hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経芽細胞腫予後良好因子の病態制御機構の解明と自然消退への応用

予後良好な神経芽腫で高発現していたDHRS3、CYP26A1、NR0B1を過剰発現系で神経芽腫細胞株SKNSH、NH12、TGW、GOTO、NH6などに導入し機能解析を行った。DHRS3とNR0B1は、細胞増殖、細胞周期の抑制、造腫瘍能力の低下などが誘導され、RNAseqを用いた網羅的なトランスクリプトーム解析では、細胞周期や細胞増殖に関する遺伝子の発現が低下し、レチノイドX受容体活性化pathway、JNKsignaling、腫瘍の抑制および腫瘍増殖の促進に関与するTGF-βsignalingの抑制に関わる遺伝子群を見出した。DHRS3とNR0B1は神経芽腫の自然縮退に関連する可能性がある。来年度は動物実験であり、かなり時間がかかることが予想されるため、本年度の実験作業は前倒しにして進めていた。このため、本年度は概ね順調に進めることができた。Tet-On遺伝子発現の結果、CYP26A1は予後良好因子として関与していない可能性がでてきたので、予後良好因子の候補から外し、ノックダウンモデル動物の作成は行わないことにした。本研究では、予後良好な神経芽腫の患者に高発現していたDHRS3, CYP26A1のNR0B1の強制発現とノックダウンの系を作製し神経芽腫細胞株で機能解析を行った。qPCRでmRNAの発現量を調べると、DHRS3は全細胞株で低発現で、CYP26A1とNR0B1では中程度発現があった。WBでは、強制発現前の神経芽腫ではDHRS3は検出できず、CYP26A1とNR0B1の発現も低かった。細胞増殖アッセイの結果、DHRS3の導入では全細胞株で増殖が抑制した。CYP26A1では、Tet-On系では増殖能が亢進し、ベクター系では増殖抑制された。NR0B1ではNH12とTGWでベクター系は増殖抑制されていた。RNAiでは、DHRS3はSKNSHとNH12で増殖抑制効果がみられ、CYP26A1ではNH12とTGWでは死滅し、NR0B1では全ての細胞で増殖阻害が起こった。過剰発現DHRS3はNH12で遊走能の低下がみられた。CYP26A1はTGWとSKNSHで細胞間接着の増強と凝集が誘導され、NR0B1ではTGWとNH12で遊走能の低下がみられた。NR0B1を発現した細胞株はSA-beta-galで強陽性であり、細胞老化が示唆された。RNA-seqでの遺伝子発現解析を行うとDHRS3の過剰発現株では、レチノイドX受容体活性化経路を介して下流のJNK signalingや、腫瘍の抑制および腫瘍増殖の促進に関与するTGF-βsignalingに関連する遺伝子群が抑制されていた。CYP26A1では、細胞運動、細胞形態、細胞周期などの抑制がみられ、SKNSHとNH12ではレチノイドX受容体レチノイン酸媒介性遺伝子活性化パスウェイが示された。NR0B1では細胞形態や細胞死、P38-MAPk signalingなどの関連が示唆され、これらは間接的な神経芽腫治療のためのターゲットになりうる。in vivo MYCN Tgマウス神経芽腫モデル、コンディショナルノックアウトマウスモデルでの予後良好因子群の検討: MYCNTgマウスで自然発生するマウス神経芽細胞腫にin vivoトランスフェクションで予後良好因子が作用するかを検討する。また、予後良好因子群のコンディショナルノックアウト動物を作成し、MYCN Tgマウスと交配させ悪性度の高いモデルも作成し病態を解析する。RNA-seqの遺伝子発現結果と照らし合わせながら、相関する候補遺伝子を絞り込み検討をすすめてゆく予定である。小児がん次年度使用額が生じた理由は、測定のための装置の使用料金や、必要な消耗品の試薬が年度末に立て込んだからです。消耗品を購入する予定で予算を残していたのですが、実験計画が遅れて購入できなかったので次年度に繰り越します。消耗品と機器使用のために使用します。次年度に消耗品として試薬を購入するために使用します。
アウトカム評価と科学的評価による補完・代替医療の学際的評価と臨床応用

今回の研究ではこれまでの看護師、音楽療法士に加え、新たに、保健医療職として医師・保健師・理学療法士・作業療法士・言語聴覚士・福祉職を加えたチームアプローチで、世界でも稀な、まったく新しいコンセプトによる代替療法・音楽療法を活用した、安寧と心身の健康増進プログラムの設計・開発を行った。前期・後期の計10回、おおよそ2週間に1回の音楽療法を開催し、パーキンソン友の会会員を対象にセッションをもった。音楽療法のセッションは、札幌市内の音楽療法士3名の協力を得て行った。看護職スタッフは、音楽療法セッション前後の健康チェック、前回参加後から健康状態はどうであったかの確認および健康相談を行った。この健康チェックの際に、6段階の簡易的な気分スケールを用い評価したところ、音楽療法セッションの一時的な効果を確認した。また生活の質向上への長期的な効果を測るために、前期開催時5月と終了時8月、および後期開催時9月と終了時12月に、血圧・脈拍、PDQ39、HADS、ニーズ調査票、オリジナル健康調査票(独自に作成)を用いて調査を行った。音楽療法が終了する12月から次年度開催の5月開催まで、長期間にわたりケアが中断されるため、アロマセラピーを2回開催し、健康チェック・健康相談も行い参加者への支援を続けた。前期終了時(8月)および後期終了時(12月)、参加者とともに会合を持ち、意見交換を行った。またスタッフ間での会議を持ち、参加者の健康の維持や生活の質の向上に寄与できているかを調査結果から評価し、ニーズ達成状況を確認した。セッション内容の振り返りと医療者の専門的アドバイスを受け、音楽療法士はその後の音楽療法セッションのプログラム改善に努めた。看護師は参加者の状況把握の方法および環境づくりに調査結果を反映させ、健康チェック・健康相談の内容の改善、調査法の工夫、癒しの場の創り方を検討した。1:音楽療法を受けているパーキンソン病患者の日常生活に及ぼす音楽療法の影響や効果をインタビュー方式により分析した。その結果、患者が語る音楽療法の効果はマズローの欲求階層説で構成され、以下の6つのカテゴリーが得られた。すなわち、【身体機能の向上】、【安定・安心機能の向上】、【社会的機能の向上】、【自己肯定機能の向上】、【生きがい・折り合いの自己実現】、【審美的欲求】であった。音楽療法を選択するまでの過程は、信頼できる医師からの勧めで音楽療法士と出会い、症状の緩和への期待という動機づけがあり、音楽が好きであることと、これまでの生活過程の中で音楽との楽しい思い出が連動していた。音楽療法の効果は、まず【身体機能の向上】≪言語機能・コミュニケーション機能の回復と発達≫≪運動機能・感覚運動スキルの改善・促進≫に出現した。疾患を抱える患者であっても音楽療法によって、人間の基本的欲求充足は高次のレベルのものまでも獲得されていることが確認された。2:「パーキンソン病のクライエントに対する音楽療法の効果測定に関するインタビュー研究-ケアリングの視点からの心の健康の定性的評価」(猪股.2006)を基に、パーキンソン病患者の音楽療法の効果測定アンケートを作成し、音楽療法に参加しているパーキンソン病患者と、参加したことのないパーキンソン病患者の日常生活における健康状態を比較することによって、音楽療法の効果を検証した。その結果、音楽療法併用のパーキンソン病患者の健康状態は、友人との交流などにより社会的機能の向上が認められた。特に音楽への嗜好や、音楽療法に対する興味・関心度の高い患者は、音楽療法への積極的参加により、身体機能の向上、安定・安心機能の向上、社会的機能の向上、自己肯定機能の向上、生きがい・折り合いの自己実現、審美的欲求充足が期待される。医師・看護師はパーキンソン病患者の健康状態を音楽療法士へ情報提供を行い、音楽療法士は患者のニーズを反映した音楽療法プランの作成と実行に関与し、そして、多職種と患者参加による音楽療法の効果や意義を評価するプロセスを繰り返す、健康マネジメントにより、パーキンソン病患者の身体機能の向上、安定・安心機能の向上、社会的機能の向上、自己肯定機能の向上、生きがい・折り合いの自己実現、審美的欲求が充足される生きる意欲を引き出す援助となることが考えられた。1.統合医療に必要な概念の研究を推進するために、研究会を開催(北海道地区癒しのヘルスケアシステム研究会、統合医療を考える看護研究会)した。ホリスティックヘルスとヒーリングの学習、治療的環境を整備するためのコンセプトや知識、最適な、癒し環境の構成要素による環境設計、多様な臨床場面の患者集団に対する補完代替療法や統合医療がどのように提供されるかの検討、患者に選択されたヒーリング実践のありかた、個々人の健康とウエルビーイングのためにホリスティックヘルスとヒーリングの概念を適応した実践計画を立案し、教育や臨床の場で、ホリスティックヘルスとヒーリングのリーダーシップを発揮するストラテジーなどを検討し、IMJ学会誌に論文を掲載した。2.患者の健康を回復・増進する医療としての、CAW音楽療法活用の方法論開発を行い、ヘルスケア向上のシステムを設計し、実践を平成20年5月から12月まで、財)北海道難病連、全国パーキンソン病友の会北海道支部、社)日本リウマチ友の会北海道支部の皆様のご協力とご支援を頂き、補完代替医療を活用したヘルスケア向上システム構築プロジェクト研究「音楽療法を活用した健康増進プログラムを共に創る会・パーキンソン病患者様に対する音楽・看護療法実践」を北海道難病センターにおいて開催することができた。

