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汽水域における魚類の生活史に関する生態学的研究

汽水域は海洋と陸水域との接点であり、両水域間の物質循環や生物種多様性を維持する上で重要な水域である。しかし、わが国における汽水域に関する研究は諸外国と比較した場合後れの目立つ分野である。本研究では沿岸水域との水の交換が維持されている茨城県の涸沼を汽水域の,岩手県の閉伊川を河川河口域のモデル水域として研究を行った。野外採集調査は、張り網、MTDネットによる卵仔稚魚採集、小型引き網を用いて行った。潮汐作用による涸沼と沿岸水域との魚卵仔稚魚の移動・滞留機構を解明するために,涸沼の流出河川、下涸沼川に掛かる大貫橋において,月二回の大潮の際に24時間採集調査を実施した。3時間ごとに表層と底層にMTDネットを投入し、潮汐流によって運ばれてくる魚卵・仔稚魚の採集を行った。その結果,涸沼からは62種の硬骨魚類が確認された。その多くが春から夏にかけて出現する遇来種であった。大貫橋で実施した調査の結果,7、8月にはサッパの卵が大量に採集され,涸沼水系が本種の産卵場として機能していることが示唆された。10-11月にはアユ仔魚の流下が確認された。現在アユ仔魚の滞留機構を解明すべく,データを解析中である。涸沼に周年出現したシラウオは,魚類中幼型進化的異時性を示すことで知られている。現在シラウオに見られる特異な幼型進化の持つ汽水域への適応機構を新規研究課題として実施している。閉伊川では遡河回遊型ワカサギの産卵遡上生態調査を行い,現在標本とデータを解析中である。ワカサギ仔魚流下調査も行い,多数のワカサギ仔魚を採集した。現在閉伊川河口域におけるワカサギ仔稚魚の滞留機構を研究中である。以上、二年間にわたり,涸沼と閉伊川をモデル水域として,汽水域における魚類の生活史に関する生態学的研究を実施した。平成10年10月に本研究課題の採択を通知されて以来、魚類の生活史における汽水域の持つ生態学的意義を解明すべく、閉伊川河口域(岩手県)、霞ヶ浦・北浦・涸沼(茨城県)を調査水域として研究を実施した。各水域における研究実績の概要は以下の通りである。閉伊川河口域遡河回遊型ワカサギの生活史を解明すべく、河口周辺海域において小型巻き網とサーフゾーンネットを用いた採集を行った。現在採集物を解析中である。霞ヶ浦・北浦近年、本来は両側回遊を行うアユが霞ヶ浦・北浦水系内において生活史を完結し、近年増加傾向にある。このアユの陸封化メカニズムを解明すべく、張り網、トロール網などを利用した採集調査を実施した。現在得られた標本を元に、アユ稚魚の成長履歴などの解析を行っている。涸沼涸沼水系内における魚類の生態・生活史に関して過去に収集したデータを元に、魚類目録と仔稚魚出現カレンダーを作成した。また産卵のために涸沼へ遡上するコノシロとサッパの産卵生態予備調査を実施した。現在本調査の準備中である。以上の結果を踏まえ、平成11年度には魚類の生活史にとって汽水域の持つ意義についてより総合的な調査研究と考察を行う。
細胞融合の手法による新しい活性物質の生物的合成研究

報告者は一連の研究により、細胞融合法により得られたハイブリッド菌株が我々の創造力を超えた代謝産物を産生することが可能であることを示してきた。すなわち、Penicilliumcitreo-virideB IFO6200および4692を親株として作製したハイブリッド菌株KO0031からはプロテインファルネシルトランスフェラーゼ(PFTase)の阻害活性を示すシトレオハイブリドンB(IC_<50>3.6μM)を単離し、抗ガン剤の開発のための新たなリ-ド化合物を提供した。さらに、ハイブリッド菌株KO0011から天然物としては極めて稀なアゾ基を有するピロン化合物を単離した。また、この化合物はレタスの発芽種子を用いた下胚軸の伸長試験において生長抑制作用を示した。このことはシンプルなピロン類が新たな農薬のリ-ド化合物となり得ることを示唆したものと考えている。また、当初はセスタテルペノイドであると考えられていたシトレオハイブリドン類は、その後の生合成の研究によりテルペノイドとポリケチドが、まさに、ハイブリッドしたmixed polyketide-terpenoid生合成経路により生合成された極めて稀なメロテルペノイドであることを明らかにし、従来の生合成研究に大きな衝撃を与えた。さらに、天然物としては極めて稀なアゾ基を有する化合物を単離できたことは、この化合物の構造的新規性および生物活性もさることながら更めて細胞融合の手法の有用性を示すことができたものと考えている。まだ実現してはいないが、将来、細胞融合法により得られたハイブリッド菌株の産生する代謝産物から新薬が創出されることを信じている。最終目的は創薬なので時間がかかると思うが、ここ数年で足掛りはできたので12年以内に飛躍できるものと考えている。
レーザビームの電気光学偏光によるマイクロ波影像装置の開発

本研究は,被検査体を透過したマイクロ波ビームの電場分布を電気光学結晶に入力されたレーザビームの偏光に置き換えることによりマイクロ波影像を得る装置を開発し,被検査体の電磁物性分布を画像化することを目的とするものである。高分解能なマイクロ波影像をリアルタイムで取得可能な装置の開発,さらにその応用としてシリコンウェーハの導電率分布の非接触計測への実用化を図る。2年継続により,(I)マイクロ波影像装置の開発,(II)マイクロ波周波数及び電気光学結晶の最適化,(III)シリコンウェーハの導電率分布の定量評価,なる3項目の研究を推進し,目標を達成する。本年度は以下の実績を得た。1.マイクロ波周波数及び電気光学結晶の最適化マイクロ波周波数,及び電気光学結晶の種類を変化させ,それぞれにおけるマイクロ波影像を得ることにより,マイクロ波影像装置におけるマイクロ波周波数,及び電気光学結晶の種別の影響を調べ,最適化を行った。これにより,高分解能,高感度の影像を実現した。2.シリコンウェーハの導電率分布の定量評価上記の研究成果を踏まえ,マイクロ波影像装置の応用例として,シリコンウェーハの導電率分布の非接触計測を実施した。種々の加工条件により導電率分布の違うシリコンウェーハ試験片を用いて,試験片を透過したマイクロ波の電場分布をマイクロ波影像装置により測定し,試験片の導電率分布によって変化するマイクロ波の応答を計測した。さらにマイクロ波の応答と従来の接触型測定法により評価される試験片の導電率から,マイクロ波による導電率の定量評価式を生成し,シリコンウェーハの導電率分布の非接触リアルタイム計測を実現した。まず,高分解能なマイクロ波影像をリアルタイムで取得可能な装置の開発を狙う。さらに,その応用としてシリコンウェーハの導電率分布の非接触計測への実用化を図る。1.マイクロ波影像装置の開発本研究の根幹となるマイクロ波影像装置を構築した。信号源としては現有の設備であるネットワークアナライザ(HP8510C)を利用し,連続正弦マイクロ波を発生させ,ホーンアンテナを介して被検査体であるシリコンウェーハに向けて照射する。被検査体を透過したマイクロ波ビームの電場を,被検査体の後方に設置したマイクロ波影像装置中の電気光学結晶に印加すると,電気光学効果によって同結晶中に入力されたレーザビーム(現有設備であるレーザ発振装置(Millennia Vs)による)に偏光が生じる。装置中に設置した偏光ビームスプリッタにより偏光されたレーザビームを取り出し,高感度CCD検出器により,マイクロ波の電場分布の変化に対応するレーザビームの偏光を検出した。2.マイクロ波周波数及び電気光学結晶の最適化上記の研究成果を踏まえ,マイクロ波周波数,及び電気光学結晶の種類を変化させ,マイクロ波影像装置におけるマイクロ波周波数,及び電気光学結晶等の最適化を行い,より高分解能,高感度の影像の実現を図る。
新生仔期及び成体における神経新生のメカニズムと精神機能の分子病態

