hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳磁図を用いた相互相関解析法によるヒト視覚野情報処理過程ダイナミックスの解析

目的:ヒトの高次脳機能を非侵襲的方法により捉えることが可能となり、中でも脳磁計は神経が賦活されたことによる直接的な一次信号を捉え、その時間・空間分解能は極めて優れている。そこで個々の記録点で得られた脳磁場反応にアナログ相互相関解析法Cross-Correlation Analysisを適用した。また脳磁図から推定されてた磁場源とfMRIで得られた活性化部位を比較検討した。方法:島津製作所が開発した129チャンネル・ベクトル型脳磁計により、正常被検者10名より聴性誘発磁場および視覚誘発磁場を測定した。聴覚刺激には1000Hzのtone burstを用いた。また視覚刺激としては縦15度、横15度の視野に、一辺が1.5度の白黒のチェッカーボード・パターンを提示した。また刺激視野は左右の半視野と左右上下の1/4視野とした。さらに視覚誘発磁場測定時と同一の視覚刺激によりfMRIを記録した。またPerke1ら(1967)、Toyamaら(1981)の方法によるアナログ相関解析法のプログラムを開発した。結果:聴性誘発磁場反応はすべての被検者で記録することができた。この反応を用いて、近接する二点間の反応のアナログ相関解析を試みたが、計算は不可能であった。その原因は脳磁計のS/N比が不良であった為と推定された。今後、S/N比の改良を試み、アナログ相互相関解析法による解析を進める。視覚誘発磁場反応ではすべての被検者より良好なP100mを得ることができた、最も著明な頂点はP100mで、その磁場源は後頭葉の鳥距溝付近に推定された。また同一の刺激で得られたfMRIにおける活性化部位は、磁場源近傍に認めた。しかし、脳回レベルでは磁場源と活性化部位は必ずしも一致しなかった。今後は、刺激方法を改良し、ヒトのretinotopyを詳細に解析し、さらにヒトの運動視における情報処理過程を明らかにする。
π中間子原子分光実験の展開

π中間子原子の精密分光研究を展開するための実績は主に以下の3点からなる。(1)パイ中間子原子の分光実験の高精度・系統的な研究を展開するための実験に向けた準備を行った。分光実験のためのスペクトロメータとなる理研RIBF施設のBigRIPSの光学系について詳細な計測と開発を行った点である。そこで、実地の光学収差計測を行い、分解能に影響を与える収差の量を測定し、補正に必要となるパラメータを収集し、データ解析に適用した。同時に、分解能に影響を与える入射ビームのエミッタンスや、エネルギー巾を計測し、改善するためのスリット設定などを策定した。(2)データの解析。昨年度までに得られたπ中間子原子分光実験のデータを解析した。上記で計測したアクセプタンスを適用するなどして、スペクトルのより詳細な解析を行った。同時に理論と共同で研究を行う事で、次期実験で計測するべきスペクトルを、これまでの計測結果にもとづき、検討することが出来た。(3)上記の検討に基づき、次期分光実験の準備を進めた。検出器の開発・テストを行い、より高精度・高統計の実験準備を行った。震災以降、電力料金の値上がりのためもあって実験を行うための施設RIビームファクトリーの稼働時間は大きく短縮されている。そのため、本研究を遂行するためのビームタイムも施設側の都合で延期が繰り返されており、科研費の充当年度内には実験できなかった。その後、実験グループ側には全く非がないにもかかわらず、2013年秋には実験が承認されてから一定期間を経過したため、承認が取り消されるという事態にまで発展したが、上記のような綿密な準備に基づきより豊富な物理の内容を含めて再申請した結果、より長いビームタイムが承認された。紆余曲折の末ようやく2014年5月28日から一週間の実験が確定した。このような環境では学生の育成や外国との共同研究に支障を来たしかねない。25年度が最終年度であるため、記入しない。(2)データの解析。分光実験のためのスペクトロメータとなる理研RIBF施設のBigRIPSの光学系について詳細な計測と開発を行った。BigRIPSを分光スペクトロメータとして利用する際、高次の光学収差によって分解能が悪化する事が知られている。そこで酸素18ビームを用いた、実地の光学収差計測を行い、分解能に影響を与える収差の量を測定し、補正に必要となるパラメータを収集した。分解能に影響を与える入射ビームのエミッタンスや、エネルギー巾を計測し、改善するための設定などを策定した。(2)データの解析。上記の光学収差補正などを適用するなどして、スペクトルのより詳細な解析を行った。同時に理論と共同で研究を行う事で、強い相互作用を精度良く決定するために、計測するべきスペクトルを検討した。研究を展開する上での懸念される点は、以下の通りである。

震災以降、電力料金の値上がりのためもあって実験を行う施設RIビームファクトリーの稼働時間は大きく短縮されている。そのため、本研究を遂行するためのビームタイムも延期が繰り返されており、ようやく2014年前半に一週間のビームタイムが確定した。現在国内の大型加速器施設は、多くが同じ問題を抱えており、検出器のテストさえ外国で行う方が簡単な状況にある。これでは学生の育成を含めた、研究分野の進展を期待するのが難しく、大変忸怩たる思いである。25年度が最終年度であるため、記入しない。電力料金の値上がりのためもあって実験を行うための施設RIビームファクトリーの稼働時間は、本来より大きく縮減されている。そのため施設側の都合で、本研究を遂行するためのビームタイムも延期されているが、ようやく2014年前半の実験実施が確定した。研究全体としては戦略的な展開を行っている。実験実施が確定しているため、この準備を実施する。データの解析を行う。
筋萎縮性側索硬化症治療薬としての分子シャペロン誘導剤の探索研究

