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離散可積分系の手法を用いた直交多項式・連分数展開の理論と応用

時間連続の可積分系と直交多項式との関連性は,従来から様々な観点から研究がなされてきている.しかし全ての時間・空間変数が離散変数である離散系の場合は,Spiridonov, Zhedanovらによる離散戸田分子方程式,離散Lotka-Volterra方程式と3項間漸化式を満たす直交多項式との対応関係などのいくつかの部分的な結果しか得られていなかった.そこで本研究課題では,離散可積分系と双直交多項式との関連について考察した.そのために,まず、様々な離散可積分系を個別的に調べ,それぞれ直交多項式・連分数展開との関係を明らかにしてきた.例えば、離散Hungry Lotka-Volterra方程式の半無限格子解と$N({\ge 3})$項間の漸化式を満たす直交多項式、結合型KP方程式とパフィアンにより表される歪直交多項式などの関係を広田のタウ関数を導入することにより解明した.これにより広範囲は適用範囲を持つ直交多項式の議論が可能となった.さらに,ここで得られる離散方程式は任意の間隔で離散化された方程式であり,不等間隔離散可積分系の導出手法を与えている.また、ここでの結果を用いた特異値計算アルゴリズムの開発に対する理論的支援がなされている.これは,解の表記が可能であり,Lax-pairを持つという離散可積分系の特徴を用いることにより,離散ロトカ・ボルテラ方程式と行列の特異値との関連を明らかにした.時間連続の可積分系と直交多項式との関連性は,従来から様々な観点から研究がなされてきている.しかし全ての時間・空間変数が離散変数である離散系の場合は,Spiridonov, Zhedanovらによる離散戸田分子方程式,離散Lotka-Volterra方程式と3項間漸化式を満たす直交多項式との対応関係などのいくつかの部分的な結果しか得られていなかった.そこで本研究課題では,離散可積分系と双直交多項式との関連について考察した.そのために,まず、様々な離散可積分系を個別的に調べ,それぞれ直交多項式・連分数展開との関係を明らかにしてきた.例えば、離散Hungry Lotka-Volterra方程式の半無限格子解と$N({\ge 3})$項間の漸化式を満たす直交多項式、結合型KP方程式とパフィアンにより表される歪直交多項式などの関係を広田のタウ関数を導入することにより解明した.これにより広範囲は適用範囲を持つ直交多項式の議論が可能となった.さらに,ここで得られる離散方程式は任意の間隔で離散化された方程式であり,不等間隔離散可積分系の導出手法を与えている.また、ここでの結果を用いた特異値計算アルゴリズムの開発に対する理論的支援がなされている.これは,解の表記が可能であり,Lax-pairを持つという離散可積分系の特徴を用いることにより,離散ロトカ・ボルテラ方程式と行列の特異値との関連を明らかにした.本年度は、離散可積分系と直交多項式について個別的に調べ,データの蓄積を行った。得られた研究実績は以下の通りである。研究の成果の一部分は、昨年裳華房から出版された「可積分系の応用数理」(中村佳正編著)の第1章「可積分系の離散化について」と第6章「離散可積分系と数列の加速法」にまとめられている。また、相対論的戸田方程式をその特殊な場合に含む,R-IあるいはR-II多項式と呼ばれる多項式についても同様な議論ができることを確かめることができた。この多項式から、双直交性を持つ有理多項式を導くことが可能であり、現在、様々な研究が進められている。本研究において,行列式表現を基本とした理論を展開することにより、統一的議論が可能となることが期待されており、いくつかの場合において、その有用性を確かめることができた。本研究課題に関連して13年度は,離散可積分系と双直交多項式との関連について考察した。特に、前年度までに得られた結果と離散可積分系の理論を用い,離散Hungry Lotka-Volterra方程式の半無限格子解とN(【greater than or equal】3)項間の漸化式を満たす直交多項式との関係を明らかにした.またここで現れる離散方程式は,2次元戸田ヒエラルキーの離散化である.特にこの場合は任意の間隔を差分間隔とする不当間隔離散可積分系が導出されている.離散可積分系の特徴である解の表記が可能であり,Lax-pairを持つということを用いることにより,離散ロトカ・ボルテラ方程式と行列の特異値との関連を明らかにした.この結果を用いた特異値計算アルゴリズムの開発に対する理論的支援がなされているまた、離散方程式の導出に関連して,ソリトン解がパフィアンで表されるタイプについて,いくつかの新しい可積分な方程式の導出がなされている.ここでは主に,戸田方程式やKdV方程式のパフィアン化を議論した。さらに、代表的な超離散ソリトン系であるソリトンセルオートマトンが,ある拡張された戸田分子方程式の超離散化によって得られる事実に基づき,ソリトンセルオートマトンの保存量を求めることに成功した.
ヒツジ胎仔を用いた人工胎盤に応用できる膜型人工肺の開発

