hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人為的環境改変によるリュウキュウコノハズク二系統の同所化と浸透性交雑に関する研究

これらをサンプルとし過去の遺伝的構造の推定を試みる。環境改変が現在程進行していない段階の100年前の沖縄島には、南系統は生息していなかったと予測される。南西諸島に分布するリュウキュウコノハズクは、分断分布による種レベルの遺伝的差異を蓄積した南北二系統に分けられた。それぞれが進化的に重要な単位(ESU)である。しかし沖縄島には小型の北系統が優占するものの大型の南系統が同所的に生息することが確認された。これは人為的環境改変が南系統の分布域を変化させた結果と推察された。地史的時間スケールで形成された近縁種が、生態学的時間スケールで同所的に生息するようになった例である。本研究では、この機会を利用して二系統間に生じる交雑、同類交配、配偶者選択、移動分散など、生態学的諸側面を解明することでESUの実質的な意義を明らかにすることを最終目的とする。本研究では、まず分断分布に矛盾する個体群の成立要因について検証する。小型の北系統のリュウキュウコノハズクの主な生息地である沖縄島と奄美大島には、それぞれノグチゲラとオオアカゲラが分布する。この島々においてリュウキュウノコハズクはこれらのキツツキの古巣に営巣する。そのために体サイズが小型に維持されてきたと推測される。巣穴の入口サイズが異なる巣箱を架設し、それぞれを利用するリュウキュウコノハズクの系統を明らかにすることが検証の一歩となる。2016年には穴のサイズの異なる十分な数の巣箱を架設した。異なる穴サイズの巣箱で繁殖するつがいの系統が明らかになる。さらに繁殖成功を比較することで、系統間での繁殖の和合性、不和合性が確認され、系統の違いに応じた繁殖成功を評価する準備が整った。巣箱繁殖つがいの遺伝解析に先駆け、既存の500個体以上のリュウキュウコノハズクを用い、マイクロサテライトDNA領域12個のプライマーが利用可能であることを確認した。また北系統には渡りをする個体群が存在する可能性が本研究過程で確認された。そこでGPSロガーの装着を行い、2017年には渡りの有無、時期、ルート、越冬地が判明する。本研究では、リュウキュウコノハズクの巣立ちに雛に衛星追跡GPSを装着し、移動分散と配偶者選択の過程を解明する予定であった。しかし使用を予定していたアルゴスシステムを用いた最新超小型追跡用のデバイスが、日本の電波法の基準をクリアーできず使用不可能となった。このためGPSデータロガーを用いることになった。衛星追跡GPSを使用すれば、研究室に居ながらにして測位データが得られたのであるが、GPSデータロガーの場合、再捕獲をしデバイスを取り外した上でコンピュータを用い位置データを取り出す必要がある。そのため再捕獲の可能性が極めて低い雛に、再捕獲が必要なGPSデータロガーを装着することはできない。つまり雛の分散過程の追跡、および配偶者の解明は諦めざるを得なかった。そこで、繁殖個体の土地執着性や配偶者執着性を足輪を用いて確認し、同類交配、異系交配による配偶成功を経年的に比較する現実的な方法を採用することとした。しかしアルゴスシステムを使うデバイスよりも、GPSデータロガーは比較的安価であるため、より多くの個体に装着が可能になる。また、本研究の過程で北部個体群が渡りをしている可能性があることがわかり、その解明にもGPSデータロガーを役立てることができる。個体群の遺伝的構造を解明する上で、重要な情報を提供する。
マグマの発生と多様性のダイナミクス

本研究の目的は、地球上のさまざまなテクトニックセッティングにおけるマグマの成因を明らかにして、地球内部のダイナミクスを理解することにある。当核期間において、得られた主要な成果は、以下のものである.1.沈み込むリシスフェア-の化学的役割の解明:高圧下の脱水分解反応における元素移動度を実験により求め、このメカニズムが、マグマの化学的特徴を説明することを明らかにした.2.含水マントル物質の地震波速度の決定:高圧下での含水マントル物質の地震波速度を実験により決定し、マントルウェッジ最下部の低速度層が含水カンラン岩層である可能性を確認した.3.マントルウェッジ内高温域の成因の解明:沈み込むリソスフェア-によって励起される二次対流が、マグマ発生に必要な高温領域を形成することを明らかにした.4.沈み込み帯におけるマグマ発生の包括的モデルの提唱:沈み込み帯火山活動における一般的特徴を明らかにし、この特徴を合理的に説明しうる包括的モデルを、上記の成果をふまえて提唱した.5.背孤海盆形成に伴うマントルダイナミクスの解明:日本海形成時における火山活動を解析し、マントルウェッジの化学的進化、温度構造の変化を明らかにした。全マントル規模の物質循環の解明:南太平洋ポリネシア地域に産するHIMU玄武岩の岩石学的・地球化学的特性を明らかにし、このマグマの発生に、沈み込んだ海洋地殻物質が関与し、その貯蔵庫が下部マントル最下部に存在することを明らかにした.本研究の目的は、地球上のさまざまなテクトニックセッティングにおけるマグマの成因を明らかにして、地球内部のダイナミクスを理解することにある。全マントル規模の物質循環の解明:南太平洋ポリネシア地域に産するHIMU玄武岩の岩石学的・地球化学的特性を明らかにし、このマグマの発生に、沈み込んだ海洋地殻物質が関与し、その貯蔵庫が下部マントル最下部に存在することを明らかにした.本研究は、マントルウェッジ内の物質移動・リフト形成に伴う地域深部ダイナミクス・プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス、の3点の解明を目的とする。1.マントルウェッジ内の物質移動:マントルウェッジ内の温度構造を支配してマグマの発生に決定的な役割を果たす2種の2次対流について、岩石学的な束縛条件に基づいて評価を行ない、スラブの沈み込みに伴う対流が主要な役割を果たすことを明らかにした。さらに、本年度導入したワークステーションを用いて粘性係数の温度変化を考慮に入れた数値シミュレーションを行ない、マントルウェッジ内の物質移動と温度構造の合理的な再現を行った。2.リフト形成に伴う地球深部ダイナミクス:日本海背弧海盆の形成に伴う物質移動について、日本海・東北日本弧の岩石について実験岩石学・地球化学的なデータを生産した。これらを束縛条件にしてアセノスフェアーの貫入と冷却に伴うリフト下の温度構造の時間変化について数値シミュレーションを行ない、背弧海盆形成に伴うマントル内の物質移動を明らかにした。同様の解析をアフリカ・ケニア地溝帯に対しても行なっている。3.プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス:カムチャッカ半島に分布する、従来プレート内火山活動であるとされた岩石について、地球化学的さらに数値シミュレーションに基づく検討を行ない、トランスフォーム/沈み込み境界での熱異常の結果マグマが発生したことを明らかにした。また、スラブ物質の大規模循環を考察する上で重要な束縛条件となる、脱水分解反応に伴う元素移動について、高温高圧実験を行ない、特に鉛が移動しにくいことを発見した。このことにより、ある種のプレート内マグマの発生に、マントル・核相互作用が重要であることが明らかになった。本年度は、マントルウェッジ内の物質移動とマグマ成因論・プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス、に関して、以下のような進展があった。1.マントルウェッジ内の物質移動とマグマ成因論:昨年度までの研究成果に基づいて、包括的な沈み込み帯におけるマグマ成因モデルを提唱した。このモデルによって、多くの沈み込み帯火山活動で認められる一般的な特徴はもとより、特異な火山活動の成因も理解することが可能となった。また、脱水分解反応に伴う元素移動に関するより精密な実験と、鉛同位体比を含む高精度の地球化学データを組み合わせることにより、沈み込み帯のマグマが有する化学的特徴の成因を、定量的に説明できる可能性が高くなった。

