hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛇行長期動態の物理機構に基づく自然営力順応型川づくり

H28年度では前年度までの主な検討対象であった砂礫床河川の蛇行現象の対象を拡大させ,より現実に即した現象に適応させるため,岩盤河床河川,湿地河川,急流河川,粘着性護岸を有する河川の蛇行等について検討を進めた.また災害時の突発的な蛇行形状変化に関する検討も実施した.まず山地河川のように河床が岩盤で構成される河川の蛇行現象の解明を目的として,一様湾曲部における岩盤の侵食過程を明らかにするための実験を行った.無限長の一様湾曲部を再現するため円形水路の水面に接したドーナツ状板を回転させ,シアーにより流れを作りだした.内岸側に二次流による堆積砂州が形成されること,水路内の砂が十分でない場合は外岸側に岩盤露出が生じ,砂で覆われた領域との領域境界で活発な侵食が発生することが明らかとなった.これらの現象を再現できる数値解析モデルの構築を行った.また,風化現象やニックポイントの上流移動について,実験および数値解析を用いて分析した.急流河川については,反砂堆上の水面波に関する線形安定解析を行い,水面波と砂州が共存しうることを確認した.一方,湿地河川については,直線部と屈折部が連続する特有の蛇行形状に着目し,大型水路を用いての流れの可視化とLDV計測を実施した.粘着性護岸を有する蛇行については,河岸土砂の粘着性と河岸内の不飽和浸透流を考慮したブロック状の河岸崩落現象の数値解析モデルを構築するとともに水路実験を実施し,ブロック状の河岸崩落現象の数値解析による再現を試みた.また,ミャンマー国マンダレー市周辺のエーヤワディー川の流れと河床変動の現地観測を開始した.一方2016年8月北海道豪雨災害を対象に蛇行の直線化,直線流路の蛇行化等の急激な流路変動を観測し,それらが流砂非平衡性によるものであることを例証した.一般的な砂礫河川の蛇行現象から対象を広げ,粘着性護岸,岩盤河床河川,急流河川,湿地河川などの蛇行現象を広く扱い,それらの特性やメカニズムを明らかにすることに成功した.また,台風来襲による北海道水害に着目し,機を逃さずその蛇行に及ぼす影響やそのメカニズムを明らかにした.これらの成果より,本研究の進捗状況は当初の研究計画の進行速度に勝るとも劣らぬ迅速性を達成していると判断され,おおむね順調に進展していると判断した.これまでに軽微な研究計画変更があったものの,研究目的や研究開始時の計画から大きな変更を要するものではなく,ほぼ当初の研究計画に沿って研究を進めていくことが可能であると判断する.これまでの2年間を通じて研究の基礎的部分は相当構築されつつあり,これから応用的研究の割合を次第に増加しつつ,研究を展開していく.また,用的研究の割合の増加と呼応して,実河川へ直接アプローチすることをより積極的に進める.このための現地調査旅費の割合を増加させる.平成28年度の研究でスタートした,粘着性河岸の河川,岩盤河川,急流河川,湿地河川などの研究をさらに発展させ,より広範な河川蛇行現象の解明に力を注いでいく.これと並行して,気候変動や突発災害などの気象現象の影響についても,より深く切り込んでいく.一方で,ケーススタディについては国外の河川の蛇行現象にその主な対象を広げ,わが国の河川の蛇行特性との相違に着目しながら,その特性を検討することで,蛇行の普遍的メカニズムの解明へとつなげていく.
頭頸部癌におけるcSrcと放射線治療との臨床的関係および機能の解析

頭頸部扁平上皮癌臨床検体に対してcSrcの免疫染色を行った検討ではcSrcが高発現している症例ではしていない症例と比較し放射線抵抗性であることが判明している。さらにcSrcだけでなくIGF-1RとEGFRに関してもその相互作用と放射線治療の関係をin vivoモデルを用いて検討した。その結果では過去の報告と同様に抗EGFR抗体と放射線の併用では高い抗腫瘍効果示し、放射線単独と比較してその効果を増強している。抗EGFR抗体にさらにIGF-1R抗体を加えると放射線感受性はより高まり、高い抗腫瘍効果を発揮することが判明した。近年頭頸部癌、特に進行癌に対して化学放射線療法が初回治療として選択されるケースが増加してきた。化学療法のレジメの選択などによりその治療効果は高く、進行癌であっても根治可能な症例が増えてきている。しかしながら、同治療を用いても根治できない症例も少なからず存在し、また根治し得たとしても治療による粘膜炎などの障害により高度のQOL低下をきたす症例も多い。それぞれの頭頸部扁平上皮癌症例に対する放射線の感受性予測、さらなる有害作用を最小限にとどめつつ、より治療効果の高い放射線治療の開発を目的とし研究を行ってきた。がん遺伝子の一つであるcSrcにターゲットを絞り研究を行ってきた。cSrcは放射線感受性との関連が培養癌細胞では認められるという予備的知見を得ており、これらの結果が実際の臨床でも応用できるのかを検討した。臨床検体に対して免疫染色を行った検討ではcSrcが高発現している症例ではしていない症例と比較し放射線抵抗性であることが判明している。また頭頸部癌で放射線治療との併用で汎用されているシスプラチンとの併用効果を培養癌細胞で検討した。その結果ではシスプラチンと放射線との併用に比較しシスプラチン、放射線とcSrc inhibitorとの3者併用では抗腫瘍効果が高いことが判明している。それぞれの頭頸部扁平上皮癌症例に対する放射線の感受性予測とさらなる有害作用を最小限にとどめつつ、より治療効果の高い放射線治療の開発のためがん遺伝子の一つであるcSrcにターゲットを絞り研究を行っている。cSrcは放射線感受性との関連が培養癌細胞では認められるという予備的知見をえているが、これらの結果が実際の臨床でも応用できるのかを検討している。これらが応用することができれば、治療効果の予測因子として大変有用であると考える。cSrc inhibitorの抗腫瘍効果を検討し、現在頭頸部癌に対して最も頻繁に使用されているシスプラチンとの併用効果を検討予定である。シスプラチンの感受性が高い培養癌細胞に対するcSrcinhibitorの付加効果を、またシスプラチン抵抗性の細胞に対してのcSrc inhibitorの付加効果を検討する実験を行う。1)臨床検体を用いたcSrcと治療効果および予後との関係の検討咽喉頭および口腔癌により放射線治療を受けた患者の腫瘍組織パラフィン包埋材料ないし凍結保存材料を使用している。これらの組織内のcSrcの発現状況や発現パターンを免疫組織化学および遺伝子・タンパク解析法を組み合わせ総合的に頭頸部扁平上皮癌患者におけるcSrcと放射線療法の関係を明らかにする。現在、過去の症例を集積し、治療経過とcSrcの発現パターンの解析を行っている、数例に関してはデータが蓄積されてきているが、さらなる症例数の追加が望まれる。2)シスプラチン抵抗性培養癌細胞の選択以前の研究において放射線感受性を調べた培養癌細胞10種に対してMTT assayを用いてシスプラチンの感受性を調査している。各々細胞においてGI50を指標として感受性細胞と日感受性細胞の選出を終了した。今後、これらの代表的な培養細胞に対してcSrcとの関連を検討していく。臨床における症例の集積が遅れているため。現時点であまり仮説を裏付ける結果がでておらず、cSrcと放射線の関係性に関して有益な報告ができていない。過去の症例についても検討を行い症例の集積を急ぐ。また喫煙歴など症例の傾向をしぼり検討を行う予定。培養癌細胞の維持管理およびディッシュ、フラスコ、試薬などの実験消耗品への使用を予定している。またデータ管理のための保存媒体やデータ整理のPCソフトへの運用、研究経過の学会での報告のための参加費などを見積もっている。
アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析による急性肝障害の重症化予知に関する研究

