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結合原子価エネルギーによるイオン伝導性新構造ファミリーの探索

エネルギー環境分野の技術革新には優れた酸化物イオン伝導体を開発することが重要である.高い酸化物イオン伝導度は特定の構造ファミリー(結晶構造型)で発現するので,新しい構造ファミリーに属する構造を持つイオン伝導体の探索と発見が必要である.本課題ではイオン伝導体として過去に検討されてこなかった構造ファミリーの物質群について、結晶格子中をイオンが移動できる経路が存在するか否かを、結合原子価(Bond Valence)に基づいた酸化物イオンのエネルギー(BVE)図により検討している.2018年度はScなどを含む系を調べた.Scを本質的な元素として含む123組成について酸化物イオンが移動するためのエネルギー障壁を計算し,エネルギーが低い経路が格子を横切って連結するか否か、すなわちボトルネックが広いかどうかを調べ,BaGd2Si3O10型BaSc2Si3O10が比較的低い酸化物イオン移動のためのエネルギー障壁を持つことがわかった.そこでBaSc2Si3O10とBaSc1.9A0.1Si3O9.95 (A: Mg, Ca)を合成し, X線粉末回折実験により格子定数を精密化し,紫外可視スペクトルを測定,電気伝導度の温度および酸素分圧依存性を測定した.その結果,BaSc2Si3O10が酸化物イオン伝導体の新構造ファミリーであることがわかった.他にもいくつかの酸化物イオン伝導体の新構造ファミリーを発見した.結晶構造の詳細を研究することが高いイオン伝導度発現の原因究明にとって不可欠である.パイロクロア型酸化物イオン伝導体Yb2Ti2O7の酸化物イオン経路を中性子回折実験と最大エントロピー法により可視化した.これはパイロクロア型酸化物におけるイオン伝導経路を実験で可視化した世界で最初の例である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。エネルギー環境分野の技術革新には新しいイオン伝導体の探索と発見が必要である。イオン伝導体として過去に検討されてこなかった構造ファミリー(グループ)の物質群について、結晶格子中をイオンが移動できる経路が存在するか否かを、結合原子価の総和(BVS: Bond Valence Sum)図あるいはエネルギー図により検討した.ここで結合原子価とは,凝縮体中の各結合に割り当てられる原子価であり,酸化物イオンの結合原子価の総和が2に近ければ,酸化物イオンが安定であることを示す.我々は,この結合原子価法により酸化ランタン-酸化ストロンチウム-酸化ガリウム系における様々な化合物の差BVS図を計算し,イオン拡散経路を形成する化合物LaSr2Ga11O20を見出した.合成したLaSr2Ga11O20は単斜晶系で空間群がI2/mであるPb3GeAl10O20型構造を有することをX線粉末回折法により確認した.リートベルト解析の結果,LaSr2Ga11O20の結晶構造はGaO6八面体とGaO4四面体およびLaイオンとSrイオンから構成されていることがわかった.合成したLaSr2Ga11O20の電気伝導度は温度の増加と共に増加した.LaSr2Ga11O20の電気伝導度は酸素分圧に依らず一定であることから,酸化物イオンが支配的な伝導種であることが強く示唆される.このように,Pb3GeAl10O20型LaSr2Ga11O20が,酸化物イオン伝導性を示す新しい構造ファミリーであることが実験で示された.また,LaとSrの組成比を変えることで酸素空孔を導入し,イオン伝導度の増加を狙った.La1-xSr2+xGa11O20-x/2のSr濃度がx=0.01,0.02,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25となるように合成を行った.Sr濃度x=0.01,0.02の組成では,基本物質LaSr2Ga11O20と同じ回折パターンがみられ,単一の単斜相が生成したことを確認した。交付申請書に記した実施計画,「イオン伝導が報告されていない基本物質について結合原子価に基づいたエネルギー図を計算する.具体的には最初にGaを含む系であるLa2O3-Ga2O3-SrO系を選択して約20種類の化合物LaxSryGazOwの結合原子価の総和図を計算し、エネルギーが低い経路が格子を横切って連結するか否か、すなわちボトルネックが広いかどうかを調べる.経路が連結した物質群を実際に固相法により合成し、電気伝導度の温度依存性および酸素分圧依存性を調べる。合成した試料をX線回折(XRD)、ICP元素分析などで化学組成と結晶相を調べ、単相ができているかどうか確認する.XRDデータのリートベルト解析で結晶相と不純物を精査、格子定数と陽イオンの位置を決定する.生成相の評価にはX線回折を用いる.」を実際に実行しており,当初の計画通り順調にプロジェクトが進展している.その結果,イオン拡散経路を形成する化合物LaSr2Ga11O20を見出した.合成したLaSr2Ga11O20は単斜晶系で空間群がI2/mであるPb3GeAl10O20型構造を有することをX線粉末回折法により確認した.

