hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜トラフィッキング制御分子による破骨細胞分化と骨吸収の新たな調節機能の解明

膜トラッフィッキングの調節因子であるNedd4アダプタータンパク質Pmepa1の破骨細胞分化における発現と機能の解析を行なった。Pmepa1はRANKLを添加すると破骨細胞の前駆細胞に発現が見られ、象牙質切片上や骨面上の破骨細胞の細胞内小胞において強く発現していた。shRNAによる発現のノックダウン及びCrisper-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの解析から、Pmepa1は破骨細胞前駆細胞においてはRANKの細胞表面の輸送、破骨細胞においては骨吸収の制御に関わるタンパク質であることが明らかとなった。破骨細胞は膜表面に面した膜に酸や酵素を盛んに分泌する極性を持った多核細胞で、その成熟破骨細胞への分化過程には小胞輸送の様々な過程が関わっている。しかしながらその調節機構はまだ不明な点が多い。本年度においては、申請者らがマイクロアレイ解析で明らかにした膜トラッフィッキングの調節因子Nedd4アダプタータンパク質の破骨細胞分化おける発現と機能の解析及びノックアウトマウスの作成を行なった。Nedd4アダプタータンパク質は、マクロファージ細胞RAW264や骨髄マクロファージにRANKLを添加すると発現が24時間で上昇し、免疫染色ではプラスチック上で破骨細胞の前駆細胞に発現が見られたが、多核の破骨細胞に発現が見られなかった。しかし、骨髄由来の破骨細胞前駆細胞を象牙質の上で培養し形成した破骨細胞において強く発現することがわかり、破骨細胞での発現誘導に骨基質成分からの刺激が関与すると考えられた。さらにこのタンパク質の細胞内の局在を調べた結果、エンドソームやカテプシンKとの共局在が認められた。また、ラットアジュバント関節炎の骨破壊部位の免疫染色によりin vivoの破骨細胞において発現していることがわかった。このNedd4アダプタータンパク質の機能を調べるため、RAW264細胞でsiRNAにより発現を抑制すると、破骨細胞の分化が抑制された。さらにマクロファージRAW264細胞でその発現を抑制した時の、細胞表面のCD11bとRANKの発現をFlow cytometryにより解析した結果、RANKの発現が選択的に抑制され、細胞表面への輸送の制御に関わることが考えられた。さらに、Crisper-Cas9システムを用いてこのタンパク質のノックアウトマウスの作成を試みた。ゲノム解析を行ない、germlineの伝達とヘテロノックアウトマウス樹立を確認した。本年度においては、Nedd4アダプタータンパク質の発現誘導の詳細な解析を行い、その機能をsiRNAによる発現抑制により明らかにし、さらにノックアウトマウスを作成することが目的であった。その結果、プラスチック上では発現が誘導されず、骨の上でのみ破骨細胞において発現が誘導されるという誘導機構が明らかになった。この発現誘導に関わる骨基質成分についても解析を行なっており、非常に独特な発現誘導をするタンパク質であることが明らかになった。さらに、このタンパク質の発現の抑制がRANKという破骨細胞の分化に重要なタンパク質の細胞表面への輸送に関わることも明らかにした。また、Crspr-Cas9システムを用いてノックアウトマウスを作成することも出来た。骨面上の成熟した破骨細胞は極性を持った大型の細胞で、酸やタンパク質分解酵素を分泌して骨吸収を行っている。このような分泌機構には細胞内の膜トラッフィキングを制御する多くのタンパク質が関わっている。本年度においては、膜トラッフィッキングの調節に関わるNedd4アダプタータンパク質の骨面上の破骨細胞における発現調節について、いくつかの細胞外基質タンパク質の関与について調べた。培養デッシュをtypeIコラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、及びオステオポンチンでコートしNedd4アダプタータンパク質の発現の誘導を調べた結果オステオポンチンでは発現の上昇が見られたが、その他の細胞外基質タンパク質では発現誘導が見られなかった。また、骨基質内の増殖因子類についても調べたところTGF-βで刺激した場合にも発現が亢進することがわかった。さらにアレンドロネートやBafilomycin A1によって骨吸収を抑制した破骨細胞ではその発現が抑制された。一方shRNAレンチウイルスを用いて破骨細胞でNedd4アダプタータンパク質の発現を抑制した場合は骨吸収能が低下していた。さらにCrispr/Cas9システムを利用し昨年度から作成したノックアウトマウスを解析したところ、いくつかのノックアウトマウス及び変異マウスが作成されていることがわかった。これらのNedd4アダプタータンパク質変異マウスから形成した破骨細胞においても骨吸収能に異常が見られた。さらに、Nedd4アダプタータンパク質の発現を抑制した破骨細胞には分泌機能に異常が見られることがわかった。Crispr/Cas9システムを用いていくつかのNedd4アダプタータンパク質欠損マウス及び変異マウスのラインを作成することが出来た。これらのマウスを用いてNedd4アダプタータンパク質の破骨細胞の骨吸収への作用や膜トラッフィキングへの関与及びそのメカニズムについていくつかの興味深い結果が得られている。破骨細胞は酸や酵素を盛んに分泌することにより骨を吸収する多核細胞で、その分化や活性化には小胞同士による膜トラッフィキングが重要な役割をもっている。本研究では、膜トラッフィッキングの調節因子であるNedd4アダプタータンパク質Pmepa1の破骨細胞分化における発現と機能の解析を行なった。Pmepa1はRANKLを添加すると破骨細胞の前駆細胞に発現が見られたが、プラスチックシャーレ上で形成される多核の破骨細胞には発現が見られなかった。一方、象牙質の上で形成した骨吸収中の破骨細胞においては強く発現していた。Pmepa1は、破骨細胞内のエンドソームやリソソームに局在しており、ビスフォスフォネートなどによって骨吸収を抑制するとその発現が低下した。

