hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無塩化型凝結促進剤の開発と産業副産物を用いたコンクリートへの適用性に関する研究

製鋼過程で発生する高炉スラグや火力発電所から発生する石炭灰(フライアッシュ)等の産業副産物をコンクリート混和材として利用する場合,著しい凝結遅延を招く場合がある。従来から,凝結促進剤として塩化カルシウムが使用されてきたが,現在,コンクリート構造物内の鉄筋腐食を誘発させるため使用できない状況にある。以上のことから,本研究の目的は,塩化物を含有しない凝結促進剤を開発することにある。実験の結果,凝結促進剤の主成分として硫酸アルミニウム(Al_2(SO_4)_2)と硝酸バリウム(Ba(NO_3)_2)を選定するに至った。高性能AE減水剤,増粘剤または混和材として産業副産物である高炉スラグ,フライアッシュを混合したコンクリートへの無塩化型凝結促進剤の適用性を検討し,流動保持性能と凝結促進性能をバランスよく発揮させるためのAl_2(SO_4)_2とBa(NO_3)_2の適正添加比率は1:1.5であることを見出した。コンクリートの練混ぜ直後において,無塩化型凝結促進剤添加による流動性低下は認められず,練混ぜ後1時間経過時における流動性低下を510%程度に抑制しながら凝結時間を3040%短縮することができた。これは,現在一般的な凝結促進剤である亜硝酸カルシウムと比較して約15%の短縮となった。圧縮強度発現については,初期材齢から長期材齢にかけて強度低下は認められず,高炉スラグの場合は,材齢1日から28日間の各材齢において約20%以上の増加が認められた。また,凍結融解抵抗性については影響が認められなかったが,初期乾燥収縮量は若干増加する傾向にあり初期養生に対する注意が必要であることが明らかになった。さらに,産業副産物に含有する微量の重金属酸化物の内,CrO_3,PbO,ZnOがセメントの水和反応を遅延させる要因となることを明らかにし,これら重金属酸化物が凝結遅延を発生させる原因として,セメント水和物のケイ酸構造の鎖長分布に影響を及ぼすことを明らかにした。近年,高流動コンクリートに代表される高機能性を持たせたコンクリートでは,高性能AE減水剤や増粘剤などの有機化合物,さらに,高炉スラグ微粉末,フライアッシュ等の産業副産物を利用したコンクリート混和材を多量に使用している。また,高炉スラグのように鉄鋼スラグである転炉スラグ等や,一般ごみ焼却場から発生する焼却灰,下水処理場から発生する汚泥焼却灰をコンクリート材料として利用する研究成果が多く得られつつある。これらの有機物化合物や産業副産物を使用したコンクリートでは凝結遅延が問題となる。従来から良好な凝結促進剤として使用されてきた塩化カルシウムは含有する塩化物が鉄筋の腐食を誘発することから使用不可となっている。本研究は,塩化物を含まない凝結促進剤を開発することを目的としており,現在までの成果から以下のことを明らかにした。凝結促進剤の主成分となる硝酸塩と硫酸塩を構成する金属イオンの水和開始効果を比較した結果,硫酸アルミニウム(Al_2(SO_4)_2)と硝酸バリウム(Ba(NO_3)_2)を選定するに至った。

次に,高性能AE減水剤添加のモルタル試験とそのセメントサスペンションの液相分析より,硫酸アルミニウム中のアルミニウムイオン(Al^<3+>)は,水和反応によりセメントから溶出するカルシウムイオン(Ca^<2+>)と反応しコンクリートの凝結を促進させる機能を持ち,硝酸バリウム中のバリウムイオン(Ba^<2+>)は,流動性を一定時間保持させるためのAl_2(SO_4)_2中のSO_4^<2->と徐々に結合し凝結反応速度を調整する機能を持つことを確認した。また,Al_2(SO_4)_2とBa(NO_3)_2の適正添加比率はモル比で1:2となり,凝結時間の短縮率は約40%となった。さらに現在は,高性能AE減水剤,増粘剤,混和材として高炉スラグ微粉末,フライアッシュを添加した高流動コンクリートに対するこの無塩化型凝結促進剤の性能評価を実施している。製鋼過程で発生する高炉スラグや火力発電所から発生する石炭灰(フライアッシュ)等の産業副産物をコンクリート混和材として利用する場合,凝結時間の著しい遅延を招く場合がある。従来から,凝結促進剤として塩化カルシウムが使用されてきたが,現在,コンクリート構造物内の鉄筋腐食を誘発させるため使用できない状況にある。以上のことから,本研究の目的は,塩化物を含有しない凝結促進剤を開発することにあり,昨年の成果から,凝結促進剤の主成分として,硫酸アルミニウム(Al_2(SO_4)_2)と硝酸バリウム(Ba(NO_3)_2)を選定するに至った。今年度は,高性能AE減水剤,増粘剤,混和材として産業副産物である高炉スラグ,フライアッシュを混合したコンクリートへのこの無塩化型凝結促進剤の適用性を検討し以下のことを明らかにした。高炉スラグまたはフライアッシュを混合した場合の流動保持性能と凝結促進性能をバランスよく発揮させるためのAl_2(SO_4)_2とBa(NO_3)_2の適正添加比率はモル比で1:1.5であることを見出した。流動保持性については,1時間経過時においても凝結促進剤無添加と比較して10%程度の低下に抑えられることが明らかとなった。凝結時間の短縮率は,高炉スラグで約40%,フライアッシュで約30%となった。圧縮強度発現については,フライアッシュについては影響が見られず,高炉スラグは,材齢1日から28日間の各材齢において約20%の増加が認められた。さらに,水和促進効果に伴いセメント水和物結晶が大きく成長し,凍結融解抵抗性の低下と初期乾燥収縮量の増加が懸念されたが,凍結融解抵抗性については影響が無く,初期乾燥収縮量は高炉スラグの場合約10%の増加,フライアッシュの場合約20%の増加に止まった。以上のから,今回提案した無塩化型凝結促進剤は産業副産物を利用したコンクリートにも十分適用可能であることが明らかとなった。
上咽頭癌のリンパ球浸潤におけるヒト内在性レトロウイルスの関与

