hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
１９２０～３０年代の日本および東アジアのメディア言説における異常概念の解明

これは、日本近代文学の言説が、如何に性にまつわる問題を語ってきたかを幾多の文学テクストに依拠して緻密に論じたもので、幅広い知識でもって20世紀の性言説を分析した。研究例会では、この著作が持つ本研究会への刺激について報告がなされた。また、研究協力者である橋本明が『精神病者と私宅監置』(六花出版2011年12月)を刊行。近代日本の精神医療史についての基礎的研究を公にし、従来看過されがちであった私宅監置の各地方毎の傾向を統計化してみせたので、研究例会ではこの著書の読書会を行い、本研究の目的である文学/文化/医学の3分野にまたがる言説構造の様相を議論しあった。以上のように、大きな成果が本研究のディスカッションを活気づけ、一次資料の購入も進んだ。研究の目的である、異常心理言説データの随時公開については、シンポジウムを通して広く周知できていると思われる。このシンポジウム開催をもとに、研究報告書をまとめることで研究目的はほぼ達成できる見通しである。特に、東京開催のシンポジウムに関しては、研究会の知名度が昨年度よりも上昇し、研究会外部から若い大学院生の方々の関心が多く寄せられるようになったことが特筆に値する。関心を寄せてくださる若い大学院生達は、文学研究、社会学研究、文化研究、臨床心理研究の各分野に幅広くまたがっており、今後の研究会の方針に有益な意見を多く寄せていただいている。一方で、研究分担者達の研究も領域を広げ、成果発表の場も多岐に渡るようになってきた。研究例会のみで発表を終わらせるのではなく、多方面の研究会および学会にて成果を公示することで、緊張感とコミュニケーションの幅を維持できていると思われる。研究例会を名古屋で3回、東京で1回行えた。震災の最中で、上半期は多忙を極め、実質的に下半期に研究の進行が行われたにもかかわらず、例会の開催頻度は高かったと思われる。学術雑誌および紀要に掲載された論文は3本。単行本刊行は1冊。研究協力者による学会発表も1本あった。雑誌「人性」という一次資料の一括購入も果たせ、明治期の啓蒙医学誌における異常概念の定義の析出を行っている。以上の成果に基づき、おおむね順調に進展していると言える。研究報告書作成をめざして、研究分担者を中心に各自論文の準備を始める。また、科研費報告書とは別に、今後は今までの研究会での蓄積された考察をもとに、国際学会での報告をも視野に入れて論文を作成する作業を開始する。さらに、公開シンポジウムを、もうあと2回ほど開催していく。平成24年度は心理学のシンポジウムが主だったので、平成25年度は文学と社会学方面の専門家を招いてパネラーの顔ぶれをまた新たにする。海外の研究者との連携を深め、国際的な論議のできる研究公開シンポジウムを開催する予定である。また、23年度は外部の講演者を招聘して開く研究会を実施できなかったので、本年はその開催を予定する。一次資料の言説データを引き続きまとめる作業を行う。新たな一次資料の購入を計画し、速やかに購入する。学術雑誌への積極的な投稿、および学会発表の機会を利用して、広く本研究会の成果を世に問う。単行本を刊行予定の研究分担者および研究協力者へのサポートを充分に行う。○公開シンポジウムに招く研究会外部の専門家への謝金○公開シンポジウムに参加する研究協力者への旅費○研究例会で発表をお願いする研究会協力者への旅費○科研費報告書作成のための印刷製本代金・公開シンポジウムの会場費、招聘研究者への謝金、研究例会の会場費・一次資料の購入費および研究書の購入費・遠方からの研究者への旅費・資料コピー代金と消耗品の購入
手書き板書方式ビデオ教材共同開発のためのシステム基盤構築

本研究では手書き板書方式(いわゆるカーン・アカデミー方式)の教材を対象に、ペンストローク再生と合成音声を組み組合わせたビデオ教材のオープンな開発基盤について研究を行った。教材開発基盤の中心となるペンストローク記録再生ツールについては、JavaScriptを用いることでOS環境に依存しないWebアプリケーションとして実装した。作成した手書き板書教材はクラウドストレージに保存することでインターネット上ですぐに共有することができる。音声合成サーバについてもHTTP経由で受け取った台詞データを音声ファイルとして送り返す汎用的な実装を行った。本年度の研究では手書き板書教材の作成に必要となるタブレット端末の技術要件の確定、手書きストローク切り出し処理の検討ならびに実装を行った。タブレット端末の候補としてiPad,Androidタブレット,Windowsタブレットから画面サイズ・タッチパネル実現方式の異なる複数機種を選定し、手書き教材の作成に耐えるか検証を行った。その結果、静電容量方式のタッチパネルでは十分なペン入力精度が得られず、デジタイザ方式のタッチパネルが不可欠との結論を得た。A4サイズ相当の大きさで教材を作成するには、画面サイズは12インチ以上の大きさが理想的であるが、10インチ以上あれば実用的な利用が可能であると結論した。次に、ペンデジタイザから得られたペンストローク情報を元に、文字ストローク切り出し処理を行う手法について検討を行った。教材で作成する文書は日本語で一行ずつ規則正しく記述されるものと仮定し、(1)行の高さの推定、(2)行の高さに基づく文字幅の推定、(3)推定文字幅に基づく近接ストロークのクラスタリングの順で文字切り出しを行う手法を考案した。タブレットへの外部映像入力方式についても検討を行い、(1)HDMI入力に対応したUVCキャプチャデバイスを用いる方式、(2)小型LinuxサーバとHDMI信号入力ブリッジを組合わせて簡易キャプチャデバイスとして用いる方式の2つの方式が有望であるとの結論を得た。本研究で想定している手書き板書方式教材の作成が普及価格帯の市販機材で行えることが確認できたことは、本研究の実用化に向けた重要な一歩である。本年度の研究では手書き板書教材の生成に必要となる音声合成技術と外部映像信号の取り込み方式について検討を行った。日本語音声の合成に利用可能なオープンソースのシステムとしてはOpenJTalkが知られているが、Linux環境上で動作するように実装されておりAndroidタブレット上で直接利用することは想定されていない。RESTAPIを経由してネットワーク経由でOpenJTalkの音声合成機能を利用する方式について検討を行い、Docker仮想コンテナ環境上でOpenJTalkサービスを構築する方式について実用化の見通しを得た。昨年度に引き続きタブレットへの外部映像信号の取り込み方式について検討を行い、HDMI入力に対応したUVCキャプチャデバイスとAndroidタブレットの組み合わせで外部カメラの映像信号をAndroidアプリ内に直接取り込めることを実証した。また、Rasberry PiやHummingboard等の小型Linuxサーバに対応したHDMI信号入力ブリッジが一般に入手可能となったことから、小型Linuxサーバを用いた実装についても準備を進めている。手書き板書教材の実現に必要な外部映像信号の入力と音声合成の実現に目処が立ったことは、本研究の実用化に向けた大きな成果である。所属機関の変更に伴う異動のために研究環境の解体・移設作業に大幅に時間を取られ、年明け以降の作業に大幅な遅れが生じた。本年度の研究では手書き板書教材の作成に必要となるペンストローク記録再生ツールの開発ならびに音声合成サーバの構築を行った。ただし、所属研究機関の変更ならびに熊本地震の影響により、申請当初に計画していた熊本大学での開発ならびに評価・実験を行えない状況となった。音声合成サーバの構築においては実利用に向けて音声データを調整する人員を割当てる見通しが立たなくなったことから、生成音声の再配布が可能な安価な商用ソフトを用いてサーバの構築を行った。この音声合成サーバはHTTP経由で受け取った台詞データを音声ファイルとして送り返す汎用的なもので、HTMLページに埋め込んだJavaScriptからも利用可能である。ペンストローク記録再生ツールの実装方式について複数方式の検討を行った。研究開始当初はペンタブレットに最適化したAndroidアプリでの実装を進めていたが、後にiOS,Windows環境でもタッチペンを搭載した携帯型端末が多数登場した。このためOS環境に依存しないWebアプリでの実装方式を採用することとした。最新のWebブラウザではペン入力データを直接受信できることを利用し、ペン入力データの記録・再生を行うWebアプリケーションをJavaScriptで記述した。ペン入力データをクラウドストレージに保存する機能も実装しており、作成した手書き板書教材はインターネット上ですぐに共有することができる。市販の教材作成ソフトとしてペン入力に対応したものも存在するが、いずれも映像を生成することに主眼が置かれておりペンストローク情報自体の保存や共有は想定されていない。開発した音声合成サーバとペンストローク記録再生ツールを組合わせることでインターネット上の協同作業として教材の継続的な改善を行うことが可能となり、Wikipediaのように協同作業としての教材作成が一般化することが期待される。当初予定よりも手書き文字切り出し処理の基礎検討に時間を要したため、年度後半に予定していた教材収録システムの開発を終えることができなかった。このため、やや遅れていると判断している。