さらに、ラットアジュバント関節炎の骨破壊部位の破骨細胞のPmepa1の免疫染色を行ったところ、in vivoの破骨細胞においても発現していることがわかった。Pmepa1の膜トラッフィッキングの調節因子としての機能を調べるために、RAW264細胞でその発現を抑制し、RANKLで誘導される細胞表面のRANKの発現を調べた。その結果、RANKの発現が抑制され、細胞表面への輸送に関わることがわかった。また、骨髄マクロファージから形成した破骨細胞においてshRNAレンチウイルスを用いて発現を抑制すると骨吸収能が低下した。さらに、Crisper-Cas9システムを用いて3種類のPmepa1のノックアウトマウスを作成した。ノックアウトマウスから単離した骨髄マクロファージから形成した破骨細胞では、骨吸収能や破骨細胞の酸の産生量が低下するという結果が得られている。これらのことから、Pmepa1は破骨細胞の分化において重要な受容体の小胞輸送に関わり、成熟破骨細胞のなかでも骨吸収を行っている破骨細胞で高く発現し骨吸収能の調節に関わる可能性が考えられた。膜トラッフィッキングの調節因子であるNedd4アダプタータンパク質Pmepa1の破骨細胞分化における発現と機能の解析を行なった。Pmepa1はRANKLを添加すると破骨細胞の前駆細胞に発現が見られ、象牙質切片上や骨面上の破骨細胞の細胞内小胞において強く発現していた。shRNAによる発現のノックダウン及びCrisper-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの解析から、Pmepa1は破骨細胞前駆細胞においてはRANKの細胞表面の輸送、破骨細胞においては骨吸収の制御に関わるタンパク質であることが明らかとなった。今年度の結果をもとに、Nedd4アダプタータンパク質の機能の詳細を明らかにしていく。どのようなタンパク質と相互作用するか、破骨細胞における活性化のシグナル因子や伝達機構と関わりについて解析を行なう。またノックアウトマウスを用いてin vivoにおける働きや骨代謝における機能についての解析を行なう。Crspr-Cas9システムを用いて作成したいくつかのノックアウトマウスや変異マウスを継続維持しながら、Nedd4アダプタータンパク質の骨吸収促進機能のメカニズムの詳細や骨病態における関与について解析を進めていく予定である。細胞生物学、骨代謝、分子生物学本年度においてはCrisper-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作成等に費用を当てていたが、共同研究で行なったことと、予想より多くの実験を必要としなかったことから、物品費に余裕が生まれた。来年度で行なうタンパク質の機能解析やマウスの解析には予想より多くの費用を要することが考えられるため、来年度の研究費に使用することにする。当初は1系統のノックアウトマウスを作成する予定であったが、いくつかノックアウトマウスと変異マウスが作成された。
同一場における転写因子のDNA結合・転写活性同時評価法の確立

遺伝情報発現は転写調節によってその大半が制御されている。特に真核生物において、その転写調節は転写因子のDNAへの結合がトリガーとなる。従って、転写因子-DNA間の相互作用とそれに伴う転写活性化の定量化は遺伝情報発現の中心的な命題の解明につながる。しかし、これまで転写因子の機能解析に用いられてきた手法では細胞内での時空間的解析が困難であった。そこで、本申請では蛍光相互相関分光法を用い、転写因子-DNA相互作用とそれに伴う転写活性化量を経時的かつ定量的に測定可能な系の確立を目的とした。今年度は、溶液での測定系構築を目指し、昆虫細胞からのEGFP融合核内転写因子(グルココルチコイド受容体)の単離法を確立した。また、蛍光相関分光法を用いた転写産物の定量化のための蛍光タンパク質融合RNA特異的結合タンパク質(MS2 Coat Protein)の単離精製を行った。現状では目的の測定系の確立には至っていないが、測定系に必要な材料がそろいつつあるので、今後、早急に系の立ち上げを目指す。さらに、今年度はRICS(Raster Image Correlation Spectroscopy)法の確立を行い、生細胞核内での転写因子動態マッピング解析を行った。その結果、核内で転写因子の動きが著しく制限されている領域が確認された。また、DNA結合能を欠損させた変異体においては動きが制限される領域が観察されないことがわかった。これは転写因子の動きが制限される領域で転写が活発に行われていることが示唆する結果である。現在、DNA microarrayや定量的RT-PCRを用い、野生型と様々な機能欠損変異体との転写活性化の違いを解析し、核内における動きが制限される領域と転写活性化の相関について解析を行っている。従って、転写因子-DNA間の相互作用の定量的解明はとも言える。しかしながら、これまで転写因子の機能解析に用いられてきた手法では細胞内での時空間的解析が困難であった。そこで、本申請では蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy : FCCS)を用い、転写因子-DNA相互作用とそれに伴う転写活性化量を経時的かつ定量的に測定可能な系の確立を目的とした。さらに、この「転写因子のDNA結合・転写活性同時評価法」を生細胞内で測定可能にするために、細胞内へのマイクロインジェクション装置の整備を行った。このように、転写に関わる遺伝情報場の解明にむけて、溶液中での測定だけなく、生細胞への応用も見据えた測定系の基盤が整えることができた。次年度は溶液中における転写因子のDNA結合・転写活性同時評価法を完成させるとともに、生細胞への応用を本格的に行う予定である。
Cell Competitionの不具合に起因する癌発症機構の研究

まず、アポトーシス細胞の貪食を担う受容体を欠損させたショウジョウバエを作成した。その動物では幼虫の期間が長くなり、アポトーシス細胞除去が動物個体の成長に必要とされることがわかった。続いて、貪食不全により残存する負け組細胞の性質を調べるため、貪食受容体欠損動物にCell Competitionをモザイク状に起こす変異を導入した。しかし、本研究の期間内にその個体の解析を完了させるに至らなかった。本年度は、Cell Competitionが起こりやすく、かつ、研究代表者が以前に見いだしたアポトーシス細胞貧食受容体のDraperとIntegrinの両方を欠損した変異体ショウジョウバエ株を樹立するための実験に終始した。しかし、その過程で、DraperとIntegrinの両方を欠損したショウジョウバエは、対象ショウジョウバエと比較して、成虫になるまでの時間が長くなっていることが見いだされた。(論文投稿中)ショウジョウバエの初期発生過程で細胞の増殖や分化に何らかの不具合が生じると、それを正常に戻すための生体反応が起こり、それに要する時間の分だけ幼虫期間が長くなることが知られる。よって、上記の現象は、胚および幼虫においてアポトーシス細胞の貧食除去が正常に行われなかったために、細胞の増殖や分化に依存した形態形成などが十分に進まず、幼虫の期間が延長されたことを反映すると推測される。"初期発生時のアポトーシス細胞貧食除去の必要性"はいくつかの現象において示されているが、その詳しい仕組みは不明である。今回発見された現象の解析をさらに進めれば、その課題にせまることができると期待される。一方、本計画の主課題である"Cell Competitionにおいて生じるアポトーシス細胞の除去不全が癌発症につながる"という仮定の検証は来年度に持ち越される。解析対象となるショウジョウバエ株の樹立まであと少しの段階に来ており、23年度にはそれらを用いて解析を進める予定である。本研究の目的は、"癌の発症はCell Competition(細胞競合)における貪食不全に起因する"という仮説を、ショウジョウバエを利用した解析を行って検証することにある。平成23年度では、研究代表者が見いだした2つの貪食受容体であるDraperとIntegrinの両方を欠損したショウジョウバエ株にCell Competitionが起こりやすくなる遺伝子変異を導入することを目的として研究を行った。具体的な研究成果は以下の通りである。RNAi法によづてDraper、とIntegrinの両方の発現を低下させるショウジョウバエ系統の樹立に成功した。また、熱ショックを与えることによりMinute変異体が導入されてCell Competitionが起こりやすくなるショウジョウバエ系統の樹立にも成功した。2.Minute変異をモザイクで持つショウジョウバエ系統の作成熱ショック(38°C、約1時間)をかけることにより、ショウジョウバエの各組織において部分的に遺伝子組換えを起こし、Minute変異細胞をモザイクとして持たせる実験条件を確定することができた。次は、モザイクMinute変異体とDraper & Integrin欠損を組み合わせて、成虫原基における"余分な細胞"の出現が貧食受容体の欠損に依存するかどうかを調べる。そして、余分な細胞を多く持つショウジョウバエの表現型を調べ、癌の発症程度を知る。残念ながら、これらの解析については本研究課題の設定期間中には実施できず、期間を越えて取り組む予定である。
X線トポグラフによる3次元結晶配向組織の非破壊解析法の開発基礎研究

