hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多色蛍光蛋白遺伝子導入ラットの神経内分泌系でのストレス反応の可視化と生理機能解明

c-fos-mRFPトランスジェニックラット、c-fos-mRFPとバゾプレッシン-eGFPのダブルトランスジェニックラットおよびオキシトシン-mRFPトランスジェニックラットに浸透圧刺激を与え、蛍光タンパクおよび遺伝子発現の反応性を検討した。その結果、各蛍光の強度と遺伝子発現は増強していた。また、蛍光タンパクの発現が生体に及ぼす影響は観察されなかった。緑色蛍光および赤色蛍光を指標として神経内分泌系のストレス反応の可視化に成功した。Fosタンパクは神経活動の指標として広くストレス研究に用いられている。本年度は、c-fos-monomeric red fluorescent protein (mRFP)トランスジェニック(Tg)ラット、アルギニンバゾプレッシン(AVP)-enhanced greenfluorescent protein(eGFP)融合遺伝子およびc-fos-mRFP融合遺伝子をもつダブルTgラットを用いて、浸透圧刺激に対する視床下部のFosタンパク、eGFPおよびmRFP発現動態を検討した。c-fos-mRFPTgラットもしくはAVP-eGFP・c-fos-mRFPダブルTgラットの腹腔内に体重の2%の生理食塩水(コントロール)および9%高張食塩水を投与し、90分後に灌流固定を行った。脳を採取後、薄切切片を作成し、蛍光顕微鏡ならびに共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光像を撮影した。また、免疫組織化学的染色法によりFosタンパク免疫陽性細胞の発現を確認した。その結果、9%高張食塩水投与群では浸透圧感受性部位である正中視索前野、終板器官、視索上核、室傍核および脳弓下器官においてmRFPの赤色蛍光が多数観察された。同部位にFosタンパクの発現も観察された。また、ダブルTgラットでは視索上核および室傍核に局在するeGFPの緑色蛍光を細胞質に持つニューロンの核内にmRFPの赤色蛍光が観察され、さらにeGFPの緑色蛍光が増強していることも観察された。コントロール群ではmRFPの赤色蛍光およびFosタンパクはどの部位にもほとんど見られなかった。以上より、緑色蛍光(AVPニューロン)および赤色蛍光(Fosタンパク)を指標として神経内分泌系(下垂体後葉系)のストレス反応(浸透圧負荷)の可視化に成功した。本年度はc-fos-monomeric Red Fluorescent Protein (mRFP)トランスジェニック(Tg)ラットをオキシトシン(OXT)-enhanced Cyan Fluorescent Protein (eCFP)Tgラットと交配することによりダブルTgラットを作成し、研究に使用する計画であったが、OXT-eCFP TgラットにおけるeCFPの発現が個体によって安定せず実験に使用できなかったため、代わりにOXT-mRFP Tgラットを作成し、浸透圧刺激に対する視床下部のOXTおよびmRFP発現動態を検討した。OXT-mRFP Tgラットに5日間の2%高張食塩水飲水負荷を行い、灌流固定を行った。脳を採取後、薄切切片を作成し、蛍光顕微鏡を用いてmRFP蛍光の観察を行った。また、in situ hybridization法にて、mRFP mRNA、OXT mRNAおよびアルギニンバゾプレッシン(AVP) mRNAの評価を行った。体幹血を採取し、血漿浸透圧、血中ナトリウム濃度、血中OXT濃度、血中AVP濃度を測定した。コントロール群には水道水飲水群を用いた。その結果、2%高張食塩水飲水負荷群ではコントロール群と比してOXT産生細胞が存在する視索上核および室傍核においてmRFPの赤色蛍光およびmRNAが著明に増加した。OXT mRNAおよびAVP mRNAも著明に増加し野生型ラットと同様の変化を示すことが明らかとなった。血漿浸透圧、血中ナトリウム濃度、血中OXT濃度、血中AVP濃度も野生型ラットと同様の変化を示し、mRFPの発現が生体の浸透圧刺激に対する反応に影響を及ぼさないことが示唆された。以上より、赤色蛍光(OXTニューロン)を指標として神経内分泌系(下垂体後葉系)のストレス反応(浸透圧負荷)の可視化に成功した。
圧縮率とX線結晶解析を用いた変異蛋白質の構造・ゆらぎ相関の研究

蛋白質の立体構造の構築原理を理解する上で、分子のコンパクトさとゆらぎは重要な物理量であるにもかかわらず、その実験的データは非常に少ない。本研究では、蛋白質の断熱圧縮率とX線結晶構造(キャビティー・温度因子)に及ぼす部位特異的アミノ酸置換の影響を系統的に調べ、局所構造が分子全体の構造のコンパクトさやゆらぎとどのようにカップリングしているかを検討した。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデル蛋白質として、遺伝子組み換えにより3つのフレキシブルループの中心に位置するGly67,Gly121,Ala145を種々のアミノ酸に置換し水中での部分比容vと断熱圧縮率βを決定した。その結果、1アミノ酸置換によりvとβは大きく影響を受け、アミノ酸置換の影響が局所的なループ領域の変異に留まらず、分子全体の構造のゆらぎに影響を及ぼしていることが示唆された。そこで、これらの変異体の一つ(G67V)を結晶化し、X線構造解析を2.4Å分解能で行った。その結果、67位のGlyをValに置換することにより、近傍に位置するTrp74の側鎖が分子表面に追い出され、67位のループの温度因子が減少するだけでなく、130位付近のループの温度因子も大きく減少し、アミノ酸置換の影響が長距離まで及んでいることが明らかとなった。また、分子内キャビティーの数も体積も野生型に比べて減少しており、変異により分子内の原子の充填密度が増すことがわかった。これらの結果はG67Vの圧縮率が野生型より小さいことと一致しており、キャビティーがゆらぎに直接関与していること、またDHFRの構造のゆらぎにフレキシブルループが重要を役割を演じていることを示している。このように、アミノ酸置換、圧縮率データ、X線構造解析を組み合わせることにより、蛋白質構造のゆらぎの発現機構が解明できる可能性が示された。
有限密度格子QCDにおける一次相転移線の終点の数値的研究

高温高密度でハドロン相からクォーク・グルーオン相に変化する量子色力学(QCD)の相転移を、熱浴中でのクォーク密度の揺らぎの仕方を表す確率分布関数に注目することにより研究する。QCDの相転移は密度が変わることによって、相転移の性質が変わることが予想されており、そのクォーク密度の確率分布関数の形が相転移の性質を理解するうえで重要な情報となる。高密度でのQCDの数値シミュレーションには「符号問題」という深刻な問題があるが、本研究では、その符号問題を回避する方法について議論する。さらに、クォーク密度など物理量の確率分布関数を数値シミュレーションにより計算する方法の確立を目指す。
肝細胞癌におけるドライバー遺伝子変異と薬剤感受性関連遺伝子発現変化の探索

