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中高生を対象とした精神保健・福祉教育プログラムの開発～当事者の語りから学ぶ～

上記の成果報告として、教職員、精神保健福祉領域の関係者、当事者・家族を対象として、シンポジウムを開催し、広く普及に努めた。加えて、当事者の語りのエンパワメント効果についても報告書にまとめた。平成26年度報告書『中高生を対象とした精神保健福祉教育プログラムの開発ー精神障害当事者の語りから学ぶー』全78頁、2015年3月1日社会福祉おおむね順調に進展している。しかし、精神障害をもつ当事者の語りが実施できる教育機関が外部講師等への予算削減などの理由で激減している。また、学習教材となる語りを行う当事者を支援する団体や機関が度重なる法改正によって、法に規定されていない語り部活動や教育機関の活動について時間を割くことが難しくなっている。・区分(2)おおむね順調に進展している。本研究は、「中高生を対象とした精神保健・福祉教育プログラムの開発当事者の語りから学ぶ」をテーマとして、1精神障害当事者の語り部養成、2学校における精神保健福祉教育の教材づくり、3他団体の学校における精神保健福祉教育の実践に関する情報収集を3つの柱としている。本年度は、次年度以降の研究の基盤となる情報収集や精神障害当事者の語り部の養成ができた。ただ、学校における精神保健福祉教育の教材づくりに関して、その形式や内容に関して議論がなされており焦点をしぼることができていないことでやや遅れがみられる。次年度は本研究の最終年にあたるため、2つの成果を出していきたいと思っている。1中学生・高校生に対する目的別による当事者の語りを取り入れた学習プログラムを考案する。2学習プログラムにおいて当事者の語りが効果的になるような戦略を考案する。次年度は、1精神障害当事者の語りに基づく講義の実施、2学校における精神保健福祉教育の教材づくり、3精神障害当事者の語りに関する意義について検証していく予定である。研究はほぼ順調に進行しており、残額については次年度の入金をまって執行する予定である。次年度使用額(BーA)の53923円は、平成24年度における報告書の作成費(130000円)、語り部のブックレット(76000円)にあてる予定である。そのほか、次年度の研究費として、以下のものを予定している。1当事者に対する語りのインタビュー(20名×3000円)とそのテープ起こし代(200000円)2リーフレット作成費200000円3資料収集・語り部活動費(それに伴う研究協力費)200000円4分析等スーパーバイズ謝金100000円5学会発表・視察費300000円
低熱膨張性リン酸塩ガラスおよびガラスセラミックスの製造

リン酸塩を主要成分とするNa_2O-TiO_2-P_2O_5-SiO_2系とNa_2O-TiO_2-P_2O_5-GeO_2系とからそれぞれ新種ガラスおよびガラスセラミックスの製造を試み,得られたガラスおよびガラスセラミックスに対して次のような物性を明らかにした。成果は次の通りである。1.上記の二つの系のガラス化範囲を決定した。組織に多少の違いは認められるが,おおむねNa_2Oが03mol%,SiO_2またはGeO_2が510mol%のとき,TiO_2を5070mol%含有するガラスが得られた。このような高濃度のTiO_2を含有するリン酸塩ガラスの製造に成功したのは本研究が初めてである。2.ガラスの密度は2,973.14g・cm^<-3>,ガラス転移点は611638°C,熱膨張係数(30550°C)は2.63.5×10^<-1>°C^<-1>の範囲であった。熱膨張係数はP_2O_5を主要成分とするガラスとしては極めて低い値で,これまでに研究された複リン酸塩セラミックスのそれに匹敵するものであった。3.これらのガラスを再加熱したとき生成する結晶相は,TiO_2(アナタ-ス),TiP_2O_7,(TiO)_2P_2O_7,NaTi_<2-X>(PO_4)_3,またはNaTi_<2-X>Ge_X(PO_4)_3であった。4.Na_2O-TiO_2-P_2O_5-SiO_2系ガラスからは,十分な機械的強度を有するガラスセラミックスを製造することができた。このガラスセラミックスの熱膨張係数はさらに低く,2.1×10^<-6>°C^<-1>(30600°C)であり,再加熱の条件を検討することにより,これ以上の低下も期待できる。5.ガラスセラミックスの低熱膨張化は,(TiO)_2P_2O_7およびNaTi_<2-X>Si_X(PO_4)_3の生成によるものである。
細胞接着因子ギセリンの成熟神経系における新しい機能解析

1)ギセリンのゲノミッククローニングと上流解析我々はマウスギセリン遺伝子のクローニングを行い、16個のエクソンから構成されていること、2種類のアイソフォームはエクソン15のオルタナティブスプライシングにより生じる事を明らかとした。さらにギセリン遺伝子の上流解析を行った。このために上流域6kbpのクローニングを行い、さらに上流域をルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドに導入した。さらに、このプラスミドをPC12細胞に導入し、各種の増殖因子による刺激への反応性の検討を行った。更にその中で反応を示す因子に関してはその責任領域を決定するために上流域の各種欠損ミュータントを作製しその責任領域を決定した。次いでゲルシフト法を行い、そこに結合する転写因子の存在を確認し、刺激によるその結合の増大を確認した。2)PC12細胞における神経突起伸展へのギセリンの影響の検討PC12細胞に1-ギセリン発現プラスミド、コントロールとしてギセリンの膜貫通領域のみを含むプラスミドを導入し、コントロールに比してギセリン全長の発現増大によりNGFによる神経突起伸展が増強することを明らかとした。3)トランスジェニックマウス作製ギセリンの神経系における機能を解析するために、L-ギセリンcDNAをニューロフィラメント遺伝子のプロモーターの下流に結合させたものをマウスに導入したトランスジェニックマウスの作成を行った。この際にGFPをニューロフィラメントプロモーターにつないだものも同時に導入し、これまでに3系統のダブルトランスジェニックマウスと1系統のGFP単独発現トランスジェニックマウスを樹立させた。1)ギセリンはラットにおいては成熟神経系においても発現が認められる。ギセリン発現神経細胞とミエリン細胞の関係を明らかとするために、ラット海馬のPrimary cultureを行った。その結果ギセリンは神経細胞で発現が高く、非神経細胞での発現は認められなかった。ギセリンの発現は培養を継続すると消失するが、細胞同士の接触点でのみ発現が局在し、継続することが明らかとなった。一方、末梢においては脊髄後根神経節細胞の培養を行ったが、神経細胞における発現は弱く、支持細胞における強い発現が見られた。また、神経の切断実験では、切断部位におけるシュワン細胞でのギセリンのさらなる発現上昇が見られた。2)ギセリンの細胞における働きを検討するためにラットギセリン発現細胞を作製した。その形態を観察したところ、微絨毛が伸張していることを見いだした。この微絨毛の伸張はL-ギセリン発現細胞に特徴的であり、ギセリンが神経突起の伸張に加え、微絨毛の伸張にも関与していることが明らかとなった。さらに細胞内での結合蛋白質として、細胞骨格系のアクチンがあることが明らかとなった。3)ギセリン発現細胞上でギセリン発現神経細胞を培養すると神経突起の伸張が確認できたがこれに加え、PC12細胞にギセリンを導入し、神経突起が伸張するかを検討した。その結果、細胞にギセリンを導入するとさらなる突起の伸張が確認できた。4)L-及びS-ギセリンの機能をさらに検討するために各ギセリンに特異的な抗体を作製した。ギセリンは免疫グロブリンスーパファミリーの細胞接着因子である。ギセリンは我々がニワトリ神経系において発生期に発現する分子として見い出したが、現在までに、マウス及びラットのギセリンをクローニングし、その機能を解析中である。本研究はミエリンとの相互作用等神経突起伸展におけるギセリンの機能を明らかにすることであり、我々はギセリンを発現するPC12細胞を用いて、神経突起伸展について検討を行った。また、ギセリンを発現するBl6細胞を用いて、細胞内におけるギセリンの機能を解析した。その結果、1)細胞におけるギセリンの分布が微絨毛に豊富であることを明かとし、さらに微絨毛伸展に関与していることを明かとした。2)ギセリンには細胞内領域の異なる2種類のアイソフォームが存在するが、なかでも、細胞内領域の長いL-ギセリンが微絨毛の伸展作用を持つ事を明かとした。

