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社会的な規範/価値観の共有による社会形成に関与する脳神経基盤のfMRIによる解明

社会集団の共有価値観としての「社会規範槻範)」は、その集団に属する個々人の行動原理として内在化され、集団・社会の形成や維持に大きな役割を果たしている。規範が集団内で共有され、個人の意思決定・行動を規定していく過程の神経基盤を順次明らかにする為に、平成25年度は前年までに明らかにした「規範の重要度(=価値)の大きさの処理」に関わる脳活動領域の知見および「説得による規範の変化過程」に関わる脳活動領域の知見を統合し、規範を通じた社会形成の神経基盤に関する包括的な学術研究としてまとめることを目指した。ある社会の中で規範は常に固定されたものではない。特定の規範に対する個人の態度は、対人間、あるいはメディアを通じた説得的コミュニケーションを通じて肯定的にも否定的にも変化し、結果として環境保護運動の高まりや人種差別的ルールの撤廃といった大きな規範変化をもたらしてきた。本研究ではMRIスキャナ内で説得的メッセ一ジを提示して被験者の規範に対する態度を変化させ、その過程に特異的な脳領域を、機能的MRIを用いた脳機能イメージングの手法にて同定した。また、この過程に規範に対する態度自体を表象する領域がどう関わっているのかも明らかにすることを目指した。結果として、説得による規範に対する態度変化の過程は、説得一般に関わる左背外側前頭前野、前頭前野内側部などの領域に加えて、これまで社会認知や道徳判断への関与が示唆されてきた両側の側頭極、側頭頭頂連合部等の領域が必要とされる特殊な過程であることが明らかになった。さらに、説得により規範に対する態度が否定的に変化する場合には、上記の領域に加えて左側の中側頭回、縁上回領域が特異的に関与することが明らかになった。またこの2つの領域の内、左縁上回は説得による規範変化の過程の中で、説得されたことによって変化する規範に対する態度そのものを表象していることを明らかにした。平成25年度は申請計画どおりに、研究テーマである「社会的な規範/価値観の共有による社会形成に関与する脳神経基盤」において、採用年度1年目・2年目に明らかにしてきた「規範の重要度(=価値)の大小の処理に関わる脳活動領域」「説得による社会規範の変化過程に関わる脳活動領域」の知見を統合し、平成25年6月には第36回日本神経科学大会にて口頭演題として選出され発表した。また、同成果を学術論文としてまとめ、現在PNAS誌に投稿予定である(英文校正中)。申請研究は極めて順調に遂行されたと判断される。上記のように、本研究の成果を学術論文として国際学会誌に発表する予定である。社会的な集団の中で共有される価値観としての「社会規範」は、個人の行動原理として内在化され、集団・社会の形成や維持に大きな役割を果たす。この、「社会規範」が集団内で共有され、個人の意思決定・行動を規定していく過程の神経基盤を順次明らかにしていく為、平成23年度は「社会規範による個人の意思決定の神経基盤」の核となる、「規範の重要度(=価値)の大きさの処理」に関わる脳領域の同定を目指した。本研究では、様々な場面での「規範的」行動の主観的な価値・重要度を被験者に判断させ、その大小に対応して活動を変化させる脳領域を、機能的MRIを用いた脳機能イメージング手法で同定した。27人の右利き健常被験者が実験に参加した。被験者にはMRI装置内で、次々に提示される「規範的行動」の順守を示す記述(例:映画館では静かにするetc.)に対して、自分がどの程度賛同するかを8段階のボタン押しで回答してもらい、その際の脳活動を計測した。統制課題として、規範的要素のない一般的な「信念」(例:血液型で性格が決まるetc.)に対する賛同の度合いを問う条件も同様に行った。結果として、「規範的行動」「信念」のような抽象的な価値の重要度の大小処理に共通して関連する脳領域として、両側の尾状核・淡蒼球の大脳基底核、視床、中脳、前頭前野内側部、中・下前頭回、縁上回、小脳、および右の中・下側頭回領域を同定した。また、「規範的行動」特異的に価値の重要度を処理する領域として左楔前部/後部帯状回、両側縁上/右中心後回を同定した。社会的な集団の中で共有される価値観としての「社会規範」は、その集団に属する個々人の行動原理として内在化され、集団・社会の形成や維持に大きな役割を果たす。この、「社会規範」が集団内で共有され、個人の意思決定・行動を規定していく過程の神経基盤を順次明らかにする為に、平成24年度は「説得による社会規範の変化過程」に関わる脳活動領域の同定を目指した。ある社会の中で「社会規範」は流動的である。ある「社会規範」に対する個人の態度は、対人間、あるいはメディアを通じた説得的コミュニケーションを通じて肯定的にも否定的にも変化し、結果として環境保護運動の高まりや人種差別的ルールの撤廃といった大きな社会規範の変化をもたらす。本研究ではMRIスキャナ内で説得的メッセージを提示して被験者の社会規範に対する態度を変化させ、その過程に特異的な脳領域を、機能的MRIを用いた脳機能イメージングの手法にて同定した。また、この過程に社会規範に対する態度自体を表象する領域がどう関わるのかも明らかにすることを目指した。実験では27人の被験者に説得的メッセージを提示して被験者の社会規範に対する態度を肯定的あるいは否定的に変化させ、その際の脳活動を計測した。

