hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓イオンチャネルの遺伝子異常と機能破綻の分子基盤

家族性洞不全症候群(SSS)に、心房型ミオシン重鎖MYH6が関与していることが明らかとなった。本研究の目的は、新規MYH6変異(delE933)の機能解析を行うことである。免疫沈降実験から、delE933はミオシン結合タンパクCとの結合異常を介してサルコメア構造の機能連関を乱すこと、myh6ノックダウンゼブラフィッシュは徐脈をきたすこと、これを野生型MYH6は補償できるが変異MYH6にはその効果がなかった。また、delE933を安定発現させたHL-1では活動電位伝導速度が低下した。以上から、洞結節のexit blockによってSSSを発症する新しい機序が考えられた。進行性心臓伝導障害(PCCD)の発端者の139名の遺伝子解析によって、心筋Naチャネル遺伝子(SCN5A)変異12例とコネキシン(Cx40)の遺伝子変異(Q58L)を同定した。N2A細胞に発現させたQ58Lのコンダクタンスは、正常(WT)の1/10に低下していた。またGFPタグCx40の蛍光共焦点顕微鏡像から、Q58Lではプラーク形成能が障害され、細胞膜上にびまん性に発現していた。以上の結果から、Q58Lはヒス・プルキンエ細胞におけるギャップ結合の電気生理学的特性とトラフィッキングに異常をきたし、刺激伝導系に特異的な障害をきたすと考えられた。なお本研究では、Q58Lのトランスジェニックマウスとゼブラフィッシュを作成したが、ともに心房・心室の拍動異常は見られなかった。これは、Cx40の刺激伝導内分布や他のコネキシンisoformとの機能的な関連が、ヒトと小動物では大きく異なっているためかもしれない。また、最近慶応大学の福田グループとの協力で、SCN5A変異E1784KのiPS心筋細胞のNa電流と活動電位測定を開始し、現在解析を進めている。E1784Kは3型QT延長症候群(LQT3)の中で最多の変異で、高率にBrugada症候群(BrS)と洞不全症候群(SSS)を合併するものとして研究代表者が報告したSCN5A変異である(Makita et al. J Clin Invest 2008)。従来のHEK293などの非心筋細胞を用いた解析法では、活動電位などの生理学的解析や薬理学的研究は不可能だったが、iPS心筋細胞を用いることによって、より生理的な条件で、患者特異的な分子病態メカニズムや新たな薬剤の効果を検討することができる。さらに、A01班の進める生体シミュレーションと有機的に連携することによって、不整脈の統合的理解が急速に進むと期待される。進行性心臓伝導障害(PCCD)の本邦発端者49名の遺伝子解析を行い、心筋NaチャネルSCN5A(9)、心筋KチャネルKCNH2(1)、ギャップジャンクションのconnexin40(Cx40)遺伝子GJA5(1)、拡張型心筋症の原因遺伝子である核膜タンパクラミンA/C LMNA(9)の変異を同定した。N2A細胞に発現させたCx40-Q58Lのコンダクタンスは、正常の1/10に低下し、プラーク形成能が障害され、細胞膜上にびまん性に発現しており、ヒス・プルキンエ細胞のギャップ結合の電気生理学的特性とトラフィッキングの異常によって、刺激伝導系に特異的な障害がもたらされていると考えられた。また、SCN5A変異のうち1例はプロモータ領域の変異で、Luciferase法で測定したSCN5A転写活性が大きく低下していた。A2-5班との協力によって、QT延長徴候群のうちSCN5A変異を持つ本邦LQT3登録症例のうち、pore領域の変異に直目し、パッチクランプ法で解析した機能異常と臨床像を比較検討している。Pore領域以外の変異と比較することによって、QT延長のメカニズムや臨床的重症度のとの関連を明らかにしようと考えている。また、最近慶応大学の福田グループとの協力で、SCN5A変異E1784KのヒトiPS心筋細胞のNa電流と活動電位測定を行っている。従来の非心筋細胞を用いた解析法では、活動電位などの生理学的解析や薬理学的研究は不可能だったが、iPS心筋細胞を用いることによって、より生理的な条件で、患者特異的な分子病態メカニズムや新たな薬剤の効果を検討することができる。さらに、これまでの候補遺伝子解析で同定されなかった致死性不整脈家系の原因遺伝子を同定するために、国立遺伝学研究所、東京大学、フランスINSRMとの共同研究でエクソーム解析を開始している。本研究によって致死性不整脈の未知の病因の解明が可能とれば、変異の機能解析やA01班の進める生体シミュレーションと有機的に連携することによって、不整脈の統合的理解が急速に進むと期待される。本年度の研究は以下の5点に総括される

1)致死性不整脈のコンピュータシミュレーション:コネキシン40を有する進行性心臓伝導障害(PCCD)においてプルキンエ線維のリエントリを、KチャネルKCNQ1の変異を有するQT短縮症候群において活動電位の短縮と心室細動のシミュレーションを行った。2)致死性不整脈症候群のエクソーム解析:PCCDブルガダ症候群、QT延長症候群(LQTS)、家族性洞不全症候群SSS)において全エクソン解析を行い、これまでに報告のない諺遺伝子の候補をいくつか同定した。現在、さらに家系解析と機能解析を進めている。PCCDの遺伝子についてはノックアウトマウスの精子を入手し、現在ホモマウスの樹立中である3)2.オランダ、フランスと本邦を含む国際共同研究によって、BrSのGWASを行い、これまで知られていたSCN5A以外にSCN10AやHEY2という新たな修飾遺伝子が明らかになった(Bezzina, Makita, et al. Nat Genet 2013)。4)iPS心筋細胞の電気生理学的解析:上記遺伝子解析で変異を同定した患者の一部からiPS心筋細胞を作製し、現在電気生理学的機能解析を行っている5)新規Caチャネル・Naチャネルの機能解析:これまでに遺伝性不整脈で報告のない新規Caチャネル、Naチャネルの変異を全エクソン解析で同定し、現在その機能異常をパッチクランプで解析中である。家族性洞不全症候群(SSS)はまれな徐脈性不整脈で、一部の症例に心筋NaチャネルSCN5AやペースメーカチャネルHCN4の遺伝子変異が報告されているが、多くの症例では原因が未解明である。近年のゲノムワイド関連解析から心房型ミオシン重鎖遺伝子MYH6がSSSに関与していることが明らかとなり、本研究室ではSSS患者に新たなMYH6遺伝子変異を見出した。本研究の目的は、1)我々が日本人SSSに同定した新規MYH6アミノ酸欠損変異(delE933)の機能解析を行うこと、2)家族性SSSの網羅的遺伝子解析によって新規分子病態を探索することである。免疫沈降実験によって、MYH6-delE933はサルコメアの構造機能調節に必須のミオシン結合タンパクC(MyBP-C)との機能的結合異常を介してサルコメア構造の機能連関を乱すことが判明した。またゼブラフィッシに内因性myh6のノックダウンで徐脈がもたらされ、野生型ヒトMYH6はmyh6を補償できたが変異MYH6にはその効果がなく、delE933は心拍数に関して機能喪失型変異だと判明した。また心房筋細胞HL-1にMYH6を安定発現させ、64点電極上で活動電位伝導速度を測定したところ、delE933の細胞は伝導が障害されていた。以上の結果から、洞結節のexit blockによってSSSを発症するという新たな疾患メカニズムが明らかになった。次に、心疾患関連459遺伝子をターゲットとするエクソンキャプチャーで家族性SSS患者のDNA網羅的に解析を行ったところ、新たな原因遺伝子Xを見出した。その分子機序は既知の原因遺伝子とは異なるものであると推測され、網羅的遺伝子解析が新たな遺伝性不整脈の分子機序解明に有効であることが示された。当計画研究では本年度、以下の3項目の研究を行った。1プルキンエ不整脈のコンピュータシミュレーション:研究代表者は以前、突然死2名を伴う進行性心臓伝導障害障害(PCCD)1家系に、コネキシン40 (Cx40)の変異を同定した。Cx40はプルキンエ線維(PF)に強く発現するギャップ結合(GJ)である。
分子遺伝学的手法を用いた癌細胞の存在診断法の確立

