hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内分泌・代謝疾患モデルにおけるインフラマソーム作用機序の解明

炎症機構の一つインフラマソームの活性化機構を明らかにする為に、タンパク複合体インフラマソームを構成する分子群をTOF-MSを用いて網羅的な解析を行なった。候補分子の一つであるE3ユビキチンリガーゼは、インフラマソーム構成分子のひとつと特異的に結合し、ユビキチン化を誘導し、分解を促進することを明らかにした。また、この分子は、インフラマソーム構成分子の分解を介して、インフラマソームの活性化に抑制的に働くことを明らかにした。以上の結果よりユビキチン化を介したインフラマソーム構成分子の分解調節機構を明らかにした。本研究課題は、炎症経路の一つであるインフラマソームの作用機序を明らかにすることによって内分泌代謝疾患に対する新規治療薬や予防法の解明に繋がる知見を得ること目的としている。研究課題のうちの一つであるインフラマソーム活性化機構の解明に関する研究に関して、我々は分子複合体であるインフラマソーム自身を単離して、質量分析法を用い構成分子の解析を行なった結果、新規結合分子の候補を得た。この分子は、既知のインフラマソーム構成分子の一つであるNLRP3と結合することを免疫沈降法により明らかにした。また、血球系の細胞株にこの分子を強制発現させた結果、インフラマソームの活性化に抑制的に働くことを明らかにした。この分子は、E3ユビキチンリガーゼであり、ユビキチン修飾を介してインフラマソームの活性化機構に影響を与えていると考えている。現在、我々は1この分子がインフラマソームの活性化機構に与える影響を詳細に明らかにしようとしている。具体的には、インフラマソーム構成分子のユビキチン化の検出や、ユビキチン化の阻害がインフラマソーム活性化に与える影響を明らかにしようとしている。次に2内分泌代謝疾患モデルマウスを用い、この分子の発現調節が疾患の発症にどのような影響を持つかを明らかにしようとしている。上記研究計画に従い、インフラマソームの作用機序を明らかにすることによって、本研究課題の目的である内分泌代謝疾患に対する新規の治療標的を見つけようとしている。平成24年度は、インフラマソーム構成分子ASCを介した細胞内炎症反応制御機構を明らかにする為に、細胞中のASC複合体の単離精製を行った。具体的には、まずASCにタグを付けたタンパクをヒト単球系の細胞株THP-1に発現させる為にレンチウイルスを使った発現系の構築を行った。次に、タグに対する抗体を使った免疫沈降法により、ASC複合体を精製し、その複合体の構成タンパクの単離を行おうとした。しかしながら、ASC複合体は、分子量が700kDa以上の巨大なタンパク複合体を形成するため、遠心を使った分離法において不溶画分に大部分が残ってしまい、今後の解析に必要な量の精製が出来なかった。そこで、グリセロール濃度勾配遠心法を使い、ASC複合体の分離を行った。現在この分離法によりASC複合体を精製し、銀染色やMS解析によりASC複合体の構成分子について明らかにしていく予定である。また、ASCの細胞内の局在やインフラマソーム複合体の形成をライブイメージングで観察する為に、GFPとASCの融合タンパクを作った。それによって、ASCタンパクが、未活性化状態では細胞質中に拡散しているが、刺激を行うと核膜辺縁部に固まりを形成することを明らかにした。また細胞質中と核内に存在しており、核内のASCがどのようにインフラマソーム活性化に関与しているか現在解析中である。インフラマソーム構成分子ノックアウトマウス研究により、未知の活性化経路の存在が示されて来た。更に、細胞内の挙動や局在がインフラマソームの活性化に重要であると考えられている。ASC結合分子の解析は、インフラマソームに関する未知の活性化経路を明らかにするとともに、ASC分子の挙動を仲介する分子を明らかにする事が出来ると考えている。それによりインフラマソームが関連する疾患の治療法や予防法の開発に繋がることが期待される。本研究課題は、炎症経路の一つであるインフラマソームの作用機序を明らかにすることによって、炎症の関与する内分泌代謝疾患に対する新規治療薬や予防法の解明に繋がる知見を得ること目的としている。インフラマソーム活性化機構の解明を行なうため、分子複合体インフラマソーム自身を単離し、質量分析を行なった結果、新規結合分子の候補を得た。候補分子のひとつにユビキチン修飾に関与するE3ユビキチンリガーゼがあり、その分子Xに着目して研究を行った。(未発表データの為、分子Xとする)1.ヒト胎児由来腎臓細胞293T細胞株を用いた分子Xの強制発現系を作成し、免疫沈降法によりインフラマソーム構成分子の一つとの特異的に結合、ユビキチン化を誘導することを明らかにした。更に結合ドメインの同定を行なった。2.白血病ヒト

由来単球細胞株THP-1に対して、レンチウイルスを用いて分子Xの強制発現系と遺伝子欠損株を作成し、解析を行なった。遺伝子欠損株では、ユビキチン化の標的となるインフラマソーム構成分子がタンパクレベルで増強し、強制発現株では減少した。ユビキチンの標的分子は遺伝子レベルでは差が無いが、タンパクレベルで差があるため、ユビキチン修飾によるタンパク分解を介した調節が行なわれていると考えている。ATPやナノシリカによるインフラマソーム刺激に対して、候補分子の遺伝子欠損株ではサイトカインの分泌が上昇する。この結果より分子Xはユビキチン修飾を介したインフラマソーム構成分子の分解によりインフラマソームの活性化に抑制的に働くことを明らかにした。以上の結果をより詳細に解析し、論文に投稿するための準備をしている。免疫学インフラマソーム自身が難溶性の分子複合体であるため、当初計画していた免疫沈降法による精製が出来なかったため、濃度勾配遠心法による精製を行なった。また、その他にも実験系に変更・工夫が必要であったため、質量分析法を用いたインフラマソーム構成分子の解析系の確立まで時間が掛かった。現在、実験系が確立し、結合分子の候補も得られ、実際にインフラマソームの活性化機構に影響を与える結果が得られている。その結果、当初2年で本研究を行なう計画であったが、3年間に延長した。本来の予定では、平成24年度の内にASC複合体の構成分子に対するTOF-MSを使った解析を行う予定であった。しかしながら、ASC複合体は巨大分子であり、免疫沈降を用いた精製法ではうまく分離する事が出来なかった。大部分が不溶画分に存在しており、従来の免疫沈降法でTOF-MS解析を行うレベルに精製する事が出来なかった。結果として、当初予定していたASC結合分子の同定までは至らなかった。現在、ASC複合体が巨大分子であることを利用し、グリセロール濃度勾配やゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分子の大きさで分ける事によって、ASC複合体を精製している。1我々が見つけた新規インフラマソーム構成分子が、インフラマソームの活性化機構に与える影響を詳細に明らかにしようとしている。この分子がE3ユビキチンリガーゼであるため、具体的には、インフラマソーム構成分子のユビキチン化の検出や、ユビキチン化の阻害がインフラマソーム活性化に与える影響を明らかにしようとしている。次に2内分泌代謝疾患モデルマウスを用い、この分子の発現調節が疾患の発症にどのような影響を持つかを明らかにしようとしている。上記研究計画に従い、インフラマソームの作用機序を明らかにすることによって、本研究課題の目的である内分泌代謝疾患に対する新規の治療標的を見つけようとしている。単離したASC複合体構成分子の解析をTOF-MS解析によって行う。同定された結合分子の解析の為、発現ベクターやsiRNAを用いた発現調節を行い、インフラマソームの活性化やその他の自然免疫活性化経路についてどのような影響があるか評価する。それらの解析によって有力な候補分子に対して、細胞内の挙動を明らかにするために蛍光タンパクとの融合タンパクを作る。また、ASCとの結合部分を明らかにする為に、ASCのアミノ酸変異体を作製する。これらの実験によりASC結合分子の同定、機能の解析を行おうと考えている。
高精度非干渉動作制御に基づく人と共存するロボットシステムの構築