肝内胆管癌における遺伝子解析を行い、TP53, KRAS, SMAD4, NF1, ARID1A, PBRM1を代表とする32の癌細胞増殖・浸潤に係る遺伝子の有意な変異を認めた。その中で、ARID1A・KRAS・MUC17遺伝子の変異は予後に相関していた。また、BRCA1, BRCA2, RAD51D, MLH1, MSH2などのミスマッチ修復遺伝子関連の異常も約11%の症例に認め、肝内胆管癌における遺伝性発癌の可能性があることや、免疫チェックポイント阻害剤の好対象となる集団があることが分かってきた。また、これまでに行った肝細胞癌の遺伝子解析の結果との対比により、肝内胆管癌細胞の発生起源を探索したところ、これらの約3割は、肝細胞由来であることが判明した(J Hepatol. 2018;68(5):959-969.)。また、分子標的治療薬の有望な対象標的の一つであるFGFRに関しても、数種類の融合遺伝子を同定できた。現在、標準治療終了後の進行再発肝内胆管癌症例に対して、ミスマッチ修復遺伝子の解析を行い、免疫チェックポイント阻害剤の効果との関連性を検討することを計画している。肝細胞癌においては、ヒストンタンパクのメチル化関連遺伝子に関しての解析を行い、KDM5B/JARID1Bの脱メチル化酵素の発現が予後に関連していることが分かり、抑制されていた何らかのactionable geneの再活性化が肝細胞癌の増殖・浸潤に関与していると考えらた。また、in vitroの実験系で肝細胞癌株を用いて、KDM5Bノックダウンを行い、癌細胞の増殖・浸潤が抑制されることが再現された(Oncotarget. 2018;9(76):34320-34335.)。肝内胆管癌においてミスマッチ修復遺伝子の変異を認める集団をある一定の割合で認めた。これらは、免疫チェックポイント阻害剤が適応できる可能性が高い集団と言われている。今後のさらなる症例を集めて、検討を追加してく予定である。2019年度は、特に新規分子標的治療薬であるレンバチニブに関して、切除不能状態で投与され切除可能へconversionとなった症例の切除標本から、抗腫瘍効果の高い領域と低い領域から、それぞれ遺伝子を抽出し、2領域における遺伝子変異の発現の差異の解析を行い、レンバチニブ感受性に関わる遺伝子変異の抽出を行う。また、肝内胆管癌を含む原発性肝癌に対する免疫チェックポイント阻害剤の併用の有効性が示唆されているため、切除標本におけるPDL-1の発現の程度の解析も行い、レンバチニブ非投与症例の既存の切除サンプルと比較することで、免疫チェックポイント阻害剤の有効性が誘導されているかを検証する。得られた結果を取りまとめて、成果の発表を行う。さらには、患者由来癌組織からの短期培養系の樹立を図り、薬剤感受性パネルの作成を行う予定である。2017年度は、まず肝細胞癌における原発巣と再発巣との間でのドライバー遺伝子変異の相違の有無を解析し、報告した。結果、肝内転移の形式をとる原発巣と再発巣の間でのドライバー遺伝子変異はほぼ相同していた。一方で、多中心性発生の形式をとる原発巣と再発巣の間でのドライバー遺伝子変異は全く異なっており、同じ肝細胞癌の再発であっても再発形式によりゲノム的には全く異なる肝細胞癌であることを証明した(J Hepatol. 66, 363-373, 2017)。次に、肝細胞癌の悪性度に関わるEpithelial-mesenchymal transition (EMT)関連遺伝子群の発現解析を、これまでゲノム解析に用いた症例の癌部および非癌部組織を用いて行った。解析対象遺伝子として、これまでに論文で報告されているCDH1・ID2・MMP9・TCF3を挙げた。いずれも遺伝子も、非癌部と比較して癌部における遺伝子発現の程度が有意に高いことを確認した。C型慢性肝炎合併肝細胞癌に絞って、これらの遺伝子発現程度を変数に組み入れた予後予測に関してのロジスティック回帰分析(Risk score=ー0.333×[CDH1] ー0.400×[ID2]+0.339×[MMP9] +0.387×[TCF3])に当てはめたところ、予後予測が可能であることを示し、現在論文作成中である。今後は、これらの結果を用い、EMT遺伝子群の発現程度の観点から抽出された予後不良症例グループに対して、種々のドライバー遺伝子変異のクラスター解析を行い、特徴付けが可能かどうかを解析する。これまで報告されている特にCDDPの感受性に関わる遺伝子群の発現パターンを解析する予定である。ヘテロジェナイティーの強い肝細胞癌に対して、肝内転移再発におけるゲノム変異は、原発・転移病巣間でほぼ相同と言えることができ、肝内転移の制御に関しては、原発巣のゲノム変異情報の基づいた治療選択(抗癌剤選択)を行えばよいことがわかった。一方、多中心性発生では、同じ肝細胞癌の再発であっても全くゲノム変異の異なる癌組織と判断されるため、原発巣のゲノム変異情報は使えないこともわかり、今後の抗癌剤感受性遺伝子の同定および活用に際しての知見となっている。

また、BRCA1, BRCA2, RAD51D, MLH1, MSH2などのミスマッチ修復遺伝子関連の異常も約11%の症例に認め、肝内胆管癌における遺伝性発癌の可能性があることや、免疫チェックポイント阻害剤の好対象となる集団があることが分かってきた。また、これまでに行った肝細胞癌の遺伝子解析の結果との対比により、肝内胆管癌細胞の発生起源を探索したところ、これらの約3割は、肝細胞由来であることが判明した(J Hepatol. 2018;68(5):959-969.)。また、分子標的治療薬の有望な対象標的の一つであるFGFRに関しても、数種類の融合遺伝子を同定できた。現在、標準治療終了後の進行再発肝内胆管癌症例に対して、ミスマッチ修復遺伝子の解析を行い、免疫チェックポイント阻害剤の効果との関連性を検討することを計画している。肝細胞癌においては、ヒストンタンパクのメチル化関連遺伝子に関しての解析を行い、KDM5B/JARID1Bの脱メチル化酵素の発現が予後に関連していることが分かり、抑制されていた何らかのactionable geneの再活性化が肝細胞癌の増殖・浸潤に関与していると考えらた。また、in vitroの実験系で肝細胞癌株を用いて、KDM5Bノックダウンを行い、癌細胞の増殖・浸潤が抑制されることが再現された(Oncotarget. 2018;9(76):34320-34335.)。肝内胆管癌においてミスマッチ修復遺伝子の変異を認める集団をある一定の割合で認めた。これらは、免疫チェックポイント阻害剤が適応できる可能性が高い集団と言われている。今後のさらなる症例を集めて、検討を追加してく予定である。2018年度は、当初の予定通り既存の樹立された肝細胞癌株を用いた培養実験を通じて、遺伝子変異に基づく抗癌剤(CDDP)感受性遺伝子発現の変化を評価していく。さらには、新規に臨床応用が可能となった分子標的治療薬(レンバチニブ・レゴラフェニブ)に対する感受性遺伝子の検索を追加で行う予定である。2019年度は、特に新規分子標的治療薬であるレンバチニブに関して、切除不能状態で投与され切除可能へconversionとなった症例の切除標本から、抗腫瘍効果の高い領域と低い領域から、それぞれ遺伝子を抽出し、2領域における遺伝子変異の発現の差異の解析を行い、レンバチニブ感受性に関わる遺伝子変異の抽出を行う。また、肝内胆管癌を含む原発性肝癌に対する免疫チェックポイント阻害剤の併用の有効性が示唆されているため、切除標本におけるPDL-1の発現の程度の解析も行い、レンバチニブ非投与症例の既存の切除サンプルと比較することで、免疫チェックポイント阻害剤の有効性が誘導されているかを検証する。得られた結果を取りまとめて、成果の発表を行う。さらには、患者由来癌組織からの短期培養系の樹立を図り、薬剤感受性パネルの作成を行う予定である。これまでに当科にてストック済みであった癌組織かつcDNAライブラリ化済みのサンプルを、まずは2017年度実験計画の実験サンプルとして用いた。結果的に、これらのサンプルで2017年度予定していた実験計画の概ねを実行できた。よって、2017年度新規調達分の検体を2017年度に計画していた実験に供用する必要が無くなり、これらの新規サンプルはcDNAライブラリ化せず、一旦冷凍保存のまま保存する方針となった。
TAX1BP1複合体：自然免疫遺伝子群の一塩基多型と炎症性疾患との新規リンケージ

