hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
縄文時代前半期における森林資源管理・利用体系の成立と植物移入の植物学的解明

千葉県雷下遺跡で行ってきた縄文時代早期後葉の研究成果をとりまとめた。雷下遺跡では,約81007100年前に厚さ4mほどの貝層が形成された。珪藻分析では,貝層が形成される直前ごろまでは海水が及んでいたのに,貝層が形成された時期には汽水生の珪藻が優占し,河口域の環境であったことが明らかとなった。早期後葉に河口域の環境となったのは,海側における砂堆の形成が関連していると想定された。花粉組成では,落葉広葉樹のコナラ属コナラ節とエノキ属-ムクノキ属がこの時期を通して優占し,クリが貝層の形成とともに10%を占め,貝層の中上部では30%ほどを占めた。虫媒花をつけるクリの花粉が,台地から50100mほど離れた雷下遺跡で1030%ほど検出されたことは,台地上か台地斜面にクリ林が人為的に維持されていたことを示していた。用材ではコナラ属コナラ節とムクノキ,エノキ属の利用がやや多く,クリも数点使われていたが,木材をつかった遺構が検出されておらず,前期以降に認められる建築・土木材としてのクリの多用は確認できなかった。編組製品にはタケ亜科とツヅラフジが使われており,関東地方における編組製品素材としてのタケ亜科の選択がすでに存在したことが確認できた。その他に,ノブドウやフジの茎が環状素材束として,サクラ属とケヤキの樹皮が樹皮素材片として検出された。種実では,ゴボウ近似種やアサ,ヒョウタン仲間,エゴマといった栽培植物が確認でき,クリやオニグルミ,ナラガシワなどとともに利用されていたと考えられた。福井県鳥浜貝塚から出土した縄文時代前期の漆器のうち,指定外の資料について調査を行った。塗膜の顔料分析では鉄が検出され,赤色顔料としてベンガラが用いられていたことが確認できた。クロスセクション分析では,前期と通して,顔料を含まない漆層と赤色顔料を含む漆層が複数回塗られていたことが確認できた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。千葉県市川市の雷下遺跡の出土植物遺体を対象として、昨年度に引き続いて調査を行なった。また佐賀県佐賀市の久富二本杉遺跡の堆積物を対象として、年代測定と花粉分析を行い、時代的な変遷を解析した。雷下遺跡は東京湾岸の砂州の内陸側にあり、縄文時代早期後葉に落葉広葉樹林を背景として、クリを中心とした森林資源管理がはじまっていた。雷下遺跡の木製品類の解析の結果、コナラ属コナラ節とムクノキ、エノキ属の利用が多く、これについでクリが利用されていることが明らかになった。ムクノキとエノキ属は後氷期前半に,当遺跡を含めて日本列島の西半分の各地で増加することが花粉分析から明らかとなっており、当遺跡の木材の選択は昨年度に報告した花粉分析の結果にそぐうものであった。またこの時期の雷下遺跡でクリの木材の利用が少ないのは、出土木材試料が、建築土木材ではなく、道具類の破片が多いためと考えられる。久富二本杉遺跡は縄文時代早期の多数の編組製品を出土した東名遺跡の対岸にあり、そこでは東名遺跡に居住がはじまる前の時期の堆積物から東名遺跡が廃絶した後の堆積物までが採取されており、当時の人々の森林資源利用の状況をさぐるのに好適な場所であると想定された。分析の結果、東名遺跡に人が居住する以前にはコナラ属アカガシ亜属が優占する照葉樹林が成立し、居住が始まると二次林の要素であるコナラ属コナラ節やケヤキ、エノキ属ームクノキといった落葉樹が増えたことが明らかになった。一方、東名遺跡が廃絶すると、再びアカガシ亜属が増加し、シイノキ属ーマテバシイ属とともに照葉樹林を形成した。クリはすべての時期で継続して出土しており、照葉樹林や二次林につねに混生していたことが明らかとなった。しかし、クリの花粉の出現率は低いままで、クリ林の管理は認められなかった。年度当初に調査を計画していた一部の遺跡では、調整が順調に進まず年度内に調査ができなかった。一方、それ以外の遺跡においては年度当初の予定通りの調査を行うことができ、所期の成果を上げることができた。また遺跡の当事者との調整により、年度当初には予定していない遺跡の試料も調査することができ、予想外の成果を上げることができた。福井県西部に位置する鳥浜貝塚において縄文時代草創期前期の植物利用を明らかにした。この貝塚において多数の層準で放射性炭素年代測定を行い、年代値が得られた堆積物資料を用いて花粉分析と大型植物化石分析から植生分布を復元した。鳥浜貝塚の周辺の植生は6つの植生期をへて変遷していた。下位より、約

14,00013,200 cal BPのコナラ亜属とブナを主とする落葉広葉樹林期、約11,600 cal BP前後のブナ林にスギが混生する時期、約11,5008700 cal BPのコナラ亜属林にクリが多数混生する時期、約87007100 cal BPのスギ林の優占とエノキ属-ムクノキ属樹木の拡大期、約71005700 cal BPのアカガシ亜属樹木の拡大期、約5700 cal BP以降のクリが優勢な時期である。クリは草創期末以降に杭などとして木材が利用されるようになり、早期前葉には周辺丘陵にクリを多く混生する落葉広葉樹林が形成された。ウルシの花粉は草創期の約13,200 cal BPおよび約12,600 cal BPから出土し、アサの花粉は約10,500 cal BPの早期前葉から出現し、両種が貝塚周辺に生育していた可能性を指摘した。ウルシは中国原産、アサはユーラシア原産とされており、草創期から早期前葉には両種が日本列島に将来されていたことを示唆した。一方、鳥浜貝塚周辺における人類の活動の証拠は、草創期から早期にかけては少なく、その頃の鳥浜貝塚はヒシの採集活動や漁撈などの生業の場にすぎないとする意見もある。しかし、クリは現在ブナやミズナラなどが優占する森林中に混生するのみであることから、草創期から早期におけるクリの多い林は人為的に作りだされた可能性が考えられた。一方、晩氷期における気候環境は現在とは大きく異なるため、クリが優占する森林が存在した可能性も否定できなかった。計画に通りに縄文時代草創期から前期の植物遺体の検討を推進している。一部、鳥浜貝塚の堆積物資料のように、発掘調査から長い年月がたった堆積物資料においては、経年変化によって種実遺体の状態が悪化していて、種実遺体の同定が十分にはできなった資料もあった。しかし、関東地方を中心として縄文時代早期から前期の新たな資料も研究対象とすることができている。その結果、これまでほとんど解明されていなかった縄文時代早期の集落周辺の植物資源の様相が把握できつつあり、研究は順調に進展している。佐賀県東名遺跡と福岡県中村町遺跡では縄文時代早期後葉から前期にムクロジやイヌビワ,コナラ属アカガシ亜属の木材をさいて編組製品を多数製作していた。実際に復元製作をするために現在の森林中で適当な素材を探索した結果,製作に適した素材を収集するのは簡単ではなく,当時は集落周辺でそうした資源をある程度管理していたことが想定された。関東地方の中央部に位置する埼玉県神明貝塚では,貝塚東側の谷奥と開析谷の出口付近の二地点においてボーリング試料が得られており,これまで関東地方では不明瞭であった縄文時代後・晩期以前の森林資源と管理の様相を花粉分析と年代測定から検討した。その結果,縄文時代前期初頭頃には周辺に海がおよんでいて花粉化石の保存状態は悪かったものの,コナラ亜属が優占する落葉広葉樹林が広がっていたと想定された。この時期でもクリが25%ほど見出されていて,森林中に多数混生していた可能性も考えられたが,海水域の堆積物のため詳細は解明できなかった。前期後半から中期前葉には谷奥でクリの花粉が継続的に1321%検出され,中期中葉から後期後葉には谷奥で2060%検出され,クリの純林が神明貝塚の近傍に存在していたことが想定された。前期後半から中期前葉にはウルシの花粉も見出され,この時期にすでにクリとウルシを中心とした森林資源管理が存在し,それが晩期前葉まで継続していたことが確認できた。神明貝塚は後期前半の集落をふくむ馬蹄貝塚であるが,後期前半だけでなく,それ以前やそれ以降の時期においても周辺で森林資源管理を伴う人の活動が継続的に行われていたことが確認できた。ただし神明貝塚の周辺では木製品や漆器は確認されておらず,森林資源の利用の実態は把握できなかった。縄文時代早期から前期における森林資源の利用を九州や北陸地方,関東地方で確認出来ている。とくに関東地方ではこれまで後・晩期の様相しか分からなかったが,早期から中期において,千葉県や埼玉県を中心として植物資源の管理の様相が花粉分析と年代測定から把握できた。その結果,これまで東日本で想定されていたクリとウルシを中心とした資源管理が早期後葉までは遡ることが確認できた。千葉県雷下遺跡で行ってきた縄文時代早期後葉の研究成果をとりまとめた。
利尿薬による糸球体濾過圧およびアンジオテンシノーゲン濾過量の変動を可視化する

