hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトウェアプロセス品質改善のためのプロセス診断方式と信頼性評価技術に関する研究

本研究では,ソフトウェア開発プロセスの品質が最終的にプロダクトの品質を左右するという認識から,開発技法・ツール,開発技術者,開発組織,プラットフォームなどのプロセス構成要素の属性を考慮して,これらの総合属性に対する品質すなわちプロセス品質を改善するためのプロセス診断方式と,これに対する品質/信頼性評価技術について議論した.ここで,プロセス構成要素の属性としては,開発技法・ツールの使用頻度,開発技術者の能力・経験,開発組織の技術力,プラットフォームの安定性等が考えられ,これらを改善することによりプロセス品質は向上することになる.本研究では,開発プロセスの人的要因が特に影響している寄与度が高いものと考えて,下記の3点に焦点を絞り研究を進めた.(1)プロセスを構成する開発技術者の特性を人的要因として,プロセスの結果である設計仕様書やソースコードなどの中間生産物および最終のソフトウェア製品の品質/信頼性との関係を,ソフトウェア開発実験として設計レビュー実験を実施した上で品質工学的アプローチを適用し定量化した.(2)プロセス診断方式の開発のために,上記の構成要素から成るプロセスの成熟度が高い,つまりプロセスの能力が高いほど,高品質プロダクトを生産できるという考え方に立脚するW.S.Humphreyのプロセス能力成熟度モデル(CMM ; Capability Maturity Model)と,プロセスの不安定要因に起因するリスクの管理すなわちプロジェクトの失敗を回避するリスクマネジメントを併用したプロセス評価法を提案した.(3)上記(1)および(2)を踏まえて,開発プロセスの上流工程と下流工程の品質/信頼性を関係づけるソフトウェア信頼性評価法と,それに必要なプロジェクトデータ,すなわちプロセス構成要素の属性データと各プロセスのレビュー作業とテストにより検出されるフォールトデータの収集も行った.また同時に,最近のソフトウェア開発形態,例えば分散ソフトウェア開発やオープンソースプロジェクトに基づく開発,等を反映したソフトウェア信頼性評価法も提案した.以上により,プロセス品質改善の手順を,「プロセス品質定義」→「プロセス診断準備」→「プロセス品質測定とプロセス診断」→「プロセス品質とプロダクト品質/信頼性の評価」→「プロセス品質改善」のステップで進めることが可能となった.本研究では,ソフトウェア開発プロセスの品質が最終的にプロダクトの品質を左右するという認識から,開発技法・ツール,開発技術者,開発組織,プラットフォームなどのプロセス構成要素の属性を考慮して,これらの総合属性に対する品質すなわちプロセス品質を改善するためのプロセス診断方式と,これに対する品質/信頼性評価技術について議論した.ここで,プロセス構成要素の属性としては,開発技法・ツールの使用頻度,開発技術者の能力・経験,開発組織の技術力,プラットフォームの安定性等が考えられ,これらを改善することによりプロセス品質は向上することになる.本研究では,開発プロセスの人的要因が特に影響している寄与度が高いものと考えて,下記の3点に焦点を絞り研究を進めた.(1)プロセスを構成する開発技術者の特性を人的要因として,プロセスの結果である設計仕様書やソースコードなどの中間生産物および最終のソフトウェア製品の品質/信頼性との関係を,ソフトウェア開発実験として設計レビュー実験を実施した上で品質工学的アプローチを適用し定量化した.(2)プロセス診断方式の開発のために,上記の構成要素から成るプロセスの成熟度が高い,つまりプロセスの能力が高いほど,高品質プロダクトを生産できるという考え方に立脚するW.S.Humphreyのプロセス能力成熟度モデル(CMM ; Capability Maturity Model)と,プロセスの不安定要因に起因するリスクの管理すなわちプロジェクトの失敗を回避するリスクマネジメントを併用したプロセス評価法を提案した.(3)上記(1)および(2)を踏まえて,開発プロセスの上流工程と下流工程の品質/信頼性を関係づけるソフトウェア信頼性評価法と,それに必要なプロジェクトデータ,すなわちプロセス構成要素の属性データと各プロセスのレビュー作業とテストにより検出されるフォールトデータの収集も行った.また同時に,最近のソフトウェア開発形態,例えば分散ソフトウェア開発やオープンソースプロジェクトに基づく開発,等を反映したソフトウェア信頼性評価法も提案した.以上により,プロセス品質改善の手順を,「プロセス品質定義」→「プロセス診断準備」→「プロセス品質測定とプロセス診断」→「プロセス品質とプロダクト品質/信頼性の評価」→「プロセス品質改善」のステップで進めることが可能となった.ソフトウェア開発プロセスの品質が最終的にプロダクトの品質を左右するという認識から,プロセス構成要素の属性を考慮して,プロセス品質を改善するためのプロセス診断方式と,これらに対する品質/信頼性評価技術について議論した.以下は平成15年度の研究成果であり,所期の目的を達成した.(1)ユーザの要求品質を達成・確保するために,プロセスとプロダクトの品質を可視化して,費用と納期の協調を図る品質主導型プロジェクト管理方式について,既存の研究について調査し,その中でもEVM(Earned Value Management)を実際のプロジェクトに適用した.その結果,CMM(Capability Maturity Model)に基づいてEVMを適用することが極めて有効であることが分かった.(2)上記(1)と並行してソフトウェア開発プロセスの主要な構成要素である開発技術者の特性(人的要因)と,プロセスの結果である設計仕様書やソースコードなどの中間生産物の品質との関係を定量的に明らかにする人的要因モデルを構築し,それを検証するために学生を対象としたソフトウェア開発実験に基づく直交実験計画を策定した.

