hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重力波検出器ＫＡＧＲＡを用いた超新星爆発メカニズム解明に向けた研究

さらに検出器制御に用いられているコンピュータの時間同期やその精度の測定、フィードバック制御中に生じる時間遅れや位相遅れを測定し重力波信号の精密較正に向けた準備を行っている。申請者は、超新星爆発理論グループ、ニュートリノ観測グループ、重力波データ解析グループが協力してメカニズム解明に向けた研究を推進することを提案し、独自の解析グループを立ち上げ議論を行ってきた。結果として、SASI(Standard Accretion Shock Instability、衝撃波面の不安定性)からの特徴的な重力波信号とニュートリノ信号摘出のために、Δ-Σ変換を応用したフィルタを作成し、その有効性を定量評価することに成功した。この結果は国際会議でも発表しており、論文にまとめているところである。iKAGRA試験観測データを解析することにより解析手法の確立を行えただけではなく、重力波検出器に対する知識や貢献を多く行うことができた。特に、重力波信号の較正の研究は今後の重力波天文学を展開する上で非常に重要な役割を担っている。2015年に初検出されたブラックホール連星からの重力波信号解析において、重力波到来方向の決定精度に重力波信号較正精度が大きく関わっていることがわかっている。さらに今後の重力波ネットワークにKAGRA検出器が加わった際に信頼できる重力波信号の提供というのは極めて重要な課題となっている。この課題に向けてハードウェアインジェクション解析の手法の確立やフィードバック制御に使用するアナログ回路の伝達関数の測定の貢献はとても大きい。さらに、Hilbert Huang変換と呼ばれる一つの時間-周波数解析の実データに対する有効性を評価することもできている。Hilbert Huang変換は、一種のハイパスフィルタである経験的モード分解と、Hilbert変換を用いたスペクトル解析の組み合わせによって行われる。先行研究では、シミュレーションで作成した検出器ノイズに信号を注入して解析手法の検証が行われてきた。申請者は共同研究者と協力して実データに対するHilbert Huang変換の実データに対する時間周波数解析の有効性を評価した。上記したハードウェアインジェクションデータを解析することによって、非ガウス、非定常、ラインノイズを含む実データに対してもHilbert Huang変換の時間周波数解析の有効性を実証し、その解析精度を定量的に評価することができた。現在、超新星爆発信号に対するHilbert Huang変換の時間周波数解析の検証を行っているところである。申請者は今年度、「超新星爆発の新たな先駆的特徴信号摘出手法の開発」と「KAGRA検出器における重力波信号較正」を中心に研究を行った。超新星爆発から生じる重力波のようなモデル化が困難で短時間に観測されるバースト性重力波に対する解析として、Hilbert-Huang変換という時間・周波数分解能の不確定性原理のない新たな解析手法を用いて、新たな特徴信号摘出手法の研究を行った。その結果、即時対流から生じる400Hz程度の信号や、SASI活動から生じる、時間と共に周波数が増加しているg-mode oscillationからの信号、50-100Hzの判定上的な信号の特徴づけ手法を確立することができた。
院外心停止患者に対する治療戦略：効果的なAED使用ならびに心肺蘇生の研究

本研究では、20052012年間で大阪府で集積された院外心停止患者約56,000人のデータセットを確定した。救急到着前の非外傷性心停止患者の3.5%においてAEDパッドが装着されてり、AEDパッド装着と関連する因子は居合わせた人による目撃や心肺蘇生の実施があること・公共の場所で発生した心停止であることが明らかになった。また消防の電話による胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導を受けた群は従来の人工呼吸つきの指導を受けた群より実際に心肺蘇生を受けた割合は高かった。胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導は従来の人工呼吸つきの指導法より1.4倍も一般市民に対して実際に心肺蘇生を増やすことが明らかになった。本研究では、市民による自動体外式除細動器(AED)ならびに心肺蘇生に関するデータを詳細かつ前向きに登録・分析し、『院外心停止患者の救命率改善のための治療戦略として、市民による効果的なAED使用ならびに心肺蘇生の質を改善するための因子の検討を行うこと』を目的としている。研究初年度となる25年度には、研究代表者ならびに研究協力者は、2011年(平成23年)に大阪府で集積された院外心停止記録約7,700件のデータクリーニングを実施し、2005年から2011年までの約49,000件データセットを構築した。救急隊到着前に心停止に至った40,429症例のうち、4730症例に対して胸骨圧迫のみの心肺蘇生(CPR)口頭指導がなされ、70.5%の症例が実際に居合わせた人(バイスタンダー)によるCPRを施行された。また12,987症例に対して従来の人工呼吸つきのCPR口頭指導がなされ、61.9%の症例が実際にバイスタンダーCPRを施行され、統計学的に有意な差であった(P<0.01)。これらの結果は、胸骨圧迫のみのCPR口頭指導がCPRの実施割合の向上に役立つことを示唆している。公共の場所で市民による自動体外式除細動器(AED)の使用割合を評価し、市民によって目撃された心原性心停止患者9,453例を対象に解析した。公共場所における市民AED実施割合は、スポーツ施設で2005年の0%(0/7)から2011年の57%(13/23)、鉄道で0%(0/20)から41%(7/17)まで増加した。これらの結果は、市民によるAED使用状況は場所によって異なり、適正なAED普及・配置には場所ごとの戦略が必要なことを示唆している。研究はおおむね順調に進んでいる。今後は、市民AEDならびにCPRの実施状況について、また市民によるCPRの質の評価についての症例登録ならびにデータ解析を実施する予定である。本研究の目的は、院外心停止患者の救命率改善のための治療戦略として、市民による効果的なAED使用ならびに心肺蘇生の質を改善するための因子の検討を行うことである。研究2年目となる26年度には、2005年から2012年までの約56,000件データセットを構築した。前年から実施している救急指令室からの院外心停止患者に対する口頭指導種別についての分析は、1年分データを積み上げて再解析を行った。19,671症例のうち、4,022症例に対して胸骨圧迫のみの心肺蘇生(CPR)口頭指導がなされ、70.0%の症例が実際に居合わせた人(バイスタンダー)によるCPRを施行された。また13,926症例に対して従来の人工呼吸つきのCPR口頭指導がなされ、62.1%の症例が実際にバイスタンダーCPRを施行され、統計学的に有意な差であった(P<0.001)。これらの結果は、病院までの市民によるCPR実施を増加されるためには、胸骨圧迫のみのCPR口頭指導の普及が役立つことを示唆している。さらに、本登録の大阪市の2011からの2年分のデータを用いて、AEDパッドを装着した事例を抽出し、市民が現場でどのような症例に対してAEDを使用しようと試みているのかを評価した。その結果、スポーツ施設の79%、駅の51%、一般的な公共施設22%の順にAEDパッド装着が試みられていることが明らかになった。研究はおおむね順調に進んでおり、上記研究の論文化を進める。今後は、現在進行中の市民によるCPRの質の評価だけでなく、大阪府や全国で集積されている院外心停止データとも組み合わせて、院外心停止患者の予後改善に寄与する因子について、包括的かつ探索的に実施する予定である。本研究の目的は、院外心停止患者の救命率改善を目的として、市民による効果的なAED使用ならびに心肺蘇生の質の改善に寄与する因子を多面的に検討することである。研究3年目となる27年度には、研究代表者ならびに研究協力者は、20052012年の8年間の大阪府で集積された院外心停止患者約56,000人のデータセットを確定した。