慢性腎臓病において、糸球体濾過圧の上昇は糸球体から濾過されるアンジオテンシノーゲンを増加させ、腎障害の進展に関与する腎臓内レニン-アンジオテンシン系活性を亢進させる。慢性腎臓病で頻用される利尿薬は、その種類によって糸球体濾過圧に影響する可能性があるが、まだ明らかでない。本研究では、多光子レーザー顕微鏡を用いたin vivo imagingにより、腎糸球体毛細血管の血流像をリアルタイムに描出し、各種利尿薬を投与した際の糸球体濾過圧の変化を観察する。さらには、利尿薬によって糸球体濾過圧が変化することで、アンジオテンシノーゲン濾過量が変化することを証明する。
中性子散乱を利用した充放電中の蓄電池の伝導イオンの位置と流れの時空間４次元解析

本研究は、「蓄電池の中の伝導イオンの位置と伝導経路の解明、そして充放電中の時間的構造変化を調べ、電池特性との関連性を明らかにする」ことが目的である。今年度は、革新型蓄電池(正極/電解質/負極)を中心に、特にFイオンの伝導に関して研究を展開させる計画である。それらの研究は中性子回折、中性子準弾性散乱に関する実験を中心に進める。イオン伝導経路の解明は、結晶においてはMEM法、乱れた結晶やガラス状態の固体に関しては、我々が開発したBVS法を用いて行う。乱れた結晶やガラス状態における原子配列の解明にはRMCシミュレーションを活用する。特に、次世代革新型全固体蓄電池の固体電解質として着目されているフッ素系イオン伝導材料の研究では中性子・放射光X線の相補利用を目指し、それらの全散乱実験、回折実験を用いて研究を進行させる。これまでの成果として、PbSnF4イオン伝導材料の研究ではその構造を解明し、そのイオン伝導経路を明らかにしてきており、Fイオンの伝導は原子の欠陥を介在として行われ、その伝導経路はある結晶面を経由していることを示し、投稿論文として発表した。CeSrF系ではCe0.95Sr0.05F2.95の結晶構造を明らかにし、その結晶構造内でのFイオンの伝導経路がこれまで報告されていない経路であることが明らかにすることができ、現在その論文を投稿中である。さらに、コンバージョン電池の研究も開始し、その成果も2報の投稿論文として示すことができるまでに至っている。Liイオン電池関連の研究から次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)の研究の重心を移行させ、今まで以上の成果をあげている。すなわち、6件の査読付きオリジナル論文が投稿済みであり、かつ現在2件の投稿中の論文もある、また、海外と国内の学会発表も合わせて14件行っており、研究は計画以上に進んでいるものと考えている。次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)の研究を主軸において研究展開を図る計画である。同時に、充放電中の組織(結晶)変化や、イオン伝導経路の変位を視覚化するなど、今後、先進的な実験計画を行い、高度な解析システムの開発なども推し進めていきたいと考えている。本研究では、「蓄電池の中の伝導イオンの位置と伝導経路の解明、そして充放電中の時間的構造変化を調べ、電池特性との関連性を明らかにする」ことを目的としている。今年度は、全固体電池を意識し、世界最大のイオン伝導度を誇るLiGePS系に着目し、(Li2S)5(GeS2)(P2S5)ガラスとLi10GeP2S12結晶の構造を中性子散乱とX線回折で調べ、RMCにより3次元構造を視覚化し、BVS法により、Liイオンの伝導経路を明らかにした。そして、(Li2S)5(GeS2)(P2S5)ガラスからLi10GeP2S12結晶に変化すると伝導経路が多くなることから、Li10GeP2S12結晶のイオン伝導度の良さと伝導経路の関係を明らかにした。その論文をSolid State Ionicsに投稿し採択されている。さらに次世代型の革新電池の材料として着目されているフッ化物系のイオン伝導材料(PbSnF4)の構造を解明し、さらにそのフッ素イオンの伝導に関して、明らかにした。その成果を現在投稿中である。目的である充放電中(operando)の電池特性と伝導経路を明らかにするために、operandoで構造測定ができるシステムを現在作製中でである。2種類の革新電池を意識した固体電解質(超イオン電導体)の構造解析を行い、その論文を2報投稿している。Liイオン伝導固体の論文は採択され、フッ素イオン伝導固体の論文は、現在投稿中であり、研究は計画以上に進んでいると考えている。今年度は、全固体電池ならびに革新電池を意識して、LiイオンのみならずFイオンの伝導に関しても研究を行っている。それらの研究は中性子回折、中性子準弾性散乱に関する実験を中心に進めている。イオン伝導経路の解明は、結晶においてはMEM法、乱れた結晶やガラス状態の固体に関しては我々が開発したBVS法を用いて行っている。乱れた結晶やガラス状態における原子配列の解明にはRMC法を用いて行っている。特に、今年度から革新電池の研究を重点的に行っており、次世代型革新電池材料として着目されているフッ素系イオン伝導材料の研究を全散乱実験、回折実験を用いて実験を進行させている。また現在、Operanndo実験のための電池を組み、実験を開始している。一つの成果として、PbSnF4イオン伝導材料の研究ではその構造を解明し、そのイオン伝導経路を明らかにしてきており、Fイオンの伝導は原子の欠陥を介在として行われ、その伝導経路はある結晶面を経由していることを示し、投稿論文とした。BaLaF系のイオン伝導材料ではBaF4の結晶構造を明らかにするとともにBa0.6La0.4F2.4の結晶構造を明らかにし、その結晶構造にはBaF2には見られない格子間サイト上にフッ素イオンが存在し、Ba0.6La0.4F2.4のF(1)サイトに27%程度の欠損(空孔)が存在することを明らかにし、その欠損がイオン伝導経路になっていることを明らかにしている。一連の研究として、コンバージョン電池の研究も開始し、論文を1件投稿済みで、そのほか、3件の論文が投稿中である。

