hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上気道ウイルス感染に対する粘膜免疫機構の解析

上気道の感染防御機構を解明、制御することは耳鼻咽喉科領域における様々な感染症を治療するに当たり必要不可欠な課題である。しかし、上気道感染、特に日常よく見られる上気道ウイルス感染に対する局所免疫応答の研究はあまり顧みられていない現状にある。本研究により口蓋扁桃の外来抗原に対する正常な免疫応答にはB細胞上のco-Stimulatory factorの発現が重要な役割を果たしており、習慣性扁桃炎の病態はこの発現が低下していることが明らかにされた。扁桃、アデノイドにおけるcostimulatory signalの発現の検討症例及び方法ヒトロ蓋扁桃(習慣性扁桃炎症例と扁挑肥大や睡眠時無呼吸症候群などの非炎症性扁桃症例)と咽頭扁桃(アデノイド肥大症例)からリンパ球を分離し、PE-CD40L,CD28抗体とFITC-CD40,CD80あるいはCD86抗体で二重染色し、フローサイトメトリー(FACStar)で解析した。成績1)扁桃炎の既往のない扁桃に比較して、習慣性扁桃炎に罹患した扁桃リンパ球においてCD80,CD86の発現が有意(p<0.05)に低下していた。2)口蓋扁桃に比較して咽頭扁桃のリンパ球のCD80,CD86の発現が高い傾向にあった。3) IL-4+抗CD40抗体、SEB、RSV各々の刺激によって扁桃炎の既往のない扁桃、習慣性扁桃炎に罹患した扁桃リンパ球共にCD80,CD86の発現が有意(p<0.05)に増強した。考察習慣性扁桃炎のリンパ球はin vitroでは細菌、ウイルス刺激に反応しcostimulatory signalの発現が増強されるが、in vivoではその発現が抑制されており、免疫応答が低下している状態であることが示された。前年度の研究で習慣性扁桃炎に罹患した扁桃リンパ球は扁桃炎の既往のない扁桃リンパ球に比較して、Bリンパ球上のCD80,CD86の発現が有意(p<0.05)に低下していることを明らかにした。今年度はその機序につき検討を加えた。症例及び方法2)培養上清中のサイトカイン(IFN-γ,IL-2,4,5,10)をELISAにて測定した。成績1)Bリンパ球上のCD80,CD86の発現にはTリンパ球の存在が必要であった。2)培養上清中のIL-10は習慣性扁桃炎の方が非炎症性扁桃より有意(p<0.05)に高値であった。他のサイトカインには特に差を認めなかった。考察習慣性扁桃炎ではBリンパ球上のcostimulatory signalの発現が低下し、その機序としてIL-10による抑制作用が関与していることが示唆された。習慣性扁桃炎の病態としてcostimulatory signalの発現を介したT-Bリンパ球間の相互作用の低下によってウイルスをはじめとする外来抗原に対する免疫応答が低下している状態であることが推察された。
生理活性ペプチドプロセシングブロテアーゼ・PACE4アイソフォームの発現調節

PACE4は,Kexin様プロテアーゼファミリーに属するCa^<2+>依存性セリンプロテアーゼで,生理活性ペプチドや血清タンパク,レセプターのプロセシングに重要な働きを有する.PACE4タンパクはN末よりシグナルペプチド,プロペプチド,サイライシン様触媒ドメイン,ホモBドメイン,システインリッチドメインから構成されている.私共は,PACE4には3′側の異なるアイソフォームが全部で7種類存在することをcDNAクローニングにより証明し,各アイソフォームの機能,細胞特異発現について研究を進めてきた.本研究では,PACE4遺伝子をヒトゲノムライブラリーよりクローニングし,その構造解析より,アイソフォームの生成機構,発現調節機序を明らかにしようとした.またアイソフォーム(A-I,A-II,C,E-I,E-II)に関しては,その生合成,細胞内局在,共発現実験による基質特異性の同定について研究を行った.その結果,ヒトPACE4遺伝子は25ケのエクソンから成る長さ300kb以上の複雑な遺伝子であることが判明し,選択的スプライシングによるアイソフォームの生成機構が明らかとなった.遺伝子の5′-上流域にはTATA,CAT boxは認められなかったが,転写因子SP1,AP1,AP2の結合部位が存在した.また6回連続した特異な塩基配列が存在し,PACE4の発現調節に重要な役割を持つと推定された.培養細胞の過剰発現系を用い各アイソフォームの細胞内動態やその局在性に差があることも判明した.PACE4A,4Eはいずれもトランスゴルジ領域に局在するが,PACE4Aは一部細胞外へ分泌されるのに対し,4Eは全んど分泌しなかった.PACE4Cは小胞体に局在した.これらの成果は,論文発表以外に,アジア・オセアニア生化学・分子生物学会,日本生化学大会において発表された.PACE4は,Kexin様プロテアーゼファミリーに属するCa^<2+>依存性セリンプロテアーゼで,生理活性ペプチドや血清タンパク,レセプターのプロセシングに重要な働きを有する.PACE4タンパクはN末よりシグナルペプチド,プロペプチド,サイライシン様触媒ドメイン,ホモBドメイン,システインリッチドメインから構成されている.私共は,PACE4には3′側の異なるアイソフォームが全部で7種類存在することをcDNAクローニングにより証明し,各アイソフォームの機能,細胞特異発現について研究を進めてきた.本研究では,PACE4遺伝子をヒトゲノムライブラリーよりクローニングし,その構造解析より,アイソフォームの生成機構,発現調節機序を明らかにしようとした.またアイソフォーム(A-I,A-II,C,E-I,E-II)に関しては,その生合成,細胞内局在,共発現実験による基質特異性の同定について研究を行った.その結果,ヒトPACE4遺伝子は25ケのエクソンから成る長さ300kb以上の複雑な遺伝子であることが判明し,選択的スプライシングによるアイソフォームの生成機構が明らかとなった.遺伝子の5′-上流域にはTATA,CAT boxは認められなかったが,転写因子SP1,AP1,AP2の結合部位が存在した.また6回連続した特異な塩基配列が存在し,PACE4の発現調節に重要な役割を持つと推定された.培養細胞の過剰発現系を用い各アイソフォームの細胞内動態やその局在性に差があることも判明した.PACE4A,4Eはいずれもトランスゴルジ領域に局在するが,PACE4Aは一部細胞外へ分泌されるのに対し,4Eは全んど分泌しなかった.PACE4Cは小胞体に局在した.これらの成果は,論文発表以外に,アジア・オセアニア生化学・分子生物学会,日本生化学大会において発表された.
矯正歯科治療における側貌の予測数理モデルの開発