また、説得の対象になったものを含む様々な社会規範に対する被験者の態度を説得の前後で測定し、説得による態度変化の度合いを測定するとともに、その際の脳活動を計測して態度自体の表象に関わる脳領域を同定した。結果、説得による社会規範に対する態度変化の過程に特異的な脳領域として、両側の前頭前野内側部、背外側前頭前野、下前頭回、側頭極、側頭頭頂連合部、楔前部を同定した。また、説得により社会規範に対する態度が否定的に変化する過程に特異的な領域として、左側の中側頭回を同定した。また、左側の側頭頭頂連合部が、態度表象の脳領域のうち、社会的規範の説得特異的に関わる領域として同定した。社会集団の共有価値観としての「社会規範槻範)」は、その集団に属する個々人の行動原理として内在化され、集団・社会の形成や維持に大きな役割を果たしている。規範が集団内で共有され、個人の意思決定・行動を規定していく過程の神経基盤を順次明らかにする為に、平成25年度は前年までに明らかにした「規範の重要度(=価値)の大きさの処理」に関わる脳活動領域の知見および「説得による規範の変化過程」に関わる脳活動領域の知見を統合し、規範を通じた社会形成の神経基盤に関する包括的な学術研究としてまとめることを目指した。ある社会の中で規範は常に固定されたものではない。特定の規範に対する個人の態度は、対人間、あるいはメディアを通じた説得的コミュニケーションを通じて肯定的にも否定的にも変化し、結果として環境保護運動の高まりや人種差別的ルールの撤廃といった大きな規範変化をもたらしてきた。本研究ではMRIスキャナ内で説得的メッセ一ジを提示して被験者の規範に対する態度を変化させ、その過程に特異的な脳領域を、機能的MRIを用いた脳機能イメージングの手法にて同定した。また、この過程に規範に対する態度自体を表象する領域がどう関わっているのかも明らかにすることを目指した。結果として、説得による規範に対する態度変化の過程は、説得一般に関わる左背外側前頭前野、前頭前野内側部などの領域に加えて、これまで社会認知や道徳判断への関与が示唆されてきた両側の側頭極、側頭頭頂連合部等の領域が必要とされる特殊な過程であることが明らかになった。さらに、説得により規範に対する態度が否定的に変化する場合には、上記の領域に加えて左側の中側頭回、縁上回領域が特異的に関与することが明らかになった。またこの2つの領域の内、左縁上回は説得による規範変化の過程の中で、説得されたことによって変化する規範に対する態度そのものを表象していることを明らかにした。平成23年度は、申請計画どおりに機能的MRI実験の計画・実験・データ解析を行い、研究テーマである「社会的な規範/価値観の共有による社会形成に関与する脳神経基盤」のうち、「社会規範による個人の意思決定の神経基盤」の核となる規範の重要度(=価値)の大小の処理に関わる脳活動領域を明らかにした。この発見は当該分野の発展において大きな進歩となる知見であり、10月に同成果を国際学会で発表する予定である。また国際学術誌への投稿・発表も準備中である。既に、申請計画で2年目に予定されていた実験計画の一部にも着手しており、申請研究は順調に遂行されていると判断する。平成24年度は、申請計画どおりに研究を進め、研究テーマである「社会的な規範1価値観の共有による社会形成に関与する脳神経基盤」のうち、「価値観の共有が集団内コミュニケーションを介して個人の意思決定に影響する過程の神経基盤」の核となる、「説得による社会規範の変化過程」に関わる脳活動領域を明らかにした。
フランス１６世紀前半の架空譚における建築描写の研究

近年、ルネサンス期の建築描写に国際的な関心が寄せられている。当時の先進国イタリアの影響を積極的に受け入れたフランス16世紀前半の架空譚を中心に、フィクションとしての建築描写が果たした政治・思想的役割を、文学研究の側から探っていく。この作業を通して、俗語フランス文学における建築描写の萌芽から16世紀後半の流行へと至るメカニズムを、文学史の流れの中で捉えることを試みたい。
細胞内リン脂質の代謝調節と輸送に関する研究

1)リン脂質の代謝調節機構に関する研究哺乳動物細胞においてホスファチジルセリン(PS)は、2種類のPS合成酵素(1と2)により生合成され、これら酵素の活性はPSによるフィードバック制御により調節されている。この制御は、酵素の発現調節ではなく、PSの共存によって合成酵素の活性そのものが阻害される様式であり、PS合成酵素が直接あるいは間接的に細胞内のPS量を感知し、その必要に応じてPSを合成するものと考えられている。しかし現在、PS合成酵素の触媒機構と活性制御機構の詳細は不明であり、その解明を本研究の目的とし、以下に述べる研究成果を得た。(1)PS合成酵素2をほぼ単一に精製することに成功した。精製酵素の性状解析により、同酵素の活性はPSが触媒部位とは異なる、制御部位に結合することにより抑制されることが示唆された。(2)66種のアラニン置換変異型PS合成酵素1を系統的に作成し、その性状解析から、酵素活性に重要なアミノ酸残基8個と活性制御に重要なアミノ酸残基6個を同定することができた。(3)さらに、PS合成酵素1は、小胞体膜を10回貫通する膜内在性酵素であり、アラニン置換変異で同定した活性に重要なアミノ酸残基8個はすべて小胞体膜脂質二重層の中央から内腔側に配置され、活性制御に重要なアミノ酸残基6個はすべて小胞体膜の細胞質側に配置されることが示唆された。2)リン脂質の細胞内輸送に関する研究(1)PSの小胞体からミトコンドリアへの輸送に関与する哺乳動物細胞の新規タンパク質MSBP1を同定することに成功した。(2)酵母からPSの細胞内輸送に損傷を有する変異株の候補を約40種分離することに成功した。生体膜の基本骨格であるリン脂質二重層は様々なリン脂質分子から構成されており、形質膜や細胞内の各オルガネラ膜がそれぞれ固有の機能を発現するためには、それら生体膜のリン脂質の量と組成が正常に維持されている必要があるものと推定される。しかしながら現在、生体膜リン脂質の量と組成の制御の基盤となる機構は不明であり、また各リン脂質分子の生合成調節機構もほとんど理解されていない。我々は以前、動物細胞の主要リン脂質の一つであるホスファチジルセリン(PS)の生合成が、PSによるフィードバックコントロールを受けることを見いだした。さらに、このコントロールは、PS合成酵素遺伝子の転写や翻訳レベルでのコントロールではなく、PSによるPS合成酵素活性のコントロールによることも明らかにした。このPSによるPS合成酵素活性の制御機構には現在不明な点が多く存在し、PSがPS合成酵素と直接相互作用するのか、あるいは制御を仲介する何らかの因子が存在するのかも不明である。そこで我々は、PSによるPS合成酵素活性の制御機構を精製酵素を用いて解析することを目的に、同酵素の精製を試みた。酵素の精製は、FLAGとHAペプチドを連結した組み換え型のPS合成酵素2をCHO細胞において発現させ、それらペプチドに対する抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより行った。その結果、同酵素をSDS-PAGE上でほぼ単一バンドになるまで活性を保ったまま精製することに成功した。さらに、精製酵素の活性が外因性のPSにより阻害されることを明らかにした。従って、PS合成酵素とPSの直接の相互作用が、細胞内のPS量を正常に維持するために重要であることが示唆された。哺乳動物細胞において、ホスファチジルセリン(PS)は、既存のリン脂質ホスファチジルコリン(PC)或いはホスファチジルエタノールアミン(PE)と遊離セリンの塩基交換反応により生合成され、PS合成酵素I(PSS I)及びII(PSS II)がこれら反応をそれぞれ触媒する。この塩基交換反応はPSによって翻訳後のフィードバックコントロールを受けることがわかっているが、その仕組みは明らかでない。