本年度は、人と共存するロボットシステムの構築へ向けた高度な制御手法のための二つの大きな研究成果をあげた。第一に、斜交座標制御を実際のロボットシステムへと適用しその有用性を確かめた。まず、位置拘束バイラテラル制御を実現し、その安定性を解析した。また、斜交座標制御による多自由度ミクロマクロバイラテラル制御を多自由度手術ロボットに実装し、マウスの生体実験をした。斜交座標制御により非常に高精度な応答を得ることができたので、マウスの生体インピーダンスをリアルタイムに計算・取得することが可能になった。それにより、肝硬変のマウスの肝臓が硬化していることをリアルタイムかつ定量的に呈示できた。遠隔手術へも応用され非常に有用性が高いことが評価され、テレビや新聞等のメディアからの取材を受けた。第二の成果として、昨年度提案した新しい運動方程式を利用し、モバイルハプトのヨーレートの制御や速度の拘束を実現した。提案した運動方程式では、すべてのタスクを座標変換として扱うことが可能であり、それによりタスクの動特性を容易に導出できる。ヨーレートの制御や速度の拘束の実現もモバイルハプトの実現と完全に非干渉化されたタスクとして実装可能である。本年度の研究内容は、査読付き論文誌に一編が掲載され、査読付き国際会議にて二回発表した。第一に、斜交座標制御を提案した。本手法では、ロボットに与えられる複雑なタスクを座標変換と捉えることにより、位置と力のハイブリッド制御の問題へと帰着させる。これにより、複雑なタスクを簡単かつ高精度に実現することが可能になる。多自由度ロボットハンドでのバイラテラル制御を実現するうえで、そのタスクやロボット間の動特性による干渉を正確に記述した上で制御しなければならず非常に困難であったが、斜交座標制御によりそのような問題も解決された。現在までに斜交座標制御を用いて、ミクロマクロバイラテラル制御・異構造バイラテラル制御・冗長バイラテラル制御・ポジションリミットつきバイラテラル制御などを実現した。第二の成果として、一般的なタスクの記述を可能にする新しい運動方程式を提案した。斜交座標制御では、タスクが位置または時間の関数でなければならないという制約があった、これはラグランジュ方程式の座標変換がそのような制約を有することに起因する。より一般的な運動方程式として知られる正準方程式では、座標変換が任意には決められない、座標変換が代数的には与えられない、外力項を記述することが不可能である、といった大きな三つの問題があった。提案運動方程式により、正準方程式の三つの問題点は完全に解決され、任意の座標変換を代数的に実現され、外力項も記述可能になった。提案運動方程式を用いた制御系の実装例として、モバイルハプトを実現した。本年度の研究内容は、査読付き論文誌に一編が掲載され、査読付き国際会議にて三回発表した。
新しい糖尿病網膜症モデルの確立

糖尿病網膜症について、現在手術・薬物を含め種々の治療が行われていますが、視覚障害の重要な原因であり、未だ失明の原因の第三位となっています。我々は新たな治療方法として、細胞内の蛋白質のリサイクルともいえる「オートファジー」を制御することが有効ではないかと考えています。今回の研究では、新たに作成したオートファジーに障害のある糖尿病マウスを用いてオートファジーの糖尿病網膜症への影響を調べ、新しい治療法の確立へつなげようと考えています。
細胞膜類似の二分子膜を素材としたインピ-ダンス法による化学物質の高感度センシング

細胞膜に類似の構造、機能をもつ分子集合体である人工の二分子膜を素材とするインピ-ダンス法に基づく新しい二分子膜センサの開発に関し以下の成果を得た。(1)二分子膜化合物の合成・・・グルタミン酸を骨格とするアンモニウム型の二分子膜化合物を合成し、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用いてポリイオンコンプレックス型脂質を調製した。(2)修飾電極作成・・・金製パタ-ン電極をスクリ-ン印刷の手法で作成した。上記のポリマ-型脂質をクロロホルムからキャストし、各種の二分子膜修飾電極を得た。(3)インピ-ダンス応答・・・修飾電極に100mVの交流電圧を印加し、所定濃度のガスを導入した。これより以下のセンサ特性が観測された。i)二分子膜センサは、ベンゼン、酢酸エチル等の極性の低いガスにはほとんど応答が見られなかった。ii)水蒸気、アルコ-ル、アミン、二酸化イオウ、塩酸、酢酸などの極性が大きいガスには高感度に応答した。たとえば、トリエチルアミンに対しては数10ppmという低能度でもインピ-ダンスの低下が見られた。応答速度も1分以内であった。ガス濃度に対する応答の直線性も満足できるものであった。(4)応答メカニズムについて・・・応答メカニズムとして、i)ガスの二分子膜表面への吸着に伴なう伝導キャリアの発生と、これによるインピ-ダンス低下、ii)ガス吸着による二分子膜の流動性変化が考えられる。現在のところi)が主であると推定される。
極および超低出生体重児の18か月頃の行動と幼児期後期の発達特徴との関連の検討

