hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
公共交通利用促進を目的とした利用援助システムの構築に関する研究

我が国が迎えつつある高齢化社会では,公共交通の果たす役割は大きく,その維持管理に地方自治体が苦慮している例は多い.本研究計画では,情報技術の積極的な導入により,公共交通の利用の利便性を向上させることを目的としている.我々はバスネットと呼ぶ公共交通の利用援助システムの開発とその一般に公開した形での運用を行っており,一月あたりの利用者として数万件のアクセスがある.このようなバスネットの利用者の利用履歴を集計ならびに統計的なデータ解析を行うことで,従来漠然とした理由によりその経路や運行計画を立てていたものに,数値的なバックグラウンドを持つ客観的な判断基準を与えることができるようになると考えている.日本社会が迎えつつある高齢化社会では,公共交通の果たす役割は大きく,その維持管理に地方自治体が苦慮している例は多い.本研究計画では,情報技術の積極的な導入により,公共交通の利用の利便性を向上させることを目的としている.これまでの研究活動により,我々はバスネットと呼ぶ公共交通の利用援助を行うシステムの開発とその一般に公開した形での運用を行っており,一月あたりの利用者として数万件のアクセスがある.このようなバスネットの利用者の利用履歴を集計ならびに統計的なデータ解析を行うことで,公共交通の利用の目的を調べたり,利用の頻度などの1次的な集計・解析をするだけでなく,利用者が望むバス路線の構成や運行形態などのデータを抽出することができると考えている.本研究計画では,このようなデータ解析を行うシステムの構築を目指している.研究計画初年度の平成26年度には,上記の利用履歴を今後継続的に収集するための仕組み作りを行った.本年度開発したシステムでは,バスネットの利用状況を詳しく把握することを目的に,システムの利用履歴をより詳しく残すよう工夫した.具体的には,出発地や目的地,あるいは利用時刻など単純なものだけでなく,経路探索をした時刻とその際に設定した出発時間との関連,あるいは一旦経路探索したにもかかわらず,改めて条件を変えて再検索した場合の入力条件の変化なども集計することとした.これらの詳細な履歴により,本システムの利用者の利用目的や,その後の行動を把握できると考えている.我が国が迎えつつある高齢化社会では,公共交通の果たす役割は大きく,その維持管理に地方自治体が苦慮している例は多い.本研究計画では,情報技術の積極的な導入により,公共交通の利用の利便性を向上させることを目的としている.これまでの研究活動により,我々はバスネットと呼ぶ公共交通の利用援助を行うシステムの開発とその一般に公開した形での運用を行っており,一月あたりの利用者として数万件のアクセスがある.このようなバスネットの利用者の利用履歴を集計ならびに統計的なデータ解析を行うことで,公共交通の利用の目的を調べたり,利用の頻度などの1次的な集計・解析をするだけでなく,利用者が望むバス路線の構成や運行形態などのデータを抽出することができると考え,昨年度はこのようなデータ解析を行うシステムの仕組みの構築を行った.構築したシステムでは,バスネットの利用状況を詳しく把握することを目的に,システムの利用履歴をより詳しく残すよう工夫した.研究計画2年目に当たる今年度は,得られた利用履歴をもとに,利用者がどの地域からどの地域への移動に公共交通を利用しているか解析を行い,いくつかの知見を得た.また,より広い地域での傾向を知るために,バスネットの対応地域を島根県全域に拡大するとともに,外国人への対応としてバスネットの多言語化を試みた.本研究計画で開発を目指すバスネットの利用者履歴とは,1利用開始・終了時間,2利用端末の種類,3設定した出発地・目的地,4バスネットが提示した経路の乗車バス停・下車バス停.乗り換えがある場合には,5出発地から乗車バス停まで,および下車バス停から目的地までの徒歩距離.乗り換えバス停間の徒歩距離,6乗車バス停における待ち時間などである.さらに利用者アンケートとして,7利用目的,8探索結果における満足度などの回答を求める.また,利用者がスマートフォンを使用している場合には,9探索した位置などのデータをもとめる.得られた利用履歴の主成分解析により,第I主成分として鳥取駅を含む地域とその周辺地域への移動が得られ,その移動は主として平日が多い.第II主成分としては,鳥取空港を含む地域と鳥取砂丘を含む地域間での移動が大きく,その移動が思いに休日に多いことがわかった.また,島根県への対応地域の拡大に伴い,バスネットシステムが生成するネットワークを分散的に生成する仕組みを構築した.これにより,対応地域が大きくなってもネットワークデータの生成をより短い時間内に行うことができるようになった.最終年度にあたる本年度は,これまでの研究成果を踏まえ本システムの実用化とともに,その有用性を確認するためにアンケート・モニタリング調査を実施した.本システムを一般へ公開したことで,利用者の実際の利用の際の履歴を収集することができるようになった.得られたデータの代表的な解析例としては,出発地-目的地間の移動履歴から第一の主成分として,鳥取駅の位置する地域とその周辺地域との移動が該当し,第2の主成分としては,鳥取空港が位置する地域と鳥取砂丘がある地域との移動が該当した.さらに,上記の移動に対応する時期的な解析からは,2つの主成分は日頃定常的に発生しているものと,春休み,夏休みの時期に発生していることが分かった.これらの結果は,それぞれ通勤,就学によるものと,観光客の移動に関するものと解釈することができ,バスネットの利用履歴から読み取った結果の妥当性が確認できた.アンケート調査は,本システムの利用者と,利用者でない方々との意識や利用者数の割合などを評価することで,システムのさらなる改良を行おうとするものである.本調査は同時に,本システムの存在を広くバス利用者に広報する意味も持たせている.

