hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連携方式を導入した空き家活用型移住支援システムの評価とモデル構築

本研究は、関連機関と連携した発展型の空き家活用システムの組織体制と事業内容の特徴を解明した。都市部では、不動産業者や建築士会等の多様な機関と連携し、各々の専門性を活かすことにより建築専門業務を補完し且つ自治体の業務負担を軽減する方式の有効性が示された。不動産業者が地域内に存在しない農村部では、自治組織等の地縁を活用した空き家情報収集と地元工務店と連携した改修支援を導入した方式が望ましい。平成24年度は、平成23年度に実施した中四国・九州地方において空き家活用事業を実施する166自治体を対象としたアンケート調査結果を用い、(1)自治体のシステムを、専門家等の関連機関との連携の有無と事業内容を指標に細類型化した上で、カイ二乗検定を用いてシステムと事業内容の関連を明らかにすること、(2)専門機関と連携した自治体の組織体制とシステムの有効性の検証を行うことを目的とした。調査方法は、専門機関との連携が特徴的且つ実績が多い5自治体(山口県萩市、島根県飯南町・江津市・邑南町、広島県世羅町)を対象とした聞き取りで、調査期間は2011年9月2013年3月である。その結果、従来の空き家の情報収集・提供のみを行う方式を「情報提供」タイプ(3例・2.5%)とし、登録制度を導入した方式が「登録制度」タイプ(53例・43.8%)、登録制度と専門機関連携を導入した方式のうち、契約又は現地調査時の連携を「契約or現地調査連携」タイプ(45例・37.1%)、空き家募集時の連携を「募集連携」タイプ(6例・5.0%)、改修支援に関する連携を「改修連携」タイプ(6例・5.0%)、契約及び改修支援に関する連携がある場合を「契約+改修連携」タイプ(8例・6.6%)に類型化した。従来型の「情報提供」タイプは少数で、「登録制度」タイプは約4割の自治体が採用しており基本的なタイプと言えるが、契約・改修支援の実施率が低い。次に多い「契約or現地調査連携」タイプが契約時に専門機関の紹介・仲介が行われており、「登録制度」タイプからの展開システムとして位置づけられる。さらに「契約+改修連携」タイプは、契約と改修に関する支援が講じられており、現状では最も発展的なシステムとして位置付けられ、建築士会と連携し改修シミュレーションを実施する自治体も見出された。平成23年度は、中国・四国・九州地方436自治体を対象に空き家情報提供に関するアンケート調査を行い、事業の実施状況と内容を整理した上で、登録制度導入及び専門機関との連携の有無によりシステムの類型化を行い、比較分析により既存システムからの展開内容を抽出した。調査方法は、空き家情報提供事業実施が確認された166自治体を対象とした、事業内容に関するアンケート調査である。回収率は137/166(82.5%)、有効回答率は100%で、調査期間は2011年7月12月である。本研究では回答の得られた137自治体のうち、自治体が運営主体である131自治体(95.6%)を分析対象とした。その結果、1)2006年以降の平成の大合併を契機に事業を開始した自治体が半数を占め、中国地方の実施率が7割と高い。2)システムは登録制度及び専門機関連携の有無により4タイプに分類され、農村部では不動産業が未発達である背景から「登録制度」タイプが多く、人口規模が大きい程専門機関と連携する傾向が見られる。3)事業実施期間が5年以上且つ専門機関との連携によるシステム展開は、空き家登録数及び成約数の増加に一定の効果が得られていることが明らかになった。今後の課題として、自治体の業務負担を軽減する上でも、調査や契約、改修に関する建築専門業務は専門機関に委託して自治体の業務負担を軽減しつつ、行政の信頼性の高さを活かし、窓口と総合的なコーディネートは自治体が担うといった役割分担が有効であると言える。本研究目的のうち、平成23年度は、従来の情報提供型の事業方式から、「登録制度」や「専門機関連携」の導入による発展型の事業方式を見出し、既存の事業方式との相違点・展開内容を整理した上で、組織体制と事業内容の特徴を解明する目的は達成できた。一方、自治体の典型事例調査は45例程度を予定していたものの、本年は1例のみの実施となった。発展型空き家活用システムは下記3タイプに分類されるため、これら3タイプの先進事例を抽出し、自治体及び空き家活用住宅入居者への聞き取り調査よりシステムの有効性の検証を行い、その成果をもとにシステムモデルの構築を行う。1)登録制度を導入した発展型空き家活用システムの事例分析:山口県阿武町及び島根県飯南町を研究対象とする。農村地域の自治体においては、不動産業者が存在しない場合もあり専門機関との連携が難しいが、この2町は自治会や農家等の地域住民団体と連携し定住支援事業に取り組んでいる。よって自治体及び地域住民団体に対する聞き取り調査を実施し、連携内容と空き家活用との相乗効果を検証する。

2)建築専門機関と連携し契約・改修支援を導入した発展型システムの事例分析:山口県萩市を研究対象とする。萩市では改修シミュレーション業務が建築士会に委託されている点に特色を持つ。よって空き家活用住宅入居者に対する聞き取り調査を実施し、建築専門家との関わり方、改修内容・コスト決定要因分析を行うとともに、住み方調査により不動産業者及び建築士が介入した場合の契約・改修内容の特徴を明らかにする。また不動産業者・建築士に対する聞き取りを行い、役割分担と連絡体制を整理にする。3)関連機関と連携し移住支援を導入した発展型システムの事例分析:島根県江津市及び鳥取県鳥取市を研究対象とする。両市は建築専門機関との連携に加え、空き家改修助成制度が導入されており、さらに自治会・NPO法人・大学・県等と積極的に連携し、各団体の専門技術や経験を活かした多様な移住支援メニューが用意されている点が特徴である。よって自治体及び空き家活用住宅入居者に対する聞き取り調査により、転入までの意思決定プロセスと、体験住宅・体験事業・就職支援の利用状況と評価を明らかにするとともに、住まい方調査により改修助成制度を適用した空き家改修の特徴を抽出する。平成24年度は、発展型空き家活用システムの典型事例を45自治体抽出し、自治体に対する聞き取り調査を実施するとともに、空き家活用住宅入居者に対する聞き取り調査を30例程度実施する。聞き取り調査は学生を含めて2名で行うこととし、旅費2500千円と、空き家実測調査図面の清書経費(15日×1人×8千円)、聞き取り調査資料整理経費(10日×1人×8千円)を必要とする。調査先は過疎農村地域が中心のため、交通の利便性が悪い場合にはレンタカーを借りる予定である。また、研究成果を日本建築学会支部大会及び全国大会、国際会議(アジア)にて発表する予定であり、主な費用は旅費である。また、調査記録機器として一眼レフデジタルカメラ・ビデオカメラ(各1台)、図面等のデータ作成資料として地図を必要とする他、調査資料・調査結果の郵送・返送のための切手代金及び封筒代金、広報用パンフレット作成費を必要とする。
建築仕上げ材用触覚センサ-の開発とその設計への応用に関する研究

