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グリオブラストーマ根治を目指すグリオーマ幹細胞研究総合戦略PART2

我々は26年度までの基盤(B)研究「グリオブラストーマ根治を目指すグリオーマ幹細胞研究総合戦略」の主な成果として、糖尿病治療薬メトホルミンならびにJNK阻害薬がグリオーマ幹細胞標的治療薬の有力候補となることを世界に先駆けて見出し、メトホルミンについては特許成立により近く臨床試験を実施できる見込みとなりつつある。そこで本研究ではこういったJNK阻害薬あるいはメトホルミンを今後実地臨床に応用し、治療成績を向上させてゆく上で重要と考えられる事項につき基礎前臨床レベルの研究を展開している。平成29年度は特にJNK阻害薬の臨床応用を加速する目的で、ドラッグリポジショニングの発想に基づきグリオーマ幹細胞を標的とする新たなJNK阻害薬の開発に取組んだ。その結果パーキンソン病治療薬候補として臨床試験が行われヒトへの安全性が確認されているJNK経路阻害薬CEP-1347がグリオーマ幹細胞標的治療薬として有望であることが明らかとなった。尚、JNK阻害薬探索の過程で我々は偶然グリオーマ幹細胞に特異的脆弱性(=アキレス腱)が存在することを発見・報告し、この新規概念に基づいた薬剤スクリーニングから、グリオーマ幹細胞特異的殺傷効果を示す新規薬剤を同定することに成功した。グリオーマ幹細胞に対して殺細胞効果をもつ薬剤は分化誘導薬剤との併用によりグリオーマ幹細胞治療効果を高める可能性が考えられるため、本研究課題が目標とするグリオブラストーマ根治に向けて大きな成果となることが期待される。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。我々は26年度までの基盤(B)研究「グリオブラストーマ根治を目指すグリオーマ幹細胞研究総合戦略」の主な成果として、糖尿病治療薬メトホルミンならびにJNK阻害薬がグリオーマ幹細胞標的治療薬の有力候補となることを世界に先駆けて見出し、メトホルミンについては臨床試験実施を予定するに至っている。そこで本研究ではこれら治療薬を今後実地臨床に応用してゆく上で検討が必要と考えられる事項につき基礎前臨床レベルの研究を開始した。具体的には、我々はごく最近がん幹細胞制御における細胞内糖代謝の重要性を発見していることから、より有効性の高いメトホルミン治療の実現を念頭に「糖代謝への直接介入」とメトホルミンのグリオーマ幹細胞制御における相互作用について検討を行うとともに、JNK阻害薬の臨床応用を加速するため、ドラッグリポジショニングの発想に基づいてグリオーマ幹細胞を標的とする新たなJNK阻害薬の開発に取組んでいる。従来in vitro, in vivo実験に用いてきたJNK阻害薬SP600125は臨床上の(=ヒトへの)安全性が確認されていないことから、我々は臨床上の安全情報が存在するJNK阻害薬をグリオーマ幹細胞治療薬として使用することを考え、本課題で検討を行った。その結果CEP1347のみならず新たなJNK阻害薬がグリオーマ幹細胞抑制効果を示すことが確認できた。本研究課題の大きな目的であるドラッグリポジショニングによるグリオーマ幹細胞標的治療薬開発という観点で、当初予定していた薬剤のみならず新規JNK阻害薬がグリオーマ幹細胞抑制効果を示すことが新たに確認されたため。我々は26年度までの基盤(B)研究「グリオブラストーマ根治を目指すグリオーマ幹細胞研究総合戦略」の主な成果として、糖尿病治療薬メトホルミンならびにJNK阻害薬がグリオーマ幹細胞標的治療薬の有力候補となることを世界に先駆けて見出し、メトホルミンについては近く臨床試験を実施できる見込みとなりつつある。具体的には、我々はがん幹細胞制御における細胞内糖代謝の重要性を発見していることから、メトホルミン治療の有効性を高める目的で「糖代謝への直接介入」とメトホルミンのグリオーマ幹細胞制御における相互作用について検討を試みつつある。一方、JNK阻害薬の臨床応用を加速するためドラッグリポジショニングの発想に基づいてグリオーマ幹細胞を標的とする新たなJNK阻害薬の開発に取組んできたが、こちらについては子宮内膜症の治療薬として開発されすでに臨床試験でヒトへの安全性に関する情報が存在するJNK阻害薬AS602801ががん幹細胞標的治療薬として有望であることを明らかにした。すなわち我々はAS602801がin vitroではがん幹細胞の幹細胞マーカー発現やスフィア形成能を抑制するなど自己複製能抑制効果を有していることを確認するとともに、in vivoにおいては担がん動物へのAS602801全身投与により腫瘍中のがん幹細胞が低減されることすなわちAS602801のがん幹細胞治療効果を確認し、これらの成果を論文として公表した。現在さらに他のJNK阻害薬についてもドラッグリポジショニングの観点からがん幹細胞に対する治療効果を検討している。本研究課題の大目的であるドラッグリポジショニングによるグリオーマ幹細胞標的治療薬開発という観点で、当初子宮内膜症治療薬として開発されたJNK阻害薬AS602801ががん幹細胞抑制効果を示すことをin vitroのみならずin vivoにおいても実証し、論文公表できたため。

そこで本研究ではこういったJNK阻害薬あるいはメトホルミンを今後実地臨床に応用し、治療成績を向上させてゆく上で重要と考えられる事項につき基礎前臨床レベルの研究を展開している。平成29年度は特にJNK阻害薬の臨床応用を加速する目的で、ドラッグリポジショニングの発想に基づきグリオーマ幹細胞を標的とする新たなJNK阻害薬の開発に取組んだ。その結果パーキンソン病治療薬候補として臨床試験が行われヒトへの安全性が確認されているJNK経路阻害薬CEP-1347がグリオーマ幹細胞標的治療薬として有望であることが明らかとなった。尚、JNK阻害薬探索の過程で我々は偶然グリオーマ幹細胞に特異的脆弱性(=アキレス腱)が存在することを発見・報告し、この新規概念に基づいた薬剤スクリーニングから、グリオーマ幹細胞特異的殺傷効果を示す新規薬剤を同定することに成功した。グリオーマ幹細胞に対して殺細胞効果をもつ薬剤は分化誘導薬剤との併用によりグリオーマ幹細胞治療効果を高める可能性が考えられるため、本研究課題が目標とするグリオブラストーマ根治に向けて大きな成果となることが期待される。新たに見出されたJNK阻害薬のグリオーマ幹細胞標的治療薬としての有用性をin vitro, in vivoの各実験系においてさらに検証するとともに、これらの薬剤を用いてグリオーマ根治療法モデルの作成を目指す。メトホルミン治療効果を高める手法の開発を継続するとともに、AS602801に加えドラッグリポジショニングにより新たに見出されたJNK阻害薬のがん幹細胞抑制効果について検討を行う。最終的にはグリオーマ治療モデルにおいて治療効果について検討を行う。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
感染症早期マーカーとしてのインターロイキン8とその診断法の開発

