hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非経験的分子軌道法による気相ダイオキシン類の熱力学的研究及びその反応ダイナミクス

基底関数は、H、C及びO原子に対してsplit valence basis setに分極関数を加えた3-21g^*を使用した。Cu原子に関しては非相対論的効果を考慮するためにNe殻をHay-Wadtの有効内殻ポテンシャルで、原子価の3s3p3d及び4s電子をdouble zeta basis setで記述した。また、Cu(100)結晶表面はC_<2V>対称性を有するCU_<12>クラスターで記述した。Cu-Cu原子間距離は実験値をもとに2.551Åで一定とし、吸着及び表面反応による構造の緩和は吸着種分子のみとした。(これらの計算条件は本研究の目的である反応機構及び触媒効果を定性的に記述するために十分な精度を有することを確認した上で決定している。)本研究で得た知見は以下の通りであった。(1)気相均一相におけるPCDDの生成反応はねじれ構造から平面構造への移行が困難であるため非現実的である。(2)気-固不均一相におけるPCDD生成反応に対する銅の役割は、「前駆物質を吸着させることにより全エネルギーを安定化させる」「吸着した前駆物質のO-H結合を弱くする」「吸着種の平面構造性を保持する」ことであった。(3)気-固不均一相におけるPCDD生成反応に対する銅の触媒効果にみかけの活性化エネルギーを低減することにあった。本研究で得たこれらの知見はダイオキシン分解技術の開発に対して重要な知見を与えるものであり、その科学的・工学的意義は大きいと考えられる。1非経験的分子軌道法による飛灰上での前駆物質の塩化反応に対する触媒効果解析非経験的分子軌道法を用いて、飛灰上でのポリ塩化ジベンゾダイオキシンの前駆物質であるフェノールの塩化反応解析を試みた。飛灰表面はその主成分であるシリカを母体とし、その反応サイトに触媒である銅あるいは鉄原子を置いた金属酸化物担体クラスターで表現した。銅及び鉄を触媒としたフェノールの塩化反応のみかけの活性化エネルギーを算定・比較した結果、銅の方が鉄よりも大きい触媒効果を有することが示された。この結果は、実験報告と一致するものである。2ダイオキシン類の生成・分解挙動に対するSO2(g)添加効果の熱力学的考察ダイオキシン類の生成・分解挙動に対するSO2(g)のインヒビタ効果の熱力学的解釈を試みた。平衡計算に用いるダイオキシン類の熱力学パラメータは、本課題初年度において算定したものを用いた。高温かつSO2(g)添加量が多い条件下では、酸素によるダイオキシン類の完全燃焼分解が起こり、温度に関わらずSO2(g)添加量が少ない条件下では、硫黄によりダイオキシン類の塩化反応が抑制されることが示された。また、これらSO2(g)添加量によるダィオキシン類の挙動の変化は、系に存在する固体炭素の量に依存していることが明らかにされた。本年度は、本課題の最終年度として研究の総括を行った。総括事項は以下の通りである。(1)半経験的分子軌道法PM3ハミルトニアンを用いたダイオキシン類の熱力学パラメータの算定(3)ダイオキシン類の生成・分解挙動に対する酸素及び塩化水素の影響の熱力学的考察
癌細胞と宿主免疫の両者を同時にリプログラムする癌根治療法の開発

ALCAM (CD166)は、がん幹細胞(CSC)と間葉系幹細胞(MSC)に共通して高発現することが知られるが、その機能的役割については未だ明らかでない。本研究では、ALCAMについて分子生物学的、腫瘍生物学的、免疫学的、病理学的な手法を駆使して多面的に解析し、その結果、単にCSCやMSCの目印であるだけでなく、がん細胞の幹細胞性や免疫逃避、免疫抑制性細胞群の免疫抑制活性などを制御する機能分子であることから、ALCAM標的阻害療法は、がん進展に有利に編集された免疫環境をリプログラムして、抗腫瘍免疫を効果的に誘導できることを明らかにした。今後、臨床治療への応用を目指す。今年度は、癌細胞に発現するALCAMの分子機能を明らかにするため、まず、様々なヒト癌細胞株(乳癌、大腸癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、白血病、リンパ腫)を用いて、RT-PCR法でALCAMのmRNA発現を解析した。その結果、乳癌と大腸癌で、特に、高転移性の細胞株でALCAM発現が増強していることが分かった。そこで、ALCAM高発現subpopulationを含むヒトとマウスの乳癌細胞株(MCF7,4T1)を用いて、ALCAM陰性/陽性の細胞分画に分離、または、ALCAM陽性細胞分画にALCAM特異的なsiRNAを導入して、ALCAM発現に伴うEMT/CSC関連遺伝子発現や細胞機能などの変化を腫瘍生物学的に比較解析した。その結果、ALCAM発現の低下に伴って、EMT/CSC関連遺伝子の発現は低下し、Sphere形成やMatrigel浸潤、化学療法剤(Taxol,5-Fu)に対する抵抗性は有意に低下することが分かった。つまり、ALCAMは、癌細胞の逃避性や幹細胞性を制御する重要な機能分子であると考えられる。一方、ALCAMを発現する免疫細胞集団の特性を明らかにするため、マウス骨髄細胞や脾臓細胞を免疫学的に解析した。その結果、CD45+ALCAM+細胞は免疫抑制性のFoxp3+CTLA4+ TregやCD11b+Gr1+ MDSCと、無反応性のTim3+PD1+疲弊T細胞から構成され、これらは担癌に伴って増加することが分かった。つまり、ALCAMは従来報告されている“活性化マーカー"というよりはむしろ、担癌下の免疫異常を代表する分子マーカーと考えられる。これらの結果から、ALCAMの機能を阻害することは、癌細胞を弱化すると同時に、免疫系をも正しく修正し得る可能性が示唆された。初年度の研究において、がん細胞におけるALCAM発現は幹細胞性や免疫逃避を制御する重要な機能分子であり、その一方で、担がんに伴って誘導される免疫異常を構成する特定の免疫細胞群にもALCAMは高発現することを明らかにした。つまり、がん微小環境におけるALCAMの分子機能を標的として阻害することで、がん細胞の弱化と同時に、免疫系を正しく修正し得る可能性が示唆されたが、本年度行ったin vivo治療実験によって、その仮説を検証することができた。すなわち、マウスメラノーマB16-F10などを皮下・静脈内移植することで、ALCAM+細胞や可溶型ALCAM(sALCAM)がマウス体内で増加し、免疫系が破綻する同系腫瘍モデルにおいて、ALCAM阻害抗体を皮下腫瘍内に直接投与すると、その皮下腫瘍増殖のみならず、肺転移も有意に抑制され、マウスの生存期間が延長することが分かった。本モデルは、通常の免疫チェックポイント阻害剤には不応答であった。ALCAM阻害は、ALCAM+細胞やsALCAMの増加を全身的に網羅的に抑制できると考えられ、がん微小環境におけるALCAM分子機能を阻害することの重要性が示唆された。一方、sALCAMを用いてCD8+ T細胞を刺激すると、ごく低濃度でもCD8+ T細胞は疲弊状態から細胞死に至ることが分かった。これは、担がん生体内でsALCAMが増加すると抗腫瘍免疫が破綻してしまう機序を説明し得る。また、様々なシグナル阻害剤を用いた解析によって、この機序は、これまで報告されているCD6とのへテロ結合によるERK1/2ではなく、PI3K-Akt-mTORを介していることを見出した。ALCAM-ALCAMホモ結合によるシグナル伝達経路の一部と考えている。以上の結果から、ALCAMを標的とした阻害治療は、がん治療において極めて有用であると期待される。本研究は、初年度から前倒しで効率良く進めており、本年度も同様に、申請当初予定していたALCAM分子機能の免疫学的役割だけではなく、次年度に計画していたマウスin vivo治療実験も実施し、担がん生体内におけるALCAM分子の性状を明らかにすることができた。これにより、患者由来の腫瘍組織などを用いた臨床解析を十分に実施できる状況を順調に整えられ、また、本研究の最終目標であるALCAM阻害抗体の開発を実際に進めることにも着手できる体制を整えられた。初年度には、化学療法剤感受性が低く、転移浸潤能が高いがん幹細胞様のがん細胞だけでなく、免疫制御性細胞群にもALCAMは高発現しており、ALCAMの機能阻害は、がん細胞の難治性形質を低減させるだけでなく、担がん下の異常な免疫系をリプログラムして抗腫瘍免疫を適切に誘導できることをsiRNAなどを使ったin vitro実験で明らかにした。翌年度には、ALCAM-ALCAMホモ結合によるシグナル伝達経路や、がん進行に伴う可溶型ALCAMの増加とこれによる免疫疲弊化機構を新たに解明し、抗腫瘍免疫ネットワークにおけるALCAM分子の機能的役割を明確にすることができた。

