hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インスリンによるリポ蛋白リパーゼ活性化におけるAngptl4機能の解明

Angptl4の抑制により血清中性脂肪値の著明な低下が確認され、これはインスリン刺激によるLPL活性化が関与している。Angptl4遺伝子欠損マウスでは、脂質負荷における血中中性脂肪値の上昇抑制が顕著である。本研究ではAngptl4遺伝子欠損マウスにSTZ投与による糖尿病状態導入や、LDL受容体欠損マウスとの交配を行い、両者においてやはり顕著な中性脂肪低下を認めた。糖尿病合併脂質異常症の主な原因は、インスリンの作用不足により中性脂肪(TG)を水解するリポ蛋白リパーゼ(LPL)活性が低下することであると考えられている。しかし、インスリンによるLPL活性化機構に関してはいまだ不明な点が多い。Angiopoetin like protein 4(Angptl 4)という分泌蛋白は、LPLを不活性化することがすでに報告されており、さらにin vitroの系においてインスリンがAngptl4の発現を抑制することが報告されている。そこで本研究ではAngptl4KOマウス、ストレプトゾシン(STZ)投与糖尿病マウス等を用い、インスリンによるリポ蛋白リパーゼ活性化機構の解析と、Angptl4の役割の解明を行う。125mg/kg・STZ単回投与にてインスリン欠乏性の糖尿病を誘導したAngptl4KOマウスでは、WTマウスと比べTG上昇を抑制し、またolive oil経口負荷によるTG上昇を抑制することを見出した。この結果は、インスリン欠乏によるLPL活性低下がAngptl4を欠失することにより抑制された可能性を示す。また、STZ誘導性インスリン欠乏糖尿病Angptl4KOマウスでは、STZ非投与Angptl4KOマウスと比較し空腹時のTGに差がなかった。このことは、インスリン欠乏状態におけるTGの上昇が、主としてAngptl4を介して行われている可能性を示唆する。糖尿病患者における動脈硬化性疾患の原因の一部に脂質異常症が関与し、その原因がインスリン作用不足によるLPL活性低下である。インスリンによるLPL活性化機構を解明することは、糖尿病合併脂質異常症新規治僚法開発に新たな展開をもたらす可能性がある。糖尿病状態ではインスリン作用不足によりリポ蛋白リパーゼ(LPL)活性低下し中性脂肪(TG)値が上昇する。Angiopoetin like protein 4(Angptl4)という分泌蛋白は、LPLを不活性化することが報告されており、さらにin vitroの系においてインスリンがAngptl4の発現を抑制することが報告されている。そこで本研究ではAngptl4 KOマウス、ストレプトゾシン(STZ)投与糖尿病マウス等を用い、インスリン欠乏下でのAngptl4の役割の解明を行った。125mg/kg・STZ単回投与にてインスリン欠乏性の糖尿病を誘導したAngptl4 KOマウスでは、WTマウスと比べTG上昇を抑制し、またolive oil経口負荷によるTG上昇を抑制することを見出した。また、STZ誘導性インスリン欠乏糖尿病Angptl4 KOマウスでは、STZ非投与Angptl4 KOマウスと比較し空腹時のTGに差がなかった。このことは、インスリン欠乏状態におけるTGの上昇が、主としてAngptl4を介して行われている可能性を示唆した。また、家族性高脂血症患者はLDL受容体異常により高コレステロール血症を呈する疾患であるが、血清TG高値群で虚血性心疾患の合併率が高いことが報告されている。以上よりAngptl4抑制は家族性高脂血症または糖尿病合併脂質異常症新規治療法開発に新たな展開をもたらす可能性があると考えられた。
in vivoで機能するがん治療用MENDの創製

昨年度までの研究により、元来エンドソーム脱出を促進するための素子として開発されてきたGALAペプチドがリボソームの肺移行性を促進する有力な素子であることを見いだしている。さらに、その機構を明らかとした結果、本粒子は血液中を凝集せずに循環し、さらにその細胞への取り込みには、細胞膜上のシアル酸末端糖鎖が関与することを明らかとしている。一方、これまで、我々は、脳毛細血管内皮細胞を用いた検討によりApical側(血管側)からBasal側(脳実質側)までのリボソームの輸送を可能とするペプチド(Clone95)の同定に成功している。本素子は、血管内皮細胞のカベオラ経路を標的化する素子として期待される。そこで、GALAペプチドとClone95の併用により、肺毛細血管内皮細胞を透過し、上皮細胞まで送達可能なシステムの構築を試みた。共焦点レーザー顕微鏡により血管透過を可視化するため、蛍光標識されたリボソームの肺内分布を解析した。GALA修飾リボソームの殆どが血管内皮のシグナルと共局在する様子が観察された。一方、さらにCL95を修飾した粒子においては、赤色単独で観察される点が観察された。CL95の修飾により肺組織内における分布が変化し、血管から一部上皮細胞まで移行することが示唆された。本上皮細胞への移行を機能の点から解析するために、本粒子内に上皮細胞の特異的マーカーであるEpCAMに対するsiRNAを導入したリボソーム粒子を構築した。本粒子を2mg/kgとなるように尾静脈内投与し、その後の遺伝子ノックダウン効果を解析した。従来のGALA-MENDに関しては、遺伝子ノックダウン効果が認められなかったのに対し、CL95/GALA-MENDに関しては、まだ弱いながらも有為な遺伝子ノックダウン効果が認められた。これらの結果から、CL95/GALA-MENDは、血中投与により肺の実質細胞(上皮細胞)を標的化可能なシステムであることが示唆された。siRNAを初めとする核酸は次世代医薬品として近年注目を受けている.しかしながら,核酸を臨床応用するためには体内動態及び細胞内動態の制御が不可欠であり,生体内での動態を高度に制御できるデリバリー技術の開発が求められている.当研究室では,核酸の細胞への取り込みやエンドソーム脱出,核移行などのさまざまな細胞内動態を制御する効率的なベクターとして,多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)の構築に成功している。一方で,近年、細胞内エンドソーム脱出を促進する機能性ペプチドとして知られているGALAが新たな機能として肺移行性能を有していることも明らかとしており、これらの知見をsiRNAに応用することで,現在臨床試験が実施されているAtuPLEXを凌駕するノックダウン効率をもたらすキャリアの開発に成功している。このキャリアを実用化するためには,効果,毒性及び製造の観点からGALA修飾MEND(GALA-MEND)を構成する脂質組成の最適化が必要となり、特に効果,毒性に大きな影響を及ぼすカチオン性脂質の選定が重要な鍵を握っている。Ayman博士は約10種類のカチオン性脂質の異なるGALA-MENDを調製し,マウスへの全身投与後における肺のノックダウン効果を評価することにより,現行GALA-MENDに匹敵する脂質組成を数種類見出し,組成選択肢の幅を大きく広げた。これらデータは,GALA-MENDの特許をサポートするデータにもなっている。今後,肺転移癌モデルマウスを用いて,GALA-MENDを癌治療への応用の可能性を検討する予定である。GALAを修飾したMENDは、肺血管内皮細胞に効率的に取り込まれ、効率的に特定の遺伝子をノックダウン可能なキャリアとして開発されたものである。H23年度は、GALAを修飾siRNA封入MENDを用いた抗腫瘍効果を期待して、抗腫瘍活性の実弾としてのESAM遺伝子のノックダウン実験を行った。ESAMは、血管内皮細胞の増殖時における形態維持を行う上で極めて重要な役割を果たし、本遺伝子をノックアウトした細胞においては、メラノーマ細胞の肺転移が抑制されることが示されている。本遺伝子に対する4種のsiRNAをin silico情報に基づいて設計し、in vivoの肺における遺伝子ノックダウン活性を評価した。その結果、1種のsiRNAにおいて、極めて高い遺伝子ノックダウンが得られることを確認し、また、これらのsiRNAを含む数種のsiRNAの複合において、遺伝子ノックダウン効果の上昇は認められなかった。従って、本1種のsiRNAをESAMノックダウンの実弾として選択した。また、本MENDの繰り返し投与を行う上で、ノックダウン効果の持続性を評価することは極めて重要である。単回投与した後の経時的な遺伝子ノックダウン効果を解析した結果、5日後まで遺伝子ノックダウン効果が維持されていることが明らかとなった。また、一方で、in vivoイメージングを用いた肺がん転移の評価系について、基礎的検討を行った。ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現した肺がん転移モデル癌細胞を静脈内投与することにより、時間依存的に腫瘍が肺に蓄積する様子が観察された。本評価系を用いて、ESAMに対するsiRNA導入時の肺転移抑制効果について評価為ていく予定である。