なお上記は,現状で経路探索システムとして一般に公開され,すでに広く多くの一般の利用があるバスネットが存在するので収集が可能となったデータに基づいたものである.その意味からも,ここで計画している解析手法やその解析内容は,これまで他所で計画されることがなかった,利用者履歴を詳細に解析しようとするもので,本計画の新規性が表れている.同時にそれらから得られた解析結果は,単なる統計データではなく,今後の路線バスシステムの運行計画に対して重要な指針を与えるものとなった.このような利用者履歴の解析は,これまでになく,利用者履歴データの解析手法や解析内容は,学術的に新たな知見を与えるものとなったと考えている.我が国が迎えつつある高齢化社会では,公共交通の果たす役割は大きく,その維持管理に地方自治体が苦慮している例は多い.本研究計画では,情報技術の積極的な導入により,公共交通の利用の利便性を向上させることを目的としている.我々はバスネットと呼ぶ公共交通の利用援助システムの開発とその一般に公開した形での運用を行っており,一月あたりの利用者として数万件のアクセスがある.このようなバスネットの利用者の利用履歴を集計ならびに統計的なデータ解析を行うことで,従来漠然とした理由によりその経路や運行計画を立てていたものに,数値的なバックグラウンドを持つ客観的な判断基準を与えることができるようになると考えている.本研究計画で開発を目指すバスネットの利用者履歴の収集・解析システムの基礎的な部分ともいえる,利用者の利用履歴を収集する仕組みの考案・実装がほぼ完了した.実装を完了した利用者の利用履歴とは,1利用開始・終了時間,2利用端末の種類,3設定した出発地・目的地,4バスネットが提示した経路の乗車バス停・下車バス停.乗り換えがある場合には,5出発地から乗車バス停まで,および下車バス停から目的地までの徒歩距離.乗り換えバス停間の徒歩距離,6乗車バス停における待ち時間などである.さらに利用者アンケートとして,7利用目的,8探索結果における満足度などの回答を求める.また,利用者がスマートフォンを使用している場合には,9探索した位置などのデータをもとめる.現在ではこれらの生データの集計システムを構築し,それらの特徴を視覚的にもより特徴を見いだしことが容易となるシステムの開発まで行った.今の段階では,得られたデータの集計程度であり,本研究計画で開発を目指す統計的なデータ解析とは呼べないが,利用者の利用頻度の多いバス停やそれらが存在する地域,あるいは利用者の多い時間帯などの解析を行うことができ,今後の解析の基本データともいえるものが収集できている.平成26,27年度に構築した利用者履歴を収集するシステムに基づき,平成28年度も継続してデータ収集を行う.上記,現在までの達成で述べたように,利用者履歴からいくつかの知見は得られているが,今年度も同様の解析を行うが,より広範囲での解析を行うために,島根県で得られる利用者履歴も解析対象に加え,山陰両県での公共交通の利用状況を解析する.また,海外からの旅行者についても解析を行い,どのような地域を訪れる旅行者が存在するのか調査する.
緑膿菌感染における菌体付着機構と代謝酵素発現制御因子との関連解析

緑膿菌は生活環境に広く分布し、日和見感染症や院内感染の起因菌として最も重要な細菌の一つである。消毒薬や抗生物質に抵抗性があり、基礎疾患等で感染防御能が低下した患者にとって重篤な症状を引き起こす緑膿菌は、高い環境適応能力を備える特徴がある。今回、環境変化に伴う代謝機構や形態変化を制御している調整因子について関係を解析したところ、一部機能を共有し、昜感染に貢献している可能性が示唆された。・定着因子である線毛の発現に影響を与える栄養素の検討炭素源、窒素源となる基質の種類を変えた培地で菌体を培養し、線毛の主要なサブユニットの一つであるPilAの発現量の変化を調べることで、線毛発現と栄養条件との関連を解析した。PilAの発現量を測定するため、pilAのプロモーター領域を野生株であるPAO1株からPCRにより得、lacZと融合させたプロモーターアッセイ用のプラスミドを作製した。PAO1株に導入し、基質を変えて培養した菌体でのβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果、ヒスチジンで培養した場合コハク酸+塩化アンモニウム等、他の培地と比べ活性の低下が観察された。現在、引き続き基質の種類を変え活性測定を行っている。また、直接の応答因子であるPilR、窒素利用に関わる応答制御因子であるNtrC、炭素利用に関わる応答制御因子であるCbrBそれぞれの対応遺伝子欠損株を作製途中であり、それぞれの菌株についてpilAおよびpilBのプロモーターアッセイを行い、代謝との関連解析を進める予定である。・代謝酵素発現制御因子の制御機構解析緑膿菌の代表的な代謝酵素発現制御因子であるCbrAB、NtrBCは、菌体付着因子である繊毛の発現制御因子(PilRS)と同じσ54依存性の2成分制御因子であるが、その詳細な制御機構は未だ十分に解析されていない。そこでヒスチジン代謝オペロンをモデルとした制御因子のDNA結合解析を行った結果、プロモーター上流に特異的な結合領域があることを10月に行われた日本細菌学会・関西支部会で報告した。また、緑膿菌のヒスチジン代謝についてPseudomonas Volume 5:A Model System in Biology(Springer)に共著執筆した。(印刷中)緑膿菌の菌体付着初期において重要な因子である線毛の発現について、影響があるとの報告がある生育栄養条件、各発現制御因子との関係を解析した。1.線毛発現制御因子および代謝発現制御因子破壊株の作製線毛の主要な構成成分であるPilAの発現制御因子pilRの破壊株と、pilRと同じσ54依存性の2成分制御応答因子であり、緑膿菌の炭素源利用代謝酵素発現制御因子であるcbrB、および窒素源利用代謝酵素発現制御因子であるntrCの各破壊株、更にそれぞれとpilRとの2重破壊株を作製し、供試菌株とした。2.線毛発現と生育栄養条件との関連解析炭素源、窒素源となる基質の種類を変えた培地(コハク酸+塩化アンモニウム、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン)で各遺伝子破壊株を培養し、Twitching Motility能(TM能)を測定した。その結果、TM能は生育速度に応じた値を示す結果となり、上述アミノ酸における培地成分の明らかな影響は見られなかった。pilR破壊株ではいずれの場合もTM能が完全に抑制された結果となった。3.線毛発現と代謝発現制御因子との関連解析栄養条件との関連について、PilAの発現量の変化を調べることでも解析を行った。昨年度作製した、pilAのプロモーターとlacZとを融合したプロモーターアッセイ用のプラスミドを使用し、各菌株における活性測定を行った結果、ΔpilRではグルタミン酸培地で野生株の1/15まで活性が低下した。また、cbrBとの二重破壊株で更なる低下が見られたことから、cbrBは線毛発現のマイナーな制御因子として関与している可能性が考えられる結果となった。他の栄養条件でも解析中である。・線毛の発現と代謝発現制御因子との関連解析緑膿菌の菌体付着初期において重要な因子である線毛の発現について、生育条件、各種発現制御因子との関係を解析した。これまでに作製した、線毛の主要な構成成分であるPilAの発現制御因子(PilR)の破壊株と、PilRと同じσ54依存型の2成分制御因子であり、緑膿菌の代表的な代謝酵素発現制御因子であるcbrB、ntrC破壊株、更にpilRとの2重破壊株を供試菌株として解析した。昨年度に引き続き、炭素源、窒素源となる基質の種類を変えた培地(各種アミノ酸、糖類)で各供試菌株を培養し、PilAの発現量を解析した結果、培地成分による明らかな影響は見られなかった。既にグルタミン酸培地で確認したCbrBの補佐的な制御が見られる程度であり、予想されたクロストークは確認されず、培地成分と線毛発現との連動は他の要因であることが示唆された。