さらに,品質工学的アプローチを適用した結果,人的要因から見た設計レビュー工程に対するプロセスの最適条件を導出できた.(3)(2)で抽出された人的要因等を考慮したソフトウェア信頼性評価モデルとして,分散ソフトウェア開発環境下におけるテスト工程を対象とした確率微分方程式モデル,不完全デバッグ環境を考慮した信頼性/可用性/安全性評価モデル,離散化による高精度信頼性予測法について提案できた.(4)(3)のソフトウェア信頼性評価モデルによる信頼性データ解析手順を,オブジェクト指向設計法に基づいてツール化した.特に,分散開発環境下における信頼性評価ツールについては,プロトタイプを作成できた.プロダクトとしてのソフトウェア最終製品の品質は,その開発プロセスで作り込まれるという認識から,プロセス品質向上のためにプロセス構成要素の属性を考慮して,プロセス品質を改善するためのプロセス診断方式と,これらに対する品質/信頼性評価技術について議論した.以下は平成16年度の研究成果であり,所期の目的を達成した.(1)品質主導型プロジェクトマネジメント方式の確立のために,プロジェクトリスクを評価し管理するリスクマネジメント,コストとスケジュールを関連づけて計測するEVM(earned value management),およびレビューによるプロダクト品質保証等のプロセス計測データを用いて,プロセス構成要素の属性間およびこれらと最終プロダクト品質との相関分析を実施した.これらの結果から,ソフトウェア開発早期の段階でプロダクト品質を定量的に予測する品質予測モデルを導出した.(2)開発プロセスの上流工程と下流工程の品質/信頼性を関係づけるために,前年度に議論した人的要因モデルを拡張してソフトウェア開発実験を行い,品質工学的アプローチにより人的要因から見た設計レビュー工程に対するプロセスの最適条件を導出した.(3)上記(2)で抽出された人的要因等を考慮したソフトウェア信頼性評価法として,分散ソフトウェア開発環境下における統合テスト工程および総合テスト工程を対象とした確率微分方程式モデル,テスト網羅性を考慮したソフトウェア信頼度成長モデル,不完全デバッグ環境を考慮した信頼性/可用性/安全性評価モデル,オープンソース共同開発環境におけるソフトウェア信頼性モデル等について提案できた.(4)(3)で提案したソフトウェア信頼性評価結果に基づいて,製品を出荷するのに最適な時期を見積る最適リリース問題を議論できた.また,前年度のツールを拡張し,オブジェクト指向設計法に基づいて,分散開発環境下における信頼性評価ツールを作成できた.ソフトウェア開発のプロセス品質が最終的にプロダクト品質を左右するという立場から,開発技法・ツール,開発技術者と開発組織,プラットフォームなどのプロセス構成要素の属性を考慮して,これらの総合属性に対する品質すなわちプロセス品質を改善するためのプロセス診断方式と,これらに対する品質/信頼性評価技術について議論した.以下は平成17年度の研究成果であり,所期の目的を達成できた.
有限群のコホモロジー論

有限群の表現論においてブロック・イデアルの理論は最も基本的で主要な研究対象である。本研究はコホモロジー理論を用いてブロック・イデアルを考察しようとするものである。しかし、ホモロジー代数の手法が通用せず、目下のところはブロック・イデアルのソース多元環を詳細に調べる必要がある。本研究ではデフェクト群のコホモロジー環からの写像によってブロック・イデアルのコホモロジー環を記述しようとする。また、特性両側群集合も密接に関連する対象であり、これらの理論は、ブロック・イデアルのコホモロジー環の理論の土台部分を構成するものとなる。
オンライン「国際協力的」と「国際共同的」語学学習方法の比較

諸外国の大学などとオンラインコースをリンクさせて実践的言語利用の場を構築し、その利用を通じて学生の言語レベルや文化理解の向上に貢献した。「国際協力的」コミュニケーション及び「国際共同的」コミュニケーション活動の結果を分析して学生の語学学習や文化理解に対する両者の有効性を明らかにし、どちらの教育法がより効果的であるのかを明確にした。「国際協力的」コミュニケーション活動では、日本の英語学習者と米国・豪州の日本語学習者を対象とし、日本語と英語を使用した。「国際共同的」コミュニケーション活動では、南米のコロンビアや他のアジアの国の英語学習者と日本の英語学習者をその対象とし、使用言語は英語とした。平成25年7月、研究協力者である庄司教諭とPhuong准教授が調査研究のために来日し、我々は室蘭工業大学において研究会を実施した。研究会ではコース内容(シラバスやコンテンツ)の改善点についての検討、本研究参加者間のシラバス共通部分の交換、その内容の比較・点検を行い、教育法の統一について議論を重ねた。その結果を踏まえ、平成25年10月から平成26年1月まで「国際協力的」および「国際共同的」なオンライン学習を実施した。その間、学生に対してはMoodleのフォーラムとスカイプを利用させつつプロジェクトの推進や種々のテーマについての意見交換等がスムーズに進むよう様々な便宜を図った。全学生のフォーラム投稿文を分析した結果、それがMoodle上の国際語学学習並びに交流における学生の英語学習に対するモチベーション向上に役立ったことや実践的な英語を使用する場となったことが明らかとなった。こうした語学学習が達成すべき目標は複数存在するが、我々は先ず実際のコミュニケーション量の増加に着目した。Moodleをチェックすることでその量を調べることはある程度可能である。インターネットログや活用レポート、実際に利用している単語数を見ると、国際協力コース全体は国際共同コースと比べると国際協力コースの活用が多い。本学の学生に対するアンケート調査では、両コースとも学生からは好意的な反応が見られた。しかしその評価に安住することなく我々は微調整を続けていかなければならない。平成26年7月、本研究の代表者と庄司教諭、オンライン学習に詳しいヘネベリー教授(島根県立大学)、清水教授(富山高等専門学校)の4名が室蘭工業大学に集い、研究会を実施した(研究会実施直前及び直後の2回にわたり、代表者はコース内容やシラバス等、研究全般に関し、庄司教諭と意見交換・調整を行った)。また、上記研究会の実施と平行し、日本全国から参加した15名の教員を前に本研究に関する発表も行った。当初の予定とは異なり、ハノイ建築大学がベトナム政府からの要求もあって英語カリキュラムの変更を余儀なくされ、4週間の集中講義という形でしか参加できなくなった。その代わりに国際共同的オンライン語学学習で交流校として参加したのは、コロンビアSENA国立教育機関とマレーシア国立大学である。国際協力的オンライン語学学習は計画通りに庄司教諭と平成26年10月から翌年の1月まで「国際共同的」と「国際協力的」オンライン学習を実施することとした。参加校の教員と学生たちの協力を得、教育管理システム「ムードル」に関するプロジェクトを実施したが、その結果明らかとなったのは、実践的に学習している言語を利用し意見交換を行うことは可能であるということであった。そこから得られたデータが示しているのは、国際共同的学習方法と比較した場合の国際協力的な学習方法の優位性である。しかしながら、オンライン学習実施後のアンケートを見ると、両学習方法に対する学生たちの評価は非常にポジティブなものであった。現在では、学内・学外を問わず多くの教員がこの学習方法に大きな関心を示すようになり、その発展に向けた活動に取り組み始めている。代表者は今回の結果に関して数編の論文を作成するとともに、韓国においては基調プレゼンテーションを行い、米国のACTFL学会においても発表を行った。オーストラリアの大学と米国の高校での日本語学習者と、日本の高等教育機関での英語学習者間における、日英二重言語によるオンライン語学学習交流(Dual Language Virtual Exchange DLVE)と室蘭工業大学と他の国内大学の学生とコロンビアやベトナムの学生の英語のみによるオンライン語学学習交流(Single Language Virtual Exchange SLVE)システムを実施し、このようなDLVEとSLVE(両方使うとVE)方法が、学習言語使用の量と質、学習動機、他文化理解を高めることを確認しました。国や個々の教育機関では、学習者が達成すべき特定の目標を提示している。米国におけるナショナル・スタンダード、及び、21世紀教育基準は、オーストラリアや日本の基準と多くの点で類似している。これらの国家的基準と個々の教育機関の目標、特にグローバルな視点を持つ学習者を育成する必要性に基づき、当システムを開発した。VEの目的は学習者に目標言語を使う場を与えること、そして、日本、米国、オーストラリア、ベトナム、コロンビアの文化比較やディスカッションをしながら互いの文化についての理解を深め、語学力向上を促していくことである。しかし、VEに潜在する可能性は知識、言語能力の発展にとどまらない。文化に関する交流課題を選ぶことによって、異文化理解の知識を深めると同時に、目標言語でのコミュニケーション能力に対する学習者の自信の向上につながった。更に、この交流は、ネイティブスピーカーとノンネイティブスピーカーの内容のあるコミュニケーションの機会を最大限に活用する機会を与えるだけではなく、それぞれが属するコミュニティの社会的な一員としての生活技能すなわちライフスキルの向上にも大きく貢献していると考えられる。