前年に抽出した大阪市データとは異なり、大阪府全域における2011-2012年の2年分のデータから、救急到着前の非外傷性心停止9987件を対象としてAED市民が現場でどのような症例に対してAEDパッドが装着されているのかを評価し、全体の3.5%においてAEDパッドが装着されていた。内訳としてスポーツ施設の69.4%、空港の66.7%、学校の50.0%、駅の46.2%の順であり、多変量解析においてAEDパッド装着と関連する因子は居合わせた人による目撃や心肺蘇生の実施があること・公共の場所で発生した心停止であることであった。また院外心停止患者に対する消防電話口頭指導種別の解析については、2005-2012年の8年分のデータから、救急到着前の非外傷性心停止19669件において、5743症例に対して胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導がなされ、70.0%の症例が実際に居合わせた人による心肺蘇生法を施行され、また13,926症例に対して従来の人工呼吸つきの心肺蘇生法の口頭指導がなされ、62.1%の症例が実際に心肺蘇生法を施行された(P<0.001)。多変量解析において、胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導は従来法よりも1.42倍も一般市民に対して実際に心肺蘇生を増やすことが明らかになった。研究は順調であり、AEDパッドの関する論文は投稿準備中、口頭指導に関する論文を出版し、日本蘇生協議会の2015蘇生ガイドラインに引用された。今後は大阪府で集積されている病院搬送後集中治療データともリンクし、院外心停止患者の予後改善に寄与する因子を包括的かつ探索的に評価する予定である。本研究では、20052012年間で大阪府で集積された院外心停止患者約56,000人のデータセットを確定した。救急到着前の非外傷性心停止患者の3.5%においてAEDパッドが装着されてり、AEDパッド装着と関連する因子は居合わせた人による目撃や心肺蘇生の実施があること・公共の場所で発生した心停止であることが明らかになった。また消防の電話による胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導を受けた群は従来の人工呼吸つきの指導を受けた群より実際に心肺蘇生を受けた割合は高かった。胸骨圧迫のみの心肺蘇生法の口頭指導は従来の人工呼吸つきの指導法より1.4倍も一般市民に対して実際に心肺蘇生を増やすことが明らかになった。研究2年目となる26年度には、2012年(平成24年)に大阪府で集積された院外心停止記録約7,800件のデータクリーニングを実施し、2005年から2012年までの約56,000件データセットを構築した。市民に指示した口頭指導内容を、従来の人工呼吸つきの心肺蘇生(CPR)ならびに胸骨圧迫のみの心肺蘇生別に居合わせた人によるCPR施行率を比較した。この前年から実施している分析については、1年分データを積み上げて再解析を行った。19,671症例のうち、4,022症例に対して胸骨圧迫のみの心肺蘇生(CPR)口頭指導がなされ、70.0%の症例が実際に居合わせた人によるCPRを施行された。また13,926症例に対して従来の人工呼吸つきのCPR口頭指導がなされ、62.1%の症例が実際にバイスタンダーCPRを施行され、統計学的に有意な差であった(P<0.001)。多変量解析でも同様の結果であった。これらの結果は、病院までの市民によるCPR実施を増加されるためには胸骨圧迫のみのCPR口頭指導が役立つことを示唆している。さらに、本登録の大阪市の2011-2012の2年分のデータを用いて、AEDパッドを装着した事例を抽出し、市民が現場でどのような症例に対してAEDを使用しようと試みているのかを評価した。その結果、スポーツ施設の79%、駅の51%、一般的な公共施設22%の順にAEDパッド装着が試みられていることが明らかになった。これらの結果は、市民によるAED使用状況は場所によって異なり、適正なAED普及・配置には場所ごとの戦略が必要なことを示唆している。
湿地性ゴミムシ類の保全に関する基礎研究