今回の研究ではこれまでの看護師、音楽療法士に加え、新たに、保健医療職として医師・保健師・理学療法士・作業療法士・言語聴覚士・福祉職を加えたチームアプローチで、世界でも稀な、まったく新しいコンセプトによる代替療法・音楽療法を活用した、安寧と心身の健康増進プログラムの設計・開発を行った。前期・後期の計10回、おおよそ2週間に1回の音楽療法を開催し、パーキンソン友の会会員を対象にセッションをもった。音楽療法のセッションは、札幌市内の音楽療法士3名の協力を得て行った。看護職スタッフは、音楽療法セッション前後の健康チェック、前回参加後から健康状態はどうであったかの確認および健康相談を行った。この健康チェックの際に、6段階の簡易的な気分スケールを用い評価したところ、音楽療法セッションの一時的な効果を確認した。また生活の質向上への長期的な効果を測るために、前期開催時5月と終了時8月、および後期開催時9月と終了時12月に、血圧・脈拍、PDQ39、HADS、ニーズ調査票、オリジナル健康調査票(独自に作成)を用いて調査を行った。音楽療法が終了する12月から次年度開催の5月開催まで、長期間にわたりケアが中断されるため、アロマセラピーを2回開催し、健康チェック・健康相談も行い参加者への支援を続けた。前期終了時(8月)および後期終了時(12月)、参加者とともに会合を持ち、意見交換を行った。またスタッフ間での会議を持ち、参加者の健康の維持や生活の質の向上に寄与できているかを調査結果から評価し、ニーズ達成状況を確認した。セッション内容の振り返りと医療者の専門的アドバイスを受け、音楽療法士はその後の音楽療法セッションのプログラム改善に努めた。看護師は参加者の状況把握の方法および環境づくりに調査結果を反映させ、健康チェック・健康相談の内容の改善、調査法の工夫、癒しの場の創り方を検討した。
記憶学習に関与する神経回路の可視化とシナプスにおける変化の解析

研究代表者らが開発した誘導系GFP-GluR1トランスジェニックマウスを主に用いて、高次脳機能に中心的役割を果たすと考えられているAMPA型グルタミン酸受容体の記憶学習時における動態を指標に、学習によるニューロン、シナプスの分子・細胞変化の解析を行った。また、記憶学習に異常が認められるいくつかの遺伝子改変マウスにおける、分子・細胞・回路・行動レベルでの変化を明らかにした。記憶するということは経験により脳内に生じた"何らかの変化"が維持されることであると考えられる。そこで、この何らかの変化が生じると予想される神経細胞同士のつなぎ目であるシナプスにおける分子・細胞変化を明らかにすることは極めて重要な課題である。本研究課題では、研究代表者らが開発した誘導系GFP-GluR1トランスジェニックマウスを主に用いて、中枢神経系の神経伝達に中心的役割を果たすと考えられているAMPA型グルタミン酸受容体の記憶学習時における動態の解析と、学習によるニューロン、シナプスの分子・細胞変化の解析を行っている。本年度は、学習直後のAMPA型グルタミン酸受容体めシナプスへの取り込みとその形態との関連についての解析を行う上で必要な種々の条件を確立した。現在、データを取得し、解析を進行中である。また、学習刺激により活動した神経細胞と活動しなかった神経細胞間での分子的差異を明らかにするために、種々のシナプスマーカーを用いた免疫染色、western blot、銀染色などを用いた解析を行った。更に、AMPA型グルタミン酸受容体の脳内での挙動を明らかにするための新たなトランスジェニックマウス作製のためのベクターを作製、受精卵へのインジェクションを行い、外来遺伝子が染色体に組み込まれた系統を得る事が出来た。記憶するということは経験により脳内に生じた"何らかの変化"が維持されることである。この"何らかの変化"は特定の神経回路内に起きると考えられているので、その特定の回路を同定し、そのつなぎ目であるシナプスの分子・細胞変化を明らかにすることが極めて重要な課題である。そこで本研究では、シナプス可塑性に中心的役割を果たすと考えられているAMPA型グルタミン酸受容体の記憶学習時における動態とそのシナプスの形態との関連の解析を行っている。申請者らが開発した誘導系GFP-GluR1トランスジェニックマウスを利用することにより、恐怖条件付け学習直後のGFP-GluR1の局在を共焦点顕微鏡を用いて観察した。その結果、背側海馬CA1領域の錐体細胞の樹状突起上のスパイン(ポストシナプス)の中でも特定の形態を示すスパインにGFP-GluR1のシグナルが高い割合で存在していることが認められた。このことは、多様かつダイナミックに変化するスパインの形態が学習において重要な役割を果たしている可能性を示唆する。次年度は、この結果を踏まえて更に詳細な解析を行う。記憶学習を含む高次脳機能は神経細胞同士のつながりにより支えられている。したがって、そのつなぎ目であるシナプスのin vivoでの知見は、高次脳機能を理解するうえで極めて重要な手がかりとなるが、技術的制限などの問題により解析困難であるのが現状である。近年の多くの研究によりAMPA型グルタミン酸受容体はシナプス可塑性に中心的役割を果たしているという証拠が蓄積しつつある。そこで本研究では、申請者らが開発した「任意の行動刺激により活動した神経細胞においてAMPA型グルタミン酸受容体(GFP-GluR1)の挙動を観察することが可能なトランスジェニックマウス」を利用することにより、in vivoにおけるシナプス入力・可塑性のパターンの空間的な解析を行った。トランスジェニックマウスを新規環境に提示することにより細胞体におけるGFP-GluR1のde novo合成を誘導し、24時間後にそのシナプス局在を共焦点顕微鏡を用いて観察した。得られた顕微鏡データを東京大学との共同研究により解析を行った結果、背側海馬CA1領域の錐体細胞の樹状突起上ではGFP-GluR1陽性のシナプスが8umの範囲内で有意にクラスターを形成していることが明らかとなった。つまりシナプス可塑性が空間的に近傍のシナプスの間で生じやすいことを示唆している。この現象は樹状突起における入力の非線形的な加算に大きく影響すると考えられ、実際の脳内で働いている神経細胞の演算方法の理解に大きく貢献するものである。
日本列島第四紀玄武岩類の微量成分・同位体比と上部マントルの不均一性

