hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジーンターゲティングによるアルドース還元酸素欠失マウスの作製とヒト酵素の発現

初年度ヒトアルドース還元酵素(AR)cDNAをプローブとして25個のマウスAR候補遺伝子クローンを単離した.しかしこの中にマウスARとして報告されているmouse vas deferens protein(MVDP)に相当するもの無く,改めてラットARのcDNAをプローブとしてマウス腎臓cDNAライブラリーのスクリーニングを行った.得られたクローンの塩基配列はMVDPとは異なっており,その推定アミノ酸配列はラットARと97%一致していた.本cDNAの蛋白コード領域を大腸菌系にて発現した組み替え蛋白はARとしての酵素学的特徴を示したことから,MVDPはマウスARとは異なった蛋白であり,今回単離したクローンがマウスのARをコードするものであることが明らかとなった.そこでさらにARの近縁蛋白mRNAの腎臓における局在について検討した.ARmRNAはマウス腎臓でinner medullaとpelvisに局在が認められた.一方,MVDPと最近新たなAR近縁蛋白として報告されたfibroblast-growth-factor-1-regulatated protein(FR-1)とは腎臓juxtaglomerular cellsに局在することから,ARと構造の類似した近縁蛋白は全く異なった生理機能を担っている可能性が示唆された.得られたマウスARcDNAの塩基配列をもとにプライマーを合成し,先に単離した25個のクローンよりARの遺伝子を同定するためにPCRスクリーニングを行った.この中の2個のAR遺伝子クローンについてイントロン構造を認めたので,制限酵素地図を作製し,全エクソンの配列解析とエクソン・イントロン境界部位を決定した.現在マウスAR遺伝子のエクソン2と3をターゲットとしたノックアウト用ベクターの作製を進めている.初年度ヒトアルドース還元酵素(AR)cDNAをプローブとして25個のマウスAR候補遺伝子クローンを単離した.しかしこの中にマウスARとして報告されているmouse vas deferens protein(MVDP)に相当するもの無く,改めてラットARのcDNAをプローブとしてマウス腎臓cDNAライブラリーのスクリーニングを行った.得られたクローンの塩基配列はMVDPとは異なっており,その推定アミノ酸配列はラットARと97%一致していた.本cDNAの蛋白コード領域を大腸菌系にて発現した組み替え蛋白はARとしての酵素学的特徴を示したことから,MVDPはマウスARとは異なった蛋白であり,今回単離したクローンがマウスのARをコードするものであることが明らかとなった.そこでさらにARの近縁蛋白mRNAの腎臓における局在について検討した.ARmRNAはマウス腎臓でinner medullaとpelvisに局在が認められた.一方,MVDPと最近新たなAR近縁蛋白として報告されたfibroblast-growth-factor-1-regulatated protein(FR-1)とは腎臓juxtaglomerular cellsに局在することから,ARと構造の類似した近縁蛋白は全く異なった生理機能を担っている可能性が示唆された.得られたマウスARcDNAの塩基配列をもとにプライマーを合成し,先に単離した25個のクローンよりARの遺伝子を同定するためにPCRスクリーニングを行った.この中の2個のAR遺伝子クローンについてイントロン構造を認めたので,制限酵素地図を作製し,全エクソンの配列解析とエクソン・イントロン境界部位を決定した.現在マウスAR遺伝子のエクソン2と3をターゲットとしたノックアウト用ベクターの作製を進めている.本申請者らはヒトアルドース還元酵素(AR)cDNAをプローブとして25個のマウスAR候補遺伝子クローンを単離した。しかしこの中にマウスARとして報告されているmouse vas deferens protein(MVDP)に相当するものが無いことがわかり、改めてラットARのcDNAをプローブとしてマウス腎臓cDNAライブラリーのスクリーニングを行った。得られたクローンの塩基配列はMVDPとは異なっており、その推定アミノ酸配列はラットARと97%一致していた。本cDNAの蛋白コード領域を大腸菌系にて発現した組み換え蛋白はARとしての酵素学的特徴を示したことから、MVDPはマウスARとは異なった蛋白であり今回我々が単離したクローンがマウスのARをコードするものであることが明らかとなった。同時にこの結果はマウスにはARと高い構造類似性を持つ近縁蛋白(MVDP)が存在することを示すものであった(研究発表;Gui et al.)。次にこの塩基配列をもとにプライマーを合成し、単離した25個のマウス遺伝子クローンよりARの遺伝子を同定するべくPCRスクリーニングを行った。現在この中の2個のAR遺伝子クローンの制限酵素地図を作成し、エクソンを中心とした塩基配列を決定してターゲティングベクター作製の準備を進めている。当初の計画のターゲティングベクターの作製に遅れを生じたが、本年度単離したマウスARのcDNAは文献報告されておらず、マウスにはMVDPというAR類似蛋白が存在するという新知見が得られた。この結果はヒト組織でも未知のAR様蛋白が存在して何らかの機能的役割を分担している可能性を示唆し、今後の本研究の展開にも重要な意味を持つ所見と考えられる。本申請者らはラットアルドース還元酵素(AR)のcDNAをプロ-としてマウス腎臓cDNAライブラリーのスクリーニングを行い、従来マウスARとして報告されていたmouse vasdeferens protein(MVDP)とは異なるがラットARと97%の相同性を有する新しいクローンを単離した。本cDNAの蛋白コード領域を大腸菌系にて発現した組み換え蛋白はARとしての酵素学的特徴を示したことから、MVDPはマウスARとは異なった蛋白であり我々が新たに単離したクローンがマウスのARをコードするものであることを報告した。この結果はARと高い構造類似性(約70%)を有する近縁蛋白MVDPがマウスに存在することを示すものであった。

そこで本年度はARの近縁蛋白mRNAの腎臓における局在についてさらに検討を進めることとした。ARmRNAはマウス腎臓でinner medullaとpelvisに局在が認められた。一方、MVDPと最近新たなAR近縁蛋白として報告されたfibroblast-growth-factor-1-regulatated protein(FR-1)とは腎臓juxtaglomerular cellsに局在することが明らかになった。この結果はARと構造の類似した近縁蛋白がARとは全く異なった生理機能を担っている可能性を示唆している。また本年度マウスAR遺伝子クローンの制限酵素地図とエクソン1から9までの配列解析を終了し、現在エクソン2と3をターゲットとしたノックアウト用ベクターの作製を進めている。当初の計画より大幅な遅れを生じたが、マウスには局在の異なるAR類似蛋白(MVDP,FR-1)が存在するという新しい知見は今後の本研究の展開に重要な意味を持つものと考えられる。
光散乱法を用いた透光性結晶のクラック先端近傍転位の観察