配向組織をもつ結晶性金属材料の3次元配向情報を、高い空間分解能(目標≦1mm)で非破壊的に求める解析・評価法を開発するための基礎研究が行なわれ、つぎの成果を得た。1.3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置の開発先端材料の一つである一方向凝固共晶合金を対象として、その凝固組織の非破壊測定法を開発するために、金属単結晶の凝固一次組織の評価に応用された長隙ラウエ法による3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置を改良して、新しい機能をもつ測定システムを試作した。長隙スリット[(1段)長さ200mm,幅10mm,厚さ5mm,(2段)長さ100mm,幅1mm,厚さ5mm]により近似的に平行に絞られた長隙白色X線平板ビームを試料に照射して、得られる回折像を写真フィルムに記録した。透過に加え反射像も得られた。2.結晶配向組織情報の非破壊収集凝固速度を制御した条件(100,300,500mm/min)下で、大野式Strip Casting(OSC)法で作成した、凝固組織の制御された板状アルミニウムを試料として用いた。凝固速度が遅い(100mm/min),強く配向した試料からは、凝固方向に平行にのびたラウエ線条が明瞭に観察され、凝固速度の増大に伴い、配向性の低下に対応する像の変化が観察された。これは、内部の金属組織情報(破壊法による)と一致する結果であった。配向組織を持つ結晶性材料の3次元配向情報を、高い空間分解能(目標≦1mm)で非破壊的に求める評価・解析法を開発するための基礎研究が行なわれ、つぎの成果を得た。(1)3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置の試作先端材料の一つである一方向凝固共晶合金を対象として、その凝固組織の非破壊測定のために、金属単結晶の凝固一次組織の測定に開発された長隙ラウエ法による3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置を改良して、新らしい機能を含む測定装置を試作した。長隙スリット[(1段)長さ200mmX幅10mmX厚さ5mm,(2段)長さ100mX幅1mmX厚さ5mm]により平行に絞られた長隙白色X線ビームを試料に照射してえられた、長隙ラウエ回折像を写真フイルムによって記録・測定・解析する準備が進められた。(2)試作装置による結晶配向組織情報の非破壊収集凝固速度(100,300,500mm/min)を制御した条件下で、大野式Strip Casting(OSC)法で作成した板状アルミニウムを試料として用いた。凝固速度が遅い(100mm/min)試料からは、凝固方向に平行にのびたラウエ線条が明瞭に観察され、強い配向性の組織情報が非破壊的にえられた。凝固速度の増大に伴い、配向性の低下に対応する像の変化が観察された。材料内部の金属組織情報(破壊法)と一致する結果がえられた。X線が透過する試料の厚さ方向を含む、3次元結晶配向評価法の開発のためにはBraggの法則に基づく回折条件の解析が必要であり、回折角、光子エネルギーの評価を含む、シンクロナイズ機構をもつマイクロスリット系の開発およびイメージングプレートシステムの開発が計画されている。弱い配向性の組織情報についえては、画像処理解析による測定でえられた特徴量と関連づけることが課題として示された。配向組織を持つ結晶性金属材料の3次元配向情報を、高い空間分解能(目標≦1mm)で非破壊的に求める解析・評価法を開発するための基礎研究が続けられ、つぎの成果を得た。1. 3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置の試作・改造先端材料の一つである一方向

凝固共晶合金を対象として、その凝固組織の非破壊測定のために、金属単結晶の凝固一次組織の評価に応用された長隙ラウェ法による3次元結晶配向X線トポグラフ測定装置を改良して、新しい機能をもつ測定システムを試作した。長隙スリット[(1段)長さ200mm,幅10mm,厚さ5mm,(2段)長さ100mm,幅1mm,厚さ5mm]により近似的に平行に絞られた、長隙白色X線ビームを試料に照射してえられる、回折像を写真フィルムに記録し、透過に加え背面反射像もえられるように改造された。2.結晶配向組織情報の非破壊収集凝固速度(100,300,500mm/min)を制御した条件下で、大野式Strip Casting(OSC)法で作成した板状アルミニゥムを試料として用いた。凝固速度が遅い(100mm/min)強く配向した試料からは、凝固方向に平行にのびたラウエ線条が明瞭に観察され、凝固速度の増大に伴い、配向性の低下に対応する像の変化が観察された。内部の金属組織情報(破壊法)と一致する結果がえられた。3,今後の課題背面反射像に基づく表層領域の非破壊解析法の開発は可能であることが明らかにされた。しかし、X線が透過する試料の厚さ方向を含む3次元結晶配向評価法とするためには、回折角、光子エネルギーの評価を伴う、マイクロスリット系の開発およびイメージングプレートシステムとのシンクロナイズ機構が必要と考えられる。
ノックアウトマウスを用いた尿細管における電解質輸送の研究

