hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
言語表現の使用実態を踏まえたソーシャルメディア上の誹謗中傷行為の検出に関する研究

本研究課題では,「いじめ」につながる誹謗中傷行為について,ソーシャルメディア上での言語表現レベルでの詳細な実態調査をおこない,その結果を踏まえた言語解析技術に基づく誹謗中傷行為の高精度な自動検出技術の開発を目的とする.主な研究成果として以下が挙げられる:(1)およそ5,000件の投稿データを対象にした言語表現の使用実態調査をおこない,誹謗中傷表現および被害者/加害者表現の出現傾向をある程度明らかにした.(2)上記傾向を考慮したSVMベースの検出モデルを提案し,その有効性を示した.(3)被害者情報の自動取得では知識ベース素性が大きく貢献することを明らかにした.本研究課題は,ソーシャルメディア上に流れる誹謗中傷行為の高精度な自動検出技術を開発することを目的とする.平成27年度は,インターネット上の実投稿テキストデータ約3,000投稿を対象として,誹謗中傷行為に使用される言語表現の実態調査および,その結果に基づいた誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを開発した.言語表現の使用実態調査では,アノテーションガイドラインを作成後,アノテーターが誹謗中傷行為に関わる言語表現についてのタグ付与作業を実施した.タグ付与作業の主な項目は以下の通りである.(1)誹謗中傷表現,(2)被害者(人物)表現,(3)上記のテキスト上での相対位置,(4)上記の品詞種別,(5)(2)がもつ格情報など.なお,格情報については,表層格と深層格を区別し,深層格については述語項構造解析の先行研究を参考に数種類のタイプを定義して作業に用いた.上記の調査結果を踏まえ,SVMに基づく誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを開発した.本プロトタイプは今後の技術開発過程における基盤環境となるものである.プロトタイプでは,一般的な単語ユニグラム素性を採用しているが,モデル開発の足掛かりとして,被害者情報が特別に組み込まれており,被害者の種別に応じて複数ある検出モデルから適切なモデルが自動選択される機構をもつ.予備実験の結果,被害者の種別に注目したモデル選択機構が検出性能の向上に貢献することを確認した.平成27年度は,インターネット上の実投稿テキストデータを対象として,誹謗中傷行為に使用される言語表現の実態調査および,その結果に基づいた誹謗中傷検出モデルのプロトタイプ開発をおこなう計画であったが,以下の通り,概ね計画通り進行している.言語表現の使用実態調査では,誹謗中傷表現は動態述語でなく状態述語としてあらわれ,特に形容詞,形容動詞が多いこと,被害者表現は名詞として出現する傾向が強く,特に一般名詞,固有名詞,代名詞が多いことを確認した.また,加害者については投稿IDを除けば投稿内であらわれることは稀であることを確認した.誹謗中傷表現と被害者表現の相対的な位置関係については,被害者表現でない名詞とのあいだの平均単語数は13.2であるが,被害者表現とのあいだの平均単語数は6.54であり,誹謗中傷表現と被害者表現は投稿内で相対的に近い位置に現れることを確認した.また,被害者表現がもつ格関連情報については,被害者表現は後続する助詞が省略されやすいこと,省略されない場合は助詞「は」およびそれの話し言葉調で崩れた形である「って」となる傾向があることを確認した.上記の調査結果を踏まえ,SVMに基づく誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを開発した.本プロトタイプは今後の技術開発過程における基盤環境となるものである.プロトタイプでは,一般的な単語ユニグラム素性を採用しているが,モデル開発の足掛かりとして被害者情報が特別に組み込まれており,被害者の種別に応じて複数ある検出モデルから適切なモデルが自動選択される機構をもつ.モデル選択は被害者種別クラスに基いておこなわれる.本手法を実装した予備実験の結果,被害者の種別に注目したモデル選択機構が検出性能の向上に貢献することを確認した.本研究課題は,ソーシャルメディア上に流れる誹謗中傷行為の高精度な自動検出技術を開発することを目的とする.平成28年度は,昨年度に引き続き,インターネット上の実投稿テキストデータを対象として誹謗中傷行為に使用される言語表現の実態調査をおこなった.また,実態調査の結果に基づき,昨年度開発した誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを改良した.言語表現の使用実態調査では,昨年度に加え新たに2,100投稿のテキストデータを対象として誹謗中傷行為に使用される言語表現の実態調査をおこなった.この結果,誹謗中傷の検出に有効な言語表現は投稿内の限られた一部の箇所にのみ出現する傾向があることがわかった.上記の調査結果を踏まえ,誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを改良した.具体的には,検出モデルの構築時に利用する教師事例の不足を補うために仮想教師事例を自動生成するが,その際に,既存手法に対して上記の出現傾向を考慮した手法(事例プール法および単語に関する出現分布法)を提案し,モデル構築をおこない,その有効性を検証した.さらに,誹謗中傷行為を受けている被害者情報を自動取得する足がかりとして,投稿内から人物(および組織)表現を自動抽出する方法論に対する現状の問題点について,固有表現の要素となる割合および固有表現の要素となる場合のその固有表現の異なり度合いに基づいて言語表現毎に抽出難易度を測定し,人物表現自動抽出手法の性能と抽出難易度の関係性を調べた.平成28年度は,インターネット上の実投稿テキストデータを対象として誹謗中傷行為に使用される言語表現の実態調査をおこない,また,その結果に基づいて誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを改良する計画であったが,以下の通り,概ね計画通り進行している.言語表現の使用実態調査では,今年度新たに2,100投稿のテキストデータを調査対象に追加し,継続調査を実施した.その結果,検出モデルの改良に繋がる幾つかの知見を得た.

