hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
主観的感情強度の時間変化に関する研究

本研究では感情の主観的な時間変化を心理生理学的に検討した。はじめに主観感情強度をリアルタイム計測するシステムを製作した。これを用いて計測すると、感情喚起刺激の提示に伴い感情強度は10秒程度の間増大することが分かった。その後は、たとえ感情喚起刺激が提示されていても感情強度は徐々に低下した。こうした感情の喚起に伴い、脳波は感情との関係を表す前頭部の左右差モデルやアルファ波の揺らぎモデルを一部支持する結果を示した。私達はネガティブな感情を体験すると、その感情に強く支配された状態が続くことを知っている。一方で、こうした感情は時間が経つと消失してしまう。本研究はこのような感情の時間変化を明らかにしようとする試みである。本年度は、まず、主観感情強度のリアルタイム計測システムの製作と信頼性確認を行った。Griffin社製PowerMateを用いてノブ型評価装置を試作し、その動作特性を検討したところ、最小の心理変化の表現に約4度ノブを回転させる必要があること、また、回転量と変化する目盛りの間には直線的な関係があることを確認できた。さらに、この装置を用いて異なる周波数に対する主観的な音量を評価する実験を行ったところ、従来報告されている聴感度曲線と類似した結果を得ることができた。このことから、開発した装置が心理量を精度良く表現し、十分に信頼性のある計測方法であることを確認した。次に、匂い刺激を提示した際に生じる快不快感情の時間変化を検討した。実験参加者16名に対して快または不快感情を喚起する匂い刺激をそれぞれ150秒間提示した。開発した装置を用いた主観感情評価からは、匂い提示後40秒程度まで感情強度が高まり、その後は一定水準を推移する変化が示された。同時に記録した生理指標、特に脳波活動の分析からは、不快な匂い提示において相対的な前頭部の右活性や左前頭部におけるα波周波数のゆらぎ係数に低下がみられた。これらの変化は、主観感情強度変化と必ずしも対応しなかったが、不快感情に対する従来の知見と一致した。平成22年度は昨年度行った予備実験を踏まえて、快または不快感情を喚起する匂い刺激を提示し、セッション中の主観感情強度変化をノブ型装置により、また、生理指標として脳波を継時的に記録した。匂い刺激を呈示すると、主観的感情強度は刺激後30s程度まで上昇し、その後一定強度を保った。快不快による大きな違いはみられなかった。脳波については、左右差指数から不快条件のときに右前頭部が相対的に賦活することが示され、前頭部の感情側性化モデルの賦活パタンと一致した。さらに、左右前側頭部位間のコヒーレンスは、不快感情を喚起する匂い刺激呈示に伴い低下した。コヒーレンスの低下は部位間の関連性の低さを示すことから、不快条件では、刺激呈示に伴い左右前頭部のそれぞれが、より独自に機能している可能性があった。また、不快条件における特徴はゆらぎ係数においても確認できた。不快条件のゆらぎ係数は、その他の条件よりも大きく、従来のゆらぎのモデルを支持した。次に、匂い刺激に代えて画像刺激を用いて実験してみると、感情状態に伴う前頭部の脳活動に左右差は確認できなかったが、刺激呈示開始直後のコヒーレンスやゆらぎ係数の変化が認められ、このことが刺激提示に伴う一過的な応答に対応したものと考えられた。さらに、感情喚起画像の提示時間操作し(60ms、600ms、6s、60s)、条件間で比較してみる実験を行った。主観評価では提示時間に関らず画像提示中は主観感情強度も一定の変化を示した。一方、生理指標ではどの条件でも画像提示に伴い一過的な覚醒反応が認められた後、緩やかに低下するといった定位反応と慣れの文脈が当てはまった。これまで感情の時間変化を明らかにするために、感情喚起刺激の提示時間を操作して、感情の主観応答を検討してきた。平成23年度は、刺激が誘引した感情状態に対して、新たな感情喚起刺激をプローブとして提示した。実験1では先行画像として快、不快及び中性画像のどれか一つを提示中に、新たな画像を後続画像として提示した。先行画像がもたらす感情の喚起、持続、消失の各フェイズ(0.2s、8s、20s)において後続画像を提示することで、生じる感情応答を提示フェイズ間で比較した。これまでと同様にノブ型装置を用いた主観感情評価の時間変化を検討してみると、先行画像と後続画像刺激が同一条件の場合は、後続画像に対する主観評価(回転量)が抑えられていた。これは後続画像刺激に対する慣れによるものと考えられた。先行画像と後続画像が異なる場合は、先行画像の快画像の提示時間が0.2s条件において後続画像に対する不快評価が低下した。このことは、快感情が十分に認識できる場合に不快刺激が与えられると、その際に生じる不快感情はリバウンド現象のように増強する可能性を示唆した。続いて、実験2では時系列的な感情変化に注目して、感情S1-S2パラダイムを感性情報の評価に用いることを試みた。感情S1-S2

パラダムではS1(手掛り刺激)とS2(標的刺激)の2つの刺激を系列として提示した。この課題は標的刺激が感情を喚起する刺激であり、手掛り刺激は到来する標的刺激の感情内容に関する暗黙の期待を導く刺激である。この刺激パラダイムに伴う刺激先行陰性電位(SPN)や後期陽性電位(LPP)を計測することで、感情画像の予期や期待に関連した脳波活動を検討した。その結果、SPNは到来画像への顕在的な期待を反映し、LPPは期待と到来画像との整合性を反映することを示唆した。
シニアのためのコミュニティソフトウェアの開発

