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AAA+シャペロンがリング構造を利用して凝集タンパク質をほぐす仕組み

凝集タンパク質を再生する分子シャペロンClpBは、リング状の6量体で働く。6量体中の隣接するサブユニットを、ジスルフィド結合でつなぐことで、変異サブユニットが交互に並んだヘテロ6量体を作製した。これを用いた解析で、ClpB6量体ではATPの結合はランダムに、加水分解は協同的に起こることを示した。分子シャペロンDnaKはClpBとともに働くが、その親和性は低い。両者の協力の仕組みを解明するため、これらをペプチドリンカーを介して融合させた。この融合体のDnaK部分に変異を導入しその影響を解析したところ、DnaKは基質を強く結合するClosed型のときにClpBを活性化することが分かった。AAA+タンパク質の一つである分子シャペロンClpBは、変性・凝集したタンパク質をほぐし(脱凝集)、再生することができる。ClpBは、サブユニット内にAAA1、AAA2、と呼ばれる2つのATP結合ドメインを持ち、リング状の6量体を形成して働く。この6量体内では、AAA1、AAA2それぞれがリング状に会合する。ClpBは、凝集体内のタンパク質を一つづつこのリングの中央の孔に通すことで、ほぐすと考えられている。本研究では、このClpB6量体のサブユニットの並びを制御し、サブユニット間の協同性、および6量体リング全体の構造変化を明らかにし、脱凝集反応の分子機構に迫る。まず、ClpBがタンパク質をリング中央の孔に通す、糸通し活性について、各AAAドメインでのATPの結合・加水分解、さらに、中央孔部分に保存されている芳香族アミノ酸の役割を調べた。その結果、変性状態のタンパク質であれば、ATPの加水分解なしに糸通しが起こること、またその際、ATPの結合や、リング中央の芳香族アミノ酸は、変性タンパク質の結合に重要な役割を果たしていることを見出した。また私たちは、これまでに、変異導入したシステイン残基間のジスルフィド結合で、ClpBリング内で隣り合うサブユニットを固定する方法を見出している。これを利用して、ATP結合能、あるいは加水分解活性を失わせたサブユニットを6量体中に交互に並びいれたヘテロ6量体を多数作製し、解析をおこなった。その結果、ClpB6量体中の各AAAドメインは、それぞれ独立にATPを結合し、その加水分解はリング内で協同的に行われること、また、一方のAAAドメインからなるリングへのATPの結合が、もう一方のリングでの協同的な加水分解に必要であることを見出した。さらに、有意な脱凝集反応には、少なくとも一方のリングでの協同的なATP加水分解が必要であることを明らかにした。リング状の6量体を形成して働く分子シャペロンClpBは、AAA+タンパク質ファミリーに属し、1サブユニット中に、AAA1、AAA2と呼ばれる2つのAAA+モジュールを持つ。これらのAAA+モジュールは、それぞれATPを結合・加水分解し、そのサイクルに応じて構造を変化させる。平成26年度には、特異的なジスルフィド結合により、特定の変異を導入したClpBサブユニットを6量体リング内に交互に並びいれる方法を開発し、ATP結合・加水分解サイクルにおける協同性を解析した。平成27年度は、この系を利用して、構造変化の協同性の解析を進めた。その結果、ミドルドメインと呼ばれる棒状のドメインの構造変化が、隣接するサブユニットのミドルドメインの構造に影響を与える可能性が示された。また私たちは、ミドルドメインの先端に、ClpBのシャペロン活性に必須のアミノ酸残基が複数あり、隣接するサブユニットと相互作用することを見出している。光架橋試薬を用いた解析から、その相互作用先の部位をある程度絞ることができた。最近、ClpBとともに働く分子シャペロンDnaKが、ヌクレオチド結合ドメインと呼ばれる部分でClpBのミドルドメインに結合し、ClpBのATP加水分解活性やシャペロン活性を制御することが明らかになりつつある。このDnaKによる制御と、ClpBリング内の協同性の関連を明らかにするため、DnaKとClpBからなる融合タンパク質を作製した。また、この融合タンパク質では、ClpBの活性が促進された状態にあることが確認できた。3サブユニットを特定の並びで連結させたClpB6量体の作製など、一部の実験は遅れているが、特定の変異サブユニットを6量体リングに交互に並びいれる方法を用いた、構造変化の協同性の解析により、新たな成果が得られている。また、ClpBのサブユニット間の協同性が、シャペロン機能にどう関わるのかを解明するための有効なツールとして、DnaKとClpBからなる機能的な融合タンパク質の作製に成功している。分子シャペロンClpBは、リング状の6量体を形成して働くAAA+タンパク質で、サブユニット1つは、2つのAAA+モジュールと、Nドメイン、ミドルドメインからなる。AAA1、AAA2と呼ばれる2つのAAA+モジュールは、それぞれATPを結合・加水分解し、そのサイクルに応じて構造を変化させる。これらのAAA+モジュールの間に位置するミドルドメインは、ClpBの活性を制御し、また、ClpBとともに働く分子シャペロンDnaKと結合することが見出されている。私たちはこれまでに、サブユニット間の特異的なジスルフィド結合により、特定の変異を導入したClpBサブユニットを6量体リング内に交互に並びいれる方法を開発しており、平成27年度には、この方法を用いて、隣接するサブユニットのミドルドメイン間で協同的な構造が起こる可能性を見出した。一方で、ミドルドメインの構造変化はDnaKの結合とも強く関連すると予想される。

ところが、DnaKとClpBの相互作用は非常に弱く、そのままでは詳細な解析が難しかったため、DnaKとClpBからなる融合タンパク質を作製した。平成28年度は、主にこの融合タンパク質を用いた解析を行った。その結果、DnaKは、凝集基質を強く結合したclosed状態で、ClpBに結合し、その活性を促進することで、脱凝集反応を効率的に進行させることを見出した。また、この仕組みは、無差別なタンパク質のアンフォールドや、ATPの無駄使いといった、ClpBの負の効果を非常に効果的に抑制するものであると考えられた。凝集タンパク質を再生する分子シャペロンClpBは、リング状の6量体で働く。6量体中の隣接するサブユニットを、ジスルフィド結合でつなぐことで、変異サブユニットが交互に並んだヘテロ6量体を作製した。これを用いた解析で、ClpB6量体ではATPの結合はランダムに、加水分解は協同的に起こることを示した。分子シャペロンDnaKはClpBとともに働くが、その親和性は低い。両者の協力の仕組みを解明するため、これらをペプチドリンカーを介して融合させた。この融合体のDnaK部分に変異を導入しその影響を解析したところ、DnaKは基質を強く結合するClosed型のときにClpBを活性化することが分かった。当初予定していた、3つのサブユニットを特定の並びで連結させたClpB6量体の作製は遅れているが、糸通し活性の解析、および、変異サブユニットを交互に導入したClpBヘテロ6量体の解析が大幅に進み、それぞれの成果を論文発表できた。得られた成果の公表を進めるとともに、DnaKとClpBの融合タンパク質を用いた解析を進める。タンパク質科学引き続き、3つのサブユニットを特定の並びで連結させたClpB6量体の作製を試みる。また一方で、変異導入したサブユニットを6量体リングに交互に並びいれる方法が、6量体リング内の協同性を調べる有効な手法であることも分かってきた。そこで、この方法を応用して、ATPの加水分解サイクルだけでなく、構造変化の協同性についても、同様の解析を進める。既存の物品・試薬等で十分な実験を行えたため。物品・試薬の購入や成果の公表に使用するとともに、研究を強力に推進するための実験補助員の雇用にも使用する。
Nitric oxideを用いた悪性神経膠腫の治療方法の検討

