hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
意思決定に関する二つの心理物理法則の共通神経基盤：ウェーバーの法則とヒックの法則

多肢択一における決定時間はヒックの法則に従うことが知られている:決定時間は選択肢数の対数に比例する。しかしながら、ヒックの法則の神経機構はまだわかっていない。ヒックの法則を再現する皮質回路モデルを提案した。このモデルはさらに、決定時間がウェーバーの法則に従うことを予言する:決定時間の変動係数は選択肢数によらず一定である。これらの結果は、二つの心理物理経験則が共通の神経基盤に立脚することを示唆する。さらに、多肢選択の神経機能をモデルにネットワークからコミュニティを効率的・効果的に検出する方法を構築した。これは、脳に学ぶことによって新しくかつ実際に役に立つ技術の創出が可能であることを例証する。Hickの法則:n通りの選択肢から一つを決定するのに要する時間はnの対数の1次関数で表わされる。Weberの法則:被験者にある長さの時間(標的時間)を提示し、次に同じ長さの時間を再生させたとき、再生時間の平均値と標準偏差との比(Weber比)は標的時間によらず一定となる。本研究の目的は、意思決定時間に関するこれら二つの心理学経験法則が共通の神経機構に由来することを証明することである。そのために、神経機構モデルの構築・解析を通じて、Hickの法則が成り立つとき、Weberの法則も成り立つ(すなわち、Weber比が選択肢数に関わらず一定になる)ことを示す。さらに、モデルが予言する「選択肢数と決定時間のばらつきの大きさとの間の規則性」を、実際の心理物理実験で確認する。昨年度は、神経機構モデルを提案し、Hickの法則が成り立つときにはWeberの法則も成り立つことを、数値実験で確認した。本年度は、二法則が両立する条件および理由を解析的に明らかにすることを試みた。モデルのパラメタ(シナプス強度、ノイズ強度、他)に対して、Hickの法則が成り立つための条件を定めることができた。さらに、Hickの法則が成り立つための前提条件の下で、Weber比が一定となることも示した。本研究遂行の過程で、意思決定の神経機構モデルを用いて、ネットワークからコミュニティを抽出できることに気付いた。ネットワークにおいて、その内部ではリンクの濃度が密であり、その外部とはより疎に繋がる部分(かたまり)のことを「コミュニティ」とよぶ。効果的・効率的なコミュニティ抽出アルゴリズムの開発は、近年ネットワーク科学における中心課題である。意思決定神経機構モデルによるコミュニティ抽出を、人工ベンチマークネットワークおよび実際の社会ネットワークを用いて試した。これらのネットワークの正解コミュニティ構造が正確に再現された。Weberの法則:被験者にある長さの時間(標的時間)を提示し、次に同じ長さの時間を再生させとき、再生時間の平均値と標準偏差との比(Weber比)は標的時間によらず一定となる。昨年度、神経ネットワークモデルの基本構造を記述する「オーダーパラメタ」の式を導き、Hickの法則が成り立つ係数パラメタ条件の下で、Weber比が一定になることを示した。本年度は、オーダーパラメタの式の数学的解析を進め、両法則が両立する理由を、「LambertのW関数」の性質により説明できることを示した。本研究では、神経ネットワークのモジュール構造(コミュニティ構造)が本質的役割を果たす。本研究遂行の過程で、ネットワークから階層性と重なりのあるモジュール構造を検出する機械学習アルゴリズムを着案した。そこで、我々が考案したアルゴリズムの性能確認を本研究課題の枠組みで実施することにした。このアルゴリズムを用いて、脳ネットワーク(サル皮質領野間ネットワークおよびC.elegansの神経ネットワーク)を階層と重なりのあるモジュールに分解できることを示した。ヒックの法則:多肢択一に要する時間(反応時間)は、選択肢数の対数の一次関数で表わされる。ヒックの法則は、ユーザインタフェース設計やユーザビリティ評価における指針として、広く実用に供せられている。それにもかかわらず、この心理物理経験則の背景にある神経機構については、ほとんど何もわかっていない。本研究の第一の目標は、ヒックの法則の神経機構を説明するモデルを世界で初めて構築・提案することである。多肢択一における反応時間のゆらぎと選択肢数との関係についても、実験的あるいは理論的知見はこれまでなかった。本研究の第二の目標は、反応時間のゆらぎと選択肢数との間の定量的関係をモデルから導き、これを実験への予言として提案することである。さらに、実際に心理物理実験を行ってこの予言を検証することが、本研究の第三の目標である。

皮質におけるミニカラム構造および抑制性ニューロンの多様性を考慮した皮質回路モデルを構築した。各選択肢に対応するニューロン群があり、これらのニューロンの活動が、対応する選択肢が選択されている度合を表わすと仮定した。シミュレーションによる解析の結果、一つのニューロン群の活性がしばらく漸次的に増加した後、急激に増加し、それに伴って他のニューロン群の活性が減少することがわかった。前者の活性が急激に増加するタイミングを反応時間として定義すると、その平均値がヒックの法則に従うことがわかった。さらに、同じ選択肢数に対して反応時間は試行毎にばらつくが、その標準偏差は反応時間平均の一次関数で表わされることがわかった。なぜモデルがヒックの法則を再現するのか、そして、なぜ反応時間のゆらぎが平均に対して線形になるのかを、統計力学的手法を用いて解析的に明らかにすることも試みた。これについては、まだ最終的な結果を得ておらず、次年度も解析を続行する。セルアセンブリ仮説は、同一アイテムをコードするニューロン同士は結合する傾向にあり、その結果、密につながったかたまり部分(セルアセンブリ)が形成されると主張する。あるアイテムが脳内に想起されるとき、このアイテムをコードするニューロンが持続的に活性化される。セルアセンブリ内における神経活性の反響伝播が記憶想起に伴う持続活性の背景機構と考えられている。さらに、我々が多くのことを記憶するという事実は、脳におけるニューロンのネットワークに多くのセルアセンブリが埋め込まれていることを意味する。多肢択一の過程ーこれまでその神経機構のモデル化に取り組んできたーにおいて、最初は個々の選択肢に対応するセルアセンブリがすべて活性化されるが、やがて一つのセルアセンブリだけが完全に活性化され、他のセルアセンブリの活性は静止状態に落ち着く。これまでに、一つのセルアセンブリが完全活性化されるまでの時間(決定時間)がWeberの法則とHickの法則を同時に満たすことを示した。本最終年度では、これまでに得られた学術的成果を社会・産業に還元すべく、そこから実用的な技術を導出することを試みた。ネットワーク科学では、ネットワークの中のノードが密なかたまり部分のことを「コミュニティ」と呼ぶ。実世界における様々なネットワークのコミュニティ構造がわかれば、大きな社会・産業上の利益が得られると期待されており、そのため、ネットワークからコミュニティを検出するアルゴリズムの開発は、ネットワーク科学の中心テーマとなっている。ニューロン、シナプス結合およびセルアセンブリを、それぞれ、ネットワークのノード、リンクおよびコミュニティに対応させることにより、多肢択一過程とのアナロジーとしてコミュニティを抽出することを提案した。正解コミュニティが既知のネットワークを用いた評価を行い、提案アルゴリズムの高いコミュニティ検出性能を示した。脳型情報処理数値実験によれば、Hickの法則とWeberの法則の成立は必要十分の関係にある。
褐色藻類の葉緑体分裂機構に関する形態学的研究