シニアのためのコミュニティソフトウェアの研究を行った。具体的には、以下の内容について開発を行った。1.シニアがWEBコミュニティ利用をサポートするためのリモートサポートシステムの研究シニアの初心者ユーザはソフトウエアの学習において、しばしば操作方法を'忘れて利用できなくなることがある。これを防ぐために、シニアの操作を遠隔からサポートすることが有効である。本研究では、リモートコントロールのためのソフトウエアとシニアユーザのためのソフトを組み合わせ、さらに音声コミュニケーションのためのソフトウエアを組み合わせて効果的なリモートサポートのシステムについて研究を行った。ITボランティアメンバーによる利用実験を通して、システムの有用性を確かめた。2.シニアのグループ活動を支援するコミュニティシステムの開発シニアのグループ活動を支援し、円滑なグループ活動を支援するためのWEBコミュニティソフトを設計・試作した。これは、通常のコミュニティ支援システムに比べ機能を絞って簡単に使えるものであり、初心者のシニアユーザでも容易に利用可能なシステム設計を行った。このコミュニティソフトを使うためのオンライン教材も開発して、シニアグループはネットワークを通じ、どこでもこのコミュニティソフトの利用法を学習し使いこなすことが可能である。実際にいくつかのグループ活動に利用した実験では非常に使いやすいコミュニティソフトであるとの評価を得た。シニアのためのコミュニティソフトウエアの研究を行った。1.シニアがWEBコミュニティに参加するのをサポートするシステムの開発シニアユーザが円滑にインターネット利用をサポートするためには適切にサポートすることが必要となる。シニアユーザ向けパソコンソフトe-なも君のためのコールセンターでの問い合わせ内容を分析し、コールセンターでの適切な対応を与える知識ベースの対応サポートシステムを開発した。また、この知識ベースをシニアパソコンソフトを教育するボランティア講師が参考にし、より適切な教育を可能にするサポートシステムを開発した。2.シニアのためのWEBコミュニティソフトの開発シニアパソコンユーザのパソコン利用をサポート・ガイドし、コミュニティ形成を促すためのWEBコミュニティソフトを設計・試作した。これは、シニアユーザが自分でパソコンの新しいソフトやサービスを利用することをサポートする学習サイトを備えており、回りに相談する人が少ないシニアユーザをサポートすることを目指す。また、シニアユーザ間の相互サポートを促し、個々のユーザの情報発信を可能にするWEBコミュニティソフトを設計・試作した。3.地域コミュニティの安全・安心をサポートするWEBシステムの開発名古屋市の一つの区を対象にして、その地域での安心・安全情報を効果的に収集して住民の間で情報共有を可能にするシステムを開発した。このシステムの開発には、その地域での住民、商店、行政担当者などに参加してもらい地域の意見を汲み取ってシステムの開発を行った。シニアのためのコミュニティソフエアの研究を行った。1.シニアがWEBコミュニティ利用をサポートするためのリモートサポートシステムの研究シニアの初心者ユーザはソフトウエアの学習において、しばじば操作方法を忘れて利用できなくなることがある。3.シニア初心者のためのパソコン学習支援ツールの開発すでに開発しているパソコン初心者のためのメール・インターネット利用ソフト「eなもくん」の汎用化のためのシステム設計を行った。このソフトの開発により名古屋市に限定していた利用者を全国に広げることが可能になるとともに、シニア初心者にとって障壁となっていた本入認証のプロセスを簡略化した。またキーボード操作を学習するための支援シールを開発し、キーボード学習を容易にした。
肢芽前方部に存在する新しいシグナルセンターの解明

本研究では、肢芽の前方部に存在すると予想されるシグナルセンターを解明する目的で、肢芽前部に特異的に発現する遺伝子の検索を行った。その結果、新規のPaired typeのホメオボックス遺伝子であるAlx4を単離した。この遺伝子は、ニワトリとマウスの両者で肢芽の発生直後から肢芽前部に限局して発現していた。この発現パターンは、ソニックヘッジホグ(Shh)の初期発現とは相補的であった。マウスの遺伝学的なデータを利用して解析したところ、この遺伝子は、マウスの有名な軸前性多指症であるStrong's luxoid(lst^ )の位置にマップされた。詳細に検討を加えたところ、lst^マウスのAlx4遺伝子に16bpの欠失が見つかった。これは、Alx4の変異が、Shhの異所的発現を肢芽前部に引き起こすこと、Alx4はShhの発現を負に調節して肢芽後部に発現を限局させていることを示していた。ニワトリを使って詳細に確認したところ、Shhを肢芽前部に作用させるとAlx4の発現が極めて急速に抑制されること、Alx4の発現はShhの発現より早く起こることなどの知見が得られた。また、Alx4は、肢芽前部に発現する他のGli3とは全く別のシグナル経路で働くことが明らかとなった。以上の知見を総合すると、肢芽では、その発生の初期にAlx4が肢芽前部で発現してShhに抑制的に働き、Shhは肢芽後部に限局して発現する。その後、ShhもAlx4に抑制的に働く結果、Alx4は前部に、Shhは後部に発現が相補的に維持される。肢芽の発生後期には、Gli3などの遺伝子がShhの発現を負に地調節しながら肢芽の前後軸の非対称性を維持確立していく。このような負の調節関係が乱れると、Shhが肢芽前部で異所的に発現し、軸前性多指症を引き起こす。したがって、肢芽の前後軸は前部と後部との密接な相互作用から決定されることを示している。このような知見は、これまでの理解をより広く、かつ深くする物であり、医学的にも重要な発見である。本研究によって、平成10年度は新規の転写因子Alx4の機能解析で新しい知見を得た。Alx4はpaired型のホメオドメインをもつ転写因子で、本研究により単離され、肢芽の前方部にのみ発現することが明らかとなった。レチノイン酸とソニックへッジホグ(Shh)との関連を探る目的で、これらの因子を肢芽前方部に作用させると,Alx4の発現が抑制されることが明らかとなった。したがって、Alx4はレチノイン酸やShhと拮抗的に働くことが予想された。また、マウスのAlx4を染色体上にマップしたところ、Strong`s luxoidとよばれる軸前性多指症変異マウスの位置に一致した。この変異マウスからAlx4遺伝子を単離し解析したところ16bpの欠失が確認された。

これらの事実は、Alx4がStrong`s luxoidの原因遺伝子であること、またStrong`s luxoidの肢芽では前方部に異所的にShhの発現をみることから、Alx4が肢芽前方部でShhの発現を抑制していること、Alx4の変異でこの抑制がはずれてShhが発現して軸前性多指症を引き起こすことが明らかとなった。すなわち、肢芽においては前方部のAlx4と後部のShhの間にnegative feedbackが存在し、この調節関係が肢芽の前後軸の決定に重要であると結論できる。平成10年度では肢芽前方部に存在すると予想させるシグナルの実体は明らかにできなかったが、Alx4遺伝子の発見は肢芽の前後軸がShh単独で一義的に決まるのではなく、前後のシグナルの拮抗的な関係の上に成り立つことを明らかにした。本研究では、肢芽の前方部に存在すると予想されるシグナルセンターを解明する目的で、肢芽前部に特異的に発現する遺伝子の検索を行った。その結果、新規のPaired typeのホメオボックス遺伝子であるAlx4を単離した。この遺伝子は、ニワトリとマウスの両者での肢芽の発生直後から肢芽前部に限局して発現していた。この発現パターンは、ソニックヘッジ゚ホグ(Shh)の初期発現とは相補的であった。マウスの遺伝学的なデータを利用して解析したところ、この遺伝子は、マウスの有名な軸前性多指症であるStrong's luxoid(Ist')の位置にマップされた。詳細に検討を加えたところ、Ist'マウスのAlx4遺伝子に16bpの欠失が見つかった。これは、Alx4の変異が、Shhの異所的発現を肢芽前部に引き起こすと、Alx4はShhの発現を負に調節して肢芽後部に発現を限局させていることを示していた。ニワトリを使って詳細に確認したところShhを肢芽前部に作用させるとAlx4の発現が極めて急速に抑制されること、Alx4の発現はShhの発現より早く起こることなどの知見が得られた。また、Alx4は、肢芽前部に発現する他のGli3とは全く別のシグナル経路で働くことが明らかとなった。以上の知見を総合すると、肢芽では、その発生の初期にAlx4が肢芽前部で発現してShhに抑制的に働き、Shhは肢芽後部に限局して発現する。その後、ShhもAlx4に抑制的に働く結果、Alx4は前部に、Shhは後部に発現が相補的に維持される。肢芽の発生後期には、Gli3などの遺伝子がShhの発現を負に地調節しながら肢芽の前後軸の非対称性を維持確立していく。このような負の調節関係が乱れると、Shhが肢芽前部で異所的に発現し、軸前性多指症を引き起こす。したがって、肢芽の前後軸は前部と後部との密接な相互作用から決定されることを示している。このような知見は、これまでの理解をより広く、かつ深くするものであり、医学的にも重要な発見である。
カルスト地形の発達に及ぼす森林の影響の定量化

