hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HyperAMDによるハイパー核構造の解明とバリオン間三体力の効果

ハイパー核は、通常の原子核にラムダ粒子等の異種粒子(バリオン)が加わった原子核であり、実験研究の進展により様々なハイパー核が生成可能になりつつある。バリオン間三体力は、中性子星の研究からその存在が示唆されている。本研究では、バリオン間三体力が存在する場合、その効果がハイパー核のエネルギーにどのように影響を与えるかを理論的に予言し、将来のハイパー核生成実験でどのように観測可能であるのか明らかにした。ハイパー核は、通常の原子核にsクォークを含むバリオン(ハイペロン)が加わったバリオン多体系である。本研究の目的は、ラムダ粒子が核の様々な構造・変形状態に結合することで現れる新奇な状態を明らかにするとともに、ハイパー核の定量的な構造計算によってハイペロンを含むバリオン間三体力のハイパー核における効果を理論的に解明することである。具体的課題として、(1)“ラムダ粒子の結合で現れる新奇な回転帯の構造と生成断面積の予言"及び(2)“ラムダ粒子の束縛エネルギーの系統的予言とバリオン間三体力の効果"に取り組む計画である。本年度は、主に課題(2)に取り組んだ。課題(2)では、中性子星の理論研究で存在が議論されているバリオン間三体力が、地球上の実験で生成可能なハイパー核の束縛エネルギーにどのような影響を与えるのかを明らかにする。その際、具体的には、質量数10-60程度の非常に広い質量数領域のハイパー核を対象とした。これらのハイパー核は様々な構造を持ち基底状態の密度分布が核によって大きく異なるため、相互作用の密度依存性を介して、バリオン間三体力の有無がラムダ粒子の束縛エネルギーに影響すると考えられる。本研究では、三体力を含まず二体力のみの場合と三体力を含む場合とを比較し、三体力による付加的な密度依存性により、ラムダ粒子の束縛エネルギーに違いが現れることを明らかにした。さらに、変形などの核構造も相互作用の密度依存性を通して束縛エネルギーに大きく影響することを明らかにした。したがって、こうした三体力効果をハイパー核の実験データを通して明らかにするためには、核の様々な変形など構造を十分に記述した上で理論計算を実施し、実験データと比較・分析する必要があると考えられる。この成果は、日本物理学会年次大会及びハイパー核物理に関連する国際研究会にて口頭発表した。さらに、誌上論文として現在投稿中である。ハイパー核の束縛エネルギーにおけるバリオン間三体力の効果と、その密度依存性との関連を明らかにすることができた。こうした効果の模型依存性を明らかにすることが今後の課題であるが、その準備となる分析も進みつつある。ハイパー核生成断面積の予言については、準備となるハイパー核の構造計算は進行しつつあるが、反応計算の部分については今後本格的に取り組む必要がある。ハイパー核は、通常の核にsクォークを含むバリオン(ハイペロン)が加わったバリオン多体系である。本年度は、昨年度の引き続き、主に課題(2)に取り組んだ。課題(2)では、中性子星の理論研究で存在が議論されているバリオン間三体力が、相互作用の密度依存性を通して、地球上の実験で生成可能なハイパー核の束縛エネルギーにどのような影響を与えるのかを明らかにする。そこで、昨年度から引き続き、まずは三体力を加えない場合(二体力のみ)について分析を行った。その結果、原子核の変形がラムダ粒子の束縛エネルギーに大きく影響するため、ハイパー核のエネルギーから相互作用の情報を引き出すためには、それを適切に記述する必要があることがわかった。次に、三体力を加えて同様の分析を行った。その結果、三体力効果はハイパー核のエネルギーに影響を与えるが、その影響は基にする二体相互作用模型に依存することがわかった。この結果から、中性子星の観測を説明できる三体力の存在を仮定すれば、既存の相互作用模型に制約を加え、模型を選別できる可能性があることを示している。反対に、ハイペロン散乱実験等で2体相互作用が決定されれば、ハイパー核の系統的なデータから三体力の存在を確かめることができる可能性がある。これらの成果について、関連する学会や国際研究会で報告した後、誌上論文として投稿(1編出版済、1編受理済み・印刷中)した。ハイパー核の束縛エネルギーにおけるバリオン間三体力の効果については、それを調べるために不可欠な点であるハイパー核の構造計算の重要性を具体的に示し、誌上論文として発表することができた。さらに、それに引き続き、束縛エネルギーにおける三体力効果の模型依存性についても明らかにすることできた。一方で、本研究による計算結果は既存の実験データを系統的には非常に良く再現できているものの、個々のハイパー核では実験のエネルギースペクトルと異なる傾向のものがあった。これらは相互作用模型の不定性に起因している部分と考えられる。今後は、こうした実験との違いが相互作用のどの部分の性質の違いから来ているのか、分析する必要があると考えている。

本研究の目的は、ラムダ粒子が核の様々な構造に結合することで現れる新奇な状態を明らかにするとともに、ハイパー核の定量的な構造計算によってハイペロンを含むバリオン間三体力のハイパー核における効果を理論的に解明することである。具体的課題として、(1)“ラムダ粒子の結合で現れる新奇な回転帯の構造と生成断面積の予言"及び(2)“ラムダ粒子の束縛エネルギーの系統的予言とバリオン間三体力の効果"を設定した。このうち課題(2)については、これまで、バリオン間三体力の効果が相互作用の密度依存性を通してハイパー核の束縛エネルギーの系統的データに影響を与えることを示してきた。そこで本年度は、その相互作用模型に対する依存性を明らかにし、ハイパー核の束縛エネルギーのデータから相互作用のどのような情報を引き出すことが可能か理論的に明らかにした。課題(1)に関して、本年度は、実験データが豊富なp殻ラムダハイパー核を中心に構造計算を実施した。その結果、元の核の構造に加え、ラムダ-核子間相互作用のスピン依存性が励起スペクトルの構造に大きな影響を与えることを明らかにした。このように本研究では、当該研究期間全体を通じ、核構造とラムダ-核子間相互作用の性質との関係や、ラムダ粒子を含むバリオン間三体力の影響について、核構造計算に基づき理論的に分析・予言してきた。その結果、バリオン間三体力が存在する場合、その効果がハイパー核の束縛エネルギーにどのように現れ、その結果からどのような情報を引き出すことが可能であるか理論的に示すことができた。本研究の予言は、将来米国のジェファーソン研究所で計画されているハイパー核の電子線生成実験によって検証され、現在の核物理の大きな課題であるバリオン間三体力の理解に大いに貢献するものと期待される。ハイパー核は、通常の原子核にラムダ粒子等の異種粒子(バリオン)が加わった原子核であり、実験研究の進展により様々なハイパー核が生成可能になりつつある。バリオン間三体力は、中性子星の研究からその存在が示唆されている。本研究では、バリオン間三体力が存在する場合、その効果がハイパー核のエネルギーにどのように影響を与えるかを理論的に予言し、将来のハイパー核生成実験でどのように観測可能であるのか明らかにした。引き続き、課題(2)“ラムダ粒子の束縛エネルギーの系統的予言とバリオン間三体力の効果"に関しては、性質の異なる模型相互作用を用い、三体力効果の模型依存性を明らかにする。課題(1)“ラムダ粒子の結合で現れる新奇な回転帯の構造と生成断面積の予言"について、Mgハイパー核についての準備となる計算は既に行っている。今後は、ハイパー核生成断面積を計算する部分について模型の拡張を進める。課題(2)“ラムダ粒子の束縛エネルギーの系統的予言とバリオン間三体力の効果"については、当初予定していたハイパー核エネルギーの分析は昨年度までに実施できた。しかし、上に挙げたように、今回の計算では、二体力の相互作用模型の不定性から来る三体力効果の模型依存性が明確に現れたため、その原因をさらに分析する必要がある。そこで、課題(2)については、二体相互作用模型の性質に着目し、その不定性とエネルギースペクトルとの関係を引き続き分析する。課題
MAdCAM-1遺伝子の発現抑制による新しい炎症性腸疾患治療法の開発

