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エマニュエル・レヴィナスを中心とした戦後現象学における政治の問題

今年度は、前年度に引き続き、エマニュエル・レヴィナスを中心とした戦後現象学における政治の問題という研究課題のうち、主として1)その主著『全体性と無限』における「政治」の問題、2)レヴィナスの思想が形成される時代的背景との関連、3)同時期の思想家との比較研究というテーマで研究を実施した。1)については、『全体性と無限』に明らかに見られる政治批判を支えるロジックが、「作品」概念に対するレヴィナスの解釈から浮き彫りになると思われ、この点を示すとともに、その後のレヴィナスの思想において「作品」概念に全く異なった評価が与えられていく経緯について、その概念的変更がいかなるものであったのかを示した。この作業によって、レヴィナスの政治観の中期と後期との乖離について、明白な見通しを得ることができた。2)については、レヴィナスの時代的コンテキスト、中でも「アウシュヴィッツ」/「ショアー」をレヴィナスがどのように引き受けたのかを検討した。とくに本研究は、レヴィナス自身が「ショアー」から学ぶべき点の最も重要な点として「内面的生」の復権を掲げていることに注目した。この語に注目してレヴィナスのテキストを時代ごとに検討していくと、レヴィナス自身の態度には注目すべき変遷が見られる。本研究はこの変遷を丹念に追うことで、いかにしてレヴィナスにおいて「内面的生」の問題が重要であったのか、またそれはどのようなかたちで「ショアー」への応答となっていたのかを示した。3)については、中でもレヴィナスと同年に生まれた思想家ハンナ・アレントに注目した。一見した差異にもかかわらず、両者の思想において多くの点で興味深い符号が見られると思われた。本研究は中でも、両者の主著、『全体性と無限』ならびに『人間巨条件』がともに着目している「はじまり」の概念に注目し、この概念を起点に両者の差異と近さを検討した。本研究は、戦後現象学に位置づけられる哲学の中でもエマニュエル・レヴィナスの哲学に注目し、そこにおける政治の位相を明らかにすることを目的とし、(1)レヴィナスにおける「ユダヤ闇題」と政治の関連(ヒトラー主義、全体主義批判、および「イスラエル」の問題系)、(2)倫理思想の構築そのものにおける政治批判(主箸『全体性と無限』における政治批判の意磯)、(3)レヴィナスが『存在の彼方』以降提唱する正義論の意義、の各テーマを主軸に、研究を遂行しでいる。平成19年度においては、上記諸点につき、関連文献の調査・読解を中心に研究を進めた。第一に、拙論「30年代のエマニュエル・レヴィナスにおける「ヒトラー主義の哲学」批判」では、30年代のレヴィナスの思想における「ヒトラー主義」の批判の哲学的含意を、同時期のレヴィナスの思想背景を考慮しつつ位澱づけ、同時にこの初期思想がレヴィナス哲学全体においても一つの転機をなすものであることを明らかにした。第二に、上記(2)につき、レヴィナスの主著『全体性と無限』に見られる「作品」概念と、その後の思想における同概念の差異について、その差異の整合的解釈を提示し、同時にこの解釈がレヴィナスにおける政治の位相の解釈に哲学的な土台を与えるものであることを指摘する学会発表を10Eに行った。この発表の成果を踏まえ、さらにその後明らかとなった点も加味し、加筆修正した論文は『フランス哲学・思想研究』に掲載予定である。上舘研究計画のうち、レヴィナスにおける政治の問題におけるユダヤ思想の影響およびイスラエル等の「ユダヤ問題」をめぐる研究については平行して継続中であり、来年度中に公表を予定している。
心筋幹細胞由来エクソソームと放射線誘発心血管疾患

細胞から分泌するエクソソームには、様々なタンパク質、mRNA、miRNAが含まれ、癌の進展や炎症免疫性に重要な役割を果たし、組織の再生修復にも深く関与することが明らかにされた。一方、心臓に存在している心筋幹細胞は、間葉系幹細胞の特性を示し、多量なエクソソームを分泌することがよく知られている。また、心筋幹細胞は放射線に対する感受性が高く、影響を受けやすいことが我々の最近の研究で明らかにされた(Sci Rep. 2017; 7: 40959.)。以上のことから、我々は、放射線被ばくが心筋幹細胞のエクソソーム分泌の変化を介して組織細胞傷害を引き起こすという仮説を立て、心筋幹細胞由来エクソソームはバイオマーカーおよび治療薬として放射線誘発心血管疾患の診断・予防・治療に役立つと考えている。我々はヒト胎盤組織由来間葉系幹細胞に5Gyのγ線照射を行い、48時間後に細胞培養上清から超遠心法によりエクソソームを分離した。回収したエクソソームのサイズ分布、CD63発現、タンパク質含量については、放射線による著明な影響が認められなかった。しかし、回収したエクソソームにおけるmiRNAの発現を網羅的に調べたところ、放射線照射により多くのmiRNAは2倍以上に変化していたことが判明した。また、我々は回収したエクソソームを心筋細胞や内皮細胞の増殖、アポトーシス、DNA傷害、および機能に与える影響を調べた。その結果、非照射群と比べ、照射した間葉系幹細胞由来エクソソームは心筋細胞や内皮細胞に傷害を与えることを明らかにした。本研究成果は、新たな角度から放射線誘発性心血管疾患の機序解明に寄与できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、放射線照射による心筋幹細胞由来エクソソームの分泌変化および線量依存性を調べ、それらの心臓組織細胞への放射線障害における役割を解明し、放射線誘発心血管疾患を的確に評価できる新たなバイオマーカ・治療法の開発を目指す。今年度は、心筋幹細胞は間葉系幹細胞の特性を示したため、放射線被ばくによる間葉系幹細胞由来エクソソームの分泌変化および心筋細胞と内皮細胞に与える影響について評価した。約80%confluent状態のヒト胎盤組織由来間葉系幹細胞に5Gyのγ線照射を行い、48時間後に細胞培養上清を回収し、エクソソームを分離した。回収したエクソソームはWestern blot法(エクソソーム表面マーカーのCD63の発現)および電子顕微鏡で確認した。zeta-sizeおよびmicro BCA protein assayにて、非照射と照射した間葉系幹細胞由来エクソソームのサイズと蛋白質量は変化がなかったことが認められた。また、非照射と照射した間葉系幹細胞由来エクソソームを心筋細胞と内皮細胞に添加培養し、24時間後に、それぞれへの影響を評価した。KI67と53BP1/γ-H2AX免疫染色において、非照射群と比べ、照射した間葉系幹細胞由来エクソソームにおける心筋細胞と内皮細胞の増殖は有意な減少やDNA障害は有意な増加が認められた。上記の結果から、照射した間葉系幹細胞由来エクソソームが心筋細胞と内皮細胞に損傷を引き起こすことを示唆した。今後は、ヒト心筋幹細胞のエクソソームの分泌変化及び心筋細胞と内皮細胞に与える影響と機序を同定し、心筋幹細胞由来エクソソームの投与による放射線誘発心血管疾患の改善効果を進めていく予定である。照射した間葉系幹細胞由来エクソソームが心筋細胞と内皮細胞に損傷を引き起こすことを見出した。心筋幹細胞は間葉系幹細胞の特性を示したため、放射線被ばくによる心筋幹細胞由来エクソソームが組織細胞に傷害を引き起こすことになり得た。