「国際協力的」コミュニケーション及び「国際共同的」コミュニケーション活動の結果を分析して学生の語学学習や文化理解に対する両者の有効性を明らかにし、どちらの教育法がより効果的であるのかを明確にした。「国際協力的」コミュニケーション活動では、日本の英語学習者と米国・豪州の日本語学習者を対象とし、日本語と英語を使用した。「国際共同的」コミュニケーション活動では、南米のコロンビアや他のアジアの国の英語学習者と日本の英語学習者をその対象とし、使用言語は英語とした。基本的に計画通り進展している。計画に記したようにベトナムの学校だけでなく、それ以外の国の学生とも国際共同的語学学習を実施した。今回は、コロンビアSENA国立教育機関とマレーシア国立大学がそれに加わっている。その交流結果も今後データとして活用する予定である。また、国際協力的語学学習プロジェクトにおいては、ウーロンゴン大学(オーストラリア、ニューサウスウェールズ州)や本学の姉妹校であるロイヤルメルボルン工科大学の日本語専攻学生との間でもオンライン交流を実施した。相手国の学生数が大きく増加したこともその背景にあるが、歓迎すべきことに本学の他の英語教員や他大学の教員と学生もこのプログラムに参加するようになっている。その結果もデータとして活用する予定である。以上のことから、次年度はこれまで以上の成果が期待できるものと考えている。語学教育平成27年度は、前年度に得られたデータと学生からのフィードバックを元に両学習方法に改善を加え、更なる発展を目指す。本学において、学生が1年時と3年時(オンライン交流参加後)に受験するTOEICのIPテストの結果を比較すれば、本プロジェクトの効果の有無は明確なものとなるはずである。当然のことながら、学生の「英語を学ぶ意欲」や「異文化間コミュニケーション能力」の変化に関する評価も欠かすことは出来ない(時間的余裕があれば、Byramメソッドを用いた学生の異文化間コミュニケーション能力に関する評価も行いたいと考えている)。その結果を分析することは、両学習方法の有効性を評価するために重要である。米国においては2013年、コミュニケーション・文化・コネクション・比較・コミュニティーという語学教育のための5つの学習目標を柱とするWorld-Readiness Standards for Learning Languagesが策定されている。オンライン言語交流を対象とする本研究も、その基準を満たすことを目標としている。また、TOEICテストの結果及び異文化間コミュニケーション能力、学生へのアンケート調査を分析すれば、両学習方法の有効性に対する総合的評価が可能となるであろう。その結果を踏まえ、将来のあるべきオンライン交流像を目指し、共同研究者たちと共に慎重に研究を進めて行く。
植物界におけるCAMP情報伝達機構の分子生物学的解析

植物の環境応答現象は、情報の受容と伝達・様々な遺伝子発現の制御・代謝調節などの複合した生命現象である。従来、原核生物には、外部シグナルに迅速に応答するcAMP-信号伝達系は存在しないと考えられてきた。我々はcAMPの合成酵素であるアデニル酸シクラーゼの遺伝子の単離を試み、形質転換型のラン藻のAnabaena PCC7120において5つの異なったアデニル酸シクラーゼ遺伝子を発見した。遺伝子の構造解析を行った結果、この酵素は動物に含まれるものと高い相同性を示すことが明らかとなった。また、この中にはバクテリアの二成分系信号伝達タンパク質と、その一次構造がよく似ているものがあった。そこで、大腸菌を用いて、このアデニル酸シクラーゼ遺伝子を大量発現させ、得られたタンパク質を用いて酵素分子の活性化機構の解析を行った結果、CyaCはまず、自己リン酸化し、そのリン酸基を分子内で転移すること、リン酸化によってアデニル酸シクラーゼ活性が高くなることが明らかとなった。さらに、Anabaena cylindricaに赤色光および近赤外光を照射し、細胞内のcAMP量を測定した結果、赤色光照射ではcAMPレベルが急激に減少し、近赤外光照射では逆に増加が見られ、このラン藻にはフィトクロムのようなタンパク質を光受容体とする光信号伝達系が存在することが示唆された。また、Synechocystis PCC6803のアデニル酸シクラーゼを破壊した細胞に青色光を照射し、細胞運動の様子を観察し、cAMPは細胞の運動を促進すること、Synochocystisでは青色光が細胞内cAMP濃度の増加を介して細胞の運動を促進すること等を明らかにした。本研究では、ラン藻Anabaena cylindricaからcAMP合成酵素であるアデニル酸シクラーゼ遺伝子を単離し、その全塩基配列を決定し、構造の解析を行った。決定した塩基配列より推定されるアミノ酸配列中には、既知のアデニル酸シクラーゼにおいてよく保存されている触媒領域のアミノ酸配列が見い出された。このアデニル酸シクラーゼは、膜貫通型であり原核・真核生物双方に存在するタイプのアデニル酸シクラーゼにおける保存領域のアミノ酸配列と相同性を示すことが明らかになった。糸状性ラン藻Spirulinaは、滑走運動をするラン藻としても古くから知られていた。最近我々はcAMPの刺激によってこのラン藻の運動性が増大し、その結果細胞の凝集が起こり、円盤状のマットを形成する現象を見い出した。S.platensisのアデニル酸シクラーゼ活性は、膜画分および細胞質画分の双方において検出されることが明らかにされており、このことから少なくとも2種類のアデニル酸シクラーゼが機能分担していることが示唆される。そこでスピルリナにおいてもアデニル酸シクラーゼの遺伝子の単離を試みた。その結果、真核生物において広く見いだされるタイプのアデニル酸シクラーゼ遺伝子が複数見いだされた。これらの遺伝子をそれぞれcyaA.cyaB、cyaCと命名した。CyaAは494アミノ酸残基からタンパク質である。アミノ酸配列についてホモロジー検索を行った結果、CyaAの推定細胞外領域がPseudomonas solanacearumのVsrA遺伝子の推定細胞外領域と相同性を示すことが明らかになった。CyaBは膜結合型のアデニル酸シクラーゼであることが示唆された。CyaCのアミノ酸配列を用いたホモロジー検索の結果、CyaCのアデニル酸シクラーゼ保存領域の上流に、タンパク質リン酸化反応を介した情報伝達機構として多種類の細菌においてよく知られているtwo-component制御系を構成する因子と相同性のある配列が見いだされた。本研究において、形質転換型のラン藻のAnabaena PCC7120において5つの異なったアデニル酸シクラーゼ遺伝子を発見した。