さらに、一部の特異な火山活動では、マントルウェッジ内の異常高温によるスラブ(堆積物)融解が、主要なトリガーになっていることが、明らかになってきた。2.プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス:全マントル規模のスラブ物質の大循環を考察する上で重要なフレンチポリネシアの玄武岩類について、深部マントル起源と浅部起源のマグマの化学組成を比較し、前者がより玄武岩成分・ペロブスカイト成分に富むことを明らかにした。このことは、スラブ内の玄武岩質海洋地殻が下部マントルにまで達して、大循環していることを強く支持する。さらに、日本列島の付加帯を構成する緑色岩類の中に、ポリネシア域の深部マントル由来玄武岩と同一の化学的特徴を有するものが見いだされ、過去にも、巨大なマントル内大循環が起こっていたらしいことが、明らかになってきた。また、沈み込み帯背後の大陸内火山活動は、枯渇したマントル物質がその起源物質であることが、中国東北部玄武岩の解析から明らかになってきた。この枯渇した物質が、スラブ物質であるか否かが、今後の重要な関心事である。3.本年度導入したプラズマ発光分析装置を用いて希土類元素を、迅速高精度で分析する方法を開発した。本年度は、マントルウェッジ内の物質移動とマグマ成因論・プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス、に関して、以下のような進展があった。1.マントルウェッジ内の物質移動とマグマ成因論:昨年度に提案した、包括的な沈み込み帯におけるマグマ成因モデルを、さらに発展させるために、沈み込み堆積物の化学的特徴、特異な火山活動に関する解析を行った。堆積物が脱水分解反応する際の元素移動に関して結果を得ることができ、このデータを用いることでより一般的な化学的進化を議論できるようになった。また、特異な高Mg安山岩質マグマの発生が、マントル内の異常高温によってもたらされたことを、年代測定・古地磁気測定・熱計算シミュレーション・同位体比測定の結果に基づいて示した。このことにより、初期地球における大陸地殻の形成、という地球科学の重要な問題について強い束縛条件を与えることができた。また、全上部マントル規模のプレート沈み込みに伴う対流の発生について解析し、マントル深部物質の沈み込み帯への上昇を確認した。2.プレート内火山活動と地球深部ダイナミクス:昨年度に引き続き、日本列島・サハリンの付加帯およびシャツキ-海台を構成する玄武岩質岩石に関して地球化学的検討を行い、ポリネシア域の深部マントル由来玄武岩と同一の化学的特徴を有するものを見いだし、しかも、その活動が地球磁場静穏気と一致することを明らかにした。このことにより、巨大マントル上昇流が地球システムの変動に大きな影響を与えていることが明らかになった。また、沈み込み帯背後の大陸内火山活動に関して、シホテアリン地域の玄武岩類について、年代測定・化学分析を行い、予察的ではあるが、枯渇したマントル物質がその起源物質であることが明らかになってきた。3.プラズマ発光分析装置を用いて希土類元素を、迅速高精度で分析する方法を更に発展させ、日常的な分析が行えるようなシステムを完成した。
土構造物の性能設計とリスク評価・管理及び社会制度に関する総合的研究

現在我が国の建築、道路橋、港湾施設等多くの分野で、設計基準の性能規定化が進んでいる。さらに、我が国の多くの設計コードは,ISO2394などに準拠した信頼性設計法に移行している。今後の我国の設計コードは、要求性能を性能により規定し、性能照査を信頼性設計法によるものとなって行くと考えられる。性能設計は本質的に多様であり、現在いろいろなグループや、種々の構造物の主管機関で出されている提案には、多くのバリエーションがある。いまだに明確な全体像は明らかでない。しかし性能型設計が、構造物のより正確な挙動の予測とその予測精度の定量的把握(不確実性の定量化)を技術者に対して要求するとともに、従来からの設計・施工・維持管理に関する社会的な制度の変更をも迫っていることは間違いない。これはリスク評価と分担、発注形態、設計審査機関、設計者へのインセンティブの付与、地盤調査・設計・施工・維持管理の情報連携などの問題である。これらを、土構造物を対象として考える必要がある。以上のような成果を踏まえた、土構造物に適したモデル設計コードの提案も、必要な課題である。以上のような背景を踏まえて,本研究では,次のような成果を挙げた。1.土構造物の性能設計のための既存の設計法、FEMなどより進んだ設計法の、予測精度を定量的に評価し、土構造物の性能設計の可能性と限界を明確にする。この結果は,3の設計コードの開発にも反映された.2.性能設計を可能にする設計・施工の社会的制度とリスク評価・管理手法の提案性能設計を導入するに当たり、リスクの評価、リスクの分担やこれに応じた発注形態、設計技術の審査機関、いろいろな認証制度、設計者へのインセンティブの与え方、地盤調査-設計-施工-維持管理における情報連携などに関し、文献調査を行うとともに,欧州の動向を現地調査した.この結果は,報告書に特に詳細にまとめられたおり,今後のこの種の研究に貴重な情報を与えている.3.土構造物モデル設計コードの提案を行った.これは,地盤工学会の「性能設計概念に基いた基礎構造物等の設計原則」(JGS4001-2004)を土構造物に拡張したものであり,今後開始される設計コードの拡張に寄与するものである.現在我が国の建築、道路橋、港湾施設等多くの分野で、設計基準の性能規定化が進んでいる。この結果は,3の設計コードの開発にも反映された.2.性能設計を可能にする設計・施工の社会的制度とリスク評価・管理手法の提案性能設計を導入するに当たり、リスクの評価、リスクの分担やこれに応じた発注形態、設計技術の審査機関、いろいろな認証制度、設計者へのインセンティブの与え方、地盤調査-設計-施工-維持管理における情報連携などに関し、文献調査を行うとともに,欧州の動向を現地調査した.この結果は,報告書に特に詳細にまとめられたおり,今後のこの種の研究に貴重な情報を与えている.3.土構造物モデル設計コードの提案を行った.これは,地盤工学会の「性能設計概念に基いた基礎構造物等の設計原則」(JGS4001-2004)を土構造物に拡張したものであり,今後開始される設計コードの拡張に寄与するものである.性能設計を可能とする設計法不確実性の把握と、設計・施工の社会的制度・リスク管理方法の提案を行うのが、本研究の目的であり、最終的目標は、次のようなものである。1.土構造物の性能設計のための設計法の評価(1)土構造物の要求性能の性能規定の方法に関して提案し、主な設計法との関連を整理、明確化する。(2)既存の設計法、FEMなどより進んだ設計法の、予測精度を定量的に評価し、土構造物の性能設計の可能性と限界を明確にする。(3)情報化設計・施工法の性能設計との関連を明確化、(2)と合せて性能設計を実現する設計法を提案。

