hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
誘電体微粒子の単色熱放射

白熱球などマクロな物体からの熱放射は、Planckの放射法則でよく記述できる。一方、ミクロな原子からの発光は原子固有の線スペクトルである。物体が小さくなるにつれて熱放射のスペクトルはどのように放射体の個性を獲得していくのか?我々は、光トラップで捕捉した単一の誘電体微粒子の熱放射スペクトルを計測し、熱放射のサイズ効果を検証しようとしている。今年度は、ミクロンサイズの球形ルビー微粒子を対象として、アルミナ母体結晶にドープされたCrイオンの共鳴線(R線)が、球状共振器の固有モードであるwhispering gallery mode (WGM)の影響で、どのような発光特性を示すのかを調べた。一般に、原子の自然放出確率は、原子が存在する空間の電磁場のモード密度に依存する。ルビー微粒子からの熱放射においても、R線の発光がWGMと整合した時に増強される共振器QED効果が観測された。WGMのQ値とモード体積から、R線の自然放出レートは自由空間と比較して数倍程度大きくなっていることが明らかになった。一方、Mie散乱の理論に基づく計算によると、粒子径が小さくなるにつれてWGMの共鳴構造は長波長側から順に消失していく。WGMが消えた赤外域には物質に固有の鋭い共鳴線が現れる。この赤外共鳴は、有限サイズのイオン結晶の表面フォノンポラリトンであることが分かっており、ナノレベルまで縮小した微小結晶の熱放射はこの共鳴周波数に単色化すると予想される。光トラップされた単一微粒子の赤外分光は感度不足であることが前年度までに判明したため、今年度は金属表面に分散させた微粒子集団からの赤外熱放射を、FTIRにより観測した。シリカ微粒子からの熱放射スペクトルは、バルクのガラス板では放射が抑制される波長域に強度分布を持つことが明らかになったが、現在までに表面フォノンポラリトンの明確なピークは観測されていない。2017年度の研究結果から、単一微粒子の赤外熱放射スペクトルの観測には、FTIRやサーモカメラなど汎用検出器の感度が不足していることが明らかになった。そこで2018年度は、光トラップによる空間捕捉をいったん放棄し、複数の球形微粒子を放射率の小さい金属表面に分散させた試料を対象としたFTIR観測を開始した。現時点での遅れは、このような大きな方針転換によるものである。表面フォノンポラリトンの共鳴構造は、微粒子の形には強く依存するが、大きさにはあまり依存しない。そのため、形状のそろった微粒子集団であれば、粒径分布によらず明確なスペクトルが観測できると期待される。研究実績の概要に示したように、シリカ微粒子の熱放射スペクトルがバルクのそれと異なる様相を見せているが、表面フォノンポラリトンと思われる明確な構造は見出されていない。これは、金属上で微粒子が凝集して不定形となっているためである。粒子同士の凝集を防ぎかつ観測視野内になるべく多数の孤立粒子を配列する手段の確立が急がれる。熱放射における表面フォノンポラリトンの観測については、微粒子集団からの熱放射のFTIR分光がより有力な手段と考え、前述の問題点の克服に努める。微粒子同士の凝集を防ぐ対策として、マイクロミストの利用を考えている。微小液滴(マイクロミスト)に微粒子を分散させておき、それを金属面に噴射する。金属面上で溶媒が蒸発した後には、微粒子が互いに距離をとって配列すると期待される。一方、現在は試料からの熱放射を凹面鏡によるコリメーションを経てFTIR分光計に導入しているが、微粒子集団の信号に常温の背景放射や支持台金属からの熱放射の信号が重畳している。微粒子の熱放射の背景放射に対するコントラストを上げるためには、視野を微小な領域に限った顕微FTIRが有効であり、このための光学系を構築する必要がある。物体が小さくなるにつれて熱放射のスペクトルはどのように放射体の個性を獲得していくのか?我々は、光トラップで捕捉した単一の誘電体微粒子の熱放射スペクトルを計測し、ミクロンレベルの微粒子の熱放射特性を解明してきた。本研究では、微粒子がナノレベルまで縮小したときに、熱放射が放射体の内部自由度に固有の共鳴線に単色化していく最終段階を検証し、サイズ効果の理解を完結させる。Mie散乱の理論に基づく計算によると、ミクロンサイズの球形微粒子の熱放射スペクトルには、球状共振器の固有モードであるwhispering gallery mode (WGM)のピークが現れる。粒子径が小さくなるにつれてWGMの共鳴構造は長波長側から順に消失していく。WGMが消えた赤外域には物質に固有の鋭い共鳴線が現れ、粒径が1ミクロン以下になると、その放射強度は可視域の放射強度を大きく凌駕するようになる。この赤外共鳴は、有限サイズのイオン結晶の表面フォノンポラリトンであることが分かっており、ナノレベルまで縮小した微小結晶は、表面モードで振動する巨大分子として振る舞い、熱放射がこの共鳴周波数に単色化することを示唆している。2017年度行った検証実験では、8ミクロンから14ミクロンをカバーする回転フィルターを導入し、光トラップされたジルコニア微粒子からの熱放射スペクトルの測定を試みた。検出器には赤外サーモカメラを用い、空間に浮かぶ微粒子の赤外光学像をとらえることに成功した。

