hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクチノロージンの有機触媒作用に基づく生体触媒成立の分子基盤の解明

アクチノロージンと相互作用するタンパク質はアクチノロージン生合成クラスター中のタンパク質(SCO5074)であると判明した。さらに、アクチノロージンと本タンパク質は表面プラズモン共鳴法により相互作用することが明らかとなり、超遠心分析法によってモル比が1:1で結合し、モノマーであることが判明した。アクチノロージン非生産菌の組換えSCO5074タンパク質のX線結晶解析では立体構造が明らかとなったが、その結晶にアクチノロージンをソーキングしてもアクチノロージンとの共結晶は得られなかった。そこで、S. coelicoloer A3(2)のSCO5074タンパク質を精製し、アクチノロージンを含む結晶を得るため実験を継続中である。新たな有機触媒の探索の結果、約800株の菌から顕著な活性を持つ菌を4株獲得した。またこの中から1株選抜し有機触媒の精製に成功した。今後は化学構造を決定する。また、SCO5074の遺伝子情報を基に新規有機触媒の探索を行った結果、グラナチシンも有機触媒であると発見した。これは微生物由来有機触媒として2例目である。今後は計画通り本タンパク質をコードする遺伝子の時期特異的な転写・発現がないか調べる予定である。また、結晶化による立体構造の決定では十分な解像度のデータが得られておらず、加えて組換えタンパク質を用いた結晶であることから、更なる解像度の向上を目指した結晶化の条件検討と、アクチノロージンとの共結晶を目指す。スクリーニングでは新たな触媒作用を持つ有機触媒のスクリーニングも継続し、すでに得られたアクチノロージンと同様の触媒作用を有する菌株からは、その有機触媒の精製を目指す。
澱粉の微細構造とレオロジー的性質に関する研究

澱粉のレオロジー的性質について系統的に研究を進め、微細構造との関係を明らかにすることを目的として、以下のような研究成果を得た。(1)熱帯産澱粉の分子特性と熱的性質:6種の澱粉を用い、イソアミラーゼを用いて枝切り後ゲルろ過を行って、アミロース並びにアミロペクチンに由来する区分を得、アミロースの平均鎖長を求めた。熱的性質では、糊化ピーク温度、転移熱量にも試料による差が認められ、糖添加によって不凍水は増加した。(2)葛及びサツマイモ澱粉の理化学的性質、とくに澱粉ゲルの物性:葛はサツマイモに比べて、平均粒径は小さく、糊化開始温度はやや低かった。最高粘度の差は僅かであつたが、葛は上昇カーブが湾曲し、ゆるやかな粘度上昇を示した。葛は粘調性があり、サツマイモは破断のあるゲル特性を示した。(3)糯米、ワキシーコーン及びキャッサバ澱粉のレオロジー的性質:澱粉糊が成形できるゲルとならず、半固体状で流動性を示す3種の澱粉糊液の静的粘弾性及び動的粘弾性を検討した。また、曵糸距離及び曵糸応力を検出できる測定装置を開発し、試料湖液の曵糸性の特徴を検討した。(4)ココヤム澱粉の理化学的性質:熱帯産ココヤム澱粉の一般的な理化学的性質を検討するとともに、糊化過程の動的粘弾性、糊液の曵糸性及びゲルのクリープ特性を、同一地域で正産量の多いサツマイモ澱粉と比較検討を行った。(5)澱粉ゲルの物性による種別化:5種の澱粉ゲルを用い、官能評価並びに機器による物性測定を行い、種別化を試みた。手法はそれぞれ、数量化第二類及びステップワイズ判別法により解析した。また、官能評価と機器測定値間の相関関係も検討した。(6)根茎澱粉の糊化-老化過程のレオロジー的性質:キャッサバと馬鈴薯澱粉を用い、一定条件下で糊化後老化させて、糊化度の変化を測定するとともに、静的粘弾性及び動的粘弾性を検討した結果両試料のの老化機序の違いが示唆された。澱粉の微細構造とレオロジー的性質の関係を明らかにする目的で,本年度は各項目ごとに研究を進め,以下のような結果を得た.1.澱粉の微細構造(1)アミロース及びアミロペクチンの分離調製:2種の澱粉を用いBanksーGreencuood変法により,アミロース,アミロペクチン及び中間体のC区分に分離し,精製を行った結果,ブタノールによる再結操作を繰り返し行うことにより,純度の高いアミロースを得ることができた.(2)アミロースの純度測定:アミロースのヨウ素親和力は脂質の存在が大きな影響をもっていることが知られているが,本実験のDMSOによる前処理やアミロースの再結操作を繰り返すことにより,脂質による影響を無視できることが認められた.アミロースを精製した試料中,ブタノールによる再結を5回繰り返した試料が最もヨウ素親和力が高かった.2.澱粉のレオロジー的性質(1)澱粉糊液の曵糸性:曵糸性測定装置を考案し, 8種の澱粉糊液の曵糸性の速度依存性及び,曵糸距離と内部保留エネルギーについて検討した.各試料ともに,速度が増加するに從い,曵糸距離も増加し,また,濃度が高くなるに從って曵糸距離は増加するが,一定濃度を超えると,遂に曵糸距離は減少し,濃度と曵糸距離の間に最大点のあることが認められた.内部保留エネルギーは,曵糸距離よりも,濃度に依存することが認められた.(2)糊化過程の動的粘弾性:澱粉懸濁液の糊化過程の貯蔵弾性率(G′),損失弾性率(G′′)及び力学的損失正接(tamδ)を求め,試料間のレオロジー的挙動を検討した.(3)澱粉ゲルの静的粘弾性:各種澱粉ゲルを調製し,クリープ測定を行って,静的粘弾性の温度依存性を検討した.すなわち,温度ごとのクリープコンプライアンスカーブより,マスターカーブを合成し,シフトファクターと絶対温度の逆数の関係から,みかけの活性化エネルギーを求めた.澱粉のレオロジー的性質について系統的に研究を進め、微細構造との関係を明らかにすることを目的として、以下のような研究成果を得た。

