hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マメ毒に対するマメゾウムシ類の適応分化：解毒機構と乾燥種子利用の遺伝的多様性

嶋田と分担者の中野、連携研究者の大林と伊藤はササイカチマメゾウムシに特異的な核遺伝のEST-SSRマーカー開発を行なった。このマーカー開発技術の論文は国際誌Appl. Ent. Zool.に受理され、さらに、現在国内個体群の遺伝構造解析を進めている。また、嶋田と分担者徳永、伊藤、大林は、中国産アズキゾウムシと日本産アズキゾウムシの交雑実験として、中国産系統を母親にした交雑ラインと日本産系統を母親にした交雑ラインを比較した。多様な乾燥完熟種子を与えて広食能力を調べたところ、交雑ラインは母親をどちらの系統であっても広食能力は半減されたことにより、広食能力は母性効果ではなく核ゲノムの作用であることが分かった。藤井はモロッコ、バングラデシュ等5か国でマメ科を中心とした植物のアレロパシー活性を検定した。活性の強い植物については、種子、植物体、根などに含まれる成分をGC-MS等を用いて分析した。昆虫や植物に対する有毒性が知られているカナバニン等の非タンパク性アミノ酸等のアレロケミカルが他の生物に及ぼす影響を調べた。徳永はマメゾウムシ採集についてのABS協定を交渉のために2019年3月に台湾大学のChau-Ti Ting博士を訪問し、その結果、輸入よりも相互に実験個体群を共有する共同研究で合意した。マメゾウムシ実験個体群を用いた学会発表を2件、昨年のインゲンゾウムシのmtDNA配列解明に端を発したゲノム=アッセンブリに関する発表を1件行なった。現在論文を投稿を進めている。津田は昨年度の実験を追試し、種子捕食昆虫への抵抗性を持つアジア産ツルアズキVigna umbellataをササゲと同時に与えると、セコブマメゾウムシ属で害虫2種とタイ産野生種1種を比較したところ、産下した卵サイズや生存率・発育期間について、タイ産野生種のツルアズキへの適応の差異が検出された。嶋田と徳永、連携研究者の大林で、中国産アズキゾウムシと日本産アズキゾウムシの交雑系統の示す広食能力を調べた結果、純粋の中国産アズキゾウムシ(dxC)は被子植物門で系統の遠い4目で多数が羽化する超広食性であるのに対して、交雑系統の場合、母親は中国産と日本産によらず、交雑系統の広食能力は半減することが分かった。一方で、羽化体重は両交雑系統は日本産(jC系統)の遺伝子が混じっているため体重が中国産dxCと有意に大きく、広食能力と羽化体重の間にはtrade-offがあることが分かったのは、重要な発見である。藤井によるメタボローム解析によって、どの毒物質の代謝が中国産と日本産の遺伝子発現の差異になって現れれているかを特定する。他にも、津田がタイで発見したツルアズキから羽化した被害虫種の産下した卵サイズに着目した特性の差異は、H30年度の追試で明確になったので、マメゾウムシ類の生活史の進化に関わる重要なデータであることが分かった。平成31年度は以下のように進める方針である。(1)中国産アズキゾウムシ(dxC系統)と日本産アズキゾウムシ(jC系統)の交雑実験におけるtrade-offの解析・・・両系統を交雑した時に、どちらの系統を雌にして交雑しても広食性は同程度に低下したので、核遺伝子群の作用が決まった。それと同時に、日本産jCとの交雑系統は中国産dxCと比較して羽化体重が大きい。このtrade-offを詳細に詰めるために、P世代(中国産、日本産)へのバッククロスにより選抜実験を施すことで、広食能力と同時に体重も大きくなる両方有利な性質を有するtrade-offの解消の進化実験を計画する。(2)中国大陸も含めたアズキゾウムシ各地域個体群の分子系統樹作成・・・中国各地で採集したさまざまな系統(計画)と日本各地で採集した系統(こちらはすでに現有)とを対象にCOIやその他のmtDNAを使って分子系統樹を作成し、各地域系統がどの程度の遺伝的距離で互いに関係をもっているかを解明する。中国の温州大学に嶋田研出身が特聘准教授の職を得たので、調査・共同研究がやりやすくなる。同種とはいえ、中国大陸のクレードと日本各地のクレードでの相互の距離を解析したい。(3)寄主乾燥種子を使った毒物質のメタボローム解析の計画・・・さまざまな寄主乾燥種子をGC-MSのミニ・メタボロームキットを使って、独物質の成分を分析する。これにより、中国産アズキゾウムシが食べて育つ種子で、かつ日本産アズキゾウムシが食べても育たない種子の毒物質メタボロームを対象に、中国産のみが解毒できる代謝パスウェイが絞られてくるはずである。

活性の強い植物については、種子、植物体、根などに含まれる成分をGC-MS等を用いて分析した。昆虫や植物に対する有毒性が知られているカナバニン等の非タンパク性アミノ酸等のアレロケミカルが他の生物に及ぼす影響を調べた。徳永はマメゾウムシ採集についてのABS協定を交渉のために2019年3月に台湾大学のChau-Ti Ting博士を訪問し、その結果、輸入よりも相互に実験個体群を共有する共同研究で合意した。マメゾウムシ実験個体群を用いた学会発表を2件、昨年のインゲンゾウムシのmtDNA配列解明に端を発したゲノム=アッセンブリに関する発表を1件行なった。現在論文を投稿を進めている。津田は昨年度の実験を追試し、種子捕食昆虫への抵抗性を持つアジア産ツルアズキVigna umbellataをササゲと同時に与えると、セコブマメゾウムシ属で害虫2種とタイ産野生種1種を比較したところ、産下した卵サイズや生存率・発育期間について、タイ産野生種のツルアズキへの適応の差異が検出された。嶋田と徳永、連携研究者の大林で、中国産アズキゾウムシと日本産アズキゾウムシの交雑系統の示す広食能力を調べた結果、純粋の中国産アズキゾウムシ(dxC)は被子植物門で系統の遠い4目で多数が羽化する超広食性であるのに対して、交雑系統の場合、母親は中国産と日本産によらず、交雑系統の広食能力は半減することが分かった。一方で、羽化体重は両交雑系統は日本産(jC系統)の遺伝子が混じっているため体重が中国産dxCと有意に大きく、広食能力と羽化体重の間にはtrade-offがあることが分かったのは、重要な発見である。藤井によるメタボローム解析によって、どの毒物質の代謝が中国産と日本産の遺伝子発現の差異になって現れれているかを特定する。他にも、津田がタイで発見したツルアズキから羽化した被害虫種の産下した卵サイズに着目した特性の差異は、H30年度の追試で明確になったので、マメゾウムシ類の生活史の進化に関わる重要なデータであることが分かった。嶋田と連携研究者大林、分担者の中野は、サイカチマメゾウムシに特異的な核遺伝マーカー開発を行うため、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を開始した。発現遺伝子の部分配列中のマイクロサテライト領域(EST-SSR)を対象に、ゲノムワイドなマーカー設計を行い、現実の個体群で有効性が確認された。この一部の成果が国際誌に受理された。現在国内個体群の解析を進めている最中である。また、嶋田は徳永、大林と共同で、中国産アズキゾウムシ(dxC系統)、Callosobruchus subinnotatus、サイカチマメゾウムシを研究対象に、広食能力を13種の乾燥種子を使って調べた。藤井はガーナ、カンボジア、イラン、トルコ、バングラデシュ、ベトナム、中国内モンゴル自治区等においてマメ科を含む薬用植物等のアレロパシー活性を測定した。活性の強い植物についてはその成分を分析した。植物生育阻害作用の強い成分についてはプロトプラストを用いた植物細胞への影響を調べた。徳永はカンボジアとラオスにおけるABSのための協力研究者、行政官を捜したが、対象国と周辺国の国情に阻まれ、筑波大学のABS担当部局の協力を得た上でも、2017年度中に協定を結ぶことが困難であった。そのため、広食性を示す既存のインゲンゾウムシ4地域集団の系統関係を明らかにする軌道修正を行い、mtDNAの配列解析の結果を現在まとめ中である。
嚥下運動の調節機構に関する基礎的研究

