hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非肥満型非アルコール性脂肪性肝炎における胆汁酸の影響

我々はこれまで、高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料で肝臓脂肪蓄積・肝炎・線維化へと進展する非肥満型非アルコール性脂肪肝炎(NASH)モデルSHRSP5/Dmcrを開発してきた。HFC飼料は、普通飼料に脂質、コレステロール、胆汁酸が添加されている。これまで、HFC飼料に添加されている成分である胆汁酸の影響は明らかにしていない。そこで、本研究では、非肥満型NASH病態における胆汁酸の影響を明らかにすることを目的とする。動物は、SHRSP5/Dmcr:Arteriolipidosis-prone rats(ALR)雄性10週齢(24匹)を用いた。飼料は、高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料の胆汁酸濃度が異なる餌4種1胆汁酸0%、2胆汁酸0.5%、3胆汁酸2%(従来のHFC飼料)、4胆汁酸4%とした。摂餌期間は8週間とし、自由摂取とした。本モデルは痩せ型でNASH様の肝障害を確認することから、NASHの痩せの原因を明らかにするため、胆汁酸の褐色脂肪細胞の受容体(TGR5)を介する影響の評価を試みた。褐色脂肪細胞のTGR5発現は、免疫染色による染色程度を胆汁酸濃度が異なる4種類の飼料群間で確認した。免疫染色の条件設定に手間取っていたが、抗体の選定、各種条件検討を行い、染色条件が定まった。褐色脂肪細胞TGR5発現は、いずれの群も脂肪組織に対して原則びまん性に陽性を示した。4群間の比較は、胆汁酸0%を基準に比較した。染色強度においては群間に差が認められなかった。小腸TGR5発現は、陰窩粘膜層中層程度の範囲の上皮に染色性を認めた。4群間の比較は、群間に染色強度や養成分布に差は認められなかった。これらのことから、SHRSP5/DmcrのNASH肝障害の原因は、褐色脂肪細胞及び小腸のTGR5を介した経路以外である可能性が考えられた。ヒトNASH患者と同じく高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料の摂取により、重篤な肝線維化を引き起こすがHFC飼料に添加されている成分の何が直接の原因か明らかにされていなかった。これまで、脂質の吸収を促進する目的で添加されている「胆汁酸」のNASH病態への影響は検討していない。そこで、今回の研究は、非肥満NASHにおける胆汁酸の影響を検討することを目的とした。動物は、SHRSP5/Dmcr雄性10週齢を使用し、高脂肪・高コレステロール(HFC)の胆汁酸(CA)濃度が異なる飼料4種、計4群(各6匹)に分ける。1CA0%、2CA0.5%、3CA2%、4CA4%。摂餌期間は8週間とした。体重、血圧は隔週で計測した。肝臓重量、一般血液生化学項目は摂餌後8週間目に測定した。肝臓の病理所見は脂質沈着、炎症と線維化を検討するため、それぞれヘマトキシリンエオジンとアザンで染色した。体重は、CA濃度が高くなるほど低値を示した。血圧は、CA4%群が他の3群に比較し有意な低値を示したが、CA0%、0.5%、2%群の間にそれぞれ有意な差は認められなかった。肝臓重量は、CA4%群を除き、CA濃度が高くなるほど高値を示した。血清総コレステロールとγ-GTPは、CA4%群が他の3群に比較し有意な高値を示した。ASTとALTは、CA0%群に比較しCA0.5%、2%、4%群がそれぞれ有意な高値を示した。肝臓の形態変化は、CA濃度が高くなるほど肝臓の白色化と硬化の進行が認められた。組織学的には、肝臓への脂質沈着、炎症、線維化が認められ、CA濃度が高くなるほど大滴性脂肪、線維化の進行が認められた。今回の研究では、SHRSP5/DmcrのNASH病変に対して、餌の含有成分である胆汁酸が影響を与えているかを検討する。3年計画の1年目である今年度は、胆汁酸の一種であるコール酸濃度の異なる餌を調整した。調整した餌を、対象動物に与えて各サンプルを取得し、今後の解析の下準備を行った。各群対象動物の摂餌中の状態は、体重と血圧を定期的にモニタリングすることにより確認した。取得したサンプルを組織学的に評価するため、肝臓の組織標本を作製後、脂肪沈着・炎症はヘマトキシリン・エオジンで、線維化はアザンでそれぞれ染色し、観察した。これらの結果から、食事性胆汁酸濃度が増えると肝障害が重症化することを明らかにした。しかし、これらを数値化して評価するには至らなかった。また、食事性胆汁酸の受容体を介した病態への影響は、褐色脂肪細胞の受容体G protein-coupled receptor(TGR5)の免疫染色が難航し、結果を出すまでには至らなかった。

これまで、NASH病態に及ぼすHFC飼料に添加された成分の影響として、次の2点、1脂質量の影響、2コレステロールの影響、を明らかにしてきた。しかし、HFC飼料に添加されている最後の成分である「胆汁酸」の影響は明らかにしていない。そこで、本研究では、非肥満型NASH病態における「胆汁酸」の影響を明らかにすることを目的とする。動物は、雄性10週齢SHRSP5/Dmcrを使用し、飼料は、胆汁酸濃度が異なるHFC飼料を4種類用いた。胆汁酸濃度は、1HFC胆汁酸0%、2HFC胆汁酸0.5%、3HFC胆汁酸2%(従来HFC飼料)、4HFC胆汁酸4%とした。摂餌期間は8週間とし、自由摂取とした。本モデルは、痩せ型NASHを発症することから、NASHの痩せの原因を明らかにするため、胆汁酸の褐色脂肪細胞の受容体(TGR5)を介する影響の評価を試みている。そこで、褐色脂肪細胞のTGR5の免疫染色を行い、その染色の程度を胆汁酸濃度が異なる4種類の飼料群間で比較することを試みている。現在、免疫染色のための、抗体の選定、各種条件の検討を行い、免疫染色の条件設定がおおむね最終段階に入った所である。褐色脂肪細胞の受容体(TGR5)を介する影響は、ミトコンドリアが活性化し、エネルギー消費量が増加することで抗肥満作用を示す報告がある。本モデルは、痩せ型NASHを発症することから、その痩せの原因を明らかにするため、褐色脂肪細胞の受容体(TGR5)を介する影響の評価を試みている。これにより、食事性胆汁酸濃度がNASHにおける非肥満作用に関係する一因を明らかにしようとしている。しかし、褐色脂肪細胞の免疫染色の条件設定が定まらず、抗体の変更、その他条件の変更など、いくつかの条件検討を試み、適切な染色条件を探っている。我々はこれまで、高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料で肝臓脂肪蓄積・肝炎・線維化へと進展する非肥満型非アルコール性脂肪肝炎(NASH)モデルSHRSP5/Dmcrを開発してきた。HFC飼料は、普通飼料に脂質、コレステロール、胆汁酸が添加されている。これまで、HFC飼料に添加されている成分である胆汁酸の影響は明らかにしていない。そこで、本研究では、非肥満型NASH病態における胆汁酸の影響を明らかにすることを目的とする。動物は、SHRSP5/Dmcr:Arteriolipidosis-prone rats(ALR)雄性10週齢(24匹)を用いた。飼料は、高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料の胆汁酸濃度が異なる餌4種1胆汁酸0%、2胆汁酸0.5%、3胆汁酸2%(従来のHFC飼料)、4胆汁酸4%とした。本モデルは痩せ型でNASH様の肝障害を確認することから、NASHの痩せの原因を明らかにするため、胆汁酸の褐色脂肪細胞の受容体(TGR5)を介する影響の評価を試みた。褐色脂肪細胞のTGR5発現は、免疫染色による染色程度を胆汁酸濃度が異なる4種類の飼料群間で確認した。免疫染色の条件設定に手間取っていたが、抗体の選定、各種条件検討を行い、染色条件が定まった。褐色脂肪細胞TGR5発現は、いずれの群も脂肪組織に対して原則びまん性に陽性を示した。4群間の比較は、胆汁酸0%を基準に比較した。染色強度においては群間に差が認められなかった。小腸TGR5発現は、陰窩粘膜層中層程度の範囲の上皮に染色性を認めた。4群間の比較は、群間に染色強度や養成分布に差は認められなかった。これらのことから、SHRSP5/DmcrのNASH肝障害の原因は、褐色脂肪細胞及び小腸のTGR5を介した経路以外である可能性が考えられた。
国家の戦争行為責任と「戦後補償」に関する実証的研究