ヒト内在性レトロウイルス(HERV)タンパクがスーパー抗原としてT cell receptorに結合して免疫抑制的に機能することが報告されている。また、HERVはいくつかの癌種で高発現していることが報告されているが、上咽頭癌では皆無である。我々はEpstein-Barrウイルス(EBV)関連上咽頭癌の微小環境では「リンパ球浸潤が著しいにも関わらず免疫寛容であること」に着目し、この現象にHERVが関連すると考えた。本研究では、仮説「上咽頭癌ではEBVがHERV関連タンパクの発現を促進し、その結果、上咽頭癌の微小環境におけるリンパ球集簇と免疫寛容が誘導される」を検証する。さらに、細胞外小胞exosomeへの内包やEBVによるHERV転写活性メカニズムについても検討を行う。上咽頭癌組織と細胞株でHERVの発現を認めたため、昨年度、HERVがRE-1 likeモチーフを多く含むことから転写抑制因子であるRE1-silencing transcription factor (REST/NRSF)の発現に着目して研究を行った。LMP1陽性細胞株ではそうでないものと比べてRESTの発現が高いことが分かった。ユビキチンプロテアソーム系の阻害ではRESTの発現上昇は軽度であったが、LMP1を強制発現させるとRESTのタンパクとmRNAレベルでの発現は強く上昇することが分かった。今年度はRESTを強制発現させると癌幹細胞の表現型で見られるようにCD24の発現が抑制され、さらにマトリゲルを通過する細胞の数が増えたことから、RESTは転写抑制因子として上咽頭癌細胞の癌幹細胞化に関わっており、上咽頭癌の浸潤能に寄与することが示唆された。ヒト内在性レトロウイルス(HERV)蛋白がスーパー抗原として非特異的にTcell receptorに結合して免疫を過剰に活性化することが報告されている。申請者はEpstein-Barrウイルス(EBV)関連上咽頭癌の微小環境ではリンパ球浸潤が著しいことに着目し、この現象にスーパー抗原であるHERVが関与すると考えた。本研究では、仮説「上咽頭癌ではEBVがHERV関連蛋白の発現を促進し、それが細胞外へ放出された結果、上咽頭癌の微小環境におけるリンパ球集簇が誘導される」を検証する。さらに、EBVによるHERV転写活性化メカニズムとリンパ球からのサイトカインによる腫瘍微小環境形成についても検討を行う。本研究計画では以下の検討を行う。1) EBV感染細胞株や上咽頭癌組織におけるHERV-K蛋白検出2) EBVによるHERV-K蛋白発現機構の解明3)上咽頭癌患者におけるHERV-K蛋白発現と癌の浸潤転移や予後の解析まず、上咽頭癌30症例を目標にしているが、上咽頭癌10症例でHERVとEBV癌タンパクであるLMP1に対する抗体を用上咽頭癌組織の免疫染色を行った。複数の抗体を用い実験を行い、HERVとLMP1に対する有効な抗体を確認することができた。まだ有意な差ではないがLMP1とHERVの発現に相関関係がある傾向にあり、今後残り20症例の免疫染色を行う予定である。また、vitroの実験としてEBV感染細胞とEBV非感染細胞を用いてHERVに対するwestern blottingを行い、EBV感染細胞でHERVの発現が認められた。上咽頭癌組織と細胞株でHERVの発現を認めることができたため。我々ははEpstein-Barrウイルス(EBV)関連上咽頭癌の微小環境では「リンパ球浸潤が著しいにも関わらず免疫寛容であること」に着目し、この現象にHERVが関連すると考えた。exosomeの実験系に着手できていないため。上咽頭癌組織と細胞株でHERVの発現を認めたため、昨年度、HERVがRE-

1 likeモチーフを多く含むことから転写抑制因子であるRE1-silencing transcription factor (REST/NRSF)の発現に着目して研究を行った。LMP1陽性細胞株ではそうでないものと比べてRESTの発現が高いことが分かった。ユビキチンプロテアソーム系の阻害ではRESTの発現上昇は軽度であったが、LMP1を強制発現させるとRESTのタンパクとmRNAレベルでの発現は強く上昇することが分かった。今年度はRESTを強制発現させると癌幹細胞の表現型で見られるようにCD24の発現が抑制され、さらにマトリゲルを通過する細胞の数が増えたことから、RESTは転写抑制因子として上咽頭癌細胞の癌幹細胞化に関わっており、上咽頭癌の浸潤能に寄与することが示唆された。EBV関連転写因子のherv-kプロモーターへの結合の検討(溶解感染関与の場合)本来はサイレントであるHERVがEBVの溶解感染サイクル経路を利用して遺伝子発現をしていると考え、EBV転写因子(ZEBRAやRta)のHERV-Kプロモータ上への結合をクロマチン免疫沈降で検証する。EBV蛋白によるherv-kプロモーター活性の解析(潜伏感染関与の場合)herv-kプロモーターはメチル化され、転写調節がされている。そこで、LMP1、LMP2A、EBNA1をトランスフェクションした細胞で転写調節領域のメチル化の程度を半定量的に解析する。1) 5-Aza-cytidine処理で脱メチル化処理した細胞としてない細胞から、それぞれゲノムDNA抽出2)そのゲノムDNAをDNaseで1000bp程度の長さに切断3)メチル化DNA結合蛋白を結合させたビーズで、メチル化DNAを回収し、それを鋳型にherv-kの転写調節領域のPCR増幅を解析HERVもしくはRESTのexosomeにおける発現を検討する。細胞培養維持費、抗体購入費、EBV蛋白によるherv-kプロモーター活性の解析を行うため、プロモーター解析キットの購入、学会発表の旅費などのため。次年度にexosome抽出キットなどを頻回に使用するためEBV感染細胞の培養を継続し、プロモーターアッセイなどを行う。また、研究内容に関して学会発表を行う。
病は気からを科学する－交感神経と転移

本研究ではストレス受容器である交感神経に着目し、転移における交感神経の機能解析を行った。交感神経は原発巣において血管新生に関与し、がん細胞の増殖に寄与していること、また、転移巣においては転移前微小環境形成に関与していることが示唆された。さらに、交感神経は免疫担当細胞と直接相互作用していること、また交感神経β受容体アゴニストが骨髄由来免疫抑制細胞に作用し炎症サイトカイン群の発現を誘導することが明らかとなった。病は気からと言われるようにストレス受容器である交感神経と疾患は密接な機能的関連を有している。例えば、交感神経の有無が前立腺がんの進行・再発に関与すること、また、交感神経の活性化ががんの増殖や転移を促進することが報告されている。しかし、いずれも分子機構は不明であり現象論の域を出ない。本研究は日本人の死因の第一位であるがんと交感神経活動に着目し、がんと交感神経活動の機能的関連を明らかにしがん患者の予後改善を目指す。腫瘍組織内に貫入した交感神経の機能を解明するために交感神経を選択的に除去する神経毒である6-OHDAを投与しその効果を検討した。6-OHDAの投与により腫瘍組織内に貫入したチロシンヒドロキシラーゼ陽性の神経の消失が確認された。また、新生腫瘍血管CD31およびMECAで標識される血管内皮細胞の減少がみとめられたことから血管新生が減少したことが示唆された。さらに、6-OHDA投与群が得られた腫瘍血管ではSMAとCD31の共局在が多く観察されたことから、腫瘍血管のペリサイトのカバー率が上昇し未熟な腫瘍血管の正常化が亢進していることが示唆された。また、予備実験において6-OHDAの投与で転移が顕著に抑制されたことから交感神経阻害薬であるβブロッカーが転移を抑制することが示唆された。よって、βブロッカーを担がんマウスに投与し転移に対する効果を検討したところ肺転移頻度の抑制がみとめられた。現在、その詳細な抑制機構について解析を行っている。原発巣における交感神経の機能解析およびβブロッカーの転移に対する効果の検討が順調で当初予定した研究計画に沿って進んでいるため。1年以上の交感神経β受容体遮断薬の服用歴がある乳がん患者は服用歴がない患者と比べて予後が良いとの統計結果が報告されている。しかしながら、乳がんの予後改善における交感神経β受容体遮断薬の詳細な機能は不明であると同時に臨床では予後改善を目的として使用されていない。昨年度は原発巣における交感神経の機能解析を行い、原発巣において交感神経は血管新生に関与し腫瘍の増大に寄与していることが明らかとなった。今年度は転移巣における交感神経に着目し機能解析を行った。神経毒6-OHDAをマウスに投与し可逆的に交感神経を消失させ、転移前微小環境形成における交感神経の機能解析を行った。その結果、骨髄由来免疫抑制細胞の肺への遊走が低下し、炎症性サイカイン群の発現が低下していた。次に炎症サイトカイン群の発現における交感神経の機能を検討したところ、交感神経はマクロファージと直接相互作用していること、また交感神経β受容体アゴニストがマクロファージに作用し炎症サイトカイン群の発現を誘導することがあきらかとなった。今後はβ1-β3の各交感神経β受容体のノックアウトマウスまたは各β受容体特異的阻害剤を用いてβ1-β3のどの交感神経受容体が転移に寄与しているのかを明らかにしていく予定である。また、肺の透明化処理および共焦点顕微鏡を用いた観察により3次元的な交感神経ネットワークの観察に成功しており、詳細な転移微小環境における交感神経の機能の解明が期待できる。3種類のβアドレナリン受容体のうち、どのβアドレナリン受容体依存性に転移を促進しているのか選択的アンタゴニストを用いて解明する予定である。アンタゴニストで依存性が明らかとならない場合はノックアウトマウスを用いて解析を行う予定である。分子細胞生物学実験試薬を購入しようとしたが残金が不足しており次年度購入する予定としたため今年度予算分から昨年度末に購入予定の試薬を購入し、研究計画に沿って支出していく。
眼の前房で誘導したトレランスによる臓器移植生着手法の開発

