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宮都・官衙の空間構造とその変遷からみた古代国家統治機構形成過程の研究

本研究の目的は、6世紀代に構築された氏族制的・族制的原理による支配制度が、7世紀後半に中央集権的支配機構を動かす官僚制・官司制的支配制度へ転換した様相を考古学的方法で明らかにするである。27年度には7世紀以前における親族構造変動と地方支配組織形成との関係を検討した。考古学における古墳時代親族構造研究の主張と、現在の文献史学の戸籍・計帳研究に基づく古代家族論・親族組織論との間の大きな齟齬がある。その原因は、7世紀後半における新徴税システムの開始、兵士徴発、大規模造営への徭役労働の徴発が重なり、農民層の疲弊と基層的社会組織の動揺が進み、家長の直系継承が途切れ、家族集団の弱体化・不安定化・流動化が進んだ結果と考えるべきであり、それらの様相を一般集落遺跡や農民層の墳墓などの資料から裏付けた。28年度には、7世紀中葉9世紀初頭に至る、中央・地方の宮跡・官衙遺跡の空間構造・建物配置とその時間的変動、中央から地方への影響関係や機能的類似度を検討した。王宮の中枢部における「小帝国」の秩序と構造を表明・誇示し、官人層や諸蕃に確認させる国家的儀式・饗宴の場とその構造を通時的に検討すると、帝国標章は、平城宮への遷都時、および平安宮への遷都時に特に強く現れており、平安宮朝堂院の構造を平城宮朝堂院の構造からの要素の脱落として理解するのは妥当でない。29年度には、西海道における各級官衙中枢部構造の成立事情の研究を深化させ、8世紀代の地方官衙のうち国庁の建物配置がいかなる歴史的背景の中で形成されたのかを検討し、それに影響を与えた宮中枢部施設の構造と国家の帝国的方策との関係を確認し、大宰府政庁や西海道国庁の建物配置の歴史的評価を再検討した。30年度には、研究期間の最終年度であるためまた4年間の研究成果を総合した著作物の敢行準備を進め、当該著作は令和元年5月に刊行の予定である。本研究では6世紀代に構築された氏族制的・族制的原理による支配制度が、7世紀後半に中央集権的支配機構を動かす官僚制・官司制的支配制度へ転換した様相を考古学的方法で明らかにすることを目的としている。研究を進める過程で、そうした制度的・機構的変動の基礎には、支配者層の族組織としての安定や被支配者としての農民層の経営単位としての安定があり、文献史学者の主流的見解のように未開社会の上に古代国家が忽然と形成されたのではないことを再確認した。その意味で、社会的基盤における親族組織の構造変動の実態とその意義の評価が重要であるが、考古学における古墳時代親族構造研究の主張と、現在の文献史学の戸籍・計帳研究に基づく古代家族論・親族組織論との間に大きな齟齬が生じていることから、齟齬が生じた背景を明らかにし、考古学サイドでいかなる研究を進めるべきか考察しておく必要が生じたため、それに注力し研究論文として纏めた。その結果、齟齬の成因を合理的に説明するためには、7世紀後半における新徴税システムの作動に加え、軍事行動への兵士としての挑発、大規模造営への徭役労働への徴発が重なり、農民層の疲弊と基層的社会組織の動揺が進んだ結果、家長の直系継承が途切れ、家族集団の弱体化・不安定化・流動化が進んだと考えるべきであり、それらの様相を一般集落遺跡や農民層の墳墓などの資料から裏付ける必要があることが明らかとなった。この点については次年度以降に具体的研究を実施する。8世紀において古代国家が組織した協業・分業のあり方の解明のために、先進的形態であった官営作業場の実態解明の必要から、超大規模造営における資材調達の事例として、造東大寺司による正倉院正倉の瓦調達・生産の状況を検討し、平瓦の生産地についての見通しを得た。研究実施計画では、本年度には九州四国地方の官衙遺跡に関わる情報を収集し、時期区分・遺構配置復元・構造復元・機能推定を行い、宮都の諸施設との異同を検討することとなっており、計画通り資料・情報の収集を進めたほか、近畿地方についても順調に作業を進めた。当初の計画では宮跡・官衙遺跡の建物配置・空間構造を中心に検討する予定であり、それは順調に進めつつある。それに加えて、支配のための組織の表現形態の在り方の解明のためには、支配組織の内実、質的編成原理にまで検討を及ぼす必要があることに注目した。そこで8世紀については、先進的分業・協業組織であった造東大寺司の活動の一端を明らかにすべく、瓦の生産・調達現場の実態解明という形で着手することができた。今年度には、原理転換後の7世紀中葉9世紀初頭に至る、中央・地方の宮跡・官衙遺跡の空間構造・建物配置とその時間的変動、中央から地方への影響関係や機能的類似度を検討し、古代国家の中央および地方における官僚機構・官司制、統治・行政機構の形成・整備課程を解明する研究に着手した。奈良文化財研究所などで研究対象遺跡の発掘調査報告書、考古学・文献史学の研究論文等の情報を収集し、調査・研究の到達点を確認するとともに、遺跡・遺構の分析を行った。遺跡の立地・環境を確認するため、重要遺跡を選定し、現地に行き観察・情報収集に努めた。