MAdCAM-1(mucosal adressin cell adhesion molecule-1)は腸管リンパ組織のHEV(high endothelial venule)に発現し、2つの免疫グロブリン(Ig)ドメインとムチンドメインを有する小分子である。リンパ球、とくにメモリーT細胞表面のインテグリンα4β7とIgドメインとが結合し、これらリンパ球のホーミングにきわめて重要な役割を演じている。最近、ヒト炎症性腸疾患においても炎症局所の血管内皮での発現が亢進していることが明らかにされ、治療標的分子として注目されるが未だに十分な検討はなされていない。本研究ではTNBSマウス大腸炎モデルにおけるMAdCAM-1アンチセンス療法の有効性を検討し以下の結果を得た。1)アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASと略)の腹腔内投与によってTNBS大腸炎は抑制され、体重減少の有意な抑制、死亡率の有意な低下、および組織学的炎症スコアの改善を認めた。2)炎症腸管局所におけるMAdCAM-1 mRNAおよび蛋白の発現レベルは、AS投与マウスにおいて有意に低下した。3)炎症腸管局所におけるCD4+T細胞およびβ7+細胞数の有意な低下を認めた。4)FITC標識ASを用いて、炎症局所への高率な取り込みを確認した。ASの安全性は既に他の遺伝子に関するいくつかの臨床試験を通じて明らかにされており、今回の結果はMAdCAM-1 ASの第1相臨床試験のための基礎データとなるものと考えられた。本年度は以下の知見を得、ほぼ予定どうり研究計画を遂行した。1)MAdCAM-1mRNAの発現抑制に有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下ASと略)を選択するために、培養血管内皮腫瘍細胞b.end3に種々のASを加え、それらのMAdCAM-1 mRNA発現抑制レベルを半定量RT-PCR法にて観察した。その結果、リーダー配列の一部に対するASが最も有効であった。2)次に、上記ASのin vivoにおける効果について検討した。大腸炎モデルとしてマウスTNBS腸炎を用いた。方法は、1mgのTNBSをday1およびday4に投与し、day7に病理解剖を行って効果を観察した。対照オリゴヌクレオチドとしてASのセンスオリゴヌクレオチド(以下Sと略)を用いた。AS群、S群、PBS群の3群に分け、各々20匹のマウスについて7日間の体重変化と生存率を観察した。その結果、体重、生存率ともにAS群で有意に高い値を示し、本ASのin vivoでの有効性が明らかとなった。炎症巣におけるMAdCAM-1 mRNAの発現レベルを半定量RT-PCR法にて検討したところ、AS群で有意な低下を認めた。浸潤リンパ球の免疫組織染色では、CD4陽性T細胞が優勢であった。また、組織スコアでもAS群で低下傾向を認めた。以上より、MAdCAM-1のASが大腸炎の治療に応用しうる可能性が示唆され、さらに詳細な検討を加えつつある。

4)FITC標識ASを用いて、炎症局所への高率な取り込みを確認した。ASの安全性は既に他の遺伝子に関するいくつかの臨床試験を通じて明らかにされており、今回の結果はMAdCAM-1ASの第1相臨床試験のための基礎データとなるものと考えられた。
地域計画文書の計算機による知的処理のための知識利用方策に関する基礎研究ー文章の理解と学習のための視点制御に基づく知識利用方策の実現ー

