hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
等質射影多様体のLie環論的,および,代数幾何的研究

1.前田英敏は,下記の研究成果を得た。(1)Eをn次元の非特異射影代数多様体X上の階数n-2の豊富なベクトル束で,Zが小平次元1の代数曲面の場合に,零点集合がZになるような大域切断を有するEの構造を完全に決定し,豊富な因子の場合を扱うSommeseとShepherd-Barronの結果を一般化した.(2)Eをn次元の非特異射影代数多様体X上の階数n-1の豊富なベクトル束で,零点集合が有理曲線や楕円曲線になるような大域切断を有する場合に,編曲多様体(X, E)を分類した。また,Eが非常にに豊富なベクトル束の場合に,種類が2以上の超楕円曲線Z上で消滅するような大域切断を有するEの性質を調べた。特に,Zの種数が2のとき,XとEから成る一般偏極多様体(X, E)を分類した.(3)非特異複素射影代数多様体上の豊富なベクトル束に対して,零点集合がそのベクトル束の回数と同じ余次元の非特異部分多様体になるような大域切断が存在するという仮定の下で,その零点集合が2重楕円切断を含む場合に,多様体とその上の豊富なベクトル束から成る偏極多様体を分類した.また零点集合が非特異曲線上の2次超曲面ファイバー束の場合に以前分類していた偏極多様体に関する結果を改良した.2.保倉理美は,揖元と共同で随伴多様体,sumplectic triple system,そして複素単純リー代数の接触型階数分解の関係に関する具体的研究を行った.さらに,Fruedenthal多様体の射影幾何的性質をsymplectic triple systemの言葉で記述・証明することに成功した.特に,随伴多様体について,割線多様体の軌道分解および射影幾何的記述を得た.また,Freudenthal多様体について,随伴多様体とのlinear section関係および等質性の本質的証明を得た.1.前田英敏は,下記の研究成果を得た。特に,Zの種数が2のとき,XとEから成る一般偏極多様体(X, E)を分類した.(3)非特異複素射影代数多様体上の豊富なベクトル束に対して,零点集合がそのベクトル束の回数と同じ余次元の非特異部分多様体になるような大域切断が存在するという仮定の下で,その零点集合が2重楕円切断を含む場合に,多様体とその上の豊富なベクトル束から成る偏極多様体を分類した.また零点集合が非特異曲線上の2次超曲面ファイバー束の場合に以前分類していた偏極多様体に関する結果を改良した.2.保倉理美は,揖元と共同で随伴多様体,sumplectic triple system,そして複素単純リー代数の接触型階数分解の関係に関する具体的研究を行った.さらに,Fruedenthal多様体の射影幾何的性質をsymplectic triple systemの言葉で記述・証明することに成功した.特に,随伴多様体について,割線多様体の軌道分解および射影幾何的記述を得た.また,Freudenthal多様体について,随伴多様体とのlinear section関係および等質性の本質的証明を得た.前田英敏は,非特異複素射影代数多様体の上の階数が多様体の次元よりも1つ低い豊富なベクトル束に対して零点集合が楕円曲線となるような大域切断を有する場合に,多様体とその上の豊富なベクトル束から成る対を分類した.野間淳は,正標数の代数閉体上に定義された多様体の,射影空間への埋め込みに対するガウス写像で,分離次数が1より大きくなっている場合を研究した.その結果,一般型ではない小平次元が正の非特異射影多様体のうちには,そのような例が存在することがわかった.大野真裕は,非特異射影多様体上の豊富なベクトル束について研究した.特に数値的半正値の観点から研究することにより,従来の随伴束の数値的半正性に関する結果を,ベクトル束の階数がより低い場合にも成り立つよう改良することができた.原伸生は,正標数の可換環のフロベニウス写像と,それを用いて定義されるtight closureの概念を通して,代数多様体の有理特異点,対数的末端特異点の特徴付けを行い,また,特異点の幾何種数等の不変量に関する公式を導いた.楫元,保倉理美は,接触型の階数別複素単純リー代数の構造とその射影随伴閉軌道のsecant多様体の構造との関係を具体的に研究した,特に,楫元は,A型随伴多様体の(高次も含めた)secant多様体の定義方程式,そして,BD型随伴多様体の定義方程式を明らかにした.

保倉理美は,横田一郎氏(信州大学名誉教授)および宮坂隆氏(長野県松本美須々ケ丘高等学校数学教諭)との共同研究によって,コンパクト型単連結例外型リー群E_7の最低次元表現空間の元がある意味で対角化可能であることの証明を,2通り具体的に与えた.前田英敏は、非特異複素射影代数多様体上の豊富なベクトル束に対して、零点集合が階数と等しい余次元の非特異部分多様体となるような大域切断が存在するという仮定の下で,零点集合が随伴理論において特殊な構造を有するときに,多様体とその上の豊富なベクトル束から成る偏極多様体を分類した.野間淳は,次数が低い非特異空間有理曲線のGeneric Initial Idealを決定する問題のうち,今まで知られていなかった次数6の場合を決定した.また,種数がある数以上の射影曲線に対して,その定義イデアルのregularityのより正確な上限を与えた.これにより,定義方程式のより正確な次数の上限と接触回数の大きな割線の非存在がわかる.原伸生は,正標数のde Rham複体とCartier operatorを用いて2次元特異点の特異点解消に関するある消滅定理を証明した.また,可換環のtight closure理論と双有理代数幾何においてそれぞれ重要な意味をもつtest idealとmultiplieridealの対応を示した.保倉理美,楫元は,随伴多様体,symplectic triple system,そして,simple Lie algebra of contact typeの関係に関する具体的研究を行なった.さらに,フロイデンタール多様体の射影幾何的性質をsymplectic triple systemの言葉で記述・証明することに成功した.また,楫元は,homogeneous projective varieties with one apparent double pointの分類を行った.1.前田英敏は,今年度は,以下の2つの研究を行った.(1)Eをn次元の非特異射影代数多様体X上の階数n-2の豊富なベクトル束とする.Zが小平次元1の代数曲面の場合に,零点集合がZになるような大域切断を有するEの構造を完全に決定し,豊富な因子の場合を扱ったSommeseとShepherd-Barronの結果を一般化した.(2)Eをn次元の非特異射影代数多様体X上の階数n-1の豊富なベクトル束とするとき,零点集合が有理曲線や楕円曲線になるような大域切断を有するEの分類を以前に行っていた.この研究の続きとして,Eが非常に豊富なベクトル束の場合に,種数が2以上の超楕円曲線Z上で消滅するような大域切断を有するEの性質を調べた.特に,Zの種数が2のときには,XとEから成る一般偏極多様体(X,E)を分類することにも成功した.1.前田英敏は,非特異複素射影代数多様体上の豊富なベクトル束に対して,零点集合がそのベクトル束の階数と同じ余次元の非特異部分多様体になるような大域切断が存在するという仮定の下で,その零点集合が2重楕円曲線切断を含む場合に,多様体とその上の豊富なベクトル束から成る偏極多様体を分類した.また,零点集合が非特異曲線上の2次超曲面ファイバー束の場合に以前分類していた偏極多様体に関する結果を改良することにも成功した.2.保倉理美は,前年度に引き続き,揖元(早稲田大学理工学部教授,ブラジル数学研究所IMPA)と共同して,複素単純リー代数に対応して存在するFreudenthal多様体(C型の場合は,空集合となる)について研究した.特に,その等質性について,前年度までに得られていた幾つかの証明の幾何学化を試みた.具体的には,複素単純リー代数のFreudenthal型構成に現れるsymplectictriple
ヘテロ原子含有有機物のゼオライト細孔内拡散機構解明