湿地性ゴミムシ類の保全に関する基礎研究として、各種の生態の解明に取り組んだ。これまで生活史が未知であった複数の種の飼育に成功し、特殊な産卵生態や幼虫食性を明らかにした。一部の種では、これらの生態特性を通して湿地環境に依存していることが示唆された。また、ゴミムシ類の重要な生活史形質の一つである幼虫食性について、大顎形態から推定する方法についても開発した。これらの成果は、絶滅が危惧される湿地性ゴミムシ類の保全に役立つ有用な基礎データとなりうるだろう。平成25年度は主たる調査地である渡良瀬遊水地における分布調査、および得られたサンプルを用いた飼育実験を行ない、以下の結果を得た。1.分布調査:研究対象である湿地性ゴミムシ類が過去に採集された複数の地点について複数回の調査を行なった。その結果、全体的に乾燥化や植生遷移の進行が進んでおり、以前と比べた個体数の減少や種組成の変化が認められた。この結果については様々な原因が考えられるものの、2011年3月11日の東日本大震災に伴う、当地におけるヨシ焼きの2年間の中止に起因する環境変化も一因である可能性があり、今後もモニタリングを続けていく予定である。2.飼育実験:研究対象種の一部について、繁殖期に採集した成虫を用いた飼育実験を行ない、幼虫形態や生活史の解明を行なった。また、一部の希少種については飼育法の確立も試みた。その結果、トネガワナガゴミムシPterostichus bandotaroについては飼育・羽化させた個体をさらに繁殖させる完全累代に成功した。本種の飼育羽化個体を用いた実験は2014年5月現在も継続しており、様々な生活史形質の測定を行っている。3.遺伝子解析用のサンプルの採取:遺伝子解析に用いるサンプルの採取を行なった。普通種については十分な個体数が得られたものの、希少種については十分な個体数を得ることができなかった。マイクロサテライトマーカーの作成についての論文など、今後の実験にかかわる既知情報の探索も行なった。平成26年度は、前年度に引き続いて主として飼育実験と分布調査を行ない、以下のような結果を得た。1.ハンミョウモドキ属(genus Elaphrus)の生活史の解明:調査地の一つである渡良瀬遊水地に生息するハンミョウモドキ属の2種、ワタラセハンミョウモドキ(Elaphrus sugai Nakane)とコハンミョウモドキ(Elaphrus punctatus Motschulsky)はともに、近年見直された環境省のレッドリストで絶滅の危機に瀕しているとされている。2014年度は両種ともに繁殖期のメス成虫を得ることができ、飼育実験によってこれまで知見のなかった生態の一部を明らかにすることができた。ワタラセハンミョウモドキについては、生息地における微小スケールでの分布規定要因としてはたらいている可能性のある特異な繁殖生態について明らかにした。コハンミョウモドキについては、幼虫期における特異な生態を明らかにし、この生態が分布規定要因および近年の衰退にかかわっている可能性がある。2.分布調査:これまで明らかになった湿地性ゴミムシ類の生態をもとに、渡良瀬遊水地内におけるさらなる分布調査および、周辺の湿地環境における希少種の分布可能性を検討した。その結果、遊水地内については、既知産地以外では希少種の分布の可能性があまり高くないことが判明した。遊水地外の周辺湿地については、比較的近い位置にある群馬県内のいくつかの湿地の現地視察を行ない、植生などの環境を調べた。前年度に引き続いて飼育実験を行なうサンプル採取のための調査を行なった。ワタラセハンミョウモドキについては、懸命な調査に関わらず、2013年度・2014年度に採集された地点において採集することができなかった。コハンミョウモドキについては複数個体が昨年度までと同一地点で採集され、安定的な発生を確認することができた。オサムシ科において最も重要な生活史形質の一つである幼虫食性について、口器形態からの推定法の確立を試みた。湿地性ゴミムシを含むオサムシ科複数種の大顎形態の幾何学的形態測定(geometric morphometrics)の解析結果と、幼虫食性の関連性を調べたところ、両者に強い関連性が確認された。幼虫食性が未知であったエゾナガゴミムシ(Pterostichus thunebrgi)を対象として、幼虫飼育による推定結果と口器の形態測定による推定結果を比較したところ、両者は一致した。ゆえにこの手法は、湿地性ゴミムシを含む幼虫食性が未知の種について、形態から食性を推定する方法として有効であると考えられた。2015年4月の異動に伴って研究環境が激変した。飼育実験や遺伝子解析の一部が年度初期には行えず、全体として遅れ気味となった。2012年の環境省のレッドリストの見直しにおいて、多くの昆虫類が新たに絶滅の危機に瀕していることが明らかにされた。湿地性ゴミムシ類はその一つであり、このグループの保全に寄与する可能性のある基礎データの収集が本研究の大きな目的である。湿地性ゴミムシ類のサンプリング地としては、多くの絶滅危惧種が生息することで知られる渡良瀬遊水地を選んだ。基礎的な生活史を明らかにすることを目的に、多くの湿地性種の飼育を試みた。これらのうち、ワタラセハンミョウモドキ、コハンミョウモドキ、トネガワナガゴミムシ、カジムラヒメナガゴミムシについては野外捕獲した繁殖成虫から得た卵を、室内飼育条件下で成虫まで飼育することに成功した。

いずれの種も、非湿地性種の多くが産卵時に土中に形成する卵室を作らず、泥内に直接産卵することが観察された。トナガワナガゴミムシとカジムラヒメナガゴミムシについては羽化成虫の越冬・越冬後の繁殖も成功し、累代飼育が可能な条件を明らかにした。幼虫食性については、コハンミョウモドキがミミズ食であることが確認され、この食性が本種の希少性と関わっている可能性が示唆された。他3種は昆虫幼虫食であり、湿地に特異的な幼虫食性は持たないことが示唆された。また、重要な生活史形質の一つである幼虫食性について、口器形態からの推定法の確立を試みた。湿地性ゴミムシを含むオサムシ科複数種の幼虫大顎の幾何学的形態測定の解析結果と、幼虫食性の関連性を調べたところ、両者に強い関連性が確認された。幼虫食性が未知であったエゾナガゴミムシを対象に、幼虫飼育による推定結果と口器の形態測定による推定結果を比較したところ、両者は一致した。ゆえにこの手法は、湿地性ゴミムシを含む幼虫食性が未知の種について、形態から食性を推定する方法として有効であると考えられた。湿地性ゴミムシ類の保全に関する基礎研究として、各種の生態の解明に取り組んだ。これまで生活史が未知であった複数の種の飼育に成功し、特殊な産卵生態や幼虫食性を明らかにした。一部の種では、これらの生態特性を通して湿地環境に依存していることが示唆された。また、ゴミムシ類の重要な生活史形質の一つである幼虫食性について、大顎形態から推定する方法についても開発した。これらの成果は、絶滅が危惧される湿地性ゴミムシ類の保全に役立つ有用な基礎データとなりうるだろう。研究計画の核となる飼育実験と分布調査は比較的よく進んでいるため、上記のように判断した。研究環境の整備は2015年度内に終了したので、2016年度は2014年度と同様のペースで研究を進めていく予定である。また、最終年度であるので、結果の公表にも力をいれていきたい。昆虫学研究環境の変更に伴い、飼育実験などがやや難しい状況になった。よって、分布調査や初年度に採取したサンプルに基づいた分子実験に力をいれたほうがよいかもしれない。また、3年計画の最終年度でもあるので、これまでの研究結果のとりまとめにも力を入れていきたい。最も重要である飼育実験についてほぼ予定通り進んでいるため、全体としては順調に進展していると考えられる。研究代表者は平成27年度より千葉大学に異動となった。これに伴って研究実施環境が大幅に変わり、一部の実験についてはほとんど行うことができなかった。2013年度に取得した育児休業による室内作業の遅れが一年では取り戻せなかったため。研究実施環境についての問題か解決されたので、当初予定に従って研究を再開する予定である。今後は、初年度に行なえなかった分子実験などに力を入れていく予定である。今年度は分子実験に力をいれる予定である。2014年1-3月で育児休業を取得し、そのため当初予定していた分子実験ができなかった。そのため、次年度使用額が生じた。当初予定していた分子実験を行なう計画である。
糸状菌転写因子ClrBとMcmAの協調によるセルラーゼ遺伝子発現誘導の分子機構

糸状菌はセルロース系バイオマス分解酵素の主要な供給源であり、産業利用における酵素生産コストの低減化を実現するためにはその生産制御機構を解明することが重要である。セルラーゼ遺伝子の発現は培地中にセルロース由来の低分子糖が存在する時に誘導されるが、その分子機構の詳細は不明である。本研究では、モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおいて、セルラーゼ遺伝子特異的な転写活性化因子ClrBならびにこれと協調作用を示す広域転写因子McmAが作動するための活性制御機構を解析する。加えてClrBの類似因子がセルラーゼ発現に及ぼす影響も解析し、糸状菌のセルラーゼ遺伝子発現誘導機構の解明を目指す。
ユビキチン非依存性膜蛋白質小胞体品質管理の謎と偽ロンボイド分子ダーリンの役割