本研究ではアクチン結合分子Girdinが統合失調症の脆弱性因子であるDISC1分子と結合し、新生仔期と成体期における海馬歯状回の神経新生、特に神経芽細胞の移動と位置決定を制御していることを明らかにした。Girdinは脳室下帯で新生した神経芽細胞の嗅球への移動にも重要であることも示した。さらにGirdinのファミリー分子であるGipieおよびDapleの機能についても解析を行い、それぞれ小胞体ストレス応答およびWntシグナル伝達機構を制御することを明らかにした。本研究の目的は、アクチン結合分子GirdinとDISC1の機能解析を通して生後、すなわち新生仔(児)期と成体期における神経新生の分子メカニズムと精神機能の分子病態を解明することである。さらにGirdinの発現制御機構やそのファミリー分子の細胞生物学的解析を通して、生後の神経新生を制御するより普遍的な分子ネットワークおよび細胞内シグナル伝達機構を明らかにする。本年度は下記の事項について検討した。(1) Girdinノックアウトマウスは生後4週程で死亡する。時期・組織選択的にGirdin遺伝子を欠失させることが可能なコンディショナル遺伝子改変マウスを作成するためにGirdin遺伝子の開始コドンを含むexon1領域の前後にloxPサイトを、intron2にFlp発現によって除去できるneomycin耐性遺伝子を導入するターゲティングベクターを作成し、ES細胞に導入、続いてG418による薬剤選択を行い複数のES細胞クローンを得た。サザン分析により組み換えES細胞を得た後、胚盤胞への注入によりキメラマウス、さらにFlマウスまで作出した。(2) GirdinのN末端を強制発現するとGirdinとDISC1の結合が阻害されることを事前に生化学的手法で確認している。今年度はラット新生仔(生後6日目)の海馬歯状回にGirdin shRNA(shorthairpin RNA)およびGidinのN末端ドメインを組み込んだレトロウイルスを注入し、その2週間後、幹細胞から分化した神経前駆細胞の移動と位置を観察した。その結果、Girdinをノックダウンした場合と同様に、GirdinのN末端を発現した神経細胞でも、新生神経細胞の位置異常が観察された。このことはGirdinとDISC1の結合が新生神経細胞の分化、特に細胞移動や位置決定に関わることを示しており、米国科学誌に報告した(Enomoto, A. etal, Neuron 63:774-87,2009)。(1)時期・組織選択的にGirdin遺伝子を欠失させることが可能なコンディショナル遺伝子改変マウスを作成するためのF1マウスを作出した。今年度はさらに神経組織特異的にCreリコンビナーゼを発現するnestin-Creマウスと掛け合わせることで、神経特異的遺伝子改変マウスを作成した。海馬歯状回および脳室下帯における組織学的解析を現在実施している。(2)脳室下帯で産生される新生神経細胞の移動におけるGirdinとDISC1の意義を引き続き組織学的に解析した(Wang et al., in revision)本研究の目的は、アクチン結合分子Girdinと統合失調症原因因子DISC1の機能解析を通して生後、すなわち新生仔(児)期と成体期における神経新生の分子メカニズムと精神機能の分子病態を解明することである。さらにGirdinのファミリー分子の細胞生物学的解析を通して、生後の神経新生を制御するより普遍的な分子ネットワークおよび細胞内シグナル伝達機構を明らかにする。平成23年度は下記の点について明らかにした。(1)昨年度までにGirdin遺伝子の神経特異的遺伝子改変マウスを作成した。海馬歯状回および脳室下帯における組織学的解析を施行したところ、ノックアウトマウスと同様に新生ニューロンの著明な移動異常や位置異常が確認された。また生後3-4週間程で死亡することも明らかとなり、新生仔(児)期の海馬あるいは脳室下帯における神経新生が生存に必要であることも示唆された。(2)脳室下帯で産生される新生神経細胞の移動におけるGirdinとDISC1の意義を引き続き組織学的に解析し、論文を報告した。(3)Girdinのヘテロノックアウトマウス(Girdin+/-)において行動解析を施行したところ、海馬依存的な記憶の障害がみられることを明らかにした。一方、学習や新規対象認識試験では異常が観察されなかった。(4)統合失調症では介在ニューロンの異常が報告されている。生後10日目のGirdinノックアウトマウスにおいて介在ニューロンを各種マーカーの抗体を用いて染色したところ、パルブアルブミン陽性の介在ニューロンが著明に減少していることが明らかとなった(投稿準備中)。

(5)Girdinのファミリー分子であるDapleの機能解析を行い、Wntシグナル依存的な低分子量Gタンパク質Racの活性を制御することを示した(論文投稿中)。
隣接水酸基同時除去による糖類からのジデオキシ糖の触媒的合成