例えば,誹謗中傷検出モデルの構築にとって有効な言語表現は投稿内の限られた一部の箇所にのみ限定的に出現する傾向があることがわかった.上記の知見にもとに,誹謗中傷検出モデルのプロトタイプを改良した.プロトタイプでは,検出モデルの構築時に利用する教師事例の不足を補うために仮想教師事例を自動生成する.この自動生成の既存研究では仮想教師事例を生成する際に文章(本研究では投稿テキスト)中の一部分を編集する(単語を追加,削除する)操作をおこなうが,上記で述べた知見を考慮しないため誹謗中傷行為に直接関与する単語も編集してしまう致命的な問題があった.この問題に対して,事例プール法および単語に関する出現分布法という2つの手法を提案し,モデルの改良を検討した.評価実験を通した検証した結果,多くの実験設定において提案手法が有効であることを確認した.さらに,誹謗中傷行為を受けている被害者情報を自動取得する足がかりとして,投稿内から人物(および組織)表現を自動抽出する方法に対する現状の問題点を検討した.具体的には,固有表現の要素となる割合および固有表現の要素となる場合のその固有表現の異なり度合いに基づいて言語表現毎に抽出難易度を測定した.その結果,抽出難易度と抽出性能に相関関係が認められること,抽出難易度の高い事例は表現自体が短く,その原因として省略表現が多用されていること等が明らかになった.本研究課題は,ソーシャルメディア上に流れる誹謗中傷行為の高精度な自動検出技術を開発することを目的とする.平成27年度および平成28年度は以下の項目を実施した:(1)およそ5,000投稿のテキストデータを対象にして,誹謗中傷行為に使用される言語表現の使用実態調査を実施した.(2)使用実態調査の結果を踏まえた誹謗中傷検出モデルを開発し,提案手法の有効性を示した.(3)被害者表現の自動認識のための難易度調査を実施した.また,これらの実施を通して,被害者の情報が誹謗中傷行為の検出に影響を与えることを明らかにした.以上の成果のうち,平成29年度は,開発が未着手であった誹謗中傷行為を受けている被害者情報を自動取得する手法を主に検討した.具体的には,投稿テキストから(組織を含む)人物をあらわす表現を自動認識する手法および,人物表現と実世界の人物エンティティとの対応付け手法を開発した.投稿テキスト中の人物表現を自動認識する手法については,条件付確率場に基づく既存手法に対して,新たに知識ベースに基づく素性および文節情報に基づく素性を取り込む手法を提案し,人物表現認識性能の向上を達成した.また,前年度に開発した難易度指標を用いた分析の結果,知識ベースに基づく素性はすべての難易度の事例群に対して有効であることがわかった.文節情報に基づく素性では,難易度の高い事例群に対して文節主辞の情報に加えて格情報を考慮することが重要であることがわかった.人物表現と実世界の人物との対応付け手法については,固有表現クラス情報に基づくフィルタリングを導入することで不要なエンティティ候補を削減し,これによって人物表現に関する実世界の人物エンティティとの対応付け正解率が向上することを示した.以上から,本研究課題は研究期間全体を通して当初研究目的で述べた項目について概ね達成できたと言える.
種々の多変数多重ゼータ関数とゼータ正規化積の研究

ゼータ正規化積の一般化である"深さrのゼータ正規化積"を導入し、その代数的・解析的性質の研究を行った。特に、多様体上のラプラシアンの"深さrの行列式"について、特別な場合にその明示的な表示を得た。一方で、現在研究されている多重ゼータ関数を広く含む" Schur多重ゼータ関数"を導入し、その基本的な性質について調べた。また、具体的に数値計算を行うことで、このゼータ関数が満たす組合せ論的な性質についても研究した。Milnorによってガンマ関数の一般化が導入されたが(以下これをMilnorガンマ関数と書く)、ゼータ正規化積の観点から見れば、それはガンマ関数の"higher depth"版と見ることができる。これを踏まえ本年度は、"一般の深さのゼータ正規化積"と呼ぶべき以下の対象に対して、それぞれ次のような研究を行った。1、高次元球面上のラプラシアンに対する"一般の深さの行列式"の研究:現在までの研究で、それは多重ガンマ関数の冪の積商で書けることが分かっている。この冪の部分に対して、それらの母関数を研究することで、より明示的な表示を得ることができた。2、負定曲率のコンパクトリーマン面上のラプラシアンに対する"一般の深さの行列式"の研究:現在までの研究で、それは多重ガンマ関数と、"Milnor-Selbergゼータ関数"と呼ぶべき関数(Selbergゼータ関数の一般化)で書けることが分かっている。この関数は一般に多価関数なので、その解析は非常に難しい。しかし、"一般の深さのゼータ正規化積"の一般論を展開することで、リーマン面上の関数とみれば、それはSelbergゼータ関数同様関数等式等の良い性質を満たすであろうことが分かってきた。これは現在も継続して研究中である。3、Hecke L関数の零点に関する"一般の深さのゼータ正規化積"の研究:2の数論的な類似として、Hecke L関数の零点に関する"一般の深さのゼータ正規化積"を計算し、それがMilnorガンマ関数と"ポリHecke L関数"と呼ぶべき関数(Hecke L関数の一般化)で書けることが分かった。これはDeningerの結果の一般化を与える。また、上記ポリHecke L関数については、その反復積分表示を導き、それが解析接続を与えることも確かめた。以上は九州大学の若山正人氏との共同研究で、論文にまとめて現在投稿中である。本研究の主目的は、Milnorによって研究されたガンマ関数の"higher depth版"(以下これをMilnorガンマ関数と呼ぶ)の幾何学的・数論的な類似を調べることである。本年度の研究結果は以下の通りである。1、負定曲率のコンパクトリーマン面上のラプラシアンに対する"higher depth行列式"の研究:昨年度までの研究で、それは多重ガンマ関数と"Milnor-Selbergゼータ関数"と呼ぶべき新しい関数(Selbergゼータ関数の一般化)で書けることが分かっていた。このMilnor-Selbergゼータ関数について、対数関数の分枝をうまく選ぶことで、通常のSelbergゼータ関数同様(然るべきスリットを入れた領域への)解析接続、関数等式、さらにはオイラー積表示を得ることができた。これらの結果は、東京工業大学の黒川信重氏と九州大学の若山正人氏との共同研究で得られたものであり、論文にまとめて投稿した。2、高次元球面上のラプラシアンに対する"higher depth行列式"の研究:昨年度までの研究で、それは多重ガンマ関数の冪の積商で書けることが分かっていた。この表示には対称性が強く現れており、一般化を考えるにあたって大変見通しの良いものとなっている。この結果を論文にまとめて投稿した。Deningerによって、Riemannゼータ関数の非自明零点に渡るゼータ正規化積が本質的に完備Riemannゼータ関数に一致する、という結果が得られている。この結果の"higher depth版"を、GL_dの保型カスプ表現に付随するL関数に対して導いた。より詳しく、上記L関数の非自明零点に渡る"higher depthゼータ正規化積"が、Milnorガンマ関数と"poly L関数"と呼ぶべきL関数のある一般化で書けることが分かった。また、このpoly L関数については、その反復積分表示を導き、それが解析接続を与えることも確かめた。これらの結果は九州大学の若山正人氏との共同研究で得られたものであり、論文にまとめて投稿した。本年度は、多重ゼータ関数およびゼータ正規化積に関連する以下の二つの研究を行った。1.Schur関数に付随する多変数多重ゼータ関数の研究:現在盛んに研究されている多重ゼータ関数だが、それは、考える多重和において等号を付けるか付けないかの大きく分けて2通りのものが存在する。これら2つを統一的に扱うべく、報告者は、Schur関数が半標準盤に渡る和で定義されることを踏まえ、Schur関数(分割)に付随する多重ゼータ関数を導入し、その基本的な性質(例えば収束性など)を研究した。

