hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音声記録の所在確認調査に基づくアーカイブズ的資源化のための指標づくりに関する研究

アーカイブズ学の立場から、文書館や図書館を対象に音声記録の所在確認調査を行ない、記録史料としての位置付けを再検討することで、人文科学研究や資料保存の実務に用いることが可能な指標を示すことが目的であり、調査結果から音声記録の多様性を解明しようとした。従って、全国の文書館と都道府県・市立図書館(中央館)計872館にアンケートを送付すること、音声記録の資料化を行なっている文書館や図書館・博物館・大学・研究機関への実地調査を行なうことを研究方法とした。アンケートは音声の所蔵の有無やその内容・媒体・利用制限等を設問とし、65%以上の回答を得た。実施によりアンケートが想定する「音声記録」と「録音資料」の差異への照会が多い等の課題も抽出されたが、館種を超えて受入方針により収蔵されていること、目録編成や代替化・マスキングを含む公開方針等に統一基準がないことが、継続事業として位置付けられにくい一因であることが確認できた。ISAD(G)第2版の「3.2.4取得あるいは譲渡の直接の源泉」に受入方針を反映させる等、研究開始時に想定していた総則的な指標ではなく細則的な指標が求められていると受け止めている。また、実地調査は兵庫県(阪神・淡路大震災の震災資料)や北海道(北方資料)、沖縄県(戦争証言記録)の所蔵機関に、アンケート作成時・実施時の課題等への実際の取り組みを伺った。地域資料としての音声に着目する中で、音声と他媒体の記録を史料群として提供することで組織体の記録が個人の存在を保証することも確認できた。本研究の到達点は決して目新しいものではないが、全国の実務者からの回答を多くの母数で得ることができたことに意義があると考える。また、その過程で音声を「ドキュメンテーション」という切り口でみることで、他媒体の記録史料と同等に検討できるとの結論に至った。これらを反映した内容を平成22年度・23年4月に論文や学会発表で報告した。
マイコプラズマ滑走メカニズムの解明

マイコプラズマ(Mycoplasma mobile)は、細胞壁のない原核生物で、フラスコ型の細胞形態を持つ。細くなった方の端でガラスの表面にはりつき、そのまま滑るように動く滑走運動を行う。その速度は毎秒2.5マイクロメートル(細胞長の約4倍)で、最大力は27ピコニュートンに達する。しかしマイコプラズマには、他の運動性バクテリアで見られるようなべん毛や線毛も、さらには真核生物の細胞運動で見られる、ミオシンのようなモータータンパク質も存在しない。そのため、この運動のメカニズムは現在の生物学では説明できない。本研究はこの未知のメカニズムを解明することを目的として行われ、以下のことを明らかにした。1.滑走運動の中心的な役割を果たしているのは、それぞれ349、521キロダルトンという大きな分子量と、特殊な構造を持っている2つのタンパク質である。それらをGli349とGli521と命名した。2.Gli349タンパク質は滑走中のガラス結合を、Gli521は力発生を行っている。3.滑走タンパク質がマイコプラズマ細胞の細くなった部分の基部(neck)表面に帯状に存在している。4.滑走しているマイコプラズマを、急速凍結フリーズフラクチャーシャドーウイング電子顕微鏡法で観察することにより見られた滑走装置は、膜からつきだしている50ナノメートル長のスパイク様構造である。5.精製したGli349タンパク質分子は全長約115ナノメートルの音符のような構造である。6.以上の結果は、Gli521によって動かされているGli349がガラスへの結合と解離をくり返すことによって細胞を押し出していると考えるとよく理解される。その速度は毎秒2.5マイクロメートル(体長の約4倍)で、最大力は27ピコニュートン(ミオシンの3-5倍)にも達する。他の運動性バクテリアでかならず見られるような、べん毛や線毛も、さらには真核生物の細胞運動で一般的に見られる、ミオシンやキネシンのようなモータータンパク質も存在しない。本研究はこの未知のメカニズムを解明することを目的としている。マイコプラズマ細胞表面に対するモノクローナル抗体を作製し、多数の抗体の中から、滑走を特異的に阻害するものを選び出した。その結果、2つの抗体が取得された。