hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA損傷応答制御による慢性腎臓病の治療法開発

DNA損傷は変異蛋白産生の原因となり場合によっては細胞の癌化や機能不全を引き起こし、細胞レベルでの老化との関連も知られているが、臓器機能低下につながる線維化との関係は明らかになっていない。そこで、我々はDNA損傷に対する防御機構であるDNA損傷応答機構(DDR)に注目し、DDRの最上流で機能するATM and Rad 3-related (ATR)に注目して研究を進めた。そこでDDRによって維持されるゲノムDNAホメオスターシス維持機構が腎臓病に及ぼす影響を明らかにするため、動物モデル(遺伝子改変マウス)に種々の腎障害を作成し解析、ヒト腎生検検体を免疫染色にて解析、さらにヒト多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイド解析、の3つの大きな実験をすることでを総合的に評価した。マウスモデルにおいて、虚血再灌流、薬剤性さらに閉塞性の3種類の腎障害モデルを作成したところ、ATR機能欠失は結果として障害後の近位尿細管上皮細胞のDNA損傷を増幅させることが明らかとなった。その転帰として、急性腎障害は重症化し死亡率が上昇した。また生存した場合にも慢性腎臓病への移行が見られ、腎機能や腎予後と関連するパラメーターである腎間質線維化の増悪が認められた。またヒト腎臓病でもDNA損傷の関与が明らかになり、ATRの活性化とDNA障害の程度は逆相関していることが明らかとなった。ヒト多能性幹細胞由来のオルガノイドでも同様の現象を確認できた。つまり、初期段階でのDNA障害に対する機構はより重度のDNA障害を防ぐべく機能しており、腎臓病に対して保護的に働いていると考えられた。つまりDDR調節が腎機能の治療標的となり得ると考えられた。この結果は第61回日本腎臓学会総会、アメリカ腎臓学会にて報告し、現在学術誌に論文投稿中である。今回はDNA損傷に対する防御機構であるチェックポイント機構(DDR)に注目し、DDRの最上流であるATM and Rad 3-related (ATR)の尿細管特異的コンディショナルノックアウトマウス(ATRRPTC-/-)を作成し、種々の腎障害モデルで評価を進めている。まず、近位尿細管のDNAを直接障害する抗癌剤であるシスプラチン投与による急性腎障害モデルの解析をさらに進めた。ノックアウトマウスでは腎障害が増悪するが、ATRをノックアウトすることにより、尿細管上皮細胞のDNA障害が増幅されていること、より多くのアポトーシスが誘導されることが明らかになった。さらにp53-p21シグナルの活性化も増強しており、生存細胞においてはG2/M期での細胞周期の停止が増悪することが明らかとなった。次に、慢性腎臓病におけるDDRシグナルの異常とその病理学的指標である尿細管間質の線維化の直接の関係を作成するため、タモキシフェン投与後にマウスの一側の尿細管を結紮し、腎臓線維化のモデルであるUUOモデルを作成し腎病変を評価した。ノックアウトマウスではワイルドタイプと比較して、尿細管の障害が増悪し、TGF-βおよびCTGFの発現も増加を認め、より高度の腎線維化が認められた。動物モデルにおいて、当初の予測のとおりDDRの破綻が急性腎障害においても、腎尿細管間質線維化モデルにおいてもDNA障害を増悪させることを証明できた。そこで、我々はDNA損傷に対する防御機構であるチェックポイント機構(DDR)に注目し、DDRの最上流であるATM and Rad 3-related (ATR)に注目している。まずマウスモデルでの解析を行うため、近位尿細管特異的コンディショナルノックアウトマウス(ATRRPTC-/-)を作成し種々の腎障害モデルが及ぼす影響の解析を進めている。薬剤性、閉塞性に加えて虚血再灌流障害による腎障害モデルの解析を新たに追加した。これに加えてさらにヒトでの現象を確認するために、ヒト多能性幹細胞由来のオルガノイド、ヒト近位尿細管上皮細胞および当院にて倫理委員会の承認を得た、腎生検検体の解析を行った。マウス虚血再灌流モデルでは急性期の腎障害の程度にノックアウトマウスとコントロールマウスでは差がなかったが、その後の回復過程に差が生じ、腎機能の回復が遷延した。最終的にノックアウトマウス群では4週間後の腎臓の線維化が増悪した。オルガノイドにシスプラチン投与を行うと、ATRは活性化され、DNA障害も起こることが明らかとなった。ATRを低分子化合物で阻害するとシスプラチンや低酸素による尿細管上皮細胞のDNA障害が増悪し、細胞死も増えていた。さらに腎生検検体の解析では、腎機能と近位尿細管のDNA障害の程度は逆相関することが明らかとなった。さらにATRの活性化とDNA障害の程度は逆相関していることが明らかとなった。つまり、初期段階でのDNA障害に対する機構はより重度のDNA障害を防ぐべく機能している可能性を示唆している。マウスモデルにおいて、当初の予測のとおりDDRの破綻が急性腎障害においても、腎尿細管間質線維化モデルにおいてもDNA障害を増悪させることを証明できたことのみならず、加えて、実際にヒト検体を用いた検討においてもDDRが腎臓病の進展に影響していることが証明できたため。

