hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シロイヌナズナ変異体ｓｙｐ２２－１の抑圧変異体の解析によるＡＲＡ６の機能の究明

今年度はsyp22-1の抑圧変異vas6Dの原因遺伝子VAS6について、その機能や抑圧のメカニズム、VAS6の輸送経路の解析を行った。昨年度中の結果から、VAS6と同様の局在を示すホモログVAS6hの機能欠失変異体vas6h-1とVAS6の機能欠失変異体vas6-1の二重変異体は致死であることが明らかになった。自家受粉させた次世代での分離比や、種子の表現型の観察の結果から、この二重変異体はハート型胚のステージで胚発生の止まる胚致死性の表現型を示すことが明らかとなった。syp22-1の花成遅延の表現型に関して、vas6Dとvas6-1どちらの変異もsyp22-1におけるFLCの発現量の上昇を抑圧しないことが昨年度中に明らかになった。そこで、FLCの下流因子であるFT、LFY、SOC1についてsyp22-1、syp22-1 vas6Dとsyp22-1 vas6-1植物体における発現の解析を行った。FTはsyp22-1背景で発現量が上昇していたものの、vas6Dとvas6-1で抑圧はみられなかった。またLFY、SOC1はいずれにおいても野生型と発現量に差はなかった。VAS6はこれらの遺伝子よりもさらに下流の部分に関わるか、FLCを経由しない経路を介して花成に関与しているかの2つの可能性を考えている。昨年度中に明らかになったVAS6の色素体への局在に必要な配列のうち、N-グリコシル化されうる配列に変異を入れた蛍光タグ付きVAS6を、シロイヌナズナ培養細胞で一過的に発現させた。その局在は野生型のものと差が見られなかったことから、先行研究で知られているイネのERとゴルジ体を経由する経路とは異なる輸送経路を介してVAS6が輸送されていることが考えられる。また、各種オルガネラマーカーとの局在比較から、VAS6はARA7とは独立したARA6エンドソームに局在していることが示された。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は抑圧変異vas6の抑圧様式の解析と、VAS6の細胞内局在についての解析を中心に行った。vas6変異の抑圧様式を調べるために、syp22-1変異体の表現型から、葉の縮れ、花茎の伸長遅延、花成遅延、TGG1の転写産物の蓄積の4つの表現型について解析を行った。ara6-1変異がこれら4つの表現型を抑圧するのと同様に、syp22-1 vas6でも4つの表現型いずれについても抑圧が見られた。この結果から、ARA6とVAS6の機能的な関係性が示唆された。vas6変異の候補遺伝子について、この遺伝子が責任遺伝子であることを確認するために、変異型のゲノム断片をクローニングし、syp22-1植物体に導入した。この形質転換体の表現型を解析した結果、この候補遺伝子の変異型のゲノム断片はsyp22-1に対する抑圧活性を持っており、確かにこの遺伝子がvas6の原因遺伝子であるということが確認された。ただし、花成遅延の表現型は抑圧されなかった。さらに、VAS6のT-DNA挿入変異体vas6-1について解析を行った。発現解析の結果、vas6-1は全長での遺伝子発現のみられない、機能欠失変異体であることが明らかになった。vas6-1とsyp22-1の二重変異体について表現型の解析を行ったところ、花成遅延の抑圧がみられたものの、葉の縮れと花茎の伸長、TGG1タンパクの蓄積の表現型は抑圧されなかった。これらのことから、syp22-1の表現型ごとに、異なる仕組みの抑圧機構が存在することが示唆された。また、VAS6の色素体への局在について、局在に必要な領域を決定するために、シロイヌナズナのプロトプラストに蛍光タンパク質との融合タンパク質を一過的に発現させて、その局在を解析した。VAS6の部分断片に蛍光タグをつけたものの局在の観察を行った結果から、N末端側、C末端側の配列は色素体への局在に必要でなく、58アミノ酸からなる配列だけで色素体に局在することが可能であることを明らかにした。今年度は、syp22-1の優性抑圧変異vas6Dの原因遺伝子VAS6について、抑圧様式とそれに関わる経路の解析を行った。昨年度の結果から、vas6変異は完全優性ではないのではないかと考え、VAS6の機能欠失アリルvas6-1を用いてvas6+/D及びvas6D/-1の葉の縮れ、花茎の伸長遅延、花成遅延の表現型について抑圧の有無を調べた。その結果、花成遅延については前者では抑圧がみられず、後者ではみられる一方、葉の縮れ、花茎の伸長の表現型については、vas6Dホモに比べてどちらも弱い抑圧活性を示すという結果が得られた。これらのことから、vas6Dは花成遅延については機能欠質アリルで劣性、葉の縮れと花茎の伸長の表現型については不完全優性の変異であると考えている。シロイヌナズナにはVAS6を含めて7つのパラログが存在しており、まだ解析の行われていない3つについてシロイヌナズナ培養細胞の一過的発現系を用いて細胞内局在を観察した。

3つのうち1つはVAS6と同様に色素体とドット状の構造に、残る2つはミトコンドリアに局在していた。そこでVAS6と同様の局在を示したパラログのT-DNA挿入変異とvas6-1の二重変異体を作製したところ、致死になることが明らかになった。このことから、VAS6には機能的パラログが1つ存在し、この冗長性が葉と花茎の表現型について、vas6Dを不完全優性にしていることが示唆された先行研究からsyp22-1背景でのFLCの発現の上昇が花成遅延の原因であることが明らかになっている。そこで、qRT-PCRでsyp22-1 vas6Dとsyp22-1vas6-1のFLCの発現量を測定した。どちらの植物体でもFLCの発現量の抑圧は見られず、VAS6の機能欠失はFLCよりも下流の部分に関わるか、FLCを経由しない経路を介して花成を促進しているかの2つの可能性を考えている。遺伝学的な解析については当初の想定以上の進展があり、vas6Dの抑圧様式についてより詳細に明らかにすることができた。また、花成の表現型についてVAS6が関わる経路の解析に着手し、少なくともFLCの上流ではないことを明らかにした。VAS6のパラログについて細胞内局在を解析することで、VAS6と同様の局在を示すホモログが1つ存在することが明らかになり、二重変異体の解析からそれがVAS6と機能的にホモログであることを示すことができた。さらに昨年度からの課題であったシロイヌナズナ植物体でのVAS6の局在の観察だが、薬剤誘導性プロモーターでタグ付きタンパクの発現を駆動する形質転換体を作製し、その観察準備を進めていることから、おおむね順調な達成度と判断した。今年度はsyp22-1の抑圧変異vas6Dの原因遺伝子VAS6について、その機能や抑圧のメカニズム、VAS6の輸送経路の解析を行った。昨年度中の結果から、VAS6と同様の局在を示すホモログVAS6hの機能欠失変異体vas6h-1とVAS6の機能欠失変異体vas6-1の二重変異体は致死であることが明らかになった。自家受粉させた次世代での分離比や、種子の表現型の観察の結果から、この二重変異体はハート型胚のステージで胚発生の止まる胚致死性の表現型を示すことが明らかとなった。syp22-1の花成遅延の表現型に関して、vas6Dとvas6-1どちらの変異もsyp22-1におけるFLCの発現量の上昇を抑圧しないことが昨年度中に明らかになった。そこで、FLCの下流因子であるFT、LFY、SOC1についてsyp22-1、syp22-1 vas6Dとsyp22-1 vas6-1植物体における発現の解析を行った。FTはsyp22-1背景で発現量が上昇していたものの、vas6Dとvas6-1で抑圧はみられなかった。またLFY、SOC1はいずれにおいても野生型と発現量に差はなかった。VAS6はこれらの遺伝子よりもさらに下流の部分に関わるか、FLCを経由しない経路を介して花成に関与しているかの2つの可能性を考えている。昨年度中に明らかになったVAS6の色素体への局在に必要な配列のうち、N-グリコシル化されうる配列に変異を入れた蛍光タグ付きVAS6を、シロイヌナズナ培養細胞で一過的に発現させた。その局在は野生型のものと差が見られなかったことから、先行研究で知られているイネのERとゴルジ体を経由する経路とは異なる輸送経路を介してVAS6が輸送されていることが考えられる。また、各種オルガネラマーカーとの局在比較から、VAS6はARA7とは独立したARA6エンドソームに局在していることが示された。遺伝学的な解析については当初の計画以上の速さで進展があった。
生体内モーションキャプチャシステムを応用した口腔機能総合解析システムの開発