また今年度には、石母田正の「東夷小帝国論」の検証も兼ねて、宮都中枢部の構造の通時的検討を行った。その結果、国内において「小帝国」の秩序と構造を表明・誇示し、官人層や諸蕃に確認させるために、それら蕃夷に朝貢させ、元日朝賀・拝朝などの儀式に参列させ、饗宴で授位することによって、位階制に基づく礼的秩序の中に組み込むとともに、それら儀式の参加者が、「小帝国」を再認識する場が設けられた、という見方は基本的に妥当であると考えた。それら国家的儀式の場では、儀式参列者が天皇との距離、互いの立場を確認し、天皇を頂点とした国家構造を再確認した。それら儀式が行われる場所とその構造を通時的に検討すると、平城宮への遷都時、および平安宮への遷都時に特に強く現れることが明らかで、平安宮朝堂院の構造を平城宮朝堂院の構造からの要素の脱落として理解するのは妥当でないと考えるに至った。研究実施計画では、本年度には山陽・山陰地方の官衙遺跡に関わる情報を収集し、時期区分・遺構配置復元・構造復元・機能推定を行い、宮都の諸施設との異動を検討することになっており、計画通り、資料・情報の収集を進めた。当初の計画では宮跡・官衙遺跡の建物配置・空間構造の検討も中心課題に据えており、それは順調に進めつつある。特に都城中枢部の構造決定の背後にある原理についても、石母田正の「小帝国論」と関連させつつ見通しを得ることができた。本研究では6世紀代に構築された氏族制的・族制的原理による支配制度が、7世紀後半に中央集権的支配機構を動かす官僚制・官司制的支配制度へ転換した様相を考古学的方法で明らかにすることを目的としている。今年度には、8世紀代の地方官衙のうち国庁の建物配置がいかなる歴史的背景の中で形成されたのかの研究を開始し、それに影響を与えた宮中枢部施設の構造と国家の帝国的方策との関係を確認したうえで、大宰府政庁や西海道国庁の建物配置の歴史的評価を再検討した。まず、律令制府の中国・朝鮮半島政策、隼人・南島政策、蝦夷政策の時期的推移を探り、帝国標章の盛行・顕在期を探った。その結果、顕在期は7世紀末8世紀第一4半期と8世紀第三4半期9世紀の2時期あると判明した。この2時期の意義を念様に7世紀末9世紀初頭に至る宮の中枢部構造の変化を調べた。平城宮第一次大極殿院と中央区朝堂区画の構造の意義、それが平城環都後復活しなかった事情を考察し、長岡宮の構造への長安城宮城・皇城の影響、平安宮大極殿への長安城大明宮の影響を検討した。大宰府政庁II期については平城宮中央区大極殿院・朝堂区画を圧縮・接合した形態として設計され、帝国意識高揚期の産物であると結論付けた。8世紀前半における西海道国庁の建物配置基本型は大宰府型ではなく、むしろ城柵政庁型に近く、その配置が西海道と陸奥・出羽にあるのは、帝国の中で「蕃客」「化外民」と対峙した地域にみられることは、脇殿における政務よりも正殿と広い庭における服属儀礼や饗宴を重視したものであることを結論付けた。研究実施計画では、今年度に近畿・北陸地方の官衙遺跡に関する情報を収集し、時期区分・遺構配置復元、構造復元、機能推定を行い、宮都の諸施設との異同を検討吸う事になっており、計画通り、資料情報の収集を進めた。当初の計画では、宮跡・官衙遺跡の建物配置・空間構造の検討も中心課題に据えており、それは順調に進めつつある。特に西海道における大宰府政庁・国庁の構造について通説と異なる見解に達し、論文としてまとめた。「古代都城における帝国標章の浮沈」であり、『大宰府史跡発掘調査50周年記念大宰府の研究』(2018年10月刊行予定)に掲載される。
RA由来B型滑膜細胞へのオリゴヌクレオチド導入による転写因子活性抑制効果の検討

病態を引き起こしている病因物質が発現、生産される過程を選択的かつ特異的に制御して発現を抑えることにより病状を寛解することがと推測されるアンチセンス療法について検討を行った。当初、炎症反応に関与する多様な遺伝子の活性化を制御する転写因子NF-κBの発現を制御することを目的としていたが、NF-κBに関してはPTX、サリチル酸、等の比較的特異的にNF-κBの活性化を抑える薬物がすでに存在しているので、今回はヒトTh1型T細胞に特異的に発現しており、Th1型T細胞のサイトカイン産生に関わっていると予想される細胞内情報伝達に関与しているチロシンキナーゼTxkのアンチセンスDNAによる抑制効果を検討した。ヒト末梢血単核細胞を抗原で刺激しT細胞クローンを樹立した。樹立したT細胞クローンは、INF-γとIL-4の産生性をELISA法で測定しサイトカイン産生パターンからTh0、Th1、Th2型T細胞に分類した。これらのT細胞クローンのTxkmRNAの発現をRT-PCR法で検討しTh1型T細胞で特異的にTxk mRNAが発現していることを確認した。Th1型細胞クローンにTxk遺伝子の翻訳開始点と相補的な配列を持つ20merのホスホロチオエ-ト型アンチセンスDNAを添加し24時間後、抗原で刺激し、さらに24時間後のINF-γの産生量をELISA法で測定したところ、アンチセンスDNAの添加によりTh1型T細胞が産生するINF-gの産生を完全に抑制した。アンチセンスDNA添加後48時間のbeta-actinのmRNA産生量には変化を与えなかった。TxkアンチセンスDNAは、細胞毒性でない機序でTh1型T細胞からのINF-γ産生を抑制したものと考えられる。
日本語における人称格制約効果に関する研究

ロマンス語族言語などで観察される人称格制約の効果が日本語にも観察されるかどうかを検証した。関連する例文、例えば「友梨奈が秋元先生に私を推薦したそうだ。友香も{彼に/[e]} {私を/[e]}推薦したらしい。」などにおいて、後続文の関節目的語と直接目的語のいずれもがゼロ形である場合でも容認度の低下が見られないという結果を得た。これにより、日本語には当該効果が観察されないという結論に至った。この観察は、人称格制約を形態論的条件とみなす立場と統語論的条件とみなす立場のいずれにおいても説明されうることを確認した。本研究の目的は、いわゆる人称格制約(the Person Case Constraint)の効果が日本語にも観察されるのかどうかを明らかにし、当該効果の日本語における存在もしくは非在の理由を説明することである。これにより、普遍的とされる人称格制約効果の普遍性を検証するとともに、日本語における関連する機能範疇の投射を含めた拡大動詞句の構造、1人称(話者)、2人称(聞き手)及び3人称の代名詞類の認可の方法を詳細に調べ、関連する普遍文法の原理・操作やパラメーターの精緻化に貢献することを目指す。申請する3年間で、日本語の三項動詞(「与える、紹介する」など)、使役動詞、状態述語などを含む文が人称格制約の効果を示すかどうかを、一定規模の母語話者を対象とする調査などにより明らかにする。当該効果が生じるのは目的語接辞という「弱形」代名詞や一致に認可される空代名詞が用いられる場合なので、日本語でも上記述語の主語や目的語が音形のない事例を考察する。日本語における当該効果の有無を明確にした後、その存在もしくは非在の理由を、人称に関わる機能範疇や拡大動詞句構造との関連を含めて解明する。平成27年度は、先行研究の理解及び詳細な検討を実施し、人称格制約の研究に関わる背景や基礎知識を得ることに努めた。特に同制約の効果が観察される言語の基礎的理解とそこで考察されている構文や現象の把握に努めた。また、途中段階の成果ではあるが、日本語の1人称代名詞と空項の文中の分布について先行研究を調査する中で、日本語の1人称空項には、空代名詞的であるものと音形のある代名詞(「私」など)の省略により生成されるものの2種類が存在することがわかった。平成27年度は当初予期していなかった部局組織内・学内の役職が与えられ、校務に多くの時間をとられたため。平成28年度は27年度に暫定的に得られた知見を精緻化することに取り組んだ。具体的には、日本語の1人称代名詞と空項の文中の分布に関する先行研究を調査し、日本語の1人称空項には空代名詞であるものと音形のある代名詞(「私」など)の省略により生成されるものの2種類が存在することの論拠をより強固なものにした。また、人称格制約について一般的に用いられる三項動詞構文において直接目的語と関節目的語の組み合わせを様々な人称のパターンで検証した。暫定的ではあるが、ロマンス語に観察されるような効果が生じないという結果を得た。平成27年度に引き続き、28年度もこの補助金申請時には想定していなかった部局組織内の役職が与えられ、校務に多くの時間を取られたため。本研究の目的は、いわゆる人称格制約(the Person Case Constraint)の効果が日本語にも観察されるのかどうかを明らかにし、当該効果の日本語における存在もしくは非在の理由を説明することであった。これにより、普遍的とされる人称格制約効果の普遍性を検証するとともに、日本語における関連する機能範疇の投射を含めた拡大動詞句の構造、1人称(話者)、2人称(聞き手)及び3人称の代名詞類の認可の方法を詳細に調べ、関連する普遍文法の原理・操作やパラメーターの精緻化に貢献することを目指した。研究期間中に当該現象に関する文献調査を行なったが、日本語に関する研究で公表されているものは見当たらなかった。その意味で本研究には新規性があったと言える。また、スペイン語など従来詳細な調査が行われている言語のデータをもとに、対応する日本語の例文を作成し、それらの容認度を日本語母語話者に判断してもらった。使用した例文は以下のようなものである。