急性肝障害はしばしば重症化し、集学的治療を必要とするが、肝障害の発症初期における重症化や予後を予測するモデルは明らかではない。我々が以前に行った予備研究では、急性肝障害の肝予備能評価のためにアシアロシンチグラフィを行った症例のうち、発症初期にSPECT/CT像で肝臓集積が低下し分布が不均一であった症例では急性肝不全に陥るものが多かった。そこで急性肝障害の発症初期にアシアロ糖蛋白受容体活性が低下している症例では、その後に重症化し予後不良である、という仮説を立てた。急性肝障害の発症初期にアシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析を行い、重症化と予後との関連を調査する前向き研究は、2019年3月31日現在、予定症例数40例には達していないため症例のエントリーを継続している。本研究にて使用する放射性薬剤であるTc-99m-GSA(アシアロシンチ注)は年度末の時点で安定供給されており、画像解析ワークステーションは正常稼動している。エントリーされた症例については機能性肝体積、肝臓集積率、肝臓集積均一度の定量解析を行い、データ蓄積中である。肝予備能評価のため過去にアシアロシンチグラフィを行った慢性肝胆道疾患症例について、SPECT/CT撮像によるアシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析が可能であった症例を検討したところ、肝線維化が進行した症例(F2以上)では肝線維化の軽度の症例(F1以下)と比べ、肝受容体結合率(LHL15)が低く、肝臓集積均一度が高いことが判明した。さらに、多変量解析にて肝臓集積均一度が進行した肝線維化(F2以上)の独立した寄与因子であることを確認した。そのため肝臓集積均一度は肝予備能だけでなく進行した肝線維化(F2以上)の評価に有用である旨を論文にて報告した(Kotani K, et al. Medicine. 2018Aug;97(31):e11765.)。2017年度上旬に、本研究にて使用する放射性薬剤であるTc-99m-GSA(アシアロシンチ注)の原料である人血清アルブミンの安定供給が困難なため、2017年8月に同薬剤が供給停止になる通知が製造元の製薬会社からなされた。そのため研究の遂行ができなくなる可能性があったが、2017年7月に同薬剤の安定供給再開が可能となった旨の通知がなされた。それを受けて研究計画書を当院の倫理委員会に申請し、2017年度末に研究承認を得たため研究の開始が遅れた。2018年度は患者のエントリーを開始し、年度末までに3例が登録されている。エントリーされた症例数が少ないため、結果の解析の段階には未だ至っていない。アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析による急性肝障害の重症化予知に関する前向き研究の開始が遅れたため、過去にSPECT/CTを用いたアシアロシンチグラフィを行った慢性肝胆道疾患患者51例を対象とした後ろ向き観察研究を行ったところ、肝臓集積均一度(集積の最大/平均比)が肝予備能だけでなく進行した肝線維化と関連することを見出した。そのため同内容については論文報告を行った(Kotani K, et al. Medicine. 2018Aug;97(31):e11765.)。アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析による急性肝障害の重症化予知に関する前向き研究については、引き続き症例エントリーを随時受付し、急性肝障害の発症初期と1-2ヶ月後にアシアロシンチグラフィを行い、SPECT/CT像から機能肝細胞量と肝内分布を定量評価する。症例のエントリー開始が遅れたため、当初の予定症例数である40例に達しない場合には15例エントリーされた時点で重症度および予後とシンチグラフィ定量値との関連を調査する。15例以上エントリーされそうであれば当初の予定である40例を目標に可能な限り症例を追加する。最終的な解析結果については学会報告や論文作成を行う予定である。SPECT/CT像を用いたアシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析に関する後ろ向き研究については、急性肝障害だけでなく、慢性肝障害や肝硬変症例における肝内の集積度や分布も検討する。定量値に関して、機能性肝体積、肝臓集積率、肝臓集積均一度、SUVを評価項目とする。血液学的所見、超音波やエラストグラフィ、門脈血行動態や側副血行路についても調査を行い、SPECT/CTから得られた定量値との関連を解析する。解析結果がまとまった時点で学会報告や論文作成を行う予定である。急性肝障害はしばしば重症化し、血漿交換や血液濾過透析を含めた集学的治療や肝移植を念頭に入れた診療が必要である。一般的な肝予備能検査として、血清アルブミン、凝固因子、ビリルビン、ICG試験等が挙げられるが、凝固異常、低栄養、胆汁うっ滞を合併する急性肝障害ではこれらの数値は正確な肝予備能を反映しない可能性が知られている。アシアロシンチグラフィは肝細胞表面のアシアロ糖蛋白受容体に特異的に結合するTc-99m-galactosyl human serum albumin(GSA)を用いた受容体イメージングであり、機能肝細胞量を反映する直接的な肝予備能検査法である。急性肝障害の予後予測について、Model for End-stage Liver Disease(MELD score)や肝移植適応ガイドラインは重症化した症例では有用であるが、肝障害発症初期での診断能は高くない。