両酵素のcDNAがクローニングされ、互いに約30%のホモロジーを有し、ともに疎水性が高く、恐らく膜を複数回貫通する膜内在性蛋白であることが判明したが、他の既知のタンパク質との類似性が見い出されず、アミノ酸配列比較によるモチーフ或いはドメイン構造などの情報は得られない。そこで、PSS Iの活性、或いはPS合成調節に関わるアミノ酸残基を探索する目的で、二つの酵素に共通する66の極性アミノ酸残基を逐次アラニンに置換したPSS IをCHO-K1細胞に過剰発現させ、インタクト細胞におけるPS合成調節の変化と細胞抽出液中の塩基交換活性の変化を調べた。その結果、R95,H97,C189,R262,Q266,R336をそれぞれアラニンで置換すると、PS合成調節に異常を生じ、Y111,D166,R184,R323,E364,K370を置換すると蛋白の発現に著しい低下がみられ、H172,E197,E200,N209,E212,D216,D221,N226の置換では発現した蛋白のセリン塩基交換活性は著しく失われていた。また、N209,K308のアラニンへの置換は、セリン塩基交換反応を低下させるが、コリン及びエタノールアミン塩基交換反応にはあまり影響しないことが明らかとなった。これらの結果を基に、PS合成酵素の活性部位及び調節部位の解明、またPS合成調節機構についてさらに解析を進めていきたい。ホスファチジルセリン(PS)生合成のフィードバック制御機構に関する研究膜内在性(マルチスパン型)であり、その精製が非常に困難であった動物細胞のPS合成酵素-2を世界に先駆けて精製することに成功した。精製酵素を用いた酵素速度論的解析から、PSがPS合成酵素2の触媒部位とは異なる部位(制御部位)に直接結合し、同酵素の活性を阻害することを明らかにした。従って、この制御部位が、細胞内のPS量を検知するセンサーとしての機能を有し、PSの恒常性維持に重要な役割を担うことが示唆された。さらにPS合成酵素の構造に関して、PS合成酵素1と2の両者が小胞体膜を10回貫通し、そのN末端とC末端がいずれも小胞体の細胞質側に露出していることを示唆する結果を得た。リン脂質の細胞内輸送機構に関する研究リン脂質の細胞内輸送機構を解明する目的で、リン脂質の種々のオルガネラ間輸送に特異的な欠損を有する変異株の分離を試みた。その結果、遺伝学的解析が容易な酵母から目的の変異株を分離する方法を確立することに成功し、その方法を用いることによりPSの小胞体からミトコンドリアへの輸送に損傷を有する酵母変異株の候補を約40株、PSの小胞体からゴルジ体への輸送に損傷を有する酵母変異株の候補を約10株、ホスファチジルエタノールアミン(PE)のミトコンドリアから小胞体への輸送に損傷を有する酵母変異株の候補を4株、PEのゴルジ体から小胞体への輸送に損傷を有する酵母変異株の候補を1株、分離することに成功した。1.ホスファチジルセリン(PS)の生合成と代謝調節に関する研究PS合成酵素1の部分精製を行い、その性状解析から、次の2つの知見を得ることができた。(1)哺乳動物細胞におけるPS合成は、既存のリン脂質(PCあるいはPE)のコリンあるいはエタノールアミン部分と遊離のセリンの交換により行われる。
ゲノムのワードプロセシング技術の新展開－酵母染色体任意領域重複技術の開発

産業酵母の有用形質には染色体の部分異数性が重要であることが明らかになってきた。こうした部分異数性と有用表現型との関係を明らかにするため,任意領域の重複を自在に作り出すゲノム工学技術(PCDup法と命名)を開発した。PCDup法により、16本の染色体の全てについて,200kb毎の重複(62領域)を作成することを試みた。その結果,53領域について重複株を得る事ができた。さらに53株について表現型を調べた。その結果、高温や酸に対して耐性が見られる株もあった。重複領域内の遺伝子の単独過剰発現ではそうした表現型は報告されていないので、それらの表現型は重複領域内複数遺伝子の同時重複によると考えられた。産業酵母では、異数性、特に部分重複が有用形質に関係することが明らかになってきた。こうした事実から、染色体の任意領域が重複した異数体を自在に作り出す技術は、これまでに、産業酵母の育種や、ゲノムの網羅的機能解析に有用と考えられる。しかし、いずれの生物種においても開発されていない。そこで、本研究では、出芽酵母における新規のゲノム工学技術として、任意の染色体領域を簡便に重複させる技術(PCDup法と命名)の開発と応用を目指す。PcDup法では、まず、i)重複させる領域の両端400bp程度を相同組換え標的部位として、それぞれPCRで増幅する。次に、ii)オーバーラップPCRにより、2つの標的断片のそれぞれと、別途増幅した選択マーカー、CEN4、テロメアシード配列を持つ断片を融合する。iii)調製した2種類のPCR断片を用いて酵母の形質転換を行う。本年度は、様々な染色体上の50kb150kbの重複に成功した。さらに長い領域が重複できるか否かについて試みた結果、300kbまでの長さについては重複体を得ることができた。次に、本技術を有用菌株の育種やゲノムの機能解析へ応用するため、染色体全領域にわたり200kbずつ重複染色体を保持する重複株タイリングシリーズの作製を試みた。これまでに、XV番、VII番、XII番、XI番、V番染色体について目的とする重複株を得ることができた。続いて、得られた重複株について育種に重要な表現型の解析を行った。その結果、高温、酸への耐性変化が見られる重複株もあった。それらの領域内にある遺伝子の単独過剰発現では、そうした表現型は報告されていない。従って、こうした表現型の変化は重複領域内の複数の遺伝子が同時に増幅されたことに起因すると予想された。これらの結果より、PCDup法は、育種への応用だけでなく、ゲノム機能の解析技術としても有用であることが明らかとなった。産業酵母の有用形質には,染色体部分領域の重複が重要であることが明らかになってきた。こうした部分異数性と(有用)表現型との関係を明らかにするためには,染色体任意領域の重複を自在に作り出すゲノム工学技術(PCDup法と命名)が必要である。いずれの生物種においても開発されていなかったこうした技術を昨年度までに開発し,PCDup法によって、期待通り,部分重複が可能であることを実証した。そこで,本年度は,16本の染色体の全てについて,200kb毎の重複(合計64領域)を作成することを目指した。その結果,重複を試みた42領域のうち39領域について重複株を得る事ができた。興味深いことに,42領域のうち3領域については重複株が得られなかった。これらの領域については,その領域全体の重複が致死性を引き起こす可能性を考え、200kbの領域を50kbずつわけた時に重複が可能かどうか実験を行っている。続いて、得られた重複株について表現型の解析を行った。その結果、高温、酸への耐性変化が見られる株もあった。それらの領域内にある遺伝子の単独過剰発現では、そうした表現型は報告されていないので,こうした表現型は重複領域内の複数遺伝子の同時重複に起因すると考えている。次に、複数部位のワンステップ同時分断技術の開発を目指した。昨年度までにいくつかの方法を検討したが,同時分断を引き起こすことはできなかった。そこで,近年開発されたRNAガイドにより二重鎖切断を可能とするCRISPR/Casゲノム編集技術を取り入れることにした。CRISPR/Casにより二重鎖切断を誘導した条件で染色体分断を行ったところ、100倍以上形質転換効率が向上し,ゲノム上の独立した2か所での同時分断を引き起こすことに成功した。こうした部分異数性と(有用)表現型との関係を明らかにするためには,染色体任意領域の重複を自在に作り出すゲノム工学技術が必要である。