前回実施した研究の参加児(修正月齢1歳6か月から2歳までの極または超低出生体重で生まれた、医学的合併症、先天性疾患および神経発達障害を有しない幼児)の保護者を対象に、児が35歳となった際に質問紙(CBCL1.5-5)調査を実施した。保護者宛てに郵送法により本研究について明示する文書を提示し、協力することに了解が得られた場合にCBCL1.5-5を返送していただいた。結果、13名のデータを収集することができた。得られたデータはスコアリングソフトへ入力し、7つの症状尺度(情緒的反応、不安抑うつ、身体的訴え引きこもり、睡眠の問題、注意の問題、攻撃的行動)、2つの上位尺度(内向尺度、外向尺度)、総得点を分析した。総得点を見ると、13名中1名が臨床域、2名が境界域であった。内向尺度では、1名が臨床域、2名が境界域であった。外向尺度では、1名が境界域であった。症状尺度では、「注意の問題」を示した児は臨床域で1名、境界域で5名みられ、「引きこもり」で2名が臨床域、1名が境界域を呈した。また、「不安/抑うつ」で3名が境界域を呈し、「睡眠の問題」を示した児が境界域で2名みられた。1歳半から2歳の時に実施したM-CHATの結果、通過した10名のうちCBCLのT得点が総得点、内向尺度、外向尺度のいずれも正常域であったのは8名で、1名が総得点と内向尺度が臨床域、外向尺度が境界域を示し、1名は総得点で境界域を呈した。M-CHAT不通過であった3名のうち、1名は総得点および内向尺度が境界域、1名は内向尺度が境界域、1名は総得点、内向尺度、外向尺度のいずれも正常域であった。極および超低出生体重児は、幼児期早期に情緒や行動の問題が見られなくても後期以降に顕在化することがある一方、幼児期早期に問題が認められても後期には落ち着く場合も考えられることが示唆された。平成30年度の研究実施計画として、1)データ収集・整理: VLBW・ELBW児約50名1CBCL1.5-5を用いた保護者への質問紙調査、21のデータをコード化して入力、32のデータをスコアリングソフトにて解析2)これまでに得られた結果をまとめ、関連学会にて発表、を挙げた。ほとんど計画どおりに実施できたが、収集できたデータ数が13名分と少なかったため、やや遅れていると判断した。調査票の回収率の向上に努めながらデータ収集を継続し、より多くののデータを得られるように進めていく。得られたデータは、統計解析ソフトを利用して2群間比較や経時的変化等の解析をする。

調査票の回収率の向上に努めながらデータ収集を継続し、より多くののデータを得られるように進めていく。得られたデータは、統計解析ソフトを利用して2群間比較や経時的変化等の解析をする。〈理由〉購入予定のパソコンを今年度購入できなかったことが最大の理由である。加えて、書籍や消耗品の購入も少なかったために、次年度使用額が(B-A)が生じたと考える。〈使用計画〉次年度はパソコンを購入するとともに、今年度参加した米国公衆衛生学会よりも高額なアジア大洋州小児神経学会の参加費として使用する予定である。また、必要な書籍を購入するためにも使用したいと考える。
新たなアプローチによるアミロイド沈着機構の解明と原因蛋白質の検出法に関する研究

SELDI-TOF MSを用い、異型TTRを迅速に検出できることを明らかにした。アミノ酸変異に由来する理論的な質量差とSELDI-TOF MS実測値の差は良好に相関した。本システムはFAPの診断に有効と考えられる。しかし、一部のTTR変異型のFAPで異型TTRが検出困難であることも判明した。その理由として、(1)野生型TTRと質量差がわずか(15Da未満)である場合と、(2)異型TTRの産生が低下している場合があった。これらの変異型TTRを持つFAPは稀であるが注意が必要である。1.アミロイド形成に関運した因子の網羅的解析マウスにAAアミロイドーシスを惹起させ経時的に安楽死させた後に肝臓と脾臓を採取しRNAを抽出した。オリゴDNAチップを用いて網羅的な遺伝子発現変動を解析したところいくつかの遺伝子で発現が増減することが判明した。対照として炎症のみを惹起させたマウスを便用した。これらの潰伝子が増減していることを確認するため、プライマーを設計しリアルタイムPCR法でmRNAレベルを確認中である。また、血清を用いてSELDI TOF-MSで網羅的な蛋白質解析を行ったところ、こちらもいくつかのピークが変動していることか判明した。現在はピークの由来蛋白質の同定に向けて解析中である(1)炎症反応が強い患者血清を用いて、SAAをSELDI-TOF MSで解析したところSAA由来と考えられる複数のピークが検出された。SAAのアミノ酸が一部断片化したためと考えられた。遺伝子多型との関連を含めて検討中である。(2)SELDI-TOF MSを用い、種々の異型TTRをSELDI-TOF MSで解析し検出率の高い条件を検討したところ、Q10チップを用いて最も良好な検出が出来ることが判明した。本システムは迅速なFAP診断に有効であると考えられる。しかし、一部のTTR変異型のFAPで異型TTRが血中より検出しにくいことも判明した。病態との関運を解析中である。3.細胞株を用いたTTR代謝動熊のリアルタイム解析マウス由来の細胞株であるP19CL6を用いてTTRの動態解析を行うため基礎検討中である。1.アミロイド形成に関連した因子の網羅的解析マウスに、AAアミロイドーシスを惹起させ、タクロリムスでアミロイド形成を抑制した後に肝臓を採取しRNAを抽出した。タクロリムスによるアミロイド抑制効果に関与すると予測される遺伝子発現を解析するために、オリゴDNAチップを用いて網羅的に発現変動を解析したところ、Saa3遣伝子の発幌が抑制されていることが判明した。プライマーを設計しリアルタイムPCR法でmRNAレベルを確認したところ、マイクロアレイの結果と同様にSaa3のmRNAレベルが減少していることが確認できた。抗マウスSaa3抗体を用いて免疫染色を行ったところ、アミロイド沈着部位ど一致してSaa3の陽性像が得られた。しかし、ウエスタンブロットの結果から、アミロイド線維抽出物にはSaa3が含まれないと考えられた。本アミロイドーシスにSaa3がどの程度関与するのか、更なる検討が必要である。SELDI-TOFMSプロティンチップを用い、FAPの病原蛋白質である異型TTRを迅速に検出できることを明らかにした。アミノ酸変異に由来する理論的な質量差とSELDI-TOF MS実灘値の差は良好に相関した。検出困難な理由として、(1)野生型TTRと質量差がわずか(15Da未満)である場合と、(2)異型TTRの産生が低下している場合があった。これらの変異型TTRを持つFAPは稀であるものの、本システムを用いた診断時には注意が必要である。FAPの大部分をしめる変異型であるV30Mは、本システムで良好に検出できた。
ドリブルを用いたバスケットボール授業における状況判断力の向上に関する実証的研究

