hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ワクチン開発に向けた培養細胞由来E型肝炎ウイルス粒子の中和抗体誘導能に関する研究

平成24年度は不活化ワクチンの原料となる培養HEVを大量生産することを目的として、馴化HEV 181J株(26代目)を各種株化細胞に接種し、培養上清中へのHEV産生効率及び産生されたHEV粒子の性状に関する検討を行った。その結果、新たにHepG2/C3A細胞(ヒト肝癌)、Li-7細胞(ヒト肝癌)、Huh7細胞(ヒト肝癌)及びCaco-2細胞(ヒト結腸癌)でも、培養上清中に10の8乗copies/mL以上の高濃度のHEVの約3カ月に及ぶ長期産生が可能となった。また、各種培養細胞由来のHEV粒子の主分画は浮上密度1.15-1.17g/mLであり、ORF3タンパク質及びエンベロープのような膜様構造物で覆われてカプシド抗原は露出していなかったが、界面活性剤(デオキシコール酸ナトリウム)及びタンパク質分解酵素(トリプシン)で処理することにより、カプシド抗原が露出し、その抗原性が保持されたHEV粒子を調製することができた。マウスへの免疫実験及びin vitro中和試験により、カプシド抗原を露出させた培養HEV粒子はHEVの感染を阻止する中和抗体誘導能を有することが示された。以上より、HepG2/C3A、Li-7、Huh7及びCaco-2の各株化細胞はHEV不活化ワクチン原料の製造に利用可能であると考えられた。処理済み培養細胞由来HEVは未処理の培養細胞由来HEVと同等の感染性を有するため、ワクチンとして使用するために感染性を不活化する条件についての検討を継続中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、ワクチン抗原原料の大量生産を目的としてHEV高効率培養法のスケールアップ及びHEV精製方法の検討を行うとともに、各種アジュバントによる免疫原性の増強効果について検討を行う予定である。研究を遂行する上での問題点は特にない。
内部量子効率100%を示す蛍光性有機EL素子の創成

熱活性化遅延蛍光(TADF)材料をドナー分子、蛍光材料をアクセプター分子とすることで、電流励起によりTADF分子上で生成した全ての励起子を蛍光分子へとエネルギー移動させ、内部量子効率100%で発光する有機EL素子を実現した。本手法を用いることで、蛍光材料を発光中心とする有機EL素子においても、リン光素子と同様に理論限界に達するEL効率が実現可能であり、さらに、素子の耐久性も大幅に改善することを見出した。本研究では、熱活性化遅延蛍光分子(以下、TADF分子)の三重項励起子を一重項励起子にアップコンバージョンする技術をさらに発展させ、蛍光分子を発光材料とする有機EL素子中にTADF材料をアシストドーパントとして有機EL素子の発光層中へ分散することで、電気励起下でTADF分子上にて生成された三重項励起子と一重項励起子を、すべて蛍光分子へエネルギー移動させることが可能であることを見出し、ほぼ100%の効率で蛍光分子からの発光を得ることに成功した。特に、TADF分子であるPXZTRX(Chem. Comm. 48, 11392-11394 (2012))をアシストドーパント、TBRb(Thin Solid Films. 496, 626-630 (2006))を蛍光色素として用いた有機EL素子において、最大外部量子効率18%を得ることに成功した。有機EL素子の耐久性に関しては、TADF分子を発光分子とした有機EL素子と比較し、2.5倍以上に達する素子耐久性の向上が可能であることを明らかにした。発光量子効率および発光寿命などの各種光学物性評価に基づき、各種のTADF分子における三重項励起状態から一重項励起状態への逆項間交差速度(kRISC)を算出した結果、10^5 sec-1程度の速いkRISCを有するTADF分子において、顕著な素子耐久性の向上を実現可能であることを見出した。これは、速いkRISCにより、有機EL素子の発光層中に生成・蓄積される三重項励起子密度が減少したためであると考えている。本研究では、熱活性化遅延蛍光分子(以下、TADF分子)の三重項励起子を一重項励起子にアップコンバージョンする技術をさらに発展させ、蛍光分子を発光材料とする有機EL素子中にTADF材料をアシストドーパントとして有機EL素子の発光層中へ分散することで、内部量子効率100%で発光する蛍光有機EL素子を、申請提案の通り実現した。また、昨年度までにTADF分子を発光分子とした有機EL素子と比較し、2.5倍以上に達する素子耐久性の向上が可能であることも見出した。さらに、申請段階で提案していた新奇なエネルギー移動過程を、研究の進捗によりさらに発展させ、レーザー色素へと三重項励起エネルギーを移動させることにより、従来は不可能であると考えられていた三重項励起状態を経由したレーザー発振が可能であることを、世界に先駆け実証することにも成功した。発光量子効率および発光寿命などの各種光学物性評価に基づき、各種のTADF分子における三重項励起状態から一重項励起状態への逆項間交差速度(kRISC)を算出した結果、10^5 sec-1程度の速いkRISCを有するTADF分子においてレーザー色素からのレーザー発振が可能であることを見出した。これはその速いkRISCにより、生成された三重項励起子は速やかに一重項励起状態へと逆系間交差するため、三重項-三重項間相互作用による励起子消滅過程が抑制された結果、速やかにレーザー色素の一重項励起状態へと励起エネルギーが移動したためであると結論している。H26年度研究計画では、TADF分子を蛍光有機EL素子のホスト材料として用いる計画であったが、研究を進める中で、本提案のエネルギー移動過程を有効に活用し、EL発光効率の向上を実現するためには、1TADF分子と蛍光分子間の平均分子間距離を制御し、Dexterエネルギー移動過程を抑制する必要があること、2TADF分子間で生じる濃度消光現象を抑制することの2要件が重要な因子であることを見出した。そこで、TADF分子をアシストドーパントとして用いる素子構成を提案し、研究目標の実現を目指した。結果、青・緑・黄・赤色を発する蛍光分子を発光材料とし、各蛍光分子の一重項励起準位に対し、励起エネルギーを移動可能なTADF分子をアシストドーパントとして用いることにより、電流励起により生成されたすべての励起エネルギーを蛍光分子へとエネルギー移動させることに成功した。結果として、内部量子効率100%で発光する蛍光有機EL素子を創出した。またさらに、本研究提案のエネルギー移動過程を利用し、外部EL量子効率12%を示す白色蛍光有機EL素子を実現した。素子寿命に関しては、TBRb分子を発光中心とした蛍光有機EL素子において、3,500時間を超える素子寿命を得ることに成功している。しかしながら、青色蛍光有機EL素子での素子寿命は、現状100時間程度に留まっている。この要因としては、高い三重項励起エネルギーを閉じ込めるために必要な、ホスト分子の電気化学的安定性が不十分であるためと考えている。

