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脊髄損傷修復作用をもつヒト歯髄由来細胞の特性の解明とその医学的応用

以前の研究から、脊髄損傷モデルラットに線維芽細胞増殖因子(FGF2)を投与すると脊髄内在性の間質系細胞の誘導を介し、軸索再生を促し後肢の運動機能が顕著に回復することを明らかにしていた。また、近年、類縁の間質系細胞である歯髄細胞を脊髄損傷モデルに移植すると、同様の治療効果が得られることが報告された。本研究では、この2つの併用による相乗効果の可能性を検討した。FGF2処理した歯髄細胞は無処理の細胞よりも顕著な移植治療効果を示した。また、治療効果にはドナーによる差を認めた。さらに、FGF2注入と歯髄細胞の移植はそれぞれ単独で顕著な治療効果を示したが、2つの併用は効果増強にはつながらなかった。国内の脊髄損傷の患者総数は約10万人であり、毎年5000人が新たに受傷している。脊髄に損傷を受けると損傷部より下位の運動・知覚機能が失われてしまう。中枢神経系では軸索再生が困難であり、失われた機能が回復することはない。抜本的治療法の開発が切望されている。申請者らはFGF2に応答性のラット脊髄内在性線維芽細胞(FIF)細胞あるいはヒトの歯髄細胞を脊髄損傷モデルラットの損傷部に移植すると、運動機能が顕著に改善することを見出している。本研究ではこの成果を臨床応用に結びつけるべく、研究を展開している。FGF2の添加の有無により培養した1ドナー由来の細胞を脊髄損傷モデルラットの損傷部に移植したところ、顕著な運動機能回復効果を示したが、FGF2不含培地で培養した同じドナー由来の細胞では細胞非移植群と同様に麻痺した後肢の運動機能回復は認められなかった。また、同年齢、同性別かつ歯牙形成のステージもほぼ同等の3種のドナー由来の歯髄細胞をFGF2を含む培地で培養して移植したところ、2種のドナー由来歯髄細胞の移植では顕著な運動機能回復効果を示したが、残り1種のドナー由来歯髄細胞では細胞非移植群とほぼ同等に麻痺した後肢の運動機能回復が認められなかった。したがって、歯髄細胞の移植による脊髄損傷モデルラットの運動機能回復効果には歯髄細胞のドナーによる違いが大きく関与することが示唆された。また、それぞれ移植前の歯髄細胞の遺伝子発現プロファイルをcDNAマイクロアレイ法を用いて検討しており、いくつかの遺伝子が差別的に発現していることを明らかにした。FIFについてはサル脊髄から形態の類似した細胞を誘導できることを見出しており、この細胞の性状検討を行っている。これまでの成果として、FGF2に応答性の高いヒト歯髄細胞の存在比を高めて、脊髄損傷モデルラットの損傷部に移植すると、元の歯髄細胞を移植した場合よりも、顕著に運動機能の回復効果が誘導されることを見出している。本年度はこの現象のメカニズム解明を目指した。まず、脊髄組織への移植後の細胞動態を調べる目的で、継代数の少ないヒト歯髄細胞にGFP発現ユニットをレンチウイルスベクターにより遺伝子導入した。ほぼすべての細胞でGFP遺伝子の発現が認められた。培養歯髄細胞における神経系分化マーカーの発現(免疫染色法)および代表的な神経栄養因子の発現(real-time PCR法)を調べたところ、ウイルスによる遺伝子導入およびFGF2の添加の有無による違いは認められなかった。一方、遺伝子導入した細胞でもFGF2応答性の細胞の存在比を高めることにより、運動機能改善の促進が観察された。その後の組織解析の結果から、運動機能回復と軸索再生には正の相関が認められた。損傷7週後でもGFP陽性細胞が観察されたため、運動機能回復と定量的相関があるかどうか検討している。神経化学細胞移植法の改善(損傷後から移植のタイミングや細胞の移植方法の検討など)に関する事項の検討が若干遅れている。当初の予定では、損傷直後の細胞移植と同様に細胞懸濁液を損傷部に流し込む予定であったが、損傷から1週間経過すると、組織の浮腫や癒着により切断面が不明瞭になることが分かった。したがって、脊髄固定器を用いて脊髄を動かないように固定して、装置に固定したガラスキャピラリーを用いて注入する計画である。移植した細胞の生着率や分化状況を明らかにするために免疫染色法を用いて各種神経系細胞のマーカーの発現を検討する。移植細胞はHuman Nuclei AntigenもしくはGFP発現ユニットをウイルスベクターを用いて導入することによって追跡できるようにする。安全性試験、歯髄

由来細胞には腫瘍形成能はないと考えられているが、念のためにFGF2を処理した歯髄由来細胞を免疫不全マウス(SCIDマウス)に移植し、奇形種の形成の有無を評価する。歯髄細胞の安全性に関する項目については効果のあった細胞のみについて行うため、今年度分の開始が遅れたため。前年度遅れ分の動物代を含み、動物代、飼育代、物品購入費として使用する。
オルガネラの形態を人工的に操作する技術の開発とその応用

(1)ミトコンドリア外膜上におけるAMPKゾーンの解析AMP-activated protein kinase (AMPK)は細胞質や様々なオルガネラ膜上に局在する基質をリン酸化することで、多彩な細胞機能の制御に関与している。しかしオルガネラ膜上に存在する複数の基質をどのようにして選択的にリン酸化しているのかは十分に理解されていない(Herzig and Shaw. Nat RevMolCellBiol.2018)。そこで我々はミトコンドリア膜上におけるAMPKの活性レベルをgenetically-encoded FRET biosensor (Miyamoto et al. Cell Rep. 2015)を用いて高い空間分解能で可視化する手法の開発を行った。その結果、ミトコンドリア外膜上におけるAMPKの活性レベルは不均一であることを見出した。これは、AMPKは少なくともミトコンドリア外膜上においては特定の活性領域(AMPKゾーン)を形成していることを示唆する初めての発見であり、AMPKの基質選択メカニズムの解明につながると考えている。(2)オルガネラの形態操作法iCOMの開発オルガネラは細胞内で複雑な構造を形成しており、その形はオルガネラの機能と関連していることが知られている。しかしオルガネラの形態自体にどういった生物情報がコードされているのかは十分に理解されていない。そこで我々は秒から分のオーダーでオルガネラの形態を変化させることができるinducible Counter Organelle Morphology (iCOM)の開発を行った。その結果、ミトコンドリアや小胞体の形態を様々な別の形へ変える手法の開発に成功した。当初の予定通り、オルガネラの形態を変化させることができるactuatorsの開発に成功している。またAMPKに関しても、オルガネラ膜上における活性レベルの不均一性を可視化することに成功している。従って、おおむね順調に進展していると判断した。オルガネラの形態操作により、細胞内の情報がどのように変化するのかを検討する。AMPKに関しては、どのような情報素子がAMPKのオルガネラ膜上における活性レベルの不均一性を生み出しているのかを検討する。
大腸癌におけるＣＤ１６９陽性マクロファージの病理学的意義の解明