我々が以前に行った後ろ向きの予備研究では、急性肝障害の肝予備能評価のためにアシアロシンチグラフィを行った症例のうち、肝障害の発症初期にSPECT/CT像でRadioisotope(RI)集積が低下し分布が不均一であった症例では急性肝不全に陥るものが多かった。そこで我々は急性肝障害の発症初期にアシアロ糖蛋白受容体活性が低下している症例では、その後に重症化し予後不良である、という仮説を立てた。急性肝障害の発症初期および1-2ヶ月後にアシアロシンチグラフィを行い、アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析をSPECT/CT像を用いて実施し、得られた定量値および変化率と肝障害の重症度、予後との関連を調べることとした。平成29年度は当院の倫理委員会にて研究開始の承認を得た。症例のエントリーを随時受付する予定である。2017年度上旬に、本研究にて使用する放射性薬剤であるTc-99m-GSA(アシアロシンチ注)の原料である人血清アルブミンの安定供給が困難なため、2017年8月に同薬剤が供給停止になる通知が製造元の製薬会社からなされた。そのため研究の遂行ができなくなる可能性があったが、2017年7月に同薬剤の安定供給再開が可能となった旨の通知がなされた。それを受けて研究計画書を当院の倫理委員会に申請し、年度末に研究承認を得た。そのため研究の開始が遅れており、症例はまだエントリーできていない。アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析による急性肝障害の重症化予知に関する前向き研究の開始が遅れたため、後ろ向き研究として過去にSPECT/CTを併用したアシアロシンチグラフィを行った82症例を対象に、アシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析を行い、従来の指標との関連を調べることとした。具体的にはSPECT/CT像からPET検査と同様にstandardized uptake value(SUV)を撮像装置固有のbecquerel calibration factor(BCF)を用いて計測することとし、肝臓全体に関心領域を設定したSUVを算出した。Dynamic planar撮像により得られる肝受容体結合率(LHL15)と血中クリアランス率(HH15)との相関関係を調べた。その結果、SUVとLHL15は正の相関関係を、またSUVとHH15は負の相関関係を認めた。また、SUVmeanが20以下では全例LHL15が0.90未満、HH15が0.60以上であったことから、従来のLHL15、HH15に加え、SUVが3次元定量解析における新たな肝機能指標となる可能性が示唆された。急性肝障害はしばしば重症化し、集学的治療を必要とするが、肝障害の発症初期における重症化や予後を予測するモデルは明らかではない。我々が以前に行った予備研究では、急性肝障害の肝予備能評価のためにアシアロシンチグラフィを行った症例のうち、発症初期にSPECT/CT像で肝臓集積が低下し分布が不均一であった症例では急性肝不全に陥るものが多かった。そこで急性肝障害の発症初期にアシアロ糖蛋白受容体活性が低下している症例では、その後に重症化し予後不良である、という仮説を立てた。急性肝障害の発症初期にアシアロ糖蛋白受容体活性の3次元定量解析を行い、重症化と予後との関連を調査する前向き研究は、2019年3月31日現在、予定症例数40例には達していないため症例のエントリーを継続している。本研究にて使用する放射性薬剤であるTc-99m-GSA(アシアロシンチ注)は年度末の時点で安定供給されており、画像解析ワークステーションは正常稼動している。
流れの脈動による複雑流路内の伝熱促進機構の解明とホットスポット直冷技術への展開

2018年度は,脈動流を応用するアプリケーションに近い流路構造および冷却対象において,脈動流による伝熱促進効果が広く期待できるかどうかを,主に数値シミュレーションにより評価した。とりわけ空冷での脈動流に焦点を絞り,ファン空冷を行う電子機器を想定した幅60 mmの流路を検証対象とした。流路内部に断面寸法30 mm ×30 mmの角柱を,距離を変えながら3本直列に設置した場合に起こる,流れの脈動化による伝熱促進効果を検証した。角柱は発熱部品や伝熱促進体を想定している。脈動時の伝熱促進効果は,時間平均流量が同じ定常流の結果と比較することで検証を行った。時間平均の流速は,ファン空冷を行う小型電子機器で見られる,幅60 mm,高さ40 mmの筐体にファンで空気を供給した場合を想定したReynolds数が1000に相当する値とした。検証した範囲において,次の結論が得られた。まず,脈動しない通常の定常流において,流れがはく離し,高温の空気が淀んでしまう角柱の隙間で,流れの脈動化による高い伝熱促進効果を確認できた。脈動による効果は最上流の1本目より,下流側の2本目,3本目の角柱のほうが高かった。定常流において一般的に見られる流れの下流側における伝熱性能の低下を,流れの脈動化により抑制できる良好な効果を確認できた。これは既報の部品単体の場合と同様,減速周期で部品の隙間や背後のはく離領域に流れを誘起することで,隙間における空気の滞留を防ぐことでより伝熱されることによる。以上から,構造が複雑な冷却対象においても,脈動による伝熱促進の効果が得られる結果を得ることが出来た。とりわけ,冷却空気の流れが複雑化する高密度実装電子機器や,より高い伝熱を得るために複雑な構造になる傾向がある冷却デバイスの内部において,脈動流の適用による冷却の効率化が実現できる感触を得ることが出来た。当初計画では,2017年度の成果を踏まえ,複雑な電子機器における空冷やホットスポット直冷用水冷デバイスなどの,実際の応用対象を模擬したモデルを用い,脈動流の有用性および実機応用の可能性を検証することを予定していた。特に実験と数値シミュレーションの双方による評価を計画していた。複雑な電子機器を想定した複数の発熱部品が実装されたケースにおける,空冷における脈動流の伝熱促進への有効性については,数値シミュレーションを通じて一定の評価を行うことができた。一方,2018年4月に研究代表者が異動したこともあり,計画していた脈動水流実験系の調整が遅れた。そのため,実験による評価と,脈動流によるホットスポットの温度制御を実現する一連の冷却機構の設計指針を整理し提案するまでには至らなかった。以上の進捗状況から,研究目的の達成度について「やや遅れている」と評価した。遅れたステップについては,補助事業期間の延長により,2019年度に完了することを目指す予定である。2018年度の成果も踏まえ,改めて実際に脈動流を応用する冷却システムを想定した評価系の設計製作を行う。実験と数値シミュレーションの双方から,脈動流の実機応用に向けた検討を実施する。冷媒は空気と水の双方を検討するが,とりわけ2018年度に検証が不足した水を重点的に評価する。評価系は複数の伝熱促進体を設置したものとし,2017年度に検証を行った脈動波形の設計情報も参考に,伝熱効率を最適化する脈動流の制御を行う。冷却システム全体の流れの可視化や,温度場の過渡応答の評価を実施し,冷却システム内部の脈動流による伝熱効率を最大化させるための流れの設計情報を体系的に整理する。2019年度の研究により,改めて流れの脈動によるホットスポットの温度制御を実現するための,冷却機構の設計指針について提案していく予定である。電子機器のファン空冷を想定し,cmスケールの矩形筐体内に設置した発熱体を,脈動させた空気で冷却した場合の伝熱促進効果について実験し,伝熱促進に向けた脈動波形の制御指針を探索した.実験は研究室所有の風洞で行った.ピストン・カム機構を用いて風洞を流れる空気を脈動させた.流路は19インチラックに搭載する1Uサイズの機器を想定し,断面の寸法は80mm×40mmとした.幅方向の中心に発熱体を設置した.発熱体は電子部品やピンフィンなどの伝熱促進体を想定し,断面が一辺30mmの正方形の角柱とし,表面にステンレスヒータを貼り付け一様熱流束条件で加熱させた.空気の脈動周波数は1Hzまたは2Hzとし,カムの形状を変更することで脈動波形を変更した.脈動時の最大流量に基づくReynolds数を定義し,実験時のReynolds数は1500とした.伝熱促進に対する脈動の有効性の確認は,脈動時の最大流量で固定した定常流の結果との比較により行った.流量の脈動波形を変化させ,正弦波状の緩やかな波形と,より急峻な変化をもたせた波形を比較した場合,後者は前者に比べ更に10%程度高い流量低減効果が得られた.脈動時の最大風量で固定した定常流の72%の時間平均流量で,脈動流は同等の伝熱性能を得た.また,周波数を1Hzから2Hzに変更した場合,条件により多少伝熱が向上したが,大きな違いはなかった.