1.20°Cでの温冷・硬軟・粗滑の3物理量を測定できる一個のコンパクトな触覚センサを作製した。2.1の物理量からそれに対応する心理量が求められる一次式を求めた。3.2の心理量から快・不快感、乾湿感が求められる1次式を作成した。4.10°C30°Cの範囲内では、硬軟、粗滑、乾湿の3心理量は一定であるが、温冷、快・不快の2心理量は温度に依存する。5.10°C30°Cの5心理量を、20°Cの温冷、硬軟および粗滑の3心理量で表わす式を提案した。6.20°Cの3心理量を、10°C30°Cの任意温度の物理量で求められる推定式を作成した。7.6に沿うように触覚センサを改良した。8.材質感に偏りがないように選んだ実際の建築仕上げ材料42種類について、10°C30°Cの範囲内で上記17の各項の妥当性を検証した。9.温度依存性の高い温冷、快・不快の2心理量が、30°Cを越えた体温の前後でどのように変容するかを生理、心理学的に究明した。10.手、足、腰などの人間の各部位が建築要素を含めたどのようなものの表面に、何のために、どれ位の時間触れるかを、夏期・冬期にわたって2回調査し、集計し、設計のための資料を得た。1.温冷・硬軟・粗滑の3物理量を測定できる一個の触覚センサ-を作製した。2.実際の建築仕上げ材料42種類を測定し、それぞれの材種や表面仕上げの試料に十分当該触覚センサ-が対応できるかどうかを検証し、その問題点を拾い上げた。(1)3物理量測定機が合体したため、それぞれの接触初期値の調整に一工夫が要請される。(2)粗滑の物理量測定において、試料に直角に作用する荷重が試料の種類によって変動するための誤差が生じる。このための考案が望まれる。もちろん(1)との関連も深い。(3)温冷の物理量の測定は定温下で十分なものであったが、外気温が高温になって接触子との温度差が小さくなると測定時間が長くなる。接触子の温度を外気温と一定にするなどの対策が考えられる。(4)接触子の摩耗の影響がどの程度になるか、何回位の測定で交換すべきかの見極めが必要である。基準試料を測定し、その測定値が一定値を越えると交換するなどの対策が考えられる。3.以上に基づき接触センサの改良を一部行った。4.温冷・硬軟・粗滑の物理量と心理量の対応を試み、相関係数0.8以上を得た。5.温冷・硬軟・粗滑3感の常温以外の適用性と限界について実験、考察した。6.部位別性能基準値や各空間各部位の設計指針の作成は、当該年度から、次年度に持ち越された。2.1の物理量からそれに対応する心理量が求められる1次式を求めた。

9.温度依存性の高い温冷、快・不快の2心理量が、30°Cを越えた体温の前後でどのように変容するかを生理、心理学的に究明した。10.手、足、腰などの人間の各部位が建築要素を含めたどのようなものの表面に、何のために、どれ位の時間触れるかを、夏期・冬期にわたって調査し集計し、設計のための資料を得た。
希少さび病菌標本の遺伝子修復と次世代シーケンサーによる時空間的遺伝子動態解析

さび病菌の多くは絶対寄生菌であり、試験管内培養は殆ど不可能であるため、分子遺伝学的なアプローチが困難で、植物病原体としての重要性に比して、遺伝子レベルでの研究は進んでいない。一方、多くのさび病菌は古くからさく葉標本として保存されており、それらから遺伝情報を抽出し、解析することが出来れば有用な多くの知見が得られることが期待できる。本研究では比較的菌体を得やすく、経年標本が揃っているStereostratum corticioides(メダケ赤衣病菌)を用いて、DNAおよびRNA試料の抽出を試み、条件検討を詳細に行い、次世代シーケンサーを用いた大量解析に適した長鎖DNAの調製方法の検討を行った。今年度は、比較的材料供給に余裕があるメダケ赤衣病菌(Stereostratum corticioides)を用いた微少サンプルからの効率よい核酸抽出方法について検討した。具体的にはシリコンコートしたカバーグラス中に抽出用緩衝液と胞子を混合し、顕微鏡で検鏡しつつ圧着して対象をつぶす操作により、微量サンプルからの核酸抽出を行った。その結果、PCR増幅が可能なDNAサンプルを得ることが出来た。しかし、この方法では、得られるDNAの量にばらつきが大きいことが判明し、その解消のためにはさらなる検討が必要であると思われた。一方、染色体外遺伝因子として重要なウイルス由来の二本鎖RNAの検出を試みたところ、新鮮なサンプルからは期待通りの分子が回収されたが、古い乾燥標本からの抽出は十分なサンプル量をもちいたにもかかわらず成功せず、それは極めて困難であると思われた。しかし、今後は抽出方法や緩衝液系を改良して、再度試みたい。1年度目の実験でDNA試料の確保はほぼクリアできたと判断しており、2年度目は次世代シーケンサーを用いたDNA解析に入る予定だが、周辺情報が乏しいので他の実施例を参考にしつつ慎重に進めたい。また、乾燥標本の維持と整理も重要な問題となるが、よりコンパクトに長期間の保存に耐える方法について検討を開始した。残念ながら、最適な方法を決定するには至らなかったが、将来的にも数十年以上の劣化に対応する必要があると思われるので、今後も引き続き保存方法に関する情報収集を継続して行う。古いさび病菌標本からの核酸抽出手法の確立が本研究の要点であるが、貴重なさび病菌標本を大量に供試して条件検討等を実施するのは極めて困難であり、慎重な実験手法の検討が必要であった。今年度は、昨年度に引き続き、比較的材料供給に余裕があるメダケ赤衣病菌(Stereostratum corticioides)を用いた微少サンプルからの効率よい核酸抽出方法について検討するとともに、次世代シーケンサー(NGS)を用いたDNA解析に必要とされる、長鎖DNAの取得方法についても検討を加えた。今年度採集した、比較的新鮮なメダケ赤衣病菌の冬胞子を用い、ガラスホモジナイザーによる磨砕、あるいは乳鉢による磨砕で、SDSとProteinase Kを含む抽出緩衝液によるDNA抽出を試み、それらの収量と品質についてアガロースゲル電気泳動を用いて調査した。その結果、ガラスホモジナイザーを用いた場合ではDNAの断片化が顕著であり、望ましい品質のDNA試料を得ることは困難であること。乳鉢を用いた方法では効率良いDNA抽出は難しく、DNAの収量はガラスホモジナイザーを用いた場合と比較して著しく劣ることなどが判明した。DNA抽出効率が悪いのは乾燥標本で顕著であり、PCR増幅無しでNGSを用いた解析を実施するのは極めて困難であると考えられた。今後は抽出緩衝液の組成と、破砕方法について十分な検討が必要であり、穏和な冬胞子の破砕方法の開発が必須であることが認識された。昨年度に検討した、染色体外遺伝因子として重要なウイルス由来の二本鎖RNAの検出を試みたが、今年度採集したサンプルからはアガロースゲル電気泳動では明瞭なバンドが確認できず、予想外の結果となった。過去の研究結果(1985-1990年に本研究代表者が実施)では日本国内で採集された全てのメダケ赤衣病菌からウイルス粒子が検出されており、それらの分布は普遍的であると思われたが、本年度の標本からは検出出来なかった。今後引き続き調査を続け、ウイルスの在非とそれらの分布について調べることで、本菌のウイルスに関する新知見も得られる可能性がある。大量にDNA試料を準備することが困難であることが今後も予想されるので、DNA増幅について重点的に検討し、超微量サンプルでも対応可能な実験技術について集中的に検討する。植物病理学
遺伝的アルゴリズムによる3次元粒子画像流速測定法の実用化と帯電液体流測定への応用