申請者らがこれまでに開発した気相、液相、超臨界流体中での多孔質材料細孔内拡散係数測定法を駆使しすることにより、これまでに報告例がほとんどないヘテロ原子を分子構造中に持つ炭化水素のゼオライト結晶内拡散機構解明ならびにその体系化に挑む。さらに、モデル反応としてバイオマス構成ユニット類似の含酸素有機化合物を用いた反応の反応速度解析を実施し、拡散速度の情報に基づくヘテロ原子を持つ炭化水素が関わる反応の触媒設計指針を得る。
超低速ミュオン線形加速器の開発

本研究では,「A01班:超低速ミュオン顕微鏡と極微μSR法創成」において計画されているビーム尖鋭化に必要な基盤技術として,ミュオニウムをレーザー解離することで得られた超低速ミュオンを1MeV以上に再加速するための,高周波四重極型線形加速器(RFQ)とインターディジタルーH型線形加速器(IH-DTL)から構成される,超低速ミュオン加速器の開発をおこなった。平成25年度は,前年度に基本デザインを終えた運転周波数324MHzの超低速ミュオン加速用IH-DTL原理実証機について実機製作をおこなった。その基本構造は,一枚板から全てのドリフトチューブ電極を立体的に削り出したセンタープレートに,半円形のサイドシェルを両側から取り付けるスタイルとなっている。最終デザインの3次元CADモデルから製作図面を描き起こして,精密機械加工メーカーに依頼してセンタープレートとサイドシェルを削り出した。製作後の両者を組み合わせ,ネットワークアナライザーによる高周波測定と,3次元電磁場解析ソフトウェアによるシミュレーションを同時におこないながら,サイドシェルのフランジ部の厚さを削り込んでいき,共振周波数を324MHz近傍に調整して原理実証機を完成させた。今後は,とくに本研究で取り入れた高周波電場の加速位相の符号を交互に変化させて収束する(Alternating Phase Focus: APF)法の成果について配慮しながら,ビーム加速特性やビーム収束特性を評価し,超低速ミュオン顕微鏡やg-2/EDM実験のための実機デザインにフィードバックする予定である。また,新しい超低速ミュオン線形加速器として誘導加速型の検討グループを立ち上げ,高エネルギー加速器研究機構において保管されていた既存のファインメットコアを用いた実機デザインに引き継いだ。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,「A01班:超低速ミュオン顕微鏡と極微μSR法創成」において計画されているビーム尖鋭化に必要な基盤技術として,ミュオニウムをレーザー解離することで得られた超低速ミュオンを1MeV以上に再加速するための,高周波四重極型線形加速器(RFQ)とインターディジタルーH型線形加速器(IH-DTL)から構成される,超低速ミュオン加速器の開発をおこなっている。平成24年度は,J-PARC主加速器のために製作された,既存の運転周波数が324MHzの負水素イオン加速用RFQの予備機に30keVミュオンを入射・加速した場合のビーム特性を,荷電粒子運動解析コードにより解析し,超低速ミュオン加速への利用可能であることを明らかにした。また,これまでg-2/EDM実験用として検討してきたミュオン加速用IH-DTLに関するビーム軌道計算を,最新鋭の計算用ワークステーションを導入して本研究用に発展させ,前述したRFQの解析結果をビーム初期条件として取り入れるとともに,高周波電場の加速位相の符号を交互に変化させて収束する(Alternating Phase Focus: APF)法を導入し,ビーム収束が効果的に機能するような最適な加速位相セットを探求した。そして,一枚板から全てのドリフトチューブ電極を立体的に削り出したセンタープレートに,半円形のサイドシェルを両側から取り付ける構造をもつ,運転周波数324MHzの超低速ミュオン加速用IH-DTL原理実証機のデザインを完了した。研究計画どおり進展している。本研究の成果は,平成24年8月30日9月1日北海道大学で開催された「第2回領域会議公開シンポジウム」,同年9月19日21日に広島大学で開催された「日本原子力学会2012年秋の大会」,同年11月27日28日に東京大学で開催された「第6回物性科学領域横断研究会」および平成25年3月26日29日に広島大学で開催された「日本物理学会第68回年次大会」において,各々口頭発表をおこなった。

平成24年度にデザインした,運転周波数324MHzの超低速ミュオン加速用IH-DTL原理実証機を具体化し,電気的特性試験および真空特性試験を実施する。これまでg-2/EDM実験用として検討してきたIH-DTLの試作モデルにAPF法を適用した改造をおこない,装置全体を組み立て,ネットワークアナライザーなどの計測器により,加速空洞の電気的特性を評価する。そして,性能的に問題のないことが確認されたら,ビーム加速特性やビーム収束特性を評価し,今後製作が予定されている超低速ミュオン顕微鏡やg-2/EDM実験のための実用機デザインにフィードバックする。また,新しい超低速ミュオン線形加速器として,誘導加速型の検討もおこなう。25年度が最終年度であるため、記入しない。
セラミド-1-リン酸の動的挙動解析に基づくホスホリパーゼA2分子認識機構の解明

細胞膜上に局所的に分布するセラミド-1-リン酸(C1P)が、どのようにして細胞質型ホスホリパーゼA2 (cPLA2α)と特異的に結合するのか、その分子基盤の解明を目指す。そのために、構造改変したC1P類縁体を化学合成し、多様な計測手法を用いて、人工膜や細胞膜におけるC1PおよびcPLA2αとの複合体の動的挙動や相互作用を原子レベルで観測する。これらを統合的に解析することによって、C1Pの挙動秩序と生理機能の関係の理解が深まることが期待される。
ツツジ亜属種におけるCCD4遺伝子の発現と常緑性黄花ツツジ育種への応用