・医療設備内分離緑膿菌における定着因子の特性医療機関での施設内環境サーベイランスを行い、得られた分離株と、緑膿菌感染症患者由来株との間で特徴的な差があるのか、線毛運動性(TM)に注目して研究を行った。TMが特に高い菌株が、医療施設内分離株で約15%、患者由来株では約55%に見られた。今後、生育環境の違いにおける線毛発現と代謝能との関係解明を進めていく。・緑膿菌のポリアミン存在下における薬剤感受性への影響緑膿菌は培地中へポリアミンを添加すると薬剤感受性が変化するが、その機構は未だ明らかになっていない。2成分制御因子による代謝酵素発現調整を受けているポリアミンの代謝機構から薬剤感受性変化作用点を検討した結果、これらの変化が、ポリアミンの菌体内への移行に伴う現象ではなく、菌体外に存在するだけで生じることを明らかにした。今後、線毛を含めた菌体外のポリアミンから直接影響を受ける箇所の因子について関連解析を進めていく。
東ドイツ文学史記述のための方法論としてのクロノトポス

東ドイツ文学の通史的な文学史把握を批判的に補完するクロノトポス的な考察方法を提示できた。党の文化政策に規定された東独文学にあって、1970年代以降の地下出版文学は小さな「公共性の孤島」を作り出した。そこでは社会的、政治的、経済的なヒエラルキーも国家のイデオロギー言語も完全に放棄された。西側市民社会の「公衆の原理的な開放性」(ハーバーマス)とは違い、芸術家だけからなる小さなサークルは「公共性の孤島」と呼ぶのがふさわしい。その性格を考えるに当たって、バフチンの「クロノトポス」を基本に、フーコーの「ヘテロトポス」やユートピア的なクロノトポスなどを取り込み、概念の精密化にも大きく貢献することができた。本プロジェクトの目的は、クロノトポスとヘテロトポスという時間と空間を掛け合わせた独自な概念を基礎に置いて、東ドイツ文学史を記述することに置かれている。この新たな文学史では目的論を放棄し、発展や衰退などを想定しない。バフチンのクロノトポス概念を援用するエメリヒ、ボッセ、オストハイマーらこれまで蓄積された研究成果を踏まえながら、フーコーのヘテロトポス概念を取り込むことで、概念を拡大していく。東ドイツ文学のなかでも、1980年代に独自の発達を遂げたいわゆる反体制地下出版(サミズダート)文学に焦点を当て、この地下文学が文学史の上でどのように位置づけることができるかを検討している。初年度は当初の研究計画どおりに進行した。まずバフチンのクロノトポス概念に対して、上記の先行研究と対決しながら、詳細な検討を加えた。クロノトポス文学史記述の理論的根底を確立することに成功した。関係する二次文献を読みあさり、この研究テーマを専門とするドイツ語圏のドイツ文学研究者数名と意見交換をおこなった。そのうえで、東ドイツの重要なアンダーグラウンド雑誌の一つを編集し、現在は東ドイツアンダーグラウンド文学アーカイブの所長を務めているウーヴェ・ヴァルンケとコンタクトを持ち、当事者しか知らない貴重な情報を得ることができた。2014年7月末から8月にかけてはドイツに研究滞在した。ベルリンの国立図書館および文学研究センターを訪れて、東ドイツ文学の一次文献と最新の研究書を詳細に読み、資料収集に努めた。この研究成果をもとにして、帰国後(9月から2015年2月にかけて)には、本研究の方法的手がかりをつかむことができた。その際、ヘテロトピー概念により集中的に取り組む結果となったが、これは本プロジェクトの先行研究にない新しさがその点に認められるからである。研究プロジェクトの二年目は、研究計画通りに、アーカイブでの資料収集に重点が置かれた。ベルリン、ハレ、ライプチヒの各大学の図書館資料館を訪れて、1980年代に、東ドイツ国家の検閲によって公式には出版され得なかった地下文学のテキストが公刊されえた独立系文芸雑誌などの資料を研究した。その際、特に『エントヴェアター/オーダー』『アリアドネファビリーク』『リアーネ』『ブレーゲン』の四誌に集中的に取り組んだ。というのも、これらには実験的な抒情詩のテキストが多く発表されていたからである。二重三重の意味をはらむことで、これらのテキストは政治的にも詩論的にも注目すべき特別な文学史的な位置づけを獲得している。研究の二番目のフォーカスは、文芸雑誌、特に『アリアドネファブリーク』の綱領的なテキストを分析することで、ポスト構造主義的な理論を手がかりにして東ドイツの公式の文化政策と相容れない美学的な新しい文学的な試みを浮かび上がらせることにあった。2015年10月に日本独文学会秋期研究発表会(鹿児島大学)で、「東ドイツにおける文学的公共の場」というテーマに関するシンポジウムを主宰し、みずからも「公共性の離れ小島としての地下文学東ドイツにおける独立系雑誌文学」という題目で口頭発表をした。2016年には編集責任者として、シンポジウムの記録論集を日本独文学会研究叢書の形で出版することにしており、2016年4月現在、集まったドイツ語原稿の精査をしている段階にある。さらに、早稲田ドイツ語学文学会の機関誌『早稲田ブレッター』に、本研究プロジェクトの最初の研究成果として、査読付き論文「1980年代の地下出版文芸誌におけるもう一つの東ドイツ文学の声」を発表した。研究計画は計画通りに実行に移されている。ベルリン、ライプチヒ、ハレでのアーカイブ調査は計画通り進んでおり、現地でコピーした資料をデジタル化する作業を進めている、研究計画全体の80パーセント90パーセントの資料がデータベース化された。国際共同研究についても、ミュラー=タム教授(ベルリン自由大学)フルダ教授(ハレ大学)、シュナイダー教授(ライプチヒ大学)、ヘルビヒ教授(ロストック大学)ら国際共同研究のパートナーとも緊密に連絡を取り合って、共同研究の推進は想定以上に進んでいる。最終年度後半に計画している東京での国際シンポジウムについては、国際共同研究者たちの日程調整の都合もあり、ドイツで開催することになるかもしれず、この点については現在調整中である。研究成果の発表は、「早稲田ブレッター」に論文を発表したのなど15本にのぼり、口頭発表も5本であり、この点では想定以上以上の進展を認めることができる。東ドイツ文学における時間と空間の関係を研究することから出発して、ドイツの図書館やアーカイブでの資料調査研究を推し進め、これまでの通史的な文学史把握に対抗するものとして、クロノトポス的な考察方法の可能性を提示することができた。

