hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電動車いすの２次元傾斜モデルとその制御系設計に関する研究

本研究の目的は、2次元傾斜面上での電動車いすのモデリングとその制御系設計法を確立することである。本研究では上りまたは下り坂(前後)の傾斜と片流れ(左右)の傾斜における車いすモデルの構築を行い、走行環境の状態を推定するために各種の慣性センサを使用する。また、その慣性センサ群を用いた拡張カルマンフィルタによって傾斜角の動的推定問題を取り扱う。そして、2次元の傾斜角推定法を組み合わせた適応制御系設計法を提案する。提案した推定法と適応制御設計法の有効性をシミュレーションおよび制御実験により確認した。最後に傾斜環境における重力補償はジョイスティック入力による電動車いすの場合でも有効であることを確認した。本研究の主な目的は、電動車いすが車いす特性(質量や摩擦など)と傾斜環境を2次元モデル(片流れ傾斜)として状態推定し、それらの情報に基づいた車いすの制御系設計法を確立することである。そこで、今年度は第1Phaseとして2次元傾斜における車いすの動特性モデルの構築に取り組んだ。実際の走行環境に対応するために2次元傾斜に対する車いすの運動方程式をラグランジュ法によって導出した。このとき車いすは運動学的な拘束つまり、車体と車輪とが連結されていることより車輪の接地点の速度と車体の並進・回転の速度が等しくことを利用している。また、斜面によってタイヤが横滑りを起こさない条件を考慮し、運動方程式を簡略化することができた。摩擦項としては、車輪と軸に生じる粘性摩擦力や路面とタイヤとの転がり摩擦力が考慮されている。つぎの第2Phaseはその動特性モデルに基づいた2次元傾斜の状態推定と適応制御法の適用である。得られた車いすモデルは、力学的な未知パラメータと計測可能な状態変数との線形結合で表現することができる。そのため、使用する適応制御則は、逐次未知パラメータを更新しながら真値に収束するように調整される。また、平地走行を想定した理想的な仮想車いすモデルの設定も行う。最後に構築された車いすシステムの性能を評価するために、まずは1次元傾斜環境(上り坂:4度)における走行制御実験を行なった。性能評価の指針として、制御面の立場から位置や推定パラメータなどの特性に加え、利用者がハンドリムに加える力つまり、推進力を得るための上腕三頭筋の筋電信号を用いることにした。その結果、推定までの応答速度(収束まで約3秒)が遅いものの車いすの状態量を推定できることを示した。また、市販品の電動車いすとの筋電信号による比較では、提案する車いすは坂道においても平地感覚に近い状態(力)で操作できることを示した。そこで、今年度は問題視されていた2次元傾斜の状態推定量の高精度化に取り組んだ。その方法は、加速度センサやジャイロセンサおよび磁気センサを内蔵した安価な慣性センサ群の情報により、拡張カルマンフィルタを構成する方法と言える。その結果、ロール・ピッチ・ヨー角の姿勢角が車いすの動作時において最大で約2度程度の誤差で計測できることを確認した。この成果は2次元傾斜面における制御系設計法の基礎となるため、本研究では極めて重要な成果と言える。つぎの段階として2次元傾斜面上のパワーアシスト車いすモデルに基づいた適応制御法の構築を行う。2次元傾斜面上での車いすモデルは、利用者を含む車いすの質量や路面との摩擦係数などの未知パラメータと状態変数とが線形結合で表現することができる。そのため、使用する適応制御則は、逐次未知パラメータを更新しながら真値に収束するように構成されている。そのとき、平地走行を想定した理想的な仮想車いすモデルを用いることにする。提案した適応制御系の有効性を、斜面の横断や斜め方向への横断などのシミュレーションにより確認した。また、どの方向からの横断においても斜面を走行でき、良好な結果を得ることができた。一方、我が国ではハンドリム入力によるパワーアシスト車いすよりもジョイスティックによる操作方法が圧倒的に多い。そのため、そうした車いす利用者のために、今年度は力センサと直流モータを内蔵したジョイスティックを開発した。この力センサの情報により、利用者の操作方法の評価が可能となる。また、未然に危険な操作を防止するためやジョイスティックの操作教示のために、直流モータによる力提示も可能となる。本研究の目的は移動用福祉機器である電動車いすに注目し、使用者または介助者の負担を軽減するために、走行環境の2次元状態推定法を利用した電動車いすの計測・制御方法の確立および、電動車いすの高機能化を実現することである。その推定法は、慣性センサを内蔵した安価なセンサ群の情報により、拡張カルマンフィルタを構成する方法と言える。しかしながら、推定された状態量にバイアス信号が含まれるため、推定時間の使用が制限されてしまう問題があった。そこで、新たにバイアス信号も推定するアルゴリズムを付加することで、ロール・ピッチ・ヨー角の姿勢角が車いすの動作時において最大約1度程度の誤差で計測できることを確認した。制御系設計法として2次元傾斜面上のパワーアシスト車いすモデルに基づいた適応制御系を構築した。ある仮定に基づいた車いすモデルの構造は、車いすの慣性モーメントや質量およびころがり摩擦係数などの未知パラメータと状態変数とが線形結合で表現することができる。提案した適応制御系の有効性を、斜面の横断や斜め方向への横断などの実機による制御実験により確認した。