DNA損傷は変異蛋白産生の原因となり場合によっては細胞の癌化や機能不全を引き起こし、細胞レベルでの老化との関連も知られているが、臓器機能低下につながる線維化との関係は明らかになっていない。そこで、我々はDNA損傷に対する防御機構であるDNA損傷応答機構(DDR)に注目し、DDRの最上流で機能するATM and Rad 3-related (ATR)に注目して研究を進めた。そこでDDRによって維持されるゲノムDNAホメオスターシス維持機構が腎臓病に及ぼす影響を明らかにするため、動物モデル(遺伝子改変マウス)に種々の腎障害を作成し解析、ヒト腎生検検体を免疫染色にて解析、さらにヒト多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイド解析、の3つの大きな実験をすることでを総合的に評価した。マウスモデルにおいて、虚血再灌流、薬剤性さらに閉塞性の3種類の腎障害モデルを作成したところ、ATR機能欠失は結果として障害後の近位尿細管上皮細胞のDNA損傷を増幅させることが明らかとなった。その転帰として、急性腎障害は重症化し死亡率が上昇した。また生存した場合にも慢性腎臓病への移行が見られ、腎機能や腎予後と関連するパラメーターである腎間質線維化の増悪が認められた。またヒト腎臓病でもDNA損傷の関与が明らかになり、ATRの活性化とDNA障害の程度は逆相関していることが明らかとなった。ヒト多能性幹細胞由来のオルガノイドでも同様の現象を確認できた。つまり、初期段階でのDNA障害に対する機構はより重度のDNA障害を防ぐべく機能しており、腎臓病に対して保護的に働いていると考えられた。つまりDDR調節が腎機能の治療標的となり得ると考えられた。この結果は第61回日本腎臓学会総会、アメリカ腎臓学会にて報告し、現在学術誌に論文投稿中である。今回作成した腎障害モデルをさらに解析することにより、腎障害において幅広くDDRが果たしている役割を解明する。これに加えて、AKIからCKDの移行を考えるために、両側腎動脈虚血/再灌流(IRI)やアリストロキア酸腎症モデルの作成と解析を進める。また、実際にヒト腎生検組織を用いてヒトの腎臓病にもDDRが認められるのか、腎機能や腎予後の指標である尿細管間質の線維化と関連があるのか評価を進めていく。フェノタイプに加えてメカニズム解析のため、細胞周期や老化に注目したシグナルに関してのマウスの解析を進めている段階である。これら結果をまとめ論文投稿の準備を進めていく予定とする。虚血再灌流手術は厳密な体温管理が必要であるため、直腸温センサーならびにマウス体温を一定に保つヒートパッド購入予定であったが、効率よく一定数のマウスに手術を行うには3セット必要であることが後に明らかになったが、3セットの購入を行った場合、他の物品の購入が困難な状況になることが明らかになったため、先に上記の特別な装置を必要としないシスプラチン腎症モデルのさらなる解析を進め、片側尿細管結紮術モデルを作成、評価した。虚血再灌流手術や尿管結紮に必要な温熱装置が研究室内にあり共用物品で使用できたこと、免疫染色に必要な試薬や抗体のうち共通で使用できるものが多数あったため。
海藻バイオマス完全活用を目指した糖化酵素開発

海藻バイオマスに含まれる多糖類を効率よく糖化できる酵素システムを開発するため、海藻を主食とするアメフラシの消化液の多糖類糖化機構について研究を行った。アメフラシ消化液中に存在するセルロース、でんぷん、ラミナラン分解に関与する酵素を同定し、これらの酵素の作用機構を解析するとともに、大量発現と応用をめざし、cDNAクローニングを行った。また、褐藻類の海藻に多く含まれ、多糖分解酵素に強い阻害作用を示すフロロタンニンの作用を抑制することにより、褐藻類の消化作用を促進するEHEP (Eisenia Hydrolysis Enhancing Protein)を発見し、その作用機構について解析した。でんぷん分解に関与するアメフラシ消化液に存在する酵素として、2種類の59 kDa, 80 kDa α-アミラーゼ(Amy)、2種類の74 kDa, 86 kDa α-グルコシダーゼ(AGL)を精製し、でんぷん、マルトヘプタオース、グリコーゲン、デキストラン等の基質に対する作用機作について解析し、59kDa, 80kDaアミラーゼの主要プロダクトは、それぞれマルトトリオース、マルトースであり、一方74kDaのα-グルコシダーゼに比べ、80kDaのα-グルコシダーゼは、α-1,6結合を含むアミロペクチンをよく切断することを明らかにした。さらに、でんぷん分解に関与する4種類の酵素およびセルロース分解に関与する95, 65, 45, 21kDa β-1,4-エンドグルカナーゼ(EG)、210, 110kDa β-グルコシダーゼ(BGL)の内部アミノ酸配列からプライマーを設計し、アメフラシ肝膵臓cDNAよりPCRクローニングを行い、大量発現系構築の準備を進めた。さらに、アラメの消化を促進する25kDaの蛋白質を同定し、その作用機構について解析した。また、アルギン酸ビーズを用いて固定化したBGLの有用性を証明した。以上の成果のうち、アメフラシのでんぷん分解系システムについては、FEBS Open Bio (2014) 560-570に発表した。アメフラシ消化液に存在する多糖類分解酵素の構造解析、および大量発現と応用をめざし、cDNAクローニングを行い、110kDa β-グルコシダーゼ(BGL),59kDa、80kDa α-アミラーゼ(Amy)、45 kDa, 21kDa β-1,4-エンドグルカナーゼ(EG)は、完全長のcDNAを得た。74 kDa, 86 kDa α-グルコシダーゼ(AGL)、95kDa, 65kDa β-1,4-エンドグルカナーゼについては、全体の90%程のcDNAを得、現在5'-RACEによって完全長cDNAクローニングを進めている。さらに、アラメ消化液と種々の海藻を反応すると、最も多くのグルコースが遊離するのはアラメ(乾燥重量10mgあたり2.5mgのグルコースが遊離)であるが、アラメとBGL、EG、ラミナリナーゼ等の精製酵素を反応してもほとんどグルコースの遊離は認められない。その原因を解析する過程で、アラメの糖化を促進する25kDaのタンパク質(EHEP)を同定した。EHEPはアラメに含まれるβ-グルコシダーゼ阻害物質であるフロロタンニンと結合し、その阻害作用を抑制することによってラミナランの糖化を促進することを明らかにした。EHEPのcDNAクローニングも行い、塩基配列を登録(LC122548)した。また、消化液に含まれる機能未知のタンパク質を精製し、アミノ酸配列情報を収集した。アメフラシ肝膵臓cDNAを鋳型としたPCR法によって多糖類分解酵素のクローニングを進め、45kDa, 21kDa EG、110kDa BGL、74kDa AGL、59kDa, 80kDa Amyは全長cDNAを得た。また、アラメの分解を促進するEHEPのクローニングも行ったので、現在、多糖類分解酵素やEHEPの酵母による発現系の構築を進めている。さらに、ラミナランを分解する新規の酵素CDEを同定し、そのクローニングも進めている。また、アラメの分解を促進するEHEPの作用機構を解析し、フロログルシノールから構成されるフロロタンニンと特異的に結合するポリフェノール結合タンパク質であることを明らかにした。EHEPの特異抗体を作製し、EHEPタンパク質の発現分布や生合成機構を解析する準備が整った。アメフラシ消化液に存在する多糖類分解酵素の構造解析、および大量発現と応用をめざし、110kDa β-グルコシダーゼ(BGL),59kDa、80kDa α-アミラーゼ(Amy)、45 kDa, 21kDaセルラーゼ(EG)をコードする完全長cDNAをクローニングと大腸菌または酵母による発現を試みた。110kDaBGLcDNA, 45kDa EGcDNAは、完全長のcDNAが得られたので、それぞれLC189267, LC189346としてDDBJに登録した。また、褐藻類の海藻でもアラメやカジメに多く含まれ、糖質分解酵素に阻害作用を示すフロロタンニンと結合し、その阻害作用を抑制することにより褐藻類の消化作用を促進するEHEP (Eisenia Hydrolysis Enhancing Protein)の大腸菌による発現も試みた。45kDa, 21kDa EGはともに大腸菌で発現すると不溶性画分に回収され、尿素による再生を試みたが可溶化できなかった。

