hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生合成マシナリー構築に向けたロドコッカス属細菌の宿主最適化と遺伝子ツールの拡充

ロドコッカス属細菌の最適化宿主株の構築のため、前年度までに取得した外来遺伝子を安定的に保持できる候補株について、それ以外の株と共にゲノム比較を行った。各株共通して保持しているものをロドコッカスの基本構成遺伝子構造とし、それ以外の部分は株に個性を与える要因となる遺伝子であると考えられる。しかし最適化宿主の候補株が、ある遺伝子を有していることが有利なのか、あるいは有していないことが有利であるかについては各遺伝子の詳細を調べる必要がある。このため、ロドコッカスの基本構造のみに単純化した(大規模にDNA領域を削除した)ゲノムの宿主株を作製、また個別の特に興味深い遺伝子については遺伝子破壊株、遺伝子導入株の作製を進めた。ゲノムの大規模領域削除株についてはcre/loxPのシステムをロドコッカスで初めて実行し、2つのプラスミドにloxLE配列とカウンターセレクション遺伝子、またはloxRE配列とcrerecombinase遺伝子を分けて搭載し、それぞれのプラスミドには更に削除する領域の末端と相同な配列を片方ずつ導入した。この2つのプラスミドの二重シングルクロスオーバー変異株を作製し、その後にcre recombinaseを発現することで、2ステップの非常に簡便な方法によるゲノム削除の手法を開発することに成功した。またロドコッカスには多数の線状、環状プラスミドが存在するが、これらも不必要なものであるため、脱落手法についてsacB遺伝子を用いた新たな手法を構築した。プラスミドを3種保持する株については3回脱落の作業が必要となるが、こちらも高効率で達成する手法を開発する事に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.宿主の選択と育種これまでに遺伝子(プラスミド)保持安定性の高いD32株を選抜した。しかし本株は他の宿主候補であったR09株と比較し、培養時に細胞凝集性が高く、生育速度がやや遅いと言う欠点もあった。この性質が改善された変異株を得るため、プロトプラストリジェネレーションを繰り返し、コロニーがスムース型に変異したクローンの取得に成功した。本変異株は液体培養時に細胞凝集性が無く、生育速度も親株と比較し非常に高くなっていた事から、D32Aと命名し新たな宿主としてさらなる改変へ用いる事とした。2.発現ベクターの開発ロドコッカス用の発現ベクターはこれまでに2種のレプリコン、2種の選択薬剤と耐性遺伝子、4種の発現プロモーターの組み合わせによる各バリエーションを開発していた。これらに加え、新規のプロモーターとして2種の構成的発現プロモーターとベンゾエート誘導型プロモーターを開発した。構成型プロモーターは既存の強い発現強度の物と比較し、約1/2、1/4と弱めた物を準備した。ベンゾエート誘導型は既存のチオストレプトン誘導型とは異なり、誘導剤が細胞に与える負担が低く、耐性遺伝子を持たせる必要が無い利点がある。また誘導剤にかかるコストも数十分の1に抑える事が出来る。3.生合成遺伝子クラスターの発現aurachin REはR. erythropolis JCM 6824が生産するキノロン環抗生物質で、その生合成遺伝子・経路について我々のグループで解析を進めている。本テーマではこのaurachin REの生合成遺伝子をモデルとし、ロドコッカス属による抗生物質の異宿主生産を試みた。いくつかのロドコッカス宿主に導入し、aurachin REの生合成を試みたところ、上述のD32で最も良い生産性を得る事が出来た。本研究はロドコッカス属細菌を宿主とし、生合成マシナリーの新しいシステムの開発を行うことを目的としている。これまでに遺伝子の安定性の高い宿主の選抜に成功し、このドラフトゲノム解析も行っている。

ロドコッカス属のゲノムサイズは10M程度とバクテリアとしてはかなり大きい方であり、また大規模な繰り返し領域(領域長、およびコピー数の多さ)の問題、さらに巨大線状plasmidを保有することからも、完全ゲノム情報を構築する事はかなり大変な作業である。しかし生合成マシナリーの宿主として用いるには不可欠であることから、複数種の次世代シーケンサーを用いた配列解析も着手した。また発現ベクターとしては多数のレプリコン、多数の誘導型、構成型プロモーター、多数の選択薬剤マーカー遺伝子などの組み合わせにより多彩な選択肢を供給できる状態に出来ている。また上記宿主・ベクター系を用い、ロドコッカスでは初の組換え体による抗生物質生産に成功している。これらのことから本研究は概ね順調に推移していると考えている。遺伝子の追加と削除:外来遺伝子の安定化に寄与するとして選定された遺伝子のうち削除する対象については、相同組換えを利用したマーカーレス遺伝子破壊法を用いる。本手法を繰り返すことで1つの株に多数の変異を痕跡無しに累積させる事が可能である。また大きな領域をまとめて削除する場合は、ロドコッカスではまだ実績がないが、ストレプトマイセスで成功しているCre/loxPの手法を応用出来ると考えている(Streptomyces avermitilis SUKAシリーズ、北里大学)。また追加する対象についてはプラスミドに組み込む、あるいはゲノムに挿入する、のどちらかで実行する。またこのようにして改変、構築した宿主の形質を慎重に評価する。プラスミドの安定性の試験は24年度までに簡易な方法を考案しているが、試験の性格上時間がかかるものであるので、改変候補が得られ次第順次進める。またベクター開発についても引き続き多様性を増やし、新規のプロモーターについてはその発現の強度や誘導のパターン、最適な誘導時間等を測定する。また本研究で得られた新規宿主、発現ベクターを用いて抗生物質等の物質生産を試み、生合成マシナリー宿主としての性能を元株と比較しながら検証する。
近世の文芸作品に見られるオノマトペー浄瑠璃・歌舞伎脚本を対象にー

