hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神分裂病の前頭葉機能の神経心理学的研究:多義図形の注視点と視覚的認知文脈の関連

精神分裂病患者を対象に、視覚認知課題遂行時の眼球運動を指標として、方略や認知文脈の更新過程に反映される前頭葉機能を検討した。まず、本研究の第1段階として課題遂行時の方略が眼球運動記録に反映されやすいパラダイムの工夫を行い、さらに眼球運動データの記録ならびに解析を可能とするための実験システムを整備し、独自の解析プログラムを作成した。眼球運動検出装置にはアイマークレコーダ(NAC,modelV)を用い、実験の制御ならびにデータ解析にはマイクロコンピュータ(NEC,pc98olVM2)を使用した。その結果、複数の試行ならびに複数の被験者の眼球運動データを同一画面上に重ねて検討することが可能となり、視覚認知課題における方略の検討に眼球運動を指標として利用し得る範囲を拡大した。次に、本研究の第2段階として、DSM-【III】の診断基準を満たす精神分裂病の外来患者16名(平均年齢39.1歳)および正常者7名(平均年齢32.0歳)を対象として2種類の眼球運動記録実験を行った。実験1では、刺激としてJastrowの「カモとウサギ」、Boringの「娘と老婆」の2種類の多義図形を用いた。課題は2種類あって、課題1は多義図形の2通りの見方を各々維持し続ける課題で、課題2は2通りの見方をできるだけ正確にかつ多く反転する課題である。実験2では、Neisserの視覚探索課題を改変して用いた。実験1,2に先立ち、ベントン視覚記銘検査を施行した。これらの実験の結果、精神分裂病患者は、正常者と比較して、総じて課題遂行方略ならびに課題遂行成績が劣る傾向を示したが、正常者と同様の成績を示す患者群が認められた。したがって、精神分裂病患者の前頭葉機能や認知機能を考える際には、群として一括して論じることの危険性と臨床症状や社会適応レベルと関連させた詳細な検討の必要性が示唆された。
尿中近位尿細管刷子緑膜小胞を用いたイオン輸送解析系の確立

これまで、尿中に落下した腎尿細管細胞を培養系に移し、培養された各種の細胞系を利用して細胞内での遺伝子メッセージの発現や、たんぱく質の発現などを検討してきた。今回は、この仕事の上に立ち、さらに尿中に多数浮遊している事が推測されている破砕細胞膜片の小胞体構造が、研究対象となり得るかどうかに関しての検討を進めた。まず、正常ヒト尿を通常の方法で採取し、それらを摂氏4度にて、通常遠心機を用いて2000回転で15分遠心し、その上清を分離後、超遠心10万gにて30分施行した。その上清は破棄し、残ったペレットをホモジナイザーを用いて粉砕し、アイソレーションバッファーとしてD-mannnitol、EGTA、Trisバッファーph7.4に再度懸濁し、Mgを用いて細胞膜分画だけを再度同様の超遠心にて沈殿させた。当初、文献(BBA647:169-176,1981とAm J Physiol F61-68,1996)に記載された方法を用いて、通常の組織片からの小胞の分離を想定し、初期遠心後の上清をポリトロンにより破砕し、細胞膜成分の中でも、サイズの大きい分画の処理を進めてみたが、残念ながら超遠心後の膜成分の回収が著しく悪く、最終的なMg沈澱処理後の小胞体の回収はほとんどゼロの状況で、そのままでは研究対象として扱えない事が明らかとなった。このため、方法論を再検討した結果、上述のように細胞膜のポリトロンによる破砕を省略し、生成を進めた結果、最終産物に細胞膜成分と思われる小胞体構造を得る事が出来た。さらにこの方法を簡略化し、小胞体の回収率を上げるために、当初の採取尿に直接Mgを加える手法を導入したところ、回収率は、最高となった。しかしながら、実際に回収された小胞体ペレットは、全尿100mlから、蛋白成分量にしても1mgにはほとんど到達せず、残念ながら今回の検討結果からは、高度に感受性のある抗体などで、存在する蛋白を同定する場合には利用可能と考えられるものの、腎組織より直接精製した小胞体で行われる膜輸送機能の検討に供するためには、大量の採尿が必要と考えられた。今後、微小サンプルでの輸送機能検討方法の確立が前提と考えられる。
虚血性心疾患患者のセルフモニタリング実践の効果と影響要因-非実践者との比較から-

本研究では冠危険因子の関わる生活や心身の状態を6ヶ月間セルフモニタリングした実践群41名と対照群36名の男性虚血性心疾患患者を対象として、前後の冠危険因子の変化を分析した。その結果、セルフモニタリングの実践は血中HDLコレステロール、脂肪エネルギー比率、飽和脂肪酸エネルギー比率の摂取の管理目標値内への維持、改善に有効であった。またモニタリング頻度は抑うつ状態に関連があったが、冠危険因子の改善状況とは必ずしも関連がみられず、モニタリング頻度よりも意識的な監視と評価の重要性が推察された。本研究は虚血性心疾患患者で通院治療中の男性を対象として、身体活動、食生活、体重や血圧等生理的状態をセルフモニタリングすることと、その成果としてのライフスタイルや健康状態との関係、セルフモニタリングへ影響すると予測される達成動機、心理的状態、症状等の身体的状態との関係を明らかにすることを目的としている。20年度は、文献検討を実施し、虚血性心疾患患者が活用できるセルフモニタリング日誌、調査用紙(ライフスタイル、健康状態、セルフモニタリングへの影響因子である心身の状態、基本属性等に関するもの)を作成した。また研究者の所属施設、データ収集施設における倫理委員会の承認、調査施設での研究協力者との打ち合わせを経て、プレテストを実施した。プレテストは1施設において、75才未満の虚血性心疾患男性患者20名を選出し、実施した。対象20名のうち、脱落者は1名、他の疾患が悪化して除外されたもの1名で、実践群に関しては1割程度の脱落を見込むこととし、本調査の対象者数を設定した。また対象者により外来受診の間隔が異なるため、調査時期は1ヶ月程度の幅を持たせて、実施前、実施12ヶ月後、実施34ヶ月後、実施67ヶ月後と設定することとした。その他、データの正確性を確保するための食生活調査、身体活動の調査時の留意点を確認し、マニュアルを作成した。21年度はその結果をふまえ、予定している2施設で本調査を開始する予定である。平成21年度は2施設でのデータ収集を実施し、実践群、非実践群(対照群)合計で90名の対象者を得た。そのうち脱落者は1名、途中研究協力辞退者2名であった。また他の疾患や合併症の悪化、治療内容の変更などで研究の継続が不可能となったり、分析対象者として妥当でなかった者計10名を除外した。その結果77名(実践群41名、コントロール群36名)のデータが得られ、セルフモニタリング実践群の予備的な分析を行った。セルフモニタリングは参加者のうち、82%が6ヶ月間実施できたが、セルフモニタリング期間のうち50%以上の日数を記述した者が28名68.3男、50%未満の記述にとどまった者が13名、31.7%で、全体とし、半年間に記述割合は時間とともに有意に低下していた。また6ヶ月間のセルフモニタリングの記述日数はモニタリング期間中の抑うつや無気力の程度や開始前の血清脂質、ヘモグロビンAlcなどの健康状態と負の相関が見られた(p<0.05)。セルフモニタリングには抑うつや無気力などの心理状態や血清脂質等の値などに伴う健康管理への自己効力感などが関わっていることが推測される。今回の予備的分析により、セルフモニタリングの適応の判断と途中でのフォローアップの重要性が示唆された。今後は実践群、非実践群のライフスタイルや身体状況の差異、実践群における記述状況とライフスタイルや身体状況の差異などを分析する予定である。本研究では虚血性心疾患患者で通院治療中の男性が冠危険因子の関わる生活や心身の状態をセルフモニタリングすることの効果とセルフモニタリングへの影響因子の関係を明らかにすることを目的としている。最終年度である本年度は、収集したデータを分析し、支援指針を検討した。91名の研究参加者のうち、脱落者等を除外し、6ヶ月間のセルフモニタリング実践群(以下実践群)41名、対照群36名を分析対象とした。その結果、両群とも6ヶ月間のストレス状態は「普通」レベルであり、実践前後で有意な差はなかった。身体状態に関しては実践群で血中のHDLコレステロールの値は維持できていたが、対照群では有意な低下が見られた。栄養摂取に関しては実践群では脂肪エネルギー比率、飽和脂肪酸エネルギー比率は有意な変化がなかったが、対照群では有意に増加した。塩分摂取量は、実践前から管理目標値を大きく上回っており、両群ともに有意な変化はなかった。身体活動に関しても両群とも、有意な変化はなかった。実践群は身体状況、栄養摂取、身体活動のいずれかが冠危険因子管理目標値内に改善した者の割合は80.5%であり、対照群44.4%に比べ、有意に高かった。

