hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中学校高校数学における動的データ探索ソフトによるコンテンツの開発と効果

本研究の目的は,中学校・高校数学において利用可能な「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発し,実験授業を通して生徒の統計的思考力の発達を検証して,コンテンツの効果を明らかにすることであった。研究代表者が中心となって,「動的データ探索ソフト」によるコンテンツの開発を推進し,研究分担者が中心となって,評価問題の開発を推進した。そして,研究協力校で実験授業を実施し,開発されたコンテンツの効果を検証した。これらの研究から得られた成果に基づいて,「動的データ探索ソフト」による授業モデルを公開し,コンテンツの教育的利用を促進した。平成26年度の目的は,統計教育に関する先行研究や国内・国外の数学教科書の文献を調査し,中学生・高校生を対象にした「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発することであった。主な研究実績は,次のとおりである。統計の指導教材の整理:国内・国外の数学教育関連書で取り上げられている統計の指導教材などについて,動的なデータを分析する必要性が高いものを抽出して整理した。特に,米国数学教師協議会による「データ解析の道標」(NCTM,2009)で利用された統計の指導教材を整理した。また,国内の高校数学教科書で利用されている統計の指導教材を整理した。コンテンツ開発対象の内容の特定:中学校・高等学校の学習指導要領に基づいて,コンテンツ開発対象の内容を特定した。まず,コンテンツ開発対象の内容の特定に向けて,2次元表を作成した。一方の軸には,学習指導要領における統計の内容の軸を設定した。もう一方の軸には,利用されるデータについて,静的データ・動的データで区分する軸を設定した。そして,中学校数学で動的データを利用する代表的なコンテンツとして「標本抽出」(単純無作為抽出,層化抽出,クラスター化抽出),高校数学で動的データを利用する代表的なコンテンツとして「標本平均の分布」(標本の大きさと標本標準偏差との関係)を開発対象の内容とした。「動的データ探索ソフト」によるコンテンツの開発:学習指導要領における統計の内容に対応させて,「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発した。そして,それぞれのコンテンツを授業で活用できるように,授業における発問系列を作成した。その際,「動的データ探索ソフト」として「Fathom」(ファズム)を利用した。また,コンテンツの開発とともに,中学校・高等学校数学における統計の内容の系統性を明確にし,評価問題作成のための準備をすすめた。平成27年度の目的は,「ARTIST」研究プロジェクトや統計検定の問題を調査し,わが国の学校数学カリキュラムの内容と照合して,中学生・高校生を対象にした統計的思考力の評価問題を作成することであった。統計検定の問題の分類:研究分担者の1名が中心となって,中学校・高等学校数学における統計の内容に基づいて,統計検定の問題を分類した。特に,高等学校卒業程度の水準に相当する統計検定3級の問題を整理し,高等学校数学における統計の内容を網羅できるように,問題と内容の対応づけを行った。「ARTIST」研究プロジェクトの問題の翻訳と分類:研究代表者が中心となって,中学校・高等学校における統計の内容に基づいて,「ARTIST」研究プロジェクトの問題を分類した。米国の統計学入門を受講した水準の大学生を対象にした調査の正答率を参照し,難易度が異なる問題についてレベル分けを行った。統計的思考力の評価問題の作成:研究分担者の1名が中心となって,学習指導要領における統計の内容に対応させて,統計的思考力を評価するための問題を作成した。このことについては,統計的問題解決のProblem・Plan・Do・Analysis・Conclusionサイクルに基づいて,各段階に対応する問題を作成した。本研究の目的は,中学校・高等学校数学において利用可能な「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発し,実験授業を通して生徒の統計的思考力の発達を検証して,コンテンツの効果を明らかにすることである。平成27年度は,「ARTIST」研究プロジェクトや統計検定3級の問題などを参考にして,中学生・高校生を対象にした統計的思考力の評価問題を作成した。平成28年度以降は,研究協力者などの中学校・高等学校で,開発されたコンテンツによる実験授業を実施し,統計的思考力の評価問題に対する回答を分析して,コンテンツの効果を検証する。そして,「動的データ探索ソフト」による授業モデルを作成し,開発されたコンテンツの教育的利用を促進する。現在までの達成度は,次のとおりである。統計的思考力の評価問題の作成:中学校・高等学校数学における統計の内容に基づいて,統計検定の問題を分類した。また,「ARTIST」研究プロジェクトの問題を分類した。そして,学習指導要領における統計の内容を網羅するように,統計的思考力を評価するための問題を作成した。これまでの年度において,ほぼ研究計画のとおりに研究が進捗している。平成28年度の目的は,研究協力者の学校などで,開発されたコンテンツによる実験授業を実施し,統計的思考力の評価問題に対する回答を分析して,コンテンツの効果を検証することであった。コンテンツを利用した実験授業の実施:研究協力者の学校などにおいて,「動的データ探索ソフト」による実験授業を実施した。平成28年度は,教師の演示でコンテンツを利用できる環境における実験授業を実施した。

実験授業後に,研究分担者の1名が中心となって,授業プリントにおける生徒の反応を分析した。また,研究分担者の1名が中心となって,統計的思考力に関する事前・事後調査問題に対する生徒の反応を分析した。その結果,標本の大きさをパラメータとして標本比率の分布を動的に変化させることによって,大数の法則などの概念理解を促進する効果がみられた。コンテンツの改良:実験授業の分析結果に基づいて,研究代表者が中心となって,顕著な効果がみられなかったコンテンツの改良をすすめた。その結果,コーシー分布のような特殊な分布を変化させることはできるが,その数式表現とグラフ表現を関連付けて理解させることは難しい学習状況がみられ,改良が必要な事項となった。平成29年度において,生徒が4人グループで1台のコンピュータを利用できる環境における実験授業を実施する予定のため,生徒がコンテンツを操作しやすいように説明を加えることに留意して改良した。本研究の目的は,中学校・高等学校数学において利用可能な「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発し,実験授業を通して生徒の統計的思考力の発達を検証して,コンテンツの効果を明らかにする計画である。平成28年度は,研究協力者の学校などで,開発されたコンテンツによる実験授業を実施し,授業プリントと統計的思考力の事前・事後調査問題に対する回答を分析して,コンテンツの効果を検証した。平成29年度は,「動的データ探索ソフト」による授業モデルを作成し,多くの学校で開発されたコンテンツの教育的利用ができるようにすることである。現在までの達成度は,次のとおりである。「動的データ探索ソフト」によるコンテンツの開発:学習指導要領における統計の内容に対応させて,「動的データ探索ソフト」によるコンテンツを開発した。そして,授業における発問系列を作成した。その際,「動的データ探索ソフト」として「Fathom」(ファズム)を利用した。統計的思考力の評価問題の作成:中学校・高等学校数学における統計の内容に基づいて,統計検定の問題を分類した。また,「ARTIST」研究プロジェクトの問題を分類した。そして,学習指導要領における統計の内容を網羅するように,統計的思考力を評価するための問題を作成した。コンテンツを利用した実験授業の実施:研究協力者の学校などにおいて,「動的データ探索ソフト」による実験授業を実施した。また,研究分担者の1名が中心となって,事前調査・事後調査における生徒の反応を分析した。これまでの年度において,ほぼ研究計画のとおりに研究が進捗している。
多発性骨髄腫の酸代謝の実態と酸代謝を標的とした新規抗腫瘍療法の創出