有機光エレクトロニクス燐光有機EL素子に匹敵する外部量子効率を、蛍光有機EL素子においても実現したが、その素子耐久性は不十分である。これまで大きなkRISCを示すTADF分子を用いることで、素子耐久性の向上が可能であることを見出してきた。今後、kRISC =10^6 sec-1を示すTADF分子の設計・合成を優先的に進め、数値目標の達成を目指す。本年度は、既に報告されている熱活性化遅延蛍光材料の光物性解析および蛍光有機EL素子への適用について重点的に研究を実施した。そのため新規熱活性化遅延蛍光分子の合成については一部遅れが生じている。しかしながら、本年度の研究を通し得られた知見を元に、次年度は新規分子の合成を加速させる計画である。また、当初計画では有機EL素子用の基板およびマスクを整備する計画であったが、作製装置の導入に遅れが生じたため、本年度での整備を見送り、既存設備を利用し研究を実施した。次年度においては、本年度で得られた知見を元に、当該助成金により合成試薬を購入し、新規有機発光分子の合成を加速する計画である。また、有機EL素子作製装置の導入が完了したため、200mmサイズのガラス基板および対応するフォトマスクの整備を速やかに実施し、有機EL素子開発を加速させる計画である。
配位化学理論に基づいたNi系合金触媒の創製による官能基選択的水素化触媒の開発

本研究では、4つの大きな成果が得られた。第1は安価で豊富なNi系合金触媒を簡便な水熱合成で製造できることを見出した。第2はこの合金触媒を不飽和アルデヒドおよび不飽和ケトンの水素化反応に適用すると、カルボニル基のみを水素化した不飽和アルコールを高選択的(最高で100%)に合成することを見出した。第3は、不飽和ニトロ化合物から不飽和アミンがほぼ定量的に合成できることを見出した。第4は、Ni-希土類酸化物触媒が得られ、フルフラールの水素化分解に用いると、1,5-ペンタンジール(1,5-PeD)が選択的に得られることを見出した。本年度は、安価な合金あるいは合金前駆体を独自の方法で創製し、配位化学的な考え方に基づいて、極性の高い官能基のみを水素化する官能基選択性の高いNi系合金触媒の開発を行った。すなわち、高い水素化活性を持つが官能基選択性に乏しいNiに第二金属種のSnおよびFeを添加し、水熱合成で合金触媒を作成したところ、不飽和カルボニルを水素化すると不飽和アルコールのみを選択的に得ることに成功した。また、不飽和ニトロ化合物を水素化すると不飽和アミンをほぼ定量的に得た。何れの場合も、無極性のC=C結合よりも、C=OあるいはNO2の極性のある官能基を選択的に水素化することに成功した。1. Ni-Sn触媒による不飽和カルボニルの水素化: Ni-Sn触媒では水素圧3MPa、383453Kの温度範囲でフルフラールの水素化反応を行ったところ、Niのみでは完全水素化生成物のテトラヒドロフルフリルアルコールが生成したのに対し、Snを添加したN-Sn合金では99%の収率でフルフリルアルコールが得られた。すなわち、C=Oのみが水素化されるという、官能基選択性を示した。他の基質に対しても、高い選択性を示した。特に、TiO2に担持した触媒は、高い選択性のみならず高活性であった。2. Ni-Fe触媒による不飽和カルボニルの水素化: Ni-Fe触媒も同様にC=Oを選択的に水素化する傾向をしめした。しかしながら、Ni-Sn触媒と比較して基質により選択性に差がみられた。すなわち、芳香族系アルデヒドおよびケトン、非共役系不飽和アルデヒドおよびケトンに対しては、高いC=O水素化選択性を示したが、2-cyclohexen-1-oneなどの共役系不飽和カルボニルに対しては、選択性が大幅に低下した。Ni系合金として、Ni-Sn合金、Ni-Fe合金およびそれぞれの合金をTiO2、Al2O3、MgOなどの金属酸化物に担持した触媒を調製し、水素化反応を行った。また、不飽和カルボニル水素化触媒反応についても、90%以上の選択性を得た。さらに、Ni-Sn触媒を用いた不飽和ニトロ化合物の水素化においても、選択的にNO2を水素化することを見出した。今後、Ni合金を担持することによりナノサイズに微粒子化することで、活性の向上および選択性への影響を検討する。しかしながら、Ni-Fe触媒においては、共役系不飽和カルボニル化合物を用いた際に、その選択性が著しく低下することが判った。その原因として、1.初期に選択的にC=Oを水素化し、その後異性化して飽和カルボニルが生成したのか、2.初期からC=OとC=Cを水素化しているのかを詳細に調べる必要がある。また、反応機構については計画通り、Ni系合金触媒が選択的にC=Oに吸着していると予測しており、基質の触媒表面への吸着状態をFT-IR測定により検討し、反応機構を明確にする予定である。本研究では,2つの大きな成果が得られた。1つは豊富で安価なNi系合金をより簡便な水熱合成法で製造し,これを不飽和アルデヒドおよび不飽和ケトンから高選択的に不飽和アルコールが得られることを発見したこと。塩化ニッケルと塩化鉄から均一な水溶液にしたのち,沈殿させて水熱合成および水素処理でNi-Fe合金(Ni3Fe)を得た。これを用いて様々な基質に用いたところ,最高で98%の選択性で不飽和アルコールを得た。2つ目はNiに希土類のLaおよびYを加えるとLa(OH)3およびY2O3にNi金属微粒子が分散した二元系触媒が得られ,これがフラン化合物を水素化分解し,フルフラールから1,5-ペンタンジオール(1,5-PeD)を選択的に合成できることを見いだしたことである。具体的には,従来,Ni金属触媒のみでは不飽和アルデヒドおよび不飽和ケトンの水素化に殆ど選択性は見られず,C=CとC=Oの両結合を水素化していたが,NiにNiよりも電気陰性度の低いSnやFeを加えたNi-SnやNi-Fe合金触媒を用いるとフルフラールからフルフリルアルコールにほぼ100%の選択性で合成することを見いだした。この合金触媒は,芳香族アルデヒドやケトン,C=C結合を持つ不飽和アルデヒドやケトンに対して,C=Oを選択的に水素化し,不飽和アルコールを得た。更に,Ni-M合金をTiO2担持触媒(Ni-M/TiO2)も開発した。二番目の成果でNi-La(OH)3あるいはNi-Y2O3を触媒として用い,フルラ-ルを水素化分解すると,55.8%および46%の収率で1,5-PeDを得ることに成功した。

