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覚せい剤による依存形成に関与する新規機能分子の同定と生理機能の解明

覚せい剤や麻薬による薬物依存は大きな社会問題であるが,治療法がほとんど確立されていないのが現状である.治療薬の開発が遅れている理由として,依存形成の鍵となるタンパクが明らかになっていないことが挙げられる.そこで,PCR-select cDNAサブストラクション法を用いて,薬物依存形成の鍵となる新規機能分子の探索を試みた.その結果,覚せい剤メタンフェタミンを連続投与されたマウス脳側坐核から新規機能分子`shati'を同定した.昨年度までに、shatiが,メタンフェタミン誘発自発運動量亢進および場所嗜好性の形成に対して抑制的に働くことを明らかにした.さらに,shatiがメタンフェタミンによって引き起こされる細胞外ドパミン量の増加およびドパミン再取り込み能低下を抑制することを示した.本年度は,メタンフェタミン依存形成段階においてshatiが関与していることを検討するに留まらず,薬物依存抑制因子として報告されているTNF-αとの関連についても明らかにした.PC12細胞へshati発現ベクターをトランスフェクションすると,コントロール細胞と比較して,shatiおよびTNF-αmRNAの発現量の増加,ドパミン再取り込み能の促進,メタンフェタミン誘発ドパミン再取り込み能低下の抑制が観察された.これらshatiの作用は,可溶性TNF受容体およびTNF-α抗体を前処置しTNF-αを中和することよって抑制されたことから,shatiはTNF-αを介してドパミン再取り込みを促進していると考えられる.今後,shatiの依存形成メカニズムへの関与をさらに詳細に解明することが,薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋がると考えられる.覚せい剤や麻薬による薬物依存は大きな社会問題であるが、治療法がほとんど確立されていないのが現状である。依存形成の鍵となる機能分子を同定するために、メタンフェタミン(METH)を連続投与した時の運動量増加作用に過感受性を示したマウス脳の側坐核から取り出したmRNAを用いて、cDNAサブストラクション法によって、新規機能分子'shati'を同定した。Shatiがどのように薬物依存に関与しているかを、行動実験的、神経化学的および分子生物学的手法で検証した。マウスにshati-アンチセンス(shati-AS)を脳室内に注入すると、shati-スクランブルオリゴヌクレオチド(shati-SC)を注入されたマウスと比べて、shatiの発現レベルが有意に抑制された。METHをマウスに皮下投与すると、自発運動量が亢進し、5日間連続投与することで、METHに対する反応性(運動量)が増加し、逆耐性が形成された。また、METHの連続投与によって場所嗜好性が形成された。shati-AS群では、SC群および人工脳脊髄液(CSF)群と比較して、自発運動量亢進、逆耐性、および場所嗜好性の形成が有意に増強された。これらの結果から,shatiはMETH誘発過感受性および報酬効果に対して、抑制的に働いていることが明らかとなった。Shati-AS群では、SC群およびCSF群と比較して、METH連続投与によって引き起こされる側坐核での細胞外ドパミン(DA)量の増加およびシナプトソーム内へのDA再取り込み能低下を有意に増強した。METHはDAトランスポーターに作用して、DAの再取り込みを阻害する一方で、シナプト間隙のDA遊離を促進する。その結果、自発運動量亢進および場所嗜好性の形成が引き起こされると考えられる。本研究の結果より、shatiは、DA再取り込みを促進し、DA遊離を抑制することにより、シナプト間隙のDA量を減少させ、METH依存形成を抑制していることが示唆される。今後、shatiの依存形成メカニズムへの関与を詳細に解明することが、薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋がると考えられる。覚せい剤や麻薬による薬物依存は大きな社会問題であるが,治療法がほとんど確立されていないのが現状である.治療薬の開発が遅れている理由として,依存形成の鍵となるタンパクが明らかになっていないことが挙げられる.そこで,PCR-select cDNAサブストラクション法を用いて,薬物依存形成の鍵となる新規機能分子の探索を試みた.その結果,覚せい剤メタンフェタミンを連続投与されたマウス脳側坐核から新規機能分子'shati'を同定した.昨年度までは、shatiが,メタンフェタミン誘発自発運動量亢進および場所嗜好性の形成に対して抑制的に働くことを明らかにした.さらに,shatiがメタンフェタミンによって引き起こされる細胞外ドパミン量の増加およびドパミン再取り込み能低下を抑制することを示した.本年度は,shatiのドパミン再取り込みにおける機能の詳細なメカニズムを明らかにするために,shatiの発現ベクターを構築し,shatiを過剰発現させたPC12細胞を用いて,shatiの生理機能の検討を行った.PC12細胞へshati発現ベクターをトランスフェクションすると,コントロール細胞と比較して,shati mRNA発現量の増加,ドパミン再取り込み能の促進,メタンフェタミン誘発ドパミン再取り込み能低下の抑制が観察された.メタンフェタミンはドパミントランスポーターに作用して,ドパミンの再取り込みを阻害する一方で,シナプス間隙のドパミン遊離を促進する.その結果,自発運動量亢進および場所嗜好性の形成が引き起こされると考えられる.本研究の結果より,shatiは,ドパミン再取り込みを促進し,ドパミン遊離を抑制することにより,シナプス間隙のドパミン量を減少させ,メタンフェタミン依存形成を抑制していることが示唆される.

今後,shatiの依存形成メカニズムへの関与をさらに詳細に解明することが,薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋がると考えられる.覚せい剤や麻薬による薬物依存は大きな社会問題であるが,治療法がほとんど確立されていないのが現状である.治療薬の開発が遅れている理由として,依存形成の鍵となるタンパクが明らかになっていないことが挙げられる.そこで,PCR-select cDNAサブストラクション法を用いて,薬物依存形成の鍵となる新規機能分子の探索を試みた.その結果,覚せい剤メタンフェタミンを連続投与されたマウス脳側坐核から新規機能分子`shati'を同定した.昨年度までに、shatiが,メタンフェタミン誘発自発運動量亢進および場所嗜好性の形成に対して抑制的に働くことを明らかにした.さらに,shatiがメタンフェタミンによって引き起こされる細胞外ドパミン量の増加およびドパミン再取り込み能低下を抑制することを示した.本年度は,メタンフェタミン依存形成段階においてshatiが関与していることを検討するに留まらず,薬物依存抑制因子として報告されているTNF-αとの関連についても明らかにした.PC12細胞へshati発現ベクターをトランスフェクションすると,コントロール細胞と比較して,shatiおよびTNF-αmRNAの発現量の増加,ドパミン再取り込み能の促進,メタンフェタミン誘発ドパミン再取り込み能低下の抑制が観察された.これらshatiの作用は,可溶性TNF受容体およびTNF-α抗体を前処置しTNF-αを中和することよって抑制されたことから,shatiはTNF-αを介してドパミン再取り込みを促進していると考えられる.今後,shatiの依存形成メカニズムへの関与をさらに詳細に解明することが,薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋がると考えられる.
運動による認知機能低下予防効果の機序の解明