3)また、その細胞内領域の中でも、2139番目のアミノ酸領域がモエシンと結合し、微絨毛伸展作用を持つことを明かとした。一方、細胞内領域の短いS-ギセリンには微絨毛伸展活性は無く、モエシンとも結合しないことを明かとした。4)ギセリンの2つのアイソフォームの機能的差異を明かとするために各アイソフォームに対する特異的抗体を作成した。現在この抗体を用いてそれぞれのアイソフォームの機能を解析中である。5)また、各アイソフォームの機能を明かとするために各細胞内領域をベイトとした結合タンパク質のスクリーニングをイーストツーハイブリットシステムを用いて行った。現在までに数個のクローンを得ており、その機能を解析中である。6)ギセリンは神経細胞に発現するアイソフォームにより神経突起伸展作用が異なることを明かとしている。1)ギセリンのゲノミッククローニングと上流解析トランスジェニックマウス及びノックアウトマウス作成を視野に入れてマウスギセリンのゲノミッククローニングを行い、上流域8kを含む15kbpのクローンを単離し、全エクソンイントロン構造と上流域の決定を行った。この結果、ギセリン遺伝子は16個のエクソンから成り、アイソフォームはエクソン15のスプライシングによるものであることが確認できた。さらに、上流域の解析のために、各種の長さの上流域をルシフェラーゼレポーターにつなぎ、現在転写シスエレメントの解析を行っている。その結果、特定のグロースファクターに反応し、ギセリンの発現が上昇することが確認された。一方、コンディショナルノックアウトマウス作成のために、ターゲティングベクターを作成中である。さらに、転移に関するギセリンの機能を解析するために、アイソフォームスペシフィックトランスジェニックマウス用ベクターを作成中である。2)細胞内領域の機能解析ラットギセリンとGFPとの融合蛋白質発現ベクターをPC12細胞に導入し、神経細胞に発現するギセリンの機能を解析した。その結果、細胞内領域の異なるs-ギセリンとl-ギセリンでは神経突起伸展に相反する作用があることが明らかとなった。3)ラットギセリン細胞内領域に結合するタンパク質の検索ラットギセリンは細胞接着因子としての機能を持っているが、細胞内領域のみ異なる2種類のアイソフォームが存在することから、その細胞内領域にはそれぞれ異なった働きが有ると推察された。そこでs-及びl-ギセリンの細胞内領域に結合するタンパク質の検索を行い、数個の候補クローンを単離した。現在、各アイソフォームとGSTとの融合タンパク質を用いたプレイとの結合実験を行い、真に細胞内領域に結合するかの確認中である。1)ギセリンのゲノミッククローニングと上流解析我々はギセリン遺伝子のクローニングを行った後、その遺伝子の上流解析を行った。このために上流域6kbpのクローニングを行い、さらに上流域をルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドに導入した。さらに、このプラスミドをPC12細胞に導入し、各種の増殖因子による刺激への反応性の検討を行った。
細胞遊走を負に制御する新規細胞内シグナルリング機構の探索

スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)のユニークな生理活性としてS1P受容体サブタイプ依存的な二方向性細胞運動制御が挙げられる。我々は、S1P受容体の中でS1P1とS1P3はともにRacの活性を促進して化学遊走を誘導するが、逆に、S1P2は化学走化因子によるRac活性化を抑制して化学遊走を抑制すること、さらにS1P2によるRac抑制はG12/13-Rho情報伝達経路を介することを明らかにしてきた。平成16年度は、Rhoキナーゼ阻害薬や一部分のエフェクターとのみ相互作用する活性型RhoA二重変異体を用い、S1P2による細胞運動・Rac活性・アクチン骨格調節におけるRhoキナーゼの役割を検討した。Rhoキナーゼ阻害薬はS1P2によるstress fiber形成は抑制したが、Rac活性、細胞遊走およびラッフル膜形成は抑制しなかった。Rhoキナーゼと相互作用するV14-RhoAあるいはV14, C42-RhoAの発現はCHO細胞においてstress fiberを形成したが、Rhoキナーゼを活性化しないV14, A39-RhoAの発現はstress fiberを形成しなかった。これら3種類の活性型Rho変異体はいずれも、CHO細胞及びCOS7細胞の化学走化因子に対する化学遊走を抑制し、COS7細胞においてGTP結合型Rac1量を減少させた。以上の結果から、Rhoキナーゼの関与は否定的であった。平成17年度は、細胞遊走の抑制を来すRacの抑制が、Rhoのどのエフェクターを介して引き起こされるのかRNA干渉法を用いて同定を試みた。PKN1、PKN2、CRIK、mDia1、RhotekinのsiRNAのCHO細胞への導入により各Rhoエフェクターの蛋白質発現量が特異的に抑制されることをウエスタンブロット法で確認した。mDia1siRNAの細胞内導入はS1Pによるストレスファイバー形成を阻害した。しかしながら、上記siRNA各種を細胞内導入してもinsulin-likegrowth factor I(IGF-I)による細胞遊走、およびS1P2受容体を介したS1Pによる細胞遊走抑制には影響を与えなかった。また、Rhoキナーゼ阻害剤はS1Pによるストレスファイバー形成を抑制したが、S1P細胞遊走およびラッフル膜形成の抑制には影響しなかった。S1P2受容体によるRac活性・細胞遊走の抑制には、Rhoの活性化が必須である。RhoによるRacの抑制機序として、神経細胞やある種のリンパ細胞では、RhoエフェクターであるRhoキナーゼの関与が示されているが、私達の実験系(CHO細胞)では、Rhoキナーゼ阻害薬は無効であった。さらに、Rhoキナーゼ以外のRhoエフェクターのsiRNAの細胞内導入で特異的に該当蛋白質の発現量を抑制しても、S1P2受容体を介した細胞遊走抑制は阻害されなかった。これらの結果から、RhoによるRac活性の抑制が、未知のRhoエフェクターによるものか、エフェクターを介さずにRhoの直接の作用によるものか、また、既知のRhoエフェクターが複数関与するのか、等の可能性が考えられた。

