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組織間信頼の形成と維持に関する研究――日伊の比較を通じて

本研究の目的は、組織間信頼の形成と維持のメカニズムについて、普遍的なモデルを確立することである。組織間信頼に関しては、組織論において、少なくとも日本では理論的な検討がほとんどなされてこなかった。また、組織間信頼の形成・維持の要因、メカニズムが解明されておらず、これを明らかにすることが課題とされている。そこで、本研究では、先行研究において前提とされてきた、経済的合理性や機会主義的行動の抑制といったものから形成される組織間信頼ではなく、同地域や同業種といった、取引前から組織間に一定の関係があり、従来の経済的合理性のみでは説明のつかない組織間信頼について考察する。組織と組織の信頼がどのように形成され、維持されていくのか、それぞれの要因と要因間の関係について検討を行い、そこで得られた要因について具体的に検討するため、主に産業集積地(日本とイタリア)における組織間信頼を事例として考察する。当該年度においては、上記の研究目的を実現するため、これまでの研究で明らかになった組織間信頼の形成・維持の要因およびメカニズムについてさらに理論的検討を進めた。大枠となるメカニズムについては、博士論文において既に明らかにしていたが、理論的整合性などの点で大幅に修正、再検討をする必要があった。これに関しては、2019年6月に著書『組織間信頼の形成と維持』が出版される予定である。また、継続して行っている日本における共同受注ネットワークへのインタビュー調査に加え、イタリアの産業集積に関する文献収集および次年度から行う予定であるインタビュー調査先の検討・準備を行った。理論的検討の部分については、まだ課題が多く残されている。しかし、イタリアの産業集積地における文献収集およびインタビュー調査先の検討についてはほぼ予定通り行うことができたと思われる。今後の研究の進め方としては、当初、課題として挙げた理論的検討を進めていくとともに、イタリアにおけるインタビュー調査を実施し、日本とイタリアにおける産業集積地の組織間信頼の比較を行い、組織間信頼の形成と維持のメカニズムの普遍的モデルを確立することを試みる。
海岸・海洋構造物の連結目地内での流体共振の発生条件と運動特性の体系化に関する研究

ケーソン護岸および防波堤連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模に関して,昨年度の規則波を用いた実験による体系化に続き,本年度は,理論解析手法の構築,さらに不規則波を用いた実験により,共振の発生条件およびその規模の体系化を行った.また,大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解に関しては,複数の間隙が存在する場合に対応できる理論解析手法を構築することに成功した.以上の研究成果は次のようにまとめられる.(1)ケーソン護岸およびケーソン防波堤護岸連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模漸近接合法を用いた理論解析手法に,目地内部でのエネルギー消散効果を取り込むことにより,これまで明らかにされてきている,規則波入射に対する流体共振の発生条件に加えて,発生規模の予測を検討することが可能となった.さらに,不規則波実験では,入射波成分に,規則波入射時に流体共振が発生する共振周波数成分が含まれている場合に,流体共振が発生すること,また,その規模は,入射波に含まれる共振周波数成分のエネルギー比にほぼ線形的に比例することが分かった.(2)大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解間隙個数を増加させた場合に対応できる流体共振の発生条件の解析法を,エネルギー保存則を用い,多自由度系の連立振動方程式の解法を援用することによって構築した.この解として,系内の固有振動数を,矩形浮体長さ,喫水深および間隙幅を陽に含む形で新たに誘導し,実験結果との比較から,誘導した固有振動数を用いて,間隙内での流体共振の発生が良好に予測できることが分かった.ケーソン護岸およびケーソン防波堤連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模に関して,本年度は,規則波を用いた実験によりこれらの体系化を行った.さらに,大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解の誘導に成功した.以上の研究成果は次のようにまとめられる。(1)ケーソン護岸連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模ケーソン護岸連結目地内において流体共振現象が発生することを実験的に確認し,目地内の最大波高が入射波高の5倍を上回る場合を流体共振の発生条件とした場合,本研究で対象とした実験範囲(形状比a/L<0.039,a:連結目地幅,L:ケーソン岸沖方向長さ)において,1次モードの流体共振がkL=1.12.0(k:入射波の波数)の場合,さらに,2次モード流体共振がkL=4.14.8の場合に発生することが分かった.(2)ケーソン防波堤連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模ケーソン防波堤連結目地内において流体共振現象が発生することを実験的に確認し,目地内の最大波高が入射波高の4倍を上回る場合を流体共振の発生条件とした場合,本研究で対象とした実験範囲(形状比a/L<0.039,a:連結目地幅,L:ケーソン岸沖方向長さ)において,1次モードの流体共振がkL=2.53.5の場合に発生することが分かった.(3)大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解2つの矩形浮体要素から構成された1の間隙を伴う浮体の場合を対象とし,管径が非一様なU字管内の流体振動の解析法を応用して,間隙内流体振動に関する固有振動数を,矩形浮体長さ,喫水深および間隙幅を陽に含む形で新たに誘導した.実験結果との比較から,誘導した固有振動数を用いて,間隙内での流体共振の発生がおおよそ予測できることが分かった.ケーソン護岸および防波堤連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模に関して,昨年度の規則波を用いた実験による体系化に続き,本年度は,理論解析手法の構築,さらに不規則波を用いた実験により,共振の発生条件およびその規模の体系化を行った.また,大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解に関しては,複数の間隙が存在する場合に対応できる理論解析手法を構築することに成功した.以上の研究成果は次のようにまとめられる.(1)ケーソン護岸およびケーソン防波堤護岸連結目地内での流体共振の発生条件とその発生規模漸近接合法を用いた理論解析手法に,目地内部でのエネルギー消散効果を取り込むことにより,これまで明らかにされてきている,規則波入射に対する流体共振の発生条件に加えて,発生規模の予測を検討することが可能となった.さらに,不規則波実験では,入射波成分に,規則波入射時に流体共振が発生する共振周波数成分が含まれている場合に,流体共振が発生すること,また,その規模は,入射波に含まれる共振周波数成分のエネルギー比にほぼ線形的に比例することが分かった.(2)大型浮体を構成する浮体要素間の微小間隙内における流体共振の発生条件に関する理論解間隙個数を増加させた場合に対応できる流体共振の発生条件の解析法を,エネルギー保存則を用い,多自由度系の連立振動方程式の解法を援用することによって構築した.この解として,系内の固有振動数を,矩形浮体長さ,喫水深および間隙幅を陽に含む形で新たに誘導し,実験結果との比較から,誘導した固有振動数を用いて,間隙内での流体共振の発生が良好に予測できることが分かった.
関孝和の功績と中国数学, 西欧数学との比較研究及びその視点を活かした中等教育の実践