1.本研究は、種々の「戦後補償」請求訴訟で問われている問題について、憲法・国際法・政治学・歴史学の立場から学際的・比較法的に実証研究を行うことを目的とした。2.われわれが平成5年度6年度に渡る図書購入・分析、調査出張等による資料収集や聞き取り、専門家を招いた研究会や研究取りまとめのための合宿研究会を通じて得た新たな問題解明の成果を総括するならば、おおむね以下の通りである。(1)韓国、朝鮮人の強制連行・労務強制および従軍慰安婦の強制、中国人の強制連行はいずれも日本が当時加入していた国際条約に違反し、それらの人々との関係では不法行為責任が発生しており、日本国憲法前文の規定を媒介としてその責任は日本国に継承されていると考えるべきであろう。(2)政府は条約において補償請求権を放棄することができるが、それは政府の外交保護権の放棄にとどまり、個人の意思によらずに補償請求権を放棄することは許されない。その意味で日韓請求権協定に伴う日本の国内法による韓国国民(ただし在日韓国人を除く)の請求権の消滅規定は、適正手続きによらない人の財産権の剥奪に当たり、違憲問題を提起するであろう。平成7=1995年は戦後50年である。早急な個人補償を求めるアジアの民衆に対する戦争責任と真摯に向き合う「過去の克服」という重い課題に仕えるためには、国会の不戦決議を経た立法的解決、すなわち本共同研究報告書に資料として収めた外国人戦後補償法試案(戦後補償を考える弁護士連絡協議会案)のような立法の制定が望ましいであろう。1.本研究は、種々の「戦後補償」請求訴訟で問われている問題について、憲法・国際法・政治学・歴史学の立場から学際的・比較法的に実証研究を行うことを目的としている。2.われわれが今年度の図書購入・分析・調査出張による資料収集・聞き取り、専門家を招いた研究会・シンポジウムおよび合宿研究会を通じて得た問題解明の成果は、おおむね以下の通りである。(1)「補償」(ドイツ語のWiedergutmachung)とは、国家間の戦争賠償とは異なり、当該国家の戦争行為によって被害を受けた人々の対する「償い、贖い」を意味し、それを法的に構成しなければならない。(2)韓国・朝鮮人の強制連行・労務強制および従軍慰安婦の強制、中国人の強制連行はいずれも日本が当時加入していた国際条約に違反し、それらの人々との関係では不法行為責任が発生しており、日本国憲法前文の規定を媒介としてその責任は日本国に継承されていると考えるべきであろう。(3)政府は条約において補償請求権を放棄することができるが、それは政府の外交保護権の放棄にとどまり、個人の意思によらずに補償請求権を放棄することは許されない。3.戦後補償問題の早急な解決には、困難な裁判的救済の方式よりも国会会議を経た立法的手当のほうが望ましいとも考えられ、さらに国際的には第三者機関の設置による基金運用の方式も検討されるべきであるが、これらは次年度の研究課題としたい。2.われわれが昨年度に引き続き本年度の資料収集、専門家を招いた研究会および合宿研究会などを通じて得た新たな問題解明の成果を総括するならば、おおむね以下の通りである。(1)日本の戦争責任と戦後責任・戦後補償問題を取り扱った図書・資料は、この数年でかなりの点数が発表された。われわれの共同研究では、これらの文献を整理することも重要であると考え、「法学セミナー」誌からの掲載依頼に応えて戦後補償研究会の名で文献案内を執筆・発表した。

これは、同じテーマを研究する人々に対して適切な水先案内の役割を果たすことができるものと思う。(2)本共同研究では、与党戦後50年問題プロジェクト・従軍慰安婦問題等小委員会の「いわゆる従軍慰安婦問題についての第1次報告」(平成6.12.7)、および内閣外政審議室による「戦後50年への取り組み(対外関係)に関する予算措置について」(平成7.1.27)を入手し分析・検討したが、われわれは、これらは平和条約などの国家間賠償処理による決着にこだわるために、個人補償を求めるアジアの民衆に対する戦争責任と真摯に向き合う「過去の克服」という重い課題に仕えるものとはいえないと判断した。3.平成7=1995年は戦後50年である。戦後補償問題-個人補償の実現-の早急な解決には、国会の不戦決議を経た立法的解決、すなわち本共同研究報告書に資料として収めた外国人戦後補償法試案(戦後補償を考える弁護士連絡協議会案)のような立法の制定が望ましいであろう。
黄鉄鉱中に存在する重金属元素のナノ・原子レベル解析

