hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音響的特徴に基づく話者交替に関する発話単位の認定基準の構築

話者交替に関する発話単位を会話分析の専門家でなくとも付与できるようにする客観的基準を構築するため、発話の区切りを示す音声の音響特徴量について分析を行った。その結果、発話全体に渡る音声の基本周波数が発話末へ向けて下降し、どの発話でも発話末ではほぼ同じ値になることが明らかになり、この変化が発話末を示す手がかりとなることを示した。また、発話末に置かれる統語要素である発話末要素で特に大きく韻律が変化し、ヒトがその韻律から発話末を予測できることから、音響特徴量から発話末を予測できうることがわかった。本研究は、会話コーパスに必要とされる発話ラベルの付与を容易にするために、話者交替の起こりうる箇所の識別に有用な音響的特徴を明らかにすることを目的としている。平成25年度は昨年度に引き続き、自発性の高い発話が収録されている2種類のコーパスを用い、発話の区切りを特徴づける韻律変化について対話音声を対象として重点的に分析した。昨年度の独話音声の分析では、発話全体にわたって現れる特徴として基本周波数(F0)が発話末へ向けて徐々に下降すること、発話末では急激にF0が低下し発話の長さによらずほぼ一定の高さとなることが観察された。また、強い統語境界ではF0の下降傾向のリセットが生じていた。そこで、対話について同様の分析を行ったところ、対話音声でもF0の下降傾向と強い統語境界でのリセットが生じているものの、発話末の急激なF0下降があまり見られなかった。詳細な分析の結果、独話・対話に関わらず自発性の高さと発話末のF0下降の程度には負の相関関係があり、これまで発話末を示すとされていた急激なF0下降が自発性の高い発話では発話末を識別する手がかりとはならない可能性が示唆された。さらに、韻律を操作した合成音声を用いた聴取実験を行い、対話音声における韻律変化と聞き手の発話末認知との関係について調べた。発話末を特徴づける言語情報である助動詞「です・ます」や終助詞「ね・よ」といった発話末要素との対応についても考慮した実験により、発話末要素が存在する場合は最終アクセント句のF0やパワーの変化が通常と異なると聞き手の発話末の予測に乱れが生じる傾向が観察された。また、最終アクセント句のF0下降が発話末要素の有無を予測する手がかりとなる可能性が示唆された。しかし、発話末要素が存在しない発話においては発話末を予測させる韻律情報は不明であり、音響情報による発話ラベル付与にはさらなる分析が必要である。対話コーパスに必要とされる発話ラベルを付与するために、話者交替の起こりうる箇所の識別に有用な音響的特徴を明らかにすることを目的として研究を行っている。平成24年度は「日本語話し言葉コーパス」と「千葉大3人会話コーパス」の2種類の自発性の高い発話が収録されたコーパスを用い、発話の区切りを特徴づける音響的特徴の調査を行った。発話の全体的な特徴を調べるために、日本語話し言葉コーパスの学会講演と模擬講演における独話の韻律変化について分析したところ、従来言われていたアクセント句のダウンステップ以外に発話の冒頭から末尾に向けてイントネーション句単位でも徐々に基本周波数が下降していること、発話中に強い統語境界がある場合に下降傾向のリセットが生じること、それにより長い発話であっても発話末だけにfinal loweringと呼ばれる基本周波数の著しい下降が生じることが観察された。対話音声については、千葉大3人会話コーパスを基に話者交替が生じるときに発話末付近でどのような韻律変化が起きているのか、またその変化が聞き手の発話末認知にどのような影響を及ぼすのかを調べている。アクセント句単位で見ると最終アクセント句で基本周波数が最も低下して基底値に達すること、パワーは最終アクセント句で急激に低下すること、発話速度は発話末に向けて速くなっていくが最終アクセント句では逆に遅くなることが観察された。またこれらの特徴は発話末要素と呼ばれる助動詞「です・ます」や終助詞「ね・よ」といった統語要素の存在によって強く現れ、韻律変化が発話末要素の出現を特徴づけているという知見を得た。また、発話末要素を除去した音声による聴取実験を行い、発話末要素が出現する前にヒトはその発話に発話末要素が付属することを知覚できることがわかった。平成24年度の研究計画として挙げていたのは(1)分析対象となる対話コーパスへの話者交替ラベルの付与(2)話者交替に関する音響的特徴の調査(3)話者交替に関する客観的基準の策定の3点であるが、(1)はコーパスに元から付与されていた各種タグを基に統語的な節単位や長い発話単位(LUU)を用いて効率的に話者交替が可能な位置のラベルの付与を行うことができた。

(2)の音響的特徴に関しても対話だけではなく独話も含めた幅広い自発発話の分析を行い、様々な知見を得ることができている。(3)の基準についてはまだ十分な検討はできていないが平成25年度も引き続き取り組む予定であり、全体的に予定通り達成できている。平成25年度は平成24年度に行った調査に加えて、以下の内容を行う予定である。・発話権をとらない聞き手発話の分析:「発話権が移動しない聞き手発話」を考慮し、相槌を話者交替と認定することのないように、発話権をとらない聞き手発話の特徴を分析し、話者交替に関わる発話単位から相槌を排除できるような基準を設ける。・策定した基準を用いた非専門評定者による話者交替ラベルの付与:分析に用いた以外の既存の対話コーパスに対して、策定した客観的基準に基づいて、会話分析の専門知識を持たない評定者によって話者交替に関する発話単位のラベリングを行う。・認定マニュアルの公開:話者交替の発話単位の認定基準をマニュアルとしてまとめて公開する。購入を予定していた計算機の価格が計画時よりも低下したことと、国際会議発表として予定していた渡航先がアメリカからマカオに変更になったため、次年度への研究費の繰り越しが発生した。平成25年度は、本研究で策定した話者交替ラベルの付与を非専門評定者により行うため、大量のデータを処理・保管するための計算機と、作業実施者に支払う謝金のために研究費を使用する。計算機・記録装置・消耗品に約40万円、作業実施者に対する150時間の作業費用として謝金15万円を予定している。また国内外で研究成果の発表を行うため、旅費・投稿費として約45万円を使用する予定である。
新規ｉｎ　ｓｉｔｕバイオフィルムモデルにおけるエピガロカテキンガレートの影響

