hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオンエネルギー確率分布関数制御型プラズマによる窒化ホウ素薄膜の組成制御の研究

窒化ホウ素膜(BN膜)は、sp3軌道やsp2軌道からなるネットワーク構造をとりうる特異な材料である。本研究では、その混相系の組成制御技術の確立を目指し、プラズマ曝露によるBN膜構造変化を解析する。BN膜にプラスマ処理を施し、その表面構造・組成をナノスケールで解析した結果、入射するイオンのエネルギーに依存し押し込み硬さなどの物性値が変化することを観測した。また、分子動力学法によるシミュレーションコードを開発し、その構造変化過程を予測した結果、表面数ナノの領域でのAr原子の入射エネルギーに依存した表面構造変化を確認した。イオンエネルギー制御によるBN膜最適構造設計が可能であることがわかった。本研究は、イオンエネルギー確率分布関数(IEDF)を制御することで、超高硬度・高ガスバリア特性・高耐酸化性膜として期待されている窒化ホウ素膜(BN)の組織・組成制御技術の確立を目指している。本年度の課題の1つである、BN多層薄膜形成システムの新規立ち上げについては、基本コンセプトでもあるプラズマ中の磁場構造の設計修正が発生したため、年度内立ち上げが完了しなかった。一方で、既存の反応性プラズマ支援成膜(RePAC)システムにより形成したBN薄膜構造について、以下の知見が得られた。(1)BN/Si構造における電気伝導はFrenkel-Poole型であり、得られる誘電率は電気容量のそれと同程度である。(2)BN積層構造における剥離および硬度低下の要因として、相境界(粒界)へのBの偏析が考えられる。Bの偏析を制御することにより、剥離の防止、硬度低下の抑制が見込まれることが判明した。(3)RePACシステムによって形成したBN膜については、電気容量と機械的硬度(ヌープ硬さ)との明確な相関を確認することができなかった。(3)BN薄膜反応過程の計算コードを新たに開発し、プラズマ曝露を想定したイオン衝撃によるsp2結合-sp3結合の構造遷移が確認できた。今後、研究協力者とともにそれらの成果を学会発表する。なお、新規のBN多層薄膜形成システムについては、平成28年度8月を目処にプロセス立ち上げを完了させる予定である。当初予定の新規のBN多層薄膜形成システムの新規立ち上げが、プラズマ中の磁場構造の設計修正が発生したことにより年度内立ち上げが完了しなかったため。ただし、それ以外は計画通りに進んでいる。昨年度からの継続案件である、BN多層薄膜形成システム(反応性プラズマ支援成膜法、Reactive Plasma-Assisted Coating:RePAC)の新規立ち上げについては、本年度(H28)に完了し、Si基板上への成膜を確認した。また、原型機により作製したBN多層構造について様々な解析を進めた結果、以下の新しい知見を得た。(1)誘導結合型プラズマ曝露(バイアス周波数400 kHz)を施したBN膜最表面を、ナノインデンテーション法により解析した結果、押し込み硬さおよびヤング率が実効深さ約200nmの領域で変化することがわかった。またそれらの変化量が、プラズマ曝露条件に依存することがわかった。(2)BN積層構造における剥離防止法として、BN膜中のN量最適化が有効であることがわかった。(3)RePACシステムによって形成したBN膜は、BN膜組成比を最適化することで、大気暴露および真空環境下において安定した(低)摩擦係数が実現されることがわかった。(4)プラズマ曝露を想定した古典的分子動力学法によるシミュレーションを用いることで、イオン衝撃によるsp2結合からsp3結合への構造遷移およびsp3結合を有するクラスター構造形成を確認することができた。今後、(1)についてはバイアス周波数13.56 MHzの場合の構造変化、また(2)(3)については、新規システムによるBN膜に対する解析を進める。また、研究協力者とともに引き続きそれらの成果を学会発表する。新規のBN多層薄膜形成システムの立ち上げが、ようやく昨年度に完了した。そのため、新システムによるBN膜の構造解析が若干遅れている。本研究は、イオンエネルギー確率分布関数(IEDF)を制御することで、窒化ホウ素膜(BN)の組織・組成制御技術の確立を目指している。BN薄膜形成システム(反応性プラズマ支援成膜法、Reactive Plasma-Assisted Coating:RePAC)により成膜したBN膜の安定性を確認した。(1)誘導結合型プラズマ曝露(バイアス周波数400 kHz)を施したBN膜最表面を、ナノインデンテーション法により解析した結果、入射イオンの平均エネルギーに依存して、押し込み硬さの変化が異なることはわかった。特に、200 eV近傍でのプラズマ曝露では押し込み硬さは余り変化しないが、400 eVより大きい領域では押し込み硬さが減少することが明らかになった。(2)上記の押し込み硬さの変化の起源となる領域が、表面層から約30 nmの領域に限定されることも明らかになった。(3)上記BN膜形成過程およびその後のプラズマ曝露を模擬した古典的分子動力学シミュレーションを構築した。その結果、BN膜形成後のsp2結合およびsp3結合の組成比が、Arプラズマ曝露により変化することがわかった。

さらに、組成比の変化が、入射イオンの平均エネルギーに依存することが判明し、(1)で得られた結果と同様の傾向が示唆された。これらの結果は、入射イオンのエネルギーを制御することで、プラズマ曝露後のBN膜組成、特に機械特性を所望の値に設計できることを意味している。今後、電気特性変化などをさらに詳細に解析し、プラズマ曝露によるBN薄膜の表面構造・組成制御手法の確立を目指す。窒化ホウ素膜(BN膜)は、sp3軌道やsp2軌道からなるネットワーク構造をとりうる特異な材料である。本研究では、その混相系の組成制御技術の確立を目指し、プラズマ曝露によるBN膜構造変化を解析する。BN膜にプラスマ処理を施し、その表面構造・組成をナノスケールで解析した結果、入射するイオンのエネルギーに依存し押し込み硬さなどの物性値が変化することを観測した。また、分子動力学法によるシミュレーションコードを開発し、その構造変化過程を予測した結果、表面数ナノの領域でのAr原子の入射エネルギーに依存した表面構造変化を確認した。イオンエネルギー制御によるBN膜最適構造設計が可能であることがわかった。平成28年度は、(1)新規チャンバー立ち上げを優先して進める。平行して、研究協力者が提供する(2)BN膜/Si基板構造における機械特性・電気特性ならびにそれらパラメータの長期安定性に着目した解析を進める。特に(2)については、極限環境下の模擬したプラズマ曝露によるBN膜構造(組成、膜厚など)の変化・腐食を、入射イオンエネルギー依存性の観点から解析する。解析は主に、電気容量による誘電率及びトンネル電流による電気特性、ヌープ硬さ・摩擦係数による機械特性、表面ラフネス及び断面観察などの物理特性の3つの手法で実施する。さらに平行して、古典的分子動力学法によるシミュレーションを活用し、上記の実験事実を検証する。特にc-BN相とh-, r-BN相の遷移過程を中心に、入射イオンエネルギーの効果を明らかにする。[本課題での研究協力者]神港精機株式会社野間正男システム・プロセス設計協力とBNサンプル提供平成29年度は、(1)新チャンバーにより作製するBN膜の評価解析を進める。平行して、研究協力者から提供されたBN膜/Si基板のプラズマ曝露による構造変化を詳細に解析する。プラズマ曝露は、これまでと同様、誘導結合型プラズマシステムを用いるが、バイアス周波数を13.56 MHzに変更し、イオンエネルギー分布関数を変化させる。プラズマ曝露による機械特性・電気特性変動を詳細に解析する。解析は主に、ナノインデンテーション法による押し込み硬さおよびヤング率、電気容量測定法による誘電率に着目して実施する。平行して、古典的分子動力学法によるシミュレーションを継続し、上記の実験事実を検証する。特にc-BN相とh-, r-BN相の相互遷移過程や、c-BN相のクラスタリング過程の、入射イオンエネルギーの効果を明らかにする。[本課題での研究協力者]神港精機株式会社野間正男プロセス設計協力(及びBNサンプル提供)29年度が最終年度であるため、記入しない。
発生工学を用いた性腺・配偶子形成におけるTGF-β/Smadシグナルの機能解析