日本列島第四紀に噴出したソレアイト、高アルミナ玄武岩、カルクアルカリおよびアルカリ系列火山岩類と上部マントル由来超苦鉄質と下部地殻由来苦鉄質捕獲岩類の主成分・微量成分について重量法、炎光法、原子吸光法、蛍光X線法、光量子放射化法、ICPーMas法や質量分析法などを併して40種類以上の元素を定量、またSr・Nd同位体比を質量分析計により測定した。その結果、多くの顕著な成果を得ることができた。その代表的結果について幾つか記述する。1、東北日本弧の火山岩類はそれらの非調和元素規格化パタ-ンを描かせるといずれも典型的なBa、KとSr正異常とNb負異常を示し、海溝側から背弧側に向かってそれらの元素濃度は増大し、Sr同位体比は低下し、一方Nd同位体比は増加する。2、隠岐島後火山岩のSr同位体比は日本海拡大以前は0.707以上であったが、その後徐々に低くなり0.705以下になった。また非調和元素規格化パタ-ンにおいてNb負異常が認められなくなる。3、壱岐と北九州のアルカリ系列のSr同位体比はそれぞれ0.70370.7043と0.70400.7045、また非調和元素規格化パタ-ンは北九州のものは僅かに島弧型の異常が認められるが、壱岐のものにはない。隠岐島後や壱岐のアルカリ系列は沈み込み帯の影響を受けないマントル物質(かんらん岩)からマグマが供給された。4、集積岩起源苦鉄質捕獲岩の非調和元素規格化パタ-ンはいずれも顕著なBa、KとSr正異常とNb負異常を示し、明らかに島弧ソレアイト高アルミナ玄武岩マグマからの早期晶出鉱物である。またSr・Nd同位体比はマントル・アレイの上に点示され、かつ日本列島の島弧火山岩の領域に示される。つまり日本列島の基盤は島弧玄武岩の集積岩起源の物質から構成され、大陸や海洋地殼が欠如している。日本列島第四紀の代表的な火山として西南日本から由布、鶴見火山、東北日本から八幡平、焼山、森吉、蔵王、吾妻、那須、男体、鳥海火山を選び、火山岩類を採集した。それらの岩石について主成分・微量成分について重量法、炎光法、原子吸光法、蛍光X線法、光量子放射化法、IPC発光法、イオン電極法、質量分析法などを併用し、定量を試みた。また質量分析法によってSr同位体比とK-Ar年代の測定も行った。それらの結果のうち、成果の顕著なもの幾つかについて記述する。1、東北日本弧の代表的な大型火山である那須岳と鳥海山は約60万年かかって形成された。那須岳では6040万年前にソレアイト系列、204万年前にソレアイト系列とカリクアルカリ系列、4万前現在にカルクアルカリ系列を噴出、鳥海山では6040万年前にカルクアルカリ系列溶岩によりほぼ現在の規模の火山が形成され、その後山体崩壊と中央火口丘形成を繰り返している。2、八幡平-焼山火山群では東から西へ向かってK_2Oに対してMgOが増加し、またSr^<87>/Sr^<86>は減少する。