これまでのLiイオン電池関連の研究のみならず、次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)の研究も開始し、一定の成果として2件の投稿論文とするとともに3件の投稿中の論文もあり、研究は計画以上に進んでいるものと考えている。本研究は、「蓄電池の中の伝導イオンの位置と伝導経路の解明、そして充放電中の時間的構造変化を調べ、電池特性との関連性を明らかにする」ことが目的である。今年度は、革新型蓄電池(正極/電解質/負極)を中心に、特にFイオンの伝導に関して研究を展開させる計画である。それらの研究は中性子回折、中性子準弾性散乱に関する実験を中心に進める。イオン伝導経路の解明は、結晶においてはMEM法、乱れた結晶やガラス状態の固体に関しては、我々が開発したBVS法を用いて行う。乱れた結晶やガラス状態における原子配列の解明にはRMCシミュレーションを活用する。特に、次世代革新型全固体蓄電池の固体電解質として着目されているフッ素系イオン伝導材料の研究では中性子・放射光X線の相補利用を目指し、それらの全散乱実験、回折実験を用いて研究を進行させる。これまでの成果として、PbSnF4イオン伝導材料の研究ではその構造を解明し、そのイオン伝導経路を明らかにしてきており、Fイオンの伝導は原子の欠陥を介在として行われ、その伝導経路はある結晶面を経由していることを示し、投稿論文として発表した。CeSrF系ではCe0.95Sr0.05F2.95の結晶構造を明らかにし、その結晶構造内でのFイオンの伝導経路がこれまで報告されていない経路であることが明らかにすることができ、現在その論文を投稿中である。さらに、コンバージョン電池の研究も開始し、その成果も2報の投稿論文として示すことができるまでに至っている。Liイオン電池関連の研究から次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)の研究の重心を移行させ、今まで以上の成果をあげている。すなわち、6件の査読付きオリジナル論文が投稿済みであり、かつ現在2件の投稿中の論文もある、また、海外と国内の学会発表も合わせて14件行っており、研究は計画以上に進んでいるものと考えている。全固体電池や次世代型革新電池に対応する固体電解質(超イオン電導体)の構造とイオン伝導経路の解明をさらに進展させるとともに、充放電状態(operando)にしてイオン伝導の状況を測定することを進めている。単セル電池の作製、中性子散乱装置におけるセットなど高度な実験を行う計画で、進めている。Liイオン系を対象とする全固体電池のみならず次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)に関しても研究を速やかに展開したいと考えている。同時に充放電中(operanndo)の組織(結晶)の変化や、イオン伝導経路の変位に関しても明らかにするなど、高度な実験計画、高度な解析システムの構築などを推し進めていきたいと考えている。次世代型革新電池(アニオン型、カチオン型)の研究を主軸において研究展開を図る計画である。同時に、充放電中の組織(結晶)変化や、イオン伝導経路の変位を視覚化するなど、今後、先進的な実験計画を行い、高度な解析システムの開発なども推し進めていきたいと考えている。
ヴィクトリア期イギリスの職業女性の学習/学習支援活動に関する成人教育学的研究

本研究は、「家庭の天使」像が浸透していたヴィクトリア期イギリス社会において、職業女性がどのような自己形成や自己教育を経たのか、また職業的自立のためにどのような教育活動を展開したのかを明らかにすることを目的とするものである。これまで、本研究課題について、中産階級女性による「働くこと」を中核テーマとした社会運動、労働者階級女性の生活と労働実態についての調査を進めてきた。平成23年度は、それまでの調査の到達点と課題を踏まえた上で、(1)教育職と(2)医療職(看護師及び医師)に着目した研究を行った。(1)教育職女性については、ケンブリッジ大学における教育職女性の大学拡張講義の取り組みに注目し、その実際を明らかにした。この運動は、A.J.クラフ(Anne Jemima Clough)がケンブリッジ大学のJ.スチュアート(James Stuart)の協力を得て組織化した教育職女性の自己教育運動であった。この取り組みは、従来、イギリス成人教育史の一端として位置づけられてきたにも関わらず、具体的展開や意義については十分に検討されてきたとは言えない。この点を踏まえて本研究課題では、教育職女性が自らの課題を基盤として、どのような教育活動を展開し、そこで発展した学習方法論とはどのようなものであったかを明らかにした。(2)医療職については、女性の看護師及び医師養成の動きに着目した。例えば、F.ナイティンゲール(Florence Nightingale)は、従来、労働者階級女性が劣悪な環境で働く非専門的な仕事とされてきた看護職を、専門職として確立すると共に、養成学校を設立・運営した。また、イギリス国内で初めて医師資格を取得したE.G.アンダーソン(Elizabeth Garrett Anderson)は、女性と子どものための病院を設立するなどして、女性医師養成の道を開拓した。現時点では彼女らの思想や活動の実際を把握するにとどまるが、今後、これらの指導者が、職業的自立を展望しようとする女性に対してどのような役割を果たしたのかを明らかにしたい。本研究課題については、計画通りに進めることができた。本年度は、今までの「女性の職業」という一般的な枠組みから、女性専門職に着目できた点は大きな進歩であったと考える。一方で、成果発表が学会での口頭発表にとどまり、論文等の発表に至らなかったことはたいへん残念である。平成24年度には論文、学会発表で研究成果を発表する予定である。今後は、女性の専門職に焦点化した研究を進める。とりわけ、医師という専門職として代表的な職種において、いかにして女性が働く可能性とその意義を開拓・発展させたのか、指導者はどのような役割を果たしてきたのかを明らかにする。単なる歴史研究にとどまらず、現代的課題と照らし合わせて、どのような示唆を得られるのかを検討したい。このためには、社会学や社会思想、女性学などの分野の知見を用いながら、職業女性が直面する課題の本質を捉えることが必要であると考える。