一つは細胞の突出部付け根に局在するタンパク質を認識するもので、滑走中のマイコプラズマに加えると、ガラスへの結合が特異的に阻害された。その標的分子はN末端付近に膜貫通領域を持つ349キロダルトンの巨大タンパク質で、細胞あたり100分子存在していた。もう一つも細胞の突出部付け根に局在するタンパク質を認識していたが、滑走中のマイコプラズマに加えると、ガラスへの結合が阻害されることはなく、運動のみが特異的に阻害された。この抗体の標的タンパク質はN、C両末端近辺に膜貫通領域をもつ521キロダルトンのタンパク質だった。以上の結果は、349キロダルトンのタンパク質がガラスに張り付く役割(接着)を果たし、もう片方が、そのはりついているタンパク質を動かす役割(力発生)を果たしていることを示している。

他の運動性バクテリアでかならず見られるような、べん毛や線毛も、さらには真核生物の細胞運動で一般的に見られる、ミオシンやキネシンのようなモータータンパク質も存在しない。そのため、この運動のメカニズムは現在の生物学では説明できない。本研究はこの未知のメカニズムを解明することを目的としている。すでに平成13年度に、349kDaと521kDaというそれぞれ巨大な分子量を持つ2つのタンパク質、Gli349とGli521が滑走運動に直接関わっていることを明らかにしていた。14年度にはそれらに対するモノクローナル抗体による滑走速度とガラス結合の阻害、さらにガラス表面に種々の修飾を施した時に起こる、結合と滑走速度の変化を詳細に調べた。それらの結果を、申請者が過去に測定した滑走の力学的性質に照らし合わせた。それにより、Gli349がガラスへの結合と解離と構造変化を繰り返して細胞を押し出しており、Gli521がGli349の力と動きを作っているというモデルを提唱した。また、過去に単離した、接着と滑走ができない変異株を解析することにより、滑走に関与していると考えられる新規のタンパク質、Gli123を同定した。このタンパク質は、細胞中で上記二つのタンパク質とは異なった部分に位置していた。マイコプラズマ(Mycoplasma mobile)は、細胞壁のない原核生物で、フラスコ型の細胞形態を持つ。細くなった方の端でガラスの表面にはりつき、そのまま滑るように動く滑走運動を行う。その速度は毎秒2.5マイクロメートル(体長の約4倍)で、最大力は27ピコニュートンに達する。他の運動性バクテリアでよく見られるような、べん毛も線毛も、さらには真核生物の細胞運動で一般的に見られる、ミオシンやキネシンのようなモータータンパク質も存在しない。すでに平成14年度までに、それぞれ123、349、521kDaの分子量を持つ3つのタンパク質、すなわちGli123、Gli349、Gli521が滑走運動に関わっていることを明らかにしていた。15年度にはGli349を中心に研究を進め、以下の結果を得た。(1)Gli349分子内の、タンパク質分解酵素にセンシティブな部位、接着できない変異株で変異の入っている部位、抗体が結合する部位、に関して位置を決定した。(2)Gli349分子を単離、精製してその分子構造を電子顕微鏡で観察した。Gli349は115ナノメートルの棒状の分子で3つの折れ曲がり点を持っていた。そのうち1つは固定角を、2つは自由角を有していた。(5)抗Gli349抗体が結合しても滑走が阻害されない変異株を取得し解析した。その変異は全てGli521に導入されていることが明らかになった。
嫌悪施設の包摂的立地による地域防災力向上への挑戦

福祉施設は既存集落と離れた災害リスクの高い場所に疎外的に立地する傾向がある.2016年8月の岩泉町の水害を受けて立地規制が強化されれば,今後の施設整備の困難さは増し,長期的な不足につながる恐れがある.本研究は,洪水や津波への垂直避難が可能な堅牢な建物と健康・福祉の知識がある職員の昼夜を通じた常駐が,周囲の地域の防災力を高める可能性に注目し,これまで「嫌悪施設」と捉えられてきた福祉施設を既成集落内に包摂的に立地させ,地域防災力を高める方策を研究する.災害リスクの分布と制御を扱う土木工学,避難行動を扱う交通計画,施設の活用とコミュニティーを扱う社会システム工学,施設立地の法規制と助成制度を扱う都市計画学,福祉・医療機能の実態を扱う災害医療の,各分野の研究者の協力体制により,包摂的立地の災害時・平常時の効果を理論的に裏付けるとともに,住民とのコミュニケーション方法と立地推進制度を提案する.