hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己免疫疾患のB細胞異常活性化とT細胞による調節機能不全の分子生物学的解析-特にCD40リガンドの役割について

自己免疫疾患の病態形成においては、B細胞の異常活性化に基づく自己抗体の産生が深く関与することが考えられる。2年間に亘る本研究の結果、ヒトB細胞の活性化及び細胞周期回転の調節機序については以下の知見が得られた。1.Th1型細胞の分化を誘導するIL-12はCD40リガンドの発現を増強させることから、B細胞の活性化と抑制について重要な役割を演じていることが示された。2.CD40リガンドによるCD40の架橋により活性化B細胞に抑制化のシグナルを入れることができる点が確認された。但し、この際にはT細胞の存在を必要とすることから、CD40-CD40リガンドを介したシグナル以外に別の分子を介したシグナルが必要であることが示唆された。この点については、今後さらに明らかにしてゆく必要がある。3.免疫調節薬である注射金製剤と傾向金製剤が相乗的にB細胞の活性化を抑制すること、また、NSAIDと位置づけられるインドメタシンファルネシルのファルネシル基がB細胞の活性化を抑制することなどが明らかになった。特に、後者はテルペン基と細胞活性化シグナルといった重要な問題に直結するものであり、今後の検討の継続が大切である。4.ループス腎炎の治療薬であるミゾリピンがB細胞のサイクリンAmRNAのstabilityを抑制する点を明らかにした。この点については、サイクリンAmRNAのtranscriptionレベルでの検討を加える必要があり、今後の問題である。今回の研究で明らかになった、T細胞上に存在するB細胞の増殖分化を、CD40リガンド分子と共同で抑制する分子について、今後その同定を行ってゆく必要がある。本年度は、SLEに代表される自己免疫疾患におけるB細胞の異常活性化メカニズムを解析するために、B細胞のFas抗原の発現動態とその役割、及びT細胞のCD40リガンドの発現の調節機序とそれがB細胞の活性化に及ぼす影響について検討を行った。固相化抗CD3抗体刺激下にマイトマイシンC処理T細胞とB細胞を混合培養してB細胞を活性化した際に、B細胞表面上のFas抗原の発現は増強した。さらに、抗Fas抗体を添加した際に、このB細胞によるIg産生は著明に抑制された。従って、T細胞依存性に異常に活性化されたB細胞はFas依存性のアポトーシスにより鎮静化されうることか明らかになった。しかし、抗CD3抗体刺激により誘導されたサプレッサーT細胞の表面にはFasリガンドは殆ど発現されておらず、また抗Fasリガンド抗体を添加しても、これらのサプレッサーT細胞のB細胞への抑制作用は変化しなかった。従って、生体内ではサプレッサーT細胞はFas-Fasリガンドとは別の抑制システムを有していることが考えられた。一方、抗CD40リガンド抗体を添加することにより、サプレッサーT細胞のB細胞抑制活性は有意に低下したことから、CD40-CD40リガンドを介したシグナル伝達がB細胞の抑制作用に関与していることが明らかとなった。次に、固相化抗CD3抗体でT細胞を刺激した際、IL-12を添加するとT細胞によるIFN-γ産生が増加するとともに、その表面のCD40リガンドの発現も有意に上昇した。逆に、IL-4あるいはIL-10は、抗CD3抗体で活性化されたT細胞のIFN-γ産生を低下させるとともに、そのCD40リガンドの発現も有意に抑制した。従って、このようなTh1細胞とTh2細胞への分化とCD40リガンドの発現は並行しており、これがB細胞の抗体産生の調節において重要な役割を果たしていることが示唆されるに至った。これまでの検討において、抗CD3抗体刺激CD4+T細胞は活性化B細胞による免疫グロブリン産生を抑制することを示してきた。

このシステムに抗CD40リガンド(CD154)抗体を添加すると逆に免疫グロブリン産生を増強することから、このT細胞によるB細胞の抑制においてもCD40-CD40リガンドの相互作用が必要であることが示唆されるに至った。本年度はまずこの点を確認するために、ヒトCD40リガンド-マウスCD8のfusion proteinがB細胞の免疫グロブリン産生に及ぼす影響について検討を行った。固相化抗CD3抗体の存在下に、マイトマイシンC処理CD4+T細胞(T4 mito)とB細胞を72時間培養した後に、CD40リガンド-CD8fusion proteinを添加した。ここに、抗マウスCD8抗体を添加すると、B細胞によるIgM及びIgGの産生は著明に抑制された。しかしながら、予めStaphylococcus aureus + IL-2で72時間活性化したB細胞に対しては、CD40リガンド-CD8fusion proteinはむしろそのIgM及びIgGの産生を増強した。従って、CD40リガンド-CD40の細胞間相互作用以外に、B細胞の増殖分化を抑制するのに必要な別のシグナルがT細胞より供給されている可能性が強く示唆された。さらに、ループス腎炎の治療薬として用いられる免疫抑制薬のミゾリビンもB細胞の活性化を抑制することが明らかになっている。その作用機序についてさらに詳細に検討した結果、ミゾリビンはB細胞のサイクリンAの発現をmRNAのレベルで抑制すること、さらにその機序の1つとして少なくともミゾリビンがサイクリンAのmRNAのstabilityを阻害することなどが明らかになった。従って、細胞周期回転の抑制がSLEのような自己免疫疾患の治療として有効であることが示唆された。
天然有機物の腐植化過程における生化学的普遍性の解明