一方、様々ながん種のマウス腫瘍細胞を移植した転移モデルを用いて、ALCAM標的阻害治療は、がん進展に有利に修飾された体内環境をがんと免疫の両側面から正しく修正することで、抗腫瘍免疫を適切に誘導できることをin vivoレベルで明らかにした。そして最終年度は、将来的なALCAM標的療法の臨床応用を見据えて、上記ALCAM機能を阻害し得るモノクローナル抗体を数種樹立するとともに、ヒト末梢血細胞を用いて、マウスで同定したALCAM発現免疫抑制性細胞群がヒトにおいても存在することを明らかにした。さらに、市販の様々ながん種の患者由来腫瘍組織について免疫組織化学的解析を行い、乳がんや大腸がんなどメジャーながん種だけでなく、骨肉腫や神経芽腫などの希少がんにおいてもALCAM発現が亢進していることをタンパクレベルで確認し、特に、放射線療法や化学療法などに不応答性・抵抗性であった患者検体において高発現であることを見出した。つまり、ALCAMを標的としたがん治療は、臨床治療においても有用である可能性を示唆しており、ALCAM高発現を指標にがん種や患者を選択することで、従来にない作用機序でより効果的にがんを治療できる戦略として期待される。ALCAM (CD166)は、がん幹細胞(CSC)と間葉系幹細胞(MSC)に共通して高発現することが知られるが、その機能的役割については未だ明らかでない。本研究では、ALCAMについて分子生物学的、腫瘍生物学的、免疫学的、病理学的な手法を駆使して多面的に解析し、その結果、単にCSCやMSCの目印であるだけでなく、がん細胞の幹細胞性や免疫逃避、免疫抑制性細胞群の免疫抑制活性などを制御する機能分子であることから、ALCAM標的阻害療法は、がん進展に有利に編集された免疫環境をリプログラムして、抗腫瘍免疫を効果的に誘導できることを明らかにした。今後、臨床治療への応用を目指す。本年度は、当初予定していた癌細胞側におけるALCAM分子の機能的役割だけではなく、次年度に計画していた免疫細胞側におけるALCAM分子の機能的役割についても解析し、癌と免疫の両者におけるALCAM発現の意義を同時に明らかにした。これによって、当初は研究最終年度に計画していたマウスin vivo治療実験や患者組織などを用いた臨床研究を予定よりも早く実施できる状況を整えることができ、本研究の最終目的である新規癌治療法の開発に向けて、大きく前進できたと考えている。今後は、マウスで同定したALCAM発現免疫細胞がヒトにおいても免疫抑制性細胞であるのか、ヒト末梢血細胞を用いてそのrelevancyを確認するとともに、様々な病期(Stage I-IV)のがん患者由来原発・転移腫瘍組織などを用いて、がん細胞と免疫細胞におけるALCAM発現と臨床病態との関連性を臨床レベルで明らかにし、将来臨床で展開するALCAM阻害治療の適応症例の予測や選択などに活かしていく。腫瘍免疫、腫瘍生物学今後は、今回得られたin vitroベースの研究成果がin vivoやヒトにも適用可能なのか否か、十分に見極めていく。まずは、ALCAM発現腫瘍細胞移植マウスモデルを用いて、ALCAM特異的なsiRNAや中和抗体などによるALCAM標的阻害が、生体内の免疫系をどのように修飾して治療効果を発揮するのかを詳細に評価していく。
DNA分子組織体上での光エネルギーのベクトル輸送