(3)糯米、ワキシーコーン及びキャッサバ澱粉のレオロジー的性質:澱粉糊が成形できるゲルとならず、半固体状で流動性を示す3種の澱粉糊液の静的粘弾性及び動的粘弾性を検討した。また、曵糸距離及び曵糸応力を検出できる測定装置を開発し、試料湖液の曵糸性の特徴を検討した。(4)ココヤム澱粉の理化学的性質:熱帯産ココヤム澱粉の一般的な理化学的性質を検討するとともに、糊化過程の動的粘弾性、糊液の曵糸性及びゲルのクリープ特性を、同一地域で正産量の多いサツマイモ澱粉と比較検討を行った。(5)澱粉ゲルの物性による種別化:5種の澱粉ゲルを用い、官能評価並びに機器による物性測定を行い、種別化を試みた。手法はそれぞれ、数量化第二類及びステップワイズ判別法により解析した。また、官能評価と機器測定値間の相関関係も検討した。(6)根茎澱粉の糊化-老化過程のレオロジー的性質:キャッサバと馬鈴薯澱粉を用い、一定条件下で糊化後老化させて、糊化度の変化を測定するとともに、静的粘弾性及び動的粘弾性を検討した結果両試料のの老化機序の違いが示唆された。澱粉の微細構造とレオロジー的性質の関係を明らかにする目的で、本年度は、とくにレオロジー的性質について研究を行い、次の結果を得た。(1)糯米、ワキシーコーン及びキャッサバ澱粉のレオロジー的性質について検討した。澱粉糊の曵糸性では濃度が増すに従って曵糸距離が増加する傾向が示され、ワキシーコーン、キャッサバ、糯米の順にその増加率が大きかった。澱粉糊のクリープ特性では、キャッサバが弾性率、粘性率ともに最も高い値を示した。見かけの活性化エネルギーは糯米38.6、ワキシーコーン28.3、キャッサバ26.3KJ/molであった。澱粉糊の動的粘弾性の周波数依存性では、キャッサバがかなり高い値を示した。ワキシーコーン澱粉は流動しやすく、逆にキャッサバ澱粉は流動しにくく、糯米澱粉はその中間であることが認められた。(2)澱粉ゲルの物性による類別化を目的として、5種の澱粉ゲルの物性についての官能評価及び機器測定のデーターから判別分析を行った。官能評価の結果、馬鈴薯は透明感、弾力性があり、くずれにくく、甘甘藷は歯切れがよく、葛は弾力性がなく、とけ易いことが示された。数量化理論第II類を用いて解析し、判別値を求めた。また、機器測定値からはステップワイズ判別分析により類別を行った結果、明確な類別化が可能であった。(3)根茎澱粉の糊化一老化過程のレオロジー的性質では、キャッサバは馬鈴薯に比べて保存温度にかかわらず老化しにくい傾向が認められた。また、その老化澱粉には、結晶性の回復は殆んど認められず、馬鈴薯にのみ認められた。糊化、老化澱粉の動的粘弾性率ともに一定の割合で増加した。静的粘弾性からは、キャッサバ、馬鈴薯の糊化、老化澱粉の温度依存性は全く異なることが認められた。以上のことから、両試料間では、老化の機構が全く異なることが示唆された。
家族性肥大型心筋症の発症機序に関する検討-変異蛋白の収縮能と組織所見との対比-

1)肥大型心筋症の心筋トロポニンT(TnT)遺伝子異常については、13種類の遺伝子異常が報告されている。その中で我々は、Glu244Asp、Intron15の2種類およびArg278CysのTnT変異でCa感受性が亢進することを報告した。また、Phe11OIleとGlu244Aspの2種類の変異では、最大張力が増大した。他の変異では、pH7.0の条件では最大張力は変わらなかったが、何故この2種類は最大張力が増大するのか更に追究するため、pH6.5、pH7.0、pH7.5の3種類の条件下で、それぞれ最大張力、Ca感受性収縮、協同性について機能的解析を中心に検討した。2)方法は、ヒト心筋TnTcDNAのクローニングを行い、wild-typeTnTとTnT変異遺伝子(Phe110IleとGlu244Asp)を作製し、変異TnTの生理学的検討を心筋レベルで解析し、生理的(実験)条件をpH6.5、pH7.O、pH7.5の3種類で比較検討した。既存の方法にてウサギスキンドファイバー中でトロポニン3成分の交換除去を行い、最人張力、Ca感受性収縮、協同性について検討した。その結果、最大張力は、それぞれの条件下で2種類の変異ともwild-typeTnTと比較して、有意に増大した。Ca感受性収縮は、pH6.5、pH7.0の条件下では、Glu244AspTnTは増大し、Phe110IleTnT-は、いずれの条件下においても変化は認めなかった。これらの結果から、2種類の心筋TnT遺伝子異常肥大型心筋症の最大張力については、pHの条件に関係ないことが明らかとなり、異常心肥大の原因が従来言われて来た収縮力の低下による代償性肥大ではない可能性が推測された。1)肥大型心筋症の心筋トロポニンI(TnI)遺伝子異常については、1997年に6種類の遺伝子変異が報告されており、その中でArg145Glyの変異については、2000年にTakahashiらがCa感受性増加の起こることを報告した。そのため我々は、先に心筋トロポニンT(TnT)遺伝子異常について、同じくCa感受性増加を見い出したが、何故Ca感受性が増加するのか更に追究するため、TnIのリン酸化の影響について機能的解析を中心に検討を行った。2)ヒト心筋TnTcDNAのクローニングを行い、wild-type TnTとTnT変異遺伝子(Intron15の二つの変異、三つの点変異)を作製し、変異TnTの生理学的検討を心筋レべルで解析した。既存の方法にてウサギスキンドファイバー中でトロポニン3成分の交換除去を行い、次にphosphataseで脱リン酸化したTnIと、PKAでリン酸化したTnIをそれぞれ組み込み、Ca感受性、最大張力、協同性について検討した。その結果、TnIのリン酸化したものも、リン酸化していないものもwild-type TnTと比較して、Ca感受性収縮は有意に亢進していることが明かとなり、いずれのTnT変異遺伝子もTnIのリン酸化には影響しないことが明らかとなった。また、Intron15の二つの変異では、協同性も低下することが明らかとなり、これについてもTnIのリン酸化には影響しなかった。最大張力についてはIntron15のうちTnTΔ28(+7)変異遺伝子では、TnIのリン酸化の影響を強く受けることが明らかとなった。これらの結果から心筋TnT遺伝子異常肥大型心筋症のCa感受性増加は、TnIのリン酸化の影響に関係ないことが明らかとなり、異常心肥大の原因が従来言われて来た収縮力の低下による代償性肥大ではない可能性が推測された。これらの結果から、2種類の心筋TnT

遺伝子異常肥大型心筋症の最大張力については、pHの条件に関係ないことが明らかとなり、異常心肥大の原因が従来言われて来た収縮力の低下による代償性肥大ではない可能性が推測された。
グローバリゼーションに直面する国家を読み解く世界史単元の開発

(1)研究の目的1グローバル社会で主体的に生きるために必要な世界史単元の学習方法を解明する。・これまで開発してきた単元を実践できるように改善し、分析する。網羅的・羅列的な一斉授業ではなく、体験学習や討論学習などを手段にして生徒の興味関心を高め、地図や写真を分析し意見を表明するような、グローバル社会で主体的に生きるために必要な学習方法を明らかにする。2現代の諸課題の要因の一つであるグローバル化を歴史的に考察する世界史単元を開発する。・明らかにした効果的な学習方法に基づいて近現代史におけるグローバリゼーションが都市に与える影響について考える単元を開発する。(2)研究の方法1単元「戦争の記憶を考える」と単元「言説『帝国』を考える」を改善し実践する。また、授業を分析し、世界史単元の学習方法を解明する。2学習方法の効果をはかる評価問題を開発し、実証的に検討する。3グローバル化における都市について考える新しい単元を開発する。(3)研究成果1グローバル社会で主体的に生きるためには、社会問題への対応を歴史的言説として分析し、社会的言説へと構築し、生徒自身の言説として再構築するように、社会問題への対応を言説として思考させる学習方法が必要であることを明らかにした。2社会問題への対応を言説として思考する学習方法の効果を評価するために、授業内容に基づく認識の変容と教材に基づく認識の変容を評価する方法を示し、実際に実践した。約7割の生徒に効果があったことを実証した。3グローバル化の中で都市を言説として認識させる教材研究を進めたが、具体的な単元を示すことができなかった。今後の研究課題としたい。
移動オブジェクトと分散トランザクションを統合する分散システムの設計と実装

