を連続値とした場合での既存の割付手法の性能評価について、すでに研究に着手していた部分を論文としてまとめ、昨年度に投稿しており、採択された。目的2については、12つのスクリーニング検査法の陽性的中率および陰性的中率を比較する、既存の検定手法についてレビューし、シミュレーションにて性能の比較を行った。また、22つのスクリーニング検査法の陽性的中率および陰性的中率を比較するための、小規模臨床試験において適用可能な正確検定法の開発も進めた。12ともに研究結果がまとまったため、まとめて論文化し、現在国際誌に投稿中である。また、3陽性的中率・陰性的中率を比較する際、どちらか一方の優越性、他方の非劣性を示すデザインについて検討するためには、まず陽性的中率・陰性的中率の比較における非劣性検定を新たに開発する必要があった。今年度は非劣性検定の開発に注力し、こちらも研究結果がまとまった。国際学会で発表するとともに、現在国際誌に投稿中である。目的1については、平成30年度に達成すべき内容について完了している。目的2についても、平成30年度に行う予定であった研究については結果がまとまり、論文投稿段階に至っている。目的1については、文献レビューを引き続き行い、2小規模臨床試験における、治療効果を2値とした場合での既存の割付手法の性能評価について研究を進める。目的2については、今年度にまとめた研究結果についての国際学会での発表や論文投稿を積極的に行い、3陽性的中率・陰性的中率を比較する際、どちらか一方の優越性、他方の非劣性を示すデザインについても研究を進める。昨年度出産したため出張が困難となり、国内旅費費用が0円となった。現在は出張可能であるため、31年度、32年度の出張で対応する。物品については、既存の物品の使用で今年度は対応できたため、31年度以降に購入する。
白血病発症におけるTEL/ARG融合遺伝子作用の分子生物学的解析

TEL/ARGは白血病患者検体より検出された転座型融合遺伝子であるが,同遺伝子機能ならびに白血病発症への役割はまだ良く解析されていない.私はこれまでよりTEL/ARGの分子機構の解明と同遺伝子による生体への作用の正確な把握を目的に研究を継続しており,今回はその分子生物学的基盤の解明に向け,機能発現における遺伝子構造必須領域の決定を目指した.方法として野生型(WT)に相対して7種類の変異体遺伝子を作製した.その内容はTEL構造内では(1)蛋白ホモダイマー形成能を担っているPointed領域の削除(ΔPNT)(2)自己リン酸化部位の一つでras経路活性化に関与するGRB2蛋白の結合が示唆されるチロシン残基Y314のフェニルアラニンへの点突然変異(Y314F)(3)Y314Fの対称としてのY314Fを含むExon5領域全体の削除体(ΔEx.5),ARG構造内では(4)SH3領域の削除(ΔSH3)(5)SH2領域の削除(ΔSH2)(6)C末端領域の削除(ΔC-term)(7)ARGチロシンキナーゼ失活化点突然変異体(K317R),の以上を作製した.各遺伝子はテトラサイクリン誘導発現系にてTon.B細胞株に導入し,樹立した細胞株毎に変異体による直接作用を比較検討した.その結果すべてのTEL/ARG機能にはPNT領域による分子の重合化とARGチロシンキナーゼ活性が必須である事が観察された.WTで観察した細胞生存能にはSH2とC末端領域,増殖因子に対する反応亢進にはY314ならびにSH3とC末端領域が重要と,変異株間で解離が認められ,細胞生存と増殖因子の反応に必要な遺伝子責任領域ならびにシグナル伝達経路は別個である事が示唆された.