研究の背景:感染症の診断には、従来の検査より鋭敏で、特異性の高いマーカーの開発が、急務である。感染早期活性化のサイトカインとしてインターロイキン8(IL-8)に注目した。そこで、単球由来で感染症特異IL-8をクローニングし抗体を作製後、感染炎症の新しい診断法の確立を試みた。研究成果;敗血症で来院した患者65人の血中IL-8レベルを測定し、異常高値(>10pg/ml)となり、100%の感受性を示した。化学療法中の白血病患者は、従来の感染症マーカーである好中球数はあてにならず、患者の血中IL-8を測定しCRPや発熱の上昇と比較検討した。血中IL-8は、従来の感染症マーカーであるCRPや好中球、そして発熱のいずれよりも早期に上昇した。培養においても、ヒトモノサイトでPMA刺激後1時間よりIL-8mRNA発現が認められたが、対照としたIL-6mRNAの発現は3時間まで同定できなかった。。以上より、血中IL-8の測定は、極く早期の感染症疾患の活動を同定できる新しいマーカーであることが示唆された。そこで、好中球増加や発熱より早期に変化する単球由来のIL-8を測定するすることは、感染症の臨床診断に有用である。。敗血症で来院した患者65人の血中IL-8レベルを測定したところ、異常高値(>10pg/ml)となり、100%の感受性を示した。健常人で、92%は10pg/ml以下であった。血中IL-8は、従来の感染症マーカーであるCRPや好中球そして発熱のいずれよりも早期に上昇した。培養においても、ヒトモノサイトでPMA刺激後1時間よりIL-8mRNA発現が認められる。私たちはウイルス性心筋炎に対する免疫療法を行ってきており、IL-6を代表とする炎症性サイトカインは、急性期の炎症を抑制することがわかった。心臓粘液腫内にあるサイトカインから、分子量10-13kDの特有なIL-8サブクラスを発見し、SDS-PAGE電気泳動と抗IL-8抗体によるウエスタンブロッテイングによって解明した。加えて、好中球やマクロファージの抗IL-8抗体によるウエスタンブロッテイングによって、本来のバンド以外の新しい分子量のサブクラスの存在を単球で認めている。血中に流出するIL-8を早期微量で判定可能となり、一般内科医のスクリーニングとして利用できる。研究成果:敗血症で来院した患者65人の血中IL-8レベルを測定し、異常高値(>10pg/ml)となり、100%の感受性を示した。。
海洋産マクロリド、スウインホリド系天然物の全合成研究

本研究では、最近、紅海産あるいは沖縄産海綿より単離されたスウインホリド系天然物の全合成研究を行なう。本系天然物としてスウインホリドAG、ビステオヘリド類、サイトファイシン類が知られており、それらはいずれも顕著な抗腫瘍活性を有し、合成化学的にも薬理学的にも極めて興味深い化合物である。これらスウインホリド系天然物の応用性の高い合成法の開発を目指し、まず44員環2量体マクロリド、スウインホリドAの全合成を目的とする。すでに超高圧下でのニトロアルドール反応,左右対称分子の左右保護基の選択的除去,C20-メチル基の立体選択的導入等をへて,C11-C23セグメントおよびC24-C32セグメントを合成し,両者のアルドール縮合によりC11-C23部に相当する縮合体の立体選択的合成を達成した。本年度は重要合成中間体である左右対称ケトンをC16-水酸基を有する各種誘導体に導き、ジボラン還元すると位置及び立体選択的に左右保護基を区別して除去でき、サイトファイシンAE等の他の類縁天然物に存在するエポキシ基,ヒドロキシメチル基等に立体選択的に変換するルートの開発に成功した。これらは、コンピュータ化学計算の予測とほぼ一致する結果を得ることが出来た。また、C11-C32部のより効率的合成を目指してSharplessのエポキシ化、パラジウム還元を基盤とした別途合成を検討した。
分泌刺激時における外分泌細胞膜のカルシウムおよび水素イオン輸送機序

1.蛍光プロ-ブ法およびパッチクランプ法による唾液腺腺房細胞膜におけるカルシウムイオンインフラックスの輸送機序(西山)。(1)遊離腺房標本にFura-2AMを負荷し、Argus-100/Ca(浜松ホトニクス)を使用して細胞内カルシウム濃度(Ca^<2+>_i)を測定した。静止時のCa^<2+>_iは50100rMであった。ムスカリンおよびα-アドレナリン受容体刺激によりCa^<2+>_iは1μMまで上昇した。β-受容体刺激によってCa^<2+>_iは上昇しなかった。刺激によるCa^<2+>_iの上昇は初期相と持続相からなり、持続相は無Ca^<2+>_i液あるいはN_i^<2+>の投与によって抑制された。(2)遊離腺房標本にパッチクランプ法を応用し、ムスカリンおよびα-受容体刺激によりCa^<2+>依存性K^+(底側膜)およびCl^-(腺腔膜)コンダクタンスが活性化されることを見いだした。2.蛍光プロ-ブ法による外分泌腺腺房細胞における水素イオンエフラックスの輸送機序(斎藤)。遊離ラット涙腺および唾液腺腺房標本にBOECF-AMを負荷し、Argus-100を使用して細胞内水素イオン濃度(pHi)を測定した。静止時のpHiはおよそ7.0であった。ムスカリン受容体刺激によりpHiは一過性の、しかし不定の変動を示した。しかし、プロテインキナ-ゼC阻害剤(H-7)存在下で、刺激によりpHiは酸性化した。またフォルボルエステルとCa^<2+>イオノフォアを同時投与するとpHiはアルカリ化した。この結果はCa^<2+>依存性プロテインキナ-ゼCがNa^+-H^+対向輸送を賦活することを示唆する。3.細胞内電極法によるイノシト-ル3リン酸の細胞内投与の効果(林)。マウス摘出耳下腺組織におけるIP_3の細胞内注入は技術的に困難であった。IP_3-Ca^<2+>を介するα-受容体刺激効果を解析した。この刺激がCa^<2+>依存性K^+およびCl^-コンダクタンスを活性化するほかに、底側膜のNa^+-Cl^-共輸送およびNa^+-K^+ポンプを賦活することを見いだした。分泌刺激時の外分泌腺腺房細胞膜のカルシウムおよび水素イオン輸送を解明するため、イオン電極法によるマウス摘出腺組織の細胞内イオン活力測定およびイオン感受性蛍光色素法による単離外分泌腺腺房の細胞内イオン濃度の測定を行った。(1)細胞内カルシウムイオン(Cai)蛍光色素クイン-2あるいはフラ-2を負荷したラットの単離涙腺および唾液腺(耳下腺、顎下腺)腺房の静止時のCaiは100150nMであった。コリン作動性およびα-アドレナリン受容体の刺激は著明なCaiの上昇をもたらした。この上昇は初期相と持続相からなり、持続相は外液のCaイオンの存在に強い依存性を示し、この相でCaイオンのインフラックスが上昇することが示唆された。唾液腺細胞ではサイクリックアデノシン三リン酸を第二メッセンジャーとみなされているβ-アドレナリン受容体の刺激も僅かながらCaiを上昇させることを確かめた。(2)細胞内水素イオン(pHi)マウス涙腺の静止時のpHiは7.25であり、アミロライド(1mM)の存在下あるいは無Na液中でコリン作動性刺激はpHiを減少せしめた。この事実は底側膜にNa-H対向輸送が存在することを示唆した。H^+輸送の外液Naに対するミカエリス定数は65mMであった。BCECFを負荷したラット単離顎下腺腺房の静止時のpHiは7.2であり、コリン作動性受容体刺激はpHiを減少した。このpHiの減少はアミロライドの存在下あるいは無Na液下で増強され、Na-H対向輸送系の存在を示唆した。この輸送系にはNaの他にLiによっても代行されるが、K,Cs,Rbによっては代行されないことを確めた。マウス膵腺房細胞のpHiは6.97.0であり、パンクレオザイミンの刺激はpHiをアルカリ化した。しかし、アミロライド存在下では分泌刺激はpHiを減少させ、Na-H輸送の存在を示唆した。