所属機関に変更に伴い、当初想定していた全学対象情報教育科目でのシステム評価は行えない見通しとなった。これについてはシステム評価のための題材を情報セキュリティ教育等の他の題材に置き換えることで対応する予定である。研究機関の異動に伴う研究環境の再構築を速やかに終え、システム評価のための体制を整えるとともに、大学院生などの補助要員を有効活用することで効率よく作業を進めていく。教育学習支援情報システム本年度考案した文字切出し手法、外部映像入力方式を組合わせた教材作成支援システムの開発を速やかに行う。既存のライブラリやオープンソースソフトウェアを流用することで開発を効率よく進めていく予定である。研究代表者永井の所属研究機関の異動が急遽決まり、研究環境移設作業のために年明け以降の研究活動に遅延が生じたことが大きな理由である。当初予定よりも手書き文字切り出し処理の基礎検討に時間を要したため、教材収録システムの開発に必要な機材一式の購入を次年度に先送りしたことが残額が生じた大きな理由である。これまでに得られた成果を速やかに国内外の学会等で発表するとともに、大学院生などの補助要員を当初予定よりも活用することで作業の遅れを取り戻す計画である。教材収録システムの開発に必要な機材を導入してシステム開発を迅速に行う。更に、今年度の目標である合成音声を用いたナレーション差し替え機能の実現に取り組む。中間的な成果が得られた段階で学会発表などの対外発表を行う。
摂食により亢進するプロテアソーム系タンパク質分解が担う生体機構の解明

本研究は摂食が及ぼす影響を包括的に捉えることを目的として、栄養学的な観点に加え、生体が食品因子から受ける刺激がエネルギー恒常性に与える影響、とくに脳を介する調節機構を解明することを目的とした。摂食には栄養面に加えて、感覚面(視覚・嗅覚・味覚)や食物が消化管に摂食することで生じる面など様々な効果がある。その中で、味覚刺激や消化管刺激が栄養素代謝と連動しているか否かを、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現情報の解析等様々な観点から明らかにしようとするものである。これまで甘味刺激により脂質代謝関連遺伝子を始めとした肝臓の遺伝子発現プロファイルが大きく変化することを明らかにしている。本年度は味覚障害モデルマウスを用いて甘味刺激を与えた時の影響を解析した結果、脂質代謝の変化は認められなかった。この結果より、甘味刺激が脳に伝達されることで遺伝子発現変動が誘導されるという新たな経路が強く示された。さらに、脳から肝臓への制御機構を検討するため、肝枝切除手術を施したマウスでは、脂質代謝関連遺伝子の発現変動は認められなかった。このことは、甘味刺激が脳へと伝達された後、迷走神経を介して肝臓の遣伝子発現変動を誘導する経路が存在することを示唆している。以上の結果は、甘味という味覚刺激が肝臓の栄養素代謝に直接影響するだけでなく、体内でエネルギー源として利用されないとされてきた人工甘味料が栄養素代謝に影響を及ぼす可能性を示した新たな知見である。本研究で得られた味覚刺激による肝臓遺伝子発現への影響が、サッカリン特異的に生じる影響であるかについて他の人工甘味料を用いて明らかにする。その他、甘味刺激以外の味覚が生体に与える影響についても明らかにしていきたい。(抄録なし)(抄録なし)摂食が生体に及ぼす影響を包括的に捉えることを目的として、栄養科学と感覚科学の両面のアプローチから研究を行っている。1.栄養科学からのアプローチこれまで摂食により肝臓で生じる遺伝子発現変動の時系列解析を行い、栄養素代謝関連遺伝子の発現変動以外に、摂食によってプロテアソーム関連遺伝子の発現が亢進することを明らかにした。このプロテアソームと摂食との関係を明らかにすることを目指している。本年度は白色脂肪組織におけるDNAマイクロアレイ解析を実施したところ、白色脂肪組織においてはプロテアソーム関連遺伝子の発現変動は見られず、摂食によるプロテアソームへの影響は肝臓特異的であることが示唆された。続いて、プロテアソーム関連遺伝子が発現変動するタイミングの前後で栄養素代謝経路に関連する代謝物の変化をメタボローム解析によって測定したところ、数個の代謝物の変化は見られたものの、代謝系全体への影響は見いだせなかった。この結果からではプロテアソームの標的分子を推定できないため、タイムポイントや測定項目について今後検討する必要がある。2.感覚科学からのアプローチ摂食には栄養面に加えて、視覚・嗅覚・味覚といった感覚面での効果がある。その中で、味覚刺激が栄養素代謝と連動しているか否かを、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現情報の解析から明らかにしようとしている。そこで、インスリン分泌や血糖値に影響を与えない人工甘味料であるサッカリンを用いることでマウスに対して甘味刺激のみを与え、遺伝子発現に及ぼす影響を解析した。その結果、サッカリン刺激によって肝臓の遺伝子発現プロファイルが大きく変化していることが明らかになった。今後、甘味を含む一部の味覚を欠損させたマウスを利用することで、甘味刺激時に応答が消失する遺伝子を同定し、味刺激と摂食応答との関連の解明を行なっていきたいと考えている。本研究は摂食が生体に及ぼす影響を包括的に捉えることを目的として、従来の栄養科学ではなく感覚科学のアブローチから研究を行っている。摂食には栄養面に加えて、視覚・嗅覚・味覚といった感覚面での効果がある。これまでにインスリン分泌や血糖値に影響を与えない人工甘味料であるサッカリンを用いた甘味刺激をマウスに対して与えた時の、肝臓遺伝子発現に及ぼす影響を網羅的に解析している。今年度、発現変動遺伝子の機能的特徴に関して詳細な解析を行ったところ、脂肪酸やコレステロール等の合成関連遺伝子は発現低下した一方で、脂肪酸β酸化関連遺伝子は発現上昇し、エネルギー産生の亢進が示唆された。続いて、味覚の関与の有無を明らかにするために、サッカリン溶液をゾンデにより胃内投与した実験からは、遺伝子発現プロファイルの変化や、脂質代謝関連遺伝子の発現変動はほとんど見られなかった。この結果より、甘味刺激が肝臓遺伝子発現に影響をおよぼすことが明らかとなった。さらに、飲水量やストレスのかけ方の違いによる影響を排除するため、自由飲水群とゾンデ投与群の飲水量を揃え、自由飲水群に対してはシャムのゾンデ操作を行う動物実験の追試を行った。その結果、同様の影響が見られ再現性を得ることができた。現在、味覚障害モデルマウスに対して同様の処理を行った時の影響を解析中である。また、他の人工甘味料による影響や、迷走神経切断等の実験を今後行い、味覚刺激が脳を介して肝臓の遺伝子発現を制御することでエネルギー代謝に影響していることを明らかにしたいと考えている。

