hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アイソトープ治療に適した抗体標識薬剤の分子設計

組織移行性と血液消失の速やかな低分子化抗体やAffibodyなどのポリペプチドが開発され、アイソトープ治療の有効性と安全性の向上が期待される。しかし、これらのポリペプチドは腎臓への非特異的な集積を示して重篤な腎臓障害を招く。ポリペプチドが腎細胞へ取り込まれる前に、放射性化合物を遊離させて尿中へ排泄できれば腎臓の放射活性を大きく低減できると考えた。本薬剤設計に必要な、腎臓の酵素で速やかに開裂される結合様式と新たな標識薬剤についての知見を得た。ラジオアイソトープ(RI)標識抗体フラグメントやペプチドを用いるがんのRI治療は,優れた抗腫瘍効果を示す一方で,これら薬剤の腎集積のため重篤な腎障害を誘発する.この問題の解消は優れた抗がん剤の開発に直結することから,本研究では,酵素による代謝開裂特性を付与したペプチド標識薬剤の開発からこの問題の解消を行う.すなわち,腎刷子縁膜に存在する酵素の作用で抗体やペプチドから,放射性代謝物を速やかに遊離して尿中へ排泄する標識薬剤を設計,合成し,これによる腎臓の放射線障害の解消を目的とする.錯体の基本骨格として,金属RIであるイットリウム-90(^<90>Y)やインジウム-111(^<111>In)と安定な錯体を形成する1,4,7,10-tetraazacyclododecane tetraacetic acid (DOTA)を選択した.尿排泄性の放射性代謝物としてDOTAの一つの酢酸を4-methylbenzoylglycineに置換したD3B-Gを設計し,先ず,その合成法を検討した.そして,DOTAに三分子の酢酸エステルを収率良く導入する反応条件,DOTAの残りの二級アミノ基にbenzylbromideを収率良く結合する条件を明らかにし,D3G-Bの高収率合成法を確立した.腎刷子縁膜酵素によりD3B-Gが選択的に遊離される基質としてグリシルリジン,グリシルチロシン,グリシルグルタミン酸,グリシルアスパラギン酸を選択し,現在,これらの基質配列を有するD3B-G誘導体の合成を進めている.また,D3B-Gと^<111>Inとの反応を検討したところ,DOTA骨格へのベンジル基の導入は^<111>Inとの錯形成反応速度を予想以上に妨げることを認めた.今年度以降,腎刷子縁膜酵素により速やかな開裂を受ける基質構造の探索を行うと共に,^<111>Inとの錯形成反応に適したDOTA誘導体の設計,合成を行う計画である.ラジオアイソトープ標識抗体フラグメントやペプチドを用いた癌治療の有効性と安全性の向上には,腎集積の低減が必要である。本研究では,腎臓刷子縁膜酵素の作用で標識抗体から尿排泄性の放射性代謝物を遊離する標識薬剤の開発を検討した。刷子縁膜酵素の作用で抗体から遊離する金属RIキレートには、腎細胞へ取り込まれることなく速やかに尿中へ排泄を受ける性質が要求される。また,任意の比放射能の標識抗体の作製が可能であるよう低濃度においても金属RIと速やかに錯体を形成すること、血漿中において安定な錯体を維持する必要がある。本年度は,これらの要求を満たすインジウムー111(In)およびテクネチウムー99m(Tc)標識薬剤の検討を行った。1,4,7,10-Tetraazacyclododecane tetraacetic acid(DOTA)の一つのアミノ基にベンジル基を導入した場合、生成するIn錯体の安定性の低下が観察された結果を受け、DOTAのアミノ基にフェネチル基を導入した。しかしこの場合も、In錯体の安定性は低減し、DOTAの骨格炭素の修飾から尿排泄性の高いIn錯体を開発することが本薬剤設計に不可欠であることを明らかにした。従来汎用されるTc(V)に比べてTc(I)は加水分解等に対する高い安定性を有することから,比放射能の高いTc標識抗体の作製に有利と考えられる。Tc(I)に適したキレート試薬の検討から,ニコチン酸を基本構造とする数種の候補化合物を開発した。さらに,これらの化合物にglcyl-lysineやglycyl-tyrosine配列を導入した場合,ラット腎臓から調整した刷子縁膜小胞により,これらペプチド結合が速やかに開裂されることを認めた。20年度は最も優れた候補化合物を選択し,抗体フラグメント標識薬剤への応用を検討する。アイソトープ標識低分子化抗体の投与で腎臓に持続的に高い放射活性が観察され、アイソトープ治療の大きな障害となっています。現在、affibodyを始めとするアイソトープの運搬体として優れた性質のペプチドの開発が進められていることから、腎臓に対流する放射活性を解消する薬剤設計が達成されれば、アイソトープ治療の有効性と安全性が大きく向上する。申請者らは、低分子化抗体が腎細胞へ取り込まれる刷子縁膜に存在する酵素の作用で、低分子化抗体から尿排泄性の放射性化合物を遊離する薬剤設計からこの問題の解決を進めている。

昨年までの研究から、DOTAのアミノ基の1つに4一methylbenzoylglycineを結合することで、glycineに結合したlysineあるいはtyrosineとのペプチド結合が刷子縁膜酵素によりきわめて速やかに開列を受けることを認めた。しかし、4-methylbenzoylglycineの導入は、DOTAが有する111Inとの錯形成能を大きく損なうことを認めた。そこで、DOTAの錯形成能を損なわずに尿排泄性の高い111In標識化合物を与える配位子の開発に必要なベンジルDOTAの高収率合成法を検討した。そして、DOTA骨格に導入したベンゼン環のパラ位に任意の官能基の導入が可能な新規合成方法を確立した。本化合物にglycineを導入後、様々なアミノ酸とペプチド結合で架橋した場合のペプチド結合の開列性並びにglycine誘導体の体内動態について検討を継続する予定である。また、テクネチウム-99m(99mTc)に対しては、イソニコチン酸にジアミンを導入した誘導体が1価の99mTcと熱力学的にも速度論的にも安定な錯体を形成することを明らかにした。現在、本化合物にさらなる官能基の導入を行い、アロステリック効果による錯形成能の向上を目指して検討を進めている。
古代アンデス文明形成期祭祀センターの比較研究