1)骨髄腫細胞に特徴的な細胞外酸感知受容器と酸排出に関わるモノカルボン酸トランスポーター(MCT)の発現制御機構、酸感受の下流で活性化する生存シグナル経路やエピゲノミックな遺伝子異常発現機序を解明し、2) PI3K-AktおよびPIM2などの生存経路の阻害やMCT阻害による細胞内pHの低下がもたらす解糖系やミトコンドリアによるエネルギー産生やコレステロール合成系等の代謝経路、薬剤排出ポンプ発現への影響や自己複製能をもつ癌幹細胞やSP分画の生存に及ぼす効果を明らかにする。
骨リモデリングにおけるBMPとビスホスフォネートの協調作用効果の解析

BMP単独では骨吸収作用が勝り、骨形成が間に合わない。臨床例においてもBMP使用の失敗例が報告されている。一方BMPとZAを組み合わせると、BMPの骨吸収作用とZAの骨吸収抑制作用がうまく打ち消しあい、かつBMPの骨新生形成作用が働いて、理想的な結果が得られた.BMP単独では骨吸収作用が勝り、骨形成が間に合わない。一方BMPとZAを組み合わせると、BMPの骨吸収作用とZAの骨吸収抑制作用がうまく打ち消しあい、かつBMPの骨新生形成作用が働いて、理想的な結果が得られた.【目的】ラットチャンバーモデルにおける移植骨の病理組織学検討と、組織形態計測による検討【方法】24匹のラットを屠殺後、両脛骨骨髄内より移植骨を採取し,-80°Cに24時間以上保存した.全身麻酔下,24匹のラット両脛骨内側に移植骨を中に入れたボーンチャンバー(BC)を挿入した(BCの先端は骨髄と交通している).移植骨には一側のみBMP-7(2μ-g)を投与し,反対側はsalineを投与した(B(+)群・B(-)群).手術2週後12匹のラットにZoledronic acid(ZA)(0.1mg/kg)を皮下投与し,残りの半数はsalineを皮下投与した(ZA(+)群・ZA(-)群).手術6週後にBCを摘出し,移植骨の病理組織学的検討と組織形態計測による移植骨内のbone ingrowth length(BIL)を検討した.またbone ingrowth内の骨密度はMerz grid法により検討した.【考察と結論】BMP-7の骨吸収・リモデリングの作用と2週後に投与したZAの骨吸収抑制作用が協調するメカニズムが考えられた。骨壊死症は進行すると圧潰をきたす.骨細胞の死そのものが圧潰の原因ではなく,骨再生過程におこる骨吸収の結果であり,十分な新生骨が形成せるまで骨吸収を抑制できれば圧潰は回避できると推測される.最近,大腿骨頭壊死症に対するビスホスフォネートによる保存的治療が報告されているが,BMP-7とビスホスフォネートを組み合わせることにより,さらに効果的になる可能性がある.【目的】BMP-7とビスボスフォネート(Zoledronic acid)存在下での骨質の検討(ラット大腿骨骨折モデル)【方法】対象:Sprague Dawleyラット雄、10週齢、体重300g48匹1)ラット大腿骨骨折モデル:麻酔下約3cmの皮膚切開の後、大腿骨骨幹部にボーンソーにより骨折を加える。骨膜はすべて剥離する。C-wire(0.45インチ)で逆行性に強固な固定を行う2)24匹にたいし、骨折部にBMP-7(2μg)をカルボキシメチルセルロース(CMC)を担体として投与する。のこり半数のラットにはコントロールとして、CMCのみを投与する。3)BMPを投与した12匹とコントロールの12匹に手術2週間後Zoledronic acid(ZA0.1mglkg)を皮下投与し、残りの半数は生理食塩水を投与する。4)手術6週後、大腿骨を摘出し、軟X線撮影後、強度試験(ねじり、圧縮試験)を行う。評価方法:レントゲン撮影後、画像をパソコンに取り込み、専用ソフト(analySIS FIVE)を用いて仮骨の面積を求める。また強度試験に関しては骨強度試験機(TK-252C、室町機械株式会社)を用いて測定しC-C群、BMP-C群、C-ZA群、BMP-ZA群において統計学的検討を行う。【考察と結論】BMPZA群が骨癒合、仮骨量ともに有意差をもってC-C群よりも上回った。ZAの破骨細胞抑制作用のみでも微量ながら同様な傾向がみられることから、BMPを加えた場合の効果は十分期待できる。またこれまで、ZAの投与のタイミングについて検討してきた(骨折手術2週前、骨折手術と同時、骨折手術2週後の3通り)。その結果、骨折手術2週後にZAを投与したほうが、骨折に最適であることが判明した。その理由としては、破骨細胞と骨芽細胞のturn overの期間、ZAの効果発現時期などが影響していると考えている。力学的強度試験の結果、十分な強度を備えておりBMP-7とビスホスフォネートでいわゆる強制的に作成した新生骨の骨質はけっして劣ったものではないことが証明された。
認知症患者・介護者の介入によるストレスバイオマーカー変化の検討