本研究は摂食が及ぼす影響を包括的に捉えることを目的として、栄養学的な観点に加え、生体が食品因子から受ける刺激がエネルギー恒常性に与える影響、とくに脳を介する調節機構を解明することを目的とした。摂食には栄養面に加えて、感覚面(視覚・嗅覚・味覚)や食物が消化管に摂食することで生じる面など様々な効果がある。その中で、味覚刺激や消化管刺激が栄養素代謝と連動しているか否かを、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現情報の解析等様々な観点から明らかにしようとするものである。これまで甘味刺激により脂質代謝関連遺伝子を始めとした肝臓の遺伝子発現プロファイルが大きく変化することを明らかにしている。本年度は味覚障害モデルマウスを用いて甘味刺激を与えた時の影響を解析した結果、脂質代謝の変化は認められなかった。この結果より、甘味刺激が脳に伝達されることで遺伝子発現変動が誘導されるという新たな経路が強く示された。さらに、脳から肝臓への制御機構を検討するため、肝枝切除手術を施したマウスでは、脂質代謝関連遺伝子の発現変動は認められなかった。このことは、甘味刺激が脳へと伝達された後、迷走神経を介して肝臓の遣伝子発現変動を誘導する経路が存在することを示唆している。以上の結果は、甘味という味覚刺激が肝臓の栄養素代謝に直接影響するだけでなく、体内でエネルギー源として利用されないとされてきた人工甘味料が栄養素代謝に影響を及ぼす可能性を示した新たな知見である。本研究で得られた味覚刺激による肝臓遺伝子発現への影響が、サッカリン特異的に生じる影響であるかについて他の人工甘味料を用いて明らかにする。その他、甘味刺激以外の味覚が生体に与える影響についても明らかにしていきたい。摂食により変動するプロテアソームは、現在までに標的分子を推定できていないものの、肝臓特異的に生じることが示唆され、着実に前進していると考える。一方で味覚刺激による生体の応答に関しても、サッカリン投与によって肝臓の遺伝子発現プロファイルが大きく変化するという新たな知見を明らかにできたのは大きな前進である。昨年報告した内容が正しいことを多面的に検証できた他、新たな評価系の構築に成功した。味覚障害モデルマウスの利用に関しても条件検討から実験までは既に行なっており、概ね順調に進展していると考えている。(抄録なし)摂食応答によって発現亢進するプロテアソームについては、メタボローム解析を行うタイムポイントや測定項目について今後検討する必要がある。そこで呼吸商など様々な観点から、摂食によって変化が生じる部分を明らかにしていきたい。味覚刺激による生体の応答に関しては甘味を含む一部の味覚を欠損させたマウスを利用することで、甘味刺激時に応答が消失する遺伝子を同定し、味刺激と摂食応答との関連の解明を行なっていきたいと考えている。また、長期間摂取を行った時に生じてくる変化についても着目していく予定である。既にサンプリングまで行った味覚障害モデルマウスを用いた実験について解析を進める他、他の人工甘味料による影響を解析することで甘味刺激と遺伝子発現変動の関連性について明らかにしたいと考えている。また、迷走神経や味神経等の切断実験や脳の解析を行う事でその分子機構の解明にも迫りたいと考えている。(抄録なし)
閉塞性肺疾患におけるビタミンの役割