それは、分割が縦一列のときは等号なしの、横一列のときは等号付きの多重ゼータ関数を与える。また、分割が小さい全ての場合に特殊値を具体的に計算し、それらの間の関係についていくつかの予想を立てることができた。特に、Schur関数の場合と類似した組合せ論的な性質を満たすであろうことも確認できたが、現在のところまだ証明には至っていない。2.離散トーラスに付随するラプラシアンのスペクトルゼータ関数および行列式の研究:報告者は以前、トーラスに対するラプラシアンのスペクトルゼータ関数、Selbergゼータ関数、および行列式(ゼータ正規化積)の研究を行ったが、本年度は、その離散類似である離散トーラス(有限無向グラフ)に対して同様の研究を行った。熱核の一意性からスペクトルゼータ関数は第一種変形Besse1関数を用いて書けるのだが、今回その級数表示を用いて詳細に計算することで、一般次元の場合のスペクトルゼータ関数がLauricellaの多変数超幾何関数を用いて書けることが分かった。特に、ここで得られた表示とGaussの超幾何関数のある二次の変換公式を用いれば、1次元の場合の既存の表示がより簡明に導出される。また、2次元の場合は上記Lauricellaの多変数超幾関数が一般超幾何関数に落ちることも分かり、2次元と3次元以上の場合の問題の難しさの違いもこの意味で明らかとなった。
心筋症ハムスターに対する肝細胞増殖因子遺伝子導入による心不全治療

(1)ラットHGFcDNA (rHGF)を、筋親和性を実現するべくβアクチンプロモーターを有するプラスミド(pCAGGS)に組み込んだ(pCAGGS-rHGF)。同様にヒトHGFcDNA (hHGF)をpCAGGSに組み込んだ(pCAGGS-hHGF)。rHGFの発現のみ確認された。実験にはpCAGGS-rHGFを使用した。(2)培養細胞に対する遺伝子導入:超音波穿孔法を試みた。超音波のみにては遺伝子発現は認められず、ラット培養心筋細胞に対し、超音波造影剤との併用によりrHGFの培養上清中への有意な発現を確認した。(3)心筋組織に対する遺伝子導入:心筋症ハムスターTO-2の前壁中隔に体外より注射針による直接遺伝子導入を試みた。閉胸でのエコーガイドの際に超音波造影剤との併用を試みた。レポーター遺伝子LacZの心筋内発現が確認されたが、末梢血中へのHGF産生は認められなかった。(4)個体への遺伝子導入:TO-2の下肢骨格筋に対しLacZならびにIL5プラスミドを電気穿孔法にて導入し、局所でのレポーター発現と末梢血中へのIL5産生を認めた。電気穿孔法の条件を100V,50ms左右6回パルスと決定した。(5)心筋症ハムスターTO-2に対する電気穿孔法によるrHGF導入:下肢骨格筋(M. Tibialis. Ant.)へのrHGF投与量を200,400,800μgとすると800μgで血中濃度が最大となるため、この投与量を(4)の穿孔法条件にて導入。血中濃度は2週間以上にわたって5ng/mL以上を維持した。心エコー法による心機能は導入群で対照群、偽薬群に比し改善した。心筋組織病理上、導入群にて心筋線維化減少・毛細血管密度の増加が認められた。導入群ではコラーゲン分解にかかわるMMP-1活性の上昇が認められ、薬剤作用機序と推察された。(平成14年3月、第29回日本集中治療医学会にて最優秀演題の表彰を受けた。投稿中。)(1)ラットHGFcDNA (rHGF)を、筋親和性を実現するべくβアクチンプロモーターを有するプラスミド(pCAGGS)に組み込んだ(pCAGGS-rHGF)。投稿中。)(1)ラットHGFcDNA(pBS-rat)を、筋親和性を実現するべくβアクチンプロモーターを有するプラスミド(pCAGGS)に組み込んだ(pKSCX-ratHGF)。同様にヒトHGFcDNA(pBS-7)をpCAGGSに組み込んだ(pKSCX-humanHGF)。プラスミド設計が遺伝子発現に妥当かを確認するため、蛋白発現実験系として繁用されるHEK293細胞に対するカチオン性脂質遺伝子導入法を用い、2種のHGF発現を計測した。ラットHGFの発現は確認されたが、ヒトHGFの発現は認められずコンストラクトの再検討を要するため、実験にはpKSCX-ratHGFを使用した。(2)培養細胞に対する遺伝子導入:予算上、細胞用電気穿孔装置が入手できず、超音波穿孔法を試みた。超音波のみにては遺伝子発現は認められず、293細胞とラット培養心筋細胞の両者に対し、超音波造影剤との併用によりラットHGFの培養上清中への有意な発現を確認した。(3)心筋組織に対する遺伝子

導入:心筋症ハムスターTO-2(当初予定のBio53.58は系自体が死滅したため同系のTO-2へ変更)の心臓前壁中隔領域に体外より注射針による直接遺伝子導入を試みた。閉胸でのエコーガイドの際に超音波造影剤との併用を試みた。レポーター遺伝子LacZの心筋内発現が確認された。造影剤併用の有無にかかわらず、末梢血中へのHGF産生は認められなかった。心機能変化は導入一週間以内には認めなかった。心筋局所でのHGF産生は内在性HGFと区別しうる測定系をTaqManプローブを用いて現在設計中。(4)個体への遺伝子導入:TO-2の下肢骨格筋に対しLacZならびにIL5プラスミドを電気穿孔法にて導入し、局所でのレポーター発現と末梢血中へのIL5産生を認めた。(5)次年度予定:骨格筋へのHGF導入後の心筋組織病理・心機能測定。心筋に対する電気・超音波穿孔法の試み。(1)ラットHGFcDNA(pBS-rat)を、筋親和性を実現するべくβアクチンプロモーターを有するプラスミド(pCAGGS)に組み込んだ(pKCX-ratHGF)。HEK293細胞に対するカチオン性脂質遺伝子導入法を用い、HGF発現を計測し、ラットHGFの発現は確認され、コンストラクト設計の妥当性が実験にpKSCX-ratHGFを使用した。(2)培養細胞に対する遺伝子導入:超音波穿孔法を試みた。超音波のみにては遺伝子発現は認められず、ヒト培養臍帯静脈内皮細胞とラット培養心筋細胞の両者に対し、超音波造影剤との併用によりラットHGFの培養上清中への有意な発現を確認した。この際DNA量、孵卵時間、超音波照射時間、照射繰り返し回数、超音波造影剤量につき変動の影響を検討した(Cirrculation 2000;102:II-561-2)。(3)心筋組織に対する遺伝子導入:心筋症ハムスターTO-2の心臓前壁中隔領域に体外より注射針による直接遺伝子導入を試みた。心筋組織のHE染色・Trichrome染色では有意な変化を認めなかった。同様の手法にてHGFプラスミドの導入を試みるも末梢血中へのHGF産生は認められなかった。(5)予定:培養細胞への超音波遺伝子導入の条件設定を更に詳細に検討その条件を心筋組織に対する遺伝子導入に応用する。(1)ラットHGFcDNA(rHGF)を、筋親和性を実現するべくβアクチンプロモーターを有するプラスミド(pCAGGS)に組み込んだ(pCAGGS-rHGF)。同様にヒトHGFcDNA(hHGF)をpCAGGSに組み込んだ(pCAGGS-hHGF)。rHGFの発現のみ確認された。実験にはpCAGGS-rHGFを使用した。超音波のみにては遺伝子発現は認められず、ラット培養心筋細胞に対し、超音波造影剤との併用によりrHGFの培養上清中への有意な発現を確認した。(3)心筋組織に対する遺伝子
「分化の波」の進行を制御する複数シグナルの相互作用の理解

