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うつほ物語の基礎的研究

『うつほ物語』は、先行する多くの和歌や物語、漢詩文、史実を吸収することで、日本最初の長篇化を達成した。また、さまざまな階層からなる、個性豊かな人物が多く活躍することも物語の長篇化を促した要因の一つである。本研究は、引用と作中人物の造型という側面から『うつほ物語』について考察し、作品の特性を解明した数本の論文を発表した。また、『うつほ物語』に多大な影響を与えた、『竹取物語』『伊勢物語』などについても研究を進め、物語文学史の展開を考察した。近年、注釈も整備され著しい進展を示している『うつほ物語』であるが、研究と読解の指針となる事項を網羅した事典類は、必ずしも多くはない。『うつほ物語』は、多くの先行作品の貪欲な摂取のもとに独自の達成を示しており、典拠の新たな発見と、引用の方法の解明が最重要かつ喫緊の研究課題である。本研究は、将来の『うつほ物語事典』の完成をめざして、基礎的事項の再検討と整理、さらに新たな知見を付け加えることで、『うつほ物語』研究の水準をさらに向上させるものである。特に先行作品(和歌・漢詩文・史書・仏典・物語・日記文学)の引用について、近世以降現代にいたる研究成果を再検討し、かつ新たに得られた情報を追加した一覧の作成を進めている。また、『うつほ物語』の長篇化を可能にした要因の一つに、千首を超える膨大な和歌があるが、歌群のなかに埋没した、非個性的で稚拙なものとして本格的には扱われてこなかった。しかし、当然のことながら、同時代の和歌と強い連続性を有しており、あらためて一首一首を吟味し直すべき時機に来ている。歌ことばや類歌性に着目しつつ、さらには『源氏物語』への文学史的展開をも視野に収めた作中和歌の研究が求められている。本研究では、やはり作中和歌一覧を作成することで、問題点が明確に把握され、かつ研究の基盤が整備される。今年度は、主に首巻「俊蔭」から第五巻「嵯峨院」までの和歌・漢籍引用について調査し、データを整理し、かつ当該巻までの和歌綜覧の作成を進めた。『うつほ物語』を正面から扱ったわけではないが、「老いらくの恋ー『伊勢物語』第六十三段とその周辺ー」(『名古屋大学文学部研究論集文学60』)「『竹取物語』を読み解くー誕生から、『かぐや姫の物語』まで」(『美術手帖』998号)、「死ぬる命をすくひやはせぬー『竹取物語』注釈の補訂ー」(『むらさき』第50号)などの関連論文を発表した。近年、多くの研究成果が発表され活況を呈している『うつほ物語』研究にあって、基礎的な事項を整理した総合的な事典の作成が急務である。本研究は、『うつほ物語事典(仮称)』の完成をめざし、主に典拠(和歌・物語・漢詩文・史書・仏典など)について、従来の注釈書の指摘を踏まえつつ、新たに精査しなおすことを中心課題にしている。また、検索に至便な和歌総索引の作成も進める。昨年度の作業に引き続き、今年度は、第六巻「祭の使」から第十二巻「沖つ白浪」までを調査の対象とし、得られたデータを整理した。また、『伊勢物語』初段および第四十一段の〈女はらから〉の物語が、『うつほ』にも影響を及ぼし、かつ『源氏物語』や『夜の寝覚』にも継承されていく、物語史的な展開について、論文「〈女はらから〉の文学史」(『名古屋大学文学部研究論集文学61』で論じた。前々年度、前年度に引き続き『うつほ物語事典(仮称)』をめざして、『うつほ物語』の和歌・漢籍引用の調査・整理、および作中人物総攬の作成を進めた。従来の誤りを訂し、新たな知見を付け加えたものの、まだ調査不足、不確実な箇所も多々あるが、なるべく早く纏まった形としたい。『うつほ物語』に関する論文として、「蔵人少将源仲頼の物語ー『うつほ物語』作中人物覚書ー」および「労ある秋の夕暮れー『うつほ物語』「内侍督」の表現ー」を発表した。それぞれ副題が示すように、前者は作中人物論、後者は表現論である。前者においては、求婚譚の重要人物の一人である源仲頼の人物造型を明らかにし、かつ仲忠らとの変わらぬ友情のありようについて論じた。仲頼は、管弦に秀でた「世の中の色好みであり、彼の出家は物語に大きな喪失感をもたらした。あて宮への恋に殉じたその生き方は、他の多くの求婚者たちとは一線を画し、人々に大きな感動を与えるのであった。後者は、この長篇物語にあって、前半部と後半部をつなぐ肝要な巻である「内侍督」について、「そらごと」「労あり」「夕暮れ」「風」「蓬・葎」などの、いくつもの要語や動機が繰り返されるのが特徴である。かつ『竹取物語』や、徐市伝承や王昭君説話など多くの漢籍が引用されることで、物語が首巻「俊蔭」へと回帰し、主題性を顕著にしてゆく様相を明らかにした。なお、あて宮求婚譚の先蹤たる『竹取物語』の求婚譚について、「五人の求婚者たちと難題」を発表した。

『うつほ物語』は、先行する多くの和歌や物語、漢詩文、史実を吸収することで、日本最初の長篇化を達成した。また、さまざまな階層からなる、個性豊かな人物が多く活躍することも物語の長篇化を促した要因の一つである。本研究は、引用と作中人物の造型という側面から『うつほ物語』について考察し、作品の特性を解明した数本の論文を発表した。また、『うつほ物語』に多大な影響を与えた、『竹取物語』『伊勢物語』などについても研究を進め、物語文学史の展開を考察した。初年度は、研究の方法について試行錯誤の段階という面があったが、二年目となり、研究方針が定まってきたように思われる。日本文学これまで行ってきた、先行テクストの精査と整理、および和歌総覧の作成を継続し、最終年であるので、最終巻「楼上」下巻まで終了させたい。これらの作業を通じて蓄積されたデータを公表できるよう準備する。また、これまでの調査をもとに論文を発表する。平成25年度は、国文学研究資料館に客員准教授として招かれた。本研究課題とほぼ重なる「うつほ物語の研究」を資料館での研究テーマとした。恵まれた環境のなかで調査・研究を進めることができた。初年度の繰り越しがわずかに残っていたのと、今年度は出張費を用いなかったため、少額ではあるが、次年度に繰り越すこととなった。引き続き、和歌や漢詩文、史書、仏典などと『うつほ物語』の引用について整理し、和歌綜覧の作成も進める。後半部の「蔵開」上中下巻までを対象としたい。また、話型や人物造型の観点から〈引用〉概念の拡張が可能であるとの感触を抱き始めており、かかる面からのアプローチを深めていきたい。作中和歌の屏風歌とのかかわりは従来からも注目されてきたが、物語の場面・絵解などの解明に有効であるとの見通しも持ち始めている。研究に必要な図書や資料がまだ充分に揃っているとはいえないので、購入する。パソコンなどの機器を購入し、研究環境の整備をはかる。資料収集のための出張も行う。また、今年度が最終年度であるので、成果の発表に用いる予定である。当該年度は、国文学研究資料館の客員准教授となったため、資料館での調査にかかる出張費は本科研費から充当する必要がなくなり、当初の予定より経費を抑えることができた。物品および書籍、出張費に使用する予定。
脂質の多様な機能を司るオルガネラ間相互作用と脂質輸送メカニズムの解明