S1P2受容体によるRac活性・細胞遊走の抑制には、Rhoの活性化が必須である。RhoによるRacの抑制機序として、神経細胞やある種のリンパ細胞では、RhoエフェクターであるRhoキナーゼの関与が示されているが、私達の実験系(CHO細胞)では、Rhoキナーゼ阻害薬は無効であった。さらに、Rhoキナーゼ以外のRhoエフェクターのsiRNAの細胞内導入で特異的に該当蛋白質の発現量を抑制しても、S1P2受容体を介した細胞遊走抑制は阻害されなかった。これらの結果から、RhoによるRac活性の抑制が、未知のRhoエフェクターによるものか、エフェクターを介さずにRhoの直接の作用によるものか、また、既知のRhoエフェクターが複数関与するのか、等の可能性が考えられた。スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)のユニークな生理活性としてS1P受容体サブタイプ依存的な二方向性細胞運動制御が挙げられる。我々は、S1P受容体の中でS1P_1とS1P_3はともにRacの活性を促進して化学遊走を誘導するが、逆に、S1P_2は化学走化因子によるRac活性化を抑制して化学遊走を抑制すること、さらにS1P_2によるRac抑制はG_<12/13>-Rho情報伝達経路を介することを明らかにしてきた。Rhoのエフェクターには、キナーゼ活性を持つRhoキナーゼ、プロテインキナーゼNやシトロンキナーゼ及びキナーゼ活性を持たないDia、Rhotekin等が現在知られている。RhoによるRac抑制の機序として、神経細胞や白血球細胞ではRhoキナーゼの関与が示されている。その関与を検討するために、Rhoキナーゼ阻害薬や一部分のエフェクターとのみ相互作用する活性型RhoA二重変異体を用い、S1P_2による細胞運動・Rac活性・アクチン骨格調節におけるRhoキナーゼの役割を検討した。Rhoキナーゼ阻害薬はS1P_2によるstress fiber形成は抑制したが、Rac活性、細胞遊走およびラッフル膜形成は抑制しなかった。Rhoキナーゼと相互作用するV14-RhoAあるいはV14,C42-RhoAの発現はCHO細胞においてstress fiberを形成したが、Rhoキナーゼを活性化しないV14,A39-RhoAの発現はstress fiberを形成しなかった。これら3種類の活性型Rho変異体はいずれも、CHO細胞及びCOS7細胞の化学走化因子に対する化学遊走を抑制し、COS7細胞においてGTP結合型Rac1量を減少させた。以上の結果から、Rhoキナーゼの関与は否定的であった。今後、Rhoキナーゼ以外のRhoエフェクターの細胞運動・Rac抑制への関与について検討を進めていく予定である。我々は、S1P受容体の中でS1P_1とS1P_3はともにRacの活性を促進して化学遊走を誘導するが、逆に、S1P2は化学走化因子によるRac活性化を抑制して化学遊走を抑制すること、さらにS1P_2によるRac抑制はG_<12/13>-Rho情報伝達経路を介することを明らかにしてきた。本年度では細胞遊走の抑制を来すRacの抑制が、Rhoのどのエフェクターを介して引き起こされるのかRNA干渉法を用いて同定を試みた。
アレルギー患者におけるIL-18の動態と意義の解明

アレルギー発症の原因因子としてのIL-18の意義付けを検討し、当該研究期間内に以下の結果が得られた。1)IL-18はIL-3の共存下に好塩基球やマスト細胞に作用して、IL-4、IL-13そしてヒスタミンの産生を誘導する。2)IL-18はIL-2の共存下にナィープCD4^+T細胞に作用して、CD40リガンドの発現とIL-4の産生を誘導する。3)ナイーブCD4+^T細胞は抗原刺激存在下にIL-18で刺激されると、T細胞由来のIL-4によって、Th2細胞に分化する。4)無処置のBAL/cマウスにIL-18を単独投与するだけで、投与量に依存して血中にIL-4とIL-13の産生が誘導され、更にIgE産生が誘導さる。一方、5)IL-4Rα鎖遺伝子欠損マウス、IL-4遺伝子欠損マウス又は、CD4^+T細胞を除去したBALB/cマウスにIL-18を投与してもIgE産生は誘導されないこと、さらに6)可溶型IL-13Rα2を投与してIL-13活性を中和したBALB/cマウスにIL-18を投与してもIgE産生は誘導されないことから、IL-18によるIgE産生誘導はCD4^+T細胞から産生されるIL-4に依存していることが明らかとなった。最後に、5)caspase-1(IL-18前駆体を成熟型IL-18に変関する酵素)トランスジェニックマウスを作製した。このマウスは、出生初期から血中IL-18は高値を示し、高濃度のIgEを産生し、ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した疾患を発症する。6)卵白アルブミン特異的T細胞レセプターを発現するトランストランスジェニックマウス(DO11.10)に抗IgD抗体を投与すると、Th2細胞の誘導が認められないにも関わらず、IL-18産生の上昇に伴ってIgE産生が認められた。7)この抗IgD抗体によるIgE産生は、抗IL-18抗体の生体内投与によって内因性IL-18を中和することで抑制された。以上の結果から、DO11.10マウスへの抗IgD抗体によるIgE産生誘導は、IL-18による"自然型IgE産生"の有効な実験モデルマウスと考えられた。8)アトピー性皮膚炎のモデルマウスであるNC/Ngaマウスでは、皮膚炎発症前から血清IL-18が高値を示し、IgE抗体が上昇するに従って皮膚アトピー様症状を発症した。9)アトピー患者と正常人のIL-18産生能を比較検討した結果、アトピー性皮膚炎患者血清中のIL-18値は高値を示し、IgE値との相関した。以上の結果は、"IL-18の過剰発現に起因するアレルギーの発症"という全く新しいアレルギーの誘導メカニズムを提供するものである。この様な研究結果を通じて、我々は生体内におけるIgE抗体産生には、アレルゲンが関与する"獲得型IgE産生"と関与しない"自然型1gE産生"があり、IL-18は"自然型IgE産生"の誘導因子であると考えるに至った。以上の結果から、DO11.10