セルフモニタリングの導入はHDLコレステロール、脂肪エネルギー比率、飽和脂肪酸エネルギー比率の管理目標値内への維持、改善に有効であったが、ストレス管理、食塩摂取、身体活動の改善への明らかな有効性は確認できなかった。また、実践群のうち、手帳記述量が50%未満群は50%以上群に比べ、抑うつ状態が有意に高い結果であったが、その他の心身の状態に有意差はなかった。また50%未満群であってもコレステロール、脂肪エネルギー比率、飽和脂肪酸エネルギー比率など栄養摂取状況が有意に改善しており、セルフモニタリングには記述量よりも意識的に監視し、評価することに意義があると推察された。以上の結果から支援指針を検討した。
陸棲ラン藻における極限的な乾燥耐性の分子機構

陸棲ラン藻Nostoc communen(和名:イシクラゲ)が示す極限的な乾燥耐性の分子機構を解明するために、本研究課題では細胞内で働いている要素に着目して研究した。本研究経費によってエバポレイティブ光散乱検出器を導入することのよってトレハロースを定量できるようにした。乾燥したイシクラゲはトレハロースを蓄積していたが、吸水することによってトレハロース量は低下し、完全に水和したコロニーでは検出されなかった。コロニーの水分含量に応答してトレハロース量が調節されていることを示す。乾燥ストレスによってトレハロースが蓄積される機構を明らかにするために、トレハロース合成酵素およびトレハロース加水分解酵素(トレハラーゼ)の活性制御を解析した。イシクラゲにおいてトレハロース合成酵素遺伝子treZ、treY、およびトレハラーゼ遺伝子treHがひとつの転写単位を構成していた。これらの遺伝子の転写産物量は乾燥ストレス処理によって大きく変化することはなく、転写レベルの制御ではないことが示された。生化学的解析を行なったところ、トレハロース合成酵素は反応溶液中の塩濃度に影響されず高い活性を示したが、トレハラーゼは塩濃度の上昇に伴って活性が阻害されることが分かった。トレハラーゼがトレハロース量の調節において鍵酵素として働いており、乾燥ストレス下で活性が阻害され、トレハロースの合成量が相対的に高くなることが重要であることを示唆する。細胞外基質に存在する可溶性タンパク質を解析した。β-グルコシダーゼを精製しアミノ末端配列解析を行なったところ、ファシクリンタンパク質と相同性を示すことが分かった。イシクラゲに特徴的なタンパク質として知られているWspAを精製し酵素活性を調べたところβ-ガラクトシダーゼ活性を示すことが分かった。これらのタンパク質は細胞外基質において重要な役割をもつと考えられる。光合成原核生物である陸棲ラン藻Nostoc commune(和名:イシクラゲ)を研究材料とし、本生物が示す極限的な乾燥耐性の分子機構を細胞内の要素に着目して研究した。陸棲ラン藻は、本来水中に生息していたラン藻が陸上に生活圏を広げて過酷な環境に適応して生きているため、乾燥、凍結、熱など、多くの環境ストレスに対して極限的な耐性を示すユニークな生物である。これまでの研究では、陸棲ラン藻が自ら合成し細胞の周囲に分泌している細胞外多糖類が乾燥耐性に必要であることを明らかにしている。平成18年度には、乾燥時に水の代わりとなって細胞内部の生体膜やタンパク質の構造を維持する適合溶質について解析を行なった。本研究経費によって購入したエバポレイティブ光散乱検出器を現有している高速液体クロマトグラフに接続して無標識のトレハロースを直接定量できるようにした。乾燥状態のN.communeからの抽出物中にはトレハロースが高いレベルで検出され、乾燥時に適合溶質として機能していることが示唆された。吸水するとトレハロースのレベルは低下し、水和したN.communeではトレハロースが検出されないことから、吸水によって呼吸基質としてすみやかに消費される機構があると考えられる。現在、トレハロース加水分解酵素およびトレハロース合成酵素の活性変動を解析している。また、細胞外多糖類の機能をさらに調べるために、細胞外多糖類をもつ水棲ラン藻Nostoc verrucosum(和名:アシツキ)が示す環境耐性をN.communeと比較した。その結果、N.verrucosumは、N.communeと同様の凍結耐性を示すが、乾燥耐性を示さないことが分かり、細胞外多糖類の有無は極限環境耐性を示すための必要条件の1つでしかないことが明らかとなった。陸棲ラン藻Nostoc commune(和名:イシクラゲ)が示す極限的な乾燥耐性の分子機構を細胞内で働いている要素に着目して研究した。

