hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
4アゾリジン-2,4-ジカルボン酸を介する蓚酸生成経路の検討

蓚酸は,動物では有害無益な代謝終産物とされており,過剰に生産されると多くの組織への蓚酸カルシウム結晶の沈着のため重篤な状態を引き起こす。草食動物(ヒトを含む)では,蓚酸の直接の前駆体であるグリオキシル酸をその主たる生産部位であるペルオキシソームにおいて除去する機構(SPT/AGTという酸素)を備えることにより蓚酸生成を抑制している。本研究では,動物において何故蓚酸が作られるに至ったかを理解するために,蓚酸生成機構を解明しようとした。主たるグリオキシル酸産生臓器である肝臓での蓚酸生成を研究対象とした。グリコール酸オキシダーゼがグリコール酸からグリオキシル酸へ,更に蓚酸へという連続した2段階の酸化反応を触媒する可能性はほぼ完全に否定された。グリオキシル酸とシステインあるいはシステアミンの付加物(チアゾリジン化合物)を介する経路の関与については,たとえあるにしても主たるものではないことが示唆された。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)に関しては,単離ペルオキシソームに検出される活性は吸着LDHのものと結論された。しかし,その強い活性故に,サイトソルに極く微量存在するグリオキシル酸が,同酵素によって触媒される乳酸-ピルビン酸間のシャトルにおいて基質の一つになり,蓚酸に酸化される可能性が大となった。一方では,ペルオキシソームで生産されたグリオキシル酸がSPT/AGTの作用を逃れてサイトゾルへ放出されるか否かとその速度を検討すると共に,多量の乳酸,ピルビン酸が存在する生体内でのLDHによるグリオキシル酸酸化を動力学的に解析するためのより単純な系を検索した。その結果,積極的に蓚酸を生産しているイネもみ枯細菌病菌(Pseudomonas glumae)の蓚酸を作らない,したがって病原性を持たない変異株が供給されたグリオキシル酸からは蓚酸を生産することを見出した。このPs.glumae変異株での蓚酸生成の動力学的解析の上で再び肝臓を研究する。動物では終末代謝産物であり主として尿へ排泄される蓚酸は,そのカルシウム塩が水に〓溶であるため尿路結石の原因となる。特に,蓚酸過剰生産を主徴とする原発性高蓚酸尿症では、腎臓をはじめ諸臓器への蓚酸カルシウムの沈着が起こり.重篤な状態となる。蓚酸の主な前駆体はグリオキシル酸であるが,グリオキシル酸からの蓚酸生成機構が今以って不明である。三種の酵素がグリオキシル酸から蓚酸への酸化触媒活性を示すが,いずれも他に本来の役割を持っており,酵素の性質等からも,本来の基質が共存する生体内での蓚酸生成への実質的な関与は疑問である。本研究では蓚酸生成機構の解明を目指して,以下の実験を行った。1.チアゾリジン-2,4-ジカルボン酸(TDCA)からの蓚酸生成-グリオキシル酸は生体内SH化合物であるシステインに容易に付加しTDCAとなる。

蓚酸がTDCAを介して生産される可能性を検討するため、マイクロプレートリーダーによる効率的な蓚酸生成法を開発した後,TDCAおよび関連化合物を投与(腹腔内および経口)したラットからの尿への蓚酸排泄を経時的に測定した。その結果,1.2mモルTDCAを経口投与すると蓚酸排泄は約6倍に増加し,この増加量は0.3mモルグリコール酸を投与した時とほぼ同じであった。現在,組織中蓚酸の定量法を開発し,TDCAからの蓚酸生成過程の解析を進めている。2.ペルオキシソームの乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性-グリオキシル酸酸化活性を持つ酵素の一つであるLDHは代表的なサイトゾル酵素の一つとされているが,肝臓全体のLDH活性の約1%がペルオキシソームに存在することが明らかになった。グリオキシル酸生産の主たる細胞内部位はペルオキシソームであるので,このオルガネラにLDH活性を持つ酵素が存在することの蓚酸生成における意義は大きいと考え,現在同酵素を精製中である。蓚酸は,動物では有害無益な代謝終産物とされており,過剰生産されると多くの組織への蓚酸カルシウム結晶の沈着のため重篤な状態を引き起こす。草食動物(ヒトを含む)では,蓚酸の直接の前駆体であるグリオキシル酸をその生産部位であるペルオキシソームにおいて除去する機構(SPT/AGTという酵素)を備えて蓚酸生成を抑制している。本研究では,動物において何故蓚酸が作られるに至ったかを理解するために,蓚酸生成機構を解明しようとした。主たるグリオキシル酸産生臓器である肝臓での蓚酸生成を研究対象とした。グリコール酸オキシダーゼ(GOD)がグリコール酸からグリオキシル酸へ,更に蓚酸へという連続した反応を触媒する可能性はほゞ完全に否定された。グリオキシル酸とシステインあるいはシステアミンの付加物(チアゾリジン化合物)を介する経路の関与については,たとえあるにしても主たるものではないことが示唆された。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)に関しては,単離ペルオキシソームに検出される活性は吸着LDHのものと結論された。しかし,その強い活性故に,サイトゾルに極く微量存在するグリオキシル酸が,同酵素によって触媒される乳酸・ピルビン酸間のシャトルにおいて基質の一つとなり,蓚酸に酸化される可能性が大となった。一方では,ペルオキシソームで生産されたグリオキシル酸がSPT/AGTの作用を逃れてサイトゾルに放出されるか否かとその速度を検討すると共に,多量の乳酸,ピルビン酸が存在する生体内でのLDHによるグリオキシル酸酸化を動力学的に解析するためのより単純な系を検索した。その結果,積極的に蓚酸を生産しているイネもみ細菌病菌(Pseudomonas glumae)の蓚酸を作らない,したがって病原性を持たない変異株が供給されたグリオキシル酸からは蓚酸を生産することを見出した。このPs.glumae変異株での蓚酸生成の動力学的研究の上で肝臓に戻って本研究を仕上げる予定である。
多様流動的生産環境に対する臨機応変混成生産システムの機動的管理方式の開発

