hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノム構築に基づいた場の情報シグナルによる細胞系譜制御プログラムの解析

個体発生に伴う生体内各器官・組織の形成においては様々な細胞系譜の厳密な制御プログラムの基盤となるゲノム構築システムの存在が必須である。各々の器官・組織を構成する種々の細胞系譜のもととなる器官・組織特異的幹細胞の分化制御はそれら幹細胞が存在する場に働く増殖分化因子や接着因子などからの細胞外来性の情報シグナルによる遺伝子の発現制御が重要な役割を担っていると考える。また、場の情報シグナルという細胞外来性のシグナルとは別に、ゲノム情報の発現制御にはDNAメチル化やヒストンアセチル化などのエピジェネティックな修飾に代表される細胞内在性のプログラムも重要な役割を果たしている。本研究はこのような背景をもって、細胞系譜制御機構をゲノム情報の制御という観点から明らかにすることを目的として実施された。成果1:中枢神経系幹細胞のin vitroでの多分化能維持に必要な因子basic FGFを添加した神経幹細胞培養画分とbasic FGFを除いた培養画分からmRNAを抽出してマイクロアレイにて解析し、両者に発現量の変化のあるクローンを幾つか見いだしたので、時空間的発現解析と機能解析を実施中である。成果2:ニューロンやアストロサイトのもとになる前駆細胞は共通でありながら胎生中期の脳ではニューロン分化は盛んに生じるがアストロサイト分化は皆無で、一方胎生終期になるとニューロン分化は殆ど見られず代わってアストロサイト分化が優位となる点に着目した研究を実施した。アストロサイト特異的マーカー分子GFAPの遺伝子プロモーターにはGFAP遺伝子発現にクリティカルな転写因子STAT3の認識配列が存在する。そのSTAT3認識配列に存在するシトシンが胎生中期では高度にメチル化され、胎生後期にはそのメチル化が外れることと、そのSTAT3認識配列のメチル化がSTAT3のDNA結合と転写活性化とを阻害することを見いだした。これらの結果はアストロサイトの細胞系譜の制御にはDNAメチル化というエピジェネティックなシグナル制御機構が関与することがわかった。
日本の聴覚障害教育の制度的・方法的整備とドイツ情報の影響に関する比較教育学的研究

明治期にドイツ留学を経験した耳鼻咽喉科医師である岡田和一郎は、帰国後、「聾唖」児の残存聴力の評価と適切な活用による教育の必要性とともに、聾唖教育の義務化、無教育聾唖者のための保護施設の設置等を主張した。久保猪之吉は、大学耳鼻咽喉科教室の研究・臨床環境の整備を通して地方および全国の両レベルで聾唖教育に関わった。しかし、聾唖学校や小学校に難聴児のために学級が設置されるのは、岡田の最初の主張から四半世紀後の1926年のことであった。本研究は、日本の聴覚障害教育が制度的・方法的に整備される過程で、その手本となった先進国の一つであるドイツからの情報がどのように摂取され、日本の聴覚障害教育の制度的・方法的整備にいかなる影響を与えたのかを究明することを目的とする。具体的には、次の手順をとる。(1)明治期から昭和戦前期を対象として、ドイツ渡航を経験した聴覚障害教育の関係者が残した足跡を整理し、ドイツから紹介された情報が日本の聴覚障害教育の制度的・方法的整備にどのように関係していったのかを明らかにする。(2)戦後期については、アメリカ教育使節団からのアメリカ情報の流入により、ドイツ的要素がどのように変容したのかを1960年代までを区切りとして明らかにしていく。本研究の目的は、日本の聴覚障害教育が制度的・方法的に整備される過程で、ドイツからの情報がどのように摂取され、いかなるに影響を与えたのかを究明することである。平成19年度は、以下の二点に集約される文献の収集をおこなった。第一は、明治期以降の教育、科学、文化、政治等の日独交流史に関する文献であり、第二は、明治期以降にドイツを主要な留学先として飛躍的に発展し、日本の聴覚障害教育の方法的整備にも影響があったと考えられる耳鼻咽喉科学分野の文献である。後者の文献については、本邦耳鼻咽喉科学の草創期に開設された九州帝国大学医学部耳鼻咽喉科学教室(現・九州大学大学院医学研究院耳鼻咽喉科学教室)にて収集されてきた史資料の調査を行った。同教室は、1906 (明治39)年4月に開設され、翌年2月、ドイツ留学を終えた久保猪之吉(1874-1939)を教授に迎え、1927 (昭和2)年5月には、本邦最古の耳鼻咽喉科学博物館である久保記念館を設立、翌1928 (昭和3)年には専門雑誌「耳鼻咽喉科」を創刊させた。九州大学附属中央図書館および医学分館、久保記念館、そして耳鼻咽喉科教室図書室等でおこなった史資料調査の結果、部分的ではあるが以下の仮説が導き出された。1.九州帝国大学の耳鼻咽喉科学教室は、明治末期から昭和戦前期の耳鼻咽喉科学の臨床・研究、及び情報発信の一大拠点であった。2.明治30年代後半から耳鼻咽喉科医師の聴覚障害教育への関心は存在したが、昭和初期以降になると、「声音及言語障害」の研究分野としての確立や、聴力検査機器の導入により、さらに顕著となった。3.明治期から昭和初期の耳鼻咽喉科医師と聴覚障害教育との関わりは、聴器疾患や言語治療の臨床面だけでなく、聾唖教育の普及や聾唖者の社会的地位の向上といった社会的側面にも及ぶものであった。平成20年度の研究実績は、以下の二点に集約される。第一は、明治末期以降の聾唖教育の方法的整備における耳鼻咽喉科学の役割の分析である。とくに今年度は、九州帝国大学医学部耳鼻咽喉科学教室を検討対象とした。同教室は、1906(明治39)年4月に開設され、翌年2月にドイツ留学から帰国した久保猪之吉(1874-1939)を教授に迎えて以降、内外の耳鼻咽喉科学の拠点の一つとなった。同教室が、明治末期から昭和戦前期における聾唖教育の方法的整備に果たした役割として、(1)「無響室」「声音言語障碍治療部」等の設置による聾唖や残聴利用についての基礎的・臨床的研究の促進、(2)臨床・研究上の知見に基づく、近隣の福岡盲唖学校の口話教育・残聴利用の教育との連携、(3)聾唖教育関係者への日本初の検査設備・機器の紹介という三点をあげることができる。第二は、ドイツ共和国バイエルン州ミュンヘン市への訪問調査である。