心ポンプのみで駆動させて回路内を陽圧に保つ人工胎盤の有用性と安全性について動物実験モデルを用いて検討した.人工胎盤を装着し胎児循環を保ちながらヒツジ胎仔を15時間生存させることができたが,高乳酸血症が進行して心ポンプ機能が悪化し,回路内血流量を保てなくなった.並列回路で分葉化させて膜型肺の血流抵抗を減らすことができれば,回路内血流量を維持して生存期間を延長できる可能性がある.心ポンプのみで駆動させて回路内を陽圧に保つ人工胎盤の有用性と安全性について動物実験モデルを用いて検討した.人工胎盤を装着し胎児循環を保ちながらヒツジ胎仔を15時間生存させることができたが,高乳酸血症が進行して心ポンプ機能が悪化し,回路内血流量を保てなくなった.並列回路で分葉化させて膜型肺の血流抵抗を減らすことができれば,回路内血流量を維持して生存期間を延長できる可能性がある.これまでの実験では東京電機大学(理工学部生命理工学系舟久保昭夫教授研究室)のプロトタイプ膜型肺(膜面積0.30m^2)を導入したことによって,人工胎盤回路を用いてヒツジ胎仔を6-12時間生存させることが可能となった.しかし,いずれもその経過とともに末梢循環不全による高乳酸血症が進行したため,それ以上の循環管理の継続は困難であった.今年度の実験では,高乳酸血症の進行を食い止めるため,ヒツジ胎仔と人工胎盤回路を恒温槽(39°Cの生理的食塩水)に浮遊させ,不感蒸泄による体温喪失を最低限にできる中性温度環境下で実験を実施した(n=8).その結果,3頭のヒツジ胎仔において1530時間の生存を達成した.これらのヒツジ胎仔では輸血なしで十分な中心静脈圧を維持することができ,循環血液量を自動補正するためのリザーバ回路は不要であった.人工胎盤回路内の血流量は概ね100200ml/minの間で変動し,体血圧との間に負の相関が認められた.すなわち,体血圧が高くなれば人工胎盤の血流が増え,動脈血pHは上昇,pCO_2は減少した.その結果,体血圧は低下に向かい人工胎盤血流は減少した.すると今度は動脈血pHが下降,pCO_2は増加することとなり,必然的に体血圧は上昇した.このような適応反応は30時間生存した胎仔で最も顕著に繰り返し認められた.また,今年度においては,実験を中断せざるを得なかった第一の理由は,高乳酸血症の進行というよりはむしろ膜型肺の劣化(中空糸の目詰まりや液漏れ破損による酸素化能・換気能の低下)であった.加えて,上記の3頭では出生前24時間,出生後2時間,出生後8時間の3回にわたって各臓器の血流量を測定することができた(colored-microspher法).血流量の増加もしくは維持が認められたのは副腎と左右心筋で,脳組織では血流量が減少しており,とくに皮質,白質,小脳ではその減少が著しかった.今後は膜型肺を適時交換しながら人工胎盤による循環管理のレベルアップをはかることが重要である.現行の新生児集中治療ではたとえ胎児肺に強い未熟性や低形成があっても人工呼吸が強制されるが,胎盤循環を模した人工胎盤装置を開発すればこうした症例を救命できる可能性が開かれる,心ポンプのみで駆動させて回路内を陽圧に保つ人工胎盤(臍帯動脈からの脱血回路+膜型肺+臍帯静脈への供血回路)の有用性と安全性について動物実験モデルを用いて検討した.東北大学動物実験委員会の承認(22医動-18)のもと平成22年1012月に実施した.実験には妊娠期間が確定したSuffolk種ヒツジを用いた.妊娠125140日(満期147日)に帝王切開で胎仔を娩出させ,臍帯動静脈に血管カヌラを挿入し,膜型肺に接続した.リポPGEを持続点滴して動脈管血流は胎児循環と同じ右左短絡を維持させた.回路内は予めヘパリン加母獣血で充填し,活性化凝固時間に基づいて回路内凝血を予防し,血流量は電磁血流計で測定した.手術後,胎仔ならびに人工胎盤は恒温漕(39°Cの生理的食塩水)に浮遊させた.Colored-microspher法を用いて各臓器の血流量を出生前後に測定し比較した.人工胎盤を装着できた3例ではいずれも胎児循環を保ちながら15時間生存させることができた.回路内血流量は約30120ml/min/kgの間で変動し,低酸素と低換気が進行すると血圧が上昇して回路内血流量が増加し,酸素化と換気が改善すると血圧が低下して回路内血流量が低下する適応現象が観察された.経過とともに高乳酸血症が進行して心ポンプ機能が悪化し,膜型肺自体の酸素添加能ならびに炭酸ガス除去能は維持できていたが回路内血流量を保てなくなった.出生後26時間に臓器血流量を維持できていたのは副腎と左右心筋のみで,脳では減少傾向が認められた.人工胎盤でヒツジ胎仔を15時間生存させることができた.並列回路で分葉化させて膜型肺の血流抵抗を減らすことができれば,回路内血流量を維持して生存期間を延長できる可能性がある.脳血流量を減少させない安全な循環管理の必要性が指摘きれた.
有機合成の手法による新しい甘味配糖体の開発

砂糖の数百倍の甘味を有するジテルペン配糖体バイユノシドの全合成を目的として、本研究を遂行し、天然物の全合成を達成すると共に24種類にのぼる関連化合物を合成した。人工類縁化合物のひとつである(+)バイユノ-ルにβーGlcーαーGlcを結合させた化合物は,天然物より以上に強い甘味を発現するのに対し、βーGlcーβーGlcを結合させた化合物は非常な苦味物質である事を知った。ごくわずかな構造の変化が甘味と苦味という正反対の感覚をよびおこす事実は、味の生理学に関しても興味深い。本研究の過程で、本研究者は熱グリコシル化反応を開発した。アルコ-ルと糖を結合させる問題は重要で、現在世界中がより効率的な手法の確立をめぐって競争をくりひろげているが、熱グリコシル化法は経済性と操作の容易さに関して、先頭に立つものであると確信している。本手法を様々な糖と様々なアルコ-ルの組み合わせについて検討し、また立体化学制御法についても可能性を見出すに至った。特に低温で長時間、αーメチルスチレンを酸補捉剤として反応させる手法を開発することにより、反応収率が大きく向上すると共に、動力学支配の生成物を高選択的に生成する事を明らかにした。立体選択的熱グリコシル化反応を機軸として、より複雑な構造からなるステロ-ルトリサッカライドであるオスラジンの合成研究を展開し、本法が縦横に活用できることを示した。当グループが先に確立した、バクユノサイドのアグリコン合成法により、大量のバイユノールを合成した。このアグリコンにまず2'位を識別したグルコース導入を検討し、当初従来のKoenigs-Knarr法により目的を達したが、銀塩や水銀塩を使用する欠点を改めるべく、新しいグルコシル化反応を検討した。その結果2位を保護していない塩化グルコシルとマルコールとの反応で、無水条件下、加熱のみにより進行することを見出した。かくて好収率に合成した2'位識別モノグリコシドに、第二の糖キシロースの導入を行った。高速液体クロマトを駆使して分離精製した生成物は天然のバイコノシドに完全に一致し、強い甘味を発現した。第二の糖をグルコースやラムノースに変える事により、アグリコンの絶対構造やグルコシル結合の立体化学にもとずく多数の誘導体を合成することができた。このうち天然型アグリコンにβ-glc-α-glcが結合した化合物が天然物をはるかにしのぐ強く、良質の甘味を発現することが明らかになった。β-glc-β-glc体は興味深いことに、強い苦味を発現した。先に述べた熱のみによるグルコシル化反応は、2位OHの糖のみでなく、ベンジル基で保護されたハロゲン化糖で一般的に応用すること可能となり、いっさいの金属塩を使用しない、簡便なグルコシル化法として確立することができた。第二の甘味天然物オスラジンの合成は、スティグマステロールを原料にして、アグリコン部の炭素骨格を組み上げる所まで進展した。今後グルコシル化反応を経て天然物を合成し、報告されている構造が真の甘味配糖体である事を確認した上で、誘導体の合成を行う。甘味配糖体の合成戦略には二つの重大要素である。アグリコンの炭素骨格合成法の確立、および効率的グリコシル化反応の開発である。当該年度、本研究者は後者の問題点を重点的に研究し、新しい、非常に簡便かつ経済的なグルコシル化ー熱グリコシル化反応ーを確立した。従来のグリコシル化反応は多量の銀もしくは水銀塩を必要とし、いわゆるけっして工業的プロセスに成り得ない反応であったのに対し、本研究者らが今回開発した方法は、一切の金属を必要としない点で画期的である。たとえばコレステロ-ルに対しての1.2当量のベンジル基で保護した塩化グリコシルの熱反応は、溶媒すら用いる事なく、120°Cに2時間加熱するだけで、92%の収率でグリコシドを与えた。