本研究では、既存の装置では不可能であった下顎および舌の立体的な運動の同期的測定を行うことにより咀嚼、嚥下、発音などの口腔機能をより正確に評価し、さらには失われた機能に対するリハビリテーションにも応用可能なシステムを構築することを目的としている。具体的には、複数の小型永久磁石を磁気マーカとして利用した生体内直流磁界式モーションキャプチャシステムおよび6自由度運動計測方法での基本技術をベースとし、共同研究機関の本学電気通信研究所で開発に成功した常温では世界最高感度を有する高周波キャリア型薄膜磁界センサおよび交流磁界式のLC共振型ワイヤレス磁気マーカを導入することにより、口腔機能測定用として十分満足できるだけの100μm以下の位置精度を獲得することを目標とする。本年度は、口腔機能測定用として特化して開発された新システムにより、実際に被験者に対し測定を行い、実用化へ向けてさらなる改善を行った。(1)データ解析用ソフトウェアの開発下顎や舌に配置された複数の磁気マーカより同期的に得られた計測データを解析し、下顎や舌を立体として構築した上で、6自由度運動として画面表示装置に表示するソフトウェアの開発を行った。(2)システム全体の正常動作の確認磁気シールドルーム内において、非磁性体材料のみから製作された顎模型モデルを利用し、システム全体の正常動作の確認を行った。サンプリング速度やデータ処理速度に問題があったため、磁界センサ信号処理用電子回路、データ解析用ソフトウェアの修正を行い、問題点を解決した。(3)システムの改善,利便性の向上開発されたシステムを用い、あらかじめ本研究について充分な説明を行い、同意を得たボランティアに対し口腔機能の測定を行ったところ、なめらかな運動軌跡を表記できることが確認された。今後、口腔機能のリアルタイム表示や口腔機能評価の自動化など、さらに操作性を高めたシステム構築を行っていく予定である。本年度は、すでに完成している生体内直流磁界式モーションキャプチャシステムおよび6自由度運動計測方法での基本技術をベースとし、高感度高周波キャリア型薄膜磁界センサおよび交流磁界式のLC共振型ワイヤレス磁気マーカを導入することにより、口腔機能測定用として特化したシステムの開発を行った。(1)LC共振型ワイヤレス磁気マーカの製作高周波用高透磁率薄型磁性体を用いた集積インダクタおよび薄膜コンデンサからなる大きさ3mm×3mm、厚さ100μm程度の超小型ワイヤレス磁気マーカを製作した。(2)センサ信号処理用電子回路の製作共振周波数の異なる複数の磁気マーカからの情報を、磁界センサにより3次元的に計測するためのセンサ信号処理用電気回路の製作を行った。(3)データ解析用ソフトウェアの開発下顎や舌に配置された複数の磁気マーカより同期的に得られた計測データを解析し、下顎や舌を立体として構築した上で、6自由度運動として画面表示装置に表示するソフトウェアの開発を行った。現在、正常動作を確認しながら改良を行っている。
光源の揺らぎ成分を利用した受動的距離計測のための広帯域基礎研究

本研究は、太陽光強度の揺らぎや蛍光灯光の変動成分を信号として、受動的に距離計測を行うための基礎的研究である。ビデオカメラ上で物体の明るさ変動を観測し、光源の揺らぎ成分との相関計算を精密に行えば、二次元画像各点の距離情報を一挙に獲得できることになるが、サンプリング間隔以下の微小時間差の決定が必要である。計算上は、大量の観測データによりnsオーダに相当する距離測定が期待できるが、現実の対象では、信号の帯域幅や、光源以外の変動要因、空間相関度、サンプリング時間長等の現実的制約が大きい。そこで、これらの影響を調べるため、イメージディセクタを利用したランダムアクセスカメラにより、従来より広帯域の測定系で現実的対象の揺らぎ成分の観測を行った。太陽光を大本の光源とする物体の輝度変化の観測では、1Hz以下でほぼ1/f特性を示し、それ以上の周波数ではフラットなノイズ特性を示した。高周波域でフラットなのは、カメラが蓄積効果を持たないので、光のランダムパルス的性質が現われたものと考えられる。したがって、相互相関の計算には、強度の大きい低周波成分を有効利用する必要がある。一方、蛍光灯を光源とした観測では、周期成分が充分にあるため、相関度は高く、カメラ視野上でずらした点間の相関もあり、距離と相関度の関係を求めることができた。ただし、光源サイズと物体の散乱特性の影響も考える必要があった。今後、揺らぎ成分の空間特性と光源の統計モデル、初期の段階で有効な情報を抽出する方法について検討する必要がある。
プラズマ流におけるイオンおよびラジカル生成に関する量子力学的研究