当初申請した通りに研究を推進していく予定である。具体的には、放射線被ばくによるヒト心筋幹細胞のエクソソームの分泌変化及び心筋細胞と内皮細胞に与える影響と機序を同定し、心筋幹細胞由来エクソソームの投与による放射線誘発心血管疾患の改善効果を明らかにしていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ラジオアイソトープ標識ペプチドの腎集積低減法の新規開発

がんの治療法の一つに、ラジオアイソトープ(RI)で標識したがん集積性ペプチドを生体内に投与し、がんに放射線を照射する方法がある。しかし、この治療法では、正常な腎臓に放射能が集積することによる副作用が問題となる。本研究では、腎臓に存在する酵素を利用した、RI標識ペプチドの新しい腎放射能低減法の開発を目的として、検討を進めた。その結果、企図した腎放射能低減法の開発に有用な情報を得ることができた。ラジオアイソトープ(RI)標識抗体フラグメント・ペプチドを用いたがんのアイソトープ治療では、腎臓での非特異的な放射能集積による副作用が問題となる。本研究では、申請者が以前示した戦略(腎臓の刷子縁膜酵素で認識されるペプチド配列を含有するRI標識試薬を用いて標識し、腎臓に取り込まれる前に尿排泄性の放射性代謝物を遊離させることにより、腎放射能レベルを低減する戦略)を応用し、^<90>Y-DOTA-octreotideをモデルとして、RI標識ペプチドの腎放射能レベルの低減法を開発することを目的とする。まず、尿排泄性代謝物として適する放射性化合物を見出すため、設計、合成、評価を行った。その結果、腎臓への集積性が低いと考えられる化合物を見出すことに成功した。ついで、その化合物を腎臓刷子縁膜酵素の作用により遊離しやすいペプチド配列を探すため、その化合物と種々の保護ペプチドとが結合したモデル化合物を合成し、腎臓刷子縁膜小胞を用いて、その評価を行った。その結果、腎臓刷子縁膜酵素によって認識されやすい配列を見出した。今年度、上記のものと同様の検討を継続するとともに、上記の結果あるいは今年度の結果に基づいて新規RI標識octreotide誘導体を設計、合成、評価することにより、新しい腎放射能レベルの低減法を開発することが可能と考えられる。したがって、本研究成果は、難治性のがんの治療に新しい可能性を与えるものと考えられる。ラジオアイソトープ(RI)標識抗体フラグメント・ペプチドを放射性医薬品として用いたがんのアイソトープ治療は、難治性がんの治療に有用であると高く評価されている。しかし、本治療法では、腎臓での非特異的な放射能集積による副作用が問題となる。本研究では、申請者が以前示した戦略(腎臓の刷子縁膜酵素で認識されるペプチド配列を含有するRI標識試薬を用いて標識し、腎臓に取り込まれる前に尿排泄性の放射性代謝物を遊離させることにより、腎放射能レベルを低減する戦略)を応用し、欧米で臨床使用されている放射性医薬品の^<90>Y-DOTA-octreotideをモデルとして、RI標識ペプチドの腎放射能レベルの低減法を新たに開発することを目的とする。本年度は、腎臓の刷子縁膜酵素の作用で遊離する尿排泄性放射性代謝物として適するRI標識DOTA類似体の設計と合成を行い、また、そのRI標識DOTA類似体を腎刷子縁膜酵素の作用で遊離するペプチドとの結合体の設計と合成を、昨年度の検討結果に基づいて行った。本研究に対する科学研究費の助成は本年度で終了する。助成期間内に尿排泄性RI標識DOTA類似体とペプチドとの結合体を導入したoctreotideの合成と評価を行うことはできなかったが、今後も検討を継続し、最終目的とする新規RI標識octreotide誘導体の設計につなげ、その合成と評価をすることにより、新しい腎放射能レベルの低減法を開発できるものと考える。したがって、本研究の実施は、難治性がん治療の可能性の向上につながるものであったと考える。
ミトコンドリアダイナミクスの制御機構

(1)ミトコンドリア(Mt)の分裂に関わる細胞質の因子Drp1のノックアウト(KO)マウスの作成に始めて成功し、全身Drp1-KOならびに神経Drp1-KOマウスの個体ならびに細胞での表現系の解析を行った。さらに肝臓、膵臓beta-細胞、心筋、卵巣でのDrp1-KOマウスを作製し解析を行っている。(2)Mt外膜上のDrp1受容体は不明で会ったが我々は従来考えられていたFis1ではなく新規な外膜蛋白質Mffが受容体として働くことを始めて明らかにした。(3)神経のMt軸索輸送に関わる新規な因子KLP6の同定に成功した。(4) Rab-GAPタンパク質TBC1D15がその受容体であることを明らかにした。(5) rp1の機能を抑制するとマトリクス内のmDNA-タンパク質複合体のサイズが増大する現象を見いだし、これがクリステ構造を安定化することでアポトーシスを抑制することを見出した。ミトコンドリア(Mt)は外膜、内膜2枚の膜に囲まれ細胞における好気的ATP産生、アポトーシス、カルシウムシグナリングなどに関わる真核細胞に必須のオルガネラであり、細胞の環境や病態に応じて融合・分裂を介してダイナミックに形態を変化させる。このダイナミックな動態の調節は細胞の生と死に重要な役割を果たす。この動態調節には4つの高分子量GTPaseが主要な因子として関与する;細胞質に局在しMtにリクルートされてその分裂を行うDrp1、外膜の融合に関わるMfn1とMfn2、ならびに内膜の融合とクリステ構造維持に関わる膜間部のOPA1(内膜結合)である。本申請は哺乳類Mtの融合・分裂の分子機構を明らかにすることを目的とし、平成22年度は以下の事柄を明らかにした。(1)Mtの分裂に関わる細胞質の因子Drp1のノックアウト(KO)マウスの作成にはじめて成功し、全身Drp1-KOならびに神経Drp1-KOマウスの個体ならびに細胞での表現系の解析を行った。さらに肝臓、膵臓β細胞、心筋、卵巣でのDrp1-KOマウスを作製し解析を行っている。(2)Mt外膜上のDrp1受容体の実態は長らく不明であったが、我々は従来考えられていたFis1ではなく新規な外膜蛋白質Mffが受容体として働くことを明らかにした。(3)Mffの高次機能を解明する目的でMff-KOマウスの作成に着手した。(4)神経のMt軸索輸送に関わる新規な因子KLP6の同定に成功した。ミトコンドリア(Mt)は外膜、内膜2枚の膜に囲まれ細胞における好気的ATP産生、アポトーシス、カルシウムシグナリングなどに関わる真核細胞に必須のオルガネラであり、細胞の環境や病態に応じて融合・分裂を介してダイナミックに形態を変化させるが、この動態の調節は細胞の生と死に重要な役割を果たす。この調節には4つの高分子量GTPaseが主要な因子として関与する;細胞質に局在しMtにリクルートされてMt分裂を行うDrp1、外膜の融合に関わるMfn1とMfn2、ならびに内膜の融合とクリステ構造維持に関わる膜間部のOPA1(内膜結合)である。本申請は哺乳類Mtの融合・分裂の分子機構を明らかにすることを目的とし、平成23年度は以下の事柄を明らかにした。(1)Mtの分裂に関わる細胞質の因子Drp1の全身Drp1-KOならびに神経Drp1-KOマウスの作成に続いて肝臓、膵臓β細胞、心筋、卵巣でのDrp1-KOマウスを作製し解析を行っている。膵臓β細胞では2型糖尿病の、心筋では心筋梗塞の症状を示し、また卵巣では卵の分裂停止を惹起することが明らかになった。(2)Mt外膜上のDrp1受容体の実態は長らく不明であったが、我々は従来考えられていたFis1ではなく新規な外膜蛋白質MffがDrp1受容体として働くことを明らかにし、現在反応機構解析を行っている。(3)Mffの高次機能を解明する目的でMff-KOマウスの作成に着手しES細胞を胚盤胞に注入する段階に到った。ミトコンドリア(Mtと省略)は外膜、内膜2つの膜に囲まれ好気的ATP産生のほか、カルシウムシグナル伝達やアポトーシスに中心的な役割を果たす。