光エネルギーのドナー,メディエイター,アクセプターとして,三種類のクロモフォア(JOE,TAMRA,ROX)を選択し,それらをシーケンスの異なる10残基のオリゴDNAの5 '末端に導入したコンジュゲートを合成した。これらのコンジュゲートに相補的な配列をつなぎ合わせた配列を有する30残基のマトリックスオリゴDNAと各コンジュゲートとを水溶液中で混合し,クロモフォア・アレイを形成させた。定常光およびフェムト秒パルスレーザーを光源とした蛍光スペクトル測定により,クロモフォア・アレイ上でメディエイターであるTAMRAを介したJOEからROXへの多段階光エネルギー移動が起こっていることを確認した。また,DNA二重鎖上でのクロモフォアの空間配置および距離とエネルギー移動との関連について明らかにするため,20残基DNAの5 '末端にアクセプタークロモフォアとしてヘキサクロロフルオレセイン(Hex)を導入し,ドナークロモフォアとなるフルオレセイン(Flu)を任意の場所に導入したコンジュゲート群を合成し,二重鎖状態でのクロモフォア間の距離とエネルギー移動との関連について検討した結果,クロモフォア間の距離が長くなるほど光エネルギー移動の効率は低下する傾向が認められた。さらに,ドナークロモフォアとして,チミン塩基結合フルオレセイン(T(F))を用い,複数のドナークロモフォアを導入したマルチドナークロモフォア・アレイとしてT(F)を1から5個導入したシステムを構築し,励起スペクトル測定を行ったところ複数のドナーによって効果的に光エネルギーの捕集が起きていることが示唆された。本研究の目的は、DNAの相補的水素結合を利用して光機能性クロモフォアをエネルギー順位の順で空間的に配列し、人工光合成の光捕集アンテナを模したDNA二重らせんに沿った遠距離・多段階の光エネルギーのベクトル的輸送および化学エネルギーへの変換の達成である。今年度は,光エネルギーのドナー,メディエイター,アクセプターとして,三種類のクロモフォア(JOE, TAMRA, ROX)を選択した。それらを既に報告した方法に従って、シーケンスの異なる10残基のオリゴDNAの5'末端に導入したコンジュゲートを合成した。続いて,これらのコンジュゲートに相補的な配列をつなぎ合わせた配列を有する30残基のマトリックスオリゴDNAと各コンジュゲートとを水溶液中で混合し,DNA二重らせんに沿ってクロモフォア・アレイを形成させた。まず,定常光励起による蛍光スペクトル測定を行なったところ,より吸収波長の短いクロモフォア(JOE)の蛍光の消光,および吸収波長の長いクロモフォア(ROX)の発光が観測され,クロモフォア・アレイ上でメディエイターであるTAMRAを介したJOEからROXへの光エネルギー移動が起こっていることが示唆された。次に、フェムト秒パルスレーザーを光源に用いた時間分解蛍光スペクトル測定および蛍光寿命解析を行なった。その結果,JOEの吸収波長でパルス励起した後,50-300ps後にTAMRAに由来する蛍光が観測され,さらに時間をおいて700psを超えたあたりからROXに由来する発光が観測された。この結果から,観測されたROXの発光は,初期励起によるものやJOEからの直接のエネルギー移動によるものではなく,メディエイターであるTAMRAを介した光エネルギー移動による発光であることが証明された。また寿命解析からこの2段階のエネルギー移動のエネルギー移動効率は,約53%であると見積もられた。本研究の目的は、DNAの相補的水素結合を利用して光機能性クロモフォアをエネルギー順位の順で空間的に配列し、DNA二重らせんに沿った遠距離・多段階の光エネルギーのベクトル的輸送の達成することである。

光エネルギーのドナー、メディエイター、アクセプターとして、三種類のクロモフォア(JOE、TAMRA、ROX)をシーケンスの異なる10残基のオリゴDNAの5'末端に導入したコンジュゲートと、これらのコンジュゲートに相補的な配列をつなぎ合わせた配列を有する30残基のマトリックスオリゴDNAから、DNA二重らせんに沿ってクロモフォアを配列化させたクロモフォア・アレイを作成した。前年度までに、定常光およびフェムト秒パルスレーザーを光源に用いた蛍光スペクトル解析により、エネルギー移動が起こることは確認していたが、二重らせんを安定化するため、低温・高塩濃度という条件が必要であった。今年度は、室温および生理条件下で効率の良いエネルギー移動を達成するため、DNA二重らせんを安定化させる働きをもつカチオン性グラフト共重合体(デキストラングラフト化ポリリシン、PLL-g-Dex)の添加効果について検討した。その結果、グラフト共重合体をDNAとのチャージ比4で共存させたところ、Tmが約28度上昇し、CDスペクトルの変化もほとんど見られなかったことから、共重合体によって二重らせんがその形態を維持したまま安定化されていることが分かった。また、定常光を用いた蛍光スペクトル測定により、低塩濃度・室温および生理的条件下においても、低温・高塩濃度の時と同程度の効率の良いエネルギー移動が起こることも確認され、本研究で作成したクロモフォア・アレイとグラフト共重合体の組み合わせが、生理条件下でのDNA検出デバイスや常温での光エネルギー変換デバイスとしての可能性を有していることが示唆された。今年度は,DNA二重鎖上でのクロモフォアの空間配置および距離とエネルギー移動との関連について明らかにするため,20残基DNAの5'末端にアクセプタークロモフォアとしてヘキサクロロフルオレセイン(Hex)を導入し,ドナークロモフォアとなるフルオレセイン(Flu)をそのDNA,あるいは相補鎖の任意の場所に導入したコンジュゲート群を合成し,二重鎖状態でのクロモフォア間の距離とエネルギー移動との関連について検討した。Hexを1本のDNA鎖(A鎖)の5'末端に有し,Fluを同一鎖(A鎖)上で5残基離れた位置にFluを導入したもの(A6Flu1Hex+B),同様に8残基離れた位置にFluを導入したもの(A11Flu1Hex+B),および相補鎖(B鎖)上で6残基離れた位置にFluを導入したもの(B15Flu+A1Hex),同様に相補鎖(B鎖)上で16残基離れた位置にFluを導入したもの(B5Flu+A1Hex)を調製し,クロモフォア・アレイを構築した。これらを二重鎖形成状態で蛍光スペクトル測定を行った。これらの結果より,予想していた通り,クロモフォア間の距離が長くなるほど光エネルギー移動の効率は低下する傾向が認められた。しかし,ドナークロモフォアがアクセプタークロモフォアと同一鎖にある場合と相補鎖上にある場合とでは,エネルギー移動効率の値に大きな差が見られ,同一鎖にある方がエネルギー移動効率が高くなった。また,同じ10残基を介した場合であっても,以前に報告していたような,10残基の5'末端にクロモフォアを導入してマトリックスDNA上で配列化させたパターンよりも,同一鎖に導入した場合の方がエネルギー移動効率が高くなることが明らかとなった。ドナークロモフォアとして,チミン塩基結合フルオレセイン(T(F))を用い,複数のドナークロモフォアを導入したマルチドナークロモフォア・アレイとしてT(F)を1から5個導入したシステムを構築した。
新しいモデルマウスを用いた歯周炎におけるヒト免疫応答の解析