慢性炎症が進行する膠原病およびその類縁疾患、心血管疾患などの患者582例と既往歴を有さない健常対照群120例について、TAX1BP1エクソン18およびTNFAIP3/A20エクソン3領域の塩基配列を解読し、アミノ酸置換を伴う一塩基多型(SNPs)の出現頻度を比較した。欧米とは異なり、TNFAIP3/A20のエクソン3領域におけるF127CのSNPs頻度は有意に患者群で高く、特に全身性エリテマトーデスにおいて約5倍の発生頻度が観察された。一方欧米では高頻度となるシェーグレン症候群およびリュウマチ性関節炎患者群においてF127Cは一例も観察されなかった。以上を論文として近日中に投稿予定。自然免疫系の制御因子TAX1BP1は機能上のパートナーであるA20/TNFAIP3と協調して、病原体の侵入や紫外線などの外部刺激による炎症反応の過剰活性化を抑制的に制御する。TAX1BP1の機能が一部欠損したマウスは全身性の炎症だけでなく心弁膜症・心肥大などの循環器系機能不全を来たし突然死の増加と平均余命の短縮が観察される(伊波等、EMBOJ 2008;中野等PLoSOne 2013)。TAX1BP1、A20/TNFAIP3の一塩基遺伝子多型(SNPs)と、リウマチ・全身性エリテマトーデス・心弁膜症などの炎症性疾患の実際の臨床例との相関性を検証するため、582例の炎症性疾患患者の血液検体についてアミノ酸置換を伴う変異の有無を塩基配列の解読によって進めている。初年度は、TAX1BP1、A20/TNFAIP3それぞれのエクソン18、エクソン3領域に限定して解析し、前者で1例、後者で8例のアミノ酸置換をともなうSNPsの存在を確認した。今年度は両遺伝子に加え、RNF11、ITCH、合計4遺伝子の全エクソンの解析を次世代シーケンス技術を用いて進める計画である。免疫系の過剰活性化による自己免疫性炎症疾患の発症には様々な要因が関与している。自然免疫を制御する一連の遺伝子群の機能不全もその中に含まれており、本研究事業では特に4遺伝子(TAX1BP1、A20/TNFAIP3、RNF11、ITCH)の機能に着目し、それぞれの遺伝子多型(SNPs)と炎症疾患の相関について解析を進めている。今年度までに582例の炎症疾患患者試験群および90例の健常者対照群について、TAX1BP1、A20/TNFAIP3それぞれのエクソン18およびエクソン3領域の塩基配列を解読し、A20/TNFAIP3の当該領域における両群のSNPs出現頻度の統計的な有意差を確認した。このSNPsはアミノ酸の置換を伴うため、炎症惹起の目安となるTNFα投与後のNF-κB活性化の抑制機能について検討を加え、アミノ酸置換により抑制能が8%にまで減弱したことも確認した。試験群中のA20/TNFAIP3-SNPsの9例には血縁のペアがあったので、病態の進展と遺伝的背景の相関性について全エクソン解読データをH27年度の前半までに完了し詳細な考察を加えたい。自然免疫の過剰活性化を抑制する調節機構として、TAX1BP1、TNFAIP3/A20、RNF11、ITCHの4遺伝子産物は機能し、特に前者二遺伝子は免疫調節機構の本体である、脱ユビキチン化活性を担う主要なサブユニットである。慢性炎症が進行する膠原病およびその類縁疾患、心血管疾患などの患者582例と前述の既往歴を有さない対照群120例について、TAX1BP1およびTNFAIP3/A20両遺伝子産物の脱ユビキチン化活性を担う領域をコードするエクソン18およびエクソン3領域の塩基配列を解読し、アミノ酸置換を伴う一塩基多型(SNPs)の出現頻度を比較した。欧米で報告されている結果とは異なり、TNFAIP3/A20のエクソン3領域におけるF127Cの多型発生頻度は有意に患者群で高く、特に全身性エリテマトーデス(SLE)において約5倍もの発生頻度の差が観察された。一方欧米では高頻度に観察されたシェーグレン症候群(SjS)およびリュウマチ性関節炎(RA)患者群においてF127Cは一例も観察されなかった。以上の結果についてまとめた論文を近日中に投稿予定である。A20/TNFAIP3第3エクソンのSNPs出現頻度について患者試験群と健常者対照群とで統計的な有意差を得て、アミノ酸置換の影響をin vitroの系を用いて定量化した。さらに当初の目的である次世代シーケンサーの解析対象となる貴重な2例の検体も確保した。免疫学上記2例の全エクソン配列の解読と解析。

またTAX1BP1およびA20/TNFAIP3の酵素学的な活性を司る、ユビキチン修飾活性について詳細な解析を加えたい。昨年度の時点で、次世代シーケンサーの導入は無く、従来法での塩基配列解析を進めたが、当初設定したTAX1BP1、A20/TNFAIP3双方の最重要機能領域を包含するエクソン領域の塩基配列は解析が終了し、アミノ酸置換を含む一塩基多型の存在を確認できた。全エクソンシーケンス解読用の費用として次年度に繰り越した。今年度本学に導入指した卓上型次世代シーケンサーを駆使し、本研究課題の対象となるTAX1BP1、A20/TNFAIP3、RNF11、ITCH、4遺伝子の全エクソン解読を行う予定である。物品費は全エクソンシーケンス解読費用として、旅費は学会発表用の旅費として、人件費・謝金は学生アルバイトの謝金として、その他は検体の輸送費などに使用予定。当初計画した課題は達成した。人件費及び旅費で若干の余りが生じたので、次年度使用に持ち越した。積極的に成果を発表するため、分子生物学会での発表を計画中であり、その旅費に使用する予定である。
複製型ヘルペスウイルス血管内投与による複合遺伝子治療