研究目的18世紀, 19世紀の和算を軸とした数学史全般について原典の解読,研究を進めた.特に,関孝和の数論と円理について中国伝来の解法および西欧での研究との比較検証を進めた.また,数学史の研究,原典の解読の成果をもとに,高校2年生対象の学習指導要領「数学活用」をはじめ高校1年「数学I」「数学A」の[課題学習]および他すべての科目において,数学史の視点を活かした授業の研究,さらに生活の中に活きている数学について発見,気付かせる授業の研究,実践を進めた.特に「数学活用」, [課題学習]では,生徒による主体的な数学的活動の充実,アクティブラーニングの取り組みの研究,実践を続けた.今年度は解読,調査,研究そして授業実践に力を注ぎ,研究発表は行えなかったが,過年度までの実績をもとに,次年度,平成28年度には報告,発表の予定を得ているの.数学史の専門的な研究と中等教育における授業研究は直接的な関連が薄いとも考えられるが,数学嫌いを多く生んでいる現状を鑑み,数学の本質的な意義,良さを伝えるため,数学が拠って生まれ来るその歴史を踏まえた授業の実践,先人達が築き上げた数学的な実りとそれに至る数学的営みをよく理解した上で教壇に立つことが肝要と考え,数学史の研究とその視点を活かした授業の研究,実践を試みている.研究方法京都大学数理科学研究所の研究集会「数学史の研究」および全国和算研究大会長野大会に参加,原典,特に関孝和,建部賢明,賢弘兄弟による『大成算経』と中国南宋の数学者秦九韶の『数書九章』の精読に努めた.そのほか「数学教育の会」(お茶の水女子大学),共立出版に於ける数学文献を読む会など多数の学会,研究会に参加し,研鑽を積んだ.研究成果今年度は授業の実践と原典の精読に努めた.次年度,各研究会にて報告,発表を進めたい。
骨髄は痛みを感じるか

骨髄内を刺激することで興奮する脊髄ニューロンの活動電位を記録することに成功した。これらのニューロンは主に痛み刺激に反応するニューロンであり、骨髄内の神経が痛み刺激を伝達している可能性が示唆された。また、骨髄内の刺激に反応するニューロンは皮膚からの刺激にも反応があり、骨の中の刺激を皮膚の痛みとして感じる可能性があることが分かった。これらの結果から骨のがん、整形外科手術後などの骨の中だけの病変でも痛みを感じる原因となりうることが分かった。細胞外記録により骨髄内刺激(バルーン拡張、骨髄吸引)に応答する脊髄後角ニューロンの存在が明らかとなった。骨髄内刺激に応答するニューロンは、侵害刺激に応答するwide-dynamic rangeニューロンもしくはhigh-thresholdニューロンでありその多くが皮膚にも受容野を持つことが明らかとなった。また、骨髄内刺激に応答するlow-thresholdニューロンは今回の実験では記録されず、骨髄内の神経は侵害刺激を特異的に伝達している可能性が示唆された。骨髄刺激に応答する脊髄後角ニューロンはモルヒネを脊髄投与することで刺激に対する反応が低下し、ナロキソンを投与することで反応が戻ることが明らかとなった。このことからも、骨髄内の神経が侵害刺激を受容し脊髄後角に伝達していることがわかった。大腿骨内にバルーンを留置したモデルラットを作成し、骨髄内刺激に対する行動薬理学的評価を行った。骨髄内でバルーンを拡張すると、痛み行動(guarding)をとり、電気生理学的研究で得られた皮膚受容野で痛覚過敏が起こることが明らかとなった。これらの行動はモルヒネのくも膜下投与により抑制され、ナロキソン投与により拮抗された。以上の結果から骨髄内刺激により痛みを知覚し、皮膚受容野で痛覚過敏を引き起こすことが行動薬理学的に明らかとなった。これらの結果から、骨髄内の神経も痛みの受容に関わっており、骨髄からの刺激により該当皮膚受容野で関連痛が起き骨折手術後の創部通を増強する可能性が示唆された。本研究の結果は、骨転移性がん痛や整形外科手術後痛、関節炎・骨髄炎の痛みの機序の一部を明らかにする重要な知見であった。細胞外記録により骨髄内刺激に応答する脊髄後角ニューロンの存在が明らかとなった。骨髄内刺激に応答するニューロンは、侵害刺激に応答するWide-Dynamic RangeニューロンもしくはHigh-Thresholdニューロンであり皮膚にも受容野を持つことが明らかとなった。また、骨髄内刺激に応答するLow-Thresholdニューロンは今回の実験では記録されず、骨髄内の神経は侵害刺激を特異的に伝達している可能性が示唆された。このことからも、骨髄内の神経が痛みを受容し脊髄後角に伝達していることが分かった。大腿骨にバルーンを挿入したモデルラットを用いた行動薬理学的評価では、骨髄内のバルーン拡張に伴い、痛み行動を取ることが明らかとなった。また、これらの行動はモルヒネをくも膜下投与することで抑制されナロキソンを投与することでモルヒネの作用が拮抗された。以上の結果からも骨髄内刺激により痛みを知覚することが行動薬理学的にも明らかとなった。この結果は、骨髄からの痛みで当該皮膚に関連痛が起こり、骨折手術後の創部痛を増強する可能性を示唆している。本研究の結果は、今後、骨転移性がん痛や整形外科手術後痛、関節炎・骨髄炎の痛みの機序を解明するための重要な知見である。現時点で骨髄から脊髄後角に入力するニューロンの電気生理学的特性が明らかとなった。また、行動生理学的にも骨髄内のニューロンが侵害刺激を受容していることが明らかとなっている。これらから、骨折や悪性腫瘍の骨転移などにおける痛みに骨髄内の神経が侵害刺激を受容している可能性が示唆され、骨痛の痛みのメカニズムの一部が明らかになった。今後は、同様のモデルを用いて、AMPAレセプタ拮抗薬、NMDAレセプタ拮抗薬、オピオイドなどを脊髄に投与し,骨髄内刺激による脊髄後角V層ニューロンの興奮がどのレセプタの活性化により惹起されているかについて検討を行う予定である。同様に、行動薬理学的にもAMPAレセプタ拮抗薬、NMDAレセプタ拮抗薬、オピオイドなどを脊髄くも膜下に持続投与による骨髄内刺激に対する応答性の評価を行う。また、神経トレーサーを用いて骨髄や皮膚からのニューロン投射の解析やモデルラットにおける脊髄でのリン酸化ERKの定量及び、c-fos mRNAとリン酸化ERKの免疫染色を行う。当初計画で見込んだよりも安価に研究が行えたため、次年度使用額が生じた。また、当初計画では神経トレーサーを用いた解析を行う予定であったが、研究の進捗状況により次年度実施することとなったため、次年度使用額が生じた。

次年度は骨髄刺激に応答するニューロンの薬理学的特性を明らかにするため、実験動物、薬理学実験試薬(AMPAレセプタ拮抗薬、NMDAレセプタ拮抗薬)、生化学実験試薬、細胞標的関連試薬に使用する。
主要部が非線形微分作用素である高階非線形常微分方程式の解の構造の研究