更に,テトラヒドロフルフリルアルコールの水素化分解では,92.4%および77.6%の高収率で1,5-PeDを得た。このように,殆ど選択性を示さないNi金属に新たな第二の元素を加えることにより,新規な性能を見いだすことに成功した。主に2つ有り,1つ目はNi-Fe合金触媒を用いた不飽和カルボニルの水素雰囲気下での水素化反応では、芳香族カルボニルを基質に用いるとほぼ定量的に芳香族アルコールを得た。非共役系不飽和カルボニルを基質に用いても高い選択性で不飽和アルコールを得たが,シンナミルアルデヒドやシクロへキセノンなどの共役系不飽和カルボニルを基質にすると,不飽和アルコールへの選択性は著しく低下した。この原因が,異性化反応が起こっていることが主要な原因であることが判り,このような異性化を起こさない触媒開発が必要であることを解明したこと。2つ目は,Ni-LaおよびNi-Yの二元系触媒を用いたフルフラール(FFR)からのペンタンジオールへの水素化分解反応で,その反応機構を解明したことにある。すなわち,我々の開発した触媒では,バイオマス資源由来のFFRからフルフリルアルコール(FFAと略,C=Oのみを還元した生成物)を経由して,テトラフルフリルアルコール(THFAと略,C=OとC=Cの両方を還元した生成物)に至り,更にTHFAのフラン環のC-Oを選択的に切断した1,5-ペンタンジオールを生成することが判明した。1,2-ペンタンジールが少量(数%)生成するがこれはFFAのC-Oを切断した結果であることも判明した。従って,我々の開発した触媒では,主にTHFAを経由することで選択的に1,5-ペンタンジールを生成していることが判明した。初期に速い水素化反応が起こり,FFRからTHFAを生成し(水素化反応過程),THFAのフラン環を選択的に解裂して1,5-ペンタンジオールを生成することが判った。本研究では、主に4つの大きな成果が得られた。第1番目は安価で豊富なNi系合金触媒を簡便な水熱合成で製造できることを見出した。Niに電気的にNiより陽性の第2金属を単に混合するのでは無く、規則的に配列させ合金化することで、化学的性質のことなる触媒を得た。第2番目はこの合金触媒を不飽和アルデヒドおよび不飽和ケトンの水素化反応に適用すると、カルボニル基のみを水素化した不飽和アルコールを最高でほぼ100%の選択性で合成できることを見出したことである。第3番目は、この触媒を不飽和ニトロ化合物の水素化反応に適用すると、ニトロ基のみを優先的に水素化した不飽和アミンをほぼ定量的に合成できることを見出した。第4番目は、Niに希土類のLaあるいはYを加えると、La(OH)3あるいはY2O3にNi金属ナノ粒子が分散した二元系金属複合体が得られ、この複合体をフルフラールの水素化分解に用いると、フラン環が選択的に開裂し、1,5-ペンタンジール(1,5-PeD)が選択的に得られることを見出した。具体的には、(1)Ni-Sn系ではNi3Sn、Ni3Sn2、Ni3Sn4合金が得られたNi-Fe系ではNiFe合金が得られた。。(2)これらの合金触媒をフルフラールの水素化に用いるとC=Oのみを選択的に水素化したフルフリルアルコールをほぼ100%の選択性で得た。他の不飽和カルボニルを基質に用いても、相当する不飽和アルコールを87-100%の選択性(TiO2担持触媒)で得た。(3)不飽和ニトロ化合物を86-100%の選択性で相当する不飽和アミンを得た。(4)Ni単独では、423Kではフラン環の開裂が進行しなかったが、Ni-LaあるいはNi-Y触媒を用いると、フラン環の開裂が進行し、テトラヒドロフルフリルアルコールを基質とすると、最高で93%の選択性(Ni-Y触媒)で1,5-PeDを得た。
αvβ3インテグリン結合分子の骨転移癌のアポトーシス・接着制御機能の解析

オステオポンチンは腫瘍の転移における乳癌の予後との相関が報告され、また血中のオステオポンチンレベルが前立腺癌の予後との相関を持つことが臨床的に明らかにされたが、なおその癌の転移とオステオポンチンレベルの相関性をつなぐメカニズムについては明らかでない。今回の研究においては癌の転移巣における血管形成とオステオポンチンの役割についての検索を行った。すなわち、静脈より導入した悪性黒色腫細胞が転移する肺における転移巣の数がオステオポンチンの欠失により抑制されるモデルを用い、その転移巣の周囲の血管組織を形態学的に観察したところ腫瘍の転移巣周辺の血管組織の形成においては野生型とオステオポンチンのノックアウトマウスはほぼ同様であった。B16悪性黒色腫細胞とこの細胞が誘導する可能性のある血管形成におけるオステオポンチンの役割を明らかにするためにB16悪性黒色腫を皮内に投与し、約1cm直径の腫瘍塊を形成させる実験を行ったところ、野生型ならびにオステオポンチン欠失マウスともに同様の大きさの腫瘍塊の形成が観察され血管形成の検索を行った結果、両遺伝子型で同様の血管の形成が観察された。一方、炎症による血管形成モデルについてはオステオポンチンの欠失によって抑制が観察された。以上の結果は腫瘍の転移の形成の際に起こる血管形成や腫瘍が局所で腫瘍塊を形成して固形癌としての増大する際の血管形成についてはオステオポンチンが関与しないメカニズムが存在し、この分子の癌の転移における作用点は転移先の腫瘍形成以前の段階、即ち血管からの遊走や血管内への着床の段階にあることが推察された。
高張液処理によって発現する3種類のX線誘発潜在致死損傷修復の研究

今まで、X線誘発による潜在致死損傷(PLD)の修復は2種類あることが知られていた。我々は、従来使われてきた高張液(0.5M NaCl、20ー30分処理)と、それよりもうすい高張液(0.225M NaCl、3ー4時間処理;0.16M NaCl、16時間処理)で処理することによって、対数増殖期細胞では高張液処理によって3種類の回復時間が異るPLDが発現されることを明らかにした。0.5M NaClで発現されるPLDは、定常期細胞でも同じように発現され、従来Utsumi and Elkindによって研究されてきたはやい修復をうけるものと同一であると考えられる。一方、うすい濃度(0.255M)での定常期細胞の処理は、増感作用を示さないが、定常期細胞でみられる遅いPLD修復は抑制している。また、修復時間が同じなので0.225Mで発現されるPLDの修復は、従来の遅い修復と同じであると考えている。0.16Mは、定常期細胞では、増感もしないし遅いPLD修復を完全には抑制しない。既知のPLDと違うと考えている。PLDとSLD(亜致死損傷)とは同じものではないかという議論がある。分割照射の間に高張液を処理するといずれの場合でも分割照射によって観察される亜致死損傷(SLD)の修復は抑制されるが、分割照射間の高張液処理の後、正常培地に5時間置くと生存率は増加し、修復が起きていることがわかった。抑制は一時的なもので、損傷の固定といった不可逆的なものではなく、PLDとSLDとは少くともある部分は独立していることを示す。今まで、高張液はMEMにNaClを加えることによって得ていた。最近血清を10%含む正常の培地を高張にした場合、特に長時間処理では非照射細胞に対する毒性が著しく軽減されるが、今までの高張液と同程度PLDを発現させることがわかった。今後のPLD機構解明、および、がん治療への応用のために有効であると思われる。
企業内法令遵守体制にかかる法的責任分担原則に関する研究