要介護者の2人に1人は認知症であり、介護する家族・介護スタッフの負担は計り知れない。物忘れ外来通院中の40組において介護サービスが十分受けられ、満足していると答えた患者・介護者においては、心理検査でも不安、QOLの維持・改善傾向が見られた。介護負担の中で食事の支度が大変という意見が多く、平成27年は患者および介護者の栄養調査を行った。魚の摂取量は、AD女性患者とその介護者で成人平均量の半分と少なかった。食の偏りは介護者の性でなく患者の性が影響していた。栄養指導・簡単な食事の支度のアドバイスにより魚摂取量は増やすことができたが、男性介護者にとって食事の支度は大きな負担になっていた。認知症患者の増加に伴い介護負担が原因で病気になる家族も増えている。申請者は、介護者に何らかの心身の症状がでる病態を「介護ストレス症候群」と名づけ、バイオマーカーの探索的研究を行い、心理検査や唾液ストレスマーカーの測定を実施。自宅介護中の介護者がストレスを感じているとき、患者も同様にストレスを感じているという結果を得た。本年は、介護ストレスの調査と同時に、患者・介護者の栄養調査も行い、食事の準備の負担、食事の偏りも解析にいれることにした。栄養調査は、介護者に記入してもらう簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた。現在、30名のアルツハイマー病患者・介護者のデータを集めた。女性アルツハイマー病患者と介護者(夫・娘)に「甘い物」摂取量が多く、「魚」の摂取量が少なかった。食事の支度の負担があるのか、菓子パンで朝・昼食をすませる傾向があった。次年度は、100例を目標に症例を増やし、BDHQをもとに行う食事指導の効果についても栄養価とストレスバイオマーカーの変化についても検討する。認知症群と正常群を比較すると野菜、海藻、魚が少ないという国内の報告があり、栄養と認知症の関係については、欧米・アジアからも報告が多い。食事の支度は介護者にとっても負担になることが多く、楽で適切な食事指導を行うことを目的として調査を行った。<結果>女性患者(平均年齢82±4歳)の平均摂取カロリーは1703kcal/日(必要量1670kcal/日)、魚摂取量平均43g/日、菓子類摂取量平均86g/日。男性患者(平均年齢81±5歳)の平均摂取カロリーは2265kcal/日(必要量2185kcal/日)、魚摂取量平均82g/日、菓子類摂取量平均73g/日。厚生労働省の平成24年国民健康・栄養調査での70歳以上の魚摂取量平均は86.5g/日、菓子類摂取量は23.8g/日である。女性AD患者には魚摂取量不足、菓子類摂取量過剰の傾向、男性AD患者は菓子類摂取量過剰、摂取カロリー過剰の傾向が認められた。女性患者の介護者(夫5名、娘4名、息子1名)にも、魚摂取不足(54 g/日)があった。介護者に対し、「魚を増やし、お菓子を減らす」ことを指導した。3か月ごに同じ調査を行い、認知症患者は、魚が増えていたが、お菓子量は変わらなかった。介護者は、魚も増えず、お菓子も変わらなかった。「認知症患者に魚を食べて、これ以上認知症が進まないようにしてほしい、と思ったが、自分はまだ大丈夫だから、と魚は増やさなかった」と答えた。<結論>AD患者には食習慣の偏りがあり、介護者にも患者と同様の傾向が認められた。魚を食べ、お菓子を減らすように食習慣を変えることは、丁寧な指導と定期的な調査が必要と考えらえた。介護者ストレス・栄養調査が本年度24名新規に登録があり、今後も外来、入院患者において登録が増えてゆく見通しがあるから。1観察研究:老老介護家族における患者・介護者ストレス(30組):介護者ストレスの評価と投薬、心理士による患者・介護者の面談介入を行った。研究開始時、介護者中心に介入を検討していたが、初期から中期の認知症者においては、介護者だけでなく、認知症者当事者の心理的な不安やストレスと介護者のストレスがかかわっている可能性が示唆され、当初50組を予定していたが、30組として認知症者への心理的な評価と介入も行った。2入院患者における夜間せん妄の原因とケア介入の効果:せん妄のリスクとなることが当科の看護研究で判明しているADL低下、認知症、絶食、尿道カテーテルの有無と、せん妄はDST(Delirium Screening Tool ; DST)を用いて評価することを目的としていた。平成27年5月当院に入院した認知症者が適切な医療を安全に受けられるようにアドバイスを行う「高齢者ケアサポートチーム」を立ち上げ、認知症認定看護師と2人で週1回院内回診を行った。平成27年度151件、平成28年度191件(のべ)相談を受けた。周術期、緊急入院など6割が外科からの相談であった。抑制帯をできるだけ使用しないケアの指導や投薬指導でせん妄の予防を行ってきた。現在「高齢者ケアサポートチーム」介入前後の自己抜針やせん妄発生の件数の変化などを解析中である。3介護者ストレスと食事の支度:1年目の調査で、介護者が1日3回の食事の支度に負担を感じていることがうかがえた。そのため、認知症者と介護者の食事調査を追加した。

お菓子摂取量が多く、朝昼食に菓子パンを食べているケースが多かった。食事の支度に負担を感じ、また、簡単に食べられる菓子パンで食事を済ませることで、栄養に偏りが見られた。それぞれの家庭で可能なバランスの良い食習慣の指導を行った。要介護者の2人に1人は認知症であり、介護する家族・介護スタッフの負担は計り知れない。物忘れ外来通院中の40組において介護サービスが十分受けられ、満足していると答えた患者・介護者においては、心理検査でも不安、QOLの維持・改善傾向が見られた。介護負担の中で食事の支度が大変という意見が多く、平成27年は患者および介護者の栄養調査を行った。魚の摂取量は、AD女性患者とその介護者で成人平均量の半分と少なかった。食の偏りは介護者の性でなく患者の性が影響していた。栄養指導・簡単な食事の支度のアドバイスにより魚摂取量は増やすことができたが、男性介護者にとって食事の支度は大きな負担になっていた。アルツハイマー病患者の診療にあたる他の老年病科医師の協力もあり、研究に協力いただける患者が得られているため。入院患者のストレス研究を開始しており、患者の唾液アミラーゼ、SF8、睡眠モニター、顔写真による表情解析を行いはじめ、現在100名登録があり、今後、解析を進めてゆく。老年医学、認知症100例を目標に症例を増やし、BDHQをもとに行う食事指導の効果についても栄養価とストレスバイオマーカーの変化についても検討する。また、入院患者のせん妄とストレスについての研究も病棟ではじめてゆく。
13族典型金属元素化合物の新規反応性の開拓とその有機合成への利用

有機ハロゲン化物のアルケニル化反応は、Heck反応や交差カップリング反応など遷移金属触媒を用いる反応については詳しく検討されている。これに対し、ラジカル反応による有機ハロゲン化物のアルケニル化反応については、中性条件下で反応を行えるという利点があるにも関わらず、一般に困難であるため、その報告例は限られている。そのうえ、これらはいずれも二重結合を活性化する官能基の置換が必須であるため、導入できるアルケニル基に制限がある。さらにTHF中加熱還流といった条件が必要であるため、より温和な条件で進行する一般性の高い反応の開発が望まれていた。そこで、インジウムラジカルを脱離基として用いるラジカル機構によるアルケニル化反応を計画し、検討を行った。触媒量のトリエチルボラン存在下、α-ヨードエステルに対してβ-スチリルインジウムジクロリドを作用させたところ、室温という穏和な条件でラジカル的スチリル化反応が収率よく進行した。この反応は様々なα-ヨードカルボニル化合物及びα-ブロモカルボニル化合物に適用できることを明らかにした。また、このアルケニルインジウムを用いたラジカル的アルケニル化反応を用いることにより、既に報告されているラジカル的アルケニル化反応とは異なり、芳香環や電子求引性基の置換していないアルケニル基の導入を行えることを見出した。さらに、この反応によって導入されたアルケニル基は、反応剤であるアルケニルインジウムの立体化学を保持していることを明らかにした。また、アルキンに対するラジカルヒドロインジウム化によって得られるZ-アルケニルインジウムをこのラジカル的アルケニル化反応にワンポットで用いることにも成功した。
炭素材料を基盤としたpKa傾斜を持つヘテロ積層型プロトン伝導体の創製

