hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クロマグロ住血吸虫症の対策に向けての基礎研究

第一に,太平洋クロマグロの住血吸虫は,従来,主に鰓血管に寄生するCardicola orientalis1種と考えられていたが,第2種として主に心室に寄生するCardicola opisthorchisを見出し,新種記載した。第二に,鰓に集積した虫卵がどちらの住血吸虫に由来するかを形態によって鑑別する方法を開発した。さらに,鰓組織をNaOHで融解したのちに,虫卵を計数する方法を開発した。第三に,沖出し後45日目に2種の寄生を確認し,その1週間後には成虫を、さらにその1週間後には鰓に虫卵を確認した。第四に,C. opisthorchisはプラジクアンテル(PZQ) 7.5 mg/kg魚体重以上の用量の3日間連続投与で完全に駆虫されることを確認した。なお,投与1か月後には再寄生が認められた。魚体内の薬剤は投与24時間後に検出限界以下となった。第五に,PZQのin vitroにおける効果を調べた。SEM観察によって,2種ともに外被の損傷が激しかった。すなわち,C. opisthorchisでは体表の膨隆と収縮,および体表に皺形成が顕著となった。一方,C. orientalisでは体表面に小穴の形成が特徴的であった。1.寄生種の分類、同定、寄生部位並びにセルカリアの侵入時期の推定:これまでの検査で虫卵は鰓に、虫体は心臓と鰓血管のみにみられた。本研究申請時点では、住血吸虫は単一種と考えられていたが、形態と遺伝子解析の結果、鰓血管寄生はCardicola orientalis、心室寄生は別種(Cardicolaの新種として論文投稿中)と判明した。2種の住血吸虫を区別するPCR系を作製し、マグロ稚魚を定期的にサンプリングしたところ、沖出し後45日目に鰓と心臓でPCRにより2種の寄生を確認した。その1週間後には心臓に成虫を確認し、さらにその1週間後には鰓に虫卵を確認した。これにより、セルカリアは沖出し直後からマグロに侵入し、2ヶ月後には成熟、産卵することが示された。2.鰓に集積した虫卵の種鑑別と計数法の開発:鰓薄板内には主に楕円形虫卵、小入鰓動脈内には三日月型虫卵が集積していた。これらの虫卵の遺伝子解析の結果、楕円形、三日月型虫卵はそれぞれC.orientalis、C.sp.(前出の別種)のものであることが明らかとなった。これにより、鰓弁の虫卵観察による2種の簡易診断法を確立した。鰓弁内の虫卵の分布は不均一であったため、片側4枚の鰓組織をNaOHで融解して、一定量の液中の虫卵を計数し、換算して鰓全体の虫卵数を表現することとした。その結果、沖出し10週後で131万個もの虫卵が集積したクロマグロもみられた。3.住血吸虫のin vitro飼育:コモンフグのPsettarium sp.とクロマグロのC.sp.をプラジクアンテル加L-15培地に収容したところ、どちらの種も0.2ppm・24hr処理で明瞭な影響が観察された。薬剤を含む培地中で24-72時間処理した虫体を薬剤無添加の培地に移したところ、P.sp.では、1ppm・24hr処理で、C.sp.では、0.2ppm・72hr処理で、薬剤の影響から回復できなくなった。近年、各地で展開されているクロマグロ養殖において,住血吸虫の寄生による被害が深刻になっているが,対策は確立していない。一方で、一部に未承認薬が駆虫剤として用いられている実態があり、食の安全上の問題となっている。そこで、クロマグロの安全かつ安定的な養殖生産に資することを目的として、本症を防除するための基礎研究を行う。平成23年度には以下の実験を行い,成果を得た。1)駆虫実験:感染の確認されたグロマグロ幼魚10-50尾を小型の網イケスに収容し,プラジクアンテル(PZQ)製剤の経口投与による薬剤有効性試験を行った。その結果,心室に寄生する住血吸虫

Cardicola opisthorchisは7.5mg/kg魚体重以上の用量の3日間連続投与で完全に駆虫されることを確認した。2)住血吸虫の虫卵による種鑑別および害作用の評価:鰹弁内に集積した虫卵の形態と遺伝子解析により,虫卵の形態によって2種を鑑別する方法を開発した。それによって,Cardicola orientalis卵は鰐薄板内に,C. opisthorchis卵は主として小入鯉動脈内に集積することを明らかにした。また,虫卵集積による害作用を病理組織学的に評価した。3)住血吸虫の人工培養液中におけるPZQの有効性評価:クロマグロの住血吸虫2種(C. orientalis, C. opisthorchis)を無傷のまま十分の数を準備することが困難であったため,コモンフグの内臓血管に寄生する住血吸虫Psettarium sp.に対するPZQの有効濃度を求めた。その結果,L-15培地内ではPZQ 0.2ppmを24時間以上作用させると全身運動を呈した。1ppmで24時間以上,5ppmで3時間以上の処理では死亡する虫体が認められ,薬剤無添加培地に戻しても,回復は限定的であった。薬剤処理した虫体のSEM像では,虫体の委縮や外被の傷害が確認された。近年、クロマグロ養殖において,住血吸虫の寄生による被害が深刻になっていて、一部に未承認薬が駆虫剤として用いられている実態があり、食の安全上の問題となっている。そこで、クロマグロの安全かつ安定的な養殖生産に資することを目的として、本症を防除するための基礎研究を行った。平成24年度には以下の実験を行った。1)駆虫実験:最低有効量決定するために,プラジクアンテル(PZQ)15,7.5,3.25,0mg/kgを3日間経口投与した結果,7.5mg/kg以上の用量でC. opisthorchisの完全駆虫が確認された。魚体内におけるPZQの動態を調べるため,15mg/kgをクロマグロに経口投与し,経時的に採材し,肝臓,腎臓,筋肉,血清中のPZQ濃度をHPLCにより測定した。その結果,血清中で90分後に最大値の2.0μgとなった。いずれの臓器においても投与10時間後までに急激に減少し,24時間後には検出限界(0.02μg)以下となった。2)PZQのin vitroにおける効果:C.opisthorchisでは0.2ppm・24時間処理で明瞭な影響が観察された。2472時間暴露した虫体を薬剤無添加の培地に移したところ、0.5ppm・72時間処理で、薬剤の影響から回復しなかった。SEM観察では,24時間後でもPZQ無添加対照区では病的変化はなく,虫体外被は微細な畝状構造が規則正しく配列し、体表面には乳頭状の突起が観察された。0.2ppmの6.5時間処理では著変は認められなかったが,13時間後では体表の膨隆と収縮,および体表に雛形成が顕著となった。こうした病変は1ppmでは6.5時間後にすでに明瞭であった。C. orientalisの0.2ppmの6.5時間処理では体の収縮はさほど顕著ではなかったが,体表面に小穴の形成が特徴的であった。1ppmの6.5時間では,体表面の小穴以外に体表に皺の形成が認められ,16.5時間後にはさらに体表の膨隆と収縮も確認された。また,低濃度区での小穴の形成は軽微な個体が多かったが,病変は時間経過とともにより顕著に表れる傾向があった。本研究の目的は住血吸虫症の防除法を確立することであるが,これまでに虫卵の形態による種鑑別法,害作用,プラジクアンテル製剤の経口投与法や有効濃度についてほぼデータを取り終えた。
抗血栓性因子プロテインＳとＡＤＡＭＴＳ１３の研究を通した血栓症と血管障害症の解明