大脳基底核による嚥下運動の調節機構を検討した。基底核からの下行性経路として基底核-中脳-脳幹網様体系が主要であることから、中脳の脚橋被蓋核(PPN)および赤核後領野(RRF)が脳幹網様体の嚥下パターンジェネレータを調節し、基底核はさらにこれら中脳のニューロンへの入力を通じて嚥下運動を調節しているという仮説をたてた。今回は、この仮説のうち基底核-中脳系の情報伝達様式について検討した。(1)基底核出力核である黒質網状部(SNr)からPPNのコリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロンおよびRRFのドパミン作動性ニューロンへの入力の有無を明らかにし、(2)その入力に関わる神経伝達物質および受容体ついて調べた。実験にはラット(9-16日齢)のin vitroスライス標本を用いた。SNr、PPN、RRFが同一スライスに含まれるようにした。SNrの電気刺激に対するPPN、RRFのニューロンの電気応答をホールセルパッチクランプ法にて解析した。PPN、RRFのニューロンにおける神経伝達物質の同定は、膜の電気生理学的特性、免疫組織化学染色およびシングルセルRT-PCR法で行った。その結果、SNrからPPNのコリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロンおよびRRFのドパミン作動性ニューロンの全てに対しGABA抑制性入力がある、(2)PPNのニューロンへの入力はGABAA受容体を介し、RRFのニューロンへの入力はGABAA受容体とGABAB受容体の両方を介すること、の2点を明らかにした。PPNおよびRRF由来のアセチルコリン、グルタミン酸、ドパミンが脳幹網様体の嚥下中枢に作用しているとすれば、今回の結果は、基底核がこれらの作用を抑制性に制御することで嚥下運動の調節を行っている可能性を示唆している。中脳-脳幹網様体系の情報伝達様式の解明が今後の課題として残った。脳血管障害やパーキンソン病などの大脳基底疾患では嚥下障害など咽喉頭筋の運動障害を伴うことが多い。咽喉頭筋や顎顔面筋の運動は大脳基底核から脚橋被蓋核への投射により制御される可能性が指摘されている。平成11年度は大脳基底核-脚橋被蓋核投射系の機能的接続様式を検討した。(1)大脳基底核出力部である黒質網状部から脚橋被蓋核のコリン細胞および非コリン細胞への投射の有無を検討し、(2)その際動く神経伝達物質の同定を試みた。実験にはラット(50-120g)の黒質網状部および脚橋被蓋核を含むin vitroスライス標本を用いた。黒質網状部を電気刺激し、脚橋被蓋核での細胞活動をパッチクランプ法を用いてホールセル記録した。記録した細胞がコリン作動性であるか否かの判定には、膜の電気生理学的特性ならびに免疫組織化学染色を用いた。その結果、(1)黒質網状部から脚橋被蓋核のコリン細胞および非コリン細胞の両者に対し抑制性投射があること、(2)この抑制系はGABA作動性であること、の2点を明らかにした。この結果は、大脳基底核から脚橋被蓋核のコリン細胞および非コリン細胞へのGABA作動性投射が脚橋被蓋核の出力レベルを調整することを示唆する。次年度は大脳基底核-脚橋被蓋核系が嚥下運動の発現にどのように関与するのかを検討する。
神経原線維変化形成機構

トランスジェニックマウスの作製と解析PDGF-βプロモーター下流にV337M変異を持っ4リピートタウcDNAを組み込んだベクターを導入したタウマウスを作製した。発現量は内在性タウの5-10%程度であり、海馬および大脳皮質に発現が見られた。11ヶ月令で、このマウスの海馬CA2,3部位に生化学的にSDS不溶性である過剰リン酸かタウの蓄積が観られた。脳スライスを用いた実験では海馬における神経活動の低下が観察された。さらに、行動観察によって高架式十字迷路でhabituationをおこさず、オープンアームにおける有為な滞在を示した。このことから、神経原線維変化形成は神経活動の低下とそれに伴う行動異常を引き起こすことが明らかになった。CAMKIIプロモーター下流にR406W変異を持つ4リピートタウcDNAを組み込んだベクターを導入したタウマウスの場合。このマウスはADやR406Wの患者と類似した病理病態の特徴を持つマウスモデルであることが示された。更に、タウリン酸化に関与する酵素の検討から変性を示す神経細胞ではGSK-3Bと活性化JNKの蓄積が生じていることが明らかになった。タウ過剰リン酸化と線維形成上記GSK-3B及びJNKによるタウリン酸化の繊維化への影響を調べた。これらの発現によってPHF-tauに特異的な抗原であるAT100の抗体反応性の出現を含め使用した12カ所のリン酸化部位においてリン酸化充進が観察された。細胞からSDS不溶性画分において短いタウ陽性の構造物が観察された。このことから、GSK-3βおよびJNKによるタウの過剰リン酸化が線維形成に関与することが示された。さらに、タウトランスジェニックマウスを用いてβアミロイドによってGSK-3を活性化するとマウス脳内に神経原線維変化、シナプス消失、神経脱落が生じた、LiによってGSK-3を抑制するとβアミロイドによって引き起こされる減少を阻止することが可能であった。今回の我々の研究の目的は遺伝子改変動物を作製し、ヒトでみられるのと同様の病理変化と行動変化を観察することである。家族性のFronto-temporal dementia parkinsonism 17(FTDP17)の遺伝子変異の中でR406W変異を持つ患者は記憶障害を主な症状とし神経源線維変化はアルツハイマー病で見られるのと同様のPHFとなる。そこで我々はR406W変異を持つヒト4リピートcDNAをマウスに遺伝子導入し、3ラインの動物を得た。発現量は内在性のタウの20%であった。CAMkinaseIIプロモーターを用いた変異タウ発現は前脳で観察された。この変異タウを発現する神経細胞はリン酸化タウ抗体で陽性に染色された。ガリアス鍍銀染色では変異タウを発現している神経細胞の中でも変形した核を持つものが陽性に染色された。これらの細胞は複数のリン酸化抗体、PHFタウに特異的な抗体Alz50,ユビキチン抗体に陽性に染色されることから、神経原線維変化でみられる抗原性を有することが示された。さらに、β-シート構造を認識するチオフラビン、コンゴーレッドの複屈折性を示すことからこれらの神経細胞内にタウの繊維状構造物である神経原線維変化が形成されていることが示唆された。生化学的検討においてもSDS不溶性画分において電子顕微鏡下で繊維化したタウの存在が確認された。また、変異タウおよび内在性タウがSDS不溶性画分に回収されたことから内在性および変異タウがこのタウの繊維化に寄与していることが示された。