実用の観点からは,脈動の減速期間で流れが必要以上に発熱体周りに停滞し伝熱を抑制しない程度の脈動周波数でよい感触を得た.また,次年度に向けた先行調査として,研究室所有の数値解析技術を用いて,mmスケールの矩形流路に脈動水流を流した場合の伝熱促進効果を調査した.断面が5mm×5mmの流路に,伝熱促進のためのリブを設け流れを脈動させた場合,cmスケールの空気流と同様の伝熱促進効果が得られる可能性を明らかにできた.cmスケールのファン空冷を対象とした場合について,脈動流による伝熱促進効果を,脈動波形を変えながら実験的に検証することができた.カムの形状を変更することにより,実験で脈動波形を制御する技術の構築に成功した.脈動波形を変更しながら比較を進め,脈動流による発熱体まわりの伝熱促進効果を最適化するための脈動波形の設計指針を獲得できた.これは脈動流の実機応用に向けて重要な基礎情報となる.また,並行して,次年度計画しているmmスケールデバイスにおける脈動流の伝熱促進に関する研究に向けて,数値解析による先行調査を進められた.次年度の計画の詳細を詰めるために必要な情報を入手できた.一方で,冷却システム全体としての効率を検討するために必要な物体周りの圧力損失の評価については,数値解析による評価は問題なく実現できた.しかし実験については,計測は行えているものの,流路内の静圧の分布や,計測系の時間応答に対する信頼性の評価が遅れており,信頼性の改善が必要となった.しかし平成28年度のうちに,計測点の増加,計測装置の変更による計測系の改善に向けた準備を完了し,実験においても圧力損失の評価を行えるよう準備できた.以上の進捗状況から,研究目的の達成度について「おおむね順調に進展している」と評価した.平成28年度の結果を踏まえ,脈動流による伝熱促進が冷却システムの寸法や作動流体に依らないかどうか,スケール効果の検証を進めた。特に脈動風洞による実験と,水冷を想定した数値シミュレーションを主に,脈動流の伝熱促進効果と作動流体や寸法の関係についての検証を行った。特に水冷の検証では,水冷デバイスを想定した5 mm×5 mmの流路に伝熱促進のためのリブ(突起)を設置し脈動水流を付与した場合の流れ場および温度場を評価した。とりわけ,流路全体の伝熱促進の効果,圧力損失も加味した伝熱効率の改善効果,リブを複数設置した場合の変化を評価した。本研究の検証の範囲において以下の結果が得られた。まず,時間平均流量が同じ定常流と比較して,作動流体や寸法を問わず,脈動流による大幅な伝熱促進が実現できることを明らかにできた。また,生成する脈動波形の最適な制御を行うことで,脈動の加速期間において見られる圧力損失の増加を抑制することができ,伝熱効率の最適化につながることもわかった。2点のリブを適正な間隔で流路に設置した場合には,双方のリブで発生する逆流が適度に干渉することで,リブ単体で見られた効果より高い伝熱促進効果が得られることを明らかにできた。実際の水冷デバイスにおいて散見されるT字分岐の周りにおいても,脈動流の伝熱促進効果が得られることも併せて確認した。以上から,冷却対象のスケールを変更した場合でも,脈動流の生成により高い伝熱促進が実現できる可能性を明らかにできた。脈動流による伝熱効率の向上がスケールを問わずに実現できる流量制御指針について,一連の重要な情報が得られた。平成28年度の成果を踏まえ,よりホットスポット直冷機構に近づけた検証を行うために,対象の作動流体の変更と冷却流路のダウンサイジングを無事実施し,1年間の検証を行うことができた。
角化細胞分化に連動したヒトパピローマウイルスクロマチンの転写複製機構の解明

1、ヒト293細胞でのヒトパピローマウイルス(HPV)DNA複製系を用いて、角化細胞で発現している転写因子がHPV複製に及ぼす効果を調べ、ヒト転写因子hSkn-laがHPV複製を増強することを見出した。ゲルシフト解析により、hSkn-laがウイルス複製オリジンの二ヶ所に結合することが示された。またクロマチン免疫沈降法により、細胞内でこの部位へのhSkn-laの結合を検出した。この結合部位にhSkn-laが結合出来ない塩基置換を導入すると、その複製増強作用が消失した。hSkn-laがオリジンへの結合を介して、分化に連動したHPV複製に関わることが示唆された。2、HPV後期プロモーターP670に20塩基の置換を端から順次導入したリポータープラスミドを用いて、P670に二ヶ所の転写抑制配列があることを見出した。組換えCDP蛋白質を用いたゲルシフト解析によって、細胞の転写抑制蛋白質CDPがこれらの配列に結合することが分かった。未分化細胞における後期プロモーターの抑制にCDPが関わる可能性が示唆された。3、HPV16型の環状ゲノムDNAをヒストンおよびヒストンシャペロン蛋白質NAP-2、クロマチン再構築因子ACFと共に混合し、ATP分解のエネルギーを用いて、生理的なヌクレオソーム間隔を持つHPVクロマチンを作成した。HPVクロマチン上でのヌクレオソームの位置をマイクロコッカスヌクレアーゼ分解法にて解析したところ、ヌクレオソームがP670プロモーター領域に正確に配置され、細胞内でのHPVクロマチンを再現していることが分かった。また、HPV16型の複製蛋白質E1とE2を組換え蛋白質として精製し、ヒト293細胞の抽出液中でE1/E2存在下にHPVゲノムDNAを複製させる無細胞実験系を構築し、この複製系にて再構成HPVクロマチンが複製されることが示された。ヒトパピローマウイルス(HPV)のゲノム複製は感染角化細胞の分化に同調して制御されるが、その分子機構は不明である。そこで角化細胞で発現する細胞転写因子がHPV複製に与える影響を検討した。高リスク型HPV16ゲノムのLCR-E6-E7領域を組み込んだHPV16オリジンプラスミドを、HPV16複製蛋白質E1/E2の発現プラスミドと共にヒト293細胞にトランスフェクションし、72時間後にHirt法にて細胞内のオリジンプラスミドを回収、制限酵素DpnIの消化に抵抗性を示す複製したオリジンプラスミドの量をreal-time PCR法にて定量した。種々の角化細胞転写因子の共発現で生じる複製プラスミド量の変化を調べた結果、HPV複製は角化細胞の分化を誘導する転写因子hSkn-1aの共発現で約2倍に増加した。hSkn-1aのDNA結合能を欠失させたアミノ酸変異体やDNA結合ドメインだけを発現しても複製促進は認められなかった。他の転写因子Oct-1、Tst-1、C/EBPβは複製を阻害し、CDPは顕著な効果を示さなかった。さらに組換えhSkn-1a蛋白質を用いてHPV16のオリジン領域DNA配列に対するゲルシフト解析を行い、二ヶ所のhSkn-1a結合部位を見出した。オリジンプラスミド中のこれらの部位にhSkn-1aの結合が減弱する塩基変異を導入すると、293細胞中でのhSkn-1aによる複製増強作用が消失した。従って、hSkn-1aはHPVオリジンと直接結合することでウイルス複製を増強することが示唆された。hSkn