リートベルト解析の結果,LaSr2Ga11O20の結晶構造はGaO6八面体とGaO4四面体およびLaイオンとSrイオンから構成されていることがわかった.合成したLaSr2Ga11O20の電気伝導度は温度の増加と共に増加した.LaSr2Ga11O20の電気伝導度は酸素分圧に依らず一定であることから,酸化物イオンが支配的な伝導種であることが強く示唆される.以上の様に,イオン伝導体の新構造ファミリーも発見され,新しい組成の探索も進めており,プロジェクトは順調に進展している.エネルギー環境分野の技術革新には新しいイオン伝導体の探索と発見が必要である.昨年度2015年度にPb3GeAl10O20型LaSr2Ga11O20が,酸化物イオン伝導性を示す新しい構造ファミリーであることを発見したので,15組成のPb3GeAl10O20型酸化物を合成し,結晶構造とイオン伝導を調べた.その結果いくつかの新物質も発見した.イオン伝導体の新構造ファミリーLaSr2Ga11O20について,様々な組成の合成を行い,電気伝導度と結晶構造を評価した.結晶相の評価と結晶構造解析にはX線回折法だけではなく中性子回折法を利用した.301 K1073 KにおいてLaSr2Ga11O20,La1.02Sr1.98Ga11O20.01,La0.99Sr2.01Ga11O19.995の結晶構造は単斜晶系I2/mのPb3GeAl10O20型であり,相転移がないことがわかった.La1.02Sr1.98Ga11O20.01とLa0.99Sr2.01Ga11O19.995の電気伝導度は酸素分圧に依存しないので,酸化物イオン伝導が強く示唆された.La1.02Sr1.98Ga11O20.01とLa0.99Sr2.01Ga11O19.995の酸化物イオン伝導度は,基本物質LaSr2Ga11O20より高いことがわかった.La1.02Sr1.98Ga11O20.01のイオン伝導には格子間酸素が寄与しており,一方,La0.99Sr2.01Ga11O19.995の酸化物イオン伝導には酸素空孔が関与していると考察した.この一連のイオン伝導体では酸化物イオンがGaO6八面体あるいはGaO6四面体の稜に沿って移動しうることが結合原子価法により示唆された.また,2015年度に引き続き,イオン伝導体として過去に検討されてこなかった構造ファミリー(グループ)の物質群について、結晶格子中をイオンが移動できる経路が存在するか否かを、結合原子価の総和図あるいはエネルギー図により検討した.その結果,Inと希土類元素を含むイオン伝導体の新構造ファミリーを発見した.交付申請書に記した計画,「イオン伝導が報告されていない基本物質について結合原子価に基づいたエネルギー図を計算する.具体的には最初にInや希土類を含む系を選択して結合原子価の総和図を計算し,エネルギーが低い経路が格子を横切って連結するか否か、すなわちボトルネックが広いかどうかを調べる.経路が連結した物質群を実際に固相法により合成し、電気伝導度の温度依存性および酸素分圧依存性を調べる.合成した試料をX線回折(XRD),ICP元素分析などで化学組成と結晶相を調べ,単相ができているかどうか確認する.できない場合には、焼成温度と時間と冷却速度を工夫するXRDデータのリートベルト解析で結晶相と不純物を精査、格子定数と陽イオンの位置を決定する.生成相の評価にはX線回折を用いる.イオン伝導性あるいは電気伝導性が確認されれば、化学組成を変えたサンプルを多数合成、電気伝導度を測定して高いイオン伝導度を示す新物質を探索する.イオン伝導度が高い組成の試料について室温から高温まで中性子回折および放射光X線回折実験により結晶構造とイオン伝導経路を実験で調べて、結晶構造とイオン伝導度の関係を明らかにする.昨年見出したイオン伝導性新構造ファミリーについて組成を調整し,新たなイオン伝導体を探索する.
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた高効率な植物ゲノム編集技術の開発

前年度では、リボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いて、イネとシロイヌナズナにおいて変異導入に成功した。しかし、今後のゲノム編集技術では、変異導入だけではなく、塩基置換や遺伝子のノックインが可能なGene Targetingの技術の開発も望まれた。そのため、本年度はCRISPR/Cas9を用いることで、植物におけるGene Targeting効率の向上を図るため、前年度に作成したSpCas9-gRNAベクターと、一般的なCRISPR/Cas9の発現系であるSpCas9/gRNAベクターを用いたGene Targeting系の構築を行った。この際、イネのアセト乳酸合成酵素遺伝子(ALS)に対してGene Targetingでアミノ酸置換を導入することで効率の評価を行った。CRISPR/Cas9によるDNA二重鎖切断をALS遺伝子の2点変異近傍に起こすSpCas9/gRNAとSpCas9-gRNAの両方の系では、CRISPR/Cas9の発現がないコントロールの系に対して、Gene Targeting効率が向上したが、動物(ヒト細胞やマウス等)の報告ほど著しい向上は見られなかった。また、SpCas9-gRNAの系では、SpCas9とgRNAを同時期に発現させることができるため、細胞周期の一部の時期のみしか起きない相同組換えを利用するGene Targetingにおいて、SpCas9/gRNAの系よりも優位であると期待していたが、両方の系においてALS遺伝子のGene Targeting効率の差はほとんどなかった。Gene Targeting効率のさらなる向上のため、イネカルスの選抜法の改良や、CRISPR/Cas9の発現ベクターの改良を加えたことで、ALS遺伝子でのGene Targeting効率は、約20倍程度向上させることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。植物におけるCRISPR/Cas9を用いた発現系では、Sterptococcus pyogenes由来のCas9(SpCas9)をRNA polymerase IIプロモーターを発現させ、gRNAをRNA polymerase IIIプロモーター(Pol III-pro)で発現させるのが一般的であるが、Pol III-proに関する植物の知見は少なく、組織特異的や誘導的にgRNAを発現させることは難しい。本研究では、Pol III-proを用いらずに、組織特異的や誘導的にSpCas9とgRNAを発現させる高精度な植物のゲノム編集を行うことを目的とした。本年度は、リボザイム配列を用いてSpCas9とgRNAを1つの発現カセットとして発現させるCRISPR/Cas9ベクター(SpCas9-rz-gRNA)の構築を行った。イネカルスを用いてgRNAのノーザンブロット解析や標的変異効率の解析により、リボザイムによる自己切断でSpCas9遺伝子のmRNAから切り出されたと考えられるgRNAのシグナルが検出され、さらに、作製したSpCas9-rz-gRNAベクターでは、高効率で標的変異が可能であることを明らかにした。また、標的配列の選択の幅を広げるために、SpCas9(認識配列:NGG)以外のRNA-guided nucleaseとして、SpCas9よりも小型のStaphylococcus aureusに由来するCas9(SaCas9,認識配列:NGGRRT)やFrancisella novicida由来のCpf1(FnCpf1,認識配列:TTN)を用いた標的変異を行った。イネにおいてSaCas9とFnCpf1をそれぞれ用いたところ、標的変異が可能であったため、リボザイムでgRNAと1つの発現カセットにしたSaCas9とFnCpf1のベクターを作成し評価を行った。本年度では、リボザイム配列を用いてSpCas9とgRNAを1つの発現カセットとして発現させるSpCas9-rz-gRNAベクターを構築した。リボザイム配列+gRNA配列の最適な導入位置を選定する際、マーカー遺伝子と並行してSpCas9遺伝子の5'末端と3'末端にそれぞれリボザイム配列+gRNA配列を導入したベクターを作製し評価したことで、迅速にSpCas9-rz-gRNAベクターを構築することができた。また、SpCas9遺伝子のmRNAがリボザイムで切断された場合、mRNAが不安定になり、自己切断されたmRNAが正常なSpCas9タンパク質へと翻訳されない可能性がある。そのため、複数のリボザイム配列から、ゲノム編集に適した自己切断効率を持つリボザイム配列を選定する予定であったが、本研究で最初に選定したリボザイム配列で、SpCas9遺伝子のmRNAから切り出されたと考えられるgRNAのシグナルが検出され、さらに作製したSpCas9-rz-gRNAベクターはイネにおいて高効率で標的変異が可能であった。そのため、リボザイム配列の検討を省略し、次年度の計画であるSpCas9-rz-gRNAベクターを用いた組織特異的なプロモーターや誘導的プロモーターを用いたゲノム編集の研究の準備を行い、評価を進めることができた。したがって、おおむね順調に進展していると判断した。植物におけるCRISPR/Cas9を用いた発現系において、SpCas9/gRNA発現ベクターをDNAとして植物に導入する際、RNAの5 ́末端と3 ́末端に修飾がされないRNA polymerase III (pol III)制御下にあるプロモーターでgRNAを発現させる方法が一般的となっている。しかし、pol IIIプロモーターの知見は乏しい。そのため、RNA polymerase II (pol II)制御下にあるプロモーターで発現させたRNAから、RNA-cleaving enzymes等(e.g. Csy4, tRNA, ribozyme)を用いることで、キャップ構造やポリ(A)鎖等の修飾を除いて、機能的なgRNAを生成する系が植物でも報告されている。