本研究では、マクロファージマーカーの1つであるCD169について、ヒトでの抗腫瘍免疫に着目して解析を行った。83例の大腸癌を対象として、所属リンパ節のCD169陽性マクロファージと臨床病理学的因子との相関について免疫組織学的に解析した。その結果、CD169陽性マクロファージが多い症例では少ない症例と比較して、有意に生存率が高いことを明らかにした。また、リンパ節のCD169陽性細胞数とCD8陽性Tリンパ球の腫瘍組織内浸潤数は正の相関を示していた。即ち、リンパ節のCD169陽性マクロファージは抗腫瘍免疫を活性化している可能性が示唆され、大腸癌の予後マーカーとして有用であると考えられた。本研究は、がんの所属リンパ節とがん免疫の関係に着目し、抗原提示細胞であるリンパ節洞マクロファージ(Mφ)とがん免疫能ならびに生命予後を反映するマーカー分子を同定することが目的である。前年度の研究により、CD169が炎症性Mφを識別する有用なマーカー分子であり、リンパ節のCD169陽性Mφが単変量ならびに多変量解析にて大腸がん患者の独立した予後因子になることを明らかにした。本年度は、CD169陽性Mφと腫瘍免疫に直接関与するCD8陽性Tリンパ球との関連について検証した。まずは腫瘍組織内に浸潤するCD8陽性Tリンパ球との相関性を免疫組織学的に検討し、所属リンパ節のCD169陽性Mφ数と腫瘍組織内のCD8陽性Tリンパ球数が正の相関を示すことを明らかにした(R = 0.445, p < 0.0001)。リンパ節洞を組織学的に解析すると、CD169陽性MφはCD8陽性Tリンパ球と直接接触しており、これらの細胞間相互作用がリンパ球活性化に関与している可能性が想定される。さらにリンパ節洞のCD169陽性Mφの周囲にはIFNα産生細胞が散見された。ヒトMφを対象とした培養実験では、IFNαはCD169の強力な誘導因子であり、このIFNαがリンパ節MφのCD169発現を維持している可能性が推測される。Mφとリンパ球の共培養によるリンパ球増殖試験では、IFNαで誘導したCD169陽性Mφにリンパ球増殖促進能を認めた。以上の結果より、所属リンパ節のCD169陽性Mφは主にCD8陽性Tリンパ球を介したがん免疫を活性化している可能性が示唆され、CD169は大腸がんの有用な新規予後マーカーになると考えられる。本研究成果はCancerScience誌に発表した。本研究は、大腸癌の所属リンパ節のCD169陽性マクロファージ(Mφ)がM1 Mφの機能、即ちリンパ球活性化を介した抗腫瘍作用をもつのかどうか解析し、大腸癌の予後マーカーとしての有用性を明らかにすることが目的である。この方針に従い、以下の解析を行った。まずはCD169がM1 Mφのマーカー分子になりうるのかどうか検討するため、ヒトMφを用いて培養実験を行った。InterferonやLPSで刺激したM1 MφではCD169の発現が強く誘導されるのに対し、IL-4やIL-10で刺激したM2 MφではCD169発現は誘導されなかった。即ち、CD169はM1 Mφを識別する有用なマーカー分子の1つである可能性が示唆された。次に所属リンパ節のCD169陽性Mφと83例の大腸癌症例の臨床予後との相関を解析した。興味深いことにリンパ節中のCD169陽性Mφ数は症例毎に大きく異なり、CD169陽性Mφが多い症例では少ない症例と比較して全生存率が有意に良好であった(Log-rank p = 0.0092)。さらに多変量解析を行った結果、汎MφマーカーであるCD68陽性Mφ数に対するCD169陽性Mφ数の割合(CD169陽性率)は大腸癌の独立した予後因子となることを明らかにした(p = 0.027)。CD169陽性Mφはリンパ節洞内でCD43(CD169のリガンド)を発現するCD8陽性Tリンパ球と直接接触しており、さらにCD169陽性率と腫瘍組織内へのCD8陽性Tリンパ球の浸潤数は正の相関性を示した。即ち、所属リンパ節のCD169陽性Mφは主にCD8陽性Tリンパ球を介した腫瘍免疫を活性化している可能性が示唆され、大腸癌の予後マーカーとして有用であると考えられた。平成24年度の計画である大腸癌と所属リンパ節の組織を対象とした免疫組織学的解析、臨床予後との相関解析は予定通り年度内に完了出来た。

当初の計画通り、CD169陽性MφとTリンパ球活性化の相互関係について詳細に解析するため、培養実験を行う計画である。また腫瘍移植モデルによる動物実験を計画している。大腸癌以外の腫瘍についても、同様の解析を進めていく予定としている。上記の研究方針に従い、マクロファージやリンパ球の調整試薬、培養実験に必要な各種試薬やCD169発現を検討するための抗体の調達に本研究費を使用する計画である。また動物実験も進めていくため、実験用マウスの購入費や飼育費、免疫染色やPCR法などに必要な各種試薬の購入費として、本研究費を使用する予定である。
ミヤコグサにおける根粒形成初期過程の発生遺伝学的解析

マメ科植物ミヤコグサLotus japonicusはその共生細菌Rhizobium lotiの感染によって窒素固定器官根粒を形成する。本研究ではミヤコグサのミュータントの単離を通じて、根粒という共生的窒素固定器官の発生を細分化し、細分化されたそれぞれのステップに関与する因子を明らかにすることを目的とする。17,000のEMS処理したM2種子を播種し根粒形成に異常を示すミュータントをスクリーニングし、最終的にM4世代まで形質の安定な11系統のミュータントを単離した。戻し交配、ミュータント間でのアレリズムテストより今までに5つの根粒形成を制御する遺伝子座を同定している。内訳は、根粒形成が完全に見いだされないミュータントに2遺伝子座[Nod-]、根粒形成の効率がわるいものに1遺伝子座[Nod+-]、窒素固定活性の発現に関与するものに2遺伝子座[Fix-]を明らかにした。[Fix-]の2種のミュータントは、電子顕微鏡による内部形態の観察によりさらに明確に2分された。その一つ(wabl)は根粒菌が感染糸をとおして宿主細胞内に進入し、最終的にエンドサイトシによって取り込まれる過程がブロックされており、バクテリアの宿主細胞内への取り込みに関与する遺伝子に変異が生じたことが類推された。一方、feclミュータントは根粒菌の細胞内共生は成功しているが、細胞内共生したバクテリアが充填した宿主細胞の肥大成長の過程に異常が観察された。[Nod-]の2種のミュータントに関しては、根粒菌の分泌するNod factorの応答性について検討し、そのうちの1系統は野生型で観察される根毛の変形が観察されず、Nod factorの受容に関与する遺伝子の変異に起因するミュータントであることが示唆された。得られたミュータントの遺伝解析さらに、カルシウムの応答性については現在検討中である。また再度ミュータントのスクリーニングを行い、いままでのカテゴリーに当てはまらないミュータントの単離も進行中である。
エネルギー代謝を司る腸内細菌叢由来の新規ペプチド性因子の探索と機能解析