一方、我が国ではハンドリム入力によるパワーアシスト車いすよりもジョイスティック入力による電動車いすが圧倒的に販売されている。そのため、そうした電動車いす利用者のために、今年度は力提示を可能としたジョイスティックを開発した。また、2次元傾斜面上でその重力項を補償するとともに、希望する方向と実際の方向とが異なっている場合に力提示によってその誤差を修正する力提示アルゴリズムを提案した。この力提示手法と重力補償によって、電動車いすの制御誤差が小さくなることを実機によって確認した。このとき、提案した手法は高価な力覚センサを用いることなく、力提示が可能であることも確認した。本研究の目的は、2次元傾斜面上での電動車いすのモデリングとその制御系設計法を確立することである。本研究では上りまたは下り坂(前後)の傾斜と片流れ(左右)の傾斜における車いすモデルの構築を行い、走行環境の状態を推定するために各種の慣性センサを使用する。また、その慣性センサ群を用いた拡張カルマンフィルタによって傾斜角の動的推定問題を取り扱う。そして、2次元の傾斜角推定法を組み合わせた適応制御系設計法を提案する。提案した推定法と適応制御設計法の有効性をシミュレーションおよび制御実験により確認した。最後に傾斜環境における重力補償はジョイスティック入力による電動車いすの場合でも有効であることを確認した。傾斜面環境の2次元状態推定は、拡張カルマンフィルタを用いることで高速・高精度に傾斜角を推定できることを確認した。また安価な慣性センサ群(1万円程度)を用いた場合でも車いすの動作時に最大2度程度の誤差で抑えられることを確認した。しかしながら、理想的な仮想車いすモデルの出力軌道(目標軌道)への追従制御ではサーボ補償の作用により良い制御性能が得られたものの、未知パラメータのうち重力項の推定精度が悪い問題が残されている。これらの新たな問題は生じているが、2次元傾斜面上での動的な状態推定法はシミュレーションや一部実機による検証も行っているため、当初の目的の85%程度は達成できているものと考えている。2次元傾斜面での状態推定に基づいた適応制御法については、車いすシステムに導入可能な安価な慣性センサ群に基づいた適応制御法の提案を行なっている。この適応制御系の有効性はシミュレーションでの検証に留まっているものの、理論体系を整えるという観点からすればその目的をほぼ達成できていると考えている。また、提案する制御系は推定された未知パラメータをフィードフォワード項で補償することができるため、介助者へのモード変更が容易である利点を有している。最後に、今年度から新たに導入した力フィードバック可能なジョイスティックシステムを構築し、新たな力提示法を提案した。さらに、ジョイスティック操作の感覚を物理的に力覚センサで評価することができるため、より多くの電動車いすユーザを包含できる。以上の進展状況を総合的に判断すると、今年度の研究はおおむね順調に進展していると考えられる。ロボット工学
ヒト赤血球膜における薬物輸送と薬物相互作用・有害反応の場としての赤血球

ヒト洗浄赤血球および赤血球膜小胞(IOVs, ROVs)を用いた研究から、(1)臨床で観察されるバルプロ酸-カルバペネム系抗生物質の相互作用の分子メカニズムとして、異物排出トランスポーターMRP4が関与していること、(2)リバビリンの副作用の溶血性貧血の原因である赤血球内移行にはヌクレオシドトランスポーターhENT1が関与し、その活性調節因子が赤血球内に存在する可能性が示唆された。これらの研究成果は、赤血球における薬物相互作用・有害反応の回避、並びに新たな薬物治療法の開発へと繋がることが期待される。本研究は、薬物相互作用や有害反応の分子メカニズムについて、薬物の赤血球内移行の観点から解明することを目的としている。本年度はヒト赤血球から反転膜小胞(IOVs; inside-out vesicles)を調製し、ヒト赤血球膜における排出トランスポーターMRP機能について評価し、以下の結果を得た。1)MRP基質である2,4-dinitrophenyl-S-glutathione (DNP-SG)、メトトレキサート(MTX)および5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)のIOVsへのATP依存的な取り込み活性に温度依存性および濃度依存性が認められた。各種MRP阻害剤の影響およびヒト赤血球膜にはMRP1,4,5が発現していることから、DNP-SGの高親和性輸送はMRP1介在性であること、MTXを用いることによって主にMRP4の輸送特性を、またCDCFを用いることによってMRP5の輸送特性を評価できることが示唆された。2)抗てんかん薬であるバルプロ酸(VPA)はいずれの基質の取り込みも阻害した。一方、カルバペネム系抗生物質であるパニペネム(PAPM)はDNP-SGおよびMTXの取り込みを阻害したが、CDCFの取り込みは阻害しなかった。3)VPAのIOVsへの取り込みにはATP依存性が認められた。また、ヒト洗浄赤血球において、VPAの赤血球内蓄積量がPAPAMによって有意に増加し、VPA排出の阻害が示唆された。今後は、ヒト赤血球膜における各種MRPの発現レベルと輸送活性との相関解析を行うとともに、赤血球内に取り込まれたバルプロ酸の運命についても検討を加える。本年度は、ヒト赤血球膜における薬物輸送と薬物相互作用・有害反応の場としての赤血球の研究をさらに進める目的で、リバビリン及びヌクレオシドトランスポーター(ENT)の代表的基質であるウリジンの輸送特性を中心に、ヒト洗浄赤血球及びヒト赤血球膜小胞を用いて解析し、以下の結果を得た。1.ヒト洗浄赤血球におけるリバビリンおよびウリジンの取り込みには濃度依存性(飽和性)が認められ、またENT1阻害剤であるS-(4-Nitrobenzyl)-6-thioinocine(NBMPR)によって阻害された。2.ヒト赤血球反転膜小胞IOVsにおけるリバビリン及びウリジンの取り込みにも濃度依存性が観察されたが、赤血球の場合とは異なり、シグモイドカーブを示し、基質の親和性が低く見積もられた。3.ヒト赤血球反転膜小胞においてNBMPRは、基質濃度が低い場合には取り込み促進効果を示し、高い濃度では取り込み阻害効果を示した。4.ヒト赤血球膜小胞ROVsを用いた検討においても、IOVs同様、低い基質濃度ではNBMPRによる取り込み促進効果が観察された。このように、洗浄赤血球と膜小胞において結果の乖離が見られた原因として、インタクトな赤血球内に存在している何らかの物質が通常はhENT1に作用し活性を調節しているが、赤血球膜を小胞化する際に消失している可能性が考えられた。リバビリンの主な副作用である血液障害は、その赤血球内移行と密接に関係するものと考えられる。この活性調節因子を解明することにより、リバビリンの赤血球内移行における分子メカニズムが明らかとなり、リバビリンの有害反応の回避へと繋がるものと期待される。
抗腫瘍抗生物質生合成系の解析

1)アクラシノマイシンのアグリコンであるアクラビノン生合成遺伝子系に見出されたORFのうち、酸化酵素(OX)、縮合酵素(KS)、Chain Length Factor(CLF)、Acyl Carrier Protein(ACP)各酵素について、その発現を試みた。発現系としては、大腸菌を宿主とするpETベクター系を用いた。OXは、His-tag付加体として効率よく発現、精製することができた。その活性はemodinanthroneを代替基質とすることにより、確かにanthroneからanthraquinoneへの酸化酵素活性を持つことを確認することができた。また、部位特異的変異導入により、Trp-67が活性発現に重要であることを確認した。また、KS、CLF、ACPについては、Thioredoxinとの融合タンパクとして、発現させ、KS、CLFは、封入体として、また、ACPは可溶性タンパクとして得ることができた。KS、CLFは、尿素による変性、refoldingにより可溶可できた。現在、Thioredoxinの切り放しと再構成系の確立を検討中である。2)ダイネミシン生産菌M.chersinaのゲノムDNAをベクターpKU110を用いてStreptomyces lividansに導入し、ダイネミシン耐性株をスクリーニングし、ダイネミシン自己耐性遺伝子の検索を試みた。S.lividans野性株の約10倍の耐性を示す形質転換体を選択することができたが、回収したプラスミドのインサート中には耐性遺伝子は見いだされず、S.lividansの自然変異により、耐性株が出現したものと考えられ、現在さらに耐性株のスクリーニングを検討中である。
口腔癌の高浸潤性獲得メカニズムと微小管の関連解析