ラフィド藻Heterosigma akashiwoの葉緑体は,Dinoflagelateを除く他のChromophytaの葉緑体と同様に,4枚の膜で包まれている.このようなChromophytaの葉緑体の起源については,いわゆる二次共生説が有力である.その最も有力な証拠は,CryptomonasやChlorarachnionにおいて外側の2枚と内側の2枚の間のスペースにヌクレオモルフとリボソームが存在することである.しかし,他のChromophytaについては,特に証拠はなく,外側の2枚の膜の起源が二次共生説によって説明できるというのみであった.本研究の目的のひとつはH.akashiwoの葉緑体においても分裂リングが存在するかどうか,存在するとすれば4枚の膜のどの膜上に存在するかを明らかにすることである.今回の研究において,化学固定では固定が困難であったH.akashiwoの細胞を急速凍結-凍結置換法によって固定する方法を確立した.その結果,葉緑体分裂リングが本藻にも存在し,内側の2枚の膜の外側表面に局在することが明らかになった。この結果は,葉緑体分裂リングの普遍性をさらに支持するものであり,二次共生説を強く支持する新しい知見である.また,外側の2枚の膜は内側の膜とは異なる機構で分裂することも明らかになった.これらの研究成果は,1編の論文としてProtoplasma誌に掲載予定(1997)で,現在印刷中である.葉緑体分裂リングを構成するタンパクが核ゲノムにコードされていること,さらに,アクチン様タンパクである可能性が強いことが筆者らの研究によって示唆されている。蛍光抗体法やロ-ダミン=ファロイヂン染色などによってアクチンの存在について検討を行ったが現在のところその存在を示す証拠は得られていない.蛍光染色のための固定が困難であったためでさらに検討が必要である.ラフィド藻Heterosigma akashiwoの葉緑体は,Dinoflagelateを除く他のChromophytaの葉緑体と同様に,4枚の膜で包まれている.このようなChromophytaの葉緑体の起源については,いわゆる二次共生説が有力である.その最も有力な証拠は,CryptomonasやChlorarachnionにおいて外側の2枚と内側の2枚の間のスペースにヌクレオモルフとリボソームが存在することである.しかし,他のChromophytaについては,特に証拠はなく,外側の2枚の膜の起源が二次共生説によって説明できるというのみであった.本研究の目的のひとつはH.akashiwoの葉緑体においても分裂リングが存在するかどうか,存在するとすれば4枚の膜のどの膜上に存在するかを明らかにすることである.今回の研究において,化学固定では固定が困難であったH.akashiwoの細胞を急速凍結-凍結置換法によって固定する方法を確立した.その結果,葉緑体分裂リングが本藻にも存在し,内側の2枚の膜の外側表面に局在することが明らかになった。蛍光抗体法やロ-ダミン=ファロイヂン染色などによってアクチンの存在について検討を行ったが現在のところその存在を示す証拠は得られていない.蛍光染色のための固定が困難であったためでさらに検討が必要である.Heterosigma akashiwoの細胞を通常の化学固定によって固定するのは,従来非常に困難であったが,急速凍結-凍結置換法を成功させることによって,膜の微細形態と葉緑体分裂リングの観察を可能にした.そのことによって,当初の研究計画の最も主要な眼目であった葉緑体分裂リングの存在とその存在部位を明らかにすることができた.すなわち,H.akashiwoの葉緑体分裂リングが葉緑体外包膜の細胞質側表面(cERと葉緑体外包膜の間の区画)に存在することが明らかになった.この発見はcERをもつ葉緑体の起源に関する二次共生説を強く支持する証拠として重要な意義を持っている.また,cERの分裂の過程も明らかにすることができ,cERは葉緑体本体(包膜から内側の部分)とは時間的にも機械的にも異なる過程で分裂することが明らかになった.これらの知見によって,葉緑体分裂リングの普遍性がさらに支持され,cERと葉緑体包膜との関係がより明確になったことは,葉緑体と葉緑体分裂機構の進化に関する研究における重要な進歩と考えられる.これらについてはその内容を雑誌に投稿準備中である.葉緑体分裂リングを構成するタンパク質が核ゲノムにコードされていること,さらにアクチン様タンパク質である可能性が強いことが他の生物についての研究から既に示唆されているが(Hashimoto & Possingham 1989,Mita& Kuroiwa 1989,Hashimoto 1992など),上記のHeterosigma akashiwoの葉緑体リングも同様である可能性が高いと考えられる.そこで,現在、新たに見つかった葉緑体分裂リングとアクチン繊維など細胞骨格系との関連を免疫電顕法と蛍光抗体法によって調べているところである。

ラフィド藻Heterosigma akashiwoの葉緑体は,Dinoflagelateを除く他のChromophytaの葉緑体と同様に,4枚の膜で包まれている.このようなChromophytaの葉緑体の起源については,いわゆる二次共生説が有力である.その最も有力な証拠は,CryptomonasやChlorarachnionにおいて外側の2枚と内側の2枚の間のスペースにヌクレオモルフとリボソームが存在することである.しかし,他のChromophytaについては,特に証拠はなく,外側の2枚の膜の起源が二次共生説によって説明できるというのみであった.本研究の目的のひとつはH.akashiwoの葉緑体においても分裂リングが存在するかどうか,存在するとすれば4枚の膜のどの膜上に存在するかを明らかにすることである.今回の研究において,化学固定では固定が困難であったH.akashiwoの細胞を急速凍結-凍結置換法によって固定する方法を確立した.その結果,葉緑体分裂リングが本藻にも存在し,内側の2枚の膜の外側表面に局在することが明らかになった.この結果は,葉緑体分裂リングの普遍性をさらに支持するものであり,二次共生説を強く支持する新しい知見である.また,外側の2枚の膜は内側の膜とは異なる機構で分裂することも明らかになった.これらの研究成果は,1編の論文としてProtoplasma誌に掲載予定(1997)で,現在印刷中である.葉緑体分裂リングを構成するタンパクが核ゲノムにコードされていること,さらに,アクチン様タンパクである可能性が強いことが筆者らの研究によって示唆されている.蛍光抗体法やロ-ダミン=ファロイヂン染色などによってアクチンの存在について検討を行ったが現在のところその存在を示す証拠は得られていない.蛍光染色のための固定が困難であったためでさらに検討が必要である.
金属堆積環境でのナノ構造加速成長と核融合炉への影響