1.標的遺伝子の検索:carcino embryonic antigen(CEA)、estrogen receptor(ER)、MAGEの3種類の遺伝子について、正常組織・癌組織でのmRNAレベルの発現をRT-PCR法を用いて調べた。その結果、CEAは検索した150症例の正常上皮組織および癌細胞のすべてで発現が認められた。ERは癌細胞および正常上皮組織の約1/3に発現が認められた。MAGEは正常上皮組織では全く発現がなく、癌組織では1060%の症例で発現を認めた。以上より遺伝子としてまずCEAを用い、次いで陽性例についてMAGEを用いる方法が最適と結論した。2.リンパ節における微量癌細胞の検出:102例の手術症例より606個のリンパ節を摘出し半分を組織細胞(HD)、残り半分をRT-PCR法による遺伝子診断(GD)に用いた。各症例を(HD/GD)の組み合わせでみると(+/+)37例、(-/+)47例、(-/-)18例で(+/-)はなかった。再発率は(-/-)では0%、(+/+)では35%あったが(-/+)でも8%であり注目された。以上よりRT-PCR法による遺伝子診断では、組織診断で発現できない転移を検出できることが示された。3.末梢血中の微量癌細胞の検出;104例の癌患者の末梢血2mlをRT-PCR法で調べた。その結果、CEAmRNAの発現は対照健常者0%、治愈切除例19%、非切癒切除例56%、再発率70%であった。治癒切除例62例中CEA陰性の50例は全く再発していないが、陽性12例では3例が再発した。以上よりわずかの量の末梢血液より癌細胞の血中流入が判断でき、これが再発予測に活用できることが示された。4.化学療法の効果判定の応用:食道癌、胃癌患者の化学療法前後で血中のCEA遺伝子検出を行った。CR1例では術前CEA(+)がCEA(-)に変化した。これはpreliminaryであるが今後応用が期待できる分野である。以上、現時点でCEAを標的としたRT-PCR法はリンパ節や末梢血液中のわずかな癌細胞を検出できること、臨床的にもその応用が重要となり得ることが明らかとなった。1.標的遺伝子の検索:carcinoembryonic antigen(CEA)、estrogen receptor(ER)、MAGEの3種類の遺伝子について、正常組織・癌組織でのmRNAレベルの発現をRT-PCR法を用いて調べた。その結果、CEAは検索した150症例の正常上皮組織および癌組織の全てで発現が認められた。ERは癌組織および正常上皮組織の約1/3に発現が認められた。以上より標的遺伝子としてまずCEAを用い、次いで陽性例についてMAGEを用いる方法が最適と結論した。

2.リンパ節における微量癌細胞の検出:102例の手術症例より606個のリンパ節を摘出し半分を組織診断(HD)、残り半分をRT-PCR法による遺伝子診断(GD)に用いた。各症例を(HD/GD)の組みあわせでみると(+/+)37例、(-/+)47例、(-/-)18例で(+/-)はなかった。再発率は(-/-)では0%、(+/+)では35%であったが(-/+)でも8%であり注目された。以上よりRT-PCR法による遺伝子診断で、組織診断では発見できない転移を検出できる事が示された。3.末梢血中の微量癌細胞の検出:104例の癌患者の末梢血2mlをRT-PCR法で調べた。その結果、CEAmRNAの発現は対照健常者0%、治癒切除例19%、非切癒切除例56%、再発例70%であった。治癒切除62例中CEA陰性の50例は全く再発していないが、陽性12例では3例が再発した。以上よりわずかの量の末梢血液より癌細胞の血中流入が判断でき、これが再発予測に活用できる事が示された。以上、現時点でCEAとMAGE遺伝子を標的としたRT-PCR法はリンパ節や末梢血液中のわずかな癌細胞を検出できる事、臨床的にもその応用が重要となり得る事が明らかとなった。1.リンパ節における微量癌細胞の検出:平成8年度より更に症例数を増やし125例の手術症例より700個のリンパ節を摘出し半分を組織診断(HD)、残り半分をRT-PCR法による遺伝子診断(GD)に用いた。各症例を(HD/GD)の組みあわせでみると(+/+)47例、(-/+)51例、(-/-)27例で(+/-)はなかった。再発率は(-/-)では0%、(+/+)では37%であったが(-/+)でも10%であり注目された。この事は以前よりリンパ節転移なしと診断された症例からも約10-20%に再発がおこることを支持した所見と考えられる。2.末梢血中の微量癌細胞の検出:128例の癌患者の末梢血2mlをRT-PCR法で調べた。その結果、CEAmRNAの発現は対照健常者0%、治癒切除例19%、非治癒切除例59%、再発例79%であった。治癒切除67例中CEA陰性の52例は全く再発していないが、陽性15例では4例が再発した。この事は治癒切除例でも血中CEA遺伝子検出が陽性であれば再発率が高いことを示唆している。3.化学療法の効果判定の応用:食道癌、胃癌患者12名の化学療法前後で血中のCEA遺伝子検出を行った。CR1例では術前CEA(+)がCEA(-)に変化した。これはpreliminaryであるが今後応用が期待できる分野である。以上、現時点でCEAを標的としたRT-PCR法はリンパ節や末梢血液中のわずかな癌細胞を検出できる事、臨床的にもその応用が重要となり得る事が明らかとなった。
IL-18で誘導されるMyD88非依存在、IL-4依存性IgE産生誘導機構の解明