ADの発症を予防するためには臨床的に認知症を発症する時点(Clinical AD)からの介入では手遅れであり、より前段階から進行を抑制する必要があると考えられており、認知症発症以前のPreclinical ADと呼ばれる状態の特徴を明らかにすることが求められている。認知症を発症する前段階で記銘力のみが低下している状態をMild cognitive impairment (MCI)と呼び、近年ではMCIよりも、更に前段階の客観的な認知機能低下を認めないが自覚的な物忘れのみがある段階をsubjective cognitive impairment(SCI)と呼ぶ。一方で運動は認知症予防の有力な方法である可能性が指摘されている。しかし、その効果の機序については明確でない。我々はMCIの患者を対象とし運動介入の前後で認知機能、髄液Aβ、リン酸化Tauなどを評価することによって運動による認知機能保護効果がAβ沈着の進行抑制によって得られるか否かを検討してきた。MCIを対象とした試験では有意差が認められなかったため、さらに前段階のSCIの段階の患者を対象に同様の試験を行い、運動介入の前後で髄液バイオマーカーに変化が起こりうるか否かを明らかにしたいと考えた。しかしながら近年の医療倫理問題の深刻化から当該研究の髄液採取に関して慎重な対応が必要となり、倫理委員会の承認に長期間を要した。2017年11月に倫理委員会の承認を得たものの、被験者を探すことに難渋し、2018年度も患者登録を広く呼びかけ、延長申請をしたが、研究に参加意思を示したものの髄液採取を拒否されるケースが多く、髄液採取の目処が立たず到底目標数達成できないことが判明した。加えて同様の研究成果が各国から報告されているが、いずれも有意差が無いことも判明したことから本研究はやむなく補助事業期間内で終えることとなった。認知症を発症する前の段階で、記銘力のみが低下している状態をMild cognitive impairment (MCI)と呼び,近年ではMCIよりもさらに前の段階として、記銘力低下も起こっておらず客観的な認知機能低下をみとめないが自覚的なもの忘れのみがある段階をsubjective cognitive impairment (SCI)と呼び、それがMCIのさらに前段階である可能性が指摘されている。一方で、最近、運動によって認知機能が改善するという研究報告や介入報告があいついでおり、前年度にも運動介入と認知機能に関連する報告は相次ぎ、運動と髄液バイオマーカーの報告も多く情報収集を行った。我々は昨年まで、MCIの患者を対象とし、運動介入の前後で、認知機能、髄液Aβ、リン酸化Tauなどを評価することによって、運動による認知機能保護効果が、Aβ沈着の進行抑制によって得られるものか否かを検討してきた。残念ながらMCIを対象とした試験では有意差が認められなかった。今回はSCIを対象とするとはいえ、前年度までのMCIを対象とした同様の研究では明らかな有意差をみいだせなかったこと。登録者を延ばすことができなかったことを踏まえ、研究手法の問題点、改良点を抽出し分析することが何より重要と考え、その上で、より正確な髄液検査手法の取得のための情報収集を行った。加えて当院の倫理委員会が本年度から髄液採取における安全基準が厳格化されたことや、患者に対する保障制度が変更となったこともあり倫理委員会通過に時間を要している。また前MCIを対象とした同様の運動介入研究では登録希望者を獲得するのに難渋した経緯がある。今回はその登録不可能となっていた者のうち、SCIと診断された者を優先的にピックアップし、内諾得ている。運動指導担当者、神経心理テスト担当者に対しての教育は終了している。前年度までのMCIを対象とした同様の研究では明らかな有意差をみいだせなかったこと。登録者を延ばすことができなかったことを踏まえ、研究手法の問題点、改良点を抽出し分析することが何より重要と考え、その上で、より正確な髄液検査手法の取得のための情報収集を行い時間を要した。加えて当院の倫理委員会が本年度から、侵襲性のある臨床介入研究には、倫理規定がより厳格化され、特に髄液採取における安全基準が厳格化されたこと、患者に対する保障制度が変更となったこともあり倫理委員会には現段階で申請途中となっている。(申請受理見込み)認知症を発症する前段階である記銘力のみが低下している状態をMild cognitive imparement(MCI)とよび近年ではMCIよりもさらに前の段階として、記銘力低下もおきておらず、神経心理テストなどでは客観的な認知機能低下を認めないが自覚的な「もの忘れ」のみがある段階をSubjective cognitive imparement(SCI)と呼び、それらがMCIのさらに前段階である可能性が指摘されている。一方で最近、運動によって認知機能低下を抑制できるという研究報告や介入報告があり、運動介入と認知機能に関連する報告は相次いでいる。他施設から運動とバイオマーカーに関する報告も小規模ながら多くされているが、一致した見解をえていない。それらをふまえ、なぜこのように結果が一定しないのか情報収集を行った。我々は一昨年までMCIの患者を対象にとし、運動介入の前後で認知機能低下、髄液Aβ、リン酸化Tauなどを評価することにより運動による認知機能保護効果がAβ沈着の進行抑制によって得られるか否かを検討した。そのため、手技や試験方法について研究手法に問題がないか改良する点について情報収集を行った。

