hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
構成主義的・証明論的観点からの哲学的意味理論の研究

その一つは、この意味理論の形式的枠組みの候補とみなせる直観主義タイプ理論(Intuitionistic Type Theory)についての検討であり、もう一つはこの意味理論と親和的な真理論としての照応理論(Anaphoric Theory of Truth)をめぐる考察である。まず、直観主義的タイプ理論が、構成主義的な哲学的意味理論の範型となりうることは、これまで、述語論理の言語および数学の言語について示されてきた。しかし、タイプ理論が自然言語を含む言語一般をどのように扱いうるかは必ずしも明らかではなかった。そこで、自然言語における実質的推論(material inference)に焦点を当て、それらをタイプ理論の枠組みに収容する可能性について議論した。その過程で意味理論がもつ形而上学的な関わりについての知見が得られた。また、真理に関する照応理論は、しばしば収縮主義的な(deflationary)真理論の一種とみなされるが、それは必ずしも明らかなことではない。収縮主義においては、「A」が真であるのはAのときそしてそのときに限る、という図式こそが基本的であり、この図式から真理概念のもつすべての特徴が導かれるとされる。しかしながら照応理論において、この図式は、真理述語の持つ代用文形成の働きに基づいて正当化されうるものである。したがって、代用文形成という機能にどのような実質的内容を賦与できるかが問われることになる。この問いにたいして、構成主義的意味理論の観点から図式の実質的内容を特徴付けられるという見込みが示された。
高分子・超分子内エネルギー変換過程の時間分解ベクターポテンシャル分光

本研究では、高分子・超分子内の原子振動が電気エネルギーへと変換される最適条件を見出し、実際に生じるエネルギー変換過程を、先端が原子レベルで鋭利に尖ったプローブ顕微鏡の探針を用いてより鮮明に可視化する方法を具体的に検討することを第一歩としている。そのため、単層カーボンナノチューブ(Single-walled Carbon Nanotube:SWNT)を標準試料として研究を進めてきた。SWNTは、炭素原子が2次元的に蜂の巣状に配列した単一原子の厚さのシート状物質(グラフェン)がチューブ状に巻きあがったものである。SWNTを平坦な基板上に分散させると、最表面側では基板の影響が極めて小さいため、いわゆる「フリースタンディング(freestanding)」な状態が得られる。同じ状態のグラフェンでは内部の原子振動が熱的ゆらぎにより誘発される度合いが高いことが知られており、近年国内外で活発な研究が行われている。そこで、本研究ではそれらを参考に、SWNT系内での熱的な原子振動について検討を行った。また、探針先端原子とSWNT最表面原子との間に働く引力相互作用によりSWNT内の炭素原子が鉛直方向に移動する現象についてその詳細な解析を行った。その結果、熱的振動のうち特に鉛直(縦)方向の振動が電気エネルギーへの変換効率を高める主要な因子となり得ることを見出すと共に、縦方向の熱的振動における原子の移動と同程度の移動量が、探針との引力相互作用によりSWNT最表面原子へも誘発されることを見出した。また、SWNTとグラフェンにおける両者の違いを明確化するため、SWNT由来のフリースタンディング状グラフェンについての原子分解能観察と3次元力場分光測定の結果をもとに同様な移動量について詳細な検討を行った。その結果、局所的により高い曲率が得られる場合に電気エネルギーへの変換効率がより高くなる結果が得られた。当初の予定では、電気エネルギーへの変換効率は顧みず、プローブ顕微鏡の探針を用いてSWNT最表面原子に原子振動を誘発し、その過程で原子振動が電気エネルギーへと変換される過程を観察できれば良しと考えていた。しかし、探針先端とSWNT最表面との間に働く引力相互作用について、平成30年度に改めて詳細に検討し直した結果、時間的なスケールを度外視すると、探針先端原子によるSWNT最表面原子の移動方向と移動量が原子振動による高効率なエネルギー変換を実現させるための理想的な条件にかなり近いことが見出された。こうした効率化に関するより具体的な検討が、最終的な成果に繋がる早道であると判断し、これまでの実験結果についての更なる理論解析に重点を置くこととなった。そのため、当初の計画にあった除振機構の開発については設計段階までで、実際に業者へ製造依頼を行うのは次年度に繰り越されることとなった。また、具体的な測定機構についてのコンピュータによる自動化用ソフトウェア開発も、より具体的な計測方法について今一度十分な検討が必要となるため、次年度に持ち越しとなった。平成30年度の研究では、SWNTとSWNT由来のフリースタンディング状グラフェンにおいて熱的ゆらぎによる原子振動の度合いとそれによる電気エネルギーへの変換効率を高める因子について見出すことができた。そこで、それらの成果をもとに、分子動力学によるシミュレーションを改めて行い、実際に使用する試料の形態およびサイズについて絞り込みを行うと共に高効率化を実現する実験条件についてより具体的な検討を行う。また、探針先端原子と試料内原子との間の引力相互作用により、試料内の原子移動に伴う電荷移動をケルビンプローブ法等により直接画像化するための装置の設定を進めて行く。その過程で現存装置の除振機構について改めて検討し直し、前年度に進めてきた基本設計に手直しを加えた上で業者に製作を依頼する。以上の過程の中で、電気エネルギーへの変換過程の時間スケールについて、実験とシミュレーションの両方でより詳細な検討を行い、時間分解分光測定がスムーズに実現できるように準備を進める。また、SWNTとグラフェンにおける両者の違いを明確化するため、SWNT