東独文学は党主導の文化政策と検閲の影響を強く受けていたが、監視の網をかいくぐって読者聴衆を見出し、小さな「公共性の孤島」を作り出すことも可能であった。特に注目されたのは、1970年以降に活発になったいわゆるザミスダート(地下出版)文学である。この非公式的な公共の場では社会的、政治的、経済的なヒエラルキーは取り除かれ、メンバーの対等な関係が保証されたし、国家のイデオロギー言語も完全に放棄されることもできた。そこで議論されたのは公式の場では語り得ない主題で、これによって党公認の公共性の場を補完する役割を果たした。この空間は、多くの点で西側市民社会の公共性とも共通するが、「公衆の原理的な開放性」(ハーバーマス)とは違って、東ドイツの小さなサークルはあくまでも詩人、作家たちによる閉じた組織であった。それゆえに本研究では「公共性の孤島」と呼ぶことにした。そしてこの性格を考える場合に、バフチンの「クロノトポス」ほどふさわしい概念はないということが明らかになった。そればかりではなく、「ヘテロトポス」的なクロノトポスやユートピア的なクロノトポスなど、この概念の精密化にも大きく貢献することができた。研究の成果としては、査読制学術雑誌『早稲田ブレッター』に「1980年代の地下出版雑誌にみるもう一つの東ドイツの声」を発表して、多様性をもつクロノトポスの概念を発展させた。2015年秋にはドイツからも研究者を招聘して、日本独文学会のシンポジウムを主催したが、2016年度にその記念論集を責任編集者としてまとめて公刊することもできた。東ドイツ文学の通史的な文学史把握を批判的に補完するクロノトポス的な考察方法を提示できた。党の文化政策に規定された東独文学にあって、1970年代以降の地下出版文学は小さな「公共性の孤島」を作り出した。そこでは社会的、政治的、経済的なヒエラルキーも国家のイデオロギー言語も完全に放棄された。西側市民社会の「公衆の原理的な開放性」(ハーバーマス)とは違い、芸術家だけからなる小さなサークルは「公共性の孤島」と呼ぶのがふさわしい。その性格を考えるに当たって、バフチンの「クロノトポス」を基本に、フーコーの「ヘテロトポス」やユートピア的なクロノトポスなどを取り込み、概念の精密化にも大きく貢献することができた。2014年度の課題は、クロノトポスとヘテロトポスという二つの時空間概念の東ドイツ文学史記述への応用可能性を検討することに置かれていた。比較的新しい両概念を概念史の上で正確に位置づけるために、まずは両概念とユートピアなどの近接概念との差別化を先行研究の批判的な検討を通じて図った。その上で、東ドイツ文学史理解にとって両概念がどこまで有効であるかを見比べていった。国内外の専門家たちとのディスカッションによって、この所期の目的は十分に果たせたということができる。もう一つの成果としては、国内外の専門家とコンタクトをとるなかで、最終年度に計画している国際シンポジウム実施のための人的ネットワークの構築に成功したことがあげられる。2015年秋の日本独文学会研究発表会に向けて、現在国内から4名が参加し、ドイツからロストック大学のヘルビッヒ教授を招聘する計画が進行中であり、この礎の上に、2016年秋をめどにして計画を進めているさらに規模の大きな国際学会を実現できると考えている。
イヌES細胞株の樹立と再生獣医学への応用

イヌにおける発情誘起、体外受精およびES細胞株の樹立について検討し、以下のことを明らかにした。1.雌イヌでは、発情開始に先立って視床下部中P450アロマターゼ遺伝子の発現量、視床下部および下垂体中エストロジェンレセプターαおよびβ遺伝子の発現量、および血中エストラジオール-17β濃度が増加することが明らかとなった。2.性腺刺激ホルモン放出ホルモンの徐放剤(酢酸リュープリン)の経鼻投与により、雌イヌにストレスを与えることなく発情誘起が可能であり、エストロジェンの経口投与どの併用により、さらに効率よく発情誘起できることが示された。3.エストロジェンおよび上皮成長因子は、イヌ卵子の第一減数分裂中期までの成熟を促進するが、両者だけでは第二減数分裂中期への成熟を促進しないことが明らかとなった。4.胎子線維芽細胞と共培養することにより、イヌ卵子の核および細胞質の成熟が促進され、イヌ胎子線維芽細胞群では16細胞期、マウス胎子線維芽細胞群では桑実胚までの受精卵を得ることができた。5.イヌES様細胞の初代コロニー形成率は、桑実胚0%、胚盤胞期胚25.6%、,脱出胚盤胞期胚67.9%であり、脱出胚盤胞期胚からES様細胞を効果的に分離・培養できることが分かった。6.イヌES様細胞は幹細胞特有の形態的特徴を持ち、強いアルカリ性ホスファターゼ活性を有しており、胚性抗原のSSEA-1や、遺伝子の転写因子であるOct-4など陽性を示し、浮遊培養によって嚢胞状の胚様体を形成した。また胚様体の接着培養により、神経細胞様、上皮細胞様、線維芽細胞様、色素産生細胞様、および拍動する心筋細胞様の細胞群が観察された。7.コラゲナーゼ処理によるイヌES様細胞の継代では3代目にはすべてのコロニーが分化・死滅したが、物理的継代では2つのcell-lineが8代目まで未分化な状態を維持できた。イヌ胚盤胞期胚供給のための基礎的技術の確立として、雌イヌの発情回帰におけるエストロジェンの役割について検討するとともに、エストロジェンと性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の徐放剤を用いて、雌イヌの発情の人為調節を検討した。さらに、卵巣刺激後、雄イヌと交配させた雌イヌから、胚盤胞期胚の採取とES細胞(胚性幹細胞)株の樹立を試み、以下の結果を得た。1.雌イヌにおいては、視床下部中エストロジェン合成酵素であるアロマターゼ遺伝子の発現量が発情開始に先立って増加するとともに、視床下部および下垂体中エストロジェンレセプターαおよびβ遺伝子の発現量も併行して増加することが明らかとなった。2.GnRHの経鼻投与により雌イヌの発情誘起が可能であり、エストロジェンの経口投与との併用により、さらに効率よく発情誘起できることが示された。3.発情誘起後、雄イヌと自然交配した雌イヌの子宮から胚盤胞期胚を採取する時期を検討した結果、交配後1516日目においてES細胞を分離するのに適した胚が得られることが分かった。4.胚盤胞期胚の内部細胞塊を分離後、マウス胎仔線維芽細胞と共培養した結果、分化した細胞に混ざって形態的に細胞質が少なく、相対的に核の占める割合が多いES細胞と思われる細胞のコロニーを選別することができた。本細胞はマウスやカニクイザルのES細胞と同様に強いアルカリ性ホスファターゼ活性を有していることが示された。