グリコ-スのみならず、キシロ-ス、ラムノ-ス、マンノ-ス等の糖を用いても反応はスム-ズに進行し、アルフ-ルの種類を様々に変化させて、本法を一般的に有効な手法として確立することができた。特に、マンノ-スやラムス-ムのように、2位のアキシャル置換基を有する糖に対しては、反応の立体選択性は非常に高く、αグリコシドを高選択的ないしは特異的に生成することを見出した。次にアグリコン部分の合成は、甘味配糖体オスラジンの有するステロイド環の形成及び側鎖上の置換基の立体化学制御の問題を検討し、すべての問題点を解決することができた。超甘味配糖体オスラジンとその類縁体合成の為に必要な条件は整備され、いよいよ甘味物質の全合成を進める時に至った。砂糖の数百倍の甘味を有するジテルペン配糖体バイユノシドの全合成を目的として、本研究を遂行し、天然物の全合成を達成すると共に24種類にのぼる関連化合物を合成した。人工類縁化合物のひとつである(+)バイユノ-ルにβーGlcーαーGlcを結合させた化合物は、天然物より以上に強い甘味を発現するのに対し、βーGlcーβーGlcを結合させた化合物は非常な苦味物質である事を知った。ごくわずかな構造の変化が甘味と苦味という正反対の感覚をよびおこす事実は、味の生理学に関しても興味深い。本研究の過程で、本研究者は熱グリコシル化反応を開発した。アルコ-ルと糖を結合させる問題は重要で、現在世界中がより効率的な手法の確立をめぐって競争をくりひろげているが、熱グリコシル化法は経済性と操作の容易さに関して、先頭に立つものであると確信している。本手法を様々な糖と様々なアルコ-ルの組み合わせについて検討し、また立体化学制御法についても可能性を見出すに至った。特に低温で長時間、αーメチルスチレンを酸補捉剤として反応させる手法を開発することにより、反応収率が大きく向上すると共に、動力学支配の生成物を高選択的に生成する事を明らかにした。立体選択的熱グリコシル化反応を機軸として、より複雑な構造からなるステロ-ルトリサッカライドであるオスラジンの合成研究を展開し、本法が縦横に活用できることを示した。
精神分裂病患者に対する訪問ケアの技術とその効果に関する研究

訪問看護室を擁し、4年間以上の訪問実績を有する精神科病院において、訪問ケア開始後2年間を経過した精神分裂病患者の全てを対象に訪問看護の開始前後2年間について入院期間と医療費を産出して比較した。調査を行うことが出来た全数50名(男性27名)について分析した結果、訪問看護前後において精神科への入院回数はともに1.2回であり変化は認められなかったが、訪問看護開始前の入院日数が平均で約366日間であったのに対して訪問看護開始後は平均で約102日と大幅に短縮されていた。また、訪問看護開始前後の2年間における医療費を試算した。試算の条件として、外来診療を2週間に1回、訪問看護を週に1回としておこなった。結果、訪問看護開始前の医療費総額は4,958,830円と算出された。これに対し、訪問看護開始後の医療費総額は2,478,992円と算出され、これも大幅な減少がみられ統計的に有意であった。また、精神科領域において訪問看護を利用する当事者に対してインタビュー調査と看護記録による生活背景の調査を行い、利用者の持つ主観的な訪問看護へのニードを分析した。その結果、訪問看護におけるケアは利用者のニードによって3つの領域「生活行動への援助」「情緒的充足をもたらす会話」「医療や状態管理に関する援助」にわけられ、それぞれにおいて利用者が重視する要素が異なっていた。たとえば生活行動への援助においては、「一緒に」「かわりに」等の看護者が生活行動に関わる割合(ケアの代償レベル)を重視しており、また情緒的充足をもたらす会話においては、利用者の意思を表出させるような言葉かけを重視していることが抽出された。精神分裂病患者に対する訪問看護によるケアの効果を明らかにするため、本年度は以下のように研究を実施し、知見を得た。1.医療記録の分析による訪問看護開始前後の入院日数の分析調査時点において2年間以上にわたって訪問看護を実施していた精神分裂病患者50名について、訪問看護開始前2年間との入院日数の比較を医療記録の分析により行なった。その結果、訪問看護開始前2年間における平均入院日数は367.5日、訪問看護開始後の2年間における平均入院日数は102.3日であった。2.医療記録の分析による訪問看護におけるケア内容の分析医療記録の分析から、訪問看護の機能における5つのカテゴリが抽出された。それらは症状モニタリング、セルフケア行動の不足を補う、日常生活動作における変化を察知する、現在の症状に関する判断、外来および入院治療を勧めるという5カテゴリであった。3.3事例におけるケア内容の継時的調査現在、3事例について訪問ケアの追跡調査を実施中である。これに対し、訪問看護開始後の医療総額は2,478,992円と算出され、これも大幅な減少がみられ統計的に有意であった。

その結果、訪問看護におけるケアは利用者のニードによって3つの領域「生活行動への援助」「情緒的充足をもたらす会話」「医療や状態管理に関する援助」にわけられ、それぞれにおいて利用者が重視する要素が異なっていた。たとえば生活行動への援助においては、「一緒に」「かわりに」等の看護者が生活行動に関わる割合(ケアの代償レベル)を重視しており、また情緒的充足をもたらす会話においては利用者の意思を表出させるような言葉かけを重視していることが抽出された。
バーチャルコンピュータに基づくコンピュータ動作の発見的学習教育システムの試作