金属錯体・有機分子・酸化グラフェンを交互積層法を用いて、pKa勾配を持つプロトン伝導に適した構造体の作製を目指して研究を進めた。まず、炭素材料に吸着可能なルテニウム錯体を合成した。ルテニウム錯体にはピレンアンカー基を導入し、HOPGに対する吸着挙動を明らかにした。またピレンアンカー基を導入したルテニウム錯体を用いて、ナノチューブやHOPGなどの炭素材料への吸着挙動を明らかにし、錯体から炭素材料への電子移動速度を比較した。エネルギー問題は21世紀に与えられた地球規模の大きな課題の一つである。化石エネルギーや原子力エネルギーに頼らないクリーンなエネルギー源が求められている。全固体型の畜電池は次世代エネルギーを担うものとして研究対象の一つであり、固体型燃料電池などに関して多くの電極材料が日夜研究開発されている。燃料電池では正・負極を分離するプロトン伝導体が重要な役割をする。最近、多孔性金属錯体などの有機ー無機ハイブリッド系のプロトン材料を創製に成功している。しかしながらこれらの系ですらプロトン伝導サイトは多孔性金属錯体中に導入された1種類の置換基(カルボン酸もしくはリン酸)のみで行われている。本研究ではグラフェンなどのナノ炭素材料を基盤としたpKa傾斜を持つヘテロ接合型プロトン伝導体を創製する事を目的とする。酸化グラフェン、金属錯体、有機物の積層構造を作製し、各層を形成する3種のユニット材料にpKaの異なるホスホン酸(pKa=23)、カルボン酸(pKa=34)、イミダゾール(pKa=67)を導入し、pKa勾配を持たせる事でプロトン移動を面内だけでなく断面方向にも選択的に効率的なプロトン移動を起こし、プロトン移動に方向性を持たせる。従来報告されているプロトン伝導体はプロトン移動のメカニズムや効率化のみに焦点が当てられており、プロトンの流れに方向性を持たせた材料設計がなされてこなかった。酸化グラフェンなどの層状ナノ炭素材料を用いることで新たなpKa傾斜をもつプロトン伝導材料が創製できる。金属錯体・有機分子・酸化グラフェンを交互積層法を用いて、pKa勾配を持つプロトン伝導に適した構造体の作製を目標に研究を進めた。金属錯体の中心金属には安定なレドックス活性を示すルテニウムを選択した。研究を進めるに当たり、まず炭素材料に吸着可能なルテニウム錯体を合成した。ルテニウム錯体には炭素材料に吸着可能なアンカー基としてπ-π相互作用によって吸着するピレンを導入し、さらにピレンアンカー基の数を変化させ、より強固に炭素材料への吸着を可能にした。ルテニウム錯体には1、2、4,8本のピレンアンカー基を導入し、HOPGやグラフェンへの吸着挙動を電気化学によって評価した。合成した多脚ルテニウム錯体の1H NMRやマススペクトルを測定し、同定を行った。HOPG電極表面での電気化学測定の結果からピレンアンカー基の数を増加させるに従い、炭素材料に強く吸着することが明らかとなった。また、8脚のピレンアンカー基を有するルテニウム錯体においては基板表面で多層膜を作製することが明らかとなった。次に炭素材料の種類をHOPGや直径の異なる単層もしくは多層カーボンナノチューブと変化させた場合の錯体から炭素材料への電子移動速度を評価した。平面のHOPGや湾曲の少ない直系の大きな多層カーボンナノチューブにおいて、錯体からの電子の移動速度が早くなることが明らかとなった。これらの結果をまとめると、炭素材料、特にHOPG、グラフェン、カーボンナノチューブに吸着可能なルテニウム錯体の分子設計の指針を得ることが出来た。今後はプロトン応答性を示すルテニウム錯体にピレンアンカー基を導入し、炭素材料表面におけるプロトン伝導性の評価を行いたいと考えている。錯体化学ピレンアンカー基を有するプロトン応答型ルテニウム錯体とホスホン酸を有するピレンなどのプロトン伝導体の構成ユニットの合成に成功した。ピレンアンカー基を有する金属錯体はグラフェンやカーボンナノチューブ、HOPGなどへの吸着挙動をあきらかにした。またピレンアンカー基を有するルテニウム錯体について、ピレンアンカー基の数を変えたところ、数に応じて吸着力が大きくなることが明らかとなった。さらにPH応答性を評価したところ、pHを酸性から塩基性に変化させたところ、酸化還元電位が低電位側にシフトすることが明らかとなった。さらにプロトン共役電子移動について詳細を明らかにするために、プルベーダイアグラムの作製を行った。交互積層構造体の作製を行う。まず固体基板もしくは電極上にナノチューブに担持した有機分子を積層させる。次に参加グラフェンを積層させる。最後にナノチューブに担持した金属錯体を積層させ、目的の構造体を作製する。構造体はAFM、SEMやTEMを用いてその構造を観察し、XRDなどのX線による構造解析を行うことで詳細な構造を明らかする。加えてFT-IRやXPSを用いて置換基の有無や含有元素を明らかにする。

また、交互積層構造体の物性評価としてサイクリックボルタンメトリー(CV)測定、固体化の電気伝導度測定、プロトン伝導度測定(インピーダンス測定)を行う。これらを行うとこにより層構造やpKa勾配の大きさ、順序などを相対的に評価し、プロトン伝導に適した構造体の作製の知見を得る。初年度に予定していた炭素材料の積層の作製のための材料を購入予定であったが、現段階での実験の進行状況から購入を控えた。さらに学会での発表を控えたためである。当初の計画に加え、次年度に購入を控えた、試薬、材料の購入するとともに、学会での発表を行う。
抗うつ作用を有するセロトニン神経回路の同定とその可塑的変化の分子機構の解明

