hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯原性腫瘍におけるカルシウム感受性受容体の解析と新規治療の開発へ向けた研究

歯原性腫瘍から採取した線維芽細胞はカルシウム刺激で活性化されるカルシウム感受性受容体を発現しているが、その詳細な機能については理解されていない。本研究ではこの歯原性腫瘍由来線維芽細胞をカルシウムで刺激するとカルシウム濃度依存性に骨形成因子の1つであるBMPー2の遺伝子と蛋白の発現が増強されることが判明した。この結果からカルシウムによる安価で安全な骨形成に対する新規治療法の可能性が示唆された。結果:1)角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞では、細胞外Ca濃度依存性にBMP-2 mRNAの発現を増加させた。また、CaSRアゴニストであるネオマイシンもBMP-2 mRNAの発現を増加させた。2)角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞では、高Ca刺激やネオマイシンはBMP-2発現を増加させた。さらに、CaSRアゴニストであるR568はBMP-2分泌を増加させ、またCaSRアンタゴニストであるNPS2143は高Ca刺激によるBMP-2分泌を抑制した。3)角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞にCaSRに対するsiRNAをイオン導入すると、細胞膜上のCaSR発現は減弱し、高Ca刺激によるBMP-2 mRNA発現も抑制された。4)角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞で高Ca刺激を行うと、p38 MAPK, ERK1/2, JNKのリン酸化とNF-kB p65蛋白の細胞質から核内への移行が認められた。また、p38 MAPK, ERK1/2, JNK、NF-kBの各阻害剤によって、高Ca刺激によるBMP-2 mRNA発現が抑制された。以上より、角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞の高Ca刺激では、CaSRを介して38 MAPK, ERK1/2, JNK、NF-kBが活性化され、BMP-2発現を増強させると示唆された。本研究は角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)由来線維芽細胞におけるカルシウム感受性受容体(CasR)の役割を解析し、カルシウム刺激による骨代謝に及ぼす影響について検討することを目的としているが、本年度における研究では以下の結果を得た。1)KCOT由来線維芽細胞はカルシウム濃度依存性にPGE2 mRNAと蛋白の発現を増強した。2)KCOT由来線維芽細胞はカルシウム濃度依存性にBMPー2mRNAと蛋白の発現を増強した。3)KCOT由来線維芽細胞のCasR発現をノックダウンさせるとカルシウム刺激によるBMP-2 mRNA発現が阻害された。4)KCOT由来線維芽細胞におけるカルシウム刺激によるBMP-2 mRNA発現はPLC阻害剤であるU-73122、PKC阻害剤であるstaurosporinで有意に抑制された。5)KCOT由来線維芽細胞をカルシウム刺激するとp38 MAPK、ERK1/2及びJNKがリン酸化され、p38 MAPK、ERK kinase、JNKの各阻害剤SB203580、PD98059、SP600125によってカルシウム刺激によるBMP-2 mRNAの発現が阻害された。6)KCOT由来線維芽細胞をカルシウム刺激すると、p65が細胞質から核内へ移行し、NF-κBの阻害剤PDTCによってカルシウム刺激によるBMP-2 mRNAの発現が阻害された。以上の結果より、KCOT由来線維芽細胞をカルシウム刺激するとp38 MAPK、ERK1/2、JNK及びNF-κBの活性化によりBMPー2mRNAと蛋白の発現が増強されると示唆された。本年度は角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞に対するCa刺激による骨形成の可能性について検討を行った。その結果、角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞はCa濃度依存性にPGE2 mRNAと蛋白の発現を増強するとともに、BMP-2mRNAと蛋白の発現を増強した。一方、角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞におけるカルシウム感受性受容体(CasR)の発現をノックダウンさせるとCa刺激によるBMP-2 mRNA発現が阻害され、PLC阻害剤であるU-73122、PKC阻害剤であるstaurosporinでもCa刺激によるBMP-2 mRNA発現は有意に抑制された。角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞のCa刺激では、p38 MAPK、ERK1/2及びJNKがリン酸化され、p38 MAPK、ERK kinase、JNKの各阻害剤SB203580、PD98059、SP600125によってCa&#178;&#8314;刺激によるBMP-2 mRNAの発現が阻害された。角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞をCa刺激すると、p65が細胞質から核内へ移行し、NF-κBの阻害剤PDTCによってCa刺激によるBMP-2 mRNAの発現が阻害されることが判明した。角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞のカルシウム感受性受容体に対するCa刺激によるBMP-2遺伝子や蛋白の発現に関する機序がほぼ明らかになった。本研究は角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)由来線維芽細胞に置けるカルシウム感受性受容体(CasR)の役割を解析し、カルシウム刺激による本腫瘍の骨代謝に及ぼす影響について検討することを目的として実施した。その結果、本研究では以下の結果を得た。(1)KCOT由来線維芽

細胞はカルシウム濃度依存性にBone morphogenic protein (BMP)-2 mRNAとその蛋白の発現を増強した。(2)KCOT由来線維芽細胞のCasR発現をノックダウンさせるとカルシウム刺激によるBMP-2 mRNAとその蛋白の発現が阻害された。(3)KCOT由来線維芽細胞をカルシウム刺激するとp-38 MAPK、ERK1/2及びJNKがリン酸化された。(4)KCOT由来線維芽細胞をp-38 MAPK、ERK1/2及びJNKの各阻害剤SB203580、PD98059、SP600125で処理するとカルシウム刺激によるBMP-2 mRNA発現が抑制された。(5)KCOT由来線維芽細胞をカルシウム刺激するとp65蛋白が核内移行し、NF-kB阻害剤であるPDTCはカルシウム刺激によるBMP-2 mRNA発現を抑制した。以上の結果より、KCOT由来線維芽細胞はカルシウム刺激によりCasRを介してp-38 MAPK、ERK1/2及びJNK、NF-kBを活性化し、カルシウムの濃度依存性にBMP-2発現を増強すると考えられた。また、ヒト脂肪組織から採取したヒト脂肪組織由来幹細胞をカルシウム刺激するとKCOT由来線維芽細胞と同様にBMP-2発現を認めた。これらの結果より、KCOT由来線維芽細胞やヒト脂肪組織由来幹細胞を用いて安価で安全なカルシウムによる骨形成の新規治療法の可能性が示唆された。歯原性腫瘍から採取した線維芽細胞はカルシウム刺激で活性化されるカルシウム感受性受容体を発現しているが、その詳細な機能については理解されていない。本研究ではこの歯原性腫瘍由来線維芽細胞をカルシウムで刺激するとカルシウム濃度依存性に骨形成因子の1つであるBMPー2の遺伝子と蛋白の発現が増強されることが判明した。この結果からカルシウムによる安価で安全な骨形成に対する新規治療法の可能性が示唆された。角化嚢胞性歯原性腫瘍由来線維芽細胞におけるカルシウム感受性受容体(CasR)を介したBMPー2発現のメカニズムを十分に解析することができたため。今後、小動物を用いて生体内にけるCa刺激による骨形成の可能性について検討を行っていく。口腔外科学本研究では脂肪由来未分化間葉系細胞はBMP-2刺激によって骨芽細胞へ分化し、骨形成することを明らかにしている。しかしながら、BMP-2は非常に高価で、臨床応用は今のところ困難である。よって、今後は角化嚢胞性歯原性腫瘍をカルシウム刺激することで分泌されるBMP-2を介して脂肪由来未分化間葉系細胞が骨芽細胞へ分化できるかどうかを検討する予定である。歯原性腫瘍である角化嚢胞性歯原性腫瘍から線維芽細胞を単離培養してCaSRを介したBMP-2発現について検討を行い、論文作成準備に至っている。研究の進捗がわずかであるが遅延したことと、適切な国際学会での研究成果の発表機会が得られなかったため。実験で試薬などでストック品を使用することができたため物品費が小額ですんだ。研究を完結させるとともに、研究成果を適切な学会で発表して論文作成を行う。今後は、CaSRを介しての破骨細胞の分化、活性化について、また他の間葉系幹細胞について検討を行う予定である。
低分子から高分子,ゲルまで適用可能な状態方程式の開発