本研究の目的は、変異に富むヒトの側貌の識別に有効な図形パラメータ(特徴量)を専門医の知識に基づいて決定し、さらに矯正歯科治療前後の側貌の変化を前記の特徴量を用いて記述し、治療前の側貌から治療後の側貌を予測する数理モデル開発を行うことにある。本研究の結果、治療前の側貌パターンにより、治療前後の側貌の変化の様相が異なることが明らかとなった。術前の側貌パターンを用いることにより、中程度以上の精度を有する数理モデル開発の構築を行うことができた。現代の矯正歯科治療においては社会心理学的な立場から,顔の軟組織の形態を改善することは,重要な治療目標のひとつとみなされている.しかしながら,現在,顔の軟組織の形態予測を行う機能をもつとされる市販のソフトウェアで用いられているアルゴリズムの多くは,側貌における硬組織と軟組織の移動量が比例関係を有するとの誤った前提に立つものであり,また,比例定数値の指定は術者に依存するなど予測結果の正当性に関する根拠は乏しい.そこで本研究では,個々の患者の治療前の顎顔面形態Mに対応する典型的な側貌の変化Cを数学的に記述する.生成したテンプレートベクトルT[M,C]と新しく検証(診断)しようとする患者の側貌Mについてマッチングを行い,治療前の側貌Mから治療後の側貌M'を予測する数理モデルを構築することを目的とする.本年度は,矯正歯科医の知識データベースの構築と側貌の数学的な分類を行い,側貌を表現するテンプレートベクトルT[M,C]を生成した.本結果については,以下の論文として発表予定である.初年度に予定していた矯正歯科医の知識データベースの構築と側貌の数学的な分類が完了し、文献(1)として発表した。治療による変化について検討し、国際誌に発表した。ひとの顔は個人を識別するための重要な指標であり,相互の社会的コミュニケーションを適切に行う上で重要な機能を果たしている.現代の矯正歯科治療においては社会心理学的な立場から,顔の軟組織の形態を改善することは,重要な治療目標のひとつとみなされている.不正咬合を有する患者の治療計画を立てる場合には,抜歯か非抜歯のいずれが治療方法として適切かを判断したり,カムフラージュ治療(外科手術を伴なわない治療)か外科手術を伴う治療のいずれが治療方法として適切かを判断したりする上で,側貌を分類・評価し,さらに治療予測を行うことは不可欠の作業のひとつである.本年度は、側貌を分類する際に用いた特徴抽出手法を,蓄積したデータベースに適用し,治療前の側貌から治療後の側貌を予測する数理モデルを構築した.数理モデルの構築には,マッチング手法を応用した.構築した数理モデルについて予測精度を検証し、一部成果については来年度報告する予定である。成果については以下、国際学会・国内学会で発表した。<特許申請>1件良好な結果が得られたため、一部の実験を追加して行っており、そのため成果発表については2016年度に行う予定である。顔の形(容貌)は自己が社会的に受け入れられているという心理的充足を得る上で強い影響を及ぼし、また、顔の表情は社会生活において感情や思考の伝達を行う上で、非言語コミュニケーションの手段として重要な役割(機能)を果たす。現代の矯正歯科治療においては社会心理学的な立場から顔の軟組織形態を改善することは、重要な治療目標のひとつとみなされている。不正咬合を有する患者の治療計画を立てる場合には、抜歯か非抜歯のいずれが治療方法として適切かを判断したり、カムフラージュ治療(外科治療を伴なわない治療)か外科手術を伴う治療のいずれが治療方法として適切かを判断したりする上で、側貌を分類・評価し,さらに治療予測を行うことは不可欠の作業のひとつである。そこで、本研究の目的は、抜歯を治療方針として矯正歯科治療を行った成人女性患者について、治療前の顔の側貌より、術後の顔の側貌を予測するシステムを開発することを目的とした。研究成果については、以下の発表を行った。すなわち、歯の移動に伴う、顔の形態の変化については、3つのコードに最適分類することが可能であることが明らかとなった。各コードについて予測モデルを構築したところ、中程度以上の精度を有するモデルが開発された。さらに、本研究成果について、三次元の顔の変化の予測に応用可能であることが明らかとなった。今後、本研究成果について、実用化が可能か否かについて検討する予定である。国際誌に発表したことからおおむね順調に進展していると考えられる。2016年度に成果発表のため、ヨーロッパ矯正歯科学会および国際歯科学会にて発表予定である。矯正歯科側貌を分類する際に用いた特徴抽出手法(初年度に検証済み)を,初年度に蓄積したデータベースに適用し,治療前の側貌から治療後の側貌を予測する数理モデルを構築する.数理モデルの構築には,マッチング手法を応用する.また,構築した数理モデルについて予測精度を検証する.成果については国際学会・国内学会で発表する.論文として発表される予定であり,順調に進展している。学会申し込みは当該年度中に行ったものの、発表自体は次年度となったため。

8898円の差額が生じたが、これは物品の一部の金額(HDD)が安くなったことによるものである。旅費として使用する。近年の技術の発達を考慮し,二次元顔面写真のみではなく三次元での評価を行うこととした。英文校正費として使用することを検討している。シンガポール国立大学との研究ミーティングが3月から4月に延期となったため2014年4月にシンガポール国立大学との研究ミーティングを行い使用した。
国際移民の自存戦略とトランスナショナル・ネットワークの文化人類学的研究