近世の浄瑠璃・歌舞伎脚本に見られるオノマトペの使用状況と特徴を研究するため、今年度は、近世前期の近松門左衛門の手による浄瑠璃作品を対象として研究を行った。日本古典文学全集『近松門左衛門集』13に収載されている30作品(世話物24編、時代物6編)すべてからオノマトペを抽出し、地の文と会話文に分類し、作品ごとに一覧表を作成した。さらに、世話物と時代物に見られる特徴を考察した。近松門左衛門浄瑠璃の世話物の特徴については「近松門左衛門の世話浄瑠璃に見られるオノマトペの特徴」『佐賀大学教育学部研究論文集』第3集第1号(pp.81-94)にまとめた。ここでは、世話物12編(『近松門左衛門集』2に収載された作品)を対象に、地の文、会話文それぞれに見られる特徴と共通した特徴、中世軍記物語のオノマトペとの関連、和語と漢語のオノマトペの関連などについて考察した。論文発表後には、世話物の残りの12編(『近松門左衛門集』1に収録された作品)、時代物6編(『近松門左衛門集』3に収録された作品)から全てのオノマトペを抽出し、地の文と会話文のそれぞれの特徴をまとめている。今年度の研究の成果は、近世前期に見られるオノマトペの様相が具体的に明らかになったことである。従来、時代ごとのオノマトペの様相が詳細に研究されてはいなかったが、今回の研究で、近世前期の近松作品において、地の文に中世軍記物語のオノマトペの影響が色濃く残っていること、そこに近世独特のオノマトペが加わっていること、会話文には近世の新しい口語的なオノマトペが多用されていることが具体的に明らかになった。今後は、今年度明らかになった近松作品の特徴をもとに、近松門左衛門以外の作者の作品を対象に調査し、近松作品に見られた特徴が近松独自のものか近世前期全般に共通するものなのかを考えていく。初年度の研究成果は、2年度以降の研究の基盤となるものである。近松門左衛門の代表的な浄瑠璃作品(世話物24編、時代物6編、小学館日本古典文学全集『近松門左衛門集』13)を対象にオノマトペを抽出し、地の文と会話文とに分類し、使用状況を一覧表にまとめた。全30作品からオノマトペを抽出して整理する作業にはかなりの労力と時間がかかった。一覧表を作成したうえで。近松作品のオノマトペの特徴について、分析・考察した。世話浄瑠璃については、地の文と会話文に見られるオノマトペの特徴、中世軍記物語との関連、近松作品に多用されたオノマトペの表現、中世には見られなかった近世のオノマトペの表現と特徴、和語と漢語のオノマトペの関連などの視点からまとめ、「近松門左衛門の世話浄瑠璃に見られるオノマトペの特徴」(『佐賀大学教育学部研究論文集』第3集第1号)に発表した。時代浄瑠璃については、オノマトペの整理を終えて一覧表を作成し、現在、特徴を分析し、まとめている最中である。世話浄瑠璃との比較を交え、時代物独自の特徴とともに、世話物と時代物に共通した特徴についてまとめている。初年度に近松門左衛門の浄瑠璃作品のオノマトペの分析を終えたので、この分析をもとに、2年度は江戸時代中期の浄瑠璃・歌舞伎脚本を対象にオノマトペを抽出して整理し、特徴を分析する。新日本古典文学大系『竹田出雲・並木宗輔浄瑠璃集』『近松半二江戸作者浄瑠璃集』『上方歌舞伎集』に収載されている作品を対象に研究を行う予定である。今年度と同様に、地の文(ト書き)と会話文に分けて整理して一覧表にまとめ、その表をもとに、地の文と会話文に見られる特徴をまとめる。中世の影響や近世の新しいオノマトペの様相、和語と漢語の関連等の視点から分析する。研究の成果は論文にまとめて発表する予定である。当初の計画通り、3年度は江戸中期・後期の歌舞伎脚本(『東海道四谷怪談』など鶴屋南北を中心に)、最終年度は江戸末期の河竹黙阿弥の歌舞伎脚本を対象にオノマトペを整理して分析し、近世を通して浄瑠璃・歌舞伎脚本に見られるオノマトペの使用状況と近世のオノマトペの特徴をまとめる予定である。

論文発表後には、世話物の残りの12編(『近松門左衛門集』1に収録された作品)、時代物6編(『近松門左衛門集』3に収録された作品)から全てのオノマトペを抽出し、地の文と会話文のそれぞれの特徴をまとめている。今年度の研究の成果は、近世前期に見られるオノマトペの様相が具体的に明らかになったことである。従来、時代ごとのオノマトペの様相が詳細に研究されてはいなかったが、今回の研究で、近世前期の近松作品において、地の文に中世軍記物語のオノマトペの影響が色濃く残っていること、そこに近世独特のオノマトペが加わっていること、会話文には近世の新しい口語的なオノマトペが多用されていることが具体的に明らかになった。今後は、今年度明らかになった近松作品の特徴をもとに、近松門左衛門以外の作者の作品を対象に調査し、近松作品に見られた特徴が近松独自のものか近世前期全般に共通するものなのかを考えていく。初年度の研究成果は、2年度以降の研究の基盤となるものである。近松門左衛門の代表的な浄瑠璃作品(世話物24編、時代物6編、小学館日本古典文学全集『近松門左衛門集』13)を対象にオノマトペを抽出し、地の文と会話文とに分類し、使用状況を一覧表にまとめた。全30作品からオノマトペを抽出して整理する作業にはかなりの労力と時間がかかった。一覧表を作成したうえで。近松作品のオノマトペの特徴について、分析・考察した。世話浄瑠璃については、地の文と会話文に見られるオノマトペの特徴、中世軍記物語との関連、近松作品に多用されたオノマトペの表現、中世には見られなかった近世のオノマトペの表現と特徴、和語と漢語のオノマトペの関連などの視点からまとめ、「近松門左衛門の世話浄瑠璃に見られるオノマトペの特徴」(『佐賀大学教育学部研究論文集』第3集第1号)に発表した。時代浄瑠璃については、オノマトペの整理を終えて一覧表を作成し、現在、特徴を分析し、まとめている最中である。世話浄瑠璃との比較を交え、時代物独自の特徴とともに、世話物と時代物に共通した特徴についてまとめている。初年度に近松門左衛門の浄瑠璃作品のオノマトペの分析を終えたので、この分析をもとに、2年度は江戸時代中期の浄瑠璃・歌舞伎脚本を対象にオノマトペを抽出して整理し、特徴を分析する。新日本古典文学大系『竹田出雲・並木宗輔浄瑠璃集』『近松半二江戸作者浄瑠璃集』『上方歌舞伎集』に収載されている作品を対象に研究を行う予定である。今年度と同様に、地の文(ト書き)と会話文に分けて整理して一覧表にまとめ、その表をもとに、地の文と会話文に見られる特徴をまとめる。中世の影響や近世の新しいオノマトペの様相、和語と漢語の関連等の視点から分析する。研究の成果は論文にまとめて発表する予定である。当初の計画通り、3年度は江戸中期・後期の歌舞伎脚本(『東海道四谷怪談』など鶴屋南北を中心に)、最終年度は江戸末期の河竹黙阿弥の歌舞伎脚本を対象にオノマトペを整理して分析し、近世を通して浄瑠璃・歌舞伎脚本に見られるオノマトペの使用状況と近世のオノマトペの特徴をまとめる予定である。今年度、大学より「若手・女性研究者支援費」10万円が支給されたため、科研費から使用する予定の物品費をそちらからまかなうこととなった。書籍に関しては、購入予定の書籍が手に入らないなどの事情により、使用金額が少なくなった。また、1年に3回の出張を予定していたが、勤務校の仕事の関係で出張が2回になってしまい、予定していた旅費の使用額が少なくなった。来年は、今年度出張できなかった分も含めて4回の出張を予定している。また、今年度大学から支給された研究支援経費がなくなるため、物品費が必要となるが、購入を予定している書籍が当初の計画よりも多くなったため、今年度の予算を次年度に回してまかないたい。
治療的コミュニケーション技術を教育するための「客観的感情表示システム」の作成