由来のフリースタンディング状グラフェンについての原子分解能観察と3次元力場分光測定の結果をもとに同様な移動量について詳細な検討を行った。その結果、局所的により高い曲率が得られる場合に電気エネルギーへの変換効率がより高くなる結果が得られた。当初の予定では、電気エネルギーへの変換効率は顧みず、プローブ顕微鏡の探針を用いてSWNT最表面原子に原子振動を誘発し、その過程で原子振動が電気エネルギーへと変換される過程を観察できれば良しと考えていた。しかし、探針先端とSWNT最表面との間に働く引力相互作用について、平成30年度に改めて詳細に検討し直した結果、時間的なスケールを度外視すると、探針先端原子によるSWNT最表面原子の移動方向と移動量が原子振動による高効率なエネルギー変換を実現させるための理想的な条件にかなり近いことが見出された。こうした効率化に関するより具体的な検討が、最終的な成果に繋がる早道であると判断し、これまでの実験結果についての更なる理論解析に重点を置くこととなった。そのため、当初の計画にあった除振機構の開発については設計段階までで、実際に業者へ製造依頼を行うのは次年度に繰り越されることとなった。また、具体的な測定機構についてのコンピュータによる自動化用ソフトウェア開発も、より具体的な計測方法について今一度十分な検討が必要となるため、次年度に持ち越しとなった。平成30年度の研究では、SWNTとSWNT由来のフリースタンディング状グラフェンにおいて熱的ゆらぎによる原子振動の度合いとそれによる電気エネルギーへの変換効率を高める因子について見出すことができた。そこで、それらの成果をもとに、分子動力学によるシミュレーションを改めて行い、実際に使用する試料の形態およびサイズについて絞り込みを行うと共に高効率化を実現する実験条件についてより具体的な検討を行う。また、探針先端原子と試料内原子との間の引力相互作用により、試料内の原子移動に伴う電荷移動をケルビンプローブ法等により直接画像化するための装置の設定を進めて行く。その過程で現存装置の除振機構について改めて検討し直し、前年度に進めてきた基本設計に手直しを加えた上で業者に製作を依頼する。以上の過程の中で、電気エネルギーへの変換過程の時間スケールについて、実験とシミュレーションの両方でより詳細な検討を行い、時間分解分光測定がスムーズに実現できるように準備を進める。平成30年度は、高分子・超分子内で生じる原子の振動が電気エネルギーへと変換される最適な条件を見出し、先端が原子レベルで鋭利に尖ったプローブ顕微鏡の探針を用いてより鮮明に直接可視化する方法を具体的に検討することに注力したため、年度中に予定していた除振機構の設計が完了せず次年度に持ち越しとなった。また、具体的な試料の条件についても検討段階であったため、消耗品などの支出も控えるかたちとなった。そのため、年度内で得られた成果をもとに、除振機構を改めて見直し、基本設計に手直しを加えた上で業者への発注を行う。また、最適な測定条件をもとに試料作製に取掛り、さらに原子移動に伴う電荷移動の直接観察用にケルビンプローブ法の実験設備の購入を行う。
パネル・データに基づく経済厚生分析

本研究では、本研究が実施する大規模な社会調査「雇用と子育てに関するパネル調査」(LOSEF)をはじめ、履歴情報を含む各種社会調査から得られるパネル・データを駆使して、人々の経済社会行動や主観的厚生の決定要因を計量的に分析した。その結果、「子供の貧困」が成人期の健康に及ぼす影響、初職がその後の職業人生に及ぼす影響、家族介護が介護者のメンタルヘルスに及ぼす影響など、政策的含意に富む知見が数多く得られた。初年度の平成26年度においては、当初の計画通り、「雇用と子育てに関するパネル調査」(LOSEF)の第1回インターネット調査を平成26年12月に実施した(回収数1397件)。現在、データのクリーニングと暫定的な分析を進めているところである。そのほか、既存の大規模調査等に基づいて以下のような研究を進めた。(1)LOSEF(郵送による本調査)を用いて、父親の働き方と母乳育児との関係を分析した結果、父親がフレックスタイム制のようなより柔軟な働き方をすることで、母乳育児が多くなり授乳期間も延びることを確認した。(2)LOSEF(インターネット・パイロット調査)を用いて、初職が非正規だった経験が現時点のメンタルヘルスに及ぼす影響を分析した結果、男性の場合、初職が非正規だった経験は、あまり媒介されず直接に現時点のメンタルヘルスを悪化させることを確認できた。(3)JSTAR(くらしと健康の調査)を用いて、日本における年金受給年齢の男性の労働状況を分析し、米国と比較した結果、50歳代に雇用者であった男性は現状より働く余力を持っているとの結論が得られた。(4)厚生労働省「中高年者縦断調査」のパネルデータを用いて、中高年のメンタルヘルスの決定要因を分析した結果、家族介護への関与の影響が、ほかの社会経済的要因より大きいことを確認した。(5)子どもの自己肯定感に対する、貧困や学力、学力以外の能力の影響を分析した結果、貧困は、学力・能力低下を経由することによってだけでなく、それ自体が自己肯定感を引き下げることが明らかになった。(6)第3号被保険者制度を廃止した場合の影響を、マクロ(年金財政への影響)・ミクロ(将来の高齢者の貧困率、マイクロシミュレーションモデルによる推計)の両面から定量的に評価した。平成27年度においては、当初の計画通り、雇用と子育てに関するパネル調査」(LOSEF)の第2回インターネット調査を平成28年2月に実施した(回収数891)。現在、データのクリーニングを進め、第1回調査のデータとの接合作業を行っている。第1回調査のデータを用いた分析結果は日本年金学会で報告したほか、本研究に基づいて二次利用申請して得た「国民生活基礎調査」の分析と組み合わせ、貧困率の将来推計などダイナミック・マイクロ・シミュレーション作業に発展させ、内外の学会で報告した。さらに、LOSEFのデータに基づく分析と同時並行して進めている、各種パネル・データを用いた分析も着実に成果を上げている。特に、厚生労働省「中高年者縦断調査」のデータを用いた、家族介護がメンタルに及ぼす影響や、メンバーが調査に参加している「くらしと健康の調査」(JSTAR)を用いた高齢者の就業と健康に関する研究成果は、すでに内外の学術誌に掲載ないし掲載予定となっている。そのほか、職場ストレスが余暇活動に及ぼす影響や、余暇の過ごし方が定期健康診断の結果に及ぼす影響に関するパネル・データ分析の成果も論文化されている。当初の計画通り、「雇用と子育てに関するパネル調査」(LOSEF)の第2回インターネット調査を平成28年2月に実施し、今後の研究を進める上で十分なデータを得ることができた。また、LOSEFを用いた分析を補強するため、政府が公表している各種パネルデータに用いた実証分析も積極的に行い、多くの研究論文の刊行や学会報告を行うことができた。特に論文では、インパクト・ファクターが3を上回る国際ジャーナルに採択されたものが2本、2を上回るものが1本あった。なお、予定していたLOSEF第3回調査は、平成28年12月下旬にインターネット調査として実施した。回収率は87.3%という予想以上の高さであり、第1回から追跡できるサンプルとして4,982人のデータを確保できた。現在、データ・クリーニングや予備的な解析を進めており、その成果を順次刊行するとともに、一橋大学経済研究所からの一般公開に向けての準備を進めつつある。なお、LOSEFについては英語による解説書を刊行し、国際的にも利用可能な形にした。さらに、本研究の成果を公開するため、少子高齢化に関する日中韓の3ヵ国共同シンポジウムを高麗大学との共催で平成28年8月26日に開催し、小塩と臼井が出席・報告した。そこでの報告論文はジャーナルに投稿し、現在、査読結果待ちである。また、研究成果の一般向けの発信としては、小塩が一橋大学開放講座『メンタルヘルスが危ない:大介護時代心構えはありますか』(平成28年11月17日、於東京・如水会館)において、介護者のメンタルヘルスに関するパネル分析の結果を紹介した。