訪問目的は、東京帝国大学医学部耳鼻咽喉科学講座の主任候補として、1896(明治29)年3月から1899(明治32)年12月にかけて、ドイツ、オーストリアに留学した岡田和一郎(1864-1938)の足跡を辿ること、彼の留学先の一つであったルードヴィッヒ・マクシミリアン大学(ミュンヘン大学)での、ドイツの聴覚障害教育に関する史資料の収集、同大学の聴覚障害教育の研究者から研究助言指導を得ることであった。ミュンヘン市での調査では、大学附属図書館、国立ミュンヘン図書館等において、ドイツ聴覚障害教育史に関する史資料を収集するとともに、上述の岡田和一郎に関する資料の所蔵を確認した。聴覚障害教育の研究者からは、史資料収集の場所や時期等について情報を得た。また、現代ドイツの聴覚障害教育をめぐる諸問題(とくに人工内耳に関わる)について情報を得るため、ミュンヘン大学医学部耳鼻咽喉科の医師と言語病理学者、また人工内耳装用児を育てる家族と、それぞれ面談をおこなった。1.ドイツロ話法の思想的基盤の歴史的検討ドイツロ話法の父であるサミュエル・ハイニッケの創設したライプツィヒ聾学校の聴覚言語障害文庫にて、貴重資料の閲覧・複写、特に20世紀初頭のドイツの難聴児教育に関する資料を収集するとともに、今後、ドイツの聴覚障害教育の歴史的研究を深めていく上で有用となる史資料の所蔵状況の把握、文庫責任者との面談による情報収集をおこなった。2.日本の聴覚障害教育における耳鼻咽喉科学の役割の総合的検討昨年度に引き続き、九州帝国大学医学部耳鼻咽喉科学教室の役割に関する分析をおこない、今後解明すべき4つの課題を示した。第一に、明治末期から昭和戦前期において、連続音叉やオージオメータを用いた検査がどの程度の判定力をもったのかという点、第二に、聾〓児の聴力評価が聾〓学校の教育方法上の開発や、別種の学校・学級の設置といった制度上の整備とどう関係したのかという点、第三に、教育方法の実質的な変化が生じる時期とその結果、そして第四に、他大学の耳鼻咽喉科教室による臨床・研究活動や聾〓教育への関与との異同である。3.現代ドイツの聴覚障害教育の研究動向および現状の調査ミュンヘン大学心理教育学部附属図書館での聴覚障害教育・福祉・医療関係の諸資料の調査から、ドイツでは人工内耳に対する関心が高まっていると同時に、聴覚障害のある子どものアイデンティティ形成についても問題関心が持たれていること、成人聴覚障害者が文化的活動や聴覚障害者の生活史・教育史への強い関心をもっていることが了解された。ライプツィヒでは、義務教育段階後の聴覚障害青年の教育・訓練の場の一つである、ライプツィヒ聴覚言語障害者のための職業訓練センターの見学、市内の初等学校で聴覚障害児が1名在籍するクラスの授業見学をおこない、聴覚障害のある青年の社会参加に向けた取り組みの特徴、通常学校で学ぶ聴覚障害児への教育的支援の現状を把握した。1.日本の耳鼻咽喉科医師の聴覚障害教育への関与の分析明治末期にドイツ留学を経験し、その後、日本の聴覚障害教育に関与した岡田和一郎(東京帝国大学医学部耳鼻咽喉科初代教授)および久保猪之吉(九州帝国大学医学部耳鼻咽喉科学教室初代教授)の役割を改めて分析した。岡田が「残存聴力」の程度を評価し、その活用を主張する上で、ウィーンおよびミュンヘンでの学びは重要な意味をもった。久保は岡田の教え子として、留学前から「残存聴力」を活用する教育や新しい補聴器の紹介をおこなった。帰国後の久保は、耳鼻咽喉科学領域の学術雑誌や書籍の編纂、内外諸研究の摂取に尽力し、学術・研究面からも聴覚障害教育に関与した。両者は、聴覚障害者の福祉的課題への関心もあった。2.国際聾教育学会での研究成果の発表上述の内容について、第21回国際聾教育会議(バンクーバー)の「教育におけるテクノロジー/手話とろう文化」のポスター・セッションにて発表をおこなった。北米のろう者との質疑では、耳鼻咽喉科医師の関与がろう当事者の生活にどのようなインパクトを与えたのかという視点からの分析が必要との示唆を得た。一方で、聴覚活用は今日までの日本の聴覚障害教育の特徴でもあり、その特長と課題の把握には、耳鼻咽喉科学の関与という視点からさらに研究を進める必要があると思われた。3.日独の聴覚障害教育の方法論の歩みの比較検討
幼児の目撃証言時の記憶に関する実験的検討

(1)幼児の顔の識別に及ぼす髪型と眼鏡の影響(日本教育心理学会第43回総会(2001)発表論文集p.11)本研究では,髪型の変化や眼鏡の有無が幼児の顔の識別能力に及ぼす影響について検討するために,幼児と成人を被験者とし,ターゲット刺激と同じ人物の写真を3枚の写真(ターゲットの髪型や眼鏡を変化させた正答刺激1枚と2枚のディストラクタ)から選択させる課題を行った。その結果,成人であればすべての課題において正答率がほぼ100%であったのに対して,幼児は,ターゲットと正答刺激の髪型が異なる課題の正答率が低く,特に,ターゲットと正答刺激の髪型と眼鏡の有無の両方が異なる課題ではほとんど正答できないことなどが明らかになった。(2)幼児と成人による顔の性別判断に及ぼす髪型と顔つきの影響(日本心理学会第65回大会(2001)発表論文集p.282)本研究では,性別判断の正確さに髪型と顔つきがどの程度影響するのかを検討するために,幼児と成人を被験者とし,髪型(髪なし,ショートヘア,ロングヘア)と顔つき(男っぽい男,女っぽい男,男っぽい女,女っぽい女)を組み合わせて作成した顔刺激について性別判断を求めた。その結果は以下の通りである。(1)髪なしとショートヘアの場合:成人は男っぽい女に対して,あとの3つの顔つきより正確な判断ができず,また,その3つの顔つきに対して判断の正確さに差はなかった。しかし幼児は,男よりも女に対してのほうが正確な判断ができず,さらに,男の中では女っぽい男に対して,女の中では男っぽい女に対して,正確な判断ができなかった。(2)ロングヘアの場合:成人は女に対する判断よりも男っぽい男に対する判断が正確になった。しかし,幼児は女よりも男に対する正確な判断ができず,その中でも特に,女っぽい男に対する判断は不正確であった。(1)ある出来事の行為者の顔と周辺人物の記憶に関する発達的検討幼児がある出来事とその行為者の顔や服装をどの程度結びつけて記憶できるかを検討した従来の実験的研究(杉村:1998,1999)では,行為者の顔の記憶は幼児より成人の方が優れていること,服装の記憶に関しては成人であっても難しいことなどが明らかにされている。本研究では同様のパラダイムを用いて,主要な行為を行っていない周辺人物の行動や顔についてどの程度記憶されているかを検討した。その結果,(1)行為と行為者の顔とを結びつけて記憶することは幼児よりも成人のほうが優れていること,(2)周辺人物の顔の記憶は成人であっても難しいこと,(3)幼児は主要な行為を行っていない周辺人物についてはその存在すら認識しておらず,周辺人物の顔や行動についてはほとんど記憶していないことが明らかになった。(2)成人が幼少期の社会的出来事を回想する際の誤記憶の検討生前,就学前,小学校期の社会的出来事(芸能・事件)に関する記憶について,生起時の誤った既知感(生前に起こった出来事に対して,起こった当時のことを憶えていると判断するなど)や,誤った生起時期の認識(生前に起こった出来事を,小学校の時に起こったと判断するなど)がどの程度おきるのかについて検討した。まず,生起時の誤った既知感については,芸能よりも事件の方が誤った既知感をもつ者が多い傾向にあった。次に,生起時期の判断については,小学校期の出来事が一番正答率が高く,生前と就学前の出来事を比較すると,就学前の出来事に対して誤った判断をする割合が高い傾向があった。
有機薄膜/半導体接合を用いる高感度分子センサーに関する研究

