hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アゼピン骨格を有する天然化合物ライブラリーの構築とVCD法による絶対構造の決定

アゼピン骨格を有する3級アミン型ステモナアルカロイドのNーオキシド誘導体化については、過酸化水素によりNーオキシド化が進行することを確認できた。また、Nーオキシド体の物性について検討を加えたところ、中性では安定であるが酸性条件で容易に分解することがわかった。現在密度汎関数法によりそのVCDスペクトルの計算を実施している。一方、化合物ライブラリーを充実するため、タマビャクブメタノールエキスのアルカロイド画分についてカラムクロマトグラフィーおよびHPLCによる分離を継続しており、種々の既知アルカロイドとともに新規アルカロイドを単離している。平成30年度は、ビャクブ科植物、タマビャクブ(Stemona tuberosa)の根のメタノール抽出エキスを分配操作して得られた各画分を種々のクロマトグラフィーにより分画して得たアルカロイド含有画分を、分取用高速液体クロマトグラフィー装置により分離・精製し、新規アルカロイド5種を単離した。このうち3種の化合物は、単結晶X線解析により相対立体構造を決定した。2種の化合物については、IRスぺクトル、MSスペクトル、および二次元NMRスペクトルの解析により、一部の相対配置を含む平面構造を決定した。これらのうち4種の化合物はアゼピン骨格を持つが、1種はアゼピン骨格が酸化開裂した構造であった。5種のアルカロイドはいずれも微量であったため、VCDスペクトルの測定はできなかった。3種の化合物についてアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を評価したが、いずれもガランタミン(IC50 = 0.12 μg/mL)に比べて活性は弱かった(IC50 = 124 >200 μg/mL)。また、昨年度VCD法により立体構造を決定することができなかった茜草根(Rubia cordifoliaの根)由来RA系ペプチド化合物(分子量950)について、誘導体化後単結晶X線解析を行うことにより、絶対配置を含めてその構造を決定することができた。平成28年度平成30年度を通じて、11種の新規ステモナアルカロイドを単離・構造決定した。また、比較的多量に得られる既知ステモナアルカロイドを用いてNーオキシド体を得る条件を見出し、アゼピン骨格の配座構造を固定できることを確認した。一方、VCDスペクトル法について、構造中の一部の立体配置が不明な中分子化合物の構造決定への応用を検討した。天然化合物ライブラリー拡充のため、Stemona tuberosaの粗アルカロイド画分よりアゼピン系アルカロイドの分離精製ならびに構造解析を継続する。これらのアゼピン系アルカロイドのなかには化学的安定性が低く、分離操作中もしくは精製後保存中に徐々に分解するものも少なくない。そこで、これらの化学的安定性の劣るアルカロイド類の効果的な精製条件を新たに確立する。また、本植物より得られるアゼピン系アルカロイドは構造の多様性に富み、新規性の高い化合物が種々得られているが、新たにアゼピン系アルカロイド資源として有用な同属植物試料の収集を検討する。
金属表面上への異種金属窒化物単原子層の形成とその構造観察

金属単結晶上に形成した単原子層の金属窒化膜は、下地金属との格子不整合のため、短周期、長周期に特異な構造をとり、面白い化学的性質も発現すると期待されている。しかし現状では、窒化層形成に強い条件(高いイオンエネルギー、高いアニール温度)が用いられ、下地金属と表面窒化膜の可能な組合せは、大きく制限されている。本研究は、穏和な条件での窒化膜形成法を開発し、可能な組合せを大きく拡大しようとするものである。装置改造を中心に奨励研究を進めた。単原子層窒化膜の表面構造を原子レベルで観察するには、走査トンネル顕微鏡(STM)が必要である。室温STM装置(東京大学物性研究所)の試料準備室を改造し、そこに窒化膜形成用アタッチメントを設置することとした。既存装置の狭い空間への組込みとなるため、小型の窒素イオン源をどう実現するかが鍵であるが、市販の小型真空ゲージをケース無し仕様で入手し、転用することとした。このイオン源を真空槽内で支持し、必要な電力を外部から供給するため、両面真空フランジを独自に設計し、北野精機(株)で製作した。穏和な窒素イオン源としての動作には、フィラメント加熱用など4台の電源と、微小なイオン電流を測る機器が必要であるが、汎用の直流電源と計測器を購入し、それらを束ねる配電ボックスを自作することで実現した。電気系の整備も終了し、現在、試運転、動作条件最適化の段階であるが、東日本大震災による電力不足のため、一時休止せざるを得ない状態となっている。一方、伝統的な高エネルギー窒素イオンの打込みによる金属表面窒化層についての研究も継続している。Cu(001)面の窒化により形成される特異なグリッド構造について、その原因、構造モデルを英文論文として出版し、学会発表4件を行なった。また異種金属窒化物系として、作成可能なCu(001)面上のロジウム窒化膜について、発表2件を行なった。
関節リウマチにおけるHLAと生物学的製剤への治療反応性の関連解析

関節リウマチ(rheumatoid arthritis: RA)の治療は生物学的製剤の開発によって劇的に改善した。しかし生物学的製剤を使用しても疾患活動性の改善が得られない症例も実臨床では経験し、どういった背景因子の患者において生物学的製剤が有効であるかは不明な点が多い。RAの発症と最も確実な関連を示すものは、HLA-DRB1遺伝子であり、HLA-DRB1アリルのアミノ酸配列のうちposition 70-74がQKRAA, QRRAAあるいはRRRAAのいずれかの配列はshared epitope(SE)と称され、RAの発症や重症度と関係していることが明らかになっている。しかし、HLA-DRB1遺伝子と生物学的製剤の有効性との関連に関しては定まった見解が得られていない。またHLA-DRB1以外の疾患感受性遺伝子であるHLA-B及びHLA-DPB1についても治療反応性への関与についての報告はない。そこで本研究では、生物学的製剤を使用しているRA患者を対象とし、同意を取得したのちにNGS法を用いてHLA全11座のタイピングを行い、HLAとRAにおける生物学的製剤の有効性および安全性との関連について明らかにすることを目的とした。本年度は倫理審査委員会の承認を得たのち、対象となる生物学的製剤を使用しているRA患者をリストアップの上、計75名から同意を取得した。同意取得済みの患者の末梢血液を用いてNGS法にてHLA全11座のタイピングを行った。併行して、対象となるRA患者の疾患活動性や安全性の臨床情報についてデータを取得した。本年度は倫理審査委員会の承認を得たのち、対象となる生物学的製剤を使用しているRA患者、計75名から同意を取得し、NGS法にてHLAのタイピングを行った。また、対象となる患者のRA疾患活動性推移や、感染症の発生有無に関して臨床データを取得した。現在、追加での同意取得及びHLAタイピング及び統計学的解析を行っている。次年度は、生物学的製剤の有効性および安全性との関連についての解析を進めていく。解析により得られた結果を取りまとめ、研究の総括及び成果の発表を行いたい。今後、HLAタイピングとHLA含めた背景因子に応じてRAの治療選択を行うPrecision Medicineの開発を目指す。
サイトカインによる好中球活性化機構とアクチンの再構築