本研究の目的は、小学校バスケットボール授業における重要な学習内容としてプレー原則に着目し、認知・パフォーマンス面から状況判断力の変容を検討することであった。学習者の認知レベルについては,単元前後に「戦術的知識テスト」と「映像による状況判断テスト」を適用したところ,いずれも単元後に有意に向上した。またパフォーマンスレベルについては,ゲーム中の状況判断の適切さを分析した結果,単元序盤に比べて単元終盤に有意に向上した。これらにより、バスケットボール授業を通して,学習者はプレー原則に関する戦術的知識を習得し、それを活用しながら認知・パフォーマンスにおける状況判断力が向上することが明らかになった。H27年度(研究1年目)は、(1)戦術的知識テストの開発に向けた先行研究の収集・検討を行った。具体的には、体育授業における学習者だけではなく、競技スポーツの競技者を対象にした先行研究も取り上げ、戦術的知識・状況判断力として「何を」「どのように」評価しているのかについて検討した。そして、体育授業で活用可能な戦術的知識テストを開発するために、(2)予備的なテスト問題の作成を行った。具体的には、まず1適切な状況判断をするために必要となる「効果的な情報収集のしかた」に関する知識や「プレーのしかた」に関する知識の特定を行った。その上で、2問題となるゲーム場面・ゲーム状況をどのように提示するかという提示方法について検討した。なお、本研究は、体育授業で適用することを踏まえると、多くの対象者に対して一度に短時間で行えるという条件を考慮しなければならない。加えて、学習の記録を残すためにもテストの結果を回答用紙などに残せるものにすること、採点者が短い時間で採点できることが求められる。これらの条件をクリアするために、3回答方法につては記述式ではなく、選択肢を設定し、回答用紙にマークする形式を採用することにした。1戦術的知識として取り上げる内容、2問題の提示方法、3回答方法を確定できたことによって、作成した予備テストに対して「体育科教育の専門家によるヒヤリング調査」をはじめている。そして、このヒヤリング調査を受けて予備テストの検討・修正という工程を繰り返すことを経て、H28年度には「戦術的知識テスト」を完成させたい。研究当初の予定では、H27年度に予備テストを作成し、H28年度(研究2年目)にはそのテストに対して体育科教育の専門家へのヒヤリング調査を行い、予備テストの検討・修正を図るという工程を複数回繰り返して、「戦術的知識テスト」を完成させる予定であった。しかし、H27年度に1戦術的知識として取り上げる内容、2問題の提示方法、3回答方法を確定できたことによって、作成した予備テストに対して「体育科教育の専門家によるヒヤリング調査」をはじめることができた。戦術的知識テストの作成にあたり、平成27年度(研究1年目)は予備テストを作成した。そして、平成28年度(研究2年目)は、予備的なテスト問題の作成を通して明らかになった問題点を改善するために、体育科教育の専門家、およびバスケットボールの専門家のヒヤリング調査を行い、ディスカッションを重ねながら、テストの検討・修正を図った。具体的には、プレーの選択肢として、シュート、パス、ボールキープに「ドリブル」を加えることによって、フルゲームでのパフォーマンスの向上につながる理解度テストとするために、問題となるゲーム条件とそれに応じたプレー、問題の提示方法、回答方法等を検討し、修正を重ねた。また、子どもたちが理解しやすいようにテストの進め方についても検討し、戦術的知識テストを完成させた。次年度(研究3年目)は、授業研究として小学校高学年を対象に10時間のバスケットボール単元を実施することから、学習内容を設定し、学習内容を習得するためのゲーム教材:ドリルゲーム(主として個人的技能の習得や習熟を目的としたゲーム)・タスクゲーム(個人及び集団の技術的、戦術的能力の育成を目的とした課題の明確なミニゲーム)・メインゲーム(児童のレベルに合ったボール運動のゲーム)を設定し、単元構想を行った。また、その単元の学習成果を図る尺度として、今年度に作成した戦術的知識テストを適用する(認知レベル)とともに、ゲーム中のパフォーマンス(パフォーマンスレベル)を分析する。学校での体育授業を撮影することになることから、研究協力校に対して研究の目的・手続き・倫理的な配慮事項を説明し、了承を得た。戦術的知識テストの開発に向けて、当初の予定では、平成27年度(研究1年目)はテスト作成に向けた情報収集を行うとともに、予備的なテスト問題を作成することであり、平成28年度(研究2年目)は、これを受けて1専門家によるヒヤリング調査・ディスカッションを重ねながら戦術的知識テストを完成させることと、2次年度の授業研究に向けた準備を進めることであった。なかでも、平成28年度は専門家によるヒヤリング調査の1つとして6th International Teaching Games for Understanding Conference(TGfU国際学会)への参加を予定していたものの、テロの影響で参加することはできなかった。この他、全体を通してみると、概ね順調に進展しているといえる。小学校高学年のバスケットボール単元(10時間)における重要な学習内容として、ドリブルを含めた状況判断を取り上げ、認知面及びパフォーマンス面から状況判断力の向上を実証的に検討することを目的とした。学習者の認知レベルの状況判断力を測定する尺度として、1本研究で作成した「戦術的知識テスト」と2平成2021年度科学研究費補助金で作成した「映像による状況判断テスト」を取り上げ、単元前後に実施した。また、パフォーマンスレベルでの状況判断力は、単元序盤(2-3時間目)と単元終盤(9-10時間目)のメインゲームをパフォーマンステストに位置づけ、ゲームパフォーマンス評価法(GPAI)を用いて分析した。