本研究は有機物の薄膜が気体分子を選択的に吸着したり、溶液中のイオンを特異吸着して表面電位が変化する現象を利用して、無機半導体に有機物薄膜を接合した系を用い、有機薄膜上の化学種の吸脱着による表面電位の変化を、無機半導体の表面電気伝導度および反応電流の変化として検出するセンサーを作製することを目的としている。作用電極としてはn型Sn【O_2】-Nafion薄膜系を用いた。検出の選択性を賦与するために、Nafion中のプロトンを他の陽イオン、たとえば【Fe^(3+)】イオンに置換した。測定系は対極が白金、参照極がAg/AgClの三極セルを用いて行なった。プロトンをキャリヤーとするNafion膜を用いた場合、この作用電極のフラットバンド電位は溶液のプロトン濃度と共に負にシフトした。その傾きは-60mV/pHであった。Nafion中の【H^+】を【Fe^(3+)】に置換した作用電極の場合は、プロトン濃度によってフラットバンド電位は影響を受けなかったが、溶液中の【Fe^(3+)】の濃度を変化するとフラットバンド電位は20mV/p【Fe^(3+)】の割合でアノード方向にシフトした。この系のフラットバンド電位がSn【O_2】の仕事関数に等しくなるときの【Fe^(3+)】濃度は、Cpzc=【10^(-4.4)】Mであった。以上の結果から、この作用電極におけるn型Sn【O_2】の表面電位はVs=20(mV)×log(C【Fe^(3+)】/Cpzc)+【V_x】-【V_w】と表わされることがわかった。ここで、【V_x】はSn【O_2】の仕事関数、【V_w】は作用電極の電位である。このことからまた、アノードバイアス下での表面電気伝導度はC【Fe^(3+)】/Cpzcの対数に比例することがわかる。作用電極の電位を負方向にシフトさせると反応電流が流れはじめる。表面電流をIs、反応電流を【I_R】とすると、1+(【I_R】/Is)はC【Fe^(3+)】と線型関係にあることがわかった。このように、両電流成分Isと【I_R】を同時に測定することにより、溶液中のイオン種の濃度を高精度かつ選択性良く求められることがわかった。
日本中世古文書フルテキストデータベースの構築方法に関する研究

本研究の目的は、第一に歴史文字資料の全文をコンピュータに入力する際の前処理の方法、第二に管理情報の付与の形態、第三に文字・キーワード・検索方式の研究の三点にあった。1については、HTML形式で入力して前処理を基本的に省略する仕様を確定し、学界・社会からの要請のスピードにあわせて、フルテキストを形成し、同時に、将来、電算印刷情報をデータベース化する際の受け皿の基本的考え方につなげることができた。2の管理情報付与の形式については、刊本資料集にはかならず存在する「目次」を利用するという単純な結論となった。これは、近年のア-カイヴスの動向の中で大きな問題となっているが、大量に存在している目次を史料構成要素の最基礎段階(ITEM段階)を機械的に総覧する道具として使用することが実際的なことを確定できた。3については、中世史料処理のための必須漢字表を集成したこと(これは今後のコンピュータの文字文化の議論の有力な手段となる)、歴史語彙としては最高数(約8万件)のキーワード辞書を形成したこと(これは歴史語彙コーパス形成のための今後の語彙学との学際的議論の前提となる)、KWIC検索方式(コンコーダンス方式)を確定したことなど、多様な成果があった。さらに、データ形成と公開については、本研究によって、『平安遺文』と『大日本古記録』(平安時代分)を中軸とすると「平安時代史料フルテキストデータベース」を構築し、史料編纂所ホームページから公開したこと、本件級の中心をなした『平安遺文』(竹内理三編纂)については、CD-ROMの発行を実現したこと(1998年4月予定)、本研究の発展として『大日本古文書』のフルテキストデータベース構築(1997年度より研究成果公開促進費、データベース)が開始されたことをあげておきたい。以上、コンピュータデータベース構築における公開原則の先進例を提供することができたと考えている。1、古文書全文の電算化前処理の研究。すでに活字化されている古文書史料の前処理方針の要点として、(1)割書、傍書、訂正、注の処理、(2)活字版面の行組を生かし、前処理を簡便化し、フルテキストの行統御情報にも利用(なお、検索語彙が行を越える場合は改行符を無視してキ-付与する方式を考案)、(3)管理情報は古文書聖教DBおよび別途開発の汎用架蔵コードの体系を装備{消耗品費、旅費などを使用}。2、多様な利用の可能となるシステムの構築。(1)検索システム。メインコンピュータ、ACOS上で作動する単漢字検索とEWS上にカスタマイズしたキーワード検索ソフト(future/happiness)の二重性。(2)検索結果の表示方式。ACOS上でのコンコーダンス表示、全文詳細表示、キーワード検索ソフトの表示の多重性。(3)目録DBとしての古文書聖教DBシステムとのリンク。(4)キーワード検索ソフト(future/happiness)の導入によるネットワーク公開の準備など。{その他、システム開発費使用}3、データ入力。当初、入力対象とした東京大学史料編纂所編纂の『大日本古文書』東大寺文書でなく、竹内理三氏編纂の『平安遺文』を入力対象とし、その半分(6冊、文書約3000点)を入力した{その他、外注経費使用}。4.語彙・漢字字種の研究、日本史史料の電算化のためにどのようなJIS第二水準外漢字が必要かについての研究を開始し一応の成果をえた。歴史辞書としては最高数(約8万件)のキーワード辞書をEWS上に形成した。(1)システムの開発:メインフレームのACOSとfuture/happinessの二重システムをより有効に利用し、システムの連関性を強化するためにデータ長・DOS出力などに関するシステム開発の追加を行った。