P-糖蛋白質(P-gp)を欠損したマウスとその野生型マウスの近位尿細管S2セグメントをcollapseした状態で灌流し、細胞容積調節におけるP-gpの役割とP-gpによる細胞容積調節における基底側膜Na/H交換輸送体(NHE)の関与について検討した。結果は以下の通りであった。1.P-gp活性非存在下では、mannitolによる高浸透圧刺激で調節性容積増加(RVI)が出現するがP-gp活性存在下ではこれは起こらない。一方、低浸透圧刺激時にはP-gp活性の有無に関らず調節性容積減少が出現する。2.mannitolによる高浸透圧刺激で出現するRVIには一部基底側膜のNHEが関与している。3.P-gp活性の有無に関らず、ureaによる高浸透圧刺激ではRVIは観察されず、細胞容積は一過性に縮小後、速やかに刺激前値に復帰する。7.P-gp活性の有無に関らず、ureaによる高浸透圧刺激を与えるとtyrosine kinaseを介して基底側膜のNHEが活性化される。近位尿細管のタイトジャンクションに発現しているクローディン2の細胞間短絡路のNaCl輸送における役割を解明するため、ジーンターゲティング法により、クローディン2遺伝子のノックアウト(KO)マウスを作成し、その野生型(WT)マウスを対照として、近位尿細管の形態と機能を、それぞれパラフィン切片法による光学顕微鏡観察、超薄切片法、フリーズフラクチャー法による電子顕微鏡観察と、単離・灌流した近位尿細管の正味のNa、Cl、水輸送量、経上皮抵抗およびタイトジャンクション抵抗、細胞間短絡路のNa/Clの透過性の比、および腎クリアランス法によって、比較した。光学顕微鏡および電子顕微鏡による形態的解析では、KOマウスの近位尿細管上皮細胞においてもタイトジャンクションが存在することが観察され、WTマウスと比較してその構造に著しい差は見られなかった。機能的解析では、近位尿細管上皮を介したNa、Cl、水再吸収量は、WTマウスに比し、KOマウスで有意な低下を認めた。近位尿細管の経上皮抵抗およびタイトジャンクション抵抗は共にWTマウスに比しKOマウスで約2倍の増加を示したが、管腔側膜抵抗、基底側膜抵抗は不変であった。WTマウスの近位尿細管の細胞間短絡路はNa透過性が優位であるのに対し、KOマウスではCl透過性が優位であった。腎クリアランス法では、分画Na排泄、分画Cl排泄、分画水排泄は、2群のマウスで不変であった。一方、furosemide、bendroflumethiazide、amilorideを同時投与し、近位尿細管より遠位部のNa/Cl輸送を抑制すると、分画Na排泄、分画Cl排泄、分画水排泄はいずれも、KOマウスで有意な増加を示した。以上より、クローディン2は、近位尿細管の細胞間短絡路の抵抗を小さくし、この経路を介したNa/Cl再吸収、特にNa選択性の維持に重要な役割を担っていることが考えられた。平成15年度に引き続き今年度も、近位尿細管のタイトジャンクションに発現しているクローディン2の細胞間短絡路のNaCl輸送における役割を解明した。ジーンターゲティング法により作成したクローディン2遺伝子のノックアウト(KO)マウスとその野生型(WT)マウスを用いて、腎機能と血圧を比較検討した。代謝ケージに24時間2群のマウスを入れ、水を自由に飲水できる状態で分画Na排泄と分画Cl排泄を測定したところ、いずれもKOマウスで有意な増加が認められなかった。一方、1日尿量はKOマウスでWTマウスの1.7倍に増加するとともに、尿浸透圧は有意に減少したことにより、KOマウスで尿濃縮力障害が存在することが示唆された。自由飲水での分画Na排泄と分画Cl排泄がKOマウスで増加しなかったことは、近位尿細管でのNaCl再吸収障害を遠位尿細管が代償していることが考えられた、これを証明するため、2%NaCl溶液を3日間飲水として与え、近位および遠位尿細管へのNaCl負荷を増加させたところ、2群のマウスはいずれも分画Na排泄と分画Cl排泄が増加したが、KOマウスでその増加が有意に大きかった。また、KOマウスではNaCl負荷後有意な体重減少が認められたのに対し、WTマウスでは不変であった。

血圧はNaCl負荷前後で、2群のマウスで不変であった。昨年の報告と併せると、クローディング2欠損マウスは、1)近位尿細管上皮細胞においてもタイトジャンクションが存在し、WTマウスと比較してその構造に著しい差は認められない、一方、2)近位尿細管の細胞間短絡路の抵抗の増大と、この経路を介したNa再吸収を抑制する、3)Na負荷に対し過剰のNa利尿を示すことが明らかとなり、クローディン2が近位尿細管細胞間短絡路のNa再吸収に重要な役割を担っていることが考えられた。
マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成および環境調和型反応プロセスの開発

マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成について種々のマイクロ波反応装置で迅速合成法を研究した。Ir(III)-ポリピリジン錯体、Tb(III),Eu(III)のポリピリジンおよびβ-ジケトン類を配位子とする発光性錯体を検討した。この結果、発光物質として有効な錯体を迅速かつ高収率で合成することができた。これらの錯体の光物性について検討した。環境調和型反応プロセスの開発として特に半導体HPAをマイクロ波源とする半導体HPAマイクロ波源と楕円焦点式反応器を組み合わせた精密マイクロ波反応装置を開発し、発光性微粒子、貴金属ナノ粒子の精密合成法への適用を研究した。マイクロ波反応の温度制御、反応系へのマイクロ波エネルギーの入力、反射電力の測定がリアルタイムで解析され、表示される装置を完成した。本テーマ"マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成及び、環境調和型反応プロセスの開発"はこのように、発光性錯体、貴金属ナノ粒子を対象に環境調和型化学プロセスを可能にする装置開発で締めくくることができた。関連する研究として液晶製錯体や有機物の合成と物性、新規配位子を用いた発光性錯体の合成研究を行った。研究成果は、電気化学会、日本化学会、マイクロ波応用国際会議、ACS2007、化学工学会等で発表された。研究成果を報告書にまとめた。「マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成及び環境調和型反応プロセスの開発亅の平成16年度研究実績は下記の通りである。発光物質として、白金族錯体のマイクロ波合成について、Irを中心金属として、ポリピリジン錯体をマイクロ波合成法を研究した。この結果、有機ELの発光物質として有効な錯体を迅速かつ高収率で合成することができた。研究成果は、電気化学会、日本化学会、マイクロ波応用国際会議度で発表された。研究の結果を総合すると、1.マイクロ波熱触媒作用は物質の誘電特性に基づく誘電加熱による、自発的熱発生機構により化学反応の速度が加速されるために生じる。2.従来合成が困難で、長時間の合成時間を要し、収率が極めて低かった発光性錯体がマイクロ波法により高効率に製造されることが分かった。3.合成した錯体は、有機ELの発光材料としてまた、液晶材料として利用できる物性を示す。4.合成した配位子も発光性をしめし、その金属錯体も高輝度発光を示す。今後マイクロ波合成で生成した新しいリン光性錯体について、微粒子化や高分子への挿入法を検討し薄膜発光体への値適用に付いて検討する。「マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成及び環境調和型反応プロセスの開発」の平成17年度研究実績は下記の通りである。発光物質として、発光性希土類錯体のマイクロ波合成についてマルチモードマイクロ波反応装置(マイルストーン社製スタート)およびシングルモード式グリーンモティーフI(東京電子IDX製)ヲ用いた。Tb(III),Eu(III)を中心金属として、配位子についてはポリピリジンおよびβ-ジケトン類を検討した。また、配位子としてTetrakis(2-quinolinylmethyl)ethylenediamine(TQEN)、f2、6-Diaryl-4-(2-substituted thienyl-5-yl)Pyridinesを合成し、物性を検討した。1.マイクロ波熱触媒作用は物質の誘電特性に基づく誘電加熱による、自発的熱発生機構により化学反応の速度が加速されるために生じる。2.長時間の合成時間を要し、収率が極めて低かった発光性錯体がマイクロ波法により高効率に製造されることが分かった。Tb, Eu錯体は100°Cから250°Cの範囲で融解性、昇華性を示すものがあった。4.半導体高出力アンプを波源とする半導体高出力マイクロ波源と楕円焦点式反応器を組み合わせた精密マイクロ波反応装置を開発した。研究成果は、電気化学会、日本化学会、マイクロ波応用国際会議、Pacifichem 2005、化学工学会等で発表された。