申請者らは、昨年度までに、この技術(PCDup法と命名)を開発し、16本の染色体の全てについて,200kb毎の重複(合計62領域)を作成する研究を進めてきた。その結果,62領域のうち53領域について重複株を得る事ができた。重複株が得られなかった9領域について、200kb領域を任意に50kb領域に分け重複を試みた結果、7領域については、50kb領域のひとつが重複できず、残りの2領域については、4つの50kbの全てが重複可能であった。これらの結果より、7領域のそれぞれにおいて重複できない50kbの領域については、その領域内に、同時にコピー数が2コピーに増加すると合成致死を引き起こす遺伝子ペアがある可能性が示唆された。また残りの2領域については、4つの50kbの領域のいずれかの組合わせにおいて、同時にコピー数が2コピーに増加すると合成致死を引き起こす遺伝子ペアがある可能性が示唆された。さらに、全53株について表現型の解析を行った。その結果、多くの重複株はストレス感受性を示すものの、高温や酸に対して耐性が見られる株もあった。重複領域内の遺伝子の単独過剰発現では、そうした表現型は報告されていないので、こうした表現型は重複領域内複数遺伝子の同時重複に起因すると考えている。次に、ゲノムの改変をスピードアップするため、複数部位のワンステップ同時分断を目指す研究を開始し、近年開発されたCRISPR/Casゲノム編集技術を、申請者らが開発したPCS法に融合することにより、異なる染色体上、および同一染色体上の2カ所について同時分断が可能であることを明らかした。26年度が最終年度であるため、記入しない。酵母遺伝学,ゲノム機能工学26年度が最終年度であるため、記入しない。開発を目指した新しいゲノム工学技術(PCDup法)が期待通りに有効に機能したため。PCDup法が確立したので,ゲノム全体にわたる200kbの領域の重複は時間の問題であったが,それが予想通り進展したこと。および,染色体の複数部位同時分断にCRISPR/Casゲノム編集技術を取り入れ,成功したことが順調に進展したと判断できる理由である。当初の計画に従い、全ゲノムに渡る染色体部分領域重複株の構築を完成する。これが完成すれば、全ての重複株の表現型をできるだけ多く調べる。表現型の変化が見られたものについては、また、これと平行して、「染色体複数部位のワンステップ同時分断技術の開発」を目指す。このため、PCDup法に、CRSPR-Cas9システムを導入し、その有効性を検討する。当初の計画に従い、64領域全てについて,全ゲノムに渡る染色体部分領域重複株の構築を完成する。200kbの大きさで重複ができない領域については、100kb,あるいは50kbずつにわけて重複を作成する。これは,当初の研究推進方策と変わりが無い。CRSPR-Cas9システムを導入したことにより,異なる染色体上の複数部位の同時分断に成功したが、同一染色体上の複数部位でも可能かどうかを検討し、PCDup技術の拡張を図る。
ゲノムＤＮＡメチル化はスギの表現型多様性にどのように寄与するか？

致死的でない高温ストレスを前もって与えることで個体が高温により強くなる、「耐暑性」の獲得が針葉樹を含む樹木でも報告されている。本研究では、耐暑性誘導処理や由来する地域がエピジェネティックな制御を介して高温ストレス反応に関わる遺伝子発現に影響を及ぼすかを、スギで明らかにすることを目指した。気象データの主成分分析で4クラスタに分けられる7集団から、発芽率のよい22母樹を選んで15ブロックにランダムに種子を播種した。暗期8時間(16°C)、明期16時間(25°C)で発芽を行い、ほぼ全ての実生で本葉が展開した時点で半分の実生について暗条件下で38°C・3時間の耐暑性誘導処理を2日間行った。耐暑性誘導処理終了から24時間後に実生のサンプリンクを行い、さらに24時間経過後全ての個体に45°C・2時間の高温ストレスを与えた。高温ストレス後に針葉の葉色が変化した実生の割合は耐暑性誘導処理なしのサンプルで大きかったが、有意な差ではなかった。高温ストレス終了後25°Cに戻し、1時間後及び24時間後にサンプリングを行った。計3回のサンプリングでは、耐暑性誘導処理あり・なし及び4つの気象条件の異なるクラスタを考慮した8グループから各2個体、計16個体からRNAを抽出した。このうち、各時点において8個体、計24個体について次世代シーケンサーでRNA-Seq解析を行った。総計423,735,176リード、約41Gbpのデータが得られた。24個体をプールしたデータと既存のスギ遺伝子情報により参照配列を構築した。まず他植物で高温ストレス応答制御の鍵となる転写因子ファミリーのスギホモログついて発現レベルを比較したところ、気象によるクラスタや耐暑性誘導処理による明瞭な差はなかった。しかし高温ストレス処理後に最も高い発現を示したことから、スギでも他の植物と同様の高温ストレス応答経路が機能していると考えられた。本研究は、スギの環境適応に関連する表現型の多様性に対し、ゲノムDNAのメチル化等によるエピジェネティック(後天的)な遺伝子発現制御がどの程度寄与するかを解明する目的で行っている。自然条件下で年変動が大きくかつ実験的制御の行いやすいこと、温暖化の影響に対する知見が期待できることから、スギの実生を用いて気温(特に高温ストレス)による遺伝子制御の変化を対象として解析を進めている。高温ストレス応答が由来する地域によって異なるかを考慮するため、北海道から九州までの13集団から110母樹を選んだ。発芽条件を検討するため、各母樹から12種子を水分条件がより均一に近いとされるロックウール培地にランダムに播種した。人工気象器を用いて暗期8時間と明期16時間のサイクルで発芽及び高温ストレスの試験を行った。発芽は1暗期16°C-明期25°C(標準条件)、2暗期21°C-明期30°C(高温条件)の2種類で行った。全体の発芽率は両条件とも30日後に約20%であり、母樹により大きく異なった(0-83%)。発芽率の温度条件による違いは全体、集団毎とも有意ではなかった。母樹の由来する集団は気象データの主成分分析の結果に基づきさらに6つのクラスタに分けられるが、発芽に要する日数はクラスタ間で、標準条件及び高温条件ともに有意に差があった(p<0.05)。発芽に要する日数は標準条件と高温条件間で母樹によって変動が認められたが、気象条件によるクラスタの影響は有意ではなかった。また、25°Cで発芽させた母樹について、実生の子葉がほとんど展開した時点で暗期28°C-明期38°Cの高温ストレス条件下へ移し、遺伝子発現の変化を解析するための経時的なサンプルを得た。シロイヌナズナで高温ストレス応答の鍵となる遺伝子について、スギのホモログ遺伝子(cjHsfA1)の塩基配列を得た。

