hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パーキンソン病遺伝子改変モデルの解析及びモデル作成

パーキンソン病の病態を解析するためにはパーキンソン病の症状を忠実に再現するモデルマウスの作製は不可欠である。しかし、これまでパーキンソン病の遺伝子改変マウスにはそのようなモデルは存在していない。本研究期間で新たに作製したミトコンドリア呼吸酵素のNDUFV2欠損マウスと家族性パーキンソン病の原因遺伝子PINK1欠損マウスはミトコンドリアの機能障害を呈しパーキンソン病モデル動物として今後の研究に有用であるパーキンソン病の病態を解析するためにはパーキンソン病の症状を忠実に再現するモデルマウスの作製は不可欠である。本研究期間で新たに作製したミトコンドリア呼吸酵素のNDUFV2欠損マウスと家族性パーキンソン病の原因遺伝子PINK1欠損マウスはミトコンドリアの機能障害を呈しパーキンソン病モデル動物として今後の研究に有用である本年度は、parkinノックアウトマウスとMPTPで処理したマウス(パーキンソン病(PD)モデル)のin vivoボルタメトリーを使ったドパミン遊離の解析とドパミントランスポーター(DAT)阻害剤ノミフェンシンを使った行動異常の是正の有無を検討した。我々が開発したslip rod testを用いることで運動学習能力を検討した。MPTPマウスではドパミンの枯渇量に依存して運動学習能力が低下した。またアポモルフィンを投与すると前シナプスのD2受容体刺激によりドパミン遊離が低下して運動学習能力が向上しないことが分かった。ノミフェンシン投与では運動学習能力は改善した。このslip rod testを用いることで薬物の治療効果を判定できる(Shiotuki et a1. J Neuroscience Methods in press)。またPark9の原因遺伝子ATP13A2の遺伝子改変モデルマウスの作成に取りかかり作成に成功した。現在、解析を始めた。一方、in vitro系での解析ではPark2と6の遺伝子産物parkin、PINK1は協働して異常ミトコンドリアのクリアランスに関与していることが分かった。言い換えればparkinもPINK1もmitophagyに関わっていることが予想された。Mitophagy効果を示すにはparkinがミトコンドリア外膜に集積することが重要であり、集積効果を示すのにPINK1の存在が必要であることが分かった(Matsuda eta1. J Cell Biol in press。新規パーキンソン病(PD)モデルとしてIron response protein2(IRP2)のtransgenic miceとparkin knock out miceを交配して行動異常、そしてドパミン低下の有無を検討した。その結果、加齢に伴い細胞脱落、ドパミン低下が観察され、行動異常もドパミン低下に伴い観察された。更に我々はミトコンドリア電子伝達系の複合体Iの24-kDaサブユニット(NDUFV2)のノックアウトマウスを作成し、神経毒であるMPTPに対する感受性が高いことを見出した。ミトコンドリア機能低下がバックグラウンドにあるマウスとして今後、遺伝性PDの遺伝子改変モデルと交配する予定である。本年度は、parkinノックアウトマウスの膵β細胞を用いてインスリンの分泌機構を検討した。その結果ドパミンのみならずインスリンの分泌低下も観察された。インスリン分泌は二相性によって制御されており、parkinノックアウトマウスでは、第1相の選択的低下が認められた。第1相はシンタキシン依存性のシナプス開口機構であり、ドパミン放出の低下と併せてparkinノックアウトマウスではシンタキシン依存性放出機構が障害されていると考えられた。既にparkinの基質として放臆されているseptin5についてTotal Internal Reflection Fluorescence(TIRF)にて観察してみると線維状に蓄積してあたかもインスリン顆粒の分泌を阻害している像が認められた。この現象が中枢神経系でも観察されるか検討中である。神経系はグルコースを利用している臓器であり、低血糖は致死的状態を惹起する。また過食症にはドパミンが関連していることは明らかであり、インスリン分泌機構はドパミン放出機構と共通したメカニズムをもっていることが予想される。神経系は多様性の高いグループであり、解析上この多様性が大きな弊害となっている。一方、膵β細胞は均一であり、β細胞の解析結果が神経系に適合できることが分かれば、新しい解析方法として有効な手段と高い評価を受ける可能性が高い。一方、parkinのmitophagyへの関与が明らかになり、その活性化にPINK1のミトコンドリア外膜への集積が必須であることが分かった(Kawajiri et al. FEBS Lett 2010 ; Matsuda et al. J Cell Biol 2010)。このPINK1の外膜への集積はミトコンドリア膜電位の低下により誘導される。更にPINK1と結合し、mitophagyを制御する分子Xを見出し、詳細な機能解析を開始した。更にドパミン補充で症状の改善が観察された。このマウスモデルは特許として出願した。家族性パーキンソン病の中にあってParkinとPINK1を原因遺伝子とする若年発症パーキンソン病はミトコンドリア機能異常がその病態の中核をなす疾患として注旨されている。PINK1は損傷ミトコンドリアを認識し除去(ミトファジー)することにより細胞内環境を健全に保つ機能を有する。

その一方で、ミトコンドリアにも局在するPINK1自身がミトコンドリア機能にいかに関与しているかは未だ不明な点が多い。そこで本年度はPINK1ノックアウトMEFを用いて呼吸鎖や膜電位への影響を以下のように検討した。1)PINK1ノックアウトマウス胎児由来のMEF細胞を不死化し、PINK1ノックアウト株と野生株をグルコース培地とガラクトース培地で培養することによりミトコンドリア呼吸依存的な増殖率を比較した。2)ミトコンドリアを抽出しOxygenMeterとMitocell MT2000により単位細胞当たりの酸素消費を定量することにより呼吸能を比較した。MEFからミトコンドリア分画を抽出し単位ミトコンドリア当たりの呼吸機能をModular Kinetic Anaiysisにより測定した。3)MEFの単位細胞あたりのROSの産生とプロトンリークを測定し比較した。また免疫染色によるミトコンドリアの形態や膜電位の変化を観察した。その結果、PINK1ノックアウトMEFではガラクトース培地にて増殖の低下が顕著であった。またミトコンドリアからのプロトンリークやATP合成能には変化は認められないものの、基質酸化能は低下していることが判明した。さらにはミトコンドリアの膜電位も2次的低下を認めると共に、細胞当たりのATPは約80パーセントに低下していた。このような膜電位の低下した異常ミトコンドリアは本来であればミトファジーによって除去される運命にある。PINK1自身の機能が十分でない場合はミトファジーを誘導できなくなるため、異常なミトコンドリアを除去できずに結果として細胞内に蓄積する。この悪循環による異常ミトコンドリアの蓄積が若年発症の原因の一因であると推測される。このような異常ミトコンドリアを蓄積するPINK1ノックアウトMEFはパーキンソン病のモデル細胞として今後の病態解析に有用である.
増殖から分化への切り換えを制御する二種の蛋白質分解システム