複数菌種から成るデンタルバイオフィルムを再現するin situバイオフィルムモデルを新規に作製し,形成されたデンタルバイオフィルムの経時的な変化を検討した。バイオフィルム形成後,細菌数は24時間まで対数増殖を示し,その後,4日まで緩やかな増加を示した。また,抗菌作用を有するエピガロカテキンガレート(EGCg)が,口腔細菌のバイオフィルムに及ぼす影響の検索を行った。その結果,EGCgがバイオフィルムの抑制および形成阻害効果を有することが明らかとなったが,その作用機序は異なるものであると示唆された。殺菌効果が報告されているエピガロカテキンガレート(EGCg)がPorphyromonas gingivalisのバイオフィルムに及ぼす影響の検索を行った。成熟したバイオフィルムに及ぼす影響:ATP測定の結果,MIC以上のEGCg作用群は対象群と比較し,有意にバイオフィルム量の減少を認めた。また,走査型電子顕微鏡観察において,対照群では菌体外マトリックスに覆われたバイオフィルムが観察されたのに対し,EGCg作用群では,細菌が散在している部分がみられた。さらに,透過型電子顕微鏡観察において,EGCg作用群で,細胞膜が破壊され細胞質が溶出している像が認められた。バイオフィルム形成に及ぼす影響:MIC未満のEGCg作用群において,対象群と比較して,バイオフィルム形成量が有意に減少した。また,試料をLive/Dead Kitsにて染色し,共焦点レーザー顕微鏡を用いて3次元的に解析したところ, EGCg作用群においてバイオフィルム形成領域の低下が認められた。以上より,EGCgはP. gingivalisの成熟したバイオフィルムおよびバイオフィルム形成のいずれにも抑制効果があることが示された。一方,デンタルバイオフィルムを再現できるin situバイオフィルムモデルを用いた経時的観察では,Real-time PCRにて定量的解析を行った結果,細菌数はそれぞれ1時間後:4.05e+7, 4時間後:1.45 e+8, 8時間後:7.63e+8, 12時間後:1.22e+9, 16時間後:1.05e+9, 20時間後:7.69e+8, 24時間後:2.85e+9, 48時間後:1.31e+10, 60時間後:1.129e+11, 72時間後:1.30e+10, 96時間後:4.09e+10(単位:cell/ mm2)であった。電子顕微鏡観察において, 1時間後:球菌の付着,4時間後:球菌によるマイクロコロニー形成,12時間後:様々な大きさの球菌、桿菌および線状菌の出現, 16時間後:マトリックスに被覆されたバイオフィルム, 24時間以降:バイオフィルム形成領域の増加が認められた。これまでのバイオフィルムに関する研究はほとんど単一菌種バイオフィルムによるものであり,複数菌種バイオフィルムモデルに関しても,用いる細菌種に限りがありデンタルプラークとは異なるものであった。一方,本研究で開発したin situバイオフィルムモデルはヒト口腔細菌のバイオフィルムを作製するもので,デンタルプラークを可及的に再現できるシステムであり,デンタルプラーク形成メカニズムを解明する糸口になると考えられる。本研究では,デンタルバイオフィルム形成過程における構成細菌の量,種類の動態を明らかとするために,in situバイオフィルム形成装置を用いて可及的に再現したデンタルバイオフィルムを,経時的に取り出し,定量的解析,走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡による形態学的観察を行った。1.real-time PCRを用いて定量的解析を行った。細菌数は,それぞれ1時間後6.62E+05 /mm2,4時間後2.02E+06 /mm2,8時間後3.18E+06 /mm2,12時間後1.22E+07 /mm2,16時間後1.05E+07 /mm2,20時間後1.26E+07 /mm2,24時間後2.34E+07 /mm2,48時間後4.70E+08 /mm2であった。バイオフィルム形成12時間まで急速な増殖が認められたが,その後の増殖は緩やかなものであった。2.形態学的観察においては,4時間でマイクロコロニーの形成が認められ,8時間後に球菌主体のバイオフィルムが観察された。12時間後には糸状菌が出現,16時間後にはマトリックス様構造物で被覆された像が観察された。24時間および48時間後には球菌,糸状菌,桿菌の多様な形態から構成されたバイオフィルム形成が認められた。本年度の研究計画は,in situバイオフィルム形成系を開発し,定量的解析および走査型電子顕微鏡を用いた経時的解析を行うことであったが,バイオフィルム形成系を確立し,経時的に定量的解析および走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡によるバイオフィルムの観察を行ったため,おおむね順調に進展していると考えられる。今後,確立したバイオフィルム形成系を用いて,3次元的検索および定性的解析を行う予定である。

1.3次元的検索1)バイオフィルム形成細菌の生死の観察:バイオフィルムサンプルをLive/Dead®BacLightTM Bacterial Viability Kitsにて染色し,共焦点レーザー顕微鏡(現有設備,右図)を用いてバイオフィルム内の細菌の生・死を解析することでEGCgが,バイオフィルム形成に与える影響を評価する。また,共焦点レーザー顕微鏡で得た画像を立体構築ソフト(Imaris)にて処理し,バイオフィルムの3次元的画像を構築し,EGCgがバイオフィルムの厚みや密度等の立体構造に及ぼす影響について検索を行う。2)バイオフィルム形成細菌種の立体的配置の観察:Fluorescence in situ hybridizationにより,経時的なバイオフィルム構成細菌の変化を3次元的に観察する。バイオフィルムサンプルを,固定・脱水・ハイブリダイズを行った後,共焦点レーザー顕微鏡にて観察する。その後,得られた画像をImarisにて立体構築するとともに,構成細菌の比率を計算する。また,EGCg作用群と比較することで,EGCgがバイオフィルム構成細菌に及ぼす影響を検討する。2.バイオフィルム構成細菌種の定性解析:バイオフィルムサンプルよりゲノムDNAを回収し,抽出する。得られるDNAより16S rRNA遺伝子を増幅する。PCR産物を大腸菌への形質転換し,プラスミドライブラリーを作成する。その後プラスミドDNAを回収し,シークエンサーによりそれぞれのインサートの塩基配列を決定する。得られる塩基配列を,NCBI database BlastNProgramにて照合し,配列解析ソフトによりマルチアライメントを行い,配列間の進化距離を計算して系統樹を作成する。3次元的解析の用いる染色キットおよび試薬・器材の購入に使用する予定である。また遺伝子工学的な解析は研究室で行うのに比べて安価かつ時間の短縮が可能なため,外注費を予定している。本研究で得られる研究成果を,国内外の学会で発表するとともに,国際学術雑誌に投稿し,世界に発信する予定であり,学会経費および投稿経費を計上している。
悪性脳腫瘍髄腔内播種に対する髄腔内化学療法