本研究では、合成脂質プローブ分子を用いた斬新でユニークな生化学・分子生物学的な解析によって脂質輸送体の同定および機能解析を行い、脂質の輸送メカニズムを解明することを目指している。本年度は、バイオインフォマティックスの手法によって同定した小胞体とミトコンドリアの接触部位において脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質について解析を行った。まず、同定したタンパク質のうち、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功したSLMO-TRIAPについて精製を行い、それらの発現タンパク質について脂質との結合能を調べた。その結果、精製したタンパク質にはPEやPGなどの大腸菌が持っている脂質が結合していたが、シロイヌナズナから抽出した脂質のリポソームと混ぜるとガラクト脂質と結合することがわかった。このタンパク質は酵母では、ミトコンドリアの外膜から内膜へPAを輸送することが報告されているが、シロイヌナズナのタンパク質はガラクト脂質の輸送に関わっていることが示唆された。次に遺伝子が破壊された変異体を調べたところ、リン欠乏下での生育が野生株に比べて悪いことから、リンが欠乏したときに起こるDGDGの色素体外への輸送に関わっている可能性がある。他のタンパク質についても同様の解析を行っている。一方、合成脂質プローブ分子を用いた解析も行った。昨年度は、タンパク質と光架橋させるためのタグやクリック反応をおこさせるためのタグを導入した、PCとPGの脂質プローブ分子の合成に成功した。しかし、そのプローブを用いてPCとPGに特異的に結合するタンパク質をゼニゴケとシロイヌナズナから同定することを試みたが、同定には至らなかった。本年度は、光架橋やクリック反応の条件を検討し、最適な条件を見出すことに成功した。今後、その条件のもとで、PCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を進める。バイオインフォマティックスの手法によって脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質の遺伝子をゼニゴケとシロイヌナズナから見つけ出し、それらの遺伝子にコードされたタンパク質を大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功した。それらのタンパク質と脂質との結合解析や変異体を用いた機能解析は概ね順調に進んでいるが、合成脂質プローブ分子を用いた解析がやや遅れている。タンパク質と光架橋させるときの条件やクリック反応の条件を最適化するのに時間がかかってしまった。最適化についてはクリヤーできたので、今後はその条件で実験を進めることで、研究が順調に進むものと考えている。バイオインフォマティックスの手法によって同定したタンパク質について、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させたものを用いて、特定の脂質と特異的に結合するタンパク質、特にPGやPCと特異的に結合するタンパク質の同定を進める。合成脂質プローブ分子を用いた解析については、タンパク質と光架橋させるときの条件やクリック反応の条件を最適化することができたので、それらの条件のもとでPCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を行う。2つの解析によってPGやPCと特異的に結合するタンパク質が同定できたら、GFPとの融合タンパク質をシロイヌナズナで発現させて細胞内局在性を明らかにする。また、それらのタンパク質の中から、脂質の輸送活性をもつものをin vitroのアッセイ系を使って選別するとともに、脂質との結合や輸送活性に必要なドメインを同定し、輸送メカニズムを明らかにする。さらに、オルガネラ間の脂質輸送と脂質の部位特異的な機能を解明する。平成29年度は、オルガネラ間の接触部位に存在するタンパク質および脂質輸送タンパク質を同定するために、バイオインフォマティックスの手法による解析を行った。酵母や動物において同定されている、小胞体とミトコンドリアの接触部位において脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質の遺伝子のホモログをゼニゴケとシロイヌナズナのゲノムで検索し、多くの候補遺伝子を見つけることができた。また、それらの遺伝子にコードされたタンパク質を大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功し、それらの発現タンパク質について脂質との結合能があるかどうかをチェックしている。平成30年度も同様の解析を続け、ホスファジルグリセロール(PG)やホスファジルコリン(PC)と特異的に結合するタンパク質を同定する。まず、解析に必要な脂質プローブ分子の合成を行った。タンパク質と光架橋させるためのタグやクリック反応をおこさせるためのタグを導入した、PCとPGの脂質プローブ分子を合成した。また、それらのタグ付き脂質プローブ分子を用いてPCとPGに特異的に結合するタンパク質を、ゼニゴケとシロイヌナズナから同定することを試み、実験条件を検討した。平成30年度も引き続き、PCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を進める予定である。また、タンパク質と光架橋させるためのタグやクリック反応をおこさせるためのタグを導入した脂質プローブ分子を合成することにも成功した。これらは本研究を推進する上で鍵となるステップであり、それらをクリヤーできたことで研究がおおむね順調に進んでいると考えている。

