hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタレベル記述可能なワークフロー支援システムの研究

近年,複数の作業者によって行われる定型的な作業を支援するグループウェアとしてワークフロー支援システムが盛んに研究・開発されている.本研究では,我々の先行研究であるワークフローのRDAPモデルを基に、従来の支援システムの問題であった複雑かつ大規模な作業、動的な作業変更への対応を可能とするための拡張RDAPモデルの構築を行っている.RDAPモデルは,R(Role):作業の実施者を抽象化した役割,D(Data):役割が作業を行うための必要な情報やそれを作成する際に必要なフォーマットであるデータ.A(Action):作業の中で役割があるデータを基に、別な役割へ送るデータを作る行為,P(Protocol):役割間でのデータの流れ,の4つの要素から,ワークフローを定式化するモデルである.拡張RDAPモデルでは,これらの,要素に他の種類の要素を記述,また,他のワークフローを扱えるような記述(ワークフローのメタレベル記述)を可能とする記述体系である.また拡張RDAPモデルによって,作業の動的な変更への対応や、大規模かつ複合的な作業形態に対応できるなど作業の様々な形態・性質に対応したワークフロー記述が行えることを考察した.さらに,拡張RDAPモデルの実用性の評価を行うために,以下の3種類のアプリケーションへの適用を考察した.(1)作業者探索支援システム:作業グループ立上げ時のメンバ選択の作業の流れを支援するシステム,(2)電子掲示板選択支援システム:電子掲示板への過去の投稿状況をもとに,掲示板への投稿の作業の流れを支援するシステム,(3)コミュニケーションのためのメディア選択システム;ユーザの過去の作業履歴を基に,コミュニケーションに最適なメディアの選択支援を行うためのシステム.近年,複数の作業者によって行われる定型的な作業を支援するグループウェアとしてワークフロー支援システムが盛んに研究・開発されている.本研究では,我々の先行研究であるワークフローのRDAPモデルを基に、従来の支援システムの問題であった複雑かつ大規模な作業、動的な作業変更への対応を可能とするための拡張RDAPモデルの構築を行っている.RDAPモデルは,R(Role):作業の実施者を抽象化した役割,D(Data):役割が作業を行うための必要な情報やそれを作成する際に必要なフォーマットであるデータ.A(Action):作業の中で役割があるデータを基に、別な役割へ送るデータを作る行為,P(Protocol):役割間でのデータの流れ,の4つの要素から,ワークフローを定式化するモデルである.拡張RDAPモデルでは,これらの,要素に他の種類の要素を記述,また,他のワークフローを扱えるような記述(ワークフローのメタレベル記述)を可能とする記述体系である.また拡張RDAPモデルによって,作業の動的な変更への対応や、大規模かつ複合的な作業形態に対応できるなど作業の様々な形態・性質に対応したワークフロー記述が行えることを考察した.さらに,拡張RDAPモデルの実用性の評価を行うために,以下の3種類のアプリケーションへの適用を考察した.(1)作業者探索支援システム:作業グループ立上げ時のメンバ選択の作業の流れを支援するシステム,(2)電子掲示板選択支援システム:電子掲示板への過去の投稿状況をもとに,掲示板への投稿の作業の流れを支援するシステム,(3)コミュニケーションのためのメディア選択システム;ユーザの過去の作業履歴を基に,コミュニケーションに最適なメディアの選択支援を行うためのシステム.近年,複数の作業者によって行われる定型的な作業を支援するグループウェアとしてワークフロー支援システムが盛んに研究・開発されている.しかし,従来の研究ではシステムとしてワークフロー支援が行える作業の範囲が明確化されておらず,実際の作業をワークフローとして分析し支援システムで取り扱うためのワークフロー記述モデルが定式化されていない.本研究では,我々の先行研究であるワークフローのRDAPモデルを基に,従来の支援システムの問題であった複雑かつ大規模な作業,動的な作業変更への対応を可能とするための拡張RDAPモデルの構築を行う.RDAPモデルは,R(Role):作業の実施者を抽象化した役割,D(Data):役割が作業を行うために必要な情報やそれを作成する際に必要なフォーマットであるデータ,A(Action):作業の中で役割があるデータを基に,別の役割へ送るデータを作る行為,P(Protocol):役割間でのデータの流れ,の4つの要素から,ワークフローを定式化するモデルである.拡張RDAPモデルでは,これらの,ある要素に他の種類の要素を記述,また,他のワークフローを扱えるような記述(ワークフローのメタレベル記述)を可能とする記述体系であり,これの定式化を行った.また,拡張RDAPモデルによって,作業の動的な変更への対応や,大規模かつ複合的な作業形態に対応できるなど作業の様々な形態・性質に対応したワークフロー記述が行えることを考察した.近年,複数の作業者によって行われる定型的な作業を支援するグループウェアとしてワークフロー支援システムが盛んに研究・開発されている.しかし,従来の研究ではシステムとしてワークフロー支援が行える作業の範囲が明確されておらず実際の作業をワークフローとして分析し支援システムで取り扱うためのワークフロー記述モデルが定式化されていない.この問題を解決するために,我々は前年度において,複雑な作業,動的な作業変更への対応を可能とするための拡張RDAPモデルの構築を行った.今年度は,この研究成果に基づき,拡張RDAPモデルの記述能力の評価を行った.拡張RDAPモデルの記述範囲と記述能力が設計通りであるかを分析するために,我々の大学内研究室運営における事務作業の拡張RDAP

モデルに基づく記述を行った.研究室運営における事務作業は,さほど大規模ではないが,研究活動により生じる事務作用は複数の種類の事務作業が複雑に関係し,また,動的な作業変更が行われる.この様な作業を実際に拡張RDAPモデルで記述することにより,拡張RDAPモデルが設計通りの記述能力を持つことが検証された.近年,複数の作業者によって行われる定型的な作業を支援するグループウェアとしてワークフロー支援システムが盛んに研究・開発されている.本研究では,我々の先行研究であるワークフローのRDAPモデルを基に、従来の支援システムの問題であった複雑かつ大規模な作業、動的な作業変更への対応を可能とするための拡張RDAPモデルの構築を行っている.RDAPモデルは,R(Role):作業の実施者を抽象化した役割,D(Data):役割が作業を行うための必要な情報やそれを作成する際に必要なフォーマットであるデータ.A(Action):作業の中で役割があるデータを基に、別な役割へ送るデータを作る行為,P(Protocol):役割間でのデータの流れ,の4つの要素から,ワークフローを定式化するモデルである.拡張RDAPモデルでは,これらの,要素に池の種類の要素を記述,また,他のワークフローを扱えるような記述(ワークフローのメタレベル記述)を可能とする記述体系である.また拡張RDAPモデルによって,作業の動的な変更への対応や、大規模かつ複合的な作業形態に対応できるなど作業の様々な形態・性質に対応したワークフロー記述が行えることを考察した.さらに,拡張RDAPモデルの実用性の評価を行うために,以下の3種類のアプリケーションへの適用を考察した.(1)作業者探索支援システム:作業グループ立上げ時のメンバ選択の作業の流れを支援するシステム,(2)電子掲示板選択支援システム:電子掲示板への過去の投稿状況をもとに,掲示板への投稿の作業の流れを支援するシステム,(3)コミュニケーションのためのメディア選択システム;ユーザの過去の作業履歴を基に,コミュニケーションに最適なメディアの選択支援を行うためのシステム.
マイクロビームにおけるクロマチン損傷誘発バイスタンダー効果のイオン種・LET依存性