目的:遺伝学的アプローチによりアクチビンIIA受容体-Smad2シグナル伝達機構を個体レベルで明らかにし、その性腺を含めた個体発生における役割を解明する結果:1)アクチビンIIA受容体-Smad2シグナルのと中胚葉誘導、頭部形成アクチビンIIA受容体ホモ接合体(ActRIIA-/-)の15%は中胚葉異常を呈し胎生9.5-10.5日で致死となり、稀に頭顔面形成異常を生じ出生直前に死亡し、残り約80%は正常に出生する。アクチビンIIA受容体とSmad2遺伝子の遺伝学的相互関係を調べる目的でその複合ヘテロ変異マウスを作成し解析した。その結果ActRIIA-/-Smad2+/-の遺伝型のマウスはその殆どが中胚葉異常を呈し胎生9.5-10.5日で致死となり、稀にこの時期を過ぎたものでも頭顔面形成異常を生じ出生直前に死亡した。またActRIIA+/-Smad2+/の一部でも同様な現象がみられ、さらに性腺の低形成を認めた。すなわち、Smad2遺伝子1コピーを欠損することで、ActRIIA-/-では形質のpenetranceが100%に上昇し、ActRIIA+/-で新たにActRnA-/-でみられる形質が出現したことより、中胚葉形成、性腺形成などの個体形成においてActRIIAとSmad2は同一シグナル伝達経路に位置する可能性が示唆された。2)アクチビンIIA受容体と始原生殖細胞ムアクチビンIIA受容体欠損マウスを用いてその胎生期における始原生殖細胞の解析を行なった結果、ActRIIA-/-で始原生殖細胞の著明な減少を認め、ActRIIA+/-では野生型とActRIIA-/-の中間の値を示した。このことより、アクチビンIIA受容体は始原生殖細胞の発生、増殖、移動にも不可欠あることが示唆された。本研究は、遺伝学的アプローチにより性腺におけるアクチビンIIA受容体-Smad2シグナル伝達機構を個体レベルで明らかにし、Smad2の性腺機能、その発生分化における役割を解明する。1)性腺におけるSmad2遺伝子発現b-galactosidase遺伝子の挿入変異を持つSmad2ヘテロ接合体マウスより卵巣を回収、lacZ染色を行ない、Smad2遺伝子の発現を解析した。Smad2は卵胞発育の特異的段階に発現をすることを明らかにした。さらにアポトーシスとの関連を調べ、正常量のSmad2の発現が卵胞成熟に不可欠であることも明らかにした。このことは現在投稿準備中である。性腺の機能および発生過程においてSmad2がActRIIAの下流に位置するならば、ActRIIAホモ接合体マウスでみられる性腺の異常が、Smad2遺伝子1コピーを欠損することで増強されると考えられる。このことをマウス個体レベルで証明するため、Smad2ヘテロActRIIAホモ接合体を作成しその性腺を解析する。現在複合ヘテロ接合体の作成を終了し、ActRIIAホモ接合体の雄と交配中である。3)Smad2コンディショナルノックアウトマウスの作成Smad2遺伝子のloxP配列を有するターゲティングベクターの作成を完了し、胚性幹細胞(ES細胞)に導入、196個のES細胞クローンをスクリーニングした。その結果、5個の相同変異体を得ることに成功した。現在、これらES細胞クローンにCRE発現ベクターをさらに導入し、薬剤耐性遺伝子カセットの除去を試みている。最終的に得られた変異ES細胞よりキメラマウスの作成を行ない、Smad2loxpマウスの作成を行なう予定である。性腺特異的CRE発現トランスジェニックとの交配により、性腺特異的にSmad2遺伝子を破壊し、その機能を解析する。2)アクチビンIIA受容体と始原生殖細胞ムアクチビンIIA受容体欠損マウスを用いてその胎生期における始原生殖細胞の解析を行なった結果、ActRIIA-/-で始原生殖細胞の著明な減少を認め、ActRIIA+/-では

野生型とActRIIA-/-の中間の値を示した。このことより、アクチビンIIA受容体は始原生殖細胞の発生、増殖、移動にも不可欠あることが示唆された。
次世代航空通信向けマルチユーザMIMO技術の開発及び航空機縮尺モデルを用いた評価