閉塞性肺疾患患者のビタミン濃度と酸化ストレス、閉塞性障害および活動性との関連性を検討した。閉塞性障害の程度、酸化ストレスの指標および活動性の間には関連性はみられなかった。今後、抗酸化ストレス作用のあるビタミンの摂取が閉塞性肺疾患患者の呼吸機能や活動性に影響を及ぼすかどうかの前向きな検討が必要である。また、基礎実験では平滑筋細胞を用いてビタミンEの成分であるトコトリエノールを用いて検討を行った。α、γ、δトコトリエノールは気管支平滑筋細胞の増殖や遊走、筋線維芽細胞様への細胞の分化も抑制した。このことから気管支喘息にみられる気道リモデリングをトコトリエノールが抑制できる可能性が示唆された。閉塞性呼吸器疾患である気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)では酸化ストレスがその病態に関与していることが報告されている。この酸化ストレスは、ビタミンA,C,Eなどの抗酸化作用のあるビタミンが有効である可能性がある。これまで我々は基礎実験および臨床研究でこれらのビタミンに関する検討を行った。基礎実験については平成24年度同様に気道平滑筋細胞を用いて検討した。ビタミンEのisoformsのうちαトコトリエノール、γトコトリエノール及びδトコトリエノールを用い、気道平滑筋細胞の遊走能および増殖能について検討した。それぞれのトコトリエノールはPDGF-BBによる平滑筋細胞の遊走および増殖をその濃度依存性に抑制した。また、気道平滑筋細胞はTGF-β1刺激により筋線維芽細胞様へ分化誘導される。この分化誘導が各種トコトリエノールにより抑制されるかどうかについて検討した。分化誘導の指標はα-smooth muscle actin (αSMA)、collagen I(Col I)よびfibronectin (FN)の蛋白の発現量を用いた。TGF-βは平滑筋細胞のαAMA, Col I, FNの発現量を増強した。また、γ-トコトリエノールはTGF-βによるαAMA, Col I, FNの発現量の増強を濃度依存性に抑制した。これにはSmad 2およびSmad3のリン酸化の抑制と平滑筋細胞の分化に関連した転写因子Id1の抑制が関与していた。臨床研究では閉塞性肺疾患患者21名(気管支喘息19名、COPD患者2名)について検討を行った。酸化ストレスは、diacron reactive oxygen metabolites (dROMs):高値であれば酸化ストレスが高いとされている:を測定した。閉塞性肺疾患患者ではdROMs濃度と閉塞性換気障害との程度には有意な相関は得られなかった。気管支喘息及びCOPDの病態には酸化ストレスが関与している。この酸化ストレスには、ビタミンA, C, Eなどの抗酸化作用のあるビタミンが有効である可能性がある。我々は基礎実験および臨床研究で、これらビタミンに関する検討を行った。基礎実験は培養気道平滑筋細胞を用い、ビタミンEの平滑筋細胞の増殖、遊走および筋線維芽様細胞への分化に及ぼす影響について検討を行った。ビタミンEには8つのisoformがあるが、これらの中でα-tocotrienolとγ-tocotrienol, δ-tocotrienolを用いた。細胞の刺激にはPDGF-BBおよびTGF-βを用いた。γ-tocotrienolは濃度依存性にPDGF-BB刺激による気道平滑筋細胞の遊走および増殖を抑制した。また、同様の結果がδ-tocotrienolでも認められた。また、TGF-βによる気道平滑筋細胞の分化についてはα-sm-actinの発現量をWestern blotting法で確認した。γ-tocotrienol及びδ-tocotrieonolはTGF-βによるα-sm-actinの発現の増強を有意に抑制した。臨床では55名の慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息患者を含む何等かの基礎疾患を持つ患者を対象として検討した。ビタミン接種量はアンケートにより、酸化ストレスは、diacron reactive oxygen metabolites (dROMs):高値であることは酸化ストレスが高いとされる:を測定した。ビタミンEのisoformの一つであるα-tocopherolはd-ROMsと負の相関を示し、また、一秒量、%1秒量もd-ROMsと負の相関を示した。従って、ビタミンEが閉塞性肺疾患の病態に関与している可能性が示唆された。また平滑筋細胞に影響を及ぼすことより、閉塞性肺疾患の治療に有用である可能性が示唆された。1.患者を対象とした研究について21名の閉塞性肺疾患患者(19名の気管支喘息患者、2名の慢性閉塞性肺疾患患者)を対象に、血清ビタミン濃度、ビタミン摂取量、呼吸機能、酸化ストレスの程度、身体活動性との関係について検討した。酸化ストレスはFree Radical Analytical System (Wismerll社製)を用い、血清及び呼気dROMs値(diacron reactive oxygen metabolites)、抗酸化力はBAP test (biological antioxidant potential)で評価した。

活動性は加速度計であるActiwatchを用いて評価した。ビタミンは簡易型自記式食事歴法質問票及び血中濃度を測定した。酸化ストレスの指標とビタミンA,ビタミンC、α-tocopherolと活動性、各種酸化ストレスと活動性との間には有意な相関は見られなかった。また、各種ビタミン濃度及び活動性と%FEV1、FEV1%, %VCとの間にも有意な相関は見られなかった。酸化ストレス、呼吸機能、身体活動性との関連性を見出すことは一時点の評価では難しいことが推測された。2.気道平滑筋細胞を用いた研究について抗酸化力作用のあるビタミンEのうち、トコトリエノールを用いて検討を行った。トコトリエノールのisoformにはα、β、γ、δの4つがあるが、このうち、α、γ、δトコトリエノールを用いて検討を行った。αおよびγ、δトコトリエノールは濃度依存性にPDGF-BBによる気道平滑筋細胞の遊走および増殖を抑制した。この機序としてMAPKおよびAkt1の活性化の関与はみられなかった。また、γトコトリエノールは、PDGF-BBによるRhoの活性化を抑制することにより、気道平滑筋細胞の遊走および増殖を抑制していることが分かった。呼吸器内科各種ビタミン濃度、ビタミン摂取量および閉塞性肺疾患の患者での呼吸機能との検討がまだ十分できていない。また同意の得られた患者が21名と少なく、今後さらに多くの患者に協力を依頼する必要がある。ビタミンA, C,およびDについての検討がまだ十分できていない。今後検討する予定である。同意の得られた患者さんが少なく、今後さらに多くの患者に協力を依頼する必要がある。基礎実験についてはδ-tocotrienolの検討が十分できていない。またビタミンA, Cに関する検討も行っていく予定である。臨床研究については21名の患者より、血清、呼気濃縮液の採取、ビタミン摂取量についてのアンケート調査を終了しており、各種ビタミン濃度、ビタミン摂取量と酸化ストレスの各種マーカー、抗酸化力について検討していく予定である。現在、気管支喘息およびCOPDの患者の血清中のビタミン測定および呼気濃縮液の採取を行っており、今後酸化ストレスおよび呼吸機能検査などの測定を行う予定である。まだ同意の得られた患者さんが少なく、今後さらに多くの患者に協力を依頼する必要がある。基礎実験が予定より遅れているため。また対象患者が21名と少なく、当初予定していた40名の半分程度であるため。
レーザー誘起蛍光法による海苔養殖管理技術の開発