これは史料編纂所における歴史資料の目録データベース、画像データベースとフルテキストデータベースの複合システムの一部である。(2)データ入力と公開・竹内理三氏編纂の『平安遺文』を入力対象とし、その全体(11冊、文書約5300点)を入力し、基本部分の校正を終了した。特定の時代の文書をすべてフルテキストデータベース化し、(著作権者・版権者との協議の上)CD-ROM化による公開を見通しえたという意味で、コンピュータを利用した日本史研究の発展の上で画期的な成果である。また従来より別途蓄積してきた古記録フルテキストの内、小右記、御堂関白記、貞信公記、九暦などの平安時代の重要古記録をこの新システムに移行させ、公開・利用可能にした。(3)語彙・漢字字種の研究:平安時代古文書のほとんどを収載している『平安遺文』の全文を実際に入力することにより、日本史史料の電算化のためにどのようなJIS第二水準外漢字が必要かについて研究し、平安時代について一覧表(稿)を作成した。また歴史辞書としては最高数(約8万件)のキーワード辞書をEWS上に形成した。以上、94年度(平成6年度)における全体システムの開発を前提として、本年度も、所期の成果を挙げることができた。特に、全文歴史情報の研究にとって最大の隘路であった公開に目処をつけたこと、活字本のコンピュータ化は翻刻の誤りや誤植訂正する上で有効なことを確認した点などは評価すべきと考える。本年度は、古記録フルテキストとのシステム関係の処理、ハイパーテキスト方式による東大寺文書・真珠庵文書などの全文フルテキストの蓄積などで予算を使用し、所期の成果を収めた。しかし、本年度の最大の成果は、これまで開発してきたシステムを前提として、史料編纂所編纂の『大日本古記録』(岩波書店発行)の内、『貞信公記』『九暦』『小右記』『御堂関白記』『後二条師通記』の5点、『平安遺文』(竹内理三氏編纂、東京堂出版発行)のフルテキストデータをインターネット上で公開したことである(97年2月から3月)。これによって、(古文書のみでなく古記録をふくめて)平安時代の歴史史料の基本部分を全世界から簡便に検索することが可能となった。この過程で特に問題であったのは、版権をゆうする出版社との折衝であったが、インターネットブラウザ上で、任意のキーワードを中心に前後各約10字のみを公開し、全文情報については別途の協議事項とするという形で合意をうることができた。本グループが開発したKWIC(キーワードインコンテキスト)方式、あるいはいわゆるコンコーダンス方式の検索は、あくまでもフルテキストデータの学術的大量処理と公開のために構想されたものであるが、それが現状のコンピュータ文化の中で、版権者の権利に対する技術的配慮の側面でも有効性をもつことになったのは、その必要性や当否は別として意外な結果であった。なお、『平板遺文』のテキストの最終校正などの問題は、科研グループの手を離し、版権者などの努力で、97年度中にも、フルテキストを収めたCD-ROMが発売される予定である。
血管新生阻害因子エンドスタチンの腫瘍血管における動態と作用機構の解明

エンドスタチンは内因性の血管新生阻害剤であり、血管などの基底膜を構築するXVIII型コラーゲンの分解産物であり抗がん剤としての臨床試験が進行中である。しかしエンドスタチンの作用機構に関しては依然として不明であるのが現状である。本研究の究極的な目標はがんの増殖抑制、浸潤や転移阻害における分子メカニズムを解明することである。私達はエンドスタチンが種々のMMP(Matrix Metalloproteinase)の活性を阻害することを見出し、特にゼラチンを分解するMMP-2、9に対する阻害活性が高いこと、またMMP-12、13、14に対しても相対的に高い阻害活性を示すことを明らかにした。これらのMMPはいずれもがんの浸潤、転移に深く関与することが知られており、エンドスタチンのMMP阻害活性は抗がん作用・抗炎症作用の一翼を担っていると考えられる。MMP-14は細胞膜に存在しインテグリンαvβ3と複合体を形成することからエンドスタチンの受容体である可能性が示唆されたが、エンドスタチンを反応させた血管内皮細胞において細胞膜上にエンドスタチンとMMP-14、インテグリンαvβ3とが共存するか否かを共焦点レーザー顕微鏡で3次元的に解析した結果、共局在像が観察されないことから受容体である可能性は低いと考えられた。血管内皮細胞のエンドスタチンに対する応答性の差異を明らかにするために、応答性の異なる2種の細胞の遺伝子発現をジーンチップマイクロアレイによって比較した。この結果応答性の細胞では非応答性細胞に比較して発現が亢進している遺伝子が1.86%、発現が減少している遺伝子が2.9%、変化の認められない遺伝子が95%であった。エンドスタチンは内因性の血管新生阻害剤であり、血管などの基底膜を構成するXVIII型コラーゲンの分解産物で抗がん剤としての臨床試験が進行中である。しかしエンドスタチンの作用機作は依然として明らかではなく、本研究の究極的な目標はがんの増殖抑制、浸潤や転移阻害作用における分子メカニズムを解明することである。私達はエンドスタチンが数種のMMP(Matrix Metalloproteinase)の活性を阻害することを見出し、特にゼラチンを分解するMMP-2,9,MT1-MMPに対して高い阻害活性を示すことを明らかにした。MMPはがん細胞に強く発現され、がんの浸潤、転移に深く関与していることから、この阻害活性がエンドスタチンの抗がん作用、抗炎症作用の一翼を担っていると考えられる。さらにMT1-MMPは血管内皮細胞の細胞膜上に発現していることからエンドスタチン結合蛋白と推定され、コラーゲン基質上ではエンドスタチンと結合能を有するインテグリンαvβ3と会合して存在することから、両者の複合体がエンドスタチンの高親和性受容体である可能性が高いと考えられた。この仮説を証明するために血管内皮細胞にFLAG-エンドスタチンを作用させ、抗MT1-MMP抗体、抗αvβ3抗体、抗FLAG抗体を用いて染色し各々の局在を調べたところ、これらは細胞膜上、特に内皮細胞間や偽足状の突起の先端部位に強く発現しており、かつ共存している像が観察された。さらにMT1-MMPがエンドスタチンと結合するのみならず、受容体として機能している可能性を検討するために、内皮細胞にMT1-MMPを強制的に高発現させた場合並びにsiRNAを用いて発現を阻害した場合におけるエンドスタチンに対する反応性の相違を内皮細胞遊送阻害実験にて検討している。

昨年度の研究成果からエンドスタチンが数種のMMP(Matrix Metalloproteinase)の活性を阻害し、特に血管内皮細胞膜上に発現するMT1-MMPの活性阻害が顕著なことからMT1-MMPとintegrinα_vβ_3との複合体がエンドスタチンの受容体として機能していると考えられた。この仮説を立証するために種々の抗体を用いて局在を調べたところ、蛍光顕微鏡による観察ではエンドスタチンを暴露した内皮細胞膜上でエンドスタチンとMT1-MMPが共局在していると判断される像が得られた。しかし共焦点レーザー顕微鏡下で3次元的に局在を精査すると、細胞の形態によってエンドスタチンとの局在が異なることが明らかになった。すなわち伸展接着している細胞では、エンドスタチンは細胞の基底面に班状に染色されるが、伸展していない球状の細胞ではエンドスタチンは細胞質内に取り込まれていることが示された。現在integrinとの共局在の可能性を検討しているが、接着班に局在している可能性は低いという結果が得られている。一方異なるアプローチでエンドスタチン受容体の検索を開始した。血管内皮細胞にはエンドスタチンに応答する細胞と、応答性が低下している細胞が存在するが、各々の内皮細胞の発現遺伝子をマイクロアレイにより比較したところ、発現量に有意差が認められた遺伝子は245であり、発現比(log_2)が2以上に亢進している遺伝子が20,-2以下に発現が減弱している遺伝子が8であった。これらの遺伝子発現情報に基づき、エンドスタチンの応答性を支配している遺伝子を特定することにより、受容体をはじめとする反応機構を明らかにする試みを開始した。
末梢神経損傷に対する細胞移植治療を目的とした新規シュワン細胞誘導法