試作した学習教育システムは2つある。まずプログラムとデータの流れを中心に表示する初級コース用システムである。これは,あまり細部の厳密性にとらわれずにコンピュータ動作のアウトラインを直感的に理解できるよう,表示内容を大幅に簡単化してアニメーション作成ソフトFlashを用いてアニメーション表示と擬音を発するシステムである。もう1つは,制御信号の働きをクロックピリオド単位で表示する機能を持った中級コース用システムである。中級コース用システムでは,コンパイラを組み込んで任意の演算内容が取り扱い可能であり,各構成要素などの解説はテキスト文の表示とナレーションによる説明が機能する。大学の文系3学部1年生(情報処理概論)および大学教員養成学部2年生(情報基礎)の講義に中級コース用システムを使用して評価したところ,コンピュータの内部動作の仕組みを学習するのに,教科書に従ったコンピュータの構成や個々の構成要素の解説よりも,モデルコンピュータを用いた本研究で試作した学習教育システムの方が分かり易く学習者の興味を引くことが確認できた。ナレーションによってさらに細部に注意を喚起することができた。また,中学2年生の技術・家庭科の情報基礎領域の授業に使用したところ,扱いは易しいと感じられ,コンピュータの仕組みを学習するのに理解し易く,表示画面の構成は約半数の生徒からよかったと評価された。授業の教示用としてだけではなく,単独で個人学習するのにも使用可能である見通しが得られた。今後は継続して,初級コース用システムの評価をするとともに,各構成要素の動作のシミュレーション機能を設けて試作を進める。コンピュータ内部でのプログラムやデータが入力される過程、コンパイル過程、実行時の命令とデータがやり取りされる過程、出力過程の各動作を視覚的に及び聴覚的に表現することで、コンピュータが外からの入力に対してどのように動作していくのかを理解するための支援となる学習教育システムの構築を目的とする。このときキャッシュメモリのサイズによるスワッピングの状態変化などのシミュレーション機能をもたせコンピュータ内部の各構成要素の働きと特性を興味に応じてどんどん発見的に体得できるようにする。本研究の試作は3段階に分けて進める。第1段階はプログラムとデータの流れを中心に表示する初級コース用システムの構築と基本仕様の検討である。コンパイラーと制御信号の働きを表示する機能をさらに追加した中級コース用システム構築を第2段階、各構成要素の動作のシミュレーション機能を設けた上級コース用システムの構築を第3段階とする。本年度は、デスクトップ型パーソナルコンピュータを用いた第1段階のシステム構築と基本仕様の検討を行った。基本仕様はまだ先を見越した十分な内容ではなく、これから何度か変更を重ねていくことになると考えている。試作システムは、コンピュータそのものを数ビットの簡潔なマシンとして、プログラムとデータの流れをクロックの刻み毎に動画で表示するようにし、マウスのクリックでコンピュータの各要素の解説を表示するようにしている。解説が簡潔でない、聴覚的表現が含まれていない、など改善すべき点は幾つかあるが、ネットワーク上で使えるようにしているのでインターネットの使えるパソコンルームでの授業に実際に利用可能である。この試作システムを実際の授業に使用し、その検討結果を踏まえて第2段階の試作を進める予定である。このときキャッシュメモリのサイズによるスワッピングの状態変化などのシミュレーション機能をもたせコンピュータ内部の各構成要素の働きと特性を興味に応じて発見的に体得できるようにする。第2段階はコンパイラーと制御信号の働きを表示する機能をさらに追加した中級コース用システムの構築とその評価である。各構成要素の動作のシミュレーション機能を設けた上級コース用システムの構築を第3段階とする。本年度は、まず昨年度に作成した試作システムを実際の授業に使用して、使い勝手と教育的効果などを検討した。

その結果、コンピュータの動作に興味を持たせ、コンピュータ動作の理解を助けるのに効果のあることを確認できた。本年度は第2段階としてコンパイラー部分をJavaを用いて作成し、コンパイラーの動きを表示する機能を追加し、インターネット上で使えるようにした。また、コンピュータのモデルを4ビット化してより実用的なシステムへの拡張を行い、第2段階のシステム構築を進めている。コンピュータ内部でのプログラムやデータが入力される過程、コンパイル過程、実行時の命令とデータがやり取りされる過程、出力過程の各動作を視覚的に及び聴覚的に表現することで、コンピュータが外からの入力に対してどのように動作していくのかを理解するための支援となる学習教育システムの構築を目的とする。このときキャッシュメモリのサイズによるスワッピングの状態変化などのシミュレーション機能をもたせコンピュータ内部の各構成要素の働きと特性を興味に応じて発見的に体得できるようにする。本研究の試作は3段階に分けて進める。第1段階はプログラムとデータの流れを中心に表示する初級コース用システムの構築と基本仕様の検討である。第2段階はコンパイラーと制御信号の働きを表示する機能をさらに追加した中級コース用システムの構築とその評価である。各構成要素の動作のシミュレーション機能を設けた上級コース用システムの構築を第3段階とする。本年度はシステムを第2段階としてより機能的にまとめた。具体的にはJavaを用いて作成したコンパイル機能への入力方法として、計算式をパソコンから直接キーインする方法と電卓のようなテンキーで入力する方法の両方が使用できるようにし、入力後には直ちにコンパイル結果がモデルコンピュータ内にセットされるようにした。その後はクロックの指定を進めるごとにモデルコンピュータ内の動作を動画によって信号の流れなどを分かり易く表示するとともに解説も表示するようにした。各構成要素の解説はマウスのクリックによって別にwindowを生成して表示するようにした。中学校で実際に授業で使用してみた結果、コンピュータ内の動作理解を支援する上で約3/4の生徒から本システムの有効性を示す結果が得られた。
超流動ヘリウム中の原子、分子、イオンの生成と分光学的研究

超流動ヘリウム中に中性原子や分子、イオンを注入できればそれらの粒子は気体、固体や通常の液体中とは全く異なったエネルギー構造、ダイナミックスを示すことが予想され、また多くの基礎科学への応用の可能性が高い。しかし、特に中性原子や分子の液体ヘリウムへの注入が困難であり、実験的には殆ど研究が成されていなかった。我々は、この困難を乗り越えるべくレーザースパッターを利用し、多くの種類の粒子を高密度で注入できる方法の開発を行い、これに成功した。本研究で特に関心を向けたのは簡単なエネルギー構造を持つアルカリ原子である。その結果、CsやRb原子の光学的スペクトルを初めて観測する異に成功し、それらのスペクトルのシフトが球形の原子バブルモデルにより良く説明できることを明らかにすることができた。更に、観測されたスペクトルの形から、原子の周りのヘリウムの分布が四重極振動をしていることを見いだした。また、軽いアルカリ原子では微細構造準位間の混合により電子の角運動量状態が重い原子と異なり、そのために消光やエネルギー準位の大きなシフトをもたらすことがわかった。我々は、更に円偏光レーザー光を用いた光ホンピング実験を行い、原子を完全にスピン偏極する事にができ、磁気共鳴、超微細構造共鳴の光学的観測にも成功し、g-因子、超微細構造定数の測定をする事ができた。得られたこれらの物理量の値は原子バブルモデルによる理論で説明することができた。本研究では、更に、超流動ヘリウムの表面に偏極された水素原子を吸着させる研究をも行った。水素原子の化学反応により分子が生成されるが、これらの分子はヘリウムの表面で反射し大きな加熱をもたらさないことがわかり、ボ-ズ凝縮実現に非常に近い密度の2次元偏極水素を作ることに成功した。本研究は、超流動ヘリウム中で大量の原子、分子、イオン、やクラスター生成し、これらの内部エネルギー状態やそれらの間のダイナミックスをレーザー分光法を駆使した実験および理論の双方から総合的に研究し、新しい環境下における物性物理学の足がかりになることを目的としている。超流動ヘリウム中の不純物粒子の物性は世界的にも興味をもたれているが粒子導入の困難から殆ど研究がなされていない。本年度では超流動ヘリウム中にこれらの粒子を効率よく生成できるレーザースパッタリング法の開発と装置の製作を行った。次に、このシステムを用いて、先ず種々のアルカリ金属のスパッタリングを行い、それにより生成されるアルカリ原子に、波長が大幅に変化できるパルス色素レーザーやTi:Al_2O_3レーザーからの光を与え、世界で初めて超流動ヘリウム中のアルカリ原子の吸収および発光スペクトルの精密な分光を行い、エネルギーの測定を行なうことに成功した。観測できた元素はルビジウムとセシウムで、これらの原子の吸収スペクトルは広く、自由原子に比べ大きく青方にシフトしているが、放出スペクトルは鋭く、その位置は殆ど自由原子のそれと一致していることを見いだした。特に注目すべき点は、D_2線に相当する吸収スペクトルは二重構造をしているということである。そこで、アルカリ原子のエネルギー原子バブルモデルを用いて計算を行なった。その結果スペクトルの位置、広がりは球状のバブル構造でおおよそ説明できることができた。しかし、D_2線に見られるスペクトル構造から、原子の周りヘリウムが非対称な振動をもしている成分もあることが明らかになった。更に、超流動ヘリウム中のルビジウムおよびセシウム原子に関し円偏光レーザー光による光ポンピングの予備的な実験を行い、これらの原子のスピンを偏極し、磁気共鳴を光学的に観測することにも初めて成功した。平成5年度には先ず、我々が開発したレーザースパッタ法により超流動ヘリウム中に導入したアルカリ原子の光ポンピング及び光-高周波(マイクロ波)二重共鳴の研究を行なった。