本研究課題で着目しているContinuous Phase Modulation (CPM:連続位相変調)方式は,変調信号の包絡線が一定であるため,長距離通信を行う航空無線に適している.これを複数アンテナを用いた信頼性向上のためのMIMO方式であるSpace Time Block Code (STBC:時空間ブロック符号)と組み合わせることで,従来方式よりも信頼性の高い航空無線通信システムの実現をめざした.最終年度は,前年度までに提案した8送信アンテナの場合のSTBC-CPM符号化方式に関して,追加のシミュレーションを実施することにより,提案方式の有効性を確認し,査読論文として最終のとりまとめを行い投稿した.また,ソフトウエア無線プラットフォームを用いた評価環境の構築を実施した.さらに,構築したソフトウエア無線プラットフォームを活用し,複数周波数に対応した統合型航空無線通信端末についての基礎検討を実施した.近年,送受信アンテナを多数搭載したMassive MIMOが注目されている.今後の研究展開として,本研究成果と構築したソフトウエア無線プラットフォームを発展させることで航空無線へのMassive MIMOの適用可能性についても検討していきたい.本研究ではマルチユーザMIMOシステムを空港面における航空通信に適用するため、空港面環境におけるマルチユーザMIMO信号処理技術、地上および航空機上のアンテナ配置の検討を行う。平成27年度には、基礎検討としてすでに実用化されているマルチユーザMIMOシステム(IEEE802.11.ac)を用いた評価を行った。評価の結果、マルチユーザMIMOシステムを見通し通信が基本となる空港面に適用する際の課題が明らかとなった。本年度の基礎検討に基づき、平成28年度以降、マルチユーザMIMOシステムを空港面通信システムに適用するための基礎検討を実施していく予定である。また、平成27年度には、航空通信に適した変調方式である連続位相変調方式をMIMOシステムに適用させるための技術について基礎検討を行い、計算機シミュレーションによってその有効性を確認した。本研究成果は国内学会および国際学会にて発表し、次年度以降実用化へ向けた評価を実施していく予定である。本年度は、すでに実用化されているマルチユーザMIMOシステム(IEEE802.11.ac)を用いた評価を行うことで、既存システムの問題点について検討した。既存システムを利用したことで実験システムを効率よく構築することができた。今年度の検討事項を基に、次年度に改善方式を検討していく予定で進めており、おおむね順調に進展しているといえる。また、シミュレーションによる信号処理方式の基礎検討も平行して行っており、こちらに関しては順調に進展し、研究成果の発表を行うことができた。本研究ではマルチユーザMIMOシステムを空港面における航空通信に適用するため、空港面環境におけるマルチユーザMIMO信号処理技術の向上、地上および航空機上のアンテナ配置の検討を行っている。今年度は、見通し環境下におけるMIMO信号処理技術向上のための文献調査を中心に実施した。既存技術を整理するとともに提案方式に関する検討を行った。現在、ソフトウエア無線システムを用いたマルチユーザMIMO評価システムの構築中である。次年度は構築した評価システムを用いて評価及び信号処理方式の検討を継続していく予定である。最終年度には電波無響室での実評価を実施する。並行して、航空通信向けの信頼性向上を目的としたMIMO方式の検討を実施している。スペクトル特性が良好で定包絡線特性を持つため、航空通信に適した連続位相変調方式とMIMO方式の一種である時空間ブロック符号を組み合わせたCPM-STBC方式の検討を行った。ビット誤り率の簡易式を導出し、シミュレーション結果との比較を行い、良好な特性が得られていることが確認できた。本年度は文献調査及びシミュレーション評価を中心に実施したため、評価システムの構築がやや遅れてしまったが、次年度中に挽回見込みである。本研究課題で着目しているCPM方式は,変調信号の包絡線が一定であるため,長距離通信を行う航空無線に適している.これを複数アンテナを用いた信頼性向上のためのMIMO方式であるSTBCと組み合わせることで,従来方式よりも信頼性の高い航空無線システムの実現をめざしている.MIMO方式は,複数アンテナを用いることで多重化通信と信頼性向上を同時に実現可能である.本研究課題では,まず信頼性向上のためのSTBCについて検討し,その拡張として空間多重への適用を検討する.また,基礎検討としてはじめにシングルユーザMIMOについて検討を行い,その一般化としてマルチユーザMIMOへの適用を検討していく.今年度は,前年度までに評価した2及び4送信アンテナの場合を8送信アンテナへと拡張し,シミュレーションによる評価を行った.8送信アンテナの場合の符号化方式として様々なSTBCを比較検討するとともに,準直交符号を用いることで,従来方式よりも周波数効率を改善できる符号方式の提案を行った.提案方式に対する,理論検討及びシミュレーションによる評価を実施し,提案符号が従来方式よりも周波数利用効率を改善できると同時に,ブロック長の短縮(復号遅延の短縮)も可能であることを示した.来年度は,提案方式をソフトウエア無線を用いて実装し,実機評価を行う予定である.最終年度を残してシミュレーションによる評価まで完了した.本研究課題で着目しているContinuous Phase Modulation (CPM:連続位相変調)方式は,変調信号の包絡線が一定であるため,長距離通信を行う航空無線に適している.これを複数アンテナを用いた信頼性向上のためのMIMO方式であるSpace Time Block Code (STBC:時空間ブロック符号)と組み合わせることで,従来方式よりも信頼性の高い航空無線通信システムの実現をめざした.最終年度は,前年度までに提案した

8送信アンテナの場合のSTBC-CPM符号化方式に関して,追加のシミュレーションを実施することにより,提案方式の有効性を確認し,査読論文として最終のとりまとめを行い投稿した.また,ソフトウエア無線プラットフォームを用いた評価環境の構築を実施した.さらに,構築したソフトウエア無線プラットフォームを活用し,複数周波数に対応した統合型航空無線通信端末についての基礎検討を実施した.近年,送受信アンテナを多数搭載したMassive MIMOが注目されている.今後の研究展開として,本研究成果と構築したソフトウエア無線プラットフォームを発展させることで航空無線へのMassive MIMOの適用可能性についても検討していきたい.平成28年度には、1シミュレーションによる信号処理方式の検討、及び2ソフトウエア無線システムを用いた基地局アンテナ4本×ユーザアンテナ1本×4ユーザのマルチユーザMIMO評価環境の構築・評価を行う予定である。平成29年度には、1シミュレーションによる信号処理方式の改善、及び2ソフトウエア無線システムを用いた基地局アンテナ4本×ユーザアンテナ2本×2ユーザのマルチユーザMIMO評価環境の構築・評価を行う予定である。平成30年度には、構築したソフトウエア無線システムを用いて1航空機縮尺モデルを用いたマルチユーザMIMOシステムの評価、及び2航空機縮尺モデルを用いたアンテナ配置の検討に取り組む予定である。次年度は構築した評価システムを用いて評価及び信号処理方式の検討を実施する。次々年度(最終年度)は電波無響室での実評価を実施する。最終年度にソフトウエア無線を用いた実装と評価を実施し,より実用的な観点からの検討へと移行する予定である.実験用器材(IEEE802.11.ac関連機器)の単価が下がり、予定よりも安く購入できたため。文献調査等を優先的に実施したため実験用器材の購入が先送りとなったため。次年度以降の実験結果をより効率的に公表するための学会参加費及び、より詳細な実験を行うための実験機材の購入を予定している。次年度以降の実験時にあわせて購入予定である。
新規開発「低エネルギ-かさ高食」と味覚物質の便秘、肥満、糖尿病への治療応用