本研究によって明らかになった成果は以下の点である。1古代アンデス文明発展の初期において公共的祭祀のための特別な建築すなわち神殿が社会の中心として機能した。その建築の規模は移跡によりまた時期によりさまざまであるが、非常に大規模な建設作業が必要であり、労働集約的である。2このような神殿建設は、アンデス文明形成期と呼ばれる時代の少し前から始まっており、形成期という時代の定義の変更をして紀元前2500年頃までにさかのぼらせることが必要かもしれない。この点は今後の研究課題である。3先土器時代末期の神殿はペル-の高地と海岸の両方の地域で発達していた。中部海岸のやや内陸部にまで北高地南部のコトシュ宗教伝統が広がっていたが、北海岸では円形半地下式広場を伴う神殿が一般的であった。4形成期前期では中部海岸と北海岸に巨大な祭祀センターが発達する。土を盛り上げた段階テラス型神殿と、細長くのびる広場型、U字形神殿といった形態の変異がある。北高地では3段の土留め壁をめぐらした大基壇神殿が多い。5紀元前700年前後の頃、北高地において海岸の神殿と高地の神殿の両方の特徴を融合させた特異な神殿が現れる。パコパンパ、クントゥル・ワシ、ラ・パンパ、チャビン・デ・ワンタルなどである。年代測定のデータをあてはめると、これらの神殿が建設されるとき、北海岸と中央海岸での大規模な祭祀建築は放棄されている。この現象の実体とその意義については今後の調査による解明が必要である。本年度の研究において、特に力を入れたのは、研究の中心課題であるアンデス形成期の祭祀センター諸遺跡の平面図や構造のわかる報告書や研究論文の渉猟である。また、研究代表者自身の調査が明らかにしたクントゥル・ワシ遺跡、ワカロマ遺跡、セロ・ブランコ遺跡の図面の整理も行って、比較研究のための基礎資料の作成を行った。現在手元に集積できた形成期祭祀センターの図面資料は、ペル-北高地のクントゥル・ワシ、ワカロマ、ライソン、セロ・ブランコ、北高地南部のコトシュ、パウカルバンバ、サハラパクタ、ラ・パンパのものである。今後、比較研究のために、北高地南部のチャビン・デ・ワンタル、そして北ならびに中央海岸の形成期遺跡に関する平面図および構造図を報告書などから選び出し、あるいは記述から復元する必要がある。クントゥル・ワシ調査では、建築や広場の床下を走る排水溝の仕組みがかなりの程度明らかになった。このことはこれまで部分的にしかわからなかった高地の神殿に伴う地下式排水溝の意味について、その解明を一歩進めるところとなり、その図下作業もほぼ終了した。年代測定もある程度進んでおり、クントゥル・ワシ神殿の測定結果は、クントゥル・ワシ期の神殿が紀元前800年から450年頃、つづくコパ期の神殿が450年から250年頃までと出て、北高地北部の他の祭祀センターの年代と矛盾しないことがわかった。ただし、北高地南部の大センターであるチャビン・デ・ワンタルの年代とは矛盾する点があり、今後さらに関連する遺跡の年代測定を充分な形で行い、形成期の時間的幅や各遺跡の時間的位置づけを明確にし、比較研究の基礎としたい。なお、クントゥル・ワシとセロ・ブランコの調査成果は、スペイン語の報告書として出版した。また、一般向けの形ではあるが、研究成果の一端を日本語の書物の中で紹介した。その建築の規模は遺跡によりまた時期によりさまざまであるが、非常に大規模な建設作業が必要であり、労働集約的である。

3先土器時代末期の神殿はペル-の高地と海岸の両方の地域で発達していた。中部海岸のやや内陸部にまで北高地南部のコトシュ宗教伝統が広がっていたが、北海岸では円形半地下式広場を伴う神殿が一般的であった。4形成期前期では中部海岸と北海岸に巨大な祭祀センターが発達する。土を盛り上げた階段テラス型神殿と、細長くのびる広場型、U字形神殿といった形態の変異がある。北高地では3段の土留め壁をめぐらした大基壇神殿が多い。5紀元前700年前後の頃、北高地において海岸の神殿と高地の神殿の両方の特徴を融合させた特異な神殿が現れる。パコパンパ、クントゥル・ワシ、ラ・パンパ、チャビン・デ・ワンタルなどである。年代測定のデータをあてはめると、これらの神殿が建設されるとき、北海岸と中央海岸での大規模な祭祀建築は放棄されている。この現象の実体とその意義については今後の調査による解明が必要である。
マイクロビームX線回折法による水中油滴型エマルション中の油脂の結晶化機構の解明

(1)ビーム径0.7x1.0mmのマクロビームを用いた実験ヘキサデカン(炭素数16の長鎖アルカン)を油相とした水中油滴型エマルション(油滴の平均粒径1,10,30,40マイクロメートル)にマクロビーム放射光X線をあてながら、冷却過程とその後の加熱過程における油滴の結晶化および融解挙動の経時変化を調べた。その結果、油滴に添加剤(親油性界面活性剤)を加えたすべての粒径の油滴結晶化において、添加剤が界面で鋳型となりバルク系とは異なる結晶多形、pseudo-hexagonal相の出現する界面不均一核形成および結晶成長が見られた。これは、n-ヘキサデカン以外の油脂を用いた系でも同様の結果が示唆された。さらに、平均粒径10マイクロメートル以上の場合、バルク系で報告されている結果と同様の回転相の存在が確認されたが、1マイクロメートルの粒径のものでは、回転相は見られなかった。また、油滴に親油性界面活性剤を添加した場合、全ての粒子径において回転相が確認された。以上をまとめると、油水界面で、界面不均一核形成を引き起こされ、回転相およびpseudo-hexagonal相が出現しやすくなったと考えられる。添加剤は、油水界面における鋳型を補強すると考えられる。(2)ビーム径5.0マイクロメートルのマイクロビームを用いた実験油滴をヘキサデカン(炭素数16の長鎖アルカン)を油相とした水中油滴型エマルション(油滴の平均粒径30,40マイクロメートル)にマイクロビーム放射光X線(ビームサイズ5x5マイクロメートル)をあてながら、結晶化後の油滴粒子一つずつの結晶の様子を調べた。その結果、油滴の端にビームを当てた場合には、油滴の中央を貫くようにビームを当てた場合に比較して、回転相に対応する回折ピークが新たに現われた。このことより、回転相は界面付近より現われており、予想通り油水界面からの界面不均一核形成により回転相が出現することが示唆された。(1)ビーム径0.7x1.0mmのマクロビームを用いた実験長鎖アルカンを油相とした水中油滴型エマルション(油滴の直径を10,30,45マイクロメートルに調整)にマクロビーム放射光X線をあてながら、冷却過程とその後の加熱過程における油滴の結晶化および融解挙動の経時変化を調べた。その結果、ヘキサデカン(炭素数16の長鎖アルカン)に回転相の存在することを示唆する回折ピークが見出された。この結果は、1999年にバルク系で報告されている結果(E.Sirota et al.,Science 283,529-532(1999))と一致する。しかし、上記バルク系における報告では非常に限られた温度条件でしか存在しないと指摘しているのに対し、エマルションのような油水界面が多数存在する状態では、冷却過程において、必ず回転相が出現するという点がバルク系と異なり、今回初めて得られた知見である。現在、然るべき国際的学術雑誌に投稿準備中である。(2)ビーム径5.0マイクロメートルのマイクロビームを用いた実験レーザートラップ法により、上記と同様のエマルションの固定は技術的に可能となり、何度か測定も試み、データも得たが、問題点として、レーザー照射による油滴中の温度上昇を十分に制御できず、レーザートラップ法ではうまくいかないことが判明した。

