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言語行為として見た明治以降の詔勅の研究

天皇の詔勅は古代律令制以来存在してきたが、近代になってはじめて「国民」全体に向けて発せられるようになった。天皇は「国民」に呼びかけることで近代的な「天皇」へと転換した。他方で、「国民」は天皇の発する詔勅の受信者となることで成立した。このように、近代日本において天皇と国民は、詔勅を通して「呼びかけ-呼びかけられる」関係におかれていた。本研究では、こうした相互の呼応関係が、どのように成立したかを分析することによって、近代日本における「国民」意識の特質を明らかにすることができた。本研究の目的のひとつには詔勅の文体分析があるが、それに先立って明治時代の公用文の変遷をとりあげ、同時代の人々自身が文体の変化をどのようにとらえていたかを見定める必要があった。論文「「放縦不法」から「妖魔文章」へ」では、矢野文雄と福地源一郎という明治を代表するジャーナリストの文章論をとりあげ、時代認識が文章意識にどのように反映していたかを明らかにした。この視点を言語意識全体に広げたものに、論文「「国語」ということばの新しさ」がある。そこでは、明治時代になって「国語」という概念がどの程度新しいものとして受けとられたかを明らかにした。こうした作業を基礎にして、2007年1月12日から15日にかけてハワイ大学で開催された第五回人文学国際会議において、「日本の近代国家形成における詔勅の役割」(英語)という発表をおこなった。そこでは、詔勅は天皇から「臣民」への呼びかけという形式をとる以上、典型的な言語行為として把握することができること、その一方、詔勅の発せられる場所、テーマ、受信者にしたがって文体と語彙にも変異が生じていることを確認した。そして、「爾臣民」という呼びかけの形式が生まれた過程をたどることで、詔勅による「呼びかけ」と「呼応」の関係性が国民形成に果たした役割を分析した。その会議では国際的に活躍する日本学者も多く参加しており、数々の貴重なコメントを頂くことができた。現在、この発表をもとにした論文を計画中であり、2008年度にはアメリカのアジア学会で報告を予定している。論文「ひとが「文化」に直面するとき」は、こうした研究から生まれた副産物であるともいえ、「文化」という制度がそこに属さない他者にとっては暴力として作用する可能性があるという観点から、現代日本の文化状況を論じた。平成19年度の研究の第一の目的は、明治以降の思想史のなかで詔勅がどのような意味を担わされていたかを明らかにすることであった。そのために二つの領域を設定した。ひとつは民俗学であり、もうひとつは憲法学である。この二つの領域は一見したところ隔たりが大きいように見えるが、天皇の詔勅が古代以来の「みこともち」の系譜の上でとらえられていたことを考えるなら、それほど唐突な結びつきではない。そのことは、大日本帝国憲法が君主である天皇の意志の発現であり、憲法の方向性を定めた天皇の「上輸」が憲法前文としての役割を果たしていることによく現れている。この「上輸」は、憲法の内部にあると同時に外部にあるという非常に曖昧な性格をもっており、この不確定性は詔勅全般にも当てはまる。二本の研究論文では、柳田国男と折口信夫の民俗学における天皇制の意味を追究した。とくに折口が天皇のことばに付与した重要性に注目した。また、学会発表では、天皇制と日本の文化的アイデンティティの関係について考察した。これらの研究成果をまとめたかたちで、2008年4月にアメリカのアトランタ市で開催されるアジア学会年次大会での研究発表を申請し、受理された。その報告では、天皇の詔勅の法的位置づけ、民俗学的意味づけ、政治文化的制度の問題などをあつかう予定である。また本年度には、これまで発表してきた文化論、政治論に関する論文を集めて、一冊の著書を上梓することができた。著書を刊行することは、これからの研究の方向性を定めることに大いに役立った。平成20年度においては、4月にアメリカ合衆国アトランタ市で開かれたアジア学会年次大会(The Association for Asian Studies Annual Meeting)に参加し、「日本史における君主制と政治的操作:中世から明治までの転換点」というセッションで研究発表を行なった。その発表では、明治時代に詔勅が天皇と国民の間を結びつける役割を担い、それを通して天皇と国民が「呼びかけ/呼びかけられる」関係に置かれるようになったことを論じ、詔勅の言語行為的側面を明らかにすることができた。この発表は学会で好意的に迎えられ、多くの専門家から貴重なサジェスチョンをいただくことができた。当初はこの発表を英文論文として発表する予定であったが、その後、日本語論文としてまとめることに計画を変更したため、まだ論文として公刊するには至っていない。その後、7月には国立国語研究所、韓国国語院と本研究科が共催した国際シンポジウムで日本の定住外国人に対する言語施策に関する発表を、10月には韓国の延世大学における国際学術会議において近代日本の言文一致についての発表を行なうなど、新たな研究発表に取り組んだ。

さらに、2009年2月には、本年度の研究成果をもりこんだかたちで、これまで発表してきた言語思想史関連の論文を一冊の著書にまとめた。この本はすでに書評にもとりあげられ、好意的な評価が得られた。年度全体として見て、当初の計画の変更はあったが、たいへん充実した成果を挙げることができた。
過活動膀胱は予防可能か?