常緑性のツツジ亜属種と落葉性で黄色花のPentanthera亜属種との亜属間交配で得られた実生の黄色花色は,ツツジ亜属種より遺伝したCCD4の高発現のため退色化する.すなわち,常緑性黄花ツツジ作出には,交配親としてCCD4遺伝子の発現量が低い常緑性ツツジ種を用いることが有効と考えられる.一昨年度の報告で,開花当日の花弁内におけるCCD4遺伝子の発現量は,常緑性ツツジ種によって大きく異なり,特に,ケラマツツジ亜節に発現量の低い種が存在することを明らかにした.本年度は,常緑性黄色花ツツジ作出のための育種素材として,ケラマツツジ亜節に属するツツジ類の有効性を検討するため,開花当日の花弁内でのCCD4遺伝子の発現量が低かったケラマツツジ亜節のサキシマツツジおよびヤクシマヤマツツジ,サツキ亜節サツキ列のサツキの3種と,逆に,発現量が高かったサツキ亜節サツキ列のセンカクツツジ,サツキ亜節ヤマツツジ列のタイワンヤマツツジおよびオオシマツツジツツジの3種を用いて花弁発育に伴うCCD4遺伝子発現量の変化を調査した.花弁発育に伴うCCD4遺伝子の発現量について,サキシマツツジ,センカクツツジ,タイワンヤマツツジおよびオオシマツツジでは,開花前日から当日にかけて増加し,その後,減少した.残りの3種では,開花前日から2日後にかけて増加し,その後,減少した.キレンゲツツジと比較すると,センカクツツジおよびタイワンヤマツツジの発現量は全発育期間を通して有意に高く,また,オオシマツツジは開花当日以降,サツキは開花2日後以降に有意に高かった.一方,サキシマツツジおよびヤクシマヤマツツジの2種では,全発育期間を通してキレンゲツツジの発現量と有意差はみられなかった.特に,サキシマツツジの発現量は,開花当日以降で調査した常緑性ツツジの中で最も低く,また,開花2日後以降では,キレンゲツツジより発現量が低かった.常緑性黄色花ツツジの作出を目的とした常緑性のツツジ亜属種と落葉性で黄色花のPentanthera亜属種との亜属間交配で得られた実生の黄色花色は,ツツジ亜属種より遺伝したCCD4の高発現のため退色化する.一方,キレンゲツツジでも常緑性ツツジと相同性が非常に高いCCD4遺伝子が存在し,その発現量は低いながらも認められていることから,この両親間の発現量の差が何に起因するのかを明らかにすることは重要である.よって,本年は,すでにCCD4遺伝子の塩基配列を明らかにしているツツジ亜属種の白花ミヤマサツキとPentanthera亜属種の黄花キレンゲツツジについて,CCD4発現量の差をもたらす要因を明らかにするために,翻訳開始点より下流側のゲノム構造解析を行った.その結果,両種とも2つのイントロンが存在したが,両イントロンともキレンゲツツジの方が塩基配列が長かった.このことから,イントロンの長さの違いが発現量に影響している可能性が考えられた.次に,CCD4の発現量の低いツツジ亜属種の探索を目的に,ツツジ亜属の18種計31系統の開花当日の花弁を用いて,リアルタイムPCRによりCCD4遺伝子の発現解析を行った.その結果,Pentanthera亜属のレンゲツツジの発現量を1としたときの相対的発現量は,レンゲツツジの発現量に比べいずれも高かったが,その相対的発現量は10倍から100倍まで変異した.ツツジ亜属のうち,発現量が最も低かったのはサキシマツツジで,ついでチョウセンヤマツツジ,サツキ,ヤクシマヤマツツジであり,これらは,いずれもレンゲツツジの10倍前後であった.以上のことより,CCD4の発現量は,ツツジ亜属種内で大きく異なることが明らかとなった.また.これらの種については,CCD4遺伝子の塩基配列を調査しているところである.ミヤマサツキおよびキレンゲツツジのCCD4遺伝子について,翻訳開始点より下流側のゲノム構造解析が終了したこと,ツツジ亜属の18種計31系統の開花当日の花弁のCCD4遺伝子の発現解析を行ったこと,さらに,これらの種のうち11系統についてCCD4遺伝子のクローニングおよび塩基配列の解読が終了している点から,おおむね順調に進んでいると判断した.常緑性のツツジ亜属種と落葉性で黄色花のPentanthera亜属種との亜属間交配で得られた実生の黄色花色は,ツツジ亜属種より遺伝したCCD4の高発現のため退色化する.昨年度の研究で,交配親のミヤマサツキとキレンゲツツジについて翻訳開始点より下流側のゲノム構造解析を行い,両種とも2つのイントロンが存在するが,いずれもキレンゲツツジのサイズが大きく,特に,第2イントロンで809bpの挿入配列が確認されることを明らかにした.そこで,本年度は,まず,第2イントロンの長さの違いがCCD4遺伝子の発現量に与える影響を明らかにするために,リアルタイムPCRにより第2エキソンー第2イントロンー第3エキソン間でのスプライシング効率を確認した.その結果,第2エキソンー第3エキソン間で設計したプライマーでは,ミヤマサツキの発現量が3倍高かったのに対し,第2エキソンー第2イントロン間で設計したプライマーでは,キレンゲツツジの方が1.3倍高かったことから, CCD4の発現量の差に,第2イントロンのサイズが影響している可能性が考えられた.次に,昨年度の研究でCCD4の発現量の解析を行ったツツジ亜属の18種計31系統に加え,Pentanthera亜属の4系統について,cDNAのクローニングおよびイントロンのサイズの調査を行った.