更に、これらの遺伝子改変動物の行動解析から記憶障害がこのマウスでは生じていることが示された。これらのことから、当初の目的であるアルツハイマー病で見られる行動変化と神経原線維変化を形成するマウスの作出する事が出来、今後このマウスを用いて神経変性機構を明らかにする予定である。CAMK IIプロモーター下流にR406W変異を持つ4リピートタウcDNAを組み込んだベクターを導入したタウマウスを作製した。発現量は内在性タウの20%程度であり、前頭部位に発現が見られた。18ヶ月令のこのマウスでV337Mと同様の性質を持つ神経原線維変化が海馬、大脳皮質等で観察された。更に行動観察において記憶の保持に障害が起こっていることが示された。すなわちこのマウスはADやR406Wの患者と類似した特徴を持つマウスモデルであることが示された。更に、タウリン酸化に関与する酵素の検討から変性を示す神経細胞ではGSK-3βと活性化JNKの蓄積が生じていることが明らかになった。タウ過剰リン酸化と線維形成上記GSK-3β及びJNKによるタウリン酸化の繊維化への影響を調べるため、アデノウィルスを用いた遺伝子導入法を用いてタウ、GSK-3β,JNK3,及びΔMEKKをCOS細胞に同時に発現させた。JNK3,及びΔMEKKの発現によってSer422を含む多くの部位においてタウのリン酸化亢進が観察された。更にGSK-3βを発現することによってPHF-tauに特異的な抗原であるAT100の抗体反応性の出現を含め使用した12カ所のリン酸化部位においてリン酸化亢進が観察された。すなわち、ADで見られるのと同様の過剰リン酸化が引き起こされることが示された。この細胞からSDS不溶性画分を回収して観察するとこの中にタウが含まれ、電顕観察において短いタウ陽性の構造物が観察された。このことから、タウの過剰リン酸化が線維形成に関与することが示された。アミロイドβによる神経原線維変化形成機構アルツハイマー病発症には脳老化が生じていることが前提となるであろうこと。及びFTDP17の変異は脳老化を促進するであろうことからFTDP17変異タウトランスジェニックマウスは脳老化を示すマウスであると仮定した。そこで、これまでに作成したV337Mトランスジェニックマウスにアミロイドβを注入し神経原線維変化を形成させることで、これをアルツハイマー病のモデル動物として捉え、そこにおける神経原線維変化形成機構を検討した。ダイマーより大きい凝集体を持つアミロイドβを3ヶ月令マウスCA1領域に注入すると4週後にCA3,CA4にリン酸化タウ陽性、銀染色陽性神経細胞が出現する。生化学的検討ではβアミロイドによってSDS-不溶性タウが出現した。更にはシナプスマーカーであるシナプトフィジンの抗体反応性が減少とゴルジ染色のdendriteの枝分かれ及びdendritic spineの減少が示された。更に4週間後では神経原線維変化とともに神経細胞の有意な脱落が示された。この動物を用いて受動回避行動を用いた記憶試験を行ったところ。アミロイドβを注入した動物群では有意な記憶保持低下が示された。
低次元ナノ構造化によるスピン緩和時間の増大と面内構造3端子素子への応用

伝導電子スピンの緩和現象の理解は、スピントロニクス素子の開発に関する重要な課題であり、本研究ではナノ粒子や超薄膜等の低次元系におけるスピン緩和に関して、トンネル磁気抵抗測定等の実験を行った。ナノ粒子では離散準位に起因すると思われるスピン緩和時間の増大が見られるが、超薄膜ではそれを示唆する挙動は得られなかった。超薄膜では、面内方向が量子化されていないためと考えられる。また、スピン緩和時間が増大した場合における2重トンネル素子の設計に関するモデル計算を行った。スピントロニクス分野において、スピンの緩和現象は巨大磁気抵抗効果(GMR)をはじめとする種々のスピン伝導機能や、それらのダイナミクスの理解と制御に直接関係する重要な研究課題である。本研究では、これまでほとんど研究されていなかったスピン緩和に及ぼす低次元ナノ構造化(ナノ粒子化や超薄膜化等)の効果を系統的に調べる。これにより、どのような低次元ナノ構造においてスピン緩和時間が増大するのかを明らかにするとともに、そのメカニズムの解明を狙う。本年度は、まずCoナノ粒子を含むCo-C60グラニュラー薄膜の物性を詳細に調べ、その特異なトンネル磁気抵抗効果に及ぼすスピン蓄積の効果を検討した。その結果、Co-C60グラニュラー薄膜では、界面のスピン分極等の影響が顕著であり、その効果に隠れて、明瞭なスピン蓄積効果やスピン緩和時間の増大は観測されなかった。続いて、超薄膜物質の新規作製という観点から、エピタキシャル成長したNiおよびFe超薄膜を作製し、異常ホール効果等の磁気伝導効果を測定した。異常ホール抵抗の面内抵抗依存性は、超薄膜特有の振舞いを示すことが示唆された。Fe超薄膜の作製とその構造の熱安定性の実験においては、MgO等の格子不整合が小さくない下地の上では、超薄膜構造がナノ粒子配列よりも著しく構造不安定であることが分かった。良質な超薄膜試料の作製には、格子不整合を十分小さくする必要があることを示す結果である。また、2重トンネル接合の磁気抵抗効果は、超薄膜中のスピン緩和の定量評価において重要である可能性があるため、モデル計算によって磁気抵抗効果とスピン緩和の関係を調べた。2重トンネル接合では、中間電極内でのスピン蓄積が系全体の磁気抵抗効果を大きく変化させることが分かり、磁気抵抗測定によってスピン緩和を定量的に評価する表式を得た。スピンの緩和現象は、巨大磁気抵抗効果をはじめとする種々のスピン伝導機能や、それらのダイナミクスの理解と制御に直接関係する重要な研究課題である。本研究では、これまでほとんど研究されていなかった電流注入による非平衡スピンの緩和に及ぼす低次元ナノ構造化の効果を調べる。これにより、どのような低次元ナノ構造においてスピンの緩和時間が大きく増大するかを明らかにするとともに、そのメカニスムの解明を狙う。本年度は、Crナノ粒子を含む2重トンネル接合構造、成長中ガス導入法による超薄膜の作製、超薄膜電極用トンネルバリア材料の開発などに関して研究を行った。Crナノ粒子を含む2重トンネル接合の作製と評価の実験では、サイズ分布の小さなCrナノ粒子が得られ、作製した試料のいくつかにおいて、スピン蓄積に起因すると思われるトンネル磁気抵抗効果を観測することに成功した。試料ごとに特性が異なる理由としては、Crが容易に酸化する物質であることや、スピン緩和時間の増大効果があまり大きくなく、体積の大きなナノ粒子ではスピン蓄積が生じないことなどが考えられる。成長中ガス導入法による超薄膜の作製の実験では、Feの成長中にNガスを導入することによって、MgO下地上に平坦度の高い超薄膜を得ることができた。熱処理による構造安定性の実験を行った結果、FeN合金として成長することによる歪みエネルギーの緩和よりも、成長中の表面サーファクタント効果が超薄膜構造の形成に寄与していることが示唆された。超薄膜電極用トンネルバリア材料として、スピネル化合物について検討を行った。本研究では、これまでほとんど研究されていなかった電流注入による非平衡スピンの緩和に及ぼす低次元ナノ構造化の効果を調べた。これにより、どのような低次元ナノ構造においてスピンの緩和時間が大きく増大するかを明らかにするとともに、そのメカニズムの解明を試みた。本年度は、AgやCu超薄層を中間電極とする擬2重トンネル接合構造素子を作製し、そのスピン輸送を通じてスピン緩和を調べた。この素子構造では、一方のトンネルバリアはMgOであり、もう一方の疑似バリアはFeとAg(またはCu)のバンドミスマッチを用いている。また、Cuの場合には平坦なbcc構造超薄膜層をFeにエピタキシャル成長させており、Agよりも明瞭な結果を得た。超薄膜に特有の量子井戸準位に起因する磁気抵抗効果の振動現象が観測されたが、中間層厚に対して磁気抵抗効果が急激に減少する様子が見られた。