家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)の原因遺伝子である変異SOD1の病態的意義を解明するために、変異SOD1と結合する新たなタンパク質を同定し、その役割について解析した。マウスのneuroblastoma cell lineであるNeuro2Aに変異SOD1(G93A)を過剰発現したサンプルおよび変異SOD1(G93A)トランスジェニックマウスの脊髄組織で変異SOD1と特異的に結合するバンドが認められ、質量分析にてheatshock protein 105(HSP105)と判明した。HSP105と変異SOD1の結合は抗体を用いたプロットでも確認した。また一定量の沈降抗体により共沈するHSP105の量は、wild type SOD1では認められず、変異SOD1の病原性の強さと相関していることが分かった。G93Aトランスジェニックマウス脊髄の主要なシャペロンのタンパク量の経時的な変化を検討したところ、運動麻痺の進行期においてHSP70およびHSP27は上昇を示したが、対照的にHSP105は減少を示した。野生型マウスの脊髄前角の免疫染色では、SMI32で染色される運動ニューロンはHSP105で染色され、HSP105は運動ニューロンに多いことが判明した。さらに、培養細胞系でHSP105の過剰発現により変異SOD1を含む凝集体の形成が抑制されることが判明した。以上の結果は、HSP105は変異SOD1と結合し、変異SOD1の凝集形成を抑制することを示した。神経難病であるALSの新たな治療法として、HSP105レベルを増加させる手法の可能性を示唆していると考えられる。マウスのneuroblastoma cell lineであるNeuro2Aに対してC末端にFLAG配列を付加したSOD1を一過性過剰発現し抗FLAG抗体で免疫沈降すると、wild type SOD1を過剰発現したサンプルを用いた免疫沈降ではみられず変異SOD1(G85R, G93A)を過剰発現したサンプルのみに特異的にみられるバンドが75kD付近と100kD付近に1本ずつ認められた。銀染色にて認める有意な2本のバンドをゲルより切り出し質量分析にて解析すると、それぞれheat shockcognate protein70(HSC70)、heat shock protein105(HSP105)と判明した。HSP105と変異SOD1の結合は抗体を用いたブロットでも確認した。また一定量の沈降抗体により共沈するHsP105の量は、wild、D96Nでは認めず、D90A<<G85R≒G93Aの順に多くなり変異SOD1の病原性の強さと相関していることが分かった。次にin vivoにおけるSOD1とHSP105の結合をマウス脊髄(littemate control、wild SOD1 transgenic、G93A SOD1transgenic)をサンプルとして免疫沈降で検討したところ、in vitroでの結果と同様にG93A変異SOD1に最も多くHSP105が結合していた。G93A transgenicマウス脊髄の主要なシャペロンの蛋白量の経時的な変化を検討したところ、運動麻痺の進行期においてHSP27は上昇を示したが、対照的にHSP105は減少を示した。野生型マウスの脊髄前角の免疫染色では、SMI32で染色される運動ニューロンはHSP105でも染色され、HSP105は運動ニューロンに多いことが判明した。
亜硝酸塩による豚肉製品のトランス脂肪酸生成：そのメカニズムと制御法の研究

ハムやソーセージなど、豚肉製品の加工時におけるトランス脂肪酸(TFA)生成の原因および制御法について研究を行った。その結果、食肉製品の発色剤である亜硝酸塩を高濃度に添加すると、豚肉中の不飽和脂肪酸をTFAに異性化する触媒として作用することが明らかになった。触媒として作用する濃度は、食肉加工で試料される濃度の5倍以上であった。また、原材料のpHが5.0より低くなると、亜硝酸塩濃度がより低い条件下でも触媒作用が認められた。本研究の結果から、亜硝酸塩の添加量および原料肉のpHを適正に管理することで、豚肉製品中のTFA生成量を十分に抑制し、製品の安全性を担保できると結論された。本年度は夾雑するさまざまな食肉成分の影響を除き、豚肉の塩漬行程におけるトランス脂肪酸(TFA)の生成条件をより詳細に検討するため、抽出脂肪を用いた単純な実験系により評価した。豚ロース肉から抽出した豚肉脂肪にpHを17に調整した亜硝酸ナトリウム(NaNO2)水溶液を添加し、震盪しながら6585°Cにて30分間加熱した。加熱を終えた豚肉脂肪は直ちに流水で室温まで冷却し、常法により総脂質を抽出した。総脂質をけん化・メチル化、固相抽出カラムを用いたクリーンアップならびにTFAの予備分画を行った後、ガスクロマトグラフによりトランス脂肪酸の定量分析を行った。豚肉脂肪中のTFAはNaNO2水溶液のpHに依存して変化した。すなわち、pHが5以下の条件下においてTFAが増加し、特にpHが3以下になると顕著に増加した。このことは,酸性条件下においてNaNO2から生成する亜硝酸ラジカルによる酸化反応により,シス形脂肪酸のトランス異性化が進行する可能性をし際するものであった。本年度の研究において検出されたTFAはパルミトエライジン酸(C16:1n-7t),エライジン酸(C18:1n-9t),リノレライジン酸(C18:2n-6t)の3種であった。このうち,C18:1n-9tとC18:2n-6tはNaNO2およびpHの影響により脂肪中の含量が増加し,豚肉脂質の総TFA含量に大きく影響を及ぼした。一方,C16:1n-7tについては,総TFA含量に及ぼす影響はさほど大きくなかったものの,加熱の影響のみで含量が増加することが示唆された。以上の結果から,亜硝酸ラジカルによる酸化反応ならびに加熱によるトランス異性化反応の2つの反応がTFAの生成機構であると推測された。これらは,TFAに着目した食肉製品製造工程の管理点を定めるための根拠を与える,重要な知見である。豚肉への亜硝酸塩添加によるトランス脂肪酸の生成条件を調査し,塩漬加工時の重要管理点を明らかにするため,以下の検討を行った。豚ロース肉に2%食塩および1001000ppmの亜硝酸ナトリウムを添加し,冷蔵下で塩漬を行った。塩漬後の生肉から総脂質を抽出し,メチル化,固相抽出カラムを用いたクリーンアップを行った後,本年度購入したガスクロマトグラフを用いてトランス脂肪酸の定量分析を行った。その結果,亜硝酸塩添加量が1000ppm以上になるとエライジン酸(C18:1n-9t)の含量が増加することが確認された。次に,上記と同条件で塩漬を行った肉および未塩漬肉を,食品衛生法で規定された加熱条件(中心温度63°C,30分間以上の加熱)で蒸気加熱殺菌し,トランス脂肪酸の定量分析を行った。亜硝酸塩を含まない未塩漬肉では,トランス脂肪酸の増加傾向は認められたが,統計学的に有意ではなかった。一方,加熱塩漬肉については,亜硝酸塩濃度500ppm以上の条件でエライジン酸含量が数倍増加した。また,原料肉中には検出されなかったパルミトエライジン酸(C16:1n-7t)やリノレライジン酸(C18:2n-6t)も定量可能なレベルで検出された。このことから,比較的少量の亜硝酸塩が添加された条件下では,加熱によりトランス脂肪酸が生成することが確認された。次いで,pHを4.55.5に調整した豚肉を,200ppmの亜硝酸ナトリウム共存下で塩漬し,加熱殺菌した。その後,トランス脂肪酸含量を測定したところ,pH5.0以下の条件でトランス脂肪酸の生成量が数十倍まで増加することが確認された。以上から,加熱食肉製品においてトランス脂肪酸は亜硝酸塩濃度依存的に生成し,肉のpHに依存して生成速度が変化することが確認された。このような検討はこれまで行われておらず,本研究成果は食肉衛生の観点から重要な知見であると言える。