様々な濃度のパクリタキセル及びビンブラスチンをOSC-20細胞、OSC-19細胞、HOC313細胞の培養液に添加し、72時間に増殖細胞の数を測定した。得られた結果より、3種類の口腔扁平上皮癌細胞株のパクリタキセル及びビンブラスチンに対する感受性をそれぞれ比較し、浸潤様式と感受性の関係、申請者がすでに報告しているエリブリンの結果と比較検討した。OSC-20細胞、OSC-19細胞、HOC313細胞にIC50濃度のエリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチンを添加し、72時間後にmRNAおよびタンパク質を回収する。上皮マーカー:E-cadherin、間葉系マーカー:Vimentin、N-cadherin、Snailの解析にはFAM/ZEN/IBFQラベルプローブを、内部標準の18S rRNAの解析にはHEX/ZEN/IBFQラベルプローブを作製し、real-time RT-PCR法で各遺伝子発現を解析した。細胞から抽出したタンパク質はWestern blot法にて検出し、各種タンパク質の発現量を比較検討した。これらの結果をこれまでに申請者が報告したエリブリンの結果と比較し、METがパクリタキセやビンブラスチンでも誘導されるか検討した。さらに、上記で同定した微小管阻害薬処理で変動する微小管調節タンパクの発現をsiRNAで阻害し、METの誘導が阻害されるかを検討し、METの誘導に関連する微小管調節タンパクを調べた。大幅な遅延なく進展している。セツキシマブの感受性が低いHOC313細胞をエリブリンとパクリタキセルとビンブラスチンで処理し、mRNAおよびタンパク質を回収する。EGFR遺伝子の解析にはFAM/ZEN/IBFQラベルプローブを、内部標準の18S rRNAの解析にはHEX/ZEN/IBFQラベルプローブを作製し、real-time RT-PCR法で解析する。タンパク発現はWestern blot法並びに免疫蛍光染色にて検討する。もし各種タンパク質の検出がWestern blot法で困難な場合、検出感度が高いELISA法を用いて検討を行う。免疫組織蛍光染色はHOC313細胞を、エリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチン存在下及び非存在下でそれぞれ20時間培養した後、4%ホルムアルデヒド溶液で固定し、EGFRを抗EGFR抗体(DAKO)と2次抗体(Alexa Fluor 488-labeled)で標識し蛍光顕微鏡で観察する。エリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチン処理でEGFRの発現変化を調べ、セツキシマブへの感受性が変化するかを検討する。さらに、上記2の実験で同定した微小管阻害薬処理で変動する微小管調節タンパクの発現をsiRNAで阻害し、EGFRの発現が阻害されるかを検討し、EGFRの発現に関連する微小管調節タンパクを調べる。高浸潤口腔癌患者の生存率は、近年の新しい分子標的薬の開発にもかかわらず依然として厳しい状況にある。我々は、乳癌に対する微小管阻害薬が高浸潤口腔癌細胞に対して、特異的に高い感受性をもち、さらに低浸潤性癌細胞の表現型へ誘導することを見出した。以上の背景から本研究では、口腔癌の高浸潤性獲得メカニズムと微小管の関連を解析し、高浸潤口腔癌の克服のための情報を提供することを目指している。浸潤様式の異なる口腔扁平上皮癌由来細胞株(3型:OSC-20細胞、4C型:OSC-19細胞、4D型:OLC01細胞)を用いて、それぞれの細胞について、微小管阻害薬であるエリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチンの感受性を調べるために、IC50濃度を求めた。結果、エリブリンはビンブラスチンや頭頸部癌で使用されるパクリタキセルと比較し、高浸潤性である4D型細胞に対し高い感受性を示した。また、細胞間でも3型、4C型細胞と比較し、4D型細胞において感受性が高かった。この結果より、今まで化学療法に対し耐性を示していた高浸潤性の癌細胞にエリブリンが効果を示す可能性が示唆された。そこで薬剤と微小管との関連を解析するために、リアルタイムRT-PCRを用い、各細胞の各チューブリンβの発現について調べ、薬剤処理による発現の変化を検討した。未処理では他の細胞と比較し、4D型細胞で特に高い発現を示したのはTUBB3であった。また、TUBB3はエリブリンによる処理をすることで、発現低下が認められた。このことよりTUBB3が関連が考えられた。平成29年度は浸潤様式の異なる扁平上皮癌細胞株を用いて、チューブリンα、β、γの発現、また微小管と相互作用するその他の因子について合わせて検討する予定であった。微小管阻害薬は主にチューブリンβに結合し、作用することから今回はまず、チューブリンβのみを調べることとした。また、チューブリンの発現を調べる中でTUBB3の発現に着目することとしたため、その他の因子についても検討に至っていない。次年度に予定していた、微小管阻害薬エリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチンの各細胞の感受性を調べ、比較検討を本年度におこなった。このことにより、各細胞へ薬剤処理による影響を検討する際に使用する薬剤濃度を決めることができ、薬剤処理によるチューブリンの発現変化の検討も本年度へとくりあげておこなった。本年度は実験結果よりターゲットを絞ることにより次年度に予定していた実験を前倒ししたものもあるが、検討に至らなかったものも多く、全体としてやや遅れていると思われる。

