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未来のガリレオ育成のための天文教育－食連星の観測と光度曲線解析－

地域貢献としての未来のガリレオ育成活動:世界天文年2009から行っている小中学生対象の公開講座「天体観測会ー君も未来のガリレオだ!ー」については、第1回6/1(金)19:4521:15「口径35cm望遠鏡で金星と木星を見よう」、第2回7/20(金)18:3021:00「夏休みスペシャル手作り望遠鏡で月を見よう」、第3回10/12(金)18:3020:00「口径35cm望遠鏡で土星と火星を見よう」、第4回12/1(水)13:3015:30「分光器を作ろう、太陽望遠鏡をのぞいてみよう」を開催した。保護者等も参加することと、なるべく多くの天体を見てもらうため受講生定員は1回当たり20名としていた。計4回の講座の受講生は86名、保護者等も含む参加者は約179名であった。講座の肯定的な評価が90%、普通の評価が8%、否定的な評価が2%であった。高専生に対する未来のガリレオ育成活動:上記天体観測会に対し、本校2年チャレンジゼミナール基礎および3年全系横断演習I学生10名には補助学生として、望遠鏡操作や「手作り望遠鏡」「簡易分光器」作成指導などで主体的に参加してもらった。また、ケプラー方程式による惑星軌道シミュレータ作成について試行的な指導を行った。食連星の観測と光度曲線解析:7月31日に火星の大接近があったので、今年度はケプラー方程式を用いる惑星の軌道計算に取り組んだ。ケプラーの第2法則によると、惑星が一定時間に掃引きする軌道面の面積は常に一定である。これを離心近点角と時間の関係として表現するものがケプラー方程式である。惑星軌道の計算方法をまとめ、具体例として、地球と火星の軌道シミュレータを作成した。地域貢献としての未来のガリレオ育成活動:公開講座「天体観測会ー君も未来のガリレオだ!ー」については予定通り開催し、概ね好評であった。地域の小中学生に天文教育を行うという意味で、完全に達成できたと考える。高専生に対する未来のガリレオ育成活動:上記天体観測会に対し本校2年チャレンジゼミナール基礎および3年全系横断演習I学生10名が補助学生を務め「教えることで教えられる」相互教育を実施した。食連星の観測と光度曲線解析:今年度はケプラー方程式を用いる惑星の軌道計算に取り組んだ。装置の整備とその活用が遅れているので「やや遅れている」とした。令和元年度に整備の上、その活用に注力したい。未来のガリレオ育成活動:津山地域の小中学生には天文への興味付けと観測体験のため、天体観測会を継続する。高専のチャレンジゼミナール生には天体観測会補助学生の他に天体写真撮影を重視する天文教育を継続する。また、ケプラー方程式の理論的理解の推進を図る。科学的活動:科学的成果を挙げられるよう、高専生と共に食連星についてWD計算コードやPHOEBEにより光度曲線解析を行い、対象連星系の物理パラメータや特徴を研究する。ケプラー方程式についても取り組みを継続する。天体観測室の口径35cm望遠鏡について、GPSの2019年4月7日問題に対応するため、ファームウェアをアップデートする。気象観測装置が利用できなくなっているので、更新等の対策を始める。また、素粒子論、特に量子色力学のシミュレーションプログラムLTKf90を用いた高専生に対する物理シミュレーション教育の検討を行う。地域貢献としての未来のガリレオ育成活動:世界天文年2009から行っている小中学生対象の公開講座「天体観測会ー君も未来のガリレオだ!ー」については、第1回5/29(月)19:4521:15「口径35cm望遠鏡で木星を見よう」、第2回8/1(火)18:3021:00「夏休みスペシャル手作り望遠鏡で月を見よう」、第3回9/26(火)19:0020:40「口径35cm望遠鏡で土星を見よう」、第4回10/25(水)18:3021:00「夏秋の星座を見よう」を開催した。計4回の講座の受講生は87名、保護者等も含む参加者は約184名であった。講座の肯定的な評価が94%、普通の評価が4%、否定的な評価が2%であった。また、津山市公民館「天体観測教室」にも対応し、その参加者は24名であった。高専生に対する未来のガリレオ育成活動:上記天体観測会に対し、本校2年3年チャレンジゼミナール学生12名には補助学生として、望遠鏡操作や「手作り望遠鏡」「ペーパークラフト」作成指導などで主体的に参加してもらった。また、学生は主体的に校内天体観測会を実施した。食連星の観測と光度曲線解析:連星系理論のWDコードを実装するオープンソースソフトPHOEBEを用いたおとめ座HW星の光度曲線から物理量を引き出す手法と連星系の基礎知識をまとめた。また、高校「地学」や「物理」の知識の範囲で、光度曲線と視線速度曲線から物理量を引き出す手法をまとめた。

地域の小中学生に天文教育を行うという意味で、完全に達成できたと考える。高専生に対する未来のガリレオ育成活動については、上記天体観測会に対し本校2年3年チャレンジゼミナール学生12名が補助学生を務め「教えることで教えられる」相互教育を実施した。食連星の観測と光度曲線解析:オープンソースソフトPHOEBEを用いた手法をまとめた。装置の整備とその活用が遅れているので「やや遅れている」とした。平成30年度に整備の上、その活用に注力したい。地域貢献としての未来のガリレオ育成活動:世界天文年2009から行っている小中学生対象の公開講座「天体観測会ー君も未来のガリレオだ!ー」については、第1回6/1(金)19:4521:15「口径35cm望遠鏡で金星と木星を見よう」、第2回7/20(金)18:3021:00「夏休みスペシャル手作り望遠鏡で月を見よう」、第3回10/12(金)18:3020:00「口径35cm望遠鏡で土星と火星を見よう」、第4回12/1(水)13:3015:30「分光器を作ろう、太陽望遠鏡をのぞいてみよう」を開催した。保護者等も参加することと、なるべく多くの天体を見てもらうため受講生定員は1回当たり20名としていた。計4回の講座の受講生は86名、保護者等も含む参加者は約179名であった。講座の肯定的な評価が90%、普通の評価が8%、否定的な評価が2%であった。高専生に対する未来のガリレオ育成活動:上記天体観測会に対し、本校2年チャレンジゼミナール基礎および3年全系横断演習I学生10名には補助学生として、望遠鏡操作や「手作り望遠鏡」「簡易分光器」作成指導などで主体的に参加してもらった。また、ケプラー方程式による惑星軌道シミュレータ作成について試行的な指導を行った。食連星の観測と光度曲線解析:7月31日に火星の大接近があったので、今年度はケプラー方程式を用いる惑星の軌道計算に取り組んだ。ケプラーの第2法則によると、惑星が一定時間に掃引きする軌道面の面積は常に一定である。これを離心近点角と時間の関係として表現するものがケプラー方程式である。惑星軌道の計算方法をまとめ、具体例として、地球と火星の軌道シミュレータを作成した。地域貢献としての未来のガリレオ育成活動:公開講座「天体観測会ー君も未来のガリレオだ!ー」については予定通り開催し、概ね好評であった。高専生に対する未来のガリレオ育成活動:上記天体観測会に対し本校2年チャレンジゼミナール基礎および3年全系横断演習I学生10名が補助学生を務め「教えることで教えられる」相互教育を実施した。食連星の観測と光度曲線解析:今年度はケプラー方程式を用いる惑星の軌道計算に取り組んだ。令和元年度に整備の上、その活用に注力したい。未来のガリレオ育成活動:津山地域の小中学生には天文への興味付けと観測体験のため、天体観測会を継続する。高専のチャレンジゼミナール生には天体観測会補助学生の他に天体写真撮影を重視する天文教育を継続する。
非線形状態空間モデルの推定と金融データへの応用分析