さらにキナーゼ活性に基づく生物学的機機能の発現にはARG C末端領域が重要であり,その機能発現機構の一つにC末端領域とのアクチン結合を介した細胞骨格系への関与が示唆された.TEL/ARGは白血病患者検体より検出された転座型融合遺伝子であるが,同遺伝子機能ならびに白血病発症への役割はまだ良く解析されていない.私はこれまでよりTEL/ARGの分子機構の解明と同遺伝子による生体への作用の正確な把握を目的に研究を継続しており,今回はその分子生物学的基盤の解明に向け,機能発現における遺伝子構造必須領域の決定を目指した.方法として野生型(WT)に相対して7種類の変異体遺伝子を作製した.その内容はTEL構造内では(1)蛋白ホモダイマー形成能を担っているPointed領域の削除(ΔPNT)(2)自己リン酸化部位の一つでras経路活性化に関与するGRB2蛋白の結合が示唆されるチロシン残基Y314のフェニルアラニンへの点突然変異(Y314F)(3)Y314Fの対称としてのY314Fを含むExon5領域全体の削除体(ΔEx.5),ARG構造内では(4)SH3領域の削除(ΔSH3)(5)SH2領域の削除(ΔSH2)(6)C末端領域の削除(ΔC-term)(7)ARGチロシンキナーゼ失活化点突然変異体(K317R),の以上を作製した.各遺伝子はテトラサイクリン誘導発現系にてTon.B細胞株に導入し,樹立した細胞株毎に変異体による直接作用を比較検討した.その結果すべてのTEL/ARG機能にはPNT領域による分子の重合化とARGチロシンキナーゼ活性が必須である事が観察された.WTで観察した細胞生存能にはSH2とC末端領域,増殖因子に対する反応亢進にはY314ならびにSH3とC末端領域が重要と,変異株間で解離が認められ,細胞生存と増殖因子の反応に必要な遺伝子責任領域ならびにシグナル伝達経路は別個である事が示唆された.さらにキナーゼ活性に基づく生物学的機機能の発現にはARG C末端領域が重要であり,その機能発現機構の一つにC末端領域とのアクチン結合を介した細胞骨格系への関与が示唆された.TEL/ARGは白血病患者検体より検出された転座型融合遺伝子であるが,その遺伝子の機能ならびに白血病発症への役割は未だ良く解析されていない.本研究ではTEL/ARGの分子機構の解明と同遺伝子による生体への作用の正確な把握を目的としている.これまでに私は野生型のTEL/ARG遺伝子をテトラサイクリンによる誘導発現系を用いて細胞に発現させる事によりARGキナーゼの活性亢進に伴う細胞内シグナル伝達,ならびに細胞の増殖因子非存在下での生存能力と増殖因子に対する反応性の増強作用といった基礎研究結果を得てきている.今年度はまず細胞生物学的および生化学的作用へのTEL/ARG構造必須領域を決定する為に,人工的に後述する7種類の遺伝子変異体を作製しての検討を開始した.すなわちTEL構造内では(1)ホモダイマー形成能を担っているHelix-loop-helix領域の削除(ΔHLH),(2)自己リン酸化部位の一つでras経路の活性化に関与するGRB2蛋白の結合が示唆されるチロシン残基Y314のフェニルアラニンへの点突然変異(Y314F),(3)Y314を含むExon5領域全体の削除体(ΔEx.5)を対称として作製した.加えてARG構造内において(4)SH3領域の削除(ΔSH3),(5)SH2領域の削除(ΔSH2),(6)C末端領域の削除(ΔC-term),ならびに(7)ARGチロシンキナーゼ失活化点突然変異体(K317R)を分子生物学的手法を用いて作製した.