昨年度からの研究に引き続き、電子一個を有する水素原子における電子衝突イオン化、すなわち、(e,2e)プロセスの理論と実験の精密な比較検討を行った。昨年度の成果と比較し、入射電子が引き起こすPolarization(分極)の物理的効果をより明確に吟味するとともに、既に開発された理論モデルおよび数値解析手法の有効性に関するより数理学的な研究を行った。ここで開発した理論モデルおよび数値解析手法の特徴は、部分波展開した半径方向基礎方程式(2階の微分方程式に交換項と呼ばれる積分項を含んだ形となる)において、交換項に対する近似を行わないことにある。これによって、入射電子のエネルギーが比較的低い場合、すなわち、実際のプロセスプラズマにおける電子エネルギー領域での、イオン化衝突現象の詳細な記述が可能になり、その解析精度も大幅に向上した。さらに、本研究によって、三重微分断面積を定量的に予測することが初めて可能となり、また、交換項やPolarizationの効果がより明確になった。英国ケンブリッジ大学が管理している実験データと比較検討を行った結果、従来の理論解析結果よりも実験事実をよりよく再現できることもわかった。これらの成果はまもなく専門誌に掲載予定であり、さらに、2001年12月下旬英国ケンブリッジ大学モードリン学寮で開催された「電子散乱に関する国際会議」において、研究代表者は招待講演を依頼され、A Study of Iterative Methods for Integro-Differential Equations of Electron-Atom Scatteringと題したクーロンフェイズシフトの効率的数値解析法に関する研究を紹介した。新しい計算手法を提案し、その効果について論じ、実験結果とよりよい一致を見たことが高く評価された。ヘリウム原子(e,2e)プロセスの量子力学的解明を行う前段階として,電子の一つ少ない水素原子(e,2e)プロセスの理論と実験の精密な比較検討を行った.ここで開発した理論モデルおよび数値解析手法の概要は次のとおりである.入射電子および射出電子は反対称性(フェルミ粒子としての取り扱い),Identical(付加弁別性)およびスピンを考慮した.衝突前の原子は,基底状態だけでなく種々の内部状態(量子数)を考慮し,衝突後は励起(ラジカル化),イオン化を考える.基礎方程式は2階の微分方程式に積分項(交換項)を含んだ形となるが,従来この交換項に対する種々の近似方法が考えられてきた.しかし,研究代表者は,数値流体工学で培ったノウハウをいかし,近似を行わない数値解法を開発した.これによって,入射電子のより低エネルギー領域での解析精度が格段に向上し,実際のプロセスプラズマにおける電子エネルギー領域を正確にカバーすることができた.また,基礎方程式は線形であるが,衝突断面積の計算には波動関数を少なくとも7桁精度で求めておかなければならない.さらに,クーロンポテンシャルは無限遠方までその影響が及ぶ(カットオフのテクニックも使用可能であるが,将来,光子による励起イオン化を考えたいので,このテクニックは使わない)ので,クーロンフェイズシフト(位相のずれ)をも計算しなければならない.これらを考慮した高精度数値解析手法の開発にも成功し,三重微分断面積を定量的に予測することが初めて可能となった.英国ケンブリッジ大学が管理している実験データと比較検討を行った結果,従来の理論解析結果よりも実験事実をよりよく再現できることがわかった.これらの成果はまもなく専門誌に掲載予定であり,さらに,2001年12月英国で開催予定の「電子散乱に関する国際会議」において,研究代表者は招待講演を依頼されている.昨年度からの研究に引き続き、電子一個を有する水素原子における電子衝突イオン化、すなわち、(e,2e)プロセスの理論と実験の精密な比較検討を行った。
次世代高速マルチメディアPHS方式実現の研究

本研究では、20Mb/sを超える高速マルチメディア通信を屋内外で実現できるPHSシステムの実現を目指して研究を実施した。その結果、以下のことが明らかになった。1.屋内外の伝搬測定を実施した。屋外では、従来のPHSシステムに近い環境で測定し、100ns前後の遅延分散を確認した。また同時にMMACシステムによる誤り率測定を実施し、誤り率特性との因果関係を明らかにした。屋内では高分解能の遅延時間測定装置により直接的に遅延到来波をモデル化可能な測定結果を得ることができ、計算機シミュレーションによる直接的な利用が可能であることを確認した。2.仮想並列計算機を用いた計算機シミュレーションを実施し、従来のOFDMシステムの耐多重波性を確認すると共に、屋内でのOFDMパラメタの改善余地のあることを確認した。また、屋内伝搬測定結果を用いた計算機シミュレーションを検討し、伝搬データをほぼそのまま利用した計算機シミュレーションを実施できることを確認した。3.MMAC-HiSWAN方式による実機を開発し、屋外での伝送実験を行い、これまで検討してきたシンボル同期を始めとする回路方式の動作を確認すると共に、遅延プロファイルに基づく誤り率改善への方策の検討を行った。4.移動を前提としたマルチメディアPHSシステムを実現するためにまず、干渉検出による通信品質評価を利用したシンボル同期法を検討し、計算機シミュレーションによりその効果を検討し、見通しを得た。また、ニューラルネットワークに基づく適応型判定回路を提案し多重波による波形歪補償を実現できることを確認した。5.更に、時々刻々変化する伝搬路状況に対応できる適応伝送速度OFDM変調方式を検討するため、DAPSK-COFDM方式を提案し、硬判定ビタビ復号方式による符号合成ダイバーシチ受信を適用して効果のあることを確認した。6.これらに空間ダイバーシチ枝を組合わせた適応伝送速度DAPSK-COFDM方式を提案し、回路規模を大きくせずに集積化の容易な受信装置を構成できる方式について検討を行い、計算機シミュレーションシステムの構築に向け鋭意検討中である。(1)屋内外遅延伝搬特性の把握と伝搬モデルの作成:本年度は遅延時間分解能0.5nsを有する屋内遅延プロファイル測定装置の試作を行い、屋内実測伝搬モデルの検討に見通しを得た。また、YRP横須賀リサーチパークにて屋外伝搬遅延特性の測定とディジタル伝送実験を併せて行い、高、低アンテナ高基地局を想定した伝搬路の特性を得ることができた。(2)仮想並列計算機によるディジタル伝送シミュレーション:(3)干渉検出技術および誤り訂正技術の検討:干渉検出検出技術を組合せた可変ガードインターバルOFDM方式の基礎検討およびマルチ変調方式に対応する適応伝送速度OFDM方式の検討を行い、その見通しを得た。(4)MMACシステムの試作および評価方法の検討:MMACシステムの機能検証を目的として装置を試作し、来年度の機能評価へ向けて検討を行った。その結果、試作装置は当初の性能を示した。また、その事前検討として、屋外での伝送実験を行い、実伝搬路において誤り率による評価を行った。その結果、高、低両アンテナ高において見通し内で比較的良好な伝送特性の得られることが明らかになった。更に、OFDM適用伝搬路の性能評価のために遅延プロファイルの評価方法を提案しアンテナ指向性による伝搬路改善の可能性を検討した。(1)屋内遅延伝搬特性の把握と伝搬モデルとディジタル伝送シミュレーション:本年度は遅延時間分解能0.5nsを有する屋内遅延プロファイル測定装置による屋内実測伝搬遅延プロファイルを直接利用したディジタル伝送シミュレーションを検討した。