この中にはバクテリアの二成分系信号伝達タンパク質と、その一次構造がよく似ているものがあり、ラン藻のアデニル酸シクラーゼの活性調節がどのように行われているかについて新しい疑問が提示された。この遺伝子と同様の遺伝子はSpirulina platensisにおいても発見された。そこで、大腸菌を用いて、このアデニル酸シクラーゼ遺伝子を大量発現させ、得られたタンパク質を用いて酵素分子の活性化機構の解析を試みた。その結果、大腸菌での大量発現は、多くの場合、大腸菌の生育に阻害的な効果を示すこと、また発現されたタンパク質は、インクルージョンボディを形成することが明らかとなった。しかし大腸菌を大量に培養し、わずかに溶けているタンパク質を精製し、酵素活性を持つアデニル酸シクラーゼを得ることができた。酵素の生化学的性質を検討した結果、酵素分子の調節領域のリン酸化が酵素の活性化に必要であることを示唆するデータが得られた。一方、Synechocystis PCC 6803において、光合成独立栄養条件と光混合栄養条件における代謝制御の中心的なタンパク質の遺伝子を単離した。この遺伝子はグルタミン酸合成酵素の遺伝子であり、このタンパク質のアミノ酸を一つ変えることで、このラン藻の生育環境に対する応答現象が大きく変化することが明らかとなった。昨年に引き続き、糸状性ラン藻Spirulina platensisのアデニル酸シクラーゼの遺伝子でcyaCの解析を行った。cyaCはN末端側から応答レギュレータータンパク質、シグナルセンサータンパク質、応答レギュレータータンパク質、そしてアデニル酸シクラーゼの機能部位が順に並んだ構造をしていた。さらに、CyaCの機能を生化学的な手法で解析するために、cyaCをヒスチジンが6個並んだタグとの融合タンパク質(His-CyaC)として大腸菌を用いて発現させた。精製したHis-CyaCを用いた解析から、His-CyaCが自己リン酸化活性を持つことが明らかとなった。また、部位特異的に変異を導入したHis-CyaCを解析することによって、CyaCはまず、572番目のヒスチジン残基を自己リン酸化し、そのリン酸基を895番目のアスパラギン酸残基に転移すること、このアスパラギン酸残基のリン酸化によってアデニル酸シクラーゼ活性が高くなることが明らかとなった。また、別の種のラン藻であるAnabaena sp.strain PCC 7120のcyaCの破壊変異株の解析から、cyaCが細胞内cAMPレベルの維持に必須の遺伝子であること、また単色光照射によって起こる細胞内のcAMPレベルの変化に重要な働きをしていることを明らかにした。さらに、Anabaena cylindricaに赤色光および近赤外光を照射し、細胞内のcAMP量を測定した結果、赤色光照射ではcAMPレベルが急激に減少し、近赤外光照射では逆に増加が見られた。この変化は、光合成と直接的には関係していなかった。赤色光と近赤外光を同時に照射したところ、それぞれの光の効果が打ち消された。赤色光/近赤外光と連続的に照射したところ、cAMP量は可逆的に変化した。A.cylindricaにはフィトクロムのような光受容体とする光信号伝達系が存在することが示唆された。
思考と実践をつなげる実習前教育の構築　ーケースマップの活用ー

看護提供の場が多様化した現在の医療体制において、より患者の生活を視点に入れた看護が求められているが、看護学生は経験値の不足から患者の状態と経過による変化を把握することが困難である。実習での学びを深めるためには、実習前に学内において、既習の知識・技術をいつ、どの場面でどのように使うのか判断の助けとなる事前学習ツールを用いた学習支援が重要な課題である。本研究では、看護学生が思考と実践をつなげられる事前学習のためのツールとしてケースマップ法(以下CM法)を用い、実習前教育を充実させ、臨地実習において看護実践能力の向上を目指すことを目的とする。
電磁・電歪現象融合超音波センサによる革新的高温配管検査システムの開発