本年度の研究では、SpCas9タンパク質の存在下において、内在性のRNases等によるRNAプロセシングによって、RNA-cleaving enzymes等の認識配列を必要としなくても、機能的なgRNAが生成され、ゲノム編集ができることを明らかにした。本研究で作成したリボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いたゲノム編集は、イネとシロイヌナズナにおいて成功した。そのため、植物において普遍的にgRNAを生成できる可能性が示唆された。また、SpCas9-gRNAベクターを用いて、組織特異的や誘導的プロモーターによる高度なゲノム編集系のブラッシュアップも同時に行った。誘導系において、蛍光タンパク質であるGFP遺伝子をつないだGFP-SpCas9-gRNAベクターを作成した。この発現ベクターではGFPの蛍光をモニタリングすることで、ゲノム編集が起きた系統を容易に選択することができた。本年度では前年度に作成したSpCas9-rz-gRNAベクターにおいて、リボザイムが機能的に働いてgRNAを生成していることを示すために、コントロールベクターとして作成したSpCas9-gRNAベクターを作成した。このSpCas9-gRNAベクターをイネカルスに形質転換し、CRISPR/Cas9による標的変異の有無を確認したところ、SpCas9-rz-gRNAと同程度の高効率な標的変異効率を示していた。また、gRNAのノーザンブロット解析において、SpCas9-gRNAベクターを形質転換したカルスから、機能的と考えられるgRNAのシグナルが確認された。このgRNAのシグナルはSpCas9が発現している場合で、強いシグナルを示し、SpCas9タンパク質の存在によってgRNAが生成されていることをイネカルスで確認した。このことから、リボザイムが無くても、機能的なgRNAが生成される過程には、SpCas9タンパク質の存在が必須であると考え、in-vitroのCRISPR/Cas9 cleavage assayを試みた。その結果、gRNA配列を含むがribozyme配列がない約1kbのRNAとSpCas9タンパク質を用いた場合は、DNAの切断は行われなかった。しかしながら、RNAをランダムで切断するRNase IIIやRNase T1をさらに加えて、in-vitro cleavage assayを行うと、DNAの切断が行われるようになった。植物細胞内では、gRNAとしての活性がないgRNA配列を含むRNAは、内在性のRNases等によるRNAの分解とSpCas9によるgRNAの分解の保護が協調的に働きによって、機能的なgRNAが生成させるメカニズムを発見し、論文を発表した。
定容容器内燃料濃度勾配下を伝播する火炎に及ぼす乱流場の影響

燃料を筒内に直接噴射する火花点火機関は,低負荷において現在の20-30%程度の熱効率向上が可能となり,二酸化炭素排出低減に効果がある.しかし,実際の機関においては現象が非常に複雑であるので,もっと単純な場を実現させ,乱流場において濃度勾配のある混合気中を火炎が伝播する様子を系統的に捉えることが必要であると考えた.そこで,本研究では,円筒形の定容容器内に旋回流を生成させ,燃焼室中心部に燃料(プロパン)を供給し,中心で火花点火させることにより,軸対称的な火炎を形成させた.旋回流すなわち,乱れの強さおよび燃料濃度勾配を種々に変化させて実験を行った.乱れ強さはレーザドップラ流速計で,燃料濃度はレーザ誘起蛍光法で測定し,火炎伝播は高速度ビデオで直接撮影した.また,燃焼後の未燃焼炭化水素濃度を波長3.39μmのレーザを用いて吸収法で測定した.また,(4)初期燃焼に関しては,以下のようなことがわかった.すなわち,均一混合気の場合には着火不可能な平均当量比でも着火し,また,中心部付近が濃い場合,あるいは薄い場合でも,均一混合気燃焼の場合よりは燃焼期間が短い.これらは,乱れにより濃度に不均一性が見られるために平均当量比だけでは議論できず,当量比の分布を持つために理論混合比に近い側の当量比の混合気が存在する確率が高いからであると考えられる.燃料を筒内に直接噴射する火花点火機関は,低負荷において現在の20-30%程度の熱効率向上が可能となり,二酸化炭素排出低減に効果がある.しかし,実際の機関においては現象が非常に複雑であるので,もっと単純な場を実現させ,乱流場において濃度勾配のある混合気中を火炎が伝播する様子を系統的に捉えることが必要であると考えた.そこで,本研究では,円筒形の定容容器内に旋回流を生成させ,燃焼室中心部に燃料(プロパン)を供給し,中心で火花点火させることにより,軸対称的な火炎を形成させた.旋回流すなわち,乱れの強さおよび燃料濃度勾配を種々に変化させて実験を行った.乱れ強さはレーザドップラ流速計で,燃料濃度はレーザ誘起蛍光法で測定し,火炎伝播は高速度ビデオで直接撮影した.また,燃焼後の未燃焼炭化水素濃度を波長3.39μmのレーザを用いて吸収法で測定した.また,(4)初期燃焼に関しては,以下のようなことがわかった.すなわち,均一混合気の場合には着火不可能な平均当量比でも着火し,また,中心部付近が濃い場合,あるいは薄い場合でも,均一混合気燃焼の場合よりは燃焼期間が短い.これらは,乱れにより濃度に不均一性が見られるために平均当量比だけでは議論できず,当量比の分布を持つために理論混合比に近い側の当量比の混合気が存在する確率が高いからであると考えられる.燃料を筒内に直接噴射する火花点火機関は,低負荷において飛躍的な熱効率向上が可能となり,二酸化炭素排出低減に効果がある.しかし,実際の機関においては現象が非常に複雑であるので,もっと単純な場を実現させ,乱流場において濃度勾配のある混合気中を火炎が伝播する様子を系統的に捉えることが必要であると考えた.そこで,本研究では,円筒形の定容容器内に旋回流を生成させ,燃焼室中心部に燃料(プロパン)を供給し,中心で火花点火させることにより,軸対称的な火炎を形成させた.旋回流すなわち,乱れの強さおよび燃料濃度勾配を種々に変化させて実験を行った.乱れ強さはレーザドップラ流速計で,燃料濃度はレーザ誘起蛍光法で測定し,火炎伝播は高速度ビデオで直接撮影した.また,燃焼後の未燃焼炭化水素濃度を赤外吸収法で測定した.その結果,以下のようなことが明らかになった.全体としての燃焼に関しては,(1)平均的な濃度分布が同じで乱れ強さの異なるような条件を見いだし,乱れ強さの影響のみを定量的に把握することができた.(2)全体としての当量比が約0.7以上では燃焼効率は約97%以上であるが,それ以下の当量比の場合,混合気濃度分布と乱れ強さの相対関係により,燃焼効率が30%程度になる場合もあった.(3)中心部に濃い燃料濃度分布が見られる場合,一部に輝炎が観察された.また,燃焼質量割合が1%となる初期燃焼に関しては(1)中心部付近が濃い場合,あるいは薄い場合でも,均一混合気燃焼の場合よりは燃焼期間が短い.また,均一混合気の場合には着火不可能な混合気でも着火する.これらは,乱れにより濃度に不均一性が見られ,そのために平均当量比だけでは議論できず,その前後に当量比の分布を持ち,理論混合比に近い側の当量比の混合気が存在する確率が高いからであると考えられる.燃料を筒内に直接噴射する火花点火機関は,低負荷において現在の20-30%程度の熱効率向上が可能となり,二酸化炭素排出低減に効果がある.しかし,実際の機関においては現象が非常に複雑であるので,もっと単純な場を実現させ,乱流場において濃度勾配のある混合気中を火炎が伝播する様子を系統的に捉えることが必要であると考えた.そこで,本研究では,円筒形の定容容器内に旋回流を生成させ,燃焼室中心部に燃料(プロパン)を供給し,中心で火花点火させることにより,軸対称的な火炎を形成させた.旋回流すなわち,乱れの強さおよび燃料濃度勾配を種々に変化させて実験を行った.