私達は、プロテインS K196E(PS-K196E)変異特異的モノクローナル抗体を作製し、このモノクローナル抗体を用いてPS-K196E変異体の簡便な測定系を開発し、変異保有者の同定を行うシステムの開発に成功した。ADAMTS13遺伝子欠損マウスを用いて深部静脈血栓を検討したところ、遺伝子欠損マウスは野生型マウスより大きい血栓を示すことを明らかにした。TTP発症の類似疾患である非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)患者の遺伝的背景を検討し、日本人aHUS患者に比較的広く見られる遺伝子変異を同定することに成功した。本研究では、凝固制御因子プロテインSと血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の原因遺伝子であるADAMTS13を研究対象として、私達がこれまで行ってきたこれら2つの抗血栓性因子の解析を進め、日本人の血栓症発症のメカニズムを解明し、それらを血栓症の予防・予知に資することにある。私達は、凝固制御因子プロテインSのK196E変異が、静脈血栓症の遺伝的リスクであることを報告した。本研究では、プロテインS K196E変異体の簡便な測定系を開発し、変異保有者の同定を行う。このため、プロテインS K196E変異体を特異的に認識する単クローン抗体の作成を進めた。野生型Lys残基および変異Glu残基を含むペプチドを合成し、ヘモシアニンに固相化した後にマウスに免疫源として用いた。一方、野生型Lys残基および変異Glu残基を含むプロテインSの第EGF様ドメイン1-4を哺乳動物細胞で発現させ、これらの組み換え蛋白質を精製し、抗体のスクリーニングの準備を整えた。私達はプロテインS遺伝子ヘテロ欠損マウスを作製した。米国の報告では、血管の脆弱性が報告されている。そこで、私達が作製したヘテロ欠損マウスにエバンスブルー色素を静注し、血管の脆弱性を検討したが、色素の血管外への露出は観察されなかった。私達はADAMTS13の基質結合ドメイン(399残基)の立体構造を報告している。本研究では触媒領域(metalloprotease domain)を含むADAMTS13の立体構造のX線構造解析を目指す。動物細胞を用いて、触媒領域を含むADAMTS13の大量発現系を構築した。この組み換え蛋白質は凝集しやすい性質をもち、精製法の改良が必要と考えられた。私達は、プロテインS K196E変異が、静脈血栓塞栓症の遺伝的リスクであることを報告した。本研究では、プロテインS K196E変異体の簡便な測定系を開発し、変異保有者の同定を行ことを目的とした。前年度から、プロテインS K196E変異体を特異的に認識する単クローン抗体の作成を進め、今年度は変異Glu残基を含むペプチドに対する単クローン抗体の作製に成功した。すなわち、単クローン抗体をスクリーニングし、野生型Lys残基を含むペプチドには反応しない変異Glu残基特異的単クローン抗体3種を見いだした。次いで、血漿中のプロテインS K196E変異体の簡便な測定系を確立するため、変異特異的単クローン抗体を用いたELISA系の構築に取り組んでいる。このため、まず組み換えプロテインS K196E変異体をCHO細胞で発現させ精製した。3種の単クローン抗体は変性条件下ではプロテインS K196E変異体を強く認識するものの、生理的な条件下では結合が弱いことが判明した。現在、条件を検討している。私達はADAMTS13遺伝子欠損マウスを作製しその血栓能を検討してきたが、今年度は電気通電による内皮細胞障害を伴う深部静脈血栓症モデルを用いて検討した。マウス下大静脈にステンレス電極を挿入して100μA・10分間通電した。電極の電気分解の結果生じるフリーラジカルにより、血管内皮細胞が活性化し、血栓形成が誘発される。生じる血栓が最大となる処置2日目に下大静脈内血栓を取り出し、その重量を測定した。ADAMTS13遺伝子欠損マウスの血栓重量は、野生型マウスより重い傾向を示したが有意差は見られなかった。ADAMTS13のMDTCS領域の結晶構造解析のため、組み換えタンパク質を大量に調製した。単クローン抗体のFab断片との複合体の結晶化を進めている。血栓症は凝固制御因子や血小板凝集抑制因子の機能低下がリスクとなる。私達は、血管内皮細胞が示すプロテインC抗凝固機構を構成する凝固制御因子プロテインSのK196E変異が、静脈血栓塞栓症の遺伝的リスクであることを報告した。

本変異は、日本人約55人に1人に見られ、ホモ接合体は約10,000人に1人と計算された。一方、血小板凝集抑制因子の機能低下がリスクとなる血栓症として、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)がある。TTPは、ADAMTS13の活性著減による超巨大フォンビルブランド因子(VWF)マルチマーの蓄積が原因である。私達は50家系以上の先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析や、ADAMTS13の特異的蛍光合成基質を開発してきた。本研究は、私達がこれまで行ってきたこれら2つの抗血栓制御因子の解析を進め、日本人の血栓症発症のメカニズムを解明し、それらを血栓症の予防・予知に資することにある。本研究で私たちは、プロテインS K196E(PS-K196E)変異体の簡便な測定系を開発し、変異保有者の同定を行うシステムの開発に成功した。すなわち、私たちはPS-K196E変異特異的モノクローナル抗体を作製し、このモノクローナル抗体を用いて、血漿中のPS-K196E変異体を検出するサンドイッチELISA法を確立した。本測定法を用いると野生型PSと変異型PS保有者を迅速・簡便に識別できる。本測定法は、遺伝子解析を行わずに変異の同定ができるため、本邦における血栓症の予防や診療に有用であると考えられた。ADAMTS13の触媒ドメイン(M)を含むMDTSC領域およびADAMTS13のC末端に位置するCUBドメインをCHO細胞を用いて発現させ精製し、結晶化条件を詳細に検討した。しかし、立体構造解析に適した回折データを得ることができる結晶はできなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。血栓止血学26年度が最終年度であるため、記入しない。静脈血栓症の遺伝的リスクであるプロテインS K196E変異体の簡便な測定系を開発が、本研究の進展に重要と考えられ、測定系に必要な特異的単クローン抗体の作製を進めた。プロテインS遺伝子ヘテロ欠損マウスやADAMTS13の立体構造の解析は、研究を開始したところであり、今後研究の進展が見込まれる。静脈血栓症の遺伝的リスクであるプロテインS K196E変異体の簡便な測定系の開発のため、変異特異的単クローン抗体(3種)の作成に成功した。静脈血栓の形成機構の最近の研究から、静脈血栓はフィブリンに加え血小板も関わることが明らかになってきた。今回、静脈血栓における血小板の関与を明らかにするため、ADAMTS13遺伝子欠損マウスを深部静脈血栓症モデルで血栓能を評価した。また、結晶化を目指してADAMTS13のMDTCS領域の大量調製を行った。プロテインS K196E変異体を特異的に認識する単クローン抗体を作製する。特異抗体の作製はプロテインSKI96E変異体の簡便な測定系の開発、および変異保有者の同定に必須である。また、初年度に進めたプロテインSK196E変異ノックインマウスとプロテインS遺伝子欠損マウスの血管構築の研究やADAMTS13の立体構造の解析を継続して行う。今年度に作製したプロテインS K196E変異体特異的単クローン抗体を用いて、血漿中の変異体の簡便な測定系の確立を行う。すなわち、この単クローン抗体とポリクローナル抗体を用いてサンドイッチELISA系を組み、血漿中のプロテインS K196E変異体の定量システムを確立する。
江戸学芸家の墓所・碑文に関する基礎的研究