1昨年度において、慢性社会的挫折ストレスマウスにおける薬理学的検討から、慢性社会的挫折ストレスモデルマウスにおけるうつ様行動の発現を確認し、セロトニン遊離薬であるフェンフルラミン投与によるうつ様行動の減弱を見いだした。本年度は、この抗うつ作用がセロトニン遊離上昇によるものであるか確認するために、セロトニン枯渇薬であるpCPAを前投与した際のフェンフルラミンの効果について検討した。その結果、pCPAによりフェンフルラミンの抗うつ作用が抑制されたことから、セロトニン遊離上昇が抗うつ作用に重要であることが示唆された。2セロトニン神経特異的なプロモーターを持つアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を新たに作製することで、以前使用していたレンチウイルスベクター(LV)よりも非常に強力な遺伝子発現が可能であることを確認した。一方でこのAAVではセロトニン神経への特異性が減少していたため、TPHプロモーター部位の最適化やウイルスタイターの最適化を行ったところ、改善が見られた。3Tph2-tTAマウスへtetO-GOI LVを投与することによりセロトニン神経特異的かつ十分な遺伝子発現が得られたことから、本マウスを用いてDRNセロトニン神経を光遺伝学的に刺激しながら、尾懸垂試験を行ったところ、抗うつ作用が確認された。現在このマウスを用いて神経投射先ごとの抗うつ作用の有無を検討しているところである。4マウスと同様にしてラットのセロトニン神経特異的なLVを作製し投与したところ、セロトニン神経特異的かつ機能的な光遺伝学的ツールの発現が確認された。そこで、DRNセロトニン神経を光刺激しながら各種行動試験を行ったところ、オープンフィールド試験における自発行動量変化や高架式十字迷路試験における不安様行動には変化は見られなかったが、強制水泳試験において抗うつ様効果が見られた。29年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、マウス縫線核(背側および正中)に光遺伝学的ツール(ChR2:興奮性、eArch:抑制性)やDREADD(hM3Dq:興奮性、hM4Di:抑制性)を発現するレンチウイルスベクターを投与することで、セロトニン神経特異的な刺激が可能であるか電気生理学的に検討を行った(1)。また、うつや不安といったセロトニン神経の関与する行動試験を用いて、ChR2などにより縫線核セロトニン神経回路全体を刺激した際の行動変化を検討した(2)。同様に、縫線核へウイルスベクターを投与することでセロトニン神経の各投射領域において神経発火に十分なChR2などの発現が可能であるか確認し、単一セロトニン神経回路選択的な刺激技術の確立を試みた(3)。1セロトニン神経特異的レンチウイルスベクターを用いて神経興奮性のChETAおよび神経抑制性のeArchTを発現させたラットおよびマウスにおいて、縫線核の急性単離切片を作製し、光照射に応じたセロトニン神経制御が可能であることを確認した。2セロトニン神経特異的レンチウイルスベクターを用いて、背側縫線核にChETAを発現させ、セロトニン神経特異的に光刺激による活性化を行った際に、尾懸垂試験におけるうつ様行動が有意に減弱するが、高架式十字迷路における不安様行動には影響を与えないことを見出した。これらの結果は、背側縫線核の直接的な活性化が抗うつ薬様作用の発現に十分であることを示すものである。3各投射先領域においてセロトニン神経回路特異的な光刺激を可能にするため、セロトニン神経特異的レンチウイルスベクター投与後1, 2, 3ヶ月後において解析を行ったところ、1-2ヶ月で腹側被蓋野において、3ヶ月後において側坐核、前頭皮質などセロトニン神経投射先におけるChETAの発現を確認した。高頻度逆行性ウイルスベクターを作製し免疫染色による解析を行ったが、逆行性に発現が認められた細胞数は少なく、実用レベルではなかった。しかしながら、セロトニン神経特異的レンチウイルスベクター投与後数週間の回復期間をおくことにより、腹側被蓋野や皮質などにおける遺伝子発現が観察された。さらに、新たにセロトニン神経特異的な遺伝子発現が可能であるアデノ随伴ウイルスベクターの作製およびトランスジェニックマウスとレンチウイルスベクターを併用することにより、より強力な神経投射領域における遺伝子発現が観察された。これらを用いて、投射領域における電気生理学的検討および行動学的検討が行えると考えている。また、オプトジェネティクスを用いて、セロトニン神経特異的に光刺激による活性化を行った際に、尾懸垂試験におけるうつ様行動が有意に減弱するが、高架式十字迷路における不安様行動には影響を与えないことを見出している。1初年度は尾懸垂試験など、SSRIの単回投与が効果を示すうつ様行動試験を用いた検討を行った。今年度は、さらに、よりモデルとして妥当性が高いとされている。慢性社会的挫折ストレスマウスの作製を行い、薬理学的検討を行った。まず、慢性社会的挫折ストレスを与えるとうつ様の行動を示すことを確認し、セロトニン遊離薬であるフェンフルラミンを投与することで、そのうつ様行動が減弱することを見いだした。2以前使用していたレンチウイルスベクターでは、セロトニン神経終末までの十分な遺伝子発現が見られないことを確認した。

そのため、より高い遺伝子発現が可能と考えられるアデノ随伴ウイルスベクターを新たに作製し、TPH2プロモーター領域の最適化を行っているところである。さらに、最近効率的な逆行性アデノ随伴ウイルスベクターが報告されたため、これを用いてセロトニン神経特異的な逆行性ウイルスベクターの作製を試みた。神経細胞に対して非特異的に遺伝子発現が可能なhSynプロモーターを用い、逆行性感染が可能であることを確認した。現在、セロトニン神経特異的な逆行性アデノ随伴ウイルスベクターを作製しているところである。また、Tph2-tTAマウスを導入し、tetO-GOIレンチウイルスベクターを投与することによるセロトニン神経特異的かつ十分な遺伝子発現を目指した。このtTA-tetOシステムの使用により、セロトニン神経特異的かつ神経終末での十分な遺伝子発現が確認できた。以降、これを用いて各種行動実験を行う予定である。3セロトニン神経終末を特異的に刺激することで、抗うつ様作用の発現が見られるか検討した。まず、Tph2-tTA::tetO-ChR2マウスの側坐核へ光ファイバーを埋め込み、光照射しながら尾懸垂試験を行った。しかし、対照群と比べ、有意な差は見られなかった。今後、他の神経核においても同様の検討を行う予定である。以前開発したセロトニン神経特異的ウイルスベクターでは神経終末において十分な発現量が得られないことが分かった。そこで、Tph2-tTAマウスを導入し、tetOの下流で遺伝子発現が可能なレンチウイルスベクターと組み合わせ、tTA-tetOシステムを用いることで、遺伝子発現量の上昇が見られた。さらに、最近報告された効率の良い逆行性アデノ随伴ウイルスベクターを導入し、hSynプロモーター下で遺伝子を発現するウイルスベクターを作製・投与することで、マウスにおいて多数の逆行性感染細胞が見られることを確認している。今後はセロトニン神経特異的プロモーターの下流に載せ替えたウイルスベクターを作製することで、セロトニン神経特異的な逆行性ウイルスベクターが作製できることが期待される。これらを利用することにより、セロトニン神経の投射先でも十分なChR2の発現が見られ、セロトニン神経単一回路選択的な刺激が可能だと考えられる。また、現在うつ病の動物モデルにおいて、セロトニン遊離薬の投与により、うつ様行動の減弱が見られている。さらなる検討により、セロトニン神経の特異的な刺激がモデル動物でも抗うつ様作用が見られるのかが解明できると期待される。また、うつ様行動に関与する単一セロトニン神経回路の解明に関しては、現在側坐核が関与しないことを示唆するデータを得ている。今後、前頭前皮質や腹側被蓋野などにおける投射先選択的なセロトニン神経終末の刺激を行うことにより、どのセロトニン神経投射が重要であるのかが解明できると期待される。1昨年度において、慢性社会的挫折ストレスマウスにおける薬理学的検討から、慢性社会的挫折ストレスモデルマウスにおけるうつ様行動の発現を確認し、セロトニン遊離薬であるフェンフルラミン投与によるうつ様行動の減弱を見いだした。本年度は、この抗うつ作用がセロトニン遊離上昇によるものであるか確認するために、セロトニン枯渇薬であるpCPAを前投与した際のフェンフルラミンの効果について検討した。
古代日本語における形容詞述語文主語標示の形態論的研究