新たに開発した献立の実施と受入れ状況と体重減少効果を検討した。この献立は多くの肥満患者から受け入れられ、体重減少に有用であることが示唆された。現在、症例を増して継続性と効果を検証している。精神疾患患者の便秘の重症度の評価には、主観による指標よりも超音波による画像情報が有用であることが示唆され、集計作業を進めている。満腹感や容積について考慮され、具体的な献立が公開されたエネルギー制限食の報文やガイドラインは少ない。糖尿病や肥満を対象とした市販の1400kcal食と1600kcal食の献立集各3冊の栄養価を「五訂増補日本食品成分表」にもとづき算出した。献立集ごとの平均値を「日本人の食事摂取基準2010年版」および「平成20年度国民健康・栄養調査結果の概要」の40才代男女の値と比較した。6冊には315日分の献立が収載されていた。1冊は栄養成分の記述がなく、マンガンと必須脂肪酸はいずれにも記載されていなかった。算出エネルギー量は記載値の-41+11 kcalであった。飽和脂肪酸と食塩相当量は目標量や国民栄養調査結果よりも過剰な献立集があった。n-3系不飽和脂肪酸、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、ビタミンAは、推奨量、推定平均必要量あるいは目安量を満たさない献立集があった。サプリメントを使用しないエネルギー制限食の設計の難しさが再認識された。私達は、低エネルギーでありながら常食(1900kcal/日)と同等の満腹感が得られる献立を試作した。蛋白質は60g/日を確保し、食材だけでのビタミン、ミネラルの充足を条件とした。複数の献立を試算し、野菜の増量と玄米の活用により1200kcal(20kcal/kg標準体重)までの減量であれば朝食15種、昼夕75種の食事設計が可能であった。これを下回るエネルギー量では日常食としての献立は困難であった。1200kcal食では、月4回の行事食、麺類、カレーを常食と同じものにしても月間エネルギーの増加は1%以下であった。統合失調症による長期入院中の肥満患者で間食を制限せず、この食事の効果を検討した。その結果、1年後に有意な減量効果が得られ更に1年後の有意なリバウンドはなかった。肥満や糖尿病などでは病院のエネルギー制限食を基本として栄養指導されることが多く、長期的な療養生活の重要な指導媒体となる。今年度は昨年の1400および1600kcalの献立集に続き、市販の「1200kcalの肥満治療食」献立集4冊を検証した。いずれもビタミン、ミネラルの量は記載されていなかった。算出エネルギー量の平均値は記載値よりも43130kcal多く、エネルギー密度は0.660.81kcal/gであった。三大栄養素量は概ね肥満治療ガイドラインに合致していた。食事摂取基準と比較すると、飽和脂肪酸や食塩相当量が上限値を超え、n-3系不飽和脂肪酸、ビタミン、ミネラル、食物繊維が基準を満たさない献立集があった。しかし、いずれの値も国民健康・栄養調査結果に近い値であった。すなわち、献立集は低エネルギーでありながら可食重量は常食に近く、栄養成分の記載を充実すると患者の従来の食事と組み合わせた効果的な活用が期待できる。また、福岡県内7病院において糖尿病食として提供された1600kcalと1400kcalのエネルギー制限食を検討した。21日間のエネルギー量の平均は、1400kcal食で1,4261,504kcal、1600kcal食で1,5771,663kcalであった。いずれの病院もマグネシウム、亜鉛、ビタミンB_6が推奨量に、マンガンが目安量に、食物繊維とn-3系不飽和脂肪酸が目標量に達していなかった。一部の病院は、レチノール等量、ビタミンB_1、B_2、C、D、E、カリウム、カルシウムが推奨量や目標量に達していなかった。飽和脂肪酸が上限値を超え食塩相当量が目標量を上回る病院もあった。したがって、エネルギー制限食は病院管理栄養士が作成する献立でさえ栄養素が不足しやすいと考えられる。以上の結果を踏まえ、現在、栄養素が充足したモデル図献立の設計に取組んでいる。肥満患者は、エネルギー過剰でもビタミンやミネラルが不足する栄養障害(いわゆる現代型栄養失調)に陥ることがある。この栄養障害を防ぐために私たちは満腹感の得られる「低エネルギーかさ高食(1200kcal、熱量密度0.7 kcal/g)」を開発した。主食(炭水化物)と脂質を半減し、蛋白必要量60g/日を維持し、ビタミンとミネラルを玄米などの加工度の低い穀類で充足した。献立のバリエーションは110種類あり、エネルギー制限は1日ではなく月単位で考慮し、行事食、麺類やカレーは、常食と同じものを提供することで継続性を高めた。これまでに患者の過半数に受け入れられ、その約80%は間食を制限しなくとも体重が減少した。

また、「糖尿病食」「肥満治療食」と表題された市販の献立集16冊の栄養価を、食品成分表をもとに算出し「日本人の食事摂取基準2010」と比較検証した。その結果、すべての市販献立集において複数の栄養成分が不足していた。さらに、6つの総合病院で実施された21日分の「一般食」および「糖尿病食」の献立を検証したところ、全ての病院において複数の栄養素が食事摂取基準2010に達していないこと、および病院給食に共通して不足しやすい栄養素が判明した。病院での実施献立の調査は計画以上に進展し成果が得られている。一方、消化管に発現している味覚受容細胞と腸管運動との関連に関するin vitroでの実験は、1日あるいは2日のまとまった時間が確保できなかったため、やや遅れている。病院における甘味物質と便通との調査にはとりかかったが、参加する被験者が少ないため更なる時間を要する。24年度が最終年度であるため、記入しない。献立の調査は一段落したので、最終の今年度は、味覚と消化管運動に関する研究を集中して実施する予定である。
流星の質量を求める実習用可搬型流星観測教材の開発