乱れ強さはレーザドップラ流速計で,燃料濃度はレーザ誘起蛍光法で測定し,火炎伝播は高速度ビデオで直接撮影した.また,燃焼後の未燃焼炭化水素濃度を波長3.39μmのレーザを用いて吸収法で測定した.また,(4)初期燃焼に関しては,以下のようなことがわかった.すなわち,均一混合気の場合には着火不可能な平均当量比でも着火し,また,中心部付近が濃い場合,あるいは薄い場合でも,均一混合気燃焼の場合よりは燃焼期間が短い.これらは,乱れにより濃度に不均一性が見られるために平均当量比だけでは議論できず,当量比の分布を持つために理論混合比に近い側の当量比の混合気が存在する確率が高いからであると考えられる.
原子・イオンダイナミクスの超高分解能直接観察に基づく新材料創成

本年度の主たる研究成果は下記の通りである。1.電子線高速走査ユニットの設計:走査透過型電子顕微鏡(STEM)の時間分解能を向上させるため、電子線走査ユニットの設計を行った。この際、512x512ピクセルの画像を30フレーム/秒以上で取得することを要求条件として走査速度とフライバックタイムを試算したところ、走査速度は100nm/pix以下、フライバックタイムは10us/pix前後にする必要があることがわかった。この試算を参考に試作機を作製し性能評価を行った結果、32フレーム/秒の時間分解能を達成した。2.精密試料作製法の検討:本年度に導入した集束イオンビーム式試料加工装置を用い、各種その場観察用環境制御デバイス上に試料片を固定および薄膜化する方法を模索した。荷重負荷デバイスを用いた実験においては、試料は十分に薄膜化されており、原子分解能を達成可能であることが分った。3.粒界・界面の原子構造解析:酸化物を中心とした材料系において粒界・界面の原子構造の解析を行った。特にイットリウム安定化ジルコニア(YSZ)の粒界構造および粒界組成の解析において顕著な成果が得られた。エネルギー分散型X線分析(EDS)STEM法によりΣ5(210)、Σ5(310)、Σ9、Σ13粒界の局所組成を解析したところ、Σ5(210)粒界においてはバルク部分と比較し組成の違いがほぼ見られないのに対し、それ以外の粒界においてはZr4+が減少し、Y3+およびO2+が濃化していることが明らかとなった。Y3+イオンはZr2+サイトを置換し正味-1価のイオンとして存在していると考えられるため、粒界には負のイオンが濃化していると解される。このことより、Σ5(210)粒界は電気的に中性、その他の粒界は正に帯電していると考えられる。本結果は粒界帯電現象の粒界方位依存性を実証したものであり、学術的に極めて重要な成果である。1.電子線高速走査ユニットの設計、2.集束イオンビーム式試料加工装置を用いた精密試料作製法の検討のいずれの項目においても当初の計画通りに進行しており、次年度に計画しているSTEM内での各種実証実験を予定通り実施できる見込みである。3.粒界・界面の原子構造解析においては、国際学術論文発表を中心としてYSZ、Al2O3、ZnO、SrTiO3などの粒界・界面構造に関する新しい知見を報告することができ、一定の成果が認められる。次年度は主に下記の項目を重点的に進める予定である。1.電子線高速走査ユニットの実証実験:初年度に設計した電子線高速走査ユニットの実機を作製し既存のSTEMに組込む。種々の走査速度、フライバックタイムの条件下において時間分解能、取得像の精度、安定性等の点から性能評価を行う。2.環境制御デバイスの駆動試験:初年度に引続き集束イオンビーム式試料加工装置を用いた試料作製法の検討を進める。環境制御デバイスとして、加熱、荷重負荷および電場印加デバイスを選択する。適宜STEM内において試料状態の確認およびデバイスの動作試験を行う。3.粒界・界面の構造解析、局所物性測定:酸化物を中心とした材料系において各種粒界・界面の原子構造解析を引続き行う。さらに局所物性を評価し、原子構造と機能特性との相関性を明らかにした上でダイナミクスが発現する局所構造を探索し、原子・イオンダイナミックスの観察対象を絞り込む。

1.電子線高速走査ユニットの設計、2.集束イオンビーム式試料加工装置を用いた精密試料作製法の検討のいずれの項目においても当初の計画通りに進行しており、次年度に計画しているSTEM内での各種実証実験を予定通り実施できる見込みである。3.粒界・界面の原子構造解析においては、国際学術論文発表を中心としてYSZ、Al2O3、ZnO、SrTiO3などの粒界・界面構造に関する新しい知見を報告することができ、一定の成果が認められる。次年度は主に下記の項目を重点的に進める予定である。1.電子線高速走査ユニットの実証実験:初年度に設計した電子線高速走査ユニットの実機を作製し既存のSTEMに組込む。種々の走査速度、フライバックタイムの条件下において時間分解能、取得像の精度、安定性等の点から性能評価を行う。2.環境制御デバイスの駆動試験:初年度に引続き集束イオンビーム式試料加工装置を用いた試料作製法の検討を進める。環境制御デバイスとして、加熱、荷重負荷および電場印加デバイスを選択する。適宜STEM内において試料状態の確認およびデバイスの動作試験を行う。3.粒界・界面の構造解析、局所物性測定:酸化物を中心とした材料系において各種粒界・界面の原子構造解析を引続き行う。さらに局所物性を評価し、原子構造と機能特性との相関性を明らかにした上でダイナミクスが発現する局所構造を探索し、原子・イオンダイナミックスの観察対象を絞り込む。
エレクトロクロミック層状セラミック材料の合成と表示素子への応用