バイスタンダー効果で非照射細胞に誘導される細胞損傷を明らかにするため、ヘリウムイオン照射で生成されるクロマチン損傷をヒト正常上皮性細胞を用いて直接照射細胞と非細胞に分けて解析した。直接照射された細胞には、低LET放射線で観察される軽微な損傷に加えて高LET放射線で観察される重篤な損傷が生成された。一方、直接照射細胞の近傍にある非細胞には、低LET放射線で観察される軽微な損傷しか生成されなかった。高LET粒子放射線低フルエンス照射に対する生物影響研究のうち、生じた生物効果に対するバイスタンダー効果誘導研究は、238Puから放出されるアルファ線又はヘリウムイオンマイクロビームを用いた研究が先行しており、ヘリウムよりも原子番号の大きな核種のイオンビームや低LET放射線である電磁波放射線マイクロビームを用いた研究は、全世界的に見ても殆ど行われていない。本研究課題においては、ヒト培養細胞を用いた細胞レベルの生物効果に対する放射線誘発バイスタンダー効果の放射線の線質依存性(粒子放射線と電磁波放射線、加速イオン種とLET依存性)とその誘導メカニズムの解明を、線質の異なる放射線のマイクロビーム(ヘリウム、炭素、ネオン、アルゴンなどの重粒子線、プロトン、X線)を明らかにする。項目別目的1:マイクロビーム照射によるクロマチン損傷誘発のバイスタンダー効果のイオン種およびLET依存性平成18年度は日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所TIARA重粒子マイクロビーム照射装置を利用して、マイクロビーム細胞照射方法を確立する目的も含めて、ヒト正常細胞の生物効果(細胞致死)とそのバイスタンダー効果の誘導を調べた。細胞致死はコロニー形成法による細胞の増殖死として検出した。TIARAサイクロトロンで加速された220MeV(細胞照射位置での推定LET=103keV/μm)炭素イオンマイクロビーム照射は、直径36mmの照射用シャーレ面上にコンフルエント状態に培養した細胞に対して格子状(16x16=256点)に直径20μm内に8個のイオン照射を行った。この照射方法により、同一照射野に炭素イオンビーム照射細胞と非照射細胞(バイスタンダー細胞)を共存させることが可能となる。平成18年度に行った3回のマシンタイムにおいて、マイクロビーム照射群の細胞生存率は、81-94%であった。今回確立した照射条件では、全細胞数に対して炭素イオンが直接照射される細胞の割合は8-9x10^<-3>%と計算される。細胞致死が炭素イオンが直接ヒットした細胞のみに生じ、非ヒット細胞には起こらないと仮定すると、非照射細胞の一部にも二次的・三次的な何らかのメカニズムによって細胞致死が誘導されたと考えなければ今回得られた結果は説明することが出来ない。このことにより、炭素イオン照射された細胞集団において細胞致死効果にバイスタンダー効果が誘導されたと結論する。また、ギャップジャンクション特異的阻害剤を併用した実験から、細胞生存率はほぼ100%まで回復した結果が得られ、観察されたバイスタンダー細胞致死効果の誘導にはギャップジャンクションを介した細胞間情報伝達機構が密接に関与していることが示唆された。平成18年度に確立したマイクロビーム細胞照射法を用いて、日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所TIARA重粒子マイクロビーム照射装置の炭素イオンマイクロビームと高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設単色軟X線マイクロビーム照射に対するヒト正常細胞の生物効果(細胞致死)に関する照射効果とそのバイスタンダー効果誘導を調べた。ヒト正常細胞は、理化学研究所BioResource Centerより供給されたヒト胎児皮膚由来正常線維芽細胞を用いた。細胞致死はコロニー形成法による細胞の増殖死を検出した。炭素イオンマイクロビームでは前年度得られた実験結果を再現し、マイクロビーム照射群の細胞生存率は80-92%であった。また、照射時にギャップジャンクション特異的阻害剤を併用した場合は、生存率は100%前後であった。一方、単色X線マイクロビームでは、照射単独群およびギャップジャンクション特異的阻害剤併用群いずれの場合も生存率は100%前後であった。今回得られた結果のうち炭素イオンでは、細胞致死は炭素イオンが直接ヒットした細胞のみに生じ、非ヒット細胞には起こらない、と仮定すると、イオンが照射された細胞が0.08-0.18%しか存在しない細胞集団に生ずる結果として説明することが出来ず、非照射細胞の一部にも二次的・三次的な何らかのメカニズムによって生物効果が誘導されたと考えることが必要となる。また、ギャップジャンクション特異的阻害剤を併用した実験結果から、観察されたバイスタンダー効果の誘導にはギャップジャンクションを介した細胞間情報伝達機構が密接に関与していることが示唆される。一方単色X線マイクロビームでは炭素イオンで観察されたような生物効果のバイスタンダー効果が起こらず、バイスタンダー効果の誘導には、放射線の線質依存性が存在することが示唆された。