電磁誘導コイルと薄膜積層型圧電超音波素子を組み合わせて、電磁誘導コイル仕様最適化の結果、当初目標を上回る20cm遠方からの超音波探触子の駆動に成功した。次に400度までの高温実験を実施し、コイルのみを加熱した場合は検出感度に変化がないこと、圧電薄膜積層型超音波センサを同時に加熱した場合も感度低下は発生するが十分な受信信号強度が得られることを確認した。次に、試験パイプ周方向に等間隔で圧電振動子型超音波センサを添付して電磁誘導法によるガイド波の送受信に成功し、10mm径の貫通穴を検出することができた。本研究の基本アイデアを全て確認することができた。昨年度は薄膜積層型圧電超音波センサを駆動するための電磁誘導コイル最適化を実施し、最終的に本来の目的である圧電薄膜積層型超音波センサと組み合わせて10cm以上遠方から圧電薄膜積層型超音波センサの駆動が可能であるという実験結果を得た。次に400度までの高温実験を実施し、感度低下は発生するが十分な受信信号強度が得られることがわかった。今年度は、試験パイプ(パイプ周方向に等間隔で薄膜積層型圧電型超音波センサが成形)を用いて電磁誘導法によるガイド波の送受信を試みた。周方向に成形・添付された4つの薄膜積層型圧電型超音波センサを同時に安定して駆動する工夫が必要であったが、200kHZに中心帯域を持つパイプガイド波の送受信信号を確認することができた。受信信号のS/Nは疵検出には不十分であった。次にフレキシブル薄膜積層型圧電型超音波センサを試験パイプ周方向に添付することで同様な実験を試みた。その結果、パイプガイド波は検出できたが更に弱い受信信号であった。受信信号のS/Nが不十分である原因について検討した結果、薄膜積層型圧電型超音波センサ、フレキシブル薄膜積層型圧電型超音波センサ共に、中心駆動周波数が9MHzにあり、パイプガイド波として駆動するための周波数200kHzと不整合があることがわかった。薄膜積層型圧電型超音波センサの製作メーカと協議した結果、製作上の困難さは伴うものの200kHz中心帯域の薄膜積層型圧電型超音波センサの製作は可能であり、薄膜積層型圧電型超音波センサを用いたパイプガイド波送受信システムの実用化条件を明らかにすることができた。次に薄膜積層型圧電型超音波センサ添付型パイプを高温槽を用いて、200°Cまで加熱したが受信信号は検出することができた。今年度は、パイプガイド波の信号強度の向上と500°C程度までの高温実験を実施し、本手法の有効性を確認する。薄膜積層型圧電超音波センサを駆動するための電磁誘導コイル最適化を実施し、圧電薄膜積層型超音波センサと組み合わせて20cm以上遠方から圧電薄膜積層型超音波センサの駆動が可能であるという実験結果を得た。次に400度まで電磁誘導コイル及び薄膜積層型圧電超音波センサを加熱し、超音波センサとしての性能に対する影響を確認した。その結果、コイルのみを加熱した場合は検出感度に変化がないこと、圧電薄膜積層型超音波センサを同時に加熱した場合も感度低下は発生するが十分な受信信号強度が得られることを確認した。次に試験パイプを用いて電磁誘導法によるガイド波の送受信を試みた。周方向に成形・添付された4つの薄膜積層型圧電型超音波センサを同時に安定して駆動する工夫が必要であったが、200kHzに中心帯域を持つパイプガイド波の送受信信号を確認することができた。ただし受信信号のS/Nが不十分であるという結果になったが、その原因については、薄膜積層型圧電型超音波センサ、フレキシブル薄膜積層型圧電型超音波センサ共に、中心駆動周波数が9MHzにあり、パイプガイド波として駆動するための駆動周波数200kHzと不整合があることがわかった。最後に大きさの異なる複数の貫通穴をパイプに加工し、検出感度を確認した。その結果、10mm径までの貫通穴は充分なS/Nで信号を検出することができた。パイプで腐食が進み、貫通する直前には10mm程度相当の円形の大きさになっていることが多く、開発した検査システムが将来、構造物として用いられるパイプの検査に適用可能であることを確認できた。当初目標とした電磁誘導コイルと市販の圧電振動子型超音波探触子と圧電振動子を用いて、電磁誘導コイルの線径、巻き数、直径、材質等の仕様の最適化を実施した。

その結果平面状円形コイルを用い、直径を大きくしていくことで、遠方から駆動・検出できることを明らかにした。しかし、遠隔駆動時に受信信号波形が狭帯域化するという課題も発生し、その原因が電磁誘導コイルのインピーダンス上昇に起因することを明らかにした。そこで高温に耐えることができ、かつインピーダンス変動の小さい電磁誘導コイルの最適化を図り、電磁誘導コイルを形成する導線の径を0.5mm程度とし、円形のみならず螺旋状形状を採用することが有効であることを見いだした。最終的に当初目標(圧電振動子型超音波探触子と電磁誘導コイルの距離を10cm離して駆動する)を上回る20cm遠方からの超音波探触子の駆動に成功した。最適化された電磁誘導コイルを用い本来の目的である圧電薄膜積層型超音波センサと組み合わせた実験を行い、10cm以上遠方から圧電薄膜積層型超音波センサの駆動が可能であるというほぼ同等の実験結果を得た。次に400度までの高温実験を実施し、コイルのみを加熱した場合は検出感度に変化がないこと、圧電薄膜積層型超音波センサを同時に加熱した場合も感度低下は発生するが十分な受信信号強度が得られることがわかった。最後に肉厚測定実験を実施し、厚さ10mm100mmの範囲で十分な精度で肉厚の評価ができることを確認した。当初目標とした電磁誘導コイルと市販の圧電振動子型超音波探触子と圧電振動子を用いて、電磁誘導コイルの線径、巻き数、直径、材質等の仕様の最適化の結果、最終的に当初目標(圧電振動子型超音波探触子と電磁誘導コイルの距離を10cm離して駆動する)を上回る20cm遠方からの超音波探触子の駆動に成功した。次に400度までの高温実験を実施し、コイルのみを加熱した場合は検出感度に変化がないこと、圧電薄膜積層型超音波センサを同時に加熱した場合も感度低下は発生するが十分な受信信号強度が得られることを確認した。次に、目標とした、試験パイプ(パイプ周方向に等間隔で圧電振動子型超音波センサを添付)を用いて電磁誘導法によるガイド波の送受信に成功し、その疵検出性能を確認する段階に至っている。従って、予定通り進行していると判断できる。目標とした電磁誘導コイルを用い圧電薄膜積層型超音波センサと組み合わせて10cm以上遠方から圧電薄膜積層型超音波センサの駆動の目処を得ており、また400度までの高温でも本手法が適用可能であることも実証できた。本研究の基本的なセンサ駆動コンセプトは有効であることは確認できている。平成25年度は、まとめの年として、傷検出能について、発生させた複数の超音波モード毎に評価し、実用化の可能性を探る。今後、実用的な非破壊評価に役立てるため、センシングシステムの感度向上に努める。またより一層高温での性能評価を進める。また実用的な非破壊評価という観点から、肉厚測定のみならず傷検査を視野に入れる。その為、平成23年度予算で入手した、試験パイプ(パイプ周方向に等間隔で圧電振動子型超音波センサを添付)を用いて電磁誘導法によるガイド波の送受信を試みる。平成23年度終了時点で211,886円の研究費を繰り越したこともあり、研究が順調に進展したものの224,046円を残すこととなった。平成25年度は50万円を越える物品の購入計画はなく、超音波センサを改善するための電子部品や試験材料購入が主な使用用途となる。
骨破壊性疾患における非ヒストンタンパク質のメチル化修飾の意義