3.ER膜上での分解過程を追跡できるよう、分子内に複数箇所の蛍光マーカーをもつR664X AE1を作製し、HEK細胞における発現を解析している。1. Derlin-1とDerlin-2のキメラ蛋白質Der1/2とDer2/1を用い、これらとR664X AE1が相互作用することを示したが、特にDer2/1の発現効率の低さが解析の障害になっている。以下に述べる変異体についても同様の解析を試みている。2.基質側構造の違いによる分解過程の相違を探索することを目的に、細胞質ドメインを欠くΔCD AE1、R664X AE1同様のpremature termination変異体であるR826C AE1、R845X AE1を作製、HEK293細胞に発現させて分解動態と細胞内分布を解析した。1)R845X AE1は、R664X AE1と類似の細胞内分布、即ち小胞体ERにおける滞留を示し、プロテアソーム阻害により分解が抑制されたが、その分布に変化は見られなかった。R826C AE1変異体は、細胞内分布が不明確、かつ細胞生存率が低く解析が困難であった。一方、ΔCD AE1は、小胞体近傍、あるいは細胞質領域に不溶性凝集塊アグリソームを形成し、プロテアソームを阻害するとその増加が認められた。これらの結果から、R845XとΔCD AE1は、いずれもR664X AE1同様にプロテアソームによる分解を受けることが示された。R664XとR845Xが小胞体に止まって分解されるのに対しΔCDは小胞体から細胞質に逆行輸送で引き抜かれてからプロテアソーム分解を受ける可能性が示された。これは、R664X、R845XとΔCDとでは逆行輸送の過程と分解の場が異なることを示している。2)R845XとΔCD AE1の分解は、siRNAによるDerlin-1の抑制時とDerlin-2の抑制時とで明確な違いが認められなかった。この点は従来のR664Xでの知見と異なる。また、R845X AE1、ΔCD AE1はプロテアソーム阻害時にイムノブロットでのラダー形成が認められないことから、いずれもUb化を受けないことが示唆された。これらの知見はさらに検討と実証が必要である。小胞体膜に存在する偽ロンボイドプロテアーゼであるDerlinsの役割、特にR664X AE1の分解への影響と分解に関わるプロテアソームを検討するために、平成27年度は以下の2項目について検討を行った2.基質蛋白質の分解とUb依存性の相違に関わるプロテアソームタイプの解析を行うため、19S,20S、および26SプロテアソームのR664X AE1に対する基質分解に関する特異性と程度の検討を行った。野生型(WT)AE1およびUb依存性の小胞体関連分解を呈することがわかっているΔ508-CFTRをコントロールとして比較したところ、いずれのプロテアソームにおいても有意な差を認められなかった。また、20Sの阻害剤であるラクタシスチン、19Sの阻害剤であるグルコサミンを用いた細胞に対する影響を検討した実験においても有意な差が認められず、基質ープロテアソーム分解に関わる他の必須因子の存在やそれ以外のプロテアソーム(11Sなど)の関連が示唆された。この点については今後改めて検討と実証が必要である。1.R845X、ΔCDなど、複数の構造変異体の分解過程をR664X AE1と比較することにより、同じAE1分子でありながら構造変異の相違により小胞体からの逆行輸送に違いがあること(分解に先立って分子全体が引きずり出されるか否か)、プロテアソーム分解の場が異なること(小胞体膜上か細胞質か)が示された点は大きな進展である。これにより、何がこの違いを生み出すのか、Derlin分子群はそれにどのように関与するのかの解明が次の課題となることが明らかになり、研究目的の達成に近付いた。2.一方で、基質とDerlin-1とDerlin-2の相互作用/結合については、R845X、ΔCD AE1にR664X AE1で見られた選択性が認められず、また相互作用部位についても未同定であり、現在、Ub化非依存性の検証とともに実験を継続している。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子医学1.上記知見と課題をベースに、Derlin-1/Derlin-2とR664X、R845X、あるいはΔCD AE1との相互作用のメカニズムを追求する。まず、これらと20S、あるいは26Sプロテアソームの直接結合についての検討を行い、さらにDerlins-基質複合体中に同定されたp97/VCP、calnexin、TIF1β等の関与を培養細胞発現系と試験管内再構成系で解析する。2.上記から推定される相互作用が小胞体からの逆行輸送の形式を規定することを検証し、DerlinのUb非依存性小胞体関連分解における役割を明らかにする。

1.基質蛋白質R664Xと相互作用をもつER分子、あるいは細胞質分子群の同定に成果が得られ、さらに2ー1)、2ー2)各項に示すように、Derlin-1とDerlin-2がp97/VCPとの結合の有無で全く異なること、Derlin-2とERシャペロンcalnexinとの相互作用など、Derlin-2の選択性に関わるメカニズム解明の有用な端緒を得ることができ、本年度の最も重要な課題は一定レベルで達成できたと考える。一方、基質蛋白質とDerlinsとの相互作用自体は明確になったものの、作製した数種のキメラDerlinsは、それ自体が細胞内で不安定性であり、基質ーDerlins間結合の仕組みの解明が遅れている。2.基質蛋白質のER膜上での分解の視覚化は比較的困難であり、具体的成果に至っていない。これは、複数の蛍光マーカーを組み込むことによる基質蛋白質の性状変化等の問題が主たる要因である。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験経費、特に消耗品費の節減に努めた結果、約1,400円の残額が生じた。1.基質蛋白質分解の視覚化については、4ヶ月間、現計画を継続し、基質性状の大きな変化を生じない蛍光検出マーカーの可能性を検討する。ただし、安定な結果が得られる変異体作製が困難な場合は、プロテアソームと基質のER上相互作用を想定し、これらの生化学手法による検出に転換する。2.平成25年度に得た諸知見をもとに、Derlin-2とR664X AE1の選択的相互作用のメカニズムを追求する。まず、これらと20S、あるいは26Sプロテアソームの直接結合についての検証を行い、さらにDerlins-基質複合体中に同定されたp97/VCP、calnexin等の関与を培養細胞発現系と試験管内再構成という異なる観点から検討する。次年度の消耗品費とあわせて有効利用する。経費のかかるアイソトープ標識メチオニンを用いた実験に代替法を用いた先行実験を行い、またプロテアソーム再構成系の作製とこれを用いた実験計画を次年度に繰り越したことによる。次年度にアイソトープ、ならびにプロテアソーム再構成系を用いた実験を計画しており、これに経費を充てる。
Nusuttodinium属渦鞭毛藻における共生藻との親密化機構の解明