昨年度までに、豚肉における亜硝酸塩によるトランス脂肪酸の生成には肉のpHが深く関与していることが示唆する研究成果を得た。そこで最終年度は、トランス酸生成量のpH依存性について再現性の確認を行うと共に、亜硝酸塩によるトランス酸生成機構について検討した。その結果、トランス脂肪酸の生成は主に酸性条件下で促進され、特にpHが3.0以下になると生成量が顕著に増加することが再確認された。また、ESR(電子スピン共鳴)スペクトル解析などから、この反応は強酸性条件下において亜硝酸イオンから生成した亜硝酸ラジカルによるモノ不飽和脂肪酸の酸化反応に起因すると推測された。亜硝酸ラジカルによるモノ不飽和脂肪酸のトランス異性化反応は、市販の亜硝酸ラジカル発生剤を用いた実験においても確認された。それに対し、亜硝酸イオンや一酸化窒素の共存下で行った同様の実験ではトランス脂肪酸生成を認めなかった事実は、亜硝酸ラジカルによる脂肪酸の異性化が豚肉中のトランス脂肪酸の生成要因であるという、先の実験結果を支持するものであった。本年度までに実施した研究の結果を通して、食肉加工時に多量の亜硝酸塩を添加するとトランス脂肪酸が生成するリスクがあること、亜硝酸塩によるトランス脂肪酸生成は肉のpHに依存すること、トランス脂肪酸生成は酸性条件(特にpH3.0以下)で促進されること、酸性条件下でのトランス異性化反応は亜硝酸イオンから生じる亜硝酸ラジカルによる酸化反応に起因することが明らかになった。亜硝酸塩の添加は食肉製品の色調や呈味を整えるなど重要な働きもあるため、食肉加工から除外することはデメリットも大きい。一方、発酵製品など特殊なものを除き、食肉製品のpHが5.0を下回ることはまずない。従って、一般的な食肉製品の製造管理上は、pHをモニターしコントロールすることで、トランス脂肪酸に関連するリスクを低くできると結論した。農学当初計画において目標としていた亜硝酸塩によるトランス脂肪酸の生成要因について概ね明らかとなり,食肉製品の製造工程における重要管理点が定まりつつある。今後,これまでに蓄積した知見の妥当性および再現性を確認するための追試験ならびに補完実験が必要であるが,研究の進捗状況としては順調であると判断している。当初計画では,亜硝酸塩濃度および加熱条件に関する検討を重点的に行うこととしていた。本年度は,亜硝酸塩濃度について検討がおおむね終了した。一方,加熱条件の影響に関しては,食品衛生法に準じた最低限の加熱殺菌条件について慎重に検討する必要が生じたため,他の条件を十分に検討できなかった。しかし,「トランス脂肪酸生成に関する重要管理点を知る」という目的においては,法で義務付けられた加熱殺菌条件においてもトランス脂肪酸が生成し得るという事実が確認されたことから,一定の成果は得られたと判断している。また,研究の過程でトランス脂肪酸の生成に食肉pHが影響を及ぼしていることを予測させるデータが得られた。この点については当初計画にはなかったが,本研究において重要な知見となることが予測されたことから,詳細な検討を加えることにした。それにより,食肉pHが亜硝酸塩によるトランス脂肪酸生成に相乗的な影響を与えていることを示唆する結果が得られたことは,大きな成果であったと考えている。以上のことから,研究目的の達成度について,上の通りの評価を下した次第である。本年度の検討結果から、トランス脂肪酸の生成には亜硝酸ナトリウムから低pH条件下で生成する亜硝酸ラジカルが関与していることが示唆された。今後は、電子スピン共鳴(ESR)等の機器分析により、この点について詳細に検討し、亜硝酸塩によるトランス脂肪酸の生成機構を明確にしたい。
胎生期から新生期にわたる呼吸中枢解析のためのマウス摘出脳幹-脊髄標本の開発

呼吸の神経回路は生まれて、すぐに呼吸し始められるように基本的なところは胎生期において完成していると考えられる。しかし、いつ呼吸リズムが生まれ、どのように発達するのかについては、ほとんど知られていない。また、胎生期にほぼ完成する呼吸系神経回路は遺伝子レベルで制御されていると考えられる。したがって、本研究では、胎生期・新生期マウス摘出脳幹-脊髄標本を開発することにより、胎生型から成熟型へのネットワーク変遷を追える実験系を確立し、呼吸不全を示す遺伝子欠損マウスの摘出脳幹-脊髄標本を併用することによって、呼吸リズム形成ネットワークの発達と遺伝子レベルの制御の解明を目的とする。本年度は、呼吸不全を示すHox11L2遺伝子欠損マウスの摘出脳幹-脊髄標本における呼吸性ニューロンネットワークの異常が中枢性であるのか、この異常が何によって引き起こされたものであるかを検討した。ホメオボックス遺伝子の1つであるHox11L2を欠損したマウスは、呼吸不全により生後24時間以内に死亡する。このマウスの呼吸パターンは吸息相が短く、呼吸リズムが速く、頻発する無呼吸によって特徴づけられた。このマウスからの摘出脳幹-脊髄標本においても同様の呼吸パターンであったため、これらは呼吸中枢の神経回路の異常により引き起こされたと考えられた。さらに、摘出脳幹-脊髄標本におけるHox11L2欠損型の吸息性活動は、ビククリン、ピクロトキシンの灌流、あるいはCl^-濃度を30%に下げたKrebs液により正常呼吸パターンへ変化した。従って、この欠損マウスにおいては、GABA_A依存性Cl^-チャネルによる異常抑制のために、ニューロン間の興奮性結合が弱められ、吸息性ニューロンのバースト形成の維持が十分にできないことが呼吸不全の一因として示唆された。マウスは、神経機能の発達が早く、遺伝子組み換え技術を用いることによって、遺伝子の発現と呼吸性ニューロンネットワーク解析に威力を発揮する。本研究では、胎生・新生期マウス摘出脳幹-脊髄標本を開発することにより、胎生型から成熟型へのネットワーク変遷を追える実験系を確立し、呼吸不全を示す遺伝子欠損マウスの摘出脳幹一脊髄標本を併用することによって、呼吸リズム形成ネットワークの発達と遺伝子レベルの制御の解明を目的とする。本年度は、胎生・新生マウス摘出脳幹-脊髄標本の作製と呼吸中枢ネットワークの解析を試みた。新生マウスをエーテル深麻酔後、脳幹・脊髄部分を摘出する。標本を実験灌流槽に置き、95%O_25%CO_2で飽和したクレブス液(25-26°C)で灌流する。ガラス吸引電極を用いて、横隔神経へ出力する第4(C4)頚髄前根から記録されたバースト活動を呼吸の指標とした。胎生マウス摘出脳幹一脊髄標本は、不規則な呼吸リズムが観察される日齢(E13-14)以降のマウスを使用した。マウス標本の04はE18まで不規則なバーストが混在しているが、低濃度アドレナリンにより、不規則性バーストは消失し、呼吸性ニューロンネットワークのみが強まった。新生マウス摘出脳幹-脊髄標本の延髄部(呼吸リズム形成機構が存在する)から、ホールセルパッチクランプ法を用いて、呼吸性ニューロンを細胞内記録した結果、吸息先行型ニューロン3種類と吸息性ニューロン3種類と呼息性ニューロン2種類の計8種類に分けられた。この中に成熟型に近いタイプのものが観察された。また、胎生期のマウス摘出脳幹-脊髄標本において、胎生13-16日齢のC4吸息性活動は吸息相が短い。胎生17以降のC4吸息活動は吸息相が長く新生型呼吸となる。これは、吸息性ニューロン同士の興奮性シナプスが発達したためであると考えられた。