継代培養することにより、拍動する心筋などに分化することが観察された。以上の結果のように、イヌ胚盤胞期胚を効率よく採取する方法を確立し、ES細胞と思われる細胞コロニーを分離することができ、細胞の性質や細胞株の樹立方法については、現在さらに本実験を継続して検討中である。イヌ胚盤胞期胚供給のための基礎的技術の確立として、雌イヌ卵巣中エストロジェンレセプター(ER)αとβ遺伝子(mRNA)の発現を調べるとともに、卵胞内未成熟卵子の体外成熟過程に及ぼすエストロジェンの役割について検討した。また、エストロジェンと性腺刺激ホルモン放出ホルモンの徐放剤を用いて卵巣刺激後、雄イヌと交配させた雌イヌから、胚盤胞期胚の採取とES細胞(胚性幹細胞)株の樹立を試みた。さらに、β2-マイクログロブリン遺伝子をノックアウトしたマウス(MHC欠損マウス:免疫拒絶反応を起こさない臓器をもつマウス)からのES細胞株の樹立を試み、以下の結果を得た。1.雌イヌにおいては、卵巣中ERβmRNAの発現量はERαmRNAに先行して、無発情期の中期から後期および発情前期において高まることが明らかとなった。2.卵丘細胞の付着したイヌ未成熟卵子にエストラジオール-17βを添加した場合、卵丘細胞を除去した卵子に比べ、卵子の成熟が促進されることが示された。3.イヌ胚盤胞期胚の内部細胞塊を分離後、マウス胎仔線維芽細胞と共培養した結果、分化した細胞に混ざって形態的に細胞質が少なく、相対的に核の占める割合が多いES細胞と思われる細胞のコロニーを選別することができた。本細胞はマウスやカニクイザルのES細胞と同様に強いアルカリ性ホスファターゼ活性を有していることが示された。本細胞は5代目まで形態を維持することが観察された。4.MHC欠損マウスから上記3と同様にしてES細胞と思われる細胞のコロニーを分離することができた。本細胞は強いアルカリ性ホスファターゼ活性を有しており、3代目まで形態を維持することが観察された。以上の結果のように、イヌでは発情回帰に伴い、卵巣におけるERβの発現が高まること、エストロジェンは卵丘細胞を介して卵子の成熟を促進することを明らかにするとともに、イヌおよびMHC欠損マウスの胚盤胞期胚からES細胞と思われる細胞コロニーを各々分離することができた。現在、イヌES細胞の未分化状態を維持するために、イヌ白血病阻害因子(LIF)の作製を試みており、さらに本実験を継続して検討中である。イヌES細胞株の樹立に必須となる胚盤胞期胚を安定して供給するために、他の動物種に比べてイヌでとくに立ち遅れている体外受精の技術開発を試みた。すなわち、イヌにおける卵胞内未成熟卵子を体外で成熟させる方法、および精子の受精能獲得法について検討した。さらに、イヌ胚盤胞期胚から分離したES様細胞株の特性を解析し、以下の結果を得た。1.若く、発情期のイヌ卵巣から良質の卵子が数多く採取できることが示された。2.未成熟卵子をマウスあるいはイヌ胎子線維芽細胞と共培養することにより、卵子の体外成熟は促進され、体外受精には48時間培養が適していた。3.Epidermal growthfactor (EGF)は卵丘細胞に存在する自身のレセプターを介して、卵子の成熟を促進していることが示された。4.精子の受精能獲得には、swin up法を用いて、TYH培地で34時間培養することが体外受精に適していた。5.マウスあるいはイヌ胎子線維芽細胞は体外成熟だけではなく、受精および胚の発育にも効果的であった。6.イヌ胚盤胞期胚の内部細胞塊を分離後、マウス胎子線維芽
アルツハイマー病克服を目指したアミロイド凝集およびBACE1の阻害剤開発

日本は急速に高齢化社会に移行しており、アルツハイマー病(AD)患者の増加は国家の基盤を揺るがす社会問題となっている。アルツハイマー病を克服するため、アミロイドβの凝集およびBACE1の阻害剤を設計した。チアジアゾール骨格を有するBACE1阻害剤は膜透過性が向上しており、医薬候補化合物として有望である。凝集阻害剤は特定のAβコンホマーを認識するため、アルツハイマー病の病理解析のツールとして有用である。日本は急速に高齢化社会に移行しており、アルツハイマー病患者の増加は国家の基盤を揺るがす社会問題となっているが、未だ根本的治療薬は存在しない。本研究はアルツハイマー病の克服を目指し、発症の原因物質であるとされているアミロイドβペプチド(Aβ)の凝集阻害剤および産生酵素であるβ-セクレターゼ(BACE1)を阻害する医薬候補化合物を複数創製することを目標とする。報告されているAβ阻害剤はAβの特定の部位を認識すると思われるが、Aβはモノマー、オリゴマー、フィブリルなど様々な会合状態が知られており、固体NMRに基づいた複数の立体構造が提案されている。従来の阻害剤は特定の立体構造のAβを認識するわけでなく、薬効の評価のあり方に問題点があった。本研究代表者は特定のAβコンホマーを認識する阻害剤を設計した。この阻害剤を用いると、Aβの凝集体に含まれるAβコンホマーの解析が可能になり、Aβの凝集メカニズムの解析ツールとしても使える。今後、この阻害剤を用いて、より低分子で実用的な凝集阻害剤を設計したい。BACE1のArg235側鎖と阻害剤の相互作用は阻害活性発現に重要な意味を持っており、本研究代表者は、Arg235側鎖との相互作用に着目してKMI-1303などの強力な低分子阻害剤を設計した。この化合物は研究用試薬として和光純薬工業(株)から発売されている。さらに世界最小の分子サイズを持つBACE1阻害活性を示すペプチドを設計した。これは天然アミノ酸のみで構成されており、将来、アルツハイマー病の遺伝子治療にも応用できると期待される。本研究はアルツハイマー病克服を目指し、発症の原因物質であると考えられているアミロイドβペプチドの凝集阻害剤、およびその産生酵素であるβ-セクレターゼ(BACE1)を阻害する医薬候補化合物を複数創製することを目標とする現在、報告されている阻害剤はAβ分子の特定の部位を認識するように設計されているが、Aβはモノマー、オリゴマー、フィブリルなど様々な会合状態が知られており、個体NMRによる複数の立体構造が提案されている。従来の阻害剤はKLVFFA配列などのAβ分子の一部分のみを認識するため、阻害メカニズムや評価のあり方に問題があった。本研究代表者は、Aβの立体構造を決定する重要な部分は、Aβのターン構造であると考え、Aβのターン部分を認識する化合物を設計した。これは抗体を除き、低分子化合物としては世界初である。この阻害剤ライブラリーを用いると、Aβ凝集体に含まれるAβコンホマーの解析が可能になる。今後、この阻害剤を用いて、より低分子で実用的な凝集阻害剤の創製が期待される。BACE1のX線結晶構造およびSwedish-mutantAPP配列に基づいた阻害剤が報告されて以来、Swedish-mutant配列に基づいて阻害剤が設計されてきた。しかしながら野生型とSwedish-mutantのkm値は同じであり、BACE1に対する親和性は変わらない。Swedish-mutant配列はkcat値が高いため、BACE1により切断されやすと考えられるが、このような相互作用は阻害剤として好ましくない。研究代表者はこの点に着目し、in-silicoで高活性な阻害剤を設計した。本研究代表者はAβのターン構造をミミックするリンカーを有するペプチドを合成し凝集阻害剤ライブラリーを作製した。この凝集阻害剤は特定のAβコンホマーを認識する。この阻害剤ライブラリーを用いて、Aβ凝集体には27-31位でターン構造を有する(27-31)-turn Aβがと25-28位でターン構造を有する(25-28)-turn Aβが少量混在していることを明らかにした。また天然アミノ酸に置換した阻害剤ライブラリーも設計し、同様な阻害プロファイルを示すことも確認した。今後、これらの阻害剤ライブラリーを用いて、より実用的な低分子Aβ凝集阻害剤を開発したい。多くの研究者はSwedish-mutantAPP配列に基づいて阻害剤を設計してきた。しかしながら野生型とSwedish-mutantのkm値はほとんど同じであり、BACE1に対する親和性は同じと言える。Swedish-mutant配列はkcat値が高いため、BACE1により切断されやすいと考えられるが、このような相互作用は阻害剤として好ましくない。Swedish-mutant型阻害剤とBACE1阻害剤との相互作用に特徴的なのは、P2部位に見られるBACE1のArg235側鎖との水素結合による相互作用だが、多くの高阻害活性を示すBACE1阻害剤はこの部分がメチル基のような疎水性基でBACE1のArg235側鎖とσ-π相互作用をしていた。水素結合の方がσ-π