平成15年度には,音声に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた実験を行った.同年11月に「15年度科学研究費補助金交付決定」が通知されたため,通知を受けて即座に,「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」作成するための実験装置を作成する準備を行った.具体的には,(1)本研究を行う上で,脳波データから人間の基本的な感情要素(喜怒哀楽など)の時間変化を解析することが重要であるため,株式会社エヌエフ回路設計ブロック製「感性スペクトル解析装置ESA-16」を購入した.次に,(2)言語および音声から得られるデータ解析を行うためのマイク装置一式を購入し,前述した(1)と(2)を同期させたデータを収集するための実験環境の整備を行った.平成16年度には,平成15年度に作成した実験装置群を基にして,「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」を検討し,作成した感情推定モデルを検討するための予備実験を行った.具体的には,脳波と言語・音声・表情情報を融合した,データ収集方法を実験により確認した.感情データ特性の解析手法が未だ構築されていないため,感性の中でも感動時における脳波活動からその特性波形を抽出する実験プロトコルと解析手法の概念枠組みを同定し,それを実証するための実験を重ねた.平成17年度は,治療的コミュニケーション技術の中でも特に重要な「ケアリング」の特性を実験プロトコルに組み込み実験を行った.その成果は,9月にスペインのBenidormで行われたThe 9th IASTED International Conference on ARTIFICIAL INTELLIGENCE & SOFT COMPUTING 2005,また10月に中国の武漢で行われたIEEE International Conference on Natural Language Processing and Knowledge Engineeringで発表した.平成18年度は,感情推定モデルを用いて「客観的感情表示システム」のシステム化のフローを作成し,その方向性を示した.さらに脳波を用いた感情分析とケアリングとの関係などについて,オーストラリアで行われたInternational Association for Human Caring Conference,またフィリピンで行われたThe 10th East Asian Forum on Nursing Science Conferenceなどで発表した.平成15年度には,音声に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた実験を行った.同年11月に「15年度科学研究費補助金交付決定」が通知されたため,通知を受けて即座に,「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」作成するための実験装置を作成する準備を行った.具体的には,(1)本研究を行う上で,脳波データから人間の基本的な感情要素(喜怒哀楽など)の時間変化を解析することが重要であるため,株式会社エヌエフ回路設計ブロック製「感性スペクトル解析装置ESA-16」を購入した.次に,(2)言語および音声から得られるデータ解析を行うためのマイク装置一式を購入し,前述した(1)と(2)を同期させたデータを収集するための実験環境の整備を行った.平成16年度には,平成15年度に作成した実験装置群を基にして,「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」を検討し,作成した感情推定モデルを検討するための予備実験を行った.具体的には,脳波と言語・音声・表情情報を融合した,データ収集方法を実験により確認した.感情データ特性の解析手法が未だ構築されていないため,感性の中でも感動時における脳波活動からその特性波形を抽出する実験プロトコルと解析手法の概念枠組みを同定し,それを実証するための実験を重ねた.平成17年度は,治療的コミュニケーション技術の中でも特に重要な「ケアリング」の特性を実験プロトコルに組み込み実験を行った.その成果は,9月にスペインのBenidormで行われたThe 9th IASTED International Conference on ARTIFICIAL INTELLIGENCE & SOFT COMPUTING 2005,また10月に中国の武漢で行われたIEEE International Conference on Natural Language Processing and Knowledge Engineeringで発表した.平成18年度は,感情推定モデルを用いて「客観的感情表示システム」のシステム化のフローを作成し,その方向性を示した.さらに脳波を用いた感情分析とケアリングとの関係などについて,オーストラリアで行われたInternational Association for Human Caring Conference,またフィリピンで行われたThe 10th East Asian Forum on Nursing Science Conferenceなどで発表した.平成15年度には、音声に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた実験を行った。また、平成15年11月に「15年度科学研究費補助金交付決定」が通知されたため、通知を受けて即座に、「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」作成するための実験装置を作成する準備を行った。具体的には、(1)本研究を行う上で、脳波データから人間の基本的な感情要素(喜怒哀楽など)の時間変化を解析することが重要であるため、株式会社エヌエフ回路設計ブロック製「感性スペクトル解析装置ESA-16」を購入した。次に、(2)言語および音声から得られるデータ解析を行うためのマイク装置一式を購入し、前述した(1)と(2)を同期させたデータを収集するための実験環境の整備を行った。脳波・言語・音声情報を融合した感情データ特性の解析手法は未だ構築されていないため、今年度は音声自身に含まれる感情に起因する成分、言語表現に潜在的に包含されている感性データ特性についての、実験プロトコルと解析手法の概念枠組みを共同研究者で構築した。

平成16年度には、平成15年度に作成した解析手法の概念枠組みと実験装置を基にして、1)音声自身に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」を作成する、2)作成したモデルの検証実験を行う予定である。平成15年度前半には、音声に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた実験を行った。平成15年後半は、11月に「15年度科学研究費補助金交付決定」が通知されたため、通知を受けて即座に、「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」作成するための実験装置を作成する準備を行った。具体的には、(1)本研究を行う上で、脳波データから人間の基本的な感情要素(喜怒哀楽など)の時間変化を解析することが重要であるため、株式会社エヌエフ回路設計ブロック製「感性スペクトル解析装置ESA-16」を購入した。次に、(2)言語および音声から得られるデータ解析を行うためのマイク装置一式を購入し、前述した(1)と(2)を同期させたデータを収集するための実験環境の整備を行った。平成16年度前半には、平成15年度に作成した実験装置群を基にして、「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」を検討し、作成した感情推定モデルを検討するための予備実験を行った。具体的には、脳波と言語・音声情報を融合した、データ収集方法を実験により確認した。平成16年度後半は、感情データ特性の解析手法が未だ構築されていないため、感性の中でも感動時における脳波活動からその特性波形を抽出する実験プロトコルと解析手法の概念枠組みを同定し、それを実証するための実験を重ねた。また、治療的コミュニケーション技術におけるケアリングの特性についても、『Nursing As Caring : A model for Transforming Practice』という本の翻訳権を取得し、日本語版として『ケアリングとしての看護』として翻訳出版した。その特性についても、17年度の実験プロトコルに反映させる予定である。さらに、16年度の実験結果については、平成17年9月にスペインで行われるThe 9th IASTED International Conference on ARTIFICIAL INTELLIGENCE & SOFT COMPUTINGASC 2005で発表する予定である。平成15年度には、音声に含まれる感情に起因する成分と音声認識により得られた言語情報を用いた実験を行った。同年11月に「15年度科学研究費補助金交付決定」が通知されたため、通知を受けて即座に、「脳波・言語・音声情報を融合した感情推定モデル」作成するための実験装置を作成する準備を行った。
甲状腺ホルモン作用における選択的作用発現調節機構に関する研究