平成19年度は,乾燥時に水の代わりとなって細胞内部の生体膜やタンパク質の構造を維持するトレハロースの蓄積機構を明らかにするために,トレハロース合成酵素およびトレハロース加水分解酵素(トレハラーゼ)の活性制御を解析した。全ゲノム配列が決定している糸状性ラン藻Anabena sp.PCC7120では,グルコースのポリマーであるオリゴマルトデキストランやグリコーゲンからトレハロースを合成するTreY/TreZ経路の酵素遺伝子treZ,treY,およびトレハラーゼの遺伝子treHがひとつの転写単位を構成していることが既に明らかとなっている。陸棲ラン藻においてもこれらの遺伝子は遺伝子クラスターを構成しており,乾燥ストレス処理によって転写産物量は大きく変化することはなかった。トレハロース合成酵素は反応溶液中の塩濃度に影響されず高い活性を示したが,トレハラーゼは塩濃度の上昇に伴って活性が阻害されることが分かった。乾燥ストレスにさらされた細胞がトレハロースを蓄積する際にトレハラーゼが鍵酵素として働いており,溶質濃度の上昇に伴ってその活性が阻害されることが重要であることが示唆された。また,細胞外基質に存在する可溶性タンパク質を解析した。細胞外基質中に存在するβ-D-グルコシダーゼを精製しアミノ末端配列解析を行なったところ,ファシクリンタンパク質と相同性を示すことが分かった。既に細胞外基質に特徴的なタンパク質として知られている水ストレスポリペプチドを精製し酵素活性を調べたところβ-D-ガラクトシダーゼ活性を示すことが分かった。現在,これらのタンパク質の機能解析を進めることにより細胞外基質の役割を研究している。
太平洋クロマグロ成魚の回遊機構の解明

東部太平洋で漁獲されたクロマグロの腹腔内にアーカイバルタグを装着し、2002から2004年の7-8月に合計300個体を放流し、これまでに再捕・回収された90個体のタグに記録された水温、遊泳深度、腹腔内温度の時系列データを解析した。クロマグロは表層混合層内で夜間は表層,昼間は摂餌のためより深い水深を遊泳しており,照度の昼夜変化に応じて,遊泳深度を日周期的に変化させていた。一方,水温躍層の発達する夏季は,躍層付近での急激な水温変化を避けて一日の大半を表層で過ごし,昼間は照度のなくなる水深まで5分程度の短時間の潜行を繰り返すようになった。夜間,クロマグロの平均遊泳深度と月齢とに有意な相関が認められた。しかし,摂餌はほとんど行なわれなかったことから,月の照度によって遊泳深度を変化させる行動は,捕食者から身を隠すためのものと推察された。またクロマグロは日出時と日没時にも必ず潜行を行ったが,摂餌は見られなかった。彼らの視細胞の明・暗反応の切り替えには多少時間がかかるため,急激な照度変化にさらされると,彼らは一種の盲目状態に陥ることが報告されている。よってこの鉛直移動は,朝夕の照度変化を避け,一定の照度環境を保つための補償行動ではないかと思われる。以上のようにクロマグロは時間的・空間的な照度変化を巧みに利用して,"食うこと"と"食われないこと"を満たしていると考えられた。東部太平洋の鉛直構造や餌分布様式ならびにバイオマスと本種の遊泳行動との関係や生息環境が本種の体温生理に与える影響を調べるため、平成17年3月から9月までアメリカ、スタンフォード大・ホプキンス臨海実験所、バーバラ・ブロック博士の研究室に滞在し、逐次再捕され回収に成功した遊泳水深、環境水温、体温などの時系列データの解析も行った。東シナ海対馬沖でアーカイバルタグ(標識型小型記録計)を腹部に装着して放流しその後1995年から2001年に再捕に成功した約40個体のクロマグロから得られた遊泳水深、環境水温、体温などの時系列データについて解析を行った。その結果、体サイズの大きい個体ほど体温と水温との差が大きくなる傾向にあったが、温度差の増大する割合は成長に伴い小さくなり、平均体温は30度を越えることはなかった。熱収支モデルより成長に伴い体の断熱性が増大するものの、その一方で発熱速度は減少することが示され、その結果、体温は致死温度には至らず、それが成長しても温帯域で活動を可能にし、ひいては魚類の中で最大級にまで成長させる要因のひとつとなっていることが明らかになった。以上の結果について、10月に韓国ソウルで開催された第12回PICES(North Pacific Marine Science Organization) meetingで口頭発表を行った。また、東部太平洋において、現場海域の鉛直構造や餌分布様式ならびにバイオマスと本種の遊泳行動との関係や生息環境が本種の体温生理に与える影響を調べるため、平成15年7月10日から9月10日、平成16年1月30日から3月31日までアメリカ、スタンフォード大学・ホプキンス臨海実験所、バーバラ・ブロック博士の研究室に滞在し、サンディエゴ沖にてクロマグロのアーカイバルタグ取り付け・放流実験を行った。また、逐次再捕され回収に成功した遊泳水深、環境水温、体温などの時系列データの解析も行い、西部太平洋のクロマグロの鉛直遊泳行動との比較を行った。東部太平洋で漁獲されたクロマグロの腹腔内にアーカイバルタグを装着し、2002および2003年の7-8月に合計160個体を放流し、これまでに再捕・回収された16個体のタグに記録された水温、遊泳深度、腹腔内温度の時系列データを解析した。夏季、南カリフォルニア湾からバハ・カリフォルニア沿いの陸棚上で、クロマグロは躍層付近での急激な水温変化を避けて一日の大半をごく表層で過ごしていた。しかし、昼間には水温躍層を越える鉛直移動が短時間ながら頻繁にみられた。摂餌に伴い腹腔内温度が一時的に低下することを利用して摂餌頻度・水深を推定した結果、彼らは様々な水深で活発に摂餌を行っていることがわかった。10月から11月にかけてほとんどの個体は南カリフォルニア湾から北方へと回遊し、モントレー沖の沿岸湧昇フロント付近で滞留した。この海域は表層付近の水温が低いため、クロマグロも表層を遊泳する傾向が強く、日出時と日没時にみられた鉛直移動を除けば50m以深への潜行頻度も低い傾向にあった。ここではクロマグロは主に水平移動を行いながら、フロント付近に集積しているカリフォルニアマイワシなどを摂餌しているものと推察された。これらの結果から、空間的な環境水温の鉛直構造の変化が本種の鉛直遊泳行動・分布を規定していることが分かった。以上の結果について、10月にハワイで開催された第13回PICES meetingで口頭発表を行った。東部太平洋の鉛直構造や餌分布様式ならびにバイオマスと本種の遊泳行動との関係や生息環境が本種の体温生理に与える影響を調べるため、平成16年4月1日から9月7日までアメリカ、スタンフォード大・ホプキンス臨海実験所、バーバラ・ブロック博士の研究室に滞在し、逐次再捕され回収に成功した遊泳水深、環境水温、体温などの時系列データの解析も行った。

