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なぜ低親和性抗-ヒストンH1モノクローナル抗体が敗血症の治療効果を有するのか？

本研究ではエンドトキシンショックからマウスを救命する低親和性抗-ヒストンH1モノクローナル抗体(C93-3)について、ヒストンH1以外の抗原を同定し、作用機序を解明することを目的とした。C93-3はα-actinin 1、α-actinin 4、nucleolin、hnRNP U、DNAを抗原として認識する多反応性抗体だった。市販の抗-DNAモノクローナル抗体をエンドトキシンショックモデルに投与した結果、生存率の向上が認められた。この結果から、C93-3は細胞外DNAを捕捉することで炎症反応を抑制する可能性が示唆された。細胞外DNAの捕捉は重症敗血症の治療において有効な手段となる可能性がある。抗-ヒストンH1モノクローナル抗体C93-3はヒストンH1への親和性が低いものの、エンドトキシンショックモデルマウスを救命する効果が認められた。本研究の目的は、その作用機序を解明し、敗血症の治療薬を開発するために必要な基礎的データを得ることである。C93-3が認識する抗原の同定: C93-3は血液中に遊離する抗原、または免疫細胞表面に存在する抗原を認識する可能性がある。そこで、マウスの血漿タンパク質、脾細胞の細胞膜タンパク質およびサイトゾル、マウスマクロファージ様細胞RAW 264.7の細胞膜タンパク質を用いてC93-3の抗原を調査した。その結果、hnRNP U、nucleolin、α-actinin 1、α-actinin 4が抗原であることが判明した。同定した3種類の抗原のアミノ酸配列には相同性が認められなかったことから、C93-3は抗原に共通する立体構造をエピトープとして認識すると推定された。α-actininは、自己免疫疾患患者の抗-DNA抗体が交差反応する抗原の1つであることから、C93-3がDNAに反応するかどうか調査した。その結果、C93-3はdsDNAおよびssDNAに反応することが判明した。同定した抗原に対する市販抗体の救命効果を評価:死細胞から放出された自己DNAとHMGB1やLL37ペプチドからなるDNA複合体は、TLR7やTLR9を刺激し、炎症反応を惹起することが知られている。C93-3はDNAを介してこれら複合体を捕捉することで救命効果を発揮する可能性が考えられた。市販の抗-DNA抗体をエンドトキシンショックモデルマウスに投与し、救命効果を評価した。その結果、市販の抗-DNA抗体投与群の48時間生存率は16.7%で、コントロール群の0%比べると有意な生存率の向上が認められた。しかし、C93-3投与群の48時間生存率70%には及ばなかった。この結果から、C93-3によるDNA複合体の捕捉は作用機序の一端を担うと考える。C93-3のDNA以外の抗原への結合が、作用機序において重要であると推測する。低親和性抗-ヒストンH1モノクローナル抗体C93-3は、エンドトキシンショックからマウスを救命した。本研究ではその作用機序を解明し、敗血症治療薬を開発する上で必要な基礎的なデータを得ることを目的とした。Nucleolinはマクロファージの表面に存在し、リポ多糖(LPS)によるマクロファージの活性化に関与することが報告されている。C93-3がマクロファージ表面のnucleolinに結合することで、LPSによる活性化を抑制する可能性を考え、これを検証した。C93-3は細胞表面に存在するnucleolinを介してマウス腹腔マクロファージに結合する可能性が示唆されたものの、LPSによる活性化を抑制しなかった。DNAはtoll-like receptorのリガンドとして働き、炎症反応を誘導することが報告されている。C93-3が細胞外DNAを捕捉することで炎症反応の誘導を抑制する可能性を考え、これを検証した。市販の抗-DNA抗体をエンドトキシンショックモデルマウスに投与して生存率を測定した。昨年度も同様の実験を行ったが、実験条件に問題があり、これを修正して再度実験を行った。その結果、抗-DNA抗体の投与は生存率の向上をもたらした。この結果から、C93-3の作用機序には細胞外DNAが関与する可能性が示唆された。DNAとヒストンタンパク質で構成されるヌクレオソームによる好中球の活性化をC93-3が抑制するか検証を試みた。しかし、既報のような細胞外ヌクレオソームによる好中球の活性化は認められず、C93-3の評価には至らなかった。本研究は、細胞外DNAの捕捉が敗血症治療の有効な手段となる可能性を提示した。C93-3が認識する抗原の同定: α-actinin 1および4、nucleolin、hnRNP U、ssDNA、dsDNAがC93-3の抗原であることを明らかにした。

これらの抗原には配列的な相同性が認められないことから、C93-3はこれらの抗原に共通する立体構造をエピトープとして認識することを明らかにした。おおむね研究は順調に遂行できたと考える。同定した抗原に対する市販抗体の救命効果を評価:市販の抗-DNA抗体をエンドトキシンショックモデルマウスに投与し、抗-DNA抗体の救命効果を評価した。その結果、抗-DNA抗体の救命効果を確認することができたが、C93-3には及ばなかった。C93-3によるDNA複合体の捕捉は作用機序の一端を担うものの、DNA以外の抗原への結合が作用機序において重要であると推測する。DNA以外の抗原についても、市販の抗体を用いて評価すべきであるが、多量の抗体が必要であるため、資金的な問題から実施を断念した。分子生物学活性化したマクロファージは、エンドトキシンショックモデルにおいて炎症反応を惹起する重要な免疫細胞である。LPSによるマクロファージの活性化には、マクロファージの細胞表面に存在するnucleolinが関与するという報告がある。そこで、C93-3がマウス腹腔マクロファージ表面のnucleolinに結合することで、LPSによる活性化を阻害するかどうか調査する。エンドトキシンショックでは、活性化した好中球が産生する活性酸素などによって組織障害が起こり、多くの細胞がネクローシスする。HMGB1は核内でDNAに結合するタンパク質であり、炎症反応を引き起こすdamage-associated molecular patterns(DAMPS)の代表格である。C93-3の抗原であるhnRNPU、nucleolin、histone H1もまたDNAに結合するタンパク質である。これらのDNA結合タンパク質とDNAの複合体は、ネクローシスに伴って細胞外に放出されると推測する。C93-3は複合体中のDNAおよびhnRNP U、nucleolin、histone H1に結合することで複合体を包み込み、HMGB1の遊離を抑制して炎症反応を抑制する働きがあるのではないかと推測する。そこで、過酸化水素等でRAW 264.7にネクローシスを誘導し、培養上清へのHMGB1の遊離をC93-3が抑制するかどうか調査する。敗血症では、好中球のネトーシスによって放出されたneutrophil extracellular traps(NETs)に含まれる物質が、血栓形成の原因となることが知られている。C93-3がNETsの形成を抑制するかどうか調査する。同定したC93-3の抗原について、エンドトキシンショックモデルにおける血中濃度の変遷を調査する。症状の増悪に伴って濃度が上昇する抗原は、炎症に関与する抗原である可能性がある。学会発表や研究ミーティングのために旅費20万円を計上した。しかし、旅費を使用したのは学会発表の1回だけだったため、当該助成金が生じた。次年度は、本年度よりも積極的に学会や研究ミーティングに参加する予定である。当該助成金は次年度の旅費に充てる予定である。
IL-18の心不全発症保護作用の検討