2.性能設計を可能にする設計・施工の社会的制度とリスク評価・管理手法の提案性能設計を導入するに当たり、リスクの評価、リスクの分担やこれに応じた発注形態、設計技術の審査機関、いろいろな認証制度、設計者へのインセンティブの与え方、地盤調査-設計-施工-維持管理における情報連携などに関し、段階を踏まえて、調査・研究し、最終的にいくつかの代替的な制度を提案する。(1)文献やプロジェクト事例を集め、性能設計導入の障害となっている制度的な問題点・疑問点を整理。(2)海外P/J、リスク評価・管理関連の研究機関やコンサル、性能設計を支える制度(認証機関等)を現地調査。(3)上記の調査・研究を踏まえて、リスクの評価・管理の方法、代替的な社会制度などを提案する。3.土構造物モデル設計コードの提案上記1、2の研究・提案を踏まえ、地盤工学会基準(案)「性能設計概念に基づいた基礎構造物等の設計原則」の土構造物への拡張版を執筆し、成果を公表する。2については昨年11月に欧州調査を行った。また3については盛土についての章を起稿した。現在我が国の建築、道路橋、港湾施設等多くの分野で、設計基準の性能規定化が進んでいる。さらに、我が国の多くの設計コードは,ISO2394などに準拠した信頼性設計法に移行している。今後の我国の設計コードは、要求性能を性能により規定し、性能照査を信頼性設計法によるものとなって行くと考えられる。性能設計は本質的に多様であり、現在いろいろなグループや、種々の構造物の主管機関で出されている提案には、多くのバリエーションがある。いまだに明確な全体像は明らかでない。しかし性能型設計が、構造物のより正確な挙動の予測とその予測精度の定量的把握(不確実性の定量化)を技術者に対して要求するとともに、従来からの設計・施工・維持管理に関する社会的な制度の変更をも迫っていることは間違いない。これはリスク評価と分担、発注形態、設計審査機関、設計者へのインセンティブの付与、地盤調査・設計・施工・維持管理の情報連携などの問題である。これらを、土構造物を対象として考える必要がある。以上のような成果を踏まえた、土構造物に適したモデル設計コードの提案も、必要な課題である。以上のような背景を踏まえて,本研究では,次のような成果を挙げた.研究の最終的目標は、次のようなものである。1.土構造物の性能設計のための既存の設計法、FEMなどより進んだ設計法の、予測精度を定量的に評価し、土構造物の性能設計の可能性と限界を明確にする。この結果は,3の設計コードの開発にも反映された.2.性能設計を可能にする設計・施工の社会的制度とリスク評価・管理手法の提案性能設計を導入するに当たり、リスクの評価、リスクの分担やこれに応じた発注形態、設計技術の審査機関、いろいろな認証制度、設計者へのインセンティブの与え方、地盤調査-設計-施工-維持管理における情報連携などに関し、文献調査を行うとともに,欧州の動向を現地調査した.この結果は,報告書に特に詳細にまとめられたおり,今後のこの種の研究に貴重な情報を与えている.3.土構造物モデル設計コードの提案を行った.これは,地盤工学会の「性能設計概念に基いた基礎構造物等の設計原則」(JGS4001-2004)を土構造物に拡張したものであり,今後開始される設計コードの拡張に寄与するものである.
動画システムを用いた遠隔病理診断による病理組織及び細胞学的診断の実用的研究

術中遠隔病理診断(以下、テレ診断と略)システムにおける凍結標本の作成を病理担当技師に指導した。その結果、採取された材料の凍結、薄切、染色が改善され診断に苦慮する原因となっていた標本の挫滅、染色不良が減少し、診断に適した標本となった。細胞診断では悪性と誤診する原因となる核の過染性は改善されたが、臨床側での標本採取、固定などが問題点として残っている。平成15年10月2日から庄原赤十字病院と動画、静止画を併用したテレ診断を開始した。電送される組織の観察には動画を用い、画像の保存と手術室への診断報告には静止画を使用した。静止画のみの診断に比較し、以下の項目の改善があった。(1)凍結標本全体を連続的に観察可能で切除断端の診断が容易になった。(2)画像伝送から診断報告までの時間の短縮ができた。(3)細胞診標本では不十分ではあるが、スクリーニングが可能となった。(4)焦点を連続的に変えることが可能で細胞や核内の構造、細胞集塊内部の詳細な観察が可能となった。(5)診断病理医の拘束時間、精神的負担の軽減がはかれた。1993年から静止画による術中遠隔病理診断(以下、テレ診断と略)を開始し、2003年3月末までに626例の術中迅速診断を行った。我々はこれまでのテレ診断に於ける以下のような種々の問題点を指摘、発表してきた。(1)標本作製:凍結標本の薄切、染色が診断上重要である。凍結標本では日常診断に使用しているパラフィン包埋標本に比較し、標本が厚く、細胞が大型となる傾向があり、悪性と誤診する原因となる。染色性に関しては核クロマチンの好塩基性が増し、核異型度が強調され悪性と誤診される原因となる。これらは、標本作製時の凍結温度、核染色を行うヘマトキシリンの種類、濃度を最適なものを選択する必要がある事により解決した。殊に、細胞診標本においては核の染色性に特に気を配り、よりよい染色を行うことが必要である。(2)静止画によるテレ診断では標本全体の観察に長時間を要し、診断を報告する時間が直接検鏡による迅速診断より遅くなる。これは、術者、診断病理医の両者にとって精神的苦痛を増す原因であった。静止画は細胞診断においてはスクリーニングに不向きであり、全体像がとらえがたい。また、異型細胞の核内構造や細胞重積部の内部構造が分かりにくい等の問題点を指摘してきた。試験的に動画システムによる術中診断、細胞診断を行ったところ、これらの問題点が大幅に改善されることが明らかとなった。これらの結果をふまえて平成15年度には動画システムを導入することを予定し、より診断に適したシステムの開発に向けてさらに検討を行う。平成14年度に引き続き、術中遠隔病理診断(以下、テレ診断と略)、遠隔細胞診断における標本作製の検討を行った。術中組織標本においては標本の凍結・薄切・染色を病理診断担当技師に指導し、診断に適した標本作製が可能となった。細胞診断では染色性の改善を試みたが、臨床側での標本採取、固定などが問題点として残っている。電送される組織の観察には動画を用い、画像の保存と手術室への診断報告には静止画を使用している。(1)迅速標本の全体像の観察が容易となり、標本断端部の組織標本の見落としが防げるようになった。(2)連続的に所見を観察でき、診断の報告までの時間の短縮ができた。(3)診断開始から終了までの時間的ロスが少なくなった。(4)細胞診標本では不十分ではあるが、スクリーニングが可能となった。(5)細胞診標本の観察では焦点を連続的に変えることが可能で細胞や核内の構造、細胞集塊内部の詳細な観察が可能となった。(6)診断病理医の拘束時間、精神的負担の軽減がはかれた。
心筋細胞特有のゲノムDNA損傷応答機構の解明

