hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語諸方言に見られる中間言語的変異の研究-言語変異理論の立場から-

次年度に行う予定の本調査の準備のために,方言変化に関わる文献資料の収集と,予備調査として福岡の若年層の談話を収集し,資料整理を行った。なお,これらの研究の成果は,次年度は国内・海外の学会で発表し(いくつは申し込み済み),順次印刷刊行する予定。今年度は各自以下のような研究成果をあげた。(太田)鹿児島方言の文末音調と語アクセントの関連を,音声アンケート等の調査にもとづき,話者の社会的属性を中心に考察した。また,大学生に対する聴取実験の結果から,鹿児島方言の語アクセントに変化が起きつつあると見られる結果を得た。(日比谷)トロントでフィールド調査を行い、日系カナダ人の自然談話録音資料を収集し、その日本語に観察される中間言語的変異を分析した。(助川)外国人日本語学習者の日本語韻律における中間言語的変異を観察するための調査票を開発し、試行実験を実施した。(松田)東京語「を」格ゼロマーク化研究の発展として言語変化と年齢差(age-grading)の関係を探り、拡大恒速度仮説(ECRH)を提唱し、国内外での発表および論文執筆を行った。(高野)北海道方言の韻律に関して、異なる世代の話者から談話資料を収集し分析をした。異なるレジスターからの自然談話を収集し、韻律強調に関する分析をおこなった。また、米語における類似の変異との比較した。(二階堂)福岡の若年方言談話を観察し,関西方言出自のものなど、外部の言語の影響がみられることがわかった。また話者へのフォローアップインタビューを行い、言語意識の点などに見られる変化の新しい側面・問題を浮かび上がらせることができた。(ロング)小笠原における英語との接触により生じた日本語方書の変種に見られる変異現象を分析した。また小笠原における言語調査の録音資料(テープ)編集,およびパソコンでの分析用の音声ファイルを作成した。今年度は鹿児島と福岡で研究会を開き,中間言語的変異の可能性などについての意見交換を行った。また,これまでに得られた成果をまとめて,8月にフィンランドで開催された国際方言学会(Methods)で,太田,ロングが,10月に米国スタンフォード大でのNWAV第31回大会では高野,松田が発表した。最終年度の今年度は,仙台と鹿児島で2度の研究報告会を行い,研究の進捗状況を確認し,議論した。また各人が以下の研究を行い,報告書を作成した。(1)これまでに集めた文献とデータから,言語研究における変異理論の有用性の再点検,中間言語的変異の言語理論上の位置づけについて考察した。(太田)(2)南大東島と小笠原諸島の実態調査を行い二つの方言に見られる中間言語的要素を探った。琉球語を母語とする人、または小笠原英語を母語とする人との間に生まれた日本語には中間言語的な側面が著しく現れていることが分かった。(ロング)(3)福岡の談話資料と先行研究の結果をつき合わせ、検討。談話の話者への確認調査などを実施した。その結果、アンケート回答などではわかりにくい、文脈上の使用特徴などを明らかにすることができた。(二階堂)(4)日系カナダ人2、3世の自然談話
脳機能解明に向けたシグナル伝達の多項目同時イメージング法の開発

脳に関する情報伝達や記憶といった機能や神経変性疾患の理解は、光学的手法や機能的核磁気共鳴画像法などの分析技術の発達により確実に深まっている。一方で、これらの分析手法は定量性が乏しいことや、単項目解析であることが課題であった。そこで、定量性を有し、多項目同時解析可能な新規電気化学イメージングセンサを開発する。具体的には、これまでに開発した集積回路を利用した電気化学デバイスを基板として、集積回路への多項目計測システムの導入、種々の神経伝達物質の選択的検出、活動電位の高感度検出を目指す。これらにより、神経伝達物質の選択的検出および活動電位の高感度検出を可能とする新規電気化学センサの開発を目指した。1年目および2年目では複数の神経伝達物質を同時に評価できる電気化学イメージングデバイスの開発に着手してきた。このデバイスでは、選択的に電極に酵素を導入した電極を作成することで、ドーパミンおよびグルタミン酸の同時検出に成功している。最終年度になる3年目では、これまでに作成してきた新規電化学デバイスの神経伝達物質の検出感度をさらに高感度化するために、シグナル増幅機構および神経伝達物質の選択的検出能を有する電気化学イメージングデバイスの設計、シミュレーションそして作成を行った。作成した新規電気化学イメージングデバイスその結果、2から3倍近く神経伝達物質の検出感度の向上を確認した。また、シミュレーション結果とも一致しており、設計通りのデバイス作成に成功したと言える。本デバイスを用いて神経様細胞塊を評価し、リアルタイムで神経様細胞塊から放出される神経伝達物質の検出に成功した。これらの成果をまとめ、現在学会発表や国際誌への投稿を行っている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、脳組織、特に脳スライスから放出される2つ以上の神経伝達物質および、活動電位を同時に計測することを目標としている。測定に使用するのは電気化学的手法で、電気化学測定電極が基板上に20×20個配列した電気化学測定デバイスを使用する。これにより、各電極において、目標を達成するために、神経伝達物質を選択的に検出する方法が必要になる。当該年度は、多項目同時計測デバイスの開発および神経伝達物質の選択的検出に向けた2つの検出システムの検討を行った。1多項目同時計測に向けて、2つの電位を同時に印加することが可能なCMOS電気化学センサを作製した。このセンサを利用することで、各電位で各神経伝達物質を計測することができる。当該年度では、デモンストレーションとして、神経細胞塊から放出されるドーパミンと、細胞の代謝に関連している呼吸活性を同時に評価した。この同時計測により神経伝達物質の放出と呼吸活性に強い相関性が見られないことが分かった。また、神経伝達物質には電気化学的に活性を持たないグルタミン酸や、アセチルコリン等があり、これらを選択的に検出するために、酵素を修飾した電極を作製する必要がある。現在、酵素-メディエーター修飾電極の作製に取り組んでおり、ドーパミンとグルタミン酸の同時検出が可能なデバイスの開発に成功している。2生体組織中には神経伝達物質以外に様々な生体関連物質が含まれているが、窒素原子を含有した炭素電極は窒素原子を触媒点とし、神経伝達物質(ドーパミン)および生体内に混在する生体関連物質(アスコルビン酸や尿酸等)のシグナルを分離することができる。当該年度は、ドーパミンの重合体であるポリドーパミンを原料として、ポリドーパミンの薄膜を作製し、焼成することで、窒素原子含有炭素電極の作製を検討した。以上の成果は国内、国際学会で発表を行った。当該年度では、多項目同時計測可能なデバイスの開発および神経伝達物質の選択的検出に向けた開発を予定していた。多項目同時計測可能なデバイスでは、2つの電位を印加可能なデバイスの開発に成功しており、生体組織から放出される神経伝達物質および、生体組織の呼吸活性の同時評価に成功している。デモンストレーションとして、神経細胞塊から放出されるドーパミンと、細胞の代謝に関連している呼吸活性を同時に評価した。神経伝達物質の検出に関しては、神経伝達物質には電気化学的に活性を持たないグルタミン酸や、アセチルコリン等があり、これらを選択的に検出するために、酵素を修飾した電極を作製する必要がある。この酵素修飾電極は、神経伝達物質と特異的に反応する酵素を用いることで、酵素を介して神経伝達物質が電気化学シグナルに変換するが可能である。現在、酵素-メディエーター修飾電極の作製に取り組んでおり、ドーパミンとグルタミン酸の同時検出が可能な多点計測デバイスの開発に成功している。この電気化学デバイスを用いてドーパミンとグルタミン酸の2つの神経伝達物質の同時検出に成功している。以上の成果が得られていることから、期待通りに研究が進展しているといえる。測定に使用するのは電気化学的手法で、電気化学測定電極が基板上に20×20個配列したCMOS型電気化学測定デバイスを使用する。当該年度は、多項目同時計測デバイスの開発および神経伝達物質の選択的検出に向けた3つの検出システムの検討を行った。