本研究では、一酸化窒素(以下NO)の培養神経膠腫細胞に対する増殖抑制作用と放射線増感作用を調べた。NO発生剤としてS-nitroso-N-acetyl-penicillamine(以下SNAP)とsodium nitroprusside(以下SNP)を用い、ヒトおよびラット神経膠腫細胞(T98G,U87,C6)の増殖に及ぼす影響を調べた。SNAPとSNPは、水溶液として培地中に添加すると濃度依存性にNOを発生することが明らかとなった。さらにこれら薬剤は全ての細胞株の増殖を濃度依存性に抑制した。この細胞増殖抑制作用は、NO吸着作用のある牛ヘモグロビンの前投与によって著しく減弱した。したがってNO発生剤によるグリオーマ細胞の増殖抑制作用は、NOそのものの作用であることが示唆された。次にNO発生剤のC6細胞の放射線感受性に及ぼす作用を検討した。培地中に薬剤添加直後にX線照射を行い、その後形成されるコロニー数から評価した。その結果、SNAPあるいはSNPの存在下では、X線照射後のC6細胞のコロニー形成率は濃度依存性に低下し、160μMのSNAPおよびSNPはC6細胞の放射線感受性を2-3倍に高めた。以上の結果からNO発生剤であるSNAPとSNPは悪性神経膠腫の増殖抑制に働き、放射線増感剤としても有望であると考えられた。近年NOは腫瘍内の血流の調節因子として注目され、NO発生剤投与でin vivoの腫瘍内血流が増加したとの報告もある。したがってNOを有効に用いることにより、悪性神経膠腫に対する薬剤到達性や酸素化の改善がなされ、放射線化学療法の有効性を高めることが期待される。これまでの我々の研究で、一酸化窒素(以下NO)は培養神経膠腫細胞に対して増殖抑制作用を有することが明らかとなった。そこで平成8年度の本研究では、増殖抑制作用の小さい低濃度のNOが培養神経膠腫細胞の放射線感受性を高めるかどうかを検討した。実験に用いたのはラット神経膠腫細胞(C6)である。NO発生剤はS-nitroso-N-acetyl-penicillamine(以下SNAP)とsodium nitroprusside(以下SNP)を用いた。C6細胞の放射線感受性は、薬剤添加後にX線照射を行い、その後形成されるコロニー数から評価した。その結果、SNAPあるいはSNPの存在下では、X線照射後のC6細胞のコロニー形成率は濃度依存性に低下し、160μMのSNAP、SNPはそれぞれC6細胞の放射線感受性を3倍、2倍に高めた。以上の結果からNO発生剤であるSNAPとSNPが、悪性神経膠腫の放射線増感剤として有望であると考えられた。平成9年度にはラット脳腫瘍モデルを用いて、in vivoにおける抗腫瘍効果を検討する予定である。その結果、SNAPあるいはSNPの存在下では、X線照射後のC6細胞のコロニー形成率は濃度依存性に低下し、160muMのSNAPおよびSNPはC6細胞の放射線感受性を2-3倍に高めた。

以上の結果からNO発生剤であるSNAPとSNPは悪性神経膠腫の増殖抑制に働き、放射線増感剤としても有望であると考えられた。近年NOは腫瘍内の血流の調節因子として注目され、NO発生剤投与でin vivoの腫瘍内血流が増加したとの報告もある。したがってNOを有効に用いることにより、悪性神経膠腫に対する薬剤到達性や酸素化の改善がなされ、放射線化学療法の有効性を高めることが期待される。
破骨細胞の骨基質接着と骨吸収におけるCa^<2+>の動態

破骨細胞は骨に接着すると極性化し、細胞膜は明帯、波状縁、血管側細胞膜の3つの領域に区別される。明帯(clear zone)は、アクチン-インテグリンからなる接着機構で骨表面のビトロネクチンと結合して骨に接着する領域であり、波状縁(ruffled border)は、明帯の内側に形成される膜構造で、骨吸収機能に直接関わる。破骨細胞は、骨基質のミネラル成分や有機質を分解するために、波状縁から酸や加水分解酵素などを分泌し、それと同時に、骨吸収により生じた分解産物を取り込んで、波状縁近傍に多数存在する空胞内で消化し、対極の血管側細胞膜から排泄する機構(transcytosis)を持つと考えられている。しかし、この破骨細胞のtranscytosisには依然として不明な点が多く、特に、骨の分解により生じるCa^<2+>が、破骨細胞内をtranscytosisされるのか否かについては議論がなされるところである。我々は、破骨細胞の骨吸収機能により遊離したCa^<2+>は、波状縁から破骨細胞内に取り込まれ、血管側にtranscytosisされるとの作業仮説を立て、骨片上で培養した破骨細胞と、細胞膜不透過性でCa^<2+>特異的に結合する蛍光色素を用いて、焦点レーザー顕微鏡を観察手段に様々な検討を行った。その結果、Ca^<2+>は微細な2μm以下の顆粒として破骨細胞に取り込まれ、時間経過とともに25μm径の顆粒として細胞内全体に観察された。そこで、波状縁に分布するV-ATPaseの阻害剤バフィロマイシンAを処理したところ、破骨細胞のCa^<2+>の取り込みは完全に抑制され、我々の仮説が立証された。また、取り込み後6872時間後にはCa^<2+>顆粒の大きさは5μm径以上になり、ほとんどが血管側細胞膜近傍に認められ、血管側に放出される可能性が考えられた。従って、一度破骨細胞内に取り込まれたCa^<2+>顆粒は、細胞内を血管側細胞膜側に移動しながらリソソームと融合し、やがて放出されるのではないかと考えられた。また、Ca^<2+>顆粒の細胞内の移動方法を検討するため、細胞骨格蛋白質であるアクチンおよびチューブリンの脱重合剤カルシトニンおよびノコダゾールを各々処理した結果、細胞内のCa^<2+>顆粒は拡散、消失し、Ca^<2+>顆粒の移動には細胞骨格が関与していることが強く示唆された。破骨細胞の骨吸収活性により骨基質から遊離するCa^<2+>が血中に取り込まれる経路には以下の3つが考えられる。1)Ca^<2+>は骨基質面と破骨細胞の隙間から自然に拡散し血管に吸収される。2)Ca^<2+>は自然拡散すると同時に一部は細胞膜上のCa^<2+>チャンネルを介して破骨細胞に吸収される。