網目状・チューブ状構造をとって細胞内に張り巡らされたMtは細胞の分化や病変に応じて分裂と融合を介してダイナミックに構造を変化させ機能変換をはかる。たとえばアポトーシス時には分裂して膜間スペースのアポトーシス因子[Cytochrome c(Cyt.c)が主役]を放出し死のカスケードを作動させる。Mtの分裂・融合に関わる主要な因子として哺乳類では4つの高分子量GTPaseが知られている。細胞質からリクルートされてMt分裂に関わるダイナミン様蛋白質Drp1、外膜の融合因子Mfn1とMfn2、内膜の融合とクリステ構造の維持に関わる膜間部の(内膜結合型)OPA1である。Mtの分裂・融合の生理的意義は次第に明らかになっているが、反応機構については関与する因子も含めて不明な点が多い。本計画においては、細胞質のDrp1がMtに集積し分裂を実行する機構を明らかにするために研究を行い以下の事柄を明らかにした。(1)Mt外膜に局在してMt分裂因子Drp1の受容体と考えられていたhFis1がDrp1受容体として機能していないことを明らかにし、さらに(2)Rab-GAPタンパク質TBC1D15がその受容体であることを明らかにした。(3)我々が見いだしたDrp1受容体Mffについてそのノックアウトマウスの作成に成功した。(4)大腸菌で発現したDrp1およびその変異体を精製し、それらの形態、リポソームとの結合、ならびにMtとの結合を電顕ならびに高速原子間力顕微鏡にて解析する作業を開始した。(5)Drp1の発現を抑制するとMtマトリクスに存在するmDNA-蛋白質複合体(ヌクレオイド)のサイズが増大する現象を見いだしその生理的意義と機構の解析を行っている(投稿中)。ノックアウトマウスのフェノタイプの解析は順調に進んでいるが、組み替えMffとDrp1を用いたin vitro分裂反応の機構解析に手間取っている。組み替えMffが可溶性の安定な標品として調整できないことが原因の一つである。24年度が最終年度であるため、記入しない。ノックアウトマウスの解析はこのまま進行させる。分裂機構解析は別のMff発現用プラスミドに切り替えて組み替え体の精製を行い直面している問題を解決する。
漸増力を利用した新しい矯正学的歯の移動-DNAチップを用いた組織障害の網羅的研究-

歯の移動に伴い初期荷重が小さい力から増加していく"漸増力"を用いて、Wistar系成熟ラットを用いて上顎第1臼歯の舌側移動を行った。初期荷重に4.96gfと2.26gfとの二種類を用いた。装置装着後1,3,7,10,14日後に屠殺を行い、通法に従い灌流固定を行いラット上顎の薄切標本を作製し第1臼歯歯根圧迫側の歯槽骨表面の破骨細胞数、歯根膜腔の硝子様変性の面積の比率を測定した。破骨細胞数、硝子様変性の面積の比率ともに有意差を示した。装置撤去後1日目および2日目の破骨細胞数は小さな初期荷重を用いた群において大きく、硝子様変性の面積の比率は小さな初期荷重を用いた群において小さかった。この結果より、小さな初期荷重を用いた矯正的歯の移動において硝子様変性という病的な現象を減少する可能性が示唆された。また、本実験で用いたフォースシステムでは矯正的歯の移動において漸増力を発生するために用いた磁石が実験期間内に接触をしてしまい長期の歯の移動とその歯周組織に対する影響を見るためには不適であると考えられた。本研究で注目した矯正力として用いる小さな初期荷重から歯の移動に伴い増加する"漸増力"を発生させる磁石の構造であるが、発生する力の大きさ、磁石の構造強度およびラット口腔の解剖学的な制限により磁石の設計自体の変更は難しい。そこで漸増力と現在の矯正治療で主に用いられている歯の移動に伴い初期加重が大きな力から減少していく"漸減力"の比較をすることとし、漸増力には同様に磁石を用いたメカニクスを用い、漸減力にはニッケルチタンワイヤーを用いた。漸減力の初期加重はネオジウム-鉄-ボロン系磁石がたがラット上顎第一臼歯をレシプロカルに舌側移動を行い、疼痛の発現の比較を試みた。小さな初期荷重から小さな初期荷重から歯の移動に伴い増加する"漸増力"を用いて、Wistar系成熟ラットを用いて上顎第1臼歯の舌側移動を行った。また、本実験で用いたフォースシステムでは矯正的歯の移動において漸増力を発生するために用いた磁石が実験期間内に接触をしてしまい長期の歯の移動とその歯周組織に対する影響を見るためには不適であるということが見い出された。従って本研究で注目した矯正力として用いる小さな初期荷重から歯の移動に伴い増加する"漸増力"を発生させる磁石の構造であるが、発生する力の大きさ、磁石の構造強度およびラット口腔の解剖学的な制限により磁石の設計自体の変更は難しかったために、上記実験では左右両側の第一臼歯に接着した磁石同士を引き合わせるレシプロカルなフォースメカニクスを用いたが、一側の第1臼歯のみに口蓋側への力をかけ、反対側をコントロールとして変則に力を作用させるメカニクスの検討を行った。漸減力の初期加重はネオジウム-鉄-ボロン系磁石がたがラット上顎
免疫応答の初期過程の研究

