hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞表層配位化学による膜タンパク質の機能プログラミング

生細胞は膜表面に存在する膜タンパク質受容体により外部刺激を感知し、その性質・機能を適応させる。しかしながら、膜タンパク質受容体の三次元構造は非常に類似しているため、生細胞においてそれらの生理機能の詳細を明らかとすることは未だ困難である。本研究では、標的膜タンパク質受容体の活性を人工的制御するための手法として、錯体化学と遺伝子工学を組み合わせたケモジェネティック的方法論(OcCC: On-cell Coordination Chemistry)を開発した。OcCCを用いることで生細胞上において神経細胞に存在するグルタミン酸受容体や薬物標的として重要なclass A GPCRの活性制御に成功した。本研究の目的は、配位結合が示す高い構造設計性を利用し、リガンド作動性イオンチャネルやGタンパク質共役受容体(GPCR)等の膜受容体を人工的に活性化する手法を開発することである。具体的には、膜受容体に対して、ヒスチジンやグルタミン酸などの金属配位性アミノ酸残基を部位特異的変異導入し、金属イオン・金属錯体との配位結合により、膜受容体の活性化構造の誘起やリガンド結合を強固にする戦略である。本研究では、世界的に見ても活性化手法が不足しているclass A GPCRの生細胞における新規活性化手法を構築することを目的としている。平成27年度は、GPCRの中でも最大のファミリーを形成するclass A GPCRの人工活性化を目指し、アドレナリン受容体の選択的活性化を試みた。Class A GPCRの一種であるアドレナリン受容体は、主に脳や心臓に局在し、その構造活性相関が詳細に調べられている受容体である。末端に金属錯体を持つアゴニスト(金属錯体-アゴニスト複合体)を、N末端領域にヒスチジン連続配列を部位特異的変異導入により導入した改変アドレナリン受容体に作用させることで、アゴニスト-受容体間相互作用だけでなく、金属錯体-ヒスチジン間の配位結合の多点相互作用により、改変アドレナリン受容体を選択的に活性化する戦略である。実際、モデル細胞であるHEK293T細胞に対して、改変アドレナリン受容体を強制発現させたのち、金属錯体-アゴニスト複合体の活性を評価したところ、Niイオン存在下で親和性が100倍程度上昇することを見出し、本手法の概念実証実験に成功した。配位アンカー法を実証するためには、アドレナリン受容体のリガンド結合ポケットとHis変異間距離と金属錯体-アゴニスト間距離が一致していることが求められる。またClass A GPCRのN末端領域は今までに結晶構造解析等の構造解析が全く行われておらず、構造デザインが非常に困難であった。そこで本研究では、His変異の位置を変化させた変異アドレナリン受容体ライブラリーと金属錯体-アゴニスト間のリンカー長を変化させた金属錯体-アゴニスト複合体ライブラリーを構築し、生細胞におけるスクリーニング実験から、ヒットペアを見つける方針を打ち立てた。実際、変異型アドレナリン受容体は4種類、金属錯体-アゴニスト複合体を3種類構築・合成したのち、その活性を評価したところ、2つのペアでアドレナリン受容体の活性が上昇することを見出した。さらに発見したヒットペアの詳細を検討したところ、金属錯体-アゴニスト複合体による活性化は、Niイオン存在下でEC50が100倍低濃度シフトすることを示し、配位アンカー法が生細胞上において機能することを実証した。本研究の目的は、配位結合が示す高い構造設計性を利用することで、Gタンパク質共役受容体(GPCR)に代表される膜受容体の機能を合理的に設計・制御することである。遺伝子工学による点変異導入技術により膜タンパク質表面に対して、金属配位サイトを位置選択的に導入することで、金属イオン・錯体との配位結合により膜タンパク質のプログラム制御を行うことに成功した。【グルタミン酸受容体の活性制御】グルタミン酸受容体は、神経細胞に局在し記憶や学習に関与する重要な受容体である。本研究では、活性化時に観測される受容体の構造変化を配位結合により誘起することで、グルタミン酸受容体の活性制御に成功した。具体的には、グルタミン酸受容体のリガンド結合部位に対してヒスチジン変異を導入した変異型グルタミン酸受容体を遺伝子工学により構築した。構築した変異型受容体を哺乳類モデル細胞・培養神経細胞に発現させたのち、活性化を評価したところ、変異型グルタミン酸受容体のみを選択的に活性化することに成功した。この手法を用いることで、記憶や学習におけるグルタミン酸受容体の生理機能の解明につながると期待される。【配位アンカーによるclass A GPCRの活性制御】Class A GPCRは膜タンパク質の中でも、最大のファミリーを形成しており、その生理学的重要性は極めて高い。そこで本研究では、標的class A GPCRを人工的に活性化できる新手法として、配位アンカー法を考案した。配位アンカー法を用いることでclass A GPCRの一種であるアドレナリン受容体の活性化に成功した。この手法は、原理上全てのclass A GPCRに適用できると考えられ、膜受容体の機能解析のために役立つと期待される。

OcCCを用いることで生細胞上において神経細胞に存在するグルタミン酸受容体や薬物標的として重要なclass A GPCRの活性制御に成功した。今後は、概念実証実験に成功した配位アンカー法の一般性の拡張や標的受容体が実際に機能する心筋細胞や神経細胞への適用を目指す。配位アンカー法は、標的受容体に対してヒスチジンを選択的に導入すると言う非常にシンプルかつ簡便であることから、class A GPCRに限らず、多様な膜受容体に対して適用可能であると期待される。本研究ではclass A GPCRの異なるファミリーであるムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)への適用を目指す。アドレナリン受容体と同様に、N末端領域に対してHis連続配列の導入、mAChR選択的な金属錯体-アゴニスト複合体の合成を行ったのち、配位アンカー法がmAChRに適用可能かを検討する。さらに、アドレナリン受容体・ムスカリン性アセチルコリン受容体が内在的に発現している心筋細胞や神経細胞において配位アンカー法が通用するのかを実証する。具体的には、モデル細胞と同様に心筋細胞等の初代継代細胞に対して、変異型アドレナリン受容体を強制発現させたのち、金属錯体-アゴニスト複合体により変異型受容体のみを選択的に活性化できるか評価する。活性化出来次第、変異型受容体活性化に伴う生理機能の解明に取り組む方針である。さらにこうした挑戦を行いつつ、配位アンカー法に用いる金属錯体や金属配位性アミノ酸配列の最適化を行うことで、より低濃度の金属錯体-アゴニスト複合体で活性化できるよう改良を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。錯体化学、超分子化学、ケミカルバイオロジー28年度が最終年度であるため、記入しない。
呼気ガス測定によるパクリタキセル点滴後のアルコール残存量評価とその改善方法の検討