平成30年度は,避難機能向上の定量評価,防災機能に関する合意形成の技術、医療・福祉施設の業務継続性分析、平常時の福祉施設の地域連携機能の強化方法、包摂的立地促進制度のそれぞれについて、関連研究のレビューと基礎データの収集を中心に実施した.特に,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法を集中的に研究し,自動車での避難を必要とする住民と利用可能な自動車・運転者数のバランスが異なる状況下での最適避難方法に関する定量分析手法を確立できた.また、平常時の機能と災害時の避難機能とのトレードオフ関係を分析するための方法を研究し、その成果を口頭発表し、査読論文を準備した。平成30年度は,避難機能向上の定量評価,防災機能に関する合意形成の技術、医療・福祉施設の業務継続性分析、平常時の福祉施設の地域連携機能の強化方法、包摂的立地促進制度のそれぞれについて、関連研究のレビューとデータの収集を進めることができた.特に,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法を確立でき、複数の査読論文の公表につながった.また、平常時の機能と災害時の避難機能とのトレードオフ関係を分析するための方法を研究し、その成果を口頭発表し、査読論文を準備した。合わせて、近年の日本における自然災害の被災地の関係機関におけるヒアリングをすすめ、実証的な検討を行う準備を整えてきている。平成31年度は本研究の最終年度であり、各研究分担者がこれまでの成果を取りまとめるとともに、一同に会して研究成果と課題を総合的に議論する場を設けることとしている。福祉施設は既存集落と離れた災害リスクの高い場所に疎外的に立地する傾向がある.2016年8月の岩泉町の水害を受けて立地規制が強化されれば,今後の施設整備の困難さは増し,長期的な不足につながる恐れがある.本研究は,洪水や津波への垂直避難が可能な堅牢な建物と健康・福祉の知識がある職員の昼夜を通じた常駐が,周囲の地域の防災力を高める可能性に注目し,これまで「嫌悪施設」と捉えられてきた福祉施設を既成集落内に包摂的に立地させ,地域防災力を高める方策を研究する.災害リスクの分布と制御を扱う土木工学,避難行動を扱う交通計画,施設の活用とコミュニティーを扱う社会システム工学,施設立地の法規制と助成制度を扱う都市計画学,福祉・医療機能の実態を扱う災害医療の,各分野の研究者の協力体制により,包摂的立地の災害時・平常時の効果を理論的に裏付けるとともに,住民とのコミュニケーション方法と立地推進制度を提案する.平成29年度は,福祉施設等の立地制度のレビュー,福祉施設の疎外的立地データの収集と解析,福祉施設の医療・コミュニティ形成機能,ハザード情報の公開と理解度の実態収集,市街地リスクの現状分析について,関連研究のレビューと基礎データの収集を中心に実施した.特に,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法を集中的に研究し,歩行者と自動車の混在する状況下の最適化,自ら運転が不可能な避難者を途中で乗車させる方策の考慮,一方通行化の効果分析手法の確立などが進展した.平成29年度は,福祉施設等の立地制度のレビュー,福祉施設の疎外的立地データの収集と解析,福祉施設の医療・コミュニティ形成機能,ハザード情報の公開と理解度の実態収集,市街地リスクの現状分析について,関連研究のレビューと基礎データの収集を中心に実施した.また,研究分担者が有する研究ネットワークを情報交換し,本課題に関連する知見を有する有識者をピックアップしてヒアリング調査の企画を行うなどの進展を得た.また,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法の研究が進展し,歩行者と自動車の混在する状況下の最適化,自ら運転が不可能な避難者を途中で乗車させる方策の考慮,一方通行化の効果分析手法の開発が進んだ.福祉施設は既存集落と離れた災害リスクの高い場所に疎外的に立地する傾向がある.2016年8月の岩泉町の水害を受けて立地規制が強化されれば,今後の施設整備の困難さは増し,長期的な不足につながる恐れがある.本研究は,洪水や津波への垂直避難が可能な堅牢な建物と健康・福祉の知識がある職員の昼夜を通じた常駐が,周囲の地域の防災力を高める可能性に注目し,これまで「嫌悪施設」と捉えられてきた福祉施設を既成集落内に包摂的に立地させ,地域防災力を高める方策を研究する.