本研究では,多様流動的生産環境として,製品需要が激しい非定常変化と,作業者からなる生産工程において,生産する際の習熟や個人差,さらに,その結果として問題となる,生産システムの構成が均質でない混成生産システムを前提とする.そのような多様流動的生産環境に対する臨機応変混成生産システムの機動的管理方式について開発した.開発した機動的管理方式では,生産ラインと生産セルを切り替えることにより,生産の構成とその能力を制御することで,変動に対応する.本研究では流動的生産環境に対する臨機応変生産システムの機動的管理の問題を,(1)生産システム編成を固定した下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理,(2)生産システム編成も制御対象とした下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理の2つの具体的目的に分けて考えることとした.本年度は,そのうちの前者について,対象とする多段階生産システムの検討,および需要変動と習熟の影響分析と工程編成方式の検討を行った上で,需要変動・習熟に対する検知・調整方式の開発,および需要変動・習熟とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータの開発を行った.対象とする多段階生産システムの検討では,従来の生産システムのパラメータや構成を動的に制御している研究,生産工程の習熟も研究についても検討した.またこの際,需要の非定常変動と習熟の過程を離散的な段階で表現することについて検討した.需要変動と習熟の影響分析と工程編成方式の検討では,需要の非定常変動と習熟の過程やそれに対する工程編成を離散事象マルコフ連鎖で表すマルコフ連鎖モデルで表現することとした.さらに需要変動・習熟とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータの開発では,シミュレーションではなくマルコフ連鎖モデルから定常状態確率を求める数値計算により解析するための計算プルグラムについて検討した.本研究では流動的生産環境に対する臨機応変生産システムの機動的管理の問題を,(1)生産システム編成を固定した下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理,(2)生産システム編成も制御対象とした下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理の2つの具体的目的に分けて考えることとした.本年度は,そのうちの後者について,需要変動・習熟に対する検知・調整方式の実験的評価と検討,生産システム編成の影響分析と生産システム編成も含めた工程編成方式の検討,需要変動・習熟に対する生産システムとその工程の編成調整方式および生産システムシミュレータを開発した.また,開発した需要変動・習熟に対する検知・調整方式の実験的評価を行った.対象とする多段階生産システムの検討では,従来の生産システムのパラメータや構成を動的に制御している研究,生産工程の習熟に関する研究についても検討した.この際,昨年度の成果を踏まえて,需要の非定常変動と習熟の過程を離散的な段階で表現することについて検討した.また,需要変動と習熟の影響分析と工程編成方式の検討では,需要の非定常変動と習熟の過程やそれに対する工程編成を離散事象マルコフ連鎖で表すマルコフ連鎖モデルで表現することとした.さらに需要変動・習熟とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータの開発では,シミュレーションではなくマルコフ連鎖モデルから定常状態確率を求める数値計算により解析するための計算プログラムについて検討した.本研究では流動的生産環境に対する臨機応変生産システムの機動的管理の問題を,(1)生産システム編成を固定した下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理,(2)生産システム編成も制御対象とした下で,多様流動的生産環境に対する機動的管理の2つの具体的目的に分けて考えることとした.本年度は,そのうちの後者について,これまで行ってきた,需要変動・習熟に対する検知・調整方式の実験的評価と検討,生産システム編成の影響分析と生産システム編成も含めた工程編成方式の検討,およびこれまでに開発した需要変動・習熟に対する生産システムとその工程の編成調整方式および生産システムシミュレータを下に,昨年度に引き続き,開発した需要変動・習熟に対する検知・調整方式の実験的評価を行った.数値実験では,開発した機動的管理方式と,比較対象として生産セルのみの数により対応する方式について比較検討を行った.生産ラインでは,生産セルよりも習熟はかからないことと習熟後は高い生産率が想定される反面,切り替え時の準備時間がかかることが想定される.それら習熟や生産率,段取り時間の影響を明らかにすると同時に,それぞれが有利となる領域を明らかにした.さらに,最終年度であり,計算の結果について,全員で研究成果を学会発表などにより,他の研究者の評価を受けた.この評価の結果,開発した機動的管理方式により十分な効果が得られたことを確認した.その上で,各年度の研究成果を検討し,本研究全体として成果をまとめるための方針について検討し,本研究の成果を報告書にまとめることとした.本研究では,多様流動的生産環境として,製品需要が激しい非定常変化と,作業者からなる生産工程において,生産する際の習熟や個人差,さらに,その結果として問題となる,生産システムの構成が均質でない混成生産システムを前提とする.そのような多様流動的生産環境に対する臨機応変混成生産システムの機動的管理方式について開発した.開発した機動的管理方式では,生産ラインと生産セルを切り替えることにより,生産の構成とその能力を制御することで,変動に対応する.実験的評価については,特性に影響を与える要因として,ライン生産における処理率や,セル生産における学習前の処理率と学習時間を取り上げ,それらの影響を明らかにした.工程編成方式の優位性についての比較検討のための実験などについては,さらに継続する必要があるが,想定の範囲内であり概ね予定通りと考えられる.複合新領域来年度は最終年度となり,研究計画調書では,研究成果の検討とまとめを予定している.現在までの達成度で述べたように一部実験の継続が必要であることから,それら残された実験を行った上で,研究成果について検討すると同時に,研究のまとめを行う予定である.

当初のモデルの表現方法,解析方法を変更したこともあり,当初予定の解析用シミュレータ開発までが完了しているわけではないものの,対象のモデル表現,解析法について検討がほぼ完了しており,概ね予定通りと考えられる.当初予定していた実験補助の人件費・謝金,備品が少なくてすんだため引き続き,研究計画調書に従って研究を推進していく.次年度の使用計画書を見直して,新たな人件費・謝金や備品あるいは別の費目に変更して使用する計画である.当初計画していた出張を取りやめたため。次年度の使用計画を見直して,新たな出張あるいは別の費目に変更して使用する計画である。
筋障害における血管形成因子の動態