同一山体ではソレアイト系列はカルクアルカリ系列よりも高く、後者は前者から導かれたものではなくて、初生マグマは上部マントルにおいて別個に生成された。3、由布、鶴見火山ではSr同位体比は、0.703910.70437で、それらのオ-トリスは0.703850.70395である。この変化傾向はSiO_2、Srの含有量及びRb/Srの変化と良い相関関係を示し、苦鉄質と珪長質マグマの混合によって安山岩が生成したことを暗示する。日本列島新生代後半の代表的な火山岩類について主成分・微量成分について重量法、炎光法、原子吸光法、蛍光X線法、光量子放射化法、ICP発光法、ICPーMASS法や質量分析法などを併用して40種類以上の元素を定量した。また質量分析法によりSr,Nd同位体比を測定した。それらの結果のうち、精成果の顕著なもの幾つかについて記述する。1、北九州呼子と壱岐地域アルカリ系列玄武岩類の非調和元素規格化パタ-ンは非調和度が高くなるにつれて連続的に規格化値が増加し、海洋島や大陸のものと一致し、一方先に噴出したソレアイト、高アルミナ玄武岩とカルクアルカリ玄武岩は島弧火山岩特有のBaとSr正異常とNb負異常を示す。これは時間と共にテクトニックな場の物理・化学的条件が変化したことを示す。2、Sr同位体比についてみると上記地域の非アルカリ系列は0.70420.7054、呼子のアルカリ系列は0.70400.7045、壱岐のアルカリ系列は0.70370.7043であって、非アルカリ系列が最も高く、またアルカリ系列では壱岐のものは呼子のものよりも高い。これらは明瞭に同位体比的にも上部マントルが不均一であることを示す。また粗面岩や流紋岩のSr同位体比は玄武岩のものとほぼ同一であり、一連の結晶分化作用によって生成したことを示す。3、隠岐島後火山岩のSr同位体組成をみると、日本海拡大以前は^<87>Sr/ ^<86>Sr比はほとんど0.707以上と非常に高く、その後徐々に低くなり5Ma頃まで0.706以上の値が続いた。5Ma以後は急激に低くなり0.705以下になった。また非調和元素規格化パタ-ンにおいてNb負異常が認められなくなり、沈み込み帯の影響を受けないマントル物質からマグマは供給された。日本列島新生代に噴出したソレアイト系列、高アルミナ玄武岩系列、カルクアルカリ系列およびアルカリ系列に属する代表的な火山岩類と上部マントル由来超苦鉄質と下部地殻由来苦鉄質捕獲岩類の主成分・微量成分について重量法、炎光法、原子吸光法、蛍光X線法、光量子放射化法、ICP-Mas法や質量分析法などを併用して40種類以上の元素を定量した。また質量分析法によりSr・Nd同位体比を測定した。それらの結果のうち、本年度の研究成果について顕著なものについて幾つか記述する。1、八幡平火山群においては様々な組成の溶岩が噴出している。本火山群の岩石はこれまで単純にソレアイト系列とカルクアルカリ系列の2つに分けられていたが、これらはお互いに漸移的なものであることが明らかとなった。また時間的にも空間的にもある程度規則性があり、西から東へカルクアルカリ系列からソレアイト系列へと変化する。2、沖縄トラフは現在活発な背弧海盆拡大の初期段階にある。中新世現世に至る間に噴出したマグマは安山岩が主体の活動からバイモ-ダル活動へと変化した。玄武岩類は沈み込み帯の火山岩に共通した高いLIL/HFS比をもつカルクアルカリ質岩から背弧海盆玄武岩へと変化し、これはプレ-トの沈み込みに関係していないアセノスフェア-がウエッジマントルに貫入したことに起因する。さらにこのアセノスフェア-の貫入により沖縄トラフは能動的に拡大した。
地震による屋外避難路の明るさの確保と誘導システムの構築

本研究は地震災害時に発生する広域停電下での屋外避難経路の明かりの確保と避難誘導を円滑にするシステムを住宅の門灯や玄関灯などを利用して構築することを目的としている。屋外の非常時の明かりの機能として、避難路面の明るさの確保と、避難場所への誘導性が求められる。日常夜間の安全な歩行のための路面照度は犯罪からの回避が可能な平均3lx(この条件では最低鉛直面照度0.5lx程度が確保される)が堆奨されている。これまでの検討から非常時では0.50.1lxの路面照度があれば、避難経路を誤認することなく、通常歩行時に近い避難速度が得られことが見いだされている。しかしながら、これらの知見は室内の模擬街路といった限定された牢間での検計結果であり、実空間の広がりのある環境下や湾曲した街路では連続して点灯している門灯の遠近感を喪失し、避難経路を誤認する可能性がある。そのため、今年度は、天空漏れ光がほとんどなく、月没後の時間帯で全天空照度が0.03lx以下となる山間部の地方都市のグランドにおいて、試作した停電時電池点灯のLED門灯の色温度、発光面輝度(指向透過性および拡散透過性発光面(グローブ))、設置間隔を変化させ、被験者の避難時の歩行速度測定と主観評価実験を行った。その結果、設置間隔30mまでの歩行速度は色温度にかかわらず、輝度の高い指向性透過性状を有するグローブでは、街路照明により照明された街路の通常歩行速度と変わらない値が得られた。これは、歩行経路の路面照度はほとんど得られないが、照射された門灯近傍の路面全体が面光源化して、誘導性が向上したことによると推察された。しかしながら、設置間隔が50m以上になると、門灯により照射された路面はほぼ認識されなくなり、門灯だけが点光源と認知されるとともに距離感が喪失して誘導性が低下することに起因すると考えられた。拡散透過性グローブではより誘導性が低下した。以上の結果、LED門灯による屋外誘導システムの有効性と設置要件が明らかになった。本研究は地震災害時に発生する広域停電下での屋外避難経路の明かりの確保と避難誘導を円滑にするシステムを住宅の門灯や玄関灯などを利用して構築することを目的とする。屋外の非常時の明かりの機能として、避難路面の明るさの確保と、避難場所への誘導性が求められるが、今年度は避難路に面して存在する住宅の門灯、玄関灯に予備電源を組み込ことによって、広域停電下の避難路面の明るさの確保を図るシステムを構築するため、市販のLED門灯に加速度センサーによる点灯回路を組み込む作業を行った。当初予定していた、LED門灯の駆動回路が変更になったため市販の自動火災感知器に内蔵された加速度センサーの転用調整に時間を要した。そのため、被験者による評価実験は次年度に実施することにし、今年度は配光特性について測定を行った。さらに、誘導性の評価を行う方法として、視認距離、屋外誘導システムの発光面性、発光輝度と誘目性の関係について検討を行った。予備電源等がない場合や暗所視での誘導を想定して、低輝度の蓄光標識による視認性評価を行った。蓄光標識は経時的に輝度低下するため、視認評価実験は困難であるので、視認性に影響を与えない紫外光を利用して発光輝度を定常的に調整できる方法を開発した。これによって、任意の経過時間後の蓄光標識の視認性評価が可能になった。標識の設置距離、標識の面積、発光輝度と誘目性の検討を行って、所定の経過時間後に必要な誘目性を確保できる残光輝度と標識面積の関係を明らかにした。これから、標識の設置間隔によって必要な標識の大きさがあらかじめ想定できることになった。更に研究代表者が既に行った太平洋沿岸部の津波避難を想定して設置されている避難誘導標識の実態調査データを利用して、現状で設置されている蓄光標識の誘導性が十分でないことを明らかにした。これは、歩行経路の路面

照度はほとんど得られないが、照射された門灯近傍の路面全体が面光源化して、誘導性が向上したことによると推察された。しかしながら、設置間隔が50m以上になると、門灯により照射された路面はほぼ認識されなくなり、門灯だけが点光源と認知されるとともに距離感が喪失して誘導性が低下することに起因すると考えられた。拡散透過性グローブではより誘導性が低下した。以上の結果、LED門灯による屋外誘導システムの有効性と設置要件が明らかになった。
界面ケミストリ制御に立脚した高い輸送特性を有する銅系導電性ペーストの開発