実験ではCs及びRb原子を対象に、円偏光したTi:サファイアをレーザー光で光ポンピングを行い、その基底状態の磁気共鳴と超微細構造準位間の共鳴を観測した。その結果、電子スピン、核スピンともほぼ100%偏極することに成功し、鋭い磁気共鳴の観測に成功した。また超微細構造スペクトルの観測にも成功し、エネルギー間隔が自由原子に比べ約0.5%増加していることを見い出した。これは、原子軌道が周りのヘリウムにより圧縮され、超微細相互作用が増加したことによるもので、原子バブルモデルによる理論的予想と一致することが確かめられた。次に液体ヘリウムの圧力を40気圧以下で自由に変えることのできるクライオスタットを製作し、これを用いて励起スペクトル、放出スペクトルの圧力依存性の研究を行なった。その結果、約20気圧までは圧力の増加とともにスペクトル巾及びシフトはほぼ比例して増加することが明らかになった。更に高い圧力では励起原子の放出が減少する現象を見い出した。この現象が従来懸案であった軽い原子が観測できない問題解決の糸口になるものと考えている。約25気圧でヘリウムは液相から固相へと相転移を生じるが、その前後でのスペクトルの変化の観測を現在進めている。我々が最初に開発に成功したレーザースパッター法により、超流動ヘリウム中にアルカリ原子を注入し、その光領域スペクトル、遷移の実験を行い、理論との対比を行った。本年度特に注意を払ったのは、アルカリ原子をレーザー励起した時、CsやRbなどの重い原子は光を放出が観測されるのに対し、それらより軽い原子は全く観測できないこと、またRbやCsに対しても、ヘリウム圧力のを増加させていくと、スペクトルの位置や幅の変化をもたらすだけでなく放出される光の強度が急激に減少するといった特異な現象の解明である。実験事実から、原子を取り巻くヘリウムの空間分布がこのような現象をもたらしていることを予想し、理論的考察を行った。CsやRb原子に対しては、1つのヘリウム原子との相互作用エネルギーが微細構造準位間隔より小さく、電子の全角運動量Jがよい量子数であるのに対し、軽いアルカリ原子では相互作用エネルギーの方が大きくLS結合が破れ、軌道角運動量Lが良い量子数となり、そのため原子の周りのヘリウムの分布が重い原子と軽い原子では大きく違い、そのため内部殻に近接するヘリウム原子の数が異なる。そのため軽い原子では基底状態と励起状態のエネルギーが接近、または交差し、スペクトルが大きく長波長側にシフトするか無輻射遷移を誘起するかの何れかが生じ、そのため実験的な観測ができないことがわかった。観測されたCsやRb原子のD_1とD_2線の強度比も同様な機構で説明できた。更に、D_2線の励起スペクトルが2成分に分離することを見いだし、これが原子バルブの四重極振動による一種のヤン・テラー効果であることを見い出した。
フィリピン小児出生コホートにおける急性呼吸器感染症病原体の経時的かつ網羅的解析

急性呼吸器感染症は小児において重要な疾患であり、発展途上国では小児死亡の主原因でもある。急性呼吸器感染症に関与する病原体の解明は、小児急性呼吸器感染症の診断や治療、予防に重要である。分子生物学的手法により、ヒト呼吸器臨床検体から多くのウイルスや細菌が高い感度で検出されるようになったが、それら病原体が有する臨床的意義の解明は十分ではない。フィリピンの小児出生コホートにおける定期的な呼吸器検体採取と分子生物学的検出手法の併用により、小児急性呼吸器感染症に関与する病原体の経時的かつ網羅的解析を目的として本研究を行う。
糖尿病におけるAGEs蓄積が軟骨変性に及ぼす影響に関する研究