若年性歯周炎の原因としてプラーク(細菌塊)がその直接の原因と考えられている。特にActinobacillus actinomycetemcomitans(Aa)が原因菌として重要視されている。我々は歯周炎における免疫応答の生物学的意義を明らかにするため、歯周炎とAa感染のヒト病態マウスモデルをJackson Labs由来のNOD-SCIDマウスを用いて確立した。NOD-SCIDマウスは補体活性、NK細胞、マクロファージを欠くためヒト組織の移植定着の効率が通常のSCIDマウスよりもはるかに良いが、飼育、繁殖には厳重な衛生管理が要求される。このマウスに歯周炎患者からの末梢血リンパ球(1x10^7)を腹腔内に移植した(NOD-SCIDマウスはSCIDマウスと異なりヒトリンパ球を移植されてもXGvHDの兆候を示すことはない)。さらにAa(10^9cfu)をこのマウスの口腔内に毎週2回、3週間に渡り接種した。接種後3、5週目にマウスを屠殺し、歯周組織を病理組織学的に検討した。Aaを接種されたマウスにおいてのみリンパ球の浸潤が観察された。さらにヒトCD4,CD8,CD45特異的なマウスモノクローナル抗体で免疫組織化学的検索を行いヒトリンパ球の浸潤を確認した。稀なケースでは、CD19^+B細胞(約200のセクションのうち1)が観察された。これらの結果はこのマウスモデルが歯周炎のヒト病態動物モデルとして使用できることを示している。現在、Aa抗原に対するヒトT細胞の免疫応答を解析中である。特にActinob acillus actinomycetemcomitans(Aa)が原因菌として重要視されている。我々は歯周炎における免疫応答の生物学的意義を明らかにするため、歯周炎とAa感染のヒト病熊マウスモデルをJackson Labs由来のNOD-SCIDマウスを用いて確立した。稀なケースではCD19^+B細胞(約200のセクショシのうち1)が観察された。若年性歯周炎の原因菌と考えられているActonobacillus actinomycetecomitans(Aa)に対する免役応答を中心に研究した。具体的には、歯周炎患者からの末梢血リンパ球を移植したNOD/SCIDマウスを用いて作製したヒト病態マウスモデル(このマウスモデルについては昨年度の報告書で述べた)のヒトT細胞の免役応答を解析した。Aa-HuPBL-NOD/SCID

マウスの歯周組織からヒトT細胞を採取し、同じドナーの抗原提示細胞を用いて、Aaに対する増殖応答をin vitro実験系で検討した。その結果マウスから採取したヒトT細胞ではコントロール(同じドナーのCD4^+T細胞)の3倍以上の増殖応答が確認された。Limiting Dilution Assayにおいても抗原(Aa)特異的T細胞の頻度がコントロールと比較してやはり4倍ほど上昇していることが観察され抗原特異的T細胞のClonal Expansionが起こっていることが示唆された。また、これらのマウスの血清中にはコントロールドナーの4-5倍以上のAa特異的IgGが検出された。昨年度の結果も含めて我々の開発したマウスモデルが歯周炎のヒト病態モデルとして使用できることが示された。
アフリカ南部クラトンの結合:原生代中期から後期における変動

本年7月から9月の51日以上を費やし,本研究の対象地域であるザンビアにおいて,高圧マフィック変成岩類のエクロジャイト等の重要な露頭の調査を行なった.さらにザンビア南部においても調査を行ない,未知の島弧複合岩体の岩石を初めて採取した.今回の調査により,約400kgの岩石試料を採取し,古い島弧の試料20kgは航空便速達にて,それ以外の試料(エクロジャイト)は,船便にて日本に送付した.島弧の岩石試料について,X線マイクロアナライザー(EPMA)を用いて,テクトニックに変形したときの温度圧力の復元と岩相の記載を行なった.さらにこの島弧の火成活動の年代を精密に決定するために,島弧の6種類の岩相についてU/Pbイオンマイクロプローブ(SHRIMP)により年代測定を行ない,10801050Maという値を得た.この年代は,ジンバブエ北部に産出する同様の岩石の年代と区別がつかない.また,これらの岩石の変成年代は570Maと求められた.この年代は,本地域全体の変成年代とよく一致している.以上の結果は,我々が提唱しているアフリカ安定地塊どうしの衝突,つまりテクトニックセッティングと衝突年代についての仮説を,さらに拡張するためにとても重要である.この島弧マグマをもたらしたマントルの起源と年代を決定するため,これらの岩石からジルコンを拾い出し,本年4月に東京工業大学のイオンマイクロプローブにて測定を行なう.火成活動の年代とジルコン中のHf同位体組成は,島弧の火成活動が本地域で終息した時期(およそ1050Ma以降),火成活動の様式およびマントルの起源を理解する上で重要である.特に1050から570Maにおける本地域のテクトニクスについては,現在も未解決である.本研究の成果を元に,最低3本の論文が一流国際学術雑誌に投稿出版の予定である.
ハンドウイルカの保全生態学的研究-天草定住個体群の海域移動の原因を探る-

九州の天草周辺海域ではハンドウイルカが周年にわたって出現する,平成12年の春,熊本県通詞島周辺海域を生息の場としていた個体の大部分が60km位離れた鹿児島県長島周辺海域に移動した.本研究はこの移動の原因を探ることを当初の目的としていたが,平成13年の春にほとんどの個体が通詞島周辺海域に戻ってきて,逆に一部の個体のみ長島周辺に残った.ハンドウイルカTursiops truncatusとされていた種が最近の分類学的研究からハンドウイルカT. truncatusとミナミハンドウイルカT. aduncusに分けられるようになった.天草周辺海域のハンドウイルカがどちらの種であるかを判定する必要があった.そこで,両海域間での個体群特性の比較に焦点をあてつつ,種判定,個体数および海域利用を明らかにすることを本研究の目的とした.本研究から以下の成果を得た.この海域のハンドウイルカは形態学,遺伝学的特性からミナミハンドウイルカであることが分かった(Shirakihara et al.2003).このイルカは周年定住型であり,その個体数を218頭,95%信頼区間を195-242頭と推定した(Shirakihara et. al.2002).この個体群は日中,主に水深20m以浅域を利用し,岸に沿った比較的規則正しい日周移動のパターンを示した.夜間、外海には行かず何らかの活動をした後、朝の過渡期を経て、昼間に浅海域で休息し、夕方から夜間の活動場所に向かい始めると推測した.天草周辺海域にはこのようにミナミハンドウイルカの小さな周年定住型個体群が生息しており,ウォッチングからのストレスほかの負の人為的な影響にさらされている.今後も個体数が減少してないかどうかの確認が必要である.九州の天草周辺海域ではハンドウイルカが周年にわたって出現する,平成12年の春,熊本県通詞島周辺海域を生息の場としていた個体の大部分が60km位離れた鹿児島県長島周辺海域に移動した.本研究はこの移動の原因を探ることを当初の目的としていたが,平成13年の春にほとんどの個体が通詞島周辺海域に戻ってきて,逆に一部の個体のみ長島周辺に残った.ハンドウイルカTursiops truncatusとされていた種が最近の分類学的研究からハンドウイルカT. truncatusとミナミハンドウイルカT. aduncusに分けられるようになった.天草周辺海域のハンドウイルカがどちらの種であるかを判定する必要があった.そこで,両海域間での個体群特性の比較に焦点をあてつつ,種判定,個体数および海域利用を明らかにすることを本研究の目的とした.本研究から以下の成果を得た.この海域のハンドウイルカは形態学,遺伝学的特性からミナミハンドウイルカであることが分かった(Shirakihara et al.2003).このイルカは周年定住型であり,その個体数を218頭,95%信頼区間を195-242頭と推定した(Shirakihara et. al.2002).この個体群は日中,主に水深20m以浅域を利用し,岸に沿った比較的規則正しい日周移動のパターンを示した.夜間、外海には行かず何らかの活動をした後、朝の過渡期を経て、昼間に浅海域で休息し、夕方から夜間の活動場所に向かい始めると推測した.天草周辺海域にはこのようにミナミハンドウイルカの小さな周年定住型個体群が生息しており,ウォッチングからのストレスほかの負の人為的な影響にさらされている.今後も個体数が減少してないかどうかの確認が必要である.九州の天草周辺海域ではハンドウイルカが周年にわたって出現する.平成12年の春,熊本県通詞島周辺海域をそれまでの定住の場としていた個体の大部分が60km位離れた鹿児島県長島周辺に移動した.本研究はこの移動の原因を探ることを目的としていたが,平成13年の春にほとんどの個体が通詞島周辺海域に戻ってきて,逆に一部の個体のみ長島周辺に残った.このために,研究目的を両海域間での海域利用の比較に焦点をあてつつ個体群生態学的知見の充実に変更して,当初の予定した項目の調査を行った.2001年春一秋,通詞島周辺で20回,長島周辺で11回,1回1-4時間,ボートでイルカの群れに接近し背びれの写真を撮影した.背びれ後縁の傷の形等をもとに個体を識別した.通詞島沖では標識再捕法を用いて個体数を推定し,群れの小さい長島沖では全個体の撮影・確認を試みた.1994年以降の識別個体の再発見、天草周辺域の広域目視調査のデータも解析に用いた通詞島周辺の個体数は172頭と推定された.長島周辺には親子5組を含む計32頭(多くは通詞島沖で識別されていた個体)がいて,構成メンバーはほぼ同じであった.両海域で重複して発見された個体はなく,海域間での個体の相互移動は少ないと考えられた.2001年,両海域での推定総個体数は204頭となった.死亡あるいは他海域へ移動したとみなした識別個体(その年以降発見のない個体)の数は,94-97年は平均4.8頭であったが,98-01年は13.3頭であった.広域目視調査では両海域以外でイルカの群れを確認できなかった.利用海域の変更前後に個体数が減少した可能性は否定できない.九州の天草周辺海域ではミナミハンドウイルカが周年にわたって出現する.

