hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄間葉系幹細胞を用いた血管柄付きハイブリッド人工骨の開発

H15年度の研究により、骨髄間葉系幹細胞の足場となる人工骨は、通常の多孔体セラミックスでは気孔同士の連通が少ないために、血管束移植の媒体に適していないことが判明した。そのため、ほぼ全気孔が連痛している東芝セラミックス社製のNEO BONEを用いることで、移植血管から生じた新生血管が人工骨全体を栄養できることが判明し、予備実験を行い血管柄付き培養人工骨の作製に成功した。本年度はさらに統計学検索も行うために個体数を増やし実験を進めた。まずラット大腿骨から採取した骨髄間葉系幹細胞を初期培養した後に30個のNEO BONEに播種し、骨形成培地で骨芽細胞に分化させることで培養人工骨を作製した。次にこの培養人工骨にラット伏在動静脈移植を行い大腿部皮下に留置した。移植2週後に大腿動静脈を血管柄とする血管柄付き培養人工骨を手術顕微鏡下に作製した。この時点で10個の人工骨は摘出し生化学的および組織学的評価を行った。残りの20個はすべてシリコンラバーで人工骨を包むことで周辺からの血管進入を防止し、さらに半数の10個は大腿動静脈も結紮した後、大腿部皮下に再留置した。コントロールとして培養細胞を添加していない10個の人工骨にも血管束移植を行い、血管柄付き培養人工骨作製と同様の手技を行った。移植4週後に30個の人工骨をすべて取り出し生化学的、組織学的評価を行った。生化学的にはアルカリフォスファターゼ活性およびオステオカルシン含量は、血管柄付き培養人工骨群では移植2週後よりも4週後で統計学的に有意に増加しており、また血管茎を結紮した培養人工骨群およびコントロール群よりも有意に高値を示していた。組織学的には血管柄付き培養人工骨群では移植4週後で良好な骨形成が気孔内に確認できたが、血管茎を結紮した培養人工骨群およびコントロール群では骨形成は全く認めなかった。以上の結果より培養人工骨に血管束移植を行うことで、血行不良な部位でも移植血管からの血行により生存が可能である血管柄付き培養人工骨が作製できること実験的に示唆された。H.15、H.16年度の研究により、全気孔連通型ハイドロキシアパタイトを足場として骨髄間葉系幹細胞を培養し、これに血管束移植術をおこなうことで、血管柄付きハイブリッド人工骨の作製が可能であることが判明した。さらにこの血管柄付きハイブリッド人工骨を血管束移植2週後にシリコンラバーで包むことで血行不良部位での活性を調べた結果、骨形成能を維持し得ることも判明した。H.17年度は、血管柄付き人工骨以外に、対象群としてシリコンラバーで包んだ後に血管柄を結紮して血行を途絶させた群、コントロール群として培養細胞を含まない群をそれぞれ10個体ずつ作製し、統計学的検討もおこなった。血管束移植4週後で、血管柄付き人工骨は、血行を有さない対象群およびコントロール群に比して骨形成能の指標となるアルカリフォスファターゼ活性およびオステオカルシン含量は有意に高値であった。組織学的にも、血管柄付き人工骨では気孔内に新生骨の形成を認め、新生骨は移植血管の周囲のみならず、シリコンラバーと接する辺縁にも存在しており、人工骨全体に血管新生が広がっていることも証明された。一方、対象群では気孔内には壊死組織しか認めず、血行不良部位では培養人工骨単独では活性を維持できないことが判明した。
化石・考古学遺物用バイオマーカーとしてのⅠ型コラーゲン配列情報の総合的解析

コラーゲンファミリーは細胞外マトリクスを構成するタンパク質の一群であり、多くの生物が有している。その中でもI型コラーゲンは特に体組織を構成する主要なコラーゲンタンパク質として知られている。2018年度はこのI型コラーゲンをコードする遺伝子配列を、分子生物学的手法と情報学的手法の両方を使ってゲノム内から集中的に探索した。この結果、複数の種から新しくI型コラーゲンの相同領域を同定することができた。分子生物学的解析のために幅広い種で保存されている領域にプライマーを設計して、近縁種のゲノムをテンプレートとしてPCRを実施したが、期待した増幅産物は得られなかった。既知配列と情報学的手法で得られた配列の系統解析を実施した所、系統関係とは必ずしも一致しない特異なバリエーションが多く見られ、改めてコラーゲンのコード領域が特異な進化を辿っていることが推察された。これらのコラーゲン配列をデータベースにまとめ、バイオサイエンスデータベースセンターから新しく公開を行った。この変異情報を利用して古代タンパク質や動物性遺物の種同定のためのリファレンスとなることを期待し、今後もデータベースの拡張を実施していく予定とした。2017年度は計画通り、探索方針の検討、情報学的手法を利用したコラーゲン配列の単離、保存領域の検討、並びに分子生物学的手法を利用したコラーゲン配列の単離の準備作業を実施した。サンプルについては岩手大学の協力の元、日本に生息するシカの複数個体の組織を入手し、別途イノシシの自然個体の組織を購入した。それぞれのゲノムを抽出し、分子生物学実験のターゲットとした。また、情報学的手法を用いてまだ構造が報告されていない9種の生物のコラーゲン配列を公共データベースから取得した。得られた配列を元に構造解析と保存領域の検討を実施した。3残基ごとのグリシンが定期的に出現する反復構造と、エキソンモジュールの大規模な反復構造を避ける位置に、ハイブリダイゼーション用オリゴヌクレオチドを設計し、PCR用のプライマーとした。作成したプライマーでの増幅実験に着手し、2018年度も継続していく。一方、配列解析の過程で、I型コラーゲンα鎖の塩基配列ごとではなくモジュールごとの進化を示唆する情報が得られた他、領域ごとに反復配列挿入の頻度差があることを確認したため、国内学会での発表を予定している。今後データベースを作成し、新しく確認できたコラーゲンの情報を広く発信していくことで、化石標本や考古学的試料から採取されたコラーゲンとの迅速な比較が可能となり、生物種の同定に役立つものと考えられる。更にアミノ酸残基レベルからエキソンモジュールレベルまで、多様な反復構造を有するコラーゲンの進化史を解明することは、多くの生物の形態形成に重大な役割を持つ繊維状タンパク質や、ゲノム全体の進化にとって有用な情報となると考えられる。本研究課題で2017年度に予定していたプロセスを遂行することができた。次年度における解析対象や公開対象としての材料が整いつつあるが、研究対象はより多い方が新たな知見が得られる可能性があり、公開するデータベースとしても有用であるため、引き続き材料の収集については継続していく。最終年度となる2018年度は、コラーゲン配列の分子生物学的手法を利用した単離と、データベース構築、データ解析・研究の総括を実施する。分子生物学的手法による実験においては、予め設計したプライマーを利用し、入手したサンプルのコラーゲン領域の配列決定をおこなう。入手した生体サンプルからのゲノム抽出、設計したオリゴヌクレオチドの合成、PCRによる対象領域の増幅、primer-walkingによる対象領域の配列決定を実施する。コラーゲン領域の全長(約14kbp)の解読を目標とするが、遺伝子の高次構造や抽出されたゲノム中の色素による酵素反応阻害等のために対象領域の増幅やシーケンシングがうまくいかない可能性がある。その場合オリゴヌクレオチドの再設計を1回程度実施し、期間内に成功しない場合はそこまで解読できた部分配列のみを解析に使用することとする。もし配列解析が成功しない場合は代わりに情報学的な相同領域抽出に専念し、データベースへの機能強化(文献情報の追加等)をおこなうものとする。データベース構築においては、新しく決定した配列や構造について属性情報をまとめ、多様な分野の利用者が自由にアクセスできるオープンデータ環境を提供する。今回同定したコラーゲンコード領域を整理し、リファレンスデータベースへとまとめ公開した。