正常人ボランティアから供血を受け、デキストラン処理、ファイコールコンレイによる比重遠心、浸透圧による溶血などを行い、ヒト好中球を分離し研究に使用した。ファロイジンがFアクチンと結合することを利用して、細胞内のFアクチンの変化を観察した。走化性因子によるアクチン細胞骨格の変化は報告されている。我々もこの現象を確認した。つまり、Fアクチンの増加つまりはアクチンの重合が観察され、その後もとのFアクチンの量に戻るという現象である。好中球において、サイトカイン、その中でもTNF,GM-CSF G-CSFによる刺激により、アクチン細胞骨格に変化が起こるとする報告はない。今回、ヒト好中球を使用し、サイトカインで刺激を行い、経時的にFアクチンの変化を測定をした。フローサイトメーターによる測定では、Fアクチンはサイトカイン刺激により減少し、それが維持されていた。また、アクチン細胞骨格の変化はその細胞内における分布が重要である。今回、我々は共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。走化性因子であるFMLPによる刺激においては、アクチン重合状態において、細胞辺縁にFアクチン増加がみられた。アクチン重合状態からアクチンがもとの総量に戻るときには、進行方向と考えられる部分にFアクチン増加がみられ、進行方向と反対の部分にはFアクチンの減少が確認された。TNF,GM-CSF,G-CSFによる刺激によるアクチンの脱重合においては、辺縁を中心にFアクチンの減少が観察された。走化性因子によるアクチンの重合の変化は、MAPK系の細胞内シグナルとは独立していた。サイトカインによるアクチンの脱重合はMAPK系の細胞内シグナルにより制御されていた。ファロイジンがアクチン細胞骨格などのFアクチンと結合することを利用して、細胞内のFアクチンの変化を観察した。走化性因子例えばFMLPによるアクチン細胞骨格の変化は報告されている。つまり、1分以内にFアクチンの増加つまりはアクチンの重合が観察され、その後もとのFアクチンの量に戻るという現象である。ところで、好中球において、サイトカイン、その中でもTNF, GM-CSF, G-CSFによる刺激により、アクチン細胞骨格に変化が起こるとする報告はない。TNF, GM-CSF, G-CSFによる刺激によるアクチンの脱重合においては、辺縁を中心にFアクチンの減少が観察された。このような変化がどのようなシグナル伝達系によって制御されているのかを研究するために、シグナル伝達系のインヒビターを使用し、どのシグナル伝達系が関与しているのかを確定した。
多自由度を有する量子ホール系の局在-非局在転移

(1)正孔量子ホール系において,磁気抵抗の長時間緩和現象を観測した.抵抗の緩和の振る舞いは,ν>1とν<1で大きく様子が変化することが見いだされた.現象の説明として,我々は,核スピンや平行伝導が関与する可能性を排除し,異なるスピン自由度を持つランダウサブバンド間での正孔の移動がスピンフリップを伴うために極低温では起こりにくくなることを起源としている可能性を議論した.面内磁場印加に伴う緩和時間の増大や,緩和時間の磁場依存性は,この描像により定性的に説明できる.この結果はPASPS国際会議(仙台、8月)、および日本物理学会(松山3月)で発表した。(2)電子量子ホール系において,抵抗検出各磁気共鳴(RDNMR)の研究を行なった.特徴的な分散型線形が,スカーミオン励起が形成される充填率ν=1付近において観測される.分散型線形は,充填率|ν-1|<0.15の領域,温度T<150mKの領域で観測された.分散型線形のディップ部分のRF周波数を用いて得た核スピンの縦緩和率1/T1は,ν>1で明確な増大と異常な温度依存性が観測された.一方,分散型線形のピーク部分のRF周波数を用いて得た核スピンの縦緩和率1/T1は,ν>1でもほぼ変化が見られない.ディップ部分のRF周波数を用いて得た核スピンの縦緩和率1/T1の振る舞いは,この充填率領域で形成されるスカーミオン結晶の性質を反映しているものと考えられる.この結果は、半導体特性に関する国際会議(オーストリア・ウィーン、7月)、スピンに関する国際会議(仙台、8月)、日本物理学会(鹿児島)で発表した。1.2層量子ホール系において、2層自由度が縮退したとき局在長臨界指数がどのように変化するかを詳細に調べた。いくつかの理論的な予想に反し、臨界指数は2層縮退によって変化しないことを実験的に明らかにした。この結果は2次元電子系の性質に関する国際会議(米国ニューメキシコ・7月)等で発表した。2.超短周期平面超格子量子ホール系の局在長臨界指数を調べた。結果、臨界指数が電流をどの方位に流すかによって大きく値を変えることを明らかにした。特に電流を流す方向とポテンシャル変調のストライプ方向が平行であるとき、臨界指数は通常の2次元電子系のそれ(2.3)に比べて1程度小さい値(1.3)が得られることを発見した。この結果は、低温物理国際会議(米国フロリダ・8月)、および日本物理学会(9月京都)等で発表した。3.高移動度正孔系の充填率ν1/3付近の分数量子ホール領域で非周期的な再現性ある磁気振動が起こることを発見した。これはウイグナー結晶状態と分数量子ホール液体状態の混合状態が形成されていることを反映した現象であるかもしれないことを、いくつかの実験事実によって示した。この結果は、低温物理国際会議(米国フロリダ・8月)、および日本物理学会(3月千葉)等で発表した。4.高移動度正孔系において、充填率ν2/5,2/3,4/3付近の量子ホール領域で、数十分から数時間程度の長時間緩和を伴う磁場によるヒステリシス現象を観測した。この結果は、メゾスコピックスケールの超伝導系とスピントロニクス関する国際シンポジウム(1月神奈川)で発表した。
細胞骨格線維に特異的に作用する海産毒ラトランキュリンの合成研究

ラトランキュリン類は,紅梅に分布する海綿から単離されたマクロライドであるが,チアゾリジノン環を含む珍しい天然物である.強い魚毒性を示すことが知られていたが,最近,細胞の骨格繊維(フィラメント)の構造を可逆的に変化させる強い活性を有することが発見され,細胞生理学的な研究の推進のためにも,本化合物やアナローグの人工合成による供給が期待されている.大量合成可能な効率の良い全合成ルートの確立を目指して検討し,次の成果を得た.1.ホモアリルアルコール誘導体の立体選択的なエポキシ化法と,カルバメートの分子内隣接基関与を利用した,オキサゾリジノンの立体選択的な合成法を開発して,オキサアナログのキラルサブユニットの合成に成功した.2.ネロールのオゾン酸化により,極めて短段階で,ラトランキュリンのアキラルサブユニットの合成を達成した.今後は,まずオキサアナログの全合成を目指して,今回得たサブニットの連結を検討する.ラトランキュリン類は,紅梅に分布する海綿から単離されたマクロライドであるが,チアゾリジノン環を含む珍しい天然物である.強い魚毒性を示すことが知られていたが,最近,細胞の骨格繊維(フィラメント)の構造を可逆的に変化させる強い活性を有することが発見され,細胞生理学的な研究の推進のためにも,本化合物やアナローグの人工合成による供給が期待されている.大量合成可能な効率の良い全合成ルートの確立を目指して検討し,次の成果を得た.1.ホモアリルアルコール誘導体の立体選択的なエポキシ化法と,カルバメートの分子内隣接基関与を利用した,オキサゾリジノンの立体選択的な合成法を開発して,オキサアナログのキラルサブユニットの合成に成功した.2.ネロールのオゾン酸化により,極めて短段階で,ラトランキュリンのアキラルサブユニットの合成を達成した.今後は,まずオキサアナログの全合成を目指して,今回得たサブニットの連結を検討する.
里山林の断片化が生物多様性と生態系機能に及ぼす影響:鳥による種子散布パタンの解明