災害リスクの分布と制御を扱う土木工学,避難行動を扱う交通計画,施設の活用とコミュニティーを扱う社会システム工学,施設立地の法規制と助成制度を扱う都市計画学,福祉・医療機能の実態を扱う災害医療の,各分野の研究者の協力体制により,包摂的立地の災害時・平常時の効果を理論的に裏付けるとともに,住民とのコミュニケーション方法と立地推進制度を提案する.平成30年度は,避難機能向上の定量評価,防災機能に関する合意形成の技術、医療・福祉施設の業務継続性分析、平常時の福祉施設の地域連携機能の強化方法、包摂的立地促進制度のそれぞれについて、関連研究のレビューと基礎データの収集を中心に実施した.特に,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法を集中的に研究し,自動車での避難を必要とする住民と利用可能な自動車・運転者数のバランスが異なる状況下での最適避難方法に関する定量分析手法を確立できた.また、平常時の機能と災害時の避難機能とのトレードオフ関係を分析するための方法を研究し、その成果を口頭発表し、査読論文を準備した。平成30年度は,避難機能向上の定量評価,防災機能に関する合意形成の技術、医療・福祉施設の業務継続性分析、平常時の福祉施設の地域連携機能の強化方法、包摂的立地促進制度のそれぞれについて、関連研究のレビューとデータの収集を進めることができた.特に,時間的に変動する自然災害の被災リスクに対する最適な避難方法を求める手法を確立でき、複数の査読論文の公表につながった.また、平常時の機能と災害時の避難機能とのトレードオフ関係を分析するための方法を研究し、その成果を口頭発表し、査読論文を準備した。合わせて、近年の日本における自然災害の被災地の関係機関におけるヒアリングをすすめ、実証的な検討を行う準備を整えてきている。一部の研究分担者が海外学術研究のため不在となるなどの状況はあるが,海外における福祉施設の活用事例の収集も可能となることから,当初に定めた研究計画を大きくは変更しない形で,着実に研究を進めていくこととしている.平成31年度は本研究の最終年度であり、各研究分担者がこれまでの成果を取りまとめるとともに、一同に会して研究成果と課題を総合的に議論する場を設けることとしている。研究費申請書作成段階では,初年度4月の交付内定後すぐに執行する目算で年度別の使用額を見積もっていたが,実際の交付内定が7月であり,海外旅費などを他の財源から充当した.一方,本研究費は基金であり,無理に年度ごとの執行額を固守するよりも,次年度以降の予算額と合わせて使用することが有効と考えられたため,次年度使用額が発生した.当初の計画より、平成30年度と31年度を一括して研究計画を立案し、関係先ヒアリングや調整の進捗に合わせて研究を進めることととしていたが、予算計上段階に比べて平成30年度内に経費を必要とする活動が少なかったため、31年度の使用額が発生した。平成31年度は最終年度であるため、この分を含めて有効に活用し、本研究の成果の取りまとめを行う予定である。
骨折治癒におけるTIMP3の機能的意義と、新規骨折治癒促進薬の創薬

単球は破骨細胞と樹状細胞に分化することが知られているが、その分化振り分けの機序は不明な点が多い。我々は骨髄間質細胞がTIMP3を豊:富に産生すること見いだし、これによって単球のTACE活性を阻害し単球上のM-CSF受容体発現を誘導することで、破骨細胞分化を促進し樹状細胞分化を抑制することを明らかとした。さらには破骨細胞分化に従い単球自身のTIMP3発現も誘導され、TACE活性の抑制によるM-CSF受容体発現誘導に寄与するものと考えられた。本研究により、骨髄間質細胞はTACEを介したM-CSF受容体切断を制御し単球分化を破骨細胞側へとシフトさせ骨吸収と同時に抗炎症効果をもたらし、骨治癒や骨リモデリングに関与すると示唆された。TACE活性抑制制御因子であるTIMP3の骨折治癒過程における役割を検討するため、in vitroで骨リモデリングを担う骨芽細胞、破骨細胞、免疫細胞等との相互作用を検索した。まず、各臓器および各種細胞でのTIMP3発現パターンを比較した。結果、各臓器においてはほぼ均等な発現パターンを示し、各種細胞については間質細胞での発現が非常に高くおよび破骨細胞での強いTIMP3発現を認めた。次に組み替えTIMP3蛋白添加ならびに、siRNA導入による破骨細胞分化と骨芽細胞分化についての影響について検討した。組み替えTIMP3蛋白添加では双方とも特記する変化は認められなかったが、siRNA導入によるTIMP3発現抑制系において、破骨細胞分化を強力に抑制した。そこで破骨細胞分化における各種段階でのTIMP3発現について検索したところ、破骨細胞前駆細胞ではほとんど認められず、破骨細胞に分化するに従いその発現が増強する事を見いだした。また、Maesらの報告(Maes et al, J Clin Invest. 