hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
延髄孤束核ニューロンにおける喉頭知覚情報の処理に関する生理学的研究

喉頭粘膜からの末梢性情報は、上喉頭神経および舌咽神経をおもな入力路として延髄孤束核に中継され、その後の中枢過程で、嚥下や咳嗽といった上気道防御反射が惹起される。また、嚥下活動における筋活動は左右対称性であるとされており、我々はこれまでにネコを用いた脳幹切断実験や破壊実験などから、嚥下の左右同期性出力に関与すると思われる、脳幹内における末梢性情報の対側投射経路について検討してきた。その結果、一側脳幹への上喉頭神経を介する入力が、延髄の広い範囲にわたって対側へともたらされることが判明した。現在、対側延髄の電気刺激に対する延髄嚥下関連ニューロンの逆行性応答を細胞外記録法にて記録同定し、対側延髄への投射経路の詳細を検討している。具体的には、延髄小細胞性網様体にて同定された嚥下関連ニューロンにおいて、対側延髄の疑核(嚥下関連運動核)領域からの逆行性応答を記録している。そして、逆行性刺激に応答したニューロンの存在部位と、刺激部位との位置関係には、これまでのデータからは明らかな相関はみられない。この結果は、我々の対側嚥下関連ニューロンへの延髄内投射は広範囲にもたらされるという報告を裏付けるものである。今後はさらにsampleを増やし、検討を重ねていく予定である。さらに、in vivo patch clamp法を用いてラットの脊髄後角侵害受容ニューロンの細胞膜電位記録を行い、末梢からの疼痛、触刺激および熱刺激にたいするdirectな応答の解析を検討している。この結果、これまでに脊髄膠様質において、疼痛刺激および触刺激には応答するものの、熱刺激には応答しないニューロンが記録された。今後は本研究の手技を、孤束核嚥下関連ニューロンに応用し、嚥下や咳嗽といった様々な上気道防御反射の惹起に関する末梢知覚情報の処理について検討を行う予定としている。これまでの研究から咽頭期嚥下は,咽頭・咽頭粘膜を支配する上喉頭神経内枝ならびに舌咽神経によって惹起され,その出力パターンを形成するニューロン(嚥下関連ニューロン)はおもに延髄内に存在することが判明している.本研究は延髄弧束核およびその周囲の小細胞性網様体に存在する咽頭内注水によって惹起された嚥下時の嚥下関連ニューロンの神経活動を細胞外記録し,これらのニューロンに対する両側上喉頭神経ならびに舌咽神経からの促進性あるいは抑制性入力について解析した.その結果同側上喉頭神経から単シナプス性に入力を受けていると考えられる弧束核内のsensory-relayニューロンにおいては対側からの入力はわずか4%であった.そしてこれら末梢からの入力を受ける嚥下関連ニューロンはおもに弧束核間質亜核に存在していた.これに対して弧束核周囲の小細胞性網様体で記録された介在ニューロンにおいては対側からの入力は31%と弧束核内のsensory-relayニューロンに比し有意に高率に認められた.さらに対側からの入力には条件刺激下に明かとなった閾値下の興奮性および抑制性入力のいずも存在した.このことから対側末梢神経からの情報は弧束核内ではなく,おもに小細胞性網様体に存在する介在ニューロンにおいて処理されていることが示唆された.今後は除脳ネコを非動化し人工呼吸下にfictive swallowingさせ,各嚥下筋を支配する運動神経の神経電位を導出しながら,弧束核間質亜核内で嚥下関連ニューロンの膜電位変化を記録する予定である.喉頭粘膜からの末梢性情報は、上喉頭神経および舌咽神経をおもな入力路として延髄孤束核に中継され、その後の中枢過程で、嚥下や咳嗽といった上気道防御反射が惹起される。

今後は本研究の手技を、孤束核嚥下関連ニューロンに応用し、嚥下や咳嗽といった様々な上気道防御反射の惹起に関する末梢知覚情報の処理について検討を行う予定としている。
口腔バイオフィルム初期定着菌群による歯周病の個体差別予防モデルの構築

平成29年度は、平成28度の唾液細菌叢解析に引き続き、健康な児童50名分の唾液サンプルを更に追加して、出身地域別にその細菌叢を解析した。結果として、地区間に有意な差は認められなかったが、口腔清掃状態別にそれを解析すると、先の解析結果同様、清掃状態が悪化するに従い、Veillonella属細菌の割合の増加が認められた。これらの解析から、う蝕や歯周病の直接的原因である口腔バイオフィルムの初期形成に重要な役割を果たすVeillonella属細菌が、口腔清掃状態が悪化するに従い、定着しやすくなることが明らかになった。更に、本口腔細菌叢解析の過程で、既報のVeillonella属細菌には分類されないVeillonella属細菌未同定株を分離した。ゲノムシークエンスデータによるAverage Nucleotide Identity算出、複数のハウスキーピング遺伝子の塩基配列解析、生化学的性状検査等を行った結果、本未同定株を新菌種Veillonellainfantiumとして確立し、国際機関に株の寄託を行った(JCM 31738T、TSD-88T)後、口腔内におけるその出現頻度を明らかにした。また、研究実施計画に基づき、上記新菌種を含む口腔Veillonella全7菌種標準株のドラフトゲノム解析後、KEGGデータベースを用いて比較ゲノム解析を行った。特に口腔バイオフィルムの初期形成に影響を与えることが示唆されているVeillonella tobetsuensis由来Autoinducer (AI)-1、AI-2及びCyclo-Leu-Proの代謝経路を含めた機能解析、当該産物産生責任遺伝子の同定作業を遂行した。これら研究成果により、口腔バイオフィルム初期形成菌であるVeillonella属細菌を応用した口腔感染症の予防及び治療法の確立の可能性が強く示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。口腔バイオフィルム(歯垢)は歯周病の直接的原因である。その初期形成を担う、Streptococcus(ストレプトコッカス)属細菌とVeillonella(ベイオネラ)属細菌が定着しやすい個体環境を持つ宿主(ヒト)は、将来的に歯周病に罹患しやすいことが考えられる。本研究では両細菌属を用いて、歯周病の個体差別予防モデルの構築を目的として研究を進めている。これまでの研究過程から、我々が新菌種として発見したV. tobetsuensis(ベイオネラトウベツエンシス)由来の細菌間情報伝達物質がその形成に重要な役割を担うことが示唆された。本研究により、口腔バイオフィルム初期形成の役割を大きく担うV. tobetsuensisの情報伝達物質とそのゲノム情報が明らかになったことで、歯周病の原因である口腔バイオフィルムの形成機序が解明され、その予防法の開発にも繋がる重要な結果を得ることが出来た。研究計画に基づき、以下1.4.の要領で研究を遂行中である。3.上記項目2.の結果から、V. tobetsuensis由来AI-2産生に直接的に関わるLux S遺伝子の検索を行ったが、該当遺伝子は存在しなかった。しかし、明らかにV. tobetsuensisの培養上清からAI-2活性が認められていることと、AI-2の前駆体をコードする遺伝子が見つかったことから、V. tobetuensisのAI-2産生は通常の細菌のそれとは別経路で行われていることが示唆された。さらに、AI-1及びCyclo-Leu-Proの産生に関与するコード遺伝子は現在検索中である。4.上記項目3.において検索中の遺伝子の欠損株を作製するにあたり、CRISPR/Cas9及びCpf1システムを用いた口腔細菌では初のゲノム編集技術確立に向けて実験中である。本研究ではStreptococcus(ストレプトコッカス)属細菌とVeillonella(ベイオネラ)属細菌を用いて、歯周病を代表とした口腔感染症の個体差別予防モデルの構築を目的として研究を進めている。平成28年度は、Veillonella tobetsuensis(V. tobetsuensis)が産生する細菌間情報伝達物質、Autoinducer(AI)-1、AI-2、及びCyclo-Leu-Proの産生に関与するコード遺伝子を検索するに当たり、その比較対象となる口腔Veillonella全7菌種の全ゲノム解析を開始した。更に、V. tobetsuensis由来のAI-2及びCyclo-Leu-Proを用いて、代表的口腔バイオフィルム形成開始菌であるStreptococcus gordonii (S. gordonii)に対する影響を解析したところ、いずれもそのバイオフィルム形成を有意に抑制したが、プランクトニック細胞の増殖には影響を与えなかった。これらの結果から、V. tobetsuensis由来AI-2及びCyclo-Leu-Proは、S. gordoniiのバイオフィルム形成に抑制的に働きかけ、その増殖因子は別に存在することが明らかになった。更に、Streptococcus属とVeillonella属細菌が定着しやすい個体条件の選定を進めるため、その第一段階として、健康なヒト90名の唾液を採取し、そのメタゲノム解析を行った。その結果、口腔清掃状態が悪化するにつれて、Streptococcus属の割合は減少し、Veillonella属の割合が有意に増加することが明らかになった。これらの研究成果により、Veillonella属細菌が口腔感染症の予防、診断及び治療の指標として応用できる可能性が強く示唆された。研究計画に基づき、以下1.5.を遂行中である。1.口腔Veillonella全7菌種の全ゲノム解析を継続中である。2.上記研究実績概要より、V. tobetsuensis