国際社会における人の移動は、社会経済全体のグローバル化や移動・通信手段の発達によって多様な展開をみせる。移民は受け入れ社会への受動的な参入や自己隔離ではなく、エスニックグループや同胞とのトランスナショナルなネットワークを基軸にして、より主体的に受け入れ社会への関わりを深めている。本研究ではヨーロッパ、アフリカ、日本を含むアジアにおける移民の出身地と定着地を往還する現地調査を実施し、ミクロなレベルに現れる移民の能動的な実践、すなわち自存戦略と多様な形態をもつトランスナショナル・ネットワークを調査した。具体的には、在日及び在フィンランド・ベトナム人(庄司)、南アフリカ及びザンビアの移民(小倉)、在日ネパール人(南)、アジアに移動するソニンケ人(三島)、在日及び在オーストラリア・フィリピン人(高畑)、在フィンランド日本人(ランシサルミ)を対象として、各研究者が経済(資本のグローバル化)、歴史(植民地支配と世界システム)、言語、ジェンダー、アイデンティティなどの論点から、グローバルなネットワークの個々の実情と特徴を研究し、主題に総合的にアプローチした。個々の知見は『研究成果報告書』に譲るが、全体として移民は、グローバル化のなかで曖昧になるエスニシティや拡散する個別性をあえて積極的な戦略として、経済的、社会的、文化・精神的な活力の基盤に用いていることが示された。また、そうして作られたネットワークは、送り出し社会と受け入れ社会をつなぐ双方的な関係から、複数の国家にまたがる多元的な関係に拡大していることが確認された。今後の課題は、多極化する定着地をその国家史ならびに移住史と移民政策に目配りしながら比較研究していくことであろう。3年計画の初年度にあたる本年は、各研究分担者が対象とする国(地域)あるいは民族に関して、移民の動態、エスニック集団のネットワーク、ホスト社会の移民政策及び関連法、人びとの社会的適応の状況という基本的なデータを収集・分析することを目的として各自が調査研究を行った。具体的には、庄司はフィンランドとスウェーデンにおいて、移民、難民の流入状況、文化・言語政策を主とする移民政策について、とくにベトナム人難民を対象に調査した。小倉は南アフリカにおいて移民政策の歴史的展開を把握することを目的とし、1897年来の関連法律、議会議事録、鉱山会議所資料、外交文書を収集し分析した。南はネパールと国内の東海地域で在留ネパール人労働者の日本社会への参入を、エスニック協会を軸とした互助、本国の協会本部との紐帯、ネパール人労働者の来日史という側面から調査した。三島は香港とタイにおいて、アジアの諸都市を結んで広く経済活動を行うソニンケ人(セネガル)の動態、民族ネットワーク、現地の商人などとのビジネス・ネットワークについて調査した。ランシサルミはフィンランドにおける日本人在留者の状況と日本人社会の組織について調査し、留学、業務駐在、婚姻など由来を異にする人びとの多様な定着過程を整理した。高畑は研究協力者として在日フィリピン人のネットワークを日本の援助組織、本国の出身地及び支援組織との関係から調査した。これらを通じ、各国における国際移民を取り巻く基本的状況と、移民政策の概要を把握することができた。全体では、ホスト社会の政策が近年変化してきていること、エスニック集団の違いにより社会への統合過程やネットワークの役割に大きな差があることなどの特徴が明らかになった。初年度の基本事項の調査結果を踏まえ、班員それぞれは対象地域、民族に応じたより重点的・集約的な調査を進め、また受入側の対応についても一部でさらに調査を深めた。具体的には、庄司はフィンランド、スエーデンにて多文化センター、難民受入センターなどにおいて、それらの目的、活動、問題点について調査を行い、ベトナム人を中心にネットワーク、文化活動について調べた。小倉は、南アフリカにおいて、中国人労働者導入をめぐるトランスヴァールでの世論の動向と導入決定に至るその変化について資料の収集をおこなった。中国人導入問題は北米やオセアニアにおける移民政策との影響関係が見られた。ザンビア、ルサカでは北ローデシア時代の東部州植民地行政官が、労働力流出による地域社会への影響をどの様に理解していたかについて調べた。ペタウケでは、昨年度に引き続き,国境地帯において、モザンビークからの移動者について予備調査を行った。

南は、ネパールのカトマンズにおいて、マガールとチャンテャル協会本部と在日協会支部とのネットワーク、労働者海外斡旋業及びネパールの移民法に関する調査を、ナワルパラシ郡においてマガール村落の環境問題と出稼ぎに関する調査を行った。国内では在留ネパール人のライフヒストリーを聞き取り調査した。三島は、タイ、フランス、セネガル、マリにおいて、西アフリカ出身のソニンケ移民のアジアとアフリカをつなぐ経済活動の実態についての調査を行い、取り扱う日用品の種類と規模、アフリカの市場での販売状況、民族ネットワークの役割などについて新たな情報を得ることができた。高畑は、東京都内にて、在日フィリピン人の文化継承活動につき、数箇所で参与観察を行った。日比家庭に育った子どもたちの創作演劇活動、子ども会活動について情報を得た。また、シドニーで、フィリピノ語が高校の第二外国語科目として認定された経緯につきインタビューを行った。国際社会における人の移動は、社会経済全体のグローバル化や移動手段の発達によって多様な展開をみせている。移民は受け入れ社会への受動的な参入にとどまらず、エスニックグループや同胞のネットワークを基軸にして、より主体的に受け入れ社会への関わりを深めている。また移民のネットワークは、送り出し社会と受け入れ社会をつなぐ双方的な関係から、複数の国家にまたがる多元的な関係に拡大しつつある。このようなトランスナショナルなネットワークを形成する要素として、これまでの調査により、移民による文化活動の展開と行政による文化活動への介入、「エスニックビジネス」の出現といった事象が抽出されてきた。また、地球上の経済格差によって生じる人の移動を、世界経済の「周辺」に注目しながらそのような経済構造を作り出した歴史的背景から理解する試みもなされた。3年計画の最終年度にあたる今年度は、こうして浮かび上がってきた重要な課題のうち、(1)文化・言語継承活動、(2)エスニックビジネス、(3)歴史的考察の3点を重点的にとりあげ調査を実施した。本年度調査の調査によって、トランスナショナルなネットワークを強化する移民の文化活動や経済行為などの実態を把握することができた。また今日の人の移動は、植民地支配によってつくられた経済構造に従属するだけのものではなく、あらたな人の交流によって地域経済の活発化をもたらしていることが確認された。他方、移動の要因を民族の文化として理解する視点も指摘された。3年間の研究を通じて、送り出し社会と受け入れ社会の両側から言語、経済、歴史など異なったアプローチで移民をとらえ、双方をつなぐグローバルなネットワークの存在を浮き彫りにすることができた。移民はグローバル化のなかで曖昧になる民族性や拡散する個別性を、あえて積極的な戦略として活力の基盤としている。
視覚情報並列処理系への脳幹からの修飾機構ー外側膝状体中継細胞のイオンチャンネル解析ー

本研究の目標はネコ外側膝状体のスライス標本にパッチクランプ法を適用し、外側膝状体の中継細胞におけるNa,K,Caイオンチャンネルの性質を明らかにし、次いでそれらのチャンネルを通る電流がアセチルコリン、ノルアドレナリン、セロトニンなどの局所投与によってどのように影響されのるかを調べるところにある。その予備的実験として本年度はin vitro網膜組織におけるCaチャネルの同定とそのGABAおよびアセチルコリンによる修飾機序について研究を行なった。孵卵3日目の鶏胚より網膜神経層を剥離摘出し、カルシウム蛍光指示薬(Fura2-AM)をロードした後、ピペットにより各種の試験溶液を投与し、直径50μmのスポット上にて蛍光測光を行ない、F340と380の蛍光強度の比から細胞内Ca濃度を経時的に算出した。その結果、高K外液で細胞膜を脱分極させると持続的な細胞内Ca濃度の上昇がみられ、種々の薬理学的検討からL型Caチャンネルを介するものであると同定された。次の外液へのGABAの投与によっても細胞内Ca濃度の上昇が生じ、この応答もL型Caチャンネルを介する反応であることがわかった。さらに細胞内記録と薬理学的検討の結果、GABA_A受容体を介したC1イオンの流出に伴う脱分極によって膜電位依存性Caチャネルが開いた結果と解釈された。次に外液へのアセチルコリンの投与によっても細胞内Ca濃度の著明な増加が確認されたが、この場合にはムスカリン受容体から細胞内のIP3を介したCa貯蔵からの遊離であることがわかった。今後同様の方法を用いて外側膝状体のスライス標本にて研究を進める計画である。
不安定な鉄硫黄クラスターの生合成を担う超分子マシナリーの作動機構