浅熱水性鉱床中の主要なAuのホスト鉱物である、ヒ素含有パイライト、arsenian pyriteに注目して、結晶化学的特徴から、生成プロセス、環境への影響の解明を目指した。Asが3+という通常よりも酸化的な条件で生成したArsenian Pyriteを発見し、その重金属含有量、構造の歪、粒径のナノ化を明らかにした。また、Asに富む流体包有物がナノスケールで、pyrite中に存在することを示した。AsとCuには逆相関関係があり、その産状から鉱床形成時の条件を推定することができた。さらに、還元条件において鉄硫化物のナノ鉱物とAsとの相互作用を実験的に解明した。本研究課題は、浅熱水性鉱床におけるAuなど貴金属元素の重要なホスト鉱物であるarsenian pyrite,Fe(As^<-1>,S)_2に、貴金属、有害重金属がどのような状態で存在しているか、原子・ナノレベルの分析から明らかにすることを目的としている。本年度の実行計画に基づき、カーリンタイプ・熱水タイプ鉱床の観察・分析を行ったところ、ペルー、Yanachocha金鉱床のパイライト試料の中に、通常のAsの形式とはことなるAs3+のパイライトを初めて発見した。Asは一つのパイライト粒子の中でAsに富むマイクロゾーニングを構成していた。XPS測定からAsは3価の陽イオンとして置換していることが分かり、微量元素成分は、3.05at%ofAs and0.53at.%,0.1at.%,0.27at.%,0.22at.%,0.08at.%and0.04at.%ofPb, Au, Cu, Zn, Ni, andCoであった。HRTEM観察から、Asフリーのコア粒子にシャープな境界でゾーニングが開始しているのが見られた。また、各ゾーンは8-20nm、100-300nm、400-900nmのサイズの異なるナノ結晶の集合体から構成され、結晶サイズが小さいものほど高濃度の有害重金属を含有することが示された。熱力学的相図関係から、この新しい形式のAs-pyriteは、比較的酸化的で3価のAs化学種が存在するまれな条件下(高sulfidation epithermal鉱床と浅部の地下水系との混合条件)で形成されることが分かり、そのような条件下でのナノ結晶が重金属取り込みメカニズムの重要な役割を果たしていることが明らかとなった。一方、ドミニカ共和国、Pueblo Viejoのパイライトは(Fe_0.998As_0.003)_1.001S_2から(Fe_0.963As_0.050Cu_0.003Ag_0.001)1.017S_2の組成を持ち、FeとAsが逆相関の関係にあった。HRTEM観察から、ナノスケールの非晶質As-Fe-Sインクリュージョンが見つかり、それらがAs-pyriteの(100)面に平行に析出していることが示された。このインクリュージョンは、およそ62at%S, 28at%Fe, and10at%Asの組成をもち、As-pyriteの第三のAs担持構成成分として存在することが明らかになった。本研究課題は、浅熱水性鉱床においてAuなど貴金属元素の主要なホスト鉱物であるarsenian pyrite, Fe(As^<-1>, S)_2中の貴金属、有害重金属存在状態を原子・ナノレベルの分析から明らかにすることを目標にした。本年度の実行計画に基づき、カーリンタイプ・熱水タイプ鉱床の観察・分析を継続して行った。また、これら有害金属を含むpyriteの表層環境中における変質過程を解明するためにAsと硫化物の相互作用の実験も行った。Pueblo Viejo(ドミニカ共和国)とYanacocha(ペルー)は高sulfidation-Au-Ag鉱床で、マグマティックな蒸気プルームとの相互作用で生成したと考えられているが、その主要構成鉱物であるpyriteのEMPA、SIMSを用いた分析から、3つのタイプの成長ゾーンが存在することが分かった。ひとつは、Au, Ag, Sb, Te, Pbに富むAs-richゾーンで、2つめはそれら重金属の含有量が極端に低いCu-richゾーン、3つめはどの重元素もほとんど含まないpyriteのゾーンであった。これらの明確なゾーン形成はpyrite生成流体とマグマ蒸気の断続的な混合によるものと考えられ、As-richな高温のマグマ蒸気と低温なCu-rich気相によるものであることが示唆された。さらに、Asと硫化鉄の相互作用を調べるために、無酸素条件下においてmackinawite(FeSm)とAs^<3+>反応実験をpH=5と9、室温でおこない、生成物を透過型電子顕微鏡とX線光電子分光法で分析した。pH5では非晶質のAs硫化物が沈殿し、そのAsの酸化状態はrealgarに類似した。

一方pH9において非晶質As硫化物は生成せず、As oxyanionがmackinawite表面にほぼ均一に吸着していることが分かり、これらの結果から、redoxプロセスと相転移のpH依存性が明らかになった。最後に、この2年間の研究で得られた成果を基に、チリ大学、オーストラリアCSIROとともに2010年ゴールドシュミット会議において、本研究のテーマに関するセッションを立ち上げることに成功した。
都市型大学の長期的基本計画書における計画項目と手法のデータベース化

本年度は、前年度に引き続き下記の内容を進めた。本研究は、現代の都市型キャンパスの計画理論を構築するため、これまでに計画されてきた海外ならびに国内の近代的大学キャンパス計画の実態とその実践形態をデータベース化して整理・応用することが目的である。データベース化にあたって、キャンパスの配置図を中心に、計画項目の関連を主題とした。アルゴリズムの発展キャンパスマスタープラン図面の収集を収集し、作成したデータベースに対して、データベースの中核となる配置図に関する分析手法として、配置図の幾何学的な建物どうしの距離関係を把握できるように、ランダム点法による障害物つき最短距離計測のアルゴリズムの開発を前年度に引き続き行った。アルゴリズムはランダムな点を手がかりに、最短距離を求めるまったく新しいタイプのもので、複雑な平面を持つ建物における避難シミュレーションや、建物内の人口分布を考慮した建築計画手法などに応用できる。アルゴリズムを実用ベースに乗せるため、処理方法を便宜的に近似できるように、ドロネイ網を利用して点の数を少数化できる手法も開発した。これにより、処理速度を飛躍的に向上し、より複雑な現実の建物のプランにも応用し、分析することが可能となった。今後はさらに精度を上げるような操作もアルゴリズムに組み込みたい。このアルゴリズムは数理的に一般解法を持たない問題を便宜的に解くことができるため、他の研究分野への応用も可能である。資料の整理・収集代表的な都市型キャンパスの諸元表を電子情報に変換するため、必要な資料の収集にあたった。ヒアリング調査によって得た情報に加えて、過去に出版されている文献や雑誌等の情報、そしてなにより、近年飛躍的に整備が進む、ネットワーク上の大学の情報からかなりの情報を得ることができる。それらの内容を整理しつつ、キャンパスの配置図を中核として電子媒体の上に記録する作業を行いつつある。データベースの開発キャンパスマスタープラン図面の収集、マスタープラン作成者、その他関係者へのヒアリング、キャンパス街の都市環境と学生の居住環境の調査、キャンパスが立地する都市の形成史と大学の発展史の資料収集、キャンパス内風景のビデオ・写真撮影などを行った。これらのデータを関連付けしてデータベース化を進めている。データベースの中核となる配置図に関する分析手法として、配置図の幾何学的な建物どうしの距離関係を把握できるように、ランダム点法による障害物つきの最短距離計測のアルゴリズムを開発した。
肺酸素障害発生機序の解明:摘出肺潅流モデルにおける活性酸素検出の試み