一方当院の倫理委員会が昨年度から健常者に対する髄液採取における安全性における懸念を表明し、倫理委員会通過に難渋した。髄液採取に関しては他医局からの意見もあり緩和方向であり現時点で倫理委員会提出中であり、通過見込みである。前年度までのMCIを対象として同様の研究では明らかな有意差をみいだせなかったこと。登録者をのばすことができなかったことを踏まえ研究手法の問題点、改良点を抽出し分析することが何より重要と考え、その上でより正確な髄液検査手法(特に採取後の髄液の取り扱いについて)の情報収集に時間を要した。加えて当院の倫理員会の侵襲性ある臨床介入研究には倫理規定が厳格化され特に髄液採取における安全基準の見直しが厳格化されたこと、患者に対する保証制度が変更となり倫理委員会通過が極めて困難になったことが大きい。しかしながら、髄液採取に関して一定の倫理員会の通過めどがたったため、申請中である。ADの発症を予防するためには、臨床的に認知症を発症する時点(clinical AD)からの介入ではすでに手遅れであり、より以前の段階から病理変化の進行を抑制する必要があると考えられており、認知症発症以前のpreclinical ADと呼ばれる状態の特徴を明らかにすることが求められている。認知症を発症する前の段階で、記銘力のみが低下している状態をMild cognitive impairment (MCI)と呼び、近年ではMCIよりもさらに前の段階として、記銘力低下も起こっておらず客観的な認知機能低下をみとめないが自覚的なもの忘れのみがある段階をsubjective cognitive impairment (SCI)と呼ぶことが定着してきた。一方で、運動は認知症予防の有力な方法である可能性が指摘されている。しかしその効果の機序については明確ではない。我々は、軽度認知機能異常(MCI)の患者を対象とし、運動介入の前後で、認知機能、髄液Aβ、リン酸化Tauなどを評価することによって、運動による認知機能保護効果が、Aβ沈着の進行抑制によって得られるものか否かを検討してきた。MCIを対象とした試験では有意差が認めらなかったため、さらに前段階のSCIの段階の患者を対象に同様の試験を行い、運動介入の前後で髄液バイオマーカーに変化がおこりうるのか否かを明らかにしたいと考えた。しかしながら近年の医療倫理問題の深刻化から当該研究の髄液採取に関して慎重な対応が必要となり倫理委員会の承認に長期間を要した。2017年11月に倫理委員会承認を得て、被検者を探しており研究開始しているが現時点で目標数に達せず、引き続き期間延長を申請した上で研究をすすめている。1健康なSCI患者からの髄液採取およびスポーツインストラクターの指導による運動介入の危険性に関しては当施設の研究倫理委員会の細則変更や慎重な姿勢もあり委員会通過に長期間を要したこと。2本研究の前のMCIに対する同様の研究における髄液バイオマーカー計測に、かなり個人差や変動が生じており実験手技の未熟さが懸念されたため、バイオマーカー計測手技の熟達に時間を要した。3本研究前のMCIに対する同様の研究における運動介入の方法、指導に問題がないかどうかを再度検証し、スポーツインストラクターの指導方法の研修に時間を要した。
血漿リポ蛋白異常症の遺伝素因の分子生物学的解析と治療法の開発に関する研究

1)家族性高コレステロ-ル血症におけるLDLレセプタ-異常の解析:ホモ接合体17家系について線維芽細胞を材料にしてLDLレセプタ-活性の測定を行い、蛋白質レベルでの解析で遺伝的変異の多様性を証明した。現在遺伝子解析を進めているが、その中の1例において、EG下前駆体相同領域(第7から第14エクソン)の完全な欠損のためにβーVLDL(アポE)は結合出来るがLDL(アポB)を結合出来ず、リサイクリングの障害された変異が見出された。臨床症状との対比において、レセプタ-機能が僅かでも残っている変異体では完全欠損例に比べて動脈硬化の進展が比較的遅いことがわかり、LDLレセプタ-が生体のコレステロ-ル代謝に果す役割の重要性が認識された(文献1,2)。2)動脈硬化に関連したアポリポ蛋白Eの変異:アポEにはE4、E3、E2の3つの同位体があるが、これに加えて、E5、E7という日本人の中で比較的頻度の高い変異を見出し、遺伝子解析の結果,E5はE3からGlu3(GAG)→Lys(AAG)、E7はGlu244、245(GAG→AAG)の変化をしたものとわかった。いづれも心筋梗塞患者の中に高率に見出され、おそらくLDLレセプタ-への強い干渉にために血漿LDLのクリアランスを妨げることによると推測された(文献4、5)。3)I型高リポ蛋白血症におけるリポ蛋白リバ-ゼ欠損の分子レベルでの解析:リポ蛋白リバ-ゼと肝臓トリグリセライドリバ-ゼに対する特異抗体を作成し、これを用いてヘパリン静注後血漿中の両酵素の分別定量を行い、酵素欠損を診断した。一家系において血液単球マクロファ-ジを用い、酵素の合成が欠損していることを証明した。mRNAはごく僅かのみ認められ、遺伝子のRFLPでは異常を認めていない。(文献3)。4)コレステロ-ルエステル転送蛋白異常の解析:同蛋白の受け皿としてのHDLの機能の悪い高HDL血症の一家系を発見した(文献6)。(文献3)。1.家族性高コレステロール血症(FH)における低密度リポ蛋白レセプター(LDLレセプター)の遺伝変異の解析:FHホモ接合体21例(16家系)を対象とし、患者から採取した培養皮膚線維芽細胞とLDLレセプターに対する単クローン抗体を使いて、これら細胞におけるレセプターの合成過程を【^(35)S】メチオニン標識によって追求した。16家系中5家系(5例)においてはLDLレセプター蛋白の合成は完全に欠除し、2家系では12kdの前駆体から16kdの成熟形へのプロセシングの極度の障害、2家系では合成レセプター数の極度の減少、そして1家系では抗体と反応するレセプターは一応合成されているが、成熟障害がある上に成熟形が極めて不安定な特異型と判明した。以上10家系(13例)はいづれもレセプターnegativeタイプに入るものである。他の5家系はLDLの結合や細胞内へのとりこみ活性が正常の20%程度残存するレセプターdefectiveタイプに属し、そのうち2家系(4例)では数の減少、3家系(3例)では12kd前駆体から16kdへの成熟障害であることが明らかになった。