このことは、2次元的な超薄膜では量子準位は形成されても、ナノ粒子の場合のような完全孤立準位ではないためスピン緩和時間の増大が生じにくいことを示唆している。Auナノ粒子を中間電極層とした2重トンネル接合素子による研究も、協力研究者らとともに行い、磁気抵抗特性のナノ粒子サイズ依存性や温度依存性について顕著な結果を得た。得られたサイズ依存性は、ナノ粒子内での伝導電子の離散準位の形成がスピン緩和時間の増大の主因であるとするモデル計算結果に概ね一致した。また同時に、ナノ粒子内では超波長フォノンが形成されにくいことも考えられ、そのような寄与の存在も示唆された。これらはナノ粒子内のスピン緩和に関する新しい知見である。
高分子MRI造影剤による脳微細血管網イメージング技術の開発

本研究では、臨床利用されている低分子MRI造影剤で描出できなかった脳の微細血管網を高精細でイメージングするための多分岐型高分子ガドリニウム造影剤を開発した。分子量15kDa程度の分岐型ポリエチレングリコール末端にガドリニウム錯体を結合させた造影剤は、分岐構造による緩和能の増大を示し、投与24時間後で尿中排泄され、血中炎症性マーカーを過剰に誘導せず低毒性であることを明らかとした。この造影剤は100μm程度の微細血管を造影でき、中大脳動脈閉塞モデルラットにおいて脳虚血部位での血管閉塞や側副血行路をMRAにより診断できる可能性を見出した。本研究では、従来の低分子MRI造影剤では描出できなかった脳の微細血管網を超高精細で描出させるための多分岐型高分子ガドリニウム造影剤を合成し、微細血管網を診断できるMRIイメージングの造影剤を開発することにある。平成27年度では、分岐型高分子造影剤の合成とその物性評価を中心として、7T-MRIを用いた造影効果のデータから微細血管網を描出できるメカニズムについて詳細に検討した。まず、微細血管網の描出に必要な分子構造を検討するために、ガドリニウム(Gd)が標識された8分岐型ポリエチレングリコール(8-arm PEG-Gd)にFluoresceinを標識して、血中造影効果を7T-MRIにより比較した。その結果、Fluoresceinでわずかに標識されている8-arm PEG-Gdでは、これまでの微細血管の造影を再現よく描出できることを確認した。一方で、Fluoresceinが標識されていない8-arm PEG-Gdを用いた場合、造影効果は示されず、造影剤は組織内へ早期に漏出する傾向が示された。そこで、それぞれの分子の流体力学半径を評価するために、動的光散乱法により分子サイズを計測した。その結果、Fluoresceinでわずかに標識された8-arm PEG-Gdは、静電相互作用に基づく一時的な凝集反応を引き起こすことが示された。また、このような凝集は造影剤のT1緩和能に影響を与えないことを確認している。この結果から、微細血管網を描出するためには、造影剤のわずかな凝集反応を誘導する事が微細血管のイメージングで必須であることが判明した。一方でこの凝集反応が、生体内における炎症反応等の惹起に係わるかどうかは不明であり今後の課題である。本年度の研究から、ラットの脳の微細血管をイメージングするデータの再現性が十分に確認できたこと、さらに微細血管網を描出するために必要な分子構造や物性を解明することができた。この実験データに基づいて、さらなる高感度化造影剤の設計が可能となり、また安定したMRIイメージング効果が期待できることから、今後の脳微細血管診断法への評価において基盤技術が構築できた。このことから、上記のような評価とした。本研究では、脳の微細血管を可視化するMRI造影剤を開発している。平成27年度では、造影剤の基礎物性の評価として分子サイズと表面チャージ、体内での代謝性について評価した。その結果、8分岐型ポリエチレングリコールにフルオレセインとガドリニウムを導入した造影剤(F-8-arm PEG)は、他の構造のポリエチレングリコールを用いた場合と比較して、高い造影能を有していた。これは分岐鎖の運動制御による緩和能の向上である。また、生体環境下では、フルオレセイン基を介して分子凝集体を形成することや、これにより血中滞留性が一時的に向上して微細血管網を描出し、その後体外へ完全に排泄できることを明らかとした。このような成果に基づいて、平成28年度では、F-8-arm PEGを脳血管造影剤として選択し、F-8-arm PEGの分子構造や、分子凝集体が生体内での炎症応答にどのように関わるのか詳細に検討した。血中に投与された造影剤による炎症反応を評価するために、CRPやインターロイキンを評価した。その結果、開発したF-8-arm PEG造影剤は、投与6時間後にインターロイキン6や1βなどの炎症性マーカーを増加させるものの、臨床利用されている造影剤と同程度であることや、その値は24時間後には正常値まで減少した事、さらに血中CRPの応答は全く増加させなかった。これらの結果から、開発した造影剤は生体に有害な炎症反応を惹起させないことが明らかとなった。現在MCA閉塞プロトコルを用いてラットの脳梗塞モデルを作成中であり、最終年度である平成29年度では、脳梗塞における毛細血管網の再建メカニズムやその再生プロセス、さらにはこれらの脳血管閉塞プロセスが運動能力や記憶、生存率に対してどのように影響するのか詳細に解析する。これによりMRIを使った微細血管網の診断の有意性について明らにする。平成28年度では、開発したMRI造影剤の生体内における炎症反応惹起性について詳細に解析した。投与6時間後でのインターロイキンの応答は認めたもののその程度は低く、造影剤の早期体外排泄に伴って有害な炎症を惹起しない、というエビデンスを取得できた。脳微細血管網の描出だけでなく、生体内での安全性も認められたことから、今後、モデル動物での脳血管診断法への応用において基礎データを取得し微細血管用プローブとしての有用性を検討する。

