hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素の局在化メカニズムの多様性：テトラヒメナとゾウリムシの明瞭な違い

シグナル配列を欠く.しかし代わりに,C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた.つまり,両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高いのである.今回の研究ではParameciumに存在する4種類のAKに焦点を当て,それらの細胞内での機能と局在メカニズムを明らかにする.今年は,以下の進捗状況の欄に詳細が記載されているように,P. tetraurelia AK3に見出された基質阻害のメカニズムの解明,抗体検出による4種類のAKの細胞内局在,P. tetraurelia AK3と同様にプレニル化シグナル配列を持つオオウミシダAKのプレニル化の証明実験を行った.1.P. tetraurelia AK3の基質阻害のメカニズムの解明:基質阻害は,基質濃度が高くなると酵素活性が低くなる現象を指し,一般的には活性部位に本来の基質結合部位とは異なる第2の基質結合部位が生じることによって引き起こされる.この現象は,整理機能と密接に関わっている場合がある.4種類のAK酵素の中で,AK3にこの現象が見られた.AK3の基質結合に関わるGS領域のアミノ酸配列D-D-S-Q-V (77-81番目の残基)に変異を導入した6種類の変異体(D77A, D78A, S79A, Q80A, Q80S, and V81A)を作成して基質阻害メカニズムの解明を行なった.結果的に,S79A変異体において基質阻害の大部分が消失し,S79が基質阻害に関わっていることが証明された.野生型酵素であるAK3に,この基質阻害が見られる生理的意義について今後議論する必要がある.2.AK1-4の細胞内局在:Paramecium AKの生体内局在を確かめるために、ポリクローナル抗体を使ったウエスタンブロットを行った.今回はAK2とAK3に対する二種類のポリクローナル抗体を作成した.Parameciumの生細胞全体,繊毛を除去した細胞,繊毛を単離し,上記二種の抗体を使ってウエスタンブロットによりAK2,AK3の局在を確認した.しかしながら,ウエスタンブロットの結果からは,局在に関する明瞭な情報は得られなかった.しかし,繊毛と細胞ではAKの発現量が大きく異なっていることが分かった.3.オオウミシダAK1のプレニル化の解明:オオウミシダのAK1はC末端側に明瞭なプレニル化シグナル配列を持つ.AK1を無細胞タンパク質合成系を用いて合成した.それをトリプシンで消化し,マススペクトル分析を行った(外注).その結果,C末端のトリプシンペプチドがゲラニルゲラニル化されていることが明らかとなった.高度な生理機能の維持には,酵素の局在化が重要な役割を果たしている場合が多い.この局在化が妨げられると酵素は本来の行き場を失い生理機能に重大な支障をきたす.我々は,繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ(AK1)が,N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした.そして,繊毛運動においてAK1をキー酵素とする連続的なATP供給機構を提唱した.一方で,繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる.後者のAKは,N末のミリストイル化シグナル配列を欠く.しかし代わりに,C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた.つまり,両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高いのである.
精子細胞特異的な転写因子PEBP2αAの構造・機能解析

成体マウスの各種臓器を用いたノーザン法では、PEBP2αA遺伝子は胸腺Tリンパ球及び精巣でのみ発現が認められ、極めて組織特異性が高い。生殖細胞を欠損するW/W^Vマウス由来の精巣にはPEBP2αAの発現は認められず、従ってPEBP2αAの発現は生殖細胞特異的である。野生型成体マウスの精巣よりパキテン期精母細胞・精子細胞を分画後ノーザン法を行うと、前者にも発現は多少認められるが、後者即ち半数体細胞において極めて強い発現が観察された。更に精子細胞が同調的に分化する、生後4週令の精巣でも強い発現が認められた。精子細胞で発現するPEBP2αAmRNAのcDNAの構造を決定した所、Tリンパ球mRNAとは、5′末端の塩基配列が異なる事が判明した。ゲノム・クローンを単離し解析の結果、精子細胞・Tリンパ球では異なる第1エクソンが用いられており、PEBP2αA遺伝子の発現が、組織特異的プロモーターの分別的制御下にあることが示唆された。また精子細胞mRNAのポリA鎖は、ORFの途中で付加しており、その20nt上流にATTAAAのポリA鎖付加シグナルが認められた。Tリンパ球mRNAではこの付加シグナルは利用されず、ずっと3′下流にある付加シグナルが利用されている。精子細胞mRNAは、開始Metコドンは有するが終止コドンは現れないという、不完全なORFを有する。in vivoにおいて本mRNAから蛋白が翻訳されているか否かについては、未だ明らかでない。しかしながら精巣・生殖細胞画分の抽出液には、PEBP2のDNA結合活性が検出されることは確認した。
単一微小油滴の自励発振現象

界面活性剤を含む水溶液中にキャピラリー先端から微小油滴を生成させると、キャピラリー先端に保持された油滴自身が激しく自励発振することを見出した。本研究においては、この自励発振現象を顕微鏡下で観察するとともに、振動を支配する要因の解明やレーザー散乱法などを用いて、その発振周波数の決定を試み、その特徴を明らかにした。自励発振現象が起こるためには、水相中にsodium dodecylsulfateなど界面活性剤の存在が必要不可欠であること、油相としてはオクタノール、ノナノール、ブタノールなどの低極性ではなく、水への溶解性が適度に高い必要があることを明らかにした。極性の低いニトロベンゼンや、カチオン性・中性界面活性剤を用いた場合には、油滴の発振現象は確認できなかった。また、油滴サイズとしては直径15030マイクロメートル程度で観測され、発振の持続時間は約1時間半、周波数16Hzであった。油滴の振動が停止した後に、油滴に新たな油相を注入すると再び発振が始まった。以上のような知見から、以下のような発振機構を考察した。まず、油滴表面に界面活性剤が吸着する。その後、微量の油が界面活性剤とともに水相へ溶け出るが、その際に油滴表面の表面張力変化を生じ、これにより油滴が振動するものと考えられる。界面活性剤濃度が低下した油滴表面に改めて界面活性剤が吸着し、連続的に発振する。時間とともに、界面活性剤が油滴中に蓄積されると振動は停止する。フレッシュな油相を油滴に注入することにより、界面活性剤の飽和が緩和され、再び発振し始める。以上により結果を合理的に説明できた。本研究においては、この自励発振現象を顕微鏡下で観察するとともに、振動を支配する要因の解明やレーザー散乱法などを用いて、その発振周波数の決定を試み、その特徴を明らかにすることを目的とした。1)微小油滴の自励発振現象:自励発振現象が起こるためには、水相中にsodium dodecylsulfateなど界面活性剤の存在が必要不可欠であること、油相としてはオクタノール、ノナノール、ブタノールなどの低極性ではなく、水への溶解性が適度に高い必要があることを明らかにした。また、油滴サイズとしては直径15030マイクロメートル程度で観測され、発振の持続時間は約1時間半であった。この知見は発振機構を推定する上で、極めて重要な発見であると考えている。2)自励発振周波数の見積もり:顕微鏡下において発振している単一油滴にレーザー光を照射し、その散乱光強度の時間変化を解析することにより発振周波数の決定を試みた。その結果、油滴は約16Hzで発振していることを明らかにした。本年度においては、見出した現象の特徴を明らかにすることを主眼として研究を進めた。得られた特徴や知見に基づき、次年度においては発振機構を明らかにする予定である。
出芽酵母を用いたがん関連遺伝子のスクリーニング法の開発とその実用化