-1aは低リスク型HPV11のオリジンプラスミド複製も増強したことから、hSkn-1aの作用はHPV増殖を助ける普遍的な現象であることが考えられる。1、ヒト293細胞でのヒトパピローマウイルス(HPV)DNA複製系を用いて、角化細胞で発現している転写因子がHPV複製に及ぼす効果を調べ、ヒト転写因子hSkn-1aがHPV複製を増強することを見出した。ゲルシフト解析により、hSkn-1aがウイルス複製オリジンの二ヶ所に結合することが示された。またクロマチン免疫沈降法により、細胞内でこの部位へのhSkn-1aの結合を検出した。この結合部位にhSkn-1aが結合出来ない塩基置換を導入すると、その複製増強作用が消失した。hSkn-1aがオリジンへの結合を介して、分化に連動したHPV複製に関わることが示唆された。2、HPV後期プロモーターP670に20塩基の置換を端から順次導入したリポータープラスミドを用いて、P670に二ヶ所の転写抑制配列があることを見出した。組換えCDP蛋白質を用いたゲルシフト解析によって、細胞の転写抑制蛋白質CDPがこれらの配列に結合することが分かった。未分化細胞における後期プロモーターの抑制にCDPが関わる可能性が示唆された。3、HPV16型の環状ゲノムDNAをヒストンおよびヒストンシャペロン蛋白質NAP-2、クロマチン再構築因子ACFと共に混合し、ATP分解のエネルギーを用いて、生理的なヌクレオソーム間隔を持つHPVクロマチンを作成した。HPVクロマチン上でのヌクレオソームの位置をマイクロコッカスヌクレアーゼ分解法にて解析したところ、ヌクレオソームがP670プロモーター領域に正確に配置され、細胞内でのHPVクロマチンを再現していることが分かった。また、HPV16型の複製蛋白質E1とE2を組換え蛋白質として精製し、ヒト293細胞の抽出液中でE1/E2存在下にHPVゲノムDNAを複製させる無細胞実験系を構築し、この複製系にて再構成HPVクロマチンが複製されることが示された。
遺伝子ノックインによる体細胞内在性mRNP複合体動態の解析

本研究では、新規に樹立した生物細胞内からのmRNA-protein (mRNP)複合体の分離精製技術と新たに導入する体細胞での遺伝子ノックインシステムを組み合わせることで、細胞内在性サイトカインmRNPの転写後動態を生化学的、細胞生物学的に解析し明らかとすることを目的とする。またmRNA精製タグのノックインと同時にルシフェラーゼもしくはGFPをサイトカイン遺伝子のタンパク質コード領域に導入し、mRNAの翻訳効率および翻訳産物の安定性をモニターするための細胞株を樹立する。この細胞株は、全く新しい概念のサイトカインの発現制御薬の高効率スクリーニングシステムともなることも期待される。平成21年度は、以下の解析を行った。a)アデノ随伴ウィルスベクターを用いた体細胞での遺伝子ノックインによるBoxB配列およびLuciferase/GFPの挿入システムの確立モデルシステムとして使用するVEGF, IL6, IL5, IFNbeta, IFNgamma遺伝子のノックイン用領域(終止コドン周辺2-2.5kbp)をHCT116細胞より取得したgenomic DNAをテンプレートにPCRにより増幅、クローニングした。現在、ノックインベクターの構築を進めている。b)レンチウィルスベクターを用いたゲノム中に1コピーのFlprecombinationtarget (FRT) siteを持つ培養細胞樹立システムの確立アデノ随伴ウィルスを用いた遺伝子ノックインが期待通りに進まない可能性を考慮し、BoxBおよびLuciferase/GFPで標識した発現誘導型プロモーターにより転写されるサイトカイン遺伝子を発現する細胞株を樹立する。このため、数十kbpの遺伝子の導入が可能なFRT siteを1コピー持つHeLaTet Off, HeLa Tet On Advanced, HCT116細胞を作成した。本研究では、新規に樹立した動物細胞内からのmRNA-protein(mRNP)複合体の分離精製技術と新たに導入する体細胞での遺伝子ノックインシステムを組み合わせることで、細胞内在性サイトカインmRNPの転写後動態を生化学的、細胞生物学的に解析し明らかとすることを目的とする。平成22年度は、以下の解析を行った。a)アデノ随伴ウィルスベクターを用いた体細胞での遺伝子ノックインによるBoxB配列およびLUciferase/GFPの挿入システムの確立HCT116細胞ゆらいのgenomic DNAをテンプレートにPCRにより増幅しクローニングしよたモデルシステムとして使用するIFNbeta遺伝子のノックイン用領域(終止コドン周辺2-2.5kbp)をとBoxB配列を用い、ノックインベクターを構築した。b)レンチウィルスベクターを用いたゲノム中に1コピーのFlprecombinationtarget(FRT)siteを持つ培養細胞樹立システムの確立アデノ随伴ウィルスを用いた遺伝子ノックインが期待通りに進まない可能性を考慮し、BoxBおよびLuciferase/GFPで標識した発現誘導型プロモーターにより転写されるサイトカイン遺伝子を発現する細胞株を樹立する。このため、数十kbpの遺伝子の導入が可能なFRT siteを1コピー持つ気道上皮由来細胞株BEAS-2B TetOffFRT細胞株を樹立した。また、BoxB配列を含む・含まないIL-6,IFNbeta,IL28B,IL-5遺伝子全体をpTRETight-FRTベクターに導入した。現在、BEAS-2B細胞を用いた安定発現株の構築を進めている。
「エネルギーシステムの外部性統合研究の特定領域化研究」企画調査