様々な生命現象は多様なシグナル経路の複雑な相互フィードバックにより制御される。これまで、個々のシグナル経路の動作機構の理解が進んできたが、多細胞系において複雑なシグナル間相互作用を正確に記述することは困難であった。本研究では、シグナル間相互作用を包括的に理解するモデルとして、ショウジョウバエ視覚中枢の発生における「分化の波」に着目する。数理生物学的手法と実験生物学的手法を融合することにより、「分化の波」の進行を制御する複数シグナルの相互作用の包括的な理解を目指す。
HLA-クラスI遺伝子導入マウスを用いたクルーズトリパノソーマ感染防御機構の解析

1.HLAトランスジェニックマウス(HLA-TG)を用いたクルーズトリパノソーマ症(TC)に対する防御免疫の解析TCに対する防御免疫には実験マウスにおいてCD8陽性の細胞障害性T細胞が主要な免疫細胞として働くことが報告されている。そこで、ヒトのペプチドワクチン開発のための新しい手段として、HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用い、CD8陽性T細胞を刺激するHLAと親和性のある抗原ペプチドの同定を試みた。選んだHLA-TGはHLA-B35の遺伝子をC3H/Heに導入したHLA-B35-TGである。ペプチドの検索は、ヒト細胞内感染型のアマスチゴ-トで高い発現が認められているシステインプロテアーゼ(CP)分子の全長のアミノ酸配列を基に行なった。この配列の中からHLA-B35の結合モチーフとして報告のある配列から8個から10個のペプチドを61種合成した。さらにHLA-B35トランスフェクタントに対する結合ペプチドの阻害活性を指標として各ペプチドのB35分子に対する親和性から5種のペプチドを刺激抗原とした。感染後2カ月のHLA-B35-TGマウスの脾細胞をin vitroでIL-2とペプチド下で刺激培養したが、2週から4週の長期培養をしても特異的な細胞障害性T細胞の活性は検出されなかった。この原因は、HLA-B35分子とこれらのペプチドの結合力が他の抗原で報告されている抗原ペプチドの結合力に比べ弱かったこと、CD8陽性T細胞の活性化のために必要なヒト由来のCD8分子が、この系には欠損していたことが考えられた。2.ヒト宿主での主要抗原の同定および、感染型TCでのCP分子の種内変異の同定。上記1項の問題を解決するため、主要抗原分子の検索と抗原分子の種内変異を侵淫地で調査した。CP分子とほぼ同じ分子量の蛋白分子がT細胞抗原として分離され、中南米にはTCに5種の系統が存在することが明らかとなった。HLA-B35遺伝子導入トランスジェニックマウスに、シャガス病の病原原虫であるトリパノソーマクル-ジを感染させ、慢性感染状態で誘導されてくる、防御免疫能の中枢であるCD8陽性の細胞障害性T細胞を株化してそのT細胞株が認識するB35分子と結合した抗原ペプチドを同定することを目的として、2年計画の初年度の研究を行った。遂行したのは以下の事項である。1.感染系の確立。T.cruzi Y strainのin vivoおよびin vitroの継代培養系を確立した。用いたY strain(長崎大より恵与)はC3H系マウスに対し強毒性を示し、マウスで継代中のトリポマスチゴ-ト10^3個の腹腔内投与で100%のマウスが1週から2週で原虫血症を起こし死亡した。従ってこの実験系は、防御免疫能の検定に適したものと考えられた。また、慢性感染マウス作製には、in vitro培養したエピマスチゴ-ト1-2x10^6個を腹腔内投与するのが最適であることも明かとなった。慢性感染の指標として、エピマスチゴ-ト抗原をコートしたラテックス凝集反応を用いる血中抗体測定法を確立した。2.抗原ペプチドの作製。

原虫感染細胞膜上のHLA-B35結合ペプチドを直接蛋白化学的に分離同定することは困難であると判断し、すでに感染細胞中で発現の確認されているシステインプロテアーゼ(クルジパイン)にターゲットを絞り、この分子の全アミノ酸配列から、HLA-B35分子の抗原結合モチーフに照合して8-9merのペプチド約30種を合成しまずin vitroで結合能を測定し、B35と親和性の強い約8種のペプチドを選びCD8T細胞の長期培養系の刺激抗原として培養を開始した。現在維持培養している各細胞株の機能について検討中である。1.クルーズトリパノソーマ慢性感染マウスの作成慢性感染マウスの作成には、4週齢のC3H/He、あるいは、C3H由来HLA-B35トランスジェニックマウス(HLA-B35-TG)に、培養エピマスゴ-ト1×10^6コを投与するのが、最も安全で確実な方法であることが判明した。これにより、投与後2週後には血清抗体価の上昇が認められ、2ヵ月後も抗体価は接続して上昇した。2.抗原ペプチドによる刺激培養感染後約2ヵ月のマウスの脾細胞1×10^6/mlを5種類のHLA-B35と親和性の強い、システインプロテアーゼ抗原由来の8-9merペプチド各10μMの濃度で3日間刺激培養した。4日後に、IL-2 30U/mlを加え、さらに7日間培養を続けた。培養開始10日後に、生細胞を集め、自己の放射線照射した脾細胞5×10^6コと共に培養を続けた。培養開始後、14日目に生細胞を回収し、マウスCD8に対する単クローン抗体で、CD8陽性T細胞の数を算定した。予想に反して、細胞数は増加しておらずペプチドによる刺激効果は不十分であると推測された。この細胞のペプチド抗原添加HLA-B35トランスフェクタント(P815-B35tf)に対する細胞障害性を^<51>Crを用いて常法により行なったがまったく障害性を示さなかった。慢性感染マウスに対してペプチド抗原の刺激活性が低かった要因として以下のことが考えられた。(1)B35モチーフで作成したペプチドは、いずれも結合性試験で弱い親和性しか示さなかった。つまり、選んだシステインプロテアーゼに対してHLA-B35が最初から低応答性の可能性がある。(2)ペプチドの決定に用いたデータは、Y株ではなくTulahuen株由来のため、配列が異なっていたため刺激しなかった。(3)トランスジエニックマウスのHLA分子が機能するには、ヒト由来のCD8分子のダブルトランスジエニックマウスが必要であるとの報告があり、これと同様の機序が働いた。
次世代通信向けの超低消費電力のLDPC復号器研究開発