【はじめに】外来がん化学療法においても頻用されるパクリタキセル(以下PTX)は水に難溶であり、無水エタノールを含む溶解液に溶解されているため、特に患者本人が自動車を運転して帰宅する際、重大な事故につながる恐れや違法となる可能性がある。これまで、PTXなどのアルコール含有製剤点滴後に、呼気中アルコール濃度測定によるアルコール残存の評価は行われている。また、飲酒後の呼気中と血中アルコール濃度の関係も検討されている。しかし、アルコール点滴後の呼気中と血中アルコール濃度の関係は検討されていない。本研究は、今後PTX点滴後の患者のアルコール残存を評価するための基礎データを集積する目的で行った。まず健常人にアルコール点滴後、呼気中及び血中アルコール濃度を測定し、呼気中アルコール濃度測定法によりアルコール残存を適切に評価できるかを検討した。またPTXによる治療の後に予想されるアルコール残存を推察した。【方法】健常人13名又は25名を対象として、1毎週PTX療法(80mg/m^2)又は2PTX (175mg/m^2)/カルボプラチン療法で投与されるアルコールに相当する量の無水エタノールを同様の条件で点滴し、点滴前、点滴中、点滴終了時、点滴終了180分後又は2120分後までの呼気中及び血中アルコール濃度を測定した。【結果・考察】呼気中及び血中アルコール濃度は、無水エタノール点滴終了時に高値を示したが、酒気帯び運転の基準(呼気中: 0.15mg/L)未満であった。また、点滴終了140分後又は280分後(カルボプラチン点滴終了20分後に相当)には検出限界未満となっていた。このことから、外来でPTX点滴後に帰路に着く頃には、アルコールの影響はあまりないことが推察された。また、検出された呼気中及び血中アルコール濃度は低値であり、相関関係を認めることはできなかったが、呼気中濃度が検出限界以下の場合は、血中濃度も酒気帯び運転の基準に相当する濃度(30mg/dl)よりも十分に低値であった。
β-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの1次構造解析

3-ヒドロキシアスパラギン酸(HO-Asp)はアスパラギン酸のOHアナログであり、天然界ではペプチド性抗生物質の構成成分などとして見いだされる。分子中に2個の不斉炭素を有し、4つの光学異性体が存在する。近年では神経細胞の興奮性グルタミン酸トランスポーターの特異的阻害剤として注目されている。HO-Aspを単一炭素源としてスクリーニングした土壌細菌Pseudomonas sp.T62より、HO-Aspデヒドラクーゼを取得した。本酵素はL-スレオ体のHO-Aspに特異的に作用し、HO-Asp分解のための酵素であると考えられた。本酵素をコードする遺伝子をクローニングし、アミノ酸配列を解析した結果、Saccharomyces cerevisiaeのYKL218C遺伝子産物(旧称:セリンラセマーゼホモログ)、ヒト・マウスのセリンラセマーゼ、アカガイのアスパラギン酸ラセマーゼなどと相同性を示した。S.cerevisiaeの酵素もL-スレオ体のHO-Aspに特異的であり、セリンラセマーゼ活性は検出されなかった。次にD-スレオ体のHO-Aspを基質としてスクリーニングを行い、Delftia属細菌からD-スレオ-HO-Aspデヒドラターゼを取得した。本酵素の立体選択性は甘く、D-スレオ体およびL-エリスロ体のHO-Aspに対して高活性を示したが、L-スレオ体に対しても活性を示した。本酵素はD-スレオ-HO-Aspに対して活性を示すデヒドラターゼの初めての例である。N末端アミノ酸配列より、本酵素はゲノム解析の行われたDelftia acidovorans SPH-1株のPutative Alanine Racemaseと同一、もしくは極めて類似の酵素と考えられた。そこで本研究ではPseudomonas sp. T62のL-THADHをコードしている遺伝子をクローニングし,本酵素の諸性質を解明するために大腸菌での発現系を構築した.本酵素の既知の部分アミノ酸配列を元にDegenerated PCRを行った.その結果得られた内部配列を元にInverse PCRを行い,本酵素をコードしている全長960bpの遺伝子配列を取得した.本酵素のアミノ酸配列を解析した結果, S. cerevisiaeのセリンラセマーゼホモログ,ラットやヒトのセリンラセマーゼ,アカガイのアスパラギン酸ラセマーゼ, E. coliのスレオニンデヒドラターゼなどと相同性を示し,セリン/スレオニンデヒドラターゼファミリーに属していることが判明した。本酵素遺伝子配列をHis-tagが付加される発現ベクターpQE-30に組み込んで大腸菌で発現させた結果, M9-カザミノ酸培地で良好な発現がみられた.得られた組換え粗酵素溶液をアフィニティークロマトグラフィーカラムで精製したところ,ワンステップで電気泳動的に均一な精製酵素を得た.
ヒト細胞を用いた３次元脳組織のin vitro再構成への挑戦