Fizzyファミリー蛋白質はAPC/サイクロソームの活性化に必須であり、分裂酵母ではG2-M進行時にSlp1(Cdc20ホモログ)がその役割を担う。G1期で機能するホモログであるSte9(Cdh1)の機能欠損株は、通常の増殖は正常だがG1期制御が異常になり、細胞分化(接合、減数分裂、胞子形成)が全く起こらない。分裂酵母ゲノムには未解析のfzr1,fzr2,fzr3を含め計5個のFizzyホモログが存在し、これらの細胞分化時の機能を調べた。slp1の転写量は減数分裂前DNA合成後、第一分裂前から第二分裂にかけて一過的に十倍以上に増加し、この時期の機能が推測される。slp1温度感受性株では許容温度でも通常の4つの一倍体胞子ではなく2個の二倍体胞子が形成され、これは減数第一分裂がバイパスされ第二分裂だけが起こるためで、Slp1の機能が第一分裂に必須である事がわかった。fzr3の転写量は減数分裂前DNA合成後から第一核分裂前まで増え、fzr1は核分裂時に転写のピーク、fzr2はfzr1とオーバーラップし更に後期にかけて強く誘導される。これら3つの遺伝子の破壊株はいずれも正常に生育し、fzr2やfzr3破壊株では細胞分化にも特に影響はなかったが、fzr1破壊株では胞子は生じるものの、その大半が12個で形とサイズが不規則だった。詳しく調べると減数分裂前DNA合成や、核分裂自体は正常だが、セントロソームにあたるSPBから派生する二重膜が核を包み込み、成熟胞子になる過程が欠損していた。またste9変異株の減数分裂不能性はRas-ERKMAP kinaseの活性化により抑圧され一倍体でも胞子形成するため、Ste9が減数分裂開始と進行を制御する事が推測される。全貌の解明は今後の課題であるが、Fizzyファミリー蛋白質が増殖時の細胞周期調節以外にも重要な機能を持つ事が明らかになった。申請計画に基づき、細胞分化の開始制御におけるユビキチン依存性蛋白質分解の役割を調べた。分裂酵母のSte9蛋白質は、重要なユビキチンリガーゼであるAnaphase-promoting complex/サイクロソームのG1期における活性化因子である。Ste9が機能しない変異株はG1期で細胞周期を停止せず、細胞分化(接合、減数分裂、胞子形成)しないが、同時にGap1(Ras蛋白質に対するGTPase activating protein)が機能しない場合には、一倍体細胞が減数分裂を開始してしまう異常な性質を示す。この原因追求のため、gap1遺伝子を破壊した親株を変異誘起処理し、一倍体でも減数分裂する類似形質の変異株を単離した。取得した8つの変異株の原因遺伝子の特定から、これらはプロテアソームそのもの、又はその機能に密接に関係する蛋白質に変異を有する事がわかった。減数分裂開始制御破綻の原因として、プロテアソームによる蛋白質分解不全があると予想され、APC/Cの関与と、原因基質の同定を試みている。取得した変異株は増殖時にも欠損があり、特に体細胞分裂時は、p38 MAPキナーゼがプロテアソームと協調しつつ細胞周期進行を制御している事を示す結果を得た。変異株の表現型から、両者が核分裂や細胞質分裂をコントロールしている可能性が示唆され、実際、細胞質分裂を制御するいくつかの蛋白質がユビキチン化されている事がわかってきた。二つ目の蛋白質分解系であるN-end rule経路については、その主要な構成因子であるUbr1が細胞分化に必須である事、分化のみならず増殖時にもゲノムの安定性や細胞形態維持といった種々の事象に関係している事を見つけた。ubr1株の示す異常について、先に報告したN-end rule蛋白質分解経路の基質候補であるMei2の関与を含め、その原因を調べている。

詳しく調べると減数分裂前DNA合成や、核分裂自体は正常だが、セントロソームにあたるSPBから派生する二重膜が核を包み込み、成熟胞子になる過程が欠損していた。またste9変異株の減数分裂不能性はRas-ERKMAP kinaseの活性化により抑圧され一倍体でも胞子形成するため、Ste9が減数分裂開始と進行を制御する事が推測される。全貌の解明は今後の課題であるが、Fizzyファミリー蛋白質が増殖時の細胞周期調節以外にも重要な機能を持つ事が明らかになった。
地理情報システムGISを活用した非集計データの時空間分析

本研究の目的は,非集計ミクロデータとGIS(地理情報システム)をリンクさせ一体的に計量分析を行う有効性を地理学的観点から検討することにある.この課題を達成するため,6人の地理学者が,(1)「時空間データベースの構築とその利用」,(2)「GISによる時空間解析」,(3)「インターネットGISの実現」の3グループに分かれて研究を行った.(1)のグループは,既存の公表統計・集計資料だけでなく,アンケート,聞き取り,観察などによって得られた未公表,あるいは私的な量的・質的データを体系的に整理し,地理行列化する手順について検討するとともに,それを用いて実証分析を行った.(2)のグループは,GISを援用して,ミクロ統計データを用いた都市内部建物利用の時空間データベースを作成し,それに分析・表示用ツールを付加することによって,都市政策決定のための支援システムを構築した.さらに,町丁・字のような,自由な境界線をもつ不規則な小地区データの空間的自己相関分析を通して,ミクロデータの空間単位の最適な設置問題にアプローチした.このグループの最終目的は,GISによる時空間解析のモデュール化であった.(3)のグループでは,入手が困難な小地域統計とその地図データベースをネットワークで提供し,ユーザが自在に時空間分析できるシステムの構築をめざした.本年度は実験的にインターネット上で明治時代の地域統計を地図化するOpen-GISを作成した.本研究の目的は,非集計ミクロデータとGIS(地理情報システム)をリンクさせ一体的に計量分析を行う有効性を地理学的観点から検討することにある.この課題を達成するため,6人の地理学者が,(1)「時空間データベースの構築とその利用」,(2)「GISによる時空間解析」,(3)「インターネットGISの実現」の3グループに分かれて研究を行った.(1)のグループは,既存の公表統計・集計資料だけでなく,アンケート,聞き取り,観察などによって得られた未公表,あるいは私的な量的・質的データを体系的に整理し,地理行列化する手順について検討するとともに,それを用いて実証分析を行った.(2)のグループは,GISを援用して,ミクロ統計データを用いた都市内部建物利用の時空間データベースを作成し,それに分析・表示用ツールを付加することによって,都市政策決定のための支援システムを構築した.さらに,町丁・字のような,自由な境界線をもつ不規則な小地区データの空間的自己相関分析を通して,ミクロデータの空間単位の最適な設置問題にアプローチした.このグループの最終目的は,GISによる時空間解析のモデュール化であった.(3)のグループでは,入手が困難な小地域統計とその地図データベースをネットワークで提供し,ユーザが自在に時空間分析できるシステムの構築をめざした.本年度は実験的にインターネット上で明治時代の地域統計を地図化するOpen-GISを作成した.
痴呆性老人の空間反応に関する建築計画的研究