当初の計画通り、「雇用と子育てに関するパネル調査」(LOSEF)の第1回インターネット調査を平成26年12月に実施し、今後の研究を進めるうえで十分なデータを得ることができた。また、LOSEFの郵送調査など既存のデータを用いた実証分析を積極的に行い、多くの研究論文の刊行や学会報告を行うことができた。研究は当初の予定通りに進捗しており、最終年度となる平成28年度も計画に沿って研究を推進する。特に同年度においては、郵送調査という形で実施したLOSEFの第1回、第2回調査のサンプルを追跡する第3回調査をインターネット調査の形で実施し、パネル・データの拡充を目指す。さらに、最終年度でもあり、論文作成や各種学会発表をこれまで以上に進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。公共経済学2年目の平成27年度においては、第2回LOSEFインターネット調査を実施する。今回の調査は基本的に第1回調査と同様のものとするが、対象者を中高年世代とする。また、第1回LOSEFインターネット調査のデータが利用可能になるので、それに応じて実証分析をさらに進める。具体的には、1年目に得られた研究成果をベースとして、(1)公的年金と引退行動の関係の解明、(2)親の社会経済的地位の子供への影響、(3)主観的厚生の動学メカニズムの解明、(4)世代間の利害調整メカニズムの解明、などを進める。
CC-FESEMを用いたナノコロイドプローブによるナノ粒子間相互作用の評価

従来不可能だったサブミクロン以下のナノ粒子の一個粒子間相互作用の直接測定を可能とするため、原子間力顕微鏡(AFM)探針に接着したカーボンナノチューブ(CNT)の先端にナノ粒子一個を接着したナノコロイドプローブ作製法の確立を試みた。AFMの探針に分離精製した直線状のCNT、さらにナノ粒子を接着するために、昨年度、設計・試作した高分解能FE-SEMシステムに設置可能な六軸の駆動用ピエゾ素子を用いた超小型ナノマニュピレーターシステムを現有の計算機制御FE-SEMシステム内に設置した。このマニュピレーターは、原子間力顕微鏡用探針を取り付ける側の腕がx, y, zの三軸方向、さらに回転方向4軸、ナノ粒子やカーボンナノチューブを取り付ける腕は、二軸の同様の微動用ピエゾが取り付けられており、いずれのピエゾ素子も0.1nmのオーダーで微駆動可能なものに設計した。このマニュピレーターの駆動精度をFE-SEMにより観察した結果、設計したナノスケールでの微動が可能であることを確認した。次に、AFM探針に接着用の直線状のCNTの分離精製法とナノ粒子一個まで分散するための分散法を検討した。CNT合成時には、本研究で使用可能な直線状のCNTは実際にはごく僅かしか生成せず、直線状のCNTの分離と単離したCNTをエッジ上に一端を付着させ直立させるため、溶媒中に分散させたCNTに高周波電源を用いてエッジ上に直線状CNTの櫛状の付着を試みた。また、ナノ粒子についても、溶媒中での一次粒子までの分散が必要であり、粒子径数nmのγ-アルミナを用いて分散可能な分散剤構造を探索し、分子量の低い分散剤が有効であることを確認した。この分散性ナノ粒子を噴霧乾燥顆粒を得て、粒子の表面状態が変化しない程度に加熱処理し、AFM探針に接着したナノ粒子からなるコロイドプローブを用い、ポリエチレンイミン(PEI)のエタノール中でのアルミナナノ粒子間相互作用に及ぼす分子量・分子構造の影響を検討した。その結果、サブミクロン粒子では最も高い分散性と立体障害斥力を発生させる分子量10000の分岐型PEIが、ナノ粒子になると粒子間に架橋を形成し、数十nmの遠距離引力が生じるナノ粒子固有の挙動の存在を確認した。ナノ粒子間相互作用を原子間力顕微鏡(AFM)により評価するための手法として、AFMの探針にカーボンナノチューブを介してナノ粒子を接着するナノプローブ法の確立を試みた。この手法ではカーボンナノチューブの表面に有する炭化水素にFE-SEMの電子線を照射することで炭素化して結合させる方法を考案した。この方法により、探針先端にカーボンナノチューブの一端を接着し、別の一端にナノ粒子の接着を試みる。このカーボンナノチューブを用いたナノコロイドプローブの作成には、FE-SEM内で高分解能観察をしながら探針やカーボンナノチューブをナノレベルの精度で操作できるナノマニピュレーターが必要である。本年度は高真空FE-SEM内に設置するナノ粒子採集用マニピュレータを設計,発注し,導入した。本装置は,ピエゾ素子を用いて2軸方向に変位制御が0.5nm刻みで可能なAステージと3軸方向に変位制御が同様の精度で可能であり、さらに回転角も制御可能なBステージから構成されている。FE-SEM内で試作したマニピュレーターが設計した精度で可動することを確認した。このシステムによりナノプローブを作製するためには、直線性の良いカーボンナノチューブが必要であるが、製造されているカーボンナノチューブは、直線性の良いものは僅かしか得られないため、製造したバルクのカーボンナノチューブから直線性の高いチューブの分離法の検討を進めた。本年度はさらに,ナノコロイドプローブ作成の前段階として,これまで,本研究グループが開発してきた10μm以上の粒子を用いたコロイドプローブ作成法に改良を施し,1μm前後の粒子をAFM探針に接着したコロイドプローブの作成に成功した。本コロイドプローブを用い,薬剤粒子の相互作用力の測定を実施した。

また、ナノ粒子についても、溶媒中での一次粒子までの分散が必要であり、粒子径数nmのγ-アルミナを用いて分散可能な分散剤構造を探索し、分子量の低い分散剤が有効であることを確認した。この分散性ナノ粒子を噴霧乾燥顆粒を得て、粒子の表面状態が変化しない程度に加熱処理し、AFM探針に接着したナノ粒子からなるコロイドプローブを用い、ポリエチレンイミン(PEI)のエタノール中でのアルミナナノ粒子間相互作用に及ぼす分子量・分子構造の影響を検討した。その結果、サブミクロン粒子では最も高い分散性と立体障害斥力を発生させる分子量10000の分岐型PEIが、ナノ粒子になると粒子間に架橋を形成し、数十nmの遠距離引力が生じるナノ粒子固有の挙動の存在を確認した。
ヒト遺伝性疾患関連領域から単離した機能未知遺伝子GOLSYNの生理機能の解析