ヘリウムプラズマとタングステンを含む金属の相互作用(ヘリウム照射効果)により,来金属粒子とプラズマからの粒子が共堆積する環境下で,繊維状ナノ構造の桁違いの加速成長が起こることが明らかにされてきた。本研究では,これまでのヘリウム照射効果を根本的に変える可能性がある共堆積環境でのヘリウム照射効果に着目し,mmスケールのナノ構造成長の起こる条件と加速成長のメカニズムの解明と,核融合への影響や産業応用への分野への波及を視野に入れ加速成長を自由に制御することを目指し,直線型プラズマ装置を用いた実験を中心に研究を進める。
コンドロイチン硫酸Ｅによる骨形成促進作用と骨補填材への応用に関する研究

コンドロイチン硫酸E(CS-E)は骨芽細胞分化を促進し、破骨細胞分化を抑制する。その作用機序として、CS-Eはosteoactivin(OA)及びそのレセプターであるintegrinに結合し、OAのintegrin及びヘパラン硫酸への作用を阻害することで、破骨細胞分化を抑制していることが明らかとなった。一方、骨芽細胞はbiglycan及びE構造を有するCSを産生し、それらは分化(石灰化)前に一過的に上昇していたことから、添加したCS-Eに加え、骨芽細胞が産生したCSも分化に関与していると考えられた。今後は、得られた結果をもとに、CS-Eを用いた骨補填材の可能性について検討予定である。骨基質には、decorinやbiglycanなどのプロテオグリカン(PG)が存在し、骨代謝を調節している。これまでに、PGの糖鎖であるグリコサミノグリカンのうち、多硫酸化構造を有するコンドロイチン硫酸(CS)が、マクロファージ株RAW264と同様にM-CSF依存性骨髄細胞の破骨細胞分化を抑制することを確認している。CS-Eの作用機序として、破骨細胞分化調節因子との相互作用が考えられたため、接着因子に着目しαvβ3 integrinとそのリガンド(vitronectin、osteoactivin)の関与について検討した。CS-E、heparinには、vitronectin、osteoactivinのみならず、そのレセプターであるαvβ3 integrinに対しても結合性が認められた。また、αvβ3 integrinとosteoactivinを予めCS-Eと反応させることで、両者の直接の結合が阻害された。なお、αvβ3 integrinとCS-Eの結合はDRGDSにより阻害されなかった。αvβ3 integrinを固層化してRAW264細胞上のintegrin/リガンドの結合を阻害すると、破骨細胞分化が抑制された。また、osteoactivin固層化による骨吸収促進活性をCS-Eは阻害した。以上の研究結果から、E構造を有するCSが前破骨細胞のαvβ3 integrinとosteoactivinの両者に結合し、integrin/osteoactivinの直接の結合を阻害することで破骨細胞分化を抑制している可能性が示唆された。骨芽細胞上には多硫酸化CSが存在し、integrin系を介して破骨細胞の分化を調節していると考えられた。なお、CS-EはRANKLやBMPとの結合性も示したことから、これらの分子とCS-Eを組み合わせて骨補填材としての可能性について検討していく予定である。プロテオグリカン(PG)は骨基質にも存在し、骨芽細胞及び破骨細胞の分化を調節している。これまでに、PGの糖鎖であるグリコサミノグリカン(GAG)のうち、多硫酸化構造を有するコンドロイチン硫酸E(CS-E)が、骨芽細胞分化を促進し破骨細胞分化を抑制することを認めている。CS-Eの作用機序として、bone morphogenic proteinに加え、接着分子との相互作用が考えられた。そこで、fibronectin(FN)、vitronectin(VN)、osteoactivin(OA)、osteopontin、integrin αvβ3(αvβ3)への結合性について検討した結果、CS-E及びheparinはこれら全ての接着分子に対し親和性を示した。また、heparan sulfate(HS)はOAとFNに、CS-BはOAのみに結合し、GAGの種類により接着分子への親和性が異なることが明らかとなった。これら接着分子をリン酸カルシウムプレートに固層化して破骨細胞分化への影響について検討した結果、OA及びFNは分化(pit形成)を促進したが、VN及びαvβ3は逆に抑制した。CS-Eは、OAのαvβ3及びHSへの結合を阻害し、OAにより誘導された破骨細胞分化を抑制した。一方、OAに対する中和抗体あるいはheparinase処理により破骨細胞分化が抑制されたことから、内因性のOA及びHSも分化に関与していることが示唆された。以上の結果から、CS-Eは直接、integrin及びHSへの結合を阻害することで破骨細胞の分化を抑制していると考えられた。OAは骨芽細胞においても発現し、分化を調節していることが報告されている。今後は、骨芽細胞を用い、OA及びGAGの作用について明らかにし、骨補填材への応用について検討していく予定である。骨基質にはdecorinやbiglycanなどの種々のプロテオグリカン(PG)が存在する。我々は、これまでに、PGの糖鎖であるグリコサミノグリカン(GAG)のうち、多硫酸化構造を有するコンドロイチン硫酸(CS)が、BMP-4を介し骨芽細胞株MC3T3-E1の分化を促進することを明らかにした。