ゼノフリーの培養系の樹立の検討我々が線維芽細胞から直接転換で誘導したシュワン細胞の臨床応用を考えた時、導入の過程で動物由来の血清を使用することは、未知のウィルスの混入などをの可能性を完全に排除することができないことなど、使用上の安全面において障壁となる。そこで、遺伝子導入後のヒト線維芽細胞を、FBS添加培地に換えて種々の無血清合成培地、またはヒト血清を添加した培地を用いて培養を行い、最適なゼノフリー培養条件を検討した。しかしながら、FBS添加培地に比して、シュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングの効率が37%から5%に低下した。また誘導した誘導シュワン細胞のViabilityも低下することが明らかとなった。今後、誘導したシュワン細胞の培養下維持のためにFBSに含有されている必須の因子を同定することが必要であり、今後の重要な研究課題と思える。線維芽細胞以外の体細胞(血液リンパ球、脂肪由来の間質細胞)からの誘導皮膚線維芽細胞以外のさらなる低侵襲な体細胞として、血液由来の細胞もしくは脂肪組織由来の間質細胞が考えられる。これらの細胞を、線維芽細胞と同様の方法で遺伝子導入後、シュワンに誘導される効率と誘導に要する期間を比較し、もっとも適した細胞を検討した。血管内皮細胞を細胞材料としても、20%近くの効率でシュワン細胞に誘導できたが、内皮細胞の増殖力が乏しく、遺伝子の導入効率に問題があった。一方、皮膚線維芽細胞の代替え細胞として脂肪組織由来の間質細胞は、皮膚線維芽細胞を上回る(45%)導入効率を示した。しかし、われわれが目指した線維芽細胞60%以上のシュワン細胞への誘導効率を持つ代替え細胞ソースが見いだされた。今後、線維芽細胞に代わる細胞材料として脂肪間質細胞が注目されていくことが予想される。シュワン細胞の発生や分化に大きく関わる因子合計9因子のうち2因子の強制発現でヒト線維芽細胞の約30%をシュワン細胞に直接誘導できる(Direct reprogramming schwann cell:dSC)ことが明らかとなった。われわれは、まず真(内在性の)のシュワン細胞(Primary Schwann cell:pSC)と比較するためにヒト由来培養シュワン細胞の分離・培養を行った。皮膚由来ヒト線維芽細胞(HDF)からiSCへの細胞転換を分子生物学的に確認するため、dSC、pSC、HDFのそれぞれについて免疫組織学的染色とRT-PCRを行い、細胞の表面抗原や遺伝子発現プロファイリングの比較を行った。結果、dSCはpSC同様、s100b,p75NTR,NG2、GAP43といったシュワン細胞マーカーの陽性であったが、通常の条件ではグリアマーカーであるGFAPやミエリンマーカーであるMBPやP0は陰性であった。遺伝子レベルにおいても同様のパターンがみられた。次にdSCの神経突起伸長効果などの細胞機能の検証を行った。そこで、dSC由来の神経再生関連放出因子をELISA法で検討したところ、pSCとdSCの神経栄養因子発現パターンは類似しており、いずれもConに比較して発現量は有意に増加していた。われわれの方法で誘導したシュワン細胞をマウス坐骨神経欠損部に移植する場合の足場の設定に予定以上に時間を費やしている。また後根神経との培養条件の設定に予定より大幅な時間が必要となった。本年度はダイレクト・リプログラミング技法により誘導できたiSCについてのシュワン細胞に特有のミエリン化形成能やin vivoにおける移植効果などのさらなる細胞機能についての検討が重要であると考えた。そこで後根神経節細胞との共培養によりミエリン化形成能の有無についての検討を行った。また免疫不全マウス坐骨神経障害モデルにおいてiSCの移植を行い、神経再生効果についてヒト線維芽細胞(HDF)、ヒト培養SC (HCSC)と比較検討を行った。評価項目は坐骨神経機能、織学的検索(再生架橋、ミエリン形成)、支配筋の委縮・変性とした。また移植したiSCのミエリン形成能についても組織学検討を行った。結果としてin vitroモデルでiSCのミエリン化が確認された。神経損傷部位への移植実験ではHDF群に比較してiSC群でより優れた神経再生効果が確認され、一部の評価項目ではiSC群はHCSC群に匹敵していた。また移植したiSCは再生神経内で直接ミエリン形成していることも明らかとなった。以上よりiSCは、SC細胞と同等の神経再生機能とミエリン形成能を有していることが証明された。実験結果がわれわれのの当初の仮説と大きく矛盾するようなこがなかったためと思われる。本年度はダイレクト・リプログラミング技法により誘導できたdSCについてのin vivoにおける移植効果についてさらなる細胞機能についての検討が重要であると考えた。そこで免疫不全マウス坐骨欠損モデルへのdSCの移植し、細胞を移植しない群とプライマリーcultureSC(pSC)をconにその末梢神経再生能を比較検討した。再生された神経架橋についてはマクロ像でのcon群よりしっかりとした架橋が生成されており、pSCとも明らかな差異はみられなかった。再生神経の短軸切片のLuxol fast blueによるミエリン染色により、再生したミエリン数を比較したところCon群に比較して有意にミエリン再生が優れており、pSC群に匹敵していた。坐骨神経機能インデックスでは12Wの時点でdSC群はpSCに匹敵する坐骨神経機能の回復がみられた。また支配筋の委縮についてもCon群と比較して委縮は軽度であり、dSCとdSC間での有意差はみられなかった。