一方、EHEPは、大腸菌で可溶化すると不溶性画分に回収されたが、8M尿素で可溶化後、徐々に尿素濃度を減少させることにより再生することができ、活性も有していた。EHEPについては北海道大学との共同研究を進め、消化液から精製した標品を用いて結晶構造解析を行い、立体構造を決定した立体構造解析の結果より、大腸菌による発現系を利用して部位特異的変異体を作成し、フロロタンニンとEHEPの結合様式を分子レベルで分析することが可能となった。さらに21kDaセルラーゼはセルロースと結合し、セルロース分解に重要な役割を持つことを見出した。以上、アメフラシ消化液中に含まれる多糖類分解酵素を用いて、海藻の中でバイオマスとして有望なアオサと褐藻類であるアラメの効率的な酵素糖化システムについて明らかにした。海藻バイオマスに含まれる多糖類を効率よく糖化できる酵素システムを開発するため、海藻を主食とするアメフラシの消化液の多糖類糖化機構について研究を行った。アメフラシ消化液中に存在するセルロース、でんぷん、ラミナラン分解に関与する酵素を同定し、これらの酵素の作用機構を解析するとともに、大量発現と応用をめざし、cDNAクローニングを行った。また、褐藻類の海藻に多く含まれ、多糖分解酵素に強い阻害作用を示すフロロタンニンの作用を抑制することにより、褐藻類の消化作用を促進するEHEP (Eisenia Hydrolysis Enhancing Protein)を発見し、その作用機構について解析した。大量発現系構築のため、分解酵素の内部アミノ酸配列からプライマーを設計し、アメフラシ肝膵臓cDNAを鋳型としたPCR法によってセルロース、でんぷん分解酵素のクローニングを進めた。これまでに45kDa, 21kDa EG, 110kDa BGL, 74kDa AGL, 59kDa Amyは全長cDNAを得た。95, 65kDa EG, 80kDa Amy, 86kDa AGLについては5'-RACEによって完全長cDNAのクローニングを行っており、近いうちに210kDa BGLを除いて、9種類のグリコシダーゼの酵母を用いた発現系の研究を開始できる準備が整った。さらに、アラメに多く含まれるラミナランはBGLによって加水分解され、効率よくグルコースが産生されるが、アラメとBGLを反応してもグルコースは産生されない。そのため、アメフラシ消化液中にBGLによるアラメ分解を促進する蛋白質がないか検索したところ、25kDaのBGL分解促進蛋白質を同定し、この25 kDaの蛋白質のクローニングも開始した。また、アルギン酸ビーズで固定化することによって、BGLやAGLはセルロースやでんぷんの分解産物からのグルコース産生反応に複数回(10回程度)使用可能で、酵素コストを減らすことができることを示した。既にクローニングを終了、または進行中のセルロースとラミナラン分解系、及びでんぷん分解系を構成する消化酵素の酵母による大量発現を構築し、海藻の種類に応じた酵素糖化システムの確立をめざす。今回、特に褐藻類に含まれるフロロタンニンと結合し、その酵素阻害作用を抑制することによって、ラミナラン分解を促進するEHEPを発見したので、EHEPと精製酵素による、ラミナラン含量が高く、グルコース産生量が海藻の中で最も高いアラメの糖化に至適化した酵素カクテルを作成する。また、EHEPの作用機構をさらに解析するためには、EHEPの立体構造解析が必須であるため、北海道大学とX線結晶構造解析について共同研究を開始した。
mRNAの翻訳と分解を制御する新規G蛋白質群の機能

我々は翻訳終結因子であるeRF3/GSPTが、eRF1と相互作用し翻訳終結過程を制御する一方で、ポリA鎖結合蛋白質(PABP)とも相互作用し翻訳終結と共役してmRNA分解過程を制御していることを示してきた。本研究の目的は、この翻訳終結と共役したmRNA分解の分子機構の詳細を明らかにすることにある。平成16年度においては、特にeRF3/GSPTのGTP結合蛋白質(G蛋白質)としての性質に着目し、共役過程においてこのG蛋白質としての特性がどのように使われているかを検討し、以下の知見を得た。(1)eRF3/GSPTはGTP結合型においてeRF1と結合し、このようなGTPの効果は、他のヌクレオチド(ATP, UTP, CTP, ITP)では観察されない。また、GDP結合型においてeRF3/GSPTは、eRF1から解離する。eRF3/GSPTのGTP結合部位に変異を導入するとeRF1との結合が阻害されることからもこのGTP依存性の重要性が裏付けられた。また、このような変異をもつ細胞株を作製し翻訳終結過程を調べると異常が観察されることから、eRF3/GSPTへのGTPの結合が翻訳終結において必須の役割を果たしていることを証明することができた。(2)一方、eRF3/GSPTとPABPとの結合に関しては、GTP結合型、GDP結合型に関わらず観察され、eRF3/GSPTのGTP結合部位の変異による影響も観察されなかった。しかしながら、このような変異をもつ細胞株において、mRNA分解過程には異常が観察され、mRNA分解過程がGTP依存的な翻訳終結過程と共役しているということを強く示唆した。(3)さらに、eRF3/GSPTの機能欠損株においてeRF1を過剰発現すると翻訳終結は正常なレベルに回復するが、このような株においてmRNA分解の異常は回復しないことから、mRNA分解を引き起こすには翻訳終結にみでは不十分でありeRF3/GSPTが必須の役割を果たしているいることを証明した。以上のように、eRF3/GSPTはG蛋白質としての特性を使い、翻訳終結とmRNA分解とを共役させる分子スイッチとして機能していることを明らかにした。先に我々はeRF3/GSPTが、翻訳伸長因子EF1Aと相同なCドメインにおいて翻訳終結因子eRF1と相互作用し翻訳終結過程を制御する一方で、固有のNドメインにおいてポリA鎖結合蛋白質(PABP)と相互作用し、翻訳終結と共役してmRNA分解過程を制御していることを示してきた。平成15年度においては、この翻訳終結と共役したmRNA分解機構の詳細についてさらに検討を進め、以下の知見を得た。1、出芽酵母eRF3/GSPTの変異株を用いた解析から、eRF3/GSPTの作用点はmRNA分解の律速段階であるポリA鎖の短縮化過程にあることを明らかにした。出芽酵母においてmRNAポリA鎖の短縮化は、PAN複合体とCcr4-Pop2複合体の2種のmRNAデァデニラーゼによって制御されているが、免疫沈降実験により、eRF3/GSPTはPAN複合体と結合することを示した。また両者の変異株の表現型が完全に一致し、Ccr4-Pop2複合体のものとは明らかに異なることを示し、eRF3/GSPTはPANデアデニラーゼを介してポリA鎖分解を制御していることを証明した。2、モデル系である出芽酵母において明らかにしてきたこれまでのシステムがヒトにおいても存在することを示した。まず、ヒトにおけるPAN複合体(PAN2/PAN3)を新たにクローニングし、酵母PANと同様の生化学的特性を有することを証明した。すなわち触媒サブユニットであるPan2はポリAに特異的な3'-5'ニキソヌクレアーゼ活性をもち、Pan3を介してPABPと相互作用することでデアデニラーゼとしての活性が促進に制御されていることを示した。また、ドメイナントネガティブ変異体を用いた解析からeRF3/GSPTと共にPANが細胞内におけるmRNAポリA鎖分解の制御に関わることを証明した。ヒトにおいてはeRF3/GSPTとPAN複合体がPABPに対して競合関係にあり、翻訳の進行に伴って両者が入れ替わることを新たに見い出し、翻訳終結に伴うPABPからのeRF3/GSPTの解離とPAN複合体の結合、PABPによるPANの活性化とポリA鎖の分解といった一連の反応が進行することで翻訳終結と共役したmRNAポりA鎖の分解がおこることを証明した。