平成12年の春,熊本県通詞島周辺海域をそれまでの定住の場としていた個体の大部分が60km位離れた鹿児島県長島周辺海域に移動した.本研究はこの移動の原因を探ることを目的としていたが,平成13年の春にほとんどの個体が通詞島周辺海域に戻ってきて,逆に一部の個体のみ長島周辺海域に残った.このために,研究目的を両海域間での海域利用の比較に焦点をあてつつ個体群生態学的知見を充実させることに変更して,当初に予定した内容の調査を行った.長島海峡を航行する2つのフェリーに群れの発見記録を前年同様に依頼した.測量機器セオドライトを用いて,長島の陸上定点から群れの追跡(群れの刻一刻の出現位置の計測)調査を本年度から開始した.この定点からは群れの出現海域全域は見渡せないものの、長島海峡南部海域での群れの移動を追跡することは可能であった.この調査を4月から11月まで32日間行った.フェリーによる群れ発見記録,調査船による群れの追跡,セオドライト調査からのデータから、長島海峡に出現する群れは朝に内湾(八代海)に近い海峡北部海域、昼間は南部に、夕方は再び北部海域に出現する傾向が認められた.一方,海岸線が東西に伸びる通詞島周辺海域では東西方向の日周移動が見られていることから,日周移動と地形との関連が示唆された.両海域とも水深20m以浅域で数時間以上滞在し,この間の規則的な潜水行動が観察された.この状態は休息と考えられた.夜間、外海には行かず何らかの活動をした後,朝の過渡期を経て,昼間に浅海域で休息し,夕方から夜間の活動場所に向かい始めると推測された.
アスペクト指向アーキテクチャに基づく組込ソフトウェア開発環境の設計と実現

本研究は組込ソフトウェアの開発を支援するマルチプラットフォーム環境の開発を目指すものである.組込ソフトウェアは並行に動作する状態遷移機械の集合というアーキテクチャに基づいてモデル化できる.開発環境はプラットフォーム独立なモデルの作成支援(前処理)とモデルからのプラットフォーム依存コードの生成(後処理)を支援する.以下の研究を行った1.ソフトウェア開発プロセスの整理ソフトウェアの開発プロセスを大きく4つ,仕様モデル決定,ソフトウェアアーキテクチャ構築,実行前検査,コード生成として整理した.2.アスペクト指向ソフトウェアアーキテクチャの文書化アスペクト指向ならびにプロダクトラインソフトウェアエンジニアリングの観点からソフトウェアアーキテクチャの多重視点を整理し,統一的かつ実用的なアーキテクチャの記述方法を提案した.3.ソフトウェアの実行前検査方法の提案前処理において,ソフトウェアの設計に対する実行前検査の方法について提案した.UMLでの設計から検査ツールの入力コードに変換する方法,検査により判明した欠陥箇所をUML図上で表示する方法について考察した.4.コード生成系の設計と実現後処理において,モデル駆動型アーキテクチャの概念に従って,ソフトウェアの設計から,Java,C++,Cをプラットフォームとしたプログラムコードを生成する自動生成系を設計・実現し,その有効性を確認した.5.仕様モデルとソフトウェアアーキテクチャの対応関係の整理ソフトウェアが実現すべき特性を整理した仕様モデルとソフトウェアアーキテクチャの関連を明確にし,円滑なソフトウェア開発を支援する方法を考察した.6.高速なXML問い合わせ言語処理系の設計と実現XML形式で保存されたソフトウェア文書の再利用を支援するために.XML文書に対する高速な検索方法を提案した.本研究は組込ソフトウェアの開発を支援するマルチプラットフォーム環境の開発を目指すものである.組込ソフトウェアは並行に動作する状態遷移機械の集合というアーキテクチャに基づいてモデル化できる.開発環境はプラットフォーム独立なモデルの作成支援(前処理)とモデルからのプラットフォーム依存コードの生成(後処理)を支援する.以下の研究を行った1.ソフトウェア開発プロセスの整理ソフトウェアの開発プロセスを大きく4つ,仕様モデル決定,ソフトウェアアーキテクチャ構築,実行前検査,コード生成として整理した.2.アスペクト指向ソフトウェアアーキテクチャの文書化アスペクト指向ならびにプロダクトラインソフトウェアエンジニアリングの観点からソフトウェアアーキテクチャの多重視点を整理し,統一的かつ実用的なアーキテクチャの記述方法を提案した.3.ソフトウェアの実行前検査方法の提案前処理において,ソフトウェアの設計に対する実行前検査の方法について提案した.UMLでの設計から検査ツールの入力コードに変換する方法,検査により判明した欠陥箇所をUML図上で表示する方法について考察した.4.コード生成系の設計と実現後処理において,モデル駆動型アーキテクチャの概念に従って,ソフトウェアの設計から,Java,C++,Cをプラットフォームとしたプログラムコードを生成する自動生成系を設計・実現し,その有効性を確認した.5.仕様モデルとソフトウェアアーキテクチャの対応関係の整理ソフトウェアが実現すべき特性を整理した仕様モデルとソフトウェアアーキテクチャの関連を明確にし,円滑なソフトウェア開発を支援する方法を考察した.6.高速なXML問い合わせ言語処理系の設計と実現XML形式で保存されたソフトウェア文書の再利用を支援するために.XML文書に対する高速な検索方法を提案した.本研究は組込ソフトウェアの品質を決定する主要な性質を信頼性と耐故障性と定義し,その開発を支援するマルチプラットフォーム環境の開発を目指すものである.組込ソフトウェアは並行に動作する状態遷移機械の集合というアーキテクチャに基づいてモデル化できる.開発環境はプラットフォーム独立なモデルの作成支援(前処理)とモデルからのプラットフォーム依存コードの生成(後処理)を支援する.本年度は前処理および後処理に関する基礎的な研究を行った.1.組込みソフトウェアの構成制御とその記述法に関する研究プラットフォーム独立なモデルの作成支援の観点から,状態遷移機械を適切に構成する手法を提案した.状態遷移機械の分割の指針として構成制御の概念を導入し,システム構成の動的な変更を状態遷移機械で表現することの妥当性,および形式的なアプローチの適用を検討した.UMLのステートマシン図を用いた構成制御の図式表現からCSPへの変換手法を提案した.CSPにより記述された状態遷移機械をモデル検査ツールFDRを利用して検証する方法を考察した.2.アスペクトの干渉に関する研究モデルからプラットフォーム依存コードを生成するさいに,アスペクトの干渉問題が生じる可能性があるので,干渉生起可能性箇所をプログラム実行前に検証する方法を提案した.アスペクトの干渉とは,あるアドバイスコードと別のアドバイスコードによる同一オブジェクト内の同一属性上での意図しない副作用を引き起こす欠陥が実行時に顕在化し,故障となることである.本研究により,プログラム実行前に,干渉が起こりうる箇所を検出でき,それを取り除くことができる.本研究は組込ソフトウェアの開発を支援するマルチプラットフォーム環境の開発を目指すものである.組込ソフトウェアは並行に動作する状態遷移機械の集合というアーキテクチャに基づいてモデル化できる.開発環境はプラットフォーム独立なモデルの作成支援(前処理)とモデルからのプラットフォーム依存コードの生成(後処理)を支援する.本年度は以下の研究を行った.1.開発プロセスとアーキテクチャの整理ソフトウェアの開発プロセスを大きく4つ,仕様モデル決定,ソフトウェアアーキテクチャ構築,実行前検査,コード生成として整理した.各プロセスでのステイクホルダを考え,ステイクホルダが協調する場面で必要となるアーキテクチャとして,コンセプチュアルアーキテクチャ,プロダクトラインアーキテクチャ,プロダクトアーキテクチャを定義し,その記述法を提案した.2.モデル検査方法の提案前処理において,ソフトウェアの設計に対するモデル検査の方法について提案した.モデル検査はCSPにおける詳細化検査ツールFDRとチャネル通信オートマトンのための検査ツール