その結果、高遅延分解能により分離されてプロファイルデータの有効性を確認することができ、今後のプロファイル測定と計算機シミュレーションの実時間実行を目指したシステムの検討が期待される。(2)OFDM方式に適用できる誤り訂正技術の検討:周波数選択性ライスフェージング通信路において、DAPSK変調方式、畳み込み誤り訂正符号及びダイバシチ受信を用いるDAPSK-COFDM伝送方式を研究し、最大比ダイバシチ合成のビット誤り率特性の理論解析を行い、更に符号合成ダイバシチ合成方式を提案し、理論解析を行った。符号合成方式は最大比合成方式に比べ、簡単な回路構造でより良い誤り率特性を得られることが分かった。(3)適応伝送速度OFDM伝送方式の検討:適応伝送速度OFDM伝送方式に適用できるマルチ変調方式対応適応型判定回路を提案し、シミュレーションによる性能解析を行い、良い結果を確認した。また、適応伝送速度DAPSK-COFDM伝送システムの計算機シミュレーションシステムを構築し、性能解析を行った。
細胞内膜輸送システムに関与する新しい分子の細胞生物学的研究

前年度の研究では,膜二回貫通型RINGフィンガータンパク質MARCH-II (membrane-associated RING-CH finger protein)を同定し,これが膜輸送・膜融合の調節因子であるSNAREタンパク質syntaxin6と直接結合することを明らかにした。平成17年度の研究では,さらにMARCH-IIに相同性の高い分子としてMARCH-IIIを同定し,その機能解析から以下に述べるようにMARCH-IIIがMARCH-IIに非常に良く似た性質をもつことを明らかにした。(1)ラットMARCH-IIIがユビキタスな組織発現分布を示すことを明らかにした。(2)培養細胞COS7細胞にMARCH-IIIを発現させたところエンドゾームに一部局在することを認めた。(3)免疫沈降法によりMARCH-IIIがsyntaxin6と複合体を形成することを明らかにした。(4)MARCH-IIIの過剰発現により,トランスフェリンの取り込み阻害が生じ,細胞表面とトランスゴルジ網(TGN)を循環することが知られているTGN46がMARCH-IIIの存在する膜構造に集まることを認めた。(5)このような阻害効果は,MARCH-IIIのRING fingerドメインやPDZ結合モチーフを欠失した変異体を発現させた際には観察されなかった。(6),MARCH-IIおよびMARCH-IIIのRING fingerドメインはE3ユビキチンリガーゼ活性を有することを明らかにした。以上の結果からMARCH-IIIがエンドゾームにおける膜輸送に関与することを示唆することができた。私は膜二回貫通型RINGフィンガータンパク質MARCH-II(membrane-associated RING-CH finger protein)を同定し,これが膜輸送・膜融合の調節因子であるSNAREタンパク質syntaxin6と直接結合することを免疫沈降法およびGST-pull down法により明らかにした。MARCH-IIの細胞内局在を間接蛍光抗体染色法により調べたところ,エンドゾーム膜上に局在し,syntaxin6と共存することを認めた。MARCH-IIを培養細胞に過剰発現させたところ,細胞表面とトランスゴルジ網(TGN)を循環することが知られているTGN38やfurinのTGNへの輸送が阻害され,MARCH-IIの存在する膜構造に集まることを認めた。このような阻害効果は,syntaxin6の膜貫通領域を欠失した変異体を発現させた際に観察されるものと同様であり,MARCH-IIの過剰発現がsyntaxin6の機能に影響を及ぼすことを示唆するものと考えられる。逆に,RNA干渉法によってMARCH-IIの発現を抑制したところ,部分的な効果ではあったがTGN38(またはTGN46)の局在や輸送に異常が認められた。以上の結果から,syntaxin 6と共にMARCH-IIがエンドゾームとTGNの間の膜輸送に関与することを示すことができた。また,MARCH-IIの細胞内C末端に存在する3個のアミノ酸配列がPDZドメイン結合モチーフであり,MARCH-IIの細胞内局在の決定に深く関わることを明らかにした。
ヒトデ初期胚におけるクロマチン機能獲得過程の生物有機化学的研究

イトマキヒトデの初期胚においてクロマチンが発生進行とともに変化する過程を生物有機化学的に特徴付けることを試み、以下の結果を得た。胞胚期後期になってクロマチンにトランスグルタミナーゼが出現し、ヒストンH2Bの9位グルタミン残基とヒストンH4の5位リジン残基とのトランスアミデーション反応を触媒し、その結果、ε-(γ-Glutamyl)lysine架橋したイソペプチドが形成する。この反応は発生進行に不可欠であることが示唆された。本年度は、イトマキヒトデの初期胚において機能的なクロマチンが形成される分子過程を生物有機化学的に解明することを目的として、次下の研究を進めた。(1)核型Transglutaminaseによって初期胚において形成される二量化ヒストンの発生上の役割を明らかにするために、核型Transglutaminase mRNAアンチセンスオリゴを胚細胞内に導入し、本酵素タンパク質の生成を抑制することによって、ヒストン二量化の阻害を試みた。しかし、この操作による発生停止は観察できなかった。本酵素タンパク質mRNAが複数個検出されたので、次年度は酵素タンパク質全てのサブタイプの生成を阻害することによって発生停止を試みる。(2)核型Transglutaminaseの活性あるいはその遺伝子発現を阻害する天然有機化合物を見いだし、これを用いてヒストン二量化を阻止し、二量化ヒストンを含有するクロマチンが発生進行にどのような役割を有するかを明らかにする目的で、多数の放線菌株培養液を準備し、そのイソプロパノール抽出物をイトマキヒトデ胚に与えて発生させた。胚が前期原腸胚期まで発生し、この時期で発生停止をもたらすサンプルを選択したが、最終的に、核型Transglutaminase活性を選択的に阻害する物質は得られなかった。今後は、10,000種以上の化合物からなるケミカルライブラリー中に目的とする化合物を探索し、目的とする研究の遂行を続ける。イトマキヒトデの初期胚においてクロマチンが発生進行とともに変化する過程を生物有機化学的に解明することを目的として、以下の研究を進めた。核型トランスグルタミナーゼによって初期胚において二量化ヒストンが生成されるが、その化学構造を決定することを試みた。すなわち、胞胚期後期からクロマチンに形成されてくるヒストンH2BとヒストンH4の架橋二量体p28を中期原腸胚から精製・単離し、通常のマイクロシーケンス分析を施したところ、N末端の31アミノ酸残基は1箇所を除いてヒストンH2B単量体の配列と同一であった。異なるのは9番目の残基で、これは同定できなかった。p28をAzotobactor lyticusプロテイナーゼまたはV8プロテイナーゼで断片化し、得られた断片ペプチドをHPLCで精製した後、Tof Mass分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンス分析した結果、断片F3を除いてすべて胚ヒストンH2BとH4のプロテアーゼ分解物と同一の配列であった。F3の構造はPositive-ionfast atom bombardament-tandem質量分析によってヒストンH4のN末端にアセチル化されたセリン残基を有するオクタペプチドにおいて、5位のリジン残基がヒストンH2Bの31アミノ酸残基からなるN末端ペプチドの9位グルタミン残基とε-(γ-glutamyl)lysine架橋したイソペプチドであることが判明した。また、Maldi-Tof質量分析から、p28のヒストンH4配列において、16位リジン残基が部分的にアセチル化されており、20位リジン残基がモノ、またはジメチル化されていることが明らかになった。このほかに、二量化ヒストンp30が存在し、その化学構造がヒストンH2Bの鎖間でε-(γ-glutamyl)lysine架橋したイソペプチドであることが判明した。初期胚クロマチンにおいてこのように特異な翻訳後修飾が生起することの発生学的意義については、今後に残された問題である。
発作性夜間血色素尿症の分子病態