本研究の目的は酸素障害(oxidant stress)によるとされている障害の発生に、実際に活性酸素が関与していることを証明することである。本研究ではケミルミネッセンス法により摘出潅流肺におけるスーパーオキサイド(O^-_2)のex vivoでの検出を試みた。なお、酸素障害モデルとして高濃度酸素曝露動物を用いる計画であったが、技術的な問題等から、ARDS(adult respiratory distress syndrome)モデルとして一般によく用いられるリポポリサッカライド(LPS)投与による肺障害モデルについて主に検討した。1)ARDSモデル:LPS投与後経時的にラットから肺を摘出し、O^-_2を測定した。その結果、O^-_2産生およびPMA刺激によるO^-_2産生能の著しい増加を捉らえることができ、肺障害に先立って活性酸素が過剰に生成されることを証明した。また、opsonized zymosanを用いて刺激すると、O^-_2の細胞内での生成と細胞外への放出を同時に観察できる可能性が示唆された。O^-_2の産生細胞は、サイクロフォスファマイド投与により多挾球depletionモデルを作成して検討した結果、主に好中球によるものと考えられた。2)高濃度酸素曝露による障害モデル:高濃度(80%O_2)酸素下で一週間飼育したラットから摘出した肺について検討したところ、、無刺激でのphotonカウントがコントロールに比して有意に高く、O^-_2が無刺激で産生され続けていることが示唆された。しかし、この上昇はその後に添加したSODにより阻害されなかったことより、O^-_2はSODの到達しない間質や肺胞付近で発生しているものと考えられる。末梢血の好中球あるいは肺胞マクロファージを単離し、O^-_2産生能を測定したが、増加は認められず、炎症細胞の関与の可能性は少ないものと考えられた。O^-_2産生系について現在検討中である。ARDS、高濃度酸素による肺障害、虚血再灌流障害等の発症は、酸素障害(oxidant stress)によるものであると考えられているが、in vivoでの直接証明はほとんど得られていない。本研究では、酸素障害モデルとして高濃度酸素暴露を行い、ケミルミネッセンス法により摘出肺灌流肺におけるスーパーオキサイド産生のex vivoでの検出を試みた。100%酸素暴露したラットについて肺を摘出し、摘出灌流肺モデルを作成し、スーパーオキサイド産生および刺激剤を添加してスーパーオキサイド産生能を測定し、空気下で飼育したラットの肺と比較した結果、両者に有意の差は認められなかった。この理由の1つとして、装置側に問題点があることが考えられ、ラット肺でより感度よく発光を測定できるよう装置のblack boxを改良した。今年度は、酸素障害モデルとして、以前に行ったin vitroの実験結果より、スーパーオキサイド産生の検出がより容易であると考えられるリポポリサッカライド(LPS)投与による肺障害モデルについて検討した。LPS投与による肺障害はARDSモデルとして一般によく用いられる。その結果、スーパーオキサイド産生、およびphorbor ester opsonized zymosan刺激によるスーパーオキサイド産生能の著しい増加を捉らえることが出来、肺障害に先立って、活性酸素が過剰に生成されることを証明した。また、用いた2種類の刺激剤によるスーパーオキサイド産生能は異なるふるまい示し、ARDSの病態の一部を反映することが分った。この系でのスーパーオキサイド産生の主体は好中球、あるいはマクロファージであると考えられたが、現在、免疫学的手法によりそれぞれの役割を検討中である。

現在、装置の改良によりラット肺でのスーパーオキサイド産生測定に適した測定が可能になり、感度が約35倍に増加したので、次年度は再び高濃度酸素暴露動物について検討したい。本研究の目的は、酸素障害(oxidant stress)によるとされている障害の発生に、実際に活性酸素が関与していることを証明することである。本研究では、ケミルミネッセンス法により摘出潅流肺におけるスーパーオキサイドのex vivoでの検出を試みた。なお、酸素障害モデルとして高濃度酸素暴露動物を用いる計画であったが、技術的な問題等から、ARDS(adult respiratory distress syndrome)モデルとして一般によく用いられるリポポリサッカライド(LPS)投与による肺障害モデルについて主に検討した。ARDSモデル:LPS投与後経時的にラットから肺を摘出し、スーパーオキサイドを測定した。その結果、スーパーオキサイド産生、およびphorbor ester(PMA)刺激によるスーパーオキサイド産生能の著しい増加を捉らえることができ、肺障害に先立って活性酸素が過剰に生成されることを証明した。また、opsonized zymosanを刺激剤として用い、スーパーオキサイドの細胞内での生成と細胞外への放出を同時に観察できる可能性が示唆された。スーパーオキサイドの産生細胞は、サイクロフォスファマイド投与により好中球depletionモデルを作成して検討した結果、主に好中球によるものと考えられた。高濃度酸素暴露による障害モデル:無刺激でのカウントが有意に高く、スーパーオキサイドが無刺激で産生され続けていることが示唆された。しかし、これはその後に添加したSODにより阻害されなかったことより、スーパーオキサイドはSODの到達しない間質や肺胞付近で発生しているものと考えられる。末梢血の多核白血球あるいは肺胞マクロファージを単離し、スーパーオキサイド産性能を測定したが、増加は認められず、炎症細胞の関与の可能性は少ないものと考えられた。スーパーオキサイド産生系については検討中である。
アメリカ植民地時代史の研究

今回の研究計画は、ほぼ順調に消化されたとはいえ、マニュスクリプト史料の解読には予想以上の時間がかかり、ある程度のデータ化はおこないえたものの、未だ完全とは言いがたい。したがって、早急な研究結果の発表は現在のところ難しく、今後さらに史料の整理、データ化を進め、それらがまとまった時点で、論文の形にまとめたいと考えている。計量的な歴史研究には、多大の研究資金・時間が必要であり、根気強い研究態度が要求される。じっくりと腰を据えて、研究を継続・進展させてゆきたい。
多置換芳香族ボロン酸誘導体の新規合成法の開発