鉄硫黄(Fe-S)タンパク質のコファクターであるFe-Sクラスターの生合成には複雑な多成分酵素系(マシナリー)が関与している。本研究では、大腸菌の2種類の生合成マシナリー(ISCとSUF)についてin vivo機能解析と構造解析を進めることにより、以下の知見を得た。1)大腸菌のイソプレノイド生合成経路を代謝改変することによってFe-Sクラスター生合成系の必須性を回避し、Fe-Sクラスターが無くても生きられることを見出した。2)関連遺伝子群を自在に操作することによって、マシナリー成分の新たな特性を明らかにした。3) SUFマシナリーの中心成分SufBCD複合体の結晶構造を明らかにした。大腸菌ではISCとSUFというタイプの異なる2種類のマシナリーがFe-Sクラスターの生合成を担っている。近年私たちは、大腸菌のイソプレノイド代謝経路を改変することによってFe-Sクラスター生合成マシナリーの必須性を回避し、両マシナリーをコードする遺伝子群を自在に操作できる実験系を開発した。H24年度はこのin vivo実験系を駆使して、マシナリーの中心成分の機能残基/機能領域を洗い出し、さらに、二次的なサプレッサー変異を同定した。それらの知見に基づいて、H25年度は機能不全変異/サプレッサー変異を持つマシナリー成分(IscU、IscS、SufBCD複合体、SufS、SufE)を精製し、それぞれの残基が具体的にどのような反応に関与しているのか、in vitroの反応を中心に解析を進めた。その結果、IscUのTyr3はIscSとの相互作用にきわめて重要で、活性中心を含むループ領域の構造変化を引き起こし、硫黄原子の受け渡しを促進する役割があることを見出した。またSufBCD複合体において、SufBのCys267はSufEから硫黄原子を受容する部位であること、Cys418とE447はFe-Sクラスターの新規形成部位としての可能性が高いことが判明した。一方、グラム陽性細菌のFe-Sクラスター生合成系は、大腸菌のISCとSUFマシナリーの成分が入り交じったユニークなハイブリッド型と予想される。H25年度は、枯草菌のイソプレノイド代謝経路を改変してsufCDS-iscU-sufBオペロンの必須性を回避し、このオペロンを欠失した変異株を構築した。これらの変異株は形質転換能を欠如していたが、コンピテンスのマスター制御遺伝子であるcomKのプロモーターを改変することによって遺伝子導入が可能になり、関連遺伝子群を操作できる実験系を構築することができた。鉄硫黄(Fe-S)クラスターは単純な形のコファクターだが、化学的には不安定な物性のため、その生合成には極めて複雑なマシナリーが関与している。近年私たちは、大腸菌のイソプレノイド代謝経路を改変することによってクラスター生合成マシナリーの必須性を回避し、関連遺伝子群を自在に操作できる実験系を開発した。H24年度はこのin vivo実験系を駆使して、マシナリーの中心成分の機能残基/機能領域を洗い出し、さらに、二次的なサプレッサー変異を調べることによって、マシナリー成分の構造と機能、成分間の相互作用を明らかにすることを目的とした。クラスター生合成系ISCマシナリーの中心成分であるIscUに対して、系統的な変異導入を行い、in vivo機能に必須な7残基を同定した。さらに、IscUのTyr3変異をサプレスする二次的な変異をIscS内に3種類見出した。IscUのTyr3については、IscSとの相互作用(硫黄原子の受け渡し)において、IscSの活性中心ループの構造変化を引き起こす分子スイッチとしての機能が示唆された。HscAとHscBはISCマシナリーに必須なHsp70型シャペロンとコシャペロンだが、それらの欠損をサプレスする変異をIscUコード域に12種類見出した。これら変異型IscUタンパク質を生化学的に解析すると、立体構造が変性状態に変化していることが判明した。逆に、IscUの立体構造を安定化するよう変異を導入したところ、機能不全となった。したがって、IscUはstructuredとdenaturedの2種類の分子形態をとることが必要であり、その変換にはHscAとHscBが関与すると考えられる。鉄硫黄(Fe-S)クラスターは、複雑な多成分酵素系(マシナリー)の働きによって形成されることが知られている。大腸菌はiscオペロンにコードされるISCマシナリーと、sufオペロンにコードされるSUFマシナリーという2種類のFe-Sクラスター生合成系を有しており、これらが独立してクラスターの形成を担っている。H26年度はこのin vivo実験系を駆使して、sufオペロンを欠失したバックグランドでiscオペロンの7種類の遺伝子をそれぞれ破壊した二重破壊株を構築し、それらの表現型を詳細に比較・解析することによって以下の新知見を得た。すなわち、IscS, IscU, IscA, HscB, HscA, Fdxの6つの因子は、好気条件下でISCマシナリーの機能に必須だが、嫌気的な条件下ではIscAとFdxは必ずしも必要ではないことを見出した。また、これらの変異株において、種々のフェレドキシンにおけるFe-Sクラスターの形成量を調べた結果、好気条件下でISCマシナリーの機能に必須な6つの因子は、いずれも4Fe-4Sクラスターの形成に必須であることが分かった。

それらのうちIscS, IscU, HscB, HscA, Fdxの5種類は4Fe-4Sクラスターだけでなく2Fe-2Sクラスターの形成にも必須だが、興味深いことに、IscAは2Fe-2Sクラスターの形成には関与しないことが判明した。したがって、このマシナリーでは、IscS, IscU, HscB, HscA, Fdxの5種類の成分で2Fe-2Sクラスターを形成した後、IscAの働きによって4Fe-4Sクラスターに変換されると考えられる。鉄硫黄(Fe-S)クラスターは、複雑な多成分酵素系(マシナリー)の働きによって形成されることが知られている。私たちは、大腸菌のイソプレノイド代謝経路を改変することによってFe-Sクラスター生合成マシナリーの必須性を回避し、関与する遺伝子群を自在に操作できる実験系を開発した。本研究課題ではこのin vivo実験系を駆使してISCマシナリーの6種類の成分の詳細な解析を行い、個々の成分の役割や相互作用、マシナリーとしての作動機構について、以下の重要な知見を得た。1. ISCマシナリーの成分のうち、IscAは4Fe-4Sクラスター形成にのみ関与することを見出した。ISCマシナリーではIscS, IscU, HscB, HscA, Fdxの5種類の成分で2Fe-2Sクラスターを形成し、その後、IscAの働きによって4Fe-4Sクラスターに変換されると考えられる。2. IscUの機能に必須な7残基を同定し、さらに、IscUのTyr3変異をサプレスする二次的な変異をIscS内に見出した。このTyr3はIscSとの相互作用(硫黄原子の受け渡し)において、IscSの活性中心ループの構造変化を引き起こす可能性が浮上した。3. HscAとHscBはISCマシナリーに必須な分子シャペロンとコシャペロンだが、それらの欠損をサプレスする変異をIscUコード域に見出した。変異型IscUタンパク質をin vitroで解析することによって、IscUはstructuredとdisorderedの2種類の分子形態をとることが必要であり、その変換にHscAとHscBが関与すると考えられる。4.平成27年度は、Fdxの機能に必須な6残基を同定し、さらに、サプレッサー変異やin vitroの解析から、FdxはIscSと一過性の相互作用(電子伝達)をすることが判明した。また、高度好熱菌Aquifex aeolicusのIscSとIscUは複合体を形成し、その中に新生2Fe-2Sクラスターを安定に保持することを見出した。鉄硫黄(Fe-S)タンパク質のコファクターであるFe-Sクラスターの生合成には複雑な多成分酵素系(マシナリー)が関与している。本研究では、大腸菌の2種類の生合成マシナリー(ISCとSUF)についてin vivo機能解析と構造解析を進めることにより、以下の知見を得た。1)大腸菌のイソプレノイド生合成経路を代謝改変することによってFe-Sクラスター生合成系の必須性を回避し、Fe-Sクラスターが無くても生きられることを見出した。2)関連遺伝子群を自在に操作することによって、マシナリー成分の新たな特性を明らかにした。3) SUFマシナリーの中心成分SufBCD複合体の結晶構造を明らかにした。
カルシウムによる転写調節-DREAMの作用-