残る1家系は既報の内部転送障害型であるが、この細胞では培地中に分子量の小さいレセプターが多量に放出していることがわかった。なおレセプターdefectiveタイプの中虚血性心疾患がはっきりしているのは7例中1例のみであったのに対し、レセプターnegativeタイプでは13例中10例が+で、LDLレセプター活性が20%でもあるか否かが動脈硬化に密接に関係していることがわかった。2.高脂血症と虚血性心疾患に強い関連をもつアポリポ蛋白Eの遺伝変異、E5、E7について:患者から得た白血球を用いてDNAの解析を行っているが、現在までの所、遺伝子の部分的なdeletionは見られず、E5については点変異のためターミナルコドンが早く出て、カルボキル末端部20残基の欠損を生じたと判断される。1. I型高リポ蛋白血症におけるリポ蛋白リバーゼ(LpL)欠損の解析:ヘパリン静注後血漿から精製したLpLおよび肝臓由来のトリグリセライドリパーゼに対して特異的な抗体(ポリクロンおよびモノクロン)を作製し,これらを用いて高脂血症患者血漿中に遊離してくる両種酵素活性を正確に分別定量, LpL欠損症のホモおよびヘテロ接合体を適確に診断するシステムを開発することに成功した.次に家族性高カイロマイクロン血症患者の血液單球マクロファージを培養し,ヘバリン添加培地中に分泌されるLpL活性を測定すると共に, ^<35>Sメチオニンで蛋白質を標識後,上記の特異抗体によってLpLを沈降分離, SDS電気泳動上にLpLを同定することを試みた.その結果, 3家系の患者のうち1例はLpL蛋白質の合成が全く欠損して居り, 1例は抗体と反応する蛋白質はあるがLpLの酵素活性は欠除,最後の1例では量的減少の状態で, 3者いづれも異ったタイプの遺伝的欠損であることが示唆された.現在核酸RNA, DNAレベルで検索継続中である.2.高脂血症と動脈硬化に関連したアポリポ蛋白Eの特異な変異(E5)の解析:患者白血球から採取したDNAのアポE会遺伝子を含む11kbの断片をλファージに組込んでクローニングした後,シャトルベクターに導入してアポEを発現させ,これよりE5をもつクローンを同定,この種のアポE遺伝子を定法によって分析した.この分析の結果, E5患者では野性型成熟アポE(E3)のアミノ末端から3番目のアミノ酸Glu(GAG)のGがAに換ってLys(AAG)に変異したものであることがわかった.3.コレステロールエステル転送蛋白(CETB)の精製とコレステロール逆輸送に果す機能の同定:ヒト血漿からCETPを本精製し, Kineteisを正しく求めるために系を開発中である.アポ蛋白をつけたトリオレインと燐脂質から成る人工粒子を基質として使用.(1)家族性高コレステロール血症(FH)におけるLDLレセプター異常の解析:これまで蛋白質合成面からLDLレセプター異常を解析した16家系のFHホモ接合体の中に、見かけ上の分子量が12万と小さく、抗LDLレセプター抗体と反応するにもかかわらず^<125>I標識LDLを結合する能力著しく低下し、リサイクリングの障害されている新しい変異が見出された。培養線維芽細胞を用いてリポ蛋白の結合を詳しく調べた所、このレセプターはアポEをもつβーVLDLをかなり良く結合することがわかった。現在遺伝子異常の解析を進めて居り、LDL結合領域の最後の繰り返し構造からEGF前駆相同領域にかけてこの部分の欠失が推定されている。(2)動脈硬化に関連したアポリポ蛋白Eの変異の解析:昨年度のアポE5の変異点の解析につづいて本年はアポE7の解析を行った。患者白血球から採取したDNAのアポE全遺伝子を含む11kbの断片をλファージに組込んでクローニングした後、ψ2細胞に発現させE7をもつクローンを同定、この株のアポE遺伝子を定法によって解析した。
時間栄養学による記憶学習能力の解析と認知症対策への基礎的研究

時計遺伝子変異クロックマウスと野生型マウスに高脂肪食を与えて、電流刺激回避試験と水迷路試験により記憶学習能力を解析した。その結果、1)マウスの記憶学習能力に系統差があること、2)餌の組成の違いで行動リズムに差が生じること、3)クロックマウスは特に高脂肪食摂取時の記憶学習能力の低下が著しいこと、4)高脂肪食の摂取時の能力低下は雌が顕著であること、がわかり、高脂肪食摂取が時計遺伝子の発現異常を介して、記憶学習能力に影響することが明らかとなった。平成24年度では、以下の1)3)の実験を行い、それぞれの成果を得た。1)前年度に検討したマウスの記憶学習能力を調べる最適条件下で、電流刺激回避測定装置を用いて実験した結果、牛脂に富んだ高脂肪食を摂取したマウスの能力に性差が存在すること、特に雌マウスにおける記憶学習能力の低下が顕著であることが判明した。この性差による違いは水迷路装置を用いて行った空間認識記憶実験においても認められたが、電流刺激回避測定の結果と比較すると小さな違いだった。2)各組織における関連遺伝子の相互作用への影響を解析するために、それぞれの飼育条件下にあるマウスから血液と脳、肝臓を採取し、脂質代謝系遺伝子と時計遺伝子や転写因子の発現変動について調べた。その結果、肝臓中のclockやper2で検討した時計遺伝子の発現リズムは、高脂肪食摂取後に移相のずれが認められた。しかし、このとき性差による有意な差は認められなかった。一方、脳におけるニュートロフィンやその受容体の遺伝子、グルタミン酸受容体関連遺伝子の発現では、NGFBやBDNF、NTFに大きな変化はなく、NMDA-2AとKIF17-1の発現に食組成と性差による違がみられた。また、本来の餌摂取時刻ではない明期(マウスの休息期)にのみ餌を与えたところ、高脂肪食摂取群でKIF17-1発現が増加していた。3)長期に渡って高脂肪食摂取させたマウスを用いて、加齢による記憶学習能力への影響を調べた結果、普通食摂取マウスと比較して高脂肪食をほぼ1年間自由に摂食させ続けたC3H系マウスにおいて明らかに記憶学習能力が低下した。野菜を中心とする抗酸化活性を有する食材をマウスに与えて調べる実験は現在検討中であるが、4週間程度の摂食期間では明らかな効果がなかった。以上のように、本研究によって人の認知症への応用が可能と考えられる食生活のあり方に関する基礎的なデータが得られた。平成23年度では、計画していた以下の1)3)の実験を行い、また4)の検討を進めている。1)本研究を遂行するために、最初にマウスの記憶学習能力を測定するための装置(電流刺激回避測定装置(A)と水迷路装置(B))の測定条件について検討し、装置Aでは電流量や刺激時間とその回数、刺激間隔について、また装置Bでは避難台の設置条件や訓練の仕方、休息時間の間隔と目標物の設置について、それぞれの条件を確立した。2)牛脂に富んだ高脂肪食をclockマウスと野生型マウスに与えて、経時的に電流刺激回避試験と水迷路試験により記憶学習能力の違いについて解析した。その結果、C3H系とICR系の2系統でその能力に違いのあること、また餌の組成の違いによって行動リズムに差が生じることが判明した。また、時計遺伝子クロックが変異したclockマウスでは、普通食であっても同能力の低下が認められ、概日リズムとの関連性からアプローチすることは妥当であるとの結果だった。3)餌を与える時間帯を変化させた制限給餌の環境下において、マウスの記憶学習能力を比較した。その結果、特に大きな違いが認められたのは固体差によるものだった。費用の関係からマイクロアレイ解析は行えない状況であるが、個々のマウスの脳や肝臓における関連遺伝子の発現変化について調べている現段階において、グルタミン酸受容体遺伝子の発現が記憶能力と関連する可能性が示唆されている。4)長期に渡って飼育したマウスを用いた記憶学習能力に対する加齢の影響についての実験を進行させている。1年以上の飼育を続けると、C3H系マウスの老化が顕著であり、また若年マウスに対する記憶学習能力の測定と同様の実験条件で調べるのは適当でないことが判明した。現在、長期の記憶学習能力の測定法を改善するための条件を検討しつつ、種々の環境下や負荷状況下にあるマウスの飼育と経時的な検討を行っている。申請者が平成23年度において計画した研究実施内容の3つの項目の中で、能力検定と制限給餌の実験では、C3H系とICR系の両マウスを用いること、またclock変異マウスを野生型マウスと比較することを掲げていたが、これらマウス間での検討する実験はほぼ目的を達成している。また、餌の内容に関する実験については、高脂肪食を摂取させたときの関連するデータが得られていることから、一定の評価をすることができる。