様々な濃度のパクリタキセル及びビンブラスチンをOSC-20細胞、OSC-19細胞、HOC313細胞の培養液に添加し、72時間に増殖細胞の数を測定した。得られた結果より、3種類の口腔扁平上皮癌細胞株のパクリタキセル及びビンブラスチンに対する感受性をそれぞれ比較し、浸潤様式と感受性の関係、申請者がすでに報告しているエリブリンの結果と比較検討した。OSC-20細胞、OSC-19細胞、HOC313細胞にIC50濃度のエリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチンを添加し、72時間後にmRNAおよびタンパク質を回収する。上皮マーカー:E-cadherin、間葉系マーカー:Vimentin、N-cadherin、Snailの解析にはFAM/ZEN/IBFQラベルプローブを、内部標準の18S rRNAの解析にはHEX/ZEN/IBFQラベルプローブを作製し、real-time RT-PCR法で各遺伝子発現を解析した。細胞から抽出したタンパク質はWestern blot法にて検出し、各種タンパク質の発現量を比較検討した。これらの結果をこれまでに申請者が報告したエリブリンの結果と比較し、METがパクリタキセやビンブラスチンでも誘導されるか検討した。さらに、上記で同定した微小管阻害薬処理で変動する微小管調節タンパクの発現をsiRNAで阻害し、METの誘導が阻害されるかを検討し、METの誘導に関連する微小管調節タンパクを調べた。大幅な遅延なく進展している。平成30年度は、口腔扁平上皮癌細胞での微小管阻害処理(エリブリン、パクリタキセル、ビンブラスチン)による微小管の関連を引き続き検討する。微小管の関連を解析するため、mRNAで認めた発現変化がタンパク質でも同様に生じているかを検討するためWestern blot法を用いて各チューブリンβの発現解析を行う予定である。また、口腔癌細胞マウス移植腫瘍での微小管阻害薬の感受性と浸潤性の変化を前倒しして検討したいと考えている。口腔扁平上皮癌細胞における微小管阻害薬の感受性について平成30年度に予定していたが、本年度に検討することができたため、ヌードマウスの舌に高浸潤性OLC01を移植し、ヒト口腔癌細胞移植マウスを作成する。この高浸潤口腔癌モデルマウスに各微小管阻害薬を静脈内投与し、腫瘍重量を測定する。また、腫瘍、リンパ節転移部を観察後に切除、パラフィン切片を作成。微小管阻害薬処理による変化を検討したいと考えている。セツキシマブの感受性が低いHOC313細胞をエリブリンとパクリタキセルとビンブラスチンで処理し、mRNAおよびタンパク質を回収する。EGFR遺伝子の解析にはFAM/ZEN/IBFQラベルプローブを、内部標準の18S rRNAの解析にはHEX/ZEN/IBFQラベルプローブを作製し、real-time RT-PCR法で解析する。タンパク発現はWestern blot法並びに免疫蛍光染色にて検討する。もし各種タンパク質の検出がWestern blot法で困難な場合、検出感度が高いELISA法を用いて検討を行う。
人工構造物により生じた連続的で異なる河川生息場における生物多様性と攪乱後の過程

河川は古くから人間の暮らしと密接にかかわっており、河川環境を理解することは極めて重要な課題である。平成18年に多自然川づくりについての指針がまとめられているが、護岸や堰などの人工構造物にの多い河川において有機物の移動や連続しつつも個々に特徴を持つ生息場の研究は発展途上である。本研究では、大和川本川と支川の富雄川に焦点を当て、まず河川に生息する水生動物群集にいついて明らかにし、その上で本川では人工的に造成されたワンドや自然形成されたワンドにおける生物相を明らかにし、支川の富雄川では攪乱後の底生無脊椎動物群集の攪乱からの過程について明らかにした。本川支川ともにユスリカ類が多数を占めた。河川法では当初治水と利水に焦点が当てられていたが、1997年に初めて環境の整備と保全が目的に加えられた。平成18年に多自然川づくりについての指針がまとめられ、河川が本来有している生物の生息・生育・繁殖環境及び多様な河川景観を保全・創出するための河川管理が提言されているが、護岸や堰などの人工構造物の多い河川において有機物の移動や、連続しつつも個々に特徴を持つ生息場の研究は発展途上である。本研究は治水のために河川に人工構造物が設置されることを前提とし、護岸され水路化した河川であっても一部が生物の生息場所として機能することで河川全体の生物多様性が保全されると考え、一河川内における短い区間(生息場)ごとの生物相の把握とかく乱からの回復過程について焦点を当てる。1年目は、人工河川におけるワンドと直線部に着目し、調査区間を設定して調査区間ごとの水理環境と生物相を把握するとともに、その形成過程について考察を試みた。調査地は大和川本川における、ワンド区間2区間、それに連続する直線区間2区間とした。各区間、流路延長を100mに設定し、5月と10月の計2回調査を行い、以下の項目について計測を行った。1水深2流速3流向分布4河床材料5サーバーネットを用いて河床に滞留する有機物の測定、および河床生物の定量調査6タモ網を用いた生物の定性調査7流下有機物量、無機物量の計測。これらの測定結果から、似たようなワンドであってもその形成過程が異なることで機能が異なることが推察された。これらの成果について「大和川の直線区間およびワンド区間における平水時の水理特性と生物の対応」応用生態工学会第19回郡山大会大会講演要旨集pp54で発表を行った。大和川本川は出水による水位変動が大きい河川であるため、常に水位情報を確認しながら慎重に調査日を決定した。最初データの取り方を決定するまで苦労したが、研究の進行とともに調査に慣れ、順調にデータを取ることができた。調査の成果は昨年応用生態工学会で発表した。また、追加のデータを加えて解析を進めている。本研究の結果、以下のことが明らかになった。1、大和川本川では、自然発生したワンドと人為的に造成したワンドを対象として調査を行った。その結果、人為的に造成したワンドでは上流からの堆砂が激しく、出水などによって半年程度でワンドが消滅しかけ生物の生息場としての機能が直線部と比較して優れているという結果にはならなかった。2、大和川本川では、水草が水生動物の生息場として重要な機能を果たしており、水草の保全が生息場創出にもつながると考えられた。3、大和川支川では、ユスリカ類が多く、かく乱が生じても5日以内に個体数が回復することがわかった。昨年から、土砂堆積の推定のためセディメントトラップを試作設置して回収頻度について検討中である。

おおよその方向性が固まったので、大和川本川と支川にて今年度は土砂の堆積にも着目して調査を行う。また、出水前後の底生動物の移動について把握するため、トラップを試作中である。支川においてはおおよその調査区間を決定したので、今後は試験的にネットを設置して調査を進める予定である。河川生態学
Zn-金属プロテアーゼの基質認識機構の解明