本年度は、複製型ヘルペスペクターを用いたウイルス療法において、これまで行ってきた浸潤抑制蛋白を同時に発現させる方法を動物実験にて検証するとともにその安全性の確認を行い、さらにウイルスを投与後に腫瘍内で抗ウイルス免疫によって攻撃され不活化することを抑制することによって、抗腫瘍効果の増大を図る研究を行った。さらに、ウイルスの腫瘍特異性を高めるため、前立腺癌特異抗原PSA、悪性グリオーマ特異抗原としてMusashi-1に着目しそのプロモーター活性を解析した。(1)TIMP2発現HSVベクターを高濃度に濃縮し、生存解析上十分な治療効果を示す濃度にて、正常マウスに静脈内投与したのち、各臓器別にウイルスによる傷害が起こっていないかどうかを、組織および免疫化学的に解析したところ、明かな傷害は認められなかった。(2)患者血清により治療用ウイルスが不活化されるかどうかを解析したところ、抗HSV抗体を有する患者で有意に不活化され、その期間は殆ど24時間以内であった。(3)化学療法(CHOP)、(MCNU+VCN)中の患者血清では、抗ウイルス活性は有意に抑制されていた。(4)抗ウイルス免疫を抑制するため、シクロホスファミドをウイルスと同時に腹腔内投与したところ、ウイルスの不活化が有意に抑制され、動物実験で抗腫瘍効果の有意な増加を認めた。(5)以上よりウイルス療法を悪性腫瘍に対する化学療法と同調させることで、より高い治療効果が得られることが予想された。(6)PSAおよびMusashi-1プロモータ下流にLacZを挿入し、各種細胞株に遺伝子導入したところ、他の細胞株と比べてPSAでは前立腺癌、Musashi-1ではグリオーマで有意なプロモータ活性を示した。(7)このことは、腫瘍特異的プロモータによりウイルス複製を制御させることによって、より特異性の高い治療用ベクターが開発出来ることを示唆している。
教育臨床におけるミニチュアプレィルーム導入による実践研究

今年度は、これまで蓄積してきたミニチュアプレィルームの指導事例における臨床実践資料に関する分析を進め、2年間に渡る研究成果を報告書にまとめた。そこでは、この教育臨床実践を生態学的視野からアプローチしていくための理論的構築を図った上で、指導事例に関する分析、検討が深められている。その結果、以下のことが明らかにされた。(1)数年間に渡って指導を継続してきた事例における、縦断的指導資料を分析し、観察記録を作成した上で、ミニチュアプレィルームによる指導において示された発達ステージを描写した。この指導事例の場合、そこで展開される遊びのストーリーが深められながら、集団指導場面及び日常の学級活動場面との連環性が強まっていったことが明らかにされた。また、この指導事例においては第1回目指導から他者視点の取得を獲得していることを確認できる行動が示されていた。(2)ミニチュアプレィルームによる発達ステージと子どもの発達段階について検討するために、(1)の事例に加えて、さらに2つの指導事例を取り上げた。その結果、(1)の事例で認められた集団指導場面及び日常の学級活動場面との連環性が示されるようになる前段階として、これらの活動場面における要素がトピックス的に表われている事例と、ストーリーの深まりはないものの集団指導場面における活動内容が表出されている事例として、これらの2つの事例が考察され得ることを明らかにした。なお、標準化された他者視点の取得にかかわる検査結果との比較分析は今後の課題として残されている。(3)年度当初に、立案していた指導実践に関するフィードバック、意見交換は予備的に実施されている段階にとどまり、この点にかかわっての今後の課題か示されている。本研究は、対人関係行動に課題を抱える特殊学級に在籍する障害をもつ子どものコミュニケーション能力の育成を目的として研究者が開発したミニチュアプレィルームを用いた教育臨床実践をテーマとしたものである。ミニチュアプレィルームによる臨床実践は、後藤ら(1984)によって開発された集団指導法「行動空間療法」をミニチュアの世界に提示するものであり、個別指導形態を基本とした取組である。この指導によって、他者視点の取得や自己の行動のモニタリングを促すこと等が期待されている。なお、ミニチュアプィイルームの構築にあたっては、一部、ソシオメトリー及び箱庭療法の理論と技法を参考にしている。本年度は継続指導を実施してきている指導対象事例に関する分析、検討を進めた。その結果、指導回数の経過に伴って、ミニチュアプレィルーム場面と集団指導場面を関連づける行動が示され、さらには、日常の学級活動と関連づけた活動がミニチュアプレィルーム場面において展開されるようになったことが明らかにされた。なお、他の事例においては第1回目ミニチュアプレィルーム指導において集団指導場面が再現されている。また、指導初期の指導対象事例の集団指導場面における対人関係行動系とミニチュアプレィルーム場面における対人関係行動系には連関性があることが示されている。本事例の場合、ミニチュアプレィルームによる指導以前から、学級活動場面において他者視点の取得が認められる行動を表わしているが、初回のミニチュアプレィルーム指導場面において学級メンバーの顔写真の貼られた人形に対しても他者の視点にたった行動を示していることが確認されている。これらの研究結果は、ミニチュアプレィルームによる取組が指導対象左の日常の活動場面と連動させた観点からコミュニケーション能力の育成を図っていける指導の特性を保持していることを示していると考えられる。
分子システムを対象とした電子励起状態理論の開発と光合成系の電子メカニズムの解明

