hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
犬小腸および結腸粘膜下組織を用いた無神経再生腸管への神経節細胞移植

本年度の研究結果は以下のごとくである。前年度の研究では、Thiry-Vellaループを作成後、2週間のプラスチックチューブの留犀では内腔の閉塞を来たした。そのため、新たにビーグル犬5頭を用いて犬結腸のThiry-Vellaループを作成し、同時に小腸を用いてBadylakらの方法にて小腸粘膜下組織を採取した。この採取した小腸粘膜下組織(SIS)を4層にして内部にプラスチックチューブを挿入して長さ5cmのSISチューブとして両端は4-0吸収糸にてそれぞれチューブに固定し、Thiry-Vellaループの結腸を切断してSISチューブを間置し、SISチューブとThiry-Vellaルループの結腸断端とは全層にて吻合した。SISチューブが問置したThiry-Vellaループは口側と肛門側をストーマとして固定し、SISチューブの部分は腹壁の腹膜をシート状にデザインして腹膜で被覆した。被覆したSISチューブと壁側腹膜間に腸管組織からトリプシン・コラゲナーゼ法で分離したものをPBS液に浮遊させた神経節細胞・平滑筋細胞を移植した。閉腹し、抗生物質を1週間投与し、経口摂取は翌日から開始し、実験動物を管理する。Thiry-Vellaループを3日に1回、生理食塩水で洗浄し、内腔のPatencyを保持し、2週間後、プラスチックチューブを抜去し、その後2週間に1回、内視鏡にてSISチューブの内側を観察した。モデル作成後全例、生存した。モデル作成の後、一ヶ月後にプラスチックチューブを抜去したが、3頭でSISチューブと結腸とID縫合不全を生じ、2例は7日後に内腔が閉塞し、本実験では内腔が保てないと判断した。そこで、Wistar系ラット4頭を用いて、エーテル麻酔下で開腹し、横行結腸2cmを用いてThiry-Vellaループを作成した。同時に小腸を5cm切除し、切除した小腸より粘膜下組織を採取し、小腸粘膜下組織を2層にして、内腔に8Frサイズのプラメチックチューブを挿入し、長さ1cmのSISチューブを作成した。現在、ラットのThiry-Vellaループの切断後にSISチューブとの吻合を行い、ラットでのモデル作成中である。ビーグル犬10頭を用いて全身麻酔下に開腹し、犬結腸を後腹膜より受動し、横行結腸の8cmのThiry-Vellaループを作成し、同時に小腸を用いてBadylakらの方法^<1)>にて小腸粘膜下組織を採取した。この採取した小腸粘膜下組織(SIS)を4層にして内部にプラスチックチューブを挿入して長さ5cmのSISチューブとして両端は4-0吸収糸にてそれぞれチューブに固定し、Thiry-Vellaループの結腸を切断してSISチューブを間置し、SISチューブとThiry-Vellaループの結腸断端とは全層にて吻合した。SISチューブが間置したThiry-Vellaループは口側と肛門側をストーマとして固定し、SISチューブの部分は腹壁の腹膜をシート状にデザインして腹膜で被覆した。モデル作成後、全例、生存した。モデル作成の後、2週間後にプラスチックチューブを抜去して36日後に内腔が閉塞し、本実験では内腔が保てないと判断し、現在、プラスチックチューブの留置期間を1ヶ月に延長して検討を行っている。前年度の研究では、Thiry-Vellaループを作成後、2週間のプラスチックチューブの留置では内腔の閉塞を来たした。

モデル作成後、全例、生存した。モデル作成の後、一ヶ月後にプラスチックチューブを抜去したが、3頭でSISチューブと結腸との縫合不全を生じ、2例は7日後に内腔が閉塞し、本実験では内腔が保てないと判断した。そこで、Wistar系ラット4頭を用いて、エーテル麻酔下で開腹し、横行結腸2cmを用いてThiry-Vellaループを作成した。同時に小腸を5cm切除し、切除した小腸より粘膜下組織を採取し、小腸膜下組織を2層にして、内腔に8Frサイズのプラスチックチューブを挿入し、長さ1cmのSISチューブを作成した。現在、ラットのThiry-Vellaループの切断後にSISチューブとの吻合を行い、ラットでのモデル作成中である。本年度の研究結果は以下のごとくである。前年度の研究では、Thiry-Vellaループを作成後、2週間のプラスチックチューブの留犀では内腔の閉塞を来たした。そのため、新たにビーグル犬5頭を用いて犬結腸のThiry-Vellaループを作成し、同時に小腸を用いてBadylakらの方法にて小腸粘膜下組織を採取した。この採取した小腸粘膜下組織(SIS)を4層にして内部にプラスチックチューブを挿入して長さ5cmのSISチューブとして両端は4-0吸収糸にてそれぞれチューブに固定し、Thiry-Vellaループの結腸を切断してSISチューブを間置し、SISチューブとThiry-Vellaルループの結腸断端とは全層にて吻合した。SISチューブが問置したThiry-Vellaループは口側と肛門側をストーマとして固定し、SISチューブの部分は腹壁の腹膜をシート状にデザインして腹膜で被覆した。被覆したSISチューブと壁側腹膜間に腸管組織からトリプシン・コラゲナーゼ法で分離したものをPBS液に浮遊させた神経節細胞・平滑筋細胞を移植した。閉腹し、抗生物質を1週間投与し、経口摂取は翌日から開始し、実験動物を管理する。Thiry-Vellaループを3日に1回、生理食塩水で洗浄し、内腔のPatencyを保持し、2週間後、プラスチックチューブを抜去し、その後2週間に1回、内視鏡にてSISチューブの内側を観察した。モデル作成後全例、生存した。モデル作成の後、一ヶ月後にプラスチックチューブを抜去したが、3頭でSISチューブと結腸とID縫合不全を生じ、2例は7日後に内腔が閉塞し、本実験では内腔が保てないと判断した。同時に小腸を5cm切除し、切除した小腸より粘膜下組織を採取し、小腸粘膜下組織を2層にして、内腔に8Frサイズのプラメチックチューブを挿入し、長さ1cmのSISチューブを作成した。
大自由度系における階層的タイムスケールの力学的起源と内部自由度をもつハミルトン系