低消費電力低密度パリティ検査(LDPC)IEEE802.15.3cPHYをするためのコードデコーダLSI(WPAN)に関する研究重要度:IEEE802.15.3cPHYをまたはWPANは、ギガビットワイヤレス通信をサポートする最先端の通信規格です。携帯端末装置用の低電力LDPCデコーダLSIが必要となります。我々は、パリティ検査行列構造の探査に基づいて、メッセージ置換方式を提案する。結果、メッセージ・パッシング・ネットワークは、純粋な線を含まなく論理回路の実装を備えていません。従来構造と比較して、グローバルなゲート数40%の電力の35%が原因で提案アイデアの導入にそれぞれ削減されます。この作品は第18回アジア南太平洋設計自動化会議設計競争で発表されていました。IEEE802.16e規格におけるLDPC符号復号器LSIに関する研究(WiMAXの)重要度:IEEE802.16e規格やWiMAXは、特にデータ転送速度の長期的に高品質な無線通信を提供する有望な無線通信規格です。しかし、WiMAXのに含まれているLDPCデコーダの高い消費電力が将来のアプリケーションのボトルネックになっている。したがって、低電力LDPCデコーダLSIの研究は間違いなく重要と有意義です。我々は、WiMAXアプリケーションのためのビットシリアル完全に並列復号を用いた高エネルギー効率LDPCデコーダアーキテクチャを提案する。それは、事前に列の置換技術を使用して、2つの行の同時デコードを提供しています。メッセージの相互結合網の複雑さは飛躍的にビットシリアルメッセージパッシングのアイデアを導入することにより低減されます。この作品は、2012年IEICE論文誌で発表されていました。●低消費電力低密度パリティ検査(LDPC)IEEE802.15.3cPHYをするためのコードデコーダLSI(WPAN)に関する研究重要度:IEEE802.15.3cPHYをまたはWPANは、ギガビットワイヤレス通信をサポートする最先端の通信規格です。-我々は、パリティ検査行列構造の探査に基づいて、メッセージ置換方式を提案します。結果、メッセージ・パッシング・ネットワークは、純粋な線を含むことはなく論理回路の実装を備えていません。-この作品は、VLSI設計、オートメーション2011国際会議で発表し、最優秀論文賞を受賞しました。また集積回路2011国際シンポジウムと併せて開催されたチップ設計競争のブロンズ賞も受賞しています。重要度:IEEE802.16e規格やWiMAXは、特にデータ転送速度の長期的に高品質な無線通信を提供する有望な無線通信規格です。しかし、WiMAXのに含まれているLDPCデコーダの高い消費電力が将来のアプリケーションのボトルネックになっており、低電力LDPCデコーダLSIの研究は間違いなく重要と有意義です。-我々は、WMAXアプリケーションのためのビットシリアル、完全に並列復号を用いた高エネルギー効率LDPCデコーダアーキテクチャを提案します。-この研究については、2011年アジア固体回路会議で発表しました。超低消費電力LDPCデコーダLSIの私たちの当初の計画によると、このトピックで具体的な成果を案施しています。結果は国際会議で、ジャーナルの両方に2つのLSIチップや紙の出版物が含まれています。当初の計画としてさらに、今年度は次世代無線通信用の超低消費電力LDPCデコーダLSIの研究に焦点を当てます。LDPC

畳み込み符号(LDPC-CC)は、この分野で現在非常に人気があります。いくつかの研究はLDPC-CCに指定されたデコーダLSIチップの消費電力を下げるために、このトピックで実施したいと思います。また、非バイナリLDPC(NB-LDPC)符号の低複雑性復号アルゴリズムは利益になり、さらにLSIチップは、我々の提案のアイデアを検証するために設計されると思います。その後、私たちの研究を提示する国際会議や学術誌にて発表する予定です。
原生生物クラミドモナスにおける機械的刺激を受容するメカニズムの研究

原生生物は光、温度、化学生物など様々な外的な刺激に対して行動を変える。原生生物のクラミドモナスはそのような巧妙な反応系を持つ原生生物の一つであるが、機械刺激に対する反応は未知である。本研究では、機械的刺激に対してクラミドモナスが周期的な活動電位のようなスパイクを出すことを発見し、その性質を明らかにした。クラミドモナスの細胞体を吸引電極に吸い付け、吸引電極を通じて細胞の膜電流を測定し、吸引圧力を与えた。鞭毛をピペットに吸い込んだ状態で吸引を行うと、活動電位のようなスパイクが約1Hzの頻度であらわれ、吸引をやめるとしばらく続いた後に止まる。1)このスパイクは鞭毛を吸引しないと現われないことから、鞭毛にあるメカノセンサーが関与していることが考えられる。2)短い鞭毛を持つ細胞は小さい振幅のスパイクしか出さなかった。従って鞭毛の全長に分布しているチャンネルがスパイクの電流を通していると考えられる。3)与えた圧力(5-20cmH_2O)が高いほどスパイクの頻度(0.5-1.0Hz)は高かった。刺激の強さを活動電位の頻度に変換するfrequency codingは中枢神経系を持つ生物では一般的であるが、原生生物では初めての報告である。4)カルシウムイオンを取り除いたり、カルシウムチャンネルブロッカーを与えるとスパイクは消失した。このことはスパイクがカルシウムイオンの流入によることを示している。5)電位依存性のチャンネルによるスパイクより、機械刺激によるスパイクの方が大きかった。これはstretch-activated channel自体がスパイク電流を流していることを示唆している。繰り返しスパイクを出すことは、高等動物の機械刺激受容・伝達の機構に似ていて興味深い。クラミドモナスには単細胞生物と多細胞生物を繋ぐ機械刺激受容の仕組みがあるのかもしれない。
セルフクリーニングpH電極ならびにディスポーザブルpH電極の開発