大規模な分子システムの電子励起状態を精度良く記述できる電子状態理論と、そのような電子状態を解析する理論を開発した。この理論開発により、光励起、吸光、蛍光、蛍光消光、イオン化、電荷分離、光ラジカル解離、励起状態プロトン移動といった、複雑で多様な電子励起状態における化学プロセスを、分子間相互作用や溶媒効果などを考慮した上で、理論的に精度良く記述できるようになった。この方法を、最先端の機能性色素に関する実験研究結果の解析や電子メカニズムの解明に用い、新しい光化学の構築や機能性色素の実用化に向けた研究を行った。また、より簡便な計算手法である密度汎関数法との比較検討を行い、その妥当性と限界を示した。1.大規模超分子のためのSAC-CI法の開発SAC-CI法は、クラスター展開に基づいた電子状態理論で、分子系の基底・励起状態等の多様な電子状態を統一的に記述でき、その特徴として、系の大きさに対する無矛盾性がある。これは、計算精度が系の大きさに依らず一定に保たれる事を保証し、分子集合体などを対象とする場合、本質的に重要である。こうした性質とは別に、SAC-CI計算を大規模な系に適用するため、本年度は、波動関数を記述する励起演算子の次元を減らすための摂動選択法に局在化軌道を合わせて用いる方法を開発した。この局在化軌道を用いた摂動選択によるSAC-CI法の計算効率、近似精度、大きさに対する無矛盾性に対する影響を多様な分子系(ポルフィリン等のヘテロ多環分子、核酸、アミノ酸、多環芳香族、有機金属、最大1億1000万次元の計算)を対象に検証した。局在化軌道と摂動選択の組み合わせで、大きさに対する無矛盾性を崩す事無く、計算コストを10分の1に減らすことに成功した。光合成系のクロロフィル多量体のような系の計算が、大きさに対する無矛盾性を保ったまま、現実的な計算コストで可能であることが実証的に示された。2.電子励起を解析する方法の開発電子励起は有軌道間の電子遷移で議論される事が多いが、実際には多数の軌道が関与し、また、私は、巨大系に局在化軌道を用いるため、軌道エネルギー描像が崩れてしまう。そこで、軌道によらずに電子励起を特徴づけるため、基底・励起状態間の差電子密度を用いた指標を開発し、特に電子移動励起の解析に適用した。この電子移動指標を用いると、電子移動の距離を半定量的に求めることができ、電子移動の位置に関する情報も併せ持つため、双極子モーメントよりもより詳細に電子励起を解析することができる。光合成系のような複雑なプロセスを議論できる新たな指標となることが期待できる。1.縮環イミダゾリウム色素の電荷移動型励起状態に対する溶媒環境の効果縮環π電子系イミダゾリウム化合物の分子構造や電子状態と蛍光スペクトル及びその溶媒依存性との関連を明らかにした。高配位ヘテロ元素を含むπ電子化合物は、π電子系の大きさ及びヘテロ元素の種類や配位数といった複数の調整可能なパラメータを含むため、光機能分子を柔軟に設計できる。一方で、こうした分子構造パラメータと光機能の相関は直感的には理解できず、高精度な量子化学計算が必要になる。縮環π電子系イミダゾリウム化合物の分子構造や電子状態と蛍光スペクトル及びその溶媒依存性との関連を、SAC-CI計算により明らかにした。アミノ置換イミダゾリウム色素では、芳香環がなす二面角が励起状態で基底状態よりもかなり大きくなることが分かり、ねじれ型分子構造により誘起される電荷移動の寄与が示唆される結果を得た。2.ヘテロ環状色素の電子移動と光化学クマリン系の色素と溶媒分子間の励起状態での電子移動およびプロトン移動反応のメカニズムをSAC-CI計算により明らかにした。励起状態での光誘起プロトン移動反応は、2重井戸型ポテンシャル面上の反応であり、励起状態の精緻なポテンシャル面の計算が要求される。また、電荷移動を伴うため溶媒効果が重要となる。典型的な例として、クマリン系誘導体とメチルイミダゾールの反応を取り上げ、前年度から開発している手法により量子化学計算を行った。結果として、トルエン中で反応障壁約2kcal/molの2重井戸型ポテンシャルを得た。励起状態でのプロトン・電子移動は光エネルギー変換において重要な過程であり、理論計算でその詳細な仕組みが予測できたことは、光合成系のメカニズムの理解や人工光合成系の設計に資する成果である。本年度は、光合成に関連したクルロフィル色素集合体における、励起状態での電子移動とエネルギー移動を研究対象とする計画であった。しかしながら、現状の進捗状況は、計画よりもやや小さな系であるクマリン-イミダゾールの系の計算にとどまっている。本年度の成果も、光合成の基礎的なメカニズムを明らかにするうえでの重要なステップであるが、実際のクルロフィルの計算には至らなかったため、進捗状況をやや遅れていると判断した。電子励起状態における光化学反応やエネルギー移動と光電子移動が競合する系において、それぞれの過程の進行を、簡便なモデルを用いたSAC-CI法による量子化学計算に基づいて予測する方法を提案した。具体例として、光化学的なヒドロキシラジカル前駆体として知られているN-hydroxypyridine-2(1H)-thione (N-HPT)において光化学的なOHラジカル解離反応と光イオン化反応が競合する事を、PCM SAC-CI法による量子化学計算で明らかにした。

光化学反応としては、最低エネルギーのπ*状態に励起された分子が、OH解離の反応座標に沿った、π*とσ*状態間での円錐交差を経て、解離型のポテンシャルエネルギー面に移行する。さらに基底状態との円錐交差を経て、ラジカル型の解離生成物へと反応が進行することを見出した。また、水溶液中での光イオン化の閾値が3.45 eVと見積もられた。この値は、π*励起エネルギー3.38 eVと非常に近接している。中性条件においては可視-近紫外光の照射により、光解離とイオン化反応が競合しうることが示された。この計算手法は、溶液中や凝集相における多くの光化学に応用可能である。また、励起状態のポテンシャルエネルギー面の計算結果を、様々な密度汎関数による時間依存密度汎関数法をSAC-CI法の比較により検証した。励起状態におけるプロトン移動反応(ESPT)をターゲットとした。時間依存密度汎関数法を用いた場合、ESPTのポテンシャルエネルギー面は汎関数依存性が非常に大きく、溶媒効果と電子状態両方の適切な記述が、実験結果を再現するためには重要であることが明らかとなった。本年度は、光合成に関連したクロロフィル色素集合体における、励起状態での電子移動とエネルギー移動を研究対象とする予定であった。しかしながら、現状の計算対象は、計画より小さな系にとどまっている。本年度は、研究代表者の勤務先が変わり、それに伴う、研究実施場所の変更や教育及びその他業務の増加があったため、研究計画の遂行に遅れが生じた。1.分子集合システムにおける電子励起状態を効率良く計算し、それを分子間相互作用や分子内の電子状態変化に分けて解析し、分子システムにおける電子過程と光化学を量子化学計算に基づいて解析・予測する方法を提案した。この方法でアミノ酸薄膜のクラスターモデルの真空紫外吸収と円二色性分光を解析し、光吸収に引き続く光化学反応について考察した。脂肪族アミノ酸には明確に発色団と呼べるものはカルボキシル基しか無く、真空紫外吸収は、基本的には分子間電荷移動励起に帰属される事を明らかにした。電荷移動型励起により、アニオンラジカルとカチオンラジカルが生じ、電荷再結合により基底状態へと失活する過程と、ラジカルからの化学反応経路が可能であることが分かった。カチオンラジカルらは脱炭酸反応が、アニオンラジカルからは、脱アミノ反応が優先し、アミノ酸の分解につながる事が分かった。2.ヒドロキシフェニルベンゾイミダゾール化合物の励起状態におけるプロトン移動反応のエネルギ論と、その置換基効果及び溶媒や分子結晶等の環境効果を、本課題で開発してきた分子システムにおける電子励起状態計算から明らかにした。プロトン移動反応の制御には、OHとNHの酸塩基性がカギとなる。電子励起状態における酸塩基性に影響する要因としての環境効果と置換基効果を考察し、実験結果を理論的に説明した。3.ハイブリダイゼーションに感度の高いオリゴヌクレオチド近赤外蛍光プローブ色素の発光特性メカニズムを、本課題で開発してきた量子化学計算法により解明した。このプローブはチアゾール色素二量体が適当なオリゴヌクレオチド鎖に結合しており、DNAやRNAの特定の配列を認識しハイブリダイゼーションする。すると、チアゾール色素二量体の会合状態が変化し、その結果、蛍光波長と蛍光強度が環境により劇的に変化し、多色蛍光プローブとして機能する事を理論計算から明らかにした。
ゲノム情報・遺伝子発現プロファイルと逆遺伝学を利用した葉緑体分裂制御機構の解明