由来AI-2及びCyclo-Leu-Proの両物質が歯周病を代表とした、口腔バイオフィルムによる感染症の予防に応用できることが期待できる。そのAI-2が、S. gordoniiのバイオフィルム形成に与える影響の解析結果に関してはJournal of Oral Biosciencesに受理され、Cyclo-Leu-Proの研究成果に関しては現在投稿準備中である。3.上記1.の結果から関連遺伝子を特定し、その欠損株を作製する。そのために、昨年度から継続してCRISPR/Cas9及びCpf1システムを用い、口腔細菌では初の試みとなるゲノム編集技術確立に向けて、諸条件を検討中である。また、表現型欠損株作製のコントロールとして、V. tobetsuensisと同じ口腔偏性嫌気性菌であるP. gingivalisを追加した。4.上記研究実績概要のメタゲノム解析結果より、Veillonella属細菌が口腔感染症予防、診断の指標として応用できることが示唆され、その成果は現在、PLoSONEに投稿中である。5.上記のヒト唾液のメタゲノム解析の他に、rpoB遺伝子の塩基配列を応用して口腔Veillonella属菌種特異的プライマーセットを開発した。その結果はOne-step PCR法として、平成28年度にPLoS ONEで公表した。更にそれを用いて、同唾液サンプル中のVeillonella属の分布と出現頻度を菌種レベルで解析した。その成果は、現在Anaerobeに投稿中である。平成29年度は、平成28度の唾液細菌叢解析に引き続き、健康な児童50名分の唾液サンプルを更に追加して、出身地域別にその細菌叢を解析した。結果として、地区間に有意な差は認められなかったが、口腔清掃状態別にそれを解析すると、先の解析結果同様、清掃状態が悪化するに従い、Veillonella属細菌の割合の増加が認められた。これらの解析から、う蝕や歯周病の直接的原因である口腔バイオフィルムの初期形成に重要な役割を果たすVeillonella属細菌が、口腔清掃状態が悪化するに従い、定着しやすくなることが明らかになった。更に、本口腔細菌叢解析の過程で、既報のVeillonella属細菌には分類されないVeillonella属細菌未同定株を分離した。ゲノムシークエンスデータによるAverage Nucleotide Identity算出、複数のハウスキーピング遺伝子の塩基配列解析、生化学的性状検査等を行った結果、本未同定株を新菌種Veillonellainfantiumとして確立し、国際機関に株の寄託を行った(JCM 31738T、TSD-88T)後、口腔内におけるその出現頻度を明らかにした。また、研究実施計画に基づき、上記新菌種を含む口腔Veillonella全7菌種標準株のドラフトゲノム解析後、KEGGデータベースを用いて比較ゲノム解析を行った。
高分子多相系における結晶化と高次構造形成-(ミクロ)相分離の効果-