摂食・エネルギー代謝調節は、多くの生理活性ペプチドによって複雑かつ精巧に制御されている。近年、腸内細菌叢より産生される液性因子がエネルギー代謝、栄養摂取及び免疫機能等を制御することにより、肥満の病態や糖尿病の発症に直接的な役割を果たすことが明らかにされている。ヒトにはペプチド性リガンドが結合しエネルギー代謝を制御すると予測されながら、内因性リガンドの不明な受容体(オーファン受容体)が数多く残されており、未知のエネルギー代謝調節ペプチドの存在が示唆されている。本研究では、腸内細菌叢より産生される新規ペプチド性因子をオーファン受容体のリガンド探索より同定し、細胞や個体レベルでの機能解析を行う。
犬および猫の全身性炎症反応症候群(SIRS)に伴う腎炎の病理発生に関する研究

1.炎症マーカーとしてのSAA測定法の開発動物のSAAは血清からの精製が困難なため研究が非常に遅れていた。そこでリコンビナント猫(rf)SAAの作成を試みこれに成功した(論文5)。次いで、マウス抗猫SAAモノクロナール抗体の作成を試みこれにも成功した(論文1)。そこでこのモノクロナール抗体を用いたELISAによる猫SAAの測定系を開発し臨床的応用性を検討した。その結果、猫SAAの炎症マーカーとしての有用性が確認され(未発表)、将来炎症性疾患の病態解明に大きく寄与するものと期待された。2.犬および猫の炎症性疾患に係わるT細胞接着分子およびサイトカインの利用犬や猫の自己免疫疾患に係わるT細胞接着分子(CTLA-4,CD28)(論文2,3,6)、およびアレルギーに係わる犬のサイトカイン(IL-4)のクローニングおよび蛋白の発現に成功した(論文7)。現在これらの物質の研究および臨床面での利用性を検討中である。3.小動物疾患における血管炎マーカーとしての抗好中球細胞質抗体(ANCA)測定系の確立先ず犬や猫の疾患時にANCAが検出されるか否かについて、間接蛍光抗体法およびヒト好中球細胞質精製抗原を用いたELISAにより調査した結果、種々の疾患でANCAが検出された(口頭発表1,2)。そこで現在2で述べた各種サイトカインを用いたANCA測定系の開発を検討中である。4.炎症性サイトカイン、急性期蛋白およびANCAの相互作用に関する解析これらの問題については現在ほとんどわかっていない。そこで我々は犬、猫の各種急性期蛋白(C-反応性蛋白:CRP,SAA,その他)の疾患時における動向を調べその臨床的意義を検討した(論文4,8、未発表)。将来、1,2,3で述べた各手法の完成により、これらの相互作用の解明が飛躍的に進展するものと期待される。本研究の具体的目的は以下の3点であるが、それぞれについて以下のような成果が得られた。1.炎症マーカーとしてのSAA測定法の開発リコンビナント猫血清アミロイドA(SAA)の作製に成功した。これを抗原とする抗猫SAA兎ポリクロナール抗体を作製しサンドウイッチELlSAによる猫SAA測定法を確立し、種々の猫疾患におけるSAAの動向を検討した。さらに猫SAAのモノクロナール抗体を作製中であり測定に有用であると考えられる2株の細胞株の樹立に成功した。2.犬および猫の炎症性サイトカイン測定法の検討炎症性サイトカインの主要な一つである犬インターロイキン-4のクローニングに成功した。これよりリコンビナント犬インターロイキン-4を作製した。3.小動物疾患における血管炎マーカーとしての抗好中球細胞質抗体(ANCA)測定系の確立基礎的研究として小動物疾患時におけるANCA出現を間接蛍光抗体法およびヒト好中球細胞精製抗原を用いたELlSA法により調査した。その結果、犬、猫の種々な疾患でANCAが出現していることが示唆された。そこでリコンビナント猫(rf)SAAの作成を試みこれに成功した。次いで、マウス抗猫SAAモノクロナール抗体の作成を試みこれにも成功した(論文2)。

2.犬および猫の炎症性疾患に係わるT細胞接着分子およびサイトカインの利用犬や猫の自己免疫疾患に係わるT細胞接着分子(CTLA-4,CD28)のクローニングおよび蛋白の発現に成功した(論文1,3)。現在これらの物質の研究および臨床面での利用性を検討中である。3.犬、猫の急性期蛋白の臨床的意義」犬、猫の急性期蛋白(C-反応性蛋白:CRP,血清アミロイド:SAA)の疾患時における動向を調べその臨床的意義を検討した(論文4,未発表)。その結果、種々の炎症性疾患において、炎症の程度および炎症の過程により、これらの値は刻々変化することが判明し、炎症の予後判定、治療効果の判定に有用であることが判明した。
生物運動の制御基盤；化学力学フィードバックループ