IL-18は、IFN-γ誘導因子として発見された。しかし、その様な機能を発揮するのはIL-12が共存した場合で、IL-12の非存在下ではTh2サイトカインの産生を誘導する。例えば、IL-2の存在下(IL-12は非共存)でT細胞をIL-18で刺激すると、Th2サイトカインの産生が誘導できる。また、IL-3の存在下で好塩基球/肥満細胞を刺激すると、Th2サイトカイン、ケモカイン、そして化学伝達物質の産生を誘導できる。これらの産生物は、これまでの研究から、いずれもがアレルギー性炎症を誘導しうることが明らかにされている。実際、今回の研究から、「IL-18の過剰産生は自然型アトピー性疾患を誘導する可能性」が示唆されてきた。私達は平成13年度は、IL-18によるIgE非依存性のアトピー性皮膚炎(AD)の誘導機序を研究した。その結果、IL-18が皮膚局所で過剰集積する遺伝子改変マウス(caspase-1トランスジェニックマウス)が、アレルゲン感作がなくても、ADを発症することが明らかとなった。次に、このマウスからStat6を欠損させたところ、血中でIgEは全く検出できなくなったが、ADの発症程度は軽減しなかった。以上のことから、IL-18依存性、IgE非依存性にADが発症することが明らかとなった。平成14年度は、IL-18によるIgE産生誘導機序を研究した。その結果、IL-18は、恒常的にIL-18Rを発現しているCD1d拘束性のNKT細胞を刺激して、IL-4の産生とCD40Lの発現を誘導すること、そしてこのIL-18で刺激されたNKT細胞が、通常のヘルパーT細胞と協調してB細胞を刺激し、IgE産生を誘導することが明らかとなった。そして、最終年度の平成15年度は、IL-18による気管支喘息の誘導を証明した。私達は新しい実験的な喘息モデルを樹立できたと考えている。特に従来、抗原投与だけでは、DTHはおこるが、AHRはおこらないTh1を移入されたマウスであっても、IL-18/抗原チャレンジによって、AHRが誘導されることを示すことが出来た。特に、IL-18で刺激されたTh1細胞は、Th1サイトカインとともに、Th1サイトカインを産生することも明らかとなった。従って、IL-18はアレルギー性疾患に対する効果的な薬剤を作製する上で、重要な薬理学的な標的分子になると考えられる。IL-18はIL-12の共存下でT細胞、B細胞、NK細胞に作用して、IFN-γの産生を極めて強力に誘導する。一方、IL-2の存在下でIL-18はナイーブT細胞に作用して、IL-4とIL-13の産生ならびにCD40Lの発現を誘導する。IL-18のシグナルはMyD88/IRAK/TRAF6等のシグナル伝達分子を介して核内に伝達される。

従って、MyD88KOマウスの脾細胞をin vitroでIL-18で刺激してもNK活性あるいはIFN-γの産生は誘導されなかった。また、IL-12とIL-18をMyD88KOマウスに投与しても、IFN-γの産生は誘導されなかった(WTマウスでは大量のIFN-γが検出されていた)。興味あることには、IL-18を投与したMyD88KOマウスでは、その血清中に早い時期から大量のIgEを検出することができた。しかし、前もってCD4^+T細胞を抗体処置で消去しておくと、IL-18を投与してもIgE産生は誘導されなかった。また、抗IL-4抗体と抗IL-4R抗体を投与したMyD88KOマウスにIL-18を投与してもIgE産生は起こらなかった。以上のことから、IL-18をMyD88KOマウスに投与すると、MyD88非依存的にCD4^+T細胞が刺激を受けてIL-4とCD40Lを発現すること、そしてCD40LとIL-4がB細胞に作用してIgE産生を誘導することが明らかとなった。しかし、IL-18をMyD88KOマウスに投与した場合、同様にIL-18を投与されたWTのマウスに比し、IL-4とIL-13の産生は軽度であった。また、今回の研究から、MyD88KOマウスでは、既にTh2優位に傾いており、SPFで飼育していてもIgEのレベルが高値であることが示された。今後は、IL-18のIL-4産生に結びつくシグナルの伝達経路を解明していきたいと考えている。IL-18は発見当初、IFN-γ誘導因子と呼ばれた。その後、その様な作用を発揮するのは、IL-12が共存した場合であることが明らかとなった。IL-18のシグナルはMyD88/IRAK/TRAF6等のシグナル伝達分子を介して核内に伝達される。一方、IL-2の存在下でIL-18はナイーブT細胞に作用して、IL-4とIL-13の産生ならびにCD40Lの発現を誘導する。我々は、IL-18を投与したMyD88KOマウスでは、その血清中に早い時期から大量のIgEを検出することができた。以上のことから、IL-18をMyD88KOマウスに投与すると、MyD88非依存的にCD4^+T細胞が刺激を受けてIL-4とCD40Lを発現すること、そしてCD40LとIL-4がB細胞に作用してIgE産生を誘導することが予想された。最近我々は、IL-18がNKL1.1^+CD4^+T細胞(NKT)細胞に作用することを明らかにした。実際NKT細胞を欠損するCD1KOマウスにIL-18を投与するとIgE産生が誘導されないことを明らかにした。今後は、NKT細胞におけるIL-18によるIL-4産生に結びつくシグナルの伝達経路を解明していきたいと考えている。IL-18のシグナルはMyD88/IRAK/TRAF6等のシグナル伝達分子を介して核内に伝達させる。
骨髄異形成症候群におけるアザシチジン治療抵抗性をもたらす遺伝子変異の網羅的解析