本研究は.工学分野で重要な乱流場を対象に.その3次元の流速ベクトルを比較的高速に測定できる新しい粒子画像流速測定法(PIV)技術を開発して.さらに実用化のための評価を行うと同時に電気流体力学現象で取り扱われる帯電液体の乱流測定を実施することを研究の目的に研究開発を行ったものである。以下に,研究の実施計画に従って成果を整理する。1.3次元粒子画像流速測定法本研究で開発を進めたPIVは.流れ場に混入したトレーサ粒子の時間的および空間的対応付けにより粒子追跡を実行して、その速度ベクトルを算出する画像計測法である。この時間的および空間的対応付けには、遺伝的アルゴリズムによる組み合わせ最適化処理技術を用いた。すなわち.本手法による画像計測の基本原理は,複数の時系列画像間で一対一に対応付けらる個々のトレーサ粒子を追跡することで.流れ場の速度ベクトル分布を求めるアルゴリズムとなった。2.粒子位置の3次元位置計測方法実際の流れ場に適用するためには.3次元空間に分布する多数のトレーサ粒子の位置測定を行うことが重要である。1.本研究では,まず画像処理CPU装置を用いて直角座標系におけるX-Z面とY-Z面の同期した各2次元粒子画像処理を行うシステムを構築し、次にその処理結果から3次元空間での粒子の位置計測を計算機のソフトウェア上で精密に行う画像計測システムを構築した。また、構築したシステムと本手法の性能評価については,乱流場のコンヒュータシミュレーションに基づく解析と検討から優れた基本性能が明らかとなった。3.帯帯液体の乱流ば計測実際に流体運動を制御した帯電液体を対象にして、本手法による3次元乱流場の測定を実施し,電気流体力学的現象における流動計測が可能になった。今後の展開としては,実用化に向けて技術の発展を目指すとともに,帯電液体流に関して多くの知見を得るために応用研究を進めたいと考えている。本研究は,工学分野で重要な乱流場を対象に,その3次元の流速ベクトルを比較的高速に測定できる新しい粒子画像流速測定法(PIV)技術を開発して,さらに実用化のための評価を行うと同時に電気流体力学現象で取り扱われる帯電液体の乱流測定を実施することを研究の目的に研究開発を行ったものである。1.3次元粒子画像流速測定法本研究で開発を進めているPIVは,流れ場に混入したトレーサ粒子の時間的および空間的対応付けにより粒子追跡を実行して,その速度ベクトルを算出する画像計測法である。この時間的および空間的対応付けには,遺伝的アルゴリズムによる組み合わせ最適化処理技術を用いた。すなわち,本手法による画像計測の基本原理は,複数の時系列画像を解析データとして利用し,各画面の間で一対一に対応付けられる個々のトレーサ粒子を追跡することで,流れ場の速度ベクトル分布を求める上位のアルゴリズムとなった。2.粒子位置の3次元位置計測方法本研究で目的とする3次元流速測定を実際の流れ場に適用するためには,3次元空間に分布する多数のトレーサ粒子の位置測定を行うことが重要である。本研究では,まず画像処理CPU装置を用いて直角座標系におけるX-Z面とY-Z面の同期した各2次元粒子画像処理を行うシステムを構築し,次にその処理結果から3次元空間での粒子の位置計測を計算機のソフトウェア上で精密に行う画像計測システムを構築した。また,構築したシステムと本手法の性能評価については,乱流場のコンピュータシミュレーションに基づく解析と検討から優れた基本性能が明らかとなった。
軟X線を利用した光励起プロセスの基礎研究

酸化シリコン上へ吸着した有機金属化合物ジメチルアルミニウムハイドライド(DMAH)にAlKαX線を照射すると、吸着種が分解する現象を見いだした。これは、アルミ薄膜形成のCVD初期過程をX線分光(XPS)により観測している際、XPS信号の時間的変化として観測された。薄膜形成過程の診断の立場から、XPSの信号強度が変化して一定でないことは不便である。一方、最近光励起プロセスは光源にシンクロトロン放射光など短波長のハードフォトンの利用が始まろうとしている。その立場からは、XPS用のAlKα線は波長が短く(0.83nm)、単色光であり、かつ装置が簡単であるなどの利点があり、ハードフォトン励起プロセスの研究に適している。欠点は強度が放射光に比べると弱いことである。しかし、吸着種を分解するだけの強度があった訳である。本研究では、まずAlXPS信号強度のDMAHの曝露量依存性から、吸着種が酸化シリコン表面上で一分子層を形成していることを確認した後、AlKαX線照射効果の基板温度依存性、曝露量依存性などについて、系統的に観測した。その結果、X線照射前の吸着種の種類により、分解の速さが変わることを見いだした。分解後の吸着種はアルミではなく、同定不可能なものであった。これは、分解生成物が表面の原子と反応したためと推定される。分解機構は、X線による直接分解と基板から放出される二次電子による間接分解の二通りが考えられる。前者は分解断面積が小さく可能性が低く、後者では20eVを頂点として二次電子が観測されたことから、後者の可能性が高いと考えられる。本研究は本年度補正予算で採択された。それが関係して、研究には時間的余裕がなかったが、以前見いだした吸着種のXPS信号の時間的な変化について、組織的な研究を始めることができた。すなわち、ジメチルアルミニウムハイドライド(DMAH)をSiO_2上の吸着種にAlKα線(1478eV)を照射すると、AlのXPS信号のピークが時間的にシフトすることと、それに合わせて、C信号の強度が減少することを確認した。さらに、基板温度を上げると、これらの変化が早くなることを観測した。分子研のUVSORを照射しても、同様な変化が観測された。さらに、基板依存性についても結果が得られた。すなわち、SiO_2に加えて、Si,Ti,TiO_2,TiN及びその酸化膜、Pd上でのDMAHの吸着種に対しては、AlKα照射の効果は認められなかった。吸着種のX線による分解の機構については、直接光分解と二次電子による間接的分解の二種類が考えられる。そこで、SiO_2基板から放出される二次電子のエネルギー分布をXPSで観測した。その結果、20eVあたりにピークを持つ分布が観測された。これは吸着種を電子で分解するのに好都合であることを示唆している。しかし、二次電子による間接的分解とはまだ断定できない。正式な研究が始まるのが遅くなったため、これは本年度中には解明できなかった。SiO_2表面がなぜ特異なのかも解明される必要がある。これら機構解明の問題は次年度の最重要研究課題となっている。