本研究では、レーザ誘起蛍光法(LIF法)による海苔の養殖管理技術を確立することを目的としている。今回、様々な栄養塩を用いて培養した海苔の蛍光スペクトルを測定し、栄養欠乏の影響を検討した。十分な栄養分が含まれた栄養強化培地(PES)、栄養分を添加しない天然ろ過滅菌海水(SW)、リン源を除いたP-Free、窒素源を除いたN-Freeの4種類の培地で培養した海苔藻体を測定した。PESの場合と比較して、P-Freeの場合にはフィコエリスリンに起因する波長580nm付近の蛍光強度が大きく、N-Free、SWの場合には蛍光強度が相対的に弱くなった。さらに、温度特性についても検討した。これまでの蛍光寿命測定では励起光源にLEDを用いて蛍光寿命の測定を行なってきた。しかしパルス幅が数nsと大きく0.1ns程度の蛍光寿命を精度よく測定することができなかった。そこで今年度は励起光源にパルスレーザを用いて時間分解能の高い蛍光寿命測定を行った。蛍光寿命測定には浜松ホトニクス製の小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus-Tau)を使用した。励起光の波長はスサビノリの生育診断に適している励起波長であるフィコエリスリンの吸収ピーク波長付近の470nmの励起光を用いて蛍光寿命測定を行った。測定した蛍光の波長はフィコエリスリンに起因すると思われる蛍光波長の580 nm、アロフィコシアニンに起因すると思われる蛍光波長の660 nm、クロロフィルaに起因すると思われる蛍光波長の685 nm、720 nmとした。試料には、平成24年12月に新富津漁業協同組合で養殖したスサビノリを用いた。測定した蛍光減衰曲線より、2成分であると仮定してフィッティングを行い、デコンボリューション処理を行うことにより蛍光寿命を導いた。正常なスサビノリの平均寿命は580 nmの蛍光ピークの場合で0.12 ns0.19 ns、660 nmの蛍光ピークの場合で0.15 ns0.17 ns、685 nmの蛍光ピークの場合で0.21 ns 0.22 ns、720 nmの蛍光ピークの場合で0.12 ns0.13 nsとなった。このようにパルスレーザを励起光源に用いることで精度よく蛍光寿命を求めることができるようになった。我々はこれまでに、あかぐされ病などの病害の影響により蛍光スペクトルが変化することを明らかにし、蛍光分光がスサビノリの生育診断に有効であることを明らかにしてきた。一方、各色素の蛍光寿命は各色素間でのエネルギー移動に関連していると考えられるため、蛍光寿命は蛍光スペクトルよりもストレスによる障害に対して敏感に反応すると考えられる。そこで、蛍光寿命計測によるスサビノリの生育診断を検討した。時間分解能の高い測定を行うため、パルスレーザを用いて蛍光寿命測定を行い、平均寿命を計算したところ、正常なスサビノリの平均寿命は580 nmの蛍光ピークの場合で0.12 ns0.19 ns、660 nmの蛍光ピークの場合で0.15 ns0.17 ns、685 nmの蛍光ピークの場合で0.21 ns0.22 ns、720 nmの蛍光ピークの場合で0.12 ns0.13 nsとなった。あかぐされ病に感染したスサビノリの蛍光寿命を測定したところ、あかぐされ病が進行するにつれて、平均蛍光寿命が長くなることがわかった。また、蛍光スペクトルではほとんど変化が見られないような初期のあかぐされ病の場合でも、平均蛍光寿命は大きく変化しており、蛍光寿命測定が蛍光スペクトル測定より感度の高い生育診断法であるという見通しを得た。今年度はスサビノリの蛍光寿命を検討した。まず初めに、スサビノリの生育診断に適している励起波長であるフィコエリスリンの吸収ピーク付近の470nmの励起光を用いて蛍光寿命測定を行った。測定した蛍光の波長はフィコエリスリンに起因する580 nm、アロフィコシアニンに起因する660 nm、クロロフィルaに起因する685 nm、720 nmの4つの波長である。それぞれのピークについて測定を行い、デコンボリューション処理により蛍光寿命を解析した。その結果、クロロフィルaによる蛍光(685 nm、720 nm)は、フィコエリスリン、アロフィコシアニンによる蛍光(580 nm、660 nm)に比べて、ゆるやかに減衰することがわかった。蛍光寿命を見積もると、フィコエリスリン、アロフィコシアニンが0.1 ns以下、クロロフィルaが1.4 ns程度であった。次に、蛍光寿命の励起波長依存性を検討した。励起波長は470nmの他に、405nm、630nmを用い、685 nmのクロロフィル蛍光の蛍光寿命の測定を行った。

その結果、5 ns以降で励起波長405 nmの場合は他の励起波長と比べてゆるやかに減衰しており、長い蛍光寿命の成分を含んでいることがわかった。720 nmのクロロフィル蛍光の蛍光寿命測定においても同様の結果が得られた。405 nmはクロロフィルaの吸収ピーク付近の波長であり、励起光を吸収する色素によってエネルギー移行の過程が変化していると考えられる。各色素の蛍光寿命は各色素間でのエネルギー移行に関連していると考えられる。そのため、蛍光寿命は病害などのストレスの影響に対してより敏感に変化すると考えられる。今年度は、主として蛍光寿命測定を試みた。その結果、各色素の蛍光寿命が明らかになってきた。各色素の蛍光寿命は各色素間でのエネルギー移行に関連していると考えられるため、蛍光寿命は病害などのストレスの影響に対してより敏感に変化すると考えられる。そのため、スサビノリの養殖管理技術として非常に有効な方法と考えられる。昨年度まで問題であった、蛍光寿命測定の時間分解能をパルスレーザを用いることにより解決した。そのため、次年度に蛍光寿命とストレス関係を明らかにする準備が整ったと考えている。さらに、今年度は色素定量のために遠心機を購入したが、色素定量のための準備実験も順調に進んでおり、次年度以降に色素量と蛍光スペクトルの関係を明らかにする準備が整ったと考えている。今年度確立した蛍光寿命測定を用いて、栄養欠乏の影響、病害などのストレスにより蛍光寿命がどのように変化していくかを検討する。さらに、色素定量の技術を確立し、色素量と蛍光スペクトルの関係を明らかにしていく予定である。今年度確立した蛍光寿命測定を用いて、病害等のストレスにより蛍光寿命がどのように変化していくかを検討する。また、フィコビリン蛍光の寿命は非常に早く、今年度の測定では正確な寿命が計測できていないため、短パルスレーザを使用してフィコビリン蛍光の寿命を正確に測定する。次年度は、色素定量技術を行うために、ホモジナイザーを購入する予定である。また、蛍光寿命測定の高精度化のために、固体試料測定用サンプル室を購入する予定である。次年度は信州大学斉藤教授のグループと連携して研究を進める予定である。そのため、成果報告のための学会出張の他に、研究打合せのための出張を計画している。次年度は、今年度購入した遠心機を利用して、色素定量技術の確立を目指す。そのため、購入する物品は主として薬品等の消耗品となる。また、短パルスレーザを使用した蛍光寿命測定のために、信州大学斉藤教授のグループと連携して研究を進める予定である。
多成分ペプチド連結法の開発とタンパク質の機能の解明