マウスへの抗IgD抗体によるIgE産生誘導は、IL-18による"自然型IgE産生"の有効な実験モデルマウスと考えられた。8)アトピー性皮膚炎のモデルマウスであるNC/Ngaマウスでは、皮膚炎発症前から血清IL-18が高値を示し、IgE抗体が上昇するに従って皮膚アトピー様症状を発症した。9)アトピー患者と正常人のIL-18産生能を比較検討した結果、アトピー性皮膚炎患者血清中のIL-18値は高値を示し、IgE値との相関した。以上の結果は、"IL-18の過剰発現に起因するアレルギーの発症"という全く新しいアレルギーの誘導メカニズムを提供するものである。この様な研究結果を通じて、我々は生体内におけるIgE抗体産生には、アレルゲンが関与する"獲得型IgE産生"と関与しない"自然型1gE産生"があり、IL-18は"自然型IgE産生"の誘導因子であると考えるに至った。初年度は,マウスを用いた実験から,アレルギー発症の原因因子としてのIL-18の意義付けを検討し、以下のような結果が得られた.1)IL-18は好塩基球やマスト細胞に作用して,IL-4,IL-13そしてヒスタミンの産生を誘導する.2)IL-18はIL-2の共存下にナイーブCD4^+T細胞に作用して,CD40リガンドの発現とIL-4の産生を誘導する.3)ナイーブCD4^+T細胞は抗原刺激存在下にIL-18で刺激されると,T細胞由来のIL-4によって,Th2細胞に分化する.4)無処置のBALB/cマウスにIL-18を単独投与するだけで,投与量に依存して血中にIL-4とIL-13の産生が誘導され,更にIgE産生が誘導さる.一方,5)IL-4Rα鎖遺伝子欠損マウス,IL-4遺伝子欠損マウス又は,CD4^+T細胞を除去したBALB/cマウスにIL-18を投与してもIgE産生は誘導されないこと,さらに6)可溶型IL-13Rα2を投与してIL-13活性を中和したBALB/cマウスにIL-18を投与してもIgE産生は誘導されないことから,IL-18によるIgE産生誘導はCD4^+T細胞から産生されるIL-4に依存していることが明らかとなった.最後に,5)caspase-1(IL-18前駆体を成熟型IL-18に変関する酵素)トランスジェニックマウスを作製した.このマウスは,出生初期から血中IL-18は高値を示し,高濃度のIgEを産生し,ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した疾患を発症する.以上の結果は,"IL-18の過剰発現に起因するアレルギーの発症"という全く新しいアレルギーの誘導メカニズムを提供するものである.今後はこれらの結果を基盤にして,ヒトアレルギー発症におけるIL-18の役割を明らかにしていきたいと考えている.平成12年度は、抗原刺激(アレルゲン)を伴わないIL-18単独投与によってIgE抗体産生を誘導しうることを明らかに、アレルゲンを特定できないアトピー患者においては、IL-18がIgE産生に深く関与している可能性を示した。この様な研究結果を通じて、我々は生体内におけるIgE抗体産生には、アレルゲンが関与する"獲得型IgE産生"と関与しない"自然型IgE産生"があり、IL-18は"自然型IgE産生"の誘導因子であると考えるに至った。平成13年度は、"自然型1gE産生"の概念を実験モデルマウスを用いて確立し、更にヒトアトピー患者におけるIL-18産生能を検討し、以下の様な結果が得られた。(1)卵白アルブミン特異的T細胞レセプターを発現するトランストランスジェニックマウス(D011、10)に抗IgD抗体を投与すると、IL-18の産生が認められ、Th2細胞の誘導を伴わずIgE産生が認められた。
神経免疫疾患における新規内在性レトロウイルスの検出とその病因的意義に関する研究

多発性硬化症は中枢神経系を病変の主座とする自己免疫性疾患と考えられている。その成因にはHLAをはじめとする遺伝的因子と、ウイルス感染をはじめとする様々な環境因子が複雑に関与していると想定されているが、環境因子の候補のひとつとして、レトロウイルスの関与が提唱されている。最近Perronらにより多発性硬化症患者の血漿および髄液から新規内在性レトロウイルスであるMSRV(multiple sclerosis retrovirus)がクローニングされた。しかし、MSRVの多発性硬化症における病因的意義は確立されていない。今回我々は日本人多発性硬化症患者からもMSRVが検出されるか否かについて検討を試みた。好中球より分離したゲノムDNAを鋳型とした場合、全ての多発性硬化症患者DNAよりMSRVに相当するバンドが増幅された。一方、血漿より単離したRNAから、RT-PCR法によりMSRVに相当するバンドの検出を試みたが、今回検討した日本人多発性硬化症患者からは検出されなかった。今回我々の検討でMSRVが検出できなかったのは、対象が疾患活動性の低い症例が多かったことによる可能性があると思われる。今後、MSRVの多発性硬化症における病因的意義に関しては、今後、初発および再燃例を含め、更に症例数を増やして検討する必要があると考えられる。また今回の研究期間中に得られた自己免疫の成因に関する成果として、β2glycoprotein Iの247番アミノ酸変異が本邦並びに欧米人の抗リン脂質抗体症候群の発症に果たす役割が明らかにされ、また慢性B細胞リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域の多様性が自己免疫の与える影響などについて明らかにできたことがあげられる。今回、日本人における新規のレトロウイルスの同定には至らなかったが、多発性硬化症をはじめ自己免疫疾患の成因に関する有益な結果が得られたと考えられる。最近、Perronらにより多発性硬化症(MS:multiple sclerosis)から斬規・内在性レトロウイルス(MSRV:multiple sclerosis retrovirus)が同定された。本研究で私は日本人MS患者におけるMSRVの関与に関して研究を進めている。MS患者および健常人の血漿よりRNAを抽出しDNasel処理した後、特異プライマーにより作成したcDNA、及び好中球より抽出したDNAを鋳型としてnested-PCR法によりMSRVのpol領域の増幅を試みた。その結果、好中球のDNAを鋳型とした場合には全ての検体からMSRVのpol領域が増幅された。これはPCR産物をアガロースゲルからサザンブロットし、特異プローブで検出することにより真のウイルスゲノムであることを確認している。今までのところ、日本人MS患者の血漿RNAからはMSRVのpol領域は検出されていないが、実験系の感度をさらに上げるとともに、未治療例や再燃例を中心に、解析を進める必要があると考えている。これと並行して、MSRVの多型性に関して、好中球より抽出したDNAを鋳型としてPCR法により得られたMSRV-PCR産物の塩基配列を決定し、そのポリモルフィズムの解析を並行して行っており、来年度さらに症例数を増やして検討することにより、健常人とMS患者で、MSRVゲノムのポリモルフィズム分布に、患者と健常人とで有意な差異が存在するか否かについて明らかにする必要があると考えられる。