116(5) : 1230-42, 2006)を参考にマウス骨折治癒モデルを確立した。方法として、(a)10週齢雄性マウスを用い脛骨を露出させ、脛骨近位より26G針を骨軸に平行に髄内へ刺入し、髄内釘挿入部を作成し、(b)矢印に示す骨幹部でニッパーを用いて骨切り。(c)その後、直径0.4mmのステンレススチールワイヤーを26G針の内部に挿入し、骨近位より髄内、骨折部を通り遠位骨片髄内へ挿入し、髄内釘として骨折部を固定。骨折後3日、7日、10日、20日目において軟エックス線撮影、マイクロCTによる形態学的観察を行った。また組織の固定後、薄切切片を作製しin vivoにおいて骨折治癒過程におけるTIMP3の発現分布を免疫染色にて現在、検討中である。本年度はTIMP-3ノックアウトマウスを用いてその骨芽細胞や前駆細胞である間質細胞、破骨細胞、樹状細胞を中心とした免疫細胞等との相互作用を検索した。骨芽細胞の前駆細胞である骨髄間質細胞には、豊富にTIMP-3の発現が認められ、骨髄間質細胞と破骨細胞の前駆細胞である単球を共培養すると、単球の細胞膜表面のM-CSFR発現が著しく亢進した。一方でTIMP-3ノックアウトマウスは、骨組織に対し特記すべき表現系は存在しなかった。TIMP-3ノックアウトマウスの間質細胞と単球の共培養で単球のM-CSFR発現上昇は認められなかった。これはTIMP-3ノックアウトマウスの間質細胞と野生型マウスの単球を共培養した場合でも同様であり、間質細胞の発現するTIMP-3が単球のM-CSFR発現に対し正に制御することが考えられた。そこで骨髄間質細胞の発現するTIMP-3が単球の破骨細胞と樹状細胞分化にどのような影響を及ぼすかを検討した。TIMP-3ノックアウトマウス単球のGM-CSFとIL-4の刺激による樹状細胞分化能については野生型と比較し優位な差は認められなかった。しかしながら、野生型マウスの骨髄間質細胞は破骨細胞分化を促進し、樹状細胞分化を抑制したのに対し、TIMP-3ノックアウトマウスの骨髄間質細胞は樹状細胞分化の抑制が認められず破骨細胞分化の促進も認められなかった。この結果、骨髄間質細胞は骨髄内でTIMP-3を豊富に産生することで単球のM-CSFR発現を促進し破骨細胞分化を誘導し、樹状細胞分化を抑制していることが示唆された。本研究により骨髄内という環境での免疫抑制と骨吸収の調節機構が明らかとなった。本研究の成果は現在投稿準備中である。
ラット遊離潅流肺標本を用いての肺の虚血/再潅流障害の機序解析

ラット遊離環流肺標本において、左右肺動脈を周囲組織から剥離、左右肺動脈を個別に遮断できるモデルを作製した。我々の仮説は、虚血により、虚血肺に好炎症性サイトカインが強く発現し、虚血・再環流障害の原因となるである。このモデルにおいて5%炭酸ガス加空気にて両肺を換気下に60-100分左肺の環流を遮断した後(環流は4%bovine serum albumin加Kerbs-Henseleit solutionで0.04ml/gram body weight)、左右肺から個別に再環流を0-20分おいてより100mg前後の組織を数ヶ所より採取した。この肺組織よりChomczzynski and Sacchiの方法によりtotal RNAを抽出、MPCR primerを用いてTNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,Interferon-γを各サイトカインの至適温度とサイクル数でRT-PCRを行い、合成されたDNAをagarose gel中で電気泳動、cthidium bromideで発色させて検出した。その結果は、TNF-α,IL-1β,IL-6は同様な発現を示した。すなわち、左肺虚血60100分の虚血、再環流020分で、右肺に左肺と同程度かより強く発現した。この傾向は虚血・再環流時間で変動しなかった。IL-10では、虚血・再環流により左肺に強く発現し、Interferon-gは一定の傾向を示さなかった。環流を受けていた右肺に好炎症性サイトカインが強く発現した原因は、環流液中のbovine serum albuminがstandard品であるため、endotoxinを含んでいることに起因すると想定された。左右肺に好炎症性サイトカインが発現しながら、左肺に虚血・再環流障害が生じることは、好炎症性サイトカインにより誘導された因子と、酸素供給が充分あることにより産生されたoxygen radicalが反応して細胞膜を傷害し肺水腫を形成する機構を示唆した。