現在pH電極に用いられているLi伝導型のガラス電極には,汚れの蓄積により容易にpH応答が低下するという問題がある。この問題を解決するために二種類のメンテナンスフリーのpH電極を開発した。一方,遷移金属酸化物をゾル-ゲルコーティングしたステンレス電極は,高いpH感度と高速pH応答を示した。加工性に優れる電極なのでディスポーザブルのpH電極として利用が期待される。遷移金属酸化物コートSUS電極のpH応答性能の評価については,各種遷移金属酸化物をコートしたSUS電極のpH応答性能の評価を行い,未コートのものより良好な感度を示すことがわかった。H27年度の結果から,他のガラス形成酸化物でも良好な結果が得られたためH28年度も継続して行う必要が出た。その他の部分は順調に進展している。H29年度に予定していたMxOy-Bi2O3-B2O3ガラスに関して,前倒しで研究をしたところ,ガラス形成能が低いあるいは比抵抗が高いなどの理由により,MxOyとしてはこれまで用いていたFe2O3が最適であると判断した。ディスポーザブル電極に関して,Fe2O3などの第一遷移系列の遷移金属酸化物コートSUS電極は未コートのSUS電極よりpH感度が高かった。また,コートしていないSUS電極は500度で24時間熱酸化膜を形成することによってもpH感度が上昇することがわかった。さらに,Alなどの他の金属電極を用いたところ下地となる金属のpH感度の影響が非常に大きいことがわかった。現時点では,金属として元々pH感度がある程度高い,SUSが最適であると判断した。いくつかのSUS管を入手し,ゾルーゲルコート条件の検討を行い,SUS板と比較してコートは困難であるが,pH応答を評価できるレベルの電極の作製に成功した。セルフクリーニングpH電極に関して,H27年度とH28年度の内容を入れ替えて進める予定であった。しかし,Fe2O3-Bi2O3-GeO2に関する結果が大変良好であったため,H28年度はFe2O3-Bi2O3-GeO2についての詳細な組成依存性の研究を行った。そのためFe2O3-ZnO-B2O3に関しては行わなかった。ディスポーザブル電極に関して,順調に進んでいる。現在pH電極に用いられているLi伝導型のガラス電極には,汚れの蓄積により容易にpH応答が低下するという致命的な問題がある。これまでに,この問題を解決するために,既存の概念にとらわれない新規のセルフクリーニング機能を有するpHガラス電極を開発してきた(H24-H26年度・基盤C(一般)・24560823)。一つは申請者が開発した光触媒機能を有するTiO2-P2O5ガラスの酸化→還元→酸化というアニールプロセスによる自己洗浄型のpH応答ガラスの開発である。もう一つは,申請者が開発した撥水性ガラスに電子伝導性を付与したFe2O3-Bi2O3-B2O3ガラスによる自己防汚型のpH応答ガラスの開発である。今回,既存のpH応答ガラス(リチウムシリケート)電極では実現不可能な,清浄な状態を保つことでpH応答性能を保証する二種類のメンテナンスフリーのpH電極を開発した。防汚特性(撥水性)に基づく自己防汚型のガラス電極の開発に関しては,既存のFe2O3-Bi2O3-B2O3ガラスより撥水性に優れたFe2O3-Bi2O3-GeO2ガラスの開発に成功した(Sens. Actuators B: Chem., 2018)。FeBiGeを作用極,FeBiを比較電極とする複合ガラス電極は,被験液を内部液(KCl)で汚染しないというメリットがある。また,遷移金属酸化物をゾル-ゲルコーティングしたステンレス電極は,高いpH感度と高速pH応答を示した。加工性に優れるので,ディスポーザブルのpH電極へ応用が期待できる。いずれも先端材料分野やバイオ・創薬関係での新しいツールになり得る。pH深さ方向測定をするために,SUS細管を用いたプロトタイプのpH電極を作製した。市販のpH電極と比較して,深さ方向に急峻なpHの変化のある液体のpHを測定できることを明らかにした。セルフクリーニングpH電極については,H27年度に当初予定していた研究を行う。ディスポーザブルpH電極については,予定通りSUS管へのコーティング実験を進めるが,追加でSUS電極以外の金属電極に関する調査も行う。セルフクリーニングpH電極に関して,H29年度分に関してはH28年度に完了した。H28年度の結果からB2O3含有ガラスよりGeO2含有ガラスの方が,pH感度と接触角に関して優れているという結果が得られたので,Fe2O3-MxOy-GeO2を中心に実験を進めることにする。ディスポーザブル電極に関して,予定通りpH深さ方向測定の実験を進める。工学予定していた備品のディップコーターのモデルが入手できなくなり,グレードを下げざるを得なかったため予算が余った。しかし,当面購入物品で研究に支障を来すことはない。予定していた反射アタッチメントについて,デモ測定を依頼したところ,メーカから測定不能との返事を受け,購入を取りやめたため予算が余った。

研究の進展としては特に問題はなかったが,H28年度での優先順位が下がったため,SUS電極等の加工用の小型精密切断機の購入(50万円)を見送った。一方,研磨治具の更新(20万円)などで10万円程の残額を生じた。90万円ぐらいの残額が出たので,以下の経費を追加で計上した。(1)SUS基板の断面観察用に既設のマイクロスコープに使える画像解析ソフトとPCを購入予定(20万円)である。(2)論文投稿時にオープンアクセスにするために20-40万円の経費がかかる予定である。(3)SUS管の切断に使う精密カッターを購入予定(40万円)である。H29年度の予算の大部分は小型精密切断機(49万円)の購入に充てる。
気泡振動の能動的制御による水中衝撃波のソリトン遷移を狙う非線形音響理論