ヒト8番染色体q23領域から単離したGOLSYNは、コイルドコイル領域を持つ膜貫通蛋白質をコードしている。ラット海馬神経細胞においてGOLSYNは、キネシン重鎖とシナプス小胞を繋ぐリンカー分子として機能し、シナプス小胞の神経終末への輸送に関わることが示唆されている。一方、ヒト上皮系細胞ではGOLSYNは主にゴルジ体に存在している。平成18年度はGOLSYNのゴルジ体局在化機構について解析し、以下の研究成果を得た。1)GOLSYN蛋白質の細胞内局在とゴルジ体への局在化に必要な領域の解析(1)各ゴルジ嚢に局在する蛋白質とGOLSYNの二重染色を行い、GOLSYNのゴルジ嚢における発現分布を調べた。その結果、HeLa細胞では、GOLSYNはトランスゴルジネットワーク(TGN)に豊富に存在していることを明らかにした。(2)種々の領域を欠失させた変異型および野生型GOLSYNの細胞内局在を解析し、GOLSYNのゴルジ体局在化にはC末端の疎水性領域とコイルドコイル領域を含むアミノ酸267-660番目の領域が必要であることを明らかにした。2)GOLSYNと相互作用する分子の検索(1)HA-syntaxin1-4およびFLAG-GOLSYNをコトランスフェクトしたHeLa細胞を用いてsyntaxinとGOLSYNの相互作用を調べ、GOLSYNがsyntaxin1,3および4と結合する可能性を示した。(2)FLAG-GOLSYNを一過性に発現させたHeLa細胞を用いて、免疫沈降法によりGOLSYNと内在性syntaxinとの相互作用を調べた結果、GOLSYNが内在性syntaxin3および4と結合することを見出した。以上の結果から、GOLSYNはヒト上皮系細胞では主にTGNに局在しており、syntaxin3,4などの膜蛋白質のTGNから細胞膜への輸送に関与している可能性が考えられた。【研究目的】我々がヒト8番染色体q23領域から単離したGOLSYN遺伝子は、コイルドコイル領域と膜貫通領域を持つ蛋白質をコードしている。GOLSYN蛋白質は神経細胞におけるシナプス小胞輸送に関与するシンタフィリンと高い相同性を示すことから、細胞内蛋白質輸送に関わる分子であることが予想されるが、その生体内における役割については分かっていない。そこで、GOLSYN遺伝子の細胞内機能を明らかにする目的で、ヒト細胞株を用いてGOLSYN蛋白質の細胞内局在について解析した。【実験結果】GFP-GOLSYN融合蛋白質を発現できるプラスミドベクターを構築し、HeLa細胞で発現させたところ、GOLSYN蛋白質は細胞核の周辺に点状の局在を示した。ゴルジ体のマーカー蛋白質であるKDEL受容体と小胞体のマーカー蛋白質であるPDIに対する抗体を用いた二重染色を行ったところ、このGOLSYN蛋白質の点状のシグナルはKDEL受容体の染色像とほぼ一致した。微小管重合阻害剤であるノコダゾールで細胞を処理するとGOLSYN蛋白質は、細胞質全体に拡散した微小な点状の局在を示すようになった。これらのことからGOLSYN蛋白質はゴルジ体に局在していることが示唆された。次にGOLSYN蛋白質の細胞内局在を詳細に調べるために、GOLSYN蛋白質のN末端を特異的に認識する抗体を作製した。ショ糖密度勾配遠心法によってHeLa細胞の細胞小器官を分画し、GOLSYN蛋白質が回収される画分をウエスタンブロット法により調べたところ、GOLSYN蛋白質はゴルジ画分に回収されることが分かった。さらにGOLSYN蛋白質のゴルジ膜との結合を調べたところ、1% Triton X-100を含む溶液で処理した場合のみ、GOLSYN蛋白質が膜から遊離することが分かった。【結論】GOLSYN蛋白質は膜貫通蛋白質としてゴルジ体に局在していることが推察された。ヒト遺伝性疾患に連鎖する8番染色体q23領域から単離したGOLSYN遺伝子は、コイルドコイル領域を持つゴルジ膜蛋白質をコードしている。平成17年度は脳におけるGOLSYN遺伝子の生理機能の解析に焦点を絞り、マウス相同遺伝子(m-Golsyn)の単離と脳組織における発現分布を調べ、以下の研究成果を得た。(1)マウス脳cDNAライブラリーからRACE法を用いて、完全長m-Golsyn cDNAの単離を行い、そのゲノム構造を決定した。m-Golsyn遺伝子は8個のエキソンからなり、マウス15番染色体B3.2領域内にテロメア側からセントロメア側に向かって約115kbにわたって存在していた。(2)m-Golsyn遺伝子から転写開始点の違いと選択的スプライシングによって生成する3種の転写物が、組織特異的な発現様式を示すことを明らかにした。(3)マウス成体脳を用いた免疫組織化学的解析によって、m-Golsyn蛋白質が、様々な脳領域の神経細胞に広く発現していること、また、脳脊髄液を産生・分泌する脈絡叢上衣細胞に強い発現が認められることを見出した。(4)マウス大脳皮質を用いてショ糖密度勾配による細胞分画を行い、m-Golsyn蛋白質が小胞体を含む細胞内小器官に分布していることを明らかにした。2)マウス成長過程におけるm-Golsyn蛋白質の発現変動

(1)成長過程のマウス脳を用いた解析によって、胎児から成体に至るまで大脳皮質の梨状葉、海馬の錐体細胞、小脳のプルキンエ細胞および脳室の脈絡叢上衣細胞にm-Golsyn蛋白質の強い発現が見られることを明らかにした。(2)マウス成体脳を用いてin situ hybridizationを行い、大脳皮質の梨状葉、海馬の錐体細胞、小脳のプルキンエ細胞にm-Golsyn mRNAが豊富に存在していることを見出した。ヒト8番染色体q23領域から単離したGOLSYNは、コイルドコイル領域を持つ膜貫通蛋白質をコードしている。ラット海馬神経細胞においてGOLSYNは、キネシン重鎖とシナプス小胞を繋ぐリンカー分子として機能し、シナプス小胞の神経終末への輸送に関わることが示唆されている。一方、ヒト上皮系細胞ではGOLSYNは主にゴルジ体に存在している。平成18年度はGOLSYNのゴルジ体局在化機構について解析し、以下の研究成果を得た。1)GOLSYN蛋白質の細胞内局在とゴルジ体への局在化に必要な領域の解析(1)各ゴルジ嚢に局在する蛋白質とGOLSYNの二重染色を行い、GOLSYNのゴルジ嚢における発現分布を調べた。その結果、HeLa細胞では、GOLSYNはトランスゴルジネットワーク(TGN)に豊富に存在していることを明らかにした。(2)種々の領域を欠失させた変異型および野生型GOLSYNの細胞内局在を解析し、GOLSYNのゴルジ体局在化にはC末端の疎水性領域とコイルドコイル領域を含むアミノ酸267-660番目の領域が必要であることを明らかにした。2)GOLSYNと相互作用する分子の検索(1)HA-syntaxin1-4およびFLAG-GOLSYNをコトランスフェクトしたHeLa細胞を用いてsyntaxinとGOLSYNの相互作用を調べ、GOLSYNがsyntaxin1,3および4と結合する可能性を示した。(2)FLAG-GOLSYNを一過性に発現させたHeLa細胞を用いて、免疫沈降法によりGOLSYNと内在性syntaxinとの相互作用を調べた結果、GOLSYNが内在性syntaxin3および4と結合することを見出した。以上の結果から、GOLSYNはヒト上皮系細胞では主にTGNに局在しており、syntaxin3,4などの膜蛋白質のTGNから細胞膜への輸送に関与している可能性が考えられた。
新規パーキンソン病関連遺伝子midnolinの生理的、病理的な役割の解明