1.ブロック共重合体のミクロ相分離下からの結晶化における高次構造形成において以下の結果を得た。(1)非晶性成分のガラス転移温度が結晶性成分の融点より非常に低いブロック共重合体において、ラメラ状ミクロ相分離からの結晶化では構造が再編された。一方、結晶性成分が円筒状ドメインにある場合はミクロドメイン内で結晶化し、その逆の場合は、結晶化温度が高い場合は結晶化によってミクロ相分離が破壊され低い場合はミクロ相構造を保持して結晶化した。(2)非晶性成分がガラス状態にある場合からの結晶化においては、ラメラ状円筒状を問わずミクロ相構造が完全に保持された。2.上記(2)の結晶化において、島状ドメインからの結晶化は認められず、円筒状あるいはラメラ状からの結晶化においてはアブラミ指数が小さくかつ見掛けの結晶化の活性化エネルギーが著しく大きかった。しかし、(1)においてはこれらの結晶化挙動はミクロドメイン形態に依らなかった。3.融点の互いに近い結晶性成分のみから成るブロック共重合体において、片方の成分が優先的に核生成・結晶成長し、その後もう一方の成分が結晶化することが観察され、その結果、組成の近いABA型トリブロック共重合体においては、同心円状の2重球晶が形成された。4.グラフト共重合体の結晶化において、核生成密度および結晶生長速度はグラフト密度に依存した。結晶性-非晶性成分から成るブロック共重合体のミクロ相分離構造場からの結晶化と生じた高次構造の特性を、(1)ミクロ相分離が強い偏斥下にある系と(2)弱い偏斥下にある系について、検討した。(1)について、ポリスチレン-block-ポリエチレングリコール-block-ポリスチレン(PSt-PEG-PSt)トリブロック共重合体を用いて検討した結果、結晶化度、融点ともPEGドメインがラメラからシリンダー状になる組成で不連続的に低下し、PEGドメインが島状である場合は結晶化が認められなかった。また、結晶化の見かけの活性化エネルギーは、シリンダー状以下の組成において非常に大きい値であった。小角X線散乱(SAXS)により評価された結晶化試料の高次構造は、融体中でPEGドメインが海状ミクロ構造である組成においては結晶-非晶のラメラ状繰り返し構造であり、シリンダー状組成においてはシリンダードメインを保持したままその中で結晶化している構造であった。(2)については、PEGとポリブタジエン(PBd)を成分とするジブロックおよびトリブロック(PBd-PEG-PBd)共重合体を用いて検討された。結晶化度、融点、結晶化の見かけの活性化エネルギー等の観察の結果、結晶化によって融体中のミクロ構造が破壊される本系においても、結晶化がミクロ相分離構造に影響されることが明らかになった。また、ジブロックとトリブロック共重合体の全結晶化速度の比較により、ミクロ相分離中のコンホメーションが結晶化に影響を与えることも示唆された。SAXSにより高次構造を解析した結果、PBdドメインがシリンダー状であっても、結晶化試料の結晶-非晶繰り返し構造はラメラ状であり、その試料の融解直後のミクロ相分離構造もラメラ状であった。結晶性-非晶性ブロック共重合体のミクロ相分離構造下からの結晶化によるミクロ相構造の再構成について、(1)融体中のミクロ相分離が弱い偏斥下にある場合と(2)強い偏斥下にある場合において、シンクロトロン放射光からの小角X線散乱法(SR-SAXS)により検討した。(1)においては、ポリエチレングリコール(PEG)とポリブタジエン(PBd)を成分とし、PEG成分が70%(BE70)、57%(BE57)、51%(BE51)および34%(BE34)のジブロック共重合体を用いた。融体中でラメラ状ミクロ相分離構造を呈したBE57とBE51においては、結晶状態においても結晶-非晶層のラメラ繰り返し構造を示したが、結晶化過程において結晶-非晶繰り返し構造に基づくピークの出現・発展とともにミクロ相分離構造に由来するピークが消失し、高次構造が再構成されることが示唆された。

融体中でPEG成分がマトリックス状に存在するシリンダー構造を示したBE70は、低い結晶化温度においては結晶状態でもシリンダー構造を示し、高い結晶化温度ではラメラ構造を形成した。一方、BE34では融体中でPEGがシリンダードメイン内にあるミクロ相分離構造を示しそこからの結晶化は全結晶化温度でその構造を維持したまま結晶化した。以上のように、弱い偏斥にあるミクロ相分離構造下からの結晶化においてもミクロ相分離構造や結晶化温度によっては、融体中のミクロ相構造を維持したまま結晶化することが明らかになった。(2)の系としてポリエチレン-ポリスチレンブロック共重合体(SE)を用いて検討した。この場合、結晶化においても散乱曲線のピーク位置は全く変化せず、融体中のミクロ相分離構造内で結晶化することを示した。グラフト共重合体の結晶化の特性および結晶性成分鎖のみからなるブロック共重合体の結晶化における結晶高次構造形成について明らかにした。(1)グラフト共重合体自身の結晶化の特性を明らかにするために、主鎖と側鎖が相溶する系である(ポリメチルメタクリレート)PMMAを主鎖としポリエチレングリコール(PEG)を側鎖とするグラフト共重合体を用いて、PEG側鎖の結晶化におけるグラフト密度の依存性を検討した。その結果、グラフト密度の大きいものについては、球晶の多発生が観察され核の発生が容易であることが示唆された。一方、グラフト密度が小さくなるにつれ、球晶の発生数が少なくなり、球晶成長も著しく遅くなった。これは側鎖間の距離が大きくなることおよびグラフト高分子の拡散速度の遅さに起因するものと推測された。(2)結晶性成分のみから成るブロック共重合体として、互いの融点が近いポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)とPEGを成分とするトリおよびジブロック共重合体を用い、その結晶高次構造の形成を互いに比較検討した。両共重合組成が互いに近いトリブロック共重合体においては、最初にPEGの球晶が発生・成長し次いでその成長面からPCL球晶が成長することにより、同心円状の2重球晶という特異な球晶を形成した。一方、ジブロック共重合体においては2重球晶の形成は認められなかった。しかし、最初にPEGが結晶化しその結晶ラメラの間でPEGが結晶化することが示唆され、ジおよびトリのどちらの共重合体においてもPEGの結晶化はPCLの結晶化後に生じるという特異な現象が生じることが示唆された。
森林バイオエアロゾルを標的とした高高度大気観測：風送拡散とその気候影響の評価