東部太平洋で漁獲されたクロマグロの腹腔内にアーカイバルタグを装着し、2002から2004年の7-8月に合計300個体を放流し、これまでに再捕・回収された90個体のタグに記録された水温、遊泳深度、腹腔内温度の時系列データを解析した。クロマグロは表層混合層内で夜間は表層,昼間は摂餌のためより深い水深を遊泳しており,照度の昼夜変化に応じて,遊泳深度を日周期的に変化させていた。一方,水温躍層の発達する夏季は,躍層付近での急激な水温変化を避けて一日の大半を表層で過ごし,昼間は照度のなくなる水深まで5分程度の短時間の潜行を繰り返すようになった。夜間,クロマグロの平均遊泳深度と月齢とに有意な相関が認められた。しかし,摂餌はほとんど行なわれなかったことから,月の照度によって遊泳深度を変化させる行動は,捕食者から身を隠すためのものと推察された。またクロマグロは日出時と日没時にも必ず潜行を行ったが,摂餌は見られなかった。彼らの視細胞の明・暗反応の切り替えには多少時間がかかるため,急激な照度変化にさらされると,彼らは一種の盲目状態に陥ることが報告されている。よってこの鉛直移動は,朝夕の照度変化を避け,一定の照度環境を保つための補償行動ではないかと思われる。以上のようにクロマグロは時間的・空間的な照度変化を巧みに利用して,"食うこと"と"食われないこと"を満たしていると考えられた。東部太平洋の鉛直構造や餌分布様式ならびにバイオマスと本種の遊泳行動との関係や生息環境が本種の体温生理に与える影響を調べるため、平成17年3月から9月までアメリカ、スタンフォード大・ホプキンス臨海実験所、バーバラ・ブロック博士の研究室に滞在し、逐次再捕され回収に成功した遊泳水深、環境水温、体温などの時系列データの解析も行った。
運動により誘発される不随運動発作症のイオンチャンネルに関する遺伝学的解析

Paroxysmal kinesigenic choreoathetosis (以下PKCと略す)は運動で誘発される不随意運動で,舞踏病,アテトーゼ,ジストニアを主徴とする。発作間歇期は正常な神経学的所見を呈し突然の運動や,驚愕か誘因となる。本症か良性てんかんを合併する家系が多い事からてんかん説,錐体外路障害説などがあるが病因は未だ不明である。われわれは自験例3世代の常染色体優性遺伝の大家系の患児,両親,祖父母,従兄弟のDNA抽出後遺伝子解析を行ってきた。近年Zepetowskiらは1997年,PKCと乳児けいれんを有する家系を解析し,16p12-p12に連鎖していることを報告した。今回,日本人常染色体優性の5家系,24人の罹患者の遺伝子連鎖解析を行った。D16S420,D16S3133,D16S3068,D16S3131,D16S3100,D16S3093,D16S517,D16S3044,D16S411の9のマイクロサテライトマーカーを用いて解析した。Lod score2.0以上はD16S420(Zmax=2.02,θ=0.07),D16S3133(Zmax=2.41,0=0.00),Dl6S3068(Zmax=2,57,θ=0.06),D16S3131(Zmax=2.26,θ=0.007),D16S3093(Zmax=2.41,θ0.00)が得られた。日本人PKC家系も16番に連鎖していることが強く考えられた。Paroxysmal kinesigenic choreoathetosis(以下PKCと略す)は突然の運動で誘発される不随運動で,舞踏病,アテトーゼ,ジストニアを主徴とする。われわれは本邦の多施設調査をおこない,100人のPKC患者の臨床像,家系調査を報告した。近年Zepetowskiらは1997年,PKCと乳児けいれんを有する家系を解析し,16p12-q12に連鎖していることを報告した。今回,日本人常染色体優性の8家系,43人の罹患者を含むトータル84人の遺伝子連鎖解析を行った。D16S403,D16S3131,D16S3093,D16S517,D16S3081,D16S3105,D16S3044,D16S3080,D16S411,D16S3136,D16S416,D16S419,D16S415の13のマイクロサテライトマーカーを用いて解析した。2点LODスコアはMINK(FASTLINKソフトウェア)で解析し,マルチポイントLODスコアはVITTESEプログラムで解析した。まずD16S3080で高い2点LODスコア(Zmax=6.94,θ=0.00)が得られた。次にD16S3080近傍のマーカーを調べD16S3081で10.27(θ=.00,p=.7)の最も高い2点LODスコアが得られた。最高のmultipointLODスコアはD16S3080で11.51(p=.8)がえられ,PKCgeneはD16S3093とD16S416の間にあることがわかった。またD16S3093,D16S517,D16s416の3つのクローンを用いたFISH解析により,PKCは16p11.2-q12.1の間にmapすることがわかった。現在この間にあるイオンチャンネルをcandidateとして解析中である。
慢性肝疾患に対する発想を変えた新しい治療を目指して

本研究ではend stage liver disease特に慢性肝疾患の肝不全に臓器移植以外の方法をその生体内に求めた点にその特色がある。肝臓を一臓器と考えると、その構築となる非実質細胞の役割を無視できない。また従来の脾臓への生着を考慮すると、その組織構築類似性から類洞内皮細胞(HSEC)が重要な役割を担っていると考えた。そこで混合spheroid(ここでは肝細胞+HSEC、分化形質を長期間維持する凝集塊)を利用し、排泄、解毒、免疫学的機能を有する腎臓への生着を試みた。また腎臓は生体内に二つあり、またもし胆汁が生成されるのなら尿管を胆汁流出路と考えたわけである。すでに我々は腎臓被膜に混合spheroidを移植後10ヵ月後にその生着を確認しており、今回は再確認およびその機能を含め現在進行中である。現段階では混合spheroidは肝細胞単独、肝細胞+非実質細胞、肝細胞+HSECのspheroidを正常ラットの肝臓、経門脈、脾臓、腎臓実質および被膜に移植し約7ヶ月が経過している。またその生着部位の確認後、膵臓通過後の門脈と腎動脈のできるだけ末梢との吻合を考慮、さらには尿管と小腸と吻合したモデルに応用する予定である。またこれと同時進行に四塩化炭素(CCl4)慢性肝障害モデルを作成し、効果的な混合spheroidをCCl4投与開始時および非可逆的となる24週に移植し、また移植初期および生着後に前述した吻合モデルを用い、AST,ALT,T.Bil.,PT,HPT,NH3,血糖値、生存率を検討し、さらには組織学的検討を行う。確認実験に時間が費やされているがその終了後は円滑に実験が進む準備がある。
ナノ核酸デバイスを用いた自然免疫応答発現機構の網羅的解析