2.蛍光プロ-ブ法による外分泌腺腺房細胞における水素イオンエフラックスの輸送機序(斎藤)。遊離ラット涙腺および唾液腺腺房標本にBOECF-AMを負荷し、Argus-100を使用して細胞内水素イオン濃度(pHi)を測定した。静止時のpHiはおよそ7.0であった。ムスカリン受容体刺激によりpHiは一過性の、しかし不定の変動を示した。しかし、プロテインキナ-ゼC阻害剤(H-7)存在下で、刺激によりpHiは酸性化した。またフォルボルエステルとCa^<2+>イオノフォアを同時投与するとpHiはアルカリ化した。この結果はCa^<2+>依存性プロテインキナ-ゼCがNa^+-H^+対向輸送を賦活することを示唆する。3.細胞内電極法によるイノシト-ル3リン酸の細胞内投与の効果(林)。マウス摘出耳下腺組織におけるIP_3の細胞内注入は技術的に困難であった。IP_3-Ca^<2+>を介するα-受容体刺激効果を解析した。この刺激がCa^<2+>依存性K^+およびCl^-コンダクタンスを活性化するほかに、底側膜のNa^+-Cl^-共輸送およびNa^+-K^+ポンプを賦活することを見いだした。
電力パケットによる自律分散電力需給制御とその配電ネットワークの設計に関する研究

本研究は、パルス状の電力に情報タグを物理的に直接付与した伝送単位である電力パケットを用いた配電網の設計を、実験をもとにネットワークの最適化問題の一つと捉えて定式化する。具体的には、実際の系の例として電気自動車を想定し配電網を構築、既存の直流配電と電力パケットによる配電の比較を行う。以降は実験データをもとに、数値計算によって制御手法を検討、最終的には制御情報とその情報に基づき伝送される電力との関係から、配電網設計の定式化を行う。
外来DNAに対するホスト細胞のエピジェネティック制御機構の解明

ウィルス感染などにより誘導されるエピゲノム異常と疾患の関わりが示唆されており、分子機構の解明が希求されている。Epstein-Barrウイルスはホスト細胞感染時にエピソームを形成し、ウイルスゲノム自身もホストゲノムDNAもエピゲノム変化を生じる。その分子機構を明らかにするため、エピソーマル型プラスミドをホスト細胞に導入し、エピソームに対するエピゲノム変化およびその原因候補タンパクの探索を行った。プラスミドは、oriP配列とEBNA1遺伝子、さらにGFP遺伝子と薬剤耐性遺伝子を導入した11kbのエピソーマル型プラスミドEB-Multi GFP(以下EBM)を用いた。GFPタンパクは、薬剤選択下では、高発現状態が維持されたが、薬剤非選択下では様々な発現レベルを示す集団が観察された。エピソームのDNAメチル化状態についてGFP遺伝子領域を含め、パイロシークエンス法を用いて解析し、メチル化の誘導を同定した。次にEBNA1にFLAGタグを結合したFLAG-EBNA1タンパクを発現した293T細胞に、ビオチンラベルしたEBMプラスミドを導入し、エピソームに結合するタンパクの同定を行った。アビジンビーズによりEBM導入6日後の細胞からビオチンラベルDNAを回収し、これに結合するタンパクを抽出した。抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロティング解析により、抽出物中のFLAG-EBNA1タンパクをコントロールとして確認した。銀染色では複数のバンドを認め、LC-MS/MSによるEBM結合タンパクのプロテオミクス解析を行った。同定した候補タンパクのうちp53タンパクについては、ウエスタン法によりEBMプラスミドへの結合が確認された。さらに、shRNAによりp53発現を抑制した細胞では、EBMプラスミドのGFP発現の増大が観察され、p53がEBMプラスミドの発現制御に関与していることが示唆された。ホスト細胞は外来ウィルスDNAに対し、フリーDNA状態からヌクレオソームを形成し、DNAメチル化やヒストン修飾を行うなどダイナミックにエピゲノムを制御するが、時系列的に変遷するエピゲノム状態については不明な点が多い。GFP遺伝子を持つEpstein-Barrウィルス型エピソーマルプラスミドDNAを293T細胞に導入すると、薬剤非選択条件下において、発現抑制が見られた。経時的にシトシンのメチル化(以下、DNAメチル化)誘導の有無を調べたところ、導入後10日後の細胞集団では、GFPの発現抑制はみられたが、DNAのメチル化誘導はみられなかった。一方、導入後50日後の細胞ではDNAメチル化誘導が観察された。よって、培養後10日後にみられたGFPの発現抑制はDNAメチル化以外の機構によることが分かった。次に、GFPの発現抑制に関わる因子の同定を目指し、ビオチンラベル処理をおこなったエピソーマル型プラスミドDNAを293T細胞に導入し、プラスミドDNAに結合するタンパクの検索を行った。複数の候補タンパクを同定し、現在、エピゲノム制御との関連を調査している。また、原子間力顕微鏡(AFM)を用い、メチル化DNAに特異的に結合するMBD蛋白によるDNAメチル化状態の可視化を試みている。エピソーマル型プラスミドDNA(oriP配列、EBNA1遺伝子およびGFP遺伝子を含む、以下EBM)をホスト細胞にトランスフェクションして、そのDNAメチル化状態の変遷をバイサルファイトシークエンス法およびパイロシークエンス法によって解析した。既報において、ES細胞では、1週間の短期培養後にプラスミドDNAのメチル化誘導は見られるが、293T細胞では見られないとされていた。我々もEBM導入後10日前後の細胞集団では、DNAのメチル化誘導はみられなかった。しかしながら、導入後50日後の細胞ではDNAメチル化誘導が観察された。さらに、別のエピソーマル型プラスミドDNA(oriP配列、EBNA1遺伝子およびlacOリピート配列を含む、以下EBV-lacO)を用い、バイサルファイトシークエンス法にてOri15A領域の解析を行ったところ、長期培養によりメチル化誘導が見られた。EBV-lacOを細胞へ導入後、GFP-lacRおよびmCherry-MBDを共発現させたところ、48時間後の細胞では共局在は見られなかったが、長期培養後に共局在が観察され、細胞内でのメチル化状態の可視化に成功した。また、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたDNAメチル化の可視化の試みとして、メチル化DNAにメチル化DNAに結合するMBD蛋白を加えたところ、DNA蛋白複合体が観察された。次にEBNA1にFLAGタグを結合したFLAG-EBNA