本研究では次世代シークエンサーを用いた経時的な解析により、骨髄異形成症候群患者に認められるアザシチジン抵抗性を獲得する遺伝子変異を探索し、7つの候補遺伝子を抽出した。そのうち唯一の新規新出変異であるMAP4K2に着目し、同遺伝子の詳細な解析をin vitroで行った。まず変異遺伝子の外因性発現を行った白血病細胞およびCRISPR/Cas9システムで作成した遺伝子変異の片アレルノックインを導入した白血病細胞の両者において、アザシチジン耐性が獲得されることをアザシチジン投与後の増殖能の評価により示した。また変異遺伝子の外因性発現を行った白血病細胞ではアザシチジン投与後のアポトーシス亢進が認められないことも確認した。加えてアザシチジン耐性惹起に関する分子学的機序の解析として、MAP4K2が関わるTNF-aとJNK経路に着目した。まずアザシチジン投与時に変異遺伝子の外因性発現を行った白血病細胞ではTNF-aの発現が上昇することを定量PCRで捉えた。またこの現象はTNF-a投与時にも同様に認められた。更にはウェスタンブロッティングを用いて、MAP4K2遺伝子変異導入に伴うユビキチン化低下によるMAP4K2蛋白の安定性の向上が起こり、それによりTNF-a投与時にJNK経路の活性化することを証明している。本研究はMDS患者検体の全エクソンシークエンスにより認められた遺伝子変異を用いて、in vitroでアザシチジン治療抵抗性が誘導されることを証明した初めての研究報告である。本研究ではMAP4K2遺伝子変異によるアザシチジン投与時のTNF-α活性化および引き続いてのJNK経路の活性化がアザシチジン耐性に寄与している可能性を示唆しており、今後のアザシチジン治療抵抗性メカニズムの解明の一助となることが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。今までの研究で同定された遺伝子変異がアザシチジン治療に抵抗性をもたらしているかを確認するため、新規新出変異であるMAP4K2に着目し、その野生型および変異体を外因性に発現させるレトロウイルスベクターを作成し、白血病細胞株であるKasumi-1へ導入しアザシチジン暴露に対する表現系の変化を調べた。低用量のアザシチジン投与から12日間増殖能を確認したところ、day 10からの3日間ではMAP4K2野生型および変異体を発現した細胞はコントロールの細胞株と比較して有意に高い増殖能が認められた。次にMAP4K2が真にアザシチジンのDNA脱メチル化効果に対して耐性を惹起することを確認するため、脱メチル化が強く見られるアザシチジンの添加条件におけるMAP4K2の効果を、day 8から6日間の細胞増殖を評価した。結果、アザシチジン暴露後のMAP4K2野生型および変異体を発現させた細胞はコントロールの細胞株と比較して有意に高い増殖能が認められた。また同条件でのアザシチジン添加後のアポトーシス細胞の増加の有無について、day 11の時点で解析を行ったところ、コントロール細胞では有意なアポトーシス細胞の増加が認められたものの、MAP4K2野生型および変異体を発現した細胞では、アポトーシスの有意な増加は認められなかった。続いてアザシチジンによる長期的影響を増殖・分化能の保持の点から解析することを目的として、半固形培地を用いたコロニー形成能の変化を確認したところ、MAP4K2変異体を発現した細胞はコントロールと比較してアザシチジン添加後に高いコロニー形成能が認められ、長期的に高い増殖・分化能を保持していることがわかった。以上、本年度では骨髄異形成症候群患者検体の経時的な全エクソンシークエンスで認められた遺伝子変異を用いて、in vitroでアザシチジン治療抵抗性が誘導されることを確認した。本研究は骨髄異形成症候群に対するアザシチジン治療中の耐性獲得機序を探索するため、ヒト検体を用いた経時的な全エクソンシークエンスで認められた遺伝子変異を用いて、アザシチジン耐性が惹起されることを確認することを主目的としている。この点について本年度の研究では、今まで得られている遺伝子変異の内、MAP4K2という新規新出変異が実際にアザシチジン耐性を誘導することを、白血病細胞株を用いたin vitroの実験系で示している。そのため現状では、飛躍的に研究が進展しているとまで言うことは出来ないものの、おおむね予定通りの研究の進捗状況が得られていると考えられる。

更にはウェスタンブロッティングを用いて、MAP4K2遺伝子変異導入に伴うユビキチン化低下によるMAP4K2蛋白の安定性の向上が起こり、それによりTNF-a投与時にJNK経路の活性化することを証明している。本研究はMDS患者検体の全エクソンシークエンスにより認められた遺伝子変異を用いて、in vitroでアザシチジン治療抵抗性が誘導されることを証明した初めての研究報告である。本研究ではMAP4K2遺伝子変異によるアザシチジン投与時のTNF-α活性化および引き続いてのJNK経路の活性化がアザシチジン耐性に寄与している可能性を示唆しており、今後のアザシチジン治療抵抗性メカニズムの解明の一助となることが期待される。今後の本研究の方針としては、MAP4K2がどのようにアザシチジン耐性を誘導するかの分子学的機序を探索するため、アザシチジンやMAP4K2を刺激するサイトカインであるTNF-aを投与した際の遺伝子発現量の推移を、全RNAシークエンスやRT-PCRを用いて確認する。またMAP4K2やその経路を阻害する小分子化合物を用いて、MAP4K2野生型および変異体を発現させた細胞が示したアザシチジン耐性が、MAP4K2阻害等で解除されるかを解析する。また現在得られているデータを補強するため、CRISPR-Cas9システムを用いたMAP4K2遺伝子変異のノックイン細胞を作成し、レトロウイルスによる遺伝子発現の系と同様のアザシチジン耐性獲得が得られるかを確認する。それに加え、遺伝子の発現抑制もしくは過剰発現を来すコンストラクトを、現在準備中のNUP98-HOXD13トランスジェニックマウスの骨髄に導入して移植し、MDSマウスを作製する。移植後MDSを発症したマウスに対し、アザシチジンを投与し、アザシチジン治療抵抗性がin vivoの系で再現されるかを検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
近世大名家の教育における「奥」「表」関係の成立と発達に関する比較制度史的研究

本研究の課題は、近世大名家の城中における教育の実態の解明と、その様式や慣行の成立・発達の過程にみられる阻害的要因と促進的要因との間の相互関係の検討である。従来、城中教育の展開は、好学の藩主の恣意によるとされ、発展性や継続性を保証しない特異な事績として処理されてきた。何処で、どの様に、どんな科目を学んだかという検討が、学習様式や教育慣行の成立の解明に結びつかなかった。それは、城中という特殊性を過大に評価した結果であるが、必ずしも正確ではない。そこで、比較の基準として、初めに尾張徳川家の城中教育の問題を取り上げ、次いで岡山藩主池田家、加賀藩前田家、高田藩榊原家、新発田藩溝口家と対比し、同様の事態が存在したかどうか、阻害的要因・促進的要因はどの様な形で現れたかを検討したのである。その結果、以下の諸点が明らかになった。(1)城中は(江戸城に典型的に見られるように)、概ね3つの空間(奥・中奥・表)から成り立っており、多様で厳格な制約が勤務する武士・足軽の行動を縛っていた。それ故、家臣が自発的な学習の機会を設定することは困難で、個人的学習の場を外に求めるほかなかった。(2)中奥・表における教育の機会が組織されたのは、そのような制約の緩和によるが、固め・通用・座席などの規式は始終重要な意味を持ち、教育の形態を身分的・閉鎖的・儀式的にした。(3)幕末になると、城中の学習活動は盛んとなり、教育組織と構造を欠くものの「巨大な学校」の観を呈した。翻訳・会読・輪講・素読などが頻繁に行われ、御廉中が「透き聞き」をすることもあった。今後は、さらに多くの大名家の実態を検討し、以上の成果と比較しながら、両要因の影響関係の解明を進めたい。本研究は、近世武家社会の教育文化を手がかりとして、その発達経緯と近代的素地の形成過程を解明しようとするものであり、とくに、諸大名家の日常的な奥向き教育の実態とそれに関わる伝統や慣行の分析を行い、学問所・藩校などの教育との一体性・関連性を明らかにすることを目的として行った調査・研究の結果、本年度においては、以下のことが分かった。1,加賀藩前田家文書・高田藩榊原家・尾張藩徳川家文書の家政史料によって、城中規式・慣行の検討を進め、とくに、比較の基準としての尾張徳川家における御小納戸役の文化・文政期「御留守日記」70冊を撮影・整理し、これまでに収集した「尾州御小納戸日記」「江戸御小納戸日記」と併せて分析したところ、「表」と「奥」(大奥・中奥)には空間的・社会的に厳然とした区別があり、とりわけ「奥」は藩主を中心とする特定の、許可された者たちの世界であることが明らかになった。2,「奥」には、秩序を維持するために、様々な規式・慣行があり、学問・教育を行う上でも大きな制約になっていた。出入り願い、御側固め、誓詞・判元の決まりなどは、奥での教育の機会の開放を妨げる規式であり、月次講釈ですら、厳格な座列の規定と警護のなかで行われたことが知られる。3,奥に出入りが許された者たちは、職務に関わる知識にとどまらず、藩主なその弟子の学問・教養形成に関与することが多く、詩歌を献じたりすることもあり、日常的に「稽古」の必要に迫られており、「片出入り」の願いを出して私邸に教師をまねいて教養を積んだ。