急性尿閉による膀胱機能不全は、14日後までは過活動膀胱を示すが28日後には排尿動態はほぼコントロールのレベルまで戻った。この急性尿閉による膀胱機能障害はラジカルスカベンジャーであるエダラボンや、K_<ATP>チャンネル開口薬であるニコランジルとクロマカリムで予防できる事がわかった。高血圧に関連するSHRラットの膀胱機能不全に対しては、K_<ATP>チャンネル開口薬であるニコランジル、α_<1A>ブロッカーであるシドロシンおよびRhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルの慢性投与が膀胱血流増加という作用機序を介して治療効果を示す事が示唆された。ラットで動脈分岐部を遮断し、膀胱を30分間の虚血-60分間の再灌流するモデルを用いてプレコンディショニングの効果を確認した。膀胱を摘出後、恒温槽を用いた平滑筋の機能を観察した。5分間3回のプレコンシショニングで膀胱平滑筋の機能が優位に予防できる事が確認できた。このとき、虚血-再灌流やプレコンディショニングは膀胱を収縮するメカニズム(ムスカリンM3受容体)に変化を与えない事が確認できた。ラット急性尿閉モデル(SDメスラッット3ml、60分間)を作成し、60分後導尿し、3日1、2、3、4週間後にラットの排尿動態をメタボリックケージを用いて観察した。また、2、4週間後には膀胱内圧測定を恒温槽を用いた平滑筋の機能を、また組織学的検討ではH&E染色とマッソンとリクローム染色を行い観察した。排尿動態では3日後から著明な頻尿状態となり、約3週間持続した。しかし、膀胱内圧測定やアセチルコリン値よびKC1刺激による収縮力の変化は認められなかった。組織学的検討では2週目は炎症の持続が観察されたが、4週間後では繊維組織の増加が粘膜下層と平滑筋層で確認できた。以上の結果から膀胱平滑筋にも虚血-再灌流障害に対する防御メカニズムであるプレコンディショニングが存在する事が明らかになった。また、急性尿閉とその解除モデルが過活動膀胱のモデルとして使用できる可能性が示唆された。特発性過活動膀胱は、膀胱の慢性虚血による膀胱部分的除神経が一因とされているが急性尿閉とその解除後に起こる現象が、過活動膀胱の機序を解明知る手がかりになるかもしれない。急性尿閉とその解除後膀胱では虚血-再灌流が生じる。その結果、膀胱の易刺激性が高まり過活動の状態になることを前年度に報告した(Mol. Cell. Biochem. 333 : 109-114, 2010)。心臓や腎臓等の臓器では、K_<ATP>チャンネル開口薬ニコランジルやクロマカリムがpreconditioningを誘導し、虚血-再灌流障害に対し臓器保護作用をもたらすことが知られている。今回、急性尿閉解除時における膀胱機能障害に対して、K_<ATP>チャンネル開口薬がpreconditioning効果を示すのかを検討した。8週齢の雌性SDラットを用いて、外尿道口をクランプし、膀胱頂部に膀胱瘻を作成した後5分間で2.5mlの生理食塩水を注入し、尿閉による虚血状態を誘発した。30分後に尿閉を解除して、60分間の再灌流状態を作り、これを急性尿閉モデルとした。このAURモデルに、薬物投与群としてニコランジル3および10mg/kg、クロマカリム100および300μg/kgを尿閉開始30分前に腹腔内投与した。また、対照として急性尿閉のみの非投与群と非急性尿閉のコントロール群の計6群で実験を行った。尿閉開始から解除60分後までの膀胱内圧および膀胱血流量を測定した後に膀胱を摘出した。膀胱平滑筋切片を作成し、高温槽にてKC1(100mM)による収縮とカルバコールの累積投与による最大収縮力(Emax値)とEC_<50>値を測定した。各群共に、膀胱内圧測定では生理食塩水注入1cc前後より急激に上昇し注入停止後に膀胱内圧は低下したが、高圧な状態が持続した。膀胱血流量は膀胱内圧上昇と共に低下し、尿閉解除と共に有意に上昇した。平滑筋収縮実験において、急性尿閉モデルではコントロール群に対してKCIおよびカルバコール刺激に対して有意な収縮力の低下が認められ、カルバコールに対するEC_<50>値は有意に上昇した。これらの変化はニコランジルおよびクロマカリムの投与で有意に抑制できた。急性尿閉とその解除における膀胱平滑筋障害は、K_<ATP>チャンネル開口薬であるニコランジルやクロマカリムの投与で改善することが示唆された。骨盤内血流の低下は過活動膀胱の原因の1つと考えられている。SHRラットは高血圧関連の過活動モデルとして知られている。

そこで、骨盤内血流を増加させ、かつ血圧への影響は少ない3剤(α1Aブロッカーであるシロドシン、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジル、およびATP依存性Kチャンネル開口薬であるニコランジル)をSHRラットに投与し、膀胱血流の変化と排尿筋過活動の改善について検討した。12週齢のSHRラットに、シロドシン100μg/kg(p.o.)、塩酸ファスジル1mg/kg(i.P.)、ニコランジル10mg/kg(i.p.)を連日6週間投与した。コントロールとしてWistarラットと無治療のSHRラット用いた(各群n=8)。6週間後、代謝ケージにて1日排尿量、1日排尿回数および1回排尿量を測定し、tail cuff法にて収縮期/拡張期血圧と脈拍を測定した。ウレタン麻酔下(1.0g/kg,i.p.)、膀胱内圧測定にて最大排尿圧(Pdet)、1回排尿量および残尿量を測定し、水素クリアランス法にて膀胱血流量を測定した。さらに、排尿筋過活動のバイオマーカーである膀胱組織中NGFを測定した。SRRラットはWistarラットと比較し血圧、排尿回数、組織内NGF濃度は有意に高値を示し、1回排尿量および膀胱血流量は有意に減少していたが、Pdetと残尿量は変化がなかった。シロドシン、塩酸ファスジル、ニコランジルによる治療介入により、SHRラットは無治療群と比べ、血圧、Pdetおよび残尿量を変化させることなく、有意な膀胱血流量と1回排尿量の増加および、1日排尿回数および組織内NGF濃度の低下を認めた。本結果からシロドシン、塩酸ファスジル、ニコランジルの慢性投与は血圧関連排尿筋過活動を改善することが示された。この作用機序は、排尿筋に直接作用せずに膀胱血流を増加し、その結果排尿筋活動を抑えると考えられた。
ハワイ諸島及びニウアフォッオウ島のポリネシア諸言語に関する緊急調査研究