我々は、IL-18ノックアウトマウスに横行大動脈縮窄(TAC)による圧負荷をかけたところ、心不全が野生型マウスに比較して重症であること、心筋の脂肪酸代謝の障害、ATP産生の低下を伴っていることを明らかにした。さらに、IL-18ノックアウトマウスでは、TACによるAMPKの活性化障害が生じていることも明らかにした。そこで、IL-18にAMPKの特異的活性剤を投与して、TACをかけたところ、マウスの心筋障害が抑制されることを明らかにした。以上より、圧負荷では心臓でIL-18が産生され、脂肪酸代謝を亢進させ、圧負荷に代償していることが明らかになった。野生型マウスおよびIL-18ノックアウトマウスに対して、大動脈縮窄術による急性圧負荷ストレス負荷を行った。急性圧負荷ストレスに対して、野生型マウスは耐性を示したが、IL-18ノックアウトマウスでは、不耐を示し、有意に高い死亡率を示した。また、心エコーで心機能を調べたところ、野生型マウスでは、左室内腔の拡大、心収縮能の低下は認められなかったが、一方IL-18ノックアウトマウスでは左室空の拡大、心収縮能の低下が認められた。圧負荷に対する細胞内情報伝達機構を調べたところ、野生型マウス、IL-18ノックアウトマウス間で、MAPKファミリー分子のリン酸化には有意な差は認められなかった。一方で野生型マウスに認められるAkt、AMPKのリン酸化が、IL-18ノックアウトマウスでは認められなかった。AMPKはエネルギーが枯渇した状態で、ATPを産生するシグナルを活性化させ、ATPを消費するシグナルを不活化する働きを持つ。そこで、心筋の主要なATP産生源である脂肪酸代謝について注目をした。そこで、長鎖脂肪酸のβ酸化の律速酵素であるCPT-1B (carnitine palmitoyltransferase 1B)のRT-PCRを施行した。野生型マウスでは、圧負荷ストレスでCPT-1Bは増加するが、IL-18ノックアウトマウスではその発現が減少することが分かった。CPT-1Bヘテロノックアウトマウスでは、IL-18ノックアウトマウス同様に、圧負荷ストレスに不耐用が報告されており、今後、IL-18ノックアウトマウスでの脂肪酸代謝能を調べる予定としている。我々は、IL-18ノックアウトマウスが横行大動脈を縮窄することによる圧負荷(TAC)に脆弱であることを発見した。野生型マウスはTAC後1週間では死亡しないが、ノックアウトマウスはTAC後約1週間で50%のマウスが心不全により死亡した。心不全死の原因として圧負荷によるエネルギー代謝の変化を検討した。TAC直後のエネルギー産生を調べた。TAC後1時間のATP産生は、野生型マウスに比べてノックアウトマウスでは有意に低下していた。IL-18ノックアウトマウスは脂肪酸代謝が低下していることが報告されているため、TAC直後の心筋の中性脂肪量を評価したところ、野生型マウスでは低下していたが、ノックアウトマウスでは上昇していた。ノックアウトマウスでの上昇の機序として、心筋での脂肪酸利用障害が原因と考え、中性脂肪をグリセリンと遊離脂肪酸に分解する酵素であるリポタンパクリパーゼ(LPL)の活性をTAC前後で評価した。野生型マウスではLPL活性はTAC後に上昇するが、ノックアウトマウスではLPL活性は低下した。PPARαはエネルギー欠乏時に脂肪酸由来のエネルギーを産生させる。PPARαの発現量を調べたところ、野生型マウスではTAC前後で変化は認められなかったが、ノックアウトマウスでは発現量の上昇が認められた。この反応は、遊離脂肪酸生成が抑制されていることに対する代償反応と考えている。IL-18ノックアウトマウスの圧負荷による脆弱性の原因はLPL活性化障害による遊離脂肪酸産生障害とATP産生障害であることを明らかにできた。上記を論文化している途中である。我々は、野生型マウス(C57BL/6)および、C57BL/6バックグラウンドのIL-18ノックアウトマウス(IL18-/-マウス)に対して、横行大動脈縮窄(TAC)による圧負荷ストレスを与え、2週間経過を観察した。術後2週間後に両群マウスの生存率、心エコーによる心機能を調べたところ、IL18-/-マウスでは、野生型マウスに比べ有意に生存率の低下、左室拡張末期径の拡大、左室内径短縮率の低下が認められた。IL18-/-マウスのTACによる生存率の低下は、心不全の程度がより重症であることが明らかとなった。IL-18-/-マウスの死亡はTAC後3日以内に生じる。IL-18はエネルギー代謝に関わることは報告されているため、TAC術1日後の血清乳酸レベル、心筋の活性酸素種の産生、心筋のATP産生量を調べた。IL18-/-マウスでは野生型マウスに比し、TACにより有意に血清乳酸レベル、活性酸素種産生が上昇した。また心筋のATP産生レベルは低下していた。心筋は主に脂肪酸をエネルギー源とする。そこで心筋内の中性脂肪レベルを測定したところ、IL18-/-マウスでは野生型マウスに比し有意に上昇していた。このことは、心筋での中性脂肪から遊離脂肪酸への分解が障害されるためと考えた。β酸化のキーレギュレーターであるAMPK活性のTACによる影響を検討したところ、野生型マウスではTACにより上昇するが、IL18-/-マウスではその上昇が全く認められなかった。