天然有機物の短期的・長期的腐植化または続成作用において、主に微生物影響由来のアミノ酸・アミノ糖成分への顕著な寄与が大きく、さらに異なる環境下でも特にGlcN/GalN比において減少するという普遍的な傾向が見られることを明らかにした。天然有機物腐植化について、初期変化と長期的変化に関する研究を行った。まず初期変化については、室内での培養実験とフィールドでのリターバック実験を行い、腐植中の加水分解性アミノ酸組成の変化を調べた。その結果、リターの加水分解性アミノ酸組成は、バクテリア体の構成に近づくことが分かった。また、腐植化の長期的変化については、クロノシークエンスに沿った土壌サンプリングに基づいた調査を行った。具体的には、北海道内で年代の異なる様々な火山灰堆積層から腐植有機物を採取した。現在これらの腐植サンプルの化学分析を進めており、天然有機物腐植化の長期的化学的特性の変化について今後明らかになってゆく。さらに、こうした天然有機物腐植化の海洋及び生物体内との普遍性に関して、ケイ素の植物体から腐植中への含有形態過程が共通する可能性が見出された。次年度は、これらも念頭に入れた研究を行っていきたいと考えている。本研究の意義は、陸上土壌、海洋、生物体内という異なる環境下の天然有機物腐植化過程を、統合的に捉えるという試みにある。こうした腐植化過程は、これまで異なる研究領域で別々に論じられてきたが、微生物を中心とした有機物の生化学的変化の過程であるという点においては基本的には共通する部分も多い。そのため、こうした全く異なる環境下の有機物分解研究を統合的に行うことで、これまでそれぞれの領域でのみ認識されていた知見を相互補完し、分野横断的な普遍性の追及へ発展させることが可能となる点に、本研究の重要性がある。本研究では、陸上土壌、水域、生物体内の腐植化過程において普遍的にみられる天然有機物の生化学的特性を解明することを主目的とした。まず、陸上土壌、水、生物体内抽出物について、GPCソフトを内蔵したHPLCにより、分子量を求めた。その結果、タンパク質ベースで分子量およそ7000Da付近に極大なピークが一つだけみとめられる特性があることが分かった。また、University of South CarolinaのRonald Benner教授の下、アミノ酸等の測定法について学び、上記サンプルについて加水分解性アミノ酸を測定することができた。その結果、異なる種類の植物葉を入れた土壌では、初めは異なっていたアミノ酸組成が、分解を経るごとに植物種によらず似通ってくることが分かった。同様のことは、生物体内についても言えた。異なる餌を与えた乳牛および乾乳牛中の消化管内容物は、消化を経るごとにアミノ酸組成が似通っていった。また、分解につれて割合が増えるアミノ酸と逆に割合が減るアミノ酸もほぼ同様であった。これらの傾向は、水域で得られている値とも似通っており、陸上土壌、水域、生物体内において有機物の組成が腐植化過程で似通ってくることが示唆された。また、クロノシークエンスによる天然有機物の長期腐植化については、北海道苫小牧市の露頭にて採取された樽前山埋没火山灰、それに北海道洞爺湖町の新鮮有珠山火山灰を用いて比較検討を行った。その結果、年代の長いものほど溶存態有機物が主に鉄やアルミの水酸化物類とともに豊富に吸着され、長期になるほどその吸着が飽和してゆくことが明らかとなった。天然有機物は地球上の重要な炭素蓄積源であるため、こうした知見は温室効果ガスである二酸化炭素の放出をはじめとする地球規模での気候変動に関する理解に大きく資すると考えられる。本研究では、陸上土壌、海洋、生物体内の腐植化過程において普遍的にみられる天然有機物の生化学的特性を解明することを主目的とした。そこで、異なる生態系において、天然リターのリターバック分解実験を行い、異なる環壌中で腐植化過程においてどのような生化学的普遍性が見られるかを、加水分解性アミノ酸及びアミノ糖収量などを比較することで調べた。また、長期的な普遍性を明らかにするため、クロノシークエンスに沿った火山灰サンプルを採取・比較し、これを短期的な変化であるリターバック実験の結果と整合させ、議論した。その結果、陸域と水域で行ったリターバック実験のサンプルは、どちらにおいても、リター中の加水分解性アミノ酸の単位炭素あたりの収量、ならびに加水分解性アミノ等の単位炭素あたりの収量が、分解段階が進むと共に増加する傾向が顕著に見られた。また、グルコサミン(GlcN)とガラクトサミン(GalN)の比であるGlcN/GalNが、分解とともに減少し、概ね4-15ほどであった比が、12に落ち着く傾向が見られた。こうした分解における生化学的変化は、植物体由来の物質が、微生物体由来の物質に変化していることを示唆していた。また、こうしたことが異なる環境下で同じように起きていたことは、天然有機物の腐植化過程において、普遍的に微生物影響が生化学的特性の変化に寄与していることを示唆している。また、クロノシークエンスに沿った変化としては、アミノ酸・アミノ糖の収量は時間軸に沿って増加する傾向は見られなかった。一方で、GlcN/GalNは、古い有機物ほど低い傾向を示し、短期間での有機物分解と同様の結果となった。

このことは、数万年レベルの長期間でも微生物影響が継続していることを示すと共に、GlcN/GalNが減少するという普遍的な生化学的変化が腐植化やdiagenesisの過程でみられるものであることを示していた。
寄主-寄生者系の空間的プロセスと生態的・遺伝的多様性の維持機構

捕食者の種数が被食者よりも多い「頭でっかち」の系は、構成種が消滅しやすく不安定であるとの理論がある一方で、個体数が振動しながら長く共存した例もあり、定まった説がまだない。代表者の嶋田は、寄主アズキゾウムシと2種の寄生蜂(コガネコバチA.c.、コマユバチH.p.)からなる実験系で長期にわたる共存を確認し、LENNSとRSMの両解析法によりアズキゾウムシとA.c.の時系列でカオスの発生を検出した。さらに、カオスを発生させる個体群機構を解明するため、嶋田は、研究協力者の津田みどりや分担者のH.C.J.Godfrayとともに、時系列解析と齢構成モデルの双方向から解析を試みた。これらの蜂は、A.c.の寄生効率は寄主密度に強く依存するのに対し、H.p.は依存しない。また、両蜂とも4齢幼虫から蛹に寄生するが、H.p.の方がやや若い寄主を選好するのに対し、A.c.はやや老熟な方をより好む。このため、モデル化するには、蜂の機能的反応の差違・寄生対象となる寄主の齢構成などをどのように取り込むかが鍵となる。時系列解析は、いくつかの密度依存性を組み合わせた差分型モデルを用いて、複数の候補から対数尤度が最大となる最適モデルを選択した。齢構成モデルは、蜂の寄生選好性の違い(ニッチ分化)を表すより複雑な齢構成モデルである。両アプローチの結果、寄主-寄生蜂系の非平衡共存にもニッチ分化が重要であることが分かった。また、嶋田は北アリゾナ大C.D.Johnson教授の協力を得て、新大陸におけるマメ科寄主一種子寄生性昆虫マメゾウムシの食う-食われる関係をもとに、群集の共進化的構造の生成過程を研究した。調査地は、ハワイ・アリゾナメキシコである。各地域で、マメ科植物が最も豊富に果実をつける時期に、マメ科の豆果やその他の科の種子を採集し、東大の輸入禁止害虫専用の恒温室に持ち込んで羽化を観察した。羽化したマメゾウムシの各種ごとに、寄生植物ごとの単位種子量当たりの羽化数を階級に分け、寄主植物利用から見た構成種のニッチ類似度にもとづく最大節約法によるデンドログラムを作成した。その結果、マメゾウムシと寄主植物の食う-食われるの相関図は、ハワイよりもアリゾナ・メキシコの方で1:多の関係がいっそう頻繁に見られ、食う-食われるの相関図はより複雑なものになった。ハワシでは、まだ寄主植物とマメゾウムシが1:1の関係になっているものがいくらかあるが、アリゾナ/メキシコでは1:多の関係になることから、マメゾウムシの間にニッチの重複が生じ、さらに寄主シフトが頻繁に起こっていることが解明された。さらに、野生マメゾウムシの寄主種子利用に関する空間分布の行動的側面も解析した。サイカチマメゾウムシは、地上に落下したサイカチの完熟乾燥種子を利用して多化性活性環を実現しているが、種子に潜り込む際に、多くの種子で1粒に1匹が潜り込む行動が見られた。幼虫密度を人為的に高めて複数の幼虫が1粒の種子に潜り込むように設定しても、羽化してくる幼虫は1粒から1匹だけで、その羽化生重は減少せず、種子内部の資源を1匹が独占していることが分かった。このことから、種子寄生性昆虫の資源利用に関する適応戦略を論じた。分担者の巖佐は、寄主植物と植物性昆虫の食う-食われる関係に見られる共進化を、ゲーム理論の観点から解析した。また協力者の津田みどりと共に、寄主-寄生蜂実験系における局所的収容力の進化と動態の安定性を、進化的に安定なゲーム理論の観点から数理モデルで解析した。その結果、局所的収容力が募占型になるほど動態の安定性が高まることが分かった。M.P.HassellとH.C.J.Godffrayらは、さらに寄主-寄生者系の動態特性に関するモデル解析も行い、空間構造と時間構造の両効果を評価した。以上の研究から、寄主-寄生者系のダイナミクスと共進化に及ぼす集団の空間構造の多様な効果が解明できた。今後の課題は、寄主-寄生者系の遺伝的な構造と変化を解明することであろう。