本研究は、痴呆性老人介護施設における痴呆性老人の空間認知の状況を把握することにより、痴呆性老人にとって認識しやすい施設空間のあり方を探ることを目的とした。1)平成6年度(1)全国の特別養護老人ホームを対象とした郵送アンケート調査により、介護現場で空間認知を容易にするためのしつらいや工夫の現状を把握し、多くの示唆を得た。(2)特別養護老人ホーム2施設において痴呆性老人14名を対象として、質問調査と行動観察調査を行い空間認知機能の残存状況をとらえたところ、医学的痴呆評価と空間認知能力は一致しない、自分の居室等をある程度は把握している、空間認知の手がかりは様々であった。2)平成7年度設計者が空間的な分節化を意図した特別養護老人ホーム2施設において、入居者の生活領域形成状況を観察調査した結果、生活領域形成に4つの類型を見いだした。さらに、痴呆性老人の居室探索行動を追跡調査して、居室群のしつらい、居室位置、生活拠点からの方向、名札や色彩などの目的などを居室認知の手がかりとしていることが判明した。3)平成8年度(1)特別養護老人ホーム2施設99名の入居者について、生活状況と心身状況の入居時からの経年変化を調査した結果、居室位置の把握状況が比較的よい、目印のうち名札の把握状況がよい、ADLの低下に伴って居室把握機能が低下する、などをとらえた。(2)同じ2施設において、23年にわたって継続的に観察できた16名の痴呆性老人について、居室把握状況の経年変化を検討して、変化の要因と思われる事項を整理した。3年度にわたるこれらの研究をもとに、居室の分かりやすさの条件を考察し、建築計画上の指針を得た。1.研究の目的痴呆性老人介護施設において、痴呆性老人が自立的に快適に過ごすための生活環境にあり方を探るために、施設空間の分かり易さについて検討することを目的とする。本年度においては居室把握の能力と方法、および研究方法の検討を目的とした。2.研究の方法痴呆性老人専用特別養護老人ホーム2施設において、対象者へのヒアリング調査および行動観察調査を試行実施した。自立歩行ができかつ会話等の意志疎通がある程度できる入居者合計17名を対象に、食堂・デイルーム等自分の居室から離れた場所で質問し、【.encircled1.】会話だけで、【.encircled2.】平面図や写真を示して、【.encircled3.】さらに居室に案内してもらうという方法で、居室把握の程度および手がかりをとらえた。3.研究の主な結果(1)居室把握の方法に、【.encircled1.】完全に把握できているタイプ、【.encircled2.】場所の空間的特徴で把握しているタイプ、【.encircled3.】居室が和室であるなどの空間情報で把握しているタイプ、【.encircled4.】居室の位置がある程度分かっていて名札等で確認するタイプ、【.encircled5.】ひとつずつ部屋を見て回るタイプ、の5つのタイプが見出された。(2)面的な色や特徴的な空間情報が居室把握に対して有効であると考えられる。(3)高次脳機能検査簡易型によって判定した痴呆の程度と居室把握の能力と方法には関連性は見られない。(4)質問調査や行動観察調査による研究方法は一定程度の有効性をもつものと考えられる。1.研究の目的痴呆性老人介護施設において、痴呆性老人が自立的に快適に過ごすための生活環境のあり方を探るために、施設空間の分かり易さについて検討することを目的とする。本年度においては、(1)自分の居室の認知方法の把握、(2)研究方法の有効性の確認、および(3)建築計画指針策定のためにヒントを得ることを目的とした。2.研究の方法平成6年度に行った調査と同様な方法により、新たに2つの痴呆性老人看護施設を対象として調査を実施した。

調査に際して、色彩情報による場の認識の可能性をもとらえるように意図した。3.主な研究結果(1)質問調査や行動観察調査による研究方法は、軽度の痴呆性老人に対しては一定の有効性をもち得る(2)居室の探索行動の調査結果から見ると、居室やその周辺の「しつらえ」等の空間情報、および名札などの文字情報や色彩情報を居室認知の手がかりとしている例が多い。(3)色彩情報については、赤・青・緑などの明確な色彩が有効で、それらが場の通称(赤コーナーなど)と一致していると認知されやすい(4)建築計画指針策定のためのヒントとして、(1)居室群の位置は、共用空間に近く見通しの良い位置が望まれる(2)居室群の識別には、居室群としての「しつらい」や色彩による空間の差別化が有効であるなどの研究結果が得られた。1.研究の目的痴呆性老人介護施設において、痴呆性老人が自立的に快適に過ごすための生活環境のあり方を探るために、施設空間の分かり易さについて検討することを目的とする。本年度においては、(1)施設内での生活領域形成状況の把握、(2)自分の居室の認知方法の把握、および(3)建築計画指針策定のためにヒントを得ることを目的とした。2.研究の方法平成67年度に行った調査と同様な方法により、建築設計者が空間把握の容易さを意図して設計した施設事例2例において調査を実施した。調査に際して、痴呆性老人と非痴呆性老人の違いを把握するために両者を比較対照した。3.主な研究結果(1)生活領域形成には、(1)居室拠点型、(2)共用空間拠点型、(3)複数共用空間滞留中心型(4)複数共用空間移動型がみられ、痴呆性老人には(1)が少なく、(2)(3)(4)が多い。(2)痴呆性老人の居室探索には、(1)居室群のしつらい把握型、(2)居室群内の居室位置把握型、(3)生活拠点からみた居室方向把握型などがみられる。(3)居室の探索には、痴呆性老人でも名札や居室のしつらいの違いが役に立っている。また、明確な色彩は認知度が高い。(4)建築計画指針策定のためのヒントとして、(1)居室群の位置は、生活拠点となる共用空間に近く見通しの良い位置が望まれる、(2)居室群の識別には、居室群としての「しつらい」や色彩による空間の差別化が有効である、(3)居室群内での位置関係を覚え易いように34室が一瞥できるような居室配置が望ましいなどの研究結果が得られた。なお、重ねて痴呆性老人の空間把握状況の経年変化についても調査を実施したが、その結果については科学研究費補助金研究成果報告書および同概要で報告する。
インターネット トラヒックパターンの解析とその応用に関する研究