今年度は、Midnolin(MIDN)の病態生理的な役割に関して、in vitroおよびin vivoの両面からの解明を試みた。PC12細胞において、MIDNのトランスクリプトーム解析(RNA-seq法)を以前に行ったが、MIDNにより発現が4倍以上亢進する遺伝子群をあらたに抽出して、それら各遺伝子のプロモーターに共通する配列を複数見出した。さらに、その共通配列に結合すると予想される転写因子の候補4つを見出した。現在はMIDNとこれらの転写因子の結合を免疫沈降法などで調べている段階である。また、このトランスクリプトーム解析により、MIDN遺伝子を欠損させると、パーキンソン病の原因遺伝子であるSNCAの発現上昇およびPRKN(Parkin)の発現低下が認められたが、ヒト脳由来のSHSY5Y細胞においては、MIDNノックダウンによるPRKNの発現の減少が再現出来たが、SNCAの発現量は増大しなかった。in vivoの実験に関しては、すでにMIDNノックアウトマウスをゲノム編集法により作製し、繁殖に成功していた。そのヘテロノックアウトマウスと野生型のマウスを交配させると、野生型およびヘテロノックアウトマウスがメンデル則に従って1:1で生まれるが、ヘテロノックアウトマウス同士を交配させると、ホモノックアウトマウスはほぼ生まれず、稀に生まれた個体も生後すぐに死亡する。これらのことから、MIDN遺伝子の完全なノックアウトは致死的になり、MIDNが生体内での必須の役割を担っているものと思われる。今後はこのヘテロノックアウトマウスがパーキンソン病様の症状を呈するかどうか、マウスの自発的運動量を測定する計画である。Midnノックアウトマウスの繁殖が順調に進み、現在は12ヶ月齢を超えるノックアウトマウスの個体数が増えてきた。18ヶ月齢に達したマウスから順に行動解析を行い、パーキンソン病様の症状を呈しているかどうかを確認する予定である。次年度はMidnノックアウトマウスの行動解析を行うとともに、ヒトMIDN遺伝子プロモーターをクローニングして、MIDN遺伝子の発現に重要なプロモーター部位の特定および転写因子を同定していく予定である。(理由)当該年度に購入予定だった動物行動解析システム(ハードウエア、ソフトウエア一式)を、次年度に購入することにしたために、次年度使用額が生じた。そのために、残金を繰越し金として次年度に使用することにした。(使用計画)当該年度に購入予定だった動物行動解析システムを次年度に購入する予定である。
DNP-NMRを用いた有機デバイス材料の構造解析

本研究では、非晶質材料の局所構造解析に非常に有用な手法である固体NMR、及びその高感度測定法である固体DNP-NMRを用い、これまで未解明であった、有機非晶膜における分子のコンフォメーション、分子間距離、πスタッキング構造などの非晶構造体に内在する局所構造を分子レベルで明らかにし、非晶構造と有機デバイス特性との相関解明を通じて、さらなる高特性材料開発の設計指針を得るとともに、有機デバイスの基礎科学の構築を進める。
胃がんにおけるmiRNAクラスターの発現制御機構とそのがん化との関連の解析

本プロジェクトでは、胃がんにおいて異常DNAメチル化により発現が低下している複数のmiRNAが、がん関連遺伝子発現制御を協力的に行っているかどうかを調べる事を目的とした研究を行った。解析の結果、dihydropyrimidinase-like 2(DPYSL2/CRMP2)遺伝子が胃がんで発現増加し、miR-224クラスター(miR-224/452)がDPYSL2を含めた複数の標的遺伝子の発現制御に関与している事がわかった。またmiR-224クラスターはDNAメチル化により発現低下することを明らかにした。さらに原発性胃がん組織においてmiR-224のメチル化はDPYSL2の発現増加に寄与し、DPYSL2は胃がんにおいて細胞増殖に関連するがん関連遺伝子である事を示した。一方、miR-340/181cも同様にDNAメチル化により発現低下し、協力的に複数の癌関連遺伝子の発現調節を行っていることを示した。また胃がん細胞の増殖抑制に関与する可能性も示した。以上より、エピジェネティックな発現制御を受けているmiRNAは協力的に標的遺伝子を発現調節している可能性が高く、胃がんにおいて、複数のmiRNA発現低下は癌関連遺伝子の発現増加に大きく影響する事が推測される。さらに、このようなmiRNAの発現調節機構の研究は胃がんの発症機構解明並びに、新規治療薬の開発にも役立つと考えられる。以上の内容は原著論文として2013年5月、国際学術誌PLoS Oneに掲載された。また、昨年度はスペイン・ベルビッチェバイオメディカル研究所にてDr.Manel Estellerのグループと共同研究を行った。大腸がんにおいて異常脱メチル化により発現低下する長鎖非コードRNA(1ncRNA)を探索したところ、ヒトがんで発現異常が報告されているmiRNA(仮称:miR-Y)の発現と相関する1ncRNA(仮称:lnc-X)を見つけた。さらにlnc-Xは原発性ヒト大腸がん組織だけでなく、肝がん組織においても高頻度のがん特異的メチル化が検出された。これまでのところmiR-Yの発現は様々ながんで発現低下が報告されているものの、その発現調節機構については不明な点が多く、今後はmiR-Yの調節制御にlnc-Xが関与している事を明らかにするつもりである.当初のmiRNAはDNAメチル化との関連性が低かったため別のmiRNAに注目した。本研究では胃がんにおいて異常DNAメチル化により発現が低下している複数のmiRNAが、がん関連遺伝子発現制御を協力的に行っているかどうかを調べる事を目的とした。協力的に機能するmiRNAの候補を選出するために私たちが前回行ったmiRNAマイクロアレイを再解析したところ、脱メチル化剤処理後の胃がん細胞株で50個のmiRNAの発現が発現増加していた。私たちはGEOマイクロアレイデータベースにより胃がんで発現増加していると報告されている遺伝子に注目し、これらの遺伝子を標的とするmiRNAを50個のmiRNAから探索した。解析の結果、dihydropyrimidlnase-like 2(DPYSL2/CRMP2)遺伝子が胃がんで発現増加し、miR-224クラスター(miR-224/452)の導入により標的遺伝子が大きく低下した。またmiR-224クラスターはDNAメチル化により発現低下することがわかった。さらに原発性胃がん組織においてmiR-224のメチル化はDPYSL2の発現増加に寄与し、DPYSL2は胃がんにおいて細胞増殖に関連する癌関連遺伝子である事を示した。一方、私たちはmiR-340/181cがDNAメチル化により発現低下し、これらを共に胃がん細胞株に導入したところ、協力的に複数の癌関連遺伝子の発現調節していることを示した。また胃がん細胞の増殖抑制が起こる事も示した。以上より、エピジェネティックな発現制御を受けているmiRNAは協力的に標的遺伝子を発現調節している可能性が高く、胃がんにおけるこのような複数のmiRNA発現低下は癌関連遺伝子の発現増加に大きく影響する事が推測される。このようなmiRNAの発現調節機構の研究は胃がんの発症機構解明並びに、新規治療薬の開発にも役立つと考えられる。