本研究の目的は,非線形Sturm-Liouville微分作用素が主要部である高階常微分方程式の解の振動性と漸近挙動の精密な解析を行い,それを拠り所にして解の全体構造を解明することである.本年度は,高階非線形微分方程式への橋頭堡となる4階非線形微分方程式の解の全体構造の精細な研究と高階非線形微分方程式の内で最も単純な偶数階非線形常微分方程式及びずれの変数を含む偶数階非線形関数微分方程式に対して,"非振動解の無限遠における漸近挙動の精密な分析"と"全ての解が振動あるいは非振動である状況の特徴付げ"などを重点課題として研究を行った.[研究実施の具体的な内容](1)振動理論の発展史の総括.考究の対象となっている微分方程式の種類,それらに対して得られている結果,結果を導出するために利用されている数学的方法・手段・技術を分類し,可能な限り体系的にまとめる作業を行った.情報の収集にはインターネット(Math.Sci.Net.,Zentralblatt MATH等)と他大学の図書館を利用した.(2)研究成果報告.研究経過を定期的に振動理論の世界的権威で世界の情報を握っている草野尚教授(広島大学名誉教授,福岡大学)に報告して批判と助言を求めた.[主な研究成果](1)非線形Sturm-Liouville微分作用素に含まれている係数関数に,ある積分収束条件を仮定し,その条件の下で,4階微分方程式の非振動解の構造と振動解の存在性に関する結果を得た.(2)セルビアのKaramataによって創始されたKaramata関数(正則変動関数)をさらに一般化したKaramata関数の枠組みの中で,2階非線形微分方程式の非振動解の漸近行動を解析し,解の構造に関する情報を得た.(3)ずれの変数を含む偶数階非線形関数微分方程式の非振動解の漸近的性質と振動解の存在性を吟味し,解の構造に関する結果を得た.(4)ある高階非線形微分方程式の全ての解が振動するための必要十分条件を求めた.本研究の目的は,非線形Sturm-Liouville微分作用素が主要部である高階の常微分方程式の解の振動性と漸近挙動の精密な解析を行い,それを拠り所にして解の全体構造を解明することである.本年度は,高階の非線形常微分方程式に対して,"非振動解の無限遠における漸近行動の精密な分析"と"全ての解が振動あるいは非振動である状況の特徴づけ"などを重点課題として研究を行った.[研究実施の具体的な内容](1)微分方程式の解の性質を調べる研究に対しては,有効な数学的手段・技法の効果的な適用が一義的に重要である.そこで,文献の収集やインターネット(MathSciNet等)の活用を通して必要な情報を蓄積して,それを的確に総括,整理し,問題の解決に有効な方法や技法(解析的,位相的,幾何学的)網羅する作業を行い,自らの手で新たな方法論を開発し計算を実行した.さらに,無限区間における(振動性と無限遠における漸近行動)を推測するために,計算ソフトMapleを活用した.(2)研究経過を定期的に振動理論の世界的権威である草野尚教授(広島大学名誉教授,福岡大学)に報告して批判と助言を求めた.(3)振動理論の第一人者であるスロバキアのコメニウス大学のJaroslav Jaros教授に来日して頂き,高階微分方程式の振動性について討論,情報交換を行った,[研究成果](1)高階のSturm-Liouville微分作用素を含む非線形微分方程式の非振動解を無限遠点における漸近挙動に従って分類し,その分類された各々のタイプの解が存在するための条件を求めた.(2)4階非線形Sturm-Liouville常微分方程式の主要部である微分作用素の係数に,ある積分収束条件を課し,非振動解の存在について述べ,さらに全ての解が振動するための十分条件を求めた.本研究の目的は,非線形Sturm-Liouville微分作用素が主要部である高階の常微分方程式の解の振動性と漸近挙動の精密な解析を行い,それを拠り所にして解の全体構造を解明することである.昨年度は,高階非線形微分方程式への橋頭堡となる4階非線形微分方程式の解の全体構造の研究を行い,本年度は高階非線形微分方程式の内で最も単純な偶数階非線形微分方程式に対して,"非振動解の無限遠における漸近挙動の精密な分析"と"全ての解が振動あるいは非振動である状況の特徴付け"などを重点課題として研究を行った.[研究実施の具体的な内容]1振動理論の発展史の総括.考究の対象となっている微分方程式の種類,それらに対して得られている結果,結果を導出するために利用されている数学的方法・手段・技術を分類し,可能な限り体系的にまとめる作業を行った.情報の収集にはインターネット(Math.Sci.Net.,Zentralblatt MATH等)と他大学の図書館を利用した.2研究成果報告.研究経過を定期的に振動理論の世界的権威で世界の情報を握っている草野尚教授(広島大学名誉教授,福岡大学)に報告して批判と助言を求めた.[研究成果]1 4階非線形微分方程式の主要部である微分作用素の係数に,ある積分収束条件を課し,全ての解が振動するための必要十分条件を求めた.21970年セルビアのKaramataによって創始されたKaramata関数(正則変動関数)をさらに一般化したKaramata関数の枠組みの中で,2階非線形微分方程式の非振動解の漸近行動を分析した.

3ずれの変数を含む偶数階非線形微分方程式の振動性,非振動性を比較原理を用いて分析した.本研究の目的は,非線形Sturm-Liouville微分作用素が主要部である高階常微分方程式の解の振動性と漸近挙動の精密な解析を行い,それを拠り所にして解の全体構造を解明することである.本年度は,高階非線形微分方程式への橋頭堡となる4階非線形微分方程式の解の全体構造の精細な研究と高階非線形微分方程式の内で最も単純な偶数階非線形常微分方程式及びずれの変数を含む偶数階非線形関数微分方程式に対して,"非振動解の無限遠における漸近挙動の精密な分析"と"全ての解が振動あるいは非振動である状況の特徴付げ"などを重点課題として研究を行った.[研究実施の具体的な内容](1)振動理論の発展史の総括.考究の対象となっている微分方程式の種類,それらに対して得られている結果,結果を導出するために利用されている数学的方法・手段・技術を分類し,可能な限り体系的にまとめる作業を行った.情報の収集にはインターネット(Math.Sci.Net.,Zentralblatt MATH等)と他大学の図書館を利用した.(2)研究成果報告.研究経過を定期的に振動理論の世界的権威で世界の情報を握っている草野尚教授(広島大学名誉教授,福岡大学)に報告して批判と助言を求めた.[主な研究成果](1)非線形Sturm-Liouville微分作用素に含まれている係数関数に,ある積分収束条件を仮定し,その条件の下で,4階微分方程式の非振動解の構造と振動解の存在性に関する結果を得た.(2)セルビアのKaramataによって創始されたKaramata関数(正則変動関数)をさらに一般化したKaramata関数の枠組みの中で,2階非線形微分方程式の非振動解の漸近行動を解析し,解の構造に関する情報を得た.(3)ずれの変数を含む偶数階非線形関数微分方程式の非振動解の漸近的性質と振動解の存在性を吟味し,解の構造に関する結果を得た.(4)ある高階非線形微分方程式の全ての解が振動するための必要十分条件を求めた.
感染と関連した腎疾患における補体を介した腎組織障害機序とその指標の解明