(1)友梨奈が秋元に私を推薦したそうだ。--友香も彼に{私を/[e]}推薦したらしい。(2)話者A:「私は秋元先生に会いたいの。」--話者B:「友梨奈が彼に{君を/[e]}紹介するそうだよ。」(1)と(2)の2つ目の例文において、与格目的語「彼に」が存在し、対格目的語は(1)では1人称、(2)では2人称になっている。スペイン語など人称格制約が働いている言語では非文となる構造であるが、これらの日本語文は悪くなっていない。特に、スペイン語などのいわゆる弱形代名詞に相当すると考えられるゼロ形([e])であっても十分容認される。このことから、日本語では人称格制約の効果が観察されないと結論づけられる。これは、日本語の空項が(弱形の)空代名詞ではなく、項削除により派生されるという仮説を採用すれば説明することができる。ロマンス語族言語などで観察される人称格制約の効果が日本語にも観察されるかどうかを検証した。関連する例文、例えば「友梨奈が秋元先生に私を推薦したそうだ。友香も{彼に/[e]} {私を/[e]}推薦したらしい。」などにおいて、後続文の関節目的語と直接目的語のいずれもがゼロ形である場合でも容認度の低下が見られないという結果を得た。これにより、日本語には当該効果が観察されないという結論に至った。この観察は、人称格制約を形態論的条件とみなす立場と統語論的条件とみなす立場のいずれにおいても説明されうることを確認した。平成28年度は、平成27年度に予定していて実施できなかった先行研究・文献調査を継続して行うとともに、申請時に計画していた、日本語の関連構文において人称格制約の効果が観察されるかどうかのインフォーマント調査及びその結果の分析を行う。平成29年度は最終年度になるので、関連する例文の作成とインフォーマント調査を実施し、データを得る。その後、そのデータの分析を行う。言語学平成27年度に使用を見込んでいた人件費は大学院生による研究補助のためのものであったが、自分が指導する適当な大学院生がおらず、そのため人件費の支出がなかった。また、外国での研究発表が招待講演であったため、当初見込んでいた旅費の大半が主催者で負担してもらえたため、こちら側の支出にならなかった。平成28年度は入試関連校務があり、長期休みの期間の多くが校務に取られ、予定していた海外出張が計画できなかった。平成28年度は自分が指導する大学院生がいるので、適宜研究補助を行わせる予定である。また、外国での学会等における研究発表を計画し、予定通り研究費を使用するようにする。平成29年度は最終年度になるので、研究成果を発表するための国内外の学会発表を計画する。
水中・気液界面放電水処理における最適リアクタ構造の解明

放電により酸化力の優れたOHラジカルを生成し、水中有機物を分解することで水を浄化する技術がある。本技術に関する多くの研究が存在するが、これまでどのようなリアクタ構造にすれば、低エネルギーで多くのOHラジカルが有機物と反応するのか明らかになっていない。本研究はそれを明らかにすることを目的として、水中放電方式、気泡内放電方式、水滴表面放電方式のリアクタを設計、製作し、まずOHラジカル生成反応効率と放電形態に対する印加パルス電圧等の影響を調べる。次にオゾン濃度とOHラジカル生成量の関係から、各リアクタのOHラジカル生成経路を調べる。最後に、それらを比較することで最適なリアクタ構造を明らかにする。
色素色色覚異常における分子生物学的研究

J.Nathansらが報告した赤・緑遺伝子の塩基配列を参照に、Exon1からExon6までの各Exonについてプライマーを合成した。色素色色覚異常の3症例に対し静脈血中のリンパ球からDNAを採取し、そのDNAを鋳型とし、先に合成したプライマーとPCR法によって各Exonの増幅を試みた。その結果Exon1,2,3,4,5の増幅に成功し、色素色色覚異常者においても色覚正常者と同様に少なくとも1から5までのExonをもつ赤・緑遺伝子が存在することが解った。
コランダム型構造酸化物による新しい混晶系の創成とその応用探索

コランダム構造酸化物には様々な物性を示すものが多く、その混晶は魅力的である。これまで固溶限が大きいα-(Ga, Fe)_2O_3薄膜が、金属間化合物等の析出物や混晶における元素の濃度分布の偏りが無く、さらに300Kで磁化のヒステリシスカーブを示す事を報告してきた。これらの結果から、α-(Ga, Fe)_2O_3が真の磁性半導体である可能性が高いが、その磁化発現機構を解明するための電子状態、また実用デバイスへの応用上重要である電子輸送特性について評価を行わなかった。そこで、物質材料機構の上田茂典博士、大阪府立大学の山田幾也講師ご協力のもと、Spring-8のBL15XUラインでの硬X線光電子分光(HAXPES)手法を用いて、電子状態評価を行った。その結果、α-(Ga, Fe)_2O_3の磁化発現がFe金属の析出由来では無い事、α-(Ga, Fe)_2O_3薄膜中のFeイオンは3価で存在している事が示俊され、GaサイトにFeイオンが置換固溶しており、またFeOやFe_3O_4等の磁性酸化物が含まれておらず、これらの磁性酸化物が強磁性発現の原因でない事が示された。さらに、α-(Ga, Fe)_2O_3について、フランスVersailles大学のYves Dumont教授、Ekaterina Chikoidze研究員のご協力のもと、Hall効果装置を用いて電子輸送特性を測定したところ、移動度がμ=7.8cm^2/Vs、キャリア密度がn=8.9×10^<14>cm_<-3>を示し、磁性半導体として比較的高い移動度を示した。さらに、磁気モーメントの磁場強度依存性を測定したところ350Kまでヒステリシスループが確認され、キュリー点が350Kを超えている事を確認した。これらの結果から、α-(Ga, Fe)_2O_3は室温以上の温度で強磁性を示す磁性半導体であり、室温動作が可能である事から応用可能性の高さを示す事ができた。spring-8のラインを使用させて頂いた事で構造評価は大きく進み、またその結果、α-(Ge, Fe)_2O_3の磁化発現機構の解明に大きく前進した。しかしながら、バンド構造計算による実験値との比較や、Snドーピングによるキャリア密度の向上等を行う事が出来ず、研究の実施ペースとしてはやや遅れている印象がある。その理由として、膜中の不純物を低減させるための装置改良に予想以上の時間がかかってしまった事が挙げられる。α-(Ge, Fe)_2O_3を強磁性電極に用いるスピントランジスタの開発のためにはα-Ga_2O_3/α-(Al, Ga)_2_O_3界面における2DEG形成が必須であり、早急に実現する必要がある。そのためにはまず、Snドープα-(Ge, Fe)_2O_3のドーピング量に対する正確なキャリア密度制御及び高温域でのSnドナー失活の問題を克服しないと、α-(Ge, Fe)_2O_3へのSnの変調ドーピン、及び高温成長による急峻なα-Ga_2O_3/α-(Al, Ga)_2O_3界面の形成は実現しない。これはとても大きな課題であり、未だに実現されていないので、最優先すべき課題である。さらに、α-(Ge, Fe)_(2) O_(3)以外の機能性酸化物であるα-(In, Fe)_2O_3、α-(In, Fe)_2O_3、α-(Ga, V)_2O_3の作製を行い、物性評価を進める。α-(Ga, V)_2O_3は既に作製を行い、物性評価を進めているが、結晶性の高い薄膜の作製に難航しており、その問題を克服する必要がある。また、本年度以降の記述については本研究課題は平成25年度が最終年度のため、記入しない。