微粒子が発する赤外線のスペクトルはほぼ10ミクロン帯の単色であり、トラップ光である炭酸ガスレーザー光が散乱されたものであった。熱放射の信号レベルはさらに低く、サーモカメラの感度では検出できないことが判明した。2017年度は、赤外熱放射スペクトルにおける表面フォノンポラリトンによる共鳴構造を初めてとらえることを目標に進めてきたが、検出感度の問題でスペクトルを測定するには至らなかった。微粒子からの微弱な赤外放射を分光するためには、検出器の感度不足と点光源からの赤外線を検出器に導く光路調整の困難を克服しなければならない。2017年度に用いたサーモカメラの利点は、光学像をモニターできるためアラインメントがほぼ不要であることにあったが、撮像面を構成するマイクロボロメータの検出感度は、単眼の半導体検出器には大きく劣る。2018年度は方針を転換し、検出感度に優れるHgCdTe半導体検出器を導入する予定である。サーモカメラで微粒子の像点の位置を把握することで、検出に適した光学配置を取ることができると期待する。白熱球などマクロな物体からの熱放射は、Planckの放射法則でよく記述できる。一方、ミクロな原子からの発光は原子固有の線スペクトルである。物体が小さくなるにつれて熱放射のスペクトルはどのように放射体の個性を獲得していくのか?我々は、光トラップで捕捉した単一の誘電体微粒子の熱放射スペクトルを計測し、熱放射のサイズ効果を検証しようとしている。今年度は、ミクロンサイズの球形ルビー微粒子を対象として、アルミナ母体結晶にドープされたCrイオンの共鳴線(R線)が、球状共振器の固有モードであるwhispering gallery mode (WGM)の影響で、どのような発光特性を示すのかを調べた。一般に、原子の自然放出確率は、原子が存在する空間の電磁場のモード密度に依存する。ルビー微粒子からの熱放射においても、R線の発光がWGMと整合した時に増強される共振器QED効果が観測された。WGMのQ値とモード体積から、R線の自然放出レートは自由空間と比較して数倍程度大きくなっていることが明らかになった。一方、Mie散乱の理論に基づく計算によると、粒子径が小さくなるにつれてWGMの共鳴構造は長波長側から順に消失していく。WGMが消えた赤外域には物質に固有の鋭い共鳴線が現れる。この赤外共鳴は、有限サイズのイオン結晶の表面フォノンポラリトンであることが分かっており、ナノレベルまで縮小した微小結晶の熱放射はこの共鳴周波数に単色化すると予想される。光トラップされた単一微粒子の赤外分光は感度不足であることが前年度までに判明したため、今年度は金属表面に分散させた微粒子集団からの赤外熱放射を、FTIRにより観測した。シリカ微粒子からの熱放射スペクトルは、バルクのガラス板では放射が抑制される波長域に強度分布を持つことが明らかになったが、現在までに表面フォノンポラリトンの明確なピークは観測されていない。2017年度の研究結果から、単一微粒子の赤外熱放射スペクトルの観測には、FTIRやサーモカメラなど汎用検出器の感度が不足していることが明らかになった。そこで2018年度は、光トラップによる空間捕捉をいったん放棄し、複数の球形微粒子を放射率の小さい金属表面に分散させた試料を対象としたFTIR観測を開始した。
ロボットによる歩行支援で生じる感覚運動適応の解明:歩行機能回復への支援に向けて

本研究では健常者および歩行機能障害者に対する外骨格型ロボットの歩行支援によって生じる歩容の適応変化を動作解析や筋電図解析から明らかにすることを目的とした。神経系で生じる適応をより詳細に調べるために、アシスト歩行前後に電気生理学的検査も実施した。ロボットアシスト有無によって、歩容や筋活動パターンは健常者、歩行機能障害者ともに変化した。また、ロボットアシスト歩行の前後に行った通常歩行を比較した場合に、歩行速度の遅い患者ではステップ長や筋活動パターンに変化がみられた。近年、歩行機能障害者の歩行訓練や高齢者の歩行支援に向けて歩行ロボットが開発されているが、ロボットによる歩行支援がヒト側にどのような適応変化を生じさせるのか明らかとなっていない。ロボットアシストを用いた訓練プロトコル(訓練時間、訓練頻度など)や支援方法(トルクアシストのタイミングやその大きさ)を確立するうえでもこれらの適応を調べることは重要な課題と考えられる。本研究では、歩行支援前後にアシストなしで行う歩行パターンを三次元動作解析や筋活動パターンから比較し、アシスト後に生じた変化をafter-effectとしてとらえ、適応変化を明らかにすることを目的としている。本年度、股関節と膝関節にパワーユニットを装備した外骨格型のロボットスーツHALを用いて、ヒトの歩行時にロボットによるトルクアシストを両脚に与えて歩行支援した。ロボットによる歩行支援前後にトレッドミル上にて通常歩行を行い、デジタルビデオカメラによる撮影に加えて、表面筋電図によって大腿直筋、大腿二頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋の下肢筋群から筋活動を計測した。ロボットアシストを受けた歩行時には通常歩行とは異なった歩行パターンがみられ、ステップ長や歩行率に変化が生じた。また、アシスト歩行時には下肢筋活動パターンにも変化が観察された。アシスト歩行直後の通常歩行でもまた計測項目にafter-effectがみられたが、持続的な強い効果ではなかった。下肢筋群間でもアシストによる活動パターン変化に差異がみられるようであり、今後更なる実験が必要と思われる。歩行機能障害者の歩行訓練や高齢者の歩行支援を目的とした歩行支援ロボットが開発されているが、ロボットによる歩行支援がヒト側にどのような適応変化を生じさせるのか明らかとなっていない。ロボットアシストを用いた訓練プロトコルやアシスト方法を確立するうえでもロボットアシストによってもたらされる適応を調べることは重要な課題と考えられる。本研究では、歩行支援前後にアシストなしで行う歩行のパターンを三次元動作解析や筋活動から比較し、アシスト後に生じた変化を明らかにすることを目的とした。本年度、股関節と膝関節にパワーユニットを装備した外骨格型の支援ロボットを用い、歩行時にロボットによるトルクアシストを両脚に与えた。ロボットによる歩行支援前後にトレッドミル上もしくはフロアー上にて通常歩行を行い、テレメータ表面筋電計によって下肢筋群から筋活動を記録した。健常者の他に脊髄損傷や脳卒中患者も対象とし、計測を行った。歩行支援時の筋活動パターンは支援のない通常歩行時とは異なっており、患者間でその変化には大きな差がみられた。一方、歩行アシスト前後の筋活動パターンを比べてみると、被験者の多くで顕著な適応変化は観察されなかった。日を変えて計測しても同一被験者からは再現性の高い結果が得られた。しかしながら、歩行支援後に行った通常歩行時に歩行速度の増加を示すケースもみられ、メカニズムに関しては患者の重症度などを踏まえた更なる検証が必要であろう。当初、平成23年度に購入を予定していた動作解析システムが交付金減額によって購入できなかったため、次年度購入予定のテレメトリー式筋電システムを購入することとなった。そのため、機器の選定や実験プロトコルの修正などによって実験開始時期がやや遅れたことから、現在までの達成度をやや遅れていると評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度予算にて動作解析ソフトウェアの購入を予定している。これによって解析にかかる時間が短縮でき、達成度の遅れを取り戻せるものと考えている。今年度初めは昨年度までの実験プロトコルにて被験者数をさらに増加する予定である。その後、交付申請書に沿って、アシスト量やアシスト時間などを変更した実験条件にて計測を行い、アシスト歩行による適応変化を検証する予定である。以上の結果をとりまとめ、学会発表や論文として成果報告を行う。
耐熱性スーパーエンジニアリング・プラスチックの分子量並に分子量分布