高分子の性質はその単量体の性質でほぼ決定され、さらにゲルはゲル網目を構成している高分子の性質に依存するとされている。本研究では,現在までにゲル相転移が確認されているが水溶液中であることに着目し、水分子の相互作用という観点から低分子から高分子・ヒドロゲル系の相平衡推算モデルを開発することを目的として、まず水分子の相互作用を反映できる状態方程式について、低分子および高分子系それぞれについて検討した。低分子系については、Jorgensenらのグループ寄与状態式(以下GC-EOS)の適用性について検討した。GC-EOSは、分子の大きさを考慮した自由体積項およびグループ間の相互作用に基づく引力項より成る。さらに、グループの連結性を考慮するために、新たに有効表面積の概念を導入した。推算を行ったところ、従来から推算が困難とされているCO_2-水-エタノール系を含めて3成分系の推算精度は良好であった。CO_2-エタノーループルパノール-水4成分系については気液共存組成の推算誤差はやや大きいもののタイラインの傾きに関しては良好で実験値の傾向を表わすことができた。次に高分子系については、Prangeの格子モデルについて検討した。ゲルの膨潤圧データからパラメータを決定し、膨潤平衡推算を試みた。膨潤域での推算精度は十分とは言えないが、架橋度による転移幅の違いを弾性項のみで表現することができた。転移温度の推算値は実験値と異なったが、これは本式の高分子溶液の液液平衡に対する適用性がゲルの転移点の推算結果にも現れたものと考えられる。これらのことから本式は弾性項よりは混合項に検討すべき点があると結論できる。
高比圧縮と引張強度を兼備する最新型FRP構造材料の創製

高強度・高弾性率の繊維強化複合材料(FRP)は,航空宇宙など幅広い分野に普及し使用されている.しかしFRPは,カーボン繊維などに樹脂を含浸・成形するため,繊維軸方向の圧縮強度と引張強度の比は0.10.5と低い.飛行機などの構造材では曲げ荷重に耐えるために圧縮変形部に繊維を多用して補強しているが,引張り強度の低下を招く.このトレードオフの関係の改善が求められている.本研究では,強化繊維束(フィラメントヤーン)をカバリング補強して, FRPの圧縮特性を格段に向上させる手法を提案する.昨年度で試作した高強度フィラメント繊維を鞘糸としたカバリングカーボン繊維も製作できる機械で高強度繊維などの強化繊維(芯糸、カーボン繊維)に対して,引張り弾性率が大きいPBO,ガラス繊維などの少本数繊維束を鞘糸として,カバリングヤーンを試作することができた.カバリングヤーンで作製したFRPが高圧縮特性を示している.カバリングヤーンFRPの圧縮パターンと破壊様式を解析した結果,鞘糸のバンド効果で, FRPの圧縮特性の向上に大きく貢献している.また,強化繊維束をカバリングすることによりFRP圧縮特性への影響を解明するために,パラメータが異なる各種サンプルを作製し,引張り試験,曲げ試験,圧縮試験などを行った.FRPが圧縮座屈変形のモデルを確立し,汎用FEMプログラムでシミュレーションもした.鞘糸の本数による影響(本数が多くなると,芯材の強化繊維の含有率が低くなる),鞘糸のテンションの影響(テンションが大きくなると,圧縮強度が多くなるが,大き過ぎると,芯材が湾曲し,引張り強度が低下),鞘糸の巻角度の影響(程度の巻角度が必要)などが解明した.高強度・高弾性率の繊維強化複合材料(FRP)は,カーボン繊維などに樹脂を含浸・成形するため,繊維軸方向の圧縮強度と引張強度の比は0.10.5と低い.飛行機などの構造材では曲げ荷重に耐えるために圧縮変形部に繊維を多用して補強しているが、引張り強度の低下を招く.このトレードオフの関係の改善が求められている.本研究では,強化繊維束(フィラメントヤーン)をカバリング補強して, FRPの圧縮特性を格段に向上させる手法を提案する.昨年度で試作した高強度フィラメント繊維を鞘糸としたカバリングカーボン繊維も製作できる機械を利用して、高強度繊維などの強化繊維(芯糸、カーボン繊維)に対して,引張り弾性率が大きいPBO,ガラス繊維などの少本数繊維束を鞘糸として,カバリングヤーンを試作することを試みた.芯材と鞘糸の材質,力学特性,表面の摩擦係数など相対関係により,芯糸と鞘糸にそれぞれにかけているテンションの大きさと割合を調整して,芯糸をできるだけ真直ぐになるよう創製する.さまざまな組み合わせの試験の結果を評価し,最適な芯糸と鞘糸の配合を明らかにした.糸でバンドした芯糸の繊維の間に間隙は少なくなり,繊維束へ少量かつ均一な含浸が困難となると予測され,含浸と成形方法を提案したが,カバリングカーボン繊維を用いたFRPの試成形の結果,今までのVaRTM成形法では,ほぼ問題なく含浸できて,樹脂をわずかに薄めて,均一な含浸と硬化できたFRPを作成できることが分かった.そのメカニズムはこれから検討し論文を執筆する予定である.カバリングヤーンの使用によるFRPの圧縮性能を確認するため, JIS規格に準拠し,FRPの曲げ試験を実施し, FRPの圧縮弾性率と強度及び曲げ弾性率と曲げ強度を測定して,評価したところ,大幅に向上していることが確認された.1)新型カバリングフィラメント装置で各種の高強度フィラメント繊維を鞘糸としたカバリングカーボン繊維が試作できた.高品質のカバリングフィラメントの作製条件を概ね把握した.2)カバリングカーボン繊維を用いたFRPの成形に成功した.高品質のFRPが得られた.高強度・高弾性率の繊維強化複合材料(FRP)は,航空宇宙など幅広い分野に普及し使用されている.しかしFRPは,カーボン繊維などに樹脂を含浸・成形するため,繊維軸方向の圧縮強度と引張強度の比は0.10.5と低い.飛行機などの構造材では曲げ荷重に耐えるために圧縮変形部に繊維を多用して補強しているが,引張り強度の低下を招く.このトレードオフの関係の改善が求められている.本研究では,強化繊維束(フィラメントヤーン)をカバリング補強して, FRPの圧縮特性を格段に向上させる手法を提案する.昨年度で試作した高強度フィラメント繊維を鞘糸としたカバリングカーボン繊維も製作できる機械で高強度繊維などの強化繊維(芯糸、カーボン繊維)に対して,引張り弾性率が大きいPBO,ガラス繊維などの少本数繊維束を鞘糸として,カバリングヤーンを試作することができた.カバリングヤーンで作製したFRPが高圧縮特性を示している.カバリングヤーンFRPの圧縮パターンと破壊様式を解析した結果,鞘糸のバンド効果で, FRPの圧縮特性の向上に大きく貢献している.また,強化繊維束をカバリングすることによりFRP圧縮特性への影響を解明するために,パラメータが異なる各種サンプルを作製し,引張り試験,曲げ試験,圧縮試験などを行った.FRPが圧縮座屈変形のモデルを確立し,汎用FEMプログラムでシミュレーションもした.鞘糸の本数による影響(本数が多くなると,芯材の強化繊維の含有率が低くなる),鞘糸のテンションの影響(テンションが大きくなると,圧縮強度が多くなるが,大き過ぎると,芯材が湾曲し,引張り強度が低下),鞘糸の巻角度の影響(程度の巻角度が必要)などが解明した.高強度・高弾性率の繊維強化複合材料(FRP)は,航空宇宙など幅広い分野に普及し使用されている.