近年、分散システムの構築方法として移動オブジェクト(移動エージェント)技術が注目されている。その目的の一つはプログラムのコンピュータ間協調において、プログラムを通信相手のコンピュータに移動させることにより、コンピュータ間通信を一つのコンピュータ内に局所化して通信遅延を削減することである。しかし、同時に一つのコンピュータにしか移動できない.このため,多数のコンピュータとの密接な協調を要する分散アプリケーションではその能力が発揮できない。そこで同様に通信遅延の削減技術である分散トランザクション技術を導入することで、複数ホストへの移動を可能にするとともに、両技術を融合する新しい分散システムを設計・実装した。また、分散トランザクションの新しいの実装技術として移動オブジェクトを利用した方法を提案した。分散トランザクションでは通信切断などの耐故障処理が複雑になるが、トランザクションを処理を移動オブジェクトとして実現することにより、.通信を2回に最小化して一貫性を失うことなく処理を簡易化した。これらの成果はオブジェクトブローかシステムとして統合される。これは移動オブジェクトの分散トランザクションによる複製オブジェクトを統一的に扱うことができる。この他、この研究のアプリケーションとして、グループウェア及び分散検索、ネットワーク管理システムなどを実装し、実際的な利用を考慮した評価を行い、有用性を証明した。この研究では、移動オブジェクト(移動エージェント)技術と分散トランザクション技術の融合した新しい分散システムの構成方法を提案することにある。研究初年度では当初の計画に従い、両技術を実現するシステムをJava言語のオブジェクトを対象としながら設計・実装した。前者は移動オブジェクトを実現し、特にコンピュータ間移動に際しては、そのオブジェクトがもつインスタンス変数などの実行状態とともに転送し、転送先ではその実行状態から処理が継続可能になった。後者に関してはオブジェクトの移動性を考慮した分散オブジェクトトランザクションのアルゴリズムを設計した。これは2相コミット方式を基礎とするが、クライアント側におけるトランザクションの不可分実行部分をトランザクションマネジャ側コンピュータに移動・実行させることにより、トランザクション処理時のコンピュータ間通信をオブジェクト移動だけに、通信失敗可能性を最小化し,効率化と耐故障性が向上できる。特に、これは移動オブジェクトの移動性を考慮した初めのトランザクションとなり新規性が高い。これらにより、両技術の問題、つまり前者はプログラム自体をコンピュータ間で移動させて通信コストの低減や耐故障性の向上を可能にするが、分散トランザクションと異なり複数のコンピュータに同時に移動できない。一方、後者は一貫性の維持に大きなコストがかかるが、両者を融合させることによりそれぞれの利点を失うことなく欠点をなくせることがわかった。当初の研究計画通り、前年度に設計した分散オブジェクトトランザクションを実装した。この分散トランザクションは移動オブジェクトを対象にしたものである。これは2相コミット方式を基礎とするが、クライアント側におけるトランザクションの不可分実行部分をトランザクションマネジャ側コンピュータに移動・実行させることにより、トランザクション処理時のコンピュータ間通信をオブジェクト移動だけに、通信失敗可能性を最小化し、効率化と耐故障性を向上させることができる。これは移動オブジェクトと複製オブジェクトの特性の両方を統一的に扱う分散システムに道を開くものであることが示された。特に移動オブジェクトは、これまで複製機構などは提案されておらず、移動先は常に一つに限られていたが、この手法を用いることにより、複製したオブジェクトを異なるコンピュータに移動させても、両者の内部状態を一貫性を保つことが出来ることになり、既存技術の問題を解決する点でも重要である。これにより複製された移動オブジェクト間の一貫性を保証されるが、各複製オブジェクトに対する更新や参照事象への順序付けでは、移動性に対処するために、移動先コンピュータとオブジェクト移動に対応してタイムスタンプを組み合わせる方法を設計した。そして、一貫性を維持するスキームに関しては、移動中の複製オブジェクトに対する更新及び後戻り操作はシステム構成やアプリケーションの要求により相違することから複数方式を提案した。なお、実装では前年度に実装を行ったJava言語をベースとした移動オブジェクトの実現システムを利用して行い、オブジェクトのコンピュータ間移動に際しては、そのオブジェクトがもつインスタンス変数などの実行状態とともに転送し、転送先ではその実行状態から処理を継続できるようにした。当初の計画通り、前年開始した移動オブジェクトのための分散オブジェクトトランザクションを設計・実装を完了するとともに、これらの移動オブジェクトと分散トランザクションを統一的に扱うためのオブジェクトリクエストブローカを構築した。これは移動オブジェクトの現在位置だけでなく、オブジェクトの複製性も抽象化し、アプリケーションプログラムに対して単一かつ固定的なオブジェクトとして見せかける機構となる。そして、前年度までに実装した移動エージェントシステム上に実装し、移動オブジェクトと分散トランザクションを統合し、そのプロトタイプシステムを実装した。

これまで移動オブジェクトと分散オブジェクトトランザクションは通信遅延の削減という共通目的をもっていたが、その実装方法は大きく異なっていた。この機構は両手法を統合する点でさきがけに位置する研究となった。この機構を既存の分散オブジェクトソフトウェアから利用する方法として、オブジェクトリクエストブローカ(ORB)機構に対応した機構も導入した。これは移動オブジェクト内に実装するORBであり、既存分散オブジェクト向けアプリケーションの移植を行い、既存ソフトウェア資産との継続性も考慮する。なお、このオブジェクトリクエストブローカ機構も移動オブジェクト内に実装した。この他、この研究のアプリケーションとして、グループウェア及び分散検索、ネットワーク管理システムなどを実装し、実際的な利用を考慮した評価を行い、有用性を証明した。この際、オブジェクトの移動コストと一貫性維持コストの比較を通じて、アプリケーション要求とネットワークやコンピュータの性能に応じて、前述の両方式の選択基準なども明らかにし、動的な選択に道を開くものとなった。このほか、内外に対して研究成果の周知に努めた。
カメラ映像を用いた血圧変動成分の非接触計測に関する研究