また、昨年度はスペイン・ベルビッチェバイオメディカル研究所にてDr.Manel Estellerのグループと共同研究を行った。大腸がんにおいて異常脱メチル化により発現低下する長鎖非コードRNA(1ncRNA)を探索したところ、ヒトがんで発現異常が報告されているmiRNA(仮称:miR-Y)の発現と相関する1ncRNA(仮称:lnc-X)を見つけた。さらにlnc-Xは原発性ヒト大腸がん組織だけでなく、肝がん組織においても高頻度のがん特異的メチル化が検出された。これまでのところmiR-Yの発現は様々ながんで発現低下が報告されているものの、その発現調節機構については不明な点が多く、今後はmiR-Yの調節制御にlnc-Xが関与している事を明らかにするつもりである.今回の目的であった、クラスターを含めた複数のmiRNAが相乗的に作用している標的遺伝子を同定できた。またこれらのmiRNAの中には実際にクラスターを形成していなくても、エピジェネティックな発現制御を受けるmiRNA集団として標的遺伝子の発現調節に関わっている事を示す事ができた。このような概念はこれまでに報告されておらず、脱メチル化剤の作用機序解明並びに副作用の予測やsiRNA創薬の発展に非常に重要であると考えられる。今後は、約一年間であるが、スペイン・Bellvitgeバイオメディカル研究所・Dr.Estellerのチームのもとでの共同研究を予定している。著名なエピジェネティクス研究者であるDr.Estellerと連携し、別の消化器系がんにおいてエピジェネティックな発現制御を受けている複数のmiRNAとその標的遺伝子との関連や最近報告されたmiRNAの囮として機能していると言われるcompetitive endogenous RNA(ceRNA)との関連についてさらなる解析を行いたいと考えている。
構造制御サブナノ局所強調場での分子集団相転移

分子オーダーの大きさで,極めて強い分子表面間相互作用をするサブナノ空間中の分子挙動を、微小吸着熱測定,X線回折測定,分子吸着測定から総合的に調べた。特にナノオーダーの分子集団における相転移そのものの存在性からも検討した。超臨界NOはサブナノ空間中でダイマー(NO)_2になり,超臨界気体・擬蒸気転移を生ずる。相互作用が極めて小さいCH_4の場合にも、高圧吸着実験の解折から,サブナノスペースの分子場により,超臨界・擬蒸気転移を起している。D-NMRによる検討も加えると,サブナノスペース中でのベンゼンはバルク液相よりも高い移動性を持っており,特殊なベンゼン分子集団体相が実現している。これらの分子集団相転移現象の中でも,吸着熱測定と分子間ポテンシャル検討から明らかになった,SO_2分子双極子配列転移は本研究費による支援があって初めて見出された重要事実である。0.75nmスリット空間中でSO_2分子は2次元シート様分子集団構造を形成する。充填率が0.6以下ではSO_2分子は双極子を互いに平行に配列して,分子・スリット細孔壁間相互作用を強めている。充填率が0.6以上になると,平行配置のSO_2双極子間反発が高まり、SO_2分子は双極子を互いに反平行にして配列するようになる。この現象は微分吸収熱の充填率変化カーブに明瞭に示された。つまり,充填率0.6までは,微分吸着熱はサブナノスペースの強い分子場に対応して,ほぼ一定である。ところが,充填率が0.6を超えると微分吸着熱が急増する。このように双極子配列構造がサブナノスペース中で,吸着分子数に伴い急変する現象の発見は,綿密かつ総合的実験と理論解析によるものである。サブナノ細孔中に吸着した分子集団はバルク分子系とは異なる相を形成する可能性があるので、in situ熱量測定と固体側の電子状態変化測定から研究を行なった。双子型高感度熱量計の試作を行ない、分子吸着用高真空システムを付加し、in situ条件下での微小熱量測定を可能とした。微小熱量測定ができるようになったので、室温におけるサブナノスペース中での分子集団相転移実験に移った。試料系としては極めて大きなサブナノスペースを持っているミクログラファイト性炭素である活性炭素繊維(ACF)およびSO_2を使用した。ACFとしては、細孔径の異なる3種類のピッチ系ACFを用い、参照用にノンポーラスカーボンブラック(NPC)を使用した。まずACF類のミクロ孔構造を77Kにおける精密窒素吸着測定から決定した。ミクロ孔容積、表面積、スリット型細孔の細孔径をα_S-プロットから決定した。これまで吸着熱測定した細孔径0.75nmのACFおよびNPCへのSO_2吸着に関して報告する。303KにおけるSO_2吸着等温線およびSO_2吸着熱測定を行ない、サブナノスペース中におけるSO_2分子集団構造形成を検討した。サブナノスペースを持たないNPCでは、微分吸着熱になんら異常が認められず、バルクSO_2の凝縮熱(25kJ/mol)とほぼ同じである。ところが、ACF系においては、微分吸着熱が充填率0.1%以下のところで大きく、その後35kJ/molと一定となる。更に、充填率が0.7%を越えると、20kJ/molものジャンプを生じる。この結果は極めて重要である。吸着初期の高い吸着熱は僅かにある表面官能基への化学吸着、中途の一定領域はミクロ孔場によるSO_2吸着強調による。高充填率におけるジャンプはサブナノスペース固有のSO_2分子集団構造形成に由来すると見られる。

特に熱量変化が大きいので、非常に強いミクロ孔場でバルク相の結晶とは違う特別なSO_2分子集団構造が形成されていると考えられる。このようなSO_2分子集団構造形成をサイズの異なるサブナノスペースを持つACFについて、さらなる検討を行ない、研究目的を遂げる予定である。固定側の電子状態変化については、カーボンの電子状態に鋭敏な電子スピン共鳴法を導入して、吸着熱測定と相補的な精報を得て、本題に迫る予定である。電子スピン共鳴装置を購入後、現在吸着装置との連結を図っているところである。分子オーダーの大きさで,極めて強い分子・表面相互作用をするサブナノ固体空間中の分子挙動を吸着測定、熱測定、X線測定等総合的に調べた。超臨界NOはサブナノ空間中でダイマー(NO)_2になり,超臨界メタンも擬蒸気様として存在する。D-NMRによるとベンゼンは超流動性を有する特異な挙動を示す。なかでも、双極子を持つSO_2は、0.75nmスリット空間中で2次元吸着層を形成する。吸着熱、分子間ポテンシャル、エントロピー等の検討によると、充填率0.6以下においてはSO_2分子は双極子平行配列をとり、充填率0.6以上では反平行配列をとる。この事はサブナノ空間中での分子配列のため、SO_2分子が強誘電的配列をとりうる事を示しており、極めて注目される。
エージェント概念を導入したCAD, CAE,知識に基づく異部門間「すりあわせ」支援