1.内部振動の自由度をもつ1次元格子振動系,さらには,回転自由度をもつ2次元力学系を考え,系のエルゴード性と混合性が内部自由度の存在によっていかに影響を受けるか,という問題を調べた.この結果,内部自由度があるハミルトン系では,モデルの詳細にあまりよらず適当な条件下では,遅い緩和が現れ得ること,とくに,モードエネルギーのパワースペクトルにベキ的成分が現れることが確認された.これは,ハミルトン系における摂動論を用いた予言(Boltzmann-Jeans予想)を支持する結果である.2.剛体球モデルで見られる遅い緩和の起源を,ハミルトン力学系の遅い緩和の問題としてどのように理解すべきか?という視点から,2次元,および3次元剛体球モデルのシミュレーションを行った.とくに,系に存在する2種類の周期軌道,すなわち,(1)平行な辺で反射を繰り返す,いわゆるball bouncing mode,(2)2つの球がすれ違うボトルネックに存在する周期軌道,が緩和過程にいかなる影響を及ぼすかについて検討した。その結果,前者については,位相空間に占めるbouncing ball modeの次元が剛体球の数が増大すると共に相対的に低くなることからその影響力が小さくなることを明らかにし,また,後者については,緩和の速度を遅らせる効果はあるものの,緩和の関数型を指数関数的なものからずらす効果はないことを見出した。まず最も単純なモデルとして,内部振動の自由度をもつ1次元格子振動系,さらには,回転自由度をもつ2次元力学系を考え,系のエルゴード性と混合性が内部自由度の存在によっていかに影響を受けるか,という問題を調べた.力学系理論,特にハミルトン力学系の摂動論の立場から,内部自由度をもつハミルトン系における遅い緩和(相関関数が代数的,さもなければ,引き延ばされた指数関数型にしか減衰しないタイプの緩和)発生の基本的な機構を探ることが目的であった.この結果,内部自由度があるハミルトン系では,モデルの詳細にあまりよらず適当な条件下では,遅い緩和が現れ得ること,とくに,モードエネルギーのパワースペクトルにベキ的成分が現れることが確認された.これは,ハミルトン系における摂動論を用いた予言を支持する結果である.遅い緩和にの自由度依存性などについては,大規模の計算を要するため現在計算を継続中である.それと並行して,現実的な分子・分子集団系における遅い緩和の起源を調べる目的で,液相状態にある水のダイナミクスの分子動力学計算を行った.分子動力学計算の利点をフルに活用して,実際の分子のもつ質量,ポテンシャル,結合の角度などを可変なパラメータとみなし,さまざまな仮想的分子に対するシュミレーションを行い,誘電緩和,ラマンスペクトルなど実験的に観測可能な諸量を計算すると共に,瞬間基準振動解析などダイナミクスのより詳細な性質をモニターし,われわれの考える遅い緩和のシナリオと矛盾しないことを確認し,本研究の基礎固めを行った.大自由度ハミルトン力学系における遅い緩和の起源を,系の内部自由度の存在,という観点から調べることが本研究の主たる目的であるが,本年度は,その問題をより明確に切り出すために,剛体球モデルにおける遅い緩和発生の起源の研究を開始した.近年,2種の大きさをもつ剛体球モデルにおいて,ガラス転移現象が起こることが計算機上で発見され,ガラス転移のミニマルモデルとして研究が盛んになされている.われわれは,剛体球モデルで見られる遅い緩和の起源を,ハミルトン力学系の遅い緩和の問題としてどのように理解すべきか?という視点から,2次元,および3次元剛体球モデルのシミュレーションを行った.厳密な証明は与えられていないものの,円筒状の障害物がある一体のビリヤード問題(シナイのビリヤード系)と同様に剛体球モデルはエルゴード性を満たし,かつ,一様双曲性をもつことが期待される.したがって,昨年度考察した,ソフトなポテンシャルをもつ系のように,系の(近似的)保存量が存在することにより遅い緩和が発生することはあり得ず,異なる理由を考察する必要がある.本年度は,まず,数個(25個程度)の剛体球系の相転移を詳しく調べた.

とくに2次元の剛体球系では,剛体球の個数が2個の場合とそれ以上の場合とでは,エルゴード成分の分離のされ方に定性的な相違があることが明らかになり,力学系としての性質を詳しくしらべた.また,系のシステムサイズが大きい際のシミュレーションも実行し,固液の相転移点の近傍で長時間の緩和現象を発見し,そのシステムサイズ依存性などをしらべた.本年度の目的は,箱の中を運動する2つの剛体球系を調べることにより,力学系理論の観点からガラスにおける遅い緩和過程を理解するための足がかりをつくることであった。2つの剛体球系は,適当な条件下での系のエルゴード性が厳密に証明され,多体ハミルトン系として最も単純な力学系であり,さらには,Awazuにより,ガラスの動力学を特徴づける引き伸ばされた指数型緩和が見られることが報告された系でもある。ここでは,この系の緩和過程に影響を及ぼすことが期待される不変構造の候補として,系に存在する2種類の周期軌道,すなわち,(1)平行な辺で反射を繰り返す,いわゆるball bouncing mode,(2)2つの球がすれ違うボトルネックに存在する周期軌道,が緩和過程にいかなる影響を及ぼすかについて検討した。前者は,1体のビリヤード系において代数的な緩和を発生させる原因となるものであり,後者は,高次元の遷移状態として最近研究の進んでいる「法双曲多様体」に対応するものである。その結果,前者については,位相空間に占めるbouncing ball modeの次元が剛体球の数が増大すると共に相対的に低くなることからその影響力が小さくなることを明らかにし,また,後者については,緩和の速度を遅らせる効果はあるものの,緩和の関数型を指数関数的なものからずらす効果はないことを見出した。以上の考察をもとに,配置に関する相関関数を計算し,ガラスと類似の2段階緩和を見出す一方,遅い運動に対応する緩和も指数関数的なものでしかないことを示した。
固形腫瘍治療薬としての血管標的薬剤の意義に関する研究

休止期(Q)腫瘍細胞に対する血管標的薬剤の効果を、殺細胞効果を有する放射線照射や抗癌剤投与等との併用も加味して、すでに我々によって確立された、細胞の増殖死と密接に関連する微小核出現頻度と5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)の連続投与によるQ腫瘍細胞の同定とを結合した、選択的にQ腫瘍細胞反応を検出する手法を用いる事によって評価し、固形腫瘍に対する総合的な分析を行なってきた。その結果、血管標的薬剤併用による中性子捕捉化合物、特にBorocaptate-^<10>B(BSH)からの硼素-10の腫瘍内分布、特にQ腫瘍細胞への分布の向上が認められ、中性子捕捉化合物使用後の熱中性子線照射による全腫瘍細胞とQ腫瘍細胞との感受性の拡大をある程度縮小できる可能性が示唆された。更には、低酸素細胞分画の大きなQ腫瘍細胞を効率よく殺す低酸素細胞毒の生体還元物質の効果は、血管標的薬剤との併用によって、さらに増強でき、この血管標的薬剤併用による増強効果が腫瘍細胞のp53 Statusにも依存しないことも明らかになった。他方、生体還元物質の投与を、従来の担腫瘍マウスへの腹腔内投与ではなく、浸透圧ポンプを用いた皮下持続投与で施行するとかなり効果的であり、特に急性低酸素領域の大きな細胞集団の制御にこの手法が効果的である事が明らかになった。以上より、腫瘍内の低酸素細胞集団に対しては、一般的にTirapazamineなどの生体還元物質の投与が効果的であり、その中でも腫瘍血管から遠い為にほぼ決まった部位にほぼ恒常的に存在するとされる慢性低酸素領域の大きな腫瘍に対しては、以前の我々の研究成果より低温度温熱処置との併用が有効であった。他方、腫瘍血管のスパスムスが原因となって腫瘍内のさまざまな部位に一時的に生ずるとされる急性低酸素領域の大きな腫瘍に対しては、生体還元物質の持続的皮下投与が効果的である事が今回新たに明らかとなった。以上の生体還元物質の特性を生かし、従来の中性子捕捉化合物では硼素-10を分布させることが非常に困難である腫瘍内低酸素領域にある程度指向性を有した新規の化合物(生体還元物質硼素-10キャリアー)の開発に関しても、現在候補化合物が絞られつつある(TX-2100など)状況である。休止期(Q)腫瘍細胞に対する血管標的薬剤の効果を、殺腫瘍細胞効果を有する放射線照射や抗癌剤投与等との併用も加味して、すでに我々によって確立された、細胞の増殖死と密接に関連する微小核またはアポトーシスの出現頻度と5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)の連続投与によるQ腫瘍細胞の同定とを結合した、選択的にQ腫瘍細胞反応を検出する手法を用いることによって評価し、固形腫瘍に対する総合的な分析を行う事を目的とする。これまでの我々の研究より明らかになったが、低酸素細胞分画の大きなQ腫瘍細胞を効率よく殺すことのできる低酸素細胞毒の生体還元物質の投与との併用による効果の分析、さらに研究代表者の所属部局で施行中の中性子捕捉療法への応用に向け、血管標的薬剤併用による中性子捕捉化合物の腫瘍内分布向上に関する分析なども世界でほぼ初めての試みとして行ってみた。