高温測定が可能で、しかもGPCに結合可能な小容量、高速の光散乱光度計を試作した。光源は5mw He-Ne-レーザー、光源変化をモニターしながら、散乱光の光度を浜松ホトニクス製フォトニカウンターC-1230にて測定し、入射光と散乱光の比を計算した。散乱角度は45°、90°並に135°にて測定可能であるが、現在は45°に固定している。光電子増倍管は同じく浜松ホトニクス製R-6 49である。溶液セルは1/4"石英ガラス管で表面光学みがきをした。溶液は下部よりHPLL用ポンプにて流入させ、上部に流出させた。セル表面を黒色アルマイト処理したアルミブロック容器中に入れ、保温、遮光、並に光軸調整を行った。セルは全体を250°空気恒温槽中に置き、外部よりGPC用ポンプ、金属チューブを用いて試料溶液をセルに送り込む。散乱光は250°Cまで耐える光ファイバーにてセルより取り出しディフュザーを通してフォトマルに入光する。この方法にて、25°Cに於ては、極めて少量の試料にて重量平均分子量を測定出来ることを標準ポリスチレンを用いて確認した。標準試料の重量平均分子量4.39×10^4に対し4.4×10^4の測定値が得られた。またベンゼン溶液中の第二ビリアル係数3.64×10^<-6>も妥当な値である。測定温度を上昇させ、高温に於ける測定値の信頼性を検討中であるが、高温になるに従って誤差が大きくなる。原因は金属性のセル収納容器の膨張による光軸のずれが原因であることが明らかになった。現在、高温にて光軸を微調整することが出来るように改良中である。高温用GPCカラムは東ソー株式会社に特注した。すでに出来上っているが、未だ光散乱光度計と接続するまでには到っていない。
新規に開発した高伸張性生分解性ポリマーを足場とした血管再生医療技術の確立

今年度、分子量80万という旧ロットのPHA(ポリヒドロキシアルカノエート)では、紡糸に成功した。分子量300万というさらに高分子量のPHAならば「より高い伸展性と耐久力」を兼ね備えており人工血管に最適であるので、現在その巨大培養槽作成を共同研究先の三菱ガス化学にて行っている。30リットルまでの培養槽作成はすでに行えており、現在500リットルの培養槽を作成中である。大量供給が可能となれば、高分子量のPHAを紡糸し人工血管を試作する工程、さらには血管損傷ラットに適用する実験に進むことが可能となる。血管損傷ラットモデルの確立は今年度行った。具体的には、大腿動脈の中へカテーテルを挿入後、腹部大動脈にこれを誘導したのち、大動脈の近位と遠位をクリッピングして、I型の膵エステラーゼ(Sigma社)15ユニットを30分投与することでおこなう。分子量80万の旧ロットPHAを紡糸したものでは、今年度すでに人工血管を試作し、血管損傷ラットに適用を試みるところまでは行っているが、今後は、高分子量PHAの大量供給が可能になるのを待ってから、それによる組織再生足場材、既存の生体吸収性材料であるPGA(ポリグリコール酸)による足場材、伸展性のないPHAの一種であるP3HB(3-ヒドロキシ酪酸)による足場材をそれぞれ血管損傷ラットに適用し、(1)血栓形成の有無,(2)血管組織再生の程度、(3)炎症の程度(fibroblastの数、マクロファージの数、等)などを評価・比較していく必要がある。新規に開発した高純度PHAに対し、ISO10993医療機器の生物学的評価シリーズに準拠した生物学的安全性評価を、「細胞毒性試験」「急性全身毒性試験」「皮下埋没試験」で行った。細胞毒性試験:感度の高い試験法である抽出法によるコロニー形成法で行った。結果は対照材料のIC50値(相対コロニー形成数が50%となる抽出液濃度)と比較した所、IC50値が100%を超えた為、細胞毒性無しと判定した。全身毒性試験:溶媒(生理食塩水)20mlに対し、PHA粉末を4g混ぜ、37°のインキュベーター内で3日間抽出し、遠心分離器にかけた後、その上澄み液を採取した。ラット10匹をPHA注入群と生食注入群(コントロール群)の2つにrandomに分け、尾静脈より注入した。結果は、3日間毎日、観察と体重測定を行ったが、2群の内10%以上の体重減少をきたしたラットはおらず、下痢、呼吸障害、痙攣、死亡例も存在しなかった。また注入3日後に臓器解剖を行ったが、両群ともに、視診上異常を来しているラットはおらず、病理学的検査でも、胆汁うっ滞」や「肝細胞の変性、壊死」といった所見や、「間質性腎炎」や「尿細管壊死」の所見等は、両群とも認めなかった。皮下埋植試験:ISO10993医療機器の生物学的評価シリーズに準拠し、ラットの皮下に厚さ0.5mmで直径10mmの1PHA(N=36)、2ポリエチレン(N=12)、3PLA(N=12)のシートをそれぞれ埋植し、2週、4週、8週で殺処分後、プレパラート検体にし、炎症反応の量などを病理評価し、1PHA群と各群を比較した。結果、陰性対照群のポリエチレン群と比べPHA群は、炎症の有無、変性・壊死の有無、線維性被膜肥厚の有無において、Fisher検定で有意差を認めなかった。また、既にヒトで使用実績のあるPLA群と比べても有意差を認めず、PHAは対象群と「同等」の炎症所見と考えた。ラットの大動脈血管損傷モデルの確立は行えているが、損傷血管へのPHA足場材の適用実験はまだ行えていない。共同研究先の三菱ガス化学にて、2017年夏に500L規模の巨大培養槽が完成し、今までの3Lと比べ、PHAの作成量が格段に増加する。

これにより、提供されるPHAの量が増え、Preliminaryな実験を含めた実験が、スピードアップし行っていく事ができると考える。今後はIn vitroの実験に加え、in vivoの試験に移る。具体的には、各血管損傷ラットに、PHAによる組織再生足場材(長さ10mm、薄さ150μm)、PGAによる足場材、P3HBによる足場材を適用し、血栓形成の有無、血管組織再生の程度、炎症の程度(fibloblastの数、周囲組織の厚み、マクロファージの数)、PHAの分解程度等を定期的に評価、比較していく。
スペクトル有限要素法を用いた大規模浮体構造物の波浪中弾性応答解析法の開発