1. WBAによる自然免疫応答の評価:ナノ核酸デバイスをセンス鎖中央部分(siR1)、アンチセンス鎖5'末端部分(siR2,4など)ならびにセンス鎖5'末端部分(siR3,5など)に導入したsiRNA(12種類、計24本)を合成し、これらについてWBAを行ない、自然免疫応答変化を評価した。平成26年度の研究結果として、siR1, 2および4においては顕著なTNF-α誘導量変化が観察されないのに対し、センス鎖5'末端付近に3Br-deAを導入したsiR3および5では自然免疫応答の増強が観察されることを明らかとした。そこで平成27年度は、TLRシグナルのカスケード阻害剤であるchloroquine存在下、再度WBAを実施した。その結果、いずれのナノ核酸デバイス導入siRNAを用いた場合にも、自然免疫応答の賦活化はほとんど観察されないことが明らかとなった。すなわち、siRNAにより惹起される自然免疫応答の発現にはTLRが大きな役割を担っていると考えられ、WBAにおける活性変化はTLR7/8との相互作用による影響を強く受けていることが示唆された。2. WBAにより観察された自然免疫応答変化をもたらす鍵となるパターン認識受容体を同定すべく、光捕捉型ナノ核酸デバイスの開発を検討し、デアザ部位に光反応性基であるトリフルオロジアジリン基を導入した新しいナノ核酸デバイスの合成法を確立した。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.WBAによる自然免疫応答評価:ナノ核酸デバイスをセンス鎖中央部分(siR1)、アンチセンス鎖5'末端部分(siR2, 4ほか)ならびにセンス鎖5'末端部分(siR3, 5ほか)に導入したsiRNAを調製した(12種類、計24本)。これらについてWBAを行い、自然免疫応答変化をIL-8の誘導量を指標にして定量評価した。その結果、siR1, 2および4においては顕著なIL-8誘導量変化が観察されないのに対し、センス鎖5'末端付近に3Br-deAを導入したsiR3および5では自然免疫応答の増強が観察された。この結果は先に著者らが行なったTLR3との相互作用解析により得られたものとは異なる。しかし、その傾向に一般性が見られたことから、さらなる自然免疫応答誘導パターン認識受容体との分子認識機構の理解が求められることが示された。2.WBAにより観察された自然免疫応答変化をもたらす鍵となるパターン認識受容体を同定すべく、ナノ核酸デバイスを用いた光ラベル化法を検討した。これまでに報告された核酸とタンパク質の相互作用を解析する方法として、ピリミジン塩基の5位に臭素あるいはヨウ素原子を有した5-Bromo (5-Iodo)uridineを利用し、これに光照射を行なうことにより生じたラジカルを介して標的を補足する手法が知られている。著者らが開発したナノ核酸デバイスにおいても同様の光照射による標的補足が可能であると期待し、まずはヌクレオシドレベルでの検討を行なった。しかし、5-iodo uridineが5分以内にラジカルを生じる条件においても7-Br-7-deazaA (7Br-deA)および3Br-deAからはラジカルの発生が確認されなかった。そこで、臭素原子の代わりにトリフルオロジアジリン基を導入した新しいナノ核酸デバイスを設計し、その合成について検討中である。ナノ核酸デバイスを導入siRNAを用いてWBAを行ない、どのような修飾様式を持ったsiRNAが自然免疫応答を誘起あるいは回避するのかを明らかに出来た。その自然免疫応答の変化が、どのパターン認識受容体との相互作用によって誘起されているのか?については明らかに出来なかったが、パターン認識受容体捕捉用の核酸デバイスの創製についてはほぼ目処をつける事が出来た。このような理由から、研究は概ね順調に進展していると判断した。次年度は本研究課題の最終年度である。当初の計画通り、siRNAと相互作用し自然免疫応答を誘起するパターン認識受容体を明らかにし、さらにその相互作用部位を詳細に解析する。
構造システムの各性能指標を高度化させたハイブリッド連続繊維補強材の創出

まず,複数種類の連続繊維材の引張剛性,強度,靭性およびクリープや疲労などの長期性状に注目したハイブリッド連続繊維材(以下,ハイブリッド材)の設計思想を明確にし,各種評価指標の提案や設計法の構築を行った.特に,繊維材の一部が破断する際に生じる応力変動や強度低下について,各繊維材の含有率に着目した制御指標を提案し,その有意性を実験的に明らかにした.また,衝撃エネルギー吸収性に優れる繊維材を用いて,これらの現象を大きく抑制できることも究明した.さらに,ハイブリッド材の耐疲労・クリープ性や高温耐久性を実験的に検証した.次に,高弾性繊維材を導入したハイブリッド材を補強材として用いた場合に,RC構造物の使用性指標(鉄筋降伏前の剛性など)が大きく向上されることや,伸度も意識した3種類の繊維材を用いることで,構造物の性能を総合的に向上させる効果も明確に示された.その中,適切な配合設計により補強材の剥離が防がれ,より大きな補強効果が得られることも実証された.そして,各種繊維材を適材適所に用いたFRP (Fiber reinforced polymers)-RC構造形式を提案した.一方,これらの構造物において,最も重要な破壊モードである繊維材の剥離破壊に関して,複雑なひび割れも考慮して繊維材の接着界面を詳細にモデル化した非線形有限要素解析モデルを新たに構築した.さらに,接着界面の短・中・長期クリープ挙動を実験,解析の両面から検討し,接着界面のクリープ挙動を明らかにした.最後に,導電性のある各種繊維のハイブリッド化により,電気抵抗変化を利用して補強構造物を自己センシングするシステムを開発した.通常はひび割れがかなり成長するまで検知できないが,繊維材に事前処理を行うことにより,微細なひび割れも検知できるようにした.また,光ファイバをハイブリッド材に混入することによる自己診断システムも開発した.まず,複数種類の連続繊維材の引張剛性,強度,靭性およびクリープや疲労などの長期性状に注目したハイブリッド連続繊維材(以下,ハイブリッド材)の設計思想を明確にし,各種評価指標の提案や設計法の構築を行った.特に,繊維材の一部が破断する際に生じる応力変動や強度低下について,各繊維材の含有率に着目した制御指標を提案し,その有意性を実験的に明らかにした.また,衝撃エネルギー吸収性に優れる繊維材を用いて,これらの現象を大きく抑制できることも究明した.さらに,ハイブリッド材の耐疲労・クリープ性や高温耐久性を実験的に検証した.次に,高弾性繊維材を導入したハイブリッド材を補強材として用いた場合に,RC構造物の使用性指標(鉄筋降伏前の剛性など)が大きく向上されることや,伸度も意識した3種類の繊維材を用いることで,構造物の性能を総合的に向上させる効果も明確に示された.その中,適切な配合設計により補強材の剥離が防がれ,より大きな補強効果が得られることも実証された.そして,各種繊維材を適材適所に用いたFRP (Fiber reinforced polymers)-RC構造形式を提案した.一方,これらの構造物において,最も重要な破壊モードである繊維材の剥離破壊に関して,複雑なひび割れも考慮して繊維材の接着界面を詳細にモデル化した非線形有限要素解析モデルを新たに構築した.さらに,接着界面の短・中・長期クリープ挙動を実験,解析の両面から検討し,接着界面のクリープ挙動を明らかにした.最後に,導電性のある各種繊維のハイブリッド化により,電気抵抗変化を利用して補強構造物を自己センシングするシステムを開発した.通常はひび割れがかなり成長するまで検知できないが,繊維材に事前処理を行うことにより,微細なひび割れも検知できるようにした.また,光ファイバをハイブリッド材に混入することによる自己診断システムも開発した.本研究では、ハイブリッド連続繊維補強材の設計思想を確立し、実用的なハイブリッド補強筋、補強シートおよびそれらの応用手法の開発を目的としている。本年度の研究成果は以下のとおりである。1.本研究代表者がこれまで初歩的に考案してきたハイブリッド連続繊維補強材の基本概念を基に、超高弾性、高弾性および高強度の三種類炭素連続繊維とPBO連続繊維、その他各種レベルの高伸度を有するガラス、ダイニーマなどの繊維材の剛性、強度、靱性、耐クリープ性、耐火性、耐疲労特性、温度適応性能などを生かしたハイブリッド設計を行った。また、連続繊維のエネルギー吸収性能が連続繊維の破断過程において発揮する有効な役割を定量的に究明し、PBOやダイニーマ繊維の破断瞬間における変形特性の分析結果から適切な高伸度繊維の最適選択法を検討している。2.ハイブリッド連続繊維補強材にヘルスモニタリング知能性能を持たせるために、繊維材料自身の段階的な破断による繊維方向の電気抵抗の変化を利用した自己診断システムの検討を行った。また、光ファイバをハイブリッドロッドやシート中に配置することにより、補強材にセンサ機能を付与し、高精度で適切な光ファイバモニタリングシステムの検討を行っている。3.ハイブリッド連続繊維ロッド材およびシート材の試作を行い、試作した補強材の静的な力学性能、耐疲労性能、耐クリープ性能およびモニタリング知能性状を実験的に確認している。また、試作された各種レベルのハイブリッド連続繊維補強材に対して、コンクリートとの接着・付着特性、圧縮・曲げ・せん断・靱性補強効果、復旧性能、モニタリング性状などに関する実験および解析を行った。4.変位適合条件や各種材料の応力-ひずみ関係を導入した非線形有限要素解析を行い、ハイブリッド連続繊維補強筋および補強シートの補強設計、補強効果の評価を行った。