そこで、油滴の固定と温度制御の両方を行うことの可能な代替法として、マイカの薄膜内に試料を閉じ込め、薄膜の両側(壁面)で油滴を固定することを考え、代替法として利用可能であることを確認した。今後、測定を本格化する予定である。(1)ビーム径0.7x1.0mmのマクロビームを用いた実験ヘキサデカン(炭素数16の長鎖アルカン)を油相とした水中油滴型エマルション(油滴の平均粒径1,10,30,40マイクロメートル)にマクロビーム放射光X線をあてながら、冷却過程とその後の加熱過程における油滴の結晶化および融解挙動の経時変化を調べた。その結果、平均粒径10マイクロメートル以上の場合、バルク系で報告されている結果と同様の回転相の存在が確認されたが、1マイクロメートルの粒径のものでは、回転相は見られなかった。また、油滴に親油性界面活性剤を添加した場合、全ての粒子径において回転相が確認された。これまでの我々の研究報告をもとに考えると、親油性界面活性剤が油水界面において鋳型の役割をして、界面不均一核形成を引き起こし、回転相が出現しやすくなったと考えられる。(2)ビーム径5.0マイクロメートルのマイクロビームを用いた実験油滴をヘキサデカン(炭素数16の長鎖アルカン)を油相とした水中油滴型エマルション(油滴の平均粒径30,40マイクロメートル)にマイクロビーム放射光X線(ビームサイズ5x5マイクロメートル)をあてながら、結晶化後の油滴粒子一つずつの結晶の様子を調べた。その結果、油滴の端にビームを当てた場合には、油滴の中央を貫くようにビームを当てた場合に比較して、回転相に対応する回折ピークが新たに現われた。このことより、回転相は界面付近より現われており、予想通り油水界面からの界面不均一核形成により回転相が出現することが示唆された。現在、この現象の再現性を確認中である。
集団の的確で創造的な問題解決を促進するチームワークの研究

本研究は、集団による的確で創造的な問題解決を導くような優れたチームワークに備わっている諸特性と機能について、社会心理学的視点から明らかにすることを目指した。まず、チームワークの概念を整理し、先行研究のレビューを行って、関連研究の動向を確認し、本研究の目的と位置づけを明確にする作業を行った。続いて、企業組織における販売営業チームを対象として、実証的検討を行った。具体的には、対象企業の協力を得て、モバイル・コンピュータやEmail、電子会議を活用したシステムを介して行われたチーム・コミュニケーションの様相について、データベースに記録されたすべての交信ログを内容分析し、時系列的に検討した。引き続き、質問紙調査およびインタビューを行って、メンバーが、チーム・コミュニケーションやチームワークに関して、どのように認知しているのか検討した。さらに、これらの分析データについて、優秀な業績をあげ続けているチームと、業績が伸び悩んで苦戦しているチームとで比較することによって、優れたチームワークを規定する変数を検討した。分析結果は以下のようにまとめられる。優れた業績をあげているチームでは、チーム内で交わされる情報の性質は課題遂行・問題解決を指向するものが主流を占め、チームワークの概念として「個々が役割をきちんと果たすこと」が多く選択されていた。これに対し、苦戦するチームでは、情緒的支援や指示伝達情報の確認のためのチーム・コミュニケーションが主流を占め、チームワークの概念として「互いの弱点を補い合うこと」が多く選択されていた。本研究では、メンバーに認知されるチームワークの概念は、チーム・コミュニケーションのあり方やチームの業績と相互作用しながら、チームの個性を生み出していることが示された。そうした相互作用がチームの問題解決や課題遂行と連関していく様相のさらなる解明が今後の課題として提示された。本研究は、集団による的確で創造的な問題解決を導く優れたチームワークが備えている諸特性と機能について、社会心理学的視点から明らかにすることを目的としている。初年度となる本年は、企業組織の現場に実証的検討の場を求め、優秀な業績をあげ続けているチームと、業績が伸び悩んで苦戦しているチームのそれぞれについて、チーム・コミュニケーションやリーダシップなど、チームワークの重要な要素にかかわる実態を解明し、比較検討して、効果的なチームワークの特性究明を試みた。具体的には、まず、第一段階として、チーム・メンバーへの質問紙調査およびインタビュー調査を行って、仕事の中でチームワークとみなしていることがらや自らの行動について、現場の当事者がどのように認識しているのか把握した。次に、第二段階として、各チームの活動状況の観察と、社内情報交換システムに蓄積されたチーム・コミュニケーションの記録の内容分析を行った。チーム・コミュニケーションの内容分析を通して、業績不振のチームと対比させながら、業績優秀チームに見られるチームワークの特性について明らかにすることに取り組んだ。この内容分析はの作業は、社内情報交換システムのサーバー・コンピュータに1995年から記録されたすべてのログを対象にして行う膨大なものであり、引き続き来年度にも継続し、さらに意味のある知見を見いだす取り組みを続ける。なお、理論的枠組みの精緻化をはかるために、セルフ・マネジング・チーム研究の権威である南カリフォルニア大学のS.G.Cohen教授の協力を仰ぎながら研究デザインのリビュー行っている。得られた研究成果のは、2000年8月の産業・組織心理学会、9月の日本グループ・ダイナミックス学会、11月の日本心理学会および日本社会心理学会において発表した。また、論文にまとめているところであり、近く投稿するところまできている。

具体的には、対象企業の協力を得て、モバイル・コンピュータやEmail、電子会議を活用したシステムを介して行われたチーム・コミュニケーションの様相について、データベースに記録されたすべての交信ログを内容分析し、時系列的に検討した。引き続き、質問紙調査およびインタビューを行って、メンバーが、チーム・コミュニケーションやチームワークに関して、どのように認知しているのか検討した。さらに、これらの分析データについて、優秀な業績をあげ続けているチームと、業績が伸び悩んで苦戦しているチームとで比較することによって、優れたチームワークを規定する変数を検討した。分析結果は以下のようにまとめられる。優れた業績をあげているチームでは、チーム内で交わされる情報の性質は課題遂行・問題解決を指向するものが主流を占め、チームワークの概念として「個々が役割をきちんと果たすこと」が多く選択されていた。これに対し、苦戦するチームでは、情緒的支援や指示伝達情報の確認のためのチーム・コミュニケーションが主流を占め、チームワークの概念として「互いの弱点を補い合うこと」が多く選択されていた。本研究では、メンバーに認知されるチームワークの概念は、チーム・コミュニケーションのあり方やチームの業績と相互作用しながら、チームの個性を生み出していることが示された。そうした相互作用がチームの問題解決や課題遂行と連関していく様相のさらなる解明が今後の課題として提示された。
口腔ケアが精神的ストレスの軽減に寄与するか