近年多変量の資産収益率のモデリングが注目されているが,本年度も昨年に引き続き多変量非線形状態空間モデルとして表現できる多変量確率的ボラティリティ変動(multivariate stochastic volatility, MSV)モデルの計算効率的な推定法とその応用に関する研究を行った.扱ったモデルは,(1)交差レバレッジのあるMSVモデル,(2)交差レバレッジのある行列指数MSVモデル,(3)レバレッジのある因子MSVモデル(4)レバレッジのある因子MSVモデルの4種類である.(1)から(3)までそれぞれのモデルに対して効率的なマルコフ連鎖モンテカルロ法のアルゴリズムを提案し,それに基づいたベイズ推定法用いて株式指数収益率を用いた実証分析を行い,情報量基準DICを用いたモデル比較も行った.(1)に関してはS & P500の業種別株価指数を用いた実証分析を行い,提案したアルゴリズムの効率性もシミュレーションにより示された.その結果は査読付き論分に投稿し,採択が決定された.(2)については(1)と同様のアルゴリズムを開発し,その効率性を示すとともに東証株価指数・日本国債価格指数・円ドル為替レートの収益率を用いた実証分析を行った.また情報量基準モデルDICを用いたモデル比較では(2)のモデルが(1)のモデルよりあてはまりが良いことが分かった.更に応用として(3)モデルを用いたポートフォリオ選択の問題も今年度は扱い粒子フィルタを用いたポートフォリオ選択法を提案した.(2),(3)に関する研究に関しては学位論文にまとめた.(4)のモデルはすでに先行研究で推定法は提案されていたため,(1)のモデルとの比較を行った.その結果は来年度出版される予定の書籍の一章としてまとめられた.本年度は,大別して三つの研究を行った.一つ目は研究計画書の「これまでの研究」にある『マルコフ・スイッチング確率的ボラティリティ(Stochastic Volatility SV)モデル』を用いた日本の株式指標に関する推定法とパフォーマンスを評価した.二つ目は研究計画書として提出した『行列指数を用いた動学的相関・レバレッジ効果を考慮したSVモデル』に関する研究である.しかしながら直接的には行列指数を用いたモデルに関する研究ではなく,特にその前段階である『相関一定のレバレッジ効果を考慮した多変量SVモデル』と『レバレッジ効果を考慮した因子SVモデル』の推定と比較に関する研究に集中した.前者は行列指数SVモデルの特殊ケースであり,同様アプローチが使え,単純であり,研究として行列指数と同等かそれ以上の成果になると期待されるためである.後者に関しては異なる定式化で,計算効率から注目を受けている因子モデルであり,大森裕浩教授が理論的な部分の研究を終えており特に実証分析を担当した.また二つのモデルのパフォーマンスを比較した.どちらのモデルに関しても我々のとるブロックサンプラーと呼ばれるマルコフ連鎖モンテカルロ法を用いた推定のアプローチが非常に有効であることがわかった.三つ目の研究は,『マルコフ・スイッチングSVモデル』にrealized volatility (RV)を加えて拡張したモデルである.RVやそれを多変量に拡張したrealized covarianceはSVモデルと同時モデリングすることが非常に予測などを考える上で重要であることがわかった.そこで,まず『マルコフ・スイッチングSVモデル』に応用して研究を行った.また行列指数SVに応用する研究も現在進めている.昨年度に引き続き,確率的ボラティリティ変動モデルのベイズ推定と応用に関する研究を行った.「相関一定のレバレッジ効果を考慮した多変量確率的ボラティリティ変動モデル」に関してはマルコフ連鎖モンテカルロ推定の計算効率の向上と交差レバレッジ効果のモデル化を行った.ここでいう交差レバレッジとはある株価下がった日の次の日のその株式のボラティリティが大きくなるという通常のレバレッジ効果だけでなく,ある株価が下がった日の次の日の別の株式のボラティリティへの影響をモデル化したものであり,実際のデータにおいても別の株式のボラティリティは大きくなるという結果が明らかになった.前者のモデルを用いた結果はワーキングペーパーとしてまとめ,学術誌に投稿中である.「レバレッジ効果を考慮した因子確率的ボラティリティ変動モデル」に関しては比較的高次元を扱うことができるため研究計画にあるポートフォリオ最適化に関する研究に応用することを目的として,モデルの拡張,予測・予測精度の評価法を構築し推定・予測に関する計算を行っている.計算が終了次第ワーキングペーパーとしてまとめ学術誌に投稿する予定である.昨年度,「2状態のマルコフスイッチング確率的ボラティリティ変動モデル」により定式化を行っていたものの推定結果等を考慮して多状態の構造変化モデルに変更している.この構造変化モデルは昨年度扱っていたモデルを含むより一般のモデルとなっている.三つ目は主な研究対象として扱っている.「レバレッジのある行列指数を用いた確率的ボラティリティ変動モデル」に関する研究である.今年度はより非効率ではあるが,シンプルであるプログラムを用いて予備的な実証分析を行った.株価の収益率の相関係数の変動を捉えることができることがわかっている.近年多変量の資産収益率のモデリングが注目されているが,本年度も昨年に引き続き多変量非線形状態空間モデルとして表現できる多変量確率的ボラティリティ変動(multivariate stochastic volatility, MSV)モデルの計算効率的な推定法とその応用に関する研究を行った.扱ったモデルは,(1)交差レバレッジのあるMSVモデル,(2)交差レバレッジのある行列指数MSVモデル,(3)レバレッジのある因子MSVモデル(4)レバレッジのある因子MSVモデルの4種類である.(1)から(3)までそれぞれのモデルに対して効率的なマルコフ連鎖モンテカルロ法のアルゴリズムを提案し,それに基づいたベイズ推定法用いて株式指数収益率を用いた実証分析を行い,情報量基準DICを用いたモデル比較も行った.(1)に関してはS & P500の業種別