さらに、α-(Ga, Fe)_2O_3について、フランスVersailles大学のYves Dumont教授、Ekaterina Chikoidze研究員のご協力のもと、Hall効果装置を用いて電子輸送特性を測定したところ、移動度がμ=7.8cm^2/Vs、キャリア密度がn=8.9×10^<14>cm_<-3>を示し、磁性半導体として比較的高い移動度を示した。さらに、磁気モーメントの磁場強度依存性を測定したところ350Kまでヒステリシスループが確認され、キュリー点が350Kを超えている事を確認した。これらの結果から、α-(Ga, Fe)_2O_3は室温以上の温度で強磁性を示す磁性半導体であり、室温動作が可能である事から応用可能性の高さを示す事ができた。spring-8のラインを使用させて頂いた事で構造評価は大きく進み、またその結果、α-(Ge, Fe)_2O_3の磁化発現機構の解明に大きく前進した。しかしながら、バンド構造計算による実験値との比較や、Snドーピングによるキャリア密度の向上等を行う事が出来ず、研究の実施ペースとしてはやや遅れている印象がある。その理由として、膜中の不純物を低減させるための装置改良に予想以上の時間がかかってしまった事が挙げられる。α-(Ge, Fe)_2O_3を強磁性電極に用いるスピントランジスタの開発のためにはα-Ga_2O_3/α-(Al, Ga)_2_O_3界面における2DEG形成が必須であり、早急に実現する必要がある。そのためにはまず、Snドープα-(Ge, Fe)_2O_3のドーピング量に対する正確なキャリア密度制御及び高温域でのSnドナー失活の問題を克服しないと、α-(Ge, Fe)_2O_3へのSnの変調ドーピン、及び高温成長による急峻なα-Ga_2O_3/α-(Al, Ga)_2O_3界面の形成は実現しない。これはとても大きな課題であり、未だに実現されていないので、最優先すべき課題である。さらに、α-(Ge, Fe)_(2) O_(3)以外の機能性酸化物であるα-(In, Fe)_2O_3、α-(In, Fe)_2O_3、α-(Ga, V)_2O_3の作製を行い、物性評価を進める。α-(Ga, V)_2O_3は既に作製を行い、物性評価を進めているが、結晶性の高い薄膜の作製に難航しており、その問題を克服する必要がある。また、本年度以降の記述については本研究課題は平成25年度が最終年度のため、記入しない。
基質に隔てられた軟骨細胞がATPによる情報伝達をしていることを証明する

細胞培養:家兎の膝関節から関節軟骨を薄切し、酵素処理して軟骨細胞を単離した。これを比較低密度でプラスチックシャーレに単層培養した。概ね17年度と同じ実験系を用いたが、標本数を増やし詳細な観察を行った。つまり、Fura2を培養液に添加しカルシウム濃度を蛍光観察し、細胞によってCa濃度の周期的な自律変動があることを観察した。この自立的変動を定量的に解析し、刺激がないときの基準値を作成した。続いて、培養液にUTPを加え、培養液中に放出されたATP濃度上昇をルシフェリン/ルシフェラーゼで半定量的に測定することに成功した。そしてUTPを加えたときに細胞内Ca濃度が無刺激時の基準値を超えて上昇していることが明らかになった。同じ実験系に20μM Suramin(ATP受容体阻害剤)を加えると、Ca濃度は基準値を超えることがなかった。したがって、Ca濃度変化の伝播はATP受容体阻害によってほぼ完全に遮断されると結論した。さらに細胞内レベルでの詳細な観察をするために、パッチクランプでATPチャネルの検出を試みたが、これは成功しなかった。乳腺細胞では同様の方法で成功していたが、軟骨細胞の場合には長時間の酵素処理や非生理的な低密度培養などが影響していると考えた。組織培養:家兎の膝関節軟骨を0.2mm程度に薄切し、共焦点顕微鏡で細胞内Ca濃度を観察した。前年度は軟骨の準備方法が一定にできなかったためにATPの効果をアーチファクトから区別することはできなかったが、専用の刃物を考案して厳密な観察をすることに成功した。そしてATPおよびATP阻害剤の効果が細胞培養のときとほぼ同じであることを確認した。家兎の関節軟骨を酵素処理して軟骨細胞を単離し、比較的低密度でシャーレに撒き24時間後に分析した。1)軟骨細胞の性質を確認:低密度培養では形質を維持しにくいため、aggrecanとtype II collagenの発現をRT-PCRで検出した。2)細胞内Ca濃度の計測:Ca感受性蛍光色素Fura-2を培養液に加え、軟骨細胞に負荷した。蛍光顕微鏡と画像処理装置を使用して蛍光の変化を観察し、軟骨細胞で細胞内Ca濃度変化が観察できることを確認した。3)培養細胞を機械刺激して周囲細胞への影響を確認:倒立顕微鏡でCa画像を観察しながら、ガラス棒で1つの細胞を押さえ機械的刺激を与えた。発生した細胞内Ca濃度の変化が、周囲の細胞に伝達されていくことを観察した。4)培養液にUTPを投与した後、培養液中のATPの濃度をルシフェリン/ルシフェラーゼで計測し、軟骨細胞のATPに対する応答を細胞内Ca濃度の変化によって確認した。5)軟骨細胞に存在するATP受容体P_<2Y2>を阻害する20μM suraminを投与し、Ca濃度の変化が伝播しないことを観察した。組織内の細胞の観察6)ATPの投与によって組織内の軟骨細胞が、細胞内Ca濃度を変えていることを観察:家兎の膝関節軟骨を0.2mm程度の薄片とし組織培養した。Ca感受性色素を負荷し、共焦点レーザー顕微鏡で観察しながら、ATPを培養液に加えた。細胞培養実験で効果を確認できたATP放出阻害試薬(Niflumic acidかDIDS)とATP受容体阻害試薬(suramin)によって、ATPに対する応答が消失することを観察した。細胞培養家兎の関節軟骨を酵素処理して軟骨細胞を単離し、比較的低密度でシャーレに撒き24時間後に分析した。平成16年度の研究で軟骨細胞の形質がある程度保たれていることを確認していたが、平成17年度は以下の分析を前年よりも厳密に行って検証した。1)細胞内Ca濃度の計測:Ca感受性蛍光色素Fura-2を培養液に加え蛍光の変化をビデオカメラに撮影した。これによって経時的変化を捉えることに成功した。2)培養液にUTPを投与した後、培養液中のATPの濃度をルシフェリン/ルシフェラーゼで計測した。これもビデオカメラで経時的に観察したが、基準の取り方に更なる工夫が必要であった。3)ATP放出の経路になっていると予想できるATP channelを検出すべくパッチクランプを行なった。しかし、明らかなATP channelをとらえることが出来なかった。試行回数を繰り返すとともに細胞調整の仕方も修正する必要があると考えた。4)軟骨細胞に存在するATP受容体P_<2Y2>を阻害する20μM suraminを投与して観察したところ、Ca濃度の変化が伝播しないことが明らかになった。ただし、感度設定の仕方をさらに厳密にしなければ完全に阻害されているかどうかは断定できない。組織培養1)家兎の膝関節軟骨を0.2mm程度の薄片とし細胞内Ca濃度を観察した。共焦点顕微鏡で観察しながら、ATPおよびATP放出阻害試薬(Niflumic acidかDIDS)を加えた。前年度の観察においては細胞培養と同様の現象が起こると考察したが、詳細に観察すると基準光度の取り方で解釈に大きな違いが出ることが分かった。この違いは、検出精度のみによるものなのか、細胞と組織の違いによるものなのか、組織の切り出し方に起因するものなのか、という疑問に結論を下すにはさらに観察を続ける必要があった。