最終年は特に半導体HPAをマイクロ波源とする半導体HPAマイクロ波源と楕円焦点式反応器を組み合わせた精密マいクロ波反応装置を開発し、発光性微粒子、貴金属ナノ粒子の精密合成法への適用を研究した。マイクロ波反応の温度制御、反応系へのマイクロ波エネルギーの入力、反射電力の測定がリアルタイムに解析され、表示される装置を完成した。本テーマ"マイクロ波熱触媒作用による発光物質の選択合成及び、環境調和型反応プロセスの開発"はこのように、発光性錯体、貴金属ナノ粒子を対象に環境調和型化学プロセスを可能にする装置開発で締めくくることができた。研究成果は、電気化学会、日本化学会、マイクロ波応用国際会議、ACS 2007、化学工学会等で発表された。
黄砂の疫学的健康影響評価

【目的】長崎において黄砂が死亡率に及ぼす影響を明らかにするため、以下のデータを収集した。【方法】1)黄砂データ:「気象庁」長崎海洋気象台において1990年-2006年に観測された黄砂日。「ライダー」長崎市において2003年-2006年にライダーで観測された高度120-900mの黄砂消散係数の日中央値をもとに黄砂日を定義した。2)気象データ:同気象台で観測された同時期の気象データ。3)大気汚染物質濃度:長崎市内の大気汚染観測局(一般局)におけるSPM、光化学オキシダント(Ox)、二酸化窒素(NO2)の日平均濃度。4)死亡データ:被爆者コホート(長崎市居住)から死亡日・性・年齢・死亡原因・既往疾患・喫煙などの情報を抽出した。統計解析:一般化線形ポワソン回帰モデルを用いて時系列解析を行った。黄砂日を指標変数、大気汚染物質(SPM,Ox,NO2)を連続変数、気象(気温、湿度)のnatural cubic spline、年・月・曜日・休日を指標変数としてモデルに投入した。【結果】総死亡は黄砂により4.1%(95%信頼区間:-8.4,18.4)増加(当日)、循環器系疾患死亡は13.8%(同:-9.4,42.9)増加(当日)、呼吸器系疾患死亡は1.6%(同:-25.9,39.1)増加(当日)を認めた。いずれも統計学的有意差はなかった。年齢、慢性疾患、喫煙習慣によるサブグループ解析ではいずれも統計学的有意差のあるリスク上昇は認めなかった。ライダーによる黄砂日を用いた解析では、総死亡は黄砂により12.9%(同:-24.6,69.1)増加(ラグ2日)、循環器系疾患死亡は-3.2%(同:-55.4,110.0)増加(ラグ2日)、呼吸器系疾患死亡は40.6%(同:-39.9,228.9,増加(当日)を認めた。【結論】黄砂日では循環器疾患死亡および呼吸器疾患死亡の増加を認めたが、統計学的有意差はなかった。ライダーまたは気象庁の黄砂定義により推計値が異なり、いずれにおいても死亡との関連のエビデンスは得られなかった。長崎海洋気象台において1990年-2006年に観測された黄砂日を気象庁HPより得た。また、同気象台で観測された気象データを国立環境研究所データベースより入手した。また、長崎市内の大気汚染観測局(一般局)におけるSPM、光化学オキシダント(Ox)、二酸化硫黄(SO_2)、二酸化窒素(NO_2)の1時間値より日平均、日最高濃度を算出した(1日20時間以上データがある場合のみ)。各観測局における各汚染物質の日平均、日最高濃度を平均し長崎市内における曝露指標とした。ライダーは高度200-1000mの黄砂消散係数と球形エアロゾル消散係数の日平均値を用いた。被爆者コホート(長崎市居住)から死亡日・性・年齢・死亡原因・既往疾患・喫煙などの情報を抽出した(1990年-2006年)。死亡原因は循環器疾患(ICD-9:390.0-459.9,ICD-10:I00-I99)、呼吸器疾患(ICD-9:460.0-519.9,ICD-10:JOO-J99)に分類し、外因死(ICD-9:800.0-999.9,ICD-10:S-Z)は解析から除外した。死亡者20,822人のうち、60歳以上が95%を占めた。死因は循環器疾患が33%、呼吸器疾患が17%であった。非喫煙者が24%、既往疾患は糖尿病が5%、高血圧が14%であった。3-5月の黄砂日と非黄砂日における各大気汚染物質濃度の比較では、黄砂消散係数、SPMおよびOxが黄砂日で有意に高く、気温、相対湿度は有意に低かった。死亡者数の有意差は認めなかった。【結果】

総死亡は黄砂により4.1%(95%信頼区間:-8.4,18.4)増加(当日)、循環器系疾患死亡は13.8%(同:-9.4,42.9)増加(当日)、呼吸器系疾患死亡は1.6%(同:-25.9,39.1)増加(当日)を認めた。いずれも統計学的有意差はなかった。年齢、慢性疾患、喫煙習慣によるサブグループ解析ではいずれも統計学的有意差のあるリスク上昇は認めなかった。ライダーによる黄砂日を用いた解析では、総死亡は黄砂により12.9%(同:-24.6,69.1)増加(ラグ2日)、循環器系疾患死亡は-3.2%(同:-55.4,110.0)増加(ラグ2日)、呼吸器系疾患死亡は40.6%(同:-39.9,228.9,増加(当日)を認めた。【結論】黄砂日では循環器疾患死亡および呼吸器疾患死亡の増加を認めたが、統計学的有意差はなかった。ライダーまたは気象庁の黄砂定義により推計値が異なり、いずれにおいても死亡との関連のエビデンスは得られなかった。
機械学習に基づく画像認識処理の進化的自動構築に関する研究