本研究では,統合失調症で入院中の高齢患者に口腔ケアを施行し,その口腔環境に及ぼす効果について検討した。口腔ケア介入により口腔衛生状態,口臭,口腔乾燥などの口腔環境の改善を認めた。また,介入16週後において精神症状(陰性症状,総合精神病理)と生活障害(持続性・安定性)の有意な改善を認めた。唾液ストレスマーカーについては,介入16週後にアミラーゼ活性値が有意に減少した。以上より,統合失調症患者への定期的かつ継続的な口腔ケアの介入は,口腔環境の改善のみならず精神症状や精神的ストレスを増強することなく口腔環境を改善することが示唆された。統合失調症患者は,自己管理の低下や抗精神病薬の副作用等による口腔環境の劣悪性が指摘されており,口腔衛生の支援が必要とされている。また,統合失調症は治療が長期に及ぶため,長期入院患者の高齢化や退院遅延も問題になっている。近年,口腔ケアは誤嚥性肺炎の予防,摂食・嚥下機能の向上,栄養改善等に有効であることが報告されているが,統合失調症患者に及ぼす効果は明らかにされていない。そこで本研究では,統合失調症で入院中の高齢患者に口腔ケアを施行し,その口腔環境に及ぼす効果について検討した。慢性統合失調症のために札幌花園病院・精神科に入院している患者20名(男性10名,女性10名,平均年齢69.2歳)を対象とした。週1回・16週間の歯科医師による口腔ケアを行い,口腔ケア介入前,介入8週後および介入16週後に口腔内診査を行った。また,唾液を採取し,各種唾液ストレスマーカーを測定した。また,唾液ストレスマーカーについては,介入16週後にアミラーゼ活性値が有意に減少した。以上より,統合失調症患者への定期的かつ継続的な口腔ケア介入は,精神的ストレスを増強することなく口腔環境を改善することが示唆された。週1回・16週間の歯科医師による専門的口腔ケアを行い,口腔ケア介入前,介入8週後および介入16週後に口腔内診査,精神症状,生活障害,および抑うつ症状の評価を行った。以上より,統合失調症患者への定期的かつ継続的な口腔ケアの介入は,口腔環境の改善のみみならず精神症状や精神的ストレスを増強することなく口腔環境を改善することが示唆され,口腔ケアの新たな有効性が示唆された。
針葉樹における葉緑体の形成と光合成機能発現機構に関する研究

針葉樹の特徴の一つとして,暗所でクロロフィル(Chl)a,bを生成し,葉緑体(D-葉緑体とよぶ)を形成する.本研究ではこの葉緑体の構造および光合成活性の性質を詳細に調べると共に,光照射下における葉緑体の発遠過程を解析した.暗所で生育したトウヒ子葉のD-葉緑体はよく発達したチラコイド膜(TK)の外にわずかなグラナを小さなプロラメラボディ(PLB)をもつ.このことはChl生合成の中間体プロトクロロフィリドとプロトクロロフィールの存在を示唆する.そこで先ず,高速液体クロマトグラフィを用いて色素分析を行い,微量のプロトクロロフィルの存在を認めた.さらにD-葉緑体からPLBを分画したのち,プロトクロロフィリドの存在と,この色素の光によるクロロフィリドへの転換を見出した.次にD-葉緑体からTK画分を調整した.この画分は光合成の光化学系I, IIの電子伝達活性をもち,水分解酵素が特異的に不活性化された状態にあり,酸素発生能を欠くことを確認した.そこで, TKから光化学系IIを含む膜片を分離してその性質を調べたところ,水分解に関与するすべてのポリペプチド(PP)を含むことを抗体を用いて認めた.光照射すると, 30分以内に水分解酵素が光活性化されて,その後12時間まで酸素発生活性は変化しない.この期間内にPLB由来と思われるたんぱく質の消失以外にTK組成に変化は見られなかった. 12時間後,光化学系IIの活性は増加しはじめ, 24時間で2倍に達した.しかし光化学系I活性, TK組成に顕著な変動はない. 2日後Chl・たんぱく質およびPP組成に著しい変化がおこった. 5種のPPが消失し, 4種のものが増加した.特に集光性クロロフィルたんぱく質(LHCP)の著しい生成がみられた.酸素発生活性は4倍に達する.以上の成果から,暗所におけるChl生合成の経路は明所でみられるものと本質的に同じである.チラコイド内の光合成単位のサイズは小さく,光照射によってLHCPが蓄積してサイズは増大する.同時にチラコイド膜からグラナが構築されて葉緑体形成が完成する.裸子植物ではグラナ形成が律速となっている.針葉樹の特徴の一つとして,暗所でクロロフィル(Chl)a,bを生成し,葉緑体(D-葉緑体とよぶ)を形成する.本研究ではこの葉緑体の構造および光合成活性の性質を詳細に調べると共に,光照射下における葉緑体の発遠過程を解析した.暗所で生育したトウヒ子葉のD-葉緑体はよく発達したチラコイド膜(TK)の外にわずかなグラナを小さなプロラメラボディ(PLB)をもつ.このことはChl生合成の中間体プロトクロロフィリドとプロトクロロフィールの存在を示唆する.そこで先ず,高速液体クロマトグラフィを用いて色素分析を行い,微量のプロトクロロフィルの存在を認めた.さらにD-葉緑体からPLBを分画したのち,プロトクロロフィリドの存在と,この色素の光によるクロロフィリドへの転換を見出した.次にD-葉緑体からTK画分を調整した.この画分は光合成の光化学系I, IIの電子伝達活性をもち,水分解酵素が特異的に不活性化された状態にあり,酸素発生能を欠くことを確認した.そこで, TKから光化学系IIを含む膜片を分離してその性質を調べたところ,水分解に関与するすべてのポリペプチド(PP)を含むことを抗体を用いて認めた.光照射すると, 30分以内に水分解酵素が光活性化されて,その後12時間まで酸素発生活性は変化しない.この期間内にPLB由来と思われるたんぱく質の消失以外にTK組成に変化は見られなかった. 12時間後,光化学系IIの活性は増加しはじめ, 24時間で2倍に達した.しかし光化学系I活性, TK組成に顕著な変動はない. 2日後Chl・たんぱく質およびPP組成に著しい変化がおこった. 5種のPPが消失し, 4種のものが増加した.特に集光性クロロフィルたんぱく質(LHCP)の著しい生成がみられた.酸素発生活性は4倍に達する.以上の成果から,暗所におけるChl生合成の経路は明所でみられるものと本質的に同じである.チラコイド内の光合成単位のサイズは小さく,光照射によってLHCPが蓄積してサイズは増大する.同時にチラコイド膜からグラナが構築されて葉緑体形成が完成する.裸子植物ではグラナ形成が律速となっている.クロロフィル蛋白質の生合成トウヒ(針葉樹)子葉は暗所で葉緑体を形成する。この子葉に連続光を照射すると、チラコイド膜のクロロフィル含量、ポリペプチド組成が著るしく変動し、チラコイド膜の性質は暗所生育下のものと異なっていた。この結果から裸子植物においても特定のクロロフィル蛋白質の合成には光が必要であることが明らかとなった。これを確認するため子葉のチラコイド膜を界面活性剤(オクチルグリコシド)で可溶化した後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、次の結果を得た。(1)光照射下で生育したトウヒ子葉チラコイド膜では、光化学系【II】のクロロフィル蛋白質(CP)であるCP