本研究では、臨床で使用されている造影剤では描出できなかった脳微細血管網を超高精細で描出させるための多分岐高分子型ガドリニウム造影剤を合成し、脳疾患の初期診断を可能にするMRIイメージング法を開発することにある。平成27年度から平成29年度では、造影剤の分子構造の評価を実施した。その結果、8分岐型ポリエチレングリコールにフルオレセインとガドリニウムを導入した造影剤(F-8-arm PEG-Gd)は、水溶液中で凝集体構造を形成いていることを突き止めて、その凝集体構造が血中循環性の維持に大きく寄与していることを証明した。さらに、この凝集体は血中において速やかに解離して尿中へ排泄されることから、炎症性マーカーであるCRPやインターロイキンを増強させないことを証明できた。これらの成果に基づいて平成29年では、MCA閉塞プロトコルを用いてラットの脳梗塞モデルの構築と、このモデルラットを用いた梗塞領域のイメージングについて検討した。その結果、梗塞領域に形成された毛細血管網をMRIにより高精細でイメージングできることが示された。さらに脳梗塞ラットへ造影剤を投与しても死亡するような症例はなかった。また市販の造影剤では、閉塞により再構築された微細細血管網を可視化できなかったことから、開発したF-8-arm PEG-Gdにより、脳血管障害を診断できる高感度なMRプローブであることを立証できた。研究計画の最終目標である脳疾患の初期診断の可能性をMCAOラットモデルで立証することができ、これらの成果を踏まえて論文投稿も完了することができた。本研究では、臨床利用されている低分子MRI造影剤で描出できなかった脳の微細血管網を高精細でイメージングするための多分岐型高分子ガドリニウム造影剤を開発した。分子量15kDa程度の分岐型ポリエチレングリコール末端にガドリニウム錯体を結合させた造影剤は、分岐構造による緩和能の増大を示し、投与24時間後で尿中排泄され、血中炎症性マーカーを過剰に誘導せず低毒性であることを明らかとした。この造影剤は100μm程度の微細血管を造影でき、中大脳動脈閉塞モデルラットにおいて脳虚血部位での血管閉塞や側副血行路をMRAにより診断できる可能性を見出した。平成28年度は、当初の予定通りMRIを用いた微細血管の造影効果の評価を中心として、体外排泄効率の定量化や、脳微細血管のイメージング効率の定量化、さらには高分子MRI造影剤による炎症反応の惹起の有無について評価する。炎症反応の評価は、実用的なMRIの造影剤の設計において非常に重要であることから、PCR法やELISAなどを併用して慎重に検討する。平成29年度では、MCA閉塞プロトコルを用いたラット脳梗塞モデルを作製して、開発した造影剤による微細血管網の評価を進める。MCAを閉塞させることで脳内に虚血状態を誘導でき、その状態から微細血管網が発達する過程を定量的に追跡する。微細血管網の発達と同時に、運動能力や記憶、生存率にどの程度の影響があるのかをモニターすることで、閉塞部位や血流再建の程度が、予後にどの程度の影響を与えるのか、開発した造影剤で明らかとする。さらに、脳梗塞の自然発症モデルをつかって個体の成長と同時に脳血管の形成や構造異常をこの造影剤を使って評価する。これらの検討から、開発した造影剤を脳疾患の診断につかう有意性について評価する。組織再生工学、バイオマテリアル平成27年度は、当初予定していた動物実験数より少ない数で評価を終えることができた。このため、合成や分析実験を主に進めたので繰越できる予算が発生した。
拡張運用プロファイルを用いた高効率のテストケース生成手法の開発と評価

本研究では、従来の運用プロファイル(テスト対象ソフトウェアの期待される振舞いと、運用環境において想定される使われ方を表すモデル)に対して、欠陥が潜在する可能性や、テスト実施に要するエフォートに関する情報を付与したり、大規模ソフトウェアや並行ソフトウェアの期待される振舞いの記述に適したモデリング法を導入したりする拡張を行った。そして、その拡張された運用プロファイルに基づいて効率的なテストケース(テストするべき項目)を生成する新たな手法を、最適化手法を導入することによって構築した。本研究は、ソフトウェア信頼性を効果的に改善するために、限られた工数の中でできるだけ多くの重要な欠陥を発見するための新たなソフトウェアテスト法を開発し、その有効性を評価するというものである。欠陥を効果的に発見するには、テストケース(テストすべき項目)をいかにして設計するかが鍵となる。本研究では、まずテスト対象ソフトウェアの期待される振る舞いと使われ方を表す拡張運用プロファイルと呼ばれるモデルを提案した。拡張運用プロファイルは、確率付き有限状態機械である従来の運用プロファイルに対して、各遷移に必要とする工数の情報を付加するとともに、状態や遷移における詳細な動作、遷移の発火条件、イベントパラメータなどを記述できるようにしたものである。これによって、複雑な振る舞いを行うソフトウェアに対しても本手法を効果的に適用できるようになった。そして、この拡張運用プロファイルに基づいて、限られた工数の中で実行可能で、ソフトウェア信頼性に深刻な影響を与える欠陥を重点的に発見し、かつ、全体をできるだけ網羅するようなテストケースを選りすぐって生成するアルゴリズムを構築した。このアルゴリズムは遺伝的アルゴリズムを応用したもので、テスト担当者はアルゴリズムのパラメータを調節することによって、個々の開発プロジェクトに応じたテストケースを生成できる。本研究では、本手法を実装したツールを開発し、商用ソフトウェアに試験適用した。その結果、従来の運用プロファイルを用いたテスト法と比較して有効であることを確認した。本研究の成果は、学術雑誌や学術シンポジウムで発表した。また、次年度に向けて、本手法の新たな課題を明らかにし、その解決方法について検討することができた。ソフトウェアの品質を確保するには、ソフトウェアテスト法によってソフトウェアの欠陥を出荷前に発見し取り除く必要がある。本研究は、ソフトウェアテスト法の一種である運用プロファイルベースドテスト法を改良するものである。運用プロファイルとは、遷移確率などを付加したステートマシンを用いて、ユーザによるソフトウェアの使い方を統計的に表したモデルであり、これに基づいてテストケースが生成される。本研究では、欠陥が潜在する可能性に関する情報を付加した運用プロファイル(拡張運用プロファイル)を考案するとともに、その拡張運用プロファイルに基づいて効果的なテストケース(すなわち、指定されたテスト入力数の上限を超えない範囲で、欠陥の潜在する可能性の高い箇所をできるだけ網羅するようなテストケース)を選りすぐって生成するアルゴリズムを構築した。また、運用プロファイルは技術者の手作業によって従来作成されており、特に大規模・複雑なソフトウェアに対する運用プロファイル作成の手間が、本手法を開発現場に適用する上での問題となっていた。そこで本研究では、ソフトウェアの構成要素ごとに作成された小規模な運用プロファイルを合成することで、より効率的なテストを可能にするための方法を構築した。さらに、本研究の手法を並行ソフトウェアに対しても効果的に適用できるようにするための運用プロファイルの拡張として、ステートマシンではなくプレース/トランジションネットに基づいて運用プロファイルとテストモデル(テスト履歴を表す特殊な運用プロファイル)を作成する方法を考案した。本研究の成果の一部を国際会議や国内学会において発表することができた。本研究は、拡張された運用プロファイルを用いて、できるだけ多くのソフトウェアの故障を重要なものから優先して発見するためのテストケース生成手法を開発し、評価するというものである。運用プロファイルを用いたソフトウェアテスト法は、ソフトウェア信頼性を評価したり、ソフトウェア信頼性に深刻な影響を与える可能性のある故障を重点的に発見する手法であり、本研究はこの運用プロファイルを使用したテスト法を改良することでソフトウェア信頼性の改善に寄与することを目的としている。本年度においては、(1)拡張運用プロファイルの作成手法の構築、(2)テストケース生成アルゴリズムの構築、(3)ツールの開発、(4)適用実験、(5)評価を行い、その結果を学術シンポジウムおよび学術雑誌で発表した。より具体的に言えば、まず(1)で従来の運用プロファイルに対してテスト実行に必要な労力に関する情報を付加した拡張運用プロファイルを定義し、その作成方法を示した。次に(2)において、拡張運用プロファイルからテストケースを生成する新たなアルゴリズムを遺伝的アルゴリズムを応用して構築した。そして(3)でそのテストケース生成アルゴリズムを実装したツールを開発し、(4)で商用ソフトウェアを例題とした適用実験を行った。(5)でその適用実験の結果を評価した結果、従来の運用プロファイルを用いたテスト法と比較して有効であることが分かった。なお、当初は(6)として遺伝的アルゴリズムのパラメータの調整を予定していたが、これを(4)の一部として実施した。また、次年度に向けて、拡張運用プロファイルの更なる拡張について検討することができた。