本研究では、送信点と異なる場所に多数の受信点を配置し(多地点観測法)、流星が流れたときその飛跡に沿って生じるプラズマで反射した電波(流星エコーと呼ぶ)を、複数の地点で受信して、その到達時間差と送信点-反射点-受信点の距離を同時に測定することにより、精密な流星飛跡を求める観測装置を開発した。この教材は携帯性に優れ、流星の諸パラメータを求めることができ、超高層大気と極微小天体の関係を身近に感じることができる実習教材である。本研究は、送信点と異なる場所に多数の受信点を配置し(多地点観測法)、流星が流れたときその飛跡に沿って生じるプラズマに反射した電波(以下流星エコーと呼ぶ)を、多地点で受信してその到達時間差と送信点-電波反射点-受信点の距離(測距)より流星の正確な飛跡を求め、流星の質量を求める教材の開発を目的としている。本年度は距離を求める方法の開発に重点を置いた。測距にふさわしい送信電波の変調方法を様々に検討した結果、FMCW(Frequency-Modulated Continuous Wave)方式を採用した。そこで、この変調波を送信する変調機の作製、受信機の整備、200KHzで正確にサンプリングできるA/Dコンバータの開発を行い、総務省からの免許取得後、実際に測距実験を行った。既知の距離約61Km間の実験結果は約61.5Kmと得られ、誤差0.5Kmで求まることがわかった。次に実際に2009年12月のふたご群と2010年1月のしぶんぎ群で測距実験を行った。その結果、送信点-電波反射点-受信点の距離を求めることに成功した。一方で、各観測点での到達時間差より流星の三次元ベクトルと速度を求め、多地点観測法は空のどの領域に飛んだ流星を捉らえているのか観測で確かめてみた。使用する周波数を4波、受信地点を9ヵ所設置して観測に望んだ。長野県から発射されている3つの周波数の電波を東京近郊の9ヶ所で受信し、さらに福井県から発射されている電波もその中の3ヶ所で受信し、実効30地点の観測網を実現した。観測は2009年7月下旬から8月上旬のみずがめ座6流星群を目標に観測を行い、送信点群-受信点群を結ぶ方向が最も良く流星を捉えていることがわかった。バイスタティック・レーダーの一種である前方散乱レーダーの原理と矛盾しない結果である。さらに大規模なレーダー施設である京都大学のMUレーダーを用い、流星体自身が発生する微弱なプラズマからのエコー(ヘッドエコー)を観測し、正確な飛跡を求めることを試みた。そのため干渉計の補正法の検討を行い、補正ソフトを開発した。開発した教材のうち3KHzサンプリングのものは、東京大学教養学部の実習授業に取り上げられ、有効に教育的効果を発揮した。また、東海大学理学部や甲南大学にこの教材の普及活動を行った。さらに、国民向け(とりわけ若年層)には福島県鮫川村立鹿角平天文台の一般公開日に実演し、訪台者の関心を惹いた。上記の成果は、関連する学会・研究会で発表を行った。開発した観測方法は大気中で起こる短時間現象の検出にも応用でき、宇宙線観測への適用を試みた例も発表した。本年度は次の2点を重点的に開発した。一つは、初年度(21年度)開発した測距用受信機の動作信頼性の向上と、流星到達時間差法と組み合わせるための鏡面反射条件を満たす流星エコーの検出方法の開発である。受信機の問題は、回路および使用素子の検討を行い、実験で最適なものを見出し、改良を施した。検出方法はソフト的にS/N比を向上させ、数は少ないが、鏡面反射条件を満たすものを検出できるようになった。実際に2010年12月のふたご群と2011年1月のしぶんぎ群で測距実験を行った。その結果、低温時においても安定して作動し、送信点-電波反射点-受信点の距離を求めることに成功した。二つ目は、各観測点での到達時間差より流星の三次元ベクトルと速度を求める方法の確からしさを数値シミュレーションで検討を行った。その結果、この方法で求められた流星の位置は、計算結果と調和的であること、初年度の観測で流星を捉えられない空間的領域があることは、送信偏波の方向を考慮すると説明できることがわかった。そこで、2010年7月下旬にみずがめ座8南流星群を目標に観測を行い、数値シミュレーションから導き出された偏波の方向を考慮した4つのビーコン波を利用し、9カ所の受信地点を配置して観測に望んだ。その結果、捉えられない時間帯の問題は解決した。

また、大規模なレーダー施設である京都大学のMUレーダーを用い、流星体自身が発生する微弱なプラズマからのエコー(ヘッドエコー)を観測し、正確な飛跡を求めるための干渉計の補正法の検討と補正ソフトを引き続き開発した。さらに、開発した観測方法は大気中で起こる短時間現象の検出にも応用できると考えられ、宇宙線観測への適用を試みた例も発表した。開発した教材のうち3KHzサンプリングのものは、東京大学教養学部の実習授業に取り上げられ、有効に教育的効果を発揮した。また、前年度の東海大学、甲南大学に加え、今年度は大阪市立大にもこの教材の普及活動を行った。さらに、国民向け(とりわけ若年層)には総務省・文部科学省後援のアマチュア無線家向けのフェアで講演を行い、聴衆者の関心を惹いた。上記の成果は、関連する学会・研究会で発表を行った。本研究は、送信点と異なる場所に多数の受信点を配置し(多地点観測法)、流星が流れたときその飛跡に沿って生じるプラズマに反射した電波(以下流星エコーと呼ぶ)を、多地点で受信してその到達時間差と送信点ー電波反射点ー受信点の距離(測距)より流星の正確な飛跡を求め、流星の質量を求める教材の開発を目的としている。22年度までに開発した測距用受信機システムを4セット完成させた。同時に多地点解析用高帯域受信エコー時刻取得ソフトの開発を行った。これらを2011年12月のふたご座流星群で動作確認を行ったところ、安定に受信機が作動し、データ収集も問題なくできることが確認できた。このときのデータを解析した結果より、さらに流星エコー数を増やすため、S/N比を上げる目的でバンドパスフィルターの設計・製作を行った。また、遠隔地の観測点の保守を現地に行かなくとも動作状況や簡単な保守ができるように3G回線を使ったワイヤレス化を目指し、成功した。さらに移動に便利で観測場所での展開を容易にするために、バンドパスフィルター、受信機、電源、GPS、A/D変換器、データ収集システムを一体化した筐体に納めた。こうした改良を施した観測機材を実習授業に実際に投入し、その評価を試みた。その結果2012年7月下旬のみずがめ座δ南流星群の観測において、各観測点のエコー到達時間差から計算された距離のデータと本研究で開発した測距システムによるデータを、同時に得ることに初めて成功した。その結果の違いは約20Kmの違いで、各観測点で矛盾のないものであった。また、そのデータは青山学院大、東海大の卒論にも使用された。上記の成果の一部は、関連する国際学会・研究会で発表を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。
3Dプリンタによる4次元足場とiPS細胞を用いたフルカスタムメイド再生骨の開発