1タンパクを発現した293T細胞に、ビオチンラベルしたEBMプラスミドを導入し、エピソームに結合するタンパクの同定を行った。アビジンビーズによりEBM導入6日後の細胞からビオチンラベルDNAを回収し、これに結合するタンパクを抽出した。抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロティング解析により、抽出物中のFLAG-EBNA1タンパクをコントロールとして確認した。銀染色では複数のバンドを認め、LC-MS/MSによるEBM結合タンパクのプロテオミクス解析を行った。同定した候補タンパクのうちp53タンパクについては、ウエスタン法によりEBMプラスミドへの結合が確認された。さらに、shRNAによりp53発現を抑制した細胞では、EBMプラスミドのGFP発現の増大が観察され、p53がEBMプラスミドの発現制御に関与していることが示唆された。ビオチンラベル処理をおこなったエピソーマル型プラスミドDNAを293T細胞に導入し、プラスミドDNAに結合するタンパクの検索を行った。複数の候補タンパクを同定しており、現在、これらタンパクの発現抑制系の構築を目指しており、エピゲノム制御との関連を調査している。また、MBD蛋白を用い、メチル化DNAとのDNA蛋白複合体像の観察が原子間力顕微鏡(AFM)により可能となったため、今後は細胞に導入したプラスミドDNAを経時的に細胞から抽出し、どのようにメチル化が誘導されるか、観察する。
ウェアラブル脳波計を用いた実環境下におけるワークロードの推定

ウェアラブル脳波計を用いて,実環境下におけるヒトのワークロードの評価に関する研究を行った.ヒトのワークロードとは,どの程度脳が使用されているかを表す指標である.ワークロードを知ることで,特定の作業や,物事,サービス,行動がどの程度,ヒトに対して負荷を与えているかを知ることができる.本研究では,このワークロードを評価するための指標として,聴覚定常状態応答を用いた.最終年度は,この聴覚定常状態応答を脳波データから正確に抽出するための信号解析法に関する研究に携わった.脳波計測信号には,脳活動を反映する脳波成分とノイズとなるアーチファクト信号が混合している.計測信号の中から,脳活動に由来する聴覚定常状態応答を明確に抽出することは,ワークロードをより正確に評価することにつながる.最終年度は,この脳波信号とノイズ信号の分離に関する信号処理技術に関して解析,評価を行った.具体的には,独立成分分析といったブラインド信号源分離に関する方法を比較検討した.その結果,独立成分分析のなかのInfomaxアルゴリズムを用いた方法が比較検討したなか,もっとも聴覚定常状態応答を強く抽出することができた.この成果は,ヒューマンインタフェース学会論文誌に採択された.本研究は国立研究開発法人情報通信研究機構の倫理委員会およびパーソナルデータ取扱研究開発業務審議委員会の承認を受け,すべての参加者に対して実験内容について事前に十分な説明を行った後,参加の同意を得た上で行われた.すべての実験は,ヘルシンキ宣言に記載された倫理基準に従って実施された.ウェアラブル脳波計を用いた脳波計測から、人がどの程度、脳を使用しているかといったワークロードを推定するための研究を実行中である。ワークロードの指標には、聴覚定常状態応答(ASSR)と呼ばれる脳波成分を使用した。ASSRは、申請者の過去の研究において、ワークロードに変化に応じて変調することが明らかにされている。本申請では、実環境下における脳波,ASSR計測からワークロードを推定することを狙いにしている。本研究では、人が歩行している状態においても、ワークロード推定か可能かどうかを検証するため、人がトレッドミルの上を歩いている状態において脳波計測実験を行った。脳内のワークロードを変化させるために、Nバック課題と呼ばれる記憶課題を使用した。また、運動による負荷によってもワークロードが変化するかどうかを明らかにするために、歩行の運動幅を制限する拘束具を装着した状態における歩行実験も行った。Nバック課題による記憶課題実験では、合計で15人のデータを集めることに成功した。その結果、ASSRの活動はNバック課題の難易度が増加するにしたがって、減少することを示した。また、運動課題では、歩行が制限された課題において、通常の歩行課題よりもASSRの活動が減衰した。これらの結果から、ASSRは記憶負荷と運動負荷の両方において、人の脳内のワークロードが増加するにしたがって、活動が弱まることが示唆された。本研究では、ASSRという脳活動を歩きながらでも、ウェアラブル脳波計という手軽に脳活動が計れるシステムにおいて抽出することに成功した。なお、本実験は国立研究開発法人情報通信研究機構の倫理委員会の承認を受け、すべての参加者に対して実験内容について事前に十分な説明を行なった後、参加の同意を得たうえで行なわれた.すべての実験は、ヘルシンキ宣言に記載された倫理基準に従って実施された。ASSRからワークロードを推定する研究は、当初の予定よりも進展している。当初、歩行中に脳波データに大きなノイズが重畳するために、ASSRの抽出が困難ではないかという懸念があった。しかしながら、実際に脳波計測を行ったところ、脳活動とノイズの分離は容易であった。そのため、スムーズな実験、解析が実行できた。現在では、Nバック課題による研究成果は、ヒューマンインターフェースシンポジウム,IEEE EMBC学会で発表している。また研究成果を論文として世界に発信するために、frontier in human neuroscienceに投稿中である。ウェアラブル脳波計を用いた脳波計測から,ヒトがどの程度,脳を使っているかという指標であるワークロードを推定するための研究を行っている.昨年度は,トレッドミルを歩行している間,複数の難易度の課題を実行したときに,脳活動がどのように変化するかを実験,調査した.その結果,聴覚定常状態応答と呼ばれる脳活動が,課題難易度に従って減少することが示された.この実験結果は,聴覚定常状態応答が脳内のワークロードの指標となることを示している.この成果を世界中に発信するために,本成果を学術論文としてまとめた.論文はFrontiers in Human NeuroscienceのOriginal Researchとして採択された.また,聴覚定常状態応答がワークロードの指標となるという結果を受けて,現在,企業との共同研究を実施している.工場において作業員が業務として設定された課題を行っている間,課題に対する習熟度が脳内におけるワークロードから推定できるのではないかという仮説を立てた.この仮説を検証するために,工場を模した環境下において課題を実行中の脳活動が,課題を熟知している熟練者と,初めて課題行う非熟練者においてどのような変化が見られるかを検証した.その結果,非熟練者は毎日,課題を行うごとにワークロードの値が小さくなった.