1.本研究では、江戸(東京)に墓所の存在する近世学芸家について、調査、収集した資料に基づき、「江戸学芸家墓所索引」を作成し、あわせて個々の墓地について実地調査を行った。2.墓所、碑文資料として、静嘉堂文庫所蔵の『江都墓所一覧』(文化15刊)『墳墓集』(近世後期写)『古墳一覧』(同)『東京古蹟誌』(明治31刊)等を紙焼き写真にして収集した。3.作成した「江戸学芸家墓所索引」は、まず近世の墓碑文資料としてはもっとも詳細な五弓久文編『事実文編』と原念斎編『史氏備考』という二つの資料をもとに抽出した、近世学芸家約二千名を基本項目とする。ついで旧来の江戸(東京)の掃苔録を集大成した観のある藤波和子編『東京掃苔録』により、戦前昭和十年代における墓所の地点、寺院名を確認、さらに『国史大辞典』『国書人名辞典』等によって現時点での墓所の有無を確認して作成した。また本索引の各項目は、人名、地点(区名、町名等)、寺院名、資料名からなり、人名の五十音順と寺院別の二通りの排列とした。4.東京都台東区の浅草地区および下谷地区を中心とする約五十ヶ寺について、墓所の地点、墓石の現況、碑文の有無に関する実地踏査を行った。調査の具体的方法は、墓石の実見記録、住職等からの聞き取りおよび写真撮影等による。ただし時間的制約から、予定していた寺院数をこなすことができなかったなど、課題が残った。5.今回の研究をもとに、将来、墓所や碑文の情報を整理、集成した仮称「江戸学芸家墓碑録」の作成を考えたい。(1)資料の収集静嘉堂文庫所蔵の墓所・碑文資料として『江都墓所一覧』(文化15刊)『墳墓集』(近世後期写)『古墳一覧』(同)『東京古蹟誌』(明治31刊)を紙焼き写真にして収集した。(2)資料のデータベース化近世の碑文資料である『事実文編』『史氏備考』から江戸の学芸家に関する項目を抽出し、資料別・人名別に索引化した。また『東京掃苔録』を加えて、昭和期における墓地の状況を併せて一覧できるように、索引の補訂を進めている。(3)墓地の調査東京台東区の浅草地区を中心に金竜寺をはじめとする約30ヶ寺について、寺院の転移、墓所の地点、墓石・碑文の有無・現況に関する実地踏査を行った。調査の具体的方法は墓石の実見記録、住職等からの聞き取りおよび写真撮影等によった。その結果、寺院の転移は、『東京掃苔録』(昭和15年)の調査以来、ごく少数に止まること、また墓石の多くも意外に原状を保っていることが確認され、今後の調査にかなり期待出来ることがわかった。調査の問題点としては、過去帳が伝存する場合でも、その調査については拒否されることが多く、実際に許可されたのは二三に過ぎないことがあげられる。また長文の碑銘については、時間的・労力的制約のため当面はその判読、記録は見送らざるをえず、一通り調査を終えたところで、『史氏備考』等の碑文資料との照合を計りつつ、あらためて調査を実行する予定である。1.本研究では、江戸(東京)に墓所の存在する近世学芸家について、調査、収集した墓所、碑文資料に基づき、墓所や碑文の情報を整理、集成した仮称「江戸学芸家墓碑録」の作成に備えるため、「江戸学芸家墓所索引」の作成と、それと併行して墓所の実地踏査を行った。2.「江戸学芸家墓所索引」は、まず近世の墓碑文資料としてはもっとも詳細な五弓久文編『事実文編』と原念斎編

『史氏備考』という二つの資料をもとに、該当する近世学芸家約二千名を抽出し、ついで旧来の江戸(東京)の掃苔録を集大成した観のある藤波和子編『東京掃苔録』により、戦前昭和十年代における墓所の地点、寺院名を確認、さらに『国史大辞典』『国書人名辞典』等によって現時点での墓所の有無を確認して作成した。また本索引の各項目は、人名、地点(市名あるいは区名、町名)、資料名からなり、人名の五十音順と地点別の二通りの排列とした。3.東京都台東区の下谷地区を中心とする約20ヶ寺について、墓所の地点、墓石の現況、碑文の有無に関する実地踏査を行った。調査の具体的方法は、墓石の実見記録、住職等からの聞き取りおよび写真撮影等による。ただし、碑文の判読は、非常な困難を伴うため、その記録や照合は見送らざるを得なかった。また時間的な制約から、予定していた寺院数を大幅に下回るなど、予想できたこととは言え、実地踏査には多くの課題が残ったので、今後の宿題としたい。
新しい細胞間接着分子ならびにムチン遺伝子の発現と癌の浸潤・転移との関連