Streptomyces caespitosusが産出する金属プロテアーゼSCNPの構造・機能相関を解明するためにアミノ酸配列と立体構造を決定した。[1]アミノ酸配列はEdmann分解法で決定した。132個のアミノ酸残基からなり、83-87番目にかけて亜鉛金属プロテアーゼに共通に見られるHEXXH配列が存在している。これまで発見されている亜鉛金属プロテアーゼの中で最も分子量が小さく、相同性も見られない。[2]結晶構造解析の結果、最終的にR-factorが0.18(2.0A分解能)の精度で立体構造が決定できた。5本のβ鎖から成るβシートと3本のαヘリックスからできている。HEXXH配列(H83-E-T-G-H87)は2番目のヘリックス上に存在し、H83、H87、水分子が亜鉛に配位している。更にD93も配位子となっており、全体としては4面体配位構造をとっている。これまでにアミノ酸配列と立体構造が決定されている亜鉛金属プロテアーゼは、全てHEXXH配列中の2つのHisと水分子が配位し、アミノ酸残基数・アミノ酸配列が異なるのに共通の主鎖のfoldingを持っている。この共通のfoldingはSCNPの構造そのものである。即ち、SCNPは蛋白質分解活性に必要な最低限のアミノ酸残基・構造を示していると考えられる。亜鉛への配位の様子についてはthermolysinが4配位構造をとっているのに対して、他のサブファミリーではすべて5配位構造なっている。更に、thermolysin以外はHEXXH配列の最初のHisから数えて8番目に共通にGlyが見られる。このGlyは、11番目のHisが亜鉛に配位できるように、主鎖をこの部分で鋭く曲げている。SCNPについて見ると、8番目にGlyがあり11番目のアミノ酸残基が亜鉛に配位しているが、SCNPではAspである。また、5配位構造ではなく、thermolysinと同じ4配位構造となっている。このように、SCNPはJiangらによって分類されたいずれにも属さず、新規なサブファミリーであると考えられる。Streptomyces caespitosusが生産する中性プロテアーゼSCNPの基質認識機構を解明するために以下の研究を行なった。(1)SCNPのnative構造を2.5A分解能の電子密度図をもとにして決定し、精密化をほぼ終了させた。その結果、SCNPは3本のα-ヘリックスと4本のβ-鎖からなるβ-シートからできており、サーモリシンに代表されるこれまでに立体構造がわかっている亜鉛プロテアーゼとは異なった立体構造をとっていることがわかった。しかし、一次構造中には他の亜鉛プロテアーゼと同様、His-Glu-X-X-Hisというconsensus配列が存在し、この中の2つのヒスチジン残基の側鎖が亜鉛に配位していた。更に、水分子とAsp93が配位子となっており亜鉛は4面体配位構造をとっていることがわかった。サーモリシン等ではアスパラギン酸ではなくグルタミン酸が配位子になっているという違いがあるものの、一次構造や立体構造の異なる蛋白質に於て、活性に深く関与している亜鉛原子の配位構造が似ているということは分子進化の上で興味深い。

今後は基質阻害剤との複合体結晶の構造を精密化し、SCNPに阻害剤がどのように結合しているのかを明らかにすることで、酵素反応のメカニズムや基質認識の機構を明らかにしていく。(2)活性中心の亜鉛原子を他の金属に置き換えた金属置換体SCNPを調製し、それらの活性測定と結晶化を行なった。その結果、Co置換体ではnativeに比べて活性が少し減少するが、Mn置換体やCd置換体では活性が上がることがわかった。現在のところ結晶はMn置換体ができているのみであるが、今後これら置換体の構造解析、置換体と阻害剤との複合体結晶の構造解析を行ない、活性中心の金属原子の違いと活性の関係を立体構造をもとにして解明していく。Streptomyces caespitosusが産出する金属プロテアーゼSCNPの構造・機能相関を解明するためにアミノ酸配列と立体構造を決定した。[1]アミノ酸配列はEdmann分解法で決定した。132個のアミノ酸残基からなり、83-87番目にかけて亜鉛金属プロテアーゼに共通に見いだされているHEXXH配列が存在している。これまで発見されている亜鉛金属プロテアーゼ(Jiangらによって5つのサブファミリーに分類されている)の中で最も分子量が小さく、相同性も見られない。[2]結晶構造解析の結果、最終的にR-factorが0.18(2.0A分解能)の精度でSCNPの立体構造が決定できた。5本のβ鎖から成るβシートと3本のαヘリックスからできている。HEXXH配列(H83-E-T-G-H87)は2番目のヘリックス上に存在し、H83、H87、水分子が亜鉛に配位している。更にD93も配位子となっており、全体としては4面体配位構造をとっている。これまでにアミノ酸配列と立体構造が決定されている亜鉛金属プロテアーゼは、全てHEXXH配列中の2つのヒスチジンと水分子が配位し、アミノ酸残基の数・アミノ酸配列が異なるにも関わらず共通の主鎖のfoldingを持っている。この共通のfoldingはSCNPの構造そのものである。即ち、SCNPは蛋白質分解活性に必要な最低限のアミノ酸残基・構造を示していると考えられる。亜鉛への配位の様子についてはthermolysinが4配位構造をとっているのに対して、他のサブファミリーではすべて5配位構造なっている。更に、thermolysin以外はHEXXH配列の最初のヒスチジンから数えて8番目に共通にグリシンが見られる。このグリシンは、11番目のヒスチジンが亜鉛に配位できるように、主鎖をこの部分で鋭く曲げている。SCNPについて見ると、8番目にグリシンがあり11番目のアミノ酸残基が亜鉛に配位しているが、11番目は他のものではヒスチジンなのにSCNPではアスパラギン酸である。また、5配位構造ではなく、thermolysinと同じ4配位構造となっている。このように、SCNPはJiangらによって分類されたいずれにも属さず、新規なサブファミリーであると考えられる。
疫学研究における１０年間の心電図変化と生活習慣病予防