本研究は、開発工程においてソフトウェアの信頼性を効果的に確保するために、拡張運用プロファイルと呼ばれる形式的モデルに基づいて、高い効率のテストケース(テストするべき項目)を選りすぐって生成する手法を構築するものである。従来の運用プロファイルは、テスト対象ソフトウェアの期待される振舞い、および運用環境において想定される使われ方を確率付きステートマシンとして表現することが一般的であった。本研究ではこれに、テスト実施に必要なエフォートや、欠陥が潜在する可能性に関する情報を付与するという拡張などを行ってきた。さらに、テスト作業に投入可能なエフォートを超えない範囲で、リスクの高い箇所を重点的にテストしたり、網羅的にテストしたりするためのテストケースを最適化アルゴリズムの応用によって生成する手法を検討してきた。最終年度においては、並行ソフトウェア(複数のコンポーネントが相互作用を行いながら並行動作するソフトウェア)に対して効果的に適用できるようにするために、プレース/トランジションネットに基づいて拡張運用プロファイルを生成したり、テスト終了基準の評価を行うために用いるテストモデル(拡張運用プロファイルをベースにしたモデル)を生成したりする手法を構築した。また、アントコロニー最適化を応用して拡張運用プロファイルからテストケースを生成する手法を構築した。本研究の成果を、国内学会や国際会議などにおいて発表することができた。ソフトウェア工学当初の計画通り、拡張運用プロファイルおよびテストケース生成アルゴリズムをさらに拡張し、本手法の有効性を高めることができた。そしてその成果を、学術雑誌や学術シンポジウムで発表することができた。運用プロファイルの拡張およびテストケース生成アルゴリズムの構築を行い、本手法の有効性を高めることができた。そしてその成果の一部を国際会議や国内学会で発表することができた。研究実施計画の通り研究活動を実施し、拡張運用プロファイルやテストケース生成アルゴリズムの定義、ツールの開発、実際のソフトウェア開発における有効性の確認を行うことができた。そしてその成果を学術シンポジウムおよび学術雑誌で発表することができた。当初の研究実施計画にしたがって研究を推進する。すなわち、(1)拡張運用プロファイルの更なる拡張、(2)テストケース生成アルゴリズムの拡張、(3)ツールの拡張、(4)適用実験、(5)評価を行い、その結果を学術雑誌や学術シンポジウムで発表する予定である。(1)については、並行動作を扱うことができるようにプロダクトマシン(並行動作する複数の有限状態
炭素―硫黄結合軸不斉による不斉反応場の構築と反応

平成13年度、平成14年度は1-スルフィニルナフタレンの2位のカルボアルデヒド基あるいはイミノ基への求核攻撃が立体選択的に起こることを明らかにしてきた。すなわち、スルフィニル基の置換基にかさ高い2,4,6-トリイソプロピルフェニル基を有する場合、炭素-硫黄結合軸不斉が生じ、スルフィニル基の影響により高立体選択性で反応が進行する。グリニヤー反応、アルキルリチウムによるアルキル化、LiAlH_4,Dibalによる還元反応、向山アルドール反応などきわめて高い立体選択性を実現できた。平成15年度、ナフタレンの1位と2位、1位と8位にスルフィニル基、を有する不斉配位子の合成を検討したが、その合成に手間取り、不斉配位子としての適用の検討はなお、今後の解決すべき問題として残った。スルフィニル基を使ったβ-ケトネルホキシドの還元反応ではDibalによって一方のみの還元体を与えることを見出した。この反応は動的速度論的分割により起こり、スルフィニル基とβ位のシリル基によって立体選択性が制御されていることがわかった。またフェロセン骨格を用いる軸不斉を利用した不斉配位子について検討した。上と下のフェロセン骨格の1,1'-位にスルフィニル基、ジフェニルホスフィニル基を導入した新しいキラルリガンドを合成し、Pdを用いたアリルアセタートとマロン酸エステルとの反応を行った。スルフィニル基上の置換基を検討したところ、かさ高い3,4,6-トリイソプロピルフェニル基の場合、収率立体選択性共に低く、1-ナフチル基の場合が収率、立体選択性共最も高かった。塩基、付加物、溶媒などを検討したが、炭酸セシウムを塩基として用い、ジクロロエタン中で反応を行ったとき高収率で生成物が得られた。(2,4,6-triisopropylphenyl)sulfiny1基を持つnaphthaldehydeに対するグリニヤー反応及び向山アルドール反応は非常に高い立体選択性で対応する生成物を与えた。向山アルドール反応ではルイス酸により生成物の立体化学が完全に逆転することがわかった。2-acylnaphthaleneのDibalによる還元とLiAlH_4による還元反応では全く異なった絶対配置のアルコール体を与える。これらの反応はスルフィニル基上の置換基がトリル基やメシチル基では立体選択性が低く、トリイソプロピルフェニル基が最も良好な結果を与えた。一方、嵩高い第三級ブチル基の場合に得られる立体異性体の比は、反応基質のC-S軸不斉に由来する立体異性体比と一致した。これらの実験結果とX線構造解析、^1Hおよび^<13>C-NMRスペクトル解析により得られた知見を総合し、上記sulfinylnaphthaldehydeの反応における高立体選択性は、C-S結合の回りの回転異性体に起因することを明らかにした。C-S軸の回転異性体を利用した不斉合成の例は本研究が初めてであり、新しい不斉合成反応としての道を開いた。一方、(2,4,6-triisopropylphenyl)sulfinyl benzaldehydeのグリニヤー反応および、対応するアシル体のDibal還元反応は完全に立体選択的に進行する。これらの反応でアルキルリチウムやLiAlH_4は低い立体選択性しか示さない。これらの結果は、ナフタレンの場合と異なり、ベンゼン環についたsulfinyl基の場合にはC-S結合が自由に回転し、キレーション構造の中間体を経る反応の時のみ高立体選択性を示す。生成物からスルフィニル基を除去することにより、光学的に純粋なジ置換メタノール誘導体を簡便に得ることができる。