ヒト甲状腺髄様癌由来細胞株(TT)において、アンチセンスDREAMの導入によりCa^<2+>濃度上昇によってカルシトニン(CT)の発現と分泌が増加したなど、平成15年度の成果より、DREAMのCT分泌調節への関与は確実であると考えられ、さらにその発現調節にも働いている可能性が示唆されたので、平成16年度は主に転写因子DREAMを介するCT遺伝子発現制御機構の解析を行った。CT遺伝子の転写開始点付近から上流の様々な長さの領域を、レポーター(ルシフェラーゼ)遺伝子の上流に組み込んだコンストラクトを作り、DREAMを発現しているTT細胞や、DREAMを発現していないHeLa、HEK293等の培養細胞に形質導入してルシフェラーゼアッセイを行い、Ca^<2+>濃度依存的な転写活性化に必須の領域を検討した。その結果、DRE様配列を含む上流450bp付近の領域が、その特異的な発現調節に関わっていることが分かった。TT細胞では、Ca^<2+>濃度上昇によりプロモータ活性が上昇したが、DREAMを発現していないHeLa細胞では、その変化が見られなかった。そこで、ゲルシフトアッセイを行ったところ、上流450bp付近のDRE様配列にDREAMが結合することが確認された。その他、DRE様配列を含むイントロン1,5についてもコンストラクトを作製し転写活性を検討したが、特に顕著な変化を与える領域は存在しなかった。また、遺伝子導入した細胞にprotein kinase A(PKA)を活性化するforskolin刺激を与えると、Ca^<2+>濃度変化による転写活性の上昇を上回る活性化が見られたので、PKAを介した情報伝達経路の下流に位置するCREBやCREMを介した転写制御もまたCT遺伝子の発現調節に関与していると考えられ、Ca^<2+>を介したシグナリングとのバランスでその遺伝子発現が調節されている可能性が示唆された。平成15年度は、主にCa^<2+>濃度変化に応じたカルシトニン(CT)分泌へのDREAMの関与について解析を行った。1.実験に使用する各種コンストラクトの構築:ヒトRNAよりDREAM cDNAを合成し、野生型と、Ca^<2+>結合能を欠失した変異型のcDNAを作製した。それぞれを、GST或いはGFPとの融合蛋白質発現用ベクターに組み込んだコンストラクトを構築した。また、DREAM cDNAをそれぞれセンス、アンチセンス方向に哺乳類細胞発現用ベクターに挿入したものも作製した。2.発現・精製したDREAMのCa2+濃度依存的DNA結合能の検討:発現・精製したDREAMの野生体及び変異体について、Ca^<2+>濃度依存的なDRE配列特異的結合能の変化をゲルシフトアッセイにより検討した。プロダイノルフィン及びCT両遺伝子のDRE配列において、いずれも、野生体ではCa^<2+>濃度依存的なDNA結合が見られたが、変異体ではそのCa^<2+>濃度感受性が消失していた。3.CT分泌性細胞株を用いた解析:CT分泌性細胞株として当該研究領域で広く用いられている、ヒト甲状腺髄様癌由来細胞株(TT)を用いて種々の解析を行うために、まずRT-PCR-サザンブロッティング法及びウエスタンブロッティング法により同細胞株の内在性DREAMの存在を確認した。次に、DREAM野生体、変異体それぞれをTT細胞に過剰発現させ、カルシウムイオノフォア投与等による細胞内Ca^<2+>濃度変化に伴うCT分泌量の変化を検討したところ、Ca^<2+>濃度上昇により変異株においてはCTの発現と分泌は減少していた。また、アンチセンスDREAMを導入した場合においては、Ca^<2+>濃度上昇によってCTの発現と分泌は増加しており、DREAMの発現抑制に伴い、DREAMによるCTの転写抑制が減少したためであると示唆された。これらのことから、DREAMのCT分泌調節への関与は確実であると考えられた。

また、遺伝子導入した細胞にprotein kinase A(PKA)を活性化するforskolin刺激を与えると、Ca^<2+>濃度変化による転写活性の上昇を上回る活性化が見られたので、PKAを介した情報伝達経路の下流に位置するCREBやCREMを介した転写制御もまたCT遺伝子の発現調節に関与していると考えられ、Ca^<2+>を介したシグナリングとのバランスでその遺伝子発現が調節されている可能性が示唆された。
抗体ミルクを用いた小児腸管感染ウィルス感染防御効果の検討