その立場からは、XPS用のAlKα線は波長が短く(0.83nm)、単色光であり、かつ装置が簡単であるなどの利点があり、ハードフォトン励起プロセスの研究に適している。欠点は強度が放射光に比べると弱いことである。しかし、吸着種を分解するだけの強度があった訳である。本研究では、まずAlXPS信号強度のDMAHの曝露量依存性から、吸着種が酸化シリコン表面上で一分子層を形成していることを確認した後、AlKαX線照射効果の基板温度依存性、曝露量依存性などについて、系統的に観測した。その結果、X線照射前の吸着種の種類により、分解の速さが変わることを見いだした。分解後の吸着種はアルミではなく、同定不可能なものであった。これは、分解生成物が表面の原子と反応したためと推定される。分解機構は、X線による直接分解と基板から放出される二次電子による間接分解の二通りが考えられる。前者は分解断面積が小さく可能性が低く、後者では20eVを頂点として二次電子が観測されたことから、後者の可能性が高いと考えられる。
ホルムアルデヒド資化経路がリグニンモデル化合物資化性菌の代識に及ぼす影響

近年、メチロトローフ細菌のみに存在するといわれてきたHCHO資化経路(リブロースモノリン酸経路)が様々な原核微生物のシークエンスプロジェクトの進行により、非メチロトローフ細菌においても広く遺伝情報として持つことが明らかになってきた。本研究ではこの資化経路が様々な生育条件下で副次的に生成するHCHOの強い毒性を回避する機構として備わっている可能性を想定し、バイオマス資源として注目されているリグニンモデル化合物の代謝に着目した。Burkholderia cepacia TM1はバニリンやバニリン酸といったリグニンモデル化合物を資化し、その代謝過程では副産物としてHCHOを生成する。このことからこの代謝において生成したHCHOとHCHO資化経路との関係を明らかにすることを目的とした。培養時に微量のHCHOを培養液中に添加することにより、微弱ではあるがHCHOを糖リン酸へと固定する酵素3-ヘキシュロース6-リン酸シンターゼ(HPS)活性が誘導され、さらに、リグニンモデル化合物を炭素源としたときにもHPS活性が誘導されることが明らかになった。これはリグニンモデル化合物代謝時の脱メチル化反応により生成するHCHOにより誘導を受けたものと考えられ、HCHO資化経路が毒性回避機構として機能することを示唆している。昨年度までにB. cepacia TM1への形質転換方を確立したことから、メチロトローフ細菌の強力なHCHO固定酵素をコードする遺伝子をB. cepacia TM1で過剰発現させ脱メチル化反応に及ぼす影響を検討した。その結果、形質転換体はHCHOを含む培養液中で生育のラグタイムが短くなる傾向が見られ、リグニンモデル化合物を炭素源として生育させると生育速度、菌体収量が増加することが明らかになった。これは代謝過程でバニリン酸の脱メチル化反応によって生成したHCHOの毒性を低く保つことができるようになったためと考えられる。(投稿中)近年、メチロトローフ細菌のみに存在するといわれてきたHCHO資化経路(リブロースモノリン酸経路)が様々な原核微生物のシークエンスプロジェクトの進行により、非メチロトローフ細菌においても広く遺伝情報として持つことが明らかになってきた。本研究ではこの資化経路が原核生物一般において、自然界に多量に存在するHCHOの強い毒性を回避する機構として備わっている可能性を想定し、非メチロトローフ細菌であり、バニリン、バニリン酸といったリグニンモデル化合物を単一炭素源として生育するBurkholderia cepacia TM1をモデルとしてHCHO資化経路の存在を確認し、モデル化合物代謝時に副次的に生成するHCHOとの関係を明らかにすることを目的とした。培養時に微量のHCHOを培養液中に添加することにより、かなり微弱ではあるがHCHOを糖リン酸へと固定する酵素3-ヘキシュロース6-リン酸シンターゼ(HPS)活性が誘導され、さらに、リグニンモデル化合物を炭素源としたときにもHPS活性が誘導されることが明らかになった。これはリグニンモデル化合物代謝時の脱メチル化反応により生成するHCHOにより誘導を受けたものと考えられる。今回モデルとしたB.cepacia TM1株はバニリンを炭素源として培養したとき、培養液中に多量のバニリン酸を蓄積する。このことはバニリン酸の脱メチル化反応が律速であり、律速因子がHCHOであることが考えられる。これはHCHO固定活性が微弱であり、HCHOの毒性が速やかに回避できないことに起因していることが考えられ、この点を遺伝子工学的手法により育種するため、B.cepacia TM1への形質転換をエレクトロポレーション法で行うことに成功した。現在、メチロトローフ細菌の強力なHCHO固定酵素をコードする遺伝子をB.cepacia TM1で発現させ脱メチル化反応に及ぼす影響を検討している。

これは代謝過程でバニリン酸の脱メチル化反応によって生成したHCHOの毒性を低く保つことができるようになったためと考えられる。(投稿中)
高分解能構造解析によるシトクロムb5還元酵素反応系における電子伝達分子機構の解明