小規模閉鎖会社を除き、一定の人員と規約等からなる組織を通じて企業内法令遵守体制の整備を図っている会社はそれほど珍しくなくなり、むしろ、こうした仕組みにより違法行為等の事実及びその危険性が取締役会に伝達されたときに、取締役会がいかなる行動をとれば注意義務(監視義務)を果たしたものといえるかどうかに議論の中心が移りつつある。平成17年度の研究では、この問題に関連して米国デラウェア州会社法判例の最近の傾向を調査分析した(具体的には、研究計画のBに関連する)。その結果、取締役の監視義務違反を問うためには、明白な警告情報を無視したなど非難可能性の高い場合が念頭に置かれており、会社法上は責任追及が難しいことが判明した。そして、設置すべき体制の中身については、会社判例において相当とされる実務慣行を念頭に、サーベンス・オクスリー法(SOX法)が個別具体的に開示内容につき規定を行っているという連携関係も明らかになった。しかし、開示書類において適切な体制であると評価するためには客観的基準が必要であるとの指摘も多い。そこで、内部統制監査の一環としてSOX法の実務において一般にいかなる評価基準と手続が用いられているかを調査し検討した。平成17年度の後半期において、日本法への示唆となるべき検討作業を行った。具体的には、(1)法令遵守体制を含むリスク管理システムの概念とその変遷、(2)商法および会社法において体制整備の任にあたるべき者、(3)責任追及の法的根拠(善管注意義務違反、不実開示等>、(4)因果関係ある損害の範囲、(5)過失の認定基準について、議論を整理し分析を行った。これらの成果は、論文として公表される予定であるが、平成18年10月の日本私法学会(於大阪市大)において、ワークショップ「内部統制」の報告を担当することとなったので、この機会を利用して本研究の成果の一部を発表することとした。本研究は(1)企業内法令遵守体制の有無や機能状況が取締役の法的責任認定に及ぼす影響を検討するとともに、(2)企業内法令遵守体制に関与する者相互間の法的責任の分配のあり方につき考察を加えることを目的とするものである。平成16年度における研究ではまず前記(1)に関連して、米国のサーベンス・オクスリー法が企業開示内容の真実性確保のため、開示書類作成のプロセスが適正であるかどうかの監視を取締役会に要求している点を調査・検討した(具体的には研究計画のC,D,Eとして行った)。連邦法により取締役の行為規範を定めるやり方には州による会社規制権限を認める米国の法体系上疑問を提示する見解もあるが、取締役の注意義務(監視義務)のうち、いくつかを具体的表現内容を有する形で連邦法として別途規律することは注意義務の内容に変化を与え、州会社法上の、取締役の責任追及にかかる障壁をある程度除去するものとして評価する見解もある。しかし、会計専門家等のいわゆるゲートキーパーについては責任内容が明確であり、かつ罰則も大幅に強化されている反面、取締役の場合責任発生事由が不明確なところもあり、裁判規範としては期待できないとの指摘もある。これを踏まえて、専門家であるゲートキーパーの責任に力点を置くべきであるとする見解も説かれるところ、その責任の根拠及び負担内容と因果関係の立証方法をめぐっては対立がある。このように議論は錯綜しており、いずれの見解が正しいかは今後の動向を注意深く見ながら確認するほかないようにも思われるが、イベント・スタディと呼ばれる統計学的手法により簡易に究明しようとするアプローチがしばしば採用されており注目されている。そこで平成16年度の研究成果としてまとめた雑誌論文において、イベント・スタディの手法を紹介するとともに、本研究にかかわるいくつかの論点をめぐる議論の有効性について検討を加えた。
肝受容体イメージング製剤を用いた、新しい肝特異的遺伝子導入法の開発

ネオガラクトシルアルブミン(GSA)のSH基を活性化、遺伝子と複合体を形成する性質を有ずるデンドリマー(G4)にマレイミド基を導入したものと反応させ、GSA-G4を合成、オリゴDNA(olDNA)の担体とした。GSA-G4と^<111>In-olDNAを混和し、GSA-G4/DNA複合体を形成、正常マウスに静脈内投与、体内分布を調べたところ、肝臓へのolDNAの集積を認めたが、同時に腎、肺、脾への高集積も見られ、GSA-G4とolDNAの結合が不安定で、かなりのDNAが血中で遊離したこと、および高分子量の複合体が形成されたことがその原因と考えられた。そこで、GSAと同様に豊富な糖鎖を有し、肝細胞に取り込まれる性質を有するアビジン(Av)を用いて同様の検討を行った。Avにビオチン(bt)を介してolDNAを結合させたもの(Av-bt-DNA)、およびG4にbtを介してAvを結合させ、これとolDNAを反応させたもの(Av-bt-G4/olDNA)の二種類の複合体を合成し、正常マウスにおける体内分布を検討した。Av-bt-olDNAは、肝臓に非常に高い集積を示し(投与15分後:40.76%、60分後:・38.31%)、一方他臓器へのAv-bt-olDNAの集積は低く、高い肝臓・バックグラウンド比が得られた。Av-bt-G4/olDNA複合体でも、肝臓への中等度の集積(15分後:21.04%、60分後:23.24%)が得られたが、同時に肺、脾への非常に高い集積が認められ、GSA-G4/DNA複合体と同様に高分子量の結合体およびその凝集体が形成され、肺、脾にトラップされたものと思われた。Avを用いる肝臓へのolDNA運搬の可能性が示されたが、Av-bt-G4/olDNA複合体では、凝集体形成の問題があり、門脈内投与など投与ルートを工夫する必要がある。オリゴDNAにアミド基を導みしておき、このアミド基に、キレートを結合させ、インジウム-111(In-111)で標識。これにより、効率のよい(標識率>90%)DNA標識が可能となった。ネオガラクトシルアルブミン(GSA/NGA)は、ヒト血清アルブミシ(HSA)1個あたりに51個のガラクトース基を結合させて作成。NGAのSH基を活性化、遺伝子と複合体を形成するデンドリマー(G4)にマレイミド基を導入したものと反応させ、NGA-G4を合成。NGA-G4(またはHSA-G4)とIn-111標識DNAを100:1で混和し、NGA(or HSA)-G4/DNA複合体を形成し、マウスに静脈内投与、15分後の体内分布を調べたところ、肝臓への標識DNAの集積はNGA-G4/DNAの方が高かったが、その値は満足できるものではなく、同時に腎、肺、脾への高集積も見られた。これは、NGA-G4とDNAの結合が不安定で、かなりのDNAが血中で遊離したため、および高分子量の複合体が形成されたためと考えられた。