単なる歴史研究にとどまらず、現代的課題と照らし合わせて、どのような示唆を得られるのかを検討したい。このためには、社会学や社会思想、女性学などの分野の知見を用いながら、職業女性が直面する課題の本質を捉えることが必要であると考える。
ゲノムが転移因子との進化的軍拡競争において獲得した防御機構の解明と育種への応用

本研究は、イネ活性型転移因子mPingおよびPingを抑制する遺伝要因を同定・単離することで、進化的軍拡競争における宿主ゲノムの転移因子への対抗手段の一端を明らかにし、得られた知見を新たな育種技術の開発に利用しようとするものである。イネ品種銀坊主には、600コピー以上のmPingが存在し、これらは元の挿入位置から切り出される活性型と切り出されない不活性型に大別される。これまで、銀坊主に由来する実験系統EM334は、不活性型mPingが転移する突然変異体であると考えられていた。本年度の研究において、EM334と銀坊主のPing挿入多型を比較解析したところ、EM334は銀坊主に銀坊主由来突然変異系統が自然交配して得られたF1雑種であることが明らかになった。このことから、EM334を用いてmPingを抑制する遺伝要因を解析することは不可能であるとの結論に至った。mPingが不活性化している日本晴が育成されるまでの交配組み合わせを遡るとmPingが活性化している銀坊主に行き当たりる。このことは、銀坊主から日本晴が育成されるまでの過程でmPingが不活性化したことを示唆している。日本晴の育成に用いられた祖先品種農林8号、農林22号、ヤマビコ、および中新110におけるmPing転移活性を調査したところ、これらの品種においてmPingは、転移活性を有しているものの、体細胞で転移している可能性が示唆された。一方、銀坊主の祖先品種である愛国および身代起では、mPingは今なお受精3日目の胚で活発に転移している可能性が示唆された。これらの結果から、初めに、銀坊主と朝日の交配によって農林8号が育成される過程で、受精3日目の胚におけるmPing転移活性が失われた。そして、ヤマビコと中新110の交配によって日本晴が育成される過程で、体細胞におけるmPing転移活性が失われたと考えられた。本年度の研究において、不活性型mPingが転移する突然変異体EM334が銀坊主と銀坊主由来細粒突然変異系統の自然交雑によって得られたF1雑種であったことから、当初計画していたmPingの転移を抑制するnon-epigeneticな機構の解明には至った。しかし、イネ品種日本晴が育成されるまでの過程におけるmPing転移活性を解析することで、mPingは2つの段階を経て不活性化した可能性を提示できた。これまでの研究から、熱帯ジャポニカ品種Oiranでは、Pingの発現を全身的に抑制する因子によってmPingの転移が抑制されていると考えられた。今年度は、Oiran(Pingは全身的に発現しない)と日本晴(Pingは葉身でのみ発現)の交雑後代F2のうち、Oiran由来のPingのみをもつ系統をPCRによってスクリーニングできた。平成31年度は、まず、日本晴が育成される過程でPingの時期・組織的発現が消失した原因を調査する。これまでの研究では、Ping内部のSNPが時期・組織特異的発現に寄与している可能性が示唆されている。このことから、日本晴の祖先品種におけるPingの発現時期と部位を調査し、Ping内部のSNPが時期・組織特異的発現におよぼす影響を明らかにする。次いで、OiranにおけるPingの発現抑制因子を同定する為に、RT-PCRによってOiran-日本晴のF3系統におけるPingの発現を調査する。F3系統の発現解析の結果に基づき、Pingが発現するF2 (日本晴型F2バルク)と発現しないF2 (Oiran型F2バルク)のDNAを等量混合し、次世代シーケンサーに供試する。Oiranと日本晴間のSNPについてSNP-indexを求め、日本晴型F2バルクとOiran型F2バルク間で異なるSNP-indexを示すゲノム領域を同定する。同定された領域にはOiranに由来するPing抑制因子が座乗する可能性が高い。

日本晴の育成に用いられた祖先品種農林8号、農林22号、ヤマビコ、および中新110におけるmPing転移活性を調査したところ、これらの品種においてmPingは、転移活性を有しているものの、体細胞で転移している可能性が示唆された。一方、銀坊主の祖先品種である愛国および身代起では、mPingは今なお受精3日目の胚で活発に転移している可能性が示唆された。これらの結果から、初めに、銀坊主と朝日の交配によって農林8号が育成される過程で、受精3日目の胚におけるmPing転移活性が失われた。そして、ヤマビコと中新110の交配によって日本晴が育成される過程で、体細胞におけるmPing転移活性が失われたと考えられた。本年度の研究において、不活性型mPingが転移する突然変異体EM334が銀坊主と銀坊主由来細粒突然変異系統の自然交雑によって得られたF1雑種であったことから、当初計画していたmPingの転移を抑制するnon-epigeneticな機構の解明には至った。しかし、イネ品種日本晴が育成されるまでの過程におけるmPing転移活性を解析することで、mPingは2つの段階を経て不活性化した可能性を提示できた。これまでの研究から、熱帯ジャポニカ品種Oiranでは、Pingの発現を全身的に抑制する因子によってmPingの転移が抑制されていると考えられた。今年度は、Oiran(Pingは全身的に発現しない)と日本晴(Pingは葉身でのみ発現)の交雑後代F2のうち、Oiran由来のPingのみをもつ系統をPCRによってスクリーニングできた。平成31年度は、まず、日本晴が育成される過程でPingの時期・組織的発現が消失した原因を調査する。これまでの研究では、Ping内部のSNPが時期・組織特異的発現に寄与している可能性が示唆されている。このことから、日本晴の祖先品種におけるPingの発現時期と部位を調査し、Ping内部のSNPが時期・組織特異的発現におよぼす影響を明らかにする。次いで、OiranにおけるPingの発現抑制因子を同定する為に、RT-PCRによってOiran-日本晴のF3系統におけるPingの発現を調査する。F3系統の発現解析の結果に基づき、Pingが発現するF2 (日本晴型F2バルク)と発現しないF2 (Oiran型F2バルク)のDNAを等量混合し、次世代シーケンサーに供試する。Oiranと日本晴間のSNPについてSNP-indexを求め、日本晴型F2バルクとOiran型F2バルク間で異なるSNP-indexを示すゲノム領域を同定する。同定された領域にはOiranに由来するPing抑制因子が座乗する可能性が高い。
海洋生態系における珪藻ブルームの役割