インターネットにおけるトラヒックパターンの測定として、以下の4つの運用システムにおけけるトラヒック特性の測定を行い解析を行った。(1)インターネットにおけるトラヒックデータレポジトリの設計と運用ユーザのプライバシーに関する情報を秘匿しつつ、エンドエンドインターネット通信のトラヒック特を計測解析可能なトラヒックデータのパラメータとデータの保存方法に関する検討を行い、実際にシテムの構築と運用評価を行った。(2)ルートドメインネームサーバへの問い合わせパケットのトラヒック計測ルートドメインネームサーバに到着するDNS解決要求パケットをテープドライブに記録し、要求ハットの問い合わせ元および問い合わせ先情報の解析を行った。ルートドメインネームサーバは世界13個存在しており、ユーザがどのサーバを利用するかを決定することができるために、DNS解決要パケットの処理は13個のルートDNSサーバによって分散処理される。測定の結果、アジアからの求よりも、欧米諸国からのDNS解決要求パケットの割合が多いことが明かとなった。(3)ラベルスイッチシステムにおける必要ラベル数の評価ラベルスイッチシステムにおいて必要となるラベル数の評価を実トラヒックデータを用いて行い、大らに、大規模システムにおいて、ラベル数を実装可能な数に減少させる方法を提案し、実トラヒックータを用いて評価を行った。(4)デジタルビデオを用いた遠隔会議システムにおけるパケットのトラヒック計測東京大学と慶應義塾大学の間でデジタルビデオを用いた高精細の動画像の転送実験を行い、トラヒッ計測と解析を行った。大容量のファイル転送とデジタルビデオ情報の転送、さらにIPSecを用いて暗した場合に情報転送の場合におけるトラヒック特性の計測と解析を行った。この計測実験により、速データ通信が行われる環境において、受信パケットの統計情報を記録することが可能であることを確認することができた。インターネットにおけるトラヒックパターンの測定として、以下の2つの運用システムにおけるトラヒック特性の測定を行い解析を行った。(1)ルートドメインネームサーバへの問い合わせパケットのトラヒック計測ルートドメインネームサーバに到着するDNS解決要求パケットをテープドライブに記録し、四要求パケットの問い合わせ元および問い合わせ先情報の解析を行った。ルートドメインネームサーバは世界に13個存在しており、ユーザがどのサーバを利用するかを決定することができるために、DNS解決要求パケットの処理は13個のルートDNSサーバによって分散処理される。測定の結果、アジアからの要求よりも、欧米諸国からのDNS解決要求パケットの割合が多いことが明かとなった。(2)デジタルビデオを用いた遠隔会議システムにおけるパケットのトラヒック計測東京大学と慶應義塾大学の間でデジタルビデオを用いた高精細の動画像の転送実験を行い、トラヒック計測と解析を行った。大容量のファイル転送とデジタルビデオ情報の転送、さらにIPSecを用いて暗号した場合に情報転送の場合におけるトラヒック特性の計測と解析を行った。この計測実験により、高速データ通信が行われる環境において、受信パケットの統計情報を記録することが可能であることを、確認することができた。(3)ラベルスイッチシステムにおける必要ラベル数の評価

ラベルスイッチシステムにおいて必要となるラベル数の評価を実トラヒックデータを用いて行い、大らに、大規模システムにおいて、ラベル数を実装可能な数に減少させる方法を提案し、実トラヒックータを用いて評価を行った。(4)デジタルビデオを用いた遠隔会議システムにおけるパケットのトラヒック計測東京大学と慶應義塾大学の間でデジタルビデオを用いた高精細の動画像の転送実験を行い、トラヒッ計測と解析を行った。大容量のファイル転送とデジタルビデオ情報の転送、さらにIPSecを用いて暗した場合に情報転送の場合におけるトラヒック特性の計測と解析を行った。この計測実験により、速データ通信が行われる環境において、受信パケットの統計情報を記録することが可能であることを確認することができた。
ソリトンによるフォノンの構造変化の研究

1.フォノンの構造本研究の主要な目的は非線形相互作用によってソリトンが生成する電子格子系で、ソリトンによって格子振動のフォノンがどのように構造変化するかを理論的に解明することであった。これはかなり前から手がけられている問題であるが、とくに光学型フォノンに関して研究が完全でないので、それを徹底するのが目的であった。残念ながら時間不足のためこの目的はまだ達成されていない。予備的計算のための高性能パソコンの導入も、新しいOSのパソコンの発売を待っていたため、年末になった。現在それの調整を終わった段階である。この研究計画は来年度に進展することを期待している。2.導電性高分子のソリトン格子の金属転移トランス型ポリアセチレンを例として、不純物が乱雑に分布するとした簡単なときに、できたソリトン格子が金属転移を起こすかどうかをもう一つの問題として研究している。似たような問題は半導体の金属転移で定式化されているが、ソリトン格子ではオーダパラメタが空間的に一様でないという特徴がある。この場合にもかなりよい近似で適用できるself-consistentな理論を作った。その結果、電子状態密度のgapは実験にほぼ対応する不純物密度で消えることが示せた。オーダパラメタ自体は消えないので、系はgapless Peierls状態になると言える。この仕事の予備的な報告は7年度に発表された。現在詳しい報告を準備中である。
寡占市場における数量競争に基づく企業立地モデルの分析

まず数量競争に基づく立地モデル、いわゆる立地-数量モデルの基本的な性質を明らかにした。最初に、代表的なモデルである円環市場モデルを取り上げた。昨年度の研究では、数カ所に多くの企業が集まる均衡(部分集積)や各企業が等距離に立地し集積が起きない均衡(分散均衡)など、様々なタイプの均衡があることを明らかにした。今年度はこの性質を精査し、どちらのタイプの均衡がより出現しやすいのかを分析した。その結果、前者の均衡は同時手番ではなく逐次手番を考えれば現れないこと、また前者の均衡が存在するには輸送費用関数の形状に制約を加える必要があるが、後者には必要ないこと、などがわかった。これらの結果は分散タイプの均衡がよりrobustであることを示している。次に、もう一つの代表的なモデルである直線市場モデルにおける、企業立地と経済厚生の関係を明らかにした。企業集積は、価格競争モデルと異なり、必ずしも経済厚生を損なうものではないことを明らかにし、複占に限らず企業数一般の寡占モデルにおいて、企業が集積する誘因は社会的に見て過大であることを明らかにした。また応用研究として、公企業と私企業が競合する混合寡占市場について、立地モデルを使って分析した。まず、私企業が国内企業である場合には、全ての私企業の集積が現れることを明らかにした。これは、公企業との競争は私企業の横並び行動を誘発することを明らかにする結果である。更に、私企業に外国企業が含まれるケースも分析し、外国企業数が少数である場合には外国企業の存在は国内私企業の立地パターンに影響を与えないが、外国企業数が増えるにつれて影響が表れることを明らかにした。通常の混合寡占モデルでは、外国企業が1社でも存在すると均衡が劇的に変わるのであるが、この研究は、この法則が必ずしも成立しない事例を明らかにしたという点でも意味のある研究である。同時に、基礎的な研究として、企業の研究開発と立地行動の関係も分析し、研究開発に伴う不確実性が企業の集積を生むメカニズムを明らかにした。まず数量競争に基づく立地モデル、いわゆる立地一数量モデルの基本的な性質を明らかにした。まず、代表的なモデルである円環市場モデルを取り上げ、企業数が3以上の寡占モデルにおける立地パターンについて分析した。既存研究では円環市場では集積が起こらないとされてきたが、実際に全ての企業が一箇所に集積することはないものの、数カ所に多くの企業が集まる集積は均衡において表れることを明らかにし、しかもその集積のパターンは様々で、非常に多様な均衡が存在しうることを明らかにした。また、もう一つの代表的なモデルである直線市場モデルにおける、企業立地と経済厚生の関係を明らかにした。企業集積は、価格競争モデルと異なり、必ずしも経済厚生を損なうものではないことを明らかにし、集積は常に消費者の利益になること、市場規模に比して十分に輸送費用が小さい場合には集積が総余剰も最大化することを明らかにした。また、市場規模に比して輸送費用が大きい場合には、集積が経済厚生上望ましくないのにもかかわらず集積が起こる可能性はあるが、その逆はあり得ないことを明らかにした。また応用研究として、独占禁止法の運用上の政策的な含意を得るために、企業立地と違法な企業間の暗黙の協定であるカルテルの安定性との関係を分析した。従来の研究では遠く離れて立地した企業間のカルテル程安定的であるとされていたが、数量競争モデルではそのような単調性は必ずしも成り立たないことを明らかにし、より近くに立地する企業間のカルテルの方が安定的になる可能性を明らかにした。同時に、基礎的な研究として、企業の戦略的な行動について戦略的なコミットメントや情報戦略について分析し、タイミングゲームにおいて純粋戦略均衡が存在のための条件や純粋戦略均衡が存在しないケースでの混合戦略の性質についても明らかにした。