本研究では,進化計算法を用いて画像認識器を自動構築する方式について研究した.その結果,進化的条件判断ネットワークと呼ぶ方式を開発した.本方式では,認識対象データと参照データを入力し,特徴量の大小判定を行うだけでそれらをクラス分類することができるネットワーク構造を,学習用画像セットから全自動で構築することができる.本方式を医用画像認識などのいくつかの画像認識の課題に適用し,その有効性を確認した.本研究では,進化計算法を用いて画像認識器を自動構築する方式について研究した.その結果,進化的条件判断ネットワークと呼ぶ方式を開発した.本方式では,認識対象データと参照データを入力し,特徴量の大小判定を行うだけでそれらをクラス分類することができるネットワーク構造を,学習用画像セットから全自動で構築することができる.本方式を医用画像認識などのいくつかの画像認識の課題に適用し,その有効性を確認した.本研究では構築に膨大な労力と時間を要する画像認識プロセスを,事例に対する機械学習を通して自動構築・最適化するための情報処理技術を研究をしている.平成21年度の成果を次に示す.1.画像認識自動構築方式の開発プロトタイプとして開発したGIN(Genetic Image Network)と称する,進化計算法を用いて画像認識回路を自動構築する方式に対して,弱認識回路を並列的に並べることで認識精度を高めるブースティングの考え方を導入することで,高い認識精度を達成する方式を開発した.また,認識に用いる画像特徴量を最適化することで,従来よりも高精度の認識を達成する方式を開発した.2.自動構築されたアルゴリズムの検証本研究では,開発した方法論の適用分野として,セキュリティ分野・ITS分野・医療分野を想定しており,特に全方向カメラによって撮影した画像中の歩行者の識別,人物(頭部)の検出,男女性別の認識などに適用して有効性を検証した.さらに,開発した方式を医用画像の正常/異常分類に適用した.それらの実験結果を通して,本方式によって自動構築された画像認識回路,並びに自動選択・生成された画像特徴量を用いた画像認識が,従来法よりも平均して1020%程度高い認識精度を示すことを確認することができた.本方式では,さらに認識プロセスを自動構築することができる,という大きなメリットがある.これらより,本研究で開発した方式が,開発効率・認識精度の両面において従来法よりも優れていることを証明することができた.本研究では構築に膨大な労力と時間を要する画像認識プロセスを,事例に対する機械学習を通して自動構築・最適化するための情報処理技術を研究をしている.平成22年度の成果を次に示す.1.画像認識自動構築のための進化的条件判断ネットワークEDENの開発平成21年度に開発したGIN(Genetic Image Network)と称する,進化計算法を用いて画像認識回路を自動構築する方式を"人にとって分かり易い処理構造を作る"という観点から改良することで,進化的条件判断ネットワークEDEN(Evolutionary Decision Network)と称する方式を開発した.本方式は,一般に人が理解し易いとされる木構造を用いて分類を行う決定木(decision tree)を包含し,複数入力・複数出力のネットワーク構造へと一般化したものである.本方式は,平成22年度の成果として横浜国立大学から特許出願された(特願2010-2217177).2.進化的条件判断ネットワークEDENの性能の検証開発したEDENを分類性能を評価するための各種のベンチマーク問題に適用し,EDENによって特徴空間中に適切な部分空間が形成されることを確認した.さらに,より現実的な問題として医用画像処理(カプセル内視鏡画像の正常/異常判定),ITS(Intelligent Transportation System)の画像処理(歩行者/非歩行者の分類),一般物体認識問題(画像中の自動車の領域を決定する問題)などに適用したところ,従来法より優れた分類性能をもつことを確認した.またEDENによって,人にとって直感的に理解し易い分類処理を構築することができることを確認した.本方式はあらゆる画像分類・画像認識問題に適用することができる有効な方式である.本研究では構築に膨大な労力と時間を要する画像認識プロセスを,事例に対する機械学習を通して自動構築・最適化するための情報処理技術を研究をしている.平成23年度の成果を次に示す.1.画像認識自動構築法である進化的条件判断ネットワークEDENの改良平成22年度に開発した進化計算法を用いて画像認識回路を自動構築する方式である進化的条件判断ネットワークEDEN(Evolutionary Decision Network,特願2010-2217177)を改良した.これまで,EDENでは入力画像の特徴量毎の大小判定ノードを組み合わせて画像認識回路の自動構築を行なってきたが,固定しきい値による判別のため,特徴空間中に異なるクラスのデータが一部混在するようなデータに対する認識性能に問題があった.そこで判定ノードにファジイロジックを導入することでそれを改善した.2.進化的条件判断ネットワークEDENの応用開発したEDENを医用画像処理(カプセル内視鏡画像)の正常/異常判定,水道原水中の微生物の分類処理,動的に変化する3次元環境中の人物の検出処理に適用したところ,従来法より優れた分類性能をもつことを確認した.またEDENによって,人にとって直感的に理解し易い分類処理を構築することができることを確認した.平成23年度で本研究は終了となるが,3年間を通して,画像を認識・分類する処理回路を,人手をあまりかけずに自動生成するとともに,人にとって分かり易い認識回路を作るという本研究の当初の目標を達成し,多くの研究成果を残すことができたと考えられる.
高齢者福祉の場における対人援助技能習得プログラムの開発