バインダ配合成分やフィラー表面処理剤という化学的因子と銅フィラーの界面反応を利用する銅系導電性接着剤の材料設計について検討した.この材料設計により大気キュア可能な高電気伝導性の接着剤を実現できた.エポキシバインダ系の試料では,変性ポリアミドアミンを硬化剤として用いた場合,180 °C以上の温度でキュアすることで100 μΩcm以下の低い電気抵抗率を得ることができた.フェノールバインダ系の試料では,塩基性度の高いテトラエチレンペンタミンで処理した試料では大気キュアにより50 μΩcm程度の低い電気抵抗率が得られただけでなく,湿熱環境曝露によっても電気抵抗率の増加は見られなかった.電子部品の微細接続やファインピッチ電子回路の印刷形成などに使用される導電性ペーストの現在の主流は銀ペーストであるが,近年の銀価格の高騰により安価な非銀系ペーストの開発が電子材料メーカーにおける緊急の研究課題となっている.銅系導電性ペーストにおいては,大気環境下で銅フィラーは酸化されやすく容易に表面絶縁酸化膜が形成されるため,不活性雰囲気や還元性雰囲気中で加熱硬化させる必要があると考えられてきた.本研究では,バインダ樹脂構成成分とフィラー表面の選択的化学反応(錯体形成ー還元反応)を利用した界面ケミストリ制御技術を銅系導電性ペーストに適用し,大気中で低温キュアが可能なペースト材料の開発することを目的としている.平成27年度は,銅と錯体を形成する可能性があるアミン系硬化剤をグリシジルアミン系硬化剤に配合したバインダを用いて銅系導電性ペーストを試作し,大気キュアによる導電性発達挙動を調べた.その結果,脂肪族アミン硬化剤を用いた場合に,100150 °Cの比較的低い温度域で導電パス形成が起こることがわかった.一方,脂環族や芳香族アミン硬化剤を用いた場合には180190 °Cの温度域で導電バス形成が見られたことから,銅系導電性接着剤における導電性発現挙動には化学的因子が強く影響を及ぼしていることが示唆された.また,銅フィラーの酸化状態は硬化剤の種類によって大きく異なり,脂肪族アミンを使用した場合には,200 °C以上の温度でも酸化が抑制できることが明らかになった.さらに,銅ミクロフィラーがエポキシ系バインダ中で焼結(ネッキング)する現象も確認できた.これらの現象から,界面化学反応制御が銅系導電性接着剤を開発する上での鍵となることが示唆された.アミン硬化系エポキシ樹脂バインダを用いた銅系導電性接着剤において、大気キュアによって100μΩcm50μΩcmの電気抵抗率を実現できることを見出した。また、硬化挙動や銅フィラーの酸化挙動がバインダの種類によって大きく異なることが分かったほか,ミクロサイズの銅フィラーをエポキシ樹脂バインダ中でネッキング(焼結)させることも可能であることが明らかになった。国際会議や国内学会で口頭発表を行うなど、順調にデータが蓄積されている。本年度は、昨年度に得られたエポキシ系バインダを用いた場合の結果基づいて、フェノール系バインダ(レゾールフェノール)を用いて大気キュア可能な銅系導電性接着剤の作製を試みた。銅フィラーをバインダと混合する前に所定のアミンやカルボン酸で表面処理を実施したところ大気キュア可能な銅系導電性接着剤を作製することができた。150200°Cでキュアしたところ、数十μΩcmの電気抵抗率が実現できた。キュア後に得られる電気抵抗率は表面処理に使用する処理剤の種類によって大きく異なった。特に脂肪族アミンと脂肪族カルボン酸が電気抵抗率を低下させるために有効な表面処理剤であることがわかった。大気キュア後の試料の断面微細組織を観察したところ、銅フィラーが集合したドメインが連結した凝集構造が発達していることが示唆された。この微細組織発達は、銅フィラーのネッキングを伴って進行している可能性があり、今後、詳細な検討を行う。脂肪族アミンと脂肪族カルボン酸はともに電気抵抗率低減に有効な表面処理剤であるが、湿熱環境曝露を行った場合の電気抵抗率変化には大きな違いが生じた。脂肪族カルボン酸を用いた場合には銅フィラーの酸化を抑制することができず、電気抵抗率が大きく上昇した。一方,脂肪族アミンを表面処理剤として用いた場合には湿熱環境曝露による電気抵抗率上昇は明確に抑制された。湿熱環境曝露後の試料の微細組織観察により、脂肪族アミンは銅フィラーの酸化抑制に有効な表面処理剤であることが明らかになった。銅系導電性接着剤の挙動の全体像を把握するためには、エポキシ系以外の樹脂バインダを用いた場合の挙動についても調べておく必要がある。本年度はレゾールフェノール系バインダを用いてモデル材料を試作したが、昨年度得られた結果に基づく予測とほぼ一致する形で導電性接着剤の開発を行うことができることがわかった。このことから、大気キュア可能な銅系導電性接着剤の作製に重要な役割を果たしているのは、脂肪族アミンや脂肪族カルボン酸など銅と錯体形成を起こすような官能基を有する有機分子であることが示唆された。また脂肪族カルボン酸を用いた場合には、銅フィラーの酸化は抑制できないことも明らかになり、酸化抑制そのものが電気抵抗率を低下させるメカニズムではないことも明らかになった。以上のことから、次のステップのメカニズム解析のための周辺情報が抑えられたと考えており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。

最終年度では,大気キュア可能な銅系導電性接着剤(フェノール系およびエポキシ系)の湿熱環境および高温環境下での電気抵抗率変化の挙動を調べるとともに,その挙動のメカニズムを中心に検討を行った.高級脂肪酸の例としてオレイン酸を銅フィラーの表面処理剤として使用した試料を85°C/85%RH環境中に曝露したところ,300500 h程度の曝露時間で電気抵抗率の急激な上昇が見られた.試料の微細組織評価の結果,この電気抵抗率の上昇は試料内部の銅フィラーの酸化に起因するものであることがわかった.これに対して,85°C(1%RH以下)環境に同じ試料を曝露したところ,1000 h後においてもほとんど電気抵抗率の変動は見られなかった.したがって,銅フィラーの酸化は水の存在によって促進されたことになるが,熱力学的考察から水が直接的に銅と反応したのではなく,水和酸素により銅フィラーの酸化が進行していることが示唆された.一方,アミンを銅フィラーの表面処理剤として添加した試料においては,湿熱環境での抵抗上昇挙動がアミンの分子構造の影響を受けて変化することがわかった.塩基性の高い脂肪族アミンを用いた場合には,85°C/85%RH環境中に1000 h曝露しても電気抵抗率はほとんど変化しなかった.レゾールフェノールバインダを用いた試料の電気抵抗率は約50 μΩcmの非常に低い値を維持していた.湿熱環境曝露中の挙動の違いは試料中で形成される銅ーアミン錯体の安定性に起因すると考えられる.さらに,150°C以上の高温環境への曝露試験も実施した.150°C曝露の結果は,すべての試料において電気抵抗率の上昇が見られなかった.250°C以上の高温に曝露した場合,テトラエチレンペンタミンで処理した試料においては200°Cで大気キュアした試料の電気抵抗率は250°C以上の高温に曝露しても顕著に増加することはなかった.バインダ配合成分やフィラー表面処理剤という化学的因子と銅フィラーの界面反応を利用する銅系導電性接着剤の材料設計について検討した.この材料設計により大気キュア可能な高電気伝導性の接着剤を実現できた.エポキシバインダ系の試料では,変性ポリアミドアミンを硬化剤として用いた場合,180 °C以上の温度でキュアすることで100 μΩcm以下の低い電気抵抗率を得ることができた.フェノールバインダ系の試料では,塩基性度の高いテトラエチレンペンタミンで処理した試料では大気キュアにより50 μΩcm程度の低い電気抵抗率が得られただけでなく,湿熱環境曝露によっても電気抵抗率の増加は見られなかった.初年度で大気キュア可能な銅系導電性接着剤の基本配合設計が明らかになったので、これをもとにキュアプロセス中で発現する界面現象の解析を行う予定である。また、現在のところ明らかとなっている配合のポイントはバインダの硬化剤と言うことになっているが、フィラー間界面コンタクト形成が界面反応に起因するものであることを考えるとフィラーの表面処理によって界面コンタクト形成を促進されることも可能になると考えられる。そこで、フィラー表面処理の効果についても検討を進める予定である。昨年度、本年度の研究により、大気キュア可能な銅系導電性接着剤の作製には、銅フィラーと特定の有機分子の化学的相互作用を利用することが重要であることが示唆された。今後は、この化学的相互作用の実態と、それによって引き起こされる導電性接着剤中の微細組織発達などをキュアプロセス解析を通じて調査することを予定している。
アレルギー性鼻炎における感作・発症に関する研究