このことから,非熟練者は作業を繰り返すことで,作業に対する熟練度が上達し,その結果,脳内のワークロードが小さくなったと考えられる.なお,本研究は国立研究開発法人情報通信研究機構の倫理委員会およびパーソナルデータ取扱研究開発業務審議委員会の承認を受け,すべての参加者に対して実験内容について事前に十分な説明を行った後,参加の同意を得た上で行われた.すべての実験は,ヘルシンキ宣言に記載された倫理基準に従って実施された.学術論文として研究成果をまとめる段階において,データの再解析を行うことで,聴覚定常状態応答の変化が,実験課題による難易度だけではなく,被験者の実験に対する疲労といった要因も絡んでいると考えられ,当初,予期していなかった情報が反映されている可能性が示された.本成果はFrontiers in HumanNeuroscienceの学術論文に投稿し,採択された.また,企業との共同研究を行い,工場を模した環境下において,作業員が業務を行っているときの脳内のワークロード計測実験を行った.実験は,業務を常日頃行っている熟練者と,業務に携わったことがない非熟練者の条件下にて行われた.実験の結果,熟練者は,毎日実験課題を行っていてもワークロードの値が変化しなかったが,非熟練者は,課題中のワークロードが日毎に小さくなるという結果が得られた.この結果は,聴覚定常状態応答が,ヒトの課題に対する上達度を評価する指標として利用できる可能性を示している.ウェアラブル脳波計を用いて,実環境下におけるヒトのワークロードの評価に関する研究を行った.ヒトのワークロードとは,どの程度脳が使用されているかを表す指標である.ワークロードを知ることで,特定の作業や,物事,サービス,行動がどの程度,ヒトに対して負荷を与えているかを知ることができる.本研究では,このワークロードを評価するための指標として,聴覚定常状態応答を用いた.最終年度は,この聴覚定常状態応答を脳波データから正確に抽出するための信号解析法に関する研究に携わった.脳波計測信号には,脳活動を反映する脳波成分とノイズとなるアーチファクト信号が混合している.計測信号の中から,脳活動に由来する聴覚定常状態応答を明確に抽出することは,ワークロードをより正確に評価することにつながる.最終年度は,この脳波信号とノイズ信号の分離に関する信号処理技術に関して解析,評価を行った.具体的には,独立成分分析といったブラインド信号源分離に関する方法を比較検討した.その結果,独立成分分析のなかのInfomaxアルゴリズムを用いた方法が比較検討したなか,もっとも聴覚定常状態応答を強く抽出することができた.この成果は,ヒューマンインタフェース学会論文誌に採択された.本研究は国立研究開発法人情報通信研究機構の倫理委員会およびパーソナルデータ取扱研究開発業務審議委員会の承認を受け,すべての参加者に対して実験内容について事前に十分な説明を行った後,参加の同意を得た上で行われた.すべての実験は,ヘルシンキ宣言に記載された倫理基準に従って実施された.現在、ワークロードを評価するためには、2-3分の脳波計測の時間が必要となっている。そのため、細かな時間変動、例えば数十秒単位でワークロードがどの程度変化しているかを評価することは難しい。そのため、今後の研究の方針の1つは、どの程度細かな時間においてもワークロードが可能かを検証することである。
Wolfram症候群における糖尿病の「優性」遺伝様式に関する検討

Wolfram症候群は「尿崩症・インスリン依存型糖尿病・視神経萎縮・難聴」を4大症状(DIDMOAD)とする常染色体劣性の遺伝性疾患である。Wolfram遺伝子(WFS1)の遺伝子異常のホモ接合では若年型IDDM、ヘテロ接合では成人型NIDDMになるという仮説を初年度に立てた。当該年度では、2型糖尿病者に加えて気分障害患者のWolfram遺伝子のスクリーニングを継続し完了させた。(1)Wolfram遺伝子に関する患者遺伝子のスクリーニング2型糖尿病者と気分障害患者のWolfram遺伝子の8個のエクソンをPCR法で増幅した後直接シーケンスして変異の同定を試みた。対象の数を前年度からさらに増やして調査した結果、7種類のミスセンス変異(R456H,V503G,G576S,H611R,1720V,E737K,R756H)とアミノ酸の変化しない6種類のpolymorphismが最終的に同定された。しかし、これらの遺伝子変異と疾患発症との関連解析では、それぞれの病態において共に有意の関連が認められなかったので、ヘテロ接合が主たる遺伝素因の一つであるという当初の研究者らの仮説は否定された。(2)マウスとヒトWolfram遺伝子産物に対する抗体の作成本年度はマウスとヒト蛋白に対するペプチド抗体の作成に着手したが、現時点ではマウス抗体の作成にのみ成功している。上述のように、我々の申請時の仮説が否定されたので、以降に予定されていた発現実験は中止された。ホモ接合では若年型IDOM、ヘテロ接合では成人型NIDDMになるという仮説を立てた。Wolfram症候群では躁鬱病などの気分障害の合併も26倍多く、ヘテロ接合では気分障害の約1/4が関与すると推定されている。そこで本研究では、2型糖尿病者に加えて気分障害患者のWolfram遺伝子をスクリーニングして変異の同定を試みた。その結果、現在までに7種類のミスセンス変異(R456H,V503G,G576S,H611R,1720V,E737K,R756H)とアミノ酸の変化しない6種類のpolymorphismを同定した。これらの遺伝子変異と疾患発症との関連解析では有意の成績は認められていない。しかし、結論するにはまだ少ないので、数を増やす必要があると考える。ヒト抗体に関して継続中である。これらの抗体は、次年度以降の発現実験や免役組織学的解析に供する予定である。
光障害時におけるオートファジーを介した葉緑体品質管理とその制御機構の解析