研究成果の概要は以下の通りである。ストップトフロ-法と蛍光プロ-ブとの組み合せにより、T細胞、好塩基球細胞等の免疫応答の初期過程を追究する新しい手法を確立した。この手法を用いて、免疫応答の初期過程の研究を行った。同時に、1個の免疫細胞でのミリ秒単位で起こる生化学的現象を画像化する蛍光顕微鏡画像処理装置を開発した。そして、ミリ秒単位で、単一の免疫細胞のカルシウムイオンの細胞内動態を測定することに成功した。また、ヘルパ-T細胞と抗原提示細胞との相互作用を蛍光ストップトフロ-法および蛍光画像処理法により追究した。その結果、ヘルパ-T細胞のカルシウムシグナルの伝達には、抗原特異性とMHC拘束性があることが明らかになった。すなわち、MHC抗原異なった非特異的な抗原提示細胞を用いた場合は、たとえ外来抗原が存在していても、ヘルパ-T細胞のカルウムシグナルは観測されなかった。また、クロ-ン化したT細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度上昇にはtime-lagがあり、個々の細胞ではtime-lagが大きく違うことを見い出した。これは好塩基球細胞の場合も同様であった。また、サプレッサ-T細胞はヘルパ-T細胞の機能を一方向的に抑制することを明らかにした。サプレッサ-T細胞の存在下ではヘルパ-T細胞のカルシウムシグナルは観察されなかった。さらに、蛍光画像処理法により、単一の好塩基球細胞のカルシウムシグナルの解析を行なった。そして、個々の細胞でカルシウムシグナルの実体を解明し、細胞内へのカルシウムイオンの流入が約0.1秒で進行していることを明らかにした。最後に、ヘテロなT細胞の集団から特定のT細胞の機能解析をするシステムを開発した。この方法は、今後、T細胞の分化抗原の研究に画期的な寄与をするものと考えられた。蛍光ストップトフロー法と蛍光顕微鏡画像処理法により、T細胞の免疫応答の初期過程の研究をおこなった。T細胞の活性化の初期過程の追究としては、細胞内カルシウムイオンの濃度変化に着目した。カルシウムイオンは蛍光色素(fura-2)を用いて測定した。fura-2を標識したヘルパーT細胞を予め抗原処理をした抗原提示細胞とストップトフロー装置を用いて混合すると、ヘルパーT細胞のfura-2の蛍光強度が急速に(12秒)増大した。これは、T細胞抗原レセプターが抗原提示細胞上のMHC抗原(主要組織適合性抗原)と外来抗原を認識したことが引き金となり、細胞外からT細胞内にカルシウムイオンが流入したことを表していた。T細胞へのカルシウムイオンの流入には、MHC拘束性が見られた。自己と同一のMHC抗原と、外来抗原の両者が存在したときにのみ、T細胞にカルシウムイオンの流入が起こった。さらに、サプレッサーT細胞の機能解析も可能にした。サプレッサーT細胞の場合もヘルパーT細胞と同様に、抗原提示細胞と外来の抗原の存在により活性化され、細胞内にカルシウムイオンが流入した。しかし、予め活性化されたサプレッサーT細胞はヘルパーT細胞へのカルシウムイオンの流入を一方向的に阻害するが、ヘルパーT細胞はサプレッサーT細胞へのカルシウムイオンの流入を阻害しないことを見出した。一方、蛍光画像解析装置を試作し、T細胞の細胞内カルシウムイオンの動態を単一細胞レベルで追究した。T細胞腫瘍(Jurkat)のシグナル伝達に関与するT3複合体に対する抗体を添加すると、十数秒のtime-lagの後に、急速に細胞内のカルシウムイオンの濃度が増大することを見出した。しかも、クローン化したT細胞でも、time-lagは幅広い分散があることが分かった。この装置を用いてヘルパーT細胞と抗原提示細胞の相互作用を単一細胞レベルで追究中である。

蛍光ストップトフロ-法と多種の蛍光プロ-ブとの組み合せにより、T細胞を始めとする免疫細胞の免疫応答の初期過程を追究する新しい方法論を確発した。この方法論の確立を基に、迅速、高感度の免疫細胞の機能解析に適した蛍光ストップトフロ-装置の開発を行った。次いで、1個の細胞でのミリ秒単位で起こる生化学的現象を画像化する蛍光顕微鏡画像処理装置を組み立てた。そして、免疫細胞の細胞内カルシウムイオンの動態測定から、免疫細胞の初期活性化の追究を可能にした。特に、ミリ秒単位で単一細胞のカルシウムイオンの測定法の開発に成功した。そして、ヘルパ-T細胞と抗原提示細胞との相互作用を蛍光ストップトフロ-法及び蛍光画像解析法により追究した。その結果、ヘルパ-T細胞のカルシウムシグナルには、抗原特異性とMHC拘束性があることを明らかにした。非特異的な抗原提示細胞では、ヘルパ-T細胞の応答は見られなかった。また、クロ-ン化したT細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度上昇にはtime-lagがあり、個々の細胞でtime-logがかなり違っていた。クロ-ン化した細胞でも既に個性が存在することを明らかにした。また、サプレッサ-T細胞はヘルパ-T細胞の機能を一方向的に抑制することも明らかにした。さらに、蛍光画像処理法により、単一の好塩基球細胞のカルシウムシグナルの解析を行なった。そして、個々の細胞でのカルシウムシグナルの実体を解明し、細胞内へのカルシウムイオンの流入が約0.1秒で進行していることを世界に先駆けて明らかにした。最後に、ヘテロなT細胞の集団から特定のT細胞の機能解析するシステムを開発した。この方法は、今後、T細胞の分化抗原の研究に画期的な寄与をするものと考えられた。
音声対話システムにおける用例からの単語・概念獲得

本研究では音声対話システムにおいて、対話コーパスなどの用例を利用して単語や概念を獲得する方法に関する基礎研究を行なった。具体的には、1)対象とする音声対話システムの基本要素の開発、2)対話データの収録とデータベース化および3)対話事例ベースによる自由発話解析手法の提案を行ない、知識獲得に必要な要素を明らかにした。音声対話システムの基本要素に関しては、用例からの類推のような不確実な知識も扱えるような、確率推論を用いた発話解析手法を提案した。確率推論の方法としては、計算量などを考慮してベイジアンネットワークを用いた。対話データの収録に関しては、今年度新たに30対話(10人分×3タスク)の対話を収録し、書き起こしを行なった。これらのデータに対して、発話タイプ・意図の情報は付与したが、品詞などを人手で付与するのは大変なので、現在自動タグ付けツールを開発中である。このツールが完成すれば、本研究における用例として十分な量のデータになると思われる。対話事例ベースによる自由発話解析手法では、新たな事例の単位を提案し、その解析結果を知識として獲得する方法を示した。具体的には、従来手法では事例として文を単位として考えるものが大半であったが、我々は対話システムに適用することを考え、対象としている文とその前の発話に関する情報とで事例の単位とした。この枠組の中で、発話内容の推定および未知語の解析方法のアルゴリズムを提案した。結論として、本研究では発話解析手法の開発・用例の収集と並行して、用例を利用した解析手法を提案し、解析結果をシステムの知識として獲得する方法を示した。しかし、新たな知識の追加などによって、獲得した知識が間違いであったと分かった場合に、知識の見直しをする必要がある。これは新しい知識を信念として扱い、一定回数以上使われた信念を知識として格上げするなどの工夫が必要となろう。
FISH法を用いたデンタルプラーク構築過程の解明