通常の混合寡占モデルでは、外国企業が1社でも存在すると均衡が劇的に変わるのであるが、この研究は、この法則が必ずしも成立しない事例を明らかにしたという点でも意味のある研究である。同時に、基礎的な研究として、企業の研究開発と立地行動の関係も分析し、研究開発に伴う不確実性が企業の集積を生むメカニズムを明らかにした。
光エネルギーを操るナノハイブリッド系の共奏光触媒への展開

ゼオライト細孔中へ機能を待った物質を導入することにより、それら個々の機能とは異なった新規の機能を創製するナノハイブリッドゼオライトは、光化学、光触媒、発光材料などの観点から注目されている。そこで我々は、溶液中とゼオライト細孔内における4-acetylbiphenylの光物性について、共存する金属イオンの効果の観点から系統的に調べた。4-acetylbiphenylのBlue発光は、単独溶液系やゼオライト細孔内に導入しただけでは発現しないことが明らかとなった。また、4-acetylbiphenylは共存金属イオンによってその光物性を変え、ゼオライト細孔内で特定の金属イオン(Gd(III))と共存した場合のみ、Blue発光(蛍光)とりん光を同時に室温において与えた。4-acetylbiphenylの光物性を詳細に検討することで、複雑なRGB発光機構の解析を行うことができ、なおやつこの系の発光色制御、しいては光を操るナノハイブリッド系の構築に結び付けたいと考える。さらに、ホスト材料して2次元制限空間を有する層状ケイ酸塩を用いて、構造と4-acetylbiphenyl発光挙動について検討したところ、層状ケイ酸塩のケイ酸骨格構造の変化が発光スペクトルに影響していることが分かった。また、層状ケイ酸塩に導入した4-acetylbiphenylは、室温下・空気雰囲気下でりん光発光を示した。
両大戦間フランスにおける中等教育無償法制化過程の研究

本研究は、両大戦間フランスにおける中等教育無償法制化過程を解明することを課題とした。そのために本研究で採用した方法は、フランス議会の公教育予算委員会報告書を基礎資料として、これを分析した。その結果、ここで得た知見は、以下の通りである。1.中等教育の無償制度は、無償制度の推進主体である「急進党の統一学校理念」の分析から「統一学校の完成」と位置づけられていることが、その基礎にあったこと.2.中等教育の無償制は、「子どもの教育を受ける権利」を保障する観点から位置づけられていたこと.3.子どもの教育を受ける権利を保障するためには、授業料を徴収する有償学校とそれを求めない無償学校の2元的制度を解消しなければならず、そこで急進党の採った政策が、中等教育機関と高等小学校との合併校舎制度の導入であったこと.4.この合併校舎制度により、同一校舎内での授業科徴収の不合理さを解消するために、合併校舎における中等教育の授業料廃止に踏み切ったこと.5.次ぎに、単独校舎の中等教育機関と合併校舎での中等教育機関での2元制を解消するために、単独校での中等教育の無償制を学年進行で実現していったこと.6.中等教育無償制度の全面実施を支える論点は、「教育を受ける子どもの権利の平等」であったとともに、「社会的エリ-ト層の拡大」にもあり、この点から、当時理解されていた「教育を受ける子どもの権利」とは、「無償の中等教育を受けて、社会的エリ-トになる権利の平等」と理解されていたこと、以上の諸点が、急進党提案の「公教育予算委員会報告書で進展されたことが明かになった。なお、議会議事録の分析に基づく、「無償制反対論」の論拠との関連は、今後の分析作業として残された。
高周期14族元素常磁性化学種に関する研究