そして、破壊力学的評価手法を用いて、ハイブリッド化された繊維シートの剥離・段階的な繊維シートの破断および通常のコンクリートひび割れを同時に評価できる非線形有限要素による構造解析手法を提案している。本研究では,ハイブリッド連続繊維補強材の設計思想を確立し,実用的なハイブリッド補強筋,補強シートおよびそれらの応用手法を開発することを目的として実施した.本年度の研究成果としては,まず,前年度の研究を継続検討し,(1)繊維の破断過程における連続繊維のエネルギー吸収性能の有効性を定量的に究明し,PBO繊維などの有機繊維材を含む多種多様な連続繊維の破断の瞬間に散逸する衝撃エネルギーを分析して有意なハイブリッド配合方法を検討した.(2)光ファイバをハイブリッドロッドやシート中に配置して自己センシング可能としたインテリジェント構造材およびそれらによる構造形式を新たに提案し,その有意性を実験的に検討した.(3)ハイブリッド連続繊維複合材を試作して力学特性,耐疲労・クリープ特性およびセンシング性状を実験的に究明した.次に,RC曲げ構造物に対するハイブリッド連続繊維補強筋および補強シートの補強設計,補強効果の評価を実験的に行うとともに,変位適合条件や各種材料の応力-ひずみ関係を導入した算定法の適用性を究明した.その上で,今まで成果を挙げてきた連続繊維シートの補強設計・解析法,破壊力学的評価手法を用いて,ハイブリッド連続繊維シートの剥離・段階的な繊維の破断およびコンクリートひび割れを評価する非線形有限要素解析手法を確立した.さらにこれらの手法を応用し,補強構造物の破壊過程を究明した.さらに,前年度までの研究成果や本年度の検討成果として今までデータを蓄積している単一種類の連続繊維を接着・補強する技術に関する知見を活用して,開発されたハイブリッド連続繊維筋とシート,接着界面,補強補強物の構造性能をより確実に検証した.そして,既存研究と比較することでハイブリッド連続繊維材の各種構造システムにおける有効性と実用性を定量的に評価した.
Volunteer Reseedingによる草生栽培での雑草管理に関する研究

サブ・クローバ→デントコーンの作付体系下での雑草防除体系とデントコーンの生育・収量、クローバの生育および雑草発生との関係を明らかにし、サブ・クローバのVolunteer Reseedingによる草生栽培の確立を試みた。サブ・クローバが自生している耕地を対象として試験を実施した。供試したサブ・クローバの品種はMt.Bakerである。7月にサブ・クローバが枯死した後、デントコーン(90日種)を播種した。デントコーンの播種前には(1)ロータリ耕耘区(RT)(2)草刈+不耕起播種(CNT)(3)草刈+除草剤散布(ジクワット・パラコート)+不耕起播種(CHNT)(4)除草剤散布(ジクワット・パラコート)+不耕起播種(HNT)の処理を行った。この結果、クローバ結実後、ロータリ耕耘などで土壌を撹乱すると、夏季の雑草発生を抑制しかつ土壌表層に分布するクローバ種子は土中で生存し、その後不耕起とすることで表層に分布する種子が発芽し、翌春においても十分に植生を再生すると考える。また、不耕起栽培では、クローバ枯死後は草刈をせずに除草剤散布→デントコーン不耕起播種体系が、雑草発生が少なくかつクローバの自生化数が多くなる。このことから、Volunteer Reseedingを取り入れた草生栽培では、夏のロータリ耕耘や除草剤散布などを効果的に組み合わせることで、サブ・クローバの草生を経年維持することが可能であるものと考えた。
想定外のストレス下での精神・自律神経系の恒常性維持機構の解明

