hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深層循環の層重特性

平成元年度は、6月の淡青丸と8月の白鳳丸の研究航海を実施し、ソーファーフロートシステムによる四国海盆の深層循環の直接測定を行った。3台の受信局を北緯30度、東経135度を中心とする一辺約250Kmの三角形の頂点に係留し、観測深度の海水中で中立になるように密度を調整したフロートを放流する。フロートは780Hzの音響信号を1日2回するので、各受信局への到達時刻からフロートの位置を決めることができる。淡青丸では受信局2台の設置回収と8台のソーファーフロートの放流を行った。放流深度は、1000、2000、3000、4000mで各々2台である。白鳳丸では受信局1台の設置回収を行った。昭和63年4月の白鳳丸航海で1500m層に2台、11月の散天丸航海で1500m層に2台のフロートを放流してある。従って、四国海盆には12台のフロートが漂流しており、1時間毎に音響信号が発信されていることになる。平成元年8月までに、1500mの2台については450日、他の2台については240日分の受信記録が得られた。これらの記録からフロートの位置決めを行い、次の知見が得られた。1)四国海盆には、北緯31度、東経136度を中心とする直径約400Kmの時計回りの循環がある。約300日で一周するので平均速度は4cm/secである。海上保安庁は、200m層に19°C等温線で見ると、直径300Kmの暖水塊が観測されたことを報告しており、フロートの軌跡はこの暖水塊の回りの循環を計測している。2)九州の南方から東方の黒潮の下層には南向き、2cm/secの反流がある。3)伊豆海嶺の西方に35月に最大流速80cm/secの南北振動がある。これらの成果について、国際学会の発表と学会誌への論文投稿を予定している。
放射線による血管内皮細胞の老化機構と血管新生に及ぼす影響

腫瘍の血管新生に対する電離放射線(IR)の影響に関する研究は少ない。本研究では、IRが腫瘍血管を構成する血管内皮細胞(EC)にどのような影響を及ぼすのかについて検討した。IRがECにアポトーシスを引き起こすことはよく知られているものの、その頻度は10Gyという比較的大線量でも10%程度である。我々は、増殖期にある血管内皮細胞(EC)に8Gy照射すると、ほとんどのECが(90%)3日目あたりから扁平巨大化し、増殖が停止することを見いだした。この現象は線量依存的で、老化様形質と極めて類似していたことから、老化マーカーとして知られるβ-ガラクトシダーゼ活性を調べると、ほとんどの細胞が陽性を呈していた。また、網羅的遺伝子発現プロファイル解析により、DNA複製関連遺伝子群と紳胞周期進行遺伝子群の発現減少、接着因子群の発現上昇といった老化細胞に特徴的なパターンを示したことから、この現象は老化であると結論した。次に、IRによって老化した細胞を用いて、血管新生能がどのような影響を受けるかについて検討した。その結果、細胞増殖能、遊走能、浸潤能が有意に低下しており、IRによって老化を誘導したECは、その血管新生能が抑制されると推測された。我々は、プラトー状態で静止期にあるECでは、老化様形質の発現が抑制されることを見いだし、その原因は、IRによって引き起こされたDNA二重鎖切断(DSB)修復能がプラトー期において充進しているためであることを突き止めた。以上の結果は、IRによって引き起こされる老化様形質の発現が、IR照射後のECの血管新生能に大きな影響を及ぼしている可能性を示唆した。本年度は、γ線8Gy照射によって老化様形質を示した血管内皮細胞の血管新生能について検討を行った。血管内皮細胞としては、増殖期にあるウシ大動脈由来血管内皮細胞(BAEC)とヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を用いた。増殖期のBAECは、ほとんどの細胞が老化梯形質を示し、これはHUVECでも同様であったので、これらの老化様細胞と正常な細胞との間で、アフィメトリクス社のマイクロアレーを用いて遺伝子発現パターンの違いを解析した。老化様細胞ではDNA複製と細胞周期進行に関連する遺伝子の発現が最も影響を受けており、実際、BrdUの取り込みや細胞増殖能が著しく低下していることがわかった。また、老化した細胞では細胞外マトリックスの発現が亢進し、MMP-9の発現も亢進していた。そこで、ゼラチナーゼ活性を利用したアッセイによりMMP-2とMMP-9の活性を調べた所、前者の活性のみが検出され、老化様細胞において有意に亢進していた。スクラッチアッセイによる遊走能では、HUVECにおいて老化様細胞においてやや亢進していたが、BAECでは差は認められなかった。マトリゲル上でのキヤピラリー形成能をみると、両者に差はなかった。次にマトリゲルを通過する浸潤能をみると、いずれの細胞でも老化様細胞において低下しており、また、細胞をマトリゲルに包埋して遊走してくる細胞をみると、老化様細胞においてその能力は低下していた。以上の結果から、放射線によって老化様形質を示した血管内皮細胞は、増殖能が著しく低下し、また、in vivoに近い状況においては、遊走能や浸潤能が低下することがわかった。従って、放射線は、増殖期の血管内皮細胞に老化を引き起こし、結果として血管新生能を低下させる方向に向うことが示唆された。以上の結果は、現在論文投稿中である。興味深いことに、コンフルエントな状態では老化様形質が回避されるメカニズムが存在することもわかり、次年度はそのメカニズムについて研究を進める。我々は、ウシ大動脈血管内皮細胞(BAEC)を用いて、コンフルエントな状態で放射線を8Gy照射すると老化様形態の発現が顕著に抑制されることを見いだし、本年度は、そのメカニズムについて検討した。

細胞が進展するスペースの問題を検証するため、照射直後に低細胞密度で播き直してみると、増殖期の細胞と同様、ほとんどの細胞が老化様形態を呈した。ところが興味深いことに、照射後72hインキュベーションしてから播き直しを行うと、老化様形態の発現が顕著に抑制されていた。このことは、照射後コンフルエントな状況でインキュベーションしている間に、老化様形質の発現が回避される現象が起こっていることを示唆している。最近、細胞分裂を繰り返すことでテロメアの短縮が起こって老化する現象、すなわち複製老化において、テロメア断端のDNA二重鎖切断(DSB)の蓄積が老化の原因でみるとの考え方が受け入れられている。放射線は直接DSBを引き起こすことから、コンフルエントな状況において、DSB修復の亢進が起こっている可能性を考えた。そこで、コンフルエント状態と増殖期にある細胞におけるDSB修復の効率を、ヒストンH2AXのリン酸化(γH2AX)を指標にした免疫蛍光染色にて検討した。増殖期の細胞では、照射していない細胞でもγH2AXが検出されることから、ATMの基質となるp-LS/TQ配列を認識する抗体を併用し、二重染色フォーカスを放射線特異的なDSBとして定量した。その結果、コンフルエント状態にある細胞において、フォーカス消失速度が早く、DSB修復が亢進していることが判明した。これは、放射線生物学で古くから知られる潜在的致死損傷回復(PLDR)との関連性を強く示唆するもので、BAECにおいてPLDRとは、DSB修復が亢進し老化が回避された結果、増殖能が維持されてコロニー形成率が上昇する現象であるという新しい解釈を提唱した。
都市の再生と地方の自立のための経済理論研究