本研究では、森林の断片化が鳥による種子散布の効果に与える影響を明らかにするため、人間活動による断片化が顕著な里山林を野外実験室として、面積が異なる林分において種子散布システムを対象に定性的・定量的調査をおこなった。「鳥による種子散布」(以下、鳥散布)は森林生態系を維持する上で重要な生態系機能であるが、その効果については果実(餌)と鳥(散布者)の2生物問の直接的作用を対象とした研究がこれまで主であった。しかしながら、健全種子量や果実の質を変化させる昆虫(食害者)の直接的・間接的作用によっても影響を受けていることから、調査は果実-鳥に昆虫を同時に扱った3生物間の相互作用に着目しながら個別におこない、森林生態系における鳥散布の生態学的意義の理解を目指した。調査を通してこれまでに明らかになった点は、1)森林面積の減少に伴う鳥類の飛来数・密度の減少(面積効果)、2)鳥類の飛来数に対する林分あたりの果実生産数の効果(餌資源効果)、3)凶作年における強い面積効果と豊作年における強い餌資源効果、であった。面積効果は豊作年よりも凶作年において強く現れた一方、餌資源効果は、凶作年では面積の効果にくらべてより弱く、豊作年ではより強かったことが示された。鳥類の渡りの中継地である調査地域では、果実資源が豊富な年は越冬時期まで滞在する個体が増え、それらが柔軟に果実を追跡し消費しながら越冬していると考えられる。今後は、林分ごとに果実・種子食害、落下・散布種子、実生の定着率について解析を進めて、種子散布に対する鳥頬と食害昆虫の直接的・間接的関係の定量化を図り、森林の断片化が鳥散布システムに与える総合的効果について考察していく。森林の断片化が森林動態における鳥散布の効果に与える影響を明らかにするため、果実・種子の生産量、食害量、果実除去・種子散布量、実生の定着率、鳥の飛来数といった鳥散布パラメーターを導きだすべく次の4つの個別調査を行った。1.果実量と鳥数とそれらの季節動態:今年度は開花種数・個体数にくらべて結実種数・個体数が著しく少なく、それを受けて果実生産量も少なかった。この傾向は調査地とした森林パッチ全てに共通し、調査地域では果実の不作年であったと考えられる。他方、果実食鳥類の種数・密度は面積の増加に伴い増える傾向があるが、小面積では極端に少なかった。2.種子散布者の特定:直接観察ではヒヨドリによるコシアブラの果実除去、カケスによるコナラ堅果の持ち去りなど、越冬鳥種が依存している餌が明らかになりつつある。環境省第一級鳥類バンディングステーション(福井県織田山)で捕獲されたのべ508個体から約150個の排泄物を収集した。現在内容物の確認を進めている。3.種子の散布量と食害量の推定:計180個のトラップを設置し、結実が本格的になる9月から1月の降雪時まで回収を行った。現在乾燥サンプルの仕分け・種子同定・食害確認を進めており、来年度夏までの作業完了をめざす。4.発芽種子・実生・幼木の季節動態:結実時期期間中(10月11月)に計40個の調査枠を設置して931実生のモニタリングを開始した。次回調査は来年度4月の予定である。以上から、森林パッチ面積の大小と果実密度に相関はない、小面積の森林パッチでは果実食鳥類が飛来しない、果実生産量に関係なく果実食鳥類が飛来する、の3点が明らかとなり小面積の森林パッチにおける散布種子の減少が推測される。ただし、これらの結果は極端な不作が影響していると考えられ、今後のなり年の結果と併せて、結実の豊凶年による断片化効果の違いに注目しながら考察を進めていく。1.果実量と鳥数とそれらの季節動態:結実種数・個体数、果実生産量が著しく少なかった昨年度にくらべて今年度は非常に多種多量の果実が結実した。この傾向は調査地とした森林パッチ全てに共通し、調査地域では果実の豊作年であったと考えられる。他方、果実食鳥類の総種数・総個体数は昨年度と大きく変わらなかったが季節パタンに違いがみられた。2.種子散布者の特定:今年度は豊富な果実資源を背景に果実を採餌する鳥種が頻度高く観察され、昨年度の記録と併せて各植物種の種子散布者が明らかになりつつある。3.種子の散布量と食害量の推定:計180個のトラップを設置し、結実が本格的になる9月から12月の降雪時まで回収を行った。現在乾燥サンプルの仕分け・種子同定・食害確認を進めている。4.発芽種子・実生・幼木の季節動態:計40個の調査枠において931実生を対象に6月と10月に追跡調査を行った。

以上からこれまでに明らかになったことは、森林パッチ面積の大小と果実密度に相関はない、小面積の森林パッチでは果実食鳥類の飛来数が少ないがその面積効果に加えて森林パッチ内の総果実量の効果が見いだされている、果実食鳥類の出現は果実の豊凶年によって鳥種によってパタンが異なる、の3点が明らかとなり小面積の森林パッチにおける散布種子の減少が推測されると同時にその散布パタンは果実の豊凶によって変化することが推測された。本研究では、森林の断片化が鳥による種子散布の効果に与える影響を明らかにするため、人間活動による断片化が顕著な里山林を野外実験室として、面積が異なる林分において種子散布システムを対象に定性的・定量的調査をおこなった。「鳥による種子散布」(以下、鳥散布)は森林生態系を維持する上で重要な生態系機能であるが、その効果については果実(餌)と鳥(散布者)の2生物問の直接的作用を対象とした研究がこれまで主であった。しかしながら、健全種子量や果実の質を変化させる昆虫(食害者)の直接的・間接的作用によっても影響を受けていることから、調査は果実-鳥に昆虫を同時に扱った3生物間の相互作用に着目しながら個別におこない、森林生態系における鳥散布の生態学的意義の理解を目指した。調査を通してこれまでに明らかになった点は、1)森林面積の減少に伴う鳥類の飛来数・密度の減少(面積効果)、2)鳥類の飛来数に対する林分あたりの果実生産数の効果(餌資源効果)、3)凶作年における強い面積効果と豊作年における強い餌資源効果、であった。面積効果は豊作年よりも凶作年において強く現れた一方、餌資源効果は、凶作年では面積の効果にくらべてより弱く、豊作年ではより強かったことが示された。鳥類の渡りの中継地である調査地域では、果実資源が豊富な年は越冬時期まで滞在する個体が増え、それらが柔軟に果実を追跡し消費しながら越冬していると考えられる。今後は、林分ごとに果実・種子食害、落下・散布種子、実生の定着率について解析を進めて、種子散布に対する鳥頬と食害昆虫の直接的・間接的関係の定量化を図り、森林の断片化が鳥散布システムに与える総合的効果について考察していく。
シャープターンをもつ矩形断面流路内乱流の熱・運動量輸送に関する実験的研究