心筋細胞は細胞内で発生する活性酸素種(ROS)によるDNA損傷が引き金となって生後すぐに分裂増殖能を喪失する。心筋細胞はまた、細胞内で大量に発生するROSによるDNA損傷にも細胞死を選択することなく、場合によってはDNA損傷を蓄積して生涯にわたって個体の生命を支え続ける。これら二つのDNA損傷に対する反応は、いずれも通常の分裂細胞で認められるものとは異なる心筋細胞特有の反応である。本研究の目的は、DNA損傷を時間的・空間的・定量的に制御可能な実験系を構築することで、心筋細胞特有のDNA損傷応答機構を明らかにし、そのメカニズムを解明することである。
骨吸収と骨形成の共役機構を解析できる実験系の確立

OPG欠損マウスを用いて骨代謝共役を解析し、以下の結果を得た。(1)前駆細胞から破骨細胞への分化にp38MAP kinaseが必須であることを証明した。一方、成熟破骨細胞ではp38MAP kinaseシグナル系が作動しないことを見出した。(2)破骨細胞は骨形成促進因子を産生する可能性はあるが、炎症性サイトカインを産生する可能性はないことが示された。(3)骨の形態計測より、OPG欠損マウスは、骨吸収と骨形成がともに亢進していた。また、血中のアルカリホスファターゼ(ALP)活活性とオステオカルシン値は高値を示した。(4)OPG欠損マウスの血中には極めて高濃度の可溶性RANKLが見出された。(5)OPG欠損マウスに活性型ビタミンD_3を投与すると、血中の可溶性RANKL値は更に高値を示した。活性型ビタミンD_3を投与したマウスの骨組織ではRANKL mRNA発現は上昇したが、脾臓やT細胞ではRANKL mRNAの発現誘導は認められず、OPG欠損マウスに認められる血中の可溶性RANKLは骨芽細胞に由来することが示唆された。(6)OPG欠損マウス由来の骨芽細胞の培養系において、OPG欠損骨芽細胞はRANKLを培養液中に遊離したが、正常骨芽細胞はRANKLを殆んど遊離しなかった。OPGを添加するとOPG欠損骨芽細胞のRANKL遊離は阻害された。(7)OPG欠損マウスにビスフォスホネート(リゼドロネート)を投与し骨形態計測を行ったところ、亢進していた骨吸収は抑制され、同時に骨形成も著明に抑制された。(8)ビスフォスホネートの投与により、OPG欠損マウスの血清ALP活性とオステオカルシン値は正常化したが、血中可溶性RANKL値の低下は認められなかった。(9)骨誘導因子(BMP)をOPG欠損マウスと正常マウスに移植し、異所性骨形成を観察したところ、BMPが誘導する骨形成はOPG欠損と正常マウスに差は認められなかった。以上の知見より、骨吸収と骨形成は共役していること、その共役は局所因子により担われている可能性が示された。また、OPGはRANKLの可溶化を阻害し、局所で破骨細胞を誘導するために重要な役割を果たしていることも示された。骨吸収が起こると、続いてその吸収部位に新たな骨組織が形成される。そのため、骨吸収と骨形成を共役させる因子(カップリング因子、共役因子)の存在が想定されている。本基盤研究では、共役因子の同定と存在様式を解析できる新たな実験系の確立を目的に実験を行い、以下のことを明らかにした。1.破骨細胞を用いた共役因子の解析系の確立破骨細胞とC3H10T1/2細胞を共存培養すると、破骨細胞と接したC3H10T1/2細胞はアルカリホスファターゼ(ATPase)陽性細胞に分化した。2.Smadレポーターシステムを用いた解析系の確立

BMPシグナルを伝達するSmad1/5複合体が結合する配列(29塩基)を、Id遺伝子のプロモーター解析により同定した。ゲルシブトアッセイより、この配列には、Smad1/5とSamd4の複合体が結合することが示された。さらに、この配列を用いたレポーターアッセイ系を構築し、BMP様因子を検索中である。3.破骨細胞が産生するサイトカインの解析破骨細胞はLPSの受容体であるtoll-like receptor 4を発現することを見いだした。マクロファージと破骨細胞にLPSを作用させ、各種のサイトカインの産生能を検索した。LPSは骨髄由来マクロファージのIL-1β,TNFα,IL-6の産生は著しく促進したが、破骨細胞のそれらのサイトカインの産生を全く促進しなかった。4.破骨細胞と骨髄マクロファージの機能に対するp38MAPKの役割の解析M-CSFとRANKLの存在下で、骨髄マクロファージは破骨細胞に分化したが、RANKL添加時にp38MAPキナーゼの特異的阻害剤であるSB208530を短時間同時に処理するだけで、破骨細胞誘導は完全に抑制された。しかし、SB208530は、RANKLが誘導する破骨細胞の延命と吸収窩形成を全く阻害しなかった。破骨細胞と骨髄マクロファージはともに同じレベルのp38MAPKを発現していた。RANKLは骨髄マクロファージのp38MAPKのリン酸化を促進したが、破骨細胞のp38MAPKのリン酸化を全く促進しなかった。骨吸収が起こると、続いてその吸収部位に新たな骨組織が形成される。本研究では、この骨代謝共役因子の同定と存在様式を解析できる実験系の確立を目的とした。1.破骨細胞が産生するサイトカインの解析(1)LPSは破骨細胞の延命と骨吸収能を促進した。また、LPSは破骨細胞のNF-κB、ERK、p38MAPKを活性化した。(2)破骨細胞前駆細胞である骨髄細胞マクロファージ(Mφ)は、LPSに反応してIL-1、TNFα、IL-6を分泌したが、破骨細胞ではそれらのサイトカインの産生亢進は認められなかった。(3)破骨細胞と未分化間葉系細胞との共存培養系より、破骨細胞は未分化間葉系細胞をアルカリフォスファターゼ(ALP)陽成細胞へ分化させる因子を出していることが示された。(4)このALP陽成細胞の誘導に対して、可溶性BMP受容体(BMPR type-IA)の添加は何ら抑制効果を示さなかった。(5)破骨細胞と間質細胞の直接接触を阻止した条件では、ALP陽性細胞は誘導されなかった。以上の実験より、成熟破骨細胞が骨髄間質細胞をALP陽性細胞に分化誘導させる因子を発現している可能性が示唆された。この骨芽細胞分化誘導因子は破骨細胞の細胞膜表面上に存在しているものと考えられる。2.OPG欠損マウスを用いた骨代謝共役機構の解析OPG欠損マウスにビスフォスホネート(BP)を投与し、骨吸収と骨形成の代謝共役を解析した。(1)骨形態計測を行ったところ、OPG欠損マウスは、骨吸収マーカーと骨形成マーカーがともに亢進していた。(2)BP投与により、骨吸収マーカーの低下とともに骨形成マーカーの著明な低下が認められた。(3)血清ALP活性は、OPG欠損マウスでは高値を示したが、BPの投与によって正常値以下にまで低下した。(4)正常マウスでは、血中に可溶性RANKLは殆んど検出できなかったが、OPG欠損マウスの血中に高濃度の可溶性RANKLが認められた。一方、BPの投与によって骨吸収を抑制しても、OPG欠損マウスの血中RANKL量は低下しなかった。
リンパ節特異的な細胞動員シグナルによる免疫細胞の組織特異的動員と自己応答性の制御