BRCA1,BRCA2,ATM,APC,DNAミスマッチ修復遺伝子(hMSH2、hMLH1)の出芽酵母における遺伝子診断システムを開発した。このうち前5遺伝子については酵母のマーカー遺伝子URA3との融合発現ベクターを用いることにより、これら遺伝子の変異の大部分を占めるナンセンス・フレームシフト変異を特異的に検出できるストップコドンアッセイである。hMLH1遺伝子についてはその機能を出芽酵母のミスマッチ修復能でモニターすることにより変異の有無を判定できる遺伝子機能診断法である。出芽酵母のアッセイ用マーカー遺伝子を改良することにより多サンプル処理能力の大幅な改善およびアッセイ時間の短縮が得られるため、GFP遺伝子をアッセイ用マーカー遺伝子にして上記出芽酵母の遺伝子診断系を改良を試みた。その結果、GFPをマーカーとすることによりp53遺伝子の転写機能診断系、上記ストップコドンアッセイシステム、hMLH1遺伝子の機能診断系の改良に成功し、短時間に多検体を処理できる遺伝子診断システムが構築された(論文投稿中)。hMLH1遺伝子の機能診断系により、遺伝性非腺腫症性大腸癌由来の約50種類のミスセンス変異について機能診断を行った。その結果、本アッセイ系は大部分の変異を検出できることが示された。従って出芽酵母を用いた遺伝子診断系は遺伝子変異スクリーニング法として有用であることが判明した。1.出芽酵母を用いた新しい遺伝子診断系の開発BRCA1,BRCA2,ATM,APC,DNAミスマッチ修復遺伝子(hMSH2、hMLH1)の出芽酵母における発現用ベクターシステムを開発した。2.出芽酵母を用いた遺伝子診断系の信頼性のテストすでに開発済みの出芽酵母を用いたp53がん抑制遺伝子の機能診断系を用いて各種ヒト培養細胞株を変異の有無についてスクリーニングした結果と、自動DNA塩基配列決定装置(平成9年度購入設備備品)で得たp53遺伝子の変異データは一致した。3.多サンプル処理能力のための改良・技術開発より少ない検査材料から各種遺伝子断片増幅のための至適PCR条件を設定した。RNA抽出操作に関しては市販のキットを用いたが、手技がやや繁雑であるためさらなる技術改良が必要であることが判明した。出芽酵母のアッセイ用マーカー遺伝子を改良することにより多サンプル処理能力の大幅な改善およびアッセイ時間の短縮が得られるため、GFP遺伝子をアッセイ用マーカー遺伝子にして上記出芽酵母の遺伝子診断系を改良を試みている。1.出芽酵母を用いた新しい遺伝子診断系の開発2.出芽酵母を用いた遺伝子診断系の信頼性のテストhMLH1遺伝子の機能診断系により、遺伝性非腺腫症性大腸癌由来の約50種類のミスセンス変異について機能診断を行った。3.多サンプル処理能力のための改良・技術開発出芽酵母のアッセイ用マーカー遺伝子を改良することにより多サンプル処理能力の大幅な改善およびアッセイ時間の短縮が得られるため、GFP遺伝子をアッセイ用マーカー遺伝子にして上記出芽酵母の遺伝子診断系を改良を試みた。
蛍光計測に基づく青果物熟度の評価手法の確立と非破壊測定器の開発

研究実績の概要】最大800字大玉トマト(モモタロウ),キウイフルーツ(ヘイワード),洋ナシ(ラ・フランス),プリンスメロン,カボチャを供試実とした蛍光スペクトル測定を行った。モモタロウについては,励起光(波長470,530,620 nm)を試料赤道面に垂直に照射し,励起光入射軸に対して15°180°の方向に果実内部から放出される蛍光スペクトルを測定した結果,追熟に伴う蛍光スペクトルの変化は,果実中のクロロフィルによるF685の再吸収の割合に起因し,励起波長620 nmで光入射軸より45°の方向に放出されるクロロフィル蛍光の強度比F688/F740の対数を指標(FMI)とすることで,緑熟から完熟の全期間で熟度評価を行うことができることを明らかにした。FMIは目視による観察で果皮色に変化が見られない緑熟期にも変化することから,緑熟期の熟度評価に有効であると考えられる。また,追熟により果皮色がほとんど変化しないヘイワードおよびラ・フランスにおいても追熟に伴うFMIの変化を観察することができた。一方,プリンスメロン,カボチャに関しては,果実内部から放出されるクロロフィル蛍光の内,F685は厚い表皮において再吸収されてしまい,FMI変化を精度よく測定することができなかった。しかし,プリンスメロンに関しては,表皮表面から放出されるクロロフィル蛍光のスペクトル形状が,追熟に伴って変化することが明らかとなった。予定していたほとんどの果実を用いて,蛍光スペクトル計測を行い,FMIを求めるための最適条件を調査することができた。特に,大玉トマトについては,目視変化が見られない緑熟期においても,FMIが変化することを突き止めることができた。現在のところ,当初の計画以上に進展している。大玉トマトに関しては,色度とFMIの関係を調査する。キウイフルーツに関しては,FMIと硬度および糖酸度の関係を求め,FMIによる熟度評価が可能であるかを明らかにする。また,追熟条件(温度,雰囲気,光条件)を変化させて,FMI変化を測定しデータベース化を行う。さらに,メロンに関しては,樹上における計測を可能とする装置を開発し,表皮表面の蛍光スペクトル変化を観察する。予定していた測定装置の改良におけるキセノンランプの単色光に関して,既存の干渉フィルターを用いて実現可能であったため,差額が生じた。新たな実験計画として,屋外でメロンを生育しながら,圃場において蛍光スペクトル計測を実施する予定であり,その為には励起光源として携行可能な小型半導体レーザーを準備する必要があることから,差額に関しては,それらの購入にあてる予定である。
間葉系幹細胞の口腔顎顔面へのホーミング機構の解明とその増殖・分化制御ニッチの同定