平成15年度は、前年度作製した各種腸管感染ウィルス対する抗体ミルクに関して、宿主免疫応答における有用性を中心に研究を進めた。前年度の研究結果より作製した抗体ミルクは免疫した各種エンテロウィルスに対して高い中和抗体価を有し、スキムミルク状の粉末体でもその機能は保持されていることが判明した。抗体ミルクの生体への作用について解析するため、免疫した7種のエンテロウィルスの中でマウスに感染させると心筋炎・心房心筋炎を発症させることがよく知られているCVB3を用いて、腸管粘膜免疫誘導における抗体ミルクの作用機序およびi-IELの機能について検討した。予め抗体ミルクを経口投与したC3H/HeN幼若マウスにCVB3を経口感染させ、ウィルス感染後経時的に腸管初めとする主要臓器中におけるウィルスを病理組織学的手法および分子生物学的手法を用いて検出した。陰性対照ミルクを投与したマウスにおいては、CVB3感染後経時的にウィルスの感染像が認められたのに対し、抗体ミルクを投与したマウスにおいては標的臓器におけるウィルス感染像ならびにRNAレベルでのウィルスは検出されなかった。さらに抗体ミルク投与マウスにおいてCD4陽性T細胞の増加とさらにCD25分子の発現増強が観察された(第33回日本免疫学会・福岡にて発表)。近年になり、CD25陽性T細胞の一部は制御型T細胞として注目を集めており、抗体ミルクによる宿主の免疫賦活効果が推察された。また、CD4陽性CD25陽性T細胞を単離し、ウィルス抗原刺激に対する応答性を解析したところ、IL-2およびIFN-γの著しい産生増強が認められ、抗体ミルク投与による宿主免疫応答の亢進が示唆された。一方、異種蛋白による免疫応答が惹起されたことも示唆されたが、非免疫ウシ由来の陰性ミルクではそのような応答は認められなかった。さらに、抗体ミルクを酵素処理した場合にも同様の免疫賦活傾向が観察され、FCRを介した非特異的な免疫応答よりはむしろ抗体ミルク成分中に免疫賦活因子が存在する可能性が推測された。等電点電気泳動により、抗体分子以外にはpH7.2に活性化分子が存在することが判明し、中和抗体と活性化物質の相乗作用により、腸管免疫機構の機能亢進が行われているものと推察され、小児腸管ウィルス感染症に対する抗体ミルクの有用性が示唆された。平成14年度は、各種腸管感染ウィルスに対する抗体ミルクの作製および精製を中心に研究を進めた。小児において特に流行の認められるCoxsackie virus A9,A16,B3,B5およびEcho virus7,11 18の各種エンテロウィルスを雌牛に免疫し、抗体ミルクを作製した。この抗体ミルク中には高力価のウィルス中和活性を持つ免疫グロブリン(IgG)が認められた。免疫した7種のエンテロウィルスの中でマウスに感染させると心筋炎・心房心筋炎を発症させることがよく知られているCVB3を用いて、腸管粘膜免疫誘導における抗体ミルクの作用機序およびi-IELの機能について検討した。予め抗体ミルクを経口投与したC3H/HeN幼若マウスにCVB3を経口感染させ、ウィルス感染後経時的に腸管、腸管膜リンパ節、脾臓および心臓を初めとする各臓器中におけるウィルスをin situ hybridizationまたは免疫染色等の病理組織学的手法およびRT-PCR等の分子生物学的手法を用いて検出した。これらの現象が抗体ミルクの中和作用によるものか否かを検討したところ、抗体ミルク投与マウスにおいてCD4陽性T細胞の増加とさらにCD25分子の発現増強が観察された。抗体ミルクをパパインで処理した場合にも同様の傾向が観察され、FCRを介した非特異的な免疫応答よりはむしろ抗体ミルク成分中に免疫賦活因子が存在する可能性が推測された。パイロットスタディでは、pH7.4付近に活性化分子が存在することが判明し、抗体ミルクに含まれる中和抗体と活性化物質の相乗作用により、腸管免疫機構の機能亢進が行われているものと推察された。

近年になり、CD25陽性T細胞の一部は制御型T細胞として注目を集めており、抗体ミルクによる宿主の免疫賦活効果が推察された。また、CD4陽性CD25陽性T細胞を単離し、ウィルス抗原刺激に対する応答性を解析したところ、IL-2およびIFN-γの著しい産生増強が認められ、抗体ミルク投与による宿主免疫応答の亢進が示唆された。一方、異種蛋白による免疫応答が惹起されたことも示唆されたが、非免疫ウシ由来の陰性ミルクではそのような応答は認められなかった。さらに、抗体ミルクを酵素処理した場合にも同様の免疫賦活傾向が観察され、FCRを介した非特異的な免疫応答よりはむしろ抗体ミルク成分中に免疫賦活因子が存在する可能性が推測された。等電点電気泳動により、抗体分子以外にはpH7.2に活性化分子が存在することが判明し、中和抗体と活性化物質の相乗作用により、腸管免疫機構の機能亢進が行われているものと推察され、小児腸管ウィルス感染症に対する抗体ミルクの有用性が示唆された。
イミダゾリウム塩から派生する化学種の特性を利用した新しい反応の開発と応用

本研究は,「共通の前駆体」であるイミダゾリウム塩から派生する「化学種」であるにも拘わらず,これまで別個に研究されてきた二つの化学種,「含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)」と「イオン液体(IL)」のインターフェースにあたる部分の化学に焦点を絞ったものである.その結果,配位子としてのNHCの特徴を生かしたいくつかの新たな反応の開発に成功し,更にILの機能を利用した新たな「触媒リサイクル型反応」を開発することができた.本研究は,「共通の前駆体」であるイミダゾリウム塩から派生する「化学種」であるにも拘わらず,これまで別個に研究されてきた二つの化学種,「含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)」と「イオン液体(IL)」のインターフェースにあたる部分の化学に焦点を絞ったものである.その結果,配位子としてのNHCの特徴を生かしたいくつかの新たな反応の開発に成功し,更にILの機能を利用した新たな「触媒リサイクル型反応」を開発することができた.イミダゾリウム塩を共通の中間体として「含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)」と「イオン液体(IL)」という興味ある二つの化学種が発生する.本研究課題では,これまで申請者らが行ってきたこれら二つの化学種に関する研究を更に展開するとともに,それらのインターフェースに相当する部分の研究を展開することを目的としている.本年度の研究においては,NHCに関する研究において新しい光学活性単座型NHC配位子の創出に成功し,この光学活性配位子を用いたNi触媒による1,3-ジエン,アルデヒド,及びシランの不斉三成分カップリング反応の開発に成功した.一方,ILに関する研究としてはカチオン性ロジウム触媒を用いたヒドロアシル化反応,及び環化異性化反応の二つの反応において,触媒リサイクル型反応への展開に成功した.今後は更にこれらの研究を統合的に発展させ,そのインターフェース部分の研究に展開していきたいと考えている.すなわち,NHCの配位子としての機能に着目し,その機能を保持した機能特異的IL(Task-specific IL,TSIL)の創製を行い,NHCが持つ特異な反応性を環境調和型分子変換型プロセスへと発展させ,触媒リサイクル型反応へと展開することを目指していく予定である.本研究課題では,イミダゾリウム塩を共通の母核構造として有する「含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)」と「イオン液体(IL)」という興味ある二つの化学種入の特性を生かした反応系の探索と展開を目指しているが,本年度の研究においては主にILに関する研究が大きく進展した.すなわち,昨年度までの研究成果としてカチオン性ロジウム触媒を用いたヒドロアシル化反応及び環化異性化反応の二つの反応の触媒リサイクル型反応への展開に成功しているが,これらの反応では同一の触媒を用いたほぼ同条件下での反応にも拘わらず,至適ILがそれぞれBMI(ブチルメチルイミダゾリウム)カチオンを持つIL及びBDMI(ブチルジメチルイミダゾリウム)カチオンを持つILであるという違いがあった.この至適ILの違いがBMIから系内で生成するNHC種が配位子として作用し, Rh触媒の活性に影響を与えているのではないかという作業仮説に基づき,今年度はNHCとdppeの両方が配位した(NHC)Rh(dppe)Cl錯体の調製と反応性の検証を行った.その結果, (NHC)Rh(dppe)C1錯体の合成,及びそのX線結晶構造解析にも成功した.また,この錯体が当初予想したとおりヒドロアシル化反応には触媒活性を持つものの,環化異性化反応にほとんど触媒活性を示さないことも明らかとした.今回合成に成功しだ錯体は, NHCとdppeを配位子として持つことから極めて中心金属の電子密度が上昇していると予想され,通常の金属錯体では酸化的付加が起こりにくい基質との反応も可能であると考えられるため,今後更に反応性の検討を行っていく予定である.本研究課題では、イミダゾリウム塩を共通の母核構造として有する「含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)」と「イオン液体(IL)」という興味ある二つの化学種の特性を生かした反応系の探索と展開を目指している。本年度は、IL中でのエニンメタセシス反応を中心に検討した。すなわち、申請者らは最近Guillemin, Mauduitらによって報告された「IL類似構造をテザ一部分に持つRu錯体」を用いたIL中でのエニンメタセシス反応を詳細に検討し、エチレン雰囲気下で反応を行うことで触媒のリサイクルが可能になることを見出したが、オレフィンメタセシス反応と比較してそのリサイクル効率には問題を残していた。おそらく、反応をエチレン雰囲気下で行っているため、錯体中のTSIL構造部位とエチレンとの反応によりRu-ビニリデン錯体が形成され、この錯体が反応終了時に元のRu錯体へと戻りにくいため、抽出の際に錯体のリーチングが起こっていると考えられた。そこで、Ru錯体内のTSIL構造の導入部位に注目し、Ru錯体に強力に配位している含窒素ヘテロ環カルベン(NHC)配位子上にTSIL構造を持たせたRu錯体を合成した。その結果、ILとしては[BMI][NTf_2]を用いた場合は2回の触媒リサイクルが可能となった。更に、リサイクル効率の向上を目指し、カルベン部位にもTSIL部位を導入したRu錯体の合成を行ない、エニンメタセシス反応を種々検討した。その結果、TSIL部位を二箇所に持つこのRu錯体を用いるとオレフィン、及びエニンメタセシス反応において触媒のリサイクルを効率良く行うことができることが分かった。
ゲノム解析による魚類レンサ球菌とヒト由来毒性レンサ球菌との毒性因子の比較研究