補体系は感染防御の重要な構成要素であるが、その過剰な活性化は組織障害性に働くことが知られている。そこで感染と関連した腎疾患における補体による腎障害機序の検討を進めている。当初、対象疾患として感染関連糸球体腎炎の解析を進める予定であったが、東京医科大学八王子医療センター及び防衛医科大学校腎臓内分泌内科に保存されている感染関連糸球体腎炎の腎生検凍結組織を調べたところ、非常に限られており解析できる十分なサンプル数に及ばないことが判明した。そこで対象疾患をサンプル数が豊富ですぐに解析を開始できる、ANCA関連腎炎に変更することとした。20例のMPO-ANCA陽性MPA患者を対象として、腎生検組織と血清を中心に解析を進めてきた。血清に関して、Wieslabのキットを用いて、補体の活性化3系統の評価を実施したところ、一部のサンプルで副経路、レクチン経路の特異的な活性化がみられるものもあったが、古典経路を含め全経路が一緒に活性化しているサンプルも存在し、結果の評価が困難であった。この原因として結成の保存状態が検査結果に影響して不安定な結果になってしまっている可能性が考えられた。一方、腎生検組織に関しては、C4d, MBL, C3, C5, FBb, C5b-9などを直接蛍光抗体法で組織染色をしたところ、C4d, C5, C5b-9はほぼ全例で陽性ながらMBLはほぼ全てのサンプルで陰性であり、おそらく古典経路を中心とする補体活性化が起こって、腎組織障害に関与している可能性が示唆された。当初予定していた対象疾患である感染関連糸球体腎炎の患者さんの腎生検凍結組織の保存が非常に限られており、解析できる十分なサンプル数に及ばないことが判明したため当初の解析予定疾患を変更して解析を進めている。さらに、組織染色に用いる蛍光標識した補体関連蛋白に対する抗体をBioss社から購入して使用したが、全く染色結果が安定せず、抗体の信用性に欠ける状況であった。抗体の信用性を評価するため、染色法の条件を種々に振って実施したが結局安定した結果が得られず、やむを得ず多数の抗体を他社から再購入し、染色も間接法に変更して再度検討したことで遅延を生じた。また、感染関連糸球体腎炎に関しては、解析サンプルを増やす必要があり、他施設サンプルの使用の可能性を調査中で、全体に研究の進捗は遅れている。血清に関して、Wieslabのキットを用いた補体の活性化の評価結果が不安定であったため、C5a,可溶性C5b-9のアッセイキットを用いた評価や、古典経路の活性化と関連した血中免疫複合体の存在を検査会社に依頼して実施する予定である。また、血清でうまく解析が実施できるようであれば、尿に関しても、C5a,可溶性C5b-9などのレベルをELISAを用いて検討する。さらにANCA関連血管炎での検討で、評価方法が確立しつつあるので、これらの評価方法を用いて、感染関連糸球体腎炎、敗血症性急性腎障害症例を対象とした検討も早急に進めたい。当初、対象疾患として感染関連糸球体腎炎の解析を進める予定であったが、東京医科大学八王子医療センター及び防衛医科大学校腎臓内分泌内科に保存されている感染関連糸球体腎炎の腎生検凍結組織を調べたところ、非常に限られており、解析できる十分なサンプル数に及ばないことが判明した。そこで、対象疾患をサンプル数が豊富ですぐに解析を開始できる、ANCA関連腎炎に変更し、まずは腎生検組織の解析を開始することとした。補体C5の活性化を抑制しC5b-9の生成を抑制する治療薬であるエクリズマブ(抗C5モノクローナル抗体)を蛍光色素で標識し、直接蛍光抗体法で組織染色をしたところ、検討した18例のANCA関連腎炎全例でC5の沈着を認め、その沈着強度は、腎炎の活動性と相関すると予測される血尿のレベルと有意な正の相関がみられた。当初予定していた対象疾患である感染関連糸球体腎炎の患者さんの腎生検凍結組織の保存が非常に限られており、解析できる十分なサンプル数に及ばないことが判明したため当初の解析予定疾患を変更して進めている。さらに、組織染色に関して、C4d, C3b, C5b-9やC5a, Factor H, MSP-1などの標識ズミ抗体をBioss社から購入して使用したが、全く組織染色がされず、抗体の信用性に欠ける状況であった。そこで、現在、蛍光抗体関節法で使用可能な抗体を購入しなおして再検討を進めるなど、手間取っている状況がある。

血清に関して、Wieslabのキットを用いて、補体の活性化3系統の評価を実施したところ、一部のサンプルで副経路、レクチン経路の特異的な活性化がみられるものもあったが、古典経路を含め全経路が一緒に活性化しているサンプルも存在し、結果の評価が困難であった。この原因として結成の保存状態が検査結果に影響して不安定な結果になってしまっている可能性が考えられた。一方、腎生検組織に関しては、C4d, MBL, C3, C5, FBb, C5b-9などを直接蛍光抗体法で組織染色をしたところ、C4d, C5, C5b-9はほぼ全例で陽性ながらMBLはほぼ全てのサンプルで陰性であり、おそらく古典経路を中心とする補体活性化が起こって、腎組織障害に関与している可能性が示唆された。当初予定していた対象疾患である感染関連糸球体腎炎の患者さんの腎生検凍結組織の保存が非常に限られており、解析できる十分なサンプル数に及ばないことが判明したため当初の解析予定疾患を変更して解析を進めている。さらに、組織染色に用いる蛍光標識した補体関連蛋白に対する抗体をBioss社から購入して使用したが、全く染色結果が安定せず、抗体の信用性に欠ける状況であった。抗体の信用性を評価するため、染色法の条件を種々に振って実施したが結局安定した結果が得られず、やむを得ず多数の抗体を他社から再購入し、染色も間接法に変更して再度検討したことで遅延を生じた。また、感染関連糸球体腎炎に関しては、解析サンプルを増やす必要があり、他施設サンプルの使用の可能性を調査中で、全体に研究の進捗は遅れている。今後、C5の陽性所見の詳細をC5b-9, C5a, C5aRなどに対する抗体を用いた間接蛍光抗体法で確認を進めるとともに、組織だけでなく、血清・尿などに関して可溶性C5b-9などのレベルをELISA法などを用いて検討し比較評価する。さらに、ANCA関連血管炎での評価方法を用いて、敗血症性急性腎障害の検討も進める。感染関連糸球体腎炎に関しても、他施設との共同研究の形にして、解析症例数を増やすことを考える。血清に関して、Wieslabのキットを用いた補体の活性化の評価結果が不安定であったため、C5a,可溶性C5b-9のアッセイキットを用いた評価や、古典経路の活性化と関連した血中免疫複合体の存在を検査会社に依頼して実施する予定である。また、血清でうまく解析が実施できるようであれば、尿に関しても、C5a,可溶性C5b-9などのレベルをELISAを用いて検討する。さらにANCA関連血管炎での検討で、評価方法が確立しつつあるので、これらの評価方法を用いて、感染関連糸球体腎炎、敗血症性急性腎障害症例を対象とした検討も早急に進めたい。当初、試料の保存・整理用にディープフリーザを購入する予定であったが、実験室の管理・運営系統の変革があり、すぐに購入することができなくなったため、機器使用予定金がかからなかった。今年度購入した抗体などの試薬で、予想通りに働かない試薬もあり、次年度は、これらの代替用試薬やELISA kitなど多数の試薬購入に使用する予定である。昨年度購入した抗体などの試薬で、全く予想通りに働かない試薬があってかえって研究の遅れを生じてしまったこともあり、試薬・キットの購入をより慎重に実施していることもあって使用額が少なめになっている。
ヒトの発生・老化における癌原遺伝子の新たな役割の解明

