hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非侵襲的な慢性ストレスバイオマーカーの開発

本研究では唾液を用いて非侵襲的にストレスを測定するバイオマーカーを開発することを目的とした。期間中に健常小児22名(健常群)と通院中の心身症患児6名(患者群)を対象として1日5回の唾液採取により、コルチゾールと免疫グロブリンA(IgA)の日内変動を検証した。その結果起床直後の患者群IgAが健常群より有意に低い平均値であることが判明。さらに患者群の起床直後IgAが心理質問紙(小児抑うつ尺度、Youth Self Report)と有意な負の相関を示すことが明らかとなった。すなわち、自覚症状が重症の患児ほど起床直後のIgAが低い事が証明され、患児の自覚症状と免疫能の関連が示唆された。近年、メンタルヘルスへの関心の向上に伴い、ストレスの客観的評価法に注目が集まっている。本研究では唾液を用い非侵襲的に測定できるストレスマーカーの開発を目的としている。古くからコルチゾール、アミラーゼ、クロモグラニンAなどがストレスマーカーとしてよく知られている。しかし本指標は急性ストレスのみを反映する点や、日内変動があることより、マーカーとして安定しているとは言い難い。本研究では既知のストレス指標に比して、慢性的なストレスを反映し、なおかつ日内変動の影響が比較的少ない安定した唾液中ストレスマーカーを開発することが目的である。平成25年度は上記の生物学的マーカーの客観的裏付けとして用いる心理定量的な評価尺度の標準化を進めた。その結果、健常者370名、小児科及び精神科通院患者73名、小児がん経験者110名を対象として、小児抑うつ尺度(CDI)、小児行動評価尺度(YSR)、精神科半構造面接(MINI)を施行した。その結果小児科及び精神科通院患者において、有意に抑うつが高い現状が明らかとなった。今後標準化に向けて、信頼性を証明する調査を行いさらなる解析を行う予定である。上記を踏まえて平成26年度は新たに健常者を対象とした唾液中マーカーの研究を開始する予定である。唾液中マーカーと心理尺度の相関を検索し、生物学的な裏付けを行う予定である。今後はさらに小児科及び精神科通院児童を対象として唾液中マーカーの測定を行い、その結果の意義を明らかにすることを計画している。本研究では唾液を用いて非侵襲的にストレスを測定する生物学的マーカーを開発することを目的としている。コルチゾールやアミラーゼなどの研究が多く報告されているが、急性ストレスや健常人の日内変動に焦点があたった研究であり、慢性ストレスに焦点が当たった研究は報告されていない。平成25年、26年度においては健常小児22名と小児科外来通院中の心身症患者6名を対象として1日5回の唾液採取を行い、その日内変動パターンを検証した。予備研究の結果としてコルチゾールと免疫グロブリン(IgA)を測定した結果、患者群における起床直後のIgAが低い傾向(健常群137 vs患者群63.6μg/ml)が認められたが、統計学的には有意で無かった。コルチゾールにおいては、1日5回の観測点すべてにおいて有意差は認めれらなかった。心身症患者においては慢性的な身体症状と社会活動が制限されることのストレスにより視床下部ー下垂体ー副腎系の内分泌機能が低下することが知られているが、本予備調査では関連した免疫系の低下が示唆される結果となった。対象患者数が少なかったこともあり統計学的有意差が認められなかった。平成27年度は施設を拡大(カナダ、ブリティッシュコロンビア小児病院)し、より多くの臨床患者にアプローチすることにより統計学的にも意義のある研究を継続する計画である。さらにマーカーもコルチゾル、IgAの他クロモグラニンAや3-methoxy 4-hydroxyglycolなどカテコラミン系のマーカーにも注目して、慢性心身症患者の症候やストレスとの関連について明らかにする予定である。成人領域においてはコルチゾール、アミラーゼ、IgAなどの報告がされているが、小児の心身症患者に焦点を当てた研究はほとんどなされていない。平成25年、26年度は日本において健常小児22名(健常群)と通院中の心身症患児6名(患者群)を対象として1日5回の唾液採取により、コルチゾールと免疫グロブリンA(IgA)の日内変動を検証した。平成27年度はブリティッシュコロンビア小児病院において、日本と同じデザインで健常群41名と心身症患者群5名を対象として調査を行った。平成28年3月末に検体採取を終了し、日本での解析を開始した。また、平成25年27年にかけて心理質問紙「小児抑うつ尺度(CDI)」日本版の標準化解析を終え2016年2月12日講演会において発表した。現在投稿準備中である。

その結果起床直後の患者群IgAが健常群より有意に低い平均値であることが判明。さらに患者群の起床直後IgAが心理質問紙(小児抑うつ尺度、Youth Self Report)と有意な負の相関を示すことが明らかとなった。すなわち、自覚症状が重症の患児ほど起床直後のIgAが低い事が証明され、患児の自覚症状と免疫能の関連が示唆された。本研究の目的として、唾液中のマーカーの検索を行う事と心理質問紙の開発を行うこと。また両者の関連を検証することを目的としていた。唾液中マーカーは2年度目に予備研究を行い一定のデータを得ることができ、同時に行った質問紙調査において標準化に必要なデータが出そろい学会及び論文発表の前段階まで来たため、おおむね順調に進展していると考える。最終年度で上記3つの目的に出来る限り近づけるよう研究を進める。児童精神科、小児心身症、小児内分泌研究施設を拡大し、臨床患者により焦点を当て研究のリクルートを行う。年度中に一定のデータをまとめ、非侵襲的なマーカーを明らかにする。心理評価尺度の標準化がなされ、唾液中のマーカーとの相関が明らかにされることにより、児童思春期のメンタルヘルス向上に役立つツールがより子供たちや家族に身近な存在になる。本研究の目標として子どものうつ病あるいは抑うつ状態に関連するストレスマーカーが明らかにされることで,早期発見や関連要因への適切な働きかけが可能となり,自殺予防への重要な足がかりとする事とした。初年度としては、ストレスマーカーの裏付けとなる心理尺度の開発が順調に進み、平成26年度にその成果の一部を学会発表する予定となっており、おおむね順調な進展状況と考える。人件費、謝金について十分予算を使い切ることが出いなかった。最終年度に本格的に調査を行うため、3年間で使い切る予定である。健常者を対象とした唾液中マーカーの研究計画を策定し、久留米大学倫理委員会での承認を経たのちに30名50名を目標に調査を行う予定である。その解析の結果、心理評価尺度が標準化され、唾液中マーカーとの相関が明らかにされる予定である。健常群、臨床群ともに精力的に調査を行い、謝金を支出する予定である。この他成果を発表する国際学会への旅費や参加費、測定キットにも支出する予定である。現在海外勤務であるため、事務作業の一部を秘書に依頼している。このため、秘書の事務作業への謝金も支出する予定である。旅費、人件費、その他について十分予算を使い切ることができなかった。当初予定していた健常者対象の調査が平成26年度にずれ込んだため、謝金を使うことができなかった。健常者を対象とした唾液中マーカーの謝金として使用する予定である。また、旅費に関しても国際学会をはじめ積極的に参加し、研究協力者とも活発に交流して消費してゆく予定である。
社会性行動の異常に関わる回路のマイクロエンドフェノタイプの解明