本研究の第一の目標は、輸送・振動・分裂などの生物要素運動に必要な分子モーターや細胞骨格動態などが生み出す力が、要素運動の制御にフィードバックするという化学力学フィードバックループ(CMFループ)の存在を明らかにすることであった。その点、筋収縮自励振動(SPOC)現象における「ミオシンクロスブリッジ(CB)による力発生、筋フィラメントの滑り運動、フィラメント格子間隔の変化、CB形成確率の変化」というループの存在が強く示唆されたこと、外力パルス依存的に染色体分配のタイミングが調節されること、細胞質分裂に必要な収縮環の形成を人工細胞系で実現するなど、CMFループの具体例を示すことができた。H.23年度は、本課題の主要な研究手法である力学・熱物性解析手法のうち、とくに熱刺激法について進展があった。1)弛緩状態にある心筋細胞に局所熱パルスを加えると、一過的な収縮が生じることを発見した。このことは、Caイオン濃度が低い弛緩状態にある筋細胞が熱刺激だけで興奮収縮することを意味し、新しい興奮ルートが見出されたことになる(Oyamaら,BBRC,2011)。2)pHやイオン強度には応答せず、温度だけに応答する(カチオン性ポリマーをコートした)蛍光性ナノビーズを合成し、HeLa細胞に振りかけたところ、Endosomeに自動的に取り込まれ、しかも微小管上を輸送されることが見出された。そこで熱パルスを与えたところ、温度上昇に伴う運動速度の上昇がみられた。我々はこのビーズを"歩くナノ温度計"となづけた(Oyamaら,Lab on a Chip,印刷中)。一方筋収縮系の研究に関して、1分子レベルでは、1)アクチンフィラメントの螺旋ピッチに相当する周期で、ミオシン分子モーターが結合しやすい"ターゲットゾーン"の存在を示した(Suzukiら,Biophys.J.,2011)。SPOC研究においては、1)心筋収縮系の生理学的研究(慈恵医大との共同研究)が着実に進展する一方、2)SPOC機構に関する理論構築が終わり、単位モデルを発表することができた(Satoら,PBMB,2011)。これの連結拡張モデル(筋原線維モデル)の構築も着実に進展している。さらに、3)HeLa細胞への力学刺激によって、細胞分裂のタイミングを制御できるという著しい成果が、PNASに受理された(Itabashiら,2012)。そして、4)染色体分配装置のミクロ力学に関するRockefeller大学との共同研究の成果を発表した(Shimamotoら,Cell,2011)。1)本基盤研究Sの中心課題の一つであるSPOC研究では、“単位モデル"を弾性的に連結した“連結モデル"に拡張し、実験観察で得られた全てのSPOC特性を再現できる1次元筋原線維モデルを完成した(Satoら、PRL.2013)。特に、3つの常微分方程式を1つの位相方程式に集約することができ、モデルの数理的構造を明らかにした。2)ラットの幼若心筋細胞内で、筋原線維内Z線の主要構成タンパク質α-アクチニンにGFPを融合したものを遺伝子発現し、生きた細胞内でのサルコメア長のナノメトリーを実現。自発拍動中での各サルコメアの振動を定量的に(数nmの精度で)記録することに成功した(Shintaniら、J.Gen.Physiol.2014)。3)1分子研究では、Formin存在下でのアクチン重合の1分子解析を終え、一分子ずつの重合過程を捉えた上で、Forminの機能モデルを作ることができた(論文作成中)。4)Xenopus卵抽出液中で自己集合した紡錘体のミクロ力学に関して、一対の微小ガラス針を用いた変形実験の解析から、紡錘体の粘弾性モデルを構築した(Takagiら、Cell Rep.2013,2014)。さらに、Xkidの紡錘体内での動態を1分子イメージングし、Xkidが染色体を紡錘体の中心面に集める役割を担うことを証明した(Takagiら、Sci.Rep.2013)。5)細胞内の温度分布イメージングについては、レシオ型のナノ温度計を開発し、細胞内での絶対温度の計測を実現した(Takeiら、ACS Nano,2013)。6)油中液滴や単層リポソームという微小空間内にアクチンフィラメント+ミオシンを封入することによって、球形の液滴中の真ん中にアクチンバンドルが形成され、ATP存在下ではそれが収縮することを明らかにした。これは細胞質分裂を担う収縮環のモデル系ともいえる(論文2編投稿中)。1)SPOC研究において、単位モデルの拡張版である1次元連結モデルを完成した(論文投稿改訂作業中)。特に、モデルの中心をなす3つの常微分方程式を1つの位相方程式に集約することができ、モデルの数理的構造についての見通しを立てることができた。2)1分子研究では、遺伝子操作を加えたアクチンを安価で大量に調製するためのプロトコールを作成し(Ohkiら、2012)、Formin存在下でのアクチン重合の1分子解析が進捗したこと(論文準備中)などに進展があった。3)細胞分裂への力学刺激の作用について、1年間にわたる改訂作業ののちPNAS論文(Itabashiら、2012)として発表できたが、さらに、力学パルスによる細胞分裂の加速の原因探索や、染色体分配直前に見られる染色体振動の解析を進め、HeLa細胞以外の細胞も取り上げた。

4)Xenopus卵抽出液中で自己集合した紡錘体のミクロ力学と形状維持のメカニズムについては、一対の微小ガラス針を用いた紡錘体の変形実験の解析から、紡錘体の粘弾性モデルを構築した(論文準備中)。また、紡錘体中で働くキネシンやダイニン分子モーターの特異的機能阻害剤を加えることによる異常形態紡錘体(たる型や放射型形状)を、微小ガラス針で力学操作することによって紡錘体形状に戻したり、逆に、紡錘体形状の一方の極を押し広げると、他方の極も自発的に広がって“たる型"になることや、それらの場所ごとの弾性率の計測などの実験を進めた。5)細胞の熱伝導率イメージングや、細胞機能の熱刺激応答性などの研究も着実に進展した。温度分布のナノイメージングについては、レシオ型のナノ温度計が開発できたことから、細胞内での絶対温度の計測が可能になった(論文投稿中)。また熱パルスについては、微小空間内での分子集合や、分子モーター機能への影響など、細胞機能への作用に限らず、研究が広がっている。箇条書きにまとめる。1)SPOCについて、ヒト心筋(正常と、拡張型心筋症のヒト心臓から調製したグリセリン筋モデル)に関する予備実験データを含むレビューを、シドニー大学の共同研究者とともにまとめた(Kagemotoら、Biophys. Rev. 2015)。2)ラット幼若心筋細胞は自発的に周期的なCa2+発火を行って拍動するが、40°C付近にすると、自発拍動振動数の数倍の高速振動が重畳すること、つまり、Ca2+濃度の変動とは独立に、SPOC様の高速自励振動が発生することを発見した(Shintaniら、BBRC, 2015)。3)1分子研究では、「1分子生物学」(化学同人2014)という概説書を編集し発表した。4)直径10 &micro;m程度の油中液滴(油中に形成させた、一層のリン脂質で覆われた球形の水溶液滴)という微小空間内にアクチンフィラメント+ミオシンを、アクチンフィラメントの束化因子とともに封入すると、球形の液滴の赤道面にリング状のアクチン束が自己集合したうえ、それが収縮することを発見した(この画期的な成果は、2014年度に投稿し、2015年にNature Cell Biol.誌に掲載)。5)油中液滴を油・水界面を通過させることで、リン脂質2重膜に包まれたリポソームを作ることができる。そのリポソームのラメラリティー(膜の層状構造)を蛍光顕微鏡法によって定量化し、90%以上が単層の2重膜からなることを実証(Chibaら、Biophys. J., 2014)。6)「1細胞熱力学」の創成を目指して開発中の、細胞内の温度分布の計測法と、局所熱パルス法に関するレビューを発表し(Suzukiら、CRC Press, 2015)、局所熱パルスに対するWI38繊維芽細胞のCa2+応答性に関する論文を発表(Itohら、BIOPHYSICS, 2015)。本研究の第一の目標は、輸送・振動・分裂などの生物要素運動に必要な分子モーターや細胞骨格動態などが生み出す力が、要素運動の制御にフィードバックするという化学力学フィードバックループ(CMFループ)の存在を明らかにすることであった。
馬尾ならびに腰部神経根圧迫障害の病態生理学的検討と治療方法に関する臨床的・基本的研究