シロイヌナズナの遺伝子発現プロファイルから葉緑体の分裂子であるARC3やFtsZと共発現している遺伝子群120個を選別し、それぞれの遺伝子破壊株をストックセンターより取り寄せた。それぞれのラインを自家受粉させて得られた種子から、PCRによってホモ変異体の選別を行なった。得られたホモ変異体の葉緑体の表現型(大きさ・細胞内の数)を葉組織の固定・単細胞化後光学顕微鏡下で観察する事により葉緑体の数・大きさが野生型と異なる変異体の同定を行なった。その結果、At1g56050、At1g26230の遺伝子破壊株において細胞内における葉緑体の数が減少しており、大きさが増加していた。これらはこの遺伝子が新規の葉緑体分裂因子である事を示唆していた。また、ARC3タンパク質との相互作用をYeast Two-hybrid systemを用いて解析を行なった。その結果At1g56050はARC3タンパク質と相互作用する事が示された。これらの事よりAt1g56050(GTP-binding protein)は新規葉緑体分裂因子である事が示唆された。葉緑体分裂因子ARC3の変異体であるシロイヌナズナarc3と野生型とを用いたDNA array解析から、変異体と野生型での遺伝子発現の違いはほとんどなく、唯一At5g42825が野生型では発現していないのに対し変異体では高発現していた。At5g42825は明確なコード領域がなくRNAiとして機能している事が考えられる。シロイヌナズナの遺伝子発現プロファイルから葉緑体の分裂因子であるARC3やFtsZと共発現している遺伝子群120個を選別し、それぞれの遺伝子破壊株をストックセンターより取り寄せた。その結果、Atlg56050(GTP-binding protein)、Atlg26230(Chaperonin)の遺伝子破壊株において細胞内における葉緑体の数が減少しており、大きさが増加していた。その結果Atlg56050(GTP-binding protein)はARC3タンパク質と相互作用する事が示された。これらの事よりAtlg56050は新規葉緑体分裂因子である事が示唆された。また、上記で取り寄せた遺伝子破壊株の中には、新規葉緑体分裂因子であるが一重変異体では葉緑体の表現型に変化が現れない事が考えられたので、既知の葉緑体分裂因子であるFtsZやARC3変異体との二重変異体の作成を掛け合せによって作成した。これらについては現在植物体を生育中である。葉緑体分裂因子ARC3の変異体であるシロイヌナズナarc3と野生型とを用いたDNAarray解析から、変異体と野生型での遺伝子発現の違いはほとんどなく、唯一At5g42825が野生型では発現していないのに対し変異体では高発現していた。At5g42825はsnRNAでありRNAiとして機能している事が考えられる。ARC3 Promoter-GUSコンストラクトを導入したシロイヌナズナの解析から、葉緑体分裂因子であるARC3は細胞分裂・発達のさかんな部位である子葉全体で高い発現が観察され、本葉においてはその発現が低い事が示された。また、葯における花粉と鞘における胚においても高い発現が観察された。暗所発現させた子葉においてARC3の発現は植物ホルモンであるサイトカイニンとオーキシンで誘導される事も示された。これらの事より、ARC3の発現には植物の部位

特異的な発現制御を受けており、その誘導にはサイトカイニンとオーキシンが関与していることが示唆された。また、ARC3タンパク質は葉緑体包膜構成成分のうちリン脂質であるフォスファチジルエタノールアミン(PE)に特異的に結合する事を示した。PEは原核・真核生物における細胞分裂時に重要な機能を持つ事が示されおり、PE特異的な抗体を用いた抗体組織染色解析から、葉緑体分裂時にPEはARC3タンパク質と同様なリング構造を分裂面に形成する事が示された。葉緑体の祖先と考えられているシアノバクテリアはPEを持たない事から、ARC3-PEコンプレックスによる葉緑体分裂機構は原始原核光合成細菌の原始真核生物への共生後に生じたと考えられる。
半導体ヘテロ接合界面形成の動的過程評価

III-V族化合物半導体の一つであるInSbの{111}A,B-(2×2)表面の原子配列としては、それぞれ、In-vacancy bucklingモデル((111)A面)および、Sb-trimerモデル((111)B面)が広く認められている。しかし、その表面垂直方向に関する原子座標は未だ確定されていない。そこで、本研究では、反射高速電子回折法(reflection high-energy electron diffraction;RHEED)を用い、その電子線入射方位を晶帯軸方向から数度ずらすことによって(この条件を一波条件という)、表面平行方向に関する動力学的回折効果を消し、両表面の垂直方向の原子座標に関する情報を得ることを狙った。その結果、(111)A表面では最表面のIn原子層が約0.8Å程度バルク側へ変位していることが、(111)B表面に対しては(i)Sb-trimerが(111)B基板から約2.6Åの高さに位置していること、(ii)Sb-trimerの直下の原子が表面垂直方向に大きく変位していること(約1.2Å)が明らかとなった.次に、原子配列の確定したInSb{111}A,B-(2×2)表面上でのα-Sn成長の動的過程をRHEED強度振動法を用いて評価した。InSb(111)A上では、Snは、基板のIn-vacancy buckling構造のIn-vacancyサイトに優先的に吸着した後、二原子層(BL)単位で層状に成長した。一方、InSb(111)B上でのSnは、Sn膜厚が6原子層以下のときには単原子層(ML)周期で、それ以上の膜厚ではBL周期で成長した。このSnのML周期の成長は、基板のInSb(111)BからSn成長最表面へ偏析したSbがサーファクタント(表面活性剤)として働き、Snの表面拡散を抑制したために起こったことが明らかとなった。
癌/精巣抗原を標的とした新しい癌早期診断システムの構築