時系列解析は、いくつかの密度依存性を組み合わせた差分型モデルを用いて、複数の候補から対数尤度が最大となる最適モデルを選択した。齢構成モデルは、蜂の寄生選好性の違い(ニッチ分化)を表すより複雑な齢構成モデルである。両アプローチの結果、寄主-寄生蜂系の非平衡共存にもニッチ分化が重要であることが分かった。また、嶋田は北アリゾナ大C.D.Johnson教授の協力を得て、新大陸におけるマメ科寄主一種子寄生性昆虫マメゾウムシの食う-食われる関係をもとに、群集の共進化的構造の生成過程を研究した。調査地は、ハワイ・アリゾナメキシコである。各地域で、マメ科植物が最も豊富に果実をつける時期に、マメ科の豆果やその他の科の種子を採集し、東大の輸入禁止害虫専用の恒温室に持ち込んで羽化を観察した。羽化したマメゾウムシの各種ごとに、寄生植物ごとの単位種子量当たりの羽化数を階級に分け、寄主植物利用から見た構成種のニッチ類似度にもとづく最大節約法によるデンドログラムを作成した。その結果、マメゾウムシと寄主植物の食う-食われるの相関図は、ハワイよりもアリゾナ・メキシコの方で1:多の関係がいっそう頻繁に見られ、食う-食われるの相関図はより複雑なものになった。ハワシでは、まだ寄主植物とマメゾウムシが1:1の関係になっているものがいくらかあるが、アリゾナ/メキシコでは1:多の関係になることから、マメゾウムシの間にニッチの重複が生じ、さらに寄主シフトが頻繁に起こっていることが解明された。さらに、野生マメゾウムシの寄主種子利用に関する空間分布の行動的側面も解析した。サイカチマメゾウムシは、地上に落下したサイカチの完熟乾燥種子を利用して多化性活性環を実現しているが、種子に潜り込む際に、多くの種子で1粒に1匹が潜り込む行動が見られた。幼虫密度を人為的に高めて複数の幼虫が1粒の種子に潜り込むように設定しても、羽化してくる幼虫は1粒から1匹だけで、その羽化生重は減少せず、種子内部の資源を1匹が独占していることが分かった。このことから、種子寄生性昆虫の資源利用に関する適応戦略を論じた。分担者の巖佐は、寄主植物と植物性昆虫の食う-食われる関係に見られる共進化を、ゲーム理論の観点から解析した。また協力者の津田みどりと共に、寄主-寄生蜂実験系における局所的収容力の進化と動態の安定性を、進化的に安定なゲーム理論の観点から数理モデルで解析した。その結果、局所的収容力が募占型になるほど動態の安定性が高まることが分かった。M.P.HassellとH.C.J.Godffrayらは、さらに寄主-寄生者系の動態特性に関するモデル解析も行い、空間構造と時間構造の両効果を評価した。以上の研究から、寄主-寄生者系のダイナミクスと共進化に及ぼす集団の空間構造の多様な効果が解明できた。今後の課題は、寄主-寄生者系の遺伝的な構造と変化を解明することであろう。本年度では、寄主一寄生者系の共存のダイナミクスと共進化に関して以下のような成果が得られた。(1)寄主一寄生者系の齢構成モデルの構築:昆虫のように複数の発育段階から成る集団では、寄生者は特定の発育段階にのみ寄生する。このような特異性は、両者の共存と共進化に多大な影響を与えると思われる。まず、推移行列な遅れの微分方程式などを用いて、寄生昆虫と寄生蜂の系、宿主と病原体の系についてダイナミクス解析を行い、共存を促進する要因の作用を分析した。この研究は主に嶋田とGodfrayによりなされた。その結果、寄生を受ける期間の長さが重要であることが分かった。(2)寄主一寄生者系の共進化の数理的解析:宿主と病原体の共進化を対象に、両者が相互作用の関係を持続して、その結果、いかなる生活史特性が両者にとって適応的かを解析した。これは、主に巌佐とハッセルによりなされた。
発声障害者の末梢・中枢における病態に関する研究

痙攣性発声障害、吃音者の患者の発話機構をポジトロン断層法を用いて検出した。健常者では発話時には運動野とともに補足運動野が運動のプログラミングとして働くが、痙攣性発声障害患者においては、この補足運動野の活動が認められなかった。この部位の障害があると自発的な発話が障害をうけることが知られており、痙攣性発声障害の一因にこの補足運動野の機能異常が関与している可能性が示された。ただし、この障害が1次的なものか2次的なものかはなお多くの症例を積み重ねて検討する必要があり、同時に今後高性能PETにより基底核の異常がないかどうかの確認も重要と考えられる.吃音では、運動野、補足運動野は正常人と同様の活動パタンを呈し、症例によっては補足運動野の活動が右半球優位であったり、正常人に比べ過剰であったり、バリエーションにとんだ所見を呈した.吃音が個人による差が大きいことと、その病因・病態に多くのバリエーションがあることが示唆された。痙攣性発声障害、ジストニアの患者の発話機構をポジトロン断層法を用いて検出した。その結果、痙攣性発声障害患者においては、通常みられるはずの補足運動野の活動が認められなかった。補足運動野は運動のプログラミングをおこなう場とされ、この部位の障害があると自発的な発話が障害をうけることが知られている。痙攣性発声障害の一因にこの補足運動野の機能異常が関与している可能性が示された。ジストニアでは逆に補足運動野の活動が強く観察され、いわゆる痙攣性発声障害とは異なるメカニズムがあるものと考えられた。今後さらなる症例での検討が必要であるが、これらの疾患の病因が捉えられる可能性がでてきたものと考えられる。
契約危殆責任の構造とその法的救済のあり方