各々変異cDNAはその野生型と同様にテトラサイクリン誘導発現ベクター(pTRE)に組み入れ、テトラサイクリン誘導規制遺伝子を導入したBa/F3細胞であるTon B.細胞株にエレクトロポレーション法を用いて導入した.この時ハイグロマイシン耐性遺伝子を共導入して薬剤選択を行った.既に薬剤耐性細胞株をスクリーニングの結果,テトラサイクリンの添加により各々目的変異蛋白が発現する細胞株を樹立する事ができた.来年度は得られた各種変異TEL/ARG遺伝子の誘導発現細胞株を用いて,同変異蛋白の発現に伴う細胞の生物学的ならびに生化学的な作用の検討を予定している.TEL/ARGは白血病患者検体より検出された転座型融合遺伝子であるが,同遺伝子機能ならびに白血病発症への役割はまだ良く解析されていない.私はこれまでよりTEL/ARGの分子機構の解明と同遺伝子による生体への作用の正確な把握を目的に研究を継続しており,今回はその分子生物学的基盤の解明に向け,機能発現における遺伝子構造必須領域の決定を目指した.方法として野生型(WT)に相対して7種類の変異体遺伝子を作製した.その内容はTEL構造内では(1)蛋白ホモダイマー形成能を担っているPointed領域の削除(ΔPNT)(2)自己リン酸化部位の一つでras経路活性化に関与するGRB2蛋白の結合が示唆されるチロシン残基Y314のフェニルアラニンへの点突然変異(Y314F)(3)Y314Fの対称としてのY314Fを含むExon5領域全体の削除体(ΔEx.5),ARG構造内では(4)SH3領域の削除(ΔSH3)(5)SH2領域の削除(ΔSH2)(6)C末端領域の削除(ΔC-term)(7)ARGチロシンキナーゼ失活化点突然変異体(K317R),の以上を作製した.各遺伝子はテトラサイクリン誘導発現系にてTon.B細胞株に導入し,樹立した細胞株毎に変異体による直接作用を比較検討した.その結果すべてのTEL/ARG機能にはPNT領域による分子の重合化とARGチロシンキナーゼ活性が必須である事が観察された.WTで観察した細胞生存能にはSH2とC末端領域.増殖因子に対する反応亢進にはY314ならびにSH3とC末端領域が重要と,変異株間で解離が認められ,細胞生存と増殖因子の反応に必要な遺伝子責任領域ならびにシグナル伝達経路は別個である事が示唆された.さらにキナーゼ活性に基づく生物学的機機能の発現にはARG C末端領域が重要であり,その機能発現機構の一つにC末端領域とのアクチン結合を介した細胞骨格系への関与が示唆された.
胸腺上皮性腫瘍のイメージングバイオマーカーの確立

(1)胸腺上皮性腫瘍の画像データと臨床データは約250例の集積が終了、病理組織標本と肉眼所見データは約70例の集積が終了し、画像解析を行った。また、画像解析結果を元に予後予測因子を調査し、ほぼ終了している。(2)本研究では、画像所見と病理所見の比較検討を目標としており、CT画像所見と臨床病理学的所見の検討、CT画像所見と予後因子の検討は終了し、論文を作成中である。さらに、MRIの画像データと臨床病理学的所見についても検討を行っており、昨年度までに収集した症例も含めて、新しく提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、病理組織分類と病期分類を行った。さらに、新たな改定案から得られた臨床病理学的所見について解析し、予後予測因子とCTやMRIの画像所見についての比較検討も行いこの成果を国内外の学会で発表した。現在論文を作成中である。(3)イメージングバイオマーカーとなる18F-FDG PETについて、治療前に検査が行われていた約45例データを収集した。そのPET画像所見についても臨床病理学的所見の検討を行い、この成果を国外の学会で発表した(第38回日本胸腺研究会2019年2月、American Roentgen Ray Society Virtual meeting 2019)。発表にあたり再検討するべき点を指摘されたため、この点について検討を重ねるとともに、論文作成を進めていく予定である。CT, MRI PETの画像所見とTNM分類、病理組織データとの比較検討が遅れており、現在検討を進め論文作成を行っているところである。1.症例の病理組織データと画像所見データについて、論文作成のために再検討を進めていく。2.