本研究は、生体3次元神経組織モデルを構築する為に、脱細胞脳組織を足場とした3次元培養技術および神経細胞シートの積層化による3次元培養技術の開発を実施した。ブタ脳を用いて作製した脱細胞化脳組織にヒトiPS細胞由来ニューロンを播種したところ、脱細胞組織上および内部に神経ネットワークの形成を確認した。また、脱細胞脳組織の溶液がヒトiPS細胞由来ニューロンの生存率向上、神経突起の伸長を促すことがわかり、脱細胞組織を足場とした培養法の有効性が示された。更に、温度感受性基板を用いることで、機能を保った状態でヒトiPS細胞由来ニューロンシートを剥離できること、および積層化できることがわかった。本研究は、ヒト由来細胞を用いて3次元神経組織モデルをin vitroで構築することを目的としている。具体的には、組織の構造および細胞外基質が豊富に残存している「脱細胞化した脳組織」を足場に、分化済みのヒト由来ニューロンおよびヒト由来神経幹細胞を播種することにより、神経回路の構造を3次元再構築する培養技術の開発を行う。初年度は、ブタ脱細胞組織の作製条件の検討と脱細胞組織のゲル化条件の検討および脱細胞組織内でのヒトiPS細胞由来ニューロンの培養法の検討を行った。界面活性剤(SDS, Triton-X)やDNAse、RNAseなどの濃度、投与時間、温度等の条件の違いにより、組織構造の維持や残存するDNA量が異なることを、組織化学染色法、DNA量測定により明らかにした。脱細胞組織の凍結乾燥による粉末化、ペプシンによる脱細胞化脳組織の可溶化、および架橋剤を用いたゲル化に成功し、脱細胞脳組織を材料とした粘度の異なるゲルを作製することができた。ゲル内での培養評価および至適ゲル濃度の検討が今後の課題である。また、脱細胞組織体へ直接3次元培養させる手法においては、ヒトiPS細胞由来ニューロンが脱細胞組織内に培養されている様子を共焦点顕微鏡で確認した。本年度は、ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロンを高密度に培養し、長期培養によるネットワークの機能的成熟化に要する培養日数を同定した。培養300日目と117日目のサンプルを免疫化学染色したところ、培養300日目においてプレ・ポストシナプスの共局在が見られ、細胞体の大きさ、神経突起の太さ共に117日目に比べて有意に増大し、また、大脳皮質に見られる錐体細胞様の形態も観察された。電気生理学的な成熟化過程をモニタリングした結果、培養2-3週目から自発活動が観察され、培養10週程度でシナプス伝播による同期バースト発火が観察され、培養20週目にかけて顕著に活動頻度が上昇する様子が観察された。ラット由来の初代培養大脳皮質細胞における同期バースト発火は、培養1-2週間程度で観察されるため、ヒトiPS細胞由来大脳皮質ネットワークのシナプス伝播および同期発火の発生は、ラットとは異なり培養日数を要することがわかった。また、各種グルタミン酸受容体およびGABA受容体に対する薬剤を用いて、培養10-15週目と33-36週目に自発活動の変化および電気刺激誘発応答を調べたところ、培養33-36週目の方がより顕著な薬理応答を示した。得に、グルタミン酸受容体であるAMPA受容体とNMDA受容体それぞれの応答は33-36週目で明確に現れた。また、ペンチレンテトラゾールを用いて異常発火を示すてんかん現象を誘発し、抗てんかん薬であるフェニトイン、バルブロ酸ナトリウムを用いて、異常発火が抑制される現象を検出した。ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロンの電気生理学的な成熟化には少なくとも20-30週程度の培養期間が必要であること、および平面微小電極アレイを用いたヒトiPS細胞由来中枢神経ネットワークの長期活動計測法が薬効評価に有効であることを示した。ヒトiPS細胞由来ニューロンの600日以上の長期培養と電気活動計測を実現し、機能的成熟化に要する培養時間を明らかにすると共に、薬剤応答特性を見出した。本研究成果は、ヒトiPS細胞由来ニューロンを用いた薬効評価の実現可能性を示すとともに、薬効評価を展開する上で考慮すべき重要な知見を示したため。本年度は、ヒトiPS細胞由来ニューロンを用いた3次元組織モデルの構築に向けた培養技術の検討を行った。具体的には、神経細胞シートの積層化による3次元培養技術と脱細胞脳組織を用いた3次元培養技術を検討した。神経細胞シートの積層化技術は、温度感受性基板上にヒトiPS細胞由来中枢ニューロンおよびアストロサイトが2から3層になるように培養し、培養中に剥離して積層化する手法を試みた。4°C下で基板から剥離させ、その後の神経ネットワーク活動を平面微小電極アレイ(MEA)計測法で計測したところ、ネットワーク全体から電気活動が観察され、機能維持が確かめられた。また、剥離後の神経シートを免疫染色したところ、シナプス形成の維持も確認された。剥離したヒトiPS細胞由来神経シートを重ねて培養することにも成功したことから、3次元培養技術として有効であることが示唆された。脱細胞脳組織を足場とした培養技術は、東京医科歯科大学生体材料工学研究所物質医工学分野との共同研究にて行った。ラット大脳を冠状スライスした薄切脳を、高静水圧処理により、脱細胞化脳を得た。脱細胞化処理後も脳の形態が維持され、未処理脳に類似した組織構造を示した。得られた脱細胞化脳上に神経細胞を培養したところ、海馬、髄質に比べ大脳新皮質に有意に接着し、神経突起の伸長を共焦点レーザー顕微鏡にて確認した。

一部においては、脱細胞化脳の構造を反映した神経ネットワークの形成が観察されたことから、脳構造を模倣した3次元神経組織モデル構築の可能性が示唆された。本研究は、生体3次元神経組織モデルを構築する為に、脱細胞脳組織を足場とした3次元培養技術および神経細胞シートの積層化による3次元培養技術の開発を実施した。ブタ脳を用いて作製した脱細胞化脳組織にヒトiPS細胞由来ニューロンを播種したところ、脱細胞組織上および内部に神経ネットワークの形成を確認した。また、脱細胞脳組織の溶液がヒトiPS細胞由来ニューロンの生存率向上、神経突起の伸長を促すことがわかり、脱細胞組織を足場とした培養法の有効性が示された。更に、温度感受性基板を用いることで、機能を保った状態でヒトiPS細胞由来ニューロンシートを剥離できること、および積層化できることがわかった。脱細胞脳組織を材料としたゲル作製法を開発したこと、および脱細胞脳組織内での細胞培養が確認されたことから、次の課題として3次元培養に最適なゲル条件および脱細胞組織条件の検討が行える為。3次元培養したサンプルの機能的な差異を見出すことを今後の課題とする。神経医工学初年度に検討した脱細胞脳組織のゲル化法を用いて、ヒトiPS細胞由来ニューロンの3次元培養に最適なゲル条件を見出すことを予定している。脱細胞脳組織ゲルを足場とした3次元培養の効果を形態的および機能的に評価する。また、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞を用いた3次元培養をゲルおよび構造を保った脱細胞組織を用いて行い、分化特性等を評価する予定である。残額47513円を消耗品使用で0に調整するようりも、次年度に使用した方が有効的に使用することができるため。残額5343円を消耗品の使用で0に調整するよりも、次年度に使用した方が有効的に使用することができるため。残額47513円を次年度の助成金と合わせて、必要な消耗品を購入する。残額5343円を次年度の助成金を合わせて、必要な消耗品を購入する。
KKR-グリーン関数法による合金中の有効原子対相互作用の計算方法の開発

本年度の主な研究成果は以下の2つである。(1)不純物KKR-グリーン関数法で金属中の3d遷移金属不純物、3d遷移金属不純物-3d遷移金属不純物、および3d遷移金属不純物-空格子の系でのスピン偏極エネルギーを調べた。空格子が第一近接位置に存在すると、3d遷移金属不純物の3d軌道はより孤立原子にちかくなり、磁気モーメントが増加してスピン偏極エネルギーも増加する。3d遷移金属系の表面エネルギー、凝集エネルギーなどの磁気異常エネルギー(方物線変化からのずれ)も、母体原子に比して孤立化することによるスピン偏極エネルギーの増加で説明できることを示した。また、不純物クラスターを大きくして、その中でいろいろな原子配置を考えることで、合金の電子状態を研究するやり方の可能性を調べた。例えば、Cu中の55-原子不純物クラスター(4近接原子まで)で、不純物をすべてCoとすると、真ん中のCoは殆どbulk-Coの磁気モーメントになる事がわかった。他の遷移金属についても、同様である。(2)LMTO法によって、PerdewとWangによって提唱された、局所密度近似を越える試みの1つであるGGA(generalized gradient approximation)の可能性を調べた。Fe,(γ,δ)Mnの凝集エネルギーが定性的に説明される。また、LSD近似の範囲内ではあるが、FLAPW法でγFの磁気エネルギーによる格子変形をしらべた。これから、GGAを取入れた計算を行ない、実験と比較する。
IL-15と類似した低分子化合物の探索と高齢者敗血症治療への応用