契約危殆については、ドイツ法、アメリカ法のいずれもが、その法的救済の異同にもかかわらず、契約危殆に陥った契約の解消の可否の判断プロセスにおいて、正常な契約への復帰に向けられた交渉の有無、態度に重要な役割を与える。これに対し、日本にかつて存在した履行拒絶についての議論には、その視点は意識されてこなかった。日本においてその視点が意識されるとき、契約危殆時における規範選択のあり方が問題となる。契約危殆という問題の構造を知り、有効な救済方法を獲得するためには、一方で、従来、この問題が民法体系上どこに割り当てられてきたか、他方で、他国の法制度が同様の問題にどう対応してきたかを知ることが不可欠である。この観点から、2008年度の研究を大別すると、(1)日本における契約危殆に対する法的救済の歴史的展開の調査と分析、(2)ドイツにおける契約危殆に対する法的救済の歴史の調査と分析の二つとなる。(1)については、履行期前の履行拒絶を取り上げ、旧民法起草過程から現在に至るまでの展開を追跡し、議論の契機が明治末期に生じ、本格的な議論の出発点が大正後期から昭和初期にあることを確認した。この過程において、旧民法財産編383条1項前段の履行拒絶が履行期後のそれであることが確定された(これついては、下記備考を参照。)。更に、現在に至るまでの履行拒絶論の展開を調査し、かつての履行拒絶論と現在の履行拒絶論との比較分析を行った。これらの調査と分析にあたっては、学説の理論的な系譜関係及び勢力関係の論証だけでなく、当時の学者層の研究環境、主要な書籍の発行部数、戦災天災等、人的・物的な事柄が学説の展開(特に、勢力関係)に及ぼした影響の論証をも試みた。これについては、一定の成果が得られたが、資料の不十分、統計批判などの課題も残っており、今後の研究継続により解決を図りたい。(2)関連するドイツ法の文献の収集と調査を行った。ドイツにおける履行期前の履行拒絶の取り扱いの史的展開を追跡した。今後は、不安の抗弁や解除等の関連する救済手段にも調査の範囲を広げ、ドイツにおける契約危殆に対する法的救済の全体像を分析する。なお、これらの成果については、2009年度以降、総合と再分析を行い、適宜公表する予定である。本研究の目的は、契約がとりわけ履行期前にその実現を不安視される状態、すなわち契約危殆状態の法的構造とそれに対する法的救済のあり方を探究することにあり、その目的遂行のために、諸外国、とりわけアメリカとドイツの法的救済とその形成過程を追跡するとともに、日本における契約危殆の紛争実態を探る作業が行われた。前年度から引き続き行った研究のほか、本年度の研究成果として以下のものが挙げられる。(1)契約の拘束力を限界づける法的救済の実相の比較考察である。ドイツ法(BGB321)、アメリカ法(UCC2-609)のいずれもが、その法的救済の異同にもかかわらず、(1)契約危殆に陥った契約の解消の可否の判断プロセスにおいて、正常な契約への復帰に向けられた交渉の有無、態度に重要な役割を与える点に類似性がみられ、かつ、(2)いずれの法的救済も交渉の機会を保障し、交渉を促進する機能を果たす一面があるという知見が得られた(もっとも、このドイツ法の法的救済とアメリカ法のそれとの間の類似性に対するカール・ルウェリン、エルンスト・ラーベル等の寄与は確認できていない)。(2)契約危殆時における規範選択の方法論的考察である。アメリカ法における関係的契約論の展開過程において登場した契約維持的規範と契約切断的規範に着想を得て、(1)契約危殆時における紛争解決指針として関係維持的指針と関係切断的指針を想定する必要性、可能性及び有用性を考察し、(2)契約危殆時における規範選択手続のモデル構築の試論を行った。アメリカ法における契約維持的規範と契約切断的規範の位置づけの把握、規範選択手続のモデルの実効性の検証などになお課題が残り、本報告作成時点においては結論を得るに至らなかったため、これについては、今後、更なる研究が必要と考える。
プログラミング言語にもとづいた空間認知表現の評価

本研究では、簡便な構文規則と数学的に定義されたセマンティクスを持っているプログラミング言語を記述・表現メディアとして採用する事により、被験者の自然言語運用能力の影響を減少させ、空間の認知をより精密に表出させる事を意図した。複数種の課題を考察・作成し、難聴者グループ、健聴者グループそれぞれを比較対照する実験を行った。その中で特に地図トレース課題において、戦術変更動作にグループ間の有意差を検出する事が出来た。今年度は3年間の研究期間の中で準備段階に相当する年度であり、実験環境の構築を中心に研究を行った。まず空間認知能力を計測するための二次元・三次元における課題について検討を行った(研究実施計画1)。課題として、プログラミング言語で表現されたものを図形として回答させる理解問題、提示した図形をプログラミング言語で表現させる表現問題に加えて、方向指示の方法(絶対的方向/相対的方向)を比較する地図問題について検討を行った。並行して、大型ディスプレイを用いて、課題画像の提示方法の検討を行う(研究実施計画2)とともに、出題・回答用言語であるHyperlogoに対して2次元および3次元タートルグラフィックス機能の拡張を行った(研究実施計画3)。2008年12月初旬には研究会を行い、回答用言語の開発状況、実験における評価項目、実験プロトコルについての考察、関連研究の調査などに関して、プロジェクトメンバ内での情報交換を行った。この研究会での検討を受け、2009年2月に、空間認知に関する予備的な実験を行った(研究実施計画4)。この結果、地図課題による相対的・絶対的方角指示方法に基づく空間認知能力の比較可能性が明らかになるとともに、回答用言語の三次元表示系についての改良点が判明した。実験の結果をまとめたものを、2009年にアメリカで開催されるヒューマンインタフェースに関する国際学会HCII2009に投稿し、採択された(研究実施計画5)。今年度は、昨年度に実施した予備実験の結果を踏まえつつ、実験手法の検討、実験環境の微調整を行った。空間認知能力を計測するための課題については、昨年度の予備実験の結果、二次元空間における問題提示・回答方法としての有用性が確認された地図表現について、被験者の試行過程の追跡を重点目標として課題の内容、被験者への提示方法などに関して検討を行った。また、三次元空間課題についても引き続き検討を行った(研究実施計画1)。検討した課題内容、提示方法を用いて、昨年度と同様の実験を行い、地図課題による相対的・絶対的方角指示方法に基づく空間認知能力の比較と、被験者の試行錯誤過程の解析による経路決定戦略についての分析を行った(研究実施計画3)。並行して、出題・回答用言語であるHyperlogoについて、主に三次元タートルグラフィックス機能に関しての改良を行った。具体的には、昨年度の予備実験で判明した、被験者に対するユーザインタフェースの改善、および三次元表示機能の安定化・高速化などを目標に、言語処理系のプログラムの改良を行った(研究実施計画2)。これまでの実験結果に基づく研究成果をまとめたものを、2009年7月にアメリカ・サンディエゴ市で開催された第13回コンピュータと人間のインタラクションに関する国際学会HCII2009にて発表した。また、この分野の研究者と研究の今後の方向性などについての意見交換を行った(研究実施計画4)。今年度は、これまでの予備実験の結果をもとに、最終的な実験環境の整備を行い、その元で評価実験を行った。空間認知能力を計測するための課題については、これまでの予備実験からその有用性が確認された地図表現を用い、被験者の試行過程の追跡を重点目標として、課題の内容、被験者への提示方法、および被験者人数の増加への対応などに関して改良を行った(研究実施計画1)。検討した課題内容、提示方法を用いて、聴覚障害学生と健聴学生に対して地図表現における進路決定に関する実験を行い、相対的・絶対的方角指示方法に基づく空間認知能力の比較と、被験者の試行錯誤過程の解析による経路決定戦略についての分析を行った(研究実施計画3)。あわせて、出題・回答に用いるプログラミング言語Hyperlogoについて、言語アーキテクチャの再構成について検討を行った。処理系の可搬性を高めるため、仮想計算機のプラットフォームの変更を含めたシステム構成の組み直しについて検討した(研究実施計画2)。これまでの実験結果に基づく研究成果をまとめたものを、2011年7月にアメリカ合衆国オーランド市で開催される第14回コンピュータと人間のインタラクションに関する国際学会HCII2011に投稿し、採択された(研究実施計画4)最後に、これまでの研究成果をまとめた報告書を作成した(研究実施計画5)
微生物による放射性セシウム除去を目指したセシウム濃集機構の解明