1.昨年度に続き、多項目同時計測に向けて、2つの電位を同時に印加することが可能なCMOS電気化学センサの開発に取り組んだ。このセンサを利用することで、各電位で各神経伝達物質を計測することができる。当該年度では、酵素修飾された電極および酵素修飾されていない電極の2種類の電極を用いることで、2種類の神経伝達物質(グルタミン酸およびドーパミン)の同時イメージングに成功した。また修飾する酵素の種類を変えることで、測定可能な神経伝達物質を選ぶことも可能である。これらに関する研究内容は、現在論文投稿中である。2.生体組織内には神経伝達物質以外に、アスコルビン酸等の電気化学活性種が共存しており、ドーパミンを電気化学的に検出する際にこれらも同時に検出されてしまう。そこで、特定の酸化還元電位の物質のみのシグナルを増強できるレドックスサイクルと呼ばれるシステムを本CMOS電気化学センサに組み込むことで、選択的に特定の神経伝達物質のみを検出することを検討した。これにより、ドーパミンの高感度検出のみならず、アスコルビン酸存在下での神経伝達物質の選択的イメージングに成功した。これらの結果に詳細な解析を加え、今後論文を投稿する予定である。本研究では、脳組織、特に脳スライスから放出される2つ以上の神経伝達物質および、活動電位を同時に計測することを目標としている。当該年度でも初年度同様に、多項目同時計測可能なデバイスの開発および神経伝達物質の選択的検出に向けた開発を予定していた。初年度に作製した多項目同時計測可能な電気化学デバイスを用いて、ドーパミンとグルタミン酸の2つの神経伝達物質の同時イメージングに成功し、これに関する論文は投稿中である。新たに本デバイスを改良し、レドックスサイクル誘導な電気化学イメージングデバイスを開発することにより、アスコルビン酸等の存在下においても、神経伝達物質のみを選択的にイメージングすることに成功した。以上の成果が得られていることから、期待通りに研究が進展しているといえる。脳に関する情報伝達や記憶といった機能や神経変性疾患の理解は、光学的手法や機能的核磁気共鳴画像法などの分析技術の発達により確実に深まっている。一方で、これらの分析手法は定量性が乏しいことや、単項目解析であることが課題であった。そこで、定量性を有し、多項目同時解析可能な新規電気化学イメージングセンサを開発する。具体的には、これまでに開発した集積回路を利用した電気化学デバイスを基板として、集積回路への多項目計測システムの導入、種々の神経伝達物質の選択的検出、活動電位の高感度検出を目指す。これらにより、神経伝達物質の選択的検出および活動電位の高感度検出を可能とする新規電気化学センサの開発を目指した。1年目および2年目では複数の神経伝達物質を同時に評価できる電気化学イメージングデバイスの開発に着手してきた。このデバイスでは、選択的に電極に酵素を導入した電極を作成することで、ドーパミンおよびグルタミン酸の同時検出に成功している。
細胞核の機能構造:分子構築と分子間コミュニケーション

平成7年度発足重点領域研究「細胞核の機能構造:分子構築と分子間コミュニケーション」(課題番号359)の準備のために以下の活動を行った。1)ワーキンググループ会議の開催:水野(東北大)、丹羽(かずさDNA研)、広瀬(遺伝研)、米田(阪大)、木南(新潟大)が平成6年9月2日(東京)、平成7年2月3日(新潟)、2月18日(東京)に集まり、研究計画、研究組織等に関する相談をおこなった。2)班会議の開催:平成6年12月15日に神戸国際会議場で開催し、領域の研究方針、総括班組織、計画研究班組織、公募研究の選択基準、ワークショップの開催、海外の研究状況等ついて話し合った。3)ワークショップの開催:平成7年2月2日4日に新潟厚生年金スポーツセンターを会場として、木南(新潟大)を世話人として染色体ワークショップを開催した。計画班予定班員の大部分と本領域に関連する分野の研究者が約70名出席し、34題の研究発表とデイスカッションを行った。
玉類の流通からみた威信財システム脱却過程に関する考古科学的研究