そこで、IL-18-/-マウスでは、TACによりAMPKが活性化されないことが、TACによる代償不全を引き起こすと考えた。そこでマウスにAMPK直接活性化剤であるAICARを投与し、TACを行ったところ、TACによる生存率、心機能の低下は抑制された。我々は、IL-18ノックアウトマウスに横行大動脈縮窄(TAC)による圧負荷をかけたところ、心不全が野生型マウスに比較して重症であること、心筋の脂肪酸代謝の障害、ATP産生の低下を伴っていることを明らかにした。さらに、IL-18ノックアウトマウスでは、TACによるAMPKの活性化障害が生じていることも明らかにした。そこで、IL-18にAMPKの特異的活性剤を投与して、TACをかけたところ、マウスの心筋障害が抑制されることを明らかにした。以上より、圧負荷では心臓でIL-18が産生され、脂肪酸代謝を亢進させ、圧負荷に代償していることが明らかになった。IL-18ノックアウトマウスにおいて脂肪酸代謝の律速酵素の発現が有意に低下する異常を見出した。急性圧負荷ストレス不耐容の原因である可能性が明らかにできた。すでに、種々の臓器や細胞で遊離脂肪酸が細胞毒性を持つことが報告されている。遊離脂肪酸の細胞毒性として認められる現象を、野生型マウスとIL-18マウス間で比較検討し、IL-18マウスで遊離脂肪酸によることに矛盾しない細胞毒性を調べる前段階まで到達しているから。IL-18のLPL活性化機構を明らかにすることが残された課題である。分子心臓病学CPT-1Bは細胞質に存在する遊離脂肪酸をミトコンドリア内に輸送する律速酵素である。そのため、IL-18ノックアウトマウスは圧負荷ストレス下で、遊離脂肪酸代謝が低下する可能性が考えられる。遊離脂肪酸は、両親媒性のため、大量に存在すると、洗剤作用(界面活性作用)により、細胞膜を溶解させ、細胞を破壊する。また、遊離脂肪酸によりinducible nitric oxide synthase(iNOS)の発現が誘導され,増加したnitricoxide(NO)によって細胞のアポトーシスが引き起こされることも知られる。脂肪酸代謝低下によるエネルギー供給障害と、遊離脂肪酸が細胞質に増えることによる直接の毒性の両面を野生型マウス、IL-18ノックアウトマウス間で比較することにより、急性ストレス耐容におけるIL-18の役割を明らかにする。分担研究者の岩破が、2014年9月から2015年3月まで兵庫医科大学篠山医療センター勤務となり、基礎研究に従事する十分な時間が取れなかったため。昨年度施行予定だった14Cでラベルされたパルミチン酸を用いた心筋の遊離脂肪酸のβ酸化についての研究を本年度にずらして行っており、平成26年度の余剰分は本年度14Cでラベルされたパルミチン酸購入に使う。
高齢者の身体的自立を促す指導プログラム開発-意識と行動のずれを修正する体の使い方

高齢者の身体的自立を促す指導プログラム開発のために、佐賀県内の60歳以上高齢者約500人を対象に股関節と膝関節の解剖学的な知識と、椅子に座位する際の体幹部と脚部の境界認識と、階段昇降時の身体の使い方についての意識について調査行った。その結果、股関節位置の正解率は2.3%、膝関節位置の正解率は13.8%、(p<0.01)だった。椅子に座位する際の脚部の位置認識について約65%が解剖学的に正しく認識していた。しかし、約65.0%が「脚は胴体部を挟むように位置する(という図を選択)と正しく認識していたにもかかわらず股関節について、身体図に書き入れるという方法から正しい知識を有していたと判断できたのは1.9%だった。逆に、股関節について正しい知識を有していた1.9%は椅子に座位する認識も正しかった。これより、多くの人が、椅子に座位する図を正しい知識に基づいて選択したのではないことがわかる。これらから、骨格構造に依拠した「からだの使い方」に関して、股関節や膝関節についての誤認・無知や、知識と自分の行為についての認識との間に齟齬があることが明らかになった。本調査では身体の使い方の意識や認識を明らかにするために提示した図を選択するという方法をとった。しかし必ずしもこの方法によって意識や認識の実態を正確に把握したとは言えない。しかし、知識について正確に実態を把握するためには、選択肢方式ではなく、図に直に書き入れる方法が妥当であると判断できた。この方法によって、高齢者特有の丸背(猫背)の誘因である肩関節や環椎後頭関節や環椎軸椎関節の位置に対する知識の実態も把握できる見通しが持てた。本研究期間中に高齢者向けに高齢者の身体の使い方に関する自主学習用テキストを作成することが最終目的であったが、さらに調査を経てから作成することとした。360名を対象に高齢者の身体的自立を促す指導プログラムを実施した。1回約2時間の学習主体のプログラムである。指導(学習)効果を見るために、指導前後における「体の使い方」についての「知識」「認識」「意識」の変化を調査した。その過程と実施指導から、高齢者の「体めの使い方」に関する知識・認識・意識については以下のような点について、誤認、無知が多くみられた。・脚と胴体の関係、すなわち股関節の位置や機能について。・膝の位置や、「膝を回すとは、股関節の回旋運動であること」について。・膝と内踝・外踝との関係、それらと股関節の関係について。・猫背(丸背)の起序、とくに「下を見る」際の首の使い方について。これらについての知識を正したり、認識を促したりしながら、「椅子に座る・椅子から立つ」や「歩行」のデモンストレーションや参加者数人をモデルに指導をおこなった。学習によって、知識や認識の改善が見られた。しかし、知識を身体化するには一定時間の練習を要する。受講者の追跡が来年度の課題である。これらの詳細については、現在データの分析中である。なお本研究の成果を、2006年8月開催の「アジア障害者体育・スポーツ学会」第9回大会(長崎)で発表する予定である。本年度の実践と、これまでの本研究課題に関連する研究成果を、日常生活での体の使い方に関しての啓蒙書として、および、体の使い方に関す技法論として著書にまとめた。
AIDS痴呆の病態生理と治療に関する基礎的研究

最近の研究ではAIDS痴呆がgp120によるNMDAレセプターの過剰興奮により生じることが推測されている。本研究では、Heat Shock Protein(HSP70)を指標とすることによりNMDA受容帯拮抗薬の神経細胞の障害を可視化することから研究を開始した。昨年我々はAIDS痴呆の治療薬として現在アメリカで臨床治験中であるmemantineが神経障害を起こすことを報告したが、本年はその神経障害を起こす成因の解明につとめた。その成果としては、1)NMDA受容体拮抗薬による神経障害においてムスカリニック受容体が関与しており特に3層と5層で異なること(Brain Research 1997)、2)その神経障書の発現においてホスホジエステラーゼ阻害薬が神経障害を防止できないこと(European Journal of Neuroscience 1997)を報告した。またAIDS痴呆のモデル動物としてgp120の脳室内慢性投与の試みを始めた。エイズ痴呆のモデル動物になりうるか組織学的検討を行い始めた。今後の方向としてはNMDAレセプター拮抗薬による神経細胞障害の機序を調べるとともに、そのAIDS痴呆への臨床的活用の可能性について来年も検討を行っていく予定であった。しかし研究代表者の富高がカリフォルニア大学のSharp教授とエイズ痴呆の共同研究のため留学が決まったため本年度で終了となった。しかし研究テーマとしては留学後も継続していくので、科学研究費の補助は終了するが今後も前述したような計画で研究をすすめていきたい。
複数のテンソルからの効率的なデータ構造推定

現代社会のデータに急増する以下2つの組み合わせに着目する。1)テンソル:例えば、購買データは従来の「ユーザx商品」から購買履歴データとして「ユーザx商品x時間」が得られる。2)複数データ:購買データのみならずSNS等からユーザ間のリンク(隣接行列:「ユーザxユーザ」)等が補助情報として得られ、モード(例えばユーザ)を共有する複数データ(行列)が得られる。従って、「モードを共有する複数テンソルの内在構造の効率的解析手法」構築を目指す。具体的に、複数テンソルを表現(近似)可能なノルムを設計し、ノルムの低ランクパラメータの効率的学習手法の構築及び学習誤差の解析から問題の包括・普遍的理解を行う。
河畔湿地地下水でみられる低硝酸性窒素濃度形成機構