3)Ca^<2+>は自然拡散もするが、多くは骨基質とともに破骨細胞内に吸収(endocytosis)され、血管側に移動・放出(transcytosis)される。これまでは主に1)が支持されてきたが、我々は破骨細胞のruffled border(波状縁)付近に多くのvacuoleが観察されること、そのvacuole内部にしばしば骨基質分解産物が観察されることから、3)の説を支持し、それを証明するために、骨基質上で骨芽細胞と共存培養した破骨細胞と細胞膜不透過性のCa^<2+>結合色素を用いる独自の方法で、コンフォーカル顕微鏡(LSM)で詳細に観察を行った。また、LSMに付属する生細胞観察装置を導入し、固定細胞のみならず、骨基質上の生破骨細胞を用いてCa^<2+>取り込み(vacuole様)、Ca^<2+> vacuoleの細胞内移動の観察に成功した。その結果、a)骨基質から遊離したCa^<2+>の多くは予想通り活性化した破骨細胞内にendocytosisされた。b)取り込まれたCa^<2+>はvacuole様の形態を示し、lysosomeのマーカー蛋白質と共局在した。c)生破骨細胞の観察から、Ca^<2+> vacuoleは波状縁から対極の細胞膜近辺に移動することが明らかになった。また、破骨細胞内のCa^<2+> vacuoleは時間とともにサイズが大きくなることから、vacuole同士が融合することが考えられた。これらの結果より上記3)の説が強く示唆されたため、論文を作成し現在投稿中である。今後は、GFP-チューブリンまたはGFP-アクチン発現破骨細胞を用いて、Ca^<2+> vacuoleと細胞骨格とのかかわりを観察する。さらに、生破骨細胞を用いてCa^<2+> vacuoleの細胞外放出を確認する。また、上記仮説2)にあるようにCa^<2+>チャンネルを介した流入するCa^<2+>のに対応して、破骨細胞内の波状縁面近傍にCa^<2+>結合蛋白質カルモジュリン(CaM)が極性化して観察されることから、CaMの役割と破骨細胞の機能との関連についても検討したい。破骨細胞の骨吸収活性により骨基質から遊離するCa^<2+>は以下の3つの経路で血中に取り込まれると考えられる。1)Ca^<2+>は骨基質面と破骨細胞の隙間から自然に拡散し血管に吸収される。2)Ca^<2+>は自然拡散されるとともに、破骨細胞膜上のCa^<2+>チャンネルを介して破骨細胞に吸収され放出される。現在は主に1)が支持されている、我々は破骨細胞のruffled border(波状縁)付近に多くのvacuoleが観察されること、そのvacuole内部にしばしば骨基質分解産物が観察されることから、3)の説を支持し、それを証明するために、骨基質上で骨芽細胞と共存培養した破骨細胞と細胞膜不透過性のCa^<2+>結合色素を用いる独自の方法で、コンフォーカル顕微鏡(LSM)を用いて詳細に観察を行った。また、生細胞観察を行い、固定細胞のみならず生破骨細胞内でのCa^<2+>取り込み(vacuole様)、Ca^<2+> vacuoleの細胞内移動の観察に成功した。b)取り込まれたCa^
電気力学的遅延による筋機能評価とコンディショニングへの応用

本研究では、骨格筋が電気的活動を開始してから実際に運動が起こるまでのわずかな時間遅れ(Electromechanical delay, EMD)を精密・詳細にとらえる実験系を確立し、基礎データを蓄積することを目的とした。また、EMDが筋の機能やコンディションをどのように反映するのかについても検討した。一連の研究結果より、EMDを測定することで従来の指標(最大筋力など)とは異なる側面から筋の機能・コンディションを評価できることが示唆された。本研究の目的は、骨格筋の電気力学的遅延(Electromechanical delay, EMD)という現象を利用した筋機能評価法の確立に向けて基礎データを蓄積することである。平成25年度は若齢女性を対象としてEMDの筋間差について検討した。また、EMDと他の筋機能指標(随意的な最大筋力および筋力の発揮速度、電気刺激による収縮力および収縮時間など)との関連性についても検討した。詳細は以下の通りである。1)1835歳の女性65名を対象とした。右脚の膝伸展筋群および足底屈筋群の収縮を皮膚表面電極を用いた電気刺激により誘発した。筋腹に貼り付けた高感度加速度計により刺激から筋収縮が開始するまでの時間(Tec)を測定し、筋力計により刺激から関節トルクが発揮されるまでの時間(EMD)を測定した。また、これらの値の差から筋収縮力の伝達に要する時間(Tm)を算出した。加速度計は、膝伸展筋群の収縮においては外側広筋と大腿直筋に貼り付け、足底屈筋群の収縮においては腓腹筋内側頭とヒラメ筋に貼り付けた。2)足底屈筋群と比較して、膝伸展筋群のTecは有意に短く、Tmは有意に長かった。両値の合計であるEMDは膝伸展筋群において有意に長かった。また、これらの値について足底屈筋群と膝伸展筋群における有意な相関関係は認められなかった。3)EMDやその構成要素と他の筋機能指標との間に強い関連性は認められなかった。4)以上の結果から、EMDやその構成要素には筋間差、個人差があることが示唆された。ただし、膝伸展筋群のEMDが足底屈筋群よりも長い理由としては、測定時の関節角度の影響なども考えられるため、今後は複数の関節角度においてEMDを評価する必要がある。補助事業期間の初年度である平成24年度は「EMDの性差・筋間差の検討」を課題とした。1) 2337歳の男女22名(男性11名、女性11名)を対象とした。被検筋は腓腹筋内側頭とし、筋収縮は皮膚表面電極を用いた電気刺激により誘発した。左足関節を中間位で筋力計に固定し、腓腹筋の長さ変化の影響を観察するため様々な膝関節角度において筋電気刺激を与えた(今回は分析が終了している膝完全伸展位および屈曲90度における結果についてのみ報告する)。皮膚表面に貼り付けた高感度加速度計により刺激から筋収縮が開始するまでの時間(Tec)を測定し、ロードセルにより刺激から足底屈トルクが発揮されるまでの時間(EMD)を測定した。2)膝完全伸展位におけるTec、Tm、EMDはそれぞれ7.3±1.5、6.2±2.4、13.5±2.2 ms(いずれも平均±標準偏差)であり、我々が以前に測定した上腕二頭筋の結果と比較するとTecは長いが、TmとEMDは同程度であった。また、いずれの指標についても性差は認められなかった。一方、膝屈曲90度におけるTec、Tm、EMDはそれぞれ7.3±1.3、8.0±2.5、15.4±2.6 msであり、いずれの指標についても性差は認められなかったが、TmとEMDは膝完全伸展位よりも有意に高値であった。3)以上の結果から、若齢者の腓腹筋においてEMDの性差は存在しないこと、膝屈曲位でのTmおよびEMDの増大は筋腱の弛み(slack)によるものであること、などが示唆された。平成26年度は単一の高強度運動によるEMDの縦断的変化について検討することを目的として、大腿四頭筋を対象とした予備実験を実施した。その結果、関節角度(筋長)の変化や運動に伴うEMDの変動が、これまで対象としてきた肘屈曲筋群や足底屈筋群と比較して小さかったため、測定対象筋や実験プロトコルの変更を検討することとした。一方で、EMDと関連の深い指標と考えられる筋スティフネスが高強度運動により一過的に変化することが報告された(Lacourpaille et al. Acta Physiol, 2014)ため、上記実験系のセットアップと並行して、超音波せん断波エラストグラフィによる筋スティフネス評価法の確立にも取り組んだ。今後、筋スティフネスとEMDを同時に評価することで、より詳細に筋の状態を把握できるものと考えられる。