この報告書は、本研究による研究実績の一部を報告している。(スペースの関係である。)本研究において、多数の人々が研究分担をし、その他の多数の研究協力者をえた。実際の成果物については本報告書の論文欄に示している以外にも多数ある。そのいくつかを研究報告論文集として、まとめている最中である。本研究は、成果としての論文等だけでなく、海外の国際学会に出席し論文を発表したり、台湾での研究発表・シンポジウムを行い、さらに年度末には、研究をまとめ、今後のさらなる発展を目指した、沖縄でのシンポジウムなどを行うことが出来た。都市の再生は、今年から現内閣の重点政策の一つにも数えられ、様々な側面からも我々の問題意識が確認された年でもあった。これらの追い風をうけ、許されるならば将来にわたって、この研究組織を有効利用した研究を行っていきたい。本年度は、夏に韓国財政学会と合同シンポジウムを行い、スペインでの国際財政学会にもメンバーの多くが参加し、論文発表やコメントを通じ、活発な研究交流を行うことができた。加えて、毎月1回のペースで行われている研究会も順調に進み、その総決算として、2月に関西の研究者の参加も得て、シンポジウム、研究発表会を行った。1年間の活動を報告書の形にまとめるつもりである。報告書は、論文集の形をとり、以下の論文が収録される。3.林正義「租税外部性と租税負担」7.横山彰「地方環境税と政府行動」10.門前直孝・福重元嗣「公立高校への財政支出の実証分析」この報告書は、本研究による研究実績の一部を報告している。
古代末から初期中世に至る教会堂建築の空間的展開-周歩廊の形成とその意味-

本研究では、周歩廊の機能と中央空間との関係を明らかにすることを目的として、実測調査とスポリア材の配置計画の分析を行った。各事例の調査結果を比較したところ、(1)スポリアの配置によって周歩廊と中央空間は異なる空間秩序をもつことが示されており、また(2)中央空間に対するアプシスの軸線と周歩廊の一部である会堂入口の軸線が斜めに交差することから、人々は入場後、周歩廊を環状に回ってから中央空間に入場すること、が明らかになった。サンタ・マリア・マッジョーレ洗礼堂の再利用材調査から以下の特徴が確認された。1、身廊と周歩廊を区画する15組30本の二連環状列柱の柱身は、石材の種類と色調を基準にアプシスから対称に配置されているが、アプシス北側から5番目の柱で対称性が崩されている。2、柱頭は基本的にコリント式だが、アプシスから時計回りで6・11・12番目の身廊側にのみキリスト教的象徴性をもつイルカの柱頭が使用されている。これは例外的な意匠であり、仕上げの水準も非常に高い。またサンタンジェロ聖堂でも以下の特徴が確認された。1、身廊と周歩廊を区画する16本の環状列柱の柱身には、白色系の石材と暗色系の石材が2本ずつ身廊を挟んで対称に使用されている。白色系石材はアプシス(東西方向)と入口(南北方向)に対応している。暗色系石材のうち6本は黒大理石だが、南西に位置する2本の柱身のみ大きく緑色の縞が波打つチポッリーノが使用されている。2、柱頭はほぼすべてがコリント式であるが、南西の柱頭のみコンポジット式が一つ使用されている。通常、初期中世の教会堂の再利用材は、対称性を重視し空間の機能や意味を視覚的に示すように配置される。この原則は上記会堂においても基本的に守られているが、柱身と柱頭の例外的な部材はアプシス及び主入口からの軸線とも対応しない不規則な位置にある。また、アプシスに向かう軸線に対して約120150度ほど振れた位置に例外的な部材が配置されている点でも共通している。この位置関係は、サン・ヴィターレ聖堂(6世紀初頭)におけるアプシス軸線に対する入口軸線の傾きと同様であり、6世紀の集中式会堂における身廊と周歩廊の関係を考察する上で注目される。また上部架構および壁面に関しては、高精細画像をもとに三次元写真画像解析ソフトによる解析を進めている。トータルステーションによる測量は次年度の調査許可を申請している。前年度に引き続き、サンタ・マリア・マッジョーレ洗礼堂(ノチェーラ)の調査を実施した。3月の調査ではポータブル・レーザー測距器の使用許可を取得して簡易実測を実施した結果、以下の考察を得た。中央に洗礼槽をもつ身廊と周歩廊を区分する15組30本の二連環状列柱の柱間は、内側で約1.92m(1.861.97m)、外側で約2.26m(2.112.38m)であった。アプシス前はやや広く、内側が3.44m、外側が3.89mであった。各柱間の幅にみられる約1027cmの差は、寸法の異なる再利用材を使用していることに起因すると考えられる。また、身廊側列柱において、その他の柱間とアプシス前の柱間の比率は約1:1.8であり、列柱の位置が正十六角形ではないことを確認した。このことから、まず身廊中心とアプシスを結ぶ主軸線の延長が反対側の環状列柱の円と交差する位置に最初の円柱を配置し、そこから他の円柱をアプシス方向へほぼ等間隔で配置した、という仮説を得た。さらに、柱間と正対するように反対側に円柱が配置されており、周歩廊から柱間を通して身廊を見るとき、反対側の周歩廊(およびアプシス)は視界に入らない。したがって、必然的に視線は身廊におかれた洗礼槽に集中することになる。この配置は、身廊内の儀式に対して周歩廊にいる人々の意識をより焦点化するため意図的に行われたと考えられる。上記のような特性は、環状列柱の配置において対称性と十字架形の交差軸線を意識したサント・ステファノ・ロトンド聖堂(ローマ)およびサンタンジェロ聖堂(ペルージャ)とは明らかに異なっている。今後、さらに精密な測量を実施し、スポリアの配置と空間構成について検討する。本年度は、サンタ・マリア・マッジョーレ洗礼堂(ノチェーラ)およびサン・ミケーレ・アルカンジェロ聖堂(ペルージャ)の現地調査を実施した。サンタ・マリア・マッジョーレ洗礼堂ではく三次元レーザースキャナを利用して会堂内の三次元計測を実施した。この建築では初めての三次元実測であり、基礎データとして重要な意義を持つ。外壁部についても実測する予定であったが、天候が悪化して残念ながら実測することができなかった。