1平成14年7月から8月にかけてハワイ諸島に現地調査に赴き、現地ハワイ語教育機関の協力を得ながら、ハワイ州内に散在するネイティブスピーカーの所在情報と研究協力依頼を進めました。それにより、前年度までまとまった調査の対象にしてこなかったニイハウ島方言を含めた調査も行うことができました。ネイティブスピーカーの協力を得て、聞き取り調査、及びデジタルメディア(DAT, DVテープ)への録音・録画を行いました。また、同じく7月から9月にかけて、研究協力者の塚本晃久がトンガ王国に調査に赴き、ニウアフォッオウ島の言語の収集調査を行いました。2収集した資料は不要部分(無関係な英語発話、電話や来客による会話中断など)を削除するなどの整理編集の後、長期保存及び分析のための反復使用に供するため、より信頼度の高いデジタルメディア(音声はCD-R、MD、ヴィデオ映像はDVD-R)へ移行する作業を行いました。3このように収集・記録したデータはネイティブスピーカーの協力も得ながら文字化しコンピュータ入力を進めました。文字化が済んだデータについては語彙(及び語法)・文法等の分析・整理を進めました。これまでに分析・整理が済んだ部分については近刊の「環南太平洋の言語」第3号の中に音声データCDと共に収録されます。研究協力者の塚本晃久によるニウアフォッオウ語の調査分も同じく近刊の「環南太平洋の言語」第3号の中に音声データCDと共に収録されます。1ハワイ語協会(ハワイ州ホノルル市)の協力を得て、オアフ島を中心にハワイ島、カウアイ島を含めたハワイ各地に点在するハワイ語のネイティブスピーカであるお年より達の所在情報を集めました。2オアフ島内各所(ホノルル市内数箇所、カネオヘ地区、ライエ地区、ワヒアワ地区など)において合計7人のネイティブスピーカーを訪問しました。訪問先には、ハワイ語協会からもう一人のネイティブスピーカーが同行し、インタビュアーを務めました。それぞれ一時間程度の会話をデジタル録音し、また、会話分析の際の参考とするために、インタビューの様子をデジタルビデオにも記録しました。また、オアフ島カネオヘ地区で一人のネイティブスピーカーを訪問し、ハワイ語のモノローグをデジタル録音し、その様子をデジタルビデオに記録しました。それぞれの音声データは現地でCDとして保存し、ハワイ語協会の方にも1セット寄贈しました。また、どのような形式で公開するのがハワイ語復興教育に役立つかについて、現地の関係者と意見交換を行いました。3現地のネイティブスピーカーの協力を得ながら、録音したハワイ語データを編集・整理し、文字化・コンピューター入力を進めました。文字化したものについては、文法、語彙について分析し、それらを加えた成果を、本特定領域研究の環南太平洋班研究報告の中で公開予定です。4共同研究協力者の塚本晃久が、ハワイ語と同じくポリネシア諸語で危機的な状況にあるニウアフォッオウ語とその周辺言語の調査を行い、現地で聞き取り調査を行いました。この成果も本特定領域研究の環南太平洋班研究報告の中で公開予定です。1平成13年7月から9月にかけてハワイ諸島に現地調査に赴き、現地ハワイ語教育機関の協力を得ながら、ハワイ州内に散在するネイティブスピーカーの所在情報と研究協力依頼を進めました。それにより、前年度までの先行調査以来調査を続けてきたオアフ島に加えて、今回は燐島での調査も行うことができました。オアフ島では2名、オアフ島の西にあるカウアイ島で2名、オアフ島の東側にあるモロカイ島で2名、合計8名のネイティブスピーカーの協力を得て、聞き取り調査、及びデジタルメディア(DAT, DVテープ)への録音・録画を行いました。基本的には会話又は一人語りの収集が主でしたが、カウアイ島では伝統的な製塩を行っている塩田において、製塩技術についてのハワイ語による解説場面を録音・録画しました。2収集した資料は不要部分(無関係な英語発話、電話や来客による会話中断など)を削除するなどの整理編集の後、長期保存及び分析のための反復使用に供するため、より信頼度の高いデジタルメディア(CD-R、MD、DVD-R等)へ移行する作業を行いました。この編集記録作業は次年度へかけて継続予定です。これらの作業も次年度へ向けて継続中であり、その結果を次年度夏ごろにまとめて解説付き資料集として出版し、地元関係機関に配布する予定です。上記の2と3については設備備品として購入したノートパソコン等を活用しました。

2収集した資料は不要部分(無関係な英語発話、電話や来客による会話中断など)を削除するなどの整理編集の後、長期保存及び分析のための反復使用に供するため、より信頼度の高いデジタルメディア(音声はCD-R、MD、ヴィデオ映像はDVD-R)へ移行する作業を行いました。3このように収集・記録したデータはネイティブスピーカーの協力も得ながら文字化しコンピュータ入力を進めました。文字化が済んだデータについては語彙(及び語法)・文法等の分析・整理を進めました。これまでに分析・整理が済んだ部分については近刊の「環南太平洋の言語」第3号の中に音声データCDと共に収録されます。研究協力者の塚本晃久によるニウアフォッオウ語の調査分も同じく近刊の「環南太平洋の言語」第3号の中に音声データCDと共に収録されます。
Crigler-Najjar症候群の異常遺伝子の解析

世界で3番目、日本では初めて、Crigler-Najjar症候群I型患者ビリルビンUDP-グルクロニルトランスフェラーゼの遺伝子異常を決定し報告した。この遺伝子は一つの遺伝子から6つのトランスフェラーゼアイソザイムを転写、発現する。それぞれのトランスフェラーゼは五つのエキソンからなる転写ユニットからできており、5'端側に基質特異性を決めている、それぞれのトランスフェラーゼに固有なエキソン1が一かたまりとなって並び、3'端側に一組のみ、共通に使われるエキソン2-5が位置している。この遺伝子から転写されるトランスフェラーゼのうち2つがビリルビンを基質とすることが報告されている。このような遺伝子構造から、これまでCrigler-Najjar症候群I型では酵素活性が完全に欠損するので、エキソン2-5の領域におきた突然変異が2つの酵素活性を同時に消失させることが予想されていた。実際にアメリカ合衆国での2つの報告では予想通りの領域に変異が存在した。しかしわれわれが日本の患者で見いだした変異はエキソン1に停止コドンがホモで存在していた。この変異の発見により、これまで2つと考えられていたヒトのビリルビンUDP-グルクロニルトランスフェラーゼのうち、1つのみがビリルビン代謝に重要であることが明らかになった。また日本のCrigler-Najjar症候群I型の全患者、(三家系、4名)の遺伝子について変異を調べたところすべて同じ突然変異であった。さらにCrigler-Najjar症候群II型患者にビリルビンUDP-グルクロニルトランスフェラーゼのミスセンス突然変異を見いだし、遺伝子解析からもこの症候群が常染色体性劣性遺伝をすることを世界で最初に報告した。研究実績:Crigler-Najjar症候群I型の日本人患者で疾患の原因となっているビリルビンUDP-グロクリン酸転移酵素遺伝子の変異部位を明らかにした。変異は酵素の280番目のアミノ酸システインをコードするTGCの停止コドンTGAへの変化であった。その結果活性のない、ペプチド鎖の正常より短い酵素タンパクが翻訳され、酵素活性が欠損し、ビリルビンを解毒できなくなり、先天性の重症黄疸となることが判明した。この報告は世界で3番目のものであった。しかし遺伝子の構造からかんがえると、今迄予測されていなかった新しいタイプの突然変異であった(詳細については学会報告で述べた)。結果は下記の報告と論文で公表した。1.招待講演2.論文世界で3番目、日本では初めて、Crigler-Najjar症候群I型患者ビリルビンUDP-グルクロニルトランスフェラーゼの遺伝子異常を決定し報告した。

さらにCrigler-Najjar症候群II型患者にビリルビンUDP-グルクロニルトランスフェラーゼのミスセンス突然変異を見いだし、遺伝子解析からもこの症候群が常染色体性劣性遺伝をすることを世界で最初に報告した。
産婦人科領域における副甲状腺ホルモン関連蛋白の役割に関する研究