癌/精巣抗原はあらゆる癌細胞に発現し、精巣・卵巣を除く正常組織では発現していない癌特異的タンパク質の総称である。報告者は癌/精巣抗原が早期癌診断システムの標的になるか否かを評価するため、発癌物質に暴露直後の癌/精巣抗原の発現の変化について検討した。本研究結果から、癌/精巣抗原は発癌物質に曝されただけでは発現せず、細胞が新たに悪性形質を獲得すると共に発現することがわかった。したがって、癌/精巣抗原は発癌物質によって悪性形質獲得直後に発現することから、早期癌診断システムの標的として適している。癌/精巣抗原は癌細胞および正常組織では生殖系組織に発現している抗原で、癌免疫療法の魅力的な標的分子として考えられている。我々は、癌/精巣抗原を標的とした新たな早期癌診断方法の確立を目指している。当該年度は、(1)癌/精巣抗原遺伝子の選抜および(2)発癌因子Helicobacter pylori (H.pylori)による初期感染状態(発癌初期状態を想定)の癌/精巣抗原遺伝子の発現量解析を行った。(1)3週齢のC57BL/6Nマウスの正常臓器組織におけるCAGE-1、OY-MS-4、SSXa1、SSXb1、SSXb2およびMAGE-A3の遺伝子発現量をリアルタイムPCR法にて測定した。CAGE-1およびOY-MS-4については、複数の臓器組織より発現が認められているため、癌診断の標的分子としてふさわしくないと考えられた。したがって、今後の発現解析に用いる抗原をSSXa1、SSXb1、SSXb2およびMAGE-A3とした。(2)H. pylori (NCTC11637;CagA産生株)を感染させた後、選抜した癌/精巣抗原遺伝子の発現量を測定した。細胞株MethAおよびC3H/10T1/2にH. pyloriをM.O.I.:10100および110で感染させた場合、MAGE-A3が発現した。なお、細胞株MCAおよびB16-F1でのMAGE-A3の発現上昇は認められず、H. pylori感染前にMAGE-A3を発現しているC3H/MCAでのMAGE-A3の発現変化は認められなかった。なお、いずれの細胞株においても、SSXa1、SSXb1およびSSXb2の遺伝子発現に変化は認められなかった。以上の結果は、細胞が発癌因子に感作された直後で癌/精巣抗原が発現したことを示している。よって、当該年度の研究からは、癌化初期細胞が癌/精巣抗原を発現する可能性について見いだすことができた。我々は、早期癌診断方法の確立を目指している。その診断方法に用いる標的分子として、癌/精巣抗原が最適だと考えている。我々は前年度までに発癌因子Helicobacter pylori (H.pylori)を腫瘍細胞Meth-Aに接種することで癌/精巣抗原の一つであるMAGE-A3の発現が上昇したことを報告した。しかしながら、H.pyloriの感染の程度(菌数および感染時間)によって一度検出されたMAGE-A3が消失するという現象が起きた。当該年度は以上の現象を解明するための実験を行った。また、正常細胞にH.pyloriを感染させた際のMAGE-A3の発現について解析した。(1)H.pylori感染によりMAGE-A3の発現が上昇したMeth-A細胞を限界希釈法にて単細胞化した。単細胞化した276のクローンのMAGE-A3の発現についてリアルタイムPCR法にて解析したところ、3クローンでMAGE-A3の発現が認められた。(2)H.pylori強感染によるMAGE-A3の発現の消失は、MAGE-A3陽性細胞の細胞死が原因と仮定し、フローサイトメーター解析でMAGE-A3が消失した時の生細胞の割合について検討したところ、MAGE-A3発現時の10%から0.1%に減少していた。(3)正常胃細胞および脾細胞に対してH.pyloriを感染させたところ、いずれにおいてもMAGE-A3の発現は検出できなかった。以上のことから、H.pyloriによって一度発現したMAGE-A3は永続的に発現すること、およびH.pylori感染を受けた非癌細胞では、MAGE-A3は発現しないことが示唆された。癌/精巣抗原が一発癌因子の刺激によって永続的に発現し、非癌細胞では発現しないことは、癌診断の標的分子として価値のある事象だと考えられる。

我々は前年度までに癌/精巣抗原MAGE-A3は、H.pylori感染によって発現が上昇するのではなく、H.pylori感染によって悪性形質獲得を伴った場合に発現が上昇することを報告した。この結果は発癌因子に感作された非癌細胞を偽陽性として判定することがないことを示している。なお、今後の検討項目として、発癌因子特異的な特定の癌/精巣抗原の誘導、および、MAGE-A3発現を誘導したH.pyloriの構成因子の同定が挙げられる。当該年度は、MAGE-A3の発現誘導に関与したH.pyloriの構成因子としてcagAに注目し、cagAによるMAGE-A3の発現変化について検討した。H.pylori NCTC11637株のcagA遺伝子を欠損したΔcagA株およびcagAを宿主細胞に移送する際に必須であるvirD4遺伝子を欠損したΔvirD4株をMeth-A細胞に接種した場合のMeth-A細胞中のMAGE-A3の発現についてリアルタイムPCR法にて検討した。ΔcagA株およびΔvirD4株いずれを接種したMeth-A細胞においてもM.O.I.100および30でMAGE-A3の発現が認められた。なお、ΔcagA株およびΔvirD4株を接種したMeth-A細胞の培養上清中から、cagA遺伝子およびvirD4遺伝子は検出されなかったため、各欠損株への標準株のコンタミネーションによるMAGE-A3の発現誘導ではないことがわかった。以上の結果から、MAGE-A3の発現誘導にはcagA非依存的経路が存在すると考えられた。我々は、癌/精巣抗原を標的とした早期癌診断方法の確立を目指しており、その必須条件となる早期癌および癌化直後の細胞での癌/精巣抗原の発現の可能性について言及してきた。我々は、癌化した細胞に限り、発癌因子によって癌/精巣抗原の発現誘導が起こることを前年度まで明らかにした。本研究では、マウスにおいて特定の発癌因子Helicobacter pylori(H. pylori)が特定の癌/精巣抗原Mage-A3を誘導することも明らかにした。以上のことから、ヒトの癌においてもH. pyloriによって誘導される癌/精巣抗原の存在を確認する必要がある。本邦における胃癌の8割はH. pylori感染によるものと報告されている。したがって当該年度は胃癌における癌/精巣抗原の発現とH. pylori感染との関連性について予備的検討を実施した。当病院の進行癌の胃癌患者より採血し、血清を回収した。同一患者の胃癌摘出後回収した胃より癌部位の1部を回収し、RNA抽出、cDNA合成を実施し、MAGE-A1、MAGE-A3およびNY-ESO-1についてはリアルタイムPCRにて、KK-LC-1については従来のRT-PCRにて癌/精巣抗原の発現解析を実施した。胃癌におけるKK-LC-1、MAGE-A1、MAGE-A3およびNY-ESO-1の発現頻度は79%、38%、48%および24%であった。また、胃癌患者血中H. pylori抗体価はKK-LC-1の発現が認められる症例で高値を示すことがわかった(p=0.0046)。なお、他の癌/精巣抗原の発現の有無とH.pylori抗体価との関連性については認められなかった。抗H.pylori IgGが高値である症例の胃癌では、KK-LC-1の発現が認められた。H. pyloriは胃癌を誘導すると共に、癌/精巣抗原KK-LC-1の発現も誘導する可能性が示唆された。本研究は、癌/精巣抗原が早期癌診断の標的として適しているかを検討するものである。
一酸化窒素還元酵素の活性中心構造と触媒反応機構の解明