本研究では、合成脂質プローブ分子を用いた斬新でユニークな生化学・分子生物学的な解析によって脂質輸送体の同定および機能解析を行い、脂質の輸送メカニズムを解明することを目指している。本年度は、バイオインフォマティックスの手法によって同定した小胞体とミトコンドリアの接触部位において脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質について解析を行った。まず、同定したタンパク質のうち、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功したSLMO-TRIAPについて精製を行い、それらの発現タンパク質について脂質との結合能を調べた。その結果、精製したタンパク質にはPEやPGなどの大腸菌が持っている脂質が結合していたが、シロイヌナズナから抽出した脂質のリポソームと混ぜるとガラクト脂質と結合することがわかった。このタンパク質は酵母では、ミトコンドリアの外膜から内膜へPAを輸送することが報告されているが、シロイヌナズナのタンパク質はガラクト脂質の輸送に関わっていることが示唆された。次に遺伝子が破壊された変異体を調べたところ、リン欠乏下での生育が野生株に比べて悪いことから、リンが欠乏したときに起こるDGDGの色素体外への輸送に関わっている可能性がある。他のタンパク質についても同様の解析を行っている。一方、合成脂質プローブ分子を用いた解析も行った。昨年度は、タンパク質と光架橋させるためのタグやクリック反応をおこさせるためのタグを導入した、PCとPGの脂質プローブ分子の合成に成功した。しかし、そのプローブを用いてPCとPGに特異的に結合するタンパク質をゼニゴケとシロイヌナズナから同定することを試みたが、同定には至らなかった。本年度は、光架橋やクリック反応の条件を検討し、最適な条件を見出すことに成功した。今後、その条件のもとで、PCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を進める。バイオインフォマティックスの手法によって脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質の遺伝子をゼニゴケとシロイヌナズナから見つけ出し、それらの遺伝子にコードされたタンパク質を大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功した。それらのタンパク質と脂質との結合解析や変異体を用いた機能解析は概ね順調に進んでいるが、合成脂質プローブ分子を用いた解析がやや遅れている。タンパク質と光架橋させるときの条件やクリック反応の条件を最適化するのに時間がかかってしまった。最適化についてはクリヤーできたので、今後はその条件で実験を進めることで、研究が順調に進むものと考えている。バイオインフォマティックスの手法によって同定したタンパク質について、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させたものを用いて、特定の脂質と特異的に結合するタンパク質、特にPGやPCと特異的に結合するタンパク質の同定を進める。一方、合成脂質プローブ分子を用いた解析も進める。PCとPGに特異的に結合するタンパク質を同定することができたら、GFPとの融合タンパク質をシロイヌナズナで発現させて細胞内局在性を明らかにする。
高齢者の転倒予防に向けた立位姿勢保持能を高めるフットケアの確立と効果の検証

立位姿勢保持能を高めるフットケアの評価指標を見出す目的で,足底圧分布を測定し,形態および転倒との関係をみた。成人の足指圧は,前傾に伴い増加し,足圧中心位置約60%FLで急増した。特に母指圧の増加が早く,増加率も大きかった。また,縦足弓高が低いと早期から母指圧が増加した。高齢者の足指圧は,成人と比べて「同様」「安静立位時に高い」「前傾に伴う増加が低い」に分類され,転倒との関連がみられた。以上から,足指圧が姿勢保持の指標の1つであるとの示唆を得た。高齢者の立位姿勢保持能を高めるフットケアプログラムを開発する基礎調査として,インフォームド・コンセントの成立した地域高齢者76名を対象に,安静立位から最前傾にいたる足底部の接地圧分布を測定し,転倒との関連を検討した。さらに,立位姿勢保持能の関連要因として足問題について調査した。安静立位時と最前傾時の足底部の接地圧分布は,安静立位時と最前傾時ともに10趾がすべて接地しているA群,最前傾時のみ10趾すべて接地しているB群,安静立位時と最前傾時ともに接地していない足趾がみられるC群に大別された。足趾接地圧分布は,安静立位時、最前傾時ともに母趾が最も強く,また安静立位時と比べて最前傾時の分圧は高くなっていた。最前傾時の母趾の接地分圧は,C群では体重比約5%であり,A群とB群では約10%であった。また,転倒経験はB群の約10%,A群とC群の約20%にみられた。足問題については,足問題ありの者は約60%にみられた。足問題の種類は,鶏眼、胼胝,外反母趾,白癬,足底の角化,巻き爪であった。足問題の数は,1種類が約半数を占めていた。足問題あり群はなし群と比べて,よくつまずくと答えた者が多く,また,転倒については屋内の平坦な場所で転倒経験ありの者が多かった。以上の結果から,前傾において母趾が立位姿勢の安定性に関与している可能性,および足問題が立位姿勢の安定性を低下させる可能性が示唆された。20年度は、高齢者の立位姿勢保持能を高めるフットケアプログラムの基礎資料を以下の2つの視点からまとめた。1.足底圧分布の測定と足に関するアンケート調査:昨年度に引き続いて行った。インフォームド・コンセントの成立した地域高齢者70名を対象に、安静立位から最前傾にいたる足底部の接地圧分布を測定し、足部に関する情報と転倒との関連を検討した。さらに、経年的に測定できた58名については昨年度のデータとの比較を行った。安静立位時と最前傾時の足底部の接地圧分布は、昨年度にパターン化した安静立位時と最前傾時ともに10趾がすべて接地しているA群、最前傾時のみ10趾すべて接地しているB群、安静立位時と最前傾時ともに接地していない足趾がみられるC群に大別され、1年間で転倒した者の割合はC群に多かった。経年的な変化として特徴的なものは認めなかった。なお、胼胝による痛みのため歩行時に苦痛を感じている1事例について、フットファイルを用いたケアを3ヶ月間継続した結果、胼胝および痛みは消失した。以上より、前傾姿勢において母趾が立位姿勢の安定性に関与している可能性、および足問題が立位姿勢の安定性を低下させる可能性が示唆された。2.文献検討:足問題と転倒および転倒予防に関連したフットケアに関する文献検討を行った。統一された介入はなく、(1)フットケアのアウトカム指標の開発、(2)足趾の運動介入の効果、(3)適切な靴の評価、(4)足、趾、爪の観察と手入れ、(5)フットケアの実施状況および意識に関する実態、に大別された。本年度は、高齢者の立位姿勢保持能を高めるフットケアプログラムのアウトカム指標について検討した。1.文献検討:昨年に引き続いて文献検討を行い、「転倒予防を目的としたフットケア研究の動向と看護研究の課題」としてまとめた。その結果、フットケアの概念は明確ではなく、エビデンスに基づいたケアプログラムとするためにはアウトカム指標の検討が重要と考え、以下の研究を行った。2.立位姿勢の安定性の指標の検討:(1)整形外科学的および神経学的に問題のない成人17名を対象に、前傾姿勢における足部の荷重変曲点および足部アーチ構造との関連を検討した。

その結果、前傾姿勢における荷重変曲点が最も早い部位は左右とも1趾であり、足圧中心は約60%であった。この部位は、形態学的には第1中足骨頭位置よりも第5中足骨頭位置に近かった。また、1趾と前足部内側および前足部中部の荷重変曲点とに相関がみられること、および2-5趾と比べて1趾の足底分圧の割合が高いことから、前傾姿勢において重心位置の変化をいち早くキャッチし、かつ体重を支えることが示唆された。さらに、足部アーチ構造の指標とされている舟状骨高と1趾荷重変曲点の左右差の相関係数が0.65(p<0.05)であったことから、1趾は足部アーチ構造を補助する役割を有することが示唆された。(2)地域高齢者の前傾姿勢における足底圧分布、および転倒との関連を検討した。(1)の結果から1趾分圧に注目すると、成人同様前傾に伴い1趾分圧が高くなるA群、成人と比べて安静立位時から1趾分圧が高いB群、安静立位時および前傾ともに1趾分圧が低いC群に大別された。転倒はC群、B群、A群の順に多く、またC群では足部アーチ崩れのある者が多かった。以上より、足部アーチに問題がある場合、1趾が前傾姿勢の安定性を補助していると考えられ、足底圧分布が立位姿勢の安定性の指標の1つであることが示唆された。
プラズマ―容器壁相互作用による中性高次分子の発生機構に関する研究