酸化セリウムへ高分散担持した酸化レニウムをパラジウム金属粒子で修飾したReOx-Pd/CeO2触媒が、シス位で隣接する水酸基を持った様々な糖のメチルグリコシドを、酸化レニウム種を活性点とし、水素分子を還元剤とする脱酸素脱水反応と、パラジウム粒子表面上で進行する炭素ー炭素二重結合の水素化により、対応するジデオキシ糖のメチルグリコシドへ高い収率で変換できることを示した。さらに、水溶液中でジデオキシ糖のメトキシ基を水酸基に置換し、開環で生成した炭素ー酸素二重結合を水素化することで、光学活性なトリオールを高い収率、高い鏡像体過剰率で与えることも示した。糖類と水素の反応により、ジデオキシ糖(2つのC-OHをC-Hへと脱酸素されたもの)を選択的に与える固体触媒反応システムの開発を目的とする。糖類は、その分子中に数多くの水酸基(C-OH)を持っており、そのため、糖類を還元し、デオキシ糖を選択的に得るには、非常に精度の高い官能基認識能が必要となり、通常酵素反応が用いられてきている。これに対して、本研究は、最も安価な水素を還元剤として用いることを可能とすると同時に、酵素に置き換わるポテンシャルを持つ固体触媒の開発を目指す。固体触媒と還元剤としてを用いることが可能になれば、生成物と触媒の分離の簡便性、十分な耐熱性を活かしたより高温反応による劇的な反応速度向上、原子効率の高い触媒変換などにつながることも期待される。本年度は、ReOx-Pd/CeO2を固体触媒として用い、様々なメチルグリコシドを基質として触媒反応を行ったところ、隣接してシス位に位置する水酸基二つを同時に除去できることを示した。生成物はほとんどが市販されてないものであるため、生成物の単離や単離された生成物の構造解析などについても行った。例えば、メチルα-D-マンノピラノシドを基質として用いた場合に、反応条件の最適化を行った結果として、ガスクロマトグラフから求めた収率で96%、単離収率で91%という高い収率で目的生成物が得られることを示した。触媒の反応前後の構造解析や触媒再使用性の検討などについて今後行っていく予定である。平成28年度の実施予定の研究が順調に行えたため。糖類は、その分子中に数多くの水酸基(C-OH)を持っており、そのため、糖類を還元し、デオキシ糖を選択的に得るには、非常に精度の高い官能基認識能が必要となる。これに対して、本研究は、最も安価な水素を還元剤として用いることを可能とすると同時に、酵素に置き換わるポテンシャルを持つ固体触媒の開発を目指し、平成27年度の研究成果として、酸化セリウム上の担持した酸化レニウム触媒をパラジウム金属粒子で修飾したReOx-Pd/CeO2触媒が、シス位で隣接する水酸基を持った様々な糖のメチルグリコシドを、酸化セリウム上の担持した酸化レニウム種を活性点とし、水素分子を還元剤とする脱酸素脱水反応と、パラジウム粒子表面上で進行する炭素ー炭素二重結合の水素化により、対応するジデオキシ糖のメチルグリコシドへ高い収率で変換できることを見いだした。本年度は、この有効な触媒について、活性点構造として、酸化セリウム上で単核状に分散した酸化レニウム種が考えられること、酸化レニウム種の+4と+6の間での酸化・還元で触媒反応が進行していることなどを明らかにした。また、ここで開発した触媒は、適切な手続きを踏むことで容易に再使用できることも示した。。本反応系では、固体触媒と還元剤を用いることが可能になり、生成物と触媒の分離の簡便性、十分な耐熱性を活かしたより高温条件での反応速度向上、原子効率の高い触媒変換につながることが示された。などにつながることも期待できる。ReOx-Pd/CeO2の有効性について前年度で示すことができ。触媒については、さらに担体(ZrO2, Al2O3, SiO2, TiO2等)の依存性、Reの担持量の依存性、添加金属の依存性(Pd, Pt, Rh, Ru, Au等)を検討し、性能決定している因子についての知見を得たいと考えている。前年度の結果も踏まえて、最も優れた触媒について反応条件をさらに最適化しながら触媒性能評価を行う。反応前後の触媒の構造解析(XRD, BET, Raman, FTIR, EXAFS, XANES, XPS,吸着量測定等)を行い、活性点となっていることが想定されているRe種の構造、担体との相互作用に着目してキャラクタリゼーションを行う。また、触媒の再利用性を評価する。

触媒反応機構については、反応速度の水素分圧依存性と基質濃度依存性を測定し、反応次数をえて、その結果に基づいて速度論解析を行う。また、基質と触媒表面の相互作用についても検討する。触媒化学
表出言語と知能に障害をもつ病児の電子合成音声による認知開発と社会参加への看護支援

平成19年度は前年度の結果を基に引き続き臨床検討を行った。倫理的配慮・契約は前年度に準じた。滋賀県立大学では、保育園1園、中学校(障害児学級)1校の協力を得て、表出言語障害のある知的発達障害児を対象として、それぞれの職員に現場の生活指導の用具として使用をしてもらい、ソフトの実用性について検討した。結果、両施設とも、相手の返答や表情への反応と、コミュニケーションを理解して楽しむ場面が見られるようになった。この他に保育園では機器に興味を持ち関わってきた他児と対象児が普段はもつことが困難な場面共有と、言葉を発する必然性を子どもが感じる場を生み出せた。中学校では保護者や職員のみが理解可能な対象児固有の言葉を一般社会で通じる言葉へ置き換える指導に用いて効果が認められた他、授業中の表情が能面様から穏和な笑顔になり、多動が消失して着席が維持できるようになった。昼休みも引きこもらず、他児と同じ部屋で研究ソフトの入ったパソコンで遊ぶようになった。検討終了時には、使用した教員および協力者以外の子どもと親から、研究継続への協力の申し出と機材使用の要望があった。神戸大学では、養護学校に通学中の子どもを対象に臨床評価(1ヶ月の介入プログラム)を行うため、ある養護学校の協力を得て2台の機器(Uribow Talk)を用いて介入し、表出言語能力の異なる2名の実践検討を行った。対象者には、事象(食事が出てくる,音楽がかかるなど)が機器から発声される音声の内容に合わせて起こることへの理解が形成され、機器に興味を持つようになった。また、要求を示す音声を使用すると、機器使用への要求が高まる様子が見られ、要求に基づいた言語を機器にセッティングすることで言語理解を効果的に高められる可能性が示唆された。以上のことから、開発ソフトの活用範囲は広く、各発達段階に応じた言語認知と社会性の発達支援に貢献できる可能性が示唆された。本年度は初年度であり、まず、電子合成音声補助具の内容に関するニーズ調査を行った。結果、内容・仕様のニーズについては、その家族の文化的価値概念・生活習慣が多種多様であり、個々の家族がそれぞれの生活で活用できる補助具を想定すると、プリセットする音声内容の標準化が非常に困難であることが明らかになった。そこで、標準化した音声を使用するのではなく、音声は母親もしくは父親が自分でパソコンに向かって録音し、それを自動的に父親の声は男児の声に、母親の声は女児の声に変換するシステムを開発した。使用機器については、研究開発後の臨床現場への普及を容易にするため、市販タブレットPCを使用することにし、知的障害があり、巧緻性も低い対象児が使用可能で最軽量のものを検索し990gのFUJITSUFMV-P8210(Windows(R)XP TabletPC Edition)を用いることにした。また、今回、携帯して使用することが前提であるので、移動時の携帯負担感の少なさと機材保護を重視した携帯用ケースを開発した。また、動作はタッチパネル画面で行うが、数量に制限のあるアイコンについても、上記の理由により、標準化が困難なため、自由にテキストを入力し,それをボタンに表示するようにした。また、アイコンの表示ボタンは弱視者にも識別が容易なように濃い色にし、認知を容易にするシンボリックなイラストも準備した。さらに個別的な認知を容易する写真などの画像を保護者が自由にアイコンに貼り付けられるように設定した。本年度は以上の内容のα版およびβ版の電子合成音声オーサリングソフトウェアの開発をもって終了した。

