hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホメオボックス蛋白質ＣＤＸ２による大腸癌細胞の増殖と生存の抑制機序の解析

そこで、この仮説を検証するための実験を進めたところ、CDX2の発現の誘導により、細胞内のATP/ADP比が低下することが分かった。これらの実験結果と一致して、CDX2の発現誘導により、大腸癌細胞は、浮遊時の生存が著しく低下することが分かった。浮遊した癌細胞が細胞内で産生するエネルギー代謝は、活性酸素量に強く影響を受ける。これらの一連の実験結果から、CDX2は、細胞内エネルギー代謝を制御することにより、大腸癌細胞の増殖や生存を制御していることが分かった。また、浮遊した大腸癌細胞の増殖を、CDX2が強く抑制することから、CDX2は転移の一過程である脈管内での癌細胞の生存を抑制していると思われる。これまでの解析から、CDX2が大腸癌細胞の増殖と生存を制御する新たな分子機構がわかりつつある。これらの機構については、今までの解析からは想定されなかった機序であることからも、本研究課題の目的に達成に近づいていると判断できるため。本研究課題では、腸管上皮細胞に特異的に発現するホメオボックス転写因子CDX2が転写活性を介した機能と、転写活性を介さない機能(オートファジーの活性化)の二つの異なる機能により細胞周期のG1期-S期移行と、細胞生存を負に制御することが明らかにした。そこで、その機序解析を進めたところ、CDX2がオートファジーの必須酵素であるATG7に直接に結合することでオートファジーを活性化することや、オートファジーの活性化を介して細胞内の活性酸素の産生を促進することが分かった。活性酸素の発生を抑制すると、CDX2による大腸癌細胞の生存の抑制が解除されることから、CDX2は、オートファジーの活性化による活性酸素の産生を介して、大腸癌細胞の増殖と生存を抑制していることが明らかになった。興味深いことに、CDX2は転写機能を介して、活性酸素量の低下させる遺伝子の発現を抑制することで、活性酸素の調節を行っていることも分かった。また、CDX2は、活性酸素の産生を介して、細胞内エネルギー産生を抑制していることなども分かった。以上のCDX2による大腸癌細胞株の増殖生存抑制機能は、大腸癌細胞株を浮遊状態にしたときにより顕著になることから、CDX2は大腸癌細胞株の転移過程における生存を強く抑制していると思われる。また、この結果と一致する、個体レベルの実験結果が得られた。今後の引き続きの研究により、大腸癌細胞の転移過程における細胞生存を抑制するための標的などの解明を進める。本研究課題では、腸管上皮細胞に特異的に発現しているホメオボックス転写因子CDX2が、DNA結合領域であるホメオドメインを介して、オートファジーの必須酵素であるATG7と直接に結合して、オートファジーを活性化することや、オートファジー活性化を介して大腸癌細胞の増殖と生存を抑制することが分かった。その機序として、CDX2によるオートファジーの活性化により、活性酸素(ROS)を産生することにより細胞障害を発生することが分かった。とくに、大腸癌細胞が浮遊したときに、これらの機構が強く働くことから、CDX2が大腸癌細胞の腫瘍の成長過程だけではなく、転移などの悪性化過程を抑制することが分かった。
内在性D体アミノ酸を活用した運動失調症治療の確立に向けた開発的研究

Dセリンは脳特異的な内在性のD体アミノ酸で、NMDA型グルタミン酸受容体のストリキニン非感受性グリシン結合部位を認識するモデュレーターとして知られている。本研究以前にNMDA受容体のアンタゴニストであるPCP(1-phenyl cyclohexy1 piperidine)投与により齧歯類で運動失調が誘発されること、及びDセリンがPCPで誘発される運動失調を抑制することを見いだしていたので、本研究ではDセリン誘導体(Dセリンエチルエステル、Dサイクロセリン)の運動失調症改善作用の有無をシトシンアラビノシド処置により作製した小脳変性マウス並びにreeler,pcdなどの遺伝性小脳変性マウスを用いて検討した。運動失調の重篤度の指標にはオープンフィールド法により算出された転倒指数を使用した。当該研究期間中、Dセリンエチルエステルの腹腔内投与により小脳における細胞外Dセリン濃度が3時間以上に渡って上昇持続すること、またシトシンアラビノシド処置マウス、遺伝性小脳変性マウス(reeler,およびpcd)のいずれにおいても用量依存的にDセリンエチルエステル投与により転倒指数が改善することをまず見出した。さらに、Dセリン誘導体の効果がD体に特異的であることを確定し、その効果の大部分が確かにNMDA受容体を通してのものであることをストリキニン非感受性グリシン結合部位のアンタゴニストである5,7-dichlorokynurenate(DK)を使用して確認した。すなわちDセリンエチルエステルの効果はDKの同時投与により消失した。またDセリンに類似したDサイクロセリンにも運動失調改善作用が存在することをシトシンアラビノシド処置マウスを用いて発見した。このDサイクロセリンの運動失調改善作用は抗結核薬として使用される量よりも低量で認められた。以上の結果よりDセリン誘導体による新規の運動失調症療法を動物レベルで開発・確立した。Dセリンは脳特異的な内在性のD体アミノ酸で、NMDA型グルタミン酸受容体のストリキン非感受性グリシンサイトを認識するモデュレーターとして知られている。我々はこれまでの研究でNMDA受容体のアンタゴニストであるPCP(1-phenyl cyclohexyl piperidine)投与により齧歯類で運動失調が誘発されること、及びDセリンがPCPで誘発される運動失調を抑制することを見いだしていたので、Dセリン誘導体(Dセリンエチルエステル、Dサイクロセリン)の運動失調症改善作用の有無についてシトシンアラビノシド処置により作製した小脳変性マウス並びにreeler,pcdなどの遺伝性小脳変性マウスを用いて検討を加えた。薬剤は腹腔内に投与した。まず予備的実験としてDセリンエチルエステル投与により小脳細胞外Dセリン濃度の推移を微小透析法にて計測したところ、投与後45分をピークに3時間以上に渡って細胞外Dセリン濃度の上昇持続することを見いだした。この結果に基づき、Dセリン誘導体の治療効果の判定は投与後30分から1時間までの30分間で行うことにした。その結果、シトシンアラビノシド処置マウス、遺伝性小脳変性マウスのいずれにおいてもDセリンエチルエステル投与による用量依存的な転倒指数の改善を認めた。この効果は異性体であるLセリンエチルエステルでは認められなかった。またシトシンアラビノシド処置マウスにおける運動失調がやはり用量依存的にDサイクロセリン投与により改善することを見いだした。以上の結果はDセリン誘導体が運動失調症改善の有力な候補薬剤であることを示す。