古墳時代後期終末期における威信財システムの構成部分として、玉類の流通状況に関する検討を行った。地域性や時期的変化を把握するために適当な調査対象資料を選定するとともに、ひたちなか市埋蔵文化財センターおよび紀伊風土記の丘資料館において、実物資料の観察を行った。得られたデータは、既調査資料と併せて、それぞれの地域の様相を実証するものである。すなわち、前者の所蔵資料においては、終末期前半まではガラス小玉を中心に、石製の山陰系や東海系が加わった豊富な玉類の副葬が継続するが、国家システムに由来する玉類は認められない。一方、後者の所蔵資料では、後期中頃には玉類の構成がほぼガラス小玉に限定され、種類の構成も前者を含めた東日本とは大きく異なっていた。また、ひたちなか市埋蔵文化財センター所蔵の資料に含まれていた鉛ガラスを素材とし、鋳型を用いて再生されたガラス小玉に関しては、鉛同位体比の材質調査および鉛同位体比の測定を行った。結果は、古墳時代的な素材の獲得および玉への加工を示すものであった。ちなみに、当該の種類のガラス小玉に関して鉛同位体比の測定を行ったのは、本研究が最初である。一方、対象時期における鉛原料の獲得状況を検討するために基礎的データとして、近畿北部福井県と愛知県北部において鉱石資料の収集を行い、そのうち4サンプルについて鉛同位体比の測定を行った。現状、古代における利用が想定されるような分析値ではなかったが、引き続きデータの充実を図る予定である。また、比較データとして、学術雑誌に公表された中国大陸および朝鮮半島の鉱山で産出した鉱石の鉛同位体比を集中的に収集した。その結果、鉛ガラスの生産に利用された原料産地に関して、かなり具体的に議論することが可能となった。最も中心的な作業内容である各地域の代表的な資料群の実見調査に関しては、対象資料の選定を行ったが、勤務地における業務とのかねあいから、現地を訪問した上での調査は予定ほど進めることができなかった。また、鉛素材の供給関係を示す資料であり、玉類に準じて流通したと考えられる資料でもあることから、新たに注目していた鉛製耳環についても鉛同位体比の測定を計画していたが、所蔵機関との交渉において借用の体制および期間の交渉が遅れたことから、年度内の実施を断念した。以上の点から、進捗状況はやや遅れていると判断した。現在はやや進捗が遅れているが、時間配分のみで解決可能な問題である。次年度は、特に前半に時間的な余裕が見込めることから、現地を訪問した実見調査を集中的に実施して、遅れを解消する予定である。また、借用交渉を進めていた鉛製耳環の鉛同位体比分析についても、早々に開始する。他の内容に関しては、当初の予定通り行う。玉類の分類的な再検討としては、古墳時代後期後半以降に出現する種類として、重層ガラス玉を含む植物灰ガラスの分析値を重点的に追加する。また、鉛同位体比の鉱石データとしては北陸東部および中国地方西部において、サンプルの収集を行う。

次年度は、特に前半に時間的な余裕が見込めることから、現地を訪問した実見調査を集中的に実施して、遅れを解消する予定である。また、借用交渉を進めていた鉛製耳環の鉛同位体比分析についても、早々に開始する。他の内容に関しては、当初の予定通り行う。玉類の分類的な再検討としては、古墳時代後期後半以降に出現する種類として、重層ガラス玉を含む植物灰ガラスの分析値を重点的に追加する。また、鉛同位体比の鉱石データとしては北陸東部および中国地方西部において、サンプルの収集を行う。本年度は、実物資料を所蔵する調査機関を訪問して行う実見調査を、予定の回数ほど実施することができなかったことから、次年度使用額が発生した。対象資料の選定自体は済ませてあることから、今後はこの実見調査を重点的に行う予定である。そのため、旅費が当初の予定以上に必要であり、次年度使用額を利用したいと考えている。
炎症を基盤とするがん化過程における腫瘍壊死因子・ケモカインの役割の解析

腫瘍壊死因子・ケモカインの、がんの発症から進展過程における役割を、マウス・モデルにて解析した。その結果、慢性腸炎に伴う大腸がんの発症と進展過程において大腸局所で産生される腫瘍壊死因子が、肺転移モデルにおいては肺局所で産生されるケモカインであるCCL3が、それぞれ重要な役割を果たしていることが明らかとした。これらの結果は、腫瘍壊死因子・ケモカインががんの発症・進展過程において重要な役割を果たしていることを示唆している。アゾキシメタン(AOM)をマウスの腹腔内に投与した5日後から、デキストラン硫酸塩(DSS)を飲料水に加えて5日間飲用させることを3回間歇的に反復させて生じさせる、大腸がん発症モデルについて検討を加えた。野生型マウスでは、サイクロオキエナーゼ(COX)-2の発現亢進とともに、全例でβカテニンの核染を伴う腺がんが多発した。腫瘍壊死因子レセプター(TNF-R)p55欠損マウスでは、全経過を通してCOX-2発現亢進が減弱している上に、腫瘍の発生数が著明に低下した。骨髄キメラマウスの解析から、COX-2を発現している骨髄由来細胞である顆粒球・マクロファージが、TNFの作用によって、腸管内に浸潤することによって大腸がんの発症・進展が起きることが判明した。さらに、ずでに大腸がんが発症している段階で、TNFに対する阻害剤を野生型マウスに投与しても、発生した腫瘍の数と大きさとが減少し、βカテニンの遺伝子変異の頻度も減少することが明らかとした。これらの結果を、Journal of Clinical Investigationに発表した。この結果は、TNFを標的とした大腸がん冶療の可能性を強く示唆する結果であると考えられる。TNF-Rp55欠損マウスでは、野生型マウスに比べて、種々のケモカインの発現が充進しておらず、これらのケモカインに対するレセプターを欠損しているマウスでは、AOM/DSSによる大腸がん発症が軽減するという予備的な結果も得られた。さらに、ウレタン投与によって生じる多発性の肺腫瘍の形成過程においても、これらの炎症性サイトカイン・ケモカインが肺局所で発現が亢進していることを示す予備的結果も得られた。1)アゾキシメタン(AOM)投与後に硫酸デキストラン塩(DSS)溶液を反復投与すると生じるマウス大腸がんモデルにおいて、腸局所で産生される腫瘍壊死因子(TNF-α)が、サイクロオキゲナーゼ(COX)-2発現マクロファーを浸潤させることによって、大腸がんの発症過程のみならず進展過程にも密接に関与していることを昨年度報告している。TNF-α自体にはマクロファージに対する遊走活性が無いことから、マクロファージに対する遊走活性を示すケモカインであるCCL2の役割について本年度解析を行った。その結果、CCL2がCOX-2発現マクロファージを腸内に集積させることによって、大腸がんの発症から進展過程に密接に関与していることを明らかにした。2)マウス腎臓がん細胞株Renca細胞をマウスの尾静脈に接種した時に生じる肺転移巣の形成時において、CCL3・CCL4が肺局所で産生され、これらのケモカインに対するレセプターであるCCR5を発現しているマクロファージ・好中球さらには線維芽細胞が、転移巣の形成とともに集積することを認めた。さらに、CCL3はCCR5依存的にマクロファージの集積を引き起こすのみならず、マトリックスプロテナーゼ(MMP)-9の産生を誘導した。さらに、CCL3はCCR5依存的に線維芽細胞を集積させるとともに、線維芽細胞からの肝細胞増殖因子(HGF)産生も誘導した。CCL3欠損マウスあるいはCCR5欠損マウスに、Renca細胞を同様に尾静脈に接種した時には、マクロファージ・線維芽細胞の肺への集積が軽減されるとともに、MMP-9ならびにHGF発現が低下する結果、肺での転移巣形成が、野生型に比べて減弱することを明らかにした。
血清抗体を用いた睡眠時無呼吸症候群の脳・心血管イベント発症予測マーカーの同定