1)PTHrP(PTH関連蛋白)の正常生殖器における発現おのび作用の検討遺伝子発現およびPTHrP蛋白の局在について検討をした。(a)子宮内膜、脱落膜、絨毛、卵管、卵巣、子宮筋、卵膜(羊膜、絨毛膜),妊娠初期および妊娠中期の胎児組織よりmRNAを抽出しRT-PCRにより、PTHrPの遺伝子発現を検討した.PTHrPの遺伝子発現は子宮内膜、脱落膜、絨毛、卵管、卵巣、子宮筋、卵膜および胎児の肝臓、腸、皮膚に見られた.(b)ホルマリン固定した、正常子宮内膜、脱落膜、卵膜を用いてC端(109-141)を認識する抗体を用いた免疫染色(ABC法に準じた)によりPTHrPの局在を検討した.PTHrP蛋白は子宮内膜では内膜腺細胞、脱落膜では内膜腺細胞および間質細胞、卵膜では絨毛膜細胞、脱落膜間質細胞、絨毛では合胞体細胞に局在が認められた。(c)乳汁中に高濃度に含まれるPTHrPは産褥婦血中に移行する.(d)羊水中のPTHrP濃度は妊娠中期で高値となる.また、奇形児、羊水過多症におけるPTHrP濃度は正常児のそれと異ならなかった.しかし、致死性四肢短縮小では低値であった.(e)卵胞液中にPTHrPが高濃度に含まれるか卵胞液は多量のPTHrPを含む.(2)高Ca血症を伴わない卵巣腫瘍におけるPTHrPの遺伝子発現と患者血清中および腫瘍内容液中のPTHrP.(a)PTHrP測定の意義.術前良性卵巣腫瘍(34例)、悪性卵巣腫瘍患者(27例)の血清、腫瘍組織(悪性10例、良性5例)、腫瘍内容液あるいは癌性腹膜炎の腹水(良性-14例、悪性-14例)中のPTHrP濃度を測定した.血清中のPTHrP値は正常コントロール(45例)のM+2SD,38.5pmol/L以上を高値とする良性群では5例(16%)に軽度高値例が見られた。一方悪性群では10例(37%)は高値例が見られた.これらの高値例はいずれも術後正常値となった.腫瘍内容液中に、PTHrPは良性、悪性卵巣腫瘍でいずれも検出された.特に500pmol/L以上の高値例は悪性群で5例(35%)良性群では1例(7%)に見られた.よって、卵巣腫瘍の腫瘍マーカーとして有用であると考えられた。(b)PTHrP遺伝子発現は良性、悪性卵巣腫瘍組織のいずれにも見られた。

婦人科悪性腫瘍患者血清、腫瘍内容液、腹水中のC-PTHrP測定し、悪性腫瘍がPTHrPを産生しているか、あるいは腫瘍マーカーとして有用であるかについて検討した。一般にPTHrPは高Ca血症を引き起こす物質として知られているが、高Ca血症を伴わない悪性腫瘍組織中あるいは患者血清中にも高値で検出されることがあると指摘されている。今回は、正常Ca値の患者を対象に測定した。正常コントロール;45例、悪性あるいは良性腫瘍の手術前の患者あるいは再発悪性腫瘍患者(悪性卵巣腫瘍;17例、子宮頚癌;13例、子宮体癌;7例、良性子宮腫瘍;12例、ジュウ毛性疾患;3例)、手術時腹水;2例、腫瘍内容液;5例を採取した。検体中のPTHrPはC端に対する抗体を用いたRIAにより測定した。結果:血清中のC-PTHrP値:子宮体癌30. 7±9. 45,nsジュウ毛性疾患29. 5±6.49,ns良性子宮腫瘍28. 8+12. 39,nsであった。カットオフ値を正常コントロールのM+2SD以上とすると。高値例はそれぞれ、11%、15%、14%、0%、14%、0%に見られた。また、腫瘍内溶液中のC-PTHrP値は54.5+30.33(M+SD)であり同上のカットオフ値を用いると、2例に高値を認めた。PTHrPは悪性腫瘍において高カルシウム(Ca)血症を引き起こす物質として知られているが、高Ca血症を伴わない悪性腫瘍においても産出されていることが知られている。本年度は、、高Ca血症を伴わない卵巣癌組織におけるPTHrPの遺伝子発現、患者血清中および腫瘍内溶液中のPTHrP濃度について検討した。[方法](1)患者の同意を得て、術前良性卵巣腫瘍(34例)、悪性卵巣腫瘍患者(27例)の血液を採取した。また同様に手術時腫瘍組織(悪性10例、良性5例)、腫瘍内溶液あるいは癌性腹膜炎の腹水(良性-14例、悪性-14例)を採取した。(2)腫瘍組織よりmRNAを抽出しRT-PCRによりPTHrP遺伝子発現を検討した。(3)PTHrP蛋白はC端(109-141)を認識する抗体を用いてRIA(第一ラジオアイソトープ社)により測定した。[結果](1)RT-PCRを行った悪性10例、良性5例すべての腫瘍組織にPTHrP遺伝子発現が認められた。(2)血清中のPTHrP値は正常コントロール(45例)のM^+2SD,38.5pmol/L以上を高値とすると良性群では5例(16%)に軽度高値例が見られた。一方悪性群では10例(37%)に高値例が見られた。これらの高値例はいずれも術後正常値となった。(3)腫瘍内容液中に、PTHrPは良性、悪性卵巣腫瘍でいずれも検出された。特に500pmol/L以上の高値例は悪性群で5例(35%)良性群では1例(7%)に見られた。[結論](1)PTHrP遺伝子発現は良性、悪性卵巣腫瘍組織のいずれにも見られた。(2)しかしながら、血清中、腫瘍内容液中のPTHrP濃度の高値例は悪性卵巣腫瘍でより多く見られたこと、また腫瘍摘出後、血清中のPTHrPが正常値となったことより悪性卵巣腫瘍の腫瘍マーカーとして有用であると考えられた。1)PTHrP(PTH関連蛋白)の正常生殖器における発現および作用の検討遺伝子発現おのびPTHrP蛋白の局在について検討をした.(a)子宮内膜、脱落膜、絨毛、卵管、卵巣、子宮筋、卵膜(羊膜、絨毛膜),妊娠初期および妊娠中期の胎児組織よりmRNAを抽出しRT-PCRにより、PTHrPの遺伝子発現を検討した・PTHrPの遺伝子発現は子宮内膜、脱落膜、絨毛、卵管、卵巣、子宮筋、卵膜および胎児の肝臓、腸、皮膚に見られた.(b)ホルマリン固定した、正常子宮内膜、脱落膜、卵膜を用いてC端(109-141)を認識する抗体を用いた免疫染色(ABC法に準じた)によりPTHrPの局在を検討したPTHrP蛋白は子宮内膜では内膜腺細胞、脱落膜では内膜腺細胞および間質細胞、卵膜では絨毛膜細胞、脱落膜間質細胞、絨毛では合胞体細胞に局在が認められた。
ウルツ鉱型窒化ホウ素砥粒を固定したソーワイヤによるダイヤモンド基板の精密加工