本研究ではタンパク質アルギニンメチル化酵素PRMT5の遺伝子欠損マウスを作成し、解析を実施した。その結果、全身で当該遺伝子を欠損するマウスは胎生期、極初期の発生段階が障害され、PRMT5が個体発生に必須の役割を果たすことを明らかにした。またPRMT5のヘテロノックアウトマウスにはその成長段階にともなって、顕著な腫瘍形成が見られ、生体内のPRMT5の量的制御が重要である可能性が示唆された。さらに、破骨細胞特異的にPRMT5を欠損するマウスは、骨組織には異常が見られず、同Type II PRMTファミリーに属するPRMT7が相補的な役割を果たしている可能性が示唆された。我々は破骨細胞の分化マスターレギュレーターとしてnuclear factor of activated T cellsc1(NEATc1)を同定してきた。しかし、破骨細胞分化に特異的な、他のNEATファミリーでは代替不能なNFATc1の役割を説明する制御機構は不明であった。本研究ではNFATc1の翻訳語修飾に着目しその制御機構を解明することを目的とする。我々は、まず予備研究として、翻訳後修飾のひとつであるタンパク質メチル化酵素PRMT5がNEATc1と結合することを明らかにした。そこで、PRMT5の欠損マウスを作出・解析し、PRMT5の骨組織における意義を明らかにする。20年度は、遺伝子欠損が致死性であることを考慮し、Cre-loxPシステムを用いたターゲティング法によるPRMT5遺伝子改変マウスの作成に成功し、現在、破骨細胞特異的にPRMT5を欠損するコンディショナルノックアウトマウスの作成に着手している。また、PRMT5を標的とするshRNAレトロウイルスを作成し、in vitro破骨細胞分化における発現抑制の影響を検討した結果、破骨細胞分化は抑制されることを明らかにした。一方、PRMTタンパクファミリーは2つのサブクラスに分類できるため、その機能を比較解析することを目的とし、PRMT5とは異なるサブクラスに属するPRMT4の破骨細胞分化における役割を検討した。PRMT4の欠損マウスは共同研究先(University of Texas, Dr. Mark T Bedford)より供与を受け、破骨細胞分化に及ぼす影響を解析した結果、正常に破骨細胞分化は誘導されることを見出した。これらのことは、PRMT5が他のPRMTファミリータンパクにない特異的な機能を持って、破骨細胞分化に寄与することを示唆している。21年度のPRMT5欠損マウスを用いた骨組織解析の必要性を支持するデータである。1.本年度は、昨年度に作成したPRMT5 Floxマウスと破骨細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとの交配を行い、コンディショナルノックアウトマウス(cKO)の作成を進めてきた。まず、PRMT5を全身で欠損するマウスの作成を試みたが、PRMT5-/-マウスは誕生しないことから、PRMT5はマウスの発生に必須の役割を果たすことを見出した。次に、破骨細胞の前駆細胞の段階でPRMT5遺伝子の組み換えを誘導するPRMT5 cKOマウスと破骨細胞分化過程においてPRMT5遺伝子の組み換えを誘導するPRMT5 cKOマウスを作製した。これらのマウスの骨構造解析を単純X線撮影とマイクロCTを用いて行った。現在、雌雄差および週令差を含めた解析を計画しており、サンプル数を確保するために交配を進めている。一方、他のPRMTサブクラスに属するPRMT4欠損マウスの胎児骨組織解析およびin vitroでの破骨細胞分化を解析した結果、異状はみられなかったことから、PRMT5が他のPRMTファミリータンパクにない特異的機能を持つことが示唆された。2.PRMT5と同じサブタイプに属するPRMT7はNFATc1の転写活性を正に制御することをレポーターアッセイにより明らかにした。3.PRMT5の破骨細胞分化過程における細胞内局在を検討し、核にも存在するが、細胞質にも存在していることが見出され、タンパク質メチル化修飾がNFATc1の核移行に作用する可能性を示唆する結果を得た。4.PRMT5をレトロウィルス発現法により破骨細胞に過剰に導入し、破骨細胞分化を検討したが、影響を与えなかった。このことは、タンパクのメチル化修飾がアミノ酸配列によって厳密に制御を受けているためと考えられるので、22年度のNFATc1におけるメチル化修飾を受けるアミノ酸残基を同定する必要性を支持するデータであると考えている。昨年度は、RMT5を全身で欠損するマウスの作成を試みたが、PRMT5-/-マウスは誕生しないことから、PRMT5はマウスの発生に必須の役割を果たすことを見出した。そこで胎生期のどの過程で死に至るのかを詳細に解析し、胎生期E12.5胚で致死に至ることを見出した。

E12.5以前の胚の組織切片を作成し、発生のどの段階で致死に至るのかについて解明を進めてきた。一方、PRMT5-/-マウスの致死性を回避するために、昨年度に作成したPRMT5 Floxマウスと破骨細胞や骨芽細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとの交配を行い、コンディショナルノックアウトマウス(cKO)の作成を進めてきた。破骨細胞特異的にPRMT5を欠損させるために、PRMT5 Floxマウスと破骨細胞マーカー遺伝子CtskやRANKのプロモーター活性に依存してCreを発現するマウスと交配し、破骨細胞特異的PRMT5コンディショナルノックアウトマウスの作成に成功した。このマウスの骨組織を解析した結果、破骨細胞形成初期に発現するRANKに依存してPRMT5遺伝子を欠損するマウスでは、破骨細胞形成遅延が認められ、このマウス由来の骨髄細胞からの破骨細胞分化は低下することを明らかにしたが、生体レベルでの骨量に影響を与える程度ではなかった。一方、骨芽細胞特異的遺伝子OsxやClolalに依存してPRMT5を欠損するマウスも同時に作成し、解析を試みている。現在までに、骨芽細胞の骨形成は、PRMT5欠損によって低下し、コンディショナルノックアウトマウスは骨量低下を示すことが示唆された。骨芽細胞においてもNFAT転写因子は必須の役割を果たすので、骨芽細胞におけるNFATに対するアルギニンメチル化に着目して研究を進める計画に到達した。
新規蛋白スパイカーによるスパイン形成制御機構の解明

樹状突起スパインを構成する蛋白群がどのようにしてスパインへ選択的に集積するかは、スパイン機能を解明する上で非常に重要である。本研究では、ドレブリンに結合する新規蛋白スパイカーのスパイン形成に関する機能を明らかにした。Spikarは非神経細胞では主に核のみに存在するが、神経細胞では細胞質特に樹状突起スパインに強く局在している。非神経細胞におけるSpikarとドレブリンの共発現実験により、Spiakrが細胞質に出現するためには、ドレブリンと結合していることが必要であることが示唆された。次に、神経細胞でのSpikarの機能を探るため、Spikarの発現亢進および抑制実験を行った。まず、Spikarの核移行シグナルにミューテーションを導入したところ、核内への移行が阻止されたことより、この部位が核移行シグナルであると結論されたので、核移行シグナルにミューテーションを入れる事により細胞質のみに存在する性質を有するようになったSpikar変異体mNLS-Spikarを作成し、このコンストラクトを培養8日の神経細胞に発現させ、約1週間後にスパイン数を測定したところスパイン数が有意に増加していた。次に、RNAiを用いてSpikarの発現抑制を行った。培養3日後からSpikarの発現を抑制した神経細胞で約2週間後に解析したところ、フィロポディアおよびスパイン数とmEPSC頻度が有意に減少していた。しかし、mEPSCのアンプリチュードやスパイン内へのドレブリンの集積度には変化がないことが示唆された。したがって、Spikarはシナプス誘導には関与するが、一端できあがったシナプスの維持には関与しないことが示唆された。以上より、Spikarは核では転写調節因子として働き、核外(細胞質)ではシナプス形成誘導に関与している新規蛋白であると考えられた。本研究はドレブリン結合蛋白として、スパインと核に局在する新規蛋白スパイカーがどのような機序によりスパイン形成に関与するかを明らかにすることを目的としている。予備的実験により、スパイカーの発現制御によりスパイン形成が変化することが判ったので、初代培養神経細胞を用いて、スパイカー発現抑制(KD)細胞および過剰発現細胞を作成し、その際に起こるスパイン機能蛋白集積の変化を解析したところ、スパイカーの集積なしに他のスパイン機能蛋白集積は起きないことが示唆された。次に、スパイカーのスパインターゲッティングモチーフを同定するため、種々のスパイカーフラグメントをGFP蛋白に融合し、培養神経細胞に発現させたところ、スパイカーC末端領域はスパインターゲット能を持つことが示唆された。一方、ドレブリン結合能力はスパイカーのN末端領域にあることが判った。スパイカーN末端ドメインを用いて抗スパイカー抗体は既に作成済みであったので、この抗体を用いて幼若ラットと成熟ラットの脳を固定後、免疫染色したところ、幼若ラットより成熟ラット脳の方が核め染色像が増加する傾向を認めた。連携研究者の崎村博士と共同してスパイカーノックアウト動物を作製した。'ノックアウト動物は胎生致死となり、生後の解析が不可能であった。
光プローブ法を利用して解明する物理ゲルの動的形成機構とエイジング