最終目標は、「ドナーの細胞を培養し、前房内に移植する事によってドナーアロ抗原に対するトレランスを誘導して臓器移植の生着を勝ち取ること」である。生体肝移植などにおいては、ドナーが生存しているため、ドナーに対するトレランスを誘導してから臓器移植を施行することも可能である。それには、(1)ドナー細胞を前房内に安全に生着させる事、(2)トレランス誘導を証明すること、(3)臓器移植をも生着させる事を証明すること、(4)ヒトへの応用に向けたプロトコールを作成する事、が本研究の流れである。まずはマウスモデルを用いて(1)(2)を検討した。前房内に角膜内皮細胞を移植した際には拒絶応答も生じず、安全にドナー細胞が生着し、8週間経過後はドナーに対するトレランスが誘導されていることが明らかとなり、全層角膜移植は完全に生着することが明らかとなった。さらに、心臓移植においても有意に生着することが分かった。しかし、臓器特異的に発現しているアロ抗原を抑制出来ないと考えられ、心臓移植において急性拒絶は100%抑制されたにも関わらず、心筋細胞内に炎症応答が生じていたため、さらなる解決策が必要となった。まずは、血管内皮細胞を用いたところ、前房内に注入した際にはほぼ全例において前房出血を来す事が始めて明らかとなり、トレランス誘導が実現したとしても視力を失う結果となるため臨床応用には問題があることが明らかとなった。そこで、前房出血を生じないような薬剤治療の検討や前房を用いずにトレランスを誘導できる手法の開発を手がけている。ドナー細胞を前房内に移植して長期生着させる事によってトレランスを誘導可能であることは明らかとなった。健常人ドナーから角膜内皮細胞を採取することは不可能であるため、血管内皮細胞の採取というプロトコールを考案したが、マウスモデルにおいて血管内皮細胞の前房内注入では高率に前房出血が生じる事が判明し、種々の治療を施しても避けることが出来なかった。臨床においては視力低下や緑内障などの合併症が生じる事となるため、この手法は非現実的と考えられた。前房内に移植することを主として考慮する場合は、内皮細胞を変異させて使用する仮説が考えられ、また、前房以外に移植する事を主として考慮する場合は、前房で生じさせる事が出来るトレランスを前房以外で誘導する手法を開発せねばならないため、TGF-β処理をした抗原提示細胞の静脈注射などの方法に置き換えて現在検討を行っている。前房内に長期生着したアロ細胞が誘導するトレランスは非常に強力であり、マウスモデルにおいては全層角膜移植をアロ抗原特異的に完全生着させることが出来る。Immune Privilege siteにおいて、アロ細胞が拒絶されずに長期生着する状態が必要と考えており、(1)内皮細胞以外の線維芽細胞を使用する、(2)血管内皮細胞を出血関連因子を出さないように治療を加える、(3)前房以外で同様のトレランスを誘導出来る報告(Sano Y et al. Curr Eye Res. 1997や、Okamoto S etal. Transplantation. 1995)を応用して、TGF-β処理をした抗原提示細胞の静脈注射などの方法に置き換えて心臓移植生着が実現できるかどうかを検討中である。最終目標である、「アロの培養細胞を用いて、生体肝移植や生体腎移植に十分な効果が得られるトレランスを誘導する」に向けて、「アロ内皮細胞を用いて、前房内に細胞移植し、生体心臓移植に十分な効果が得られるトレランスを誘導する」について検討を行っている。アロ内皮細胞として、primary角膜内皮細胞を前房内に移植した場合は有意な心臓移植生着延長が得られた。ドナーにはC57BL/6、もしくは、MHC適合されているB10.D2を用い、BALB/cをホストとして用いた。一般的に用いられているC3Hホストでの検証実験を開始している。100日を越える心臓生着も見られているが、組織標本からは炎症細胞浸潤がみられており、軽度の拒絶応答がある可能性が考えられ、角膜内皮細胞では心臓特異的に発現していると思われるアロ抗原に対する免疫応答を抑制出来ない可能性があり、血管内皮細胞を用いた検討に切り替えた。臨床的にも血管内皮細胞はリーズナブルなドナー細胞であり、重要な拒絶のターゲットでもある。C57BL/6由来のprimary静脈血管内皮細胞を購入し、培養による変性がない事を確認した。前房内へ細胞移植を施行したところ、70%以上の個体において前房出血を来す事が判明した。角膜内皮細胞の移植では、マウス血管内皮細胞でもヒト血管内皮細胞でも、さらに10倍の細胞数を移植しても全く問題が生じない。現在、出血を来す原因追及を行うとともに、出血を抑制出来る手法開発を行っている。同時に、出血を来していない個体においてトレランス誘導が出来ているかについて検討を始めている。また、ヒトにおいても採取可能な適切な細胞を用いる事が可能かどうか検証にはいる。たとえば皮膚から採取した線維芽細胞などを候補として考えており、前房内で生着するかどうかや、トレランス誘導が可能かどうかについて早急に検討を始める。マウス血管内皮細胞の購入に関して、米国の会社の遅れが生じた。GFPマウスの血管内皮細胞が起きず、再作成予定となったが、結局マウス調達不可で購入不可となった。この部分に5ヶ月を要した。結局通常のC57BL/6血管内皮を購入した。