ラットをネンブタールip投与にて麻酔後、気管切開、カニュレーション、5%炭酸ガス加空気にて換気、胸骨縦切開、肺動脈を分離後、ヘパリン投与、右心室に小切開を加えて肺動脈に還流のためのカニュレーション、ついで左心室に小切開を加えて経左心室にて左房にカニュレーション、肺血管床に肺静脈圧の上昇をきたさない状態を確保してより用意しておいた4%アルブミン加Krebs-Henseleit液をperistaltic pumpにて流し、肺血管床の血液を充分除去できた状態で左房カニュレーションをリザーバーへと接続して還流をはじめ、心肺をen blockとして取り出し、37度C恒温室内にてForce-displacement transducerに懸架する。左右主幹肺動脈を周囲組織から剥離して個別に遮断できるように準備を整え、一定還流量下での右左肺血管床の個別の還流圧、及び急激に還流を遮断した状態で肺静脈圧を一定圧に上昇、保った状態での肺組織の重量増加の時間経過をForce displacement transducerにより記録し、左右肺血管床の透過係数を個別に決定できるモデルを確立した。このモデルにおいて、内部コントロールの右肺の透過係数の変動との比較において、虚血によりどの程度透過性が変化したかを決定できることを確認した。測定終了後、右左肺を個別に採取、lipuid nitrogen中に保存、total RNAを抽出し、PCRによりTNF-alpha,IL-1-betaのmRNAを検出する予備実験を行える目途がついた。

ラット遊離肺環流標本を作製、5%炭酸ガス加空気にて換気を行っている条件下で左右肺動脈を分離、左右肺動脈を個別に閉塞できるモデルを作成した。環流は、Krebs-Henseleit solutionに4%でbovine serum albuminを加えて0.04ml/g body weight/minの流量にて行った。このモデルで、左右肺を換気下に、左肺を一定時間虚血にさらしてより再環流することにより、左肺に肺水腫が発生することから、左肺は低酸素症により肺水腫をきたすのでないことを明らかにした。左肺の虚血・再環流による肺水腫の原因を明らかにするために、再環流後一定時間経過後に肺組織の一部を採取、RT-PCRにてサイトカインmRNAの検出を行うことを今年度の主目的とした。本モデルでは、左右肺が同一温度、換気下におかれているため、右肺を内部コントロールとして用いることができ、実験条件に影響されやすいmRNAの発現を厳密に検討できることが特徴である。左肺を虚血100分後、両肺環流として、再環流5,10,15,20,25,30分にて左、右肺の一部を採取、残り肺でwet/dry ratioを求めて虚血にて肺水腫が発生することを確認した。採取した肺サンプルから直ちにRNA-witzerを用いてRNAを抽出、分光光度計にてRNA量を測定、左右肺からのRNAを同量にそろえた。IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-αのPCR primerを使用して、至適条件の温度、cycling timeを求めてRT-PCRを行った。このサンプルを電気泳動にて分離したところ、コントロールのGAPDH mRNAには差がみられず、IL-1β,IL-6mRNAは、左肺にのみ虚血100分後、再環流5,10,15分で発現した。左肺は虚血にさらされているが右肺と同じガスで換気されており、肺胞からの酸素化により虚血肺は低酸素におちいっていない肺組織に特異的な病態で、好炎症性サイトカインmRNAが発現し、肺水腫をきたす病態と密接に関係していることを示唆した。ラット遊離環流肺標本において、左右肺動脈を周囲組織から剥離、左右肺動脈を個別遮断できるモデルを作製した。我々の仮説は、虚血により、虚血肺に好炎症性サイトカインが強く発現し、虚血・再環流障害の原因となるである。このモデルにおいて5%炭酸ガス加空気にて両肺を換気下に60-100分左肺の環流を遮断した後(環流は4%bovine serum albumin加Kerbs-Henseleits solutionで0.04ml/gram body weight)、左右肺から個別に再環流を0-20分おいてより100mg前後の組織を数ケ所より採取した。この肺組織よりChomczzynski and Sacchiの方法によりtotal RNAを抽出、MPCR primerを用いてTNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, Interferon-γを各サイトカインの至適温度とサイクル数でRT-PCRを行い、合成されたDNAを. agarose gel中で電気泳動、ethidium bromideで発色させて検出した。その結果は、TNF-α, IL-1β, IL-6は同様な発現を示した。
思春期青年期における自己の否定的側面への対処と親による支援についての検討