本研究は、近世武家社会の教育文化を手がかりとして、その発達経緯と近代的素地の形成過程を解明しようとするものであり、平成7年度における研究成果に基づいて、諸大名家の日常的な奥向き教育の実態とそれに関わる伝統や慣行の分析を行い、学問所・藩校等の教育との一体性・関連性を明らかにすることを目的とする。とりわけ本年度においては、奥向き教育の実態とその発達の経緯を分析し、促進的要因と阻害的要因の関係について検討した結果、以下の諸点の知見を得た。1,城中では、藩主やその子弟の学問・教育がまず中奥で開始され、側近(小姓・御小納戸)の学習活動が捕足的位置づけの中で組織された。場所を異にする諸種の講釈・会読が、そのような目的に対応していた。2,それらは、決して好学な藩主の恣意によって開始され、学問熱の低下と共に終了したのではなく、典籍・日時を決め、参加者や参加形式に制限を加えつつも継続され、儀式化された。3,幕末になると、城中の学習活動は盛んになり、教育組織と構造を欠くものの、城中はまるで「巨大な学校」の観を呈した。講釈・会読・輪講・素読などが頻繁に行われ、尾張家では、御廉中が「透き聞き」をすることもあった。4,こうした傾向は、儒学の学習に留まらず、国学・有識故実・絵画・華道・座作進退・囲碁・音楽から武術の稽古にまで及んだ。このような検討は、家政資料に拠らざるを得ないが、いずれも膨大であり、研究をさらに精緻にするためにはさらに多くの大名家を調査する必要がある。今後も、着実に個別研究を重ねたい。
細胞接着シュウタントの解析と変異遺伝子の単離

ニンジンの細胞株non-embryogenic callusは、ソマクローナル変異の結果、細胞接着がルーズになるとともに、形態形成能力を失っている。この細胞株では、ペクチン多糖の中性糖側鎖(アラビナン)に変化が見出されたが、ニンジンでは原因遺伝子の探索が事実上不可能である。そこで本研究では、Nicotiana属中で最小のゲノムを持つN.plumbaginifoliaの半数体植物を材料として用い、同様の性質を示すミュータントの作出と解析を行うことで、ペクチン多糖の機能解明と細胞接着関連遺伝子の単離をめざし、以下の成果を得た。1.半数体N.p.の葉切片に重粒子線の照射(窒素,5Gy)を行ったところ、細胞間接着性が弱く不定芽形成能力を失ったカルスが、11.8%の葉切片に出現した。次に、T-DNAをアグロバクテリウムを介して導入したところ、6.7%の葉切片に不定芽分化をせず細胞接着の弱いカルスが出現した。2.変異カルス株nolacp-H14について組織化学的観察を行ったところ、細胞間が分離しており、ルテニウムレッドによるペクチンの染色性が非常に弱いことが観察された。また、細胞壁多糖を分画し、多糖の解析を行ったところ、nolacp-H14では、ヘミセルロースと挙動をともにするペクチン側鎖のアラビナンが欠失しており、本来細胞壁と結合するべきペクチンが培地に漏出していることが判明した。3.これらの細胞株から、TAIL-PCR法を用いて、T-DNAの挿入された遺伝子のクローニングを行ったところ、5種類の細胞壁機能・合成に関係している可能性の有るクローンが得られた。中でも、nolacp-H18は、動物の多糖合成酵素と相同性が見出された。現在、これらの遺伝子の機能確認を行うとともに、発現特性の調査を行っている。ニンジンの細胞同士が堅く結合しているカルスEmbryogeniccallus(EC)は不定胚形成能力を有するが、長期間継代培養された細胞株Non-embryogeniccallus(NC)は、ソマクローナル変異の結果、非常に細胞接着がルーズになるとともに、形態形成能力を失っている。この細胞株では、ペクチン多糖の中性糖側鎖の構造および量に大きな差のあることが見出された。しかし、NCはソマクローナル変異で生じたものなので、その原因遺伝子の探索が事実上不可能である。そこで本研究では、Nicotiana属中で最小のゲノムを持つN.plumbaginifoliaの半数体植物を材料として用い、ニンジンのNCと同様の性質を示すミュータントの作出を行うことで、細胞接着関連遺伝子の単離をめざした。その結果、半数体N.p.の葉切片に重粒子線の照射(窒素,5Gy)を行うことにより、細胞間接着性が弱く不定芽形成能力を失ったカルスが、11.8%の葉切片に出現した。また、ハイグロマイシン耐性マーカーを有するT-DNAを導入したところ、6.7%の葉切片に同様のカルスが出現した。次に、T-DNAの導入により得られた変異カルス株nolacp-H8について、組織化学的蜆察を行った。その結果、nolacp-H8では、細胞間が分離しており、ルテニウムレッドによる染色性が非常に弱いことが観察された。本研究において新たに得られた器官分化能力を喪失し細胞間接着が弱くなったN.p.の突然変異体を用いることにより、今後、未だ全く解明されていない高等植物の細胞接着の機能とメカニズムについて分子生物学的なアプローチからの研究が進むことが期待される。