その結果、低酸素細胞毒であるTirapazamineや新規の低酸素細胞毒であるTX-402の殺腫瘍細胞効果は、血管標的薬剤の併用によって増強される事、中性子捕捉化合物、特にBSHの腫瘍内分布が血管標的薬剤の併用によって改善され、化合物投与による腫瘍内増殖期(P)細胞とQ腫瘍細胞との感受性の差もある程度減少させ得る事が明らかになった。また付随的にではあるが、TirapazamineやTX-402などの低酸素細胞毒の連続的投与が、腫瘍内の急性低酸素細胞分画に対して効果的に作用し、それらによる殺腫瘍細胞効果を増強させる事も明らかになった。次年度は、血管標的薬剤による効果や低酸素細胞毒の連続的投与による効果のp53 Status依存性、放射線の分割照射や抗癌剤投与時に血管標的薬剤を併用する場合の効果的順序などを検討したい。休止期(Q)腫瘍細胞に対する血管標的薬剤の効果を、殺細胞効果を有する放射線照射や抗癌剤投与等との併用も加味して、すでに我々によって確立された、細胞の増殖死と密接に関連する微小核出現頻度と5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)の連続投与によるQ腫瘍細胞の同定とを結合した、選択的にQ腫瘍細胞反応を検出する手法を用いる事によって評価し、固形腫瘍に対する総合的な分析を行なってきた。その結果、血管標的薬剤併用による中性子捕捉化合物、特にBorocaptate-10B(BSH)からの硼素-10の腫瘍内分布、特にQ腫瘍細胞への分布の向上が認められ、中性子捕捉化合物使用後の熱中性子線照射による全腫瘍細胞とQ腫瘍細胞との感受性の拡大をある程度縮小できる可能性が示唆された。更には、低酸素細胞分画の大きなQ腫瘍細胞を効率よく殺す低酸素細胞毒の生体還元物質の効果は、血管標的薬剤との併用によって、さらに増強でき、この血管標的薬剤併用による増強効果が腫瘍細胞のp53 Statusにも依存しないことも明らかになった。他方、生体還元物質の投与を、従来の担腫瘍マウスへの腹腔内投与ではなく、浸透圧ポンプを用いた皮下持続投与で施行するとかなり効果的であり、特に急性低酸素領域の大きな細胞集団の制御にこの手法が効果的である事が明らかになった。以上より、腫瘍内の低酸素細胞集団に対しては、概してTirapazamineなどの生体還元物質の投与が効果的であり、その中でも腫瘍血管から遠い為にほぼ決まった部位にほぼ恒常的に存在するとされる慢性低酸素領域の大きな腫瘍に対しては、以前の我々の研究より低温度温熱処置との併用が有効であり、他方、腫瘍血管のスパスムスが原因となって腫瘍内のさまざまな部位に一時的に生ずる急性低酸素領域の大きな腫瘍に対しては、生体還元物質の持続投与が効果的である事が明らかとなった。付随的にではあるが、この生体還元物質の特性を生かし、従来の中性子捕捉化合物では硼素-10を分布させることが非常に困難である腫瘍内低酸素領域にある程度指向性を有した新規の化合物(生体還元物質硼素-10キャリアー)の開発に関しても、ある程度候補化合物が絞られつつある(TX-2100など)。
抗ガン剤生合成マシナリーの再構築および多様性創出機構の解明

東北大五味教授との共同研究として5種のベクターが使用可能な栄養要求性麹菌変異株を用いた異種遺伝子発現系を活用した糸状菌由来の生物活性物質の全生合成を検討した。その過程で、遺伝子導入を短縮し、かつ限られたベクター数の効率の良い使用が問題となったが、一挙に4個の遺伝子を導入する(Tandem法)を考案し、化合物種に関係なく遺伝子数4-17個を使って、構造の複雑な天然物が自在に合成できるシステムを開発した。このほか抗腫瘍性物質や抗生物質を含む放線菌由来の骨格構築酵素の機能解析や構造多様化に向けたハイブリッド酵素系の開発を検討した。その結果、生合成酵素の複合体の精妙な制御系を見出した。既に我々はサフラマイシンの生合成酵素SfmCが、チロシン誘導体と単純な鎖状アルデヒドから7段階の反応を触媒し、一挙に5環性のテトラヒドロイソキノリン骨格を合成することを見出した。そこでアルデヒド側基質の合成アナログとのSfmCによる酵素反応を検討し、様々な誘導体さらには臨床用抗ガン剤エクチナサイジン(ET)と同じものを調製するための第一歩として以下の検討を行った。今回、サフラマイシンと構造が近縁の放線菌Streptomyces griseoplanus SF-1739由来の複雑な6環性構造を有する抗腫瘍性物質シアノサイクリン、および放線菌Streptomyces melanovinaceusの生産する比較的単純な構造を有するキノカルシンの生合成遺伝子クラスターを同定すべく、ゲノムDNAを調製後、シーケンス解析を行った。次いで得られたデータのバイオインフォマティクス解析により、目的とするペプチド合成酵素候補を見出した。今回扱った二種の天然物に共通する窒素含有ヘテロ環を供給するアミノ酸を同定すべく、cya16の大量発現、酵素反応を行い、アルギニンが酸化された前駆体を得た。この実験結果を基にサフラマイシンの生合成酵素SfmCの反応機構を参照にして、シアノサイクリンの合理的な骨格構築機構を提唱した。さらにSfmCに関しては、アルデヒド側基質の合成アナログを用いた酵素反応を行い、基質アナログの受容能に関する知見を得た。東北大五味教授との共同研究として5種のベクターが使用可能な栄養要求性麹菌変異株を用いた異種遺伝子発現系を活用し、DNAポリメラーゼα特異的阻害剤アフィディコリンの効率的生産(130mg/L相当)を達成した。糸状菌は生物活性物質の宝庫であるが、一般に物質生産に必要な遺伝子数は10個以下であり、今回の成功はこうした多くの物質を麹菌で生産できる方法論を提供したことになる。天然物にはポリエーテルと呼ばれる化合物群があるが、その代表的化合物ラサロシドの骨格合成を担う鍵酵素であるエポキシド加水分解酵素Lsd19とその不安定な基質との複合体のX線結晶構造解析に成功した。これにより2組の酸性アミノ酸残基が関与する詳細な触媒機構が明らかにされた。このほか関連するモネンシン型ポリエーテルのエポキド加水分解酵素MonBI,BIIの触媒反応の詳細な解析により、従来の酵素には見られない弱い相互作用を介した精妙な触媒作用が明らかになった。これらエポキシド加水分解酵素は基質特異性が低いことが判っており、今後多様なポリエーテル合成への活用が期待される。テルペンは重要な天然物の一群であるが、この構造多様性をさらに増やすと予想される酵素の触媒機構が、問題の酵素の立体構造から明らかになった。この酵素はテルペンの普遍的前駆体であるゲラニル二リン酸(C10)の二重結合をメチル化する酵素であり、その触媒部位にはこうしたメチル基転移酵素には稀なMg2+イオンを保持するアミノ酸残基を介したピロリン酸認識部位が存在した。昨年度解析したキノカルシン(QCN)の非リボソーム依存ペプチド合成酵素(NRPS)の機能解析に続いて、シアノサイクリン(CYA)NRPSの機能解析を行い、QCNの場合と同様、補助タンパクCya16は、2種のNRPS, Cya17/Cya19と複合体を形成して活性を示すことがわかった。また三者複合体は、dehydroarginineに比べ、芳香族アミノ酸3-hydroxytyrosineや修飾チロシン誘導体を優先的に(510倍)活性化することから、基質のサイズに対応して、鎖状アルデヒドと二環性アルデヒドの二種の基質を使い分けるなど複雑な機構で多環性骨格を構築することを突き止めた。機能解析が終了したことから、宿主で生合成マシナリーの再構築を試みているが、最終産物の毒性のためか、現在までのところ成功していない。ポリエーテル系抗生物質モネンシンの生合成において、その特徴的な環状ポリエーテル環の骨格構築にはMonBI、BIIの二種の酵素が必須である。