まず他植物で高温ストレス応答制御の鍵となる転写因子ファミリーのスギホモログついて発現レベルを比較したところ、気象によるクラスタや耐暑性誘導処理による明瞭な差はなかった。しかし高温ストレス処理後に最も高い発現を示したことから、スギでも他の植物と同様の高温ストレス応答経路が機能していると考えられた。気象条件の異なる地域に由来するスギの種子を用い、一定の発芽条件下では発芽特性が由来する地域によって異なることを明らかにできた。また、高温ストレスによる遺伝子誘導を調べるためのサンプリングを行うことができた。植物育成機器の故障により次世代シーケンサーによる発現遺伝子プロファイルの解析は次年度に持ち越しとなったが、概ね順調に進展している。まず、高温ストレス下におけるcjHsfA1の発現の経時的な変化をおさえる。また、38°Cの高温処理では20日後も生残している実生個体がほとんどだったため、45°Cでの高温ストレスによる実生個体及びcjHsfA1遺伝子発現の変化について調べる。これらの結果に基づいて、高温ストレスにさらされた異なる地域及び発芽条件の個体からRNAを経時的にサンプリングし、次世代シーケンサーで解析を行う。高温ストレスへの発現応答に対する種子の産地・発芽温度の影響が有意であった遺伝子の情報を得て、メチル化の関与について解析する。また、必要に応じてゲノム全体のメチル化についても解析を行い、ゲノム全体の塩基多型及びメチル化多型と遺伝子発現パターンの統計解析を行う。植物を育成する機器の故障により実験計画に遅れが生じ、当該年度の予算のほとんどを使用する予定であった次世代シーケンサーによる受託解析を次年度に行うことにしたため。次世代シーケンサーによる受託解析を本年度において行う予定である。解析結果に基づき次世代シーケンサーの解析を行うサンプル数を増やす必要が生じた場合や受託解析の価格の変動等、やむを得ない場合においては翌年度分として請求した助成金の一部を合わせて使用する。それ以外の助成金については、当初の計画書の予定にしたがって、遺伝子発現実験やゲノムDNA解析に使用する。
ニュートリノの質量行列とCPの破れの研究

次の課題の研究を行った。(1)ニュートリノ系でのCPの破れの研究低エネルギーでニュートリノ振動実験から決めることの出来るディラックCP位相と、高エネルギーでの例えばレプジェネシスで現れるCPを破る位相(マヨラナ位相)との間の関係を調べた。特に高エネルギーでのニュートリノ混合がbi-maximal混合である場合ついて、繰り込み群を用いて、これらの位相の関係を調べ、模型がすべての実験を再現できることを示した。また他の実験で得られる量である、二重ベータ崩壊での有効質量V_<13>の大きさ等を調べた。レプトン数を破る過程である、μ→e+γなどの分岐比を計算した。(2)クォーク系やレプトン系でのCPを破る位相を一元的に記述する模型の可能性を検討している。(3)レプトン数を破る過程の研究一般的な相互作用を仮定し、次のプロセスが起こる頻度を計算した。μ^-+原子核→μ^++原子核μ^-+原子核→e^++原子核本研究では、主に次の点について研究をおこなった。1.ニュートリノ混合におけるCPの破れ2.ニュートリノ混合におけるTの破れの研究3.ニュートリノ振動実験や二重ベータ崩壊実験の解釈4.宇宙におけるニュートリノの役割高杉は、ニュートリノ混合におけるCPの破れの位相の予言を可能にするニュートリノの質量行列をZ_3対称性に基づいて導出した。この模型では、ミューとタウニュートリノの間の大きな混合と90度のCPの破れの位相を予言することを示した。さらに、この模型の量子補正による安定性を議論した。さらに、このような考えをクオークに拡張し、クオーク混合とニュートリノ混合でのCPの破れの位相を同時に予言する質量項を考察している。最近、ニュートリノ工場実験でのTの破れについて、ニュートリノの通過する物質(マントル)の影響について考察した。特に、物質の密度の変動がどのようにTの破れについて影響を与えるかを研究した。田中は、ダークマターが超粒子である可能性を考察し、どのように観測するかを議論した。末松は、左巻きだけでなく軽い右巻きのニュートリノが存在する場合のニュートリノ振動を考察し、また、ステライル・ニュートリノをもつ統一模型を研究している。福山は、ニュートリノ振動実験のデータを二重ベータ崩壊などのレプトン数を破る過程と関連づけることにより、ニュートリノの混合行列と質量にに強い制限が与えられることを示した。この結果を基に、SO(10)の模型でクオークとレプトンの質量行列を考察た。また、ニュートリノと宇宙との関わり、特にガンマー線バーストにおけるニュートリノの役割や、ニュートリノへの強い重力のおよぼす効果について考察した。私どもの研究は以下の通りである。1.ニュートリノの質量行列の研究を行った。特に、(a)CPの破れの位相δを予言する模型の構築した。(b)ニュートリノの質量行列を統一理論から提案した。(c)ニュートリノとクオークや荷電レプトンも併せて質量の統一的な理解を得るために、SO(10)大統一理論に基づいて、ニュートリノの質量の行列を構築した。(d)ステライル・ニュートリノの研究を行った。2.ベータ崩壊や二重ベータとニュートリノ振動実験を総合的に解析し、ニュートリノの混合行列や質量について考察した。3.レプトン数非保存過程の研究、特にの過程の理論的研究を行った。4.ニュートリノ工場でのCPの破れの位相の検出の可能性を研究した。特に、Tの破れの非対称性の測定は、地球物質の効果が少なく、位相の検出には最も適していることを示した。次のような課題について研究を行った。(1)ニュートリノの質量行列とCPの破れ3世代ニュートリノ系では、CPを破る位相は、1つのディラック位相δと2つのマヨラナ位相がある。高エネルギーではV_<13>=0でδ=0である質量行列について、低エネルギーでどのような大きさのV_<13>とδが繰り込み群の効果で現れるか調べ、質量が近似的に縮退しているとき、実験で観測できる程度の大きさが現れることを示した。高エネルギーでのマヨラナ位相は、レプトジェネシスを起こすCPを破る位相と関係しており、全ての位相が統一的に理解できる可能性を示した。(2)二重β崩壊から得られるニュートリノの有効質量<m_ν>がニュートリノ混合とCPの破れに関係しているかを研究した。特にマヨラナ位相とニュートリノの質量の関係を調べた。(3)大統一理論から、ニュートリノの質量行列を調べた。(4)マヨラナの性質を探る過程を研究した。特に、レプトン数が破れる過程であるの寿命を調べた。(3)レプトン数を破る過程の研究
インターネットによる地球規模の自然環境要因と動物行動のリアルタイム測定と解析