2017年度の研究状況を引き継ぎ、2018年度は主語名詞の文法的意味と形態的差異の関係性について検討をすすめるとともに、主語名詞の文法的意味により分類を作成し、これに基づいて名詞と質的形容詞のむすびつきのつくる意味的関係性のタイプによる分類の作成および名詞と質的形容詞のつくる意味的関係性と名詞の形態的差異について検討をおこなう計画をたてていた。しかし、本研究の中心的な課題である名詞語形態の機能と諸形態の関係性について分析するにあたり、「ハダカ格」も含めた諸格標示形態の位置づけや理論的な立場について問われ、これまで先行研究でとりあげられてきた諸知見のなかで本研究でとりあげる格標示機能について整理しなおす必要が生じた。このため、当初の予定を変更し、「ハダカ格」も含めた格標示形態としての名詞の諸語形態の捉えかたについての学誌的な研究を記述的研究に優先させることとし、論文(「言語分析における『ゼロ記号』の意義をめぐってー格標示機能に焦点をあててー」『歴史言語学』第7号、pp.17-33、2018年)にまとめた。このことにより、本研究の理論的な輪郭が明らかになり、記述的研究の意義や課題についてもより一層、明確なものとなった。拙著『平安期日本語の主体表現と客体表現について』(2014)に対して複数の書評をいただいたことを受け、本研究においても中心的な課題となる「ハダカ格」も含めた格標示形態としての名詞の諸語形態の捉えかたについて、先行諸研究との関係性を整理し、理論的な立場を示す必要が生じたため。作業の遅れている形容詞述語と意味的関係をもつ名詞諸語形の意味・機能についての記述的研究を重点的におこなう予定である。それとともに、格標示形態としての名詞の諸語形についての理論的な研究も継続しておこなう。本研究は、古代日本語においてもっとも主要な主語の形態である助辞をともなわない名詞の格(名詞-φ)の用法を中心に据え、助辞付与を伴う名詞の格(名詞-ノ、名詞-ガなど)の用法と対照し、古代日本語の形容詞述語文の主語名詞の機能を体系的に捉えることを目的としている。「研究実施計画」では、初年度(平成28年度)は1)テキストを用いて研究対象を抽出し、記述し、そのデータ化をおこない、2)関連する先行研究の調査、収集、精読を進め、本研究との関係性について整理をおこなう予定であったが、本研究の土台となる古代語の動詞述語の主語標示に関する研究をまとめた拙著(2014)『平安期日本語における主体表現と客体表現』(ひつじ書房)が書評(近藤泰弘2015「高山道代著「平安期日本語の主体表現と客体表現』」『日本語の研究』11-4)にとりあげられたことを受け、書評でとりあげられた古代日本語の名詞の格に関する他の類型学的研究との関係性について整理し、論文としてまとめた(高山道代2017「書評(近藤泰弘2015)に答えるー言語類型に関する研究の参照についての問題を中心にー」宇都宮大学国際学部研究論集第43号、43-62頁)。本研究をおこなう上で、書評に答え、他の類型学的研究との関係性の整理をすることは重要であると判断し、2)を先行させるかたちで研究を進めた。その結果、平成28年度の研究計画において予定していた研究環境の整備、研究対象の記述・分析およびデータ化は平成29年度の研究課題として持ちこされることになった。本研究をおこなう上で、書評に答え、他の類型学的研究との関係性の整理をすることは重要であると判断し、関連する先行研究と本研究との関係性についての整理(上記「研究実績の概要」における2)の一部にあたる)を先行させるかたちで研究を進めた。本研究の目的は、古代日本語においてもっとも主要な主語の形態である、助辞をともなわない名詞の格(名詞-φ)の用法を中心に据え、助辞を付与する名詞の格(名詞-ガ、名詞-ノなど)の用法と対照し、古代日本語における形容詞述語文の主語名詞の機能を体系的に捉えることにある。平成29年度はデータ化した資料に基づいて分類を作成し、名詞と質的形容詞のつくる意味的関係と名詞の形態的差異についての分析をおこなう予定であったが、当初の予定よりも紙面テキストを用いた分析に時間がかかり、現在も紙面での分析およびデータ化を継続して進めている。今後の研究の基礎となる重要な作業であるため、可能な範囲で今後も時間をかけておこないたい。また、分析作業と並行して、本研究の主要課題となる古代日本語における名詞-φの機能を明らかにするにあたって、名詞-φの学説史におけるあつかいに関して調査をおこなっている。本研究における名詞-φの位置づけと学説史における位置づけを対照し、整理することは、本研究の目的とも深くかかわっており、重要である。平成30年度は紙面での調査を継続しながらデータ化の作業を進め、より広範囲のデータを蓄積しながら、昨年度から取り組んでいる分析も進め、さらに、主語名詞の機能についての分析に取り組めるよう努める。また、名詞-φをめぐる学説史研究についても、平成29年度までにおこなってきた整理をもとにさらに発展させたいと考えている。研究計画を作成した当初の予定よりも紙面テキストを用いた分析に時間がかかっており、その後の作業に遅れをきたしている。

2017年度の研究状況を引き継ぎ、2018年度は主語名詞の文法的意味と形態的差異の関係性について検討をすすめるとともに、主語名詞の文法的意味により分類を作成し、これに基づいて名詞と質的形容詞のむすびつきのつくる意味的関係性のタイプによる分類の作成および名詞と質的形容詞のつくる意味的関係性と名詞の形態的差異について検討をおこなう計画をたてていた。しかし、本研究の中心的な課題である名詞語形態の機能と諸形態の関係性について分析するにあたり、「ハダカ格」も含めた諸格標示形態の位置づけや理論的な立場について問われ、これまで先行研究でとりあげられてきた諸知見のなかで本研究でとりあげる格標示機能について整理しなおす必要が生じた。このため、当初の予定を変更し、「ハダカ格」も含めた格標示形態としての名詞の諸語形態の捉えかたについての学誌的な研究を記述的研究に優先させることとし、論文(「言語分析における『ゼロ記号』の意義をめぐってー格標示機能に焦点をあててー」『歴史言語学』第7号、pp.17-33、2018年)にまとめた。このことにより、本研究の理論的な輪郭が明らかになり、記述的研究の意義や課題についてもより一層、明確なものとなった。拙著『平安期日本語の主体表現と客体表現について』(2014)に対して複数の書評をいただいたことを受け、本研究においても中心的な課題となる「ハダカ格」も含めた格標示形態としての名詞の諸語形態の捉えかたについて、先行諸研究との関係性を整理し、理論的な立場を示す必要が生じたため。上記のような理由から、研究実施計画上は遅れが生じたことになるため、平成29度から「研究実施計画」に沿って平成28年度研究課題である研究環境の整備、研究対象の記述・分析およびデータ化に取り組むとともに、二次資料の調査、分析、整理も並行して進める予定である。紙面テキストを用いての分析は本研究全体の基礎となる重要な作業であるため、時間的な遅滞は生じるが、時間をかけておこないたい。また、学説史研究についても本研究と深くかかわっており、重要であるため、分析作業と平行して進めていきたい。作業の遅れている形容詞述語と意味的関係をもつ名詞諸語形の意味・機能についての記述的研究を重点的におこなう予定である。それとともに、格標示形態としての名詞の諸語形についての理論的な研究も継続しておこなう。「研究実績」において示したように、研究上の必要から、平成28年度は他の類型学的研究との関係性の整理を先行させておこなったため、研究をはじめるにあたっての環境整備をはじめとした初年度研究予定の大半が平成29年度研究課題として持ち越されたたことによる。当初の予定よりも紙面テキストを用いた分析とデータに時間がかかっていることなどから、支出の面でも遅れが生じている。また、データ入力の依頼にあたり、適切な人材がみつからず、人件費が使用できていないことも大きな要因となっている。次年度は、調査、発表のための出張を予定しているほか、適切な人材を見つけ、データ入力の依頼がおこなえるよう努める。当初、研究補佐員による作業補助を予定していたが、適任者が見つからず研究代表者が一人で作業を進めなければならない状況となっており、人件費の支出がないことによる。また、研究進度の遅れや研究計画の変更から、資料および情報収集等の出張の機会が減ったことによる。今年度も代表者本人が作業をおこなう予定であるが、常時研究補佐員の募集をかけ、適任者が見つかりしだい、補佐員の採用をおこないたい。
多環芳香族パネルを有する動的ケージの構築とその高次フラーレンの選択的分離