今年度準備した機器およびソフトウェアにより、次年度は実践検討に入る予定であり、モニターの募集・選定・依頼も終了している。本年度は初年度に開発したソフトを用い、実践検討を行った。パソコンは既存で最軽量990gのFUJITSU FMV-P8210(Windows (R)XPTablet PC Edition)を用いた。対象児は、保育園1園、療育教室1園の協力を得て、表出言語障害のある知的発達障害児を募集した。実施にあたっての倫理的配慮では、施設としての倫理的配慮も検討され、両施設とも実質機材を利用する担当保育士を保護者代理とすることを条件としたため、研究者は施設長ほか直接関係職員に研究目的と実施内容を説明して了承を得て、保護者への説明は施設関係者が行った。保育園に関しては保護者との面接を許可され、直接説明も行った。書面契約については両施設とも、保護者との契約は実践する施設が行い、研究者との契約は施設長と取り交わした。保育園の対象児は自閉性障害のCA4歳の女児1名が使用し、自由保育場面で使用した。結果、VTR記録でソフトを媒体として、他児との交流ができるようになった様子が確認でき、子どもが社会への参加が促進された。療育教室の対象児は先天性コルネリア症候群でMA1歳9ケ月のCA6歳の男児、自閉性障害でMA2歳8ケ月のCA5歳の男児、原因不明でMA2歳6ケ月のCA4歳の男児、MAの検査が不可能なCA4歳の男児、の計4名であうた。4名は来訪時、おやつの時間、遊具の選択、帰宅時に使用した。結果、来訪時と帰宅時の挨拶で、対人面での効果が認められたが、他の場面では機材がタイミングよく作動せず、活用が困難だったことや、音量が最大にしても静かなところでないと聞き取りにくいなど、機材の能力的な限界が指摘され、家庭では使用が困難だろうとの見解が示された。しかし、両施設とも、このソフトが既存の物より、重度の障害児には使用できる可能性が高いとの評価を示し、使用方法の工夫と対象とする児を検討して、次年度も使用を続行したいと要望しており、次年度も両施設での実践検討を予定している。平成19年度は前年度の結果を基に引き続き臨床検討を行った。倫理的配慮・契約は前年度に準じた。滋賀県立大学では、保育園1園、中学校(障害児学級)1校の協力を得て、表出言語障害のある知的発達障害児を対象として、それぞれの職員に現場の生活指導の用具として使用をしてもらい、ソフトの実用性について検討した。結果、両施設とも、相手の返答や表情への反応と、コミュニケーションを理解して楽しむ場面が見られるようになった。この他に保育園では機器に興味を持ち関わってきた他児と対象児が普段はもつことが困難な場面共有と、言葉を発する必然性を子どもが感じる場を生み出せた。中学校では保護者や職員のみが理解可能な対象児固有の言葉を一般社会で通じる言葉へ置き換える指導に用いて効果が認められた他、授業中の表情が能面様から穏和な笑顔になり、多動が消失して着席が維持できるようになった。昼休みも引きこもらず、他児と同じ部屋で研究ソフトの入ったパソコンで遊ぶようになった。検討終了時には、使用した教員および協力者以外の子どもと親から、研究継続への協力の申し出と機材使用の要望があった。
抗菌成分含有口腔ケア剤による高齢者の口腔および全身疾患発症予防の可能性について

申請者らは,これまで天然抗菌成分カテキン含有ジェルを開発し,in vitroで口腔正常維持に関わる菌群に影響を与えず,齲蝕原因菌や歯周病原菌などに対して抗菌効果を示すことを確認した。今回,このジェルの臨床でのパイロット実験を実施した結果,日和見感染症の起因菌を含め,口腔の微生物叢・数のコントロールと長期使用の可能性を見出した。一方,新たな天然抗菌成分としてアリルイソチオシアネートおよびイオン水を見出し,これらが歯周病原菌およびC. albicansに対して顕著な抗菌効果を発揮することを確認した。したがってこれらの抗菌成分は高齢者の健康維持とQOLの向上に貢献できる可能性が示唆された。申請者は抗菌,抗真菌,抗ウイルスおよび抗酸化作用を持つ天然抗菌成分カテキンを含有する抗菌ジェルを開発し,in vitroにおいて要介護高齢者の口腔において有害な病原菌に対して抗菌効果を示すが,口腔の正常維持に関わるレンサ球菌には影響を与えないことから,臨床での口腔の微生物叢・数のコントロールと長期応用の可能性を見出した。さらに,このジェルはin vitroで肺炎および日和見感染症の起因菌である肺炎レンサ球菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対しても抗菌効果を示すことを確認した。また,口腔、特に義歯装着率の高い高齢者から優勢に検出され,口腔カンジダ症の原因真菌であるCandida albicansにも抗菌効果を発揮することを確認するとともに,その抗菌機序は菌のATP産生量の減少および病原性を発揮する菌糸形への変換を遺伝子レベルで抑制することを解明した。一方,日本大学歯学部倫理委員会より承認を受け,研究に同意を得た要介護高齢者を対象とした臨床実験を実施した。その結果,カテキンジェルを4週間,口腔内に塗布することによって齲蝕原因菌,歯垢成熟に関与する菌,歯周病原菌群およびC. albicansそれぞれの菌数が有意に減少した。しかし,口腔の正常維持に関わる口腔レンサ球菌群菌数への影響は認められず,in vitroの実験結果と同様な抗菌効果を臨床で発揮することを確認した。これらの結果から,開発したカテキンジェルは要介護高齢者の口腔内微生物数のコントロールに有用で,かつ,長期使用が出来ることから,口腔病原微生物が関与する口腔ならびに全身疾患の発症予防に役立ち,健康維持とQOLの向上に貢献できる可能性が示唆された。本年度の進捗状況は,1.歯周病原菌群に対する抗菌機序の解明を企画したが,時間およびマンパワー不足の関係で検討に至らず残念であり,次年度に繰り越すこととなった。2.カテキンジェルの要介護高齢者口腔内の日和見感染病原体への影響を検討した結果,緑膿菌,ブドウ球菌および肺炎レンサ球菌数は有意に減少し,口腔が原因となる日和見感染症の発症予防に役立つ可能性が考えられた。3.健康高齢者を対象として実験を実施した結果,要介護高齢者の場合とほぼ同様な結果となり,口腔内微生物コントロール効果が確認され,現在詳細な分析を行っている。4.バイオアクティブガラスから放出される金属イオンがCandida albicansに及ぼす影響を検討した結果,発育を阻害するとともに,この真菌が病原性を発揮する酵母形から菌糸形への変換も抑制することが確認され,このガラスを義歯床用レジンに含有させることにより,高齢者の口腔カンジダ症および関連する真菌症の発症予防に寄与する可能性が考えられた。申請者らは、まず.抗微生物および抗酸化作用を持つ天然抗菌成分カテキン含有ジェルを開発し,in vitroで口腔の正常維持に関わるレンサ球菌群には影響を与えないが,齲蝕原因菌,歯周病原菌などの有害な病原菌に対して抗菌効果を示すことを確認し,臨床での口腔の微生物叢・数のコントロールと長期使用の可能性を見出した。さらに,口腔に限局せず一般病原菌である肺炎レンサ球菌,黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対しても抗菌効果を示すことを確認した。また,口腔カンジダ症の原因真菌であるCandida albicansにも抗菌効果を発揮すること,その抗菌機序は菌のATP産生量の減少および病原性(付着能,菌糸形変換およびタンパク分解酵素産生能)の阻害で,これらは遺伝子レベルで抑制することを解明した。一方,日本大学歯学部倫理委員会より承認を受け,研究に同意を得た要介護高齢者を対象とした臨床でのパイロット実験を実施した。In vivoでの実験の結果,カテキンジェルを4週間,口腔内に塗布することによって齲蝕原因菌,歯垢成熟に関与する菌,歯周病原菌群およびC. albicansそれぞれの菌数が有意に減少した。一方,in vitroと同様に口腔の正常維持に関わる口腔レンサ球菌群菌数への影響は認められず,選択的抗菌効果を示したことから,臨床においても十分有用な抗菌効果を発揮するものと考えられた。さらに臨床で応用可能な新たな抗菌作用を見出し,新たな口腔ケア剤の開発へと繋がるものと示唆される。本年度の進捗状況は,1.加齢および性別が口腔細菌叢の変化に与える影響について検討する目的で研究に賛同を得た健康被験者と,実験予定にはなかった障害者から唾液を採取し,次世代シークエンス機器(MiSeq,Illumina)による菌叢解析と,real-time PCR法による菌数,特に歯周病原菌数の算定を行い,比較検討を行った。