1.扁平上皮癌に関して(1)扁平上皮癌細胞に発現しているトロンボモジュリン(TM)と血管内皮細胞に存在するTMが同一であることを明らかにした。また、TMの高発現株と低発現株を比較から、低発現株のより高い浸潤性を明らかした。(2)ヒトの口腔や肺の扁平上皮癌においても、食道癌と同様に、リンパ節転移巣でTMの発現低下がみられることを明らかにした。(3)腺癌のみならず、咽頭・喉頭ならびに食道の扁平上皮癌においても、MUClが優れた腫瘍マーカーであり、殊に、ヒト食道癌においては、シアル酸の結合したMUC1ムチン(DF3抗原)の陽性群は陰性群に較べて明らかに予後が悪かったが、MUC1ムチンコア蛋白の陽性群と陰性群の間には予後の差はなかった。2.腺癌に関して(1)膵や肝内胆管の膨脹性発育腫瘍でも、その経過中に浸潤性増殖を始める症例においては、浸潤性発育部位で、予後不良因子の膜結合型MUC1ムチンが発現し、腫瘍の浸潤にかかわっている可能性が見い出された。(2)膵や肝内胆管の膨脹性発育腫瘍に特徴的なMUC2ムチンの発現は、MUC2mRNAにより制御されており、MUC2mRNAの発現が癌患者の予後良好因子になることを明らかにした。(3)浸潤傾向の少ない「粘液産生性膵腫瘍」の各組織亜型でのムチン発現の検索により、分泌型ムチンのMUC5AC(胃型)とMUC2(腸型)の遺伝子発現様式が各組織亜型により異なっていることを明らかにした。(4)膵と肝内胆管の腫瘍においてシアリダーゼ処理によるコア蛋白と糖鎖の結合状況を検討する研究を行い、浸潤性癌に特徴的なMUC1ムチンにおいてはシアル酸エピトーブが重要であることを明らかにした。(5)ファーター乳頭部癌や胃癌においても、MUC1ムチンの発現は予後不良因子であり、逆に、MUC2ムチンの発現は予後良好因子であることを明らかにした。1.扁平上皮癌に関して(1)ヒト食道扁平上皮癌培養細胞(TE1とTE2)を、免疫細胞化学、ウェスタンプロット、ノーザンプロットで検索し、扁平上皮癌培養細胞に発現しているトロンボモジュリン(TM)と血管内皮細胞に存在するTMは同一であることを明らかにした。さらに抗凝固活性の測定により、扁平上皮癌細胞も抗凝固活性を有することを明らかにした。(2)肺扁平上皮癌34例や口腔扁平上皮癌65例でも、原発巣とリンパ節転移巣におけるTMの発現を比較し、食道扁平上皮癌と同様、リンパ節転移巣でのTM発現が原発巣より有意に減少していることを明らかにした。(3)ヒト食道扁平上皮癌の転移巣から得られた培養株(TE3)より、蛍光励起細胞分離装置(FACS)を用いて、TM高発現株とTM低発現株を分離し、双方の浸潤能の差をinvasion assay法によって検討したところ、TM低発現株はTM高発現株より明らかに浸潤能が高いことが判明し、扁平上皮癌転移巣でのTM発現の減少との関連が示唆された。

2.腺癌に関して(1)膵や肝内胆管の腺癌のin situ hybridizationによる検索で、浸潤傾向の弱い癌に特徴的なMUC2ムチンの発現は、MUC2mRNAにより制御されており、MUC2mRNAの発現が癌患者の予後良好因子になることを明らかにした。(2)膵や肝内胆管の腺癌の組織切片でのムチンの発現様式のシアリダーゼ処理による変化から、浸潤傾向が強く予後不良の癌に高率に発現するMUC1ムチンはシアル酸エピトープを持つことが判明した。一方、浸潤傾向の強い癌と弱い癌との間のMUC2ムチンの染色性の違いにはシアル酸エピトープは関与しないことも明らかとなった。(3)ファータ-乳頭部癌や胃癌においても、膵や肝内胆管の腺癌と同様に、MUC1ムチンの発現は予後不良因子であり、逆に、MUC2ムチンの発現は予後良好因子であることを明らかにした。(4)大腸や胃粘膜におけるMUC2ムチンコア蛋白とムチン型糖鎖であるシアリルTnの細胞内局在を二重染色を用いた免疫電顕で同時に超微形態的に観察することに成功し、腫瘍性病変における詳細な検索への応用が期待される。1.扁平上皮癌に関して(1)ヒト食道扁平上皮癌の転移巣から得られた培養株(TE3)より分離・樹立したトロンボモジュリン(TM)の高発現株(TE3HTM)と低発現株(TE3LTM)を用いて、その浸潤・転移に関連する生物学的特徴を解析した。両株の細胞形態及び増殖速度に差異はみられなかったが、matrigel invasion assayにてTE3LTMの方がより高い浸潤性を示した。TE3HTMでVEGFが、TE3LTMでGM-CSF、IL-1α、IL-6がより高い濃度を示し、また、TE3HTMの培養上清はより強くヒト膵帯静脈内皮細胞(HUVEC)を活性化させた。TMはヒト扁平上皮癌の浸潤能、血管新生能、及び接着能に関与することが示唆された。(2)腺癌のみでなく、咽頭、喉頭、ならびに、食道の扁平上皮癌においても、膜結合型ムチンであるMUCIが優れた腫瘍マーカーとなることが明らかとなった。食道癌においては、MUC1ムチンのうちでも、DF3抗原陽性の場合が、陰性の場合よりも患者予後が有意に悪いことが明らかになった。2.腺癌に関して(1)膵・肝内胆管の膨張性発育腫瘍でも、その経過のうちに浸潤性増殖を始める症例においては、浸潤性発育部位で、予後良好因子の分泌型ムチンであるMUC2(腸型ムチン)が消失し、予後不良因子のMUC1ムチンが発現するという現象を発現した。(2)膵・肝内胆管腫瘍において、MUC2と同じく分泌型ムチンであるMUC5AC(胃表層型ムチン)の遺伝子発現をin situ hybridizationで検索した結果、MUC5ACmRNAの発現は、膨張性発育腫瘍では高率に陽性であったが、浸潤性発育腫瘍ではその陽性率は低く、MUC5ACもMUC2と同じく予後良好因子と思われた。(3)高齢者胃癌と若年者胃癌のムチン抗原発現を組織型別に比較したところ、高齢者胃癌の管状腺癌と低分化腺癌で、DF3の陽性率が若年者の管状腺癌より有意に高かった。患者の生存率は若年者・高齢者ともに、DF3陽性の胃癌においてDF3陰性のものより有意に低かった。1.扁平上皮癌に関して(1)ヒト食道扁平上皮癌の転移巣から得られた培養株より分離・樹立したトロンボモジュリン(TM)の高発現株と低発現株を比較して、低発現株の方がより高い浸潤性を示すことを明らかし、また、TMが扁平上皮癌の血管新生能、及び接着能に関与することも見い出した。(2)ヒトの口腔や肺の扁平上皮癌において、食道癌と同様にリンパ節転移巣でTMの発現低下が起こることを明らかにした。(3)ヒト食道癌において、シアル酸の結合したMUC1ムチンの陽性群は陰性群に較べて明らかに予後が悪かったが、MUC1ムチンコア蛋白の陽性群と陰性群の間には予後の差はなかった。2.腺癌に関して(1)膵と肝内胆管の膨脹性発育腫瘍でも、その経過のうちに浸潤性増殖を始める症例においては、浸潤性発育部位で、予後不良因子の膜結合型MUC1ムチンが発現し、腫瘍の浸潤にかかわっている可能性が見い出された。
プロスタグランジン輸送体を基盤とする肺線維化とその抑制手法に関する研究