また、このような変異をもつ細胞株を作製し翻訳終結過程を調べると異常が観察されることから、eRF3/GSPTへのGTPの結合が翻訳終結において必須の役割を果たしていることを証明することができた。(2)一方、eRF3/GSPTとPABPとの結合に関しては、GTP結合型、GDP結合型に関わらず観察され、eRF3/GSPTのGTP結合部位の変異による影響も観察されなかった。しかしながら、このような変異をもつ細胞株において、mRNA分解過程には異常が観察され、mRNA分解過程がGTP依存的な翻訳終結過程と共役しているということを強く示唆した。(3)さらに、eRF3/GSPTの機能欠損株においてeRF1を過剰発現すると翻訳終結は正常なレベルに回復するが、このような株においてmRNA分解の異常は回復しないことから、mRNA分解を引き起こすには翻訳終結にみでは不十分でありeRF3/GSPTが必須の役割を果たしているいることを証明した。以上のように、eRF3/GSPTはG蛋白質としての特性を使い、翻訳終結とmRNA分解とを共役させる分子スイッチとして機能していることを明らかにした。
原子炉格納容器内の燃料デブリ解体を目的とした小型水中ハツリ装置の開発

現在、福島第一原発は廃炉に向けて様々な作業が行われている。その中でも燃料デブリの解体は重要な廃炉作業の工程の一つである。現在進められている燃料デブリ解体の研究としては、レーザー技術を応用する方法がある。しかしこの方法では、燃料デブリが粒状となって格納容器内に飛散して水を汚染してしまう。また、加工装置自体も大型かつ複雑なものとなり、高い放射線量下における装置の設置、メンテナンスなどの運用面も心配される。そこで本研究では、一般的にコンクリートの解体工事で用いられているハツリ装置を応用したシンプルな加工装置を開発し、燃料デブリの加工を行う。前年度(H29年度)はエンペラ回転部と軸受け部分を改良し、高回転が得られるようにした。その結果、ハツリ加工が出来る目途は立ったが効率の良い加工には至っていない。さらに高回転、高トルクが得られるように装置の改良が必要であることがわかった。そこで、本年度(H30年度)は高トルクが得られない原因として、水がスムーズに装置内に取り込まれていないことが考えられるため、水の流れがエンペラに効率よく伝わるためにエンペラのケーシング部と軸受け部分を改良し、高トルクが得られるように工夫した。その結果、工具先端部が微小振動子してハツリ加工が出来る目途は立ったが、加工試料として用いたコンクリートブロックは加工できなかった。まだ加工のために必要な回転トルクが小さいようである。しかしこの方法では、燃料デブリが粒状となって格納容器内に飛散して水を汚染にしまう。このハツリ装置は排水ポンプにより水を吸い上げることによる水流を動力源とした小型の装置である。平成28年度はハツリ装置の設計および試作を行った。ハツリ装置は水を効率よくタービン内に取り込めるように取り込み口形状を工夫し、装置全体は圧力容器内に散乱すると考えられる部材を避けてデブリまで到達できるようになるべく小型化させた。試運転ではタービンが回転し、ラチェット機構による加工工具の振動は確認したが,被削材の加工までには至らなかった。回転トルクの不足が主な原因と考えられるが、工具先端の形状の検討も必要である。次年度に装置の仕様を見直すなどして加工実験を行う予定である。また、冠水した格納容器内を想定した実験環境をドラム缶を使い試作した。そこでは、加工状況をビデオカメラで撮影でき、そのデータを用い加工状況を詳細に検討する。装置の設計・試作および試運転までできたので初年度の目標はクリアしている.現在、福島第一原発は廃炉に向けて様々な作業が行われている。前年度はハツリ装置の設計および試作を行い、加工実験も行った。しかし、加工工具を振動させるためのエンペラの回転がスムーズではなく、ハツリ加工を行うための振動が不十分であった。そこで、本年度(H29年度)はエンペラ回転部と軸受け部分を改良し、高回転が得られるようにした。さらに高回転、高トルクが得られるように装置の改良が必要である。また、エンペラを回転させるために周囲の水を取り込んでいるが、本年度開発した装置では水がスムーズに取り込まれていないようであり、それが原因で回転数とトルクが得られていないようである。そこで、周囲の水の取り込み方も工夫する必要があることがわかった。さらに、加工工具の形状も検討する必要がある。試作装置は完成させ、実験及び改良を繰り返している。目標としている加工効率は達成できていないが、最終年度には達成できる見込みである。