変形性関節症(OA)と糖尿病(DM)の関連性を両疾患の病態に関与するとされている糖化最終産物(advanced glycation end products, AGEs)に着目して解析した。DMラットと正常ラットの比較において、膝関節内のAGEs蓄積と軟骨変性に関連する遺伝子および蛋白発現には差がなく、軟骨細胞を高血糖状態で培養しても軟骨細胞へのAGEs蓄積は増加しなかった。膝前十字靱帯切離によるOAモデルではDMラットの軟骨変性がわずかに高い傾向を示したが、DMでは関節内に蓄積したAGEsが軟骨変性に関連するとした仮説は実証されなかった。本研究は、変形性関節症と糖尿病との関係をAGEsに注目して評価することが目的である。平成19年度は、非肥満II型糖尿病モデルであるGKラットを用いて、5週齢と20週齢の関節軟骨内に蓄積するAGEsとRAGEの発現が軟骨基質代謝に及ぼす影響について同週齢のWistarラットと比較検討した。1.血液生化学的検討では、GKラットの血糖値は20週齢で317mg/dl(Wistarラット174mg/dl)と中程度の高血糖状態を呈したが、肥満と脂質代謝異常は認めなかった。4.関節軟骨の細胞培養において、GKラットではWistarラットに比べてMMP-13のmRNA発現が亢進していた。また培養液にAGEsや抗RAGE抗体を添加することで、GKラットではCILPのmRNA発現が亢進した。蛋白レベルでは上記刺激により、CILP、RAGE、MMP-13の産生量が両群とも増加したが、刺激に対する反応性はGKラットの軟骨細胞が正常ラットに比べて低かった。以上の結果より、GKラットとWistarラットで関節軟骨のAGEs蓄積に差はなかったが、軟骨細胞培養の実験では、刺激に対する細胞の反応性が両群で異なることが確認された。しかし今回の結果では変形性関節症と糖尿病との関連性の評価には不十分であるため、さらなる検討が必要である。平成20年度は高血糖状態が軟骨細胞に及ぼす影響を確認した。5週齢Wistarラットの関節軟骨より軟骨細胞を単離培養して、培養液にglucoseをそれぞれ5mM,10mM,20mM,30mM添加した群を作成した。1週、2週、4週後に以下の検討を行った。2.RAGE発現の評価:軟骨細胞のRAGEはRT-PCRとWestern blottingでともに検出され、培養期間が長いほど発現が強かったが、glucose濃度の違いによる発現量に差はなかった。3.軟骨細胞機能の評価:RT-PCRによるII型コラーゲンとアグリカンのmRNA発現量は各群間で差がなかった。4.小胞体ストレスの評価:軟骨細胞のユビキチンはWestern blottingにより、XBP-1とCHOPのmRNA発現はRT-PCRで確認されたが、glucose濃度による差はなかった。しかし、ユビキチンとCHOPの発現は4週培養が2週培養より強かった。以上の結果をまとめると、培養期間が長くなればRAGEの発現やER stressは上昇したが、glucose濃度が変化しても軟骨細胞内のAGEs蓄積やER stressの上昇はなく、細胞機能も障害されなかった。つまり500mg/dl程の高血糖状態では、関節軟骨にはAGEs蓄積およびER stressが上昇しないことが確認され、糖尿病における軟骨変性には別の要因が関与していることが示唆された。平成21年度は糖尿病ラット(GKラット)における滑膜組織へのAGEs蓄積と軟骨のsusceptibilityに及ぼす影響について組織学および分子生物学的に検討し、Wistarラット(対照群)と比較検討した。1.滑膜組織の評価20週齢の両群ラットの右膝関節を採取してパラフィン標本を作製した。左膝関節からは滑膜組織を採取し、mRNAと蛋白質を抽出して、以下の検討を行った。2.ラット変形性膝関節症モデルでの評価20週齢のGKラットとWistarラットの右膝関節前十字靭帯を切離(ACLT)し、術後2週、3週、4週目にラットを屠殺して、膝関節を採取し、脱灰後にパラフィン標本を作製した。(1)軟骨変性度:ACLT切離後の時間の経過に伴って勢骨の変性は進行した。術後3週時の大腿骨のみにおいてGKラットがWistarラットに比べ変性が強かったが、4週時では両群に差がなかった。(2)滑膜変化:ACLT2週後から滑膜の肥厚、血管増生、細胞浸潤、肉芽形成を認め、術後3週、4週時にも同等の所見がみられた。これらの変化はGKラットとWistarラット間で差がなかった。(3)免疫組織学的評価:滑膜のAGEsとMMP-13は強く染色されたが、RAGEの染色性はわずかだった。ACLTによる染色性の増強はなく、GKラットとWistarラット間で差がなかった。以上の結果より、糖尿病ラットにおける滑膜のAGEs

蓄積およびACLTによる軟骨や滑膜の変化は正常ラットと明らかな違いは認められず、糖尿病の関節内AGEs蓄積や軟骨変性への関与は証明されなかった。
パーソナルメディアの利用活性化に対応する駅の公共デザインのシステム再編

本研究は現代のスマート環境での多目的パーソナルメディアの利用特性とその行為が行われる環境との相関性に着目している。空間利用において、パーソナルメディア活用行為のメリットとデメリットを反映し、公共スペースでの活用行為を規制または促進できる建築計画の特性を把握した。調査結果、スマートフォンを中心とするパーソナルメディアの活用行為は視環境の質的水準と密接な関連があった。したがって、これから駅を中心とする公共領域デザインの改善は、現在の案内施設および広告中心の視環境の計画範囲を利用者の視線処理と関わる空間の風景要素までに検討の範囲を拡大し、豊かな空間を造成する一次元進歩された計画への転換が要求される。本研究は都市の生活環境のうち最も代表的な公共施設である駅舎の公共スペースの利用におけるパーソナルメディア活用行為のメリットとデメリットを反映し、その活用行為を規制または促進させることができる建築計画の側面からのガイドラインを講じることを目的にする。本研究の目的を達成するため、既往研究を基に駅でのパーソナルメディアの活用実態に関する理論的分析と問題構造の体系化する一方、大都市の駅からローカル駅に至る多様な類型の駅を対象にし行動観察調査(Town Watching)を行い、駅でのパーソナルメディアの利用実態と行為内容を類型化した。これからはその結果を深化させ、駅でのパーソナルメディアの活用に関わる「利用者の行為」と「多角的環境要因」の間のメカニズムの究明までを調査及び分析の範囲にする。それを通じて駅でのパーソナルメディアの適切な利用を誘導する公共デザインシステムの再編案の提示する計画で、最終的には、パーソナルメディアの利用活性化に効果的な公共デザインの実践的ガイドラインの確立することを目標している。最初の計画のとおり研究が順調に進行され、駅でのパーソナルメディアの利用現状に関する実態調査を行った。また、研究成果をまとめ論文を投稿するなどおおむね順調に進捗していると判断される。本研究は、現代のスマート環境での多目的パーソナルメディアの利用特性とその行為が行われる環境との相関性に着目し、空間利用上のパーソナルメディア活用行為のメリットとデメリットを反映し、公共スペースでの活用行為を規制または促進できる建築計画側面からの特性を把握することを目的とした。調査結果、駅の中でも待機を支援する静的空間である乗り場のような「安全で視覚的閉鎖感が高い環境」でパーソナルメディアとの相互作用がより強く作用することで確認された。しかしながら、広告のような一方的なメッセージを伝える施設の密度が高い環境ではむしろ活用行為の頻度もともに上昇した。したがって、これからの駅の計画には広告施設を中心とする視環境の整備がもっとも重要であると考えられる。つまり、今の広告面積及び施設の拡大を目標とする量的計画方式から最小面積と施設の選択的設置によって視環境の整備を実施し、広告効果と公共施設内の利用者安全が一緒に考慮される計画方向に転換が要求される。今後のこのようなパーソナルメディアの活用行為の持続的な増加に対応するため、すべての公共施設の視線処理と関わる視環境と行動の相互性に基づく改善案の模索が必要な時点であると考えられる。年次計画のとおり研究を進行して行く。また、研究から得られた成果は国内・外の関連学会に持続的に投稿・発表する。デザイン学今までの研究の進行が実態調査に集中され、最初の直接経費の予算中、旅費の使用が増加した一方、データの処理のための人件費及び物品費等の使用が減少し、該当の助成金が発生された。これからの研究は海外の実態調査より日本の実態と調査結果を比べながら今までのデータを総合的に考察し、よりレベル高い研究結果にまとめすることを目指している。したがって、これからは研究スケジュールに合わせ、最初の予算計画のように人件費と物品費等の増額が予想される。
次世代酵素センサの開発と応用