しかし、曲率が途中で変化する中央ドーム内面の形状を正確に計測し、また周歩廊外壁に残る開口部の痕跡や修復の痕跡を記録することができた点で、大きな成果であった。今後、本研究で検証を進めているアプシスへ向かう軸線と開口部の関係を、本実測に基づく三次元モデルによって分析していく。またサン・ミケーレ聖堂では、レーザー距離計によって堂内各部の実測を行った。環状列柱のそれぞれの柱間と、柱頭・柱身のスポリア材および柱台によって示された十字型の軸線、およびその軸線から外して配置された本来の入口との関係について考察を進めている。特に、アプシス軸線と正対しない入口およびスポリア材という特性については、本研究の対象であるサンタ・マリア・マッジョーレ洗礼堂とアギオス・セルギオス・ケ・バッコス聖堂にも共通する特徴であることは注目すべき点である。初期中世に建設された集中形式において、この特別な配置がもつ意味、および各会堂本来の機能との関係について、最終的な論考をまとめる予定である。
人間の思考と言語に関する大脳各領域のポジトロンCTによる研究

“前日の出来事を経過を追って思いだし、喋る"という日常よく行なっていることを課業として用いた時の脳の賦活のされ方をポジトロンを用いて局所脳血流量や局所脳酸素代謝率の変化を指標として調べた。この課業を行なうには、課業を行なおうとする意志やその遂行のためのプログラミングに関する機能、記憶に関する機能、言語機能、口や舌、咽頭の運動およびその強調に関する機能などさまざまな機能が要求される。したがって、本課業により被検者の脳の多くの部位で局所脳血流量、脳酸素代謝率の増加が見られる。正常人では左大脳半球のシルビウス裂周辺部、いわゆる言語野や反対側のシルビウス裂周辺部、両側の前運動野、補足運動野などが特に賦活された。本方法はさまざまな病変を持つ患者の脳の機能の研究にも応用することが出来る。例えば脳に占拠性病変を持つ2症例(40歳、右利き男性、左視床腫瘍(astrocytoma)、及び37歳、右利き男性、右側頭葉クモ膜嚢胞)では、いづれも意識障害なく、日常会話は普通に可能であったが、局所脳血流においても局所脳酸素代謝率においても病巣と反対側のシルビウス裂周辺部、とくにブロ-カ野に相当する右前頭葉で増加が著しいことが明らかにされた。病変を有する脳では、脳の機能の障害に応じて賦活のされかたの違いがあり、正常人とさまざまな障害を有する患者の脳の賦活のされかたを比較することにより、障害を有する脳の統合機能の特性、ひいては正常人の脳機能の解明に近付くことが出来ると考えられる。
尿路性器感染症における尿中炎症増強物質の検討-好中球活性酸素生成に対するPriming作用の検討-

われわれは、既に尿路感染症患者の尿中に遊出する好中球について、尿中に遊出後も機能が残存していることを解明してきている。また末梢血好中球は種々の物質によりプライミングを受け、刺激応答が著しく増強することを示してきた。今回は尿路感染症患者の尿中に含まれる物質により末梢血好中球が如何にプライミングを受け、その活性酸素の生成機構を変化させ、その尿路感染症の炎症反応の強弱に関与しているかを検討した。ヒト末梢血好中球は既報の如く測定した結果、活性酸素を1.25×10^<-8>MのFMLP刺激で0.42±0.7nmol/5min/10^6cells、同じく1×10^<-9>MのPMA刺激で11.3±3.25nmol/5min/10^6cells生成した。この好中球に対し、患者感染尿をプライミングさせて活性酸素生成能を比較検討したが、患者の感染形態、プライミングの時間、感染尿の濃度等に関係なく活性酸素生成能の増強作用は認められかった。結果として、今回の検討では尿路感染症患者の尿中物質による好中球の活性酸素生成能の増強は認められず、尿路感染症の炎症反応の強弱と尿中物質との関連を好中球の活性酸素生成から関連づけることは出来なかった。今後は症例の更なる蓄積に加え、尿路感染症尿に含まれる物質の分画を抽出し、その濃度やプライミング時間を変化させて好中球の活性酸素生成能を測定することで、尿路感染症への尿中溶解物質の関与を検討し、好中球の尿路感染症の関与等の尿路感染症機構の解明を続けていく予定である。
抑止力のない罰則を機能させる仕組：罰則情報のフィードバック効果に関する実験研究