前年に引き続き,クラック先端近傍におけるクラックと転位の相互作用を理解し転位がクラックの進展にどのような影響を及ぼすかを検討するため,可視光を透過する塩化ナトリウム結晶を用いてクラックの進展とそれに伴ったすべり変形による転位密度の増加の評価を行った.光散乱を利用したバルク結晶の転位の三次元分布の観察は,転位以外の微小欠陥からの散乱光の影響で非常な困難を極めたため,試験片形状を工夫し,偏光顕微鏡を利用した光弾性二次元像による巨視的な応力場とエッチピットによる微視的なひずみ場(転位数個に相当)の観察によって,状況を二次元問題に単純化して捉えた.得られた知見について以下に列記する.(1)光弾性像による応力場観察より,単結晶中のクラック前方には転位のすべりによるせん断応力場と圧縮応力場が発生し,クラックを進展させる応力を緩和する効果をもたらすことがわかった.固溶体硬化を利用して転位の易動度を抑制するために,塩化ナトリウム結晶に臭化ナトリウムを固溶させた試料を作製してクラックの進展を観察したところ,純粋な塩化ナトリウム結晶における結果に比べてクラックは速く進展し,クラック前方の転位密度も小さくなった.また,臭化ナトリウムの濃度を大きくするとより結晶が破壊されやすくなった.さらに,ガンマ線照射により転位をトラップした試料についても,通常の結晶に比べてクラック進展速度は大きくなった.これらはクラック前方の転位がクラック進展阻止の効果を持つことを如実に示す結果である.(2)双結晶を用い結晶粒界に向かってクラックを進展させたときのクラック前方の転位密度および応力拡大係数の変化を調べ,次のことがわかった.クラックの前進に伴いクラック先端より転位が発生しすべり帯が形成される.双結晶では単結晶での結果と比べ,クラック先端が粒界に接近するにつれクラック先端前方の転位密度の増加率が大きくクラックの進展速度が遅くなっていること,応力拡大係数もクラックが粒界に衝突するまで次第に増大していることから,粒界に堆積した転位群がクラックの進展を阻止する効果を持つと考えられる.本年度はクラック先端におけるクラックと転位の相互作用をより理解し転位がクラックの進展にどのような影響を及ぼすかを検討するため,塩化ナトリウム結晶を用いてクラックの進展とそれに伴ったすべり変形による転位密度の増加の評価を行った.すべり変形によって生じるすべり帯の観察には透光性結晶である塩化ナトリウム結晶の特性を生かして偏光顕微鏡を利用した光弾性二次元像を,転位密度の評価には腐食によるエッチピットを用いた.また,バルク材料における転位の三次元分布を観察するための光散乱を利用した観察装置を構築中であるが,転位以外の材料中の微小欠陥からの散乱光の影響のため転位の把捉が困難になると予想され現在解決の糸口を模索中である.これまでに得られた知見について以下に列記する.1.双結晶を用い結晶粒界に向かってクラックを進展させたときのクラック前方の転位密度および応力拡大係数の変化を調べ,次のことがわかった.クラックの進展に伴いクラック先端より転位が発生しすべり帯が形成される.単結晶でクラックを進展させたときに比べ,双結晶の場合はクラックが粒界に近づくにつれ転位密度が増加し応力拡大係数もクラックが粒界に衝突するまで次第に増大していること,また,クラックの進展速度が遅くなっていることから,粒界に堆積し密度の大きくなった転位群によりクラックの進展が阻止される効果がある.2.固溶体硬化を利用して転位の易動度を抑制するために塩化ナトリウム結晶に臭化ナトリウムを固溶させた試料を作製し1.と同様の実験をしたところ,純粋な塩化ナトリウム結晶における結果に比べ,クラックは速く進展しクラック前方の転位密度も小さくなった.また,臭化ナトリウムの濃度を大きくするとより結晶が破壊されやすくなった.この結果は結晶粒界によるクラック進展阻止の効果が転位を仲立ちにしていることを示すもので,今後はより定量的な見地からの検討が必要であろう.前年に引き続き,クラック先端近傍におけるクラックと転位の相互作用を理解し転位がクラックの進展にどのような影響を及ぼすかを検討するため,可視光を透過する塩化ナトリウム結晶を用いてクラックの進展とそれに伴ったすべり変形による転位密度の増加の評価を行った.光散乱を利用したバルク結晶の転位の三次元分布の観察は,転位以外の微小欠陥からの散乱光の影響で非常な困難を極めたため,試験片形状を工夫し,偏光顕微鏡を利用した光弾性二次元像による巨視的な応力場とエッチピットによる微視的なひずみ場(転位数個に相当)の観察によって,状況を二次元問題に単純化して捉えた.得られた知見について以下に列記する.(1)光弾性像による応力場観察より,単結晶中のクラック前方には転位のすべりによるせん断応力場と圧縮応力場が発生し,クラックを進展させる応力を緩和する効果をもたらすことがわかった.固溶体硬化を利用して転位の易動度を抑制するために,塩化ナトリウム結晶に臭化ナトリウムを固溶させた試料を作製してクラックの進展を観察したところ,純粋な塩化ナトリウム結晶における結果に比べてクラックは速く進展し,クラック前方の転位密度も小さくなった.また,臭化ナトリウムの濃度を大きくするとより結晶が破壊されやすくなった.さらに,ガンマ線照射により転位をトラップした試料についても,通常の結晶に比べてクラック進展速度は大きくなった.これらはクラック前方の転位がクラック進展阻止の効果を持つことを如実に示す結果である.

(2)双結晶を用い結晶粒界に向かってクラックを進展させたときのクラック前方の転位密度および応力拡大係数の変化を調べ,次のことがわかった.クラックの前進に伴いクラック先端より転位が発生しすべり帯が形成される.双結晶では単結晶での結果と比べ,クラック先端が粒界に接近するにつれクラック先端前方の転位密度の増加率が大きくクラックの進展速度が遅くなっていること,応力拡大係数もクラックが粒界に衝突するまで次第に増大していることから,粒界に堆積した転位群がクラックの進展を阻止する効果を持つと考えられる.
卵胞発育を制御する細胞外核酸：卵子の質の向上に向けて