株価指数を用いた実証分析を行い,提案したアルゴリズムの効率性もシミュレーションにより示された.その結果は査読付き論分に投稿し,採択が決定された.(2)については(1)と同様のアルゴリズムを開発し,その効率性を示すとともに東証株価指数・日本国債価格指数・円ドル為替レートの収益率を用いた実証分析を行った.また情報量基準モデルDICを用いたモデル比較では(2)のモデルが(1)のモデルよりあてはまりが良いことが分かった.更に応用として(3)モデルを用いたポートフォリオ選択の問題も今年度は扱い粒子フィルタを用いたポートフォリオ選択法を提案した.(2),(3)に関する研究に関しては学位論文にまとめた.(4)のモデルはすでに先行研究で推定法は提案されていたため,(1)のモデルとの比較を行った.その結果は来年度出版される予定の書籍の一章としてまとめられた.
特許法における当業者概念の具体的意義と機能――比較法的観点から

初年度である2018年度は、主に英国における当業者概念につき検討を行った。2017年に英国最高裁で判決が下されたActavis v. Eli Lilly事件、及びその他の裁判例の調査から、英国下級審では、(侵害成否のみが争われた事案であっても)係争特許の名宛人たる当業者がどのような者であるか、そしてその者がどのような「通常の一般的知識」を有するかが当事者により争われ、裁判所により具体的に認定されていることを確認した。他方、日本では、当業者を判断基準と明示する29条2項、36条4項(特許庁の審査基準では両条文における当業者の定義は異なる)、均等論第3、第4要件の関係性が問題とされることは少ないながらあるものの、一般に、個別事案において当業者の同定が争われることはなく、これがクレーム解釈との関係で問題とされた例も見られない。このような相違に関係する事情として、(1)英国では、ドイツと同様に、クレーム解釈資料たり得る公知技術が、(明細書記載のもの以外は)当業者の通常の一般的知識に属するものに限られているが、日本ではそのような限定がないこと、(2)英国の裁判実務では専門家証人が法廷に出て証言をするが、日本では当事者が提出した書類の審理が中心であることが挙げられる。以上につき研究会(11月の株式会社商事法務知的財産判例研究会)で報告を行った。上記(1)は、両国の相違の理由というよりむしろ、英国で当業者概念がクレーム解釈において具体的に機能していることの表れと考えられる。上記(2)については、実務家との意見交換から、実務上の大きな要因と推測されることが裏付けられた。また、日本特許法29条2項の進歩性の有無は当業者を基準に判断されるところ、進歩性判断における「効果」の位置付けについても関連的に検討し、短い判例評釈(2019年4月刊行の「平成30年度重要判例解説」に掲載)を執筆した。2018年度と2019年度は、現状分析のための基礎的な研究を行う計画であった。計画に則り、外国法については、文献調査の成果を研究会で報告するなどして研究を進めることができており、順次論文の形で公表していく予定である。他方、日本において当業者論の展開が見られないことに関しては、当初計画でも、外国で当業者論が果たしている機能が日本ではそもそも問題とされていない可能性だけでなく、他の概念により代替されている可能性も検討することとしていたが、2018年度の文献調査及び実務家との意見交換から、今後日本の法的状況の調査分析を進めるには、当初の想定以上の工夫が必要であるとの認識に至った。このような課題はあるものの、研究実績の概要記載のとおり、視野を広く持ち関連論点も含めて研究を行うことができており、また、今後の研究推進方策の見通しもあることから、おおむね順調に進展していると評価してよいものと考える。2019年度も、現状分析のための基礎的な研究を行う。外国法については、引き続き、資料収集と分析を行い、成果が一定のまとまりになった時点で公表する。他方、日本法については、学説での議論は非常に少なく、また裁判例で当業者の同定も行われていないことから、英国法・ドイツ法と同様の研究方法によるだけでは十分な情報を得られない。外国において多局面で当業者論が果たしている機能が我が国では他の(いくつかの)概念により代替されている可能性について、広く実務家の率直な認識を知ることが不可欠と考えられるため、あり得る可能性を具体的に複数提示して意見交換を積極的に行う。これにより得られた視角から裁判例(や審決)を再度分析し、そのような代替手法の有無、内容、利点及び限界につき、国内外の研究者との議論も通じて理論的検討を行う。

また、日本特許法29条2項の進歩性の有無は当業者を基準に判断されるところ、進歩性判断における「効果」の位置付けについても関連的に検討し、短い判例評釈(2019年4月刊行の「平成30年度重要判例解説」に掲載)を執筆した。2018年度と2019年度は、現状分析のための基礎的な研究を行う計画であった。計画に則り、外国法については、文献調査の成果を研究会で報告するなどして研究を進めることができており、順次論文の形で公表していく予定である。他方、日本において当業者論の展開が見られないことに関しては、当初計画でも、外国で当業者論が果たしている機能が日本ではそもそも問題とされていない可能性だけでなく、他の概念により代替されている可能性も検討することとしていたが、2018年度の文献調査及び実務家との意見交換から、今後日本の法的状況の調査分析を進めるには、当初の想定以上の工夫が必要であるとの認識に至った。このような課題はあるものの、研究実績の概要記載のとおり、視野を広く持ち関連論点も含めて研究を行うことができており、また、今後の研究推進方策の見通しもあることから、おおむね順調に進展していると評価してよいものと考える。2019年度も、現状分析のための基礎的な研究を行う。外国法については、引き続き、資料収集と分析を行い、成果が一定のまとまりになった時点で公表する。他方、日本法については、学説での議論は非常に少なく、また裁判例で当業者の同定も行われていないことから、英国法・ドイツ法と同様の研究方法によるだけでは十分な情報を得られない。外国において多局面で当業者論が果たしている機能が我が国では他の(いくつかの)概念により代替されている可能性について、広く実務家の率直な認識を知ることが不可欠と考えられるため、あり得る可能性を具体的に複数提示して意見交換を積極的に行う。これにより得られた視角から裁判例(や審決)を再度分析し、そのような代替手法の有無、内容、利点及び限界につき、国内外の研究者との議論も通じて理論的検討を行う。【理由】図書については、特許法全体を扱う和書・洋書を他の経費で購入することができたこと、及び、購入予定だった複数冊の洋書の刊行が遅れていること等のため、本予算を予定ほど執行しなかった。また、物品については、すぐに必要なものを購入させていただいた一方、性能等の十分な検討を要したために翌年度の購入としたものもある。加えて、旅費については、学務と日程が重なった等の理由で、当初予定していた出張(研究会参加)を行うことができないことが複数回あった。【使用計画】2019年度以降の研究に必要な図書及び物品(経年劣化してきた、資料収集・分析・保存・研究報告用の電子機器を含む)の購入をさせていただく。さらに、今後の研究の推進方策に記載したように、実務家・研究者と、関連し得る事項を不足なく視野に入れた意見交換を行うべく、研究会・関係官庁等への出張を積極的に行う。年代の古い資料や会員に配布されるタイプの資料については、所蔵する図書館や機関が限られるため、必要に応じて資料調査に出向く。
超音波検査のコンピュータ処理:心エコー図による心臓肥大の診断と予後予測