本研究は、骨随由来間葉系幹細胞(MSC)が血行性に口腔・顎顔面領域の各組織内にホーミングするための分子機構を解明するために実施された。まず、開発された強蛍光発現トランスジェニックマウスよりMSCを採取してin vitroで増殖させることに成功した。次に、増殖したMSCを免疫不全マウスに移植して体内動態を追跡した。組織透過性が従来の緑色蛍光より高いとされる赤色蛍光を発現するMSCの移植後の体内動態について、リアルタイムin vivoイメージングシステムにより蛍光トレース観察することにより成功した。現在、移植後のMSCを組織切片から採取し、MSC増殖・分化メカニズムの解析を実施中である。前年度までに確立したマウス骨髄由来間葉系幹細胞mesenchymal stem cell (MSC)様細胞の培養環境を更に改変し(酸素分圧の調整)、この細胞の増殖能力を高めることに成功した(投稿準備中)。加えて、この培養法により、表面抗原の異なる複数の細胞が同時に増殖することを発見した。これまでに我々は、これらの種類が異なるMSCマーカー陽性細胞が相互作用により増殖する分子メカニズムの一部を解明した(投稿準備中)。また、これらの各種の細胞のMSC様分化能力(骨芽細胞、軟骨細胞ならびに脂肪細胞への分化能力)を調査したところ、骨芽細胞や脂肪細胞への分化能力は確認されたが、予想に反して軟骨細胞への分化能力は確認できなかった。このことは、我々の開発したマウス骨髄由来細胞初代培養法は、軟骨細胞への分化能力の低い骨芽細胞/脂肪細胞共通前駆細胞の増殖には適しているが、MSCの初代培養系としては適していない可能性を示唆するものである。言い換えれば、これまでに我々は、骨芽細胞/脂肪細胞共通前駆細胞の増殖に適した培養系を確立し、この細胞のホーミング能力や分化能力を評価する実験系が確立できたものと判断された(投稿準備中)。しかしながら、この初代培養系では、MSCを増殖させることは困難であるため、現在、赤色蛍光強発現TGマウス骨髄細胞を採取した直後に、不死化遺伝子を導入することにより、赤色蛍光強発現MSC様細胞株の樹立を試みている。これまでに、継代を20代以上繰り返しても増殖を続ける細胞が数十種採取できており、また現在、各々の増殖ならびに分化能力を確認しているところである。今後は、昨年度までに確立したヌードマウスへの移植後のトレース実験系を用い、先に述べた初代培養による骨芽細胞/脂肪細胞共通前駆細胞ならびにMSC様細胞株のin vivoのホーミング能力や増殖・分化メカニズムを解明したい。移植後の蛍光細胞から発現される蛍光の体内透過性をより強力にする目的で、赤色蛍光tdTomato遺伝子導入TGマウスのホモマウス骨髄より間葉系幹細胞(MSC)の採取を試みたが、tdTomato遺伝子導入TGホモマウスは34週齢以降の生育が同ヘテロTGマウスやWTマウスと比較して著しく劣ること(原因は調査中)がわかり、tdTomatoが強発現しすぎると細胞毒性が高まる等の問題が起こるものと推察された。そこで、このtdTomatoマウスからのMSC株の作製は、そのヘテロマウス骨髄由来細胞で行うこととし、同様な目的で緑色蛍光EGFP遺伝子導入TGホモマウス骨髄由来MSCの細胞の不死化を試みた。tdTomatoマウスと同様にIPTG法で作製されたEGFP遺伝子導入TGホモマウスはtdTomatoホモマウスと異なり、WTマウスと同様に34週齢以降も問題なく生育したため、EGFPホモマウス由来MSCの株化を試みた。一方、我々の骨髄細胞培養系では、MSCの増殖をサポートする別の細胞集団があり、現在この細胞の性質について調査している(投稿準備中)。また、このMSCサポート細胞とMSCを異種蛍光マウスよりそれぞれ別に採取して混合培養すると、これらの細胞の相互作用を異種蛍光でビデオトレースすることによりリアルタイム観察することができた(投稿準備中)。この事実より、2種の細胞をそれぞれ赤と緑の異なる強蛍光マウスより採取すれば、これらの細胞の移植後のin vivoでの相互作用について観察しうるものと期待された。以上のように、我々の課題であったIPTG法による多色種強蛍光発現マウス由来MSC細胞株の作製は予定通りに進み、in vitroレベルでの細胞間相互作用の観察が可能であることが明らかとなった。現在、in vivo移植後の多色種強蛍光発現MSCの体内動態について調査を進めているところである。赤色蛍光強発現マウス(tdTomatoマウス)の脛骨ならびに大腿骨より、骨髄細胞を取り出し、その細胞集団中に含まれる間葉系幹細胞mesenchymal stem cell (MSC)の最適な培養条件を決定するために、市販のMSC専用培地の数種を用いて培養実験を実施した。その結果、R&D社のStemXVivo培地を用いると、10継代を経ても旺盛に増殖し続ける付着性細胞が観察された。

加えて、この細胞の5継代目の細胞に各分化刺激を施したところ、骨芽細胞分化ならびに脂肪細胞分化が確認されたため、この細胞がMSC様多分化能力を有することが判明した。また、この細胞が、市販の蛍光マウスよりも安定して強い蛍光を発することを、IVISリアルタイムin vivoイメージングシステム、蛍光顕微鏡レベルで確認した。さらには、フローサイトメーターにより、この細胞集団の90%以上がMSCマーカーとして知られるSca-1ならびにCD44を発現していることが判明した。以上の結果から、tdTomatoマウス骨髄由来MSCの抽出方法ならびに培養法の基盤が完成した。さらに、この細胞から発する強蛍光の体内組織透過性を確認したところ、皮下に3 x 100,000個の細胞を埋入した場合、IVISにて体外からその透過蛍光を確認できることが判明した。興味深いことに、市販の蛍光マウスより採取したMSCでは、このように高い組織透過性を有していないことを確認している。さらに、tdTomato骨髄由来MSCをヌードマウス背部皮下に埋入した後、1ヶ月後の蛍光シグナルも外部より確認された。この蛍光MSC埋入部分の組織像を確認したところ、蛍光顕微鏡下で、その局在を確認することに成功した。以上のように、我々は、tdTomatoマウスより、骨髄由来MSCを抽出・培養することに成功し、また、ヌードマウスにおける埋入実験の基本型を確立した。現在、平成24年度以降の主目標である蛍光強発現TGマウス由来MSCのホーミング先組織における多分化能力発現機構の解明に向かい、前年度までに確立したMSC初代培養系を用い、そのホーミング能力を調査しているところである。具体的には、初代培養蛍光強発現MSCをマウス頭蓋骨欠損部に埋入してMSCの局所へのホーミング能力をIVISにより観察するとともに、骨再生能力をCTにより観察する実験系を開始している。しかしながら、この実験に用いる初代培養による骨髄由来細胞は、軟骨細胞への分化能力の低い骨芽細胞/脂肪細胞共通前駆細胞であることが確認されたため、研究テーマである骨髄由来MSCのホーミング機構や増殖・分化メカニズムについての探究範囲が制限されてしまう可能性が示唆された。このため、24年度中に、我々が有する強蛍光色発現TGマウスの骨髄由来間葉系細胞の不死化遺伝子導入による株細胞化を試みたところ、不死化されたと判断できる長期培養可能な細胞株を数多く得ることに成功した。現在、これらのMSC様細胞株の増殖・分化能力をMSCと比較しているところである。幸い、その能力の程度には違いがあるものの、その多分化能力について確認できていることから、これらの細胞株を用いてMSC口腔領域周囲のホーミング能力の調査ならびにその増殖・分化メカニズムの解明を進めているところである。確かに、初代培養MSCを用いる方がin vivoの細胞に近い性質を反映できるので理想的ではあるが、株化細胞を用いることで、実験の再現性や利便性が増したことから、今後の本研究の更なる発展が期待される。平成23年度の主目標であるtdTomatoマウスからのMSCの分離・培養法の確立を達成した。
考古学データの統合研究環境の構築：文化伝達プロセスの推定とデータベース構築