相互作用よりも結合エネルギーが高いため、ドッキング計算によるスコアリングでは水素結合をするSwedish-mutant型阻害剤の方がスコアが高く出る。しかしながら、Swedish-mutant型阻害剤は一部の例外を除いて、ほとんどBACE1阻害活性がない。本研究代表者はこの点を改善すべくelectrondonor bioisostereの概念を提唱し、高活性なBACE1阻害剤を設計した。日本は急速に高齢化社会に移行しており、アルツハイマー病患者の増加は国家の基盤を揺るがす社会問題となっているが、未だ根本的治療薬は開発されていない。本研究課題はアルツハイマー病克服を目指し、発症の原因物質であると考えられているアミロイドβペプチドの凝集阻害剤、およびその産生酵素であるβ-セクレターゼ(BACE1)を阻害する医薬候補化合物を複数創製することを目標としている。現在、報告されているAβ凝集阻害剤はAβ分子の特定の部位を認識するように設計されているが、Aβは会合状態によりモノマー、オリゴマー、フィブリルなど様々の形態が知られており、固体NMRにより複数の立体構造が提案されている。例えばAβの凝集過程に重要な役割を果たすKLVFFA配列に結合する阻害剤が報告されているが、KLVFFAモチーフはモノマーにもオリゴマーにも存在し、阻害剤はAβの構造の一部を認識するのみであり、凝集阻害メカニズムの解析や評価のあり方に問題があった。本研究代表者は、オリゴマー中のAβ分子の立体構造を決定する重要な部分はAβ中のターン構造であるとの仮説に基づき、Aβのターン構造を認識する阻害剤を設計した。BACE1のX線回折による結晶構造およびSwedish-mutantAPP配列に基づいた阻害剤が報告されて以来、多くの阻害剤が報告されてきた。しかしながら、野生型とSwedish-mutant型のAPPのkm値はほとんど同じであり、BACE1の活性中心に対する親和性は同程度であると思われる。Swedish-mutant型のAPPはkcatの値が高いため、BACE1により切断されやすいと考えられが、このような相互作用は阻害剤として好ましくない。本研究代表者はこの点に着目し、Swedish-mutant型のAPPとBACE1の相互作用に基づかない阻害剤を設計した。本研究代表者はAβのターン構造をミミックするリンカーを有するペプチドを合成し、凝集阻害剤ライブラリーを作製した。この凝集阻害剤は特定の立体構造を有するAβコンホマーを特異的に認識する。この凝集阻害剤ライブラリーを用いて、Aβ凝集体には(27-31)-turn Aβと、ごく僅かに(25-28)-turn Aβが混在していることを明らかにした。しかしながら、これらの阻害剤はリンカーとして複雑な非ペプチド部分を有している。そこでリンカー部分をプロリン3残基に置換した阻害剤も合成した。この阻害剤はアミノ酸のみで構成されており、これらのアミノ酸配列をコードしたDNAを用いたアルツハイマー病の遺伝子治療にも応用できると考えられる。今後、これらの阻害剤ライブラリーを用いて、より実用的な低分子Aβ阻害剤を開発したい。多くの研究者はSwedish-mutantAPP配列に基づいてBACE1阻害剤を設計してきた。
肺癌の特異的血清およびエクソソーム由来マイクロＲＮＡの同定および個別化治療の応用