葉緑体は、光合成生物が非光合成生物に取り込まれ、2つの細胞が統合されたことに由来するオルガネラである。しかし、宿主がどのように特定の共生藻と共生確立までの関係を築き、共生成立に至ったのかは未だ解明されていない。この問題を解明するため、クリプト藻を特異的に取り込んで盗葉緑体とする渦鞭毛藻類Nusuttodiniumspp.を対象する。これまでの代表者の研究によって、Chroomonas sp. Dc01株を与えたN. aeruginosumでは、盗葉緑体の拡大、クリプト藻核の維持、宿主細胞との同調分裂が起こることを明らかにした。さらに、本種では与えるクリプト藻の種によって盗葉緑体の形状が異なることが示唆されている。本研究では、異なる2種のクリプト藻を与えた時の詳細な形態観察と盗葉緑体現象の差異を生み出す遺伝基盤を明らかにすることで、特定の藻類と共生関係を親密化させる機構を解明することを目的とした。平成30年度は、2種のChroomonas spp.を与えた時の共生状態の変化を形態的に観察し、比較を行った。Dc01株を与えた際には、渦鞭毛藻内に取り込まれたクリプト藻核が徐々に拡大していく一方で、HrL01株を与えた場合はクリプト藻核の拡大が起こらないことを見出した。また、前年度のトランスクリプトーム解析を継続して行ったところ、宿主渦鞭毛藻のトランスクリプトームから、無機窒素同化に重要な幾つかの遺伝子が見出され、これらのタンパク質に対して抗体を作成し、局在解析を行った。さらに、窒素源を変動させた培養実験では、Dc01株を与えた場合、窒素源を添加していない培地で渦鞭毛藻が増殖しないのに対し、HrL01株を与えた場合は培地中に無機窒素を添加していなくても渦鞭毛藻が増殖することを見出した。宿主渦鞭毛藻とクリプト藻間の共生現象で重要だと思われる遺伝子を発見し、そのタンパク質の局在も明らかにできたため。さらに、種々の培養実験によって、HrL01株とDc01株の共生状態の違い、栄養塩利用の違いを明らかにすることができたため。これまで作成した抗体に加えて、特に重要そうなタンパク質に対しても新たに抗体を作成する。栄養塩を変動させた種々の培地を用いて、渦鞭毛藻+Dc01株の条件と渦鞭毛藻+HrL01株の条件で培養実験を行い、注目すべき遺伝子の発現量とそのタンパク質の発現量、局在を解析する。平成29年度は、培養株の整備(Chroomonas sp. HrL01株の無菌化、培養条件の検討)を行い、安定的な無菌株を得ることに成功した。この株を用いて光学顕微鏡による形態観察を行ったところ、HrL株由来の盗葉緑体は細胞全体に拡大されず、常に複数個の盗葉緑体(クリプト藻細胞)を維持することが明らかとなった。これはDc01株を与えた際に観察される、1つの葉緑体が細胞全体に拡大される現象とは対象的である。Dc01株を与えた際の渦鞭毛藻とクリプト藻のトランスクリプトーム変動解析を行った結果、渦鞭毛藻の各種トランスポーター遺伝子が明条件下で発現上昇することが明らかとなり、渦鞭毛藻が共生クリプト藻に対して光合成・葉緑体拡大のための栄養塩供給を行っていることが示唆された。Chroomonas sp. HrL01株及び本種を捕食させた渦鞭毛藻のRNA-seq解析は未実施であるが、渦鞭毛藻+Chroomonas sp. HrL01の安定的な培養株作成に成功し、光学顕微鏡下における形態観察を行った。渦鞭毛藻+Chroomonas sp. Dc01のトランスクリプトーム解析は既に完了しており、一時的な共生現象に重要であると思われる候補遺伝子をいくつか見出した。そのため、この解析結果とHrL01株で得られる解析結果を円滑に比較解析できると見込まれる。

これまでの代表者の研究によって、Chroomonas sp. Dc01株を与えたN. aeruginosumでは、盗葉緑体の拡大、クリプト藻核の維持、宿主細胞との同調分裂が起こることを明らかにした。さらに、本種では与えるクリプト藻の種によって盗葉緑体の形状が異なることが示唆されている。本研究では、異なる2種のクリプト藻を与えた時の詳細な形態観察と盗葉緑体現象の差異を生み出す遺伝基盤を明らかにすることで、特定の藻類と共生関係を親密化させる機構を解明することを目的とした。平成30年度は、2種のChroomonas spp.を与えた時の共生状態の変化を形態的に観察し、比較を行った。Dc01株を与えた際には、渦鞭毛藻内に取り込まれたクリプト藻核が徐々に拡大していく一方で、HrL01株を与えた場合はクリプト藻核の拡大が起こらないことを見出した。また、前年度のトランスクリプトーム解析を継続して行ったところ、宿主渦鞭毛藻のトランスクリプトームから、無機窒素同化に重要な幾つかの遺伝子が見出され、これらのタンパク質に対して抗体を作成し、局在解析を行った。さらに、窒素源を変動させた培養実験では、Dc01株を与えた場合、窒素源を添加していない培地で渦鞭毛藻が増殖しないのに対し、HrL01株を与えた場合は培地中に無機窒素を添加していなくても渦鞭毛藻が増殖することを見出した。宿主渦鞭毛藻とクリプト藻間の共生現象で重要だと思われる遺伝子を発見し、そのタンパク質の局在も明らかにできたため。さらに、種々の培養実験によって、HrL01株とDc01株の共生状態の違い、栄養塩利用の違いを明らかにすることができたため。Chroomonas sp. HrL01株及び本種を捕食させた渦鞭毛藻のRNA-seq解析を株の準備が整い次第実施する。渦鞭毛藻+Dc01株のトランスクリプトーム変動解析で見出された候補遺伝子がHrL01株を与えた際にどのように発現変動するかについて、特に注目して解析を進める。これまで作成した抗体に加えて、特に重要そうなタンパク質に対しても新たに抗体を作成する。栄養塩を変動させた種々の培地を用いて、渦鞭毛藻+Dc01株の条件と渦鞭毛藻+HrL01株の条件で培養実験を行い、注目すべき遺伝子の発現量とそのタンパク質の発現量、局在を解析する。本年度は信頼性の高いRNA-seq解析を行うため、渦鞭毛藻とクリプト藻の安定的で無菌の培養株の作成、培養条件の検討を中心に行った。RNA-seq解析の準備は整っているが、RNA-seq解析はデータの納入までに時間を要するため、時間的な余裕を鑑みて初年度に予定していたRNA-seq解析を次年度に行うことに変更した。これまでの解析によって、宿主渦鞭毛藻から共生状態の維持に重要であると考えられる幾つかの遺伝子群が見つかった。本研究で扱う渦鞭毛藻は形質転換法が確立されていないため、これらのタンパク質の局在、発現解析には抗体の作成が必要である。本研究を遂行するためには数多くの抗体作製を要する上に、抗体の作成には数ヶ月かかるため、時間的な余裕を鑑みて次年度の始めに抗体を作成することに変更した。
渦法による波浪と浮体の干渉計算法に関する研究