〔研究目的〕層状結晶β-ZrNClを電極として還元・酸化を行うと,リチウムが層間にインターカレーション・デインターカレーションし,電極は,淡い黄緑色から黒色に可逆的に変化する.このエレクトロクロミック現象を表示素子に応用することを目的として,以下の研究を行った.〔研究成果の概要〕1.β-ZrNCl合成法の確立と生成機構の解明:ZrH_2あるいはZr金属を塩化アンモニウム蒸気を直接反応させ,高純度なβ-ZrNClを高収率で得る方法を開発した. (NH_4)_2ZrCl_6が中間生成物として生成し,これがβ-ZrNClに熱分解する機構を明らかにした.2.プラズマCVD法によるβ-ZrNCl薄膜の作製:ZrCl_4とNH_3-N_2^-の混合ガス相のプラズマCVDによりβ-ZrNCl薄膜を作製した.3.常圧および低圧CVD法によるβ-ZrNCl薄膜の作製:(NH_4)_2ZrCl_6蒸気の熱分解を利用するCVD法により均質なβ-ZrNCl薄膜を作製した.作製条件について,結晶層が基下に平行に成長した(001)配向膜と,垂直に成長した. (100)配向膜が得られた.薄膜の光透過性は良好でバンド吸収端は3.2eVに存在する.4.エレクトロクロミック表示素子の試作と性能評価:金蒸着基板上にCVD法によって均質なβ-ZrNCl薄膜を析出させ,これを電極とする表示素子を試作した.電解液には1MLiClO_4/炭酸プロピレンを用いた. (100)配向膜がサイクル特性に優ぐれることがわかった.5.β-ZrNCl/リチウム電池の充放電特性:β-ZrNCl電極のサイクル特性を向上させるため,リチウム電池を組み充電特性を詳しく調べた.深い放電を繰り返すと,電極の結晶性が低下し,電解液の分解が起こることがわかった.〔研究目的〕層状結晶β-ZrNClを電極として還元・酸化を行うと,リチウムが層間にインターカレーション・デインターカレーションし,電極は,淡い黄緑色から黒色に可逆的に変化する.このエレクトロクロミック現象を表示素子に応用することを目的として,以下の研究を行った.〔研究成果の概要〕1.β-ZrNCl合成法の確立と生成機構の解明:ZrH_2あるいはZr金属を塩化アンモニウム蒸気を直接反応させ,高純度なβ-ZrNClを高収率で得る方法を開発した. (NH_4)_2ZrCl_6が中間生成物として生成し,これがβ-ZrNClに熱分解する機構を明らかにした.2.プラズマCVD法によるβ-ZrNCl薄膜の作製:ZrCl_4とNH_3-N_2^-の混合ガス相のプラズマCVDによりβ-ZrNCl薄膜を作製した.3.常圧および低圧CVD法によるβ-ZrNCl薄膜の作製:(NH_4)_2ZrCl_6蒸気の熱分解を利用するCVD法により均質なβ-ZrNCl薄膜を作製した.作製条件について,結晶層が基下に平行に成長した(001)配向膜と,垂直に成長した. (100)配向膜が得られた.薄膜の光透過性は良好でバンド吸収端は3.2eVに存在する.4.エレクトロクロミック表示素子の試作と性能評価:金蒸着基板上にCVD法によって均質なβ-ZrNCl薄膜を析出させ,これを電極とする表示素子を試作した.電解液には1MLiClO_4/炭酸プロピレンを用いた. (100)配向膜がサイクル特性に優ぐれることがわかった.5.β-ZrNCl/リチウム電池の充放電特性:β-ZrNCl電極のサイクル特性を向上させるため,リチウム電池を組み充電特性を詳しく調べた.深い放電を繰り返すと,電極の結晶性が低下し,電解液の分解が起こることがわかった.層状結晶β-ZrNclを電極として還元・酸化を行うと、リチウムが層間にインターカレーション・デインターカレーションし、電極は淡い黄緑色から黒色に変化する。このエレクトロクロミック現象を表示素子に応用することを目的として研究を行っており、本年度は以下の知見を得た。【(NH_4)_2】Zr【Cl_6】蒸気相の熱力学特性についても調べた。2.β-ZrNClへの水素吸蔵:β-ZrNClを【NH_4】Clおよび水素と高温で処理すると、水素が吸蔵されることを見い出した。3.スパッタ蒸着法による薄膜の作製:β-ZrNCl粉末をターゲットとしてrfマグネトロンスパッタ蒸着装置を用いて、低温での薄膜作製を試みた。雰囲気ガスとして、Ar,Ar-【Cl_2】,Ar-【NH_3】などを用いたが、一段でβ-ZrNCl薄膜を得るに至っていない。引き続き作製を試みる。4.CVD法による薄膜の作製:【(NH_4)_2】Zr【Cl_6】蒸気の熱分解を利用するβ-ZrNCl薄膜作製を行った。

アンモニアをキャリャガスとして用い、基板温度500600°Cで低圧CVDを行うと、均質なβ-ZrNCl膜が得られることがわかった。自記分光光度計による光学特性の測定を行い、薄膜の可視光領域での光透過性は良好で、2.9eV付近にバンド吸収端があることを明らかにした。ECD素子を試作するため、引き続き透明導電性被膜ガラス基板上への薄膜作製を試みる。
運動時の呼吸困難度と持久性運動能力の関係