氷雲の形成を促す「氷晶核(氷核活性を持つ粒子)」の発生源は不明であり,その粒子密度は気候変動予測での不確定因子となる。その為,近年,分析・観測技術の向上に伴い検出可能となった大気浮遊微生物(バイオエアロゾル)の氷核活性へ学術的関心が集まっている。申請者らは,長年の飛行機観測などで,高度数千mの粒子から氷核活性を持つ微生物を検出しており,その種類から森林由来であると推察してきた。しかし,微生物の森林からの放出量は定かでなく,氷晶核の主要発生源とは断定できない。そこで,本研究では,観測機器を完備した森林観測サイトでの地上観測に,微生物捕集に特化した高高度大気観測を併用することで,森林地表から高高度までの浮遊微生物の鉛直分布を明かとし,氷核活性微生物の森林からの放出量を追究しつつある。2018年度は,森林バイオエアロゾルの捕集する観測調査を,筑波実験植物園と福島県波江において実施した。大気微生物が増える時期(6月と10月)には,植物園では,ヘリコプターと建物屋上を利用し,それぞれ高度500mと10m(樹冠)で大気粒子を捕集し,糸状の真菌が樹冠上まで浮遊し垂直分布していることを突き止めた。また,大気粒子試料から,糸状を形成する真菌が10種程度分離培養され,複数種のカビやキノコの胞子が樹冠外に放出されていることにあたりをつけた。一方,大気粒子から微生物のゲノムDNA直接抽出し(培養を経ない),解析した結果,分離培養された菌以外にも数百種以上の細菌と真菌が,森林内外に浮遊していることが分かった。こうした風送微生物に関する研究成果への学術的評価は高く,大気科学雑誌JGRに論文発表され,その論文がForbesのサイトにてニュースとして取りあげられた。また,一般市民からの注目も熱く,牧代表が密着取材をうけ,森林観測全般をサイエンスゼロ(Eテレ)にて30分番組にとして放送された。森林バイオエアロゾルの捕集調査:2018年4月から2019年3月にかけて,森林地帯に隣接した観測サイト(茨城県筑波実験植物園と福島県波江)において,地面上(高さ3m)において大気粒子を長期的に採取する観測調査を実施した。平行して,大気微生物が増える時期(6月と10月)には,筑波実験植物園において,ヘリコプターと建物屋上を利用し,それぞれ高度500mと10m(樹上)で大気粒子を捕集するとともに,係留気球によって高度100mまでの浮遊する大気粒子の垂直分布を測定した。いずれも,大気粒子はフィルター上に吸引捕集し,大気観測機器によって,粒子の垂直混合の指標となる環境データ(粒子密度,地表面水分,温湿度,風速等)も順調に計測した。培養を経ない微生物ゲノム解析:大気粒子試料から直接抽出したゲノムDNAに含まれるrRNA遺伝子とITS領域(細菌・カビに普遍的に存在し種の指標となる)の遺伝子情報を,超並列シーケンサー(MiSeq)によって解読した。遺伝子情報をバイオインフォマティクスによって系統分類学的に解析し,森林内外を浮遊する微生物群は数百種以上で構成され,カビとキノコ類が優占して浮遊していることが明らかになった。微生物の集積培養:大気粒子試料中の微生物を,寒天平板法および希釈培養法(液体培地)を用いて,培養し,分離株を得た。環境ゲノムから判った種組成情報をもとに,真菌用のポテトデキストロース培地で多くの微生物を分離できることが分かった。分離株のrRNA遺伝子とITS領域を解読し,種を同定したところ,10種以上の真菌と細菌で構成されていた。分離株の氷核活性の評価:小滴凍結法と氷核活性計測定を使って,真菌株の氷核活性を検証したところ,ー13度程度から氷を形成する菌株を確認できた。従って,森林から氷核活性細菌を分離培養できたと判断した。平成30年度に引き続き,森林地帯に隣接した観測サイト(茨城県筑波実験植物園と福島県波江)において,地面上(高さ3m)にける大気観測調査を継続する。また,平行して,大気微生物が増える時期(6月と10月)には,筑波実験植物園において,ヘリコプターと建物屋上を利用した観測を実施し,森林内外の垂直分布解明の手がかりとなる観測データと試料を集積する。拡充された大気試料を使って,「培養を経ない微生物ゲノム解析」を継続して実施する。また,既に解析済みの微生物群集構造データを,環境因子と比較することで,微生物群集の鉛直分布および時系列変化を理解し,「森林から放出(鉛直混合)される微生物群」を特定する。種組成解析を主体とした群集構造解析に加え,全ゲノム解析も重点化し,試料に含まれる氷核活性に関わる遺伝子の情報も集める。「微生物の集積培養」も推し進め,分離株のストックを増やす。分離株のrRNA遺伝子とITS領域を解読し,種を同定するとともに,氷核活性を小滴凍結法と氷核活性計によって検証する。強い活性の分離株を,活性の雲生成チェンバー実験に使い,実大気に近似した気象条件下(現場に近い断熱膨張過程)で大気粒子化し,雲形成過程を確める。「氷核活性微生物種の動態・分布調査」を本格化させる。「微生物群集の鉛直分布」と「氷核活性の評価」をもとに,森林から放出され氷核活性を持つ微生物の種(キーストーン種)を選定する。

キーストーン種に特異的な核酸(プローブとプライマー)を合成した後,核酸プローブを使い,蛍光顕微鏡下で試料中の特定種を識別する検出系(FISH法)を構築するとともに,核酸プライマーを用いて,微生物一細胞から計数できる遺伝子定量法(定量PCR法)を確立する。両手法を使い,大気粒子に含まれる微生物を経時的に計数し,氷核活性種の森林内外での動態と分布を定量的に理解する。氷雲の形成を促す「氷晶核(氷核活性を持つ粒子)」の発生源は不明であり,その粒子密度は気候変動予測での不確定因子となる。その為,近年,分析・観測技術の向上に伴い検出可能となった大気浮遊微生物(バイオエアロゾル)の氷核活性へ学術的関心が集まっている。申請者らは,長年の飛行機観測などで,高度数千mの粒子から氷核活性を持つ微生物を検出しており,その種類から森林由来であると推察してきた。しかし,微生物の森林からの放出量は定かでなく,氷晶核の主要発生源とは断定できない。そこで,本研究では,観測機器を完備した森林観測サイトでの地上観測に,微生物捕集に特化した高高度大気観測を併用することで,森林地表から高高度までの浮遊微生物の鉛直分布を明かとし,氷核活性微生物の森林からの放出量を追究しつつある。2018年度は,森林バイオエアロゾルの捕集する観測調査を,筑波実験植物園と福島県波江において実施した。大気微生物が増える時期(6月と10月)には,植物園では,ヘリコプターと建物屋上を利用し,それぞれ高度500mと10m(樹冠)で大気粒子を捕集し,糸状の真菌が樹冠上まで浮遊し垂直分布していることを突き止めた。また,大気粒子試料から,糸状を形成する真菌が10種程度分離培養され,複数種のカビやキノコの胞子が樹冠外に放出されていることにあたりをつけた。一方,大気粒子から微生物のゲノムDNA直接抽出し(培養を経ない),解析した結果,分離培養された菌以外にも数百種以上の細菌と真菌が,森林内外に浮遊していることが分かった。こうした風送微生物に関する研究成果への学術的評価は高く,大気科学雑誌JGRに論文発表され,その論文がForbesのサイトにてニュースとして取りあげられた。また,一般市民からの注目も熱く,牧代表が密着取材をうけ,森林観測全般をサイエンスゼロ(Eテレ)にて30分番組にとして放送された。森林バイオエアロゾルの捕集調査:2018年4月から2019年3月にかけて,森林地帯に隣接した観測サイト(茨城県筑波実験植物園と福島県波江)において,地面上(高さ3m)において大気粒子を長期的に採取する観測調査を実施した。平行して,大気微生物が増える時期(6月と10月)には,筑波実験植物園において,ヘリコプターと建物屋上を利用し,それぞれ高度500mと10m(樹上)で大気粒子を捕集するとともに,係留気球によって高度100mまでの浮遊する大気粒子の垂直分布を測定した。いずれも,大気粒子はフィルター上に吸引捕集し,大気観測機器によって,粒子の垂直混合の指標となる環境データ(粒子密度,地表面水分,温湿度,風速等)も順調に計測した。培養を経ない微生物ゲノム解析:大気粒子試料から直接抽出したゲノムDNAに含まれるrRNA遺伝子とITS領域(細菌・カビに普遍的に存在し種の指標となる)の遺伝子情報を,超並列シーケンサー(MiSeq)によって解読した。遺伝子情報をバイオインフォマティクスによって系統分類学的に解析し,森林内外を浮遊する微生物群は数百種以上で構成され,カビとキノコ類が優占して浮遊していることが明らかになった。
アメリカの住宅・コミュニティ開発政策における非営利組織の位置と役割に関する研究