遠賀川式土器と、それに先行する突帯文土器の形態を、幾何学的形態測定学の一手法である楕円フーリエ解析をもちいて定量化し、土器形態の地理的変異を定量化・可視化した。土器は、ゆるくではあるが、遺跡ごとにまとまりをつくる傾向があった。また、地理的に近い遺跡の土器がつくるクラスターは、近接していた。さらに、突帯文土器と遠賀川式土器は、それぞれ別のクラスターをつくる傾向がみられた。加えて、文化の融合を扱う数理モデルを構築した。各個体(土器の製作者)は、前世代の製作した土器を模倣し、それに若干の改良を施すことで、土器の製作をおこなうと仮定した。模倣の際に選択するのは土器形態の特徴量に依存する。通常は、複数ある形態の特徴量を、すべて単一の土器から模倣するが、一定の確率で、複数の土器の形質を独立に模倣し、土器の製作をおこなうとした。模倣の仕方として、ランダム、特定の形態の形質値が大きいほど好まれるモデル、集団の多数派に同調するモデルを検討した。複数の形質を独立に模倣する場合、それぞれの形質について、異なる模倣戦略をとりうるとした。このような仮定のもと、とくに異なる2つの集団が接触した場合について注目して、模倣の仕方や初期状態によって、時間とともに形態の特徴量がどのように変化するかを検討した。また、国内外の学会で、考古遺物の幾何学的形態測定学に関する発表をおこなったほか、関連分野の総説およびチュートリアルを執筆した。データ解析、数理モデリング、データベースのそれぞれがおおむね順調に進んでいる。数理モデルの構築はおおむね完了しており、今後データへの当てはめがおこなえる状況にある。また、複数の文化伝達プロセスをデータから判別する見通しもついている。土器データについては、当初の想定よりも集まっていない地域があるものの、大まかなパターンを把握することはできている。次年度以降は、データへの当てはめとデータベースの整備を重点的に行う。数理モデルについては、生物の遺伝子型と表現型の対応を参考にし発展させる。模倣のされやすさは形態の特徴量(表現型に対応)に依存するが、伝達されるのは技術要素(遺伝子型に対応)だとする。文化の融合を扱う場合、形態形質を直接的に融合させるのではなく、技術要素を融合させるとする。この融合のさせ方により、形態の変化がどのような軌跡をえがいておこるのかを検討する。データ解析においては、近畿地方のデータが当初の予定よりも集まっていないため、引き続き文献調査をおこなうとともに、東海地方まで射程を広げる。また、個々の遺跡についても、層位ごとの傾向などの検討をおこなう。第一子出生に際し配偶者出産休暇および育児休暇を取得したため。
海洋空間利用を目的とした大型浮体構造物における流体・弾性体連成挙動の予測と制御

大型浮体式海洋構造物の波浪応答解析法の確立を目的として,流体・弾性体連成挙動を考慮した理論解析プログラムの開発と水槽膜型実験による検証を行った。主な研究成果は以下の通りである。1.大型浮体構造物の波浪中弾性応答を空中モード展開法とハイブリッド型積分方程式法を併用して予測する理論解析プログラムを開発した。2.大型浮体構造物の縮小模型として,剛性を負担するアルミニウム平板に浮力を負担するスリット入り発泡ポリエチレンを接着させた箱型浮体模型を製作し,規則波中における浮体の弾性応答(変位,ひずみ)の測定実験を行った。アルミニウム平板の剛性を変えたモデル,付加重量を搭載したモデルのほか,浮体応答の低減を目的に波上側端部に鉛直反射板または水平没水板を付設したモデルについても実験を行い、以下の知見を得た。(a)浮体の運動応答は低周波数域では剛体モードが支配的であるが,周波数が増加するにつれて低次から高次弾性モードに移行して行くとともに,変位振幅も小さくなり,変位の大きな部分が波上側端部に集中してくる。(b)浮体の曲げ剛性が増加すると,変位応答及びひずみ応答は波上側端部の変位応答が大きくなる以外は全般的に小さくなる。(c)浮体の質量が増加すると,変位応答,ひずみ応答は小さくなる。(d)波上側端部に端板を付設することにより,浮体の変異応答、ひずみ応答は端板のない場合に比べて低減される。その効果は周波数が高くなるほど顕著になり,波長に対する浮体長が5倍程度になると,喫水深と同サイズの端板を付設するだけで応答は2/31/2になる。(e)波浪応答解析プログラムによる解析結果は実験結果と良い一致を示す。浮体式海洋構造物においては,波浪による外力及び応答が大きく,これらを正確に予測することが,施設の安全性及び居住性の確保の観点から重要な課題となる。特に,海洋空間利用を目的とした大型浮体構造物は,平面的な広がりが数百mから数kmに及ぶ巨大なものであり,その波浪中における応答は剛体変位よりも弾性変形が支配的となり,流体・弾性体動的相互作用を考慮した流体力及び応答の評価が必要になる。本研究では,流体・弾性体動的相互作用を考慮した流体力及び応答の評価が必要になる。本研究では,流体・弾性体連成挙動を考慮した大型浮体構造物の波浪応答解析手法を整備するとともに,造波水槽を用いた実験によりその妥当性を検証することを目的とする。本年度は3年計画の初年度であり,解析理論の展開,数値解析プログラムの開発及び計測実験システムの開発に重点を置いて研究を行った。本年度の主な研究成果は次の通りである。1)大型浮体構造物の弾性応答解析理論の展開と数値解析プログラムの作成大型浮体構造物の波浪中における弾性応答の流体・弾性体連成挙動を考慮した解析理論を展開し,ハイブリッド型積分方程式法を利用してこれを評価するための数値解析プログラムを開発した。2)大型浮体構造物の弾性変形計測システムの開発画像方式による2次元運動計測システムを導入し,大型浮体構造物模型の弾性変形の多点同時計測システムを開発した。3)水槽模型実験による理論の検証箱型浮体模型を用いて,規則波中における浮体の弾性応答(変位,ひずみ)の計測実験を行い,理論値と計測値を比較して,理論との一致を確認しその妥当性を検証した。本年度は3年計画の2年目に当たり,前年度に開発した大型浮体構造物の波浪応答解析プログラムと計測実験システムを使用して広範囲のパラメトリック・スタディを行った。