我々は昨年度に引き続き、ホウ素官能基を配向基として用いることでベンザインの反応位置選択性を制御し、多置換芳香族ボロン酸誘導体の新規合成法を開発することを目的として本研究を行ない、本年度は以下に示す成果を得た。1)ホウ素置換ベンザインと3-アルキルフランのDiels-Alder反応では、ホウ素官能基とフラン由来のアルキル基が隣接位に置換したsyn-付加体が高位置選択的に得られた。本反応はフラン上の3位アルキル基によって位置選択性が発現した初めてのDields-Alder反応である。2)ホウ素上の官能基を種々変えて2-アルキルフランとのDiels-Alder反応を検討したところ、特に立体的に小さなホウ素官能基を有するベンザインの場合に高い選択性が生じた。本結果は、ホウ素の高配位中間体が位置選択性発現に重要な役割を果たしていることを示す。また、ホウ素官能基として無保護のボロン酸を使用した場合においても高い選択性及び収率で環化体を得ることができた。3)Diels-Alder反応によって得られた環化体上ホウ素の官能基変換を検討したところ、銅触媒を用いたUllmanカップリングによりホウ素官能基を窒素官能基へ、過酸による酸化反応により水酸基へと変換できた。また、環化体を酸で開環後、鈴木-宮浦クロスカップリングによりホウ素官能基を種々の炭素官能基へと変換することができた。以上の結果より、ホウ素置換ベンザインと置換フラン類とのDiels-Alder反応により多様な置換形式の芳香族ボロン酸誘導体を選択的に合成した。更に、得られた環化体のホウ素官能基は、種々の置換基へと変換可能であり、本法は多置換芳香族化合物合成法としても有用であることを示した。本研究では、ホウ素官能基によりベンザインの反応位置選択性を制御し、幅広い分野において有用な多置換芳香族ボロン酸誘導体の新規合成法を開発することを目的としている。本年度は、主にホウ素置換ベンザインとアルキルフランとDiels-Alder反応における位置選択性について詳細に検討した。一般にアルキル基のみが置換したフラン類は両端のHOMO軌道係数の差が小さいため、Diels-Alder反応を位置選択性に行うことは極めて困難である。今回、我々はホウ素置換ベンザインと2-アルキルフランとのDiels-Alder反応が高アンチ選択的(ホウ素官能基とフラン由来のアルキル基が付加体であるナフタレン環の1位と5位に配置)に進行することを見出した。これらはいずれも以前、我々が行ったケイ素置換ベンザインと2-アルキルフランのDiels-Alder反応より高い位置選択性及び一般性を示した。また、本選択性はアルキル基の嵩高さによって変化せず、2-メチルフランを用いた場合においても高い選択性を示した。さらに興味深いことに3-アルキルフランを使用した場合にはシン選択的(ホウ素官能基とフラン由来のアルキル基がナフタレン環の1位と7位に配置)に環化付加反応が進行した。以上の結果より、ホウ素置換ベンザインと置換フラン類とのDiels-Alder反応により多様な置換形式の芳香族ボロン酸誘導体を合成できることが明らかとなった。また、ホウ酸エステルの種類を変更した場合にも同等の選択性を示した。しかし、現在までのところホウ素上の置換基効果について詳細に検討するには至っていない。ホウ素置換ベンザインの求核付加反応については、明確な結果を得ることができなかったので、次年度も継続して検討を行う。
新素材を用いた、肺切除術後の術後癒着予防法の開発

おおむね順調に進んでいる。動物モデルの変更はなく、大動物モデルを使用している。ビーグル成犬に全身麻酔を導入し、側方開胸を行い、ヒトに対してと同様の方法で右肺上葉切除術を行った(つまり、肺門部の胸膜を切開して肺静脈の上葉枝、肺動脈の上葉枝、上葉気管支を絹糸にて結紮し切離する)結果、肺門部の癒着モデルは安定して得られている。ネオベールシート(生体吸収性の組織補強材)で肺門部を覆い、周囲組織と隔離したところ、コントロール群と比較して術後の癒着は軽度にはならなかったという結果を踏まえて、現在市販されており、腹部手術で使用されいているアドスプレー(腹部の術後癒着を防止する噴霧生体吸収性素材)を肺門部に噴霧する予備実験を再度行ったところ、感染や気管支断端の治癒不全等の有害事象は認めなかったものの、肺門部における癒着軽減はみられなかった。そのため、同素材を使用した本実験及び血清学的評価に進まず、他の生体吸収性素材を実験に使用することとした。スプレータイプではなく、シート状の生体吸収性素材を再度使用する方向で検討している。現在市販されており、主として腹部手術で使用されている酸化再生セルロース製のシートは、臨床での使用実績がある。胸部手術においても、術後癒着を軽減する可能性があるため、実験に使用して肉眼的所見を確認する。手術用縫合糸で固定することも容易であるため、実験モデルとして安定したものを作成可能である。上記の肺門部の癒着モデルにおいて使用し、癒着防止が認められれば、コントロール群と実験群を設定し、実験計画に記載されている評価項目(1胸水の有無、胸腔内洗浄水中のインターロイキン(IL)-6, IL-8, IL-1β等の炎症性サイトカインの測定、血液中の白血球数、血清中C反応タンパクの測定)を中心に評価を行う。大動物で充分なサンプルサイズが得られない可能性もあり、その場合は小動物モデル(ラット)を使用した同様の実験に変更する可能性も検討している。ビーグル成犬に全身麻酔を導入し、側方開胸を行い、ヒトに対してと同様の方法で右肺上葉切除術を行った(つまり、肺門部の胸膜を切開して肺静脈の上葉枝、肺動脈の上葉枝、上葉気管支を絹糸にて結紮し切離する)。まず、市販されているネオベールシート(生体吸収性の組織補強材)で肺門部を覆い、周囲組織と隔離したところ、コントロール群と比較して術後の癒着は軽度にはならなかった。そこで、同様に現在市販されており、腹部手術で使用されいているアドスプレー(腹部の術後癒着を防止する噴霧生体吸収性素材)を肺門部に噴霧したところ、コントロール群に比較して、肉眼的所見においてやや癒着が軽度になる傾向が見られた。現在市販されており、腹部手術で使用されいているアドスプレー(腹部の術後癒着を防止する噴霧生体吸収性素材)は、胸部手術においても、術後癒着を軽減する可能性があるため、サンプルサイズを増やして肉眼的所見を確認する。そのうえで、コントロール群と実験群を設定し、実験計画に記載されている評価項目(1胸水の有無、胸腔内洗浄水中のインターロイキン(IL)-6, IL-8, IL-1β等の炎症性サイトカインの測定、血液中の白血球数、血清中C反応タンパクの測定)を中心に評価を行う。アドスプレーの癒着軽減効果が確認できない様なら、新しい生体吸収性素材を探し予備実験を行う予定である。

アドスプレーの癒着軽減効果が確認できない様なら、新しい生体吸収性素材を探し予備実験を行う予定である。スプレータイプではなく、シート状の生体吸収性素材を再度使用する方向で検討している。現在市販されており、主として腹部手術で使用されている酸化再生セルロース製のシートは、臨床での使用実績がある。胸部手術においても、術後癒着を軽減する可能性があるため、実験に使用して肉眼的所見を確認する。手術用縫合糸で固定することも容易であるため、実験モデルとして安定したものを作成可能である。上記の肺門部の癒着モデルにおいて使用し、癒着防止が認められれば、コントロール群と実験群を設定し、実験計画に記載されている評価項目(1胸水の有無、胸腔内洗浄水中のインターロイキン(IL)-6, IL-8, IL-1β等の炎症性サイトカインの測定、血液中の白血球数、血清中C反応タンパクの測定)を中心に評価を行う。大動物で充分なサンプルサイズが得られない可能性もあり、その場合は小動物モデル(ラット)を使用した同様の実験に変更する可能性も検討している。
質量顕微鏡を用いた新規疾患解析手法の実用性の検討