本研究以前にNMDA受容体のアンタゴニストであるPCP(1-phenyl cyclohexyl piperidine)投与により齧歯類で運動失調が誘発されること、及びDセリンがPCPで誘発される運動失調を抑制することを見いだしていたので、本研究ではDセリン誘導体(Dセリンエチルエステル、Dサイクロセリン)の運動失調症改善作用の有無をシトシンアラビノシド処置により作製した小脳変性マウス並びにreeler,pcdなどの遺伝性小脳変性マウスを用いて検討した。運動失調の重篤度の指標にはオーブンフィールド法により算出された転倒指数を使用した。昨年度までにDセリンエチルエステルの腹腔内投与により小脳における細胞外Dセリン濃度が3時間以上に渡って上昇持続すること、またシトシンアラビノシド処置マウス、遺伝性小脳変性マウス(reeler,およびpcd)のいずれにおいても用量依存的にDセリンエチルエステル投与により転倒指数が改善することを見出した。本年度はDセリン誘導体の効果がD体に特異的であることを確定し、その効果の大部分が確かにNMDA受容体を通してのもであることをストリキニン非感受性グリシン結合部位のアンタゴニストである5,7-dichlorokynurenateを使用して確認した。すなわちDセリンエチルエステルの効果は5,7-dichlorokynurenateの同時投与により消失した。またDサイクロセリンの運動失調改善作用は抗結核薬として使用される量よりも低量で有効であることをシトシンアラビノシド処置マウスを用いて見いだした。Dセリンは脳特異的な内在性のD体アミノ酸で、NMDA型グルタミン酸受容体のストリキニン非感受性グリシン結合部位を認識するモデュレーターとして知られている。本研究以前にNMDA受容体のアンタゴニストであるPCP投与により齧歯類で運動失調が誘発されること、及びDセリンがPCPで誘発される運動失調を抑制することを見いだしていたので、本研究ではDセリン誘導体(Dセリンエチルエステル、Dサイクロセリン)の運動失調症改善作用の有無をシトシンアラビノシド処置により作製した小脳変性マウス並びにreeler,pcdなどの遺伝性小脳変性マウスを用いて検討した。昨年度までにDセリンエチルエステルの腹腔内投与により小脳における細胞外Dセリン濃度が3時間以上に渡って上昇持続すること、またシトシンアラビノシド処置マウス、遺伝性小脳変性マウス(reeler,およびpcd)のいずれにおいても用量依存的にDセリンエチルエステル投与により転倒指数が改善すること、Dセリン誘導体の効果がD体に特異的であることを確認した。その作用が確かにNMDA受容体を通してのものであることはストリキニン非感受性グリシン結合部位のアンタゴニストである5,7-dichlorokynurenateがDセリンエチルエステルの効果を消失させることで確認した。
家禽精子のエイジングと精子の膜機能の変化

家禽の精子を体外で保存した場合にみられる、精子の活力および受精能力の著しい低下は、精子の膜の機能が大きく変化することにも起因している。本研究では、とくに精子の膜脂質の変化ならびに膜の透過性の変動に着目して、体外保存あるいは種々の精液希釈剤によって精子の膜の機能がどのように変化するのかを追究した。得られた結果の主なものは次の通りである。(1)鶏の射出精子は好気的下条件下におかれると容易に脂質の過酸化が生ずることが観察された。また精子を適当な希釈液で希釈して保存した場合、液のpHあるいは保存温度(0,5,10°C)によって脂質の過酸化の程度に顕著な差異はみられなかった。しかし精子の過酸化脂質の産生量は雄鶏個体間にかなり差のある事が認められ、精子膜の機能が遺伝的に支配されている可能性が示唆された。この点はさらに追究して行く必要があるように思われる。(2)精液希釈液に抗酸化剤を添加した場合、または血液保存として使用されている液(ACD)を用いて精子を保存した場合には、精子の過酸化脂質の産生が著しく抑制された。このことは、精液希釈液または保存用液の構成々分を改良することによって、精子の、主として膜の機能はある程度正常に保持されるということが推察された。(3)鶏および七面鳥精子を体外で低温保存すると、精子の膜の透過性は増大することが観察された。しかも保存時間を長くすることによって、その傾向が強くなることも確認された。しかしこれら2種類の精子を凍結保存した場合には、膜の透過性に関して正反対の現象がみられた。鶏精子の膜の透過性は凍結によって増加したが、七面鳥精子の場合には逆に低下した。したがって、この両者の精子の膜の機能には若干相違のあることが推察された。このように家禽の種類によって精子の膜の機能に差異のあることが考えられるので、今後はさらに、他の家禽の精子についても検討して行く必要があろう。
膜貫通型CD14発現のサイトカインによる制御および歯周病病型診断への応用の可能性

歯周病原性細菌のlipopolysaccharide(LPS)は、モノサイト/マクロファージや線維芽細胞のサイトカイン産生を誘導し、また、骨吸収を促進することから、歯周病の発症および進行に深く関わっていることが明らかにされている。また、これらの細胞の表層に存在している膜貫通型CD14(mCD14)はLPSレセプターの1つであり、これらの細胞におけるシグナル伝達機構において重要な役割を演じていると考えられている。そこで本年度我々は、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)におけるmCD14局在の確認、およびHGFにおける各種サイトカインによるmCD14発現の制御について検討し、以下に示す結果を得た。(1)HGFは恒常的にmCD14を発現していることがメッセージレベルおよび蛋白レベルで確認された。(2)非刺激の条件下で、mCD14の発現量は各cell populationにより異なっていた。(3)mCD14の発現はIL-1β、TNF-αあるいはIFN-γの刺激により促進されることが、メッセージレベルおよび蛋白レベルで確認された。これらの結果は、HGFもmCD14を介してLPSのシグナルを細胞内に伝達し得ること、またこのmCD14の発現は炎症歯肉組織中において促進されている可能性があることから、mCD14が局所における炎症のマーカーに成り得ることを示唆している。
心房細動における新しいIABP駆動法の理論的確立とその臨床応用に関する研究