本研究の目的は,大規模浮体構造物の初期計画において,重量分布,剛性分布などの設計パラメータと弾性応答との関係を把握できる簡易弾性応答解析法を開発することにある。具体的には,浮体を弾性基礎上の1次元梁に置き換え,この場合の曲げおよびねじり応答の振動方程式の一般解を変位関数とするスペクトル有限要素法を定式化した。この方法によれば,与えられた外力下の弾性基礎上梁の曲げおよびねじり振動応答の厳密解を効率的に求めることができる。また,浮体長さ方向の剛性,質量分布および波力分布の変化も,有限要素法の手法を適用して容易に考慮可能である。本解析法をポンツーン型およびセミサブ型浮体に適用して,弾性応答に対する質量および剛性分布の影響について考察した。得られた主な結果は,以下の通りである。(1)ポンツーン型浮体の場合,浮体のたわみおよび曲げ応力の共振を回避し,応答を減じる方策として,端部質量の軽減が有効である。(2)浮体の剛性の増加は,準静的応答のピークを低周波数側にシフトさせ,また共振時の応答を低下させるため,応答改善に有利である。(3)曲げ応答に対する縦剪断剛性の影響は非常に小さい。(4)浮体端部の剛性の増加は,斜め波中の応答軽減にも有利である。ただし,長さに比べて幅の大きな浮体では,梁として取り扱うと剛性を過大に扱うことになる,言い換えれば現実の浮体では幅方向に曲げ変形が生じるため,一次元梁としての取り扱いには一定の限界が存在する。以上のように,本研究では大規模浮体の初期設計に有効な簡易応答解析法を開発すると共に,構造パラメータと応答特性の関係を明らかにしたことにより,当初予定した通りの成果を得ることができた。本研究の目的は,大規模浮体構造物の初期計画において,重量分布,剛性分布などの設計パラメータと弾性応答との関係を効率よく把握できる,簡易弾性応答解析法を開発することにある。具体的には,大規模浮体を弾性基礎上の一次元梁に置き換え,スペクトル有限要素法の手法を用いて,任意の剛性,質量分布および波力分布に対して振動方程式の厳密解が得られる解析法を開発する。本年度の成果の概要は,以下の通りである。(1)最も基本的な場合として剪断たわみと回転慣性を無視したBernoulli-Euler梁について,スペクトル有限要素の剛性方程式を導いた。これを用いて,ポンツーン型浮体とセミサブ型浮体に縦波が作用する場合を解析し,非常に少ない要素数で,たわみおよび曲げ応力に関する振動方程式の厳密解が得られることを示した。(2)ポンツーン型浮体を対象にして,浮体端部の質量と剛性を変化させた場合の弾性応答の変化を系統的に調べた。その結果,ポンツーン型浮体では,浮体端部のたわみと曲げ応力の低減が設計上重要となり,これらの応答の共振を回避し,応答を減じる方策として,端部質量の軽減が有効であることをしめした。さらに,浮体の剛性の増加は,準静的応答のピークを低周波数側にシフトさせ,また共振時の応答を低下させるため,応答の改善に有利であることを明らかにした。(3)剪断変形と回転慣性を考慮したTimoshenko梁について,同様に動剛性方程式を導き,弾性応答に対する剪断剛性の影響を調べた。その結果,最も剪断剛性が低いと考えられるトラス構造の隔壁を有する場合でも,剪断剛性の影響は非常に小さいことを明らかにした。以上のように,本年度は当初予定した通りの成果を得ることができた。

本研究の目的は,大規模浮体構造物の初期計画に有効な簡易弾性応答解析法として,浮体を弾性基礎上の一次元梁に置き換え,スペクトル有限要素法の手法を用いて弾性振動方程式の厳密解が求められる解析法を開発することにある。昨年度は,縦波中の曲げ応答解析のためのBernoulli-Euler梁要素とTimoshenko梁梁を開発した。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)斜め波中の浮体の曲げねじり応答を解析できるよう昨年度の解析法を拡張した。本解析法によれば、長さ方向に曲げ剛性,ねじり剛性,質量,曲げ回転慣性,およびねじり回転慣性が変化する浮体について,弾性基礎上の一次元梁としての曲げ,およびねじり応答を効率的に解析できる。(2)質量および剛性を変化させて斜め液中での応答を解析し,応答の性質,応答に及ぼす構造剛性および質量分布の影響を明らかにした。その結果,浮体端部の剛性の増加は,斜め波中の応答軽減にも有利であることを示した。ただし,長さに比べて幅の大きな浮体では,梁として取り扱うと剛性を過大に扱うことになること,言い換えれば現実の浮体では幅方向に曲げ変形が生じるため,一次元梁としての取り扱いには一定の限界があることを明らかにした。(3)要素浮体に波なし周波数の存在するセミサブ型大型浮体について解析し,波なし点の存在は浮体の応答に有利に作用することを明らかにした。(4)以上の解析結果に基づいて,浮体の応答と構造および質量特性の関係を整理した。以上のように,本年度は当初予定した成果を得ることができた。
小学校英語教育における課題解決型「読むこと」の学習方法の構築

1.研究の目的小学校における「読むこと」の学習を児童の発達段階に応じて,段階的かつ弾力的に行うカリキュラムを提示し,その指導方法を精査することである。2.研究は次のように遂行した。1第36学年における課題解決型のカリキュラムの提示2初期段階の読むことの方法の開発(第34学年)(i)絵カード・小型カードの活用(ii)文を絵と文字で表現(iii)フォニックスを活用した読みの学習3自発的に「読むこと」を進めるシステムの構築(第56学年)自発的に読むシステムとどのくらい読めたかを評価できるシステムの構築4GRを活用した表現力を伸ばすカリキュラムの構築3.研究の成果は,以下に集約できる。《児童の実態》・中学年・高学年を通して文字に興味を持ち,英語で書かれた物語や説明など読んでみたいと考えている児童が多く,「読むこと」の活動をしてみたいと考える児童が多い。《読むことについて》・初期段階の読むことの方法を中学年から導入することで,簡単な物語を読むことができるようになる。・英文や物語を読ませる際にGRの挿絵やことばの表す絵を補助手段として使うことで意味の理解が深まる。《教材について》・初期段階は,会話文を多用し,児童の力に合うものにリライトすることが有効である。・児童に興味のある分野の絵本や繰り返しのある絵本,また,同じ動詞や名詞が様々な場面で使われているような絵本を選択することで,意欲的に取り組むことができる。《学習形態》・個別ではなく,ペアやグループでの活動を多用し,お互いに助け合うことで,発音,意味理解ともに進めることができる。
candida尿路感染症に関する基礎的・臨床的研究(診断基準作成への試み)