肺線維症進行に関連するPGE2に着目し、PGE2濃度調節因子であるプロスタグランジン輸送体(OATP2A1/SLCO2A1)が肺線維症に果す役割を解明するために研究を推進している。平成29年度は、げっ歯類から調製した2型肺胞上皮細胞を1型様に分化転換後transwell上に培養して樹立した評価系を用い、外因性PGE2膜透過および内因性PGE2分泌を分離評価し、定量的に解析した。OATP2A1阻害剤を用いた検討により、1型肺胞上皮細胞肺胞腔側に発現するOATP2A1が肺胞腔へのPGE2分泌調節に関わることが示された。さらに、肺胞腔から取り込まれたPGE2は代謝を受けず間質側へと輸送されたことから、OATP2A1はPGE2膜透過を介して間質組織のPGE2濃度に影響を及ぼすことが示唆された。現在、肺胞上皮細胞と線維芽細胞に加え、肺胞マクロファージとの共培養によるOATP2A1の役割を探索中である。Slco2a1-/-マウスBAL細胞で、マクロファージで主に産生される炎症性サイトカインの発現が有意に増加したことから、Slco2a1-/-マウスの肺線維化における責任細胞として(肺胞)マクロファージの関与が示された。さらに、OATP2A1はマクロファージ内PGE2分解を抑制し分泌維持に働くため、OATP2A1機能欠損によるPGE2自己分泌シグナル低下が炎症性サイトカイン分泌抑制に関係することが示された。OATP2A1の発現・機能調節物質の探索については、肺胞において上皮間葉転換や線維化を関わるTGB-bがOATP2A1の転写を増大させること、線維症のリスク因子であるタバコの成分がOATP2A1の機能や発現を低下させることを発見した。重喫煙負荷は線維症のリスク因子であることからもOATP2A1の肺保護作用が示唆された。当初の計画通り、肺組織におけるPGE2細胞内動態調節因子であるOATP2A1の発現と機能について情報が得られつつある。In vivo、in vitroの検討により、OATP2A1による肺胞PGE2濃度調節とマクロファージの活性化が関与することが示唆された。OATP2A1発現調節物質として、TGF-bやタバコなどに含まれる成分を見出したが、OATP2A1発現調節機構の解明研究は現時点でも進行中である。複雑な構造を有する肺組織での微小透析法によるPGE2は困難であるが、微小透析法による脳内でPGE2濃度測定に成功した。今後、この手法を肺組織へと展開する。これまでの申請者らの研究において、Slco2a1-/-マウスで増悪した線維化は、肺胞腔PGE2の間質側への再分泌低下および肺胞マクロファージの活性化に起因することが示唆された。さらに、suraminやタバコ抽出物などOATP2A1に親和性の高い阻害物質を発見した。平成30年度においては、OATP2A1の機能や発現の低下が肺線維症を悪化させるという仮説を、in vitro、in vivoで検証する。In vitroでは、現在作成を進めている肺胞上皮細胞と線維芽細胞、あるいはマクロファージとの共培養系により、OATP2A1の機能低下と線維化との関係を分子レベルで実証する。In vivoでは、研究計画「5.発現・機能調節物質の肺線維化に及ぼす作用」を基に、Slco2a1+/+およびSlco2a1-/-マウスにBLM等で肺線維症を誘発させ、OATP2A1の阻害効果が認められた薬物や物質を投与し、肺線維化の経過を個体の体重変化、肺組織病理所見や組織PGE2量等により比較検討し、肺線維化進行におけるSlco2a1の寄与を明確にすることに挑戦する。特に、重喫煙負荷は線維症のリスク因子でもあるため、タバコ成分によるOATP2A1阻害が線維症リスクの一因になりえることを実証する。野生型(WT)およびプロスタグランジン輸送体OATP2A1(PGT)をコードするSlco2a1遺伝子KOマウス(Slco2a1-/-)から肺組織、肺胞上皮細胞、および気管肺胞洗浄液を調製し、PGE2細胞内動態調節因子について検討した結果、Cox-2やPGE2代謝の律速酵素15-Pgdhの発現に変化は見られなかった。また、気道や肺胞上皮細胞に強く発現するOatp2a1は、気道・肺胞腔からのPGE2取込みに支配的な寄与を示すことが明らかになった。Slco2a1-/-の肺胞洗浄液中のPGE2量はWTに比べ有意に高値を示したことから、OATP2A1による肺PGE2動態の破綻が線維化重症化と関連することが示された(PLOS ONE, 10:e0123895, 2015)。さらに、線維化悪化原因の特定のため、炎症期においてOATP2A1が肺組織に与える影響、およびPGE2の肺組織内動態と組織線維化との関係を解明している。これまでに、BLMを投与後5日目に線維化の前段階である炎症状態を比較した結果、Slco2a1-/-において、肺気道・肺胞腔中への細胞浸潤、肺病理所見ならびに炎症性マーカーの発現のいずれの点からも炎症の増悪が認められた(日本薬学会第136年会、横浜、2016.3.27)。