腰部神経根障害に伴う病態は、障害された神経根の髄節症状として定型的に理解される場合と様々な神経症状に修飾された複雑な、時には非論理的とも云うべき症状を示す場合とがある。本研究の目的はこれらの腰部神経根障害に伴う病態を改めて検討しその対策を講ずることであった。そのために基本的に多根性の症状を呈することの多い腰部脊柱管狭窄症、さらには腰部椎間板ヘルニア、その他の要因による腰痛症などを対象として検討を行い、動物を用いた実験的検討も加え、多面的な解析により神経根障害の発症のメカニズムについて検討を行った。我々が経験した臨床症例を分析した結果、隣接した神経根ブロックが愁訴発現の原因と考えられていた髄節症状を軽減したと判断される症例が認められた。また随伴する腰痛についても椎間関節ブロックの効果について検討したところ、椎間関節由来と考えられる疼痛のみならず腎部、下肢に放散する関連痛の消失などに加えて、下肢の異常筋緊張の低下など多彩な影響が観察された。また、臨床的に障害が加わっていると考えられた神経根から電気生理学的に異常所見が認められなかった例もあった。これらの所見を総合的に判断すると、神経根障害と判断される症状は典型的な場合には単純に根障害として理解される。しかし、かなり非定型的な症例も存在し、種々の疼痛を伝達する信号が傍脊椎神経節あるいは脊髄後角において集積され、それに当該根からの何らかの程度の上行するインパルスが加重されて疼痛として認識されるというよなメカニズムが関与しているのではないかと推論された。また、間歇性跛行の際に出現する髄節症状に対する末梢神経幹電気刺激の効果を根の血流の変化としてとらえようと試みたがその変化は極めて軽微であり、他の要因の関与が考えられた。このメカニズムも単純ではないことが示嗟された。腰部神経根障害の症状発現のメカニズムを理解するためには,神経根部に発生する障害を客観的にとらえることがまず要求される.その理解の上にさらに障害部位における組織血流の変化,あるいは腰椎の不安定性など,動的とも言える要因がどのような付加的な影響を及ぼすか否かも検討されなければならない.本年度は臨床例を用いた研究として,手術症例における術中神経根電位の記録,神経根部に電気刺激を加え,強さ時間曲線の描記を行った.末梢神経幹刺激により,神経根部から単極針電極を用いて記録した電位は,明らかに低振巾を示すと判断されたものが多く,中には多相性波として観察されたものもあった(8根中3根).しかし,これらの所見は針電極の微妙な位置の相違により影響を受けることがしばしば経験されたことから,術前検査として施行することの困難さを示すものとして理解された.神経根部に電気刺激を加え,強さ時間曲線を描記する試みは,現在までに8神経根に行ったが,神経学的に障害の著しいと考えられた神経根3根においては,曲線の右上方移動が認められた.この変化が誘発電位の低振巾化,多相性化と一致したものは2例のみで,今後このような症例をさらに収集したいと考えている.ネコを用いた動物実験においては,まず,末梢神経幹電気刺激が神経根部あるいは馬尾の血流に及ぼす影響を観察した.脛骨神経に2030Hz,閾値の約5倍の強さの電気刺激を加えると,上記部分の血流が増加することを交差熱電対法を用いて観察することが出来た.この影響は一時的なものであったが,現時点までの観察ではこの現象の下での神経活動電位の振巾の変化などは,観察し得ていないが,慢性障害神経根をサルを用いて作製中であり,ヒト手術例の障害根における観察も含めて,検討を行いたいと考えている.腰部神経根障害に伴う病態は、障害された神経根の髄節症状として定型的に理解される場合と様々な神経症状に修飾された複雑な、時には非論理的とも云うべき症状を示す場合とがある。

また、間歇性跛行の際に出現する髄節症状に対する末梢神経幹電気刺激の効果を根の血流の変化としてとらえようと試みたがその変化は極めて軽微であり、他の要因の関与が考えられた。このメカニズムも単純ではないことが示嗟された。腰部神経根ならびに馬尾障害について、今年度は実験的研究として昨年度に着手していたサルを用いた馬尾圧迫実験モデルの検討を行なった。人間に似て馬尾が長いサルの第3あるいは第4腰椎の椎弓を切離して、椎弓管内に落とし込み硬膜管を圧迫してキルシュナー鋼線にて固定した。現在までに手術を行なったサルは計6匹であるが、いずれも術後に亀背形成を示し、馬尾が著明に圧迫されている状態がミエログラフィーで確認された。これらのうち4匹を3ケ月から12ケ月の期間で屠殺し、馬尾を神経生理学的、組織学的に検討したところ、馬尾の神経活動電位で著明な障害の存在を明確に証明し得た例は無かった。これは馬尾を一塊として伝導性を観察した方法論に原因があったと考え、本年はさらに細かく観察する予定にしている。組織学的には、障害のある馬尾と正常の組織像を示すものがあり、一定せず、圧迫から逃げている馬尾が存在することが示されていた。神経根誘発電位の術中記録は前年度に引き続き行い、約40神経根の検討を行った。その結果、明らかな神経線維の伝導障害を示す典型的な障害神経根が認められる訳であるが、臨床的に症状ありと認め、除圧により愁訴改善した神経根が正常と考えられる活動電位を示した症例、さらには、L_4神経根記録で腓骨神経刺激で低振幅分裂波形を記録するが、脛骨神経刺激では正常と判断される波形が記録された症例など、理解に苦しむ例も認められた。技術的な問題として極めて微妙な電極先端の位置が波形に大きく影響することが、大きな問題であることは前年度にも述べたところである。以上の結果から、現在、神経根誘発電位が障害根診断に有用であるとの報告が多いが、単純にそのように結論づけるのは、短絡的であると言わねばならないのではないかと考えている。本研究の目的は、腰部神経根障害に伴う病態の理解とその対策を再検討することであった。すなわち、神経根障害の典型的な病態は神経支配領域に一致した神経症状として理解されているが、我々が経験した症例を分析した結果、隣接した神経根のブロックが愁訴発現の原因と考えられていた髄節症状を軽減したと判断される症状が認められた。また隋伴する腰痛についても椎間関節ブロックの効果について検討したところ、椎間関節由来と考えられる疼痛のみならず臀部、下肢に放散する関連痛の消失など加えて、下肢の異常筋緊張の低下など多彩な影響が観察された。また、臨床的に障害が加わっていると考えられた神経根から電気生理学的に異常所見が認められなかった例もあった。これらの所見を総合的に判断すると、神経根障害と判断される症状は典型的な場合には単純に根障害として理解される。しかし、かなり非定型的な症例も存在し、種々の疼痛を伝達する信号が傍脊椎神経節あるいは脊髄後角において集積され、それに当該根からの何らかの程度の上行するインパルスが加重されて疼痛として認識されるというようなメカニズムが関与しているのではないかと推論された。また、間歇性跛行の際に出現する髄節症状に対する未梢神経幹電気刺激の効果を根の血流の変化としてとらえようと試みたがその変化は極めて軽微であり、他の要因の関与が考えられた。
義歯床下粘膜の痛み－リスクファクターと，咀嚼機能に及ぼす影響－