当施設で調査した3453人の中で、スギ花粉に対する血清特異的IgE保有者は、57.5%であり、その中でスギ花粉症を発症していたのは72.2%であった。残りの27.8%は感作陽性未発症者であった。非アレルギー者、感作陽性未発症者、スギ花粉症患者の血清ケモカイン濃度を測定し、発症予測因子を検討した。また鼻粘膜上皮細胞における遺伝子発現解析を行い、感作から発症に関する遺伝子としてcystatin SN(CST1)を同定した。スギ花粉症発症のメカニズムを解明すべく、スギ花粉症患者群、非アレルギー者であるコントロール群、血清スギ特異的IgE陽性でありながら今まで症状を認めていない感作陽性未発症者群の3群間における鼻粘膜搾過細胞、末梢血CD4陽性T細胞、CD14陽性単球細胞の網羅的遺伝子解析を行った。その中で鼻粘膜搾過細胞のgene X(特許申請のためgene Xと呼ぶ)とIntelectin 1(ITLN1)、末梢血CD4陽性T細胞のInterleukin17 receptor B(IL17RB)がスギ花粉症患者群で高発現していた。これらの遺伝子がどのように鼻上皮細胞や血球細胞と関連し、スギ花粉症発症に関与するかを調べた。まずスギ花粉症患者の末梢血よりMACS磁気細胞分離システムを用いてB細胞を分離し、gene XとIL-4と抗CD40抗体の刺激を行い、IgE産生を測定した。その結果gene XはIgE産生には影響しないことが判明した。次に鼻下甲介粘膜を培養し、gene XとITLN 1を上皮に作用させ、IL-33を測定したところ、IL-33の産生には影響しないことが分かった。培養した鼻粘膜上皮細胞にpapain、スギ花粉を作用させたところZO-1とclaudin-1のmRNAが低下した。しかし、gene Xを鼻粘膜上皮細胞に作用させると、ZO-1とcaludin-1のmRNAの低下は認めず、papainやスギ花粉のprotease活性を干渉する働きがgene Xにあると示唆された。これまでにスギ花粉症の感作から発症に至る遺伝子について、網羅的遺伝子解析の結果数遺伝子を候補遺伝子として同定できた。これらの遺伝子についてスギ花粉症患者、感作陽性未発症者、及び非アレルギー者の3群間における動向を、症状や末梢血白血球分画、血清中サイトカイン濃度と比較することで、各遺伝子がどのように発症に関与するか同定できた。その中で感作から発症に至る重要な遺伝子としてgene XとITLN 1に注目し、その機能解析を行った。現時点でgene Xが上皮のバリア機能に関与していることが示唆された。今後は培養した鼻粘膜上皮細胞にプラスミドDNAを用いてgene XとITLN 1をknock inし、stable transfection細胞を樹立する。その細胞が通常の鼻粘膜上皮細胞とどのような差異を生じているかを以下の方法で追認する。1マイクロアレイを用いてstable transfection細胞と正常鼻粘膜上皮細胞との遺伝子発現変化を調べる。2その変化を認めた遺伝子についてパスウエイ解析を行う。3アレルゲン、LPS、poly(I:C)の抗原刺激を行いその後上皮から産生されるIL-25、IL-33、TSLP、periostinを測定する。4stabletransfection細胞と好酸球を共培養し、アレルゲン投与時における好酸球遊走の変化を調べる。鼻粘膜上皮培養キット、gene XとITLN 1のプラスミドDNA、各サイトカインのELISAキット並びに定量real-time PCRに関する試薬とprobeについて使用する予定である。また研究成果を学会で発表するためと、共同研究施設との打ち合わせに必要な旅費に使用する予定である。
大気海洋界面における温室効果気体の挙動

大気中のCO_2などの温室効果気体の消長に果たす海面の役割の大きさを決める手法として、1.地球化学的収支、2.大気中濃度の解析、3.大気海洋界面における濃度差の解析、4.海水中濃度の時間的変動、経年変化の解析、5.海底堆積物に残された記録の解析による方法がある。そこで、1については、これまでのデータを再吟味し、主に1960年代に加えられたC-14の推移に注目して解析した。2については、海洋上をわたる大気に注目し、札幌近くの日本海沿岸に観測所を設け、日本海からの空気中のCO_2、O_2、H_2O、のOとHの同位体比の微細変動を解析した。3については、海水中のCO_2の逃散度を他の海洋炭酸系に関わる成分と同時に測定し、海洋表面水の平衡からのずれとそれの解消を支配している因子を明らかにした。また、CO_2そのものの交換速度定数を求め、交換量を求めた。泡の効果により、CO_2の交換速度はO_2の交換速度よりかなり大きかった。また、海水中のCH_4、N_2O、DMSも測定し、これらの逃散量を見積もった。4については、西部北太平洋ばかりでなく、東シナ海、噴火湾などの縁辺海や大陸棚域の炭酸系と時間変化の詳密な観測を行い、その構造を明らかにした。これには、水温、塩分、溶存酸素、栄養塩、全炭酸、pH、アルカリ度ばかりでなく、トレーサーのCFCs、トリチウム、C-14なども含まれる。その結果、太平洋水はもともとCO_2を吸収しやすい海であるが、沿岸域(大陸棚ポンプを提唱)や高緯度域から海洋に大量に送り込まれ、またSiが主導する生態系と太平洋中層水が働いて、大きな吸収量になることが明らかとなった。5については、炭酸塩をあまり含まない西部北太平洋の堆積物について、オパールなどを用いて氷期と間氷期間の差異を明らかにし、海水循環の違いから、炭素循環の違いを考察した。また、CO_2の吸収量に影響する生物ポンプの働きを海底での化学成分の挙動から明らかにした。二酸化炭素を中心にDMS、メタン、亜酸化窒素などの温室効果気体の海面における挙動を知るため、それらを測定だけでなくラドン、酸素同位体、炭素同位体などをトレーサーとして研究している。今年度得られた成果は下記の通りである。1.表層海水に溶けている二酸化炭素の活量の時間変化を溶岸の定点で詳密に測定したところ、亜寒地帯では生物活動により大きな日変化があることがわかった。2.大陸棚域と外洋域の二酸化炭素活量、全炭酸などの分布を比較し、解析したところ、大気二酸化炭素の海洋への呼吸に関する大陸棚ポンプなる用語を提唱するに至った。また、北太平洋水の呼吸能が大きいことをPotential Sink Capacityを定義して説明した。3.DMS、メタンのこれまでの測定結果を整理し、印刷公表するとともに、溶岸域の役割の大きさを明らかにした。4.亜酸化窒素も溶岸域での放出量が大きいので、海底で壊される場合と海底で生産される場合があり、それによって海面の濃度も大きく異なる。5.酸素の同位体を用いて交換速度を出す方法をほぼ確立した。生物活動の影響が大きいので、利用可能である。6.炭素同位体を用いる方法も測定ラインができ、テストを行った結果、実用化できる見通しが立った。