本研究の目的は、化学的構造が高度に制御された生理活性システインリッチタンパク質をペプチドライゲーション法を用いて迅速かつ効率的に合成する方法論の開発およびそれらを用いたケミカルバイオロジー研究への応用である。タンパク質を化学合成することにより、化学修飾構造を精密に導入することが可能である。蛍光標識の導入などにより、生物活性の機構の解明に応用が可能である。平成29年度はKAHAライゲーションとnative chemical ligation(NCL)の2種類のペプチドライゲーション反応を組み合わせて花粉管誘引因子であるCALL1タンパク質の化学全合成研究を行った。ペプチドライゲーションに必要なそれぞれのペプチド断片は、Fmoc固相ペプチド合成法によって合成した。NCLに必要なC末端チオエステルとして、C末端ヒドラジドを前駆体としてカルボン酸アジドを経由してチオエステルを生成した。またKAHAライゲーションに必要なヒドロキシアミンを備えたペプチド断片を合成した。その後の検討の結果、三成分を連結し、CALL1の全長タンパク質の合成を達成した。今後はリフォールディングによる活性型タンパク質への変換と生物活性の確認を行なう予定である。また、EPF familyタンパク質など、複数の生理活性システインリッチタンパク質の合成を達成することもできた。現在は蛍光標識体を合成中であり、生命科学者との共同研究により、その機能の解明研究に展開する予定である。本研究の目的は、化学的構造が高度に制御された生理活性システインリッチタンパク質をペプチドライゲーション法を用いて迅速かつ効率的に合成する方法論の開発およびそれらを用いらケミカルバイオロジー研究への応用である。平成28年度はモデル基質を用いて(1)KAHAライゲーションとnative chemical ligation(NCL)の2種類のペプチドライゲーション反応の組み合わせが一つのタンパク質合成ターゲットに対して適用可能であること、(2)花粉管誘引因子であるCALL1タンパク質の化学全合成研究の2点を行った。(1)では、モデル基質を用いた検討から、NCLに必要なC末端チオエステルとして、C末端ヒドラジドを前駆体としてカルボン酸アジドを経由してチオエステルを生成する方法が有効であることがわかった。またKAHAライゲーションに必要なヒドロキシアミンの保護基として紫外線によって脱保護されるphoto-cleavable protecting groupを開発した。これらを用いることで三成分連結によるタンパク質の迅速化学合成が可能であることが示された。(2)では、(1)で得られた基礎的知見をもとに花粉管誘引因子であるCALL1タンパク質の化学全合成に必要なペプチドフラングメントの合成を行った。ペプチド固相合成の条件検討により、3つのペプチドフラグメント(CALL1-Seg1、CALL1-Seg2、CALL1-Seg3)が問題なく合成できることが明らかとなった。来年度はペプチドフラグメントの連結によるCALL1タンパク質の全合成に取り組む。1年目の研究で、ペプチドの三成分連結反応に必要な合成ルートを確立することができた。これによりそれぞれの生理活性システインリッチタンパク質の化学合成に展開していく基盤が整ったと言える。平成29年度は前年度までに検討したKAHAライゲーションとnative chemical ligation(NCL)の2種類のペプチドライゲーション反応の組み合わせが花粉管誘引因子であるCALL1タンパク質の化学全合成研究に対して適用可能であることを検証した。モデル基質を用いて検証した場合から、さらに反応条件や側鎖保護基を検証することにより、CALL1-Seg1、CALL1-Seg2、CALL1-Seg3の3つのペプチドフラグメントの連結に成功した。モデル基質での検討から、多少の条件最適化は必要であったが、スムーズに全合成へと展開することができた。これにより、様々なシステインリッチタンパク質の全合成研究に展開していくにあたり、強固な基盤が整ったと言える。平成29年度は、前年度に得られた合成化学的知見に基づいてCALL1タンパク質の全合成に取り組む。さらに並行してEPFファミリータンパク質など他の植物由来システインリッチタンパク質の合成研究も行う。

平成30年度は、前年度に最適化した反応条件を用いて様々なシステインリッチタンパク質の合成へと展開する。さらに合成を達成したCALLタンパク質については、化学修飾を行いケミカルバイオロジー研究へと展開する予定である。今年度、少額(21,054円)が未使用であったが、支給額の5%以下であった。そのため全体の予算の使用計画に変更はない。
Ｉｎ　ｖｉｖｏ　脳刺激による褐色脂肪細胞の分化誘導

褐色脂肪組織は、熱産生を通じた積極的なエネルギー消費によって肥満の防止に寄与する。交感神経性の熱産生刺激を長期間与えると白色脂肪組織中に誘導型褐色脂肪細胞(brite cell)の分化誘導を促進できることが示唆されている。そこで本研究では、光遺伝学的手法を用いて褐色脂肪の熱産生を制御する延髄の交感神経プレモーター領域を刺激し交感神経性熱産生を亢進させることで、brite cellの分化誘導を促進させることを可能にする技術の確立を試みた。その結果、光刺激により褐色脂肪組織交感神経の活性化を惹起し、それに伴う褐色脂肪組織温度の上昇が観察できた。褐色脂肪組織は、その熱産生機能を通じた積極的なエネルギー消費によって肥満の防止に寄与する。最近、交感神経性の熱産生刺激を長期的に与えることで、白色脂肪組織中における誘導型褐色脂肪細胞(brite cell)の分化誘導を促進できることが示唆され、新たな肥満治療技術の開発につながるものとして注目されている。そこで本研究では、褐色脂肪熱産生の制御に関わる延髄の交感神経プレモーター領域を、光遺伝学的手法を用いて長期的に刺激し、交感神経性熱産生を亢進させることで、brite cellの分化誘導を促進させることを可能にする技術の確立を試みた。光遺伝学的手法を用いて延髄の淡蒼縫線核吻側部(rRPa)を中心とした交感神経プレモーター領域を刺激するため、特定波長の光を受けて神経細胞を活性化するカチオンチャネルChIEFを発現させるアデノ随伴ウイルスベクターの構築を行った。これまで光遺伝学の実験にはチャネルロドプシン-2(ChR2)が主に用いられてきたが、本研究計画ではbrite cellの分化誘導のために脳内を長期的に光刺激する必要があることから、脳組織への傷害が少なく、比較的弱い光出力でも神経細胞を活性化できるChIEFを発現させるウイルスベクターを作製した。研究代表者は、このウイルスをラットのrRPaを中心としたプレモーター領域に注入し、感染したニューロン群がChIEFを発現することを組織学的に確認した。そこで、ChIEFを発現させた領域に麻酔下で光ファイバーを挿入し、in vivo光照射を行ったところ、褐色脂肪組織交感神経の群放電活動の活性化を惹起し、交感神経活性化に伴う褐色脂肪組織温度の上昇・脈拍上昇・血圧上昇なども観察できた。本研究では、褐色脂肪熱産生の制御に関わる延髄の交感神経プレモーター領域を、光遺伝学的手法を用いて長期的に刺激し、交感神経性熱産生を亢進させることで、brite cellの分化誘導を効率良く促進させる技術を確立する。光遺伝学的手法を用いて延髄の淡蒼縫線核吻側部(rRPa)を中心とした交感神経プレモーター領域を刺激するため、特定波長の光を受けて神経細胞を活性化するカチオンチャネルChannelrhodopsin-2(ChR2)を発現させるアデノ随伴ウイルスベクターを作製した。申請者は、このウイルスをラットのrRPaおよび近傍のプレモーター領域に注入し、感染したニューロン群がChR2を発現することを組織学的に確認した。ChR2を発現させたrRPaの領域に麻酔下で光ファイバーを挿入し、in vivoで光照射を行ったところ、褐色脂肪組織交感神経の群放電活動の活性化を惹起できた。しかし、ChR2を用いた光刺激には強いレーザー光が必要であり(12 mW)、長期間の光照射による脳組織の損傷が懸念された。そこで、弱い光でも活性化する改良型ChR2(ChIEF)を発現させるウイルスを作製し、同様の光照射実験を行った。その結果、弱い光の照射(6ー8 mW)でも十分に褐色脂肪組織の交感神経の群放電活動の活性化を惹起し、交感神経活性化に伴う褐色脂肪組織温度の上昇・脈拍上昇・血圧上昇なども観察された。今後は、これらの実験結果を基に、覚醒下での長期光照射によるbrite cellの分化誘導実験を行う。