研究成果としては、若齢女性を対象としてEMDの筋間差等について検討した結果(平成25年度実施)を第69回日本体力医学会大会にて発表した。また、高強度運動として実施する筋力トレーニング運動のプロトコルを考えるために過去の筋力トレーニング研究の結果を整理し、メタ解析を試みた。その成果の一部を日本ストレングス&コンディショニング協会(NSCA)のカンファレンスにて発表した。本研究の目的は、骨格筋の電気力学的遅延(Electromechanical delay, EMD)という現象を利用した筋機能評価法の確立に向けて基礎データを蓄積することである。平成27年度は単一の高強度運動によるEMDの縦断的変化について検討することを目的として、肘屈筋群を対象とした実験を実施した。対象者は健康な若齢男性とした。高強度運動には重量負荷を利用した伸張性収縮を採用した。運動直後、2日後、4日後において、安静状態の上腕二頭筋に電気刺激を与え、同筋の筋腹に貼り付けた高感度加速度計により刺激から筋収縮が開始するまでの時間(Tec)を測定し、筋力計により刺激から肘屈曲力が発揮されるまでの時間(EMD)を測定した。また、TecとEMDの時間ずれを筋収縮力の伝達に要する時間(Tm)として算出した。その結果、運動4日後におけるTmおよびEMDは、運動前と比較して増大する傾向が観察された。Tmは筋が発揮した収縮力が結合組織を介して関節トルクに変換される過程における力学的効率の指標と考えられる。したがって、高強度運動は一過的に筋の力学的効率を低下させることが上記の結果から示唆された。平成27年度の研究成果としては、初年度から取り組んできたEMDの性差に関する検討結果を第70回日本体力医学会大会で発表したことが挙げられる。測定の対象とする筋(部位)や分析方法について未だ検討の余地が残っていることもあり、論文としての成果発表には至らなかったが、補助事業期間を総括して、EMDが筋機能の有用な指標となり得ることを示唆するデータが数多く得られたと考えている。本研究では、骨格筋が電気的活動を開始してから実際に運動が起こるまでのわずかな時間遅れ(Electromechanical delay, EMD)を精密・詳細にとらえる実験系を確立し、基礎データを蓄積することを目的とした。また、EMDが筋の機能やコンディションをどのように反映するのかについても検討した。一連の研究結果より、EMDを測定することで従来の指標(最大筋力など)とは異なる側面から筋の機能・コンディションを評価できることが示唆された。上述したように、予備実験の結果から測定対象筋の変更を検討したこと、筋スティフネスを評価項目に追加したこと等により、当初予定していなかった測定装置のセットアップや実験プロトコルの再検討が必要となり、年度内に本実験が実施できなかった。健康・スポーツ科学、筋生理学今後は、単一の高強度運動前後とその回復期におけるEMDの縦断的変化について実験的に検討して本研究課題の締めくくりとしたい。データは概ね順調に取得することができた。ただし、前年度に生じた遅れ(主に研究代表者の所属変更に起因するもの)を完全に取り戻すことはできず、年度内の成果公表には至らなかった。研究代表者の所属変更に伴い、新たな実験環境を構築する必要があったために若干の遅れが生じた。上述したように今年度に実施予定であった本実験が実施できなかったため、実験被検者謝金と消耗品代が未使用となった。今後は、同一被験者から縦断的に(経時的に)データを取得する予定である。
ガングリオシドの糖鎖情報の解読と細胞機能の制御

平成2年度より発足する文部省科学研究費補助金重点領域研究ガングリオシド糖鎖情報の解読と細胞機能の制御を推進するために主要研究課題について予備実験を実施するとともに必要な情報を集め、研究計画の大要を決定した。ガングリオシドのバイオシグナルを(1)細胞膜上及び膜より細胞内への情報伝達、(2)細胞質内における情報伝達及び情報発現機序、(3)細胞質から核内への情報伝達機序及び核内における情報発現機序、などの解明に焦点を合せて、神経系、造血系、免疫系等の正常並びに悪性細胞、及びこれらの細胞間相互作用系、精子ー卵相互作用系、ミクソウイルスー宿主細胞相互作用系、イノシト-ルリン脂質とサイクリックAMP情報伝達系についての解析を積極的に進めることになった。今年度の成果として、永井は神経芽細胞腫細胞の分化誘導能を持つシアリルコレステロ-ルが細胞内に入った後、核内に到達していることと、細胞膜上キナ-ゼの阻害剤が分化誘導能を消失させることを明らかにした。また、斎藤はヒト白血病細胞株をレチノ-ル酸で顆粒球への分化させる系をラクト系列ガングリオシドが代替して行なえることを明らかにした。また、鈴木は各種ガングリオシドや糖脂質の発現に関与する遺伝子の検索を進め、染色体上の位置を決定することに成功した。また、飯田はヒト腎から新しい構造を持つ糖脂質を単離し、これが組織特異的機能を担っていることを予想した。安藤も神経系細胞の神経ネットワ-ク形成時に特徴的に変化するガングリオシドを各種モノクロ-ナル抗体を用いて明らかにすることに成功した。さらに芝らは、化学合成リピドAによる免疫系の制御を行い、どの構造がそれぞれの生理活性の発現に必要であり、構造変化が惹起する活性変化についても解明した。これらの成果を踏まえ上記課題を分担して組織的に実施して行く。
近代ロシア文学の成立にみるドイツ的表象とその変容－留学生がもたらしたもの－