心房細動(af)時の大動脈圧(AP)駆出時間が先行するECG上のRR間隔、即ち左室充満時間によって制御されているとの発想の基に初年度は新しいアルゴリズムの理論的確立を図り最終年度には現在市販中のIABP駆動装置のafモ-ドとの比較を行い新しいアルゴリズムの有用性を検定した。〔方法〕初年度に確立した先行RR間隔とR波dicrotic notch間の2次回帰分析を基に実際の開心術後臨床例から収録したECG・AP波形を用いてそのballoon拡張時相の至適性を検討した。また、市販5機種との比較は同一ECG・AP波形を用いてin vitroで行った。最終的には、ECG・AP波形から先に述べた2因子即ち、先行RR間隔とR波dicrotic notch間の2次回帰分析をIABP休止時に得られる90140心拍より行い、この回帰式に基づいて駆動するDriverを開発した。〔結果〕RR間隔850900msecまでは2次回帰式で十分に良好な相関を示し臨床例3例で相関決定係数は0.60.75を示した。In vitroにおけるafモ-ドの比較では今回考案したアルゴリズムが至適balloon拡張性の上で優れており、市販機種の1/63/5の誤差で作動した。即ち最も良好な追従性を示したKontronKー2000では14.89msec、不良な追従性を示したAvco10で54.44msecのズレ幅を示したが、新アルゴリズムでは8.50msecであった。この背景のもとに本アルゴリズムを内蔵したDriverを開発した。IABP休止時に得られたECG・AP波形より2次回帰分析を行い、直ちに先行RR間隔に対する値を設定表より得て、R波dicrotic notch間隔を予測し作動する機構とした。現在、費用の関係で回帰分析のみパソコンを用いているが、afのモ-ド制御は基本的ではあるがdriver制御とし、予め組立てられた回帰式によるテ-ブルを用いて即時作動性をもたせた。心房細動(af)時の大動脈圧(AP)収縮期時間が先行する心電図(ECG)上のRP間隔、即ち左室充満時間によって規定されているとの考えのもとにIABPの新しい駆動アルゴリズムを考案しその理論的確立と検定を行なった。〔方法〕1)臨床のaf合併例を用いて心カテーテル法、開心術後各種モニターなどによるECG、AP波形をデータレコーダーに集積し、先行RR間隔とLVETの関係を分析し回帰曲線の算出を行なった。2)臨床例よりデータレコーダーに収録したECG、AP波形の入力による市販5種のIABP駆動装置の模擬駆動を行ない、assist-mark出力をECG、AP波形と共に適時サーマルアレイコーダに記録しafの追従性に関して新アルゴリズムと比較検討した。〔結果〕1)心臓カテーテル検査例(n=36)にみる先行RR間隔とLVETの関係は、分布領域がET=-2.49×10^<-4>×RR^2+0.58×RR+13.4とET=-3.01×10^4×RR^2+0.72×RR-124.4にある正の相関を示し先行RR間隔が1000msec以上ではLVETはほぼ一定値であった。開心術後急性期IABP使用のaf例より収録したIABP休止時のECG・AP波形より2次回帰式:ET=-1.7×10^<-4>×RR┣D12+0.286×RR+243.3(r┣D12┫D1=0.6140)を得、この回帰式に基づきIABPの拡張を制御してみると頻脈【double arrow】徐脈移行時にも至適タイミングで追従した。2)市販機種では先行数心拍の平均値より次心拍予測制御型はballoon拡張タイミングのズレ分散は大きくS.D.4354msecを、絶対時間制御型はS.D.1419msecを示したが、新アルゴリズム型はS.D.8.5msecと著しく良好な追従性を示した。〔結語〕今回、我々の考案したafにおける先行RR間隔とタイミングの関係は病態生理的に考えて最も理論的・合理的なアルゴリズムであり、今後このシステムを用いて全自動制御可能なIABP駆動装置を試作の予定である。

即ち最も良好な追従性を示したKontronKー2000では14.89msec、不良な追従性を示したAvco10で54.44msecのズレ幅を示したが、新アルゴリズムでは8.50msecであった。この背景のもとに本アルゴリズムを内蔵したDriverを開発した。IABP休止時に得られたECG・AP波形より2次回帰分析を行い、直ちに先行RR間隔に対する値を設定表より得て、R波dicrotic notch間隔を予測し作動する機構とした。現在、費用の関係で回帰分析のみパソコンを用いているが、afのモ-ド制御は基本的ではあるがdriver制御とし、予め組立てられた回帰式によるテ-ブルを用いて即時作動性をもたせた。心房細動(af)時の大動脈圧(AP)駆出時間が先行するECG上のRR間隔、即ち左室充満時間によって制御されているとの発想の基に初年度は新しいアルゴリズムの理論的確立を図り最終年度は現在市販中のIABP駆動装置とのafモ-ドの比較を行い新しいアルゴリズムの有用性を検定した。〔方法〕初期度に確立した先行RR間隔とR波dicrotic notch間の2次回帰分析を基に実際の開心術後臨床例から収隶したECG・AP波形を用いてそのballoon拡張時相の至適性を検討した。また、市販5機種との比較は同一ECG・AP波形を用いてin vitroで行った。最終的には、ECG・AP波形から先に述べた2因子、即ち先行RR間隔とRdicrotic notch間の2次回帰分析をIABP休止時に得られる90140心拍より行い、この回帰式に基づいて駆動するDriverを開発した。〔結果〕RR間隔850900msecまでは2次回帰式で十分に良好な相関を示し臨床例3例で相関決定係数は0.60.75を示した。In vitroにおけるafモ-ドの比較では今回考案したアルゴリズムが至適ball oon拡張性の上で優れており、市販機種の1/63/5の誤差で作動した。即ち最も良好な追従性を示したKontronKー2000では±14.89msec、不良な追従性を示したAvcoー10で±54.44msecのズレを示したが、新アルゴリズムは±8.50msecであった。IABP休止時に得られたECG・AP波形より2次回帰分析を行ない、直ちに先行RR間隔に対する値を設定表より得て、R波dicrotic notch間隔を予測し作動する機構とした。現在、費用の関係で回帰分析のみパソコンを用いているが、afモ-ド制御は基本的であるがDriver自体の制御とし、予め組立てられた回帰式による数値表を用いて先行RR測定終了後に即時作用可能とした。
化学的・生化学的手法を用いたメラニン生成関連遺伝子の機能解析