しかし、炎症増悪の原因は特定されておらず、分子機序解明を進める。一方、肺PGE2動態については、予備試験段階であるものの、肺胞上皮細胞を用いたPGE2の透過試験により、PGE2は代謝を受けず、気道・肺胞腔から組織側への移行することが確認された。本結果は、PGE2の組織内動態調節因子としてOATP2A1の役割を示すものであり、本PGE2動態の変化と組織炎症・線維化との関連について、検討中である。また、OATP2A1機能阻害物質についても、一部FDA承認薬物ライブリーのスクリーニングにより候補化合物を得た。当初の計画通り、肺組織におけるPGE2細胞内動態調節因子の発現について情報が得られた。さらに、炎症期にOATP2A1が肺組織に及ぼす影響ならびに肺PGE2動態と組織の炎症・線維化との関係についても予定通り研究を開始した。OATP2A1の肺組織に及ぼす影響については、Slco2a1-/-でNF-kbの核内移行増大が示されるなど、OATP2A1機能欠損において炎症増悪が認められたことから、今後の分子機序解明に進展が期待できる。一方、肺PGE2動態についてはマウス肺からの上皮細胞の単離が困難であることが判明した。十分な細胞数を確保できず、実験に要求されるクォリティを保つ単層膜が得られなかったことから、同じくげっ歯類であるラットを用いて研究を実施する。本計画書に記載した微小透析法の確立に関して、すでに連携研究者から技術導入を済ませており、今年度から肺PGE2動態に取り組む。未だ有効な治療法のない特発性肺線維症の進行に関連するPGE2に着目し、その作用部位濃度変動ならびにその調節因子としてプロスタグランジン輸送体(OATP2A1/PGT)に焦点を当て、肺線維症の発症機構解明と治療法の提案を目指した研究を推進している。平成28年度は、肺線維症モデルマウスにおけるPGE2の肺組織内動態を解析するため、ラットから調製した1型肺胞上皮様細胞をTranswell上に培養した膜透過評価系を樹立し、OATP2A1阻害剤を用い、apical(肺胞腔)側からbasolateral(間質)側へのPGE2膜透過に対するOATP2A1関与示すことができた。代謝物はほぼ観察されず、OATP2A1はPGE2の膜透過を媒介し肺胞腔および間質中PGE2濃度調節に働くことが示唆された。さらに、PGE2肺内動態と炎症との関係については、Slco2a1欠損マウスにおいて、様々な炎症性マーカーの発現を同定することにより肺間質性肺炎が悪化することが確かめられ、気道・肺胞腔中に浸潤した炎症細胞の活性化が一因であると考えられた(Nakanishi et al,第38回生体膜シンポジウム)。また、肺胞上皮/線維芽細胞に対するOATP2A1作用はラット1型肺胞上皮様細胞および線維芽細胞共培養系により評価された。OATP2A1阻害剤で線維芽細胞の活性が抑制される傾向がみられた。さらに、OATP2A1の発現・機能調節物質の探索については、FDA承認薬ライブラリーを用い、636個の薬物のOATP2A1輸送活性に対する影響をスクリーニングし(Kamo et al, J Pharm Sci, in press)、薬物の構造とOATP2A1輸送活性との相関関係について情報を得た。当初の計画通り、肺組織におけるPGE2細胞内動態調節因子であるOATP2A1の発現と機能について情報が得られつつある。炎症期にOATP2A1が肺組織に及ぼす影響ならびに肺PGE2動態と組織の炎症・線維化との関係についても研究を開始し、OATP2A1欠損により観察された薬剤誘導性間質性肺炎の増悪にPGE2動態の変化と炎症細胞の活性化が関与することが示唆された。
GPIアンカー合成の調節機構と合成不全症

GPIアンカー生合成経路の酵素群の研究に関し、第1ステップに働くNアセチルグルコサミン転移酵素の新規構成成分PIG-Yをクローニングし、この酵素が7つのサブユニットからなる極めてユニークな単糖転移酵素であることを示した。GPIアンカー欠損症で、後天性遺伝子病である発作性夜間血色素尿症の発症メカニズムに関し、GPIアンカー欠損クローンの拡大が良性腫瘍性に起こることを示唆する第2の遺伝子変異を証明した。平成15年度の成果として報告したPGAP1は、タンパク質に結合直後のGPIアンカーのイノシトールから脂肪酸を除去する脱アシル化酵素である。PGAP1が機能しないとGPIアンカーは3つの脂肪鎖を持ったまま細胞表面に発現してしまう。このとき生体に何が起こるかを知るため、PGAP1ノックアウトマウスを作製した。ノックアウト個体の多くは周産期致死を示し、生き残った個体も成長が遅延した。雄は不妊であったので、不妊の機序を解析したところ、精子が卵子の透明体に付着できないことがわかった。ノックアウト個体の精子上のGPIアンカー型タンパク質のレベルを調べたところ、いくつかの蛋白質の量が正常より多かった。GPIアンカーの切断が、精子の妊性獲得に重要であるとの報告もあり、イノシトールからの脂肪酸除去不全がGPIアンカー型タンパク質の精子からの切断除去を阻害している可能性が考えられた。DPM2は、ドリコールリン酸マンノース(DPM)合成酵素を正に制御するサブユニットとして発見された。DPM2が欠損するとDPM合成が100分の1以下に低下する。DPMは、N型結合型糖鎖、GPIアンカー、C結合型マンノース(おそらくO-結合型マンノースも)のマンノース供与体であるので、DPM2はこれらの糖鎖の合成を制御し得る因子である。その後、DPM2はGPIアンカー生合成の第一ステップであるPIへのNアセチルグルコサミンの転移を司るGPI-GnTにもサブユニットとして含まれていること、DPM2が存在しないとGPI-GnTの活性が1/3から1/4に低下することが見い出された。DPM2が小胞体の2つの複合体酵素の正の制御サブユニットとして働くことから、さらに別の酵素にも働いている可能性を検討した。エピトープタグを付けたDPM2を発現させた細胞から、DPM2をジギトニンで可溶化し、アフィニティ精製し、結合してくるタンパク質を質量分析で同定した。GPI-GnTの5つの成分を排除するため、GPI-GnT欠損細胞を用いた。その結果、タグを変えても共通に結合してくるタンパク質が、DPM合成酵素の残りの2成分であるDPM1とDPM3以外に数種類確認された。対照として用いたDPM3には、DPM1とDPM2しか結合しなかったので、これらの数種類のタンパク質はDPM2に特異的に結合していると考えられる。これらのうちの2つは、oligosaccharyltransferase(OST)の構成成分であったので、DPM2はOSTに特異的に結合していることが予想された。酵素、接着因子、受容体など細胞表面の様々な機能を持つタンパク質がGPIアンカーによって膜に結合しており、それらはラフトと呼ばれる膜ドメインに主として存在している。ラフトは細胞表面から内部へのシグナル伝達の起点として働いている。GPIアンカー型タンパク質が持つ様々な機能は、GPIアンカーの合成が正しく制御されて初めて正しく発揮されるはずであり、実際GPIアンカーの完全欠損は胚性致死をもたらす。特定の組織における欠損は発作性夜間血色素尿症のように疾患を引き起こし、また不完全欠損も疾患として現れると考えられる。遺伝的糖鎖不全症の一部はGPIアンカーの不完全欠損を伴っている。今後、不完全欠損に基づく疾患が見いだされていくものと予想される。本研究の目的は、小胞体におけるGPIアンカー生合成の調節機構を明らかにし、合成不全症の病態解明につなげることである。GPIアンカー合成の調節に働く遺伝子を明らかにするために、GPIアンカー型タンパク質の発現が部分的に低下した変異細胞株を分離した。既知のGPI生合成遺伝子の変異細胞が分離されないよう、それらのcDNAを導入したCHO細胞を親株として用いた。その結果2つの新規変異細胞株が得られた。