甲状腺ホルモンはその受容体を介し,NADPH-依存性甲状腺ホルモン結合蛋白を誘導する。この誘導はVitamin Dによっても観察される。すなわちnuclear receptor familyの中で,non-specificな遺伝子発現調節を示す。しかし,この蛋白は,細胞増殖能の著しい,ある種の癌細胞で著明に高く,悪性腫瘍細胞での分化能力,すなわち,脱癌化作用を有する機能蛋白と考えられた。以上の事実は,正常細胞での分化維持と同時に癌細胞など幼若細胞の機能分化に,甲状腺ホルモン受容体などnuclear receptor famailyが,多彩で,かつ,選択的機能を有することを示していると考えられた。1.細胞質NADPH依存性甲状腺ホルモン結合蛋白(CTBP)による甲状腺ホルモン応答性機能蛋白合成の抑制CTBPは甲状腺ホルモンで誘導される。しかもこの誘導は甲状腺ホルモンによるCTBPの転写促進として実験的に証明された。そのためこのCTBP遺伝子には甲状腺ホルモン応答部位(TRE)が存在する可能性がある。本研究ではCTBP蛋白よりアミノ酸配列、およびこれに基づくヌクレオチド配列解明を行った。しかし、一部の構造解明はできたもののFull lengthの構造解析は不可能であった。そのため既知のTREによってこのヌクレオチドを探索したが、これでもCTBP遺伝子の構造解析に結び付くような良い結果は得られなかった。現在、ラット成長ホルモン、およびミオシン重鎖の存在するTREを用いて、再びCTBPに存在すると考えられるTREの性状を分析し、これの結果を踏まえてCTBPの遺伝子構造解明を試みている。2.CTBP蛋白による細胞増殖刺激一方、CTBP蛋白による細胞増殖刺激に関する研究は飛躍的に進んだ。CTBP蛋白の誘導は甲状腺ホルモンのみならず、c-erb Aを受容体とするホルモン、たとえばビタミンD3、レチノイン酸、エストロゲン、などでも生じることが明かとなった。これらによる誘導は明らかに細胞増殖を刺激する情報を核内に伝達する。しかし、興味あることは、これらの刺激により細胞機能分化が平行して生じていることである。これらの結果は細胞増殖と機能分化が同時に進行するような調節器能をCTBPが有していることを示すものである。甲状腺ホルモン受容体は核受容体群の一つとして知られ,標的組織の増殖,分化を調節する重要な働きを持っている。先に研究者らは細胞内ホルモン輸送蛋白としてのNADPH-依存性甲状腺ホルモン結合蛋白を単離した。この蛋白が単に細胞内ホルモン貯溜機能を有するのではなく,細胞分化にも深くかかわっていることを証明した。更にこの蛋白はこれら核受容体ファミリーのいずれによっても誘導される。特に甲状腺ホルモン受容体とVitamin D_3受容体による誘導は正常細胞よりもむしろ悪性細胞で顕著であった。この作用はこれらのホルモン受容体が悪性細胞における分化機能の抑制を解除することを意味し,悪性疾患の治療という意味では極めて重要である。以上,甲状腺ホルモンがその受容体を介して分化と増殖の選択的作用を示すことを正常細胞と悪性細胞で比較することにより証明した。
本研究では、第一に、膜蛋白質結晶中の脂質二重膜を可視化する技術を確立し、燐脂質と膜蛋白質との相互作用の詳細を明らかにすることを目指している。具体的には、脂質二重膜からの寄与が大きい分解能10 Åよりも低角の反射点の位相を決定する技術を確立することである。第二に、これまでに開発してきた溶媒コントラスト変調法を発展させることを目指し、前提となる膜蛋白質結晶の大型化技術の開発を目指している。低角反射点の位相決定に関しては、重原子同型置換法の適用を目指し、実験手法の改善を図った。前提となるのは、結晶中での蛋白質の配置を変えることなく回折強度を十分変化させる重原子試薬である。その同定のために多数の重原子化合物とクラスターを実際の結晶に添加し、SPring-8で回折強度データを収集した。その結果、有望なものが複数同定された。そこで、位相付けを可能にする精度があるかを反射点ごとに検討するためのソフトウェアを開発し、まずは位相が0°か180°に限定される反射点を用いて予備的検討を行なった。結晶の大型化に関しては、これまでに多くの経験を積んだカルシウムポンプ蛋白質を用い、基礎となる相図作製のための結晶化実験を行なった。種結晶を使う方法や、結晶中に組み込まれることによって減少する蛋白質を補填することなど種々の方法を試した。ある程度大きくできるものの、その効果は限定的であり、生理的状態によっては沈殿剤が無くても結晶化が起こる、微結晶の発生を抑えられないなどの問題点も明らかになった。適当な重原子クラスターが見つかるかが最初の関門であったが、複数の有用な化合物を見出すことができた。また、測定精度や位相の決まり具合をグラフィカルに検討できるソフトウェアも初期的なものの作製には成功し、期待を持てる結果が得られている。結晶の大型化に関して基礎となる相図の作成も遂行することができ、初年度としてはまずまずの結果と考える。これまでに開発してきた溶媒コントラスト法を適用できる新たな結晶が得られたが、これまでに対処していなかった結晶系に属するためソフトウェアを拡充する必要があることが判明した。結晶の大型化のためのアイデアは色々あるが、開発した技術は、脂質二重膜の可視化のためのみならず、通常の膜蛋白質構造決定のためにも極めて有用であった。そのために、本来の目標とはやや異なるが、微小結晶への適用も追及したい。
制がん剤耐性機構とその克服