巨大科学や大規模技術が、環境や社会を通して人間の生存システムに及ぼす効果を、客観的総合的に評価する方法はこれまで知られていない。エネルギーセキュリティ上のリスク,社会的な需要・産業技術や構造の変化,対策や新技術の研究開発なども,同時に広義の環境社会影響として統合的に評価されなければならない。これら,技術が環境を介して人に及ぼす影響は、個人や社会が、直接に支出や利益としない形で受けるものが大きく、市場メカニズムを介さないことから,「外部性」と呼ばれている。本企画調査研究では,この「外部性」を評価する方法論研究を新たな学術研究領域として創設すること,また,その概念に基づいて具体的なエネルギー・環境、社会をめぐる問題を分析することを目標として,全体会合において,総合的な学問分野構築のための研究組織を構成して,情報交換と全体調整を行うとともに,サブテーマの研究体制,研究項目の摘出並びに実施計画の検討を行った.その結果として,(1)外部性とリスクリテラシーの概念構築,(2)リスク・セキュリティー・セーフティー分析とエネルギー供給システムへの応用,(3)社会環境の中におけるエネルギー技術の効用総合評価法の構築,並びに環境を通じたエネルギー影響の分析を行う(4)放射性物質の環境動態を考慮した低線量放射線生体影響評価の4つのサブテーマより構成される,特定領域研究「環境・エネルギー・人間生存システムの外部性-巨大科学技術のリスクと便益の統合評価」の提案書をまとめた。
脱窒土壌細菌でのN2O生成鍵遺伝子水平伝播の検証と化学物質によるN2O発生制御

N2O放出能の高い熱帯泥炭開墾土壌,北海道黒ボク畑地土壌,ならびに亜北極湿地ミズゴケから亜酸化窒素(N2O)生成細菌を探索・分離し,それらのN2O生成機構の共通性と違いを比較した。熱帯泥炭地のN2O放出細菌Burkholderia属はnosZを欠く一方,黒ボク土壌のPseudomonas属細菌では機能低下nosZ保有株が見出された。亜北極のパルサ泥炭崩壊地では, Rhizobium属細菌とSerratia属細菌の混合体にKNO2から効率的にN2Oを発生する能力があった。パラコートやアリルイソチオシアネートに強いN2O放出抑制活性を見出し,新たな活性物質候補として細菌分化誘導因子を見出した。N2O放出能の高い北海道黒ボク畑地土壌,熱帯泥炭開墾土壌,ならびに亜北極湿地ミズゴケから亜酸化窒素(N2O)生成細菌を探索・分離し,それらのN2O生成鍵遺伝子の解析を試みた。黒ボク土壌から分離したN2O生成能の極めて高い10株について,16S rRNA遺伝子の相同性による同定を試み,これらが全てPseudomonas属細菌であることを明らかにした。また,これら分離株のショ糖添加によるN2O亢進効果とN2O生成の基質受容性の検討により,これらが脱窒過程の最終ステップを行わず,N2Oを最終電子受容体として放出することを明らかにした。分離株10株は,N2O還元酵素を特異的に阻害するアセチレン阻害試験によって,明らかにN2O還元酵素活性を喪失しN2O放出レベルが有意に上昇しない株群(6株)と,アセチレン添加でN2O放出量の2倍程度の増加が再現性良く認められる株群(4株)に分けられた。これら2群全株に対し,2種類のプライマーペアによるN2O還元酵素遺伝子(nosZ)の検出を試みた結果,前者の株群は6株全てでnosZが検出されず,後者は全てnosZが検出された。全株で検出された硝酸還元酵素遺伝子(narG)は,16S rRNA遺伝子1.5 kbpを用いた系統樹解析と高い類似性を示したが,nosZではその関係性が崩れており,nosZでは欠落や属間水平伝播が起こりやすいと考えられた。また,熱帯泥炭地から得られる強力なN2O放出Burkholderia属細菌がGammaproteobacteria亜門に由来する脱窒関連遺伝子を持つことから,難培養性Gammaproteobacteria亜門細菌の検索のため,熱帯泥炭土壌からDGGE解析に耐えうる高品質DNAの調製法を確立した。深さ4 m熱帯泥炭土壌にGammaproteobacteriaであるEscherichia coli近縁の難培養微生物が高密度に棲息している証拠を得た。N2O放出ホットスポットの土壌から分離したN2O生成細菌や窒素固定細菌の無機窒素代謝のタイプを分類し,それらグループ分けしたN2O生成細菌株のうち,代表的性質を示すもの2株の,次世代シーケンサーによるゲノムDNAパイロシーケンシングを行い,得られた配列情報からN2O放出能獲得に至る再構築遺伝子の共通点を探索した。特に脱窒関連遺伝子群それぞれの由来を精査した。N2O生成や他の酸化還元を伴う窒素や炭素の無機代謝に寄与する主要な鍵遺伝子(napA, nirB, nifH, mcrA等)のうち,明らかに宿主由来でないものについては,それら機能性遺伝子のドナーとなった微生物の探索を試みたが,熱帯泥炭土壌から分離したPseudoxanthomonas属細菌は,ドナーと遺伝子の型が一致しなかった。また,特に土壌に抵抗なく散布できる除草剤や作物根由来の二次代謝産物中に,極微量(2 μM以下)でN2O生成抑制に効果のある化学資材を探索し,アリルイソチオシアネートとブチルイソチオシアネートをN2O放出抑制物質として見出した。これらは,有望な薬剤として2014年に報告したパラコートの約10倍量で十分効果を発揮した。しかしながら,メチルイソチオシアネートやC5以上のエキメチレン型直鎖アルケン側鎖では,活性はこれらの1/10以下に低下していた。また,ダイコン幼苗にはN2O放出量を上昇させる活性が認められた。この活性上昇は,菌体増殖効果だけでは説明できなかった。これらの効果を明らかにするため,特に活性の強かったハツカダイコン芽生え地上部のメタノール抽出物について分画を試みた結果,メタノール抽出物のメタノール再溶解不溶-水可溶部に強い促進活性が認められ,この分画物を逆相ODSカラムによって分画したところ,素通り画分に続く2% MeOH溶液溶出画分に活性が認められ,活性成分の濃縮が可能であることが分かった。北方泥炭から強力な亜酸化窒素放出細菌が見つかった。加えて,本研究のために導入した次世代シーケンサーによる解析が順調に稼働しているため,遺伝子水平伝播の研究はこの2年間で大きく進展すると考えられる。また,多くの遺伝子マーカーを入手したことで,遺伝子水平伝播に係る環境要因の探索にも取りかかることができる。N2O生成抑制化学資材の探索において,キガラシ芽生え地上部MeOH抽出物に強いN2O放出抑制効果が見出されたため,キガラシ芽生えの主たる二次代謝産物であるシニグリンとアリルイソチオシアネートについて効果を調べたところ,カラシ油本体であるアリルイソチオシアネートのみ30マイクロM濃度で完全なN2O抑制が認められた。