福島第一原発の周辺地域で放射性セシウムによる環境汚染が問題となっている。本研究では、微生物を利用した、福島第一原発より環境中に大量に放出された放射性セシウムの効率的な回収・除染への知見を提供することを目的とした。5416種類の微生物の一種である酵母を利用した研究の結果、放射性セシウムの耐性には液胞膜合成に関連する遺伝子が関係していることを明らかにした。また、酵母と、同じく微生物の一種であるきのこの菌糸を利用した野外実験の結果、800平方cmの範囲で、酵母で最大75Bq、きのこで最大86BqのCs-137を濃集した。今後もこの研究を進め、さらに効率的な放射性セシウム除去技術の確立に努めていく。鉱物や有機化合物、植物等を利用した除染活動が試みられているが、どれも決め手を欠く状況となっている中、微生物による放射性セシウム回収の可能性が探られている。本研究では、5416種類の一遺伝子欠損酵母コレクションから、放射性セシウムを特異的に濃集する/しない株を特定する。それらの株と一遺伝子欠損酵母の親株を利用して、放射性セシウム存在下で特異的に発現するもしくは発現しないタンパク質を特定・同定する。放射性セシウム濃集/非濃集に関連する欠損遺伝子と発現/非発現タンパク質から、放射性セシウムに対する酵母の応答反応を遺伝子レベルで調べ、酵母が放射性セシウムを濃集する機構の解明を目指す。また、これら一連の研究を通して、微生物または生体物質を利用した、福島第一原発より環境中に大量に放出された放射性セシウムの効率的な回収・除染への知見を提供する。平成25年度は、5416種類の酵母株を、放射性セシウムを含む寒天培地上で複数回培養し、全ての酵母株についてその成長の度合いとセシウム濃集割合を評価した。成長度合いは、コロニーの生育度を自動で認識するソフト「マルチゲージ」を利用した。酵母に濃集した放射性セシウムの放射能はバイオイメージングアナライザー「BAS2500」を利用した。解析の結果、1コロニーあたり30ベクレル以上の放射性セシウムを濃集する酵母を130株程度特定した。それとは逆に、放射性セシウムを濃集しない酵母も50株程度特定した。現在これら酵母の欠損遺伝子の役割を調査中である。さらに、放射性セシウムを濃集する酵母を予備培養して、その後液体培地で本格培養を開始した。この研究により、特に放射性セシウムを濃集する酵母数株を特定する。平成25年度は、5416種類の酵母株を、放射性セシウムを含む寒天培地上で複数回培養し、全ての酵母株についてその成長度合いとセシウム濃集割合を評価した。その結果、1コロニー辺り30ベクレル以上の放射性セシウムを濃集する酵母を130株程度特定した。平成26年度は放射性セシウムに耐性のない酵母株を10種類特定した。その株に欠損している遺伝子を調べたところ、6種類までが液胞膜合成に関連した遺伝子であった。そのことから、放射性セシウム耐性には液胞膜合成に関連する遺伝子が関係していることを明らかにした。さらに、二次元電位泳動解析により放射性セシウム存在下、カリウム存在下で特異的に発現するタンパク質を特定した。平成27年度に当該タンパク質の同定を行う予定である。住居エリアでは徐々に除染が進んでいるが、森林はほとんどが手つかずのままである。鉱物や有機化合物、植物等を利用した除染活動が試みられており、どれも決め手を欠く状況となっている中、微生物による放射性セシウム回収の可能性が探られている。本研究では、微生物または生体物質を利用した、福島第一原発より環境中に大量に放出された放射性セシウムの効率的な回収・除染への知見を提供する。

平成26年度は放射性セシウムに耐性のない酵母株を10種類特定した。その株に欠損している遺伝子を調べたところ、6種類までが液胞膜合成に関連した遺伝子であった。そのことから、放射性セシウム耐性には液胞膜合成に関連する遺伝子が関係していることを明らかにした。平成27年度はCs-137存在下で発現するタンパク質を特定する試験を行った結果、4種類のタンパク質が発現し、2種類のタンパク質が発現しなくなることを明らかにした。本成果は、平成27年度の日本生化学会で発表を行った。また、同じ真菌微生物である酵母ときのこを用いてCs-137を濃集する野外試験を福島県内の汚染森林内で実施した。0.08平方メートルの区分けから酵母で最大75 Bq、きのこで最大86BqのCs-137を濃集した。以上の成果から、当初の計画を達成した。今後もこの研究を進め、さらに効率的な放射性セシウム除去技術の確立に努めていく。福島第一原発の周辺地域で放射性セシウムによる環境汚染が問題となっている。本研究では、微生物を利用した、福島第一原発より環境中に大量に放出された放射性セシウムの効率的な回収・除染への知見を提供することを目的とした。5416種類の微生物の一種である酵母を利用した研究の結果、放射性セシウムの耐性には液胞膜合成に関連する遺伝子が関係していることを明らかにした。また、酵母と、同じく微生物の一種であるきのこの菌糸を利用した野外実験の結果、800平方cmの範囲で、酵母で最大75Bq、きのこで最大86BqのCs-137を濃集した。研究スケジュールに記載してあるとおりの進捗状況である。環境放射線、微生物、当初の研究計画に大きな変更点・問題点はない。平成27年度最終年度となるので、出来るだけ計画を早めて研究を進めていきたい。当初の研究計画に大きな変更点はない。大きな問題点も発生していないので、出来るだけ計画を早めて研究を進めていきたい。当初申請予算より減額されたこと、消費税が上がったことにより、平成26年度の予算不足が懸念された。そのため、平成25年度の使用予算を切り詰めることにより次年度の使用予算に振り分けた。次年度使用額が生じても当初計画していた予算よりはまだ不足している。効率的な使用を心がけ、それでも不足する場合には所属機関研究予算から支出して計画通りの成果を出す。
ヒ素誘導発癌の機序解析と新予防法の開発・実践