27,CP29,CP43,CP47,さらにCP27の会合体CP64,光化学系【I】の反応中心を含むクロロフィル蛋白質複合体CP1,光化学系【I】の集光性クロロフィル蛋白質(LHC1)とCP1の複合体CP130など9本のCPバンドが認められ、少なくとも6種類のCPにより構成されていた。(2)これに対して、暗所で生育したトウヒ子葉のチラコイド膜では、CP27,CP64,CP130などのCPに相当するバンドが欠如していた。以上は、明所でクロロフィル量は約4倍増加するが、その多くは光化学系【I】,【II】の集合性クロロフィル蛋白質となることを意味する。暗所で生成されるクロロフィルの多くは光化学系【I】,【II】の反応中心を構成するものと思える。またこの結論は低温ケイ光スペクトル,クロロフィル分析からも支持できた。クロロフィルの生成と分解暗所で低温またはアミノデブリン酸の存在下で生育したトウヒ子葉は種々のフィトール誘導体をもつクロロフィル類を含むことが明らかとなった。また、クロロフィル蛋白質を電気泳動中にも同様のフィトール誘導体をもつクロロフィル類がクロロフィルから人工的に生成された。従ってフィトールの酸化と環元の機構について今後明らかにする必要がある。
住宅における効果的昼光利用と光環境の快適性に関する基礎的研究

住宅において自然エネルギーとしての昼光を有効利用するとともに、快適な光環境を創出するための基礎的な資料を得ることを目的として、アンケート調査、住宅における実態実測調査および側窓採光による室内昼光空間評価の影響や窓装飾や窓遮蔽材が光環境評価や在室感にどのように影響するかまた実験室実験を行った。その結果、以下のことが明らかになった。昼間には中高年齢層は居間を、青年層は私室を利用していることが多い、高齢者は明るくなくても人工照明をつけずに生活していることが多い。集合住宅の中・低層階居住者は採光に不満を抱くとともに戸外からの視線を気にする人が多い。実測調査では、人工照明をつける=輝度が高くなるというわけではない住宅も認められた。室内照度は、軒・庇の出や開口面積とより隣家との関係が大きく影響している。在室感評価は、レースカーテンの物理的性質のうち透過率と最も関係があり、在室者の視線に対する意識の高低も関係する。視線意識の低い人であれば60%程度の透過率を目安にすればよい。窓幅に対する生地の使用幅は標準より20%程度少なくてもそれほど違和感なく在室する事が出来る。室内昼光空間の光量感評価実験では高齢者に比べて若齢者の方が照度の低下に伴う評価値の変化量が大きく、照度の低下に伴う光の量の感じ方も敏感であるといえる。また、人工照明の必要・不要の判断にも照明室の順応照度や昼光室での順応時間が影響することが明らかになった。近年、建築物の過密化により充分な昼光を室内に取り入れることは物理的に困難になってきている上、プライバシーの保護、直達日射の遮蔽などを目的にブラインドやレースカーテンを閉めたりして、昼間でも昼光が有効利用されずに人工照明に頼る傾向が強くなってきている。また、生活の質的向上や生活スタイルの多様化に伴い、室内を均一に照らす全般照明だけでなくスポットライトやダウンライトなどの局部照明も多く取り入れられるようになってきた。本研究では、実空間である住宅居室の実態調査を通して、居住者の普段の生活光環境とその光環境評価との関連を明らかにし、自然光の有効利用を考えつつ室内の効果的かつよりよい光環境を創出するための基礎的資料を得ることを目的としている。調査協力家庭24件を対象に昼間よく使用する居室の光環境を居住者の普段の使用状態で測定した。居住者の生活行為を記録、行為時の明るさ感・まぶしさ感さらに室内の雰囲気に関する6項目について評価を行なわせた。居住者は21歳から89歳までの24名である。調査時期は7月末から8月初に15件、9月初に3件、10月末に6件である。調査時期のずれによる評価への影響を検討するため別途青年女子を被験者として評価実験を行った。行為の種類別に、年齢と照明を必要と感じた時点の照度との関係をみると年齢が上がるとばらつきがみられ、年齢とともに個人差が大きくなり、特に視作業以外の行為で顕著である。また、照明を必要と感じた時点の照度が高い人は、「ちょうどよい」明るさと答えた時の照度の値が高いことが認められ、年齢との関係は認められない。一般に高齢者は若者に比べて高照度を要するとされているが、主観評価では年齢による相関は低い。全般照明だけで局部照明を併用している高齢者は少なく、青年より暗い環境で生活している人が多い。つまり、個人の明るさ感は年齢による差よりも普段生活している場の光環境が影響していると考えられる。本年度は、昨年度の実態調査をふまえ、昼光のみの光環境に着目し、擬似昼光装置を用いて昼光変動に伴う室内光環境と評価との関連を昼光量(照度)、光の方向性の観点から明らかにするとともに、その心理的評価については若齢者と高齢者を比較することを目的としている。

Hf照明器具(起動方式PD型)を壁面に14台(32W×2本×14台)取り付け、その前面に照度調節用のヴェネシャンブラインドを設置、擬似開口部は乳白色の電飾フィルムとした。調光用コントローラにより蛍光灯の光束を100%から5%まで変化させた。光束100%の室内の光環境に慣れた後、擬似昼光を60分かけて光束を次第に下げていく中で、若齢者・高齢者に行為のしやすさ・室全体の雰囲気・空間の光量感を評価させた。評価実験と並行して、机上面中央1点と開口部側3点で30秒おきに照度を連続測定(ミノルタCL-200)した。なお、光束の変化により机上面照度はほぼ4701xから301xまで変化した。被験者は若齢者(女子大生1822歳)42名、高齢者(7075歳、男16名・女17名)33名である。実験時期は2002年1011月である。その結果、若齢者よりも高照度で人工照明を必要とする高齢者は、「新聞を読む」行為で3割程度に過ぎず、「書きものをする」行為ではいない。また、行為をするのに支障をきたしはじめる照度は高齢者の方が若齢者よりも低く、高齢者は若齢者ほど照度を必要としていない。光の方向性では、若齢者・高齢者ともに右側から光が入ってくる場合では他の方向より書きものをするのに支障をきたし始める照度が高い。これは側窓採光による横からの光であるから、人工照明によるシーリングライトの場合より顕著にあらわれていると考えられる。若齢者は照度の低下に伴って空間の光量感や明るさ感の感じ方が敏感であるのに対し高齢者は若齢者ほど敏感ではなく、年齢層により光量感や明るさ感の捉え方が異なる。昨年度に引続き、今年度は1.順応を考慮した昼光閾値の実験を行い、昼光空間に充分順応している場合とそうでない場合とで人工照明を必要とし始める昼光室内空間の光環境にどのような違いがあるかを明らかにすること、昼間室内に昼光を取り入れ利用可能であるにもかかわらず室内情報の流失を恐れウインドウトリートメントを利用している家庭がみられることから、2.レースカーテンが在室感評価に及ぼす影響を検討し、昼光の効果的利用を行いつつ問題なく在室できるレースカーテンの指標を明らかにすること、3.簾やロールスクリーンなどについても同様の検討を行うこと、を目的としている。1.前室の順応照度が低いと、昼光空間の明るさ感評価は高くなり、入室時の第一印象と順応後の第二印象との評価の差も小さく、人工照明を必要とする昼光室照度が低くなる。また、順応照度が高いと、昼光空間の評価に個人差が顕著に認められる。2.在室感評価に影響を及ぼす要因は、レースカーテンの透光率,レースカーテンの生地の使用幅、居住環境における視線に対する意識を高める要因の有無が上げられる。視線の遮断が必要である場合、透光率の低いレースカーテン生地を選択し使用幅も多めに、視線の遮断がそれほど必要でない場合には透光率の高いカーテン生地を選択すれば昼光の明るさを利用することができ、使用幅は通常の20%少なくしても,違和感なく在室することができる。3.実態調査から得られた昼間および夕方人工照明をつける直前と直後,夜間の各照明条件における窓処理材の視線遮蔽効果と在室感について明らかにすることができた。人工照明点灯直後には、室外側からと室内側からでは、視対象の存在感に対する評価が似通っていることがわかった。また、同じ素材でも視対象との輝度比が大きくなる明度が低い色の窓処理材は、室外側から見た時、視対象が見えやすくなる。以上から、窓処理材の素材、色による物理的効用性を知った上で適切な窓処理材の利用を考える必要があることが明らかとなった。昼光減少(夕方)時を想定した擬似昼光量減少時に行った、行為のしやすさ評価
シアセチルポリアミンの代謝と細胞増殖制御