そこで、DNAとの結合力がより強いデンドリマー(G6)とNGAとの結合体を合成し、NGA-G4、NGA-G6とDNAとのより低分子量での複合体形成の可能性を検討した。種々の割合でNGA-G4(G6)とDNAを混和して、複合体の形成を調べたところNGA-G4:DNA=25:1、NGA-G6:DNA=5:1で複合体を形成しうることがわかった。今年度は、NGA-G4(G6)/DNA複合体と単離肝細胞との反応性、細胞内移行性を検討するとともに、マウスでの肝臓へのDNA運搬効率をNGA-G4とHSA-G4、さらにNGA-G4とNGA-G6との間で比較検討し、効率のよい遺伝子運搬法を見出す。さらに、静脈内投与に加え、門脈内投与により、肝臓への移行性がさらに向上するかについても検討を加える。初年度の検討より、ネオガラクトシルアルブミン(GSA)と第4世代デンドリマー(G4)の結合体では、放射性標識オリゴDNA(olDNA)を効率よく肝臓に運搬できないことがわかったため、本年度は、olDNAの保持力がG4よりも強いと期待される第6世代デンドリマー(G6)とGSAを結合させて、olDNAの肝臓への運搬能を検討した。GSA-G6はolDNAとインビトロで安定な複合体を形成したが、これらを正常マウスに静脈内投与したところ、肝臓へのolDNAの集積は、olDNA単独の場合よりは高いものの、決して満足できる値ではなかった。そこで、GSAと同様に豊富な糖鎖を有し、肝細胞に取り込まれると考えられるアビジン(Av)を用いて同様の検討を行うこととした。Avにビオチン(bt)を介して直接olDNAを結合させたもの(Av-bt-DNA)、およびG4をbtを介してAvと結合させ、これとolDNAと反応させたもの(Av-bt-G4/olDNA)の二種の複合体を作製し、正常マウスにおける体内分布を検討した。Av-bt-olDNAを正常マウスに静注すると、肝臓への高集積が得られ(投与15分後:40.76%、60分後:38.31%)、一方他臓器へのAv-bt-olDNAの集積は低く、高い肝臓・バックグラウンド比が得られた。しかしAv-bt-G4/olDNA複合体を投与すると、肝臓への中等度の集積(15分後:21.04%、60分後:23.24%)に加え、非常に高い肺への集積(15分後:103.03%、60分後:73.00%)が認められ、高分子量の結合体およびその凝集体が形成され、肺にトラップされたものと思われた。Avを用いる肝臓へのolDNA運搬の可能性が示されたが、Av-bt-G4/olDNA複合体では、凝集体形成の問題があり、門脈内投与など投与ルートを工夫する必要がある。
血清中シアリルルイスXの合成制御機構および生体内免疫応答への関与

初めに、sLeX合成関連糖転移酵素群のFUT VIの遺伝子発現制御機構を転写レベルで解析し、転写開始点およびHNF-4αがFUT VIの発現に重要であることを明らかにした。つぎに、sLeXの生体内免疫応答への関与を、NK細胞上のCD94およびNKG2Dに着目し、その糖鎖リガンドを明らかにした。本研究により、NK細胞上のCD94およびNKG2DがsLeX様の糖鎖を認識し、がん細胞の増殖を抑制することが考えられた。炎症やがんなどの病態時における、sLeX合成関連糖転移酵素群の発現メカニズムや制御機構等に着目し、研究を行った。sLeXを細胞膜上や分泌タンパク質上に高発現している肝癌細胞株HepG2細胞を用いて、恒常的FUT VIの遺伝子発現制御機構を転写レベルで解析した。FUT VI転写開始点を5'-RACE法により決定し、promoter領域の同定を、5`上流のdeletion vectorによるluciferase assayにより行った結果、-186-156及び-56-19の領域が、FUT VI発現に重要であることが明らかとなった。さらに、これらの領域に含まれるHNF-4αの強制発現により、転写活性およびFUT VI mRNA発現の増加が認められたことから、HepG2細胞では、HNF-4αFUT VIの発現に重要であることを明らかにした。この仕事は、FUT VI promoter領域を初めて同定した仕事である。IL-1βによるFUT VI mRNA発現調節機構を、mRNA安定化に着目し、mRNAの半減期をreal-time PCRにて解析した結果、FUT VI mRNAのt1/12は、4.0h、4.1hであった。この結果から、炎症モデルであるIL-1β刺激によるFUT VI mRNA発現の上昇は、安定性によるものではないことが明らかとなった。また、IL-6応答性モデルを、肝がん細胞株を用いて構築するために、各種肝癌細胞株に対して、C/EBP reporter assayを行った結果、HLF細胞において、IL-6刺激によるルシフェラーゼ活性の増加が認められた。この結果から、HLF細胞を用いた炎症モデルの構築が可能となった。以上の結果は、肝臓における免疫応答に対する糖転移酵素の発現やその制御機構についての病態生化学的知見が得られたものと考えられる。sLeXの生体内免疫応答への関与を、NK細胞上のKLRsに着目して、KLRsと糖鎖の結合を解析した。KLRsであるCD94およびNKG2Dのレクチンドメインを、NK細胞株由来KHYG細胞のcDNAから、PCRでクローニングし、pGEX4-T1ベクターに組み込み、ampicminによるセレクションから、pGEX/KLRsベクターを得た。このベクター用いて、IPTG誘導後、rCD94およびrNKG2Dを大腸菌にて発現させ、グルタチオンカラムにて、目的のKLRs-GST融合タンパク質を得た。そして、sLeXプローブとして、HepG2細胞由来Transferrin(TF)との結合をEIA法により解析した結果、rNIKG2DおよびrCD94は、濃度依存的に固相化HepTfに特異的な結合が見られた。また、sLeXを構成する単糖の共存ではNeuAcのみで結合が阻害され、Asialo-HepTfに対する結合が有意に低下したことから、NKG2DおよびCD94の糖鎖認識にNeuAcが重要であることが明らかとなった。より詳細なリガンド構造を特定するため、TF糖鎖リモデリングを行い、結合を解析した結果、rNKG2DおよびrCD94はa2, 3-NeuAcをもつ34本鎖のN結合型糖鎖を認識することを明らかにした。また、これらの結合は、rNKG2D(Y152A)、rCD94(F114A、N160A)のミューテーションにより、低下したことから、糖鎖認識に重要なアミノ酸残基の一部を明らかにすることが出来た。本研究により、CD94およびNKG2Dの糖鎖リガンドを同定することに成功した。そして、NK細胞機能に及ぼすsLeXの関与を明らかにすることが出来た。生体内では、NK細胞上のCD94およびNKG2Dがこれらの異常な糖鎖を認識し、がん細胞の増殖を抑制することが考えられる。
他覚的味覚検査法としての舌電気刺激による舌、鼓索および顔面神経誘発電位の測定