エッチングあるいは半導体薄膜形成用プラズマ内のブラズマー容器壁相互作用による中性活性種、特に中性高次分子ラジカルの発生機構について調べるため、炭素系アイソトープガスと通常のガスの分子質量数の差(=1)を利用し、各種質量分析法によるそれら中性活性種の診断を試みた。代表的な炭素系ガスとしてメタン、四フッ化炭素を用い、以下のような研究実績を得た。_(1)電子サイクロトロン共鳴プラズマ装置壁に基板ホルダーを設置し、CH_4、C^<13>H_4、CF_4、C^<13>F_4プラズマを発生し、基板と容器壁に膜を形成した。基板温度が室温から200°C付近まで増加するにつれ、膜の堆積速度は増加し、200°C以上では堆積速度は減少した。また水素ガスを添加した場合、膜の堆積速度は数倍増加したことから、水素原子はプラズマ-容器壁相互作用に著しく影響を与えることが分かった。FTIR測定によると、どちらのガスの場合も、得られた膜は水素あるいはフッ素を比較的多く含むポリマー状の低密度膜であり、水素やフッ素はsp^3結合の炭素に多く結合していることが分かった。ラマン分光測定によると、炭素同士の結合はsp^2構造が支配的であり、ラマンシフトの増加とともに背景散乱が増すことから、やはりポリマー状の低密度膜であることが分かった。(2)アイソトープメタンガスおよび通常のメタンガスプラズマで被膜した容器壁に対し、ArあるいはH_2プラズマを照射し、メチルラジカル等の中性活性種の計測を行った。Arプラズマの場合、壁からのメチルラジカル等の発生はほとんど観察されなかった。H_2プラズマの場合、アイソトープガスで壁を被膜するとほぼC^<13>H_3のみが観察されたのに対し、通常のガスではCH_3のみが観察され、両者の密度はほぼ一致した。以上によりアイソトープガスを用いた場合に質量数差を観察できていること、そしてアイソトープガスを使用した場合にも、H_2プラズマ照射によるプラズマで被膜した容器壁に対し、ArあるいはH_2プラズマを照射した場合、測定系丙の微量な不純物の影響のため、質量数差を十分に判別できていない。
難治性疼痛に対する新たな治療法の開発

本年度は前年度に得られた脊髄への遺伝子導入の手技をもとに、実際に鎮痛遺伝子とレボーター遺伝子を持つプラスミドを作成し、in vivoで実際の疼痛に対する治療効果があるかどうかを検討した。1.鎮痛遺伝子であるβ-endorphinの前駆体、proopiomelanocortinの抽出マウス(C3H)全脳より逆転写反応にてcDNAを合成、設計したプライマーにてPCR反応を行い標的遺伝子(POMC)を増幅・回収。2.プラスミドの作成3.タンパク発想の確認作成したプラスミドが標的タンパクを発現するかどうかinvitroで確認した。293T細胞に超音波エコーを用いて遺伝子導入した結果、コントロール(GFPのみ)と比較するとGFP発現自体かなり少量であった(100:5個)。種々条件を変更し、最も発現量の多いと思われる条件にてマウスへの導入を行った。4.マウスへの遺伝子導入およびタンパク発現・機能の確認前年度に確立した手技により脊髄に遺伝子を導入した。GFPタンパクの発現を病理組織切片を作成し蛍光顕微鏡にて経時的に観察したが、コントロールに比して明らかに発現量が少なく、定量化できなかった。しかし、機能的に鎮痛効果が発現している可能性も考え、ホットプレート試験にて観察したが、コントロール群と比べて有意差は見られなかった。以上より、今後プラスミドDNAの形状を詳細に検討し、改良を加え、さらなる導入効率の向上をin vitroにて確認の後、再度動物実験にて鎮痛効果の確認を行いたい。現在も進行中である。マウス(BALB/c雄68週)をペントバルビタール腹腔内麻酔後、L4-5間より27G注射針で髄腔内にプラスミドDNA (pGL3-Control Luciferase reporter vector)とマイクロバブル(診断用超音波造影剤アルブミンバブルOptison^<TM>)の混合液10μlを注入し、直ちに水中で刺入部脊椎に垂直に超音波を照射した。照射条件は、プローブ径6mm、周波数945kHz、強度5W/cm2、DUTY比20%、照射時間1分とした。照射1日、3日および1週間後に剖出脊髄にLuciferinを直接注入し、in vivoリアルタイムイメージング装置を用いた発光解析により発現遺伝子を定量した。また脊髄における導入部位を免疫組織化学的に検討した。結果は、遺伝子導入後1日目より脊髄にLuciferin発光が確認され、Luciferase発現は1週間以上継続した。また対照群と比較して超音波照射とマイクロバブルを併用することにより高い遺伝子導入効率が得られた。組織化学的には髄膜細胞に限局したタンパク発現が確認された。この方法により非侵襲的に脊髄に遺伝子を導入することができ、臨床応用の可能性が示唆された。また、次年度へのステップとしてβ-endorphinのプラスミドDNAを作成し、in vitroにおいて培養細胞に遺伝子導入したところ発現が確認できたので、vivoで応用する予定である。現在も進行中である。
ワサビ種子の老化の生理・生化学及び老化の防止に関する研究