呼吸器疾患のない健常人では、運動時の呼吸困難感の大きさ(BS)は主に換気量(V_E)に依存して増大する。しかし、V_Eが同じであってもBSには個人差があり、これには抹消化学受容器の感受性(HVR)が関与していることを最近我々は見出した(J.Physiol.499:843-848、1997)。一方、持久性運動能力(Vo_2max)の高い人は相対的にHVRは低く、また運動時のBSも低い傾向にあることが報告されているので、今回、運動時のBSに対するVo_2maxとHVRの影響を検討する目的で2つの実験を行ない、以下のような結果を得た。1.縦断的実験・・・非運動鍛錬者(N=11)に毎回20分、毎週3回の割合で4週間、持久性運動トレーニングを行ってもらい、これに伴う自転人口ルゴメータ漸増負荷運動時のV_E-BS関係の変化とこの変化に及ぼすVo_2maxとHVRの影響を調べた。トレーニングによりVo_2maxは平均14%増加し、HVRは低下傾向を示し、V_E-BS関係は右方移動(あるV_E下でのBSは低下する方向に移動)した。重回帰分析により、V_E-BS関係の右方移動の28%はVo_2maxの増加に、16%はHVRの低下に、残り56%は未知の要因によるものであると推定された。2.横断的実験・・・Vo_2maxが一般的に高い持久性運動鍛練者(N=9)と逆に低い瞬発製運動鍛練者(N=14)の間で漸増負荷運動時のV_E-BS関係はどう違うか、その違いはVo_2maxやHVRとどのように関連しているかを調べた。持久性鍛練者群のVo_2max(ml/分/kg)は55、瞬発性群では40と両群間に有意差が見られたが、HVRや運動時のV_E-BS関係には差異は見られなかった。縦断的実験における非運動鍛練者群の4週間トレーニング後のVo_2maxは39であったが、V_E-BS関係は上記運動鍛練者群と類似していた。以上の結果から、運動時の呼吸困難感は運動トレーニングにより軽減されるが、この変化に対するVo_2max増加やHVR低下の関与は小さく、大半は未知の要因、多分、運動時の呼吸困難感の経験と慣れが関係していると推測された。呼吸器疾患のない健常人では、運動時の呼吸困難感は主に換気量(V_E)に依存して増大する。しかし、換気量が同じであっても呼吸困難感の程度(BS)には個人差が見られる。最近、我々はこの個人差の一因として末梢化学受容器の感受性(HVR)が関与していることを見出した(この値が低い人ほど運動時のBSは低い。J.Physiol.499:843-848、1997)。

一方、持久性運動能力(Vo_2max)の高い人は相対的にHVRは低く、また運動時のBSも低い傾向にあることがそれぞれ別々に報告されているので、今回、運動時のBSに対するVo_2maxとHVRの相互的影響を検討する目的で2種類の実験を計画した。(1)持久性運動トレーニングによるVo_2max向上はHVRと運動時のBSにどの様な影響を及ぼすか--縦断的実験、(2)Vo_2maxは運動トレーニングによっても変化するが、そのbasal levelは本来固体固有のものである。この値が一般に高い長距離競技者群と逆に低値を示す短距離競技者群について、Vo_2max、HVR、BS、三者の関係を調べる--横断的実験。本年度は(1)の縦断的実験を行った。【方法】非運動鍛錬者11名(男子5名、女子6名)に4週間、運動トレーニング(屋外で20分間ランニング、週3回)を行って貰い、トレーニング終了後、実験室にて、安静時のHVRと自転車エルゴ-メータでの漸増負荷運動時のBS、V_E、Vo_2maxを測定した。【結果】(1)トレーニングにより、Vo_2maxは平均15%増加、HVRは27%低下した。(2)漸増負荷運動中、V_Eがある値(V_E閾値)以上では、Bsは直線的に増加した(その傾斜:△BS/△V_E)。トレーニングによりV_E閾値は107%増大、△BS/△V_Eは9%低下、その結果、同一V_E下でのBSは低下した。(3)運動時のBSは多重直線回帰モデル(BS=a[V_E]+b[Vo_2max]+c[HVR]+Const)で表されると仮定し、回帰分析を行った。その結果から、トレーニングによるBS低下は主にVo_2max増加に起因することが判明した。呼吸器疾患のない健常人では、運動時の呼吸困難感の大きさ(BS)は主に換気量(V^^・_E)に依存して増大する。しかし、V^^・_Eが同じであってもBSには個人差があり、これには末梢化学受容器の感受性(HVR)が関与していることを最近我々は見出した(J.Physiol.499:843-848、1997)。一方、持久性運動能力(V^^・o_2max)の高い人は相対的にHVRは低く、また運動時のBSも低い傾向にあることが報告されているので、今回、運動時のBSに対するV^^・o_2maxとHVRの影響を検討する目的で2つの実験を行ない、以下のような結果を得た。1.縦断的実験・・・非運動鍛練者(N=11)に毎回20分、毎週3回の割合で4週間、持久性運動トレーニングを行なってもらい、これに伴う自転車エルゴメータ漸増負荷運動時のV^^・_E-BS関係の変化とこの変化に及ぼすV^^・o_2maxとHVRの影響を調べた。トレーニングによりV^^・o_2maxは平均14%増加し、HVRは低下傾向を示し、V^^・_E-BS関係は右方移動(あるV^^・_E下でのBSは低下する方向に移動)した。重回帰分析により、V^^・_E-BS関係の右方移動の28%はV^^・o_2maxの増加に、16%はHVRの低下に、残り56%は未知の要因によるものであると推定された。2.横断的実験・・・V^^・o_2maxが一般的に高い持久性運動鍛練者(N=9)と逆に低い瞬発性運動鍛練者(N=14)の間で漸増負荷運動時のV^^・_E-BS関係はどう違うか、その違いはV^^・o_2maxやHVRとどのように関連しているかを調べた。持久性鍛練者群のV^^・o_2max(ml/分/kg)は55、瞬発性群では40と両群間に有意差が見られたが、HVRや運動時のV^^・_E-BS関係には差異は見られなかった。縦断的実験における非運動鍛練者群の4週間トレーニング後のV^^・o_2maxは39であったが、V^^・_E-BS関係は上記運動鍛練者群と類似していた。以上の結果から、運動時の呼吸困難感は運動トレーニングにより軽減されるが、この変化に対するV^^・o_
エピソード記憶形成に関する海馬の数理モデルと実験的検証