7.ラドンについて過去のデータを整理したところ、気泡の効果が極めて大きいことがわかり、来年度以降に観測するための高精度な分析法を考え、テストした。海洋炭酸系の観測は、西部北太平洋の155°Eに沿って年間1回、北海道の噴火湾でほぼ毎月1回行った。また、ラドン、酸素、フロンなどを用いる大気海洋間の気体の交換速度の観測も行った。得られた成果については、現在解析中であるが、これまでに得られた成果とあわせて、以下のような仮説の検証を行った。仮説は、海洋水はモデラ-達が考えている以上にCO_2を(産業革命以前に比べて年間3ギガトン程度増加)吸収しているが、最近急速にその吸収量を減らしている、というものである。これの検証に第1歩として、大西洋深層水に比べて太平洋深層水が特にCO_2を吸収しやすいことをPotential Sink Capacity,Θを定義して説明した。これは、南極海での気体交換の効果、炭酸塩溶解の効果、大気CO_2増加の効果よりなり、これらを合計すると、15Svといわれる南極海より北上する深層水は年間1.0ギガトンのCO_2を余分に吸収しうることを、これまでのデータをもとに算出した。この効果は、これまでのもでる計算において殆ど考慮されていないので、これを算入し、これまで計算されてきた表層水や中層水への吸収量を加えれば、上記の仮説の前半は証明されるものと考えられる。なお、北太平洋には、実際に上記の吸収を行う4つの過程が存在することを見つけ、それの定量化を試みている。それらは、北太平洋中層水および南極中層水、大陸棚ポンプ、荒天化の高緯度域、けい藻を主体とする北部北太平洋の生態系である。現在、大気海洋間の気体の交換量は、大気海洋間のフガシチー差とトレーサーを使って求めた交換速度の積から見積もっているが、両者は時々刻々大きく変動しており、気体間の交換速度の違いの問題もあって、正確なフランクスが得られているとはいい難い。そこで、海水が滞留する噴火湾において、月に1回、海水中の溶存酸素、全炭酸、pH、アルカリ度および炭素同位体比の鉛直分布を測定し、酸素、二酸化炭素、炭素同位体の交換速度を求めた。その結果、この順、つまり気液平衡に要する時間が長いほど、交換速度は大きくなることがわかった。この原因は、海洋水中に持ち込まれる泡や空気塊が交換に大きな役割を果たしている結果と推定される。これ(交換の機構)については、海水中のラドンの鉛直分布を観測して、結果を解析中である。また、同時にクロロフルオロ炭素類および6フッ化イオウについても測定した。気体が交換した結果は、当然海水に記録される。したがって、海水中の存在量を測定し、気体交換以外による項を消去できれば、交換量がわかる。この解析法を工夫して北太平洋水に応用したところ、多くの欧米の研究者が妥当と考えている数字以上の人間活動起源の二酸化炭素が溶け込んでいることがわかった。この原因について考察し、一つは、太平洋水は、大西洋水より大きな吸収容量をもともと持っているためとわかった。これは太平洋深層水が南極海を経由するとき二酸化炭素を放出し、栄養塩は使われていないからである。もう一つは、沿岸域から外洋水の下部に押し込まれているからである。これをContinental Shelf Pumpと名付けた。大気中のCO_2などの温室効果気体の消長に果たす海面の役割の大きさを決める手法として、1.地球化学的収支、2.大気中濃度の解析、3.大気海洋界面における濃度差の解析、4.海水中濃度の時間的変動、経年変化の解析、5.海底堆積物に残された記録の解析による方法がある。
イモゾウムシ病原性原虫の感染伝播機構と宿主代謝制御機構の定性・定量的解析