1年目では顆粒層細胞の増殖や代謝に影響を及ぼす卵胞液中のmiRNAおよび細胞外DNAの探索とその検証を行った。ブタ卵巣を用いた実験にて、卵胞サイズ(大小)および卵胞内の細胞数(多少)という2つのカテゴリー別に分けた顆粒層細胞のRNA-seqおよび卵胞液中エクソソームのsmall RNA-seqの発現データを解析し、卵胞の発育に影響する卵胞液中の候補miRNAを同定した。得られた候補miRNAを未発育卵子の体外培養系に外挿し卵子の発育について検討したところ、顆粒層細胞の代謝を変化させ発育卵子の質を向上させるという結果が得られた。また、生理条件の異なる個体のエクソソームmiRNAプロファイリングを行うため、マウスやウシから卵胞液および血液サンプルを回収した。この解析は新年度に行う予定である。また細胞外DNAについての実験では、顆粒層細胞中のミトコンドリアの機能不全を誘導し、ミトコンドリアの分解を誘起させることで培地中の細胞外DNAが増加した。さらにオートファジーを阻害することでさらに増加した。一方で小胞形成を阻害すると減少した。この結果より顆粒層細胞由来の細胞外DNA分泌メカニズムにはオートファジーが関係していることを見出した。初年度では卵胞液中のエクソソームが卵子の発育を支持していること、エクソソーム中のmiRNAが顆粒層細胞の代謝を変化させることを明らかにした。これらの知見については投稿中である。また卵胞液中の細胞外DNAについてはミトコンドリアの分解およびオートファジーがその分泌メカニズムに関与していることを明らかにし、これらに関する論文も受理されている。さらに卵胞液中の細胞外DNAの配列について次世代シーケンサーを用いた解析を行い詳細な解析を進めている。2年目では個体の生理条件(肥満や痩身、加齢など)が卵胞内の細胞やエクソソームmiRNA発現プロファイルに及ぼす影響について検討する。また、細胞外DNAが細胞機能や性状に及ぼす影響とそのメカニズムの解明を行う。加齢や肥満などの生理条件では卵胞液の組成が変化することが知られており、その変化は卵子の質に影響を及ぼす。そこで加齢や肥満などで発現変動が見られたmiRNAを未発育卵子の体外培養系へ外挿し、卵子の発育に及ぼす影響について検証を行う。また、卵胞液中の細胞外DNAについても外挿し、細胞機能に及ぼす影響を明らかにする。さらに細胞内オートファジーの活性とDNA分解の関係性を明らかにすることで詳細な細胞外DNAの分泌メカニズムとその意義を明らかにする。
ラット脳アセチルコリン遊離に対するプロポフォールの作用とGABA受容体との関連:微小透析法を用いた研究

中枢神経系のコリン作動性神経は覚醒リズムと密接な関係を持つ。コリン作動性神経の変化は麻酔作用の発現に重大な影響を持つと考えられるが、新しい静脈麻酔薬プロポフォールのコリン作動性神経に対する影響は不明である。本研究では、ラット脳前頭皮質、海馬、線条体からのアセチルコリン遊離に対するプロポフォールの腹腔内投与の影響をHPLC-ECDを組み合わせた微小透析法を用いて測定した。また、プロポフォールが作用するとされるGABA_A受容体の関与を調べるために、GABA_A受容体拮抗薬ビククリンの前処置による影響を検討した。その結果、プロポフォールは前頭皮質、海馬において著明なアセチルコリン遊離抑制作用を示したが、線条体における抑制作用は軽微であった。我々の以前の研究ではペントバルビタールは前頭皮質、海馬、線条体のすべてにおいてアセチルコリン遊離を著明に抑制したことから、プロポフォールはバルビツレートと比較して部位選択的な作用を示すことが示唆された。線条体は運動制御に重要な役割を持つことから、この結果は、麻酔覚醒後の協調運動能の回復が速いというプロポフォールの臨床的特徴と関連があると考えられた。また、海馬においてはGABA_A受容体拮抗薬ビククリンの局所投与によりアセチルコリン遊離抑制が拮抗され、海馬におけるプロポオォールのアセチルコリン遊離抑制の一部が海馬内のGABA_A受容体を介して制御されている可能性を示した。一方、前頭皮質におけるプロポフォールのアセチルコリン遊離抑制はビククリンの局所投与には影響を受けず、全身投与によってのみ有意に拮抗され、前頭皮質外のGABA_A受容体を介する制御の可能性が示された。本研究はプロポフォールのアセチルコリン遊離に対する影響を微小透析法を用いて調べるとともに、GABA_A受容体拮抗薬投与がアセチルコリン遊離をどう修飾するかを調べ、in vivoでプロポフォールのGABA_A受容体に対する作用を調べるものである。SDラットを用い、麻酔下に脳定位固定装置にて右前頭皮質、海馬、線条体に透析用プローブのガイドカニューレを挿入した。手術48時間以後にプローブを挿入し、10μMエゼリン加人工脳脊髄液を流速2.0μl/minで潅流し、アセチルコリン基礎遊離量が安定した120分後に、20分毎のサンプリングを開始した。基礎遊離量として3サンプル採取後、プロポフォール(25,50mg/kg)を腹腔内投与した。サンプル内のアセチルコリンを固定化酵素付HPLC-ECDで測定した。測定結果は基礎遊離量に対する%で表わした。薬剤投与前のアセチルコリン基礎遊離量は、前頭皮質0.93±0.15pmol、海馬1.50±0.38pmol、線条体15.15±1.31pmolであった。プロポフォール25,50mg/kg i.p.は、ラット前頭皮質ではアセチルコリン遊離をそれぞれ基礎遊離量の30.9%,15.8%に減少させ、海馬ではそれぞれ49.0%,28.4%に減少させた。プロポフォール25mg/kg i.p.はラット線条体アセチルコリン遊離に有意な変化を与えず、50mg/kg i.p.は基礎遊離量の80.9%に減少させた。線条体は大脳皮質の広範な領域から大脳基底核への入力部位であり、運動機能、特に錯体外路系の発現や制御に重要な役割を果たしている。アセチルコリンは線条体内部の介在ニューロンの伝達物質であり、プロポフォールによる遊離抑制が線条体で選択的に軽度であったことは臨床的に協調運動の回復が速いことと関連があると考えられた。
金属格子に励振される表面プラズモンの特性解明と濃度センサへの応用