信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタをセンサとして応用し、極めてシンプルな分析ができる汎用バイオ計測システムの構築を最終目的として、酵素センサの開発と応用を行った。本センサは種々の酵素反応で生じる微少な水素イオン濃度の変化を直接的且つ効率良く電気信号に変換し、リアルタイム検出できる。本研究では、さまざまな生体成分の測定方法・測定試薬の開発と、測定装置の小型化検討を並行して行い、新規酵素センサシステムが構築できた。1.微量生体成分の分析法の確立(1)具体的な測定対象として、まず腎不全や食品検査、乳牛管理等の汎用マーカーである尿素を選択し、分析法を検討した。結果として、累積効果により約10倍の感度上昇を果たし、1酵素のみのシンプルな測定法を確立した。分析技術として必要な測定の直線性、同時再現性および日差再現性も十分なレベルに収まった。(2)癌マーカー候補のサルコシン、あるいはグリシンやDーアミノ酸の分析法開発のため、グリシンオキシダーゼを使用した測定法を検討している。本酵素はわれわれが初めて発見し、さらに特性の異なる酵素を種々のグラム陽性細菌から取得し、精製標品を調製した。それらの酵素にてSAーISFETセンサを構築中である。尿素と同様、1酵素のみでシンプルに測定可能を確認している。2.核酸合成反応の検出と遺伝子検査への応用核酸合成反応の検出として、T7RNAポリメラーゼを用いたRNA合成反応の検出を検討した。核酸合成ではピロリン酸が生成し、最終的に水素イオン濃度が上昇する。この濃度変化を、SAーISFETでの10倍累積にて検出することができた。本反応は、すでに遺伝子検査法として実用化されているが、SAーISFETを用いることにより光学系のいらない極めて簡便な遺伝子検査システムを構築することができる。装置の小型化も容易である。信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタ(Signal Accumulation Type of Ion Sensitive Field Effect Transistor: SA-ISFET)を応用し、極めてシンプルな汎用バイオ計測システムの構築を最終目的とする。SA-ISFETを用いたシステムでは、メディエーター等の仲介物質、あるいは光学検出法に要求される発色反応や蛍光標識を用いないので、測定対象が広範囲であり、前処理が簡単なものとなり簡便に測定できる。また、光路長を必要とする光学測定系を使用しないので装置の小型化に向いており、かつ液体クロマトグラフィー、質量分析等の大型機器に比べコストが低く、測定に高い技術力を必要としないといった数多くの利点が期待できる。平成26年度は、生体成分分析の汎用性を拡大し、実サンプル測定への応用を果たした。また、装置の小型化を検討し、コンパクトサイズ測定装置の開発に目処をつけた。1.生体成分分析の汎用性拡大:臨床検査や食品分析などに多用されるペルオキシダーゼ活性測定(過酸化水素定量)を行うための分析系を考案し、実際にSA-ISFETにての測定を実証した。累積効果、測定の直線性や再現性も十分なレベルであった。また、平成25年度に引続きグリシンオキシダーゼの測定系を構築、カテコールジオキシゲナーゼ測定系も目処を得た。2.実サンプル測定への応用:平成25年度に開発した尿素測定系にて種々ミルク中尿素の分析を行い、実用レベルの測定を確認した。3.測定装置の小型化:より実用的なコンパクトサイズ測定装置の開発を検討、固体参照電極の採用などにより装置の大幅な小型化を実現した。従来の基礎検討装置の外寸(縦39.0cm×横36.5cm×高さ47.5cm)に対し、コンパクトサイズ測定装置の外寸は縦22.5cm×横19.5cm×高さ9.0cmとなった。信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタ(SA-ISFET)を応用し、極めてシンプルな分析ができる汎用バイオ計測システムの構築を行った。SA-ISFETは種々の反応で生じる微少なプロトン濃度変化を直接的且つ効率良く電気信号に変換するため、さまざまな生体反応をプロトン量変化として簡便にリアルタイム検出できる。さらにメディエーター等の仲介物質、発色反応や蛍光・発光標識が不要、測定対象も従来システムより広範囲である。本研究では、さまざまな生体成分の測定方法・試薬の開発と、測定装置の小型化検討を並行して行い、新規酵素センサシステムが構築できた。1生体成分分析方法の開発:臨床検査や食品分析などの測定項目を中心に、尿素窒素、クレアチニン、生体脂質、カテコール、アミノ酸、そして遺伝子検査などの酵素的分析方法を開発した。これらの殆どは単一酵素反応をリアルタイム検出可能で、従来法より格段にシンプルな方法となった。ただし、尿酸、乳酸、グリシンなど一部のオキシダーゼ反応基質の高精度な測定は単一酵素では困難と分かった。そこでペルオキシダーゼ利用の過酸化水素定量系を考案し、オキシダーゼとの組合わせによる種々の測定法を追加開発した。また、本定量系は免疫測定系にも応用可能であることを確認した。2測定装置の小型化:固体参照電極の導入およびセンサへの電極内臓で、大幅な装置の小型化に成功した。作成した測定装置の外寸は225x195x90mmで、従来の装置と比して体積が約1/17となった。今後、分析方法開発技術をさらに多項目へ水平展開すると共に、癌マーカーの検出や微生物検査へと発展させる。装置についても、電子機器メーカーとのコラボレーションを前提にハンディータイプへと深化させたい。