対象は、2017年11月14日から12月18日にかけて、群馬県S市立T小学校6年A組24名(男子14名、女子10名)であった。1授業時間においては、準備運動の後にドリルゲームを行い(シュート、パス、ドリブル、ピボット)、次に教師による学習内容の確認を行うようにした。その後の主運動場面は、「アウトナンバーゲーム」を取り入れ、2対1(単元後半は3対2)のタスクゲームと3対2のメインゲームで構成した。その結果、認定面をみると、1「戦術的知識テスト」及び2「状況判断テスト」の得点は、いずれも単元前に比べて単元後に有意な向上が認められた。また、パフォーマンス面についても、3単元序盤に比べて終盤に有意な向上が認められた。これらにより、小学校高学年バスケットボール授業において、ドリブルを含めた状況判断を学習内容として位置づけた体育授業を展開することによって、「わかる(認知レベル)」と「できる(パフォーマンスレベル)」の状況判断力が向上することが明らかになった。本研究の目的は、小学校バスケットボール授業における重要な学習内容としてプレー原則に着目し、認知・パフォーマンス面から状況判断力の変容を検討することであった。学習者の認知レベルについては,単元前後に「戦術的知識テスト」と「映像による状況判断テスト」を適用したところ,いずれも単元後に有意に向上した。またパフォーマンスレベルについては,ゲーム中の状況判断の適切さを分析した結果,単元序盤に比べて単元終盤に有意に向上した。これらにより、バスケットボール授業を通して,学習者はプレー原則に関する戦術的知識を習得し、それを活用しながら認知・パフォーマンスにおける状況判断力が向上することが明らかになった。H28年度(研究2年目)は、引き続き予備テストに対してヒヤリング調査を行い、その結果を踏まえて修正を加える。また、体育授業で活用できる評価法にするために、子どもたちが理解しやすいテスト形式、デザインについて検討する。これらの手続きを繰り返して、戦術的知識テストを作成する。そして、このテストをバスケットボール経験者・未経験者を対象に実施し、テストの信頼性・妥当性を確保した評価法を開発する。H29年度(研究3年目)は、小学校高学年を対象に10時間のバスケットボール単元を実施し、その学習成果を測る尺度として、1本研究で作成する「戦術的知識テスト」ならびに2平成2021年度科学研究費補助金で作成した「映像による状況判断テスト」を適用し、学習者の認知レベルの状況判断力を測定する。また、単元前後にパフォーマンステストを位置づけ、パフォーマンスレベルでの状況判断力についても測定し、総合的に学習成果を評価する。平成29年度(研究3年目)は、小学校高学年の10時間のバスケットボール単元での重要な学習内容としてのドリブルを含めたプレー原則(ボール保持者の状況判断)に着目し、認知・パフォーマンス面からの状況判断力の向上について実証的に検討することを予定している。
新規がん抑制遺伝子産物RUNX3蛋白発現解析と遺伝子導入による抗腫瘍効果の検討

本研究では、申請者により作製されたRUNX3特異的抗体を用い、ヒト口腔組織標本169例、ヒト食道組織標本114例およびヒト肺組織標本115例を用い免疫組織化学的に発現解析をおこなった。正常口腔粘膜および正常食道粘膜においてRUNX3蛋白は有棘層から表層の細胞に発現しており、増殖帯である基底層における発現はなかった。一方、口腔および食道扁平上皮癌においてRUNX3陽性細胞は、主として癌真珠に観察された。RUNX3陽性細胞率は扁平上皮癌において高分化癌、中分化癌、低分化癌の順で有意に減少していた(P<0.01)。さらに口腔扁平上皮癌におけるRUNX3陽性細胞率は、ki-67陽性細胞率と有意に逆相関していた(P<0.001)。従って、RUNX3蛋白発現は、口腔および食道粘膜、口腔および食道扁平上皮癌において組織学的分化度および細胞増殖と負の相関を示すことが見いだされた。一方、肺胞組織においてRUNX3蛋白はII型肺胞上皮に発現し、肺腺癌におけるRUNX3陽性細胞は、細気管支肺胞上皮(BAC)型に多く、非BAC型には発現していなかった。RUNX3蛋白の3つのバリアント(RUNX3/P46,P44,P27)の内、口腔および肺組織においてはP44のみ、食道組織においてはP44およびP27を発現していた。RUNX3陽性細胞率を計測し、口腔および食道扁平上皮癌においては5%、肺腺癌においては10%をカットオフ値とし、高発現群と低発現群に分類した場合、いずれにおいても有意差をもって後者で予後不良であった(P<0.05)。ヒト胃癌細胞において転写因子として機能するRUNX3蛋白の発現が細胞増殖に与える影響を検索するため、Tet-On systemを用いたRUNX3発現アデノウイルスベクターを構築した。本ベクターをヒト胃癌細胞株MKN-1に感染させ、ドキシサイクリン添加により経時的にRUNX3蛋白発現が誘導された。細胞内局在は主として核であり、転写因子として機能している可能性を示唆した。RUNX3蛋白発現により、アポトーシスが誘導されていることをフローサイトメトリーおよびヘキスト染色により確認した。本研究にて構築したベクターが、RUNX3の機能解析に有用であることが示唆された。本研究では、申請者により作製されたRUNX3特異的抗体を用い、ヒト胃組織標本84例および肺組織標本115例を用い免疫組織化学的に発現解析をおこなった。ヒト正常胃粘膜においてRUNX3蛋白は主として主細胞、被覆上皮およびガストリン産生G細胞に発現し、腸上皮化生、腺腫および腺癌における発現が乏しいことを見いだした。一方、ヒト肺胞組織においてRUNX3蛋白はII型肺胞上皮に発現し、肺腺癌におけるRUNX3陽性細胞は、細気管支肺胞上皮(BAC)型に多く、非BAC型には発現していなかった。加えて肺腺癌症例を高発現例(RUNX3発現細胞が腺癌細胞の10%以上)と低発現例(同10%未満)に分類し比較した結果、低発現例は高発現例と比較し有意に予後が不良であることが示された(P=0.027)。ヒト細胞に感染可能なRUNX3発現組換えアデノウイルスベクターを作製し、ヒト胃癌細胞株MKN-28に対する細胞増殖抑制効果を検討した。作製したベクターは、MKN-28に対し50MOI(multiplicity of infection)で高率な感染およびRUNX3蛋白の過剰発現を確認した。ウエスタンブロット法により、少なくとも感染72時間後までRUNX3蛋白発現は経時的に増加した。RUNX3発現ベクター導入MKN-28は、コントロールベクター導入MKN-28と比較しその増殖が抑制され、胃癌細胞に対しRUNX3蛋白発現が増殖抑制効果を示すことを示唆した。この効果を細胞周期停止およびアポトーシス誘導の両面から検索した結果、感染72時間後ではフローサイトメトリー解析にてG2/M期停止が示された。一方、DNAラダー形成およびヘキスト染色による形態学的解析では、アポトーシスは観察されなかった。RUNX3の過剰発現が誘導するG2/M期停止が、どの様なシグナル伝達により生じるのか、加えて肺癌細胞株における検討については、今後の課題とした。