しかしながら、脂肪中の脂肪酸組成の違いの面からの検討は、実験が長期間に渡ることについての配慮が多少不足していたことから、十分な検討が行われている状況ではない。一方、マウスに対する餌の給餌時間を制限する実験では、当初の計画に基づいて制限給餌ツールを購入するための予算が減額されたために、遅れが生じている。しかし、マンパワーを使うことで装置の不足を補い、実質上計画した実験についてかなりの部分が目標レベルをクリアできている。ただし、人的労力を注ぐことには限界があるので、今後の計画を少し修正する必要がある。次に、記憶学習能力と遺伝子発現との関連性についての実験では、リアルタイムPCRの条件検討に時間と費用が予想以上に必要だった。予めコンベンショナルなPCR実験を行うことにより、脳の標的遺伝子についてある程度の情報を得ることができたことから、この点についても評価することができる。さらに、加齢に伴う記憶学習能力の測定実験については、高齢マウスを飼育しつつ計画通りに条件検討を行っている。高齢化に伴いマウスの電流刺激に対する感受性の低下が見られることが明らかになったことは、次年度の実験を進めるための改良点についての貴重な情報であり、本研究の達成度を評価するためのマイナスの材料にはならないと認識している。以上により、本研究の現在までの達成度はおおむね順調に進展していると評価した。上記の「現在までの達成度」に示した研究の進行状況との関連から、今後の研究の方針としては、1)餌中の脂肪酸組成の違いの面からの検討、2)制限給餌実験の進展、3)脳の構造を意識した特定部位での記憶学習関連遺伝子の発現変動の検討、が中心課題である。また、これまでは雄性マウスを用いて実験してきたが、性差の面からの検討も行いたいと考えており、今後の実験では雌マウスを用いて行うことも計画している。さらに、1)の脂肪酸組成の実験や、2)の制限給餌の実験では、認知症の基礎研究に結び付けられように、野菜などを中心とした食材を取り入れて検討することを考えており、今後文献による調査を開始して、候補を絞り込みたい。すなわち、平成23年度におけるこれまでの検討・解析結果を基に、平成24年度では主に以下の3項目から研究を推進する。1)記憶学習能力の改善効果(食組成、食時刻、運動、性差、加齢の実験):野菜を中心とする抗酸化活性を有する栄養成分をマウスに与え、制限給餌条件下において記憶学習能力を調べる。本学に申請して購入された強制運動負荷(回転かご)装置を用いて、マウスに対する運動負荷を行い、記憶学習能力への改善効果を調べる。2)病態モデルマウスを用いた検討:認知症と密接に関連する糖尿病や血栓症の病態マウスやストレス負荷状態にあるマウスを準備してその行動や記憶学習能力を調べると共に、前述した特定の食材による記憶能力減退に対する予防効果や治療効果について検討する。3)脳と肝臓における時計遺伝子と核内受容体の総合作用の解析:各条件下で飼育したマウスの脳と肝臓における標的遺伝子の変動と時計遺伝子や転写因子との関連性を調べる。特に、概日リズムに関連するタンパク質とニュートロフィン系やその受容体の遺伝子、さらにグルタミン酸受容体関連遺伝子について解析すると共に、脳の特定部位での遺伝子発現について検討する。平成24年度では、当初の計画として明示した通りに設備備品を購入する予定はない。すなわち、基本的に研究費のほとんどは、基礎実験を行うための試薬や生体成分の測定キットと抗体、並びにマウスの購入代と飼育維持に必要な消耗品代に充当する。
断層プロセスゾーンの存在を考慮した活断層連動性および地震動予測手法の確立

西南日本内帯を対象フィールドとして,(1)断層プロセスゾーンの特性評価(例えば、S波速度、幅、微細組織)(2)断層プロセスゾーンによる潜在断層(現在の応力場で動きやすい断層)の抽出,(3)断層プロセスゾーンの存在を考慮した疑似3D断層運動シミュレーション手法を改良した連動性および地震動評価手法の開発,(4)活断層帯(系)の地震動予測手法の確立,および(5)活断層保存施設の保守・運用、を行った.西南日本内帯を対象フィールドとして,(1)断層プロセスゾーンの特性評価(例えば、S波速度、幅、微細組織)(2)断層プロセスゾーンによる潜在断層(現在の応力場で動きやすい断層)の抽出,(3)断層プロセスゾーンの存在を考慮した疑似3D断層運動シミュレーション手法を改良した連動性および地震動評価手法の開発,(4)活断層帯(系)の地震動予測手法の確立,および(5)活断層保存施設の保守・運用、を行った.西南日本内帯に分布する潜在断層を対象として,以下の調査・研究・解析を実施した.(1)文献調査によって,断層プロセスゾーンの幅と断層長さに関するデータを集約し,両者の関係の一般式を導き出した.さらに,根尾谷断層と木戸山西方断層の現地調査を行い,得られた一般式の妥当性を検証した.(2)低活動度の活断層として中国地方西部の大原湖断層系を構成する活断層を対象として,断層プロセスゾーンの微細組織特性を明らかにするとともに,高活動度の断層として,中部地方の根尾谷断層と阿寺断層を対象として,微細組織解析を実施した.(3)既刊の20万分の1および5万分の1地質図から,それぞれ地質断層と活断層を抽出して,『日本の断層マップ』を作成した.さらに,地質断層と活断層が一致する断層から代表的なものを選択して,現地調査を実施した.(4)公開されている大地震の震源メカニズム解,長期間の地震活動データ,GPS測地データを総合して,西南日本の現在の広域応力場を解析した.(5)断層データと造構環境および(2)で得られた微細組織のデータを組み合わせ,潜在断層の認定方法を確立した.(6)小断層,節理および複合面構造やマイクロクラックなどのデータを使って,局所応力場の解析方法を再検討した.さらに,微細組織の形成の新旧関係から,古応力場の変遷に関する基礎資料を取得した.(7)有限要素法による断層運動シミュレーション法を改良し,2005年福岡県西方沖の地震と2000年鳥取県西部地震を対象として,断層プロセスゾーンを含む断層周辺の変位,速度,加速度,震度分布を再現した.西南日本内帯で最大級の活断層系である大原湖-弥畝山断層系および1927年北丹後地震に関して、以下の調査、研究、シミュレーションを実施した。(1)上記活断層系の南部を構成する宇部東部断層を対象として現地調査を行い、発見した断層露頭を詳細に記載するとともに、中位段丘面との関係から最新活動時期と平均変位速度を求めた。さらに、北東部を構成する美都断層と弥畝山西断層の性状と分布から断層間のテクトニクスを議論した。(2)現地調査の結果から得られた断層の性状とプロセスゾーンの幅を入力して、上記活断層系と岩国断層帯の2D断層運動シミュレーションを行い、加速度波形と震度分布を予測した。大原湖-弥畝山西断層系北東部でのシミュレーション結果は、現地調査の結果とよく整合し、非活動部とセグメンテーションがうまく再現できた。(3)1927年北丹後地震のときに地表に現れた郷村断層と山田断層を対象として現地調査を行うとともに、断層露頭でのプロセスゾーンの幅などの基礎資料を得た。これらのデータを入力して実施した2D断層運動シミュレーションでは、北丹後地震の震度分布をうまく再現することができ、この手法の妥当性が検証できた。北丹後地震での山田断層の非破壊部を震源として、同様なシミュレーションを行い、この地域の震動分布を評価した。(4)以上のデータを総合して、断層長とプロセスゾーンの幅、地震被害とプロセスゾーンの分布との関係、断層のセグメンテーションとプロセスゾーンの位置関係、および2D断層運動シミュレーションの結果をテクトニクスの視点から評価した。中国地方西部と中部地方を事例研究のフィールドとして,以下の調査・研究を実施した.1断層プロセスゾーンの特性評価:断層プロセスゾーンの幅と断層長に関するデータ解析と補足の現地調査を実施した.金折は大学院生(植山)の協力を得て,連携研究者大谷具幸(岐阜大学工学部・准教授)と連携しながら,微細組織の解析を行い,断層内微細組織から局所応力場を復元した.2断層プロセスゾーンによる潜在断層の抽出:金折と今岡は大谷と連携して,既存データの再解析と現地調査を行い,潜在断層に関する基礎データを取得した.