タンパク質分子間における電子伝達反応機構を理解するためには、それぞれのタンパク質における酸化還元状態調節機構とタンパク質間の電子伝達経路を明らかにすることが重要な課題となっている。酸化還元状態間の構造変化を追跡するためには、タンパク質表面の水分子を含めた全原子構造情報を取得することが必要不可欠であり、電子伝達経路の解明には反応の起こる状態である複合体での構造情報が重要となる。本研究では、哺乳類の肝臓代謝系において脂質合成などに関与するNADH-シトクロムb5還元酵素(b5R)とシトクロムb5(b5)の反応系全体について、X線と中性子それぞれの特長を生かした構造解析を行うことで、水素原子を含めた全原子構造とb5R-b5複合体構造を明らかにし、電子伝達反応において重要な酸化還元状態調節と電子伝達経路の構造基盤を解明することを目的とする。2018年度は還元型b5Rの高分解能X線構造解析を実施した。野生型と還元型を安定化するT66V変異体について試料調製条件および結晶化条件の検討を行い良質な結晶作製に成功した。放射光X線を利用した回折実験の結果、これまでより高分解能である1オングストローム分解能を越える回折データセットを取得することが可能となった。立体構造精密化の結果、野生型と変異体で全体構造に大きな変化は観測されなかったが、水素移動に重要と考えられる、アミノ酸、補酵素、水分子の立体構造情報を取得することができた。2018年度は還元型b5RのX線構造解析を実施した。野生型だけでなく還元型を安定化する変異体(T66V)の調製も実施した。酸素存在下で不安定な還元型結晶の作製は無酸素チャンバー内で実施した。また回折能の向上を目指し、再結晶化によるタンパク質純度の向上および結晶化条件の再検討を行い、野生型および変異体どちらについても良質な結晶作製に成功した。大型放射光施設SPring-8のBL44XUビームラインにおいてX線回折実験を行った結果、これまでに得られていた1.3オングストローム分解能を上回る1オングストローム分解能を超える高分解能の回折データセットを取得することが可能となった。立体構造精密化の結果、タンパク質のアミノ酸残基の一部とタンパク質に結合する補酵素(FADとNAD)の一部について水素原子由来の電子密度を観測することができた。その結果、野生型はNAD+結合状態、変異体はNADH結合状態であることが明らかとなった。野生型と変異体の立体構造を比較したところ、全体構造に大きな変化は見られなかったが、FADおよびNAD(H)結合部位周辺において一部構造変化が観測された。観測された構造変化から、水素移動に重要と考えられるアミノ酸、補酵素、水分子の立体構造情報が明らかとなった。2019年度は、b5R一電子還元型、再酸化型の高分解能X線構造解析、還元型の中性子構造解析およびb5R-b5複合体のX線構造解析を行う。b5R一電子還元型および再酸化型の結晶は、まず無酸素チャンバー内で二電子還元型結晶を作製し、酸化剤の添加もしくは酸素暴露により調製する。大型結晶の作製は、種結晶を成長させるシーディング法または酸化型と同様にタンパク質溶液と結晶化溶液を混合し静置するバッチ法により行う。b5R還元型結晶は、液体窒素中もしくは低温窒素気流下で凍結する。大型結晶の凍結が困難な場合は、無酸素チャンバー内でガラスキャピラリーに結晶を封緘する。b5R還元型および再酸化型が結晶中で保持されているかの確認は、顕微分光装置を利用し吸収スペクトル測定により行う。X線回折実験は、放射光施設(Photon FactoryおよびSPring-8)において行う。1オングストローム分解能を超える高分解能X線回折データ収集ができれば、水素原子を含めた立体構造精密化を行う。中性子回折実験は、室温または100 Kの低温で行う。中性子回折実験は、大強度陽子加速器施設J-PARCのiBIXまたは、より強度の強い中性子ビームや単色中性子を利用できる海外の中性子回折装置(アメリカSNS MANDI、ドイツFRM-II BioDiff)において行う。b5r-b5複合体のX線回折データを取得するため、複合体の調製および結晶化は無酸素チャンバー内で実施する。結晶が取得できれば、X線回折実験は放射光施設において行う。酸化還元状態間の構造変化を追跡するためには、タンパク質表面の水分子を含めた全原子構造情報を取得するが必要不可欠であり、電子伝達経路の解明には反応の起こる状態である複合体での構造情報が重要となる。本研究では、哺乳類の肝臓代謝系において脂質合成などに関与するNADHシトクロムb5還元酵素(b5R)とシトクロムb5(b5)の酸化還元反応系全体について、X線と中性子それぞれの特長を生かした構造解析を行うことで、水素原子を含めた全原子構造とb5R-b5複合体構造を明らかにし、電子伝達反応において重要な酸化還元状態調節と電子伝達経路の構造基盤を解明することを目的とする。平成29年度は酸化型b5Rの中性子構造解析および二電子還元型b5RのX線構造解析を実施した。酸化型b5Rの中性子構造解析の結果、タンパク質表面の多数の水分子について水素原子を含めた構造を明らかにすることができた。

その結果、水分子の水素原子を含めた水素結合ネットワークの詳細が明らかとなり、酸化還元反応に伴うプロトン移動経路の理解に重要な立体構造情報を取得することができた。また、二電子還元型b5Rについては、高分解能X線構造解析を目指し、タンパク質調製方法および結晶化条件の検索を行い、従来より高分解能の回折データを取得することが可能となった。平成29年度は酸化型b5Rの中性子構造解析および二電子還元型b5RのX線構造解析を実施した。酸化型b5Rについては、ドイツの研究用原子炉(FRM-II)に設置された生体高分子用回折装置(BioDiff)を利用して取得した中性子回折データを用い、水素原子を含めた立体構造解析を行った。これまで酸化型b5Rの高分解能X線構造解析において約20分子の水分子について水素原子を含めた立体構造が報告されているが、中性子構造解析により約300分子の水分子について水素原子を含めた立体構造を明らかにすることが可能となった。その結果、b5Rの酸化還元反応の中心である補酵素FAD周囲の水分子の水素原子を含めた水素結合ネットワークの詳細が明らかとなり、酸化還元反応に伴うプロトン移動経路の理解につながる立体構造情報を取得することができた。二電子還元型b5Rについては、良質な結晶を作製するため試料調製方法の検討を行った。従来の二電子還元型b5R調製条件に加えて再結晶化を行うことで純度向上を計った。さらに、結晶化条件のスクリーニングを行うことでこれまでと異なる条件で結晶を取得することができた。得られた結晶を用い放射光施設Photon FactoryのBL5AビームラインにおいてX線回折実験を行った結果、高分解能(1.3オングストローム)の回折データを取得することができた。分解能毎の回折点強度平均値を計算した結果、高分解能側での強度の減衰がこれまでの二電子還元型結晶から取得した回折データに比べ抑えられていることがわかり、さらに高分解能での回折データ収集の実現可能性が高くなった。また立体構造解析を行ったところ、報告されている二電子還元型b5Rと比べて全体構造に大きな差は見られなかった。タンパク質分子間における電子伝達反応機構を理解するためには、それぞれのタンパク質における酸化還元状態調節機構とタンパク質間の電子伝達経路を明らかにすることが重要な課題となっている。酸化還元状態間の構造変化を追跡するためには、タンパク質表面の水分子を含めた全原子構造情報を取得することが必要不可欠であり、電子伝達経路の解明には反応の起こる状態である複合体での構造情報が重要となる。本研究では、哺乳類の肝臓代謝系において脂質合成などに関与するNADH-シトクロムb5還元酵素(b5R)とシトクロムb5(b5)の反応系全体について、X線と中性子それぞれの特長を生かした構造解析を行うことで、水素原子を含めた全原子構造とb5R-b5複合体構造を明らかにし、電子伝達反応において重要な酸化還元状態調節と電子伝達経路の構造基盤を解明することを目的とする。2018年度は還元型b5Rの高分解能X線構造解析を実施した。野生型と還元型を安定化するT66V変異体について試料調製条件および結晶化条件の検討を行い良質な結晶作製に成功した。
大腸菌O157の感染力に対するマイクロ波の影響