社会性行動の異常は様々な精神疾患に見られる表現型であるが、その病態はよくわかっていない。本研究では我々の開発したヒトで見られる遺伝子変化と社会性行動の異常を反映すると考えられるマウスモデルを利用して、社会性行動の異常のマイクロエンドフェノタイプを同定し、その病態の理解に迫ることを目標とした。当該年度は昨年度に実施した行動解析の結果を異なるマウスコホートを用いて追試し、Gtf2i遺伝子を1コピー持つマウスが野生型に比べて過剰な社会性行動を、3コピー持つマウスが社会性行動の減弱を示すことから、この遺伝子のコピー数に応じて社会性行動の量的変化が見られるという結果に再現性があることを確認した。さらにこの行動解析にマッチさせた条件における社会性行動によって活性化される脳領域をc-fosマッピングによって詳細に解析し、昨年度明らかにした前頭前野、扁桃体、線条体、海馬以外に視床のある特定の領域も社会性行動によって活性化されることを明らかにした。さらに社会性行動の解析を行った野生型、Gtf2i遺伝子を1コピー持つマウス、3コピー持つマウスを用いて前頭前野及び扁桃体からRNAを抽出しRNAseqによる遺伝子発現のパターンをこれらのマウスで比較検討し、それぞれの領域において社会性行動の量的な変化に応じた発現変化を示す幾つかの遺伝子を同定した。これらの遺伝子は社会性行動の異常に関与する可能性が考えられ今後これらの遺伝子が社会性行動の発達にどのように関与するかという研究に発展させる。また、これらの遺伝子群は社会性行動の変化に関係する脳領域におけるマイクロエンドフェノタイプとして、今後様々なマウスモデルを使った社会性行動の異常を示す様々な精神疾患の病態解析につなげていくことが出来ると考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では我々の開発したヒトで見られる遺伝子変化と社会性行動の変化を反映すると考えられるマウスモデルを利用して、社会性行動の異常のマイクロエンドフェノタイプを同定し、その病態の理解に迫ることを目標とする。当該年度では新たに作製されたGtf2iトランスジェニックマウス(Gtf2i遺伝子3コピー)を野生型(遺伝子2コピー)及びヘテロザイゴスマウス(遺伝子1コピー)と共に社会性行動を中心に行動解析を行い、トランスジェニックマウスではヒトで見られるのと同様に社会性行動の低下(自閉症様の症状)が見られることを確認した。また、ヘテロザイゴスマウスではやはりヒトで見られるのと同様な過剰な社会性行動(ウィリアムス症候群様の症状)が見られることを再確認した。当該研究領域の班会議における研究者交流及びディスカッションに基づき、社会性行動の様々なステップにおいて活性化される脳領域の同定のため、社会性行動に伴ったc-fos陽性細胞の解析手法の条件検討を行い、その結果から、前頭前野、扁桃体、線条体、海馬を今後の解析の標的とすることを決定した。これらの脳領域での遺伝子発現の変化を解析するため、社会性行動の解析を行った後のマウスを用いて上記の脳領域からRNAを調整した。遺伝子発現のパターンをマイクロアレイ解析する予定であったが、近年の技術革新と設備の整備に伴い、組織における遺伝子発現の差をより明確にまた再現性よく感知出来るリボゾーム結合RNA画分のRNAseqを行うことに計画を変更した。これにより遺伝子発現の変化の解析まではできてはいないが、そのあとのqPCRを用いた再確認の段階での擬陽性の確率を減らすと考えられ、結果としてそのあとの解析の遅延にはつながらないと考える。当該年度に確認した社会性行動の異常を異なるマウスコホートを用いて追試する。

また、発達段階の行動解析と組み合わせ、社会性行動の行動要素の発達過程のどこに異常があるかを検討する。これら社会性行動の異常が見られるマウスの社会性行動に関与する脳領域の遺伝子発現のパターンを包括的にリボゾーム結合RNA画分を用いてRNAseqで検討する。得られた遺伝子変化をqPCRにて確認し、行動要素の発達過程の異常への遺伝子変化の関与を推察、これらの遺伝子変化の社会性行動の異常のマイクロエンドフェノタイプとしての妥当性を検討する。当該研究領域の班会議等で他研究者との研究交流、ディスカッションを行い、遺伝子変化の行動への関与を解析する手法ならびに他のマイクロエンドフェノタイプの解析手法について検討し、可能性の高いものにつきセットアップを行う。
ＯＥＣＤ諸国における学校評価制度とその効果に関する比較分析

本研究の目的は、諸外国の学校評価制度を目標管理の視点から類型化した上で、こうした学校評価制度の差異が教職員間の協働にどのような違いを生じさせるのか明らかにすることであった。分析の視角として、トップダウンとボトムアップの目標管理という軸を用い、第一の作業課題として諸外国の学校評価制度にトップダウンとボトムアップの目標管理がどのように反映されているのかを明らかにすること、第二の作業課題として学校評価制度の差異が教職員間の協働にどのような違いを生むのか明らかにすることを設定した。第一の作業課題については、フランスと日本の事例を基に制度分析を行った。フランスで実施されている参加型学校評価の試みが教職員間の協働にどのような影響を及ぼしているのかをボルドー大学区におけるフィールドワークから明らかにし、また、日本の市町村教育委員会における学校評価制度における目標管理の動態について質問紙調査によって明らかにした。第二の作業課題については、ランダムサンプリングによって抽出した日本の小中学校を対象に質問紙調査を実施し、各学校の学校評価の実践における目標管理の実態とそれが教職員間の協働にどのような影響を及ぼしているのか、質問紙調査及び事例分析を行った。上記の研究は、概ね順調に進展したと考える。その理由は、第一に、フランスにおける現地調査から、ボトムアップ型の目標管理が教職員間の協働に果たす条件について仮説生成を行った点である。第二に、日本の学校評価の制度と実践においてボトムアップとトップダウンの目標管理がどの程度運用されているのか、そのインパクトの実態も明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、諸外国の学校評価制度を目標管理の視点から類型化した上で、こうした学校評価制度の差異が教職員間の協働にどのような違いを生じさせるのか明らかにすることである。本年度は、第一の作業課題について、フランスと日本の事例を基に制度分析を行った。フランスで実施されている参加型学校評価の試みが教職員間の協働にどのような影響を及ぼしているのかをボルドー大学区におけるフィールドワークから明らかにし、フランス教育学会紀要の論文「参加型学校評価による教師の協同的省察の可能性とその条件ーフランス、ボルドー大学区における実践事例の検討を通してー」として掲載された。また、日本の市町村教育委員会における学校評価制度における目標管理の動態について、10月の日本教育行政学会で発表し、その後同学会の学会誌に投稿した。また、学校評価を教育条件の面からも分析し、「教育条件を重視する学校評価の理論と制度ー教職員,児童生徒・保護者一体の学校づくりの観点からー」という題目で、千葉工業大学紀要に共著論文として掲載された。第二の作業課題については、ランダムサンプリングによって抽出した日本の小中学校を対象に質問紙調査を実施し、各学校の学校評価の実践における目標管理の実態とそれが教職員間の協働にどのような影響を及ぼしているのか、現在分析を行っている。同分析結果は6月の日本教育経営学会で発表し(発表題目:学校評価における目標管理が教職員間の協働に及ぼす影響に関するマルチレベル分析)、11月に投稿する予定である。フランスにおける現地調査から、ボトムアップ型の目標管理が教職員間の協働に果たす条件について仮説生成を行った。こうした仮説を日本や諸外国で検証することによって、今後多国間比較を行うことも可能になると考える。また、日本の学校評価の制度と実践においてボトムアップとトップダウンの目標管理がどの程度運用されているのかの実態も明らかになったが、日本の実態を踏まえた上で、今後海外での実践を見ていくことで、日本の独自性や課題がより明確になると考える。以上の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。