免疫細胞の組織特異的な動員は自己応答性を制御する。本研究では以下の成果を得た。1)接着分子nepmucin/CD300LGは、生理的条件下で多くの組織の細動脈・細静脈・毛細血管に構成的に発現するが、免疫特権部位には発現しない。一方、炎症組織や腫瘍組織の微小環境に由来するシグナルは所属リンパ節におけるnepmucin/CD300LGの発現を負に制御する。2)悪性中皮腫細胞によるがん微小環境の形成において、CD44/HA系とActivin-A/ALK4系がそれぞれスフェア形成とスフェア内でのALDH陽性がん幹細胞様細胞の維持に重要である。本研究は、免疫細胞のリンパ組織への動員と組織内遊走の自己応答性の制御における意義の解明と末梢組織に形成される免疫制御性の微小環境(炎症性微小環境やがん微小環境)がこれに及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度はまず血管内皮細胞に発現し、リンパ球の接着や血管外遊走に関与する細胞接着分子であるnepmucin/CD300LGのリンパ節および種々の末梢組織における組織特異的な発現とその制御機構について解析した。その結果、nepmucin/CD300LGは生理的条件下において多くの組織の細動脈・細静脈・毛細血管に発現しているが、脳・睾丸および子宮などの免疫特権部位には発現しないことが示された。また急性炎症を惹起するとリンパ節におけるnepmucin/CD300LGの発現は急速に減弱し、この発現減少にはTNFαが関与することが示唆された。また腫瘍および所属リンパ節においてnepmucin/CD300LGの発現が減弱することが見いだされ、nepmucin/CD300LGの発現は、炎症および腫瘍が局所に形成する微小環境によって制御されることが示された。次に、腫瘍を取り巻く微小環境と癌幹細胞および免疫細胞の機能に及ぼす影響を解析した。その結果、ヒト悪性中皮腫細胞(MSTO)をsphere形成条件で培養するとaldehyde dehydrogenase (ALDH)陽性で幹細胞関連遺伝子を発現する癌幹細胞様細胞が濃縮されることが示された。またこの癌幹細胞様細胞は特定の炎症性サイトカインを産生することから、癌幹細胞が周囲の免疫環境を積極的に修飾していることが示唆された。さらにこの癌幹細胞様細胞の形質にはTGFβ系のシグナルが関与することが示唆された。本年度は腫瘍が形成する免疫制御性の微小環境が免疫細胞の機能や癌の幹細胞性に及ぼす影響について解析した。ヒト悪性中皮腫細胞(MSTO)をスフェア形成条件で培養するとaldehyde dehydrogenase (ALDH)陽性で幹細胞関連遺伝子を発現する癌幹細胞様細胞が濃縮され、移植実験において強い造腫瘍性を示す。そこで、免疫制御性の微小環境の形成に関与しうるサイトカイン経路について解析した結果、スフェア形成条件下のMSTOはactivin-Aを産生し、スフェア中に濃縮されるALDH陽性細胞にactivin-A受容体ALK4が発現することが示された。抗activin-A抗体やMSTOに発現するALK4のノックダウンはMSTOのスフェア形成には影響しないが、スフェア中のALDH陽性を著しく減少させた。また、ALK4をノックダウンしたMSTOには造腫瘍性の低下が認められることから、activin-Aとその受容体を介するシグナルはスフェア形成条件下のMSTOに濃縮されるALDH陽性細胞の維持とその造腫瘍性に重要な役割を果たすことが示唆された。また、MSTOが形成する腫瘍はマクロファージ浸潤を伴うがん微小環境を形成する。そこで、MSTOと免疫細胞の機能的な相互作用を解析した結果、MSTOは共培養によりヒト単球様細胞株THP-1にTGF-betaなどの産生を誘導し、M2マクロファージ様細胞に変換することが示唆された。これらの結果から、造腫瘍性を有するMSTO細胞は特定の細胞集団に幹細胞性を維持させるとともに、積極的に周囲の免疫細胞の機能を修飾して免疫制御性の微小環境を形成している可能性が示唆された。本研究は、免疫細胞のリンパ組織への動員と組織内遊走の自己応答性の制御における意義の解明と末梢組織に形成される免疫制御性の微小環境(炎症性微小環境やがん微小環境)がこれに及ぼす影響を明らかにすることを目的として実施した。本年度はがん微小環境に注目した解析を行い、ヒト悪性中皮腫細胞(MSTO)において、癌幹細胞様細胞の濃縮を促進するスフェア形成にCD44とそのリガンドHAが重要な役割を持つことが示された。またがん微小環境におけるエフェクターT細胞の自己反応性を制御する抑制性受容体であるPD-1の発現機構を解析した結果、Jurkat T細胞におけるPD-1発現にカルシウムシグナルが重要であることが示された。研究期間全体を通じて、以下の成果が得られた。1)リンパ球の接着や血管外遊走に関与する細胞接着分子nepmucin/CD300LGは、生理的条件下で多くの組織の細動脈・細静脈・毛細血管に発現するが、急性炎症を惹起したリンパ節ではその発現が急速に減弱し、この発現の減少にTNFαが関与することが示唆された。