発作性夜間血色素尿症(以下PNHと略す)は、PIG-A遺伝子に体細胞突然変異を持つ異常な造血幹細胞クローンが拡大し、多数のGPIアンカー欠損血球を抹消に供与することにより発症する。PIG-Aのマウス相同遺伝子Pig-aを欠損したES細胞を用いて作ったキメラマウスの解析から、異常クローンの拡大には、PIG-Aの変異以外に第2の要因があることが示唆されていた。しかし、キメラマウスの中に生後1年後から異常血液細胞の拡大を起こした個体が出現した。本研究では、この現象を再現し第2の要因がPig-a欠損の造血幹細胞自体に起こるのか、骨髄環境に起こるのかを区別し、2つの要因とクローン性拡大の関係を明らかにすることを目的とする。通常の手法でキメラマウスをつくろうとすると、強い致死性のため低キメリズムの個体が少数得られるだけであった。安定に多数のキメラを作るためコンディショナル遺伝子ターゲティングの手法を用いた。まず、X染色体上のPig-a遺伝子のエクソン6をはさむようにlox P配列を挿入したマウスの系統を確立した。このマウスの雄とヒトサイトメガロウイルスプロモーターでCreを発現するトランジェニックマウスの雌を交配し胎児を得た。14日目の肝の赤血球は半数以上がGPI欠損であったので、造血幹細胞を含む細胞画分を、致死量照射したマウスに移植した。6週後末梢血を調べると各血液系にGPI欠損細胞が存在していた。すなわち胎児肝中にGPI欠損造血幹細胞が存在し、移植によって血液系キメラマウスができることがわかった。これらのキメラはPNH発症の第1要因を備えたマウスであり、第2の要因の解析に応用していく予定である。
有機半導体と金属錯体からなる可視光駆動型二酸化炭素還元光触媒系の創製

本研究では有機半導体(C3N4)と金属錯体を融合したCO2還元光触媒系の発展を目指して研究を進めてきた。平成30年度以前の先行研究において、我々はC3N4とルテニウム錯体を融合した高効率なCO2還元光触媒系の構築に成功してきた。本反応は、C3N4の光励起後のキャリア(特に電子)がルテニウム錯体へと移動することで反応が進行すると考えられている。しかしながら、C3N4の光励起キャリアダイナミクス、およびルテニウム錯体への電子移動過程は観測されておらず、またその観測手法も確立されていなかった。そこで、本年度は種々の「分光測定」を駆使することでこれらを明らかにすることを目指した。特に、過渡発光測定と過渡吸収測定を組み合わせることで、C3N4からルテニウム錯体への電子移動はピコ秒オーダーという非常に速い時定数で進行していることを初めて明らかとした。また、一連の研究で用いてきたC3N4の吸収端は約450 nmと比較的短波長側に存在する。そのため、太陽光の利用といった観点では、450 nm以上のより長波長の光(近赤外光)を利用できる材料の開発も重要な課題となる。そこで本年度は、広域可視光応答が可能なカーボンナイトライドを合成してルテニウム錯体触媒と組み合わせることで、吸収領域を拡大させた光触媒系の構築も行なった。一方、将来的な本系の発展のためにはルテニウムという貴金属を用いない系へと展開することも重要な課題となる。そこで、本年度では共同研究の一環として、C3N4にFe錯体を混合させることで、ルテニウム錯体と同程度の効率でCO2還元反応が駆動できることを実証した。このように、平成30年度では、従来までに我々が構築した系において、分光的な側面による詳細な評価を行うのみならず、「広域化可視光の利用」、「貴金属を用いない系への展開」といった従来系の高機能化にも成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、有機半導体と金属錯体を融合した光触媒を用い、可視光照射下、水中にて、水を還元剤とした二酸化炭素還元反応の駆動を目指して研究を推し進めている。この反応の駆動するための前段階として、可視光照射下にて、水溶液中で二酸化炭素の還元反応を駆動させることが必要不可欠である。可視光下、水溶液中にて二酸化炭素の還元反応を駆動した例は少数あるが、いずれも副反応である水素生成反応が競合し、目的とする反応(二酸化炭素の還元反応)を高効率、高選択的に駆動することは困難であった。事実として、我々が報告した先行例(R. Kuriki., et. al, J.Am.Chem.Soc.2016,138(15),5159-5170.)では、二酸化炭素還元における触媒の回転数、選択率は、それぞれ660, 75%程度に止まっていた。本年度はこの改善を目指した。低い活性(選択性)の主要因として、水溶液中における反応条件の検討が不十分、かつ水溶液中で金属錯体が有機半導体上から脱離することが挙げられる。本年度の研究にて、従来のメソポーラス構造を有する有機半導体カーボンナイトライドからナノシート構造を有する有機半導体へと半導体部位を変化させることで、金属錯体とホスフォン酸アンカーを介して比較的強固に複合化できることを見出した。