1.歪成分耳音響放射は、2周波数の純音(周波数f1およびf2、f1<f2)で同時に刺激した際に外耳道内でのその歪成分が記録され、健常者では、無刺激時には、2f1-f2周波数成分のみが良好に記録された。2.健常者での舌刺激時(電気味覚検査装置にて)には、2f1-f2のみでなく、f1-f2および3f1-f2にても良好な記録が得られた。3.現在味覚障害患者および顔面神経麻痺患者の記録比較検討を行っている。以上、2および3の結果により新しい知見が得られるものと考える。購入した耳音響放射装置GSI-60使用することにより以下のごとく(1および2)研究成果が得られたとともに、今後の研究(3、4および5)についても言及する。1.歪成分耳音響放射は、2周波数の純音(周波数f1およびf2、f1<f2)で同時に刺激した際に外耳道内でのその歪成分が記録されるが、2f1-f2周波数成分のみが良好に記録された。2. 2つの刺激音の周波数比f1:f2=1:1.22付近、刺激音圧は、L1(f1の音圧)-L2(f2の音圧)が5から10dB程度で2 f1-f2成分は最大となるため、この付近に2つの刺激音の周波数と音圧の条件を設定(f1:f2=1:1.22、L1=70dB SPL,L2=65dBSPL)した。3.以上の設定で健常者の歪成分耳音響放射の測定を行う。無刺激時と電気味覚検査装置にて舌を刺激したときの双方での記録を行い比較検討する。4.同様の設定で味覚障害患者の歪成分耳音響放射の測定を行い、3と同様の条件下に記録を行う。健常者と味覚障害患者の記録の比較検討を行う。5.さらに、3,4と同様の設定、同様の条件下に、顔面神経麻痺患者の測定を行い記録を行う。健常者と味覚障害患者および顔面神経麻痺患者の記録の比較検討を行う。以上、3、4および5の結果により新しい知見が得られるものと思われる。
進行肝細胞癌に対する、標準的肝動注化学療法の確立に関する多施設共同研究

進行肝細胞癌に対する標準的治療の確立を目指し、H23年度は多施設共同前向き臨床試験の企画・実施を行った。本臨床試験は、進行肝細胞癌患者を対象に肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動注化学療法の有効性と安全性を検証するための第2相臨床試験であり、適格基準は1組織学的あるいは臨床的に診断された肝細胞癌症例、2肝切除や局所焼灼療法、肝動脈化学塞栓療法による治療効果が見込めない症例、3進行度分類(BCLC-stage)BまたはC、4肝機能がChild-Pugh score 8点以下、除外基準は1肝細胞癌に対して白金系薬剤での治療歴を有する、2肝外転移を有する、3高度な脈管腫瘍栓(Vp4、Vv3、B3、B4)を有する、4著明な動脈-門脈シャントまたは動脈-静脈シャントを有する症例とした。本臨床試験のPrimary endpointは奏効率、Secondary endpointsは有害事象の発現頻度と程度、腫瘍マーカーの変化、全生存期間、6ヶ月生存率、1年生存率、無増悪生存期間と設定した。12か月の登録期間で35症例の症例登録を予定している。現在までに国内39施設が本臨床試験に参加、15施設からの症例登録があった。2012年9月で予定症例登録数に達したため、現在は登録症例の追跡調査中である。本研究の目的は「進行肝細胞癌に対する標準的治療を確立すること」である。本年度は進行肝細胞癌症例を対象とした多施設臨床試験の実施を行い、2013年9月をもって予定症例登録数に達し、現在は追跡調査中である。よって、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。追跡調査終了後にエンドポイントに対する解析・評価を行い、進行肝細胞癌に対する肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動注化学療法の有効性と安全性を検証する。その後は、他のレジメンを用いた肝動注化学療法との比較、あるいはソラフェニブ等の薬物療法との比較試験を実施する予定である。必要物品の価格や、研究グループ会議の運営費が当初の計画と少し異なったため、次年度使用額が発生した。次年度使用額は、次年度に請求する研究費と合わせ、本臨床研究グループの運営費(会議室使用料、資料作成、講演料)、研究グループ会議および成果発表時の旅費、治験コーディネーターおよび統計専門家の支援経費に使用する予定である。本臨床試験は、進行肝細胞癌患者を対象に肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動注化学療法の有効性と安全性を検証するための第2相臨床試験であり、適格基準は(1)組織学的あるいは臨床的に診断された肝細胞癌症例、(2)肝切除や局所焼灼療法、肝動脈化学塞栓療法による治療効果が見込めない症例、(3)進行度分類(BCLC-stage)BまたはC、(4)肝機能がChild-Pugh score 8点以下、除外基準は(1)肝細胞癌に対して白金系薬剤での治療歴を有する、(2)肝外転移を有する、(3)高度な脈管腫瘍栓(Vp4、Vv3、B3、B4)を有する、(4)著明な動脈-門脈シャントまたは動脈-静脈シャントを有する症例とした。現在までに国内38施設が本臨床試験に参加、このうち、2012年4月の時点で13施設より28症例の症例登録があった。進行肝細胞癌に対する標準的治療の確立を目指し、多施設共同前向き臨床試験の企画・実施を行った。本臨床試験は、進行肝細胞癌患者を対象に肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動

注化学療法の有効性と安全性を検証するための第2相臨床試験であり、適格基準は(1)組織学的あるいは臨床的に診断された肝細胞癌症例、(2)肝切除や局所焼灼療法、肝動脈化学塞栓療法による治療効果が見込めない症例、(3)進行度分類(BCLC-stage)BまたはC、(4)肝機能がChild-Pugh score 8点以下、除外基準は(1)肝細胞癌に対して白金系薬剤での治療歴を有する、(2)肝外転移を有する、(3)高度な脈管腫瘍栓(Vp4、Vv3、B3、B4)を有する、(4)著明な動脈-門脈シャントまたは動派-静派シャントを有する症例とした。本臨床試験のPrimary endpointは奏効率、Secondary endpointsは右害事象の発現頻度と程度腫瘍マーカーの変化全生存期間、6ヶ月生存率、1年生存率、無増悪生存期間と設定した。12か月の登録期間で35症例の症例登録を予定している。現在までに国内39施設が本臨床試験に参加、14施設からの症例登録があった。2012年9月で予定症例登録数に達したため、現在は登録症例の追跡調査中である。本研究の目的は「進行肝細胞癌に対する標準的治療を確立すること」である。本年度は進行肝細胞癌症例を対象とした多施設臨床試験の実施を行い、2013年9月をもって予定症例登録数に達し、現在は追跡調査中である。よって、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。本年度は進行肝細胞癌症例を対象とした多施設臨床試験の企画・実施を行い、すでに予定症例数のうち約80%の症例登録が終了している。追跡調査終了後にエンドポイントに対する解析・評価を行い、進行肝細胞癌に対する肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動注化学療法の有効性と安全性を検証する。その後は、他のレジメンを用いた肝動注化学療法との比較、あるいはソラフェニブ等の薬物療法との比較試験を実施する予定である。今後も引き続き臨床試験への症例登録を行い、次年度中の症例登録完了を目指している。症例登録および追跡調査終了後にエンドポイントに対する解析・評価を行い、進行肝細胞癌に対する肝動注用シスプラチンとリピオドールの懸濁液を用いた肝動注化学療法の有効性と安全性を検証する。必要物品の価格や、研究グループ会議の運営費が当初の計画と少し異なったため、次年度使用額が発生した。次年度使用額は、次年度に請求する研究費と合わせ、本臨床研究グループの運営費(会議室使用料、資料作成、講演料)、研究グループ会議および成果発表時の旅費、治験コーディネーターおよび統計専門家の支援経費に使用する予定である。必要物品の価格や、CRC支援経費が当初の計画と少し異なったため、次年度使用額が発生した。
大正・昭和初期における生活改善運動の運動史・思想史的解明