SPINを用いて行う.検査の実用化のために,UMLでの設計から検査ツールの入力コードに変換する方法,ならびに検査により判明した欠陥箇所をUML図上で表示する方法について考察した.3.MDAに基づいたコード生成系の設計と実現後処理において,ソフトウェアの設計からプログラムコードを自動生成する方法について考察した.モデル駆動型アーキテクチャの概念に従って,Java,C++,Cをプラットフォームとしたコード生成系を設計・実現し,その有効性を確認した.4.高速なXML問い合わせ言語処理系の設計と実現ソフトウェア文書の保存形式としてXMLが用いられている.文書の再利用を支援するために,XML文書に対する高速な検索方法を提案した.
湿式微粉砕による草本系バイオマスの固体糖化発酵

本研究の目的は含水率3060%程度の草本系バイオマス(稲わら,エリアンサス,ミスカンサス)を湿式微粉砕し,固体状態で糖化発酵させる技術を開発することである。微粉砕可能な既存の農業機械を調査したところ、植繊機が候補として挙がった。植繊機とは草木質系バイオマスを一軸可変リードスクリューで加圧・混練・昇温・摩砕する機械であり、竹や農業残渣などの堆肥化促進のために使用されている。植繊機出口部の成型プレートの抵抗を調整し、稲わらを処理したところ、出口温度は約90°Cまで昇温した。出口温度が90°Cであれば、スクリュー内部の温度は90100°Cと推察される。機械的エネルギーで発生する90100°Cの熱を有効に利用し、湿潤状態の草本系バイオマスを減容化するとともに十分に酵素糖化可能な物質に変換できることは、実用化の観点から大変意義深い。しかしながら、植繊機で処理しただけの稲わらでは十分な糖化率を得られなかった。水酸化カルシウムを用いた酵素糖化のための前処理温度は95100°Cであり、植繊機内部の温度はほぼ等しい。そこで、刈り取り直後の稲わらを想定して含水率を5060%に調整し、原料乾量の10%の水酸化カルシウムを添加し、植繊機で処理。処理物を酵素糖化させたところ、グルコース回収率が80%に達することが明らかとなった。アルカリと少量の水が存在する状態で、加圧・混練・昇温・摩砕によってメカノケミカル反応が誘起され、リグニンとヘミセルロースによるセルロースの保護が外れて、易糖化性の物質が得られたと考えられる。
排便に援助が必要な在宅要介護者を介護する家族への効果的な訪問看護師の援助