デンタルプラークの初期形成過程を明らかにすることを目的として研究を行った。3次元構造理解のため非破壊的に細菌種を染め分け可能なfluorescence in situ hybridization法でハイドロキシアパタイトディスク上にプラーク形成させ観察する系を確立した。従来考えられていた層状構造ではなく数種類の菌が集まった山塊状のコロニーが大きくなり融合する形で初期プラークを形成することがわかった。そこでin vitoroの系で細菌を混合しこの現象の再現を行ったところ初期山塊状コロニーに類似の構造形成に必要不可欠な細菌種はNeisseria属とActinomyces属であることがわかった。本研究の今年度の目的はヒトの口腔内に設置したハイドロキシアパタイトディスクに付着したデンタルプラーク内において立体構造を保ったままfluorescence in situ hybridization(FISH)法により個々の細菌種を染め分け、観察出来る手法を確立することであった。実際に申請者を含む本研究室に所属する者3名に検体作成を依頼し8.16.24時間のデンタルプラークを作成し観察したところStreptococcus属, Neisseria属, Actinomyces属,Prevotera属など8属にわたる主要菌属の染め分けを行うことが可能であった。この手法に関しては現在までのところ主要菌属のみでしか試行は行っていないがプローブを作成しさえすればほぼ全ての菌属・菌種での染め分けが可能であると考えられる。さらにStreptococcus属, Neisseria属, Actinomyces属を用いて共染色を行いデンタルプラーク内の構造解析及び口内細菌の初期付着を経時的に観察した。すると実際のヒトの口腔内においては、これまで考えられていたように層状に菌が堆積してプラークを形成していくわけではなく、幾つかの菌属が集まって一つのドーム状or山状の構造を作りこれが成長してさらに大きなバイオフィルムとして成熟していくような経過が観察できた。またその際も特定の菌が最下部に存在しており、この菌がデンタルプラークの初期形成過程において重要な役割を果たしている可能性が考えられた。昨年度はこれまでは実際のヒトの口内で起こっている現象の観察を行ってきたが、今年度は培養細菌を用いた培養系に移し替えて研究を行った。昨年度得られた知見として1.幾つかの菌属が集まって一つの山塊状の構造を作りこれが成長してさらに大きなバイオフィルムとして成熟していくような現象の観察。2.その際に特定の菌が塊の下部に存在しており、この菌がデンタルプラークの初期形成過程において重要な役割を果たしているか。ということについての検証・再現をin vitroの系を使用して試みた。具体的にはStreptococcus mutans, Actinomyces naeslundiiおよびNeisseria mucosaをそれぞれ単独で培養しても密度の濃い塊上のコロニーは形成されずS,mutans-N.mucosaおよびS,mutans- A.naeslundiiでも同様であった。しかしながらN.mucosa- A.naeslundiiでは小規模ながら細菌同士の凝集が確認でき3種を混合するとN.mucosa- A.naeslundiiを中心としてその周辺にS,mutansが付着する形で実際の口腔内と似通った山塊状の構造を示すことがわかった。このことからデンタルプラークの初期構築過程においてはActinomyces属およびNeisseria属が重要な役割を果たしているのではないかということが考えられた。上述の通り本研究の今年度の目的はFISH法により個々の細菌種を染め分け、観察出来る手法の確立までであった。この手法については実際に8属にわたる主要菌属の染め分けを行うことが可能であり、さらにはプローブを作成しさえすればほぼ全ての菌属・菌種での染め分けが可能であると考えられ、ひとまず系は確立できたと考えられた。さらに今年度の研究過程で得られたサンプルを用いて観察・解析を行ったところ、系の確立のみならずこれまでの常識とは異なった知見を示唆するような結果を得ることができた。この知見については本当であれば大変興味深く今後の歯学研究に大いに貢献すると考えられるので今後も深く掘り下げていきたいと考えている。以上のような状況から本研究における今年度の達成度は当初の計画以上に進展していることとした。予防歯科当初の研究計画では今後は本学の学生でう蝕経験の全くない者10名に直径5 mmのハイドロキシアパタイトディスク6枚を接着したマウススプリントを7日間装着してもらい、装着後1、2、3、4、5、7日目に1枚ずつディスクを回収しディスク上に形成したプラークを観察し、解析を行う予定であった。しかしながらこれまでの研究過程において、48時間以上の十分に成熟したデンタルプラークではFISH法では個々人のサンプルを観察しても顕著な差を見出すことが難しい点や昨年度の研究からハイドロキシアパタイトディスク上への細菌の初期付着において興味深い点などが見出されたことから当初の計画を変更することとした。

具体的にはこれまでは実際にヒトの口内で起こっているを主眼に置いた実験系において研究を行ってきたが、これを実験室の培養系に移し替える。そして様々な菌を取捨選択して混ぜ合わせて培養を行い、昨年度得られた知見:幾つかの菌属が集まって一つのドーム状or山状の構造を作りこれが成長してさらに大きなバイオフィルムとして成熟していくような経過及び特定の菌が最下部に存在しており、この菌がデンタルプラークの初期形成過程において重要な役割を果たしているか、についての検証・再現とこの現象に必要不可欠な菌属の特定を目的として研究を行うこととした。昨年度は主に実験系の確立のために予算を使用し、そのための技術習得などを目的として他の研究室に出張して多少の研究を行う予定であった。しかしながら自研究室での研究が予想以上にうまくいってしまったため出張旅費及び出張先で使用する物品費などが必要なくなり次年度に繰り越すこととなった。今年度は実験計画を多少変更し当初必要と考えていなかった実験室内での培養系において研究を行うことを計画しているため、消耗試薬やプラスチック代などの消耗品・物品費が余計に必要と考えている。
軟部腫瘍の病理診断の精度を向上させるための細胞遺伝学的ならびに分子病理学的研究