血管形成因子angiogeninの分離精製をfettらの原著に基づいて,ヒト結腸腺がん細胞のHT-29細胞の培養上清より行った. 5%牛胎児血清含有DMEM培地を用いて, 2,000ml, 6,000cm^2の培養用量のcell factoryの中で, HT-29細胞を培養増殖させ,十分に増殖した後に牛胎児血清を含まないDMEM培地に置換. 23日ごとに,その上清を集め以下のごとく, angiogeninの分離精製を行った.5%酢酸溶液にした上清にペプスタチンAを加え,タンパク分解を抑制した上清を限外濾過で200分の1の体積に濃縮,透析後,凍結乾燥し保存.さらに溶解後, CMセルロース・カラムに通し吸着されたタンパクを1MNaclにて溶出し,再び透析と凍結乾燥を行った.8,000mlの上清より35mgの固形成分が得られた.さらに0.1%TFAと0.08%TFAに調整された2-プロパノール・アセトニトリル・水混液(5:5:4)との濃度勾配クロマトグラフィーによりFettらの原著に記載されている濃度において有意な蛋白質のピークを認め, angiogeninが分離精製されたと考えられる.しかし,当初の細胞培養上清1,000mlあたりで得られた蛋白は0.3μg以下の少量でありangiogeninの生物学的検定に供するには十分の量ではなく,今後,さらに細胞培養を大量に行い,上清よりのangiogeninの分離精製を行い貯蔵蓄積する.さらに, HT-29などの腫瘍細胞以外の血管形成因子に富む組織からのangiogeninの抽出によるモノクローナル抗体の作成に着手していて,各種の血管反応における血管の成長因子の動態について検討中である.血管形成因子angiogeninの分離精製をfettらの原著に基づいて,ヒト結腸腺がん細胞のHT-29細胞の培養上清より行った. 5%牛胎児血清含有DMEM培地を用いて, 2,000ml, 6,000cm^2の培養用量のcell factoryの中で, HT-29細胞を培養増殖させ,十分に増殖した後に牛胎児血清を含まないDMEM培地に置換. 23日ごとに,その上清を集め以下のごとく, angiogeninの分離精製を行った.5%酢酸溶液にした上清にペプスタチンAを加え,タンパク分解を抑制した上清を限外濾過で200分の1の体積に濃縮,透析後,凍結乾燥し保存.さらに溶解後, CMセルロース・カラムに通し吸着されたタンパクを1MNaclにて溶出し,再び透析と凍結乾燥を行った.8,000mlの上清より35mgの固形成分が得られた.さらに0.1%TFAと0.08%TFAに調整された2-プロパノール・アセトニトリル・水混液(5:5:4)との濃度勾配クロマトグラフィーによりFettらの原著に記載されている濃度において有意な蛋白質のピークを認め, angiogeninが分離精製されたと考えられる.しかし,当初の細胞培養上清1,000mlあたりで得られた蛋白は0.3μg以下の少量でありangiogeninの生物学的検定に供するには十分の量ではなく,今後,さらに細胞培養を大量に行い,上清よりのangiogeninの分離精製を行い貯蔵蓄積する.さらに, HT-29などの腫瘍細胞以外の血管形成因子に富む組織からのangiogeninの抽出によるモノクローナル抗体の作成に着手していて,各種の血管反応における血管の成長因子の動態について検討中である.
電磁プラズマセイルの推力発生機構の解明

プラズマ噴射による磁場展開(磁場インフレーション)を伴わない磁気セイルについて以下の結果を得た:1.電磁流体力学に基づいた数値解析から,磁気セイルが磁気圏中に流れる誘導電流から受けるLorentz力により推力を得ることを明らかにした.ダイポール磁場の磁気モーメントが太陽風流方向と平行な場合が最も推進の効率が良いことが分かった.2.Full PIC法で太陽風と磁場の干渉解析を行い,推力の見積もりを行った.3.太陽風とダイポール磁場との干渉の数値シミユレーションをHybrid PIC法により行い,さまざまなスケールの磁気セイルについて太陽風に対する抵抗係数を解析し,近似計算法則を求めた.4.磁気セイル周りのプラズマ流を模擬する地上実験設備の設計・製作を行った.磁場インフレーションを伴う電磁プラズマセイルについて以下の結果を得た:5.電磁流体モデルを用いて電磁プラズマセイルを数値シミュレーションし,電磁プラズマセイルの抵抗係数を求めた.電磁プラズマセイルの性能について評価し,イオンスラスターよりも良いパフォーマンスを得るには,大きな機体が必要となることを明らかにした.6.3次元ハイブリッドコードによりプラズマ噴射による磁場インフレーションと太陽風-磁場干渉のシミュレーションを行った.噴射プラズマによって磁場がインフレーションされることを確認した.太陽風-磁場干渉解析から推力を概算し,数十kmの磁気圏において十分に推力が発生できることを確認した.7.電磁流体解析により,電磁プラズマセイルから噴射するプラズマと磁気圏の大きさ,及び推力との関係を求めた.噴射プラズマのβ値を大きくすることで磁気圏はより大きく広がるが,低いβ値でないと電気推進と比べ効率が良くないことがわかった.磁気セイル,磁気プラズマセイルを深宇宙探査に応用した際の有用性について評価した.プラズマ噴射による磁場展開(磁場インフレーション)を伴わない磁気セイルについて以下の結果を得た:1.電磁流体力学に基づいた数値解析から,磁気セイルが磁気圏中に流れる誘導電流から受けるLorentz力により推力を得ることを明らかにした.ダイポール磁場の磁気モーメントが太陽風流方向と平行な場合が最も推進の効率が良いことが分かった.2.Full PIC法で太陽風と磁場の干渉解析を行い,推力の見積もりを行った.3.太陽風とダイポール磁場との干渉の数値シミユレーションをHybrid PIC法により行い,さまざまなスケールの磁気セイルについて太陽風に対する抵抗係数を解析し,近似計算法則を求めた.4.磁気セイル周りのプラズマ流を模擬する地上実験設備の設計・製作を行った.磁場インフレーションを伴う電磁プラズマセイルについて以下の結果を得た:5.電磁流体モデルを用いて電磁プラズマセイルを数値シミュレーションし,電磁プラズマセイルの抵抗係数を求めた.電磁プラズマセイルの性能について評価し,イオンスラスターよりも良いパフォーマンスを得るには,大きな機体が必要となることを明らかにした.6.3次元ハイブリッドコードによりプラズマ噴射による磁場インフレーションと太陽風-磁場干渉のシミュレーションを行った.噴射プラズマによって磁場がインフレーションされることを確認した.太陽風-磁場干渉解析から推力を概算し,数十kmの磁気圏において十分に推力が発生できることを確認した.7.電磁流体解析により,電磁プラズマセイルから噴射するプラズマと磁気圏の大きさ,及び推力との関係を求めた.噴射プラズマのβ値を大きくすることで磁気圏はより大きく広がるが,低いβ値でないと電気推進と比べ効率が良くないことがわかった.磁気セイル,磁気プラズマセイルを深宇宙探査に応用した際の有用性について評価した.磁気インフレーションの理想電磁流体力学解析を行い、噴射プラズマによる磁場拡大現象を確認し、投入電力に対する磁場拡大の効率を求めた。プラズマを噴射した場合の磁束密度はプラズマベータ値の関数で、磁束密度が半径の1.52乗に反比例して減少することがわかった。太陽風と磁場相互作用の理想電磁流体力学解析を行い、発生する推力と推力方向が磁気モーメントの太陽風に対する傾き角度によってどれほど変化するかを見積もった。磁気モーメントを太陽風に対して傾けることにより、推力の大きさ及び推力の方向を変えることが出来ることがわかった。ただし可変量は、磁気モーメントを傾けるだけでは、わずかしかとれないこともわかった。全粒子コードを開発し、太陽風と磁場相互作用の粒子法による解析を行った。ダイポール磁場と希薄電化電離プラズマとの相互作用を解析し、ダイポール周りに発生する誘導電流・誘導磁場の構造と、ダイポールに作用する電磁気力が推力となることを検証した。電磁プラズマセイルによるミッション・軌道計画を検討した。現状予想される電磁プラズマセイルの諸元を仮定して、外惑星探査への応用を検討した。推力方向の可変度が大きいほど到達可能距離が長くなり、可変度によっては太陽系脱出も可能であることがわかった。反太陽方向に加速される探査機のダイナミクスを解析した。また、目標惑星が遠日点に位置すると仮定して、太陽風をガウス分布する確率事象として捉え、低推力軌道に拡張されたスペーシング則の理論を応用することにより、終端誤差要求を満足する磁気プラズマセイルの推力制御方法、終端付近で必要となる化学推進によるΔV量の評価を行った。電磁プラズマセイルの物理現象の素過程を検証するための地上実験をおこなった。太陽風を模擬したプラズマ流と磁場の干渉によるイオン軌道の変化を調べ、磁場によるプラズマ流の流れの変化を確認した。1、理想MHDシミュレーションならびにプラズマ粒子法解析を行い,磁気セイルについて,無次元推力係数Cd値を算出した.高速プラズマ流である太陽風が,探査機周りの磁場によって受ける運動量の変化が、電磁力を介して探査機へ伝達されるメカニズムを明らかにした.