金折は大学院生(久保)の協力を得て造構環境と広域応力場に関わる基礎データを収集した.それらのデータを集大成して,西南日本内帯における広域応力場を解明した.金折と今岡が中心となって,断層データと造構環境および2-1で得られる微細組織のデータを組み合わせ,潜在断層の認定方法を確立するとともに,潜在断層のカタログを整備・充実した.金折は大谷の協力を得て,局所応力場を解析手法wp検討した.3地震動予測手法の確立:地震危険度の最も高い潜在断層を例として,変位,速度,加速度,を計算し,断層近傍の正確な震度分布を求めた.これらの結果を一般化して,断層近傍の地震動予測手法を確立して,新しい地震災害予測手法を提示した.断層プロセスゾーンの微細構造と応力変化シミュレーションに基づく連動性から,現在の応力場のもとで最も地震危険性の高い潜在断層を抽出する手法と活断層帯(群)の客観的な認定方法を確立して,地震被害想定の基礎となる地震規模の精度の高い見積もり方法を提示した.4活断層保存施設の保守・運用:金折は山口市阿東篠目に設置されている木戸山西方断層の保存施設の保守およびその活用を図った1927年北丹後地震のときに地表に現れた郷村断層と山田断層の断層露頭を数多く確認することができ、郷村断層を震源として2D断層運動シミュレーションを行い、北丹後地震の震度分布をうまく再現することができるとともに、山田断層の非活動部を破壊源として、今後の地震被害想定が実施できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)山口県中南部から島根県南西部にかけて分布する大原湖-弥畝山西断層系全域にわたる地質調査によって長大断層系に伴われるプロセスゾーンの全容を解明する。(2)現地調査のデータを入力して、2D断層運動シミュレーションを行うとともに、シュミレーション手法の改良を目指す。
高純度ブタ及びヒト卵巣莢膜細胞を用いた顆粒膜・莢膜細胞間相互作用の解析

(1)培養法の確立我々が確立した高純度のブタ卵巣莢膜細胞培養法によりヒト卵巣においても高純度の莢膜細胞を得ることができた。(2)排卵直前の軽度増加する血中プロゲステロンの産生細胞の同定ブタ莢膜細胞および顆粒膜細胞をそれぞれ単離培養しこれにエストロゲン(E2)を添加しプロゲステロン(P)産生を調べるとE2添加により濃度依存的に顆粒膜細胞においてはP産生は抑制される一方、莢膜細胞においては高濃度のE2添加でP産生が促進される結果となった。高濃度のエストロゲン環境は排卵直前の状態を示しており両細胞の全く異なる内分泌摘動態は、排卵直前の軽度増加する血中プロゲステロンの産生細胞は莢膜細胞であることが示された。(3)各種サイトカインの卵巣内局所調節機構への関与の基礎的検討ブタ卵巣細胞の単離培養法をヒト卵巣において応用した。婦人科開腹手術の際、手術前に患者本人から同意の得て卵巣から卵胞を摘出し、これから顆粒膜細胞、莢膜細胞をそれぞれ単離培養した。無血清培地にて培養しその上清中から各種サイトカインをELISA法にて測定検出した。莢膜細胞分離において、白血球細胞の混入は57%程度であった。得られた莢膜細胞はプロゲステロン産生においてFSHの刺激は受けなかった。ヒト莢膜細胞はIL-6を分泌し、しかもhCGにより増強された。(p<0.05)(4)今後の展開ヒト卵巣においても純度の高い莢膜細胞が得られ、これが十分に実験に使用できることがわかった。上記実験(2)をヒトで確認する予定である。また、実験(3)ではさらにサイトカインが顆粒膜、莢膜細胞相互作用にどのような役割を示すのか、さらに、排卵・黄体現象にどのような関係を示すのか明らかにする予定である。
炭素繊維強化プラスチックの吸水による長期疲労強度の低下機構の解明