しかしFRPは,カーボン繊維などに樹脂を含浸・成形するため,繊維軸方向の圧縮強度と引張強度の比は0.10.5と低い.飛行機などの構造材では曲げ荷重に耐えるために圧縮変形部に繊維を多用して補強しているが、引張り強度の低下を招く.このトレードオフの関係の改善が求められている.本研究では,強化繊維束(フィラメントヤーン)をカバリング補強して, FRPの圧縮特性を格段に向上させる手法を提案する.圧縮強度が大きいFRPを実現するために,弾性率が大きい繊維を巻きつける糸(鞘糸)としたカバリングヤーンを作成する必要がある.今までのカバリングヤーンを作成する機械をそのままで使用すると,弾性率が大きい鞘糸が巻装置のガイドとの摩擦が大きく,さらに接触角が大きいため糸に毛羽を大量に生じ,破断してしまい,カバリングヤーンの作成が不可能である.繊維との摩擦を低減するために表面にテフロンでコーティングしたセラミックスガイドと採用し,ガイドでは繊維を折れないように小曲率曲面を設けるなど,新型カバリングヤーン機械を設計し自作で完成させた.その機械を利用して, FRPを成形するために必要なカバリングヤーンを毛羽なく,スムーズに量産可能になった.鞘糸は繊維の引張り強度に寄与せず,バンドは数本の繊維で十分であるため,鞘糸の繊維の本数はできるだけ少ないことが望ましい.しかし,高強度繊維を高効率で紡糸するために,数千本の繊維束にしているのが現状である.数千本のフィラメント束を数百本,数十本に分ける必要がある.ここで,東洋紡の協力を得て,高弾性率繊維に適した分繊法を新しく提案し,高弾性率繊維の分繊装置を試作した.数十本の鞘糸のPBO繊維まで得ることができた.1)新型カバリングヤーン機械を設計し、試作し、完成した。2)小本数の鞘糸の作成法が完成し、作製ができた。以上の2点から、ほぼ当初の計画どおり進んでおり、順調に進展しているといえる。計画通り,カバリングフィラメントを使用したFRPの圧縮特性と曲げ特性の評価を行い, FRPの圧縮破壊のメカニズムを追及する.計画通り、作製した小本数の鞘糸を利用して新機械でフィラメントカバリング繊維束を作成する。これらを利用して、新型FRPを試作し、圧縮特性や曲げ特性を評価する。当初論文発表する予定だった会議が2017年度に延期したため未使用額が生じた。
マルチモデルサンプリングに基づくSoCの欠陥レベル見積り及び削減法

本研究の目的は,超微細プロセスで製造された大規模半導体デバイスに対して,その市場不良率(欠陥レベル)を高精度に見積もる手法,および欠陥レベルを高度に削減可能なテストパターン生成法の開発である.国内半導体産業の動向を鑑み,製造プロセスを持たないファブレス企業での利用を想定したフローの開発を目指す.まず,個別の故障動作について解析する.次に,チップ全体での欠陥レベル見積もり法について検討する.その後,欠陥レベルを削減するためのテストパターン生成法について検討する.本研究の目的は,超微細プロセスで製造された大規模半導体デバイスに対して,その市場不良率(欠陥レベル)を高精度に見積もる手法,および欠陥レベルを高度に削減可能なテストパターン生成法の開発である.国内半導体産業の動向を鑑み,製造プロセスを持たないファブレス企業での利用を想定したフローの開発を目指す.まず,個別の故障動作について解析する.次に,チップ全体での欠陥レベル見積もり法について検討する.その後,欠陥レベルを削減するためのテストパターン生成法について検討する.
セイヨウナシ果実の追熟能を考慮した貯蔵限界支配要因の決定