1958年から福岡県久留米市田主丸町で行っている住民検診のうち1977年2009年の結果を用い、65歳以上の男性の約30年間に及ぶ血液生化学所見、心電図所見の経年変化を明らかにした。参加者1977年231人、1989年332人、1999年389人、2009年445人であった。SASを用いて解析した。冠危険因子では年齢で補正した検討に於いて、BMI、拡張期血圧、総コレステロール値、中性脂肪値、尿酸値の上昇を認めた。心電図所見では年齢で補正した検討に於いて、心拍数、PR間隔、QTc間隔、肥大所見は有意に減少しており、QRS幅及びMajor abnormalitiesの頻度は有意に増加した。我が国の死因はがん及び脳・心血管疾患がほとんどであり、増加の一途をたどっている。これらの疾患の予防と健康管理が重要で、疫学調査の原点である。本研究の目的は疫学調査という視点より、10年間の心電図変化と生活習慣病との関係を解明し、疾患予防を啓蒙していくことにある。1.平成11年、21年度に40歳以上の住民に対して住民健診を行った。受診者数は各年度2000名に及んだ。計4000名の心電図を整理し、一人ずつ再度読影し解析用にコンピュータへ入力しデータ保存を行った。平成11年、平成21年度のすべてのデータ(年齢、性別、身体測定、栄養調査、血液検査、心エコー図、頸動脈エコーなど)を統合した。2.フィールドワークである予後調査を実施した。検診対象者に対し、現在の健康状態及び脳・心血管疾患の発症をチェックする手紙を送付し、返信された手紙をもとに病院、医院でのカルテ・死亡診断書の閲覧を行った。返信されなかった検診者に対しては電話または直接訪問による調査を今後行う予定である。3.平成11年、21年度の検診を双方とも受診したサンプルを抽出した。心電図変化と脳・心血管疾患、がん発症・死亡の予後調査より、10年間の心電図変化との関連を縦断的に解析する。4.解析結果をもとに、10年間の心電図変化が生活習慣病へもたらす影響を疫学的に検討していく。その結果を考察することで、生活習慣病への応用が可能であるかを検討する。1958年からSeven Countries Studyの一環として、福岡県久留米市田主丸町で住民健診を行っている。住民健診では身体測定、栄養調査、血圧測定、血液検査(血計・肝腎機能・脂質代謝、血糖などの一般生化学検査)、心電図などの検査を施行した。本研究では1977年2009年の間に施行した、住民健診の結果を用いて、65歳以上の男性の約30年間に及ぶ、血液生化学所見、心電図所見の経年変化を明らかにした。まず、1977年2009年に施行した田主丸住民健診に参加した65歳以上男性を抽出、1977年は231人、1989年は332人、1999年は389人、2009年は445人であった。次に各年度の心電図所見をMinnesota Codeに従ってコード化し、高度異常Q波、ST下降、陰性T波、完全房室ブロック、WPW症候群、人工調律、完全左脚ブロック、完全右脚ブロック、心房粗細動、ST上昇をMajor abnormalityとし、異常Q波、高電位R波、軽度ST-T異常、PR間隔延長、不完全左脚ブロック、不完全右脚ブロック、左脚前枝ブロックをMinor abnormalityと定義した。経年的な冠危険因子および心電図所見の経年的変化をSASを用いて解析した。冠危険因子では、年齢で補正した検討に於いて、肥満者の増加とそれに伴う拡張期血圧、総コレステロール値、中性脂肪地、尿酸値の上昇を認めた。心電図所見では、年齢で補正した検討に於いて、心拍数、PR間隔、QTc間隔、肥大所見は有意に減少しており、QRS幅及びMajor abnormalitiesの頻度は有意に増加した。冠危険因子では、高齢者でも肥満の増加が他の因子に影響している可能性が示唆された。心電図所見では、心室内伝導障害およびMajor abnormalitiesの頻度が増加していることが示された。疫学研究計画に準じてこれまでのデータの蓄積及び整理、予後調査も既に実行できておりおおむね順調な進展であると考える。平成11年、21年度の検診を双方とも受診したサンプルを抽出し、心電図変化と脳・心血管疾患、がん発症・死亡の予後調査より、10年間の心電図変化との関連を縦断的に解析する。

解析結果をもとに、10年間の心電図変化が生活習慣病へもたらす影響を疫学的に検討していく。その結果を考察することで、生活習慣病への応用が可能であるかを検討する。今年度においては、旅費、人件費・謝金への使用がなかったことや、そのほかの物品や経費(検体検査料など)の使用において多少の差額が生じたことが理由として挙げられる。次年度の予算の中で主に検診実施における通信費や物品費などに加算して使用予定である。
O-アシルイソペプチド法を利用したクリックペプチドの開発:光反応によるAβの産生

本研究者らは、効率的なペプチド合成法として独自が開発した"O-アシルイソペプチド法"を基盤として、ケミカルバイオロジーを指向した生物学的実験ツール"クリックペプチド"の開発を行っている。クリックペプチドはネイティブペプチドのペプチド主鎖内部に化学修飾が施さたペプチドアナログである。このアナログはそれ自身、ネイティブペプチドとは異なる物理化学的・生物学的性質を有する一方、ある刺激(いわば"クリック")に応答して、生理的条件下で速やかにネイティブペプチドへと変換される。具体的に本研究者らは以前より、光照射("光クリック")またはpH変化("pHクリック")によって、アルツハイマー病原因ペプチドであるアミロイドβペプチド(Aβ)1-42を産生するクリックペプチドを創製してきた。今年度、本研究者らは、近年報告された変異型である22位グルタミン酸欠損型Aβ1-42、[E22Δ]-Aβ1-42(T.Tomiyama et al.,Ann.Neurol.2008,63,377-387.)のpHクリックペプチドを創製した。このペプチドはネイティブペプチドより高い水溶性を示し、特定の二次構造を形成しない一方、クリック後、本来の[E22Δ]-Aβ1-42に変換されると、β-シート構造形成を起こした。[E22Δ]-Aβ1-42は野生型Aβ1-42と凝集性、毒性において相違点があることから大変注目を浴びており、このようなAβの変異と性質との相関性を研究する上で、クリックペプチドは有用な実験ツールになると考えられる。または、今回の結果はクリックペプチド戦略に汎用性があることを示唆しており、今後、Aβ以外のアミロイド性ペプチド/タンパク質においても広くこれを適用することができる可能性を示した。本研究者らは、独自が開発した効率的ペプチド合成法である"O-アシルイソペプチド法"を基盤として"クリックペプチド"を創製した。具体的一例とし、アルツハイマー病原因ペプチドであるアミロイドβペプチド(Aβ)1-42の光応答型クリックペプチドは、Aβ1-42由来の凝集性を有しない一方、光照射(光クリック)により速やかにAβ1-42へ変換された。本クリックペプチドを用いることで、望む時間・望む場所でインタクトなモノマーAβ1-42を産出することができ、Aβ1-42モノマーから凝集体に至る病的凝集過程を再現できる可能性が示唆された。現在、Aβ1-42は制御困難な自己会合を容易に起こすため、そのアルツハイマー病発症機構に深く関連する凝集過程等を生物学的実験で再現するのは大変困難である。そこで、本クリックペプチドの開発は、未だ不明瞭なアルツハイマー病の病因解明において、有益な生物学的研究ツールの提供に繋がると期待される。さらに本研究者らは、O-アシルイソペプチド法を簡便化する"O-アシルイソジペプチドユニット"、Boc-Ser/Thr(Fmoc-Xaa)-OHを基盤とした研究を行った。本ユニットを用いることにより、エピメリ化のケアが必要であるなど、様々な点で煩雑な固相上でのエステル化反応を行うことなく、全自動合成などによりルーチンに本手法を使用できると考えられる。そこで、天然アミノ酸からなる40種のユニットを合成し、それぞれの液相合成におけるエピメリ化を検討した。また、合成したユニットの固相上カップリングにおける溶媒、試薬等の検討を経て、具体的にインフルエンザAウイルス関連生理活性ペプチドやAβ1-42を効率的に合成した。これら新規合成法開発に関する成果は、将来クリックペプチド等のさらなる効率的化学合成に貢献できるものと考えられる。本研究者らは、独自で開発した効率的ペプチド合成法"O-アシルイソペプチド法"を基盤とし、光照射やpH変化等の刺激に応答してアルツハイマー病関連アミロイドβペプチド(Aβ)1-42へ変換されるアナログ"クリックペプチド"の開発研究を行った。以前開発した光応答型クリックペプチドはその低水溶性に問題があった。そこで今回、本研究者らは、光応答型クリックペプチドに水溶性の高い光解離性保護基を適用することによって、その問題を克服し、より実践的に使用可能な水溶性光応答型クリックペプチドの創製に成功した。さらに本研究者らは、pH応答型クリックペプチドおよびその産生したAβ1-42の凝集性・二次構造を、サイズ排除クロマトグラフィー、チオフラビン-Tアッセイ、円二色性(CD)スペクトル法等の物理化学的分析法を駆使して検討した。その結果、本クリックペプチドからAβ1-42を素早く産生することで、ランダムコイル構造を持つモノマーAβ1-42から始まる凝集過程を再現することができることを示した。現在、Aβ1-42の難水溶性・高凝集性に起因して、モノマーをスタートに揃えたAβ1-42の凝集過程を実験で再現することが困難であり、これがアルツハイマー病の発病機構解明において大きな障害となっている。この背景の中で、クリックペプチドからモノマーAβ1-42を容易に産生させる実験系は、アルツハイマー病研究において大変有用であると考えられる。このため、クリックペプチドはWiley Encyclopedia of Chemical Biologyに収載されるなど、ケミカルバイオロジー分野において大変重要視されている。