その結果,次世代シークエンスの結果では,両被験者とも口腔レンサ球菌群が優勢で検出比率がもっとも高かった、しかし,全菌叢に占めるその割合は健康高齢者の方が高く,他の主だった菌属に相違が見られた。Real-time PCRによる歯周病菌数の解析では健康高齢者の方が多く認められた。今後得られたデータから年齢・性別の相違について分析する予定である。2.カテキンジェル塗布が口腔細菌叢に与える影響として1.の被験者を対象に口腔ケア剤であるカテキンジェルの口腔内塗布による細菌叢の構成と菌数変化を同様に評価したところ,両解析法において塗布による両被験者の口腔レンサ球菌属菌への影響は認められなかった。一方,real-time PCR法では歯周病原菌群およびカンジダ菌数が減少し,特に健康高齢者で有意差が認められた。3.新たな抗菌成分による抗菌効果の検討としてバイオアクティブガラスから放出するイオンの歯周病原菌・病原性因子の抑制効果を検討したところ,歯周病原菌のP. gingivalisの発育,タンパク分解酵素であるRpgおよびKgp活性および血球凝集能を濃度依存的に抑制することを確認した。申請者らはこれまで抗微生物および抗酸化作用を持つ天然抗菌成分カテキン含有ジェルを開発し,in vitroで口腔の正常維持に関わるレンサ球菌群には影響を与えないが,齲蝕原因菌,歯周行原菌などの有害な病原菌に対して抗菌効果を示すことを確認した。一方,日本大学歯学部倫理委員会より承認を受け,研究に同意を得て要介護高齢者を対象とした臨床でのパイロット実験を実施し口腔の微生物叢・数のコントロールと長期使用の可能性を見出したことから,臨床においても十分有用な抗菌効果を発揮するものと確信した。さらに肺炎および日和見感染症の起因菌である肺炎レンサ球菌,黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対しても抗菌効果を示すことも確認した。以上の結果から,今回はカテキン以外の新たな天然抗菌成分を検索する目的で実験を重ねたところ,ワサビの主成分であるアリルイソチオシアネートが選択的抗菌効果を有し,歯周病原菌およびC. albicnasに対して抗菌効果を示すことが明らかとなった。さらにその他の抗菌成分を検索した結果,6種類の混合陽・陰イオン水がC. albicansの発育を阻害するとともに病原因子(付着能,二形性変換能およびタンパク分解酵素産生能)を著しく抑制することを確認した。これらの実験結果から,新たに見出したアリルイソチオシアネートおよびイオン水を臨床に応用することは,新しい歯周病およびカンジダ症の予防法の確立と,高齢者の健康維持およびQOLの向上に貢献できる可能性が示唆された。現在,歯周病原菌の病原因子に対する抗菌効果および抗菌機序について検討中である。申請者らは,これまで天然抗菌成分カテキン含有ジェルを開発し,in vitroで口腔正常維持に関わる菌群に影響を与えず,齲蝕原因菌や歯周病原菌などに対して抗菌効果を示すことを確認した。今回,このジェルの臨床でのパイロット実験を実施した結果,日和見感染症の起因菌を含め,口腔の微生物叢・数のコントロールと長期使用の可能性を見出した。一方,新たな天然抗菌成分としてアリルイソチオシアネートおよびイオン水を見出し,これらが歯周病原菌およびC. albicansに対して顕著な抗菌効果を発揮することを確認した。
DNAの構造的性質に基づくゲノムクロマチンの構築原理の解明