シャープターンをもつ矩形断面流路内の乱流では,ターン通過時に遠心力の影響により二次流れが発生するとともに,内壁(隔壁)先端付近で流れのはく離・再付着が起こるため,3次元かつ非定常な流動特性を示す.また,こうした流動特性の影響を受けて,壁面上の局所熱伝達率も非常に複雑に変化する.本研究では,PIVおよびLDVを用いて流路内の複雑な流動特性を測定するとともに,ナフタレン昇華法により各流路壁面上の局所熱(物質)伝達率を測定し,両者の相関からシャープターン流路における伝熱のメカニズムを明らかにすることを目的とした.まず,180^。シャープターンをもつ矩形断面流路において,種々の実験条件のうちターン部の間隙と隔壁の傾斜角度が局所伝熱特性に及ぼす影響に注目し,流路全壁面上の局所熱(物質)伝達率をナフタレン昇華法で測定した.その結果,ターン内からターン下流領域における複雑な局所熱伝達率分布と,伝熱特性に及ぼす上記のパラメータの影響が明らかとなった.次に,PIVによりターンとその下流における流動特性の測定を行い,ターン内コーナー部における再循環領域,ターン下流における二次流れ,ターン下流の隔壁上に形成されるはく離泡と流れの再付着,再付着後における流れの偏りなど,比較的大規模な流れ場の構造を明らかにした.このPIVによる結果を参考にしながら,局所伝熱特性が特に人きく変化したターン部の流路端面,ターン下流の内・外壁近傍において,LDVによる詳細な平均および変動速度場の測定を行った.この測定結果とナフタレン昇華法による局所伝熱特性の測定結果とを比較・検討することにより,ターン後の伝熱に対しては各壁面に垂直方向の平均速度成分による寄与が大きいことを明らかにした.シャープターンをもつ矩形断面流路内の乱流では,ターン通過時に遠心力の影響により二次流れが発生するとともに,内壁(隔壁)先端付近で流れのはく離・再付着が起こるため,3次元かつ非定常な流動特性を示す.また,こうした流動特性の影響を受けて,壁面上の局所熱伝達率も非常に複雑に変化する.本研究では,PIVおよびLDVを用いて流路内の複雑な流動特性を測定するとともに,ナフタレン昇華法により各流路壁面上の局所熱(物質)伝達率を測定し,両者の相関からシャープターン流路における伝熱のメカニズムを明らかにすることを目的とした.まず,180^。シャープターンをもつ矩形断面流路において,種々の実験条件のうちターン部の間隙と隔壁の傾斜角度が局所伝熱特性に及ぼす影響に注目し,流路全壁面上の局所熱(物質)伝達率をナフタレン昇華法で測定した.その結果,ターン内からターン下流領域における複雑な局所熱伝達率分布と,伝熱特性に及ぼす上記のパラメータの影響が明らかとなった.次に,PIVによりターンとその下流における流動特性の測定を行い,ターン内コーナー部における再循環領域,ターン下流における二次流れ,ターン下流の隔壁上に形成されるはく離泡と流れの再付着,再付着後における流れの偏りなど,比較的大規模な流れ場の構造を明らかにした.このPIVによる結果を参考にしながら,局所伝熱特性が特に人きく変化したターン部の流路端面,ターン下流の内・外壁近傍において,LDVによる詳細な平均および変動速度場の測定を行った.この測定結果とナフタレン昇華法による局所伝熱特性の測定結果とを比較・検討することにより,ターン後の伝熱に対しては各壁面に垂直方向の平均速度成分による寄与が大きいことを明らかにした.シャープターンをもつ矩形断面流路内の流れは,ターン通過時に遠心力の効果により二次流れが発生するとともに,ターン部の内壁先端(エッジ)で流れがはく離するため,3次元かつ非定常な特性を示す.そのため,従来の点計測法では流動の全貌を明らかにすることは出来ない.そこで本研究では,瞬時の流れ場を面計測することが可能なPIV法(粒子画像速度計測法)を応用して,流路内の複雑な流動特性を測定することとした.とくに,伝熱実験と同じ条件で速度計測を行うために,従来は難しかった空気流に対してPIV法を適用し,熱と運動量輸送のメカニズムの解明を試みた.PIV法としては,2台のシート状レーザー光源とクロスコリレイション・カメラを同期させ,数十μ秒の時間間隔で撮影した2枚の画像の相互相関から速度を求める2画像相関法を採用した.まず空気流の計測に適したシード粒子を検討・選定するために,単純な直線流路において測定を行った.その結果,プロピレングリコールを加熱して得た微小粒子をシードした場合に,主流速度に関して良好な精度が得られることが判明した.次に,はく離や逆流を伴う流れへの有効性を検討するために,詳細なデータが公開されているバックステップ流の測定を行ったところ,主流速度のみならず断面内速度,変動速度強度,乱流応力の測定値に対しても,ここで採用したPIV法は高い信頼性を有することが確認された.以上の結果を踏まえて,180度シャープターンをもつ矩形断面往復流路のターン部分において流れ場の測定を行うとともに,熱(物質)伝達実験も行い両者の関係を比較した.その結果,ターン部分の内壁先端における流れのはく離・再付着,コーナー部での再循環,流路壁への衝突の状態が明らかになるとともに,これらの流動特性が局所伝熱特性と極めて良く対応することが見出された.