一つは、第1マンノースの付加が不全であった。第2の変異細胞は、GPIアンカーがタンパク質に付加された後のステップに異常があると考えられた。これらの変異株の責任遺伝子を発現クローニング法で分離した。酵素、接着因子、受容体など細胞表面の様々な機能を持つタンパク質がGPIアンカーによって膜に結合しており、それらはラフトと呼ばれる膜ドメインに主として存在している。ラフトは細胞表面から内部へのシグナル伝達の起点として働いている。GPIアンカー型タンパク質が持つ様々な機能は、GPIアンカーの合成が正しく制御されて初めて正しく発揮されるはずである。本研究の目的は、小胞体におけるGPIアンカー生合成の調節機構を明らかにし、合成不全症の病態解明につなげることである。小胞体内腔側で、Dol-P-Man/Gluを供与体に用いる糖転移酵素には、N-グリカン前駆体とGPIアンカー前駆体の合成、タンパク質中のセリンへのマンノースの付加に働く酵素など10数種(Alg3,9,12,6,8,10,PIG-M, PIG-B, PIG-V SMP3, PMTs)がある。これらは、全体のトポロジーや活性部位候補アミノ酸が保存されており、ファミリーを形成している。これらER糖転移酵素の制御因子は知られていなかった。我々は、このうちGPIアンカーの第1マンノースの転移酵素であるPIG-Mの制御因子を初めてクローニングし、PIG-Xと名付けた。PIG-Xは、PIG-Mに結合し安定化させる。PIG-Xを欠損したCHO細胞はGPIアンカー生合成活性がほとんどなかった。GPI生合成の第1ステップに働くGPI-Nアセチルグルコサミン転移酵素は、ヒトでは少なくとも6つの成分を含む複合体である。複合体中に第7成分が含まれることを見出し、遺伝子をクローニングした。GPIアンカー型タンパク質欠損細胞の一つが、その遺伝子を欠損している変異細胞であることを見出し、この遺伝子が実際GPIの生合成に必要であることを示した。1)生合成第1ステップの酵素の解明GPI N-アセチルグルコサミン転移酵素は7つのサブユニットで形成されている特異な糖転移酵素である。昨年度発見したPIG-Yが、触媒サブユニットであるPIG-Aに結合すること、その結合が酵素活性の発現に極めて重要であることを見出した。2)新規変異株の分離GPIアンカーに含まれるマンノースは、ドリコールリン酸マンノース(Dol-P-Man)から供与される。高等生物のDol-P-Man合成酵素は、触媒サブユニットであるDPM1と、小さな膜タンパク質であるDPM2とDPM3の3種のサブユニットより構成されている。今回、DPM3欠損変異株CHO2.38株が初めて得られ、機能解析が可能になった。CHO2.38株はDol-P-Man合成酵素活性を完全に失っており、DPM3がDol-P-Man生合成酵素に必須のコンポーネントであることが示された。DPM3のC末端に見られるコイルドコイル様領域は、DPM1との結合およびDol-P-Man合成酵素の機能発現に必須であった。
ハイブリッド・コントロールによる高度化交通構造物の開発

兵庫県南部地震を契機に,高い耐震性能を有するインフラ構造物が要求されている.そのため,さまざまな耐震・制震・補修補強技術の高度化に関する研究がますます重要になっている.一方,社会基盤構造物は,長期間の自然作用や荷重作用による経年劣化から逃れられない.よって,構造物の経年劣化による構造特性の変化への対処ができる適応制震技術や構造物の健全性診断技術が重要となる.本研究では,既に開発したシステムの非パラメータ同定及び適応制御アルゴリズムに基づいて,大規模構造システムを対象に,局所化と分散化制御コンセプトの導入により,斜張橋などの大規模構造システムに対する局所化と分散化適応制御アルゴリズム及びハイブリッド・コントロールによる制御手法を提案し,数値シミュレーションによりそのアルゴリズムの有効性・適応性を検証した.一方,構造物の安全性向上と機能の高度化を目指し,構造物のヘルスモニタリング及び同定手法に関する研究が進められている.本研究では,特に,構造物の常時微動や小規模地震による構造物の震動応答及び自由振動応答を用いた構造物のヘルスモニタリング手法とパラメータ同定アルゴリズムを提案した.そして,大規模構造システムに適用するために,局所化ヘルスモニタリング手法とパラメータ同定アルゴリズムを提案した.また,光ファイバセンサーで計測された構造物の振動ひずみの時刻歴を用いた構造の損傷診断及びパラメータ同定手法も提案し,これら提案した手法が損傷に敏感で精度高く損傷を同定することができることを数値シミュレーションにより検証した.また,実構造物に適用することが期待されている広域で分散化光ファィバセンシング技術を用いて,複合材料で補強された実構造物の長期間モニタリングに関する実験研究も行っている.兵庫県南部地震を契機に,高い耐震性能を有するインフラ構造物が要求されている.そのため,さまざまな耐震・制震・補修補強技術の高度化に関する研究がますます重要になっている.一方,社会基盤構造物は,長期間の自然作用や荷重作用による経年劣化から逃れられない.よって,構造物の経年劣化による構造特性の変化への対処ができる適応制震技術や構造物の健全性診断技術が重要となる.本研究では,既に開発したシステムの非パラメータ同定及び適応制御アルゴリズムに基づいて,大規模構造システムを対象に,局所化と分散化制御コンセプトの導入により,斜張橋などの大規模構造システムに対する局所化と分散化適応制御アルゴリズム及びハイブリッド・コントロールによる制御手法を提案し,数値シミュレーションによりそのアルゴリズムの有効性・適応性を検証した.一方,構造物の安全性向上と機能の高度化を目指し,構造物のヘルスモニタリング及び同定手法に関する研究が進められている.本研究では,特に,構造物の常時微動や小規模地震による構造物の震動応答及び自由振動応答を用いた構造物のヘルスモニタリング手法とパラメータ同定アルゴリズムを提案した.そして,大規模構造システムに適用するために,局所化ヘルスモニタリング手法とパラメータ同定アルゴリズムを提案した.また,光ファイバセンサーで計測された構造物の振動ひずみの時刻歴を用いた構造の損傷診断及びパラメータ同定手法も提案し,これら提案した手法が損傷に敏感で精度高く損傷を同定することができることを数値シミュレーションにより検証した.また,実構造物に適用することが期待されている広域で分散化光ファィバセンシング技術を用いて,複合材料で補強された実構造物の長期間モニタリングに関する実験研究も行っている.
３大認知症の潜在性併存診断とアミロイド排除による正常圧水頭症の長期予後改善研究

特発性正常圧水頭症(iNPH)は、高齢者の認知症の原因となる疾患の一つであるが、地域在住高齢者の1%と高頻度に存在し、かつシャント術で認知症が治せる重要な病態である。本研究では、シャント術を受けたiNPH患者が2年後でも、よい状態が続いていることを確認するとともに、よい状態が続く条件は何かを、iNPH以外の3大認知症、すなわちアルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症の併存の有無という観点から明らかにする。またアルツハイマー病が併存しているiNPH患者に対しては、シャント術による脳内アミロイドの排泄と治療効果との関係も調べる。
病変声帯のモデル化並びに嗄声の音響分析による声帯病変の類別及び診断に関する研究