研究期間中に、大気中で砥粒を塗布し高真空炉へ連続的にソーワイヤを製造できる実験設備を開発し、タングステン線を心線として50μm以下の高温ろう付け固定砥粒型ソーワイヤを完成することができた。砥粒としては、cBN, hBN,ダイヤモンド、およびフラーレンを用いてソーワイヤを製造し、タングステンカーバイドやダイヤモンド基板を切断できることを確認した。これにより、本研究の目的である、世界で最も細い50μm以下のソーワイヤを製造して、ダイヤモンド基板を切断するということが達成された。心線に関しては、これまで高温に強いタングステン線を使用してきたが、高強度ステンレス鋼でも心線に使用できることが明らかとなった。ウルツ鉱型窒化ホウ素(wBN)の合成を目的に、爆薬メーカーである日本工機と共同研究を続けてきた。hBNを出発物質とする爆発合成を現在も続けているが定常的にwBNを製造するに至って居ない。入手可能でダイヤモンド基板を加工できるツール素材としては、ダイヤモンド微細砥粒であり、これを用いて、本研究の目的を達成することができた。ダイヤモンド表面をCuSnろう材で濡らしてタングステン線に接合するためには、高真空中で強い還元雰囲気を作る必要がある。これは、水素化チタン(TiH2)を900°Cまで素早く加熱することにより実現することができた。直径2ー3μmのダイヤモンド微細粒を確実にろう材で濡らすための要因は3つある。ダイヤモンド微細砥粒を混合するときに表面に強固な物理吸着酸素を形成しないように混合に注意すること。水素化チタンの昇温速度を高くして、分解温度を高温にシフトすること、そして真空度が10ー3Pa以下にすることである。こうして、確実にダイヤモンドを加工できるソーワイヤを製作することができる。直径40μmのタングステン芯線に対して直径3μmの窒化ホウ素(BN)およびダイヤモンド砥粒を、真空度が10ー3Paの真空炉でろう付けすることにより、出来上がり直径が50μm以下すなわち髪の毛の半分の直径の固定砥粒型ソーワイヤを製造する事が出来た。製造する時に、これまではキサンタンガムを水で溶かして攪拌していたので、不均質になる場合があったために、今年度は航空機ろう付け用の特殊バインダーゲルを用いた。そのため、ワイヤの凹凸が少ない均質なワイヤの製造に成功した。また、今年度、大きく改良に成功したのは、製造の高能率化である。これまでは、砥粒を大気中で塗布してボビンに巻いて乾かし、次の工程で真空炉に入れてから製造していた。しかし、今年度は、大気中から真空中にワイヤを連続で入れる技術を確立して、連続で大量に製造できる方法を実現した。これにより、途中でのボビン巻きをしないで、大気中と真空をつなぎ、連続で製造できるようになった。これは、30年度に計画していた改良を、2年早く実施できたものである。次に、このようにして製造したワイヤによる切断試験を実施した。タングステンカーバイド(WC)を切断した場合、ソーワイヤの移動量1m当たり約5μm程度の切断速度であった。また、ダイヤモンド基板を切断した場合は、移動量1m当たり約1μmの切断速度であった。ダイヤモンドの切断速度は、およそWCの5分の1である事が明らかとなった。また、10mの長さのソーワイヤを繰り返し使用した場合に、ダイヤモンド基板では2回程度の繰り返し寿命しかない。今後の課題はこの寿命を長くする事である。計画していた目標のうち達成できた事は、次の2点である。ひとつには、市場に類を見ない50μm以下の固定砥粒型のソーワイヤを均質に製造する事が出来たことである。これは、遊離砥粒(スラリー)を用いることなく、水だけで速い切断速度で50μm以下のスリットを加工できること意味しており、スラリーで汚染されないクリーンな加工現場を実現できる可能性がある。ふたつ目は、ソーワイヤの製造工程を、砥粒の塗布と真空炉焼付けの2工程になっていたものを連続させて1工程にまとめたものである。このため、大気中から真空炉中へ連続でワイヤを通過させて製造する装置を完成させた事は実用的な観点から評価が高い。また、この自動化の実現は、計画よりも2年早いので今後の加速的な進捗の可能性がある。一方で、課題は、窒化ホウ素(BN)からw-BNを抽出することである。現在、連携企業と協力して合成と抽出を試みているが完成には至っていない。

入手可能でダイヤモンド基板を加工できるツール素材としては、ダイヤモンド微細砥粒であり、これを用いて、本研究の目的を達成することができた。ダイヤモンド表面をCuSnろう材で濡らしてタングステン線に接合するためには、高真空中で強い還元雰囲気を作る必要がある。これは、水素化チタン(TiH2)を900°Cまで素早く加熱することにより実現することができた。直径2ー3μmのダイヤモンド微細粒を確実にろう材で濡らすための要因は3つある。ダイヤモンド微細砥粒を混合するときに表面に強固な物理吸着酸素を形成しないように混合に注意すること。水素化チタンの昇温速度を高くして、分解温度を高温にシフトすること、そして真空度が10ー3Pa以下にすることである。こうして、確実にダイヤモンドを加工できるソーワイヤを製作することができる。本研究で使用する硬質粒子である、ウルツ鉱wBNの合成に関しては、高圧破砕剤で実績のある日本工機と共同で推進している。wBNの市場で入手することは難しく、独自に合成することとした。平成29年度は常圧で合成されたcBNを出発物質として、爆発による高圧処理をした。高圧処理は、銅板でcBNを挟み込み両側から爆発させて高圧を発生するものである。その後に薬品処理により溶出するものであるが、wBNへの相変化はほとんど確認できなかった。そのため今後は、常圧で合成された六方晶窒化ホウ素すなわちhBNを出発物質として、高圧処理を行うこととした。次に、これまで用いてきたタングステン芯線は、延性が低く疲労寿命が短かったので、これを特殊な高強度ステンレス線に変更することにより、ソーワイヤの寿命を延ばす事が出来た。更に、直径3μmのcBN砥粒を用いて、直径約50μmのソーワイヤを試作して、ダイヤモンド板に切り込む事が出来た。ただし、切り込み量は1mm以下と小さく、これらを増加させるには、wBNの微小粒子を合成する必要があると考えられる。新たに発見した現象としては、水素化チタンの熱分解に関してである。砥粒とろう材のぬれ性を改善するために水素化チタンを用いているのであるが、その分解温度は、昇温速度が速くなるほど高温側に移動する事がわかった。その現象を利用して、ろう材の溶融温度付近に水素化チタンの分解温度を移動すると、ぬれ性が改善できることを発見した。窒化ホウ素としてcBN砥粒を用いた固定砥粒型の極細ソーワイヤを完成させて、ダイヤモンド基板に切り込むことは出来た。しかしながら、更に硬度の高い窒化ホウ素として、本研究で目差しているwBNの合成に至っていないため、やや遅れていると判断される。今後の研究では、次の3点について推進する。1.ワイヤの製造と改良ーこれまでの経験から、ソーワイヤの切断寿命は、クラッシュ材(大きな鉱石を砕いたもの)よりも、自然結晶体である方が強度も寿命も長い。これは、本来のウルツ鉱構造の六方晶を破砕しないで、そのまま使用するという意味である。そのため、3μm以下のw-BN自然結晶をふるい分けしてソーワイヤに使用する事の可能性を、日本工機と検討することとする。つまり、通常のBN粉末から、爆発合成により、3μm程度のw-BN微細結晶とするための条件を検討することとなる。2.ワイヤ製造上課題となっているのは、固定された砥粒の分布が不均質であるという事である。
ガングリオシドーシスの中枢神経系における炎症のメカニズムの解明