平成19年度における研究目的は、(1)生活改善同盟会(のち生活改善中央会)の活動状況の解明、(2)生活改善同盟会と団体外部の官製運動と連携の様相の解明、(3)生活改善同盟会における中心的人物の言説・思想の解明、であった。(1)については、平成18年度の研究作業にも含まれていたものであり、今年度は昨年度の資料収集をふまえた論文執筆作業が中心となった。その研究実績である、「昭和前期における生活改善中央会の組織と事業」(『兵庫教育大学研究紀要』第31巻2007年9月)では、先行研究で殆ど言及の無かった、昭和前期に焦点を置いて生活改善運動を分析した、(2)については、今年度の文献収集の中心となる作業であった。その文献収集をふまえた研究実績である、「戦前生活改善運動史研究に関する再検討と展望-運動を支えた組織・団体をめぐる論点を中心に」(『兵庫教育大学研究紀要』第32巻2008年2月)では、生活改善運動史研究に関するこれまでの研究状況のレビューを行うとともに、生活改善運動においてこれまで曖昧にしか言及されてこなかった、「組織・団体間の連携」という観点から運動の実態を分析した。(3)については、平成18年度の研究実績の中にも含まれていたものであり、今年度は昨年度の資料収集・草稿作成をふまえた論文執筆作業が中心となった。その研究実績である、「大正後期・昭和前期における教養活動・余暇活動と〈調査の視線〉-社会教育調査史研究のための一試論」(『生涯学習・社会教育研究ジャーナル』第1号2007年11月)では、生活改善運動だけでなく、大正・昭和初期の社会教育活動に対する「科学的分析」を標榜する言説・思想全般をとりあげ、その認識枠組みに関する考察を、これまで社会教育研究になかった調査史的視点から行ったものである。1生活改善運動の運動史的解明-生活改善中央会の組織・事業に関する考察先行研究での言及が殆ど見られない昭和初期の生活改善運動の実像を明らかにするため、当時の文部省外郭団体である生活改善中央会の組織と事業の実態を詳細に整理する作業を行った。具体的には、生活改善中央会の刊行物等の収集・分析を基に、生活改善中央会の役員組織と実際の人事、講演会・講習会などの事業実施状況、財政状況などを記述し、昭和初期の生活改善運動の性格を明らかにした。この研究成果は、「昭和初期における生活改善中央会の組織と事業」(『兵庫教育大学研究紀要』第31号)として平成19年9月刊行予定である。2生活改善運動の思想史的解明-予備作業としての「戦間期社会教育の対象者把握」に関する考察大正・昭和初期の生活改善運動は、人々の生活実態の把握を基にした提言活動が中心であったが、この「運動の対象者を把握する方法」の具体的性格を明らかにすることは、正解改善運動を支えた「思想」を読み解くという意味で、これまでの先行研究で着手されていない教育史上の重要な検討課題である。申請者は平成19年度の研究の一部として、上記の「対象者把握に見る生活改善運動の思想」を構想しているが、平成18年度はその予備的作業を行った。即ち、戦間期・戦中期の社会教育事業全体における、調査に基づく対象者認識の特徴を、大都市行政調査資料や社会教育関連雑誌の記述を基に、概括的に捉えた考察である。この研究成果は、「大正後期・昭和前期における教養活動・余暇活動と調査の<視線>-社会教育調査史研究のための一試論」(『生涯学習・社会教育研究ジャーナル』第1号)として、平成19年7月刊行予定である。その研究実績である、「大正後期・昭和前期における教養活動・余暇活動と〈調査の視線〉

-社会教育調査史研究のための一試論」(『生涯学習・社会教育研究ジャーナル』第1号2007年11月)では、生活改善運動だけでなく、大正・昭和初期の社会教育活動に対する「科学的分析」を標榜する言説・思想全般をとりあげ、その認識枠組みに関する考察を、これまで社会教育研究になかった調査史的視点から行ったものである。
産科的DIC(常位胎盤早期剥離)におけるカルシウムプロテアーゼの動態

健常及び常位胎盤早期剥離症例(早剥)胎盤のカルパインの存在と動態を以下の実験法によって比較検討した。(1)胎盤内カルパイン活性の検討常法に従い、娩出された胎盤を速やかにカルパイン精製液中でホモジナイズした後に遠心処理し、上清を硫安カット及び透析後、DEAEセファロースカラムにてカルパインを含むフラクションを得た。精製した検体について、カゼインを基質とした分解活性によりカルパイン活性を簡易的に測定したところ、早剥例に残存カルパインによるカゼイン分解量の低下が認められた。当教室で作製した各種抗カルパイン抗体を用い、以下の実験によりカルパインの検索を試み、μ-及びm-カルパインの関与、前駆体及び活性型カルパインの関与やカルシウム感受性を検討した。尚、特異的反応である事を抗原ペプチドによる抗体吸収実験で確認した。(2)胎盤内カルパインのSDS-PAGE・ウエスタンブロッテッング法による測定健常例に比べ早剥例にμ-カルパイン80Kの前駆型に対する抗体の染色性の低下が認められた。(3)胎盤の免疫組織染色によるカルパイン動態の解析健常例に比べ早剥例にμ-カルパイン80Kの前駆型に対する抗体の絨毛細胞の核への染色性の低下が認められた。また、同連続切片を用いた、TUNEL法では明らかなアポトーシスの存在は観察されなかった。以上より、ヒト胎盤に存在するμ-カルパインが常位胎盤早期剥離の病態において活性化されている可能性が示唆された。現在カルパインの活性化の機序として、低酸素状態の関与を想定し培養絨毛細胞の低酸素モデルを用いて検討中である。
細胞死阻害因子の遺伝子導入による卵巣内潜在的卵母細胞を救命する異種移植法の開発