そこで本研究では、褐色脂肪熱産生の制御に関わる延髄の交感神経プレモーター領域を、光遺伝学的手法を用いて長期的に刺激し、交感神経性熱産生を亢進させることで、brite cellの分化誘導を促進させることを可能にする技術の確立を試みた。光遺伝学的手法を用いて延髄の淡蒼縫線核吻側部(rRPa)を中心とした交感神経プレモーター領域を刺激するため、特定波長の光を受けて神経細胞を活性化するカチオンチャネルChIEFを発現させるアデノ随伴ウイルスベクターの構築を行った。このウイルスをラットのrRPaを中心としたプレモーター領域に注入し、感染したニューロン群がChIEFを発現することを組織学的に確認した。そこで、ChIEFを発現させた領域に麻酔下で光ファイバーを挿入し、in vivo光照射を行ったところ、褐色脂肪組織交感神経の群放電活動の活性化を惹起し、交感神経活性化に伴う褐色脂肪組織温度の上昇・脈拍血圧の上昇なども観察できた。本研究計画では長期光照射によるbrite cell分化誘導実験を行う予定であったが、高いレーザー出力が得られないなどの問題から長期間にわたる光刺激条件の決定には至っていない。しかしながら、光遺伝学を用いて褐色脂肪組織の熱産生反応や代謝の上昇を惹起させることに成功している事からUCP1やPPARgammaなどの褐色脂肪関連遺伝子発現の上昇を招いていると予想される。今後も引き続き長期光刺激によるbrite cellの分化誘導実験を継続し、肥満症解決の糸口をつかみたい。環境生理学分子細胞生物学平成25年度の研究計画では、1ワイヤレス光照射装置テレオプトを用いた長期脳内LED照射によるbrite cell分化誘導を検討すること。2分化誘導されたbrite cellの分子生物学的・形態学的解析をおこなうことを予定していた。1ワイヤレス光照射装置テレオプトを用いた長期脳内LED照射によるbritecell分化誘導のin vivo解析申請者はこれまでに、脳組織への傷害が少ない光照射を行うため、比較的弱い光でも神経細胞を活性化できるChIEFを発現させるために必要なウイルスを作製済みであり、本ウイルスをラットのrRPaへ注入し、多数のニューロンにChIEFを発現させることに成功している。こうしたChIEF発現ニューロンに対し、麻酔下で光照射実験を行った結果、長期的な脳内光照射が可能な程度の弱い光(5-8 mW)で褐色脂肪の交感神経活動を活性化することに成功した(論文投稿中)。しかしながら、自由行動下のラットで長期光照射を行うために業者と開発を進めていたワイヤレス光照射装置では活性化に必要な強度の光を得ることが出来なかった。そのため計画を変更し、有線での光刺激実験を行うこととしたことから計画に遅れが生じた。現在、rRPaへChIEFを発現させたラット脳内へ有線にて光ファイバーを挿入し、効率的に褐色脂肪の交感神経を活性化することが出来る光照射条件を検討中である。2分化誘導されたbrite cellの分子生物学的・形態学的解析ワイヤレス光照射装置ではChIEFが発現した神経細胞群を活性化させるのに十分な強さの光が得られていないことから、長期光照射に伴うbrite cellの詳細な解析には遅れが生じている。現在、有線での長期間の光照射に伴う交感神経出力の亢進によって白色脂肪細胞中でのbrite cellの分化誘導が惹起されるか否かの確認を進めており、今後、褐色脂肪関連遺伝子の遺伝子発現解析や抗UCP1抗体を用いた免疫組織化学実験を行う。
多発家系iPS細胞による双極性障害細胞モデルの開発と原因変異の探索

研究開始時までにある双極性障害と反復性うつ病の多発する家系で疾患と強く共分離するハプロタイプを発見し、原因候補変異の絞り込みとiPS細胞樹立に成功していた。本研究は双極性障害iPS細胞モデルを確立することを目的とし、本家系の罹患者由来iPS細胞を用いて、in vitro神経分化誘導系により双極性障害の神経細胞表現型を明らかにすること、そしてゲノム編集技術により、家系にみられるゲノム変異と表現型の関係を示すことを目指している。まず、iPS細胞の分化誘導系を検討した。本家系における気分障害の候補遺伝子Aに着目し分化誘導の標的細胞種の検討を行った。ヒト脳の遺伝子発現データベースから遺伝子Aが特徴的な脳局在を示すことがわかり、また双極性障害に関連を示唆されるある領域に多く分布していた。そこで、はじめにiPS細胞を遺伝子Aの発現する領域の細胞に分化誘導を試みた。各種化合物を添加しiPS細胞を神経幹細胞へ分化誘導し、ニューロスフェアを継代したのち、分散して接着培養することで神経細胞を誘導した。qRT-PCRで遺伝子Aの発現を確認した。市販抗体を用いて免疫細胞染色を試みたが、特異的な染色像が得られず、遺伝子Aが発現している細胞は不明であった。つぎに家系内双極性障害患者と健常者のiPS細胞由来神経細胞の自発的興奮を蛍光標識指示薬を用いたカルシウムイメージングで比較した。仮説では家系内双極性障害患者由来神経細胞は細胞内カルシウム濃度変化が高い頻度で観察できる。実際に双極性障害由来細胞の自発的興奮は亢進しているような結果を得ることができた。しかし、本実験に用いた培養方法では、細胞密度を均一にすることが困難で、また誘導されるニューロン/グリアの比も変動したため、再現性を考えると報告期間内に結論を出すことができなかった。当初の研究計画のとおり、平成30年度にiPS細胞分化誘導系の条件検討とカルシウムイメージングを行い、部分的に目標を達成できた。iPS細胞から神経細胞への分化誘導は成功した。一方で、候補遺伝子Aに着目したアプローチをとったため分化誘導系の評価には遺伝子Aの細胞免疫染色を行いたかったが、染色はうまくいかなかった。抗体が機能しなかったと考えられる。分化誘導神経細胞でカルシウムイメージングを行い、予備的な結果を得ることができた。同時に培養細胞の密度、ニューロン/グリア比など、実験条件の安定化に課題を認めた。また、平成30年度にはゲノム変異編集用のターゲッティングベクター作成を計画していた。着手したもののクローニング過程に難しいところがあり、ベクター作成については予定よりも遅れている。次年度は(1)分化誘導方法の再検討とカルシウムイメージング、(2)家系内双極性障害患者iPS細胞の遺伝子A変異の修復、(3)遺伝子Aの抗体作成を行う。(1)分化誘導方法の再検討とカルシウムイメージング:ニューロスフェアを用いる方法のほか、ウイルスベクターを用いたリプログラミング法も試す予定である。(2)家系内双極性障害患者iPS細胞の遺伝子A変異の修復:遺伝子Aには3つのミスセンス変異があるため、すべてを修復するためには繰り返しサブクローニングが必要になる。またiPS細胞の継代数が進むと核型異常が生じやすいため、最終的に作成した修復株が核型異常で不適になるリスクもある。できるだけ注力し、研究期間内の完了を目指す。(3)遺伝子Aの抗体作成:遺伝子Aの発現細胞種を明らかにするため、抗体を作成する。これまでに遺伝子Aのコード配列のクローニングは終えているので、蛋白質発現ベクターに遺伝子を挿入し、動物に免疫を行う。