また太陽風に対する磁気モーメントの方向と推力方向の関係を求めた.2、磁気セイルの代表長(探査機周りの磁場の大きさ)を、10kmから100km(推力で0.21N程度)と小型なものの場合,磁気圏境界面におけるイオンLarmor半径は,磁気セイルの代表長とほぼ同じ大きさとなるが,このような領域でも,粒子法解析の結果から,比較的大きなCd値を取り、磁気セイルとして実現することが分かった.3、プラズマ噴射によってどれだけ磁場を拡大させることができるか,それに伴ってどれだけ推力が増大するかについて,MHDシミュレーションと粒子法解析により,引き続き解析を行っている.4、太陽風と磁場の干渉を地上で模擬できる実験装置を開発した.擬似太陽風発生にはDCアークジェットを用い,探査機周りの磁場発生にPulse Forming Networkによる強磁場発生装置を用いることで,実機周りのプラズマスケールを合わせている.5、推力電力比および推力方向の周方向からの角度をパラメタとして,到達可能な太陽からの距離について調べ,太陽系探査への応用の可能性を検討した.推力方向が半径に制限された場合でも、外惑星に直接移行することが可能であることを示し,金星や地球の重力アシスト(惑星スイングバイ)を使用せず飛行時間の短縮が可能であることを示した.電磁プラズマセイルの推進原理と推進特性を明らかにするため数値解析及び実験を行い,以下の知見を得た.1.電磁流体力学に基づいた数値解析から,ダイポール磁場の磁気モーメントを太陽風流れ方向と平行に向けたときが最も推進の効率が良いことが分かった.2.太陽風とダイポール磁場との干渉の数値シミュレーションをHybrid PIC法により行い,さまざまなスケールの磁気セイルについて太陽風に対する抵抗係数を解析し抵抗係数の近似計算法則を開発した.3.磁気セイル周りのプラズマの流れ場を模擬する地上実験設備の設計・製作を行った.磁気セイル周りの流れ場を模擬することができた.4.電磁プラズマセイルの性能について評価した.イオンスラスターよりも良いパフォーマンスを得るには,大きな機体が必要となることが明らかになった.6.有限ラーマ半径効果を考慮に入れて,3次元ハイブリッドコードによりプラズマ噴射による磁場インフレーションと太陽風干渉のシミュレーションを行い,十分に推力が発生できることを確認した(40kmの磁気圏で約3.4N).7.噴射プラズマのβ値が大きい程磁気圏は大きく広がるが,β値が小さい程効率が良い関係にある.8.一定加速度を持った場合と太陽からの距離の2乗に反比例して加速度が小さくなる場合の2ケースについて,太陽系脱出に必要な増速分を解析し,無次元加速度と脱出距離の関係を解析的に求めた.
武力不行使原則の構造変化とその意義

第1に、19世紀中葉から国連憲章制定にいたる自衛権概念の展開についての研究を出版した。その出版準備の中でとくに、国連憲章の制定過程、とりわけ憲章第2条4項の、「国際連合の目的と両立しない他のいかなる方法による」との但し書きについての米国代表団の見解を明らかにした。第2に、武力行使概念および自衛権の必要性および均衡性原則に注目して近時の国際判例の検討を進めた。第3に、いわゆる「サイバー攻撃」との関係を中心に武力行使概念について検討を進めた。本研究の目的は、現代国際法における武力不行使原則の法的構造を明らかにし、その成果を国際的に問うことにある。申請者のこれまでの研究によって、国連憲章2条4項における武力行使の禁止とは、国連の目的と両立しない武力行使は許されないということが出発点にあり、それは、国連の目的と両立する武力行使は許されることを意味するものと理解されていたことが明らかとなった。これに対し、現在では、武力不行使原則とそれに対する例外との関係については、厳格な禁止と明確な例外(国連安全保障理事会による強制措置および武力攻撃に対する自衛権)という捉え方が、言いかえれば、こうした明確な例外以外の武力行使は許されないと理解することが一般的である。こうした変化、あるいは少なくともこうして変化した形で理解されていることについて、(1)そうした変化は実定法上生じたと言えるのか、(2)そのことはどのような意義を有するのか、を明らかにしようとするものである。本研究の1年目である本年度は、関連する学説の検討を進めた。冷戦終焉以降、国際社会における武力行使はむしろ増大しており、それに対応して関連文献の数は夥しい量に上る。今年度はモノグラフとしてまとめられたものを中心に検討を行った。こうした検討と並行し、歴史的再検討の重要性に鑑み、これまで進めてきた19世紀中葉から国連憲章制定にいたる自衛権概念の展開についての研究をまとめ、東京大学出版会から、『自衛権の基層:国連憲章に至る歴史的展開』として出版した。今年度に行ったその出版準備の中で、国連憲章の制定過程、とりわけ憲章第2条4項の、「国際連合の目的と両立しない他のいかなる方法による」との但し書きについての米国代表団の見解を明らかにした。すなわち、米国代表団は、同国の代表団会議における議論においては、国連の目的と両立する武力行使は許されると一貫して理解していたのに対し、サンフランシスコ会議における議論においては、「[国連]の目的に合致すると主張してなされる、国家による単独主義的な武力行使を承認する」ことになるという他国の危惧に対し、それを明確に否定した。こうした米国の態度は一見して矛盾するものだが、米国自身はそれを矛盾するものとは理解していなかったと考えられる。すなわち、米国は、「[国連]の目的に合致すると主張してなされる、国家による単独主義的な武力行使」と国連の目的と両立する武力行使とを区別しており、その区別は、目的との両立性について国連安全保障理事会の判断に服するとすることによって維持されると理解していたのである。この点は、自衛権にとどまらず武力不行使原則を対象とする本研究においても、検討の出発点となろう。本研究の2年目である本年度は、昨年度に続いて関連する学説の検討を進めた。冷戦終焉以降、国際社会における武力行使はむしろ増大しており、それらを対象とした関連文献が続々と公刊されてきており、それらは夥しい量に上る。今年度もモノグラフとしてまとめられたものを中心に検討を行った。こうした検討と並行し、武力行使に関連する近時の国際判例の検討を進めた。関連裁判例としては、もはや古典的というべきニカラグア事件(国際司法裁判所(ICJ)、1985年)のほか、オイル・プラットフォーム事件判決(ICJ、2003年)、パレスチナ壁建設事件勧告的意見(ICJ、2004年)、コンゴ領軍事活動事件(ICJ、2005年)、武力行使の合法性事件判決(エリトリア・エチオピア請求権委員会、2006年)に加え、武力行使とはなにか、という観点から、スペイン・カナダ漁業管轄権事件(管轄権判決)(ICJ、1998年)、サイガ号事件(第2判決)(国際海洋法裁判所、1999年)、ガイアナ・スリナム仲裁事件(2008年)などを取り上げた。その結果、海上での警察活動の際に外国船舶に向けられるUse of Forceが、国連憲章2条4項で禁止される「武力行使」なのか、あるいはそれとは区別される「実力の行使(国連公海漁業協定22条1項(f)参照)」なのか、という問題につき検討を深めたほか、自衛権の必要性および均衡性原則につき、ある武力行使が自衛権の行使として正当化されるためには、武力攻撃の発生が前提とされ、その上で、自衛権の行使として行われる措置が当該攻撃に対応するために必要であり、かつそれとの間で均衡のとれたものであることが求められるとされていることなどが明らかとなった。