心臓に於ける超音波検査法の発展により,心臓肥大が多く発見されるようになり,その際生じる,心筋組織変性と病態生理学的変化の関連性が注目されている.更に,最近になって心臓肥大とその予後予測との関連が,心エコー図検査上重要となり,臨床応用の拡大が期待されている.一方,我々はここ数年来,心エコー図検査のコンピュータ処理を行い,心形態の立体的描出を容易に可能にするシステムを開発してきた.そこで,このシステムにより以下の方法で研究を進めた.1.京都大学付属病院検査部に於て,心エコー図検査を実施したもののうち,心臓肥大と診断され,良好な超音波信号の得られる患者について,ビデオテープに収録した.2.現在当部にて稼働中のコンピュータシステムによって,心エコー図検査の記録をオフラインにて処理して,超音波信号情報の解析を行い,特徴的な超音波情報パラメーターを抽出し,大容量記憶装置にデーターを保存した.3.以前より記録保存してある,心エコー図記録をオフライン処理して,上記と同様の処理をし,病例数を蓄積した.4.一方,これまで蓄積されている臨床情報から心臓肥大に関する特徴を抽出,解析した.5.この様にして得られた,心エコー図検査による心臓肥大の特徴的情報と,臨床上の特徴を対比して,心臓肥大の診断と予後予測の関連ついての基礎的検討をくわえた.このように,心エコー図検査のコンピュータ処理により,超音波信号を特徴づける情報を抽出し,心臓肥大の診断,病態生理と,その予後の予測の対比検討を行うことにより,心臓肥大の診断とその予後予測に関する基礎的な検討を加えた.心臓に於ける超音波検査法の発展により,心臓肥大が多く発見されるようになり,その際生じる,心筋組織変性と病態生理学的変化の関連性が注目されている.更に,最近になって心臓肥大とその予後予測との関連が,心エコー図検査上重要となり,臨床応用の拡大が期待されている.一方,我々はここ数年来,心エコー図検査のコンピュータ処理を行い,心形態の立体的描出を容易に可能にするシステムを開発してきた.そこで,このシステムにより以下の方法で研究を進めた.1.京都大学付属病院検査部に於て,心エコー図検査を実施したもののうち,心臓肥大と診断され,良好な超音波信号の得られる患者について,ビデオテープに収録した.2.現在当部にて稼働中のコンピュータシステムによって,心エコー図検査の記録をオフラインにて処理して,超音波信号情報の解析を行い,特徴的な超音波情報パラメーターを抽出し,大容量記憶装置にデーターを保存した.3.以前より記録保存してある,心エコー図記録をオフライン処理して,上記と同様の処理をし,病例数を蓄積した.4.一方,これまで蓄積されている臨床情報から心臓肥大に関する特徴を抽出,解析した.5.この様にして得られた,心エコー図検査による心臓肥大の特徴的情報と,臨床上の特徴を対比して,心臓肥大の診断と予後予測の関連ついての基礎的検討をくわえた.このように,心エコー図検査のコンピュータ処理により,超音波信号を特徴づける情報を抽出し,心臓肥大の診断,病態生理と,その予後の予測の対比検討を行うことにより,心臓肥大の診断とその予後予測に関する基礎的な検討を加えた.
化学物質リスク評価に基づいた意思決定支援のための経験則と理論的知識の構造化

初年度、第2年度を通して構築した、構築してきたプロセス設計と評価に関する手法群や既存の知識、さらにはそれらに関わる経験則と理論的知識を論理的に解析し、全体を一つの知識構造体として体系化していく作業を中心に行った。プロセス設計と評価に関する知識を、リスク項目の特定、プロセス評価、代替案生成、プロセスシミュレーション、リスクの解釈という5つの知識に分類し、それぞれの知識において必要となる既存の経験則や理論的知識と要求項目を検討した。この分類により、設計や評価に関する知識を一般的に体系化して議論することが可能となり、それぞれの知識・手法群の関係を考慮できるようになった。この知識構造をもとにすることで、化学物質リスク評価に基づいた意思決定を支援するためのフレームワークの詳細な検討が可能となった。プロセス評価と設計に関する知識の一般的な体系化に加えて、ケーススタディの対象となっている金属洗浄に関しては、実際に5つの知識を基にした知識情報基盤システムを実装した。まず、金属洗浄における設計の制約条件を考慮しながら、5つの知識を用いるビジネスモデルと情報システムをアクティビティモデリング言語IDEFOと情報システムモデリング言語UMLを用いてそれぞれモデル化した。これらのモデルは、化学物質リスク評価を組み込んだ新しい業務モデルとソフトウェアシステムの設計図となり、実際のシステム構築をより効率的かつ効果的に行うことが可能となった。特にプロセスモデリングに関しては、工業用洗浄装置を用いた実験。現場プロセスの調査、数値流体力学によるコンピュータシミュレーションを行い、エビデンスを収集してプロセスの物理モデルと数値モデルを構築した。これをプロセス評価方法と関連付けさせて一部をシステムに実装した。化学物質リスク削減のためのプロセス設計方法に関して、産業洗浄分野において蓄積されている経験則を調査・分類するために、洗浄サイト、溶剤メーカ、及び装置メーカのエンジニアにヒアリングを行った。これに加えて、既存の体系化されたリスク評価手法を調査し、それぞれの手法が評価可能である評価項目を産業洗浄プロセス設計における評価項目とする際の適応可能性と妥当性に関して検討して、産業の経験則と理論的な評価手法の間の差異を分析した。また、この作業とともに、リスクの要因となる洗浄プロセス情報・パラメタ・条件に関しても、同様に経験則と理論的な手法の調査・分類を行い、先に述べたリスク項目の解析結果と結びつけながら整理した。整理できた情報を基にして、プロセスにおける化学物質リスクを特定化する化学物質リスク特定化モジュールと、リスク削減対策を導出する代替案導出モジュールの基盤となる、化学物質リスク-プロセスパラメタ連関モデルを構築した。これにより、リスク削減プロセス導出システムに不可欠なデータベースの構造を明確化できた。さらに、洗浄プロセスモデルの構築のために、洗浄プロセスの種類を分類した。その中で特に、現在汎用的に用いられている塩素系溶剤を使用したプロセスに関する実験と解析を行い、洗浄プロセスモデルの一部を実装した。このモデルにより、代表的なオペレーションパラメタの変化に伴う化学物質リスクの変化を推算することが可能となり、リスク削減対策として導出された代替プロセスのリスク評価が可能となった。経験則と理論的知識の構造化におけるケーススタディである、産業洗浄におけるプロセス設計に関し、産業の関係者から協力を得ることができた。その結果から現場固有の機能や制約を考慮したリスク削減の方法を考慮するとともに、第1年度に構築したリスク評価手法の現場プロセスへの適用を行うことができた。既に、このリスク評価手法に関して、2本の論文が採択されている。また、初年度に体系化した、化学物質を利用するプロセスにおいて評価すべきリスク項目の特定化と代替案導出を行うための知識と情報を、さらに具体化してコンピュータシステムのモジュールとして表現した。このときのリスク特定化のための情報と洗浄プロセスモデルに関する情報を関連付けし、リスクに基づく意思決定を支援する知識・情報基盤システムを提案することができた。さらに、工業用洗浄装置を用いた現場の条件を考慮したリスク定量化実験を実施し、第1年度から構築してきた洗浄プロセスモデルの一部を拡張・構築した。合わせて数値流体力学を用いて装置内の物理現象を可視化し、産業洗浄関係者でも明確に理解していなかった物理現象の一部を解明することができた。同時に、現実の複雑さを反映できるように、様々な経験則の収集も行った。実際の研究活動に加え、第2年度は数多くの国際学会に参加し、海外の産業プロセスにおける現状と化学物質リスク評価手法に関して調査、さらに研究発表・意見交換を行ってきた。スイス連邦工科大学において、海外の情勢の調査と意見交換を行った。化学物質リスクに基づく意思決定が世界中で必要となり、各研究機関で同じようにリスク削減のための研究が行われていることを再認識するとともに、本研究がリスクに基づく意思決定のための支援システム構築の研究として重要な位置にあることを確認することができた。