ケイ素=ケイ素二重結合化合物の1電子酸化で得られるカチオンラジカル種では、スピン及び陽電荷が二つの骨格ケイ素上に非局在化した電子状態を持つのに対し、1電子還元で得られるアニオンラジカル種ではスピン及び陰電荷が各々の骨格ケイ素に局在化した電子状態を持つことを明らかにした。また、二つのケイ素ラジカル種をパラ-及びメタ-フェニレン基で連結した分子を合成し、パラフェニレン体は閉殻1重項分子である一方、メタフェニレン体は基底3重項状態を示すビラジカル種であることを明らかにした。典型元素ラジカルではスピン中心となる原子のs軌道、p軌道がその役割を担うが、炭素、窒素、酸素などの第2周期元素では主量子数が同じであるためそのサイズは類似したものになり、原子核の電荷の違いによる若干の軌道サイズの差があるに過ぎない。一方で、主量子数が異なる高周期典型元素では根本的に軌道サイズが異なっており、分子内、分子間におけるスピン間の相互作用も自ずと変化すると考えられる。本研究ではフェニレン基を連結子に用い、複数のケイ素ラジカル(シリルラジカル)中心を同一分子に組み込んだ化学種を合成し、その構造、スピン状態について検討した。極めて嵩高いtert-ブチルメチルシリル基を二つ導入したブロモシラン部位をパラおよびメタフェニレン基に導入した前駆体の還元的脱臭素化反応により、対応するフェニレン架橋ビス(シリルラジカル)の合成を試みた。その結果、パラ体を良好な収率で合成することに成功し、X線結晶構造解析により結晶中では1重項ジシラパラキノジメタン型構造を持つことを明らかにした。一方、溶液状態では強い常磁性シグナルが観測されており、明瞭な核磁気共鳴シグナルを与えないなどの事実から、構造変化が容易な溶液中では3重項状態との平衡混合物として存在することを示唆する結果を得た。一方、メタフェニレン架橋ビス(プロモシラン)の還元反応では一つのブロモシランユニットでの還元によりシリルアニオン中心を生成し、もう一方のブロモシランユニットでの脱臭素化反応が進行せず、同方法では対応するメタフェニレン架橋ビス(シリルラジカル)が得られないことが分かった。前年度までに二つのケイ素ラジカルをパラフェニレン基で連結したパラジシラキノジメタンの合成に成功し、1重項キノジメタン構造を持つことをX線結晶構造解析により明らかにしている。本年度は、二つのケイ素ラジカルをメタフェニレン基で連結したメタジシラキノジメタンを合成し、その分子構造、スピン状態について実験的、理論的に検討した。極めて嵩高い七ert-ブチルメチルシリル基が二つ置換したヨードシラン部位をメタフェニレン基に導入した前駆体の還元的脱ヨウ素化反応により、メタジシラキノジメタンを合成、単離することに成功した。そのX線結晶構造解析により、二つのケイ素ラジカル部位のケイ素3p軌道は共にメタフェニレン基のπ軌道との相互作用が発現しない直交配座をとっており、またメタフェニレン基内のC-C結合に結合交替が存在しないことが明らかとなり、二つのケイ素ラジカル部位が単純にメタフェニレン基で連結された分子構造を持つことが分かった。メタジシラキノジメタンのスピン状態を検証すべく3-メチルペンタンマトリックス中、極低温におけるEPRスペクトル測定の結果、3重項種特有のシグナルが観測され、その強度の温度依存性からメタジシラキノジメタンが基底3重項状態を持つことが実験的に示され、理論計算の結果もそれを支持した。また、先に合成・単離に成功しているパラジシラキノジメタンについては固体NMRによる同定に成功し、分子構造を含めて基底1重項状態を持つことを明らかにした。
非線形超音波伝搬特性を用いた積層構造の非破壊評価への新たな試み

非線形超音波法を用いた積層構造の層間欠陥(接着不良や閉じたはく離)の高感度検出法の確立を目的として,本年度の研究では積層構造の層間における二次高調波(入射波周波数の2倍周波数を有する波)発生挙動の理論解析および予備実験を実施した.理論解析では,任意の積層数を有する積層構造を仮定し,各層間界面を非線形スプリング界面でモデル化した.そして,伝達マトリクス法(周期構造中の線形な超音波伝搬を取り扱う理論解析手法)と摂動解析(弱非線形近似)を組み合わせることで,縦波を積層構造に垂直入射したときの反射波・透過波に含まれる二次高調波振幅を理論的に求めた.その結果,二次高調波の振幅は入射周波数,積層数,非線形界面の位置に強く依存することが明らかとなった.また,すべての層間界面が同一の非線形性を有する場合に,二次高調波振幅が界面数とともに単調増加するような周波数帯が生じることも明らかとなった.本解析で得られた結果をまとめ,海外論文誌Wave Motionへ投稿を行った(2017年4月29日現在査読中).次に,PC,オシロスコープ(信号発生器内臓),信号増幅器,圧電素子を用いて高調波測定系の構築を行った.信号発生器で生成する電圧波形や測定した信号の保存等はすべてMATLABで制御できるように設定した.二次高調波の測定を行うには,大振幅の超音波を発生させる必要がある.そこで予備実験として,アルミニウムブロックに対して超音波透過波の測定を行い,本測定系で発生可能な超音波の最大振幅について検討した.その結果,最大200 Vpp程度の電圧を波形にひずみが生じることなく圧電素子に印可できることがわかった.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
デキストラングルコシダーゼ基質複合体の結晶構造解析による触媒機構の解明

これまでに得られた結晶構造を基に,加水分解反応に用いられると思われる水分子を予測し,その結合部位に変異を導入することで,糖転移能の改善を目指した.水分子と水素結合を形成しているアミノ酸残基を置換した9つの変異体は全て,野生型酵素よりも高い糖転移能を示した.合成及び天然基質を用いたときの糖転移及び加水分解速度をそれぞれ測定し速度論的解析を行ったところ,これら変異体は,1)アクセプタ親和力の増加2)加水分解速度の低下3)糖転移速度の増加により,野生型酵素よりも高い糖転移能を示すことが明らかとなった.また,変異体は天然基質に対しても高い転移能を示したことから,他の加水分解酵素へ同様の変異を導入し糖転移能を上げることで,新しい糖質合成法と成りうることが示された.さらに変異体の1つを結晶化し,その立体構造を決定したところ,注目した水分子を含めて触媒残基周辺の立体構造は保存されていた.このことから糖転移能が上昇した理由として次の2つが考えられる.1)注目した水分子は加水分解に使われる水分子ではないが,触媒残基と結合しているため,反応中間体の安定性に影響を与え糖転移能が上昇した2)注目した水分子は加水分解反応に用いられ,変異体では水分子を捕らえにくくなり糖転移能が上昇するが,結晶構造のような静的な構造には反映されない変異体は全て野生型より高い糖転移能を示したが,その転移速度は大きく低下していた.転移速度を落とさずに転移能を上げる変異が今後の課題である.これまでに得られていたX線回折データを用いて触媒残基変異体-基質複合体の構造精密化をおこなった.本構造は,α-1,6グルコシド結合加水分解酵素において初めての基質複合体構造であり,基質認識機構を立体構造から理解するために重要な結果が得られた.デキストラングルコシダーゼは,サブサイト-1では他のアルファアミラーゼファミリー酵素群の酵素と同様に基質と結合していたが,サブサイト+1においてLys275およびGlu371が基質と水素結合を形成することで,基質のα-1,6グルコシド結合を認識していることが明らかとなった.またポケット状の活性部位の底に水分子が並んだ穴が見つかったことから,基質が酵素と結合する際に活性ポケット内にある水分子を排出する排水口の役割があると考えられた.このような構造はアルファアミラーゼでは見つかっておらず,基質を非還元末端から分解するグルコシダーゼに特有の構造であると考えられる.この他,結晶からX線回折データを精度よく収集するため,結晶の凍結条件の改善を試みた.これまでは抗凍結剤に高濃度のポリエチレングリコールとグリセロールを用いていたため,浸透圧が大きく,結晶にひびが入るなど品質の低下がみられた.そこで抗凍結剤を2-メチル-2,4-ペンタンジオール(8%)に代えることにより,品質低下を抑えながらデータ収集を行えるようになった.本凍結方法を用いることで,放射光施設よりも弱い実験室系のX線発生器を用いても,2.0Å以上の高分解能なデータ測定が可能となった.前年度に得られた基質複合体の立体構造を基に,基質認識に重要な3つのアミノ酸に変異を導入することで,デキストラングルコシダーゼの基質特異性の変換に成功した.野生型の酵素はα-1-6グルコシド結合を加水分解するのに対し,変異体酵素はα-1,4グルコシド結合のみに作用した.本来の基質特異性を完全に失わせ,新たな特異性を獲得させた例はほとんどなく,アルファアミラーゼファミリー酵素群の広い基質特異性を理解する上で重要な結果である.また,作成したα-1,4グルコシド結合に特異的な変異体と,その阻害剤であるacarboseの複合体の結晶構造解析を行った.この変異体では,結合しているacarboseに対し,結合により適するように酵素の構造が変化していた.2つの疎水的アミノ酸がコンフォメーションを変えることにより,α-1,4結合を持つ基質に適しか結合サイトを形成していた.さらに,本構造中のacarboseのコンフォメーションは,α-1,4結合を特異的に切断するαアミラーゼに結合したacarboseのものと同様であった.すなわち,今回作成した変異体酵素は,α-1,4結合に特異的であるアルファアミラーゼと類似のメカニズムにより基質を認識していると考えられる.これらの結果に加え,結晶化条件のさらなる検討を行うことで,実験室系のX線発生装置を用いて1.7Å分解能での結晶構造解析に成功した.さらに,以前は酵素の阻害剤であるトリスを結晶化に用いていたが,トリスを用いずに結晶を育成することにも成功した.これまでは,酵素の活性中心にトリスが結合した構造が得られていたが,新たな条件で結晶化することにより,阻害剤と相互作用していない触媒残基の状態を明らかにできると考えられる.これまでに得られた結晶構造を基に,加水分解反応に用いられると思われる水分子を予測し,その結合部位に変異を導入することで,糖転移能の改善を目指した.水分子と水素結合を形成しているアミノ酸残基を置換した9つの変異体は全て,野生型酵素よりも高い糖転移能を示した.合成及び天然基質を用いたときの糖転移及び加水分解速度をそれぞれ測定し速度論的解析を行ったところ,これら変異体は,1)アクセプタ親和力の増加2)加水分解速度の低下3)糖転移速度の増加により,野生型酵素よりも高い糖転移能を示すことが明らかとなった.