近年、チロシナーゼに関連するタンパクであるTRP1とTRP2が黒色のユ-メラニン生成に関与することが,遺伝子レベル及びタンパクレベルで明らかにされた。特に,TRP1はbrown遺伝子座の産物であり,5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸(DHICA)酸化活性を有すること,TRP2はslaty遺伝子座の産物であり,ドーパクロームからDHICAへの異性化を触媒する酵素と同一であることが示された。これら3種の酵素の協調的な発現により黒色のユ-メラニンが生成する。マウスの体毛においてはTRP1とTPR2の変異によりそれぞれ茶色(brown)と灰色(slaty)系のユ-メラニンになることがわかっているが,マウスの毛色メラニンの性状はメラニンの構造の複雑さ,その不溶性のためにほとんど解明されていない。そこで先ず,我々はHPLCを用いる特異的な定量法と新規に開発した比色法によru-メラニン定量法を用いて,遺伝的な背景の明確なマウスの体毛について,全メラニン量,ユ-メラニン量,フェオメラニン量,高分子ユ-メラニン量などを測定した。その結果,brownのメラニンはblackとDHICA含量は同じであるが,分子量が小さいこと,slatyのメラニンはDHICA含量がblackの1/5であることを明らかにした。遺伝的背景の明確なヒツジの体毛及び種々の色調のヒト毛髪メラニンを上記の手法で化学的に分析した結果,ヒトの毛髪のユ-メラニンはDHICA含量が低いこと,ヒトやヒツジの赤毛のフェオメラニンはマウスの黄色のそれとは性状が大きく異なることがわかった。これらの研究過程で,比色法によるユ-メラニンとフェオメラニンの簡便な同時定量法も開発した。続いてチロシン,ドーパ,5,6-ジヒドロキシインドール(DHI),DHICAをチロシナーゼで酸化し,得られた合成メラニンの性状を化学的に分析し,ユ-メラニン中のDHICA含量や分子の大きさを推定する方法を確立した。1.合成ユ-メラニンの性状の化学的分析チロシン,ドーパ,5,6-ジヒドロキシインドール(DHI),DHI-2-カルボン酸(DHICA)をチロシナーゼで酸化し,得られたメラニンの性状を,我々の開発したHPLC法及び比色法により化学的に分析した。可溶性のDHICAメラニンをゲルろ過HPLCで分析して分子量分布を調べた。これらの結果に基づき,ユ-メラニン中のDHICA含量や分子の大きさを推定する方法を確立した(投稿準備中)。2.化学的手法によるマウス毛色遺伝子の機能の解析遺伝的な背景の明確なマウスの体毛について,全メラニン量,ユ-メラニン量,フェオメラニン量,高分子ユ-メラニン量などを定量した。その結果,brown(TRP1変異)のメラニンはblackとDHICA含量は同じであるが,分子量が小さいこと,slaty(TRP変異)のメラニンはDHICA含量がblackの1/5であることなどを明らかにした。Sliverもbrown型のメラニンであった(J Invest Dermatol, 1995)。3.ヒツジ及びヒト毛髪中のメラニンの化学的分析遺伝的背景の明確なヒツジの体毛及び種々の色調のヒト毛髪中のメラニンを,上記の手法を用いて化学的に分析した。

その結果,ヒトの毛髪のユ-メラニンはDHICA含量が低いこと,ヒトやヒツジの赤毛のフェオメラニンはマウスの黄色のそれとは性状が大きく異なることがわかった(Pigment Cell Res,印刷中)。これらの研究の過程で,比色法によるユ-メラニンとフェオメラニンの簡易な同時定量法を開発した(投稿準備中))。近年,チロシナーゼに関連するタンパクであるTRP1とTRP2が黒色のユ-メラニン生成に関与することが,遺伝子レベル及びタンパクレベルで明らかにされた。特に,TRP1はbrown遺伝子座の産物であり,5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸(DHICA)酸化活性を有すること,TRP2はslaty遺伝子座の産物であり,ドーパクロームからDHICAへの異性化を触媒する酵素と同一であることが示された。これら3種の酵素の協調的な発現により黒色のユ-メラニンが生成する。マウスの体毛においてはTRP1とTRP2の変異によりそれぞれ茶色(brown)と灰色(slaty)系のユ-メラニンになることがわかっているが,マウスの毛色メラニンの性状はメラニンの構造の複雑さ,その不溶性のためにほとんど解明されていない。そこで先ず,我々はHPLCを用いる特異的な定量法と新規に開発した比色法によるユ-メラニン定量法を用いて,遺伝的な背景の明確なマウスの体毛について,全メラニン量,ユ-メラニン量,フェオメラニン量,高分子ユ-メラニン量などを測定した。その結果,brownのメラニンはblackとDHICA含量は同じであるが,分子量が小さいこと,slatyのメラニンはDHICA含量がblackの1/5であることを明らかにした。遺伝的背景の明確なヒツジの体毛及び種々の色調のヒト毛髪メラニンを上記に手法で化学的に分析した結果,ヒトの毛髪のユ-メラニンはDHICA含量が低いこと,ヒトやヒツジの赤毛のフェオメラニンはマウスの黄色のそれとは性状が大きく異なることがわかった。これらの研究過程で,比色法によるユ-メラニンとフェオメラニンの簡便な同時定量法も開発した。続いてチロシン,ドーパ,5,6-ジヒドロキシインドール(DHI),DHICAをチロシナーゼで酸化し,得られた合成メラニンの性状を化学的に分析し,ユ-メラニン中のDHICA含量や分子量の大きさを推定する方法を確立した。
植物細胞系譜の多様性を生み出す転写ネットワークの分子メカニズム

生物は、高度に特殊化した細胞を分化させ、それらを秩序立って組み合わせることで生存戦略を発展させてきた。研究代表者は、進化の過程で生物が新しい細胞系譜を生み出した分子基盤を理解したい。それは、遺伝子機能の転用や遺伝子の新機能獲得と考えられている。遺伝子の新機能獲得は、遺伝子の重複とそれに続く片方の遺伝子への変異導入によってなされている。しかしながら、遺伝子機能の変化と細胞種の多様化の因果関係は不明な点が多い。本研究では、植物の二つの特殊化した細胞【孔辺細胞とミロシン細胞】をモデルに、マスター転写因子の機能解析を通して、細胞種の多様化の分子メカニズムにせまる。
漫画をもちいた健康教育の効果検証