海馬CA1錐体細胞の2-コンパートメントモデルのダイナミクスとカントールコーディングに対するさまざまな外乱の影響を調べた。まず、この領域で知られている脳波に由来するγリズムやθリズムとこのコーディング方式との関係をみるために、CA3ネットワークモデルについての検討を行った。CA3ネットワークモデルを構築し、学習によってネットワークに埋め込まれた記憶間の動的な遷移過程におけるγ波とθ波の与える影響を調べた。ニューロンモデルとしては抽象的なニューロンモデルを使用してその特徴を抜き出したが、海馬でのθリズムとカントールコーディングとの関係を明らかにするためには生理学的なモデルを使用することの検討を加えているところである。結果を次に記す。入力はθ波とγ波をともに与えるがその位相をひとつのパラメーターとする。1.抑制性ニューロンをθリズムに同期させて発火させたとき、θ入力と抑制間の時間差が30msec前後と200msec前後で入力間時間差がそれほど小さくないときにはθリズムに同期した記憶が想起されやすいがそれ以外の条件ではむしろγリズムに同期した記憶が想起されやすくなる。2.抑制性ニューロンをγリズムに同期させて発火させた時、ほぼ入力時間差によらず、θ記憶かγ記憶かどちらが想起されるかがγ入力と抑制間の時間差に対して周期的に変化する。3.抑制性ニューロンをθリズムと同期させたほうがγリズムで同期させた時よりも想起確率は高くなる。これらはまだ準備的な計算結果であるが、記憶想起にθリズムやγリズムの位相差が関係していることを示唆しており、抑制性ニューロンをθリズムで入力した場合のほうが想起確率が上がることは海馬において普遍的に観測されているθ波の役割を考える上でも重要な結果である。さらに、前年度から始めている仮想的なベクトル測定を実データに当てはめて、カントール集合状の膜電位のクラスタリングの分離度を上げるテクニックを開発した。エピソード記憶の形成過程に関する計算論的モデルの構築、および実証実験の確立をめざした。海馬CA1における時系列情報のコーディングとデコーディングに関する数理モデルを構築した。またそれを玉川大学塚田グループと協力して実験的に検証した。当初計画では、NMDAチャネルなどの効果による学習機能によって、これらの情報の動態の変化を明らかにすることも計画に入れていたが、本年度中にはこの計画は実行できなかった。学習実験は来年度に持ち越しとなった。現在の実験ではシャーファー側枝の束の十分に離れた2ヶ所を刺激し単一電極を用いてパッチクランプ法にようてCA1ニューロンの膜電位を測定しているので、測定は一次元である。このような測定をスカラー測定と呼ぶ。これは我々が構築した2-コンパートメントモデルによる数理モデルの表現とは異なっている。数理モデルではCA1ネットワークの状態を各時点での状態としているので観測量は多次元であるようなベクトル測定を仮定している。このギャップを埋めるには実験においてベクトル測定を行うのが最良の方法であることは言うまでもないが、我々のグループの現在の技術では難しい。そこで、現在のスカラー測定から仮想的にベクトル測定を構成し、表現の再構成を行うことでこのギャップを埋めた。ニューロエルゴード性を仮定し、スカラー測定の実験結果である一次元時系列から複数の断片を抜き出すことでそれらを多点でのベクトル測定と同一視した。その結果、スカラー測定のデータよりはより明確なカントルコーディングとカントル集合を生み出す縮小アフィン写像が得られた。結果を次に記す。
口腔疾患に伴う構音障害および代償性の解明に関する研究-MR撮像法と音響分析による治療前後の声道形態および音声の変化の検討-

本年度は以下の項目について比較検討を行った.1.MR撮像に対して同意の得られた舌・口底切除症例4例において,安静時および発音時のMR画像および音響分析を比較検討した.その結果,舌半側切除後前腕皮弁で再建した症例において,声道形態,特に舌後方の形態の違いにより軟口蓋音および母音/a/の発話明瞭度に大きな差が現れる事が示唆された.2.上顎劣成長を伴った骨格性下顎前突症に対し,上顎骨骨延長術と下顎枝矢状分割術を施行し,治療前後の構音機能,鼻咽腔閉鎖機能を比較検討を行った結果,構音機能,摩擦音のサウンドスペクトル上での正常化,鼻咽腔閉鎖機能の適応性変化が認められた.3.口蓋に口蓋隆起を認め,発音困難を自覚症状とした症例に対し,口蓋隆起切除術を施行し,治療前後のパラトグラム,舌造影側方部X線規格写真,サウンドスペクトログラムを比較した結果,自覚的にも他覚的にも構音障害が改善することがしめされた.4.口蓋裂患者の開鼻声があると診断された患児32名と健常児32名の母音/i/の持続音で、ディジタルバンドパスフィルターを用いて1/3オクターブ分析した。結果,口蓋裂児の母音/i/の開鼻声のスペクトルの特徴はF1の帯域のレベルの上昇と、F1・F2間の帯域のレベルの上昇およびF2・F3間のレベルの下降であることが明らかとなった。特にF1・F2間の帯域のレベルの上昇は個人差の影響を受けにくい開鼻声の特徴と考えられ、この音響的特徴を用いて開鼻声を定量的に評価できることが示唆された。以上の結果,これらの測定方法が治療前後の定量的な評価として有用であることが示唆された.今後,症例を増やし,口腔形態と構音障害の関連性について検討を重ねる予定である.本年度は,MR撮像にたいして同意の得られた舌・口底切除症例4例(舌可動部半側切除症例3例,舌半側切除症例1例)において,軟口蓋音においてなぜ発話明瞭度に大きな個人差が認められるのかを,安静時および発音時のMRI画像を比較検討することにより考察した。その結果,1.発音時,後鼻棘において声道断面積が広い症例では軟口蓋音に強い障害が認められた。2.安静時と/i/発音時,後鼻棘付近で声道断面積が狭く変化が少ない症例では,母音/a/に障害が認められた。3.母音/i/発音時に舌位が前方に偏位している症例では,/ki/発音時に/tji/,/sji/と構音位置が前方に移動した音に置換されていた。以上の結果より,術後の構音障害の程度は同様の切除範囲であっても、再建後の形態により軟口蓋音に大きな差が現れる事が示唆された。これらの成果は第21回日本口腔腫瘍学会総会にて発表した。今後,同時に音響分析ソフトにより同被験者の発音時の解析を行い,口腔形態と障害の程度の関連性について検討を重ねる予定である。以上の結果,これらの測定方法が治療前後の定量的な評価として有用であることが示唆された.今後,症例を増やし,口腔形態と構音障害の関連性について検討を重ねる予定である.
過敏性腸症候群の脳腸相関の病態基盤を形成する腸内細菌叢の同定