また腫瘍組織においてもnepmucin/CD300LGの発現が減弱することから、nepmucin/CD300LGは炎症および腫瘍が形成する微小環境で発現が制御されることが示された。2)免疫細胞の自己反応性を制御するがん微小環境の形成について解析し、MSTO細胞において、CD44/HA系とActivin-A/ALK4系がそれぞれスフェア形成とスフェア内でのALDH陽性がん幹細胞様細胞の維持に重要であることが示された。ALK4のノックダウン実験から、MSTOスフェアに濃縮されるALDH陽性細胞が造腫瘍性に重要であることが示された。また、がん微小環境中でエフェクターT細胞の自己反応性を制御するPD-1の発現にカルシウムシグナルが重要であることが示唆された。免疫細胞の組織特異的な動員は自己応答性を制御する。本研究では以下の成果を得た。1)接着分子nepmucin/CD300LGは、生理的条件下で多くの組織の細動脈・細静脈・毛細血管に構成的に発現するが、免疫特権部位には発現しない。一方、炎症組織や腫瘍組織の微小環境に由来するシグナルは所属リンパ節におけるnepmucin/CD300LGの発現を負に制御する。2)悪性中皮腫細胞によるがん微小環境の形成において、CD44/HA系とActivin-A/ALK4系がそれぞれスフェア形成とスフェア内でのALDH陽性がん幹細胞様細胞の維持に重要である。平成26年度はがん細胞が形成する免疫制御性の微小環境が免疫細胞の機能やがん細胞の幹細胞性に及ぼす影響について解析し、造腫瘍性を有する悪性中皮腫細胞が細胞集塊中の特定の細胞集団に幹細胞性を維持させつつ、積極的に周囲の免疫細胞の機能を修飾して免疫制御性の微小環境を形成している可能性を示す知見を得ることができた。免疫学平成26年度はがん細胞による免疫細胞の機能的特性の制御とがん幹細胞性の維持に関する分子機構について解析を行った。今後はこれらの知見を発展させ、当初計画に沿ってリンパ組織やがん組織への制御性細胞の動員とその組織微小環境による制御について解析したい。また、がん細胞が作り出す免疫制御性の微小環境が局所リンパ組織における細胞動員シグナルの発現や自己応答性の制御に及ぼす影響についても解析を進めたい。平成25年度は免疫担当細胞の血管内皮細胞への接着や血管外遊走を制御する細胞接着分子の組織特異的な発現とその制御機構の一端を明らかにすることができた。またがん幹細胞様細胞の特性とがん幹細胞様細胞が形成する微小環境の特性について基礎的な知見を得ることができた。平成26年度はがん細胞による免疫細胞の機能修飾とがん幹細胞性の維持に関する基礎的な解析を行った。平成26年度は当初計画に比し、細胞培養などに関する新規品目を少なく抑えることができたため、次年度使用額が生じている。平成25年度は免疫担当細胞の生体内動態を制御し血管内皮細胞に発現する細胞接着分子の特性とがん幹細胞およびその特性について解析を行った。今後はこれらの知見を発展させ、当初計画に沿ってリンパ組織への制御性細胞の動員とその組織微小環境による制御について解析したい。また、がん細胞が局所につくりだす微小環境がリンパ組織における細胞動員シグナルの発現に及ぼす影響や免疫環境を修飾する分子機構についても解析を進めたい。平成27年度は設定した研究期間の最終年次にあたる。
全血中での使用を目指した新規吸光度検出型バイオセンサにおける発色剤の開発

1.ルテニウム錯体の合成吸光度検出型血糖値(グルコース)センサの発色剤として用いるために、ルテニウム(III/II)錯体[Ru(NH_3)_5(L^*)]^<4*/3*>(L^*:4,4'-ビピリジニウムイオン)を合成し、それらの分光化学的性質を調べた。[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]3^*は580-680nmにモル吸光係数が10^4 M^<-1>cm^<-1>オーダーの電荷移動吸収帯を有するのに対して、[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]^<4+>は可視部に吸収をもたないことがわかった。2.血糖値(グルコース)センサへの適用[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]^<4+>が有用な発色剤として作用するためには、還元型グルコースオキシダーゼとの反応が速く、瞬時に[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]^<3+>となり発色する必要がある。そこで、GOx_<red>+2Ru(III)→GOx_<ox>+2Ru(II)+2H^+の電子移動反応速度定数を求めた。その結果、L^+の違いにより、5.7×10^6-1.7×10^7 M^<-1>s^<-1>となり、オスミウム錯体よりも大きな値を示した。これは、ルテニウム錯体とGOx_<ox>間に静電的相互作用があり、さらにL^+とGOx_<ox>の補酵素であるFADのイソアロキサジン環との間にπ-πスタッキングがあることを、^1HNMRと蛍光スペクトルから明らかにした。このような弱い非共有性相互作用の存在により、大きな電子移動速度定数をもつことを解明した。ルテニウム(III)錯体とGOx_<ox>を含む中性溶液(pH7.0)中にグルコースを添加すると、瞬時に無色から青色に発色した。この際、1cmセルを用いて測定を行ったところ、すべてのL^+において650-750nmの測定波長で5-45μMのグルコース濃度で検量線が直線となり、ヘモグロビンの影響を受けることなくグルコース検出が可能であることが示唆された。1.ルテニウム錯体の合成と性質吸光度検出型血糖値センサの発色剤として用いるために,ルテニウム(III/II)錯体[Ru(NH_3)_5(L^+)]^<4+/3+>(L^+=4,4'-ビピリジニウムイオン)を合成し,それらの分光化学的および電気化学的性質を調べた.[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]^<3+>は580680nmにモル吸光係数が10^4 M^<-1> cm^<-1>以上の電荷移動吸収帯を有するのに対して,[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]

^<4+>は可視部に吸収をもたないことがわかった.また,[Ru(NH_3)_5(L^+)]^<4+/3+>の酸化還元電位は0.150.18V vs.Ag/AgClと比較的低い電位を示した.すなわち,無色の[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]^<4+>が還元型のグルコースオキシダーゼと反応すると,600nmより長波長に強い吸収を有する[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]^<3+>を生成するので,全血中のヘモグロビンの影響を受けずにグルコース検出が可能な発色剤になりうることが示唆された.2.ルテニウム(III)錯体とグルコースオキシダーゼ間の電子移動反応3.ルテニウム(II)錯体とグルコースオキシダーゼとの相互作用酵素と錯体間の電子移動反応GOx_<red>+2Ru(III)→GOx_<ox>+2Ru(II)で[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]^<4+>が大きな速度定数をもつ理由を明らかにするために,[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]^<3+>とグルコースオキシダーゼとの相互作用を検討した.その結果グルコースオキシダーゼの補酵素であるFADと[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]^<3+>のL^+との間にスタッキング相互作用があり,L^+が酵素内へ入り込む,いわゆる"アンテナ効果"で大きな速度定数が得られることが示唆された.1.ルテニウム(III)錯体を発色剤とした血糖値センサ吸光度検出型血糖値(グルコース)センサの発色剤として合成したルテニウム(III)錯体[Ru^<III>(NH_3)_5(L^+)]Cl_4(L^+:4,4'-ビピリジニウムイオン)は可視領域に吸収をもたない。一方、還元型の[Ru^<II>(NH_3)_5(L^+)]Cl_3はL^+の違いに応じて、580-680nmにモル吸光係数が10^4M^<-1>cm^<-1>オーダーの電荷移動吸収帯を有するので、(1)、(2)式の反応からグルコースの吸光度検出が可能になる。ルテニウム(III)錯体とGOx_<ox>を含む中性溶液(pH7.0)中にグルコースを添加すると、瞬時に無色から青色に発色した。この際、1cmの石英セルを用いて測定を行ったところ、すべてのL^+において650-750nmの測定波長で5-45μMのグルコース濃度で検量線が直線となり、ヘモグロビンの影響を受けることなくグルコース検出が可能であることが示唆された。これらの成果は次の雑誌に掲載された。"Dipolar ruthenium-ammine complexes with 4,4'-bipyridinium ions accessible for both amperometric and colorimetric glucose sensors, Inorg.Chem.Commun.2006,9,935-938."2.発色剤とグルコースオキシダーゼ間の電子移動反応の解明昨年度(2)式の電子移動反応速度定数を求めたところ、L^+の違いにより、5.7×10^6-1.7×10^7M^<-1>s^<-1>と非常に大きな値であることを明らかにした。これは、ルテニウム錯体とGOx_<ox>間に静電的相互作用があり、さらにそれに加えて4,4'-ビピリジニウムイオンとGOx_<ox>の補酵素であるフラビンアデニンヂヌクレオチドのイソアロキサジン環との間に芳香環同士のπ-πスタッキングがあることが、^1H NMRと蛍光スペクトルから明らかになった。このような弱い相互作用の存在により、大きな電子移動速度定数をもつことを解明した。
ステロイド骨粗鬆症におけるビタミンD代謝異常の解析