本研究は,DNAの構造的性質に基づいたゲノムクロマチンの構築とその遺伝子発現制御における役割を明らかにすることを目的として,以下の三つの観点から研究を展開した.真核生物ゲノムに散在するさまざまな種類の単純反復配列が,in vivoでのヌクレオソーム形成に及ぼす影響について,酵母ミニ染色体のアッセイ系を用いて解析した.その結果,ヌクレオソーム形成に対する効果として,阻害的に働く配列から促進的に働く配列まで4つのグループに分類できた.2.特殊なDNA構造によるクロマチンの改変を利用した転写制御機構の解析出芽酵母α細胞ではa-細胞特異的遺伝子はα2/Mcm1pによって抑制されており、そのプロモーターではヌクレオソームがポジショニングしている。本研究において、ヌクレオソーム形成を阻害するDNA配列を用いて,出芽酵母ゲノムBAR1遺伝子座およびSTE6-lacZプラスミドにおいて解析した結果,a-細胞特異的遺伝子の転写抑制にはヌクレオソームポジショニングが本質的な役割を果たしていることが実証された.3.トリプレットリピート配列の特殊DNA構造とクロマチンの構築神経筋疾患遺伝病の原因となるトリプレットリピート配列(CTG,CGG,GAAリピート)がクロマチン構造と遺伝子発現に及ぼす影響をin vivoで明らかにした.さらに,Friedreich運動失調症の原因となるリピートについて,sticky DNAとクロマチンとの関係について考察した.以上,DNAの構造的性質がin vivoにおけるヌクレオソーム形成に重要な役割を果たしていることが明らかになった.さらに,本研究は,DNA構造によるクロマチンの改変によって遺伝子発現を人為的に制御できる可能性を示している.本研究は,DNAの構造的性質に基づいたゲノムクロマチンの構築とその遺伝子発現制御における役割を明らかにすることを目的として,以下の三つの観点から研究を展開した.真核生物ゲノムに散在するさまざまな種類の単純反復配列が,in vivoでのヌクレオソーム形成に及ぼす影響について,酵母ミニ染色体のアッセイ系を用いて解析した.その結果,ヌクレオソーム形成に対する効果として,阻害的に働く配列から促進的に働く配列まで4つのグループに分類できた.2.特殊なDNA構造によるクロマチンの改変を利用した転写制御機構の解析出芽酵母α細胞ではa-細胞特異的遺伝子はα2/Mcm1pによって抑制されており、そのプロモーターではヌクレオソームがポジショニングしている。本研究において、ヌクレオソーム形成を阻害するDNA配列を用いて,出芽酵母ゲノムBAR1遺伝子座およびSTE6-lacZプラスミドにおいて解析した結果,a-細胞特異的遺伝子の転写抑制にはヌクレオソームポジショニングが本質的な役割を果たしていることが実証された.3.トリプレットリピート配列の特殊DNA構造とクロマチンの構築神経筋疾患遺伝病の原因となるトリプレットリピート配列(CTG,CGG,GAAリピート)がクロマチン構造と遺伝子発現に及ぼす影響をin vivoで明らかにした.さらに,Friedreich運動失調症の原因となるリピートについて,sticky DNAとクロマチンとの関係について考察した.以上,DNAの構造的性質がin vivoにおけるヌクレオソーム形成に重要な役割を果たしていることが明らかになった.さらに,本研究は,DNA構造によるクロマチンの改変によって遺伝子発現を人為的に制御できる可能性を示している.本研究は,DNAの構造的性質に基づいたゲノムクロマチンの構築とその遺伝子発現制御における役割を解明することを目指している。まず、特殊なDNA構造を形成してヌクレオソームを破壊するホモポリマー配列A_<34>を用いて、出芽酵母α2/Mcm1pによる転写抑制機構について検討した。A_<34>配列を挿入すると、a、αいずれの細胞においても、転写の活性化が見られ、ヌクレオソームが転写制御に重要であることが示された.次に、ヌクレオソームがTATA-box結合タンパク質(TBP)の結合を阻害して転写を抑制するという作業仮説を検証するために、TBPを人為的にリクルートする実験系を構築した。その結果、A_<34>配列の挿入は、TBPの人為的リクルートを促進して転写を脱抑制することが示された。したがって、α2/Mcm1pによるa細胞特異的遺伝子の転写制御について、ヌクレオソームのポジショニングは重要な転写抑制機構の一つであると結論づけられた。次に、神経筋疾患遺伝病の原因であるトリプレットリピートの伸長とDNAの特殊な高次構造形成との関係に着目して、CTG、CGG、GAAリピートについて、酵母ミニ染色体におけるクロマチン構造と遺伝子発現に及ぼす影響について検討した。(CTG)_<12>はヌクレオソームの形成を促進するが、(CGG)_<12>はそれを阻害した。また、(GAA)_<12>はヌクレオソーム形成に大きな影響はなかった。さらに、(CGG)_<12>は転写を活性化し、(CTG)_<12>は抑制することが示された。この結果は、それぞれの配列がヌクレオソーム形成に及ぼす効果と関連づけて説明することができた。以上の結果は、DNA構造によって規定されるクロマチンの構造が転写制御に重要な役割を果たしていることを示している。本研究は、DNAの構造的性質に基づいたゲノムクロマチンの構築とその遺伝子発現制御における役割を明らかにすることを目的としており、以下の二つの観点から研究を展開した。1.特殊なDNA構造によるクロマチンの改変を利用した転写制御機構の解析:出芽酵母α細胞ではa-細胞特異的遺伝子(BAR1など)はα2/Mcm1Pによって抑制されており、そのプロモーターではヌクレオソームがポジショニングしている。

本研究において、非B型構造を形成するpoly dA・poly dT、poly dG・poly dC配列をBAR1プロモーターに挿入したところ、BAR1の脱抑制が起こりα-factorが分解された。この結果は、ヌクレオソームポジショニングが転写抑制に重要な役割を果たしていることを示しているとともに、DNA構造に基づくヌクレオソーム配置の改変によってin vivoで転写活性を制御できる可能性を提示している。2.トリプレットリピート配列の特殊DNA構造とクロマチンの構築:ゲノムの反復配列とクロマチンの構築という観点から、神経筋疾患遺伝病の原因となるトリプレットリピート配列のクロマチン構造の特徴について研究を進めている。今年度は、Friedreich運動失調症の原因となるGAAリピートに焦点を絞った。近年、GAAリピートは三重鎖DNAを基盤としたsticky DNA構造を形成することが報告されており、Friedreich失調症との関連が注目されている。今回、様々な長さの(GAA)_n(n=12,23,89,126)をヌクレオソーム中央部位またはヌクレオソームフリー領域に挿入したミニ染色体を構築して、そのクロマチン構造を解析した。その結果、GAAリピートが長くなるほど、ミニ染色体におけるヌクレオソームポジショニングが破壊されることが示され、sticky DNAの形成との関連が示唆された。
魚類の還元的カロテノイド代謝に関わる新奇酵素の探索