recalcitrant性であるワサビ種子の老化に伴って不飽和脂肪酸であるリノール酸の減少が認められたが,同じ不飽和脂肪酸であるオレイン酸及びリノレン酸は増加した.この研究を更し押し進めて,多少異なったカテゴリーのrecalcitrant性を示すニガウリ種子の貯蔵について調査した.ニガウリ種子では低温に対する感受性の品種間差が大きく,スリランカの品種であるMC43は最も低温に弱く,日本の品種では太が最も強く,大長2尺はその中間性を示した。こうした性質と種子浸出海の電気電導度,可溶性糖含量,アミノ酸含量,膨潤種子のエチレン発生量,デヒドロゲナーゼ活性,ATP含量,油脂含量,MDA含量等を調査した。これらの性質がニガウリ種子の低温感受性(recalcitran大性)に密接に関係していることが明らかとなった。すなわちMC43は種子浸出海のEC,可溶性種含量,アミノ酸含量が最も大きく,太はその反対で,大長2尺は中間値を示す場合が多かった。エチレン発生量及びATP含量は太が最も大で,MC43は最も小さかった。油脂及びMDA含量はMC43が最も大であった。こうしたことから,ワサビ,ニガウリ等の種子のrecalcitrant性と脂肪の過酸化,種子浸出海のEC,膨潤種子のエチレン発生量等とが密接に関係していることが認められ,種子の老化を防ぐにはこうした点に注意する必要があると考えられる.recalcitrant性であるワサビ種子の老化に伴って不飽和脂肪酸であるリノール酸の減少が認められたが,同じ不飽和脂肪酸であるオレイン酸及びリノレン酸は増加した.この研究を更し押し進めて,多少異なったカテゴリーのrecalcitrant性を示すニガウリ種子の貯蔵について調査した.ニガウリ種子では低温に対する感受性の品種間差が大きく,スリランカの品種であるMC43は最も低温に弱く,日本の品種では太が最も強く,大長2尺はその中間性を示した。こうしたことから,ワサビ,ニガウリ等の種子のrecalcitrant性と脂肪の過酸化,種子浸出海のEC,膨潤種子のエチレン発生量等とが密接に関係していることが認められ,種子の老化を防ぐにはこうした点に注意する必要があると考えられる.
神経細胞死の制御機構

Necdin遺伝子は15番染色体のPrader-Willi症候群欠損領域に存在し、主要な原因遺伝子と考えられている。Prader-Willi症候群は、視床下部ニューロンの異常が原因と考えられているが、Necdin遺伝子欠損マウスでは、視床下部においてホルモン産生ニューロンの減少が報告されている。Necdin結合蛋白質についていくつか報告してきたが、その中でもNecdinは転写因子E2F1やp53と結合し、その転写活性を抑制し、E2F1やp53によって誘導される細胞死を保護する。Necdinは、MAGEファミリーに属するが、その中でMAGE-D1は、p75NTR(p75 neurotrophin receptor)と結合して神経細胞死を誘導することが報告されている。MAGEファミリーには、MAGEhomology domainが共通して存在し、このdomainを介していくつかの結合蛋白質が共通して結合する。Necdinもまた、p75NTRと結合するがその作用の違いについて検討を行った。p75NTRは、NGF(nerve growth factor)受容体であるTrkAとheterodimerを形成するが、MAGE-D1の発現によってこの両者の結合が解離するのに対して、Necdinの発現によっては両者の結合の増強が認められた。次に、NecdinあるいはMAGE-D1同士のhomoの結合が報告されていることから、NecdinとMAGE-D1のheteroの結合について検討を行った。さまざまなMAGE-D1欠損変異体を大腸菌で発現させ、Necdinとのpull-down assayを行ってところ、MAGEhomology domainを介して、NecdinとMAGE-D1が結合することが認められた。MAGE-D1は、interspersed hexapeptide repeat domainを介して、homeobox型転写因子であるMsxと結合するが、Necdinは、MAGE-D1との結合を介してMsxとも相互作用することが明らかとなった。このようなNecdinとMAGE-D1の相互作用の結果、NGFの受容体への親和性を変化させ神経細胞死あるいは生存を制御していると考えられた。Necdinは、神経発達障害であるPrader-Willi症候群の原因遺伝子と考えられ、ニューロンの分化や細胞死に関与している。Necdin蛋白質のアミノ酸配列は、MAGEファミリーと相同性があり、その中でもMAGEL2(necdin-like1)とMAGEG1(necdin-like2)は、Prader-Willi症候群欠損領域である染色体15qにnecdinとともに存在している。そこでnecdinおよびMAGEL2、MAGEG1をnecdin結合蛋白質との関連について生化学的、機能的に解析した。Necdinは増殖細胞に対してその増殖抑制能を有しているが、colony formation assayおよびBrdU incorporation assayで解析したところ、MAGEG1にはnecdinと同様の細胞増殖抑制能が認められたが、MAGEL2には認められなかった。Necdinの細胞増殖抑制能は、細胞周期調節に関与する転写因子E2F1との結合とその転写活性の抑制によるものと考えられているが、MAGEG1もまたE2F1と結合し、その転写活性を抑制することがわかった。またE2F1は、ニューロンにおいては細胞死のmediatorとなっていると考えられている。分化誘導を行ったN1E-115neuroblastoma細胞に遺伝し導入を行ったところ、necdinおよびMAGEG1の発現はE2F1によって誘導される神経細胞死に対して抑制的に働いた。これに対してMAGEL2にはこのようなE2F1との相互作用は認められなかった。

p75NTRは、NGFなどの神経栄養因子に対してTrkAなどの高親和性受容体と複合体を形成して働く膜受容体である。逆にp75NTRとTrkAとの解離はNGFによって神経細胞死を誘導するがその分子機構についてはよくわかっていない。MAGEファミリーに属するNRAGEはp75NTRと結合し、p75NTRとTrkAを解離させ、神経細胞死を誘導することが報告されている。分化誘導を行った胚性がんP19細胞を用いた内在性蛋白質および強制発現系において免疫沈降を行ったところ、necdinおよびMAGEG1とp75NTRの特異的な相互作用が認められ、MAGEL2とは認められなかった。さらに免疫細胞染色を行いnecdinの分布をみたところ、E2F1との共発現ではnecdinは主に核に局在し、p75NTRとの共発現では主に細胞膜に局在することがわかった。分化誘導を行ったN1E-115neuroblastoma細胞に遺伝し導入を行ったところ、p75NTRの発現はE2F1によって誘導される神経細胞死を増強し、その際にはnecdinとE2F1の結合を解離させnecdinを細胞膜へ誘導することが認められた。したがってp75NTRシグナルによって誘導される神経細胞死の分子機構の一つとして、necdinとE2F1の結合の解離が考えられる。またMAGEファミリー間でさまざまな共通の結合パートナーが存在し、ニューロンの分化、細胞死を調節していると考えられる。Necdin遺伝子は15番染色体のPrader-Willi症候群欠損領域に存在し、主要な原因遺伝子と考えられている。Prader-Willi症候群は、視床下部ニューロンの異常が原因と考えらているが、Necdin遺伝子欠損マウスでは、視床下部においてホルモン産生ニューロンの減少が報告されている。Necdin結合蛋白質についていくつか報告してきたが、その中でもNecdinは転写因子E2F1やp53と結合し、その転写活性を抑制し、E2F1やp53によって誘導される細胞死を保護する。Necdinは、MAGEファミリーに属するが、その中でMAGE-D1は、p75NTR(p75 neurotrophin receptor)と結合して神経細胞死を誘導することが報告されている。MAGEファミリーには、MAGEhomology domainが共通して存在し、このdomainを介していくつかの結合蛋白質が共通して結合する。Necdinもまた、p75NTRと結合するがその作用の違いについて検討を行った。
クロマチンリモデリング因子Mi-2による細胞増殖制御機構の解明