ニンジンの細胞同士が堅く結合しているカルスEmbryogeniccallus(EC)は不定胚形成能力を有するが、長期間継代培養された細胞株Non-embryogeniccallus(NC)は、ソマクローナル変異の結果、非常に細胞接着がルーズになるとともに、形態形成能力を失っている。この細胞株では、ペクチン多糖の中性糖側鎖の構造および量に大きな差のあることが見出された。しかし、NCはソマクローナル変異で生じたものなので、その原因遺伝子の探索が事実上不可能である。そこで本研究では、Nicotiana属中で最小のゲノムを持つNplumbaginifoliaの半数体植物を材料として用い、ニンジンのNCと同様の性質を示すミュータントの作出と解析を行うことで、ペクチン多糖の構造と機能の理解と細胞接着関連遺伝子の単離をめざした。その結果、ハイグロマイシン耐性マーカーを有するT-DNAを導入したところ、6.7%の葉切片に不定芽分化をせず細胞接着の弱いカルスが出現した。そこで、変異カルス株nolacp-H14について、組織化学的観察を行ったところ、nolacp-H14では、細胞間が分離しており、ルテニウムレッドによるペクチンの染色性が非常に弱いことが観察された。また、細胞壁多糖を分画し、その構成糖分析とペクチンの構造解析を行ったところ、nolacp-H14では、ペクチン側鎖のアラビナンが欠失しているおり、本来細胞壁と結合するべきペクチンが培地に漏出していることが判明した。ニンジンの細胞株non-embryogenic callusは、ソマクローナル変異の結果、細胞接着がルーズになるとともに、形態形成能力を失っている。この細胞株では、ペクチン多糖の中性糖側鎖(アラビナン)に変化が見出されたが、ニンジンでは原因遺伝子の探索が事実上不可能である。そこで本研究では、Nicotiana属中で最小のゲノムを持つN.plumbaginifoliaの半数体植物を材料として用い、同様の性質を示すミュータントの作出と解析を行うことで、ペクチン多糖の機能解明と細胞接着関連遺伝子の単離をめざし、以下の成果を得た。1.半数体N.p.の葉切片に重粒子線の照射(窒素,5Gy)を行ったところ、細胞間接着性が弱く不定芽形成能力を失ったカルスが、11.8%の葉切片に出現した。次に、T-DNAをアグロバクテリウムを介して導入したところ、6.7%の葉切片に不定芽分化をせず細胞接着の弱いカルスが出現した。2.変異カルス株nolacp-H14について組織化学的観察を行ったところ、細胞間が分離しており、ルテニウムレッドによるペクチンの染色性が非常に弱いことが観察された。また、細胞壁多糖を分画し、多糖の解析を行ったところ、nolacp-H14では、ヘミセルロースと挙動をともにするペクチン側鎖のアラビナンが欠失しており、本来細胞壁と結合するべきペクチンが培地に漏出していることが判明した。3.これらの細胞株から、TAIL-PCR法を用いて、T-DNAの挿入された遺伝子のクローニングを行ったところ、5種類の細胞壁機能・合成に関係している可能性の有るクローンが得られた。中でも、nolacp-Hl8は、動物の多糖合成酵素と相同性が見出された。現在、これらの遺伝子の機能確認を行うとともに、発現特性の調査を行っている。
生理機能の発現と組換え機構

(1)細胞分化におけるDNAの再編成の機構の解析。川市は、抗原受容体遺伝子のVーDーJ部分の組換え部位にある23塩基対のスペ-サ-を持つJk型の認識配列に特異的に結合する蛋白質RBPーJkを未熟リンパ球から精製し、そのアミノ酸配列を基にしてcDNAのクロ-ニングに成功し、ヒト、マウス、ショウジョウバエのRBPーJkの遺伝子構造を明らかにした。さらに、ショウジョウバエのRBPーJkの遺伝子が、Suppressor of Hairlessとして知られる末梢神経系や感覚器官の分化決定に重要な役割を果たす遺伝子であることが判明した。山岸は、同様に抗原受容体遺伝子の再編成の解析を行ない、マウス抗体L鎖VJ遺伝子再配列の産物としての環状DNAを解析し、複数個の逆位と欠失による組換えを明らかにした。マウス抗体H鎖クラススイッチの過程で産生される環状DNAを解析し、スイッチ領域のなかの部域的組換えの存在を明らかにした。大石は、ゲノムDNAのdifferential cloningのためIGCR法の方法を開発したが、さらに本方法に改良を加え、哺乳動物ゲノム中に10^<ー6>から10^<ー7>の頻度で存在する異なったDNA断片をモデル系から濃縮クロ-ニングすることに成功した。(2)原核生物における遺伝子機能の発現制御に関与する組換え機構の解析。小林は、胞子形成に関与するspoIVCA遺伝子を解析し、それが胞子形成中期に母細胞で働く部位特異的組換え酵素の遺伝子であることを発見した。この酵素はinvertaseやresolvaseと高い相同性を持ち、欠失によって胞子形成期に特異的なシグマ因子σ^Kを新しく作りだすことが分かった。駒野は、プラスミドR64のなかにrci遺伝子によって起こされるDNA逆位の存在を発見し、シャフロンモデルを提唱した。さらに、pilV遺伝子がシャフロンのDNA再編成によりC末端部を変換することで、液内接合伝達において受容菌の特異性を決定していることを明らかにした。(3)遺伝子の標的組み込みと非相同的組換え機構の解析。池田は、ファ-ジT4における非相同的組換えについて解析し、ファ-ジT4トポイソメラ-ゼと、相同的組換えに関与するファ-ジT4 uvsX遺伝子が、相同性のない、あるいは短い相同性を持つDNA間の組換えに関与することを見いだし、それぞれの機能が独立した機構で働いていることを示した。島田は、TTR(トランスサイレチン)遺伝子を単離し、家族性アミロイド-シスの原因が変異TTR遺伝子であることを明らかにした。又、ヒト変異TTR遺伝子をマウス胚性幹細胞に導入してキメラマウスを作製し、得られたキメラマウスどうしを交配することによって変異TTR遺伝子をホモ接合体として持つTTR欠損マウスの作製に成功した。町田は、Agrobacterium tumefaciens Tiプラスミド上のTーDNAが植物細胞に移動し、染色体DNAに組み込まれる機構を研究している。二つの独立に単離した形質転換タバコの染色体上のTーDNA挿入部位近傍の塩基配列を解析したところ、いずれの場合にもその近くにSINEと呼ばれる転移性の反復配列が存在することを見いだした。池田は、ファ-ジT4における非相同的組換えについて解析し、ファ-ジT4トポイソメラ-ゼと、相同的組換えに関与するファ-ジT4 uvsX

遺伝子が、相同性のない、あるいは短い相同性を持つDNA間の組換えに関与することを見いだし、それぞれの機能が独立した機構で働いていることを示した。島田は、TTR(トランスサイレチン)遺伝子を単離し、家族性アミロイド-シスの原因が変異TTR遺伝子であることを明らかにした。又、ヒト変異TTR遺伝子をマウス胚性幹細胞に導入してキメラマウスを作製し、得られたキメラマウスどうしを交配することによって変異TTR遺伝子をホモ接合体として持つTTR欠損マウスの作製に成功した。町田は、Agrobacterium tumefaciens Tiプラスミド上のTーDNAが植物細胞に移動し、染色体DNAに組み込まれる機構を研究している。二つの独立に単離した形質転換タバコの染色体上のTーDNA挿入部位近傍の塩基配列を解析したところ、いずれの場合にもその近くにSINEと呼ばれる転移性の反復配列が存在することを見いだした。
非小細胞肺癌における癌関連肺線維芽細胞による癌進展のメカニズムの解明