その結果,ツツジ亜属内の種間におけるCCD4のアミノ酸レベルでの相同性は,97%以上と高かった.また,第2イントロンのサイズについて,CCD4の発現量が低いPentanthera亜属の3系統はいずれもキレンゲツツジと同様の大きさであったのに対し,同亜属で発現量が高い1系統では,小さかった.ツツジ亜属種の第2イントロンのサイズは,CCD4の発現量にかかわらず,いずれもキレンゲツツジに比べ小さかった.このことから,同亜属内におけるCCD4の発現量の差には,他の要因が考えられた.昨年度の研究計画でキレンゲツツジおよびミヤマサツキのCCD4のプロモーター領域を含む翻訳開始点より上流域の塩基配列を決定することを予定していたが,先にイントロンサイズの影響を調査した.ミヤマサツキおよびキレンゲツツジのCCD4遺伝子の発現量の差に対する第2イントロンのサイズの影響を調査したこと,ツツジ亜属の18種計31系統のCCD4遺伝子のクローニングおよび塩基配列の解読が終了したことから,おおむね順調に進んでいると判断した.常緑性のツツジ亜属種と落葉性で黄色花のPentanthera亜属種との亜属間交配で得られた実生の黄色花色は,ツツジ亜属種より遺伝したCCD4の高発現のため退色化する.すなわち,常緑性黄花ツツジ作出には,交配親としてCCD4遺伝子の発現量が低い常緑性ツツジ種を用いることが有効と考えられる.一昨年度の報告で,開花当日の花弁内におけるCCD4遺伝子の発現量は,常緑性ツツジ種によって大きく異なり,特に,ケラマツツジ亜節に発現量の低い種が存在することを明らかにした.本年度は,常緑性黄色花ツツジ作出のための育種素材として,ケラマツツジ亜節に属するツツジ類の有効性を検討するため,開花当日の花弁内でのCCD4遺伝子の発現量が低かったケラマツツジ亜節のサキシマツツジおよびヤクシマヤマツツジ,サツキ亜節サツキ列のサツキの3種と,逆に,発現量が高かったサツキ亜節サツキ列のセンカクツツジ,サツキ亜節ヤマツツジ列のタイワンヤマツツジおよびオオシマツツジツツジの3種を用いて花弁発育に伴うCCD4遺伝子発現量の変化を調査した.花弁発育に伴うCCD4遺伝子の発現量について,サキシマツツジ,センカクツツジ,タイワンヤマツツジおよびオオシマツツジでは,開花前日から当日にかけて増加し,その後,減少した.残りの3種では,開花前日から2日後にかけて増加し,その後,減少した.キレンゲツツジと比較すると,センカクツツジおよびタイワンヤマツツジの発現量は全発育期間を通して有意に高く,また,オオシマツツジは開花当日以降,サツキは開花2日後以降に有意に高かった.一方,サキシマツツジおよびヤクシマヤマツツジの2種では,全発育期間を通してキレンゲツツジの発現量と有意差はみられなかった.特に,サキシマツツジの発現量は,開花当日以降で調査した常緑性ツツジの中で最も低く,また,開花2日後以降では,キレンゲツツジより発現量が低かった.本年は,ツツジ亜属種とPentanthera亜属種とのCCD4発現量の差が,翻訳開始点より上流域(シスDNAエレメント)での塩基置換や挿入,欠失の存在などによりもたらされているかを明らかにするため,キレンゲツツジおよびミヤマサツキのCCD4のcoding領域の塩基配列をもとにプライマーを(2もしくは3種)作成し,ゲノムウォーキングキットをもちいてプロモーター領域を含む翻訳開始点より上流域の単離する.得られた産物をTAクローニング法でクローニングし,塩基配列を決定する.
タイプIII型輸送系 ; バクテリアのべん毛タンパク質輸送装置の構造解析

バクテリアのべん毛は構造の大部分が細胞外にある。したがって、その構成タンパク質は細胞内で合成された後、べん毛タンパク質特異的輸送装置によって細胞外に運ばれると考えられる。べん毛タンパク質特異的な輸送装置を構成する成分としては、べん毛遺伝子群のうち第3領域に属するfliH,fliIが候補としてあげられる。それらが欠失するとべん毛構築が初期段階で阻害されるからである。私たちは急速凍結/ディープエッチ法と膜分画法の改良によりサルモネラ菌の細胞を外側と内側の両面から観察し、細胞質膜上の構造を明瞭に視覚化する方法を開発した。その結果、べん毛基部に細胞質側に突出しているリング状構造体を発見した。さらに、その過程でべん毛モーターにきわめて酷似した構造体を発見した。精製単離して、その構成タンパク質を調べたところ、病原性遺伝子産物のPrgH、PrgK、InvGであることがわかった。このことから、べん毛モーターと病原性が同一の起源をもつという仮説を強く指示される。バクテリアのべん毛は構造の大部分が細胞外にあるため、構成タンパク質は合成の後なんらかの方法で細胞外に運ばれなければならない。べん毛基部にはリング状構造体および穴の開いたロッド構造が細胞質側に突出しており、べん毛タンパク質の輸送に関与していると考えられる。このべん毛タンパク質専用の輸送機構を遺伝学的、生化学的解析を元に、急速凍結レプリカ電顕法を駆使して詳細な構造解析を行うことが本研究の目的である。輸送装置のうち可溶性因子を同定することがまだできていない。ミュータントの膜画分に含まれるべん毛初期タンパク質をイムノブロット法により同定することができた。べん毛基部体にあるスウィッチ・タンパク質に対する抗体を用いてイムノブロット法によりミュータントの膜画分を調べる。その結果から、べん毛初期タンパク質の構築経路をある程度同定することができた。また、浸透圧ショック法により、各ミュータントから細胞膜画分を調製した。浸透圧ショック法は微妙なテクニックである。初期過程でべん毛構築が停止したミュータントでは、外膜と内膜をつなぐべん毛基部体構造がないために浸透圧のかかり方も野生株とは異なることが予想されたが、各ミュータントで微妙な調節を行いながら最適条件を探ることができた。このようにして調整した膜画分を急速凍結法・ディープエッチ法により可視化処理して、電子顕微鏡で観察した。その結果、いまだ機能のわからなかったfliO、fliQの遺伝子産物は輸送装置の形態形成に必要であることがわかった。私たちは急速凍結/ディープエッチ法と膜分牙画法の改良によりサルモネラ菌の細胞を外側と内側の両面から観察し、細胞質膜上の構造を明瞭に視覚化する方法を開発し、これまでにべん毛基部の細胞質側に突出しているリング状構造体およびべん毛タンパク質特異的な輸送装置と思われるロッド状構造体を発見した。べん毛初期発現遺伝子のうち、RegionIIIbと呼ばれる領域に属するfliP,fliQの変異体のロッド状構造体は野生株のものと異なっていた。また、輸送装置のタンパク質認識能の厳密さを見るために、培地中ノモノマー状態で放出されるタンパク質を解析した。その結果、約10種類のタンパク質が同定されたが、そのうち6種類(FliD,FliK,FlgE,FlgG,FlgD)はべん毛モーターのロッド以降の構造を構成するタンパク質であった。また3種類はべん毛と無関係のタンパク質であり、1種類は病原性に関するタンパク質(InvC)であった。
新規高機能性固体触媒の設計および環境調和型物質変換プロセスの構築

本申請研究では、金属酸化物等の無機結晶性化合物の諸特性に基づいて設計した高機能性固体触媒による環境調和型反応系の開発を目的としている。特に、固体表面を触媒活性種の配位子として捉え、活性金属種の電子状態、配位環境を精密に制御することを目指す。具体的には、ハイドロキシアパタイトのイオン交換能、吸着能に基づき、触媒活性種となる遷移金属を固定化し、分子・原子レベルで精密制御された不均一系触媒の開発を行った。また、これら合成した触媒を、各種有機合成反応に用いその機能を評価した。対象とした反応は、酸素分子、過酸化水素を酸化剤とする、オレフィン類のエポキシ化反応、C-H結合の酸素化反応などの高難度酸化反応、およびPd触媒を用いたHeck、Suzuki反応、希土類金属触媒によるクロスアルドール反応などの炭素-炭素結合形成反応である。また、医薬品など高付加価値化合物の合成に有用な固体不斉触媒反応系を開発した。さらに、種々の分光学的手法(UV-VIS、NMR、ESR、XRD、TEM、XPS、XANES/EXAFS)を駆使した反応活性点近傍の構造解析を通して、その優れた触媒機能と分子・原子レベルでの構造との相関を明らかにした。本研究で行った新規不均一系触媒の創製は、触媒設計分野のみならず、高機能性材料の創製を目指すナノテクノロジーの幅広い分野においても重要な知見を与えたといえる。本申請研究の成果は学術雑誌へ既に投稿済であり、またサクラメント(アメリカ合衆国)で開催された国際学会でも発表を行った。対象とした反応は、酸素分子、過酸化水素を酸化剤とする、オレフィン類のエポキシ化反応、C-H結合の酸素化反応などの高難度酸化反応、およびPd触媒を用いたHeck、Suzuki反応、希土類金属触媒によるクロスアルドール反応などの炭素-炭素結合形成反応であり、医薬品など高付加価値生成物の合成を検討した。本申請研究の成果は学術雑誌へ既に投稿済であり、また、ユトレヒト大学(オランダ)、およびワシントンDC(アメリカ合衆国)で開催された国際学会でも発表を行った。
19-ヒドロキシタキソールおよびその誘導体の不斉全合成研究