ランスフィールドC群レンサ球菌のゲノム解析の結果、病原性に関わる遺伝子を同定できた。その中から血清白濁因子(SOF)に注目し、その活性の違いを検討した。その結果、活性の違いにより3タイプ分けられることを明らかにした。また、迅速診断のため細胞表面の免疫原生タンパク質を同定するとともに、クローニングしリコンビナントタンパク質を作成した。そのリコンビナントタンパク質を抗原として、C群レンサ球菌症の診断法のためにELISAを開発した。さらに、養殖場においても診断ができるようにこのタンパク質をビーズに吸着させ、凝集反応で感染魚から凝集抗体を検出できるようにした。免疫学的手法を用いたGCSD診断法の開発;感染魚の抗体と強く反応するStreptococcus dysgalactiaeの表層タンパク質を同定した。また、タンパク質をコードする遺伝子を明らかにし、リコンビナントタンパク質を作成した。このリコンビナントタンパク質を抗原としたELISA法の開発を行った。また、このリコンビナントタンパク質をビーズに吸着させることで、養殖現場でも利用することが可能である凝集試験法を開発した。その結果、迅速で簡便な診断法が確立できた。ノックアウト株の作成と病原性の欠落の確認;リコンビナントワクチンとして可能なタンパク質探索のために、ゲノム配列から病原因子を検討した。その結果、病原因子候補タンパク質としてのSOF(血清白濁因子)タンパクに注目した。SOFをコードする遺伝子を相同組み換え法で破壊し、ノックアウト株を作成した。ノックアウト株の病原性が欠落するのかを、血液中の細菌の増殖速度を指標に検討した。その結果、SOFを破壊した株は野生株と比較して、普通の細菌用増殖培地では早く増殖するが、血液中では増殖が抑制されることがあきらかとなり、SOFが病原因子であることが示唆された。●SOFを大腸菌に発現させた、そのリコンビナントタンパク質を精製した。従来のワクチンにより誘導された抗体が、今回作成したリコンビナントタンパクと反応することを明らかにした。●魚類GCSDの病原性にリンクするする遺伝子であるSOFを用いて、魚類株に特有な配列をもとにプライマーを設計し、魚類GCSDの診断法を確立した。魚類由来株より強毒性株を選択:病原性を評価する指標として、ヒトおよびブタ由来S.pyogeneseおよびS.s uisの病原性因子の一つとして考えられいる血清白濁因子(SOF)の活性の強さを基に、魚類血清を強く白濁させる菌株と弱い菌株あるいは活性の認められな菌株を、教室保存の菌株(400株以上)から選択し、強毒株とした。次世代シークエンサーによりゲノム解読:病原性が強い魚類代表株のゲノム塩基配列を次世代シークエンサーで解析レファレンス株としてヒトおよび畜産来強毒株のゲノム配列をもとに両者を比較した。レファレンス株は、ヒトの心膜炎由来株である、ランスフィールドC群レンサ球菌Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilisとデータベース上のヒト由来S.pyogenesを用いて解析した。その結果、特に、Mタンパク、血清白濁因子、フィブロネクチン結合タンパク、溶血性遺伝子(ストレプトリジンS)およびスーパー抗原遺伝子等のヒトあるいは畜産動物に対して病気を起こさせる遺伝子群を保有していることが判明した。また、同時に魚類病原性レンサ球菌の強毒株と弱毒株との比較解析を行い、毒性の弱い株にはない配列をいくつか検索できた。魚類病原性ランスフィールドC群Streptococcus dysgalactiaeのゲノム解析を基に、魚類病原性C群レンサ球菌とヒトおよび哺乳動物由来の同属同種レンサ球菌、さらにはヒトに病原性を示す近縁なレンサ球菌S. pyogenesの毒性因子に関する比較研究を行った。その結果、魚類由来の1菌株の完全長のゲノム解析ができた。その結果、2,142,780bpのゲノムサイズであった。ヒトのレンサ球菌と共通の毒性因子として、M-like protein、Fibronectin-binding protein, Serumopacity factor, Collagen-binding protein,IgG binding protein等が確認できたSerum opacity factor(血清白濁因子)の遺伝子を相同組み換えでノックアウト株を作成し、魚類の血液における増殖能を検討した。その結果ノックアウト株は、野生株と比較して増殖が抑制されたことから魚類由来株においても毒性因子と考えられた。また、SOFのリコンビナントタンパク質を作成した。魚類由来の細胞表面に発現しているタンパクで、免疫原性が強いタンパク質を同定し、そのリコンビナントタンパク質を作成し、ELISAで抗体検出を可能とした。また、そのリコンビナントタンパク質をラテックスビーズに吸着させ、スライド凝集で、感染魚の凝集抗体の検出を可能とした。水族病原微生物学計画を予定した項目に関しておおむね良好に推移している。最終年度に向けて、ワクチン応用化のためにリコンビナントタンパク質の精製を行っているところであり、計画は順調と考える。