グルココルチコイドの大量投与により、ステロイド誘導性の骨粗鬆症が発症することが知られている。しかし、ビタミンD代謝におけるグルココルチコイドの影響については不明な点が多い。マウスにグルココルチコイドのDexamethasone(Dex)を投与すると、腎における24-水酸化酵素発現を強く促進することを報告した。そこで、骨と腎の細胞における、24-水酸化酵素発現抑制に対するDexの作用機構を解明する目的で、本研究を行った。Subconfluentになった骨芽細胞様細胞(UMR-106)及び腎尿細管細胞(LLC-PK_1)を無血清培地で24時間培養した。UMR-106の場合、1,25(OH)_2D_3を添加後24時間培養し、さらにDexを加えて448時間培養した。LLC-PK_1には1,25(OH)_2D_3とDexを同時に添加して48時間まで培養した。24-水酸化酵素mRNA発現量の測定は細胞からTotal RNAを抽出してNorthern blot法により行った。10^<-7>Mの1,25(OH)_2D_3の存在下で骨、腎いずれの細胞でも24-水酸化酵素mRNA発現量、及び酵素活性はDexの用量依存的、また経時的に上昇した。この促進作用は他のステロイドホルモン添加では観察されなかったことから、Dexに対し特異的であった。Dex単独の投与では24-水酸化酵素発現はみられなかった。また、Cycloheximideの前処理によってもDexの促進効果は消失した。さらにDex投与によりc-fos mRNA発現量が著明に上昇した。以上の結果から、Dexの24-水酸化酵素発現促進作用は新たなタンパク性の転写促進因子の合成、少なくとも一部はFosタンパク質の合成促進を介して発現するものと考えられた。グルココルチコイドの大量投与により骨粗鬆症が発症することはよく知られている。研究代表者はデキサメタゾン(Dex)をマウスに投与し、腎のビタミンD代謝である1α-および24-水酸化酵素の発現調節について検討を行った。8週齢のddYマウス(雄性)を低カルシウム・ビタミンD欠乏食で2週間飼育し(-Ca-D)、半数に屠殺6日前からグルココルチコイドとしてDexを2.0mg/kg bw/dayで5日皮下投与した。屠殺後、血液採取と腎の摘出を行った。血漿Ca濃度は、-Ca-D群では正常食マウス(+Ca+D)に比べ有意に低下したが、Dex投与により+Ca+D群以上に増加した。P濃度に変化は認められなかった。1,25(OH)_2D_3濃度は-Ca-D群で有意に増加したが、Dex投与による変化は見られなかった。腎の1α-水酸化酵素、24-水酸化酵素、およびビタミンD受容体(VDR)mRNAをノーザンハイブリダイゼーション法により検討したところ、-Ca-D群における腎の1α-水酸化酵素mRNAと酵素活性は、Dex投与により低下した。一方、24-水酸化酵素のmRNAと酵素活性はDex投与により約10倍以上の増加を示した。この時のVDRmRNAはDex投与により1.5倍に上昇した。しかし、Bindin gassayにより機能的VDRの発現量を調べたところ、Dex投与による変化は認められなかった。すなわち、Dexによる24-水酸化酵素遺伝子発現の上昇と1α-水酸化酵素遺伝子発現の低下は、機能的VDRの発現量に起因するのではなく、Dexの直接作用によると考えられる。

おそらく、グルココルチコイドの未知の作用機序により24-水酸化酵素発現が上昇したと推測される。以上の結果より、低カルシウム・ビタミンD欠乏食で飼育したマウスの腎では、グルココルチコイド投与により1α-水酸化酵素発現が抑制され、24-水酸化酵素が強く誘導されることが示された。グルココルチコイドの大量投与によりステロイド誘導性骨粗鬆症が発症することが知られている。そこで研究代表者は、カルシウムの恒常性を維持する上で極めて重要なステップである腎での25OHD_3代謝に対する、グルココルチコイド、Dexamethasone(Dex)、の効果をin vivoで検討した。その結果、Dexは24-水酸化酵素発現を強く促進し、一方、1α-水酸化酵素発現を緩徐に抑制することを見い出した(Akeno et al. J.Endocinology 164:339-348,2000)。Dexの作用は24-水酸化酵素において強く発現することから、骨と腎の細胞における24-水酸化酵素発現制御に対するDexの作用機構を解明するために、本研究を行った。10^<-7>Mの1,25(OH)_2D_3の存在下で、骨、腎いずれの細胞でも24-水酸化酵素mRNA発現量はDex10^<-6>M添加で著明に上昇した。上昇のピークは骨細胞でDex投与後8時間であったのに対し腎細胞ではDex投与後24時間であった。24-水酸化酵素活性が最高値を示したのは骨細胞、腎細胞とも48時間であった。また、Dexの促進効果は用量依存的であり、10^<-7>Mで有意な上昇がみられ、10^<-6>Mで最大となった。この促進作用は他のステロイドホルモン添加では観察されなかったことから、Dexに対し特異的であった。Dex単独の投与では24-水酸化酵素発現はみられなかった。また、Cycloheximideの前処理によってもDexの促進効果は消失した。Dexは骨と腎において、1,25(OH)_2D_3により誘導された24-水酸化酵素発現を増強する。これはDexにより誘導された転写促進因子がビタミンD受容体複合体と相互作用をすることにより引き起されるものと推察された。グルココルチコイドの大量投与により、ステロイド誘導性の骨粗鬆症が発症することが知られている。しかし、ビタミンD代謝におけるグルココルチコイドの影響については不明な点が多い。マウスにグルココルチコイドのDexamethasone(Dex)を投与すると、腎における24-水酸化酵素発現を強く促進することを報告した。そこで、骨と腎の細胞における、24-水酸化酵素発現抑制に対するDexの作用機構を解明する目的で、本研究を行った。Subconfluentになった骨芽細胞様細胞(UMR-106)及び腎尿細管細胞(LLC-PK_1)を無血清培地で24時間培養した。UMR-106の場合、1,25(OH)_2D_3を添加後24時間培養し、さらにDexを加えて448時間培養した。LLC-PK_1には1,25(OH)_2D_3とDexを同時に添加して48時間まで培養した。24-水酸化酵素mRNA発現量の測定は細胞からTotal RNAを抽出してNorthern blot法により行った。10^<-7>Mの1,25(OH)_2D_3の存在下で骨、腎いずれの細胞でも24-
軽度外傷性脳損傷に対するジンセノサイドRb1と誘導体の治療効果に関する研究