本研究の課題は近代ロシア文学成立の初期である18世紀後半から19世紀初頭に外国文化が果たした役割、特にロシアの上流社会の知的発展の拠り所であったドイツ文学、文化の役割を明らかにすることであった。調査の際には具体的な研究対象として、ドイツへ国費留学で派遣された知的エリートの1人О.П.コゾダヴレフの活動に注目し、彼がドイツでの教育と経験を経て、帰国後に移入した作品、及びその文化的表象を調査し、これらが近代ロシア文学形成に果たした役割について考察した。コゾダヴレフはむしろ政治家として評価された人物であったが、本研究では彼の文学活動を取り上げ、ゲーテの演劇『クラヴィーゴ』の翻訳や雑誌『ロシア語愛好者の話し相手』(1783-1784)での編集及び執筆作業、晩年の10年にわたる《北方郵便》紙の編集活動等の調査と考察を行った。その結果、コゾダヴレフがライプツィヒ大学留学中に得た幅広い教養と視野を生かしながら、常に西欧諸国の文化・文学を相対的に捉えようと試みていたことが明らかになった。コゾダヴレフの傾向は当時の他のドイツ留学生達にも共通して認められるものであった。これは、他の先進諸国に比して言語や文化の形成において遅咲きであったドイツが、18世紀ロシアの知的階層にとって文化的発展のためのモデルとしての意味を有していたことと関わりがある。以上の調査と考察を行うに際しては、研究期間中サンクト・ペテルブルグのロシア科学アカデミー・ロシア文学研究所に所属し、研究所で雑誌を閲覧し、市立図書館で新聞資料を収集した。研究成果はペテルブルグのロシア文学研究所での研究報告会、ニージュニー・ノヴゴロドでの国際学会のほか、ポーランドでの学会等で適宜口頭発表したほか、ロシアの学術定期刊行雑誌《ロシア文学》等に論文を発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の課題は近代ロシア文学成立の初期である18世紀後半から19世紀初頭に外国文化が果たした役割、特にロシアの文化人の知的発展の拠り所であったドイッ文学、文化の役割を明らかにすることである。具体的にはロシア人エリートが移入したドイツの作品とその文化的諸表象がロシア文学に与えた影響と、その表象が遂げた変容について注目する。今年度は、当時エカチェリーナ2世自らが選定したドイツ派遣留学生の1人で、ドイツ文化の移入に重要な役割を担っていたо. п.コゾダヴレフに注目し、ロシアのサンクト・ペテルブルグに滞在し、ロシア文学研究所で関連情報を収集しながら、彼のドイツ留学、および帰国後の文学活動について資料の調査と考察を行った。彼のライプツィヒ留学からの帰還後の活動を明らかにするための作業として、まず、彼によるゲーテの悲劇『クラヴィーゴ』の翻訳をとりあげた。これはロシアで最初のゲーテ作品の翻訳であり、ロシア文学史上重要な位置を占めているにもかかわらず、従来の研究では翻訳された事情、背景についての考察がほとんどなされておらず、コゾダヴレフの文学活動についての理解も表層的なものに留まっていた。そこで、本研究では訳者コゾダヴレフのドイツ留学経験者という立場、および『クラヴィーゴ』の作者であるゲーテの西欧文化に対する視点をあわせて分析し、コゾダヴレフのゲーテ理解と『クラヴィーゴ』翻訳の意図を明らかにした。その結果、彼の『クラヴィーゴ』翻訳は当時の知的エリートの西欧観を理解する上で有効な手がかりであることもわかった。その後のコゾダヴレフの文学活動として、女帝等と共に編集にも携わっていた雑誌《ロシア語愛好家の語り相手》の中の彼の作品を取り上げ、当時の主な文学思潮であるロシア・センチメンタリズムの作品との比較を通して、彼の文学的発想の特徴を明らかにした。以上の作業を通して得られた成果について、3つの学会にて研究発表を行った。

研究成果はペテルブルグのロシア文学研究所での研究報告会、ニージュニー・ノヴゴロドでの国際学会のほか、ポーランドでの学会等で適宜口頭発表したほか、ロシアの学術定期刊行雑誌《ロシア文学》等に論文を発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。所属機関、国立図書館及び歴史資料館等で文献を閲覧し、当初予定していた資料調査と分析を達成したので。今後の研究としては、既に着手している、コゾダヴレフによって発行された新聞《北方郵便》(1809-1819)の調査を継続して行う予定である。この新聞は、コゾダヴレフが西欧の様々な新聞を踏まえて作りあげたものであり、西欧諸国の記事が数多く掲載されている。現在は、この新聞が備えていた「文学的な性質」に注目しつつ、同時に19世紀初頭に行われた政府による教育改革、祖国戦争の影響等も考慮しながら、記事を調査しているところである。なお、来年度には、留学生コゾダヴレフに先んじてライプツィヒへ留学していたラジーシチェフ、クトゥーゾフ等、他の知的エリート達の文学活動についても詳細に取り上げたいと考えている。
ω3脂肪酸由来の新規抗炎症性メディエーターの同定および作用機構の解明