サンプル保管用倉庫との契約を2017年度より開始する予定だったが、仕様を満たす対象の選定に時間がかかり2018年度からの契約となったため。2018年度より次年度使用額の金額にて倉庫の契約を遂行する。
外生殖器(陰嚢、陰唇、前庭部)形成メカニズムの解析

外生殖器形成メカニズムについて様々な遺伝子改変マウスを用いて解析を行った。その結果、マウス外生殖器形成過程において、ヘッジホッグやWntシグナルを中心とした細胞増殖因子群の寄与が極めて大切であることを明らかにした。外生殖器形成過程における上皮、間葉の作用を調べるために、それぞれの組織でCr組み換え酵素を発現するマウスについて検討を行った。その結果、Shh-CreERマウスは内胚葉性上皮細胞、Gli1-CreERマウスは間葉で特異的なCre活性を示すことがわかった。これらのマウスが発現するCre組み換え酵素はタモキシフェン誘導型であるため、組織特異的な制御に加え、時期特異的な制御も可能となり、外生殖器形成過程を解析する上で有効である。これらのマウスのCre活性を利用して間葉特異的なbeta-cateninのloss-of-function実験を行ったところ、雄の外生殖器の包皮形成が阻害された。一方、beta-cateninのgain-of-function実験では雌の外生殖器の包皮が厚くなり、雄の包皮に近い形態となった。したがって、間葉におけるbeta-cateninを介するWntシグナルが外生殖器の雌雄それぞれの形態形成に極めて大切であるという結果が得られた。また、ヘッジホッグシグナルのエフェクターの一つであるGli2遺伝子のノックアウトマウスは尿道下裂様の表現型を示し、さらに雌よりも雄の方がその表現型が重篤であった。したがってGli2を介した、ヘッジホッグシグナルの正の制御が、外生殖器・会陰部形成に必要であることが明らかとなった。このように本研究では、ヘッジホッグ及びWntシグナルが外生殖器の性的二型に関与することを初めて示した。尿道下裂をはじめとする外生殖器・会陰部の発生異常はヒトでも多いことが知られており、本研究で得られた結果は、そのようなヒト先天性疾患の発生メカニズム解析に大きく寄与するものと考えられる。外生殖器形成メカニズムについてマウスを用いて解析を行った。外生殖器の初期形成過程ではヘッジホッグシグナルを中心とした細胞増殖因子群の寄与が報告されてきた。本研究では後期の外生殖器・会陰部形成に注目し、ヘッジホッグシグナルに関わる因子のノックアウトマウスの解析を行った。その結果、ヘッジホッグシグナルのエフェクターの一つであるGli2遺伝子のノックアウトマウスは尿道下裂様の表現型を示し、さらに雌よりも雄の方がその表現型が重篤であった。しかし他のGli遺伝子、Gli1、Gli3のノックアウトマウスは、外観からは外生殖器・会陰部の異常は顕著ではなかった。Shh-CreERマウス(Shh遺伝子座にタモキシフェン誘導型Cre組み換え酵素をノックインしたマウス)とRosa26レポーターマウス(Creが作用すると永続的にbeta-galactosidaseを発現する)をかけ合わせ、タモキシフェン投与時にShhを発現している細胞を遺伝的に標識し、その系譜解析を行った。Shhは外生殖器の内胚葉性上皮に発現することが知られていた。本研究では内胚葉性上皮が将来の尿道・膀胱・直腸領域のみならず、会陰部の表皮にも寄与することを見出した。

尿道下裂をはじめとする外生殖器・会陰部の発生異常はヒトでも多いことが知られており、本研究で得られた結果は、そのようなヒト先天性疾患の発生メカニズム解析に大きく寄与するものと考えられる。前年度までに、外生殖器形成過程では初期から後期にかけて、一貫してヘッジホッグシグナルを中心とした細胞増殖因子群の寄与が大切であることを明らかにしてきた。特に後期の外生殖器・会陰部形成過程においてさらにそのような細胞増殖因子群について調べるために、ヘッジホッグシグナル系のノックアウトマウスの解析に加え、今年度は重点的にWnt/beta-catenin系のコンディショナルミュータントマウスについて解析を行った。Gli1-CreERマウス(Gli1遺伝子座にタモキシフェン誘導型Cre組み換え酵素をノックインしたマウス)とRosa26レポーターマウス(Creが作用すると永続的にbeta-galactosidaseを発現する)をかけ合わせ、タモキシフェン投与時にGli1を発現している細胞を遺伝的に標識し、その系譜解析を行ったところ、そのような細胞は尿道両側間葉に分布することが明らかとなった。このCre活性を利用し、beta-cateninのloss-of-function実験を行ったところ、雄の外生殖器の包皮形成が阻害された。一方、beta-cateninのgain-of-function実験では雌の外生殖器の包皮が厚くなり、雄の包皮に近い形態となった。したがって、ヘッジホッグシグナル応答細胞におけるbeta-cateninが外生殖器の雌雄それぞれの形態形成に極めて大切であるという結果が得られた。本研究で得られたこの結果は、アンドロゲンシグナルにヘッジホッグ及びWntシグナルが外生殖器の性的二型に関与することを示す初めての報告である。
血中アミノ酸プロファイルのリプログラミングとトランスレーショナルリサーチ