1.基礎的研究:cyclphosphamide投与により免疫能を低下させたWistar系径尿未知的に接種し,上行性腎盂腎炎の実験モデルを作製した.その結果, (1)菌接種3日後までに29.7%, 7日以降で78.5%のラットに腎盂腎炎が発生した.(2)組織学的には3日後までの腎盂腎炎は腎盂に限局する急性炎症で, 7日以降のそれは腎皮質におよぶ広範な慢性炎症であり, (3)腎盂腎炎の程度が高度になるにつけ腎組織内および尿中Candida数の増加する傾向が認められた. (4)また, Candidaspp・の主要代謝産物であるD-arabinitolの血清中濃度をガスクロマトグラフィーで測定したところ,菌接種3日後までのラットにのみ検出可能であった.2.臨床的研究:尿中より10^4/ml以上のCandidaが分離された20例を対象とした. 14例は胆癌患者で, 16例は尿路へのカテーテル留置症例であり,直前まで全例に抗菌化学療法が施行されていた.その結果,(1)Candidaspp.の細胞壁mannonに対する血清抗体価を経時的に測定し, Candida腎盂腎炎やCandida血症を疑われた4例に4倍以上の上昇が認められた.しかしこの有意な上昇までに1431日を要したことより,上記病態の早期診断の指標としては有用でないと考えられた.(2)血清中D-arabinitolは無症候性Candida尿症やCandida膀胱炎の疑われた症例に比し, Candida腎盂腎炎やCandida血症の疑われた症例において高濃度で検出されるものが多く, (3)後者の4例に5-fluorocytosimeを投与すると全例にD-arabinitolの速やかな下降,消失が得られ,尿所見や臨床症状の経過と合致していた.以上より血清中D-arabinitol濃度の測定はCandida尿路感染症の早期部位診断や治療効果の判定に有用な検査方となりえることが示唆された.今後も新たなる指標の確立につき検討を行なう予定である.1.基礎的研究:cyclphosphamide投与により免疫能を低下させたWistar系径尿未知的に接種し,上行性腎盂腎炎の実験モデルを作製した.その結果, (1)菌接種3日後までに29.7%, 7日以降で78.5%のラットに腎盂腎炎が発生した.(2)組織学的には3日後までの腎盂腎炎は腎盂に限局する急性炎症で, 7日以降のそれは腎皮質におよぶ広範な慢性炎症であり, (3)腎盂腎炎の程度が高度になるにつけ腎組織内および尿中Candida数の増加する傾向が認められた. (4)また, Candidaspp・の主要代謝産物であるD-arabinitolの血清中濃度をガスクロマトグラフィーで測定したところ,菌接種3日後までのラットにのみ検出可能であった.2.臨床的研究:尿中より10^4/ml以上のCandidaが分離された20例を対象とした. 14例は胆癌患者で, 16例は尿路へのカテーテル留置症例であり,直前まで全例に抗菌化学療法が施行されていた.その結果,(1)Candidaspp.の細胞壁mannonに対する血清抗体価を経時的に測定し, Candida腎盂腎炎やCandida血症を疑われた4例に4倍以上の上昇が認められた.しかしこの有意な上昇までに1431日を要したことより,上記病態の早期診断の指標としては有用でないと考えられた.(2)血清中D-arabinitolは無症候性Candida尿症やCandida膀胱炎の疑われた症例に比し, Candida腎盂腎炎やCandida血症の疑われた症例において高濃度で検出されるものが多く, (3)後者の4例に5-fluorocytosimeを投与すると全例にD-arabinitolの速やかな下降,消失が得られ,尿所見や臨床症状の経過と合致していた.以上より血清中D-arabinitol濃度の測定はCandida尿路感染症の早期部位診断や治療効果の判定に有用な検査方となりえることが示唆された.今後も新たなる指標の確立につき検討を行なう予定である.
アルコール関連発がんの分子メカニズム解明と予防および早期診断への応用

飲酒は喫煙とならび、食道癌の危険因子と言われていたが、なぜ癌化に関わるか不明であった。われわれは、飲酒に関する体質の違いにより、食道内の遺伝子の傷が付きやすさが異なることを明らかにした。また、この遺伝子障害が半減するのに要する時間は35時間であることを明らかにし、慢性的な遺伝子障害が飲酒による食道癌を引き起こす可能性を示した。食道が特異的に障害される原因は、呼気を介する可能性も示した。IARCは、アルコール代謝酵素であるアルデヒド脱水素酵素(ALDH2)の欠損者では、アセトアルデヒドが食道癌の原因に寄与していると結論づけた。しかしながら、なぜ摂取されたアルコールが肝臓で代謝された後に食道・頭頸部の発癌につながるのかはいまだ不明な点が多い。本研究では、1)C13エタノールを経口投与してヒト呼気中のC13アセトアルデヒドの測定を行いALDH2遺伝子多型判別の簡易診断法(アルデヒド呼気テスト)を開発することと、2)アセトアルデヒドの臓器障害を明らかにするために、ALD2欠損マウスを用いて食道を経由しない投与経路(尾静脈または腹腔内)と経口経路でのエタノール投与後の、食道の炎症性変化と食道を含めた各臓器でのDNA損傷の程度をバイオマーカーであるDNAアダクト(N2-ethylidine-dG)を指標として検討することを計画している。本年度の研究では、われわれが株式会社「化研」と共同開発した酸化チタン光触媒を用いたアルデヒド呼気測定装置を試作し、ボランティアの協力のもと測定条件を検討した。100μlのC13エタノール(99.9%)を50mlの純水で内服し、1,3,5,7分後に呼気バックに呼気を採取してΔ13CO2を赤外分光計で測定した。ALDH2遺伝子型が野生型に対し、欠損型では1,3、5分後に高値を示し1分後の差がもっとも大きかった。したがって、簡易型呼気テストの条件は、C13エタノール(99.9%)100μl+50ml純水を内服後、1分後、3分後で検討しもっとも簡便かつ高感度な方法を開発する。また、アセトアルデヒドによるがん化のメカニズムを明らかにするために、ALD2欠損マウスと食道癌で高頻度に変異しているがん抑制遺伝子p53のダブルノックアウトマウスを作成した。今後このマウスを使用しアルコール投与後の組織学的変化とDNAアダクトの蓄積の違いを検討する予定である。2009年11月に世界保健機構(WHO)の下部組織であるIARCは、アルコールの代謝産物であるアセトアルデヒドを、ヒトにおける食道癌、頭頸部癌の明らかな発癌物質であると認定した。しかしながら、なぜ摂取されたアルコールが肝臓内でアセトアルデヒドの代謝された後に食道・頭頸部の発癌につながるのかはいまだ不明な点が多い。本年度の研究では、1)アセトアルデヒドが蓄積されるALDH2ホモ欠損マウスとアセトアルデヒドが蓄積されにくいALDH2正常マウスに、8週間5%エタノールを自由摂取させ、アセトアルデヒドによるDNA損傷のマーカーの一つであるDNAアダクト:N-ethyledine-dG(グアニン)の食道内の量を測定した。2)また、DNA損傷に対する重要な修復遺伝子であるp53遺伝子欠損マウスを掛け合わせて、ALDH2ホモ欠損/p53ヘテロ欠損マウス[ALDH2(-/-)p53(-/-)]、ALDH2ホモ欠損/p53ホモ欠損マウス[ALDH2(-/-)p53(+/-)]を作成し、エタノールによるDNAアダクトが増加するかも検討した。1)エタノールを自由摂取させた場合、ALDH2ホモ欠損マウスではALDH2正常マウスに比較して有意に食道内のN-ethyledine-dGの量が増加した。2)ALDH2(-/-)p53(+/-)マウスとALDH2(-/-)p53(-/-)におけるN-ethyledine-dG量は、ALDH2ホモ欠損/p53正常マウスに比較してやや増加したが有意差はなかった。このことより、アセトアルデヒド暴露によるDNAの損傷は、DNA修復遺伝子であるp53遺伝子の状態には左右されないことがあきらかになった。2009年にIARCは、アルコールの代謝産物であるアセトアルデヒド(AA)を、「ヒトにおける食道癌、頭頸部癌の明らかな発癌物質である」と認定した。しかし、なぜAAがこれらの癌を引き起こすのかはまだ不明である。本研究では、ヒトと同様に飲酒後にAAが蓄積するアルデヒド脱水素2型酵素(ALDH2)欠損マウス(ALDH2KOマウス)とAAが蓄積しにくいALDH2正常マウスを用いて、飲酒後の食道内のDNA損傷を検討した。食道内のデオキシグアニンのAA付加体(N2-ethylidene-dG)は、水摂取群ではALDH2野生型とALDH