本研究では、商業的に栽培されているセイヨウナシ7品種の貯蔵期間を,果実の追熟能力を考慮したうえで決定するとともに、貯蔵限界を支配している要因を明らかにすることを目指した。まず、早生品種のバ-トレットとマルゲリット・マリ-ラでは、貯蔵2ヶ月後には果皮に“やけ"症状が発生し、外観の点でも商品価値が失われた。他の5品種については、貯蔵5ヶ月間、外観の点では品質が保持された。しかし、ゼネラル・レクラーク、ラ・フランスおよびル・レクチェを3ヶ月間以上貯蔵した場合、果実の追熟能力が喪失し、20°Cで追熟を行っても果実のテクスチャーがセイヨウナシ特有のメルティング質にならなかった。また、ル・レクチェでは、可食時にアルコール臭のする果実があり、これは貯蔵期間が長い果実ほど顕著であった。ル・レクチェでは、貯蔵中の果重の減少率が他の品種と比較して低かったことより、果皮の透過性が低いことが考えられ,そのために果実内部がより嫌気条件になったものと推察される。他方,シルバ-・ベルとパス・クラサンでは,4ヶ月間貯蔵した果実でも,追熟を行うとテクスチャーがメルティング質となり,食味も良好であった。両品種については現在も研究が進行中であり,貯蔵可能な期間がさらに延びる可能性がある。シルバ-・ベルとパス・クラサンでは、他の品種と比較して果実内エチレン濃度が徐々に増加し、貯蔵5ヶ月後に最も高い値を示すことが判明した。このことより,貯蔵限界の支配要因の一つは果実内エチレン濃度であると思われた。次に,ラ・フランスを用いて,CA貯蔵の効果を検討したが,貯蔵期間の延長に有効であるとされている1%酸素条件下で貯蔵しても,貯蔵可能な期間は大気下で貯蔵したものと変わらなかった。以上の結果より,1°Cで果実を貯蔵した場合、7品種の貯蔵可能な期間は、バ-トレットとマルゲリット・マリ-ラでは1ヶ月間、ゼネラル・レクラーク、ラ・フランスおよびル・レクチェでは2ヶ月間、シルバ-・ベルとパス・クラサンでは4ヶ月間以上であると考えられた。
拍動流体外循環と肋間動脈圧モニターによる胸腹部大動脈瘤の対麻痺予防

胸腹部大動脈瘤手術中の最悪合併症である術中脊髄虚血による対麻痺発生を予防するため遮断大動脈の下半身動脈灌流を拍動流体外循環にして脊髄栄養動脈(前脊髄動脈)の側副血流が増加するか動物実験で検討した。下行大動脈の単純分節遮断で脊髄運動誘発電位は著明に低下した。下半身灌流を定常流から拍動流に変えると脊髄運動誘発電位は正常に回復した。胸腹部大動脈瘤手術における大動脈遮断中の下半身拍動流灌流は有用であった。近年、胸部下行、胸腹部大動脈瘤の手術がステントグラフトを用いて行われるようになった。この際に脊髄前角細胞を養うAdamkiewitz動脈(前脊髄動脈)をステントグラフトで閉塞しても対麻痺が起こらない現象が報告されている。この要因として、1)ステントグラフト挿入時は下半身血圧が拍動流で保たれていること、2)Adamkiewitz動脈には側副血行路があり、閉塞しても短時間に側副血行路が形成されることが考えられる。そこで、本研究では下半身灌流を部分体外循環下に灌流した上で、下行大動脈を広範囲に遮断して定常流灌流と拍動流灌流で脊髄虚血障害発生に差があるか否かの実験を行った。ビーグル犬(平均体重8kg)5頭を用いて、開胸、開腹して、第4胸椎から第3腰椎までの大動脈を広く剥離し、第13腰椎動脈にテーピングを行った。脊髄虚血のモニターとして頭蓋刺激の運動誘発電位(MEP)及び下肢知覚神経刺激の知覚誘発電位(SEP)を用いた。第4胸椎から第3腰椎までの大動脈を上下で遮断して下半身の体外循環灌流は30ml/Kgで行った。定常流潅流から開始したところ5頭共遮断20分30分後からMEP、SEPが軽度低下した。定常流灌流を拍動流灌流に変更して拍動流時の収縮期血圧を定常流より30mmHg上昇させたところ10分後にはMEPとSEP値が上昇し基準値に回復した。次に定常流灌流のままで第4胸椎動脈から順に第3腰椎動脈までの脊椎動脈を大動脈外側からクリッピングを行い、どの脊椎動脈レベルまでの結紮でMEPやSEPが変化するかを観察したところ、第12腰椎レベルまでのクリッピングでMEP、SEPが低下した。しかし、拍動流灌流に変更して収縮期圧を30mmHg上昇させたところMEP、SEPが回復した。以上の実験から、拍動流灌流による下半身灌流圧上昇は脊髄側副血流を増加させ対麻痺を減らすという仮説が正しいことが証明された。次年度以降は、第13腰椎動脈圧を測定して拍動流灌流下で側副血行路血流が増加して第13腰椎動脈圧が高くなるか否かを検討する。胸腹部大動脈瘤手術中の対麻痺の発生を抑制するために、遮断した大動脈の下半身側を拍動流体外循環を行って肋間動脈圧を上昇させれば対麻痺発生が抑制できると考えて動物実験を行ってきた。平成22年度はビーグル犬5頭を用いて、開胸、開腹して第4胸椎から第3腰椎までの大動脈を広く剥離して、運動誘発電位と知覚誘発電位をモニターに用いて、第4胸椎から第3腰椎までの大動脈を遮断して下半身の体外循環は30ml/kgで行った。まず定常流灌流を行い、ついで拍動流灌流を行って運動誘発電位と知覚誘発電位の変化を観察した。下半身灌流を定常流から拍動流灌流にしたところ運動誘発電位が正常に復した。さらに第12腰椎レベルまで肋間動脈を結紮しても運動誘発電位は正常に保たれた。拍動流灌流による下半身灌流圧上昇は脊髄側副血流を増加させ対麻痺を減らす仮説が証明された。次に遮断した大動脈を一部切開して左第2腰椎動脈に細いカニューレ(24G)を挿入して大動脈切開を閉鎖して肋間動脈圧を測定した。定常流から拍動流に変更したところ収縮期血圧に約5mmHgの血圧上昇が見られた。拍動流は下半身血圧を上昇させるのみでなく、側副血流路を通じて下半身の肋間動脈圧も上昇させていることが証明された。下半身の脊髄側副血流路の血流増加に効果があることが判明したが、胸部脊髄への側副血流路にまで影響があるか否かを、来年度は第46胸椎にカニューレを挿入して直接肋間動脈圧を測定して検討したい。胸腹部大動脈瘤手術中の最悪の合併症である脊髄虚血による対麻痺発生を予防する工夫として、遮断した大動脈の下半身を拍動流体外循環にしてAdamkiewicz(前脊髄)動脈への側副血流圧を上昇させれば対麻痺発生が抑制できると考えて本研究を立案した。平成23年度は、1)ビーグル犬5頭を用いて動物実験を行なった。