従って、この欠損マウスにおいては、GABA_A依存性Cl^-チャネルによる異常抑制のために、ニューロン間の興奮性結合が弱められ、吸息性ニューロンのバースト形成の維持が十分にできないことが呼吸不全の一因として示唆された。
顔面神経再生におけるプロテオリシス

Motopsinと運動神経機能との関連を調べるために、マウスの耳下腺前縁での顔面神経軸索損傷後における、顔面神経核でのmotopsin mRNAの発現を検索した。神経機能は3ヶ月間ヒゲの動きを見ることで評価した。ヒゲの動きは、損傷側で術後14日まで消失し、21から35日で徐々に回復を認めた。motopsinの発現は術後14日まで減少したが、21日までに著明に回復した。対照的にgrowth-associated protein-43(GAP-43)は術後3日で発現が誘導された。これらの結果から、motopsinの発現は顔面神経運動機能の回復と関連していることが示唆された。本研究の目的は、顔面神経核で強く発現するセリンプロテアーゼ群の、顔面神経障害および再生における機能を明らかにすることである。具体的には、Transection axotomyによる軸索損傷モデル、運動神経の移植モデル等におけるmotopsinとneurosin、GAP-43などの発現動態をin situ hybridization,免疫組織化学により明らかにする。また、運動神経の移植した場合の予後とプロテアーゼの発現動態との関連を検討し、当該プロテアーゼの臨床的意義を明らかにすることを計画する。モトプシンの中枢神経系での機能を考察するために,顔面神経の軸索損傷モデルを用いて,発現をin situ hybridizationによって検討した。マウスの顔面神経損傷モデルを作成し,実験を行った。10週齢のマウスを用いて,マウス片側顔面を切開し,耳下腺前縁部で顔面神経を露出した。Facial nerveZygomatic br.とBuccal br.とを剪刀にて切断した。損傷された場合は,ひげを動かすことができなくなり,損傷されたかどうかを判別することができる。切断後,即時に顕微鏡下にナイロン糸で神経縫合を行い,再生させることとした。術後1,2,3,5,7,9,12週目において,それぞれ灌流固定したのち脳を摘出し,DIG-label(ジゴキシゲニン標識の)in situ hybridizationを行い,Motopsin,neurosinおよびGAP-43の顔面神経核での発現を観察した。その後の解析ではmotopsinは損傷後徐々に顔面神経核でのmRNAの発現が減弱した。一方neurosinは徐々に発現が誘導された。GAP-43は発現が非常に強く誘導された。このことから神経機能不全や軸索損傷時はmotopsinの発現は減弱し,neurosin,GAP-43の発現は増強することが示唆された。Neurosinの中枢神経系での機能を考察するために、顔面神経の軸索損傷モデルを用いて、発現をin situhvbridizatlionによって検討した。マウスの顔面神経損傷モデルを作成し、実験を行った。10週齢のマウスを用いて、マウス片側顔面を切開し、耳下腺前縁部で顔面神経を露出した。Faqial nerveZygomatic br.とBuccal br.とを剪刀にて切断した。損傷された場合は、ひげを動かすことができなくなり、損傷されたかどうかを判別することができる。切断後、即時に顕微鏡下にナイロン糸で神経縫合を行い、再生させることとしたb術後1, 2, 3, 5, 7, 9, 12週目において、それぞれ灌流固定したのち脳を摘出し、DIG-12bel(ジゴキシゲニン標識の)in situ hybridizationを行い、neurosinおよびGAP-43の顔面神経核での発現を観察した。解析ではneurosinは徐々に発現が誘導された。このことから神経機能不全や軸索損傷時は、neurosin, GAF-43の発現は増強することか示唆された。GAP-43の中枢神経系での機能を考察するために、顔面神経の軸索損傷モデルを用いて、発現をin situ hybridizationによって検討した。10週齡のマウスを用いて、マウス片側顔面を切開し、耳下腺前縁部で顔面神経を露出した。切断後、即時に顕微鏡下にナイロン糸で神経縫合を行い、再生させることとした。術後1,2,3,5,7,9,12週目において、それぞれ灌流固定したのち脳を摘出し、DIG-label(ジゴキシゲニン標識の)in situ hybridizationを行い、GAP-43の顔面神経核での発現を観察した。解析ではGAP-43は発現が非常に強く誘導された。このことから神経機能不全や軸索損傷時は、GAP-43の発現は増強することが示唆された。

ニューロシンの中枢神経系での機能を考察するために、顔面神経の軸索損傷モデルを用いて、発現をin situ hybridizationによって検討した。マウスの顔面神経損傷モデルを作成し、実験を行った。10週齢のマウスを用いて、マウス片側顔面を切開し、耳下腺前縁部で顔面神経を露出した。Facial nerveZygomatic br.とBuccal br.とを剪刀にて切断した。損傷された場合は、ひげを動かすことができなくなり、損傷されたかどうかを判別することができる。切断後、即時に顕微鏡下にナイロン糸で神経縫合を行い、再生させることとした。術後1,2,3,5,7,9,12週目において、それぞれ灌流固定したのち脳を摘出し、DIG-label(ジゴキシゲニン標識の)in situ hybridizationを行い、ニューロシンの顔面神経核での発現を観察した。解析ではニューロシンは発現が非常に弱く誘導された。このことから神経機能不全や軸索損傷時は、ニューロシンの発現は減弱することが示唆された。
細胞老化を規定する分子基盤の解明とアンチエイジング創薬への応用