次に誘導したdSCのミエリン形成能を評価するために、あらかじめGFPでマーキングしたdSCを後根神経節細胞と共培養することで、in vivoの系では同様にGFPにラべリングしたdSCを神経欠損部に移植してから10週後に再生神経内で移植したdSCがミエリン化マーカーを発現しているかを検討した。GFPでマーキングしたiSCとDRGnとの共培養においてDRGの神経突起に沿って移植したシュワン細胞がみられ、多数のGFP細胞がミエリンマーカーとOverlapしていた。これらはMBPとP0の2種類のミエリンマーカーで確認された。以上よりわれわれが誘導したシュワン細胞(dSC)は真のシュワン細胞に近似した機能を保持していることが強く示された。臨床応用を考えた場合、さらに低侵襲な細胞材料として、有望な体性細胞である脂肪組織由来細胞のも見当の必要性があると考えられた。当初購入したセルライン脂肪組織由来細胞の細胞分裂能が低いため、遺伝子導入効率に問題があったが、初代培養の細胞を新しく用いることで、この問題は解決できが、その分研究が遅延してしまった。ゼノフリーの培養系の樹立の検討我々が線維芽細胞から直接転換で誘導したシュワン細胞の臨床応用を考えた時、導入の過程で動物由来の血清を使用することは、未知のウィルスの混入などをの可能性を完全に排除することができないことなど、使用上の安全面において障壁となる。そこで、遺伝子導入後のヒト線維芽細胞を、FBS添加培地に換えて種々の無血清合成培地、またはヒト血清を添加した培地を用いて培養を行い、最適なゼノフリー培養条件を検討した。しかしながら、FBS添加培地に比して、シュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングの効率が37%から5%に低下した。また誘導した誘導シュワン細胞のViabilityも低下することが明らかとなった。今後、誘導したシュワン細胞の培養下維持のためにFBSに含有されている必須の因子を同定することが必要であり、今後の重要な研究課題と思える。線維芽細胞以外の体細胞(血液リンパ球、脂肪由来の間質細胞)からの誘導皮膚線維芽細胞以外のさらなる低侵襲な体細胞として、血液由来の細胞もしくは脂肪組織由来の間質細胞が考えられる。これらの細胞を、線維芽細胞と同様の方法で遺伝子導入後、シュワンに誘導される効率と誘導に要する期間を比較し、もっとも適した細胞を検討した。血管内皮細胞を細胞材料としても、20%近くの効率でシュワン細胞に誘導できたが、内皮細胞の増殖力が乏しく、遺伝子の導入効率に問題があった。一方、皮膚線維芽細胞の代替え細胞として脂肪組織由来の間質細胞は、皮膚線維芽細胞を上回る(45%)導入効率を示した。しかし、われわれが目指した線維芽細胞60%以上のシュワン細胞への誘導効率を持つ代替え細胞ソースが見いだされた。今後、線維芽細胞に代わる細胞材料として脂肪間質細胞が注目されていくことが予想される。今後、さらに因子導入効率および直接転換効率を改善していける余地があると思われる。またdSCの神経再生に対する機能性についてもさらに詳細に検証していく必要がある。
高感度電気化学的酵素イムノアッセイ法の研究

メディエーター(Med)/ジアホラーゼ(Dia)/NADH系によるNADHの接触酸化電流(Ic)に基礎を置くNADHの高感度定量法と、この方法に基礎を置く酵素イムノアッセイ法について研究した。Med/Dia/NADH反応系は(1)1電子Med(Hexacyanoferrate(-3/-4)及びFerrocene(+1/0)系)ではSequencial機構により、また2電子Med(DCIP)ではPing-Pong機構により進行する事を、電気化学分析法及び分光化学分析法を用いて明らかにした。(2)いづれの機構によるとしても、Med濃度が十分薄い場合には、IcはMed濃度について一次、Dia濃度については1/2次反応式で与えられる同じ形式の基本式であたえられる。(3)Dia/NADH反応系は基質(NADH)阻害を受ける事が見いだされた。(4)競争的阻害及び非競争的阻害における反応速度式を導き、Icに対するNADH濃度の影響を解析した結果、阻害反応はNADH濃度について一次反応である事が示され、実効阻害定数Kiが求められた。(5)これらの結果に基づき、接触電流によるMedの高感度分析のためのNADHの至適濃度として0.25mMが設定され、この新しい設定条件の基でMed(4-aminophenol)の5x10^<-11>Mの検出が可能になった。(6)4-aminophenolphosphateのAlkalinephosphatase(Alkp-ase)による加水分解反応を上記(5)のほうほうで追跡する方法により、Alkp-aseの5x10^<-8>U/50μlは定量可能であることが示された。(7)Alkp-aseの高感度定量法に基礎を置く酵素イムノアッセイ法の可能性について具体的に論じた。今年度は昨年度につづきDiaphorase/NADH/Mediator(Med、4-アミノフェノール(2e-酸化還元系化合物)の酸化-還元系について、測定条件のより詳細な検討を行った。その結果、1)NADHの濃度効果について、上記酸化-還元酵素反応系にNADHの基質阻害効果が存在する事が推定された。そこで、上記効果を考慮した酵素反応速度式およびMedの接触電流(Ic)の理論式を誘導した。得られた理論式は既報の理論式を包含する形状を示した。2)つぎに、上記理論式の実験的検証を行った。その結果、上記基質阻害効果を無視できる条件下の接触電流(Ic)と従来の条件で得られた電流値(Ic*)との比(Ic/Ic*=)は1.3を示し、Medの検出限界濃度は5×10^<-11>M(従来の検出限界濃度は10^<-10>M)であった。3)また上記実験の結果によれば、Medの低濃度領域において電気的雑音の影響が著しいことが明瞭となった。以上の結果今後の課題として、まず実用的な問題としては電気的雑音の低減の重要性が明らかとなった。つぎに理論的な観点によれば、1e^-酸化還元系Medを利用したときの酵素反応機構についていまだに実験的に確定されていない。(この点について理論的な検討は上記1)と同時に行ったが)この問題は実用の観点からも重要な課題と考えられる。Mediator(Medと略記)/Diaphorase/NADHの系の接触電流について、(1)1e電子系と2e電子系Medにおける反応機構の違いを電気化学法および分光光度によって明確にした。(2)速度論的検討によりSequential反応機構で進行する1e電子系Medの場合においても低濃度領域ではPing-Pong反応機構を用いて解析可能なことを明らかにした。つぎに、

(3)酵素反応系(Diaphorase/NADH系)が基質阻害反応を伴うことを電気化学法および分光光度法によって実証し、速度論的手法を用いて解析を行った。その結果、(4)Medの微量分析の立場から溶液条件、特にNADH濃度の選択が重要な因子となることを明らかにし、上記解析結果を用いて至適NADH濃度を決定した。実験の結果によればMed(p-aminophenol)の5x10-11 Mの検出が可能となることが確認された。(5)本測定法を加水分解酵素の微量定量に適用したところ、Alkalinephosphataseの5x10-8 Uの検出が可能であった。
体軸形成におけるAxinの作用機構の解析

細胞間分泌蛋白質Wntは、生物種を越えて胎生期における体軸形成や細胞の増殖や分化を制御する。アフリカツメガエルの初期胚にWntやDsh(Dvl)、β-cateninを導入すると二次体軸が形成される。GSK-3β結合蛋白質AxinはAPCやGSK-3β、β-catenin、Dvlと複合体を形成し、GSK-3βによるβ-cateninのリン酸化と分解を促進してWnt依存性の体軸形成を抑制する。Axin自体もGSK-3βによってリン酸化されるがその生理的な意義は不明であった。そこで、動物細胞にAxinを発現させてGSK-3β阻害剤LiClやプロテインホスファターゼ2A(PPSA)阻害剤オカダ酸で処理したところ、Axinの蛋白質量は、LiCl処理により減少し、オカダ酸処理により増加した。さらに、Axin上のGSK-3βリン酸化モチーフを破壊した変異体を作成すると野生型Axinよりも半減期が短縮し、細胞をWnt刺激するとAxinが減少した。したがって、WntのシグナルはAxinを脱リン酸化して不安定化することにより、β-cateninの蓄積を促進する可能性が示唆された。Dvlは遺伝学的にWntのシグナルをGSK-3βに伝達しGSK-3βの活性を抑制すると考えられているが、その作用機構は不明であった。Dvlは、Axinと結合することや、Dvlの存在下ではAxin依存性のGSK-3βによるβ-cateninのリン酸化やGSK-3βによるAxinのリン酸化が抑制されることを見出した。Dvlの中央部のPDZ領域を欠損させた変異体を発現させた動物細胞では、Wnt依存性のβ-cateninの蓄積が起こらないことから、WntのシグナルはDvlのPDZ領域を通じてGSK-3βやβ-cateninに伝達されることが明らかになった。
ブナ天然林北進最前線における分布拡大過程の解明