クロマチン構造を介した遺伝子発現制御におけるDREFの役割を明らかにするために、DREF全長をbaitに用いたyeast two hybrid screenを行い、これと相互作用する因子を検索したところ、クロマチンリモデリング複合体のひとつであるNuRD複合体のサブユニットとして知られるMi-2(ATP依存性ヘリカーゼ)のcDNAを得た。免疫沈降実験により、DREFとMi-2が相互作用することを証明し、GST pull down法を用いて、両者の結合領域を決定した。さらに、ショウジョウバエの遺伝学的方法を用いたいくつかの解析から、Mi-2はDREF機能を抑制的に制御していることが結論された。また、その分子機構として、Mi-2がDREFのDNA結合活性を阻害することによることを明らかにした。生化学や遺伝学を用いた解析により、両者のin vivoでの相互作用が証明できたが、ショウジョウバエ唾腺染色体におけるDREFとMi-2の局在を免疫染色法で調べると両者は相互排除的に染色体に結合していることを観察している。Mi-2はすでにDNAに結合しているDREFのDNA結合活性には影響を与えないという実験結果を考慮すると、DREFとMi-2の特異的相互作用による新規なクロマチン構造の制御機構が存在すると予想できる。また、ヒトDREFの解析も開始し、その発現が細胞の増殖とよく相関しており、細胞周期でも変動があることを見いだした。ショウジョウバエのDNA複製/増殖関連遺伝子を共通に制御する転写因子DREF(709aa)が、クロマチンリモデリング複合体のサブユニットとして知られるMi-2(ATP依存性ヘリカーゼ)と相互作用することをショウジョウバエを用いた遺伝学的な方法や免疫沈降法などの生化学的方法により証明した。両者の結合領域をGST pull down方を用いて決定したところ、Mi-2はDREFのDNA結合ドメインに結合することが明らかとなった。さらにMi-2はDREFのDNA結合活性を阻害し,細胞内で相互作用した際にはDREFの転写因子としての機能を抑制的に制御していることを示唆した。さらに、GAL4-UAS系を用いたDREFとMi-2の過剰発現系統や、Mi-2の変異体を用いた遺伝学的な解析の結果、Mi-2の活性もDREFにより抑制的な調節を受けている可能性が示唆された。また、ショウジョウバエ唾腺染色体におけるDREFとMi-2の局在を免疫染色法で調べると両者は相互排除的に染色体に結合していることを観察している。これらの結果から、クロマチンリモデリング因子と転写因子との特異的な結合により相互の活性を負に調節するメカニズムがあるらしいことや、転写の調節にはクロマチンの構造変化の調節が重要な意味を持っていることを示唆することができた。クロマチン構造を介した遺伝子発現制御におけるDREFの役割を明らかにするために、DREF全長をbaitに用いたyeast two hybrid screenを行い、これと相互作用する因子を検索したところ、クロマチンリモデリング複合体のひとつであるNuRD複合体のサブユニットとして知られるMi-2 (ATP依存性ヘリカーゼ)のcDNAを得た。
乳腺の前癌病変:疾患概念の確立と臨床病理学的意義の検証

乳癌のほとんどは乳管内にとどまる非浸潤性乳管癌として発生し、多くがやがて浸潤癌に進行すると考えられる。しかし、癌発生の前段階や浸潤癌への進展様式は多彩であり、癌を早期に発見した際に個々の症例の特性を見極めて適切な治療戦略を立てる必要がある。本研究では、非浸潤性乳管癌を病理学的に検討し、浸潤癌への進展様式の多彩性に関する仮説を検証した。また、一部の癌には病理検査で確認可能な前癌段階があり得ることを示し、病理細胞学的にそれらを把握するための診断学的基盤を提唱した。乳癌の中には、短期間で進行癌に発展する高悪性度の癌と、進行癌に至るまでに時間がかかるか早期癌の状態で長く留まる低悪性度の癌が存在すると推測される。異なる過程を経て癌化する癌の種類を明らかにし、さらに超早期癌や前癌病変の特性を明らかにする目的で、臨床病理学的な研究を開始した。最初に、乳癌手術例の病理標本を再検討し、癌病巣の周囲や背景に付随する前癌病変(境界悪性病変)の抽出を試みた。しかし、予想以上に症例数が少なかったため、検討症例を増やしデータベース構築を試みている。次に、低悪性度早期癌の代表として、ホルモン受容体陽性、HER2陰性のLuminal A型非浸潤性乳管癌について免疫組織学的に検討し、年齢にかかわらず癌細胞がアロマターゼを発現していること、80%の症例がエストロゲン受容体の発現にかかわる転写因子GATA3およびFOXA1を、1/3例がXBPIを発現していることを明らかにした。3つの転写因子は背景の正常乳線における発現が乏しいことを確認しており、今後癌化過程のどの段階で発現が始まるのか、前癌病変の検索を実施予定である。第3に悪性度の点で対極に位置しているとホルモン受容体陰性、HER2陰性のトリプルネガティブ型非浸潤性乳管癌について解析した。これらの癌は、進行したトリプルネガティブ乳癌で高頻度に発現する基底細胞マーカーやHER1遺伝子過剰発現が乏しく、アポクリン分化傾向が目立ち、進行トリプルネガティブ乳癌とは異なる種類の癌であることが示唆された。トリプルネガティブ乳癌の真の前癌病変については現時点で明らかにできておらず、別の手法での探索が必要と思われる。以上の成果については、学会発表および論文作成の準備を進めている。乳癌には、短期間で進行する高悪性度の癌と、進行癌に至るまでに長い時間を要する低悪性度の癌が存在する。異なる進行過程を示す乳癌は、前癌や早期癌時点での細胞性格をある程度保持しながら進行してゆくものと推測される。そこで、早期癌の代表である、浸潤能を獲得していない非浸潤性乳管癌や、さらに前段階の前癌病変を収集し、種々のマーカーで免疫組織染色を実施し、その特徴を検討して、浸潤性乳癌への進行するスピードの予測や、進行した場合の治療戦略の参考になる因子の探索を行うことを研究の主目的とした。平成22年度は、非浸潤性乳管癌症例について検討を行い、ホルモン受容体陽性・HER2陰性型の癌(Luminal A型、低悪性度と目される)で発現するマーカーを明らかにした。また、その対極に位置づけられるトリプルネガティブ(2種類のホルモン受容体とHER2が陰性)型の癌では、アポクリン化生上皮マーカーの発現が高頻度に起こり、他のマーカー発現から見ても、進行したトリプルネガティブ乳癌とはやや性質が異なることを明らかにした。平成23年度には、この2つの型以外の非浸潤性乳管癌の性質を含めて乳癌の多彩性を明らかにすべく、症例の追加と、マーカーの大幅な追加を行った。染色が終了したため、結果解析と公表の準備を行っている。次に、前癌病変については、異型乳管過形成、異型小葉過形成などがそれに相当するが、いずれも低悪性度乳癌の前駆病変と目されるものである。高悪性度乳癌の前駆病変に関する知見はほとんどないため、既診断例(高悪性度乳癌の背景病変)の病理標本についてヘマトキシリン・エオジン標本のみでの再検討を行ったが、前癌と目される像は発見できなかった。低悪性度病変の前癌病変については、遭遇頻度が高いものとは言い難いため、関連施設の症例も含めて再検討し、マーカー検索可能な症例の追加を行った。浸潤性乳癌における遺伝子発現プロファイルの研究から乳癌は4つの亜型に分類され、予後を含む生物学的態度や薬物治療の選択が異なることが知られている。それぞれ異なる発癌過程を経ている可能性を想定し、浸潤癌の前駆病変とも目される上皮内癌(非浸潤性乳管癌;以下DCIS)の亜分類を行い、免疫組織学的に検討した。