1.大型浮体構造物の縮小模型として,剛性を負担するアルミニウム平板に浮力を負担するスリット入り発泡ポリエチレンを接着させた箱型浮体模型を製作し,規則波中における浮体の弾性応答(変位,ひずみ)の計測実験を行った。剛性,重量の相違が浮体の運動応答に与える影響を調べるために,アルミニウム平板の剛性を変えたモデル,付加重量を搭載したモデルのほか,浮体応答の低減を目的に波上側端部にスカートを付設したモデルについても実験を行い,以下の知見を得た。(a)浮体の運動応答は低周波数域では剛体モードが支配的であるが,周波数が増加するにつれて低次から高次弾性モードに移行して行くとともに,変位振幅も小さくなり,変位の大きな部分が波上側端部に集中してくる。(b)浮体のひずみ応答は剛体モードから弾性モードに移行するまでは周波数とともに増加するが,波長に対する浮体長が約2倍になる周波数付近で最大となり,それ以上周波数が増加してもひずみ振幅は変位振幅のように小さくはならない。(c)浮体の曲げ剛性が高いほど,また重量が大きいほど,浮体の高周波数域での応答は小さくなる。(d)波上側端部にスカートを付設することにより,浮体の変位応答,ひずみ応答はスカートのない場合に比べて低減される。その効果は周波数が高くなるほど顕著になり,波長に対する浮体長が5倍程度になると応答は約1/2に低減される。2.前年度に開発したハイブリッド型積分方程式法による波浪応答解析プログラムを適用して解析を行った結果は実験結果と良い一致を示し,解析法の妥当性が確認された。本年度は3年計画の最終年度に当たり,計測実験の補足と研究成果の取り纏めを行った。特に,大型浮体構造物の場合は,浮体中央部の応答は小さく端部だけが大きく揺れる特性を示すことが前年度までの研究で明らかにされており,これを抑制するために,浮体端部に鉛直反射板または水平没水平板を付設する手法に着目し,それによる応答抑制効果を確認する実験を行った。その結果得られた知見は以下のように要約される。1)波上側端部に端板を付設することにより,浮体の変位応答,歪応答ともに端板のない場合に比べて著しく低減される。これは入射波が端板に作用することによって浮体端部の回転が抑制される結果と考えられる。2)端板の付設は特に短波長域での応答の低減に効果的である。3)水平,鉛直いずれの端板もサイズの大きい方が,また同じサイズであれば水平端板よりも鉛直端板の方が短波長域での応答の抑制効果は大きい。4)波上側の端板に近い位置では,端板を付設することによって歪応答が増加する。これは入射波が端板に作用する際に生じる端部回転モーメントが原因であると考えられる。5)既住の研究ではサイズの大きな端板が用いられており,その付設が係留力の過大な増加を引き起こす可能性が指摘されていたが,本研究では喫水深に比べて小さなサイズの端板を用いても十分な応答抑制効果が得られることが確認された。
古文書の料紙と様式の有機的関連性についての史料学的アプローチ

本研究は、これまで主として「様式論」「機能論」といった文字列情報を中心として進められてきた古文書学を、「料紙論」「形態論」といった非文字列情報を中心として進展しつつある近年の古文書学と有機的に関連させることで、その新たな飛躍を試みようとしたものである。具体的には米沢市立上杉博物館所蔵「上杉家文書」、東京大学文学部所蔵「青蓮院文書」、國學院大學所蔵「久我家文書」「吉田家文書」、そして皇學館大学所蔵の中世文書について、熟覧を行うとともに顕微鏡画像撮影等の調査を実施し、特に詳細な調査を行うことのできた皇學館大学所蔵の中世文書55点について、高精細画像と釈文を載せた研究成果報告書を作成した。本研究は「古文書の料紙と様式の有機的関連性についての史料学的アプローチ」と題し、主として「様式論」「機能論」といった文字列情報を中心として進んできた従来の伝統的古文書学と、「料紙論」「形態論」をはじめとする非文字列情報を中心として急速に進展しつつある近年の古文書学を、有機的に連結させることで、古文書学の新たな飛躍を試みるとともに、古文書学とアーカイヴス学(文書保存学)との対話の可能性を探ることを目的とする。上記の目的のため、9月26日と12月29日には伊勢で、11月15日には京都で、27年の3月1112日には東京で、打ち合わせと調査を実施した。9月と11月には今後の研究の進め方について研究分担者・協力者と打合せを行い、12月には古文書学を中心としたここ数年間の日本中世史研究史整理の研究会を行い、3月の東京での調査では、東京大学文学部所蔵『青蓮院文書』の熟覧を行うとともに、顕微鏡撮影等の調査を実施した。これらの打合せ・調査を通じて、およそ次のような方向性を共有することができた。まず第一に、上島有が「まぼろしの紙ー檀紙」で指摘している、福井県今立町に伝存する岩野平三郎氏による越前奉書紙漉き技術の記録保存については、これを実施しない。また第二に、全国の日本史関係の講義において、古文書学のテキストとして使用することが可能であるような、カラー図版と顕微鏡画像、そして個々の文書の様式と料紙についての解説を載せたような書籍については、平成29年度に京都のミネルヴァ書房から刊行する方向で努力するという2点である。本研究は「古文書の料紙と様式の有機的関連性についての史料学的アプローチ」と題し、主として「様式論」「機能論」といった文字列情報を中心として進んできた従来の伝統的古文書学と、「料紙論」「形態論」をはじめとする非文字列情報を中心として急速に進展しつつある近年の古文書学を有機的に関連させることで、古文書学の新たな飛躍を試みるとともに、古文書学とアーカイヴス学(文書保存学)との対話の可能性を探ることを目的とする。上記の目的のため、平成27年8月18日20日には米沢で、平成28年3月15日17日には伊勢で、それぞれ古文書の調査を実施した。8月の調査では米沢市上杉博物館所蔵『上杉家文書』のうち、足利将軍家発給の古文書を中心とする91点について、熟覧を行うとともに顕微鏡画像等の調査を実施し、3月の調査では皇學館大学附属図書館・国史学科・神道研究所・史料編纂所・神道博物館がそれぞれ所蔵する古文書のうち、中世以前のものを中心とする172点について、熟覧を行うとともにプロのカメラマンに依頼しての高精細画像撮影等の調査を実施した。今回の科研では、最終的な目標として、全国の日本史関係の大学において、古文書学のテキストとして使用することが可能となるような、古文書のカラー図版入りの書籍の刊行を目指しており、既にミネルヴァ書房の了解も得ているが、今回の調査・撮影を通じ、特に皇學館大学で撮影した高精細画像が、そのための教材として適切であることが確認されたので、最終年度となる平成28年度は、これらの画像の調査と、不足分の撮影を通じ、平成29年度に上記の図書を刊行できるよう、努力していきたい。交付申請において予定していた、米沢市上杉博物館所蔵「上杉家文書」に収められている室町幕府関係文書の調査を、平成27年の8月18日20日に実施し、予定していた調査を、ほぼこの3日間で終えることができた。このことによって初年度の遅れを取り戻し、さらには皇學館大学所蔵の古文書についても調査実施することができた。よっておおむね順調に進展していると言うことができよう。上記の目的のため、平成28年8月9日10日には、東京の國學院大學で古文書の調査を実施した。具体的には國學院大學図書館所蔵『久我家文書』のうち48通と『吉田家文書』のうち45通について、熟覧を行うとともに顕微鏡画像等の調査を実施した。また今回の科研では、最終的な目標として、全国の日本史関係の大学において、古文書学のテキストとして使用することが可能となるような、古文書のカラー図版入りの書籍の刊行を目指しており、既にミネルヴァ書房の了解も得ている。