胸部下行大動脈を腰部大動脈まで広範囲遮断して脊髄運動誘発電位の低下が遮断20分後より起こることを確かめた。次に下腿動静脈を用いて部分体外循環を行なった。遮断した大動肝を一部切開して拍動流体外循環中の第47胸椎の肋間動旅にカニューレを挿入して肋間動脈圧測定を行なった。定常流に比較して拍動流時は若干肋間動脈圧が上昇したが優位の上昇ではなかった。しかし、拍動流時の方が定常流時よりも大動脈遮断中の運動誘発電位低下が防止できた。脊髄知覚誘発電位には拍動流による変化は脊髄運動誘発電位より軽微であった。以上より、胸部下行大動脈遮断時の下半身灌流には定常流より拍動流の方が内腸骨動脈系等を介した側副血行路により脊髄腰膨大部の血流が改善して対麻痺予防効果があることが動物実験で示された。2)臨床応用を行なった。胸腹部大動脈瘤3例に拍動流部分体外循環を臨床応用した。定常流部分体外循環に比較して、大動脈遮断中の下半身灌流圧は若干上昇し、脊髄運動誘発電位の低下も見られなかった。3例共に何ら脊髄神経障害を起こさなかった。本研究は今後も発展性が期待でき、臨床例の積み重ねにより胸腹部大動脈瘤手術中の対麻痺予防策として実用性のある補助手段になると思われた。次の研究では、Adamkiewicz(前脊髄)動脈への側副血流を探る研究と本研究を連動して行いたい。
急速な咬合高径変化に対する顎運動系ストラテジーの解析-下顎タッピング力調節特性-

研究の目的:急速な咬合高径の変更による下顎タッピング力調節特性を観察する上で,実際の食品を用いた実験を追加し,参考となる咀嚼運動の被調節特性を検索することにした.さらにTMD発症の観点から,男女差の影響を検索することとした.対象と方法:1.被験者は顎口腔系に異常所見のない有歯顎者24名(女性12名,男性12名,年齢23-49歳).被験者に19種の食品(直径26mm,高さ10mm)の咀嚼・嚥下を1食品につき1回ずつランダムな順で行わせた.各試行時の咬筋筋電図とMKGのデータを記録し,AD変換処理後に波形解析した(AcqKnowledge, BIOPAC System社製).分析項目は,食物の接触から最終咀嚼までの総筋活動量(A),咀嚼時間(B),咀嚼回数(C)と最大筋活動量に対する相対総筋活動量(%)(D)とし,統計的解析には,男女差,食品を主変動因子とする2元配置分散分析を用いた.2.各試験食品の圧縮貫入試験を行い,テクスチャーを評価した(島津社製テクスチャーアナライザーEZテスト).結果と考察:Aに影響を与えた因子は食品のみで(P<0.001),B, C, Dには食品と男女差双方が影響したが(P<0.001),それらの交互作用は認めなかった.またテクスチャー評価では,食品19品目は約1N90Nまでの幅広い硬さであり,A, B, C, Dの値全てが,硬い食品ほど大きくなる傾向であった.本研究の結果により,咀嚼運動は食品特性に依存することと,TMD発症頻度の男女差に関する有意義な情報が示された.対象と方法:健常被験者8名に,タッピング時の垂直的下顎位(VJPT)を変える可変装置を装着し,約1.0Hzのリズムカルな軽い下顎タッピング運動を行うよう指示した.実験では,50回以上の連続タッピング運動を1セッションとし,これを5回繰り返した.各セッションは,タッピング回数713回の5つのsub-session (SS : SS0SS4)に分け,SSの移行時にはVJPTを同量増あるいは減じて,これを1セッションで2回繰り返した.計測の対象はタッピング頻度(HZ),閉口距離(mm),最大タッピング力(N),タッピングの発現からピーク力までの時問(Time to peak : ms)である.統計的解析には,被験者(N=8),VJPT (N=5), SS(N=4),SS内のタッピング回数(TN=7)を主変動因子とする4元配置分散分析を用いた.多重比較にはLSD法を用いた.結果と考察:VJPT増加直後の閉口距離は,減少直後の値より小さかった.試行3回目までは,VJPT増加の場合には漸増,減じた時には漸減し,3回目以降はいずれも安定したレベルを維持した.またVJPT増加直後の最大タッピング力は,試行2回目と3回目の値より大きく,逆に,VJPT減少直後は継続する2回目よりも小さく,3回目以降はVJPT増減の間の差異はなかった.Time to peakは,VJPT減少の場合,2回目の値は直後の値1回目に比べ減少したが,増加直後1回目と2回目以降の値に差はなかった.以上の結果より連続下顎タッピング時に垂直的な下顎位を変化させたときのタッピング力の調節は,変化の方向に依存していること,および力の調節は変化後2-3回の試行でほぼ完成することが分かった.この変化の方向依存性と試行初期における調整の完成は,課題を忠実に遂行し,かつ咀嚼運動系の防御に必要であると考察した.研究の目的:急速な咬合高径の変更による下顎タッピング力調節特性を観察する上で,実際の食品を用いた実験を追加し,参考となる咀嚼運動の被調節特性を検索することにした.対象と方法:顎口腔系の形態及び機能に異常所見のない24名(男性12名,女性12名、平均30.0歳)に,物質特性の異なる19種の食品(試料サイズ直径26mm,高さ10mmの円柱)をそれぞれ平常摂取に近い状況で咀嚼・嚥下するように指示した.咀嚼筋活動を測定するために,各被験者の左右咬筋浅部中央の表面筋電図を双極皮下誘導法で導出した.測定は各被験者で1食品につき1回ずつ行った,食物の接触から最終咀嚼までの総筋電図積分値(左右の平均値,以下総筋活動量という),全咀嚼時間,咀嚼回数を対象として解析した.統計的解析には,男女差(N=2),食品(N=19)を主変動因子とする2元配置分散分析を用いた.結果と考察:総筋活動量に有意な影響を与えた因子は食品のみであった(P<0.001).またそれらの交互作用は認めなかった.全咀嚼時間と咀嚼回数に有意な影響を与えた因子は男女差と食品両方であったが(P<0.001),それらの交互作用は認めなかった.以上の結果より総筋活動量,咀嚼時間,咀嚼回数はそれぞれ食品の物質特性に依存していることが分かった.

さらに,各食品において総筋活動量に男女差がないにもかかわらず,女性は咀嚼時間が長く咀嚼回数も多いことがわかった.このことから,食品の物質特性を評価する手段して咀嚼筋活動量は有用なパラメータであり,また咀嚼運動1回あたりの活動量は男性が女性より大きいことが示唆された.さらに,同一の仕事量で顎口腔系に負荷をかける時間と回数は女性の方が大きく,顎関節症発症率との関連性も示唆された.研究の目的:急速な咬合高径の変更による下顎タッピング力調節特性を観察する上で,実際の食品を用いた実験を追加し,参考となる咀嚼運動の被調節特性を検索することにした.さらにTMD発症の観点から,男女差の影響を検索することとした.対象と方法:1.被験者は顎口腔系に異常所見のない有歯顎者24名(女性12名,男性12名,年齢23-49歳).被験者に19種の食品(直径26mm,高さ10mm)の咀嚼・嚥下を1食品につき1回ずつランダムな順で行わせた.各試行時の咬筋筋電図とMKGのデータを記録し,AD変換処理後に波形解析した(AcqKnowledge, BIOPAC System社製).分析項目は,食物の接触から最終咀嚼までの総筋活動量(A),咀嚼時間(B),咀嚼回数(C)と最大筋活動量に対する相対総筋活動量(%)(D)とし,統計的解析には,男女差,食品を主変動因子とする2元配置分散分析を用いた.2.各試験食品の圧縮貫入試験を行い,テクスチャーを評価した(島津社製テクスチャーアナライザーEZテスト).結果と考察:Aに影響を与えた因子は食品のみで(P<0.001),B, C, Dには食品と男女差双方が影響したが(P<0.001),それらの交互作用は認めなかった.またテクスチャー評価では,食品19品目は約1N90Nまでの幅広い硬さであり,A, B, C, Dの値全てが,硬い食品ほど大きくなる傾向であった.本研究の結果により,咀嚼運動は食品特性に依存することと,TMD発症頻度の男女差に関する有意義な情報が示された.
箱庭を用いた教師の教育相談力を高める体験型グループ研修の実践研究