本年度は,昨年度からの観測の継続と解析,結果のとりまとめを行うとともに,国際会議において研究成果を発表した。具体的な内容は以下のとおりである。1.福岡県平尾台のカルスト湧泉(2カ所)を固定観測点として,流出量と雨量の計測,および溶存成分濃度の観測を行った。昨年度から約1年間の継続観測ができた。さらに平尾台における湧泉の流域界の検討と,地下の空洞分布について調査した。2.台湾タロコ峡谷のカルスト湧泉(1カ所)を固定観測点として,平尾台と同様に流出量,雨量および溶存成分濃度の通年観測を行った。また,同地域の広い範囲に渡って河川水,湧水を調査するとともに,空洞分布の調査をおこなった.3.上記調査の結果からそれぞれの観測地点における溶食速度を算出し,グローバルなデータと比較検討した。さらにカルスト地域の溶食速度とカルスト地形の発達程度(空洞率),流域の植生,地質構造等との関係について解析した。4.上記研究成果の一部(台湾での研究結果)を,アメリカで開催された国際地質対比計画(IGCP)No.379「カルスト過程と炭素循環」のプロジェクトミーティングにおいて発表した。<本年度の研究概要>1.カルスト地域の溶食速度の算出方法と現地調査の方法について検討した.2.福岡県平尾台のカルスト湧泉(2カ所)を固定観測点として,水位計を設置し計測を開始した.同地域において湧泉の流域界の検討と,地下の空洞分布の調査をおこなった.3.新たに台湾タロコ峡谷石灰岩帯を調査対象地とし,カルスト湧泉(1カ所)を固定観測点として,水位計を設置し計測を開始した.同地域の広い範囲に渡って河川水,湧水の調査をおこなうとともに,空洞分布の調査をおこなった.<次年度の研究計画>′1.固定観測点での計測を継続し,結果をとりまとめて溶食速度を算出する.2.固定観測点以外での国内のカルスト地域において調査をおこない,溶食速度を推定する.3.これらの結果をとりまとめ,カルスト地域の溶食速度に及ばす因子を,(1)地下の空洞率,(2)気候,(3)地質構造等との関係で整理する.本年度は,昨年度からの観測の継続と解析,結果のとりまとめを行うとともに,国際会議において研究成果を発表した。
咀嚼刺激による脳由来神経栄養因子を介した生活習慣病抑制効果に関する研究

習慣的咀嚼負荷の差異が耳下腺の糖代謝ならびに脂質代謝関連遺伝子の転写レベルに影響する可能性を、マウスにおいてマイクロアレイ解析によって示唆した。肥満糖尿病マウス並びに正常マウスのそれぞれを2群に分けて、同一組成の固形飼料あるいは粉末飼料で飼育し、耳下腺サンプルを採取した。肥満糖尿病マウスでは搭載遺伝子の約35%、また同系統の正常マウスの耳下腺では約60%の遺伝子の転写レベルにおいて、飼育飼料間で統計学的な差が認められた。有意差が認められた遺伝子の転写レベルは、いずれも固形飼育>粉末飼育であった。肥満抑制の一端を歯科医療が担う新たな経路を見出したいと考え、糖や脂肪代謝への関与が指摘されている脳由来神経栄養因子BDNFに着目した。BDNFには血液に依る作用と神経シグナルとしての作用が想定され、咀嚼との関係では動物において、咀嚼が大脳海馬神経のBDNF発現を亢進することの他に、ストレス負荷時に生じる顎下腺導管上皮によるBDNF産生が木棒齧りでさらに亢進し、BDNF血中濃度上昇の主因であるとの報告がなされている。本年度は通常状況下での咀嚼刺激が、血液あるいは唾液中のBDNFレベルを増加させる可能性について、ボランティアを募って検討した(本学倫理委員会承認288)。被験者は19-30才の健康な男女25名で、咀嚼刺激群20名においては安静時、20分の無味ガム咀嚼時間の開始時と終了時の3時点で3分間唾液を採取した。このうちの11名では留置針を用いて、咀嚼開始前、咀嚼終了直後と終了後30分の3時点で血漿用採血管に採血した。対象群5名は咀嚼なしで前群と同じ時点で唾液と血液をサンプリングした。濃度測定にはELISAキット3lotsを使用したが、検量線でいずれも99%程度のr^2値が出るがその吸光度は低めで感度が低く、唾液では検出限界未満であった。新たなBDNF測定法を検討し、検出抗体結合ビーズを使用し、同時に多項目測定が可能で感度も高いといわれるマルチプレックス分析機による測定を実施した。血漿サンプルではELISAに比べ高い濃度を示しvariationは大であった。唾液サンプルでは2.5-10.0pg/mlの濃度が示された。両サンプルとも3時点における濃度は一定した変化傾向を示さなかったが、個人ごとの3時点の値は似たレベルを示した。また安静に過した非咀嚼被験者の血漿濃度にも3時点間で変動がみられたことから、血漿BDNFレベルは個人差が大きく、潜在的な変動要因の影響も考えられた。生活習慣病と歯周病の関係が次々明らかにされているが、口腔機能と生活習慣病との関係についての報告は少ない。我々は生活習慣病予防の要である肥満抑制の一端を歯科医療が担う新たな経路を見出したいと考え、糖代謝の改善効果と咀嚼により発現が誘導されうる脳由来神経栄養因子BDNFに着目している。血糖値を直接低下させるのはインスリンのみであるが、最近、肝臓の求心性神経シグナルが膵臓β細胞のインスリン分泌を亢進することが報告された。I.本年度は咀嚼関連の神経シグナルによる糖代謝への影響を生理的条件下で捉える実験法の開発を「目指し、ラット20匹余を用いて自発かつ持続的な咀嚼の誘導法の確立を試みた。各咀嚼誘導法につき4匹以上を用いて2回以上測定した。結果の概略は1.ラットは集中力や味・香りの嗜好に明白な個体差を示した。2.数種の木片、「複雑な形状の囓り棒、囓り堅紙、特注の香料・無カロリー飼料は、初回はどのラットも囓るが、週齢が進むと飽き易く持続性が減じた。3.絶食後は週齢を問わず4gのペレット1ケを完食した。4.高週齢でも氷砂糖は好んで囓った(6/9匹が15分の観察中に10分以上)。研究に先立ち小動物に対する持続的咀嚼誘導法を広く探したが報告は見あたらなかった。実験小動物にストレスを負荷せずに、自発かつ持続的な咀嚼の誘導法を得たことは意義深い。II.糖尿病動物では肝臓のBDNFと特異受容体の発現が亢進するとの報告をもとに、TSOD肥満モデルマウスを同質の固形飼料と粉餌で飼育した。8匹ずつの集団飼育で毎週2回測定したところ、糖尿病の特性である多飲性について、尿糖発現が顕化した時期以降は予想に反し、常に固形飼育>粉餌飼育マウスの飲水量であった。