本研究では,青年期に経験される自己評価・自尊心の低下について,その体験過程と克服あるいは適応の過程について,親の支援の在り方を含めて検討することを目的としている。2年目までに仮説モデルを構成し,その後モデルの検証を試みることが研究の全体計画である。研究計画に基づき,初年度に予定していた大学生へのインタビュー調査(自己評価・自尊心の低下の時期を概ね終えた対象への回顧的な情報収集)を行った。21名の大学生に「自己に関する否定的経験」の内容や,その経験をした際の心理過程,他者からの助言や支援,その後の考え方等への影響について聴き取りを行い,そのすべての内容について逐語録を作成した。分析としてはまず,逐語録からエピソードを収集する作業を行った。具体的には,58個のエピソード(一人15個)を特定して内容による分類を行った。詳細な内容の分析は,逐語録をもとに修正版グラウンデッドセオリー(M-GTA,木下,2003など)を用いて行い,否定的経験の体験過程に関する仮説モデルの構築を行った。内容の分類結果は発達心理学会において発表し,構築した仮説モデルは2019年度に発表を予定している。平行して,同じく初年度に予定していた大学生の親に対するインタビュー調査も実施した。実施対象は3名と当初の予定より少ない実施となったが,親視点からの体験過程に関する豊富な語りを得ることが出来た。こちらもすべての内容について逐語録を作成しており,2019年度当初には逐語録の分析を開始する。大学生データから作成した仮説モデルと対応づける形で,仮説モデルを発展させていくことが今後の課題である。研究費の制約等もあり,初年度は逐語録をほとんど研究代表者が独力で作成し,分析準備に多くの時間を割いたため,構成した仮説モデルを発表するところまで年度内に到達できなかった。また,大学生の親世代の調査対象の募集を直接の声かけによってのみ行ったことから,年度内に予定通り集まらず,親の支援に関わる情報が限定的にしか得られなかった。2年目は予定通りの進捗に追いつけるよう募集方法や分析の方法に工夫を行いたい。2年目は,否定的自己の経験のさなかにあると考えられる中高生とその親を対象に聴き取り調査を行い,モデルの修正(仮説モデルの完成)を行うことを計画している。ただし,初年度の調査で,大学生時期が必ずしも「否定的自己を乗り越えた時期」とも言えないことが明らかになったことから,成人期世代への追加調査も検討したいと考えている。親へのインタビューの逐語録化が年度内にすべて修了しなかったことが原因である。2019年度初頭には終了予定であり,予定通りの予算使用を終える予定である。
神経伝達物質受容体のシナプス膜面での動態を規定する分子のスクリーニング技術の開発

凍結割断レプリカ免疫電顕法は、シナプス膜面の立体構造を保持したまま、神経伝達物質受容体などのタンパク質を可視化できる技術である。しかし、遺伝子導入したニューロンのシナプスをレプリカ標本上で識別し、シナプス分子の動態に与える影響を解析する技術が確立されていなかった。今回、膜融合蛍光タンパク質を遺伝子導入マーカーとして利用し、標本作成後リフォールディングさせることにより蛍光シグナルを復活させ、遺伝子導入ニューロンをレプリカ標本上で識別する技術の開発に成功した。凍結割断レプリカ免疫電顕で検出できる遺伝子導入マーカーコンストラクトの候補として、平成23年度にpCAGGS-Venus-VAMP2, pCAGGS-Venus-VGlut1, pCAGGS-Venus-VGlut2について解析した。これらを子宮内エレクトロポレーション法により大脳皮質II/III層の錐体ニューロンに導入し、大脳皮質V層の錐体ニューロンに投射するシナプス前終末でこれらのシグナルが集積することを確認した。遺伝子導入マウスをPFAで還流固定し、遺伝子導入部位の組織片を切りだし、高圧下で急速凍結・割断し、カーボン蒸着、SDS処理により細胞質成分を除去し、SDS-FRL標本を作成した。ポリエチレングリコールとレチナールを含む溶液でSDSを含むレプリカ標本溶液を段階的に置換して蛍光タンパク質をリフォールディングし、蛍光シグナルの検出に成功した。平成24年度は、膜結合型蛍光タンパク質の発現コンストラクトpCAGGS-EGFP-H-rasおよびpCAGGS-myr-mCherryについても同様の手法でSDS処理後のリフォールディングに成功し、抗GFP抗体を用いて電子顕微鏡下でEGFPのシグナルの検出にも成功した。凍結割断レプリカ免疫電顕法は、シナプス表面タンパク質を可視化する方法として極めて有用であるが、これまで遺伝子導入と組み合わせることができなかった。今回の研究で、遺伝子導入した膜融合蛍光タンパク質を、SDS処理をした後にリフォールディングさせることにより、導入ニューロンを識別する技術が確立できた。これにより、今後シナプス分子のshRNAやfloxマウスに対するCre組換え酵素などを導入することにより、これらの分子が膜タンパク質のシナプス表面での動態に及ぼす効果を効率よく解析できることが期待できる点で、重要な意義を持つ。凍結割断レプリカ免疫電顕法(SDS-FRL法)は、膜タンパク質のシナプス膜表面での動態を解析するための極めて有効な手法であるが、遺伝子導入法と組み合わせて導入遺伝子の効果を検証するための技術は確立されていなかった。