インターロイキン-15 (IL-15)はNK細胞やT細胞に作用し、細胞増殖や活性化を誘導するサイトカインである。in silicoスクリーニングによって選抜された候補化合物15種類においてSTAT5リン酸化を指標にアゴニスト(惹起)効果ならびにアンタゴニスト(抑制)効果を測定したところ、化合物N43で強い阻害作用(阻害率32%)を認めた。さらにN6, N15, N35で弱い阻害作用を認めた。今後はサンドイッチELISA法を活用したIL-15ミメティクスのスクリーニング系の構築を目指す。研究1 IL-15受容体に結合する低分子化合物のin silico探索と結合能の評価IL-15受容体はα、β及びγサブユニットから構成され、IL-15はαサブユニットに直接結合することでその作用を発現する。IL-15とαサブユニットの複合体のX線解析は既に報告されている(PDB ID:2PSM、2Z3Qなど)。本研究では、主にこれらの複合体立体構造に基づき、IL-15受容体のアゴニストになり得る低分子化合物をin silico探索した。全ての計算は統合計算化学システムMOEを用いて行った。化合物探索に用いた化合物データベースは、Sigmaの化合物カタログに掲載されている化合物群(195,048)とCCG(Chemical Computing Group, Montreal, Canada)から供給されている医薬分子に適する化学構造を持った化合物群(458,166)である。合計653,214化合物を第一段階の探索化合物空間とした。これらの化合物の中から、医薬分子になり得る性質を持った化合物を選択するために、現在国内で使用されている医薬分子と活性代謝物合計1,487化合物の80%以上に共通に見られる「医薬分子らしさ」指数を2次元構造記述子により表現し、このフィルターを98%以上満足する合計27,959化合物を抽出した。その内、結合部位の性質を充分に表現する(75%以上)化合物6,668種を抽出した。この6,668化合物をIn silicoにてIL-15受容体部位にドッキングさせ、その親和性の強さを求めた。その結果、親和性の強い上位50化合物をリストアップし、ヒット化合物とした。平成27年度の計画は、IL-15受容体に結合する低分子化合物のin silico探索と結合能の評価であり、共同研究者の平山らにより、6,668化合物からIn silicoにてIL-15受容体と親和性の強い上位50化合物をリストアップし、これらをヒット化合物とした。以上より、実験計画通りに進行していると判断している。昨年度in silicoでスクリーニングされた化合物10個を入手し、IL-15受容体活性化作用を細胞レベルで評価した。転写因子STAT5はIL-15に応答してリン酸化を受け、特定のDNA配列に結合する。L-15に応答細胞を探すべく、いくつかのヒト由来血球系細胞株をIL-15にて刺激し、リン酸化STAT5をフローサイトメーターで測定測した。この結果、ナチュラルキラー細胞株のKAI-3細胞ならびにT細胞株のILTMAT細胞がIL-15に応答することが判明した。そこでIL-15応答細胞を候補化合物とインキュベートし、リン酸化STAT5を測した。しかしながら、今回試した10個化合物のいずれにもSTAT5のリン酸化を誘導する活性は見られなかった。同様の結果はウエスタンブロットでも確認した。IL-15類似化合物の評価系の高感度化を試みた。すなわち96ウエルプレートとプレートリーダー用いたハイスループット・スクリーニング系の構築を試みた。STAT5の結合配列の下流に発光酵素ルシフェラーゼを連結したレポーター遺伝子を含むプラスミドをエレクトロポレーション法によって、数種のヒト由来血球系細胞株に導入した。薬剤耐性マーカー遺伝子の発現を指標指にレポーター安定発現細胞選択した。この結果、2つのIL-15非応答細胞株では容易に安定発現細胞が樹立できたが、KAI-3細胞などの応答細胞では安定発現細胞の樹立が困難であり、何らかの工夫が必要であることが判明した。当初の予定通り、IL-15様活性評価系を確立し、in silico化合物のうち入手可能な化合物について評価を完了した。また、評価法の高感度化と効率アップのため、化合物のハイスループット・スクリーニング系の構築にも着手した。申請者は、IL-15がマウス敗血症モデルにて有効であることを見出した。IL-15自体を敗血症治療薬とすることはコストや安定性の面から難しいため、IL-15受容体に結合し、同様生物活性を有する低分子化合物(ミメティクス)をin silicoで選抜し治療薬として開発することを目指した。また、IL-15ミメティクスを特異的かつハイスループットに選別可能な評価系を構築する。in silicoスクリーニングによって選抜された候補化合物については、NK細胞由来細胞株KAI-3細胞において、ウエスタンブロットとフローサイトメーター(FACS)によってSTAT5活性化作用を測定した。一方、これらの計15化合物にアンタゴニスト活性があるかどうか、IL-15刺激時に共存させた場合にリン酸化STAT5の出現を抑制できるかどうか評価した。アンタゴニスト活性が見られた場合、その化合物はIL-15

レセプターへ結合している可能性を示唆する。in silicoスクリーニングによって選抜された候補化合物50のうち、購入可能な化合物は15種類であった。これらの15の化合物でIL-15受容体に対して、STAT5リン酸化を指標に化合物スクリーニングをおこなったが、アゴニスト効果を有する化合物は認められなかった。しかしながらアンタゴニストとして、化合物N43で強い阻害作用(阻害率32%)を認めた。さらに化合物N6, N15, N35で弱い阻害作用を認めた。インターロイキン-15 (IL-15)はNK細胞やT細胞に作用し、細胞増殖や活性化を誘導するサイトカインである。in silicoスクリーニングによって選抜された候補化合物15種類においてSTAT5リン酸化を指標にアゴニスト(惹起)効果ならびにアンタゴニスト(抑制)効果を測定したところ、化合物N43で強い阻害作用(阻害率32%)を認めた。さらにN6, N15, N35で弱い阻害作用を認めた。今後はサンドイッチELISA法を活用したIL-15ミメティクスのスクリーニング系の構築を目指す。研究2高齢者由来T細胞に対する化合物Xの活性化および増殖効果判定(in vitro)(平成28年度)実験2-1化合物X添加による活性化およびサイトカイン産生能の評価実験2-2化合物Xと他のT細胞増殖/活性化因子の高齢者由来T細胞活性化効果の比較研究3高齢マウス敗血症モデルにおける化合物Xの効果判定(平成29年度)実験3-1化合物X投与高齢マウス敗血症モデルの免疫機能解析(in vivo)実験3-2化合物X添加によるサイトカイン産生能の評価(in vitro)実験3-3化合物Xと他のT細胞増殖/活性化因子の老化T細胞賦活化効果の比較前年度の成果を踏まえ、今年度は以下の研究を行う予定である。1)In silico化合物のうち、試薬メーカーから市販されている10化合物の評価は終了したが、入手不可能な40化合物は未評価のままである。そこで、学内外の有機合成系の研究者に合成を委託して共同研究として評価を進めていく。2)Jurkat細胞などのSTST5レポーター遺伝子導入細胞はIL-15には応答しなかった。この原因としてIL-15のレセプターが発現していない可能性がある。そこで、IL-15のレセプターの発現レベルを調べ、発現が欠如している場合、レンチウイルスベクター等を用いて発現を補い応答細胞化する。3)敗血症モデルマススにヒット化合物を投与し、効果を評価する。救急医学平成27年度の計画は、IL-15受容体に結合する低分子化合物のin silico探索と結合能の評価であり、共同研究者の平山らにより、6,668化合物からIn silicoにてIL-15受容体と親和性の強い上位50化合物をリストアップし、これらをヒット化合物とした。研究計画通りに進んでいるものの、この実験では特段消耗品を必要としなかった。その一方平成28年度以降の研究計画は相当な消耗品を要する見込みである。
FPGAデバイスのプロセスばらつき測定法とこれを用いた設計法の開発