本研究は、光障害によって生じる障害葉緑体の選択的除去を担う葉緑体オートファジー「クロロファジー」の、品質管理機構としての重要性とその制御機構を明らかにすることを目的としている。これまでに、光障害により膨張した異常な形態を示す葉緑体が選択的に除去されることを明らかにしてきた。さらに、膨張の主要因として、葉緑体包膜の損傷により葉緑体内と細胞質のバランスに異常が生じている可能性が考えられたため、包膜の修復や維持に関わる遺伝子が欠損した変異体において、クロロファジーの誘導頻度が変化するかどうかを調べた。包膜の修復に関わる遺伝子の機能低下株では、膨張した葉緑体の頻度は増加し、クロロファジーが活性化した。一方で、その遺伝子の機能強化株では葉緑体の膨張およびクロロファジーの誘導が抑制された。つまり、クロロファジーの誘導には、葉緑体包膜のダメージが関与していることが示された。これら成果を、米国植物生理学会誌Plant Physiology (インパクトファクター2017=5.949) 7月号に発表することが出来(Nakamura et al., 2018, Plant Physiol)、International Symposium on Photosynthesis and Chloroplast Biogenesis 2018 (2018年11月)でのポスター発表では、Best Poster Awardを受賞することが出来た。さらに、異常葉緑体を認識するレセプタータンパク質を同定するため、クロロファジー機能欠損変異体のスクリーニングを行った。約10,000個体の観察から、8系統のクロロファジー特異的欠損変異体の候補株を単離し、次世代シーケンサーによるゲノムリシーケンスを実施した。得られたシーケンス情報を基に、クロロファジー関連遺伝子の候補の絞り込むことが出来た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。私はこれまでに、紫外線や強光といった光障害時に、葉緑体がまるごと液胞内へとオートファジー依存的に除去される「クロロファジー」が誘導されることを見出してきた。そこで本研究では、光障害時におけるクロロファジーの選択的除去を可能にする制御機構を明らかにすることを目的に、研究を遂行している。これまでの解析で、光障害により大きく膨張した葉緑体が選択的に除去されることが示唆されている。葉緑体が膨張する要因として、葉緑体包膜が損傷し、葉緑体内と細胞質のバランスに異常が生じている可能性が考えられる。そこで、包膜修復を担うとされる遺伝子の発現量が変化している各系統において、膨張した葉緑体とクロロファジーの発生頻度がどう変化するかを調べた。まず、包膜修復を担う遺伝子の発現量が増加している系統では、野生体と比較して、膨張した葉緑体の頻度は少なく、その後に誘導されるクロロファジーの頻度も低下していた。一方、この遺伝子の機能が低下している系統では膨張した葉緑体およびクロロファジーの誘導が活性化した。これらの結果より、クロロファジーの誘導には包膜の損傷が関与しており、葉緑体内外の浸透圧バランスの変化がクロロファジー誘導の一つのシグナルである可能性が示された。また、異常葉緑体を認識するレセプタータンパク質を同定するため、クロロファジー機能欠損変異体単離のスクリーニングを開始した。葉緑体をGFPなどの蛍光タンパク質で可視化すると、液胞に輸送された葉緑体はGFPが先に分解されるため、顕微鏡下ではクロロフィルの自家蛍光のみを持つ葉緑体として容易に検出できるため、アルキル化剤で変異原処理した上記形質転換体のM2個体群に対し強光を照射した後、蛍光顕微鏡下でクロロファジーが起きない変異体を単離した。これまでに約7,000個体の観察から、数系統の候補株を単離した。本年度に計画していた包膜の修復に関わる遺伝子の欠損変異体の解析はおおむね完了している。クロロファジー機能欠損変異体単離のためのスクリーニング系は、実験系の構築から約7,000個体までの観察を終えており、数個体の候補株の単離に成功している。また、液胞膜やオートファゴソーム膜などを蛍光タンパク質により可視化した各種系統の整備も併せて進めている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。本研究は、光障害時におけるクロロファジーの分解メカニズム、特に障害葉緑体の選択的除去を可能にする制御機構を明らかにすることを目的としている。これまでに、光障害により膨張した葉緑体が選択的に除去されることを明らかにしてきた。オートファジーの主な経路として、オートファゴソームを形成することで基質を輸送するマクロオートファジーと、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの経路が知られている。そこで、クロロファジー経路において、光障害葉緑体がどのように液胞内へと取り込まれるかを明らかにするため、前年度から作製していたオートファゴソームマーカーATG8や液胞膜を蛍光タンパク質で可視化した系統を用いてライブセルイメージングを行った。まず、ATG8をGFPにより可視化した系統を、強光照射から1日後に観察すると、膨張した葉緑体の周辺に部分的にATG8が蓄積している様子が観察された。この系統の観察を複数回行ったものの、ATG8のシグナルが葉緑体全体を包み込む様子は観察されなかったため、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの系を介しているのではないかと考え、液胞膜を可視化した系統の観察を行った。