また、進捗状況に記載したように、前房内へ血管内皮細胞を移植した際に、予期せぬ前房出血を来すという事が判明した。現在、方針転換も含め、検討を繰り返している。最終目標は、「ドナーの細胞を培養し、前房内に移植する事によってドナーアロ抗原に対するトレランスを誘導して臓器移植の生着を勝ち取ること」である。生体肝移植などにおいては、ドナーが生存しているため、ドナーに対するトレランスを誘導してから臓器移植を施行することも可能である。それには、(1)ドナー細胞を前房内に安全に生着させる事、(2)トレランス誘導を証明すること、(3)臓器移植をも生着させる事を証明すること、(4)ヒトへの応用に向けたプロトコールを作成する事、が本研究の流れである。まずはマウスモデルを用いて(1)(2)を検討した。前房内に角膜内皮細胞を移植した際には拒絶応答も生じず、安全にドナー細胞が生着し、8週間経過後はドナーに対するトレランスが誘導されていることが明らかとなり、全層角膜移植は完全に生着することが明らかとなった。さらに、心臓移植においても有意に生着することが分かった。しかし、臓器特異的に発現しているアロ抗原を抑制出来ないと考えられ、心臓移植において急性拒絶は100%抑制されたにも関わらず、心筋細胞内に炎症応答が生じていたため、さらなる解決策が必要となった。まずは、血管内皮細胞を用いたところ、前房内に注入した際にはほぼ全例において前房出血を来す事が始めて明らかとなり、トレランス誘導が実現したとしても視力を失う結果となるため臨床応用には問題があることが明らかとなった。そこで、前房出血を生じないような薬剤治療の検討や前房を用いずにトレランスを誘導できる手法の開発を手がけている。ドナー細胞を前房内に移植して長期生着させる事によってトレランスを誘導可能であることは明らかとなった。健常人ドナーから角膜内皮細胞を採取することは不可能であるため、血管内皮細胞の採取というプロトコールを考案したが、マウスモデルにおいて血管内皮細胞の前房内注入では高率に前房出血が生じる事が判明し、種々の治療を施しても避けることが出来なかった。臨床においては視力低下や緑内障などの合併症が生じる事となるため、この手法は非現実的と考えられた。前房内に移植することを主として考慮する場合は、内皮細胞を変異させて使用する仮説が考えられ、また、前房以外に移植する事を主として考慮する場合は、前房で生じさせる事が出来るトレランスを前房以外で誘導する手法を開発せねばならないため、TGF-β処理をした抗原提示細胞の静脈注射などの方法に置き換えて現在検討を行っている。出血を来す原因追及を行うとともに、出血を抑制出来る手法開発を行っている。同時に、出血を来していない個体においてトレランス誘導が出来ているかについて検討を始めている。また、ヒトにおいても採取可能な適切な細胞を用いる事が可能かどうか検証にはいる。たとえば皮膚から採取した線維芽細胞などを候補として考えており、前房内で生着するかどうかや、トレランス誘導が可能かどうかについて早急に検討を始める。前房内に長期生着したアロ細胞が誘導するトレランスは非常に強力であり、マウスモデルにおいては全層角膜移植をアロ抗原特異的に完全生着させることが出来る。
瘢痕性眼表面疾患における瞼球癒着に対するキマ－ゼ阻害剤の効果の検討

アルカリ眼外傷によるイヌ瞼球癒着モデルを作製し、キマーゼ阻害薬(CI)による結膜瘢痕抑制効果を検討した。10匹のビーグル犬を対象とし、アルカリ眼外傷作成後に、CI点眼試験を行った。肉眼的観察では眼瞼の瘢痕性変形および瞼球癒着の程度は、CI群が対照群に比較してそれぞれ有意に抑制した。組織学的検討ではHE染色でCI群、対照群ともに正常群に比較して結膜嚢円蓋部の短縮がみられた。免疫組織学的検討ではVimentin、Actin、肥満細胞、キマーゼ、アンギオテンシン2のいずれも正常群<CI群<対照群の順に陽性細胞が多くみられ、キマーゼ阻害薬の瞼球癒着モデルにおける結膜瘢痕抑制が確認できた。瘢痕性眼表面疾患に対する新しい治療薬の開発を目的として、本疾患の主要症状である結膜瞼球癒着モデルを作成し、その形成メカニズムの解明および治療薬の候補であるキマーゼ阻害薬による癒着抑制効果の検討を目標として研究を行っている。具体的な結膜瞼球癒着モデルとしてイヌを用いたアルカリ外傷モデルを採用し、以下の実験結果から、安定した結膜瞼球癒着モデル作成条件の確立と、治療薬としてキマーゼ阻害薬が応用できる可能性を示唆できた。(1)16匹のビーグル犬を対象とし、5mg/kgペントバルビタールでの全身麻酔下にて、1N水酸化ナトリウムをしみこませた3×20mm大の綿花切片を、片眼の上下結膜嚢にそれぞれ15秒間(2眼)、60秒間(9眼)、90秒間(5眼)接触させ、100mlの生理食塩水にて洗眼処置後、定期的に肉眼的観察を行った結果、洗眼処置直後には全例で結膜の融解を認めたものの、15秒間接触眼は早期から結膜が再生し瞼球癒着は起こらず(0%)、60秒間接触眼の3眼(33%)、90秒間接触眼の5眼(100%)で曝露35日以内に結膜瞼球癒着が起こることが確認できた。これより、1N水酸化ナトリウムの90秒間接触にて安定した結膜瞼球癒着モデルが作成できることが示された。(2)上記の90秒間接触条件下で曝露35日目に眼球を摘出し、HE染色とともに、肥満細胞、Vimentin、α平滑筋アクチンの発現について免疫組織化学的に検討を行った。結果、組織学的検討においては、癒着眼において結膜嚢円蓋部の短縮がみられ、肥満細胞、Vimentin、α平滑筋アクチンの全てで発現の増加が確認できた。このことから、瞼球癒着には肥満細胞、Vimentin、α平滑筋アクチンの発現が関与していると考えられ、癒着組織ではキマーゼの発現増加が予想できることから、本モデルにおける癒着抑制にはキマーゼ阻害薬が応用できる可能性が示唆された。本年度は、前年度までに安定した作成方法を確立したアルカリ眼外傷によるイヌ瞼球癒着モデルを用いて、キマーゼ阻害薬(CI)による結膜瘢痕抑制効果を検討する研究を行った。10匹のビーグル犬を対象とし、全身麻酔の下、片眼の結膜嚢内に1規定のNaOHに浸した綿花を挿入、90秒間の曝露の後に綿花を除去し、100mlの生理的食塩水で洗眼し、5匹については1mMのキマーゼ阻害薬を含む溶液を、他の5匹については0.01%Dimethyl sulfoxide溶液を、処置当日から1日1回10μlずつ処置眼に点眼しそれぞれCI群、対照群とした。処置を行わなかった僚眼を正常群とした。眼瞼の瘢痕性変形および瞼球癒着の程度をスコアリングして評価し、また曝露35日目に摘出した眼球をカルノア液で固定して標本を作製し、組織学的検討を行った。結果、肉眼的観察では標本作製の時点で10眼中全てに瞼球癒着、9眼に眼瞼の瘢痕性変形を認め、眼瞼の瘢痕性変形および瞼球癒着の程度を0,1,2点でスコア化したところCI群は、対照群に比較してそれぞれ有意に抑制(p=0.0283、p=0.0367)した。組織学的検討ではHE染色でCI群、対照群ともに正常群に比較して結膜嚢円蓋部の短縮を認め、免疫組織学的検討ではVimentin、Actin、肥満細胞、キマーゼ、アンギオテンシン2のいずれも正常群<CI群<対照群の順に陽性細胞が多くみられた。このことより、キマーゼ阻害薬本モデルにおける瞼球癒着抑制に有効であることが確認できた。