バングラデシュをはじめとするアジア地域の飲用地下水のヒ素汚染は国際的に最も注目されている環境問題の一つである。バングラデシュでは、1千万人の慢性ヒ素中毒患者の間で、すさまじい勢いで癌が増加している。しかし、ヒ素が発癌を誘導する機序はほとんど不明で、適切な予防・治療方法はないのが現状である。本研究では、c-RET癌原遺伝子産物やRET癌遺伝子をNIH3T3細胞(transfectant)やマウス(transgenic mouse)に導入し、RETを介した癌化機構を調べた。さらに、ヒ素が、この過程にどのように作用するのかについて調べ、以下の結果を得た。【試験管内における解析】1)10-1000μMのヒ素は、試験管内において、c-RETキナーゼの活性を亢進した。2)10-1000μMのヒ素は、すでに二量体化により活性化されているRET-MEN2Aキナーゼの活性をさらに亢進させた。3)ヒ素介したRETキナーゼの活性化には、RET分子におけるチロシン905及びチロシン1062のリン酸化が関与している可能性を示した。4)ヒ素を介したRETキナーゼの活性化には、RET分子内のシステインが関与している可能性を示した。5)現在、A)ヒ素がRET分子のシステインに直接bindするのかどうか、B)bindするのであれば、どのシステインが標的となるのか、について質量分析機を用いて、直接的に証明しようとしている。【生体内における解析】RET-トランスジェニックマウスに自然発症した良性腫瘍悪性腫瘍を用い、マイクロアレイ等の方法により、癌化制御に関連する分子を見つけ、機能を解析している。バングラデシュの飲用地下水のヒ素汚染は国際的に最も注目されている環境問題である。現在同国の数千万人の慢性ヒ素中毒患者に、すさまじい勢いで癌が増加している。受入研究者は、外国人研究員と共同で、ヒ素等の環境因子が癌遺伝子をはじめとするシグナル伝達分子を活性化するかどうかについて調べた。その結果、ヒ素がチロシンキナーゼの活性を促進することがわかった。さらに興味深いことに、ヒ素により誘導されたチロシンキナーゼの活性を著しく抑制する薬物を見つけた。この薬物はヒ素により誘導される細胞の形質転換を有意に抑制した。現在、薬物の作用機序を解析している。これらの研究成果は、この薬物がヒ素誘発癌の発症予防に有効である可能性を示している。そこで、動物実験を経て、この薬物のヒトでの有効性を調べる予定である。その準備段階として、受入れ研究者は、外国人研究員及びバングラデシュにおける研究協力者とともに、現地で飲用の井戸水を採取し、ヒ素濃度を測定した。これにより、高度軽度汚染地域を特定した。さらに、ヒト検体を用いた研究に進む事ができるように、倫理委員会への申請準備を日本とバングラデシュにおいて進めている。同時に、外国人研究員の従兄弟が主宰するバングラデシュのNGOと連絡をとり、協力関係を構築した。日本においても、アジア地域でヒ素誘発癌の予防等の活動を実践するためのNPOを立ち上げる準備を進めている。
消化器癌における制御性B細胞の解析とその制御による新たな癌免疫治療の開発

今回の研究を通じて以下のことを明らかにした。1.胃癌および大腸癌患者の末梢血中にIL-10を産生する制御性B細胞が健常成人に比べて有意に多く存在することを確認した。さらに根治手術を施行した胃癌および大腸癌患者の末梢血中の制御性B細胞の頻度は根治術後に術前と比較して有意に低下することを確認した。2.胃癌および大腸癌患者の末梢血においてCD19+CD24hiCD27+細胞群のなかにIL-10を産生する制御性B細胞が多く含まれていることを確認した。この結果は制御性B細胞の表面抗原マーカーとしてCD19, CD24, CD27が使用可能であることを示した結果である。次に、胃癌および大腸癌患者においてCD19+CD24hiCD27+細胞が末梢血に比較して癌組織中に有意に多く存在することを確認した。3.癌組織に存在するCD19+CD24hiCD27+細胞をソーティングし、CD4Tリンパ球と混合培養したところ、CD4Tリンパ球の増殖やIFN-γ産生が有意に抑制された。このことはCD19+CD24hiCD27+細胞が細胞性免疫抑制機能を有することを証明した結果である。4.胃癌組織においてCD19とIL-10の2重免疫染色を行い、制御性B細胞が多く存在する胃癌の予後は、制御性B細胞が少ない胃癌の予後と比較して有意に不良であることを確認した。5.最終年度(平成30年度)は食道癌でも上記と同じ結果であることを確認した。以上の結果は、食道癌、胃癌、大腸癌などの消化管癌患者では、特に腫瘍局所に免疫抑制機能を有する制御性B細胞が多く存在し、この細胞が癌の進展に大きく関与していることを示す結果である。この結果は制御性B細胞が癌免疫治療の有望な治療ターゲットとなることを示すものであり、今後の研究の進展により、新たな癌免疫治療を開発することが出来ると考えている。1.胃癌患者の末梢血および腫瘍組織から抽出した末梢血単核球をCD40L、PMA、Ionomycinで刺激し、細胞内染色にてCD19陽性B細胞のIL-10産生を検討し、一定の割合でIL-10を産生する制御性Bリンパ球が末梢血や腫瘍組織内に存在することを明らかとした。2.腫瘍組織には末梢血と比較して制御性Bリンパ球の頻度が高く認められた。これに関しては今後症例数を増加させることにより、統計学的有意差が得られるかどうかをさらに検討していく予定ある。3.胃癌患者において制御性Bリンパ球はCD19+CD24hiCD27+のPOPULATIONの中に多く含まれていることを明らかにした。今後は上記表面抗原を用いて制御性B細胞を多く含む細胞集団を分離して、制御性Bリンパ球の機能解析を行っていく予定である。4.術後は末梢血の制御性Bリンパ球の頻度低下が認められた。この点に関しても、今後、症例数を増加させて、更なる検討を行っていく予定である。5.制御性Bリンハ&#12442;球か&#12441;産生するTGF-βか&#12441;制御性Tリンハ&#12442;球の分化を促進することか&#12441;報告されており、上記と同様のサンフ&#12442;ルを用いて制御性Tリンハ&#12442;球(CD4+Foxp3+)の頻度をFACSにて検討しており、今後は制御性Bリンハ&#12442;球と制御性Tリンハ&#12442;球の関連を詳細に検討する予定である。制御性B細胞の至適刺激の条件を設定することに予定以上の時間がかかっため予定症例数の解析を終えることが出来なかった。したがって、当初の研究予定より遅れが認められている。1.これまでの研究で、まず胃癌および大腸癌患者の末梢血中にIL-10を産生する制御性B細胞が健常成人に比べて有意に多く存在することを確認した。このことはCD19+CD24hiCD27+細胞が細胞性免疫抑制機能を有することを証明した結果であると考えられる。4.胃癌組織においてCD19とIL-10の2重免疫染色を行い、制御性B細胞の頻度と予後が有意に相関する、すなわち制御性B細胞が多く存在する胃癌の予後は、制御性B細胞が少ない胃癌の予後と比較して有意に不良であることを確認した。