2KOマウスにアダクト数に差はなかったが、エタノール投与群では有意にALDH2KOマウスで高いアダクト数を示し、飲酒後の食道のDNAの傷損傷は遺伝子型によって異なることが示された。癌抑制遺伝子であるp53はDNA修復にも重要な働きをしているため、ALDH2KOマウスにp53遺伝子のダブルノックアウトマウスを作成し、飲酒後のアダクト数を検討したが、ALDH2野生型/p53野生型、ALDH2欠損型/p53ヘテロ欠損型、ALDH2欠損型/p53ホモ欠損型においてDNAアダクト数に差が認められなかった。したがって、飲酒後のDNA損傷の修復はp53以外の分子機構が働いている可能性がある。アセトアルデヒド暴露後のN2-ethylidene-dG数の半減期を浮遊系癌細胞(HL60)を用いて計測すると、約35時間であることが推定された。この結果より、日常的に飲酒をしていると体内でのDNA損傷は蓄積してく可能性が示され、慢性的なDNA障害が発癌を引き起こす可能性があると考えられた。生体呼気中のAAを簡便に測定するために、光触媒を用いた簡易呼気測定装置を開発しc^<13>標識エタノールによる測定系を作成した。また半導体ガス分析器で低濃度のAAを測定できる系も作成した。
細菌性サイトカインの精製と応用に関する研究

病原菌による食中毒が発生すると、原因菌を患者から分離すると共に、原因食品を特定するために一般的な細菌学検査が行われる。しかしながら、実際は8割が原因食品の特定に至っていない。このような低検出率の原因の一つとして、食品中の病原菌がVNC状態(viable but non-culturable)、すなわち"生きてはいるが培養不可能な状態"に移行するため、通常の細菌学検査では見逃されている可能性があると我々は危惧している。近年、種々の細菌が様々な自然環境下や食品中においてVNC状態に移行することが報告され、我々は腸管出血性大腸菌O157やサルモネラなどの食品媒介性病原菌が、高濃度の食塩や低温などのストレス環境下で容易にVNC状態に変化することを観察している。VNC状態の細菌は、動物や人の体内に入るとVNC状態から回復(蘇生)し、病原性を発揮するため、このような細菌のコントロールは公衆衛生上重要である。我々はサルモネラ菌を用いて、VNC状態からの回復を促すような蘇生因子(細菌性サイトカイン)が存在する可能性を指摘し、昨年度の研究において、この因子をコードする遺伝子rpfを同定することに成功した。本年度は同定した遺伝子の塩基配列をもとに、組み換え型のRpfタンパク(rRpf)を作製し、蘇生効果について検討した。その結果、rRpfは通常培地のみでは培養できなかったVNC状態のサルモネラを蘇生させ、検出可能な状態に回復することを見出した。また、抗Rpf抗体を蘇生過程のサルモネラ培地に添加するとその蘇生は完全に抑制された。さらに、VNCおよび蘇生過程で特異的に発現するタンパクを数種同定した。以上の成果は、rRpfを利用したVNC病原菌の検出法の開発や、VNC菌汚染の予防に繋がると思われる。細菌性食中毒が発生すると、原因菌を患者から分離するとともに、原因食品を特定するために一般的な細菌学的検査が行われるが、2割程度しか原因食品は特定されてこなかった。この原因の一端は、細菌が食品中でVNC(Viable but Nonculturable)状態、即ち生きてはいるが培養不能な状態に陥っているからで、そのため検出率が極端に低下していると我々は考えている。近年海水や河川中の環境下や食品中における種々の細菌のVNC状態への変化が報告され、我々は腸管出血性大腸菌やサルモネラ、リステリアなどの病原細菌が容易にVNC状態に変化する現象を観察してきた。すなわちVNC状態への移行は、環境のストレスに応答して、自己を防衛するために細菌が自ら保有する生命維持機構であるといえる。しかし、VNC状態の病原細菌は現在の細菌検査手法では分離培養不可能であるにも関わらず、動物に病原性を保持していることが知られている。VNC状態の細菌は栄養豊富な場で必ずしも蘇生するわけではなく、逆に栄養不足状態の方が蘇生しやすいことが判っている。このことからVNC状態の細菌は生体内で栄養が豊富になり蘇生するというよりも、何らかの蘇生誘導物質により培養可能な状態に戻り(蘇生し)、病原性を発現すると我々は仮説をたてている。実際我々は細菌の培養濾液中にVNC細菌の蘇生に関与する物質(細菌性サイトカイン)が存在することを現象として確認している。このことから細菌間で共通に産生される細菌性サイトカイン類似物質がVNC細菌の蘇生を誘導したり、感染後宿主側が類似物質を産生しているのかもしれない。そこで、このサイトカインの同定と応用を本研究で実施する。本年度は、この遺伝子を同定し、蘇生に関与することを見出した。
海老名弾正の政治思想の再検討

今年度の研究で得た主要な知見としては、以下の2点が挙げられる。1.従来の研究では海老名の政治思想の「日本主義」的、「帝国主義」的側面に着目するあまり、大正期以降を考察時期から除外するか、あるいは彼を無節操な「大正デモクラシー」への追随者であったとしてきた。それに対して、海老名自身が(宗教思想家のみならず)政治思想家としてデモクラシーの思潮をつくり上げ、リードする役割を果たしていたことを確認した。西洋像によって大きく規定されている海老名の政治思想においては、第一次大戦の勃発は思想的大事件であり、彼はその帰趨の中から、英米主導のデモクラシーの機運を読み取ったのである。そしてそれを、彼自らが主筆を務める雑誌『新人』を中心に大々的に展開したのであった。2.海老名が晩年に展開した「新日本精神」論については、従来はほとんど触れられず、稀に触れられる場合でも、その名称がもたらすイメージから彼の思想の「国粋主義」的性格を示すものとされてきた。しかしながら、「新日本精神」論において海老名が儒学思想史などを素材に主張したのは、日本思想史が<外部>に対して開かれたものとして展開してきたということであった。すなわち、時局が戦争へと向かう中で唱導されていた排他的・排外的な「日本精神」論を批判するということこそが、「新日本精神」論で彼の意図したことだったのである。海老名の思想を「日本主義」的、「国粋主義」的、「神道」的と論定する先行研究の見解は、この点でも覆されなければならないというのが、本研究の立場である。なお、これらの成果は公刊される予定である。
自己愛の発達及び病理の発生過程に関する実証研究