そこで平成28年度は、そのパイロット版としての図録作成を目指し、特に皇學館大学で撮影した高精細画像データの調査と不足分の撮影を行い、平成28年度末には『皇學館大学所蔵の中世文書』という研究成果報告書を作成した。なおこの報告書は、あくまでもミネルヴァ書房で刊行を予定している「古文書の料紙と様式の有機的関連性」についての古文書学テキストのパイロット版であるため、今後は本書をもとに、より各種の様式・料紙の古文書を掲載したテキスト作成に向けて努力したい。本研究は、これまで主として「様式論」「機能論」といった文字列情報を中心として進められてきた古文書学を、「料紙論」「形態論」といった非文字列情報を中心として進展しつつある近年の古文書学と有機的に関連させることで、その新たな飛躍を試みようとしたものである。具体的には米沢市立上杉博物館所蔵「上杉家文書」、東京大学文学部所蔵「青蓮院文書」、國學院大學所蔵「久我家文書」「吉田家文書」、そして皇學館大学所蔵の中世文書について、熟覧を行うとともに顕微鏡画像撮影等の調査を実施し、特に詳細な調査を行うことのできた皇學館大学所蔵の中世文書55点について、高精細画像と釈文を載せた研究成果報告書を作成した。交付申請に際し、私たちは米沢市上杉博物館所蔵の「上杉家文書」に収められる室町時代の文書を素材として研究を進める予定であった。しかし、交付の決定を受けた平成26年度に入り、研究代表者岡野の勤務する皇學館大学が、日本古文書学会大会の開催会場となったこと、また同じく岡野が、『史学雑誌』124編5号「2014年の歴史学界ー回顧と展望ー」日本中世のとりまとめに当たったこと等から多忙をきわめ、物理的・日程的に米沢への出張が難しく、結果として伊勢・京都・東京での打合せ・調査に終始してしまったことが原因である。しかし平成27年度に入ると、それらの業務が一段落するため、残りの2年間で、研究目的は充分に達成可能なものと考えている。平成26年度に調査した東京大学文学部所蔵「青蓮院文書」、平成27年度に調査した米沢市上杉博物館所蔵「上杉家文書」、そして皇學館大学所蔵文書など、古文書学のテキストに使えそうな古文書の画像が揃ってきたので、これらを精査するとともに不足分の調査を行い、当初の研究目的に向けた研究成果が得られるよう、努力していきたいと考えている。日本中世史平成26年度末に実施した東京大学文学部所蔵『青蓮院文書』の調査が、到底1日で終了するものではなかったので、27年度に入った時点でまずその調査を実施し、次いで米沢市上杉博物館所蔵の『上杉家文書』をはじめ、古文書学のテキストに使えそうな古文書の画像を求め、全国各地の古文書所蔵施設で調査を実施し、当初の研究目的に向けた研究成果が得られるよう努力したいと考えている。主な原因は平成26年度、43万円余りの未使用額を残してしまったことにある。当初、平成27年度に執行を予定していた金額は143万円であったが、26年度からの繰り越し43万円余が加わり186万円余りを執行することとなった。結果としてほぼ当初予定していた通りの調査によって146万円余りを執行したが、前年度からの繰り越しの内からは4万円余しか使うことができず、39万円余を次年度使用額として残すことになってしまった。研究実績の概要「現在までの達成度」の項でも述べたとおり、現在のところ研究の進捗状況はやや遅れており、それが次年度使用額が生じた主な理由である。
一方向性徐放フィルムの開発～肺静脈狭窄の完全抑制を目指して～

総肺静脈還流異常症(TAPVC)の術後遠隔期成績に影響を及ぼす最大の因子として吻合部に生じる術後肺静脈狭窄症(PVO)があげられるが、その発症メカニズム・予防法は確立されていない。我々は臨床に即したPVOモデルを確立し、PVO発症に血管平滑筋細胞の形質変化・増生が関与していることを示して、ラパマイシン徐放フィルムを適用することで一時的に肺静脈狭窄を予防し、進行を遅らせることを示した。しかし現段階では完全な予防には至っていない。本研究ではより効果的なPVO予防法確立を最終目的の一つとして、一方向にのみ徐放するラパマイシンフィルムを開発し、肺静脈狭窄症予防への有効性を検討する。
インターロイキン（IL)-18の血圧調節機構の解明