本研究ではIEEE-754準拠単精度浮動小数点除算器を例として取り上げ、高性能であり、かつ任意のクロック周波数のシステムで利用可能なハードウェア設計資産の提供を試みた.この除算器は最も高性能な構成となるよう内部生成したローカルクロック信号で動作し、外部とは非同期のハンドシェーク方式でやりとりしている.また、このような回路の設計を自動化する環境を構築し、商用FPGAデバイスでその有用性を示した.本研究ではIEEE-754準拠単精度浮動小数点除算器を例として取り上げ、高性能であり、かつ任意のクロック周波数のシステムで利用可能なハードウェア設計資産の提供を試みた.この除算器は最も高性能な構成となるよう内部生成したローカルクロック信号で動作し、外部とは非同期のハンドシェーク方式でやりとりしている.また、このような回路の設計を自動化する環境を構築し、商用FPGAデバイスでその有用性を示した.当初の研究計画では、平成18年度に主として商用FPGAをターゲットとして、(1)非同期回路を設計し実装する方法の確立と、(2)その設計自動化に取り組み、平成19年度に、(3)これを用いて商用FPGA上で動作する非同期回路ベースの実用的な機能モジュールを開発する計画であった。しかし、研究全体の見通しを良くするため、平成18年度は(1)に着手しつつ、(3)を先行して進めた。ここで(3)の題材として取り上げたのはIEEE754準拠単精度浮動小数点除算器であり、Xilinx社のFPGA向けに設計、評価した。その構成は、減算シフトの反復で仮数部の除算を行うモジュールをグローバルクロックと独立にリングオシレータで発生したローカルクロックで動作させ、前後の正規化や丸めのモジュールとは非同期のインターフェースで接続しようというものである。これまでディジタルシステムの開発において同期式設計が普及しているが、クロック周波数に応じてレジスタ間の組み合わせ回路段数を最適化しなければ十分に性能を発揮することができないため、クロック周波数が異なるシステム間での設計資産の流用は困難であった。本研究のように設計資産を非同期設計するアプローチは、(1)特定のターゲットテクノロジに対し単一の設計資産で任意のグローバルクロック周波数のシステムに対応可能、(2)ローカルクロック周波数の最適化による面積効率や電力効率の改善、などが期待される。この成果は5月に電子情報通信学会VLSI設計技術研究会にて発表する予定である。当初の研究計画では、平成18年度に主として商用FPGAをターゲットとして、(1)非同期回路を設計し実装する方法の確立と、(2)その設計自動化に取り組み、平成19年度に、(3)これを用いて商用FPGA上で動作する非同期回路ベースの実用的な機能モジュールを開発する計画であった。具体的にはIEEE754準拠単精度浮動小数点除算器をXilinx社のFPGA向けに設計し、評価した。本研究のように設計資産を非同期設計するアプローチは、単一の設計資産で任意のグローバルクロック周波数のシステムに移植が可能であり、更にローカルクロック周波数の最適化による面積効率や電力効率の改善などが期待される。この成果は平成19年5月の電子情報通信学会VLSI設計技術研究会等で発表し、さらに10月の国際ワークショップSASIMI 2007にも採択された。平成19年度は、平成18年度に取り組んだ非同期IEEE754準拠浮動小数点除算器を題材とし、上記(2)に取り組んだ。これにより、非同期IEEE754準拠浮動小数点除算器の合成や配置配線最適化に成功し、回路規模、スループット、消費エネルギーを大幅に改善し、同期式設計を凌駕するものを得ることがでぎた。この成果は平成20年3月の情報処理学会SLDM研究会で発表し、高く評価された。本研究課題は、プロセスばらつきの影響を受けない非同期回路をベースとする再構成デバイスの回路方式および利用技術の確立を目指す第一歩として、技術的に成熟した既存の商用FPGA上において非同期回路を実現する設計手法の開発、および非同期回路設計資産の開発などを行うものである。平成19年度は、平成18年度にフィージビリティスタディとして人手設計で取り組んだ非同期IEEE-754準拠単精度浮動小数点除算器を題材とし、その設計自動化フローを確立した。これにより、遅延素子段数の最適化のためのイタレーションが自動化され、また再現性よく所望の回路の配置配線結果を得られるようになった。平成20年度は、平成19年度に開発した設計フローを改善しながら実験データを取り直し、生成される回路の性能の更なる改善に取り組んだ。この設計環境を用い、IEEE-754準拠の非同期単精度浮動小数点除算器をXilinx社のFPGAデバイスVirtex-4 (XC4VFX12)をターゲットとして実装し、5種類の動作周波数に最適化された同期式設計と比較したところ、回路規模および消費エネルギーについてはどの動作周波数においても提案除算器が優れており、スループットもほぼ同等以上の性能が得られた。この除算器は同期システムの中にも組み込んで使えるものであり、設計資産として実用的な応用も期待される。この成果は平成21年2月に英文論文誌IPSJ Trans. on System LSI DesignMethodologyに掲載された。
麻疹ウイルスモノクローナル抗体によるSSPE発症機構の解析