申請者らは2005年にHRASの生殖細胞系列(受精卵に始まり全身に存在)での変異を先天奇形症候群であるCostello症候群で同定した(Aoki et al, 2005)。それに引き続き2006年にcarcio-facio-cutaneous(CFC)症候群の原因がKirsten-RAS(KRAS),B型RAFキナーゼ(BRAF)の生殖細胞系列の変異であることを世界に先駆けて報告した(Niihori,Aoki et al., 2006)。この研究の目的は1)患者で同定された遺伝子変異を導入したモデル動物を作製し、癌原遺伝子の新しい役割を明らかにすることである。2)未だ遺伝子変異の明らかでない類縁疾患の新規原因遺伝子を明らかにすることである。これまで細胞の増殖・分化・老化・死における癌原遺伝子の役割に関する研究が行われてきた。申請者らの研究がブレークスルーとなり、RAS/MAPKシグナル伝達経路上の分子がヒトの発生に重要であることが明らかになったが、それを解析するためのモデルマウスはいまだ作製されていない。この研究の目的は1)患者で同定された遺伝子変異を導入したモデルマウスを作製し、個体の発生・老化・発癌・死における癌原遺伝子の新しい役割を明らかにすることである。また遺伝子変異をもつ患者細胞・組織、変異導入を導入した培養細胞を用いることにより、多角的にヒト細胞でも老化・発癌の現象を検証する。2)これらの研究で得られたシグナル伝達情報を元に、未だ遺伝子変異の明らかでない類縁疾患の新規原因遺伝子を明らかにする。これまでにNoonan類縁疾患300人を収集し既知の原因遺伝子PTPN11,HRAS,KRAS,BRAF,MEK1/2,RAF1,SHOC2の包括的遺伝子解析を行い180人(60%)に遺伝子変異を同定した。新たに報告されたRAF1遺伝子をスクリーングするとともに,RAF1変異蛋白の活性化メカニズムを検討した。既知の遺伝子における変異陰性の類縁患者119人中18人に遺伝子変異を同定した。臨床症状の詳細な検討により他の遺伝子変異をもつヌーナン症候群に比べて肥大型心筋症と低身長の合併頻度が高いことが明らかになった。変異蛋白の機能解析にて,変異蛋白では抑制性のS259リン酸化が低下しており,RAF1活性抑制に重要な14-3-3蛋白との結合が低下し,その結果非刺激時にも下流のERKを活性化していることが明らかになった。さらにCFC症候群での血液腫瘍合併3例目として,生後早期に非ホジキンリンパ腫を発症した症例にBRAF遺伝子変異を同定した。
部材の性能と接合部の性能の相関性に関する実験的研究

本研究は合理的な木質構造の設計に欠かせない材料と接合部の強度性能の相関性を把握することを目的にした実験的研究である。従来、部材の性能を表す因子として比重が考えられ、許容応力度も比重に応じて決められていた。比重はその計測が困難で、これまで樹種に対して1比重という形態であった。しかし近年部材のヤング係数を計測することが比較的簡易に行えるようになり、部材の許容応力度もヤング係数に対して与えられるように変化してきた。そこで、本研究では部材の性能を代表するものとして曲げヤング係数を、接合部の性能を代表するものとして円形めり込み性能を考えた。実験は、様々なヤング係数の部材に、ピン径1224phiの円形めり込みを生じさせ、その荷重とめり込み量を測定するものである。実験の結果、以下の知見が得られた。1.接合強度と曲げヤング係数の間には、相関係数0.78以上の強い正の相関関係がみられた。しかし、ピン径が20mmの場合には、その傾向がみられない。2.初期剛性と曲げヤング係数の間には、接合強度ほどではないが、相関係数0.420.77程度の正の相関関係がみられる。しかし、強度の場合と同様にピン径20mmの場合にはその傾向がみられず、逆に負の相関を示した。3.部材の曲げヤング係数とは別に、含水率、比重の計測を行ったが、含水率はほとんど相関が見られず、比重は曲げヤング係数と同程度の相関が見られた。試験体数が少ないものがあったため、相関が見られないものもあったが、部材の曲げヤング係数を用いて、接合強度を評価する方法は有効だという結果が得られた。
法整備支援の手法と評価に関する理論研究