平成19年度は、平成18年度に行った調査結果をもとに、寝たきり度の高い要介護高齢者とその家族に対する訪問看護師による効果的な排便ケア方法(アセスメント視点と看護指針)を作成し、それを用いた訪問看護実践を行うことにより、その実践現場での適用可能性を検討した。また、作成した排便ケア方法の特徴を文化的視点から考察した。1.熟練訪問看護師16名に対するインタビュー調査を実施して質的に分析し、寝たきり度の高い要介護高齢者とその家族に対する卓越した排便ケアの特徴を明らかにした。その結果、『要介護者の心身や家族介護者の状況に即した、到達しうる最善の排便像を描く』『実践を通じて、対象固有の排便パターンをみつける』等の特徴が見いだされた。2.1.の結果に排便ケアに関する国内外の文献検討、修士論文の再分析の結果を加味して寝たきり度の高い要介護高齢者とその家族に対する訪問看護師による効果的な排便ケア方法を作成し、訪問看護経験者を招集してパネル会議を実施して精錬した。アセスメント視点は、〈排便が引き起こす身体的問題〉〈要介護者の排便ケアに関する意思〉〈要介護者の排便ケアの実施能力・準備性〉〈家族介護者の排便ケアに関する意思〉〈家族介護者の排便ケアの実施能力・準備性〉の5つで構成された。3.4か所の訪問看護ステーションの訪問看護師と協同して、作成した排便ケア方法を用いた看護実践を行い、実践過程の分析からその適用可能性を検討した。その結果、要介護者や家族介護者の排便ケアへの主体的参加、排便ケアの満足度の向上等が認められ、作成した排便ケア方法の実践現場への適用可能性が示された。4.以上の結果についてタイや韓国における看護実践と比較した結果、入院中も排泄ケアなどの身の回りの世話は家族によって行われることが多い等、看護師の業務範囲が異なることなどが、日本との相違点として明らかとなった。平成18年度は,排便に援助が必要な在宅要介護者を介護する家族介護者への効果的な訪問看護実践のモデルを開発するために,以下のことを行った。1.排便ケアに関する国内外の文献検討を行った。国内文献において在宅における排便ケアに関する研究は少なかった。一方,海外文献においては無作為化試験により地域在住高齢者の排便障害に対する介入効果を検討した研究等がみられたが,日本の訪問看護利用者の特徴,訪問滞在時間,看護師の裁量範囲等において適用が難しいものがほとんどであった。2.訪問看護実践における排便に援助が必要な在宅要介護者を介護する家族介護者への支援の方向性を検討するために,修士研究で得られた家族介護者に対するインタビューデータの再分析を行った。その結果,家族介護者の排便ケアに対する適応の状況は,《排便ケアを要する要介護者の状況を受け入れる》《便に対する生理的嫌悪感・抵抗感が和らぐ》《排便ケアの手際を会得する》《要介護者の排便をコントロールする》《他者の協力を得ながら排便ケアに取り組む》《排便ケアを訪問看護師に完全に委ねる》にまとめられ,排便ケアに対する家族介護者の適応の様相が明らかとなった。この結果については,現在,学術雑誌に投稿中である。3.訪問看護における排便に援助が必要な在宅要介護者を介護する家族介護者への看護実践知を収集するために,日本国内(千葉・石川・沖縄)における現地調査および全国6都県(福島・千葉・群馬・東京・神奈川・沖縄)における熟練訪問看護師19名へのインタビュー調査を行った。熟練訪問看護師は,文献および研究者のネットワークから対象者を選定し,排便ケアに関する家族支援がうまくいったケースに関する援助過程について半構成的面接を行った。以上の結果をもとに,排便に援助が必要な在宅要介護者を介護する家族介護者への効果的な訪問看護実践の援助指針を作成し,現在,精錬を試みている。

その結果、要介護者や家族介護者の排便ケアへの主体的参加、排便ケアの満足度の向上等が認められ、作成した排便ケア方法の実践現場への適用可能性が示された。4.以上の結果についてタイや韓国における看護実践と比較した結果、入院中も排泄ケアなどの身の回りの世話は家族によって行われることが多い等、看護師の業務範囲が異なることなどが、日本との相違点として明らかとなった。
臨床・教育・消費者協働による客観的臨床能力試験を用いた助産学生の助産実践能力育成

学士課程卒業時における助産師学生の助産実践能力をOSCEを用いて評価するための、OSCE運営マニュアルと課題、評価表を作成した。さらに標準模擬患者を養成するためのマニュアルとビデオ作成を行った。助産師学生の卒業時の助産実践能力を分娩介助時のOSCEから評価した結果、コミュニケーション能力や看護者としての基本的態度の育成は確認できたが、分娩介助技術や感染予防行動、医療安全への配慮に関する能力は、臨地実習による慣れの影響もあり、基本に忠実な評価指標では充分に評価できない可能性も示唆された。しかし、それらは医療従事者として習得すべき基本的な実践能力であるため、知識と技術の獲得は喫緊の課題である。昨年度作成したOSCEプログラム案をもとにOSCEを実施した。OSCEに参加した模擬患者、評価者、受験者などを対象にアンケート調査、インタビュー調査、OSCE評価得点の採点などを行い、その成果からOSCEプログラム案の修正を行った。さらに、OSCEを受験をした助産師学生の臨床実践能力の評価を行った。模擬患者養成については、養成プログラムを作成し、それをもとに模擬患者の養成を行い、OSCEに参加していただいた。≪目的≫1臨床と教育、消費者の協働による助産師学生のマタニティケア実践能力を明確化するためのOSCEプログラム案を作成する。2生殖期女性を対象としたSP養成のためのプログラムを開発するため、SPの募集とSP養成プログラム案を作成する。≪方法・結果≫1最新の助産師に求められる実践能力を把握し、それをOSCEプログラム案に反映させるため、全国助産師教育協議会の示すミニマムリクワイアメンツや厚生労働省の助産師に求める実践能力、国家試験の出題内容、助産師のコアコンピテンシー、助産師学生の臨地実習での経験状況などの資料を収集した。さらに、関連学会や研修会などに参加し、OSCEプログラム案(OSCEの目的や目標、OSCEの対象者、OSCEの実施場所、OSCE当日までと当日のジュール、OSCE担当者と学生への事前オリエンテーションの内容、OSCE課題、OSCE評価表)を作成した。2模擬患者養成プログラム案の作成については、現在関連する研修会を公聴したり、それに関する資料を収集している。SPの役割やSPとしての心構え、SPとして大切にしていること、フィードバックの方法に関するプログラムは作成した。また、模擬患者を募集するための施設の選定を行っている。学士課程卒業時における助産師学生の助産実践能力を、客観的臨床能力試験(OSCE)を用いて評価するため、OSCE運営マニュアルとOSCE課題や評価指標を作成した。複数の教育機関と協働しOSCEを実施し、教員や受験学生の意見を聴取することや、教員の所属機関や教育経験年数の違いによるOSCE評価点に相違が生じないことを確認することによって、OSCE運営マニュアルとOSCE課題や評価指標の妥当性を検証した。さらに、標準模擬患者(SP)を養成するためのマニュアルとビデオ作成を行った。それらマニュアルとビデオ教材を用いて養成したSPが参画したOSCEを実施し、SPが異なる場合でも統一されたOSCEの実施がなされたことにより、SPの養成が行えたことを確認した。学士課程卒業時の助産師学生の分娩介助時における助産実践能力を、OSCEにより評価した結果、助産師学生は主に臨地実習での産婦との関わりから、コミニュケーション能力や看護者としての基本的態度の育成は確認できた。一方、分娩介助技術や感染予防行動、医療安全への配慮に関する実践能力については、臨地実習による慣れによる影響もあり、基本に忠実な評価指標ではその能力は充分に評価できない可能性が示唆された。しかし、それらは医療従事者、特に助産師として習得すべき実践能力であるため、分娩介助技術、清潔と不潔の区別、医療事故、予防方法と対策などに関する知識と技術は、常に基本として獲得を徹底する必要がある。さらに、卒業後の新人教育においても強化がなされるように臨床の継続教育にも提言をしていきたい。母性看護学・助産学本年度は昨年度作成したOSCEプログラム案をもとにOSCEを実施すること、模擬患者養成プログラムに基づき模擬患者を養成し、OSCEに参加してもらうことを計画に挙げており、それらの計画が本年度実施できたため。平成24年度に計画していたOSCEプログラム案と、SPの役割、SPとしての心構え、SPとして大切にしていること、フィードバックの方法に関するプログラムを作成したことからおおむね順調に進展している。本年度はOSCEプログラムを再度修正し、完成を目指す。また、昨年度模擬患者養成プログラムをもとに模擬患者を養成し、OSCEに参加していただいたその成果から、模擬患者養成プログラムの修正、完成を目指す。さらに、OSCEの評価結果から助産師学生の臨床実践能力を評価、把握し、助産教育へ活用していく。平成25年度は、昨年度作成したOSCEプログラム案をもとにOSCEのプレテストを68月に行う予定である。