金属格子の表面プラズモン共鳴吸収を屈折率センサ(プラズモンセンサ)に応用する方法と、予想されるセンサの性能について、理論(計算機シミュレーション)と実験の両面から検討した。まず、誘電体でコーティングされた金属格子における表面プラズモン励振の数値計算と実験結果を比較し、コーティングによる共鳴吸収の発生位置(共鳴角)の移動を理論と実験の両面から確認した。この共鳴吸収の発生を屈折率センサとして利用するためには、共鳴角を高い精度で測定することが求められるが、従来行われてきたように回折効率の変化だけを見ていたのでは、十分な精度を得ることが困難である。共鳴角を高精度で決定するために、コニカルマウントされた回折格子の共鳴吸収に伴う強いTM-TEモード変換(TM波を入射し、回折波を測定すると、大部分がTE波である)に着目し、シミュレーションで(TM波の効率)÷(TE波の効率)を予測すると、この比の値は共鳴角で鋭いピークを示した。共鳴角の測定に共鳴吸収に伴うTM-TEモード変換を利用することによって、回折格子を用いたプラズモンセンサの実用化が可能であることを、数値計算と実験の両方から確認できた。回折格子のモード変換を利用するセンサは、現在実用されているプリズムと金属薄膜を用いたプラズモンセンサに比べて、十数倍の分解能を得ることができることを明らかにした。また、被測定試料の屈折率によって最適な方位角が存在することを指摘し、この現象を利用すれば、位相情報を用いない回折効率のみの測定でより高精度な屈折率測定が可能であることを理論的に示した。屈折率センサへの応用を目的として,金属格子に励振されるプラズモン表面波の特性と,表面波の励振にともなう入射電力の吸収(プラズモン共鳴吸収)を計算機シミュレーションによって詳細に調べた.また,予備的な実験によって,シミュレーション結果を確認した.格子の配置はプラナーまたはコニカルとし,1次のエバネッセント波がプラズモン表面波と結合する領域で,0次回折効率の入射角特性およびTM-TEモード変換特性を調べた.市販のホログラフィック格子(UV格子,1,800本/mm,Al素材,(1)MgF_2コーティングおよび(2)Auをコーティング)を用いた実験の結果は,数値計算による予測と良く一致した.コニカル配置では,プラズモン共鳴吸収は,強いTM-TEモード変換をともなう.TM波を入射させたとき,共鳴吸収の起こる入射角において,回折光のTM成分はほとんど消滅し,TE成分が支配的である.このため,TM成分の回折効率の逆数1/p_o^<TM>をプロットすることによって,この入射角を0.1°以下の精度で測定することが可能であることを確認した.プラズモン共鳴吸収を屈折率センサに応用した場合,0.1°の精度は,4桁の分解能に相当する.実験における再現性の向上と人的要因に起因する誤差の低減のため,実験装置の一部を自動化した.従来は手動で行っていたレーザ照射,ステージ回転,TM波とTE波の分離,回折効率の測定とパソコンへのデータ取り込みなどを自動化し,測定時間の短縮と誤差の低減を行うことができた.現在,自動化にともなう格子の設置法の変更(従来は格子表面水平,自動化後は垂直)に対応するため,実験装置の一部に改良を加えている.プラズモンセンサを実現するために、数値計算で得られた広範囲にわたる吸収特性・モード変換特性から、種々の制約の下で選び得る設計(格子の材質と形状、入射光の波長、入射角と方位角の範囲)の候補を検討し、特定できた。実際に数値計算と実験を行い、良く一致した結果が得られた。特に、屈折率ごとに方位角を調整することによって、従来のプラズモンセンサより10倍程度の分解能を得ることができ、プラズモンセンサの分解能の向上に大いに期待できる。

コニカルマウントされた金属格子で共鳴吸収が発生すると、TM-TEモード変換とともに、表面プラズモン波と結合するエバネッセントモードの位相の急激な変化が起きる。また、回折波のTM成分とTE成分の位相の間には、特別な関係があり、吸収角θ_<sp>を決定できる可能性について検討した。位相検出によれば、プラズモンセンサの分解能を飛躍的に向上させうることが予想される。本研究は、金属格子の表面プラズモン共鳴吸収を濃度センサ(プラズモンセンサ)への応用について検討した。現在実用化されているプラズモンセンサは、金属薄膜とプリズムを利用したものが主流であるが、我々は金属格子を利用したプラズモンセンサの可能性について理論(計算機シミュレーション)と実験の両面から検討した。まず、誘電体でコーティング金属格子における表面プラズモン励振の数値計算と実験結果を比較し、誘電体コーティングによる共鳴吸収の発生位置(入射角)の移動を実験で確認した。次に、金属格子を利用したプラズモンセンサとしての利用を考えると、吸収が起こる角度を高い精度で測定することが求められる。しかし、従来行われてきたように回折効率だけを見ていたのでは、十分な精度を得ることが困難である。そこで、我々は、共鳴吸収が格子表面付近の界の増強と、強いTM-TEモード変換を伴う(TM波を入射し、回折波を測定すると、大部分がTE波である)ことに着目した。シミュレーションで(TM波の効率)÷(TE波の効率)を予測したものは共鳴吸収の起こる入射角で鋭いピークを示した。実際、表面プラズモン共鳴吸収に伴うTM-TEのモード変換を濃度測定に応用し、プラズモンセンサへの可能性について数値計算と実験の両方から確認できた。最後、測定試料によって最適な方位角などのパラメーターを選び、入射角を固定して、方位角をまわすなどの工夫を施すことによって、測定精度が飛躍的に向上し、従来のプラズモンセンサより十数倍の分解能が得ることができ、高分解能なプラズモンセンサへの応用が可能になった。
JAG1-Notchシグナルの活性化による早期細胞老化誘導機構の解明

正常細胞における早期細胞老化機構の破綻は様々な癌に深く関与し、その破綻によって誘導される癌化の分子機構の解明は、我が国における重要な研究課題となっている。本研究では、早期細胞老化機構における新規重要因子であるJAG1遺伝子に着目し解析を行うことで、複雑に制御される癌化メカニズムの解明を目的としている。H30年度は、研究計画に基づき、(3)臨床標本データにおける新規重要因子JAG1の破綻による発癌分子機構の解明、(4) Notchシグナル活性化・非活性化細胞の共培養による早期細胞老化伝達メカニズムの解明、について解析を行った。(4)の解析では、JAG1を強制発現させた老化細胞と赤色蛍光タンパク質であるmCherryを発現させた正常細胞を共培養し、老化細胞を緑色に蛍光標識できるSPiDER-βGalを用いて細胞の老化状態を評価した。非常に興味深い事に、JAG1活性化老化細胞(緑色)と正常細胞(赤色)及び老化した正常細胞(黄色)が観察され、JAG1活性化細胞の周囲の正常細胞は離れた正常細胞と比べて有意に老化していた。またJAG1活性化老化細胞の培地上清及びリコンビナントJAG1タンパクを用いてその分子機構の検証を行った。その結果、培地上清による増殖阻害効果は認められなかったが、リコンビナントJAG1タンパクによる細胞の増殖阻害効果が認められた。以上の結果からJAG1活性化細胞が直接的な細胞間接触によるNotchシグナルの活性化を介して周辺の正常細胞を老化させている事が示唆された。H29年度は、研究計画に基づき、(1)ゲノムワイドな統合的解析による早期細胞老化のJAG1-Notchシグナル癌抑制機構の解明、(2)新規重要因子JAG1のドメイン解析及び早期細胞老化に重要な下流標的因子の解明について解析を行った。(1)では、まず癌遺伝子Ras/Rafを活性化させ早期細胞老化を誘導した際の遺伝発現変化、並びにヒストン修飾変化を網羅的に解析した。その結果、細胞老化誘導時にH3K27acの獲得を伴うJAG1の発現上昇を認め、JAG1-Notchシグナルの下流であるp21、p15にも同様の変化が確認された。またJAG1 KD下でRas/Rafを活性化すると細胞老化を回避し、SA-β-gal活性も有意に低下、老化時に見られたH3K27acの獲得を伴うp21、p15の発現上昇も起きていなかった。次にJAG1をWI-38で強制発現させた結果、Ras/Rafの活性化をせずにJAG1の単独発現で細胞老化を誘導できることが明らかとなった。さらにRNA-Seq解析から、JAG1を強制発現した老化細胞でp21、p15の上昇が認められた。(2)では、JAG1のDeletion Constructによる各ドメインの強制発現を行い、細胞増殖能を検証した結果、JAG1の細胞外ドメインに増殖抑制機能があることを見出した。また各ドメインの強制発現のRNA-Seq解析の結果、p21、p15の発現上昇が増殖抑制機能に重要であることが示唆された。H29年度に予定していた研究計画は、全て滞りなく進行した。JAG1のKDと強制発現の解析から、JAG1を介してp21とp15の発現が上昇することが早期細胞老化において重要であることが明らかになった。また既にH30年度に計画していた共培養の実験についても解析を進めている状況である。引き続きH30年度の研究計画通りに、(3)臨床標本データにおける新規重要因子JAG1の破綻による発癌分子機構の解明(4) Notchシグナル活性化・非活性化細胞の共培養による早期細胞老化伝達メカニズムの解明に関して解析を実施していく。