本研究は、アメリカの住宅・コミュニティ開発政策における非営利組織の位置づけと役割を明らかにすることを通じて、政策体系の全体像を解明することを目的とした。非営利組織に対するヒアリング調査と、これら非営利組織が手掛けたプロジェクトの実地調査を行ない、営利追求と異なる動機を有する非営利組織の行動原理を明らかにした。本研究は、政府介入のあり方の是非をめぐる学術的な議論を深めることに貢献した。本研究は、アメリカの住宅・コミュニティ開発政策における非営利組織の位置づけと役割を明らかにするものある。平成20年度の研究の核は、アメリカでの現地調査であった。このアメリカ現地調査の事前作業として、5月下旬の日本地方財政学会の場を利用して国内研究協力者と研究打ち合わせ、6月の研究会及び打ち合わせ、そして続く7月に、渡米前の事前調査研究に基づく研究発表を行なうなど、入念な準備を行なった。そのうえで、8月から9月の約6週間にわたって、サンフランシスコ・ベイエリアで、非営利開発法人へのヒアリング調査、および非営利開発法人が手掛けたプロジェクトに対する実地調査を行なった。アメリカでの調査研究は、カリフォルニア大学バークレー校との連携によって遂行した。この調査研究は、非営利組織の財務資料を入手し、組織とプロジェクトの事情を明らかにする意義深いものとなった。渡米後は、10月の研究協力者との研究会で調査研究の成果発表を行ない、翌週の日本財政学会で、成果について意見交換を行なった。この調査研究による成果は、2009年3月、非営利組織の役割を政府との関係を位置づけながら明らかにする、極めて重要性の高い論文「アメリカの低所得者向け住宅開発プロジェクトサンフランシスコ・ベイエリアにおける非営利組織と政府の役割」としてまとめることができた。2009年5月31日の日本地方財政学会(関西大学)において、昨年度の研究成果の報告となる学会報告「アメリカの低所得者向け住宅開発プロジェクトにおける非営利組織と政府の役割サンフランシスコ・ベイエリアの事例を中心として」を行ない、国内研究者との意見交換を行なった。平成21年度の研究の核は、アメリカでの現地調査であったが、このアメリカ現地調査の事前作業として、7月に研究会及び打ち合わせを行なうなど、入念な準備を行なった。そのうえで、8月末から9月初めの7日間にわたって、サンフランシスコ・ベイエリアで、非営利開発法人へのヒアリング調査、および非営利開発法人が手掛けたプロジェクトに対する実地調査を行なった。この調査研究は、非営利組織の資料を入手し、インタビューを行なうなど、組織とプロジェクトの実情を明らかにする意義深いものとなった。渡米後は、11月の研究協力者との研究会で調査研究の成果を発表し、意見交換を行なった。この調査研究による成果は、2009年4月、住宅開発非営利組織の財務内容と組織形態を明らかにする、極めて重要性の高い論文「サンフランシスコ・ベイエリアの非営利開発法人財務諸表にみる非営利法人の姿」としてまとめることができた。これに加えて、関連する比較研究として、「テキサス州ダラス地域における低所得者向け住宅の供給と非営利組織」という研究ノートもまとめることができた。平成22年度の研究を遂行するための準備作業として、4月および6月に研究会及び打ち合わせを行なうなど、入念な準備を行なった。平成22年度の研究の核は、アメリカでの現地調査であった。9月上旬の7日間にわたって、カリフォルニア大学バークレー校のAndrew Barshay教授及びJin Murakami研究員と研究に関わる意見交換を行なった。加えて、同大学Steven Vogel教授の主宰する研究会に出席した。さらに、サンフランシスコ市内の住宅・コミュニティ開発非営利組織に対するインタビューを行ない、住宅・コミュニティ開発に関する実地調査を行なった。渡米後は、10月の研究協力者との研究会で夏期調査研究の成果を総括し、意見交換を行なった。本科研費による研究成果は、今年度、いくつかの研究論文として刊行された。第一に、「アメリカの低所得者向け住宅開発プロジェクトサンフランシスコ・ベイエリアにおける非営利組織と政府の役割」渋谷博史・中浜隆編『アメリカ・モデル福祉国家I』昭和堂、2010年6月であり、第二に、「テキサス州ダラス地域における低所得者向け住宅の供給と非営利組織」『香川大学経濟論叢』第83巻,第1・2号,2010年9月であり、第三に「サンフランシスコ・ベイエリアの非営利開発法人財務諸表にみる非営利組織の姿」『都市問題』第101巻,第10号,東京市政調査会,2010年10月である。
ジオキシゲナーゼモデル錯体の有機合成における新展開