研究課題である「血清抗体を用いた睡眠時無呼吸症候群の脳・心血管イベント発症予測マーカーの同定」の研究3年目として、ほぼ計画通りに進めることができた。具体的には、初年度から取り組んできた閉塞性無呼吸症候群(OSA)患者の血液検体100例を用いて動脈硬化疾患に関連した自己抗体の同定・解析研究を進めた.初年度,2年次に同定したCOPE抗体,抗NBL抗体につづいて,本年度(3年目)新たな自己抗体-抗SNX-16(Sorting nexin 16)抗体について解析した.具体的には,OSA患者82名,急性冠症候群(ACS)患者96名,健常者(HV)64名を対象に,血清中の抗SNX16抗体値をamplified luminescence proximity homogeneous assay(AlphaLISA)法により測定し,測定値と各種臨床データとの関連性を評価した。OSA患者は診断の睡眠ポリグラフ検査入院時,ACS患者はACS発症時に採取した血清を用いた。本基盤研究Cで同定した3つの抗体-COPE抗体,NBL-1抗体,SNX-16抗体は,それらを組み合わせることでOSAS患者に合併する動脈硬化疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆された.本研究結果は,第59回日本呼吸器学会学術講演会に発表予定である(2019年4月).研究課題である「血清抗体を用いた睡眠時無呼吸症候群の脳・心血管イベント発症予測マーカーの同定」の研究初年度として、ほぼ計画通りに進めることができた。具体的には、これまで試験的に集めてきた血液検体100例の解析を進め、候補の抗体の1つであるCOPE抗体レベルを、得られた検体に対してglutathione-ドナービーズと抗ヒトIgG-アクセプタービーズを用いたAlphaLISA法により測定した。またAlphaLISA法で選別されたマーカーについて、ELISA法でも同様の結果が得られるかを確認した。その結果と個人歴、病歴、臨床経過などを調査した。特にCOPE抗体発現と睡眠時無呼吸症候群の重症度だけでなく、持続的低酸素の程度や時間、糖尿病、高血圧、脂質異常症、心疾患、脳血管障害などの併存症の有無などの関連性を検討した。その結果、重症OSAS例、脳・心血管イベントのあるOSAS例、高血圧のあるOSAS例にCOPE抗体が高値であることが明らかとなり、それらについて日本臨床生理学会総会で発表、またJournal of Clinical Sleep Medicineに投稿し論文化された。理由としては、実験結果が仮説通りであったことが大きいと考えている。その他、すでに予備実験を開始していた段階で本研究計画を考えていたため、準備が良かったことが挙げられる。研究課題である「血清抗体を用いた睡眠時無呼吸症候群の脳・心血管イベント発症予測マーカーの同定」の研究2年目として、ほぼ計画通りに進めることができた。具体的には、初年度に進めてきた閉塞性無呼吸症候群(OSAS)患者の血液検体100例の解析を進めた.初年度同定したCOPE抗体とは異なり,2年目は予備実験でOSASとの関連が予想されたNBL-1抗体の研究を行った.このNBL1抗体レベルを得られた検体に対してglutathione-ドナービーズと抗ヒトIgG-アクセプタービーズを用いたAlphaLISA法により測定し,その結果と個人歴、病歴、臨床データや経過などを解析し,比較検討した。その結果,NBL1抗体発現とOSASの重症度,酸素の低下,覚醒反応,心血管イベント既往との関連性が明らかとなった。また当院循環器内科に急性冠動脈疾患で入院された96例症例に対しても,同抗体を測定した結果,重症OSAS例、心血管イベント既往のあるOSAS例と同様に,NBL1抗体が高値であることが明らかとなった.それらについて睡眠呼吸障害研究会で発表、また海外誌PLOS-ONEに投稿し採択された。引き続き、現在は次の候補となる抗体の解析とこれまで同定した抗体の高値グループの症例の予後調査を開始した.今回同定したCOPE抗体,NBL-1抗体は,OSAS患者における動脈硬化促進に関与する可能性のあるバイオマーカーとして、臨床応用が期待されるところである。初年度の後半で開始した,新たな抗体(NBL-1)の解析が終了したこと,発表が完了したこと,海外誌PLOS-ONEに論文が受理されたことが挙げられる.研究課題である「血清抗体を用いた睡眠時無呼吸症候群の脳・心血管イベント発症予測マーカーの同定」の研究3年目として、ほぼ計画通りに進めることができた。本基盤研究Cで同定した3つの抗体-COPE抗体,NBL-1抗体,SNX-16抗体は,それらを組み合わせることでOSAS患者に合併する動脈硬化疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆された.

本研究結果は,第59回日本呼吸器学会学術講演会に発表予定である(2019年4月).今後については、さらに研究を進め、睡眠時無呼吸症候群に関連する新たな自己抗体マーカーの探求。その他、特に予後と関連する本疾患に関して臨床的に有用な動脈硬化マーカー同定できるよう研究を勧める。初年度,2年目とほぼ計画通り(もしくは計画以上)に研究が遂行できたため,最終年度はさらに研究を進めていきたい.新たな抗体の探索,これまで同定できた2つの抗体が高値である症例の予後調査など,臨床応用できる研究を遂行できたらと考えている.
根面齲蝕進行過程の解明とその齲蝕進行抑制法に関する研究