成熟した雌家畜の卵巣内には胎児期にディプロテン期で減数分裂を休止した卵母細胞が50万個前後含まれ、性周期毎に卵母細胞は卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。この課程で、最終的に排卵にいたるものの100倍以上もの卵胞が発達を開始するが、殆どが選択的に死滅して1%以下が排卵に至る。この卵胞・卵子の選択的死滅はより優秀で強靭な子孫を残す戦略として重要であるが、分子制御機構は未解明である。本研究は、家畜の卵巣において繰り返される卵胞の選択的死滅を制御している分子機構を解明し、これをもとに卵巣組織の凍結保存法を開発して、卵巣内潜在的卵母細胞を救命することで雌性遺伝子資源の保存を実現する技術を確立することを目指している。昨年度に続いて今年度も卵胞に発現している細胞死受容体系の同定をすすめ、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系の分子機構を精査した。その結果卵胞顆粒層細胞が閉鎖に支配的に関わり、これは細胞内アポトーシスシグナルがミトコンドリアを介して伝達するII型アポトーシス細胞であることを明らかにした。さらに細胞内でアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規な阻害因子cFLIPとXIAP(家畜の遺伝子とアミノ酸配列を決定した)を突き止め、免疫不全マウスの腎に異種移植した家畜の未成熟卵胞を含む卵巣組織細片を対象にしてこの阻害因子のin vivo遺伝子導入やiRNA-発現阻害処理を施して、卵胞・卵母細胞の生死を制御して救命する人為的手を開発した。多様な生殖戦略をもつ脊椎動物のうちで、多くの魚類のように数千から数億の仔の中で幸運かつ優れたものだけが生き残る戦略と異なり、哺乳類は性周期毎に110個の卵母細胞を排卵して授精し、それを母体内で発生させて、極わずかの仔を産み、それを大切に育てる戦略をとって繁栄してきた。成熟した哺乳類の卵巣内には胎児期にディプロテン期で減数分裂を休止した卵母細胞が5100万個含まれ、性周期毎に卵母細胞は卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。この課程で、最終的に排卵にいたる卵母細胞の100倍以上もの卵胞が発達を開始するが、99%以上が選択的に死滅し、1%未満のみが排卵に至る。このような卵胞・卵子の選択的死滅は、より優秀で強靭な子孫を残す戦略として重要であるが、これを制御している分子機構は未解明である。本研究は、哺乳類の卵巣において繰り返される卵胞の選択的死滅を制御している分子機構を解明し、これをもとに卵巣組織の凍結保存法を開発して、卵巣内潜在的卵母細胞を救命することで雌性遺伝子資源の保存を実現する技術を確立することを目指している。今年度は、卵胞に発現している細胞死受容体・デコイ受容体系を同定し、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系を担うカスパーゼ系の解析を進めた。さらに細胞膜直下に局在してアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規阻害因子(cFLIP:代表者らが遺伝子とアミノ酸配列を決定した)を突き止めた。免疫不全マウスの腎に異種移植した家畜の未成熟な卵胞を含む卵巣組織片を対象にcFLIPのIn vivo遺伝子導入やiRNA処理を施して、人為的に卵胞・卵母細胞の生死を制御する技術の開発研究を進めた。成熟した雌哺乳類の卵巣内には胎児期にディプロテン期で減数分裂を休止した卵母細胞が50万個前後含まれ、性周期毎に卵母細胞は卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。この課程で、最終的に排卵にいたるものの100倍以上もの卵胞が発達を開始するが、それらの殆どが選択的に死滅して1%未満が排卵に至る。このような卵胞・卵子の選択的死滅はより優秀で強靭な子孫を残す戦略として重要であるが、これを制御している分子機構は未解明である。昨年度に続いて今年度も卵胞に発現している細胞死受容体・デコイ受容体系の同定をすすめ、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系の分子機構を精査し、卵胞上皮細胞が閉鎖に支配的に関わり、それがII型アポトーシス細胞(細胞内アポトーシスシグナルがミトコンドリアを介して伝達する)であることを明らかにした。さらに細胞膜直下に局在してアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規阻害因子(cFLIP:代表者らが遺伝子とアミノ酸配列を決定した)を突き止め、免疫不全マウスの腎に異種移植した家畜の未成熟卵胞を含む卵巣組織細片を対象にしてこの阻害因子のinvivo遺伝子導入やiRNA-発現阻害処理を施して、卵胞・卵母細胞の生死を制御する人為的手法の開発を進めた。

本研究は、家畜の卵巣において繰り返される卵胞の選択的死滅を制御している分子機構を解明し、これをもとに卵巣組織の凍結保存法を開発して、卵巣内潜在的卵母細胞を救命することで雌性遺伝子資源の保存を実現する技術を確立することを目指している。昨年度に続いて今年度も卵胞に発現している細胞死受容体系の同定をすすめ、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系の分子機構を精査した。その結果卵胞顆粒層細胞が閉鎖に支配的に関わり、これは細胞内アポトーシスシグナルがミトコンドリアを介して伝達するII型アポトーシス細胞であることを明らかにした。さらに細胞内でアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規な阻害因子cFLIPとXIAP(家畜の遺伝子とアミノ酸配列を決定した)を突き止め、免疫不全マウスの腎に異種移植した家畜の未成熟卵胞を含む卵巣組織細片を対象にしてこの阻害因子のin vivo遺伝子導入やiRNA-発現阻害処理を施して、卵胞・卵母細胞の生死を制御して救命する人為的手を開発した。
蛋白質フォールディングの物理化学的解析

蛋白質フォールディング機構の研究は、本来、蛋白質一次配列や立体構造の経験的データーベースに基づく帰納的なアプローチとは相補的な関係にあり、ゲノム情報科学における根元的な課題として重要視されなければならない。本研究は、このような立場から、球状蛋白質フォールディングの統一的描像を実験と計算機シミュレーションを用いて確立することを目的とする。以下の研究成果が得られた。(1)プロリンを含まないスタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)の巻き戻り反応をストップトフローpHジャンプ法により解析した。その結果、巻き戻り反応が複数の指数項で表される多相的な反応であることがわかった。一般に巻き戻りの多相性は変性状態におけるプロリン・ペプチド結合の遅い異性化反応に帰せられるが、上記の結果は、プロリン異性化以外にも多相性をもたらす要因があることを示している、ストップトフロー・ダブルジャンプの結果より、多相性の原因は、(i)SNaseの巻き戻り初期に複数の過渡的中間体が蓄積する、(ii)各中間体を通して複数の巻き戻り経路が存在する、の二点であることがわかった。今回の結果は、単一のポリペプチド鎖が複数のフォールディング経路を通って天然状態に至ることを明確に示した最初の例であり、今後、巻き戻りにおける複数経路の役割をさらに調べることが必要である。(2)ヤギαLAの大腸菌による組換え体(N末メチオニンあり)と真性体(メチオニンなし)の二種の蛋白質を対象に、分子動力学によるアンフォールディングシミュレーションを行なった。その結果、組換え体に付加しているN末端のメチオニン残基により、常温においてもN末端近傍の揺らぎが著しく大きくなることがわかった。今後、NMR等の実験等によりこれを確かめる必要がある。