1.仮説推論方式としての視点主導型推論方式の設計...地域計画文書の計算機による知的処理のための1つの重要な課題は,計算機による計画のコンテクストの理解である.仮説推論は,「ある事象または行為が生じた原因の説明」「将来の変化や目標に影響しうる事象または行為の説明」等を,不完全な情報のもとで正当化するための推論で,計画のコンテクストの理解においても重要な役割を果たす.本研究では,仮説推論を,仮説構成・管理・検証からなる推論方式としてモデル化し,求められる仮説が満たすべき基準として,『正当性』『完備性』『最小性』『識別性』の4つを与えた.そして,これら基準を満たす仮説推論の1方式として,視点主導型推論方式を設計しそのアルゴリズムを与えた.視点主導型推論における仮説構成は,目標を導きうる視準木を『局部的拘束』により展開し,『拘束伝播』により視準木をもとに視点を仮説する.仮説検証は,仮説の正当性と識別性を判定する.仮説管理は,正当でない仮説を効率的に取り除き,仮説の識別が可能なように視準木を再構成する.2.視点主導型知識システムの設計...視点主導型知識システムは,オブジェクト指向のもとに論理指向とルール指向の知識表現を融合した知識ベースと視点主導型推論のための視点制御機構とから構成される視点主導型推論を実行するシステム構築のトゥールである.視点制御および知識操作の手続きはメツッドの集合として提供され,知識処理はメッセージインタプリタによるこれらメソッドへのメッセージ伝達により遂行される.視点制御機構は,仮説構成のための投視メソッド群,仮説検証のための視点拡張メソッド群,仮説管理のための視準管理メソッド群から構成される.これら知識ベースと視点制御機構を設計し,ワークステーションAS3050M上に実装し,その動作を確かめた.1.視点制御アルゴリズムの設計...知識処理、特に、理解において、"視点"の役割は、理解のための世界を定めることと、その世界における前提・仮定を定めることである。視点により構築される世界を"視世界"と名づけ、視点を、前提・仮定系として視世界を構築し管理するために用いる知識表現スキーマとして設計した。そして、この視点スキーマを用いて視世界を構築・管理するアルゴリズム"視点制御アルゴリズム"を設計した。このアルゴリズムは、1)投視、2)視世界上の非単調推論、3)視点指向バックトラッキング、4)視世界の監視、及び、5)知識の仮説設定、6)知識の管理のサブアルゴリズムから構成される。前者4つは、複数の視世界上での、いわゆる、dependency-directed backtrackingを遂行する仕組である。これを論理系の枠組で形式化し、視点制御により視世界を更新するための必要条件を求めた。後者2つは視点を用いた知識獲得の仕組で、62年度もひき続き設計を続ける。2.視点主導型知識システムの設計と部分的実現...視点制御アルゴリズムを実現する知識ベースシステムとして、"視点主導型知識システム"を設計し、ワークステーションAS3050M上に部分的に実現した。視点主導型知識システムの特徴は、視点制御の仕組を持つことと、ルール指向、オブジェクト指向、論理指向の知識処理形式を、視世界において融合していることである。3.プラン表現スキーマとそれを用いた理解のアルゴリズムの設計...プラン表現をGOAL,PLAN-STRUCTURE,ACTION,SITUATION,THEMEとそれらのメタ表現を基本要素として設計し、視点スキーマに埋め込んだ。ある計画の断片的記述の理解は、目的からのその計画の説明と、その計画の影響の説明によりなされる。視点スキーマとしてのプラン表現の相違により異なる理解を生みだすアルゴリズムを設計した。62年度は、このプラン表現形により地域計画文書の理解に必要な知識を知識ベース化する。1.仮説推論方式としての視点主導型推論方式の設計...地域計画文書の計算機による知的処理のための1つの重要な課題は,計算機による計画のコンテクストの理解である.仮説推論は,「ある事象または行為が生じた原因の説明」「将来の変化や目標に影響しうる事象または行為の説明」等を,不完全な情報のもとで正当化するための推論で,計画のコンテクストの理解においても重要な役割を果たす.本研究では,仮説推論を,仮説構成・管理・検証からなる推論方式としてモデル化し,求められる仮説が満たすべき基準として,『正当性』『完備性』『最小性』『識別性』の4つを与えた.そして,これら基準を満たす仮説推論の1方式として,視点主導型推論方式を設計しそのアルゴリズムを与えた.視点主導型推論における仮説構成は,目標を導きうる視準木を『局部的拘束』により展開し,『拘束伝播』により視準木をもとに視点を仮説する.仮説検証は,仮説の正当性と識別性を判定する.仮説管理は,正当でない仮説を効率的に取り除き,仮説の識別が可能なように視準木を再構成する.2.視点主導型知識システムの設計...視点主導型知識システムは,オブジェクト指向のもとに論理指向とルール指向の知識表現を融合した知識ベースと視点主導型推論のための視点制御機構とから構成される視点主導型推論を実行するシステム構築のトゥールである.視点制御および知識操作の手続きはメツッドの集合として提供され,知識処理はメッセージインタプリタによるこれらメソッドへのメッセージ伝達により遂行される.視点制御機構は,仮説構成のための投視メソッド群,仮説検証のための視点拡張メソッド群,仮説管理のための視準管理メソッド群から構成される.これら知識ベースと視点制御機構を設計し,ワークステーションAS3050M上に実装し,その動作を確かめた.
日独行政システムの比較研究:1980年代における新自由主義と行政システム

日本・ドイツの政治行政の比較研究を目的とする本研究の本年度の活動は以下の通りである。1.神戸における研究集会平成5年12月12日、日本側参加者5名を集めて神戸において研究集会を行った。この研究集会では、3月の日・独合同の研究集会において行われる報告について、各人の研究の現状が報告され、報告者以外の参加者も交えて活発な討論が行われた。2.京都におけるコンフェレンス平成6年3月1日から3日の3日間、京都・国際交流会館において、“State and Administration in Germany and in Japan"と題して、日本・ドイツ合同のコンフェレンスを開催した。このコンフェレンスでは、昨年3月にドイツ・ベルリンで行われたコンフェレンスを受け、ドイツ側5名、日本側6名、計12の報告がなされ、活発な討論がなされた。報告は以下の通りである(いずれも、報告時のタイトルは英語)。Lehmbruchの二つ目の報告およびAgata報告を除いて、日独の報告はそれぞれが一報告づつ組み合わされ、両国の国家・行政の現状が比較された。コンフェレンスでは、1)日独双方の政治・行政が、これまでの「制度的遺産」によって強く規定されていること、2)しかし、同時に1970年代以降の国際化・政策の相互依存的状況の下で、両国の政治・行政が緩やかに同じ方向を向きつつあることが確認された。また、政治学・行政学の研究について、方法論をめぐっても議論がなされたことは特筆すべきであろう。3.東京における研究集会京都におけるコンフェレンスに引き続き、東京・早稲田大学両国のペーパーについての枠組みの理解を深めた。この研究集会には、ドイツ側報告者2名、日本側報告者2名のほか、東京におけるドイツ政治の専門家を含む多数の参加者があり、活発な質疑応答がなされた。なお、本コンフェレンスの成果は、英語による出版が検討されている。
呼吸器疾患の胸部CT画像による定量的網羅的評価システムの開発と病態解明への応用