日常生活において,生体に危険を及ぼすような急激な血圧変動を把握することは重要である.本研究では,血圧変動を非接触で計測する手法の提案を行う.本手法では,対象者の顔や手などそれぞれ異なる部位をカメラで撮影し,その間における脈波の遅延時間を計算する.このようにして求めた指標は,従来の光電容積脈波から求まる脈波伝搬時間とほぼ等価であるため,血圧変動とは負の相関を持つことが予想される.20人の被験者を対象としてバルサルバ法を行う実験を行った結果,提案指標と血圧変動の相関は0.65程度であることが分かった.日常生活において,生体に危険を及ぼすような急激な血圧変動を把握することは重要である.本研究では,血圧変動を非接触で計測する手法の提案を行う.本手法では,対象者の顔や手などそれぞれ異なる部位をカメラで撮影し,その間における脈波の遅延時間を計算する.このようにして求めた指標は,従来の光電容積脈波から求まる脈波伝搬時間とほぼ等価であるため,血圧変動とは負の相関を持つことが予想される.20人の被験者を対象としてバルサルバ法を行う実験を行った結果,提案指標と血圧変動の相関は0.65程度であることが分かった.本研究では,通常のカメラなどで撮影した皮膚表面の動画像から,圧センサなどの装着を一切必要としない,完全非接触での血圧変動推定を行うための手法確立を目的としている.具体的には,動画から脈波の伝搬情報を抽出し,その速度が血圧変動と相関するという性質を用いて推定を行う.皮膚表面の動画像については,550nm周辺の緑色光信号が脈波の情報を強く反映していることが先行研究で報告されている.本研究では,動画像から緑色光の信号を抽出する際のアルゴリズムを工夫し,周辺光の影響を極力低減させることを目指した.また,血圧情報をより強く反映している注目領域(ROI)を自動的に選択するためのアルゴリズム開発についても検討を行った.本年度の研究では,まず初めに,測定機器の選定および,実験システムの構築と調整を行った.安静状態の被験者に対して,正面から顔をカメラで動画撮影し,周辺光の影響や被験者間のバラつきなどの基礎的なデータを収集する実験を実施した.その結果,顔表面の血流パターンは極めて複雑であり,周辺光や被験者のわずかな動きが推定精度に与える影響も当初想定していたよりも強く現れることが分かった.次に,周辺光や体動の影響をほぼなくした状態で顔面の血流パターンを捉えることを目的として,LEDおよび光受光素子が一体となった小型のセンサを顔面上の複数の箇所に直接装着し,カメラで撮影した動画像と比較する実験を行った.その結果,額と頬などの2点をROIとして選択し適切な信号処理を施すことによって,血圧変動とある程度の相関をもつ信号が得られることが分かった.しかし,適切なROI設定や推定精度については被験者間のバラつきが大きく,再現性もあまり高くはなかった.本研究では,カメラで撮影した皮膚の映像から脈波伝搬情報を抽出し,この情報に基づいて圧センサなどを使用しない完全非接触での血圧推定手法を確立することを目的としている.本年度は,より精度の高い血圧推定アルゴリズム開発を行うと共に,多数の健常被験者を対象とした実験を実施した.この実験データを用いて,提案手法の精度検証を行うと共に,推定に適した関心領域(ROI)の組み合わせを探索した.開発した手法では,まず,複数のROI内画素における緑色輝度値の平均値を映像フレーム毎に算出し,心拍と同期した拍動性信号(iPPG信号)を抽出する.緑色輝度値のみを対象とする理由は,この波長の光が血中ヘモグロビンを吸収しやすい特性を持つためである.続いて,ROIを2箇所に限定し,ヒルベルト変換を用いてそれぞれのROIから得られるiPPG信号の瞬時位相を求め,両者の差分である瞬時位相差(PD)を計算した.このPDは2つのROI間における遅延時間に相当することから,血圧変動と相関することが報告されている脈波伝搬時間と同様の情報を与えると考えられる.提案手法の血圧推定精度を検証するため,20名の健常成人被験者に対して実験を行った.実験では,高速撮影が可能なビデオカメラを用いて被験者の顔面と手掌を撮影すると同時に,心電図,近赤外光容積脈波,連続血圧それぞれについても計測を行った.実験中,被験者に息こらえを行ってもらうことにより,血圧を意図的に変化させた.実験結果から,手の一部をROIとして用いたPDは,収縮期血圧変動に近い変化をすることが分かった.全被験者について,このPDと収縮期血圧の相関係数を調べたところ0.65であった.従来,脈波伝搬時間は血圧と負の相関をすることが知られているが,提案指標は血圧変動と正の相関をしていることから,従来の脈波伝搬特性とは異なる情報が含まれている可能性が示唆された.生体医工学顔面の皮膚映像を撮影する際に周辺光や体動がアーチファクトとして混入するが,その影響が当初想定していた以上に強く現れることが分かり,実験環境を構築した後,さらに計測機器などの調整を行うのに多くの時間を要した.また,動画を撮影するための機器や動画像の解析アルゴリズムに関する情報収集などを行うのに,当初予定していたよりも多くの時間を要した.周辺光の影響が少なくし,かつ皮膚の表層より少し深い部位における血流を解析するため,850nm周辺の赤外光領域の信号を対象とした解析を検討する.

この予備実験として,850nm周辺の赤外光映像を撮影できる装置で被験者の顔面を撮影する実験を実施し,550nm周辺の緑色光映像とは異なる情報が得られる可能性があることを確認した.しかし,予備実験では測定の際に顔面に照射した赤外光の出力が小さかったため,センサを直接装着した場合や皮膚表面で得られる脈波と比べると波形に含まれる高周波成分が少なく,伝搬時間のような高い時間分可能を必要とする解析法を適用するには不十分である.今後は,赤外光の出力を自由に変化させることのできる照射器を用いることで,光の照射量を制御する実験を実施する予定である.これにより,例えば,異なる深さの皮下組織から得られる脈波情報を統合した解析などを行うことができる.これに加え,複数ポイントにおける脈波波形の情報量から,血圧変動を推定するのに最適なROIを抽出するための方法についても具体的な解析を行っていく予定である.備品として導入する予定であった高速度カメラについて,解析上必要なスペック等を実験系構築の過程において再検討し,改めて機種選定を行った結果,当初予定していたものよりコストを抑えた機器を使用できることが分かったため.次年度実施する実験の消耗品として使用する予定である.
トランスバクセン酸による細胞障害性の解析