免疫組織学的検討ではVimentin、Actin、肥満細胞、キマーゼ、アンギオテンシン2のいずれも正常群<CI群<対照群の順に陽性細胞が多くみられ、キマーゼ阻害薬の瞼球癒着モデルにおける結膜瘢痕抑制が確認できた。瘢痕性眼表面疾患に対する新しい治療薬の開発を目的として、本疾患の主要症状である結膜瞼球癒着モデルをイヌにおいて作成し、その形成メカニズムの解明および治療薬の候補であるキマーゼ阻害薬による癒着抑制効果の検討を目標として研究を行っている。イヌに対して以下の条件でアルカリ眼外傷を起こし、その創傷治癒過程において瞼球癒着ができることを確認し、モデルの安定した作成方法の確立、および癒着組織の病理的検討を行った。(1)5mg/kgのペントバルビタールにて全身麻酔下のイヌの片眼に1Nの水酸化ナトリウムをしみこませた3×10mm大の綿花切片を上下の結膜嚢にそれぞれ15秒、60秒間接触させ、続いて生理食塩水にて60秒間洗眼処置を行った。全例で洗眼時に結膜の溶解を認めた。15秒間接触では早期から結膜が再生し処置後2か月以上観察を行っても眼瞼球癒着は認めなかったが、1分間接触では処置眼の50%で2週間後に眼球癆がおこり約6週間後には広範囲に瞼球癒着および結膜組織の角膜内侵入が確認できた。(2)瞼球癒着を確認後に眼球摘出を行い瞼球癒着部組織、処置眼非瞼球癒着部結膜、非処置眼結膜の3群に対してそれぞれ凍結切片およびホルマリン固定標本を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色およびトルイジンブルー染色を行った。ヘマトキシリン・エオジン染色では瞼球癒着組織において円蓋部結膜嚢の短縮が確認できたものの各群間に組織学的な差は認めなかったが、トルイジンブルー染色では瞼球癒着組織において肥満細胞の増加傾向を認め、今後の実験におけるキマーゼ阻害薬での癒着抑制効果が期待できる結果となった。イヌアルカリ眼外傷による瞼球癒着モデルの作成方法の確立と組織学的検討の結果、および癒着抑制におけるキマーゼ阻害薬の有効性を示唆する所見が得られたことから、完成への筋道はついたと考えているが、安定したモデル作成条件の確立に時間を費やしてしまったことから、実験スケジュールが予定より遅れている。最初の目標であったアルカリ眼外傷後の瞼球癒着モデルの作成は達成できた。同時に、アルカリ外傷を起こしてから瞼球癒着が出現するまでには約2か月間という予想以上の期間がかかることが分かり、そのために研究の進行にやや遅れが生じている。対策として水酸化ナトリウムの濃度を濃くしたり、接触時間を長くしたりするようなことも考慮したが、その条件では強角膜の穿孔が起こり以降の実験における評価が困難になることからこれ以上の期間短縮は難しいと考えた。また現状では一度瞼球癒着が起こり始めればその進行の程度は非常に早く、癒着程度をステージ分類して評価するという当初の予定は難しいと思われることから、今後はもう少しアルカリ接触条件を弱くしての追加検討を行う予定である。あるいは臨床所見での評価は行わず、組織学的検討および培養細胞を用いた検討のみでの評価としていくことも検討している。本実験系を用いて、キマーゼ阻害剤およびアンギオテンシンII受容体拮抗剤による治療効果を、形態学的および組織学的に評価する実験をすでに開始しており、一定の効果は確認できているが、統計的有意差を出すために更に実験回数を増やす必要がある。今後は実験計画に準じて引き続き実験の継続を行う予定である。(1)上記の理由から、0.5Nの水酸化ナトリウム接触条件下での瞼球癒着モデルの作成の可能性も検討する。また、1Nの条件下でも瞼球癒着発生の有無に個体差があった理由として、瞬膜の存在が考えられることから、アルカリ処置前に瞬膜を切除する等の処理を加えることも検討する。(2)瞼球癒着組織に対する病理学的評価として現在行ったヘマトキシリン・エオジン染色およびトルイジンブルー染色に加えてMallory-Azan染色、α平滑筋アクチン染色、PCNA-positive cell染色、アンギオテンシンII染色、キマーゼ活性染色を行い癒着組織のマーカーと考えられる項目を確定する。
精神疾患における神経グリア相関異常を解明するための再生医学技術を用いた橋渡し研究