当初の研究計画のとおり、平成30年度にiPS細胞分化誘導系の条件検討とカルシウムイメージングを行い、部分的に目標を達成できた。iPS細胞から神経細胞への分化誘導は成功した。一方で、候補遺伝子Aに着目したアプローチをとったため分化誘導系の評価には遺伝子Aの細胞免疫染色を行いたかったが、染色はうまくいかなかった。抗体が機能しなかったと考えられる。分化誘導神経細胞でカルシウムイメージングを行い、予備的な結果を得ることができた。同時に培養細胞の密度、ニューロン/グリア比など、実験条件の安定化に課題を認めた。また、平成30年度にはゲノム変異編集用のターゲッティングベクター作成を計画していた。着手したもののクローニング過程に難しいところがあり、ベクター作成については予定よりも遅れている。次年度は(1)分化誘導方法の再検討とカルシウムイメージング、(2)家系内双極性障害患者iPS細胞の遺伝子A変異の修復、(3)遺伝子Aの抗体作成を行う。(1)分化誘導方法の再検討とカルシウムイメージング:ニューロスフェアを用いる方法のほか、ウイルスベクターを用いたリプログラミング法も試す予定である。(2)家系内双極性障害患者iPS細胞の遺伝子A変異の修復:遺伝子Aには3つのミスセンス変異があるため、すべてを修復するためには繰り返しサブクローニングが必要になる。またiPS細胞の継代数が進むと核型異常が生じやすいため、最終的に作成した修復株が核型異常で不適になるリスクもある。できるだけ注力し、研究期間内の完了を目指す。(3)遺伝子Aの抗体作成:遺伝子Aの発現細胞種を明らかにするため、抗体を作成する。これまでに遺伝子Aのコード配列のクローニングは終えているので、蛋白質発現ベクターに遺伝子を挿入し、動物に免疫を行う。平成30年度はゲノム修復用ターゲットベクターの作成が遅れたため、予算に計上していた修復株作成時の細胞培養用の物品費を使用しなかった。次年度に当該助成金を用いて実験を行う。
プロテオームおよびメタボローム解析による過大侵襲時の免疫抑制機序の解明

過大侵襲時の重症感染症・臓器不全発症機序を明らかにする目的で、肝胆膵外科周術期における免疫抑制機序を解析した。(1)肝胆膵術後の合併症には多様な因子が関与するが、HTX術後臓器不全ではDAMPsが、PD術後感染では膵外分泌機能が重要な因子と考えられた。(2)感染例のPBMCにおけるP2X7やT-bet/GATA-3比の術直後の低下は感染防御能の低下を示唆した。(3)感染例のPBMCにおける術後3日以降のTLRs発現増強は起因菌の排除に関与していると考えられた。以上の結果より、術後合併症発症におけるDAMPsおよびPAMPsシグナルの重要性が示唆された。本研究では、過大侵襲時の重症感染症・臓器不全発症機序を明らかにする目的で、肝胆膵外科周術期における免疫担当細胞の動態を以下の観点から解析している。(1)過大侵襲時の免疫担当細胞[PMN, CD4+Tcells, CD8+T cells, CD19+Bcells, CD56+NK, CD14+monocytes]におけるTLR-2, TLR-4、転写因子、mRNA、およびcytokine, Chemokine発現の網羅的検索による細胞間・細胞内シグナル伝達の経時的変化の解析。(2)過大侵襲時のPMNにおける脂質Mediatorの代謝経路の解析。(3)術後重症感染症・臓器不全に関わる新たな血中分子マーカーの検索。平成20年度には、肝胆膵領域の手術患者から周術期の末梢血を採取し、血漿、好中球(PMN)、単核球(PBMC)の各分画をサンプリングした。PBMC分画のmRNA発現の解析からは、術後合併症発症例では術前のGATA3の発現克進が認められTh2へのシフトが認められること、術直後にはT-bet,GATA3ともに著しい発現低下を認め、Th1Th2ともに機能低下に陥ることが予想された。平成21-22年度にはさらにPMN分画の解析を進め、好中球の機能発現に関わる転写因子であるHIFlalpha,H0-1等の発現を検索し、臓器不全との関連を明らかにする。また、術後の免疫抑制機序に重要な役割を果たすと考えられるA2A receptorの発現をPBMC,PMNの各分画について検討する。平成20-21年度には、肝胆膵領域の手術患者から周術期の末梢血を採取し、血漿、好中球(PMN)、単核球(PBMC)の各分画をサンプリングした。PBMC分画のmRNA発現の解析からは、術後合併症発症例では術前のGATA3の発現亢進が認められTh2へのシフトが認められること、術直後にはT-bet,GATA3ともに著しい発現低下を認め、Th1Th2ともに機能低下に陥ることが予想された。平成22年度にはさらにPMN分画の解析を進め、好中球の機能発現に関わる転写因子であるHIF1alpha, HO-1等の発現を検索し、臓器不全との関連を明らかにする。また、術後の免疫抑制機序に重要な役割を果たすと考えられるA2A receptorの発現をPBMC, PMNの各分画について検討する。本研究では、過大侵襲時の重症感染症・臓器不全発症機序を明らかにする目的で、肝胆膵外科周術期における免疫担当細胞の動態を以下の観点から解析した。2.過大侵襲時のPMNにおける脂質Mediatorの代謝経路の解析。3.術後重症感染症・臓器不全に関わる新たな血中分子マーカーの検索。<結果>PBMC分画の解析:TLR2,TLR4 mRNA発現は術後持続的に増強し、術後3日以降に感染例が高値を示した(P<0.05)。P2X7 mRNA発現はHTX,PD術直後から持続的に増強し、感染例が低値を示した(P<0.05)。術直後のP2X7 mRNA発現はT-bet/GATA-3と正の相関を、術後合併症の重症度と負の相関を認めた(P<0.01)。A2A mRNA発現は術後一過性の上昇を示し、術後合併症と関連を認めなかった。PMN分画の解析:PBMC分画に認められた術後感染や臓器不全との関連は認められなかった。脂質Mediatorの代謝経路にも術後感染や臓器不全との関連は認められなかった。<結論>ATP-P2X7シグナルはTh1/Th2 balanceと関連し、術後早期の感染防御に関与し、TLRsは術後感染例における起因菌排除に関与する。

過大侵襲時の重症感染症発症機序にはP2X7を介したDAMPSシグナルとTLRsを介したPAMPSシグナルが極めて重要な役割を果たすと考えられた。