本研究において、我々はω3脂肪酸由来の新規抗炎症性メディエーターとして17, 18-diHEPEを同定し、レゾルビンE3(RvE3)と命名した。RvE3の構造決定は、LC-MS/MSを用いた脂質メタボローム解析と高感度NMRを用いることで行われた。既存のRvE1, RvE2が主に好中球の5-リポキシゲナーゼ(5-LOX)活性により生成するのに対し、RvE3は好酸球の12/15-LOX活性により生成した。RvE3はわずかナノグラム用量で、マウス急性腹膜炎における初期の好中球の浸潤を抑制する、強力な抗炎症作用を有していた。以上、ω3脂肪酸由来の新規抗炎症性代謝物の同定に成功した。魚油に多く含まれるエイコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)に代表されるω3系脂肪酸には、抗炎症作用をはじめとする健康増進効果が知られている。しかしながらこれらの脂肪酸がなぜ体によいのか、分子レベルの解明は非常に遅れている。そこで本研究では、ω3系脂肪酸の代謝および生理的機能を分子レベルで解明することを目的とした。これまでにω3脂肪酸合成酵素のトランスジェニックマウス(fat-1マウス)を用いた解析から、ω3脂肪酸の代謝系が抗炎症作用に関わっていることが遺伝学的に示唆されていた。そこで本年度の研究において、高速液体クロマトグラフィー・タンデムマススペクトロメトリー(LC-MS/MS)を用いたω3脂肪酸代謝物の網羅的メタボローム解析を行った結果、これまでにfat-1マウスの体内からEPAとDHAそれぞれに由来する新規代謝物を複数見いだすことに成功した。そこでこれら新規代謝物について酵素反応を利用したin vitro合成を行い、それぞれについて生物活性を評価した。その結果、マウスにザイモザンを腹腔内投与することで惹起される急性腹膜炎における初期の好中球の浸潤を強力に抑制する活性を有する抗炎症性代謝物を同定することに成功した。前年度までに、ω3脂肪酸合成酵素のトランスジェニックマウス(fat-1マウス)と高速液体クロマトグラフィー・タンデムマススペクトロメトリー(LC-MS/MS)を用いたω3脂肪酸代謝物の網羅的メタボローム解析を行った結果、fat-1マウスの体内からEPAのモノヒドロキシ体である18-HEPEに由来する新規代謝物を複数見いだし、その中から急性腹膜炎における初期の好中球の浸潤を強力に抑制する活性を有する抗炎症性代謝物として17,18-diHEPEを新規に同定した。本年度はこれら活性代謝物の絶対構造を明らかにする目的で、光学活性な前駆体化合物として18(R)-HEPEと18(S)-HEPEをそれぞれ有機合成し(本学部有機反応化学教室、井上将行教授との共同研究)、それらを前駆体としたin vitroのリポキシゲナーゼ酵素反応を行い、その生成物について、C18逆相カラムおよびキラルカラムを用いた分離、解析を行なった。その結果、17位およ18位の水酸基の配位がそれぞれ異なるRS, RR, SR, SSの計4種類のジアステレオマーが存在し、そのうち生体内に存在するものは主にRS,RRの2種類であることが判明した。また、化合物の二重結合のシス、トランス配位については、理化学研究所NMR施設の高感度NMR(800MHz)を用いた解析を行った。その結果、新規活性代謝物17,18-diHEPEの構造について立体化学を確定することに成功した。ω3脂肪酸合成酵素のトランスジェニックマウス(fat-1マウス)と高速液体クロマトグラフィー・タンデムマススペクトロメトリー(LC-MS/MS)を用いたω3脂肪酸代謝物の網羅的メタボローム解析を行った結果、急性腹膜炎における初期の好中球の浸潤を強力に抑制する活性を有する抗炎症性代謝物として17,18-diHEPEを新規に同定した。本活性代謝物の絶対構造を解析した結果、17R,18(R/S)-dihydroxy-5Z,8Z,11Z,13E,15E-eicosapentaenoic acidであることが明らかになった。さらに本活性代謝物には好中球の遊走能をナノモルレベルで抑制する活性があることがEZ-TAXIScanを用いた解析から明らかになった。本活性代謝物をresolvin E3(RvE3)と命名し、ここまでの成果を国際誌で発表した(Isobe Y. et al. J.Biol. Chem. 287,2012)。

さらに、RvE3の17位およ18位の水酸基の配位がそれぞれ異なるRS,RR,SR,SSの計4種類のジアステレオマー全ての有機合成を完了し(本学部有機反応化学教室、井上将行教授との共同研究)、それらの抗炎症活性について構造活性相関をより詳しく調べた。その結果、天然に存在するRS,RR体は他の異性体と比べて活性が比較的高いことが明らかになった。さらに合成したRvE3をオーファンGPCRのリガンド検出システムに適用した結果、これまでにいくつかの受容体候補が得られている。
災害による損失の包括的評価方法の研究

福島原発事故は、自主的・強制的な避難など居住者に損害をもたらした。災害の損害に対する正確な評価は、復興のための補助金や補償を決定する上で重要である。損害計測の代表的手法であるヘドニック法は、居住者の均質性など仮定が厳しく、推定結果の解釈に制約が伴う。まず、本研究では、放射能汚染による被災者の居住行動を直接的に観察した上で、居住者の不均一性を考慮した損失を計測する。また、現在の補償は市場取引価格が評価の根拠となっており、強制的に移住をした被災者に対して正確な評価となっていない可能性がある。被災地主の土地の主観的評価を整理し、こうした要因が補償に反映されているかについても検証を行う。
メラノーマの新しい細胞移動メカニズムの解明

SIRT1はメラノーマ細胞で細胞質に局在し、SIRT1のノックダウンや阻害はマウスやヒトメラノーマ細胞の細胞移動を抑制した。B16F1細胞を皮下移植したマウスにSIRT1阻害薬ニコチンアミドを投与すると腹腔とリンパ節転移が抑制され寿命が有意に延長し、SIRT1をノックダウンした細胞を移植すると浸潤性転移・血行性肺転移が著しく抑制された。SIRT1は葉状突起に局在しており、ニコチンアミドで成長因子依存性の葉状突起形成が阻害された。この機序はSIRT1阻害薬がホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸の増加を抑制することと関連することを蛍光共鳴エネルギー移動法により明らかとした。応募者はメラノーマのSIRT1を調べ、核内で働くと考えられていたSIRT1がメラノーマ細胞は細胞質に局在すること、さらに、SIRT1のノックダウンやSIRT1の阻害はマウス(B16F1, B16F10)やヒト(MM418, WM266-4, MeWo,G361, SK-MEL-24)メラノーマ細胞の細胞移動を抑制することを見出した。B16F1細胞を皮下移植したマウスにSIRT1阻害薬ニコチンアミド(NAM)を投与(1日1回)するとメラノーマの腹腔転移とリンパ節転移が抑制され、寿命が有意に延長された。SIRT1をノックダウンしたB16F1細胞はコントロールのB16F1細胞に比べて浸潤性転移と血行性肺転移が著しく抑制された。メラノーマ細胞の移動は細胞の突起状構造物であるラメリポディア(葉状突起)が移動方向に向けて作られることにより始まる。SIRT1はラメリポディアに局在しており、ニコチンアミドによるSIRT1の阻害で血小板由来成長因子(PDGF)などの成長因子依存性のラメリポディア形成が抑制された。また、活性型Racはラメリポディアを形成させるが、SIRT1を阻害するとRac依存性のラメリポディア形成も阻害された。この機序は、SIRT1阻害薬がPDGFによるphosphatidyl inositol (3,4,5) trisphosphate (PIP3)増加を抑制することが関連することをFRET(蛍光共鳴エネルギー移動法)により明らかとした。局所でのPIP3の増加はラメリポディアを形成させることに十分である(Kakumoto & Nakata PLOS One 8, e70861, 2013)ため、SIRT1阻害でラメリポディアが形成されない理由は膜でPIP3が十分に形成されないためと考えられる。ラメリポディア形成とSIRT1の関連性や局在変化について調べた。メラノーマ細胞では血清や成長因子刺激によりラメリポディアが形成される。予備的検討ではB16F1メラノーマ細胞では血清刺激やPDGF、EGFによるラメリポディアの形成がSIRT1の阻害により著しく抑制されることが判明した。確認実験として他のSIRT1阻害剤(sirtinol, splitomicin)やSIRT1-shRNAが血清刺激によるラメリポディア形成を抑制するかB16F1細胞を用いて検した。また、逆にSIRT1活性化を促すNADやresveratrolのラメリポディアの形成に対する影響も検討した。予備的検討では血清刺激によるラメリポディア形成において、刺激後5 minでSIRT1がラメリポディアの先端部分の膜直下全体に局在化した。SIRT1阻害薬を投与するとラメリポディアの形成自体が阻害されるので、SIRT1の局在化は観察できない。しかし少数の細胞ではラメリポディアが作られることから、このようなラメリポディアでSIRT1が局在化しているか調べた。また、細胞の形態についても、SIRT1促進剤、阻害剤でどのように変化するのか、詳細に調べ、突起の数や長さについて検討した。さらにRac1活性化との関連について活性型Rac、または非活性型Racを用いB16F1細胞にnucleofectionまたはLipofectionし、ラメリポディア形成について調べた。ラメリポディア形成についての詳細な検討に時間がかかっており、SIRT1結合蛋白質を分離し、分離した蛋白質のなかで細胞極性や細胞移動への影響についてまだ詳細に調べることができていない。まずSIRT1結合蛋白質について詳細な検討を行う。細胞移動のキーとなるRac1について、SIRT1阻害剤の活性化Rac形成への作用をGFP-PAK1蛋白質を用いたpull-down法を用いて検討する。