2018年度は,昨年実施した実験から,情報のフィードバックを利用して相手の将来行動を操作しようとする動機を発見した.この研究成果は,実証手法を用いた経済分析などを対象とする海外ジャーナルの「Applied Economics」において公刊された.この研究について詳しく解説する.協力インセンティブがない公共財供給状況においては,ラウンドを繰り返すたびに均衡(非協力)へ近づく一方で,ある程度の協力が観察されてきた.この協力については,利他性,混乱,条件付協力,戦略的動機などいくつもの動機が提案されてきたが,これまでに一致する結果を得たわけではなかった.特に興味深いのは,相手が毎回異なる繰り返し環境(Strangers条件)であったとしても,無条件協力行動(相手がフリーライドするとわかっているのに協力する行動)を観察している点である.そこで,本研究では,被験者の行動動機を直接聞き出すcoding methodと呼ばれる新しい手法を用いて,この無条件協力動機について明らかにする実験を実施した.その結果,公共財への貢献額は,条件付協力行動と無条件協力行動で全体のおよそ8割程度を占めており,無条件付協力の動機は,教育的動機(短期的には損してでも,自分の行動を通じて相手に協力を選ぶ者がいることを教え,長期的には協力する者を増やす動機)であることがわかった.言い換えれば,フィードバック情報を用いて,相手の行動を自分達にとって都合のよい環境へと操作しようとする間接的な戦略動機であると言える.どの国にとっても,政府税収を確保することは持続的で基本的な問題である.そのため,脱税には罰則が規定されている.しかし,現実社会における低い監査率と小さい罰則では,脱税に抑止効果がないのではないかと指摘されている.本研究では,脱税に関する情報をフィードバックすることで,社会的要因が強化され,納税協力が高まり,たとえ抑止力がない罰則であったとしても機能することを実験手法を用いて検証する.本年度は,実験のデザインを完成させ予備実験をすることを目的としている.そのために,まず,抑止力のない罰則を理論的に構築する必要がある.この点については,先行研究などを調査し,適切な理論モデルを採用した.具体的には,標準的な線形の公共財供給ゲームのもとで,ある閾値水準を要求し,その水準を下回った違反者を全員罰する.なお,「閾値水準>罰則の大きさ/公共財への投資1単位あたりの損失」のときに公共財へ投資しないことが支配戦略となり,罰則制度は抑止力を失う.次に,公共財供給ゲームにおいて情報のフィードバック効果を検証している実験研究について調査し,それらも参考にしながら実験デザインを検討した.現在は,予備的な行動実験を繰り返し,適切な実験デザインを検討している段階である.また,研究目的をさらに深く理解するために,簡易な視線計測装置を用いて,どのようなフィードバック情報について被験者が注視しているのかも実験的に検証している.本研究の目的は,脱税に関する情報を公開することで,社会的要因が強化され,納税協力が高まり,たとえ抑止力がない罰則制度であったとしても機能することを実験を用いて確認することである.この研究目的を達成するために,同じ罰則の大きさ(金銭的インセンティブ)のもとで,罰則に関する情報が公開されるか,公開されないかを比較する必要がある.本年度は,研究の第1ステップとして,抑止力のない罰則の理論モデルについて決定した.さらに,第2ステップとして情報を公開するとき,しないときの予備的な行動実験を実施した.また,視線計測装置を用いて,被験者の情報探索について理解を進めている.どの国にとっても,政府税収を確保することは持続的で基本的な問題である.そのため,脱税には罰則が規定されている.しかし,現実社会における低い監査率と小さい罰則では,脱税に抑止効果がないのではないかと指摘されている.本研究では,脱税に関する情報をフィードバックすることで,社会的要因が強化され,納税協力が高まり,たとえ抑止力がない罰則であったとしても機能することを実験手法を用いて検証する.2017年度は,まず抑止力のない罰則を理論的に構築した.この点については,先行研究などから採用した.具体的には,標準的な線形の公共財供給ゲームのもとで,ある閾値水準を要求し,その水準を下回った違反者を全員罰する.なお,「閾値水準>罰則の大きさ/公共財への投資1単位あたりの損失」のときに公共財へ投資しないことが支配戦略となり,罰則制度は抑止力を失う.次に,公共財供給ゲームの実験において,フィードバック効果を検証している実験研究について調査し,それらを参考にして実験デザインを完成した.現在は,2017年度に検討した実験計画を段階的に実験している状況である.実験から,おおむね予想通りの結果が得られてはいるが,統計的な有意差が得られるにはいたっておらず,今後も引き続き,実験を続け理解を深めたい.一方で,情報のフィードバックを利用して相手の将来行動を操作しようとする動機を派生的に発見した.これについては既に論文を完成させ,現在,海外雑誌へ投稿する準備が整いつつある.予備的な実験を実施したものの,被験者は予定していた人数よりも少なく,その結果,報酬の支払額が当初よりも少なかったため.2018年度は,昨年実施した実験から,情報のフィードバックを利用して相手の将来行動を操作しようとする動機を発見した.この研究成果は,実証手法を用いた経済分析などを対象とする海外ジャーナルの「Applied Economics」において公刊された.この研究について詳しく解説する.協力インセンティブがない公共財供給状況においては,ラウンドを繰り返すたびに均衡(非協力)へ近づく一方で,ある程度の協力が観察されてきた.

この協力については,利他性,混乱,条件付協力,戦略的動機などいくつもの動機が提案されてきたが,これまでに一致する結果を得たわけではなかった.特に興味深いのは,相手が毎回異なる繰り返し環境(Strangers条件)であったとしても,無条件協力行動(相手がフリーライドするとわかっているのに協力する行動)を観察している点である.そこで,本研究では,被験者の行動動機を直接聞き出すcoding methodと呼ばれる新しい手法を用いて,この無条件協力動機について明らかにする実験を実施した.その結果,公共財への貢献額は,条件付協力行動と無条件協力行動で全体のおよそ8割程度を占めており,無条件付協力の動機は,教育的動機(短期的には損してでも,自分の行動を通じて相手に協力を選ぶ者がいることを教え,長期的には協力する者を増やす動機)であることがわかった.言い換えれば,フィードバック情報を用いて,相手の行動を自分達にとって都合のよい環境へと操作しようとする間接的な戦略動機であると言える.2016年度に実施した予備的な実験・視線計測装置を用いた実験から得られた結果を踏まえ,さらによい実験デザインがないか検証する.まずは,検証した結果を,2017年度の前半に実施する予定である.そして後半には,本番の実験を実施する予定である.2017年度に作成した実験計画を実験する.さらに,結果を分析し,論文としてまとめ,海外雑誌に投稿を目指す.当該年度では,予備的な実験を実施したものの,被験者は予定していた人数よりも少なく,その結果,報酬の支払額は当初予定よりも少なかったため.2017年度は実験被験者の数が当初予定していたより少なかったため.次年度では,予備実験のみならず,本実験も実施する.特に,本実験では,被験者数をより多く確保するために,昨年度の余剰金を利用する.多くのデータを得ることで,より精度の高い結果を導くことができると考える.
改変PEPC遺伝子導入植物の作出を目指したC4光合成酵素の構造生物学

本研究では、C4植物に特徴的な酵素であるホスホスノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)のin vitro活性調節機構を解明することを目的として、PEPCに元来備わっている活性調節の分子機構解明に加えて、PEPCの活性調節に関与する同じ代謝系の酵素群の機能を構造科学的に解明することを目的とした。まず、アロステリック阻害剤であるリンゴ酸に阻害を受けない大腸菌由来酵素変異体K620Sの立体構造解明を目的として、酵素を大量発現し結晶化を行った。その後、放射光施設Spring-8にて回析強度データ収集を行い、3.0Å分解能までのデータを収集した。続いて、分子置換法により構造解析を行い、アロステリック阻害剤脱感作の分子機構を明らかにした。現在、研究成果のとりまとめを行っている。次に、PEPCの活性調節に重要な役割を担っているPEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)の立体構造解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。微結晶は得られたものの残念ながらX線構造解析に適した単結晶は得られておらず、引き続き精製・結晶化を行っている。続いて、PEPCの阻害剤であるリンゴ酸を基質とするNADP依存型リンゴ酸酵素(NADP-ME)の構造-機能相関解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。単結晶を得ることが非常に困難であったが、SPring-8にて3.0Å分解能の回析強度データを収集することに成功した。現在、立体構造解析に取り組んでいる。更に、本研究では、立体構造情報を元に生化学者と共同でPEPC変異体を作成し、詳細なPEPC活性調節メカニズムにおける構造-機能相関を解明した。これらの成果に加えて、本研究では数種類のタンパク質を扱い結晶化を行う過程で、溶液状態制御による新しい結晶化手段を考案し、これら新規手法が良質のタンパク質結晶成長に有効であることを明らかにした。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)は、C4植物とCAM植物の光合成組織においては光合成の初期炭酸固定酵素として、またこれらの植物の非光合成組織およびC3植物においては細胞内の炭素代謝と窒素代謝のバランスを決定する鍵酵素である。その酔素活性は、PEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)による分子内リン酸化や様々な活性調節因子(リンゴ酸など)によって調節される。PEPCをイネに高発現させることによって、炭酸固定効率が増大し、光合成の酸素阻害が低減されるとの報告もあり、PEPCの活性調節に関わるメカニズム解明が待たれている。我々は、植物の炭酸固定の分子機構と活性調節機構の全容を明らかにする目的で以下の研究を行った。更に、我々は、トウモロコシ由来NADP依存型リンゴ酸酔素の精製・結晶化に取り組んだ。0.1mm程度の大きさの結晶を作成することに成功し、5.0Å分解能の回折能を示す結晶を得ている。現在、結晶の質およびサイズの改良を目指して、我々が新しく開発した溶液状態制御による結晶化を行っている(Jpn.J.Appl.Phys 43,L79-L81(2004))。また、PEPCを特異的に認識するリン酸化酵素(PEPC-PK)については、フラベリア由来PEPC-PKの大量培養および精製方法の確立に成功し、微結晶を得ており、今後更なる結晶化条件の精密化を行う予定である。また、イネ由来Rubiscoについては、Rubiscoで初めてNADPHによる活性化促進の分子メカニズムを明らかにすることに成功し、現在論文投稿準備中である。