今年度は、日本において、ボトムアップ型の目標管理を実践している学校評価の事例分析を、岡山県と鳥取県、静岡県で行うことを想定している。フランスにおける現地調査で得られた仮説を基に、日本の学校評価の目標設定において、合意形成がどのように図られるのかを明らかにすることで、日本特有の課題を明らかにしたい。ここでの分析結果は、海外の教育ジャーナルに投稿する予定である。更に、フランスにおいて、トップダウン型の目標管理を実践している学校評価の事例分析を、モンペリエ大学区を対象に行う予定である。ここでの事例分析は、ボルドー大学区の事例と比較し、比較教育学会の紀要に投稿する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
静電紡糸法によるナノファイバーの合成開発と電子デバイス材料への応用

静電紡糸法によるナノファイバー合成プロセスの改良と電子デバイスへの応用について検討し、以下のような成果を得た。1)静電防止法の各種条件がナノファイバーの形態へ及ぼす影響の調査太陽電池用の透明電極基板および二次電池材料用のナノファイバーの開発を行うために、実験条件とファイバー形態へ及ぼす影響について実験的に調査した。モデルとしてポリアクリルニトリルを用いて静電紡糸法によってファイバーを合成した。具体的には溶液の濃度、温度を変化させることで、粘度、表面張力、電気伝導度を変化させファイバーを合成した結果、ストレート、スピンドル、ビーズ状、リボン状のファイバーが合成されることが分かり、太陽電池、センサー、電磁場フィルタなどへの応用が期待される結果が得られた。2)燃料電池用ナノファイバーに作成と触媒特性評価燃料電池におけるプロトン伝導膜材料ファイバーの開発を目指して、ポリアクリルニトリルの酸化スズを出発原料とする酸化スズナノファイバーの合成について検討した。その結果、酸化スズの中空ファイバーが合成に成功し、白金を担持させることで燃料電位の固体触媒としての性能が確認された。特にアノード側の電極触媒としての性能に優れた材料であることが明らかとなった。3)レアアースフリー蛍光体BCNOファイバーの作製静電紡糸法により希土類を用いない蛍光体BCNOファイバーの合成に成功した。原料であるホウ酸の濃度を調整することにより近紫外の励起による発光色を緑色と黄色に制御できることが明らかとなった。XRDとFTIRの分析結果より、BCNOファイバーは、多結晶のBCNとB203の結晶で構成されていることが明らかとなった。またSEMおよびTEM観察より、BCNOナノファイバーが非凝集であり、機械的に強度が優れていることが示された。これらの手法では、1次元のBCNOナノ構造体の作製が可能となり、光学材料への応用が期待される。最後に、本静電紡糸プロセスによって合成したファイバーの電池材料として最適なファイバーの径、長さ、構造などを検討し、得られた研究成果の論文化および学会発表を実施した。本研究では、特別研究員がこれまでに開発した自動化制御静電紡糸法を用い、さらに高い機能をもつ無機ナノファイバーを合成し、新規エネルギー源材料および手ネルギー貯蔵材料へ応用可能なデバイスの開発を検討した。(1)静電紡糸装置の改良所有の自動化制御静電紡糸装置の改良を行った。また、精密制御可能なシリンジポンプを購入し、精密に装置のコントロールを行い、直径が均一なファイバーを合成した。合成されるポリマーファイバーを走査型電子顕微鏡で観察し、その形態を測定して最適な合成条件および制御方法により評価を行った。(2)酸化インジウムスズ(ITO)ナノファイバーの作製まず、太陽電池用の透明電極基板として利用される酸化インジウムスズ(ITO)ナノファイバーを合成した。具体的には、ITOの原料およびポリマーをプリカーサとして用い、静電紡糸化させた。その後、合成したファイバーを加熱し、ファイバーに含んだポリマーの分解およびITO化を行った。その後、合成されたファイバーの形態や物性を分析し、ファイバーの直径や長さや構造などの最適化を行い、本プロセスの最適条件を検討した。(3)二次電池材料用のリン酸鉄リチウムファイバーの作製(2)と同様であるが、合成材料として、二次電池材料用のリン酸鉄リチウムファイバーを検討した。具体的に、リン酸鉄リチウムの原料およびポリマーをプリカーサとして用い、静電紡糸化させた。その後、合成したファイバーを加熱し、ポリマー成分の分解およびリン酸鉄リチウムファイバーを合成した。また、合成されたファイバーの形態や物性を測定し、本プロセスの最適条件を検討した。本研究では、特別研究員が前年度に開発した自動化制御静電紡糸法を用い、均一径のファイバー、ビーズを有するファイバーからなる無機および有機系のナノファイバーを合成し、エネルギー源材料およびエネルギー貯蔵材料へ応用可能なデバイスの開発、さらにナノ粒子捕集用のエアフィルター素材としての応用を検討した。(1)ナノファイバーフィルタの製造とナノ粒子の捕集実験所有している自動化制御静電紡糸装置の改良を行った。精密に静電紡糸装置およびファイバーの回収板のコントロールを行い、直径が100ナノメートル以下で均一径からなるファイバーを合成し、これをフィルター層にして、大きさが100ナノメートル以下のナノ粒子の捕集実験を行い、捕集性能とフィルターの構造との関係を明らかにした。その結果、ビーズが存在すると、フィルターの構造が維持され、圧損が低くなり、捕集性能が高くなることがわかった。(2)酸化インジウム(ITO)ナノファイバーの合成前年度に引き続き太陽電池用の透明電極基板として利用される酸化インジウムスズ(ITO)ナノファイバーの合成およびデバイス化とその性能評価を実験的に検討し、ITOのファイバーの形態と性能との関連性を検討した。(3)二次電池材料用のリン酸鉄リチウムファイバーの作成二次電池材料用のリン酸鉄リチウムファイバーを検討した。合成されたファイバーをXRD、TG-DTA、FTIRおよびSEMといった分析装置により分析し、電池材料用として最適なファイバーの径、長さ、構造を明らかにした。(4)ファイバー構造およびサイズの制御静電紡糸装置の制御により、ビーズを有するファイバーが高い機能性を持つことから、そのようなファイバーが合成できる操作条件を明らかにした。1)静電防止法の各種条件がナノファイバーの形態へ及ぼす影響の調査