本研究では,異部門間の緊密な意思疎通によって,多目的性能を満足する製品を生み出す「すりあわせ」の効率化を図るべく, 2つのPhaseに基づく協調設計支援システムを開発した.Phase1では, 3D-CADとCAEを自動連携させ,セットベース設計手法に基づき,多目的性能を満足する共通集合を求め, Phase2では, Phase1で得られた共通集合から設計解を求めるための設計指針を提示する.構築したシステムを実用的な事例に適用し,その有効性を示した.本研究では,異部門間の緊密な意思疎通によって,多目的性能を満足する製品を生み出す「すりあわせ」の効率化を図るべく, 2つのPhaseに基づく協調設計支援システムを開発した.Phase1では, 3D-CADとCAEを自動連携させ,セットベース設計手法に基づき,多目的性能を満足する共通集合を求め, Phase2では, Phase1で得られた共通集合から設計解を求めるための設計指針を提示する.構築したシステムを実用的な事例に適用し,その有効性を示した.日本の製品開発の強みは,異部門間の緊密な意思疎通によって,多目的性能を満足する製品を生み出す「すりあわせ」技術であり,これは日本独自の日本の文化に根ざした設計方法といえる.しかし,この日本が誇る「すりあわせ」の製品開発そのものは人的貢献に頼るところが多く,現場では色々な歪みが生じている.本研究課題は,この「すりあわせ」の効率化を図るべく,3D-CADをベースとした協調設計支援システムを開発することを目的とする。平成21年度は,3D-CADとCAEを自動連携させることにより,多目的性能を満足する共通集合を求めるシステムの提案と実装を計画し,以下の研究成果を得た.(1)設計者間で明確にポイント値として決定できないあいまいな情報を妥協範囲(集合)として捉え,設計者の設計意図を選好度と呼ばれる0から1までの値で表現した.(2)個別の性能ことの設計解を選好度付きの集合で与え,その共通集合の絞込みから多目的満足解集合するセットベース設計手法を適用することにより,設計者の設計意図を満足した設計解集合を導出することが可能となった.(3)得られた解集合を3D-CADモデルに渡すことにより,得られた解を立体形状として理解することが可能となった,(4) 3D-CADのアドイン機能を利用することにより,3D-CADとCAEの自動連携が可能となった.これにより,設計者による3D-CADモデルの変更・修正とCAEによる解析の繰り返し作業が軽減され,設計者の作業が効率化された.以上より,多くの課題を同時に満足できる解の範囲を,広い設計領域から効率的に絞り込むことが可能となった.得られた成果は,査読付論文4報(うち1報投稿中),国際会議論文3報,国内学会論文3報にて発表した.日本の製品開発の強みは,異部門間の緊密な意思疎通によって,多目的性能を満足する製品を生み出す「すりあわせ」技術であり,これは日本独自の日本の文化に根ざした設計方法といえる.しかし,この日本が誇る「すりあわせ」の製品開発そのものは人的貢献に頼るところが多く,現場では色々な歪みが生じている.本研究課題は,この「すりあわせ」の効率化を図るべく,3D-CADをベースとした協調設計支援システムを開発することを目的とする.平成22年度は,平成21年度の成果(セットベース設計手法により設計初期段階において複数の設計者の意図を満たす設計解集合を導出した)を元に,エージェント技術に基づく「設計解を求めるための設計指針提示システム」の構築を計画し,以下の研究成果を得た.(1)設計知識をエージェント化することにより,設計プロセスの進行とともに発生する新たな要求性能を満足する設計解を設計者に提示できた.(2)Quantitative Dependencyの理論を適用することで,設計修正により他の設計者が関与する要求性能にどの程度影響を及ぼし,多目的性能を満足させるためには設計変数をどの程度変更したらよいのかを複数設計者間で共有できた.(3)構築したシステムを無段変速機の3D-CADモデル間のすりあわせ設計に適用し,システムの有効性を示した.以上より,多くの課題を同時に満足できる解の範囲から,設計者間ですりあわせを進めることで,複数の設計者がお互いに満足する設計案を提示することが可能となった.得られた成果は,査読付論文1報,国際会議論文3報,国内学会論文4報,招待講演2件にて発表した.日本の製品開発の強みは,異部門間の緊密な意思疎通によって,多目的性能を満足する製品を生み出す「すりあわせ」技術であり,これは日本独自の日本の文化に根ざした設計方法といえる.

しかし,「この日本が誇る「すりあわせ」の製品開発そのものは人的貢献に頼るところが多く,現場では色々な歪みが生じている.本研究課題は,この「すりあわせ」の効率化を図るべく,3D-CADをベースとした協調設計支援システムを開発することを目的とする.平成23年度は,平成21年度の成果(セットベース設計手法により設計初期段階において複数の設計者の意図を満たす設計解集合を導出するシステムの構築)と平成22年度の成果(エージェント技術に基づく設計解を求めるための設計指針提示システムの構築)を実用的な事例へ適用することで,構築したシステムの有効性検証を計画した.自動車の触媒マフラ構造および車体骨格構造へ適用した結果,多くの課題を同時に満足できる解の範囲から,設計者間ですりあわせを進めることで,複数の設計者がお互いに満足する設計案を提示することが可能となった.本システムは,設計者に設計改良案や次にしなければならないアクションを提示することを可能とするだけではなく,最先端の技術者たちによるハイレベルな「すりあわせ」から,部門の垣根を越えたモノづくりの強みを生み出すと考える.さらに日本の優れたモノづくりを支え,環境問題への対応,開発期間の短縮,高品質,低コストのモノづくりに貢献し,グローバルな競争で勝ち抜くことができる.得られた成果は,査読付論文3報,国際会議論文2報,国内学会論文5報,招待講演1件,図書1件にて発表した.
両生類の造血および血球形態・機能の低温応答に関する研究