本研究では,高い精度を有する,渦法による浮体構造物の非線形波浪中挙動解析法の開発を目的に,自由表面下で振動する2次元没水平板の問題に,Random-Wal k法およびCore-Spreading法に基づく渦法計算を適用し,平板に作用する流体力について検討を行った.その結果,Core-Spreading法および物体近傍での渦層モデルを用いることで,これまでの波浪問題に適用されてきたRandom-Walk法に基づく手法より実験結果と近い結果が得られた.本研究では,高い精度を有する,渦法による浮体構造物の非線形波浪中挙動解析法の開発を目的に,自由表面下で振動する2次元没水平板の問題に,Random-Wal k法およびCore-Spreading法に基づく渦法計算を適用し,平板に作用する流体力について検討を行った.その結果,Core-Spreading法および物体近傍での渦層モデルを用いることで,これまでの波浪問題に適用されてきたRandom-Walk法に基づく手法より実験結果と近い結果が得られた.近年CO2排出が制限されつつあり、再生可能エネルギーへの変換が進みつつあるが、化石エネルギーと比較してエネルギー密度が低いため、一定量のエネルギーを得るためには広大な敷地面積が必要となる。日本は陸地が狭く沿岸域は既に水産業や工業開発などで占拠されているため、広大な敷地面積を必要とする再生可能エネルギー施設は、浮体構造にして沖合の大水深領域に展開せざるを得ない。浮体式海洋構造物を沖合大水深領域に設置し、安全に施設を運用するためには浮体の動揺や漂流を低減させる必要がある。しかし沖合は沿岸域と比較して海象条件が厳しく、さらに防波堤も造成できないため、構造物自身に動揺および漂流力を低減させるメカニズムを持つ必要があり、本研究ではフィン付き浮体を提案している。平成22年度は固定翼型フィン付き2次元浮体に波が入射した時に浮体に作用する流体力を求める渦法数値計算プログラムを開発した。流体は粘性流体として考え、粘性無しのポテンシャル流れを境界要素法で解き、それに浮体やフィンから生じる渦の生成・拡散の計算を重畳させる。開発したプログラムで、浮体に働く流体力や渦度の時間的な変化を計算した。また、平成22年度には計算プログラムの検証実験に用いる強制動揺装置をはじめとした実験装置を購入した。次年度は本装置を用い水中で模型を動揺させ、模型表面から発生する渦の移流および拡散を可視化し、同じ条件の計算結果と比較することによって計算手法の検証を行う。(1)波浪中にある翼型フィン付き浮体の動揺実験波浪中にある翼型フィン付き浮体の動揺実験を行った。実験は、固定フィン、可動フィンに対して行い、フィンの取り付け位置を変化させ、数値計算の検証用データを取得した。また浮体及びフィンの運動、浮体周囲の流場計測を行った。浮体の運動はビデオカメラによる非接触画像解析で計測した。一方、浮体周囲流場の可視化は、流体に入れた微小粒子をレーザーシートで発光させ、高速度カメラで撮影した粒子画像から流体運動および速度を算出するPIV (Particle Image Velocimetry)法で実施した。(2)翼型フィンの最適位置と最適配置に関する計算上で実施したフィン付き浮体動揺実験に対応する計算を、昨年度開発した計算プログラムで行い、計算結果を実験結果と比較することにより、粘性流場の渦の生成・拡散計算部分を中心に、計算法の見直しを行った。実験結果と比較の結果、実験で得られた流体力および流場と比較的合致する計算パラメタを決定した。改良された2次元計算プログラムを用いて、フィンの断面形状、浮体に対するフィンの配置を変化させた時の、浮体の運動、浮体に働く波漂流力を計算し、浮体の動揺と浮体に働く波漂流力を同時に低減させるフィンの断面形状、フィンの最適配置を提案した。浮体型海洋構造物を沖合の厳しい海象下で安全に供用するため、浮体没水部にフィンを付加した構造物を提案する。フィンの1浮体の動揺エネルギーを渦のエネルギーに変換する(浮体動揺低減化)。2翼型フィンに発生する揚力を利用して、浮体を波の入射方向へ推進させる(波食い推進による波漂流力低減化)。という効果を利用して、大波浪下で浮体動揺を低減させ、また波漂流力を低減させる。この方法の実用化のためには,フィンの最適形状と最適配置を求めることができる計算手法の開発が必要である.計算手法には,自由表面を持った流体中にある任意の浮体およびフィンの形状を考慮でき,フィンから生じる渦の生成,拡散といった粘性影響も正確に表現すること,計算負荷が小さく実用的であることが要求される.この目的に適した計算手法の候補として,VOF法等の差分法,MPS法やSPH法等の粒子法,渦法等が挙げられる.本研究で対象とする波浪中の構造物の周りの流れは高レイノルズ数であり,計算では,物体表面の薄い境界層内部での渦の発生,発生した渦の流体中への拡散,物体からの渦の剥離等を正確に評価する必要があるという点から,渦法を用いて浮体とフィンの相互干渉を考慮した数値解析手法を開発した。おおむね計画通りに進展しているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度はプログラムを3次元に拡張する。3次元渦法を用いて、波浪中にある翼型フィン付き浮体の3次元運動、浮体に働く波漂流力、流体の流速、渦の生成、拡散の時間変化を求める計算法を開発する。
電気刺激による酵素的賦活と食肉の色調安定性に関する研究