一方、これまで、我々は、脳毛細血管内皮細胞を用いた検討によりApical側(血管側)からBasal側(脳実質側)までのリボソームの輸送を可能とするペプチド(Clone95)の同定に成功している。本素子は、血管内皮細胞のカベオラ経路を標的化する素子として期待される。そこで、GALAペプチドとClone95の併用により、肺毛細血管内皮細胞を透過し、上皮細胞まで送達可能なシステムの構築を試みた。共焦点レーザー顕微鏡により血管透過を可視化するため、蛍光標識されたリボソームの肺内分布を解析した。GALA修飾リボソームの殆どが血管内皮のシグナルと共局在する様子が観察された。一方、さらにCL95を修飾した粒子においては、赤色単独で観察される点が観察された。CL95の修飾により肺組織内における分布が変化し、血管から一部上皮細胞まで移行することが示唆された。本上皮細胞への移行を機能の点から解析するために、本粒子内に上皮細胞の特異的マーカーであるEpCAMに対するsiRNAを導入したリボソーム粒子を構築した。本粒子を2mg/kgとなるように尾静脈内投与し、その後の遺伝子ノックダウン効果を解析した。従来のGALA-MENDに関しては、遺伝子ノックダウン効果が認められなかったのに対し、CL95/GALA-MENDに関しては、まだ弱いながらも有為な遺伝子ノックダウン効果が認められた。これらの結果から、CL95/GALA-MENDは、血中投与により肺の実質細胞(上皮細胞)を標的化可能なシステムであることが示唆された。実弾としてのESAMの遺伝子ノックダウン用配列が決定され、in vivoで実際に発現抑制が観察された点や、モデルマウスの作成と評価系にたいする基礎検討が終了している点で、今後、抗腫瘍活性を解析出来る段階まで達成している点で、順調に進展していると評価できる。ESAMにたいする遺伝子ノックダウン用siRNAをMENDに投与した際の抗腫瘍効果を解析する。また、本遺伝子以外の肺血管内皮細胞における肺がん転移関連遺伝子に関して文献情報を集め、遺伝子ノックダウン可能なsiRANを探索する。ES姐単独で抗腫瘍活性が見られない場合は、投与量や間隔、タイミングなどを考慮してプロトコールを確立すると共に、新たに見いだす実弾siRNAの併用効果においても検証を加える。
超感度ビデオ・マススコープによる1細胞オンタイム分子動態・分子探索

細胞1ヶ生きた様子を見ながら、変化の瞬間、その細胞1ヶの中見たい所を吸引し、10分以内にその分子群を質量分析で網羅的に検出する事に世界で初めて成功した。本手法をアレルギー細胞の細胞質と小器官の一つ顆粒内の分子分布・代謝解析、神経分化細胞の分化時の分子変化、植物の光応答や機能分子生成、薬物の肝臓細胞での代謝直接分析、その超微量性を生かして、汗腺一滴の分子分析に応用し、その豊かな可能性を検証した。1)ビデオ・マススコープ用超高感度ハイブリッド質量分析装置(MS)の開発と応用飛行時間型(TOF)検出とタンデム4重極(Q)検出の両方が同時に出来る我々独自特許により、世界初のダブルタンデム質量分析計の試作を進め、そのベンチマーク機として今世界で2種の最先端機と言われるThermo社LTQ Orbitrap XLとアプライドバイオシステム社Q-Star Eliteを開発費確保の為リースし、手法確立用高感度質量分析検出部として極限的に使用し感度、分子同定力などの課題を検証した。2)ダイレクトセルトラップ・ナノスプレーイオン化法の開発1細胞生きたままで細胞に突き刺し、その成分を吸い上げ、そのまま質量分析装置に試料導入するキーデバイスのナノスプレーチップの最適化を進め、その改良により、多くの1細胞での分析に成功し、その多彩な応用成果を学会や雑誌で発表した。3)ディファレンシャルMSディスプレイ法による分子探索ソフトの評価比較する状態の細胞のものとのMSピークの差分を取り、特異的ピーク(分子)を発見する為、まず市販ソフトを流用し、差分のt-検定と主成分解析法によりその有用性を確かめた。4)細胞内成分MSスペクトル蓄積「セロミクスMass Bank」の基盤構築1細胞から得られたMSスペクトルをその測定条件などのデータフォーマットなどを決め、今後のへの基盤かためを行った。1)1細胞オンタイム分子動態・分子探索法の展開我々が世界で初めて成功した1細胞オンタイム分子動態・分子探索の検出・解析基盤が整い、その豊かな適用性の検証を国益確保の為にも急ぐべきと言われ、2年目からは、適用研究に教室全勢力を注入した。まず(1)医薬品開発の加速に利用できるとの産業界からの声に応え、1細胞での薬物代謝分析に成功した(現在Science誌に投稿準備中である)。また(2)生薬などの複合医薬品成分の分子追跡や、お茶成分の抗アレルギー機構の解明にも応用し研究を進めている。更に1細胞より小さい1細胞内小器官もダイレクトに分子探索できることを発見し、(3)アレルギーモデル細胞内の1顆粒内の分子代謝過程の追跡に成功し、Science誌に投稿したが、受理されなかったものの、面白いとの評価は得た(現在Nature Nanotech.誌に投稿準備中である)。他に細胞周期、細胞毒性評価、カエル卵発生ステージの追跡、植物の花の1細胞芳香成分直接分析にも成果を上げている。さらに、その量が1pLと超微量であることを利用し、(4)人の指先汗腺1ヶからの汗のダイレクト分析にも成功し、アミノ酸など24種の分子検出に成功し、摂取薬品の検出にも成功した。これらを、アメリカでの国際会議も含め、年間71件の学会報告で発表した。今年度は、アメリカへの特許戦略もあり、論文発表は控え、学会発表を特許に後込め(CIP(部分継続))する事に専念したが、来る5月2日に完了後、一気に論文発表を開始する。2)細胞内成分MSスペクトル蓄積「セロミクスMass Bank」の基盤構築1細胞から得られたMSスペクトルをその測定条件などのデータフォーマットなどを慶応大学・西岡教授グループと詰め、公開に向けて準備に入った。尚、本研究は、理化学研究所プロジェクト「計算・定量生命科学」にも参画することになった。1)1細胞オンタイム分子動態・分子探索法の展開我々が世界で初めて成功し今なお世界の追随を許さない1細胞オンタイム分子動態・分子探索の検出・解析の豊かな適用性の検証を更に広範囲に展開した。(1)医薬品開発応用:ヒト肝1細胞での薬物代謝分析にも成功しその情報を製薬企業中心にフォーラムを形成し、第一回を東京で開催し、情報公開した。これをきっかけに、多くの日本製薬企業が興味を持ち始め、現在様々な共同研究が始まっている。現在は細胞毒性の高速評価、薬物の膜も含む高速局在解析への応用も進んでいる。(2)1細胞内小器官でのアミノ酸代謝の追跡にも成功し、安定同位体による動態追跡法の確立にも成功した。細胞全体から、局所まで1ヶの細胞の分子解析ができる初めての手法となっている。(3)植物に対し、本手法が極めて有効であることがわかり、植物の発生、分化や植物工場での機能性成分の増加因子探索にも有効であることがわかった。(4)更に指先の汗腺1ヶからの1nlの汗一滴からも血中にある様々な成分が検出でき、痛くない臨床診断への道が拓けつつある。これらの成果を20演題一気にアメリカ質量分析学会(ASMS)にて発表した。