呼吸器臨床でよく用いられている胸部CT検査は、画像がもつ膨大な情報をまだ充分に活かしきれていない面がある。本研究では、呼吸器疾患の胸部CT画像を用いて、肺病変、気道病変、肺外構造を定量的に画像解析するソフトを開発した。閉塞性肺疾患、肺非結核性抗酸菌症、間質性肺炎といった呼吸器疾患に応用し、CT画像の形態解析とシミュレーションにより、肺病変の進展様式や疾患による構造の相違、骨粗鬆症のような肺外病変との関係を明らかにした。呼吸器科の臨床において胸部CT(Computed Tomography)による画像診断は、不可欠なものとなっているが、CT画像のもつ膨大な情報を充分に活かしきれていないのが現状である。本研究は、胸部CT画像を用いて、呼吸器疾患における肺病変だけでなく肺外構造を定量的に評価することで疾患特異的な定量的指標を見い出し、症状や生理学的、生化学的な他の臨床指標との関係や臨床経過との関係、全身臓器への影響を明らかにし、さらにモデルシミュレーションを施行することによって形態学からみた疾患の進展様式および病態を解明することを目的としている。研究初年度である平成22年度では.解析対象となる疾患症例の臨床データおよび画像データの収集・整理を進めると同時に、画像解析ソフトの開発を行った。まず、気道病変の3次元的解析ソフトを開発し、COPD症例および気管支喘息症例に対して応用した。異なる気道部位の気道dimensionを測定して、臨床データとの対比を行い、両疾患とも気道病変の進行においては気管支部位によるheterogeneityに乏しいことを明らかにした。次に、肺野病変に関する画像解析研究については、COPD急性増悪による気腫病変の変化に関して、CT画像を用いた肺野病変の定量的解析を行うとともに、モデルシミュレーションを適用することにより、増悪による肺野低吸収領域の増加が、単なる過膨張の増加によるものではなく、肺胞壁破壊を伴う気腫病変の進行によるものであることを示唆する結果を得た。このようにCT画像解析を通して、形態学からみた呼吸器疾患の病態解明に貢献できる成果を得ることができた。本研究は、胸部CT (Computed Tomography)画像を用いて、呼吸器疾患における肺病変だけでなく肺外構造を定量的に評価することで疾患特異的な定量的指標を見い出し、症状や生理学的、生化学的な他の臨床指標との関係や全身性の影響を明らかにし、さらにモデルシミュレーションを施行することによって形態学からみた疾患の進展様式および病態を解明することを目的としている。本年度は、COPDにおいては、急性増悪によって肺実質破壊を伴った気腫病変が進行することを定量的CT指標およびそれらを用いたモデルシミュレーションで明らかにしたのに続き、全身性影響としての骨粗鬆症に着目して、増悪の有無によって気腫病変の進行と共に胸椎の骨密度が低下すること、すなわち、増悪が骨粗鬆症に対する独立したリスク要因であることをCT画像解析によって示すことができた。これはCOPDの日常診療における肺以外の全身管理の重要性を示す結果である。また、間質性肺炎に関しては、蜂巣病変や高吸収領域の定量的指標を開発し、これらを含む肺野病変のCT指標と、肺機能、組織型などの臨床指標との関係を検討した結果、蜂巣病変の指標が組織型の鑑別に有用であること、また肺野CT値のKurtosisが予後とよく相関することが明らかとなり、論文として成果をまとめ投稿中である。さらに、肺非結核性抗酸菌(MAC)症も含めた気道病変の新たな解析法を開発し、COPDや喘息症例に適応したところ、従来の指標にはない有用性が期待できることが判明したため、CTファントムを作成して詳細に検討、評価している。このように昨年度までの成果を踏まえてCT画像解析を通して、形態学からみた呼吸器疾患の病態解明に貢献できる新たな成果を得ることができた。本研究は、胸部CT(Computed Tomography)画像を用いて、呼吸器疾患における肺病変だけでなく肺外構造を定量的に評価することで疾患特異的な定量的指標を見出し、症状や生理学的、生化学的な他の臨床指標との関係や全身性の影響を明らかにし、さらにモデルシミュレーションを施行することによって形態学からみた疾患の進展様式および病態を解明することを目的としている。本年度は、COPDにおいては、現喫煙者と禁煙者との間で気腫病変の経年変化に相違があり喫煙を継続することで気腫の進行がより大きいことを示し、さらにCT画像を用いたモデルシミュレーションを行うことで肺気腫の進展様式を明らかにした。また、気道内腔の不整性に着目した新たなCT指標の開発に成功した。本法開発の基礎となる気道ファントムを用いた研究についてはCT機器や測定条件による気道指標に対する影響を明らかにし論文投稿中である。次に、本法をCOPDと喘息のCT画像に適用したところ、本指標が両疾患の鑑別に有用であることがわかり、両疾患の病態の相違を明らかにするものとして論文投稿予定である。また、肺非結核性抗酸菌(MAC)症においても同様に胸部CT画像を用いて解析し、同症の気道病変は解剖学的な部位による相違があることを見出し、学会発表を行った。

昨年度までの呼吸器疾患と骨粗鬆症との関係に関する研究についてまとめ、学術誌に発表を行った。このようにCT画像解析を通して、形態学からみた呼吸器疾患の病態解明に貢献できる新たな成果を得ることができ、今後のさらなる応用につながるものと考えられる。研究はおおむね順調に進んで新たな成果を得てきているが、今年度、新規CT指標の開発中に気道を長軸方向に解析する指標を見い出し、COPDや喘息例に適応したところ、各疾患の病態の鑑別など従来の指標にはない有用性と呼吸器疾患全般に応用できる汎用性が期待できることが判明した。このため、本法をさらに詳細に検討、評価する必要があると考え、評価のためのCTファントム作成などに着手した。ファントムは正確かつ複雑な構造を要するため作成には時間を要しており、このため、次年度のシミュレーションによる病態解析についてはやや遅れが生じることが予想される。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記のとおり、研究途上において、有用性、汎用性が高いと考えられる新規CT指標が得られたため、次年度に続けて本法の確立を優先して行い、その後にシミュレーションによる病態解析につなげる方針とする。
ゲノム不安定性に着目した浸潤性膀胱がん遺伝子治療法の開発

膀胱の発がん進展過程は未だに不明な点が多い。近年、がんは遺伝子変化の集積に伴って多段階で生じ、染色体レベルでのゲノムの不安定性(Chromosomal instability:CIN)が見られることが解明されてきた。しかし、膀胱がん患者は遺伝・環境背景が多様なためCINの解析は困難であった。このことより私は、膀胱がんモデルマウスを用いてCINを検討することにより、ヒト膀胱発がんに関わる遺伝子の同定と解析を行うことを目的として当該研究を行った。1.6週齢のC57BL/6N雄マウスに0.05% N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamineを自由飲水投与し、膀胱がんモデルマウスを作成した。本モデルマウスは投与開始後4週で過形成、12週で高度異形成、20週から26週にかけて浸潤性膀胱がんを発生するため、各々の時期の膀胱組織よりDNAを抽出しarray CGH解析を行った。array CGHの結果、2D、9F2、11C-D、13B3、14C2の5領域にコピー数の増加を認めた。その領域にある19個の遺伝子の中で、1コピー以上の増加を認め、ヒトとの相同性が明らかな遺伝子はUQCRBのみであった。2.モデルマウスを用いた解析:UQCRBのCNA比は4週後より増加傾向を示し、12週後でピークを認め、26週後では減少する傾向にあった。また、免疫組織学的検討ではUQCRB、iNOSともに4,12週後と徐々に発現の上昇を認めたが、26週後では浸潤癌部で発現が低下する傾向にあった。3.ヒト膀胱がん組織を用いた解析:深達度の上昇に伴いCNA比は減少する傾向にあった。免疫組織学的検討において、UQCRBは表在がんでは強く均一に発現していた不要が、浸潤がん部では不均一な発現傾向を認めた。siRNAを用いた機能解析実験でノックダウン効率にばらつきがあり再現性に乏しかった。動物モデルを用いて、発がん過程におけるUQCRB、apoptosis関連蛋白、血管新生関連タンパク、iNOSについて免疫染色を行うことで、発がんまでのタンパク発現の経時的変化を比較検討することでUQCRBとがん関連タンパクの関係を考察する。また、in vitroでの機能解析実験も続行する。膀胱発がん動物モデルで同定されたCNA領域におけるヒトとの相同性について、データーベースを用いて検討を行い、ヒトとの相同性が判明している領域より、マウス染色体13領域のUqcrbに着目し、そのorthologにあたるヒトのUQCRB遺伝子を中心として本研究を進めることとなった。UQCRBはミトコンドリアの複合体IIIを形成するサブユニットの1つで、低酸素状態における血管新生に活性酸素種を誘導することを介して固形がんの進行に関与するという報告も成されているため、ヒト膀胱がん細胞株でsiRNAを用いて膀胱がん細胞株のUQCRBのノックダウンを行うことで、浸潤性膀胱がんの発症のメカニズムを解明し、診断法や治療法への発展を目的とした。当研究室にて保管しているヒト膀胱がん由来の細胞株(RT4, T24)を用いて機能解析を行った。UQCRBのsiRNAをリポフェクション法を用いて導入することで標的遺伝子をノックダウンし、RT-PCR法、Western bloting法でノックダウンの効率を確認した。HIF1aの発現をWestern blotting法で確認したが有意な差は見られなかった。そのため低酸素状態にてインキュベートすることで、血管新生関連タンパクであるHIF1αの発現を確認し、低酸素状態での検討を追加した。UQCRBをノックダウンし低酸素状態にてインキュベートすることでも、HIF1aのタンパク発現には有意な差を認めなかった。低酸素状態でのインキュベート時間やノックダウン効率の問題であるのか現在検討中である。UQCRBのノックダウン効率が安定しないこと、また低酸素状態でのインキュベート時間の検討が十分でないことより、Western blotting法でのタンパク発現量の再現性に乏しい。