ライソゾーム病のひとつであるガングリオシドーシスは、中枢神経系に先天的に代謝できないガングリオシドが蓄積することにより、病態が進行すると考えられてきた。しかし、近年、自己抗体やその他何らかの原因により中枢神経系で引き起こされる炎症反応が病態の進行に深く関与していることが解明されたが、その詳細なメカニズムは未だ解明されていない。本研究では、過剰に死細胞から放出された代謝されない糖脂質GM2, GA2がToll様受容体(TLR)を介して直接マイクログリア等を刺激することにより、中枢神経系での炎症反応を促進すると推測し、その詳細なメカニズムの解明とそのアンタゴニストを用いた治療法の開発を目的としている。現在、SD miceにTLR4のアンタゴニストとして知られているTAK-242を投与しており、投与による病態の解析、分子生物学的解析、病理学的解析を行い、その治療効果を検証する予定である。これらの結果により、SDにおける中枢神経系の炎症反応は、神経細胞等のライソソームで代謝できない糖脂質が、アポトーシスなどにより細胞外に放出され、その結果放出された糖脂質がTLR4を介してマイクログリアを刺激することにより発症している事が解明されうる。糖脂質であるガングリオシドは細菌やウイルスのリポ多糖の疑似分子になり得ることが知られており、ギランバレー症候群の発症にはTLR4が関与している事が知られている。SDにおいても、遊離した糖脂質GM2, GA2がリポ多糖を認識するTLR2, TLR4に認識され、炎症反応等の免疫反応が引き起こされると推測される。これまで詳細な発症機序が解明されていなかったライソソーム蓄積病の中枢神経系の炎症反応に関しては、in vitroの系において、代謝できない糖脂質がマイクログリアを直接TLR4を介して刺激し、TNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌を促すことを見出した。このことにより、TLR2, TLR4のアンタゴニストを用いてシグナルカスケードを遮断することにより、中枢神経系での炎症反応が低減し、病態の進行が低減すると示唆され、現在、SD miceを用いて個体レベルでの研究を進めている。これまでのin vitroの研究結果から、SDにおける中枢神経系の炎症反応は、代謝酵素の異常により分解できない糖脂質が、その蓄積した神経細胞がアポトーシス等により細胞外に放出され、放出された糖脂質がマイクログリアのTLR4を介して刺激し、TNF-αの分泌を促すことにより、炎症反応が起きていると推察される。TAK-242には、TLR4のシグナル伝達を阻害する低分子化合物である事が知られている。これまで、我々や他のグループの報告では、蓄積物の増減に関係なく、炎症反応を低減させることにより、SD miceの病態が改善する事が報告されていることから、SDの病態の進行には中枢神経系への蓄積物の増加以外にも、炎症反応が深く関与している事が知られている。我々は、TAK-242のSD miceへの投与により、TLR-4を介した炎症反応が低減すると推察している。現在、SD miceにTAK-242を投与中で、病態の解析として寿命の解析、生育の解析、運動能の解析、分子生物学的解析として、TNF-αをはじめとする炎症性サイトカインの発現量の解析、病理学的解析として、マイクログリアの活性化、神経細胞の数や形態的観察等を行ない、その治療効果を検証する予定である。本年度はGM2ガングリオシドーシスの一つサンドホフ病のモデルマウス(以下、SDマウス)を用い、SDマウスの中枢神経系よりマイクログリアを精製分離し、蓄積物がマイクログリアを刺激し、炎症性サイトカインの産生を促すかを評価した。GM2ガングリオシドーシスで蓄積が確認されるGM2, GA2をSDマウスの中枢神経系より精製し、別途分離したSDマウス由来のマイクログリアに添加すると、添加量依存的に炎症性サイトカインTNF-αが産生されることが確認された。また、GM2, GA2を添加して刺激することに際して、マイクログリアではTLR-4の発現量が増加していることが確認できた。今年度の研究で、GM2ガングリオシドーシスの一つサンドホフ病では、代謝できないGM2, GA2が炎症性サイトカインTNF-αを産生を促す刺激物質になり得ることが確認され、その刺激はマイクログリアのTLR-4を介したシグナルカスケードによるものであることを見出したこれまでの研究でSDマウス由来の蓄積物が、in vitroの系でマイクログリアを刺激してTLR-4を介して炎症性サイトカインTNF-αの産生を促すことを見出した。一方、例えば培養液中に刺激物質であるGM2、GA2とTLR-4のアンタゴニスト等を添加し、炎症性サイトカインの分泌が抑制されるかなどの治療への活用の可能性を評価する研究については、完了していない。

ライソゾーム病のひとつであるガングリオシドーシスは、中枢神経系に先天的に代謝できないガングリオシドが蓄積することにより、病態が進行すると考えられてきた。しかし、近年、自己抗体やその他何らかの原因により中枢神経系で引き起こされる炎症反応が病態の進行に深く関与していることが解明されたが、その詳細なメカニズムは未だ解明されていない。本研究では、過剰に死細胞から放出された代謝されない糖脂質GM2, GA2がToll様受容体(TLR)を介して直接マイクログリア等を刺激することにより、中枢神経系での炎症反応を促進すると推測し、その詳細なメカニズムの解明とそのアンタゴニストを用いた治療法の開発を目的としている。現在、SD miceにTLR4のアンタゴニストとして知られているTAK-242を投与しており、投与による病態の解析、分子生物学的解析、病理学的解析を行い、その治療効果を検証する予定である。これらの結果により、SDにおける中枢神経系の炎症反応は、神経細胞等のライソソームで代謝できない糖脂質が、アポトーシスなどにより細胞外に放出され、その結果放出された糖脂質がTLR4を介してマイクログリアを刺激することにより発症している事が解明されうる。糖脂質であるガングリオシドは細菌やウイルスのリポ多糖の疑似分子になり得ることが知られており、ギランバレー症候群の発症にはTLR4が関与している事が知られている。SDにおいても、遊離した糖脂質GM2, GA2がリポ多糖を認識するTLR2, TLR4に認識され、炎症反応等の免疫反応が引き起こされると推測される。これまで詳細な発症機序が解明されていなかったライソソーム蓄積病の中枢神経系の炎症反応に関しては、in vitroの系において、代謝できない糖脂質がマイクログリアを直接TLR4を介して刺激し、TNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌を促すことを見出した。このことにより、TLR2, TLR4のアンタゴニストを用いてシグナルカスケードを遮断することにより、中枢神経系での炎症反応が低減し、病態の進行が低減すると示唆され、現在、SD miceを用いて個体レベルでの研究を進めている。培養液にGM2, GA2を添加する際、TLR2, TLR4のアンタゴニスト、具体的にはTLR2に対しては抗TLR2モノクローナル抗体、TLR4に対してはLPS-RSを添加し、TNF-α、IL-1βの発現量を定量することにより、その効果を確認する。治療効果の研究として、SDマウスに尾静注により、TLR2, TLR4のアンタゴニストである抗TLR2モノクローナル抗体、LPS-RSを投与し、運動能、神経症状、寿命への効果を検証する。in vivoレベルでアンタゴニスト投与よる分子レベルでの改善効果を評価するため、中枢神経系でのTLR2, TLR4の発現量、TNF-α、IL-1βの発現量、MAPカスケード、NF-kBの活性化を定量的PCR及びウエスタンブロット法により定量、確認する。アンタゴニスト投与よる中枢神経系での組織レベルでの改善効果を評価するため、神経細胞の数や形態、プルキンエ細胞の変性状況、マイクログリアの活性化、アストロサイトの増殖程度を病理学的解析により、評価する。
樹木の花は土壌生態系へのリソースパルスとなりうるか？