コバルト(II)シッフ塩基錯体, Co^<II>(SB)は非プロトン性溶媒中でジオキシケナーゼ型反応活性を示す興味ある錯体であるが,反応溶媒,反応温度,基質およびコバルト触媒の構造等に依存して一原子酸素化反応および脱水素反応をも触媒することを明らかにした.まず,二原子酸素化反応において,フェノラート基質への二原子酸素導入反応で観測されるオルト位特異性は酸素取り込みステップに基質ラジカルが含まれない場合にのみ見られることを明らかにした.また,脂肪族ニトロ化合物を配位飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いて酸素酸化するとカルボニル化合物を生成することを見出した.一方,配位不飽和(HO)Co^<III>(SB)は一原子酸素化反応を触媒とすることがわかった. .例えば芳香族ヒドラゾン,脂肪族ニトロ化合物をメタノール中で酸素酸化すると基質C-C結合が開裂してカルボン酸メチルエステルを生成し,これは新しい型の酸化反応を提供している.さらに,スチレンは配位不飽和非平面(HO)Co^<III>(SB)を用いて2-プロパノール中60°Cで酸素酸化するとアセトフェノンと1-フェニルエタノールを生成する.この場合光学活性錯体を用いるとアルコールに不斉が導入される.合成化学的に有用な新規脱水素反応も見出されており,例えば(1)配位飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いた芳香族ヒドラゾンを酸素酸化はジアゾ化合物の簡便合成法を提供しているし, (2)配位不飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いて脂肪族ヒドラゾンを酸素酸化すると1-アルケニルコバルト錯体の新しい合成法となることも見出した.また(3)配位飽和(HO)Co^<III>(SB)存在下t-ブチルヒドロペルオキシドを酸化剤としてベンジルアルコール類を酸化すると高選択的に対応するベンスアルデヒドを生成することもわかった.以上のように,酸化反応に対して(HO)Co^<III>(SB)が重要であることがわかったが,この錯体の超酸および超塩基触媒作用も予見されるので,今後これらについて研究する.コバルト(II)シッフ塩基錯体, Co^<II>(SB)は非プロトン性溶媒中でジオキシケナーゼ型反応活性を示す興味ある錯体であるが,反応溶媒,反応温度,基質およびコバルト触媒の構造等に依存して一原子酸素化反応および脱水素反応をも触媒することを明らかにした.まず,二原子酸素化反応において,フェノラート基質への二原子酸素導入反応で観測されるオルト位特異性は酸素取り込みステップに基質ラジカルが含まれない場合にのみ見られることを明らかにした.また,脂肪族ニトロ化合物を配位飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いて酸素酸化するとカルボニル化合物を生成することを見出した.一方,配位不飽和(HO)Co^<III>(SB)は一原子酸素化反応を触媒とすることがわかった. .例えば芳香族ヒドラゾン,脂肪族ニトロ化合物をメタノール中で酸素酸化すると基質C-C結合が開裂してカルボン酸メチルエステルを生成し,これは新しい型の酸化反応を提供している.さらに,スチレンは配位不飽和非平面(HO)Co^<III>(SB)を用いて2-プロパノール中60°Cで酸素酸化するとアセトフェノンと1-フェニルエタノールを生成する.この場合光学活性錯体を用いるとアルコールに不斉が導入される.合成化学的に有用な新規脱水素反応も見出されており,例えば(1)配位飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いた芳香族ヒドラゾンを酸素酸化はジアゾ化合物の簡便合成法を提供しているし, (2)配位不飽和(HO)Co^<III>(SB)を用いて脂肪族ヒドラゾンを酸素酸化すると1-アルケニルコバルト錯体の新しい合成法となることも見出した.また(3)配位飽和(HO)Co^<III>(SB)存在下t-ブチルヒドロペルオキシドを酸化剤としてベンジルアルコール類を酸化すると高選択的に対応するベンスアルデヒドを生成することもわかった.以上のように,酸化反応に対して(HO)Co^<III>(SB)が重要であることがわかったが,この錯体の超酸および超塩基触媒作用も予見されるので,今後これらについて研究する.1.芳香族ケトンヒドラゾンのアセトニトリル溶液に室温で5配位型コバルト(【II】)シツフ塩基錯体を徐々に加えながら1気圧酸素を通じると反応は速かに進行し、対応するジアゾ化合物が好収率で得られることを見出した。この結果は触媒的酸素酸化による簡便なジアゾ化合物の新規合成法を提供するものとして注目できる。一方、この反応をメタノール中で行うと、基質ヒドラゾンの炭素-炭素結合の酸化的開裂が起こり、対応する芳香族カルボン酸メチルエステルが得られる。これは新しい型の酸化反応として興味深い。その反応機構は、先ず最初に生成したジアゾ中間体にコバルト錯体の作用で酸素が取り込まれ、ついで窒素分子脱離に伴ってメタノールが取り込まれて生ずる過酸化物コバルト錯体が分解するという、従来に例を見ない興味深いものであることを明らかにした。2.スチレン類は第1または第2アルコールの存在

下60°Cで酸素酸化されて主生成物としてアセトフェノン誘導体を生成するが、この反応の動力学的研究を行った結果、この反応が基質オレフィンとアルコールの共酸化(共酸化比=1:1)として進行し、その機構はアルコラートコバルト(【III】)錯体の律速分解によってカルボニル化合物とヒドリドコバルト種を生じ、このヒドリド中間体が速い反応で基質オレフィンに付加をし、生じた有機コバルト錯体が酸素酸化を受けてフェネチルペルオキシコバルト(【III】)錯体を生成して、これが反応条件下分解して生成物を与えるような各段階を含むことを明らかにした。更に、触媒活性に要求される錯体構造として配位不飽の非平面性シッフ塩基キレート構造が不可欠であることも明らかにした。
高齢化社会に向けての社会資本整備

本研究は、急速に高齢化・少子化が進むわが国において、今後どのような社会資本を、どの主体が、どれだけ整備すべきであるかを解明する。われわれの目指す望ましい社会資本整備は、公的年金・健康保健への国庫負担増等から生じる「高齢化の社会的費用」をできるだけ小さくするものである。従来、高齢者は年齢で区切られ、ひとまとめに論じられてきた。本研究は、むしろ高齢者を取り巻く自然環境や社会システムのなかで高齢者の経済問題を論じた。さらに、これまで顔の見えなかった高齢者を、肉体的・環境的・経済的に異なる生活者としてとらえた。これにより、高齢者の真に求める公共政策が浮かび上がり、高齢化の社会的費用を最小にする社会資本整備を考えるフレームワークを構築することができた。なお、財政面での現在肥大化している財政投融資制度の仕組みと問題点を詳細に検討した。同時に、社会資本をより広義にとらえ、公的年金や公的健康保険の社会的制度も含めて、望ましい制度のあり方を検討した。公的年金については、従来型の国庫補助依存体質を改め、各人が自己責任による老後の生活設計の下で資産蓄積を進めること、健康保険に関しては、わが国の医療体制そのものを長期的に見直し、地域医療の充実と、高度医療の区分を明確にする方策を論じた。高齢社会は現役引退後の時間が長期にわたることを意味する。その際、とくに重要となる余暇時間との関連で、米国における国立公園と博物館の二つの社会資本を論じ、望ましいあり方を提言する具体的な事例研究を行った。平成7年度は萠芽的研究の第一年目として、研究対象をできるだけ広くとるように努めるとともに、在来の分析用具に限らず様々なアプローチを試みた。研究経過は以下の通りである。1.社会資本のリスト作り:現在わが国に存在する社会資本のリストを作り、「誰が」、「どのように」活用しているのかを検討した。また高齢化社会を念頭に置き、社会資本の活用という視点から新しく社会資本を定義し直し、範囲を限定した。2.社会資本の実態調査:美術館、老人養護施設、図書館等を訪れ、実地調査を行った。3.生活者概念の明確化:経済学の「消費者」とは別の「生活者」概念を明確化させた。4.海外における高齢化進展の問題:現在および最近の英国および米国の実態。5.財政投融資の問題点:社会資本整備を財政面からみた。これら研究経過は以下のように評価されよう。高齢者の位置付けとして、個人や消費者ではなく、「生活者」の一つの類型としてとらえ、積極的な意味をもたせた。これは当初、予定していなかった成果であった。社会資本整備の実地調査により、データでは表わすことの出来ない面が多々あることを認識できた。写真・ビデオ収録を行い、実際にいかに活用されているかを調査した。海外における高齢化の現状については、英国人と米国人二人のよき助言者を得て、最新のデータとともに直面する問題点を十分に討議することができたのは有益であった。財政面では、財政投融資を詳細に検討し、有償の公的資金の必要性を確認するとともに、財政投融資の独自の存在意味を論証した。これも予定外の成果であった。当初予定の「高齢者家計の活用する社会資本」については、着手したばかりである。基盤研究Cの2年目にあたる本年度は、社会資本のなかでとくに自然とかかわる河川・公園、また高齢社会における老人施設のあり方を中心に研究を進めた。具体的な研究経過は次の通りである。1.米国における国立公園の歴史と問題点:世界で最初に国立公園制度を確立させた米国は国立公園先進国として知られている。国立公園の財政問題、自然環境保護と観光、公園の私的供給の可能性などを検討し、わが国の国立公園との比較を行った。米国における滞在型で教育機関としての国立公園の特徴が示唆的であった。