近年、社会主義体制から市場経済体制に移行しつつあるアジア諸国は、市場経済化に相応しい法体制を整備するために、外国とりわけ日本の知的・人的支援を求めている。日本政府は1996年以降、ベトナム、ラオス、カンボジアなどに対する法整備支援を開始したが、その法整備支援の実際のなかで、法整備支援の理念とは何か、どのような法分野に対して支援を行うべきか、というような基本的な諸問題が問われてきた。本領域研究においては、実際に行われつつある法整備支援事業を学問的に検討し、法整備支援学の構築を目指してきた。本班では、(1)情報科学の成果を法整備支援のプロジェクト運営と評価に利用できるような「新世代の比較法研究」の枠組みを構想し、その具体化を考察すること、(2)行政学の政策評価の手法を取り入れて、法整備支援の評価手法を確立すること、の2点を目標としてきた。これらの研究の過程で明らかになった問題や研究成果を報告書『法整備支援の情報基盤:比較法研究の新たな枠組』(松浦好治、F.Bennett、養老真一、田中規久雄編)として刊行した。本報告書では、評価手法の開発だけに焦点を小さく絞ることはせず、「新世代比較法研究の枠組み構築」という観点から研究成果をとりまとめている。今後、これらの成果を踏まえて、さらなる研究が展開されることが期待される。計画研究C1「法整備支援の手法と評価に関する理論研究」の研究実績の概要は、以下のとおりである。(1)本年度は、対外支援の有効性を図るためにこれまで用いられてきた手法の特定とその長所・短所を分析して特定する準備作業を行った。具体的には、国際協力事業団(JICA)の採用している評価手法の確認作業から開始した。JICAの手法の中に「参加型」評価と呼ばれる手法が導入されつつあること、その特徴についての資料収集と、理解を深めた。(2)スウェーデンの支援機関であるSidaについても研究の一環として2001年度に訪問調査を行った。それによって収集した評価に関する資料の分析作業を始めつつある。(3)名古屋大学が関係しているベトナムに対する法整備支援事業に関連して2002年1月にベトナムで日本側とベトナム側の間で年次協議が行われた。この年次協議は、当該年度の支援事業の評価を中核としており、その現地調査に参加し評価のプロセスの流れを直接観察した(4)2002年2月16-17日に名古屋大学で開催された「21世紀中央アジアにおける体制転換と法-法整備の現状と課題-」では、中央アジア3カ国の法整備への需要の大きさが明らかになっただけでなく、「有効かつ効率的な支援」のための評価方法についても意見を交換した。世界銀行やアジア開発銀行など多くの国際支援機関は、その事業が効率的に行われていることを確認評価し、その後援助プロジェクトの質を向上させるための評価プログラムをそれぞれ用意している。今年度は、世界銀行、アジア開発銀行、国連開発計画、JICA、スウェーデンのSidaなどの援助機関が評価に関連してどのようなアプローチを採用しているのかに関して、聞き取り調査及び文献調査を行った。これらの調査の報告は、それぞれ文書として蓄積されつつある。また、支援対象国で実際に実施された評価活動に参加し、そこから評価の実態や有効性を考えるという観点から、今年度は、JICAのベトナム法整備支援、第2フェーズ終了評価の企画立案にアドバイザーとして参加する一方、現地における評価自体にも参加して、検討を行った。評価枠組みの多様性を研究の射程に取り込むため、法整備支援以外の事業にも検討の範囲を拡大した。高等教育機関の外部評価は、法整備支援とは直接関係しないが、その評価手法は、法整備支援評価についても転用できると思われるので、イギリスにおける大学評価の手続き、その有効性についても、現地調査に参加する一方、資料の検討を進めた。日本の学位授与機構の行う評価手法についても比較の観点から概観を行った。評価の基礎となるデータの整備も重要であり、世界銀行が作成中の世界の司法と法運用の実態を統計情報から明らかにするプロジェクトにも参加し、データの収集作業を進めている。(1)支援記録のデジタルデータ化ラオスおよびベトナムに対する日本の法整備支援の記録をデジタルデータ化する作業を進め、ラオスについてはその作業を完了し、ベトナムについては継続中である。

この記録から、日本の法整備支援の特徴を明らかにし、あわせてその中でどのような評価が行われ、その後の支援に影響を及ぼしたかの検討に着手した。(2)有力な支援機関である世界銀行が法整備支援の領域でどのような支援活動評価を行っているかを調査した。その成果は、英文および日本語要約の資料としてまとめてている。(3)プロジェクトの評価について、テレビ会議システムがどの程度効率的であるかを調査するため、世界銀行がワシントンとベルギー裁判所支援機構を結んで行ったテレビ会議に参加した。また、JICAが留学生選抜のために導入したテレビ会議システムには積極的に協力し、その長所と短所に関する調査を進めている。(4)ベトナムにおいて、草の根支援の観点から支援の有効性や紛争解決の実態に関する研究を進めた。(5)行政学を中心として、政策評価に関する最新の学問的戎果を共通理解にする目的で一連の研究会の実施と、法整備支援当事者からの聞き取り作業の実施は、不十分な状態にある。1.発展途上国において起草された法案と現行法との間で矛盾がしばしば発生する。そのため、起草された法案の品質を評価し、起草段階から法令間の整合性を確保する手段を講じる必要がある。そのための立法支援ソフトの研究を進め、ベトナム司法省と共同で日本語のソフトをベトナム語化する作業を進めた。2.ベトナムに対する法整備支援の適切さを草の根レベルでモニターする研究を昨年度同様継続して行った。3.日本法令を英訳するための基礎調査として、フランス司法省法令英訳プロジェクトの実施調査を行い、法令英訳の手順、問題点などを総合的に洗い出す作業を完了した。4.法と開発というテーマで国際シンポジウムを実施し、これまでの各国の法整備事業の概要、問題点、改善の方向について検討した。詳細であるよりは、簡便で継続的に使用できる評価が必要なこと、国際的な評価体制のあり方などについて、情報を収集した。日本法令の英訳プロジェクトが進行中であり、このプロジェクトは、各国の法制度に関する最新の生きた情報を共有するための基盤となりうる点が報告された。5.中国民法プロジェクトを推進し、市場経済化に対応する中国の努力に協力した。これにより、機能する民法典に関する研究を進めた。6.日本のベトナムとカンボジアに対する法整備支援活動を歴史的に回顧し、その特徴を分析する作業を行い、その成果をまとめた。基礎資料についても、電子情報化をほぼ完了した。研究計画に従った活動を行い、次のような成果を得た。1.昨年度にまとめたカンボジア、ベトナムに対する日本の法整備支援の記録の分析を進め、報告書にまとめる作業を行った。この成果は、報告書の一部に組み込まれる予定である。この作業は、評価を行うための基礎資料の整備と分析という意味を持っている。2.ウズベキスタンについては、名古屋大学を中心とした法整備支援活動について、とくに法令起案・および法令データ的提供システムの近代化のための基礎調査を行い。データベース管理と法令起案システムの改善に関する勧告意見を提供した。
位置情報システムを用いた公共図書館利用者の情報探索行動の傾向と要因分析