SIRT1結合蛋白質について、分布や強制発現、阻害やノックダウン実験をおこない、その分子自体と細胞移動との関連を調べるとともに、flag-tagをつけたクローンの強制発現させ、細胞内局在と、ラメリポディア形成時の分布や局在変化についてflag抗体を用いた細胞免疫染色法で検討する。また、SIRT1により脱アセチル化される分子であるかどうかも確認し、アセチル化によるその分子自体が持つ活性の変化も調べる。さらにアセチル化部位をMASSを使った解析法により同定する。
社会調査における非定型データ分析支援システムの開発

本研究では、社会調査によって得られるさまざまな非定型データをコーディングする日本語版のコンピュータ・プログラムを開発し、実際に集めた異なる種類のデータを計量的に分析し、その手順を示すことで、質的調査の有効性を高める一連のプロセスを開発することを試みた。コーディング・システムの開発に関しては、テキストを分かち書きし、コードを与えて数値化したデータを出力できる操作性に優れたユーザーインターフェイスをもつプログラムを開発するとともに、その使用方法を記したマニュアルの作成を行った。マニュアルでは、インターネット上で誰でもダウンロードできるデータを例とし、実際にプログラムを実行しながらその操作法を学ぶことができるものである。コーディングの理論的背景の検討として、質的なデータの分析によく用いられるグラウンデッド・セオリー、物語論を取り上げて検討し、コンピュータを使ったコーディングを支える理論としてまとめた。本研究で収集し、応用例に用いたデータは、宗教教団の刊行物15年分、信者のインタビュー、雑誌の目次20年分、90年代の新聞記事、1200ケースあまりの質問紙調査による自由回答データである。これらの収集したデータをコーディング・プログラムによってコーディングし、分析を行った。分析は、出現した語の集計、語の共起の分析、クロス表を用いた分析、等高線図によるグラフ化、クラスター分析、対応分析などで、テキストデータを多変量解析で分析する例を示すことができた。以上のコーディング・プログラムのマニュアルと理論的背景、非定型データの分析例については、研究成果報告書としてまとめ、印刷した。コーディング・プログラムの開発の参考とするために、市販のプログラムを購入し、試用した。英語版のプログラムでは、コーディング自体には、参考にすべき点はなかったが、結果の表示の方法に優れていることがわかった。日本語のプログラムでは、処理速度や結果の表示に優れているが、データの入出力の柔軟性に欠けることがわかった。結果の表示において、市販品を上回るのは困難であると判断し、処理速度の改善とデータの入出力の柔軟性を高める工夫を来年度以降続けることにした。また、コーディングの前処理に形態素解析を取り入れたプログラムを作成している研究協力者と研究協力を行い、そのコーディングプログラムを用いて、新聞記事のデータ分析を試みた。数メガという巨大なデータから、記事の時代による変遷を抽出することができた。さらにいくつかのテーマで新聞記事を分析すること、すでに入力済みである宗教教団刊行物のデータについても同じ分析を試みながら、大規模なテキストデータから、情報を抽出していく分析手順を明示化できるように、努力していく。インタビュー調査データに関しては、その手順を明確にすることができた。それは、単純にコードをふる段階、コードを意味解釈しながら統合していく段階、統合されたコードをグラフ化して解釈していく段階の3つである。また、その手順をグラウンデッド・セオリーや物語論などの理論から裏付ける作業を行い、その一部は研究協力者によっても発表されている。また、来年度実施する予定の自由回答形式を含む質問紙調査の企画に関しては、従来から考えて検討していた階層イメージ以外にも新たに社会不平等の項目を質問項目とするのが適当ではないかというアイディアを得、それを検討している。本研究は、社会調査によって得られるさまざまな非定型データをコーディングする日本語版のコンピュータ・プログラムを開発し、実際に集めた異なる種類のデータを計量的に分析し、その手順を示すことで、質的調査の有効性を高める一連のプロセスを開発する試みである。コーディング・システムの開発に関しては、操作性に優れたユーザーインターフェイスに一部改良した。また、データマイニングのソフトが、昨年から次々と発売される傾向にあるので、それらも試用し、比較検討を行った。また、欧米の文献や研究者のアドバイスをもとに、このコーディング・システムの長所、改善点、統計量、指標を使う意義を質的調査の方法論から明らかにし、それを支える理論として、グラウンデッド・セオリー、ライフヒストリー論、物語論を取り上げて検討した。データ収集に関しては、階層と不平等の交差する領域として、教育における意識を自由回答形式を含めて質問紙調査を行った。