諏訪湖流域の原村周辺は、国内有数の高原野菜の産地であり、また多施肥のため地下水中の硝酸態窒素濃度が高いことでも知られている。この原村付近を、八ケ岳中腹から南西に向かって多数の小河川が流れ、それらはすべて宮川に合流し諏訪湖に注いでいる。これらの小河川の両側数十数メートルの幅には、水田、休耕田、湿地が帯状に連なり、いわゆる河畔湿地帯を形成している。矢の口川は原村を横切って宮川に注ぐ小河川の一つであり、河川水の硝酸態窒素濃度は年間を通して10mgN/L程度である。本研究では、矢ノ口川沿いの休耕田を借り上げ、約6m×7mの区画内に15地点、各地点3本のパイプ(2m, 1.2m, 0.8m)を埋設し、そこの浅層地下水を調べた。調査時の地下水位は、地表面から70-100cm、水温は15-17°C、pHは6.9-7.6、浅層地下水の硝酸態窒素濃度は0.3-6.0mgN/L、溶存酸素濃度は0.12.1mgO_2/Lであった。河川水の硝酸態窒素の窒素安定同位体比(δ^<15>N値)は約+5‰であり、一方、地下水のδ^<15>N値はどの地点でも+8‰を上回り、最大+21.5‰に達した。さらに、調査地土壌を室内で嫌気培養しアセチレン阻害法により脱窒活性を調べた結果、地表面下1m前後の地下水帯水層でも脱窒活性が認められた。以上のことから、調査対象の休耕田地下水中での硝酸態窒素濃度の低下には、脱窒が寄与していることが示唆された。諏訪湖流域の原村周辺は、国内有数の高原野菜の産地であり、また多施肥のため地下水中の硝酸性窒素濃度が高いことでも知られている。この原村付近を、八ケ岳中腹から南西に向かって多数の小河川が流れ、それらはすべて宮川に合流し、宮川は北西方向に流れて諏訪湖に注いでいる。矢の口川は原村を横切って宮川に注ぐ小河川の一つであり、河川水の硝酸性窒素濃度は年間を通して10-15mgN/Lと高い。矢の口川にも河畔湿地は存在するが、周辺の農耕地からの排水は、排水路を経由して直接矢の口川に流入しているのが現状である。観測時の矢の口川の硝酸性窒素濃度が7-11mgN/Lであったのに対し、河畔湿地の地下水は多くの場合1-2mgN/L以下であった。この河畔湿地では、地下水位が2070cmと高く、しかも地下水の溶存酸素濃度は0.5mgO_2/L以下でかなり嫌気的な状態であった。この河畔湿地では、低酸素、湿地植生からの有機物供給、周辺には硝酸性窒素濃度の高い水の存在が認められ、脱窒に好適な条件が整っている。一見すると、この河畔湿地でも微生物の脱窒作用により地下水中から硝酸性窒素が除去されているようにも見える。しかし、この河畔帯は礫が多く、観測井の設置は容易ではない。現在までのところ、辛うじて4本の塩ビパイプを埋め込んだのみであり、湿地周辺の地下水の流れの把握には遠く及ばない。また、脱窒の直接的証拠もまだ捉えられていない。矢の口川の河畔湿地でみられる硝酸性窒素濃度の低下のメカニズムをを明らかにしていくためには、地下水の3次元的把握とともに、現場での脱窒測定が必要であろう。
培養哺乳類細胞によるエストロジェンの発癌機構の解析

エストロジェンの17β-エストラジオール(E_2)には発癌性があるが、培養シリアン・ハムスター胎児(SHE)細胞を用いた研究から、E_2は遺伝子突然変異や染色体の構造異常を起こすことなく細胞の形質転換を誘導し、その原因として染色体の数的異常の関与が考えられている。(Carcinogenesis,8:1715,1987)。本研究ではE_2の代謝産物と発癌との関連を研究するため、各種エストロジェン〔エストロン(E_1)、2-OHエストロン(2-OHE_1)、17β-エストラジオール(E_2)、2-OHエストラジオール(2-OHE_2)、4-OHエストラジオール(4-OHE_2)、エストリオール(E_3)、2-OHエストリオール(2-OHE_3)〕をSHE細胞に作用し、それらの形質転換誘導能と染色体異常誘導能を調べた。その結果(1) SHE細胞に対する増殖抑制効果は、E_1よりも2-OHE_1、E_2よりも2-OHE_2や4-OHE_2に強くあらわれた。ただし、E_3と2-OHE_3は同等であった。(2) E_2、2-OHE_2、4-OHE_2によりSHE細胞の形質転換が誘導された。これらの形質転換率を比較すると4-OHE_2>2-OHE_2〓1=1〓E_2であった。(3) E_1、E_2、E_3によって染色体の構造異常は誘導されなかったが、水酸化ささなかった2-OHE_1、2-OHE_2、4-OHE_2および2-OHE_3では高濃度領域で異常が誘導された。(4) E_2、2-OHE_2、4-OHE_2により染色体の数的異常が誘導された。2-OHE_3においても染色体の数的異常が誘導されたが、2-OHE_2、4-OHE_2にくらべ誘導率が低かった。これらの結果は、E_2の発癌機構にはE_2による染色体の数的異常のほかに、その代謝産物である2-OHE_2や4-OHE_2による遺伝子障害が関与していることを示唆している。ジエチルスチルベストロール(DES)はヒトや実験動物に癌を起こすが、他の多くの癌原性物質と違って、バクテリアや哺乳類細胞を用いた数々の突然変異実験系では突然変異性が検出されない。我々はこれまでDESを培養シリアン・ハムスター胎児(SHE)細胞に作用させるとDNA傷害や遺伝子突然変異、染色体異常は起きないが、染色体の数的異常(Aneuploidy)が起こり、細胞が形質転換すること、また、DESにはコルセミドやビンクリスチンのようなmitotic inhibitor(細胞分裂期阻害剤)様作用があること、SHE細胞にはエストロジェン・リセプターがないこと、さらにエストロジェン作用の強弱と形質転換率がcorrelateしないこと、などから、DESによる発癌は、エストロジェニックなホルモン作用で起こるのではなく、染色体レベルの遺伝的変異で起こると報告してきた。一方、DESをラット肝ミクロゾーム分画存在下でSHE細胞に作用させると、DNA傷害が誘導される。