高血圧患者では、インターロイキン(IL)-6、IL-18やtumor necrosis factorなどの炎症性サイトカインの上昇が認められ、これに伴って惹起される慢性炎症によって内皮機能障害、動脈硬化などが進行し、さらなる血圧上昇をきたす。これまでに私たちは、アルドステロン食塩負荷高血圧モデルマウスにおいて、IL-18欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、血圧上昇が軽度であることを報告した。また、NaCl co-transporter (NCC)がIL-18の受容体の一つであることが報告されている。NaCl co-transporterが活性化されれば、NaClの再吸収が増加し、塩分感受性高血圧が発症する。このことから、アルドステロン食塩負荷モデルマウスにおいて血圧上昇が軽度である理由として、IL-18欠損マウスでは、各種ナトリウムチャネルの活性化が起こりにくい可能性を考えた。逆にいえば、IL-18がNCCを含めた各種ナトリウムチャネルを活性化するものと予想した。そして、野生型のマウスに食塩負荷+recombinant IL-18 (0.5mg/day腹腔内投与)によって、NCCを含めたナトリウムチャネルの発現が増加しないかを検討したが、それらに変化を認めなかった。IL-18単独での血圧上昇作用がなかったため、野生型マウスおよびIL-18欠損マウスでアルドステロン食塩負荷高血圧モデルでのNCCを含めた各種ナトリウムチャネルの発現量を検討したが、それらの変化も認めなかった。したがって、本研究から、アルドステロン食塩負荷高血圧モデルマウスにおいて、IL-18欠損マウスは野生型マウスと比較して、血圧上昇が軽度である理由として、NCCの発現量は関与しないことが明らかとなった。今回の検討では、NCCのリン酸化を測定系を持たず、これの検討を行えなかったが、リン酸化に差を認める可能性は残る。高血圧患者では、インターロイキン(IL)-6、IL-18やtumornecrosis factor-aなどの炎症性サイトカインの上昇が認められ、これに伴い惹起される慢性炎症によって内皮機能障害、動脈硬化などが進行し、さらなる血圧上昇をきたす。私たちはアルドステロン食塩負荷高血圧モデルにおいて、IL-18欠損マウスでは野生型マウスと比較して、血圧上昇が軽度であることを見出した。最近、NaCl co-transporter (NCC)がIL-18の受容体の1つであることが報告されている。本研究では、まずIL-18そのものに血圧上昇作用があるかを確認するため、野生型マウスに食塩負荷+recombinant IL-18 (0.5mg/day腹腔内投与)を投与する群と非投与群で血圧を検討した。その結果、recombinant IL-18投与によって血圧は約30mmHg上昇した。この上昇の原因として、IL-18によるNCC発現の増加の可能性を考え、腎臓におけるNCC発現を免疫染色法により比較したが、両者で差を認めなかった。また、マウス遠位尿細管細胞(mDCT)にrecombinant IL-18を添加し、NCCの遺伝子発現をPCR法、そのタンパク発現をWestern blot法により検討したが、明らかな上昇は認められなかった。以上の結果から、IL-18は少なくとも尿細管細胞にNCCの発現を誘導することで、ナトリウムの吸収を増加させ、血圧を上昇させる機序は否定的であった。したがって、今後はNCCのリン酸化やそのほかのナトリウムチャネルの関与の有無、炎症惹起による酸化ストレスなどの関与を検討していく予定である。現在のところ、IL-18投与により血圧上昇が確認されたため、今後はその機序の解明に取り組む予定である。高血圧患者では、インターロイキン(IL)-6、IL-18やtumor necrosis factorなどの炎症性サイトカインの上昇が認められ、これに伴って惹起される慢性炎症によって内皮機能障害、動脈効果などが進行し、さらなる血圧上昇をきたす。そして、今年度の検討で野生型のマウスに食塩負荷+recombinant IL-18 (0.5mg/day腹腔内投与)によって、NCCを含めたナトリウムチャネルの発現が増加しないかを検討したが、それらに変化を認めなかった。したがって現在、アルドステロン食塩負荷モデルでの血圧上昇に関与するアルドステロンーアルドステロン受容体のシグナル伝達をIL-18が促進する可能性を考え、現在検討中である。IL-18欠損マウスでのアルドステロン食塩負荷モデルマウスにおいて、血圧上昇が軽減されている原因として、NCCを含めたナトリウムチャネルをIL-18が活性化する可能性を考え、これまで研究を行ってきた。しかしながら、IL-18を負荷してもこれらのナトリウムチャネルの発現に変化を認めなかったため、新たな可能性を考えざるおえなかったため。

高血圧患者では、インターロイキン(IL)-6、IL-18やtumor necrosis factorなどの炎症性サイトカインの上昇が認められ、これに伴って惹起される慢性炎症によって内皮機能障害、動脈硬化などが進行し、さらなる血圧上昇をきたす。これまでに私たちは、アルドステロン食塩負荷高血圧モデルマウスにおいて、IL-18欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、血圧上昇が軽度であることを報告した。また、NaCl co-transporter (NCC)がIL-18の受容体の一つであることが報告されている。NaCl co-transporterが活性化されれば、NaClの再吸収が増加し、塩分感受性高血圧が発症する。このことから、アルドステロン食塩負荷モデルマウスにおいて血圧上昇が軽度である理由として、IL-18欠損マウスでは、各種ナトリウムチャネルの活性化が起こりにくい可能性を考えた。逆にいえば、IL-18がNCCを含めた各種ナトリウムチャネルを活性化するものと予想した。そして、野生型のマウスに食塩負荷+recombinant IL-18 (0.5mg/day腹腔内投与)によって、NCCを含めたナトリウムチャネルの発現が増加しないかを検討したが、それらに変化を認めなかった。IL-18単独での血圧上昇作用がなかったため、野生型マウスおよびIL-18欠損マウスでアルドステロン食塩負荷高血圧モデルでのNCCを含めた各種ナトリウムチャネルの発現量を検討したが、それらの変化も認めなかった。したがって、本研究から、アルドステロン食塩負荷高血圧モデルマウスにおいて、IL-18欠損マウスは野生型マウスと比較して、血圧上昇が軽度である理由として、NCCの発現量は関与しないことが明らかとなった。今回の検討では、NCCのリン酸化を測定系を持たず、これの検討を行えなかったが、リン酸化に差を認める可能性は残る。様々なサイトカインがNCCだけではなく、インテーフェロンγやIL-17などがNa+/H+ exchangerの発現、IL-6などがepithelial Na+ channelの発現、IL-1などがNa-K-Cl cotransporterの発現に影響を与えることが報告されている。このため、まずはIL-18投与によって、尿中ナトリウムの減少が観察されるか、メタボリックゲージを用いて、一日尿を採取し、IL-18投与群と非投与群で比較検討する。もし、尿中ナトリウム排泄に差が認められた場合は、それぞれのチャネルにおけるIL-18の関与を調べる予定である。特にNCCに関しては、IL-18の添加にによるリン酸化の有無も検討する予定である。さらに腎臓に依存しない血圧上昇機序も考えられるため、酸化ストレス(NADPH oxidase)活性化の検討も行う。NADPHの構成分子であるp47phox、p67phox、gp91phoxの遺伝子発現をRT-PCR法によって、それぞれの蛋白発現はそれぞれの特異的抗体を用いてWesternブロット法によって測定する。
APOBEC3によるGag-Pol前駆体プロセシング阻害の機序解明