また、免疫組織学的検討ではUQCRB、iNOSともに4,12週後と徐々に発現の上昇を認めたが、26週後では浸潤癌部で発現が低下する傾向にあった。3.ヒト膀胱がん組織を用いた解析:深達度の上昇に伴いCNA比は減少する傾向にあった。免疫組織学的検討において、UQCRBは表在がんでは強く均一に発現していた不要が、浸潤がん部では不均一な発現傾向を認めた。siRNAを用いた機能解析実験でノックダウン効率にばらつきがあり再現性に乏しかった。当初の予定通り、ヒト細胞株を用いてUQCRBをノックダウンすることで機能解析を行う。Western blotting法だけでなく、蛍光免疫染色での細胞数カウント、フローサイトメトリーも考慮する。この研究を発案するに至った膀胱癌マウスを用いての免疫染色でHIF1aのみではなく、iNOS、VEGFなどの血管新生関連タンパクを染色してみることで打開策を講じる。また、凍結標本よりタンパクを抽出してのWestern blotting法やRT-PCR法を用いての検討も考えている。さらに当科で保管しているヒト膀胱がん標本に対しPinpointTM Slide DNA Isolation Systemを用いてgenomic DNAを抽出し、UQCRBのCNAおよびタンパク発現を全摘標本とそれ以前に行われたTUR組織で比較することでその経時的変化を確認する。その結果によってはUQCRBをターゲットとした治療薬であるTerpestatinやHDNTを用いてのin Vitro、in Vivoの実験を行う予定とする。動物モデルを用いて、発がん過程におけるUQCRB、apoptosis関連蛋白、血管新生関連タンパク、iNOSについて免疫染色を行うことで、発がんまでのタンパク発現の経時的変化を比較検討することでUQCRBとがん関連タンパクの関係を考察する。また、in vitroでの機能解析実験も続行する。ゲノム解析中にシステム上のトラブルがあり、一時期解析が中断し研究が遅れたため次年度使用額が生じた。UQCRBのノックダウン効率を安定化させ、また低酸素状態でのインキュベート時間の検討を十分に行い、浸潤生膀胱癌の発症メカニズムを解明していきたい。ゲノム解析の外注会社を変更するなど、安定したゲノム解析をおこなっていく。
持続的な遺伝情報複製に対するマイクロ環境の重要性の実験的検証

自律複製する細胞のほとんど全てマイクロメーターサイズである。大きすぎるものも小さい過ぎるものも存在していない。この生命のサイズ依存性の一端を明らかにするために、本研究では人工的に遺伝情報の複製システムを構築し、その反応場サイズ依存性を実験的に検証した。その結果、ちょうど細胞と同じマイクロメーターサイズでのみ、寄生体の増殖を抑えることができ、持続的な複製が達成された。本研究は、細胞サイズは寄生体からの防御に密接に関わることを示唆する。本研究の目的は、マイクロサイズの反応場で寄生RNAが抑えられ、持続的な遺伝子複製が達成されるメカニズムを明らかにすることである。この目的のために、マイクロレベルで様々なサイズの反応場を調整し、その中で遺伝子複製反応を行なう必要があった。21年度は、まず、反応場サイズをマイクロレベルでコントロールする方法の確立を行なった。その結果、平均直径が2,4,8,16,32マイクロメートルの反応場をそれぞれ調整することができた。さらに、その内部で遺伝子複製反応が問題なく起こる条件を見出すことができた。詳細を以下に示す。本研究では、マイクロサイズの反応場として水溶液をオイルに分散させたw/oエマルションを用いた。しかし、通常の方法で作成したエマルションのサイズはばらばらであり、コントロールすることができなかった。したがって、反応場であるエマルションのサイズが内部の遺伝子複製反応に与える影響は明らかではなかった。そこで申請者らは、マイクロ流路を用いてエマルションをサイズごとに分離する装置を導入した。マイクロ流路の設計を最適化した結果、2-32マイクロメートルの各サイズのエマルションを分離して調整することができるようになった。また、もうひとつ別の問題として、エマルション内では遺伝子複製反応が阻害されるという問題があった。この問題に対しては、エマルション作成に用いたオイル、水溶液の組成を様々に変えて検討することにより、阻害しないエマルション組成を見出すことができた。今後、分離することができた各サイズのエマルション内で遺伝子複製を行い、その反応効率、寄生体の出現頻度、反応持続性を測定する。これらのサイズ依存性から、持続的な遺伝子複製が達成されるメカニズムを追及していく予定である。21年度は、まず、反応場サイズをマイクロレベルでコントロールする方法の確立を行ない、平均直径が2マイクロメートルから1ミリメートルに及ぶ範囲の反応場を調整する方法を確立した。さらに、界面活性剤の種類、反応場の調整法の検討により、その内部で遺伝子複製反応が阻害されることなく起こす条件を見出すことができた。22年度は、21年度で確立した方法を用い、実際に遺伝情報の自己複製反応を様々なサイズの反応場内で起こし、その反応効率について解析を行なった。その結果、反応場サイズが小さくなるに従って、寄生RNAの増幅が抑えられ、同時に遺伝情報の複製がより持続的になることが示された。さらに、この遺伝子複製反応の各素反応の反応速度定数を求め全反応をモデル化したところ、反応場サイズの効果は、反応場を区画化により寄生RNAが閉じ込められるという封じ込め効果で説明ができることを示した。本研究では、持続的な遺伝情報複製にとって、マイクロ環境により寄生体の増幅を防ぐことが重要であることを初めて実験的に示すことができた。この成果は、なぜほぼ全ての細胞がマイクロメーターサイズなのか?という未知の問題に対して一つの仮説を提示する。つまり、細胞が原始的で未だ複製の正確性が低かったころに、偶発的な寄生体の増幅を抑え、持続的に自身の遺伝情報を増幅するためにマイクロメーターサイズの区画構造に閉じ込められている必要があったという仮説である。本研究は、細胞サイズの起源という生物を理解する上で重要な問題について、実験的な証拠を提示できたという点において意義がある。
企業不祥事防止のマネジメント-風通しの良い組織風土の解明-