1.MCNU脳室-腰椎くも膜下腔灌流における神経毒性および薬物動態2頭の雑種成犬を用いて、水溶性ニトロソウレア剤のMCNU(logP=-0.71)1mgを人工髄液10mlに溶解して脳室-腰椎くも膜下腔灌流を1週間に1回、10週連続行い、神経症状の有無、病理組織学的変化および髄液腔内薬物動態を観察した。灌流後に明らかな神経症状はみられなかった。病理組織学的変化は脳室上衣の脱落、上衣下の海綿状変化およびグリオーシスがみられた。髄液中濃度曲線下面積は平均1152μg×min/ml、半減期は平均41.1分でこれらはいずれもACNUのそれに比べて有意に大きかった。これらの所見は、いくらかの組織学的変化はあるにせよMCNU脳室-腰椎くも膜下腔灌流が悪性グリオーマの髄腔内播種に対して有効である可能性を示唆した。1)ラットグリオーマ髄腔内播種モデルにおけるhybrid-liposome包埋BCNU(lipo-BCNU)髄腔内投与の抗腫瘍効果;ラット大槽内にラットグリオーマ細胞C6を1×106または5×106個を移植し、2日後にlipo-BCNU2.5mg/bodyを大槽内に投与し、その抗腫瘍効果を生存日数により判定した。6回の実験中3回において有意な生存日数の延長がみられた。2)lipo-BCNU髄腔内投与後の薬物動態;2頭の雑種成犬の大槽内にそれぞれlipo-BCNU 1mg/1mlまたは5% dextroseに溶解したBCNU 1mg/1mlを投与し、経時的に大槽内髄液を採取し、髄液中BCNU濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。髄液中半減期はlipo-BCNU 12.1分、5%dextrose溶解BCNU 4.2分でlipo-BCNUの方がhybrid-liposome包埋による薬剤の徐放効果のために薬物動態上有利であることが判明した。悪性脳腫瘍髄腔内播種に対するACNUによる髄腔内潅流療法の基礎的実験として、犬を用いて人工髄液10mlに溶解したACNU1mgで側脳室-腰椎くも膜下腔潅流を行い、腰部髄液中にグリオーマ細胞に対して2ないし3-log cellkillを達成できる濃度のACNUを検出する事が出来た。しかも潅流を週一回、10週連続行っても脳脊髄の組織学的変化はほとんどみられない事が判明した。これに基づき悪性脳腫瘍の髄腔内播種患者15名にACNUによる側脳室-腰椎くも膜下腔潅流を行い、排出させた腰部髄液を経時的に採取し、高速液体クロマトグラフィにて髄液中ACNU濃度を測定した。ACNU投与量は犬と人との髄液腔内容積比1:10から10mg/100mlとした。その結果、髄液中ACNU濃度はACNU点滴投与終了時前後で最高に達し、排泄相はlinear kineticsをとることが判明し、半減期は10.7から26.4分であった。また台形公式により髄液中濃度曲線下面積を求めると270.7から553.6mugxmin/mlであった。これらの髄液腔内薬物

動態は犬の実験で得られたものと同等であった。また臨床的に重篤な副作用はみられず、剖検例における組織学的検討でも髄液腔内潅流によると思われる変化は側脳室上衣の軽度の脱落のみであった。15例の患者にこの治療を行い有効率は55%であった。問題点として大脳半球円蓋部への薬剤到達が悪い事が判明し、同部への薬剤分布を改善する方法として、ドラッグキャリアとしてリポソームを用い、髄液中でのACNUの半減期を延長させることを検討している。すでにリポソームによるグリオーマ細胞への影響を増殖抑制試験により検討し、リポソーム単独ではその増殖に影響しないことを確認し、ACNUを包埋したリポソームによりグリオーマ細胞の増殖抑制を検討している。またラツトを用いてリポソームの髄腔内投与を行い、それ単独では毒性がないことを確認した。今後ACNUを包埋したリポソームの髄腔内投与による毒性実験を行い、さらにグリオーマ髄腔内播種モデルによる治療実験へと進めていく予定である。悪性脳腫瘍を代表するグリオーマは全身血行転移することは少ないが、しばしば髄液腔内播種転移する。最近グリオーマの治療成績が向上し、延命が得られるに伴い、髄液腔内播種転移のために失う症例が急増している。そこで、私たちはグリオーマの第一選択薬であるACNUによる髄液腔内化学療法を検討してきた。bolus injectionでは有効な髄液腔内薬物濃度が得られないことより、ACNU髄液腔内潅流療法を検討し、動物実験の結果から副作用なく腰部髄液腔内に有効な薬物濃度が得られることを明らかにした。また髄液腔内播種転移の患者に対してACNUの髄液腔内潅流療法を行い、副作用なく安全に施行でき、腰部髄液腔内にも治療濃度のACNUの分布を達成できた。しかし大脳半球円蓋部くも膜下腔への薬物分布に問題があり、本年度はより理想的な髄液腔内薬物分布を得るためリポソームの利用を含む薬物投与を検討した。またACNUと同じニトロソウレア系であるBCNUの髄液腔内化学療法を検討した。フォスファジルコリンとツイーン20からなる複合リポソームはin vitroにおいて人血管内皮に障害を与えず、in vivoにおいてラットの髄液腔内投与にて神経学的、組織学的に変化を認めず、ドラッグキャリアーとして有用であることを明らかにした。BCNUはACNUと違い脂溶性溶液に溶解する必要があり、髄液腔内投与に適さないとされてきたが、リポソームに包埋することにより人工髄液に溶解し、in vitroにおいて脳腫瘍cell lineに対して増殖抑制効果があることを明らかにした。1.ラットグリオーマ髄腔内播種モデルにおけるhybrid-liposome包埋BCNU(lipo-BCNU)髄腔内投与の抗腫瘍効果180gmのラットの大槽内に、ラットグリオーマ細胞C6を1×10^6個/0.1mlまたは5×10^6個/0.1mlを移植してグリオーマ髄腔内播種モデルを作成し、その2日後にlipo-BCNU2.5mg/bodyを投与し、その抗腫瘍効果をコントロール群との生存日数の比較をすることによって判定した。実験は6回行った(各群n=5-16)。いずれの実験でも治療群の生存日数の方が延長し、うち3回においてコントロール群と比較して統計学的に有意差がみられた。2.犬におけるlipo-BCNU髄腔内投与後の薬物動態体重11.8kgおよび12.1kgの雑種成犬の大槽内にそれぞれlipo-BCNU1.0mg/1mlまたは5%dextroseに溶解したBCNU1.0mg/1mlを投与し、その後、経時的に大槽内の髄液を採取し、髄液中BCNU濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果、髄液腔内半減期はlipo-BCNUが12.1分、5%
酵母におけるミトコンドリアオートファジーの制御機構と生理的意義の統合的理解