シャープターンをもつ矩形断面流路内の乱流では,ターン通過時に遠心力の影響により二次流れが発生するとともに,内壁(隔壁)先端付近で流れのはく離・再付着が起こるため,3次元かつ非定常な流動特性を示す.また,こうした流動特性の影響を受けて,壁面上の局所熱伝達率も非常に複雑に変化する.本研究では,PIVおよびLDVを用いて流路内の複雑な流動特性を測定するとともに,ナフタレン昇華法により各流路壁面上の局所熱(物質)伝達率を測定し,両者の相関からシャープターン流路における伝熱のメカニズムを明らかにすることを目的とした.まず,180°シャープターンをもつ矩形断面流路において,種々の実験条件のうちターン部の間隙と隔壁の傾斜角度が局所伝熱特性に及ぼす影響に注目し,流路全壁面上の局所熱(物質)伝達率をナフタレン昇華法で測定した.その結果,ターン内からターン下流領域における複雑な局所熱伝達率分布と,伝熱特性に及ぼす上記のパラメータの影響が明らかとなった.次に,PIVによりターンとその下流における流動特性の測定を行い,ターン内コーナー部における再循環領域,ターン下流における二次流れ,ターン下流の隔壁上に形成されるはく離泡と流れの再付着,再付着後における流れの偏りなど,比較的大規模な流れ場の構造を明らかにした.このPIVによる結果を参考にしながら,局所伝熱特性が特に大きく変化したターン部の流路端面,ターン下流の内・外壁近傍において,LDVによる詳細な平均および変動速度場の測定を行った.この測定結果とナフタレン昇華法による局所伝熱特性の測定結果とを比較・検討することにより,ターン後の伝熱に対しては各壁面に垂直方向の平均速度成分による寄与が大きいことを明らかにした.
脳血管疾患患者へのニューロフィードバックを用いた摂食嚥下リハビリテーションの確立

平成29年30年度においては、脳血管障害を有しない健常者10名を対象に、以下の3条件においてfNIRS装置Spectratech OEG-16APDを用いて前額部の脳血流測定を行い、口腔周囲の運動が脳機能に及ぼす影響を測定した。条件1)舌運動課題時(舌を挺出し左右口角に達するように繰り返し動かす)、条件2)舌運動課題想起時、条件3)他者の舌運動映像視聴時である。10名の被験者から得られた脳酸素化ヘモグロビン(Oxy-Hb)変化データは、BRain Analyzer ver.2.0(B.R.system社製)を用いて加算平均を行い、各課題条件におけるOxy-Hb変化量比較測定を行った。安静時と条件1時の比較では、課題前後のOxy-Hb変化量を比較したところ、10名中9名に有意な増大を認めた。安静時と条件2時の比較では、課題想起時においてはOxy-Hb変化量に差は見られるものの、10名中3名にのみOxy-Hb有意な増大を認めた。安静時と条件3時の比較では、他者の舌運動映像視聴時のOxy-Hb変化量は、10名中10名全員において有意な増大が認められた。本研究では、舌運動課題想起を行うことに比べ、視覚的に課題情報を得ることで効果的に脳機能の活性が得られると考えられた。訓練時において正しい訓練手技を実際に行えないとしても、他者の舌運動映像を視覚情報として与えることによって、効果的な脳機能の活性化を行うことができるものと考えられる。実際の運動課題実施と比較した場合、本研究での課題映像視聴では同等の脳機能の活性は得られなかった。このため、被験者に提供する映像課題の検討及び、映像視聴に加えて行う有効な手技の検討が必要であると考える。また、実際課題映像視聴時に自分の運動課題実施をイメージしていたかどうかについては検討が必要と考えられた。平成30年度は改めて対象となる脳血管疾患後遺症患者の症例数を増やしていく予定であったが、現在在宅療養中や施設入居中の患者においては、脳の障害部位が医療情報として得られる患者で、研究協力が得られる対象が限られており、測定が遅滞している。また、脳活性を高めるために効果的な映像課題の作製が難航しており、進捗状況が遅れる原因となった。対象患者の確保に関しては、現在連携をとっている医療施設に対して再度協力依頼を行い、対象となる脳血管疾患後遺症患者の症例数を増やしていく。また得られた症例においては平成30年度までに作成した舌運動課題施行前後のリハビリテーション効果を客観的に評価していく。課題画像の作製については、まず健常者を対象に更に測定回数を増やし改善を進め、脳血管疾患後遺症患者への利用へつなげていく。初年度である平成29年度は、脳血管障害を有しない健常者10名(男性4名、女性6名、平均年齢39.8±8.3歳)を対象に、以下の3条件においてfNIRS装置Spectratech OEG-16APDを用いて前額部の脳血流測定を行い、口腔周囲の運動が脳機能に及ぼす影響を測定した。測定条件は1)口腔周囲筋:舌運動課題時(舌を挺出し左右口角に達するように繰り返し動かす)の測定、2)口腔周囲筋:舌運動課題想起時の測定、及び3)他者の口腔周囲筋:舌運動映像視聴時の測定を当初計画した条件に追加し実施した。舌運動課題前後の脳酸素化ヘモグロビン(Oxy-Hb)変化値を比較したところ、10名中9名において前額部全域でOxy-Hb変化値の増大を認めた。次に、舌運動課題想起時においてはOxy-Hb変化値に差は見られるものの、安静時との間に有意な差は認められなかった。他者の舌運動映像視聴時のOxy-Hb変化値は、10名中8名において増大が認められた。以上の結果より、運動課題想起に加え、視覚的に課題情報を得ることにより、更に脳機能の活性が得られると考えられた。今後対象となる脳血管疾患後遺症患者においても健常者同様、自分自身の舌運動想起を行うのみでなく、今回の測定で用いた他者の舌運動映像を、自身の脳血流情報とともに視覚的にフィードバックすることによって、より効果的な脳機能の活性化を行うことができるものと考えられた。当初計画では対象とする脳血管後遺症患者の条件として、脳卒中運動機能障害重症度スケール(JSS-M)において重度患者、脳活動測定における左右差を考慮し、右半球に障害を受けたものに限定していたが、日本歯科大学口腔リハビリテーション科を外来及び訪問にて受診する患者、研究協力者が所属する各施設に入所中の患者において条件を満たす症例数が集まっていない。

安静時と条件1時の比較では、課題前後のOxy-Hb変化量を比較したところ、10名中9名に有意な増大を認めた。安静時と条件2時の比較では、課題想起時においてはOxy-Hb変化量に差は見られるものの、10名中3名にのみOxy-Hb有意な増大を認めた。安静時と条件3時の比較では、他者の舌運動映像視聴時のOxy-Hb変化量は、10名中10名全員において有意な増大が認められた。本研究では、舌運動課題想起を行うことに比べ、視覚的に課題情報を得ることで効果的に脳機能の活性が得られると考えられた。訓練時において正しい訓練手技を実際に行えないとしても、他者の舌運動映像を視覚情報として与えることによって、効果的な脳機能の活性化を行うことができるものと考えられる。実際の運動課題実施と比較した場合、本研究での課題映像視聴では同等の脳機能の活性は得られなかった。このため、被験者に提供する映像課題の検討及び、映像視聴に加えて行う有効な手技の検討が必要であると考える。また、実際課題映像視聴時に自分の運動課題実施をイメージしていたかどうかについては検討が必要と考えられた。平成30年度は改めて対象となる脳血管疾患後遺症患者の症例数を増やしていく予定であったが、現在在宅療養中や施設入居中の患者においては、脳の障害部位が医療情報として得られる患者で、研究協力が得られる対象が限られており、測定が遅滞している。また、脳活性を高めるために効果的な映像課題の作製が難航しており、進捗状況が遅れる原因となった。平成30年度は改めて対象となる脳血管疾患後遺症患者の症例数を増やしていく。現在在宅療養中や施設入居中の患者においては、脳の障害部位が医療情報として提供されていない者が多く、主治医への対診も行っていく予定である。また得られた症例においては平成29年度に作成した舌運動課題施行前後のリハビリテーション効果を客観的に評価していく。対象患者の確保に関しては、現在連携をとっている医療施設に対して再度協力依頼を行い、対象となる脳血管疾患後遺症患者の症例数を増やしていく。また得られた症例においては平成30年度までに作成した舌運動課題施行前後のリハビリテーション効果を客観的に評価していく。課題画像の作製については、まず健常者を対象に更に測定回数を増やし改善を進め、脳血管疾患後遺症患者への利用へつなげていく。(理由)対象患者の確保が遅れており、必要器具の購入を行わなかった。(使用計画)患者への視覚課題提示用モニターやソフトの購入、統計解析を進めるための解析ソフト(IBM社SPSS)、研究調査・成果発表に係る経費、別刷りの印刷代を予定している。対象患者の確保が遅れており、必要器具の購入を行わなかったため、今年度は患者への視覚課題提示用モニターやソフトの購入、統計解析を進めるための解析ソフト(IBM社SPSS)、研究調査・成果発表に係る経費、別刷りの印刷代を予定している。
IL-27/IL-35共通サブユニットEBI3による新しい蛋白質発現の制御機構