本研究は、企業不祥事を防止するための「企業不祥事防止のマネジメント」について、日本企業を対象とした詳細な定性的調査に基づき、実証的に解明しようとするものである。その際、実務家の間で企業不祥事防止のキーワードとなっている「風通しの良い組織風土(従業員の倫理的問題に対する開示・指摘行動を促進する風土)」に注目し、この風土の構成要素と先行条件、さらには企業不祥事との因果関係を検討することにより、企業不祥事防止のマネジメントへの提言を試みる。
チロシン硫酸化に注目した糖尿病性合併症のバイオマーカー探索

タンパク質のチロシン硫酸化は、生命の維持に必須の生体内反応であるが、その詳細はまだ明らかにされていない。本研究でははじめに、分解されやすいとされるチロシン硫酸化ペプチドを安定に解析する方法について検討し、これを確立した。次に、培養細胞から分泌タンパク質を回収し、この中からチロシン硫酸化タンパク質を網羅的に探索した。その結果、新規硫酸化タンパク質を複数発見した。さらに、臨床での扱いが簡便な尿中から硫酸化タンパク質を検出するに成功した。今後、本研究により同定したタンパク質チロシン硫酸化と疾患の関係を明らかにすることで、新たなバイオマーカーの開発が期待できる。本研究では、「チロシン硫酸化」という翻訳後修飾に着目してプロテオーム解析することにより、これまでに見つかっていないが機能的に有用であることが想定される新しいチロシン硫酸化タンパク質ならびにペプチドを発見することを目的とした。不安定であると言われる硫酸化ペプチドの性質を調べるために、モデルペプチドやタンパク質を用いて、酸やアルカリ、熱に対する安定性の検討を行った。その結果、通常の分画・分析作業には問題ない安定性があることが分かった。さらに、質量分析で判別できないリン酸化と明確に区別するために、脱硫酸化するための酸加水分解や脱リン酸化のためのアルカリ加水分解やアルカリフォスファターゼ処理の条件検討を行った結果、既報通り酸加水分解は可能であったが、アルカリ加水分解では、脱硫酸化しないもののペプチド自体が分解されたり修飾されてしまうことが分かった。リン酸化との区別は、アルカリフォスファターゼ処理が良いことが分かった。リン酸化ペプチドの効率的な分離のため、酸性のBufferを用いたSCXによるイオン交換クロマトグラフィーを用いる報告があるため、これをさらにマイナスイオンの強い硫酸化ペプチドに応用して、リン酸化と硫酸化の効率的な区別をしようと試みたところ、差はみられたが、主鎖ペプチドの配列に依存してしまい、汎用性のある方法にはならなかった。解析が難しいとされる質量分析装置での測定は、測定条件の調整を行ったり、解析ソフトウエアのメーカーとともにチロシン硫酸化解析用のパラメーターを調節したりすることで測定と解析を可能にした。チロシン硫酸化のみに注目して研究してきたが、平成25年度は、質量分析では区別をすることが難しいリン酸化との違いを明確にしながら研究することができ、新たな視点でそれぞれの特徴を把握することができた。糖尿病の合併症の中でも腎症は、微小炎症により引き起こされることが注目されている。本研究では、「チロシン硫酸化」という翻訳後修飾に着目してプロテオーム解析することにより、これまでに見つかっていないが機能的に有用であることが想定される新しいバイオマーカーを発見し、糖尿病合併症の早期診断や治療に役立てることを目的とした。糖尿病性腎症の変動をとらえやすく、患者からの収集も容易である尿をターゲットとすることにし、尿タンパク質を用いて、我々が作製したチロシン硫酸化認識抗体にてウエスタンブロッティングできる条件を確立した。尿には、健常者でも、また腎症患者では多量のアルブミンやIgGがあるため、市販の抗体カラムを用いて除去することが必要であった。また、脱硫酸化酵素による処理をしたところ、ウエスタンブロッティングのバンドが減少したことから、チロシン硫酸化特異的なタンパク質を検出できていると考えられる。それらを踏まえて、糖尿病性腎症の患者の尿検体を用いてウエスタンブロッティングを行い、複数のバンドを確認することができたが、糖尿病性腎症特異的なバンドや変動するバンドを見出すことはできなかったため、糖尿病性腎症では、差異がみられない可能性があるか、作製した抗体のキャラクタリゼーションが不十分である可能性がある。そこで、糖尿病患者検体を用いて、尿プロテオーム/ペプチドーム解析を行ったところ、硫酸化タンパク質/ペプチドの変動は見出されなかったが、非硫酸化タンパク質やペプチドで、新規に変動があるものを見出すことができ、ターゲットペプチド特異的なMRM測定法を確立し、多検体を用いた定量解析による検証を行っても、糖尿病性腎症の1期と3期を比較して有意差が得られる結果となった。これは、新規バイオマーカーとして有用な可能性がある。研究課題最終年度である本年度は、チロシン硫酸化に着目してプロテオーム解析することにより、これまでに見つかっていないが機能的に有用であることが想定される新規チロシン硫酸化タンパク質を発見した。硫酸化チロシン認識抗体を用いてチロシン硫酸化タンパク質を多く含む細胞の種類と分画法の検討を行い、マウス筋芽細胞C2C12細胞の培養上清を用いることにした。分泌タンパク質を含む培養上清を濃縮し、二次元電気泳動で分離後、硫酸化チロシン抗体にてウエスタンブロッティングしたところ、酸性高分子領域に多数の陽性スポットを検出し、陽性タンパク質を質量分析装置で解析した。