大腸菌O157に対する電子レンジのマイクロ波の影響を調べた。本病原体の電子レンジ処理により、生細胞数と酸耐性は共に低下した。また、電子レンジ処理後に新たに増殖した本菌のベロ毒素生産性も低下した。種々の食品に接種した本病原体に対しても電子レンジのマイクロ波は、同様の作用を示した。電子レンジの二次的な加熱作用を排除して、37°Cで本菌にマイクロ波を照射した場合にも,病原性は低下した。マイクロ波の作用は、細胞密度の増加に伴って作動するクオラムセンシング機構(特にSdiAタンパク質)に影響を与え、病原性を低下させることが判明した。大腸菌O157による食中毒の防止にマイクロ波は有用であると思われた。大腸菌O157は胃の酸性バリアーを容易に通過できる高い酸耐性をもち、また有害なべロ毒素を生産する。このような本病原体の性質は、細胞の生理学的な状態によって変動することが知られているが、食事の直前に使用される電子レンジの影響については、これまで調べられていない。電子レンジはマイクロ波の二次的な加熱作用を利用したものであり、マイクロ波は生体に対して様々な影響を及ぼすことが知られている。本研究では、本病原体に対するマイクロ波の影響を調べ、大腸菌O157を弱毒化することを目的とした。本年度の研究においては、大腸菌O157の生細胞数変化に対するマイクロ波の影響を調べた。電子レンジを使用して、5mlの大腸菌O157細胞懸濁液(3×10^5cells/ml)の最終温度が40°C及び60°Cになる条件を検討し、それぞれ170Wで30秒間と700Wで7秒間の処理条件を設定した。この電子レンジ処理を行った後の生存率はそれぞれ約65%と約10%であった。大腸菌O157は40°Cで死滅しないと考えられるが、このような電子レンジ処理により細胞に何らかの損傷が生じたと考えられる。続いて、電子レンジ処理を行った細胞の酸耐性を調べたところ、意外にも酸耐性の低下は見られないことが判明した。その原因を検討したところ、電子レンジ処理後の酸処理(pH3のLB培地中で37°C1時間インキュベーション)中に、損傷細胞の修復が起こることが判明した。一方、上述した電子レンジ処理の後、新しい培地に植え継いで培養した大腸菌O157のべロ毒素生産性は、低下する傾向にあることが判明した。同様の傾向は、マイクロ波の作用を二次的な加熱作用と切り離して調べることが可能な、マイクロ波発生装置(グリーンモチーフ、東京電子)を用いた実験でも確認できた。以上の結果から、マイクロ波は大腸菌0157のべロ毒素生産性を抑制するものと考えられた。大腸菌0157は胃の酸性バリアーを容易に通過できる高い酸耐性をもち,また有害なベロ毒素を生産する。このような本病原体の性質は,細胞の生理学的な状態によって変動することが知られているが,食事の直前に使用される電子レンジの影響についてはこれまで調べられていない。前年度は,大腸菌0157に対するマイクロ波の影響を検討し,マイクロ波によりベロ毒素生産性が低下することを明らかにした。今年度は,種々の食品に接種した大腸菌0157に対する電子レンジの影響を検討した。様々な条件で電子レンジ処理を行った後の本菌の生存率は,香辛料を含むカレーやシチューで著しく低く,デンプンを含む白がゆで高くなった。また酸耐性は,栄養培地に接種した場合に比べて,食品中に接種した場合に低くなった。この結果から,本菌の生存率と酸耐性には,食品の種類が大きく影響すると考えられた。ベロ毒素生産性も同様に,食品中に接種したほうが栄養培地に接種した場合に比べて著しく低くなった。また,電子レンジの二次的な加熱作用を排除するため,マイクロ波照射により温度を37°Cに制御してマイクロ波を照射した場合にも,ベロ毒素生産性は大きく低下することが判明した。以上のことから,食品に混入した大腸菌0157のベロ毒素生産性や酸耐性は,食品の影響を受けて低下し,さらに電子レンジ処理により大きく低下すると考えられ,本病原体の感染力低下に電子レンジ処理は有効であると考えられた。昨年度までの研究成果から、マイクロ波は大腸菌0157の有害機能を抑制すると考えられたため、大腸菌0157に対するマイクロ波の作用機構を検討した。まず、マイクロ波が大腸菌0157のベロ毒素(VT)量を低下させたことから、VT遺伝子mRNA量の変動を検討した。培養液にマイクロ波照射して培養温度を37°Cに制御して通気撹拌培養した場合と、恒温水槽で37°Cに制御して通気撹拌培養した場合では、大腸菌0157の増殖に大きな違いは見られなかった。

しかし、VT遺伝子のmRNA量は、2つの培養条件で有意な違いが見られた。恒温水槽で温度制御した場合には、定常期に近づくにつれて、細胞あたりのベロ毒素遺伝子のmRNAレベルも増大したが、マイクロ波照射した場合には、このmRNAレベルの増加が遅延する傾向が見られた。このような細胞密度の増加に伴って細胞あたりの転写活性が増大する機構は、クオラムセンシングと呼ばれ、大腸菌0157が自ら分泌するホルモン用物質(オートインデューサー)の濃度を感知して作動する制御機構であり、マイクロ波照射はこのクオラムセンシング機構に何らかの影響を与えると考えられた。クオラムセンシングには、アドレナリン様物質が細胞表層のリセプター(QseC)に結合して作動する場合と、インドールやアシルホモセリンラクトン類が細胞内に直接侵入してSdiAタンパク質を活性化する場合があるが、ベロ毒素量の経時的変化と各遺伝子の転写レベルの解析から、インドールやアシルホモセリンラクトン類が作用する経路、特に不溶性SdiAタンパク質の可溶化にマイクロ波が影響を与えたと推定された。これらの成果はマイクロ波の有用性を示すだけでなく.ベロ毒素生産抑制のための新しい標的を示唆するものと考えられた。
内側前頭前皮質による扁桃体基底外側核機能の調節機構の研究