新鮮な赤肉に対する消費者の許容程度は赤褐色の色素の蓄積、すなわちメトミオグロビンの表面における形成によって左右される。それは酸素の消費割合やメトミオグロビンの還元活性の程度を意味しており、赤肉の色調安定性は一義的には生化学的な反応因子によって決定してしまう。メトミオグロビンが還元されてミオグロビンになり紫赤色になった肉色の安定性は、メトミオグロビンの還元作用によって作りだされる。酸素の存在によって、ミオグロビンは鮮赤色のオキシミオグロビンという桜色が主となったもっとも消費されやすい色調にかわる。電気刺激によってメトミオグロビンが還元された8種類の筋肉部位からレダクターゼを単離した。メトミオグロビンの蓄積は家畜の死後の経過時間と筋肉部位によって影響される。筋肉のタイプからみた場合、背最長筋は大腰筋よりも色調が安定しており、それはメトミオグロビンの還元活性が背最長筋が最も活性が強いということを意味し、それはまた色調の安定性に影響している。食肉は流通の過程において空気にさらされたり、真空包装されたり、あるいは凍結されたりすることによって、ミオグロビンの誘導形態が変化するため、可視波長領域においてさまざまな分光化的な特徴を呈するが、肉眼的な表色系では、紫赤色、鮮赤色、赤褐色などの印象で捉えられるために、それが消費者の選択の目安とされる。これらの食肉の色調表現は家畜の種類のみならず、筋肉の部位によっても、変褪色の進み方が異なるため、その制御に対して決め手を欠いている。われわれは、系統的に行ってきた、いわゆる電気刺激によって、食肉の熟成が促進されることの他にミオグロビンのオキシ型誘導体の状態の持続時間が長いことを見出してきたが、その鮮赤色の維持は、ミオグロビンの濃度よりもむしろNADH還元酵素の活性に依存しているらしい事をつきとめた。当初計画していた電気刺激処理後の食肉の筋肉部位別保蔵と色調安定性試験は、大腿二頭筋による繰り返し試験を優先して行ったので、部位別比較は平成6年度の計画に先送りしたが、大腿二頭筋による試験結果によれば、ミオグロビン含量の高い経産牛の方が、ミオグロビン含量の低い若令肥育牛よりもNADH還元酵素活性が強いことが明らかになった。即ち、一定程度以上に加令された牛の筋肉中のNADH還元酵素の活性は、年令と共に活性化され、電気刺激によって、更に賦活されることが明らかになった。食肉の部位別ミオグロビン含量と、NADH還元酵素との関係において同様の傾向がみられる可能性があるという点で今年の研究成果に期待がもたれる。家畜を屠殺したあとに得られる食肉は、解体後の流通過程において空気にさらされたりあるいは凍結されたりすることによって、ミオグロビンの誘導形態が変化するため、可視波長領域において様々な分光化学的な特徴を呈するが、それが肉眼的な表色系では、紫赤色、鮮赤色、赤褐色などの印象で捉えられるために、その色調で消費者によって選択される。これらの色調表現は家畜の種類のみならず、筋肉部位によっても変褪色の進み具合が異なることから、その制御について対策が求められている。この研究では筋肉8部位のメトミオグロビンレダクターゼ活性について分析したところ筋肉の部位によってメトミオグロビンレダクターゼ活性に差異がみられた。ヒレ肉(psoas major)の色調は、貯蔵日数によって著しい変化を示すが、他の部位は経過日数による変化は小さかった。しかし、電気刺激によって、経過日数による変化は小さく安定していた。ミオグロビン含量とメトミオグロビンレダクターゼ活性は高い相関を示したが、他の要因(pH、ヘム色素、L値、a値、b値)との相関は高くはなかった。しかし電気刺激によってa値との相関が高くなるところから、電気刺激は少なくとも屠殺後7日目までは色調を安定化し、しかもa値を高く維持する効果がある。食肉における白色部分の構成割合は個体によって大きな差がみられ、しかも各個体の白色部分とメトミオグロビンレダクターゼ活性、あるいは色調(L値、a値、b値)との相関は低かった。
セメント質・歯根膜複合体再生を目指した人工タンパクの開発

今回の実験に当たり、象牙質並びにセメント質に結合するペプチドアプタマーを選定し、生化学的検証を行った。本研究の目的達成の予備実験的に、チタン結合アプタマーとBMPにの融合より人工タンパクを作製し、筋肉内に移植したところ、筋肉内において軟骨性仮骨形成を認め、RT-PCR法により3日目から骨関連タンパク質のmRNA発現を確認した。精製は不十分ながら象牙質およびセメント質に結合するペプチドアプタマーとBMPの融合タンパクを用い、予備実験と同様の研究を行ったところ、わずかながら骨関連タンパクの上昇を認めた(未発表)。1:標的物作製(セメント質片、象牙質片)平成24年度は、象牙質片とセメント質片を人およびビーグル犬の抜去歯牙から作製し、抜歯した歯は、厚さ3mm程度の輪切りとしセメント質を除去したものを象牙質片とし、歯牙に長軸方向に切り出し、セメント質面が出るようにしたものをセメント質片とし、表面処理、滅菌後、保管し実験に使用した。実際の臨床を考えた場合、歯周病に罹患している歯牙は多くの場合セメント質が露出しているが、歯周外科治療後には象牙質の露出が多くの場合で予想される。その為両硬組織を検討対照にすることは、臨床的応用に向けても意義深いし、重要な研究である。2:セメント質・象牙質融合ペプチドを創製ウイルスゲノムDNAを改変することで作られた、N末端に7あるいは12残基長のランダムなペプチド配列が融合したペプチド・ファージ・ライブラリーを用いて、作製した標的物(象牙質・セメント質)に特異的に結合するアミノ酸配列を提示するファージを単離・回収した。ペプチドのアミノ酸配列の情報は、DNA情報としてファージゲノムに保存されており、ファージゲノムからペプチドのアミノ酸配列をシーケンスすることができ、このアミノ酸配列を用い象牙質およびセメント質結合ペプチドを作製した。これからモチーフ組み合わせ人工タンパク質創製技術であるMolCraftを用い、ファージディスプレイ法で創製された、象牙質結合およびセメント質結合ペプチドと既知の増殖因子や分化成長因子を融合させ目的とするペプチドを持つ人工タンパク質を創製する。これができれば、歯周組織の新治療法となることが予想される。平成25年度は、象牙質質結合およびセメント質結合ペプチドと既知の増殖因子や分化成長因子を融合させ人工タンパク質を作製した。創製した人工タンパクの機能発現についてin vitro,in vivoにて検討した。人抜去歯牙およびビーグル犬の抜去歯牙から作製した象牙質片とセメント質片を創製した人工タンパク溶液中に象牙質片、セメント質片を浸漬させたものを実験群とした。対照群として、1)何も塗布しない物、2)セメント質結合ペプチドまたは象牙質結合ペプチド単体、3)増殖因子または分化成長因子、の単体を塗布した。その後、講座に保存されている人およびビーグル犬の培養歯根膜細胞を検体上で培養した3経時的に資料を観察する。検索はA:走査型電子顕微鏡による表面解析、B:透過型電子顕微鏡による断面解析、C:生体染色による細胞形態、結節形態、石灰化をアリザリンレッド染色により検討、D:RT-PCRによる骨形成、セメント質形成タンパクmRNA発現の検討した。その結果、表面性状に大きな変化は見られないものの、実験群では、付着細胞が有意に多く、アリザリンニ染色される石灰も多く見られた。また、骨関連タンパクのmRNAの発現も有意に多かった。これらの結果をまとめ論文にする予定であり、さらにin vivoの実験で検討していく予定である。今回の研究では、先にジルコニアに結合するペプチドアプタマーの選定(K.Hashimoto,T.Inoue, et al.Dental Material Journal, 30(6), 935-940, 2011)に成功した手法を用いた。つまり、象牙質並びにセメント質に結合するペプチドアプタマーを選定した。その後、これらのアプタマーに対する生化学的検証を行ったが、初年度では、充分に精製されたものは獲得できなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。実験病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。融合ペプチドが多数ある中で、ベストのものの抽出に手間取っている。研究実績の概要に記載したが、培養実験にばらつきが出て、繰り返し実験を行っているが、現時点では十分な再現性のあるデータではなく、in vitro追試実験が必要な状態である。平成24年度は概ね順調に進展したが、最終的にベストの物の抽出を行い、機能性の人工タンパク創製に向け研究を続ける。平成25年度の実験結果は統計をとれるまで至っていないのでin vitroの実験を追試し、データを分析できる情報を収集し、平成26年度のin vivoの実験により、人工タンパクの臨床応用の可能性を追求していく。
卵巣内paracrine,autocrine機構におけう細胞機能調節因子の関与