この結果からは糖代謝制御に粉餌の口中への取込嚥下に至る機能の関与もうかがえた。今後はまず個別飼育下で飲水量と食餌量を確認し、血糖値等との関係を解析する。エネルギー代謝性の生活習慣病への咀嚼の作用について世間で度々取り上げられるが、語られる内容は専ら食事中の咀嚼による満腹中枢活性化に関係する事項である。H24年度に我々は、咀嚼負荷習慣の代謝関連遺伝子発現への影響の有無を明らかにする目的で動物実験を行い、膵臓と肝臓のほか、耳下腺ならびに顎下腺を対象に加えて、DNAチップ解析を実施した。肥満・糖尿病モデルマウスTSOD♂(以下肥満マウス)及び同系統の正常マウスTSNO♂を、同一組成の固型飼料と粉末飼料で8週齢から3ヶ月間飼育し、経時的に随時血糖検査とブドウ糖試験を行って各個体の耐糖能特性を確認した。サンプリングは、前夜から絶食させた動物にブドウ糖液を体重1kg当り1gを腹注投与し所定の時間に組織を採取して液体窒素にて凍結した。遺伝子発現比較は各群3匹または4匹で行い、解析には194ヶの糖・脂質代謝関連遺伝子を搭載したマウスメタボリックDNAチップ(三菱レイヨン株ジェノパール)とチップ解析ソフト等を用いた。【結果】膵臓、肝臓、顎下腺試料では、固型飼料と粉末飼料飼育マウス間で発現レベルに有意差(p<0.05)のある遺伝子は0または少数であった。しかし耳下腺については多数の遺伝子が比較群間で有意差を示した。固型飼料飼育と粉末飼料飼育との比較では、正常マウスで114ヶ、肥満マウスで71ヶの遺伝子の発現レベルに有意差が認められ、有意差のあった遺伝子では、シグナルはいずれも固型飼料飼育>粉末飼料飼育であった。また固型飼料で飼育したマウス間の比較では54遺伝子に有意な発現差が認められ、シグナルは全て正常マウス>肥満マウスであった。以上の結果から、1)咀嚼負荷習慣は耳下腺の糖・脂質代謝関連遺伝子の発現に影響すること、2)肥満マウスの耳下腺では正常マウスに比べて糖・脂質代謝関連遺伝子の発現活性が低い可能性が示唆された。BDNFの糖代謝改善効果についてはいくつか報告がある。本課題において、咀嚼の糖代謝への関与についてBDNFを柱として検討するに当たってまず、体液を介した遠隔作用か、それとも組織内/or組織、中枢の神経応答に焦点を絞るかという点で、H22年度の咀嚼刺激によるヒト血液と唾液中BDNFレベル変化の検討から後者に重点を置くと判断した。従って動物実験ということで、H23年度はストレス負荷に依らない自発的咀嚼の誘導法を検討し、2/3の小動物が10分を超えて持続的に咀嚼する誘導法を得た。また肥満モデルマウスの集団飼育下、食餌性状によって糖尿病特性の多飲性の程度に差が出ることが示され、今後の研究の進展に繋がる重要な結果を得た。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.肥満モデルマウスを咀嚼負荷(食餌性状)異にして個別飼育し、多飲性の確認の他、摂餌量、血糖値、体重の関係を詳しく解析する。2.咀嚼負荷(食餌性状)異にして飼育した肥満モデルマウスから血液を採取し、インスリン系について解析する。3.これらのマウスから採取した膵臓サンプルにおいて、ふたつの飼育マウス間で示された差異が、主としてβ細胞のインスリン産生能に依るのか、β細胞の存在数に依るのかを検討する。4.糖尿病モデル動物では肝臓でBDNFと受容体の発現が亢進するといわれるが、食餌性状を異にするマウス間においてこれらの発現に差異がみられるかどうかによって、2の結果にBDNF系が関与する可能性の有無を検討する。
動物考古資料の食餌推定に基づく飼養化個体判別法の構築