バイスタンダー効果により非照射細胞(バイスタンダー細胞)に誘導される細胞損傷の実態を明らかにする目的で、研究計画書『項目別目的3:バイスタンダー効果によって誘導されるクロマチン損傷の実態の解明』に記載した細胞照射法を用いて、ヘリウムイオンマイクロビーム照射によって生成されるクロマチン損傷を直接照射細胞とバイスタンダー細胞に分けて解析した。細胞は、ヒト気管支由来の正常上皮性細胞を用いた。クロマチン損傷は、カリキュリンAによって誘導されたG_2期の凝縮クロマチン(G_2-PCC)を光学顕微鏡下で観察し、クロマチン損傷として、chromatid gaps、chromatid breaks、isochromatid gaps & deletions、を検出した。ヘリウムイオンマイクロビームを直接照射された細胞には、通常低LETX線照射で観察されるchromatid-typeの損傷(chromatid gaps、chromatid breaks)に加えて高LET放射線で観察されるisochromatid gaps & deletionsが生成された。また、クロマチン間のexchange-typeの損傷も観察された。一方、ヘリウムイオンを直接照射されず、直接照射細胞の近傍に存在していたバイスタンダー細胞には、chromatid-typeの損傷のうちchromatid gapsとchromatid breaksしか観察されず、直接ヒット細胞で生成された高LET放射線タイプであるisochromatid gaps & deletionsが全く誘導されないことが判った。以上の結果から、ヘリウムイオンマイクロビーム照射によって誘導されるバイスタンダー効果では、直接ヘリウムイオンを照射されていないバイスタンダー細胞に低LET放射線で生成されるクロマチン損傷と同質の比較的複雑でない損傷のみが誘導されることが示唆された。平成18年度に確立した全細胞数のうち約0.2%の細胞のみに選択的にマイクロビームを照射する方法を利用して、日本原子力研究開発機構重イオンマイクロビーム照射装置の炭素・ネオン・アルゴンイオンマイクロビーム、高エネルギー加速器研究機構単色軟X線マイクロビーム、放射線医学総合研究所プロトンマイクロビームを用いて、ヒト正常細胞の突然変異に関するバイスタンダー効果誘導の放射線線質依存性を調べた。ヒト正常細胞は、理化学研究所BioResource Centerより供給されたヒト胎児皮膚由来正常線維芽細胞を用いた。突然変異はX染色体上のhprt遺伝子座を標的遺伝子として6チオグアニン耐性クローンの出現頻度より誘発頻度を算出した。突然変異誘発効果は非照射コントロールに対してプロトンで4.2倍、炭素イオンで6.3倍、ネオンイオンで2.4倍高い誘発頻度を示したのに対して、X線とアルゴンイオンではコントロールと有意な差がなかった。また、ギャップジャンクション特異的阻害剤を併用することによって高頻度に誘発した突然変異はコントロールレベルまで減少した。
T-Engineを使ったパソコン-マイコン実験実習システムの構築

「研究目的」現在,高等教育機関である大学・高専において組み込みリアルタイム系のOSの教育や人材育成はあまりなされておらず,組み込みシステム技術者の養成が急務とされている.そこで,現状の高等専門学校のパソコン,マイコン実験実習をTRON仕様のOSを使ってどこまで置き換えられるか調べる.この研究によって,パソコンやマイコン,組み込み電子機器で異なっている基本ソフトウェアをTRON(T-Engine)仕様で統一して,実験実習出来るようにする.「研究方法」パソコンを使う実験実習(WindowsやLinux)をBTRON仕様のOS(超漢字)と比較し,現状の高等専門学校における実験実習と置き換えできるか否か調べる.又,ITRON(T-Engine)仕様のOS(T-Kernel)を現状のマイコン系の実験実習と置き換えできるか否か調べる.「研究成果」1.現状のコンピュータ系の実験実習は,TRONと置換え可能だが,WindowsやLinuxと混在させながら実験実習する必要があることがわかった.2.パソコン系実験実習はBTRON3仕様のOS(超漢字V)でコンピュータリテラシーについては置換えることが可能である.パソコン系ソフトウェア開発については,WindowsやLinuxの方が適していることがわかった.3.マイコン系の実験実習については単純な入出力をコントロールをする実験実習では,コントロールマイコン(PIC等)が適しているが多くの入出力や小型液晶ディスプレイ等を制御する実験実習ではITRON仕様のT-Engineが適していることがわかった.「研究目的」現在,高等教育機関である大学・高専において組み込みリアルタイム系のOSの教育や人材育成はあまりなされておらず,組み込みシステム技術者の養成が急務とされている.そこで,現状の高等専門学校のパソコン,マイコン実験実習をTRON仕様のOSを使ってどこまで置き換えられるか調べる.この研究によって,パソコンやマイコン,組み込み電子機器で異なっている基本ソフトウェアをTRON(T-Engine)仕様で統一して,実験実習出来るようにする.「研究方法」パソコンを使う実験実習(WindowsやLinux)をBTRON仕様のOS(超漢字)と比較し,現状の高等専門学校における実験実習と置き換えできるか否か調べる.又,ITRON(T-Engine)仕様のOS(T-Kernel)を現状のマイコン系の実験実習と置き換えできるか否か調べる.「研究成果」1.現状のコンピュータ系の実験実習は,TRONと置換え可能だが,WindowsやLinuxと混在させながら実験実習する必要があることがわかった.2.パソコン系実験実習はBTRON3仕様のOS(超漢字V)でコンピュータリテラシーについては置換えることが可能である.パソコン系ソフトウェア開発については,WindowsやLinuxの方が適していることがわかった.3.マイコン系の実験実習については単純な入出力をコントロールをする実験実習では,コントロールマイコン(PIC等)が適しているが多くの入出力や小型液晶ディスプレイ等を制御する実験実習ではITRON仕様のT-Engineが適していることがわかった.
MRI 中で測定可能な SPECT 装置に関する研究

光ファイバーイメージガイドを用いたSPECT/MRI用検出器を開発し,その性能を評価した。検出器に用いたシンチレータはY2SiO5 (YSO)で, 15 x 15のマトリクスに配置したものを用いた。光ファイバーには,0.5mm直径のダブルクラッド型を用い,それを束ねて長さ80cmのイメージガイドを構成した。そのイメージガイドの入力部にYSOブロックを光学結合し,出力部には1インチ角型位置有感型光電子増倍管(PSPMT)を光学結合した。コリメータにはタングステン含有プラスチックを用い, YSOのピクセルに1対1に配置する構成とした。PSPMTの出力はアンガー方式で位置演算を行った。コリメータを含めた空間分解能はコリメータから1.5mm離れた位置で1.7mmFWHMで,システム感度は0.06%であった。このSPECT用検出器を永久磁石式MRIの中に配置し,同時測定を行い相互影響の無いことを確認した。これらの結果より,開発した検出器はSPECT/MRI用として有望であることが明らかになった。さらにMRI中で同時撮像を行いその有効性を評価した。検出器に用いたシンチレータはY2SiO5 (YSO)で,1.2mm x 1.2mm x 6mmのピクセルを15 x 15のマトリクスに配置したものを用いた。入力部は90度曲がった構成とし,その他の部分はフレキシブルな構成とした。コリメータにはMRIでの使用を考慮してタングステン含有プラスチックを用い,厚さ7mmの平行穴コリメータ(穴径0.8mm)をYSOのピクセルに1対1に配置する構成とした。Co-57のガンマ線(122keV)に対し,YSOのほぼすべてのピクセルを弁別することができ,またエネルギー分解能は38%FWHMであった。コリメータを含めた空間分解能(システム分解能)はコリメータから1.5mm離れた位置で1.7mmFWHMで,システム感度は0.06%であった。このSPECT用検出器を0.3Tの永久磁石式MRIの中に配置し,MRIとの同時測定を行った。その結果,開発した検出器はMRI中でもCo-57の点線源を撮像することが可能であることが明らかになった。また,SPECT用検出器を配置しても,MRI画像に大きな影響を与えないことも確認した。これらの結果より,開発した検出器はSPECTとして使用可能な性能を有し,MRIとの相互影響が少なく,SPECT/MRI用として有望であることが明らかになった。今年度はMRI中で測定可能な小動物用SPECT検出器の開発を行った。低光損失の光ファイバー束を採用することによりMRIの撮像視野中には電気的な部品を配置しない構造のSPECT用検出器を開発した。検出器はコリメータ、シンチレータ、光ファイバー束、及び位置有感型光電子増倍管で構成した。また,被検体のシングルフォトン核種から放出されるガンマ線の内、平行成分のみをシンチレータに導く平行穴コリメータを開発した。MRI中でコリメータなどの金属を用いる場合には、導体を用いると渦電流が発生しMRIの均一磁場が乱れ、画像にアーチファクトを生じる可能性があるため,コリメータにはタングステンプラスチックを用いた。シンチレータは生体に近い磁化率を持ち,発光量が大きく潮解性も無いYSOを用いた。この組み合わせによりMRI中で撮像可能なSPECT用検出器を開発することができた。今年度はMRI中で測定可能な小動物用SPECT検出器の開発において,低光損失の光ファイバー束を採用することによりMRIの撮像視野中には電気的な部品を配置しない構造のSPECT用検出器を開発することができたから。MRIのRFコイルの中にシングルフォトン核種を投与したラットなどの被検体を配置し、その外に検出器のコリメータとシンチレータを配置する。