さらに、反応条件(特にpH条件、緩衝剤となる塩の添加効果)を種々検討することで、触媒回転数を最大で2100,二酸化炭素還元の選択率を98%まで高めることに成功した。これらの値は、可視光照射下、かつ水溶液中で二酸化炭素還元反応を駆動した例では過去最高の値である。申請者は本年度、従来困難だった水溶液中で高効率な二酸化炭素還元反応を駆動することに成功した。従来用いていたメソポーラス型のカーボンナイトライドからナノシート構造を有するものへと変えることで、金属錯体との強固な吸着を誘発し、結果として広いpH条件、過度の塩の添加下という従来困難であった状況下でも反応の駆動に成功した。反応条件を整えた結果、触媒耐久性は従来の約3倍の2100に達し、ギ酸生成に対する選択率も70%以下から約100%へと向上することに成功した。なお、論文発表や学会発表を通じて本成果を公表した。以上の結果から、当初の計画以上に進展したと考える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。有機半導体と金属錯体を融合した系を展開する上では、両者の間の電子移動過程を詳細に調べること(観測し速度定数を見積もること)が一つの重要な課題である。しかしながら、現状まで、有機半導体と金属錯体を融合した二酸化炭素還元系において、そのような電子移動過程を実測した例はない。そこで今後は、有機半導体の過渡的な発光挙動、および吸収挙動に注目することで、有機半導体から金属錯体への電子移動過程の観測を試みる。そして、分光学的な側面から、本系の理解をさらに深める。また、今までの知見を統合することで、水を還元剤とした反応の駆動、広域可視光を利用したシステムへの展開、貴金属を用いない系への展開といった本系の発展(一種の高機能化)も同時に行う予定である。
パッチクランプ法による視床下部ニューロン温度受容機構の解析

当初、ラット視床下部を酵素処理して単離したニューロンを用いてパッチクランプを行う予定であった。しかし温度受容ニューロンにパッチクランプ記録を適用する方法を高橋が開発したため、新方法に変更した。新方法と結果を以下に述べる。ラット視束前野の中心線付近から厚さ100ミクロンの矢状断スライスを作り、鏡筒可動型ノマルスキー顕微鏡ステージ上の記録容器にスライスを固定した。シナプス入力を遮断するため、クレブス液のCaをMgで置換した低Ca液でスライスを灌流し、温度に直接的に反応するニューロンだけを実験対象とした。顕微鏡(400倍)で直視し、ニューロン(細胞体直径10ー15μm)周囲の結合織をクレブス液のジェット流により吹き飛ばし吸引により除去することで、細胞体表面を露出した。パッチクランプ電極(先端直径12μm)を細胞体に近づけわずかな陰圧を加え電極先端と膜との間にゆるいシールを形成すると、自発発火活動が細胞外から記録可能であった。25ー35°Cの温度変化を加え、発火頻度の変化する温度受容ニューロンを同定した。この実験では、温細胞の解析にしぼった。新たなパッチ電極と同定した温細胞との間に密着したシールを形成した後、電極に加える陰圧を強め電極先端の細胞膜を破壊し、電極内と細胞内を交通させた。電流固定下の静止電位は、約-60mVであった。温度を25ー35°Cに変え、膜電位固定下に静止電位から過分極側にステップ電位を加えて電流を記録することにより電流電圧直線を求めた。すると、温度上昇に伴って、膜コンダクタンスが上昇し、膜電位が上昇した。高温と低温で得た2つの電流電圧直線の交点の電位は、約-40mVであり、これは、温度に応じて変化するチャンネル(温度受容チャンネル)の平衡電位と考えられた。今後、外液のイオン組成を変えた時の平衡電位の変化から、温度受容チャンネルを通るイオン種を同定する実験を計画している。
ウエルシュ菌α毒素の新規受容体探索：ガングリオシドとの関係

ガス壊疽の原因毒素であるウエルシュ菌α毒素の受容体探索を行った。その結果、(1)本毒素のNドメインとCドメインの間に存在するループ領域のTrp-84とTyr-85がガングリオシドGM1aの糖鎖部位と相互作用していることが示唆された。さらに、α毒素は、GM1aに結合後、GM1aのクラスター化、およびチロシンキナーゼ関連受容体(TrkA)の活性化を惹起していることが明らかとなった。(2) α毒素は、TrkAのアダプタータンパク質のホスホリーパーゼCγ-1を特異的に活性化していた。(3)毒素処理細胞膜内で生成亢進したジアシルグリセロールのフリップ-フロップがGM1aとTrkAの集積を導いた。昨年度までの解析により,ウエルシュ菌α毒素は,細胞膜上のガングリオシドGM1aとチロシンキナーゼ関連受容体(TrkA)との複合体に結合すること世界で初めて明らかにし,J Biol Chemに報告した.今年度は,α毒素による細胞膜リン脂質の変化がTrkAの活性化に重要な働きを演じているのではないかと仮説を立て,種々の蛍光色素,及び共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した.その結果,α毒素は,細胞膜上のGM1aに結合後,毒素自身が保有するホスホリパーゼC活性,及びTrkAの下流に存在する内因性ホスホリパーゼCγ-1の活性化により,ホスファチジルコリンがジアシルグリセロールへ分解され,このリン脂質の挙動変化によりTrkAのクラスター化が著しく亢進されていることが明らかとなった.TrkAのリガンドである神経成長因子では,このようなリン脂質代謝が認められないことから,α毒素の毒素たる所以は,リン脂質代謝によるシグナルの撹乱であると推察された.また,今年度は,α毒素が有するガングリオシド結合モチーフ(H___SWY___G)のどの部位とGM1aが結合しているかを解析するため,モチーフ内の8個のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した8種類の変異毒素を作成し,GM1a含有リポソームへの結合実験をBIACORE3000で解析した.その結果,α毒素の84位トリプトファン残基と85位チロシン残基がGM1aとの相互作用に重要であることが判明した.ガス壊疽の原因毒素であるウエルシュ菌α毒素の受容体探索を行った。ウエルシュ菌α毒素によるガス壊疽や様々な疾患に対する予防及び治療薬の開発を目的とし、未だ明らかにされていないα毒素の受容体探索を行った。我々は、糖脂質糖鎖固定化アレイを用いた研究により、α毒素は、ガングリオシドGM1aに結合すると示唆される結果を得てきた。本年度の研究では共同研究者である名古屋大学の古川鋼一先生より供与していただいたGM1aの合成酵素をノックアウトしたマウスから5%のチオグリコール酸培地で誘導した腹腔マクロファージを用い、α毒素処理マクロファージからのTNF-α遊離量についてコントロール細胞(GM1a発現マウス由来マクロファージ)と比較解析を行った。その結果、毒素によるTNF-αの遊離は、GM1aを欠損した細胞において少量であった。また、GM1a欠損細胞へのCy3-ラベルα毒素の結合量も著しく低いことが判明した。さらに、我々は、α毒素をGM1a欠損マウス、及びコントロールマウスに尾静脈内投与した時の致死作用、及び血清サイトカイン量についてフローサイトミックスを用いて解析した。その結果、コントロールマウスでは、α毒素投与後約12時間以内にすべてのマウス(1群5匹)が死亡したが、GM1a欠損マウスでは、約35-40時間まで致死時間の延長が見られた。また、毒素を尾静脈より投与したGM1a欠損マウスからの炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6)の遊離量は、コントロールマウスと比較して低値であった。従って、α毒素の受容体としてGM1aが深く関与していることが判明した。しかしながら、GM1a欠損マウスでも毒素による致死作用は抑制できなかったことから、GM1a以外の受容体も毒性発現に関与していることが示唆された。平成2425年度までに、ウエルシュ菌α毒素の受容体がガングリオシドであるGM1aとチロシンキナーゼ関連受容体であるTrkAの複合体であること、さらに、α毒素の84位トリプトファン残基と85位チロシン残基がGM1aのシアル酸部位と相互作用していることを明らかにしてきた。そこで、平成26年度は、ヒト肺胞上皮細胞であるA549細胞膜上のGM1aに結合したα毒素がどのようにTrkA受容体を活性化し、IL-8産生を惹起しているのか検討した。