エライジン酸はヒト乳がん由来細胞株YMB-E-1においてインスリン依存的なグルコース取り込みを抑制している。グルコーストランスポーター4(GLUT-4)の動きを蛍光抗体法で観察するとインスリンに応答した細胞内小胞から細胞膜への輸送が阻害されていた。インスリン抵抗性がどの段階で起こるか調べたところ、エライジン酸の添加した場合、正常なインスリンの伝達機構と比べ、インスリン受容体が細胞内部に移動せず、IRS-1タンパク質量の減少やIRS-1チロシンリン酸化の低下が確認された。これらの結果はエライジン酸がパターン認識受容体TLR-4を介して影響していると考えられた。これらの結果より今年度はエライジン酸の阻害機構を解析した。エライジン酸による阻害機構としてTLR-4受容体を介する可能性のほか、エライジン酸が直接的に、インスリンとインスリン受容体との結合を阻害していることを考えた。インスリンをFITCにて蛍光ラベルし、エライジン添加後に蛍光インスリンを添加し細胞膜への結合を調べた。結果インスリンはエライジン酸共存下では濃度依存的に細胞膜への結合が抑制された。ラベルされていないインスリンによる競合実験から蛍光インスリンがインスリン受容体に特異的に結合していることは確かめた。以上のことよりエライジン酸がインスリンのインスリン受容体への結合を直接阻害していることが示された。エライジン酸が細胞内シグナル伝達系の上流のTLR-4により作用していることは否定する結果となってしまったがこの現象は酪農製品に含まれるトランス脂肪酸であるバクセン酸でも観察された。のみならず炭素数18個の脂肪酸は飽和不飽和を問わずインスリンの結合を阻害する結果が得られた。炭素数の異なる脂肪酸についても確認中である。トランス脂肪酸過剰摂取により成人病のリスクが上昇すると考えられている。しかしながら生化学解析はあまりなされていない。トランス脂肪酸は工業的に生産、あるいは反芻動物の発酵胃において生産されることがよく知られているが、申請者らは工業的に硬化油を作る過程で生成される主たるトランス脂肪酸であるエライジン酸を用いてその細胞障害性を解析した。平成28年度、エライジン酸はヒト単球系白血病細胞株U937においてはカスパーゼ9を経由していた。カスパーゼ8経由でアポトーシスを誘導するとの報告は既にあるが、我々の系ではカスパーゼ8の活性化は認められず、このカスパーゼ9の活性化はカスパーゼ8によるものではなかった。またその上流はTOLL様受容体(TLR-4)でありこの活性化によりミトコンドリアの活性化を起こすものと考えられた。事実TLR-4タンパクを阻害することによりこの効果は消失した。またエライジン酸はヒト乳がん由来細胞株YMB-E-1においてインスリン依存的なグルコース取り込みを抑制することがわかった。これはグルコーストランスポーター(GLUT-4)の細胞内小胞から細胞膜への輸送が阻害されるためであり、この上流のシグナル伝達もU937細胞株のアポトーシス誘導同様TOLL様受容体(TLR-4)に支配されていた。以上のことからエライジン酸が培養細胞レベルでも細胞障害性を引き起こし、TOLL様受容体(TLR-4)によるものと考えられた。このことを踏まえ反芻動物由来のトランス脂肪酸であるトランスバクセン酸の影響のアッセイを開始した。平成29年度においては、28年度に引き続きバクセン酸の細胞への影響を検討する。バクセン酸は共役脂肪酸の前駆体となり得るため個体での影響は少ないと考えられているが、エライジン酸を構造的に類似しており同じ伝達経路により細胞に影響することが考えられる。本年度の目標はトランス脂肪酸のうちエライジン酸を用いて細胞障害性の解析法を確立しバクセン酸など他のトランス脂肪酸を調べることであった。そのうち初めの目的はアポトーシスを指標としてまとめることができた。インスリン抵抗性に関しても同様に結果を出すことができた。これらの機構はTOLL様受容体(TLR-4)を介することがわかった。今回注目すべき対象であるバクセン酸に関しても現在進行中である。しかし以下に述べる疑問が生じたので「おおむね順調」との区分にすることとした。遊離脂肪酸は疎水性のため血中ではアルブミンを担体として輸送される。実験でも通常DMSOにてストック溶液を作成後、アルブミンに吸着させ培養液中に添加する。しかしながら遊離飽和脂肪酸がTLR-4と相互作用してインスリン抵抗性を示す時、内因性リガンドであるフェチュインAが必要であるとの論文があった。これは遊離飽和脂肪酸はフェチュインAを介してTLR-4と結合するという意味である。これが事実ならば我々の見ているトランス脂肪酸によるアポトーシスやインスリン抵抗性もフェチュインを要求する可能性が大である。そのためフェチュインに結合させたエライジン酸による実験結果も検討する必要がある。しかしながら生化学解析はあまり行われていない。平成28年度以降の研究により、エライジン酸はヒト単球系白血病細胞株U937においてカスパーゼ9を介しアポトーシスが誘導されることがわかった。

これはTOLL様受容体(TLR-4)の活性化がミトコンドリアの活性化を引き起こしたと考えられ、事実TLR-4タンパクを阻害することによりこの効果は消失した。同時にエライジン酸はヒト乳がん由来細胞株YMB-E-1においてインスリン依存的なグルコース取り込みを抑制した。これはグルコーストランスポーター(GLUT-4)の細胞膜への輸送が阻害されるためで、この上流もTLR-4に支配されていた。このことはトランスバクセン酸でも同じ結果が確認された。ところが平成29年度、YMB-E-1細胞におけるインスリン依存的なグルコース取り込みのシグナル伝達経路を検討した結果、驚くべきことにエライジン酸存在下ではインスリン受容体が活性化しないことが示された。このことからインスリン受容体が何らかの阻害因子により活性化できないのか、または受容体とインスリンが結合していないのかという2点に絞られた。検討の結果エライジン存在下ではインスリンと受容体が結合できないことがわかった。またバクセン酸でも同様でありインスリン抵抗性の理由の一つと考えられた。立体構造から考えて、インスリン受容体とインスリンの結合を特異的に阻害することは考えにくく、今後脂肪酸や刺激因子の種類を変えてどのような機構で受容体への結合が阻害されるかを検討する。本年度の目標はトランス脂肪酸のうちエライジン酸を用いて細胞障害性の解析法を確立しトランスバクセン酸など他のトランス脂肪酸について調べることであった。アポトーシス及びインスリン抵抗性を細胞障害性の解析から、TOLL様受容体(TLR-4)を介するシグナル伝達経路をトランス脂肪酸が抑制していることを解析してきた。しかしこの結果に対し一部疑問が生じた。エライジン酸、トランスバクセン酸は確かにインスリン抵抗性を誘導し、インスリン依存的なグルコース取り込みが抑えられる。しかしこの効果はインスリンによるシグナル伝達が途中で抑えられたのではなく、インスリンのシグナル伝達経路が活性化しなかったためであった。これはインスリン受容体自体が活性化していないことで明らかである。このことはエライジン酸、トランスバクセン酸存在下ではインスリンが受容体に結合しても受容体の活性化が抑制されたか、またはインスリンが受容体に結合しなかったかどちらかであると予想できる。結果はインスリンが受容体に結合していなかった。つまりエライジン酸、トランスバクセン酸は直説インスリンと受容体の結合を阻害したことになる。そのためTLR-4を介した経路というのは軌道修正をする必要がある。しかしインスリンと受容体の結合を抑えているのは脂肪酸のどの部分かは非常に興味深い。トランス型不飽和脂肪酸だけでなく飽和脂肪酸、シス型不飽和脂肪酸、そして炭素長や二重結合の場所などを比較検討することは興味深い。またこのような結合阻害はインスリンと受容体だけではなく様々な因子にも広げられる。今後はこの両面から検討していく。同時にアポトーシスに関しても本当にTLR-4なのかは検討する必要がある。エライジン酸はヒト乳がん由来細胞株YMB-E-1においてインスリン依存的なグルコース取り込みを抑制している。
X-BANDにおける表面波発振器の開発