さらに高回転、高トルクが得られるように装置の改良が必要であることがわかった。そこで、本年度(H30年度)は高トルクが得られない原因として、水がスムーズに装置内に取り込まれていないことが考えられるため、水の流れがエンペラに効率よく伝わるためにエンペラのケーシング部と軸受け部分を改良し、高トルクが得られるように工夫した。その結果、工具先端部が微小振動子してハツリ加工が出来る目途は立ったが、加工試料として用いたコンクリートブロックは加工できなかった。まだ加工のために必要な回転トルクが小さいようである。次年度以降は実験を繰り返し、装置の改良を行うステージなので、実験で得られるデータを解析し、それを装置の改良に生かすことが期待される。実験環境のセッティングやデータ収集・解析にも時間がかかるため、迅速な行動が必要となる。実験と装置の改良を繰り返し、目標とする加工効率を達成させる。特に水の取り込み方とエンペラ回転部周辺の形状に焦点を当て設計を見直す予定である。仕様変更によって、申請時と購入時の実験および装置部品の違いが発生したことで、購入価格に違いが出た。H29年度に物品を残金を基に実験用の消耗品を注文したが、納品及び伝票処理が遅れ支払いに間に合わなかった。平成29年度の装置部品の購入費に充当する。
医学と連携した科学教育の礎を築く理科教材開発の研究

中学校理科での生物や人体についての学習は、実物や具体物に触れさせないまま、教科書紙面やディジタル教科書の画面上で観察・実験を擬似的に経験させ、生命現象を「分からせたつもり」にとどまっていたことが多かった。本研究では、従来の指導上の反省から、実体験を取り入れた医学的標本を活用する授業実践に向け、医学と連携し、科学的な思考力・判断力・表現力を高める授業改善の在り方を模索した。本研究では、「動物の生活と生物の進化」の授業実践において、滋賀医科大学、国立科学博物館等との連携を深め、医学的標本や博物館所蔵標本を積極的に活用した。生徒自身が標本を用いた直接的な観察・実験を行うことで、それらの結果に基づく科学的な考察が可能となり、脊椎動物の頭骨と脳容積との関係や、生物の骨格に関する証拠から、進化についての視点を見出させる新たな授業実践事例を開発し、学習効果の検証を試みた。実物(レプリカ)を用いた実験に関して、「ゴリラやオランウータンなどの頭骨などを調べたことで、ヒトの骨はどのように進化してきたということが、分かりやすく理解できた。」「ヒトの脳容積が(他の類人猿に比べ)予想以上に多く、実験を通して、脳の精密さなどについて知ることができた。」「写真だけでは分からない大きさや、奥行き、骨の出っ張りなどをよく観察できた。などのように、標本を用いた学習に肯定的な意見がられた。また、脳容積の大小の比較のみが生物進化の指標とはなり得ない点を、標本を活用した観察・実験結果をもとに、生徒自身の論理的な考察を通して理解させることができた。類人猿、人類史頭骨を複製した1/5頭骨標本について、授業や理科教員研修に活用した。3Dスキャナーで取込んだディジタルデータの蓄積を、中学校理科で扱う臓器についても実施し、前年度作成した高精細ヴァーチャルスライドと同様、観察後何度でも閲覧可能な3D画像の整備を行なった。
高次機能半導体ナノフォトニックデバイスとその光ＲＡＭへの応用

SOI基板上に集積され、レーザ発振偏光により光出力導波路の切り換え可能なVCSELを提案し、基本動作を確認した。又、Fe/x-AlOxを電極に持つLEDを作製し、室温でスピン偏極した電子の注入を実現した。偏光双安定VCSELを用いた光信号処理の基本動作である、ANDゲート機能をもつ全光型フリップ・フロップでほぼビット誤りのない動作を実現した。又、全光型のヘッダー識別とパケット切り替えを実現した。偏光双安定VCSELを2個用い、2ビットを識別し4出力ポート間のスイッチングに成功した。偏光双安定VCSELアレイを試作し、アレイ内の2つのVCSELを用いシフトレジスタ機能をもつメモリ動作を実現した。平成24年度は以下の3点で大きな研究成果を得た。1.偏光無依存高屈折率差サブ波長回折格子(HCG)と、これを光共振器として用いる光導波路結合型HCG-VCSELを検討した。偏光双安定VCSELの実現に向け、偏光無依存な反射特性をもつHCG構造を検討した結果、VCSEL用の反射器として十分な反射特性をもつことがわかった。又、SOI基板を用い、1.55 μm帯の偏光無依存HCGを作製した。さらに、HCGを用いたVCSELでは、VCSELの発振偏光を切り換えることにより、出力導波路が切り換わることがわかった。高速偏光双安定VCSELの実現とそのSi基板上への集積化に有望である。2. 980 nm帯偏光双安定VCSELに酸化狭窄構造を導入することにより、半導体レーザをベースとした光双安定素子としては世界最小である0.85 mAのバイアス電流で駆動し、全光型フリップ・フロップ動作を実現した。この結果は、1.7 mWの消費電力で1ビットの光メモリが実現できることを示している。又、一層の高速動作をめざし、通常のVCSELに比べ共振器の反射率を下げるとともに、活性層の光学利得を増加したVCSELを試作した。その結果、より一層の高速動作が期待できることがわかった。3.ポンプ・プローブカー回転法を用いて量子井戸マイクロポストにおけるスピン緩和時間を評価した。0.5 μm角のポストでは、ポスト側面における非発光表面再結合によってキャリヤ寿命は約30 psに短縮されるが、約0.74 nsの長いスピン緩和時間が維持され、スピンVCSELの発振円偏光スイッチング速度の高速化に有効であることがわかった。又、光通信波長におけるスピン光デバイスを目指して、InP(110)基板上InGaAs/InAlAs量子井戸をMBE法により成長し、室温において1 ns程度の電子スピン緩和時間を得た。平成25年度は以下の研究項目で大きな研究成果を得た。1.高次機能ナノ半導体レーザ偏光双安定VCSELと、我々が考案した偏光無依存高屈折率差サブ波長回析格子(HCG)を組み合わせることにより、発振偏光により出力光導波路の切り換えが可能なデバイスを考案した。SOI基板上に偏光無依存HCGと導波路を作製し、外部から直線偏光をもつ光を入射し、偏光により出力導波路を切り換えることができることを実験的に実証した。又、偏光無依存HCG-VCSELを作製し、室温で光励起レーザ発振に成功した。又、電子スピン緩和時間が長い(110)GaAs/AlGaAs量子井戸(QW)への電気的スピン注入をめざし、Fe/AlOxトンネル電極をもつLEDを作製し、1 kA/cm2の高電流密度においてスピン注入を実現し、40 Kで7%程度の注入スピン偏極率を実現した。さらに、(110)GaAs/AlGaAsQWに電界を引加し、室温で37 μmとデバイスで用いるのに十分な距離のスピン偏極電子の輸送に初めて成功した。2.偏光双安定VCSELとその応用偏光双安定特性を用い、全光型フリップ・フロップ動作やANDゲート動作が可能であるが、システムへの応用にはこれらの動作のビット誤り率の評価が必要である。全光型フリップ・フロップ動作で1 Gb/sまで、ほぼデジタル信号エラーのない1E-10オーダーの誤り率を実現した。又、ANDゲート動作を含む全光型フリップ・フロップ動作のビット誤り率を評価し、誤り率6E-7を得た。さらに、偏光双安定VCSELによる、全光型フリップ・フロップ動作を利用して、全光型ヘッダ識別を実現した。光パケットのヘッダ部を4ビット500 Mb/s RZ信号、ペイロード部を40 Gb/s 11段PRBS NRZ信号とし、ヘッダの2ビット目の信号によりペイロードの出力先を切り換えることに成功した。