2)細胞内成分MSデータベースの構築へ1細胞分析から得られたMSスペクトルやデータを慶応大学・西岡教授グループと共に公開に向けて準備している。3)本研究は、理化学研究所プロジェクト「生命システム研究センター」にも参画することになり、大阪のセンター内に、一細胞質量分析研究チームが結成され、升島がリーダーとなった。1)ビデオ・マススコープの開発と汎用システム化ナノスプレーイオン源と細胞採取ロボットシステムを合体し、誰でもビデオマススコープとして簡単に操作して使用できるよう汎用化を図った。2)ビデオマススコープ法の完成へ:ダイレクトな細胞およびピコ滴体液トラップ・ナノスプレーイオン化法と状態特異分子探索法など様々な可能性の開発最終年の今年度は、本手法の更なる展開を図り、その可能性を検証した。1細胞分析としては、1)植物細胞への適用とそれによってもたらされる植物工場プロジェクトなどへの展開の可能性の検証、2)動物組織、特に癌組織の直接採取検出法の確立と診断応用への検証、3)汗腺からの汗や、唾液、血液の一滴捕捉による診断法への展開の検証、4)代謝マップへの即時対応ソフトの開発に成功し、その可能性を広げた。キーデバイスのナノスプレーチップも注射針の様なものを開発し、細胞も膜成分の検出にも成功した。3)1細胞分析の応用展開による可能性の検証と細胞内成分MSデータの蓄積と公開上記の開発に加え、蛍光イメージング下での分子探索にも適用でき事も証明した。これらの成果が認められ、NHKサイエンスZeroにも取り上げられ、新聞・ネット報道も多数された。更に、本手法が、創薬の高速・高精度・低コスト化につながると2回の「1細胞分析高速創薬フォーラム」を日本製薬業16社が参加して開催し、その最新データと応用例を公開し、社会貢献の一環とした。現在、得られたMSスペクトルを細胞の状態・部位別に細胞の画像とともに蓄積したので、今後の細胞分子生物学や生命科学全体の大きな情報基盤にする為、世界初の1細胞質量分析データベースとして公開する予定である。
導体内電流分布を制御した高安定超伝導導体の開発研究

本研究に先立つ研究として超伝導撚線の電流分流特性について以下の研究を行ってきた。撚線間の電流分布の不均一が安定性に及ぼす影響について定量的な評価を行った。結果として、撚線間の転流特性を転流部での発熱が安定性を悪化させない基準値以上に保てば、偏流が生じても安定性への影響は小さいことが示された。また、素線間の接触抵抗を撚線の張力を制御することによって変化させ、接触抵抗と安定性との関連について定量的な評価を行い、最小伝播電流以上の通電電流では、安定性が接触コンダクタンスの正の関数であることを確認した。更に、実際の超伝導導体の例として、素線の表面処理を変化させたNb3Sn超伝導成形撚線の電流転流特性及び安定性を測定し、素線表面処理の相違が導体の安定性に大きな影響を与えることを示した。上記の研究成果を受け、導体内の電流分布を制御した高安定導体の開発研究を行った。導体内の電流分布を制御し、高い安定性と交流損失の低減を両立させる撚線構造の超伝導導体の開発研究を行った。まず、導体内の電流分布と交流損失の関係について考察した。撚線導体を用いた大型超伝導コイルの交流損失の測定結果から、運転周波数付近の低周波領域で交流損失が増大することが報告されており、大型超伝導コイルの実用化を阻む新たな要因として、その原因の究明が急がれていた。本研究では、撚線導体内の電流分布の不均一が導体長手方向に変化することがその原因であるとの推察に基づき、2本撚線を用いた要素実験によって、撚り乱れに起因する電流分布の不均一が交流損失増大の原因となることを示した。次に、これまでに得られた導体内の電流分布が安定性及び交流損失に及ぼす影響に関する研究成果に基づき、安定性と低交流損失をバランスさせた新しい超伝導導体の撚線構造の設計指針を提案した。本設計指針に基づいた試作導体の設計を行い、交流損失及び安定性を解析した。また、導体の製作性について検討するため導体試作を行った。本研究の目的は、これまでに得られた超伝導撚線の電流分流特性と安定性の研究成果を応用し、超伝導導体内の電流分布を制御した新しい形の高安定な大型超伝導導体の開発を行うことにある。局所的な擾乱に対して十分に安定な導体とするため、素線間の電気的な接触抵抗が小さく、熱的な接触抵抗が大きな撚線構造を実現する。具体的には、NbTiやNb_3Snなどの低温超伝導素線の外側に高温超伝導体をコーティングした超伝導撚線を試作し、素線間の高い電流転流特性と熱絶縁特性を両立させる条件を見出す。本研究では、考えを更に発展させ、導体内の電流分布を積極的に制御したより高安定な導体構造の開発を目指す。すなわち、素線間の転流特性に必要な電流パルスを確保しつつ、交流損失を低減した撚線及び導体構造を開発する。本年度は、導体設計のための重要な基礎データとなる撚線の安定性及び交流損失に電流分布が及ぼす影響に関して系統的な研究を行った。