その結果、既存のチロシン硫酸化タンパク質(Fibronectin, Nidogen)を含む、タンパク質を同定し、新規チロシン硫酸化候補タンパク質(細胞外マトリクスや接着因子など)を複数同定することができた。研究期間全体を通して、以下の成果が得られた。糖尿病患者検体を用いて、尿プロテオーム/ペプチドーム解析を行ったところ、硫酸化の変動は見出すことができなかったが、糖尿病性腎症のバイオマーカーになる可能性がある新規ターゲットを見出すことができた。新規チロシン硫酸化タンパク質探索のための準備を進め、硫酸化チロシン認識抗体を用いた二次元ウエスタンブロッティング法により、新規チロシン硫酸化候補タンパク質を同定することができた。本研究で発見したタンパク質は、個体の発生と生命の維持重要なチロシン硫酸化の機能に重要な役割を果たす可能性がある。生化学今年度は、チロシン硫酸化ペプチドの基本的な性質を自分自身でとらえて、これからの探索に欠かせない情報を多く得ることができた。大腸菌で発現させた硫酸転移酵素を用いて、インビトロで硫酸化反応を行い、これまでは35Sを用いてRIで検出する方法が主流だったが、質量分析装置にて、硫酸化ペプチドの親イオンをターゲットとして面積値で定量することも可能となった。イオン交換クロマトグラフィーによる分離は、リン酸化と硫酸化を理論通り分離することはできたが、ペプチド主鎖のアミノ酸に依存するため、多種類のペプチドには適応できないことが分かるなど、仮説通りにいかないこともあったものの、抗体カラムを使用するなど他の方法で解決できるため、対応可能と考えられる。年度途中で産前産後休暇を取得してしまったが、1年間の研究の延長が認められたため、さらに研究を進めていく所存である。チロシン硫酸化をターゲットにした、尿タンパク質を解析するために、尿タンパク質の処理法の確立やウエスタンブロッティングの最適化を行うことができた。また、脱硫酸化酵素による処理をしたところ、バンドの減少がみられたことから、チロシン硫酸化特異的なタンパク質の検出を確認した。そして、実際に糖尿病性腎症の尿タンパク質の解析を行った。ところが、複数のバンドを確認することができたが、糖尿病性腎症特異的に変動するバンドを見出すことはできなかったため、糖尿病性腎症では、差異がみられない可能性があるか、作製した抗体のキャラクタリゼーションが不十分であり、非特異的バンドを検出してしまった可能性がある。しかし、貴重な糖尿病性腎症の患者の尿検体を用いて、プロテオーム/ペプチドーム解析を行ったところ、新規に変動があるものを見出すことができ、特異的なMRM測定法を確立することができた。またさらに、多検体を用いたMRM定量解析による検証を行っても、糖尿病性腎症の重症度に応じて有意差が得られる結果となり、新しいバイオマーカーとして、有用な可能性がある。チロシン硫酸化ペプチドの性質や、解析方法などが整ってきたところなので、これから本格的に新規硫酸化タンパク質・ペプチドの探索を進めていく。さらに、実験動物の組織や培養細胞を用いて、網羅的なプロテオーム解析をするために、二次元電気泳動や、抗体を用いたウエスタンブロッティングを行うことによって、チロシン硫酸化タンパク質・ペプチドの探索を進めていく。
シンボリック相互作用論の伝統に基づく精神障害者福祉のフィールド・ワーク研究

1988年に精神衛生法が精神保健法として改正されて以来、この分野での福祉的施策、制度、施設などの改善は急ピッチで進行している。その大きな変化のなかで、精神障害当事者、家族、医療・福祉の関係者すべてが、進むべき道を模索している。報告者は、この変化を社会的相互作用過程として記述し、理論化することをめざしている。この試みは、社会学理論の発展に貢献し、「こころ」の安らぎを求めて宗教や心理療法への関心が高まっている現在を、従来とは違った角度から照射するものである。本年度は、平成9年度に名古屋の患者会で採録した、メンバーたちの精神障害者小規模作業所での経験をめぐる座談会の分析を進め、シンボリック相互作用論におけるグランデッド・セオリーなどの技法を用いた解釈を執筆した。さらに、平成9年度以降、2度訪れた沖縄県那覇市での精神保険福祉の実践について、名古屋・大阪での実践と比較していく。また、シカゴ・モノグラフ、プラグマティズムの社会・科学論とシンボリック相互作用論の関係についても研究を深め、その理論的伝統を明確化する。そして、近年の分析技法としては、話法・会話分析の技法への理解を深め、精神保健福祉に関する枠組みを構成する。その枠組みに基づき、フィールド調査によるデータを整理し、これまで積み重ねて来た社会心理学的な枠組みに基づいて、収集した資料を整理していきたい。平成9年度には、本研究に関連する業績としては、雑誌論文「自己欺瞞について一他者の感情性の誤解、その理論モデル、厚い記述、解釈」を公刊できた。これは、こころの病気に陥った人の主観的・社会的状況を分析する基礎概念として、J.-P.サルトルの業績から自己欺瞞(bad faith,mauvaise fois)の概念を取りあげ、日常生活の事例に適用を試みたものである。また、この夏には、その続編として「自己欺瞞とダブル・バインド-論理階型論による概念の整理と事例解釈」を執筆し、これは平成10年度に公刊される予定である。このように本年度に公刊・執筆した論考のなかには、本研究のテーマである精神障害者福祉のフィールドワーク研究そのものについての作品は含まれていないが、研究活動としては、従来通り、名古屋・大阪での患者会活動の参与観察を継続し、遠隔地の調査としても、秋に沖縄県・那覇市での実践を、数日間、観察してきた。名古屋での成果は、患者会メンバー自身による精神障害者小規模作業者の訪問が行われ、その時の感想をめぐる議論(フリー・ト-ク)を、二時間程度、録音できたことである。精神保健福祉の分野では当事者やその家族のプライバシー保護のために、このような業界の内情をめぐる微妙な話題に関してのデータを詳しく記録できる機械は滅多となく、今回は、当日の話題の進行からその録音テープの内容の筆記まですべてわたしが関与することができたので、分析を実証的に進めることでの研究の進展が期待できる。また、夏に訪問した沖縄では、名古屋・大阪と違って病気そのものを当事者・家族がオープンにし、社会にアピールする形で支援を取り付ける運動が行われていて、これまで集めてきたデータに対する比較対象としては最適であり、今後の調査への取り組み次第で大きな理論的実りを生むことが期待できる。
DNA・タンパク質相互作用の1分子イメージングと計測