肺癌特異的な血清エクソソーム由来マイクロRNA (miRNA)を同定することを目的とする。非小細胞肺癌細胞(NSCLC)20株の細胞培養上清中のエクソソームからの網羅的miRNA発現解析にて、17のmiRNAが肺癌細胞上清中エクソソーム内で有意に発現が上昇していた。NSCLC患者20例の血清中のエクソソーム由来miRNA網羅的発現解析にて、肺癌患者で有意に発現上昇している13のmiRNAを同定した。このうち、miR-30c発現上昇を共通に認め、腺癌、特にEGFR陽性肺腺癌において発現が高かった。血清エクソソームmiR-30cは、NSCLC、特に肺腺癌における新規バイオマーカーになり得る。本研究は、肺癌特異的な分泌型miRNAである血清miRNAおよびエクソソーム由来miRNAの存在を解明し、肺癌の新規血清バイオマーカーとして臨床応用することを目的とする。平成25年度は、平成24年度に確立したエクソソーム由来miRNA手法を用いて、肺癌細胞株30株の培養上清を用いたエクソソーム由来miRNAの網羅的解析を施行した。30肺癌細胞株培養上清からのRNA量は十分であることを確認し、5細胞株においては、エクソソームmiRNAの網羅的解析に成功したが、他の25株に関しては、再現性のある結果が得られていない。原因として培養上清中のエクソソームが微量であると考えられ,サンプル量の調整やウエスタンブロットによるのエクソソームマーカーでの検証など,現在実験手法を再検討中である。本研究は、肺癌特異的な分泌型miRNAである血清miRNAおよびエクソソーム由来miRNAの存在を解明し、肺癌の新規血清バイオマーカーとして臨床応用することを目的としている。しかしながら、そのエクソソーム由来miRNAの同定方法は未だ十分に確立されておらず、また肺癌における報告はほとんどなされていないのが現状である。今年度は、肺癌細胞株培養上清および健常者血清(研究者および共同研究者)からエクソソーム分画のみを抽出し、miRNAを精製する方法の最適化につきまず検討した。種々の細胞の条件設定に加え、超遠心法およびExoQuick Exosome precipitation solution (System Bioscience)を用いた検討で、ExoQuick Exosome precipitation solutionからのエクソソーム分画抽出とmiRNAの精製の最適化に成功した。エクソソーム分画の確認は、CD9/ CD63 Exosome ELISA Kit(System Biosciences)を用いたエクソソームマーカーにて検証を行った。次にそのサンプルから純度の高いmiRNAを精製し、3D-GENE(東レ)による解析にて再現性のあるmiRNA発現解析に成功した。このように、現在までに確立された血清エクソソーム由来miRNAの同定方法は十分に確立されておらず、この同定方法の確立は、今後の研究遂行の当たっては意義が高く、研究の第一段階での目標は達したと考えている。本研究では、肺癌特異的な分泌型miRNAである血清マイクロRNA、特にエクソソーム由来miRNAの存在を解明し、肺癌の新規血清バイオマーカーとして臨床応用することを目的とする。平成24年度から平成25年度の2年間に血清および細胞培養上清中からのエクソソーム由来miRNAの抽出方法を検討し、ExoQuick Exosome precipitation solution kitを用いた3D-GENEによる解析が最適であることを見出した。平成26年度は、この手法を用いて、20の肺癌細胞株上清と20の肺癌患者血清を用いたエクソソーム由来miRNAの網羅的解析を施行し肺癌患者特異的なエクソソーム由来miRNAを同定し、新規診断マーカーとしての可能性を検討した。現在解析中であり、研究成果報告書にて詳細を報告する予定である。肺癌肺癌細胞培養上清からのエクソソームが微量であるため,再現性のある結果が得られていない.現在実験手法を再検討中である.今年度までに、エクソソーム由来miRNA解析手法の確立に成功しており、研究の第一段階での目標は達したと考えている。現在細胞培養上清量を増やし、ウエスタンブロットによるエクソソームの検証を予定している。培養上清からのエクソソームの検証後、残り25細胞株のエクソーム由来miRNA発現解析を行う。平行して、肺癌患者血清を用いたエクソーム由来miRNA発現解析を行う。平成24年度に確立したエクソソーム由来miRNA解析手法を用いて、平成25年度は、肺癌細胞株培養上清と患者血清を用いた網羅的解析を行う。1肺癌細胞株30株の培養上清を用いたmiRNA網羅的発現解析を行い、既知の細胞株のmiRNA発現解析データとの対比から、in vitroにおける分泌型miRNAについての意義を検証する。

2肺癌患者(肺腺癌、肺扁平上皮癌、健常喫煙者、健常非喫煙者血清各10例ずつ)のエクソソーム由来のmiRNA網羅的発現解析を行い、各群における特異的血清miRNAをスクリーニングする。3バイオインフォマティクスの手法を用いて、細胞上清および患者血清miRNA網羅的発現データを統合解析し、肺癌におけるエクソソーム由来miRNAのメカニズムを明らかにする。研究の遅れで消耗品が使い切れなかった平成26年度の計画に大きな変更がないが、平成25年度に購入できなかった消耗品を購入する予定である。平成24年度に確立したエクソソーム由来miRNA解析手法を用いて、肺癌細胞株培養上清および患者血清を用いたエクソソーム由来miRNA網羅的解析を行う.研究代表者分102万(平成25年度研究費(95万)と平成24年度繰越研究費(7万))13D-GENE(miRNAアレイ)解析96万(12万/アレイ×8検体分)2国内学会出張費6万(一部データ発表と研究のための情報収集)(10月癌治療学会)研究分担者分5万(データ解析のための生化学試薬など)
階層的生物評価系を用いた脳機能改善薬の創製

私達は、新規アルツハイマー病治療候補薬であるST101 (spiro[imidazo[1,2-a] pyridine-3,2-indan]-2(3H)-one)がT型電位依存性カルシウムチャネル活性化を介し、認知機能を亢進させることを報告した。本研究では、電気生理学的手法を用い、ST101よりも強力なT型電位依存性カルシウムチャネル活性化作用を持つ化合物を探索し、階層的生物評価系を用い、脳機能改善効果を検討した。パッチクランプ法を用い、ST101の誘導体であるspiroimidazopyridine derivatives (SAKs)の中でも特にT型電位依存性カルシウムチャネル活性化作用が強いSAK3を見出した。記憶・学習障害モデル動物である嗅球摘出(OBX)マウスを用い、ST101とSAK3の脳機能改善効果を比較した。ST101 (0.5 mg/kg, p.o.)急性投与ではOBXマウスの記憶・学習障害は改善されないが、SAK3 (0.5 mg/kg, p.o.)急性投与では改善した。この改善効果はT型電位依存性カルシウムチャネル阻害薬により抑制された。さらに、SAK3 (0.5 mg/kg, p.o.)急性投与によりアセチルコリン遊離が促進し、この促進効果はT型電位依存性カルシウムチャネル阻害薬により完全に抑制された。以上の結果から、T型電位依存性カルシウムチャネル活性化は脳機能の低下を改善し、記憶・学習障害を改善したと考えられる。今後は、T型電位依存性カルシウムチャネル活性化による記憶・学習障害改善効果について詳細なメカニズムを検討し、記憶・学習に対するT型電位依存性カルシウムチャネルの生理的な機能を明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。天然物創薬研究ではシーズ探索の階層的生物評価系の確立が必須である。最初に、脳機能改善薬をスクリーニングするために、神経伝達物質遊離、脳内一酸化窒素遊離測定、神経細胞におけるCa2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)活性、情動運動機能及び認知機能を評価する階層的生物評価系を確立した。これらの評価系を用いて、本研究では1)柑橘系果皮から抽出単離したノビレチンがT型カルシウムチャネルを活性化して、海馬内でドパミン放出を促進すること、海馬神経細胞においてCaMKIIを活性化することを明らかにした。CaMKIIの活性化を介して、ドパミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素のリン酸化反応し、ドパミン合成が促進された。その結果、パーキンソン病モデルマウスであるMPTP処置マウスの認知機能と錐体外路系障害を改善した。次に、2)機能性食品(アミノ酸)であるL-シトルリンが脳梗塞後の脳血管内皮細胞の一酸化窒素合成酵素(eNOS)を保護することにより、神経細胞死を抑制すること、L-アルギニン脳内投与法による一酸化窒素の産生が上昇することを明らかにした。その結果、脳梗塞モデルマウスでは、脳梗塞後の認知機能障害を改善された。これらの研究により、天然物ノビレチンおよび機能性食品L-シトルリンの脳機能改善のメカニズムを解明し、有効性の医学的根拠を明らかにした。さらに、私達が構築した階層的生物評価系は天然物及び機能性食品の有効性を担保する新規の高次脳機能評価系として応用できる。柑橘系果皮成分ノビレチンや機能性食品L-シトルリンはこれまでに末梢作用については多くの知見がある。しかし、中枢移行性が不明であることから脳機能改善作用のメカニズムは不明であった。最近、ノビレチンが中枢移行性に優れていることが他の研究により明らかになった。