被検体から放出されるガンマ線はコリメータで平行成分のみをシンチレータに入射させ、シンチレーション光を光ファイバー束で位置情報を保ったまま位置有感型光電子増倍管に導くことで被検体のシングルフォトン核種の分布の画像化を試みる。必要に応じて,コリメータ材料の見直しを行い,新たなコリメータを製作する。これまでの成果をまとめて国内外の学会で成果発表を行う。
糖尿病角膜上皮基底膜異常検出を目的とした角膜組織散乱光測定装置の開発

糖尿病では合併症が極めて重要な臨床的問題である。一般に糖尿病合併症に共通する病態の一つは基底膜の異常である。先に生体共焦点顕微鏡を用いた観察により,糖尿病症例で角膜上皮基底膜部の散乱光の強度が糖尿病網膜症の重症化に従い増強することを見いだした。実際の臨床応用にあたっては,生体共焦点顕微鏡よりも簡便に角膜基底膜部での光散乱のみを測定する機器の開発が必要であると考え,角膜上皮表面,基底膜部,および内皮面に相当すると考えられる波形を得る組織散乱光検出機器(light scattering detection system, LSDS)を試作した。現装置では散乱光強度とその散乱光強度の測定点(測定用レンズ)からの距離しか記録されないため,測定された散乱光強度が角膜のどの部位由来の散乱光強度かを同定するのが困難であった。そのため、従来の記録データに加えて測定中の組織画像を同時に記録できるように改良し,上皮基底膜部位の散乱光強度を確定した。LSDS共焦点スペキュラー顕微鏡の測定再現性の評価をした。細隙灯顕微鏡検査にて異常所見を認めない健常人10例10眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を連続5回,同症例を隔日で3回測定したところ,得られた結果には再現性を認めた。従来の生体共焦点顕微鏡と試作した共焦点スペキュラー顕微鏡の両機で50例50眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を測定した結果,両機による測定値は有意な相関を認めた(相関係数0.75,p<0.001)。さらに,共焦点スペキュラー顕微鏡を用いて糖尿病および非糖尿病患者の角膜を観察し,糖尿病患者の群で上皮基底膜部位の散乱光強度の有意な増強を認めた(p<0.001,student's t-test)。角膜組織は単純な5層構造をとっており,角膜に可視光線をあてることによりそれぞれの構造物由来の散乱光が生じる。この散乱光強度を測定するために、ハロゲン光を光源とし,散乱光検出のために鏡面反射原理と共焦点光学系を併用した新しい角膜組織散乱光測定装置(code name : YAMA)を開発した。この装置は検出系が角膜上皮と涙液およびcoupling gelを介して角膜上皮に接触することにより常に角膜と垂直に位置することにより安定した計測ができる。検出系内に対物レンズが内蔵され,検出系内を角膜上皮側から内皮側へと移動することで角膜内構造物をスキャンし,角膜内構造物からの組織散乱光を検出する。検出された散乱高強度は数値化され,対物レンズのZ軸位置に対応させて角膜組織散乱光波形(Z-Scan wave)を描出することができる。今回の研究では,YAMAで得られたヒトにおけるZ-Scan waveの再現性を検討した。YAMAで検出できたZ-Scanwaveは,これまでほかの生体焦点顕微鏡で得られていたZ-Scan waveと同様に3つのピークを有している波形を検出できた。そこで,角膜上皮最表層を示すfirst peakから角膜内皮細胞層を示すthird peakまでを角膜厚として測定した。同一対象を繰り返し7回測定したときのYAMAでの角膜厚は560.1±8.5μmであり,角膜厚測定に一般的に用いられている超音波パキメーターで計測した値557.7±2.3μmと比較しても有意な差は見られず,非常に近似した値を得ることが可能であった。また,正常ボランティア眼76眼を測定しYAMAでの測定値と超音波パキメーターの測定値との比較を行ったが,両者の測定値は高い相関係数(r=0.86,Pearson積率相関係数)を示した。来年度以降は組織散乱高強度を示すZ-Scanwave値の再現性を検討し,機器の改良を行う予定としている。1)角膜構造物由来の組織散乱光強度を測定することを目的として試作した組織散乱光測定装置(共焦点スペキュラー顕微鏡)の改良を行った。そのため,従来の記録データに加えて測定中の組織画像を同時に記録できるように改良し,上皮基底膜部位の散乱光強度を確定した。2)上記の共焦点スペキュラー顕微鏡の測定再現性の評価をした。細隙灯顕微鏡検査にて異常所見を認めない健常人10例10眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を連続5回,同症例を隔日で3回測定したところ,得られた結果には再現性を認めた(それぞれ平均変動係数で5.7%,4.1%)。また,従来の生体共焦点顕微鏡と,試作した共焦点スペキュラー顕微鏡の両機で50例50眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を測定した結果,両機による測定値は有意な相関を認めた(相関係数0.75, p<0.001)。3)上記の組織散乱光測定装置(共焦点スペキュラー顕微鏡)を用いて糖尿病および非糖尿病患者の角膜を観察した。糖尿病患者(増殖前糖尿病網膜症9例9眼,増殖糖尿病網膜症11例11眼)20例20眼および非糖尿病患者20例20