国際学会で発表した成果に関して、さらに必要な統計処理を行い、論文作成を進めていく。(1)胸腺上皮性腫瘍の画像データと臨床データは約200例の集積が終了しており、その中で病理組織標本と肉眼所見データの集積は約60例行なっている。引き続き、症例データの収集を行なっている。また、集積されたデータについては詳細を調査中である。(2)本研究では、画像所見と病理所見の比較検討を目標としているが、今後の研究実施の一環として、まず、画像所見データと臨床病理学的所見について、新しく提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、病理組織分類と病期分類を行った。さらに、新たな改定案から得られた臨床病理学的所見とCTやMRIの画像所見についての比較検討を行なった。(3)新たに提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、胸腺上皮性腫瘍のCT所見、MRI所見における画像所見の予後決定因子の検討を行い、その成果を国外の学会で発表した。(北米放射線学会)平成28年度の目標であった、データの収集に関しては、約200例(内、病理組織データ約60例)で終了しており、現在詳細を調査中で、この進捗状況は概ね良好である。また、胸腺上皮性腫瘍の臨床データと画像所見との関係についての各種検討を行うことができ、国内外の学会でも発表できた。その他の目標として、平成28年度の内に病理組織データと画像所見データの比較検討に取り掛かる予定であったが、現在その比較検討の方法や使用するソフトウエア等を再度検討中である。(1)胸腺上皮性腫瘍の画像データと臨床データは約250例の集積が終了、病理組織標本と肉眼所見データは約70例の集積が終了した。収集した症例データの集計も進めており、並行して詳細な画像解析を調査中である。(2)本研究では、画像所見と病理所見の比較検討を目標としており、検討中である。また、研究実施の一環として、まず、画像所見データと臨床病理学的所見について、昨年度から追加された症例も含め新しく提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、病理組織分類と病期分類を行った。(3)新たに提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、胸腺上皮性腫瘍のCT所見、MRI所見における画像所見の予後決定因子について昨年に引き続き追加検討を行い、その成果を国外の学会で発表した。(北米放射線学会)臨床画像データの収集は、約250例(内、病理組織データ約70例)で終了し、現在詳細を調査中でありこの進捗状況は概ね良好である。しかし、新たに提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて検討していることもあり、TMN分類と画像所見の関係について検討に時間を要した。病理組織データと画像所見データの比較検討が遅れているが、現在症例検討を進めているところである。

(2)本研究では、画像所見と病理所見の比較検討を目標としており、CT画像所見と臨床病理学的所見の検討、CT画像所見と予後因子の検討は終了し、論文を作成中である。さらに、MRIの画像データと臨床病理学的所見についても検討を行っており、昨年度までに収集した症例も含めて、新しく提唱されているITMIGの悪性腫瘍のTNM分類第8次改定案を用いて、病理組織分類と病期分類を行った。さらに、新たな改定案から得られた臨床病理学的所見について解析し、予後予測因子とCTやMRIの画像所見についての比較検討も行いこの成果を国内外の学会で発表した。現在論文を作成中である。(3)イメージングバイオマーカーとなる18F-FDG PETについて、治療前に検査が行われていた約45例データを収集した。そのPET画像所見についても臨床病理学的所見の検討を行い、この成果を国外の学会で発表した(第38回日本胸腺研究会2019年2月、American Roentgen Ray Society Virtual meeting 2019)。発表にあたり再検討するべき点を指摘されたため、この点について検討を重ねるとともに、論文作成を進めていく予定である。CT, MRI PETの画像所見とTNM分類、病理組織データとの比較検討が遅れており、現在検討を進め論文作成を行っているところである。