本研究は、歯の表面に残される微小な傷「マイクロウェア」を、野生動物が家畜化される過程で生じた採食生態の変化指標とすることで、考古遺跡から出土した動物依存体の新たな分析手法を確立することを目指した。中でも、食肉資源として重要であり、かつ定住型農耕文化に典型的な家畜とされるブタと、その野生原種であるイノシシの判別に有効な指標の発見を主目的とした。最終年度は、これまでに得られたデータの分析と成果発表に加え、予察的な研究を開始した。具体的内容は以下の通りである。1.野生下で捕獲後に、屋内で飼料を給餌されたイノシシ集団では、磨耗痕の深さ・体積が増加した。また、野生でも、エサの違いは磨耗痕に表出することがあきらかとなり、本手法が生態の連続的な変化を高精度で検出できた。磨耗痕の形状評価にISO25178「表面粗さパラメータ」を採用したことで、再現性の高い資料分析が可能になるとともに、磨耗痕が動物の食性推定に有効なこと、食餌の内容や飼育環境の推定を通じて家畜化過程の研究に適用できることがあきらかとなった。2.イノシシ類の臼歯にみられる巨視的な形状変異を個体群間で幾何学的に比較解析し、形態学的な類似性から検証した結果、イノシシの下顎臼歯にみられる輪郭の形状は、地理学的・遺伝学的に近い集団間で相対的に類似することをあきらかにした。同様の比較を出土資料に適用すれば、地理学的・遺伝学的距離の相対値が計算できるため、各地域の在来家畜が野生種を基に作出されたのか、または他地域から導入されたのかを、出土資料の生化学的な保存状態によらず推定できる。これにより、家畜伝播ルートの解明が飛躍的に進展すると期待できる。以上の成果は、それぞれ国際学会および国際誌面上で発表し、内外の研究者と活発に議論を展開した。家畜品種とその野生原種は、形態学的および遺伝学的変異が大きく、先史時代の遺跡から出土した動物骨をもとにした両者の判別には困難がともなう。そこで本研究は、「生前、ヒトに飼養されていたのか否か」という視点を導入することで、この問題の解決を目指す。その具体的手段として、採食行動にともない歯の表面に残される微小な傷「マイクロウェア」に注目した。野生原種が人間の生活圏に接近し、本来の食性から、人間の残飯食などへ食餌を変化させていく過程では、採食行動に伴い口中に取り込まれる磨耗物質(地表中の砂塵や、食餌である植物体中の珪酸体など)の含有量や組成も変化すると予想される。この磨耗物質の違いは、食餌の咀嚼にともなって臼歯のエナメル質表面に残されるマイクロウェアの形状の違いに反映されることが知られており、既に野生種間や種内の食性の違いの判別に用いられている。そこで、この手法を動物考古試料に適用することで、食性の違いから野生原種と家畜品種を判別できる可能性が高いと考えた。また本研究は、マイクロウェアの三次元形状を共焦点レーザ顕微鏡で取得し、工業規格(ISO25178)により定量化することで、観察者間の誤差を排除することとした。平成28年度は、家畜品種のなかでも食肉資源として特に重要なブタの野生原種であるイノシシについて、現生種にみられるマイクロウェアの形状をデータベース化するとともに、ISO規格による定量化、および生息環境に応じた比較を実施した。その結果、歯の表面に残されたマイクロウェアの深さや体積が、食性の変化に応じて統計学的に有意に異なることを確認した。また、琉球列島地域の先史時代遺跡から出土したイノシシ類の資料を先行的に観察し、いずれの出土資料もマイクロウェアの保存状態が非常に良好であり、本手法が当該地域の出土資料にも問題なく適用できることを確認した。家畜品種に対するデータ収集が遅れている。特に、屋外放牧集団など、動物考古資料へ本手法を応用する際の重要な基盤的知見となるであろう資料の収集と充実化を行う必要がある。そこで、平成29年度より、国内の養豚農場関係者と、資料の入手や、飼育条件の観察記録など、研究協力体制の構築に向けた具体的な交渉を開始している。一方で、琉球列島の遺跡出土資料については、年代や地域をほぼ把握するとともに、所蔵先機関との良好な研究協力体制を構築することができた。さらに、一部の出土資料について、歯の表面の保存状態を顕微鏡下で確認したところ、現生種と遜色ない保存状態が維持されていることが判明し、マイクロウェアの解析が問題なく適用できることを確認した。当該年度は、考古学的研究の基盤となる現生動物の資料に関連して、これまで得られたデータの分析と、新たに入手した家畜品種の資料からデータを収集する作業を進めた。データ分析の結果、野生環境下にあるイノシシでは線条痕様のマイクロウェアが卓越することが明らかとなった。

一方、野生環境下で捕獲した後、屋内で配合飼料により飼養した「イノシシ」の歯の表面では、不定形の陥没様のマイクロウェアが卓越することが明らかとなった。これらの観察結果は、歯の表面形状を共焦点レーザ顕微鏡により三次元座標として計測し、国際工業規格(ISO25178)が定義する「表面粗さ」パラメータによって定量比較した結果からも支持された。以上のことから、採食生態の違いが歯のマイクロウェアに表出するとした仮説の妥当性が確かめられた。一方で、イノシシ・ブタのような雑食性動物では、マイクロウェアの個体差が大きいことも判明した。次に、琉球列島から出土した考古資料のデータを、地域・時代別に現生資料と比較分析した。その結果、一部地域では、従来の文献資料に基づく通説よりもはるかに古い時代から動物が飼養されていたことが示唆された。当該年度は、沖縄本島の生産農家と研究協力体制を構築した結果、前年度の課題だった家畜資料の入手が可能になった。既に多数の資料を標本化しており、今後、マイクロウェア解析における考古資料群内の個体差が分析結果に与えうる影響を評価する際の基盤となることが期待される。また、研究協力者によって、マイクロウェア解析に用いる共焦点レーザ顕微鏡とソフトウェアを組み合わせる際のプロトコルを最適化する研究も進み、方法論としての成熟度も高まりつつある。本研究は、歯の表面に残される微小な傷「マイクロウェア」を、野生動物が家畜化される過程で生じた採食生態の変化指標とすることで、考古遺跡から出土した動物依存体の新たな分析手法を確立することを目指した。中でも、食肉資源として重要であり、かつ定住型農耕文化に典型的な家畜とされるブタと、その野生原種であるイノシシの判別に有効な指標の発見を主目的とした。最終年度は、これまでに得られたデータの分析と成果発表に加え、予察的な研究を開始した。具体的内容は以下の通りである。1.野生下で捕獲後に、屋内で飼料を給餌されたイノシシ集団では、磨耗痕の深さ・体積が増加した。また、野生でも、エサの違いは磨耗痕に表出することがあきらかとなり、本手法が生態の連続的な変化を高精度で検出できた。磨耗痕の形状評価にISO25178「表面粗さパラメータ」を採用したことで、再現性の高い資料分析が可能になるとともに、磨耗痕が動物の食性推定に有効なこと、食餌の内容や飼育環境の推定を通じて家畜化過程の研究に適用できることがあきらかとなった。2.イノシシ類の臼歯にみられる巨視的な形状変異を個体群間で幾何学的に比較解析し、形態学的な類似性から検証した結果、イノシシの下顎臼歯にみられる輪郭の形状は、地理学的・遺伝学的に近い集団間で相対的に類似することをあきらかにした。同様の比較を出土資料に適用すれば、地理学的・遺伝学的距離の相対値が計算できるため、各地域の在来家畜が野生種を基に作出されたのか、または他地域から導入されたのかを、出土資料の生化学的な保存状態によらず推定できる。これにより、家畜伝播ルートの解明が飛躍的に進展すると期待できる。以上の成果は、それぞれ国際学会および国際誌面上で発表し、内外の研究者と活発に議論を展開した。食性が既知の現生種資料、とくに家畜品種の資料入手と分析を優先的に推進し、方法論の妥当性と信頼性を検証する。そのうえで、現生種データを比較基準として、出土資料の比較分析を実施する。現生資料に対しては、特に家畜資料について、飼料の内容や飼育環境といった情報とマイクロウェアを関連付けることで、個体レベルで飼養の程度を推定可能な解析モデルの構築を目指す。
人口電磁環境の生体作用の定量的解析と安全性評価