ストレス関連疾患の1つである過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome: IBS)の病態生理は完全には解明されていないが、心理社会的要因、消化管運動機能異常、内臓知覚異常を中心とした脳腸相関の病態がこれまで想定されている。近年、これらの病態に腸内細菌が何らかの役割を果たしていることが明らかになりつつある。しかし、その「脳-腸-腸内細菌軸」におけるIBS病態に特定の腸内細菌種あるいは代謝物がどのように関連しているかについてはよく明らかにされてはいない。一方、人種や生活環境によって腸内細菌叢の構成が異なっていることが知られている。本研究では、我が国のIBS患者の腸内細菌叢とその機能は健常者とは異なるという仮説を検証した。IBS群では健常群と比較して有意にIBS-SI全体スコアの高値を示した(p<0.01)。IBS群では健常者に比較して、1%以上のOTU構成率を有する属レベルにおいてFaecalibacteriumとCoprococcusが有意に増加し、Dialisterが有意に低下していた。さらに代謝パスウェイ解析を実行した結果、IBS群は健常群に比較して、アミノ酸代謝の有意な低下が認められた。以上の所見より、我が国のIBS症例においても腸内細菌叢の変化が存在し、腸管内のアミノ酸代謝の変化がIBSの病態生理に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。本年度は、予定通りのIBS症例ならびに健常症例の募集を実施し、集積したデータの解析を滞りなく実行できた。メタゲノム解析の結果、IBSにおける腸内細菌叢とその機能の特徴を明らかにできた。平成31年度は、計画通りに引き続き被験者の募集を実施し、腸内細菌のIBS症状、心理社会的因子、消化管機能それぞれに果たす役割を評価して、ストレス関連疾患のIBS病態メカニズムを詳細に解明する方針である。ストレス関連疾患の1つである過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome: IBS)の病態は完全には解明されておらず、心理社会的要因、消化管運動機能異常、内臓知覚異常を中心とした「脳腸相関の病態」が想定されている。近年、この脳腸軸に対して腸内細菌叢が相互に影響し合う「脳-腸-腸内細菌軸の病態」が注目されるようになった。しかし、IBSの主要な病態生理に対して特定の腸内細菌がどのような役割を果たしているかについては十分明らかにされていない。本研究では、まずIBSの腸内細菌叢は健常者の腸内細菌叢と異なるという仮説を検証した。Rome III診断基準を満たすIBS症例12例(平均年齢22歳)と消化器症状を認めない健常症例17例(平均22歳)を対象とした。各症例から糞便検体を採取し、次世代シークエンサーを用いた16S rRNAメタゲノム解析によってoperational taxonomic unit (OTU)を同定し、各群の腸内細菌叢を比較した。その結果、IBS群と健常群において菌種多様性、類似性は統計学的に有意差を認めなかった。一方、IBS群は健常群に比較してLactobacillales目(p=0.046)、Streptococcus科(p=0.027)、Streptococcus属(p=0.030)の構成比がそれぞれ有意に低下していた。以上の結果は、過敏性腸症候群患者では腸内細菌叢の異常(Gut microbiome dysbiosis)が存在しうることを示唆しており、過敏性腸症候群に想定されている脳-腸-腸内細菌軸の病態の一端を支持する所見であると考えられる。本年度は、予定通りのIBS症例ならびに健常症例の募集ができた。その結果、両群における腸内細菌叢の比較解析を実行することができた。ストレス関連疾患の1つである過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome: IBS)の病態生理は完全には解明されていないが、心理社会的要因、消化管運動機能異常、内臓知覚異常を中心とした「脳腸相関の病態」が想定されている。近年、これらの病態に腸内細菌が相互に影響し合う「脳-腸-腸内細菌軸の病態」としてIBSの病態概念が発展しつつある。しかし、IBSの病態に寄与しうる特定の腸内細菌種はまだ同定されてはいない。一方、人種や生活環境によって腸内細菌叢の構成が異なっている。本研究では、我が国のIBS患者の腸内細菌は健常者と異なるという仮説を検証した。以上の結果より、我が国のIBS症例においても腸内細菌叢の異常が存在しうることが示唆され、一部の菌種は消化器症状の調節に何らかの役割を果たしているのではないかと考えられる。その結果、両群における腸内細菌叢の比較のみならず、各菌種の構成比率とIBS症状重症度との関連性を評価することができた。

本研究では、我が国のIBS患者の腸内細菌叢とその機能は健常者とは異なるという仮説を検証した。IBS群では健常群と比較して有意にIBS-SI全体スコアの高値を示した(p<0.01)。IBS群では健常者に比較して、1%以上のOTU構成率を有する属レベルにおいてFaecalibacteriumとCoprococcusが有意に増加し、Dialisterが有意に低下していた。さらに代謝パスウェイ解析を実行した結果、IBS群は健常群に比較して、アミノ酸代謝の有意な低下が認められた。以上の所見より、我が国のIBS症例においても腸内細菌叢の変化が存在し、腸管内のアミノ酸代謝の変化がIBSの病態生理に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。本年度は、予定通りのIBS症例ならびに健常症例の募集を実施し、集積したデータの解析を滞りなく実行できた。メタゲノム解析の結果、IBSにおける腸内細菌叢とその機能の特徴を明らかにできた。平成29年度は、当初の計画通り引き続きIBS症例と健常者を募集して、解析対象症例を積み重ねる予定である。IBS症例における症状重症度、心理社会的背景が腸内細菌叢の変化とどのように関連しているかについても評価する。平成30年度は、引き続きIBS症例ならびに健常症例の募集を実施し、糞便検体からの腸内細菌叢の解析のみならず、消化管生理検査を同時に実施して、IBSの主要な病態に寄与しうる腸内細菌種を同定する計画である。平成31年度は、計画通りに引き続き被験者の募集を実施し、腸内細菌のIBS症状、心理社会的因子、消化管機能それぞれに果たす役割を評価して、ストレス関連疾患のIBS病態メカニズムを詳細に解明する方針である。
競合的RT-PCR法によるヒト肺サーファクタント蛋白質mRNA定量法の開発

(1)肺mRNAの抽出(3)肺サーファクタント蛋白質mRNAの定量肺RNAと#2で作成したSP-BのRNA competitor(9段階に希釈、10^510^9 copies)とを競合させてRT-PCRを行い、SP-BのcDNAの特異的塩基対を増幅した。PCR終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、泳動パターンからSP-BのRNA量判定を行った。すなわちSP-BのPCR産物と分子量の異なるcompetitorのPCR産物の発現量が同一レベルとなったRNA competitor量をRNA量とした。2.臨床例での検討肺疾患症例の剖検肺組織よりRNAを抽出し、上記の方法で競合的RT-PCR法を行うことにより、SP-B mRNAの発現状況を検索した。3.従来のノーザンブロット法との比較従来のノーザンブロット法との比較を行って、本研究によって開発された測定系の信頼性と有用性を検証した。(1)肺mRNAの抽出(3)肺サーファクタント蛋白質mRNAの定量肺RNAと#2で作成したSP-BのRNA competitor(9段階に希釈、10^510^9copies)とを競合させてRT-PCRを行い、SP-BのcDNAの特異的塩基対を増幅した。PCR終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、泳動パターンからSP-BのRNA量の判定を行った。2.臨床例での検討肺疾患症例の部検肺組織よりRNAを抽出し、上記の方法で競合的RT-PCR法を行うことにより、SP-B mRNAの発現状況を検索した。