機能低下に陥ったミトコンドリアを選択的に分解するミトコンドリアオートファジー(以下、マイトファジー)は、酵母からヒトまで保存されたミトコンドリアの品質管理機構である。酵母においてマイトファジーが誘導されると、ミトコンドリア外膜タンパク質Atg32がカゼインキナーゼ2(CK2)によってリン酸化され、それに続くAtg32の集積する部位が分解標的として切り離され、最終的に液胞内で分解される。しかしながら、ミトコンドリアのどのような異常が誘導シグナルとしてAtg32のリン酸化を制御しているのかは未解明である。前年度までの研究(若手研究B)において、CK2と競合しAtg32の脱リン酸化を介してマイトファジーを抑制するプロテインホスファターゼPpg1とその結合パートナーであるFar複合体(Far3、Far7、Far8、Far9、Far10、Far11)を見出していた。本研究では、マイトファジー誘導前後におけるPpg1とFar複合体の制御機構を解明することを目的としている。平成30年度は、これまでの研究成果をまとめ、論文発表(Cell ReportsとAutophagy)を行った。引き続き、Ppg1とFar複合体の詳細な解析を行うため、これらの因子すべての抗体を作製した。また、様々なFar複合体変異株をバックグラウンドにPpg1とFar複合体の免疫沈降実験を行い、Ppg1と直接結合するFar因子を同定した。Ppg1とFar複合体がAtg32の脱リン酸化を介してマイトファジーを抑制することを論文発表することができたこと、各種抗体の準備が完了したこと、Ppg1と直接結合するFar因子を同定したことから、おおむね順調に進展しているとした。Ppg1とFar複合体各因子の結合マップを作成する。また、Ppg1とFar因子の結合状態がマイトファジー誘導前後で変化するか、それを司る上流シグナル伝達経路は何かを解明する。外国人留学生が本研究に参加することになったため、当初予定していた研究補助員の雇用を取りやめたため未使用額が生じた。2019年度は、酵母用の培地と消耗品、タンパク質解析試薬、DNA解析試薬に加えて、成果を論文発表および学会発表するための費用に使用する。
心筋細胞のカルシウムイオンチャネル調節機構における蛋白キナーゼCの役割

本研究で明らかにしたことは次の事項である。Cell-attched modeによるCa^<2+>チャネル活動の記録・解析はチャネル機能を修飾する薬物・操作の評価に有用であることを先ず明らかにした。この方法に従い実験をおこなって、以下の結果を得た。(1)心筋細胞Cキナーゼを活性化させるホルボーエステルの1つである12-O-tetradecanovlphobol-13-acetate(TPA)の単離ウサギ心室筋細胞のL-型カルシウムチャネル活動におよぼす影響を検討したところ、全く作用を示さない。(2)受容体を介してCキナーゼを活性化させるendot helin-1も心筋細胞L-型Ca^<2+>チャネル活動に無影響である。したがって、心筋細胞のCキナーゼは、たとえ活性化されても、L-型Ca^<2+>チャネルに直接的な、かつ、即時的な調節をおこなわないと結論された。しかし、endothelin-1の陽性変力作用の解析から、遅延性に発現してくる収縮力の増加はCキナーゼの活性化と関係しており(Cキナーゼ阻害薬で抑制される事実)、かつ、L-型Ca^<2+>チャネル機能の亢進との関係を無視できない(L-型Ca^<2+>チャネル阻害薬であるnifedipineがこの遅延性の収縮力増加を抑制する事実)ことから、Cキナーゼ活性化は、まだ我々が知らない機構によって遅延性にL-型Ca^<2+>チャネル機能を修飾していると推測されるのである。それには次にあげる2つの可能性が考えられる。すなわち、(1)Endothelin-1投与直後に見られるCキナーゼの活性化が即時的ではなく、細胞内の複雑な情報伝達の過程を経て、Ca^<2+>チャネルの燐酸化・脱燐酸化のプロセスに影響する(例えば、脱燐酸化酵素活性の抑制)、(2)活動していない、言うなればsleepingしている状態にある、L-型Ca^<2+>チャネルがリクルートされる、である。この様な仮説の妥当性に関しては、今後の検証が必要であろう。心筋細胞L型Ca^<++>チャネルは心筋収縮調節の重要機構であるが、cAMP-Aキナーゼ系によるチャネル蛋白燐酸化の生理的意義はよく知られていて、細胞内cAMPをセカンドメッセンジャーに利用する受容体機構の最終的標的となっている。しかし、その他の蛋白キナーゼ、すなわち、CキナーゼやGキナーゼがL型Ca^<++>チャネルを修飾するかどうか不明であった。パッチクランプ法は細胞膜のイオンチャネル活動を解析する画期的な実験方法であるが、ホールセルクランプ法は細胞膜イオンチャネル活動に多大の影響を与える[Ca^<2+>]iや細胞内pHを一定値に固定・保持してしまう欠点があり、細細内pHや細胞内Ca^<2+>変化を情報伝達手段に用いる受容体機構の解明にとって不利である。そこで細胞内環境を人工的に調節することなく、Ca^<2+>チャネル活性を検討する方法としてセルアタッチドクランプ法を用いて、CキナーゼのCa^<2+>チャネルに与える影響を検討するのが本研究の目的である。ウサギ心室筋細胞を用い、セルアタッチドクランプ法によるL型Ca^<2+>チャネル機能解析の妥当性をまず明らかにした。結果は次の通りである。

1)Ca^<2+>チャネルアゴニストの膜電位依存性機序は、チャネル再開口促進作用と強く連関していること。2)細胞内cGMPによるGキナーゼ活性化はL型Ca^<2+>チャネルを抑抑すること以上の成果は、十分にセルアタッチドクランプ法でCa^<2+>チャネルの微細な調節機構を検出出来ることが示されたので、Cキナーゼ活性物質であるホルボールエステルの一種、TPAを作用させたが、Ca^<2+>チャネル活動に認めるべき影響を与えなかった。この成績はホールセルクランプ法でのIcaへの作用と一致する結果であった。より重要なのは、受容体機構で活性化されるCキナーゼの作用である。前年度の研究によって、cell-attached modeによる単一カルシウムチャネル活動の記録・解析が心筋細胞L-型カルシウムチャネル機能を修飾する薬物作用の解析に十分役立つことが明らかになったので、以下の検討をおこなった。すなわち、蛋白キナーゼC(PKC)を直接活性化させる12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)および受容体機構を介してPKCを活性化させるendothelin-1(ET-1)の心筋細胞L-型カルシウムチャネルへの影響を、酵素法で単離したウサギ心室筋細胞を用いて検討した。モルモット心室筋細胞で遅延整流性外向きK^+電流を活性化させるのに十分な濃度である10nMのTPAを細胞外に作用させたが、カルシウムチャネルの開口確率、開口時間および無開口掃引の割合に全く影響を与えず、TPAによるPKC活性化は心筋細胞L-型カルシウムチャネルの開口の調節に役割を果たしていないと結論された。さらに、モルモット心房筋細胞においてphosphatidylinositol-4,5-bisphosphateの水解を亢進し、PKC活性化を惹起するET-1(20nM)の作用を、TPAの場合と同様にcell-attached modeでのパッチクランプ法で検討したが、得られた成績は直接的にPKCを活性化させるTPAと同じであった。しかし、モルモット心房筋標本において、PKC阻害薬であるH-7およびstaurosporineの前処置はET-1による遅延性に発現してくる収縮力の増強を抑制し、また、この陽性変力相がnifedipineによって抑制される事実が得られた。すなわち、心筋細胞のPKCの活性化は、即時的にL-型カルシウムチャネルの機能調節には関与しないが、遅延性に影響を与えるものと推測され、新たな研究課題へと発展することが考えられる。
胚性幹細胞の生殖系列細胞へのin vitro分化誘導に関する基礎研究