これまで本研究室では、プロテオミクス的アプローチにより、ヒト正常線維芽細胞株(TIG-1)の細胞老化に伴い発現変化を示す16種のタンパク質を同定している。データベース解析により当該遺伝子を同定後、定量RT-PCRを行い、これら16種のうち7種の遺伝子をTIG-1細胞の分裂老化に伴い発現変化を示す細胞老化関連因子(Senescence-Associated Genes: SAGs)として同定した。これらSAGsの中で、ゴルジ体の構造・機能維持に機能していることが知られている遺伝子SAq15に着目し、細胞老化の進行に伴うゴルジ体の崩壊メカニズム、さらにはその崩壊へのSAG15の寄与を明らかにすることを目的として研究を行った。細胞老化関連因子による細胞老化誘導能を定量的に評価するために、イメージングサイトメーター(IN Cell Analyzer 1000)を用いた。まず、この遺伝子SAG15の細胞老化誘導における原因性を検証するために、若いTIG-1細胞におけるSAG15遺伝子のノックダウンを行った。その結果、老化マーカーとして知られるp21、p16の発現増強及びSA-β-Gal活性の増強、さらには増殖能力の低下といった細胞老化様の表現型を示し、SAG15のノックダウンが細胞老化を誘導することが明らかとなった。また、このSAG15ノックダウン細胞では、老化細胞に見られるようなゴルジ体の面積増大、分散化が認められた。次にゴルジ体におけるSAG15の機能性を検証するために、老化したTIG-1細胞においてSAG15を強制発現した。その結果、老化細胞において構造変化が見られるゴルジ体が、SAG15遺伝子の導入とともに、細胞核近傍に集まる様子が確認された。このゴルジ体の核周辺への集積は若いTIG-1細胞で見られるものであり、SAG15導入によるゴルジ体の構造・機能修復の可能性が考えられた。つまり、SAG15が細胞老化に伴うゴルジ体崩壊の原因であることが考えられた。これまで当研究室では、ヒト正常線維芽細胞をモデル細胞として用い、細胞の老化とともに発現を変化させるタンパク質をプロテオミクス的アプローチにより16種類同定している。それぞれのタンパク質に相当する細胞老化関連遺伝子の発現は、細胞老化の進行とともに大きく変化することが定量PCR法により明らかとなった。本研究では、これら遺伝子のうち、細胞老化とともに発現増強することが明らかとなった7種の細胞老化関連遺伝子に焦点を絞り、炎症及び炎症性疾患への寄与を明らかにすることを目的として研究を行った。モデル細胞としては、ヒト正常線維芽細胞TIG-1細胞を用い、炎症性サイトカインとしてはIL-6に焦点を当てた。細胞老化因子・細胞老化関連遺伝子の発現は定量RT-PCR法により測定した。まずTIG-1細胞の分裂老化に伴う炎症性サイトカイン発現の変化を定量RT-PCR法により定量した結果、TIG-1細胞の分裂老化に伴いIL-6発現が顕著に増大していることが明らかとなった。次に、早期老化を誘導することが知られている炎症性サイトカインであるIL-6でTIG-1細胞を処理したところ、7種の細胞老化関連遺伝子の発現が顕著に増大していることが明らかとなった。以上の結果、細胞老化シグナルと炎症系シグナルに何らかのクロストークがあり得ること、またそのクロストークに当該細胞老化関連因子が寄与しうることが明らかとなった。そこでさらに、炎症を起点とする各種疾患の発症に対し、細胞老化関連因子が寄与しうるかを、疾患患者由来cDNAを用いた定量RT-PCR法により検証した。糖尿病患者組織由来cDNAを用いた解析の結果、ほとんどの細胞老化関連因子が炎症及び炎症を起点とする疾患の発症に対し、重要な寄与をしているものと考えることができ、これら細胞老化関連因子が新たな炎症性疾患マーカーあるいは創薬ターゲットになりうるものと考えられた。これまで当研究室では、プロテオミクス的アプローチにより、ヒト正常線維芽細胞株(TIG-1)の細胞老化に伴い発現変化を示す16種のタンパク質を同定している。データベース解析により当該遺伝子を同定後、定量RT-PCRを行い、これら16種のうち7種の遺伝子を、TIG-1細胞の分裂老化に伴い発現増強する細胞老化関連因子として同定した。そこでまず各種細胞老化関連因子の細胞老化誘導能を定量的に評価するために、イメージングサイトメーター(IN Cell Analyzer 1000)及び新たなβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質を用いた、細胞老化誘導検証のための蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイを新たに構築した。次に、これら7種類の細胞老化関連因子の細胞老化プログラムにおける役割を明らかにすることを目的として研究を行った。まず、レトロウイルスを用いてこれら細胞老化関連因子7種を恒常的にノックダウンしたTIG-1細胞を用い、細胞老化誘導に対する寄与を解析した。その結果、細胞老化因子として知られるCDKインヒビターp21及びp16を含む2種の細胞老化関連因子をノックダウンしたTIG-1細胞において、細胞老化誘導が阻害される様子が観察された。次にレトロウイルスを用い、これら細胞老化関連因子の強制発現を行った結果、p21及びp16とともに、6種の遺伝子に細胞老化誘導能及び細胞増殖抑制効果が観察された。以上の結果から、当該細胞老化関連因子のなかに、細胞老化プログラムの誘導及び維持に必須の役割を演じる因子が含まれていることが明らかとなった。

データベース解析により当該遺伝子を同定後、定量RT-PCRを行い、これら16種のうち7種の遺伝子をTIG-1細胞の分裂老化に伴い発現変化を示す細胞老化関連因子(Senescence-Associated Genes: SAGs)として同定した。これらSAGsの中で、ゴルジ体の構造・機能維持に機能していることが知られている遺伝子SAq15に着目し、細胞老化の進行に伴うゴルジ体の崩壊メカニズム、さらにはその崩壊へのSAG15の寄与を明らかにすることを目的として研究を行った。細胞老化関連因子による細胞老化誘導能を定量的に評価するために、イメージングサイトメーター(IN Cell Analyzer 1000)を用いた。まず、この遺伝子SAG15の細胞老化誘導における原因性を検証するために、若いTIG-1細胞におけるSAG15遺伝子のノックダウンを行った。その結果、老化マーカーとして知られるp21、p16の発現増強及びSA-β-Gal活性の増強、さらには増殖能力の低下といった細胞老化様の表現型を示し、SAG15のノックダウンが細胞老化を誘導することが明らかとなった。また、このSAG15ノックダウン細胞では、老化細胞に見られるようなゴルジ体の面積増大、分散化が認められた。次にゴルジ体におけるSAG15の機能性を検証するために、老化したTIG-1細胞においてSAG15を強制発現した。その結果、老化細胞において構造変化が見られるゴルジ体が、SAG15遺伝子の導入とともに、細胞核近傍に集まる様子が確認された。このゴルジ体の核周辺への集積は若いTIG-1細胞で見られるものであり、SAG15導入によるゴルジ体の構造・機能修復の可能性が考えられた。つまり、SAG15が細胞老化に伴うゴルジ体崩壊の原因であることが考えられた。
レオロジー解析によるCVTの新設計方法:シャフトドライブCVTの動力伝達性能向上