本研究によって、酸化的にアミン類およびケトン類を活性化し、ワンポットで炭素-炭素結合を,形成させる手法を開発した。N-t-ブチル塩化スルフィンイミドイルを用いてN-ベンジルオキシカルボニルアミンを酸化することによって、通常合成が困難なN-ベンジルオキシカルボニルケチミンを効率的に合成する新しい手法を見出した。さらにこの手法を応用し、反応系内で-ベンジルオキシカルボニルイミンを生成させ、これを単離することなく続けてマロン酸ジエチル等の1,3-ジカルボニル化合物を加えたところ、マンニッヒ反応が効率的に進行し、対応する付加体が高い収率で単離された。この反応では一般に合成が困難な脂肪族イミンのマンニッヒ反応も効率的に進行することが特徴的である。また、ラクタムをN-t-ブチル塩化スルフィンイミドイルを用いて酸化し、反応系内で環状N-アシルイミンを生成させたのち、これに1,3-ジカルボニル化合物を加えたところ、この場合もマンニッヒ反応が効率的に進行し、ラクタムの窒素原子の隣に新たに炭素-炭素結合をワンポットで形成することのできる新しい手法を開発した。α-アシル環状ケトンおよび単純な環状ケトンをN-t-ブチル塩化スルフィンイミドイルを用いて酸化し、反応系内で対応するα、β-不飽和ケトンを生成させた後、マロン酸エステルのアニオン種を加えたところ、一挙にマイケル付加反応が進行し、ケトンカルボニルのβ位に直接炭素-炭素結合を形成させる新しい手法を開発することができた。19-ヒドロキシタキソールのBC二環性骨格を立体選択的に合成するために、8員環(B環)上にエポキシケトン部位を有し、側鎖に鎖状アルデヒド基を有する合成中間体を、研究代表者らが開発したスルフェンアミドを触媒として用いるアルコールの酸化反応を用いて効率的に調製した。この際、他の酸化手法では目的物を得ることが難しい場合であっても上記の手法により高収率で目的物を合成することができた。このように合成した中間体に、THF溶媒中で-100度という反応条件の下ヨウ化サマリウムを反応させたところ、望みの立体配置を持つBC二環性骨格を71%の収率で合成することができた。この反応によりビスアルドール構造を有する複雑な化合物を立体選択的に合成する手法を確立できた。引き続き、19-ヒドロキシタキソールのA環を構築するために、A環を構成炭素鎖をhomoallyllihiumの求核付加反応によって立体選択的に導入した。この反応では溶媒がその立体選択性に大きな影響を与えることを明らかにした。種々官能基変換を行った後、分子内に二つのケトン部位を有する合成中間体に対して低原子価チタンを作用させたところ、分子内ピナコールカップリング反応が効率的に進行し、ABC三環性骨格が中程度の収率で得られた。このようにして、19-ヒドロキシタキソール合成に必要なすべての炭素骨格を立体選択的に構築することができた。一方、塩化t-ブチルベンゼンスルフィンイミドイルを用いることによって、カルボン酸誘導体からα,β-不飽和カルボン酸誘導体を合成する新しい手法を開発した。この際、この脱水素化反応に望ましいカルボン酸誘導体の構造を明確にすることができた。この反応は、今後天然物合成などで応用されることが期待される。また、ニューキノロン系抗生物質の部分骨格であるcis-2-fluorocyclopropylamineを相間移動触媒を用いるシクロプロバン化反応を用いて安全に合成できる手法を開発した。この際、シクロプロパン化に及ぼす置換基の影響を明確にすることができた。タキソール骨格のB環形成に引き続くBC環形成、さらにABC環形成によって、19-ヒドロキシタキソイドの立体選択的合成を達成した。つまり、B環はエポキシケトアルデヒドのヨウ化サマリウム(II)による分子内ダブルアルドール反応によって合成した。また、BC環はトリメチルアルミニウム存在下での共役付加反応を経て合成したエポキシアルデヒドの、ヨウ化サマリウム(II)による分子内ダブルアルドール反応によって合成した。さらにABC環は、低原子価チタンを用いるピナコールカップリング反応によって構築した。19-ヒドロキシタキソイドは、上記のように合成したABC環の保護基の脱着および酸化還元過程を経て、ビシナルジオールのオレフィネーションによって合成した。これまで困難とされていたエノン類のβ位のビニル水素をアルキル基で直接置換する新しい手法を開発した。つまり、高次ジアルキルシアノクプラートとエノン類との反応の後、塩化N-t-ブチルスルフィンイミドイルとの反応によって、低温下でβ-アルキルエノン類が効率的に生成することを見いだした。グリコシルN-トリクロロアセチルカルバメートを糖供与体として用いることによって、モレキュラーシーブス5A存在下、触媒量のルイス酸によって上記の糖供与体が活性化され、様々な糖受容体と効率的に反応し、立体選択的にαまたはβ-グリコシドを合成する新しい手法を見いだした。この方法は1-ヒドロキシ糖からワンポットで糖供与体の合成およびグリコシル化を行えるという点で既存の方法よりも簡便にグリコシル化反応を行うことができる。

さらにこの手法を応用し、反応系内で-ベンジルオキシカルボニルイミンを生成させ、これを単離することなく続けてマロン酸ジエチル等の1,3-ジカルボニル化合物を加えたところ、マンニッヒ反応が効率的に進行し、対応する付加体が高い収率で単離された。この反応では一般に合成が困難な脂肪族イミンのマンニッヒ反応も効率的に進行することが特徴的である。また、ラクタムをN-t-ブチル塩化スルフィンイミドイルを用いて酸化し、反応系内で環状N-アシルイミンを生成させたのち、これに1,3-ジカルボニル化合物を加えたところ、この場合もマンニッヒ反応が効率的に進行し、ラクタムの窒素原子の隣に新たに炭素-炭素結合をワンポットで形成することのできる新しい手法を開発した。α-アシル環状ケトンおよび単純な環状ケトンをN-t-ブチル塩化スルフィンイミドイルを用いて酸化し、反応系内で対応するα、β-不飽和ケトンを生成させた後、マロン酸エステルのアニオン種を加えたところ、一挙にマイケル付加反応が進行し、ケトンカルボニルのβ位に直接炭素-炭素結合を形成させる新しい手法を開発することができた。
予後の悪いHLAを持つHIV-1感染者のHIV-1増殖抑制機序の解明