研究2の目的に関連し,昨年度よりデータ収集を続けていた観察実験について,結果の分析を行った。行動指標(笑顔,うなずき,視線など)をもとにしたデータにより,自己愛者が実際の相互作用の中でどのように他者を参照するのかということについて,従来の臨床実践に基づく知見や質問紙調査からの知見の確認ができ,また,質問紙調査では得られていない知見も見出された。この結果については,今年度のパーソナリティ学会において発表を行い,現在学術論文の執筆を行っている。また,類似の概念である自尊感情との相違点や共通点について知見のレビューをはじめ,ワークショップでの発表や論文執筆を行った。その成果から,両者の違いについて実証的に示すべく,新たな研究を計画し,これまでにデータ収集を行った。この研究は,成人期以降の自己愛について検討した研究1の知見を補完する意味も持っている。すなわち,研究1では,自尊感情が加齢とともに高まっていく一方で,自己愛については側面によって発達の様相が異なることが示されている。この結果は,自己愛と自尊心には共通性があるが,自己愛には自尊感情とは異なる何らかの性質が含まれていることを示唆するものと捉えられた。本年度この調査の結果については一部学会発表を行っており,学術誌への投稿を行っている途中である。来年度にむけ,両者の違いについてさらに分析を行い,学会や学術雑誌で公表を行っていく予定である。研究Iの目的に合わせ,大学生から60歳までの男女を対象に,青年期から成人期にかけての自己愛の変化およびその要因について検討し,これまでの研究から想定されていた自己愛の発達モデルについて,実証的な確認を行った。その結果,自己愛は側面によって兆達過程が異なり,青年期以降低下する傾向のある側面と,成人期以降も維持される側面とがあることが明らかになり,低下することが示唆された「評価過敏性」は,青年期以降ありのままの自己を受容できるようになるということが低下を導く一つの要因となっていることが明らかとなった。この結果は教育心理学会で発表し,さらにこの成果を論文としてまとめ,現在「心理学研究」に投稿中である。また,当該年度までの成果をまとめ,博士論文を執筆した。研究Iおよび博士論文は,本研究テーマである自己愛の発達および尿理の発生過程に関し,その時期や要因に関する有意義な知見を提出するものである。特にこれまで,自己愛は青年期特有の心性として捉えられてきたが,側面に分けてみると,一概に低下傾向があるとも言えないことが明らかとなった。この知見は今後の自己愛研究に少なからず影響を及ぼすものであると考えられる。研究2に関しては,予備的な調査として,行動指標を用いた対人相互作用の観察実験をはじめ,本年度中に予定数の半分のデータを取り終えた。実際の相互作用の中でどのように他者を参照するのかという視点はこれまでになく,質問紙調査では得られない重要な知見が得られるものと考えている。今後追加データの収集とともにデータ分析を行い,結果の発表を行っていく予定である。
酵素を利用したサリン等の神経剤分解法の開発と汚染除去法に関する研究

化学テロ現場において、原因物質のみを特異的に除染できる方法の開発を目指して、有機リン系化合物分解酵素であるorganophosphorus hydrolase(OPH)の遺伝子に変異を導入し、サリンやVX等を効率的に分解する酵素の開発に取り組んだ。136Leu、254Tyrおよび257Hisの3箇所のアミノ酸を置換した5種類の変異酵素を作成し、有機リン系化合物分解反応を調べた結果、Tyr254Hisの変異を導入した酵素が最も高い分解能力を示した。さらにこの酵素を担体に固定して作成したバイオリアクターは活性を維持し化学剤を分解したことから、酵素によるテロ現場除染技術への発展が可能と考えられた。(1)パラオキソン分解活性:最も高い活性を示したKGU0227は10 mMCo2+が活性化に最も有効であった。一方でZn2+添加の場合の活性はCo2+の1/20程度であった。KGU0094およびKGU0245ではイオンの違いによる活性の差は認められなかった。(2)各種神経剤分解活性:サリン(GB)、ソマン(GD)、タブン(GA)、シクロヘキシルサリン(GF)およびVXの分解活性を調べた。最も活性の高かったKGU0227は10 mMのCo2+を添加した場合に最も効率よく神経剤を分解し、GB、GA、GDおよびGFをほぼ完全に分解し、VXを45%分解した。Zn2+添加の場合は分解活性がやや低下し、GDは90%、VXは25%程度の分解率であった。KGU0245はこれに次いで神経剤分解の効率が高く、二価イオンの違いによる活性の差は認められなかった。KGU0094m、KGU0211およびKGU0225は野生株であるKGU0094よりもVX分解活性は低下した。これらの変異酵素のうち最も活性の高かったKGU0227遺伝子にHis-Tag配列を付加した酵素を作成し、酵素タンパク発現を試みている。前年度までに作成した遺伝子変異を導入したOPH、すなわち136Leu、254Tyrおよび257Hisの3箇所のアミノ酸を置換したOPH、KGU0094(野生株136Leu、254Tyr、257His)、KGU0094m(Leu136Tyr)、KGU0211(Leu136Asp)、KGU0225(His257Leu)、KGU0227(Tyr254His)、KGU0245(Tyr254Arg、His257Leu)の有機リン系化合物分解活性の特性および要求する二価イオンについて調べた結果、10mM Co2+存在下におけるKGU0227(Tyr254His)が最も高い活性を示したため、KGU0227遺伝子にHis-Tag配列を付加した酵素を作成した。発現させた酵素タンパクをニッケルカラムに吸着させ、不要なタンパク成分を洗浄したものを固定化酵素とした(固定化酵素I)。続いてニッケルカラムを用いて酵素タンパクを精製し、得られた精製酵素をCNBr活性化Sepharose4Bと反応させて固定化酵素を作成した(固定化酵素II)。さらに精製酵素を多孔質シリカに酵素を固定して固定化酵素を作成した(固定化酵素III)。これらの固定化酵素を用いて酵素活性を測定したところ、パラオキソン分解活性は、固定化酵素IおよびIIIにおいては遊離酵素と同程度の高い活性を維持できていたのに対して、固定化酵素IIは活性が大きく減弱していることが明らかとなった。また、神経剤分解活性については固定化酵素IおよびIIについてはパラオキソン分解活性と同様の傾向が見られたが、固定化酵素IIIは神経剤のシリカ担体への吸着が起きていることが示唆された。OPH遺伝子への変異の導入を試みた。Sphingobium fuliginis ATCC 27551からクローニングしたOPH遺伝子をテンプレートとし、任意の場所に塩基置換を導入したOPH遺伝子を作成した。この手法により、136Leu、254Tyrおよび257Hisの3箇所のアミノ酸を置換したOPH、KGU0094(野生株136Leu、254Tyr、257His)、KGU0094m(Leu136Tyr)、KGU0211(Leu136Asp)、KGU0225(His257Leu)、KGU0227(Tyr254His)、KGU0245(Tyr254Arg、His257Leu)を作成した。続いて酵素活性の測定および基質特異性の検討を行った。