初年度である平成30年度は,当初の計画通り,教育相談研修「箱庭体験グループ」(1回目)の実施とデータの収集を行った。「箱庭体験グループ」については,6名の現職教員の参加者を得ることができた。参加者には小学校・中学校・高等学校の3つの校種の教員が含まれており,教職経験年数は10年以上30年未満であった。研究代表者がファシリテーターとなり,平成30年7月から平成31年1月まで,月1回,計7回(1回約2時間)のグループを実施した。当初の予定では,7回のグループで個人箱庭を各自2回,グループ箱庭を3回行うことにしていたが,思いのほか箱庭制作が短時間で終了する参加者が多かったため,途中で回数を変更して,個人箱庭を各自3回,グループ箱庭を4回行った。また,グループ終了後の2月3月には参加者に個別に半構造化面接を行い,自身のグループ体験や体験における気づき,教育相談研修としての箱庭体験グループの意義・課題などについて語ってもらった。データは以下のように収集した。(1)グループ開始前(平成30年7月):事前の質問紙調査(2)箱庭体験グループ(平成30年7月平成31年1月):箱庭制作のプロセス(映像データ),シェアリング(音声データ),各回のふりかえり(文字データ)*参加者にはイメージ体験を深めることを意図して,ふりかえり時に「自分がつくった作品から物語をつくる」という課題も行ってもらった。この時作成された物語も個々の参加者の作品や変化のプロセスの分析の際に使用したいと考えている。(3)グループ終了後(平成31年2月3月):事後の質問紙調査および半構造化面接(音声データ)これらのデータは平成31年度に順次,整理・分析していく予定である。おおむね当初の計画通り「箱庭体験グループ」の実施とデータの収集を行うことができた。しかしながら,グループ終了後の面接調査の実施に時間がかかったため,データの整理は未着手である。また,グループの実施に先立ち,現場の教員である研究協力者とともに実践内容と質問紙の作成・吟味を行う予定であったが,実践開始まで時間的余裕がなく,また年度当初で時間的に協力を得ることが難しかったため,その点に関してはいくぶん検討が不十分にならざるを得なかった。しかしながら,初年度のグループ参加者からさまざまなフィードバックが得られているので,改善可能な点については変更を加え,2年目のグループを実施する予定である。平成31年度は,2回目の「箱庭体験グループ」の実践と,1回目のグループで得られたデータの整理・分析を行う予定である。また追跡調査として,1回目のグループ参加者に半構造化面接を行いたいと考えている。

初年度は研究に関する助言を得るための研究協力謝金および資料整理(テープ起こし)の人件費を必要経費として計上していたが,時期的,時間的な問題により研究協力が得られなかったこと,およびデータの収集に時間がかかり,資料整理が遅れていることにより,このための予算が未使用のまま残っている。資料整理は今年度進めていく予定であり,また研究協力も引き続き得る予定であるので,未使用の予算は今年度分と合わせて使用したい。
HPLC/タンデムMSによるドーピング薬物の迅速高感度検出法の確立

昨年度に行った、HPLC/タンデムMSによる利尿剤の高感度検出法の確立については、固相抽出による利尿剤の抽出に関する最適条件について現在も検討中である。昨年本学にGC/タンデムMS(GC/MS/MS)が導入されたため、一部ドーピング薬物の検出法を、本年はこのGC/MS/MSで試みた。GC/MS/MSについては、GC/MS部分でのイオン化の選択や、タンデムMS部分での親イオンの分解条件等、多数のパラメータを動かして最適条件を決定する必要がある。そのため、すでに我々が種々の方法で検出法を開発した幻覚剤のフェンサイクリジン(PCP)及び鎮痛剤のペチジンをモデルとして、GC/MS/MSの最適条件をより効率よく検索することを試みた。なお、ペチジンはIOCにおける禁止薬物のリストにも掲載されており、PCPも各国で法的に禁じられている。ペチジンについては、適切な条件を設定すれば、化学イオン化法(CI)でも、全イオンクロマトグラフィー(TIC)において、通常の電子衝撃法(EI)とほぼ同じイオン強度を得ることができた。CIでは、ペチジンのスペクトルは[M+H]^+のm/z248がベースピークであり、MS/MSでは、これを親イオンとしてさらに分解し、娘イオンをスキャンすることを試みた。得られた娘イオンはm/z220,174等があり、ベースピークはm/z174であった。この場合、MSでもMS/MSでもほぼ同じイオン強度(TICにおいて)が得られたが、MS/MSの利点は、娘イオンのパターンから化合物を同定することが可能であること(CIでは、[M]^+か[M+H]^+のどちらかしか得られないことが多い)や、夾雑物の多いサンプルではピークのs/n比がはるかに良いこと等があげられる。現在は、腐敗した血液からペチジンを同定しており、MS/MSに適した内部標準の選択を含め、さらに詳細な条件を設定を行っている。PCPについては、CIよりもEIの方が感度が高く、分子イオンの強度が低いため、既に開裂したイオンを親イオンとしてスキャンする条件を設定している。薬物乱用問題は、乱用される薬物に関しても乱用者のプロフィールについても多様化しており、ドーピングでも同様の傾向が認められる。現在IOCで禁止薬物のリストに挙げられているのは、興奮剤、麻薬鎮痛剤、蛋白同化ステロイド、利尿剤、β-刺激剤やβ-遮断剤等多岐にわたり、各項目についても多種多様な薬物が含まれる。これらの内、利尿剤は体重を減少させるためや他の薬物を隠蔽するために使用されることが多い。当該研究の研究代表者は昨年8月に所属が変わり、液体クロマトグラフィー(LC)/タンデムマススペクトロメトリー(MS/MS)及びセミミクロLCの使用ができず、今回は通常のLCシステムを使用し、酸性利尿剤のフロセミド(FURO)とハイドロクロロサイアザイド(HCTZ)の尿中からの回収について検討した。固相抽出は、体液からの薬物の精製に広く用いられており、今回我々もこの方法を用いた。まず、各2.5μgのFUROとHCTZを含む1mlの尿に8mlの蒸留水とlmlのlN HClを加え、洗浄したBondElut C_<18>カラムに加え、20mlの蒸留水で洗浄し、3mlのクロロフォルム/メタノール(9:1)で溶出し,蒸発乾固した後に250μlのメタノールに溶解してその10μlをLCに注入した。LCの条件は以下の通りである。移動相は10mM CH_3COOH/CH_3CN(60:40)で流速は0.5ml/min、UV検出器を用い270nmで検出した。BondElut C_<18>による固相抽出でFUROの回収率は130%だったが、HCTZは10%以下であった(n=4)。弱イオン交換樹脂のBondElut NH_2を用いてもFUROは良好に回収された(回収率95.4%,n=4)がHCTZは殆ど回収されなかった。これはHCTZの比較的高い親水性が関与していると考えられ、今後は親水性の高い利尿剤の固相抽出の最適条件を検討する予定である。CIでは、ペチジンのスペクトルは[M+H]