1.脱灰後/再石灰化後のミネラル分布(根面齲蝕進行過程)脱灰におけるコンタクトマイクロラジオグラフィー(MR)の特徴的所見は、病巣内部にX線不透過層を認めることである。この要因としては、溶解したミネラルが深層で停滞、これに適量のフッ素イオンが作用してミネラルが深部で再沈着したこと、および内層の有機質にミネラルが沈着した可能性が示唆された。また、再石灰化根面の特徴的所見は、再石灰化部のミネラル量が、健全部よりも高い状態を示すことである。この過再石灰化層は、エナメル質には見られない根面特有の再石灰化所見と思われる。過再石灰化層の要因としては、組織空隙の存在に加えて、脱灰が間質よりも細管の周囲と内部で著しく進行し、かつセメント質と象牙質のアパタイト結晶容積が小さいため、総じて反応性が高められる機構が考えられた。2.各種薬剤における齲蝕(脱灰)進行抑制効果根面の齲蝕(脱灰)進行抑制効果程度をフッ化物処理別に比較した結果、ミネラル増加量は、SnF_2群>APF solution群>APFgel群>フッ素洗口液群の順で高い傾向を示した。経時的にミネラル増加量(進行抑制効果)を観察すると、SnF_2群とAPF群では、処理後7日後までにほぼ上限に達し、14日後との間の差は有意ではなかった。今回は、サンドイッチ試料を用いたため、溶液量/試料面積比が過大であり、塗布直後すでにフッ素取り込みが著しいことも加わり、再石灰化(ミネラル増加)が急速に発現したものと考えられる。in vitroにおける齲蝕進行抑制効果は、進行過程でフッ化物を作用させることにより抑制され、特にSnF_2、APF solution/gelで処理した場合に強く抑制されることが確認された。フッ化物の応用は、根面初期齲蝕の進行抑制処置として有効であり、臨床的にも応用価値のあることが示唆された。しかし、今回の実験においては、齲蝕(脱灰)進行抑制効果をMRにおけるミネラル獲得量から評価したにすぎず、ミネラル獲得そのものが、酸抵抗性すなわち耐酸性を獲得したかどうかは明らかにすることはできなかった。今後より詳細に観察、検討していきたい。1.ヒト抜去歯に実験的根面齲蝕様脱灰巣を形成し、形態および脱灰過程を経時的、連続的に観察し、特にセメント質の組織構造と脱灰との関係について検討した結果,脱灰巣におけるコンタクトマイクロラジオグラフィー(MR)の特徴的所見として,X線不透過層と透過層のlaminationの構造を認めた。この要因としては,溶解したミネラルが深層で停滞,再沈着したこと,および内層の有機質にミネラルが沈着した可能性が示唆された。しかし,種々の脱灰pH,浸漬時間によりこの発現が異なっていた。すなわち,セメント質を保存した状態で根面にこのlaminationを形成するためには,pHが高く(pH5.5以上),Ca^<2+>,PO_4^<3+>等のイオンが歯質に対して過飽和な脱灰条件の設定が不可欠であると考えられた。また,このlamination内は,ミネラル濃度が異なる領域がサンドイッチ状構造の中央に観察され,再石灰化および脱灰の進行程度が各層の内部で均一ではないことが明らかとなった。現在,このlaminationにおけるミネラル分布の総合的評価を行なっており,laminationが,耐酸性すなわち齲蝕(脱灰)進行抑制にどのように影響しているか,今後より詳細に観察・検討していきたい。2.実験的根面齲蝕歯を用いて各種薬剤(NaF,APF,SnF2等)の齲蝕進行抑制効果について検討を行なった結果,フッ化物処理群が未処理群よりミネラル増加量は有意に高く,特にAPF溶液処理した場合に著明であり,根面の齲蝕進行抑制効果が確認された。しかし,フッ素取り込みと齲蝕進行抑制効果の関連で問題になるのは,獲得されたフッ素の維持安定性である。今後この維持安定性について検討を加えていきたい。

経時的にミネラル増加量(進行抑制効果)を観察すると、SnF_2群とAPF群では、処理後7日後までにほぼ上限に達し、14日後との間の差は有意ではなかった。今回は、サンドイッチ試料を用いたため、溶液量/試料面積比が過大であり、塗布直後すでにフッ素取り込みが著しいことも加わり、再石灰化(ミネラル増加)が急速に発現したものと考えられる。in vitroにおける齲蝕進行抑制効果は、進行過程でフッ化物を作用させることにより抑制され、特にSnF_2、APF solution/gelで処理した場合に強く抑制されることが確認された。フッ化物の応用は、根面初期齲蝕の進行抑制処置として有効であり、臨床的にも応用価値のあることが示唆された。しかし、今回の実験においては、齲蝕(脱灰)進行抑制効果をMRにおけるミネラル獲得量から評価したにすぎず、ミネラル獲得そのものが、酸抵抗性すなわち耐酸性を獲得したかどうかは明らかにすることはできなかった。今後より詳細に観察、検討していきたい。
アレルギー・自己免疫疾患治療開発を目指したIL-18レセプター複合体構造解析

Interleukin-18(IL-18)は炎症性サイトカインとして知られ生体防御因子として働く一方、自己炎症性疾患の悪化にも関与が指摘されている。IL-18関連疾患の病態解明,治療薬開発を目的としリガンドレセプター複合体の構造解析を目指して研究を行った。大腸菌発現系、バキュロー昆虫細胞発現系を用いてリガンドとレセプター蛋白を発現させ、リガンド/レセプター複合体として精製した。レセプター蛋白にっいて精製方法を改善したところリガンドレセプター複合体としての蛋白結晶から回折像を得ることができた。セレノメチオニン含有蛋白複合体での解析を現在進めている。21年4月からの研究期間ではIL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ複合体蛋白の結晶化条件について精密化を行い結晶のサイズを上げ、結晶構造解析にまで進めることを目指した。結晶化条件検討により結晶のサイズを上げることができ、X線回折実験にて分解能45Aの回折像を得ることができた。3A程度まで分解能を上げることで構造解析が可能となり、次の低分子阻害剤の開発に進むことができる。本年度は、結晶のサイズ、分解能の向上に向け(1)結晶化条件のスクリーニング、(2)脱糖鎖酵素による糖鎖除去、(3)アミノ酸変異導入による糖鎖除去蛋白の作成、(4)アミノ酸c末端6×hisタグの切除について検討を加えた。(1)蛋白結晶化条件についてランダムに振った条件、また以前結晶が得られた条件付近で条件を変えてスクリーニングを試み、約2倍の結晶のサイズを得ることができた。(2)、(3) IL-18Rαは8カ所、IL-18Rβは4カ所の糖鎖修飾サイトを持つが、糖鎖は結晶化の妨げになりうるため修飾サイトに変異を加えて除去を試みた。またPNGaseFによる糖鎖処理も試みたが、いずれも蛋白の可溶性低下のためスクリーニングには使えなかった。(4)本実験に用いる蛋白は精製のためC末端に6×Hisのタグを導入してある。6×hisタグをCarboxypeptidaseAにより除去することを試み、切断を抗Hisタグ抗体で確認した。現在この蛋白を用いて結晶化スクリーニングを進めている。スクリーニングで得られた結晶の一部を凍結し、大型放射光施設Photon FactoryにてX線回折実験を行った。最高で45Aの分解能で反射を得ることに成功した。得られた回折点に分裂や、重なりはみられておらず、結晶のサイズに比較してよい分解能が得られている。構造解析には3A程度の分解能が必要であるため今後さらなる条件検討を加える予定である。22年4月からの研究期間ではIL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ複合体の結晶化条件について精密化を行い結晶のサイズを上げ、結晶構造解析にまで進めることを目指した。結晶化条件検討により結晶のサイズをあげることができX線回折実験において3.5オングストロームの回折像を得ることができた。3Å程度まで分解能を上げることで構造解析が可能となり、次の低分子阻害剤の開発に進むことができる。本年度は結晶のサイズ、分解能の向上に向け、結晶化用bufferの塩濃度、添加剤(detergent)の追加、ph、温度条件を変化させてスクリーニングを行い、結晶のサイズを上げることに成功した。蛋白の性質を改善する試みとして、糖鎖除去、アミノ酸変異導入、C末Hisタグ切除を昨年度は行ったが、結晶化条件を改善には至らなかったため、本年度は得られた蛋白をそのままスクリーニングに用いている。得られた結晶はSpring8の施設で回折実験により3.5Aの像を得ることができた。3.5Aの分解能では、結合様式までは解析可能となる。そこで位相差問題の解決向け、セレノメチオニンを導入した蛋白の発現を進めた。IL-18は大腸菌発現系であるため従来の方法によりセレノメチオニンの導入が可能であった。またバキュロ昆虫細胞形に置いてもセレノメチオニン蛋白導入用キットが開発されており、現在発現を試みている段階である。結晶を得られた条件でセレノメチオニン導入蛋白を結晶化し、回折像を得て複合体結合様式の解析に向けて実験を進める予定である。通常のIL-18に比べ複合体の結晶化が進まなかったため、結晶性の向上の目的でレセプターに対し(1)アミノ酸変異導入による糖鎖除去を試みた。また、(2)等電点クロマトグラフィーによる蛋白精製を試みた。(1)IL-18Rβにおいて糖鎖付加部位へのアミノ酸変異導入により糖鎖を1箇所残した蛋白コンストラクトを作成し、バキュロ昆虫細胞発現系にて発現し、精製を行った。