北海道沿岸に位置する噴火湾湾奥部において、春季ブルーム直前から夏季に渡って、動・植物プランクトンおよびバクテリア現存量、一次生産およびバクテリア生産、メソ及びマイクロ動物プランクトンの摂食速度を測定した。珪藻の春季ブルームは、水温3-4°C下で2月中旬から始まり、3月中旬まで続いた。この間、メソ(中型)動物プランクトンバイオマスは常に低く、これらによる摂食ロスも極めて低い。マイクロ(小型)動物プランクトンバイオマスはブルームと共に増加したが、これの珪藻類に対する摂食ロスはほとんどなかった。一方、バクテリア生産はブルームと共に増加する傾向を示すものの、バイオマスの増加は見られなかった。これらの観測結果に従って噴火湾におけるエネルギーフローを描き、生態系モデルを構築し、春季ブルーム前後における食物網とエネルギーフローの違いを明らかにした。春季ブルーム期には、メソ動物プランクトン現存量が著しく低いため、珪藻の一次生産からメソ動物プランクトンに流れるエネルギーは極めて少なく、珪藻が排泄する溶存有機物からバクテリア-原生動物-メソ動物プランクトンという「微生物ループ」が卓越した。これに対して、ブルーム期以降は、メソ動物プランクトンが排泄する無機栄養塩を使って渦鞭毛藻が増殖しこれをメソ動物プランクトンが摂食する経路と、メソ動物プランクトンが排泄した溶存有機物を使ってバクテリアが増殖し、これをマイクロ動物プランクトンが摂食し、さらにこれをメソ動物プランクトンが利用する経路の2経路が存在することが分かった。すなわち、珪藻の春季ブルームは溶存有機物を介して間接的にメソ動物プランクトンを支えているが、ブルーム以降はメソ動物プランクトンによって再生される無機及び有機の栄養素が食物網を循環している事を示すことができた。北海道沿岸に位置する噴火湾湾奥部において、春季ブルーム直前から夏季に渡って月1-2回、表層から10m間隔で水温、塩分、栄養塩類を測定し、動・植物プランクトンおよびバクテリア計数用の試水を採取した。同時に一次生産およびバクテリア生産を測定し、5m深度においては、植物プランクトンの増殖速度と摂食ロスを測定した。珪藻の春季ブルームは、水温3-4°C下で2月中旬から始まり、3月の中旬まで続いた。マイクロ(小型)動物プランクトンバイオマスはブルームと共に増加したが、これによる植物プランクトンに対する摂食ロスもほとんどなかった。これらはマイクロ動物プランクトンによる摂食ロスが影響していることを示唆しており、ブルーム期間中は、植物プランクトンから動物プランクトンへ直接つながる生食食物連鎖はほとんど機能しておらず、植物プランクトンが排泄する有機物によってバクテリア生産が増加し、これらをマイクロ動物プランクトンが摂食することで間接的に動物プランクトンへつながる微生物ループが相対的に重要であることを暗示する。北海道沿岸に位置する噴火湾湾奥部において、春季ブルーム直前から夏季に渡って、動・植物プランクトンおよびバクテリア現存量、一次生産およびバクテリア生産、メソ及びマイクロ動物プランクトンの摂食速度を測定し噴火湾におけるエネルギーフローを描き、これを元に生態系モデルを構築し、春季ブルーム前後における食物網とエネルギーフローの違いを明らかにした。春季ブルーム期には、メソ動物プランクトン現存量が著しく低いため珪藻の一次生産からメソ動物プランクトンに流れるエネルギーは極めて少なく、珪藻が排泄する溶存有機物からバクテリア-原生動物-メソ動物プランクトンという「微生物ループ」が卓越した。

これに対して、ブルーム期以降は、メソ動物プランクトンが排泄する無機栄養塩を使って渦鞭毛藻が増殖しこれをメソ動物プランクトンが摂食する経路と、メソ動物プランクトンが排泄した溶存有機物を使ってバクテリアが増殖し、これをマイクロ動物プランクトンが摂食し、さらにこれをメソ動物プランクトンが利用する経路の2経路が存在することが分かった。すなわち、珪藻の春季ブルームは溶存有機物を介して間接的にメソ動物プランクトンを支えているが、ブルーム以降はメソ動物プランクトンによって再生される無機及び有機の栄養素が食物網を循環している事を示すことができた。
動物モデルを用いた成人Ｔ細胞病発症に関連する免疫不全の解析

HTLV-1のtax遺伝子を導入したマウスは、成人T細胞白血病と類似の白血病を引き起こす。発症前の若齢のマウスの一部に皮膚感染症を引き起こすマウス群を見出した。これらマウスは接種細菌に対する排除能が低かった。また、Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)の上昇を認め、この増加が細菌排除能の低下をもたらしている可能性が示唆された。細菌排除能の低下が顕著なマウスと正常の排除能をもつマウスの白血病発症を長期間比較観察したが、白血病発症率に有意差は見いだせなかった。ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)は、60年もの長い潜伏期間の後、成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia: ATL)のような腫瘍性疾患およびHTLV-1関連脊髄症(HAM/TSP)、ブドウ膜炎といった炎症性疾患を引き起こす。このウイルスがコードするtax遺伝子がこれら疾患の発症に重要な役割を果たしていると考えられている。我々は、tax遺伝子をT細胞特異的に発症するTaxトランスジェニックマウスを作製し、解析をすすめてきた。Tax-Tgマウスは、主にATLとよく似たT細胞白血病とHAM/TSPの発症病態に類似した関節炎を引き起こす。一方、このマウスは若齢マウスから老齢マウスまで、ある一定の割合で皮膚炎をも引き起こす。前年度の解析により若齢マウスの皮膚炎は、細菌起因性のものであり、細菌排除能の低下によるものであることが強く示唆された。一方、老齢マウスの皮膚炎は、体表の30%以上の皮膚が脱落する火傷のような症状を示した。このマウスを詳細に検索したところ、表皮を壊死主体とするヒトの中毒性表皮壊死症(toxic epidermal necrolysis; TEN)と類似していることがわかった。また、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群(staphylococcal scalded skin syndrome; SSSS)も同様の所見を示し、マウスでも観察されることから鑑別をおこなった。表皮からのPCRによるブドウ球菌特異的シーケンス検出は全例陰性であり、病理所見では、表皮全層の壊死が観察され、SSSS特有の角質層のみの壊死ではなかった。以上のことからこの皮膚炎はTEN類似と推察した。また、このTEN類似マウスの若齢期での皮膚炎の有無との関係はみられなかった。現在、若齢期の皮膚炎の発症とT細胞白血病発症の関連について追跡している。ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)は、60年もの長い潜伏期間の後、成人T細胞白血病(ATL)およびHTLV-1関連脊髄症(HAM/TSP)、ブドウ膜炎といった炎症性疾患を引き起こす。このウイルスが発現するtax遺伝子がこれら疾患に重要な役割を果たしていると考えられている。我々は、そのtax遺伝子を発現するTaxトランスジェニックマウス(Tg)を作製し、解析を行ってきた。Tax-Tgマウスは主にATLと類似のT細胞白血病と炎症性疾患である関節炎を発症する。一方、このマウスは若齢マウスから老齢マウスまで、ある一定の割合で皮膚炎をも発症する。今回詳細に検討した結果、若齢マウスの皮膚炎は主に細菌起因性のものであり、老齢マウスは火傷様のヒトの中毒性表皮壊死症(toxic epidermal necrolysis: TEN)と似た症状であることを見出した。6か月齢未満のTax-Tgマウスに、マウス皮膚炎より分離された黄色ブドウ球菌を皮下に接種したところ、若齢マウスでみられる皮膚炎を再現できた。また、同腹のnon-Tgマウスに比し、膿瘍の大きさ、消失までの期間の有意な延長がみられた。このことから、6か月齢未満のマウスの接種細菌に対する防御能は低下しているものと考えられた。しかし、Tax-Tgおよびnon-Tgマウスの脾臓免疫細胞に差は認められなかった。老齢マウスの皮膚炎では体表の30%以上の皮膚がはがれ、火傷のような症状を示したが、培養検査では特定の病原細菌は検出されず、また病理検査では皮膚表皮全体の壊死を主体とする、TENに類似した病理所見であった。一方、脾臓細胞のFACS解析では、CD11b+GR-1+の骨髄系抑制細胞の増加が観察された。以上の所見から、Taxによって引き起こされる皮膚炎に関与する免疫不全状態は、若齢、老齢で異なることが示唆された。ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)pX領域がコードするtax遺伝子を導入したTaxトランスジェニック(Tg)マウスは、ヒトにおけるHTLV-1感染症と良く似た病態を引き起こす。主な疾患は、HTLV-1が引き起こす成人T細胞白血病(Adult T-cell leukemia: ATL)と良く似たT細胞白血病である。