本酵素は4回の環化を触媒するが、一段階目、二段階目のエーテル環構築が両酵素の存在下でのみ進行する理由を調べた。両酵素が弱いながらヘテロ二量体を形成することを、native MSや表面プラズモン共鳴、さらにはX線結晶構造解析を使って証明した。これにより未解明だった多環性ポリエーテルの構築機構に有力な説を提唱できた。新学術領域研究が始まって、生産菌の遺伝子群を操作の容易な宿主に移し、標的化合物を収量良く生産する方法論の開発を行なっている。その一環としてポリケタイド型代謝産物の合成を検討した。成功例の少ない糸状菌由来ポリケタイド合成酵素(PKS)-NRPSのハイブリッド酵素遺伝子の発現に挑戦し、アクチン重合阻害剤サイトチャラシンの骨格合成に成功した。また特異な連続シクロプロパン構造を持つ抗真菌剤Jawsamycinの遺伝子クラスターを同定し、3種の酵素複合体の精妙な制御により骨格構築されることを見出した。インドールジテルペンaflatremの全生合成には、7個の遺伝子が必要と予想された。遺伝子導入を短縮し、かつ限られたベクター数を効率良く使用するため、一つに2個ずつ遺伝子を組み込んだ同種のベクター2個を用いて、一度の形質転換で合計4個の遺伝子を導入する手法を開発した。最初の4個の導入でpaspalineの生産に成功した。さらに修飾酵素3個を導入することで、一挙に全生合成することに成功した。本手法を適用し、さらに複雑な天然物であるpenitremを全生合成することにした。当初のゲノム解析結果から17個が必要であることがわかった。上記paspaline生産株に、修飾酵素遺伝子2個を導入したところ、paxillineが生産された。次に野生株に遺伝子4種の導入を種々試したところ、paxillineの投与により、還元;プレニル化;脱水が進行した化合物が単離された。残る7種の酸化酵素とプレニル化酵素を色々な組み合わせで試して、最終的に生合成経路を確定すると同時にpenitrem Aの生合成を達成した。これまでに報告された糸状菌天然物に関与する最大の生合成酵素遺伝子数は、aflatoxinの17個であり、それと同数が必要なpenitremを全生合成に生合成に成功したことより、理論上あらゆる糸状菌由来の代謝産物が、麹菌異種発現法で合成できることになる。さらに本法の有用性を実証するため、ポリケタイド系植物毒素であるbetaenoneの合成を行った。ゲノム解析データから推定した遺伝子クラスターに存在するポリケタイド合成酵素(PKS)、エノイル還元酵素、P450水酸化酵素の各遺伝子を導入したところ、鎖状中間体が環化し、さらに一挙に3段階の酸化が進行したbetaenone Bの全合成に成功した。以上のように、麹菌異種発現法は、生合成経路の解明および物質生産に有用であることを実証した。抗腫瘍性物質シアノサイクリン、キノカルシン生合成遺伝子の機能解析を行ない、以下の結果を得た。1)酸化酵素Cya16,Qcn18を大量発現およびそれを用いたin vitroの解析から、これまで未同定であった4番目の構成単位となる非タンパク性アミノ酸をL-dehydroarginineと決定した;2)骨格を構築するペプチド合成酵素が、補助タンパクQcn16の存在下でのみ、良好に発現可溶化することを突き止めた;
紫外線による表皮細胞の易感受性に関する研究