ブナ分布北限地域の最前線における正確な分布を調べるために、空中写真解析と現地調査を併用した結果、ブナの孤立林は最大約4km間隔で9箇所分布していることが判明した。これらの孤立林は、ブナの連続分布域から鳥などによって運ばれた種子が育ち、成立した可能性がある。遺伝的解析の結果、孤立ブナ林では孤立度が高く、多様度は低下する傾向がみられたものの、ブナの樹齢は120年以下の若い個体が多く、ブナは林冠のかく乱などを契機として今後もゆっくりと分布範囲を拡大すると考えられた。北限域におけるブナの分布拡大過程を多角的に明らかにすることを目的として,今年度はブナ林分の群落構造の把握,遺伝構造解析のためのサンプリング,野鳥による種子散布距離推定のための行動圏調査,空中写真判読のための写真のデジタル化を開始した。群落構造の把握のために,ブナ林に20x20mの調査枠を設定し,樹種構成,胸高直径を記録した。樹齢を推定するために,成長錐によるサンプリングを行った。サンプルは研究室において年輪の読み取りを行っている。遺伝構造の把握のために葉サンプルを研究室に持ち帰り,遺伝子解析を開始し,現在分析中である。この結果の一部から,北限域のブナ孤立林分の遺伝子構造には,複数の系統が存在する可能性が示唆されている。過去の空中写真の判読に関しては,現在デジタル化を進めているが,枚数が多いために,現在作業を継続中である。種子散布距離を推定するために,黒松内町添別ブナ林において,ヤマガラ1羽に超小型電波発信器を装着し,ラジオテレメトリ法による行動圏の調査を行った。この結果,北限域に生息するヤマガラの,秋の行動圏はおおよそ2から6へクタール程度であることが示唆された。このことは,ヤマガラがブナの種子を林分内に散布し,その距離はネズミ類よりも遠くへ運ぶ可能性を示唆する。また同時に,孤立林分内部におけるブナの密度上昇に貢献していることを示唆するが,数キロメートル離れた場所にある他のブナ孤立林分ヘブナ種子を運ぶ可能性は低いと考えられた。したがって,ブナが現在も北進中であると過程しても,ヤマガラが直接ブナの分布拡大に貢献するのではなく,むしろ一度定着したブナ林において,その分布面積の拡大に貢献していることが示唆された。昨年度から継続して調査、解析を行ってきた結果が明らかになりつつある。遺伝解析の結果から,最も隔離の程度が高い北限域ブナ林の3集団、三之助、ツバメの沢、裏ツバメのブナ林はそれぞれまったく違った遺伝組成になっていたことが判明した。これは3集団がそれぞれ孤立度が高く、また孤立した状態が長期間に及ぶためである。その他の集団は個々に違いはあるが、概して祖先的な遺伝組成を持っており、全体として現在の分布の大きな流れを担っていると予想された新たに発見したチョポシナイ川のブナ林について,その長期的な変化を複数年の航空写真を用いて解析した結果、1960,1974年において樹冠が疎であった林分が,1974年以降に密になった箇所が多く見られた。また,樹冠が密になるとともに,樹冠が大きくなり,樹冠サイズの小さい単木が点在している状態から,複数の単木によってパッチを形成して行く過程が明らかとなった。北限のブナ林である添別ブナ林において捕獲したヤマガラの行動から推定した一日の行動圏は、2.1haから6.5haと推定され,3日間全体では11.4haであった。また,一日の行動圏から推定したヤマガラによる種子散布の限界距離は,163mから529mであった。ヤマガラの平均移動速度は,6.6m/分から10.5m/分で,3日間全体では8.5m/分であった。これらの結果から、北限域のブナの孤立林分は長期的には分布を拡大している様子が判明しつつある。ブナ連続分布ライン付近に存在する下チョポシナイ川流域において,ブナ孤立林の植生プロット調査を2ヶ所で行い,以下の結果を得た。プロット1のブナは樹齢80年から100年をピークとする若いブナ林であることが判明した。一方でプロット2では120年から140年の個体が最も多いものの,220年や301年と推定された個体も記録され,幅広い樹齢のブナが生育していることが明らかになったプロット2の樹齢301年のブナは,現時点ではブナ北限域における最高齢のブナであると考えられる。ブナは,樹齢が同じでもDBHが数十センチ異なる場合があるため,DBH階級の情報による森林群落の樹齢推定や回転率の考察には注意が必要であることが示唆された。

下チョポシナイ川流域では一斉更新した弱齢林と老齢なブナを含む過熟林のパッチが混在しており,過去の林冠疎開の後にもブナの生育が順調で,次第に林冠を埋めつつある。林冠疎開後におけるブナの増加は,分布北限域のその他の孤立林であるツバメの沢や三之助沢のブナ林でも報告されており,ブナ北限最前線域における一貫した傾向である可能性が示唆された。孤立ブナ林の遺伝子多様性解析の結果,分布限界へ近づくにつれて,遺伝子多様度は低下傾向にあった。また黒松内低地帯を通過したブナは,目名峠に到達した後に南北へと分散し,それぞれが分布拡大しながら現在の地理的分布を形成してきた可能性が示唆された。これらのことは過去のブナの分布拡大過程や,将来の北進を考察する上で貴重な情報である。
細菌性髄膜炎の発症につながる新規細菌伝播経路と感染制御法の探索