このアナログはそれ自身、ネイティブペプチドとは異なる物理化学的・生物学的性質を有する一方、ある刺激(いわば"クリック")に応答して、生理的条件下で速やかにネイティブペプチドへと変換される。具体的に本研究者らは以前より、光照射("光クリック")またはpH変化("pHクリック")によって、アルツハイマー病原因ペプチドであるアミロイドβペプチド(Aβ)1-42を産生するクリックペプチドを創製してきた。今年度、本研究者らは、近年報告された変異型である22位グルタミン酸欠損型Aβ1-42、[E22Δ]-Aβ1-42(T.Tomiyama et al.,Ann.Neurol.2008,63,377-387.)のpHクリックペプチドを創製した。このペプチドはネイティブペプチドより高い水溶性を示し、特定の二次構造を形成しない一方、クリック後、本来の[E22Δ]-Aβ1-42に変換されると、β-シート構造形成を起こした。[E22Δ]-Aβ1-42は野生型Aβ1-42と凝集性、毒性において相違点があることから大変注目を浴びており、このようなAβの変異と性質との相関性を研究する上で、クリックペプチドは有用な実験ツールになると考えられる。または、今回の結果はクリックペプチド戦略に汎用性があることを示唆しており、今後、Aβ以外のアミロイド性ペプチド/タンパク質においても広くこれを適用することができる可能性を示した。
運動時に賦活する機能的脳ネットワークの解明と脳機能を高める至適運動条件の探索

運動が脳機能に及ぼす効果の神経メカニズムに関しては、神経生理学、細胞生物学、分子生物学の観点から貴重な知見が得られているが、その大部分は特定の脳部位(局所部位)をターゲットとしているにすぎない。個々の脳機能は中核となる脳領域に加え他の脳領域間との協調作用によって支えられていることから、運動による脳機能への効果は脳全体の統合機能に対する作用として理解されるべきである。つまり、運動は複数の脳部位を賦活化し、それぞれの脳領域間のクロストークを促進する運動時特異的な機能的脳ネットワークを形成しているはずである。本研究は、動物実験により運動時の機能的脳ネットワークを可視化し、その運動条件依存性と精神機能を反映する行動の同時解析から、脳機能を高める最適な運動条件を見つけ出すことを目的としている。本年度は、免疫組織化学法による脳機能マッピング法をベースとして、できる限り理論的に妥当な手順を駆使し、運動時の機能的脳ネットワークを可視化し、その妥当性と運動強度依存性について解明することを目指した。まず、神経活動依存性遺伝子の発現から運動時に賦活する脳神経活動の空間特性を明らかにし、相関分析を用い神経活動の領域間共変動の定量化を試みた。その結果をもとに機能的脳ネットワークを可視化し、グラフ理論を適用しその特徴を抽出した。対象とした脳領域は、運動と情動に関連する28領域とした。運動条件として、異なる運動強度(非運動、低強度運動、高強度運動)での30分間の急性トレッドミル走を用いた。結果として、運動は広範な脳領域の神経活動に影響を与え、その賦活領域の空間パターンは運動強度により異なり、さらに、運動時に形成される機能的脳ネットワークのハブ領域およびクラスター構造も運動強度により異なることが示された。これらのことは、運動時に賦活化する機能的脳ネットワークには運動強度依存性が存在することを示唆する。本研究では、動物実験により運動時の機能的脳ネットワークの可視化および精神機能を反映する行動の同時解析から、運動条件の違いによる脳機能への影響の全体像を明らかにすることを目的としている。本年度、解析対象とした脳領域は、主要な脳領域のみにとどまっており、妥当な機能的脳ネットワークの同定のためには領域数が若干不足している。これは、神経活動を視覚化したサンプルの画像取込装置(顕微鏡を含む)の老朽化・低機能によることが大きく、その結果、画像取込・解析に予想を上回る時間を要している。さらに、動物の精神機能を反映する行動実験において妥当なデータが得られておらず、計算論で求められた機能的脳ネットワークの生理学的妥当性の検討が進められていない。本年度の結果から、運動時に賦活化する機能的脳ネットワークには運動強度依存性が存在する可能性が示唆された。しかし、現段階で実験手技・方法にいくつかの問題点がみられ、これらについて実験操作の見直し、実験試薬の変更、結果の再検証などを通して改善していかなければならない。その上で、運動により賦活化する機能的脳ネットワークの探索について継続して検証し再現性のあるデータを収集するとともに、より精度の高い方法論の確立を目指す。さらに、脳機能に有益な効果をもたらす至適運動条件の確立に向けて本手法の応用可能性を高めるために、各種運動条件(強度、時間、期間、様式)を設定し、運動により賦活化する機能的脳ネットワークについて、以下の点から研究を推進する。1)対象とする脳領域を再考し適切な部位および数を選択し、運動時の脳機能マップを作成する。2)機能的脳ネットワークの中核となる主要神経核(ハブ)とその脳領域間の解剖学的結合について明らかにし、機能と構造の相互作用について解明する。3)運動による行動変容(精神機能)を捉え、機能的脳ネットワークとの関連を明らかにし、その生理学的妥当性について検討する。これらの行動神経科学的及び脳機能解剖学的データをもとに、運動の恩恵効果発現に有効な機能的脳ネットワーク(神経活動の空間パターン)を効率よく誘発する至適運動条件の抽出を試みる。