ところが,同じアブラナ科でもハツカダイコン芽生え地上部はN2O放出を非常に強く亢進し,細菌による脱窒過程を活性化させるシニグリンとは別の水溶性化合物が存在することが示された。この思いがけない現象の発見とともに,N2O放出ホットスポットの出現がどのような土壌・植生環境によるのかを着実に明らかにしている。亜酸化窒素(N2O)放出ホットスポットとして知られ,凍土融解沈降によるシステム崩壊を起こしている亜北極ツンドラ・パルサ湿原から泥炭土壌分解物を採取し,N2O放出真正細菌の探索とそれらの遺伝子水平伝播の有無を調べた。このホットスポットから最も強力なN2O放出細菌として分離したAgrobacterium属細菌の硝酸還元酵素大サブユニットタンパクの遺伝子narG配列は,Gammaproteobacteria綱Serratia属のものと極めて高い相同性を示した。従って,亜北極ツンドラN2Oホットスポットで,遺伝子水平伝播の証拠が初めて見つかった。Serratia属脱窒細菌は,我々の研究室で既に弱いN2O放出細菌として分離しており,遺伝子水平伝播の再現実験などを行うためのツールがそろった。また,北海道コーン畑の黒ボク土壌からN2O放出細菌の分離とその遺伝子水平伝播の有無を検証した。また,畑地土壌塊であっても農薬による脱窒反応停止とN2O放出抑制が可能か否かを調べた。コーン畑圃場でN2O放出に関わる細菌として比較的培養困難なBetaproteobacteria綱Duganella属細菌を特定した。この細菌は自前の脱窒関連遺伝子を有しており,土壌では優占種として窒素循環に大きく寄与している様に思われた。一方,N2Oの基質となり得るNO3-イオンを土中で生じるAOAを,16S rRNA遺伝子のハイスループット法による網羅的解析で精査し,有機物量の少ない鉱物性B層土壌や火山性砂礫土壌でThaumarchaeota門のAOAが広く棲息していることが分かった。さらに多くの細菌で,形態分化時や特殊環境下で他の細菌と濃密なコンソーシアムを形成したり,細胞壁を物質が透過しやすいコンピテント化することが分かった。植物色素や鉄キレート剤,電子伝達阻害系除草剤などの効果を調べ,今後の展開に繋がる知見を得た。亜北極ツンドラの凍土融解による沈降と湿原系の崩壊を起こしているN2Oホットスポットから,脱窒関連遺伝子の水平伝播の証拠をつかんだため,このAgrobacterium-Serratiaをモデル細菌系とした,遺伝子水平伝播メカニズム解析の資材が熱帯泥炭開墾地,温帯黒ボク土壌畑地,亜北極ツンドラ泥炭地すべてでそろった。地球規模での環境変動や攪乱は細菌群集の遺伝子水平伝播を加速するという仮説を,緯度の大きく異なる3地点のN2O放出ホットスポットで検証することが可能になったその意義は極めて大きい。北海道コーン畑の黒ボク土壌のN2O放出細菌として分離したDuganella属細菌は,増殖の遅いoligotrophic bacteriaとしては初めての報告になる。一方,好中温性Thaumarchaeota門のAOAが北方森林B層土壌に普遍的に棲息していることを次世代シーケンサーによる古細菌相解析で明らかにした。これまで土壌でもあまり注目されなかったB層で,N2Oの基質となるNO3-が供給されうることが示された。
ヒト消化器癌に表現される補体CD59(Protectin)の生物学的意義について

平成7年度間接蛍光抗体法:抗CD59抗体に対してもMKN-28,MKN-45,KATO-III,MKN-74の各細胞膜に蛍光を認め陽性細胞率はそれぞれ90%,80%,50%,15%であった.抗CD59抗体を用いた免疫組織化学染色:胃癌46例の切除標本を抗CD59抗体を用いて免疫組織化学染色した結果,CD59陽性例は28例,60.9%であった.組織型別にCD59陽性例をみると,分化型癌と低分化腺癌と二型に分類すると,CD59の発現率は分化型癌で27例中15例55.6%,未分化型癌で19例中13例68.4%と,未分化型癌でやや発現率が高かった.CD59発現率はstage IとIIの早期群とstage IIIとIVの進行群を比較するとCD59発現率はそれぞれ42.9%,83.3%であり,進行群で有意に高かった(p<0.02).深達度ではsmまでと比較して有意差はないものの深達度が増すにつれCD59発現率は高率となった.リンパ節転移では,転移なし群のCD59発現率は45.8%,転移あり群は72.7%であり,リンパ節転移あり群で有意差はないが発現率は高かった.非癌健常部胃粘膜のCD59の発現をみると粘膜上皮にはCD59の発現は認めなかったが,粘膜,リンパ濾胞のリンパ球の一部では発現していた.Northern blot hybridization:CD59は3本のバンドにハイブリダイズされた.CD59 mRNAは検索した胃癌細胞株全てに検出されたが,MKN-74では他のMKN-28,MKN-45,KATO-IIIと比較してやや発現レベルが低かった.また胃癌組織では健常部胃粘膜組織よりも強い発現がみられた.CD59が発現しているとされるリンパ球でも当然のことながらCD59の発現がみられた.平成8年度胃癌細胞ならびに胃癌組織における補体制御因子CD59,MCP,DAFの発現.1)継代培養細胞ならびに手術時得られた正常胃粘膜および癌組織をトリプシン処理し遊離細胞を対象とした.各細胞1×10^5個を抗CD59rat monoclonal抗体(YTH53.1 SEROTEC),抗MCP抗体(14-48SEROTEC),抗DAF抗体(BRIC110 SEROTEC)で免疫染色し,蛍光顕微鏡で観察,撮影した.コントロールとして二次抗体の血清を用いることと,すでに確立されている胃癌細胞株MKN28,MKN45,MKN74,KATOIIIを同時に染色した.2)CD59,MCP,DAFが胃癌においてどのように分布しているか,これを各モノクローナル抗体およびRT-PCR手法を用いて,当科の継代培養胃癌細胞株と正常胃粘膜と胃癌における染色性を観察し分布を明らかにした.CD59変異遺伝子の作製は継続中であるが,完成にはいたらなかった.平成7年度間接蛍光抗体法:抗CD59抗体に対してもMKN-28,MKN-45,KATO-III,MKN-74の各細胞膜に蛍光を認め陽性細胞率はそれぞれ90%,80%,50%,15%であった.抗CD59抗体を用いた免疫組織化学染色:胃癌46例の切除標本を抗CD59抗体を用いて免疫組織化学染色した結果,CD59陽性例は28例,60.9%であった.組織型別にCD59陽性例をみると,分化型癌と低分化腺癌と二型に分類すると,CD59の発現率は分化型癌で27例中15例55.6%,未分化型癌で19例中13例68.4%と,未分化型癌でやや発現率が高かった.CD59発現率はstage IとIIの早期群とstage IIIとIVの進行群を比較するとCD59発現率はそれぞれ42.9%,83.3%であり,進行群で有意に高かった(p<0.02).深達度ではsmまでと比較して有意差はないものの深達度が増すにつれCD59発現率は高率となった.リンパ節転移では,転移なし群のCD59発現率は45.8%,転移あり群は72.7%であり,リンパ節転移あり群で有意差はないが発現率は高かった.非癌健常部胃粘膜のCD59の発現をみると粘膜上皮にはCD59の発現は認めなかったが,粘膜,リンパ濾胞のリンパ球の一部では発現していた.Northern blot hybridization:CD59は3本のバンドにハイブリダイズされた.CD59 mRNAは検索した胃癌細胞株全てに検出されたが,MKN-74では他のMKN-28,MKN-45,KATO-IIIと比較してやや発現レベルが低かった.また胃癌組織では健常部胃粘膜組織よりも強い発現がみられた.CD59が発現しているとされるリンパ球でも当然のことながらCD59の発現がみられた.平成8年度胃癌細胞ならびに胃癌組織における補体制御因子CD59,MCP,DAFの発現.