麻疹ウイルスの構成ポリペプタイド(HA69K,NP60K,F40K,M36K)それぞれに対するマウスモノクローナル抗体をマウス腹水として得た。これらのモノクローナル抗体を用いて、麻疹ウイルスLEC株を感染させたVero細胞、麻疹ウイルスSchwarz株の持続感染細胞であるNC-37細胞内のウイルス抗原の所在を確認した。この結果いずれの細胞でもHA,Fは細胞表面と細胞質の表面附近に、Mは細胞質の核周辺に、NPは核内と細胞質の核周辺に存在していた。免疫不全状態に発症して死亡した2例の巨細胞性肺炎患児の剖検肺組織に上記マウスモノクローナル抗体によってdetectされる麻疹ウイルス抗原を同定した。死亡時において、肺組織の巨細胞に一致してすべての構成蛋白が存在することから、この疾患は麻疹ウイルスの無制限の増殖の結果発来する間質性肺炎による呼吸不全を直接死因とする事が想定された。麻疹ウイルスの脳内持続感染に起因するSSPEに罹患した患者2例(1985年発症の14才女児、1988年発症の8才男児)は現在inosiplexとTransfer Factorの治療中であり、それぞれJabbourの第1期、第2期にある。この2例の患者から得られた脳脊髄液(CSF)用いてウイルス学的検索を行なった。麻疹抗体はHIでそれぞれ4X,32X,CFでそれぞれ8X,8Xであった。可溶化した麻疹ウイルスのSDS-PAGEによるWestern bolttingによって髄液中の抗体はHA,NP,Mと特異的に反応してバンドを形成した。また等電点電気泳動で、両者の髄液中にoligoclonal bandsが証明され、IgGと同定サレタ。しかしながら髄液中の細胞からは麻疹ウイルスは分離されず、モノクローナル抗体による蛍光染色によって麻疹ウイルスの構成ポリペプタイドは同定されなかった。麻疹ウイルスの構成蛋白(HA69K, NP60K, F40K, M36K)に対するマウスモノクローナル抗体を作成した.Vero細胞に麻疹ウイルスLEK株を感染させ,各構成蛋白の局在を,作成したモノクローナル抗体を用いて検索した.この結果, HA, Fは細胞表面,胞体の表面に隣接した部位に, Mは胞体の核周辺に, NPは細胞核および胞体の核周辺に存在することが確認された.同様に麻疹ウイルスシユワルツ株の持続感染細胞であるNC-S細胞における麻疹ウイルス構成蛋白の局在を検索したが, Lytic infectionであるVero細胞における存在部位,存在様式と全く同一の所見が得られた.免疫不全状態に発症して死亡した2例の巨細胞性肺炎の患児の剖検肺組織に麻疹ウイルスを同定した.死亡時において,肺組織の巨細胞に一致してすべての構成蛋白が存在することから,この疾患は麻疹ウイルスの無制限の増殖の結果発来する間質性肺炎による呼吸不全を直接死因と想定された.発症以来7年の経過で死亡した亜急性硬化症全脳炎(SSPE)の患者の剖検脳組織を検索した.脳組織は病理学的に硬化性変化が著明であり,細胞浸潤,封入体の存在などの炎症性所見に乏しく,電子顕微鏡による形態的観察でも,モノクローナル抗体を用いた免疫組織学的検索でも,麻疹ウイルスの存在を証明する所見が得られなかった.今後急性期の患者材料(例えば脳脊髄液)の検索が必要である.麻疹ウイルスの構成ポリペプタイド(HA69K、NP60K、F40K、M36K)それぞれに対するマウスモノクローナル抗体をマウス腹水として得た。

これらのモノクローナル抗体は、麻疹ウイルス感染細胞において、持続感染系でもlytic infectionでも特異的に反応することが確かめられた。すなわちHAとFは細胞表面とCytoplasmaの表面に隣接した部位に、MはCytoplamaの核周辺に、NPは核内およびCytoplasmaの核周辺部に存在することが知られた。麻疹ウイルスの脳内持続感染に起因するSSPEに罹患した患者2例(1985年発症14才女児、1988年発症8才男児)は現在inosiplexとTransfer Factorで治療中であり、それぞれJabbourの第1期、第2期にある。この2例の患者から得られた脳脊髄液(CSF)を用いてウイルス学的検討を行なった。麻疹抗体価はHIでそれぞれ4X、32X、CFでそれぞれ8X、8Xであった。可溶化した麻疹ウイルスのSDS-PAGEによるWestern blottingによって髄液中の抗体はHA、NP、Mと特異的に反応してbandsを形成した。Polyacrylamide gelによる等電点電気泳動で、両者の髄液中にはoligoclonal bandsが証明され、IgGと同定された。しかしながら髄液中の細胞からは麻疹ウイルスは分離されず、モノクローナル抗体による蛍光染色によっても麻疹ウイルスの構成ポリペプタイドは同定されなかった。
超濃厚ゲルを用いたセラミックス材料用単分散微粒子製造プロセスの開発

先ず、現在予備的な研究に着手している結晶性の単分散チタニア微粒子の形態制御技術を確立し、その生成機構を究明する研究を行った。この系では、チタンのアルコキシドをトリエタノールアミンと錯形成させて安定化し、アンモニアを添加して比較的低温(100°C)で経時してゲル化させ、更にそれを幾分高温の140°Cで経時することでアナタース構造を有する単分散スピンドル型チタニア粒子が得られ(非晶質粒子を粉末で結晶化させるには600°C以上の高温が必要)るが、この時中間生成物として生成する水酸化物ゲルの安定性に関する検討を行った。さらに、この系の形態制御手法と単分散粒子生成機構を詳細に解明する研究を実施した。次にこの系での単分散粒子生成機構を踏まえて、他の単分散酸化物微粒子の合成研究を展開した。ジルコニアやチタン酸バリウム、アルミナ等の単分散微粒子合成を目指し、濃厚水酸化物ゲルからの微粒子生成反応において、出発物質、pH、濃度、温度、経時時間等の反応因子が粒子生成過程に与える効果について詳細に検討した。濃厚系での粒子の凝集防止の技術と反応初期の核生成期と成長期の分離技術が成熟したことで、単分散セラミックス微粒子合成の一般的手法の確立を目指して、粒径、形状、構造等を精密に制御する技術の一般性と特殊性を明確に分離し、単分散微粒子製造方法の一般解を抽出することができた。その知見を基に、濃厚系での単分散セラミックス微粒子合成において粒径、形状、構造等を自由に制御できる技術の確立をはかることが可能となった。また、単分散セラミックス粒子の焼結材料への応用研究を実施した。構造や形状を精密に制御した単分散ジルコニア微粒子の焼結特性や焼結体の構造、特性を原料の単分散微粒子のサイズ、形態等と綿密に関連付けることにより、これまでにない優れた焼結材料開発の指針を得た。この系では、チタンのアルコキシドをトリエタノールアミンと錯形成させて安定化し、アンモニアを添加して比較的低温(100°C)で経時してゲル化させ、更にそれを幾分高温の140°Cで経時することでアナタース構造を有する単分散スピンドル型チタニア粒子が得られ(非品質粒子を粉末で結晶化させるには600°C以上の高温が必要)るが、この時中間生成物として生成する水酸化物ゲルの安定性に関する検討を行った。次にこの系での単分散粒子生成機構を踏まえて、他の単分散酸化物微粒子の合成研究を展開しつつある。ジルコニアやチタン酸バリウム、アルミナ等の単分散微粒子合成を目指し、濃厚水酸化物ゲルからの微粒子生成反応において、出発物質、pH、濃度、温度、経時時間等の反応因子が粒子生成過程に与える効果について詳細に検討している。