つまり、Fura2を培養液に添加しカルシウム濃度を蛍光観察し、細胞によってCa濃度の周期的な自律変動があることを観察した。この自立的変動を定量的に解析し、刺激がないときの基準値を作成した。続いて、培養液にUTPを加え、培養液中に放出されたATP濃度上昇をルシフェリン/ルシフェラーゼで半定量的に測定することに成功した。そしてUTPを加えたときに細胞内Ca濃度が無刺激時の基準値を超えて上昇していることが明らかになった。同じ実験系に20μM Suramin(ATP受容体阻害剤)を加えると、Ca濃度は基準値を超えることがなかった。したがって、Ca濃度変化の伝播はATP受容体阻害によってほぼ完全に遮断されると結論した。さらに細胞内レベルでの詳細な観察をするために、パッチクランプでATPチャネルの検出を試みたが、これは成功しなかった。乳腺細胞では同様の方法で成功していたが、軟骨細胞の場合には長時間の酵素処理や非生理的な低密度培養などが影響していると考えた。組織培養:家兎の膝関節軟骨を0.2mm程度に薄切し、共焦点顕微鏡で細胞内Ca濃度を観察した。前年度は軟骨の準備方法が一定にできなかったためにATPの効果をアーチファクトから区別することはできなかったが、専用の刃物を考案して厳密な観察をすることに成功した。そしてATPおよびATP阻害剤の効果が細胞培養のときとほぼ同じであることを確認した。
テロメア合成酵素が大動脈弁狭窄症の発症・進展に与える影響

1大動脈弁狭窄症患者より採取した大動脈狭窄弁を石灰化部、非石灰化部に分割しそれぞれ大動脈弁間質細胞を採取した。また正常部より採取した大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行い、それぞれマイクロアレイ解析を施行した。2石灰化部から採取した大動脈弁間質細胞と石灰化刺激を行った大動脈弁間質細胞で同様の動向を示す遺伝子群をピックアップした。3その中でカルシウム・リン代謝の調節機能を有する一つの分泌タンパク質(Protein X)の同定に成功した。本タンパク質と大動脈弁狭窄症との関連についての報告はなく、i)弁石灰化部周辺に浸潤する間質細胞に高発現すること、ii)弁間質細胞の骨芽細胞分化依存的に細胞外に分泌されることから、薬物による大動脈弁狭窄症治療標的あるいは早期発見のバイオマーカーとして有望である。4Protein Xにも注目し今後の研究を進めていく予定である。5テロメア合成酵素に関してはELISAやTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) assayなどを使用し確認しているが、その発現、活性が弱く、結果にもバラツキを認めるため新たな評価方法を模索している。6テロメア合成酵素の新たな評価法を模索しつつ今回の解析で見出した因子の解析を進め大動脈弁狭窄症の発症・進展における分子機序解明を目指す。石灰化を認めない大動脈閉鎖不全症患者の弁と大動脈弁狭窄症患者の弁からmRNAを抽出してQPCRを施行したところ大動脈弁狭窄症患者の弁ではテロメア合成酵素の主要構成成分であり、遺伝子の転写調節に関与していると報告されているテロメア逆転酵素( Telomerase Reverse Transcriptase : TERT)の遺伝子発現が亢進していた。これらの結果についてELISAやTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) assayなどを使用し確認しているが、その発現、活性が弱く、結果にもバラツキを認めるため新たな評価方法を模索している。本研究の中で大動脈弁の正常部、硬化部、石灰化部より採取した大動脈弁間質細胞と正常部より採取した大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を施行しそれぞれマイクロアレイを用いた網羅解析を行った。正常部、硬化部由来の大動脈弁間質細胞の遺伝子発現には差を認めなかったが正常部・硬化部と石灰化部由来の細胞を比較すると有意に発現に差を認める遺伝子を見出した。同様に正常部由来の大動脈弁間質細胞に人工的石灰化刺激を行い同様にマイクロアレイによる網羅解析を行い、石灰化由来大動脈弁間質細胞と石灰化刺激された正常大動脈弁間質細胞で有意な変化があった遺伝子群をピックアップして解析を進めている。その中でカルシウム・リン代謝の調節機能を有する一つの分泌タンパク質(Protein X)の同定に成功した。今後はこのProtein Xにも注目し今後の研究を進めていく予定である。テロメア合成酵素の活性と石灰化を認めない大動脈弁と大動脈弁狭窄症患者の弁でQPCR上遺伝子発現が亢進していたTERTタンパク発現を確認するための新たな評価方法を検討する。加えて網羅解析で見出した遺伝子群について解析を進めていく。現在その一つである分泌タンパク質(Protein X)についての解析は進めており、実際の大動脈狭窄弁での免疫染色、大動脈弁間質細胞においてProtein Xをノックダウンまたは過剰発現させることで石灰化への影響を検討する予定である。最終的に石灰化への影響が確認されたら大動脈弁狭窄症マウスモデルを用いて遺伝子欠損マウス、過剰発現マウスを使用し病態の発症・進展への影響を検討する予定である。高齢化と生活習慣の欧米化が進み、冠動脈疾患、脳卒中とともに心臓弁膜症の一つである大動脈弁狭窄症(Aortic valve stenosis: AS)の罹患率(先進国で65歳以上の2ー4%)も急激な増加の一途を辿っている。ASは加齢により心臓弁膜の硬化/狭窄を生じ突然死・急性心不全など致命的病態を生じる最重症心疾患の一つである。テロメア合成酵素(テロメラーゼ)は癌を含めた炎症/増殖性疾患の発症・進展に関与することが報告されている。またAS病変と病理学的に酷似した動脈硬化の進展にテロメラーゼが関与することが報告されておりASの発症・進展にも関与する可能性が高い。そこで本研究ではヒト大動脈弁検体及び主要構成細胞である大動脈弁間質細胞を用いてASの進行における新規ターゲットとしてテロメラーゼの関与を検討する。平成28年度は大動脈弁狭窄症の大動脈弁を弁置換手術患者より採取し,それぞれ組織分析用(凍結切片、パラフィン切片)、RNA抽出用、蛋白抽出用、細胞採取用に分割し回収・保存を進めている。また正常弁を剖検症例から採取し同様の処理を行っている。まずヒト大動脈弁の組織学的解析を進めるためヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色、エラスチカ・ワンギーソン(EVG)染色(弾性線維)、PAS染色(多糖類:グリコーゲン・粘液タンパク、糖タンパク、糖脂質など)、マッソントリクローム染色(膠原線維)を施行し解析を進めている。また、弁の石灰化を検討するための染色としてvon Kossa染色、各種免疫染色を含めた組織学的解析を進めている。