1.胸腺上皮性腫瘍の症例データ収集を引き続き行い、症例の蓄積をする。2.症例の病理組織データと画像所見データの比較検討の方法を確立し、検討を進めていく。3.国際学会で発表した成果に関して、さらに必要な統計処理を行い、論文作成を進めていく。2.症例の病理組織データと画像所見データの比較検討を進めていく。1.症例の病理組織データと画像所見データについて、論文作成のために再検討を進めていく。2.国際学会で発表した成果に関して、さらに必要な統計処理を行い、論文作成を進めていく。論文作成の外国語論文の校閲と、来年度参加する学会費、学会旅費として使用するために繰越した。引き続き国際学会で成果を発表し、論文作成を行う為、次年度使用額が生じた。論文作成の外国語論文の校閲と、来年度参加する学会費、学会旅費として使用するため
低生産性品種・形質に向けられる心象の学融合解析と品種継承施策のパラダイム転換

伝統的品種の消滅は途上国に生じ続けている文化的破壊の一つと言える。背景として、家畜に対する合理主義・経済性追求の高まりが指摘される。そこで、低生産性と批判される家畜品種・形質を取り上げ、「経済性に劣るとされる家畜・品種集団が現実に備えている形質の機能形態学的・生態学的機能把握」を推進した。ベトナム産家禽の低生産性の理解とその人間側の受容の問題を引き続き論議している。またタイにおけるヤケイと家禽の関係性の今日的変革を課題として検討した。「低生産性品種がこれまでどのようにして人間社会に受け入れられ、愛されてきたか」、そして「その行く末は何も策を講じなければどういう結果に至るか」を論議するには、人間の精神世界・心象に踏み込み、事象の理論化を進めるしかなかろう。このことは、すなわち「命と人間の接触面の学融合的解析」が重要であることを意味する。実際、研究組織は、調査地を中心にこの学融合的解析を続けている。原初的家畜化という意味では、人文科学的に食肉に向けられる社会の価値観、家畜・牧畜の起源と狩猟の精神性を論議するに至っている。また研究の現状は、「低生産性家畜継承モデル」の確立に近づいている。このモデルは、問題の市場原理的解決策を提示するものではなく、人間と家畜生命との間柄の比較総合によって成立することが明らかである。社会的課題である「低生産性家畜の継承」の道筋を検討し、農村社会の解析に基づく、パラダイム転換を提起したい。家畜と人間の間柄に新たな真理と価値を見出す研究として、解析と総合を継続、「低生産性家畜継承モデル」の論議を深めている。30年度までにおいて、低生産性家畜の実態を生物学的および人文科学的に検討している。まず生態人類学、民俗学的、農村社会学的、民族学的手法から、各調査地においていくつかの実態を把握することに成功した。調査地としてアジアおよびインド洋圏で研究を推進し、家畜化と牧畜の起源を生態人類学から解析し、理解を深めた。食肉行為における人間社会側の精神世界と、狩猟と牧畜の境界面における人間社会の変化を論じることができた。それ以外にも、家畜を見る人間の感性論を論議することができた。家畜家禽に対する形態生理学、生態人類学的検討課題の解明を進捗させ、アジア・インド洋圏のセキショクヤケイ・在来ニワトリ集団、イノシシ・ブタの飼育様態、農耕作業面からの畜力の検証が進んでいる。今後各研究領域からの国際水準での発表が見込まれる。形態学・生理学では、セキショクヤケイの変異論のほか、ウマ、スイギュウの比較形態学を深化させている。ラオス、ベトナムとタイ、インドネシアそして欧州東部における在来鶏、在来豚、在来牛の個体レベルでの形態学的・生理学的的特性について吟味を継続している。平成31年度以降は、形態学領域ではデジタル解析空間における三次元マクロ情報を、生態学的データについてはニワトリやウマでの進捗を基礎に、東南アジア南アジアを中心に在来品種集団の性能特性を明らかにしたいと考える。希少品種や絶滅しつつある形質を含むケースが多くなるため、現地農村からの標本導入を推進する。動物園からの関連動物死体の収集を含め、家畜研究のマテリアルエビデンスを支える一次標本として、扱う家畜・関連動物群の標本化と解析、標本情報公開を進める。形態学生理学では、人間が低生産性形質に対して、それを維持していこうとする動機を解析・予測する。