この反応は、鎖状化合物にも適用でき、高立体選択的に14-遠隔不斉誘導が可能であることを明らかにした。本研究では、これまでに全く検討されていない炭素-硫黄結合軸の軸不斉を利用した不斉反応場の構築を行い、従来とは異なる方法論の画期的な不斉合成反応を開拓する。平成14年度は、[1-(2,4,6-トリイソプロピルフェニルスルフィニル-2-ナフチル]メタンイミンに対するメチルリチウム、ビニルリチウム、フェニルリチウムの付加反応を検討し、いずれも高収率で進行し、唯一つの(Rs^*,S^*)ジアステレオマーを与えるという高立体選択性を示すことを明らかにした。この高立体選択性の発現はスルフィニル基を導入した反応基質において、静電的、立体的な効果による炭素-硫黄軸の軸不斉の制御に起因することが次のことからいえる。1)スルフィニル基の置換基が」フェニル基、メシチル基、トリイソプロピルフェニル基と嵩高くなるに従い立体選択性が向上する。2)第3級ブチルスルフィニルナフチルメタンイミンへのメチルリチウム付加反応では61:39のジアステレオマー比で生成物を与える。低温でのnmrは63:39の比で回転異性体が存在することを示し、この反応では、軸不斉回転異性体から付加生成物を与えたことを示した。3)[1-(2,4,6-トリイソプロピルフェニルスルフィニル-2-ナフチル]メタンイミンは低温でのnmrスペクトルで唯一種類のシグナルしか示さず、回転異性体が一方偏っていることを示唆した。また、ぺり8位の化学シフトから回転異性体の構造が推定された。以上より、[1-(2,4,6-トリイソプロピルフェニルスルフィニル-2-ナフチル]メタンイミンの付加反応はキラルスルホキシドにより誘起されたC-S軸不斉により高立体選択性が発現したことがわかった。また、反応後、スルホキシドを容易に除去できることから、本反応はアトロープ異性体を利用した光学活性アミノ化合物の合成法となった。平成13年度、平成14年度は1-スルフィニルナフタレンの2位のカルボアルデヒド基あるいはイミノ基への求核攻撃が立体選択的に起こることを明らかにしてきた。すなわち、スルフィニル基の置換基にかさ高い2,4,6-トリイソプロピルフェニル基を有する場合、炭素-硫黄結合軸不斉が生じ、スルフィニル基の影響により高立体選択性で反応が進行する。グリニヤー反応、アルキルリチウムによるアルキル化、LiAlH_4,Dibalによる還元反応、向山アルドール反応などきわめて高い立体選択性を実現できた。平成15年度ナフタレンの1位と2位、1位と8位にスルフィニル基、を有する不斉配位子の合成を検討したが、その合成に手間取り、不斉配位子としての適用の検討はなお、今後の解決すべき問題として残った。スルフィニル基を使ったβ-ケトスルホキシドの還元反応ではDibalによって一方のみの還元体を与えることを見出した。この反応は動的速度論的分割により起こり、スルフィニル基とβ位のシリル基によって立体選択性が制御されていることがわかった。また、フェロセン骨格を用いる軸不斉を利用した不斉配位子について検討した。上と下のフェロセン骨格の1,1'-位にスルフィニル基、ジフェニルホスフィニル基を導入した新しいキラルリガンドを合成し、Pdを用いたアリルアセタートとマロン酸エステルとの反応を行った。
脳虚血細胞内カルシウムイオン濃度上昇におけるメカニズムの検討と麻酔薬の抑制効果

スライス標本における個々の神経細胞の虚血に対する電気生理学的変化の詳細について検討するために,細胞内Ca^<2+>濃度,膜電位の同時測定法を確立すべく,蛍光Ca^<2+>指示薬を用いた蛍光色素法とホールセル・パッチクランプ法を併用する方法を試みた。この方法の確立により,細胞内Ca^<2+>濃度の変動と膜電位の同時測定が可能となり,神経細胞の電気生理学的変化をより詳しく観察することができる。そのために,われわれはホールセル・パッチクランプに使用するパッチ用ガラス管電極内の細胞内潅流液中に蛍光Ca^<2+>指示薬を混注し,直接個々の神経細胞内に蛍光Ca^<2+>指示薬を投与することにした。ラットのスライス標本をクレブス液灌流下に共焦点顕微鏡を用いて観察し,パッチ電極を神経細胞とホールセルさせ,蛍光Ca^<2+>指示薬が細胞内に拡散させ単体の神経細胞を蛍光染色させた。現時点では,ホールセルパッチクランプ法による膜電位測定や興奮性シナプス後電流の観察を行うことが可能となったが,神経細胞の安定した蛍光染色が行えていなため細胞内Ca^<2+>濃度の測定は長時間安定した記録測定を行うことができていない。現在,安定した細胞内Ca^<2+>濃度測定が行えるよう改良中である。安定した細胞内Ca^<2+>濃度の記録測定が可能となったなら,細胞内Ca^<2+>濃度と膜電位の変動を同時記録し,虚血に対する神経細胞の電気生理学的変化,各種麻酔薬の修復作用について検討していきたいと考えている。
神経細胞のアポトーシスに及ぼす各種麻酔薬の影響