一方、肺胞組織においてRUNX3蛋白はII型肺胞上皮に発現し、肺腺癌におけるRUNX3陽性細胞は、細気管支肺胞上皮(BAC)型に多く、非BAC型には発現していなかった。RUNX3蛋白の3つのバリアント(RUNX3/P46,P44,P27)の内、口腔および肺組織においてはP44のみ、食道組織においてはP44およびP27を発現していた。RUNX3陽性細胞率を計測し、口腔および食道扁平上皮癌においては5%、肺腺癌においては10%をカットオフ値とし、高発現群と低発現群に分類した場合、いずれにおいても有意差をもって後者で予後不良であった(P<0.05)。ヒト胃癌細胞において転写因子として機能するRUNX3蛋白の発現が細胞増殖に与える影響を検索するため、Tet-On systemを用いたRUNX3発現アデノウイルスベクターを構築した。本ベクターをヒト胃癌細胞株MKN-1に感染させ、ドキシサイクリン添加により経時的にRUNX3蛋白発現が誘導された。細胞内局在は主として核であり、転写因子として機能している可能性を示唆した。RUNX3蛋白発現により、アポトーシスが誘導されていることをフローサイトメトリーおよびヘキスト染色により確認した。本研究にて構築したベクターが、RUNX3の機能解析に有用であることが示唆された。
医療診断・手術技能の技術化・デジタル化に関する研究

本報で取りあげる4つのシステムに対して,技能の技術化・デジタル化手法を確立した.これにあたっては,(i)安全・安心接触動作技術,(ii)機構設計技術,(iii)機能抽出・構造化技術,(iv)診断・治療タスクに応じたシステム動作切替え技術,(v)医用画像処理技術が重要であった。(1)心臓組織癒着による再手術性評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,心臓癒着度合いを客観的かつ定量的な指標を提供するシステムである.(2)血管攣縮度の評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,血管攣縮度の定量的な指標を提供するシステムである.(3)遠隔超音波診断システムとは,診断画像や検査データのやりとりだけでなく,診断画像の獲得操作さえも専門医が遠隔で行うことにより,患者が病院で通常受けるものとまったく同等の医療サービスを遠隔地に存在する患者にも提供するシステムである.(4)非侵襲超音波診断・治療統合システムとは,呼吸等により能動的に運動する患部を抽出・追従・モニタリングしながら,超音波を集束させてピンポイントに患部へ照射することにより,癌組織や結石の治療を患者の皮膚表面を切開することなく非侵襲かつ低負担で行なおうとするものである.本報で取りあげる4つのシステムに対して,技能の技術化・デジタル化手法を確立した.これにあたっては,(i)安全・安心接触動作技術,(ii)機構設計技術,(iii)機能抽出・構造化技術,(iv)診断・治療タスクに応じたシステム動作切替え技術,(v)医用画像処理技術が重要であった。(1)心臓組織癒着による再手術性評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,心臓癒着度合いを客観的かつ定量的な指標を提供するシステムである.(2)血管攣縮度の評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,血管攣縮度の定量的な指標を提供するシステムである.(3)遠隔超音波診断システムとは,診断画像や検査データのやりとりだけでなく,診断画像の獲得操作さえも専門医が遠隔で行うことにより,患者が病院で通常受けるものとまったく同等の医療サービスを遠隔地に存在する患者にも提供するシステムである.(4)非侵襲超音波診断・治療統合システムとは,呼吸等により能動的に運動する患部を抽出・追従・モニタリングしながら,超音波を集束させてピンポイントに患部へ照射することにより,癌組織や結石の治療を患者の皮膚表面を切開することなく非侵襲かつ低負担で行なおうとするものである.近年,急速に高度・専門分化してきた医療診断・治療技能に対して,個々の専門技術に対応できる医師の数は限られる.このような医療分野の特殊事情から,医療技能・技術の維持・強化が困難になってきている.この問題を克服するために,医療技術の技術化が今後ますます必要になる.具体的に,暗黙知としての専門技能を技術として明らかなものとし(形式知),これを機能として医療支援システム上に実装することで,医療技術の共有・再利用・改良が可能になり,専門医のように人体に対して安全に接触動作する医療診断・手術支援システムが実現するものと期待されている.本研究では医療診断・手術技能の技術化に関する研究を行なう.本研究で提案する医療診断・手術技能の技術科とは,医療診断・手術jにおける手技・スキルを機能として抽出・構造化し,これを定量的に解析し,さらに関数として医療ロボットの制御・機構上に実装することで,医療支援システムの開発に利用しようとするものである.本研究課題は,技能の高度化あるいは専門分化の進展が特に顕著な超音波医療診断・治療技能を取り上げ,これらの技能を技術化する方法の確立を目的とした.具体的には,暗黙知としての専門技能を技術として明らかなものとし(形式知),これを機能として医療支援システム上に実装した後,その有効性を検証することを目的とした.本研究で得られた成果は下記の3点に集約される.(i)超音波医療診断・治療システムの要求機能を明らかにして,システムの設計指針を導き,提案した。そのなかで,診断中のプローブ操作タスク,診断画像を適正化するために必要なプローブの押しつけ力・推しつけ姿勢を明らかにした。これにより,医師の診断の専門技能を技術として扱うことが可能になる.(ii)提案した設計指針に基づいて医療診断・治療システムを構築した。その特徴は,ロボット先端部と患部の間の安定的な接触を実現するための制御手法,患者にとって安全・安心な動作を実現する機構および制御アルゴリズム,診断モードに応じて好適な動作を実現する制御系の動的切り替え手法にある.(iii)構築した超音波医療診断・治療システムを用いた動物実験および臨床実験を通してシステムの有効性を実証した。ロボット技術を利用して人間の熟練した技能を再構築する,言わば"技能の技術化・デジタル化"がテクノロジーの発達とともに可能になりつつある.すでに製造業分野では,人間では不可能な高精度の作業がロボットによって実現されている.高度な技能を要求される医療分野においても医療診断・手術ロボットの開発により熟練した専門医のように人体に対して安全に接触動作するとともに,人間の能力を超える,高精度な診断・手術を実現することが期待されている.具体的に,暗黙知としての専門技能を技術として明らかなものとし(形式知),これを機能として医療支援システム上に実装することで,デジタル情報として医療技能を共有・再利用・改良することが可能になり,熟練した専門医のように人体に対して安全に接触動作するとともに,人間の能力を超える高精度な診断・手術を行なう画期的な医療診断・手術支援システムが実現するものと期待されている.