当該研究期間の実績の概要は下記の通りである1)人工表皮水疱作製器を用いて、正常成人10名とループスエリテマトーデス(LE)患者6名より無血清培地による表皮細胞の培養に成功した。2)中波長紫外線(UVB)による培養表皮細胞への毒性を検討したところ,50mJ/cm^2, 100mJ/cm^2で、有意に高い毒性がLE患者でみとめられた。3) UVBによる培養表皮細胞の易感受性を検討した。LE患者培養表皮細胞では正常人に比べてU_1RNPやSS-A/Ro抗原の発現が有意に高く、in vitroでの易感受性が確認された。4)共焦点レーザー顕微鏡で細胞表面あるいは細胞質へのU_1RNPやSS-A/Ro抗原の発現が確認された。5)アポトーシス誘導は、正常人とLEでは差がみられなかった。6)UVBによる表皮細胞毒性や易感受性は、サンスクリーン剤により制御できた。7)サイトカインの影響をみたところETAFが易感受性を増強した。以上より、in vitroの系でUVBによる易感受性を検出する方法を樹立した。この系を用いることにより表皮細胞のUVB易感受性ひいては光線過敏性や発癌との関係を研究することが可能となった。本年度の研究実績の概要は下記の通りである。1)人工表皮水疱作製器を用いて、正常成人10名とループス・エリテマトーデス(LE)患者6名より、無血清培地による表皮細胞の培養に成功した。2)中波長紫外線による培養表皮細胞への毒性を試たところ、50mJ/cm^2,100mJ/cm^2で、有意に高い毒性がLE患者でみとめられた。3)中波長紫外線による培養表皮細胞の易感受性を検討した。LE患者培養表皮細胞では、正常人に比べてU_1RNPやSS-A/Ro抗原の発現が有意に高く、in vitroでの易感受性が確認された。4)共焦点レーザー顕微鏡で、表面膜あるいは細胞質へのU_1RNPやSS-A/Roの発現が確認された。5)アポトーシス誘導は、正常人とLE患者では差をみとめなかった。以上の知見をもとに、次年度は、サイトカイン等の影響を検討する。1.正常ヒト表皮細胞を得て,無血清培地で継代培養した。中波長紫外線を50mJ/cm^2あるいは100mJ/cm^2単回照射することにより,細胞表面への核あるいは細胞質内成分とされるSS-A/Ro抗原発現を誘導した。2.上記の系に,di-(p-methoxycinnamoyloxy)-mono-(2'-ethylhexanoylovy)propane(以下サンスクリーン)を用いることにより,SS-A/Ro抗原の発現は2030%(培養細胞数あたりのパーセント)から5%前後に低下した。以上の知見は,ヒト表皮細胞の紫外線特に中波長紫外線による易感受性がサンスクリーン剤やある種のサイトカインで制御できることを示したin vitroの結果である。In vivoにおける表皮と紫外線易感受性ひいては光線過敏症や光発癌との関係あるいはそのコントロールに示唆を与えるものである。
抗偏性嫌気性菌剤徐放性高分子材料による高齢者根面ウ蝕予防

高齢化が進む現在、歯根露出に継発する根面ウ蝕の増加が憂慮されている。そこで本研究は、歯牙を切削することなく健全露出歯根面を被覆・保護して根面ウ蝕を予防する抗菌性を持つ低粘性歯質接着材料ならびに二次ウ蝕発生抑止効果を期待する抗菌性根面ウ蝕修復材料の開発を目標に計画され、検討が行なわれた。【材料】歯垢およびウ蝕象牙質の全菌に対して確実な抗菌性を有する高分子材料を開発するため、根面被覆用の試作光重合型低粘性レジンに、歯垢およびウ蝕象牙質を構成する細菌の圧倒的多数を占める偏性嫌気性菌に対し優れた殺菌効果を有するメトロニダゾール、さらに偏性嫌気性菌以外の菌にも抗菌性を有するケフラールおびシプロフロキサシンの3種の薬剤を加えた抗菌性低粘性レジンを試作した。また、歯質接着性を有しなお、反応硬化体自体にフッ素徐放性があり周囲歯質の二次ウ蝕予防効果に有効であると考えられる光硬化型グラスアイオノマーセメント(GIC)に注目し、本セメント粉末中に抗菌剤を添加した抗菌性GICを試作した。【細菌学的検討および物性試験】歯垢またはウ蝕象牙質より採取した細菌を接種したBHI寒天平板上に試作材料の硬化試片をおいて培養し、形成された阻止円の直径を測定することで材料の抗菌性を検討した。その結果、2つの試作材料の抗菌性は共に以前当教室で報告したメトロニダゾールのみを添加した試作高分子材料のそれに較べ優れていることが確認された。しかしながら,抗菌性レジンはレジンに抗菌剤を添加した時点から光照射までの保存期間が長くなるにしたがい、十分な光照射量にも関わらずかなりの未硬化反応部分が認められ、また一方GICは抗菌剤の添加により圧縮強度の低下と溶解性の増加が確認されるため、これら材料の臨床応用のために一層の改良を加え、根面ウ蝕予防効果の検討を行っている。
外来機能の強化による医療関連感染予防のための連携システム開発と評価

地域の医療安全体制の整備のために、外来部門での医療関連感染と予防対策を評価した。A県3病院の外来職員(医療職と非医療職)428人を対象に、麻疹などの抗体価測定と感染予防行動などに関する質問紙調査を実施した。ワクチン接種の重要性が理解できる教育・啓発が必要と明らかになった。全国の医療機関1,369施設を対象に質問紙調査を実施した(回収率41.6%)。感染対策を要した感染症は、インフルエンザ(84.7%)、結核(75.4%)であった。マスクや手袋などは十分に整備されていたが、陰圧室や採痰ブースを有するのは34.1/ 31.3%であった。外来部門の感染対策には、改善の余地があると明らかになった。研究協力施設の追加申請等のため,名古屋市立大学看護学部研究倫理委員会の承認を得た(平成25年9月,ID13015-2).新研究協力施設C施設での倫理審査会の承認および理事長の許可を得て研究を実施した.これまでVIDASにより麻疹・風疹等の抗体価を測定していたが,麻疹キットのみ2013年春から販売中止となっている.このため,血清32検体の麻疹抗体価をPA法及びEIA「生研」法で測定し,VIDASによる解析済みの結果と比較検討をした.この結果,麻疹抗体に関しては,EIA(計算値)にて判定することとした.また,外来職員に対する質問紙を修正した.修正内容としては,既研究協力実施機関よりも外来で勤務している職種が多いために,その職務内容を追加した他,麻疹等の抗体価測定時期とワクチン接種時期が,就業してからなのか否かを判別可能にした.今回,研究を実施したC施設における外来職員の研究協力者は,104名(内訳:医療従事者;医師10名,歯科医師6名,看護職29名,薬剤師9名,臨床検査技師7名,診療放射線技師7名,歯科衛生士4名,理学療法士2名,歯科技工士1名,非医療従事者;事務職員13名,看護助手16名)であった.年代は,20代19.2%,30代32.7%,40代31.7%,50代14.4%,60代以上1.9%であった.男性24.0%,女性76.0%であった.抗体価の測定で,陰性/判定保留(免疫非獲得)であったのは,麻疹3.9%,風疹2.9%,水痘7.6%,流行性耳下腺炎5.7%,HBs25.0%であった.今回の抗体測定結果で免疫が非獲得と判明した場合,ワクチン接種をするかと問うと,受けない/分らないと回答した者が9.6%であった.また,これまでの抗体価測定結果やワクチン接種歴等の記録を保管している者は50%に留まっていた.今後,さらに施設別,職種別,年代等によって解析を進める予定である.医療の高度化や高齢患者の増加による日和見感染の増加,伝染力の強い感染症の流行など感染症をめぐる様相は急激に変化している.本研究の目的は,その医療機関だけでなく地域の医療安全管理体制の整備に向けた取り組みとして,外来機能の強化による医療関連感染が減少する地域全体の連携システムの継続・開発と評価を行うことである.外来機能の強化による医療関連感染の減少に向けた地域全体の連携システムの開発を継続・発展させ,さらに評価することである.今年度は,同一の医療圏にある2施設における外来職員324人の職種別(医師・看護師・薬剤師・臨床検査技師・診療放射線技師・受付職員・清掃職員)の感染予防行動,感染症に関する情報源(院内・院外)の質問紙調査のデータ解析を行った.医療職(n=254人)と非医療職(n=70人)別に感染予防行動を比較したところ統計学的に有意差があったのは,1業務開始時の手指衛生,2咳・くしゃみのある患者にマスクを渡す,3咳・くしゃみのある患者に手指消毒を指導する,4血液や汚物に接触時,手袋をする,5血液や汚物に接触後,手指衛生をする,6患者の感染症情報を対応前にチェックする,7感染制御室のHPをみる,8感染予防対策マニュアルを見る,であった.医療職と非医療職別で感染症に関する情報源で統計学的に有意差があったのは,1電子カルテ上のHP,2インターネットであった.外来勤務時に「免疫を獲得しておく,もしくはワクチン接種をしたほうが良い」と考えている感染症では,麻疹・風疹・水痘・流行性耳下腺炎・インフルエンザ・B型肝炎の全てで医療職と非医療職間に統計学的に有意差があった.以上のような結果を踏まえて,学会などで最新の情報収集に務めると共に,外来職員用の質問紙調査の精度を向上するよう共同研究者間で検討を行った.医療関係者は,ワクチンで予防可能な感染症に対して免疫を獲得することが推奨されている.免疫を獲得しないまま短時間に多数の人が交差する外来業務に携わることは,感染リスクが大きい.本研究の目的は,多職種で構成される外来職員のウイルス疾患の免疫獲得状況およびワクチン接種への考え方を併せて解析し,ワクチンプログラムの構築に向けた今後の課題を明らかにすることである.今年度は,3施設の外来職員428名(医療職329名,非医療職99名)の解析を進めた.本研究の測定による抗体陽性者は,医療職vs非医療職で解析すると,風疹とB型肝炎には有意差があった.