研究代表者はヒト末梢血単球に2種類のサイトカイン(IL-34とGM-CSF)を添加することでわずか2週間で作製可能な直接誘導ミクログリア様細胞(iMG細胞)を独自開発し(PCT出願)、一次性ミクログリア病である那須ハコラ病患者、双極性障害患者、線維筋痛症患者で、iMG細胞の活性レベルが重症度と相関するなど疾患特異的な興味深い反応を見出すことに成功した。さらに、米国で開発されたヒト線維芽細胞由来直接誘導ニューロン(iN細胞)の作製技術を自身のラボで独自に改良し、わずか1週間で誘導可能な早期iN細胞の作製に成功し、NF1患者由来の早期iN細胞において興味深い遺伝子発現パターンを見出した。平成26年度は、申請者らが独自に開発したヒト血液由来直接誘導ミクログリア様細胞(iMG)の作製技術を用いて、精神疾患患者からiMGを作製し、その活性特性を評価した。疾患の状態を反映するレスポンスを予備的な知見として得ることができた。ヒト皮膚繊維芽細胞由来直接誘導ニューロン(iN)に関しても、精神疾患患者由来のiNを作製し、その特異的反応の評価を行った。本研究課題において、ヒト体細胞由来の誘導ニューロン・誘導ミクログリア様細胞を用いた新しいトランスレーショナル研究を推進してきた。ヒト末梢血から二種類のサイトカイン導入により2週間でミクログリア様細胞を作製する技術(iMG細胞作製技術)を我々の研究室では開発しており(2015年1月国際特許出願済)、今年度は、この技術により、精神疾患のミクログリア仮説解明のための研究を進めており、興味深い予備的知見を得ている。来年度以降に論文化するなどして結果を公開してゆく予定である。iMG技術を用いたトランスレーショナル研究において、すでに、幾つかの精神疾患患者にて興味深い知見を得ているため。研究代表者は、平成26年にヒト末梢血から単球を分離し、2種類のサイトカイン(IL-34とGM-CSF)を添加することでわずか2週間で誘導可能な、直接誘導ミクログリア様細胞(induced microglia-like cells:以下、iMG細胞)の独自開発に成功しており(Sci Rep 2014; PCT国際特許出願)、これまでiMG細胞を用いた精神神経疾患に関するトランスレーショナル研究を推進してきた。平成29年度は、慢性的な疼痛を有する患者(線維筋痛症患者)においてiMG細胞を作製したところ、ATP1時間刺激によるTNF-αmRNA発現が患者群で亢進しており、この発現亢進の程度が痛みや抑うつの重症度と相関することを見出し、国際学術誌へ報告した(Ohgidani et al. Sci Rep 2017)。さらに、ニューロン・グリア異常解明のためのツールとして研究代表者はヒト皮膚線維芽細胞由来ニューロン細胞(induced neuronal cells:以下iN細胞)の作製技術を改良し、一週間で誘導可能な早期iN細胞の開発に成功した。自閉症関連疾患であるレックリングハウゼン氏病(NF1)患者からiN細胞を作製し、遺伝子発現解析したところ、NF1患者由来iN細胞ではMEX3D発現が低下しており、早期iN細胞でのみ患者群でBCL2発現が低下していることを発見し、平成29年度に国際学術誌へ報告した(Sagata et al. Sci Rep 2017)。精神疾患における神経グリア相関異常を解明するためのトランスレーショナル研究を推進しており、平成28年度は、双極性障害患者から血液由来ミクログリア様(iMG)細胞を作製し、解析を行った。3名の患者由来iMG細胞において、躁状態の時と比べてうつ状態の時にCD206の遺伝子発現が亢進していることを見出すことが出来た(Ohgidani et al. Frontiers in Immunology 2017)。来年度は、さらに症例を増やして、妥当性を検証してゆく予定である。精神疾患患者から血液由来ミクログリア様(iMG)細胞を作製し、解析を行っており、いくつかの興味深い知見をFrontiers in Immunology誌をはじめとする国際学術誌に掲載することが出来たため。iMG・iNともに作製できるシステムを整えており、実際に精神疾患患者から両細胞を作製し、その活性特性をすでに予備的に評価しているため、本研究は順調に進捗している。平成27年度に見出した予備的知見を検証すべく、解析する症例数を増やしてゆく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。精神神経科学今後も、iMG細胞の作製、解析を続けてゆく。平成26年度のシステムを稼働させ、サンプル数を増やすことで、妥当性を評価してゆく。平成27年度は、iMG細胞実験を中心に行っており、iN実験に関する経費を当初予想していたほどには使用しなかったため。

平成28年度は研究代表者の所属するレドックスナビ研究拠点の閉鎖にともない、幾つかの実験を実施することが出来なかったため。今年度は、研究立ち上げ期間であり、心理検査に要する臨床心理士の雇用の必要がなくなったため。平成28年度は、iN実験も加速度的に進めるために、前年度に繰り越した分を使用する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度に前年度に実施出来なかった実験を実施する予定である。次年度は、心理検査に要する臨床心理士の雇用する。
ナノ細孔曲面を配位場とする不均一系メタセシス触媒の創製

オレフィン・メタセシスは一般に遷移金属錯体や酸化モリブデン,酸化タングステンにより触媒される.従来開発された不均一系触媒の中で,酸化レニウム触媒は単純なオレフィンのメタセシス反応に対して最も触媒活性が高いが,エステル基などの官能基を分子内に含むオレフィンのメタセシス反応では,直ちに失活することが知られていた.本研究では,メソ多孔質アルミナを塩化亜鉛で化学修飾してルイス酸性を付与した担体と,有機レニウム化合物を組み合わせると,単純なオレフィンのみならず,種々の官能基をもつオレフィンに対するメタセシス反応に対して,非常に高い触媒活性を示すことを見出した.また,塩化亜鉛で修飾したメソ多孔質アルミナの表面構造や,それに化学結合したレニウム種の化学構造も,種々の分光学的な解析をすることで明らかにした.ナノメートルオーダーの均一なナノ細孔を持つメソポーラスアルミナを,単に表面積が大きいという特徴を利用するだけではなく,細孔表面を化学修飾するという触媒設計方針に従って固体ルイス酸性を付与したメソポーラスアルミナ物質を新規に作り出し,有機金属化学種を化学結合で表面に固定することにより,固体表面の酸性部位と有機金属種の協奏的な相互作用に基づいた活性化(協奏機能作用)を目的とするものである.この研究は,ナノメートルオーダーの均一な細孔をもつ酸化物表面の構造特異性による有機金属種の安定化と,同時に触媒反応の遷移状態・反応中間体を安定化させ,目的反応をより効率的に,かつ選択的に進行させる,不均一系有機金属触媒化学を創製するものである.オレフィン・メタセシスは一般に遷移金属錯体や酸化モリブデン,酸化タングステンにより触媒される.従来開発された不均一系触媒の中で,酸化レニウム触媒は単純なオレフィンのメタセシス反応に対して最も触媒活性が高いが,エステル基などの官能基を分子内に含むオレフィンのメタセシス反応では,直ちに失活することが知られていた.本研究では,メソ多孔質アルミナを塩化亜鉛で化学修飾してルイス酸性を付与した担体と,有機レニウム化合物を組み合わせると,単純なオレフィンのみならず,種々の官能基をもつオレフィンに対するメタセシス反応に対して,非常に高い触媒活性を示すことを見出した.また,塩化亜鉛で修飾したメソ多孔質アルミナの表面構造や,それに化学結合したレニウム種の化学構造も,種々の分光学的な解析をすることで明らかにした.直径3-5nmの均一な細孔構造をとるメソポーラスアルミナ(mesoAl_2O_3)は,通常のγ-Al_2O_3の3倍程度の高い比表面積を持っている.そのメソ細孔構造の維持に伴うアルミナ格子の歪みによって,mesoAl_2O_3はγ-Al_2O_3とは異なった物性が期待できる材料である.報告者らは,酸化レニウムをmesoAl_2O_3に担持した触媒が,γ-Al_2O_3に担持したものに比べ単純オレフィンに対するメタセシス活性が高くなることを見出した.しかし,この触媒は極性官能基を有するオレフィンに対しては無力であった.一方,メチルトリオキソレニウム(CH_3ReO_3;MTO)は,単独ではオレフィンのメタセシス活性を示さないが,酸性担体であるシリカアルミナ(SiO_2-Al_2O_3)に担持すると,官能基化オレフィンにも適用できるメタセシス触媒になることが知られている.本研究では,mesoAl_2O_3をルイス酸で化学修飾することによって,ルイス酸修飾アルミナ担体の新規開発を試みた.そして,そのルイス酸修飾担体にMTOを担持して,極性官能基を持つオレフィンに対して優れたメタセシス活性を示す触媒の開発を行った.種々の検討の結果,エステル基,ケトン基,ハロゲン基,エーテル基などを有するオレフィンに対して,高いメタセシス活性を示すためには,修飾ルイス酸として,ハロゲン化金属が適していることがわかった.メソポーラスアルミナ(mesoAl_2O_3)に酸性を付与するために種々の酸性物質で表面修飾を行った結果,ZnCl_2修飾がMTOのメタセシス活性の向上に適していることを見出した.すなわち,mesoAl_2O_3にZnCl_2をエタノール中で含浸担持し,乾燥空気中400°Cで焼成して,ZnCl_2で修飾したmesoAl_2O_3(ZnCl_2//mesoAl_2O_3と表記)を調製した.真空排気して活性化したZnCl_2//mesoAl_2O_3に,MTOのCH_2Cl_2溶液を加えて表面に固定して(MTO/ZnCl_2//mesoAl_2O_3と表記),窒素雰囲気下,Methyl 10-undecenoateなどの各種オレフィンのメタセシス反応を室温で行った.他の担体についても同様にメタセシス反応を行った.様々な多孔質担体にMTOを担持して,官能基化オレフィンに対するメタセシス活性を比較したところ,MTO/ZnCl_2//mesoAl_2O_3が最も高い触媒活性を示すことを見出した.この反応結果は,ルイス酸修飾したアルミナZnCl_2//mesoAl_2O_3の表面とMTOは化学結合を作り,担体のルイス酸サイトとレニウムカルベン種が相互作用し,オレフィンのメタセシス活性を発現したと考えられる.そこで,ZnCl_2とmesoAl_2O_3から表面に形成される亜鉛化学種を特定するためにXAFS測定を行った.