本年度においては、漫画もちいた健康教育について(1)国際学術雑誌に投稿した試験的介入研究論文の修正再投稿、(2)学習過程における心理感情体験に関する調査・分析、および(3)ランダム化比較試験による健康行動実施の予測因子にあたえる効果の検証、をおこなった。(1)については、昨年度末に投稿した身体活動の実施、および食習慣の改善を意図した漫画をもちいた健康教育効果の試験的検討結果に関する論文がArchives of Public Health (BioMed Central)に掲載された。(2)については、本研究により開発した3種類の健康教育漫画を閲読した800名を対象に調査をおこない、特有の心理感情体験4因子(15項目)を抽出した。また、これらの因子は、閲読による効果指標である、動機づけ、望ましい認知的態度、主観的規範意識、自己効力感、行動意図、知識の改善・向上、および内容の記憶に対する影響力が確認された。(3)については、大学病院医療情報ネットワーク研究センター臨床試験登録システムに登録をおこない(UMIN試験ID:UMIN000034369)、漫画をもちいた健康教育介入3条件(スモールチェンジ編、習慣形成編、逆戻り予防編)、および統制群3条件(イラストによる情報提供、物語調のテキストによる情報提供、一般的なテキストによる情報提供)による無作為統制化試験をおこなった。対象者数は、試験的な検討により効果量は小程度であるという判断から、1群の280名とし、計1,680名を6群に割り付けた。現在、介入については終了し、結果をまとめ、2019年度の学会発表、および国際学術雑誌への投稿準備を進めている段階である。申請研究の目的は,漫画を用いた健康教育の効果検証,および漫画を用いた健康教育特有の心理的利得の特定,である。申請研究初年度にあたる平成28年度は,(1)身体活動の実施,および食習慣の改善を意図した健康教育漫画の開発,(2)特定保健指導の受診者を対象とした漫画を用いた健康教育の有用性研究,および(3)漫画を用いた健康教育介入研究において想定されている心理的利得に関する文献レビュー,をおこなった。(1)については,出版社,およびイラストレーターと共同で健康行動変容の段階(開始・継続・逆戻りの予防)に応じた健康教育漫画を3種類作成した。(2)については,研究協力地域における特定保健指導の対象者20名に対して,健康教育漫画(健康行動の開始編)をもちいた1ヶ月間の試験的介入をおこなった。その結果,12名がプログラムを完遂し,完遂者においては食行動の実施状況に有意な改善が認められた。(3)については,The Cochrane Libraryを検索データベースとした文献検索の結果,12件の該当研究が抽出され,主人公への共感,物語への感情関与,同一視,自身の現状との関連性の認知,意思決定への認知的不協和/葛藤,認知的態度,内包的態度,感情態度,行動への好意性,意思決定への満足度,およびスティグマ,といった34の心理的指標が抽出された。本年度の研究の結果,漫画を用いた健康教育は,通常の健康教育とは異なる特有の心理的利得を有しており,健康に対する興味・関心の低い対象者にも有用な健康教育の手段となり得る可能性が示唆された。平成28年度については,研究申請時の予定通りに研究を進めることができた。本年度は,(1)国際学術雑誌掲載の関連研究のレビューと理論的構成概念モデルの構築,および(2)漫画をもちいた健康教育介入プログラムの有用性研究により得られた知見の国際学術雑誌への論文投稿,をおこなった。(1)については,抽出された45の国際学術雑誌掲載の関連文献についてレビュー表を作成し,過去の研究により支持されている健康教育に漫画を用いることによる心理的利得の具体的な内容を抽出し,情報知覚の水準,情報処理・認知の水準,意思決定の水準,認知・行動変容の水準という4つの段階に分類した理論的構成概念モデルを構築した。また,心理的利得の具体的な内容に基づいて調査票を作成し,次年度の前半におこなう調査研究の準備をおこなった。(2)については,介入プログラムの内容として作成した健康づくり漫画の内容および理論的背景についてまとめ,メタボリックシンドロームの有症者(n = 12)を対象とした有用性研究の成果を国際学術雑誌に投稿した。投稿した論文は,現在(2018年4月),大幅修正(major revision)にて修正指示のあった内容を加筆・修正し,修正再審査の修正原稿を提出した段階にある。本年度の研究により得られた成果は,国際的にもおこなわれていない試みであり,我が国を代表する文化のひとつである漫画をもちいた健康教育の具体的な意義を示す上で重要な知見を供給するものであったといえる。一方で研究の土台となる文献検索と有用性研究の成果に関する論文執筆に時間を割いたため,研究の進捗に関する学術的成果公表を十分に実施することができなかった。次年度については,本年度の成果公表についても積極的におこなっていきたい。本年度は,科研費取得時の前所属の任期満了に伴う転職により,研究環境が大幅に変化した上,教育,学内の活動に対するエフォートも高くなった。そのため,予定していた横断調査研究を実施することができなかった。

(1)については、昨年度末に投稿した身体活動の実施、および食習慣の改善を意図した漫画をもちいた健康教育効果の試験的検討結果に関する論文がArchives of Public Health (BioMed Central)に掲載された。(2)については、本研究により開発した3種類の健康教育漫画を閲読した800名を対象に調査をおこない、特有の心理感情体験4因子(15項目)を抽出した。また、これらの因子は、閲読による効果指標である、動機づけ、望ましい認知的態度、主観的規範意識、自己効力感、行動意図、知識の改善・向上、および内容の記憶に対する影響力が確認された。(3)については、大学病院医療情報ネットワーク研究センター臨床試験登録システムに登録をおこない(UMIN試験ID:UMIN000034369)、漫画をもちいた健康教育介入3条件(スモールチェンジ編、習慣形成編、逆戻り予防編)、および統制群3条件(イラストによる情報提供、物語調のテキストによる情報提供、一般的なテキストによる情報提供)による無作為統制化試験をおこなった。対象者数は、試験的な検討により効果量は小程度であるという判断から、1群の280名とし、計1,680名を6群に割り付けた。現在、介入については終了し、結果をまとめ、2019年度の学会発表、および国際学術雑誌への投稿準備を進めている段階である。申請研究の2年目にあたる平成29年度は,予定通り(1)漫画を用いた健康教育による心理的利得のメカニズムに関する研究,および(2)漫画を用いた健康教育と従来型の文字による説明を中心とした健康教育による介入効果の差異の検討,を実施する。次年度においては,(1)本年度に予定していた横断調査研究の実施,(2)我が国における漫画文化の発展と健康増進への適応に関するナラティブレビュー,および(3)統制群を設定した介入研究,を実施する。前年度実施予定であった大規模な横断調査研究の実施が,次年度へと繰り越されたため。
急性肺損傷における肺上皮被覆液プロテオームの解析