本研究では、Epstein-Barr virus-induced gene 3 (EBI3)がCD4+T細胞中で、細胞内分子として、蛋白質の高次構造形成に重要な分子シャペロンであるカルネキシンへの結合を介し、IL-23Rαの蛋白質レベルでの発現を増強するという新しい機構を明らかにした。さらに、ヒトのゲノムワイド関連解析により明らかになったIL-23RαG149R変異体を用いた解析より、この部位がEBI3のIL-23Rαへの結合する領域で、ヒトの腸炎発症へのEBI3の関与も示唆された。ナイーブCD4+T細胞を病原誘導性Th17分化条件下(IL-1β+IL-6+IL-23)で抗CD3/抗CD28刺激した3日後ウエスタンブロット解析より調べると、EBI3欠損CD4+T細胞ではIL-23R発現の顕著な低下が見られた。この時、プロテアソーム阻害剤(MG132)とリソソーム阻害剤(Pepstatin A+E64d)の効果を比べると、プロテアソーム阻害剤処理によりEBI3欠損CD4+T細胞でのIL-23R発現の低下がキャンセルされ、同様な効果はリソソーム阻害剤では見られず、両方処理するとさらに野生型CD4+T細胞よりIL-23R発現が増加した。これらの結果より、EBI3が欠損していると正しい高次構造を有するIL-23R蛋白質の合成が低下し、欠陥蛋白質が作られるとプロテアソーム分解系に送られ分解されるが、プロテアソーム阻害剤処理により欠陥蛋白質が分解されず蛋白質発現としては同程度まで回復したと考えられる。さらに、興味深いことにプロテアソーム阻害剤処理によりEBI3の分子量が若干短くなりTruncated EBI3が生成されることがわかった。また、293T細胞へIL-23RとIL-12β1、EBI3の発現ベクターを遺伝子導入し蛍光標識された市販の抗IL-23R抗体を用いて蛍光免疫染色解析を行うと、EBI3存在下では、細胞内のみならず細胞表面でのIL-23R発現が増強されることがわかった。以上の結果より、EBI3がサイトカインとしてではなく細胞内分子として、IL-23R蛋白質の高次構造形成を亢進させる新しい機能を有していることを明らかにした。おおむね予定通り進んでいると思われる。その中で、プロテアソーム阻害剤処理によりEBI3の分子量が若干短くなりTruncated EBI3が生成されることがわかった。これは、MG132処理による小胞体ストレスによりCaspaseが活性化されて切断された可能性が一番高いと考えられる。今後、野生型EBI3とtruncated EBI3の機能の違いが見い出せれば、興味深い。(1)再構成系でのEBI3によるIL-23R蛋白質の品質管理HEK293T細胞にIL-23RやIL-12Rβ1、EBI3、IL-23反応性の(GAS)3-Luciferaseを強制発現させ、EBI3存在下・非存在下でIL-23R発現、ルシフェラーゼ活性やSTAT3のリン酸化を測定した。その結果、EBI3は発現量依存的に、IL-23R発現を増しルシフェラーゼ活性やSTAT3のリン酸化などのシグナルを増強すること、この時、免疫沈降反応より、EBI3とIL-23Rの会合が見られることがわかった。(2) EBI3による蛋白質の品質管理の特異性とその作用機序蛋白質の品質管理に関わる分子として分子シャペロンの一つカルネキシンが重要である。そこで、カルネキシンとEBI3およびIL-23Rの会合を免疫沈降反応および糖合成阻害剤を用いた検討より、EBI3はカルネキシンおよびIL-23Rに結合すること、この時、糖鎖ではなくペプチドを介して結合することがわかった。さらに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりカルネキシン発現を消失させると、EBI3のIL-23R発現増強効果が見られなくなることも見出した。(3) MHCクラスIの抗原提示能への効果EBI3欠損マウス由来DCを抗原提示細胞としてOVA特異的CD8+T細胞受容体のOT-I Tgマウス由来のCD8+T細胞を刺激し、細胞増殖を3H-チミジンの取り込み調べると、EBI3欠損マウス由来DCでは、増殖誘導が減少し、抗原提示能力が低下していることがわかった。さらに、HEK293T細胞を用いた再構成系で、EBI3がMHCクラスIに会合することがわかった。当初の予定通り概ね進んでいる。最後の1年で、論文に纏めるのと、さらにこの現象の一般性を高める検討を行いたい。(1) Truncated EBI3生成の意義その作用機序:ナーブCD4+T細胞を抗CD3抗体と抗CD28抗体で刺激するとEBI3発現が増強されるが、この刺激の際、プロテオソーム阻害剤を共存させておくと、分子量の若干小さいEBI3が発現され、リソソーム阻害剤ではそのような現象は見られなかった。これは、プロテオソーム阻害剤による小胞体ストレスにより、Caspaseが活性化されて切断された可能性が一番高いと考えられ、現在、さらに検討中である。(2) EBI3とIL-23R蛋白質発現の相関性とその意義:ヒトゲノムGWAS解析により、IL-23Rの遺伝子多型G149R、V362I、R381