胚性幹細胞(ES細胞)や胚性生殖細胞(EG細胞)は、遺伝子ターゲティング以外にもさまざまな応用が応用動物科学分野で試みられている。現在のところ、ES細胞から生殖系列細胞を確立した報告は無いが、適当な培養条件でES細胞をin vitroで生殖細胞系列化することができれば、その応用動物科学上の意味は極めて大きい。本研究の目的は、マウスES細胞をin vitroでPGCに分化誘導する条件を確立し、さらに、得られた結果をもとに、家畜のES細胞、ないしはES-like細胞について同様の実験を試み、将来の実用化への基礎を確立することにある。この目的に向けて、本年度は、単一のES細胞を胚盤胞に顕微注入して、その分化能、特に、生殖系列への分化能を解析した。その結果、単一のES細胞が生殖系列、および、解析を行った限りにおける全ての体細胞系譜に分化可能であることを確認した。さらに、ES細胞のfeeder細胞として、従来から用いられているembryonic fibroblastsの他、yolk sac細胞をfeeder細胞として用い、ES細胞(R1株)の培養を試みた。PGCのマーカーとして、しばしば用いられる4C9抗体の他、2C9など複数のPGC特異的抗体を用いて、さまざまな条件下で培養したES細胞を蛍光抗体法により解析した。特にXXの核型をもつES細胞について検討を行った。ES細胞の中でも、移動性の細胞に4C9陽性細胞が多いことが確認された。さらに、マトリゲル上で培養したES細胞のコロニーの中に、コロニー全体が4C9、2C9に対して陽性反応を示すものがあることが確認され、ES細胞の生殖系列細胞化に、興味深い予備的結果が得られた。これらの知見を端緒として、現在さらに研究を進めている。本研究の目的は、マウスES細胞をin vitroでPGCに分化誘導する条件を確立し、さらに、得られた結果をもとに、家畜のES細胞、ないしES-like細胞について同様の実験を試み、将来の実用化への基礎を確立することにある。さらに、ES細胞のfeeder細胞として、従来から用いられているembryonic fibroblastsの他、yolk sac細胞をfeederとして用い、ES細胞(R1株)の培養を試みた。ES細胞の生殖系列化については、十分な確証が得られなかったが、yolk sac細胞をfeederとしたPGCの増殖条件を確立することができた。さらに、ES細胞の生殖系列化について研究を進めている。
接着性レジンの象牙質に対する接着強化法 -HEMA,MASA,MDP/水系プライマーの効果-

歯質接着性レジンをクラウン・ブリッジの合着に用いるとクラウンマージンの辺縁漏洩が抑制でき、機能期間の延長につながる。しかし、接着の対称になる象牙質は水分や有機質を多く含有しているため接着を困難にしている。そこで親水性モノマーを含むプライマーを用いて被着面処理を行ない、モノマーを効率良くコラーゲン層内に浸透、拡散させ、コラーゲン層での重合率を向上し、辺縁漏洩を最少にする接着強化法を確立する事を本研究の目的とした。(結果)1.牛歯象牙質に対する接着強さ:被着面処理にHEMA,MDP,MASA/水系プライマー(EDプライマー)の作用時間を変化させ、接着性レジン(パナビア21)を接着した。接着強さは、60秒処理で7.6MPa、90秒処理で8.3MPa、120秒処理で12.4MPaと処理時間の延長とともに接着強さは向上した。2.牛歯象牙質に対する接着耐久性:1.と同法で接着し、4°C-60°Cのサーマルサイクリング試験を10,000回行なった。接着強さはEDプライマー60および120秒処理の場合、5,000回までは約5.0MPaの接着強さを示したが、10,000回後では60秒処理で1.0MPa、120秒処理で4.4MPaに低下した。3.接着界面の観察:EDプライマー60秒処理した象牙質とパナビア21との接着界面付近をSEM観察した結果、EDプライマー処理した象牙質に生成した接着に有効な樹脂含浸層が0.20.4μm観察された。今後はさらにEDプライマーの反応性を高め、接着耐久性の向上図る研究を行なっている。
法実証主義国際法理論の形成過程に関する日独国際共同研究のための準備作業

1本年度の科学研究費の助成を受けて、イギリスのオッペンハイムの主著「国際法」2巻(1905-06)及び特に国際法学の方法論に関する論文数点を分析し、次のような成果を得た。19世紀は自然法論と法実証主義とが競合し、次第に法実証主義が強くなっていくが、当時は法実証主義の傾向が強ければそれで法実証主義者と位置づけられてきた(例えば、クリューバー、フィリモア、ヘフタ-等)。これに対してオッペンハイムは実定国際法のみが科学の1分野たりうると述べて、明確に自然法を法源から排除する。「国際法」においても自然法論的な説明を注意深く排除している。また、彼は条約と慣習法のみを厳格に法源として挙げ、学説、国内裁判所の判例等は明白にそれから除外する。この方法は主著「国際法」においてかなり厳格に透徹されており、それまでの実証主義からぬきんでており、真の意味で法実証主義者といえよう。20世紀初頭に出版された彼の「国際法」における国際法の体系は今日まで多くの著名な国際法学者によってほぼ踏襲されており、この点で彼は20世紀国際法学の創始者としても位置づけられよう。大きな影響を与えた理由には、彼が多くの国家実行を集積し、それについての説明が客観的で公平なことが挙げられよう。2法実証主義国際法の発展過程の国際共同研究を進めるためにこの方面に関心の深いと思われる外国の学者に共同研究を呼びかけたところ、ドイツ・マックスプランク研究所のMlichael Stolleis教授及びアメリカ・デューク大学のBenedict Kingsbury教授から参加したいむねの返事を得た。今後の我々の研究成果を彼らに送付して意見交換を行うとともに、他の学者の参加もえて、この研究をもっと推進したい。
高度人体ファントムを用いた体内デバイスのリアルタイム位置推定技術