研究計画の大きな骨子は、光プローブ法を適用して、(1)物理ゲルの網目構造の生成と変化のダイナミックスに関する情報と(2)網目と溶媒の運動性に関する情報を得ることである。複数のゲルの系について研究を進め、以下の重要な結論を得るに到った。1.分子量の異なるゼラチンのヒドロゲルについて、疎水プローブであるANSの蛍光ピーク波数とゼラチン重量濃度が田中・西成式によく乗ることが確認された。従って、凝集部位に参加しているらせんが平均6本程度であるなどの結論を得た。この方法は、一般的にタンパク・ヒドロゲルの構造解明に有効であるといえる。2.アガロース・ヒドロゲル中のプローブ分子の蛍光挙動から、これまで不明だったアガロース鎖のヘリックス構造の1つが、ピッチ9.5Åでaxial riseが3.17Åの3_1ヘリックスであることを結論づけることができた。ただし、高分子量のアガロースではもっとピッチの長い別のヘリックス構造が共存していることも確認された。3.シンジオタクチックポリスチレン(sPS)が溶媒の種類によってゲルかするかしないかという問題は、溶媒の分子サイズにも原因があることがわかった。ゲル化する溶媒ではsPSのヘリックス同士の間に溶媒分子が挿入され、ポリマー・溶媒分子化合物を形成するが、溶媒の分子サイズが大きいとむしろsPSヘリックス同士は溶媒抜きで凝集し、ネットワークがもろいものになる。4.ジ-ο-ベンジリデン-D-ソルビトール(DBS)の誘導体を11種類合成・精製し、溶媒と濃度を変化させて蛍光・電顕・WAXS・SAXS・DSC・粘弾性測定を行い、低分子が沈殿しないでファイバーを形成しゲルとなる要因を明らかにした。DBS誘導体では十員環部分が積み重なる1次元方向の結晶化が優先し、溶媒との分子間力で3次元結晶成長が阻害されることが重要要因といえる。本年度は以下の3つの系について研究を進めた。(1)ANS、オーラミンOなどの分子サイズや特性の異なる蛍光プローブ分子を添加して生体高分子ゲル中の極性・疎水性部分に対する情報を得た。今年度は、分子量の異なるゼラチン・アガロース・アルブミンの水ゲルを調べた。いずれも高分子濃度の増加とともに、架橋部位に取り込まれたためと思われる波長シフトが起こった。特に、ANSはゼラチン分子のヘリックス構造によく吸着するために、ゲル化に先立つヘリックスの凝集に関する情報を得ることができ、ヒトの嚥下運動がおこるゼラチンゲル濃度に対応した変化が観測された。(2)シンジオタクチックポリスチレン(sPS)の有機溶媒ゲルについては、イソタクチックポリスチレンゲルで成功した蛍光法を適用した。sPS濃度を変化させて、分子サイズの異なるナフタレンおよびその誘導体をゲルに一定量加えて、偏光解消測定からこれらの分子が動けるような自由体積があるかどうかを検証していく方法である。その結果、ポリマー・溶媒分子化合物の存在を明確にしつつある。さらに、sPS固体は4種類の結晶形が知られているが、これらとゲル構造との相関を調べるために、完全非晶・α型・δ型およびこれらの延伸フィルムに蛍光分子をドープしてその自由体積比較を現在行っているところである。(3)ジ-O-

ベンジリデン-D-ソルビトール(DBS)の誘導体を7種類合成・精製し、WAXS・SAXS・DSC・粘弾性の測定とともに蛍光測定を行い、ベンジリデン基同士の基底状態ダイマーを検知することで、ファイバー形成を追跡した。この結果からDBSの十員環部分の構造が、水素結合や疎水結合より重要であることを明らかにした。研究計画の大きな骨子は、光プローブ法を適用して、(1)物理ゲルの網目構造の生成と変化のダイナミックスに関する情報と(2)網目と溶媒の運動性に関する情報を得ることである。複数のゲルの系について研究を進め、以下の重要な結論を得るに到った。(1)分子量の異なるゼラチンのヒドロゲルについて、疎水プローブであるANSの蛍光ピーク波数とゼラチン重量濃度が田中・西成式によく乗ることが確認された。従って、凝集部位に参加しているらせんが平均6本程度であるなどの結論を得た。この方法は、一般的にタンパク・ヒドロゲルの構造解明に有効であるといえる。(2)アガロース・ヒドロゲル中のプローブ分子の蛍光挙動から、これまで不明だったアガロース鎖のヘリックス構造の1つが、ピッチ9.5Åでaxial riseが3.17Åの3_1ヘリックスであることを結論づけることができた。ただし、高分子量のアガロースではもっとピッチの長い別のヘリックス構造が共存していることも確認された。(3)シンジオタクチックポリスチレン(sPS)が溶媒の種類によってゲルかするかしないかという問題は、溶媒の分子サイズにも原因があることがわかった。ゲル化する溶媒ではsPSのヘリックス同士の間に溶媒分子が挿入され、ポリマー・溶媒分子化合物を形成するが、溶媒の分子サイズが大きいとむしろsPSヘリックス同士は溶媒抜きで凝集し、ネットワークがもろいものになる。(4)ジ-O-ベンジリデン-D-ソルビトール(DBS)の誘導体を11種類合成・精製し、溶媒と濃度を変化させて蛍光・電顕・WAXS・SAXS・DSC・粘弾性測定を行い、低分子が沈殿しないでファイバーを形成しゲルとなる要因を明らかにした。DBS誘導体では十員環部分が積み重なる1次元方向の結晶化が優先し、溶媒との分子間力で3次元結晶成長が阻害されることが重要要因といえる。
末梢気腔破壊の機序における蛋白分解酵素阻害物質の異常に関する分子生物学的研究