電磁表面波の存在を実験的に確認し、この電磁波を用いたX-bandの発振器の開発を行った。(発振周波数可変)この波は、コルゲートした金属のような、周期的な遅波構造の表面近傍にある伝送モードであり、その存在は、解析的に示されていた。伝送試験(コールドテスト)で、この波のコルゲート板上での伝送を確認した。また、この波と電子ビームの間の相互作用特性(チェレンコフ不安定性と住みスパーセル型不安定性)を解析した。双方の結果を踏まえ、この電磁波を利用した発振器の設計・製作を行った。表面波発振器は、金属板表面を周期的に振幅させた周期的境界条件による、遅波構造上の電磁表面波を電子ビームで励起することにより発振する。この共振器部を含めたシステムの開発費を安価にするため、卓上フライスとステッピングモーターを組み合わせた、NCフライスを作製した。分散式の計算結果に基づき、共振器部の周期構造を、波長10mm・波高7mmとした。最大発振周波数9.7GHzの共振器となる。作製したフライスの加工限界を考慮し、パラメータを決定した。表面波発振器の発振周波数の、電子ビーム電圧による制御特製を計算確認した。電圧増加に対し周波数が指数関数的に増大するため、発振に際し、高周波側では電子ビーム電圧の揺らぎの影響を受けにくいが、低周波側で発振周波数を安定させるためには、電圧の高い安定度が必要である事が判った。広帯域発振を起こすスミス・パーセル型不安定性による寄生発振は、チェレンコフ相互作用による主発振に対し、使用する電子ビーム電圧の範囲では、時間的成長率が二桁程度低い事を計算確認した。従って、この寄生発振の電力では本発振に対し、影響を殆ど及ぼさないと推定される。周期構造と電子ビームの距離Dを縮めると、発振周波数は、指数関数的に増大することを計算確認した。当初予定していたD=7mmを5mmへ変更する。結果、時間的成長率は約10倍になる。強い発振はビームを遅波構造に近接させねば得られず、この特性のため、この相互作用は、これまで顕在化してこなかったと予想される。電磁表面波発振器の共振器であるコルゲート版を、アルミ板にNCフライスで波形加工を施し作製した。工作精度限界より、コルゲート振幅が0.2mm程度浅くなった。このため、発振周波数特性の僅かな低下が見込まれる。タイル上に並べることで共振器のサイズが換えられるよう、分割作製した。電磁表面波の伝送特性を調べるコールド試験が必要である。X-BANDで伝送試験を行うための送受信アンテナを、セミリジットケーブルを利用して作製した。伝送試験において、電磁表面波だけを計測するため、電磁表面波以外のエバネッセント波が反射して戻ることを防がねばなら無い。また、真空容器内に共振器を収めるに当たり、一般的に使われる吸収剤は、スポンジ状のため不都合が予想された。そこで、特定波長の電磁波を逆位相で反射する事で反射を打ち消す、北川工業のレスミラーと呼ばれる吸収剤を入手した。また、スペクトラムアナライザーの代替器として、デジタル移動無線送信機テスターを入手した。5.5GHz以下の周波数伝送テストに用いる事が出来、また、ディテクターを交換することでX-BANDまでの計測が可能となる。表面波発振器は、電子ビームを電力源とする発振器である。このため、高電圧電源から発生される直進高電圧電子ビームを、共振器表面近傍にガイドする必要がある。このガイド磁場のためのコイル線材を確保した。伊達巻と呼ばれる多層巻きコイルの作製を想定し、平角線とした。コイル作製において、強度の補強が問題にならぬよう、太目の4mm×2mmのものを選んだ。テスト動作試験として、小電流高電圧電源を利用した定常発振試験が出来るよう、30A直流電源を確保した。アルミ板を切削して作製したコルゲート板上で、X-BANDの電磁波モードの伝送を確認した。この共振器を発振器とするために、真空容器やビームガイド用の磁場コイルを作製した。計算で求めた伝送モードの存在を確認するため、分散式の計算により求めた、伝送モードの上限周波数付近の伝送特性を調べた。この周期構造では、伝送上限周波数は9.7GHzとなる。送受信アンテナには、長さ7.5mmの針アンテナを用いた。1/4波長となる周波数は10GHzである。コルゲートの波高7mmをやや越える。シグナルジェネレータで信号を送り、スペクトラムアナライザーとパワーメータを用いて、伝送特性を調べた。電磁表面波は、周期構造を利用し伝送するため、コルゲートを乗り越える方向へ伝送する。送信アンテナに対し、コルゲートを乗り越える方向とコルゲートに沿った方向に受信アンテナを、それぞれ80mmと20mm離して設置し、計測を行った。

コルゲートを乗り越える方向への電磁表面波の伝送電力は最大となる9.60GHzに対し、9.65GHzでは3.5dB、9.71GHzでは21dB減衰した。送信電力をモニタするコルゲートに沿った方向に設置したアンテナは9.71GHzで最大電力を示した。また、コルゲートの途中を平板とすると、伝送電力は10dB以上減衰する。この結果、コルゲートを乗り越える方向には、計算とほぼ一致する、9.60GHz付近を上限周波数とする電磁波モードが存在することが示された。伝送試験では、コルゲートの両側(電磁表面波の伝送方向と並行となる両辺)を電磁波吸収材で覆う必要があることがわかった。吸収材がない場合、上限周波数を超えても、伝送電力は減衰しない。計算と異なり、コルゲート板の端で、電磁波が折り返されることにより、他のモードが励起されているためと推察される。分散式の計算により示された電磁表面を、実験的に確認し、計算結果とよく一致する実験結果を得た。コルゲート板の表面近傍に電子ビームを通過させれば、ビーム電圧に応じた発振が得られる事が推察される。
動画像からの三次元情報抽出に関する数理的研究