本研究は新たな疾患組織検査手法として、質量顕微鏡法の実用性を向上させることを目的とするものである。質量顕微鏡法は組織切片を二次元に質量分析することによって、組織切片に存在する生体分子の局在を可視化する手法である。疾患検査法として質量顕微鏡法の実用性を判断するためには、多くの疾患に適用が可能であることを示すことが重要である。本研究期間にATGL変異症、粥状動脈硬化病巣、腹部大動脈瘤(AAA)の解析法を検討し、疾患発症時の代謝変動などを可視化した。本研究では申請者が若手研究(B)「質量顕微分析を用いた疾患組織検査法の確立」(研究期間2008-2009)において確立した新規の疾患組織検査法の実用性を検討する。本手法は、質量顕微鏡を用いて得られたデータに多変量解析を適用することにより、数十-数百種類もの代謝物データの中から、疾患特異的に変動する代謝物ピークを数個に絞りこむ手法である。申請者はこれまでにモデル動物を用いて本手法の有効性を報告した。本研究の目的は、この手法が臨床検査及び基礎研究においても応用可能であることを示すため、実際にヒト病理組織を用いて新規に確立した手法を評価することである。評価項目は、再現性と汎用性である。再現性に関しては、これまでに研究を行っているAdipose Tryglyceridel-ipase (ATGL)変異症を用いて行い、汎用性に関しては、動脈硬化性血管を用いた。今年度は、ATGL変異症患者筋肉の脂質代謝異常に関する解析を行い、前年度前に得られた結果と同じ結果が得られることを確認した。また、代謝異常が引き起こされている脂質がホスファチジルコリンであることをMS/MSによって同定した。さらに、適用範囲を広げるために、動脈硬化性疾患の解析も行い、動脈硬化の解析にも本手法が適用できることを示し、動脈硬化病巣における新規の脂質代謝異常を見出した。本研究は新たな疾患組織検査手法として、質量顕微鏡法の実用性を検討するものである。平成22年度まではATGL変異症を解析し、代謝異常が引き起こされている生体分子の同定に成功した。平成23年度は、粥状動脈硬化の解析に本手法が適用できるかどうかを検討した。粥状動脈硬化モデル血管には60週齢のアポEノックアウトマウス冠動脈起始部を用いた。コントロールは粥状動脈硬化発症前の12週齢のアポEノックアウトマウス冠動脈起始部を用いた。両者を質量顕微鏡法によって解析し、比較した結果、粥状動脈硬化病巣モデル血管では、m/z 671.6(コレステロールエステル)、m/z 673.6(コレステロールエステル)、m/z 804.5(ホスファチジルコリン)、m/z 832.5(ホスファチジルコリン)、m/z 566.9(未同定)が特徴的に検出された。これらの分子種の可視化は、従来の検出法では達成できないものであり、質量顕微鏡法は粥状動脈硬化病巣の解析においても有効であることが示された。平成23年度は、粥状動脈硬化病巣の解析手法について検討し、新たな血管解析法として国際誌に発表した。平成24年度はATGL変異症の研究の継続及び腹部大動脈瘤(AAA)を解析した。ATGL変異症患者由来細胞を用いて、脂質代謝異常を改善する成分のスクリーニングを行った結果、二成分に脂質代謝を改善する効果がある傾向が示された。AAAは腹部大動脈の進行的な拡張を主病変とする疾患である。質量顕微鏡法によってAAA患者血管壁を解析した結果、血管拡張部位でヘムBの検出強度が有意に低下することを見出した。ヘムBの低下は血管壁における血液循環不全を示唆するものであったため、血管壁に血液を供給する役割を担っている栄養血管を病理解析したところ、拡張部位外膜に存在する栄養血管は閉塞していることを見出した。閉塞した栄養血管を質量顕微鏡法によって解析した結果、コレステロールエステルは観察されなかった。また、病理解析により、栄養血管の閉塞は、血管平滑筋の増加による内膜肥厚であることがわかった。

以上の解析の結果から、AAA患者の血管壁では、栄養血管の閉塞による血液循環不全が生じている可能性が示された。研究成果をもとにした論文が1報受理されたことから、研究はおおむね順調に進展していると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の目的達成のためには、引き続き多数の検体を解析することが重要であると考えられる。
成長因子-レセプター系のシグナル伝達の分子機構の解明

本研究では、NMR法を用いた蛋白質の精密な溶液構造決定法の開発を神経毒蛋白質であるエラブトキシンを対象として行うとともに、この手法をErb-B4およびIGF-Iレセプターのリガンドであるheregulinα、IGF-IIに適用し、立体構造を決定するとともに、レセプター結合部位の同定を行った。次に、レセプター型のチロシンキナーゼのシグナル伝達に関与するSH3ドメインの構造を決定した。SH3ドメインはレセプターからのシグナルを下流の蛋白質に伝える構造ドメインであり、PLCγの場合では、SH2ドメインを通して、チロシンキナーゼに結合するとともに、SH3ドメインを通して細胞骨格に結合したダイナミンと相互作用することが可能となる。またGRB2ではSH3を通してGDP-GTP交換因子であるSosと結合し、レセプターの活性化に伴い、SH2がレセプターのリン酸化チロシンに結合して、膜近傍に移動し、Sosを通して膜結合したRasを活性化する。SH3と標的蛋白質の結合は、標的蛋白質に含まれるプロリンに富んだペプチドとSH3の相互作用であり、SH3がいかにしてプロリンに富むペプチドを認識するか、多くの研究者の興味を集めてきた。本研究では、SH3の構造を明らかにするとともに、プロリンに富んだペプチドとの相互作用を解明し、SH3がまさに、プロリンに富むペプチドを認識するために設計された機能ドメインであることを明らかにし、GRB2の認識するペプチドの配列を明らかにした。研究成果については既報の誌上発表中にまとめて示したので、以下に転載して成果報告に代える。Grb2はSH3-SH2-SH3のドメイン構造よりなる。EGFRテールの自己リン酸化を受けたチロシンにSH2ドメインが結合し、、SH3ドメインはRasのGDP-GTP交換活性を持つSosとよばれるタンパク質のプロリンに富んだ領域に結合する。Grb2はEGFRからRasへシグナルを伝達するアダプター分子と考えられている。我々はGrb2を介するシグナル伝達の過程をタンパク質相互の分子認識として明らかにすることを目的としている。C末端SH3ドメインをGST融合タンパク質として発現し、トリプシンを用いて切断後精製し、NMR法により立体構造を決定した。3つのbetaシートが互いに直交して組み合わされたbetaバレル構造を取っている。この構造は既に我々が報告したPLC-gammaのSH3と良く似ている^<1)>。SH3はタンパク質内で比較的独立したドメイン構造をとるものと考えられる。次にSosに含まれる3個のプロリンに富んだ領域を含むペプチドを化学合成し、蛍光法を用いて結合を調べた。その結果、VPPPVPPRRRはKdが0.1mMで結合した。もう一種類のペプチドは0.7mMで相互作用したが、残りのペプチドは結合しなかった。アミノ酸配列の比較より、コンセンサス配列としてPPVPPRが得られた。VPPPVPPRRR結合に伴うNMRシグナルの化学シフト変化を調べた所、特定の領域に含まれるプロトンが顕著にシフトすることがわかった。この部位は分子表面の一ケ所にマップされ、基質結合部位であると推定された。この領域には、ALFDFをはじめSH3ドメインに保存されているアミノ酸残基のほとんどが含まれていることは興味深い。保存残基はプロリンに富んだペプチドの特異的な構造を認識するために必要と考えられる。この領域のアミノ酸の変異体は活性を失うことが報告されている。本研究では、NMR法を用いた蛋白質の精密な溶液構造決定法の開発を行うとともに、この手法をリガンドであるheregulinα、IGF-IIに適用し、立体構造を決定するとともに、レセプター結合部位の同定を行った。