本研究では、多環芳香族パネルを有する動的ケージを新規に構築するとともに、その機能の開拓を行う。まず、配位結合やパイスタッキング相互作用、動的共有結合などを利用して、新規な動的ケージの構築に挑戦する。例えば、湾曲型の多環芳香族パネルにホルミル基を導入した前駆体を合成し、それとアミノ基を持つ架橋分子との脱水縮合で、狙いとする動的ケージを構築する。また、種々の多環芳香族パネルを含む分子パーツの自己組織化で、空間性質の異なる分子ケージも構築する。次に、得られた動的分子ケージを使って、特異な分子内包機能を開拓する。特に、難溶性で分離が困難な高次フラーレンの選択的な内包に挑戦する。さらに、水中で機能する外部刺激応答性の分子ケージやカプセルの開発にも挑戦する。本年度は、パイスタッキング相互作用を利用して、新規な光応答性分子カプセルの開発した。2つのアントラセン環の連結位置をメタ位からオルト位に変更したV型の両親媒性分子を新規に合成し、それらが水中で自己組織化して分子カプセルを生成することを明らかにした。その構造はNMRやMS, DLS, AFM, UV-vis分析によって決定した。光照射により分子内で2つのアントラセン環が定量的に閉環反応し、パイスタッキング相互作用が阻害されることで、カプセル構造を解離させることに成功した。また、加熱により2つのアントラセン環が定量的に開環反応し、再び自己組織化して分子カプセルを生成した。さらに、水中でのゲスト分子(フラーレンやフタロシアニンなど)の内包とその光刺激による放出にも成功した。光刺激に応答する動的な分子カプセルの開発を達成した。本年度は、パイスタッキング相互作用を利用して、新規な光応答性分子カプセルの構築を達成した。これまでに、吉沢グループで開発したV型の両親媒性分子に対して、その連結位置をメタ位からオルト位に変更した。オルト型の両親媒性分子も水中で自己組織化して分子カプセルを生成した。また、光照射により閉環反応を起こし、カプセル構造を解離させることに成功した。さらに、ゲスト分子(フラーレンなど)の内包とその光刺激による放出にも成功した。本成果は、Cattiを第一著者としてNature Communications誌(Nature姉妹誌)に論文投稿して、論文受理されている。以上のことから、本研究は当初の計画以上に進展している。次年度は、外部刺激に応答する新規な動的ケージやカプセルの構築と機能開拓を検討する。具体的には、湾曲型の多環芳香族パネルに高親水性のイオン性官能基や金属配位性のピリジル基などを導入することで、新たな分子パーツを合成する。それらを水中でパイスタッキング相互作用や配位結合を駆動力に自己組織化することで、新たな動的ケージやカプセルを構築する。その三次元構造を核磁気共鳴装置や質量分析装置などで解明する。また、分光学的性質や電気化学的性質を調査する。本年度は、動的共有結合などを利用して、新規な動的ケージの合成を検討した。具体的には、吉沢グループで開発した湾曲型の多環芳香族パネルに2つのホルミル基を導入した前駆体を合成した。それとアミノ基を持つ架橋分子との脱水縮合で、狙いとする動的ケージを構築を検討した。生成物の構造は、核磁気共鳴装置や質量分析装置で調査した。また、湾曲型の多環芳香族パネルを含む種々の分子パーツを合成し、それらの自己組織化で、空間性質の異なる分子ケージも構築も検討した。これまでに、吉沢グループで開発した湾曲型の多環芳香族パネルに2つのホルミル基を導入した前駆体の合成を達成した。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。

特に、難溶性で分離が困難な高次フラーレンの選択的な内包に挑戦する。さらに、水中で機能する外部刺激応答性の分子ケージやカプセルの開発にも挑戦する。本年度は、パイスタッキング相互作用を利用して、新規な光応答性分子カプセルの開発した。2つのアントラセン環の連結位置をメタ位からオルト位に変更したV型の両親媒性分子を新規に合成し、それらが水中で自己組織化して分子カプセルを生成することを明らかにした。その構造はNMRやMS, DLS, AFM, UV-vis分析によって決定した。光照射により分子内で2つのアントラセン環が定量的に閉環反応し、パイスタッキング相互作用が阻害されることで、カプセル構造を解離させることに成功した。また、加熱により2つのアントラセン環が定量的に開環反応し、再び自己組織化して分子カプセルを生成した。さらに、水中でのゲスト分子(フラーレンやフタロシアニンなど)の内包とその光刺激による放出にも成功した。光刺激に応答する動的な分子カプセルの開発を達成した。本年度は、パイスタッキング相互作用を利用して、新規な光応答性分子カプセルの構築を達成した。これまでに、吉沢グループで開発したV型の両親媒性分子に対して、その連結位置をメタ位からオルト位に変更した。オルト型の両親媒性分子も水中で自己組織化して分子カプセルを生成した。また、光照射により閉環反応を起こし、カプセル構造を解離させることに成功した。さらに、ゲスト分子(フラーレンなど)の内包とその光刺激による放出にも成功した。本成果は、Cattiを第一著者としてNature Communications誌(Nature姉妹誌)に論文投稿して、論文受理されている。以上のことから、本研究は当初の計画以上に進展している。次年度は、得られた動的分子ケージを使って、特異な分子内包能を開拓する。例えば、難溶性で分離が困難な高次フラーレンや金属内包フラーレンの選択的な内包に挑戦する。内包体の詳細な構造は、核磁気共鳴装置や質量分析装置、紫外可視吸収スペクトルで明らかにする。分子ケージ内のフラーレンは、非共有結合で内包されているため、分離後の回収が簡便に行える。また、分子ケージの再利用も期待できる。選択的かつ効率的なフラーレンの分離を目指す。さらに、関連する他の分子カプセルも構築し、その機能を解明する。次年度は、外部刺激に応答する新規な動的ケージやカプセルの構築と機能開拓を検討する。具体的には、湾曲型の多環芳香族パネルに高親水性のイオン性官能基や金属配位性のピリジル基などを導入することで、新たな分子パーツを合成する。それらを水中でパイスタッキング相互作用や配位結合を駆動力に自己組織化することで、新たな動的ケージやカプセルを構築する。その三次元構造を核磁気共鳴装置や質量分析装置などで解明する。また、分光学的性質や電気化学的性質を調査する。
歯周組織におけるオステオアクチビンの作用機序の解明