得られた蛋白の分子量は均一となったが、発現量が著しく低下し、結晶化実験が困難であることから中断した。(2)IL-18Rα、IL-18Rβともクロマトフォーカシングによる精製を加え等電点の均一な蛋白分子を精製し、複合体を形成させて結晶化スクリーニングを行った。30μm×300μmの針状の結晶が得られ、筑波Photon FactoryBL 1Aにて回折像実験を行った。1.1A波長での測定で約4Aの回折像を得られたが、セレノメチオニン最大吸収波長での回折像の分解能が低く構造解析には不十分であった。ビームラインの調整の問題があると考えられ、改めて測定する予定である。本年度の研究により蛋白3者複合体のセレノメチオニン含有蛋白の複合体結晶から低分解能な回折実験データを得た。セレノメチオニン含有蛋白で3.5A以上の回折像が得られると立体構造解析が可能となる。構造解析が終了次第、立体構造に基づいた低分子蛋白機能阻害剤の開発を行う計画である
超高サイクル疲労における内部き裂初期伝播機構の統一的理解

超高サイクル疲労の原因である内部起点型破壊において,き裂の初期伝播過程で生じる微細な凹凸状破面(粒状破面)の形成機構を明らかにすることを目的とした.「粒状破面は,気体成分の吸着が著しく少ない内部き裂の伝播過程において,き裂新生面が長期間繰返し接触をすることで形成される」という仮説を提案し,新たに開発した超高真空疲労試験機を用いて,種々の真空圧力や応力比の下で得られた疲労破面を解析することにより,その検証を試みた.その結果,内部起点型疲労破壊を生じるチタン合金および高強度鋼において,上記の仮説が検証され,内部き裂伝播に及ぼす影響因子が明らかにされた.超高サイクル疲労の原因である内部起点型破壊において,き裂の初期伝播過程で生じる微細な凹凸状破面(粒状破面)の形成機構を明らかにすることを目的とした.「粒状破面は,気体成分の吸着が著しく少ない内部き裂の伝播過程において,き裂新生面が長期間繰返し接触をすることで形成される」という仮説を提案し,新たに開発した超高真空疲労試験機を用いて,種々の真空圧力や応力比の下で得られた疲労破面を解析することにより,その検証を試みた.その結果,内部起点型疲労破壊を生じるチタン合金および高強度鋼において,上記の仮説が検証され,内部き裂伝播に及ぼす影響因子が明らかにされた.本研究の目的は,超高サイクル疲労の原因である内部起点型破壊において,き裂の初期伝播過程で生じる微細な凹凸状破面の形成機構を明らかにすることである.「この特殊な破面は,気体成分の吸着が著しく少ない内部き裂の伝播過程において圧縮負荷によりき裂新生面が長期間繰返し接触をすることで形成される」という仮説を提案し,その検証を試みる.平成18年度の実績は以下の2点である.1.真空き裂伝播特性試験機の開発超高真空対応のチャンバーを備え,任意の応力比で実験ができる疲労試験機の開発を行った.当初の設計では到達真空圧力を「高真空(10^<-5>Pa程度)」としていた.しかし,その後の詳しい検討により,き裂伝播に与える真空の影響を定量的に論ずるには,水素を代表とする軽原子の影響を評価する必要があること,到達圧力を超高真空領域に上昇させるべきこと,等が示された.このため,チャンバの仕様について設計変更を行った.開発された試験機の主な性能は以下の通りである.(1)到達圧力は4×10^<-7>Pa以下となり,超高真空での実験を行うことができる.(2)試験片の軸心あわせ機構を有し,任意の応力比で曲げ3%以下の軸荷重疲労試験を行うことができる.(3)質量分析器を取付けることにより,粒状破面の形成に及ぼす気体分子の影響を明らかにすることができる.2.チタン合金の真空中き裂伝播試験と破面解析平成19年度以降の実験の予備試験として,Ti-6Al-4Vを用いて真空中でき裂面に長期間繰り返し接触を与えるき裂伝播試験を行った.SEM破面観察の結果,き裂閉口が強く生じる部分において,微細な凹凸状の破面領域が観察された.粒状領域の大きさや形状を分析したところ,内部起点型破壊で認められている粒状領域の特徴と一致することが明らかとなった.この結果は前述の下線部に示した本研究の仮説を支持するものであり,今後1.で開発した試験機を使用して,様々な条件で真空中のき裂伝播特性や破面形成を検討するための基盤を構築することができた.本研究の目的は,超高サイクル疲労の原因である内部起点型破壊において,き裂の初期伝播過程で生じる微細な凹凸状破面の形成機構を明らかにすることである.「この特殊な破面は,気体成分の吸着が著しく少ない内部き裂の伝播過程において,圧縮負荷によりき裂新生面が長期間繰返し接触をすることで形成される」という仮説を提案し,その検証を試みる.本年度は,平成18年度の研究で開発した試験機を用いて,大気および真空圧力の下でTi-6A1-4Vのき裂伝播特性試験を行った.真空圧力は2.0×10^<-5>Pa(高真空)と2.7×10^1Pa(中真空)の2種類を用いた.計測した項目は,da/dN-ΔK曲線,da/dN-ΔK_<eff>曲線,ΔK_<th>,き裂開閉口挙動である.また,き裂伝播試験後の破面を走査型電子顕微鏡によって観察し,「微細な凹凸状破面」の形態に及ぼす真空圧力の影響を調べた.得られた主な結果を以下に示す.(1)中真空,高真空ともに,大気中に比べてき裂伝播速度が低くなった.特に10MPa√m以下の低ΔK領域での差は10100倍以上に広がった.しかし,中真空と高真空におけるき裂伝播速度に大きな差は見られなかった.(2)da/dN-ΔK_<eff>曲線による整理の結果,真空と大気のき裂伝播速度の差は小さくなった.しかし,両者は完全には一致せず,この差はき裂閉口のみでは説明できないことが明らかとなった.(3)微細な凹凸状破面は,大気中では認められず,高真空,中真空でのみ観察された.