本研究は肺気腫症における蛋白分解酵阻害物質α1ーアンチトリプシン(α1AT)の関与、ことに量的異常のない一般肺気腫症例にα1AT機能異常等の原因となるアミノ酸変異の有無を直接塩基配列より検索することを目的とし、併せ日本のα1AT欠損症例の遺伝子解析、民族的特異性を解明した。1)血清α1AT濃度正常肺気腫症例のα1AT遺伝子塩基配列を直接解読し、病因となるアミノ酸変異の有無を検討した。比較的若年発症ブラ、自然気胸23例ではα1AT活性中心(初年度)、及びプロモ-タ-領域(2年度)を、50歳台肺気腫10例においては全アミノ酸コ-ド領域(2年度)を解読したが、病的原因と考えられる有意な変異は存在しなかった。2)血清α1AT欠損38歳男子肺気腫症例(長野県飯山市)のα1AT遺伝子を解析し、Ser^<53>(TCC)ーPhe(TTC)変異を見いだしSiiyamaと命名した。この変異はα1AT分子3次元構造に影響し、肝細胞内にα1AT分子凝集体と考えられる封入体を認めた(初年度)。既報α1AT欠損9家系中検討した4家系全てにSiiyamaと同一の遺伝子異常を見た。欠損9家系中独立5家系に共通する異常を認め、本欠損亜型が日本、あるいは東洋人に多数存在する可能性が示された。このため多数例を簡便に検索できる対立遺伝子特異的塩基変異検出法を設定した(2年度)。3)欧米白人に高頻度のα1AT欠損Z亜型(・・Ala^<213>(GCG)・・Lys^<342>(AAG)・・)に症例が何故日本にないのかを解明するため、進化的に古いAla^<213>(GCG)ーVal(GTG)に注目し、この部の制限酵素による切断片で変異の頻度を検索したところ日本人156例全員がVal^<213>(GTG)であった(2年度)。欧米白人では約20%がAla^<213>(GCG)であり、進化的にも古いこの亜型から欧米白人に高頻度な欠損Z亜型が派生したことを考えると、Ala^<213>(GCG)が存在しないと考えられる日本人にはZ欠損亜型は存在しないと結論され、遺伝性疾患の人種民族上の差の一つが遺伝子解析の上から推測された。本研究は肺気腫症における蛋白分解酵素阻害物質のα1ーアンチトリプシン(α1AT)の関与を検討する一環として、量的異常のない肺気腫症個体の機能異常(α1AT活性中心の異常など)を直接塩基配列より確認することを目的とする。1.PCR法によるα1AT塩基配列決定:好熱菌DNAポリメラ-ゼを用い遺伝子の一定部分を高度増幅するPCR法(補助にてサ-マル・サイクラ-を購入)で簡便に直接塩基配列を解読した。

ことに一度増幅したDNAを精製し、プライマ-比を50:1として二度目のPCRを行い、高品位のシ-ケンス・ゲルを作成(補助にて電気泳動装置一式を購入)した。次にα1ATのコ-ド領域であるエクソンII,III,IV,Vのすべての領域をカバ-する多数の合成オリゴヌクレオチド・プライマ-を作成し、患者より採血後一週間以内に1400塩基対の全塩基配列を解読(補助により遺伝子解析用マイクロコンピュ-タ一式を購入)が可能となった。2.α1AT遺伝子塩基配列決定:(1)α1ーアンチトリプシン欠損症例(Miiyama)の解析。38歳男性(長野県飯山市)若年肺気腫症例。α1AT血中濃度14.5mg/dl。α1AT遺伝子はホモ接合でエクソンIIにおいてSer^<53>(TC__ーC)からPhe^<53>(TT__ーC)へのアミノ酸変異が明かになった。家族解析の結果、両親(従兄妹)、姉、娘はすべて同部において、ヘテロ接合であり、血清α1AT値(父;106mg/dl,母;119mg/dl,姉;78mg/dl,娘;140mg/dl)もこの結果を支持した。本アミノ酸変異は海外にても未報告でありMiiyamaと命名した(Am.Rev.Respir.Dis.141,suppl,1990、スライド報告)。(2)α1AT活性中心(Met^<358>)近傍部分の解析。DNAを抽出した患者16例(肺気腫症2例、巨大ブラ9例、自然気胸5例:内40歳未満7例)の解析では活性中心近傍Ala^<332>ーAsn^<390>において正常亜型以外のアミノ酸変異は認めなかった。この解析範囲には、正常亜型M_2,M_3における既知の変異Glu^<376>(GAA__ー)→Asp^<376>(GAC__ー)が存在する。その頻度は16例中7例がGlu^<376>/Asp^<376>のヘテロ接合、8例はGlu^<376>/Glu^<376>のホモ接合、1例がAsp^<376>/Asp^<376>のホモ接合であり既報表現型頻度によく一致した。本研究は肺気腫症における蛋白分解酵素阻害物質α1ーアンチトリプシン(α1AT)の関与、ことに量的異常のない症例のα1AT機能異常等の直接塩基配列検索を目的とし、併せ日本のα1AT欠損症例の遺伝子解析を試みた。1)<40ー50歳台肺気腫症10例におけるα1AT遺伝子全塩基配列解読。>___ー初年度のα1AT活性中心の検索に加え、2年度は全アミノ酸コ-ド領域の塩基配列を検討した。しかし検討10例における変異は既報の正常変異Arg^<101>(CGT)ーHis(CAT)5例、Glu^<376>(GAA)ーAsp(GAC)5例を認める以外アミノ酸変異は認めず1例でAsp^<256>(GAT)ーAsp(GAC)を見い出したのみであった。即ち比較的若年発症肺気腫10例であるが、α1AT分子に異常はなく、今後これら血清α1AT値正常の一般肺気腫症においては破壊因子エラスタ-ゼ、基質エラスチン等の異常も加えて検討する必要がある。2)<日本人独立5家系に共通するα1AT欠損遺伝子Siiyama。>___ー初年度報告した38歳男性肺気腫症例に認めた欠損亜型は等電点電気泳動と交差免疫染色法によりS亜型と確認し最終的にSiiyamaと命名した。既報9家系α1AT欠損家系のうち検討4家系全てにSer^<53>(TCC)ーPhe(TTC)の遺伝子異常を認めた。即ち欠損9家系中5家系に共通する異常であり、本欠損亜型は日本、あるいは東洋人に多数存在する可能性が示された。