軟部組織には多種類の腫瘍ならびに腫瘍状病変が生ずるが,多彩な組織形態を示すため,病理学的診断はしばしば困難である.本研究の目的は軟部腫瘍の細胞遺伝学的および分子生物学的特徴を明らかにし,診断の精度向上に役立つ基礎的なデータを得ることである.(1)Bednar腫瘍の染色体分析とFISHを初めて行い,本腫瘍に特徴的な余剰環状染色体が17番と22番染色体の成分から構成されていることを見出した.(2)隆起性皮膚線維肉腫と富細胞性皮膚線維腫との鑑別は困難であるが,CGH分析によって,前者では17q22-qterおよび22q13のgainがあることが鑑別に利用できることを明らかにした.(3)滑膜肉腫は上皮様成分と紡錘形細胞成分からなる特異な悪性腫瘍であるが,我々はemmbrane-based laser microdissection法とRT-PCRおよびFISHを用いて,両方の成分ともにSYT-SSX fusion transcriptを有することを明らかにした.(4)末梢神経鞘腫瘍のCGH分析によって,染色体17,19,および22qのimbalancesが高率に検出され,これらの異常が末梢神経鞘腫瘍の発生に関与している可能性が考えられた.NF1-associated neurofibromaでは17p11.2-p13のlossが多く見られ,癌抑制遺伝子p53(17p13)の変異との関連が示唆された.(5)弾性線維腫のCGH分析によってXq12-q22のDNAコピー数の増加が検出され,本腫瘍の発生との関連性が考えられた.(6)線維形成性小円形細胞腫瘍(desmoplastic small round cell tumor)は小児に生ずる難治性の悪性腫瘍であるが,我々は本腫瘍からはじめて培養細胞系を確立し,スキッドマウスへの移植にも成功した.これを用いて,従来不明であった本腫瘍の本態解明と治療方法の開発に利用することが期待される.軟部組織には多種類の腫瘍ならびに腫瘍状病変が生ずるが,多彩な組織形態を示すため,病理学的診断はしばしば困難である.本研究の目的は軟部腫瘍の細胞遺伝学的および分子生物学的特徴を明らかにし,診断の精度向上に役立つ基礎的なデータを得ることである.(1)Bednar腫瘍の染色体分析とFISHを初めて行い,本腫瘍に特徴的な余剰環状染色体が17番と22番染色体の成分から構成されていることを見出した.(2)隆起性皮膚線維肉腫と富細胞性皮膚線維腫との鑑別は困難であるが,CGH分析によって,前者では17q22-qterおよび22q13のgainがあることが鑑別に利用できることを明らかにした.(3)滑膜肉腫は上皮様成分と紡錘形細胞成分からなる特異な悪性腫瘍であるが,我々はemmbrane-based laser microdissection法とRT-PCRおよびFISHを用いて,両方の成分ともにSYT-SSX fusion transcriptを有することを明らかにした.(4)末梢神経鞘腫瘍のCGH分析によって,染色体17,19,および22qのimbalancesが高率に検出され,これらの異常が末梢神経鞘腫瘍の発生に関与している可能性が考えられた.NF1-associated neurofibromaでは17p11.2-p13のlossが多く見られ,癌抑制遺伝子p53(17p13)の変異との関連が示唆された.(5)弾性線維腫のCGH分析によってXq12-q22のDNAコピー数の増加が検出され,本腫瘍の発生との関連性が考えられた.(6)線維形成性小円形細胞腫瘍(desmoplastic small round cell tumor)は小児に生ずる難治性の悪性腫瘍であるが,我々は本腫瘍からはじめて培養細胞系を確立し,スキッドマウスへの移植にも成功した.これを用いて,従来不明であった本腫瘍の本態解明と治療方法の開発に利用することが期待される.1.目的近年、種々の軟部腫瘍において特異的な染色体・遺伝子異常が発見され、腫瘍の診断と分類に新たな展開が期待されている。本研究では、診断困難な軟部腫瘍の細胞遺伝学的および文政病理学的特徴を明らかにし、診断の精度向上に役立つ基礎的なデータを得ることを目的とする。2.研究方法3.結果ならびに考察色素性隆起性皮膚線維肉腫(Bednar腫瘍)に余剰環状染色体を検出し、この染色体異常が本腫瘍に特徴的であることを証明した。またFISHによって、17番と22番染色体の成分から構成されていることを見出した。Bednar腫瘍のFISHによる検索は本研究が最初である。さらにCGHによって、染色体17qと22のgainがあることを検出し、これらの染色体DNAの増幅がBednar腫瘍の余剰環状染色体形成に重要な意味を持っていることを証明した。このほか種々の末梢神経鞘腫瘍(Schwann腫、神経線維腫、蔓状神経線維腫、MPNST)においてCGH分折を行ったところ、17番と22番染色体の異常が高率に検出され、これらの異常が末梢神経鞘腫瘍の発生に関与している可能性が考えられた。隆起性皮膚線維肉腫では余剰環状染色体が特徴的であるが,一部の例では余剰環状染色体に8q11.2-qterと17q21-qterを含むことがCGH分析で明らかとなった(Cancer Genet Cytogenet 2001;129:102-6).Bednar

腫瘍(色素性隆起性皮膚線維肉腫)のFISHおよびCGH分析によって,余剰環状染色体が17番および22番染色体の成分を含むことが明らかになった(Genes Chromosomes Cancer 2001;30(3):305-9).隆起性皮膚線維肉腫と皮膚線維腫の鑑別はしばしば困難であるが,我々はCGH分析によって前者では17q22-qterおよび22q13の増幅があるのに対し,後者ではそれがないことが明らかにした(Cancer Genet Cytogenet 2002;132:102-108).軟部組織には多種類の腫瘍ならびに腫瘍状病変が生ずるが,本研究は診断の精度向上のための基礎的なデータを得ることを目的として,種々の腫瘍について細胞遺伝学的および分子病理学的分析を行った.2.隆起性皮膚線維肉腫と富細胞性皮膚線維腫との鑑別はしばしば困難であるが,CGH分析によって,前者では17q22-qter and 22q13のgainが特徴的にみられるが,後者ではみられないことから鑑別に利用できることを明らかにした(Cancer Genet Cytogenet 2002;132:102-8).3.弾性線維腫のCGH分析によってXq12-q22のDNAコピー数の増加が検出され,本腫瘍の発生との関連性が考えられた(Int J Mol Med 2002;10:277-280).4.線維形成性小円形細胞腫瘍(desmoplastic small round cell tumor)は小児に生ずる難治性の悪性腫瘍であるが,本腫瘍からはじめて培養細胞系を確立し,スキッドマウスへの移植にも成功した.これを用いて,従来不明であった本腫瘍の本態解明と治療方法の開発に利用することが期待される(Lab Invest 2002;82:1175-82).
多f電子系における価数揺らぎと多極子秩序の理論