日本人に多いHLA-B*35:01は、他のHLAを持つ感染者に比較し、血中ウイルス量が高く、エイズ病態進行に関連がある。本研究では、HIV感染制御に関与するB*35:01拘束性細胞傷害性T細胞(CTL)の機能解析を行った。4種類のエピトープに対して、より多く反応を示す感染者ほど、ウイルス量が低く、いくつかのエピトープに対する反応が重なることで、生体内ではウイルス増殖抑制の相乗効果が得られると考えられた。4つのエピトープ領域内にはB*35:01陽性感染者で優位に蓄積していた2つのアミノ酸変異を認めたが、CTL反応には影響がなく、交差反応を示し、ウイルス増殖に重要な役割を果たしていると考えられる。日本人に多いHLA-B*35:01は、日本人HIV-1感染者のエイズ病態進行に関連がある。我々はこれまでにB*35:01陽性HIV-1感染者について、日本人とアフリカ人のコホートを比較し、HIV-1増殖抑制に重要なHIV-1 Gag特異的細胞傷害性T細胞(CTL)反応が日本人感染者では欠如していることを示した。しかしながら、これらの日本人コホートでは、この重要なCTL反応が見られないにもかかわらず、ウイルス量が低く制御されているB*35:01陽性感染者も存在する。本研究では、ウイルス感染制御に関与するCTLを見出し、それらのCTL機能の解析を行った。B*35:01拘束性エピトープペプチド16種類(Nef 3, Gag 4, Pol 5, Rev 1,Env 3種類)に対するex vivoの反応を無治療B*35:01陽性サブタイプB慢性感染者63人のPBMCを用いてIFN-gamma Elispot assayにより検出し、これらの個々のエピトープ特異的CTL反応の有無と血漿中ウイルス量との関係を解析したところ、Gag NY9, Pol VY10, Nef RY11およびYY9エピトープに対する反応を示した感染者は反応を示さなかった感染者に比較し優位に低いウイルス量を示していた(p<0.05)。さらに、これらの4エピトープに対する反応の頻度が高いほど、ウイルス量が低いことが明らかになり、個々の反応より、いくつかのエピトープに対する反応が重なったことで、生体内ではウイルス増殖抑制の相乗効果が得られたと考えられた。更に、これら4つのエピトープ内にはB*35:01陽性感染者に優位に蓄積が見られた2つの変異を認めた(Pol VY10-6E, Nef RY11-11F)。しかしながら、変異ペプチドに対するCTLは野生型に対するものと差がなく、交差反応を示していた。この結果から、これらのエピトープは変異してもなお、ウイルス増殖に重要な役割を果たしていると考えられる。本研究は生体内でHIV-1増殖抑制能を有するCTLを誘導する治療開発に重要であり、予後が悪い感染者の今後のHIV-1治療に役立つものと考える。しかし、血中ウイルス量が低く制御されているB*35:01陽性感染者も存在する。本研究では、ウイルス感染制御に関与するB*35:01拘束性細胞傷害性T細胞(CTL)の機能解析を行った。16種類のB*35:01拘束性エピトープペプチドに対するex vivoの反応を無治療B*35:01陽性慢性感染者63人の末梢血より分離した単核細胞(PBMC)を用いてIFN-gammaの産生をElispot法により検出し、これらの個々のエピトープ特異的CTL反応の有無と血漿中ウイルス量との関係を解析した。その結果、Gag NY9, Pol VY10, Nef RY11およびYY9エピトープに対する反応を示した感染者は反応を示さなかった感染者に比較し優位に低いウイルス量を示していることを明らかにした(p<0.05)。さらに、これら4エピトープの内、より多くのエピトープに反応を示す感染者ほど、ウイルス量が低いことが明らかになり、いくつかのエピトープに対する反応が重なることで、生体内ではウイルス増殖抑制の相乗効果が得られると考えられた。感染者から検出したウイルスのこれら4つのエピトープ領域内にはB*35:01陽性感染者で優位に蓄積していた2つのアミノ酸変異を認めたが、変異ペプチドに対するCTL反応は野生型に対するものと差がなく、交差反応を示していた。さらに、エピトープ領域外のアミノ酸配列についても解析を行ったところ、B*35:01陽性感染者に優位に蓄積しているアミノ酸変異は認められず、エピトープのプロセシングには影響がないことが示された。免疫学予後の悪い無治療B

*35:01陽性サブタイプB慢性感染者63人のPBMCを用いてB*35:01拘束性エピトープペプチド16種類に対するex vivoの反応をIFN-gamma Elispot assayにより検出し、Gag NY9, Pol VY10, Nef RY11およびYY9エピトープに対する反応がHIV-1増殖抑制に重要な役割を果たしていることを見いだした。さらに、HIV-1のアミノ酸配列解析により、B*35:01特異的な2つの変異が重要な4つのエピトープ配列に蓄積されていたが、これらの変異は、CTL反応に影響しないことが明らかになった。以上のように、平成25年度の研究計画は、ほぼ計画通りに進んでおり、達成度はおおむね順調に進展していると考えらる。HIV-1アミノ酸変異解析:平成25年度はエピトープ内のB*35:01陽性感染者に特異的に蓄積した変異に焦点を当てて解析を行った。今年度は、平成25年度の研究結果から明らかとなったウイルス増殖抑制に重要な役割を果たしているGag NY9, Pol VY10, Nef RY11およびYY9エピトープ特異的CTLに着目し、B*35:01分子の有無に関連のない変異によるCTL反応の低下、および、エピトープ隣接配列(前後5アミノ酸以内)における変異のCTL反応に及ぼす影響を明らかにする。CTL反応を示していない感染者ではこれらの変異がありエピトープがプロセシングされず抗原提示が起こらない可能性が考えられる。In vivoでのCTL相乗効果の解析:生体内で実際にいくつかのCTLの相乗効果により、抗原を排除するシステムが働いていることを解明する。そのためにマウスの実験動物の系を用い、数種類のCTLを誘導し、マウスに移入し、抗原に対する細胞傷害活性能と細胞増殖能を細胞内IFN-gamma染色とCFSE dilution assayを組み合わせた方法により検出する。以上、平成25年度、26年度に得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
難治性脳形成障害胎児脳より樹立した神経幹細胞を用いた分子病態解析と治療法の探索