眼の上皮基底膜部位の散乱光強度を測定し,糖尿病患者の群で上皮基底膜部位の散乱光強度の有意な増強を認めた(p<0.001, student's t-test)。4)家兎糖尿病モデルの作成を試みたが,安定した血糖の上昇は得られなかった。糖尿病では合併症が極めて重要な臨床的問題である。一般に糖尿病合併症に共通する病態の一つは基底膜の異常である。先に生体共焦点顕微鏡を用いた観察により,糖尿病症例で角膜上皮基底膜部の散乱光の強度が糖尿病網膜症の重症化に従い増強することを見いだした。実際の臨床応用にあたっては,生体共焦点顕微鏡よりも簡便に角膜基底膜部での光散乱のみを測定する機器の開発が必要であると考え,角膜上皮表面,基底膜部,および内皮面に相当すると考えられる波形を得る組織散乱光検出機器(light scattering detection system, LSDS)を試作した。現装置では散乱光強度とその散乱光強度の測定点(測定用レンズ)からの距離しか記録されないため,測定された散乱光強度が角膜のどの部位由来の散乱光強度かを同定するのが困難であった。そのため、従来の記録データに加えて測定中の組織画像を同時に記録できるように改良し,上皮基底膜部位の散乱光強度を確定した。LSDS共焦点スペキュラー顕微鏡の測定再現性の評価をした。細隙灯顕微鏡検査にて異常所見を認めない健常人10例10眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を連続5回,同症例を隔日で3回測定したところ,得られた結果には再現性を認めた。従来の生体共焦点顕微鏡と試作した共焦点スペキュラー顕微鏡の両機で50例50眼の角膜上皮基底膜部位の散乱光強度を測定した結果,両機による測定値は有意な相関を認めた(相関係数0.75,p<0.001)。さらに,共焦点スペキュラー顕微鏡を用いて糖尿病および非糖尿病患者の角膜を観察し,糖尿病患者の群で上皮基底膜部位の散乱光強度の有意な増強を認めた(p<0.001,student's t-test)。
動物の性決定機構に関する分子系統学的解析

動物の性決定において、XX/XY型とZZ/ZW型の分子機構を比較解析することは、種の分化と進化を考察する必須と考えられる。しかしながら、ZZ/ZW型の性決定様式を持つ脊椎動物においては、雌を決定する性(卵巣)決定遺伝子およびその遺伝子を介した決定の分子機構は全く未解明であった。本研究では、実験動物として汎用され、性染色体は確定していないが遺伝学的にZZ/ZW型の性決定様式を持つ両生類のアフリカツメガエル(Xenopus laevis)を対象として、性(雌/卵巣)決定遺伝子候補xDM-Wの単離、解析を行い、以下の結果が得られた。1:xDM-Wは雌ゲノム特異的(すなわちW染色体に座位)遺伝子で、精巣形成遺伝子候補xDMRT1のパラログ遺伝子である。2:xDM-W遺伝子は性決定の初期の始原生殖巣でxDMRT1に比べ高い発現を示す。3:xDM-W及びxDMRT1タンパク質は、in vitroにおいて転写因子として同じシスエレメントに結合するが、xDMRT1による転写活性化はxDM-Wによって抑制される可能性がある。4:xDM-W発現或いはノックダウンベクターを導入したトランスジェニックガエルは、正常よりも小さく異常な生殖巣をもつ個体が存在する。以上から、アフリカツメガエルのZZ/ZW型の性(卵巣)決定では、W染色体にリンクするxDM-Wが卵巣決定(アンチ精巣形成)因子として、xDMRT1による精巣形成を抑制し卵巣を形成させる、という仮説が考えられる。また近縁種ではxDM-W遺伝子のオルソログは存在しない可能性が強いことがわかり、性決定機構と種の分化は密接に関係することが示唆される。初年度である本年度は、動物の進化と性決定との連関から、ショウジョウバエ、線虫、あるいは魚類の性の決定に関与するDM domainを持つ遺伝子(DM型遺伝子)ファミリーに注目し、まだ性染色体も確定していないが、遺伝学的にZZ/ZW型の性決定様式を持つ両生類のアフリカツメガエルのDM型遺伝子の単離を試みた。その結果、精巣形成決定に関与する可能性の高いDM型遺伝子xDMRT1、さらに画期的なことに、雌(卵巣)決定遺伝子の候補となる可能性が十分考えられる雌ゲノム特異的(すなわちW染色体にリンク)なDM型遺伝子xDM-Wの単離に成功した。DMRT1は、魚類や鳥類で性染色体にリンクしている種が存在し、精巣形成に関与し雄の性決定に重要な機能を持つことが知られている。本研究で単離されたxDMRT1はゲノムサザン解析から常染色体にリンクしていると考えられた。一方、ゲノムサザン解析からW染色体にリンクしていると考えられるxDM-WはxDMRT1とDNA結合ドメインで非常に相同性が高く、進化上、性染色体の分化の際、xDMRT1の重複によって分子進化してきたと予想されるが、xDMRT1のC末端に相当する部分が欠失していた。また、RT-PCRによる解析から、両遺伝子は共に、幼生の性決定期の未分化生殖巣で発現が確認された。これらのことから、W染色体に座位すると考えられるxDM-Wは、その転写産物がxDMRT1タンパク質の精巣形成に関わる遺伝子の転写を競合的に抑制することによって、雌(卵巣)決定遺伝子として機能するという仮説が考えられる。16年度には、この仮説の検証を行うことによって、ZZ/ZW型性決定機構に新たな分子機構を提示し、性決定機構と進化について議論したいと考えている。動物の性決定において、XX/XY型とZZ/ZW型の分子機構を比較解析することは、種の分化と進化を考察する上で欠くことができない。しかしながら、ZZ/ZW型の性決定の分子機構はまだ全く未解明である。

昨年度の本研究で、遺伝学的にZZ/ZW型の性決定様式を持つとされているアフリカツメガエル(Xenopu laevis)から、雌ゲノム特異的(すなわちW染色体にリンク)遺伝子xDM-Wの単離に成功した。xDM-wは、DM型転写因子の遺伝子ファミリーに属し、同じDM型遺伝子ファミリーに属するxDMRT1(魚類や鳥類で性染色体にリンクしている種が存在し、精巣形成に関与する可能性の高い遺伝子)と非常に相同性が高いことから、その転写産物が転写因子としてxDMRT1の機能を抑制し卵巣形成を導くというモデル(すなわちxDM-Wは性(雌)決定遺伝子である)が考えられた。本年度は、この作業仮説を検証するために、以下の事を行った。(1)xDM-WとxDMRT1が結合するDNAシスエレメントの探索を行い、結合配列の候補を同定した。(2)遺伝的雄個体(ZZ♂)がxDM-W発現によって機能的雌(ZZ♀)へ性転換がおきるかを調べるために、トランスジェニック個体作製系の確立およびxDM-Wプロモーターを含むゲノムDNA断片の単離を行った。更に、DM-W遺伝子の進化的保存性を考察するために、Xenopus laevisと同様偽4倍体である亜種Xenopus borealisおよび2倍体の近縁種であるSilurana(Xenopus)tropicalisのゲノムに対してサザンプロット解析を行ったところ、borealisにはDM-Wは存在するが、tropicalisには存在しない可能性が示唆され、ゲノムの倍数化と性決定機構および種の分化に何らかの因果関係があることが考えられた。動物の性決定において,XX/XY型とZZ/ZW型の分子機構を比較解析することは、種の分化と進化を考察する上で重要であるが,ZZ/ZW型の性決定の分子機構は今だ未解明である。我々は,15,16年度の本研究課題において,遺伝学的にZZ/ZW型の性決定様式を持つアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の雌ゲノム特異的(すなわちW染色体にリンク)遺伝子xDM-Wを単離・解析を行い,xDM-Wは、精巣形成(雄決定)に関わると予想されるxDmrt1とDNA結合領域で相同性が高いこと及び発現解析等から,その転写産物が卵巣形成を導くというモデルを考案した。本年度は昨年度に引き続き,この作業仮説を検証するために解析を行い,以下の結果を得た。1,xDM-WとxDmrt1は,共通のDNAシスエレメントに特異的に結合した。更にこの配列の下流にルシフェラーゼレポーターを連結し,培養細胞系で調べたところ,xDmrt1は転写活性化能を持つのに対し,xDM-Wは転写活性化能を欠いている可能性が示唆された。2,xDM-Wプロモーターを含むと考えられる5`上流域の下流にxDM-W cDNAを連結しトランスジェニック個体の作製を行ったところ,精巣形成の異常が認められる個体が遺伝的ZZ型に少ないものの観察された。以上より,xDM-Wは,Xenopus laevisの性決定おいて,精巣形成を阻害することによって卵巣を導く性決定遺伝子である可能性が示唆された。また,近縁種tropicalisではこの分子機構による性決定は行われず,種の分化と性決定は密接な関係にあると考えられる。
キャビテーションエロ-ジョンの分子論的解析