本課題では,部分床義歯装着者における床下粘膜痛のリスクファクター,および咀嚼機能への影響について,横断研究で検討した.333名(平均年齢71.4歳,500義歯床)に対して義歯床下粘膜痛の強さ及び頻度を評価した.34.2%(171/500床)の義歯で,評価時に痛みが有り,義歯装着以降の痛み経験は,42.8%(214/500)の義歯で有りと評価された.ロジスティック回帰分析の結果,床下粘膜痛の発生には口腔粘膜・顎堤の特性,痛み感受性,日中パラファンクション,年齢,義歯関連因子が関与することが示唆された.また,構造方程式モデリングの結果,床下粘膜痛が主観的咀嚼能力を低下させることが示唆された.平成25年度においては,本研究の実施にあたり,研究計画および方法を詳細に検討した.その後,確定した計画・方法について実施大学の倫理審査委員会への申請を行った.以下に概要を示す.テーマ1:義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター.結果因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび頻度.予測因子:患者のdemographic information,精神心理学的因子,義歯に関する因子,義歯床下の支持組織に関する因子,加圧に関する因子.主な追加および変更:(1)対象者を,部分床義歯装着者(欠損型を指定しない)に変更した.また目標サンプルサイズを500名とした.(2)一般的に,痛みは主観的な感覚的・感情的体験である.痛みは,不安(状態不安,特性不安,不安感受性など)と関連することがこれまでの研究で明らかになっていることから,本研究では,不安の評価指標として広く用いられる状態不安および特性不安を精神心理学的因子として追加した.テーマ2:義歯床下粘膜の痛みと患者立脚型アウトカムの関連.結果因子:摂取可能食品(食品摂取アンケート),義歯満足度,口腔関連QoL.予測因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび頻度.主な追加および変更:(1)対象者をテーマ1と共通とし,研究デザインを横断研究に変更した.(2)近年,治療効果を患者の視点から(患者立脚型アウトカムで)評価する重要性が指摘されている.よって本研究テーマでは,当初計画していた客観的指標(筋活動,下顎運動,客観的咀嚼能力など)を,上記の主観的指標に変更し,痛みとの関連を検討することとした.平成26年度においては,25年度に確定した研究計画および方法について,実施大学の倫理審査委員会の承認を得た.以下に研究の概要を示す.・テーマ1:義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター.結果因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度.予測因子:患者のdemographic information,状態不安・特性不安,義歯床下の支持組織に関する因子,義歯床下粘膜への加圧に関する因子,義歯に関する因子.・テーマ2:義歯床下粘膜の痛みと患者立脚型アウトカムの関連.結果因子:摂取可能食品(食品摂取アンケート),義歯満足度,口腔関連QoL.予測因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度.また,義歯床下の支持組織に関する変数の1つである粘膜圧痛閾値の術者内信頼性を確認する予備実験を経て,本実験を開始した.被験者サンプリングを行い,研究参加への同意が得られた260名に対してデータ採得を行った.データ解析の結果,義歯床下粘膜の痛みに統計的に有意に関連する因子が検出され,これらは痛みのリスクファクターになり得ることが示唆された.補綴臨床的に有意義であると考えられる結果が得られたため,平成27年5月に開催される専門学会にて発表予定である.また,引き続きデータ採得を行って(目標サンプルサイズ:500名)データ解析をし,義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター,および患者立脚型アウトカムとの関連について,発表(専門学会・学術論文)を行う予定である.平成27年度においては,引き続きデータ採得を行い,目標サンプルサイズのデータを得た.以下に研究の概要を示す.・テーマ1:義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター.結果因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度.予測因子:患者のdemographic information,状態不安・特性不安,義歯床下の支持組織に関する因子,義歯床下粘膜への加圧に関する因子,義歯に関する因子.・テーマ2:義歯床下粘膜の痛みと患者立脚型アウトカムの関連.結果因子:摂取可能食品(食品摂取アンケート),義歯満足度,口腔関連QoL.予測因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度.今年度,テーマ1についての学会発表,国際誌への論文投稿を行った.義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度には,それぞれ複数の因子が統計的に有意に関連することが示された.このうち,義歯床下の支持組織に関する因子が,痛みのリスクファクターとしての影響度が特に大きいことが示唆された.平成28年度においては,テーマ2について学会発表および論文投稿を行う予定である.おおむね研究計画に沿って進行し,また補綴臨床的に有意義であると考えられる結果が得られているため.部分床義歯装着者を対象とした横断研究にて,義歯床下粘膜の痛みに関する以下のテーマについて,探索的に検証した.研究の概要を以下に示す.・テーマ1:義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター.以下の変数をそれぞれ結果因子,予測因子として多変量解析(ロジスティック回帰分析)を行い,リスクファクターを検証した.結果因子:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度.予測