ヒト脳形成異常の病態解明のために、タナトフォリック骨異形成症(TD)に着目し、疾患由来培養神経幹細胞(NSCs)を駆使したin vitroオルガノイド培養法を確立し、分子病態解析を展開した。未分化状態のNSCs増殖能は、正常とTDで有意差はなかったが、2次元分散培養では、正常と比較してTDでグリア細胞の増生が顕著に亢進していた。NSCsからオルガノイドを作製し表現型を比較検討した結果、オルガノイド表層領域での神経細胞とグリア細胞の細胞数および分布に差異を見出した。遺伝子発現データ解析において、受容体型チロシンキナーゼ経路関連遺伝子群が、TDオルガノイド病態と関連することが示唆された。難治性脳形成障害(脳分離障害、神経細胞増殖異常、神経細胞移動異常、タナトフォリック骨異形成症(以下TD)、L1CAM遺伝子異常に伴う水頭症などが含まれる)の分子病態解明を目指して、胎児の前頭葉から樹立した神経幹細胞(以下NSCs)の培養を開始した。正常由来のNSCsと疾患由来NSCsの間で細胞増殖と細胞移動能を比較したところ、複数の疾患由来NSCsにおいて増殖または細胞移動能の差異が認められた。特に、脳分離障害の一例、タナトフォリック骨異形成症由来(FGFR3遺伝子のR248C点変異を有するライン)の一例において、細胞増殖能の有意な低下がみられた。人為的に遺伝子発現改変を施してサブラインを樹立することで、遺伝子変異の有無、遺伝子発現量、病態との関連を科学的に証明するためのツール作製を進めた。今年度はそのパイロット研究として、神経幹細胞増殖能に差異を示したTD由来NSCsに着目した。正常由来のNSCsに対して、点変異を持つFGFR3遺伝子の導入によるTD病態の再現、点変異FGFR3を有するNSCsに対して、ドミナントネガティブ変異体の導入あるいはshRNAによるノックダウン処理で、TD様病態が正常化するかどうかの検討を可能にすべく、レンチウイルスベクター構築に着手した。NSCsからミニブレインを構築する方法の確立を目指して、培養液の組成の検討と、三次元培養器具などの検討を行った。ミニブレイン構造体の評価方法として薄切後の各種細胞種マーカー蛋白を対象とした免疫組織染色法にて検討した。予備的観察ではあるが、スピナーフラスコを用いる方法と、ロータリーベセルを用いる方法では産物の構造には大差はないと思われるが、前者では支持組織として使用しているマトリゲルの回転子による物理的破壊が目立ち継続培養が難しい場面も経験した。また、多検体を同時に処理するための設備環境をさらに整備する必要がある。2NSC由来in vitro大脳様オルガノイド(ミニブレイン)作製法の樹立:神経幹培養細胞からミニブレインを作製する方法を樹立すべく、培養液組成と培養環境の条件を試行錯誤した。未発表のため詳細は示さないが、特殊環境下にてNSCからミニブレイン様の構造体を作製するに至った。内部構造の状態を把握するために切片作製後の免疫染色で細胞マーカーを検討した結果、神経細胞に分化した層とグリア細胞に分化した層がある規則性をもって区画化された状態で自発的に構造体を造り上げている様が捉えられた。1FGFR3遺伝子安定発現NSCの樹立正常ヒト由来のNSCに点変異を持つFGFR3遺伝子を導入することでTDモデル細胞の樹立を試みた。初年度では、インテグラーゼと共導入することでNSCゲノム内にFGFR3遺伝子を挿入する方法を試みたが、NSCゲノム内への挿入効率が悪く現実的でなかったため、レンチウイルスベクターによる発現に切り替えた。2NSC由来in vitro大脳様オルガノイド(ミニブレイン)作製法の樹立神経幹培養細胞からミニブレインを作製する方法を樹立すべく、培養液組成と培養環境の条件を試行錯誤した。培養液組成や支持体の有無、培養容器の形状・分化誘導環境をそれぞれ複数種組み合わせて試した。これら条件の設定は、神経幹細胞を材料にミニブレインを作製する前例がなかったため、ES細胞またはiPS細胞を用いて行われた研究報告の情報を取り入れて行った(参考文献1Nature. 2014 Dec 18;516(7531):400-4. doi: 10.1038/nature13863. 2Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 10;110(50):20284-9. doi: 10.1073/pnas.1315710110.)。27年度後半に、ミニブレイン)作製法の樹立に至った。そのため、想定以上の時間を要し、当初の予定より研究が遅れている。本年度は当初研究計画を一部変更し、FGFR3遺伝子点変異(K650E)を有するタナトフォリック骨異形成症(TD2)のヒト胎児脳から樹立した神経幹細胞(NSCs)を研究材料とした。1NSCsの増殖能:NSCsから形成されるスフェア直径の経時的変化率を指標にNSCs増殖能を比較したところ、TD由来NSCsは正常由来NSCs同等の増殖能を示した。未分化スフェア状態における細胞マーカー発現プロファイリング解析により、TD由来NSCsは正常由来と比較して、幹細胞マーカーよりむしろ放射状グリアマーカーの発現亢進を示した。2NSCsの細胞移動能:NSCsスフェアをマトリゲルに包埋し、スフェアからの細胞の側方拡散距離を計測した。正常由来とTD由来の間で移動能に有意な差は認められなかったが、NSCsの移動能に及ぼす

FGFR3変異の影響に関しては詳細な検討を要する。32次元分散培養によるNSCs分化誘導:ラミニンをコートした2次元分散培養において、TD由来NSCsは顕著なグリアへの分化指向性を示した。同培養下において施行された網羅的遺伝子発現解析データを用いて、クラスタリング解析とジーンオントロジー解析に供した結果、TD由来NSCsと正常由来NSCsの比較において受容体型チロシンキナーゼ経路関連遺伝子群の変動が見出された。4NSCs由来オルガノイド作製:全研究期間にわたり条件検討を繰返し、in vitroで3次元構造を持つオルガノイドのプロトタイプを作製するに至った。免疫組織化学によって、ニューロンとアストログリアが、オルガノイドの中央部、中間部、表層部において特徴的な層状あるいは胞巣状パターン形成を示すことが明らかになった(詳細は今後の論文発表で記載する)。オルガノイドを用いた網羅的遺伝子発現解析を施行し、3次元オルガノイド特異的に変動する遺伝子群として神経発生関連遺伝子群が抽出された。ヒト脳形成異常の病態解明のために、タナトフォリック骨異形成症(TD)に着目し、疾患由来培養神経幹細胞(NSCs)を駆使したin vitroオルガノイド培養法を確立し、分子病態解析を展開した。未分化状態のNSCs増殖能は、正常とTDで有意差はなかったが、2次元分散培養では、正常と比較してTDでグリア細胞の増生が顕著に亢進していた。NSCsからオルガノイドを作製し表現型を比較検討した結果、オルガノイド表層領域での神経細胞とグリア細胞の細胞数および分布に差異を見出した。遺伝子発現データ解析において、受容体型チロシンキナーゼ経路関連遺伝子群が、TDオルガノイド病態と関連することが示唆された。研究協力者の一人として予定していたポスドク1名の着任時期が遅れ、マンパワーが不足したため、初年度の計画がやや遅れている。NSCs培養を開始した当初は、Sphereの浮遊状態が安定せず苦労したが、低接着フラスコの使用により安定化が図れた。Sphereを形成させて増殖維持させるという細胞の性質上、細胞増殖や細胞移動能といった細胞の基本性質を解析する上でも、通常の手法が適用できないことが多いが、試行錯誤して現実的で合理的な手法を適用し、結果を導き出している。使用可能なNSCsラインは、正常由来もTD由来もともに個体数が限られるため、分子生物学的手法を用いて人為的にFGFR3遺伝子発現改変を施してサブラインを樹立することで、遺伝子変異の有無や遺伝子発現量と病態との関連が科学的に証明できると考えられる。この考えに沿って遺伝子発現改変のためのツール作製を進めた。今年度内に野生型および点変異FGFR3のコーディング領域全長のcDNAクローニングを終え、ドミナントネガティブ変異体のベクター構築にまで至った。インテグラーゼによるゲノム挿入法がNSCsに適用できなかったことは誤算であったが、ウイルスベクターによる導入で問題を解決すべく、早急にウイルス実験計画を学内遺伝子組換え実験委員会に申請・承認を得て、現在進行形で解決に向け取り組んでいる。ヒト
低～高分子までの生理活性化合物の精密合成を実現する水中反応の開発