近年,高圧送電線・各種の高出力電気機器など強力な電磁源が日常空間に現れ,我々は人類史上未経験の人工電磁環境にさらされている.最近,これらの電磁環境が生体に対しストレス性を有していること,生体の日周リズムに影響を及ぼすことなどが知られ,その解明が急がれている.欧米では既に多くの研究が行われているが,現在のところ影響を発現する生体曝露量の閾値や条件はほとんど未知に等しく,研究者間でも統一された見解はみられない.そこで,人工電磁環境の生体作用の定量的解析をめざし,数値解析法ならびに電界関知閾値の計測法を開発するとともに,それらを人体や実験動物に適用し影響評価を試みた.前者の生体爆露量解析により,人体に対する電界集中の分布および集合の度合い(印加電界値に対する比,enhancement factor)を定量的に求めることが可能となった.この解析をとおし,enhancement factorが空間イオンの存在によって大きく左右されることが明らかとなった.また,人体と動物ではenhancemet fatorが大きく異なること,また同じ動物でも姿勢によってその値が異なることが明らかとなった.これらの値は,実験動物を用いた曝露実験の結果を人体の場合に外挿する際に重要な情報となる.後者の電界感知閾値計測手法により,ヒトの電界感知閾値の解析が可能となった.この解析をとおし,相対湿度の変化に伴い電界感知閾値が顕著に変化する可能性が認められた.今後この解析を進め,平行して行っている電界のストレス性の解析結果と総合することにより,これまでより信頼性の高い生体作用の定量解析が可能となると思われる.これらの手法は,生体影響が報告されるたびに論争となる再現性の問題や安全基準値の問題に対し,有効な解決手段を提供するものと考える.近年,高圧送電線・各種の高出力電気機器など強力な電磁源が日常空間に現れ,我々は人類史上未経験の人工電磁環境にさらされている.最近,これらの電磁環境が生体に対しストレス性を有していること,生体の日周リズムに影響を及ぼすことなどが知られ,その解明が急がれている.欧米では既に多くの研究が行われているが,現在のところ影響を発現する生体曝露量の閾値や条件はほとんど未知に等しく,研究者間でも統一された見解はみられない.そこで,人工電磁環境の生体作用の定量的解析をめざし,数値解析法ならびに電界関知閾値の計測法を開発するとともに,それらを人体や実験動物に適用し影響評価を試みた.前者の生体爆露量解析により,人体に対する電界集中の分布および集合の度合い(印加電界値に対する比,enhancement factor)を定量的に求めることが可能となった.この解析をとおし,enhancement factorが空間イオンの存在によって大きく左右されることが明らかとなった.また,人体と動物ではenhancemet fatorが大きく異なること,また同じ動物でも姿勢によってその値が異なることが明らかとなった.これらの値は,実験動物を用いた曝露実験の結果を人体の場合に外挿する際に重要な情報となる.後者の電界感知閾値計測手法により,ヒトの電界感知閾値の解析が可能となった.この解析をとおし,相対湿度の変化に伴い電界感知閾値が顕著に変化する可能性が認められた.今後この解析を進め,平行して行っている電界のストレス性の解析結果と総合することにより,これまでより信頼性の高い生体作用の定量解析が可能となると思われる.これらの手法は,生体影響が報告されるたびに論争となる再現性の問題や安全基準値の問題に対し,有効な解決手段を提供するものと考える.
ヌードマウスのウイルスによる原発腫瘍を利用した日和見発癌の基礎的研究

ヒトエイズの患者や、免疫抑制剤服用者にウイルスによる日和見発癌が多い。エイズ患者におけるEBウイルスによる白血病の発生には、免疫不全によるEBウイルス増殖が強いことと、EBウイルスにより不死化したB-リンパ球が宿主の免疫力低下のため排除されず腫瘍性に増殖したためと考えられる。本研究ではヒトの日和見発癌のモデル動物実験系の開発を目的とした。マウスのレトロウイルスは、内在性レトロウイルスを含め、その病原性が明らかでないものが多い。これらのウイルスは、新生児マウスに感染させても、病原性を確認できないものが多く、これまで非病原性ウイルスと考えられていた。病原性の明らかでなかったマウス白血病ウイルス株SLv-1,WN1802BやBM5eco株をBALB/cやCBA系のnudeマウスの新生児に感染させたところ、高率に白血病が発生することが明らかになった。これらのウイルスは、BALB/cやCBAの正常新生児マウスに感染させても病原性はなく、ウイルスの増殖も弱いことが知られており、nudeマウスにおける日和見発癌と思われる。日和見発癌機構としてウイルスのnudeマウスでの増殖性の問題と、癌化細胞が個体レベルで増殖し、白血病となるための癌原性の問題が考えられる。nudeマウスに発生した白血病は大部分B系リンパ性白血病で、一部骨髄性白血病が存在することが明らかにされた。以上の研究はヒト日和見発癌の研究のモデル実験系として寄与することが多い。
マイクロペットを用いた低酸素性虚血性脳症の病態解明と治療法に関する研究