因子:患者のdemographic information,状態不安・特性不安,義歯床下の支持組織に関する因子,義歯床下粘膜への加圧に関する因子,義歯に関する因子.・テーマ2:義歯床下粘膜の痛みと患者立脚型アウトカムの関連.以下の変数をそれぞれ結果因子,予測因子として共分散構造分析(パス解析)を行い,変数間の関連を検証した.結果因子:口腔関連QoL,主観的咀嚼能力(食品摂取アンケート).予測因子:義歯床下粘膜の痛みの強さ,患者のdemographic information,義歯床下の支持組織に関する因子,義歯に関する因子,最大咬合力.研究成果:義歯床下粘膜の痛みの強さおよび経験頻度には,それぞれ複数の因子が統計的に有意に関連することが示された.このうち,義歯床下の支持組織に関する因子が,痛みのリスクファクターとしての影響度が特に大きいことが示唆された(テーマ1).また,義歯床下粘膜の痛みは,主観的咀嚼能力および口腔関連QoLを低下させるファクターであることが示され,床下粘膜の痛みを取り除くことは咀嚼機能および口腔関連QoLの回復に重要であることが示唆された(テーマ2).平成28年度(最終年度)においては,テーマ1の論文が国際誌に掲載された.また,テーマ2について学会発表を行った(論文作成中).本課題では,部分床義歯装着者における床下粘膜痛のリスクファクター,および咀嚼機能への影響について,横断研究で検討した.333名(平均年齢71.4歳,500義歯床)に対して義歯床下粘膜痛の強さ及び頻度を評価した.34.2%(171/500床)の義歯で,評価時に痛みが有り,義歯装着以降の痛み経験は,42.8%(214/500)の義歯で有りと評価された.ロジスティック回帰分析の結果,床下粘膜痛の発生には口腔粘膜・顎堤の特性,痛み感受性,日中パラファンクション,年齢,義歯関連因子が関与することが示唆された.また,構造方程式モデリングの結果,床下粘膜痛が主観的咀嚼能力を低下させることが示唆された.データ採得および解析が,おおむね研究計画に沿って進行し,また補綴臨床的に有意義であると考えられる結果が得られているため.テーマ2について,平成28年7月に開催される専門学会にて発表予定である.また論文投稿を行う予定である.咀嚼機能平成27年5月に開催される専門学会にて発表予定である.また,引き続きデータ採得を行って(目標サンプルサイズ:500名)データ解析をし,義歯床下粘膜の痛みのリスクファクター,および患者立脚型アウトカムとの関連について,発表(専門学会・学術論文)を行う予定である.実施大学の倫理審査委員会の承認を取得し(平成26年4月),26年度の予定である被験者サンプリングが実施可能であると考えられるため.平成27年4月から10月まで産前・産後休暇および育児休業を取得し(11月から復職),予算執行期間が当初予定よりも短くなったため.学会発表および国際誌への論文投稿に関する経費に使用する.効率的に被験者サンプリング,データ採得を行うため,研究協力者と密に連絡をとり,事前準備を行う.
電気化学顕微鏡を用いた心筋細胞解析技術の開発

創薬において、新規薬剤候補の心臓へ与える影響を評価するためには、心筋細胞を利用して拍動パターンの解析が必須となっている。本研究では、生細胞を対象に、非接触かつ多機能な観察が可能である走査型電気化学顕微鏡(SECM)を利用して、心筋細胞の動きやエネルギー代謝を一細胞レベルで解析可能なシステムを開発した。特に、SECMのプローブであるマイクロ電極先端に、DNA足場として二種類の酵素を固定化することで局所におけるグルコース濃度測定を実現し、細胞レベルでのグルコース消費評価の可能性を示した。薬剤の心臓への副作用は重篤な場合死に至る。そのため、創薬において心臓へ与える影響の評価は必須となっており、心筋細胞を対象として拍動パターンを解析するアッセイ系が利用されている。しかしながら、測定対象となる生体から取り出した細胞は目的以外の細胞含んでいることから定量性に課題があり、また、測定可能な細胞動態も限定されていた。本研究では、細胞を対象に、非接触かつ多機能な観察が可能である走査型電気化学顕微鏡(SECM)を利用して、心筋細胞の動き、代謝活性を一細胞レベルで解析可能なシステムの開発を目指している。平成25年度は、心筋細胞の動きと酸素消費を同一細胞で評価可能なシステムを開発した。具体的には、細胞と同程度のサイズ(10 μm)のPtディスク電極を作製し、細胞接着面と垂直方向に電極を走査しながら電流を記録するアプローチカーブ測定を利用して細胞直上1ー10 μmの位置に正確に配置するシステムを開発した。さらに、細胞近傍に配置した電極で観察される微小電流を高速サンプリングすることで、細胞の収縮、弛緩に伴う拍動パターンを電流応答として測定した。また、同じ電極を利用して酸素の還元電流を測定することで、心筋細胞の酸素消費速度を測定可能なシステムを開発した。これらの一連の測定を連続して行うことで、同一細胞で心筋細胞の拍動に伴う動きと酸素消費の評価が可能となった。開発したシステムを用いて、実際に使われている薬剤を添加した時の細胞動態を測定し、強心剤の薬理作用評価への応用が可能であることを示した。しかしながら、測定対象となる生体から取り出した細胞は目的以外の細胞含んでいることから定量性に課題があり、また、細胞単位での代謝活性の測定は難しかった。平成26年度までに、マイクロ電極を利用した心筋細胞の動きと酸素消費を同一細胞で評価可能なシステムを開発し、薬剤を添加した時の細胞動態を測定し、強心剤の薬理作用評価への応用が可能であることを示した。心筋細胞では低酸素状態や薬剤の作用によりTCA回路が阻害されると嫌気性解糖により乳酸が生成して代謝性アシドーシスが誘導される。しかしながら、細胞レベルで拍動強度と酸素消費、乳酸産生、グルコース消費などを測定することは極めて困難であった。一方、電極表面に酵素を固定化することで、グルコースや乳酸濃度を測定可能なセンサーが構築されているが、マイクロ電極は電極表面積が極めて小さいことから酵素の選択的な固定化が難しく、酵素固定化マイクロ電極はほとんど開発されてこなかった。そこで、核酸を足場として利用することでマイクロ電極先端に酵素を選択的に固定化した電極を開発し、局所におけるグルコース濃度を測定可能であることを示した。平成27年度以降に細胞のグルコース消費測定へ応用する予定である。創薬において、新規薬剤候補の心臓へ与える影響の評価は必須となっており、心筋細胞を利用して拍動パターンを解析するアッセイ系などが利用されている。しかしながら、測定対象となる生体から取り出した細胞は、目的以外の細胞を含んでいることから定量性に課題があった。また、心筋細胞では低酸素状態や薬剤の作用によりTCA回路が阻害されると嫌気性解糖により乳酸が生成して代謝性アシドーシスが誘導される。そのため、代謝活性が薬理作用の評価へ重要となると考えられるが、細胞レベルで拍動パターンと酸素消費、グルコース消費などを評価することは困難だった。本研究では、生細胞を対象に、非接触かつ多機能な観察が可能である走査型電気化学顕微鏡(SECM)を利用して、心筋細胞の動き、代謝活性を一細胞レベルで解析可能なシステムの開発を目指している。平成27年度までに、マイクロ電極を利用した心筋細胞の動きと酸素消費を細胞レベルで評価し、強心剤や拍動パターンを乱す薬剤の作用評価への応用可能性を示した。電極表面に酵素を固定化することで、グルコースや乳酸濃度を測定可能なセンサーが開発されているが、マイクロ電極は電極表面積が極めて小さいことから酵素の固定化が難しく、酵素固定化マイクロ電極はほとんど開発されてこなかった。そこで、酵素をマイクロ電極先端に選択的に固定化し、細胞レベルでのグルコース消費の評価を目指している。平成27年度までに、DNAを足場として利用することでマイクロ電極先端に二種類の酵素を固定化し、グルコース濃度を測定可能であることを示した。