DNAの相同組み換えの過程において十字型構造をしたHolliday構造DNAが形成され、この十字型分岐点の移動により組み換えが進行する。分岐点移動反応にはRuvABタンパク質複合体が関与する。RuvAはHolliday構造に特異的に結合するタンパク質である。また、RuvAはRuvBと複合体を形成する。RuvBは六量体のリング構造を形成し、RuvAの両側からはさむように結合する。分岐点の移動はモータータンパク質であるRuvBのATP加水分解のエネルギーを利用して行われる。我々はRuvABタンパク質複合体によるHolliday構造DNAの分岐点移動を光学顕微鏡で直接検出することを試みた。RuvABによる分岐点移動が起こるときDNAの回転がおこる。そこで、この回転運動を検出することにした。まず、観察に必要な十字型構造のDNAを作製した。そしてその十字型構造DNAの一方をスライドガラス基板に固定し、もう片側に磁気ビーズを付け、磁石で引っ張りあげた。そこにRuvA、RuvBタンパク質を加え、RuvAB-Holliday構造複合体を形成させ、エネルギー源であるATPを加え、ビーズの動きを観察する。RuvBがHolliday構造DNAの上下方向に結合すると、DNAを上下方向に押し出すようにして、DNAは反時計方向にねじれ、反時計方向のビーズの回転が観察されることが予想される。左右方向にRuvBが結合した場合、ビーズの回転は時計回りになる。これまでに、何例かビーズの回転が観察された。今後、さらにこのビーズの回転を詳細に観察し、これまでの生化学的解析からでは測定が困難であった分岐点移動反応の速度や1分子のATPの加水分解にともなって移動するDNAの長さ等の測定を行い、RuvABタンパク質複合体よるHolliday構造DNAの分岐点移動反応のメカニズムを明らかにしたい。DNAと相互作用するタンパク質として、大腸菌からRNAポリメラーゼを調製した。調製後のRNAポリメラーゼの活性測定を行い、正常な活性を有していることを確認した。次に顕微鏡システムのセットアップを行った。DNAは非常に強力なA1プロモーターが1つ存在する欠失突然変異T7ファージを鋳型に、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてA1プロモーターを含む長さ2マイクロメーター程度のDNAをPCR法で調製した。その際、片方のプライマーとするオリゴヌクレオチドをビオチン化しておきDNAの片端をビオチン化した。合成したDNAとRNAポリメラーゼをATP, GTP, CTP, ApU存在下で30度、3分程度処理するとRNAポリメラーゼはA1プロモーター部位から転写を開始し、20番目のAのところで転写を休止し、いわゆるstalled complexを形成することを確認した。この転写複合体をガラス基板上に固定しDNAの片端にストレプトアビジンビーズを結合させ、NTPを加えビーズのブラウン運動を観察した。はじめビーズは激しくブラウン運動しているが、転写が進むにつれて、DNAがRNAポリメラーゼにたぐり寄せられていき、ビーズのブラウン運動がしだいに小さくなり、最後にはDNAが完全にたぐり寄せられてしまい。ビーズのブラウン運動が停止するのが観察できた。ブラウン運動停止までの時間とDNAの長さからRNAポリメラーゼの転写活性を見積もることができた。これまでに、ガラス基板上に固定したRNAポリメラーゼ分子が、片端にプラスチックビーズを結合させたDNAを転写する際のビーズのブラウン運動の変化から、RNAポリメラーゼの転写速度を見積ることができるようになった。そこで、この実験系を少し改変して、転写中、RNAポリメラーゼはDNAの2重らせん構造をなぞって、らせん階段を昇っていくようにくるくると回転するかということを調べることにした。まず転写中の回転運動を観察するシステムを開発した。RNAポリメラーゼとDNAの複合体をガラス基板上に固定し、あらかじめビーズを結合させるためにビオチン化したDNAの片端に回転観察のための目印として非常に小さな蛍光ビーズ(直径20nm)をつけた、直径約0.8μmのストレプトアビジンビーズを結合させ、RNAポリメラーゼの転写を開始させる。ビーズの動きを蛍光顕微鏡で観察すると、ビーズは時計回りにくるくると回転した。時計方向の回転は、RNAポリメラーゼが右巻き2重らせんにそってDNAをたぐり寄せる時に予想される回転方向と一致する。回転速度は最高で5秒間に1回転程度であった。DNAは非常に柔らかいので、転写とは無関係に回転ブラウン運動をしている。そのために時々反時計方向にも回る。基質である4種類のヌクレオチドの濃度を変えて、回転の速度を測定した。ヌクレオチド濃度が低い時、回転の速度は遅く、濃度が高くなるにつれて回転速度は速くなっていった。これはRNAポリメラーゼのRNA合成速度を反映している。ヌクレオチド濃度が低いとき、回転速度とRNA合成速度を比較してみると、RNAポリメラーゼがDNAの2重らせんの溝を正確になぞりながら転写していることを示唆していた。昨年までに、RNAポリメラーゼとDNAの転写複合体をガラス基板上に固定し、DNAの片端につけたビーズの動きを観察した結果、RNAポリメラーゼは、10塩基対で1回転するDNAの右巻き2重らせん構造を正確になぞりながら、転写していることがわかった。すなわち、RNAポリメラーゼがDNA塩基配列上を1塩基進む間にDNAを中心軸として、36度回転することが示唆された。

そこで、RNAポリメラーゼがヌクレオチドを付加する転写反応の分子メカニズムを明らかにするために、RNAポリメラーゼが個々のヌクレオチドを付加するごとにおこる、36度ずつの回転を検出する系を確立し、転写反応の素過程、すなわち、1ヌクレオチドを付加する反応過程を可視化することを目指す実験を行った。まず、十数残基単位の繰り返し配列DNAを作成し、この配列を転写する際にみられるDNA回転運動のステップを検出することから始めることにした。そこで、5'側にT7A1プロモーター、その後Aが2個A以外の塩基が11個(AANNNNNNNNNNN)という配列が45回繰り返し、3'端には、回転観察のためのビーズを結合させるビオチン化部位という特殊な配列を持った、全長およそ0.25μmのDNAを調製した。シミュレーションの結果、このDNAを鋳型に用いた場合、溶液中のGTP、CTP、UTP濃度を各々2μM、ATP濃度を0.5μM程度にすると、Aの部分で転写が遅くなることによって、DNAの回転が断続的になることが予想される。現時点では、断続的なDNAの回転運動を再現性よく観察するまでには至っていない。以上のような高精度な計測を成功させるためには、転写に伴うDNAの回転運動を容易に観察できることが大事である。そこで、転写に伴うDNAの回転運動を高効率で検出できるようにRNAポリメラーゼαサブユニットの遺伝子を改変しのC末端側にヒスチジンタグを付加し、このヒスチジンタグを介して基板上に固定できるようにした。これまでに、我々は大腸菌のRNAポリメラーゼとDNAの転写複合体をガラス基板上に固定し、DNAの片端に付けたビーズの動きを観察した結果、RNAポリメラーゼは、10塩基対で1回転するDNAの右巻き2重らせん構造を正確になぞりながら、転写しているらしいことがわかった。この実験から、RNAポリメラーゼは1塩基転写するごとにDNAを中心軸として、36度回転することが示唆された。そこで、転写反応の分子メカニズムを明らかにするために、RNAポリメラーゼが個々のヌクレオチドを付加するごとに起こる、36度ずつの回転を検出する系を確立し、転写反応の素過程、すなわち、1ヌクレオチドを付加する反応過程を可視化することを目指す実験を行うことにした。このような高精度な計測を成功させるためには、転写に伴うDNAの回転運動を容易に観察できることが大事である。これまでの実験系では、DNAの回転運動を観察できる確率が非常に低いことが実験を行う上での大きな問題点であった。これは恐らく、RNAポリメラーゼをガラス基板上に固定する際に、転写活性に重要な部分が変性してしまうことが原因であると考えられる。そこで、4種類のサブユニットα_2ββ'σからなる大腸菌RNAポリメラーゼのうち、転写活性にほとんど関与しないαサブユニットのC末端部位にヒスチジンタグ配列を付加した組換えタンパク質を大腸菌に発現させ、ヒスチジンタグ付きRMAポリメラーゼ複合体を精製した。このRNAポリメラーゼを用いて転写反応に伴うDNAの回転を観察したところ、改変前のものと同様の回転運動が観察された。しかし、回転運動を高効率で観察することは出来なかった。これはRNAポリメラーゼやDNAとNi-NTA間の非特異的な結合が原因だと考えられる。