本研究では、C4植物に特徴的な酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)のin vitro活性調節機構を解明することを目的として、PEPCに元来備わっている活性調節の分子機構解明に加えて、PEPCの活性調節に関与する同じ代謝系の酵素群の機能を構造科学的に解明することを目的とした。まず、アロステリック阻害剤であるリンゴ酸に阻害を受けない大腸菌由来酵素変異体K620Sの立体構造解明を目的として、酵素を大量発現し結晶化を行った。その後、放射光施設SPring-8にて回折強度データ収集を行い、3.0Å分解能までのデータを収集した。続いて、分子置換法により構造解析を行い、アロステリック阻害剤脱感作の分子機構を明らかにした。現在、論文執筆中である。次に、PEPCの活性調節に重要な役割を担っているPEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)の立体構造解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。微結晶は得られたものの残念ながらX線構造解析に適した単結晶が現在のところ得られなかった。続いて、PEPCの阻害剤であるリンゴ酸を基質とするNADP依存型リンゴ酸酵素(NADP-ME)の構造-機能相関解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。単結晶を得ることが非常に困難であったが、SPring-8にて3.0Å分解能の回折強度データを収集することに成功した。現在、更なる結晶化条件の検索と立体構造解析を行っている。更に、本研究では、立体構造情報を元に生化学者と共同でPEPC変異体を作成し、詳細なPEPC活性調節メカニズムにおける構造-機能相関を解明した。これらの成果に加えて、本研究では数種類のタンパク質を扱い結晶化を行う過程で、溶液状態制御による新しい結晶化手法を考案し、これら新規手法が良質のタンパク質結晶成長に有効であることを明らかにした。
アゾール系薬剤耐性病原真菌の地理的分布の現状と将来予測

アスペルギルス症起因菌であるAspergillus fumigatus及びその関連種を対象に、本邦の主に野外環境における地理的分布とアゾール系薬剤に対する耐性株の実態解明を試みた。A. fumigatusの分布密度は緯度や土壌環境に影響をうけることが示唆された。本菌のイトラコナゾール(ITCZ)及びボリコナゾール(VRCZ)に対する耐性株は発見されなかった。本菌には地理的距離に関係しない遺伝的分化があることが分かった。一方、A. fumigatus関連種は分離頻度は低いが、広く分布していることが明らかになった。これらの種にはITCZやVRCZに耐性のある株が高頻度で存在していた。近年、アスペルギルス症の主要原因菌であるAspergillus fumigatusにおいて、臨床で頻繁に用いられているアゾール系薬剤に対する耐性株の出現が確認されている。本邦においても耐性株の存在が確認されているが、その分布にみられるパターンや分散プロセスは不明である。本研究では、耐性株の地理的な空間スケールでの分布を、農耕地や森林といった野外環境と臨床における調査から実証的に明らかにする。加えて、集団遺伝学的解析により耐性株の分散プロセスを推定する。本研究による分布の現状把握と将来予測に基づく耐性株拡散のリスク評価は、予防医学的に不可欠な情報を与えるだけでなく、自然界における微生物保全に関して考える糸口を提供する。本研究では次の二つの研究テーマを行う。テーマ1地理的分布の実態調査:アゾール系薬剤耐性株の野外環境及び臨床における分布を地理的なスケールで実証的に明らかにし、その制限要因を気候要因や土地利用の点から推定する。テーマ2集団遺伝学的パターンの調査:集団遺伝学的解析により各種における集団間の遺伝子流動や隔離の解析を行い、薬剤耐性株の分布拡大プロセスの推定を行う。最終的に、両テーマを総合的に考察する事により、将来の分布拡大を予測する。本年度は、昨年度に引き続き、それぞれのテーマの土台となる菌株の獲得と菌株のジェノタイピングを中心に研究を進めた。前者に関しては、北海道から九州に渡る12地域の森林もしくは畑地の土壌から分離培養を行い、現在のところ約300菌株を確保した。後者に関しては、昨年度開発した8遺伝子座を対象にしたマクロサテライトマーカーを用い昨年度確保した菌株のうち約200株について遺伝子型を決定した。近年、アスペルギルス症の主要原因菌であるAspergillus fumigatusにおいて、臨床で頻繁に用いられてるアゾール系薬剤に対する耐性株の出現が確認されている。本年度は、それぞれのテーマの土台となる菌株の獲得と分子マーカーの作成を中心に研究を進めた。前者に関しては、房総半島、伊豆諸島、日本アルプス、島根県出雲地域の森林もしくは畑地の土壌から分離培養を行い、約600菌株を確保した。加えて、千葉県の臨床から分離された136菌株を千葉大学からの分譲により獲得した。後者に関しては、公開されている全ゲノム情報を基に作成した165のマクロサテライトマーカーから多型性や特異性の点から集団遺伝学的解析を行うのに適したものを8個選択した。次年度はこれらのマーカーを用いたジェノタイピングを進める予定である。本研究では、耐性株の地理的な空間スケールでの分布を、農耕地や森林といった野外環境と臨床における調査から実証的に明らかにすること、集団遺伝学的解析により耐性株の分散プロセスを推定することを目的とした。