液体中で崩壊する気泡の挙動については,これまで多くの研究がなされてきた.これまで行われた理論的,数値的解析では,気泡崩壊時のマイクロジェットの生成により剛体壁に局所的に大きな圧力が加わることを予測しているが,壁面に働く力の大きさや,壁面の損傷の予測は,実験結果と定量的に一致するものではない.本研究では,気泡の崩壊や壁面の損傷に与える影響を,分子レベルのスケールで評価する第1段階として,分子動力学法による解析を行った.計算は,分子間力がレナード・ジョーンズポテンシャルで記述される系としてプラチナの固形分子で構成される平行平板間に,キセノンの液体分子が詰まっている系を考えた.計算条件として,まず,プラチナ固体壁間にキセノン液体が存在する状態で,与えられた温度に対して平衡状態を作った.そして,その状態において,下側固体壁近傍の液体より,球状の分子郡を抜き取りキャビティを形成し,それと同時にそのキャビティを崩壊させるため,上側固体壁を一定の速度で移動させた.現在のところ,上側壁面の移動に伴い,液体分子がキャビティ内に溶け込んでいく結果が得られており,期待されたキャビティの崩壊現象は得られていない.これらの結果が得られている要因として,キャビティ形成後,上側壁面を移動させる際の速度が十分大きくないため,キャビティの崩壊を起こさせるのに十分な非平衡状態を達成できていないことが考えられる.これらの問題点の解決方法としては,パラメータをさらに調整し,崩壊運動が起きる条件を探すことが考えられるが,本質的な問題点は,キャビティの形成時に分子群を抜き取るところにあると考えられる.従って,今後の改良点としては,固体壁間の液体状態において平衡状態を達成させた後,まず上側壁面を上方に引き,系全体の減圧を行い、液体に相変化を起こさせた後,急速に上壁を押し気泡の崩壊を引き起こすべきであると考えられる.液体中で崩壊する気泡の挙動については,これまで多くの研究がなされてきた.これまで行われた理論的,数値的解析では,気泡崩壊時のマイクロジェットの生成により剛体壁に局所的に大きな圧力が加わることを予測しているが,壁面に働く力の大きさや,壁面の損傷の予測は,実験結果と定量的に一致するものではない.本研究では,気泡の崩壊や壁面の損傷に与える影響を,分子レベルのスケールで評価する第1段階として,分子動力学法による解析を行った.計算は,分子間力がレナード・ジョーンズポテンシャルで記述される系としてプラチナの固形分子で構成される平行平板間に,キセノンの液体分子が詰まっている系を考えた.計算条件として,まず,プラチナ固体壁間にキセノン液体が存在する状態で,与えられた温度に対して平衡状態を作った.そして,その状態において,下側固体壁近傍の液体より,球状の分子郡を抜き取りキャビティを形成し,それと同時にそのキャビティを崩壊させるため,上側固体壁を一定の速度で移動させた.現在のところ,上側壁面の移動に伴い,液体分子がキャビティ内に溶け込んでいく結果が得られており,期待されたキャビティの崩壊現象は得られていない.これらの結果が得られている要因として,キャビティ形成後,上側壁面を移動させる際の速度が十分大きくないため,キャビティの崩壊を起こさせるのに十分な非平衡状態を達成できていないことが考えられる.これらの問題点の解決方法としては,パラメータをさらに調整し,崩壊運動が起きる条件を探すことが考えられるが,本質的な問題点は,キャビティの形成時に分子群を抜き取るところにあると考えられる.従って,今後の改良点としては,固体壁間の液体状態において平衡状態を達成させた後,まず上側壁面を上方に引き,系全体の減圧を行い、液体に相変化を起こさせた後,急速に上壁を押し気泡の崩壊を引き起こすべきであると考えられる.
絶縁性リチウム複酸化物をモデルとした導電ネットワークの制御