位置情報システムであるRFID(無線周波個体識別)技術を用いて,公共図書館利用者の情報探索行動について調査を行った。その結果,ゾーンごとの滞在時間や滞在経路などのデータを得ることができた。例えば,滞在時間は3分の1以上の利用者が30分未満と短い一方で,120分を超える利用者が約7%と少ないながらも存在する。また滞在場所は,約80%が,一般図書ゾーンであり,インターネットや契約データベース利用を含むコンピュータゾーンの滞在時間が8%にも満たないこと等が明らかになった。今回採用した手法から,図書館利用者の情報探索行動を説明するために必要なデータを得られることを確認した。本研究では,公共図書館における利用者の情報探索行動を解明することを目的とし,近年開発の進むRFID(無線周波固体識別:Radio Frequency Identification)の技術を応用して,利用者が情報探索を行う際の行動軌跡を記録,分析している。本年度は,3年計画の2年目にあたる。初年度は,情報収集や調査依頼館の決定,調査依頼館において予備調査を実施した。本年度は,初年度に行った予備調査において明らかになった問題点を改善できる方策を検討し,調査依頼館において本調査を実施した。本調査では,図書館来館者にRFIDのアンテナと電波を蓄積するためのアンテナを携帯してもらい,通常通りに図書館を利用してもらった。調査依頼館の所蔵する個々の資料にはRFIDタグが貼付されているため,資料の書誌データを利用することで,利用者の館内における時間ごとの位置と滞在中の行動軌跡を得ることができた。また利用者の退館時には,利用者の属性や,利用内容,図書館に対する認識などを問う質問紙調査を行った。これは,RFIDタグにより得られたデータを,利用者のニーズや認識により,分析するためである。調査の結果,館内における行動軌跡に関するデータと,質問紙調査の結果の両方が有効なデータは,合計211名分であった。これらのデータを,滞在時間,移動距離,部門ごとの滞在時間,資料の主題部門ごとの滞在時間等ごとに集計を行った。本研究では,公共図書館における利用者の情報探索行動を解明することを目的とし,近年開発の進むRFID(無線周波固体識別:Radio Frequency Identification)の技術を応用して,利用者が情報探索を行う際の行動軌跡を記録,分析してきた。本年度は,3年計画の3年目にあたる。初年度は,情報収集や調査依頼館の決定,調査依頼館において予備調査を実施し,2年目は,初年度に行った予備調査において明らかになった問題点を改善できる方策を検討し,調査依頼館において本調査を実施した。3年目にあたる本年度はデータ分析を経て,この手法の有効性を検討し,論文執筆を行うことを目指した。その結果,資料に貼付されたRFIDタグを用いた位置特定システムには,利用者の館内行動を把握するためのデータを取得するのに有効であること,館内の位置(書架に配架された資料の分野に至るまで)に関する詳細なデータを得ることが可能であることが確認された。データの分析の最初の段階では,業者に作成を依頼したアプリケーションソフトを使用して集計を行ったが,専門家に相談する中で,統計処理を行えば,より詳細は分析が可能であることがわかり,統計用の言語であるRを使った分析に着手した。この作業により,予定が大幅に遅れたものの,新たな可能性も見いだすことができた。調査で取得した時系列データ(時刻と座標上の位置)を用いて,平面上の確立密度を算出し,グループごとに行動パターンの傾向を見いだすことができる。例えば,資料を借りた利用者と借りなかった利用者とでは,明らかに訪問エリアに違いがある。現在も作業は継続中なので,次年度中には論文執筆を行い成果を公表する予定である。本研究では,公共図書館における利用者の情報探索行動を解明することを目的とし,近年開発の進むRFID(無線周波個体識別:Radio Frequency Identification)の技術を応用して,利用者が情報探索を行う際の行動軌跡を記録する。また探索行動に影響を与える種々の要因について,被験者に対して質問紙調査も同時に行う。本年度は3年計画の初年度にあたるため,情報収集,文献収集を行って,調査協力館と使用する機材を決定し,調査協力館に協力を依頼し,協力範囲について交渉を行った。またこれまでの研究成果を,Evidence BasedLibrary and Information Practice Conference in Salford(Greater Manchester, UK, June 30th 2011)において発表し,研究者や図書館員から意見をもらった。さらに,図書館利用者の行動軌跡を記録するための実験と予備調査を実施した。利用者の行動軌跡の記録には,平成21年に申請者が実施した調査で用いた位置情報システム(RFIDタグやリーダ・ライタ,データを処理するソフトウェア)をもとにして,より性能のよい機材を検討し,作成した。予備調査では,利用者に小型のアンテナ携帯して図書館滞在中に自由に過ごしてもらった。

アンテナは図書に貼付されているRFIDタグの電波を受信するため,個々の図書に記録された情報から,館内の位置を推定できることがわかった。電波の受信が不足する箇所には,設置用のタグを置いて補うなど,本調査に向けて機材や環境の調整を行った。以上により,今回システムにより,どのような方法で,どのようなデータを得ることができるかを把握することができた。本調査ではどのようなどのような分析が可能かについても,一応の目処を得ることができた。本年度の主な予定は,調査依頼館における本調査の計画と実施であった。予備調査においてみつかったいくつかの問題(図書館内においてRFIDタグから発信されるデータが得られない場所があるなど)について,調査手法を修正することで,おおむね解決することができ,予定していた調査計画を大きく変えることなく,無事に本調査を終えることができた。また,200件を超えるデータを得ることができたため,分析に必要なデータを一応得られたと考えている。ただし調査の実施最中に,館内における特定の位置において,データの精度が低くなることなど,分析に影響を与えるであろう問題もみつかっている。引き続き分析の手法を検討していく必要がある。また,目標としていた研究発表も無事に終えることができた。調査協力館を探し依頼すること,情報収集・文献収集を行うこと,学会発表を行うこと,そして予備調査の計画をたて実施することという当初の研究計画は一応無事に終了することができた。特に調査協力館として,理想的な図書館から協力の承諾を得ることができたことは,大きな収穫であった。また学会発表を行い,図書館員や研究者から率直な意見を得ることができたことも,今後の計画を考える上で参考になった。ただし,すべてが計画通りに進んだわけではない。本来は平成23年8月9月に実施予定であった予備調査が,実際には平成24年2月3月に遅れてしまった。これは,図書館が採用するタグの種類がすべて今回の調査が可能なものではなく,事前に数種類の機材を借りて実験をしなければならなかったため,予想以上に時間がかかったことと,第二回の助成金受入が終わるまで,業者の選定を始めることができなかったためである。時期は遅れてしまったが,調査協力館からの十分な支援を受けることができ,また心配していたトラブルも発生することなく予備調査を進めることができたため,本調査に必要な準備は一応無事に終えることができたと考えている。本調査で得られるであろうデータと分析の見通しを立てることができ,手法の検討を終えることができたため,予定どおり本調査を実施する見込みを得ることができた。平成24年度の研究計画は,無事に進行したため,平成25年度も,申請時の計画どおり進めたいと考えている。平成25年度には,平成24年度に得られたデータを整理し,分析を行う。得られたデータの分析方法として,単純集計以外の統計的手法を模索したい。
赤血球膜Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの簡易活性測定法開発と臨床検査への応用