関連資料・文献による分析と、大学の実習教育担当者、老人保健施設の実践者への実態調査をふまえ、医療や社会福祉領域の専門職者養成における対人的技術の教育課題について研究を行なった。各領域における技術を整理し、領域を超える12の共通スキルを抽出した。スキルごとに「技能習得プログラム及び評価票(試案)」を作成し、これを用いた演習を実施し、効果と課題を分析した。研究内容の公表と共に、研究成果について取りまとめた報告書を作成した。本年度は、まず福祉・看護・作業療法領域の専門職養成システムに関連する資料や文献を収集し、法的根拠や資格の取得方法、専門職の実状、国家試験の基準などを調べ、これらの3領域における専門職者養成のしくみの現状に関する整理を行い、3領域の比較を通して各専門職者養成の課題点を明確化した。次に、専門職者養成に携わる教員(主に学内実習教育担当者)への聞き取り調査を行った。調査対象者は、3領域2名ずつ、計6名。また、高齢者福祉の実践者に対する聞き取り調査および参与観察調査を実施した。調査対象者は3施設の各専門職者3名ずつ、計9名。半構造化面接法を用い、録音内容の逐語起こしを行い、ディテールと文脈を重視した質的分析を試みた。業務内容や一日のスケジュール、動き方等を整理しながら、スキルの抽出を行い、各専門領域において、どのような技能を用いているのかを明らかにするとともに、高齢者福祉の場で各専門職のスキルの特徴的な要素について対比的な整理を試みた。結果として、教員への調査からは、実習の制度やしくみを含む専門職者養成における課題等が明らかにされた。実践者への調査からは、タイムスケジュールや各部署での滞在時間、業務内容、利用者(サービス対象者)との関わり方や、コミュニケーションの方法等が明らかになった。実際の教育にみる指導の課題としては、体験的教育の難しさ、学生の主体性を促す指導方法の必要性、コミュニケーション教育の早期実施のあり方などがあげられた。これらの成果は、19年度以降のスキル学習プログラムの作成と、評価方法の検討へとつなげていく。初年度の研究結果は、学会発表2件を行い投稿論文を作成していく予定である。本年度は、昨年度収集した社会福祉・看護・作業療法領域3学科の専門職養成システムに関連する資料や文献を整理し、これらを題材に資格制度の課題や専門職者養成に関わるしくみについて検討を重ね、投稿論文の作成(2本)及び学会発表1回(日本社会福祉教育学会)に取り組んだ。また、専門職者養成に携わる教員と高齢者福祉の実践者に対して実施した聞き取り調査及び参与観察調査内容の概要をまとめ、中間報告書(簡易製本)を作成し、調査対象者へ配付し、結果について公表するとともに、調査対象者から感想をうかがい、示唆を得た。大学内における専門職者養成の課題点に沿いながら、高齢者福祉施設の実践者の専門的なスキル内容をKJ法によって分類した。456個のスキルは、「基本的コミュニケーション」、「理解を深める」、「状況把握・分析」、「問題への対応」に分類した。これを用いて、専門職者を日指す学生への技能習得プログラム「専門職の関わりスキル」の試案の作成を行なった。その内容は、「出会いのスキル」(2項目のスキル)と「関係継続のスキル」(10項目のスキル)の計12の共通基本スキルで構成した。また、これらの技能習得プログラムに呼応する「スキル尺度自己評価票」、「社会的スキル尺度票」、「振り返りチェックシート(自己評価)」、「振り返りシート」、「各スキルチェックシート(他者評価)」の5種類の評価票の試案の作成も行なった。これら試案を用いて、学科ごとの演習を実施した。演習の実施にあたっては、事前に「人づきあい」に関するアンケートを3学科の学生全数を対象に調査を実施(有効回答681名)し、これを分析中である。これらの試案については20年度に演習と評価を継続し、内容の修正を重ねて、プログラム及び評価票の完成に向けていく。本年度の研究成果は今後、学会発表3件を行ない、投稿論文を作成していく予定である。本年度は、過去2年間における、関連資料・文献による分析や、大学における実習教育担当者、老人保健施設の実践者への実態調査をふまえ、本研究の研究メンバー各自が、作業療法、看護、社会福祉に関わる専門職者養成における対人的技術の教育の課題について、所属学会等において発表(日本地域福祉学会、日本看護研究学会等)を行ない、研究内容の公表とその議論に取り組み、研究内容に関する多くの示唆を得ることができた。本研究によって昨年度までに作成していた、作業療法、看護、社会福祉領域における技能習得プログラム及び評価票(試案)を用いた演習を、本年度は各学科の3年・4年次学生を対象に引き続き実施し、成果と課題の蓄積を行なった。演習は各種評価票を用い、その効果をはかりながら実施し、学生が記入する各種シート、自己評価票や他者評価票等の修正を行ない、また進行における時間配分や説明方法等、プログラム全体の内容検討と修正に取り組んだ。

そして、これらの3領域における12の共通スキルについて完成させた。その一方で、各領域を超えた「連携」に関する技術があることにも焦点をあて、これを連携スキルとして養成をはかるプログラムを別途、検討して作成した。この内容は平成20年度教育GPの採択を受け、平成22年度まで教育実践を行なっていく予定となった。なお、本研究成果として、調査協力者や教育GPに取り組む関係者等への研究内容の公表と、さらなる議論の進展のため、これまでの研究内容について総合的に取りまとめた成果報告書を作成し、配付を行なった。
筋傷害性慢性痛症と運動療法の効果についての基礎実験的アプローチ

本研究では、軟部組織障害に由来した慢性痛症に対する運動療法の効果について基礎的に解析するために痛み系並びに自律系に変調をきたす病態モデルラットを開発し、慢性的な痛みに対する運動効果をトレッドミルで検討した。1.筋障害による慢性痛症モデル動物の開発a.ラットー側腓腹筋に内毒素及び高張食塩水を複合投与したところ足底皮膚への機械的刺激に対する反応性のみが投与後10週間以上亢進したが、これとは対照的に筋障害部位の痛み行動は3日目には消失した。本モデルが呈する痛み行動亢進は皮膚に限局しており、慢性痛症に対する運動の影響の検討には筋を始めとした運動器に慢性的痛み行動を呈するモデルの開発が必要と考えられた。b.このモデルと平行して開発された下肢不動化による運動器障害をトリガーとした病態モデルは、2週間のギプス除去後に惹起される足底への機械的・熱的刺激に対する反応性亢進と同時に筋圧痛閾値も10週間以上の低下を示すことが明らかとなり、自律系及び運動効果の実験に適切なモデルであると考えられた。2.モデル動物の自律系における機能解析下肢不動化モデルの自律系動態をテレメトリー装置により解析したところ、正常動物と比較した場合に、ギプス固定中は末梢交感神経活動の亢進が見られたが、ギプス除去後はむしろ低下していることが判明した。さらに、低温曝露刺激により血圧上昇率から、交感神経活動の感受性が増大していることが推定された。3.慢性的痛み行動に対する運動効果ギプス除去後3日目から12m/分のトレッドミル運動を週3回の頻度で2週間負荷した後、痛み行動の推移を10週以上フォローアップした。運動により皮膚と筋の痛み行動が抑制される傾向にあったが、個体間で比較した場合には効果にばらつきがあり、抑制傾向にあった痛み行動が運動終了後4週目から再び亢進する例も確認された。関節可動制限の回復時期に運動負荷は影響しなかった。軟部組織傷害に起因する慢性痛症は、発症時の患者の疼痛体験が重要なトリガーであることが臨床的に指摘されてはいるが、この病態をシュミレーションしたモデル動物は開発されていない。本研究では、一側のラット腓腹筋に対して炎症性要因であるLPS(lipopolysaccharide)と侵害性要因である6%高張食塩水(HS)を24時間間隔で複合投与した群とLPSとHSをそれぞれ単独投与した群における慢性的痛み行動出現の推移を比較した。傷害部位と関係のない足底の慢性的痛み行動は、複合刺激群のみで確認され、これは両側性に10週以上持続した。これとは対照的に、筋傷害部位の痛み行動及び腫脹は筋傷害作製後3日で消失した。また、LSPとHSの投与間隔を48あるいは96時間にした場合にも同様の慢性的痛み行動が誘発された。今回の実験結果より、少なくとも筋傷害性慢性痛症の発症には、侵害性入力に加えて、炎症性変化が必要であることが示された。また、筋傷害治癒後も持続する痛み行動に加えて、類似した痛み行動が反対側の足底でも出現していることより、足底の慢性的痛み行動は中枢の可塑的変化に由来していることが考えられ、このことは傷害部位の治癒後に発症するという臨床報告と一致する事象である。加えて、LPSの末梢への影響は1日で消失するが、複合刺激の投与間隔を延長しても同様の痛み行動が誘発されたことより、LPSは末梢よりもむしろ中枢で強く作用していることが伺える。