信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタをセンサとして応用し、極めてシンプルな分析ができる汎用バイオ計測システムの構築を最終目的として、酵素センサの開発と応用を行った。本センサは種々の酵素反応で生じる微少な水素イオン濃度の変化を直接的且つ効率良く電気信号に変換し、リアルタイム検出できる。本研究では、さまざまな生体成分の測定方法・測定試薬の開発と、測定装置の小型化検討を並行して行い、新規酵素センサシステムが構築できた。平成26年度は当初計画通り、pH計でpHを測定するように手軽に分析ができるシステムの構築に目処をつけること、を目標に検討を進めた。結果として、分析対象を拡大すると共に、実サンプル測定への応用に成功した。装置の小型化についても、コンパクトサイズ測定装置の開発が可能であることを実証した。平成27年度の研究実施計画である、SA-ISFETを搭載した分析用小型化装置の開発については、すでに平成26年度で目処を得ており、種々の測定法のプラットフォームとなる装置が具現化されつつある。以上より、当初に掲げていた研究実施計画の内容にしたがって研究が進捗しており、分析対象の拡大について多少の修正はあったものの、期待した成果が得られていると判断した。酵素工学応用微生物学当初の計画にしたがい、SA-ISFETを応用した極めてシンプルな汎用バイオ計測システムの構築を最終目的とする。平成27年度は本研究の集大成として、SA-ISFETを搭載したバイオセンサの改良とコンパクトサイズ測定装置との組合わせにより、種々の測定法のプラットフォームとなる装置を具現化する。さらに、測定項目の酵素法測定系開発を継続して行うと共に、酵素免疫測定系への応用についても検討を進める。本研究のバイオ計測システムが構築されれば、さまざまな用途が想定できる。例えば、臨床検査項目を自己診断可能な簡易システムとして利用することにより、予防医学に役立ち、将来的には医療費削減への貢献も期待できる。食品検査や環境分析などの分野においても、現場レベルでの簡便な測定が可能となる。検査・分析システムが新たに普及するためには、低コスト化や信頼性なども大きな要素となる。本研究では、ISFET製造ベンチャーである(株)バイオエックスの協力により、小型化および規格化が容易というISFETのメリットを十分活かした検討が可能なため、開発成功の可能性は高いと考える。平成25年度は、SAーISFETを用いた微量生体成分の分析法を確立すること、および核酸合成反応の検出に目処をつけることを目標に、検討を進めた。結果として、尿素測定をモデルとした微量生体成分の分析法を確立することができた。心配した実用性についても、反応条件を最適化することにより十分な再現性を得ることができた。計画時は具体的な測定対象として、サルコシンやグリシン、Dーアミノ酸などのアミノ酸類をモデルに検討する予定だったが、汎用性の高いマーカーである尿素にモデルを変更した。測定方法開発に対する経験値も高まったため、今後は様々な微量生体成分の分析法開発へと水平展開を進めていく。応用分野として、臨床検査を始めとする予防医学分野はもとより、食品分析や環境分析も視野に入れている。
光周的花芽誘導に関連した遺伝子のウキクサホモログの単離と発現解析

本研究では2種のウキクサを用いて、光周的花芽誘導の分子生物学的な解析を行っている。光周的花芽誘導の日長測定には概日時計が非常に重要なので、本年度は主に発光レポーター系を利用した概日リズムの解析を以下のように行った。1.シロイヌナズナのCCA1やAPRR1、ウキクサのLgLHYH1のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子をつないだ発光レポーターコンストラクトとウキクサのLHY、GI、ELF3ホモログ遺伝子に35Sをつないで過剰発現させたコンストラクトおよびRNAiによって発現量を低下させたコンストラクトを2つのウキクサで全ての組み合わせで同時に導入し、発光測定を行った。その結果過剰発現では全て発光が下がり、概日リズムは見られなくなった。RNAiではLHYホモログは短周期になり、GIホモログ、ELF3ホモログはリズムがなくなった。このことからウキクサのホモログ遺伝子が概日リズムに機能を持つことが明らかとなった。2.インバースPCRによってウキクサからCABのプロモーターを単離した。プロモーターには光応答に関わるTATA-boxやCAAT-box、概日リズム発現に関わるevening-elementが保存されていた。このプロモーターをLUCにつないだコンストラクトを作成し、発光測定を行ったところCABの発現と同様に夕方にピークを示す概日リズムを示した。3.発光レポーター系で発光量とLUCの発現量に相関があるかを確認するために発光レポーターを導入したウキクサのサンプリングを行い、リアルタイムPCRによる発現解析を行った。その結果相関が見られたので発光リズムはプロモーターへの制御を反映していることが示された。また本年度は論文を作成し、発表した。本研究ではウキクサを用いて、光周的花芽誘導の分子生物学的な解析を行っている。ウキクサからシロイヌナズナで概日時計や光周性、花芽形成に関わる遺伝子のホモログを単離し、概日時計が光周性にどのように働くのか知ることを目指している。そのために今年度は以下の4つについて主に研究を行った。1.単離した遺伝子が様々な日長条件下でどのような発現変化を示すのかをタックマンサーマルサイクラーを用いたRT-PCR法によって解析した。例えば骨格周期中で概日リズムを示す遺伝子がどのような発現変化を示すのかを調べた。2.ディジェネレートプライマーを用いたRT-PCR法によって概日リズムを示す遺伝子として新たに、シロイヌナズナで概日時計の中心振動体で働くLHYのホモログ遺伝子を単離した(LgLHY H1,LgLHY H2,LpLHY H1,LpLHY H2)。発現解析を行った結果LgLHY H1,LpLHY H1の発現はシロイヌナズナのLHYと同様に明け方にピークを持つこと、LgLHY H2,LpLHY H2はこれより少しピークが遅れることが分かった。3.発現量が少ない遺伝子や遺伝子のプロモーターを単離するためにL.gibba G3のゲノミックライブラリを作成した。現在シロイヌナズナで光周性に重要な働きをするCOのホモログ遺伝子をスクリーニング中であり、いくつかの候補が得られてきている。4.ウキクサのアグロバクテリウムによる形質転換法について報告があったので、これを参考にL.gibba G3の形質転換を検討中である。すでにカルス誘導に成功し、現在はアグロバクテリウムを感染させてGUS遺伝子を過剰発現した形質転換体を作成中である。形質転換法が確立次第、発光レポーター系を用いた概日リズムの解析、遺伝子の過剰発現体や遺伝子機能欠損体の解析を行う予定である。光周性には概日時計が非常に重要なので今年度は概日時計に着目し、以下について研究を行った。1.シロイヌナズナの概日時計の中心振動体で働くCCA1遺伝子のプロモーターにホタルのルシフェラーゼ遺伝子をつないだコンストラクトをパーティクルガンによってウキクサに導入し発光測定を行って、概日リズムを検出することができた。この方法によりさまざまな日長条件で概日リズムを調べ、光周性との関わりや長日植物と短日植物の違いを解析したいと考えている。2.1のコンストラクトとウキクサのLHYホモログ遺伝子に35Sをつないで過剰発現させたコンストラクトをまぜてパーティクルガンを行い、発光測定を行ったところ、CCA1の概日リズムの振幅が下がった。このことからウキクサのLHY遺伝子ホモログが概日時計に機能を持つことが示された。3.1のコンストラクトとウキクサのELF3ホモログ遺伝子をRNAiによって発現量を低下させたコンストラクトをまぜてパーティクルガンを行い、発光測定を行ったところ、CCA1の概日リズムがなくなった。このことからウキクサのELF3遺伝子ホモログが概日時計に機能を持つことが示された。4.アグロバクテリウムにウキクサのFTホモログ遺伝子に35Sをつないで過剰発現させたコンストラクトを形質転換し、これを長日植物のウキクサL.gibba G3にまぜて長日条件で培養したところベクターを形質転換したアグロバクテリウムとまぜて培養した場合に比べ、花成の促進が見られた。