魚類由来株より強毒性株を選択:病原性を評価する指標として、ヒトおよびブタ由来S.pyogeneseおよびS.suisの病原性因子の一つとして考えられている血清白濁因子(SOF)の活性の強さを基に、魚類血清を強く白濁させる菌株と弱い菌株あるいは活性の認められない菌株を、教室保存の菌株(400株以上)から選択し、強毒株とすることができた。次世代シークエンサーによりゲノム解読:その結果、特に、ヒトおよびブタ連鎖球菌の病原因子であるMタンパク、血清白濁因子、フィブロネクチン結合タンパク、溶血性遺伝子(ストレプトリジンS)およびスーパー抗原遺伝子等のヒトに対して病気を起こさせる遺伝子群を保有していることが判明した。また、同時に魚類病原性レンサ球菌の強毒株と弱毒株との比較解析を行い、毒性の弱い株にはない配列をいくつか検索できた。以上の成果は、当初計画の通りでありおおむね順調に進展していると判断する。計画は順調であり、今後精製したタンパク質がワクチンとして機能するかを明らかにするためにワクチン試験を行う予定である。今後の方向性としては、他の株とのゲノムの比較も含め、詳細なゲノムの比較研究も同時に行っていきたい。○病原因子のタンパクレベルでの発現:病原性に関わると推測される遺伝子の配列の全長を決定した後、発現系ベクターにクローニングしたのち、病原因子であるタンパクを発現させ、精製する。魚類GCSDに感染した魚類から分離した抗体と発現タンパクの反応の強さをウエスタンブロッテイングで解析する。魚類の抗体と強く反応するリコンビナントタンパクを指標として探索することで、防御抗原として可能性のあるタンパクおよび遺伝子を探索する。○病原因子を用いた診断PCRの開発:病原因子として、幅広く魚類由来株に存在する遺伝子なのかを確認すると共に、哺乳動物由来の遺伝子と異なる領域を標的としたPCR系を開発し、魚類病原性レンサ球菌のみを明確に識別診断できる診断法(PCR)を開発する。該当なし
生体組織内反応性ナノ粒子によるがん組織固定化技術の開発

本研究では、ナノ粒子を利用してがん細胞・組織周辺にネットワーク構造を形成させることでがん細胞・組織の機能を物理的に阻害する方法を開発することを目的とする。がん組織を生体内で化学反応により固定するには、固定剤を腫瘍組織に送達する技術および組織固定を目的部位のみで行うためのスイッチ機能が必要となる。これを実現するために本研究では温度応答性のナノ粒子を合成する。このナノ粒子は、癌腫瘍組織に蓄積しやすい大きさの数10ナノメートルの大きさを有し、温度変化で温度応答性高分子層の物理化学的性質が変化することにより、ナノ粒子内部に導入した分子機能の発現を制御できる。このナノ粒子にタンパク質や細胞などと反応するアルデヒド基を導入すれば、生体分子とアルデヒド基の反応により架橋構造を形成し細胞を固定化することができると考えられる。今年度は、温度変化によりナノ粒子に導入したアルデヒド基の活性が温度変化により制御可能か検証した。非温度応答性の親水性高分子鎖の両末端からスクシンイミドを導入した温度応答性高分子を生長させた。このスクシンイミド基にアセタールを導入後、アルデヒド基に置換した。このナノ粒子は相転移温度より高温では会合体を形成するが、温度低下により崩壊する性質を持つことがわかった。次に、ナノ粒子を1級アミンを有する高分子と混合すると、相転移温度より高温ではゾル状対であるのに対し、温度低下によりゲルを形成した。この変化は不可逆性であった。さらに、この反応を低pHの条件下で行うとゲル形成は観測されないことから、ナノ粒子と1級アミンを有する高分子でシッフ塩基を形成したものと考えられる。この結果より、温度応答性ナノ粒子の構造変化を利用することによりナノ粒子に導入した官能基の活性を制御することがわかり、これにより生体物質などとの反応の制御により架橋構造を形成できることが示唆された。ナノ粒子を利用してがん細胞・組織周辺にネットワーク構造を形成させるために、温度応答性ナノ粒子の開発をおこなってきた。初年度は温度変化によりナノ粒子の構造を惹起し実際に生体分子などとの反応性が制御できるかを検証した。この結果、アルデヒド基を導入することで効率的に生体分子とナノ粒子を温度制御によって反応を促進できることが示された。生体で応用することを目標とする場合には、温度上昇により反応性を制御する方法を開発する必要があるが、温度上昇により反応性を制御するナノ粒子の開発も順調に進行している。この温度上昇により反応性を制御できるナノ粒子が完成すれば、次年度に検証する予定である細胞に対する評価も実施することができると考えられる。生体内で温度応答性のシステムを利用するには温度低下ではなく温度上昇により変化するものの方が応用しやすい。そこで、ナノ粒子の構造を温度上昇により制御する方法を開発する。温度上昇によりナノ粒子を崩壊させることは困難であることから、高分子の構造変化を利用して官能基の反応性を制御する方法を開発する必要がある。現在、温度変化によりナノ粒子の構造変化を惹起させる方法について検討しており、ナノ粒子の組成を最適化することで効率的に生体分子と反応させるための条件探索をおこなっている。このナノ粒子により生体分子と効率的にゲルを形成させる方法を構築した後、細胞に適用する予定である。これにより、細胞、生体分子とナノ粒子の反応が細胞に与える影響を検証し、本手法が細胞の機能を制御するのに有効な方法か検討する。

生体で応用することを目標とする場合には、温度上昇により反応性を制御する方法を開発する必要があるが、温度上昇により反応性を制御するナノ粒子の開発も順調に進行している。この温度上昇により反応性を制御できるナノ粒子が完成すれば、次年度に検証する予定である細胞に対する評価も実施することができると考えられる。生体内で温度応答性のシステムを利用するには温度低下ではなく温度上昇により変化するものの方が応用しやすい。そこで、ナノ粒子の構造を温度上昇により制御する方法を開発する。温度上昇によりナノ粒子を崩壊させることは困難であることから、高分子の構造変化を利用して官能基の反応性を制御する方法を開発する必要がある。現在、温度変化によりナノ粒子の構造変化を惹起させる方法について検討しており、ナノ粒子の組成を最適化することで効率的に生体分子と反応させるための条件探索をおこなっている。このナノ粒子により生体分子と効率的にゲルを形成させる方法を構築した後、細胞に適用する予定である。これにより、細胞、生体分子とナノ粒子の反応が細胞に与える影響を検証し、本手法が細胞の機能を制御するのに有効な方法か検討する。平成30年度に参加予定であったが、震災のために中止となり予定より旅費の予算が少なくなった。また、本年度は粒子の合成を中心に研究を進めたため、細胞実験のために見積もっていた予算を使用しなかった。細胞購入などの初期費用が多くかかることから、この繰り越した予算によって、細胞実験にかかる物品の購入に充当する予定である。