1)継代培養細胞ならびに手術時得られた正常胃粘膜および癌組織をトリプシン処理し遊離細胞を対象とした.各細胞1×10^5個を抗CD59rat monoclonal抗体(YTH53.1 SEROTEC),抗MCP抗体(14-48SEROTEC),抗DAF抗体(BRIC110 SEROTEC)で免疫染色し,蛍光顕微鏡で観察,撮影した.コントロールとして二次抗体の血清を用いることと,すでに確立されている胃癌細胞株MKN28,MKN45,MKN74,KATOIIIを同時に染色した.2)CD59,MCP,DAFが胃癌においてどのように分布しているか,これを各モノクローナル抗体およびRT-PCR手法を用いて,当科の継代培養胃癌細胞株と正常胃粘膜と胃癌における染色性を観察し分布を明らかにした.CD59変異遺伝子の作製は継続中であるが,完成にはいたらなかった.間接蛍光抗体法:抗CD59抗体に対しても各細胞株とも細胞膜に蛍光を認め陽性細胞率はそれぞれ90%,80%,50%,15%であった.抗CD59抗体を用いた免疫組織化学染色:胃癌46例の切除標本を抗CD59抗体を用いて免疫組織化学染色した結果,CD59陽性例は28例,60.9%であった.組織型別にCD59陽性例をみると,分化型癌と低分化腺癌と二型に分類すると,CD59の発現率は分化型癌で27例中15例55.6%,未分化型癌で19例中13例68.4%と,未分化型癌でやや発現率が高かった.CD59発現率はstageIとIIの早期群とstageIIIとIVの進行群を比較するとCD59発現率はそれぞれ42.9%,83.3%であり,進行群で有意に高かった(p<0.02).深達度ではsmまでと比較して有意差はないものの深達度が増すにつれCD59発現率は高率となった.リンパ節転移では,転移なし群のCD59発現率は45.8%,転移あり群は72.7%であり,リンパ節転移あり群で有意差はないが発現率は高かった.非癌健常部胃粘膜のCD59の発現をみると粘膜上皮にはCD59の発現は認めなかったが,粘膜,リンパろ胞のリンパ球の一部では発現していた.Northern blot hybridization:CD59は3本のバンドにハイブリダイズされた.CD59mRNAは検索した胃癌細胞株全てに検出されたが,MKN-74では他のMKN-28,MKN-045,KATO-IIIと比較してやや発現レベルが低かった.また胃癌組織では健常部胃粘膜組織よりも強い発現がみられた.CD59が発現しているとされるリンパ球^<5)>でも当然のことながらCD59の発現がみられた.CD59(Protectin)が消化器においてどのように分布しているかはまだ十分解明されておらず,これをCD59モノクローナル抗体およびRT-PCRをもって,他の補体制御物質MCPならびにDAFとともに継代培養胃癌細胞株と消化管ならびに消化器癌における分布を明らかにして癌との関連性について探りたい。結果1:胃癌細胞ならびに胃癌組織における補体制御因子CD59,MCP,DAF発現を証明した。1)継代培養細胞ならびに手術時得られた正常胃粘膜および癌組織をトリプシン処理し遊離細胞を対象とした。各細胞1×10^5個を抗CD59rat monoclonal抗体(YTH53.1SEROTEC),抗MCP抗体(14-48SEROTEC),抗DAF抗体(BRIC 110 SEROTEC)で免疫染色し,蛍光顕微鏡で観察,撮影する。コントロールとして二次抗体の血清を用いることと,すでに確立されている胃癌細胞株MKN28,MKN45,MKN74,KATOIIIを同時に染色した。2)CD59,MCP,DAFが胃癌においてどのように分布しているか,これを各モノクローナル抗体およびRT-PCR手法を用いて,当科の継代培養胃癌細胞株と正常胃粘膜と胃癌における染色性を観察し分布を明らかにした。3)CD59変異遺伝子の作製は継続中であるが、完成にはいたらなかった。2:以上の成果を学会発表
白血病の原因遺伝子ろしてのWT1遺伝子の分子生物学的機能の解析

一般には,癌抑制遺伝子として認識されているWT1遺伝子は,ほとんど全ての白血病患者で異常高発現していることを見い出したが,以下の事実より,WT1遺伝子は,造血組織ではleukemogenesisを進める癌遺伝子ではないかと推測される。(1)初診時のWT1の発現レベルが高いほど,白血病の予後が悪い,(2)再発時,白血病細胞当たりのWT1遺伝子の発現量が,初診時に比べて上昇する,(3)WT1遺伝子に対するアンチセンスオリゴDNAを用いた研究で,K562などの白血病細胞株の増殖や患者白血病細胞の白血病コロニー形成能が特異的に抑制される。WT1遺伝子のleukemogenesisへの関与を明らかにするため,IL3 dependent細胞株32Dc13にWT1遺伝子を遺伝子導入した。コントロールの細胞株は,IL3刺激を解除し,G-CSFを投与すると,芽球形態から,10日後には顆粒球にまで分化し,増殖は止まるが,WT1導入細胞株では同様の処理を行なっても,芽球形態を維持したまま,増殖し続けた。この系を用いて,G-CSFレセプターからのsignal transductionを解析したところ,WT1遺伝子を導入された32D細胞では,IL3除去後のG-CSF刺激に対して,Stat3 α,Stat3 βの両者の活性化が持続的に生じたのに対して,コントロールの32D細胞では,Stat3 αは一時的に活性化されたのみで,Stat3 βは,全く活性化されなかった。WT1遺伝子産物が結果として,Stat3 isoformの量的な変化をもたらしているということが示唆された。一方,WT1遺伝子の標的蛋白を同定することを目的として,K562細胞において,West-Western法を用いて,WT1蛋白に特異的に結合する,115kdの未知の蛋白の同定に成功した。現在,この蛋白の解析中である。