^+のm/z248がベースピークであり、MS/MSでは、これを親イオンとしてさらに分解し、娘イオンをスキャンすることを試みた。得られた娘イオンはm/z220,174等があり、ベースピークはm/z174であった。この場合、MSでもMS/MSでもほぼ同じイオン強度(TICにおいて)が得られたが、MS/MSの利点は、娘イオンのパターンから化合物を同定することが可能であること(CIでは、[M]^+か[M+H]^+のどちらかしか得られないことが多い)や、夾雑物の多いサンプルではピークのs/n比がはるかに良いこと等があげられる。現在は、腐敗した血液からペチジンを同定しており、MS/MSに適した内部標準の選択を含め、さらに詳細な条件を設定を行っている。PCPについては、CIよりもEIの方が感度が高く、分子イオンの強度が低いため、既に開裂したイオンを親イオンとしてスキャンする条件を設定している。
立体構造を基にしたヒストン修飾酵素の認識機構の解明

PADは,Ca2+依存的にタンパク質中のアルギニン残基を脱イミノ化(シトルリン化)して,シトルリン残基を産出する反応を触媒するタンパク質修飾酵素である。ヒトでは5種類存在するが,その中の一つヒトPADタイプ4(PAD4)は,663アミノ酸残基からなり核内に優先的に局在する。PAD4はヒストン修飾による遺伝子発現の制御,慢性関節リウマチの発症と関連していることが示唆されている。PADは未修飾のアルギニン以外にもモノメチル化アルギニンの脱イミノ化が可能であることが示唆されている。メチル化アルギニンにはモノメチルアルギニン及びベンゾイルグリシル(非対称&対称)ジメチルアルギニンなどのメチル化誘導体が存在する。そこで,PAD4がどのメチル化アルギニンを認識するかを明らかにするために,ベンゾイルリグシルモノメチルアルギニン及びベンゾイルグリシル(非対称&対称)ジメチルアルギニンとPAD4との複合体結晶を浸漬法で調製してX線結晶構造解析を行を行なった。その結果,ベンゾイルグリシルモノメチルアルギニン電子密度は明瞭に確認できたが,ベンゾイルグリシル(非対称&対称)ジメチルアルギニンの電子密度は確認できなかった。以上の結果から,PAD4はモノメチル化アルギニンは認識するが,(非対称&対称)ジメチル化されたアルギニンは認識しないことが明らかとなった。PADは、Ca2+依存的にアルギニンで残基を脱イミノ化(シトルリン化)して、シトルリン残基を産出する反応を触媒するタンパク質修飾酵素である。ヒトPADタイプ4(PAD4)は、663アミノ酸残基からなり核内に優先的に局在する。PAD4はヒストン修飾による遺伝子発現の制御、慢性関節リウマチの発症と関与していることが示唆されている。PAD4はin vivo、in vitroでヒストンH3の2,8,17,26番目とH4の3番目のアルギニンをシトルリン化する。これまでに、ヒストンH3のアルギニン17(H3/R17)とH4のアルギニン3(H4/R3)の部位がメチル化を受けると、エストロゲンレセプターを介した転写が活性化される。一方、PAD4によってH3/R17とH4/R3がシトルリン化されると、前述したメチル化とは逆に、エストロゲン応答遺伝子の転写が抑制されることが明らかなっている。我々は生体内基質の一つであるヒストンのN末端テールとの複合体構造解析にも成功した。標的のArgの位置をNとするといずれも(N-2)から(N+2)の5残基のアミノ酸残基の電子密度が確認され,そのうち(N-2)から(N+1)の4政基がPAD4によって認識されることがわかった。主鎖原子は4政基にわたって認識されているが、側鎖の認識はターゲットとなるアルギニン残基の側鎖と(N-2)の残基の側鎖だけで基質認識の配列特異性はきわめて低い。次に,ヒストンペプチドの構造を比較してみると、ペプチド鎖は折れ曲がったβターン様の構造をとっていることがわかる。これはヒストンペプチドがPAD4の活性部位周辺の形状とArg374との相互作用によって折れ曲がったβターン様の構造が誘起されるためである。このように,通常は一定の決まった構造をとっていないペプチド鎖もPAD4に認識されると折れ曲がったβターン様の構造をとることが明らかにされたPADは,Ca2+依存的にタンパク質中のアルギニン残基を脱イミノ化(シトルリン化)して,シトルリン残基を産出する反応を触媒するタンパク質修飾酵素である。
超音波刺激法によるscaffold-free再生軟骨作成と再生医療