樹木の開花量は年により大きく変動し、生態系に大きな影響を与える。本研究は、今まで見過ごされてきた花や花粉も生態系内物質循環の駆動因子だと捉え、開花の年変動が林床への「資源パルス」(=不定期で突然多量に供給される資源)を作っているのではないか、その貢献は土壌生態系にとって無視できないものではないかという仮説を、野外実験(リターバッグ)と落葉量(リターフォール)観測データの解析の2つのアプローチを通じて、検証する。
組織培養による脳皮質形成機構の解析

大脳皮質を構成するニュ-ロンとグリアは初期神経管の管腔側に面する細胞層に由来する。この前駆細胞からのニュ-ロンとグリアの発生様式については、これまでに一元論・二元論等の説が提唱されてきたが、統一された理解にはいたっていない。マウス胎仔の大脳皮質細胞のin vitroにおける挙動から、ニュ-ロンとグリアの初期発生と分化の様式を検討してみた。細胞の識別は、ニュ-ロンに特異なNF,MAP-2の、グリア細胞に特異なGFA,RC-1のそれぞれモノおよびポリクロナル抗体を用いた免疫組織化学により行った。胎生11,12日令(E11,12)の大脳壁より分離した細胞群では、当初増殖に伴ってニュ-ロンの産生と分化がみられ、後れてbipotentな細胞からグリア細胞が出現した。その後グリア細胞は加速度的に増殖したが、ニュ-ロン産生は停止した。E14以降の大脳壁を管腔側から表面へと23分画し、それぞれの部分からのニュ-ロンとグリアの発生を検討したところ、cortical plateを含んだ表面側部の細胞群は大部分がすみやかにニュ-ロンへと成長した。一方腔側部の細胞群からは増殖に伴ってニュ-ロンとグリア細胞が出現した。増殖に伴うBraUrdの核DNAへの取りこみと、ニュ-ロン・グリアの発生の相関を検討したところ、E11の細胞群では当初ニュ-ロンのみが、E14以降の腔側部の細胞群では主にグリア細胞が標識されて分化することが示された。またE.coliのβ-galactocidaseを組みこんだレトロウイルスで細胞標識したところ、E11の細胞からは標識されたニュ-ロンのクロ-ンが観察された。これらの結果はニュ-ロンとグリアは共通した前駆細胞より(1)ニュ-ロンのみの、(2)ニュ-ロンとグリアの、(3)グリアのみの、3段階の産生を経て発生してくることを示唆した。これは藤田晢也によって提唱されているmajor differentian説を部分的に証明するものである。更に研究を継続し、より分析的に検討していく予定である。
計算機代数と代数方程式の数値解法

数式処理の基本的算法に対して、一応の調査を完了した。特に誤差範囲εを許容した上で、数式処理による厳密計算を実行し、必要に応じてεを変更した結果を比較する計算法が、数式処理と数値計算との融合計算法としては大きな可能性を秘めていることに気づいた。例えば従来は計算が困難であるとされていた近接根の分離には、極めて有効である。この線に添って組織的な研究を開始した。更にこれと関連して、以前から続けてきたスプライン補間・境界要素法などについて、若干の成果をえた。境界要素法の収束証明に関しては、分担者の磯祐介が以前に示した評価を、早川款達郎と共同で改良した。この結果は、工学方面で行なわれている数値実験結果に合致するもので、若干の仮定は必要であるが、現在では最も精密な評価になっている。また未発表であるが、陰的ルンゲ・クッタ型公式によって硬い微分方程式を有効に解く手法の実用化にめどをえた。浜田穂積提案のURR方式による数表現の誤差解析についても、在来の浮動小数点表示に対して遜色ないことを示した。また、一松と磯の主宰する数値解析セミナーでは、偏微分方程式の数値解析を話題の中心に置きながら、数値解析全般について様々な研究発表を行ない、今後の共同研究の体制もますます整った。これまでの調査でえた基本資料を基に、今後冒頭に述べた、誤差を許容する数式処理計算法の体系化を考察したく思っている。
制御性T細胞を用いた炎症性骨疾患の治療法の開発