地球上の多くの生物は、日光の周期に同調した約24時間のリズム(概日リズム)を持つことが確かめられている。また、海洋にいる生物は潮汐サイクルに適応した概潮汐リズムを持つとされ、このリズムへの適応は、海岸で生息する動物にとって必要不可欠なものであると考えられる。本研究の目的は、対象動物を複数の環境因子が変化する場所に設置して実験を行う装置の開発である。今年度は、潮汐に合せた行動が確認されているミナミコメツキガニについて、自然環境下で観察する装置、すなわち温度、湿度、気圧、照度などの環境変化のデータを屋外で計測できる装置を開発した。さらに、概潮汐リズムは潮汐サイクルも同調因子となる可能性があるため、干潮、満潮時間にあわせて、飼育している水槽の水位を変える装置を開発した。この装置を用いた水槽と用いない水槽の2つを用意して、ミナミコメツキガニの行動を観察した。また、背景差分法とAND演算によって、ミナミコメツキガニの行動を自動的に検出するための画像処理手法も開発し、目視データとの比較によりその有効性を検証した。これにより、インターネットによる接続環境があれば、地点によらずデータを取得することができる。実際に山口大学と琉球大学にこの装置を設置して、1分間隔でこれら温度、湿度、気圧、照度といった環境データとカニの匹数を取得して、行動解析を行い、ミナミコメツキガニの行動が潮汐の影響を受けること、及び概日時計を持つ可能性があることを示すことができた。当初はマウスなどの哺乳類のみについて研究を行う予定であったが、概日リズムとは別の概潮汐リズムをもつミナミコメツキガニについても実験装置の開発と行動データ取得をおこなった。その結果、ミナミコメツキガニの概潮汐リズムは、潮の満ち引きの影響を受けることに合わせて、まだ明らかにされていない、概日リズムをもつことの可能性についても示すことができた。また、山口大学と琉球大学の2地点に実際に装置を設置し、同時にデータを取得して、動物行動の比較を行うことのできるシステムをほぼ完成することができた。画像処理については、光の加減によるカニの検出への影響の処理に不十分な点があり、課題として残された。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展したと判断できる。温度、湿度、気圧、照度の環境要因を動物の行動と同時に計測する装置は完成したが、動物の行動を自動計測するための画像処置については、まだ改善の余地がある。今後はこの問題の解決に取り組む。この装置の開発により、温度、湿度、照度、気圧といった環境データとカニの行動引数のデータを自動的に大量に取得できるようになったので、今後は、このデータに対して機械学習の手法を適用して、新しい知見を見出すなど、これまでの生物リズムの研究とは違うデータサイエンス的な研究を実施することがテーマとして挙げられる。また、鳥類や魚類の行動計測などにも本研究の手法が適用できるような装置の開発も今後の研究課題として挙げられる。本研究の目的は,対象生物を研究目的にかなう環境に置き,複合的要因を同時に測定して,インターネットで伝送できる装置を開発することである.装置には,活動データを取得できる赤外線センサ,環境データを取得するため温度,湿度,気圧,照度センサを実装した.開発した装置は北海道旭川市に設置し,ハムスターの観測による実証実験を行った.夜間はセンサからの値が正しく取得できていることが確認できたが,昼間は日光の影響を受け,照度センサの値が測定範囲を超えるなどの不具合が発生した.さらに,赤外線センサが日光からの赤外線の影響を受け反応するため,動物の行動を正確に測定できない問題も生じた.そこで,これらの問題への対策として,照度センサについては,センサの変更や配置の工夫を行い,解決することができた.日光の赤外線については,加速度センサを併用することで,その影響を排除することを試みた.以上の対策を施して改良した装置を沖縄県那覇市に設置し、北海道に設置した装置による計測データと比較検討するためのデータを取得した。当初の計画では、平成28年度では動物の行動を計測する装置の開発までを行う予定であり、複数地点での同時計測は平成29年度の作業をされていた。しかし、実際には作業がこれ以上進み、北海道と沖縄の2地点に装置を設置し、行動の多地点計測まで行うことができた。このため、予算の前倒し執行も行った。本研究の目的は、対象生物を調査目的にかなう環境に置き、多要因を同時に測定して、インターネットで伝送できる装置を開発することである。このため、行動データを取得のための赤外線センサ、環境データを取得するため温度、湿度、気圧、照度センサを実装した装置を作成し、ハムスターを使って行動計測を行った。夜間は赤外線センサからの値が正しく取得できていることが確認できたが、昼間は強い日光により、照度センサの値が測定範囲を超える等の不具合が発生した。さらに、赤外線センサが日光に反応するため,動物の行動を正確に測定できない問題も生じた。そこで、これらへの対策として、照度センサについては,センサの変更や配置などの見直しを行い、日光の赤外線については、加速度センサを併用することで、その影響を排除した。北海道と沖縄の2地点での測定期間が重なる平成29年3月30日4月8日について、日照時間と行動量のデータを比較した。この期間は春分の日から間もなくのため、2地点の日照時間の差はあまりなく、照度データの測定差は最大29分であった。