ポンプの中を流れる水中において、しばしば、衝撃波という「危険な」波が形成される。これを、ソリトンという「安全な」波に変換できれば、ポンプの損傷を抑制することが可能となる。本研究の目的は、この革新的技術開発のための理論的基盤の創成にある。気泡流中において、水中音速1,500 m/sを超えて伝播するという、水の圧縮性の効果が招く高速伝播圧力波を用いて、ソリトン遷移した衝撃波をポンプ内から速やかに逃がすという着想に基づき、高速伝播圧力波の非線形伝播の理論解析および数値解析を行った。今後、本理論の実験的検証研究や、次世代のポンプへの実装を目指した産学連携研究といった、さらなる進展が期待されるだろう。ポンプに代表される水を扱う流体機械内において、機器の損傷を招く一因に、水中圧力波の非線形発展による衝撃波形成が挙げられる。水に気泡群を意図的に混入させ、その振動を能動的に制御できれば、波の分散性の効果を圧力波伝播に持ち込むことが可能となる。この効果を、波の散逸性の効果よりも卓越させることができれば、衝撃波の音響ソリトンへの遷移が期待される。本研究の狙いは、気泡流中における非線形波動の散逸性を抑制して分散性を増幅させて、衝撃波を抑制するという新技術の理論的基盤の創成にある。そのポイントは、分散性や散逸性などの波の多様な性質の大きさを、波の非線形性の大きさを基準として適切に見積もる操作(代表者ら、2010)を利用して、波が衝撃波か音響ソリトンのいずれになるかの予測にある。本年度の主要な成果は以下のとおりである:1.流体機械内において重要となる、圧力波伝播の多次元性および気泡群の非一様分布を、波の分散性と散逸性と同等に、非線形性を基準として見積もることができる方法論を提示した。これを用いて、非一様場における準一次元伝播を記述する2種類の非線形波動方程式を導出した。2.水の圧縮性の効果が招く高速伝播圧力波の有限振幅伝播を、弱非線形のレジームで調べた。圧縮性の大小に応じて、分散性と散逸性の大きさが劇的に変化するため、その取扱いにおいては、いくつかの周波数帯に分類することが重要となる。その見通しを立てた。水中衝撃波の音響ソリトン遷移という、流体機械内部の損傷を防ぐための革新的手法の実現に向けた理論的基盤の確立が目的である。本年度は、昨年度の成果を発展させて、以下の成果を得た:1.液体の圧縮性の効果が導く高速伝播圧力波の有限振幅伝播を記述する線形および非線形波動方程式を導出し、その数理的構造を明らかにした。2.気泡の数密度が小さな非一様性を有する気泡流中において、弱い回折の効果を伴う圧力波の弱非線形伝播を記述する2種類の非線形波動方程式(Kanagawa, J. Acoust. Soc. Am., 2015)の数値解析を行い、準一次元性と非一様性が圧力波伝播に与える影響を定量的に解明した。3.準一次元の拡大・縮小管(ベンリュリ管)内の非一様気泡流中の圧力計測に着手し、上記2の理論の実験的検証の見通しを得た。おおむね当初計画のとおりに研究を遂行できた。とくに、実験流体力学の専門家との共同研究によって、当初計画には含まれていなかった理論の実験的実証に着手できたことは大きな進展であって、最終年度における新展開を期待させるものといえる。また、非線形波動方程式群の網羅的な数値解析によって、初年度に蓄積した理論的知見を定量的理解へと深化させたことは、最終年度の研究総括のための十分な基礎である。水中衝撃波の音響ソリトン遷移という、流体機械内の損傷を防ぐための革新的技術の基盤となる基礎理論の構築が、本研究の目的であった。研究期間中に、当初計画からの軽微な変更はあったものの、実験的研究との融合といった当初計画には予定されていなかった新展開の実現にも成功し、総合的に当初計画の目的を達成することができた。最終年度は、昨年度末より着手した、水の圧縮性の効果が招く気泡流中の高速伝播圧力波の理論解析と数値解析をさらに推し進めた。これまでの先行研究群では着目されてこなかった、当該モードの非線形伝播を記述する非線形波動方程式群を導出し、その数値解を網羅的に整備した。その成果は、学術的な新規性に留まらず、本基礎研究を工学応用へと資するという目的においても、極めて重要なものといえる。なぜならば、水中を伝播する、衝撃波発展への危険性を秘めた圧力波は、流体機械の内部から「速やかに」逃がすべきだからである。その意味で、高速伝播圧力波を、どのように有効活用するのかへと踏み込むことが、本研究の次なる使命の一つに属する。今後、本理論の実験的検証

研究や、次世代のポンプへの実装を目指した産学連携研究といった、さらなる進展が期待されるだろう。代表者の研究機関異動のため、研究開始までにある程度の時間を要したが、概ね、申請書の初年度計画に記載のとおりに研究を遂行できた。具体的な成果は、気泡流中の非線形音響伝播において重要な散逸性と分散性を見積もるための理論の拡張、および、その理論を用いてのいくつかの波動現象の予測である。これらの成果は、散逸性と分散性の大小に支配される、衝撃波の音響ソリトン遷移の確固たる基盤になりうるものである。最終年度は、水中衝撃波の音響ソリトン遷移のための基盤確立に向けて、以下の4点に留意しながら研究を総括する予定である:1.理論・数値解析については、個々の知見は十分に得られつつあるものの、それらを結ぶ枠組みが見出せていないため、研究総括に向けて統一的な観点からの解析を行う。2.実験流体力学の専門家との共同研究を引き続き深化させて、理論の実験的実証を目指す。3.上記1と2の成果を、代表者が現在遂行している、気泡流中の圧力波を利用した工学応用研究に資することを狙う。流体力学理論解析については、まず、初年度に引き続いて、上記実績記載の2に深く踏み込む。さらに、気泡流中の弱非線形波動を包括的に調べたうえで、いかなる状況下において、圧力波が衝撃波に発展するか、音響ソリトンに発展するかの判断を下す。なお、代表者の研究機関異動によって、現在、土木工学(水面波としてのソリトン)および航空宇宙・機械工学(散逸波としての衝撃波)の流体工学の計測家との共同研究が可能な環境にある。そもそも、分散性と散逸性を非線形性を基準に見積もる方法論自体が、実験を意識した理論体系である意味において、理論解析の発展はもちろんであるが、理論の実験的検証にも見通しを立てている。1.当初計画に含まれていなかった実験的検証を行うためである。2.当初計画の一部が未遂行であるためである。3.得られた成果の一部が未公表であるためである。申請者の研究機関異動に伴って、研究計画にわずかな遅れが生じたため、次年度使用額が生じた。1.実験的検証のために、電子部品や配管部品などに使用する。2.当初計画遂行のために使用するが、上記1に要する額が大きいことから、使用額を当初計画よりも削減する。3.成果公表のために、学会参加費、国内外旅費、論文掲載費などに使用する。成果公表(論文投稿および学術会議発表)に利用する予定である。
音声による感情表現に伴う声帯振動の変化について

超高速高解像度声帯振動デジタル撮影装置を用いた声帯振動の撮像と電気声門図(EGG),光電声門図(PGG),音声の各波形との相関性、声門開大及び声門閉鎖のパタンとそれに対応したEGG波形のパタンについて及びその要因について、一部第99回日本耳鼻咽喉科学会総会にて報告し、さらに声門開大及び声門閉鎖にそれぞれ5つのパタンを再確認した上で同学会誌に投稿した。また、第11回世界気管食道科医学会にて発表した。しかし、中心的に解析すべき点と思われるゆらぎやビブラートの違いが超高速高解像度声帯振動デジタル撮影による声帯振動撮像の声門開大及び声門閉鎖のパタンとそれに対応したEGG波形,PGG波形のパタンの中でどう変化するのか、ゆらぎやビブラートは周期が長くもう一度基礎の実験より長いデータが必要となり、実験やり直した。既存のデータを含め現在解析中である。次に、4種類の感情(喜、怒、哀、楽)の表現における、超高速高解像度声帯振動デジタル撮影装置を用いた声帯振動の撮像と電気声門図(EGG),光電声門図(PGG),音声の各波形の声門開大及び声門閉鎖のパタンとそのゆらぎやビブラートによる変化について検討中である。PGGはゆらぎやビブラートの存在その周期性は捕らえられる様である。EGGはゆらぎやビブラートの1周期毎の変化をとらえられ、その声門開大及び声門閉鎖のパタンの中での変化がある様でこれを比較検討中である。今後、第17回世界耳鼻咽喉科学会総会にて発表し、Journal of Voiceに投稿する予定であり、更に音響的特徴、形状及び形状の時間的変化,感情の違いとビブラート、低周波数成分、画像上の声帯振動の変動、Intensityに関する音の立ち上がり、終わり方、ゆらぎ、および基本周波数のゆらぎ、などとの関係について検討していきたい。超高速高解像度声帯振動デジタル撮影装置を用いた声帯振動の撮像と電気声門図(EGG),光電声門図(PGG),音声の各波形との相関性、声門開大及び声門閉鎖のパタンとそれに対応したEGG波形のパタンについて及びその要因について、第99回日本耳鼻咽喉科学会総会にて報告し、さらに声門開大及び声門閉鎖にそれぞれ5つのパタンを再確認した上で現在学会誌に投稿中である。また、世界気管食道医学会にて発表する予定である。しかし、中心的に解析すべき点と思われるゆらぎやビブラートの違いが超高速高解像度声帯振動デジタル撮影による声帯振動撮像の声門開大及び声門閉鎖のパタンとそれに対応したEGG波形,PGG波形のパタンの中でどう変化するのか、ゆらぎやビブラートは周期が長くもう一度基礎の実験より長いデータが必要となり、既存のデータを含め実験及び解析中である。次に、4種類の感情(喜、怒、哀、楽)の表現における、超高速高解像度声帯振動デジタル撮影装置を用いた声帯振動の撮像と電気声門図(EGG),光電声門図(PGG),音声の各波形の声門開大及び声門閉鎖のパタンとそのゆらぎやビブラートによる変化について検討してゆきたい。
認知機能に関係する神経可塑性プロテアーゼ基質の網羅的探索とそのシグナル系の解析