このことは腫瘍局所に存在する制御性B細胞が、癌の進展に大きく関与していることを示す結果である。以上の結果から、胃癌および大腸癌患者においては、特に癌組織に制御性B細胞が多く存在し、その細胞が癌の進展を促進している可能性が示唆された。胃癌及び大腸癌では、これまでの研究は当初の研究計画にしたがい、概ね予定どおり経過していると考えている。一方で食道癌および膵癌においてはまだ検討途中である。これは当初、制御性B細胞の表面メーカーの検索および同定に時間を要したためである。今回の研究を通じて以下のことを明らかにした。1.胃癌および大腸癌患者の末梢血中にIL-10を産生する制御性B細胞が健常成人に比べて有意に多く存在することを確認した。さらに根治手術を施行した胃癌および大腸癌患者の末梢血中の制御性B細胞の頻度は根治術後に術前と比較して有意に低下することを確認した。2.胃癌および大腸癌患者の末梢血においてCD19+CD24hiCD27+細胞群のなかにIL-10を産生する制御性B細胞が多く含まれていることを確認した。この結果は制御性B細胞の表面抗原マーカーとしてCD19, CD24, CD27が使用可能であることを示した結果である。次に、胃癌および大腸癌患者においてCD19+CD24hiCD27+細胞が末梢血に比較して癌組織中に有意に多く存在することを確認した。3.癌組織に存在するCD19+CD24hiCD27+細胞をソーティングし、CD4Tリンパ球と混合培養したところ、CD4Tリンパ球の増殖やIFN-γ産生が有意に抑制された。このことはCD19+CD24hiCD27+細胞が細胞性免疫抑制機能を有することを証明した結果である。4.胃癌組織においてCD19とIL-10の2重免疫染色を行い、制御性B細胞が多く存在する胃癌の予後は、制御性B細胞が少ない胃癌の予後と比較して有意に不良であることを確認した。5.最終年度(平成30年度)は食道癌でも上記と同じ結果であることを確認した。以上の結果は、食道癌、胃癌、大腸癌などの消化管癌患者では、特に腫瘍局所に免疫抑制機能を有する制御性B細胞が多く存在し、この細胞が癌の進展に大きく関与していることを示す結果である。この結果は制御性B細胞が癌免疫治療の有望な治療ターゲットとなることを示すものであり、今後の研究の進展により、新たな癌免疫治療を開発することが出来ると考えている。条件設定がほぼ完了したので、今後は、症例数を比較的短期間のうちに増やすことが可能であると考えている。また、制御性Bリンハ&#12442;球を多く含むPOPULATIONを表面抗原を用いて明らかにすることができたため、制御性Bリンハ&#12442;球の機能解析の実験も速やかに実施可能で、これらによって実験の遅れを取り戻すことが可能であると考えている。当初の研究計画どおり、平成30年度は制御性B細胞の網羅的遺伝子解析を行い、制御性B細胞の機能制御が可能な分子やpathwayの検討を行う予定である。また、研究が遅れている食道癌や膵癌においての制御性B細胞の検討もあわせて行う予定である。制御性Bリンパ球の至適刺激条件設定に予想以上に時間がかかった為に実験に少し遅れが生じてしまった。その影響で次年度使用額が発生したと考えている。胃癌や大腸癌での制御性B細胞の検討はほぼ予定どおり進行しているが、一方で当初予定した食道癌や膵癌での検討が未だ検討途中である。このため次年度使用額が発生したものと考えている。次年度はこれらの検討も行う予定であり、その目的に研究費を使用する予定である。初年度で制御性Bリンパ球の至適刺激条件設定が完了し、また、制御性Bリンパ球を多く含むPOPULATIONを表面抗原で同定することが出来た。
スフェロイドの機械特性ソーティングを基軸とした培養環境との機械的相互作用評価

細胞凝集体(スフェロイド)を器官原器へと分化誘導する過程において,分化誘導に対する培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用はほとんど知られていない.そこで本研究では,この影響を調査するためにハイスループットにスフェロイドの硬さ等の機械的特性を計測しマルチ(多分岐)にソーティングする,機械的特性を指標としたマルチオンチップソーティングシステムの構築を目的としている.平成29年度は大きく次の5つの項目を実施した.(1)ロボット統合型マイクロ流体チップの設計・作製技術:スフェロイドの機械特性に基づくソーティングを行うために,MEMS技術を用いて,ガラスーシリコンーガラスの3層構造からなる高剛性なロボット統合型マイクロ流体チップの設計および作製を行った.(2)スフェロイドの機械的特性計測と指標化:機械的特性の連速計測のための自動計測システムを構築し,マイクロビーズおよび細胞を用いたフィージビリティを確認した.(3)オンチップソーティング技術:シリンジポンプとオンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックシステムを構築し,細胞の機械特性に応じてソーティングのための高速流体制御の基盤技術を確立した.(4)培養時の基材とスフェロイドのそれぞれ硬さの機械的作用の調査:ソーティングしたスフェロイドの培養時の培養基材の硬さ制御を行うため,従来研究で報告のあるアクリルアミドゲルを用いた硬さ制御や,マイクロピラーアレイを用いた等価硬さ制御など,広く技術を調査した.本研究において最大の課題は,スフェロイドの機械特性に応じてソーティングするシステム,Mechanical-characteristics Activated Cell Sorting (MechACS)の構築である.本年度は,スフェロイドの機械特性計測のための,ガラスーシリコンーガラスの3層構造からなる高剛性なロボット統合型マイクロ流体チップの設計および作製技術,細胞の機械特性に応じてソーティングのために,オンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックによる高速流体制御技術,および,機械的特性の連速計測のための自動計測技術に着手し,Mechanical-characteristics Activated Cell Sorting (MechACS)システムのフィージビリティを確認した.マイクロビーズおよび細胞を用いた基礎実験の結果,ソーティングのスループットは5秒/個であり,本成果を国際学会2件,国内学会2件で発表した.今後は,さらなるスループットの向上と,機械特性の指標化,および,培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用評価が課題である.現在の本研究の課題は大きく次の3つである.スループットの向上,機械特性の指標化,および,培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用評価.これらの課題に対し,以下の項目に取り組む.(1)ロボット統合型マイクロ流体チップの設計・作製技術:ハイスループット計測・ソーティングのためのマイクロ流路設計を行う.(2)スフェロイドの機械的特性計測と指標化:フロー系での連続計測を目標とした機械特性の指標化に取り組む.さらに,ハイスループットソーティングのための機械特性計測および指標化に取り組む.(3)オンチップソーティング技術:スフェロイドの機械特性に応じてマルチにソーティングするためには,マイクロ流路中を流れるスフェロイドの位置計測に基づく流体制御が必須であると考えられるため,昨年度までに構築した高速流体制御技術を基本として,シリンジポンプとオンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックシステムを改良・評価する.さらに,マイクロ流体チップと外部ポンプシステムとのインターフェースがシステム構築において重要であるため,ミクローマクロ接続技術に取り組む.(4)培養時の基材とスフェロイドのそれぞれ硬さの機械的作用の調査ソーティング後のスフェロイドを,機械的特性を調整して作製した基材上で培養することで,相互作用の評価に取り組む.細胞凝集体(スフェロイド)を器官原器へと分化誘導する過程において,分化誘導に対する培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用はほとんど知られていない.そこで本研究では,この影響を調査するためにハイスループットにスフェロイドの硬さ等の機械的特性を計測しマルチ(多分岐)にソーティングする,機械的特性を指標としたマルチオンチップソーティングシステムの構築を目的としている.平成29年度は大きく次の5つの項目を実施した.(1)ロボット統合型マイクロ流体チップの設計・作製技術:スフェロイドの機械特性に基づくソーティングを行うために,MEMS技術を用いて,ガラスーシリコンーガラスの3層構造からなる高剛性なロボット統合型マイクロ流体チップの設計および作製を行った.(2)スフェロイドの機械的特性計測と指標化:機械的特性の連速計測のための自動計測システムを構築し,マイクロビーズおよび細胞を用いたフィージビリティを確認した.(3)オンチップソーティング技術:シリンジポンプとオンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックシステムを構築し,細胞の機械特性に応じてソーティングのための高速流体制御の基盤技術を確立した.(4)培養時の基材とスフェロイドのそれぞれ硬さの機械的作用の調査:ソーティングしたスフェロイドの培養時の培養基材の硬さ制御を行うため,従来研究で報告のあるアクリルアミドゲルを用いた硬さ制御や,マイクロピラーアレイを用いた等価硬さ制御など,広く技術を調査した.本研究において最大の課題は,スフェロイドの機械特性に応じてソーティングするシステム,Mechanical-characteristics Activated Cell Sorting (MechACS)の構築である.本年度は,スフェロイドの機械特性計測のための,ガラスーシリコンーガラスの3層構造からなる高剛性なロボット統合型