ヒト尿中に存在することが最近見出され、腫瘍マーカーとしてすぐれた特性を持つことが示された新規のポリアミン成分、ジアセチルスペルミジン(DiAcSpd)およびジアセチルスペルミン(DiAcSpm)について、その代謝を明らかにし、悪性腫瘍診断への応用の生化学的基礎を解明することを目的として研究を行い、以下の結果を得た。1.多孔性膜上で培養したブタ腎上皮由来細胞(LLC-PK_1)を用いて、ポリアミン輸送系について検討を行った結果、プトレッシン、スペルミジン、スペルミンのすべてを共通に基質とする輸送体が側底膜に1種類、頂端膜には2種類存在することが明らかになった。腎尿細管におけるポリアミン再吸収のモデルとして頂端膜の輸送系な基質特異性について、放射性基質を合成して詳しく検討した結果、モノアセチルポリアミン、遊離ポリアミンとは異なり、DiAcSpd,DiAcSpmは細胞内に輸送されず、腎臓において再吸収、再利用されないことが明らかになった。再吸収の欠如により生体内における生成量が比較的正確に排泄量に反映されることは、ジアセチルポリアミン(DiAcPA)の腫瘍マーカーとしてのすぐれた特性を規定する要因の一つであると考えられる。2.DiAcPAの代謝の研究にも適用可能な迅速、高感度のDiAcPA定量系を確立するために、DiAcSpd,DiAcSpm特異的抗体の作成とそれらを用いた酵素標識抗体法によるDiAcPA測定系の開発を行った。DiAcSpd,DiAcSpmに類似の分子形状をもつハプテンを作成して抗血清を得、さらにポリアミン固定化カラムを用いた抗体の親和性精製によってDiAcSpd,DiAcSpmのそれぞれに対して高度の選択性を示す特異的抗体を調製することに成功した。この抗体を利用することによって、0.1μM以下のDiAcSpd,DiAcSpmを、共存ポリアミンの妨害を排除して正確に定量することが可能になった。
結核抗原Ag85AとIL-2とIL-18融合蛋白質による膀胱癌治療BCGの開発

癌免疫療法としてIL-2を用いたLAK(lymphokine-activated killer, IL-2LAK)療法やTILが実施されている。LAK療法ではNK細胞やT細胞、特に獲得免疫で惹起されたcytotoxic T lymphocyte (CTL)の増殖、活性化にはIL-2/IL-2Rを介したautocrine pathwayやparacrine pathwayが重要な働きをしている。我々は、死菌BCGワクチンと毒素原性大腸菌が産生する下痢毒素(LT)の変異毒素(mLT)をマウスに同時経鼻投与した場合、死菌BCGワクチンに対する細胞性免疫が増加することを明らかにしている(Vaccine,24,3591.2006)。さらに、免疫後6ヶ月経ったマウスの脾臓細胞を、生菌および死菌BCGワクチンでin vitro刺激すると、生菌で免疫したマウスに比べ、高いIL-2産生能を示す。これは、死菌BCGワクチンを頻回に経粘膜投与することにより、IL-2LAKを特異的に活性化し、膀胱癌などにおいて生菌BCG治療と同等の抗がん効果が得られる可能性が明らかになった。そこで、現在マウスの膀胱がんに対する抑制効果を検討している。そこで、我々は、死菌BCGワクチンと毒素原性大腸菌が産生する下痢毒素(LT)の変異毒素(mLT)をマウスに同時経鼻投与した。その結果、死菌BCGワクチンに対する細胞性免疫が増加することを明らかにした(Vaccine, 24, 3591. 2006)。そこでマウスの膀胱がんに対する抑制効果を比較検討を実施している。
中学校数学科における協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導に関する研究

1.研究の目的協同学習を取り入れた数学的活動を促す教材開発を中学校1年生の内容について行う。授業研究を通して数学的活動を促す指導における協同学習を取り入れる効果や問題点を明らかにし,授業づくりの示唆を得る。2.研究の方法ジグソー法を取り入れて指導することを念頭におき,中学1年生の内容を中心に教材開発を行った。特別な課題を用意するということにこだわりすぎず,既存の教科書にある問題をアレンジすることで新たな教材を開発することに取り組んだ。文献研究や公開授業研究会における情報収集を通して,協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導の意義を明確にし,教材開発に活かした。開発した教材を用いて授業実践を行った。その授業の記録を集めた。アンケート調査では,ジグソー法を取り入れた指導が数学的活動を促すことにどのように関わるのかを事例的に分析した。また,実践したものをふり返り,協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導に関する効果や問題点についての知見を得た。3.研究の成果(1)主な知見ジグソー法による協同学習により,どの生徒も自分の学習と他者の学習との係わりを感じ,主体的に学ぼうとすることにつながる。特に,自分の学習が他者の学習に対して責任があることを感じる生徒が多く見られた。ジグソー法による協同学習が,数学的活動に生徒たちが取り組む際の手立てのひとつとなる。それは数学があまり得意ではない生徒にとって一層顕著である。(2)今後の課題開発した教材の価値を一層の分析を通して確かめる必要がある。アンケートの自由記述にもあったが,グループ活動と全体で行う活動のバランスについて検討する必要がある。ジグソー法を行う際の手立てを検討する必要がある。特にこのような形態で授業を行うと,グループに対してが多くなるが,どのように指導するのか,いきづまっているグループに対してどのような手立てが必要かを検討する必要がある。
精度保証付き多次元逆スペクトル解析