年齢別では,40歳未満と40歳以上の2群に分けて比較したところ,麻疹で有意差があった.本研究では,「外来勤務において免疫を持っているか,もしくはワクチン接種をした方がよい」と回答したのは麻疹,風疹,水痘,流行性耳下腺炎の4疾患において約7割に満たず,医療者として免疫を獲得しておくことの重要性が十分に理解されていなかった.更に,「免疫が出来ていなくてもワクチン接種をしない」と回答した者は54名で,全ての職種に存在していた.この54名中22名は4疾患いずれかの抗体陰性者もしくは判定保留であった.「免疫が出来ていなくてもワクチン接種をしない」と回答した理由は,「理由なし」が最も多く,ワクチン接種不適当者は5名(9.3%)のみであった.「理由なし」,「罹らないと思った」や「家族が罹患しても罹らなかった」との回答者には,丁寧なワクチン接種に向けた対策を実施する必要がある.医療関係者であっても,抗体検査結果を返却するのみではなく,個々の状況に応じて丁寧に説明しワクチン接種を推奨する重要性が明らかになった.医療の高度化や高齢患者の増加による日和見感染の増加、伝染力の強い感染症の流行など感染症をめぐる様相は急激に変化している。研究の目的は、地域の医療安全管理体制の整備に向けた取り組みとして、外来機能の強化による医療関連感染が減少する地域全体の連携システムの開発と評価を行うことである。最終年度の調査では、外来での感染対策上の工夫(感染症の症状・徴候に関する問診票の導入)などこれまでの成果を盛り込んで、感染管理認定看護師などの所属する全国の医療機関1,369施設の感染対策担当者に対して、職員のワクチン接種プログラムや感染管理の基本である標準予防策の実施・啓発および外来での感染対策の困難点などについて質問紙調査を実施した。569施設から回収された(回収率41.6%)。感染症指定医療機関の指定が163施設(28.6%)であり、診療報酬における感染対策防止加算1が464施設(81.5%)であった。医療従事者が勤務する上で、「免疫をもっている」もしくは「ワクチン接種を推奨する」とマニュアルで規定している感染症として、B型肝炎(96.5%)、インフルエンザ(91.0%)、続いて麻疹・風疹・水痘・流行性耳下腺炎(82.486.1%)であった。平成26年度に外来部門で特に感染対策を要した感染症・疑い(複数回答)は、インフルエンザ(84.7%)、結核(75.4%)、ノロウイルス感染症(58.7%)であった。外来での感染対策で苦労した事例が有ると46.4%が回答したが、9.8%は不明と回答し、外来での感染事例を把握できていないことが示唆された。外来の感染対策で難しいことでは、感染症患者を他の患者と引き離す場所の確保が困難(70.1%)と回答したのが最も多かった。外来受付において感染症の症状・徴候に関する問診票を導入していないと20.7%が回答しており、感染対策上の工夫の余地があると考えた。地域の医療安全体制の整備のために、外来部門での医療関連感染と予防対策を評価した。A県3病院の外来職員(医療職と非医療職)428人を対象に、麻疹などの抗体価測定と感染予防行動などに関する質問紙調査を実施した。ワクチン接種の重要性が理解できる教育・啓発が必要と明らかになった。全国の医療機関1,369施設を対象に質問紙調査を実施した(回収率41.6%)。感染対策を要した感染症は、インフルエンザ(84.7%)、結核(75.4%)であった。マスクや手袋などは十分に整備されていたが、陰圧室や採痰ブースを有するのは34.1/ 31.3%であった。外来部門の感染対策には、改善の余地があると明らかになった。外来多職種職員428名の職種別(医療職,非医療職),年代別(40歳未満,40歳以上)、性別,雇用形態別(常勤,非常勤)などの解析を進めることが出来たため.看護学
呼吸循環－筋運動リズム間位相シンクロ現象におけるテレオロジカル仮説の検証