高い細胞濃度で軟骨細胞を培養すると凝集して組織となった。2.0×107cells/cm2グループのみ自然な関節軟骨に似たプレート状の組織となった。このグループは他の2つのグループよりII型コラーゲンとアグリカンを高く発現していた。興味深いのは、このグループでのみ超音波によりアグリカンの発現が有意に亢進していることがわかった。この研究では単層培養の軟骨細胞からscaffold-freeの軟骨様組織を作成することができる新たな培養システムを作成した。生体に移植したところ、有効な軟骨間接着を形成した。超音波刺激は、基質合成を高めることにより、良好な移植軟骨を作成する有効な手段となる可能性がある。これまでの予備実験で高濃度濃縮培養すると軟骨細胞は基質を産生する。しかし、ガラスやpolycarbonateなどの通常のシャーレ上で培養すると急速に細胞接着が起こり、この接着した細胞は脱分化を起こすことが判明していた。また、出来上がったscaffoldーfree軟骨constructを取り出そうとしても、polycarbonateなどのシャーレ表面との接着が強く、これを鋭的に切離すると他の5面は軟骨器質で覆われているのに、残りの1面は脱分化した線維芽細胞が並んだ歪なconstructが出来上がる。これを改善する為に細胞と全く接着しないセラミック製メンブレンを使用した。採取した軟骨細胞は一旦、1.0X106cells/dishで単層培養により23週間培養増殖させた後にセラミック製メンブレン上に高濃度で細胞を播種して高濃度培養する。このscaffoldを必要としない我々の培養系では、その条件を変えることにより軟骨類似器官の厚さ、硬さなどの形態を調節可能であるという利点を持っている.この利点を生かし、軟骨分層欠損への充填に理想的な形態(円筒形)と硬度をもつ軟骨類似器官形成のための至適条件を見出す為、1.0、2.0、および4.0×10*7 cells/cm2と具体的な軟骨細胞の濃度を変えて培養した。その結果、4.0×10*7 cells/cm2が最もしっかりした再生軟骨片が作成できた。近年、単層培養で増殖させた軟骨細胞を用いて関節軟骨を再生する試みが報告され、非常に注目されました。しかし、その後の追試で培養軟骨をそのまま移植しただけでは、良質の軟骨再生は困難であることが判明しました。そこで自家軟骨細胞をコラーゲン器質内で包埋し、軟骨類似器官を作成し、軟骨欠損部に移植するという手法が開発されました。一部で臨床試験もされていますが、この方法には決定的な問題があります。自家軟骨細胞の採取は正常軟骨組織を犠牲にしなければならず量的な限界があるためです。自家軟骨細胞数を増加させようとして単層培養すると細胞数は増えますが、細胞は脱分化を起こしてしまい、最も大切な軟骨器質産生能を失います。そこで人工の軟骨基質ーScaffold(足場とも言います)ーで軟骨細胞を包埋し、これを移植する3次元培養軟骨移植が試みられました。しかし、人工的scaffoldにはレシピエントとなる関節に異物反応を起こさないこと、自家新生軟骨により損傷が修復された後には吸収され消退することなどが求められますが、これらの諸条件を全て満たすような理想的な人工scaffoldの確立には至っておりません。もしも、採取した軟骨細胞自身に自らが包埋されるほどの十分な軟骨基質を産生させることに成功すれば、人工scaffoldを用いないので、人工的scaffoldの問題は一気に解決されます。我々はscaffoldーfreeconstructの作成を目標に研究を進めてきました。我々はPrimary culture (passage 0)では軟骨細胞の分裂・増殖能は非常に限られているが、軟骨産生能はよく保たれていることに注目しました。すなわち、500cm2の巨大シャーレにウサギから採取した軟骨細胞を播種します。我々はこれまでの予備実験で、Primary軟骨細胞は分化度が高いので分裂・増殖速度が非常に遅いのですが、巨大シャーレ上の軟骨細胞がconfluentになるまで培養することで成熟軟骨細胞の大量獲得に成功しました。軟骨細胞は一旦、1.0X106cells/dishで単層培養により23週間培養増殖させた後に合成半透膜上に高濃度で細胞を播種して高濃度培養しました。我々の系では条件を変えることにより軟骨類似器官の厚さ、硬さなどの形態を調節可能です。この利点を生かし、軟骨分層欠損への充填に理想的な形態(円筒形)と硬度をもつ軟骨類似器官形成のため、種々の軟骨細胞の濃度(1.0、2.0、および4.0×107 cells/cm2)で軟骨片を作成した。2.0×107 cells/cm2が移植手術に最も適した硬度の軟骨片を形成する事ができた。次に実験用ウサギ膝関節軟骨に直径4mmの軟骨部分欠損を作成した。各週齢5匹ずつ行った。ここに、scaffold-free再生軟骨constructを移植し、軟骨修復能についての評価を行った。軟骨類似器官移植後2週、4週、および8週での評価を行った。本研究の目標は、移植医療に耐えうる再生軟骨を作成することにある。採取した軟骨細胞は一旦、1.0X106cells/dishで単層培養により23週間培養増殖させた後に合成半透膜上に高濃度で細胞を播種して高濃度培養することでscaffold-free再生軟骨constructを作成した。

各週齢5匹のウサギ膝関節軟骨部分欠損モデルを用いて、膝関節軟骨に直径4mmの軟骨部分欠損を作成し、scaffold-free再生軟骨constructを移植した。移植後2週、4週、および8週で軟骨修復能についての評価を行った。移植の問題点としては、ウサギが運動する際に移植軟骨constructが脱落してしまう可能性が考えられる。軟骨constructはプレスフィットによる固定を行ったが、やはり脱落の問題が発生した。詳細に組織を観察すると軟骨部分欠損の深さに依存していており、軟骨下骨を穿破しない程度でできるだけ深い軟骨欠損では軟骨constructの脱落はなかったが、全く軟骨下骨に到達しない軟骨欠損モデルでは脱落の可能性が高かった。実験用ウサギ膝関節軟骨部分欠損の修復状態について経時的に検討した。代表的な軟骨器質であるアグリカンとII型コラーゲンのmRNAの経時発現量をRT-PCR法で比較すると、scaffold-free再生軟骨construct完時が最も発現量が多く、経時に減少していた。タンパクの発現はアグリカン、II型コラーゲンに対する免疫組織化学染色法とトルイジン・ブルーによるメタクロマジーの発現量で調べた。移植部軟骨との境界領域での発現が時間の経過とともに減少する傾向にあった。結論からすると、本方法でscaffold-free再生軟骨constructの作成は可能であるが、軟骨同士の結合には堪え得ないと考えられ、やはり骨髄からの幹細胞や血流の供給を要すると考えられた。高い細胞濃度で軟骨細胞を培養すると凝集して組織となった。2.0×107cells/cm2グループのみ自然な関節軟骨に似たプレート状の組織となった。このグループは他の2つのグループよりII型コラーゲンとアグリカンを高く発現していた。興味深いのは、このグループでのみ超音波によりアグリカンの発現が有意に亢進していることがわかった。この研究では単層培養の軟骨細胞からscaffold-freeの軟骨様組織を作成することができる新たな培養システムを作成した。生体に移植したところ、有効な軟骨間接着を形成した。超音波刺激は、基質合成を高めることにより、良好な移植軟骨を作成する有効な手段となる可能性がある。次年度には得られたscaffoldーfree軟骨constructをウサギ膝関節に実際に移植することを予定している。昨年の実験で移植に耐えうるしっかりした再生軟骨片が作成できた。scaffold-free再生軟骨constructの移植の問題点としては、ウサギが運動する際に移植軟骨類似器官が脱落してしまう可能性が考えられたが、軟骨constructはプレスフィットによる固定を予定で、あまり脱落しなかった。しかし、組織学的にrecipient組織との境界に介在する軟骨以外の組織があった。今後は実験用ウサギ膝関節軟骨部分欠損の修復状態について代表的な軟骨器質であるアグリカンとII型コラーゲンとし、これらの経時発現量を比較する予定である。アグリカン、II型コラーゲンのmRNAの発現はRT-PCR法による評価を、タンパクの発現はアグリカン、II型コラーゲンに対する免疫組織