こうした検討の結果は、一部を『法学教室』352号(2010年)に「演習・国際法」の形で掲載したほか、より実質的には、2010年度に改訂される『講義国際法』(有斐閣)のなかで展開される(提稿済み)。本研究の3年目である本年度は、昨年度に続いて関連する学説の検討を進めた。冷戦終焉以降、国際社会における武力行使はむしろ増大しており、それらを対象とした関連文献が続々と公刊されてきており、それらは彩しい量に上る。今年度はモノグラフとしてまとめられたものに加え、雑誌論文についても検討を行った。こうした検討と並行し、武力行使に関連する近時の国際判例の検討を進めた。その結果は、『講義国際法(新版)』(有斐閣)に反映された。また、判例の検討の中で、自衛権の必要性および均衡性原則の位置づけについても検討を行った。これらは国際慣習法上認められると一般に位置づけられるものの、そこでの必要性基準は自衛権の発動要件だったのであり、均衡性基準はそれに対して許される措置の限度を示すものであった。そのため、戦間期において戦争違法化との関係で自衛権が論じられるようになると両基準の意義は不明確となった。これに対してオイル・プラットフォーム事件判決(国際司法裁判所(ICJ)、2003年)は、実際にはニカラグア事件(ICJ、1985年)においても示唆されていたところだが、武力攻撃要件が満たされる場合にとられる措置が、当該武力攻撃に対応するのに必要であり、かつ当該武力攻撃に対して均衡のとれたものであることを要求するものとして、両者の関係を整理した。必要性基準を発動要件と位置づけるのではなく、発動要件としての武力攻撃が存在する場合に、それに対する対応の具体的な必要性を求めるものであり、自衛の目的に照らして判断されるものであることが示されている。戦間期以降の自衛権の位置づけの変化に伴い、必要性及び均衡性原則の位置づけを整理したものと言えよう。本研究の4年目である本年度は、昨年度に続いて関連する学説の検討を進めた。冷戦終焉以降、国際社会における武力行使はむしろ増大しており、それらを対象とした関連文献が続々と公刊されてきており、それらは夥しい量に上る。
強光子場クーロン爆発による実時間分子軌道イメージング

分子クーロン爆発による分子軌道イメージング法の開発と確立を行った。光源開発として,時間幅35フェムト秒のレーザーパルスから自己フィラメンテーションまたは中空ファイバーによるスペクトルの広域化を行い,時間幅サブ7フェムト秒をもつ高強度超短パルスの発生に成功した。この超短パルスをプローブ光源として用い,一酸化窒素分子の解離性イオン化で生じたN+の運動量画像を調べたところ,電子基底状態Xの分子軌道を反映した,レーザー偏光方向に45度にピークをもつ運動量分布が得られた。また,電子励起状態Aからの解離性イオン化では円環状のN+の運動量画像が得られ,電子励起状態の分子軌道イメージングに初めて成功した。分子内クーロン場に匹敵する強レーザー場中におかれた分子は複数電子の放出によるイオン化やクーロン反発による解離,クーロン爆発を起こす。イオン化の確率が電子密度に依存する場合には,解離イオンの運動量分布にはクーロン爆発前の分子軌道の形状が反映される。本研究ではこのクーロン爆発を利用した分子軌道イメージング法に基づいて,超高速に変化する分子の核波束と分子軌道との相互ダイナミクスに関する詳細な知見を得ることを最終的な目的とする。本年度はまず,超高速現象追跡のための光学系の構築および非時間依存分子軌道イメージング計測を行なった。以下に主に得られた成果を示す。自己フィラメンテーションによるスペクトルの広帯域化およびチャープミラーによるパルス圧縮を用いた高強度サブ10フェムト秒レーザーパルスの発生実験を行なった。その結果,35フェムト秒の時間幅を持つレーザーパルスからビーム品質のよい,時間幅9.5フェムト秒,出力500μJ/pulseのレーザーパルスを得た。NO分子に1x10^{14}W/cm^{2}の高強度サブ10フェムト秒レーザーパルスを照射し,解離性イオン化によって生じたN^{+}イオンを計測したところ,N^{+}イオンの運動量分布はレーザー偏光方向に対して45度方向にピークをもつX型の形状を示した。このことは,得られたN^{+}イオンの運動量画像がNO分子の電子基底状態の分子軌道を反映していることを示すものである。現在,深紫外領域まで波長可変な超短パルスの光学系を構築中であり,深紫外超短パルスを用いて分子の電子励起状態における分子軌道の測定も行なう予定である。本研究ではクーロン爆発を利用した分子軌道イメージング法の開発を行い,これに基づいて超高速に変化する分子の核波束と分子軌道との相互ダイナミクスに関する詳細な知見を得ることを目的とする。解離イオンの運動量分布からクーロン爆発前の分子軌道の形状を高精度で観測するためには,核運動による電子状態変化を最小限に抑えるための十分高い時間分解能を有するプローブ光源でイオン化を行う必要がある。この条件を満たすために,昨年度にひきつづき,超高速現象追跡のための光学系の開発・改良を行った。フーリエ限界で10フェムト秒以下の超短パルスを得るためには,高次分散の影響を考慮する必要がある。そこで,パルス圧縮における高次分散を補償するため, 3次までの分散を考慮したチャープミラーの開発・設計を行った。実際にこのチャープミラーを用いてパルス幅を計測したところ,ほぼフーリエ限界であるパルス幅サブ7fsの超短パルスを得ることができた。また,電子励起状態に励起するための波長可変システムを構築し,可視から近紫外線領域(220nm)までの超短パルスの発生に成功した。一方,実時間計測のための調整実験の一環として,波長400nmの紫外光ポンプパルスを用い,臭素分子の解離性電子励起C状態における核ダイナミクスの実時間測定を行った。C状態に生成された振動核波束は約100フェムト秒の時間スケールで解離を起こし,波束ダイナミクスのシミュレーション結果とも良い一致を示した。現在,電子励起状態の分子軌道イメージングおよび単分子反応等における分子軌道イメージングの実時間計測を試みているところである。
気分障害患者における自律神経活動動態とリワークプログラム有効性の研究