昨年の報告書での「今後の研究の推進方策」において、2018年度は「ob/obマウスをControl餌群、Val欠乏餌群、Pair fed群に分け、Adropin(以下Adpと略)を腹腔内投与し、肝臓、精巣周囲の白色脂肪、褐色脂肪組織の重量、血液の生化学パラメータ、および肝臓での脂質代謝関連遺伝子発現への影響を調べる」ことを掲げた。そこで、その点を重点的に検討した。その結果、予想に反しVal欠乏餌群のAdp投与は、内臓脂肪の減少を引き起こさなかった。一方でPair fed / Adp群およびVal欠乏餌/ Adp群ではSaline群よりも相対的体重が有意に増加した。Pair fed /Adp群およびVal欠乏餌/ Adp群とそれぞれのSaline群の摂食量に有意差は認められなかった。つまり、Pair fed群とVal欠乏餌群では、Adpの投与によって、摂取エネルギー不足による体重の減少が減弱されたと考えられた。摂食量は同じでるにもかかわらず、体重が減少したということは、エネルギー源が体蛋白質から、脂肪へとシフトしたと推測される。また、Pair fed / Adp群において、Pair fed / Saline群と比較して肝臓のPPARγmRNAの発現が有意に減少した。ob/obマウスにおいてPPARγの発現を肝臓特異的にノックダウンすると、肝臓のトリグリセリドが有意に減少することから、肝臓のPPARγが脂質代謝に関与していると考えられた。しかし、その他の脂質代謝関連遺伝子の発現にAdp投与による有意な変化は認められなかった。Adpの受容体や上流または下流の制御因子など、Adpの詳細な作用機序は未だ解明されていないことから、今後、必須アミノ酸欠乏などの特殊な栄養条件下でAdpの作用を検討することで、Adpの新たな生理作用や生理的意義を見出すことができるかもしれない。動物が単一の必須アミノ酸欠如餌を摂食すると、拒食と体重の著しい減少が引き起こされる。しかし、拒食を引き起こす中枢の機序や肝臓でのアミノ酸の恒常性維持機構は未だ解明されていない。そこで本研究では、必須アミノ酸の一つであるバリン(Val)の欠乏餌を給餌したマウスの視床下部および肝臓における遺伝子発現の網羅的な解析を行った。その結果、Val欠乏餌を摂食したマウスにおいて、視床下部のCrym、ItpkaおよびFoxg1 mRNAの発現レベルが有意に低下し、肝臓のEnho mRNA発現レベルが有意に増加することが明らかとなった。これらの遺伝子は、視床下部および肝臓においてVal欠乏への応答に関与していることが示唆された。次に、バリン(Val)欠乏餌の摂食が、肥満モデルマウスob/obの脂質代謝に及ぼす影響について検討した。wild-type (WT)マウスと同様に、ob/obマウスでもVal欠乏餌の摂食によって肝臓重量が有意に減少し、血糖値、血漿コレステロール値が有意に低下した。しかしながら、WTマウスではVal欠乏餌の摂食によって白色脂肪重量が著しく減少したのに対して、ob/obマウスでは、白色脂肪重量に変化が認められなかった。さらに、WTマウスでは、Val欠乏餌の摂食によって、脂質生合成抑制ペプチドであるAdropinをコードするEnho mRNAの肝臓における発現が有意に増加したのに対して、ob/obマウスでは、通常状態でもEnho mRNAの肝臓における発現は著しく低レベルで、Val欠乏餌の摂食による発現の増加も認められなかった。以上の結果から、Val欠乏餌の摂食は、肥満状態および正常状態における脂質代謝を大きく変化させることが明らかとなった。また、AdropinがVal欠乏条件下での脂質代謝の制御にAdropinが関与している可能性が示唆された。申請時に企画した4つの小課題の中の2017年度の2つを着実に行い、多くの知見を得ることができたため。特に、Val欠乏餌を摂食したマウスにおいて、視床下部のCrym、ItpkaおよびFoxg1 mRNAの発現レベルが有意に低下し、肝臓のEnho mRNA発現レベルが有意に増加することが明らかとなったこと、WTマウスでは、Val欠乏餌の摂食によって、脂質生合成抑制ペプチドであるAdropinをコードするEnho mRNAの肝臓における発現が有意に増加したのに対して、ob/obマウスでは、通常状態でもEnho mRNAの肝臓における発現は著しくレベルで、Val欠乏餌の摂食による発現の増加も認められなかったことは非常に興味深いと思われる。

ob/obマウスにおいてPPARγの発現を肝臓特異的にノックダウンすると、肝臓のトリグリセリドが有意に減少することから、肝臓のPPARγが脂質代謝に関与していると考えられた。しかし、その他の脂質代謝関連遺伝子の発現にAdp投与による有意な変化は認められなかった。Adpの受容体や上流または下流の制御因子など、Adpの詳細な作用機序は未だ解明されていないことから、今後、必須アミノ酸欠乏などの特殊な栄養条件下でAdpの作用を検討することで、Adpの新たな生理作用や生理的意義を見出すことができるかもしれない。2017年の研究により、ワイルド(WT)マウスでは、Val欠乏餌の摂食によって、内臓脂肪重量が著しく減少し、同時に肝臓のEnho mRNA発現が有意に増加した。対照的に、ob/obマウスでは、Val欠乏餌を摂食によって、体重が有意に減少するにもかかわらず、内臓脂肪重量に変化が認められなかった。また、ob/obマウスでは、Val欠乏餌の摂食による肝臓のEnho mRNA発現の増加は引き起こされず、WTマウスと比較して低レベルなままであった。Enhoは肝臓と脳に発現しており、分泌ペプチドAdropinをコードする。Adropinの腹腔内投与は、FasやScd1などの脂質生合成に関与する遺伝子の肝臓における発現を抑制する。以上の結果から、WTマウスにおいて、AdropinがVal欠乏餌の摂食による脂質代謝の変化に関与している可能性、さらに、ob/obマウスでは、Enho mRNA発現の上昇が引き起こされないために、Val欠乏餌の摂食による内臓脂肪の減少が起こらない可能性が推測される。もしそうであれば、ob/obマウスでは、Adropin投与により、Val欠乏餌の摂食による内臓脂肪の減少が促進される可能性が考えられる。そこで2018年度では、これらの可能性を検討するために、ob/obマウスにControl餌、Val欠乏餌、Pair fedの各条件で15日間給餌し、給餌6日目から15日目までの10日間、Adropinを0.10nmol/g BW/dayの用量で腹腔内投与し、肝臓、精巣周囲の白色脂肪(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)の重量、血液の生化学パラメータ、および肝臓における脂質代謝関連遺伝子の発現への影響を調べる。
19世紀バラッド詩の模倣と独立(Rossetti, Meredith,Swinburne)