魚類の体色発現に関与している代表的な色素であるカロテノイドには、様々な分子種が存在する。それらの代謝メカニズムは魚種により異なり、海水魚の多くは酸化的代謝を行うのに対し、ティラピアやアユ等の淡水魚には、還元的な代謝を行うものが存在する。カロテノイドの酸化的代謝に関与する酵素遺伝子については、細菌や植物において、その同定がすでに行われている。しかし、カロテノイドの還元的代謝経路に関与する酵素に関する情報は、ほぼ皆無に等しい。そこで本研究では、魚類における還元的カロテノイド変換に関与する酵素遺伝子を単離・同定し、魚類における還元的カロテノイド代謝を分子レベルで解明するとともに、新規反応メカニズムを有する酵素に関する基礎的知見を得ることを目的とする。前年度までの実験から、アスタキサンチンの還元的代謝に関与する酵素における、基質特異性に関する情報を得ることが必要と考えられた。アスタキサンチンにはβ-ヨノン環の3、3'位に存在する水酸基に関連し、(3S, 3'S)(3S, 3'R)、(3R, 3'R)の三種の立体異性体が存在する。そこで、アスタキサンチンのこれらの三種の立体異性体を、それぞれ単独の色素源として試料に添加し、ヒメダカに投与した。飼育実験終了後、前年度までに確立した分析手法により、魚体のカロテノイド組成を分析し、総カロテノイド量、および黄色系キサントフィルと赤色系キサントフィルの存在比を求めることにより、アスタキサンチン各異性体の転換効率を調べた。カロテノイドの酸化的代謝に関与する酵素遺伝子については、細菌や植物においてその同定が行われている。魚類の各組織に存在するキサントフィル類は、一部の例外を除いては脂肪酸エステルとして存在する。異なる脂肪酸分子種とエステル結合した単一のキサントフィルの分子種は、各種クロマトグラフで異なる挙動をするため、当該キサントフィルの分子種が、どの様に代謝されたか解析するための分析が難しい。そこで今年度はキサントフィル類脂肪酸エステルを、遊離型キサントフィルに酵素処理により変換した後、高速液体クロマトグラフィーにより解析する、迅速分析システムを確立した。これにより魚体に存在する、カロテン類から最も代謝が進んだアスタキサンチンまでの各種カロテノイドの分離、分析が可能となった。一方、ティラピアのゲノム情報からカロテノイド代謝に関連する酵素遺伝子の探索を試みたが、今までのところ当該遺伝子は得られていない。ティラピアに異なるカロテノイド源を投与することで、酸化型および還元型のカロテノイド代謝を行う試験魚の作成を試みたものの、当該供試魚が得ることができなった。そのため当初計画していたRNA発現解析を、次年度に延期せざるを得なかった。前年度までにβ-カロテンあるいはアスタキサンチンを、それぞれ色素源として含む餌料をヒメダカに投与し、カロテノイドの酸化的代謝あるいは還元的代謝を行っている供試魚の作出を試みた。それぞれの飼育群の魚につき、前年度までに確立した手法により、カロテノイド組成を分析したところ、特にアスタキサンチン投与魚において、期待される色素組成となっていなかった。このことから、アスタキサンチンの投与法を再検討する必要性が示唆された。また、カロテノイドの酸化的代謝に関与すると考えられる、候補酵素遺伝子の取得をPCRにより試みたところ、得られた同一酵素のcDNAクローンの塩基配列には。若干の多様性が認められた。前述の様に、カロテノイドの還元的な代謝を行う生理状態となっている供試魚の作成ができず、酸化型の代謝を行っている魚とのRNA発現状況の比較解析を行うことができなかったため。アスタキサンチンの投与法について若干の改変が必要なものと考えている。また、カロテノイド代謝関連酵素遺伝子の取得に比較的時間がかかってしまった。これは今回用いたヒメダカが遺伝的に均一な集団で無かったことも一因と考えられる。

しかし、カロテノイドの還元的代謝経路に関与する酵素に関する情報は、ほぼ皆無に等しい。そこで本研究では、魚類における還元的カロテノイド変換に関与する酵素遺伝子を単離・同定し、魚類における還元的カロテノイド代謝を分子レベルで解明するとともに、新規反応メカニズムを有する酵素に関する基礎的知見を得ることを目的とする。前年度までの実験から、アスタキサンチンの還元的代謝に関与する酵素における、基質特異性に関する情報を得ることが必要と考えられた。アスタキサンチンにはβ-ヨノン環の3、3'位に存在する水酸基に関連し、(3S, 3'S)(3S, 3'R)、(3R, 3'R)の三種の立体異性体が存在する。そこで、アスタキサンチンのこれらの三種の立体異性体を、それぞれ単独の色素源として試料に添加し、ヒメダカに投与した。飼育実験終了後、前年度までに確立した分析手法により、魚体のカロテノイド組成を分析し、総カロテノイド量、および黄色系キサントフィルと赤色系キサントフィルの存在比を求めることにより、アスタキサンチン各異性体の転換効率を調べた。ティラピア以外にも淡水魚のメダカ類は、カロテノイド類の構成成分としてツナキサンチンを有していることが、既往研究により明らかになっている。メダカ類はティラピア類よりも小型で飼育も容易である。また、メダカ類もティラピア同様、ゲノム情報が公開されており、カロテノイド代謝関連酵素遺伝子の探索が、比較的容易と考えられる。そこで次年度は、試験魚の魚種を変更することも検討している。メダカを用いる場合は体サイズが小さいことから、組織別のカロテノイド代謝解析は行わず、魚体全体を用いたRNA発現解析により候補遺伝子の絞り込みを行う予定である。アスタキサンチンにはβ-ヨノン環の4、4'位に関し、(R,R)、(R,S)、(S, S)の3種の立体異性体が存在する。魚類によるカロテノイドの代謝的還元系において、これらの立体異性体間で反応性に差があるかを考慮して、餌中に投与することを検討する。また、安定性を考慮して、遊離型では無く脂肪酸エステル体として投与することも検討する。ティラピアに異なるカロテノイド源を投与することで、酸化型および還元型のカロテノイド代謝を行う試験魚の作成を試みたものの、当該供試魚が得ることができなった。そのため当初平成28年度に計画していたRNA発現解析を、次年度に行うこととし、その必要経費を繰り越す必要があった。前年度までにカロテノイドの還元的代謝を行っていると考えられる供試魚の作成が出来なかったため、関連遺伝子の特定に必要なトランスクリプトームデータベースの作成を差し控えざるを得なかった。次年度には速やかに飼育実験を再開することで当該供試魚を作成し、トランスクリプトーム解析を行う予定であり、その費用を計上した。使用魚種の変更等により、カロテノイド代謝に関与する遺伝子候補を特定し得る供試魚を作成次第、RNA発現解析を行い、当該繰越額を充当する予定である。
マイクロRNAによる複雑な転写後抑制様式の理解に向けたin vivo解析