最終年度のまとめ卵巣内にはinsulin-like growthfactor(IGF)とその結合蛋白(IGFBP)からなるIGF-IGFBP系およびレニン・アンビオテシン系(RAS)という機能調節系が存在し、両調節系はparacrine・autocrine機序を介してゴナドトロピンによる卵胞発育・卵成熟卵機構において重要な役割を果たしている。ゴナドトロピンは、顆粒膜細胞や莢膜細胞内のプラスミン活性を上昇させる。卵胞内プラスミン活性は、GHやゴナドトロピン刺激に反応して顆粒膜細胞から分泌されるIGF-Iによっても刺激される。プラスミン活性の亢進により、卵膜壁頂部結合織の菲薄化が進行し、卵胞発育が促進される。このプロテアーゼの上昇は、IGFBPの分解を促進し、IGFBP活性が抑制され、その結果として内因性IGF-Iの作用が増強される。IGF-Iは卵巣内IGFtypeI受容体を介してE_2生合成を刺激し、卵胞発育・卵成熟を促進する。一方ではプラスミン活性をさらに亢進させ、卵巣内RASが賦活化され、レニンを経てアンギオテンシンII(Ang II)が生合成される。Ang IIは顆粒膜細胞のAT_2受容体を介してE_2やPG生合成を刺激すると同時に卵成熟や排卵を促進する。このようにIGF-IGFBP系およびRASは、卵胞発育・排卵過程での強調作用を有している。IGF-IGFBP系は卵巣機能特に卵胞発育に関与し、IGF-Iによる促進とIGFBPによる抑止の両作用をもっており、RASは卵胞発育が排卵に至までの一連の過程において促進的に作用する。卵胞発育・排卵調節機構は生殖内分泌研究の中心的課題の一つであり、その作用機序の解明は新しい生殖生理の展開につながるものと思われる。平成5年度は卵巣内renin-angiotensin系(RAS)の存在及び生殖機能に及ぼす作用について検討を加えた。1.angiotensinII(AII)の生理作用:in vitroでの家兎卵巣灌流装置を用い、外因性及び内因性AIIの排卵過程に及ぼす作用について検討した。2時間毎に投与された100mug及び10mugのAIIはgonadotropin(Gn)非存在下でin vitroでの排卵を惹起し、そのAIIによる排卵はAIIの受容体拮抗剤であるsaralasinの同時投与により完全に抑制された。さらにGnによってin vitroで惹起される排卵は、saralasinの同時投与により用量反応性に抑制された。また家兎卵巣にAIIを投与するとGn非存在下でも卵胞卵、排卵卵子の卵核成熟が促進された。AIIは卵巣内estradiol(E2)産生を有意に刺激したが、progesterone産生に影響を与えなかったことより、Gnとは異種のメカニズムを介して卵巣のsteroidogenesisを調節している可能性が示唆された。またAIIは卵巣内PGF2alpha,PGE2生合成を有意に促進し、indomethacin投与によりそのPG生合成を抑制すると、AIIによる卵胞発育及び排卵排卵は完全に抑制された。このように卵巣内RASは、排卵誘起作用、卵成熟促進作用、卵巣内E2産生促進作用を有しており、卵胞の発育や主席卵胞の選択、排卵に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。2.局所性RASの存在:Gn投与後の卵巣内AII分泌量及び組織含量は、46時間で有意な上昇を示した。また卵巣内Renin(R)活性も排卵過程で有意な変動を示した。

家兎卵巣内には高親和性(Kd=0.5×10^<-9>M)のAII受容体が存在し、AIIの選択的拮抗剤を用いた結合実験から、AII受容体のサブタイプを現在同定中である。以上、卵巣内でのRASの存在が明確となり、pracrine,autocrine機構を介して卵胞発育・成熟機構に促進的に作用することを示した。成長ホルモン(GH)は卵胞発育促進効果を有しており、その作用機序は血中あるいは卵巣局所のIGF-Iを介する二次作用やGHの卵巣直接作用などが考えられている。bovine GHを用い、GHの卵巣に対する直接作用をin vitroでの家兎卵巣灌流を用いて検討した。GHは、in vitroでの卵胞発育および卵巣におけるE_2やinsulin-like growthfactor(IGF-I)産生を用量反応性に増加した。GH投与後の卵巣内IGF-I濃度は12hで有意な高値を示し、ゴナドトロピン(hCG)投与後の卵胞発育過程と同様の変化が認められたが、hCGと異なり排卵を惹起しなかった。またGH投与後の卵胞発育と卵巣内IGF-I濃度との間には有意な正の相関が認められたことより、GHは卵巣内局所で産生されたIGF-Iを介した作用機序により卵胞発育を促進すると考えられた。家兎卵巣膜分画を用いたGH受容体は、ヒトGHに高親和性(Kd=6.1×10^<-9>M)を示したが、プロラクチンに対する親和性は低かった。またhCG投与によりGHの結合容量は減少し、排卵直前に回復する傾向を示したことから、卵巣GH受容体はゴナドトロピンにより制御されている可能性が示唆された。PRLは卵胞発育を促進せず、逆にhCGによって惹起される卵胞発育および排卵を抑制したとの報告や、今回使用したbovine GHはヒトGHと異なり、somatogenic受容体に特異的に作用すると考えられていることより、GHは卵巣内のsomatogenic受容体を介して卵胞発育を促進したと考えられた。またaffinity cross-linkingにより卵巣内IGF受容体はtype I受容体と推定された。