(1)伝承バラッドおよび近代以降のバラッド詩の意義の確率のために、本研究では19世紀のGeorge Meredith、A.C.Swiburne、Dante Gabriel Rossettiが創作したバラッド詩の模倣と逸脱を分析し、19世紀におけるバラッド受容の意味の考察を目的とした。(2)各詩人の作品分析:Rossettiのバラッド詩の特色は様式化の模倣、特にリフレインであるが、'Sister Helen'に代表されるように、伝承バラッドの様式を用いて語り手の感情の高ぶりや自我の葛藤を一層効果的に表現する明らかな技巧であり、自意識とは無縁であったリフレインをセンチメンタルリズムに貢献させる逸脱を示している。他方、晩年の長編バラッド詩では、技巧を超えて、終焉を迎える人間の感慨を託す自然な型として捉えられており、Rossettiにとってのリフレイン技巧の意味は生涯を通して大きく変化した。Swinburneはdramatic & lyrical poetryがnarrative poetryに優ると自ら述べているものの、作品の官能性や異教性が示す中世趣味は、ラファエロ前派のケルトへの興味と、ひいてはバラッドのnarrativeへの興味に関連する可能性を秘めている。更に研究を要す。Meredithのバラッド詩は、時事を風刺し時代の風潮を嘆くものが大半であり、それを素朴なバラッド・スタイルに乗せることによって風刺を強めている。これは当時流行したパロディ・バラッドの精神にも通じる、伝承バラッドの様式とスタイルが持つ批判的精神を19世紀のブロードサイド・バラッドとして受け継いだ、と捉えることができる。(2)バラッド受容の意味:模倣を超えるリフレイン、ケルトへの興味、風刺とパロディがバラッドのスタイルで表現されるのは、19世紀という閉塞した時代とその文学に対する批判を、バラッドの様式を選択することによって、伝承バラッド本来の批判的かつ遊戯的精神に託して伝えようとしたことにあると思われる。以上を論文にまとめる予定である。更に研究を要す。
ACTH産生下垂体腺腫の浸潤性、増殖性と関連するCRNDEの機能の解明

ACTH産生下垂体腺腫(ACTHoma)の中でも浸潤性の高い腫瘍は治療に難渋することが多いがその機序は不明である。我々は、ヒトACTHoma術後検体を用いたトランスクリプトーム解析により浸潤性、増殖性と関連するlncRNAとしてCRNDEを同定し、その機能解析研究モデルとして、ACTHomaオルガノイド株を樹立した。本研究ではレンチウイルスベクターを用いたCRNDE遺伝子導入オルガノイド、CRISPR/Cas9を用いたCRNDEノックアウトオルガノイドを作成し、その浸潤性、増殖性を評価する。またRIP-seq法を用い、CRNDEに結合するRNAを網羅的に解析し、その分子機序を明らかにする。
InAlGaN混晶の相分離現象の解明と格子整合系窒化物量子構造実現の研究

InAlGaN窒化物半導体混晶の相分離現象の解明とその制御を目指して、GaNエピタキシャル成長基板上にGaNに格子整合するIn組成付近のInAlN混晶および、InAlGaN混晶を成長させ、成長条件を変化させてその組成の揺らぎをX線回折により、バンドギャップの組成依存性を光透過・吸収測定および光伝導度測定により調べた。この結果、以下のことが明らかとなった。1)InAlN層中へのInの取り込みは、In組成の低い領域ではほぼ100%であるが、In組成が0.2を越えると飽和傾向を示す。2)XRD測定からは、In組成の増大に伴い組成揺らぎが増大する。格子不整合するIn組成(x=0.17)では、比較的結晶性が良好で組成の均一性が高い。3)InAlN混晶の光伝導度測定を用いて測定した禁制帯幅は、In組成が0.10.23の範囲では、GaNより大きく、GaNより小さいとする従来の報告例と大きく異なることが分かった。4)カソードルミネッセンス測定より、本研究で作製したInAlN混晶層は、大きく分けて2つの組成をもつ領域が存在していることが分かった。以上の結果を踏まえて、本研究をさらに発展させ、超格子構造、あるいは多重量子井戸構造の採用による相分離抑制と、格子整合系量子構造の実現を目指していく。AlGaInNの成長を行い、成長層中の組成不均一の成長条件依存性、さらには、成長後の熱処理条件依存性を系統的に調べることにより、成長反応に起因する相分離現象と成長後の熱履歴に基づく相分離現象それぞれについての検討を行い、相分離および組成不均一性抑制のための基礎的な知見}を得ることを目的とした。本年度は、以下の様な成果を得た。1)既存の設備にAl原料系、有機ヒドラジン系およびNH_3系を追加し、装置の試運転とそれぞれの原料を用いた場合の基礎的な成長条件の把握を行った。これにより、サファイア基板上へのGaNエピウエハの作製が可能となり、同一条件の基板上へ、リモートプラズマ励起窒素、有機ヒドラジン、およびNH_3という3種類の窒素源を用いたAlGaInN混晶の成長が可能となった。2)実際に、AlInGaN混晶の成長を行い、その成長条件の把握を行った。3)組成不均一構造の評価解析を行うため、顕微式の光反射・透過特性測定系を本年度購入した光ファイバー分光計測システムを用いて立ち上げた。これにより、空間分解能数μmの精度で、光反射・透過特性を評価することが可能となった。今後は、これらの成果を踏まえて、種々の条件下で、種々の原料を用いて混晶の成長を行い、その組成不均一構造の評価を行い、組成不均一性の改善の方策について検討を進める予定である。AlGaInNの成長を行い、成長層中の組成不均一の成長条件依存性、さらには、成長後の熱処理条件依存性を系統的に調べることにより、成長反応に起因する相分離現象と成長後の熱履歴に基づく相分離現象それぞれについての検討を行い、相分離および組成不均一性抑制のための基礎的な知見を得ることを目的とした。本年度は、昨年度までに改造を終えた有機金属気相エピタキシャル成長装置を用いて、GaN/Al_2O_3エピ基板上にNH_3を窒素原料としてAlInNおよびAlGaInNの成長を行い、その結晶性、組成の揺らぎ、光学特性の成長条件依存性を調べた。その結果、1)AlInNの成長において、成長温度の増加に伴いInの取り込み効率が低下する。2)結晶中のIn組成が増加するにつれてInの組成揺らぎが大きくなる。3)成長温度700°C、常圧で成長したIn組成10%から30%のAlInNの吸収端は、従来の報告値と異なりGaNの吸収端より短波長であった。4)ジメチルヒドラジンを用いて成長を試みたが、アダクト生成反応が激しく混晶層を得ることが出来なかった。今後は、組成不均一の激しい試料で特有の表面モフォロジーと組成あるいは光学特性の分布の対応関係について検討を進める。

また、従来報告と異なった吸収端が得られた原因について解析を進め、組成不均一性の改善の方策について検討を進める予定である。InAlGaN窒化物半導体混晶の相分離現象の解明とその制御を目指して、GaNエピタキシャル成長基板上にGaNに格子整合するIn組成付近のInAlN混晶および、InAlGaN混晶を成長させ、成長条件を変化させてその組成の揺らぎをX線回折により、バンドギャップの組成依存性を光透過・吸収測定および光伝導度測定により調べた。この結果、以下のことが明らかとなった。1)GaNと比較的格子不整合度の小さなInAlNでは、その成長条件により吸収端が大きく変動する。2)XRD測定からは、In組成の増大に伴い組成揺らぎが増大する。格子不整合するIn組成(x=0.17)では、比較的結晶性が良好で組成の均一性が高い。3)InAlN混晶の光伝導度測定を用いて測定した禁制帯幅は、In組成が0.10.23の範囲では、GaNより大きく、GaNより小さいとする従来の報告例と大きく異なることが分かった。4)カソードルミネッセンス測定より、本研究で作製したInAN混晶層は、大きく分けて2つの組成をもつ領域が存在していることが分かった。
若年者の身体活動が骨密度に及ぼす影響