太陽電池用の透明電極基板および二次電池材料用のナノファイバーの開発を行うために、実験条件とファイバー形態へ及ぼす影響について実験的に調査した。モデルとしてポリアクリルニトリルを用いて静電紡糸法によってファイバーを合成した。具体的には溶液の濃度、温度を変化させることで、粘度、表面張力、電気伝導度を変化させファイバーを合成した結果、ストレート、スピンドル、ビーズ状、リボン状のファイバーが合成されることが分かり、太陽電池、センサー、電磁場フィルタなどへの応用が期待される結果が得られた。2)燃料電池用ナノファイバーに作成と触媒特性評価燃料電池におけるプロトン伝導膜材料ファイバーの開発を目指して、ポリアクリルニトリルの酸化スズを出発原料とする酸化スズナノファイバーの合成について検討した。その結果、酸化スズの中空ファイバーが合成に成功し、白金を担持させることで燃料電位の固体触媒としての性能が確認された。特にアノード側の電極触媒としての性能に優れた材料であることが明らかとなった。3)レアアースフリー蛍光体BCNOファイバーの作製静電紡糸法により希土類を用いない蛍光体BCNOファイバーの合成に成功した。原料であるホウ酸の濃度を調整することにより近紫外の励起による発光色を緑色と黄色に制御できることが明らかとなった。XRDとFTIRの分析結果より、BCNOファイバーは、多結晶のBCNとB203の結晶で構成されていることが明らかとなった。またSEMおよびTEM観察より、BCNOナノファイバーが非凝集であり、機械的に強度が優れていることが示された。これらの手法では、1次元のBCNOナノ構造体の作製が可能となり、光学材料への応用が期待される。最後に、本静電紡糸プロセスによって合成したファイバーの電池材料として最適なファイバーの径、長さ、構造などを検討し、得られた研究成果の論文化および学会発表を実施した。
グリコサミノグリカンに関する糖鎖工学的研究のための新しい方法の開発

細胞外マトリックスを構成しているプロテオグリカンの糖鎖であるグリコサミノグリカンには細胞の接着、認識、コラーゲンとの結合等様々な機能を有する特定の糖鎖構造、即ち機能性ドメイン構造がその内部に含まれるということが明らかになってきた。そこで、我々はこのような糖鎖を切り出し、構造解析し、更に新しい機能性糖鎖の人工的合成を目的とした糖鎖工学的研究を進めた。即ち、我々はまず糖鎖の選択的切り出しに必要な新しいエンド型グリコシダーゼを3種発見した。次に、切り出された糖鎖の構造解析の方法として2-アミノピリジンで糖鎖を蛍光標識し、これを高速液体クロマトで解析し、更にこれをイオンスプレーイオン源を装着したタンデム四重極型質量分析計を用いて分析を行い、そのデータを詳細にコンピューター解析することにより、糖鎖配列に関する情報を得た。続いて、エンド型グリコシダーゼの一つである精巣ヒアルロニダーゼの糖転移能の特性を詳細に調べ、加水分解反応の逆は反応を利用した糖鎖の人工的合成法を確立した。その結果を元に、供与体、あるいは受容体としてのグリコサミノグリカンの組み合わせとその反応条件を変えることにより、最大22糖までの天然型、あるいは、非天然型の新規オリゴ糖の人工的合成を可能とした。以上の結果はグリコサミノグリカン糖鎖から機能性ドメイン部分を有する部分を切り出し、その構造を解明し、更には再構築をするという人工糖鎖のデザイン化という道を開いたことを意味している。次世代のバイオテクノロジーは糖鎖工学であると目されている。しかし、核酸やタンパク質を中心としたバイオテクノロジーに比べて糖鎖工学の研究は進んでいない。それは糖鎖工学研究の方法そのものが進んでいないためである。そこで申請者らは糖鎖工学的研究の推進のために、今年度は以下のテーマについて検討した。エンド型グリコシダーゼの糖転移活性を利用した新しいオリゴ糖の再構築グリコサミノグリカン糖鎖の再構築方法の開発は、細胞相互の接着や情報伝達などの生物学的な機能をもつ糖鎖の、有効な部分(機能性オリゴ糖)を再構築するという点で重要である。そこで生化学的アプローチとして、加水分解酵素であるグリコシダーゼの糖転移活性を利用した糖鎖の酵素学的合成法について検討した。グリコシダーゼは、加水分解するグリコシド結合の位置によりエキソ型とエンド型に大別されるが、本研究ではエキソ型グリコシダーゼによる単糖ずつの合成ではなく、エンド型グリコシダーゼにより切り離したオリゴ糖単位での合成を試みた。その結果、エンド型グリコシダーゼとして牛精巣性ヒアルロニダーゼを用い、供与体と受容体としてのグリコサミノグリカンの組み合せを変えることにより、ヒアルロン酸とコンドロイチン、コンドロイチン4-硫酸、コンドロイチン6-硫酸との混成糖鎖、あるいはコンドロイチン4-硫酸と6-硫酸との混成糖鎖等、612糖までの天然型、非天然型の任意のオリゴ糖の再構築が可能となり、当初の予定であったグリコサミノグリカン糖鎖の酵素学的合成方法の開発が達成された。細胞外マトリックスを構成しているプロテオグリカンの糖鎖であるグリコサミノグリカンには細胞の接着、認識、コラーゲンとの結合等様々な機能を有する特定の糖鎖構造、即ち、機能性ドメイン構造がその内部に含まれるということが明らかになってきた。

続いて、エンド型グリコシダーゼの一つである精巣ヒアルロニダーゼの糖転移能の特性を詳細に調べ、加水分解反応の逆反応を利用した糖鎖の人工的合成法を確立した。その結果を元に、供与体、あるいは受容体としてのグリコサミノグリカンの組み合せとその反応条件を変えることにより、最大22糖までの天然型、あるいは、非天然型の新規オリゴ糖の人工的合成を可能とした。以上の結果はグリコサミノグリカン糖鎖から機能性ドメイン部分を有する部分を切り出し、その構造を解明し、更には再構築をするという人工糖鎖のデザイン化という道を開いたことを意味している。
スキンシップが惹起する情動の脳認知科学的メカニズム