平成26年度は以下の研究項目で大きな研究成果を得た。1.高次機能ナノ半導体レーザ:電子スピン緩和時間が長い(110)GaAs/AlGaAs量子井戸への電気的スピン注入をめざし、引き続きFe/x-AlOxトンネル電極をもつLEDを作製した。LED構造を改良することにより、VCSELのレーザ発振に必要な1.5 kA/cm2の高電流密度においてスピン注入を実現し、室温で9.3%程度の電子スピン偏極率を実現した。2.偏光双安定VCSELのフリップ・フロップ動作:偏光双安定特性を用いたANDゲート機能をもつ全光型フリップ・フロップ動作はメモリやヘッダ識別などへの応用が期待できる。動作の安定性を評価するためビット誤り率(BER)を測定し、ほぼエラーのない5E-10の誤り率を実現した。又、データ光のパワーを一定にし、BER値のセット光パワー依存性の測定結果と数値計算結果を比較することにより、BERの劣化要因は偏光双安定スイッチングしきい値の揺らぎと、データ光とセット光の相対的な位相差の変動による、合波光の強度揺らぎによることが分かった。さらに、波長の異なるデータ光とセット光を用いたフリップ・フロップ動作を初めて実証した。これまでデータ光とセット光を同一波長に設定していたため、2光波の位相差を高精度で制御する必要があった。この方法を用いることにより、システムの構成を簡便にできる可能性がある。3.偏光双安定VCSELのヘッダ識別への応用:偏光双安定VCSELを2つ用い、全光型ヘッダ識別を実現した。光パケットのヘッダ部を4ビット500 Mb/s RZ信号、ペイロード部を40 Gb/s 11段PRBS NRZ信号とした。ヘッダ中の2ビットを識別することにより、4つの光出力ポートの内、ヘッダの宛先が示すポートへペイロードを切り換えることに成功し、多ビットヘッダ識別への拡張性を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。工学26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した「研究の目的」および「研究の実施計画」では以下の3点を中心に研究を行う計画であった。1.高屈折率差サブ波長回折格子(HCG)反射鏡を用いたVCSELの検討、2.偏光双安定VCSELの高速化、3.多ビットメモリ実現のための偏光双安定VCSELの特性の均一化研究実績に示したように、1.については当初の計画以上に進展し、偏光無依存HCGを実現し、HCG-VCSELのSi基板上への集積化に見通しを得た。2.については、計画通り偏光双安定VCSELの一層の高速化に見通しを得た。又、3.については、研究実績では述べなかったが、1.55 μm帯偏光双安定VCSELを試作し、全62素子中63%で明瞭な双安定性を得、均一性が確認された。それぞれの課題の進捗を自己評価すると次のようになり、総合して冒頭の判定とした。・半導体マイクロレーザとHCG-VCSEL:導波路結合型HCG-VCSELを集中的に検討した。特性の解析や、偏光無依存HCG-VCSELの作製・レーザ発振が実現でき、将来有望な素子であると考えている。(自己評価◎)・スピン注入LEDと円偏光間高速スイッチ:Fe/AlOx MOS構造電極をもつ(110) GaAs/AlGaAsLEDを作製し、1 kA/cm2の高電流密度においてスピン注入を実現し、40Kで7%程度のスピン偏極率を実現した。
ポリオキサゾリンを基本骨格とした機能性ゲルの反応設計

本研究は、ポリオキサゾリンの有する特性を利用して、新しい機能性材料としての複合ゲルの分子設計および反応設計を行うことを目的とした。本年度は特に,ポリオキサゾリンを基本骨格とした新しい高分子シランカップリング剤を合成し、テトラエトキシシランとのゾルーゲル反応を行うことにより、分子レベルでの有機ー無機高分子ハイブリッドの創成に成功した。2ーメチルー2ーオキサゾリンの重合をメチルトシレ-トを開始剤として行うと,オキサゾリニウムの活性末端を有するポリオキサゾリンが得られた。次に、このポリマ-を3ーアミノプロピルトリエトキシシランと反応させ、その後塩基性イオン交換樹脂で処理すると、トリエトキシシリル末端ポリオキサゾリンが得られた。このような高分子シランカップリング剤は、ポリマ-の末端二重結合のトリアルコキシシランによるヒドロシリル化反応によっても合成できた。種々のポリオキサゾリンシランカップリング剤とテトラエトキシシランとをゾル-ゲル法により反応させたところ、均一無色透明なガラス状のハイブリッドが得られた。これは、分子レベルで有機高分子(ポリオキサゾリン)と無機高分子(シリカゲル)が混成した、新しいタイプの複合材料として期待できる。これらのポリオキサゾリンーシリカゲルハイブリッドは高温(600°C)で熱処理することにより、ポリオキサゾリンセグメントに相当する部分が失われ、多孔質のシリカゲルが得られた。この手法を用いると、シリカゲルの細孔径がハイブリッド状態での有機高分子の大きさ、すなわち分子オ-ダ-で制御できると考えられ、種々の材料としての応用が示唆される。
光照射で除去可能な保護基の開発