加えてブタの大動脈弁、正常弁、狭窄弁から大動脈弁間質細胞を採取培養し石灰化刺激を施行し各種実験を進めている。当初は弁置換術の症例が少なくサンプルの回収に難渋した。現在は順調にサンプルが回収できている。また細胞実験で石灰化刺激を使用しているが当初ブタの大動脈弁間質細胞で試みたところ刺激期間である3週間で予測と比べて過度の細胞増殖により細胞が剥離することや、ヒトの大動脈弁間質細胞で同様の刺激を施行した場合、ブタとヒトの大動脈弁間質細胞の性質の違いにより予測に比して石灰化、細胞増殖の割合が少ないなど刺激法を適正化するのに時間を要した。現在は刺激法並びに石灰化の評価法を確立している。1非心臓死剖検症例、大動脈弁狭窄症患者、大動脈弁閉鎖不全症患者からヒト大動脈弁を採取しリアルタイムPCRを施行したところテロメラーゼの酵素サブユニットであるtelomerereversetranscriptase(TERT)の遺伝子発現が正常弁、大動脈弁閉鎖不全症の大動脈弁(手術検体)と比較し大動脈狭窄症弁で亢進していた。2ブタ大動脈弁から採取したAVICsを用いた予備実験を参考に、in vitro calcification assayを確立した。大動脈弁はもともと構成細胞が少なく、またそのその弁より採取した細胞を用いた培養実験では形質転換など細胞の特性変化により、in vitro解析が困難な場合もあったが、我々は1細胞から細胞特性を維持したまま培養する新規低酸素培養法を導入することで系の最適化に成功した。これにより生体内により近い状態で効率的に細胞を増殖させることが可能であり、効率的に研究を進めていくことが可能になった。本法をもとにヒト大動脈正常弁(非心臓死剖検症例)と狭窄弁(手術検体)よりAVICsを採取し石灰化刺激を施行した。3それら大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行いマイクロアレイ解析によりその遺伝子発現プロファイルを詳細に解析した。その結果、石灰化刺激により顕著に発現上昇している遺伝子を533種、また発現低下している遺伝子として476種を同定することに成功した。これらの中にはカテプシンKなど従来AS患者由来弁の網羅解析などで同定された遺伝子も多く含まれていたが、機能未知の新規の遺伝子も多数含まれていた。現在この結果に基づいてPathway解析を実施しており、弁膜の石灰化に関与すると考えられている遺伝子(BMP-2、BMP-4、Runx2、Ostepontin、Alkaline phosphatase)とともにテロメラーゼとの関連を明らかにする予定である。TERTの蛋白を検出するのにウエスタンブロッティングを施行しているが非特異的バンドが出現しそのバンドが確実にTERTの蛋白質であるという確証が得られず現在他の抗体を選定中である。TERTのELISAも購入し検出を試みたが値がばらつくため手法を検証している。テロメラーゼ活性をTRAPassay (Telomeric Repeat Amplification Protocol)を用いて解析しようと試みたがアッセイがうまくいかずキット販売業者とも相談し解決策を模索している。
白血病発症過程におけるDNA脱メチル化関連分子の果たす機能的役割の統合的理解

平成30年度は、急性骨髄性白血病関連遺伝子の条件的発現マウスにおける解析結果を踏まえ、まず、本研究の対象となる急性前骨髄性白血病の原因遺伝子の一つ、PML-RARαキメラ遺伝子による白血病発症の分子メカニズムにおける、ゲノムDNAメチル化関連遺伝子の役割について、独自に作成した条件的ノックアウトマウスモデルを用いた解析を開始した。予備的に、in vitroの検討として、この条件的ノックアウトマウスの骨髄幹・前駆細胞に、レトロウイルスを用いてPML-RARαキメラ遺伝子を遺伝子導入して不死化した細胞において、ノックアウトを誘導すると、コロニー形成能の増強を示唆する結果が得られた。そこで、in vivoでの検討を行うために、同様に条件的ノックアウトマウスの骨髄幹・前駆細胞に、レトロウイルスを用いてPML-RARαキメラ遺伝子を遺伝子導入した細胞を、放射線照射した同系マウスに投与する骨髄移植実験を行い、生着を確認した後に、ノックアウトを誘導し、経時的に観察、解析を行った。ノックアウト自体は、末梢血のゲノムDNAの遺伝子解析により、効率的に起こっていることを確認したが、実験経過中、経時的に末梢血中の血球数や表面抗原の発現パターンに有意な変化を見いだすことはできず、白血病を発症することはなかった。そこで、ノックアウトを先行的に誘導することが重要である可能性を想定し、先に条件的ノックアウトしたマウスの骨髄細胞を回収し、レトロウイルスを用いてPML-RARαキメラ遺伝子を遺伝子導入した細胞を、放射線照射した同系マウスに投与する骨髄移植実験を行った。既に生着は確認できており、経時的に観察、解析を行っているところである。以前、独自に解析した、公開されている急性前骨髄性白血病の遺伝子発現プロファイリングに基づくデータの通り、in vitroの実験系で、当該ゲノムDNAメチル化関連遺伝子の機能的欠損が白血病細胞に有利に作用することを見いだした。一方、より生体における白血病発症の分子メカニズムに迫るために行った、骨髄移植後の機能的欠損誘導モデルでは、期待していた急性前骨髄性白血病の発症に至らなかった。このこと自体は、in vitroモデルをそのままin vivoモデル系に適用できないという、生体における白血病発症モデルの構築において、しばしば経験されることであり、改良を重ねて克服していく予定である。想定通りのin vitro実験の結果を反映する、in vivo白血病発症モデルの構築を目指して、ノックアウトのタイミング、ヘテロノックアウトでの検討、用いる細胞の分化段階の検討など、多角的に進めていく予定である。(理由):遺伝子解析の実験において、使用した試薬の必要数が当初の計画よりも少なくすんだため。(使用計画):31年度に行う遺伝子解析の実験に使用する予定である。
アテローム血栓症におけるKalirinの関与