その結果,ZnCl_2//mesoAl_2O_3およびZnCl_2//γ-Al_2O_3の第1近接距離は,ともにZnOおよびZnCl_2よりも短いことがわかった.これは,アルミナ表面と塩化亜鉛が結合を形成していることを示した結果と考えられる.また,ZnCl_2//mesoAl_2O_3,ZnCl_2//γ-Al_2O_3の表面亜鉛種は,塩化亜鉛や酸化亜鉛そのものではなく,酸素原子と塩素原子を亜鉛原子周りに配置した化学種であると推定される.メソポーラスアルミナ(mesoAl_2O_3)を塩化亜鉛で化学修飾した担体に,メチルトリオキソレニウムを担持した触媒が,エステルをはじめとする種々の官能基をもつオレフィンのメタセシス反応において,従来のMeReO_3/SiO_2-Al_2O_3に比較して高活性であること見いだした.これはレニウム種と亜鉛種,および担体のアルミナの三者が協奏的に機能して高活性メタセシス触媒系を作り出していると考えられるので,この触媒系の構造を明らかにした.均一系分子触媒では,中心金属種の電子状態と,その周りの配位子が作り出すごく近傍の立体的要因が活性を決める.一方,不均一系触媒ではそれらに加えて,反応物や生成物の吸着や細孔内拡散なども活性に大きく影響する.そこでそれらの効果が触媒活性に与える影響を検証した.本メタセシス触媒系では,活性点の反応速度は非常に高く,反応物や生成物の細孔内拡散は遅いため,拡散速度が触媒活性に大きく影響する.MeReO_3/ZnCl_2//mesoAl_2O_3触媒系は他の触媒系よりも初期反応速度は高いが,メタセシス生成物の収率は80%程度で頭打ちになる.ここで原料オレフィンを追加すると再びメタセシス反応が進行するので,触媒活性点自体は失活していないことが分かる.この頭打ちは,長鎖のジエステル生成物の細孔内拡散が極端に遅いことに由来する.物質拡散を高めるためにアルミナ細孔径を3nmから4nmに拡大したところ,細孔内拡散の速度が増し,全体としての触媒性能(TON)は改善した.さらにZnCl_2修飾したmesoAl_2O_3を担体にすることで,不飽和エステルに対するメタセシス反応活性は著しく向上する。アルミナ表面Zn種はRe種と相互作用してメタセシス触媒能を直接的に制御しているばかりでなく,Re種周辺の反応場が間接的に働いていることも考えられる.したがって,MeReO_3/ZnCl_2//γ-Al_2O_3がMeReO_3/γ-Al_2O_3よりも高活性である理由の一つとして,γ-Al_2O_3では反応物および生成物オレフィンを強く吸着し,前述の細孔内拡散が遅くなるのに対し,ZnCl_2//γ-Al_2O_3担体内ではそれが緩和されるためと考えられる.またZnCl_2修飾により表面水酸基が保護され,エステルがカルボキシラート化するのを防ぎ,それによる触媒毒のMeOHの生成や細孔内拡散の阻害を抑制したことも高活性化の要因である.
膜結合型グルタチオンS-トランスフェラーゼの結晶構造解析

細胞膜結合型グルタチオン転移酵素(microsomal gluthathione S-transferase ; MGST)は、細胞内異物に対する解毒作用や脂肪の酸敗の主因である脂質ヒドロペルオキシドに対する還元作用のほか、アラキドン酸カスケードで合成される生理活性物質であるロイコトリエンやプロスタグランジンE2の合成を触媒する機能を併せ持つことが知られている。MGSTは喘息や炎症に対する薬剤ターゲットになる可能性があるため、その立体構造は薬剤探索において重要な情報を与える。本研究では、MGSTのX線結晶構造解析を行い、立体構造と機能解析から酵素活性機構の解明を目指す。これまでに、マウス由来のMGST1について、大腸菌によるタンパク質発現系を構築し、タンパク質の安定化のための界面活性剤の探索を含めた精製法の検討を行い、結晶化条件の探索を行った。さらに、従来法のほか立方液晶相を利用しての結晶化の検討を行った。その結果、全長MGSTについて結晶の析出がみられたが、X線回折実験の結果から、結晶は低分解能の反射しか与えず、現段階では構造解析には至っていない。同結晶の結晶化条件の最適化やアニーリング、デハイドレーション等の操作による分解能の向上や回折異方性の軽減を試みた。MGSTは広い基質特異性をもつことが知られており、グルタチオンを含めた酵素一基質類似体との複合体の調製を行い、複合体の安定性の検討および結晶化条件の検索を行っている。真核生物における細胞膜結合型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(microsomal glutathione S-transferase ; MGST)は内因性・外因性の様々な生体内異物の解毒に関与する他、脂肪の酸敗の主因である脂質ヒドロペルオキシドに対する還元作用、アラキドン酸から合成される生理活性物質であるロイコトリエンやプロスタグランジンE_2の合成を触媒する多機能な酵素である。MGSTは喘息、炎症に対する重要な薬剤ターゲットになりうるが、その詳細な分子機構については未だ明らかにされていない。本研究では、MGSTの触媒機構やMGSTに特徴的な広い基質特異性について立体構造に基づいて明らかにするため、酵素と基質あるいは基質類似体を含めた複合体の結晶を作製して、高分解能によるX線結晶構造解析を行う。研究の第一段階として、マウス由来のMGSTについて、同定されている3種類のアイソザイム(MGST-1,-2,-3)のcDNAを用いて、大腸菌による大量発現・蛋白質精製を行った。3種類全てのアイソザイムについて、ヒスチジンタグ融合蛋白質の大量発現系を構築した。広範な発現・精製条件の検討の結果、発現蛋白質を非イオン性界面活性剤の存在下で可溶化して、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー等の使用により、高純度の蛋白質試料を調製した。現在、様々な結晶化試薬や界面活性剤を用いた広範な結晶化条件の検討を行っている。今後、さらに添加剤等のスクリーニングを加えた、詳細な結晶化条件の検討を加え、質の高い結晶の作製を目指す。細胞膜結合型グルタチオン転移酵素は、細胞内異物に対する解毒作用や脂肪の酸敗の主因である脂質ヒドロペルオキシドに対する還元作用のほか、アラキドン酸カスケードで合成される生理活性物質であるロイコトリエンやプロスタグランジンE_2の合成を触媒する機能を併せ持つことが知られている。細胞膜結合型グルタチオン転移酵素は喘息や炎症に対する薬剤ターゲットになる可能性があるため、その立体構造は薬剤探索において重要な情報を与える。本研究では、細胞膜結合型グルタチオン転移酵素のX線結晶構造解析を行い、構造と必要な機能解析から酵素活性機構の解明を目指す。これまでに、マウス由来の細胞膜結合型グルタチオン転移酵素(MGST1,-2,-3)について、大腸菌にタンパク質を発現させ、タンパク質の安定化のための界面活性剤の探索を含めた精製法の検討を行い、従来法のほか立方液晶相を利用して結晶化条件の探索を行った。その結果、MGST-1については複数の条件下で微結晶の析出に成功したが、X線回折実験の結果から、結晶は低分解能(約15Å)の反射しか与えず、現段階では構造解析には至っていない。現在、構造解析に適した質および大きさの結晶を得るために、添加剤等のスクリーニングを行うとともに、MGST-1以外のホモログ(MGST-2,-3)についても同様に結晶化条件のスクリーニングを試みている。また、細胞膜結合型グルタチオン転移酵素は、基質特異性が広い特性をもつことが知られているので、酵素と種々のインヒビターとの複合体の調製を行い、結晶化条件のスクリーニングを行っている。