培養細胞を用いた実験から、マイクロRNAによる転写後抑制にはTNRC6タンパク質が必要であると考えられている。本研究では、tnrc6aとtnrc6b1の二重変異ゼブラフィッシュを作成し、脊椎動物の初期発生過程においてTNRC6がマイクロRNAによる抑制に必須であることを明らかにした。またマイクロRNA以外にmRNAの安定性を制御する要因として、コドン使用の偏りが大きな影響を及ぼすことを発見した。さらにマイクロRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングを行い、初期発生における2つの酵素の貢献を網羅的に明らかにした。miRNA経路の中核因子TNRC6AおよびTNRC6Bの変異体(MZtnrc6変異体)を用い、miRNAによる転写後抑制におけるTNRC6の機能解析を行った。miRNAにより抑制されるルシフェラーゼレポーターmRNAをMZtnrc6a受精卵にインジェクションし、6時間後にその抑制活性を検証したところ、野生型で見られたmiR-1によるレポータの抑制が、MZtnrc6a変異胚では効率よく起こっていないことを確認した。さらにポリ(A)鎖の短縮化が起こらないレポーターmRNAを用いて同様の実験を行ったところ、このレポーターにおいてもMZtnrc6a変異胚ではmiR-1による抑制が効率よく起こっていなかった。MZtnrc6a変異胚ではmiRNA経路に関わる主要な因子のタンパク質量が低下していなかったことから、変異胚における抑制活性の減少は他のタンパク質因子の発現不全による二次的影響である可能性は考えにくい。以上の結果から、TNRC6AがポリA鎖の短縮を介した標的mRNAの分解以外に、翻訳レベルでの抑制に関与していることが強く示唆された。また、miR-430による抑制を検出するGFPレポーターを発現する系統と変異系統の掛け合わせを行い、tnrc6a/tnrc6b二重変異体のバックグラウンドにGFPレポーター遺伝子を持つ系統を作出した。この系統は次年度以降の解析に用いる予定である。ユビキチン系を利用したタンパク質ノックダウン法については、cnot1のN末端にCRISPRシステムによりGFPを挿入するための準備を行い、活性の高いgRNAを選別した。本年度は、予定していたレポーターmRNAを用いた実験をMZtnrc6a胚を用いて行い、TNRC6Aの必要性を検証することができた。この結果は本研究の基盤となる部分であり、重要な成果であると考える。一方で、MZtnrc6a/tnrc6b二重変異体に関しては、成体の生存率が予想以上に低く、また加齢に伴い稔性の低下が起こったため、十分な検証をするための胚を得ることができなかった。この点に関しては次年度以降の課題である。MZtnrc6a/tnrc6b二重変異体へのGFPレポータの導入は完了していることから、次年度以降はこの系統を中心に研究を推進することができると期待できる。CRSIPRシステムの確立や標的部位の選別等は予定通り進行している。想定外の成果として、miRNA経路の解析を進める中で、miRNA以外にmRNAの安定性を制御する要因として、コドン使用の隔たりが大きな影響を及ぼすことを発見した。副次的な成果ではあるが、初期発生におけるmRNA制御を理解する上で重要な成果であり、今後本計画を進める上でも必須の知見であることから、予定の一部を変更して研究を進めた。この内容についてはMolecular Cell誌に論文として報告した。当初は予期していなかった結果が含まれているものの、全体として計画は順調に進んでいると考える。昨年に引き続き、miRNA経路の中核因子TNRC6AおよびTNRC6Bの母性接合子二重変異体(MZtnrc6変異体)を用い、miRNAによる転写後抑制におけるTNRC6の機能解析を行った。昨年度作成したmiR-430による抑制を検出するGFPトランスジーン系統を利用した解析を行ったところ、予想通りMZtnrc6変異体ではGFPの蛍光が顕著に強くなっていることが確認できた。しかしその蛍光はmiR-430をモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)で阻害した場合や、miR-430による抑制を受けないレポーターと比較して弱いことから、TNRC6AおよびTNRC6Bを欠いた胚ではmiRNAによる抑制が部分的に解除されていると結論した。一方で、miRNAによるポリA鎖の短縮を引き起こすCnot7の機能をドミナントネガティブ型タンパク質の過剰発現により阻害した場合より、MZtnrc6変異体におけるGFP蛍光は強いことが確認された。この結果より、miRNAが引き起こすdeadenylationを介したmRNA分解と翻訳開始の抑制効果より、TNRC6AおよびTNRC6Bによる直接的な翻訳抑制の方が、miRNAによる転写後抑制全体に対する寄与が大きいことが示唆された。ユビキチン系を用いたタンパク質ノックダウンについては、オリジナルの方法を改変し、Cnot7とE3結合ドメインの融合タンパク質によってCnot1を分解する方法を試みたところ、Cnot1の顕著な分解が認められた。また、miRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングを行い、その結果を解析した。本年度は、昨年度に作成していたレポーター系統を用いた実験により、TNRC6AおよびBの二重欠損時(MZtnrc6)におけるmiRNAによる抑制効果の検証を予定通り行うことができた。その結果、MZtnrc6ではmiRNAによる抑制が顕著に阻害されていたことから、今後この系統に対してレスキュー実験などを行うことによって、TNRC6の機能解析を個体発生において効率よく検証することが可能である。

ユビキチン系を用いたタンパク質ノックダウンについては、CRISPRを用いたCnot1内在遺伝子座へのGFPタグ付けが技術的に依然として難しく、やや難航している。しかしこの点に関しては、Cnot1タンパク質に結合するCnot7タンパク質とE3の融合タンパク質を利用する方法を発案し、良好な結果を得ている。今後はさらに条件を検討し、両者を併用する形で、計画を補完して進めることが可能である。また本研究計画の基盤的知見を得る目的で、miRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングを行い、これら2つの因子がmiRNA経路において不均一に貢献していることを示唆するデータを得ることができた。MZtnrc6系統を用いてこの知見を確認するためには、時間的に猶予がない可能性が考えられたので、この結果をまずは独立した論文としてまとめ、査読付き雑誌への投稿を完了した。本年度は、昨年度までに確立したMZtnrc6/miR-430 GFPセンサー系統に対して、野生型のtnrc6aをコードするmRNAを受精卵に顕微注入することにより、レスキュー実験を行なった。その結果、MZtnrc6変異体で見られていた発生遅延が回復することが確認できた。またGFPの抑制も回復する傾向が確認された。しかしながら、いずれの場合もその効果は部分的であった。このことは、tnrc6aとbには異なる機能がある可能性を示唆している。すなわち、tnrc6ファミリー間での機能分担が予想される。この結果は、本研究開始時の仮説と矛盾しないものである。一方で、MZtnrc6変異体で見られた表現型の一部は、卵形成期におけるtnrc6の欠損によるものである可能性も考えられる。次に、MZtnrc6変異体における遺伝子発現の変動を明らかにするために、受精後6時間の野生型とMZtnrc6変異胚からRNAを抽出し、RNA-seqによる解析を行った。その結果、MZtnrc6変異胚ではmiR-430の標的配列を有する一連のmRNA群が特異的に上昇していることが確認された。このことから、MZtnrc6変異胚ではmiRNAによるmRNA分解活性が全般的に低下していると結論した。本研究計画の基盤的知見を得る目的で実施し、昨年度に査読付き雑誌へ投稿していたmiRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングの報告については、査読結果をもとに追加実験と加筆修正を行い、Genes to Cells雑誌に受理された。培養細胞を用いた実験から、マイクロRNAによる転写後抑制にはTNRC6タンパク質が必要であると考えられている。本研究では、tnrc6aとtnrc6b1の二重変異ゼブラフィッシュを作成し、脊椎動物の初期発生過程においてTNRC6がマイクロRNAによる抑制に必須であることを明らかにした。