2018年度で3年度目となる本研究課題では、タンパク質やペプチドなどの生体高分子の効率的な化学修飾技術の開発を目指した研究を進めている。前年度、インドール部位を含むアルコール化合物が、弱酸性緩衝水溶液中においてタンパク質やペプチドのシステイン残基(Cys)に含まれるチオール基と脱水酸基を伴いながら特異的に結合することを報告済みである(Chem. Eur. J. 2018, 24, 3959-3964)。本反応で用いるインドール部位を含むアルコール化合物はアミノ基、イミダゾール基、水酸基、カルボキシ基やリン酸アニオンとは反応せず、チオール基と選択的に反応することから、種々の機能性小分子を生体高分子のチオール基に導入するためのプラットフォームとして利用できることが分かった。本技術により、タンパク質やペプチドなどのチオール基に薬剤やビオチンリガンドなどの任意の機能性小分子を接続できるようになった。2018年度では、これまでに得た反応に関する基礎的な知見を踏まえて、より中性に近い穏和な条件においても迅速に反応が進行する、反応性に優れた基質の設計および合成を行った。また、タンパク質中のジスルフィド結合から還元によって得られるジチオールを、再架橋できる2つの反応点を持つ分子ツールの開発を行った。さらに、本手法を用いてタンパク質やペプチドに導入した機能性小分子を任意のタイミングで放出することを念頭に置き、結合切断を意図した研究への展開のための基礎的な実験および知見の収集を行った。具体的には光反応による結合切断およびpH選択的なチオール交換反応の検討を行った。以前報告を行った、インドールを骨格に持つアルコール化合物は、pH 5.4の弱酸性水溶液中において、0.008 M-1 s-1程度の反応速度でチオール基と反応し、炭素ー硫黄結合を形成することが分かっている。本反応の反応速度の向上を意図し、基質のヘテロ芳香族部位の最適化を行った。基質の脱水酸基に伴って生成するカルボカチオン(イミニウムカチオン)中間体の安定性およびLUMOレベルを指標に、Gaussianを用いた計算化学の手法を用いて、適切な基質の探索を行った。種々の計算および実験の結果、メトキシインドリジンを骨格に持つ基質において5倍以上の反応速度の向上を行うことができた。さらに、本反応がpH6.4の、より中性に近い条件においても、円滑に進行することが分かった。種々のヘテロ環化合物を骨格に持つ基質の合成展開を行い、ジチオールと反応する基質の開発を行った。さらに、基質とチオールとの反応によって生成する炭素ー硫黄結合の安定性についても検討を行い、pH選択的にチオールの交換が起こることを見出した。また、メトキシインドリジンを含む基質の光反応性について研究を行い、基礎的な知見を得ることができている。2018年度の研究で得られた成果については一部、年度中の学会発表および論文発表に間に合わず、これらの成果の発表のために助成期間の延長手続を行った。延長の許可を得た2019年度では、研究をより精緻に達成するための追加、再現実験の実施を行うとともに学会発表および論文投稿を進める。また、2019年度に採択を受けた基盤研究Cでは、結合形成および切断が自在な生体共役反応の開発を行う。本若手研究Bで得た研究成果との橋渡しと連携を進める。ベンジル位アルコールの直接的な置換反応を用いた、均一水溶液中で進行するpH応答性の生体共役反応の開発に取組んだ。反応を促進するLewis酸およびBronsted酸を種々検討し、また基質のアルコールを種々合成した結果、弱酸性(pH 56)の緩衝水溶液中で適切な基質を用いることで最適条件を見出した。チオールを含むペプチドをモデル基質に用いて反応を検討した所、本反応はアミノ基、カルボキシ基およびリン酸アニオンが共存してもチオール選択的に進行した。pH 7以上の条件では反応は一切進行しなかった。本反応の速度論的解析により反応次数が二次であることが明らかとなった。また、反応速度は基質の電子密度の増加に従って上昇し、チオール求核剤の立体的なかさ高さに応じて減少した。本反応の有用性を検証するため、5.8 kDaから66.3 kDaまでの多様な分子量を持つタンパク質をモデルに用いて生体共役反応を検討した。タンパク質のジスルフィドの還元により生成した2つのチオールのうち一つのチオールを選択的に修飾できることを質量分析、Ellman試験および紫外可視吸収スペクトルを用いて明らかとした。さらに、中性・弱アルカリ性条件では不溶あるいは不安定なタンパク質の本反応を用いた修飾にも成功している。タンパク質に導入された基質はアジド基を有し、他の生体直交反応と組み合わせる事でタンパク質の更なる機能化のためのプラットフォームとなることを示した。本研究成果については現在論文投稿準備中である。当初計画ではLewis酸を触媒に用いて反応を検討する予定であったが反応効率は低かった。弱酸性の緩衝水溶液を用いて環境応答性(pH応答性)の反応を開発することとした。生体内は中性条件に保たれているものの、リソソームやエンドソーム、消化器官、癌細胞周辺などの一部の器官や領域では弱酸性を示すことから、本反応は様々な応用が期待できる。既に、中性・弱アルカリ性条件では不溶あるいは不安定なタンパク質の本反応を用いた修飾に成功している。均一水溶液中における、種々のアレーン及びヘテロアレーンのベンジリック位水酸基とチオールとのベンジリック位置換反応を検討した。