まず、撚線間の電流分布を制御できる実験装置を工夫し、撚線間の電流分布の不均一が安定性に及ぼす影響について定量的な評価を行った。結果として撚線間の転流特性を転流部での発熱が安定性を悪化させない基準値以上に保てば、偏流が生じても安定性への影響は小さいことが示された。また、素線間の接触抵抗を撚線の張力を制御することによって変化させ、接触抵抗と安定性との関連性について定量的に評価した。一方、撚線内の電流分流不均一が交流損失増大の原因になることを大型コイルの実験結果から推察し、2本撚線を用いた要素実験によって確認した。この結果は、従来の研究では報告されていない成果であり、安定性と交流損失を両立させた導体設計において重要な発見である。これらの基礎データを元に、平成10年度は導体の設計及び試作を行い、特性を確認する予定である。1.本研究に先立つ研究として超伝導撚線の電流分流特性について以下の研究をおこなった。撚線間の電流分布の不均一が安定性に及ぼす影響について定量的な評価を行った。結果として、撚線間の転流特性を転流部での発熱が安定性を悪化させない基準値以上に保てば、偏流が生じても安定性への影響は小さいことが示された。また、素線間の接触抵抗を撚線の張力を制御することによって変化させ、接触抵抗と安定性との関連について定量的な評価を行い、最小伝播電流以上の通電電流では、安定性が接触コンダクタンスの正の関数であることを確認した。更に、実際の超伝導導体の例として、素線の表面処理を変化させたNb3Sn超伝導成形撚線の電流転流特性及び安定性を測定し、素線表面処理の相違が導体の安定性に大きな影響を与えることを示した。2.上記の研究成果を受け、導体内の電流分布を制御した高安定導体の開発研究を行った。導体内の電流分布を制御し、高い安定性と交流損失の低減を両立させる撚線構造の超伝導導体の開発研究を行った。まず、導体内の電流分布と交流損失の関係について考察した。撚線導体を用いた大型超伝導コイルの交流損失の測定結果から、運転周波数付近の低周波領域で交流損失が増大することが報告されており、大型超伝導コイルの実用化を阻む新たな要因として、その原因の究明が急がれていた。本研究では、撚線導体内の電流分布の不均一が導体長手方向に変化することがその原因であるとの推察に基づき、2本撚線を用いた要素実験によって、撚り乱れに起因する電流分布の不均一が交流損失増大の原因となることを示した。次に、これまでに得られた導体内の電流分布が安定性及び交流損失に及ぼす影響に関する研究成果に基づき、安定性と低交流損失をバランスさせた超伝導導体の撚線構造の設計指針を示し、縮小導体の試作及び短尺導体試験を行っている。
ヌクレオモルフゲノムをモデルとした共生者ゲノムの縮小進化に関する比較ゲノム解析

新規クロララクニオン藻のヌクレオモルフ(Nm)ゲノムサイズの推定:昨年度1.OMb程度のNmゲノムを持つことが予測された新規クロララクニオン藻RCC365株(新属新種として論文発表予定)にっいて、より正確な染色体サイズ推定を行なった。パルスフィールドゲル電気泳動条件の最適化を行なうことにより各染色体DNAの分解能を向上させ、Nmのテロメア配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、染色体数は3本であり、各染色体DNAのサイズはおよそ443.9kb、333.2kb、281.6kbで、全部で約1.058Mbのサイズであった。これは既知のNmゲノムサイズの23倍で、クロララクニオン藻のNmゲノムの進化を理解する上で重要な発見である。また、昨年度行なったクロララクニオン藻群内のNmゲノムサイズの多様性に関するデータは、カナダ・ダルハウジー大学のArchibald博士と共同で論文にまとめ、国際誌Journal of Eukaryotic Microbiologyに掲載された。クロララクニオン藻2種(L. vacuolata, L. amoebiformis)のヌクレオモルフゲノム全配列の決定:これまでに調査された中で最も小さなヌクレオモルフゲノム(約330Kb)を持つL. amoebiformisについて、パルスフィールドゲル電気泳動により分離されたヌクレオモルフ染色体DNAをゲルより精製した。それを本領域の支援班へ送付し、ドラフト配列として、886,639bp、(552断片)を得た。現在、さらなるアッセンブルを進めており、これまでに全断片数を93(うち主要断片は12本)まで減少させた。このうち23本(305,958bp)はおそらくヌクレオモルフDNAの断片であり、4本がミトコンドリア、3本が葉緑体DNAであると思われ、残る63本が由来不明の断片となっている。今後はヌクレオモルフ由来の23本に焦点を当て、完全配列の取得に努めるとともに、B. natansの既知のゲノム配列との比較を行なう予定である。また、L. vacuolataについては、パルスフィールドゲル電気泳動により分離されたヌクレオモルフ染色体DNAをゲルより精製し、支援班によりドラフト配列の決定がほぼ終了した。クロララクニオン藻のヌクレオモルフゲノムサイズの多様性の要因を明らかにするため、ヌクレオモルフDNA部分配列の比較解析を行なった。クロララクニオン藻2種(L.vacuolata、L.amoebiformis)ついて、PCR法により得たヌクレオモルフDNAの部分配列内にみつかった7遺伝子について、既知のB.natansの相同領域と比較した。その結果、イントロンの長さと数は、ゲノムサイズの違いにさほど影響しないと考えられた。一方、遺伝子間領域の長さはゲノムサイズの差を生む要因の一つである可能性が考えられた。さらに、ゲノム中の遺伝子のシンテニーを比較した結果、ヌクレオモルフゲノムの進化過程で染色体間や染色体内の組換えが頻繁に起こった可能性が考えられた。この結果を、全ゲノム配列の比較により検証するため,ゲノムライブラリー用のDNAの回収をおこなった。L.amoebiformisについて、パルスフィールド電気泳動によりDNAを分離し、ゲルからの精製によってヌクレオモルフ全DNA約500ngを取得した。そのDNAを支援班に送り、ライブラリー作成とドラフトシークエンスを委託した。近年新たに確立されたクロララクニオン藻の培養株(P314株、P333株)について、パルスフィールドゲル電気泳動によりヌクレオモルフゲノムのサイズを推定した。その結果、P314株、P333株はそれぞれ、390kb、360kbであった。クロララクニオン藻のヌクレオモルフゲノムサイズはこれまで考えられいたものよりずっと多様であることが判明した。クロララクニオン藻のヌクレオモルフゲノムサイズの多様性については、カナダ・ダルハウジー大学のArchibald博士と共同で論文を投稿中である。このような研究は他に例がなく、部分配列とはいえヌクレオモルフゲノム配列の進化学的考察を行なったことは画期的な成果といえる。クロララクニオン藻2種(L. vacuolata, L. amoebiformis)のヌクレオモルフゲノム全配列の決定:

これまでに調査された中で最も小さなヌクレオモルフゲノム(約330Kb)を持つL. amoebiformisについて、パルスフィールドゲル電気泳動により分離されたヌクレオモルフ染色体DNAをゲルより精製した。それを本領域の支援班へ送付し、ドラフト配列として、886,639bp、(552断片)を得た。現在、さらなるアッセンブルを進めており、これまでに全断片数を93(うち主要断片は12本)まで減少させた。このうち23本(305,958bp)はおそらくヌクレオモルフDNAの断片であり、4本がミトコンドリア、3本が葉緑体DNAであると思われ、残る63本が由来不明の断片となっている。今後はヌクレオモルフ由来の23本に焦点を当て、完全配列の取得に努めるとともに、B. natansの既知のゲノム配列との比較を行なう予定である。また、L. vacuolataについては、パルスフィールドゲル電気泳動により分離されたヌクレオモルフ染色体DNAをゲルより精製し、支援班によりドラフト配列の決定がほぼ終了した。
悪性黒色腫の新規免疫的解析に基づくがん免疫療法継続基準の開発

本研究では、免疫チェックポイント阻害剤治療に対するレスポンダーおよびノンレスポンダー患者検体を用いた免疫応答の比較検討により、臨床効果と関わる免疫応答を検討した。末梢血を用いた網羅的な免疫関連分子発現解析により、CD4陽性CD27陽性Fas陰性セントラルメモリーT細胞の治療後の増加が治療効果と相関することが明らかになった。また腫瘍局所の解析では、レスポンダーではエフェクターのCD8陽性T細胞、ノンレスポンダーではCD4陽性制御性T細胞が優位となっていることが示され、今後は多数症例や前向きでの検討を実施し、薬剤投与の判断基準に展開する。免疫チェックポイント阻害剤治療を受けた患者検体を用いて免疫応答の解析を実施した。十分な検体数を確保するため悪性黒色腫のみならず非小細胞肺癌を含め免疫チェックポイント阻害剤が臨床応用されたがん種に焦点を当てて研究を進めた。従来の報告にあるように一部の患者では腫瘍増殖が一旦コントロールされるも、その後再増殖することが観察された。これらの患者から文書による同意を得た上で、腫瘍局所および末梢血検体を用いてエフェクターT細胞、特にCD8+T細胞、および抑制性T細胞、特に制御性T細胞のフェノタイプについて検討を進めた。患者検体を治療効果(CR、PR、SDおよびPD)に基づいて層別化したのちに解析を実施した。一例の患者でPRからPDへと症状の悪化が認められた。またSDからPDへの変化がみられる患者も存在したため、時系列で免疫応答を検討した。エフェクターT細胞に対する制御性T細胞の抑制増強が見られる患者で、腫瘍増殖(治療不応答)が認められることが明らかになった。特に、エフェクターT細胞/制御性T細胞比を検討すると、臨床効果が認められた患者(CR、PR及びSD)で、エフェクターT細胞優位(比が高値)であることが示された。一方でPD患者では制御性T細胞優位(比が低値)であった。興味深いことに、PRからPDへと腫瘍増悪が認められた患者では、エフェクターT細胞/制御性T細胞比が高値から低値へと変動したことから、腫瘍内環境を表す指標として重要で、バイオマーカー候補となると考えられた。本研究成果の中でバイオマーカー候補となることが示唆される因子はAMED研究への展開を予定している。研究の目的の達成にむけて平成28年度で悪性黒色腫およびあらたに免疫チェックポイント阻害剤が臨床導入された非小細胞肺癌を用いて腫瘍局所のエフェクターおよび抑制性T細胞の解析を進め、治療効果および腫瘍増殖と相関する可能性のある指標を同定した。また、悪性黒色腫に加えて非小細胞肺癌症例を追加して症例数を拡大して進めたことにより、新たな分子同定につながった。さらに本研究成果をもとにAMED研究への展開を予定しており、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。悪性黒色腫患者の免疫チェックポイント阻害剤治療に対するレスポンダーおよびノンレスポンダー患者検体を用いた比較検討により、レスポンダー患者ではCD4+T細胞の一部が増加していることが示された。CyTOF解析によりCD4+T細胞の詳細なフェノタイプを検討したところ、CD45RA-CCR7+central memory T細胞で、CD27+Fas-のよりnaive細胞に近い細胞群の増加が重要であることが示された(discovery set)。さらに本データを別の悪性黒色腫患者(validation cohort)で検討したところ、CD27+Fas-CD45RA-CCR7+central memory T細胞はレスポンダー患者で増加し、ノンレスポンダー患者で低下することが示された。また免疫チェックポイント阻害剤治療による制御性T細胞の抑制活性および増殖能(細胞頻度)変化について検討を進めた。昨年度の検討を患者数を増やして検討することによりエフェクターT細胞/制御性T細胞比は、臨床効果が認められた患者(CR、PR及びSD)で、エフェクターT細胞優位(比が高値)で、PD患者では制御性T細胞優位(比が低値)であることが示された。さらにこれらの変動に関して詳細な検討を実施したところ、制御性T細胞とエフェクターT細胞上のPD-1発現レベルが重要な指標となることが明らかになった。当初の計画で予定していた悪性黒色腫の少量の細胞からT細胞を含めた免疫担当細胞の解析を可能とする技術を確立できたため非小細胞肺癌症例も検討することで症例数を増加させたことにより、治療効果および腫瘍増殖と相関すると考えられる分子を同定できた。今後はこれらの分子の発現機構を明らかにすることで、免疫チェックポイント阻害剤の治療効果および腫瘍増殖との相関をより多数の症例で検討する。

さらに今後はがん抗原(shared vs neo)特異的CD8+T細胞での検討を進めることで、抗腫瘍免疫の根幹に関わる免疫応答にせまるべく研究を推進する。腫瘍学、免疫学
中学校と高等学校の連接を重視した探究活動(2) -単元「力学」-