私達の研究は、経口投与したノビレチンが中枢で神経伝達物質の放出を促進することを示した初めての研究成果であり、今後、機能性食品としての開発を加速させることができる。実際に、ノビレチンを多く含む抑肝散がアルツハイマー病患者の周辺症状を改善するという臨床治験も得られている。27年度が最終年度であるため、記入しない。1)L-シトルリン投与によりeNOSの保護作用を明らかにした。実際に脳内で一酸化窒素(NO)の産生が亢進するのかマイクロダイアリシス法で確認する。2)新たにATP感受性カリウムチャネルを賦活化して、脳機能を改善するアダマンタン誘導体誘導体を創製した。階層的生物評価系を用いて、脳機能改善の作用機序を明らかにする。
顆粒球系細胞をターゲットとした中枢神経系脱髄疾患の疾患制御と生物学的意義の解明

視神経器脊髄炎(NMOSD)はアクアポリン4 (AQP4)水チャネル分子を発現するアストロサイトを標的とする中枢神経系自己免疫疾患である. NMOSDの早期活動病巣ではAQP4発現低下,血管周囲の免疫グロブリン/活性化補体沈着,顆粒球,マクロファージ,組織常在リンパ球の浸潤を認めたことから, AQP4自己抗体は顆粒球をはじめとした免疫細胞と共同で活動病変を形成することが示唆された.またその結果,引き起こされたアストロサイト傷害は,変性ミトコンドリア集積を介し,神経軸索変性を来し,重篤な身体機能・視機能障害を引き起こすことが示唆された.視神経脊髄炎(NMO)は多発性硬化症(MS)との異同が長く論じられてきた中枢神経脱髄疾患である. NMOは近年, (1)アクアポリン4 (AQP4)を標的とする自己抗体が原因のアストロサイトパチーである,(2)免疫グロブリン・補体の血管中心性沈着と,好中球など顆粒球系細胞の集積を病変に認める,(3)インターフェロン(IFN)-beta療法などのMSに対する疾患修飾薬が増悪因子になることが発見され,その免疫基盤はMSとは異なると考えられている.本研究では「顆粒球系細胞の活性化による好中球細胞死(NETosis)や好中球細胞外捕捉(NETs)形成が, I型IFNシグナルと協調することで,免疫寛容の破綻とAQP4抗原に対する自己免疫応答の活性化を促し, NMOの病巣形成の始動と炎症量の増幅をもたらす」という仮説を立て,証明することを目的とする.初年度である平成26年度は上記目的を達成するための基盤と考え,以下を行った. (1)免疫組織学的検索によりNMOの中枢神経系に顆粒球系細胞の浸潤形態の詳細を検討した.(2)疾患対照として,顆粒球系細胞が病態に重要な役割を持つ細菌性髄膜炎などを対象にNETsを検討し, NMOとMSにおけるNETs検索の基盤を作成した.(3)健常者における顆粒球系細胞表現型の多様性解析や,プライミング刺激による活性酸素量を定量化し, NMOとMSの末梢血・髄液の顆粒球系細胞の表現型解析の基盤を形成した.本研究の継続により顆粒球系細胞の役割が明らかになれば, NMOやMSの新しい分子標的療法・新規治療ツールの可能性を提言するだけにとどまらず,自己免疫疾患において自然免疫機構(顆粒球系細胞とその上流)と適応免疫機構(自己抗体)を繋ぐ新たなメカニズムを探索できる可能性がある.視神経脊髄炎(NMO)は多発性硬化症(MS)との異同が長く論じられてきた中枢神経脱髄疾患である. NMOは近年, (1)アクアポリン4 (AQP4)を標的とする自己抗体が原因のアストロサイトパチーである,(2)免疫グロブリン・補体の血管中心性沈着と,好中球など顆粒球系細胞の集積を病変に認める,(3)インターフェロン(IFN)-beta 1a/1b療法などのMSに対する疾患修飾薬が増悪因子になることが発見され,その免疫基盤はMSとは異なると考えられている.本研究では「顆粒球系細胞の活性化による好中球細胞死(NETosis)や好中球細胞外捕捉(NETs)形成が, I型IFNシグナルと協調することで,免疫寛容の破綻とAQP4抗原に対する自己免疫応答の活性化を促し, NMOの病巣形成の始動と炎症量の増幅をもたらす」という仮説を立て,証明することを目的とする.平成26年度(初年度)は, (1)免疫組織学的検索によりNMOの中枢神経系に顆粒球系細胞の浸潤形態の詳細を検討した.(2)疾患対照として,顆粒球系細胞が病態に重要な役割を持つ細菌性髄膜炎などを対象にNETsを検討し, NMOとMSにおけるNETs検索の基盤を作成した.(3)健常者における顆粒球系細胞表現型の多様性解析や,プライミング刺激による活性酸素量を定量化し, NMOとMSの末梢血・髄液の顆粒球系細胞の表現型解析の基盤を形成した.平成27年度(次年度)は, (4) NMOとMSの病変形態の再評価を行った. NMOでは脱髄を超えて,広くアストロサイト障害・ミクログリア活性化のある部位に,変性ミトコンドリアの集積した神経軸索障害を認めた.顆粒球系細胞は,必ずしも「アストロサイト障害・神経軸索障害のある病変の広がり」に一致して浸潤しているわけではなく,「病期」に依存した浸潤形態を示した.以上より,「病期」依存的に顆粒球系細胞が重要な役割を果たしている可能性が示唆された.本年は3年計画の2年目である.これまでにNMOとMSの中枢神経病理の詳細な検討から,顆粒球系細胞の浸潤形態を病変の広がりと病期という二つの軸で検討した.これを基盤に現在,精力的にNMOとMSにおける顆粒球系細胞の役割を検討している途上である.視神経脊髄炎(neuromyelitis optica; NMO)は多発性硬化症(multiple sclerosis; MS)との異動が長く論じられてきた中枢神経炎症性自己免疫疾患である. NMOは近年, (1)アクアポリン4 (aquaporin-4; AQP4)水チャネルを標的とする自己抗体が原因として発症するアストロサイトパチーである,(2)免疫グロブリン・補体の血管中心性沈着と顆粒球系細胞の集積を中枢神経病変に認める,(3) MSとは異なり,インターフェロン(interferon; IFN)-beta 1a/1