また,変異体は天然基質に対しても高い転移能を示したことから,他の加水分解酵素へ同様の変異を導入し糖転移能を上げることで,新しい糖質合成法と成りうることが示された.さらに変異体の1つを結晶化し,その立体構造を決定したところ,注目した水分子を含めて触媒残基周辺の立体構造は保存されていた.このことから糖転移能が上昇した理由として次の2つが考えられる.1)注目した水分子は加水分解に使われる水分子ではないが,触媒残基と結合しているため,反応中間体の安定性に影響を与え糖転移能が上昇した2)注目した水分子は加水分解反応に用いられ,変異体では水分子を捕らえにくくなり糖転移能が上昇するが,結晶構造のような静的な構造には反映されない変異体は全て野生型より高い糖転移能を示したが,その転移速度は大きく低下していた.転移速度を落とさずに転移能を上げる変異が今後の課題である.
移植臓器保存において体外循環を用いた長期保存法に関する研究

肝移植において移植肝を摘出後、虚血状態を無くしてレシピエントに移植できる方法を探る目的で、3回の実験を行った。<実験方法>幼若豚を全麻下に開胸開腹し胆摘後胆管にチュービング、肝周囲の剥離を行い、門脈、下大動脈にカニューレを挿入し、心拍動があるままで体外循環をゆっくり回し始め、門脈灌流を10ml/kg/minにまで増加させる。この状態で肝動脈を結紮切離、肝上部下大動脈をクランプし、肝臓を灌流した状態のまま摘出し、37°Cのラクテックを満たしたベースン中に浸漬した。肝下部下大動脈から脱血した血液は膜型肺で酸素化してバイオポンプに接続した。<実験結果>灌流血液中の電解質、肝逸脱酵素、血糖値、酸塩基平衡、血清浸透圧等につき実験開始後12時間まで測定した。AST,ALTの変化はASTは術前値73、1時間43、3時間57、6時間48、12時間127IU/Lであった。ALTは術前値40、1時間20、3時間7、6時間5、12時間6U/LとAST,ALTともに変動が見られなかった。しかしBE1時間値が23であり、適宜メイロンを投与したが、12時間までこの値はほとんど変わらず、著しいアシドーシスを示した。血糖値は灌流開始後1時間目から3000mg/dlと著しい高値を示し、12時間目には3850mg/dlとなり、インスリンを投与したが血糖値は2/3程度には低下したものの、著明な効果はみられなかった。<結果>37°Cの実験条件下では糖新生が起こり、今回行った実験系にはこの新生された糖を細胞内に取り込むことが出来ないために、このような結果になったものと考えられた。<今後の対策について>糖新生をおこさないための対応が大切であると思われた。肝移植において移植肝を摘出後、虚血状態を無くしてレシピエントに移植できる方法を探る目的で本年度は3回の実験を行った。実験方法:幼若豚を全麻下に開胸開腹し胆摘後胆管にチュービング、肝周囲を剥離を行い、門脈、下大静脈にカニューレを挿入し、心拍動があるままで体外循環をゆっくり回し始め、門脈灌流を10ml/Kg/minにまで増加させる。この状態で肝動脈を結紮切離、肝上部下大静脈をクランプし肝臓を灌流した状態のまま摘出し、37°Cのラクテックを満たしたベースン中に浸漬した。肝下部下大静脈から脱血した血液は膜型肺で酸素化してバイオポンプに接続した。実験結果:灌流血液中の電解質、肝逸脱酵素、血糖値、酸塩基平衡、血清浸透圧等につき実験開始後12時間まで測定した。AST, ALTの変化はASTは術前値73、1時間43、、3時間57、6時間48、12時間127IU/Lであった。ALTは術前値40、1時間20、3時間7 6時間5 12時間6U/LとAST, ALTともに変動が見られなかった。しかしBE1時間値が-23であり、適宜メイロンを投与したが12時間までこの値はほとんど変わらず、著しいアシドーシスを示した。血糖値は灌流開始後1時間目から3000mg/dlと著しい高値を示し、12時間目には3850mg/dlとなり、インスリンを投与したが効果はみられなかった。