ヒトの肺上皮を覆う上皮被覆液(ELF)を対象に、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー(LC-MS)を用いた網羅的かつ定量的なプロテオーム解析を確立した。急性肺傷害の病的状態におけるELFプロテオームを網羅的に捉え、疾患ベースでの病態把握・予後改善に関わるバイオマーカー探索や治療の効果判定に応用できるように解析可能な技術を開発した。我々が開発したウェブブラウザで作動するプロテオーム分析Elficatは、多くの患者を含む急性肺傷害のプロテオームの群間比較分析を行う上で有用であると考えられた。ヒトの肺上皮を覆う上皮被覆液(epithelial lining fluid, ELF)を対象に、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー(LC-MS)を用いた網羅的かつ定量的なプロテオーム解析を確立した。ELFの採取方法には、従来の一般的な採取方法である気管支洗浄法(Bronchoalveolar lavage, BAL)との比較において、より非侵襲的で経時的な採取が可能な気管支鏡下マイクロサンプリング法(Bronchoscopic microsampling, BMS)を用いた。生理的な状態や、急性肺障害(成人呼吸緊迫症候群[ARDS]、肺炎など)などの病的状態におけるELFプロテオーム・プロフィールを網羅的に捉え、疾患ベースでの診断学や病態把握・予後改善に関わるバイオマーカー探索や治療の効果判定に応用できるシステムを構築した。ヒトの肺上皮を覆う上皮被覆液(epithelial lining fluid, ELF)を対象に、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー(LC-MS)を用いた網羅的かつ定量的なプロテオーム解析を確立する。ELFの採取方法には、従来の一般的な採取方法である気管支洗浄法(Bronchoalveolar lavage, BAL)との比較において、より非侵襲的で経時的な採取が可能な気管支鏡下マイクロサンプリング法(Bronchoscopic microsampling, BMS)を用いることを骨格とする。生理的な状態や、急性肺障害(成人呼吸緊迫症候群[ARDS]、肺炎など)などの病的状態におけるELFプロテオーム・プロフィールを網羅的に捉え、疾患ベースでの診断学や病態把握・予後改善に関わるバイオマーカー探索や治療の効果判定に応用できるように探求した。これまで、ELF採取サンプルの処理、LC-MS解析の方法、さらには実際のデータ分析のための解析ソフトの開発を達成した。今後、これらの技術をさらに応用して、各種の肺疾患の病態解明に繋げられると考える。近年のマススペクトロメトリー技術の進歩は目覚しく、これを臨床応用して体液の網羅的なプロテオーム解析を行うことが可能である。気管支鏡下に低侵襲で特定領域のELFを採取できる気管支鏡下マイクロサンプリング(BMS)法を用いてELFを採取し、エレクトロスプレイ法によるイオン化(ESI)に、液体クロマトグラフィー(LC)、イオントラップ型の質量分析計をダンデムに組み合わせた質量分析法LC/MS/MS法によるMS/MSイオンサーチ、ペプチド・マス・フンガープリンティング(PMF)法、そして安定同位体システイン残基のビオチン化を用いたIsotope Coded Affinity Tags(ICAT)法を組み合わせて、定量的なELFプロテオームのDifferential displayとして解析する技術の開発を行った。ELF模擬サンプル(肺傷害患者以外からのサンプル)を用いた解析を行い、技術的な障壁について確認を行えた。解析データは、XML化した生体情報をXMLデータベースに蓄積し、呼吸上皮を覆う上皮被覆液(epithelial lining fluid, ELF)に含まれるプロテオームを視覚的にウェブ・ブラウザ上で解析するソフトウェアElficatの開発を行った。このように膨大な生体情報を整理し、ウェブ上の関連データベースとリンクさせて分析可能とする技術は麻酔・集中治療医学研究においても今後有用であった。今後、これらの技術を応用して、急性肺傷害の病態におけるELF分析に応用を実施する。生理的な状態や、急性肺障害(成人呼吸緊迫症候群[ARDS]、肺炎など)などの病的状態におけるELFプロテオーム・プロフィールを網羅的に捉え、疾患ベースでの診断学や病態把握・予後改善に関わるバイオマーカー探索や治療の効果判定に応用できるように分析結果について解析可能な技術を開発した。今後、さらに確立した方法について病態モデルに適応して、病態特有のプロファイリング解析に繋げていく基礎技術が確立された。集中治療医学生理的もしくは急性肺障害時における肺上皮被覆液(ELF)のプロテオームをLC-MS/MS法にて網羅的に解析するための解析方法およびウェブベースでの解析ソフトウェアElficatの開発を行った。