マイクロ流体チップの設計および作製技術,細胞の機械特性に応じてソーティングのために,オンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックによる高速流体制御技術,および,機械的特性の連速計測のための自動計測技術に着手し,Mechanical-characteristics Activated Cell Sorting (MechACS)システムのフィージビリティを確認した.マイクロビーズおよび細胞を用いた基礎実験の結果,ソーティングのスループットは5秒/個であり,本成果を国際学会2件,国内学会2件で発表した.今後は,さらなるスループットの向上と,機械特性の指標化,および,培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用評価が課題である.現在の本研究の課題は大きく次の3つである.スループットの向上,機械特性の指標化,および,培養時の基材とスフェロイドのそれぞれの機械的な相互作用評価.これらの課題に対し,以下の項目に取り組む.(1)ロボット統合型マイクロ流体チップの設計・作製技術:ハイスループット計測・ソーティングのためのマイクロ流路設計を行う.(2)スフェロイドの機械的特性計測と指標化:フロー系での連続計測を目標とした機械特性の指標化に取り組む.さらに,ハイスループットソーティングのための機械特性計測および指標化に取り組む.(3)オンチップソーティング技術:スフェロイドの機械特性に応じてマルチにソーティングするためには,マイクロ流路中を流れるスフェロイドの位置計測に基づく流体制御が必須であると考えられるため,昨年度までに構築した高速流体制御技術を基本として,シリンジポンプとオンラインの高速度ビジョンを用いた画像フィードバックシステムを改良・評価する.さらに,マイクロ流体チップと外部ポンプシステムとのインターフェースがシステム構築において重要であるため,ミクローマクロ接続技術に取り組む.(4)培養時の基材とスフェロイドのそれぞれ硬さの機械的作用の調査ソーティング後のスフェロイドを,機械的特性を調整して作製した基材上で培養することで,相互作用の評価に取り組む.
細胞の形態・接着を制御するシグナル伝達系の研究

本研究は、細胞の形態・接着を制御する細胞内シグナル伝達系とその制御蛋白質を、リン酸化チロシンとSH2配列及びプロリン繰り返し配列とSH3配列の結合に焦点を当て、その多様な変異遺伝子を用いて、国際的な共同研究のもとに解析する事を目的として立案された。近年の研究から、細胞内シグナル伝達系において、リン酸化チロシンとSH2配列及びプロリン繰り返し配列とSH3配列による蛋白質間の結合が鍵を握る事を、共同研究者の花房、メイヤーらは明らかにした。一方、研究代表者は、カドヘリンを介する細胞間接着がチロシンリン酸化を介して制御されている事を見出している。そこで共同SH2,SH3配列やチロシンキナーゼによる細胞の接着・形態とりわけカドヘリン機能に注目し研究を進めた。具体的には、花房とメイヤーが樹立した癌遺伝子crkにより癌化された細胞を用いて、浜口はカドヘリン機能を解析した。その結果、Crkは細胞内在性のRasを介してカドヘリン機能を抑制することが明らかとなった。近年の研究から、細胞の形態・接着を制御する細胞内シグナル伝達系は、形態のみならず細胞の分化・増殖や器官形成等根元的な生命現象を制御する事が明らかになりつつあるが、その分子的実態の詳細は解析を要する。さて、この細胞内シグナル伝達系において、リン酸化チロシンとSH2配列及びプロリン繰り返し配列とSH3配列による蛋白質間の結合が鍵を握る事を、共同研究者の花房、メイヤーらは明らかにした。そこで本研究を立案し、共同研究研究者の持つ多様なSH2,SH3配列やチロシンキナーゼ遺伝子を活用し解析を進める事により、細胞の接着・形態とりわけカドヘリン機能を制御する蛋白質群、シグナル伝達系の詳細を明らかにする事が期待できる。昨年6月に浜口と小池は渡米し、花房、メイヤーと研究打ち合わせを行った。また11月に花房は浜口を訪れた。本年1月にメイヤーが来日した。共同研究は順調に進展しつつある。花房の作成した癌化細胞に、カドヘリン遺伝子、dominant negative rasを導入したところ、src癌化細胞の接着能の抑制は、rasを介するシグナル伝達系によって制御されている事を発見した。この結果について、現在小池が中心となり、論文を作成中である。また、浜口はメイヤーの提供したGST-SH2融合遺伝子を用いて、SH2結合蛋白質を精製し、そのモノクロナール抗体の作成に成功している。