炭素繊維の強化方向を1つの方向にそろえた一方向炭素繊維強化プラスチック積層板(一方向CFRP積層板)を取り上げ,熱処理を加えて乾燥させたDry材とDry材を吸水させたWet材の繊維方向引張および圧縮強度と繊維直角方向引張および圧縮強度と温度の関係を実験によって求め,これらの結果に対して樹脂の粘弾性現象に成立する時間ー温度換算則を基盤とした耐久性加速試験法を適用し,長期耐久性評価を行った.これにより,マトリックス樹脂の粘弾性と破壊機構の観点から吸水したCFRPの強度低下機構を解明した.炭素繊維強化プラスチック(Carbon Fiber Reinforced Plastics;CFRP)は鉄鋼に比べ高強度,高剛性という優れた機械的特性を有することから,航空機,自動車,船舶などの構造部材としての使用が増加している.CFRPの機械的特性は時間および温度により著しく変化するいわゆる粘弾性挙動を示す.さらに吸水によってこの粘弾性挙動は大きく変化する.このようなCFRPを実構造部材として実環境下で長期に渡って使用する場合,強度に及ぼす時間,温度および吸水の影響を正確に評価する必要がある.CFRPの長期寿命予測手法として,マトリックス樹脂の粘弾性挙動に成立する時間ー温度換算則を基盤とした長期耐久性加速試験法(Advanced Accelerated Testing Methodology : ATM-2)が提案されている.これにより,任意の負荷条件および温度条件における長期寿命を短時間の加速試験により予測することが可能である.本研究では,一方向CFRP積層板を取り上げ,後熱処理を施した試験片をDry材,Dry材を吸水させた試験片をWet材として,種々の温度の下で静的強度試験を実施し,各強度に及ぼす時間,温度および吸水の影響を実験的に評価した.さらに,各強度試験の結果に対しATM-2を用いて長期耐久性評価を行い,静的強度と粘弾性の関係の観点から長期強度の低下機構を検討した.その結果,一方向CFRPの静的強度は負荷方向によってそれぞれ特徴的な時間,温度および吸水依存性を示すことがわかった.炭素繊維強化プラスチック(Carbon Fiber Reinforced Plastics;以下,CFRPと略称)は,軽量かつ高強度・高剛性であることから,より大型化,高速化,省エネルギ化が要求されている航空機,船舶,車両など,長期にわたって高度の信頼性が要求される構造部材に使われるようになってきた.このようなCFRPは屋外環境で様々な影響を受けながら使用されるが,とくに吸水はその機械的特性に大きな影響を及ぼすため,吸水したCFRPの長期強度低下の評価および機構解明が急務となっている.CFRPのマトリックスである樹脂の機械的特性は時間や温度によって著しく変化する粘弾性挙動を示し,さらに吸水によりこの粘弾性挙動は大きく変化する.したがってCFRPを実環境下において長期にわたり構造部材として用いる際には,強度の時間および温度依存性に及ぼす吸水の影響を正確に評価する必要がある.申請者は,マトリックス樹脂の粘弾性挙動に成立する時間ー温度換算則を基盤としたCFRPの長期耐久性加速試験法(Accelerated Testing Methodology;以下,ATMと略称)を提案している.これにより任意の負荷条件および温度条件における長期寿命を短期間の加速試験により予測することが可能となる.本申請の研究では,炭素繊維の強化方向を1つの方向にそろえた一方向CFRP積層板を取り上げ,熱処理を加えて乾燥させたDry材とDry材を吸水させたWet材の繊維方向引張および圧縮強度と繊維直角方向引張および圧縮強度に及ぼす温度および吸水の影響について実験的に評価を行い,ATMを適用し長期耐久性評価を行った.そして,マトリックス樹脂の粘弾性と破壊機構の観点から吸水したCFRPの長期にわたる強度低下について解明した.炭素繊維の強化方向を1つの方向にそろえた一方向炭素繊維強化プラスチック積層板(一方向CFRP積層板)を取り上げ,熱処理を加えて乾燥させたDry材とDry材を吸水させたWet材の繊維方向引張および圧縮強度と繊維直角方向引張および圧縮強度と温度の関係を実験によって求め,これらの結果に対して樹脂の粘弾性現象に成立する時間ー温度換算則を基盤とした耐久性加速試験法を適用し,長期耐久性評価を行った.これにより,マトリックス樹脂の粘弾性と破壊機構の観点から吸水したCFRPの強度低下機構を解明した.炭素繊維強化プラスチック(Carbon Fiber Reinforced Plastics;CFRP)は,鉄鋼に比べて高強度,高剛性,軽量という優れた機械的特性を有することから,航空機,自動車,船舶などの構造部材としての使用が増加している.CFRPのマトリックスである樹脂の機械的特性は時間や温度によって著しく変化する,いわゆる粘弾性挙動を示す.さらに吸水によってこの粘弾性挙動は大きく変化する.このような特性を有する樹脂をマトリックスとするCFRPの機械的特性も時間や温度のみならず吸水によって著しく変化する.また,CFRPは繊維を強化材としていることから,その機械的特性には著しい異方性がある.したがって,CFRPを実環境下で長期に渡って構造部材として用いる際には,種々の負荷方向における変形や強度の時間および温度依存性に及ぼす吸水の影響を正確に評価する必要がある.本研究では,一方向CFRP積層板を取り上げ,後熱処理を加えた試験片をDry材,Dry材を吸水させた試験片をWet材として,繊維方向引張および圧縮強度と繊維直角方向引張および圧縮強度に及ぼす温度および吸水の影響について実験的に評価する.また,時間-温度換算則を適用し,長期耐久性に及ぼす温度と吸水の影響を検討した.その結果,一方向CFRPの静的強度は負荷方向によってそれぞれ特徴的な時間,温度および吸水依存性を示すことがわかった.一方向

CFRP積層板を取り上げ,後熱処理を施した試験片をDry材,Dry材を吸水させた試験片をWet材として,種々の温度の下で静的強度試験を実施し,各強度に及ぼす時間,温度および吸水の影響を実験的に評価できた.また,疲労強度試験も順調に進んでいる.当初計画のとおり,一方向CFRP積層板のDry材とWet材の繊維方向引張および圧縮の静的強度と繊維直角方向引張および圧縮の静的強度に及ぼす温度および吸水の影響について実験的に評価できたため.一方向CFRP積層板を取り上げ,後熱処理を施した試験片をDry材,Dry材を吸水させた試験片をWet材として,種々の温度の下で疲労強度試験を実施し,各強度に及ぼす時間,温度および吸水の影響を実験的に評価する.一方向CFRP積層板のDry材とWet材の繊維方向引張および圧縮の疲労強度と繊維直角方向引張および圧縮の疲労強度に及ぼす温度および吸水の影響について実験的に評価し,平成23年度の成果とあわせて,疲労強度の定式化を行う.一方向CFRP積層板を取り上げ,後熱処理を施した試験片をDry材,Dry材を吸水させた試験片をWet材として,種々の温度の下で疲労強度試験を実施し,各強度に及ぼす時間,温度および吸水の影響を実験的に評価し,その成果を国内外の学協会で発表する.研究費は,学協会へ出席するための旅費として主に利用する.平成23年度に実施予定であった試験片の成形について,若干のとり残しがあるため,その分の実験消耗品の購入費用を平成24年度へ繰り越した.平成24年度は,若干のとり残しの試験片の成形を行うために,平成24年度へ繰り越した予算を用いて,実験消耗品の購入を行う.また,当初より計画していた平成24年度の予算は,当初より平成24年度に予定している一方向CFRP積層板のDry材とWet材の繊維方向引張および圧縮の疲労強度と繊維直角方向引張および圧縮の疲労強度を求めるための実験消耗品の購入および成果発表のための旅費にあてる.
アルギン酸リアーゼの原子レベルでの構造・機能相関解析