本研究の目的はスキンシップの重要性を念頭に「脳はどのように触覚で素材を理解して、情動を惹起するのか」について脳認知科学的に明らかにすることである。成果は主に次の2点からなる。(1)昨年度は機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いた実験により、側頭葉内側部など長期記憶に関わる神経基盤が素材情報の視触覚比較に関与することを明らかにした。本年度はこの成果を国内外の研究集会(Society for Neuroscience Annual Meeting・多感覚研究会・質感脳情報学研究集会「触覚サテライトミーティング」で発表し、専門誌(Neuropsychologia)に発表した。(2)さらに本年度は他者との接触がどのように不快情報の処理を抑制するのかに関するfMRI研究を遂行した。この研究では健常被験者が、ゴムでできた偽者の手および友人の手に触れながら、不快および不快でない(中性)画像を観察し、その不快度を評定した。不快画像の条件では中性画像の条件に比べて、後頭ー側頭領域にわたる視覚野が強く活動した。しかしこの活動の一部は、偽者の手の条件でのみ観察され、友人の手の条件では観察されなかった。すなわち友人の手と接触しているときは、不快刺激に対する視覚野の活動の一部が抑制されることが明らかになった。ただし不快度の評定は親友の手と偽物の手の間に違いがないことから、不快刺激の処理に本質的に不要な活動が減弱されたと解釈した。この成果は論文としてまとめ、Frontiers in Human Neuroscience誌に採択された。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度の研究では、素材情報の視触覚比較には、長期記憶に関わる神経基盤が関与することを明らかにした。我々の身の回りにある物体の多くは、素材に何らかのコーティングがなされており、見た目だけではどのような物質でできているのか分からないことが多い。このような場合、視覚から推測される質感と触覚から得られた質感情報を比較することで、その物体の構成をよく理解することができる。昨年までに22名を対象に実施したfMRI実験データを解析し、視触覚の素材統合過程に関する脳活動パターンを明らかにした。この実験では素材(石・繊維・木材・皮)の上に方位の異なる薄い棒を付着させた刺激を用いた。参加者は(1)視覚と触覚で呈示した刺激のうち素材の種類が同じであるかどうか(素材条件)、(2)視覚と触覚で呈示した刺激のうち棒の方位が同じであるかどうか(方位条件)を判断した。素材条件では方位条件に比べ、腹側視覚経路・海馬・外側前頭前野の賦活が観察された。素材条件のうち視触覚の刺激が不一致の場合は、一致した場合に比べて、楔前部が賦活した。これらの脳領域は、長期記憶の想起に関わる神経基盤として知られている。方位は空間参照フレームを通じて視覚と触覚で比較することができるが、素材は共通の情報が視触覚の間に少ない。そのため過去の視触覚の連合学習経験を頼りに、素材の一致・不一致を検討していると解釈した。この成果は論文としてまとめ、英文科学雑誌で査読中である。当初は記憶だけでなく情動に関する神経基盤が、素材の相違に関与することを予期していたが、賦活傾向が観察されるだけであった。この点に関しては更なる解析および追加実験により検討していく。本年度の研究により、素材情報の視触覚統合に関する新しい知見を提供することができた。

しかし本研究の当初の目的は、「脳はどのように素材の弾性を理解して、情動を惹起するのか」について脳認知科学的に明らかにしようとするものである。この目的を達成するには、物理的な弾性を定義した刺激を作成し、経年劣化を考慮に入れるため、実験ごとに弾性を測定するシステムの構築を行う必要があり、これらの問題を解決するのに予想以上の時間を費やしている。そのため達成度はやや遅れているとした。引き続き申請者は素材の弾性に関する実験系の確立と心理物理学実験の実施を目指す。本実験の実施がさらに遅れる場合を考慮し、2つの触覚による素材知覚の実験(ベルベッド錯触・他者との接触効果)を実施する。これらの実験結果から、触覚による素材知覚と情動処理に関する神経基盤を多面的に明らかにし、スキンシップに関する脳認知科学的モデルを提案する予定である。
アストロサイトを標的とした急性脳症新規治療法の探索

昨年度に引き続き、アストロサイトの活性化状態を検出する指標として、アクアポリン4(以下AQP4)を利用し研究を進めた。AQP4の細胞内局在をリアルタイムで観察するために、蛍光タンパクとの融合タンパクを遺伝子導入により発現させ観察することとした。昨年度構築した、ヒトAQP4cDNAの細胞外ループに相当する部分に、pH感受性で緑色を呈するpHluorinの遺伝子を挿入し、AQP4cDNAのC末端側に赤色を呈するmKateを挿入した発現ベクターを用い、また、比較対象として、AQP4cDNAのC末端側にmKateのみを挿入した発現ベクターも利用した。さらにAQP4のアイソフォームによる局在の変化の可能性も考慮し、AQP4-M1(1番目のメチオニンからのアイソフォーム)とAQP4-M23(23番目のメチオニンからのアイソフォーム)の合計4種類のベクターを準備した。これら発現ベクターを、ラットアストロサイトーマ細胞C6及び本研究室で樹立したラットアストロサイト不死化細胞ACT57に遺伝子導入し、導入後から24時間ごとに96時間後まで、蛍光タンパクの発現と局在を観察した。pHluorinとmKateの両者を含む発現ベクターを遺伝子導入した場合、両者の蛍光が観察され、mKateのみの場合は、赤色のみ検出された。ACT57細胞においても、pHluorinのpH感受性と原形質膜上の発現を確認するため、培養液ののpHを7.4からpH6.0に変化させたところ、pHluorinの蛍光が消退した。これによりpHluorinのpH感受性と、原形質膜上にあるタンパクが緑色蛍光を発している可能性が示唆された。但し、ACT57細胞においても、遺伝子導入効率が悪く、改善の余地があり、大きな課題となった。平成30年度中にアストロサイトでのAQP4タンパクの発現系を樹立し、血管内皮細胞との共培養系を開始する予定であったが、アストロサイトにおけるAQP4タンパクの発現系の樹立に時間がかかり、血管内皮細胞との共培養系の実験を開始することが出来なかった。AQP4の発現系は、現在のところ発現ベクターを用いているが、遺伝子導入効率がやや悪く、大きな課題となった。今後は、安定発現株の樹立やウイルスベクターによる発現系も考慮する。アストロサイトの活性化状態を検出する指標として、アクアポリン4(以下AQP4)を利用することとした。ヒトAQP4cDNAの細胞外ループに相当する部分に、pH感受性で緑色を呈するpHluorinの遺伝子を挿入し、さらに、AQP4cDNAのC末端側に赤色を呈するmKateを挿入した発現ベクターを構築した。また、比較対象として、AQP4cDNAのC末端側にmKateのみを挿入した発現ベクターも準備した。これら発現ベクターを、ラットアストロサイトーマ細胞C6に遺伝子導入し、導入後から24時間ごとに96時間後まで、蛍光タンパクの発現と局在を観察した。pHluorinのpH感受性と原形質膜上の発現を確認するため、培養液ののpHを7.4からpH6.0に変化させたところ、pHluorinの蛍光が消退した。今回準備した発現ベクターの構築で、今後の研究が遂行できる可能性が高いと思われた。ただ、遺伝子導入効率が悪く、改善の余地がある。平成29年度中にアストロサイトでのAQP4タンパクの発現系を樹立し、血管内皮細胞との共培養系を開始する予定であったが、アストロサイトにおけるAQP4タンパクの発現系の樹立に時間がかかり、血管内皮細胞との共培養系の実験を開始することが出来なかった。