軽度外傷性脳損傷(Mild Traumatic brain injury, MTBI)では、脳に明確な損傷部位を特定できない場合が多い。記憶力、注意力の低下などの高次脳機能障害がよく見られる。グリア細胞の活性化などによる神経炎症がMTBIに共通する病理所見として注目されている。紅蔘成分ジンセノサイドRb1(gRb1)及びその誘導体ジヒドロジンセノサイドRb1(dgRb1)が神経炎症抑止作用を介して脊髄損傷/脳梗塞治療効果を示した。そこで、本研究では神経炎症を主たる病態とするMTBIモデル動物を用いてgRb1及びその誘導体dgRb1の治療効果とその作用機構を検討することを目的とする。
人工ナノ細胞創製　－水中物質反応in-situ高分解能TEM観察への展開－

ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を用いてコレステロールを添加したリポソームを合成した。リン脂質二重層の相安定性についてはFT-IR分光法により評価した。超純水、生理的食塩水、もしくはヨウ化セシウム水溶液を内包させた強化リポソームは通常の透過型電子顕微鏡により観察した。これらのリポソームが確かに電子顕微鏡の室温真空中で安定であることを確認した。そして電子線照射により、水は徐々に抜けリポソーム中に単結晶塩が析出する事を確認した。本研究では真空中・電子線照射下で、より強靭なナノスケールのリポソームカプセルを合成し、内部に物質を導入し、水熱反応・結晶析出反応の現場を高分解能電顕観察することを目的とする.具体的には水溶液を内包したリポソームカプセルに生起する物質反応を真空中に持ち来し、その場観察を行う.そのための課題は、1高分解能観察に適した大きさのナノ・リポソーム実現.2電子線照射に対する耐久性の向上.3ナノ・リポソーム中に物質を導入した人工ナノ細胞の創製.である。平成25年度はまず、金属ナノ粒子の形成とその捕獲方法を検討するために、イオン液体を基板として用いて金のスパッタリングを行い比較的粒径分布の狭いナノ粒子の作成に成功した。一方で、リン脂質(ジパルミトイル・フォスファチジルコリン; DPPC)に30%のコレステロールを混合し、リン脂質二重層のラメラ構造を超音波処理によりラメラ構造を分離、自己組織化による、いわゆるバンガム法によりリポソームを合成した。これらの要素を組み合わせて金ナノ粒子を包み込んだセルの合成を行い、その電子顕微鏡観察を行った。その結果、二重層は確認されず、ミセルが形成されていることが予想された。これを受けてはじめにミセルを形成し、それにDPPCを被覆するマイクロカプセル化法によるリポソーム合成方法の検討を開始した。当初予定していたDPPC+コレステロールの状態図作成については赤外分光セルの改良が遅れたため次年度に実施することとなった。本研究では真空中・電子線照射下で、より強靭なナノスケールのリポソームカプセルを合成し、内部に物質を導入し、水中反応・結晶析出反応の現場を高分解能電顕観察することを目的としている。具体的には水溶液を内包したリポソームカプセルに生起する物質反応を真空中に持ち来し、その場観察を行う。そのための課題は、1高分解能観察に適した大きさのナノ・リポソーム実現.2電子線照射に対する耐久性の向上.3ナノ・リポソーム中に物質を導入した人工ナノ細胞の創製.である。平成25年度はまず、金属ナノ粒子の形成とその捕獲方法を検討するために、イオン液体を基板として用いて金のスパッタリングを行い比較的粒径分布の狭いナノ粒子の作成に成功し、さらにリン脂質(DPPC)にコレステロールを混合し、自己組織化による、いわゆるバンガム法によりリポソームを合成した。平成26年度にはDPPC+コレステロールの混合系に対して温度を制御した透過赤外分光分析を行い、CH2伸縮振動及びH2O伸縮振動の吸光度変化を検出し、コレステロール導入による低温のゲル相から高温の液晶相への相転移に伴う変化を捉えることに成功した。コレステロール量増加に伴い相転移点近傍の吸光度変化がステップ状変化からなめらかな変化へ移行することが明らかとなった。また、水を含んだリポソームの電子顕微鏡内における変化を捉え、食塩水を内包したリポソームにおいては食塩結晶の析出過程をその場観察することに成功した。更に本科研費にて高感度の質量分析器をtop-entry型電子顕微鏡に装着し、検出感度について検討を行った。本研究では真空中・電子線照射下で、より強靭なナノスケールのリポソームカプセルを合成し、内部に物質を導入し、水中反応・結晶析出反応の現場を高分解能電顕観察することを目的とした.具体的には水溶液を内包したリポソームカプセルに生起する物質反応を電子顕微鏡の真空中に持ち来し、その場観察を行う.そのために・高分解能観察に適した厚さのナノ・リポソーム実現し、電子線照射に対する耐久性を向上させ、ナノ・リポソーム中に物質を導入した人工ナノ細胞の創製が必要である.平成25年度には、リン脂質(ジパルミトイル・フォスファチジルコリン; DPPC)にコレステロール添加量を変化させてリン脂質二重層ラメラ構造を作製し、この結果を踏まえてバンガム法によりリポソームの合成プロセスを検討した。加えて水溶液の透過赤外分光を行うための光学セルの作製に着手した。平成26年度には、リン脂質二重層ラメラ構造の温度安定性を透過赤外分光法により評価し、相転移点の検出とコレステロール添加量により相転移点が消失することを確認した。そしてリポソーム作製条件の最適化を行い、食塩水中で合成したリポソームの観察に成功した。加えて既存の透過型電子顕微鏡に本科研費にて購入したイオントラップ質量分析計を装着し、電子線照射に伴う飛散粒子の検出システムを構築した。平成27年度には水、食塩水、CdI水溶液、等を内包するリポソームに対してその場電顕観察を行い、電子線照射に伴う溶液の揺らぎ、放出水分子の検出、脱水に伴う単結晶成長を確認した。以上の結果、電子顕微鏡内の真空でもコレステロール添加により強化したリポソームは確かに水を内包して存在しており、溶液中反応の観察環境を提供し単結晶成長の場となることを確認した。