Q変異が、いずれもIL-23Rの蛋白質発現の安定性の低下により発現が低下し、炎症性腸疾患発症と負の相関がある。この内、G149Rだけが細胞外領域である。そこで、この変位を持つIL-23R変異体を作製したところ、この変異体へのEBI3の結合性が低下し、EBI3によるIL-23Rの発現増強効果も減弱することがわかった。つまり、この部位がEBI3の結合部位であり、ヒトの腸炎発症にも関与している可能性が示唆された。(3) EBI3が結合する他の分子の探索:我々は、EBI3が特に炎症時に、細胞分泌蛋白質および細胞膜蛋白質の発現増強と安定化に重要な役割を担っていることを一般化するため、EBI3が結合する分子について探索を行った。その結果、IL-23RやMHCクラスIの他に、gp130にも結合することがわかった。EBI3をHEK293T細胞に強制発現するとFACS解析によりEBI3の発現が細胞表面上に観察され、siRNAによりgp130発現を低下させると、EBI3の細胞表面発現も低下すること、再構成を用いた免疫沈降反応の解析によりEBI3とgp130が共沈することを見出した。現在さらに検討中である。本研究では、Epstein-Barr virus-induced gene 3 (EBI3)がCD4+T細胞中で、細胞内分子として、蛋白質の高次構造形成に重要な分子シャペロンであるカルネキシンへの結合を介し、IL-23Rαの蛋白質レベルでの発現を増強するという新しい機構を明らかにした。さらに、ヒトのゲノムワイド関連解析により明らかになったIL-23RαG149R変異体を用いた解析より、この部位がEBI3のIL-23Rαへの結合する領域で、ヒトの腸炎発症へのEBI3の関与も示唆された。(1)再構成系でのEBI3によるIL-23R蛋白質の品質管理HEK293T細胞では、内在性EBI3発現が見られないので、この細胞にIL-23RやIL-12Rβ1、EBI3、IL-23反応性の(GAS)3-Luciferaseを強制発現させ、プロテアーゼ阻害剤処理後IL-23刺激し、EBI3存在下・非存在下でルシフェラーゼ活性やSTAT3およびSTAT4のリン酸化を測定し、EBI3によるIL-23R発現の増強効果について再構成系を用いて検討する。(2) EBI3による蛋白質の品質管理機構の特異性とその作用機序我々は、予備的実験よりEBI3が結合する膜蛋白質としてgp130には結合するが、IL-12Rβ1には結合しないことも見出している。そこで、こられ2つの分子についても蛋白レベルでの発現の安定性を調べ特異性を明らかにし、その意義について検討する。その作用機序について、合成されたばかりの膜蛋白質や分泌蛋白質に結合し正しい高次構造形成を促進することが知られているカルネキシンの関与について検討する。(3) MHCクラスIの抗原提示能への効果我々はEBI3が短くなったTruncated EBI3が生成されることを見出している。EBI3のアミノ酸配列を調べるとマウスとヒトで保存されたCapase-8の認識配列であるAsp-X-X-Asp配列がカルボシル基末端側の約3kDaの断片が切り出される可能性を見出した(未発表)。そこで、そのAsp残基をAla残基に置換した変異体を作製し、HEK293Tに遺伝子導入しIL-23刺激やMG132処理の有無でTruncated EBI3ができるか調べ、その意義や作用機序を調べる。IL-23Rの遺伝子多型が炎症性腸疾患発症と相関する報告が複数ある。
最新の素粒子実験及び宇宙観測に基づく初期宇宙論の展開

今年度は、暗黒物質(DM)をはじめ様々な分野において研究を行った。DMは少なくとも重力的に他の粒子と相互作用することが分かっているため、筆者は共同研究者とともに重力の影響のみからDMが生成される場合について議論した。特にDMの質量がインフラトン質量よりも小さい場合にはインフラトン振動期にDMを効率的に生成可能であることを示した。また別のシナリオとして、DMが電弱相互作用を有する場合に電弱精密測定を通してこの粒子を間接的に探索する可能性を議論した。この他、筆者は共同研究者とともに、DMと銀河内の宇宙線電子との散乱により生成されたDM fluxを、ニュートリノ実験にて観測する手法を提案した。DMが軽いほど銀河内数密度は高いため、この探索方法はDMが軽い場合に有効である。また通常のDM直接探索と異なりDMが相対論的であるため、異なるkinematic regimeを探索可能であり相補的である。また散乱振幅に関する研究も行った。散乱振幅のユニタリティなどの性質から、有効理論のある種の項の係数に対して制限を得られることが知られている。筆者は共同研究者とともにケーラーポテンシャルの四次項の係数に対する制限を議論した。この符号は一般には決まらないが、ある符号を取ることは考えられる紫外補完に対し制限を与えることを示した。他にもインフレーションに関する研究も行った。特にクロモナチュラルインフレーションと呼ばれる、インフレーション中にゲージ場が一様等方な背景場を持つ模型におけるフェルミオン生成について議論した。この模型ではカイラルアノマリー方程式からそれに対応した粒子が生成されることが予想されるが、筆者は共同研究者とともに粒子生成を具体的に計算し、その結果がアノマリー方程式を満たすことを陽に確認した。また粒子生成のバックリアクションを議論し、これが無視可能であることを確認した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
視覚情報と行為の相互作用に関する認知心理学的研究

以下の4つの研究を行い、知覚と行為の相互作用は様々な知覚特性、反応特性間で生じる、人間の認知情報処理における強力で基本的な性質であることを明らかにした。1)刺激が提示された側での反応が促進される刺激反応適合性効果が知られている。同側での反応行為を自動的に活性化する知覚情報について、刺激の消失を用いて片側での変化による過渡的情報と片側での刺激源の存在による定常的情報とを分離して検討した。視覚刺激では変化が一意に同側の反応行為を活性化したが、聴覚刺激では刺激源が存在する側で反応行為の弱い活性化がみられた。2)様々な知覚関連履歴が後続の知覚事象に影響を及ぼすことが知られている。ある刺激に対する反応行為関連履歴の時間知覚への影響を検討した結果、ある刺激に関する反応競合履歴も、その刺激が再呈示された場合の時間知覚に影響を与えることを示した。3)上下、左右両方で刺激反応適合性効果が生じる場合、左右の効果の方が上下の効果よりも大きい。この左右の優勢は、左右位置に対する準備は上下位置に対する準備よりも強力であることに由来し、心的構えによって視覚と行為の相互作用の性質が影響されることを明らかにした。4)刺激反応適合性は反応時間には影響したが反応の強さには影響せず、刺激特徴の繰り返しが反応時間と反応強度に与える影響は異なるパタンを示したことから、視覚情報と行為の相互作用において視覚情報は異なる行為構成要素に対して異なる影響を及ぼすことを明らかにした。視覚情報と行為の相互作用に関して,以下の3つの研究を行った.2.行為の視知覚への影響として,遂行中の行為と特徴を共有する視覚情報を見落としやすくなることが知られている.この反応適合刺激の見落としにおいて,行為そのものの特徴の重要性が強調されてきたが,いかなる行為を行うかを指示する手がかりや行為をどちらの手で行うかといったような,行為イベントを構成する様々な要因も見落としを生じうることを示した.また一方で,上と右,下と左の空間的対応(直交型刺激反応適合性)は見落としを生じないことを確認し,特徴共有による行為から視知覚への干渉効果の生起の境界条件についての知見を得た.これらの成果についてHoustonで行われた国際学会OPAMで報告し,また英語論文を執筆し国際誌に投稿した.3.運動刺激近傍で光点が短時間提示されたとき,光点に対する運動刺激の位置が相対的に運動方向に進んで知覚されるフラッシュラグ効果において,運動刺激を指差し追跡するとフラッシュラグ効果が低減されることを示し,行為の関与が視知覚をより正確にすることを明らかにした.本研究成果を日本心理学会第70回大会で発表した.以下の4つの研究を行い、知覚と行為の相互作用は様々な知覚特性、反応特性間で生じる、人間の認知情報処理における強力で基本的な性質であることを明らかにした。
セルロースの酵素分解を促進する細菌由来黄色色素の構造と機能および合成遺伝子の探求