ACT57細胞においても、pHluorinのpH感受性と原形質膜上の発現を確認するため、培養液ののpHを7.4からpH6.0に変化させたところ、pHluorinの蛍光が消退した。これによりpHluorinのpH感受性と、原形質膜上にあるタンパクが緑色蛍光を発している可能性が示唆された。但し、ACT57細胞においても、遺伝子導入効率が悪く、改善の余地があり、大きな課題となった。平成30年度中にアストロサイトでのAQP4タンパクの発現系を樹立し、血管内皮細胞との共培養系を開始する予定であったが、アストロサイトにおけるAQP4タンパクの発現系の樹立に時間がかかり、血管内皮細胞との共培養系の実験を開始することが出来なかった。まずは、アストロサイトにおけるAQP4の発現系の確立を優先して取り組む予定である。理由としては、血管内皮細胞との共培養系は、現在所属の研究室で既に他の研究で確立している手技であるので、アストロサイトのAQP4発現系が樹立できれば、その後の研究の遂行については、これまでの経験を生かすことが出来ると考えている。AQP4の発現系は、現在のところ発現ベクターを用いているが、遺伝子導入効率がやや悪く、順調に進まないときは、安定発現株の樹立やウイルスベクターによる発現系も考慮する。AQP4の発現系は、現在のところ発現ベクターを用いているが、遺伝子導入効率がやや悪く、大きな課題となった。今後は、安定発現株の樹立やウイルスベクターによる発現系も考慮する。初代培養アストロサイトを用いた研究を企画していたが、研究に遅れが生じたため、予定していた試薬・培養液の購入を見合わせた。次年度に細胞培養液、血清等の購入を予定している。
クリプトスポリジウム症に対する卵黄抗体を用いた受動免疫療法の確立

1.クリプトスポリジウム原虫の防御抗原をコードする遺伝子のクローニング牛あるいは人由来のCryptosporidium parvumオオシストを試料として、前年度に引き続きクリプトスポリジウム特異的抗原遺伝子のクローニング及び塩基配列の解析をおこなった。そのうち、簡易診断法であるELISA抗原を特定し、血清学的診断法を確立し、疫学調査を計画した。2.ウイルスベクターを用いた遺伝子組み換え体の作成大腸菌発現タンパクと免疫原性が異なることを期待して、鶏ヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、昆虫のバキュロウイルスをベクターとして、クリプトスポリジウム遺伝子の組み換え体を作製した。ワクチン候補としての有用性を確認し、フィールドトライヤルを実施した。3.クリプトスポリジウム抗原の大量発現・精製リコンビナント原虫抗原及びクリプトスポリジウム原虫遺伝子組み操えウイルスを大量に発現・精製するシステムを利用し、鶏に免疫するための抗原を充分量確保した。4.フィールドにおける評価フィールドにおける牛群に受動免疫をおこない、免疫効果について検討した。その結果、非接種牛群と比較して、受動免疫牛群では明らかな感染防御効果が認められた。5.国内における牛クリプトスポリジウム症の疫学調査既に、我が国の河川中にはクリプトスポリジウムオオシストが広範囲に存在する事実を明らかにしている。このオオシストの感染源は牛である可能性が高く、飼育形態と密接に関係している事実を明らかにした。今後、河川中のオオシストが人あるいは牛への感染源となりうるのか、野生動物による感染拡大の可能性、河川中におけるオオシストの生存期間および病原性保持能力等について研究を継続する必要がある。1.クリプトスポリジウム原虫の防御抗原をコードする遺伝子のクローニング(1)クリプトスポリジウム(Cryptosporidium parvum)のオオシストをマウス糞便中より回収し、エーテル抽出法により分離精製した。(2)免疫血清を用いて特異抗原遺伝子のクローニングを実施した。(3)その塩基配列を解析した。2.最適なベクターを用いた遺伝子組換え体の作製鶏ヘルペスウイルス、マレック病ウイルスあるいは昆虫のバキュロウイルスをベクターとして、クリプトスポリジウム遺伝子の組み換え体を作製した。3.原虫抗原の大量発現・精製鶏に免疫するためのリコンビナント原虫抗原および組み換えウイルスを大量に発現させ、それを精製した。4.抗体ハイリスポンダー鶏種への高度免疫(1)高い抗体産生能力を有する鶏種へ精製したリコンビナント原虫抗原および組み換えウイルスを接種し、抗体産生を比較検討した。(2)免疫鶏の卵黄から抗体を精製するシステムについては、すでに確立しているが、免疫方法を検討する必要がある。5.マウスモデルを用いた受動免疫効果の評価(1)クリプトスポリジウム感受性を調べる目的で、スキッドマウスを用いた感染実験系を確立した。(2)免疫実験については、現在遂行中である。1.クリプトスポリジウム原虫の防御抗原をコードする遺伝子のクローニングCryptosporidium parvumのオオシストをマウス糞便中より回収し、エーテル抽出法により分離精製し、免疫血清を用いて特異抗原遺伝子のクローニングを実施した。さらに、その塩基配列を解析した。これらは、すでに報告のある配列も含まれていたが、新規遺伝子の発見に向けて継続中である。2.ウイルスベクターを用いた遺伝子組換え体の作製抗体産生のための免疫原として使用する目的で、鶏ヘルペスウイルス、マレック病ウイルスあるいは昆虫のバキュロウイルスをベクターとして、クリプトスポリジウム遺伝子の組み換え体を作製した。3.クリプトスポリジウム抗原の大量発現・精製鶏に免疫するためのリコンビナント原虫抗原および組み換えウイルスを大量に発現させ、それを精製し、充分量の抗原を確保した。4.抗体ハイリスポンダー鶏種への高度免疫高い抗体産生能力を有する鶏種へ精製したリコンビナント原虫抗原および組み換えウイルスを接種し、抗体産生を比較検討した。