まず、金属洗浄における設計の制約条件を考慮しながら、5つの知識を用いるビジネスモデルと情報システムをアクティビティモデリング言語IDEFOと情報システムモデリング言語UMLを用いてそれぞれモデル化した。これらのモデルは、化学物質リスク評価を組み込んだ新しい業務モデルとソフトウェアシステムの設計図となり、実際のシステム構築をより効率的かつ効果的に行うことが可能となった。特にプロセスモデリングに関しては、工業用洗浄装置を用いた実験。現場プロセスの調査、数値流体力学によるコンピュータシミュレーションを行い、エビデンスを収集してプロセスの物理モデルと数値モデルを構築した。これをプロセス評価方法と関連付けさせて一部をシステムに実装した。
生体シグナル調節におけるスフィンゴ糖脂質の作用機構と重複性の解明

1.GM2/GD2合成酵素とGD3合成酵素のダブルKOマウスの検討の結果、神経変性、皮膚損傷、抗不安と記憶・学習脳の低下、知覚機能低下、アセチルコリンのムスカリン型受容体の反応性低下と、セロトニン受容体5-HT2の反応亢進を認め、酸性糖脂質が神経組織の維持に必須であることが示唆された。2.DKOマウスでの遺伝子発現プロフィールを検討し、DKOにおいて発現低下する遺伝子5種、亢進する遺伝子15種を同定した。特に補体・補体受容体遺伝子の発現亢進が認められ、補体制御分子のラフトでの機能不全、組織障害が補体系の活性化を招き変性増強に働くことが示唆された。3.舌下神経再生実験の結果、GM2/GD2合成酵素KOマウスでは、再性能が著明に低下した。舌下神経核において発現低下する遺伝子をLCMとRT-PCRにより解析し、BDNF、GDNFなどの発現低下が示された。asialo-系糖脂質の欠損にはGD3の代償機能が不十分なことが示された。4.lac-cer合成酵素であるβ4GalT-VI遺伝子KOを樹立したが、糖脂質に明らかな変化が見られず、lac-cer合成の多くはβ4-GalT-Vが担うことが示唆された。5.GM3合成酵素の欠損マウスは問題なく出生、成長し、asialo-系列糖脂質の代償作用が示唆された。6.Gb3/CD77合成酵素(α1,4-GalT)のKOマウスを用い、ベロ毒素に対する感受性が本酵素の発現に依っていることが確認された。以上、KOマウスに残存する糖脂質の代償的機能のカバー可能な範囲と、固有の機能が見えてきた。今後のテーマとして、1、単一遺伝子KOとダブルKOマウスの異常表現型の比較による特定糖脂質構造の意義の解明、2、糖脂質糖鎖の特異的ligandの同定と意義の解明、3、糖脂質がクラスター形成する膜ミクロドメインのin vivoにおける解明が重要である。糖鎖遺伝子ノックアウトマウスが示す様々な異常表現型の発症メカニズムと、残存糖脂質による代償機能の解析をめざして、in vivoおよびin vitroの研究を展開した。GM2/GD2合成酵素遺伝子,GD3合成酵素遺伝子の両方を欠失するダブルノックアウト(KO)マウスの神経機能,行動,神経組織形態につき詳細な検討を行った。その結果、1.ダブルKOマウスでは生後間もない時期より末梢神経の変性を認めた。2.20週齢過ぎから出現する皮膚損傷部位には神経線維の増殖が見られた。3.著明な記憶,学習能の低下と抗不安を認めた。4.知覚機能低下(機械刺激に対する知覚の低下)が加齢と共に進行した。5.アセチルコリンのムスカリン型受容体アゴニストであるOxotremorine刺激に対する反応の低下と、セロトニン受容体5-HT2のアゴニストDOIに対するtwitch反応の亢進を認めた。以上の結果よりGM3以外のガングリオシドの存在が神経組織の維持にとって必須であり、その欠失がアセチルコリンとセロトニンなどのシグナル伝達の障害を惹起することにより、学習,記憶能を低下させることが判明した。現在ダブルKOと野生型マウスにおける神経組織発現遺伝子の発現プロフィールの比較に基づき、変性に関連する遺伝子を探索中である。また、舌下神経切断実験によって、神経再生における糖脂質糖鎖の役割を明らかにすべく、システムの構築を行った。