また、BMS法にてELFを採取し、MS/MS解析に繋げるサンプルのプロセッシング方法を確立した。その研究成果を以下の通り、学科等で発表した。佐和貞治シンポジウム「急性肺傷害:分子生物学から臨床診断、ベンチ-to-ベッドサイド」急性肺障害とBMS法.神戸.日本麻酔科学会第58回学術集会、神戸.2011年5月19日.佐和貞治、橋本悟、加藤秀哉、安本寛章. XMLデータベースeXistとCocoon2によるServer-Side XSLTを用いたElficatデータ解析肺上皮被覆液(ELF)プロテオーム解析への応用ーのElficatの開発.第29回麻酔・集中治療テクノロジー学会.名古屋. 2011年12月3日.佐和貞治気管支鏡下マイクロサンプリング法を用いた肺上皮被覆液のタンパク解析.日本麻酔科学会第59回学術集会.神戸.2012年6月8日.解析ソフトウェアの開発は完了した。サンプリング法や処理法についても確立した。実際の検体採取と分析については当初より遅れが生じている。今回、LC/MS解析を用いたプロテオームの分析に機器の安定的な使用を含めた技術的なトレーニングに時間を要した。一方で、解析ソフトウェアの開発部分は順調に進み、ほぼ当初の目的通り達成されている。XMLデータベース(eXist)、Apache Cocoon XSLサーバーによるサーバーサイドXSL技術、Scalable Vector Graphics(SVG)技術を組み合わせて、呼吸上皮を覆う上皮被覆液(epithelial lining fluid, ELF)に含まれるプロテオームを視覚的にウェブ・ブラウザ上で解析するソフトウェアElficatの開発を行った。気管支鏡下マイクロサンプリング法による肺上皮被覆液(ELF)のプロテオーム解析について、今回確立したサンプリングのプロセッシング法、LC-MS/MS法でのペプチドマスフィンガープリンティング、そしてバイオインフォマティクスと連動させたコンピュターソフトウェア解析技術を今後応用して、急性肺障害に関わる病態の解明のため、さらに解析を発展させた定量的なELF病態プロテオーム解析を行う。これまで確立したELFのプロテオミクス解析技術をさらに応用して、各種の肺疾患の病態解明に繋げられると考える。疾患群を群分けして、経時的なタイミングで連続サンプリングを行うことで、病態変化と治療介入の影響等を解析し、致死的な疾患の予後改善に繋げる。LC/MS解析による肺被覆液プロテオーム分析に向けて、模擬サンプル(既知のタンパクを含む)を利用して、解析条件の安定化を探る。
脂質ラフトによる光シグナル伝達の制御機構を解明する

椎動物の視細胞桿体外節において、光シグナルは生体膜を介して伝達される。光刺激はG-タンパク質共役受容体(GPCR)ロドプシン(Rh)に受容された後、三量体G-タンパク質トランスデューシン(Gt)、cGMP-ホスホジエステラーゼ(PDE6)へと伝達される。光シグナル情報伝達は、他にも、Rhを不活性化するロドプシンキナーゼ(GRK1)や、GRK1をCa2+依存的に制御するリカバリン(Rec)、等により制御されている。近年では、生体膜を介したシグナル伝達の制御に脂質膜ドメイン(脂質ラフト)が関与していると考えられており、視細胞の膜タンパク質は脂質ラフトへの局在(ラフト親和性)を変化させることで、光シグナル伝達を制御していると推測されている。特にRhにおいては、生体膜中でオリゴマーを形成することが示唆されており、これには脂質環境が大きく関与していると推測されている。しかし、生体膜中の脂質ラフトは微小かつ短寿命なため、上記の仮説が証明される事はなかった。我々は、ガラス基板上にパターン状にラフト領域(Liquid order (Lo)相)と非ラフト領域(Liquid disorder(Ld)相)を持つモデル生体膜を作製する技術を開発してきた。以前に、このパターン化膜へ膜タンパク質を再構成し、Lo/Ld分配を測定することで、ラフト親和性定量評価に成功した。この技術を応用して、光シグナル伝達を担う膜タンパク質の脂質ラフト親和性を網羅的に定量し、細胞内での脂質ラフトへの局在を定量な評価を試みた。この推測されたラフト局在を新たに反応速度論的なシミュレーションに組み込むことで、光シグナル伝達における脂質ラフトの機能的役割を定量的に示すことができる。さらに、Rhのオリゴマー形成が光シグナル伝達に及ぼす影響へ研究を発展させた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、生体膜中の脂質ラフトは微小かつ短寿命なため、ラフト親和性を定量的に評価することが出来ず、上記の仮説が証明される事はなかった。さらに、推測されたラフト局在より、光シグナル伝達における脂質ラフトの機能的役割を解明する事を目的に研究を行ってきた。光シグナル伝達における脂質ラフトの役割を解明するため、光シグナル伝達に関与する主要な膜タンパク質群をパターン化人工膜に再構成しラフト親和性を定量することに成功した。その結果、光活性化したロドプシン光受容体(Rh)がGタンパク質トランスデューシン(Gt)と複合体を形成しラフトへの親和性が高まることを定量的に示した。また、このラフト親和性上昇がRhの脂質修飾(パルミトイル鎖)によることを示した。さらに、cGMP-ホスホジエステラーゼ(PDE6)、ロドプシンキナーゼ(GRK1)のラフト親和性が極めて低いことを定量的に示した。GRK1は光活性化したRhをリン酸化して不活性化することから、Rh-Gt複合体とGRK1とが異なるラフト親和性を持つことは、ロドプシン受容体の活性化寿命およびシグナル伝達効率を増進する効果があるものと推測される。本研究において得られた人工膜を用いて得られたラフト親和性をもとに、速度論的シミュレーションモデルを構築し解析した結果、ラフトが光シグナル伝達を増進するという仮説が支持された。これらのIn vitroおよびin silicoおける定量的な解析は、ラフトのシグナル伝達における役割を解明する方法論を確立する重要な成果であると言える。本成果は、数々の国際学会で発表されたほか、現在、論文投稿の準備が進められている。

近年では、生体膜を介したシグナル伝達の制御に脂質膜ドメイン(脂質ラフト)が関与していると考えられており、視細胞の膜タンパク質は脂質ラフトへの局在(ラフト親和性)を変化させることで、光シグナル伝達を制御していると推測されている。特にRhにおいては、生体膜中でオリゴマーを形成することが示唆されており、これには脂質環境が大きく関与していると推測されている。しかし、生体膜中の脂質ラフトは微小かつ短寿命なため、上記の仮説が証明される事はなかった。我々は、ガラス基板上にパターン状にラフト領域(Liquid order (Lo)相)と非ラフト領域(Liquid disorder(Ld)相)を持つモデル生体膜を作製する技術を開発してきた。以前に、このパターン化膜へ膜タンパク質を再構成し、Lo/Ld分配を測定することで、ラフト親和性定量評価に成功した。この技術を応用して、光シグナル伝達を担う膜タンパク質の脂質ラフト親和性を網羅的に定量し、細胞内での脂質ラフトへの局在を定量な評価を試みた。この推測されたラフト局在を新たに反応速度論的なシミュレーションに組み込むことで、光シグナル伝達における脂質ラフトの機能的役割を定量的に示すことができる。さらに、Rhのオリゴマー形成が光シグナル伝達に及ぼす影響へ研究を発展させた。Rhは生体膜中ではオリゴマーを作ることが電子顕微鏡や、原子間力顕微鏡によって観察されている。また、そのオリゴマーはラフトに局在すると生化学実験で示されている。しかしながらRhオリゴマーが光シグナル伝達に与える影響はまだよく理解されていない。さらに、シミュレーションレベルでは、RhオリゴマーはGtを活性化しやすいという報告があるものの、それを証明できた例はまだない。Rhはオリゴマーを形成することでさらに光シグナルを正に制御するのか、あるいは、シグナル伝達においてオリゴマーは影響与えないのか、について考慮していく。さらに、RhオリゴマーとGtとの相互作用は高速度原子間力顕微鏡を用いた観察を試みる予定である。なお、高速度原子間力顕微鏡の観察は大阪大学基礎工学研究科の山下隼人助教と共同研究で行う予定である。また、前年度で、作成したシミュレーションモデルは単純な反応速度論的シミュレーションであった。このモデルではより詳しい分子のふるまいを再現することはできない。ゆえに、今年度はより分子のふるまいを正確に記述できるコースグレイン法などでシミュレーションしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
中学時からの親子パネル調査を活用した格差・不平等に関する領域横断的研究