さらに、酵素固定化マイクロ電極と心筋細胞を評価可能なSECMを統合し、細胞レベルでの拍動パターンと酸素消費、グルコース消費の評価を試みたが、想定以上にシステム開発に時間を要したため、一部の実験を平成28年度以降に行うこととした。平成27年度までに基盤となる細胞評価システムを開発し、心筋細胞の拍動や酸素消費などを評価している。しかしながら、初代細胞(動物由来の細胞)を評価対象としていることからロットによる変動などがあり、より精緻な評価が必要となっている。創薬において、新規薬剤候補の心臓へ与える影響の評価は必須となっており、心筋細胞を利用して拍動パターンを電気的に解析するアッセイ系などが利用されている。しかしながら、測定対象となる生体から取り出した細胞は、目的以外の細胞を含んでいることから定量性に課題があった。また、心筋細胞では低酸素状態や薬剤の作用によりTCA回路が阻害されると嫌気性解糖により乳酸が生成して代謝性アシドーシスが誘導される。そのため、代謝活性が薬理作用の評価へ重要となると考えられるが、エネルギー代謝の変化を評価することは困難だった。本研究では、生細胞を対象に、非接触かつ多機能な観察が可能である走査型電気化学顕微鏡(SECM)を利用して、心筋細胞の動き、エネルギー代謝を一細胞レベルで解析可能なシステムの開発を目的としている。平成28年度までに、マイクロ電極をプローブとして利用することで、心筋細胞の動きと酸素消費を細胞レベルで評価し、強心剤や拍動パターンを乱す薬剤の評価への応用可能性を示した。また、細胞レベルでグルコース代謝を評価するために酵素をマイクロ電極表面に選択的に固定化する方法を開発した。これまでにも、電極表面に酵素を固定化することで、グルコースや乳酸濃度を測定可能なセンサーが開発されているが、マイクロ電極は電極表面積が極めて小さいことから酵素の固定化が難しく、酵素固定化マイクロ電極はほとんど開発されてこなかった。そこで、DNAを酵素固定化の足場として利用することで、マイクロ電極先端に二種類の酵素を固定化し、グルコース濃度を測定可能であることを示した。ここでは、足場となるDNA配列を変えることで、二種類の酵素の距離や固定化量を制御し、局所における効果的なグルコース測定を可能とした。さらに、酵素固定化マイクロ電極とSECMを統合し、細胞レベルでのグルコース消費の評価の可能性を示した。創薬において、新規薬剤候補の心臓へ与える影響を評価するためには、心筋細胞を利用して拍動パターンの解析が必須となっている。本研究では、生細胞を対象に、非接触かつ多機能な観察が可能である走査型電気化学顕微鏡(SECM)を利用して、心筋細胞の動きやエネルギー代謝を一細胞レベルで解析可能なシステムを開発した。特に、SECMのプローブであるマイクロ電極先端に、DNA足場として二種類の酵素を固定化することで局所におけるグルコース濃度測定を実現し、細胞レベルでのグルコース消費評価の可能性を示した。平成26年度は、研究実施計画通りに心筋細胞の代謝活性を評価するためのマイクロ電極の開発をすすめることができた。今後、開発した酵素固定化マイクロ電極を利用して細胞の代謝活性を評価する予定である。平成27年度までに、研究実施計画に沿ってSECMによる心筋細胞評価システムにおいて、酵素固定化マイクロ電極をプローブとして利用する、細胞レベルでの代謝活性評価系を構築してきた。今後は、システムの改良と初代細胞を対象に成果発表に向けたより精緻な追加実験を実施する。
マウス肝線維化を抑制する新規インテグリン抗体の作用機序と治療応用への集大成研究

1.アロステリック型抗体の優位性:我々が作製したα8阻害抗体のうち、YZ3が競合型、YZ5がアロステリック型であることがわかった。細胞接着アッセイにおける細胞デタッチメント、固相化リガンドに結合したインテグリンに対する抗体添加による解離から判断した。今後、標識Fab抗体を用いて、dose-responseカーブを描き、生化学的に阻害様式を確かめる。2. α8β1-signalとTGF-βの協調的作用作用:コラーゲンゲルの収縮作用を指標として、α8β1-signaがTGFβと協調的に作用するかを確かめた。α8β1のリガンドであるネフロネクチンを含むゲルを作製したが、肺線維芽細胞による収縮効果を観察したところ、TGFβによる収縮増強はネフロネクチン非含有ゲルに比べ著明に増強した。またこの増強はα8阻害抗体により減弱した。以上から、TGFβはα8β1-signalと協調的に収縮力を高めることが分かった。しかし、これは二つのシグナルが独立したものか否かを判定するには至っていない。当該年度の目的であった抗体の作用様式、TGFβとの協調作用を明らかにすることができた。これまでの成果の証拠固めを行う。交代作用様式に関しては、1)タンパク相互作用を細胞を使わない系で検出(Surface plasmon resonance)で検出2)生化学的に阻害が競合型かアロステリック型かを,抗体添加によるdose response curveの変化により決定する。TGFとの協調作用については、TGF受容体の阻害剤やα8β1シグナル経路の阻害剤を用いて確認する。これまで「肝線維化を抑制する活性化星細胞特異的インテグリンの抗体:作用機序解明と治療の展開」(平成24-25年度萌芽研究)および「マウス肝線維化を抑制する新規インテグリン抗体作用機序解明と治療応用に向けた研究」(平成26-28年度基盤研究(B))などで、インテグリンα8β1抗体の持つ線維化抑制作用を示してきた。本研究ではその機序を明らかにすること、作用をさらに具体化することを目的とする。Proof of Conceptの結果として製薬企業に特許がライセンスアウトされることを期待する。具体的には以下の点が実験計画として挙げられた。1阻害抗体の作用様式による効果の違い2α8β1シグナルとTGFβシグナルは線維化に対して相乗的に働くか3α8発現誘導のメカニズム4ノックアウトマウスを用いたα8線維化寄与の証明平成29年度は3と4に関して成果が得られた。α8の発現は転写関連分子YAP1の下流にあることを、阻害剤を用いたin vitroの実験およびYAP1抗体を用いたChIP-seqアッセイ結果が公開してあるデータベース解析から見出した。ノックアウトマウスを用いた実験では、Tamoxifenによるinducible gene deletionが生ずるようにマウスを作出した。Cre recombinaseによる組み換えの効率は、Rosa-CreERをmTmG reporter miceと交配し、CCl4を投与し確認したが、期待通りの結果であった。これらにより、阻害抗体を用いた実験により確かめたα8β1の線維化促進的な役割はさらに強化された。今後は研究結果の広報を図りながら1、2の解明と3の補強に注力してゆく。当初掲げた4つの目標(概要の項に記載)のうち、2項目がほぼ達成できた。当初掲げた4つの目標(概要の項に記載)のうち、以下の未達成の2項目について研究する。1阻害抗体の作用様式による効果の違い2α8β1シグナルとTGFβシグナルは線維化に対して相乗的に働くか