本研究は,ヒトの呼吸循環ー筋運動リズム間の位相シンクロ現象に焦点をあて,位相シンクロが合目的性を持って生じるとする「テレオロジカル仮説」を実験的に検証することを目的とした。トレッドミル上で漸増傾斜歩行運動を行うことにより位相シンクロを誘導した。呼吸循環パラメータの挙動およびNIRSによる下肢筋組織酸素化ヘモグロビン濃度変化から位相シンクロの機能的意義を調査した。位相シンクロ発生時,分時換気量,酸素の換気当量,およびガス交換率が有意に低下し,筋組織の脱酸素化ヘモグロビン濃度が有意に増加した。これらの結果は位相シンクロが換気効率を向上させ,筋の好気的代謝を促進する効果があると推測された。身体には多くのリズム現象が存在し,相互作用によりリズム間の周波数や位相が同期するシンクロ現象が見られるがその機能的意義は不明であり,生理学的実証はほとんどなされていない。本研究では,ヒトの呼吸循環)筋運動リズム間の位相シンクロ現象に焦点をあて,位相シンクロが合目的性を持って生じるとする「テレオロジカル仮説」を実験的に検証することを目的とした。今年度は,歩行運動時の呼吸循環パラメータの挙動から,位相シンクロ時の肺ガス交換効率を酸素の換気当量で評価した。また,糖代謝率,脂質代謝率をindirect calorimetryから推定し,シンクロ現象がエネルギー基質に影響を与えるか検討を行った。15名の被験者をリクルートし,トレッドミル上で傾斜角1度20度の上り傾斜漸増速度歩行実験を行った。速度を増していくと,心拍数と歩行数はともに増していくが,心拍数の増加率が歩行数に比べて高いため,ある速度で心拍数と歩行数が一致し位相が同期する。心拍と歩行リズム間の位相コヒーレンスが0.5以上をシンクロ発生と定義した。シンクロが発生した場合,脱シンクロ時のデータを補間してガス交換パラメータを予測し,シンクロ時の実計測値との差異を調べたところ,酸素の換気当量は平均1.4%の減少,糖質代謝が4.8%減少,脂質代謝に12.6%の増加が見られた。酸素摂取量がシンクロ時で変化しなかったことから,換気当量の減少は換気量が減少したためと推察された。これは乳酸等の換気を亢進させる代謝産物が減少しためではないかと推測された。また基質代謝の変化については,シンクロにより運動筋への血流量が確保され,より好気的代謝が行われたため脂質に依存する割合が増えたと推測した。今後シンクロ時に骨格筋の血流量変化が生じるかどうかを確かめるため,運動筋の筋組織ヘモグロビン濃度の変化を計測して検証を進める予定である。本研究では,ヒトの呼吸循環ー筋運動リズム間の位相シンクロが合目的性を持って生じるとする「テレオロジカル仮説」を実験的に検証することを目的としている。前年度に引き続き,トレッドミル上での歩行運動時の呼吸循環パラメータの挙動から,心拍ー歩行リズム間の位相シンクロ発生時に肺ガス交換効率に変化が見られるか解析した。また,今年度は近赤外分光計により筋組織の酸素動態も計測し,位相同期時にどのような変化が見られるか計測を行った。昨年度はトレッドミルで漸増速度歩行運動を行ったが,今年度は一定速度で運動を行い,トレッドミルの傾斜が毎分0.5度づつ増加する漸増傾斜歩行実験を行った。14名の被験者をリクルートした。トレッドミルの傾斜を増していくと,歩行周波数はほぼ一定のまま心拍数が増していき,ある傾斜で心拍数と分時歩行数が一致する。心拍-歩行リズム間の位相差が標準偏差で10%未満で,かつこの状態が30秒以上続いた場合を位相シンクロと定義した。シンクロ発生が確認できた被験者は14人中7人であり,シンクロ時間は平均172秒であった。シンクロ発生近傍の脱シンクロ時のデータを補間してガス交換パラメータを予測し,シンクロ時の実計測値との差異を調べたところ,酸素換気当量は平均2.2%の減少,ガス交換比は1.5%の低下,呼気終末炭酸ガス分圧は1.7%上昇した。酸素摂取量はシンクロ時に変化せず,換気量は2.5%減少したことから,酸素換気当量の減少は換気量の減少によるものである。筋組織ヘモグロビン濃度の変化を解析したところ,シンクロ時にΔ脱酸素化ヘモグロビン濃度は平均1.9%増加,Δ酸素化ヘモグロビン濃度は6.4%減少が見られた。これは位相シンクロ発生によって筋が血液中酸素をより多く抽出したことを示しており,代謝がより好気的になったものと推察された。今後さらにデータを積み重ねて検証を進めていく予定である。本研究ではヒトの呼吸循環ー筋運動リズム間の位相シンクロが合目的性を持って生じるとする「テレオロジカル仮説」を実験的に検証することを目的とした。

前年度に引き続き,トレッドミル上での漸増傾斜歩行運動時の呼吸循環パラメータの挙動および筋組織ヘモグロビンの酸素動態から,心拍ー歩行リズム間の位相シンクロ発生時に肺ガス交換効率に変化が見られるか,運動筋での酸素利用や酸素供給に変化が見られるかについて解析を行った。新たに若年者7名の被験者を追加するとともに,今年度は中高年の同一被験者で繰り返し測定し,intra-subject variabilityを計測した。シンクロ現象の発生時間は若年者においては56±21秒(n=7)であり,一方,中高年者の同一被験者における測定では175±47秒(n=8)であった。若年者においてシンクロ発生時に酸素換気当量が平均2.4±1.4%の減少,ガス交換比が2.3±1.5%減少した。また,筋組織の脱酸素化ヘモグロビン濃度変化が3.7±3.8%増加し,酸素化ヘモグロビン濃度は3.3±2.6%減少した。中高年者被験者での8回の繰り返し測定では,シンクロ発生時に酸素の換気当量は平均2.8±1.9%の減少,ガス交換比は1.6±1.5%減少した。また,筋組織の脱酸素化ヘモグロビン濃度変化が3.6±4.3%増加し,酸素化ヘモグロビン濃度は2.9±3.9%減少した。この結果はシンクロ発生によって筋が酸素をより多く抽出したことを示しており,代謝がより好気的になったものと推察された。また,位相シンクロ時の換気当量の低下は,筋収縮時の乏血状態が解消され換気刺激が減少したことによるものと推察された。研究成果はEuropean College of Sport Science 2014および第92回日本生理学会大会で発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。生体生理工学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通りに実験を遂行したが,予定していた血圧計測機器の購入が仕様と合わず,運動時の血圧波形からの一回拍出量の推定ができなかったため研究計画を一部変更せざるを得なかった。今年度の研究成果は生体生理工学シンポジウムで論文として纏め発表した。国際誌への論文投稿はしたものの受理はまだである。実験計画を変更したことから申請時の当初の研究計画からはやや遅れていると評価している。本研究により位相シンクロ現象が運動時の換気当量の減少やエネルギー基質として脂質利用の促進をもたらすなどの示唆が得られたので,より説得力が増すようデータ数を蓄積していく予定である。また,次年度は起立ストレス時の筋ポンプと心拍リズムとのシンクロ現象を解析し,シンクロと心拍出量や圧受容器反射との関連性を検討する予定である。起立時には歩行運動時に比べて体動が少ないため,血圧波形から一回拍出量の推定は可能であり,シンクロとの関連性を検証できると考えている。昨年度までの研究により,心拍ー歩行リズム間の位相シンクロ現象が運動時の酸素換気当量の減少やガス交換比の低下をもたらす(エネルギー基質が脂質へ移行)などの示唆が得られたので,より説得力が増すようデータ数を追加蓄積して国際誌に投稿し発表していく予定である。2014年7月にオランダで開催されるEuropean College of Sports Science2014国際会議においてこれまでの研究成果を発表する予定である。
伝統的社会における発酵食品の位置づけに関する総合的・通地域的研究

和食がユネスコ無形文化遺産に登録され、味噌、醤油、日本酒などの発酵食品が海外でもブームになっている。しかし、海外のローカルな発酵食品が置かれている状況は日本とは異なり、伝統的な発酵食品が廃れるような地域も見られる。しかし、発酵食品が主食として用いられている地域も存在し,地域における発酵食品の位置づけは、極めて多様である。そこで,本研究では,発酵食品のうち主食,調味料もしくは副食,酒,種菌を対象に,オセアニア,アフリカ東部,東南アジアの3地域で調査を実施する。その際,「伝統食の中における発酵食品の位置づけ」という共通の分析枠組みを設け、総合的・通地域的に研究を行い発酵食品の位置づけを検討する。
後シナプスGABA_B受容体の小脳長期抑圧現象への寄与