申請者は2015年度に中学3年生であった子どもとその母親に対する調査を行い,2017年度に追跡調査を行った.本プロジェクトはさらに高校卒業からの3年間の継続調査を行い,様々な側面についての変化の情報を把握し,社会経済的背景,学校生活,意識・態度そして教育達成がその後の社会,経済,政治,健康に関するアウトカムにどのような影響を与えているのかその因果関係とメカニズムを解明する領域横断的研究を行う.申請者は2015年度に中学3年生であった子どもとその母親に対する調査を行い,2017年度に追跡調査を行った.本プロジェクトはさらに高校卒業からの3年間の継続調査を行い,様々な側面についての変化の情報を把握し,社会経済的背景,学校生活,意識・態度そして教育達成がその後の社会,経済,政治,健康に関するアウトカムにどのような影響を与えているのかその因果関係とメカニズムを解明する領域横断的研究を行う.
クロロキン耐性熱帯熱マラリアにおける感受性克服薬の探索

研究代表者の大崎はセファランチンのマラリアに対する薬剤排出機能に関して薬剤排出ポンプの相同性に着目し、薬剤排出機構を持つ緑膿菌を用いた実験を行った。結果:セファランチンは緑膿菌のポンプを抑制しなかった。研究分担者の春木の行った主な実験内容および結果は以下のとおりである。1クロロキン感受性変化とマラリア細胞内への蓄積に関する研究。結果:各種アルカロイドによるマラリアのクロロキン感受性変化とクロロキンの細胞内蓄積は正の相関を示し、クロロキンの作用は薬剤蓄積量に依存することが確認された。2セファランチン存在下でのマラリア原虫へのクロロキン蓄積の経時間的変化。結果:コントロールに比べ明らかにクロロキンの蓄積量が増加した。3セファランチン存在下でのマラリア原虫からのクロロキン排出量の経時間的変化。結果:マラリア原虫からのクロロキン排出量はコントロールに比べ明らかに減少した。4セファランチンの膜電位に対する影響。結果:セファランチンによりマラリア原虫の膜電位はコントロールに比べ低下した。5これらより膜電位に影響を与える物質としてTTP(tetraphenylphosphonium)を選出して同様の実験を行った。結果:TPPによってセファランチンがマラリア原虫に示した結果と類似した結果が得られた。6:薬剤のスクリーニング結果:既存薬であるH203が抗マラリア作用を示した。まとめこれらの結果よりセファランチンはマラリア原虫からの薬剤排泄を抑制し、蓄積を増加させた。TPPをモデルとした実験より、膜電位変化とクロロキン排出抑制の関連が示唆された。本研究の経過中既存化合物のなかで抗マラリア作用を示す物質を見出した。研究代表者の大崎はセファランチンの細菌における薬剤耐性ポンプに対する効果を調べるための細菌株の選定を行いつつある。一部は連合王国、リバプール熱帯医学校で行われた。クロロキン耐性熱帯熱マラリアTM6株を用い3Hクロロキン取り込み実験を行った。また膜電位の低下をきたすことから膜電位変化とクロロキン排出抑制の関連が示唆された。今後膜電位変化をきたす物質による検討を行う予定である。また薬剤排出ポンプの相同性にも着目し、細菌を用いた実験も計画している。今年度は主として1ビスベンジルイソキノリンアルカロイドによるクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫におけるクロロキン排泄および蓄積に与える影響について、2多剤耐性緑膿菌を用いた薬剤排出ポンプに与える影響について、さらに3 1の実験経過中に見出した新規の抗マラリア作用を有するH203に関するマラリア原虫発育抑制に関して、研究を行った。1ビスベンジルイソキノリンアルカロイドの混合物を用いてトリチウムでラベルしたクロロキンの取り込みに関する実験。ビスベンジルイソキノリン存在下ではクロロキン耐性熱帯熱マラリアTM6株においてクロロキンの蓄積がコントロールに比べ最高4倍増加した。経時的には60分で最高値を示した。

また高濃度のクロロキンで飽和したマラリア原虫からのクロロキン排出を観察した結果、アルカロイド存在下では排出が遅延しその排出率はコントロールの2分の1であった。マラリア原虫の各ステージにおけるクロロキン取り込みについても検討したがすべてのステージにおいてクロロキンの蓄積が認められた。色素であるTTP(Tetraphenylphosponium)をアルカロイドの対象薬として用いた結果アルカロイドと同様の結果が得られたがその濃度はアルカロイドの100倍を要した。またアルカロイドがマラリア感染赤血球の溶血を阻害することも経過中に見出された。アルカロイドによる膜電位の変化に関する実験は膜電位の低下は確認したが十分な結果はまだ得られていない。2薬剤排出ポンプ高度発現緑膿菌およびその野生株を用いた実験ではビスベンジルイソキノリンアルカロイドによる薬剤排出抑制は認められなかった。3実験経過中ある既存薬で抗マラリア作用を有する薬剤H203を発見した。効果はクロロキン耐性株であるK1に対してIC50が30nMと低く、今後のこの系に属する薬剤の側鎖などの構造を変化させることによる研究など将来、新規の抗マラリア薬の開発につなげるという意味で期待された。