本研究による分布の現状把握と将来予測に基づく耐性株拡散のリスク評価は、予防医学的に不可欠な情報を与えるだけでなく、自然界における微生物保全に関して考える糸口を提供すると期待される。北海道から沖縄県に渡る25地点においてA. fumigatusの分布調査を行い、各地点における出現頻度を算出した結果、本邦の環境中には気候帯や土地利用にかかわらず本菌は幅広く分布していることが明らかになった。分離された環境由来株のうち90株に関しアゾール系薬剤に対する感受性試験を行った。その結果、イトラコナゾール及びボリコナゾールに耐性のある株は確認されなかった。環境由来413株及び千葉県と東京都の臨床から分離された192株に対し、ゲノムワイドな一塩基多型に基づき遺伝子型を決定した。それらの遺伝子型データを基に集団遺伝学的解析を行った結果、地域集団間における遺伝子の交流は著しいものの集団レベルの遺伝的変異において地理的位置との関連性がみられる集団も存在することが分かった。これらの結果は、現状では本邦の環境中にアゾール系薬剤に耐性のある株が分布している可能性は低いものの、胞子分散による頻繁な地域集団間での遺伝子の交流により、環境中の耐性株の存在が知られているユーラシア大陸から今後移入される可能性を示唆している。複合新領域本研究の達成の鍵を握る菌株の確保に関し、本年度採取した一部の土壌サンプルについて現在も分離培養作業を継続中であるが、5月までには終了する予定である。ジェノタイピングに関しては予定よりも少し遅れているが、昨年度確保した株に関しては概ね終了した。これらのことから、研究は概ね順調に進展していると考えている。本研究の達成の鍵を握る菌株の確保に関し、本年度は野外環境から約450株、臨床から150株と予想以上の数を獲得することが出来た。集団遺伝学的解析に必須の分子マーカーの開発も順調で8個のマイクロサテライトマーカーの選抜を終了することが出来た。今年度までに菌株の確保に関しては概ね終了した。次年度は獲得した菌株に対し、抗真菌薬感受性試験やゲノタイピングを進める。ジェノタイピングに関しては、マイクロサテライト領域を対象とするものに加え、次世代シークエンサーを用いたゲノムワイドでの一塩基多型解析も行い、両者の比較を行う。得られたデータから分布パターンを、気候帯や年平均気温等の気象データ、採取地点の土壌環境、土地利用などのデータに基づく多変量解析により推定することと、集団遺伝学的解析により現在の分布形成プロセスの推定を行うことが次年度の目標である。現在のところ獲得した菌株は、採取地点が限定的であり、広域的な分布パターンを明らかにするには未だ乏しい状態である。そこで、次年度は、北海道から沖縄にわたる異なる気候帯での網羅的なサンプリングを中心に行う。本年度は獲得した菌株に対し、抗真菌薬感受性試験やマイクロサテライトマーカーによるゲノタイピングを進めることはできなかった。分子マーカーの選抜は終了したので、次年度は獲得した菌株のジェノタイピングを先ず進める。
紫外線による象牙質の強化深度の確定と疲労破壊抵抗性の評価

申請者らの研究グループは,紫外線を用いることで象牙質の機械的強度が飛躍的に向上することを発見し,この知見をもとに失活歯の破折防止のための歯の強化法の開発に取り組んでいる。今回、365nm紫外線を用いての象牙質強化効果のメカニズムの解析を行なったところ、核磁気共鳴法の結果より、象牙質構成主要有機成分の一つであるタイプ1コラーゲンに作用して、その分子構造に変化をもたらすことで、象牙質機械的強度を強化していることが示唆された。失活歯の歯根破折は,歯科臨床において解決すべき重要な課題である。本研究課題では,生体に対し比較的安全領域である365nmの紫外線照射によって象牙質の曲げ強さが向上する事象に着目し,紫外線による強化効果の及ぶ深度を明らかにすると同時に,口腔環境を想定し,紫外線による象牙質の破壊抵抗性の変化を評価することを目的としている。24年度に計画した,紫外線照射によるコラーゲンの分子構造変化について核磁気共鳴法を用いて検索を行なった。タイプIコラーゲンのモデルペプチドとしてプロリンーグリシンーグリシンの5量体に紫外線照射を行なったところ,170ppm付近のプロリンのイミド環の二重結合に相当する部位と思われるところでのピークの変化が認められた。また,30ppm付近でもピークのシフトが認められ,水分子を介した結合や新たな水素結合が生じていることが分かった。以上のことから紫外線が象牙質コラーゲンに作用し新たな分子間結合を形成することで強化効果を示したことが分かった。本研究課題は,生体に対し比較的安全領域である365nmの紫外線照射によって象牙質の曲げ強さが向上する事象に着目し,紫外線による強化効果の及ぶ深度を明らかにすると同時に,口腔環境を想定し,紫外線による象牙質の疲労破壊抵抗性の変化を評価することを目的として行なった。象牙質の紫外線照射による強化効果メカニズムを解析するために,象牙質の主要構成有機成分であるタイプ1コラーゲンに着目し,紫外線照射によるコラーゲンの分子構造変化について核磁気共鳴法を用いて検索した。紫外線照射条件は最も象牙質の機械的強度が強化される,照射強度1600mW/cm2に設定し,照射時間を30秒, 15分に変更して短時間と長時間照射による影響を測定した。また口腔環境を想定し,水分の存在下での紫外線照射によるコラーゲン分子構造変化も測定した。核磁気共鳴法の結果より,紫外線照射によってコラーゲン分子構造が変化することが明らかとなった。C=O, CH2, CH3に相当する部位で,照射前後で比較するとピークがシフトするところや増幅するところが確認出来た。また水の存在によってピークのシフトが異なることが確認出来た。このことから紫外線照射によって象牙質コラーゲンに作用し,象牙質機械的強度を強化していることが示唆された。これらのことから,紫外線照射は象牙質表層コラーゲンに作用し,失活歯の破折防止法に有用であると考えられる。24年度の実施計画のうち,核磁気共鳴法を用いての紫外線照射によるコラーゲン分子構造変化の検索については予定通り進んでいるが,原子間力顕微鏡を用いたナノインデンテーションによる強化効果影響範囲の測定については計測が遅れているため,次年度も継続して行なっていく。25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度も研究実施計画に基づき研究を遂行し, 24年度の研究計画のうち実施が遅れているナノインデンテーションを中心に実験を追加して行なう予定である。
言語の脱「民族」化と現代文学 -多文化社会における表現活動と言語選択 -