本研究では、まず、MC3T3-E1細胞が産生するPGの種類およびCS構造異性体について解析した。MC3T3-E1細胞のマトリックス中のウロン酸量は、骨芽細胞の分化に伴い増加していた。さらに、HPLCによる2糖分析の結果、骨芽細胞の分化に伴いCS-E量の増加も認められた。コンドロイチナーゼ(CHase)によりMC3T3-E1細胞の表面のCSを分解すると、骨芽細胞への分化が抑制された。また、MC3T3-E1細胞はdecorinおよびbiglycanを産生していることを、それらに対する特異抗体による染色にて確認した。このうち、biglycan量は、骨芽細胞の分化前に増加していた。これらの結果から、MC3T3-E1細胞のbiglycanの糖鎖に含まれるCS-Eが、MC3T3-E1細胞の分化を調節していることが示唆された。しかしながら、マウス初代骨芽細胞を用いた検討の結果、CS-Eは逆に骨芽細胞分化を抑制した。株細胞と初代細胞に対するCS-Eの作用の差異については現在解析中である。一方、破骨細胞分化に関しては、マクロファージ株RAW264に対する作用と同様に、CS-Eはマウス初代骨髄細胞の分化を抑制した。RAW264細胞をCHase処理した場合には、破骨細胞分化への影響は認められない。したがって、骨芽細胞のマトリックスに存在するCS-Eが、破骨細胞への分化も調節している可能性が考えられる。今後は、CS-Eの骨芽細胞および破骨細胞分化の作用機序について明らかにしていく予定である。骨芽細胞と骨髄細胞あるいはRAW264細胞を用いて骨芽細胞/破骨細胞の共存培養系の構築に取りかかったが、まだ系の確立には至っていない。しかしながら、CS-Eによる破骨細胞分化抑制の作用機序として、integrin/osteoactivinの関与を明らかにしたことや、表面プラズモン共鳴法などの高価な解析装置を使うことのない標識CS-Eを用いた親和性の測定系については、種々のタンパク質において評価可能であり、おおむね順調に進展していると考えられる。マウス骨髄由来の骨芽細胞の培養系構築に少し時間がかかったが、骨芽細胞および破骨細胞の培養系の構築およびCS-Eの作用について結果を得ることが出来た。また、MC3T3-E1細胞はbiglycanとCS-Eを産生していることも明らかにした。CS-Eの破骨細胞分化抑制の作用機序として、RANKL、OPG、BMPなどの増殖・分化調節因子との親和性ついて検討する。また、接着分子であるMac-1やインテグリンなどの接着分子を介した作用の可能性についても検討する。骨芽細胞、破骨細胞のそれぞれの培養系のみならず、両者の共存培養系を構築し、CS-Eの作用についても明らかにしていく予定である。また、MC3T3-E1細胞と異なりCS-Eは初代骨芽細胞に対し分化を抑制したため、その理由についても解析を進めていきたいと考える。今年度、骨芽細胞/破骨細胞の共存培養系の確立が遅れたため、次年度に研究費を使用して実施する。なお、次年度の研究計画に変更はないため、計画通り実施する予定である。実験用薬品として、サイトカイン(RANKL、RANK、M-CSF、OPG、BMP-4、ビタミンD3等)、抗体(CD11b、CD18、ICAM-1等)、ビオチン標識用試薬、培地等の購入に120万円を予定している。
染色体末端部位複製過程の機構

染色体末端部にあるテロメア構造は、3'端側の鎖(G-rich鎖)がグアニンとチミンに富んだ繰り返し配列になっており、シトシンとアデニンに富んだ5'端側の鎖(C-rich鎖)よりも長く突出している。この領域の複製は特殊な過程を経て行われており、いったんC-rich鎖がnucleaseによって消化され、G-rich鎖が単鎖化する。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、この単鎖化したG-rich鎖に結合し、テロメラーゼによる伸長反応とDNA polymeraseによるFill-in反応を制御しているのが、CDC13遺伝子にコードされているタンパク質である。Cdc13タンパク質の機能を解析するために、CDC13と相互作用する因子を2-hybrid法で同定し、そこから分離されたSTM1との相互作用を検討した。タンパクレベルでの直接の相互作用を検討するした。Cdc13のN端側またはC端側をGST(glutathione S-transferase)と融合したタンパク質を大腸菌内で発現させ、glutathione Sepharose beads上に固定し、ウサギreticulocyte抽出液で試験管内で生産したStm1がCdc13のN端側を固定したbeadsと共沈することがわかった。STM1遺伝子を多コピーベクターによって多量に供給することで、CDC13遺伝子の温度感受性変異株cdc13-1の異常伸長したテロメアが正常長に戻り、増殖能も回復する。このことは、遺伝学的機能においても相互作用があることを示している。このSTM1による多コピーサプレッションは、pol1-17やstn1-13の様な他のテロメア異常伸長変異には観察されず、特異的な関係があることが示唆された。
活性化ミクログリアが誘導する脊損後疼痛－ｉｎ　ｖｉｖｏパッチクランプ法による解析