最近Perronらにより多発性硬化症患者の血漿および髄液から新規内在性レトロウイルスであるMSRV(multiple sclerosis retrovirus)がクローニングされた。しかし、MSRVの多発性硬化症における病因的意義は確立されていない。今回我々は日本人多発性硬化症患者からもMSRVが検出されるか否かについて検討を試みた。好中球より分離したゲノムDNAを鋳型とした場合、全ての多発性硬化症患者DNAよりMSRVに相当するバンドが増幅された。一方、血漿より単離したRNAから、RT-PCR法によりMSRVに相当するバンドの検出を試みたが、今回検討した日本人多発性硬化症患者からは検出されなかった。今回我々の検討でMSRVが検出できなかったのは、対象が疾患活動性の低い症例が多かったことによる可能性があると思われる。今後、MSRVの多発性硬化症における病因的意義に関しては、今後、初発および再燃例を含め、更に症例数を増やして検討する必要があると考えられる。また今回の研究期間中に得られた自己免疫の成因に関する成果として、β2-glycoprotein lの247番アミノ酸変異が本邦並びに欧米人の抗リン脂質抗体症候群の発症に果たす役割が明らかにされ、また慢性B細胞リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域の多様性が自己免疫に与える影響などについて明らかにできたことがあげられる。今回、日本人における新規のレトロウイルスの同定には至らなかったが、多発性硬化症をはじめ自己免疫疾患の成因に関する有益な結果が得られたと考えられる。
アユ抗菌ペプチドの網羅的解析による冷水病耐性獲得の機構解明への取り組み

海産系アユ脾臓の酸抽出液より2種類の新規抗菌ペプチドを単離し、plecoglosin-1及びplecoglosin-2と命名した。Plecoglosin-1,-2を化学合成し、各種魚病細菌、さらにはアユ冷水病菌の原因菌に対する殺菌活性を検討した結果、いずれの魚病細菌に対しても殺菌活性を示すことが明らかとなった。本研究の目的は、冷水病菌の侵入経路にあたる体表粘液や鰓、さらには冷水病菌の主な感染部位である脾臓や肝臓で産生される構成分泌型及び誘導分泌型の抗菌ペプチドを、その電荷・疎水性・分子量に基づく多次元クロマトとLC-MSを併用して網羅的に解析し、その全体像を把握すると共に、湖産系及び海産系アユの冷水病菌に対する感受性の違いが“抗菌ペプチドの種類と産生量の違いによる"ことを証明することにある。本研究を実施することにより、湖産系及び海産系アユの組織で“構成的あるいは、冷水病菌感染により誘導的に合成・分泌される抗菌ペプチドの種類と構造に関する全体像"を把握することができるので、アユの自然免疫機構を解明する上で重要な情報を提供できる。さらに、アユの冷水病菌に対する感受性の差が抗菌ペプチドの種類や産生量、冷水病菌に対する抗菌活性の違いによることを証明できれば、冷水病菌に対する耐病性獲得の機構を明らかにすることが可能となる。1)平成24年度では、海産系アユ脾臓の粗抽出液を酸性、弱塩基性及び強塩基性画分に粗分画し、各画分の抗菌活性を測定したところ、強塩基性画分に最も高い抗菌活性が認められた。そこで、この画分をゲル濾過カラムクロマト、2段階の逆相HPLCにより抗菌ペプチドを単離した。さらに、プロテインシークエンサー並びにMS/MS解析により本ペプチドのアミノ酸配列を明らかにし、plecoglosin-1(PSLKPKLLKYD)と命名した。2)アユ脾臓抽出液の弱塩基性画分にも抗菌活性が確認されたことから、ゲル濾過カラムクロマト、2段階の逆相HPLCにより抗菌ペプチドを精製すると共に、プロテインシークエンサー並びにMS/MS解析によりアミノ酸配列を明らかにし、plecoglosin-2(PDGGFRLLGD)と命名した。1) H23及びH24年度の研究により、アユ脾臓中には2種の抗菌ペプチド、plecoglosin-1及びplecoglosin-2が存在することが明らかになった。そこで、2種の抗菌ペプチドplecoglosin-1,-2を化学合成し、逆相HPLCにより精製標品を得た。次いで、精製標品を用い、B.Subtilis, E. coliに加え、魚病細菌であるV. anguillarum, P.plecoglossicida, E. ictaluri、さらにはアユ冷水病菌の原因菌であるF. psychrophilumに対する殺菌活性を検討した結果、いずれの魚病細菌に対しても40320マイクロモルの濃度で50%以上の殺菌活性を示すことが明らかとなった。2)アユ脾臓Plecoglosin-1及びplecoglosin-2のN末側にCGGを付加したペプチドをそれぞれ作成した後、ウサギに免役し、抗血清を調製した。次いで、CGG付加ペプチド結合カラムを用いて抗体を精製した。本研究の目的は、冷水病菌の侵入経路にあたる体表粘液や鰓、さらには冷水病菌の主な感染部位である脾臓や肝臓で産生される構成分泌型及び誘導分泌型の抗菌ペプチドを、その電荷・疎水性・分子量に基づく多次元クロマトとLC-MSを併用して網羅的に解析し、その全体像を把握すると共に、湖産系及び海産系アユの冷水病菌に対する感受性の違いが"抗菌ペプチドの種類と産生量の違いによる"ことを証明することにある。本研究を実施することにより、湖産系及び海産系アユの組織で"構成的あるいは、冷水病菌感染により誘導的に合成・分泌される抗菌ペプチドの種類と構造に関する全体像"を把握することができるので、アユの自然免疫機構を解明する上で重要な情報を提供できる。