そこで今年は、肝ミクロゾーム分画存在下でDESがSHE細胞に突然変異や形質転換を誘導するかどうかを調べてみた。その結果、DESの突然変異性は肝ミクロゾーム存在下でのみ現われ、形質転換誘導能は肝ミクロゾーム存在下で増強された。これらの結果からDESの細胞形質転換誘導の機構には2つあることがわかった。1つはDNA傷害が関与しない系と、もう1つはDESの代謝産物によるDNA傷害の関与する系である。本研究費で講入した顕微鏡で細胞や染色体の観察を行った。卵胞ホルモンである17B-エストラジオール(E2)の発癌性とそのメカニズムを培養シリアン・ハムスター胎児(SHE)細胞を用いて研究し以下結果を得た.1.E_2の110μg/mlの48時間処理でSHE細胞に発癌性のマーカーになる形態質転換が誘導された.2.しかし, E2によってSHE細胞に遺伝子突然変異,染色体異常,姉妹染色分体交換やDNA傷害(不安期DNA合成より検出)は誘導されなかった.3.これとは対照的に細胞に形態形質転換を誘導する同一処理条件で染色体の数的異常が誘導された.すなわちE2によって染色体の不分離が起こることがわかった.4.これらの結果はこれまで我々が合成女性ホルモンであるジエチルスチルベストロールの発癌機構について報告してきた結果と類似していることを考え合せると,染色体の数的異常の誘導が細胞の形質転換に重要な役割を担っていること,またエストロジェンの発癌機構に染色体の数的異常が関与していることを示唆している.エストロジェンの17β-エストラジオール(E_2)には発癌性があるが、培養シリアン・ハムスター胎児(SHE)細胞を用いた研究から、E_2は遺伝子突然変異や染色体の構造異常を起こすことなく細胞の形質転換を誘導し、その原因として染色体の数的異常の関与が考えられている。(Carcinogeneses,8:1715,1987)。本研究ではE_2の代謝産物と発癌との関連を研究するため、各種エストロジェン〔エストロン(E_1)、2-OHエストロン(2-OHE_1)、17β-エストラジオール(E_2)、2-OHエストラジオール(2-OHE_2)、4-OHエストラジオール(4-OHE_2)、エストリオール(E_3)、2-OHEエストリオール(2-OHE_3)〕をSHE細胞に作用し、それらの形質転換誘導能と染色体異常誘導能を調べた。その結果(1)SHE細胞に対する増殖抑制効果は、E_1よりも2-OHE_1、E_2よりも2-OHE_2や4-OHE_2に強くあらわれた。ただし、E_3と2-OHE_3は同等であった。(2)E_2、2-OHE_2、4-OHE_2によりSHE細胞の形質転換が誘導された。これらの形質転換率を比較すると4-OHE_2>2-OHE_2であった。(3)E_1、E_2、E_3によって染色体の構造異常は誘導されなかったが、水酸化された2-OHE_1、2-OHE_2、4-OHE_2および2-OHE_3では高濃度領域で異常が誘導された。(4)E_2、2-OHE_2、4-OHE_2により染色体の数的異常が誘導された。2-OHE_3においても染色体の数的異常が誘導されたが、E_2、2-OHE_2、4-OHE_2に比べ誘導率が低かった。これらの結果は、E_2の発癌機構にはE_2による染色体の数的異常のほかに、その代謝産物である2-OHE_2や4-OHE_2による遺伝子傷害が関与していることを示唆している。
複雑条件下における不整地盤上作業機械・人間系の転倒安全快適確保システムの構築

不整地盤上作業機械とその運転者である人間よりなる系において、複雑条件下の機械転倒安全性を快適に確保するシステムの構築を目的に、運転室シミュレータと小型クローラクレーンおよびその支持地盤モデルよりなるリアルシミュレータに加え、クレーン-支持地盤系のバーチャルシミュレータを開発した。これらシミュレータより機械の転倒限界状態近傍における運転者の運転・生体特性と機械およびその支持地盤挙動との相関関係を総合考察し、転倒安全快適確保のための基本原理を示した。運転支援システムの試作および有用性確認も実施した。本研究の目的は,構築しつつある「不整地盤上作業機械の転倒に対する安全確保システム」の基盤をもとに,人間と機械の動的相互作用を踏まえた複雑な条件下においても転倒事故を限りなく少なくし,万一発生してもその被害を最小限に留めることができる次世代の転倒安全快適確保システムを構築することである.本年度は,転倒時の周辺環境への被害が大きく,つり荷の三次元的振れを伴う挙動が複雑で,安全システムの構築が容易でないクローラクレーンを対象に以下を実施した.1.複合操作対応型リアルシミュレータの設計開発機械操作の複雑性に関する解析を実現するため,油圧駆動源高出力化,制御システムおよび作業機械モデルの高度化により,複合操作に対応できるリアルシミュレータシステムを設計開発した.2.実機運転室シミュレータの設計開発および改良操縦システム,挙動摸擬システム,画像システムおよび音響システムより構成される実機運転室シミュレータを設計開発および改良した.運転者の操作指令に応じて作動する作業機械モデルで計測する挙動情報を実機相当値に補正し,それに基づく指令信号で制御される六自由度モーション装置の挙動およびエンジン等による摸擬振動,さらに作業機械モデルで撮影される実画像をスクリーンより視覚情報として得るとともにアクセル操作量に応じて擬似再現されるエンジン音等の音響情報を運転室内で被験者が受けることを可能とした.3.リアルシミュレータによるジブ起伏作業時の転倒時動特性解析リアルシミュレータを用いて,堅固なコンクリート上におけるクレーラクレーンの転倒安定性を転倒前後特性が明瞭に現れるジブ起伏作業に注目して実験解析し,転倒前後におけるクレーン各部の特性と転倒安定度の関係を定量的に明らかにした.さらに,快適な転倒安全確保システムを構築するために,運転室に搭乗する被験者たる運転者のレバー操作特性のほか,生理反応特性として心拍変動を計測して解析評価する方法を考察した.本研究の目的は、構築しつつある「不整地盤上作業機械の転倒に対する安全確保システム」の基盤をもとに、人間と機械の動的相互作用を踏まえた複雑な条件下においても転倒事故を限りなく少なくし、万一発生してもその被害を最小限に留めることができる次世代の転倒安全快適確保システムを構築することである。本年度は平成21年度と同様に、転倒時の周辺環境への被害規模が大きく、つり荷の三次元的振れを伴う挙動が複雑で、安全システムの構築が容易ではないクローラクレーンを対象に、実機運転室シミュレータと作業機械シミュレータより構成されるリアルシミュレータの高度化に注力し、以下を実施した。1.実機運転室シミュレータの高度化操縦システム、挙動摸擬システム、画像システムおよび音響システムより構成される実機運転室シミュレータを高度化した。運転者の操作指令に応じて作動する作業機械モデルで計測する挙動情報を実機相当値に補正し、それに基づく指令信号で制御される6自由度モーション装置の挙動およびエンジン等による摸擬振動、さらに作業機械モデルで撮影される実画像をスクリーンより視覚情報として得るとともに各レバー操作量に応じて擬似再現されるエンジン音等の音響情報を運転室内で被験者が受けることを可能とした。さらに、運転室に搭乗する被験者たる運転者の操縦特性および心拍数の変化特性に加え、注視点特性および筋肉活動の変化特性をも解析可能とした。2.作業機械シミュレータの高度化機械操作の複雑性に関する解析のため、複合操作に対応する作業機械シミュレータの制御システムへ自動操縦プログラムを組み込むなど、システムを高度化した。さらに実機の荷重支持特性の再現性向上のため、新型走行体系の設計開発も行った。3.リアルシミュレータによる複合作業時の転倒時動特性解析上述のように高度化したリアルシミュレータを用い、つり荷巻上げとジブ起伏の複合操作時において、クローラクレーンが転倒限界状態を超過する前後に注目し、運転者の能動特性として、「操縦および注視点特性」、その受動あるいは反応特性として、「心拍数、呼吸および咬筋活動の変化特性」および「つり荷挙動を含む機械動特性」の相関関係について作業パターンを定め解析考察した。本研究の目的は、不整地盤上作業機械を対象に、人間と機械の動的相互作用を踏まえた複雑な条件下においても転倒事故を限りなく少なくし、万一発生してもその被害を最小限に留めることができる転倒安全快適確保システムを構築することである。本年度は平成22年度と同様に、転倒時の周辺環境への被害規模が大きく安全システムの構築も容易ではないクローラクレーンを対象に以下を実施した。