動画像から剛体の3次元運動を推定する問題において、従来より最適とされてきた最尤推定量より分散の少ない推定量の構成法にさいて検討した。まず、これまでに当該研究者が提案してきた重みつき評価関数に対し、これを用いて得られる運動パラメータの推定量の分散を、任意の重みについて漸近的に(画像上での観測点数Nに対してO(1/N)まで)解析した。その結果、分散は観測雑音の標準偏差οの2乗に比例する項と4乗に比例する項から成ることがわかった。これら2つの項はともに1/Nのオーダであり、これはοが大きい場合は観測点数を増やしても4乗項が大きいことを意味する。不偏推定量の分散の下限を与えるクラメル・ラオの下界は、1/Nのオーダーではοの2乗に比例することが知られている。また、本問題における最尤推定量の分散は、クラメル・ラオの下界に一致する(οの2乗に比例)とοの4乗に比例する1/Nのオーダの項から成ることも明らかにされている。以上より、重みつき評価関数から得られる推定量の分散を最尤推定量のそれより小さくするためには、οの2乗に比例する項をクラメル・ラオの下界に一致させ、かつοの4乗に比例する項を小さくすればよいことがわかる。そこで、これを満足させる意味で最適な重みを理論的に明らかにした。この最適な重みはパラメータの真の値を知らない限り、厳密には設定できない。しかし、3次元奥行き値に関する一般的な知識(物体はカメラの前方に存在し、かつ観測点数が十分多い場合は、各観測点に対応する奥行き値は滑らかである)を用いることにより、最適な重みを近似的に構成することが可能である。この近似的最適重みの有効性を理論解析およびシミュレーションによって示した。(論文投稿中)動画像から剛体の3次元運動を推定する問題において、従来より最適とされてきた最尤推定量より分散の少ない推定量の構成法にさいて検討した。(論文投稿中)
低地に隔離分布する高山植物個体群の維持機構および進化学的重要性の評価

2018年度はコケモモ(Vaccinium vitis-idaea)を対象に、北海道内の18個体群においてマイクロサテライトマーカーを用いた遺伝構造の解析と生育形態の比較を行った他、生育地環境・倍数性の異なる個体群間で、野外実験による自殖能力の比較を行った。遺伝解析の結果とフローサイトメトリーによるDNA量解析から、北海道のコケモモには2種類の倍数性(2倍体と4倍体)が存在すること、2倍体と4倍体の個体群は遺伝的に異なる集団であることが示唆された。高山帯の個体群には2倍体のコケモモのみが分布し、4倍体は低標高に特異的であった。高山帯の2倍体個体群2地点、低標高の2倍体個体群1地点、低標高の4倍体個体群2地点を対象に、強制他家受粉・強制自家受粉・袋掛けの処理を行った結果、高山帯の2倍体個体群は2地点とも強い自家不和合性を示した一方で、低標高の個体群は倍数性に関わらず、3地点とも自家和合性を有することが示唆された。このことから、コケモモの和合性変異において倍数化は必須ではないことが予測される。更に、生育形態にも個体群間で大きく変異がみられ、生育地環境、倍数性の複合的な影響がみられた。以上の結果から、北海道の低標高には高山帯とは大きく異なる生態型のコケモモが生育していることが明らかになった。これらの成果は第66回日本生態学会大会で発表を行った他、原著論文として投稿する準備を進めているところである。また、2018年度は、コケモモと同所的に分布するツツジ科植物のイソツツジ(Rhododendron palstre)、ガンコウラン(Empetrum nigrum)についてマイクロサテライトマーカーの開発も行った。本年度は、遺伝解析・野外実験を概ね計画通りに遂行でき、北海道の高山帯と低標高では異なる生態型のコケモモが生育していることが明らかになった。本成果から、北海道低標高域の高山植物個体群の維持機構および適応進化に関する理解が進んだことから、概ね順調に研究が進展していると判断した。2018年度に開発したマイクロサテライトマーカーを用いて、コケモモと同所的に分布する植物イソツツジ・ガンコウランについても遺伝解析を進める。イソツツジについては、コケモモ同様に数個体群で受粉実験を行い、高山と低標高で交配システムが異なるかを調べる。また、コケモモについては、2種類の生態型がどのように分化したのかを明らかにすべく、海外の個体群を対象にした遺伝解析を行う予定である。
軽種馬における運動負荷に伴う赤血球膜脆弱性の変動要因に関する生理学的研究

本研究では軽種馬における運動負荷に伴う赤血球膜浸透圧脆弱性の変動要因を明確にすることを目的として、脾臓摘出、各種血液性状、運動強度等の諸要因と赤血球膜浸透圧脆弱との関係を解析し、以下の点を明確にした。1.運動負荷に伴う赤血球膜脆弱性の変動は、血管内溶血の重要な指標である。2.赤血球膜の運動ストレスに対するK-Cl共輸送系による容積減少機構の感受性、乳酸あるいはpH感受性、ならびに浸透圧脆弱性は、赤血球が脾臓に繰り返し貯蔵されることにより増加する。3.血流速度の上昇、ならびに脾臓から末梢血への赤血球の流入は、運動負荷に伴う赤血球膜浸透圧脆弱性の変動にほとんど影響しない。4.有酸素運動負荷に伴う血液のpHおよび温度の上昇は、赤血球膜浸透圧抵抗性を増加させる。5.無酸素運動負荷に伴うpHの低下、血中乳酸濃度および過酸化物の増加は、赤血球膜浸透圧脆弱性を亢進する。6.赤血球膜浸透圧脆弱性は、運動に伴う赤血球膜の脂質およびタンパク質の修飾、変性、分解および酸化還元、ならびにpHおよび温度の変化による細胞容積調整によって支配される。7.細胞内イオン恒常性および細胞容積減少機構を担うK-Cl共輸送系は、赤血球膜脆弱性に対して機能的な相互作用をもつ。したがって、軽種馬の赤血球膜浸透圧脆弱性は、トレーニング、運動能力およびストレスを判定する有効な指標となりうることを明確にした。実験1.ウマ脾臓貯蔵赤血球がその浸透圧脆弱性に及ぼす影響ウマにおける脾臓貯蔵赤血球が運動負荷時の末梢血中赤血球の浸透圧脆弱性に及ぼす影響を明確にする為、各種強度のトレッドミル運動、ならびに脾臓摘出および薬剤による脾臓収縮抑制処理がトレッドミル運動負荷時の赤血球膜浸透圧脆弱性に及ぼす影響を解析した。その結果、運動負荷時に脾臓から放出される赤血球は、末梢血中赤血球の浸透圧脆弱性の変動にほとんど関与しないことを明確にした。実験2.ウマ血中乳酸および二酸化炭素の濃度と赤血球膜浸透圧脆弱性との関係血中乳酸濃度および酸素摂取量を基準とした各種強度のトレッドミル運動を負荷し、血液中の乳酸、酸素分圧、二酸化炭素分圧、pH値、温度および血管内溶血割合と赤血球の浸透圧脆弱性との関係を解析した。その結果、血液のpH値および温度は赤血球膜浸透圧脆弱性と有意な負の相関関係を示し、特に血液pH値と赤血球膜浸透圧脆弱性との間にはr=-0.9以上の極めて高い負の相関関係が存在することを明確にした。実験3.ウマ赤血球の容積調節機構と赤血球膜浸透圧脆弱性との関係ウマ赤血球におけるK^+による細胞容積調節機能の特性を調査する為、K^+輸送活性と培地の無機イオン組成、浸透圧、pHならびに赤血球の密度との関係を解析した。その結果ウマ赤血球にはKCl共輸送体による細胞容積減少機構が存在すること、ならびに本輸送体は浸透圧およびpH値の低下により活性化されることを明確にした。したがって、KCl共輸送体は運動負荷時の血液pH値の低下に伴う赤血球膜浸透圧脆弱性の亢進に拮抗して、血管内溶血を抑制する可能性が示唆された。実験1.脾臓が赤血球膜の乳酸感受性および浸透圧脆弱性に及ぼす影響脾臓が運動負荷時の赤血球膜脆弱性の変動に及ぼす影響を明確にする為、脾臓摘出馬と未手術馬との間で、トレッドミル運動負荷前後の赤血球膜浸透圧脆弱性とその乳酸感受性、運動負荷時の溶血量ならびに血漿中ヘモグロビン結合タンパク質(ハプトグロビン)濃度を比較検討した。