新生児ブタの低酸素性虚血性脳症(HIE)モデルでは、NOが増加し大脳にiNOSの出現が認められたがビオプテリンの増加が認められず、iNOSにより産生されたNOはビオプテリンが少ないためONOO-となり組織障害性に働き、脳細胞のグルコース取り込みが低下したと考えられた。この現象は、microPETの画像でFDGの取り込みの減少として認められた。治療としてビオプテリンが有効である可能性を示した。新生児の低酸素性虚血性脳症(HIE)は痙性対麻痺や他の神経学的後遺症を起こす予後不良な疾患であるが、病態の解明と有効な治療法の開発が望まれている。我々は新生仔ブタを用いたHIEモデルで、急性期の中枢神経系に誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)が発現し、血漿中ビオプテリン濃度が急激に上昇することを発見し、一酸化窒素(NO)はHIEに関与していることを明らかにした。低体温療法は、HIEに対する新しい治療法として最近注目されているが、我々はこの新生仔ブタHIEモデルを用いてテトラヒドロビオプテリン(BH4)と低体温療法が脳と他の臓器に及ぼす影響を検討している。さらにmicro positron emission tomography (マイクロペット)装置を用いてHIE発症の経過を糖代謝の変動を通して経時的に観察し、機能低下を定量的に測定する研究を行っている。本研究の目的はマイクロペットを用いた低酸素性虚血性脳症の病態解明と治療法の開発であるが、まず平成20年度はBH4の不足がHIEの発症に関わる病態解明するためBH4補充療法の開発を行った。BH4を静脈内に1時間当たり1mg/kgの割合でコントロール群とHIE群に4時間投与したところコントロール群では脳内のビオプテリン値に変化はなかったが、HIE群では脳内のビオプテリン値に有意の上昇を認めた。従来、脳に対するBH4補充療法は脳血液関門に阻まれ無効と考えられていたが、今回の実験でHIE群では脳血液関門を通過してBH4が脳内に移行するためBH4の補充療法が有効である可能性が示唆された。これまで一般に不可能と考えられていた脳内のBH4が低下している患者の脳に外部からBH4を投与し補充する治療法は、今回の研究からHIEの患者ではBH4が容易に脳血液関門を通過するためBH4の補充療法が可能であることを示したもので非常に重要な成果が得られた。我々は新生仔ブタを用いたHIEモデルで、急性期の中枢神経系に誘導性一酸化窒素合成酵素(iNos)が発現し、血漿中ビオプテリン濃度が急激に上昇することを発見し、一酸化窒素(NO)はHIEに関与していることを明らかにした。さらにmicro positron emission tomography(マイクロペット)装置を用いてHIE発症の経過を糖代謝の変動を通して経時的に観察し、機能低下を定量的に測定する研究を行っている。本研究の目的はマイクロペットを用いた低酸素性虚血性脳症の病態解明と治療法の開発を行っている。平成21年度は昨年度に続き、BH4の不足がHIEの発症に関わる病態解明するためBH4補充療法の開発を行った。

さらにmicro positron emission tomography(マイクロペット)装置を用いてHIE発症の経過を糖代謝の変動を通して経時的に観察し、機能低下を定量的に測定する研究を行っている。本研究の目的はマイクロペットを用いた低酸素性虚血性脳症の病態解明と治療法の開発を行っている。平成22年度は昨年度に続き、BH4の不足がHIEの発症に関わる病態解明するためBH4補充療法の開発を行った。BH4を静脈内に1時間当たり1mg/kgの割合でコントロール群とHIE群に4時間投与したところコントロール群では脳内のビオプテリン値に変化はなかったが、HIE群では脳内のビオプテリン値に有意の上昇を認めた。従来、脳に対するBH4補充療法は脳血液関門に阻まれ無効と考えられていたが、今回の実験でHIE群では脳血液関門を通過してBH4が脳内に移行するためBH4の補充療法が有効である可能性が示唆された。これまで一般に不可能と考えられていた脳内のBH4が低下している患者の脳に外部からBH4を投与し補充する治療法は、今回の研究からHIEの患者ではBH4が容易に脳血液関門を通過するためBH4の補充療法が可能であることを示したもので非常に重要な成果が得られた。
普遍的なDNA組換えにおけるDNAヘリカ-ゼの役割

バクテリオファ-ジT4のDNAヘリカ-ゼをコ-ドする遺伝子41(約1400塩基からなる)をクロ-ン化したプラスミドp415をハイドロキシルアミンで突然変異誘発処理した後、サプレッサ-を持たない大腸菌MH1細胞に導入した。得られた導入株に対してT4am41ファ-ジを感染させ、T4のDNA合成を早期停止型にするような変異型プラスミドを選別することにより1クロ-ン得た。この変異型プラスミドpHA153をもつMH1細胞にT4am41が感染したとき下記1ー5に示す異常が認められるが、これらの異常は全て遺伝子41の変異に基づくものであることが以下の観察から明かとなった。即ち、pHA153と野生型のp415との間で対応する制限酵素断片を順次交換した結果、遺伝子41の中央部分の約550塩基長の断片がpHA153由来であれば全ての異常を示した。次に変異型41遺伝子の示す表現型を系統的に調べたところ以下のようになった。1.DNA合成の早期停止2.バ-ストサイズの低下3.紫外線に対する高感受性4.遺伝的組換え能の低下5.細胞内で合成されるT4DNAには1ゲノム長より長いコンカテマ-型のものが少ない以上の表現型はすべて普遍的なDNA組換え能が低下していることを示す。従って、ここで得られた研究結果は遺伝子41がT4ファ-ジの普遍的DNA組換えに関与していることを強く示唆するものである。
遺伝子工学的手法による膀胱癌の組織異形発現過程の解析

1.cーerbBー2遺伝子産物の細胞内ドメインを認識するポリクロ-ナル抗体と細胞外ドメインを認識するモノクロ-ナル抗体を用いた免疫電顕により移行上皮癌における本産物の局在を調べた。その結果、両抗体の反応は細胞膜にみられたが、この他細胞間隙の無構造沈着物にもモノクロ-ナル抗体の反応がみられたことから、cーerbBー2産物の一部は癌細胞膜から細胞外へ放出される可能性が示唆された。2.cーerbBー2とEGFーRの遺伝子産物の対する抗体を用いて、それら産物の膀胱癌細胞における発現を検索し、病理組織所見と対比した。EGFーRの発現は組織異型度、腫瘍進達度に相関しないが、cーerbBー2はこれらと有意に相関し、組織異型度、腫瘍進達度が大きくなるにつれ高率かつ強陽性に発現する事を示し、膀胱癌における両遺伝子産物の機能的意義が異なることを明らかにした。3.ホルマリン固定パラフィン組織標本を用いてcーerbBー2産物の発現と予後の関係を調べた。本染色陽性例は26%であり、それらの5年生存率は陰性例に比較して有意に短縮していた。また、同一標本からDNAを抽出し、本産物発現には遺伝子増幅以外の機序も関わることを示唆した。以上からcーerbBー2発現が膀胱癌の悪性度の指標になる可能性を示した。4.癌化学療法を困難にする多剤耐性遺伝子mdr1の産物(PーGP;Pーglycoprotein)に対するモノクロ-ナル抗体MRKー16を用いて、正常賢組織、賢癌および膀胱癌におけるPーGPの局在を検索した。PーGPは細胞膜表面に存在し、発現頻度は腫瘍の異型度に相関しなかった。5.尿路上皮癌を発症したcancer family syndromeの1家系の3例(8癌)においてホルマリン固定パラフィン包埋組織標本から得たDNA中に高率にvーmyc、cーHーras1癌遺伝子の増幅を認めた。このような遺伝子異常は本症の遺伝素因を背景としたものと考えられた。膀胱癌の予後を規制する生物学態様は、組織形態学にみると細胞自体の形態(異型度)が細胞の配列(構築)に投映され、その結果として形成される組織異型によって特徴づけられることを明らかにした。すなわち予後良好群に属する腫瘍は、正常尿路上皮にみられる細胞分化様式と同様の細胞構築を保持するのに対して、予後不良群の腫瘍にはこのような規則性がほとんど認められなかった。しかも当該腫瘍に随伴する上皮内癌(CIS)においても主病巣と同様の細胞構築がみられたことから、組織異型は発癌過程のかなり早期から発現すると考えられた。このような組織異型は各腫瘍の増殖動態をも特徴づけて、これが生物学態様に反映される可能性が大きい。そこでBrdu標識法によってDNA合成細胞の組織内分布様式を検討した。その結果、(1)腫瘍組織では正常上皮に比して明らかにDNA合成細胞が増加し、しかも組織異型に比例して増加する。(2)組織異型の軽度である乳頭状癌とbroad front invasion型非乳頭状癌では、DNA合成細胞の規則的分布がみられる、(3)これに対して組織異型の強いtentacular invasion型非乳頭状癌では、DNA合成細胞の分布が失われている、(4)各腫瘍に随伴するCISでも、それぞれ同様のDNA合成細胞分布様式がある、ことが認められた。