本年度は、スクッテルダイト系特にPrFe_4P_<12>の秩序状態に関して多バンドモデルの構築を行った。スクッテルダイト系に共通のプニクトゲンによる主要pバンドに加えて、鉄イオンのdバンドを考慮した強結合モデルを導出し、それが第一原理計算をよく再現することを示した。続いて、伝導電子-f電子の現実的な混成行列要素の計算を実行し、pバンドがf電子Γ_7状態と、dバンドがΓ_8状態とそれぞれ混成することを示した。これはdバンドにより強い近藤効果がもたらされることを強く示唆する。また、類似物質PrRu_4P_<12>の磁気抵抗の解析も行った。電荷秩序相における3重項基底に着目し、伝導電子と3重項との交換相互作用による輸送現象への寄与をボルツマン方程式の定式化により調べた。現実的な交換相互作用の値を用いて、抵抗の磁場温度変化が定量的に再現されることが示された。また、ホール効果に関して、交換場と非弾性散乱の寄与が、ホール係数およびホール移動度それぞれに明瞭に反映されていることが分かった。f電子系における八極子秩序状態の中性子散乱の理論についても取り組みを行った。特にCe_<1-x>La_xB_6のII相およびIV相に関して、それぞれ八極子T_<xyz>およびT^βの秩序状態を仮定し、磁気形状因子を計算した。異なる八極子秩序変数を反映して、2つの相では形状因子の運動量差に対する異方性が全く異なることが分かった。この結果は、最近の中性子散乱実験と大変良く一致し、八極子の型および大きさを中性子散乱により曖昧さなく決定できることを示した。さらに、URu_2Si_2に関しても、磁場誘起の八極子による形状因子の計算を行い、予想される強度および異方性を詳しく調べた。本年度は、主にスクッテルダイトPrRu_4P_<12>の電荷秩序状態の解析に取り組んだ。f^2結晶場状態の特徴を取り込んだモデルに対して動的平均場理論を定式化し、種々の輸送特性の計算を行った。電気抵抗の温度及び圧力変化、光学伝導度の周波数依存性、ホール伝導度の温度変化のそれぞれに関して計算結果が実験とよく一致していることを示した。また、それらについて、電荷秩序状態でのf電子熱揺らぎの詳しい分析を行い、異常な輸送特性の原因を議論した。重希土類系TmTeの四極子秩序によるX線トムソン散乱の解析にも取り組んだ。まず、Tmイオン間の多極子相互作用モデルに関して平均場近似を行い、磁場中の安定秩序状態を決定した。その結果を用いて、Tmイオンがf^<13>配位であることに注意して、散乱強度の散乱ベクトルGに対する依存性を詳しく調べた。磁場方向、秩序変数により、G依存性が大きく変わること、またその特徴について詳しく議論した。これらは、将来のX線実験の有力な指針になると思われる。その他、PrRu_4P_<12>の有効ハミルトニアンのjj結合近似に基づく導出にも取り組み、低温の磁気的性質の解明の足場を築いた。
ヒトパルボウイルスB19のレセプターの検索

小児伝染性紅斑の原因ウイルスとして知られているヒト・パルボウイルス(HPV/B19)は、近年、非免疫性胎児水腫や慢性関節リウマチなどの他の重篤な疾患との因果関係が指摘されている。しかし、HPV/B19感染の血清診断法の確立は充分ではなかった。我々は今までに、HPV/B19ウイルス粒子を抗原とするELISA法、抗HPV/B19モノクローナル抗体を用いたウエスタン法、PCR法を用いたHPV/B19 DNAの検出法を確立してきた。本研究では、まず大腸菌で産生したグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)と融合したHPV/B19 VP-1蛋白を抗原とした、抗HPV/B19抗体のELISA法を用いて抗HPV/B19血清の測定値と、同じ抗原を用いたWestern blot法の結果を比較した。ELISAのOD値が0.1以下検体では、OD値とWestern blot法による陽性とはかならずしも相関しなかった。この境界域を明確にするために、ELISAのOD値0.1から0.01までの73検体について詳細に検討した。その結果、OD値が0.08以上のものはWestern blot法ですべて陽性であった。0.04-0.08の検体の一部はWestern blot法で陽性と認められた。従って、本ELISA法でOD0.08以上は抗HPV/B19陽性と判定できるが、境界域のOD値0.04-0.08を示す検体はWestern blot法での確認が必要である。
コナガにおける遺伝子重複と殺虫剤抵抗性に関する分子生態学的研究

コナガのジアミド剤抵抗性の主要因はリアノジン受容体のアミノ酸変異(G4946E)による感受性の低下である。本研究ではまず、コナガにおいてリアノジン受容体遺伝子が重複している可能性を調べたが、採用した手法では確かな証拠を得る事はできなかった。今後、次世代シーケンサー等を用いた解析を行なう必要がある。コナガ個体群のG4946E頻度を調べる手法を開発した。その手法を用いて、様々な地域で採集された、ジアミド剤に対する抵抗性レベルの異なるコナガ個体群のG4946E頻度を調べた。その結果、抵抗性レベルとG4946E頻度の間には正の相関があること、G4946E頻度に基づいてジアミド剤のコナガに対する防除効果を予測できることが示唆された。すなわち、G4946E頻度が40%未満であればジアミド剤の効果が期待できるが、40%以上であればジアミド剤の効果が期待できないので、他の系統の薬剤を中心とした防除を行なうことが望ましい。上記手法を用いて、野外におけるコナガ個体群のG4946E頻度の季節的な変化を、3年間にわたって、野外のキャベツ圃場に設置されたフェロモントラップに捕獲されたコナガを用いて調べた。その結果、G4946E頻度は春から夏にかけて上昇し秋に低下すること、晩秋の頻度と翌春の頻度はほぼ同じであることが明らかとなった。以上の結果は、当該年のジアミド剤の防除効果は、前年のG4946E頻度に基づいて予測できることを示しており、コナガ管理において非常に重要である。1年目の調査では、調査圃場におけるコナガのG4946E頻度が40%を越えていたため、2年目と3年目はジアミド剤の使用を中止し、作用機作の異なる薬剤散布に切り替えた。その結果、3年目にはG4946E頻度がジアミド剤の効果が期待できる40%未満に低下した。このことは、G4946Eによるフィットネスコストを示唆している。1)ジアミド剤に対する感受性の異なるコナガ系統を用いて、ジアミド剤抵抗性に関わるリアノジン受容体遺伝子のアミノ酸変異(G4946E)部位のジェノタイピングを個体レベルで試みた。G4946E部位の配列を既報のプライマーを用いたダイレクトシーケンシングで、抵抗性ホモ、感受性ホモ、ヘテロ接合体であるかを判別しようとしたが、多くの個体で遺伝子型が判別できなかった。その理由として、リアノジン受容体遺伝子配列の重複が考えられた。典型的な例は、感受性系統において本来存在するはずのないG4946Eを含むリアノジン受容体遺伝子配列が検出されたことである。詳細な解析の結果、感受性系統で検出されたG4946Eを含むリアノジン受容体遺伝子配列にはいずれもイントロンが含まれておらず、抵抗性因子として機能していないことが示唆された。そこで、6系統由来の28個体より増幅されたリアノジン受容体遺伝子配列を、遺伝子クローニングやダイレクトシーケンシングを通じて網羅的に解析した。得られた結果に基づき、イントロンを含むリアノジン受容体遺伝子配列のみを増幅するプライマーを設計した。これによりG4946E部位の配列を個体レベルでジェノタイピングできるようになった。2)海外ではG4946E以外のアミノ酸変異(E1338D、Q4594L、I4790M)もジアミド剤抵抗性に関わっていることが報告されているが、解析に用いた系統はそれらのアミノ酸変異に関わる遺伝子変異をほとんど含んでいなかった。3)フェロモントラップによるコナガの発生調査と捕獲された個体のDNA抽出を開始した。平成28年度の計画は、1)リアノジン受容体遺伝子が重複しているか否かを明らかにする、2)mRNAとして発現しているリアノジン受容体遺伝子を明らかにする、3)感受性系統に存在するG4946Eをコードするリアノジン受容体遺伝子配列の構造を明らかにする、4)ジアミド剤抵抗性に関わるリアノジン受容体遺伝子を検出するための手法を確立する、5)G4946E以外のアミノ酸変異のジアミド剤抵抗性への関与を検証する、6)フェロモントラップを用いたコナガの発生消長調査と捕獲された成虫の回収、解析を3年間継続して行う、であった。これらの計画のうち、3年間継続して行なう6)以外については、いずれも一定の成果が得られ、成果の一部は英語の論文として公表されたため。1)昨年度はコナガのジアミド剤抵抗性の主要因であるリアノジン受容体のG4946E部位の変異を個体レベルで調べる手法を開発した。本年度は、量的シーケンシングを用いて同変異の個体群内における頻度を推定するための手法を開発した。その手法を用いて、様々な地域で採集されたジアミド剤に対する抵抗性レベルの異なるコナガ個体群におけるG4946E頻度を調べた。実際のコナガ防除においては、G4946E頻度が40%未満であればジアミド剤の効果が期待できるが、40%以上であればジアミド剤の効果が期待できないので他の系統の薬剤を中心とした防除を行なうことが望ましい。2)上記手法を用いて、野外におけるコナガ個体群のG4946