1.研究目的:次期学習指導要領において理科で育成が求められる資質・能力を育むことのできる理科授業(力学領域)の開発,及び実践成果の普及を行うことを目的とした。2.研究方法:(1)27, 28年度における探究活動の実践成果と次期学習指導要領で育成が求められる資質・能力との関連についての整理及び授業改善案,新たな授業案の作成1ICTを効果的に活用した理科授業の作成2アクティブ・ラーニングを取り入れた理科授業の作成(2)「思考力・判断力・表現力等」の評価についてのルーブリックの作成(3)授業実践1中学校による実践2高等学校による実践(4)実践結果の分析(5)研究成果のまとめと報告3.研究成果:本研究で取り上げた内容は,ニュートンの運動の法則(第2法則)である。既習の知識を再構成し,理科の見方・考え方を働かせて,物理量の関係を導き出すことをねらいとした探究活動を設定した。「内化」「外化」の往還がおきるよう,個から集団へ,集団から個へと授業展開を工夫し,次期指導要領に求められる主体的・対話的で深い学びを目指した。授業ではホワイトボードやiPadを用いて,共有の場面や,振り返りの場面に活用した。本実践において明らかになった点は以下の3点である。1実験結果についての理解が,次の課題を考えるためのレディネスとなるため,共有が重要である。2各物理量についての本質的な理解が,考察の表現に強い影響を及ぼす。3ルーブリックに基づく評価は,生徒による他己評価と教師による評価にはずれは見られず,回を重ねる毎に評価が高くなる。なお中学校における探究活動の実践については,本校の中等教育研究大会において公開授業として発表した。さらに次年度の実践を加え,学会発表及び本校の研究紀要への執筆の予定である。
微生物間代謝ネットワークを考慮した新しい生分解性評価の試み

微生物種間における基質の授受を加味した微生物生態系全体における物質フローを評価することにより、微生物生態系全体としての化学物質分解機構を解明することを目的とした。GC/MS等を用いた微生物の代謝物質を分析する方法を整備した。環境中において検出されうる化学物質に対して、分解試験を行いその分解物および微生物細胞内の代謝物の変化をモニターした。また、RNA-SIP法により、安定同位体標識した化学物質を取り込む微生物の検出を行った。(1)生態毒性を示す化学物質および化学物質分解生成物の特定本研究では、同位体標識物質が入手可能である化学物質を対象としている。そこで、Cambridge Isotope Laboratory社製品の中で、Environment Contaminantに分類される13C標識化合物、315物質の中で、これまで環境モニタリング対象として分析している108物質について、我々が実施している神奈川県一般環境を中心とした環境モニタリングデータを調査し、環境中での検出の有無を確認した。その結果、アジピン酸ジエチルヘキシル(DEHA)、ビスフェノールA、コレステロール、クロロベンゼン(異性体3物質)、フェノール、アニリン、カフェインの9物質が環境中において検出されていることが確認でき、これらを分解機構の評価対象物質候補とした。(2)分解経路既知の化学物質を用いた分解機構解明のための解析条件の最適化平成25年度は特に、代謝解析技術の確立に注力した。GC/MS、GC/MS/MS、LC/MS/MSを用い、解糖系、TCA回路、アミノ酸等の微生物代謝において重要な役割を担う物質38物質について検出する分析系を確立するとともに、ペントースリン酸経路等の約物質を含めついて検出可能であることを確認した。微生物試料への適応として、大腸菌を用いて、細胞の回収、代謝物の抽出、分析までの一連の操作について再現性を確認した。また、Pseudomonas putidaによる安息香酸分解(純菌系;初期安息香酸濃度200 mg/L)、活性汚泥を用いたアニリン分解(複合微生物系;初期アニリン濃度100 mg/L)を実施し、それぞれ、分解過程において、10物質、26物質の変動を評価することが可能であったことから、代謝解析における準備は整いつつある。前年度には、GC/MS、GC/MS/MS、LC/MS/MSを用いた代謝解析技術の確立を行った。また、分析対象とする物質として、神奈川県における環境モニタリングデータから、環境中において検出される8物質(アジピン酸ジエチルヘキシル(DEHA)、ビスフェノールA、コレステロール、クロロベンゼン(3異性体)、フェノール、アニリン、カフェイン)を評価対象として選定した。本年度はその8物質の中で分析に必要となる同位体が十分量確保できたアニリンを対象とし、RNA-SIP法により分解に関与する微生物の特定を行った。実験室で培養した活性汚泥30 mg/Lに対して13C-アニリン100 mg/Lを添加し、分解試験を行った。分解開始後14日目にアニリンは88%(BOD)分解されており、同時に行った12C-アニリン(分解率83%)と同程度であることを確認した。分解試験終了後、活性汚泥試料を回収し、RNAを抽出し、密度勾配遠心分離により分解に関与した微生物由来のRNA(13C-RNA)を含むフラクションを回収することとした。密度勾配遠心分離により、回収したフラクションの内、密度1.75から1.83 g/mLにおいて直線的に変化する11フラクションを微生物解析の対象とした。次に、各フラクションに含まれる16S rRNAを把握するため、16SrRNAを対象としたリアルタイムPCRを行った。いずれのフラクションにおいても16S rRNAが検出され、アニリン分解に関与しない微生物の12C-RNAと分解に関与した微生物の13C-RNAのピークの明確な分離は確認できず、微生物種毎の塩基配列を由来とする密度等の影響によりフラクション全体に分散していることが予想された。そこで、11のフラクション全てを対象として次世代シークエンスによる微生物群集構造解析を行い、アニリン分解に関与する微生物群の特定を行った。環境安全学計画当初において、100物質程度に対して、生態毒性・生分解性に関する情報を確認することとしたが、環境中において検出される分解物が親物質であると判断する根拠が示すことが困難であることから、環境中での検出を評価することとした。また、対象物質を315物質まで拡大することで分解機構評価対象物質として9物質を選定することができた。分析法(代謝解析・SIP法)の最適化については、SIP法について検討ができていないものの備品・消耗品、技術の修得に関する課題はなくスムーズに研究を推進可能であり、代謝解析に関する基礎的検討についてもほぼ完了したといえ、計画通り進行している。SIP法の検討について、実験機器・試薬等はすでに入手しており、順次検討する段階である。また、活性汚泥を培養する系も確立しており、候補物質に対して、分解物を調査し、分解物の毒性評価、対象物質の分解経路の評価を推進する。
光学材料設計へ向けた固体中金属イオンのスペクトル解析及び汎用多電子計算法の整備