本年度の研究計画に対応し以下の実績を得た.1.耐性癌に対するモノクローナル抗体MRKー16, 17, 18, 20の抗原の同定と精製. MRKー16, 17の認識する抗原はPーglycoproteinである.Pーglycoproteinは抗体を用いたimmunoaffinity chromatographyで精製に成功した.その結果, PーglycoproteinはATPase活性をもつことが明らかとなった.抗癌剤膜輸送にATPの関与が考えられ興味深い. MRKー18, 20の認識する抗原はそれぞれ分子量8.5万, 30万の膜タンパク質である.そのいずれの機能も現在不明である.2.Pーglycoproteinのリン酸化反応. Pーglycoproteinはbasalにもリン酸化された膜タンパクである.そのリン酸化はカルシウム拮抗薬,カルモジュリン阻害剤によって亢進する.またホルボルエステルであるPMAによって特に顕著にリン酸化が亢進した.ペプタイドを分析すると,前二者によるリン酸化部位と, PMAによるリン酸化の部位は異る. PMAによるリン酸化にはCーkinaseが関与することが考えられる. Cーkinaseによるリン酸化はPーglycoproteinの機能,例えば抗癌剤の膜輸送や耐性細胞の増殖,に関与する可能性が考えられ,現在解析中である.3.耐性遺伝子のクローニング.アドリアマイシン耐性のK562細胞のDNAをマウスLー細胞にトランスフェクトし,トランスフェクタントよりMDAを分離,制限酵素で切断後,ヒト特異的配列Aluでひろいあげることで,耐性遺伝子断片λKa2.6のクローニングに成功した. λKa2.6は各種ヒト耐性細胞に増幅して存在する.またその認識するmRNAは4.5kbであり,そのcDNAの塩基配列からPーglycoproteinの遺伝子であることが明らかとなった.本年度の研究計画に対応し以下の実績を得た.1.耐性癌に対するモノクローナル抗体MRKー16, 17, 18, 20の抗原の同定と精製. MRKー16, 17の認識する抗原はPーglycoproteinである.Pーglycoproteinは抗体を用いたimmunoaffinity chromatographyで精製に成功した.その結果, PーglycoproteinはATPase活性をもつことが明らかとなった.抗癌剤膜輸送にATPの関与が考えられ興味深い. MRKー18, 20の認識する抗原はそれぞれ分子量8.5万, 30万の膜タンパク質である.そのいずれの機能も現在不明である.2.Pーglycoproteinのリン酸化反応. Pーglycoproteinはbasalにもリン酸化された膜タンパクである.そのリン酸化はカルシウム拮抗薬,カルモジュリン阻害剤によって亢進する.またホルボルエステルであるPMAによって特に顕著にリン酸化が亢進した.ペプタイドを分析すると,前二者によるリン酸化部位と, PMAによるリン酸化の部位は異る. PMAによるリン酸化にはCーkinaseが関与することが考えられる. Cーkinaseによるリン酸化はPーglycoproteinの機能,例えば抗癌剤の膜輸送や耐性細胞の増殖,に関与する可能性が考えられ,現在解析中である.3.耐性遺伝子のクローニング.アドリアマイシン耐性のK562細胞のDNAをマウスLー細胞にトランスフェクトし,トランスフェクタントよりMDAを分離,制限酵素で切断後,ヒト特異的配列Aluでひろいあげることで,耐性遺伝子断片λKa2.6のクローニングに成功した. λKa2.6は各種ヒト耐性細胞に増幅して存在する.またその認識するmRNAは4.5kbであり,そのcDNAの塩基配列からPーglycoproteinの遺伝子であることが明らかとなった.
時間依存型構造解析手法の高精度化と耐久性照査技術への応用

ひび割れ進展を高精度に評価可能な剛体バネモデルを用いた3次元時間依存型構造解析手法を開発し、コンクリート構造物の劣化予測手法としての適用性を検討した。開発した手法が、耐久性の主な問題である鉄筋腐食によるひび割れ進展挙動を精度よく評価できることのみならず、実構造物からのコンクリート片剥落現象まで評価できることを示した。また、コンクリートが火災の影響を受けた時の問題に適用し、耐久性および安全性に問題となる爆裂現象を再現できることを示すとともに、爆裂現象発生メカニズムを明らかにした。3次元剛体バネモデル(RBSM)の高精度化を行うとともに、高精度化した解析手法を塩害解析ならびに火害解析に適用し、以下の結論を得た。1)3次元RBSMの開発3次元RBSMの構成モデルの精微化を行い、多軸圧縮応力下のコンクリートのポストピークに至るまでの荷重-変位応答や破壊領域を定量的に評価できることを示した。2)鉄筋腐食解析への3次元RBSMの適用鉄筋の腐食ひび割れ評価に本手法を適用し、電食実験結果との比較から、表面ひび割れおよび内部ひび割れの進展挙動を妥当に評価できることを示した。また解析結果による内部ひび割れの進展挙動の詳細な検討から、表面ひび割れ幅の拡大挙動メカニズムを明らかにした。3)火害解析への3次元RBSMの適用物質移動としては、トラスモデルにより熱・蒸気の移動を考慮できるモデルを開発した。さらに動的解析へ拡張した3次元RBSMと統合し、高温履歴下での温度応力やコンクリート内部の蒸気圧応力が考慮できる手法とすることで、火災時におけるコンクリートの爆裂現象の解析を可能にした。独自に開発した3次元剛体バネモデルを用いる時間依存型構造解析手法を高度な耐久性照査技術として利用するために、腐食ひび割れ解析と火害解析に適用する際の高精度化を行い、以下の結論を得た。(1)鉄筋腐食解析の高精度化鉄筋の局部腐食を考慮した腐食膨張モデルならびに腐食生成物進展モデルを開発し、鉄筋の腐食ひび割れ進展挙動を精度よく評価できる手法へと拡張した。また、(1)かぶり・鉄筋間隔などの幾何学的条件、(2)鉄筋の腐食範囲、などがひび割れ進展挙動に大きく影響することを電食実験ならびに開発した手法を用いた数値解析により明らかにした。さらに、従来考えられていなかった新たな内部ひび割れ進展挙動を明確に示すとともに、各種要因と腐食ひび割れ幅の関係、内部ひび割れと表面隆起量の関係を明らかにした。(2)火害解析の高精度化高温履歴下の温度・水分移動などの材料モデルの高精度化を行い、小型スラブ供試体の火災時の一回の爆裂現象までは概ね定量的に評価可能にした。また、内部蒸気圧生成と爆裂現象の関係について検討し、特にポリプロピレン繊維による爆裂防止現象を数値解析的に示した。独自に開発した3次元剛体バネモデルを用いる時間依存型構造解析手法を高度な耐久性照査技術として利用するために、腐食ひび割れ解析と火害解析の実構造物への適用を主眼とした検討を行い、以下の結論を得た。(1)鉄筋腐食解析の実構造物への適用実構造物への適用を考慮し寸法の大きな供試体の電食実験を行い、境界条件が腐食ひび割れ進展に及ぼす影響を実験的に検討した。一方解析的には、実構造物を想定した局所的な腐食や不連続な腐食の影響を開発した手法により評価した。さらに、開発した手法を鉄筋の腐食によりコンクリート片が落下した都市内高速道路に適用し、実際と同様の現象が再現できることを確認した。(2)火害解析の実構造物への適用開発した手法により火災時の爆裂現象に及ぼす温度応力と蒸気圧応力の影響を検討し、スラブ部材では爆裂現象は蒸気圧が主要因であり、温度応力は爆裂発生を早期化させる影響があることを明らかにした。さらにトンネルの履工コンクリートはその形状から変形が拘束されているため、トンネルへの適用を想定し、変形が拘束された場合の解析を行い、トンネルのような境界条件下では温度応力が爆裂に対して主要因となる場合があることを明らかにした。
全身性エリテマトーデスの光線過敏の発生機序に関わる制御性T細胞の機能解明