神経切断後、舌から注入したHRPは完全に逆行性輸送が遮断されるが、23週後から徐々に回復し、6週後には90%のレベルまで回復することが示された。今後、タブルKOマウスを用いて舌下神経切断後の再生能と、外来性のガングリオシドを注入した時の再生能亢進につき検討する。酸性糖脂質糖鎖の生体内機能とその代償のメカニズムの解明のため、GM2/GD2合成酵素、およびGD3合成酵素とのダブルノックアウト(DKO)の異常表現型と遺伝子発現プロフィールの検討を進めた。1、DKOマウスにおいては、野生型マウスとの遺伝子発現プロフィールの比較において、補体系遺伝子C4、C3a受容体(R)の発現亢進が認められ、S100A8などの炎症関連遺伝子、タンパク質分解酵素、RNAase、などの発現亢進も認められた。2、補体系の神経変性への関わりを明らかにするために、補体系遺伝子すべてに関して、各週齢の野生型、DKOマウスの脊髄、小脳、肝臓における発現レベルを解析したところ、脊髄、小脳においては、15週齢頃よりC1qa、C4、C3aR、C5aRなどの明らかな発現亢進が認められた。一方、肝臓では一般的に遺伝子発現レベルは高かったが、明らかな変動は認められず、神経系組織と肝臓において独自の補体系の調節機構が存在することが示唆された。また、DKOにおける補体系遺伝子の意義として、ガングリオシド欠損に基づく補体抵抗性分子(GPI型タンパク質)のラフトでの機能不全が惹起されて、補体による組織障害が発生したこと、その病変がさらに補体系の活性化を招いて、変性を増悪することが示唆された。3、複合型ガングリオシドを欠損するGM2/GD2合成酵素遺伝子のKOマウスでは、残存するガングリオシドとしてGM3、GD3が認められていたが、さらに9-O-acetyl-GD3が脳神経系で発現増強していることが判明した。KOマウスの脳組織全体に9-O-acetyl-GD3の発現が認められたが、驚いたことにプルキンエ細胞には発現を認めなかった。In situ hybridizationではGM2/GD2合成酵素遺伝子の強い発現が見られることから、本来、asialo-系ガングリオシドが高発現することが推測され、GD1cやそのderivativesの存在を検討中である。本年は、糖脂質糖鎖のノックアウト(KO)マウス間の異常表現型の比較により、代償機能と独自機能の解明を進めた。b-系列ガングリオシドを欠損するGD3合成酵素遺伝子KOマウスは、舌下神経切断実験において著明な再生能低下を示したが、GM2/GD2合成酵素遺伝子のKOマウスでは、再性能がさらに低下し、野生型のそれの約3分の1以下であることが判明した。またGT1bの切断部への注入により80%まで回復した。そのメカニズムの解明のため、舌下神経核において野生型に比してGM2/GD2合成酵素遺伝子のKOマウスで発現低下する遺伝子を、Iaser capture microdissection(LCM)およびreal time RT-PCRにより解析した。その結果、BDNF、GDNF、p75NTF、TrkB、CNTFRなどの遺伝子発現が有意に低下していることが示され、再性能の低下の要因と考えられた。これらの因子や受容体は以前の研究で、神経再生に重要であることが報告されている遺伝子である。これらの結果は、asialo-系列の欠損に対してはGD3の代償機能が十分でないことを示すものである。
製品・サービスの意味性を明らかにするビジネスマイクロエスノグラフィ手法の開発

製品やサービスの開発時には、消費者やユーザの立場にたって、製品やサービスが生活や業務にとって意味があるかどうか(意味性)を重視する必要がある。そこで、意味性を明確にするために、ユーザ経験という観点に立ち、その実態を把握する手法を開発した。当初は、ビジネスマイクロエスノグラフィと呼んでいたが、ユーザ経験に焦点を当てているため、経験想起法(ERM: Experience Recollection Method)と命名した。これは使用開始当時から現在までの人工物との関わりを想起してもらい、エピソードと経験評価値(+10-10)を継時的に記録する手法であり、ユーザ経験の実態が把握できるようになった。製品・サービスの意味性を明らかにするマイクロエスノグラフィの手法に対して適切なベースとしてUXカーブの手法をとりあげ、それを次の点に関して改善し、UXグラフとして提案した。(1)カーブそのものよりも、その変曲点に相当するライフイベントが重要であると考えられたため、記入にあたってライフイベントの座標とその内容を最初に記録させ、カーブはその後で記入させるようにした。(2)UX白書でも事前の期待感の重要性を指摘しているため、現在の前の期待感についても値を記入させることにした。(3)各イベントにおける座標はUX白書で言うところのエピソード的経験に相当するものと解釈することにした。(4)カーブそのものでは累積的UXは求められないため、現在時点での評価に対しては、現時点での総括的な評価を記入させるようにした。(5)カーブについては、各イベント間をつなぐときに、漸次的に変化している場合と、当該イベントによって急激に変化が起きる場合を区別するため、直線(場合によっては曲線)でつなぐ場合と、水平線で移行して次のイベントのところでほぼ直角に上下につなぐ場合とを区別させた。(6)隣接するイベント間の絶対座標ではなく、縦座標の差分を二番目のイベントの持っていた経験値と解釈するようにした。以上である。また記入においては、使いやすさや利用頻度など複数の縦軸を用いることをやめ、満足度ひとつに絞った。これは満足できる物はそれなりに意味があり、反対に意味がある物は人を満足させる、という考えに基づくものである。これまでにおよそ150近い事例を集めたが、集団法で施行していたために細かいニュアンスを聞き取ることができなかった。今後は個人法によって詳細なデータを得るようにし、意味性を明らかにする手法としての精度を高めることを目指す。研究テーマであるビジネスマイクロエスノグラフィは、ビジネス対象である製品やサービスについて、その利用者(ユーザ)がどのような経験をしたかを素片的(つまりマイクロな視点から)収集し、データに基づいて、ユーザの経験(UX)を総体的に明らかにすることを目標としている。初年度と今年度前半では、Kujala達の開発したUXカーブを改善して申請者が新たに開発したUXグラフをメインツールとして位置づけ、今年度後半では、そのWebアプリ化を推進した。これによって、グラフを記入しようとするユーザは、素片的な経験データを、必ずしも時系列的に想起する必要が無く、自由に記入することができるようになった。およそ一年半の期間で開発や紙ベースでのデータ収集を行ったUXグラフという手法は、横軸に時間をとり、縦軸に意味性の結果としてもたらされる満足感をとり、各時期における満足度の水準を関連するエピソードと共に記入する手法である。トータルな満足感は、最新の評価値と最大値とによって決定されるというKahnemanの説があるが、申請者が目標としているのは、単独の値としてのトータルな満足感ではなく、どのような出来事、つまり理由や原因によって、ユーザがどの程度の水準の満足感を得るかということであり、個別のエピソード的経験を収集することが必要である。もちろん記憶の変容や減衰という問題があるので、調査時点から遡るに連れて、データの信頼度は低下すると考えられ、また欠損も発生しているとは思えるが、次の開発において、満足感の高かったエピソードはそのまま保存し、満足感の低かったエピソードについては改善を施、トータルとしてのUXの満足度水準を向上させることが重要であるため、多少の信頼性の低下やデータの欠損については致し方ないことと考えた。さらにアプリ化することによって、データ記入におけるユーザの心理的負担は軽減された。・満足感と意味性を品質特性(客観的品質特性と主観的品質特性、および、設計品質と利用品質を含む)の集約的指標とし、それがUXの規定要因のなかで重要な位置を占めるという点については、HCII2015にて発表し、かなりの反響を呼んだ。特に関心のある海外、主にイギリス、の関係者と集まって、セッション終了後にその適切さを討論する場を設けるという、一般の発表ではあまりない形で、その内容が審議され、関係者の理解を得ることができた。このことは、満足感ないし意味性が重要な特性であり、それを指標にしてUXに関するデータを取得するという申請者のアプローチの適切さが確認されたことと解釈できる。・Webツールについては、情報処理学会のインタラクション2016などの機会に発表を行い、多くの人々から有益なフィードバックを得ることが出来た。具体的に一例をあげれば、UXグラフでエピソードを記入してもらうと、そのエピソードについて背景情報が欲しくなる場合があり、通常はインタビューを行うわけだが、オンラインでデータを取得するやり方の場合にその点はどうなるか、という質問があった。これについては、質問すべき内容をあらかじめ用意しておき、オンラインで対面インタビューと同等の情報を得ることができる方式を検討中であり、2016年度にシステムとして実装する予定である。本研究では、製品やサービスの利用によって、ユーザが意味のある(意義のある)経験や生活ができるようになるかを評価し確認する手法を開発した。