CVTの動力伝達性能向上を目的として,表面粗さ突起の干渉を考慮したレオロジー解析手法により,トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発した.また,すべりの分担率を考慮することで,動力を無駄なく伝達できる,動力伝達経路の新設計方法を確立した.最後に,シャフトドライブCVT試験機に上記設計手法を適用した.この装置を用いて実験を行い,トルク容量と動力伝達効率を測定することで,提案した設計方法の有効性を明らかにした.CVTの動力伝達性能向上を目的として,表面粗さ突起の干渉を考慮したレオロジー解析手法により,トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発した.また,すべりの分担率を考慮することで,動力を無駄なく伝達できる,動力伝達経路の新設計方法を確立した.最後に,シャフトドライブCVT試験機に上記設計手法を適用した.この装置を用いて実験を行い,トルク容量と動力伝達効率を測定することで,提案した設計方法の有効性を明らかにした.本研究はトラクションドライブを用いた平行軸間で動力伝達を行うシャフトドライブCVTの動力伝達性能向上に関するものであり,それを通して種々のCVTの高性能化に関する設計方法を確立する.CVTの設計には,機械要素,トライボロジー,設計工学等の高度な融合が必要であり,本研究の推進によりそれらの学術分野の発展への寄与が期待できる.社会的には,環境対策へ貢献するための自動車の燃費向上を目指している.本研究では,表面粗さ突起の干渉及びすべりの分担率を考慮したレオロジー解析手法により、トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発する.これを適用して,トラクション油膜のせん断力を無駄なく利用できる転動体形状と動力伝達経路の新設計方法を確立する.これにより,設計段階でのCVTの性能予測や最適設計による性能向上が可能になる.上記設計方法をシャフトドライブCVTの設計に適用し,動力伝達性能の向上を図る.平成22年度は,すべりの低減と油膜せん断慮力の向上を同時実現できるゼロスピンディスクの効果を実証した.油膜せん断力シミュレーションの計算精度を向上させ,これを用いてゼロスピンディスク寸法の許容誤差を求めた.ゼロスピンディスクを製作して誤差を測定したところ,最大で3%程度となり,許容範囲であった.その後,ゼロスピンディスクをCVT試験機に組み込んで実験により性能を評価した.トラクションカーブを測定し,計算結果と比較したところ,概ね一致した.皿バネを用いて動力伝達に必要な推力を与え,効率を測定したところ,最大で95.2%を得た.これは計算結果と概ね一致している.油圧ピストンで大推力を与えたところ,動力伝達効率は低下したが,トルク容量は3.35.3倍となり,最大で194.5Nmを得た.これらにより,ゼロスピンディスクが理論通り機能していることが確認できた.本研究はトラクションドライブを用いた平行軸間で動力伝達を行うシャフトドライブCVTの動力伝達性能向上に関するものであり,それを通して種々のCVTの高性能化に関する設計方法を確立する.CVTの設計には,機械要素,トライボロジー,設計工学等の高度な融合が必要であり,本研究の推進によりそれらの学術分野の発展への寄与が期待できる.社会的には,環境対策へ貢献するための自動車の燃費向上を目指している.本研究では,表面粗さ突起の干渉及びすべりの分担率を考慮したレオロジー解析手法により,トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発する.これを適用して,トラクション油膜のせん断力を無駄なく利用できる転動体形状と動力伝達経路の新設計方法を確立する.これにより,設計段階でのCVTの性能予測や最適設計による性能向上が可能になる.上記設計方法をシャフトドライブCVTの設計に適用し,動力伝達性能の向上を図る.複数の転動体を有するトラクションドライブCVTでは,各転動体間の接触状態が異なるために,そこで生じる微小すべりに差がある.本年度は,この微小すべりの差に着目したトルク容量計算方法を確立し,これまでの研究で得られた実験結果と比較することで計算方法の妥当性を確認した.さらに,このトルク容量計算方法を適用してトラクションドライブCVTの新しい動力伝達経路設計方法を考案した。これをシャフトドライブCVTに適用して動力伝達経路を改良し,これまで不完全であったバックアップローラ機構のトルク分配機能を完全なものにした.この改良によって,トルク容量がこれまでの2倍に向上することを,計算と実験の両面により確認した。本研究はトラクションドライブを用いた平行軸間で動力伝達を行うシャフトドライブCVTの動力伝達性能向上に関するものであり,それを通して種々のCVTの高性能化に関する設計方法を確立する.本研究では,表面粗さ突起の干渉及びすべりの分担率を考慮したレオロジー解析手法により,トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発する.これを適用して,トラクション油膜のせん断力を無駄なく利用できる転動体形状と動力伝達経路の新設計方法を確立する.これにより,設計段階でのCVTの性能予測や最適設計による性能向上が可能になる.上記設計方法をシャフトドライブCVTの設計に適用し,動力伝達性能の向上を図る.前年度までに,トラクション油膜のせん断力を高精度に算出する手法を開発し,これを適用して,トラクション油膜のせん断力を無駄なく利用できる転動体形状と,各転動体間にトルクを均等分配するための動力伝達経路の新設計方法を確立した.今年度は,確立した新しい動力伝達経路設計方法に基づいてシャフトドライブCVT試験機を改良し,トルク容量と効率を測定してトルクの均等分配の効果を確認した.実験の結果,動力伝達経路の追加のみでトルク容量が最大で4倍に向上することが確認できた.本結果は概ね理論通りであった.

効率は目標とした90%に届かなかったが,最大で11.3ポイント向上させることができた.また,各ディスクとローラの接触点のすべり率を測定することで,追加した動力伝達経路が理論通りに動力を伝達していることを確認することができた.さらに,動力損失の原因となるスピンが全変速範囲で発生しないゼロスピンディスクも同時適用して実験を行い,ディスク形状が変わっても追加した動力伝達経路が有効であること,および,ゼロスピンディスクの本来の効果である微少すべりの低減も維持されていることを確認した.研究は当初計画通りに進展しており,未着手の項目は無い.また,研究成果や研究業績も当初予測に近いものが得られている.以上より,(2)おおむね順調に進展していると判断する.24年度が最終年度であるため、記入しない。研究は順調に進展しており,今後も当初計画通りに遂行する.具体的には,動力伝達経路を改良したシャフトドライブCVTに動力損失の原因となるスピンが発生しない新しい転動体を同時適用してトルク容量と動力伝達効率の計算と実験を行い,油膜のレオロジーに基づくトラクションドライブの新しい設計方法の有効性を証明する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
都市再開発における持続可能性と地域アイデンティティの関連に関する研究