本年度は、前年度までの検討によりマウスiPS細胞iPS-MEF-Ng-178B-5株を用いた中胚葉系細胞への分化誘導検討を進めた。結果、一部の細胞がin vitroで中胚葉系の成熟組織を形成したことが示唆された。一方のこの組織の作出効率は大変低く分化誘導方法にさらなる改善の余地があることが考えられた。また、研究室でより多くの知見を有するヒトiPS細胞から中胚葉系細胞への分化誘導、組織化とin vivoへの移植を行ったサンプルの解析を進めたところ、中胚葉系組織の残存と、再生骨の形成が観察された。本年度は、並行して、三次元造形を施したTCPをアガロースモールドで三次元培養する検討に着手した。また、並行して三次元造形を施したTCPをマウス頭蓋骨欠損モデルに移植した。詳細は解析中であるが、概ね形状を維持しており、再生骨が形成されたことが示唆されている。マウスiPS細胞由来細胞をTCPへ浸透させ、天然骨に近い機械的特性を有し、自在に形状を制御することができる再生骨を作製するための検討を開始した。マウスiPS細胞の骨分化誘導の検討に先立ち、研究室で多くの知見を有する、iPS細胞の中胚葉系細胞分化誘導の検討を行うことで、長期にわたる分化誘導培養に適したマウスiPS細胞の無血清フィーダーフリー培養への馴化の方法を探索した。この検討にはnanogプロモータ領域にGFPタンパクを導入したマウスiPS細胞である、iPS-MEF-Ng-178B-5株を使用し、未分化性の維持ないし低下の判別を容易にした。結果、凍結保存より、一旦フィーダー細胞上に血清培地での培養をへてから、マトリゲルコート上に無血清培地での培養に馴化させることで、長期間の細胞培養が可能であることが明らかとなった。無血清フィーダーフリーへ馴化した細胞を中胚葉系細胞分化誘導培地での培養を実施したところ、経時的にnanogプロモータのGFP蛍光励起が徐々に減弱したことが観察された。現在最長12週間の培養に成功している。培地のpHや、細胞、コロニーの形態などから細胞は、生存しており、分化していることが示唆されている。中胚葉系細胞分化の程度については現在詳細に解析中である。マウスiPS細胞の未分化性の維持ないし減弱を容易に追跡することができる、iPS-MEF-Ng-178B-5株を活用することで、マウスiPS細胞を無血清フィーダーフリー環境へ馴化させ、また長い期間を要する分化誘導に応じて未分化性を減弱させることができることを確認した。コロニー形態などから、マウス細胞は分化していることが示唆されている。マウスiPS細胞の中胚葉系細胞分化誘導が確認されれば、マウスiPS細胞の骨細胞分化ができると期待される。2%アガロースモールドを用いた三次元培養方法などは研究室ですでに保有する技術であるため、平成28年度に得られた知見をもとにTCPとマウスiPS細胞由来細胞を組み合わせた、三次元形状を有する再生骨の作製条件の最適化の検討を進めることができると思われる。本年度は、マウスiPS細胞の骨分化誘導の検討に先立ち、研究室で多くの知見を保有する、マウスiPS細胞iPS-MEF-Ng-178B-5株を用いた中胚葉系の細胞への分化誘導について詳細な検討を実施した。具体的には、前年度に培養・分化誘導した細胞について、mRNAの抽出、cDNAへの逆転写、およびリアルタイムPCR法による遺伝子発現の経時的推移の評価を行った。結果、多能性マーカーであるnanogの発現は、分化誘導の後半になると減弱したことが示された。この結果は、細胞の培養時に観察された、nanogのプロモータに導入したGFPの蛍光励起が経時的に減弱したことと一致している。また、初期中胚葉系のマーカーであるbrachyuryの発現は培養期間中に亢進した時期がみられたことが示された。しかしながら、サンプル間のばらつきが目立つことから、培養方法等に改善の余地があることが考えられた。本年度は、並行して研究室でより多くの知見を有する、ヒトiPS細胞から中胚葉系細胞の分化誘導方法について検討した。研究室で有するプロトコールに則りヒトiPS細胞由来中胚葉系細胞に分化させたものをヌードマウス背部皮下に移植し、8週間の経過観察を行った。詳細は、解析中である。マウスiPS細胞iPS-MEF-Ng-178B-5株を用いた中胚葉系細胞への分化誘導検討と解析により、nanogのプロモータに導入したGFPの蛍光励起と同様に、nanogの遺伝子発現が経時的に減弱することが観察された。また、brachyuryの発現が亢進する時期がみられたことから、中胚葉系への分化誘導を進めることができると示された。しかしながら、遺伝子発現の推移にサンプル間のばらつきが見られることなどを踏まえ、培養方法に改善の余地があると考えられた。今年度は、研究室でより多くの知見を有するヒトiPS細胞から中胚葉系細胞への分化誘導、組織化とin vivoへの移植の検討を行ったところ、移植した細胞から再生骨の形成が観察された。ヒトiPS細胞から中胚葉系細胞への分化誘導法と、マウスiPS細胞から中胚葉系細胞への分化誘導法には共通点が多いことから、今後マウスiPS細胞の骨分化が速やかに進捗するものと考える。

アガロースモールドを用いた三次元培養や、TCPを用いた三次元造形、およびbFGFの徐放材などは研究室で保有する技術であるので、平成29年度に得られた知見をもとに、マウスiPS細胞由来骨細胞、TCPやbFGFを組み合わせた三次元再生骨組織作製は順調に進捗するものと考える。本年度は、前年度までの検討によりマウスiPS細胞iPS-MEF-Ng-178B-5株を用いた中胚葉系細胞への分化誘導検討を進めた。結果、一部の細胞がin vitroで中胚葉系の成熟組織を形成したことが示唆された。一方のこの組織の作出効率は大変低く分化誘導方法にさらなる改善の余地があることが考えられた。また、研究室でより多くの知見を有するヒトiPS細胞から中胚葉系細胞への分化誘導、組織化とin vivoへの移植を行ったサンプルの解析を進めたところ、中胚葉系組織の残存と、再生骨の形成が観察された。本年度は、並行して、三次元造形を施したTCPをアガロースモールドで三次元培養する検討に着手した。また、並行して三次元造形を施したTCPをマウス頭蓋骨欠損モデルに移植した。詳細は解析中であるが、概ね形状を維持しており、再生骨が形成されたことが示唆されている。培養上清やmRNAの発現量、各種染色などによる解析を進め、マウスiPS細胞の培養条件や分化誘導条件の最適化を進める。これにより、in vivoで三次元形状を有する再生骨を作製するにあたって最適な条件の探索を進める。さらに、再生骨の効率的な作製のために最適な増殖因子の徐放剤の配置などの検討の準備を進める。培養上清やmRNAの発現量、各種染色などによる解析を進め、マウスiPS細胞由来骨細胞の分化誘導法の最適化を進める。さらに、アガロースモールドやTCPやbFGFを組み合わせた三次元再生骨組織作製方法の検討を進める。iPS細胞の培養には、高額が必要となるため、まずは予備検討として、細胞や試薬など、すでに研究室で保有する物品を活用しながら、小規模での検討を行った。当初の予定よりも順調に細胞培養や分化誘導などを行うことができたことにより、順調に予定の検討を実施することができたため繰越金が発生した。iPS細胞を使用した研究には多額の費用が必要となるため、前年度に引き続き研究室で既に保有する細胞や試薬等を活用して小さな培養規模で検討を進めた。結果、予定よりも順調に検討が進んだため次年度使用額が生じた。次年度計画では、培養規模等を拡大しさらに加速度的に検討を進めていく必要があるため、この費用に充てる予定である。次年度に予定している検討項目では、培養規模を大幅に拡大する必要がある。また、次年度以降の検討の加速のための予算としても充てる予定である。
単一分子RGB蛍光団を用いたライブセル・フルカラーマッピング計測技術の開発