(1)パラオキソン分解活性:遺伝子変異を導入したOPHでは、KGU0211、KGU0094mおよびKGU0225でパラオキソン分解活性はほとんど確認できなかった。活性が確認できた酵素では、KGU0227はCo2+が活性化に有効であり、KGU0094はZn2+が有効であった。KGU0245では両イオンの差は認められなかった。なお、最も高い活性を示した酵素はKGU0227であった。(2)各種神経剤分解活性:サリン(GB)、ソマン(GD)、タブン(GA)、シクロヘキシルサリン(GF)およびVXの分解活性を調べた。その結果KGU0227がGB、GD、GAおよびGFをほぼ完全に分解し、VXを6種の酵素中では最も効率よく分解した。KGU0245はこれに次いで神経剤分解の効率が高かった。KGU0211およびKGU0225はGA、GB、GDおよびGDは効率よく分解したがVXの分解効率が悪かった。またKGU0094mは野生株であるKGU0094よりも神経剤分解活性は低下した。また神経剤分解活性における活性化に必要な金属イオンの種類・濃度についても調べた。塩基置換を導入したOPH遺伝子から発現させた酵素5種類に加えて野生株を含めた6種類の酵素について神経剤5種の分解に必要な二価イオンの種類と濃度の検討を実施し、最も高い活性を示すOPHのアミノ酸置換を見つけることができたと同時に、この酵素の最も活性が高くなる二価イオンの種類と濃度を決定した。さらにHisーTagを導入した酵素タンパクの調製も達成しており概ね当初の予定通りに研究が進行できているものと考えている。塩基置換を導入したOPHを5株作成することができた。これらの酵素に野生株を含めた6種類の酵素について活性化最適条件の検討を実施し、引き続いて神経剤5種の分解活性の測定を実施できている。またOPHにHistidineーTagを導入した酵素タンパクの調製も達成できており概ね当初の予定通りに研究が進行できているものと考えている。遺伝子変異を導入したOPHを作成し、それらの神経剤分解活性の特性を比較した結果、高い分解活性を有する酵素を作成することができたので、神経剤分解バイオリアクターの試作に向けた検討として、OPH大量精製法の検討およびバイオリアクターの試作を実施する。HisーTag導入酵素を精製し、ニッケルカラムにキレーティングさせることで固定したバイオリアクターを作成することの他に、大量の酵素を効率よく担体に結合させることができる手法を検討する。続いてバイオリアクターにより神経剤の分解が起きていることを確認し、さらに分解効率を上げるための水溶液の透過速度や反応温度、バイオリアクターの再利用の可能性や、活性を保持できる保管条件等について最適条件を検討する。遺伝子変異を導入したOPHを作成し、それらの神経剤分解活性の特性の検討を実施することができたので、今後はさらに活性特性の検討を進めるとともに、神経剤分解溶バイオリアクターの試作に向けた検討として、OPH大量精製法の検討およびバイオリアクターの試作を実施する。HistidineーTag導入酵素を精製し、ニッケルカラムにキレーティングさせることで固定したバイオリアクターを作成する。バイオリアクターにより神経剤の分解が起きていることを確認する。さらに分解効率を上げるための水溶液の透過速度や反応温度、バイオリアクターの再利用の可能性や、活性を保持できる保管条件等について最適条件を検討する。さらにE. coli培養液中からのOPHの簡易、迅速な大量精製法を検討する。大型バイオリアクターに使用可能なレベルの粗精製には、イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲルろ過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた方法を検討する予定である。
頭頚部癌由来細胞株を用いた新規MMP阻害剤のMMP-2,9活性抑制に関する研究

(目的)舌扁平上皮癌に対するMMP阻害剤の効果をヌードマウス同所移植モデルを用いて検討した。(方法および結果)1.HSC-3-M3の細胞増殖に及ぼすMMP阻害剤の影響HSC-3-M3の細胞増殖に及ぼすMMP阻害剤の影響をMTT assayを用いて検討した。培養液中のMMP阻害剤を1nMから100μMまで変化させ検討したが、MMP阻害剤による殺細胞効果は認めなかった。2.In vitroにおけるMMP阻害剤のMMP-2,9ゼラチン分解活性抑制効果ヌードマウスに移植した舌癌をホモジナイズ、遠心して得られた上清を用いてgelatin zymographyを行った。電気泳動後、TNC溶液に1nMから30nMまで濃度を変えたMMP阻害剤を加えた結果、MMP-2,9のゼラチン分解活性が濃度依存性に抑制された。3.In vivoにおけるMMP阻害剤のMMP-2,9抑制効果ヌードマウス舌への同所移植モデルを用いてMMP阻害剤による治療実験を行った。治療群と対照群の舌腫瘍をそれぞれホモジナイズしgelatin zymographyに供した。治療群と対照群のMMP-2の比は0.57:1、MMP-9は0.81:1、MMP-9の活性化率は0.21:0.36であり、MMP-2,9の発現抑制、MMP-9の活性化抑制効果が認められた。4.MMP阻害剤の腫瘍組織内ゼラチン分解活性抑制効果治療群、対照群の摘出腫瘍をfilm in situ zymographyに供した。対照群では、腫瘍存在部位および辺縁部に一致して強いゼラチン分解活性を認めた。一方治療群では著明に抑制された。すなわちMMP阻害剤による舌癌腫瘍組織のゼラチン分解活性抑制効果が証明された。(今後の展望)同様のモデルを用いて治療実験を行い、MMP阻害剤による舌扁平上皮癌の頸部リンパ節転移抑制効果を検討する予定である。
精子形成における減数分裂機構へのAmidaの役割

Amida(251aa)は、脳に特異的な最初期遺伝子Arc(activity regulated cytoskeleton-associated protein)と結合する蛋白質として、申請者らが単離した新規蛋白質である。Amidaが、脳に比べて精巣に数十倍多く存在していることを見出した。Arcは精巣にほとんど存在しないことより、精巣でのAmidaは独自の機能を有していることが考えられるので、精子形成を中心にAmidaの機能を調べた。発達期の精巣において、Amida mRNAが精子形成の減数分裂期に増加すること、さらに、腹腔内精巣を作製したときに、Amida mRNAの発現減少が、減数分裂細胞の細胞死とよく一致した。また、in situ hybridizationでは、Amida mRNAが精母細胞に、免疫組織化学では、精母細胞および半数体精子に限局していることが分かった。一方、培養細胞に過剰発現させると、細胞分裂の抑制G2/M期で引き起こすことを見出した。また、Amidaの構造解析より、2つの核移行シグナルの間の部分が細胞周期抑制に関与しており、かつ、この領域にDNAとの結合活性が存在した。セリン180が、Cdc2キナーゼにより特異的にリン酸化されることを見出した。この部位のリン酸化により、DNAとの結合活性が減少することを見出した。以上のことより、Amidaが精子形成、特に減数分裂と深く関わっていることが示唆された。