将来の骨折予防のため、若年時最大骨量の増加が重要であるといわれている。今回、背景要因の明確な職域集団を対象に、若年者の身体活動度と骨密度の関連を3年間で評価した。平成8年度に定義した2039歳の男性160人について、平成9年度には骨密度(日立メディコ製BMD-1X)値と飲酒、喫煙、牛乳摂取との関連を観察した。飲酒では毎日飲酒者の骨密度が有意に低く、喫煙者と牛乳をあまり飲まなかった者でも低かった。平成10年度には骨密度と身体活動度(握力、最大酸素摂取量、肺活量、体脂肪率)との関連を解析した。20歳代では骨密度は1.056±0.112(平均±標準偏差,g/cm^2)、左右握力の平均50.2±8.3(kg)、最大酸素摂取量39.3±5.3(ml/kg/分)、肺活量4382.7±557.9(ml)、体脂肪率19.2±4.3(%)であり、30歳代では順に、1.043±0.135(g/cm^2)、49.3±6.3(kg)、37.2±5.7(ml/kg/分)、4233.8±540.9(ml)、21.7±4.9(%)であった。年齢を調整した項目相互の偏相関をみると、骨密度は身長(相関係数0.29,p<0.001)、体重(0.22,p<0.01)、握力(0.24,p<0.01)、と正の相関を示した。身体能力のよい指標である最大酸素摂取量とは、有意ではないが負の相関(-0.08)であった。またbody mass index,BMIと骨密度の関連は有意でなく、BMIと最大酸素摂取量とは-0.45(p<0.001)と、肥満度の高い者ほど最大酸素摂取量が少ない傾向がみられた。我々は、地域コホート3,048人の8年間の追跡から、心疾患死亡ではBMI26以上でハザード比2.09(95%CI0.60-7.29)と死亡危険の上昇を、また1日歩行30分以内の者で総死亡の危険が1.70(1.25-2.31)、脳血管疾患死亡が3.35(1.13-9.94)と身体活動度の高いことが生命予後に有利であることを観察している。従って、骨密度の改善にも、生命予後の改善にも、若年期から身体活動度を高めることが有用であると考えられる。高齢者の骨折予防の二次予防対策として早期発見、早期治療のための骨密度検診が実施されるようになった。一次予防対策としては若年者の最大骨量を増加させることが、重要な課題となっている。

若年者に関しては20歳代でピークに達した骨密度は40歳頃まで同じレベルで維持されるといわれている。しかしこれらの成績は、いずれも断面調査のもので、追跡集団を設定し、縦断的に骨密度の変化を観察した研究は極めて少ない。申請者らは、骨密度が生活習慣や身体活動の影響をどの程度受けるのかを検討するために、職域集団の若年者を対象に骨密度検査と生活習慣、身体活動調査を検査計画した。本年度はそのベースライン調査として生活習慣と骨密度調査成績の結果が得られた。対象は2049歳の男性582人(20歳代59人、30歳代101人、40歳代422人)である。生活習慣調査はBreslowらのAlamed sevenに示された項目(睡眠、運動、飲酒、喫煙、規則的な生活習慣、間食、肥満、)を含み120項目に及ぶ。生活習慣について年代別に観察すると、飲酒習慣ありの率は20歳代39.3%、30歳代66.3%、40歳代68.1%と30歳代を越えると飲酒習慣の率が増加する。喫煙習慣ありの率は20歳代66.1%、30歳代53.7%、40歳代66.5%と40歳代が最も高い。骨密度は日立メデコ社製DXA装置BMDI-Xを用いて測定した。骨量(g/cm^2)の各年代別の平均値と標準偏差は20歳代1.05±0.11、30歳代1.04±0.14、40歳代1.02±0.14と年齢とともにやや減少傾向にあった。今後はエルゴメーターによる客観的な指標を用いて、身体活動度と骨密度の変化について検討する予定がある。高齢化が進行する中、将来の骨折予防のために若年時の最大骨量を増加させることが重要であるといわれている。生活習慣と骨密度の関連をみると、カルシウム摂取不足、喫煙、日光への曝露不足などが低骨密度の要因となり、身体活動度の高いことは高骨密度をもたらすと考えられている。しかしわが国では、対象を明確に定義して若年者の生活習慣と骨密度の関連を評価した研究は少ない。そこで今回は、平成8年度に定義した2049歳の男性575人(20歳代59人、30歳代101人、40歳代415人)を対象に、生活習慣要因と骨密度測定値(日立メディコ製BMD-1XによるDXA法で測定)をレコード・リンケージして解析した。年齢を調整した骨密度平均値±標準誤差(g/cm^2)は、20歳までの牛乳飲用では、あまり飲まなかった者185人で1.014±0.010、時々飲んだ者283人で1.029±0.008、毎日飲んだ者74人で1.036±0.016と、摂取頻度の高いほど骨密度も高い傾向があった(有意差なし)。現在の喫煙では、非喫煙者197人で1.038±0.010、喫煙者354人で1.018±0.007と、喫煙者の骨密度が低かった(有意差なし)。現在の飲酒では、非飲酒者92人で1.056±0.014、たまに飲酒する者101人で1.017±0.014、日常飲酒者356人で1.019±0.007と、飲酒者の骨密度が低かった(他2群に対して非飲酒者が有意に高い)。このことから、過去の牛乳摂取や喫煙は年齢(加齢)に比べて骨密度への影響は小さく、飲酒の影響は大きい可能性があることが示唆された。今後は身体活動を客観的に評価し、身体活動度別に骨密度値を解析する予定である。将来の骨折予防のため、若年時最大骨量の増加が重要であるといわれている。今回職域集団を対象に、若年者の身体活動度と骨密度の関連を評価した。平成8年度に定義した2039歳の男性160人について、骨密度(日立メディコ製BMD-1X)値と身体活動度の指標として握力、最大酸素摂取量、肺活量、体脂肪率との関連をレコード・リンケージにより解析した。20歳代では骨密度は1.056±0.112(平均±標準偏差,g/cm^2)、左右握力の平均50.2±8.3(kg)、最大酸素摂取量39.3±5.3(ml/kg/分)、肺活量4382.7±557.9(ml)、体脂肪率19.2±4.3(%)であり、30歳代では順に、1.043±0.135(g/cm^2)、49.3±6.3(kg)、37.2±5.7(ml/kg/分)、4233.8±540.9(ml)、21.7±4.9(%)であった。年齢を調整した項目相互の偏相関をみると、骨密度は身長(相関係数0.29,p<0.001)、体重(0.22,p<0.01)、握力(0.24,p<0.01)、と正の相関を示した。
転写因子Bach2による造血幹細胞の分化運命制御