都市再開発においてアイデンティティの持続可能性における意味や役割についてスイスの事例と日本の事例を対象として、「イメージアビリティ」、「場所のセンス」、「生きられた空間」を指標に明らかにした。その結果、緑や水等の自然と歩行路のネットワーク、滞留性や屋外活動の場等、都市の生活の質の向上に寄与する空間の創出、そのための官民恊働や市民や企業参加のエリアマネジメントによるスロー・デベロップメントの重要性が示された。1)国内の市街地再開発事業等都市再開発における地域アイデンティティの継承と形成および持続可能性との関連、制度について自治体担当部署への配票調査市街地再開発事業や再開発地区計画等の再開発担当部署へ、過去および現在進行中の再開発関連事業における地域アイデンティティへの配慮、位置づけ、表出されている具体的項目(アイテム)に関して配票調査を実施した。(類型化指標:環境要素:建物、オープンスペース、歴史、インフラストラクチャー等、マネジメントプロセス:マネジメント組織、マネージャー、対話プロセス、時間的ファクター、評価プロセス等)2)都市再開発における地域アイデンティティと持続可能性との関連(1)スイス及びEUの先進事例からの検討都市再開発における地域アイデンティティとの関連、位置づけについてスイスの事例(SulzerAreal地区やZurichiWest地区等)の整理と具体的事象は在スイスの研究協力者Hans Binder(スイスベルン応用科学大学教授)と現地でヒアリングや研究討議を開催し、アイデンティティと持続可能性の表出例や課題からチェック項目を抽出した。(2)環境問題からの持続可能性とアイデンティティとの関連緑地や地形(ランドスケープ)との関連から持続可能性とアイデンティティの関連を国内事例からGIS解析を行った。3)制度面の課題(1)文献調査持続可能性と地域アイデンティティの関連に関する我が国の都市再開発の法制度面での記載および、運用のマニュアル等での実態(限界があるとしたらどの点か)を把握した。(2)ヒアリング調査対象専門家:国土交通省の担当部署、再開発のコンサルタント、デベロッパー等へ都市再開発における持続可能性と地域アイデンティティの関運への認識や課題についてヒアリングを実施した。都市再開発においてアイデンティティの持続可能性における意味や役割についてスイスの事例と日本の事例を対照に調査を行った。スイス等欧州では古い建物の保全、暫定的利用(インビトウィーン・ユース)、オープンスペースなどが環境面での持続可能性と関連しながら地域アイデンティティの継承となり、他との差異化を生み、経済的な持続可能性につながるという点を明らかにした。この点を日本の事例においてアイデンティティの継承はどう持続可能性に寄与しうるか、という日本での文脈から検討しようとした。そこで国内の市街地再開発事業実施自治体の担当者に配票調査を行い、その結果、163件の回答を得て分析を行い、さらに現地調査も実施した。その結果、以下の点を把握した。敷地内のオープンスペースやランドスケープへの期待も高いという傾向をつかんだ。しかし、スイス等欧州に見るような古い建物の保全についての可能性に否定的な意見を得た。伝統的建物の少なさや、制度、耐震性等が問題として指摘されている。オープンスペースの工夫にそれら開発前の土地の記憶を継承する形のオブジェを配置する例が見られるが、長野県の飯田市のように蔵をオープンスペースに配置するというような部分的な形では可能である。規模として、再開発ビルの巨大さに比べて、小さい装飾的なものであるが、それでも利用を含めて地域のアイデンティティ形成に寄与している点は評価される。制度面からの困難さはあるもののこのようなオープンスペースとあわせた歴史的文脈からのランドスケープデザインにおける固有性はアイデンティティと持続可能性の統合された解決策となる可能性が示されている。また他のオープンスペースとのネットワーク等、敷地外の地域へ広げたエリアマネジメントによって、その活かされた方も決まってくる。都市再開発においてアイデンティティの持続可能性における意味や役割についてスイスの事例と日本の事例をもとに検討してきた結果をとりまとめた。アイデンティティと持続可能性の概念の検討から「イメージアビリティ」、「場所のセンス」、「生きられた空間」を指標に、国内の事例の追跡調査とともに、海外の先進事例を収集し、分析を行なってきた。これまでの日本とスイスの事例では、日本のスクラップ&ビルドに対して、スイスの事例のように古い建物の再利用のコンバージョン、暫定利用(インビトウィーン・ユース)等の目に見える歴史的継続性がアイデンティティと持続可能性に貢献する点が明らかであった。しかしスェーデンのマルメ市の例のように古い港湾工業地の新規再開発において、100%再生可能エネルギーや資源循環、屋上緑化、魅力的なオープンスペース、建築デザインの隠喩的シンボル継承によってアイデンティティと持続可能性が強化する可能性が示された。いずれにおいてもオープンスペースにおいて緑や水等の自然と歩行路のネットワーク、滞留生やアクティビティにとっての質の向上等、都市の生活の質の向上に寄与し、またそれら空間の形成や活動を含めた官民協働のエリアマネジメントの重要性が認められる。

これらの結果から、我が国の制度面においては、都市再開発法自体が高度経済成長時代の土地の価格上昇を前提にした制度であることからの根本の課題を抱え、また土地の権利調整、道路を中心としたインフラ整備に主眼がおかれて地域全体のビジョンや計画、周辺の事業所や居住者を含めた参加の過程が不十分であり、これら断絶が事業後の成果、地域の発展にとっての成果にも課題を抱える。構想、計画、実施、事業後の運営管理等の全体を一貫してマネジメントする体制も不十分である点も大きな課題である。都市の「縮小」時代の再開発の方向として、エリアマネジメントによるスロー・デベロップメントが可能な制度への転換が求められる。
C型肝炎ウイルスの感染初期過程の分子機構

HCVの受容体候補分子であるhCD81を全く発現していないHepG2細胞にHCVのエンベロープ蛋白質を持ったシュードタイプVSV (HCVpv)が感受性を示すことから、HCVの感染にhCD81以外の細胞表面因子の関与が示唆された。HCVpvの感染はヒト繊維芽細胞成長因子(hFGF)、特にFGF2とFGF7によって阻害され、可溶化型のhFGF受容体5(hFGFR5)がHCVpvの感染性を特異的に阻害した。また、hFGFR5を恒常的に発現するCHO細胞株はHCVpvの感染を許容できるようになり、siRNAによってhFGFR5をHepG2細胞からノックダウンさせると感受性の低下が観察されたことから、hFGFR5がHCVpvの新規受容体であることが示唆された。これまでは、CHO細胞で発現させたHCVエンベロープ蛋白質を被ったシュードタイプウイルスを用いて解析を進めてきたが、293T細胞で作製したシュードタイプレトロウイルスはhCD81依存的な感染性を示し、HepG2細胞には全く感受性を示さなかった。そこで、HCVのエンベロープ蛋白質を発現させたCHO細胞と293T細胞を用いて、それぞれHCVpv/CHOとHCVpv/293Tを作製した。両シュードタイプウイルスとも高マンノース型のエンベロープ蛋白質を保持していた。HCVpv/CHOはhFGFR5依存的にHepG2細胞に高い感染性を示したのに対し、HCVpv/293TはhCD81依存的にHuh7細胞に高い感染性を示した。また、慢性C型肝炎患者血清中にはHCVpv/293Tに対する高い中和抗体が高率に検出されたのに対し、HCVpv/CHOに対する中和抗体価は低かった。患者血清中に存在する天然のHCV粒子も、HCVpvと同様にHepG2細胞とHuh7細胞に結合した。HCV粒子のHepG2細胞への結合は可溶型hFGFR5や抗hFGFR5抗体で、また、Huh7細胞への結合は抗hCD81抗体によって阻害された。細胞培養系のないC型肝炎ウイルス(HCV)の感染の初期過程を解析し、以下の成績を得た。1)1HCVのエンベロープ蛋白質を被ったシュードタイプ水疱性口内炎ウイルス(VSV-pp)はHepG2細胞に特異的に感染し、昆虫細胞で作製したHCV様粒子(HCV-LP)の添加により濃度依存的に感染が阻害されたことから、VSV-ppとHCV-LPが同一の再棒表面分子と結合しているものと推測された。2)ヘパリンがVSV-ppの感染を阻害することから、ヘパリンとの結合が活性発現に重要な各種成長因子によるVSV-ppの感染阻止活性を調べたところ、FGF、特にFGF2とFGF7がVSV-ppの感染を特異的に阻害した。FGFの可溶化型の受容体(FGFR)の中で、FGFR4とFGFR5がVSV-ppの感染を特異的に阻害し、HCV-LPやC型肝炎患者血清中のHCV粒子とも結合した。また、セファロースに固層化したFGFR4とFGFR5はHCV-LPのみならず、ウインドウ期血清中のHCVを特異的に沈降した。