関節リウマチは全人口の1%が罹患する国民病であるが発症機序の全容は明らかになっていない。近年T細胞を標的とした治療法の有効性が示されておりT細胞の重要性が広く認識されつつある。T細胞には免疫応答を抑制する、制御性T細胞等のサブセットと、免疫応答を促進するサブセットに分けられる。本年度では、関節炎誘導性の高い細胞群を新規に同定し、この細胞群は、破骨細胞誘導因子であるRANKLを高く発現することを示した。滑膜細胞が発現するRANKLとの重要性を比較する目的で、T細胞上のRANKLの発現を欠損させたマウスと滑膜上のRANKLを欠損させた実験系の構築を行った。その結果、滑膜細胞が発現するRANKが主要な役割を果たすことを見出した。一方で滑膜細胞のRANKL発現がない状況においても、関節炎誘導性の高い細胞群は、効率的に破骨細胞の形成の促進を行うことを明らかにした。この知見はT細胞免疫の理解に基づいた治療法の確立に貢献すると考えられる。制御性T細胞の細胞数はT細胞特異的にSTIM1,2を欠損したマウスでは減少することが報告されているが制御性T細胞におけるSTIMの役割の詳細は不明であった。これまでにIL-2シグナルの異常が細胞数減少の原因であることを示唆する結果が得られていた。本年度ではFoxp3ノックインマウスやT特異的にSTIMを欠損させたマウスを交配し、STIM欠損の制御性T細胞を単離する実験系を用いて、IL-2シグナルを持続的に活性化させると細胞数は回復するが、抑制機能は回復しないという予備的な結果が得られていたが、本年度は決定的なものとした。STIM分子は制御性T細胞の抑制機能関連分子の発現を制御すると考えられる。この知見は制御性T細胞の抑制機能のメカニズムの解明に貢献すると考えられる。本研究課題は24年度で終了した。制御性T細胞は過剰な免疫応答や自己免疫の抑制に必須の細胞であり、転写因子Foxp3はTregの発生・分化、抑制機能の発現に必須なマスター遺伝子である。様々な関節炎モデルマウスにおいてTregなどの炎症抑制細胞とTh17などの炎症促進細胞のバランスの制御の重要性が示唆されており、これを視野に入れたT細胞免疫の制御法の確立が急務である。本年度では、関節リウマチを発症した関節から単離したさまざまな種類の関節構成細胞とT細胞のサブセットを試験管内で共培養を行い、T細胞分化への影響を検討した。また、生体内での評価系が確立したため、今後検討を行う予定である。さらに、Foxp3の発現、細胞数の制御の分子機構の解明はTregの生体内恒常性の理解で重要である。T細胞特異的にSTIM1,2を欠損したマウスでは野生型マウスと比べ、Foxp3+Tregの細胞数が減少するが、Foxp3+Tregの発生、増殖、生存のどの段階でSTIM分子が機能しているか不明であった。発生過程における重要性を検討するため、生後3日目のマウスの胸腺を用いてFoxp3、CD25、Ki-67、Bcl2の発現を解析したところ、(1)生後3日後のマウス胸腺でもKOマウスにおいてFoxp3+CD4+CD8-の細胞数の減少が認められ、(2)KOマウス由来のFoxp3+TregではCD25,Bcl2の発現及びKi-67陽性細胞の割合が野生型マウスに比べ有意に低い一方で、(3)Tregの前駆細胞と考えられているFoxp3-CD25hiCD4+CD8-細胞は正常数存在していた。以上によりTregの胸腺内での発生にSTIM1,2は重要であり、KOマウスにおけるFoxp3+Tregの減少は、Foxp3の発現やIL-2シグナル障害によるFoxp3+Tregの増殖や生存の抑制が関与することが示唆された。今後Foxp3ノックインマウスやFoxp3特異的にSTIMを欠損させたマウスを用いてSTIMのTregにおける役割を詳細に検討する予定である。関節リウマチは全人口の1%が罹患する炎症性骨疾患である。発症機序は未だ不明な点が多いが、近年T細胞を標的とした治療法の有効性が報告されており、T細胞の重要性が広く認識されつつある。T細胞には、免疫応答を抑制する制御性T細胞等のサブセットと、免疫応答を促進するサブセットに分けられる。本年度では、制御性T細胞と考えられてきた細胞集団の一部が、炎症を促進させる細胞に転換することを見出した。また、この細胞は滑膜細胞との相互作用により、骨破壊を引き起こす細胞である、破骨細胞の分化を促進することをin vitroにおいて見出した。今後この詳細なメカニズムについて検討する予定である。制御性T細胞はT細胞特異的にSTIM1,2を欠損したマウスでは細胞数が減少するが、STIMの機能の詳細は不明であった。本年度ではFoxp3ノックインマウスとT特異的にSTIMを欠損させたマウスを交配し、STIM欠損の制御性T細胞を単離できる実験系を確立した。このマウスを利用することで、IL-

2シグナルの持続的な活性化により制御性T細胞の細胞数は回復するが、抑制機能は回復しないことを見出した。したがってSTIM分子の機能のひとつとして制御性T細胞の抑制機能関連分子の発現を制御が考えられる。この知見は制御性T細胞の抑制機能のメカニズムの解明に貢献すると考えられる。関節リウマチは全人口の1%が罹患する国民病であるが発症機序の全容は明らかになっていない。近年T細胞を標的とした治療法の有効性が示されておりT細胞の重要性が広く認識されつつある。T細胞には免疫応答を抑制する、制御性T細胞等のサブセットと、免疫応答を促進するサブセットに分けられる。本年度では、関節炎誘導性の高い細胞群を新規に同定し、この細胞群は、破骨細胞誘導因子であるRANKLを高く発現することを示した。滑膜細胞が発現するRANKLとの重要性を比較する目的で、T細胞上のRANKLの発現を欠損させたマウスと滑膜上のRANKLを欠損させた実験系の構築を行った。その結果、滑膜細胞が発現するRANKが主要な役割を果たすことを見出した。一方で滑膜細胞のRANKL発現がない状況においても、関節炎誘導性の高い細胞群は、効率的に破骨細胞の形成の促進を行うことを明らかにした。この知見はT細胞免疫の理解に基づいた治療法の確立に貢献すると考えられる。制御性T細胞の細胞数はT細胞特異的にSTIM1,2を欠損したマウスでは減少することが報告されているが制御性T細胞におけるSTIMの役割の詳細は不明であった。これまでにIL-2シグナルの異常が細胞数減少の原因であることを示唆する結果が得られていた。本年度ではFoxp3ノックインマウスやT特異的にSTIMを欠損させたマウスを交配し、STIM欠損の制御性T細胞を単離する実験系を用いて、IL-2シグナルを持続的に活性化させると細胞数は回復するが、抑制機能は回復しないという予備的な結果が得られていたが、本年度は決定的なものとした。STIM分子は制御性T細胞の抑制機能関連分子の発現を制御すると考えられる。充実した研究環境にも恵まれ、研究を推進した結果、関節リウマチにおけるT細胞と間葉系細胞の相互作用における新規知見が得られたと考えられるため。本研究課題は24年度で終了した。交配による新規マウスの作成と細胞分取機器、蛍光顕微鏡などの研究機器の活用を精力的に行い、今後の研究を進展させる。
鼻腺細胞の分泌機序に関する分子生理学的研究

モルモットの鼻中隔の粘膜下層より単離した鼻腺細胞を用いて細胞内Ca^<2+>,Na^+濃度を顕微画像解析法によって検討した。アセチルコリン(ACL)刺激によって細胞内Ca^<2+>は二相性に増加した。最初の一過性の増加は細胞内Ca^<2+>貯蔵庫からの動員で次の持続相は外からの流入であった。前者は膜の脱分極により増強し、後者は膜内外のCa^<2+>の化学勾配やpHに依存していた。どちらもPKA,PKCの影響は受けなかった、細胞内Ca^<2+>の増加はパッチクランプ法によって測定した結果、K^+とCl^-電流を増加させた。また細胞内Ca^<2+>はカルモジュリンキナーゼ依存性酵素のリン酸化を受けたNa-K-Cl共輸送を活性化させ、一価イオンの供給系をも刺激した。このように細胞内Ca^<2+>は鼻腺細胞のイオン輸送の中心的役割を演じたことが判明した。
博物館標本から得られるDNAのビッグデータによる腹足類の多様性進化ダイナミックス

6万5千種以上含む腹足類(巻貝や傘貝)の多様性進化の全体像は未だ把握されていないが、この分類群は古くから自然史研究の対象であるため博物館収蔵標本が全世界に多数ある。本研究では、多数の腹足類の博物館標本からミトコンドリアゲノム全長配列(ミトゲノム)及び18S・28s rDNA全長配列の決定に加えて、新規ミトゲノム断片配列や公開済みの断片配列情報や、有用な化石・地質学的情報を入手する。次いで、得られるビッグデータを分析し、腹足類の多様性進化パターンと環境変動との関連を解明する。また、本研究の副産物としては、博物館収蔵標本のDNA実験への活用技術や環境モニタリングの基礎的技術の提供も期待出来る。