Halomonas halodenitrificans(旧称Palacoccus halodenitrificans)由来の一酸化窒素還元酵素(NOR)の活性中心を含むNorBサブユニットをコードするnorB遺伝子をpTrc99Aベクターのtrcプロモーター制御下に連結した発現プラスミドを作製し、ヘム合成能が増強された大腸菌Escharichia coli JCB7120株をホストに用いてNorBサブユニットの異種発現を行った。嫌気培養によりNorBを発現させた菌体から超音波破砕と超遠心分離により膜画分を調整し、Nonyl-β-D-glucosideを用いて膜タンパク質を可溶化後、陰イオン交換クロマトグラフィーにより組換え型NorBを部分精製し、その分光学的性質を野生型NORと比較した。NorB部分精製標品の吸収スペクトルでは還元型で558,527,422nmにそれぞれα,β,γ吸収帯を示し、MCDスペクトルでは酸化体のソーレ領域(420nm)と還元型のQバンド領域(560nm)に低スピンヘム鉄の吸収と、還元型のソーレ領域(430nm)に高スピンヘム鉄に特徴的な吸収が観察された。これらの吸収は野生型NORの低スピンヘムbおよび高スピンヘムb_3の吸収とよく類似していた。従って大腸菌で異種発現した組換え型NorBは野生型NORと同様に2種のB型ヘムを含むことが明らかになった。また、組換え型NorBのESRスペクトルではg=3.14,2.27に低スピンヘム鉄(III)に特徴的な斜方対称のシグナルと、g=5.99に高スピンヘム鉄(III)のシグナルが確認できたが、非ヘム鉄の存在を示唆するg=4.26のシグナル強度が野生型NORの対応するシグナルより強く、ヘムb_3-非ヘム鉄からなる複核中心の酸素架橋構造に違いがあると考えられる。脱窒菌Palacoccus halodenitrificans由来の膜結合性マルチヘム型一酸化窒素還元酵素(NOR)は1分子のc型ヘムを含む低分子量のNorCサブユニットと、2分子のb型ヘムと非ヘム鉄を持つ高分子量のNorBサブユニットからなるマルチヘムタンパク質である。本研究では大腸菌JCB7120株をホストに用い、嫌気培養によりc型ヘムを含むNorCサブユニットの大腸菌内高発現系の構築を試みた。NorCのN末端膜アンカーヘリックスを削除し、脱窒菌A. xylosoxidansの低分子量ブルー銅タンパク質であるアズリンのペリプラズム移行シグナルを付加したNorC可溶性ドメイン(NorC^*)をペリプラズム画分に高発現させた。次にNorC^*をイオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて均一に精製し、その分光学的性質および電気化学的性質を検討した。精製NorC^*はN末端アミノ酸配列解析の結果、設計したN末端より9残基短くなっており、細胞膜透過時にプロセシングを受けていると考えられる。吸収スペクトルでは酸化型で524nmにβ吸収帯、411nmにγ(ソーレ)吸収帯が、還元型では551,522nmにα,β吸収帯、416nmにソーレ帯が観測され、これらはNORホロ酵素の低スピンヘムcの吸収帯とよく一致していた。また、MCDスペクトルでも野生型NORの低スピンヘムcの特徴をよく再現しており、さらに7KにおけるESRスペクトルではg=3.48にシグナルが現れ、野生型NORで帰属がわからなかった低スピンヘムcのシグナルの位置が明らかになった。NorC^*のC型ヘムの酸化還元電位はΔE_<1/2>=+191mVであり、NOR低スピンヘムcの+240mVと比較して49mV負側にシフトしていた。
細胞の過酸化障害とその防護

細胞の過酸化障害の発生機序を生化学的に解明する目的で、家兎あるいはラット心臓に低温で虚血、及び37°Cで再潅流処理を加え、心筋の節小胞体(SR)、筋細胞形質膜(SL)、及びミトコンドリア(MIT)の性質を調べた。更に虚血・再潅流後の心機能及び異所性心移植後の病理像を観察した。家兎心の虚血保存と再潅流処理は、Ca輸送酵素の解裂による量的変化の結果、保存時間に依存してCa輸送能とCa依存性ATPase(CaATPase)活性を低下させた。他方、SLのイオン輸送能は虚血再潅流処理により失活しなかった。再潅流処理はCaATPaseの分解のみならず、活性中心の化学修飾と推測される質的変性も引き起こした。この現象のモデルとして家兎骨格筋SRを活性酸素生成系と処理すると、SH基の酸化と平行したCaATPaseの失活、急速なCa輸送能の低下、緩徐なCaATPaseの分解、より緩徐な過酸化脂質の生成が処理時間依存的に発生した。以上の事実は、SRの活性酸素による障害はリン脂質膜より酵素蛋白質により顕著に発生することを示唆したが、CaATPaseの分解様式は、虚血・再潅流障害過程の心筋のそれと必ずしも一致しなかった。長時間低温虚血保存したラット心の再潅流時の機能を調べた結果、酸素消費から収縮の総仕事へのエネルギ-変換効率は、8時間保存を境に低下し、この低下はMITの酸化的リン酸化能の低下と対応した。長期低温保存心の移植後病理像とMIT機能の変化を調べた結果、再潅流障害は血液潅流開始後短期に発生すること、障害の程度は保存条件、特に臓器浮腫の抑制により低下すること、Wisconsin大学保存液がこの観点から有効であることが示された。虚血再潅流肝ではビタミンEの前投与によってMIT機能障害が軽減した。以上の事実から、再潅流障害は潅流開始後短期に発生し、ラジカル捕捉剤で抑制され、障害部位は形質膜ではなくMIT及び小胞体に大で、障害の機序は脂質過酸化よりも酵素蛋白質の修飾が主であることが示唆された。ウサギ骨格筋小胞体からショ糖濃度勾配遠心分離により、軽い分画を調整し、そのCa^<2+>能動輸送、Ca^<2+>依存性ATPase活性(Ca-ATPase)、遊離チオ-ル基の数、および過酸化脂質量に及ぼす酸素ラジカルの影響を調べた。酸素ラジカルは、塩化第二鉄(0.1mM)およびADP(1mM)の存在下で、ジヒドロキシフマル酸(3.3mM)の自動酸化により生成させた。過酸化反応開始後、およそ10%の遊離チオ-ル基が急速に減少し、緩徐な減少がそれに続いた。チオ-ル基の二相性の減少と一致して、Ca-ATPase活性Ca^<2+>カルシウム輸送活性ともに初期におよそ50%の減少を示し、いずれについても緩徐な減少がそれに続いた。変性剤存在下での電気泳動により分析した結果、Ca-ATPaseに対応するおよそ100キロダルトンのポリペプチドが過酸化反応の進展にともなって減少し、およそ68キロダルトンのポリペプチドが見かけ上増加した。この分解は自然対数的であり、前述した3つの性質にみられたような二相性はみられなかった。一方、マロンジアルデヒドの生成量から見積った脂質の過酸化は緩やかで、しかも時間と共に直線的に増大した。以上の結果から、筋小胞体を酸素ラジカルで処理すると、システイン残基のチオ-ル基が酸化され、その結果Ca^<2+>の能動輸送が阻害され、さらに酵素分子自身が分解されることが明かとなった。また、酵素活性の消失に脂質の過酸化が大きく影響していないことが示唆された。心臓の虚血・再灌流処理においても、これと同様の反応が進行することを予想させた。なお、ス-パ-オキシドジスムタ-ゼやカタラ-ゼは有効なラジカル消去剤として機能しなかったが、鉄イオンの強力なキレ-タ-であるデフェロキサミンやニトリロ三酢酸は過酸化反応を完全に阻害した。種々のラジカル消去剤の使用とあわせて血液中の過剰鉄イオンを除去することは、心臓の虚血・再灌流障害を抑制するために有効な手段であることが示唆された。