細胞膜の動的変化を解析するため、ジアシルグリセロールを特異的に補足するタンパクをコードしたプラスミド(EYFP-C1AB)や蛍光ラベルされたホスファチジルコリン(BODIPY-PC)を用い解析した結果、α毒素処理細胞膜内でジアシルグリセロールが特にラフト上に集積し、さらにGM1aやTrkA受容体も集積していることが判明した。また、この現象は、酵素活性欠損変異体(H148G)では認められなかったことから、α毒素自身の酵素活性によりホスファチジルコリンがジアシルグリセロールに分解され、その疎水性分子間力によりジアシルグリセロールが集合したものと考えられた。加えて、H148G処理では、TrkA受容体の活性化が引き起こされなかったことから、α毒素によるTrkA受容体の活性化は、細胞膜ラフト上における集積と密接に関連していることが示唆された。一方、α毒素は、自身の酵素活性によりホスファチジルコリンを分解すると同時に内因性ホスホリパーゼCの活性化を引き起こすと約20年前より提唱されていたが、その詳細は不明のままであった。そこで、種々の内因性ホスホリパーゼCに対する抗体(リン酸化体検出用)や阻害剤、そしてsiRNAを用いて解析した。その結果、α毒素処理A549細胞のTrkA受容体が活性化後、そのアダプタータンパク質であるホスホリパーゼC-γ1が活性化され、リン脂質の分解が加速していることが判明した。細菌学α毒素は,細胞内ホスホリパーゼC活性を亢進し,様々な毒性(溶血,活性酸素産生,サイトカインやケモカイン酸性)を発現していると報告してきた.しかしながら,その活性化メカニズム,及びそのアイソタイプの種類に関しては,未解明のままであった.本年度の解析により,α毒素は,細胞膜上のGM1aに結合後,毒素自身が保有するホスホリパーゼC活性により細胞膜リン脂質組成を変化させることにより,GM1aに隣接するTrkAのリン酸化を惹起していること,さらに,TrkAのアダプタータンパク質として存在している内因性ホスホリパーゼCγ-1が特異的に活性化していることを見出した.約四半世紀の間明らかにされていなかったα毒素の受容体の発見、及び毒素によって活性化される内因性ホスホリパーゼCの種類を同定できていることから,本申請課題は,順調に遂行していると考える.本年度は、ガングリオシドGM1aのα毒素受容体としての可能性について詳細解析を行うため、名古屋大学医学部の古川鋼一先生より供与いただいたガングリオシドGM1a欠損マウスを用い、α毒素の毒性(活性酸素産生、サイトカイン産生)に対する反応を解析した。その結果、ガングリオシドGM1a欠損マウスに対してα毒素の毒性が現れにくいことが判明し、α毒素の毒性発現にガングリオシドGM1aが深く関与していることが世界で初めて明らかとなった。この結果は、アメリカ生化学会の学会誌であるJournal of Biological Chemistryに報告することができたため、本研究課題は、順調に進んでいると判断する。研究計画は,ほぼすべて順調に遂行し,完了目前であるが,「α毒素とシアル酸,及びGM1aの糖鎖部位との複合体結晶構造解析」に関しては,未だ結晶すら得られていない状況である.次年度は,ボツリヌス神経毒素と糖との複合体解析を参考にして解析する予定である.次年度は,本年度得られた研究結果をまとめ、原著論文、及び総説を投稿する予定である.本研究課題を遂行することにより、α毒素の受容体がガングリオシドGM1aであることを明らかにした。また、これまでの我々の研究でα毒素による病原性発現(活性酸素産生、サイトカイン産生)にチロシンキナーゼ関連受容体であるTrkAが密接に関与していることを報告してきた。
初期発生胚における遺伝子発現制御機構の研究

動物胚の初期発生過程における遺伝子発現制御機構を明らかにするため、ウニ胚アリ-ルスルファタ-ゼ(Ars)遺伝子をモデルにして、その転写制御に関わるシスエレメントの同定トランス因子の検出を行い、下記の成果を得た。1.CATアッセイにより、Ars遺伝子5'上流には転写の基本プロモ-タ-の他、-3kb-1.9kbには転写を促進するエンハンサ-領域、-1.5kb-1.3kbには転写を抑制するサイレンサ-領域が存在することがわかった。このうち、エンハンサ-領域には転写促進に関わる配列が複数個みつかった。2.これらの各領域に結合する核蛋白質多数をゲルシフト法で検出し、その結合する塩基配列をフットプリント法で明らかにした。各領域にはそれぞれ複数個の蛋白質が結合するというデ-タも得られており、これらの蛋白質は発生時期に伴って変動した。これらのDNA結合蛋白質はArs遺伝子転写制御のトランス因子として働くと考えられる。3.サイレンサ-領域はシトシンとチミンに富むCT領域であること、この領域中の(CT)_<11>配列は三重らせんDNA構造であることを明らかにし、これがDNA結合蛋白質の認識部位として働く可能性を指摘した。サイレンサ-領域には数種の蛋白質が塩基配列特異的に結合し、結合蛋白質のパタ-ンが、発生時期特異的に変化することもサウスウエスタン法で明らかにした。これらのDNA結合蛋白質の単離はすでに開始している。以上の結果は、初期発生胚における遺伝子発現制御の分子機構の解明に一定の貢献をしたものと考えている。平成2年度本研究は、ウニ胚におけるアリ-ルスルファタ-ゼ(Ars)遺伝子の発現制御機構を明らかにすることによって、初期発生における特異的遺伝子の発現制御に共通するしくみを解明することをねらったものである。これまでの研究でアリ-ルスルファタ-ゼ遺伝子がウニ原腸胚の反口上皮細胞でのみ発現することを明らかにしたが、本年度の研究によって以下のことを明らかにした。(1)Ars遺伝子の5'上流領域に大腸菌のCAT遺伝子をつないだ融合遺伝子をウニ卵に注入して発生させるCATアッセイによって、Ars遺伝子の転写制御に係わる領域を決定した。この領域にはポリピリミジン配列が含まれる。なお、Ars遺伝子の第1エクソン中にも転写制御に係わる部分があることがわかった。(2)S1ヌクレア-ゼ感受性実験及びエチルピロカ-ボネ-トを用いたエチル化実験から、ポリピリミジン配列が通常のB型DNA構造と異なる特異な立体構造を持つことがわかり、DNA結合蛋白質の認識部位として働くのではないかと考えている。(3)ゲルシフトアッセイにより、Ars遺伝子に塩基配列特異的に結合する蛋白質を数種検出した。特に、第1エクソン中の転写制御領域とポリピリミジン配列に結合する蛋白質は、それぞれArs遺伝子の発現が始まる時期(初期間充織胚期)に出現し、その後消失するので、転写因子である可能性が大きい。(4)in vitro転写系を作るためいろいろ試みているが、まだ成功していない。動物胚の初期発生過程における遺伝子発現制御機構を明らかにするため、ウニ胚アリ-ルスルファタ-ゼ(Ars)遺伝子をモデルにして、その転写制御機構を研究し、本年度はArs遺伝子の発生時期特異的転写開始制御に関シスエレメントに結合するトランス因子の検出を行った。本年度の成果は下記の通りである。1.ウニ胚Ars遺伝子の発生時期特異的転写制御に関わるエンハンサ-領域とサイレンサ-領域に結合する核蛋白質多数をゲルシフト法で検出し、その結合する塩基配列をフットプリント法で明らかにした。各領域にはそれぞれ1種以上の蛋白質が結合する。これらのDNA結合蛋白質の出現パタ-ンは発生時期に伴って変動するので、Ars遺伝子転写制御のトランス因子として働くものと考えられる。