宮崎大学医学部附属病院および教育関連病院で採取された心筋梗塞患者の動脈硬化病変、またはヒト剖検症例の冠動脈標本を用いて、冠動脈の動脈硬化病変でカリリンが発現しているかどうか、発現している場合は臨床所見とどのような関係にあるかを検討した。その結果カリリンは、動脈硬化病変では発現が認められず、動脈硬化との関連は明らかではなかった。今回の検討の中で、全身の動脈硬化病変を評価したところ、72%の症例で、下肢動脈に高度の動脈硬化がみられた。(1)宮崎大学医学部附属病院および教育関連病院で施行されるDCA標本200例、心筋梗塞患者の冠動脈から採取される吸引血栓・血液サンプル60例およびヒト剖検症例冠動脈標本50例を用いて、冠動脈プラークと非プラークにおけるカリリン蛋白発現の局在を免疫組織化学的に検討し、同時に細胞レベルにおけるmRNA発現量および発現様式をリアルタイムPCR法、マイクロダイセクション法およびIn situ hybridization法により検討し、動脈硬化巣の組織所見との関連を明らかにする。動脈硬化巣における組織因子活性を測定し、組織因子活性を抑制するかどうかを検討する。(2)DCA標本、吸引血栓・血液およびヒト剖検症例冠動脈標本でのカリリン蛋白・mRNA発現とその局在および蛋白量の結果と臨床所見(安定狭心症vs.不安定狭心症、再狭窄の有無・程度との関連)を比較検討し、アテローム血栓症発症におけるカリリンの関与について検討する。また、糖尿病、高脂血症、高血圧、喫煙などの危険因子との関連性についても検討する。1カリリンタンパク、mRNAの発現が確認できていない。また狭心症と不安定狭心症についても、タンパクやmRNA発現が確認できず、その関連性についての検討はできていない。糖尿病、高脂血症、高血圧についても同様に関連性を示すことはできていない。2カリリンの蛋白、mRNAの発現は確認できていない。また不安定狭心症、糖尿病、高脂血症、高血圧などの臨床的な関連性についても今のところ関連性は証明されていない。現在カリリンの発現を確認中であり、発現が認められるようであれば、臨床所見などと合わせて解析する予定である。宮崎大学医学部附属病院および教育児関連病因で施行されるDCA標本、心筋梗塞患者の冠動脈から採取される吸引血栓・血液およびヒト剖検症例冠動脈標本を用いて、冠動脈プラークとひプラークにおけるカリリンの蛋白発現の局在を免疫染色で検討したが、カリリンの発現は認めなかった。また細胞レベルにおけるmRNA発現量をリアルタイムPCR法、マイクロダイセクション法、In situ hybridizationにより検討したが、カリリンのmRNAの発現は認めなかった。血栓形成に関与に関しても、カリリンの関与はみられなかった。DCA標本、吸引血栓・血液およびヒト剖検症例冠動脈標本でのカリリン発現の結果と臨床所見(安定狭心症vs不安定狭心症、再狭窄の有無、程度との関連)を比較検討したが、カリリンと上記の臨床所見には明らかな関連性は認めなかった。また糖尿病、高脂血症、高血圧症、喫煙などの動脈硬化症の危険因子についても検討したが、これら危険因子との関連もみられなかった。剖検症例標本を用いて、全身の動脈硬化病変を評価したところ、72%の症例で、下肢の動脈(総腸骨動脈)に高度の動脈硬化変化を認め、石灰化、プラーク内出血、プラーク破綻を高頻度に認めた。下肢の動脈硬化票片は、年齢(60歳以上)、男性、高血圧症、糖尿病、喫煙者に多かった。また下肢動脈硬化病変は、心血管イベント、心筋梗塞、脳梗塞とも相関を示し、下肢の動脈硬化は、全身の動脈硬化を反映することがわかった。引き続きカリリンの発現について、蛋白、mRNAについて検討していく。また発現がある場合は、臨床所見との関連を検討していく。病理引き続きカリリンの発現について、タンパク、mRNAについて検討していく。
湿原における脱窒および亜酸化窒素生成に電子供与体が与える影響