我々は、この白血病を発症したマウスと同腹の未発症マウスの網羅的遺伝子解析によって、チロシンキナーゼの共通基質であるDokファミリー分子の発現低下を認めた。Dokファミリー分子は、現在Dok-17まで同定されており、そのうちDok-1、Dok-2およびDok-3は、血球系細胞に主に発現し、肺がん、組織球肉腫のマウスにおいて明らかな低下が観察され、がん抑制遺伝子であることが示唆されている。Tax-Tgマウスにおいて白血病を発症したマウスはDok-1、Dok-2およびDok-3すべての低下が観察された。また、まれに観察されるHTLV-1関連脊髄症/熱帯痙性麻痺(HAM/TSP)様疾患は、組織球肉腫の脊髄への移行であることを報告したが、このHAM/TSP様マウスにおいてもDok-1、Dok-2およびDok-3すべての低下が観察された。一方、これら疾患を発症していない未発症マウスにおいてはDok-2のみの発現低下が認められた。このことから、Tax発現によってDok-2の発現がまず抑制され、がん化(白血病化)の移行に伴い、Dok-1およびDok-3が低下することが考えられる。また、これら分子は免疫系に関与することも知られているため免疫不全状態にも関与している可能性が示唆される。実験動物学若齢マウスでは、明らかに細菌の排除能の低下が観察されるが、FACS解析によって脾臓におけるT細胞(CD4およびCD8)、B細胞の比率には変化がないことが明らかとなった。また、老齢マウスにおける皮膚炎は表皮全層の壊死、表皮-真皮間の細胞のアポトーシス、表皮におけるiNOSの発現が明らかとなった。また、FACS解析では、TおよびB細胞以外の細胞の増殖が確認された。このことは、若齢マウスにおける皮膚炎は、免疫不全状態における細菌排除能の低下、老齢マウスにおける皮膚炎はブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群(staphylococcal scalded skin syndrome; SSSS)と明確に区別できるTEN様であることが明らかとなった。Tax-Tgマウスの繁殖が順調ではなかったが、若齢マウスと老齢マウスにおける皮膚炎にかかわる免疫状態が異なることを明らかにできた。6か月齢未満のTax-Tgマウスにみられる細菌の排除能の低下原因についてさらに解析をすすめる。具体的には各免疫細胞の機能の解析を行う。また、この免疫低下をもたらすマウス群と白血病発症の関連性について継続的に観察を行う。現在まで、細菌排除能の低下したマウスと正常なマウスでの遺伝子解析の差はみられていないので、老齢マウス群を追加し解析する。6か月齢未満のマウスについて、引き続いて皮下に細菌を接種し、その防御能の差について同腹のTax-Tgマウスとnon-Tgマウスについて検討する。脾臓細胞の主なリンパ球系の細胞については差がみられなかったので、その他の免疫細胞について検討する。老齢マウスの皮膚炎はTENに類似しているが、CD11b+GR-1+の骨髄系抑制細胞の増加が観察され、その意義についてサイトカイン等を含め検索する。該当なし
熱力学と流動解析の統合による嫌気性消化槽内の無機物析出反応のメカニズム解明