平成30年度は、マウスAPOBEC3 (mA3)がMuLVsおよびHIV-1のGag-Pol autoprocessingを異常にする分子基盤の解明を試みた。特にmA3分子内に想定される責任配列の解明に向けて研究を行った。定量的な解析の結果、mA3に由来するC末端半分領域(mA3-Ch)にautoprocessing干渉活性が認められた。しかも、mA3-Chの干渉活性はMuLVsに限らず、HIV-1のGag-Pol autoprocessing過程により強く認められた。さらに、mA3-Ch配列の中でシチジンデアミナーゼドメインを含む約100アミノ酸残基から成る前半部分が、その責任領域であると分かった。ヒトには7つのapobec3遺伝子産物が発現するが、HIV-1に対して抵抗性因子として働くことが知られるAPOBEC3GとAPOBEC3FにmA3と同様のHIV-1 Gag-Pol autoprocessing干渉能があり、特にAPOBEC3Fはその能力が強く、autoprocessingの結果産生される成熟プロテアーゼ量を最大時には検出限界以下にまで下げていることが分かった。当初、mA3がGag-Pol autoprocessingを異常にする分子機構として、Gag-Polの2量体化阻害を想定していた。しかし、2量体化を阻害する抗レトロウイルス薬のDRVは確かに単量体Gag-Polを蓄積する一方、同条件下のmA3やその他のAPOBEC3は単量体Gag-Polの蓄積を誘導しなかった。さらに、同じ反応液においてautoprocessingにより産生される中間産物はmA3により減少していた。これらのことからmA3は2量体化を阻害するわけでなく、本来切断されることのない配列の異常切断を活性化し、最終産物であるプロテアーゼを減少させている可能性が考えられた。MuLVの成熟Protease (PR)、Gag-Pol前駆体、およびGag-Pol processing中の中間体を検出可能な自作の抗体とGag-Polを産生するin vitro転写翻訳系を利用したアッセイにより、約130kDaの分子量をもつ中間体が成熟PRおよびGag-Pol前駆体とともに検出されている。平成28年度、当該中間体の産生がmAPOBEC3量依存的に減少すること、その減少にはmAPOBEC3の全長が必要であり、1つのデアミナーゼドメインを含むN末側半分のmAPOBEC3では減少が認められないことが分かった。また、N末側半分あるいはC末側半分に短縮したmAPOBEC3はウイルス粒子内の成熟PRの産生を減少しなかった。さらに、mAPOBEC3による成熟PR産生阻害は、最終的に未成熟ウイルス粒子の増大につながることが電子顕微鏡観察で明らかとなった。次に、mAPOBEC3がGag-Pol中どこに結合するのか調べた。コムギ胚芽系を利用しGST-mAPOBEC3を、in vitro転写翻訳系でウイルスタンパク質を調整した。両者を混合し、pull down assayを行った結果、mAPOBEC3はPRと結合していた。以上の成果は現在論文作成中である。mAPOBEC3はHIVの成熟PRの産生を阻害していることが我々の初期の解析から分かっていた。本年度、HIV粒子中のmAPOBEC3を免疫沈降し共沈するウイルスタンパク質を検出したところ、mAPOBEC3はIN領域で強く結合していた。また、ヒトのAPOBEC3もHIV成熟PRの産生を阻害していることが判明した。APOBEC3の種を超えた機能の保存性が示唆される重要な知見である。また、HIVのIN産生はmAPOBEC3による阻害を受けておらず、mAPOBEC3の効果はIN産生以降に発揮されると示唆される。Gag-Pol前駆体においてmAPOBEC3が結合する領域の同定やMuLVの成熟PRの産生をmAPOBEC3が阻害する分子機構の解明について、研究計画に則った成果が着実に出ている。また、MuLVの成熟PRの産生を阻害するmAPOBEC3の活性は最終的にウイルス粒子の成熟にまで影響することを明らかにすることで、mAPOBEC3が持つ多面的な抗ウイルス活性に対する理解が格段に深まっている。一方、分子量130kDaの中間体はNC-Pol(MuLVのNC領域とPol領域からなる)であると予想しており、その実体を確認するためにGag-Pol前駆体のCA/NC切断部位にPR抵抗性の変異アミノ酸を導入する方法などの実験を組んだが、今のところ確証を得るに至ってはいない。しかし、その上流産物との量比からも当該中間体はNC-Polであることを示唆するデータが新たに得られている。また、平成28年度、mAPOBEC3はPRと結合することが判明したため、結合のための最小領域を同定中であり、現時点では50-60残基長程度まで範囲を狭められている。また、両者が結合するという事実からmAPOBEC3はPR活性を直接制御している可能性が考えられた。そこで、mAPOBEC3存在下のPR活性をを評価する実験系の確立を現在試行している。PRで切断される既知配列としてmAPOBEC3のエキソン5産物が報告されている。そこで当該エキソン5に由来するペプチド配列をN末にEDANSおよびC末にDABCYLを標識したFRETペプチドとして合成・精製し、PRの活性評価に使用できるか検討している。また、平成29年度以降に予定していたHIVの解析を前倒しで行うことができ、着実に成果が出ている。以上の通りほぼ予定通り、一部は予定した以上に成果が出ており、おおむね順調に進展していると考えている。

平成29年度にはこれまでの成果に定量的な解析を加えることでmAPOBEC3 (mA3)のGag-Pol autoprocessingに与える影響についてより正確なデータを追加するとともに、mAP3とウイルスプロテアーゼ(PR)の相互作用についてより詳細な解析を行った。その結果、以下のことが分かった。1)複製能を有するp57 strainおよびPR不活性型のp57 strainを使用し、これらがexon 5を含むmA3 (5+ mA3)および含まないmA3 (d5 mA3)をウイルス粒子内に取り込むことが分かった。2)また、5+ mA3はPR特異的に切断を受けていた。3)Moloney MuLV内に取り込まれた5+ mA3は殆ど切断されないことが分かった。4)Pull down法により、mA3との結合最小域としてPR内部配列が同定された。5)mA3によりGag-Polからの成熟PR産生は半減し、Gagの切断効率も同様に減少することが分かった。6)当初、成熟PRの産生阻害についてはmA3によるGag-Pol autoprocessing阻害を想定していたが、現在切断サイトの異常を含むGag-Pol autoprocessing異常をmA3が引き起こしている可能性が示唆されている。以上の成果を含めた論文を投稿中である。HIV-1のGag-Pol前駆体からの成熟PRの産生をmA3が阻害していることが判明している。平成29年度の解析から上記に加えて、mA3によりHIV-1粒子の産生が減少していることが分かった。ウイルス複製過程の内、集合または出芽にmA3が影響している可能性が考えられる。免疫沈降法によりmA3がGag-Pol前駆体に結合することを認めた。ウイルス粒子のコアの安定性を評価したしたところ、mA3によりコアの安定性に変化は認められなかった。MuLV Gag-Pol前駆体とmA3の結合、MuLV PRの中でmA3が結合する最小領域の同定が着実に進んだ。また、mA3がMuLV PRの産生を阻害する機構の解明について、当初は幾つかの切断が順序正しく連続して起こると考えられているGag-Pol autoprocessing過程の内、いずれかの素過程を阻害するものと想定していたが、現在までにGag-Pol前駆体中の本来は切断箇所でない部位の切断を含む異常な切断をmA3が引き起こしている可能性が新たに分かってきている。また、mA3存在下で減少する成熟PRタンパク質の量についてより定量的な解析を行い、その減少の程度が下流の反応である成熟PRによるGag processingの効率とよく相関することが分かった。さらに、成熟PRとmA3との相互作用の結果として、エキソン5を持つ5+ mA3はウイルス粒子内で分断されるが、同じMuLVであってもstrainの違いにより分断効率は著しく異なり、その効率はmA3によるMuLV Gag-Pol前駆体からの成熟PR産生阻害能と逆相関していた。これらの結果は、ウイルス(MuLV)と感染抵抗性因子(mA3)の共分子進化の概念を発展させるものであり、意義深い成果である。HIV-1についてMuLVと同様の解析を行い、mA3によるHIV-1成熟PR