アルギン酸リアーゼは、酸性多糖アルギン酸におけるグリコシド結合をβ脱離反応により切断する。本研究は、アルギン酸リアーゼの構造・機能相関を解明することを目的としている。本年度は、一次構造上多糖リアーゼファミリー(PL-)7に属する酵素A1-II'におけるクレフト内各アミノ酸残基の役割およびPL-14酵素vAL-1(S)の作用様式を解析した。(1)PL-7アルギン酸リアーゼA1-II':部位特異的変異体R146AとY284Fの立体構造をX線結晶構造解析により分解能1.0Åで決定した。R146Aの結晶構造では、クレフトを覆うループL1の揺らぎ構造が消失していた。ループL1の開閉は酵素反応に必須であり、Arg146は周辺の残基および水分子との相互作用を介して、ループL1の動的構造を制御することが示唆された。Y284Fは、大幅な活性の減少を示すが、クレフト内残基の温度因子および水素結合様式に影響を及ぼさなかった。このことから、Tyr284は、酵素と糖との相互作用にのみ関わることが明らかになった。(2)PL-14アルギン酸リアーゼvAL-1(S):vAL-1(S)は、pH7ではアルギン酸から二糖四糖のオリゴ糖を遊離したが、pH10ではアルギン酸二糖を優先的に遊離した。したがって、本酵素がpH依存的な作用様式を示すことが明らかになった(pH7,エンド型;pH10,エキソ型)。本酵素とグルクロン酸との複合体の結晶構造において、グルクロン酸はpH7ではクレフトの外側(ストランドA6-A7周辺)、pH10ではクレフトの内側(A4-A6)に結合していた。このことから、本酵素は糖との結合様式をpH依存的に変化させることで、固有の作用様式を発現させることが明らかになった。アルギン酸はグルロン酸(G)とマンヌロン酸(M)から構成されるヘテロ多糖であり、そのグリコシド結合はアルギン酸リアーゼによる脱離反応で切断される。本研究は、多糖リアーゼファミリー5と7に属するアルギン酸リアーゼ(Sphingomonas sp.A1由来A1-IIIとA1-II')に焦点を当て、超高分解能X線・中性子線結晶構造解析及び酵素科学的解析により、該酵素の基質認識及び触媒反応機構を原子レベルで解明することを目的とする。本年度は、A1-II'と糖との複合体の結晶構造解析を進め、基質認識と触媒反応に関わる構造要因を明らかにする研究を計画した。A1-II'変異体(Y284F)と3糖GGG或いは3糖MMGとの複合体の結晶構造をそれぞれ分解能1.65Åと1.55Åで決定した。GGG或いはMMGは、A1-II'クレフト内の還元末端側サブサイト+1、+2、+3に結合していた。G或いはMのカルボキシル基は、サブサイト+1ではArg146とGln189に、サブサイト+2ではThr139とAsn141により厳密に認識される。一方、水酸基はGとMとの間で異なるアミノ酸残基と相互作用する。従って、ポリG及びポリM領域の両方に作用するA1-II'の基質認識には、GとMとの結合を許容するA1-II'特有のクレフト内構造が寄与していることを明らかにした。A1-II'変異体(H191N/Y284F)と4糖GGMGとの複合体の結晶構造を分解能1.80Åで決定し、酵素の触媒反応機構を解析した。このモデルから、以下の反応機構を提唱した。Gln、His、Tyrが触媒残基としてそれぞれカルボキシル基の安定化、C5プロトンの引き抜き、及びO4へのプロトン付加を行う。今後、この触媒反応機構を原子レベルで検証するために、超高分解能結晶構造解析を行う予定である。本研究は、超高分解能でのX線・中性子線結晶構造解析によりアルギン酸リアーゼの触媒反応機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、一次構造上多糖リアーゼファミリー(PL-)7に属する酵素Al-II'及びPL-14酵素vAL-1(S)のX線結晶構造を解析した。(1)PL-7アルギン酸リアーゼAl-II':発現系及び結晶化条件を再構築し、超高分解能0.8ÅのAl-II'リガンド非結合(アポ型)結晶構造を決定した。構造モデルにおいて、活性中心周辺に水素のomit mapを確認し、触媒反応におけるプロトンの動態を考察した。また、反応産物(アルギン酸3糖)との複合体結晶構造(分解能1.2Å)では、アポ型で見られたdisorder領域が消失し、PL-7保存残基Arg146とTyr284とのスタッキング相互作用が形成される。このことから、Al-II'クレフト構成残基は、糖との結合によりリジッドな構造に変化し、触媒反応を開始することが明らかになった。(2)PL-14アルギン酸リアーゼvAL-1(S):vAL-1(S)の発現系及び結晶化条件を構築した。セレノメチオニン誘導体結晶を用いた単波長異常分散法により位相を決定し、vAL-1(S)の立体構造を決定した。

β-jelly roll構造を基本骨格とするvAL-1(S)において、クレフト内PL-14保存残基Lys92、Arg116、Tyr128、Tyr130が活性中心を構成すると考えられるが、これらの残基は他ファミリーに属するアルギン酸リアーゼと異なる配置を示す。このことから、PL-14アルギン酸リアーゼは、新規の活性中心構造を有することが示唆された。アルギン酸リアーゼは、酸性多糖アルギン酸におけるグリコシド結合をβ脱離反応により切断する。本研究は、アルギン酸リアーゼの構造・機能相関を解明することを目的としている。本年度は、一次構造上多糖リアーゼファミリー(PL-)7に属する酵素A1-II'におけるクレフト内各アミノ酸残基の役割およびPL-14酵素vAL-1(S)の作用様式を解析した。(1)PL-7アルギン酸リアーゼA1-II':部位特異的変異体R146AとY284Fの立体構造をX線結晶構造解析により分解能1.0Åで決定した。R146Aの結晶構造では、クレフトを覆うループL1の揺らぎ構造が消失していた。ループL1の開閉は酵素反応に必須であり、Arg146は周辺の残基および水分子との相互作用を介して、ループL1の動的構造を制御することが示唆された。Y284Fは、大幅な活性の減少を示すが、クレフト内残基の温度因子および水素結合様式に影響を及ぼさなかった。このことから、Tyr284は、酵素と糖との相互作用にのみ関わることが明らかになった。(2)PL-14アルギン酸リアーゼvAL-1(S):vAL-1(S)は、pH7ではアルギン酸から二糖四糖のオリゴ糖を遊離したが、pH10ではアルギン酸二糖を優先的に遊離した。したがって、本酵素がpH依存的な作用様式を示すことが明らかになった(pH7,エンド型;pH10,エキソ型)。本酵素とグルクロン酸との複合体の結晶構造において、グルクロン酸はpH7ではクレフトの外側(ストランドA6-A7周辺)、pH10ではクレフトの内側(A4-A6)に結合していた。このことから、本酵素は糖との結合様式をpH依存的に変化させることで、固有の作用様式を発現させることが明らかになった。