2.河川管理のあり方:たんに自然の猛威から生活を守るだけでなく、河川は生活の中の景観としても重要な意味をもつ。これからの社会資本整備では、本来の工学的な自然災害の防止に加え、このような生活面も反映したいものである。3.老人施設:老人諸施設の建設・運営を実態に即して検討し、福祉施設の問題点を考察した。また、民間施設との比較を行うとともに、施設面での公的介護保険の位置づけを行った。4.財政投融資の問題点:前年度から継続し、社会資本整備を財政面からみた。財政投融資の必要性を追認したが、大胆な制度改革の必要性を痛感した。これら研究経過の背景を述べよう。本年度、インターネット環境を整備したことにより、上記いずれの項目についても世界各地から最新の情報が得られるようになった。また、情報の発信も可能になったことも大きな成果であった。研究のまとめの年として、以下の課題を中心に研究を行った。1.モデル分析1:社会資本の活用者の視点から、それぞれの社会資本から得られる便益測定のためのモデルを構築し、シミュレーションを行った。一つは、年代という属性で活用者を分類し、個人的便益と社会的便益を考察した。いま一つは、どこまで自立して生活を営むことができるか、個人の能力属性にもとづいて活用者を分類し、考察した。このようにして、高齢者を分析モデルに組み入れることができた。2.モデル分析2:本年度はとくに供給サイドからも社会資本もとらえ、民間資金と公的資金にもとづく社会資本供給の効率性と公平性とを検討した。さらに、社会資本投資のタイミングも考慮に入れ、社会資本整備のタイミングの重要性を指摘した。3.歴史的な展望:高齢者の暮しのなかで、歴史的にみて、どのような形の生活様式があったかを検討した。とくに米国における高齢社会を、地域的な相違を念頭に置きながら明らかにした。一つは、伝統的な東海岸における都市型の高齢者の生活様式である。すでに出来あがった都市の機能をすべて活用しつつ、集合住宅として住まう形。いま一つは、西部、かつてカリフォルニアに見られたもので、何もないところから、高齢者の必要を見たすコミュニティを造成するという形である。後者のいわゆる高齢者村があまり成功をみなかった理由を詳細に検討し、人工的に造成されたコミュニティの脆弱さを浮き彫りにした。4.社会資本整備と高齢者の生活:従来、生産基盤の社会資本整備は生産面のコスト節約を進めたが、高齢化社会へ向けての社会資本整備によるコスト節約効果は、生活者とりわけ高齢者の生活費節約として実現するはずである。これにより、高齢家計の必要生計費に変化が生じ、さらにそれは生涯生活設計にも影響を及ぼすことを明らかにした。
魚類の細胞内寄生細菌感染症に対する感染防御機構の解明

ギンブナを用いてエドワジエラ症原因菌に対する感染防御機構を調べたところ、本細菌に対する感染防御には液性免疫ではなく、細胞性免疫が重要であることが明らかになった。また、細胞障害性T細胞が感染防御の中枢を担っていることが示された。次にブリより単離したT細胞関連遺伝子を用い、ミコバクテリウム症不活化ワクチンの有効性を解析した結果、不活化菌体単体では液性免疫を誘導したのに対し、アジュバント添加不活化菌体は細胞性免疫を誘導することが明らかになった。エドワジエラ症に対する感染防御における液性免疫、細胞性免疫の役割についてギンブナを用いて調べ、以下の成果を得た。1)E.tardaの生菌(LC)およびホルマリン不活化菌体(FKC)を接種後、抗体価を指標として液性免疫応答を調べたところ、両試験区ともに抗体価の上昇がみられたものの、FKC接種区のほうが有意に高い結果を示した。しかし攻撃試験の結果、死亡率はFKC試験区のほうが高かったことから、E.tarda感染時に液性免疫は誘導されるが感染防御には関連がないことが明らかとなった。2)LCおよびFKC接種後、細胞性免疫を制御しているIFNγおよび細胞障害時のエフェクター因子であるPerforinの腎臓白血球における遺伝子発現を指標として細胞性免疫応答を評価した。LC接種区ではFKC接種区およびPBS接種区と比較して強い発現が確認されたことから生菌接種により細胞性免疫が強く誘導されていることが示唆された。さらに生菌接種時に細胞障害性丁細胞(CTL)が誘導されるかを調べるため、フローサイトメーターにより全腎臓白血球に占めるCD8α+細胞の割合の増減を経時的に調べた。その結果、CD8α^+細胞の割合は増加するとともに細胞表面のCD8αの発現頻度が増加したことからE.tarda生菌を用いた感作によりCTLが誘導されていることが示唆された。以上の試験結果よりE.tarda感染時に細胞性免疫が誘導され、またCTLが感染防御に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、エドワジエラ症に対して不活化菌体によるワクチネーションでは感染防御能を付与できないことについて、不活化菌体では感染防御に十分な細胞性免疫能を持たせることができないことに原因があることが明らかとなった。これまでにエドワジエラ症に対する感染防御には細胞性免疫が主要な役割を果たすことを示唆してきた。平成23年度はギンブナを用いてE.tarda感作魚のリンパ球を同系統の未感染魚に養子移入して攻撃試験を行うことで、エドワジエラ症に対する感染防御にはCD8陽性T細胞が重要であることを示した。これまでホルマリン不活化菌体(FKC)をベースとした様々な試作ワクチンの有効性が検証されているが、我々のこれまでの研究によりFKC単体では細胞性免疫が早期に誘導されず、宿主に十分な感染防御能を獲得させることはできないことがわかっている。このことにより、エドワジエラ症に対しては細胞性免疫を効率的に誘導できるワクチンが有効性を示すことが明らかになった。細胞内寄生細菌に属するミコバクテリウム症原因菌について、ギンブナを用いて感染防御における液性免疫の有効性について検討した。ミコバクテリウム症原因菌を用いて攻撃試験後、組織内生菌数が減少してから血中抗体価が上昇したことから、少なくとも液性免疫はミコバクテリウム症に対する感染防御に有効ではないことが考えられた。このことから、ミコバクテリウム症に対する感染防御にも細胞性免疫が主要な役割を果たしていることが考えられた。ブリのヘルパーT細胞のマーカーCD4、細胞障害性T細胞のマーカーCD8遺伝子を単離した。これら遺伝子の組織発現様式は他魚種のCD4やCD8と同様であったことから、得られたブリCD4、CD8遺伝子はT細胞サブセットの同定に有効であることが示唆された。ミコバクテリウム症を用いて攻撃試験を行ったブリの体腎においてこれら遺伝子の強い発現が検出されたことから、ブリのミコバクテリウム症に対する感染防御にも細胞性免疫が関与している可能性が示された。ブリよりT細胞や細胞性免疫に関連する遺伝子CD4-1,CD4-2、CD8alpha、CD8betaに加えてT-bet、GATA-3、Interferon-gamma、IL-12p40を単離し、これらの発現様式を明らかにした。また、ブリのミコバクテリウム症に対する感染防御機構を明らかにするため、原因菌Mycobacterium sp.よりPurified protein derivative (PPD)を精製した。次にMycobacterium sp.に対する細胞性免疫応答を調べるため、Interferon-gamma遺伝子の発現を指標として、PPD抗原に対する遅延性過敏反応の評価手法を確立した。