この破面形態は真空圧力によって異なっており,高真空では数μmの大きさの凹凸からなるのに対し,中真空ではこの径が大きくなり,そのエッジがより明瞭に観察された.内部起点型破壊で形成される微細な凹凸模様は高真空中のそれに極めて類似していた.以上から,内部き裂周囲の環境は,中真空よりも高真空に近いことが類推された.本研究の目的は,超高サイクル疲労の原因である内部起点型破壊において,き裂の初期伝播過程で生じる微細な凹凸状破面(粒状破面)の形成機構を明らかにすることにある.「粒状破面は気体成分の吸着が著しく少ない内部き裂の伝播過程において,き裂新生面が長期間繰返し接触をすることで形成される」という仮説を提案し,その検証を試みた.本年度は,平成18年度に開発した超高真空疲労試験機を用いて, Ti-6Al-4VおよびSNCM439の△K漸減き裂伝播試験を行った.真空圧力は大気,中真空(1.6×10^<-1>Pa),高真空(2.7×10^<-5>Pa),超高真空(1.64.0×10^<-7>Pa)とした.試験後,電子顕微鏡による破面観察を行い,粒状破面の形成に及ぼす真空圧力および破面接触の影響を調べた.Ti-6Al-4Vの結果から,大気から超高真空に至るまで,真空圧力の低下に伴いき裂伝播速度が低下することが明らかとなった.粒状破面は大気・中真空中では認められず,高真空・超高真空において,繰返し破面接触(き裂閉口)が長期間生じる箇所にのみ形成された.これらの粒状破面は内部起点型破壊で観察される粒状破面と酷似していた.SNCM439の結果においても,類似の粒状破面が高真空かつ繰返し破面接触の生じる条件で観察されることがわかった.気体分子によるき裂新生面の被覆率を計算したところ,大気・中真空では100%であるのに対し,高真空・超高真空では200%となり,粒状領域の形成には気体分子の吸着による破面の保護作用が乏しいことが必要であると示唆された.以上から,内部き裂の伝播過程で生じる粒状破面は,高真空以下の低真空圧力下で,破面接触が長期間繰返されることによって生じるものであり, Ti合金や高強度鋼などの材質によらないことが明らかにされた.すなわち,冒頭の仮説の妥当性が示された.
脳シミュレータの基本モデルを組み立てる方法の開拓

脳シミュレータの基本要素である神経細胞の入出力関係を定量的に記述した.スパイク発生予測の国際コンペで優勝したMAT (multi-timescale adaptive threshold)modelについての論文を公表し(Kobayashi, Tsubo, and Shinomoto, 2009),それにさらなる改訂をおこない,オリジナルMATモデルの予測能力を保ちながら,オリジナルモデルでは達成できなかった多様な応答形式を実現できるモデルに改良した(Yamauchi, Kim, and Shinomoto, 2011).後者の研究では,オリジナルMATモデルの長所であるスパイク予測能力をそこなわないようにしてIzhikevichによって分類された多様な発火パターン20種類のすべてを実現することを可能にした.著名な外国人研究者を招へいし,質の高い情報収集を行い,またいくつかの国際共同研究を開始した.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という点に焦点を絞って取り組んでいる脳シミュレータの基本要素である神経細胞の入出力関係を定量的に記述した.スパイク発生予測の国際コンペで優勝したMAT (multi-timescale adaptive threshold) modelについての論文を公表し(Kobayashi, Tsubo, and Shinomoto, 2009),それにさらなる改訂をおこない,オリジナルMATモデルの予測能力を保ちながら,オリジナルモデルでは達成できなかった多様な応答形式を実現できるモデルに改良した(Yamauchi, Kim, and Shinomoto, 2011).後者の研究では,オリジナルMATモデルの長所であるスパイク予測能力をそこなわないようにしてIzhikevichによって分類された多様な発火パターン20種類のすべてを実現することを可能にした.著名な外国人研究者を招へいし,質の高い情報収集を行い,またいくつかの国際共同研究を開始した.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という点に焦点を絞って取り組んでいる.5年プロジェクトの前半は基本要素であるニューロンモデルを完全に整備することを目指し,後半に入りその整備が進んだ段階では,ニューロンの局所回路を論じる方向へと梶を切りたいと考えている.初期段階,20,21年度は単一神経細胞モデルの完成を目指している.最近,我々は簡素でパラメータの少ないモデルを提唱し,スイスで行われたスパイク予測の公開コンペにおいて2007年,2008年の2年にわたって連続して優勝を勝ち取った.このモデルの効率化,高機能化に成功し,実験データの変動にくらべて約90パーセントの正しい予測を可能とし,現在,その第一論文を投稿中である.我々の目標は,ニューロンの精密な記述だけではなく,反応特性を縮約記述することにより記述パラメータを最小限にとどめることにもある.脳シミュレータの実現には,パラメータ数低減の努力が不可欠である.この実証的研究を通して,数理モデル研究そのものにも新しい視点がもたらされ,新しい地平が広がると期待される.国際会議においても招待講演を通してモデルの紹介に努めている.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という点に焦点を絞って取り組んでいる.神経発火メカニズムをより深く理解する目的で,スパイク予測モデルについてのデータ収集と解析を行い,外国人研究協力者を招へいして共同研究を行ったうえで,研究成果を取りまとめる予定であったが,招へいを予定していた外国人研究協力者が事情により平成22年1月に来日できなくなった.スパイク予測モデルの解析結果をまとめるためには,本協力者との意見交換が不可欠であり,平成22年4月に来日してもらうことにした.その結果来日を得て研究の議論・講義など有益な研究情報交換が出来た.またcoldspring harbor instituteの中国での会議や米国カーネギーメロン大学での会議に出席し発表し,有益な情報交換を行うことが出来た.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という点に焦点を絞って取り組んでいる.神経発火メカニズムをより深く理解する目的で,今年度はスパイク予測モデルについてのデータ収集と解析を行った.データ解析のための解析ツールの開発も進展し,信号不規則性の分析のための状態空間法,レート推定のためのカーネル法の最適化法を確立した.カーネル最適化法に関しては応用の裾野が広く,論文出版後,頻繁にダウンロードがくり返されており,論文出版後半年以上にわたってMost downloaded articlesのトップ5位を維持し続けた.また国際会議Neuro2010の開催に付随して京都でWorkshop onspatio-temporalneuronal computationを開催し,数十名の研究者を集め,情報交換の場を提供した.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という目的で取り組んでいる.本年度の大きな発展は,スパイクモデルで大きな成功を収めたMAT Tmodelのさらなる改訂をおこない,オリジナルMATモデルでは達成できなかった多様な応答形式を実現できるモデルに改良したことである(Frontiresin ComputationalNeuroscience (2011) 5:42).この研究のポイントは,オリジナルモデルの長所であるスパイク予測能力をそこなわないようにしてIzhikevichによって分類された多様な発火パターン20種類のすべてを実現することが可能になった.神経モデリング解析など関連研究を行っている外国人研究協力者を招へいし,質の高い情報収集を行うこともでき,さらにはいくつかの国際共同研究を開始した.