プロテアーゼに対する新規基質の網羅的解析を試み、KLK8(ニューロプシン)について既報告のニューレグリン1(NRG1)の再現実験をおこなった。その結果、海馬においてKLK8はErbB4を活性化し、パルブアルブミン陽性の抑制性GABAニューロンを賦活し、興奮性ー抑制性(E/I)バランスを正常に保つ。一方、KLK8KO動物ではこのシグナル系に異常を生じ、E-Iバランスの異常を生じた。また、本網羅的解析によって、Fibronectin, Vitronectinを同定した。一方組織plasminogen activatorの基質としてプラスミンを確認した。tPA、トロンビン、ニューロトリプシンおよびカリクレイン6はいずれも脳に存在するセリンプロテアーゼ群であり、構造的にもよく類似している。そこで我々はニューロプシンにおいてすでに実用化したDirect-protease-substrate interaction(Dips法)による天然基質候補のスクリーニングを行った(参考:Tamura et al. J. Neurosci. 32:12657,2012)。作製する結合能維持変異型プロテアーゼは各プロテアーゼのLoop Gの一部を変異させたExpression vectorを作製する。この作業は後述するそれぞれの担当者が各大学で行う。いずれも数種類の変異遺伝子を作製し、結合能維持変異型プロテアーゼが出来たかどうかは細胞への遺伝子導入を行い、ウェスタン法によってプロテアーゼの理論分子量より大きいコンプレックスが出来たものを候補とする。この研究では適切な変異プロテアーゼを得ることが条件であり、カリクレイン6、トロンビンはLoopGの構造がきわめてよく類似し(Kishi et al. J. Biol. Chem. 274, 4220,1999)、ジスルフィド結合を作るC208は保存されているため、これを解くため同様にC208S変異を導入する。しかしコンプレックスが出来ない場合には僅かに位置を変え検討する。2基質複合体の質量分析検索これらの内いくつかについてコンプレックスが出来れば、それを優先して解析を進める。こうして得られたコンプレックスはMycあるいはHis-tagによって分離することが容易である。得られた高分子コンプレックスをTof-Mass解析を行う(基質スクリーニング)。Tof-Mass解析については奈良先端科学技術大で行い、分析結果を分担者と共有する。プロテアーゼの基質を同定するため、その網羅的スクリーニング法としてDeirect-Protease-Substrate-Interaction(DSPI)法を考案し、ニューロプシンの一部基質の同定に成功した。本研究ではニューロプシンおよび組織プラスミノーゲンアクティベータの新規基質の同定を目指している。これまでニューロプシンの結合能を維持するミュータントニューロプシンの作成、および本研究課題として、やはり結合能の維持するミュータント組織プラスミノーゲンアクティベータを作成できた。これら標識リコンビナントタンパク質を用い、ファーウェスターン法を実施したところ、特にニューロプシンと結合する13種のタンパク質を得ることができた。これらはその一部がすでに同定したニューレグリン1であったが、いくつかは未同定のタンパク質とコンプレックスを作っていることが明らかとなった。1、我々はDPSI法と名付けた方法により細胞外セリンプロテアーゼNeuropsinの海馬における基質として神経栄養因子Neuregulin-1の同定に成功した。この方法を応用するために組織プラスミノーゲンアクティベータのLoopG(C506S)を変異させたExpression vectorを作成し、これをCOS細胞に組み込んだ。同様の方法にてtPAC506Sを作成し、これは実際に市販されているリコンビナントplasminogenと結合することを示した。このことは従来いわれてきたものの確認されていなかった現象、すなわちtPAがplasminogenを直接結合して、切断することを直接に示したものである。このことを踏まえ、今後、変異tPAに結合するたんぱく質を海馬ホモジェネートから同定する。2、これまで田村ら(J. Neurosci. 32, 12657, 2012)が同定した変異ニューロプシン結合物の解析をさらに進めるため、NRG1に絞り、海馬および前頭皮質のNRG1の分布を検証した。NRG1はプロセシングを受けて抑制性ニューロンを亢進させるため、シナプトソーム分画など細胞分画を行いウエスタンブロットにより検証したところ濃い63Kd(mature NRG1)バンドおよび,40,34および30kDaの薄い3つのバンドを得た。カイニン酸を腹腔内に注射し大脳皮質、海馬でのArcの増加によって神経活動の亢進を確認したサンプルにおいて、上記シナプトゾームに濃縮するバンドの増強を認め、特に田村が見出した34Kdの著しい濃縮を観察した。これはニューロプシンによる切断前の断片と考えられ神経活動の亢進によって前シナプスマトリクスに集積しているものと考えられた。当初予定していた未知結合たんぱく質との結合実験を未だ行っていない。これは担当していた学生の就職や、研究代表者の定年退職などが重なったためである。今後の研究推進方策に示したように新たに旭川医科大学の吉田成孝教授を共同研究者に加えることにより遅れをとり戻す計画である。我々はプロテアーゼに対する新規基質スクリーニング法の応用を試み、プロテアーゼニューロプシン(KLK8)の直接基質としてNeuregulin1(NRG1)を特定した。これはKLK8による切断を受け、そのリガンド部分を放出させて、神経活動依存的にその受容体(ErbB4)を介してGABAインターニューロンを特異的に活性化させた(KLK8-ErbB4系)。