近年、長期休職中の気分障害患者が急増しており、復職支援デイケア(リワークプログラム)の社会的な要請が高まる中、プログラムの効果や、復職成功予測因子についての科学的な探索は十分ではない。本研究は、リワークプログラム通所中の気分障害患者を対象に、非観血的に自律神経機能を測定し、リワークプログラムが自律神経活動及び精神症状に及ぼす効果を検討した。本研究では、H29年度まで、気分障害または適応障害の患者を対象として、リワークプログラムによる精神症状と自律神経機能の評価を行ってきたが、H30年度は、リワークプログラム参加者の中核群である気分障害患者104名に対象者を限定して、より詳細な解析を行った。リワークプログラム開始時と修了時に、MADRAS-J、SASSを用いて精神症状を評価し比較したところ、抑うつ症状、社会適応度ともに有意な改善を認めた(p<0.001)。また、リワークプログラム開始時と修了時に、安静時心電図を測定後、心拍変動パワースペクトル分析により自律神経活動を定量化したところ、副交感神経活動が,リワーク後に有意に改善した(p=0.014)。また、15名を対象に運動療法プログラムを施行し、STAIによる評価を行ったところ、状態不安項目が有意に改善した。本結果から、リワークプログラムに3カ月通所した患者では、精神症状および自律神経活動の改善に有効であることが示唆された。しかし、個々の自律神経活動は個体差が大きい結果であったため、今後はさらに症例を重ねて検討したい。現在までに、リワークプログラムを実施し、参加した患者群の精神医学的診断、精神医学的評価等のデータ収集、心拍変動パワースペクトル解析による自律神活動データを収集している。現在までに、100例を超える患者を対象に、データの収集を終えている。リワークプログラムに参加する患者群の精神医学的臨床データと測定された自律神経機能を解析し、患者群の特徴を解析している。H29年度は、これらの研究成果を国内学会で発表し、さらに国際誌へ投稿中である。今後は、症例収集を継続し、臨床データと、自律神経活動との相関やプログラム前後でのより詳細な解析を進めていく予定である。本研究では、リワークプログラムに参加する精神疾患患者を対象に自律神経活動を測定し、精神医学的臨床データ、身体状況や日常活動量などを含めて包括的に解析し、リワークプログラムの有効性を評価してきた。今後はさらに、社会適応性や使用中の向精神薬などの精神医学的臨床データを収集し、復職の可否や復職継続性に関わる因子を解明すべく、詳細な解析を行う予定である。さらに、バイオマーカーとして自律神経活動動態との相関を解析していく。また、本研究では自律神経活動測定に、周波数解析を用いた心拍変動パワースペクトル解析を行ったが、対象者間の個体差が大きく、復職予測因子を推測することが困難であった。そのため、時間領域解析で自律神経のトーン、周波数解析で成分を分析することとし、あわせて、静止時だけでなく、起立時の測定結果も組み合わせ、より詳細な自律神経活動動態の解析を行うこととした。可能な限り症例数を増やすとともに、複数の自律神経活動評価による生物学的な解析をすすめ、リワークプログラムの有効性の評価や復職継続性に関わる因子を科学的に解明していく予定である。これらの結果を順次国内外の国内・国際学会に発表する。さらに、研究成果を学術誌投稿論文で報告する予定である。本研究は、リワークプログラム通所中の気分障害患者を対象に、非観血的に自律神経機能を測定し、健常者との比較、リワークプログラムが自律神経活動及び精神症状に及ぼす効果を検討した。リワークプログラムに通所中の気分障害患者96名を対象に、リワークプログラム開始時と修了時、MADRAS-Jを用いて精神症状を評価し比較したところ、抑うつ症状の有意な改善を認めた。次に、リワークプログラム開始時と修了時に、安静時心電図を測定後、心拍変動パワースペクトル分析により自律神経活動を定量化した。リワークプログラム開始時の患者群の自律神経活動の平均値は、健常者と比較し、交感神経活動が有意に高かった(p=0.03)。さらに、総自律神経活動,交感神経活動ともにリワーク前と比較し,リワーク後に高い傾向が見られたが,有意差は認められなかった(総自律神経活動: p =0.094,交感神経活動: p=0.072).本結果から、リワークプログラムに参加した患者は、健常者と比較し、リワークプログラム開始時に、交感神経活動が有意に高いことが示唆された。また、リワークプログラムに3カ月通所した患者では、総自律神経活動、交感神経活動ともに改善する傾向がみられ、リワークプログラムが、精神症状だけでなく、自律神経活動の改善に有効であることが示唆された。リワークプログラムを実施し、参加した患者群の精神医学的診断、精神医学的評価等のデータ収集、心拍変動パワースペクトル解析による自律神活動データの収集を行った。現在までに、90例を超える患者を対象に、データの収集を終えている。これらの研究成果を、国内学会に発表する予定である。