(3)に関しては、The Cancer Genome Atlas(TCGA)のデータと当研究室で保持している臨床検体を利用する予定である。また(4)に関しては、研究計画に追加して共培養実験下でのタイムラプス解析を行う予定である。
揮発性有機ハロゲン化合物の環境中での挙動解析と防除

本研究は、使用後大気中に放出された揮発性有機ハロゲン化合物の輸送および光化学過程などの挙動を総合的に解析し、環境影響の予測と防除技術の開発を目的とする。まずこれら物質の迅速・高感度分析のため、熱脱着ガスクロマトグラフィーおよび化学イオン化による質量分析法などを開発し、実際に都市大気中のこれら成分を定量した。またハロカーボンの地球規模の平均大気濃度の経年変化について精密な測定を行った結果、フロン11および12では年5%程度、フロン113では10%以上の増加率を示した。また都市大気中のフロン113の濃度も、生産量を反映してフロン11および12を上まわることがしばしばみとめられた。成層圏大気中の微量期待の輸送過程を明らかにするため、大気大循環モデルの開発を行ってきたが、今回は南極オゾンホールの消長に影響の大きい赤道波と「準2年周期振動(QBO)」の再現を試みた。揮発性有機ハロゲン化合物の局地的環境中での挙動を予測するモデルを構築するため、これら物質の大気濃度と生産・使用状況・物理化学的性質などとの相関を解析した。これら物質の大気中での挙動は分解反応によって左右されることがわかった。また有機塩素・臭素・ヨウ素化合物による成層圏オゾン破壊反応について多層ボックスモデルを用いて反応解析を行い連鎖反応の特性を比較した。そしてオゾン破壊効率がCl<Br<Iの順に大きくなることなどを明らかにした。防除技術では、まず代表的な有機ハロゲン化合物蒸気について、水蒸気共存下での活性炭への吸着平衡および流出曲線を測定し、防除技術の最適化のための條件を検討した。ハロゲン化合物の濃度が低いときには、吸着は水蒸気によってかなり影響されることがわかった。還元的脱ハロゲン処理法であるナフタレニド処理によって、フロン113やフロン12、22などの脱塩素が容易であることが明らかにされた。
植物に新しく見出された昆虫に対する被食防衛機構の多面的解析

シロイヌナズナに見出されるERbodyは長さ10μm、幅1μmの細長い形態を示す小胞体由来の新規構造体である。研究代表者が以前単離したnail変異体は、ER bodyがほとんど発達しない変異体である。nail変異の原因遺伝子であるNAIl遺伝子は、転写制御因子として機能することが知られているタンパク質をコードしていた。GFP-h植物体とnail変異体のタンパク質組成を比較解析した結果、PYK10と呼ばれるβ-グルコシダーゼと糖鎖結合タンパク質(レクチン)と相同性を有するAt3g16420タンパク質がnail変異体では欠失していた。PYK10とAt3g16420タンパク質のmRNAがnail変異体では減少していることから、NAIlタンパク質は、PYK10とAt3g16420タンパク質の量を転写レベルで制御していると考えられた。植物でこれまでに報告されているβ-グルコシダーゼの多くは、植食性昆虫もしくは病害細菌に対する植物の防御機構に関与している。また、植物由来のレクチンの多くも、植物の被食防御機構に寄与していることが知られている。実際、PYK10とAt3g16420タンパク質は、植物の傷害、食害応答に関する植物ホルモンであるジャスモン酸の処理によって、発現が誘導されることを見出した。一方、植食性生物を用いた実験を行う事により、植物の抵抗性反応に関する新しい現象を発見した農業害虫として知られるハダニを野外で採集し、実験室での分子生物学的、化学生態学的な解析を行った結果、ハダニには、植物に抵抗性反応を誘導する系統と誘導しない系統が存在していることが分かった。
ES細胞を用いた動静脈リンパ管特異的分化誘導系の構築と血管多様化機構の解析

【目的】本研究は、申請者らの系統的動静脈リンパ管内皮細胞分化誘導システムを用いて、内皮細胞多様化機構を明らかにし、腫瘍血管リンパ管に対する新しい治療戦略開発することを目的とする。すなわち、1)動静脈リンパ管内皮特異的分化誘導法を確立する。2)同分化系を用いて動静脈リンパ管分化機構を解析する。3)動静脈リンパ管内皮細胞をそれぞれ純化する。4)純化細胞を用いて内皮細胞多様化過程における遺伝子プロファイルの作製と多様化内皮細胞特異的遺伝子群の網羅的同定を行う。以上4項目の検討により、内皮細胞多様化機構を明らかにする。【結果】ES細胞由来Flk1陽性血管前駆細胞の培養条件を検討し、動脈内皮マーカーephrinB2陽性動脈内皮細胞とephrinB2陰性静脈内皮細胞を誘導することに成功した。さらに新たな動脈内皮細胞マーカーを見出し、同マーカーを用いて誘導動脈内皮細胞の純化にも成功した。また、Flk1陽性細胞からリンパ管内皮マーカーprox-1陽性リンパ管内皮の誘導および純化にも成功した。これらの分化系を用いて動静脈リンパ管内皮分化機構を解析し、サイクリックAMPシグナルが動脈内皮細胞分化に必要であること、およびnotchシグナルが動静脈リンパ管分化の振り分けに重要な役割を果たしていることを見出している(以上Yurugi-Kobayashi et al.,およびKohno et al.,投稿準備中)。現在純化細胞を用いた内皮細胞多様化過程における遺伝子プロファイル作製を行っている。【結語】動静脈リンパ管内皮の分化誘導および純化に成功し、動静脈リンパ管分化の新たな分子機構を明らかにした。以上本年度の研究計画はほぼ完全に遂行できた。
中国大陸のサンショウウオ科およびイモリ科の種多様性の再評価と系統進化