すると、膨張した葉緑体を液胞膜が直接取り囲んでいる様子が観察された。また、オートファジー機能欠損変異株atg5ではこのような様子は見られなかった。つまり、ATG8が膨張した葉緑体を基質として標識し、これを液胞膜が直接取り囲んでいくミクロオートファジーの系を介していることが示された。クロロファジー機能欠損変異体のスクリーニングについては、観察数を約10,000個体まで増やし、変異体単離を継続して行っている。得られた候補株は、随時、戻し交配を行っており、次世代シークエンサーによるゲノムリシーケンスに向けたサンプリングを行った。次年度はリシーケンスを実施し、原因遺伝子を絞り込む予定である。本年度に計画していた、液胞膜やオートファゴソーム膜などを蛍光タンパク質により可視化した各種系統の観察はおおむね完了している。光障害によって生じた膨張葉緑体の周辺にオートファゴソームマーカーであるATG8が部分的に蓄積する様子、および、液胞膜が直接葉緑体を包み込む様子が観察された。よって、ATG8が選択的な分解における基質の標識に関与していること、また、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの経路を取っていることを明らかにした。また、クロロファジー機能欠損変異体単離のためのスクリーニングは、目標としていた約10,000個体の観察を完了しており、得られた候補株の戻し交配を行っている。戻し交配が先行している系統から、随時、原因遺伝子の同定のためのリシーケンスのサンプリングを進めており、次年度から実際にリシーケンスを行う体制が整っている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。本研究は、光障害によって生じる障害葉緑体の選択的除去を担う葉緑体オートファジー「クロロファジー」の、品質管理機構としての重要性とその制御機構を明らかにすることを目的としている。これまでに、光障害により膨張した異常な形態を示す葉緑体が選択的に除去されることを明らかにしてきた。さらに、膨張の主要因として、葉緑体包膜の損傷により葉緑体内と細胞質のバランスに異常が生じている可能性が考えられたため、包膜の修復や維持に関わる遺伝子が欠損した変異体において、クロロファジーの誘導頻度が変化するかどうかを調べた。包膜の修復に関わる遺伝子の機能低下株では、膨張した葉緑体の頻度は増加し、クロロファジーが活性化した。一方で、その遺伝子の機能強化株では葉緑体の膨張およびクロロファジーの誘導が抑制された。つまり、クロロファジーの誘導には、葉緑体包膜のダメージが関与していることが示された。これら成果を、米国植物生理学会誌Plant Physiology (インパクトファクター2017=5.949) 7月号に発表することが出来(Nakamura et al., 2018, Plant Physiol)、International Symposium on Photosynthesis and Chloroplast Biogenesis 2018 (2018年11月)でのポスター発表では、Best Poster Awardを受賞することが出来た。さらに、異常葉緑体を認識するレセプタータンパク質を同定するため、クロロファジー機能欠損変異体のスクリーニングを行った。
肝細胞癌に対する液状塞栓物質を用いた肝動脈塞栓療法の有用性の研究

1%、2%、4%、6%のEV0HおよびDMS0を、家兎肝腫瘍モデルの固有肝動脈より注入した(n=15)。その直後に屠殺解剖し、摘出標本をエックス線学的、組織学的に評価した。摘出標本の軟エックス線撮影では、低濃度のEV0Hは断片化し、より末梢まで到達する傾向があった。高濃度のEVOHは中枢血管から連続して鋳型状に存在していたが、最終到達血管は低濃度より中枢であつた。軟エックス線写真上でEVOHが到達した血管の固有肝動脈からの最大分岐数は、2%EV0Hが16.0分岐、4%EVOHが13.6分岐、6%EV0Hが10.0分岐であった。1%は測定不能であった。組織学的には腫瘍部では、1%EVOHは径15μm、2%EV0Hは径20μm、4%EV0Hは径35μm、6%EV0Hは40μmの腫瘍血管内に,存在し、非腫瘍部では1%、2%及び4%EV0HはSinusoidに、6%EV0Hは径40μmの動脈に到達していた。固有肝動脈に投与したEVOHは肝腫瘍内に到達しており、その濃度を変化させることにより塞栓血管径を調節できる可能性が確認できた。EVOHは、肝動脈塞栓術に於ける塞栓物質の一つになりうると考えられた。2%、4%、6%の濃度の異なるEVOHおよびEVOHの溶媒であるDMSOを、家兎肝腫瘍モデルの固有肝動脈より注入した(n=12)。塞栓直後の腹腔動脈造影では、EVOH投与群は全例で肝動脈は閉塞していが、DMSO単独投与群では、全例で肝動脈は開存していた。摘出標本の軟エックス線撮影では、低濃度のEVOHは断片化し、より末梢まで到達する傾向があった。高濃度のEVOHは中枢血管から連続して鋳型状に存在していたが、最終到達血管は低濃度より中枢であった。軟エックス線写真上でEVOHが到達した血管の固有肝動脈からの最大分岐数は、2%EVOHが16.0分岐、4%EVOHが13.6分岐、6%EVOHが10.0分岐であった。組織学的には腫瘍部では、2%EVOHは径20μm、4%EVOHは径35μm、6%EVOHは40μmの腫瘍血管内に存在し、非腫瘍部では2%及び4%EVOHはSinusoidに、6%EVOHは径40μmの動脈に到達していた。本結果については、既に第265回日本医学放射線学会関西地方会、日本血管造影・Interventional Radiology学会第8回関西地方会にて発表し、第60回日本医学放射線学会総会においても発表予定である。Acta.Radiologica誌へ投稿予定である。1%、2%、4%、6%のEVOHおよびDMSOを、家兎肝腫瘍モデルの固有肝動脈より注入した(n=15)。

組織学的には腫瘍部では、1%EVOHは径15μm、2%EVOHは径20μm、4%EVOHは径35μm、6%EVOHは40μmの腫瘍血管内に存在し、非腫瘍部では1%、2%及び4%EVOHはsinusoidに、6%EVOHは径40μmの動脈に到達していた。固有肝動脈に投与したEVOHは肝腫瘍内に到達しており、その濃度を変化させることにより塞栓血管径を調節できる可能性が確認できた。EVOHは、肝動脈塞栓術に於ける塞栓物質の一つになりうると考えられた。本結果については、既に第265回日本医学放射線学会関西地方会(平成12年6月24日)、日本血管造影・Interventional Radiology学会第8回関西地方会(平成12年9月2日)、第60回日本医学放射線学会総会(平成13年4月7日)において発表した。学術論文がActa Radiologica誌へ掲載予定である。
中枢性化学受容体の反応性における生後発達について

研究目的:低酸素は末梢性化学受容体が感知して、中枢へ情報を伝達することで、呼吸促進が起こり、末梢性化学受容体からの入力を遮断すると、中枢側では呼吸抑制が起こることが知られている。従って低酸素は呼吸促進しないと思われてきた。しかし末梢からの入力がない標本を用いたラットにおいて、周産期(胎生18日齢(E18)生後1日齢(P1))では、低酸素でも呼吸を促進できることが分かった。この研究では、末梢からの入力がなくとも新生期では中枢でO_2に対する感受性があることを示し、そのメカニズムを解明することである。研究方法:深麻酔後の胎生・新生ラットから延髄-脊髄を摘出し、標本を作製する。標本はリンゲル液を還流させたチェンバー内に入れ、第4頸髄前根(C4)竃ガラス吸引電極で記録することにより呼吸活動をモニターする。C4活動と同時に、呼吸中枢が存在する延髄の吻側腹外側野から呼吸性ニューロンの細胞外記録を行う。呼吸リズム形成(Pre-I)ニューロンや吸息性ニューロン、呼息性ニューロンそして、持続性発火ニューロンの低酸素に対する反応性を調べた。呼吸性ニューロンの種類と発火頻度の変化を検討することにより、中枢性化学受容における低酸素応答の発達に伴う変化を検討する。研究成果:低酸素負荷によってC4リズムが促進する現象において、持続性発火ニューロンとPre-Iニューロンの発火頻度は増加傾向にあり、吸息性ニューロンではバースト内の発火頻度の有意な変化がみられなかった。一方で、呼息性ニューロンのバースト内発火頻度は有意に減少傾向を示した。これらの結果から、周産期の低酸素受容における促進反応は、ニューロンネットワークのトーヌスの調節に持続性発火ニューロンが関与し、リズム促進にはPre-Iニューロンが関与して呼吸性ニューロンネットワークを調節している事が示唆された。
50年前に原爆被爆した者における精神障害の有病率-地域調査のパイロット研究として-