調査会社の持つパネルをもとに全国の高校2年生とその母親をサンプリングし、11月に調査を実施し、618セットの親子データを収集した。現在データのクリーニング、入力中であり、来年度に分析を行う。また昨年度に引き続き、研究補助者の協力の下で、雑誌の記事や宗教教団の刊行物、新聞記事を収集、入力を続けた。さらに、調査協力を得ている宗教教団の海外支部を訪問し、インタビュー調査を行ってデータ収集を行った。コーディング・プログラムによってコーディングし、データ分析をしたものの一部は、論文として発表した。本研究は、社会調査によって得られるさまざまな非定型データをコーディングする日本語版のコンピュータ・プログラムを開発し、実際に集めた異なる種類のデータを計量的に分析し、その手順を示すことで、質的調査の有効性を高める一連のプロセスを開発する試みである。コーディング・システムの開発に関しては、昨年度に引き続き、操作性に優れたユーザーインターフェイスに部改良するとともに、その使用方法を明快に記したマニュアルの作成を行った。そこで用いたデータは、インターネット上で誰でもダウンロードできるデータを使い、実際にプログラムを実行しながらその操作法を学ぶことができるものである。また、開発したプログラム以外でも、欧米でよく使われているCAQDASの1つであるNUD・ISTを例として日本語のデータを実行するマニュアルを作成した。コーディングの理論的背景の検討として、昨年度に引き続き、グラウンデッド・セオリー、物語論を取り上げて検討し、コンピュータを使ったコーディングを支える理論としてまとめた。データ収集に関しては、昨年度に引き続き、宗教教団の刊行物、新聞記事を収集、入力を続けた。一方で昨年度までに収集したデータをコーディング・プログラムによってコーディングし、分析を行った。分析は、雑誌記事の目次の分析、宗教教団の信者のインタビューデータの分析、はがきアンケートの分析、教育における意識の自由回答の分析を行った。以上のコーディング・プログラムのマニュアルと理論的背景、非定型データの分析例については、研究成果報告書としてまとめ、印刷した。
バングラデシュのダッカ近郊の淡水域における病原性腸炎ビブリオの生態学的研究

海洋性細菌の腸炎ビブリオについて、バングラデシュのダッカ近郊の河川淡水域の58検体並びに淡水域の対照地として汽水域であるベンガル湾に近いエビ養殖田の53検体について菌分離を実施した。その結果、淡水域の浮草の根1検体、汽水域の6検体から病原性菌が分離された。淡水域では季節にかかわらず腸炎ビブリオと淡水性のV. mimicusやV. cholerae、海洋性のV. alginolyticus、V.fluvialisの共存も確認され、淡水域における病原性腸炎ビブリオの一層の生態解明の重要性が示唆された。腸炎ビブリオは生息に食塩が必須である海洋性細菌とされ、病原性を有する菌と非病原性の菌がおりヒトは病原性菌に汚染された海産魚介類を喫食して発熱、下痢などの食中毒症状を起こす。近年日本では患者数が激減しているが、世界的には1995年インドの下痢症患者から分離された新クローンと称される病原性菌が隣国のバングラデシュを経て世界中に伝播している。これまで多くの研究者が感染源追究のために海域・汽水域で調査を実施しているが病原性菌の分離例はきわめて少ない。一方筆者らはバングラデシュのダッカ郊外の淡水域から多数の腸炎ビブリオを検出したことを契機に、本研究で病原性腸炎ビブリオは海水や汽水に生息する非病原性菌とは異なり人口密集地帯の淡水域に多く生息している仮説を立て、ダッカ近郊の淡水河川、並びにエビ養殖場近郊の汽水域を3年間、毎年雨季と乾季に浮草、底泥等の菌検索を実施して菌の生態の解明、患者発生予防、輸出エビ等への病原菌汚染防止に資することを目的として研究開始した。平成22年度は雨季7月と乾季1月・3月に調査を行い、その結果、(1)雨季・乾季共に淡水域から腸炎ビブリオが検出され乾季にその病原性菌株も分離された、(2)対照地域の汽水の小川からも乾季に病原性菌株が分離された、(3)患者数の把握は検便検査実施病院の把握が困難で現在も進行中である、(4)冷凍エビの輸出状況は1製造工場を視察し対コストの問題から輸出先は日本よりEUが主であることが判明した。平成21年度までの調査結果は整理中。腸炎ビブリオは生息に食塩が必須である海洋性細菌とされ、これまで多くの研究者が感染源追究のために海域・汽水域で調査を実施しているが病原性菌の分離例はきわめて少ない。筆者らはバングラデシュのダッカ郊外の淡水域から多数の腸炎ビブリオを検出したことを契機に、本研究で病原性腸炎ビブリオは人口密集地帯の淡水域に多く生息している仮説を立て、ダッカ近郊の淡水河川、並びに対象地域としてエビ養殖場近郊の汽水域を3年間、毎年雨季と乾季に浮草の根、河川等の堆積泥等の菌検索を実施し、菌の生態の解明、患者発生予防、輸出エビ等への病原菌汚染防止に資することを目的として研究を行っている。平成23年度には検索菌種の幅を広げて調査した結果、(1)雨季9月に淡水域の浮草から病原性の腸炎ビブリオは検出されなかったが、当該菌と同様の場で生息しているV.alginolyticusやV.fluvialis、さらには淡水域に生息するV.mimicusや非病原コレラ菌(V.cholerae)も検出された。(2)乾季2月に淡水域の浮草と水域の底堆積物から非病原性腸炎ビブリオ以外に淡水性および汽水・海洋性のビブリオが検出された。(2)対照地域の汽水域から多くの血清型の腸炎ビブリオが分離され、エビの養殖田からtrh1陽性菌株が分離された。以上のように、TDH産生菌分離されていないが、雨季の洪水時期に内陸部の淡水域で腸炎ビブリオとコレラ菌などが混在生息する事実は新たな知見である。平成24年度は前年に引き続き検索菌種の幅を広げて最終調査を雨季9月に実施した。

その結果、淡水域の浮草(ホテイアオイ)の根から腸炎ビブリオは分離されなかったが、NaCl要求性のV.fluvialis、並びにNaCl非要求性のV.choleraeとV.mimicusが分離された。また、河川底堆積物からは非病原性腸炎ビブリオとNaCl要求性のV.fluvialisが分離された。これまでの成績から、新知見としてダッカ周辺の淡水域では乾季・雨季シーズン共に恒常的に腸炎ビブリオが生息していることが確実になった。今後、腸炎ビブリオとコレラ菌などの他のビブリオ属菌との共存の意義、河川のさらに上流、あるいは他地域の淡水域における腸炎ビブリオの生態に興味が持たれた。腸炎ビブリオは海洋性細菌とされ河口等の汽水域が主な生息環境とされていたが、当初の予定どおりダッカ等の都市部の人口密集地帯の淡水域でも生息していることが明らかとなった。また、一部の分離菌は病原性を有していることが判明したが、耐熱性溶血毒(TDH)産生菌株はまだ分離されておらず、感染者が少ない可能性も考えられる。さらには、淡水域では好塩性の腸炎ビブリオ以外の海洋性ビブリオや淡水に生息するコレラ菌なども同時に検出される新たな知見も観察されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。特に問題点は生じていないのでこのまま続行したい。また、今後の発展的なテーマとして、(1)淡水域に腸炎ビブリオが生息するための条件として高タンパク質環境や塩化ナトリウム以外の一定濃度の無機塩環境などの関与も解明する必要がある、(2)日本を含め、他の東南アジア各国の淡水域での腸炎ビブリオの生息状況についての調査も必要である、(3)腸炎ビブリオとコレラ菌等の混在する環境が新型クローンの出現に関与しているようにも思われるため、その環境が新たな病原性腸炎ビブリオの振興に寄与している可能性について解明する必要があると考えている。