1システマティックレビュー1「長期宇宙滞在における心理社会的ストレスに関するシステマティックレビュー」:宇宙飛行士は如何なる心理社会的ストレスを受けるのかに関する網羅的文献検索を行った。宇宙環境アナログの被験者は、種々のバイアスを避けられないため十分なエビデンスは確立されていなかった。閉鎖環境においては「人間関係ストレス」が問題になりやすい重要な因子であるとの知見が得られた。またストレス測定は、質問紙法が主流だが、様々な客観的評価法が検討され、心理社会的ストレスの評価法の確立が重要な課題であることも明らかになった。2「閉鎖環境におけるバイオマーカー測定に関するシステマティックレビュー」:閉鎖環境によるストレス反応を検出するために有用なバイオマーカーを、PubMedおよびEmbaseで検索した。検索の結果、2,035件の文献が抽出された。英語、ロシア語等の文献が抽出されたため、多言語に対応すべく対処している。2.閉鎖実験1.で得られて来ている成果を活かしながら、研究デザインのなかに健康生成論の活用とオープンダイアローグの応用を検討して来ている。一つは、健康生成論の中核概念である首尾一貫感覚(Sense of Coherence, SOC)のグループ別のデータ解析である。JAXA閉鎖実験のサンプルシェアを継続するとともに、さらなる閉鎖実験での介入試験を古川班と長瀬班と松崎班を中心に連携して共同研究として計画している。ストレス対処力が少ない群で、前頭極の重心値が経時推移を追うと大きくなることがこれまでの閉鎖実験で明らかになったため、この仮説を検証するための閉鎖実験を検討している。予定していた文献レビューの文献検索は終了した。英語、ロシア語の言語の文献と閉鎖実験についておおむね順調に遂行できた。今後は、システマティックレビューの文献の精読を進め、英語、ロシア語の結果をまとめて、他班との連携をさらに密にしていく。さらに閉鎖実験においても、さらに参加者を増やすとともに、より精密な介入デザインを検討していく。運動介入などの介入方法の導入を検討している。システマティックレビューと閉鎖実験を2つの研究計画の柱として、それぞれ進めた。1.システマティックレビュー初年度はまずPubMedデータベースを用いて、PRISMAに沿って「宇宙で宇宙飛行士はどのような心理社会的ストレスを受けるのか、またそれをどのように測定するのか。また、宇宙環境の類似アナログ地上環境と考えられる閉鎖隔離環境や災害や想定外事象下でどのような心理社会的ストレスを受けるのか。」に関する文献検索を行った。その結果、宇宙環境と閉鎖実験の各種文献を収集し、これまでの先行研究による知見をまとめた。2.閉鎖実験JAXA閉鎖実験でのサンプルシェアにおいて、生体の適応過程に関する非侵襲的ウェアラブル光トポグラフィー(NIRS)での客観データ取得に関する予備実験を行った。閉鎖環境におけるヒトにおける心理社会的影響をNIRSにより測定できるか検討する。NIRSにより測定が可能であれば、客観的評価手法としての可能性が見いだされる。本研究では、8人の被験者(成人男性)が、筑波宇宙センター宇宙飛行士養成棟に設置されている「閉鎖環境適応訓練設備」内で2週間(13泊14日)滞在した。閉鎖環境滞在中には、国際宇宙ステーションで宇宙飛行士が受けるものを模擬したストレスや、宇宙飛行士選抜試験を参考にして設定するさまざまな課題を被験者に負荷した。この閉鎖実験において、閉鎖前2回、閉鎖中4回、閉鎖後2回の合計8ポイントで、NIRSおよびSOC(Sense of Coherence)の測定を被験者8名に対して行った。現在、データ回収後解析中である。2つの研究課題について、予定通り平成27年度にスタート出来ている。これらについては、総括班でとりまとめた平成27年度報告書にもまとめることが出来ており、各計画研究班との連携も進んでいる。特に、A02-2岩崎班、A02-4長瀬班、A02-5古川班との連携で閉鎖実験実施と研究デザインに関して、複数回の打ち合わせを重ねて来ており、すでに実施した平成27年度のJAXA閉鎖実験のサンプルシェアにおいてもデータの相互参照を検討して来ている。1.システマティックレビュー昨年度の成果をもとに、システマティックレビューをさらに進めた。閉鎖環境によるストレスを検出するために有用なバイオマーカーを、PubmedおよびEmbaseで検索した。その結果、2,035件の文献が抽出された。現在、専門家による文献精査を行っている。2.閉鎖実験1.で得られた成果と昨年度のパイロットスタディーの結果を活かしながら、研究デザインのなかに健康生成論の活用とオープンダイアローグの応用を検討した。これまでに閉鎖環境下で言語流調整課題を実施し、fNIRSで脳の血流変化を測定した。閉鎖環境下で計24名の測定、および計8名の運動介入測定を終了した。その結果、14日間の閉鎖において、脳機能低下の初期徴候を検出できる可能性が示された。英語以外の言語の文献と閉鎖実験についておおむね順調に遂行できた。

またストレス測定は、質問紙法が主流だが、様々な客観的評価法が検討され、心理社会的ストレスの評価法の確立が重要な課題であることも明らかになった。2「閉鎖環境におけるバイオマーカー測定に関するシステマティックレビュー」:閉鎖環境によるストレス反応を検出するために有用なバイオマーカーを、PubMedおよびEmbaseで検索した。検索の結果、2,035件の文献が抽出された。英語、ロシア語等の文献が抽出されたため、多言語に対応すべく対処している。2.閉鎖実験1.で得られて来ている成果を活かしながら、研究デザインのなかに健康生成論の活用とオープンダイアローグの応用を検討して来ている。一つは、健康生成論の中核概念である首尾一貫感覚(Sense of Coherence, SOC)のグループ別のデータ解析である。JAXA閉鎖実験のサンプルシェアを継続するとともに、さらなる閉鎖実験での介入試験を古川班と長瀬班と松崎班を中心に連携して共同研究として計画している。ストレス対処力が少ない群で、前頭極の重心値が経時推移を追うと大きくなることがこれまでの閉鎖実験で明らかになったため、この仮説を検証するための閉鎖実験を検討している。予定していた文献レビューの文献検索は終了した。英語、ロシア語の言語の文献と閉鎖実験についておおむね順調に遂行できた。引き続き、システマティックレビューと閉鎖実験の2つの研究課題をさらに進めていく。システマティックレビューにおいては、平成27年度の成果をベースに、PubMed以外のデータベースの検索も進め、統合的な研究を進めていく。閉鎖実験においても、平成27年度の成果をベースに、データ解析を進めると同時に、次回の閉鎖実験の準備を併行して進めていく。なお、当初予算からの配分額減少により、複数台のNIRS購入ならびにチャンネル数増加、複数人同時計測は難しいことが判明してきたため、NIRS計測部位の正確な特定のためデジタイザーを平成28年度は購入することを検討している。また、計画研究班共同での閉鎖実験実施に向けて、被験者謝金を計上する。今後は、システマティックレビューの文献の精読を進め、結果をまとめて、他班との連携をさらに密にしていく。さらに閉鎖実験においても、さらに参加者を増やすとともに、より精密な介入デザインを検討していく。そのなかで、健康生成論とオープンダイアローグ、さらには自然を活用したリハビリ効果などを活用することを目指す。今後は、システマティックレビューの文献の精読を進め、英語、ロシア語の結果をまとめて、他班との連携をさらに密にしていく。運動介入などの介入方法の導入を検討している。
副甲状腺ホルモン受容体PTHR1の発現抑制による口腔癌転移の制御