霞ヶ浦の堆積物を用いて脱窒活性と溶存有機物(DOM)の関係を検討した.DOMの分子量が脱窒に与える影響をみるために,分子量の異なる有機物化合物を脱窒活性へ添加した.その結果,脱窒が必ずしもDOMの分子量に支配されないことが解った.さらに,DOMの平均結合エンタルピーが脱窒に与える影響を検討するために,分子量はほぼ同じ(約100)だが平均結合エンタルピーの異なる有機物化合物を脱窒活性へ添加した.その結果,平均結合エンタルピーと脱窒活性に相関はなかった.脱窒とDOMの相互関係を明らかにするためには,さらなる検討が必要であると考えられた.湿原において人為由来の硝酸(NO3-)の負荷量が増加しており富栄養化や酸性化が深刻化しつつある.脱窒は湿原のNO3-消失を担う重要な過程であるのに加えて温暖化ガスである亜酸化窒素(N2O)を生成するため,その把握が喫緊の課題となっている.これまで湿原の脱窒およびN2O生成に関して多くの報告があるが,未だにそれらの正確な見積もりには至っていない.その原因の1つとして脱窒の電子供与体である溶存有機物(DOC)の質とその量が考慮されていないことが挙げられる.そこで本研究では,湿地における脱窒およびN2O生成にDOCの質とその量が与える影響を解明することを目的とする.申請者は,昨年度より立正大学から東邦大学へ移動したため,まず実験機器等の設備を新たに整える必要があった.昨年度はDOC量を測定する全有機炭素(TOC)計を調製した.今年度はDOCの質を,分光蛍光光度計による三次元励起蛍光スペクトル法で得たデータをPARAFAC解析することにより同定する方法の開発に努めた.PARAFAC解析とは主成分分析に似た多元分解分析法のひとつであり,この解析により多数あるピークを統計学的に分け同定することができる方法である.PARAFAC解析にはある程度まとまった数のサンプルが必要であるため,現在空間的および時間的に異なった湿原の水サンプルを集め,解析について検討を行っている.DOCのどのような成分が脱窒およびN2O生成を支配するのか明らかにするために,引き続き湿原土壌中のDOCの質とその量を解析していく予定である.窒素安定同位体比を測定する質量分析計(GCーMS)などその他の機器についても現在調整中である.脱窒とは,嫌気条件下で硝酸を窒素ガスへ還元する微生物過程である.この過程は,生態系の窒素を無毒化し大気中へ放出するため,浄化という点で重要な過程だと考えられている.そのため富栄養化の影響を受けやすい水域で脱窒の把握が急がれている.しかしながら,これまで脱窒を支配する水温,pH,溶存酸素濃度,NO3ー濃度といった環境因子が研究されてきたが,溶存有機物(DOC)との関係については不明な点が多い.脱窒細菌は従属栄養細菌であり,DOCを利用する.これまでに有機物の量と質を同時に考慮した研究例は少なく,有機物の分子量が大きいほど脱窒細菌が利用できないなどの報告があるが定かではない.本研究では,脱窒とDOCとの関係を明らかにするために,有機物の添加培養実験を行い,有機物の量と質が脱窒に与える影響を考察した.脱窒活性はアセチレン(C2H2)阻害法に準じて測定した.脱窒と有機物の量の検討は,グルコース(Glu)を用い,脱窒活性への添加実験を行った.有機物の質の検討は,Glu,フェノール(Phe),チロシン(Tyr),キニーネ(Qui),フタル酸(Pht)を用いた.有機物の量の検討では,脱窒活性はGluの低濃度範囲では濃度に伴って増加したが,高濃度範囲では比例的に増加しなかった.これは過剰なGluに対して脱窒細菌が阻害を生じたためと考えられた.有機物の質の検討では,両炭素量ともGlu,Tyr,Pht添加の脱窒活性は有機物添加がないものに比べて増加するか同程度だった.一方,Phe,Qui添加の脱窒活性は減少した.Glu,Tyr,PhtはPheやQuiと比べて単結合が多いため,脱窒細菌に分解されやすいと考えられた.本研究を通して,有機物の分子間の結合エンタルピーの違いが脱窒を支配すると推察された.この結果は,有機物の質として分子量よりもむしろ構造の違いが脱窒に影響することを示している.霞ヶ浦の堆積物を用いて脱窒活性と溶存有機物(DOM)の関係を検討した.DOMの分子量が脱窒に与える影響をみるために,分子量の異なる有機物化合物を脱窒活性へ添加した.その結果,脱窒が必ずしもDOMの分子量に支配されないことが解った.さらに,DOMの平均結合エンタルピーが脱窒に与える影響を検討するために,分子量はほぼ同じ(約100)だが平均結合エンタルピーの異なる有機物化合物を脱窒活性へ添加した.その結果,平均結合エンタルピーと脱窒活性に相関はなかった.脱窒とDOMの相互関係を明らかにするためには,さらなる検討が必要であると考えられた.湿原において人為由来の硝酸(NO3-)の負荷量が増加しており富栄養化や酸性化が深刻化しつつある.脱窒は湿原のNO3-消失を担う重要な過程であるのに加えて温暖化ガスである亜酸化窒素(N2O)を生成するため,その把握が喫緊の課題となっている.

これまで湿原の脱窒およびN2O生成に関して多くの報告があるが,未だにそれらの正確な見積もりには至っていない.その原因の1つとして脱窒の電子供与体である溶存有機物(DOC)の質とその量が考慮されていないことが挙げられる.そこで本研究では,湿地における脱窒およびN2O生成にDOCの質とその量が与える影響を解明することを目的とする.今年度は,申請者が立正大学から東邦大学へ移動したため,まず実験機器等の設備を新たに整えた.DOC量を測定する全有機炭素(TOC)計(平沼全有機炭素測定装置TOC-2300,平沼産業株式会社)は購入し,調製した.DOCの質は東邦大学に設備されている分光蛍光光度計で解析することが出来た.NO3-,NH4+,N2Oなどの安定同位体比を測定する質量分析計(IRMS)とガスクロマトグラフー質量分析計(GCーMS)については現在調整中である.2011年8月と10月の釧路湿原土壌約0,20,50,100,150,200cmの間隙水中のDOC濃度は,土壌深度とともに増加した.分光蛍光光度計を用いたDOCの解析結果は,湿原土壌0cmの間隙水とそれ以深の間隙水で大きく異なっていた.これまでに申請者らは,土壌深層部で脱窒が抑制されている(Senga et al. 2011)ことを見出している.従って,これらの結果はDOCの質およびその量の違いが脱窒を左右している可能性があることを示唆している.DOCのどのような成分が脱窒およびN2O生成を支配するのか明らかにするために,引き続き湿原土壌中のDOCの質とその量を解析していく予定である.昨年度大学を移動し、また移動先の研究室の引っ越しを強いられるなど、設備がなかなか整わず、遅れが生じている。しかし、検討の余地はあるものの、設備は急速に整いつつあるので、今年度は十分に研究が進められると考えている。大学を移動したため、設備を新たに整えなければならず、やや遅れが生じた。研究体制を整える。引き続き釧路湿原での定期観測を行い、基礎データを集める。定期観測の結果から脱窒およびN2O生成の時間的・空間的変動を明らかにし、その支配因子との関係を検討する。質量分析計(IRMS)とガスクロマトグラフー質量分析計(GCーMS)など,研究が出来る体制を整える.特に,15Nトレーサー法(15NO3-を添加しインキュベーション後,生成したNH4+,N2,,N2Oの安定同位体比を質量分析計(IRMS)とガスクロマトグラフー質量分析計(GCーMS)で測定)を用いて,脱窒およびN2O生成とDOC構成物質との関係が解明できるようにする.釧路湿原での定期観測を引き続き行い,有機物含有量,DOCの質とその量,脱窒活性,N2O生成活性など基礎データを集める.定期観測の結果から脱窒およびN2O生成の時間的・空間的変動を明らかにし,その支配因子との関係を解析する.1発生した状況:研究設備の調製が遅れ、当初の研究計画と異なる状況となった。2物品費:565,418円(試薬類、恒温槽、採水器、センサーなど)旅費:200,000円(釧路湿原および学会の交通費および宿泊費)人件費・謝金:0円その他:100,000円(英語論文校閲代)当該研究費が生じた状況:大学を移動したため,当初の研究計画と異なる状況となった.物品費:300,000円(薬品類,サンプル瓶類等)旅費:400,000円(釧路湿原へ調査およびサンプルの回収4回,研究成果発表のための交通費および宿泊費)人件費:0円その他:50,000円(英語論文校閲代)