観測したいpHで光シグナルがOFFからONへ変化するアクチベータブル分子は、生体内の標的組織や細胞の特異的なpHを認識して可視化する分子プローブとして利用されている。しかし、一般的なturn-on型アクチベータブル分子は、pHを特異的にセンシングできる反面、連続的に変化するpHを計測することは難しい。単一分子でマルチカラー応答性を有するアミノベンゾピラノキサンテン系(ABPX)色素を母核とするpH応答型アクチベータブル分子とライブセル・マッピング計測技術に向けて、スピロエーテル(SE)環を有するABPX-SE (1)が、pHに応答して分子構造と色が段階的に変化することを見出した。一方、pHによるSE環の開閉環平衡の制御はできておらず、本色素をアクチベータブル分子として応用する上で課題となっていた。そこで、pHに対するABPX-SEの構造とSE環の開閉環平衡の関係の解明を目的とし、キサンテン環の窒素部位を構造改変したABPX-SE誘導体を新たに合成し、pH応答性を精査した。色素構造とSE環の開閉環平衡の関係の解明に向けて、電子供与能が異なる置換基を有するABPX-SE誘導体6種を新たに合成し、pH応答性を調べた。その結果、キサンテン環の窒素部位の電子供与性が大きいと生成する有色のカチオン体が安定となるため、SE環が開環する方向へ反応が進行する一方で、電子供与性が小さいと生成する有色のカチオン体が不安定であるため、閉環体が生成する方向へ反応が進行することがわかった。このように、キサンテン環の窒素部位に電子供与性が小さい置換基を導入することは、pHに応じてSE環が二段階に開環する上で有効となることが示唆された。本研究では、連続したpHをマルチカラーセンシングできる新たなアクチベータブルプローブを開発することに成功した(JOC、Heterocycles掲載)。また色素構造とpH応答性の関係を構造有機化学な手法により明らかにし、pHの変化による発色性や蛍光性の制御の向けた有用な知見を得ることができた。更に、スピロ環部位の構造改変の過程で、近赤外光発光化合物が新規に生成することを見いだした(特願2018-162404)。申請者は、「1分子で多彩な光と色を創る、操る、使う」としたコンセプトのもと、新色素骨格のアミノベンゾピラノキサンテン系(ABPX)の開発に取り組んできた。これまで、pHで分子を「操る」、「使う」分子技術の新たな知見と方策を得ることができた一方、フルカラー・マッピングに向けた蛍光団の「一分子RGB化」は達成できていない。そこで本年度は、従来の合成法では不可能であった蛍光団が非対称構造をもつABPXの合成法を新たに開発し、一分子R・G・B蛍光を示す誘導体を創製する。具体的には、ロドール系とインドール系骨格が組み合わさった蛍光団を母核構造とし、構築した合成法を用いて、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールなどを系統的に導入した非対称のABPX誘導体を合成し、モノカチオン型構造の緑色蛍光化を目指す。アミノベンゾピラノキサンテン系色素(ABPX)は、外的刺激の強さに応じてスピロ環が開閉し、平衡種の構造と色が二段階に変化する特徴をもったローダミン系色素である。一方、外的刺激による構造変換と光物性変化の段階的な制御は、本色素群をバイオイメージングプローブへ応用する要の分子技術となるが、スピロ環の開閉機構は未解明である。今回、スピロ環を構造改変したABPX誘導体を合成し、pHに対する発色の応答性を調べた。まず既知化合物のABPX-N-Ethylは塩基性からpH5.2条件下では、閉環体から有色の開環体への構造変換はほとんどみられなかったが、pH3.2から強酸性条件下で速やかにジカチオン型分子種を生成することがわかった。一方、スピロ環のカルボニル酸素を除去したABPX誘導体は、ABPX-N-Ethylと同様に塩基性からpH5.2条件下で、閉環体から開環体への構造変換はほとんどみられなかったが、pH3.3から強酸性条件下において、ジカチオン型分子種に加えて、モノカチオン型分子種の生成が増大した。更にスピロ環の酸素原子を窒素原子に構造変換したABPX誘導体は、pH4.2付近からモノカチオン型分子種の生成がみられ、pH3.3から強酸性条件下で、モノカチオン型に加えて、ジカチオン型が生成することを確認しpHに応答して構造が二段階に変化する様子がみられた。本結果より、pHに応答してABPXの構造が二段階に変化する上で、スピロ環部位の塩基性度を高めることは有用となることが示唆された。蛍光団のキサンテン環が非対称構造をもつABPX誘導体の合成に向けて研究開始時に考案した合成法では、Retro-Friedel-Crafts反応などの副反応が起こることで収率が低下する。従って,フルカラー蛍光マッピングを可能とする蛍光プローブへの機能化に必須となる一分子R・G・B化が進展していない。

単一分子でマルチカラー応答性を有するアミノベンゾピラノキサンテン系(ABPX)色素を母核とするpH応答型アクチベータブル分子とライブセル・マッピング計測技術に向けて、スピロエーテル(SE)環を有するABPX-SE (1)が、pHに応答して分子構造と色が段階的に変化することを見出した。一方、pHによるSE環の開閉環平衡の制御はできておらず、本色素をアクチベータブル分子として応用する上で課題となっていた。そこで、pHに対するABPX-SEの構造とSE環の開閉環平衡の関係の解明を目的とし、キサンテン環の窒素部位を構造改変したABPX-SE誘導体を新たに合成し、pH応答性を精査した。色素構造とSE環の開閉環平衡の関係の解明に向けて、電子供与能が異なる置換基を有するABPX-SE誘導体6種を新たに合成し、pH応答性を調べた。その結果、キサンテン環の窒素部位の電子供与性が大きいと生成する有色のカチオン体が安定となるため、SE環が開環する方向へ反応が進行する一方で、電子供与性が小さいと生成する有色のカチオン体が不安定であるため、閉環体が生成する方向へ反応が進行することがわかった。このように、キサンテン環の窒素部位に電子供与性が小さい置換基を導入することは、pHに応じてSE環が二段階に開環する上で有効となることが示唆された。本研究では、連続したpHをマルチカラーセンシングできる新たなアクチベータブルプローブを開発することに成功した(JOC、Heterocycles掲載)。また色素構造とpH応答性の関係を構造有機化学な手法により明らかにし、pHの変化による発色性や蛍光性の制御の向けた有用な知見を得ることができた。更に、スピロ環部位の構造改変の過程で、近赤外光発光化合物が新規に生成することを見いだした(特願2018-162404)。蛍光団が非対称構造をもつABPXの合成法の開発に向けて、縮環させたキサントン環骨格を段階的に構築することで非対称の蛍光団を構築し,最後に有機金属触媒などを用いることでベンゼン環を連結させる合成法の開発に新たに取り組む。申請者は、「1分子で多彩な光と色を創る、操る、使う」としたコンセプトのもと、新色素骨格のアミノベンゾピラノキサンテン系(ABPX)の開発に取り組んできた。これまで、pHで分子を「操る」、「使う」分子技術の新たな知見と方策を得ることができた一方、フルカラー・マッピングに向けた蛍光団の「一分子RGB化」は達成できていない。そこで本年度は、従来の合成法では不可能であった蛍光団が非対称構造をもつABPXの合成法を新たに開発し、一分子R・G・B蛍光を示す誘導体を創製する。具体的には、ロドール系とインドール系骨格が組み合わさった蛍光団を母核構造とし、構築した合成法を用いて、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールなどを系統的に導入した非対称のABPX誘導体を合成し、モノカチオン型構造の緑色蛍光化を目指す。フルカラー蛍光マッピングを可能とする蛍光プローブへの機能化に必須となる一分子R・G・B化が進展していないため、外的刺激による構造変換と光物性変化の段階的な制御に向けた基礎研究を優先して行ったため。当初の予定通りに前年度の研究を終えることができたが、前年度は、pHに対する応答性の解明に向けた研究を重点的に行い、非対称型構造を有するABPXの新規合成法の検討は行わなかった。従って次年度に、該当する実験項目を着手する予定である.
尿路上皮細胞の蓚酸カルシウム結晶付着能およびサイトカイン産生態の研究