我々は赤血球膜蛋白から高純度のNa+/K+-ATPaseを得るためにWGA-Agaroseゲルを用いて夾雑物の分離を行った。その結果、0.03M GlcNAcを用いて溶出したピークを目的物質として捉えることができた。この蛋白質を検証するためにSDS-PAGEを用いたNa+/K+-ATPaseサブユニット構造の解析を行った。鍍銀染色の結果、分子量97kDa付近にBF1、BF2、BF3ともに目的とするバンドが確認できた。さらに我々がブタ腎から単離したNa+/K+-ATPaseと比較検討した結果、溶出ピークは一致していた。これにより簡易的に赤血球膜からNa+/K+-ATPaseの単離法が確立できた。本研究の最終目的は赤血球からのNa+/K+-ATPaseを単離する方法を開発することにより糖尿病を始め、骨粗鬆症、関節リウマチなどの生活習慣病の予防や診断に貢献できる新たな臨床検査法を確立することにある。そのため平成25年度では24年度に行ったHPLC(高速液体クロマトグラフィ)を用いた赤血球膜からのNa+/K+-ATPaseの単離を試みるための基礎的研究を元に実際に赤血球膜からの蛋白の単離を試みた。HPLCによるNa+/K+-ATPaseの単離赤血球膜からの膜蛋白質を精製するため赤血球に冷却H20を作用させることで溶血させ、遠心分離を行い膜蛋白のみを精製した。その後、非イオン性界面活性剤のC12E8と膜蛋白濃度の混合比を変化させ、可溶化濃度を測定したところ蛋白濃度2mg/ml:C12E8濃度6mg/mlの割合が最も可溶化されることが示された。そこでP/C=2/6で可溶化し、0.2mg/ml C12E8 pH5.6の溶出液を用いてNa+/K+ーATPaseのOligomers構造の検出のためC12E8ーSECを行ったところ、複数のピークが認められた。アルブミンの分取位置から分子量を推測し、Na+/K+-ATPaseのTetraprotomer(T)、Diprotomer (D)、Protomer(P)であることが示唆された。さらにNa+/K+-ATPaseサブユニット構造(α、β、γ)の検出と定量のために採取したT分画、D分画、P分画を濃縮し、1.0%SDS pH7.0の溶出液を用いてHPLCを用いて分離を試みた結果、3つの溶出位置の異なるピークが認められた。それぞれピークの大きさは異なるもの同一溶出位置に分取されたため、Na+/K+-ATPaseのα、β、γであることが推察された。またWGA-Agaroseゲル(Bio Rad)を用いてNa+/K+ーATPase以外の夾雑物を除くことでより純度の高い赤血球膜Na+/K+ーATPaseの分離を試みた。その結果、0.03MのGlucNacで溶出したピークを目的物質として捉えることができた。本研究の最終目的は赤血球からのNa+/K+-ATPaseを単離する方法を開発することで糖尿病を始め、骨粗鬆症、関節リウマチなどの生活習慣病の予防や診断に貢献できる新たな臨床検査法を確立することである。平成24年度では下記に示す基礎的検討を行った。(1)HPLCによるNa+/K+-ATPaseの単離のための検討Na+/K+-ATPaseのSubunits構造解析のために必要な条件として、TSKgel G4000SWXLを用いてElution Bufferに界面活性剤としてSDSおよびEDTAを混じることによりα、β、γの検出が可能となり、またOligomers構造解析のためにはTSKgel G4000SWXLとG3000SWXLのカラムを組合せ、Elution Bufferに界面活性剤としてC12E8とプロピオン酸カリウムそしてpHを酸性の5.6にすることが適していることを見いだした。さらに赤血球膜からの単離に適した条件として、WGA(小麦胚芽)レクチンカラムを用いて、タンパクがレクチン-アガロースカラムに結合した後、阻害糖であるN-アセチルグルコサミン(GlcNAc、NAG)を用いてリニアグラジエントで溶出することでNa+/K+-ATPaseを単離できることを明らかにした。(2)関節リウマチとNa+/K+-ATPaseとの関連性関節リウマチ患者は破骨細胞が活性化しており、骨から血中へのCaの漏出が進み、その結果、骨粗鬆症が認められる。

関節リウマチ患者(20名)の血清検体を用いて我々が開発したTRACP-5a,5b同時検出法で両者の活性を測定したところ5aは全ての検体で高値を示し、骨疾患を併発している患者は5bも高値を示すことが明らかとなった。今後、上記方法でのNa+/K+-ATPase活性値との関連性の解析を進める予定である。本研究の最終目的は赤血球からのNa+/K+-ATPaseを単離する方法を開発することで糖尿病を始め、骨粗鬆症、関節リウマチなどの生活習慣病の予防や診断に貢献できる新たな臨床検査法を確立することである。本年度は赤血球膜蛋白の中からより純度の高いNa+/K+-ATPaseを得るためにWGA-Agaroseゲルを用いて夾雑物の分離を試みた。その結果、阻害糖である0.03M GlcNACで溶出したピークを目的物質として捉えることができた。またSDS-PAGEを用いたNa+/K+-ATPaseサブユニット構造の解析を行ったが泳動後のCBB染色では検出感度の問題でバンドが認められなかったため鍍銀染色を試み、標準物質であるNa+/K+-ATPaseα1に認められ、FTに認められないバンドの検出を行った。その結果、スタンダード分子量97,000付近にBF1、BF2、BF3に抽出された蛋白質に目的とするバンドが確認できた。さらに我々がブタ腎尿細管上皮より分離精製したNa+/K+-ATPaseと比較検討して赤血球膜から得られた標品が目的物質かを検証した。C12E8ーSECを行ったところ、Na+/K+-ATPaseの3つのピークが確認でき、これらはブタ腎から得られたピーク位置と一致していた。さらにNa+/K+-ATPaseサブユニット構造(α、β、γ)の検出と定量のために採取したT分画、D分画、P分画を濃縮し、1.0%SDS pH7.0の溶出液を用いてHPLCを用いて分離を試みた結果、3つの溶出位置の異なるピークが認められ、これもブタ腎から得られたNa+/K+-ATPaseのα、β、γの溶出位置と一致していた。その結果、我々が開発した赤血球から簡易的に単離する方法は、目的物質を的確に捉えていることが確認できた。臨床検査交付申請書に記載した研究計画では平成25年度の実験において赤血球Tetraprotomer(T)の純度検定や内因性ウアバインとNa+/K+-ATPase複合体の検出と簡易活性測定法の開発を行うことが主の目的となっていた。前年度の目標を達成するために精力的に実験を進めたが、赤血球膜に存在するNa+/K+-ATPaseは単離することはできても非常に微量のため検出が難しく、濃度の調整や夾雑物の除去に時間を取られ、試行錯誤を繰り返したために計画通りには進んでいない。しかし、赤血球膜からの膜蛋白質の精製、Na+/K+ーATPaseのOligomers構造の検出そしてNa+/K+ーATPaseサブユニット構造の解析を行うことができ、目標の80%は達成されたと考える。また糖尿病、骨粗鬆症などの生活習慣病患者のNa+/K+-ATPase活性値と病態との関連性について、骨粗鬆症患者(20名)の血清検体を用いて我々が開発したTRACP-5a,5b同時検出法で両者の活性を測定した。その結果、5bは全ての検体で高値を示し、マクロファージ活性化の指標となる5aについては炎症性疾患の併発と関連して上昇していることを見いだした。骨細胞のNa+/