私たちは、光線の中でも紫外線の照射により、制御性T細胞が皮膚のCD4+T細胞の約60%にも増えることを見出した。制御性T細胞は末梢CD4T細胞の約5-10%をしめ、自己免疫疾患など様々な免疫反応を抑制している。本研究では、紫外線が制御性T細胞を増殖誘導することに着目し、SLEの光線過敏における制御性T細胞の果たす役割について解明する。SLEの光線過敏は、皮膚症状だけでなく全身的な疾患活動性も増悪させ、QOLおよび予後に関わる重要な症状である。SLE患者は若い女性が多く、日光曝露の機会も多い。SLEは、関節リウマチを除く自己免疫疾患で最も頻度が高いが、発症機序を含め、特に光線過敏においては十分な研究がなされていない。本年度は、マウスモデルを用いて、紫外線によるダメージがSLEの場合、どのように免疫制御を行う制御性T細胞に影響を与えるか、条件検討を行うことができた。今後も研究を継続し、将来、SLEの新しい予防方法、治療法に貢献を目指す。SLEの光線過敏は、皮膚症状だけでなく全身的な疾患活動性も増悪させ、QOLおよび予後に関わる重要な症状であるが、発症機序を含め、特に光線過敏においては十分な研究がなされていない。私たちの研究室では、Foxp3+制御性T細胞のホメオスタシスが光線、つまり、紫外線によりコントロールされていることを明らかにした(J Immmunol 2014)。今年度はマウスモデルを用いて、紫外線によるダメージがSLEの場合、どのように免疫制御を行う制御性T細胞に影響を与えるか、FACS解析を中心に条件検討を行った。当研究室の研究チームに参加して、紫外線をあてた皮膚で重要な樹状細胞サブセットの同定の論文にもチームの一員として貢献することができた(J Immmunol 2018)。SLEの治療はステロイド、免疫抑制剤が中心であるが、長期間の治療は重篤な感染症のリスクが高くなる。また、SLE患者は妊娠可能な若い女性が多いが、疾患活動性や治療薬により妊娠が難しくなり、また妊娠により症状が悪化する。SLE患者の病勢や治療薬による妊娠・出産のリスク、胎児への影響を減らすためにも、新しい治療の開発や発症の予防法の発見が急務である。今後もマウスモデルによる解析を、RNA seqなどの遺伝子発現解析を中心に行い、重要な分子メカニズムを解明する。今年度は学会参加を見送ったため、旅費を使用しなかったため、その分を繰り越し、来年度に学会参加を行う計画とした。消耗品はFACS用抗体などが10万円/本など効果であるが、免疫学教室にそろっていた抗体を使用することができたため、今年度は購入しないですんだ。来年度以降にこれまでに解析を行っていない分子をFACSで検出する際に新規に購入する予定である。
7テスラ磁気共鳴装置による高分解臨床画像の開発

本研究は、本邦唯一のヒト用超高磁場(7.0T)装置を用いた高分解能画像を開発し、特定疾患における組織特性を反映するコントラスト画像法を導入することにより、組織標本に匹敵する臨床生体顕微鏡を開発することを目的とした。様々な技術開発を行い、SusceptibilityWeighted Imaging(SWI)を導入した生体顕微鏡法では、世界に先駆けて、最終園標とされたAlzheimer病の老人斑の画像化にも成功した。MR画像学の最終ゴールは、顕微鏡レベルのMR画像、つまりは、MR microscopyを臨床に提供することにある。しかし、その確立には、いまだclearしなければならない多くの技術的問題点が残されている。本研究の目的は、疾患を限定し、対照とする微細組織に特異的な画像法を確立することにより、本邦唯一の超高磁場(7.0T)装置を用いた、高解剖学的解像度を誇る、臨床画像診断法を開発することを目的としている。初年度である本年度は、まず、技術的なインフラ整備に主眼が置かれた。hardware整備においては、7Tに特化したcircuitryを持つRF coilの導入と、gradient driverの改良を行った。Software対策として、3T装置platformの7T装置への移植を行い、来年度にはその完全な同期化を図る予定としている。画像評価のためのvirtual laboratoryのインフラ整備は、平行して、遂行しているOracleをbaseとする多目的医療database system構築(Digital Medicine)との有機的連携を図り、CPUの増設にともない、vector contrastおよび、informatics baseの画像処理の高速化を実現した。技術的なインフラ整備に主眼が置いた初年度に続き、本年度はAlzheimer病にtargetを絞った技術開発をすすめた。Knock out mouseの研究から、Alzheimer病の老人班の摘出には、80micron x 80micron x 200micronのspatial resolutionが必要なことが理解されている。本年度は、直接ヒトを対象とした検索で、このspatial resolutionに到達することを目標に、様々な技術開発がなされた。具体的には、多チャンネルphased array RF receiver coilの開発導入、極小サイズのFOVに対応可能なanti-aliasing algorithmの開発、導入を行い、現在までに、49micron x 49micron x 2mmのspatial resolutionを獲得することに成功している。また、低SAR値を実現するための7Tに適合したtailored RF pulseの導入を達成し、7Tでは不可能であると思われていた脳深部のmultiple slice撮像に成功している。来年度に開始予定のAlzheimer病患者における臨床trialを前に、現在、様々な臨床例でのmicroscopyの実践撮像を進めている。本研究にて開発された撮影技術の臨床応用は、それぞれの臨床科の主幹雑誌に報告している。技術的なインフラ整備に主眼が置いた初年度、臨床応用への基礎固めを行った昨年度に続き、今年度はAlzheimer病を初めとした各種神経疾患における臨床応用を開始すると共に、技術面では臨床画像の結果をfeed backすることにより、より実践的な技術開発・改良を行った。技術開発面では、昨年なし得た49micron x 49micron x 2mmのspatial resolutionを元にした、microscopyの改良を行うと共に、老人班検出を更に確実なものとする為にSusceptibility Weighted Imaging(SWI)を導入した。Complexdivisionによるphase imageの作成とマスク処理の導入により、7テスラの高S/Nを生かした良好な脳実質コントラストを持った画像を得ることに成功している。臨床画像の実践においてはAlzheimer病患者における臨床trialを開始した。患者、および各年齢層の健常者につき画像評価を行い、正常若年者、正常高齢者、Alzheimer病患者のそれぞれについてSWIコントラストで見るアミロイドのdeposit(もしくはそれに関連するsusceptibility contrastの源)の分布型に違いがあることが実証された。また、ここで得られた知見を各種神経疾患に応用し、脳腫瘍、amyloid angiopathyなどのmicroscopy測定、画像解析を進めた。本研究の目的は、本邦唯一のヒト用超高磁揚(7.0T)装置を用いた高分解能画像の開発と、その臨床応用である。