カプセル内視鏡における問題点の一つとして,駆動源の問題があり,撮影できる枚数制限,内蔵電池から漏れ出した電解液が人体に悪影響を及ぼすなどのリスクなどといった課題がある.この問題に対し,電磁波方式を用いた体外からの電力伝送の技術の開発を提案している.さらに,提案している方法は画像データの送受信と無線による電力の供給を同一のアンテナで行えるため,カプセルの省スペースができることもメリットとして挙げられる.本研究では,無線電力伝送に用いるためにはリアルタイムでの位置推定が必要であり,低演算で実現可能な位置推定システムの検討を行った.433.92 MHzにおいて,体外アンテナとして,帯域が広く円偏波を放射することができる2線式スパイラルアンテナ,体内(カプセル)アンテナとして,カプセル内に入るサイズであるヘリカルアンテナを用いて,位置推定シミュレーションを行った.提案している位置推定アルゴリズムは,人体の組織構造による推定誤差が少ない受信信号強度を用いた位置推定方法で,さらに受信アンテナの受信角度特性を考慮して,位置を補正する推定アルゴリズムの開発を行った.また,カプセル内視鏡は体内で位置だけではなく,向きも変化するため,カプセルの向きが不明でも位置推定できるアルゴリズムの開発を行った.その結果,小腸の想定範囲内において本来の位置との誤差40 mm以内を達成することができた.位置推定アルゴリズムの評価を行うため,人体模擬ファントムの開発を行った.人体模擬ファントムは,筋肉を模擬した固体ファントムと,小腸内でのカプセルの移動を模擬できる液体ファントムで構成している.カプセルから送信を行い,体外の受信アンテナでの受信電力を基に位置推定を行った.受信アンテナの角度補正を導入しない受信信号強度だけの位置推定を行った結果,実際のカプセルの位置と推定位置は,全体の6割程度の一致をみた.人体簡易モデルによる位置推定アルゴリズムの開発に関しては,当初の予定より進捗が早く進んでおり,フルペーパーにすることができた.アンテナ開発については,ほぼ予定通り進んでいる.人体組織を考慮した位置推定アルゴリズムの開発に関しては,来年度後半から開始予定であるが,先行して人体組織のモデル化などシミュレーション環境をほぼ整え終わったため,予定通り来年度から開始できると考えている.ファントムを用いたシステム評価については,最終年度に行う予定であるが,今年度に人体簡易ファントムの開発,初期のシステム検証が行えたため,最終年度には,さらに精度の高いファントム開発ができる見込みがついた.人体簡易モデルにおける位置推定アルゴリズムは,ほぼ達成できたため,実験による検証と人体組織を考慮した精度向上のための研究に注力していく.今後の研究の推進については,当初予定通りに進めて行く.来年度は,まず,体内アンテナの高効率化および体外アレーアンテナのシステム化などを行う予定である.位置推定にあたって,受信システムのダイナミックレンジ確保が大きな鍵となっているため,アンテナの効率向上と体外アレーアンテナの最適な配置が重要になってくる.そのため,体外アレーアンテナの最適な数や配置を決定し,その制御方法などの検討を行う計画である.また,人体組織を考慮し,今年度開発した位置推定アルゴリズムの有用性の確認を計算シミュレーションにて行う.特に他の臓器の近辺など,電気定数が大きく異なる環境での位置推定精度が問題になると考えている.さらに,そのシミュレーション結果を基にアルゴリズムの改良を行っていく予定である.最終年度では,人体組織を模擬したファントムを開発し,開発した位置推定アルゴリズムの実証実験を行う計画である.カプセル内視鏡における問題点の一つとして,駆動源の問題があり,撮影できる枚数制限,内蔵電池から漏れ出した電解液が人体に悪影響を及ぼすなどのリスクなどといった課題がある.この問題に対し,電磁波方式を用いた体外からの電力伝送の技術の開発を提案している.さらに,提案している方法は画像データの送受信と無線による電力の供給を同一のアンテナで行えるため,カプセルの省スペースができることもメリットとして挙げられる.本研究では,無線電力伝送に用いるためにはリアルタイムでの位置推定が必要であり,低演算で実現可能な位置推定システムの検討を行った.433.92 MHzにおいて,体外アンテナとして,帯域が広く円偏波を放射することができる2線式スパイラルアンテナ,体内(カプセル)アンテナとして,カプセル内に入るサイズであるヘリカルアンテナを用いて,位置推定シミュレーションを行った.提案している位置推定アルゴリズムは,人体の組織構造による推定誤差が少ない受信信号強度を用いた位置推定方法で,さらに受信アンテナの受信角度特性を考慮して,位置を補正する推定アルゴリズムの開発を行った.また,カプセル内視鏡は体内で位置だけではなく,向きも変化するため,カプセルの向きが不明でも位置推定できるアルゴリズムの開発を行った.その結果,小腸の想定範囲内において本来の位置との誤差40 mm以内を達成することができた.位置推定アルゴリズムの評価を行うため,人体模擬ファントムの開発を行った.人体模擬ファントムは,筋肉を模擬した固体ファントムと,小腸内でのカプセルの移動を模擬できる液体ファントムで構成している.カプセルから送信を行い,体外の受信アンテナでの受信電力を基に位置推定を行った.受信アンテナの角度補正を導入しない受信信号強度だけの位置推定を行った結果,実際のカプセルの位置と推定位置は,全体の6割程度の一致をみた.人体簡易モデルによる位置推定アルゴリズムの開発に関しては,当初の予定より進捗が早く進んでおり,フルペーパーにすることができた.アンテナ開発については,ほぼ予定通り進んでいる.人体組織を考慮した位置推定アルゴリズムの開発に関しては,来年度後半から開始予定であるが,先行して人体組織のモデル化などシミュレーション環境をほぼ整え終わったため,予定通り来年度から開始できると考えている.ファントムを用いたシステム評価については,最終年度に行う予定であるが,今年度に人体簡易ファントムの開発,初期のシステム検証が行えたため,最終年度には,さらに精度の高いファントム開発ができる見込みがついた.

人体簡易モデルにおける位置推定アルゴリズムは,ほぼ達成できたため,実験による検証と人体組織を考慮した精度向上のための研究に注力していく.今後の研究の推進については,当初予定通りに進めて行く.来年度は,まず,体内アンテナの高効率化および体外アレーアンテナのシステム化などを行う予定である.位置推定にあたって,受信システムのダイナミックレンジ確保が大きな鍵となっているため,アンテナの効率向上と体外アレーアンテナの最適な配置が重要になってくる.そのため,体外アレーアンテナの最適な数や配置を決定し,その制御方法などの検討を行う計画である.また,人体組織を考慮し,今年度開発した位置推定アルゴリズムの有用性の確認を計算シミュレーションにて行う.特に他の臓器の近辺など,電気定数が大きく異なる環境での位置推定精度が問題になると考えている.さらに,そのシミュレーション結果を基にアルゴリズムの改良を行っていく予定である.最終年度では,人体組織を模擬したファントムを開発し,開発した位置推定アルゴリズムの実証実験を行う計画である.
HLA適合血小板および骨髄提供可能者の確率と提供登録者集団の適正規模に関する研究