ホルマリンで不活化したMycobacterium sp.(FKC)およびこれに油性アジュバントを添加したものを抗原としてワクチネーションしたブリの末梢血白血球を用いてPPDに対する遅延性過敏反応を解析したところ、FKC単体では細胞性免疫が誘導されないのに対し、油性アジュバント添加FKCの投与により強い細胞性免疫が誘導されることが明らかになった。一方これらの抗原を接種したブリのMycobacterium sp.に対する凝集抗体価を調べたところ、FKC投与魚において高い抗体価が確認されたが、油性アジュバント添加FKC投与魚では個yたいかの上昇が確認されなかった。このことから、FKC単体では液性免疫を、油性アジュバント添加FKCは細胞性免疫を誘導することが示唆された。また、魚類においても哺乳類と同様に液性免疫と細胞性免疫が相互に制御し合っていることが考えられた。ブリのMycobacterium sp.に対する感染防御機構の解明について、T細胞関連遺伝子の単離およびMycobacterium sp.を用いた攻撃試験系の確立まで進めることができたが、ミコバクテリウム症に対する感染防御における液性免疫、細胞性免疫の関与については明らかにできていない。その他の研究実施計画については、順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度の研究実施計画において未着手の課題とともに平成24年度に計画している課題について研究を進める。研究を行う上での問題点は特にない。
新規制限増殖型ウィルスを用いた消化器癌遺伝子治療の開発

消化器癌に対する遺伝子治療の有用性は報告してきたが、さらにE3 regionを改変してADPを高発現する事によって抗腫瘍効果を増強した、制限増殖型アデノウィルス(ADP CRAds)のバックボーンを作製した。このバックボーンを用いてミネソタ大学と協力して、CXCR4 promoterで増殖を制限されたCXCR4 ADP Luc CARdsを作成した。また、Cox2 promoterで増殖を制限されたCox2 ADP Luc CRADsを用いて、抗癌剤の治療効果判定を非侵襲的に行った。既存の治療効果判定法と比べ、より病理学的効果判定を反映しており、今後の有効なtoolであると考えられた。消化器癌の中でも、膵癌の予後は不良で、有効な治療方法はない。一方で、膵癌の転移症例にはCXCR4が高発現しているものが多いという報告がされている。今まで、我々はアデノウィルスのE3領域を改変し、蛍光・発光蛋白を用いることにより、微小転移の可視化をすることに成功した。一方で、我々の作成したE3改変アテノウィルスは既存の制限増殖型アデノウィルスに比べ、ADPが高発現し、より高い抗腫瘍効果を示すと考えられる。また、これらの細胞株の内、膵癌モデルを作成しやすい物、しにくい物を同定した。CXCR4 promoterを組み込んだpShuttle CXCR4と△E3ADPLucとのhomorogous recombinationを行うも、recombinationしないため、共同研究のUniversity of Alabama at BirminghamのDavid T. Curielに連絡し、sequenceを確認するも、PCの故障によりdataが無くなってしまっていたため、新たにfull sequenceを行った。その結果、squence上ではrecombinationすることが確認された。また、当院に既存していたエレクトロポレーター等は古く、確実にrecombinationを行うために、新規購入して現在、新たにrecombinationを条件の設定を変更して行っているところである。また、夏までにrecombinationができない場合は、共同研究のU of Mに行き、recombination等を行って制限増殖型アデノウィルスを作製する予定とした。一方でマウスを用いた皮下腫瘍モデルと、抗癌剤の治療効果の条件設定を同時に行い、既存の抗がん剤との比較ができるようなモデルは作成できている。一方で消化器癌と転移巣のCRCR4とCXCL12発現の定量化は、他施設からのIRBは通り難く、H23年度に倫理委員会に通す予定である。また、臨床検体を用いた組織培養系モデルは倫理的な問題もあり、in vitro、in vivoの結果を優先すべきと考えている。私の開発した新規CRAdsのバックボーンはADPを高発現し、より高い抗腫瘍効果をあげる事の出来るのみならず、CRAdsの増殖をDynamicにかつ非侵襲的にイメージングすることができる。現在まで、COX2 promoterで増殖を制限されたimaging CRAdsが微小な腹膜播種を検出することが可能なこと、抗癌剤の治療効果をimaginすることが可能であることを報告してきた。今回、我々はUSAのUniversity of Alabama at BirminghamのDr.CurielからCXCR4 promoterを分与され、CXCR4 imaging CRAdsの作製を試みてきた。しかし、homologous recombinationの段階で、新規CRAdsのバックボーンとCXCR4 shuttleとの間でのhomorogous recombinationで問題が生じ、ウィルスを精製することができなかった。そこで、University of MinnesotaのDr.Yamamoto、Dr.Davydovaが2011年度の日本遺伝子治療学会年次学術集会に参加するために来日された際にMeetingを行い、共同でCXCR4 imaging CRAdsを作製することとした。その結果、年度末にCXCR4 imaging CRAdsを作製することに成功する事ができた。一旦ここで研究を終了し、今後はこのCXCR4 Imaging CRAdsを用いてin vitro,in vivoで研究を引き続き行っていきたい。