3)FGFR4あるいはFGFR5を恒常的に発現するCHO細胞はHCV-LPや患者血清中のHCVと特異的に結合した。特にFGFR5を発現するCHO細胞株はVSV-ppの感染を許容できるようになり、siRNAによってFGFR5をHepG2細胞からノックダウンさせると感受性の低下が観察されたことから、FGFR5がVSV-ppの侵入受容体である可能性が示唆された。一方、HepG2細胞から、siRNAによってFGFR4をノックダウンさせても、VSV-ppに対する感受性の低下は観察されなかった。以上の成績から、FGFR4とFGFR5がHCVの新しい受容体候補分子であることが示唆された。4)これまでに、糖鎖付加部位を欠損あるいは新たに導入した変異E1蛋白質の解析により、糖鎖修飾の有無を指標にしてそのトポロジーを解析した結果、E1蛋白質はこれまで考えられていた1型糖蛋白質よりも、小胞体膜を2回貫通して比較的大きな細胞質領域を保持したトポロジーを取る可能性が示唆された。さらに、この細胞質領域とコア蛋白質が特異的に結合することが示された。HCVの受容体候補分子であるhCD81を全く発現していないHepG2細胞にHCVのエンベロープ蛋白質を持ったシュードタイプVSV(HCVpv)が感受性を示すことから、HCVの感染にhCD81以外の細胞表面因子の関与が示唆された。HCVpvの感染はヒト繊維芽細胞成長因子(hFGF)、特にFGF2とFGF7によって阻害され、可溶化型のhFGF受容体5(hFGFR5)がHCVpvの感染性を特異的に阻害した。また、hFGFR5を恒常的に発現するCHO細胞株はHCVpvの感染を許容できるようになり、siRNAによってhFGFR5をHepG2細胞からノックダウンさせると感受性の低下が観察されたことから、hFGFR5がHCVpvの新規受容体であることが示唆された。これまでは、CHO細胞で発現させたHCVエンベロープ蛋白質を被ったシュードタイプウイルスを用いて解析を進めてきたが、293T細胞で作製したシュードタイプレトロウイルスはhCD81依存的な感染性を示し、HepG2細胞には全く感受性を示さなかった。そこで、HCVのエンベロープ蛋白質を発現させたCHO細胞と293T細胞を用いて、それぞれHCVpv/CHOとHCVpv/293Tを作製した。両シュードタイプウイルスとも高マンノース型のエンベロープ蛋白質を保持していた。HCVpv/CHOはhFGFR5依存的にHepG2細胞に高い感染性を示したのに対し、HCVpv/293TはhCD81依存的にHuh7細胞に高い感染性を示した。また、慢性C型肝炎患者血清中にはHCVpv/293Tに対する高い中和抗体が高率に検出されたのに対し、HCVpv/CHOに対する中和抗体価は低かった。患者血清中に存在する天然のHCV粒子も、HCVpvと同様にHepG2細胞とHuh7細胞に結合した。HCV粒子のHepG2細胞への結合は可溶型hFGFR5や抗hFGFR5抗体で、また、Huh7細胞への結合は抗hCD81抗体によって阻害された。
金属ポルフィリノイド-典型元素間の結合形成と反応性を支配する配位子効果

テトラピロール配位子骨格と中心金属の反応性との相関関係を明らかにするために、今年度は、ポルフィリンのメソ位の1つが欠損した環状テトラピロール環であるコロールに着目し、そのコバルト錯体とジアゾ酢酸エチルとの反応および触媒的シクロプロパン化反応について検討した。ベンゼン中、室温において、コロールコバルト(III)錯体とジアゾ酢酸エチルとの反応を紫外可視吸収スペクトルにて追跡したところ、速やかなスペクトル変化が観測され、カルベノイド錯体の生成が示唆された。しかし、スチレンを添加しても、劇的なスペクトル変化が見られなかったことから、別の化学種であると考えられた。そこで、プロトンNMRによる反応追跡を行ったところ、-3.5から-2.0ppm付近に2本のピークが出現し、2種類の化学種の生成を示した。この2つの化学種は、約3日かけて1種類の化学種に収束し、反応後のFAB-HRMSスペクトルより、N-架橋錯体の質量数と一致する結果が得られた。また、収束に至るまでの期間に、スチレンを大過剰加えると、わずかながら、対応するシクロプロパンの生成が観測された。従って、コロールコバルト錯体とジアゾ酢酸エチルとの反応により、速やかに2種類のN-架橋錯体が生成し、これら2種類の化学種がカルベノイド中間体を経由しながら熱力学的に安定な一方のN-架橋錯体へ移行すると考えられる。DFT計算による構造最適化を実施し、2種類のN-架橋錯体のエネルギー差は、32kcal/molを見積もられた。以上、これまで一般のポルフィリンコバルト錯体では見られないジアゾ酢酸エチルとの反応が、コロールコバルト錯体で観測された。本研究では、遷移金属-典型元素結合の反応性における遷移金属上の配位子の効果を系統的に明らかにすることを目的して、テトラピロール系配位子を有するコバルトおよびニッケル錯体を取りあげ、中心金属上での14族元素との結合生成および結合後の反応性を検討した。特に本年度は、遷移金属に対する配位子効果を系統的に検討するために、ポリフィリンに代表されるテトラピロール系配位子に着目した。テトラピロールは、ピロールの配列の仕方を変える、あるいは側鎖の置換基導入により、様々な構造・電子状態を取る。そこで、まず、複数の酸化数およびスピン状態を取りうるコバルト錯体に注目し、ポルフィリノイドコバルト-14族元素との結合生成を試みた。ポルフィリノイドとしては、いわゆるポルフィリンとその異性体のポルフィセンを合成し、コバルト錯体とジアゾアセテートとの反応を追跡し、カルベン発生の挙動を精査した。その結果、コバルトポルフィリンは、通常のカルベン反応が進行し、オレフィンのシクロプロパン化が進行するが、コバルトポルフィリンは、Co=C結合が形成した後に、反応性が高すぎるため、分子内でのCo-C-N(pyrrole)架橋結合が形成する極めて興味深い反応を見出した。この構造は、Mass及びUV-visによって、同定した。このように、配位子の構造を若干変化させただけで、金属錯体の反応性が劇的に変化することが明らかとなり、ポルフィセンの反応性を活かした新たな金属錯体の触媒反応への応用が期待されることが明らかとなった。