長崎市にて生活している原子爆弾被爆者(原爆被爆者手帳の保有者)はおおよそ5万人いるが、彼らについて科学的方法論に則って詳細な疫学研究は未だ行われてこなかった。われわれは、原爆投下から50年を経過してこの被爆者における精神的な負担の程度を知り、且つ精神障害の有病率を明らかにすることによって、現在彼らが如何なる精神保健支援を必要としているかを探ろうとした。対象は調査期間内に被爆者健康診断を受診してくる被爆者のうち、本研究に参加の同意が表明された者で、彼らに全般健康調査12項目版(GHQ-12)でスクリーニングを施行し、二次調査としてCIDI面接、および三次調査として精神科医による臨床面接が実施された。協力の得られた事例は7,670名(男性3,216名、女性4,454名)である。一次調査の結果として、GHQ-12における高得点者の頻度は9.3%であり、性別・年齢階層別に全く同一の頻度ではないものの有意な差を見るほどではなかった。これを被ばく距離別に見たとき、近距離被爆者(2km)が他の被爆距離群の者より高い平均得点を示し、また高得点者も多いことが確認された。次にこの一次調査のスコアをもとに二次調査(参加協力者は225名)・三次調査対象(同212名)が抽出されたが、彼らに見られた精神障害のうち最も頻繁に見られた診断はF4「神経症性、ストレス関連性、および身体表現性の障害」であり、中でも身体表現性障害・他の不安障害の亜型が目立った。次に多かったのはF3「気分(感情)障害」で、特にうつ病圏患者が目立って多かった。今回の多数の協力をもとに、被爆者における精神疾患の有病率を推算してみると、最低の11.5919.59%までの幅があった。日本においては、こうしたデータの報告が全くと言っていいほどに見られないので、同値が低率なのか高率なのかを判断できない。われわれは、一般内科外来を受診した患者について全く同じ方法論でもって調査研究を行い、20%を越える有病率であったことを報告している。それに比すと、やや高率であることが窺われる。ただ、今後も詳細な疫学研究を継続することによって、適切な解釈が可能となるであろう。更に、こうした頻度に影響する要因の解明も必要であり、今後は心理社会的背景を綿密に調査していく予定にしている。研究実施計画に記載した方法に則って、長崎市における原爆被爆者の精神健康状態に関する調査を行った。即ち一次調査はGHQ-12を利用し、二次調査には精神医学的構成面接法CIDI、およびGHQ-30などをもとに、そして更に精神科医が三次調査を行った。本年度に対象となった被験者数は、一次調査において4,665人(全対象4,847人中のGHQ-12完了者、性別では男性1,939、女性2,726人)である。

対象者の平均年齢は男性62.61(SD ; 8.41)歳、女性64.15(SD ; 8.58)歳であり、GHQ-12スコアを低得点・中得点・高得点群に分けて高得点者の頻度をみると、男性で8.9%、女性では8.7%と僅かに差があった。ただ60歳以上では逆に女性で高率となっていた。被爆距離とGHQ-12高得点者の頻度の関係をみると、爆心地近くで被爆した者に高得点者が多かった。但し、これは、傾向であって有意の結果ではなく、今後更に解析が必要となろう。このGHQ-12のスコア分布についての解析は未だ本邦で少なく比較対象が困難であるが、われわれ自信が内科外来患者を対象に行った結果と比較するとやや低率である。二次調査のために抽出されたのは、172人(本来対象となるべき者の内59.7%が同意)で、彼らに所定の調査が施行されたが、CIDIなどの解析は完了していない。そこで三次調査の対象153人に関する結果を紹介する。この対象で、精神科診断が付された者は88人が、うつ病圏の疾患を含む「気分障害」が最も多く、「神経症性障害、ストレス関連障害および身体表現性障害」がそれに続いた。その頻度は、一般住民と比較したときやや高率であると考えられた。前年に引き続いて、長崎市にて生活している原子爆弾被ばく者(原爆被爆者手帳の保有者)を対象に所定の方式に則って、面接調査がなされた。採用した評価尺度は、全般健康調査票12項目および30項目版版(GHQ-12、GHQ-30)、統合国際診断面接法(CIDI)、社会的機能障害尺度(SDS)などであり、本研究に入るまで、これらの尺度利用に関する演習を繰り返した。一次調査としてGHQ-12項目版でスクリーニングを行い、それの総合得点別に二次調査対象を抽出した。一次調査・二次調査それぞれに詳細な説明をし、研究への協力の同意を得た。CIDIおよび臨床面接の結果は、ICD-10診断が付された。平成8年度は同年4月から8月までに、長崎原爆被爆者健康管理センターでの検診を受けた者で、更に長崎在住の被ばく二世にも協力を依頼した。ただ、予備的調査のニュアンスが強い。結果的に、調査期間を通じて重複した症例を除くと、男性3,216人、女性4,454人、併せて7,670人被ばく者が協力し、1,592人の被ばく二世が協力した。先の単年度の結果において示唆された結果が、より高い統計学的有意差を以て確認されることとなった。つまり被ばく距離別にGHQ-12得点を見たとき、近距離被ばく者(2km)が他の被ばく距離群の者より高得点で、また高得点者も多いことが確認された。彼らの中には、気分障害(うつ病)や神経症性障害、ストレス関連障害および身体表現性障害などと診断される事例の少なくないことも見られた。被ばく二世は予想に反して、高齢者である被ばく者よりGHQ-12の高得点者が多かった。こうした結果の背景について、被ばくによる家族や知己の死、あるいはその他の心理社会的負荷の関与が考えられ、現在そうした側面の評価に関する質問票を準備中である。被ばく者のかなりな人たちに心理的悪影響が発現していることが確認されたので、今後は、その背景を探ると共に、具体的支援の方法を検討していく計画である。