HLA適合血小板輸血・骨髄移植の為の非血縁ドナープールの適正規模を推定する目的で、従来調査の少なかった東北六県の155家系を対象にHLA型の調査を行った。先ず、日赤の各血液センターのHLA担当者及び今回の科研研究者の知人を通じて、書面による調査依頼を行った。承諾の得られた協力者から、最も好便な日曜日祭日を中心に、採血を行い、その24時間以内にリンパ球を分離した。各抗HLA血清を予め封入したテラサキプレートに、一定量のリンパ球を注入し、反応させた。リンパ球の細胞障害性でみるHLA検査の性格上、リンパ球のviabilityが重要であり、その操作も煩雑なことから、各回約25人の採血検査にとどめ、判定法として従来の光顕下肉眼によるものでなく、光度計測定結果をコンピューター処理し、ハプロタイプでの遺伝型式を確認しながら後日解析した。各県20家系以上、総数155家系のデータを基に計算した結果では、(1)東北地域のみで考えた場合、血小板ドナープールとして、約25、000人、骨髄ドナープールとして25、000人の登録者があれば、約80%の患者が適合ドナーが得られること。(2)従来行われた日本の他の地域のHLA家系データと合せて考えた場合、血小板ドナープールは約40、000人、骨髄移植ドナープールは100、000人あれば、約80%の患者が適合ドナーが得られること。等が判明した。さらに分離保存したリンパ球をDNAタイピング検査し、その中から、新たなHLA-DP対立遺伝子を発見した。なお、同型は、WHOの命名委員会により公認された。本研究による適正規模の推定は、1991年末に発足した公的骨髄バンク(骨髄移植推進財団)の目標ドナー数の設定にいかされている。また、現実の患者・ドナー間の適合性の割合も、ほぼ本研究の推定を裏付けている。等が判明した。HLAーA座、B座、C座、DR座抗原ハプロタイプの頻度を調べる為の家系調査を宮城県を中心とした東北地方の日本赤十字社各血液センターと共同して開始している。今回の大規模の家系調査によるHLAーA座、B座、C座、DR座のハプロタイプ頻度の決定に基づき、提供登録者集団の適正規模の決定が可能になると期待される。しかし、1家族5人以上(両親2人と子供3人以上)の条件にあい、調査に協力して下さる家系を捜し出すこと、また調査により得られた貴重な血液サンプルを速やかに処理することは必ずしも容易ではない。我国は社会医療に対する国民の関心が高く、本研究に対する一般の十分な協力も予想されるが、研究を実りあるものとするには尚一層の工夫・努力、日本赤十字社各血液センター等、関係者の協力が必要と考えている。研究に必要な機器として、検査に際し必要なアーカス蛍光光度計、検体保存用冷蔵庫、統計処理プログラム作成・データ入力用にパーソナル・コンピューター等を購入している。これらを用いて、従来の少数の家系調査に基づくHLAハプロタイプ頻度表を用いて、表現型の頻度、また、その表現型に対する適合者数、準適合者数の算出を行なった。これに基づいて登録者集団の適正規模の検討を行ない、その結果についてTransfusion誌に投稿し、採用された(in press)。これらの計算は、宮崎、高橋が作成した統計処理用プログラムを使い、パーソナル・コンピューターあるいは大型計算機を使用して行なったものである。

計画作成時に予想されたように、表現型でみると欧米に比べ比較的バラツキの少ないこと、また血小板輸血あるいは骨髄移植のunrelated donor poolの適正規模が少なくてすむこと等が判明した。これらの結果は今回の調査結果に基づいて当然修正されるべきものであるが、全般的な傾向する意味で有用と考えられた。HLA適合血小板輸血・骨髄移植の為の非血縁ドナ-プ-ルを考える時、その適正規模を推定する必要がある。本研究ではこの為先ず今まで同様の調査がほとんどなされていなかった東北六県の約150家系を対象にHLA型の調査を行なった。即ち、各家族とも両親及び子供3人のHLAーA座、ーB座、ーC座、ーDR座の表現型を血液検査によって明らかにし、その遺伝型式を確認しながら、一家族当り4本のハプロタイプを決定した。現在、解析の終了した約130家系(各県20家系以上)のデ-タを基に計算した結果では、血小板ドナ-・プ-ルとして、2,500人から5,000人、骨髄ドナ-・プ-ルとして、25,000人から50,000人の登録者があれば、約80%90%の患者が適合ドナ-を得られることが判明した。上記の数字は数年前に行なわれた全国調査300家系を基に求めた成績と近似しており、理論的な適正規模として参照すべきものであることを示している。若于、今回の計算結果の方が適合者の割合が高いのは、地域的に一定のハプロタイプが集積しているためと考えられ、人類遺伝学的にさらに検索することが望まれる。本研究でHLA検査を実際行なった際の手順も工夫を要した。予め、各抗HLA抗血清を封入したテラサキプレ-トに一定量ずつのリンパ球を注入させ反応させた。HLA検査の性格上、リンパ球のviability,も重要であり、採血後の移送の問題を解決するために、無菌的にリンパ球を分離し、移送も容易な小型の採血バッグを検査用に作成した。処理能力を高めるため、従来の光顕下での判定によらず、光度計測定結果をコンピュ-タ-処理し、ハプロタイプでの遺伝型式を確認しながら後日解析した。これらは本研究の本来の目的である非血縁ドナ-プ-ルの作成・検査登録を考える上で参照すべき経験である。
単一分子光水素発生デバイスの合成と機能制御