その結果、全長MGSTについて結晶の析出がみられたが、X線回折実験の結果から、結晶は低分解能の反射しか与えず、現段階では構造解析には至っていない。同結晶の結晶化条件の最適化やアニーリング、デハイドレーション等の操作による分解能の向上や回折異方性の軽減を試みた。MGSTは広い基質特異性をもつことが知られており、グルタチオンを含めた酵素一基質類似体との複合体の調製を行い、複合体の安定性の検討および結晶化条件の検索を行っている。
超高圧・超高温・超急冷によるフラーレンの機能性付与反応と新物質の凍結

アモルファスダイヤモンドの原子の秩序度を調べるため、電子線回析パターンから動径分布を求め、結晶ダイヤモンドおよび、他のSi, Ge半導体アモルファスとの比較を行った。強度測定は高感度でダイナミックレンジの大きいイメージングプレートを用い、その回析強度のフーリエ変換により動径分布を導出した。アモルファスダイヤモンド中の炭素原子は正四面体配位をとり、さらに、各頂点にある原子も四面体をなしている。そして、その集合様式は、ダイヤモンド結晶中のそれと、単位胞スケールまでは同じであるがその距離が少し大きく、若干パッキングが疎である。この第2近接までが秩序度をもつこと、すなわち単位胞までは結晶ダイヤモンドに匹敵することは、他の半導体アモルファスと異なる点であり、アモルファスダイヤモンドが極めてユニークな物質であることが明らかとなった。バンドギャップ等の物性を知ることは、この物質の理解を深めるためにも、工学的応用を考えるためにも重要である。本年度の研究ではアモルファスダイヤモンド、同じくC60フラーレンより衝撃合成したナノダイヤモンド、および、天然ダイヤモンドのバンドギャップを、電子線エネルギー損失スペクトロスコピーによって求め、バンドの大きさや状態密度分布を比較検討した。得られたスペクトルのKramers-Kronig解析を行い、損失関数、誘電関数のε_1ε_2を導出した(Fig. 4)。ε_2の立ち上がりよりバンドギャブ求め、アモルファスダイヤモンド、ナノダイヤモンド、天然ダイヤモンドの値はそれぞれ、4.5、3.3および5.6eVと見積もられた。さらに、アモルファスダイヤモンドはε_2の立ち上がりの様子や内殻励起スペクトルの形状から状態密度が結晶ダイヤモンドに比べてブロードであることを示された。このことは動径分布の結果に対応しており、長距離オーダーの秩序度をもたないことが特異な状態密度と、狭いギャップの大きさを生じさせていると考えられる。
内皮前駆細胞を用いる組織工学的アプローチによる経皮的血管組織再建技術の創製

本研究の目的は組織工学的アプローチで経皮的に細胞およびハイブリッド組織によって血管内腔を内張りして正常組織化する技術を開発する。具体的には、自己の末梢血より内皮前駆細胞を高効率で採取して、市飯のステント、目発中のカバード・ステントおよびバルーン・カテーテルを用いて、病変部位に上記の細胞あるいはハイブリッド組織をデリバーして接着・増殖・移植によって病変部位の内皮化を行う技術の可能性を明らかにする。具体的には、現在開発中の3つの方式のプロトタイプ技術の有効性をハイブリッド血管壁組織を用いてex vivoによって検証し、これに引き続いての大規模動物実験・前臨床研究への移行の論理的・実験的基盤を確立する。本研究の要素技術・材料とシステムは下記の通りである。具体的には3つのシステム(下記のタイプIIII)の有効性をハイブリッド管状・血管を用いて検鉦した。内皮前駆細胞の単離・純化は、研究代表者らの開発した技術によった。●タイプI:コラーゲンと前駆細胞を混合・ゲル化させて自己収縮した薄いハイブリッド管状体を作製する。このハイブリッド組織体は極めて弾性的性質を有し、伸長した。●タイプII:市販の金属ステントにスチレン化ゼラチンおよびカンファキノン(光開始剤)の混合物によりコーティングし、可視光照射によりマトリックス層を固定し、これに前駆細胞を播種して完全被覆した。●タイプIII:エキシマ・レーザ加工セグメント化ポリウレタン薄膜で被覆したカバード・ステント(開発済・特許化・欧文誌掲載)の内外膜に内皮前駆細胞を包埋した上記の光反応性ゼラチン膜を作製した。いずれもバルーン・カテーテルに搭載する。線維芽細胞とコラーゲンよりゲル化・自己収縮した管状ハイブリッド組織内に上記のカテーテルを挿入し、拡張し、上記のハイブリッド内皮化組織(タイプI)やステント(タイプIIとIII)を内腔に留置し、培養した。タイプIに関してはバルーンを拡張して血管に押しつけることによってハイブリッド内皮前駆組織を内張りする。タイプIIに関しては、留置されたステントからの前駆細胞の移動・増殖により内皮化する。タイプIIIに関しては、タイプIIよりも複雑であるが、より強力で迅速なる内皮層が形成できる。Ex vivoでの有効性の判定として、予め細胞蛍光標識剤で前駆細胞を処理しておき、共焦点レーザ走査型顕微鏡(現有)でハイブリッド組織の内腔の内皮化の速度および経時的な分布を調べた結果、本技術の有効性の判定と大規模動物実験への移行の基盤を構築した。