近年,急速に高度・専門分化してきた医療診断・手術技能に対して,個々の専門技能に対応できる医師の数は限られる.このような医療分野の特殊事情から,医療技能・技術の維持・強化が困難になってきている.この問題を克服するために,医療技能の技術化・デジタル化が今後ますます必要になる.本研究課題は,技能の高度化あるいは専門分化の進展が特に顕著な下記の2つの医療診断・手術技能を取り上げ,これらの技能を技術化・デジタル化する方法の確立を目的とする.具体的には,暗黙知としての専門技能を技術として明らかなものとし(形式知),これを機能として医療支援システム上に実装した後,その有効性を検証することを目的とする.本研究では,下記にあげる4つのシステムに対して,技能の技術化・デジタル化手法を確立した.これにあたっては,(i)安全・安心接触動作技術,(ii)機構設計技術,(iii)機能抽出・構造化技術,(iv)診断・治療タスクに応じたシステム動作切替え技術,(v)医用画像処理技術が重要であった。(1)心臓組織癒着による再手術性評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,心臓癒着度合いを客観的かつ定量的な指標を提供するシステムである.(2)血管攣縮度の評価システムとは,ロボットビジョン技術の利用により,血管攣縮度の定量的な指標を提供するシステムである.(3)遠隔超音波診断システムとは,診断画像や検査データのやりとりだけでなく,診断画像の獲得操作さえも専門医が遠隔で行うことにより,患者が病院で通常受けるものとまったく同等の医療サービスを遠隔地に存在する患者にも提供するシステムである.(4)非侵襲超音波診断・治療統合システムとは,呼吸等により能動的に運動する患部を抽出・追従・モニタリングしながら,超音波を集朿させてピンポイントに患部へ照射することにより,癌組織や結石の治療を患者の皮膚表面を切開することなく非侵襲かつ低負担で行なおうとするものである.
北東アジアにおける寒温帯性マツ属樹種の遺伝的多様性と分布変遷

北東アジアの寒温帯林に分布するマツ科チョウセンゴヨウの分布域が,数万年から数百万年という時間スケールの中でどのように変化してきたのかを明らかにするため,ミトコンドリアDNA(mtDNA)と葉緑体DNAを用いて遺伝解析を行った。現在大陸部ではチョウセンゴヨウは広く分布しているにもかかわらず,mtDNAの遺伝的多様性を失っていた。一方,分布量の極めて少ない日本において遺伝的多様性が高かった。これは大陸部において過去に分布域の縮小が生じ,遺伝的変異の消失が起きたのに対して,日本では更新世を通して大きな集団が維持されてきたためと考えられた。本年度は、北東アジアのチョウセンゴヨウ集団に対して、葉緑体DNAの遺伝解析を行い、先のミトコンドリアDNA解析から推論された分布変遷のシナリオ、すなわち、(1)チョウセンゴヨウが過去に朝鮮半島から中国東北地方南部にあったレフュージア的集団から最終氷期後の温暖化にともなって北進・拡大した、あるいは(2)日本にあったレフュージア的集団から大陸に分布拡大した、というシナリオの検証を行うことを目的とした。解析はロシア3集団、中国5集団、韓国3集団、日本5集団(各集団4個体)のDNA試料を用いて、葉緑体DNAの3つの領域(tmC-tmD、tmS-tmGおよびtmL-tmF)についてダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定して、地理的変異の探査を行った。tmC-tmDは既存の塩基配列情報を基に、シーケンス・プライマーを設計して、2,401bpの塩基配列を決定した。解析の終了したtmC-tmDについては、大きく2つの系統が大陸・日本といった地理的位置に関係なく、広域的に分布していた。これは、2つの系統が祖先多型(ancestral polymorphism)に由来しており、古い時代に成立した系統が分布域全体の各集団内に保持されているためと考えられた。このような葉緑体DNAの地理的分化がミトコンドリアDNA解析の結果とは対象的に、集団間や大陸間で全く見られなかったのは、葉緑体DNAがマツ科では父性遺伝し、花粉を介した高い遺伝子流動を生じるためと考えられた。残りの2つの領域については現在解析中であるが、分布変遷のシナリオの検証を行うためには核DNAの解析が必要と考えられた。本年度は、北東アジアのチョウセンゴヨウ(Pinus koraiensis)の16集団に対して、葉緑体および核DNAの遺伝解析を行い、昨年度のミトコンドリアDNAの解析結果との比較と、大陸内および大陸と日本間の遺伝的多様性の比較から、チョウセンゴヨウの分布変遷史を推論することを目的として研究を進めた。葉緑体DNAの2つの領域(trnS-trnGおよびtrnL-trnF)についてシーケンス解析を行ったところ、6つのハプロタイプが見つかった。しかし、その大部分は分布域全体にわたって広くみられる1つのハプロタイプで占められており、大陸と日本の間で葉緑体DNAに全く分化はみられなかった。この結果は、日本と大陸で大きく2つの系統に分かれたミトコンドリアDNAの結果と対象的であった。この理由として、葉緑体DNAにおいては、集団の縮小・拡大、分断化といった地史的イベントに対応した遺伝的変異が生じなかったか、生じたとしても、葉緑体DNAはマツ科では父性遺伝することから、花粉を介した高い遺伝子流動によって、遺伝子の地理的構造が覆い隠されてしまったためと考えられた。したがって、より解像度の高いチョウセンゴヨウの分布変遷史を描くためには、核DNAのSSRマーカーによる解析が必要と考えられた。そこで、テーダマツで開発された25座、ストーブマツで開発された23座の合計48座のSSRマーカーについて、16集団の各2個体、合計32個体のDNAをテンプレートとして、スクリーニングを行った。その結果、17座のマーカーで良好なPCR増幅を示したため、このうち特に増幅が良好な10座について蛍光プライマー化して、現在、解析を進めている。分布域全体を網羅した試料を用いたスクリーニングによって選抜した本研究のSSRマーカーを用いることで、北東アジアスケールでのチョウセンゴヨウの遺伝的多様性の評価が期待できる。
プライバシを考慮したIDベース暗号方式とトラスト管理システムへの応用