この状況下では、同一日における2地点のハムスターの行動量の違いは殆ど見られないはずであり、実際のところ、取得したデータからそのような違いを見出すことはできなかった。そこで、冬季から春季に至る日長が増加する期間において、山口と沖縄に置いた2つのハムスターの行動データを、温度、湿度、気圧などの環境データの関係とともに取得した。遠隔地の動物行動をリアルタイムモニタリングする実験系を構築するために、前年度は山口県から遠く高緯度に位置する北海道においてハムスターを飼育し、その自発行動をモニタリングすることに成功した。本年度は国内でのさらなる検討を実施した。すなわち、ハムスターの行動に対する緯度の影響を比較する目的で、沖縄県にて昨年度と同様の測定を実施した。分担者は、現地の研究者との打ち合わせや、装置のセットアップの一部とハムスターの測定環境の整備を担当した。得られたデータより、測定は成功したものを結論づけることができる。ハムスターに加えて、沖縄地方に生息するミナミコメツキガニを対象とした研究も開始した。ミナミコメツキガニは、潮汐リズムに同調した時計を体内に持っており、日長リズムとの関係を調査することは非常に興味のある課題である。現在、その装置の開発を行っているところであり、哺乳類に加えて甲殻類まで研究の対象を拡大している。地球上の多くの生物は、日光の周期に同調した約24時間のリズム(概日リズム)を持つことが確かめられている。また、海洋にいる生物は潮汐サイクルに適応した概潮汐リズムを持つとされ、このリズムへの適応は、海岸で生息する動物にとって必要不可欠なものであると考えられる。本研究の目的は、対象動物を複数の環境因子が変化する場所に設置して実験を行う装置の開発である。今年度は、潮汐に合せた行動が確認されているミナミコメツキガニについて、自然環境下で観察する装置、すなわち温度、湿度、気圧、照度などの環境変化のデータを屋外で計測できる装置を開発した。さらに、概潮汐リズムは潮汐サイクルも同調因子となる可能性があるため、干潮、満潮時間にあわせて、飼育している水槽の水位を変える装置を開発した。この装置を用いた水槽と用いない水槽の2つを用意して、ミナミコメツキガニの行動を観察した。また、背景差分法とAND演算によって、ミナミコメツキガニの行動を自動的に検出するための画像処理手法も開発し、目視データとの比較によりその有効性を検証した。これにより、インターネットによる接続環境があれば、地点によらずデータを取得することができる。実際に山口大学と琉球大学にこの装置を設置して、1分間隔でこれら温度、湿度、気圧、照度といった環境データとカニの匹数を取得して、行動解析を行い、ミナミコメツキガニの行動が潮汐の影響を受けること、及び概日時計を持つ可能性があることを示すことができた。当初はマウスなどの哺乳類のみについて研究を行う予定であったが、概日リズムとは別の概潮汐リズムをもつミナミコメツキガニについても実験装置の開発と行動データ取得をおこなった。その結果、ミナミコメツキガニの概潮汐リズムは、潮の満ち引きの影響を受けることに合わせて、まだ明らかにされていない、概日リズムをもつことの可能性についても示すことができた。また、山口大学と琉球大学の2地点に実際に装置を設置し、同時にデータを取得して、動物行動の比較を行うことのできるシステムをほぼ完成することができた。
化学合成を応用した内分泌および神経調節ペプチドの生体内調節機構の解析に関する研究

本研究は昨年度に引き続き、新しく見出された内分泌・神経調節ペプチド、ならびにそれらの前駆体の化学構造に関する情報に基づき、各種ペプチドを計画的に化学合成しさらに合成ペプチドを用いて特異抗血清の作製、ならびに特異ラジオイムノアッセイ系の確立を行うことにより、内分泌および神経調節ペプチドの生体内調節機構の解析を可能にし、一連の内分泌:神経調節ペプチドに共通する基礎的概念の樹立を目ざしている。本年度は遺伝子構造解析により推定された内分泌:神経調節ペプチド前駆体のアミノ酸配列に基づき、ヒトオキシントモデュリン、ラットPHI、ヒトGRP、ヒトCRF、NPYおよびそれに関連する各種ペプチドの化学合成、ならびに新しい調節ペプチドとして、ガラニン、ニュ-Dキニン類とそれらの関連ペプチドの化学合成を行った。本合成研究では、さきに確立した合成プログラムに準じ、ペプチド自動合成装置(バイオシステム社)を用いた。また、上記の各種合成ペプチドを免疫抗原として用い、特異抗体の作製を合目的な計画に基づき実施した。ガラニンについては、世界で初めて単クローン抗体の作製に成功した。上記合成ペプチドおよび特異抗体を用い、それぞれのペプチドに特異的なラジオイムノアッセイ系を確立した。さらに、本研究の合成調節ペプチドおよび関連ペプチド、特異抗体、ならびに特異ラジオイムノアッセイを応用し、神経芽細胞腫におけるVIP前駆体のプロセシング、膵と腸管におけるプログルカゴンのプロセシングを明らかにし、ついで、産生する調節ペプチドの生理的意義を解析した。各種神経ペプチドについては、膵潅流系を用い、インスリン放出作用を指標として検討した結果、それらの細胞内伝達機序の差が明らかに認められ、特にカラニンが特異的にインスリン分泌を抑制することを証明した。さらに各種のCCK誘導体を用いて、CCK受容体の特性を検討し、その受容体の部位特異性を証明した。
細胞周期関連蛋白質リン酸化酵素の終末分化神経細胞における機能解析

サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、細胞分裂において中心的な役割を担っているが、ある種のCDK相同性キナーゼは、終末分化し、分裂停止した神経細胞にも高発現している。本研究では、このようなキナーゼの一つPCTAIREの機能解析を通じて、終末分化した神経細胞で発現しているCDK相同性キナーゼの機能を明らかにすることを目的とした。まず、ラットcDNAライブラリーからPCTAIRE1,2,3をクローニングした。本研究によってはじめて一つの生物種よりPCTAIREファミリー全てがクローニングされたことによってPCTAIREファミリーの系統的解析が可能となった。PCTAIRE1,2,3ともに脳で発現しており特にPCTAIRE2は脳特異的に発現していた。脳の発生過程における発現は、分裂の盛んな胎生期ではほとんど発現しておらず、神経細胞が分裂を停止した生後に高発現していた。脳特異的に発現しているPCTAIRE2ついてさらに解析を進めた結果、PCTAIRE2は、グリア細胞よりもニューロンに発現していた。免疫沈降によってPCTAIRE2を回収しヒストンH1キナーゼ活性を測定したところ、セリンとスレオニン残基をリン酸化し、その活性には活性化因子が必要であることが示唆された。これらの結果からPCTAIRE2は終末分化したニューロン特異的に存在するセリン/スレオニンキナーゼであると考えられる。さらにPCTAIRE2結合因子を酵母two-hybridシステムによって検索した結果、PCTAIRE2のN末端のに強く結合する新規分子を同定し、Tudor Repeat Associator with PCTAIRE2(Trap)と名ずけた。Trapは一次構造上ショウジョウバエの正常な胚発生に必要なTudorと部分的に相同性を示す領域が5回繰り返し構造をとっていた。TrapとPCTAIRE2の結合は融合蛋白質を用いたpull down assayや免疫沈降法によって確認した。両者の結合の生理的重要性を明らかにするために、発現パターンと細胞内局在に相関があるか検討した。Trapは、脳と精巣に多く発現しており、胎生期では発現が少なく生後にかけて増加しており、PCTAIRE2の発現パターンと類似していた。両者ともニューロンでは、細胞質に局在しており、COS7細胞ではミトコンドリアに局在していた。さらにラット脳の分画から神経細胞でもミトコンドリアの表層に局在することが示唆された。脳内での分布は、大脳皮質の第V層、小脳では分子層と顆粒細胞層にPCTAIRE2とTrapが、共発現していた。以上の結果から、PCTAIRE2とTrapの結合は生理的に重要な結合であると考えられる。サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、細胞分裂において中心的6投割を担っているが、ある種のCDK相同性キナーゼは、終末分化し、分裂停止した神経細胞にも高発現している。