太陽光エネルギーを水素エネルギーに変換するプロセスの開発を見据え、水の可視光分解反応の研究が広く行われている。本課題では、光増感能と水素生成触媒能を単分子で併せ持つ単一分子光水素発生デバイスに関して、合成と機能制御を目的とし研究を行った。その結果、デバイスの活性を制御する因子を解明することに成功し、今までに例のない、白金錯体のみで水素生成を駆動する2機能複合型光水素発生デバイスの開発にも成功した。研究計画に従い、単一分子光水素発生デバイスの水素発生触媒部位の高活性化について取り組んだ。分子内に強い白金間相互作用を有する各種の白金二核錯体の合成を試み、幾つかの新規錯体の合成と単離同定に成功したものの、目的とする活性を見出すには至らなかった(Dalton Trans.への投稿準備中)。今後、異なるスペーサーを有する白金ルテニウム二核骨格を構築すべきと判明した。単核の白金触媒部を有する水素発生デバイスについては、白金側に配位したπ共役系配位子の還元電位の精密制御により、分子内電子移動の駆動力を自在に制御することに成功し、かつ、その制御因子を操作することにより、光水素発生効果を制御できることを突き止めることに成功した。見出した法則は、広く適用することができる重要なものであることが分かった(Daltons Trans.誌に投稿中)。一方、白金ルテニウム二核の水素発生デバイス二分子をエチレン鎖で連結することにより、分子内の白金-白金相互作用の形成を促進することができ、その結果活性が向上することを突き止めた(Chem. Asian J. in press)。さらに興味深い成果として、ビオローゲン多量体を導入した光増感剤としてRu錯体や水素生成触媒としての白金錯体の合成と同定に成功し、ビオローゲン多量体への多電子貯蔵過程を利用した新しいタイプの光水素発生デバイスの創出にも成功した(Dalton Trans. in press ; J. Am. Chem. Soc., submitted)。これらの研究では、白金単核錯体がPt-Pt結合を有するヒドリド中間体を経由することが初めて明らかとなった。DFT分子軌道計算、および、電気化学的反応機構解析によっても、数多くの新しく、かつ、有益な知見を得ることができた。研究計画調書に則し、白金錯体を水素発生触媒とした新規な単一分子光水素発生デバイスの合成と機能評価を展開した結果、以下に述べる幾つかの価値ある研究成果を得た。従来の光増感部-触媒部の2機能型デバイスに代え、電子供与部-光増感部-触媒部の3機能型デバイスの合成と機能評価に成功した。この研究では、電荷分離状態の延命化には成功したものの、光水素生成効率の高効率化には至らなかった。その要因が、マーカス逆転領域における電子移動速度の低下に由来することを突き止めた。一方、これまでの研究では、単一の光増感部に対して一つの触媒部位を導入した1:1型の系のみについて検討してきたが、本年度は、2つ、または、3つの触媒部を導入した1:2型及び1:3型のデバイスの合成と機能評価にも成功した。興味深いことに、触媒部位数の増加に伴い、水素生成効率が劇的に向上することを見出した。さらに、トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)を光増感部に持たない白金錯体触媒部における金属-配位子電荷移動吸収帯に用いた2機能集約型の白金単核及び二核錯体の合成と機能評価にも成功した。[Pt(trpy)Cl]^+錯体に類似の構造を有する二種の白金錯体に関し、EDTA共存下における光電子貯蔵挙動ならびに光水素生成挙動が認められた。一つは、[Pt(trpy)Cl]^+にN-methylpyridinium基を導入したメタロビオローゲン白金錯体であり、高い単一分子光水素生成挙動を示すと同時に、助触媒としての白金(II)錯体の添加による光水素生成能の向上が認められた。もう一つの化合物は、Pt(trpy)ユニットをピリジンチオラトで架橋した二核錯体であり、^3MMLCT励起状態からの電子移動過程を経由した水素生成反応が促進されることを明らかにした。研究計画調書に従い、白金錯体を水素発生触媒とする新規な単一分子光水素発生デバイスの合成と機能評価を展開した結果、以下に述べる幾つかの価値ある研究成果を得た。光増感部位-水素発生触媒部位からなる2機能型光水素発生デバイスにおいて、電子受容サイトとなる触媒部の有機配位子に強い電子吸引性を示す置換基を導入することで、既存のデバイスよりも高い活性を示す新規デバイスを開発することに成功した。この研究では、電子受容サイトのπ*軌道を安定化させ、光増感部位から触媒部位への円滑な電子移動が活性向上のための鍵因子であることが改めて示された。また、ナノ秒、及びピコ秒の発光減衰測定により、光を駆動力とした電子移動反応の速度定数におけるpH依存性や犠牲還元試薬の濃度依存性などを評価することに成功した。水素発生触媒部位に関する研究においては、どのような構造を有する白金錯体が触媒反応中により高い安定度を示すと期待されるかを評価することにも成功した。

その研究では、アミン系配位子を有する白金錯体に比べ、ピリジン系配位子を有する白金錯体の方が格段に高い安定性を持つことを明らかにした。加えて、水素生成の条件下において、各種の白金錯体が分子状水素との相互作用によって分解する反応が無視できることも示した。更に、犠牲還元試薬を必要としない水素発生システムの構築の一環として、光化学的な酸素発生を駆動する錯体触媒の創製にも成功した。その研究では、分解生成物であるコロイド種より錯体触媒種の方が高い活性を有すことが示され、コロイド種が活性種であるという懐疑的な見方を否定することに成功した。
甲状腺ホルモン受容体遺伝子の発現量を健苗性評価に用いたワカサギ増殖技術の向上研究

ワカサギ甲状腺ホルモン受容体(TR) 3種のcDNAクローニングを行い、各々のmRNA発現量測定系を開発した。ワカサギ卵のTR mRNA発現量とその卵の孵化率の間には相関がみられ、TR遺伝子発現量がワカサギ卵の健苗性評価に有効であることがわかった。また、雌成熟魚への甲状腺ホルモン投与が孵化率向上に効果的だった。ワカサギ孵化放流事業では、仔魚の大量斃死が起こる事例がみられる。事業効率化のためには、放流前に胚の健苗性評価を行い、大量斃死を抑止する技術を開発しなければならない。過去の研究から、卵中の甲状腺ホルモンが魚類の初期発生に重要な役割を果たしており、同ホルモンは甲状腺ホルモン受容体(TR)と結合して、その作用を発現することが知られている。これまで研究代表者は、胚のTRmRNA発現量と孵化後斃死率の間に相関がある傍証を得ている。本研究は、TR遺伝子の発現量を指標としたワカサギ胚の健苗性評価技術及び仔魚の生残率向上技術の開発を行うことを目的とした。平成22年度は、1.ワカサギTRcDNAのクローニング及び2.TR遺伝子発現量測定系の開発を行った。1.cDNAクローニングの結果、3種の異なる塩基配列を有するTRcDNAを得た。cDNAの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を他魚種のTRαまたはTRβと比較したところ、3種のワカサギTRcDNAは他魚種TRと90%以上の高い相同性を有し、それぞれTRαA、TRαB及びTRβに相当すると推察された。決定した本種TRαA、TRαB及びTRβcDNAはそれぞれ全長1465bp、1451bp、2125bpであり、それぞれ417、401、395のアミノ酸残基をコードする翻訳領域を含んでいた。2.課題1.で明らかになった3種(TRαA、TRαB、TRβ)のTRcDNA塩基配列において、特異性の高い5'側非翻訳領域及びA/Bドメインからプライマー及びTaqManMGBプローブを作成した。スタンダードには、TRcDNAクローニングの際5'RACE-PCRで単離されたTRcDNA断片を用いた。リアルタイム定量RT-PCR法によりTR遺伝子の発現量測定系を確立したところ、3種の測定系のアッセイ内及びアッセイ間変動係数は低値を示し、確立した測定系の精度が高いことが明らかになった。過去の研究から、卵中の甲状腺ホルモンが魚類の初期発生に重要な役割を果たしており、同ホルモンは、甲状腺ホルモン受容体(TR)と結合して、その作用を発現することが知られている。これまでの研究から胚のTRmRNAの発現量と孵化後斃死率の間に相関がある傍証を得ている。本研究は、TRmRNAの発現量を指標としたワカサギ胚の健苗性評価技術及び仔魚の生残率向上技術の開発を行うことを目的とした。平成23年度は、1.胚の健苗性評価技術の開発及び2.仔魚の生残率向上技術の開発を行った。1.3種のTRのうちTRαBのmRNA発現量が最も孵化率と相関が強かった。TRαBmRNA発現量については、8°C16°Cの間では影響がみられず、胚発生に伴い有意に増加した。健苗性評価を積算水温170°Cの発眼卵で、推定孵化率70%を下限として行うと、TRαBmRNA発現量の健苗値は約0.04amol/μgtotal RNAとなった。この健苗値を用いて9群の孵化場産発眼卵の評価を行ったところ、9群のうち6群で健苗性が良好と推察された2.雌成熟魚に各種濃度の甲状腺ホルモンを1回または2回投与し排卵された卵を人工授精させ、孵化率を調べた結果、1μg/g体重のトリヨードサイロニンを1回投与すると、約10%孵化率が向上した。