中国大陸のサンショウウオ科およびイモリ科の種多様性の評価と系統進化を探るため、中華人民共和国の四川省、浙江省、河南省、福建省、広西チワン族自治区において野外調査を行い、得られた標本や組織サンプルから形態と分子に基づく系統分類学的な解析を行った。その結果、中国における両科の分類には多くの問題があり、複数の同物異名と新種が発見された。また、多くの生物地理学的な知見が新たに得られた。今年度の調査では、5月に四川大地震が起こった為に、四川省や貴州省の山地での調査は断念して、震源地から遠い浙江省、江西省、広西チワン族自治区、海南省などの東部おにび南部で野外調査および現地学会での発表参加を行った。野外調査の結果、サンショウウオ属、フトイモリ族、イモリ属、イボイモリ属、コブイモリ属などの多くの標本を採集することができた。今年度特に力を入れたのはフトイモリ属Pachytritonであったので、本属について以下に得られた知見について報告する。フトイモリ属は中国固有イモリで、3種を含む。ムハンフトイモリP. Iabiatusはそれらの中で最も広域に分布しており、体色や体各部の比率に大きな地理的変異が存在する。本種の種内変異の実態を明らかにするため、本年度は浙江省、江西省、広西チワン族自治区で野外調査を行って標本を収集すると同時に、中国科学院成都生物研究所などの所蔵標本の調査も行った。本年度までの解析結果から、ムハンフトイモリには形態的に分けられる二群が認められ、基準産地の広西チワン族自治区大謡山にはそれら二群が同所的に見られる事が明らかになった。ドイツのフンボルト大学自然史博物館所蔵の基準標本を調査した結果、その内の一群が真のムハンフトイモリであることを特定できた。よって、残りの群は未記載種の可能性が高い。しかし、この残りの群は、北は浙江省から南は広西チワン族自治区まで広域に分布しているために地理的な変異も大きく、更に別種と思われる個体が同所的に見られる地域があるなど、多くの興味深い知見が得られている。本種の分類学的な整理には、更に多くの地点からの材料採集を行い形態比較、詳細な遺伝的解析の両面から検討する必要がある。次年度以降は、他のサンショウウオ科おにびイモリ科の採集・研究計画と調整をして、ムハンフトイモリの分類学的研究についてもまとめて成果を出す予定である。今年度の調査では、5月から6月までの一ヶ月間、中華人民共和国で調査を行った。前半の二週間は広西チワン族自治区で野外調査を行った。特にこれまでに新種の標本が得られていた北部や北東部を中心に、追加標本の採集に取り組んだ。最初に訪れた資源では、フトイモリ属Pachytritonの同所的に生息する2種のサンプルを採集することができた。また、次に訪れた賀州では、チョンシャンコブイモリParamesotr iton fuzhongensisを偶然入手することができた。本種はクワンシーコブイモリP.guangxiensisなどの同物異名とする考えもあり、本種の分類学的な有効性の調査は今後の課題となった。次に広西チワン族自治区から、四川省の成都に移動して、中国科学院成都生物研究所などの所蔵標本の調査を行った。そこでは、フトイモリ属やコブイモリ属の他、イボイモリ属、ミナミイボイモリ属、タカネサンショウオウ属、リュウサンショウウオ属の各種の基準標本の計測や写真撮影を行うことができた。また、四川滞在中には、峨眉山や合江などで短期の野外調査も行うことができた。帰国後には、昨年からの成果をまとめて、Pingia属のキメアラフトイモリP.granulosaがムハンフトリモリPachytriton labiatusの同物異名であることや、ユナンサンショウウオHynobius yunanicusがフトサンショウウオPachy hynobius shangchengensisの同物異名であることを論文として公表した。今年度は、3月の約一ヶ月間、中華人民共和国で調査を行った。前半は福建省戴雲山および武夷山において、サンショウウオ属Hynobiusとフトリモリ属Pachytritonの生息調査を行った。サンショウウオ属については、両地域から、ほぼ一世紀前の生息記録および標本が残されている。今回訪れた場所は近年まで生息が確認されていたが、確認することができなかった。いずれもかつて繁殖を行っていた窪地が乾燥して干上がっていたことが原因と考えられた。フトリモリ属は、フトイモリを両地域で採集することができた。これまでの遺伝的な調査から、両地域の個体群は別の系統に属していることが明らかになっており、今後更に詳しく解析ができるようになった。調査の後半は重慶市の東部および南部で行った。ニセサンショウウオ属Pseudohynobiusw 2地点で採集したが、その1つの南部の産地はこれまで知られていない初報告のものであった。

現在本属からは毎年のように新種が記載されており、今回得られた標本も詳しく調査する必要がある。また、南部の他の産地より、コブイモリ属Paramesotritonの水生種を採集することができた。形態的な特徴よりロンリコブイモリPar.longliensisと思われ、重慶市からは初報告であった。福建と重慶の調査の間および前後は、共同研究者のいる四川省の成都に移動して、中国科学院成都生物研究所などの所蔵標本の調査を行った。そこでは、イモリ属やコブイモリ属の各種の基準標本の計測や写真撮影を行うことができた。今年度は過去の2年間のデータをまとめ、数編の論文として公表することもできた。特に現在世界でペットとして販売されているムハンフトイモリと信じられていたイモリが、実は新種であった事を示せたことは、今後社会的にも反響があると思われる。
マウスにおける脊椎転移モデルの確立とその発育、進展過程の組織学的解析

培養細胞には金沢大学癌研究所化学療法部から供与されたmurine melanomacell,B16/F10を用いた。C57/BL/6Nマウスの6-8週齢の雌をネンブタールにて麻酔し、27ゲージの針にて、2X10^6個の細胞を左心室に注入した。腫瘍細胞注入後、1週目、2週目に各5匹づつ屠殺し、全身灌流後、10%ホルマリン液にて灌流固定した。脱灰後HE染色にて脊椎正中矢状面の切片を顕微鏡下に観察した。同種正常マウス5匹を対照に用いた。細胞注入後、1週目には、5匹中1匹(5椎骨)に脊椎転移巣を認めた。腫瘍細胞の局在は、椎体上下の軟骨板に接する部位を中心に存在していた。しかし、椎体から脊柱管に腫瘍細胞が進展している像は観察されなかった。2週目においては、病理学的には5匹全例に脊椎転移巣を認め、合計52椎骨、1匹平均10.4椎骨に転移腫瘍細胞が存在していた。また5匹中1匹に下肢麻痺が生じた。21椎骨において、転移腫瘍細胞が硬膜外腔に進展し、脊髄前方、後方、もしくはその両側より脊髄を圧迫していた。硬膜外腔での上下方向の腫瘍進展範囲は1椎体以内のものが10部位、1椎体以上2椎体以内のものが10部位、4椎体に及んだものが1部位であった。このなかで4椎体のレベルにまで上下方向に腫瘍進展を認めた1部位で、腫瘍細胞は硬膜を破壊し脊髄内に直接浸潤していた。しかし他の20部位において硬膜は腫瘍の進展を完全に阻止し、脊髄内への直接浸潤は認めなかった。左心室に腫瘍細胞を注入することにより、脊椎転移モデルの作製が可能であった。特に硬膜外腔に進展した腫瘍細胞は硬膜外腔を上下方向に進展するが、硬膜内浸潤は稀であり、硬膜がバリアー効果を発揮していたことが観察された。しかし範囲が多椎体(4椎体以上)に及ぶときは、腫瘍が硬膜を破壊し、硬膜外直接浸潤の可能性もあることが証明された。
カーボンナノチューブセンサーによる肝特異的酸化リポ蛋白の測定