内側前頭前皮質(mPFC)の制御を受ける扁桃体基底外側核(BLA)GABA作動性神経サブタイプの同定(方法)本研究には蛍光物質GFP遺伝子をGABA合成酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素67遺伝子プロモータ下流にノックインしたマウスを用いた。マウスのmPFC内にGFPと異なる励起波長をもつ蛍光物質を微量注入し,mPFCからBLAへの投射系を順向性に標識し,この投射系から入力を受けるGFP陽性GABA作動性神経細胞を同定した。(結果)形態学的に紡錘形で,生理学的にはregular-spikingパターンの発火様式を示すサブタイプ(Regular-spikling cell)がmPFCから密な投射を受けることが明らかになった(47/50)。このサブタイプがmPFCから単シナプス性入力を受ける可能性は,標識投射系に弱い細胞外電気刺激(30μA)を加えると短潜時の興奮性シナプス後性電流(EPSCs)が惹起されるという事実によって間接的に支持される。他のサブタイプに関しては,low-threshold spiking cellでは11/41、fast-spiking cellでは19/48と有意にRegular-spikig cellよりも低率であった。また,標識されたmPFCからの投射線維に対して強い電気刺激を加えても単シナプス性EPSCsが誘発されない細胞がこの2型では認められた。(考察)mPFCからBLAのGABA作動性神経細胞に投射する入力の多寡は、標的となるサブタイプによって異なり,Regular-spiking cellはBLA内のすべての領域で密な入力を受けていた。この事実は,Regular-spiking cellがmPFCからの入力を受けてフィードフォワード抑制をBLA内の主細胞に加え,恐怖条件付け学習などの情動学習を制御する可能性を示唆している。平成14年度研究実績1.扁桃体基底外側核(BLA)内GABA作動性抑制性ニューロンの電気生理学的および形態学的同定2.モノアミンによるBLA内GABA作動性ニューロンのサブタイプ別修飾BLA内GABA作動性ニューロンに対して、ノルアドレナリン(NA)はRS cellのみを、セロトニンはFS cellとLTS cellの両サプタイプを興奮させることが明らかになった。3.NAによるRScell興奮のメカニズム(1)NAは、α_1アドレナリン受容体を介した非選択性カチオンチャネルの活性化及びresting K^+コンダクタンスの抑制という二つの異なるメカニズムを介してRS cellを脱分極させ、スパイク発射に至ること(2)上記NAの興奮性作用は細胞外Ca^<2+>依存性を示す一方、phospholipase Cシグナル伝達系の活性化及び細胞内Ca^<2+>には依存しないことが明らかになった。平成15年度の研究の展開GFPノックインマウス内側前頭前皮質に蛍光トレーサーを注入し、入力を受けるGABAニューロンを同定する。内側前頭前皮質(mPFC)の制御を受ける扁桃体基底外側核(BLA)GABA作動性神経細胞サブタイプの同定(方法)(結果)BLAのGABA作動性神経細胞のうち,形態学的に紡錘形で,電気生理学的にはregular-spikingパターンの発火様式を示すサブタイプ(Regular-spiking cell)がmPFCから密な投射を受けることが明らかになった。このサブタイプがmPFCから単シナプス性興奮性入力を受ける可能性は,標識投射系に弱い細胞外電気刺激(30μA)を加えると短潜時の興奮性シナプス後性電流(EPSCs)が惹起されるという事実によって間接的に支持される。

BLAの他のサブタイプに関しては,位置するBLA内の領域によって投射密度がかなり異なっていた。また,標識されたmPFCからの投射線維に対して強い亀気刺激を加えても単シナプス性EPSCsが誘発されない細胞がこの2型では認められた。(考察)mPFCからBLAのGABA作動性神経細胞に投射する入力の多寡は、標的となるサブタイプによって異なり,Regular-spiking cellはBLA内のすべての領域で密な入力を受けていた。この事実は,Regular-spiking cellがmPFCからの入力を受けてフィードフォワード抑制をBLA内の主細胞に加え,恐怖条件付け学習などの情動学習を制御する可能性を示唆している。
固気混相超音速ガス流を制御した超音速フリージェットPVDの開発

超音速フリージェットPVDは,不活性ガス雰囲気中で皮膜となる原料を蒸発させることにより生成させたナノサイズの粒子(ナノ粒子)を超音速(3.6km/s以上)のガスの流れにより搬送,基板上に堆積,成膜させる新しい成膜原理によるコーティング技術である.本法の成膜において最も重要なキーテクノロジは,生成直後の高い表面エネルギを保ちつつ,ナノ粒子を基板に積層させることである.しかし,皮膜組成の制御性の観点から,異種ナノ粒子の精密な混合は本法にとって必要不可欠な技術である.本研究は,超音速ガス流により基板まで搬送される異種ナノ粒子を凝集・肥大化させることなく,活性な状態のままのナノ粒子を基板に積層・成膜させることを研究目的としている.そこで,研究代表者らが先に特許出願(廣木,湯本ら,流体混合装置,特願2004-173484)した同軸対向噴流による自励振動現象を用いたミキサーを,超音速フリージェットPVD用に新たに設計開発し,本装置に組み入れ成膜を試みた.開発したミキサ0は,機械的可動部を必要とせず,流体要素のみでナノ粒子を含む二つの固気混相噴流を精密に混合させることが可能なフルイディクデバイスである.本研究では,本ミキサーにおいて発振現象を得る条件(ミキサー形状,噴流の流速,圧力,流量など)を熱流体解析ソフトにより解析した.その結果,二つの噴流をミキサーに導入する導入口のアスペクト比および二つの噴流の流速・圧力が最適な発振現象を得るための条件であることを明らかとし,解析結果を基に製作したミキサーを組み込み成膜させた皮膜において,ナノ粒子を凝集させることなく異種ナノ粒子が精密に混合させた皮膜の成膜に成功した(数320nm程度の粒子が混合した欠陥の無い高密度皮膜の形成を達成).超音速フリージェットPVDは,不活性ガス雰囲気中で皮膜となる原料を蒸発させることにより生成させたナノサイズの粒子(ナノ粒子)を超音速(3.6km/s以上)のガスの流れにより搬送,基板上に堆積,成膜させる新しい成膜原理によるコーティング技術である.本法の成膜において最も重要なキーテクノロジは,生成直後の高い表面エネルギを保ちつつ,ナノ粒子を基板に積層させることである.しかし,皮膜組成の制御性の観点から,異種ナノ粒子の精密な混合は本法にとって必要不可欠な技術である.本研究は,超音速ガス流により基板まで搬送される異種ナノ粒子を凝集・肥大化させることなく,活性な状態のままのナノ粒子を基板に積層・成膜させることを研究目的としている.そこで,研究代表者らが先に特許出願(廣木,湯本ら,流体混合装置,特願2004-173484)した同軸対向噴流による自励振動現象を用いたミキサーを,超音速フリージェットPVD用に新たに設計開発し,本装置に組み入れ成膜を試みた.開発したミキサ0は,機械的可動部を必要とせず,流体要素のみでナノ粒子を含む二つの固気混相噴流を精密に混合させることが可能なフルイディクデバイスである.本研究では,本ミキサーにおいて発振現象を得る条件(ミキサー形状,噴流の流速,圧力,流量など)を熱流体解析ソフトにより解析した.その結果,二つの噴流をミキサーに導入する導入口のアスペクト比および二つの噴流の流速・圧力が最適な発振現象を得るための条件であることを明らかとし,解析結果を基に製作したミキサーを組み込み成膜させた皮膜において,ナノ粒子を凝集させることなく異種ナノ粒子が精密に混合させた皮膜の成膜に成功した(数320nm程度の粒子が混合した欠陥の無い高密度皮膜の形成を達成).超音速フリージェットPVDは,不活性ガス雰囲気中で皮膜となる原料を蒸発させることにより生成させたナノサイズの粒子(ナノ粒子)を超音速(3.6km/s以上)のガスの流れにより搬送,基板上に堆積,成膜させる新しい成膜原理によるコーティング技術である.本法の成膜において最も重要なキーテクノロジは,生成直後の高い表面エネルギを保ちつつ,ナノ粒子を基板に積層させることである.しかし,皮膜組成の制御性の観点から,異種ナノ粒子の精密な混合は本法にとって必要不可欠な技術である.本研究は,超音速ガス流により基板まで搬送される異種ナノ粒子を凝集・肥大化させることなく,活性な状態のままのナノ粒子を基板に積層・成膜させることを研究目的としている.そこで,研究代表者らが先に特許出願(廣木,湯本ら,流体混合装置,特願2004-173484)した同軸対向噴流による自励振動現象を用いたミキサーを,超音速フリージェットPVD用に新たに設計開発し,本装置に組み入れ成膜を試みた.開発したミキサーは,機械的可動部を必要とせず,流体要素のみでナノ粒子を含む二つの固気混相噴流を精密に混合させることが可能なフルイディクデバイスである.本年度はまず,本ミキサーにおいて発振現象を得る条件(ミキサー形状,噴流の流速,圧力,流量など)を熱流体解析ソフトにより解析した.その結果,二つの噴流をミキサーに導入する導入口のアスペクト比および二つの噴流の流速・圧力が最適な発振現象を得るための条件であることを明らかとし,解析結果を基に製作したミキサーを組み込み成膜させた皮膜において,ナノ粒子を凝集させることなく異種ナノ粒子が精密に混合させた皮膜の成膜に成功した(数320nm程度の粒子が混合した欠陥の無い高密度皮膜の形成を達成).