今後は、症例収集を継続し、臨床データと、自律神経活動との相関やプログラム前後でのより詳細な解析を進めていく予定である。近年、長期休職中の気分障害患者が急増しており、復職支援デイケア(リワークプログラム)の社会的な要請が高まる中、プログラムの効果や、復職成功予測因子についての科学的な探索は十分ではない。本研究は、リワークプログラム通所中の気分障害患者を対象に、非観血的に自律神経機能を測定し、健常者との比較、リワークプログラムが自律神経活動及び精神症状に及ぼす効果を検討した。H29年度は、H28年度よりさらに対象者を増やし、リワークプログラムに通所中の気分障害または適応障害の患者122名(男性92名,女性30名)を対象とした。リワークプログラム開始時と修了時、MADRAS-Jを用いて精神症状を評価し比較したところ、抑うつ症状の有意な改善を認めた(p<0.01)。また、リワークプログラム開始時と修了時に、安静時心電図を測定後、心拍変動パワースペクトル分析により自律神経活動を定量化した。リワークプログラム開始時の患者群の自律神経活動の平均値は,健常者と比較し,交感神経活動が有意に高かった(p=0.03)。また、リワークプログラム前後の比較では、副交感神経活動が,リワーク後に高い傾向が見られたが,有意差は認められなかった(p=0.078)。本結果から、リワークプログラムに参加した患者は、健常者と比較し、リワークプログラム開始時に、交感神経活動が有意に高いことが示唆された。また、リワークプログラムに3カ月通所した患者では、副交感神経活動が改善する傾向がみられ、リワークプログラムが、精神症状だけでなく、自律神経活動の改善に有効であることが示唆された。しかし、個々の自律神経活動は個体差が大きい結果であったため、今後はさらに症例を重ねて検討したい。現在までに、リワークプログラムを実施し、参加した患者群の精神医学的診断、精神医学的評価等のデータ収集、心拍変動パワースペクトル解析による自律神活動データの収集中である。現在までに、100例を超える患者を対象に、データの収集を終えている。リワークプログラムに参加する患者群の精神医学的臨床データと測定された自律神経機能を解析し、患者群の特徴を解析している。これらの研究成果を、国内学会に発表する予定である。本研究は、リワークプログラム通所中の気分障害患者を対象に、非観血的に自律神経機能を測定し、リワークプログラムが自律神経活動及び精神症状に及ぼす効果を検討した。本研究では、H29年度まで、気分障害または適応障害の患者を対象として、リワークプログラムによる精神症状と自律神経機能の評価を行ってきたが、H30年度は、リワークプログラム参加者の中核群である気分障害患者104名に対象者を限定して、より詳細な解析を行った。
超高圧電子線トモグラフィによる亀裂先端の立体構造解析

亀裂先端近傍で発生した転位の三次元構造を超高圧電子顕微鏡による電子線トモグラフィにより明らかにするとともに,それら転位の弾性応力場が亀裂先端近傍の局部応力状態に与える影響を実測した.その結果,亀裂先端の一部はそれら転位によって開口されるような応力をうけおり,その部分が新たな転位源として働く事が明らかとなった.更に転位が亀裂近傍で二重交叉辷りを起こし,フランク.リード源が生成される事が明らかとなった.亀裂先端近傍で発生した転位の三次元構造を超高圧電子顕微鏡による電子線トモグラフィにより明らかにするとともに,それら転位の弾性応力場が亀裂先端近傍の局部応力状態に与える影響を実測した.その結果,亀裂先端の一部はそれら転位によって開口されるような応力をうけおり,その部分が新たな転位源として働く事が明らかとなった.更に転位が亀裂近傍で二重交叉辷りを起こし,フランク.リード源が生成される事が明らかとなった.本研究は加速電圧が200kVである電子顕微鏡を用いて実績のあるトモグラフィと厚い試料での観察が可能な超高圧電子顕微鏡(HVEM)による観察法を融合させた「超高圧電子線トモグラフィ」により,亀裂先端転位の立体構造を解析し,亀裂近傍での転位増殖過程を解明する事を目的としている.本年度は,超高圧電顕を用いたトモグラフ観察を行うためにモデル材料としてシリコン単結晶を用いたじ.従来,回折コントラストを使った結晶性材料中の転位トモグラフ観察は困難と言われていたが,回折ベクトルが試料回転中に常に一定になるように回折ベクトルを試料の回転軸と一致させることでそれを可能とした.電子顕微鏡内で試料を±60度程度2度ごとに回転させ,亀裂先端近傍に発生した発生初期転位の連続傾斜観察を行った.得られた連続傾斜像から観察された転位をバックプロジェクション法によりコンピュータ上で再構成させた.その像を元に転位が活動したたり面を特定するともに,転位の消滅実験,コントラスト実験からそれら転位のバーガースベクトルの符号まで詳細に決定した.その結果,それら亀裂先端から発生した転位は,発生時に乗っていた{111}面から亀裂側面で別の{111}面へ交叉たりを起こしていることが明らかとなった.亀裂を含まない均一材中の転位と異なり,亀裂先端では転位密度が低いにも拘わらず頻繁に交叉辷りを起こしていることが明らかとなった.これは,亀裂先端近傍は単純な一軸応力ではなく,複雑な多軸応力になっていることに起因すると考えられる.本研究の目的は,これまで申請者が加速電圧200kVの透過電顕を用いて培ってきた電子線トモグラフィによる亀裂転位の3次元構造観察手法と,厚い試料での観察が可能な超高圧電子顕微鏡(HVEM)による観察法の融合による「超高圧電子線トモグラフィ」により,亀裂先端転位の立体構造を解析し転位増殖過程を解明する事である.本研究では,亀裂先端の構造を解析するためのモデル材料としてシリコン単結晶を用いた.これにより,亀裂先端における複雑な転位群の構造を超高圧電子線トモグラフィにより明らかにし,転位増殖プロセスを明確化する事を目的とした.昨年度の研究により,超高圧電顕法を用いたトモグラフィ観察手法が確立された.本年度はさらに,圧膜試料の観察を遂行するため,走査透過電子顕微鏡法とトモグラフィ法の融合を試みた.また新たに超高圧電顕用に特別に開発された三軸傾斜ホルダー(二軸傾斜および一軸回転が可能)を用いたことで,これまで不可能だった試料ホルダーの回転角度を±70度程度まで傾斜する事が可能となった.得られた亀裂先端近傍;における転位をSIRT法により再構成させ転位の3次元構造を明らかにした.更にそれら転位の局部応力拡大計数を計算し,これまでモデル計算に過ぎなかった局部応力拡大係数の値を実際に観察された転位構造を用いて実測値を定量的に明らかにした.その結果,亀裂先端近傍の局部応力状態に与える影響を検討した.その結果,亀裂先端近傍で発生した転位ループの外側では,外力に加え,転位が亀裂を開口するようなモードになっており,その部分が新たな転位源として働く事が明らかとなった.
アヒルB型肝炎ウイルスを用いた遺伝子発現ベクターの開発