肝不全患者血清から超遠心法とゲルろ過法により分離した肝特異的酸化リボ蛋白をマウスに免疫し、ハイブリドーマを作製し、同リボ蛋白に対する抗体を産生するクローン数個を得た。そのうち、金属酸化LDLや正常LDLとは反応しない抗体を産生するクローン1個を選択した。本クローンの抗体は肝不全患者LDL画分と強く反応したが、正常者や高脂血症患者ではほとんど反応せず特異性に優れていた。また、同リボ蛋白をウサギに免疫して抗血清を得た。本ポリクロナル抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製した特異抗体は、同モノクロナル抗体とのサンドイッチ酵素免疫測定にも応用でき、肝不全患者で著しく高い反応を示した。また、胆汁うっ滞患者や中等度の肝不全患者でも反応がみられ、肝特異的酸化リボ蛋白の出現する病態に関して示唆を得ることができた。一方、本モノクロナル抗体をカーボンナノチューブセンサーへと組み込むことについては、抗体遺伝子の可変領域遺伝子cDNAをクローニングし、さらに発現ベクターへと組み込むことにより、抗体を大量に調製することができるようになった。同抗体をカーボンナノチューブセンサーの検出基板のバックゲートに固定化したところ、肝特異的酸化リボ蛋白と迅速に反応し、高感度の検出が可能であった。以上から、肝特異的酸化リボ蛋白に対するカーボンナノチューブセンサーによる測定の基本的検討は完了し、今後は実用化に向けた研究を行う予定である。肝不全患者血清を採取し、超遠心法にて総リポ蛋白分画を採取後、さらにゲルろ過法にてLDL分画を精製した。そのリポ蛋白が肝不全に特異的に出現するトリグリセリドリッチ酸化リポ蛋白であることを次の方法で確認した。まず、1)本リポ蛋自分画の脂質組成を酵素法により決定しトリグリセリドリッチであることを確認し、2)本リポ蛋白分画が酸化LDL抗体(抗マロンジアルデヒド結合LDL抗体)と交叉反応することを確認し、次いで、3)我々が開発した化学発光高速液体クロマトグラフィー法によるトリグリセリドヒドロペルオキシド測定法にて同リポ蛋白分画が高濃度のトリグリセリドヒドロペルオキシドを含有することを確認した。さらに、4)同リポ蛋白分画がヒト単球由来マクロファージに活発に貧食され、金属酸化LDLとほぼ同等のマクロファージ泡沫化能を有することを確認した。このようにして肝特異的酸化リポ蛋白であることが確認されたリポ蛋白分画を用いて、常法に従ってマウスに免疫してハイブリドーマを作製した。現在は、同リポ蛋白分画と反応する抗体を産生するクローンであり、かつ、他のリポ蛋白種(金属酸化LDLを含む)とは反応しない条件を満たすものをスクリーニングしている。これまでのところ、トリグリセリドリッチ酸化LDLと弱く反応するクローンは得られたものの、他のリポ蛋白種とも交叉反応する性質がみられ、さらに特異性の高いクローンを得ることを目指して免疫を続けている。
FAKチロシンキナーゼを介した細胞内情報伝達機構の解析

(1)唾腺染色体in situハイブリダイゼーションにより、DFAK遺伝子の位置をバンド56Bから56Dの間にマッピングした。(2) RNA in situハイブリダイゼーション、免疫組織染色によりDFAK遺伝子及びその産物のハエ胚において中枢神経系及び筋表皮接合部(muscle attachment,apodeme)に発現していること、また免疫蛍光抗体法により、ショウジョウバエ神経由来培養細胞においてDFAK56蛋白質が哺乳類培養細胞の接着斑(focal adhesion)に相当する構造にインテグリンと共に発現していることを見出した。(3)ショウジョウバエ培養細胞を用いた実験によって、DFAK56蛋白質がインテグリンを介した細胞基質間の接着によりリン酸化が亢進し、その際ショウジョウバエのsrc相同蛋白質の一つであるDsrc41蛋白質と会合していることを明らかにした。(4)野生型およびキナーゼ活性を消失させた変異型DFAK遺伝子を誘導的・空間特異的に発現させることのできるトランスジェニックハエの系統(UAS-DFAK56)を作製し、変異体の強制発現による胚発生時の神経系への影響を観察したが、神経形成に大きな影響は見られなかった。2. PCR法を用いてヒトFAK遺伝子のcDNAにランダムに突然変異を導入した発現ライブラリーを作製し、NIH3T3細胞を用いて細胞のトランスフォーメーションを指標として活性型の突然変異を同定するためのスクリーニングを行った。約30万の変異体をスクリーニングしたが、変異遺伝子の導入によりトランスフォームした細胞は得られなかった。1.ショウジョウバエから脊椎動物のFAK(focal adhesion kinase)に相同な遺伝子をクローニングし(DFAK)、以下に示す解析を行った。(3)ショウジョウバエ培養細胞を用いた実験によって、DFAK蛋白質が脊椎動物のFAK同様、インテグリンを介した細胞基質間の接着によりリン酸化が亢進することを明らかにした。(4)野性型およびキナーゼ活性を消失させた変異型DFAK遺伝子を誘導的に発現させることのできるトランスジェニックハエの系統を作製した。以上の結果は平成9年12月に米国ワシントンD.C.で行われたアメリカ細胞生物学会年会において発表した。2. PCR法を用いてFAK遺伝子のcDNAにランダムに突然変異を導入した発現ライブラリーを作製した。現在NIH3T3細胞を用いて細胞のトランスフォーメーションを指標として活性型の突然変異を同定するためのスクリーニングを開始している。(1)免疫蛍光抗体法により、ショウジョウバエ神経由来培養細胞においてDFAK56蛋白質が哺乳類培養細胞の接着斑(focal adhesion)に相当する構造にインテグリンと共に発現していることを見出した。(2)ショウジョウバエ培養細胞を用いた実験によって、DFAK56蛋白質がインテグリンを介した細胞基質間の接着によりリン酸化が亢進し、その際ショウジョウバエのsrc相同蛋白質の一つであるDsrc41蛋白質と会合していることを明らかにした。(3)野生型およびキナーゼ活性を消失させた変異型DFAK遺伝子を誘導的・空間特異的に発現させることのできるトランスジェニックハエの系統(UAS-DFAK56)を作製し、変異体の強制発現による胚発生時の神経系への影響を観察したが、神経形成に大きな影響は見られなかった。以上の結果は現在論文発表準備中である。2. PCR法を用いてFAK遺伝子のcDNAにランダムに突然変異を導入した発現ライブラリーを作製し、NIH3T3細胞を用いて細胞のトランスフォーメーションを指標として活性型の突然変異を同定するためのスクリーニングを行った。約10万の変異体をスクリーニングしたが、変異遺伝子の導入によりトランスフォームした細胞はまだ得られていない。(1)ショウジョウバエ神経由来培養細胞においてDFAK56蛋白質が哺乳類培養細胞の接着斑(focal adhesion)に相当する構造にインテグリンと共に発現していることを見出した。また、DFAK56を哺乳類培養細胞に発現させても同様の接着斑への局在が見られたことから、FAK蛋白質の細胞内局在には高度に保存された分子機構が関与していると思われた。