超音速フリージェットPVDは,不活性ガス雰囲気中で皮膜となる原料を蒸発させることにより生成させたナノサイズの粒子(ナノ粒子)を超音速(3.6km/s以上)のガスの流れにより搬送,基板上に堆積,成膜させる新しい成膜原理によるコーティング技術である.本法の成膜において最も重要なキーテクノロジは,生成直後の高い表面エネルギを保ちつつ,ナノ粒子を基板に積層させることである.しかし,皮膜組成の制御性の観点から,異種ナノ粒子の精密な混合は本法にとって必要不可欠な技術である.本研究は,超音速ガス流により基板まで搬送される異種ナノ粒子を凝集・肥大化させることなく,活性な状態のままのナノ粒子を基板に積層・成膜させることを研究目的としている.そこで,研究代表者らが先に特許出願(廣木,湯本ら,流体混合装置,特願2004-173484)した同軸対向噴流による自励振動現象を用いたミキサーを,超音速フリージェットPVD用に新たに設計開発し,本装置に組み入れ成膜を試みた.開発したミキサーは,機械的可動部を必要とせず,流体要素のみでナノ粒子を含む二つの固気混相噴流を精密に混合きせることが可能なフルイディクデバイスである.本研究では,本ミキサーにおいて発振現象を得る条件(ミキサー形状,噴流の流速,圧力,流量など)を熱流体解析ソフトにより解析した.その結果,二つの噴流をミキサーに導入する導入口のアスペクト比および二つの噴流の流速・圧力が最適な発振現象を得るための条件であることを明らかとし,解析結果を基に製作したミキサーを組み込み成膜させた皮膜において,ナノ粒子を凝集させることなく異種ナノ粒子が精密に混合させた皮膜の成膜に成功した(数320nm程度の粒子が振合した欠陥の無い高密度皮膜の形成を達成).
ヒト羊膜中胚葉系細胞の心筋分化と免疫学的寛容機序の解明

間葉系幹細胞は近年臨床応用され、特に骨髄由来間葉系幹細胞は、心筋再生細胞治療においてその安全性と汎用性が指摘されている。そのため間葉系幹細胞は実用性においても幹細胞治療の重要な細胞源といえる。しかしながらいくつかの問題もある。骨髄由来間葉系幹細胞の効果は、その心筋分化能力の低さから限られたものがある。また幹細胞バンクの設立と免疫抑制剤の使用も必須となる。一方、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞はin vitroにおいてさまざまま組織への分化が示されている。さらにヒト羊膜は、非古典的HLAクラスIbであるHLA-Gの発現により妊娠中の免疫寛容において重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞が有用な心筋分化能を示し、in vivoにおいて移植したヒト羊膜由来間葉系幹細胞が免疫寛容を成立させ、心筋細胞へ分化し生着することを示すことを目的とする。これらの検証により、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の心筋再生医療における細胞源としての有用性により迫る研究となりうる。本研究はバイオマテリアルとしての羊膜細胞の利用法、特に再生医療臨床応用へのストラテジーを確立するという全体構想の中で、羊膜間葉細胞の心臓領域での再生医療への応用の可能性、特にアログラフトによる利用の可能性と科学的根拠を示すための研究である。我々は、従来までに羊膜細胞から間葉系細胞(Amniotic Membrane-derived Mesenchymal Cells= AMC)の分離技術を確立した。この研究によって、羊膜の再生医療に置ける有効性および汎用性が確認でき再生医療に用いうる莫大な細胞リソースの確保が可能となる。心筋誘導効率の最も良い、AMC至適培養条生の模索・異種移植時のAMCの長期生着、心筋分化の科学的実証・AMCが免疫学的寛容を生じるメカニズムの検証を同時に進行するが、初年度内に心筋誘導効率の最も良い、AMC至適培養条件の確定を目指す。心筋誘導効率の最も良い、羊膜由来細胞(AMC)至適培養条件の模索・異種移植時のAMCの長期生着、心筋分化の科学的実証AMCが免疫学的寛容を生じるメカニズムの検証をおこなっていくが、本年度は特に心筋誘導効率の最も良い、AMC至適培養条件について検討した。本研究では各種条件での培養後に心筋誘導効率を比較する事によって、どのような培養条件で心筋への分化誘導能力が高くなるかを検討した。低酸素によって培養を行った細胞、また分裂回数毎にそれぞれどの細胞が心筋になりやすいかを検討した。本研究はバイオマテリアルとしての羊膜細胞の利用法、特に再生医療臨床応用へのストラテジーを確立するという全体構想の中で、羊膜間葉系細胞の心臓領域での再生医療への応用の可能性、特にアログラフトによる利用の可能性と科学的根拠を示すための研究である。我々は、従来までに羊膜細胞から間葉系細胞(Amniotic Membrane-derived Mesenchyma1 Cells=AMC)の分離技術を確立した。心筋誘導効率の最も良い、AMC至適培養条件の模索・異種移植時のAMCの長期生着、心筋分化の科学的実証・AMCが免疫学的寛容を生じるメカニズムの検証を同時に進行するが、初年度内に心筋誘導効率の最も良い、AMC至適培養条件について検討した。具体的には各種条件での培養後に心筋誘導効率を比較する事によって、どのような培養条件で心筋への分化誘導能力が高くなるかを検討した。本年度は心筋誘導率の高い培養条件下のAMCを心筋梗塞モデルラットへ移植することにより、心機能の評価、心筋梗塞領域の測定、心筋細胞への分化及び生着率についての検証を行った。これらの検証をin vitroおよびin vivoで行うことにより、AMCの心筋再生医療における細胞源としての有用性により迫る研究となりうる。