脊髄損傷(Spinal cord injury: SCI)後疼痛モデルラットを作成し、損傷レベルより下位の脊髄後角でin vivoパッチクランプ法により自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)の解析を行った。SCIモデル群はコントロール群よりsEPSCの頻度が増強していた。このことから、脊髄損傷後疼痛では損傷部より下位の非損傷脊髄内において、何らかの興奮性の神経可塑的変化が生じ、中枢性感作の状態になっていると考えられた。次にこのSCIモデルにミクログリア活性化阻害薬のミノサイクリンを灌流投与することでsEPSCの増強に抑制が得られるか検討したが、予想に反してsEPSCは減少を認めなかった。脊髄損傷(Spinal cord injury: SCI)後疼痛モデルラットを作成し、脊髄損傷レベルとはより下位レベルの脊髄後角でin vivoパッチクランプ法により自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)の解析を行った。成熟Sprague-Dawley系雄性ラット5週齢の時点で不全脊髄損傷モデルを作成した。SCIモデルは均質なモデルを作成するため、機械的圧迫モデルをIH Impactorを用いてTh9レベルで200 kdynで1秒間圧迫することによって作成した。術後1週の時点でvon Freytestにより下肢にallodynia様の反応が出現するのを確認して実験に使用した。Th9の椎弓切除のみをsham群としてコントロールに用いた。腰膨大部レベルで脊髄膠様質ニューロンからin vivoパッチクランプ法によりsEPSCを記録した。SCIモデル群におけるsEPSCの平均頻度は14.3±1.4Hzで、平均振幅は16.0±1.6pAであった(n=30)。一方、Sham群のsEPSCの平均頻度は9.0±1.0Hzで、平均振幅は12.3±0.6pAであり(n=30)、両群間において頻度に関して統計学的に有意差を認めた。これらの結果から脊髄損傷後疼痛below level型は損傷部より下位の正常脊髄内において、何らかの興奮性の可塑的変化が生じていると考えられる。このSCIモデルのsEPSCの増強にミクログリアが関与しているか、ミクログリア活性化阻害薬のミノサイクリンを灌流投与することで変化を解析した。SCIモデルにおけるミノサイクリンの灌流投与前後でのsEPSCの変化率は頻度が115.4±22.4%で、平均振幅は107.3±14.8%であった(n=9)。当初の仮説では抑制がかかると予想していたが、仮説に反してこれらの結果は増強傾向であった。脊髄損傷(Spinal cord injury: SCI)モデルラットを作成し、脊髄損傷後疼痛のメカニズムの解析をin vivoパッチクランプ法により行なった。成熟Sprague-Dawley系雄性ラット5週齢に対して、不全脊髄損傷モデルを作成した。均質なモデルを作成するため、機械的圧迫モデルとしてIH Impactorを用いて、Th9レベルで200 kdynで1秒間圧迫することによって作成した。また、Th9の椎弓切除のみをsham群として対象コントロールに用いた。まず、脊髄損傷後疼痛の発症原因として、SCIレベルとはかけ離れた非損傷部位の下位レベルにおいて、脊髄後角ニューロンに興奮性の増強があるかどうかを調査した。腰膨大部レベルの脊髄膠様質ニューロンからin vivoパッチクランプ法により自発性興奮性シナプス後電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents:sEPSC)を記録した。SCIモデル群におけるsEPSCの平均頻度は16.3±2.0Hzで、平均振幅は17.4±2.1pAであった(n=15)。これらはSham群のsEPSCの平均頻度・振幅と比較して、統計学的に有意に増加していた。これらの結果から脊髄損傷後疼痛のなかでも、below level型は脊髄損傷部よりの下位の正常脊髄内において、何らかの興奮性の神経可塑的変化が生じていることが示唆された。脊髄損傷後モデルラットで損傷レベルとは別の部位で神経可塑性による慢性疼痛が発生していることまでは確認できた。しかし、そのメカニズムまではまだ解明できていない。引き続き、脊髄損傷後疼痛モデルラットにin vivoパッチクランプ法を適応し、解析を行っていく。神経可塑性変化による興奮性増強のメカニズムとしてミクログリアの関与を様々な薬理学的解析にて証明していきたい。解析を進めるにあたって、高額な試薬代に主に使用予定。また小動物用麻酔器の購入を検討している
画像解析に基づくｔｉｓｓｕｅ　ｄｙｓｏｘｉａ治療の実験的検討

Palladium-porphyrinを使用したphosphoresce ncedecay measurement system (OxyMap system)によりtissue dysoxiaの画像診断を行った。対象は、ウサギ(日本白色種JW/CSK)20匹を使用した。研究第2年度の目標として、エンドトキシンショックモデル(LPS、Escherichiacoli-055 : B5、1mg/kg投与)におけるtissue dysoxiaの病態を検討し、さらに、アンチトロンビンの治療効果について検討した。その結果、tissue dysoxiaの病態については、1)回腸漿膜酸素分圧の低下、組織酸素分圧較差の持続的なマイナス較差を確認し、組織前後における著明な血流シャント現象の発現を認めた。2)血圧低下を反映し、マクロの酸素代謝も著明な低下傾向を認めた。3)組織中における毛細血管間の酸素分圧の不均一性がPd-porphyrin phosphorescenceによる画像的解析により確認された。そこで、微小血栓の形成などDisseminated IntravascularCoagulationの病態を改善し、微小循環機能の調節に有用と考えられるアンチトロンビンの作用について検討した。その結果、血圧低下を反映するマクロの酸素代謝の低下を認める34時間後、dysoxiaを改善する画像が得られた。人工酸素運搬体(リポソーム包埋型Hb、粒子径200nm)によるdysoxiaの改善効果については、現在、検討中である。微小循環蘇生に関する新たな治療法としての人工酸素運搬体の作用を解析して行く予定である。人工酸素運搬体の生産量が少なく本実験への供与が困難になっている。また、Palladium-porphyrinの生産量が少なく、実験の遅れの原因となっている。OxyMap system自体の光学軸のずれなど、時々光学系の調節が必要となっており、正確なデータを得るために、調節に時間を要している。所期の目的の達成は困難である可能性がある。平成23年度に得られたデータを根拠に一歩づつ確実に実験を進めて行く所存である。リコンビナント活性化プロテインCはアンチトロンビンに切り替える。L-canavanineの投与は中止する。人工酸素運搬体に関しては、全力でその供給に務める。Palladium-porphyrinを使用したphosphorescence decay measurementsystem(OxyMap system)によりtissue dysoxiaの画像診断を行った。初年度の目標として、エンドトキシンショックモデル(LPS、Escherichia coli-055:B5、1mg/kg投与)を作成し、tissue dysoxiaの病態を検討した。その結果、1)回腸漿膜酸素分圧の低下、組織酸素分圧較差の持続的なマイナス較差が見られ、組織前後における著明な血流シャント現象の発現を認めた。2)血圧低下を反映し、全身のマクロの酸素代謝も著明な低下傾向が持続した。4)微小血栓の形成などDisseminated IntravascularCoagulationの病態を改善し、微小循環機能の調節に有用と考えられるアンチトロンビンの作用について検討したが、dysoxiaに関する明らかな改善効果は確認されなかった。5)人工酸素運搬体(リポソーム包埋型Hb、粒子径200nm)によるdysoxiaの改善効果については、現在、検討中である。微小循環蘇生に関する新たな治療法としてのアンチトロンビン、および人工酸素運搬体の作用を今後精力的に解析して行く予定である。

リコンビナント活性化プロテインCはアンチトロンビンに切り替える。L-canavanineの投与は中止する。人工酸素運搬体に関しては、全力でその供給に務める。
新規Akt特異的ユビキチンリガーゼによる細胞死制御機構の解明