さらに、アユの冷水病菌に対する感受性の差が抗菌ペプチドの種類や産生量、冷水病菌に対する抗菌活性の違いによることを証明できれば、冷水病菌に対する耐病性獲得の機構を明らかにすることが可能となる。1)平成23年度では、海産系アユ200尾より、抗菌ペプチド精製用の試料として、体表粘液、鰓、脾臓、肝臓を採取し、冷凍保存した。2)脾臓の凍結組織より酸抽出液を調製し、Sep-Pak C18カートリッジによる脱塩後、SP-sephadex C-25により酸性,中性及び塩基性の3画分を得た。なお、各精製段階の試料については凍結乾燥し、0.1%酢酸に再溶解してタンパク質濃度を測定すると共に、供試菌体としてB. subtilisを用い、37°Cで1時間反応させた後、培地に接種して一夜培養後のコロニー数を求め、各段階希釈液のコロニー数を対照のそれと比較することで抗菌活性を求めた結果、中性及び塩基性画分に高い抗菌活性が存在することが明らかになった。3)脾臓の塩基性画分からゲル濾過カラムクロマト、2段階の逆相HPLCにより、分子量1000前後の抗菌ペプチドを単離した。平成24年度の段階において、海産系アユの脾臓より2種の新規抗菌ペプチドを単離し、さらに一次構造を明らかにすることに成功していることから、研究目的の達成度は高いと考えられる。アユ脾臓より新規抗菌ペプチドの単離に成功した。1.平成24年度までの実験により、海産系アユの脾臓には2種の新規抗菌ペプチドが存在することが明らかとなり、さらにデーターベース検索の結果hepcidinの存在も明らかになったことから、ペプチド合成機により3種の抗菌ペプチドを合成した後、逆相HPLCにより精製する。これら合成抗菌ペプチド標品を用い、F. psychrophilum, A. salmonicidaなどの魚病細菌に対する殺菌活性を測定する。2.合成Plecoglosin-1,-2及びhepcidinを標品とし、LC-MSにより各抗菌ペプチドに対する検量線を作成する。次いで、湖産系、海産系及び冷水病菌感染耐過前後のアユ組織より調製した酸抽出液を用いてLC-MSにより分析し、検量線から抗菌ペプチドの濃度を求める。この抗菌ペプチド定量実験により、湖産系、海産系及び冷水病菌耐過アユが産生する抗菌ペプチドの種類と産生量(組織中の濃度)を明らかにし、冷水病菌に対する抵抗性獲得との関連性を考察する。3.合成Plecoglosin-1,-2及びhepcidinとKLHとのコンジュゲーションを作成後、ウサギに免疫することにより、抗血清を得る。合成ペプチド結合sepharoseを用いて特異抗体を精製した後、アユ組織における各抗菌ペプチドの組織・細胞内局在を明らかにする。1)海産系アユの脾臓からの抗菌ペプチドの網羅的解析昨年度に調製した海産系アユ脾臓の中性画分にも高い抗菌活性が認められたので、両画分から分子量8000以下の粗ペプチド画分を得る。次いで、粗ペプチド画分を逆相HPLCにより溶出画分を得る。得られた各画分の抗菌活性を測定し、抗菌活性を示したすべての画分については、LC-MSによる分子量測定により純度を推定する。単一成分及び混合成分と推定されたピークについては、抗菌ペプチドを精製すると共に、一次構造を決定する。これらの結果に基づいて、海産系アユの鰓、脾臓、肝臓に存在する構成分泌型の抗菌ペプチドの種類と構造、さらにはF. psychrophilumに対する抗菌活性に関するリストを作成する。
精子形成過程におけるほ乳類ポリコーム群蛋白質のエピジェネティック制御機構の解明

精母細胞において、ポリコーム群タンパク質Ring1Bは、セントロメアやXY体のようなヘテロクロマチンだけでなく、ユークロマチン上へ局在する事が分かっている。Ring1A1B遺伝子欠損マウスの精母細胞で対合障害が起こっていることから、クロマチン修飾因子であるポリコーム群タンパク質が減数分裂期のどのステージに関与しているのか詳細に調べるため、遺伝子欠損マウスの表現型を解析した。まず、Ring1A1B遺伝子欠損マウスの精巣はコントロールに比べて非常に小さく、減数分裂期前期であるザイゴテン期で分化が停止している事が明らかとなった。遺伝的相同組み換えの際の交差の起こる場所(ホットスポット)がエピジェネティックな制御(ピストン修飾)を受けている事から、当初はホットスポットのヒストンメチル化修飾に影響があるのではないかと考えていたが、それは正常であった。しかし、核内全体のピストンH2Aのユビキチン化が消失していた。また、やはり核全体に局在しているはずのトリメチル化ピストンH3K27がペリセントロメリックヘテロクロマチン(PCH)に集積している事が分かった。その後の詳細な解析から、染色体の末端であるテロメアが核膜に結合できておらず、その細胞での核膜構造タンパク質であるラミンBの局在に異常が観察された。減数分裂期の一時期に、テロメアが核膜結合し、クラスターを形成することが多くの生物種で観察されている。この現象は、相同染色体同士の対合に対して重要な役割を果たしており、その後の減数分裂期の正常な進行に必須であると考えられている。ピストンH2Aユビキチン化、ピストンH3K27トリメチル化の局在がテロメアの核膜への結合へ必要なのか、それともRinglBがラミンBの重合に関与しているのか、現段階では結論はまだ出ていないが、今後の解析に期待したい。
収容可能性から見た大震火災時広域避難場所の設計条件

我国の都市防災対策においては、大地震時の同時多発火災と市街地大火に対処するため、東京都をはじめとして多くの都市で広域避難場所を指定している。しかし、既成市街地では公園等の既存施設に頼らざるを得ないが、現行の指定基準は火災からの安全距離等を考慮した有効面積と1人当り必要面積(一般に、1【m^2】1人が標準)のみによっている。広域避難場所は、たどりついた避難者を円滑に、かつ安全に収容しなければならない。東京都では総面積数10ha,収容予定人員数10万人という巨大な避難場所が数多くあり、これらの大規模避難場所では、数kmという長距離を歩行して到着した避難者が入口附近に密集,滞溜し、後続の避難者が入り込めないことも考えられる。以上の視点から、本研究においては、屋外の大規模集会等の観測から群衆分布の特性を分析し、避難場所内の群衆分布に関する各種パラメーターを設定した上で、避難場所内群衆分布モデルを開発した。このモデルを用いて、時々刻々到着する避難者の数,属性,火災の状況等を入力データとして収容可能性を分析し、広域避難場所の入口条件,植栽計画等の設計条件を摘出した。研究の実施にあたって、はじめに仮想的な避難場所を設定しモデルの整合性の検討,パラメーターの感度分析をおこなった。つぎに、東京区部の137ケ所の広域避難場所から文京区六義園をケーススタディとして選定した。各種の計算実験の結果、(1)入口はできだけ分散すること、(2)入口が集中している場合には、誘導柵等を設け、避難者を避難場所の奥に引き込むこと、(3)滞溜可能な場所は、避難場所の中央に設けること、等が収容入口の増大につながることが指摘された。また、今後の課題としては、各種パラメーターとアルゴリズムの精緻化があげられた。
電子移動によるケイ素-ケイ素結合の開裂と新規ケイ素-異原子間結合の形成