免疫鶏の卵黄から抗体を精製するシステムについては、すでに確立しているが、免疫方法及び免疫原についての検討は継続中である。5.マウスモデルを用いた受動免疫効果の評価(1)クリプトスポリジウム感受性を調べる目的で、スキッドマウスを用いた感染実験系を確立した。(2)免疫実験については、現在も継続中である。6.国内の牛クリプトスポリジウム症に関する疫学調査我が国における牛クリプトスポリジウム症の疫学調査及び水源となる河川の汚染状況を調査した結果、牛下痢症の約半数が本症が原因であり、河川も高率に汚染されている事実が判明した。1.クリプトスポリジウム原虫の防御抗原をコードする遺伝子のクローニングマウス糞便中より回収したCryptosporidium parvumオオシストを試料として、前年度に引き続き特異抗原遺伝子のクローニング及び塩基配列の解析を実施した。免疫原生の高い特異抗原に関しては、ワクチン候補として、また、特異診断用抗原としての有用性を検討した。2.ウイルスベクターを用いた遺伝子組換え体の作製感染防御抗体産生のための免疫原として使用する目的で、鶏ヘルペスウイルス、マレック病ウイルスあるいは昆虫のバキュロウイルスをベクターとして、クリプトスポリジウム遺伝子の組み換え体を作製した。3.クリプトスポリジウム抗原の大量発現・精製鶏に免疫するためのリコンビナント原虫抗原及びクリプトスポリジウム原虫遺伝子組み換えウイルスを大量に発現・精製するシステムを確立し、充分量の抗原を確保した。4.抗体ハイリスポンダー鶏種への高度免疫高い抗体産生能力を有する鶏種を特定し、精製したリコンビナント原虫抗原あるいは組み換えウイルスを接種し、抗体産生を誘導した。免疫鶏の卵黄から抗体を精製するシステムについては、すでに確立しているが、抗体量産に向けた免疫方法及び免疫原の種類についての検討は継続中である。5.牛群を用いた受動免疫効果の評価野外応用試験により免疫効果について検討した結果、非接種対照群と比較し、明らかな防御効果が認められた。6.国内の牛クリプトスポリジウム症に関する疫学調査我が国の河川中に、クリプトスポリジウム・オオシストが広範囲に存在する事実を明らかにし、その由来については、牛である可能性が高いことを報告した。スキットマウスを用いた実験により、河川中のオオシストは感染性を有する事実も明らかにしている。1.クリプトスポリジウム原虫の防御抗原をコードする遺伝子のクローニング牛あるいは人由来のCryptosporidium parvumオオシストを試料として、前年度に引き続きクリプトスポリジウム特異的抗原遺伝子のクローニング及び塩基配列の解析をおこなった。そのうち、簡易診断法であるELISA用抗原を特定し、血清学的診断法を確立し、疫学調査を計画した。
警報フェロモンが社会性進化に与える影響：社会性アブラムシを用いた比較進化学的研究

本研究の目的は、アブラムシの社会性進化に警報フェロモンがどのように影響するのかを明らかにすることである。この目的を達成するためには、まず最初に社会性段階の異なるアブラムシ種が含まれる分類群で警報フェロモンの有無を明らかにし、次に警報フェロモンを進化させている種については警報フェロモンを構成している化学物質を明らかにする必要がある。また、警報フェロモンがどのように用いられているかを含む社会性アブラムシの生態についても明らかにする必要がある。これらについて平成27年度は以下の成果を得た。1.自身の先行研究によって警報フェロモンを進化させていることが明らかになっている真社会性アブラムシのササコナフキツノアブラムシにおいて、警報フェロモンがどのような物質によって構成されているのかガスクロマトグラフ質量分析計を用いて調べた。その結果、これまで多くのアブラムシで警報フェロモンの主物質として報告のあった(E)-β-ファルネセンは検出できず、異なる化学物質で構成されていることが明らかになった。2.真社会性アブラムシのヒエツノアブラムシが警報フェロモンを進化させているかを調べた。ヒエツノアブラムシの腹部を物理的に刺激した結果、非常に低い頻度ではあるがササコナフキツノアブラムシと同様に腹部背面に存在する角状管から赤褐色の液体を放出した。このことは、ヒエツノアブラムシが警報フェロモンを進化させていることを示唆している。3.ササコナフキツノアブラムシの防衛個体のもつ捕食者に対する防衛能力の地理的変異について調べた。その結果、捕食者との相互作用の強い集団ほど防衛個体の防衛形態形質が肥大化しており、さらに捕食者に対する防衛能力も高いことがわかった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
胃癌の新しい癌抑制遺伝子RUNX3の細胞分化・癌化機構の解明と予防・診断への応用

前年度までのRUNX3ノックアウトマウスや胃癌臨床検体の解析結果に基づき,より詳細なRUNX3の機能解析と遺伝子診断や発癌予防・治療への応用を目指して以下を展開した。1.胃癌発生母地,特に腸上皮化生や残胃粘膜,残胃癌でのRUNX3の発現変化の検討3.胃癌臨床検体及び周囲背景粘膜における胃癌前駆細胞のスクリーニング4.胃癌発生リスク評価への応用・胃癌前駆細胞の探索とその追跡調査(コホート研究)5.複数遺伝子MSPによる遺伝子診断,定量的検査の自動化・血清診断への応用6.ラット・マウス化学発癌モデルを用いたRUNX3遺伝子発現誘導による発癌予防実験7.各種悪性腫瘍におけるRUNX3の放射線や抗がん剤感受性への関連の検討既に我々は、胃癌前駆細胞のマーカーを数種類同定しており、早期多発胃癌切除標本の背景粘膜において胃癌前駆細胞を探索しつつある。また新しいHDAC阻害剤FK228やSAHAなどが開発され臨床応用されつつある。我々はこれらの薬剤がRUNX3を発現誘導し、マウス科学発癌モデルにて発癌抑制効果を示すことを確認しており、RUNX3を分子標的とした発癌予防や癌治療に応用しうると考えている。さらにRUNX3はTGFβ依存性アポプトーシスに重要な役割を果たしており、放射線化学療法の感受性に関与していることが明らかとなった(Oncogene, Sakakura, et. Al., 2007)。また我々はRUNX3ノックアウトマウスとAPCノックアウトマウスの掛け合わせにより大腸病変の発生を確認している。大腸癌の発癌シグナル伝達系(Wntシグナル系)とRUNX3-TGFβシグナル伝達系のオーバーラップする分子も同定されており、今後更なる発展が期待しうる。我々は日立ソフトLuminexシステムにより、多数の検体における複数遺伝子のメチル化を定量的に短時間で測定しうる迅速血清診断システムを確立し、実地臨床に応用可能しつつある。前年度までのRUNX3ノックアウトマウスや胃癌臨床検体の解析結果に基づき、より詳細なRUNX3の機能解析と遺伝子診断や発癌予防・治療への応用を目指して以下を展開した。1.胃癌発生母地、特に腸上皮化生や残胃粘膜、残胃癌でのRUNX3の発現変化の検討3.胃癌臨床検体及び周囲背景粘膜における胃癌前駆細胞のスクリーニング4.胃癌発生リスク評価への応用・胃癌前駆細胞の探索とその追跡調査(コホート研究)5.複数遺伝子MSPによる遺伝子診断、定量的検査の自動化・血清診断への応用6.ラット・マウス化学発癌モデルを用いたRUNX3遺伝子発現誘導による発癌予防実験7.各種悪性腫瘍におけるRUNX3の放射線や抗がん剤感受性への関連の検討既に我々は、胃癌前駆細胞のマーカーを数種類同定しており、早期多発胃癌切除標本の背景粘膜において胃癌前駆細胞を探索しつつある。我々はこれらの薬剤がRUNX3を発現誘導し、マウス化学発癌モデルにて発癌抑制効果を示すことを確認しており、RUNX3を分子標的とした発癌予防や癌治療に応用しうると考えている。さらにRUNX3はTGFβ依存性アポプトーシスに重要な役割を果たしており、放射線化学療法の感受性に関与していることが明らかになった(Oncogene、Sakakura et: al.,2007)。また我々はRUNX3ノックアウトマウスとAPCノックアウトマウスの掛け合せにより大腸病変の発生を確認している。