1.多重度を持つ固有値問題への適用入力データとなる固有値に重なりがある,または非常に接近している場合,区間Newton法に対応する行列の条件数が悪くなり検証条件が満たされないことが起こりえる.このため,クラスタが観測された場合における特異性を回避した順問題に対する固有値の包み込みのアルゴリズムを提案し,ポテンシャル関数の再構成手順(逆問題)についてもこれまでの数値的検証法が拡張可能であることを理論面から明らかにするとともに数値実験によりその実用性を確認した.2.一般の領域に対する適用実際的な問題に対応するため,より一般性を持つ2次元領域および3次元問題への拡張を理論面から検討した.さらに具体的な応用として,2次元非凸領域に対する線形化問題の事前誤差評価に基づくポテンシャル関数の再構成手法の定式化を行い,あわせて大規模数値計算に適応したアルゴリズムの高速化・並列化について検討した.3.MATLABツールボックスの構築本研究で得られた成果を公開するためのプログラミング環境として,数値計算ソフトウェアMATLABのツールボックスとして多次元逆スペクトル解析に関連する連立一次方程式,有限次元固有値問題,有限次元非線形方程式の精度保証付き計算関数を実装した.4.今後は,2.で行った定式化に基づく検証アルゴリズムの構築と数値実験による確認,および3.で実装したMATLABツールボックスにポテンシャル関数の再構成プログラムを追加し,アルゴリズムとともにソフトウェアを公開する予定である.1.ポテンシャル関数を復元する適切な関数空間を設定することにより再構成問題を有限次元非線形方程式として定式化した.領域は2次元多角形領域に限定し,不動点定理にもとづく区間Newton法と無限次元楕円型固有値問題の精度保証付き数値計算手法を組み合わせることにより,ポテンシャル関数の存在および一意性の検証条件を計算機内の有限操作の問題に帰着させた.2.順問題の離散近似解を高精度かつ効率的に求めるアルゴリズムを有限要素法およびスペクトル法を疑似Newton法と組み合わせて開発した.また,数値的安定性および要素再分割法・領域分割法との親和性などを理論面・実用面から考察した.3.2.で得られた離散近似解とその線形化問題の定量的誤差評価を用いることにより,順問題の解析解を包み込む集合を計算機内で自動的に構成する手順を与えた.以上の結果より,1.で導いたポテンシャル関数の存在・一意性検証条件を満足する再構成アルゴリズムを構成した.4.3.で与えたアルゴリズムの有効性を明らかにするための数値実験を行なった.浮動小数点演算により生じる丸め誤差を考慮した厳密な数値的評価を可能とするために,Fortran95,C++のビット操作機能,演算子再定義機能,および丸めモード変更機能を基礎とする区間演算モジュールを開発し実装した.1.多重度を持つ固有値問題への適用入力データとなる固有値に重なりがある,または非常に接近している場合,区間Newton法に対応する行列の条件数が悪くなり検証条件が満たされないことが起こりえる.このため,クラスタが観測された場合における特異性を回避した順問題に対する固有値の包み込みのアルゴリズムを提案し,ポテンシャル関数の再構成手順(逆問題)についてもこれまでの数値的検証法が拡張可能であることを理論面から明らかにするとともに数値実験によりその実用性を確認した.2.一般の領域に対する適用実際的な問題に対応するため,より一般性を持つ2次元領域および3次元問題への拡張を理論面から検討した.さらに具体的な応用として,2次元非凸領域に対する線形化問題の事前誤差評価に基づくポテンシャル関数の再構成手法の定式化を行い,あわせて大規模数値計算に適応したアルゴリズムの高速化・並列化について検討した.3.MATLABツールボックスの構築本研究で得られた成果を公開するためのプログラミング環境として,数値計算ソフトウェアMATLABのツールボックスとして多次元逆スペクトル解析に関連する連立一次方程式,有限次元固有値問題,有限次元非線形方程式の精度保証付き計算関数を実装した.4.今後は,2.で行った定式化に基づく検証アルゴリズムの構築と数値実験による確認,および3.で実装したMATLABツールボックスにポテンシャル関数の再構成プログラムを追加し,アルゴリズムとともにソフトウェアを公開する予定である.
グルタミン酸輸送体を賦活化し網膜神経節細胞を加圧傷害から防御する

眼圧上昇は緑内障の発症・悪化の重要な危険因子である。眼圧上昇によってグルタミン酸代謝が抑制された結果、網膜神経節細胞の傷害が誘導される(興奮毒性)ことから、「グルタミン酸輸送体を賦活化すると、網膜神経節細胞を眼圧上昇による傷害から防御できる」との仮説をたてた。本研究では、分離眼球標本による新しい緑内障モデルと緑内障動物実験モデルをもちいて、グルタミン酸代謝を賦活化する薬剤(17β-estradiolとtamoxifen)によって、網膜神経節細胞の傷害が防御できる可能性を示した。また、神経ステロイドは興奮毒性と拮抗して加圧傷害を抑制したことから、新しい緑内障性神経保護物質である可能性がある。昨年度までは、「グルタミン酸輸送体(GT)を賦活化すると、網膜神経節細胞を眼圧上昇による傷害から防御できる」との仮説を検証するため、まず、眼球分離標本を作成し、静水圧による加圧負荷を行った。そして、加圧を負荷することで誘導される網膜神経節細胞の軸索傷害が、グルタミン酸輸送体(GLAST)とグルタミン合成酵素(GS)の発現低下によってもたらされることを明らかにした。さらに、加圧を負荷することで誘導される網膜神経節細胞の軸索傷害が、グルタミン酸輸送体を賦活化するとされる薬物(17β-estradiol及びtamoxifen)を投与することによって、防御可能であることを明らかにした。本年度は、上強膜静脈を焼灼してin vivo緑内障ラットを作成し、ラット分離加圧標本において神経保護効果を示した17β-estradiol及びtamoxifenを投与し、加圧傷害に対する有効性を検討した。in vivo緑内障ラットにおける加圧傷害と薬物による神経保護効果は、網膜神経節細胞数を、光顕・電顕的にカウントすることで検討した。免疫組織学的に、神経節細胞の特異的マーカーであるThy-1抗体の結合性の変化についても検討した。さらに、グルタミン酸輸送体(GLAST)とグルタミン酸代謝酵素(GS)の加圧による発現抑制と、tamoxifen投与による回復について、遺伝子レベル、タンパク質レベルで調査した。その結果、tamoxifenは、ラット分離加圧標本をもちいたex vivo実験と同様に、in vivo緑内障ラットにおいても、GLASTとGSを賦活化することによって加圧傷害を防御する可能性があることが明らかになった。「グルタミン酸輸送体(GT)を賦活化すると、網膜神経節細胞を眼圧上昇による傷害から防御できる」との仮説を、正常ラット分離加圧標本をもちいたex vivo実験で調査した。正常ラットを用いて、眼球分離標本を作成し、静水圧による加圧負荷を行った。その結果、加圧を負荷することで誘導される網膜神経節細胞の軸索傷害が、グルタミン酸輸送体の発現低下によってもたらされることが明らかになった。加圧を負荷することで誘導される網膜神経節細胞の軸索傷害が、グルタミン酸輸送体を賦活化するとされる薬物17β-estradiol及びtamoxifenを投与することによって、防御可能か否かを、光顕・電顕的に検討した。その後、グルタミン酸輸送体(GLAST)とグルタミン酸代謝酵素(GS)の加圧による発現抑制と、tamoxifen投与による回復について、遺伝子レベル、タンパク質レベルで調査した。その結果、tamoxifenはGLASTとGSを賦活化することによって加圧傷害を防御する可能性があることが明らかになった。本年度は、さらに上強膜静脈を焼灼してin vivo緑内障ラットを作成することに成功した。加圧負荷時に、グルタミン酸は神経節細胞に神経傷害的に関与する一方、興奮抑制性神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸(GABA)は神経保護的に関与する可能性がある。しかし、GABA受容体の馴化の問題もあり、加圧傷害に対するGABAの神経保護作用については、ほとんど報告されていない。神経ステロイド(NS)は、神経系においてコレステロールから合成されるステロイドの総称である。NSは細胞膜に存在する神経伝達物質受容体に作用して、神経の興奮性を急激に変化させる。Allopregnanolone (AlloP)はGABAA受容体に作用し、中枢神経系における神経保護効果が報告されている。そこで我々は、加圧障害に対する神経保護の新たな可能性として、GABA自体よりもGABAA受容体アゴニストであるAlloPに着目した。「加圧障害時に、AlloPは内因性神経保護因子として、グルタミン酸興奮毒性に対して拮抗的に作用する」との仮説をたて検証するとともに、AlloPのGLAST及びGSに対する賦活化について調査することを新たな課題とした。分離眼杯に加圧負荷をかけると,網膜神経節細胞にAlloPが発現した。