本研究では、反応性電極を用いた電極還元反応においてSi-Si結合が開裂し、活性なシリルアニオン種が発生することを見出した。特に、オリゴシランを形成するケイ素連鎖の数により結合開裂の傾向が異なり、電極還元法を用いることで、この差異を積極的に利用して、位置選択的に結合切断を行うことができることが明らかになった。また、このようにして発生させたシリルアニオン種を求核剤とすることで、新規ケイ素-ケイ素結合、ケイ素-ゲルマニウム結合、および、ケイ素-炭素結合形成反応が起こることを見出した。この方法の開発により、従来に例を見ない全く新しいタイプのポリシランを合成出来るだけでなく、シラン-ゲルマン共重合体を合成することも可能になった。また、電極還元反応により生成するシリルアニオンの再結合反応をも見出したが、この反応を利用すると、ポリシランや、シラン-ゲルマン共重合体の分子量を顕著に向上出来ることも明らかになった。さらに、ヒドロシラン類の電極還元重合反応により、構造規制を行ったポリシランを高収率で合成することにも成功した。
ガリレオ時代の自然研究

本研究では、ロベルト・ベラルミーノ、クリストファ・シャイナー、チェーザレ・クレモニーニ、およびガリレオ・ガリレイを中心として、彼らの自然観がどのようにして形作られたか、彼らの自然観はどのように影響しあっていたかを考察した。ベラルミーノ、シャイナーその他のローマ学院に学んだり、そこで教鞭をとっていた人びともまた、通説とは異なり、中世を通じて信じられていたキリスト教的=アリストテレス的自然観の欠点と限界を感じており、その改善に努めていたということが明らかとなった。この点では、クレモニーニやガリレオと変わるところがなかったのである。ただし、ローマ学院の関係者たちは現実の世界を説明でき、しかも聖書の記述と矛盾しない理論を探し求めていたのに対し、クレモニーニはアリストテレスをアラビアの哲学者アヴェロエスに従って再解釈することでその有効性を回復させようとしていた。ガリレオの場合はまったく異なり、観測された事実から出発して理論を構築していた。もっとも経験を批判抜きで受け入れることはなかった。彼の重要性はしばしば言われるように、経験、あるいは観測を重視したということにあるのではなく、それを処理する際に採用した方法のほうにあると考えるべきである。このような事実を考慮して、彼らの間に生じた論争は旧来の理論に固執する保守主義者と経験のみに基づいて議論を進めていた進歩的な人びととの対立といった図式で理解できるものではなく、旧来の理論とは調和しない経験的事実をどのように評価し、キリスト教的世界観に取り入れていくかという態度の相違から生まれたということを明らかにした。
P2Y受容体の膀胱における役割の解明および過活動膀胱治療標的としての可能性

P2Y6受容体特異的Knock outマウス(P2Y6KOマウス)と野生型マウス(WT)の下部尿路機能を比較・検討した。P2Y6KOマウスでは、代謝ケージにおける排尿行動の検討で有意に頻尿を呈していた。また、膀胱内圧測定において、有意に膀胱容量が少なく、膀胱コンプライアンスが低い結果であった。オルガンバスにおける膀胱切片を用いた各種収縮・弛緩実験において両群に差を認めなかった。これらの結果から、P2Y6受容体は排尿制御に重要な役割を果たしており、膀胱より上位の神経経路にその責任部位がある可能性が示唆された。本研究において、初年度はP2Y6受容体がマウスの排尿反射経路における各組織にてどの程度発現しているかをmRNAレベルで検討した。その結果、膀胱組織においてP2Y6受容体の発現を認めた。また、DRGや脊髄、橋や大脳などの排尿反射に関連する中枢神経系においてもその発現を認めた。また、P2Y6KOマウスとWTマウスを徐脳モデルにおけるCystomtry法における各パラメーターに関して比較した。その結果、P2Y6KOマウスはWTマウスに比較して、有意に膀胱容量が小さく、また膀胱コンプライアンスが悪いことを確認した。しかしながら、一方で排尿に関与する最大膀胱収縮力に関しては、両群に有意な差を認めなかった。P2Y6受容体ノックアウトマウスと野生型マウスの下部尿路機能を比較した。本研究の実験結果から、マウスにおいてP2Y6受容体は排尿制御に重要な役割を果たしており、その欠損により著しい頻尿となることが明らかとなった。本受容体はマウス膀胱上皮及び平滑筋に存在しているが、これら膀胱P2Y6受容体と頻尿行動との関連性は少ないことが示唆された。膀胱より上位の求心性神経路、DRG、脊髄等の中枢神経経路に存在するP2Y6受容体欠損が、頻尿行動の責任部位である可能性が示唆された。当初の実験計画とは、初年度と2年目の実験内容が前後した部分もあるがおおむね計画どおりに達成できていると考える。泌尿器科学、排尿学今後は膀胱組織内の部位別(尿路上皮粘膜下層筋層)のP2Y6受容体の発現の比較を行う予定である。また、オルガンバスにおけるP2Y6KOマウスとWTマウス由来の膀胱切片の各種刺激による反応性の違いを確認する予定である。計画通り実験は進んでいるが若干の繰越金が発生した。当初の計画通りマウス、試薬などの購入に充てる予定である。
小学校・中学校理科におけるマイクロスケール実験教材の開発