本研究は、ヒドロキシル基、アミノ基などを保護し、保護基が不要になった場合は光照射により外すことが可能な試薬を開発することである。特に生体物質の合成の際に利用できる保護基をその条件の一つとした。光反応が使えるための条件としては、300nm付近に吸収をもち、反応の光収率が高く、保護の対象となる基に対する反応性が高いこと、などである。この目的にかなった光反応としてこの研究で採用したのは、ベンジル型メチレン基をそのオルト位にあるニトロ基で酸化する反応である。この目的で、塩化2ーニトロー5ーメトキシベンジル(1)をアミン類と反応させてベンジルアミン型化合物に変え、その溶液に水銀灯の313nmを照射したところ、予想通り分子内酸化反応が起こり、短時間でCH_2ーN結合の解裂して保護基が外れ、ニトロ基自身はニトロソ基に変わった。しかし、同様の反応をCH_2ーO結合をもつエ-テル型の化合物に試みたが反応は非常に遅かった。第二の型の化合物として、2ーニトロー5ーメトキシフェニル酢酸(2)のアミド、エステルなどについて、同様の光反応を試みた。メチレン基の酸化で生じるαージカルボニル結合は不安定で、加熱あるいは自発的に分解を起こして保護基が脱離することを期待した反応である。しかし、この型の化合物はベンジル型とどう条件下では光に対する活性が弱く、分解反応にかなりの時間を必要とした。アミドやエステル型のカルボニル基は、メチレンの活性化には不十分であることがわかった。以上の結果から、1の型の試薬が2よりも適当であることがわかった。ただ、CーO結合に対しては活性が弱かったので、ベンゼン環にさらに電子吸引性の基を導入して活性を強めると同時に、生体物質への利用を考えて、保護基の水溶性を高める役割もこの基にもたせることを検討中である。
緑内障の視神経障害と神経細胞死の病態機構の解明に関する研究

<基礎的アプローチとして>ラット急性眼圧上昇モデルは、墨汁を片眼の前房内に注入し、1週後に線維柱帯がpigmented bandとしてマーキングされた所を正面から直接光凝固、線維柱帯がthermal burnを起こした直後に墨汁を再注入して、持続性で角膜浮腫が生じる程度の眼圧上昇を7日以上維持した。1日後、4日後、7日後に4匹ずつ灌流固定して凍結切片を作製し、TUNEL法によるapoptotic cellの検出と、抗シトクロームC、抗活性型caspase-3ポリクローナル抗体を用いたS-ABC法による免疫染色を行った。眼圧上昇後4日目からTUNEL positiveの網膜神経節細胞が出現し、7日目には多数のapoptotic cellが認められた。一方、視神経乳頭におけるシトクロームCの活性と網膜神経線維層におけるcaspase-3の活性は眼圧負荷後24時間の時点で、既に著明に上昇していた。ラットの急性緑内障モデルの網膜神経節細胞死はアポトーシスの形をとっており、その実行機構にはカスパーゼファミリーの活性化が関与していることが確認された。軸索流のうっ滞に伴う軸索輸送成分の変化は、視神経乳頭部のミトコンドリアに対して何らかの影響を及ぼし、網膜神経節細胞のアポトーシスを誘導する可能性があると考えられた。<臨床的アプローチとして><基礎的アプローチとして>ラット急性眼圧上昇モデルは、墨汁を片眼の前房内に注入し、1週後に線維柱帯がpigmented bandとしてマーキングされた所を正面から直接光凝固、線維柱帯がthermal burnを起こした直後に墨汁を再注入して、持続性で角膜浮腫が生じる程度の眼圧上昇を7日以上維持した。<臨床的アプローチとして><基礎的アプローチとして>ラット眼を用いた眼圧上昇モデルを、墨汁の前房内注入後、反復隅角光凝固を施行した慢性モデルと、1回の隅角光凝固後ヒーロンVを前房内注入した急性モデルとに分けて作製した。得られた試料からパラフィン切片を作製し、免疫組織化学的に解析を行った。抗体には、ミトコンドリアを介した神経細胞死に関係すると考えられる、GFAP、mito-tracker、シトクロームc、活性型caspase-3を用い、細胞死の指標としてTUNEL法を用いた。急性モデルでは、処置後12時間からGFAPの視神経乳頭での活性がみられ始め、それに引き続いてアポトーシスのcascadeに関わるいくつかの因子で活性化が確認された。今後それぞれの蛋白の空間的・時間的増減について検討する予定である。一方、サルを用いた実験は、倫理委員会の通過、入手困難などの理由で平成15年10月からようやく飼育が開始されたところであり、現在眼圧上昇モデルの作製中である。<臨床的アプローチ>健常眼及び緑内障眼に対し、新しい角膜偏光代償器を搭載したスキャニングレーザーポラリメータを用いて、緑内障検出力について検討したところ、緑内障診断の感度と特異度は各々91.1%および88.9%であり、両者とも高値を示した。一方、レーザースペックルフローグラフィーを用いて、正常眼圧緑内障眼および原発開放隅角緑内障眼で、視神経乳頭微小循環と視野障害の相関について比較検討したところ、前者では有意な相関があったものの、後者では有意な相関がなく、両疾患の病態生理に違いがあることがわかった。緑内障眼における網膜神経線維層厚と視神経乳頭微小循環の相関については、今後引き続き検討する予定である。ラット眼圧上昇モデルを用い、急性モデルの視神経乳頭、網膜でシトクロームC及び活性型カスパーゼ3に対する免疫染色とTUNEL染色を行い、また慢性モデルの視神経乳頭でミトコンドリアの微細形態学的変化を観察した。ウイスター系ラット30匹60眼を用い、慢性モデルは、既報のごとく墨汁を片眼前房内に注入、炭素粒子でマーキングされた線維柱帯を1週毎に直接光凝固した。3ヶ月目に視神経乳頭を透過電顕で観察した。一方、初回光凝固の直後に粘弾性物質を前房内注入し、30mmHg以上の高眼圧が7日以上持続する急性モデルを作製した。1、3、7日後に灌流固定し、シトクロームC、及び抗活性型カスパーゼ3のポリクローナル抗体を用いたS-ABC法による免疫染色と、TUNEL法による神経節細胞死の検出を行った。慢性モデルの視神経乳頭の軸索中には、腫大してクリステが消失しinclusion

bodyを内包した、多数の変性ミトコンドリアの散在を認め、外膜の一部に破綻が見られた。急性モデルでは、眼圧上昇後1日目にはシトクロームC陽性の不均一な顆粒状の構造が視神経乳頭近傍に多数集積し、網膜神経線維層では活性型カスパーゼ3の活性が上昇していた。また、3日目からTUNEL陽性の網膜神経節細胞が認められた。緑内障モデルにおける網膜神経節細胞死に先だってカスパーゼ3の活性化と、視神経乳頭でのミトコンドリアの破壊、集積が確認され、軸索輸送障害から緑内障性視神経障害に至る過程にミトコンドリアが関与していることが示された。虚血によるATPの供給低下は、それ自体軸索輸送障害の原因となるばかりでなく、集積したミトコンドリアの破綻による更なるATP産生の低下がこの病態を加速し得る。正常眼圧緑内障における眼圧に対する易障害性に、この様なメカニズムが関与している可能性が示唆された。
新たに見出した雌マウス副腎皮質が大量に産生するプロゲステロンの 産生機序と役割