I.口腔癌細胞株においてPTHR1の発現をmRNA、蛋白レベルで検出した。これらの発現量は口腔扁平上皮細胞と比較し有意に高レベルであった。II.一方で口腔癌高転移株群と低・非転移株群との間では、PTHR1発現レベルの有意差は認められなかった。III.口腔癌組織における免疫染色でも正常組織と比較しPTHR1の高発現が認められた。IV.更に転移症例において非転移症例と比較しPTHR1発現量は有意に高レベルであった。V.PTHR1高発現口腔癌細胞株を樹立した。この内PTHrPの発現量が高いPTHR1高発現株では細胞増殖速度の増大が認められた。【本年度研究目的及び方法】I.口腔癌組織標本におけるPTHR1免疫染色を行い正常組織と比較する。II. PTHR1高発現口腔癌細胞株を樹立後、副甲状腺ホルモン関連蛋白PTHrPを定量し細胞増殖能について評価を行う。III.ヌードマウスに移植可能なヒト口腔癌細胞株でもPTHR1高発現株を樹立しPTHrPを定量後、細胞増殖速度及び転移を生じるまでの期間と転移臓器の特異性について検討する。IV.樹立したPTHR1高発現癌細胞株に対しRNAiにてPTHR1活性を抑制し、その細胞増殖速度及び転移能が制御されるかどうかを比較する。【前年度結果】I.口腔癌細胞株においてPTHR1の発現をmRNA、蛋白レベルで検出した。【本年度結果】I.口腔癌組織における免疫染色でも正常組織と比較しPTHR1の高発現が認められた。II.更に転移症例において非転移症例と比較しPTHR1発現量は有意に高レベルであった。III.PTHR1高発現口腔癌細胞株を樹立した。【結論】I.口腔癌組織においても正常組織と比較しPTHR1の高発現が確認された。更に転移症例における発現は非転移症例と比較し有意に高レベルであった。II.PTHR1高発現口腔癌細胞株において、PTHrPの発現量がupした細胞株では細胞増殖速度の上昇が認められた。【以後の研究展開】PTHR1高発現口腔癌細胞株をヌードマウスに移植し、細胞増殖速度及び転移能について検討する。次にRNAiにてPTHR1活性を抑制しこれらが制御されるかどうか検討後、転移巣に対してもPTHR1のRNAiが奏功するかどうか検討する。本研究の目的は以下の通りである。(1)正常組織と口腔癌細胞とにおける副甲状腺ホルモン受容体1型PTHR1の発現を比較し、PTHR1高発現の癌細胞株を樹立後、その発現量と細胞増殖との関連性について検討を行う。(2)高転移株群及び低・非転移株群におけるPTHR1と副甲状腺ホルモン関連蛋白PTHrPとの発現とその関係について比較検討する。(3)PTHR1高発現癌細胞株をマウスに移植し早期に転移するか検討する。これらより「PTHR1の発現と活性の阻害により、口腔癌細胞の転移制御を目指す」ことが最終目的である。【方法】・本年度は最初に(1)に関して、PTHR1 mRNA及び蛋白レベルの発現量の解析を行った。ヒト口腔扁平上皮細胞と歯肉線維芽細胞をcontrolとし、ヒト口腔癌細胞株はよく用いられ報告も多いHSC-2,HSC-3,Ca9-22,SAS,SAT,OSC-19,OSC-20の7種を用いて行った。・用いた口腔癌細胞株は転移能により下記の如く分類した。高転移株群(3種): HSC-3, OSC-19, OSC-20,低・非転移株群(4種): HSC-2, Ca9-22, SAT, SASの2群である。・Real time RT-PCRでmRNA量を、ウエスタンブロッテイングと免疫染色にて蛋白量を定量し、上記2群間の発現量を比較した。【結果】I.口腔癌細胞株においてPTHR1の発現をmRNA、蛋白レベルで検出する事が出来た。これら発現量は口腔扁平上皮細胞と歯肉線維芽細胞と比較し有意に高レベルだった。以上より口腔癌においてもPTHR1が過剰発現している可能性が示唆された。本年度は、(1)ヒト

口腔正常組織と口腔癌におけるPTHR1の発現の定量的解析を行い比較する、(2)PTHR1高発現口腔癌細胞株を樹立後、PTHrPの発現量を定量し細胞増殖能について評価を行う、という予定であった。研究進行遅延の主な理由は下記に示す通りである。I.最大の理由は、口腔癌細胞株におけるPTHR1の定量解析と口腔正常細胞における発現量との比較検討を最初に行ったためである。II.また、口腔癌臨床検体を用いたPTHR1の発現量の検討は、条件設定の段階である事、並行して組織標本の収集と標本作製を行っているため。III.高発現細胞株の樹立に用いるPTHR1発現ベクターを作成中であること。IV.異動に伴う研究環境の変化と立ち上げ・引き継ぎ・継続のため。V.震災後の研究室整備から機器メンテナンス、ラボの再構築に時間を要したため。I.まずH23年度研究予定事項について行う。具体的には口腔癌臨床検体における免疫染色を用いたPTHR1の発現の検討を行い正常組織との発現量の差異について比較検討する。II. PTHR1高発現口腔癌細胞株を樹立後、PTHrPの発現量を定量し細胞増殖能について評価を行う。PTHR1高発現株におけるPTHrPの発現量を同様に定量する。続いてこれらの高発現細胞株を用いて、元の細胞株との細胞増殖速度を比較しその差について検討する。以上より、PTHR1とPTHrPの共発現により増殖活性が増大するかについて明らかとなる。III.ヌードマウスに移植可能なヒト口腔癌細胞株でもPTHR1高発現株を樹立し、これをヌードマウスに移植し、コントロール群と比較してPTHrPの発現量を定量後、細胞増殖速度及び転移を生じるまでの期間と、転移範囲及び骨やリンパ節を含む転移臓器の特異性についての検討を行う。特にPTHR1とPTHrPが共に高発現している細胞株が最も転移能が高いかどうかを確認する。IV.樹立したPTHR1高発現癌細胞株に対して、RNAiにてPTHR1の発現と活性を抑制する。その後、コントロール群と比較しその細胞増殖速度及び転移能が抑制されるかどうかを比較する。更にPTHR1の抑制が、既に転移を起こした癌細胞に対しても奏功しその進行を制御するかどうかについても検討する。これにより、口腔癌転移におけるPTHR1の意義とPTHR1-PTHrPの分子機構をin vitro、vivoの両面から解明することが出来ると思われる。・設備備品類超高速冷却遠心器:DNAやPCR産物抽出時、tRNA回収とmRNA抽出→cDNA合成等に使用するが、超高速型で研究時間の短縮にもつながり、コストパフォーマンス面でも必要である。高機能型PCR装置:我々は既にReal-time PCR装置を有しているがこれはmRNA定量専用に使用する。その為高発現株の樹立に必要なcDNA合成、発現ベクターにインサート後の確認等には本装置を用いる。