インフルエンザウイルスのNS1蛋白がAKTと結合その活性化を促していることを確認した。この結果、AKTシグナルの抑制により、インフルエンザウイルスの治療に役立てる可能性が明らかにできた。また、protooncogeneTCL1bがTCL1同様にAkt活性化補助因子として機能し、bioinformatics解析により高い相同性が認められた。TCL1btransgenicmouseは致死的なangiosarcomaを発症した。ヒトangiosarcomaならびに他の悪性腫瘍において、TCL1bとリン酸化Aktが活性化され、TCL1b由来Akt阻害性剤を用いて細胞増殖を抑え、治療に役に立つ可能性が示された。前年度、評標的とするAkt結合因子の遺伝子欠損マウスの再作成に着手することとなった。当初私たちがこれまでの研究の中で同定した新規E3リガーゼを標的とする予定で研究を進めた。まず、新規E3リガーゼとAktとの関係について生化学的研究、細胞生物学的な研究を進めた。その結果、新規E3リガーゼにはAkt以外にもユビキチン化としての標的がある可能性があることが判明した。さらに細胞内の細胞死防御の制御の要になっているAkt分子のタンパク分解経路にはユビキチンリガーゼによるプロテアゾーム系のタンパク分解ばかりでなくライソゾーム系のタンパク分解系に関与するさらに重要な結合分子が存在することが判明した。まずこの分子Aktとの結合に関して、生化学的な検証を進めた。さらに、この分子とAktのライソゾームへの局在と結合に関して蛍光色素を用いて共焦点顕微鏡を用いてその活性化と局在の変化の検証を進めた。解析は現在も遂行中でさらなる検証が必要な段階であるが、Aktのタンパク分解にはユビキチンリガーゼによるプロテアゾーム系のタンパク分解ばかりでなく、ライソゾーム系の関与が深くかかわっていることが示唆される成果が得られている。さらに今後、遺伝子改変マウスによるin vivoでの解析に向けてin vitroでの検証を進める必要性がある。当初は22年度の研究成果に基づき、23年度の研究を粛々と進める予定を立ており、TTC3を過剰発現するtransgenic mouseはbeta-actin promoterを用いた、ubiquitousに発現を期待できるconstructを用いて作成を試みた。しかし、50匹をこえる作成を試みたにもかかわらず、geno type陽性のマウスは5ラインのfounderが得られたものの、TTC3タンパク発現するマウスは1ラインも得られなかった。また、Cre-Loxを用いたノックアウトマウスの作製は、ESへの外来遺伝子の導入により、Embryoの生育が妨げられていることが推測され、4ラインのキメラマウスは完成したが、いずれのマウスラインにおいても、germ lineへの導入が得られなかった。このような事情で、次年度に向けて我々は、Cre-Loxを用いた新規のconstruct制作を再度試みる予定で実験を進めていた。また、同時に新規Akt特異的ユビキチンリガーゼと同じAktをbaitとするyeast two hybrid法により同定したAktに対する結合因子である、protooncogene TCL1bならびに、同じくAktに結合するインフルエンザウイルスの、コードする機能蛋白であるNS1 (Non-structural protein 1)の生物機能解析を並行し、粛々と進めることとした。私たちの研究室では、細胞死の制御の要であるセリンスレオニンキナーゼAKTの活性化機構について特にその結合分子による活性化の修飾機構についての研究を進めている。我々は、同定したAkt結合因子であるインフルエンザの機能蛋白であるNS1( Non-structual protein 1)ならびにprotooncogene TCL1bならびにその機能解析を進めることとした。まず、インフルエンザウイルスがコードするNS1蛋白がAKTシグナル伝達系の修飾機構を制御することにより、インフルエンザウイルスの感染における病態を人為的に修飾し、治療に役立てる可能性について明らかにすることを目的として研究を進めた。NS1は宿主細胞の細胞死制御の要の分子であるAKTと結合し、さらにその活性を促進すること、の活性を制御することで、宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖であるAKTシグナル伝達系の修飾機構を制御することにより、インフルエンザウイルスの感染における病態を人為的に修飾し、治療に役立てる可能性について明らかにすることができた。protooncogene TCL1bに関しては細胞死要の分子であるAKTとの結合、活性化の増強、さらにbioinformaticsを用いた解析による推計学的に優位な相同性、transgenic mouseにおいて致死的なangiosarcomaが発症することを確認した。また、比較的まれな疾患であるヒトangiosarcomaにおいて、TCL1Bならびにリン酸化Aktが活性化されていること、他のヒト悪性腫瘍においても同様な結果であった。さらに、TCL1b由来のAkt阻害性ペプチドを用いてsarcoma細胞の増殖を抑えることが確認でき、protooncogene TCL1bが原因としてばかりでなく、治療にも役に立つ可能性が示唆された。当初AKTに結合するユビキチンリガーゼTTC3に関するAKT活性化修飾機構についての研究を進めてきた。

この方向での研究の中でTTC3をubiquitousに過剰発現するtransgenic mouseならびにCre-Loxを用いたノックアウトマウスを作製、そのin vivoでの機能解析を進める予定であった。しかし、TTC3を過剰発現するtransgenic mouseはbeta-actin promoterを用いたubiquitousに発現を期待できるconstructを用いて作成を試みた。50匹をこえる作成の試みにもかかわらず、geno type陽性のマウスは5ラインのfounderが得られたものの、TTC3タンパク発現するマウスは1ラインも得られなかった。また、Cre-Loxを用いたノックアウトマウスを作製は、ESへの外来遺伝子の導入により、Embryoの生育自体が妨げられていることが推測され、4ラインのキメラマウスは完成したが、いずれのマウスラインにおいてもgerm lineへの導入が得られなかった。このため、研究の方向性に多少の方向性の変更を行うこととし、新規Akt特異的ユビキチンリガーゼと同じAktをbaitとするyeast two hybrid法により同定したAktに対する結合因子であるprotooncogene TCL1bならびに同じくAktに結合するインフルエンザウイルスのコードする機能蛋白であるNS1 (Non-structual protein 1)の生物機能解析を日々、様々な問題を解決しつつ、切磋琢磨し進めていた。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初は22年度の成果に基づき、23年度の研究を粛々と進める予定でTTC3を過剰発現するtransgenic mouseはbeta-actin promoterを用いたubiquitousに発現を期待できるconstructを用いて作成を試みた。しかし、50匹をこえる作成試みにもかかわらず、geno type陽性のマウスは5ラインのfounderが得られたものの、TTC3タンパク発現するマウスは1ラインも得られなかった。また、Cre-Loxを用いたノックアウトマウスの作製は、ESへの外来遺伝子の導入により、Embryoの生育が妨げられていることが推測され4ラインのキメラマウスは完成したが、いずれのマウスラインにおいてもgerm lineへの導入が得られなかった。このような事情で、次年度に向け我々は、Cre-Loxを用いた新規のconstruct制作を再度試みる予定で実験を進めていた。
逐次型帰納学習法の開発とそのレイアウト問題への応用