平成16および17年度に技術的なインフラ整備、臨床応用への基礎検討を行い、まず、49micron x 49micron x 2mmの空間分解能を達成した。それに基づいて、平成18年度にはSusceptibility Weighted Imaging(SWI)の導入により、Alzheimer病の老人班の画像化を、世界に先駆けて成功している。老人斑画像に関しては、本年度、定量分析に着手し、健常者、正常高齢者、MCIおよびAlzheimer病症例においての老人班発現頻度の解析をスタートした。これは、最終年度に当たる20年度の終了までに、完了する予定である。また、日常の医療実践への適合を検索するため、各種神経疾患、脳腫瘍、脳血管障害、白質病変の超高分解画像の、ルーチン撮像を開始した。このプロジェクトも、平成20年度に完了する予定である。技術開発では、本年度は、3DAC(three dimensional anisotropy contrast)画像法の移植作業を行った。その結果、世界に先駆けて、脊髄の3DAC画像の撮像に成功している。また、本プロジェクトは、プロジェクトリーダが長年の間追求している「水分子の脳科学」の一環をなすプロジェクトでもあり、水分子の動態を正常脳で解析可能とする唯一の記述としても、応用を続けている。これらの成果は、それぞれの主幹雑誌に、順次に、報告を行っている。本研究の目的は、本邦唯一のヒト用超高磁場(7.0T)装置を用いた高分解能画像の開発と、その臨床応用である。平成16および17年度に技術的なインフラ整備、臨床応用への基礎検討を行い、まず、49 micron x 49 micron x 2mmの空間分解能を達成した。それに基づいて、平成18年度にはSusceptibility Weighted Imaging(SWI)の導入により、Alzheimer病の老人班の画像化を、世界に先駆けて成功し、論文発表を行った。本年度は、老人班の定量分析に着手し、健常者、正常高齢者、MCIおよびAlzheimer病症例においての老人班発現頻度の解析を行った。また、日常の医療実践への適合を検索するため、各種神経疾患、脳腫瘍、脳血管障害、白質病変の超高分解画像の、ルーチン撮像を開始し、さらに超高磁場MRI最大のadvantageである生体MR顕微鏡に適合する造影剤について基礎検討、離床応用を開始した。その結果、超高磁場MRIにおける生体MR顕微鏡において酸素の安定同位体(17O)を含む水(H2(17)O)が造影剤として適していることを発見し、技術開発としてH2(17)Oの生体応用における指摘撮像法および投与法の設定を行った。
固体酸化物形燃料電池の燃料極の微細構造制御