この系では、チタンのアルコキシドをトリエタノールアミンと錯形成させて安定化し、アンモニアを添加して比較的低温(100°C)で経時してゲル化させ、更にそれを幾分高温の140°Cで経時することでアナタース構造を有する単分散スピンドル型チタニア粒子が得られ(非晶質粒子を粉末で結晶化させるには600°C以上の高温が必要)るが、この時中間生成物として生成する水酸化物ゲルの安定性に関する検討を行った。さらに、この系の形態制御手法と単分散粒子生成機構を詳細に解明する研究を実施した。次にこの系での単分散粒子生成機構を踏まえて、ほかの単分散酸化物微粒子の合成研究を展開した。ジルコニアやチタン酸バリウム、アルミナ等の単分散微粒子合成を目指し、濃厚水酸化物ゲルからの微粒子生成反応において、出発物質、pH、濃度、温度、経時時間等の反応因子が粒子生成過程に与える効果について詳細に検討した。濃厚系での粒子の凝集防止の技術と反応初期の核生成期と成長期の分散技術が成熟したことで、単分散セラミックス微粒子合成の一般的手法の確立を目指して、粒径、形状、構造等を精密に制御する技術の一般性と特殊性を明確に分離し、単分散微粒子製造方法の一般解を抽出することができた。その知見を基に、濃厚系での単分散セラミックス微粒子合成において粒径、形状、構造等を自由に制御できる技術の確立をはかることが可能となった。また、単分散セラミックス粒子の焼結材料への応用研究を実施した。構造や形状を精密に制御した単分散ジルコニア微粒子の焼結特性や焼結体の構造、特性を原料の単分散微粒子のサイズ、形態等と綿密に関連付けることにより、これまでにない優れた焼結材料開発の指針を得た。
ヒト組織におけるアミロイドβ蛋白質代謝産物の同定と臨床的応用

脳におけるアミロイドβ蛋白質(Aβ: amyloid βprotein)の蓄積がアルツハイマー病(AD : Alzheimer's disease)の病理学的プロセスの上流に位置することから,Aβの代謝機構の解明はADの病因究明の重要課題であり,その分解に関与する酵素群が次々と明らかにされつつある。一方,脳以外のAβ代謝に関しては,現在のところほとんど研究が行われていない。本研究では、脳以外の各非神経組織(心臓,肺,肝,腎,脾,膵,小腸,皮膚)に,AβC末認識断端抗体,抗Aβ17-24抗体(4G8), AβN末断端抗体などにより陽性反応が認められたが,その反応は生化学的手法では確認されなかったことから,cross reactionの可能性が考えられた。神経細胞内Aβの存在はすでにAβC末断端抗体を用いた研究によって明らかになっている。本研究でも4G8により陽性反応が得られており,これに呼応するものといえる。神経細胞内AβのN末については,今回の検索では明らかにできなかったが,このAβN末は(1)代謝を受けていない,(2)使用したAβN末断端抗体が認識する以外の箇所で断端になっている,などの可能性が考えられた。血液中Aβの脳への移行は,少なくともラットにおいて30日間では起こらなかった。しかし,動物種,老齢動物,長期暴露によっては移行が起こる可能性があり,今後の課題である。脳におけるアミロイドβ蛋白質(Aβ:amyloid βprotein)の蓄積がアルツハイマー病(AD:Alzheimer's disease)の病理学的プロセス移行へのトリガーと考えられることから,Aβの代謝機構の解明は重要課題であり,その分解に関与する酵素群が次々と明らかにされつつある。一方,脳以外のAβ代謝に関しては現在ほとんど手つかずの状態である。我々はこれまでにAβC末断端を認識する抗体により肝細胞が標識されることを見出した。本研究では,肝臓含めた種々の非神経組織におけるAβの存在を確認し,そのAβの凝集性を検索した。1.N末に坦体蛋白質であるヘモシアニンを共有結合させたAβ37-42,Aβ32-40を各々家兎ならびにマウスに免疫して,ポリおよびモノクローナル抗体を調整した。2.上記のAβC末認識断端抗体と抗Aβ17-24抗体(4G8)を用いた免疫組織化学法によってヒト生体サンプルを検討した結果,脳,心臓,肺,肝,腎,脾,膵,小腸,皮膚にそれぞれ免疫陽性反応を認めた。3.上記の非神経組織のAβ代謝産物の凝集性を検索するために各組織をPASおよびチオフラビンSにより染色したが,陽性反応は認められなかった。これらの結果から,脳以外の各非神経組織にAβ代謝産物が存在することが確認された。また,脳内のAβは凝集性を呈するのに対して,非神経組織に存在するAβには凝集性が認められないことが判明した。アミロイドβ蛋白質(Aβ:amyloid βprotein)の代謝機構を明らかにすることはアルツハイマー病(AD:Alzheimer's disease)の病因究明において重要な課題といえる。我々はこの代謝研究の糸口として,これまでにAβC末断端を認識する抗体により脳,心臓,肺,肝,腎,膵,小腸の各組織が標識されることを見出した。本研究では,さらに下記のことが明らかになった。1.AβN末断端抗体を用いた免疫組織化学法によってヒト生体サンプル(脳,心臓,肺,肝,腎,膵,小腸)を検索した結果,腎以外の組織はAnti-N17(L)により標識され,Anti-N3(pE)では腎に加え脳,肺,肝臓,小腸に陽性反応が認められた。2.抗Aβ17-24抗体(4G8)による免疫ブロットでは心,肝,腎に陽性バンドは認められなかった。