レイアウト設計などに登場する空間制約を自動的に獲得する方法を提案した。この方法は帰納論理プログラミングを拡張したもので,特徴は(1)数値データから制約論理プログラムで表された空間制約を導出すること,(2)どの空間的制約から学習するかを自動的に決定し,その関係を階層化するという多重ターゲット学習を導入していることにある。これらの機能は帰納学習システムGKSに実現されており、過去の設計事例集を入力すると,そこに内在する空間制約を一般化したルール集合が生成される。得られたルールは自動レイアウトの際に利用することが可能で,制約充足における探索空間を縮小し,妥当な解を高速に求めるのに有効であった。
潰瘍性大腸炎関連大腸癌の新規分子マーカーの同定と治療法の開発

我々は,臨床サンプルから永続的に増殖可能なオルガノイドを作製し,希少がんの研究プラットフォームを開発した。更に,構築された潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんオルガノイドと通常型大腸がんの遺伝子変異・遺伝子発現変化の統合的な解析を行い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんに特異性を有する分子マーカーの探索を行った。大腸内視鏡解析や病理組織解析を組み合わせ,オルガノイドーオミックス解析で得られた分子マーカーを潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんの診断技術向上に導く研究システムが開発された。潰瘍性大腸炎患者の更なる高齢化に伴い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんの増加が予想されており,本研究成果は本邦において非常に有用である。潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌(CAC)は潰瘍性大腸炎患者の急増とともに,発症数の増加が懸念されている.CACは通常の大腸癌と異なり,大腸全摘術が標準的な治療法であるため,その鑑別診断技術の向上が急務である.本研究ではオルガノイド技術を用い,CACと通常型大腸癌の遺伝子変異・遺伝子発現変化の統合的な解析を行い,CAC分子マーカーの探索を行う.オルガノイド技術による疾患上皮細胞のクローン増幅は極小サンプルからのオミックス解析を可能とし,CACのようなサンプル量に制限のある疾患研究に極めて有用な手段である.得られた分子マーカーの病理組織学的発現解析はCACの診断技術向上と患者の治療法最適化に応用されることが期待できる.H27年度は5例の潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌(CAC)由来オルガノイドの作製を行った.潰瘍性大腸炎由来組織は正常粘膜上皮に比し,樹立効率が悪かったが,培養技術の最適化により安定的に樹立できるようになった.樹立したオルガノイドに対し,エキソーム解析およびマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子変異・遺伝子発現解析を行った.本研究は研究計画通り順調に進んでいる.潰瘍性大腸炎は長期間の罹患とともに,大腸発がん率が高くなることが知られている。近年,本邦において,潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌は潰瘍性大腸炎患者の急増とともに,発症数の増加が懸念されている。潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌は通常の大腸癌と異なり,大腸全摘術が標準的な治療法となっており,その鑑別診断技術の向上が急務である。しかしながら,その希少性からヒト臨床サンプルを用いた研究の推進は困難であった。我々は,臨床サンプルから,永続的に増殖可能なオルガノイドを作製することにより,希少がんの研究プラットフォームの開発を行ってきた。さらに,構築された潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌オルガノイドと通常型大腸癌の遺伝子変異・遺伝子発現変化の統合的な解析を行い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌に特異性を有する分子マーカーの探索を行う。オルガノイド技術による疾患上皮細胞のクローン増幅は極小サンプルからの分子オミックス解析を可能とし,潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌のようなサンプル量に制限のある疾患研究に極めて有用な手段である。特に,本邦が世界をリードする大腸内視鏡解析や病理組織解析を組み合わせ,オルガノイドーオミックス解析より得られた分子マーカーを潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌の診断技術向上に導く研究システムが開発された。今後,潰瘍性大腸炎患者の高齢化に伴い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌は増加することが予想され,本研究成果は本邦において有用性の高い研究といえる。H28年度は10例の潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌(CAC)由来オルガノイドの作製を行った。潰瘍性大腸炎由来組織は正常粘膜上皮に比し,樹立効率が悪かったが,培養技術の最適化により安定的に樹立できるようになった。樹立したオルガノイドに対し,エキソーム解析およびマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子変異・遺伝子発現解析を行った。本研究は研究計画通り順調に進んだ。近年,本邦において,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんは潰瘍性大腸炎患者の急増および高齢化とともに,発症数の増加が懸念されている。潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんは通常の大腸がんと異なり,大腸全摘術が標準的な治療法となっており,その鑑別診断技術の向上が急務である。さらに,構築された潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんオルガノイドと通常型大腸がんの遺伝子変異・遺伝子発現変化の統合的な解析を行い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんに特異性を有する分子マーカーの探索を行う。オルガノイド技術による疾患上皮細胞のクローン増幅は極小サンプルからの次世代シークエンス解析を可能とし,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんのようなサンプル量に制限のある疾患研究に極めて有用な手段である。特に,本邦が世界をリードする大腸内視鏡解析や病理組織解析を組み合わせ,オルガノイドーオミックス解析より得られた分子マーカーを潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんの診断技術向上に導く研究システムが開発された。今後,潰瘍性大腸炎患者のさらなる高齢化に伴い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんは増加することが予想されており,本研究成果は本邦において有用性の高い研究といえる。

大腸内視鏡解析や病理組織解析を組み合わせ,オルガノイドーオミックス解析で得られた分子マーカーを潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんの診断技術向上に導く研究システムが開発された。潰瘍性大腸炎患者の更なる高齢化に伴い,潰瘍性大腸炎患者関連大腸がんの増加が予想されており,本研究成果は本邦において非常に有用である。潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌(CAC)は比較的希少な疾患であるが,研究施設における豊富な症例から順次臨床検体の収集とオルガノイド樹立・解析を行っていく.潰瘍性大腸炎患者関連大腸癌(CAC)は比較的希少な疾患であるが,研究施設における豊富な症例から順次臨床検体の収集とオルガノイド樹立・解析を行う。消化器内科学
骨髄より間葉系幹細胞を分離回収し増殖と分化を誘導する生体機能性ガラス材料の創製