1.リアルシミュレータの安全確保システムの高度化つり荷巻上げ、ジブ起伏および旋回を組み合わせた複合操作に対応する実機運転室シミュレータおよび作業機械モデルよりなるリアルシミュレータシステムについて改めてリスクアセスメントを実施し、被験者および作業者に対する安全性向上のための安全防護柵を改良した。安全防護柵の扉の開閉を検知し、作業者が安全防護柵内に侵入した際にリアルシミュレータの動作を停止するインターロックシステムも構築し導入した。2.鋼板補強軟弱地盤モデルの構築実際の作業地盤環境に多い火山灰質粘性土を充填した土槽およびその上に敷設された鋼板からなる軟弱地盤モデルを新たに構築した。実用上重要である鋼板補強した軟弱地盤上におけるクレーン動特性解析が可能となった。地盤内に埋設された土圧センサにより作業時における地盤内応力分布の解析も可能とした。3.旋回複合操作時の転倒限界状態近傍の動特性解析高度化あるいは新規構築したモデル等よりなるリアルシミュレータを用い、つり荷巻上げ、ジブ起伏および旋回の基本三操作の内、旋回を含む二操作を組み合わせた複合操作時に、クレーン転倒限界状態を超過する前後において、パニック時にも注目し、運転者の能動特性として「操縦および注視点特性」、その受動あるいは反応特性として「心拍数、呼吸、脳波および咬筋活動の変化特性」と「つり荷挙動を含む機械動特性」の相関関係について代表的作業パターンに対し解析し考察した。本研究の目的は、複雑条件下においても転倒事故を限りなく少なくし、万一発生してもその被害を最小限に留めることができる快適な安全確保システムを構築することである。これをこれまでの研究により構築しつつある「不整地盤上作業機械のための転倒安全確保システム」を基盤に発展、高度化させ達成しようとするものである。本年度は、これまで構築してきたリアルシミュレータにバーチャルシミュレータを統合し構成するハイブリッド安全シミュレータシステムの解析結果を総合的に考察し、機械の運転者に違和感を与えずその危険行動を誘発することなく機能する「快適に転倒安全を確保できる」システムの基本原理を示してそれを実現するシステムを検討し成果を公表した。地盤の複雑性として「鋼鈑補強した軟弱地盤」を、機械操作の複雑性として「障害物回避を含む複合操作」をそれぞれ選び、鋼鈑補強地盤上に設置した小型クローラクレーンを運転初心者が操作する実験解析を実施した。複合操作条件は「つり荷巻上げと上部旋回」、「つり荷巻上げとジブ起伏」及び「上部旋回とジブ起伏」とした。機械が転倒限界状態を超過する前後における「運転者の操縦特性、行動特性及び注視点特性」、「運転者の心拍数、呼吸等の生体特性」及び「機械動特性」の相関関係についてパニック時に注目し解析考察した。バーチャルシミュレータによる解析考察結果とも総合し、快適に転倒安全を確保するには、機械の転倒安定状態を作業中リアルタイムに高精度に把握し機械側での転倒回避制御に用いること、運転者へ機械の転倒安定状態を直感的にわかりやすく提示することが重要であることを示した。
新たな末梢血幹細胞動員法の開発に関する研究

既報に従って、末梢血単核球から破骨細胞を誘導し(Blood 2004 104 : 2484-)、RANKLとM-CSFを添加して培養した.この破骨細胞に、G-CSF(10、100ng/ml)、RANKL(50ng/ml)、G-CSF(10、100ng/ml)+RANKL(50ng/ml)を添加培養し、培養上清を採取した(1、3、5日)。培養上清を用いて各種サイトカインを測定した。測定したサイトカインは、IL-8、MMP-9、cathepsinKである。その結果、破骨細胞はin vitroでIL-8、MMP-9を産生していることが証明出来たが、G-CSFやRANKLの添加による産生の変化(増加)は証明できなかった。cathepsin Kの産生は証明できなかった。末梢血幹細胞動員における破骨細胞の関与が、IL-8やMMP-9、cathepsin Kを介したものである可能性が示唆されているが、G-CSFの破骨細胞に対する直接作用ではなく、その他の細胞など介した作用であると考えられた。また、RANKLによる末梢血幹細胞動員促進の可能性を示すことができなかった。D26、CXCR1、CXCR2、CXCR4は、CD34陽性細胞分離直後には発現が無かったが、無血清培地のみで発現の増強がみられた。しかし、G-CSFやIL-8の添加による発現の変化は認めず、末梢血幹細胞動員促進の可能性を示すことができなかった。破骨細胞が、IL-8をはじめとする、造血幹細胞動員に関連していると考えられている種々のケモカインを産生していることを証明するために、まず破骨細胞の培養を試みてい破骨細胞を末梢血単核球から、the receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL)やM-CSFを用いて誘導している。この培養された破骨細胞に、G-CSFやRANKLを加えて、IL-8やMMP-9の産生があるかどうかを検討中である。既報に従って、末梢血単核球から破骨細胞を誘導し(Blood 2004 104:2484-)、RANKLとM-CSFを加えて培養した。この培養破骨細胞に、G-CSF、RANKL、G-CSF+RANKLを添加し、培養上清を採取した(1、3、5日)。破骨細胞はin vitroでIL-8、MMP-9を産生していることが証明出来たが、G-CSFやRANKLによる産生の変化(増加)は証明できなかった。G-CSFで動員・採取した末梢血幹細胞からCD34陽性細胞分画を分離した。CD34陽性細胞に発見しているCD26、CXCR1、CXCR2、CXCR4をフローサイトメーターで測定した。CD34陽性細胞無血清培地で培養し、培養細胞にG-CSF、IL-8、C-CSF+IL-8を添加した。培養細胞に発見しているCD26、CXCR1、CXCR2、CXCR4をフローサイトメーターで測定した。CD26、CXCR1、CXCR2、CXCR4は、CD34陽性細胞分離直後には発見が無かったが、無血清培地のみで発見の増強がみられた。
多系統萎縮症の進展様式の解明