59例のDCISについて、浸潤癌に準じて亜分分類を行うと、ホルモン受容体陽性・HER2陰性のLuminal A型が51例(89.6%)と圧倒的に多く認められた。ホルモン受容体陰性・HER2陰性のトリプルネガティブ(以下TN)型は3例(5.1%)のみで、同時期の浸潤癌における同亜型の約半分の頻度であった。このことは、予後不良であるTN乳癌では、上皮内癌の時期が短く、早期に浸潤癌に移行することを示すと推測された。次に、TN型のDCIS29例を抽出し検索したところ、浸潤癌における基底細胞型と目されるサイトケラチンCK5/6またはEGFR陽性の症例は3例のみであり、それらが80%を占めるTN浸潤癌とは様相が異なっていた。TN-DCISの少なくとも20例(69.0%)は細胞質が好酸性を呈し、アポクリン分化と目され、早期に進行するTN浸潤癌とは異なる発生過程を有している可能性が示唆された。なお、基底細胞型DCISは、間質にリンパ球浸潤を伴い、核異型高度、明瞭な核小体を有志、細胞質は扁平上皮様の所見を呈した。TN-DCISを非TN-DCISの207例と比較したところ、年齢は同等、核異型とグレード、p53の発現率はTNが有意に高かったが,Ki-67を用いた増殖能には差がなかった。また非TN-DCISにおけるアポクリン分化傾向は20.8%のみで有意に低頻度であった。以上のように前癌の最終段階である非浸潤癌の病理形態は多彩であり、早期発見時の適切な亜分類と個別化治療の計画が望ましいと考えられた。平成22年度から継続している、非浸潤性乳管癌に関する検討において、染色する抗血清の種類を大幅に増やしたために、結果を得るまでに時間を要した。23年度終了時で染色は終了しているため、早期の学会発表や論文化を目指す。最終目標である前癌病変に対する検討は、自験例が予想以上に少ない状況であったため、関連施設を加えた研究を行うべく倫理申請をした後、過去の診断症例について見直しを行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。非浸潤性乳管癌に関する免疫組織学的な解析を進め、年度内の論文化を目指す。前癌病変については、関連施設を含めた再検討で症例の追加ができたため、非浸潤性乳管癌の研究成果をふまえて染色を実施する。進行乳癌(浸潤性乳癌)の進行や予後に関わるマーカーが次々と報告されているので、関連論文を常時渉猟し、可能な染色を追加する。
中高一貫教育における学習の個別化と教育課程の整合性に関する日独比較研究

1.中学卒業者のほとんどが高校に進学する日本と、3割程度の者が進学するギムナジウム上級段階では、教育課程における必修科目あるいは選択必修科目の意味が異なっている。高校の必修単位が「共通の」履修単位であり、1年次にその多くを履修するのに対し、ギムナジウムの必修単位は終わり2年の教育課程を構成する基本原理となっている。2.日本の高校では、国語、数学での必修単位は各4であり、外国語に至っては選択科目である。理科・社会科目においては、1つの科目を継続して学習する機会は制限されている。又、文化系コース等に見られる数学の履修の軽減は、文化系学部の入試科目から数学がはずされることにより、数学Iレベルにとどまることを意味する。理科系コースでは数学と理科の時間確保のために、地歴・公民が最低単位数にとどまる傾向が理解できる。また、国語・数学・外国語は、ドイツでは最終学年までの継続した履修が規定されているが、日本ではこれらの科目は、制度的強制がなく、必ずしも最終学年まで継続されるとは限らない。3.ドイツのギムナジウム上級段階は、1972年のボン協定により科目選択の可能性が高められたが、その後ドイツ語・外国語・数学を中心とした科目の継続性が高められた。第12・13学年ではアビトゥア試験科目の授業が継続して行われ、学習領域の偏りを防ぐために課題領域毎に選択すべきコースの最低時間数および履修科目の制限が規定されている。4.大学入学への条件が後期中等教育段階の教育課程を規定するという構図は、日独共通である。それが主として(減少し続ける)大学入学試験科目に規定されている日本と、ギムナジウム第12・13学年の成績を総合資格に組み入れるドイツとで、教育課程の編成方法が異なるのである。平成11年度は以下の調査研究を行った。1.ドイツにおける高校生アンケート調査の実施ドイツの数州にギムナジウム上級段階生徒へのアンケート調査の依頼を行った。その結果、ブランデンブルク州で調査実施の許可を得ることができた。同州において、平成12年12月にかけてアンケート調査を実施した。回収できた調査票は2110であった。現在、この調査結果の入力作業を行っている。2.ドイツにおける大学生インタビュー調査の実施平成11年11月にドイツにおける大学生のインタビュー調査並びに質問紙調査を行った。同調査により、アビトゥアの選択科目と大学における学業との関係性を問うた。全部で100名の学生に調査を行い、現在集計作業を行っている。3.日本の高校における進路指導に関する聞き取り調査平成11年11月に新潟県立十日町総合高等学校で聞き取り調査を実施した。また、文部省委嘱研究「中高一貫教育に係る教育課程編成の在り方に関する調査研究」と連携し、中高一貫教育に関する協議会に参加し、各県における中高一貫教育に関する政策動向について情報を収集した。4.研究仮説の検討ドイツにおいて、大学生と高校生の科目選択と大学の学業における内容的接続性は、概観ではあるが、以下の点が指摘できそうである。高校生は学習内容と大学の学業の連続性を期待しているが、大学生はあまり連続性がないと評価している。むしろ一般教育の重要性を彼らは指摘している。これは日本の学力論争にも示唆を与える資料となりうる。
1細胞遺伝子発現解析と数理モデリングによる、多能性幹細胞の細胞間ゆらぎの解析