1.小脳プルキンエ細胞において、mGluR1応答はGABA_B受容体活性化により増強する。シナプス周辺部のGABA_B受容体活性化には、GABAの持続的な放出が必要である。すなわち、抑制性介在ニューロンの連続的な発火が寄与するものと思われる。平行線維の頻回刺激は、プルキンエ細胞のmGluR1を活性化すると同時に抑制性介在ニューロンの発火頻度を上昇し、結果的にプルキンエ細胞のmGluR1応答を増強して、小脳長期抑圧現象(LTD)を促進すると推測される。mGluR1のアゴニストDHPGは、小脳プルキンエ細胞のmGluR1を活性化すると伴に抑制性介在ニューロンの発火頻度を上昇することが知られていた。しかし、その発火頻度上昇が如何なるメカニズムで生じるのか不明であった。そこで薬理学的に調べたところ、Srcファミリーのチロシンキナーゼを介して、抑制性介在ニューロンが興奮性内向き電流を誘起することが明らかとなった。このメカニズムは、プルキンエ細胞のTRPC1チャネルを介する応答と全く異なるものである。2.昨年度、小脳皮質の抑制性介在ニューロンから一酸化窒素(NO)が放出され、これが小脳LTDの誘発に関わる可能性がLindenらにより報告された。しかし、NOがどの細胞から放出されるかは未だ確定していない。そこで我々は、抑制性介在ニューロンの発現するある分化・成長因子に着目し、その因子がバーグマングリア細胞に作用して、NO合成、放出を誘起し、LTD形成を促進するのではないかという仮説を立てた。そこでまず始めに、その因子の受容体アンタゴニストを投与すると、LTD形成が阻害されることが分かった。1.小脳長期抑圧現象(LTD)への後シナプスGABA_B受容体の寄与を調べた。前シナプスGABA_B受容体の関与を除外するため、グルタミン酸を電気泳動的に投与した時の興奮性電流を小脳プルキンエ細胞より記録した。LTD形成確率が50%程度の刺激条件を見つけ(8例中4例のみで20%以上の抑圧)、条件刺激とGABA_B受容体アゴニスト、バクロフェンの同時投与を行ったが、LTD形成確率の上昇は見られなかった。条件刺激をさらに検討する必要がある。2.mGluR1の生理的応答はGABA_B受容体活性化により増強したが、細胞内Ca^<2+>濃度上昇を引き起こす他のニューロモジュレーターでも生じる可能性がある。それを探索したところ、α_1アドレナリン受容体活性化により、mGluR1応答が増強することが分かった。また、小脳抑制性シナプス伝達がα_1アドレナリン受容体活性化により増強され、一方、α_2アドレナリン受容体活性化により抑圧されることを見出だした。このように2つのサブタイプのαアドレナリン受容体は正反対の修飾作用をすることがわかった。アドレナリン受容体サブタイプの時間的空間的発現パターンの変化は、小脳機能の複雑な修飾機構を作り出すものと考えられる。この結果については現在投稿準備中である。3.mGluR1応答にはホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP_2)が必須であると考えられている。そこで実際にPIP_2を組織から枯渇させるために、PIP_2の合成酵素PI4Kを阻害剤でブロックして、mGluR1応答を記録したところ、完全な消失は見られなかった。これより、PIP_2非依存的な成分がある可能性が示唆された。このメカニズムの検証により、新たな情報伝達機構が見つかるかもしれない。他方、聴覚前庭器官の有毛細胞のAdaptationメカニズムにPIP_2が必須であることを証明し、Neuron誌に発表した。1.小脳皮質において、mGluR1応答はGABA_B受容体活性化により増強したが、他の神経伝達物質により生じる可能性もある。そこでアドレナリン受容体(AR)の関与を調べたところ、α_1-ARのアゴニストphenylephrine、あるいはα_2-ARのアゴニストclonidineの投与により、一部のプルキンエ細胞においてmGluR1応答が増強することが分かった。そこで、小脳皮質におけるα_1-ARとα_2-ARの発現パターンを免疫組織染色で調べると、どちらのα-ARも小脳矢状断面の外側に多く、小脳の内側(小脳核寄り)では少ない傾向が見られた。従って、mGluR1の増強効果はα-ARをより多く発現しているプルキンエ細胞で観察されるものと考えられる。この相関関係を明確にする更なる実験が必要である。さらにまた、小脳抑制性シナプス伝達がα_1-AR活性化により増強され、一方α_2-AR活性化により抑制されることを見出した。これはα_1-ARとα_2-ARの活性化が、抑制性介在ニューロンの自発性発火頻度に対し、正反対の作用をすることに依存した。この結果をJ Neurophysiol誌に発表した。2.GABA_B受容体を阻害すると小脳長期抑圧現象(LTD)が抑制されるという報告が、Tabataらによって培養系で既になされた(PNAS、2004)。この理由として彼らは、GABA_B受容体が細胞外Ca^<2+>濃度センサーとして働き、mGluR1活性を増大するためとしている。しかし、既にmMオーダーで存在する細胞外Ca^<2+>濃度がLTD条件刺激によって大きく変化するとは考えにくく、ここでは我々が見つけたGABA_B受容体によるmGluR

1応答増大作用が、主にLTD形成に関わるものと推測される。これを証明すべく実験系を考案する必要がある。1.小脳プルキンエ細胞において、mGluR1応答はGABA_B受容体活性化により増強する。シナプス周辺部のGABA_B受容体活性化には、GABAの持続的な放出が必要である。すなわち、抑制性介在ニューロンの連続的な発火が寄与するものと思われる。平行線維の頻回刺激は、プルキンエ細胞のmGluR1を活性化すると同時に抑制性介在ニューロンの発火頻度を上昇し、結果的にプルキンエ細胞のmGluR1応答を増強して、小脳長期抑圧現象(LTD)を促進すると推測される。mGluR1のアゴニストDHPGは、小脳プルキンエ細胞のmGluR1を活性化すると伴に抑制性介在ニューロンの発火頻度を上昇することが知られていた。しかし、その発火頻度上昇が如何なるメカニズムで生じるのか不明であった。そこで薬理学的に調べたところ、Srcファミリーのチロシンキナーゼを介して、抑制性介在ニューロンが興奮性内向き電流を誘起することが明らかとなった。このメカニズムは、プルキンエ細胞のTRPC1チャネルを介する応答と全く異なるものである。2.昨年度、小脳皮質の抑制性介在ニューロンから一酸化窒素(NO)が放出され、これが小脳LTDの誘発に関わる可能性がLindenらにより報告された。しかし、NOがどの細胞から放出されるかは未だ確定していない。そこで我々は、抑制性介在ニューロンの発現するある分化・成長因子に着目し、その因子がバーグマングリア細胞に作用して、NO合成、放出を誘起し、LTD形成を促進するのではないかという仮説を立てた。そこでまず始めに、その因子の受容体アンタゴニストを投与すると、LTD形成が阻害されることが分かった。