またGRB2ではSH3を通してGDP-GTP交換因子であるSosと結合し、レセプターの活性化に伴い、SH2がレセプターのリン酸化チロシンに結合して、膜近傍に移動し、Sosを通して膜結合したRasを活性化する。SH3と標的蛋白質の結合は、標的蛋白質に含まれるプロリンに富んだペプチドとSH3の相互作用であり、SH3がいかにしてプロリンに富むペプチドを認識するか、多くの研究者の興味を集めてきた。本研究では、SH3の構造を明らかにするとともに、プロリンに富んだペプチドとの相互作用を解明し、SH3がまさに、プロリンに富むペプチドを認識するために設計された機能ドメインであることを明らかにし、GRB2の認識するペプチドの配列を明らかにした。研究成果については既報の誌上発表中にまとめて示したので、以下に転載して成果報告に代える。
磁性ビーズを用いたアセトアミノフェンの鎮痛機序の解明

アセトアミノフェンは副作用の少ない解熱鎮痛薬として小児から妊婦,高齢者に至るまで周術期のみならず緩和、ペインクリニックなど様々な場面で使用されている.しかしアセトアミノフェンの作用機序についてはいまだに明らかとなっていない。そこで機能性ナノ磁性微粒子を用いた薬剤標的タンパクの網羅的探索を足がかりにアセトアミノフェンの鎮痛メカニズム解明および新規鎮痛薬開発を目指した.初年度はアセトアミノフェン合成物とHela細胞を用いた細胞破砕液を混合し結合反応させ磁性分離によりタンパクを抽出した.得られた複数のタンパクを絞り込み,アセトアミノフェンと結合するタンパクの同定に成功した.結果的に得られた標的タンパクは体温の恒常性に関与する可能性が追加実験で判明した.そこで標的タンパクに対する阻害薬投与実験を用いて,アセトアミノフェンの解熱効果の評価を行なった.解熱効果を確認するためイースト発熱モデルを作成し,アセトアミノフェン単独投与群,標的タンパク阻害薬+アセトアミノフェン同時投与群,および対照群(溶媒のみ)にわけ評価を行った.評価は直腸温測定により薬剤投与の閾値変化で行なった。アセトアミノフェン単独投与では対照群と比べ体温の低下がみられたが,標的タンパク阻害薬を同時投与した群は対照群に比べ体温の低下はみられなかった.アセトアミノフェン投与による生体での鎮痛効果は代謝産物によるものも示唆されており今回の実験では評価に至らなかった.また,同時にアセトアミノフェンと標的タンパク結合部位の立体構造解析もおこなったが構造解析から阻害作用の解明にはいたらなかった.アセトアミノフェンの非活性化部位と思われる考えられる部位にアミノ基を結合させた化合物(Acet-1)を合成し、この化合物にアセチル基をアミド結合させた化合物(Acet-2)の合成を行った。リガンド(Acet-1、AM404-1)に磁性ビーズを固定化しアセトアミノフェンと細胞タンパクとのアフィニティ精製に用いた。アセトアミノフェン合成物の鎮痛作用を確認するためラットの行動実験を行った。アセトアミノフェン、Acet-1、Acet-2、生食の4群に分け、それぞれの薬剤を投与したのち、ラットの足底にホルマリンを皮下注射し、急性痛と炎症性疼痛の評価を行った。結果、アセトアミノフェンとアセトアミノフェン合成物は同等の鎮痛効果があることが確認された。HeLa細胞を用いて細胞破砕を行い細胞破砕液を作成し、リガンド固定化ビーズ(Acet-1)を混合し結合反応を行った。結合反応後、混合液の磁性分離を行いバッファーにより塩を溶出、加熱処理により熱溶出を行なった。溶出したサンプルを電気泳動し再現性のあるバンドを確認できた。抽出されたタンパクの中からより特異的にリガンドと結合しているタンパクを絞り込むためにリガンドによる競合阻害、競合溶出実験を行い、数種のタンパクが候補タンパクとして得られた。これらのバンドを切り出し質量分析を行っていく予定である。アセトアミノフェン合成物の生成、ラッとを用いた行動実験による合成物の鎮痛効果の確認、およびHeLa細胞を用いて磁性ビーズを用いた標的タンパク質の精製を行った。タンパク質の精製段階においてリガンド固定化量や結合反応時間などのタンパク質を精製するまでに予定より時間がかかったが、今後は計画に沿い候補タンパクの分析を行っていく段階である。平成27年度の研究結果より、アセトアミノフェン合成物とHela細胞を用いた細胞破砕液を混合し結合反応後,磁性分離によりタンパクを抽出した.得られた複数のタンパクを絞り込み,アセトアミノフェンと結合するタンパクを同定した.得られたタンパクは熱産生に関与する可能性があるため鎮痛または解熱に関与する標的タンパクに対する阻害薬を投与しアセトアミノフェンの解熱鎮痛効果の評価を行なうこととした.まず標的タンパクは解熱効果が期待できることからタンパクの阻害薬投与による解熱効果の評価を行なった。鎮痛効果を確認するためラットの足底を切開した手術後痛モデルと,解熱効果を確認するためイースト発熱モデルを作成することとした.イースト菌を用いた発熱モデルは直腸温を測定し体温の推移を計測したところ18時間後に発熱のピークがあり,その後も体温が上昇していることが確認できた.そこで,解熱効果をみるため発熱モデル作成の18時間後にアセトアミノフェン単独投与と,標的タンパクの阻害薬をアセトアミノフェンと同時投与するものと、溶媒のみ投与の対照群で,直腸温測定により薬剤投与の閾値変化に対する評価を行なった。アセトアミノフェン単独投与では対照群と比べ60分後に最も体温の低下がみられたが,アセトアミノフェンと標的タンパク阻害薬を同時に投与した群では対照群に比べ体温の低下はみられなかった.今後は鎮手術後痛モデルを用いた鎮痛効果の確認やアセトアミノフェンと標的タンパクの結合部位の立体構造解析を予定している.当初の予定ではアセトアミノフェンの結合するタンパクが鎮痛に関与するものと想定していたが,得られた標的タンパクが解熱に関与している可能性があることから,発熱モデルの作成を行なうこととした.しかし安定した発熱モデル作成ができるまでにやや時間を要した。アセトアミノフェンは副作用が少なく、周術期のみならず緩和、ペインクリニックなど様々な場面で使用されているにもかかわらず、その作用機序についてはいまだ明らかとなっていない。そこで機能性ナノ磁性微粒子を用いた薬剤標的タンパクを網羅的の探索をきっかけにアセトアミノフェンの鎮痛メカニズムおよび新規鎮痛薬開発を目指した.