多民族・多文化・多言語の共生が不可避の現実となっている現代社会の中で、作家や詩人たちが言語による表現活動において言語選択を迫られ、その言語選択が同時に彼らの表現活動の本質を特徴づけていく事例を個人的アイデンティティとの関連性において分析した。合わせてそうした輻輳するアイデンティティとの葛藤の中で行なわれる表現活動の中に、複数の社会・文化の関わりに由来する様々な問題性を検証し、新たなアイデンティティの在り方を探った。具体的な成果は以下の通りである。1アメリカ合衆国やインドなどのよく知られた「多民族国家」のみならず、日本、ドイツ、チェコ、ルーマニアといった、表面的には「国民国家」と見なされやすい国家についても多民族・多文化・多言語社会としての側面から捉え、母語と主要公用語との関係や言語教育・文化政策の現状について分析した。2当該地域で二つ以上の言語・文化を内面化しつつ言語表現活動を行なう作家・詩人のテクストを分析・検討し、社会の「多文化化」「多言語化」による言語観や文学観、言語表現の変質を跡付けた。3これらの作家・詩人が社会のマジョリティにいかに受容されているかを分析し、彼らが提示している新たな複合的アイデンティティが従来の言語観や文化観にフィードバックされる可能性を検討した。4以上の作業を通じて、従来の言語観およびそれを生み出した近代ナショナリズムを問い直し、新たな複合的アイデンティティに対する文化政策・教育政策を含めてのより広範な社会的承認の方途を探った。多民族・多文化・多言語の問題が顕在化している地域について以下の研究成果を得た。1アメリカ合衆国本土に在住するプエルトリコ人による英語およびスペイン語で書かれた文学において、表現活動と言語選択にあたって「民族」要因と共にジェンダー要因が重要な意味を持っていることを明らかにした。2インドにおける地域主義的・サブナショナリズム的な政治運動によって、地域言語のうちに「言語の脱民族化」とは逆の動きが顕著にあらわれ、歴史を捏造してまで地域の言語・文化を美化して政治利用する傾向が見られることを明らかにした。3戦後の在日コリアン文学者たちの日本語選択において、敵性の言語である日本語を逆手にとって言語としての普遍的作用を求め、想像力による虚構世界の構築によって日本的民族性を突き破り、日本文化の相対化と日本語の再創造を進めつつ、コリアン民族の原初の心を探りながら新しいアイデンティティを探る様相を検証した。4ドイツ現代文学、主としてフーヘルの詩篇において、ユダヤ・ヘブライ形象がその民族性を「脱構築」され、現代の政治状況・文化状況のなかに新たに位置付けされている様相を究明した。5現代ドイツにおける外国人の実状と問題点を各種資料や統計を駆使して考察し、非ドイツ語圏出身作家のドイツ語作品におけるアイデンティティと文学としての在り方を論究した。6ロマ社会とチェコ人社会の共生の困難さ、双方への教育の重要性を明らかにし、現代のロマの文学作品において創作言語としてはロマ語が選択されるケースが多く、またチェコの読者のために対訳本として出版されることが多いことを検証した。昨年度に引き続き、多民族・多文化・多言語の問題が顕在化している地域についての研究を行い、主として以下のような成果を得た。1カリブ海の島と米国本土に分かれて居住するプエルトリコ人のアイデンティティの様態を検証し、言語選択が必ずしもアイデンティティ保持と結びつかないこと、また統一言語の存在が必ずしもネーション存立の必要条件ではないことを明らかにした。2日系アメリカ人作家ミツエ・ヤマダの作品を分析し、イタリックスで印刷された日本語の多用によって、作者の先祖の言葉で外国語でもある日本語が醸し出す独特の効果を解明した。あわせて『収容所ノートーミツエ・ヤマダ作品集』の共訳を進めた。3ゾルベン文学におけるジャンル問題を考察し、叙情詩がもっとも開花したジャンルであることを明らかにした。あわせてその背景としてのゾルベン人の宗教性やドイツ語との関係を考察した。4亡命作家ナボーコフの小説、評論、自伝、書簡などから、母国語(ロシア語)による創作と英語による創作との意味の違いを考察した。また、革命前の祖国ロシアや少年時代の思い出がナボーコフにとってどんな意味を持つているかを明らかにした。

5ロマ文学における言語使用の様態を分析し、母語による創作活動が際立っている実態を解明した。社会状況、特にマジョリティとの関係による苦難の中で、アイデンティティ確立の手段としての母語選択に傾斜することが原因のひとつであると思われる。6ウクライナとルーマニアの国境地域に存在したブコヴィーナとよばれる地域を取り上げ、19世紀後半に積極的に行なわれたドイツ語、ルテニア(ウクライナ)語、ルーマニア語文学間の交流を、非ドイツ系ドイツ語作家たちを中心に跡付けた。
パーキンソン病サルモデルにおける多領域集団発振・同期現象の解析と介入

本研究では、パーキンソン病(PD)の霊長類モデルを用いて、大脳皮質、大脳基底核、視床、および小脳を含む広範な神経ネットワークから単一ユニット活動および局所電場電位(LFP)の同時記録をおこなう多領域多点同時記録を実施し、これらの領域の相互作用を特に周波数成分に着目して解析することにより、PDの病態発現への小脳の関与を明らかにするとともに、小脳への脳深部刺激(DBS)によるPDの治療効果を検討することを目的とする。平成30年度は、MPTP投与によって作製したPDサルモデルから、安静時およびボタン押し課題遂行中における大脳皮質、大脳基底核、小脳から神経活動(主にLFP)の多領域多点同時記録を実施した。その結果、PDサルモデルの小脳からベータ波の過活動を検出し、更にcross-frequency coupling解析により、運動遂行時における大脳皮質(特に一次運動野)との間のphase amplitude couplingが大脳基底核よりもむしろ小脳で顕著であることが明らかにした。具体的な結果は以下の2つである。(2)同様に、小脳(主に小脳皮質)と一次運動野との間のcross-frequency couplingを解析したところ、上記(1)の結果と異なり、健常時やチックモデルにおいて運動遂行時にみとめられるベータ帯域でのphase amplitude couplingが、PDモデルにおいても検出された。本研究の目的は、PDの病態発現への小脳の関与を検証し、小脳へのDBSによるPDの治療効果を検討することである。平成30年度における上記の研究実績は、PDの病態発現への小脳の関与を示唆しており、これにより、cross-frequency couplingに関する実験データに基づいて神経ネットワークの数理モデルを構築し、発振・同期の機能的意義を明らかにできるだけでなく、DBSによる治療効果の検討をとおして、神経活動への介入による発振制御とその臨床応用に関する新たな知見を得ることができる。すなわち、当初の研究計画にしたがって、前半のPDの病態発現への小脳の関与を明らかにしているため、「おおむね順調に進展している」と考える。当初の研究計画にしたがって、後半の小脳へのDBSによるPDの治療効果を検討する。具体的には、PDサルモデルにおいて、小脳、特に小脳核へのDBSによるPDの治療効果を検討する。従来PD治療のターゲットであった大脳基底核、特に視床下核へのDBSも併せて実施し、より効果的な治療法について比較、検討する。
炎症性腸疾患感受性遺伝子ＮＫＸ２．３が関与するｄｉｓｅａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ

NKX2.3は血管内皮細胞に高発現する転写因子で、炎症性腸疾患の感受性遺伝子と考えられている。NKX2.3が血管内皮細胞でどのようにして疾患感受性を高めるかを解明するために、血管内皮細胞における転写因子NKX2.3のターゲット遺伝子群を同定し、NKX2.3が疾患感受性に影響を与えるdisease pathwayを推測した。NKX2.3遺伝子導入後の発現解析とChIP on Chip両方法で同定された遺伝子は34個(MAdCAM-1を含む)あり、GO解析ではinflammatory response, cell proliferationに関与する遺伝子群が同定されてきた。炎症性腸疾患は原因不明の慢性腸炎で、日本でも患者が激増しており、病因解明が待たれている。また炎症性腸疾患は、疫学調査より発症に遺伝的要因が強く関与する多因子疾患とされ、遺伝因子を特定するため、genome wide association study(GWAS)が行われ、現在ゲノムの約30ケ所以上に有意に炎症性腸疾患と相関する領域が同定されている。その中でもNKX2.3遺伝子領域のTag SNP(rs10883365)は、人種を超えて炎症性腸疾患との相関が確認されたため、NKX2.3が有力な炎症性腸疾患の感受性遺伝子候補と考えられている。一方、GWASは統計学的に感受性遺伝子の存在する広範な領域を示すだけであり、その領域内で感受性遺伝子を確定するためには、領域内に存在する遺伝子がどのようにして炎症性腸疾患の感受性を亢進させるかというdisease pathwayを明らかにしなければならない。NKX2.3リスク対立遺伝子は血管内皮において高発現している特徴をもっていることが本申請者らの研究で明らかにされている。そこで転写因子NKX2.3が血管内皮でどのようにして疾患感受性を高めるか(disease pathway)を解析するために、血管内皮細胞における転写因子NKX2.3のターゲット遺伝子群を同定し、NKX2.3が疾患感受性に影響を与えるdisease pathwayを解明することを目的とする。また同時に、機能的にもNKX2.3が炎症性腸疾患感受性遺伝子であることを確定する。本年度は、NKX2.3発現ベクター作成を行い、HUVECを不死化したHUVEC CRL-1730を用いて、遺伝子導入の条件を検討した。遺伝子導入後の12時間後、24時間後の発現を解析した。解析には発現解析用マイクロアレイを使用した。現在、発現情報を解析している途中である。現在ゲノムの約163ケ所に炎症性腸疾患と相関する領域が同定されている。その中でもNKX2.3遺伝子領域のTag SNP(rs10883365)は、人種を超えて炎症性腸疾患との相関が確認され、NKX2.3が有力な炎症性腸疾患の感受性遺伝子候補と考えられている。そこで転写因子NKX2.3が血管内皮でどのようにして疾患感受性を高めるか(disease pathway)を解析するために、血管内皮細胞における転写因子NKX2.3のターゲット遺伝子群を同定し、NKX2.3が疾患感受性に影響を与えるdisease pathwayを解明することを目的とした。NKX2.3発現ベクター作成を行い、HUVECを不死化したHUVEC CRL-1730を用いて、遺伝子導入実験を行った。またChIP (chromatin immunoprecipitation)on Chipにてプロモター領域にNKX2.3が結合する遺伝子を同定した。さらにMAdCAM-1遺伝子5'領域をPCRにて増幅しpGL4.11[luc2P]firefly luciferase vector (Promega)に挿入し、プロモーターアッセイを行った。その結果遺伝子導入後の発現解析と、ChIP on Chipi解析にて、inflammatory response, cell proliferationに関与する遺伝子群が同定されてきた。MAdCAM-1遺伝子プロモターアッセイでは、NKX2.3の結合領域を確認することはできなかった。炎症性腸疾患は(クローン病と潰瘍性大腸炎の総称)原因不明の慢性腸炎で、日本でも患者が激増しており、病因解明が待たれている。

一方、GWASは統計学的に感受性遺伝子の存在する広範な領域を示すだけであり、その領域内で感受性遺伝子を確定するためには、領域内に存在する遺伝子がどのようにして炎症性腸疾患の感受性を亢進させるかというdisease pathwayを明らかにしなければならない。幸いにも、Tag SNP(rs10883365)が代表する領域内には、現在のところ遺伝子はNKX2.3しか存在していない。しかし、NKX2.3の機能解析は炎症性腸疾患分野においても世界的にまったく研究がなされていない。NKX2.3リスク対立遺伝子は血管内皮において高発現している特徴をもっていることが本申請者らの研究で明らかにされている。そこで転写因子NKX2.3が血管内皮でどのようにして疾患感受性を高めるか(disease pathway)を解析するために、血管内皮細胞における転写因子NKX2.3のターゲット遺伝子群を同定し、NKX2.3が疾患感受性に影響を与えるdisease pathwayを解明することを目的とする。また同時に、機能的にもNKX2.3が炎症性腸疾患感受性遺伝子であることを確定する。NKX2.3発現ベクター作成を行った。ヒトNKX2.3cDNAを哺乳類発現ベクターに挿入し,ヒトNKX2.3発現ベクターを作成した。作成方法はInvitrogen社のGatewayシステムを用いた。エントリークローンとしてヒトNKX2.3 cDNAクローン(cone ID: IOH10855 ,発現を解析した。発現解析用マイクロアレイを行った。μMACSTMmRNA Isolation Kitsを用いてmRNAを抽出精製後、Cyanine5、Cyanine3で標識RNAを作成し、AgilentのWhole Human Genomeアレイを用いてtwo color解析を行った。2011年3月11日の東日本大震災により、危機の破損、実験室棟の立ち入り制限があり、実験が施行できない状況が6月末まで続いた。7月より、水道が使用可能となり、また破損した遠心機等も購入が終了し、従来通りの研究が行える環境が整った。7月以降、NKX2.3発現ベクター作成を行った。エントリークローンとしてヒトNKX2.3 cDNAクローン(cone ID: IOH10855 , Invitrogen)を,デスティネーションベクターとしてpcDNA3.1 /nV5-DESTvector(Invitrogen)を用いて,作成した。サブクローニング後,GeneEluteエンドトキシンフリープラスミドミディプレップキット(Sigma-Aldrich)にて精製した。また、HUVECを不死化したHUVEC CRL-1730を用いて、遺伝子導入の条件を検討した。