少括:37°Cの実験条件下では糖新生が起こり、今回行った実験系にはこの新生された糖を細胞内に取り込むことが出来ないためにこのような結果になったものと考えられた。今後の対策について:糖新生をおこさないための対応大切であり、次年度は低温下での実験を行いたい。肝移植においてドナー肝の長時間保存と虚血再灌流障害を回避するためにドナー肝の灌流保存の至適条件を探ることを目的で研究を行っている。摘出ブタ肝臓の肝動脈を結紮し、門脈から膜型肺で酸素化した血流を10ml/kg/minの速度でバイオポンプを用いて注入し、下大静脈から回収した血液を膜型肺に導く回路を作製して灌流実験を行った。灌流血液温度が37°Cでは灌流血中の血糖値が30003850mg/dlと上昇し、Base Exessが-23mEq/lと著しいアシドーシスを示した。このため糖新生を含む摘出肝の代謝を低下させる目的で灌流血液の温度を21°Cに下げて灌流を行ったが、血糖値は25003500mg/dlと多少の低下がみられた程度であった。このため血糖値を安定させて長時間にわたり肝臓を灌流保存するためには、脾動静脈と腹腔動脈を用いた肝臓と膵臓の同時灌流が必要と考えられた。次年度は肝・膵同時灌流実験を行う予定である。肝移植においてドナー肝の長期保存を可能にすることをめざし、虚血再灌流障害を回避してドナー肝の灌流保存の至適条件を探ることを目的として研究を行っている。摘出ブタ肝臓の門脈に膜型肺で酸素化した血流を流して、門脈の動脈化を行い、下大静脈から回収した血液を再び膜型肺に導く回路によって灌流するシステムを作成して灌流実験を行ってきた。これまでに行った灌流温度を37°Cと21°Cに設定した実験結果では、いずれにおいても灌流血中の血糖値が25003850mg/dlと著しく高く、BEは-23nEq/lとアシドーシスとなり、灌流温度の設定のみでは糖新生を抑えることが出来なかった。平成15年度は肝・膵同時灌流実験を行った。門脈からの灌流では膵の灌流は出来ないため、右胃動脈、左胃動脈、胃十二指腸動脈と門脈本幹を結紮切離して、肝臓と膵臓の同時灌流を腹部大動脈-下大静脈系で試みた。理論上は可能な系と考えられたが、手術操作が煩雑なためか、今年度のみではこの系を完成させることは出来なかった。
生細胞環境でのケミカルラベル化を用いたタンパク質の動的構造解析

近年のタンパク質研究においては、単離精製したタンパク質の精密構造解析から、本来機能する生細胞における解析および評価へと研究の重要性がシフトしている。それに伴い、新規な方法論の開発が世界中で活発に進められているが、いずれの手法においてもタンパク質を遺伝子工学的に改変し、一過的に発現させる必要がある。我々は遺伝子操作することなく細胞に内在的に発現するタンパク質を化学修飾できる独自の方法「リガンド指向型化学」を報告した。本研究では、これまでに達成できていない、細胞内タンパク質に対する新たなラベル化法、および小分子リガンドを有さない膜タンパク質に対するラベル化およびその動態・機能制御法の開発を研究目的としている。平成28年度は、神経伝達物質受容体の一種であるグルタミン酸受容体をモデルタンパク質として、そのHis変異導入と細胞表層での配位化学(OcCC)をグルタミン酸受容体に適用し、その動的構造制御とそれに連動したチャネル活性のコントロールが可能であることを実証した。これは、リガンド結合ドメインの動的な構造変化が膜結合ドメインのチャネル部分の構造変化を誘導するということが、推定されていた受容体を用いて、膜表層での動的構造をパラジウム錯体との配位結合によって人為的に固定化することを基軸とした新しいChemical genetics的な膜受容体活性制御法と言える。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、これまでに達成できていない、細胞内タンパク質に対する新たなラベル化法、および小分子リガンドを有さない膜タンパク質に対するラベル化法の開発を研究目的としている。平成27年度は、小分子リガンドを有さないタンパク質に対するラベル化法として、抗体にアシル基転移反応の触媒として機能するジメチルアミノピリジン(DMAP)をコンジュゲートした反応性抗体を作製し、抗体の特異性とDMAPの触媒活性を協同的に作用させることによって、細胞表層のタンパク質をラベル化する方法(ScFv-DMAP法)の開発に成功した。この方法を用いて、膜受容体タンパク質の動的な揺らぎをケミカルラベルによってマッピングでき、細胞膜上での動的な構造変化の解析が可能であることを実証した。平成27年度は、細胞内でのラベル化が可能な新しいリガンド指向性の開発および、小分子リガンドを有さないタンパク質標的に対するラベル化法の展開研究を実施した。細胞内でのタンパク質ラベル化においては、プロテアーゼなどの分解酵素に作用されず、また高濃度に存在する細胞内小分子には作用しない反応基の適用が求められる。我々は、新たな反応基としてN-スルフォニルピリドン基が細胞内でのタンパク質ラベル化に適用可能かどうかを評価した。その結果、幾つかの細胞内在性のタンパク質に対して、これまでのリガンド指向性化学よりも優れた効率でラベル化が進行することを見出した。また、小分子リガンドを有さないタンパク質に対するラベル化に関しては、抗体に着目し、それにアシル基転移反応の触媒として機能するジメチルアミノピリジン(DMAP)をコンジュゲートした、新しい反応性抗体の開発に成功した。これを用いると、抗体の特異性とDMAPの触媒活性を協同的に作用させることによって、細胞表層のタンパク質をラベル化する(ScFv-DMAP法)ことが可能であった。例えば、乳ガン細胞マーカーとして知られる増殖因子受容体の一種であるHER2タンパク質を標的とし、HER2に対するScFvを用いてラベル化することが可能であった。またEGFRを標的に相互作用点が不明な抗体(affibody)をコンジュゲート担体に用いると、ラベル化部位の詳細な解析から膜受容体と抗体との相互作用点(エピトープ)を推定/確定できることが実証することができた。今後は、細胞内でのラベル化が可能な新しいリガンド指向性化学の反応機構について、さらなる解析を行い、その開発指針を提示する。

また、神経伝達物質受容体を例に、細胞膜において動的に揺らいでいるコンフォメーションを活性型に固定化して、生細胞での機能を制御する化学的方法論(Chemical Geneticsの一つ)の構築を検討する。細胞内でのラベル化に関しては、前年度までの検討において、明らかにしてきた細胞内で加水分解等の副反応を受けにくく、特定のタンパク質を選択的にラベル化できる反応基(N-スルフォニルピリドン基)について、その反応基に置換基を導入して反応性をチューニングすることにより、細胞内タンパク質のラベル化に最適な反応性を定量的に予測/評価できるかどうかを検討する。また、反応性の予測では計算化学を活用し、実際に実験で得られるデータとの相関性を評価していく。さらに、膜結合性の神経伝達物質受容体の動的な活性制御法に関しては、近年急激に進みつつある構造解析のデータを基にしながら、その動的なコンフォメーション変化の制御する試みを行う。具体的には、アミノ酸の点変異と人工金属錯体(認識分子)との組み合わせによって、受容体タンパク質を活性型コンフォメーションに動的に固定化するための新しい戦略の開発を行う。リガンド結合ドメインの構造変化がチャネル部分の構造変化に伝わるということが、構造解析から推定されているグルタミン酸受容体をテンプレートとして、His変異と細胞表層での配位化学:OcCCによるグルタミン酸受容体の動的構造制御およびチャネル活性のChemical genetics的なコントロールに挑む。28年度が最終年度であるため、記入しない。浜地研究室ホームページ