ある種の静脈麻酔薬や吸入麻酔薬、昨今では軽度低体温に脳保護効果があることが注目されている。最近の研究では、その機序が単に代謝の抑制ではなく、その他の機序の関与が示唆されているが、いまだ確定していない。ネクローシスは主に細胞内エネルギー欠乏により起こるため、代謝の抑制がネクローシス抑制につながりうる。しかしアポトーシスは、細胞内カルシウム濃度の増加、遺伝子の発現、ある種の蛋白分解酵素(caspase)の活性化など、細胞内カスケードの活性化によって起こる。すなわち、代謝抑制ではなく、これらカスケード抑制がアポトーシス抑制につながる可能性がある。そこで私たちは、麻酔薬、軽度低体温の保護効果の機序が、上記カスケードを抑制する結果、アポトーシスを抑制するのではないかという仮説をたてた。平成9年度は静脈麻酔薬が神経系アポトーシスにどのような影響を与えるか検討した。平成10年度は低体温、吸入麻酔薬の影響を検討した。神経系細胞のモデルとしてラット副腎髄質褐色細胞腫由来のPC12細胞を用い、培養液からの血清除去によりアポトーシスを誘導した。評価は細胞死の判定とアポトーシス細胞の定量化で行った。すなわち、細胞死の判定は培養液中に遊離した乳酸脱水素酵素活性によって、アポトーシス細胞の定量化は細胞をアルコール固定後ヨウ化プロピジウムで染色しフローサイトメトリーによりDNA含量を測定し行った。結果、29-37°Cの低体温は温度依存性に、細胞死ならびにアポトーシス細胞の割合の増大を抑制した。一方、イソフルラン、セボフルランなどの吸入麻酔薬にはアポトーシス抑制効果を認めなかった。本研究により、神経系アポトーシスに対して軽度低体温が抑制的であることが初めて明らかにされた。昨今、脳変性疾患、痴呆症、脳虚血などの成因として神経細胞のアポトーシスの関与が示唆されている。手術適応の拡大に伴いこのような疾患を持つ患者の麻酔管理も増大している。したがって、各種麻酔薬が神経系細胞のアポトーシスにどのような影響を与えるかを知る必要がある。平成9年度は、神経系細胞のモデルとしてラット副腎髄質褐色細胞腫由来のPC12細胞を用い、静脈麻酔薬が神経系アポトーシスにどのような影響を与えるか検討した。まず培養液からの血清除去によりアポトーシスを誘導し、アポトーシスに最も特異的とされるDNAの断片化を証明するため、DNA抽出とアガロースゲル電気泳動を行った。その結果アポトーシス誘導1日後からDNAの断片化を示すladder像がDNA電気泳動像で得られた。静脈麻酔薬としては周術期管理で汎用されるバルビツレートのペントバルビタール、ベンゾジアゼピン誘導体のミダゾラムの効果を検討した。評価はアポトーシス誘導4日後の細胞死の判定とアポトーシス細胞の定量化で行った。結果、ペントバルビタールは用量依存性に、細胞死ならびにアポトーシス細胞の割合の増大を抑制した。一方、ミダゾラムには有意な効果を認めなかった。本研究により、神経系アポトーシスに対してバルビツレートが抑制的であることが初めて明らかにされた。さらに、本研究で得られた所見は、in vivoモデルで見られるバルビツレートの脳保護効果が、アポトーシスの抑制と関連している可能性を示唆させるものである。
変形性膝関節症の病因解明と治療を目指した軟骨肥大分化誘導因子の網羅的解析

肥大軟骨分化モニタリングシステムの確立のため、代表的な肥大分化マーカーであるX型コラーゲン、VEGFおよびMMP13遺伝子のプロモーター解析を行い、それぞれのコアエンハンサーを複数同定し、これらをタンデムにしてベーサルプロモイターとをつなぎ、さらに下流に各種蛍光蛋白を接合したレポーターコンストラクトを作成した。これらのレポーターカセットをレンチウイルスベースに組み替え、軟骨細胞前駆細胞株ATDC5に安定導入して、分化に伴って蛍光を良好に発色するクローンを樹立した。これらを応用した発現クローニングによって複数の陽性クローンを得、現在それに含まれる候補遺伝子の解析を継続している。肥大軟骨分化モニタリングシステムの確立のため、代表的な肥大分化マーカーであるX型コラーゲン、VEGFおよびMMP13遺伝子のプロモーター解析を行い、それぞれの転写開始点上流1kbから下流1kbの間に存在するコアエンハンサーを複数同定した。これらのコアエンハンサーをタンデムにつなぎ、さらに転写開始点付近のベーサルプロモイターとをつなぎ、下流に各種蛍光蛋白を接合したレポーターコンストラクトを作成した。これらのレポーターカセットをレンチウイルスベースに組み替え、軟骨細胞前駆細胞株ATDC5にレンチウイルスベクターによって安定導入し、薬剤セレクションによってクローンを選択し、さらにそれぞれATDC5の分化に従って蛍光を良好に発色するクローンを樹立した。まずX型コラーゲンのコアエンハンサーを用いた細胞システムにヒト軟骨やマウス胚を起源とするcDNAから作成したレトロウィルスライブラリーを導入し、発現クローニングを行い、現在までに複数の陽性クローンを得ている。現在はその細胞にとりこまれたトランスジーンをシークエンスで確認中であり、今後肥大分化誘導候補遺伝子として軟骨組織での発現解析を行い、さらに軟骨細胞における機能解析を予定している。まだ同様にVEGFおよびMMP13遺伝子のコアエンハンサーを用いた細胞システムを用いて、同様のスクリーング実験を行っており、陽性クローンが得られ次第同様の解析を行う。代表的な肥大分化マーカーであるX型コラーゲン、VEGFおよびMMP13遺伝子のコアエンハンサーをタンデムにベーサルプロモーターと接合し、蛍光タンパクとつないだレポーターコンストラクトを昨年度に作成しており、本年度はこれを利用して様々な発現クローニングを行い、肥大分化誘導能を持った分子を複数同定した。これらの中にNotchシグナルやNFkBシグナルに関連する分子がひとつずつあり、これらの発現ベクターやsiRNAを用いた発現抑制ベクターを作成したところ、いずれも強力な肥大分化促進効果を示した。これらの分子の発現を免疫組織染色法で確認したところ、成長板軟骨、関節軟骨ともに発現がみられた。Notchシグナルの下流として同定した分子X(投稿に向けて現在も研究を推進中のため分子名は伏せる)は強力に軟骨変性マーカーを誘導することがin vitroの実験で確認されたため、現在コンディショナル・ノックアウトマウスを用いて変形性関節症の解析をinvivoで行っている。NFkBシグナルに関連する分子Y(投稿に向けて現在も研究を推進中のため分子名は伏せる)については強力に軟骨変性マーカーを誘導するとともに、2型コラーゲンなどの軟骨基質を誘導する作用もあり、相反する作用を発揮することが予想されたため、こちらもコンディショナル・ノックアウトマウスを用いて変形性関節症の解析をin vivoで行う準備をしている。この他にも肥大分化促進効果を有すると考えられる分子は複数あり、今後機会をみて解析を再開する予定である。