尿路上皮細胞の蓚酸カルシウム結晶の付着を検討するために、MDCK、LLC-PK-1、BSC-1、HK-2を用いた。細胞に付着した蓚酸カルシウム(COM)結晶の定量は、^<14>Cでラベルした蓚酸カルシウム結晶(COM seed)を用いて、細胞に付着した蓚酸カルシウム結晶を定量化した。その結果、検討した細胞株すべてが、増殖期にあたる培養開始1日後にCOM seedの吸着のピークがあり、その後、COM seed吸着は漸減していく傾向が示された。細胞株のCOM seedの吸着能に関しては、遠位尿細管由来のMDCK細胞が最も強かった。次に、MDCKを用いて、COM seedの付着能が4時間のallopurinolの前処置によってどのように変化するか検討した。Allopurinolの前処置群は、0.2mM allopurinol処置群では、コントロールの80%,2mM allopurinol処置群では、コントロールの60%までCOM seed付着が減少していた。Oxypurinolでも同様の抑制効果が示され、xanthineの類縁物質であるhypoxanthineでは、全く効果は無かった。COM seedによるMDCK細胞の細胞障害をLDH release assayにより分析した結果、240分では、13%のLDH releaseが認められたが、30分以内であれば、%LDH releaseは、2%以下と殆ど認めなかった。従って、10分間のCOM seedの接触では、殆ど細胞障害はおきていないので、allopurinolによるCOM seed付着抑制の機序は、単純な細胞障害能では説明できなかった。今後は、allopurinolの結晶付着抑制のメカニズムを探るため、フリーラジカルを含めた他のパラメーターの測定も必要であると考えられた。一方、尿路上皮細胞のサイトカインの産生能の検討としては、COM seedlmg/mlをHK-2に加えて48時間培養して、その上清中のIL-6をIL-6キットを用いて測定したが、IL-6は検出できなかった。また、尿路上皮細胞のprimary cultureは、文献どおりの操作をおこなったが、通常のプラスチックフラスコによる培養では、充分な細胞を回収することができず、サイトカインの産生能については検討できなかった。尿路結石は、ネフロンの中で、crystal nucleation,growth,aggregation,concretionの現象が関与して完成するといわれている。それらの過程において、結石結晶の尿路上皮(近位尿細管や遠位尿細管)への付着は、結晶がある程度の大きさに育ち、retentionを引きおこすという重要なステップと考えられる。この尿路上皮-結晶相互作用において、サイトカインは何らかの生理的な作用を有している可能性がある。そこで、尿路上皮細胞のサイトカイン産生能を検討するため、シュウ酸カルシウムー水化物(calcium oxalate monohydrate,COM)結晶を尿路上皮細胞に付着させるモデルを作成した。用いた尿路上皮細胞株は、MDCK,LLCPK1,BSC1,HK-2である。それぞれの尿路上皮細胞株に付着するCOM結晶量を定量化するために、^<14>CでラベルしたCOM seedを作成した。このseedをHanks Balancedsolutionに浮遊させ、尿路上皮株に、数時間から5日間まで接触させた後、非付着性のCOM seedは、3回の洗浄でのぞき、付着したCOM seedは、6NHCLで溶解した後、液体シンチレーションカンウンターにより測定した。

尿路上皮細胞がconfluentに達して安定化した状態では、同じ条件でCOM seedを接着させても、細胞により、付着能が異なることが判明した。とくに、検討した細胞の中では、MDCK細胞が最も高い付着能を示した。一方、安定期に比較して、confluentにいたる増殖期にある細胞の方が、結晶付着能は、約1.2から1.5倍増加していることがわかった。また、付加的な実験として、結石のcrystal nucleation,growth,aggregationの阻止因子と知られている酸性ムコ多糖類についても、COM seedの付着能におよぼす影響について検討した。101000microg/mlのヘパリンまたはコンドロイチン硫酸を尿路上皮細胞株の表面にコーテイングすると、酸性ムコ多糖類の用量依存性にCOM seedの付着が抑制されることが示された。(第10回尿路結石研究会にて発表。2000年)以上より、尿路上皮細胞とCOM seedの付着するモデルがほぼ確立され、このモデルを用いて、結石付着という細胞障害により各種のサイトカインが産生されるかどうかを検討する予定である。前年度の研究により、各種尿路培養細胞株のシュウ酸カルシウム結晶付着能を定量化するモデルが確立され、各種酸性ムコ多糖類がシュウ酸カルシウム結晶の付着を抑制することを再確認した。本年度は、まず、蓚酸カルシウム結晶の付着により尿路上皮細胞がサイトカイン産生するかどうかを検討した。培養細胞株(MDCK, LLCPK1,HK2)に1mg/mlのシュウ酸カルシウム結晶を4時間接触させて、その培養液上清中のIL-6の濃度をサイトカインキットを用いて測定したが、検出されなかった。従来より、いくつかの尿路上皮癌細胞株はIL-6を産生することが知られていたが、正常尿路上皮細胞では、IL-6を産生する可能性は極めて低いと考えられた。次に、シュウ酸カルシウム結晶やシュウ酸カリウムが尿路上皮細胞株にあたえる細胞障害、allopurinolによる坑細胞障害効果、さらには、allopurinolのシュウ酸カルシウム結晶の付着に及ぼす影響について検討した。シュウ酸カルシウム結晶およびシュウ酸カリウムを4時間培養細胞株に接触させ、LDH release assayによる評価では、コントロールに対して14.5%程度の細胞障害があり、antioxidantである2mMのoxypurinolやallopurinolの存在下でシュウ酸カリウムや結晶を接触させると、8%の障害までとわずかに軽減することが判明した。さらに、この尿路上皮細胞とシュウ酸カルシウム結晶との付着におよぼすallopurinolの効果を検討したところ、シュウ酸カルシウム結晶の10分間の接触では、シュウ酸カルシウム結晶の付着量は、2mMのallopurinol, oxypurinolの前処置により、コントロールの付着量の50%まで抑制することがわかった。