1.Farinocystis sp.の感染の伝播は、オーシストを介した水平伝播と考えられている。これまでの結果をもとに、宿主消化管内におけるオーシスト脱嚢に関与する宿主因子の検討を行った。その結果、ヘキサンによる前処理を行ったオーシストのみ脱嚢が確認されたが、これには、宿主消化管抽出液中にあるプロテアーゼの関与が示唆された。一方で、プロテアーゼ阻害剤による脱嚢率の低下が認められたことから、宿主消化管抽出液中にはこれらのプロテアーゼ以外にも脱嚢を誘導する因子が含まれていると推察された。また、ザイモグラフィーにより基質特異性の異なる複数のプロテアーゼが確認され、セリンプロテアーゼあるいはシステインプロテアーゼであることが示唆された。2.Farinocystis sp.の野外での伝播性を検討するために、甲虫以外のさまざまなサツマイモ害虫に対する本原虫の感染性を調査した。アブラムシ類、ヨトウ類、ハエ類などを供試して接種試験を行ったところ、いずれの昆虫にも感染力を示さなかったが、体表を汚染したオーシストを介しての伝播の可能性は否定できなかった。3.パルスNMR法により、Farinocystis sp.に感染したイモゾウムシの生体内代謝の変化を調査した。その結果、感染個体において、中腸での1H核緩和時間の増大が認められた。また、特定のシグナル強度が感染個体と非感染個体で明瞭に異なり、外見上、健全個体との相違が認められない感染個体において、代謝の変化を確認することが可能であった。本種オーシストは蛍光染色剤FITCに対して難染性であり、Cryptosporidium属原虫などで報告のあるトリアシルグリセロール(TAG)による脂質層がこれに関与している可能性が示唆された。そこで、界面活性剤や有機溶媒への浸漬など、脂質層に影響を与えうる処理を探索した。FITCによる染色強度を指標として各処理を比較した結果、界面活性剤処理では顕著な変化は見られなかったが、有機溶媒処理においてFITCの染色強度が増加した。特に、低極性有機溶媒において染色強度の増加は顕著であった。また、オーシストを浸漬したヘキサンを薄層クロマトグラフィーによって分析した結果、ヘキサン中にTAGを含む複数のオーシスト由来の脂質の溶解が確認され、本種オーシストにおいても脂質層が存在することが明らかとなった。本種オーシストに脂質層が存在することが明らかとなったため、界面活性剤や有機溶媒への浸漬など脂質層に影響を与えうる処理を行った後にトリプシン溶液中に懸濁することで、オーシストの脱嚢が誘導されるかを調査した。その結果、界面活性剤による前処理およびエタノール、アセトン、エチルエーテルを用いた試験区ではオーシストの脱嚢率に顕著な変化は見られなかったが、トルエン、キシレン、ヘキサンを用いた前処理を施した試験区において70%前後の脱嚢率が得られた。以降、本種オーシストの前処理にはヘキサンを供試して脱嚢を促すこととした。さらに、Percoll密度勾配法により、オーシストと脱嚢したオーシストから放出されたスポロゾイトを分離し、スポロゾイトのみを回収することができた。交付申請書に記載した研究実施計画に沿って、ヘキサンによる前処理とプロテアーゼ処理による原虫オーシスト人工脱嚢法を確立し、脱嚢してきた原虫スポロゾイトを密度勾配遠心法によって分離・回収することができた。しかしながら、沖縄県病害虫防除研究センターから分譲された人工飼料育イモゾウムシ個体群おいて原虫感染個体が頻発したため、原虫未感染コントロールとして供試することが不可能になり、その結果、比較実験を思うように進めることができなかった。従って、これら成果の公表が準備段階に留まったため、進捗状況をやや遅れていると評価した。1.表面殺菌した既感染人工飼料育イモゾウムシ幼虫を実体顕微鏡下で解剖して脂肪体を切り出し、30%牛胎児血清および2%抗生物質を添加したMGM464培地中27°Cで培養した。この初代培養を回収して、30%(w/w)Percoll密度勾配上に重層し、1,800 g、27°C、3分間遠心して、増員増殖期にある原虫細胞を含むバンドを回収した。これを同培養液に希釈して培養を開始した。培養開始後、増員増殖期にある鎌状のスポロゾイトは活発に増殖を続けていたが、その後、一部にやや球形の原虫細胞が認められ始め、鎌状の原虫細胞と小型球形の原虫細胞が混在した状態が長期間継続された。培養120日後の感染培養には、大型球形の原虫細胞であるガメトシスト(直径約30マイクロメーター)が観察され始め、その数が増加していった。現在の感染培養には、依然として多数の鎌状のスポロゾイト様原虫細胞および小型球形の原虫細胞が認められるとともに、ガメトシストに混在して遊離された多数のオーシストが観察されている。これらのことより、本原虫細胞は一定の栄養条件のみで分裂増殖および細胞分化が可能であること、またオーシストの自発的な脱嚢の可能性が示唆された。2.1で得られた各成育ステージにある原虫細胞を含む感染培養を30%(w/w)Percoll密度勾配上に重層し、1,800 g、25°C、3分間遠心した。その結果、上部とその下方に2本のバンドが形成され、各バンドにはそれぞれオーシストおよび増員増殖期にある原虫細胞が含まれていた。

増員増殖期にある原虫細胞を含むバンドを回収して、限界希釈法により個々の原虫細胞を単離し、これらを供試してEF1およびHSPプロモーターからのGFP発現コンストラクトの作製を試みた。しかしながら、いずれの方法でも安定した組込みが認められず、発現が確認されないか、または一過性の発現に留まった。研究が進んでいるマラリア原虫での事例を参考にGFP発現原虫体の作製を進めたが、現在までに安定したゲノムカセットの組込みとGFP発現コンストラクトを得るに至っていない。従って、一連の研究成果として公表できず、準備段階に留まった。一方で、本原虫オーシストは蛍光染色剤FITCに対して難染色性であるが、オーシスト表面の脂質層を処理することにより、染色性を高めることが可能となった。この方法を用いて、原虫オーシストの宿主体内への取り込みと分布までは定量化できることが確認された。以上のことを総合して、進捗状況をやや遅れていると評価した。1.Farinocystis sp.の感染の伝播は、オーシストを介した水平伝播と考えられている。これまでの結果をもとに、宿主消化管内におけるオーシスト脱嚢に関与する宿主因子の検討を行った。その結果、ヘキサンによる前処理を行ったオーシストのみ脱嚢が確認されたが、これには、宿主消化管抽出液中にあるプロテアーゼの関与が示唆された。一方で、プロテアーゼ阻害剤による脱嚢率の低下が認められたことから、宿主消化管抽出液中にはこれらのプロテアーゼ以外にも脱嚢を誘導する因子が含まれていると推察された。また、ザイモグラフィーにより基質特異性の異なる複数のプロテアーゼが確認され、セリンプロテアーゼあるいはシステインプロテアーゼであることが示唆された。2.Farinocystis sp.の野外での伝播性を検討するために、甲虫以外のさまざまなサツマイモ害虫に対する本原虫の感染性を調査した。アブラムシ類、ヨトウ類、ハエ類などを供試して接種試験を行ったところ、いずれの昆虫にも感染力を示さなかったが、体表を汚染したオーシストを介しての伝播の可能性は否定できなかった。3.パルスNMR法により、Farinocystis sp.に感染したイモゾウムシの生体内代謝の変化を調査した。その結果、感染個体において、中腸での1H核緩和時間の増大が認められた。また、特定のシグナル強度が感染個体と非感染個体で明瞭に異なり、外見上、健全個体との相違が認められない感染個体において、代謝の変化を確認することが可能であった。前年度に引き続き、以下の12の研究を進めるとともに、今年度は新たに3の研究に着手する。1.原虫活性定量法の検討を進め、これらの方法を用いて各種溶媒処理した原虫オーシストの不活化条件を検討することにより、イモゾウムシ卵の有効な表面殺菌法を確立して、人工飼料育イモゾウムシ個体群におけるオーシスト汚染に起因した原虫病蔓延を完全に阻止する。2.昨年度に確立済みの方法を用いて、分離・回収してきた増員増殖虫体を標的とした原虫感染検出法を検討する。3.研究が進んでいるマラリア原虫での事例を参考に、GFP発現原虫体を作製し、in vivoおよびin vitroでの原虫感染動向を可視化し定量する。FITC染色オーシストを供試するとともに、遺伝子導入方法を再検討・改良することでGFP安定発現原虫体の作製を行い、サツマイモ塊根育および人工飼料育イモゾウムシ個体・個体群、放射線照射によって不妊化されたイモゾウムシ個体・個体群における原虫動向を定量的に解析する。