1.マウス骨髄より間葉系幹細胞を分離回収するのに適した特異抗体に関する情報を文献検索と生物学系学会活動を通じて探し、Sca-1、c-kitとOct4等が妥当と判断された。2.昨年に引き続き、市販1社(Milteny Biotec社)の特異抗体付き磁性マイクロビーズを用いてマウス骨髄から間葉系幹細胞の回収を試みた。血球系細胞を除去後にSca-1抗体とc-kit抗体を有する磁性マイクロビーズを用いると最大の回収効率が得られた。3.ストレプトアビジンを表面コートした市販磁性マイクロビーズとビオチン標識1次抗体(例えばSca-1抗体)も当該目的に使用可能であることが確認された。4.表面にカルボキシル基を有する市販磁性ビーズに琥珀酸イミドとカルボジイミドを加えて有機エステル化しアミド結合によってラットの2次抗体を付加することに成功した。各種の抗ラット・マウス1次抗体(c-kit等)の結合を試みる段階まで立ち至った。5.ゾルーゲル法で合成した鉄製分配合シリカ系ガラス粉末はポリスチレンとの均質な複合化が困難であり、次段階の抗体との結合が困難であった。今後、複合体の均質化とポリスチレンへの有機官能基(カルボン酸等)の結合効率の改善および2次抗体の安定的結合を行うことを予定している。成功後、骨髄からの間葉系幹細胞の高効率な分離回収が可能になると考えられる。6.材料開発ではマウスの骨髄細胞を用いたが、ヒトの臨床応用を考慮した場合、ヒト骨髄からの間葉系幹細胞の分離回収が必要なため、今後、ヒト間葉系幹細胞に特異的な抗原の検索とヒト細胞用の磁性マイクロビーズの開発を行う予定である。本年度は市販1社(Miltenyi Biotec社)の特異抗体付き磁性マイクロビーズシステムを用いてマワス骨髄から間葉系幹細胞の分離回収を試み、併せてTEM/EDX観察から磁性マイクロビーズの材料学的性質を検討した。1.マウス骨髄に対してLineage Cell Depletionを行うと98.80%の血球系細胞が除かれ、細胞残存率は1.20%となった。この後、抗CD117抗体による磁性回収によって細胞残存率は0.56%になり;Anti-Sca-1抗体による磁性回収によって細胞残存率は0.18%になり;抗CD34抗体による磁性回収によって細胞残存率は0.13%になり;抗CD44抗体による磁性回収によって細胞残存率は0.14%となった。Lineage Cell Depletionキット、抗CD117抗体とAnti-Sca-1抗体の組合せによる磁性回収の結果、細胞残存率は0.12%となった。この値は骨髄中の間葉系幹細胞の通常の存在率(0.010.1%)に近似しており、骨髄から3回磁性分離を行った細胞の多くは間葉系幹細胞であると考えられた。2.磁性マイクロビーズの形状は楕円形で大きさは0.51.0μm程度であった。マイクロビーズ内で磁性を与える鉄成分は黒く着色された小粒子として存在し、その大きさは40nm程度であり、EDX分析の結果、磁性ビーズの無機成分にはFe以外にSi、0とC1が含まれることが明らかとなった。磁性マイクロビーズの有機成分はポリスチレン、無機成分は磁性フェライトであり、試薬溶液には他に増粘剤として微粉末シリカや鉄系塩化物が含まれると考えられた。3.これらの知見を基に鉄系粉末やゾル-ゲル法応用による磁性シリカ粉をコアにしたポリスチレン粒子を調製し、抗体(やペプチド、蛋白質等)をリンカーによって結合する研究を企画、検討している。
低酸素誘導因子(HIF)により誘導される細胞接着関連遺伝子の転写クラスター解析

細胞接着に関与する遺伝子のうちに、低酸素誘導因子(HIF)により誘導されるものを検索し、多数の遺伝子を見いだした。これらの遺伝子のHIFによる誘導機構を解析し、一部の遺伝子群は調節領域に複数の低酸素反応エレメント(HRE, hypoxia-responsive-element)を持ち、HIF単独で有意な転写誘導が見られること、他の一群の遺伝子は単一のHREを持ち、HIF以外の転写因子と協同して転写を誘導することを明らかにした。後者については共役転写因子の同定を行った。細胞接着は多くの疾患の病態生理に深く関連している。最近我々は低酸素(hypoxia)によって細胞接着に深く関連する一連の遺伝子の転写が強く誘導されることを見いだした。低酸素によってα5-インテグリン(ITGA5)、シンデカン-4(SDC4)、フコース転移酵素(FUT7)、シアル酸転移酵素(ST30)、UDPガラクトーストランスポーター(UGT1)、シアル酸トランスポーター(Sialin)の転写の誘導が観察された。これらの低酸素による誘導の背景には、転写因子hypoxia inducible factor(HIF)の働きがある。本研究の目的は、転写因子HIFによる細胞接着誘導の分子生物学的メカニズムの解明を進めることにある。予備実験の結果、低酸素によって誘導される細胞接着に関連した遺伝子は上記の六種以外にもいくつかるあことが判明したので、本年度はこれまでの検索より広範なスクリーニングを行い、さらに多くの低酸素で誘導される細胞接着関連遺伝子をあらたに見いだすことを目的とした。その結果、低酸素に伴いシアル酸の分子種が変化し、KDNが増量することが判明した。従来からKDNはシアル酸トランスポーター(Sialin)によっては輸送されないとれてるので、このことは低酸素により、Sialin以外のシアル酸関連遺伝子が変動していることを示す。また低酸素によって、ガングリオシドの脂質部分を構成するセラミド部分の修飾にかかわる遺伝子が変動することも見いだれた。ほかにも数種の低酸素によって誘導される細胞接着に関連した遺伝子が新らに見いだされたので、次年度にはこれらが転写因子hypoxia inducible facot(HIF)単独で転写誘導されるのか、HIFと他の転写因子の協調作用によってはじめて有意の転写が誘導されるのかについて検索する予定である。低酸素によってα5-インテグリン(ITGA5)、シンデカン-4(SDC4)、フコース転移酵素(FUT7)、シアル酸転移酵素(ST3O)、UDP-ガラクトーストランスポプター(UGT1)、シアル酸トランスポーター(Sialin)の転写の誘導が観察された。本年度は広範なスクリーニングを行い、さらに多くの低酸素で誘導される細胞接着関連遺伝子をあらたに見いだした。そのなかには、シアル酸のde novoの生合成に関わるN-acetylneuraminic acid 9-phosphate synthetase(NPS)およびphosphomannoisomerase(PMI)や、ガングリオシドの脂質部分を構成するセラミド部分の修飾にかかわる遺伝子であるFA2H,DES1など、ヒアルロン酸の合成酵素遺伝子、ガラクトースおよび硫酸基の転移に関わる遺伝子などが含まれていた。これら遺伝子のうち一部のものについては5'-調節領域を解析し、Luciferaseを用いたリポーターアッセイやクロマチン免疫沈降法によりHIF結合部位を同定することが出来た。低酸素状態では、これらの遺伝子の変化により細胞表層の糖鎖のうち接着能を持つものに大きな変動が起こるものと考えられた。