研究課題「小学校・中学校理科におけるマイクロスケール実験教材の開発」に関する研究実績は,下記の通りである.1.マイクロスケール実験に関する情報を,Chemical Abstractsらの抄録誌を用いて入手した.また,日本理科教育学会や日本化学会などの年会に参加して,研究の動向の把握に努めた.2.小学校第5学年理科「物の溶けかた」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.通常実験と比較して,試薬量を1/5に縮小できることを明らかにした.さらにこの内容に関して,小学生を対象とした授業実践を行い,有効性を確認した.3.小学校第6学年理科「水溶液の性質」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.通常実験と比較して,試薬量を1/10に縮小できることを明らかにした.さらにこの内容に関して,小学生を対象とした授業実践を行い,有効性を確認した.4.中学校理科第一分野「酸,アルカリと金属との反応」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量を1/10を縮小できることを明らかにした.5.中学校理科第一分野や高等学校化学IIの「水溶液」の単元で応用できる,アルコールと水の混合に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量は1/10に縮小できることを明らかにした.研究課題「小学校・中学校理科におけるマイクロスケール実験教材の開発」に関する研究実績は,下記の通りである.1.マイクロスケール実験に関する情報を,Chemical Abstractsらの抄録誌を用いて入手した.また,日本理科教育学会や日本化学会などの年会に参加して,研究の動向の把握に努めた.2.小学校第5学年理科「物の溶けかた」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.通常実験と比較して,試薬量を1/5に縮小できることを明らかにした.さらにこの内容に関して,小学生を対象とした授業実践を行い,有効性を確認した.3.小学校第6学年理科「水溶液の性質」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.通常実験と比較して,試薬量を1/10に縮小できることを明らかにした.さらにこの内容に関して,小学生を対象とした授業実践を行い,有効性を確認した.4.中学校理科第一分野「酸,アルカリと金属との反応」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量を1/10を縮小できることを明らかにした.5.中学校理科第一分野や高等学校化学IIの「水溶液」の単元で応用できる,アルコールと水の混合に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量は1/10に縮小できることを明らかにした.研究課題「小学校・中学校理科におけるマイクロスケール実験教材の開発」に関する本年度の研究実績は,以下の通りである.1.国内外の学会等におけるマイクロスケール実験に関する情報を収集した.日本理科教育学会全国大会(奈良)や化学教育国際会議(ソウル,韓国)に参加して,マイクロスケール実験に関する最新の情報を入手し,研究の動向の把握に努めた.2.小学校第5学年理科「物の溶けかた」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を進展させた.その結果,通常実験と比較して,試薬の量は1/5,実験時間は1/4に短縮できることを明らかにした.さらに,この内容を,群馬県下の第5学年児童を対象として授業実践を行い,有効性を明らかにした.研究成果は,「理科教室」,「理科の教育」や「群馬大学教科教育学研究」に発表した.3.小学校第6学年理科「水溶液の性質」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を進展させた.その結果,通常実験と比較して,試薬の量は1/5,実験時間は1/4に短縮できることを明らかにした.さらに,この内容を,群馬県下の第6学年児童を対象として授業実践を行い,有効性を明らかにした.4.群馬県下の小学校や中学校教員に,マイクロスケール実験を紹介した.マイクロスケール実験に関して既知の教員は僅少であった.しかし,ほとんどの教員が,マイクロスケール実験の長所を認め,将来,授業でマイクロスケール実験を取り入れたいという意向を示した.以上のように,平成18年度に関しては,主として,小学校理科におけるマイクロスケール実験の研究(教材開発並びに授業実践)に従事してきた.平成19年度には,主として中学校理科におけるマイクロスケール実験に関する研究に取り組む予定である.研究課題「小学校・中学校理科におけるマイクロスケール実験教材の開発」に関する本年度の研究実績は,下記の通りである.1.マイクロスケール実験関係の情報を,インターネットの検索エンジンや,Chemical Abstractsらの抄録誌,国内外の化学および化学教育関係の雑誌を利用して入手した.とりわけ,日本化学会の「化学と教育」やイギリス化学会のEducation in Chemistryに関しては,最新号より遡及調査を行った.また,日本理科教育学会や日本化学会の年会等に参加して,研究の動向の把握に努めた.2.中学校理科第一分野「酸(塩酸),アルカリ(水酸化ナトリウム水溶液)と金属(アルミニウム,亜鉛,マグネシウム)との反応」に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量を1/10に縮小できることが判明した.3.中学校理科第一分野や高等学校化学IIの「水溶液」の単元で応用できる,アルコール(エタノール)と水の混合に関するマイクロスケール実験に関して,研究を推進させた.その結果,通常実験と比較して,試薬量を1/10に縮小できることが判明した.4.日本理科教育学会
ビタミンＢ１２およびＦ４３０含有メチル基転位酵素の実践的機能モデル構築

本研究では、メチオニン合成酵素の作用機序解明のため、精密なモデル構築を行った。具体的にはメチオニン合成の活性中心であるコバラミン補因子を非天然の簡単なコリンコバルト錯体に置き換えて、アポミオグロビンに挿入した再構成タンパク質を調製した。得られたコバルト錯体を含むタンパク質は、Co(I)種を安定化し、さらにタンパク質内でコバルトーメチル錯体の形成および、遠位ヒスチジンへのメチル基転移反応の進行を引き起こすことを確認した。特に、タンパク質内でCo(I)種の結晶構造を初めて明らかにし、これまで予測されていたとおりCo(I)種構造が軸配位子が離脱した4配位の構造で存在していることを示した。本研究は、生体内で金属ー炭素結合を経由するメチル基転移反応を触媒するビタミンB12含有酵素(メチオニンシンターゼ)及びコファクターF430含有酵素(メチル補酵素Mレダクターゼ)のモデル系の構築と反応の追跡を実施し、まだ曖昧なメチル基転位反応の分子化学的作用機序を明らかにすることを目的としている。具体的には、コバルト錯体B12及びニッケル錯体F430に対する新しいモデル錯体分子を合成する。次に、得られた錯体をアポ化したミオグロビンのヘムポケットに挿入し、タンパク質マトリクスの中で錯体の物性・反応性を詳細に検討し、当該金属酵素反応に関連する新しい知見を得る。本年度は、前年度に得られたメチオニン合成酵素モデルの反応性について、評価を行った。このモデルは、コバルトコリノイド錯体を人工補欠分子として有するミオグロビンであり、すでにコバルト1価とコバルトメチル錯体の2つの中間体が生成することを明らかとした。さらに、今回、このコバルトメチル錯体のメチル基が、室温、約12時間で、ヘムポケット内に存在するヒスチジン64のイミダゾール環の窒素原子に転移することを、MALDI TOF MSのin source decay modeで確認した。さらにメチル化されたタンパク質をペプシンで分解し、そのフラグメントを質量分析と13C-NMRで同定することによって、直接的にヒスチジンがメチル化されたことを証明した。これは、メチオニン合成酵素におけるホモシステインからメチオニンへのメチル基転移のモデル反応であり、初めて天然に近い反応性を有するモデルを提案した。本年度は、まずビタミンB12(コバラミン)を模倣したテトラピロール配位子を有するコバルト錯体の合成を実施した。具体的には、ミオグロビンのヘムポケットに挿入するために、ヘムと同様に2本のプロピオン酸側鎖を有するコバルトテトラデヒドロコリン錯体を分子設計し、合成を行った。次に得られた錯体を、アポ化した(天然の補欠分子ヘムを除去した)ミオグロビンのヘムポケットに挿入し、再構成タンパク質を調製した。得られた再構成タンパク質については、NMR, MS, UV-vis、及びEPRによる同定を行い、狙い通りコバルトコリン錯体がヘムポケットに結合した再構成ミオグロビンが得られたことを示した。さらに結晶構造解析を行い、構造を明らかにした。次にこのタンパク質を還元し、これまで安定に得られなかったコバルト一価種の検出に成功した。特に、結晶解析も行い、之まで予想されていたように、4配位のコバルト1価錯体が、ヘムタンパク質の中で安定に確認された。また、このコバルト1価種にヨウ化メチルを添加して、活性種であるコバルトメチル錯体に変換されることも合わせて示した。具体的には、酵素のコファクターとして存在するコバルト錯体B12及びニッケル錯体F430に対する新しいモデル錯体分子を合成し、得られた錯体をアポ化したミオグロビンのヘムポケットに挿入して、タンパク質マトリクスの中で錯体の物性・反応性を詳細に検討する計画を立案した。