本研究は、絶縁性の酸化物に炭素による均一な導電ネットワークを形成して、粒子中および粒子間における電子およびイオンのスムーズな拡散が可能な粒子構造を実現することを目的とした。原料エアロゾルを、振動波でアシストしながら熱分解することで絶縁性複酸化物粒子を合成し、原料の種類、熱分解温度および振動波の周波数等の合成条件が、粒子の微構造に影響することがわかった。これは、原料の熱分解挙動および振動波のエネルギーに起因することが示された。本研究は、絶縁性の酸化物に炭素による均一な導電ネットワークを形成して、粒子中および粒子間における電子およびイオンのスムーズな拡散が可能な粒子構造の実現を目指すものである。これまでに、エアロゾルの熱分解を利用してリチウム複酸化物粒子中へ炭素を分散することに成功したが、不均一な炭素分布が課題となっている。本研究では、振動波をエアロゾルに与えて、全ての原料塩を瞬時に熱分解する手法を開発して課題解決し、絶縁性のリチウム複酸化物をモデルとして、均一な導電ネットワークの形成手法を確立することを目的としている。本研究では、エアロゾルを瞬時に熱分解するために必要な振動波発生装置を試作し、リン酸鉄リチウム粒子を合成モデルとして合成試験を実施した結果、原料塩、熱分解温度および振動波の周波数等の合成条件と得られた粒子の粒子特性との関係を明らかにし、複合粒子合成に重要な粒子の生成過程の知見を得ることができた。また、炭素複合リン酸鉄リチウム粒子を合成し、炭素源の種類、振動波の周波数および熱分解温度等の合成条件が粒子の微構造に及ぼす影響を調べると共に、得られた炭素複合リン酸鉄リチウム粒子の電気化学的特性を調べた。その結果、振動波の周波数および熱分解温度が粒子の微構造に影響することがわかった。しかし、導電率およびリチウムイオン電池用正極材料としてのレート特性には、大きな影響はなかった。これは、導電ネットワークを形成するための炭素が不連続的にリン酸鉄リチウム粒子に分散しているためであると考えられ、炭素複合量が粒子の微構造に及ぼす影響を明らかにすることで、導電率およびレート特性の向上が期待できる。本研究では、エアロゾルを均一に熱分解するために、パルス燃焼装置におけるエアロゾルの導入位置、熱分解温度および振動波の周波数を調整可能な仕組みが必須である。そこで、熱風発生装置および振動波発生装置を設計し、パルス燃焼装置を試作した。動作試験を実施し、900°Cまでの熱分解温度および1002000Hzの周波数で動作できることをデータとして取得し、本研究に必要な動作条件を確保できたことを確認した。また、絶縁性の高い材料であるリン酸鉄リチウムを合成モデルとして、振動波を利用した噴霧熱分解法における粒子の生成過程を解明する研究を実施した。粒子の生成過程に影響する原料塩の熱分解挙動について、示差熱重量分析によりデータを取得した。原料塩、熱分解温度および振動波の周波数等の合成条件を変化させながら、リン酸鉄リチウム粒子の合成試験を実施した。合成条件と得られた粒子の粒子特性との関係を詳細に調べた結果、噴霧熱分解時に析出し易い原料塩ほど、および、振動波の周波数が高いほど得られる粒子の粒子径が小さくなることがわかった。エアロゾルに振動波を与えると、典型的な噴霧熱分解法とは異なり、2次粒子を形成せずに1次粒子として粒子を得られることがわかり、複合粒子合成に重要な粒子の生成過程がわかった。本研究では、振動波をエアロゾルに与えて、全ての原料塩を瞬時に熱分解する手法を開発して課題解決し、絶縁性のリチウム複酸化物をモデルとして、均一な導電ネットワークの形成手法の確立することを目的としている。本研究では、エアロゾルを瞬時に熱分解するために必要な振動波発生装置を試作し、リン酸鉄リチウム粒子を合成モデルとして合成試験を実施した結果、原料塩や振動波の周波数等の合成条件と得られた粒子の粒子特性との関係から、粒子の生成過程の知見を得ることができた。また、炭素複合リン酸鉄リチウム粒子を合成し、炭素源の種類および熱分解温度等の合成条件が、粒子の微構造および電気化学的特性におよぼす影響を調べた結果、振動波の周波数および熱分解温度が粒子の微構造に影響することがわかった。

しかし、導電率およびレート特性には、大きな影響はなかった。これは、導電ネットワークを形成する炭素が不連続的に粒子に分散しているためであると考えられる。そこで、炭素の複合量および結晶相の違いが粒子の微構造および電気化学的特性に及ぼす影響について研究した。炭素複合量等を変化させながら導電率および電池特性等の電気化学的特性を調べた結果、炭素複合量が電気化学的特性に大きく影響した。これは、炭素がリン酸鉄リチウム粒子に分散し、連続的な導電ネットワークが形成されたことに起因するものであることがわかり、絶縁性のリチウム複酸化物をモデルとして、均一な導電ネットワークの形成手法を確立できた。材料工学本研究は、絶縁性の酸化物に炭素による均一な導電ネットワークを形成して、粒子中および粒子間における電子およびイオンのスムーズな拡散が可能な粒子構造の実現を目指すものであり、振動波を原料のエアロゾルに与えて、全ての原料塩を瞬時に熱分解する手法を開発して、粒子中への均一な導電ネットワークの形成手法を確立することを目的としている。平成25年度までは、次年度に合成条件、炭素分布、炭素複合量および電気化学的特性の相関関係を明らかにして、目的を達成するために、振動波発生装置を試作し、粒子の生成過程の解明に関する研究および合成条件が粒子の微構造に及ぼす影響に関する研究を実施した。試作した振動波発生装置は、本研究に必要な動作条件で動作できることを確認し、リン酸鉄リチウムの合成条件と粒子特性との関係を解析した結果から、合成条件の違いによる粒子の生成過程がわかった。また、炭素複合リン酸鉄リチウム粒子の合成条件と粒子特性との関係を解析した結果から、合成条件の違いが粒子の微構造に及ぼす影響がわかり、電気化学的特性のデータを取得することができた。本研究の実施計画通りに研究は進展しており、導電ネットワーク形成手法の基盤を確立すると共に、本年度の目標である合成条件と得られる粒子の微構造の関係を明らかにすることを達成した。本研究は、絶縁性の酸化物に炭素による均一な導電ネットワークを形成して、粒子中および粒子間における電子およびイオンのスムーズな拡散が可能な粒子構造の実現を目指すものであり、振動波を原料のエアロゾルに与えて、全ての原料塩を瞬時に熱分解する手法を開発して、粒子中への均一な導電ネットワークの形成手法を確立することを目的としている。平成24年度は、次年度以降に合成条件、炭素分布および電気化学的特性の相関関係を明らかにして、目的を達成するために、パルス燃焼装置の試作および粒子の生成過程の解明に関する研究を実施した。試作したパルス燃焼装置は、本研究に必要な動作条件で動作できることを確認し、リン酸鉄リチウムの合成条件と粒子特性との関係を解析した結果から、合成条件の違いによる粒子の生成過程がわかった。本研究の実施計画通りに研究は進展しており、研究の目的を達成するための基盤となる本年度の目標を達成した。
血小板P2Y受容体ヘテロ多量体は敗血症病態形成の新たな創薬標的となるか？