全ての血球は、骨髄中の造血幹細胞から多能性前駆細胞(MPPs)を経て分化する。MPPsでは、リンパ球、ミエロイド系(マクロファージ、単球)細胞などの成熟血球特異的な遺伝子は十分に発現しておらず、遺伝子の発現を調節する転写因子の働きにより、分化が制御される。本研究では、ミエロイド遺伝子抑制転写因子であるBach2が、定常状態及び炎症状態下のMPPsで、ミエロイド遺伝子誘導転写因子であるC/EBPファミリーと拮抗し、リンパ球の分化を促進することを明らかにした。造血幹細胞及び多能性分化細胞では、生体の生存に最適な種類の血液細胞を抹消に供給するため、常に血球系列の分化バランスが取られている。本研究では、リンパ球前駆細胞(CLPs)でミエロイド遺伝子を抑制し、B細胞分化を促進する転写因子Bach2が、CLPsより未熟でミエロイド分化能が高い幹細胞や多能性前駆細胞(多能性細胞)で、血球の系列分化を制御している可能性を探索した。その結果、Bach2は、Cebpb、Irf8、Csf1r及びCebpaなどのミエロイド系の遺伝子の発現抑制と、Foxo1、Gata3、Irf4などのリンパ球系の遺伝子の発現促進を直接制御することで、多能性細胞からのCLPsへの分化を促進していることが分かった。さらに、Bach2の遺伝子発現は、ミエロイド系前駆細胞で多能性細胞に対して低く、多能性細胞集団をグラム陰性菌感染を模倣するリポ多糖(LPS)でミエロイドへの分化刺激を行うと減弱することが分かった。この二つの結果は、Bach2の遺伝子発現がミエロイド分化時に抑制されることを示唆する。我々は、ウイルスベクターによる遺伝子発現実験とデーターベースの解析により、ミエロイド分化を強力に促進する転写因子C/EBPβとC/EBPαがBach2の遺伝子発現を抑制することを見出した。さらに、Bach2もC/EBPβとC/EBPαの遺伝子発現を抑制することを明らかにしたことから、Bach2とC/EBPファミリーは、多能性細胞において拮抗し、リンパ球とミエロイドの分化バランスを調節していることが分かった。当初Bach2の発現は幹細胞で低く、リンパ球前駆細胞分化に伴って上昇すると予測していたが、single cell PCRやレポーターマウスを使った遺伝子発現解析の結果、幹細胞でもBach2の発現が見られた。しかし、ミエロイド系前駆細胞やLPS刺激でBach2の発現が抑えられるという発見から発想を転換したことで、Bach2の上流の転写因子とリンパ球、ミエロイド系列分化の遺伝子ネットワークの拮抗に迫ることができた。研究をまとめて論文を投稿する段階に入ったことから、当初の計画以上に進んでいると考えられる。前年度は、Bach2が幹細胞、多能性前駆細胞(HSPCs)において複数のミエロイド遺伝子を抑制すること、及び、Foxo1などのリンパ球系の遺伝子を促進することを見出していた。Foxo1がHSPCsでB細胞分化を促進するか検証するため、Foxo1遺伝子をHSPCsに発現させた。この系では、Bach2遺伝子を発現させたHSPCsは、B220陽性、CD19陰性のB細胞の前駆細胞に分化する。しかし、Foxo1を発現したHSPCはB220陽性細胞へ分化しなかった。このことから、Bach2は、Foxo1の発現を促進するが、Foxo1自体はHSPCsからCLPsの分化に関わらない可能性が考えられた。一方で、ChIP-Seqで結合が見られていた、Bach2のFoxo1遺伝子座のエンハンサー領域への結合をChIP-PCRで確認したところ、結合が確認されたため、Bach2は直接標的遺伝子としてFoxo1の発現を制御していると考えられた。多能性細胞におけるBach2の基本的な役割は理解したので、成果をまとめて論文発表を目指す。査読者のコメントに応じて、随時追加実験を行う。免疫学
情報教育担当者養成のための教師教育カリキュラムと能力評価試験の開発

次期学習指導要領の施行を前提として、「(1)高等学校普通教科『情報』の担当教員養成カリキュラム」と、「(2)既存各教科における情報教育実施のための教師教育カリキュラム」とを開発し、さらに、実施用の教材や訓練・支援システムも開発して、実践、評価した。「(1)普通教科「情報」の教員養成」については、養成すべき教員の数を予測し、その供給方法について検討した。実際の供給は、文部省が企画する現職教員等講習会(平成12年度から)と、大学の教職課程における教員養成(平成13年度から)とで行われることになった。そこで、現職教員等講習会については、現場の教員を対象に、望ましい実施方法・内容を調査した。その結果、情報科教育法を重視する必要があること、教科の指導法を専門知織の獲得と関連づけ、模擬授業体験を取り入れた指導を行うことが望ましいこと、15日間の研修のみでは不十分であるという意識が強いことを明らかにし、大学との連携が求められていることを示した。一方、大学で実施すべき「情報科教育法」については、2年間試行した結果をふまえ、望ましいカリキュラムを提案した。また、そこで使用するテキストや、実習に必要な訓練・支援システムの開発を行った。これらの成果は、文部省の現職教員等講習会の企画にも活かした。また、現職教員等講習会後の自己研修機会を提供する観点から、遠隔教育手段を用いた大学授業との連携についても、試行を行った。既存各教科における情報教育実施については、実施のための基本的な授業モデルを構成し、その授業を設計するための手法を提案した。それを大学の授業や現職教員研修で試行したところ、手法を習得させるには、教員の意識改革を図る必要があることが明らかになり、そのための働きかけを系統的に行う訓練カリキュラムを開発し、試行した。さらに、その働きかけを強化するための授業設計訓練システム等も開発し、評価した。本研究は、次期学習指導要領において、独立教科としての「情報」を担当できる教員の育成と、各既存教科や「総合的な学習の時間」で情報教育の指導をできる教員の育成との両面について、その具体的な教師教育の内容と方法とを開発することを目的としている。これ等を達成するために、(1):当面する20年程度の範囲に限定して、情報教育実施のために、教師が身につけて置くべき資質(学習目標)のリストを、小・中・高校などの学校段階別や、一般教師と「情報」科担当者別にモジュール構造で作成すること、(2):上記各学習目標を達成するための教師教育カリキュラムの具体例と、教師教育テキストを試作すること、(3):(1)で検討した教師の資質の目標達成度を評価するために、評価方法や課題、さらには、その資格等を社会的に制度化することについて検討すること、(4):教員養成・研修を充実させるために、いくつかの大学の教師課程や研修会で、具体的カリキュラムの評価や、遠隔教育手段を利用した指導方法等の実践評価を行う、などを計画した。このうち、平成9年度は、(1)(4)全てにわたる基礎として、まず、高等学校「情報」科のカリキュラム内容や指導方法の検討を行い、それに基づいて教師に求められる資質の検討や、授業設計・実施能力育成のための研修方法の検討と実践を行った。特に、研修方法においては、コンピュータや将来的にはネットワークを用いた訓練方法へと発展させることを念頭に、研修ゲームの開発と評価を行った。また、既存教科については、研修カリキュラムの大枠を検討し、「情報教育の基本的考え方」「遠隔手段を活用したディベート」「情報教育の授業設計方法」「模擬授業」「情報の科学的理解の内容」「情報教育における学習評価」を柱としたカリキュラムを構成し、具体的に遠隔教育手段の活用を含めた実践を行った。