雌マウス副腎皮質では、その最内層の副腎髄質との境界領域において、コルチコステロン合成酵素を発現しない層が存在することを見出した。この層においてはCYP11B1/B2、及びCYP21の発現を認めなかったが、プロゲステロン産生に至るまでのステロイドホルモン合成酵素群は、調べた限りにおいて全て発現していた。又、この層はアロマターゼ欠損の雌マウスにおいては見出されなかったことから、この層の形成におけるエストロゲンの関与が示唆された。哺乳動物における主要なステロイドホルモン産生器官である副腎皮質と性腺の両原基は共通原基から分化する。性腺原基は雄で精巣、雌で卵巣ヘ分化し、著しい性差を生じるが、もう一方の副腎皮質における性差の研究報告は、ごく限られている。女性ホルモンであるプロゲステロンは、主に卵巣で産生されるが、副腎皮質ホルモンである糖質、硬質コルチコイド合成における反応中間物でもある。これまで、副腎皮質におけるプロゲステロンは、副腎皮質ホルモン合成における単なる反応中間物であり、最終産生ホルモンとは考えられていなかった。本研究では、雌マウス副腎皮質におけるプロゲステロン合成に必要な酵素群、及びプロゲステロンから糖質コルチコイド産生にいたる酵素群の局所発現の解析を行い、雌マウス副腎においてプロゲステロンを産生している状況証拠を得た。副腎皮質の網状層と副腎髄質の間には、糖質コルチコイド合成酵素(=CYP11B1)が発現していない層が存在することを見出し、この層は、未交尾・雌マウスに特異的に存在する層(=X-zone)に相当していた。この層には、コレステロールを基質としてプロゲステロン合成をおこなう酵素であるCYP11Aや3βHSDは発現していたが、プロゲステロンから糖質コルチコイド産生にいたる酵素であるCYP21やCYP11B1は発現していなかった。一方、雄マウスにおいては、網状層と副腎髄質の間にこのような層は見出されず、網状層のCYP21発現細胞は、髄質細胞に接する領域まで発現していた。これらの結果は、副腎皮質において、雄、雌間でステロイドホルモン産生能に性差が存在することを意味するものであった。副腎皮質と性腺は、哺乳動物における主要なステロイドホルモン産生組織であり、両原基は共通の原基から分化する。性腺原基は精巣、卵巣へ分化し、著しい性差を生じるが、もう一方の副腎皮質における性差の研究報告は、ごく限られている。性成熟雌マウスにおいては、副腎皮質と髄質との境界領域に、同時期の雄には存在しないX-zoneが存在する。又、成熟期以降の雌の副腎は、雄の副腎より大きかった。本研究では、マウス副腎皮質におけるステロイドホルモン産生能における雌雄差を明らかにするために、ステロイド合成酵素群の局所発現解析から、雌副腎皮質において髄質との境界領域にCYP11B1/B2を発現しない層を見出した。一方、この層にはStAR,CYP11A,3βHSD等は発現していた。又、エストロゲンを産生しないアロマターゼ欠損マウスを用いて雌雄の副腎皮質を比較したところ、アロマターゼ欠損雌マウスにおいては、野生型雌と異なり、髄質との境界領域までCYP11B1/B2の発現が認められ、雌特異的な髄質との境界層は認められず、この層の形成におけるエストロゲンの関与が示唆された。又、副腎におけるステロイドホルモン産生量の性差を検出する目的で、副腎プロゲステロン量を測定したところ、雌で雄より高い結果を得た。又、妊娠、出産におけるプロゲステロン量の変化を計測すると共に、副腎皮質ステロイドホルモン産生におけるエストロゲンの関与を明らかにする目的で、培養副腎皮質細胞でのステロイド合成酵素mRNAsの発現解析を行なっている。副腎皮質と性腺は、哺乳動物における主要なステロイドホルモン産生器官であり、両原基は共通の原基から分化する。本研究では性成熟雌マウスに存在するX-zoneにほぼ相当して、雌マウスの副腎皮質と髄質との境界に、プロゲステロン産生に至る酵素群は発現するが、コルチコステロン産生に関与するCYP11B1/B2の発現が認められない領域が存在することを見出した。又、アロマターゼ欠損マウスにおいては、この領域の存在が認められなかったことから、培養細胞(ヒト副腎球状層由来H295R細胞)において、エストロゲン(17beta-Estradiol)添加による、内在性のステロイド合成酵素mRNA発現への影響を定量RT-PCR法で調べたところ、エストロゲン単独投与ではコルチコステロン合成に関与するCYP11B1 mRNA量が増加するが、エストロゲンに加えてForskolinを添加したところ、CYP11B1 mRNA量は減少した。

一方、他のステロイド合成酵素mRNA (CYP11A, 3beta-HSD, CYP11B2)の発現量に変化を認めなかった。これらの結果は、女性ホルモンであるエストロゲンが、cAMP上昇時(糖質コルチコイド合成刺激時)に、コルチコステロン合成を減少させることを示唆しており、雌マウスX-zone相当領域にコルチコステロン合成酵素が認められないことへの関連が示唆された。又、実際の副腎内プロゲステロン量をマススペクトル法で計測したところ、雌マウス副腎は雄に比べてプロゲステロン量が多く、未交尾雌マウスにおいては妊娠雌より多い結果を得て、副腎プロゲステロン量がX-zoneの存在に関連することが示唆された。雌マウスにおいて雄と異なるステロイドホルモン産生酵素の分布が明らかになり、この雌雄差についてアロマターゼ欠損マウスの解析により、エストロゲンが関与することが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。副腎皮質におけるステロイド関連酵素の発現やステロイドホルモン産生の性差をより詳しく調べると共に、性差形成へのエストロゲンの関与機構を明らかにするために、副腎皮質由来培養細胞等を用いて、エストロゲンの影響を調べる。