本研究の目的は、幹細胞の遺伝子発現のゆらぎを1細胞レベルで記述し理解することであり、内在的ノイズ・外在的ノイズのコンセプトに基づいた数理モデル化と実際の実験データを組み合わせるところにその新しさがある。文献にもとづく調査や既存の装置を複数種類試行した結果から、数理モデリングに必要な数の細胞を、実行可能な研究費用で得るためには、既存の装置の単純な改良では困難であり、より良い新規の装置を開発する必要が生じた。研究分担者の創意工夫により、現在ではその開発に成功しており、幹細胞を用いてパイロットデータを得ることができた。研究分担者はその結果を、シンガポールで開催された国際学会Cell Symposia (Single Cells: Technology to Biology)でポスター発表した他、BD主催のイベントでも解析結果を口頭で発表する機会を得た。研究代表者は、1細胞遺伝子発現データの低次元表現に関する方法の理解を深めた。特に、研究代表者が開発したLAVENDER法に基づく解析と、近年のデファクトスタンダードになっているtSNEやUMAPとの比較解析を推し進めた。さらに、上記パイロットデータの解析に着手し、数理モデルの開発を進めた。上記の進捗状況に基づいて、補助事業期間を1年間延長した。引き続き、新たな装置での測定のクオリティコントロール、データの解析および数理モデル化を進めていく。また、新たな装置についても、生物学的・医学的によりよい測定対象を探索し、論文化を進める予定である。当初計画では、幹細胞の遺伝子発現を1細胞レベルで測定できる装置を完成させた後、実際の測定および数リモデリングを行う予定であった。数理モデリングに必要な数の細胞を得るために、既存の装置の単純な改良では困難であり、より良い新規の装置を開発する必要が生じた。現在は新たな装置でサンプルの測定に成功しているが、当初計画より遅くなった。上記の進捗状況を受け、補助事業期間を1年間延長した。また、新たな装置についても、生物学的・医学的によりよい測定対象を探索し、論文化を進める。本プロジェクトの主題である、1細胞の遺伝子発現の違いを可視化する方法を模索する中で、高次元空間内の遺伝子発現の分布をノンパラメトリック・バイアスフリーにとらえ、分布間の距離を計算することで座標空間への布置を行い、サンプルの多様性を司る重要な軸を抽出する新たな解析手法(ノンパラメトリック・ダイバージェンス推定とMDS再構築による潜在軸可視化解析、Latent axes visualization and evaluation using non-parametric divergence estimation and MDS reconstruction, LAVENDER法)を構想した。この手法はサンプル間の距離を保ったまま、低次元への縮約を実現することから、距離を改変することで低次元における可視化を行うtSNEなどの既存手法と補完的な解析手法となりうると考えられる。1細胞の遺伝子発現への応用に先行して、FACSデータ・マスサイトメトリーデータへのLAVENDER法の適用を行い、長浜コホート0次事業の関連データから免疫応答の個人間の多様性に関する軸を抽出することができた。この結果を国内学会・国際学会において口頭発表し、有益なフィードバックを得た。国際学会での発表はYouTubeにおいて広く公開された。現在、論文投稿に向けて準備中である。同時に、前年に引き続き、関連国際学会およびプレプリントサーバーから情報収集を行い、スナップショットデータを用いて遺伝子発現のゆらぎを研究するのに必要な細胞数を確保できる実験手法について検討した。研究分担者はそのプロトタイプの作製を開始した。1細胞の遺伝子発現の違いを可視化できるLAVENDER法の論文化を進めている。ゆらぎの研究に十分な細胞数を確保できる実験手法を絞り込んでいる。

研究代表者は、研究分担者の協力を得て、1細胞遺伝子発現の解析手法の新規論文を網羅的にサーベイした。tSNE (t-distributed stochastic neighborhood embedding)などの非線形次元圧縮に基づく方法を経験的に用いて、多次元のデータから重要な要素を抽出する様々な方法が工夫されている。また、サンプルごとのバッチエフェクト(測定に起因するノイズ)を除去する方法にも進展があった。しかし、本研究が目指すような、細胞のゆらぎと力学系を結びつける研究は概念的に新しく、発展途上である。ここ数年で、1細胞遺伝子発現の公開データベースがしだいに充実してきていることから、公開されているデータを組み合わせた研究も可能になっている。ただし、公開されているデータの質が必ずしも均一でないことに留意する必要はある。データの増大に伴い、解析論文自体は続々出版されているが、数理モデルという観点から見直すことで、今後新たな発見や構造の解明が期待される。研究分担者は、心筋分化過程の1細胞発現解析の研究を進め、英文論文を投稿した。その内容の概略について和文月刊誌の「シングル遺伝子発現解析」特集に寄稿した。iPS細胞から心筋分化の過程において、1細胞遺伝子発現データ(13000遺伝子)の主成分分析により、心筋分化の軌跡を同定した。Day 0では幹細胞マーカー、Day 3, 5では中胚葉マーカー、Day 9以降では心筋細胞マーカーの発現上昇が見られた。分化後の細胞にも遺伝子発現の不均一性(ゆらぎ)が確認された。また、Day 9における「ソートなしの細胞」を主成分分析の平面に投射することで、分化の軌跡から逸脱した細胞群が発見された。今年度、研究代表者は、データ解析に関する新規手法の論文のサーベイを行った。データの増大に伴い、解析論文自体は続々出版されているが、数理モデルという観点から見直すことで、新たな発見や構造の解明が期待される。また、研究分担者の研究室において、1細胞遺伝子発現の新規の実験を行うための複数の方法の開発が進んでいる。いずれも数百個の細胞数は最低確保できると考えられ、今回の細胞間不均一性の研究に支障は生じないと考えられる。上記の進捗状況を受け、補助事業期間を1年間延長した。引き続き、新たな装置での測定のクオリティコントロール、データの解析および数理モデル化を進めていく。また、新たな装置についても、生物学的・医学的によりよい測定対象を探索し、論文化を進める。LAVENDER法の論文化、1細胞遺伝子発現への応用を進める。研究分担者の所持するGPUマシンを利用できる目処が立ったことから、多層のニューラルネットを用いた非線形モデリングによって、遺伝子型と表現型(遺伝子発現を含む)を結びつける可能性を検討する。