またプレテストを実施し、OSCEに参加した模擬患者、評価者、学生などからの意見を聞き、プログラムの見直しを行い、13月に約20名程度の学生を対象としたOSCEの本テストを実施する予定である。模擬患者養成については、養成のためのプログラムを完成させ、模擬患者の育成を行い、OSCEの本テストに参加していただく予定である。平成26年度は、OSCEプログラム・SP養成プログラムの開発(ピアサポートグループの設立も含む)と、助産師学生の卒業時の実践能力とOSCEの有効性の検証を行う予定である。研究終了後は、速やかに成果をまとめ学会及び学術誌に報告する。また、結果をわかりやすくまとめたパンフレットと助産師学生の実践能力の客観的評価表、評価方法を作成し公表する予定である。OSCEに参加していただいた方への謝金が発生しなかったためと、学会発表・参加はしたが見積もりより安価であったため。本年度は学会発表を2回行い、また他にも学会参加する予定にしており、旅費で400000円を見込んでいる。さらに、OSCEの実施費用に200000円、OSCEプログラムや模擬患者養成プログラムの作成費用として100000円を見込んでいる。主なものは、OSCEに必要な物品の購入、調査補助員への謝金、模擬患者への謝金と交通費、成果発表のための学会参加費と交通費などの予定である。
補体による感染防御に中心的役割を果たすC3/C5転換酵素の構造と機能の研究

C3/C5転換酵素系は,補体の活性化によって生じた3分子の活性型成分が,微生物表面に順次結合して形成されるタンパク質集合体である。古典経路の本酵素系C4b2a3b複合体内で,C3bはC4bに直接エステル結合している。C4b上のC3b結合部位を決定するため,まずC4bとC3bがエステル結合した二量体を精製し,酵素消化とカラムクロマトグラフィ-によりC4とC3由来の部位を含むペプチドを精製した。このペプチドは,C3b由来のペプチドが,C4bのAla1186からLys1259の領域に相当するペプチドにエステル結合しているものである事がわかった。この領域内には12個のエステル結合形成可能な残基(Ser,Thr,Tyr)が存在するので,cDNAをSiteーdirected mutagenesis法で改変しSerとThrをAlaに,TyrをPheに変えた変異C4タンパク質を得た。変異C4タンパク質を用いてC3bとの複合体形成を調べ,Ser1217がC3bの結合残基である事を証明した。溶血活性がほとんどない異常C4であるアロタイプC4A6は,C4b2a3b複合体を正常に形成するのに,その複合体にはC5が全く結合しない事を証明した。C4A6の一次構造解析がOxford大学で行なわれ,Arg458がTrpに変異している事がわかったので,この残基がC5の結合に重要である事がわかった。第2経路のC5転換酵素は,C3b上に第2のC3bがエステル結合したC3bBbC3b複合体であるという我々のモデルを証明するためC5転換酵素の結合した多糖体からC3bーC3b二量体を分離精製し,B,D,P因子とともにC5転換酵素を再構成する事を試みた。予想通り,C3b二量体は,B,D,Pと反応する事によりC5転換酵素を形成したので,我々のモデルを支持する新たな証拠が得られた。古典経路の本酵素系C4b2a3b複合体内で,C3bはC4bに直接エステル結合しているのでC4b上のC3b結合部位を特定する事を目的として実験を行った。C4bとC3bが共有結合した二量体を精製し,酵素消化とカラムクロマトグラフィ-によりC4とC3由来の部位を含むペプチドを精製した。このペプチドは従来のSDSーPAGE法では分子量1万7千と算定されたが,低分子量領域での測定がより正確に行える尿素含有SDSーPAGEにより分子量7万のC3b由来のペプチドが分子量7万のC4b由来のペプチドにエステル結合していることが分かった。一次構造解析の結果C4b由来のペプチドはAla 1186ーLys 1259であることが分かった。この領域内では,12個のエステル結合形成可能な残基(Thr,Ser,Tyr)が存在するが,マウスC4の配列と比較し,8残基が保存されていることを知ったのでこの8残基をsiteーdirected mutagenesisの対象とする事とした。また,基質C5が,C5転換酵素に結合する時には,C3bとC4bの両方に結合する。

溶血活性が殆どない異常C4であるアロタイプC4A6は,C4b2a3b複合体を正常に形成するのに,その複合体には,C5が全く結合できないことを見いだし,発表した。C4A6の一次構造解析がOxford大学で行われ,β鎖内のArg458がTrpに変異していることがわかったので,この残基がC5の結合部位に重要である事がわかった。C3/C5転換酵素系は,補体の活性化によって生じた3分子の活性型成分が,微生物素面に順次結合して形成されるタンパク質集合体である。古典経路の本酵素系C4b2a3b複合体内で,C3bはC4bのAla1186からLys1259の領域のどこかに直接エステル結合していることが前年度の研究で明らかになった。今年度はこの領域のどのアミノ酸残基にC3bが結合しているか決定するために,Siteーdirected mutagenesis法により変異させたC4を用いて実験を行なった。エステル結合形成可能なセリン,スレオニン,チロシンをアラニンかフェニルアラニンに変える変異を行なった所,Ser1217をアラニンに変えると,複合体形成が著しく悪くなる事を見い出した。Ser1217とSer1219を同時に変えると全く複合体を形成しなかった。この事から,C3bのエステル結合部位はSer1217であり,これがない時には,低い効率でSer1219に結合する事がわかった。既ち,C3bのC4bへの結合は,特異的な反応である事が示された。この反応は,C5転換酵素がC5を分解活性化するのに必要な一定の4次構造を形成するのに重要であると考えられる。C3をヒトからマウスに変えても同様にSer1217に結合する事を確かめた。この事は,C4bと特異的に結合する機能が普通的なものである事を示唆している。第2経路のC5転換酵素は,C3b上に第2のC3bがエステル結合したC3bBbC3b複合体であるという我々のモデルを証明するためC5転換酵素の結合した多糖体からC3bーC3b二量体を分離精製し,B,D,P因子とともにC5転換酵素を再構成する事を試みた。予想通り,C3b二量体は,B,D,Pと反応する事によりC5転換酵素を形成したので,我々の支持する新たな証拠が得られた。