本課題では、プライバシを考慮したIDベース暗号方式とトラスト管理システムへの応用に関する研究を進めている。署名付き暗号化(signcryption)は電子署名と暗号化の機能を組み合わせた方式であり、秘匿と認証を同時に処理可能である。Signcryptionの安全性は、電子署名と暗号化の機能に対して、それぞれEUF-CMA2とIND-CCA2のモデルが利用される。本年度は、複数の受信者が(n,k)閾値分散の復号化を可能とするsigncryptionを検討した。2011年にQin等(Security and Communication Networks,2011)は閾値分散復号化が可能なIDベースsigncryptionを提案したが、我々はこの方式の安全性はEuF-CMA2もIND-CCA2の何れも満たさないことを指摘した。また、Qi等の方式を改良することにより、EUF-CMA2とIND-CCA2を同時に満たす方式を提案し、送信者と受信者が共にID秘匿性を持つ機能を付け加えた新しい方式を構成した。一方、検証者を特定する電子署名方式(SDV)の安全性関しても考察を行った。2011年にHuang等(Journal of Systems an dSoftware,2011)は、IDベースのSDVSとして譲渡不可能性と代理不可能性を有する方式を提案した。我々は、Huang等の方式は偽造可能かつ判別可能であることを指摘し、主張する安全性が達成できないことを示した。公開鍵暗号における鍵管理問題の解決を目指して、個人の特定が可能な生体認証情報より秘密鍵を作成する2種類の方法を提案した。第1の方式は、生体認証情報をID情報とした署名付き暗号方式(signcryption)であり、復号化ポリシ対する誤り訂正方式を利用して閾値生体認証情報b'と認証情報の距離がt以下の場合に暗号文を復号化できる。第2の方式は、fuzzy抽出器と言われるアイデアを導入し、複数の生体認証情報を用いた暗号化と認証が可能である。例えば、指紋、光彩、声紋などの複数の生体認証情報からランダムな鍵を生成することができる。第1の提案方式に対しては標準モデル(standard model)、第2の提案方式はランダムオラクル(random oracle model)において安全性証明も与えた。これらの提案方式を応用して、暗号化ポリシおよび復号化属性に幾何グラフを利用した鍵生成方式を考察した。更に、標準モデルで安全性証明が可能なIDベースsigncryption方式(Yu等09)および証明書を必要としない(certificateless)公開鍵暗号方式(Liu等09)の安全性を再考察した。これらの方式はWaterのIDベース暗号をプリミティブとして利用しているが、選択暗号攻撃に対し判別不可能(IND-CCA)ではないことを指摘した。最後に、WaterのIDベース暗号を応用して直接的にsigncryption方式を構成することは不可能であることを示した。署名付き暗号化(Signcryption)は認証と秘匿を同時に処理することができるため、暗号化に署名を付ける方式と比較して、計算量や通信量が削減可能となる。本年度は、マルチユーザーの利用環境で、閾値分散の復号化を有するグループ化可能なマルチ署名付き暗号化方式を提案した。また、検証者指定署名方式を考察して、2種類の異なる経路で署名を送信した場合でもメッセージを復元できる耐故障性をもつ方式を提案した。これにより、送信者のIDとメッセージの両方のプライバシを保つ認証方式が作成可能となる。更に、Zhang-Maoによって提案されたランラムオラクルモデルを利用しない署名長が短い署名方式の安全性を考察し、選択平文攻撃により署名が偽造できる例を示した。Zhang-Mao方式を、双線形性ペアリングを利用することにより改良し、ランダムオラクルモデルにおいて選択平文攻撃に対して存在的偽造が不可能となる安全な方式を提案した。最後に、Wu等によって提案された秘密情報配送方式に対する攻撃を考慮し、暗号文が復号化検証可能となる脆弱性を指摘した。また、Wu等の方式を改良することにより、IND-CCA安全性を満たす秘密鍵配送方式を構成した。

本年度は、プライバシを考慮したIDベース暗号方式に関して査読付き論文4編と学会発表2件を行った。特に、グループ化可能なマルチ署名付き暗号化方式や2種類の異なる経路で署名を送信した場合でもメッセージを復元できる耐故障性を有する検証者指定署名方式など提案した。本研究課題の今後の課題として、双線形性ペアリングを用いた高機能な暗号プロトコルの研究を行う予定である。特に、プライバシを考慮したIDベース暗号方式(Privacy-carrying ID-based Cryptography)を考察し、送受信者の匿名性を有する暗号キーワード検索方式やアクリゲート署名方式を研究する。これらの方式を拡張する形で、データ秘匿性、ID情報の匿名性などを考慮した新しいトラスト管理モデルを提案する予定である。
蛋白質表面における膜相互作用部位の決定方法とその応用

本研究では、蛋白質と膜との間の弱い相互作用を検出する新しい手法を開発し、その手法を用いて細胞内の物質輸送蛋白質に応用し小胞輸送を分子レベルで解明する。オートファゴソームに結合するMAP-LC3とdodecylphosphocholine(DPC)ミセルの相互作用を光CIDNP法を用いて研究した。MAP-LC3とDPCが共存する系で脂溶性色素を用いて光CIDNP実験を行うと、His86のε1プロトン、His86のδ2プロトン、およびTyr38のε1,2プロトンの位置で光CIDNP効果が認められた。その他には、His57のε1のシグナルについても弱い光CIDNP信号が観測された。それに対して、DPCが存在しない系では、His57,His86,Tyr38の信号に加えて、His27のε1とHis57のδ2に由来する光CIDNPシグナルも観測された。これらの結果から、MAP-LC3はHis86とTyr38の近傍でDPCミセルに結合していると予想された。また、NMRによる立体構造解析の結果、これらの二つの残基は立体構造上隣接していることもわかった。さらに、DPC結合状態でのMAP-LCについてもNMRによる立体構造解析を行い、90%以上のNMRシグナルを帰属することができた。前年度に引き続き、MAP-LC3のホモログであるGABARAP蛋白質についてNMRシグナルの帰属を行い、従来の方法を用いて立体構造計算を行った。さらに、GABARAPとDPCの相互作用をHSQCによって追跡し、GABARAPのDPC結合表面を予測した。また、MAP-LC3と同様にGABARAPについても光CIDNP実験を行ったところ、N末端領域に位置するTyr残基の光CIDNPシグナルがMAP-LC3と異なっていた。本年度は以下の研究成果を得た。1. MAP-LC3蛋白質の大量調整膜と弱く相互作用する蛋白質のモデルとしてオートファジー関連蛋白質MAP-LC3を大量調整した。大腸菌BL21(DE3)を発現プラスミドで形質転換しMAP-LC3蛋白質を発現させた。従来の手法を用いて精製を行いNMR測定に用いた。2.脂溶性色素を用いた光CIDNP測定条件の探索光CIDNP効果を起こしS/N比のよいシグナルを得るためには、試料中の色素濃度を上げなければならない。本研究で用いる脂溶性色素は、界面活性剤であるdodecylphosphocholine(DPC)の濃度に比例して溶解するため、試料中のDPC濃度をできるだけ上げる必要がある。本年度は、MAP-LC3蛋白質を変性させないDPC濃度を決定した。その結果、DPCの濃度を20mM以上まで上げてもMAP-LC3は変性しないことがわかり、DPC中でCIDNPを起こす脂溶性色素も高濃度で溶解させることができた。3. GABARAP蛋白質のNMR実験MAP-LC3のホモログであるGABARAP蛋白質について^<15>Nラベル体、^<13>C/^<15>Nラベル体を調製した。HCCH-COSY、HCCH-TOCSY、^<13>C-edited NOESY等のスペクトルを測定し解析した。その結果、側鎖に由来するNMRシグナルの80%程度を帰属することができた。また、HisやTyrなど芳香族側鎖のシグナル解析も行った。