肺炎球菌性髄膜炎は,成人における致死率や後遺症の発症率が依然として高い,極めて予後が不良な中枢神経系感染症である.本疾患では,鼻咽腔や口腔の常在細菌が血流を介して髄腔内に到達し,脳実質に炎症が波及すると推察されているが,細菌が脳組織へ指向性を示す機構や血液脳関門を突破する機構は不明である.本疾患の臨床像に鑑みて,鼻咽腔に定着した肺炎球菌は血液脳関門を介さず,嗅上皮中の嗅神経の軸索もしくは周囲腔を介して直接的にくも膜下腔に到達すると推察した.本研究では,鼻粘膜に定着した肺炎球菌が嗅上皮-嗅神経を介して脳内の嗅球に到達する機構を培養細胞感染モデルおよびマウス感染モデルで検証した.正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に肺炎球菌を感染させ,感染細胞における細胞間接着分子群の発現を解析した結果,アドへレンスジャンクション構成分子であるE-カドヘリンの発現量の低下を認めた.また,E-カドヘリン細胞外ドメインに対する組換えタンパク質を作製し,肺炎球菌臨床分離株の培養上清画分もしくは菌体表層画分と反応させた.その結果,複数の臨床分離株の菌体表層画分によるE-カドヘリンの分解が認められた.菌体表層画分によるE-カドヘリンの分解はプロテアーゼ阻害剤の添加により抑制された.以上の結果から,肺炎球菌は菌体表層に発現する分子のプロテアーゼ活性により上皮バリアの機能維持に重要なE-カドヘリンを分解し,鼻粘膜上皮バリアを破綻させることが示唆された.肺炎球菌の菌体表層プロテアーゼによる細胞間接着分子E-カドヘリンの分解を証明した.また,マウス鼻腔に定着する肺炎球菌株を収集し,これらの株を使用した肺炎球菌の鼻腔定着マウスモデルの構築が進捗しているため,おおむね順調である.鼻粘膜上皮-嗅上皮のin vitro共培養細胞モデルおよび肺炎球菌の鼻腔定着マウスモデルを構築し,鼻粘膜上皮-嗅上皮バリアの機能障害,ならびに肺炎球菌もしくは菌体成分の鼻腔から脳内への移行性を,細胞層のインピーダンス測定法およびin vivoイメージングシステムで解析する.また,肺炎球菌性髄膜炎の病態形成への関与が認められた細菌分子および宿主分子について,感染防御抗原もしくは創薬ターゲットとしての可能性を検討する.肺炎球菌性髄膜炎は,成人における致死率や後遺症の発症率が依然として高い,極めて予後が不良な中枢神経系感染症である.本疾患では,鼻咽腔や口腔の常在細菌が血流を介して髄腔内に到達し,脳実質に炎症が波及すると推察されているが,細菌が脳組織へ指向性を示す機構や血液脳関門を突破する機構は不明である.本疾患の臨床像に鑑みて,鼻咽腔に定着した肺炎球菌は血液脳関門を介さず,嗅上皮中の嗅神経の軸索もしくは周囲腔を介して直接的にくも膜下腔に到達すると推察した.本研究では,鼻粘膜に定着した肺炎球菌が嗅上皮-嗅神経を介して脳内の嗅球に到達する機構を培養細胞感染モデルおよびマウス感染モデルで検証した.正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に肺炎球菌を感染させ,感染細胞における細胞間接着分子群の発現を解析した結果,アドへレンスジャンクション構成分子であるE-カドヘリンの発現量の低下を認めた.また,E-カドヘリン細胞外ドメインに対する組換えタンパク質を作製し,肺炎球菌臨床分離株の培養上清画分もしくは菌体表層画分と反応させた.その結果,複数の臨床分離株の菌体表層画分によるE-カドヘリンの分解が認められた.菌体表層画分によるE-カドヘリンの分解はプロテアーゼ阻害剤の添加により抑制された.以上の結果から,肺炎球菌は菌体表層に発現する分子のプロテアーゼ活性により上皮バリアの機能維持に重要なE-カドヘリンを分解し,鼻粘膜上皮バリアを破綻させることが示唆された.肺炎球菌の菌体表層プロテアーゼによる細胞間接着分子E-カドヘリンの分解を証明した.また,マウス鼻腔に定着する肺炎球菌株を収集し,これらの株を使用した肺炎球菌の鼻腔定着マウスモデルの構築が進捗しているため,おおむね順調である.鼻粘膜上皮-嗅上皮のin vitro共培養細胞モデルおよび肺炎球菌の鼻腔定着マウスモデルを構築し,鼻粘膜上皮-嗅上皮バリアの機能障害,ならびに肺炎球菌もしくは菌体成分の鼻腔から脳内への移行性を,細胞層のインピーダンス測定法およびin vivoイメージングシステムで解析する.また,肺炎球菌性髄膜炎の病態形成への関与が認められた細菌分子および宿主分子について,感染防御抗原もしくは創薬ターゲットとしての可能性を検討する.平成30年度に肺炎球菌の鼻腔定着マウスモデルを構築し,菌体および菌体成分の脳内移行に関する解析を行う予定であったが,マウス鼻腔に定着する肺炎球菌臨床分離株の収集と選出に時間を要したため,マウス感染実験は次年度に行うように研究計画を修正した.このため,次年度使用額が生じた.
蛍光を利用した不斉触媒のハイスループットスクリーニング系の構築と応用

私は「蛍光を利用した不斉触媒のハイスループットスクリーニング系の構築と応用」を研究テーマとして研究を進めている。本研究ではHenry反応をターゲットとし、まず、Henry反応の進行によって蛍光強度が増大する蛍光プローブを開発し、Henry反応触媒の蛍光HTS系を構築した。そして、Henry反応の生成物であるnitroaldol体のalcoholがアシル化されると容易に脱離反応を起こし、光誘起電子移動によって蛍光の消光を起こしたnitroolefinを生成することを見出した。この反応を利用することにより、nitroaldolの不斉炭素に直結した水酸基に対するアシル化反応による光学分割の効率を、蛍光強度の変化によって評価することが可能なHTS系を構築した。さらに、この新しく構築した光学分割触媒のHTSを利用することによって、benzotetramisoleが効率的に光学分割を行うことが可能であることを明らかとした。また、benzotetramisoleの光学分割能を利用することによって、Henry反応生成物の不斉収率を蛍光強度の変化から評価することの出来るHTS系を構築することに成功した。このHTS系と、はじめに構築したHenry反応の進行を捉えるHTS系を組み合わせることで、不斉触媒をターゲットとした蛍光HTS系の構築に成功した。これまでに報告された蛍光HTS系には不斉誘起度を評価可能なものは存在せず、本研究は不斉触媒の蛍光HTS系に関する初めての報告と成り得る。本研究ではHenry反応をターゲットとして選択し、その第1歩としてHenry反応生成物であるnitroalcohol構造を持つ化合物について、その不斉点における化学反応を光誘起電子移動を利用した蛍光特性の変化へと繋げる事で、光学分割触媒の蛍光ハイスループットスクリーニング系の構築を達成することを目標とした。本年度はまず、不斉点を持つ蛍光性分子について光学分割に取り組んだ。種々の光学分割用キラルHPLCカラムによる分離を試みた結果、ダイセル社のCHIRALPAK IAによって効率的に光学分割が達成できることを見出し、光学分割に成功した。続いて、不斉点を持つ蛍光性分子のnitroalcohol部分が酢酸等によってエステル化されると容易に脱離反応を起こし、nitrovinylへと変化する反応を利用し、光誘起電子移動による蛍光の制御を行うことで光学分割反応の前後での大きな蛍光強度変化を達成した。これにより、Henry反応生成物の光学分割触媒について、その活性を網羅的に調べることの出来るHTS系の構築に成功した。現在、光学分割した蛍光性分子の絶対配置を決定するべく、分子にヨウ素を導入した誘導体を合成し、結晶化及びX線による結晶構造解析に取り組んでいる。また、これと同時進行で優れた光学分割触媒の探索にも取り組んでおり、不斉触媒の蛍光HTS系の構築に向けて研究を進めている。