細菌感染から組織や臓器が障害されると敗血症が引き起こされる。多くの場合、肺微小血管内皮細胞の炎症や尿路感染症、皮膚および腸管の感染と関係しており、主な細菌としてブドウ球菌、大腸菌、連鎖球菌等が挙げられる。近年、敗血症は「感染に対する制御不能な宿主反応による生命に関わる臓器不全」と再定義され、ショックや多臓器不全への進展を回避するための治療法の開発が特に救命救急領域で求められているニーズである。疾患の進行過程で播種性血管内凝固(DIC: Disseminated Intracellular Coagulation)のが出現すると極めて予後不良となり、致死率は50%を超えるため、DIC発症の予防が重要な課題となっている。DIC発症に関与する血小板には種々の受容体が発現しているが、血小板活性化にはP2Y1受容体、凝集反応にはP2Y12受容体のP2Yサブファミリーが大きな役割を担っている。これまでに申請者は、これら2種の受容体間に相互作用があり、ヘテロ多量体が形成されることを報告した。P2Y12受容体遮断薬であるクロピドグレルは抗血小板薬として広く臨床で使われているが、敗血症の症状緩和にも効果的であることが示唆されている。本研究課題では、ヘテロ多量体を標的とした敗血症治療創薬の新たな突破口を開くため、敗血症病態におけるP2Y1-P2Y12受容体の関係について明らかにすることを目的とした。ヒト血小板の代替材料として多数の論文で使用実績があるヒト血小板前駆体巨核芽球由来培養細胞MEG-01を用いて研究を行った。本細胞において、種々の炎症刺激や、抗血小板薬であるシロスタゾール添加でこれらの受容体発現制御が見られることを発見した。またその研究過程で派生した、肺微小血管内皮細胞における炎症刺激に誘発されるシグナル伝達変化に関して論文を発表した。敗血症は細菌感染を起因とする全身性の炎症反応症候群であり、現在においても30%という高い死亡率を有している。今日までにさまざまな敗血症の動物実験モデルが作られ、抗炎症薬による加療が試されてきたが、未だに劇的な効果を示すものは開発されていない。症状進行のメカニズムとしては、細菌の細胞壁主成分であるリポ多糖が血小板に作用し、血小板活性化を促進することが引き金となって播種性血管内凝固症候群(DIC)が発症し、全身性炎症症状の激化につながることが知られている。血小板は止血に不可欠な血球成分であり、膜には種々の受容体が発現しているが、そのうち血小板活性化にはP2Y1受容体、凝集反応にはP2Y12受容体が大きな役割を担っている。申請者は、これらの受容体間でヘテロ多量体が形成され、P2Y12受容体の遮断がP2Y1受容体の機能を阻害することを報告した。P2Y12受容体の遮断薬であるクロピドグレルは敗血症の症状緩和に効果的であることが示唆されている。これらの事実から申請者は、敗血症病態におけるP2Y1-P2Y12受容体の分子動態及びヘテロ多量体形成阻害効果について明らかにし、ヘテロ多量体を標的とした敗血症治療創薬の新たな突破口を開くことを目的として本研究に着手した。申請者はまず、敗血症病態における血小板膜上のP2Y1受容体、P2Y12受容体についての基礎的データを得るため、多くの血小板研究で代替材料として用いられている血小板前駆体巨核芽球由来培養細胞MEG-01を利用することにした。本細胞に敗血症様刺激を施し、P2Y1受容体とP2Y12受容体の発現量について解析したところ、特筆すべき変化を見出した。敗血症においてこれらの受容体の直接的な変化がDIC発症の引き金となることが示唆された。当初は血小板の代替細胞として血小板前駆体巨核球由来培養細胞HYT-1を用いることを計画していた。しかし培養及び入手の困難さからかHYT-1細胞に関する研究報告は少なく、より知見の多いMEG-01細胞に切り替えた。早い段階で細胞の切り替えを決断したことで今後の研究のための重要な第一段階となるP2Y1受容体、P2Y12受容体のMEG-01細胞における基礎的データをとることができた。敗血症は、高齢者人口の増加、悪性腫瘍や移植時の化学療法などによる免疫機能の低下、多剤耐性菌の出現などにより、現在においてもなお高い死亡率を有している。2016年に敗血症は「感染に対する制御不能な宿主反応による生命に関わる臓器不全」と再定義され、敗血症性ショックや多臓器不全への進展を回避するための時宜を得た治療法を見出すことが現在救命救急領域で求められているニーズである。敗血症では播種性血管内凝固(DIC: Disseminated Intracellular Coagulation)の臨床症状が出現すると予後不良となり、その致死率は50%を超えるため、臨床症状がない時点でいかにDICの発症を予防するかが重要な課題となっている。DICを引き起こす血小板には種々の受容体が発現しているが、そのうち血小板活性化にはP2Y1受容体、凝集反応にはP2Y12受容体が大きな役割を担っている。申請者は、これらの受容体間でヘテロ多量体が形成され、シグナル伝達に相互作用があることを報告した。

代表的な抗血小板薬クロピドグレルはP2Y12受容体の遮断薬であるが、敗血症の症状緩和にも効果的であることが示唆されている。申請者はこれらより、本研究において敗血症病態におけるP2Y1-P2Y12受容体の関係について明らかにし、ヘテロ多量体を標的とした敗血症治療創薬の新たな突破口を開くことを目的とした。侵襲的にヒト血小板を入手するには困難があるので、代替材料として多数の論文で使用実績があるヒト血小板前駆体巨核芽球由来培養細胞MEG-01を利用することにした。本細胞に敗血症様刺激を施し、P2Y1受容体とP2Y12受容体の発現量について基礎的データを得た。また高グルコース刺激、インターフェロンガンマ刺激、更に抗血小板薬であるシロスタゾールにこれらの受容体発現制御作用があることを見出した。糖尿病を模した高グルコース刺激によって血小板におけるP2Y12受容体発現量が制御される経路が昨年8月に発表された(Circulation.136:817-833)。よって本経路についてヒト血小板前駆体巨核芽球由来培養細胞MEG-01を用いて追試したところ、文献通り高グルコース刺激でP2Y12受容体のmRNA発現量が増加し、NFkB阻害薬によって有意に抑制されるとの再現を得た。また所属研究室において研究実績が蓄積されており、抗血小板薬プレタールとして広く繁用されているシロスタゾールによってもP2Y12受容体発現について有意に変化がもたらされるという大変興味深い結果を得た。P2Y1受容体の発現制御に関しては現在に至るまで報告は少なく、血小板及びその関連細胞においては全く報告がない。他の細胞種では、ケラチノサイトにおいてインターフェロンガンマ刺激がその発現を増加させることが報告されている(J Invest Dermatol 127, 660-7)。ヒト血小板前駆体巨核芽球由来培養細胞MEG-01を用いてこれについて検討したところ、ケラチノサイトと同様にその刺激によりP2Y1受容体発現量が上昇するという世界初の知見を得た。インターフェロンガンマは敗血症を増悪させる因子として知られており、播種性血管内凝固における血小板P2Y1受容体の役割を初めて明らかにできる糸口となる可能性がある。よって当初の計画に加えて新規の発現制御経路を見出すことができたので、当初の計画以上に進展していると判断した。細菌感染から組織や臓器が障害されると敗血症が引き起こされる。多くの場合、肺微小血管内皮細胞の炎症や尿路感染症、皮膚および腸管の感染と関係しており、主な細菌としてブドウ球菌、大腸菌、連鎖球菌等が挙げられる。近年、敗血症は「感染に対する制御不能な宿主反応による生命に関わる臓器不全」と再定義され、ショックや多臓器不全への進展を回避するための治療法の開発が特に救命救急領域で求められているニーズである。疾患の進行過程で播種性血管内凝固(DIC: Disseminated Intracellular Coagulation)のが出現すると極めて予後不良となり、致死率は50%を超えるため、DIC発症の予防が重要な課題となっている。DIC発症に関与する血小板には種々の受容体が発現しているが、血小板活性化にはP2Y1受容体、凝集反応にはP2Y12受容体のP2Yサブファミリーが大きな役割を担っている。これまでに申請者は、これら2種の受容体間に相互作用があり、ヘテロ多量体が形成されることを報告した。