2.PCR法を用いてFAK遺伝子のcDNAにランダムに点突然変異を導入した発現ライブラリーを作製し、NIH3T3細胞を用いて細胞のトランスフォーメーションを指標として活性型の突然変異を同定するためのスクリーニングを行った。約30万の変異体をスクリーニングしたが、変異遺伝子の導入によりトランスフォームした細胞は得られなかった。
介護施設における学習の共同体の研究－組織的技能形成とキャリアの相互作用を中心に－

本研究では、実践共同体の構築が個人の学習にどのような影響をもたらすか、特に実践共同体に多重所属することが学習をどのように促進するかという問題について、介護施設の事例を中心に、教育サービス会社や陶磁器産地の地域コミュニティを対象にした探索的研究を行った。実践共同体の2タイプの構造によって促進される学習方略が異なること、そこから学習によって参加する実践共同体を使い分ける意義、実践共同体の重層的構造が学習とネットワーク構築を促進することが示唆された。介護施設における実践共同体の研究については、今年度は、(1)介護施設の調査、(2)学習療法研究大会への参加、(3)他の実践共同体への調査とその比較、(4)理論的整理、の4点について実施した。(1)介護施設の調査については、今年度は6件の介護施設へのインタビュー調査を実施した。これまでの調査と同様、「学習療法センター」からの紹介のもと、学習療法を実施している施設について、[1]導入の経緯、[2]学習の様子、[3]導入と学習による組織的変化、の3点についてインタビューを実施した。その結果、学習を促進する要因として、施設内に導入に積極的なスタッフの存在があることと、そのスタッフおよび施設全体の自律的な学習活動について、トップや施設長の「ゆるやかなリーダーシップ」が存在することがうかがえた。この点については実践共同体の既存研究にもあてはまるものであり、今後の調査においても重点的に調べていく。調査結果については、3つの学会において学会報告を実施し、好評を得ている。(2)学習療法研究大会「学習療法シンポジウム」については今年度も参加し、自律的な学習活動を実施する施設の研究発表について知ることができた。そのうちのいくつかの施設については、調査対象としてインタビュー調査を実施している。(3)他の実践共同体への調査とその比較については、同様に研究している実績のある、教育サービス会社の実践共同体、陶磁器産地の実践共同体などについても事例が集まっているが、そことの比較研究を行い、その結果について学会発表を実施している。(4)理論的整理については、実践共同体との関連が想定される、組織学習および「学習する組織」についてと、活動理論と学長的学習論について文献検討を行い、実践共同体との関係性について整理した。その結果については2本の論文にまとめている。本年度は介護施設のほか、実践共同体(学習のコミュニティ)といえる他の共同体・組織も含めて、事例調査を進めてきた。介護施設ではこれまでの「学習療法」を実践する施設に加えて、身体的な運動を通じた運動機能の回復を目指す施設にも調査をすることができた。しかし取り組む療法の違いにもかかわらず、施設では実践共同体が作られ、お互いに技能向上のための学習活動をしていることがわかった。これらの成果は2つの学会発表(経営行動科学学会、日本認知科学会)において発表した。また事例調査活動と同時に、先行研究の検討活動も行った。特に実践共同体において重要であると思われる「成人学習論(成人に焦点をあてた教育・学習理論)」、「生涯学習論(生涯学習を進める教育・学習理論)」の文献検討をおこない、実践共同体を構築・運営するにあたっての理論的基盤を確立し、実践とのリンケージを考えた。その成果は2本の論文としてまとめている。そして介護施設の事例と並行して調査している教育サービス会社の事例は引き続き調査しているが、その研究成果が学会論文(組織学会)と著書(分担執筆の一章)としてまとめられた。学会論文は採択が決定し、近日掲載・刊行される。今後の研究計画としては、単著の原稿を執筆し、まとめあげることである。そのためには介護施設の事例をより確かなものとするために、追加的な調査も必要かもしれない。必要に応じて実施し、来年度中の成果発表を目指す。本研究では、組織内外で組織成員が主体的に学習する場としての「実践共同体(communities of practice)」の形成・運営について、介護施設の事例研究を中心に実施してきた。本研究の主要なリサーチサイトである介護施設に加えて、企業組織や地域レベルでの実践共同体の事例研究を実施し、成功事例から、複数の実践共同体とのつながりがより包括的な上位の実践共同体を形成し、個々の実践共同体との相互作用を行うことで、学習がより促進されることがわかった。それは個々の企業レベルから複数の企業、地域レベル、そして全国レベルの実践共同体と重層的に形成され、それが技能の形成や広範な知識の獲得、情報交換、人的ネットワークの形成といった、実践共同体の学習スタイルを多様に促進することがわかった。合わせて継続的に実施している実践共同体の概念研究では、「学習する組織」研究、活動理論、コミュニティ論、「サードプレイス」論、ラーニング・コミュニティ研究といった多様な関連分野の研究をレビューすることで、実践共同体と他概念の差異化を行うことができた。あわせて他概念との共通点を見出すことで、実践共同体における学習の特異要因として、参加者の自発性と自由度の高さ、仕事から距離を置くことでの安心感と、比較して学ぶ「複眼的学習」、人的交流からの「循環学習」といった多様な学習スタイルを見出すことができた。実践共同体による学習は、従来の組織学習論や教育学からの学習論と排他的なものではなく、新しい選択肢を提供するものである。組織がその選択肢をもつことで、これまで進まなかった学習にモティベーションを与えることができる。あわせて学習を起点にした若手のリーダーシップの育成にもつながることを提唱している。