Clostridium thermocellum ATCC27405株の菌体よりアセトンで抽出した黄色色素を微結晶性セルロース(フナセル)に吸着させ、各種セルラーゼに対する感受性を調べた。その結果、同菌株由来のセルロソームに対しては、未処理のフナセルに比べて約3倍の分解性を示した。また、3種類のセルラーゼとキメラ骨格タンパク質からなるミニセルロソームに対しても約2.5倍の分解性を示した。黄色色素がセルラーゼの分解力を高めることを示した初めての研究例で、今回の発見は極めて重要である。Clostridium thermocellumをはじめとするセルロース分解性細菌は黄色色素を生産することが知られており、セルロース分解過程における機能を明らかにすることを目的としている。C.thermocellumをろ紙を炭素源として培養し、セルロース残渣および菌体より100%アセトンを用いて黄色色素を抽出した。黄色色素のHPLCによる分離条件を小スケールで検討した。順相条件ではIntensil Diolカラムを用い、移動相をヘキサン/エタノール/酢酸エチル(60/15/25)とした時、6本のピークを検出した。また、逆相条件では、カラムにInertsil ODS-4、移動相を0.1%ギ酸を含む50-95%メタノールグラジエントを用いることにより5本のピークを確認することが出来た。両条件とも再現性よく分離することが出来、スケールアップすることにより構造解析に用いることが可能であると判断した。ろ紙を炭素源としたC.thermocellumの培養上清よりセルロソーム(セルラーゼ複合体)を調製する方法を確立した。天然のセルロソームは黄色色素と接触しており、黄色色素の機能を評価するのには適当でない可能性があり、大腸菌等の異宿主で発現することが望ましい。C.thermocellumのコヘシンと糖質結合モジュールを持つミニ骨格タンパク質を大腸菌を宿主として発現させた。一方、セルラーゼとしてC.thermocellumのエンドグルカナーゼCelAを発現させた。ミニ骨格タンパク質とCelAの複合体は微結晶セルロースであるアビセルに活性を示し、黄色色素の機能の解析に用いることが出来ることを示した。ミニ骨格タンパク質を作成する過程でコヘシンとドックリンの相互作用を解析した。以上の結果は、ほぼ実験計画通りであり、次年度の研究の重要な基礎データである。Clostridium thermocellumをはじめとするセルロース分解性細菌は黄色色素系を生産することが知られており、セルロース分解過程における機能を明らかにすることを目的としている。分取用HPLCを用いて黄色色素の単離・精製を試みた。C.thermocellumを微結晶性セルロース(アビセル)を炭素源として培養し、セルロース残渣および菌体より100%アセトンを用いて黄色色素を抽出した。てれをHPLCにより黄色色素画分を分画した。黄色色素が酸素および光に感受性があり、精製過程で退色することが見いだされ、既知のカロテノイド系色素とは異なることが予想されたため、現在精製方法を改善しているところである。天然のセルロソームは微生物の生育過程で黄色色素と接触しており、黄色色素の機能を正しく評価するのには適当でない可能性があり、大腸菌等の異宿主で発現することが望ましい。C.thermocellumの2種類のコヘシン、Clostridium josui由来のコヘシンおよび糖質結合モジュールを持つキメラ骨格タンパク質を大腸菌を宿主として発現させた。一方、それぞれのコヘシンに対応するドックリンを持つキメラセルラーゼを大腸菌で発現・精製した。キメラ骨格タンパク質とキメラセルラーゼからなる人工セルロソームを作製したところ、セルラーゼを混合した場合に比べ数倍以上の活性の増強が見られ、糖質結合モジュールの効果とセルラーゼの近接効果によるものと考えられ、黄色色素の機能解析に適切な人工セルロソームを構築できたと判断した。C.thermocellum ATCC27405株を宿主とし、プラスミドpNW33Nを用いてエレクトロボレーションによる遺伝子導入を行い、条件確立のための基礎的情報を得た。さらに、黄色色素に関する遺伝子情報を取得するため、黄色色素形成能が低下したC.thermocellum F-1株のゲノム解析を、次世代型シーケンサを用いて行った。以上の結果は、ほぼ実験計画通りであり、次年度の研究に向けてのデータを取得できた。Clostridium thermocellumをはじめとするセルロース分解性細菌は黄色色素を生産することが知られており、セルロース分解過程における機能と構造を明らかにすることを目的として研究を行った。微結晶性セルロース(アビセル)を炭素源としてC.thermocellumを培養し、セルロース残渣および菌体より100%アセトンを用いて黄色色素を抽出した。抽出液をアビセルと混合した後に水を加えることにより黄色色素をアビセルに結合させ、各種セルラーゼの反応用基質とした。セルラーゼとしてC.thermocellum由来の天然セルロソームを用いた場合、黄色色素を結合した基質では、色素を結合していない対照の基質に比べ約3倍の分解性を示した。

黄色色素を生産しない変異株を単離し、黄色色素の抽出とアビセルへの結合の操作を行い、その分解性を調べると、対照との差は見られず、黄色色素がセルロソームのセルロース分解力を高めていることが確かめられた。C.thermocellum由来ファミリー3糖質結合モジュール、Clostridiumjosui由来のコヘシン、C.thermocellum由来のタイプIおよびタイプIIコヘシンを連結したキメラ骨格タンパク質を作製し、それぞれのコヘシンに対するドックリンを有するC.thermocellum由来のセルラーゼCe19K、Ce18AおよびCbh9Aを用いてミニセルロソームを作製した。ミニセルロソームのセルロース分解力も黄色色素により約2.5倍高められた。単独のセルラーゼを作用させた時、エキソ型の活性を持つCe19KおよびCbh9Aの活性は約2倍高められたが、エンド型セルラーゼであるCe18Aの活性は逆にやや抑制された。C.jasui由来Ce19EとPaenibacillus barcinonensis由来Ce148Cを含むミニセルロソームの活性は、黄色色素の影響を受けなかった。糸状菌Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼEGIIの活性は黄色色素により数割高められたが、セロビオヒドロラーゼの活性はやや抑制された。原子間力顕微鏡観察の結果では、黄色色素の結合による結晶性セルロースの構造変化は認められなかった。光および酸素により黄色色素は構造変化を起こすため、構造決定には至っておらず、なお検討中である。