肺癌組織中の癌関連線維芽細胞(CAF)の機能解析及びより効果的なCAFを標的とする薬剤の開発につながる新たな知見の創出を目標とした。CAFの生理機能活性を制御するCAF特異的マーカーの中でもCAFで高発現しているITGA11が、CAFに強く発現しCAFの遊走能活性の亢進に関わっていることを解明した。また、CAFに発現するITGA11を介してCAFから産生されるファイブロネクチンが機能に作用することを発見した。CAFに発現するITGA11は再発の予測マーカーとしても期待さえ、CAFを介する癌の進展を制御するための新たなCAF標的創薬につながる基盤研究となった。癌間質量や癌間質内の線維芽細胞の増殖能の高さが予後と強く相関し、癌間質線維芽細胞の存在様式と癌悪性度の密接な関連性が報告され癌間質の制御の重要性が指摘され始めている。癌間質の主な構成成分である線維芽細胞は、癌関連肺線維芽細胞(CAF: Cancer-associated fibroblast)と称され、癌治療の新たな標的として注目を集めているが肺癌におけるCAFの解明は不十分である。CAFは、本来の肺臓器固有の線維芽細胞が、癌細胞の増殖や進展により変化し、活性化された筋線維芽細胞の特性を持つと考えられている。癌細胞は、癌塊のなかで線維芽細胞を筋線維芽細胞に変化させ、後にその癌筋線維芽細胞よりの増殖促進シグナルを受け、より悪性の癌細胞に変化させている。つまり、癌細胞と線維芽細胞は、癌内で共に進化していると考えられ、癌細胞は、間質組織との密接な連携のもとにはじめて生存可能であり、癌細胞-癌間質相互作用は、まだまだこれから発展する分野である。今後さらに癌間質の各種細胞間の相互作用を理解することにより、従来とは、全く異なった新たな治療戦略や診断法に発展する可能性が高い。本研究のゴールはCAFの機能解析及びより効果的なCAFを標的とする薬剤の開発につながる新たな知見の創出である。肺癌組織中のCAFの生物学的特性を解明し、CAFを標的とした肺癌治療法を新しい領域からアプローチすることを本研究の主目的とする。CAFを標的とした分子標的治療法の確立に基盤形成をなす研究である。将来的に肺癌患者の実地治療により有効な治療効果が期待され癌患者の生命予後の改善につなる可能性が十分に期待される。非小細胞肺癌の手術症例より、手術肺検体から得られる癌組織よりex vivoでの肺線維芽細胞分離培養を行い非癌部の正常肺線維芽細胞をコントロールとしてCAFの生理機能の比較検討を完了した。CAFの生理活性機能を遊走能、コラーゲンゲル収縮能が亢進していることを確認した。第4期科学技術計画(ライフイノベーション)に記述されている方針に基づき研究協力施設の理化学研究所においてCAGE解析を行い、CAFの転写活性の網羅的解析の結果からCAFで高発現する特異的なマーカーの候補因子を同定しCAFの生理活性機能との関連検討を行っている。我々は中でもCAFで特に発現が更新していたCol11a1,SPARC,SERPINEB9,GPCR5B,ERK5に着目してColl11a1とGPCR5B,SPRCに関して肺がん手術検体の腫瘍組織でのWestern-Blotting及び免疫染色でたんぱくレベルでも発現が更新していることを確認した。現在、症例増やしてこれらのCAF候補因子の高発現を免疫染色で確認して染色程度をH-scoreによる定量化を行い予後や悪性度、再発期間などの臨床背景との相関を検討しCAFの臨床バイオマーカーとしての意義を確認していく予定である。しかし、CAFの候補因子Col11a1,SPARC,SERPINEB9,GPCR5B,ERK5に関して中でもERK5の強制発現を正常の肺線維芽細胞に高発現させるためにレンチウイルスで強制発現をさせたがCAFの生理機能活性に近ずく変化、すなわち遊走能、コラーゲンゲル収縮能が亢進を認めなかった。別の手法を用いてLipofectionやElectropolationによるERK5 Vectorの挿入を試みたがTransfection効率が悪く失敗に終わっている状況である。よって、現在、CAF特異的制御因子を正常肺線維芽細胞(HFL-1)に強制発現させて肺癌細胞と共移植させてCAFの発現する特異的制御因子による癌進展の機序をin viovo検証する次のStepの前準備段階まで到達していない状況である。従来の殺細胞性の非小細胞肺癌の抗癌剤の奏効率30%と乏しいのは癌細胞のみならず癌間質を含めた肺癌組織全体の癌進展制御及び薬剤感受性の多様性があるためと考えられる。本研究の目的は、肺癌組織中のCAFの生物学的特性を解明し、CAFを標的とした肺癌治療法を新しい領域からアプローチすることを本研究の主目的とする。本年度までの研究成果として非癌部の正常肺線維芽

細胞と比較して、CAFの肺線維芽細胞の生理機能活性を特にCAFの(1)遊走能、(2)コラーゲンゲル収縮能、(3)増殖能に着目しin Vitroによる生理機能解析を行った。研究協力施設の理化学研究所においてControlとCAFの両群のCAGEによる転写活性解析を行った。我々は中でもCAGEの結果からColl11a1が特異的に発現していることに着目し新たなCAFマーカーとして肺癌組織免疫染色でも発現が亢進している事を確認した。またColl11a1を介する相互因子がCAFの遊走能の亢進に関与しており癌細胞との共培養系でもそれらの発現が亢進させることを確認して論文を現在作成中である。癌の浸潤を亢進させている活性化したCAFの特異的マーカーの同定および現象及びメカニズムの解明から候補となり得るCAF標的治療薬の検討までをin vitro in vivoの両実験系を用い以下の3期に分けて解明している。1)非小細胞肺癌の手術症例より、手術肺検体から得られる癌組織よりex vivoでの肺線維芽細胞分離培養を行い非癌部の正常肺線維芽細胞をコントロールとしてCAFの生理機能の比較検討を行う2)第4期科学技術計画(ライフイノベーション)に記述されている方針に基づき研究協力施設の提携同意が得られた理化学研究所においてCAGE解析を行い、CAFの転写活性の網羅的解析の結果からCAFで高発現する特異的なマーカーを同定しCAFの生理活性機能との関連検討を行う。3)28年度以降はin vitroでのCAFの生理活性機能に直接関与するCAF特異的なマーカーの機能をマウスへの癌細胞との混合移植モデルを用いた研究で検証しCAF新規標的治療薬としての可能性を検証する。以上をH27-29年度の3年間の研究期間内で解明を行う。現時点では2)までのin vitroの系が結果が順調に得られ同内容でまず先に論文投稿をH29年度内でおこなう。しかし、3)に関して現在論文に追加するために着手に向け準備中である。肺癌組織中のCAFの生物学的特性を解明し、CAFを標的とした肺癌治療法を新しい領域からアプローチすることを本研究の主目的とする。CAFの転写活性の網羅的解析の結果からCAFで高発現する特異的なマーカーを同定しCAFの生理活性機能との研究も行い、研究成果を報告した(H29第57回呼吸器学会総会)。この解析結果からCAFの生理機能活性を制御するCAF特異的マーカーを同定し、中でもCAFで高発現しているITGA11がCAFに強く発現しCAFの遊走能活性の亢進に関わっていることを解明した。申請者はこの研究を引き継ぎITGA11のCAFの機能に影響するITGA11の作用を更に解明し、CAFの活性を抑制することから癌の進展を制御するためのCAF標的治療薬としての創薬の基盤研究として進めてきた。CAFではITGA11とCollagen11a1の発現が増強しており、肺癌組織での免疫染色でも両者の発現が癌間質で増強していることを確認した。実際、ITGA11の発現は術後早期再発と関連していたことから、ITGA11はよりCAFの制御機能に関わる臨床マーカーであることが確認された。ITGA11を肺線維芽細胞にKnockdown及び強制発現し遊走能が制御されるかを確認した。Knockdownにより遊走能が顕著に抑制されていることを確認した。CAFのConditioned mediaを遊走刺激因子として用い肺癌細胞株A549の遊走能及びを検討し、A549の遊走能を刺激した。
難治性てんかんモデル脳における遺伝子制御機構の解析