肝細胞特異的増殖性と持続感染性を有するB型肝炎ウイルスを用いた新しい遺伝子発現ベクターの開発の試みとして、動物実験モデルであるアヒルB型肝炎ウイルス(DHBV)の変異株を作製してアヒルにおける遺伝子の発現について検討を行った。まず野性株DHBVを用いた実験で、plasmid DNA-liposome複合体を孵化後1日目のアヒル雛の末梢血管より投与したところ、DHBV DNAの高い肝細胞特異的遺伝子発現効率が確かめられた。次いでpreC領域に変異を有するDHBVDNAをcloningし、野性株DHBV DNAと比較した。PreC領域に1塩基を挿入したDHBV DNAをアヒル雛に同様の方法で接種したところ、肝内でウイルス関連遺伝子の発現及びウイルスの増殖が認められ、血中に変異型ウイルスの分泌が確認された。ウイルスの分泌は16週間以上認められ持続感染が成立したと考えられたが、ウイスル量は野性株に比べ低い傾向が認められた。10mg DNA投与時の急性及び慢性毒性は軽微であった。病理学的検討では野性株感染アヒルの肝組織はごく軽度のリンパ球浸潤を認めるのみであったが、preC変異株感染アヒルの中に慢性肝炎に相当するリンパ球浸潤と軽度の線維化を示すものがあり、preCと病原性の関係が示唆された。HBVの病原性を解析する上でも、また、ベクターとしての応用を考える上でも今後の検討を要することが明らかとなった。一方、24塩基をpreC領域に挿入した変異株を用いた実験では、接種2週間後に血中で検出されたウイルスは野性株であり、発現しうる外来遺伝子の長さと挿入部位、挿入する遺伝子の種類ついて遺伝子の安定性を含めた解析を要することが示された。肝細胞特異的増殖性と持続感染症を有するB型肝炎ウイルスを用いた新しい遺伝子発現ベクターの開発の試みとして、動物実験モデルであるアヒルB型肝炎ウイルス(DHBV)の変異株を作製してアヒルにおける遺伝子の発現について検討を行った。まずwild型DHBVを用いた実験で、liposomeとの複合体としてアヒル雛の末梢血管より投与したDNAの高い肝特異的遺伝子発現効率が確かめられた。次いでpreC領域に変異を有するDHBVDNAをcloningし、wild型DHBV DNAと比較した。PreC領域に1 baseないし2 baseのmutationを導入したDHBV DNAを孵化後1日目のアヒル雛に同様の方法で接種したところ、肝内でウイルス関連遺伝子の発現及びウイルスの増殖が認められ、血中に変異型ウイルスの分泌が確認された。ウイルスの分泌は4週間以上認められ持続感染が成立したと考えられたが、ウイルス量はwild型に比べ低い傾向が認められた。10μg DNA投与時の急性及び慢性毒性は軽微であった。PreC変異株のDHBV関連遺伝子の発現の効率と持続性について、病理学的検討も含めさらに長期的な経過を解析中である。一方、変異の領域と長さにより導入した遺伝子の安定性が低下することが示唆され、preCおよびC領域へのcloning siteの導入の可否及びこのベクターを用いて発現しうる外来遺伝子の長さと種類について検討を進めている。

ウイルスの分泌は16週間以上認められ持続感染が成立したと考えられたが、ウイルス量は野性株に比べ低い傾向が認められた。10μg DNA投与時の急性及び慢性毒性は軽微であった。病理学的検討では野性株感染アヒルの肝組織はごく軽度のリンパ球浸潤を認めるのみであったが、preC変異株感染アヒルの中に慢性肝炎に相当するリンパ球浸潤と軽度の繊維化を示すものがあり、preCと病原性の関係が示唆された。HBVの病原性を解析する上でも、また、ベクターとしての応用を考える上でも今後の検討を要することが明らかとなった。一方、24塩基をpreC領域に挿入した変異株を用いた実験では、接種2週間後に血中で検出されたウイルスは野性株であり、発現しうる外来遺伝子の長さと挿入部位、挿入する遺伝子の種類について遺伝子の安定性を含めた解析を要することが示された。
高分子量プロテアーゼを介した細胞外シグナリングの構造生物学的研究

本研究では細胞外プロテオリシスを介した生体シグナリング機構の理解を目的として、蛇毒由来の二つのプロトロンビン活性化プロテアーゼpseutarin-Cおよびmultactivaseに焦点を当て、結晶構造を解明する。これら蛇毒タンパク質は複数のサブユニットおよびドメインからなるモジュラープロテアーゼであり、これらのタンパク質に対応するヒトホモログ分子群は発生・分化、様々な疾患の原因や血栓形成に関わるシグナリング分子である。しかしながら、これらヒトタンパク質は大量発現の困難さや過渡的にしか形成されない複合体のため構造研究が進んでいない。本研究では比較的安定な蛇毒タンパク質の立体構造解析を行うが、それらを通じてヒトホモログ分子群についての構造基盤を明らかにすることを目的とする。血液凝固Va/Xa因子複合体ホモログの巨大なセリンプロテアーゼであるPseutarin-Cについては前年度までに精製方法を確立していたが、さらに糖鎖除去等を行い試料の均一性を高めることで微結晶ながら複数の条件で結晶を得ることに成功した。その内の一つの条件の結晶について50μ角程度の大きさながらSPring-8ビームラインBL44XUにおいて7.6Å分解能までの回折点を確認することに成功した。しかし、この結晶については再現性が低いこと、分解能の向上が困難な上、非対称単位に複数分子が存在するため、構造解析を進めることが困難であることが判明した。そこで糖鎖除去に加えてリジン残基の還元メチル化を試みたところ、これまでと異なる条件下で結晶が得られることが分かり、これら新たに得られた結晶のキャラクタリゼーションを現在進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では細胞外プロテオリシスを介した生体シグナリング機構の理解を目的として、主に蛇毒由来の2つの異なるプロトロンビン活性化プロテアーゼ(multactivaseおよびpseutarin-C)に焦点を当て、これらの結晶構造を解明する。本研究では比較的安定な蛇毒タンパク質の立体構造解析を行うが、それらを通じてヒトホモログ分子群についての構造基盤を明らかにすることを最終的な目的とする。今年度はmultactivaseについて3.3A分解能のNative結晶データを得て、現在構造解析を進行中である。Pseutarin-Cについては試料の自己分解が主な原因と考えられ、当初全く結晶を得ることが出来ていなかったが、阻害剤の種類と複合体試料の調製法の検討を行い、最近になり比較的安定な試料を得る方法を確立した。この試料を用いてさらに糖鎖除去等を行い、結晶化スクリーニングを行ったところ、30ミクロン程度の大きさの結晶を得ることが出来た。この結晶について実験室X線回折計を用いて長時間露光(3-6時間/フレーム)で測定したところ、20-30A分解能付近にタンパク質結晶由来と考えられる回折点を確認することが出来た。Pseutarin-Cについては安定な試料を得る方法を確立し、初期的なスクリーニングで微結晶を得ることに成功している。multactivaseについては当初計画ではH23年度中に単体での構造決定を目標としたが、構造決定には至っていない。しかし、構造決定への足がかりを作ることが出来ているので、全体としてみればおおむね順調に進展しているといえる。Pseutarin-Cについては精製のスケールを上げ、広範な結晶化条件の検討を進めることにより、十分な回折能のある結晶の調製を目指す。