また、より具体的な授業設計方法の指導を検討し、将来的にコンピュータやネットワークを活用した訓練方法へと発展させることを念頭に、特に、数学と理科を題材に、既存教科における情報教育の授業設計法を開発し、それを教職課程の授業で実践評価して、授業設計訓練システムの設計指針を得た。本研究は、次期学習指導要領で新設される情報科の教員養成と、既存教科や「総合的な学習の時間」で情報教育の指導をできる教員の育成との両面について、その具体的な教師教育の内容と方法とを開発することを目的としている。これ等を達成するために、本年度は特に以下のことを行った。まず、情報科の教員養成・研修カリキュラムを開発することを念頭に、具体的に教職課程の授業で、「情報科教育法」に相当する授業を実施した。カリキュラムは、基本的に、講義と演習とをそれぞれ1単位分、計2単位の授業として開講することを想定し、情報科のカリキュラム(教育の目標、内容、方法)の概要を説明した後、具体的に、授業設計、教材開発、模擬授業などを通して、指導能力を開発しようとするものであった。試行授業の結果、高校で実際に利用できる具体的な教科書を用意することが必要であること、情報科の授業や教材の特徴を認識させるための訓練システムを提供することが必要であることなどが明確になった。また、その結果を受けて、具体的に教科書の開発や、情報科用の「授業設計訓練システム」「研修ゲーム」を試作した。既存教科における情報教育実施のための教育研修方法については、これまで実施してきたカリキュラムを評価・改善し、既存教科において情報教育を実施することの必要性・効果をより強調するとともに、具体的にどのように授業設計したら良いかを明確に示すことが重要であることを明らかにした。また、そのような観点から従来の指導法を改善したカリキュラムを再構成した。また、開発したカリキュラムに沿った指導をより効果的に行うために、数学と理科を題材とした授業設計訓練システムを情報教育向けに拡張し、教職課程の授業で実際に利用して評価した。次期学習指導要領の施行を前提として、情報教育を担当できる教員の養成カリキュラムと指導方法を検討した。ここで、情報教育担当者には、高等学校普通教科「情報」を担当する教員と、既存教科や「総合的な学習の時間」で情報教育の指導を行う教員の2種類が考えられる。この目的を達成するために、本年度は以下のことを行った。情報科の教員養成については、文部省が実施する現職教員等研修のカリキュラムについて、現職教員を対象に、望ましい実施方法・内容を調査した。その結果、「情報」の教員養成では、情報科教育法を重視する必要があること、その際、教科の指導法を専門知識の獲得と関連づけ、模擬授業体験を取り入れた指導を行うことが望ましいことを明らかにした。この結果と、昨年度試行した「情報科教育法」の結果をふまえ、「情報科教育法」のカリキュラムを開発し、大学の教職課程や現職教員研修等で試行した。その結果、模擬授業体験が特に有効であり、普通教科「情報」のイメージ理解に役立つことが分かった。また、この体験をふまえて教材開発手法を学ぶことで、授業設計や教材開発に対する自信がつくことが分かった。この成果は、文部省の現職教員等研修用テキストに活かした。
HMGーCoA還元酵素阻害剤コンパクチンの合成

初年度においては,ジヒドロコンパクチンが持つ5つの不斉中心のうち9,11a,15,15a位の4箇所を整え,10ー11位間の二重結合をShapiro法によって導入した.最終年度では,初年度の結果にもとずき合成を進め,(+)ージヒドロコンパクチンの新しい合成法を確立した.アセチルシクロヘキセンとクロトン酸メチルとの二重マイケル反応を鍵反応として,デカリン部の基本骨格を構築した.この反応は立体選択的に進行した.10ー11位間の二重結合は新たにxanthateの熱分解法を用いた所,再現性よく導入する事ができた.残ったデカリン部8位の立体化学は,8位をホルミル基に変え塩基により安定系のエカトリアルへと異性化させ整えた.この8位のホルミル基からHornerーEmmons反応により炭素鎖を延ばし,数工程を経て光学分割により光学活性体を得た.生理活性を司っているラクトン部の構築は,TiCl_4存在下にアセト酢酸エステル等価体のアルド-ル反応を鍵反応として行われた.この反応には,遠隔不斉制御が認められた.反応後,syn選択的に還元によりセコ酸の立体化学を整え,最後にラクトン化して(+)ージヒドロコンパクチンの全合成を完了した.また,光学活性なアセチルシクロヘキセンの合成法,コンパクチンの持つジエン部の導入法を確立する事ができた.その結果,より一般性のある合成経路を開発することができ,コンパクチン類の合成という所期の目的を達成する事ができた.初年度においては,ジヒドロコンパクチンが持つ5つの不斉中心のうち9,11a,15,15a位の4箇所を整え,10ー11位間の二重結合をShapiro法によって導入した.最終年度では,初年度の結果にもとずき合成を進め,(+)ージヒドロコンパクチンの新しい合成法を確立した.アセチルシクロヘキセンとクロトン酸メチルとの二重マイケル反応を鍵反応として,デカリン部の基本骨格を構築した.この反応は立体選択的に進行した.10ー11位間の二重結合は新たにxanthateの熱分解法を用いた所,再現性よく導入する事ができた.残ったデカリン部8位の立体化学は,8位をホルミル基に変え塩基により安定系のエカトリアルへと異性化させ整えた.この8位のホルミル基からHornerーEmmons反応により炭素鎖を延ばし,数工程を経て光学分割により光学活性体を得た.生理活性を司っているラクトン部の構築は,TiCl_4存在下にアセト酢酸エステル等価体のアルド-ル反応を鍵反応として行われた.この反応には,遠隔不斉制御が認められた.反応後,syn選択的に還元によりセコ酸の立体化学を整え,最後にラクトン化して(+)ージヒドロコンパクチンの全合成を完了した.また,光学活性なアセチルシクロヘキセンの合成法,コンパクチンの持つジエン部の導入法を確立する事ができた.その結果,より一般性のある合成経路を開発することができ,コンパクチン類の合成という所期の目的を達成する事ができた.コンパクチン1の全合成をデカリン部とラクトン部との2つの部分に分けて考えた。今年度は、コンパクチン1及びジヒドロコンパクチン合成の共通中間体であるアルデヒド6の合成を成し遂げる事ができた。1)基本デカリン骨格の合成と2位、4a位,8a位の立体化学の制御:4ーTBDMSOー1ーアセチルシクロヘキセンのキネティックエノラ-トとクロトン酸メチルは、HMPA存在下に連続した2段階のマイケル反応を行い、シスーステロイド型デカロンを与えた。この化合物は、塩基処理により核間が安定型のトランス型デカロン2へと異性化した。この段階でコンパクチン類の2位,4a位,8a位の立体化学が整った。2)3、4位二重結合の導入と8位の立体化学の制御:二重結合の導入に関しては、反応の再現性、操作性の2点で、キサンテ-ト熱分解法が良い事がわかった。即ち、化合物2の4位のカルボニル基を還元するとアキシャルアルコ-ルが選択的に得られ、これをキサンテ-ト3とした。4位にアキシャル置換基が存在する時、化合物4の8位のカルボニル基の還元は、コンパクチンと同じ配置を持つアキシャルアルコ-ルを選択的に与え、更に溶容易にラクトン環を巻いた。ここで熱分解により3、4位に二重結合を導入し5とした。3)1位の立体化学の制御:計画段階で容易に異性化すると予想されていた1位のアキシャルのエステル基は、様々な試みにもかかわらず、エカトリアルへと異性化させる事が出来なかった。そこで、エステル基をより異性化し易いホルミル基に変換し、更に、8位のアキシャルアルコ-ルの立体反発を利用する事とした。ラクトン5より還元、保護、脱保護、酸化によりアルデヒド体とした。この化合物を塩基で処理すると、ホルミル基がエカトリアルへと異性化し目的とするアルデヒド6が得られた。虚血性心疾患の原因である高コレステロ-ル血症を治療,予防するためには,コレステロ-ル生合成の律速酵素であるHMGーCoA還元酵素を阻害することが本質的であり,これらの阻害剤の研究開発が活発に行われてきた.この中で,コンパクチンを筆頭とするメビノイド類はすでに臨床にも用いられ,生理学的にも合成化学的にも注目を浴びている化合物群である.