結果として、運動は広範な脳領域の神経活動に影響を与え、その賦活領域の空間パターンは運動強度により異なり、さらに、運動時に形成される機能的脳ネットワークのハブ領域およびクラスター構造も運動強度により異なることが示された。これらのことは、運動時に賦活化する機能的脳ネットワークには運動強度依存性が存在することを示唆する。本研究では、動物実験により運動時の機能的脳ネットワークの可視化および精神機能を反映する行動の同時解析から、運動条件の違いによる脳機能への影響の全体像を明らかにすることを目的としている。本年度、解析対象とした脳領域は、主要な脳領域のみにとどまっており、妥当な機能的脳ネットワークの同定のためには領域数が若干不足している。これは、神経活動を視覚化したサンプルの画像取込装置(顕微鏡を含む)の老朽化・低機能によることが大きく、その結果、画像取込・解析に予想を上回る時間を要している。さらに、動物の精神機能を反映する行動実験において妥当なデータが得られておらず、計算論で求められた機能的脳ネットワークの生理学的妥当性の検討が進められていない。本年度の結果から、運動時に賦活化する機能的脳ネットワークには運動強度依存性が存在する可能性が示唆された。しかし、現段階で実験手技・方法にいくつかの問題点がみられ、これらについて実験操作の見直し、実験試薬の変更、結果の再検証などを通して改善していかなければならない。その上で、運動により賦活化する機能的脳ネットワークの探索について継続して検証し再現性のあるデータを収集するとともに、より精度の高い方法論の確立を目指す。さらに、脳機能に有益な効果をもたらす至適運動条件の確立に向けて本手法の応用可能性を高めるために、各種運動条件(強度、時間、期間、様式)を設定し、運動により賦活化する機能的脳ネットワークについて、以下の点から研究を推進する。1)対象とする脳領域を再考し適切な部位および数を選択し、運動時の脳機能マップを作成する。2)機能的脳ネットワークの中核となる主要神経核(ハブ)とその脳領域間の解剖学的結合について明らかにし、機能と構造の相互作用について解明する。3)運動による行動変容(精神機能)を捉え、機能的脳ネットワークとの関連を明らかにし、その生理学的妥当性について検討する。これらの行動神経科学的及び脳機能解剖学的データをもとに、運動の恩恵効果発現に有効な機能的脳ネットワーク(神経活動の空間パターン)を効率よく誘発する至適運動条件の抽出を試みる。理由本研究では、動物実験を用いて運動時に賦活化する機能的脳ネットワークの同定を試みたが(方法論の確立)、神経活動の反応に、若干、予想を上回る個体差がみられ、実験操作の見直し、実験試薬の変更、結果の再解析に再検討の必要が生じたため、それらを改善するための試行錯誤や実験方法の再確認に時間を要したため、実験結果が予備的な段階にとどまり、予算についても一部は次年度に持ち越すことになった。使用計画現時点での実験手技・方法の問題点に関して、実験操作の見直し、実験試薬の変更、結果の再検証などを通して問題点を改善するために使用する。その上で、運動により賦活化する機能的脳ネットワークの探索について継続して検証を行い、再現性のあるデータを収集するとともに、より精度の高い方法論を確立するために使用する。
植物のストレス応答機構に関与する微量タンパク質の網羅的解析法の確立

本研究は、プロテオーム的手法を用いて植物のストレス応答機構についてタンパク質レベルで解明することを最終的な目的としている。しかしながら、従来のプロテオーム的手法ではストレス応答機構で重要な役割を担う微量タンパク質の検出が困難であるとの指摘があった。この問題点を解決するために昨年度の研究では、アフィニティーカラムによって存在比率の高いタンパク質を取り除いた後に微量タンパク質を解析するプロテオーム的手法を確立した(prefractionation法)。特にDNAアフィニティーカラムを用いた解析では、イネ種子からRNAシャペロンタンパク質(pBRPとGRPと命名)の検出に成功した。そこで20年度は確立したプロテオーム的手法を用いてpBRPとGRPの種子中での消長に着目した解析を行った。その結果、(1)この手法がpBRPやGRPをはじめとした複数の微量タンパク質の解析に適していること、(2)pBRPとGRPは極度に乾燥する時期に蓄積すること、および(3)発芽時のpBRPの変動にはジベレリンが関与することなどが明らかになった。これらの知見は、乾燥ストレス応答機構におけるRNAシャペロンタンパク質の生理機能を解明する上で極めて重要となる。さらにイネ以外の植物種の解析についても確立したプロテオーム的手法を適用ところ、水ストレスを受けたメロン(マクワウリ)の子葉では、ストレス応答に関与すると考えられるDNA結合性タンパク質が複数見出された。これらのことはprefractionationを組み入れたプロテオーム的手法が微量タンパク質の網羅的解析に有効であることを示している。現在、本研究成果を基盤として植物細胞の老化における微量タンパク質の解析にも着手したところである。ストレスに対する植物の応答機構の解明は、ストレスに強い作物の作出のための重要な基盤となる。ゲノム情報が整備された現在、タンパク質を網羅的に解析するプロテオミクスは、ストレス応答機構を解明する上で有効な情報を発信してくれるものと期待されている。しかしながらプロテオーム解析では、ストレス応答機構の鍵となるような微量タンパク質の検出という点では問題があることが指摘されてきた。本研究ではこの問題点を解決する手立てとして、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて存在比率の高いタンパク質を除く手法(prefractionation)を採用し、植物のストレス応答機構に関与する微量タンパク質を網羅的に解析できるシステムを確立することを目的とした研究を行っている。平成19年度は、一本鎖DNAアフィニティーカラムを用いて、イネの乾燥種子中のタンパク質についてプロテオーム的解析を行った。その結果、複数のRNA結合タンパク質の検出と同定に成功した。すなわちこの手法を採用することにより、RNA結合タンパク質のような微量タンパク質でも網羅的に解析できることを実証できた。さらに、これらのRNA結合タンパク質のうち2種(pRBPおよびGRPと命名)は、シロイヌナズナのRNAシャペロンと相同性が高いこと、発芽時に吸水すると減少すること、およびこの減少は低温ストレス条件下では起こらないことなどが明らかになった。一方、リン酸化タンパク質を特異的に分取できるQiagen社のPhospho Protein Purification Kitのカラムを用いた解析でも、ストレス応答に関わるリン酸化タンパク質の同定に成功しており、現在さらに詳細な解析を継続して行っている。