本研究では、このようなキナーゼの一つPCTAIREの機能解析を通じて、終末分化した神経細胞で発現しているCDK相同性キナーゼの機能を明らかにすることを目的とした。まず、ラットcDNAライブラリーからPCTAIREl,2,3をクローニングした。本研究によってはじめて一つの生物種よりPCTAIREファミリー全てがクローニングされたことによってPCTAIREファミリーの系統的解析が可能となった。PCTAIRE1,2,3ともに脳で発現しており特にPCTAIRE2は脳特異的に発現していた。脳の発生過程における発現は、分裂の盛んな胎生期ではほとんど発現しておらず、神経細胞が分裂を停止した生後に高発現していた。脳特異的に発現しているPCTAIRE2ついてさらに解析を進めた結果、PCITAIRE2は、グリア細胞よりもニューロンに発現していた。免疫沈降によってPCTAIRE2を回収しヒストンHlキナーゼ活性を測定したところ、セリンとスレオニン残基をリン酸化し、その活性には活性化因子が必要であることが示唆された。これらの結果からPCTAIRE2は終末分化したニューロン特異的に存在するセリン/スレオニンキナーゼであると考えられる。さらにPCTAIRE2結合因子を酵母two-hybridシステムによって検索した結果、PCTAIRE2のN末端のに強く結合する新規分子を同定し、Tudor Repeat Associator with PCTAIRE2(Trap)と名ずけた。Trapは一次構造上ショウジョウバエの正常な胚発生に必要なTudorと部分的に相同性を示す領域が5回繰り返し構造をとっていた。TrapとPCTAIRE2の結合は融合蛋白質を用いたpull down assayや免疫沈降法によって確認した。両者の結合の生理的重要性を明らかにするために、発現パターンと細胞内局在に相関があるか検討した。Trapは、脳と精巣に多く発現しており、胎生期では発現が少なく生後にかけて増加しており、PCTAIRE2の発現パターンと類似していた。両者ともニューロンでは、細胞質に局在しており、COS7細胞ではミトコンドリアに局在していた。さらにラット脳の分画から神経細胞でもミトコンドリアの表層に局在することが示唆された。脳内での分布は、大脳皮質の第V層、小脳では分子層と顆粒細胞層にPCTAIRE2とTrapが、共発現していた。以上の結果から、PCTAIRE2とTrapの結合は生理的に重要な結合であると考えられる。サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、細胞分裂において中心的な役割を担っているが、ある種のCDK相同性キナーゼは、終末分化し、分裂停止した神経細胞にも高発現している。まず、ラットcDNAライブラリーからPCTAIRE1,2,3をクローニングした。
自然突然変異の発生と抑制の制御機構

大腸菌染色体複製開始領域oriCを含むプラスミドDNAを鋳型として、精製した複製タンパク質による試験管内ローリングサークル型DNA複製系を構築した。この系を利用して、rpsL遺伝子を標的遺伝子としてDNA複製に起因する突然変異の解析を行なった。複製産物中のrpsL^-変異の頻度は鋳型DNA中に最初から存在するrpsL^-変異の頻度の約70倍に上昇しており、in vitroでの複製反応に起因する突然変異を初めて検出することに成功した。この時の変異頻度から複製エラーの発生率は約3.0X10^<-7>/bp/複製と推定された。また、検出された変異の塩基配列レベルでの解析から、複製エラーに起因する変異は1塩基フレームシフトが最も多く、これらの大部分は同一塩基の繰り返し配列上で多発することが判明した。2塩基の繰り返し配列では、2塩基のフレームシフトの発生も観察された。大きな欠失や重複、さらに配列置換変異も複製エラーに起因することが示された。様々な証拠から、in vitro系で発生した塩基置換の大部分は鋳型DNAおよび基質ヌクレオチド中のグアニン残基が酸化されて生じる8-oxo-グアニンによるミスペアが原因であると結論された。大腸菌のミスマッチ修復欠損変異株を用いたin vivoでの解析結果から、今回見いだした複製エラーの内、1塩基フレームシフトと塩基置換の大部分はミスマッチ修復機構により修正されていることが明らかにされた。本研究の目的は、DNAポリメラーゼによる複製エラーの種類と発生頻度ならびに塩基配列特異性を明らかにし、細胞が持つ自然突然変異を抑制する機能の分子機構を解明することである。本年度は、試験管内DNA複製系を用いた生化学的解析に焦点をしぼって研究を行ない、以下の結果を得た。1.大腸菌染色体複製開始領域oriCを含むプラスミドDNAを鋳型として、精製した複製タンパク質による試験管内ローリングサークル型DNA複製系を構築した。この系を利用して、大腸菌のrpsL遺伝子を標的遺伝子としてDNA複製に起因する突然変異の解析を行なった。鋳型DNA中に最初から存在するrpsL変異の頻度は3.8×10^<-6>であるのに対し、複製産物中の変異頻度は1.0×10^<-4>に上昇しており、このin vitro系を用いた詳細な解析結果から、検出された突然変異はin vitroでの複製反応に起因することが明らかにされた。2.in vitroDNA複製系で独立に生じた多数のrpsL変異の解析から、複製エラーに起因する変異は1塩基フレームシフトが最も多く、全体の62%を占めることが判明した。塩基置換変異は全体の25%であり、2塩基のフレームシフトの発生も観察された。様々な証拠から、in vitro系で発生した塩基置換は鋳型DNAおよび基質ヌクレオチド中のグアニン残基が酸化されて生じる8-oxo-グアニンによるミスペアが原因であると結論された。一方、1塩基フレームシフトはdA/dT残基が46個続く配列中でdAあるいはdTが1個付加するものが最も高頻度に発生し、その頻度はストレッチの長さに依存していた。様々な証拠から、今回用いたDNAポリメラーゼである大腸菌DNA pol IIIはdTストレッチを鋳型とする時にdATPの濃度に依存して鋳型上をスリップすることが示唆された(dTストレッチスリップモデル)。