海外での学会においても招待講演の依頼を受け,研究の国際的な認知度も急速に向上しつつある.本研究では将来期待される脳シミュレータの実現のためにその構成要素となるべきニューロンの数理的モデルを構築することを目的として実験との対応,モデル化,解析ツールの提供という目的で取り組んだ.本年度は,スパイクモデルで裁量のパフォーマンスを示した我々のMAT modelの改良に取り組みつつも,スパイクモデルを決めて出力信号列から入力を推定するという枠組みの構築を行った.一つは膜電位時系列から入力推定を行うというもの(R. Kobayashi, Y. Tsubo, P. Lansky, and S. Shinomoto, Advances in NIPS (2012) 24: 217-225.)であり,もう一つはスパイク時系列から時間変動する入力を推定するという枠組み(H. Kim and S. Shinomoto, Physical Review E (2012) 86:051903.)である.また,神経データの統計解析において関連研究を行っている外国人研究協力者を招へいし,質の高い情報収集を行い,いくつかの国際共同研究も論文として結実しつつある.海外での学会においても招待講演の依頼を受け,研究の国際的な認知度も急速に向上しつつある.大きな成功を収めたMAT Tmodelのさらなる改訂をおこなって,オリジナルモデルでは達成できなかった多様な応答形式を実現できるモデルに改良し,その論文がFrontiers Computational Neuroscienceに出版された.海外の研究者との共同研究も盛んになってきた.24年度が最終年度であるため、記入しない。脳シミュレータの構成要素となるべきニューロンの数理的モデルはほぼ完成に近づいたので,そのモデルを用いて実データを解析する段階に入ったと考える.状態空間法をもちいた神経信号データの解析手法も大きく発展させつつあるので,これらを融合することが次のターゲットになる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ソノポレーション法による骨膜への遺伝子導入

本研究は、ソノポレーション法(超音波遺伝子導入法)をin vivoで応用し、BMP2等の遺伝子をラット体内へ導入、最終的には骨造成を目指すことである。ラットの頭蓋骨骨膜および背部皮内に対して、GFP遺伝子をソノポレーション法で導入し評価を行った。実験はいくつかの濃度のプラスミドDNAを用いたが、35μgのプラスミドDNAを注入したラット背部皮下の蛍光実体顕微鏡下で48時間後にGFP発現を確認した。ラット頭蓋骨骨膜ではGFP発現を認められなかった。4週齢オスのラット頭蓋骨骨膜に、GFPをコードしたプラスミドDNA(pEGFP-N1)をマイクロバブルとともに注入し、超音波を照射した。マイクロバブルはSV-25(ネッパジーン社)を選択した。いくつかの照射条件下でGFPの発現を蛍光実体顕微鏡にて確認した。しかしながらNaked plasmid法(プラスミドDNA単体の直接導入)と比較して、差は見られなかった。現在、市販されているマイクロバブルは超音波造影剤を流用しているため、遺伝子の導入効率が低い可能性がある。よって今後はマイクロバブルの変更も検討していく必要がある。ラット骨膜の培養細胞へのプラスミドDNA(pEGFP-N1)の遺伝子導入をソノポレーション法にて行った。蛍光顕微鏡下にてGFP発現を確認した。よって、ラット骨膜細胞に対して、ソノポレーション法による遺伝子導入が可能であることがわかった。【目的】本研究は、ソノポレーション法(超音波遺伝子導入法)をin vivoで応用し、BMP 2等の遺伝子をラット体内へ導入、最終的には骨造成を目指すことである。本年度は、ラットの頭蓋骨骨膜および背部皮内に対して、GFP遺伝子をソノポレーション法で導入し評価を行なった。【方法】発現したGFPを蛍光顕微鏡で観察(導入より12,24,48時間後)、また遺伝子導入した付近の組織を切り出し、ホモジナイズ後にGFPのmRNAをPCR法により定量することを試みた。超音波用マイクロバブル(SV-25)とGFPをコードしたプラスミドDNAを混和・調整し、ラットの標的部位(頭蓋骨および背部皮内)へ注入、超音波(周波数1MHz、エネルギー1.0w/cm2、時間60秒間)を照射した。【結果】実験はいくつかの濃度のプラスミドDNAを用いたが、35μgのプラスミドDNAを注入したラット背部皮下の蛍光実体顕微鏡下で48時間後にGFP発現を確認した。ラット頭蓋骨骨膜ではGF発現を認められなかった。【考察】プラスミドDNA-マイクロバブル混和液の注入に際し、マウス体内側に液量を保てるスペースがないとその後の超音波照射が難しくなる、そのため皮内注射では注入した混和液が安定しているため、超音波によるプラスミドDNAの導入促進が起こりやすかったと推測できる。また骨膜と比べ、皮内には多くの細胞が存在していると考えられるため、プラスミドを取り込んだ細胞の数が多くなりGFP発現が高まったと思われる。引き続き行なう研究では、1)プラスミドDNA導入部位の再検討、2)適正なプラスミドDNA濃度の検討、3)BMP-2遺伝子導入時の骨量変化の評価を今後の課題としていく予定である。