人文科学的には、インド洋圏を中心に、家畜化と狩猟の境界面での人間個人と人間社会の精神世界の変化を追い続けることで、解明を図りたいと考えている。飼育者の精神世界や文化的伝統的風土に学融合的手法を適用し、家畜家禽の背景にある人間と社会の側の動機を解析したい。最終的に、説得力ある論理に基づいて「低生産性家畜継承モデル」を完成させ、国内外に普遍的に広め、パラダイム転換に結実させる。途上国を中心に多数の伝統的品種が、背景となる文化観・地域性とともに今日消滅しつつある。その背景には、家畜に対する人間社会の合理主義・経済性追求の高まりが指摘される。そこで、低生産性と批判される家畜品種・形質を取り上げ、「経済性に劣るとされる家畜・品種集団が現実に備えている形質の機能形態学的・生態学的機能把握」を開始した。実例として、ベトナム産家禽の低生産性の理解とその人間側の受容の問題を扱った。家禽の増体がどの程度まで悪いかを把握し、それに基づいてそれを受け入れる農村側の価値観を探査した。「低生産性品種がこれまでどのようにして人間社会に受け入れられ愛されてきたか」という主題は、人間の精神世界・心象に踏み込むことで議論が進展する。このことはすなわち「命と人間の接触面の学融合的解析」につながり、実際研究組織は調査地を中心にその解析を進めた。原初的家畜化という意味では、人文科学的に食肉に向けられる社会の価値観、家畜・牧畜の起源と狩猟の精神性を論議するに至った。さらに、研究の後段へ向けて、「低生産性家畜継承モデル」の確立を目指しながら、低生産性品種・形質へ向けられてきた価値観のパラダイム転換の可能性を精査し、社会的課題である「低生産性家畜の継承」の道筋を検討した。合理的な近代畜産に対して、途上国を中心とした在来家畜の非経済形質そのものと、それを動機として受け入れる農村社会の解析があってこそ、パラダイム転換は可能となると示唆される。

その説得力のある議論のために、標本資料蓄積と途上国現地調査を主たる手法とした多面的学際的比較総合により、家畜と人間の間柄に新たな真理と価値を見出す研究として、解析と総合を継続している。29年度までにおいて、低生産性家畜の実態を生物学的および人文科学的に検討している。まず生態人類学、民俗学的、農村社会学的手法から、各調査地においていくつかの実態把握を残すことに成功した。調査地としてアジアおよびアフリカで研究を推進し、家畜化と牧畜の起源を生態人類誌から解析し、理解を深めた。食肉行為における人間社会側の精神世界と、狩猟と牧畜の境界面における人間社会の変化を論じることができた。それ以外にも、家畜を見る人間の感性論を論議することができた。生物学的には、家禽に関する研究が成果を残している。インドシナ地域のセキショクヤケイ・在来ニワトリ集団間の遺伝学的関係の精査が進み、今後国際水準での発表が見込まれる。形態学・生理学では、セキショクヤケイの地理的変異論が骨学を中心に深化している。またベトナムとタイ、インドネシアそして一部欧州における在来鶏、在来豚、在来牛の個体レベルでの形態学的・生理学的的特性について吟味を継続している。伝統的品種の消滅は途上国に生じ続けている文化的破壊の一つと言える。背景として、家畜に対する合理主義・経済性追求の高まりが指摘される。そこで、低生産性と批判される家畜品種・形質を取り上げ、「経済性に劣るとされる家畜・品種集団が現実に備えている形質の機能形態学的・生態学的機能把握」を推進した。ベトナム産家禽の低生産性の理解とその人間側の受容の問題を引き続き論議している。またタイにおけるヤケイと家禽の関係性の今日的変革を課題として検討した。「低生産性品種がこれまでどのようにして人間社会に受け入れられ、愛されてきたか」、そして「その行く末は何も策を講じなければどういう結果に至るか」を論議するには、人間の精神世界・心象に踏み込み、事象の理論化を進めるしかなかろう。このことは、すなわち「命と人間の接触面の学融合的解析」が重要であることを意味する。実際、研究組織は、調査地を中心にこの学融合的解析を続けている。原初的家畜化という意味では、人文科学的に食肉に向けられる社会の価値観、家畜・牧畜の起源と狩猟の精神性を論議するに至っている。また研究の現状は、「低生産性家畜継承モデル」の確立に近づいている。このモデルは、問題の市場原理的解決策を提示するものではなく、人間と家畜生命との間柄の比較総合によって成立することが明らかである。社会的課題である「低生産性家畜の継承」の道筋を検討し、農村社会の解析に基づく、パラダイム転換を提起したい。家畜と人間の間柄に新たな真理と価値を見出す研究として、解析と総合を継続、「低生産性家畜継承モデル」の論議を深めている。30年度までにおいて、低生産性家畜の実態を生物学的および人文科学的に検討している。まず生態人類学、民俗学的、農村社会学的、民族学的手法から、各調査地においていくつかの実態を把握することに成功した。調査地としてアジアおよびインド洋圏で研究を推進し、家畜化と牧畜の起源を生態人類学から解析し、理解を深めた。