嫌気性消化槽における無機物の析出に影響を与えるカルシウム、マグネシウム、リン酸および炭酸について、特に難溶性のリン酸塩と炭酸塩の挙動を計算するモデルを開発した。また、反応のための混合流動に影響を与える嫌気性消化汚泥のレオロジー特性を調べ、汚泥のチクソトロピー性を定量的に表現するモデルを開発した。難溶性カルシウム塩、マグネシウム塩であるリン酸カルシウム系化合物、リン酸マグネシウム化合物、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムの析出溶解反応を表すための反応マップを作成し、これを用いて嫌気性消化プロセスにおけるリン酸塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩の析出反応を数学モデルによって再現した。嫌気性消化プロセスは下水処理場で発生する廃棄物系バイオマスである余剰汚泥を減量しつつメタンガスを回収する技術である。余剰汚泥中に含まれるリンは嫌気性消化反応で液中に放出され、Caイオンをはじめとする水中の陽イオンと結合し、難溶性のリン酸塩として固定される。本年度はK市H下水処理場の嫌気性消化槽から採取した嫌気消化汚泥を種汚泥とし、2Lの槽を用いてK下水処理場の余剰汚泥をHRT=25日で供給した中温消化の連続実験を100日間に亘っておこなった。無機イオンの添加により意図的に溶解性リン濃度を低下させた。国際水協会(IWA)の活性汚泥モデルを嫌気性消化反応に拡張し、余剰汚泥の嫌気的自己消化によってリン、重炭酸やCaイオン等が一定比率で生成すると見なした。さらに、無機物の析出反応モデル化としては、Ca-P塩の反応において熱力学的に最も不安定で溶解度積が最も高いCaHPO4・2H2Oが最初に析出し、次第にCaHPO4を経てCa3(PO4)2に変化すると仮定した。また、CaCO3の反応は、その溶解度積に従ってCa-P塩の反応と独立したモデルとした。計算の溶解性成分濃度は実測値とかなりよく整合しており、作成のモデルで反応挙動を説明できると考えられた。運転経過やCaCl2の添加条件に従って変化する析出固体の種類の推定も可能であった。本モデルによって嫌気性消化槽の運転条件によって消化汚泥に固定されるリンの比率や脱離液として流出してしまうリンの量を制御できると考えられた。リンの挙動を明らかにすることを目的としてCa及びMgイオンを意図的に嫌気性消化槽に添加したラボスケールの連続実験を行なった。データ解析においては溶液の熱力学的平衡ならびに経時的に変化する固体析出種に着目し、有機物の消化と無機物の溶解・析出を表す数学モデルを作成した。K市H下水処理場の嫌気性消化槽から採取した嫌気消化汚泥を種汚泥とし、2Lの槽を用いてK下水処理場の余剰汚泥をHRT=25日で供給した中温消化(35C)の連続実験をMg添加系、Ca添加系の2系列で行った。各系列において、リン酸塩が析出するよう、添加濃度を決定した。難溶性のリン酸カルシウム3種、炭酸カルシウム、3種のリン酸マグネシウムの反応を含む嫌気性消化反応の数学モデルを作成した。Ca-P塩の反応においては、熱力学的に最も不安定で溶解度積が最も高いCaHPO42H2Oが最初に析出し、次第にCaHPO4を経てCa3(PO4)2に変化すると仮定した。また、CaCO3の反応は、その溶解度積に従ってCa-P塩の反応と独立していると考えた。Mg-P塩においても、同様にMgHPO4・3H2O,Mg3(PO4)2,リン酸マグネシウムアンモニウム(Mg(NH4)PO4・6H2O, MAP)の順に変化すると仮定した。作成モデルを用いて、実測の溶解性成分のシミュレーションを行った。これら計算の溶解性成分濃度は実測値とよく整合しており、液中の各溶解性無機物質の挙動は、溶解度積と比反応速度が異なる11種類の反応式で表現できると考えられた。意図的に高マグネシウム濃度とした条件での連続実験を行い、予定通りリン酸マグネシウムアンモニウム(MAP)の固体種を考慮したモデルを構築できた。世界における急激な人口増加に伴い、リン酸の肥料需要が高まると予想される。これについて、下水汚泥の嫌気性消化プロセスで生成する溶解性リン酸塩を析出・固定することで固形肥料として回収する方法を検討した。本方法は、嫌気性消化槽にアルカリ土類金属(カルシウム塩およびマグネシウム塩)を添加するもので、これによって難溶性のリン酸塩が析出する。析出する化学種は添加条件や嫌気性消化槽内の反応時間で変化し、リン酸の飽和溶解度も異なる。そこで、反応に関わる主要なイオン濃度の測定値をもとに、難溶性のリン酸塩が析出する反応を動力学的・熱力学的にモデル化した。連続実験では、塩化カルシウムを添加すると溶解性のカルシウム濃度とマグネシウム濃度が増加し、対応して溶解性リン酸濃度が低下することが観察された。これは、余剰汚泥の消化で可溶化したリン酸がカルシウムイオンと反応して難溶性のリン酸カルシウムに転換する一方で、溶解性リン酸の濃度が低下することでカルシウムイオンのリン酸マグネシウムの析出が抑制されたことによる。また、塩化カルシウムの添加を停止すると、いったん析出した炭酸カルシウムが急に溶出するようであった。一方の析出したリン酸カルシウムもわずかに再溶出するものの、嫌気性消化槽内では熱力学的に安定で溶解度積の低い化学種に徐々に遷移していくと考えられた。

難溶性カルシウム塩・マグネシウム塩であるリン酸カルシウム系化合物、リン酸マグネシウム系化合物、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムの析出反応をそれぞれ表すための反応マップを作成し、これに基づく連続実験および回分実験の測定値をシミュレーションした。嫌気性消化プロセスにおけるリン酸塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩の析出を反応モデルによって再現できた。嫌気性消化槽における無機物の析出に影響を与えるカルシウム、マグネシウム、リン酸および炭酸について、特に難溶性のリン酸塩と炭酸塩の挙動を計算するモデルを開発した。また、反応のための混合流動に影響を与える嫌気性消化汚泥のレオロジー特性を調べ、汚泥のチクソトロピー性を定量的に表現するモデルを開発した。難溶性カルシウム塩、マグネシウム塩であるリン酸カルシウム系化合物、リン酸マグネシウム化合物、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムの析出溶解反応を表すための反応マップを作成し、これを用いて嫌気性消化プロセスにおけるリン酸塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩の析出反応を数学モデルによって再現した。嫌気性消化プロセスにおける主たるイオン種の結晶析出の挙動を熱力学的及び反応速度論的にモデル化し、溶解性成分の実測値を良好にシミュレーションすることができた。マグネシウム及びカルシウムの添加濃度を段階的に増加させた条件で試験を行う。これにより析出反応モデルの高精度化を図り、精度の高いダイナミックシミュレーションができるようにする。環境工学,用排水処理,流体力学,高マグネシウム、高アンモニア濃度の条件で連続実験の行い、ヒドロキシアパタイト(HAP)やストラバイト(MAP)の固体種も考慮したモデルを構築する。これにより嫌気性消化槽における最適なイオン添加リン除去プロセスを検討できるようにする。本年度購入予定であった物品を他予算で購入したため本年度使用予定であった物品を他予算で購入したため。次年度に物品購入で使用予定次年度物品購入に使用予定。
耐故障ディジ-チェーン方式バスア-ビタの実現法

バスア-ビタのうち,デイジ-チェーン方式をとるものについての耐故障化を目的として,調停バスライン,調停回路における単一縮退故障を対象に,故障が発生した場合においても,唯一つのモジュールにバス使用権を与えることができる調停機構の実現について研究を行なった.デイジ-チェーン方式のア-ビタを耐故障化するためには,故障による信号変化が調停要求とされないために,チェーンを少くとも3系統用意する必要がある.しかし,複数のチェーンによりシステムを構成した場合,システムに故障が存在しない状態においても信号伝播遅延のばらつきなどの理由で,リクエスタの状態に不一致が発生する可能性がある.そこで,通常動作時のチェーン上の信号伝播は,バス要求時には信号値「1」が増え,バス開放時には「1」が減るという一方向性を持つことに注目し,多数決回路を利用し,3つの系の同期をとる3重化回路構成を採用した.つぎに,リクエスタの外部動作仕様について検討した.リクエスタ回路間には許可信号のチェーンが構成されが,この信号線の固定故障を想定し,信号伝播の遅延による不一致を吸収するためにリクエスタに要求される動作の外部仕様を有限状態機械として定義した.決定したリクエスタの外部仕様が期待している耐故障性を実現できるかについて,想定される全ての信号変化および故障発生のタイミングについて考察し,ごく限られた特殊な故障発生のタイミングを除いて正常な調停動作が行えることを確認した.また,上記の特殊なタイミングでの故障発生についても一時的な擾乱ののちに正常な状態に復帰できることを確認した.以上のように耐故障デイジ-チェーン方式バスア-ビタの実現法として,3重化チェーンによる構成法について考察し,リクエスタ間のチェーン上に発生する故障についての耐故障性を確認した.バスア-ビタのうち,デイジ-チェーン方式をとるものについての耐故障化を目的として,調停バスライン,調停回路における単一縮退故障を対象に,故障が発生した場合においても,唯一つのモジュールにバス使用権を与えることができる調停機構の実現について研究を行なった.デイジ-チェーン方式のア-ビタを耐故障化するためには,故障による信号変化が調停要求とされないために,チェーンを少くとも3系統用意する必要がある.しかし,複数のチェーンによりシステムを構成した場合,システムに故障が存在しない状態においても信号伝播遅延のばらつきなどの理由で,リクエスタの状態に不一致が発生する可能性がある.そこで,通常動作時のチェーン上の信号伝播は,バス要求時には信号値「1」が増え,バス開放時には「1」が減るという一方向性を持つことに注目し,多数決回路を利用し,3つの系の同期をとる3重化回路構成を採用した.つぎに,リクエスタの外部動作仕様について検討した.リクエスタ回路間には許可信号のチェーンが構成されが,この信号線の固定故障を想定し,信号伝播の遅延による不一致を吸収するためにリクエスタに要求される動作の外部仕様を有限状態機械として定義した.決定したリクエスタの外部仕様が期待している耐故障性を実現できるかについて,想定される全ての信号変化および故障発生のタイミングについて考察し,ごく限られた特殊な故障発生のタイミングを除いて正常な調停動作が行えることを確認した.また,上記の特殊なタイミングでの故障発生についても一時的な擾乱ののちに正常な状態に復帰できることを確認した.以上のように耐故障デイジ-チェーン方式バスア-ビタの実現法として,3重化チェーンによる構成法について考察し,リクエスタ間のチェーン上に発生する故障についての耐故障性を確認した.
融合タンパク質による電子顕微鏡用分子ラベルの開発