多系統萎縮症患者(MSA)は健常群と比較しAddenbrooke's Cognitive Examination Revised(ACE-R)が有意に低下しているにも関わらず、脳の萎縮部位は小脳主体であり、大脳皮質は保たれていた。しかしながら、MSA群の中でもACE-R低下群では、健常群やACE-R正常群と比較し、tract-based spatial statisticsで検討すると広範な解剖学的神経回路障害を前方優位、上縦束優位に認めた。以上からMSAでは大脳皮質より早期に白質の解剖学的神経回路の変化が出現し、認知機能低下にはこれら解剖学的神経回路の障害が関連している可能性が示唆された。平成25年度は本研究へ参加できる症例の登録を主に行った。名古屋大学医学部附属病院神経内科に通院している、Gilmannの診断基準でprobable以上であり、頭部MRIの撮影が可能である多系統萎縮症(MSA)患者10名に、文章によるインフォームドコンセントを得ることができ、本研究へ参加していただいた。また、コントロールとなる7名にも、文章によるインフォームドコンセントを得ることができ、本研究へ参加していただいた。登録時のMD、FA、VBMはそれぞれコントロール群と比べて小脳、脳幹など、従来から変性が強く認められることが分かっている領域に明確な異常を示しており、得られた頭部MRI情報が正確にMSAの病変を示していることが判明した。名古屋大学医学部附属病院神経内科に通院している、Gilmannの診断基準でprobable以上であり、頭部MRIの撮影が可能である多系統萎縮症患者18名に、本研究の趣旨・方法などを説明し、文章によるインフォームドコンセントを得ることができた。登録できた18名のMSA患者を、臨床評価項目として神経学的診察所見(小脳失調、パーキンソニズム、自律神経障害、錐体路徴候の有無など)、臨床評価スケールとしてunited multiplesystem atrophy rating scale(UMSARS)を評価した。同時に、3.0T MR装置を用い、最適化された条件で頭部MRIを撮像した。頭部MRIの指標として、voxel-based morphometry(VBM)、tract-based spatialstatistics(TBSS)と安静時脳機能MRIを施行し、皮質や白質の異常を検討した。その結果、VBMでは小脳の萎縮を認めたが大脳の萎縮は認めなかった。また安静時脳機能MRIでは小脳の一部を除き皮質の機能的回路は保たれていた。ただ被殻に関心領域を設定すると、淡蒼球、小脳、および前頭葉の一部との皮質下の機能的回路の障害を認めた。一方TBSSでは小脳から脳幹、前頭葉を中心とした皮質下の解剖学的回路の広範な障害を認めた。以上の結果からMSAでは、皮質下の解剖学的回路の異常が先行して出現し、進行に伴って皮質・灰白質病変が出現してくる可能性がある。名古屋大学医学部附属病院神経内科に通院している、Gilmannの診断基準でprobable以上であり、頭部MRIの撮影が可能である多系統萎縮症患者29名に、本研究の趣旨・方法などを説明し、文章によるインフォームドコンセントを得ることができた。VBMにおいてACE-R低下群では小脳萎縮は認めるものの大脳萎縮は認めなかった。一方で、安静時脳機能MRIでは背側DefaultMode networkとSaliencenetworkで軽微な異常を認めたものの全般的には良く保たれていた。しかしながら、TBSSではACE-R低下群で健常群と比較し小脳脚や橋横線維に加えて、前頭葉中心とした広範な異常を認めた。またACE-R低下群とACE-R正常群と比較したところ、左上縦束を中心とした白質線維の広範な異常を認めた。MSA患者は健常群と比較しACE-Rが有意に低下しているにも関わらず、萎縮部位は小脳主体であり、大脳皮質は保たれていた。機能的脳内神経回路もほぼ保たれていた。ACE-R低下群では、健常群やACE-R正常群と比較し広範な解剖学的神経回路障害を前方優位、上縦束優位に認めた。18名の多系統萎縮症患者を登録し、全例予定通り臨床情報と頭部MRIの指標としてVBM、TBSSと安静時脳機能MRIを施行することができた。これまでの解析でVBMやTBSSを用いることにより、MSAにおいて、まず皮質下の解剖学的回路の異常が先行して出現し、進行に伴って皮質・灰白質病変が出現してくる可能性があることが解明できた。神経内科学27年度はさらに症例数を増やして臨床情報、頭部MRIを得る予定である。VBMやTBSS、安静時脳機能MRIなどと臨床情報を組み合わせて解析し、バイオマーカーとして使用するために最適な指標、解剖学的位置を検討する。これらの検討結果が得られた時点で論文化し、研究結果を公表する予定である。現在のところ、特に研究遂行にあたり問題点は生じておらず、対象患者からも好意的な意見を得ている。平成25年度は本研究へ参加できる症例の登録を主に行ったが、予定より登録症例が少なくなっている。。Gilmannの診断基準でprobable以上の多系統萎縮症(MSA)患者を20名程度登録する予定であったが、本年度は10名の登録しか行えなかった。また、コントロールも7名の登録にとどまり、MSA群およびコントロール群のさらなる症例の登録が望ましい。

発注した論文作成用のソフトウェアの納品が平成27年度になる。平成25年度は本研究への症例登録が、予定より少なかったため、平成26年度以降も新規に登録を行っていく。また、コンロトールの登録も積極的に行う。さらに、平成26年度は平成25年度に登録した症例のうち、再検が可能な症例に対して、本年度と同様の評価を行い、同一症例での経時的な変化を検討する。本年度より翌年度にかけて予定している論文関連への支払いに充当する。
臨床実践看護師の教育力向上を目指した教育プログラム開発のための基礎的研究

臨床現場で教育的役割を担う看護師に必要な能力として、看護実践力のみならず、教育する上での能力として教育力の重要性を考え、教育的役割を担う看護師の考える教育力の特徴や、その基盤となる教育に対する目標や信念、ロールモデルについて明らかにすることを目的とし、検証した。その結果、対象者は患者へのアウトカムを視野に入れ、指導や教育を行うとともに、教育や看護について一緒に考えることを教育力としていたことが示唆された。本研究は、臨床現場で教育的役割を担う看護師に必要な能力として、看護実践力のみならず、教育する上での能力として教育力の重要性を考え、教育的役割を担う看護師の考える教育力の特徴や、その基盤となる属性、教育に対する目標や信念、ロールモデルとの関係について明らかにすることを目的とし、検証した。研究者が以前に行った先行研究では看護師25名分の面接調査結果を得たが、本年度は新たに臨床経験5年以上で、臨床現場で教育的役割を担っており、本研究の趣旨、研究方法、倫理的配慮について理解し、同意が得られた看護師3名に面接調査をした。基本属性(年齢、性別、最終学歴、臨床現場で教育に携わった経験など)に関する質問紙調査と、インタビューガイドに基づいた60分程度の半構成面接調査により、教育力があると考えられる人の特徴、教育する上での目標や信念、ロールモデルについて調査をし、対象者の同意を得てICレコーダーに録音した。録音した面接データから逐語録を作成し、テキストマイニングにより分析した。分析にはTextMiningStudio4.1を使用した。言葉ネットワーク分析により、教育的な役割を担う臨床実践看護師が教育する上での目標や信念には、後輩と頭を一致させる、患者さんにとって良い看護が出来ているかを考えるという特徴が、ロールモデルには、判断力がある人や真似したいと思える言葉かけや態度を示してくれる人という特徴があった。また、教育力に関しては、患者さんにとって良い看護か考えられる、後輩が自ら気付ける働きかけができるなどの特徴があった。その他にも対応バブル分析や頻度解析を用いて特徴や関連を分析している。24年度が最終年度であるため、記入しない。
粘膜関連悪性リンパ腫の分子生物学的解析:免疫グロブリン遺伝子のクロナリティー並びにsomatic mutationの解析