各組織で認められていたAβ陽性反応は2.の生化学的手法では確認されなかったことから,cross reactionの可能性があるが,他の抗体および他の組織による検討が必要と考えられた。神経細胞内Aβの存在はすでにAβC末断端抗体を用いた研究によって明らかになっており,我々の4G8による所見はそれを確認するものといえる。神経細胞内AβのN末については今回の検索では明らかにできず,このAβN末は(1)代謝を受けていない,(2)使用したAβN末断端抗体が認識する以外の箇所で断端になっている,などの可能性が考えられた。アミロイドβ蛋白質(Aβ: amyloid βprotein)の代謝を明らかにすることは,アルツハイマー病(AD : Alzheimer's disease)の病因究明において重要な課題である。我々はこれまでに,抗AβC末断端抗体,抗AβN末断端抗体,抗Aβ17-24抗体(4G8)などによりAD患者および非痴呆者の脳,心臓,肺,肝,腎,膵,小腸の各組織が標識されることを見出し,脳以外の組織にAβ代謝産物が存在する可能性を示唆した。しかし,4G8による免疫ブロットでは,AD患者と非痴呆者の心,肝,腎に陽性バンドは認められなかった。本年度研究では,さらに下記のことが明らかになった。1.AβC末断端部分を含むペプチドの各組織における存在を確認するために,抗AβC末断端抗体を用いた免疫ブロットによりAD患者および非痴呆者の生体サンプル(脳,心臓,肺,肝臓,腎臓,膵臓,小腸)を検索したが、脳以外の組織で陽性バンドは認められなかった。2.予備実験において,Aβの1回静注だけではラット脳に変化はみられなかった。そこで,15匹のラットを5匹ずつの3群に分け,各々に(1)Aβ1-40(50μg),(2)Aβ1-42(50μg),(3)生理食塩水(0.2ml)を1回/日,30日間静注後,脳のパラフィン切片を作成し,免疫組織化学的検討を行ったが、脳実質に陽性反応は認められなかった。脳以外の各組織で認められた免疫組織学的Aβ陽性反応は,4G8や今回の抗AβC末断端抗体を用いた生化学的手法では確認されなかったことから,cross reactionの可能性が考えられる。また,血液中Aβの脳への移行は,少なくともラット脳において30日間では起こらなかった。しかし,動物種,老齢動物,もっと長い暴露時間によっては起こる可能性は残っている。
希土類錯体の新しい触媒作用によるヘテロ元素導入反応

1.希土類アミド錯体によるオレフィンのヒドロシリル化反応と共役ジエンの脱水素ダブルシリル化反応:希土類-イミン錯体,[Yb(η^2-Ph_2CNPh)(hmpa)_n](1)又はこれにPh_2NHを加えて発生するジアミド錯体はオレフィン類のPhSiH_3,Ph_2SiH_2によるヒドロシリル化反応に高い触媒活性を示すことを見出した。他方,この反応を共役ジエンに適用すると,予期したヒドロシリル化物は一切得られず,脱水素ダブルシリル化反応が起り,1,4ビスシリル-2-ブテン誘導体が高収率で生成した。この反応系中では1とヒドロシランより生成するヒドリド種[Yb]-Hとシリル種[Yb]-Siの2つの活性種が共存し,オレフィンは前者と共役ジエンは後者と選択的に反応するためにこの反応パターンの相違が生じることが明かとなった。2.希土類-イミン錯体によるアルキン等の炭素-炭素多重結合の触媒的分子間ヒドロホスフィン化反応:Ph_2PHによるアルキンの分子間ヒドロホスフィン化反応がイミン錯体1を触媒に使用すると非常に短時間,高収率で進行することを見出した。この反応は一般性が高く,芳香族,脂肪族,内部,末端いずれの基質にも適用できる。さらにジエン,ジイン,アレンなど多様な多重結合にも展開でき,その合成化学的価値は高い。D化実験,NMRトレース,Kineticsより1とPh_2PHよりジホスフィド錯体[Yb(PPh_2)_2]が発生し,この2量体にアルキンが挿入する律速段階,続くプロトン化により触媒サイクルが完成することを明らかにした。1.ホスフィン導入反応Ph2PHによるアルキンの分子間ヒドロホスフィン化反応がYb-イミン錯体,[Yb(Ph2CNAr)(hmpa)n](1)を触媒に使用すると非常に短時間,高収率で進行する。この反応は一般性が高く,芳香族,脂肪族,内部および末端いずれの基質にも適用できる。位置選択性に関しては外部にPPh2,内部にHが付加した化合物が主生成物となる。立体選択性は芳香族アルキンでは町syn付加物が,脂肪族の基質ではanti付加物が選択的に得られる。この反応はアルキン以外でもジイン,末端オレフィン,ジエン,アレン等に拡張できる。イミン錯体1とPh2PHの反応より希土類ジホスフィド錯体,[Yb(PPh2)2(hmpa)n](2)が単離でき,この錯体は1を使用する反応とほぼ同等の触媒活性を示すことより,2が反応活性種であることが明かとなった。2.ケイ素導入反応希土類-イミン錯体1はPhSiH3の脱水素オリゴマー化反応において非常に高い触媒活性を示す。この知見は反応系中で希士類-ヒドリドおよびシリル活性種が発生していることを示唆している。そこでこれらの中間体を利用するオレフィン類のヒドロシリル化反応を検討した。触媒1では電子吸引性スチレン誘導体でしか期待する反応が進行しないが,錯体1にPh2NHを加えて調製したジアミドを触媒として使用すると電子供与性スチレン誘導体や1-デセンの反応においても末端にsi基が付加したヒドロシリル化物が収率よく生成した。他方,錯体1やジアミドを触媒として共役ジエンとPhSiH3,Ph2SiH2の反応を行うとヒドロシリル化物は全く生成せず,脱水素ダブルシリル化物,1,4-ビスシリル-2-ブテン類が効率よく得られた。1.希土類アミド錯体によるオレフィンのヒドロシリル化反応と共役ジエンの脱水素ダブルシリル化

反応:希土類-イミン錯体,[Yb(η^2-Ph_2CNPh)(hmpa)_n](1)又はこれにPh_2NHを加えて発生するジアミド錯体はオレフィン類のPhSiH_3,Ph_2SiH_2によるヒドロシリル化反応に高い触媒活性を示すことを見出した。他方,この反応を共役ジエンに適用すると,予期したヒドロシリル化物は一切得られず,脱水素ダブルシリル化反応が起り,1,4ビスシリル-2-ブテン誘導体が高収率で生成した。この反応系中では1とヒドロシランより生成するヒドリド種[Yb]-Hとシリル種[Yb]-Siの2つの活性種が共存し,オレフィンは前者と共役ジエンは後者と選択的に反応するためにこの反応パターンの相違が生じることが明かとなった。2.希土類-イミン錯体によるアルキン等の炭素-炭素多重結合の触媒的分子間ヒドロホスフィン化反応:Ph_2PHによるアルキンの分子間ヒドロホスフィン化反応がイミン錯体1を触媒に使用すると非常に短時間,高収率で進行することを見出した。この反応は一般性が高く,芳香族,脂肪族,内部,末端いずれの基質にも適用できる。さらにジエン,ジイン,アレンなど多様な多重結合にも展開でき,その合成化学的価値は高い。D化実験,NMRトレース,Kineticsより1とPh_2PHよりジホスフィド錯体[Yb(PPh_2)_2]が発生し,この2量体にアルキンが挿入する律速段階,続くプロトン化により触媒サイクルが完成することを明らかにした。