具体的には、UXカーブという手法をベースにして、まずUXグラフという手法を提案した。UXカーブは、UXの水準(具体的には、一般的経験水準、魅力水準、使いやすさ水準、機能性水準、利用頻度)を横軸の時間に対して上下の高さでグラフ表現させる手法である。これに対して、UXグラフでは、横軸の単位(つまり年)を明確にし、また、どのようなエピソードがどの程度の評価を得たのかをエピソードのテキスト記述と、+10から-10までの評定による程度の評価を得ることにした点に特徴がある。いいかえれば、UXカーブにおける恣意性を、手法の厳格化によって抑えようとしたものである。しかし、UXカーブやUXグラフはグラフを描画するため、視覚的に把握できるという利点がある反面、横軸の時期に関する記憶の曖昧さによってグラフの形が影響されてしまう点に大きな課題があった。そこで、グラフという視覚化表現をやめ、エピソードのテキスト記述と評価値の記入だけに限定したのがERM(Experience Recollection Method)である。日本語では経験想起法と命名した。なお、時間軸に相当する部分については、入手前、入手した時点、その後、現時点、今後の見通し、という大ぐくりな表現とするにとどめた。記憶に関しては忘却や歪曲という心理学的プロセスの影響が懸念されるが、リアルタイムで経験値を蒐集する方法にくらべれば侵襲性が低く、長期間にわたる調査や広い分野での利用が可能である。ERMについては国内外で既に80件程度のデータ収集を行い、記入のしやすさ、自己の経験の確認の可能性、などの利点があることがインフォーマントのアンケート結果から明らかとなっている。製品やサービスの開発時には、消費者やユーザの立場にたって、製品やサービスが生活や業務にとって意味があるかどうか(意味性)を重視する必要がある。そこで、意味性を明確にするために、ユーザ経験という観点に立ち、その実態を把握する手法を開発した。当初は、ビジネスマイクロエスノグラフィと呼んでいたが、ユーザ経験に焦点を当てているため、経験想起法(ERM: Experience Recollection Method)と命名した。これは使用開始当時から現在までの人工物との関わりを想起してもらい、エピソードと経験評価値(+10-10)を継時的に記録する手法であり、ユーザ経験の実態が把握できるようになった。UXカーブに着目し、それをUXグラフに改善するための各種の改訂を行い、エスノグラフィックな手法としての有効さや効率性を基本的に確認した。UXグラフは、インタビューや観察といった一般的なエスノグラフィックな手法と異なり、総括的な(満足度という形での意味性に関する)評価を定量的に行えるという利点がある。また、個人法を採用した場合には、このカーブがインタビュー調査における媒介素材として有効に機能することが考えられるため、そうした可能性については次年度に検討することにする。
細菌内毒素による細胞活性化に関与する膜タンパク質の同定とその機能解析

細菌内毒素(LPS)は、マクロファージなどの宿主細胞を活性化し種々のサイトカインを産生することが知られている。本研究の目的は、LPSによる細胞活性化の要となっている新たな分子を同定しその特性を明らかにすることである。本研究では、細胞膜タンパク質に対する抗体およびラジオアイソトープ標識リピドAを用いて解析することで、これらの基準の多くを満足するタンパク質を同定した。これまで、マウス骨髄ストローマ細胞株ST2がCD14の発現はなく、マクロファージとほぼ同程度のLPS反応性を有することを明らかにしている。そこで、ST2細胞から精製した細胞膜およびこの細胞膜よりHPLCで部分精製したLPS結合タンパク質を抗原としてポリクロナール抗体を作製した。この抗ST2細胞膜抗体をもちいたマクロファージ膜タンパク質の解析した。ST2細胞を可溶化し作成した抗体を用い免疫沈降することで膜タンパク質を濃縮し、これを電気泳動で分離後、さらに同じ抗体でウェスタンブロットする。これによって特定の集団の膜タンパク質の発現が可能になった。[3H]標識リピドA前駆体(PE-406)および[3H]標識リピドA(PE-506)を用いたリガンドブロット法でリピドA結合タンパク質として57kDaおよび53kDaのタンパク質を同定した。本年度は、ポリクロナール抗体の作製とLPSによる細胞活性化に関与する新たな分子を検索し、生物学的特性の解析を行った。(1)CD14陰性骨髄ストローマ細胞株(ST2)細胞膜に対するポリクローナル抗体の作製。申請者はこれまで、マウス骨髄ストローマ細胞株ST2がOD14の発現はなく、マクロファージとほぼ同程度のLPS反応性を有することを明らかにしている。(2)マクロファージ膜タンパク質中のリピドA結合タンパク質の同定(1)で作製した抗体による免疫沈降で膜タンパク質を濃縮し、これを電気泳動で分離後、楠本正一教授(阪大)らにより合成された高い放射活性をもつ[^3H]標識リピドA前駆体(PE-406)および[^3H]標識リピドA(PE-506)を用いたリガンドブロット法でリピドA結合タンパク質を検出した。その結果、57kDaと53kDaの膜タンパク質(p57とp53)が無刺激のマクロファージでは発現しているが、LPSで活性化するとその発現が完全に消失すること、LPS低感受性C3H/HeJマクロファージではこのp57とp53はLPS刺激の有無に関わらず発現していること、またp53への[^3H]標識リピドA前駆体PE-406および[^3H]標識リピドA(PE-506)の結合は合成リピドA前駆体(406)、合成リピドA(506)、PE-406やPE-506では抑制されなかったが、S.minnesotaSLPSやReLPSにより抑制されることが明らかとなった。[3H]標識リピドA

前駆体(PE-406)および[3H]標識リピドA(PE-506)を用いたリガンドブロット法でリピドA結合タンパク質として57kDaおよび53kDaのタンパク質を同定してた。
膵癌に対するMUC1刺激樹状細胞療法の臨床研究―樹状細胞マイクロアレイ解析を含めて―