以上の所見は、膀胱癌の悪性度の指標である組織異型は細胞分化と密接な関係をもち、それが増殖動態をも特徴づけることも強く示唆している。このような組織異型の発現過程においては、当然のこと乍ら各種遺伝子の関与様式に変動が生ずるものと考えられる。今年度は、この点に焦点をしぼって研究を進める計画である。癌遺伝子、多剤耐性遺伝子発現の局在を免疫組織染色、Western blotならびにNorthern blot hybridizationにより検索した。また、retrospctiveに癌遺伝子異常を検索するためにホルマリン固定パラフィン包埋組織標本からDNAを回収し、dot blot hybridizationにより癌遺伝子の増幅を調べた。以下に本年度の研究成績を示す。1.EGF-receptorならびにc-erbB-2産物に対する抗体を用いて、膀胱癌組織における局在と病理組織学的異型を対比した。EGF-receptorの発現と組織異型度の間に有意の相関はなかったが、c-erbB-2産物は組織異型度が高い部位と浸潤癌先進部に有意に高率かつ強陽性に発現していることを明らかにした。2.癌化学療法を困難にする癌耐性遺伝子mdrlの産物(P-GP;P-glyco-protein)に対するモノクロ-ナル抗体MRK-16を用いて、正常腎組織、腎癌および膀胱癌におけるP-GPの局在を検索した。P-GPは細胞膜表面に存在し、発現頻度は腫瘍の異型度に相関しなかった。膀胱癌では初発31例中11例(35%)にP-GPの発現がみられた。再発のあった16例のうち科学療法を行わなかった5例ではP-GPの発現を認めなかったが、化学療法後再発例ではP-GP発現が多い傾向にあった(6例/11例)。3.尿路上皮癌を発症したcancer family syndromel家系の3例(7癌)においてホルマリン固定パラフィン包埋組織標本から得たDNA中に高率にv-myc、c-H-rasl癌遺伝子の増幅を認めた。このような遺伝子異常は本症の遺伝素因を背景としたものと考えられた。平成元年度までに、膀胱癌ではcーerbBー2産物が組織異型度の高い部分と浸潤癌先進部に高率かつ強陽性に発現するので、癌の悪性度の指標となる可能性を示唆した。そこで本年度は膀胱癌におけるcーerbBー2の発現をretrospectiveに検索し、患者予後との相関を検討した。抗cーerbBー2ポリクロ-ナル抗体を用いて、尿路上皮癌のホルマリン固定パラフィン包埋組織標本の免疫組織染色(ABC法)を行った。本染色の陽性例では同標本からDNAを抽出し、dotblot hybridizationによりcーerbBー2の増幅を検索した。その結果、尿路上皮癌91例において抗cーerbBー2抗体は24例(26%)で陽性であった。G_1、G_2ならびにG_3腫瘍の陽性率はそれぞれ16%(5/31)、19%(6/31)および45%(13/29)で、異型度の高い腫瘍に本遺伝子産物の発現頻度が高かった(p<0.05)。また、cーerbBー2産物陽性例でDNA抽出が可能であったのは5例で、遺伝子増幅はそのうち2例に認められた。中央値48(12120)カ月の観察期間中にcーerbBー2陽性11例、cーerbBー2陰性15例が死亡し、5年生存率は前者で46%、後者で71%となり、cーerbBー2陽性例の生存期間が有意に短縮していた(p<0.05)。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの遺伝子解析とその臨床的、遺伝子治療的活用

ジストロフィン遺伝子変異解析において従来のスクリーニング法で異常が検出されなかった症例につき、mRNAの直接塩基配列決定法にて微小変異を同定することから着手した。効率的な解析を目指し、mRNA抽出のカラムキットによる簡便化や、使用するprimerの条件の最適化を検討することにかなり時間をかけた。現在、exon 9-18のprimerでのRT-PCRにおいてスプライシング異常バンドが生ずる症例と、exon 53-54の欠失がある症例が見つかっており、更なる原因を検索中である。また、骨格筋細胞移植および遺伝子治療の実現に向け、筋ジス患者由来の筋衛生細胞の培養系における治療効果判定の指標を検討した。筋生検または剖検時の筋組織から筋衛星細胞の初代培養を得た後、筋細胞クローン培養、あるいはSV40による株化を行った。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)筋、Becker型筋ジストロフィー(BMD)筋、コントロール筋につき、増殖期の筋芽細胞と分化期の筋管細胞を分析した。細胞骨格蛋白に対する免疫組織染色では、ジストロフィンは筋芽細胞の段階ではいずれのサンプルにも発現はなかった。筋管細胞になるとコントロールとBMDでは細胞質に発現を認めたが、DMDでは発現しなかった。ジストログリカンはすべてのサンプルで筋芽細胞より細胞質に発現がみられ、分化により発現が上昇した。メロシンはすべてのサンプルで明らかな発現はなかった。一方、ジストロフィンmRNA発現量の経時的変化をとらえるため、比較定量RT-PCRを施行した。発現量はいずれのサンプルでも筋芽細胞よりも筋管細胞で増加する傾向があり、その程度はコントロールで約13倍、BMDで約12倍になるのに対し、DMDでは約2倍と低かった。筋管細胞同士の比較では、コントロールに比しBMDでは約6倍であったが、DMDでは約1/2の量であった。同様に、生検(or剖検)筋組織におけるmRNAの発現量を調べると、コントロールに比しBMDでは約4倍、DMDでは約0.3倍の量と、培養細胞での結果とほぼ同じ傾向を示した。以上より、DMD筋細胞では培養系においてもジストロフィンの発現が障害されており、細胞レベルでの治療の指標として応用が可能であると考えられた。