固体酸化物形燃料電池(SOFC)の燃料極は,各物質がランダムに配置されており,物質輸送や界面反応は最適化されていない.本研究では,燃料極内のYSZ,Ni,空隙を厚さ方向に配列して,それぞれ酸化物イオン,電子,ガスが効率よく輸送される構造を目指した.Ni粒子を磁場で配列し,従来に比べて最大パワー密度を1.6倍に向上した.またFIB-SEMを用いて燃料極微細構造を三次元構築,電気化学計算を行い,YSZの屈曲度を従来の7から3程度に改善したことを確認した.また,Zr基板の表面にAlを成膜,陽極酸化を用いて貫通ナノホールを作製,それを鋳型に用いて再陽極酸化することでジルコニアピラーを作製した.固体酸化物形燃料電池(SOFC)の燃料極は,各物質がランダムに配置されており,物質輸送や界面反応は最適化されていない.本研究では,燃料極内のYSZ,Ni,空隙を厚さ方向に配列して,それぞれ酸化物イオン,電子,ガスが効率よく輸送される構造を目指した.Ni粒子を磁場で配列し,従来に比べて最大パワー密度を1.6倍に向上した.またFIB-SEMを用いて燃料極微細構造を三次元構築,電気化学計算を行い,YSZの屈曲度を従来の7から3程度に改善したことを確認した.また,Zr基板の表面にAlを成膜,陽極酸化を用いて貫通ナノホールを作製,それを鋳型に用いて再陽極酸化することでジルコニアピラーを作製した.当該年度の計画は,(1)Ni,Ysz,バインダを含むスラリーをスクリーンプリンティングにより電解質基板に塗布し,磁場を用いてNiを配列させる技術,(2)ナノインプリントで核生成制御したアルミナナノホールを用いたNiナノワイヤまたはYSZナノワイヤを生成する技術を開発することであった.(1)に関しては,磁場を360mTとして作製した燃料極が,磁場をかけていない燃料極に対して最大電流密度が1.6倍になった.ただし,この実験セルは空気極を有するのでその機能も含まれた電流密度であるが,空気極は同じ材料で同じ塗布方法を用いたため,最大電流密度の向上は燃料極の改善によるものである.また,燃料極をFIB/SEMで再構築した結果,Ni,YSZ,空隙,すなわち電子,酸化物イオン,ガスの通り道の界面である三相界面長さのうち,反応に使われている三相界面の割合が,従来の60%から80%に向上した.また電気化学シミュレーションによって過電圧が小さくなった..このことから,磁場をかけることでNiが物質輸送方向に配列し有効三相界面および有効な各相の体積が増えたものと考えられる.(2)に関して,イットリウムを含むジルコニウム金属膜の上に成膜したアルミニウム膜にナノインプリントで凹のパターンを施し,陽極酸化をすることでナノホールは作製できたものの,それに続く再陽極酸化ではジルコニアナノワイヤは生成できなかった.陽極酸化がジルコニウム表面に達したときに,ジルコニウム表面が酸化し,再陽極酸化の発生に適さない表面になったことが考えられる.燃料電池は,ガスタービンやガスエンジンなどの熱機関がもつカルノー効率の制約がないため,化石燃料や余った再生可能エネルギーから取り出した燃料を有効利用できる発電装置として期待されている.中でも固体酸化物形燃料電池(SOFC)は高温で作動させるため,効率が最も高い.さらに湯沸しと合わせて用いると家庭用として有効である.ただし,電極とくに燃料極は,YSZ(イットリア安定化ジルコニア),Niの粒子をバインダーとともにスラリーにしてスクリーン印刷で塗布,13001400度で焼結する方法に基づいているため,電極内の微細構造がランダムで物質輸送や界面反応が必ずしも最適化されているわけではない.本研究では,燃料極内のYSZ,Ni,空隙を厚さ方向に配列して,それぞれ酸化物イオン,電子,ガスが効率よく輸送される構造を目指した.具体的な方法としては,スラリー塗布直後に磁場をかける.Ni粒子は磁場方向に磁気分極し,粒子同士が引き合い配列する.この方法を用いて,発電評価用フルセルを作製し,磁場がないものに比べて最大パワー密度を1.6倍に向上することに成功した.またFIB(集束イオンビーム)-SEM(走査形電子顕微鏡)を用いて燃料極微細構造を三次元構築,電気化学シミュレーションを行うことで,YSZの屈曲度を従来の7から3程度に低減したことを確認した.このことから物質輸送パスの異方性を確認した.また,ジルコニウム基板の表面にAlを成膜し,陽極酸化を用いて貫通のナノホールを作製,それを鋳型に用いて再陽極酸化をほどこすことでジルコニアピラーを作製することに成功した.当初の研究計画における初年度では,Ni,Ysz,バインダを有するスラリーに磁場をかけることで各相が配列した燃料極を作製し,発電検証をすることであった.実際にはさらに先立ってFIB/SEMにより再構築を行い,過電圧計算を行った.それに対して再陽極酸化によるナノワイヤ生成に関しては成功していない.これらの理由から(2)と評価する.25年度が最終年度であるため、記入しない。

かける磁場強度と屈曲度・有効三相界面長さ・最大電流密度との関係を明らかにし,統合的に磁場の効果を調査する.さらに,再陽極酸化によるYSZナノワイヤを成功させた上で,高強度レーザによるYSZ微細ピラーの作製も試みる.これらの方法で配向された燃料極は,基板水平方向の伝導が悪い可能性があるため,燃料極作製後にNiスラリーを塗布して集電体との伝導を確保することを試みる.25年度が最終年度であるため、記入しない。磁場によるパスの配向制御,再陽極酸化を行うためのYSZセル,スラリー,薬品等を用いる.また,微細YSZピラーを作製するための高強度レーザを用いる.これらの研究成果を対外発表するために,国内・国外発表および論文投稿を行う.25年度が最終年度であるため、記入しない。
関節軟骨延長による新しい関節形成術-新生軟骨の解析と成長因子による促進の試み-

関節軟骨の修復・再建は自家移植の採取部位が限られているため、関節軟骨の欠損、形成不全、変性・消失に対して関節軟骨自身で修復することには限界がある。そこで、関節軟骨延長による骨・関節複合体として組織新生が可能であれば、関節軟骨の修復・再建に対する新たな治療法のひとつになりうると考えられる。本研究では日本白色家兎を用いて延長の条件と延長部の関節軟骨の性状を調べ、さらに軟骨延長に対するヒアルロン酸の影響について調べた。大腿骨顆部で関節面を含めて骨切りを行い、特注創外固定延長器を装着した。3週間の待機期間の後、0.7mmX3回/週で3週間、計6.3mmの延長を行った(延長群)。対照群として骨切り後に6.3mmの隙間をあけた群、1mmの隙間をあけた群、1mmの高さの段差をつけた群を作製した。全群とも延長部での早期骨癒合を防ぐためにビスフォスフォネートの投与を最初の5週間行った。術後9週目に屠殺し、組織学的観察を行った。延長群において平均4.2mmの延長が行え、関節軟骨表面の骨切り部に、軟骨様組織が連続している所見が認められた。延長組織表面にはほとんど陥凹がみられず、基質部には全般に丸みを帯びた軟骨細胞様の修復細胞が周囲の健常軟骨基質より密に観察された。深層にはtide markが健常部より連続して出現し、その底部には骨組織が形成され連続していることが認められた。その他の群では骨切り部には軟骨様組織が折れ込むような形で形成され、その間隙は線維性組織で充足されていた。さらに軟骨延長に対するヒアルロン酸投与の影響を調べた。浸透圧ポンプを皮下に埋め込み、チューブを膝関節内に設置した。このポンプからヒアルロン酸2mlを4週間かけて持続的に関節内に注入した。コントロールとして生理的食塩水を注入する群を作成した。ヒアルロン酸注入群では関節内の瘢痕組織形成が少なく、延長部の軟骨再生は良好であった。関節疾患に対する新しい治療法のひとつとして関節軟骨・骨複合体の延長が考えられる。本研究では今年度は日本白色家兎を用いて延長の条件と延長部の関節軟骨の性状を調べた。大腿骨顆部で関節面を含めて骨切りを行い創外固定延長器を装着した。3週間の待機期間の後、6.3mmの延長を行った。全群とも延長部での早期骨癒合を防ぐためにビスフォスフォネートの投与を行った。延長群においてのみ平均4.2mmの延長が行え、その他の群では骨切り部には線維性組織が充足されているか骨癒合のみ認められ軟骨の修復は認められなかった。従って、軟骨の延長、修復には骨切り後の軟骨面を正確に合わせることが必要と考えられた。次に延長後6ヵ月待機した長期モデルを作製し、延長部の軟骨の性状を調べた。屠殺後大腿骨顆部を縦切し、半分は組織学的検討を行い、残りの半分は力学的特性を調べるためにインデンテーション試験を行った。これについては長期モデルであるため現在標本作成中であり、結果はまだ得られていない。