その結果、脾臓摘出により赤血球膜の脆弱性および乳酸感受性が低下し、運動負荷により溶血しにくくなることが明確となった。実験2.フィールド運動負荷時の赤血球膜浸透圧脆弱性の変動によるトレーニング効果の推定赤血球膜浸透圧脆弱性は血液のpH値と極めて高い負相関を示すことより、骨格筋への酸素供給能を反映し、運動能力の指標となる可能性が考えられる。一方、無酸素運動負荷が運動能力を高めるとの報告がある。そこで、有酸素トレーニング群と無酸素トレーニング群との間でフィールドでの運動能力と赤血球膜浸透圧脆弱性との関係を調査した。その結果、両トレーニング群間で無酸素運動負荷時の運動能力および赤血球膜脆弱性には明確な差異は認められなかったが、有酸素運動負荷において無酸素トレーニング群は有酸素トレーニング群に比べて有酸素運動能力が高く、逆に赤血球膜浸透圧脆弱性は低いことが示された。したがって赤血球膜浸透圧脆弱性は運動能力の指標となりうることが示唆された。
電子伝達蛋白質複合体の構造化学的解明とその会合・解離の分子機構

本年度に得られた研究成果の概要は以下のとおりである.1.シトクロム酸化酵素(CcO)の結合により誘起されるシトクロムc(Cytc)における構造変化の解明Cytcまその電子受容体であるCcOと結合し,CcO-Cytc電子伝達複合体を形成する際には,その立体構造が変化することで電子伝達反応を制御していると考えられる.一般にはこのような高分子量の膜蛋白質であるCcOを含む蛋白質複合体の構造解析は困難であるが,^<15>NラベルしたCyt cを用いて3D-^1H-^<15>N NOESYHSQC(^<15>N-edited NOESY)を用いることで,CcO結合によるCytcの構造変化を検出することに成功した.特に,本研究者等のこれまでの研究から推定されたCyt cのCcOに対する相互作用部位周辺がCcOの結合に伴い有意な構造変化が観測され,Cyt cはCcOと電子伝達複合体を形成する際にはその相互作用部位付近に特異的な構造変化を起こすことが示唆された.今後さらに定量的な構造解析を進めることにより,構造変化による電子伝達の制御機構が明らかになると期待できる.2.ドッキングシミュレーションによるCcO側の会合部位の同定東京大学の北尾准教授の研究グループと共同で,CcO-Cytc電子伝達複合体形成の際のCcO側の相互作用部位について検討を行った.剛体モデルを用いたドッキングシミュレーションの結果,Cyt c側の相互作用部位は本研究者らがNMRを用いて実験的に明らかにした部位と一致し,一方,CcO側も予想通り,負電荷と疎水性のアミノ酸残基による相互作用部位の形成が認められた.さらにここで得られた結果についてMDを適用することにより,さらに詳細にCcO)側の相互作用部位を明らかにすることで,CcO側からもCcO-Cytc間の電子伝達機構を解明できると期待できる.本研究課題で得られた成果は以下のとおりである1 X線小角散乱法測定用試料調製の条件決定X線小角散乱の実験においては,完全酸化型のウシ由来CcOを可能な限り単分散状態にて調製し,そのX線小角散乱パターンを約2.2mのカメラ長で計測した.露光に際して試料に蓄積する放射線損傷の程度を2030度の範囲で検討し,安定かつ定量的に測定できる25度で実験を行った.このような測定条件下でCcOの分子形状に関する情報を得るため,異なる蛋白質濃度の試料を6点調製し,それぞれの散乱パターンを計測したところ,散乱曲線の濃度依存性は比較的に小さく,この結果は界面活性剤をまとったCcO分子が溶液中で均一に分散していることを示唆していた.2 CcOのX線小角散乱測定とその形状の推定散乱曲線の無限希釈によって粒子間干渉効果を補正した結果, CcOの回転半径が約51Åと見積もられた,この測定結果の再現性を,異なる試料ロット,異なる精製方法で確認したところ,回転半径の試料依存性は比較的小さく,試料間の差は最大2%と見積もることができた.つまり,溶液中でのCcOの回転半径は,試料ロットや精製方法にかかわらず,ほぼ一定で約51Åであることが明らかとなった.ここで見積もられた回転半径は,既に報告されているCcOの結晶構造をもとにして算出された回転半径(約50Å)とよい一致を示している.一方,原点散乱強度から推定される見かけの分子量は, 415±20kDa程度となり,その試料間の差は最大4%であった.ここで得ちれた見かけの分子量は, CcOが溶液中では二量体を形成していることを示しているが,従来のゲルろ過による結果とは異なっており,今後,実験条件の比較,検討が必要である.本年度に得られた研究成果の概要は以下のとおりである.1.シトクロム酸化酵素(CcO)の結合により誘起されるシトクロムc(Cytc)における構造変化の解明Cytcまその電子受容体であるCcOと結合し,CcO-Cytc電子伝達複合体を形成する際には,その立体構造が変化することで電子伝達反応を制御していると考えられる.一般にはこのような高分子量の膜蛋白質であるCcOを含む蛋白質複合体の構造解析は困難であるが,^<15>NラベルしたCyt cを用いて3D-^1H-^<15>N NOESYHSQC(^<15>N-edited NOESY)を用いることで,CcO結合によるCytcの構造変化を検出することに成功した.特に,本研究者等のこれまでの研究から推定されたCyt cのCcOに対する相互作用部位周辺がCcOの結合に伴い有意な構造変化が観測され,Cyt cはCcOと電子伝達複合体を形成する際にはその相互作用部位付近に特異的な構造変化を起こすことが示唆された.今後さらに定量的な構造解析を進めることにより,構造変化による電子伝達の制御機構が明らかになると期待できる.2.ドッキングシミュレーションによるCcO側の会合部位の同定東京大学の北尾准教授の研究グループと共同で,CcO-Cytc電子伝達複合体形成の際のCcO側の相互作用部位について検討を行った.剛体モデルを用いたドッキングシミュレーションの結果,Cyt c側の相互作用部位は本研究者らがNMRを用いて実験的に明らかにした部位と一致し,一方,CcO側も予想通り,負電荷と疎水性のアミノ酸残基による相互作用部位の形成が認められた.

さらにここで得られた結果についてMDを適用することにより,さらに詳細にCcO)側の相互作用部位を明らかにすることで,CcO側からもCcO-Cytc間の電子伝達機構を解明できると期待できる.