以上の結果より、軟部組織傷害により発症する慢性痛症をシュミレーションしたモデルラットがほぼ完成したと考えている。また、痛み系自律系異常カップリングの探索と運動療法の効果についての検討は、上述のモデルラットを使用したpilot studyが進行中であり、本実験に移行するためにデータ解析を行なっている段階である。本研究では、軟部組織障害に由来した慢性痛症に対する運動療法の効果について基礎的に解析するために痛み系並びに自律系に変調をきたす病態モデルラットを開発し、慢性的な痛み対する運動効果をトレッドミルで検討した。1.筋障害による慢性痛症モデル動物の開発ラット-側腓腹筋に内毒素及び高張食塩水を複合投与したところ足底皮膚への機械的刺激に対する反応性のみが投与後10週間以上亢進したが、これとは対照的に筋障害部位の痛み行動は3日目には消失した。本モデルが呈する痛み行動亢進は皮膚に限局していたが、慢性痛症に対する運動の影響を多面的に検討するためには筋を始めとした運動器に慢性的痛み行動を呈するモデルが必要であった。このモデルと平行して開発された下肢不動化による運動器障害をトリガーとした病態モデルは、2週間のギプス除去後に惹起される足底への機械的・熱的刺激に対する反応性亢進と同時に筋圧痛閾値も10週間以上の低下を示すことが明らかとなった。2.モデル動物の自律系における機能解析下肢不動化モデルの自律系動態をテレメトリー装置により解析したところ、正常動物と比較した場合に、ギプス固定中は末梢交感神経活動の亢進が見られたが、ギプス除去後はむしろ低下していることが判明した。さらに、低温曝露刺激により血圧上昇率から、交感神経活動の感受性が増大していることが推定された。3.慢性的痛み行動に対する運動効果ギプス除去後3日目から12m/分のトレッドミル運動を週3回の頻度で2週間負荷した後、痛み行動の推移を10週以上フォローアップした。運動により皮膚と筋の痛み行動が抑制される傾向にあったが、個体間で比較した場合には効果にばらつきがあり、抑制傾向にあった痛み行動が運動終了後4週目から再び亢進する例も確認された。関節可動制限の回復時期に運動負荷は影響しなかった。
ヨーロッパトウヒ樹皮の生物活性スティルベン配糖体の局在解析と定量解析

針葉樹の樹皮は昆虫や菌の侵入に対して、構成的および誘導的に組織学的あるいは化学的な防御機構を発達させている。これまで研究からヨーロッパトウヒ樹皮にはスティルベン類が多く存在することを明らかにした。本研究は、ヨーロッパトウヒ師部におけるスティルベン類の局在のパターンを化学的情報と師部の組織構造との関係から解明することを目的として行い、以下の結果を得た。(1)師部形成とスティルベン類の蓄積師部形成は5月初旬に始まり、6月中旬までがもっとも盛んで軸方向柔細胞が形成されることがわかった。この時期はデンプンと非構造炭水化物量が最も多い。一方、可溶性糖は成長活性が最も高いこの時期に減少し、夏の終わりと冬に多くなった。また内樹皮の古い層においてもスティルベン類配糖体の増加は同時期に見られた。μCTによる三次元可視化の結果から、新規の軸方向柔細胞の形成は6月から8月であった。以上の結果から、一年間の師部細胞の形成過程は内樹皮における非構造炭水化物やスティルベン類の季節的な変化と連動していることが示唆された。(2)ヨーロッパトウヒ師部内におけるスティルベン類の局在TOF-SIMSおよびcryo-TOF-SIMSを用いた師部のスティルベン類の細胞レベルの解析から、スティルベン類は軸方向柔細胞に局在すること、新しい師部から師部中央付近までスティルベン類量が増加しさらに外側になると減少することが分かった。この傾向はGC-MSによる定量解析の結果と一致した。一方、スティルベン類の成分間で挙動の違いが見られた。組織構造の観察から、師部の外側では柔細胞の空洞化や細胞サイズの減少等の変化が見られることが分かった。そのため、このような組織構造の変化により軸方向柔細胞と放射柔細胞の連続性がなくなり、スティルベン類の合成量や合成する成分の種類が変化した可能性が考えられた。この研究は名古屋大学農学研究科福島教授らとの共同研究として行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本課題の目的は、樹皮細胞の発達過程と機能を解明するため、ヨーロッパトウヒの樹皮成分であるスティルベン配糖体の合成と蓄積の場を細胞レベルで解明することである。樹木細胞研究で最も難しい点は、樹木の乾燥による細胞の収縮変形や細胞中の水可溶性の成分が細胞表面等に析出するなど、実験中の水消失により立木での状態から変化することである。そこで本課題では、申請者らが共同で開発してきたCryo-TOF-SIMS/SEMシステムを用い、樹皮試料に存在する成分の局在を凍結状態を維持したまま(すなわち水を含んだまま)解析することを検討した。スティルベン配糖体のCryo-TOF-SIMS/SEM解析のためには樹皮試料で検出される多くの二次イオンスペクトルの中からスティルベン配糖体由来のピークを同定する必要がある。そこでまず、ヨーロッパトウヒで蓄積が見られた数種のスティルベン配糖体およびアグリコン標品を用いた解析を行った。各標品からは特異的な二次イオンスペクトルが得られたが、1つのピークのみで成分を特定できるものではなかった。現在、いくつかの特徴ピークを組み合わせて1つの成分を同定する試みを行っている。次に、樹皮試料のCryo-TOF-SIMS/SEMによる二次イオンスペクトルと標品のスペクトルと比較したところ、スティルベン配糖体に関連すると考えられる複数のピークが検出された。このことから、スティルベン配糖体の局在を細胞レベルで解析するという最初の目標は達成された。今後、各スティルベン配糖体およびアグリコンを分離して同定する必要がある。