本研究の目的はこれらメビノイドの新しい合成法を創出する事にあった.メビノイドは構造上2つの部分,ヒドロナフタレン部とラクトン部とに分けられる.合成は,ヒドロナフタレン部を構築後,ラクトン部を結びつけるという経路を取った.ヒドロナフタレン部の合成には,二重マイケル反応を,ラクトン部の合成にはアセト作酸エステル等価体とのアルド-ル反応を,鍵反応として用いた.アセチルシクロヘキセンとクロトン酸メチルとの反応により2つの不斉点が制御され,かつ必要な官能基を備えたナフタレン誘導体を合成する事ができた.これらの官能基を手掛かりにナフタレン部の酸化度を整え,また異性化,反転により残る3つの立体化学を整えた.光学分割の後,得られたナフタレン部とアセト酸酵エステル等価体とのアル反応は望む立体配置の付加体を優先的に与えた.最後にsyn選択的な還元反応によりラクトン部の立体化学を整え,(+)ージヒドロコンパクチンの合成を完了した.また,ナフタレン部へ新たな二重結合を導入する事により(+)ーコンパクチン合成の可能性を示した.この様にして所期の目的を達する事ができた.
リン脂質代謝系を組み込んだ人工細胞の構築

本研究の目的は、細胞膜を構成する主要なリン脂質の、最小合成経路をリデザインし、無細胞系をベースとした再構築を試みることである。リン脂質の生合成反応は網目状のネットワーク構造を形成しており、多くの酵素が関わる複雑な生体システムである。これまでにArchaeaの脂質生合成経路を大腸菌などの生物種で部分的に再構築した例は2、3あるが、In vitroで再構築した例は無く、また統合的な解析を行うための技術基盤も確立されていない。そこでリン脂質合成に関わる最小限の酵素8種を選別し無細胞系により合成することで、リン脂質合成代謝系をボトムアップ的に再構築する。これにより、リン脂質代謝をモデルとした膜タンパク質分子間ネットワークを無細胞内再構築することを目的とする。合成する酵素は膜局在タンパク質であるため、その局在場所としてNanoDisc(脂質二重膜をディスク状に束ねたもの)やリポソームを無細胞系に投入した。本研究計画において、plsB、plsC、cdsA、pssA、psd、pgsA、pgpA、cls遺伝子の無細胞発現を確認し、またそれら合成産物の約80%以上がNanodis膜への自発的挿入していることを確認した。plsBとplsCについては以前からアシルトランスフェラーザ活性の検出に成功していたが、今回さらにcdsAについてその活性の一端を検出する結果が得られている。また関連技術として、巨大膜小胞(GUV)内においてモデル膜タンパク質である、アルファヘモリジンとバクテリオロドプシン(それぞれGFPフージョンプロテインとして)を合成させたところ、効率的なGUV内合成と、GUV膜挿入を顕微鏡下で観察することができた。本研究で得られた成果は、これまでに理想的な手段がなかった、脂質膜環境中でどのような分子ダイナミクスが行なわれているかを詳細に解析する、試験管内技術の創造に資するものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。再構築型無細胞タンパク質合成系(PURE system)を基盤技術として、リン脂質から調製したリポソームまたは、Nanodiscを反応系内に投入し、リン脂質合成に関わる膜タンパク質の合成を行った。その結果、plsBとpssAを除く6種のタンパク質に関しては、Co-translationalな膜挿入が確認され、80%以上の合成産物が可溶性画分に得られた。pssAとplsBに関しては、膜局在のためのヘルパー因子が必要であると考えられるため、これについても研究を進めている。また、GUV内タンパク質合成について、inner leafletのみに電荷を持った脂質を配位したGUV内でGFPを合成することに成功している。負に帯電したリン脂質は膜タンパク質の活性化に必須であるケースが多い。そのため、今後はアシンメトリックなGUV内での膜タンパク質酵素の合成を試みる。計画班の陶山グループと共同して、GUV内タンパク質合成を外環境から操作できる無細胞技術の開発を行った。現在この技術をトグルスイッチ実験と組み合わせて研究を進めている。また同じく計画班の柘植グループと共同して、大腸菌ゲノム配列由来の解糖系遺伝子ついてPURE systemによる合成を行った。その結果、ポリシストロニックに並んだ遺伝子10種の内、メジャーバンドとして5種確認できた。nativeのnontranslational配列から合成が確認できたケースは初めてである。2014年にAngew. Chem.に筆頭著者として1報、2015年にNature Protocolsから筆頭著者兼corresponding authorとして1報論がアクセプトされた。また、2015年に2月にアメリカ・ハーバードメディカルスクールのJack Szostak研究室と共同してworkshopを行い、本研究の成果について発表した。