本研究課題では,目的タンパク質の特定部位に金属タンパク質を融合させることによる電子顕微鏡用部位特異的分子ラベルの開発を行っている.計画としては,(1)ラベル用金属タンパク質としてメタロチオネインを数分子つなげたポリメタロチオネイン遺伝子を作製し,これを発現・精製した後,金属イオンを取り込ませて電子顕微鏡下で観察し,ラベルとして最適なメタロチオネインの数を推定する,(2)適当な長さのポリメタロチオネイン遺伝子をキネシン重鎖遺伝子の下流に結合し,これを発現・精製した後,微小管の表面に密に結合させて,金属イオンでラベルした後電子顕微鏡で観察し,ラベルの効率,分解能を評価するというものである.本年度の計画として,まず(1)のポリメタロチオネイン遺伝子を作製するため,クローンプラスミドからヒトメタロチオネイン遺伝子を切りだし,これにグリシンを3残基コードするタグを付けて一挙にベクターへの挿入を行った.しかし,この方法では何故か上手くポリメタロチオネイン遺伝子をクローニングすることが出来なかった.そこで,方法を変えて,タグとしてのグリシン3残基とその下流に一過性のクローニングサイトを導入した目的遺伝子のプライマーを合成し,PCR法によって目的遺伝子のインサートを作製して,これをタンパク発現ベクターにクローニングすることにした.この方法では,一回のラーゲーションによって確実に1個のメタロチオネインが挿入され,この操作を繰り返すことによって目的の長さのポリメタロチオネインを作製することが出来る.さらに,これを最初キネシン遺伝子のクローニングから行うことにより,一挙に(1)と(2)の検証が可能となる.現在,合成したプライマーよりタグと一過性クローニングサイトを持ったキネシンインサートをPCR法により作製し,このクローニングを行っているところである.本研究課題では,目的タンパク質の特定部位に金属タンパク質を融合させることによる電子顕微鏡用部位特異的分子ラベルの開発を行っている.計画としては,(1)ラベル用金属タンパク質としてメタロチオネインを数分子つなげたポリメタロチオネイン遺伝子を作製し,これを発現・精製した後,金属イオンを取り込ませて電子顕微鏡下で観察し,ラベルとして最適なメタロチオネインの数を推定する,(2)適当な長さのポリメタロチオネイン遺伝子をキネシン重鎖遺伝子の下流に結合し,これを発現・精製した後,微小管の表面に密に結合させて,金属イオンでラベルした後電子顕微鏡で観察し,ラベルの効率,分解能を評価するというものである.本年度の計画として,まず(1)のポリメタロチオネイン遺伝子を作製するため,クローンプラスミドからヒトメタロチオネイン遺伝子を切りだし,これにグリシンを3残基コードするタグを付けて一挙にベクターへの挿入を行った.しかし,この方法では何故か上手くポリメタロチオネイン遺伝子をクローニングすることが出来なかった.そこで,方法を変えて,タグとしてのグリシン3残基とその下流に一過性のクローニングサイトを導入した目的遺伝子のプライマーを合成し,PCR法によって目的遺伝子のインサートを作製して,これをタンパク発現ベクターにクローニングすることにした.この方法では,一回のラーゲーションによって確実に1個のメタロチオネインが挿入され,この操作を繰り返すことによって目的の長さのポリメタロチオネインを作製することが出来る.さらに,これを最初キネシン遺伝子のクローニングから行うことにより,一挙に(1)と(2)の検証が可能となる.現在,合成したプライマーよりタグと一過性クローニングサイトを持ったキネシンインサートをPCR法により作製し,このクローニングを行っているところである.
クロマチン・レベルの制御シグナル

前年に引続きマウス及びヒトのリボソームRNA遺伝子(rDNA)と、それぞれの種に由来する細胞抽出液を用いたIn Vitroの転写系によって、1.転写開始複合体の形成機構、及び、2.プロモーター変異体の転写因子結合能、について解析を行なった。1.ではpreincubation-pulse label実験によって、転写開始複合体の形成にはRNAポリメラーゼ【I】の他に少なくとも2つの補助因子(TFIDおよびTFIA)が必要である事が明らかとなった。即ち、鋳型rDNAに先ずTFIDが結合し、続いてTFIAとRNAポリメラーゼが、恐らくこの順序に結合して前開始結合体となる。更に、他のNTPを加えると、鎖伸長が始まり、この時、RNAポリメラーゼ【I】のみが鎖伸長を行ない、TFID、TFIAはプロモーター部位に残って、次のRNAポリメラーゼ【I】の進入を迎え、新たな転写開始が起こる。2.では、遺伝子工学的に作成したrDNA変異体を細胞抽出液とインキュベートし、その後に野生型rDNAを加えて転写を行なわせ前者の転写必須因子の結合能を定量的に測定する方法を開発し、各種の欠失並びに置換突然変異体を比較した。その結果、5′側の欠失変異体のTFID結合能の低大は、転写効率の低下とほぼ比例し、-40-1の間が、その結合に必要である事がわかった。又3′側の欠失変異体の結合能の低下は、転写効率の低下より遅く、+40+1の間は結合能には大きな影響はないが、転写開始反応には重要であることが証明された。又、転写効率が10%以下になる-16のG→A変異体は、結合能が低下しているが、転写活性を全く失なった-7のG→A変異体は、野生型とほぼ同様の結合能を持っている。従ってこの変異体はTFIDの結合から先の転写開始反応に障碍があるものと考えられる。