痙攣履歴を有するE1[s]マウスの放り上げ刺激(以下T)による発作では、プロトオンコジーンのc-fosmRNAが、ベメグリド(以下B)を注射による場合に比べて延長していることを既に報告した。E1[s]マウスにTを加え、発作を誘発すると、発作後30分よりFos蛋白質が発現し、2時間でピークになったが、48時間で消失した。E1[s]マウスにBを注射し発作を誘発すると、発作後60分でFosが発現し、24時間で消失した。痙攣履歴のないE1[ns]あるいは発作非感受性のddYマウスにBを注射し、発作を惹き起すと、30分でFosの発現が認められ、E1[ns]では4時間、発作非感受性のddYマウスでは60分でそれぞれFosの発現をが消失した。このことはFosの発現もE1[s]のTでは、Bによる発作により延長mRNAと同様なパターンであった。他方、Tによって誘発されるJunの発現は、Bによる場合より短時間であった。次にFosとJunとのヘテロダイマーである転写制御因子AP-1と遺伝DNAとの結合能について比較した。発作前のAP-1 DNA結合能はddYではほとんどみられず、発作後の上昇も低かった。この結果は、E1マウスの遺伝的な発作感受性に相関するものと推定された。発作間歇期では、E1[s]、ddYとも生後34週まで顕著なAP-1 DNA結合能を示したが、脳のネットワークの構成に相関しているものと推測される。生後25週では、E1[s]マウスにのみAP-1DA結合能が認められ、ddYマウスでは消失していた。E1[s]マウスで週1回の痙攣発作を反復したことにより、てんかん発作に関与する遺伝子が誘導され、その結果、発作感受性が獲得されていくものと考えられる。痙攣履歴を有するEI[s]マウスの放り上げ刺激(以下T)による発作において、脳のc-fosmRNAの発現が、EI[s]、履歴のないEI[ns]および発作非感受性のddYマウスの腹腔内にベメグリド(以下B)を注射し、発作を誘発した場合に比べて延長していることをわれわれは既に報告した。今回は、同じ翻訳産物のFosとJun蛋白質について検討した。EI[s]、EI[ns]およびddY群の脳から2.2M-庶糖溶液を用いて核を調製し、その抽出液をSDS-PAGEで分析した。ゲルをPVDF膜に転移し、FosまたはJun抗体と[^<125>]-ProteinAとを用いてimmunoblotingを行った。反応後に出現したバンドはオートラジオグラフィーによって検出した。Fosの分子両は62kDであった。EI群にTを加え、発作を誘発した場合には、30分後よりFosが発現し、2時間後には最大となったが、その後減少し、48時間後には消失した。EI[s]群にBを注射し、発作を誘発すると、60分後にFosが発現し、24時間後に消失した。EI[ns]とddY群にBを注射すると、30分後よりFosの発現が起こり、EI[ns]では4時間後、ddYでは60分後にFosの発現が消失した。他方、Junの分子量は39kDであった。Tによって誘発されるJunの発現はBによる場合よりも短時間であった。

このことは、EIマウスにおいてTにより発作を惹き起すと、FosとJunとの複合体である転写制御因子のAP-1 complexが形成され、プロエンケファリンやその他の標的遺伝子を活性化する可能性を示唆している。その結果、EIマウス脳における異常可塑性が生じ、発作感受性が亢進すると推測される。痙攣履歴を有するEl[s]マウスに放り上げ刺激(以下T)で惹き起される発作では、脳のc-fosの翻訳産物mRNAとFos蛋白質がともに,El[s]、履歴のないEl[ns]および発作非感受性のddYマウスの腹腔内にベメグリド(以下B)を注射し、発作を誘発した場合に比べて延長していることを既に報告した。今回の研究では、マウス脳より細胞抽出液を調整し、透析後、実験に供した。この細胞抽出液を前処理した後、前もって[α-^<32>P]-dATPでラベルしたDNAプローブを加えて結合反応を行い、各マウス群におけるAP-1 DNA結合能を比較した。その結果、El[s]マウスのT発作では、AP-1 DNA結合能は発作後90分でピークとなり、72時間まで持続した。El[s]にBで発作を起させると、AP-1 DNA結合能は注射後2時間でピークとなり、48時間で発作前のレベルに戻っている。El[ns]マウスにBを注射し発作を誘発させると、El[s]の場合と同様なパターンを示した。ddYマウスにBを注射し発作を起させると、発作後90分でピークとなり、48時間後には間歇期のレベルに戻っていたが、結合能の上昇はEl群に比べると低くなっていた。また発作間歇期のAP-1DNA結合能はEl[s]>El[ns]>ddYの順序になった。このことは、Elマウスの痙攣感受性の獲得に相関するのではないかと予想された。そのため、発作間歇期におけるAP-1 DNA結合能の変化を2群マウスについて比較した。El,ddYマウスともに生後3、4週目までAP-1 DNA結合能は強く認められるが、その後は徐々に減少した。25週令のddYでは、ほとんど結合能は認められないが、他方El[s]では顕著な結合能を示している。この生後3、4週の強い結合能の存在はこの時期における脳のネットワークの活発な形成に関与するものと推測される。El[s]が25週令で強い結合能を示したのは、てんかん発作に相関する遺伝子が誘導されることを示唆している。