粘膜関連リンパ装置を起源とする節外性のリンパ増殖性疾患には病理組織学的検索のみでは腫瘍性増殖を明確に判断し難い症例が頻繁に経験される。反応性病変と腫瘍性病変の判別には遺伝子再構成の検出による増殖細胞のクロナリティの証明が有効であり、免疫グロブリン遺伝子、T細胞抗原受容体遺伝子の再構成をサザンブロット法により検索する方法が用いられてきた。我々は、遺伝子再構成の検索を通じ偽リンパ腫と呼ばれてきた病変の多くは、B細胞のクローナルな増生を有する腫瘍性の病変であること、さらに、眼科領域の病変においては特定のD領域が使用されている頻度が高いことを示してきた。特定のD遺伝子が使用されている事実は腫瘍化するクローンが限定されている可能性を示唆するもので、一定の抗原刺激に反応する特定のB細胞が腫瘍化へのプロセスに導かれている可能性を示しており、その解明により腫瘍発生を抑制あるいは予防する方策を得うることが期待された。また、VDJ結合部の一致から腫瘍細胞を特定し、その分布、広がりを確定するとともに、多発病変におけるクローンの異同についても明確な判定が可能であった。また、可変領域におけるsomatic mutationの解析から多発病変を形成するクローン同士の親子関係が把握され、腫瘍の移動、転移の経路がクローンレベルで判定可能であることが示された。眼科領域に発生したリンパ増殖性病変につき病理組織学的検索とサザンブロットによる免疫グロブリン遺伝子再構成の検索を行った。病理組織学的に腫瘍性増殖を明確に判定困難な症例が多く存在した。これらのうち、一部の症例においては最近提唱されている粘膜関連リンパ組織(MALT)由来の低悪性度リンパ腫(MALT-lymphoma)を疑うものも含まれていた。サザンブロットの結果、これらの多くの症例の免疫グロブリン遺伝子に再構成が認められ、B細胞のクローナルな増生が含まれていることが確認された。しかし、なかには再構成が確認できず、偽リンパ腫と言わざるを得ない症例も含まれていた。このように結膜領域におけるMALT、すなわちCALTリンパ腫と呼ぶにふさわしい症例とともに、MALTの組織学的診断基準を満たさない症例の存在があらためて確認された。これらを、CALTの一亜型とするべきか、あるいは新たな別の疾患概念が必要か今後の検討が必要と考えられた。また、乳腺領域に発生した大型のリンパ増殖性症例を経験し、遺伝子再構成の検索を行ったところ、オリゴクローナルなB細胞の増生が含まれていることが示された。免疫グロブリン遺伝子の可変領域をPCRで増幅後、塩基配列を検討した。得られた配列の中には自己抗体とのホモロジーの非常に高いものが含まれており、胃におけるMALTリンパ腫と同様に自己免疫的な背景や、持続する抗原刺激の結果、特定のクローンが選択的に増殖することによって腫瘍化へ導かれることを示唆する結果であった。今後、さらに詳細な検討を加えることによって本態の解明に努める。MALTリンパ腫を疑う症例の多くには免疫グロブリン遺伝子再構成が認められ、B細胞のクローナルな増生が含まれていることが確認された。眼科領域に発生した低悪性度リンパ腫においては、8年の経過を経て再発してきた症例を経験し、過去の試料と同一パターンの免疫グロブリン遺伝子再構成を認めた。このように腫瘍性の根拠を示すことのできる症例ばかりでなく、病理組織学的に腫瘍性増殖を明確に判定困難な症例が多く存在し、依然としてモノクロナリティが確認できず偽リンパ腫と言わざるを得ない症例も含まれていた。再構成を起こした免疫グロブリン遺伝子においては、somatic mutationの存在が確認され、胃のMALTリンパ腫と同様に胚中心以降の分化段階より発生した腫瘍であることが示された。また、乳腺領域に発生したリンパ増殖性疾患症例を経験し、遺伝子再構成の検索の結果オリゴクローナルなB細胞の増生が含まれていることが示された。このオリゴクロナリティは、病巣の複数の異なる部位において同様のパターンを示し、特定のクローンが広範に拡がっていることを示していた。さらに、全く同様の組織像を呈する病巣を眼科領域に形成し、しかも、同じパターンのオリゴクロナリティを示していた。

このように、特定の組織を越えた広がりを示すにもかかわらず、当初のオリゴクロナリティが保持されている症例の存在は悪性度の判定、ホーミング機構の解析など今後に多くの課題が残されていることを示していた。今後、さらなる検討を加え本態の解明に努める。粘膜関連リンパ装置を起源とする節外性のリンパ増殖性疾患には病理組織学的検索のみでは腫瘍性増殖を明確に判断し難い症例が頻繁に経験される。反応性病変と腫瘍性病変の判別には遺伝子再構成の検出による増殖細胞のクロナリティの証明が有効であり、免疫グロブリン遺伝子、T細胞抗原受容体遺伝子の再構成をサザンブロット法により検索する方法が用いられてきた。我々は、遺伝子再構成の検索を通じ偽リンパ腫と呼ばれてきた病変の多くは、B細胞のクローナルな増生を有する腫瘍性の病変であること、さらに、眼科領域の病変においては特定のD領域が使用されている頻度が高いことを示してきた。特定のD遺伝子が使用されている事実は腫瘍化するクローンが限定されている可能性を示唆するもので、一定の抗原刺激に反応する特定のB細胞が腫瘍化へのプロセスに導かれている可能性を示しており、その解明により腫瘍発生を抑制あるいは予防する方策を得うることが期待された。また、VDJ結合部の一致から腫瘍細胞を特定し、その分布、広がりを確定するとともに、多発病変におけるクローンの異同についても明確な判定が可能であった。また、可変領域におけるsomatic mutationの解析から多発病変を形成するクローン同士の親子関係が把握され、腫瘍の移動、転移の経路がクローンレベルで判定可能であることが示された。