歯科矯正で歯を動かす場合、歯が動く方向の圧迫側では歯槽骨が吸収し、牽引側では歯槽骨において骨の増加が生じるが、骨の増加のメカニズムは不明である。我々は牽引側での骨形成の促進にオステオアクチビン(OA)が関与しているのではないかと考え、OAの牽引側での発現や活性化について調べた。その結果、歯根膜線維芽細胞が牽引されることにより細胞表面のOAが切断され骨芽細胞に作用する可能性が示唆された。オステオアクチビン(OA)は骨硬化症のモデルラットよりその原因遺伝子として分離同定された分子であり、当初は骨芽細胞の骨形成を促進する分子であると考えられていたが、近年、ガン細胞や線維芽細胞にもOAの発現が報告されている。我々も以前の研究で、歯根膜線維芽細胞(PDL)にもOAが発現していることを見いだした。本年度の研究ではin vivoではラットの臼歯を実験的に歯牙移動させOAの局在を調べた。その結果、OAはPDLのみならず牽引側に存在する骨芽細胞および圧迫側に存在する破骨細胞にも局在が確認された。PDL細胞については免疫陽性反応を示すものの、圧迫側、牽引側でのOA免疫染色の染色性の違いは認められなかった。in vitroでは、ヒトPDL細胞を用い、伸展刺激を加えた時のOAの発現をRT-PCRおよび免疫染色にて調べた。伸展刺激を加えたPDLは刺激を加えない対照群に比べ、RT-PCRではOAの発現に変化がなかったものの、免疫染色ではOA免疫陽性細胞が減少していた。これらの結果より、PDL細胞に伸展刺激を加えると、OAの発現の変化はないものの、細胞外ドメインの切断(シェディング)が起こり、細胞ドメインが遊離したためにOA免疫陽性細胞が減少したものと考えられた。この伸展刺激により遊離したOAが歯槽骨の骨芽細胞まで到達し、歯牙移動時には牽引側での骨形成の促進に関わっている事が予想されたので、現在は、培養PDL細胞に伸展刺激を加えたときの細胞外ドメインの遊離をELISAで調べると共に、その伸展刺激を加えた時の培養液を使い、骨形成が促進されるかどうかを検索中である。本年度の研究ではin vitroでヒト歯根膜線維芽細胞に伸展力を加えて行った。実験には矯正治療の為に便宜抜去した健全な歯の歯根膜より分離したヒト歯根膜線維芽細胞を用いた。伸展力を加えるためにまず、専用のストレッチチャンバーにフィブロネクチンをコートして各チャンバーに10万個ずつ播種しコンフルエントに近い状態まで培養した。その後、ストレッチチャンバーを細胞伸展装置STB-140に装着し1分間に3回15%の伸展を繰り返し24時間繰り返しする場合と、3時間かけて15%伸展しそのまま24時間維持する群とを行った。細胞伸展了後、細胞のタンパクとmRNAを回収し、OAのタンパク発現をウエスタンブロット法で、遺伝子発現をRT-PCR法で調べた。その結果、細胞伸展群と非伸展群はいずれもOA発現が認められたが、有意な差は認められなかった。前年度のOAの組織像でも考えられたことであるが、細胞伸展ではOAそのものの発現よりもOAの細胞外ドメインを切断するADAM10の発現に細胞伸展が影響する可能性があるので、次年度では、培養上清のOA量の測定をELISA法で調べ、同時に細胞伸展時のADAM10の発現を調べる計画である。オステオアクチビン(OA)は、骨硬化症ラットにおいて初めに骨形成性因子として同定され、骨芽細胞分化において重要な役割を担う。OAは、膜貫通型タンパクであり、細胞内・外ドメインを持ち、細胞外ドメインのシェディングにより活性化される。歯を矯正力によって移動させた場合、移動後方の伸展側には歯槽骨に骨添加が生じる。この骨添加に歯根膜細胞のOAの役割を解明するため、歯周組織におけるOAの分布と、伸展刺激を加えたヒト歯根膜線維芽細胞におけるその発現と放出について調べた。in vivoの実験では、ラット臼歯間にゴムを挟み4日間負荷を与え歯を移動させ、深麻酔下で還流固定し上顎骨を摘出した。凍結切片を作製し、歯周組織におけるOAの分布を免疫染色にて調べた。in vitroでは、伸展刺激を24時間ヒト歯根膜線維芽細胞に与えた(伸展群、4%伸展率、5回/分)。歯根膜線維芽細胞におけるOA発現は、RT-PCR法で調べた。OA細胞外ドメインのメディウム中への放出は、ELISA法にて検出した。ラット歯周組織では、OA免疫陽性骨芽細胞および歯根膜線維芽細胞が伸展側で観察された。

In vitroにおいて、OAmRNAは歯根膜線維芽細胞で発現しており、伸展刺激ではその発現量は増加しなかった。伸展群におけるメディウム中のOA量は、コントロール群の平均1.66μMから、平均3.05μMへと増加した(n = 20)(p<0.05)。OAは骨芽細胞および歯根膜線維芽細胞に分布していた。我々の結果から、伸展刺激は歯根膜線維芽細胞からOA細胞外ドメインの放出を増加させ、矯正的歯の移動時における歯周組織の伸展側の骨形成を刺激していることが示唆された。当初の計画ではヒト歯根膜線維芽細胞に伸展力を加え、オステオアクチビンの発現変化とオステオアクチビンの細胞外ドメインの切断に関与する金属プロテアーゼADAM10の発現を調べる予定であったが、当初予定になかった機械的伸展装置が使えることになり、その伸展装置を使っての実験で至適伸展量を探すのに時間がかかってしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、上記伸展装置を使った伸展方法が確立したので、当初の予定どおりヒト歯根膜線維芽細胞に伸展力を加えた時のオステオアクチビンの発現、オステオアクチビンの細胞外ドメインの分離に関与する金属プロテアーゼADAM10の発現について調べていく予定である。