平成17年初年度の作業内容は、研究計画に沿う形で、その大部分を開発中計算プログラムの整備に当てた。Linuxシステム上で簡便に動作するよう、インターフェイスを作るシェルスクリプトの大幅な改訂を進めた。作業は開発中のプログラムに関わる他の研究者の進捗と密接に連携し、研究者によってバージョンの異なる同種のプログラムソースが混在してきたという煩雑さがあるために、それらの間の整合性を合わせる作業にも多くの時間と労力を費やすこととなった。しかし、2月には、従来は見られない完全相対論計算プログラムの講習会を所属部局に属する研究センターとの共催により開催し、研究計画に従う形でそのための説明冊子を作成し、参加者へ配布した。関係者には、今後この説明冊子をふくらませることにより、既に出版されている書籍の改訂版として新しい相対論計算プログラムの章を加えられるものと期待されている。一方、応用計算の面においては、最重要のものとして購入予定だった大規模行列対角化のための計算機が、メーカーの方針転換により生産打ち切りになることが本研究課題開始から間もなく知らされたため、将来性の無くなってしまった計算機一式の購入は敢えてしなかった。その結果、電荷移動型遷移など予定していた新しい研究課題には研究計画通りには着手できなかった。そのことが一つの理由で、夏に検討していた国際会議への参加も見送った。研究計画で計上していた研究費の使用品目と実際に使用した品目が異なる部分は、主にそのような理由による。その代わり、新しい研究課題としては、ウラン化合物の光スペクトル解析と、それに関連した電気双極子遷移振動子強度の起源に関する系統的計算を始めた。とりわけ後者の課題は、従来の理論の枠組みから得られる理解とは質的に異なる新しい理解の仕方を提案するものであり、議論の公表には慎重になる必要がある。論拠を確かなものにするためには、現状では調べ上げたイオンと配位子の組合せが未だ少なすぎると判断し、その作業は今後に残されている。
昆虫の嗅覚器官は細胞外基質のクチクラ層に配列する口径50nmのナノポアを通して匂い分子を感知する.ナノメートルレベルの細胞外基質構造が構築されるしくみを明らかにするために我々がショウジョウバエで新たに同定した小胞体分子Gore-texを手がかりにしてナノポアの構築機構を明らかにする.嗅覚器官特異的に発現する遺伝子からGore-texと共同してナノポア形成を促進させる分子を探索する.また細胞膜で分泌およびendocytosisが領域化してenvelop層の湾曲を促す様相を、三次元電顕解析により明らかにする.本研究はバイオミメティクスの生物学的基盤を明らかにするものである.昆虫の嗅覚器官は細胞外基質のクチクラ層に配列する口径50nmのナノポアを通して匂い分子を感知する.ナノメートルレベルの細胞外基質構造が構築されるしくみを明らかにするために我々がショウジョウバエで新たに同定した小胞体分子Gore-texを手がかりにしてナノポアの構築機構を明らかにする.嗅覚器官特異的に発現する遺伝子からGore-texと共同してナノポア形成を促進させる分子を探索する.また細胞膜で分泌およびendocytosisが領域化してenvelop層の湾曲を促す様相を、三次元電顕解析により明らかにする.本研究はバイオミメティクスの生物学的基盤を明らかにするものである.
大小会社区分立法と簡易監査のあり方

昭和59年5月「大小(公開・非公開)会社区分立法及び合併に関する問題点」ならびに昭和61年5月「商法・有限会社法改正試案」が法務省民事局参事官室より公表され、中小会社を大会社と区分し、適正な法制度を確立させるべく検討をすすめてきたが、このような情勢の中にあって、われわれは、大小会社区分立法に当たり、中小会社の計算公開とその信頼性をどのようにして担保するかにつき、従来のいわゆる制度監査とのかかわりで、望ましいあり方を、簡易監査という観点から共同研究を試みた。中小会社にかかわる計算公開の適正化は、第三者による計算書類の検証によって担保される種類のものであることが判明した。がしかし、各国にはそれぞれの内部事情があって多くの制度上の問題をかかえている事実が明確となった。昭和60・61年の2年間にわたる総合研究の結論として、以下のような成果を得ることができた。1.多くの研究者から、「簡易監査」ないし「限定監査」もしくは「調査」なるものは、理論的には存在しない、という主張がなされ、この趣旨に基づく論文発表がなされたということ。2.理論的考察からすると「簡易監査」はあり得ないとしても、わが国のように、公認会計士、税理士が共存して行くためには、政策的に何らかの調整を試みることによって制度化の道を拓くことが必要である、とする論者も存在している。3.わが国の現況からみて、監査とは別の考え方として指導概念を展開し、これによって、中小会社の計算公開の適正化を図るべきだ、とする新しい主張もみられた。いずれにしても、今後の課題は大きい。
機能性microRNAの生体内deliveryによる骨再生促進システムの開発

本研究の目的は、骨形成や炎症に関わるmiRNAをデリバリーすることで、BMPと骨髄濃縮液BMACによる骨再生を効果的に達成することである。実験は、まず動物実験モデルの作出のため、BMP2とBMACをマウス頭蓋骨へ移植した時に骨形成を誘導できるBMP2の臨界濃度を検討した。また、骨髄MSCの培養で、BMP2や炎症性サイトカインの添加によって発現が変動するmiRNAを探索し、候補を抽出した。その結果、BMP2によるMSCの骨芽細胞分化誘導中に発現の変動が大きかった1つのmiRNAが、通常の半量濃度のBMP2とBMACによる骨形成を促進し得ることが示唆された。本研究の目的は、micro(mi)RNAを生体内へデリバリーすることで、骨髄液から採取した幹細胞濃縮液を、培養操作を介さずに直接生体に応用する簡便で効果的な骨再生療法を開発することである。具体的には、炎症や骨形成に関わる機能性miRNAを補助的に全身や局所にデリバリーすることで、BMPと非培養骨髄細胞による骨再生を効果的、且つ安全、廉価に達成することを試みる。本年度は、まず骨髄由来MSC(BMMSC)の骨芽細胞分化へ機能するmiRNAの探索から実験を開始した。実験は、まず野生型C57BL/6マウスの大腿骨より採取した骨髄をフラッシュアウトし、遠心操作により細胞を採取した後、培養を行うことで、BMMSCを増幅させた。次に、BMMSCを骨分化誘導培地にて2週間培養を行い、骨分化誘導培地への変更時、変更後7日目、14日の時点で細胞数とALP活性を計測すると共に、細胞からRNAを抽出してmiRNAの発現プロファイルをqPCR Arrayにて解析した。その結果、ALP活性がピークに達する前の7日目にて発現の変動が大きいmiRNAをいくつか認めたたので、現在それらのmiRNAをBMMSCに導入することで、骨芽細胞分化への機能を詳細に評価しているところである。同時にさらに詳細な培養日数における発現変化を調べるため、骨分化誘導後2、4日目におけるmiRNAの発現プロファイルを解析しているところである。本年度は、まず移植モデルの作出から実験を開始した。本研究では、局所での炎症反応の抑制や骨芽細胞分化の促進に関わる機能性miRNAを応用することで、低濃度BMPとマウス骨髄由来MSC(BMMSC)による効果的、且つ安全な骨再生を実現することを目的の一つとしている。そのため、候補となるmiRNAの機能を評価するための有用な移植モデルが必要と考え、低濃度BMP2とBMMSCによる移植条件において、骨誘導が可能となるBMP2の臨界濃度の検討を行った。その結果、通常濃度の約半量にてリン酸カルシウムにBMP2を吸着させ、それにBMMSCを播種した複合体をマウス頭蓋骨上に移植した時に、骨形成が僅かに認められた。それに対して、それ以下の濃度では骨形成を認めることが出来なかった。そのため、通常濃度の半量程度が骨形成を誘導し得る臨界濃度を考え、miRNAの機能解析の移植モデルに使用することとした。現在、前年度から進めているmiRNAの発現プロファイル解析や候補因子の合成2本鎖RNAの作製などmiRNAの選定に関わる実験に注力しており、候補となり得るmiRNAを順次移植モデルに応用し、効果的な骨再生法の開発を進めているところである。口腔外科学・再生医学補助的に投与するmiRNAの候補を抽出できつつあるため、次年度は当初の計画通り移植実験を中心に行うことができると思われるため。抽出したmiRNAが仮説のように機能しない場合も考えられるため、さらに候補となるmiRNAの探索も並行して行っていく。年度末に動物への移植実験を開始することを考慮していたが、解析実験に時間がかかり、施行できなかったため。動物への移植実験を開始するため、実験動物を購入する予定である。
色素性乾皮症の新規相補性群の原因遺伝子同定とその解析