アセトアミノフェン合成物とHela細胞を用いた細胞破砕液を混合し結合反応後,磁性分離によりタンパクを抽出し,得られた複数のタンパクを絞り込み,アセトアミノフェンと結合するタンパクの同定に成功した.得られた標的タンパクは体温の恒常性に関与する可能性が追加で判明したため,標的タンパクに対する阻害薬投与実験として,アセトアミノフェンの解熱効果と鎮痛効果のそれぞれの評価を行なった.鎮痛効果を確認するためラットの足底を切開した手術後痛モデルと,解熱効果を確認するためイースト発熱モデルを作成した.アセトアミノフェン単独投与と,標的タンパクの阻害薬をアセトアミノフェンと同時投与するものと、溶媒のみ投与の対照群で,直腸温測定により薬剤投与の閾値変化に対する評価を行なった。アセトアミノフェン単独投与では対照群と比べ体温の低下がみられたが,標的タンパク阻害薬を同時に投与した群は対照群に比べ体温の低下はみられなかった.手術後鎮痛モデルを用いた鎮痛効果の確認を行い,結果をまとめているところである.また,同時にアセトアミノフェンと標的タンパクの結合部位での立体構造解析もおこなったが構造解析から阻害作用の解明にはいたらなかった.研究当初はアセトアミノフェンが結合するタンパクの作用として鎮痛に関与するものを想定していたが,得られた標的タンパクは解熱にも関係している可能性があることがわかり,発熱モデルの作成を行なったが,安定した発熱モデル作成ができるまでにやや時間を要した。また立体構造解析も行ったが阻害作用の解明には至らなかった.アセトアミノフェンは副作用の少ない解熱鎮痛薬として小児から妊婦,高齢者に至るまで周術期のみならず緩和、ペインクリニックなど様々な場面で使用されている.しかしアセトアミノフェンの作用機序についてはいまだに明らかとなっていない。そこで機能性ナノ磁性微粒子を用いた薬剤標的タンパクの網羅的探索を足がかりにアセトアミノフェンの鎮痛メカニズム解明および新規鎮痛薬開発を目指した.初年度はアセトアミノフェン合成物とHela細胞を用いた細胞破砕液を混合し結合反応させ磁性分離によりタンパクを抽出した.得られた複数のタンパクを絞り込み,アセトアミノフェンと結合するタンパクの同定に成功した.結果的に得られた標的タンパクは体温の恒常性に関与する可能性が追加実験で判明した.そこで標的タンパクに対する阻害薬投与実験を用いて,アセトアミノフェンの解熱効果の評価を行なった.解熱効果を確認するためイースト発熱モデルを作成し,アセトアミノフェン単独投与群,標的タンパク阻害薬+アセトアミノフェン同時投与群,および対照群(溶媒のみ)にわけ評価を行った.評価は直腸温測定により薬剤投与の閾値変化で行なった。アセトアミノフェン単独投与では対照群と比べ体温の低下がみられたが,標的タンパク阻害薬を同時投与した群は対照群に比べ体温の低下はみられなかった.アセトアミノフェン投与による生体での鎮痛効果は代謝産物によるものも示唆されており今回の実験では評価に至らなかった.また,同時にアセトアミノフェンと標的タンパク結合部位の立体構造解析もおこなったが構造解析から阻害作用の解明にはいたらなかった.候補タンパクの質量分析を行い、鎮痛に関与する標的タンパクの検索を行う。標的タンパクに対し、阻害薬投与によるアセトアミノフェンの鎮痛効果の評価を行う。
ヒト表皮角化細胞によるfractalkineとCXCL16の産生機構の解析

膜結合型ケモイカンであるfractalkineとCXCL16のヒト表皮角化細胞による産生を解析した。無血清培地により培養したヒト表皮角化細胞を、各種TLRのリガンドにより刺激し、それぞれの刺激後のケモカインの産生を、mRNAレベル、蛋白レベルで検討した。その結果、CXCL16は、TLR2のリガンドによる刺激により、fractalkineはTLR3のリガンドによる刺激によりmRNAの発現増強、蛋白産生を生じた.また、CXCL16の産生は主にTNF-α、IL-1刺激により、fractalkineはIFN-γ刺激により産生が増強することが明らかとなった.次に、ヒト表皮角化細胞から無刺激で産生されているCXCL16に注目し、ケモカイン以外の機能を推測し解析した。その結果、CXCL16のS.aureus、E.coliに対する抗菌活性を認め、CXCL16がヒト表皮において重要な抗菌物質の一つとして機能している可能性があることを明らかにした。さらに、ヒト皮膚の表皮では、基底細胞層と有棘細胞層でCXCL16の産生とsheddingの受け方に違いがあることが示唆された。fractalkineは、ヒト表皮角化細胞では産生されないとの報告があったが、今回の解析によりIFN-γ刺激でmRNAの発現が誘導され、蛋白として検出されるのが72時間以降であることが明らかとなった.また、fractalkineの産生は、IFN-γにIFN-αを添加することで、さらに増強した.種々の皮膚疾患においてfractalkineの発現を免疫染色で検討し、fractalkineにより誘導されていると考えられる炎症細胞の種類についても検討を行った。その結果、fractalkineのレセプターを発現する数種の炎症細胞がある種の炎症性皮膚疾患、特に薬疹において強く誘導されており、表皮には炎症細胞浸潤に一致したfractalkineの発現があることを確認した。さらに、TNF-α、IL-1、IFNγなどのサイトカン刺激によるケモカイン産生も、同様に検討した。その結果、fractalkineとCXCL16が培養ヒト表皮角化細胞で産生されること、CXCL16は無刺激のヒト表皮角化細胞でも多量に産生されていること、fractalkineとCXCL16の産生はそれぞれ異なる刺激により調節されていることが明らかとなった。そこで、ヒト表皮角化細胞から無刺激で産生されているCXCL16に注目し、ケモカイン以外の機能を推測し解析した。近年、CXCL16のようにELRモチーフを欠くCXCケモカインでは抗菌活性を示すことが知られており、CXCL16についても抗菌活性を検討した。CXCL16はsheddingをうけて分泌型となるが、抗菌活性を示すのは分泌型のケモカインドメインの部分である。そこで、ヒト表皮角化細胞におけるCXCL16のsheddingに関わる蛋白を種々のinhibitorを用いて解析を行うとともに、CXCL16蛋白の3カ所の異なる部位に対するポリクローナル抗体を作成し、western blotや免疫染色による検討を行っている。Fractalkineに関しては、皮膚疾患においての発現を免疫染色で確認し、fractalkineにより誘導されていると考えられる炎症細胞の種類を免疫染色により解析中である。