1.収集した声帯疾患者の声帯及びその音響分析データ、病変声帯のビデオ画像データ、専門医師による診察情報や病理学的検査データ等を基礎に、特に症例の多い声帯結節、声帯ポリ-プについてその振動状態を模擬できる声帯振動モデルの研究・開発及び改良を行った。2.1.で開発された声帯振動モデルを用いて嗄声を合成し、その音響的特徴量とそれを生ずる各種の病変声帯モデルの物理的条件との関係について詳細な分析と解明を行った。3.1.、2.の結果を基に、声帯病変の類別及び病変程度の推定に有用な音響的評価量に関する研究を行った。更に、病変程度(例えば、声帯結節や声帯ポリ-プの大きさ(腫脹程度)及び硬さ)の推定実験を行い、推定方法、推定に用いた嗄声の音響的特徴量及び音響的評価量の有効性について検討を行った。以上の研究の結果、以下の知見を得ることができた。[1]開発した声帯結節モデル及び声帯ポリ-プモデルでは、(1)声帯モデルを実際の声帯の構造に整合させたbody-coverモデルにしたこと、(2)従来のモデルでは考慮されていなかった声門閉鎖不全による気息性雑音を考慮したこと、等により病変を有する声帯の振動状態を適切に模擬でき、また声帯病変患者音声の特徴を有する嗄声を合成できることが確認された。[2]実験により、声帯の病変程度(声帯結節や声帯ポリ-プの大きさ)の推定が高精度で行われること、提案した推定法が有効であることなどが確認された。[3]推定に用いた音響的特徴量(波形に関する情報及び推定雑音スペクトル)は嗄声の特徴を表現するのに有効であることが確認された。1.収集した声帯疾患者の音声及びその音響分析データ、病変声帯のビデオ画像データ、専門医師による診察情報や病理学的検査データ等を基礎に、特に症例の多い声帯結節、声帯ポリ-プについてのその振動状態を模擬できる声帯振動モデルの研究・開発及び改良を行った。1.開発した声帯結節モデル及び声帯ポリ-プモデルでは、モデルの構造を実際の声帯の形状に整合させ、更に従来のモデルでは考慮されていなかった声門閉鎖不全による気息性雑音を考慮したため、病変を有する声帯の振動状態を適切に模擬でき、また声帯病変患者音声の特徴を有する嗄声を合成できることが確認された。2.実験により、声帯の病変程度の推定が高精度で行われること、提案した推定法が有効であることなどが確認された。3.推定に用いた音響的特徴量(波形に関する情報及び推定雑音スペクトル)は嗄声の特徴を表現するのに有効であることが確認された。1.収集した声帯疾患者の音声及びその音響分析データ、病変声帯のビデオ画像データ、専門医師による診察情報や病理学的検査データ等を基礎に、特に症例の多い声帯結節、声帯ポリ-プについてその振動状態を模擬できる声帯振動モデルの研究・開発及び改良を行った。

2.1.で開発された声帯振動モデルを用いて嗄声を合成し、その音響的特徴量とそれを生ずる各種の病変声帯モデルの物理的条件との関係について詳細な分析と解明を行った。3.1、2.の結果を基に、声帯病変の類別及び病変程度の推定に有用な音響的評価量に関する研究を行った。更に、病変程度(例えば、声帯結節や声帯ポリ-プの大きさ(腫脹程度)及び硬さ)の推定実験を行い、推定方法、推定に用いた嗄声の音響的特徴量及び音響的評価量の有効性について検討を行った。以上の研究の結果、以下の知見を得ることができた。〔1〕.開発した声帯結節モデルでは、(1)声帯モデルを実際の声帯の構造に整合させたbody-coverモデルにしたこと、(2)従来のモデルでは考慮されていなかった声門閉鎖不全による気息性雑音を考慮したこと、等により病変を有する声帯の振動状態を適切に模擬でき、また声帯病変患者音声の特徴を有する嗄声を合成できることが確認された。〔2〕.実験により、声帯の病変程度(声帯結節の大きさ)の推定が高精度で行われること、提案した推定法が有効であることなどが確認された。〔3〕.推定に用いた音響的特徴量(波形に関する情報及び推定雑音スペクトル)は声帯結節による嗄声の特徴を表現するのに有効であることが確認された。
トランスジェニック魚を用いるクロロフラノン化合物の遺伝子突然変異誘発機構の解明

本研究は、トランスジェニックゼブラフィッシュを用い、水道水の塩素処理副生成物である3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone(MX)を含めたクロロフラノン化合物によって引き起こされる遺伝子突然変異の検出、変異スペクトルの解析を行うことにより、クロロフラノン化合物による変異誘発機構を解明することを目的としている。本年度はクロロフラノン化合物のうちMXの遺伝毒性について検討した。MXはPadmapriyaらの合成法を一部改良し合成したものを、さらにHPLCで精製して実験に用いた。MXをジメチルスルホキシドに溶解し、ゼブラ水(0.1%人口海水)500mlに、最終濃度として1260mg/Lとなるように溶解した。1000mlビーカーにゼブラ水500mlを入れ、この中で5匹のゼブラフィッシュを泳がせることによりMXに対する暴露実験を行った。暴露開始から24時間後にゼブラフィッシュを回収し生存率を確認した。その後、生存していたゼブラフィッシュについては、血液とエラを採取し、遺伝毒性の指標となる小核の有無をそれぞれの細胞について観察した。その結果、血液、エラの細胞ともに小核を有する細胞の有意な増加は観察されなかった。この結果を受け、現在、トランスジェニック魚を使用することを考慮して、クロロフラノン化合物の暴露条件、遺伝毒性の指標となる試験方法等について再検討している。本研究は、トランスジェニックゼブラフィッシュを用い、水道水の塩素処理副生成物である3-chloro-4-(dichloromethythl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone(MX)を含めたクロロフラノン化合物によって引き起こされる遺伝子突然変異の検出、変異スペクトルの解析を行うことにより、クロロフラノン化合物による変異誘発機構を解明することを目的としている。本年度はまずMXの合成を行った。Padmapriyaらの合成法を一部改良し行った結果、原料からの最終収率は10%程度にまで上昇することができた。さらにHPLCで精製したMXを実験に用いた。次にMXの毒性についてノントランスジェニックゼブラフィッシュを用いて検討した。MXをジメチルスルホキシドに溶解し、ゼブラ水(0.1%人口海水)500mlに、最終濃度として300、60、12、2.4、0mg/Lとなるように加えた。1000mlビーカー中のゼブラ水500mlに5匹のゼブラフィッシュを泳がせることによりMXに対する暴露実験を行い、24時間後の生存率を調べた。その結果、300および60mg/LのMX濃度の溶液に暴露したゼブラフィッシュの生存率は0%であった。また、12および2.4mg/LのMX濃度の溶液での生存率は100%であった。よって24時間暴露におけるMXのLC50は12-60mg/Lの間に存在することが考えられる。またその他のクロロフラノン類(BMX-1)についても同様の傾向がみられた。以上の結果から、今後はMXの24時間暴露における正確なLC_<50>を求め、実際にトランスジェニックゼブラフィッシュを用てクロロフラノン化合物の暴露実験を行う予定である。