2.サイレンサ-領域はシトシンとチミンに富むCT領域であること、この領域中の(CT)_<11>配列は三重らせんDNA構造であることを明らかにし、この特異なDNA構造が蛋白質結合の認識部位として働く可能性を指摘した。事実、サイレンサ-領域には数種の蛋白質が塩基配列特異的に結合する。特に、サイレンサ-領域内のGストリング(Gが11個連続する配列)に特異的に結合する一群の核蛋白質をサウスウエスタン法で検出した。これらの蛋白質は中性pHでDEAEセルロ-スに結合するが、孵化期を境にDEAE結合能を失うので、これらの蛋白質に修飾等の質的変化が生じるのではないかと考えている。Gストリング結合蛋白質のこのような変化がArs遺伝子の発生時期特異的な転写制御とどのように関連しているのか現在研究中である。
淡水魚保全のための水域・水路分級とミティゲーション計画の研究

1.谷津田における水域・水路分級法の提案・生物の生息場という観点から、谷津田の水域はまず郷面と谷津の大地形区に分類され、さらに谷津は複数の小地形区に分類できることを明らかにした。・谷津の小地形区は水路と水田とため池からなり、水路は谷津内水路とテビ(地方名)から構成されていることを明らかにした。・魚類と両生類を対象にして、谷津田の大地形区と小地形区に関連深い種を明らかにした。2.谷津田のミティゲーション計画の立案・谷津田の圃場整備事業において、生物多様性を損なわないためのミティゲーション計画として、土水路の存置、用水路の地中化、排水路の地中化、水路のネットワーク化を提案し、実際の設計に反映させた。3.特定の希少種に関する生息場の評価・ホトケドジョウ、ニホンアカガエルの絶滅危惧種について、HSI(生息場適正評価手法)の手法を用いて圃場整備事業前・事業後の生息場の評価を行い、ミティゲーション計画の妥当性を判断する手法を開発した。1.沖積平野の水田水域に生息する2種の魚類について、以下の知見を得た(栃木県河内町西鬼怒川水域)。・ウグイについては、農業用小河川(谷川)で生活史を完結する個体群、およびこれに隣接する水域(内川水域、西鬼怒川水域)から移入し、産卵後、それぞれの水域に回帰する個体群を確認した。前者の個体群サイズは約5万個体と推定され、隣接水域からの移入個体数は約1000個体であった。・ホトケドジョウについては、農業用小河川と繋がった湧水性湿地で産卵し、農業用小河川で越冬する個体群を確認した。本種の移動距離は最大で140m程度であるが、多くの個体は上下流40m程度の狭い範囲で移動していた。2.谷津田に生息する魚類の生息水域について、以下の知見を得た(栃木県市貝町小貝川上流域)。・5つの谷津田に生息する魚類について、2月、6月、8-9月の生息密度を把握した。・統計分析から、ホトケドジョウは谷津上流水域、シマドジョウは谷津中・下流水域、ドジョウは谷津全体にわたって生息することが判明した。3.扇状地の水田水域に生息するイバラトミヨ雄物型について、以下の知見を得た(秋田県千畑町)。・人為的に創出した保全池、保全水路のイバラトミヨの定着状況を個体数密度によって、また繁殖状況を体長組成によって評価した。・保全水路は現況水路を石積み護岸とした水路(保全水路)と新たに敷設した石積み護岸水路(代償水路)があり、代償水路の個体数密度が保全水路に比べて高く維持されていた。・保全池の個体数密度は湧泉と比較して高く維持されていた。湧泉、保全池とも繁殖時期に未成魚の割合が増加し、繁殖場所として利用されていることが示唆された。1.沖積平野の水田水域に生息するホトケドジョウについて、以下の知見を得た(栃木県西鬼怒川水域)。〓農業用の小河川において、最上流部の湧水場を生息域とする個体群が存在し、その個体群は産卵期(5月、6月)に湧水場へ遡上、秋から冬にかけて小河川に降下、冬から春に小河川で越冬という生活史を有することが判明した。〓上記の季節移動は、湧水や河川における一定の水温と強い相関があることが判明した。2.谷津田に生息する魚類については、以下の知見を得た(栃木県小貝川上流域)。〓谷津田に優先的に生息する5種の魚類について、産卵、仔稚魚の生息、越冬の各ステージと強い相関関係をもつ資源・環境条件を明らかにした。〓とくにホトケドジョウについては環境傾度として水路水温が、ムマムツについては環境傾度として堰上げ施設(遡上障害物)が有意な意味を持つことが明らかとなった。3.沖積平野の水田水域におけるニホンアカガエルについて、以下の知見を得た。〓コンクリート水路(U字溝用水路)が移動障害となることを明らかにした。〓コンクリート水路にフタをかけて3年間にわたり観測を続けた結果、卵塊数の著しい増加が認められ、フタがニホンアカガエルの局所的な個体群の保全に効果があること実証された。