血小板凝集に係る歯周病細菌アドヘジン蛋白の活性中心と血小板上の標的分子の解明

血漿中でのP.gingivalisによる血小板凝集の活性中心であるHgp44をはじめとするgingipain由来の接着分子の生理活性、宿主標的レセプターを検討した。Hgp44の血小板凝集および赤血球凝集活性の活性はC末端が切断されたmature type(1-362aa)にあり、さらにその活性中心はN末領域、1-101aaであった。赤血球を用いて検討したところHgp44は赤血球上のglycophorinに結合していた。またHgp44は血球細胞だけではなく、上皮細胞にも結合することを免疫蛍光染色にて確認した。さらに口腔上皮細胞ではgingipainによるIL-8産生抑制が観察されるが、その抑制にはgingipain由来の接着分子が必要であることがわかった。一方この接着分子は骨髄細胞由来マクロファージの破骨細胞分化を阻害した。ヒト歯肉線維芽細胞細胞に対してgingipainは免疫反応やアポトーシス反応に影響を与えていた。本実験期間中に基準株として使用しているP.gingivalis ATCC 33277株の全ゲノム塩基配列を決定し、本菌のゲノム上にgignipain関連接着分子の遺伝子を新たに4つ検出した。またginigipain遺伝子の発現、輸送を調節する複数の調節遺伝子を検出した。これらの結果からgingipain由来の接着分子は宿主細胞へ多彩な生理活性を及ぼす事、gingipainの発現が多数の遺伝子の協調作用によってなされていることが示唆された。血漿中でのP.gingivalisによる血小板凝集の阻害剤の創薬研究において本研究課題より得られる結果は重要なものとなると考える。本年度の研究ではP.gingivalisのアドヘジンHgp44の血小板凝集活性の機能領域の同定を目指した。これまでの研究でP.gingivalisの血小板凝集活性にはmature typeのHgp44 (type B1-362aa)がP.gingivalis表面に結合していることが必須である事が明らかになっている。Hgp44のdeletion蛋白質(Hgp44蛋白質を約100アミノ酸残基ずつN末端側から小さくしたリコンビナント蛋白質、typeC:101-362aa, type D:154-362,typeE:159-362)を作製した。それぞれの領域の遺伝子断片をPCRにて増幅しHis-tagリコンビナント蛋白質発現用のプラスミドに組み込み、大腸菌に導入、発現、精製をおこなった。B-Eの各rHgp44をアドヘジン-gingipain完全欠損株KDP153菌体に反応させ(37度30分)、P.gingivalisによるヒトの多血小板血漿での血小板凝集活性を調べた。その結果B type rHgp44のみに活性がみられた。またrHgp44をKDP153菌体に反応させた後、菌体を洗浄、回収、ライゼートを作成した。各ライゼートをSDS-PAGEにて展開し抗Hgp44抗体を用いてwestern blottingを行った。その結果B type rHgp44のみP.gingivalis菌体に結合していることが明らかになった。これらの結果からHgp44のN末領域、1-101 aaは血小板凝集活性に必要であり、またHgp44が菌体表面に結合するのにも重要な領域であることが明らかになった。本年度の結果は今後の血小板凝集活性中心アミノ酸の同定にとって重要なものであった。これまでの研究でP. gignivalisの血小板凝集活性の活性中心は本菌の蛋白分解酵素遺伝子から切り出された成熟型の接着分子HGP44であることを明らかにした。が、このHGP44の宿主側のレセプター分子はまだ未定である。HGP44はヒトの赤血球