E頻度の季節的な変化を防除圧の異なるキャベツ圃場(薬剤散布圃場と無散布圃場)に設置されたフェロモントラップに捕獲されたコナガを用いて調べた。その結果、いずれの圃場においてもG4946E頻度は一般に春から夏にかけて上昇し、秋に低下すること、晩秋の頻度と翌春の頻度はほぼ同じであることが明らかとなった。以上の結果は、当該年のジアミド剤の防除効果は、前年のG4946E頻度に基づいて予測できることを示しており、コナガ管理において非常に重要である。G4946E頻度が春から夏にかけて上昇する理由は薬剤散布と考えられるが、秋に低下する理由については現時点では不明である。また、両圃場で採集されたコナガ個体群のG4946E頻度には大きな違いが認められなかったが、これは両圃場が200m程度しか離れておらず、成虫の移動による遺伝子交流があったためと考えられた。平成29年度の計画は、量的シーケンシングを用いたジアミド剤抵抗性に関わる遺伝子変異(G4946E)の個体群内における頻度推定法を開発することであった。今年度は、G4946E頻度推定法を開発して英語論文として公表した。加えて、フェロモントラップで採集された野外のコナガ個体群におけるG4946E頻度の季節的変化を明らかにし、こちらも英語論文として公表できたため。コナガのジアミド剤抵抗性の主要因はリアノジン受容体のアミノ酸変異(G4946E)による感受性の低下である。本研究ではまず、コナガにおいてリアノジン受容体遺伝子が重複している可能性を調べたが、採用した手法では確かな証拠を得る事はできなかった。今後、次世代シーケンサー等を用いた解析を行なう必要がある。コナガ個体群のG4946E頻度を調べる手法を開発した。その手法を用いて、様々な地域で採集された、ジアミド剤に対する抵抗性レベルの異なるコナガ個体群のG4946E頻度を調べた。その結果、抵抗性レベルとG4946E頻度の間には正の相関があること、G4946E頻度に基づいてジアミド剤のコナガに対する防除効果を予測できることが示唆された。すなわち、G4946E頻度が40%未満であればジアミド剤の効果が期待できるが、40%以上であればジアミド剤の効果が期待できないので、他の系統の薬剤を中心とした防除を行なうことが望ましい。上記手法を用いて、野外におけるコナガ個体群のG4946E頻度の季節的な変化を、3年間にわたって、野外のキャベツ圃場に設置されたフェロモントラップに捕獲されたコナガを用いて調べた。その結果、G4946E頻度は春から夏にかけて上昇し秋に低下すること、晩秋の頻度と翌春の頻度はほぼ同じであることが明らかとなった。1年目の調査では、調査圃場におけるコナガのG4946E頻度が40%を越えていたため、2年目と3年目はジアミド剤の使用を中止し、作用機作の異なる薬剤散布に切り替えた。その結果、3年目にはG4946E頻度がジアミド剤の効果が期待できる40%未満に低下した。このことは、G4946Eによるフィットネスコストを示唆している。
筋緊張や伸展の強い児童生徒の学習レディネスを成立させるための対応と座位姿勢の検証

座位保持椅子作成時、体圧分布測定により調整を視覚化したことで、保護者、車椅子業者、訓練士、担任との連携がスムーズになり、互いに満足できる事例が増えた。また、座位姿勢が崩れる原因が特定できるようになり、画面を見ながらの調整が可能になった。苦痛を伴うトラブルを引き起こしている多くの事例において、座骨の2点のみで体重のほとんどを支えていることが判明した。前座部と胸郭下部、頸椎部の圧力を高め、坐骨部を免苛し、ハンドリングを再現した様な調整での解決が多かった。積極的な身体へのアプローチとして、子どもの快適な表情を探るうちにできあがった『ぐるぐる体操』(両腿で対象児の骨盤を固定し体幹部を旋回させる運動〉は、言葉による発信ができない多くの子どもたちが毎日求めてくることから、重度障害のある多くの子どもに対して行うようになった。『ぐるぐる体操』を継続していくとある時期に「突然筋緊張の緩む」「背中の隆起が消える」等の数件の事例や「呼吸機能の改善」「短縮部の伸長」といった変化も認められた。取り組み前後のレントゲン撮影や写真比較などからも、有効性が確認できた。これは、活動の停滞していた体幹部を回転運動させることにより、胸郭や横隔膜、背筋群等が連続的に動かされ、筋緊張が誘発されない状態で血流量が増えたことにより、変化が引き起こされたと思われる。また、知的障害部門のぎこちない動きの子どもに対しても、意図を持った積極的な身体へのアプローチによる変化が顕著であった。身体の変化に伴って摂食や認知も変化する事例が多く、学習レディネス成立との相関関係が深いことが検証できた。週、数時間の医療訓練は活動の可能性を広げてくれるが、日常活動として定着することは少ない。多くの時間を過ごす学校においてこそ、日常的に行える状況を作りだしていくことが、今後求められていくのではないだろうか。