さらに,培養液中にAlloPを投与すると、加圧による神経節細胞の傷害が防御されたことから,眼圧上昇時にAlloPは網膜神経節細胞を保護することが明らかになった。培養液中にPicrotoxinを投与するとAlloPの神経保護効果が抑制されたことから、AlloPはGABAA受容体を介して神経保護効果を発揮すると考えられた。エンザイム・アッセーの結果、AlloPは加圧負荷時にGS活性を上昇させる可能性がある。免疫組織学的検討では、AlloPはGSとGLASTの発現を上昇させる可能性がある。緑内障の病態の基礎研究計画書の工程に基づいて、実験が進行したため。本年度はin vivo緑内障ラットの作成は予定していなかったが、作成に成功した。本年度に予定していた他の実験も、予定通り進行した。我々のこれまでの実験の結果から、加圧傷害に対して神経保護効果を示した薬物は、いずれもステロイド系薬物である。今後は、ステロイド系薬物に注目して、ニューロステロイドと緑内障の関係に着目して、研究を進めて行く。ニューロステロイドは神経伝達物質群であり,中枢神経系では、神経保護的に作用することがしられている。網膜においても、ニューロステロイドの存在が確認されているが、生理的役割については明らかにされていない。緑内障におけるニューロステロイドの役割についても、神経障害的に作用するのか、神経保護的に作用するのか、不明である。我々は、ニューロステロイドの加圧傷害における役割について形態学的、生化学的に明らかにし、神経保護治療ターゲットとしての可能性を検証する。1)緑内障ラット分離加圧標本の作成緑内障ラットを用いて、眼球分離標本を作成する。加圧実験は前頁で記載したように、眼球分離標本を高さの異なるシリンダー中に沈め、静水圧による加圧負荷を行なう。2)グルタミン酸輸送体を賦活化する薬物の投与緑内障ラットから分離眼球標本を作成し、加圧を負荷することで誘導される網膜神経節細胞のapoptosis、necrosis、necroptosisや軸索傷害が、グルタミン酸輸送体を賦活化する薬物を投与することによって防御可能であることを、以下の方法で示す。a)光顕・電顕によって、神経節細胞の形態変化を調べる。b)グルタミン酸代謝経路(GLASTとGS)の加圧による発現抑制とGLAST賦活化薬の投与による回復について、遺伝子レベル、タンパク質レベルで調査する。平成25年度の予算は、1,400,000円である。内訳は、実験動物購入・飼育費試薬代(抗体・PCR primer等)、
プロトンポンプ機構解明に向けた呼吸鎖末端酵素の構造機能解析

電子伝達(酸化還元反応)と共役したプロトンポンプのエネルギー変換機構に必須な構造要因を解明することを目的として、電子伝達系末端酵素ファミリーに属する、ミトコンドリアのプロトンポンプ性酸素還元酵素(シトクロム酸化酵素)と細菌の非プロトンポンプ性一酸化窒素還元酵素の構造機能解析を進めた。シトクロム酸化酵素の解析:酸素還元部位に阻害剤であるアジ化物が結合した酵素の構造を1.85Å分解能で決定し、論文発表した。単量体酵素の酸化型と還元型の構造を、それぞれ1.85Å分解能と1.95Å分解能で決定するとともに、単量体構造が活性型であることを明らかにした。酵素に結合するカルジオリピンの構造を決定するとともに、その他の脂質分子に含まれるリン原子の同定と1.3Å分解能での構造解析を進めた。カルシウムイオンが結合した酵素の酸化型と還元型の構造を、それぞれ1.7Å分解能で決定した。酵素反応中間体であるF型の構造を1.8Å分解能で決定した。酵素反応中間体であるO型の構造解析を進めた。一酸化窒素還元酵素の解析:酵素による電子供与体(シトクロムc、ならびにアズリン)の酸化反応の速度論的解析を進めた。反応速度に対するイオン強度およびシトクロムcの酵素結合部位の変異の効果を明らかにした。酵素による電子供与体(ユビキノール、ならびにメナジオール)の酸化反応の速度論的解析を進めた。キノールアナログ分子による阻害様式、および酵素のキノール結合部位の変異の効果を明らかにした。X結晶解析により3.0Å分解能の電子密度図を得た。低温電子顕微鏡解析により9Å分解能の像を得た。シトクロム酸化酵素の構造解析(アジ化物結合型)の成果が論文発表された。シトクロム酸化酵素の構造解析(単量体構造、カルシウムイオン結合型)が完了した。シトクロム酸化酵素の構造解析(単量体構造、カルシウムイオン結合型、F型中間体)が完了した。一酸化窒素還元酵素によるシトクロムc、ならびにアズリンの酸化反応の速度論的解析がおおむね完了した。一酸化窒素還元酵素によるユビキノール、ならびにメナジオールの酸化反応の速度論的解析が完了した。シトクロム酸化酵素の構造解析(リン脂質構造、O型反応中間体等)を引き続き進める。一酸化窒素還元酵素の結晶構造解析および電子顕微鏡解析を引き続き進める。