無尾両生類ツメガエルを低温に暴露すると末梢の赤血球,栓球,白血球の数は急激に減少し,汎血球減少症を呈する特異な現象がある。第2年度では,特に低温曝露栓球減少症モデルに着目し,第1年度に電子顕微鏡観察などで確認した栓球と血管内皮細胞の接着を調べるにあたり,現時点でアフリカツメガエル血管内皮細胞を生体から取り出してin vitro試験をするには種々の問題があったため,血管内皮由来のXLgoo細胞細胞株の単層培養上に,末梢栓球を22°Cと5°Cとで共培養した。XLgoo細胞に付着した栓球数は、5°Cでは約10倍増加しTa。in vitro低温曝露細胞培養系における両細胞の低温刺激依存性に変動する分子群を網羅的プロテオミクスで解析した結果,XLgoo細胞中のプロテオームでは22°Cに対して5°Cでは、201蛋白質分子の量比の上昇を認めた。遺伝子オントロジー解析により、これらの蛋白質分子は細胞間接着、カルシウムイオンに対する応答、および細胞骨格構成に関連していた。同時に,血小板活性化に寄与していることが明らかになった。これらのうち,αチューブリンおよびβアクチンを免疫染色し,XLgoo細胞の腫脹形態変化をさらに確認した。また,高濃度のカルシウムイオン存在下,栓球およびXLgoo細胞それぞれで細胞内へカルシウムの取り込みが上昇し,栓球は低温刺激によってアンチトロンビン非依存的なXLgoo細胞への接着性を増すことを確認した。これらのことより,低温曝露による末梢栓球数の減少の機序は,栓球,血管内皮細胞の双方で細胞内カルシウム上昇を伴う両者の接着性の亢進が一因であることが判明した。また,アクリジンオレンジで超生体染色したアフリカツメガエル末梢血球をフローサイトメトリーに進め,機械計測による血球鑑別・計数法を確立した。有核血球の解析手段として重要な進展であり,発表論文は早くも海外論文で引用された。網羅的プロテオミクスで獲得したデータについて,ジーンオントロジー解析,パスウエイ解析に進めることができた。しかしながら,これら一連のin silico解析は,いずれも哺乳類の分子機能データセットを単純に分子構造のホモロジーからアフリカツメガエルへ割り当てて解析結果を導く手法を取らざるを得ないため,実験的検証を進めなければならない。当初の予定では,低温曝露で誘導される分子に対する抗体の利用などを考えていた。しかし,カルシウムイオン輸送の取り込みを引き起こす特定の分子経路は現在のところ明らかではなく,分子機序の解明に関する結論を導くためには,今ひとつ工夫を要する課題があることを認識するに至り,第3年度に向けて取るべき手段を模索中である。しかしながら、アフリカツメガエルを利用する本モデルは、環境変動で誘発される血小板減少症の病態生理学に貢献する手応えを得たことが大きな収穫である。現時点で浮上している課題と将来展開について記す。【遺伝子改変動物の作出】当初の研究計画にある通り,第三年度に進むにあたり,最大の難関は,末梢循環血球(赤血球,栓球,白血球)のin vivoにおける組織局在性の変化とその動態を直接観察する手段を手中にすることである。遺伝子改変モデル作出に関して,アフリカツメガエルに比して,ナショナル・リソースプロジェクト(NBRP;広島大学両生類研究センター)から供給を受けることができるネッタイツメガエルは,より有利な動物種であると考えられるが,低温耐性が弱く,予備実験では低温曝露による末梢血球数の低下を確認しながらも,10°C以下の飼育温度に耐えることが難しいことが示された。また,本研究では成体ツメガエルをモデルにしており,発生以降,成体にまで成長する日数を要する問題がでる。このため,環境温度変動に対する造血・血球の応答の比較生物学的解析を可能にすべく,血球特異的な遺伝子蛍光標識をもつメダカ(NBRP;国立基礎生物学研究所)の作出を並行させることにした。これは本研究課題で予定していた遂行内容からの派生であるが,オミクスから得られる仮説を検証するために,メダカとツメガエルのモデルのそれぞれの利点を活かし,相互に補完させることを試みたい。【オミクスの課題】昨年度にも記載したとおり,依然としてアフリカツメガエル分子をヒトやマウスのオルソログ分子に読み替え,エルゼビア社のPathwayStudioや,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG;京都大学)による哺乳類のパスウエイ解析を利用している。このため,ツメガエル実験で抽出された分子機能の実検証が不可欠である。ゲノム編集や抗体作出などを摘要するにしても,短期間で結論を得るための実験系の構築に挑戦する必要がある。本研究は特に赤血球,栓球の減少を観察し,解析するためのモデル系を構築してその分子機序の特定を目指している。第1年度では,末梢栓球を主たる対象とし,低温曝露下の血球挙動の解析のために1血球トラッキング,2in vivo血流イメージング,3血球-血管内皮細胞接着,4血流量変化等計測を計画した。長期的に1,2は,栓球特異的遺伝子発現をGFP蛍光で標識する遺伝子改変(Tg)動物が不可欠と結論した。そこでネッタイツメガエルNBRP拠点の広島大両生類研究センターより修得した実験技術を稼働させる諸準備を進めた。

4では全身の低温化に伴う有意な全循環血液量変動は検出されなかったが,心拍数の顕著な低下を観測した。3では電子顕微鏡観察で低温曝露後に栓球の血管壁接着を認め,血栓形成消費による末梢栓球数減少が強く示唆された。低温刺激依存性に変動する分子群をプロテオミクスないし全RNAシークエンシングで解析するためは解析対象細胞の決定が必要にある。そこで血球と血管内皮細胞の接着を評価するin vitro実験系を構築した。コラーゲンコートガラスに接着させたツメガエル内皮細胞株XLgoo(伊藤ら,北里大学)と,末梢血液由来の蛍光標識栓球および白血球の共培養系を構築した。この系で22°C,5°Cとも赤血球だけでは内皮細胞へ接着しないが、栓球及び白血球の一部が接着し,低温下で有意に接着数が増加した。,また低温下でCaイオン、あるいはアンチトロンビン非依存的な細胞接着の誘導が示唆された。そこでLC-MS/MSによるプロテオミクス法(Nagasawa et al., 2013)により,常温あるいは低温暴露後の栓球およびXLgoo細胞のプロテオーム変動を取得しパスウエイ/GO解析を進めている。当初予定していた項目への取り組みはほぼ達成した。ただし,栓球や白血球といった小数の血球に局在変化を追跡して,包括的に本現象を全身性(systemic)の環境温度応答として捉えるためには,遺伝子改変動物の作出が必須であると結論した(別項:今後の研究の推進方策を参照)。本研究では様々な実験手法の確立が必須になる。予定していた取組み以外の副産物として,栓球や白血球などの希少細胞集団の機械計数法(いわゆるヒト臨床で常用される自動血算器)の確立が実現した。心採血したツメガエル全血をアクリジンオレンジで染色し,フローサイトメトリーによって血球鑑別・分類が可能になった(論文投稿中)。この方法は,哺乳類以外の有核赤血球,有核栓球をもつ全ての脊椎動物に基本的に適用可能と考えられる。こうした取り組みは将来の比較血液学的な学術展開に貢献する。無尾両生類ツメガエルを低温に暴露すると末梢の赤血球,栓球,白血球の数は急激に減少し,汎血球減少症を呈する特異な現象がある。第2年度では,特に低温曝露栓球減少症モデルに着目し,第1年度に電子顕微鏡観察などで確認した栓球と血管内皮細胞の接着を調べるにあたり,現時点でアフリカツメガエル血管内皮細胞を生体から取り出してin vitro試験をするには種々の問題があったため,血管内皮由来のXLgoo細胞細胞株の単層培養上に,末梢栓球を22°Cと5°Cとで共培養した。XLgoo細胞に付着した栓球数は、5°Cでは約10倍増加しTa。in vitro低温曝露細胞培養系における両細胞の低温刺激依存性に変動する分子群を網羅的プロテオミクスで解析した結果,XLgoo細胞中のプロテオームでは22°Cに対して5°Cでは、201蛋白質分子の量比の上昇を認めた。遺伝子オントロジー解析により、これらの蛋白質分子は細胞間接着、カルシウムイオンに対する応答、および細胞骨格構成に関連していた。同時に,血小板活性化に寄与していることが明らかになった。これらのうち,αチューブリンおよびβアクチンを免疫染色し,XLgoo細胞の腫脹形態変化をさらに確認した。