また我々はRUNX3ノックアウトマウスとAPCノックアウトマウスの掛け合わせにより大腸病変の発生を確認している。大腸癌の発癌シグナル伝達系(Wntシグナル系)とRUNX3-TGFβシグナル伝達系のオーバーラップする分子も同定されており、今後更なる発展が期待しうる。我々は日立ソフトLuminexシステムにより、多数の検体における複数遺伝子のメチル化を定量的に短時間で測定しうる迅速血清診断システムを確立し、実地臨床に応用可能しつつある。
歯周病原性細菌の母子伝播時期と小児口腔の変化に伴う細菌の栄養供給源の変化の解明

小児の口腔における歯周病原性細菌の検出および家族間での歯周病原性細菌の伝播に関する研究をおこなうため、昭和大学歯科病院小児歯科学講座関連施設を受診した対象者の中から出産後の母親とその子どもを対象とし、そのうち経年的にサンプル採取を行うことができた3組の対象者の解析を行った。解析の方法は、サンプルとして口腔内より採取した唾液を使用し、子どもおよび母親の口腔内における歯周病原性細菌の検出は、メタ16SrDNA解析を用いて行った。近年歯科実態調査によると若年者の歯周疾患罹患率は増加傾向にある。若年者の歯肉炎、歯周炎は重篤な症状を示すものは少ないが、将来の歯周疾患を予防するためには幼少期からの早期予防が必要であると考えられる。申請者は現在、妊娠期・出産後の母親とその子供を対象とし、歯周病原性細菌の口腔内への定着時期および初期定着における多糖分解酵素の関与の解明を行うことを最終目標としている。サンプルは唾液を用い、採取時期として新生児期、離乳食開始前期、乳切歯萌出期、一歳児期、乳臼歯萌出期、乳歯列完成期の6回とし同一対象者から経年的にサンプル採取を行うこととした。深襲性歯周炎の関連細菌であることが明らかになっているAggregatibacter actinomycetemcomitansは小児12名中10名より検出された。最少年齢は3か月の無歯顎の乳児で、母子ともに検出されたのは12組中10組であった。小児での菌検出は、無歯顎や下顎前歯部萌出時期など様々であり、口腔内の歯牙萌出状態や年齢での統一性がみられなかった。また母のみ検出されたのは12名中2名であった。Tannerella forsythiaは小児12名中1名検出され、その年齢は5か月であり、母子ともに検出されたのは12組中1組であった。Treponema denticolaは母子共に検出されなかった。Porphyromonas gingivalisは小児12名中3名検出され、最少年齢は4か月の無歯顎の乳児であり、母子ともに検出されたのは12組中3組であった。小児での菌検出は無歯顎や下顎前歯部萌出後継続的に検出される者など様々であり、口腔内の歯牙萌出状態や年齢での統一性がみられなかった。今回調べた結果より歯周病原性細菌の母子伝播の可能性は推測されたが、今後は対象者を増やし、小児では乳臼歯萌出以降も継続して菌の検出結果を解析する必要がある。近年若年性の歯周疾患罹患率は増加傾向であり将来の歯周疾患を予防するためには幼少期からの早期予防が必要であると考えられる。申請者は、妊娠期、出産後の母とその子どもを対象とし、それぞれの唾液を採取しPCR反応による歯周病原性細菌の検出を行った。侵襲性歯周炎の関連細菌であることが明らかになっているA. actinomycetemcomitansは、小児の唾液からは12名中10名で検出された。また、母子ともに検出されたのは12組中10組であった。また母親のみの検出は12名中2名であった。T.forsythiaは小児の唾液からは12名中1名検出され、母子ともに検出されたのは12組中1組であった。また、母親のみの検出は2名であった。T. denticolaは小児の唾液からは検出されず、母親のみの検出もなかった。P. gingivalisは小児の唾液からは12名中3名で検出され、母子ともに検出されたのは12組中3組であった。また母親のみの検出は5名であった。今回調べた母子においてはA. actinomycetemcomitansの検出率が高く母子間の伝播の可能性が示唆された。小児での菌検出は、無歯顎や下顎前歯部萌出後継続的に検出される者など様々で、口腔内の歯牙萌出状態や年齢などの統一性の必要があると思われた。新たに対象者を3組の母子に限定しメタ16sDNA解析を行った。解析結果より細菌の多様性は歯の萌出前は小さく、歯の萌出に伴い多様性が大きくなる傾向を認めた。歯の萌出前は3組の子どもすべてstreptococcus属優位であった。母親に多く検出される細菌が子どもの歯の萌出前にみられることは少ないことから子どもの細菌叢は、母親の細菌叢に類似しているとは言い難いようであった。この結果は、PCA解析でも同様の傾向が得られている。サンプルに唾液を使用しているため、プラーク中の細菌叢の検討も必要であると思われた。今後は長期の追跡と使用するサンプルを増やした解析を行う必要がある。小児歯科低年齢児の口腔内より唾液を採取するため必要量の唾液採取に困難を極めている。小児の体調などにより、設定した段階での唾液採取が困難であるため。

効率よく唾液を採取する方法を確立し、研究協力施設において経時的に唾液を採取し、リアルタイムPCR法を用いて歯周病原性細菌の細菌量を定量する。また、母子伝播時期および定着時期を解明する。