切除不能および再発膵癌にMUC1-CTLとMUC1-DC併用療法を施行し、その臨床効果を検討した。Leukapheresisにより抹消血単核球を分離、さらに比重遠心法を行った後、プラスチックシャーレで45分間培養し、浮遊細胞と付着細胞に分け、浮遊細胞からMUC1-CTLを誘導、付着細胞からはDCを誘導した。樹状細胞はIL-4およびGM-CSFより未熟DCを誘導、さらにTNF-αを添加して、培養終了24時間前にGMP gradeのMUC1ペプチドで刺激し、成熟DCを誘導した。MUC1-CTLは経静脈的に投与し、DCは大腿部皮内に投与、安全性を確認すると共に、臨床効果や免疫反応について検討した。9例に行い、有害事象は認めなかった。CTL移入細胞数は0.6-5.7x10^9個、DCは3.4-31X10^7個であった。CR1例、NC2例、PD6例であり、CRの1例は48ヶ月無再発生存中である。MUC1-CTLの表面マーカー解析の結果、誘導前に比べ誘導後には、明らかにヘルパーT細胞(32.7→44.6%)および細胞障害性T細胞(17.9→48.3%)の比率が増加していた。未熟DCに比較して成熟DCではCD83(2.7→88.4%)、CD80(42.9→87.3%)、CD86(50.4→99.2%)と有意に増加していた。DCの遺伝子解析では、単球の純度をあげる実験を行い、98%の純度がコンスタントに得られるようになった。現在、健常者1名、膵癌患者2名より単球、未熟DC,および成熟DCを得ており、アレイ解析を行う準備をしている。
遺伝子暗号に従わない翻訳終結/再開始のメカニズムの解明：試験管内再構成系を用いて

ヒト因子由来再構成型タンパク質合成システムを樹立した。この系で、脳心筋炎ウイルスの2A2B領域をコードする部分を翻訳すると、2Aと2Bが分断されて合成されてきた。このことは2A2Bの分断には特別な因子を必要としていないことを示している。更に、翻訳終結因子eRF1, eRF3を除いてもこの現象が起こることから、2A2Bの翻訳終結・再開始はペプチド鎖伸長の際に起こることが証明された。また、この現象のメカニズムを解明するために、様々な変異を2A2Bの分断部位に施した。特記すべきことに、所謂NPGP配列をNPGGやNPGQに変異させてもでは80%近くの分断率を示した脳心筋炎ウイルス(EMCV)のゲノムRNAはひとつのオープンリーデイングフレームを持ち、翻訳の際ポリプロテイン(L-1A-1B-1C-1D-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D)の形で合成される。ほとんどの場合ウイルス自身がコードするプロテアーゼにより個々のタンパク質に分断されるが、最初の分断である2A-2Bの間の分断はウイルス由来または細胞由来のプロテアーゼによるものでなく、翻訳という過程で起こることが知られている。そこで我々はヒト因子由来再構成翻訳系を構築し、この現象にどのような因子が関わっているのかを明らかにし、分子レベルでの分断メカニズムを探ることにした。ヒト因子由来再構成型試験管内タンパク質合成系はリボソーム、eEF1, eEF2, eRF1/3,そしてアミノアシルtRNAから成る。これまでのシステムでのアミノ酸の供給元はアミノアシルtRNAであった。しかしこのままではtRNAの再利用ができないため合成量は限られたものである。そこでアミノ酸とtRNAを結合させる酵素:アミノアシルtRNA合成酵素をすべて(20種類)リコンビナント体として十分量発現・精製し、これらを再構成系に投入し、tRNAをリサイクルさせることにより絶えずアミノ酸をリボソームに供給できるようにした。結果として、タンパク質の合成量が格段に上がり、実験系が確立されてきた。そして本研究の目的である2A2Bの合成を試みたところ、2Aと2Bの分断はこのシステムで再現され、特別な因子が必要ではないことが示唆された。ヒト因子由来再構成型タンパク質合成システムを樹立し、論文発表に至った(J. Biol. Chem. 289: 31960-31971)。このシステムに脳心筋炎ウイルスの2A2B領域をコードするDNAを投入すると2Aと2Bが分断されて合成されてきた。このことは2A2Bの分断には特別な因子を必要としていないことがわかった。翻訳終結因子eRF1, eRF3を除いてもこの現象が起こることから、2A2Bの翻訳終結・再開始はペプチド鎖伸長の際に起こることが証明された。更にこの現象のメカニズムを解明するために、様々な変異を2A2Bの分断部位に施した。所謂NPGP配列(2Aの最後の3アミノ酸がNPG、2Bの最初のアミノ酸がP)をそれぞれAに変えると、NPGの場合(APGP, NAGP, NPAP)はいずれも分断が起きなかったが、NPGAでは分断は50%で起こった。NPGG, NPGSでも同様に50%で起こったが、NPGN,NPGLでは10-20%の分断率であった。このことは従来の考え方「プロリンの脱プロトン化が起こりにくいため求核攻撃が遅く、2Aペプチドの影響で活性化された水分子がPサイトにあるペプチジルtRNAのエステル結合を先に攻撃し、ペプチドが離れる」には合致しない。なぜならA(アラニン)やS(セリン)は脱プロトン化が起こりにくいことはないからである。そこでクライオEMにより構造解析を行い、詳細なメカニズムを追究することにし、現在準備を進めている。2A2Bの分断のメカニズムを解明するために、様々な変異を2A2Bの分断部位に施した。そこでAだけでなく他のすべてのアミノ酸に置換するとNPGGやNPGQでも80%近くの分断率を示した。このことは従来の考え方「プロリンの脱プロトン化が起こりにくいため求核攻撃が遅く、2Aペプチドの影響で活性化された水分子がPサイトにあるペプチジルtRNAのエステル結合を先に攻撃し、ペプチドが離れる」には合致せず、新たなモデルの必要性が提示された。更に、アミノ酸置換を2AのC末18アミノ酸にも施し分断率を測定すると、特に、疎水性アミノ酸のGへの置換が分断を阻止することがわかった。これは、リボソームのペプチドトンネルの疎水性部位との2A末端との相互作用の重要性を示唆している。2A-2Bの分断メカニズムの完全な理解には構造解析が不可欠である。そこで、クライオ電子顕微鏡を用いて観察することにした。目下のところ、ヒト因子由来再構成型翻訳システムで2A-2Bを合成し、分断がぎりぎりで起こらない条件で、所謂アレストしたリボソームを精製しようとしている。サイトメガロウイルスのuORF2の配列(アレスト配列)を用いたコントロール実験では、リボソームとmRNAの像が観察されているが、新生ペプチドの可視化には至っていない。ヒト因子