本研究代表者は平成10年より色素性乾皮症など紫外線性DNA損傷の修復異常で発症する遺伝性光線過敏症の分子細胞診断を施行してきた。これまで348検体を解析し、108例の新規XP患者を見出した。この内100例はXP相補性群の確定が可能であったが、残り8例は各種試験を行うも群決定が困難であった。これらのXP群未確定患者は軽度の光線過敏症状、色素異常があるものの神経学的異常はなく、細胞生物学的には不定期DNA成能は30%以下と著明に低下し、紫外線感受性試験では中等度感受性亢進、カフェイン添加で感受性の変化なしという結果であった。プラスミド宿主細胞回復能は正常の1040%でありこの低下はXPA,B,C,D,F,G群発現ベクターを患者細胞に導入しても回復はみられなかった。細胞融合法による古典的相補性試験でも既知群は否定された。XPE群遺伝子変異は検出されなかった。これら結果から今回の群未知症例はXP診断は確かであるが、既知の群には属さない新しいグループである可能性がきわめて高いと考えられた。未知因子同定を目的として体細胞ハイブリッド作成法による紫外線抵抗性マウス細胞のクローン化を試みたが浮遊細胞に対する正確な至適紫外線照射線量が判明せず現在も条件検討中である。患者細胞、年齢・性を一致させた正常細胞のRNAペアを準備し、cDNAマイクロアレイ、miRNAマイクロアレイ解析を試みた結果ATM、CLSPN、FANCD遺伝子に発現低下を認めた。疾病細胞群で発現低下していたこれらの遺伝子とXP症状との関連は不明ではある。今回の研究から、神経症状非合併で皮膚症状は軽度という共通のフェノタイプを持ち既知のいずれのXP群に属さない新規XP相補性群患者が本邦では稀ながら存在する可能性が示唆された。1)患者由来リンパ芽球様細胞株の樹立とヒトリンパ芽球用細胞の紫外線感受性測定XPの新規群と考えられる患者から研究同意を得た後に血液を採取して、抽出した白血球(B細胞)をEBウィルスでトランスフォームして株化細胞を1系統樹立した。またコントロールとして必要な健常人由来リンパ芽球用細胞も同時に樹立した。これらについて紫外線感受性試験を施行し、来年度に施行開始する体細胞ハイブリッド法の際の紫外線照射の至適条件(患者由来細胞では死滅するが、健常細胞ではほとんど生存するような紫外線線量とその照射方法、条件を決定した2)DNAマイクロアレイ法による解析研究に関する同意を得た後に、患者由来細胞、年齢を患者とマッチさせた健常人由来細胞から抽出したRNAを用いて、DNAマイクロアレイ法により、患者細胞、正常細胞の間での遺伝子発現パターンの違いを網羅的に比較した。その結果、患者細胞のみで発現が低下している10数種類の遺伝子が確認された。3)新規相補性群と思われる患者の臨床的特徴は色素性乾皮症C群にきわめて類似しているため、XPCとコンプレックスを形成して作用する因子の異常ではないかという仮説のもと、骨格内にflagを含み、cent2,hHR23B遺伝子を発現するベクターを作成した。また、flagに対する抗体を使用して、我々が用いている遺伝子導入システムでの正常細胞での発現を確認した。来年度に、同発現ベクターを用いて患者細胞への遺伝子導入実験を行う予定である。色素性乾皮症は紫外線性DNA損傷の修復異常で発症する遺伝性光線過敏症で、現在、遺伝的に異なるAG群、バリアントの計8種類が知られている。研究代表者の施設で見出した、臨床的・細胞学的に既知のグループに属さないと思われる患者由来の細胞を用いて、色素性乾皮症の発症に関与すると想定される新規遺伝子の同定を種々のストラテジーで試みている。1)DNAマイクロアレイ法による解析患者

由来細胞、年齢を患者とマッチさせた健常人由来細胞から抽出したRNAを用いて、DNAマイクロアレイ法により、患者細胞、正常細胞の間での遺伝子発現パターンの違いを網羅的に比較した。その検索を2種類の患者細胞で行った結果、各々の細胞で患者細胞のみで発現が低下している1020数種類の遺伝子が確認されたが、2種類の細胞間で共通している遺伝子は存在しなかった。2)新規相補性群と思われる患者の臨床的特徴は色素性乾皮症C群にきわめて類似しているため、XPCとコンプレックスを形成して作用する因子の異常ではないかという仮説のもと、骨格内にflagを含み、XPCとコンプレックスを形成してヌクレオチド除去修復の一役を担っているcent2,hHR23B遺伝子を発現するベクターを作成した。両ベクターともにflagに対する抗体を使用して、各々cent2,hHR23B遺伝子を発現していることを複数の健常人皮膚由来線維芽細胞で確認した。その後、新規XP群と思われる4症例の細胞に同ベクターを導入して、低下しているDNA修復能の回復を紫外線照射ルシフェラーゼ遺伝子の宿主細胞回復能を指標に観察したが、cent2,hHR23Bいずれの遺伝子を導入・発現させても修復能の増加は認められなかった。3)XP軽症型であるXPE群遺伝子のシークエンスを今回の解析対象である全症例(4例)で施行したが、変異は見いだせなかった。4)1)、2) 3)のストラテジーでは新規遺伝子同定が困難と思われたため、現在、患者由来リンパ芽球様細胞とマウスB細胞を使用した体細胞ハイブリッド法による解析を進めている。