この技術を開発するために、我々は子宮内エレクトロポレーション法を用いて、マウスの大脳皮質II/III層の錐体神経細胞に膜融合型GFP発現コンストラクトを導入し、導入細胞のシナプスからのGFPの検出を試みた。様々な膜融合型GFPコンストラクトについてGFPシグナルがシナプスに効率よく移行するものを共焦点蛍光顕微鏡下でスクリーニングしたところ、VGlut1, VGlut2, VAMP2などのコンストラクトで、シナプス領域に強いシグナルが得られた。これらシグナルを指標とし、GFP発現が見られる脳の組織片を切りだし、高圧下で急速凍結・割断し、カーボン蒸着、SDS処理により細胞質成分を除去し、SDS-FRLサンプルを作成した。レプリカサンプル上でGFPのシグナルを検出する方法の開発として、SDSによって変性しているGFPタンパク質のリフォールディングを試みた。このために、ポリエチレングリコールとレチナールを含む溶液でSDSを含むレプリカ標本溶液を段階的に置換した。これを蛍光顕微鏡下で観察し、レプリカサンプル上でGFPのシグナルの検出に成功した。次にGFP抗体によりレプリカ標本の免疫染色を行い、透過型電子顕微鏡下でシナプス膜表面で導入遺伝子のシグナルの検出に成功した。子宮内エレクトロポレーション法は、複数の遺伝子コンストラクトを同時に導入できるため、今回の研究が成功したことにより、膜融合型GFPを遺伝子導入細胞の指標として、任意の遺伝子コンストラクトの、膜タンパク質の動態に与える作用を解析する技術が確立されたことになり、シナプス研究の進歩に飛躍的な影響をもたらすと考えられる。(理由)当初の計画では、子宮内エレクトロポレーション法によって導入した膜融合型GFPのシグナルを、免疫電顕法によりSDS-FRLサンプル上で検出することを中心に据えていたが、本研究ではこれに加え、SDS-FRLサンプル上でGFPをリフォールディングさせることにより、GFPの蛍光シグナルも復活させることに成功したため、当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究は、特にシナプス後膜肥厚(PSD)局在タンパク質Neuroliginの遺伝子導入細胞での神経伝達物質受容体の動態に与える影響を解析するために用いる予定であったが、マーカーとすべく膜融合GFPのスクリーニングにおいて、シナプス前終末局在性分子との融合GFPコンストラクトで効率よくシグナルが検出できた。Neuroliginはシナプス前終末タンパク質Neurexinとシナプス間隙を隔てて結合し、シナプス成熟を誘導することが知られることから、Neurexinなどのコンストラクトと膜融合型GFPコンストラクトをシナプス前終末に発現させ、シナプス前終末及びそれに接するシナプス後終末の膜タンパク質の動態を解析していきたい。

導入遺伝子コンストラクト作成のための遺伝子工学関連試薬、レプリカ免疫電顕法に関わる試薬、抗体などの消耗品の購入費、マウスの購入費や飼育費、マウスの飼育管理のための研究補助員の給与に当てる。
生体捕獲エゾシカの短期肥育特性の解明

北海道では、野生エゾシカによる農林業被害が深刻化し、その対策として生体捕獲ジカの短期飼育による有効活用(一時養鹿)が行われている。本試験では、一時養鹿に必要なエゾシカの短期飼育肥育特性の解明を目的とした。増体について、成獣雌鹿は出産や授乳の影響により増体量が低かった。成獣雄鹿も増体量は低いが、得られる肉重量は最も高かった。満1歳鹿は雌雄ともに肉重量は低かったが、増体量が高く、飼料効率は高かった。また、成獣では飼育環境により解体時期による肥育成績の差は出ないことが推察された。代替飼料の給与について、製造副産物などの代替飼料の活用により生産費の低減が可能であることが推察された。生体捕獲エゾシカの食肉生産システム(一時養鹿)において、エゾシカの飼育コスト低減が課題となっている。野生エゾシカを生体捕獲後、一定期間飼育することで肉質の改善が試みているが、近年の配合飼料価格上昇が影響し、牧場へ導入後できるだけ短期間で食肉処理されるか、捕獲時に外見上十分な体格の個体は、そのまま食肉処理されている。このため、本試験では肥育効果を検証するため、3月に捕獲後4月または10月まで飼育し、肥育成績について検討した。供試動物は2012年3月に前田一歩園財団所有地(阿寒湖周辺)で生体捕獲された野生エゾシカ成雌8頭とした。導入ジカは4月(4月解体区)と10月(10月解体区)に解体処理し、飼育成績と枝肉成績を比較した。両区のシカの平均体重は導入時体重を基にそろえ、一群で飼育した。給与飼料はNRC(2006)を参考にし、4月までは乾草を自由摂取、アルファルファヘイキューブ、ビートパルプ、圧片トウモロコシを制限給与した。4ー10月の期間は乾草および牧草サイレージを自由摂取、トウモロコシサイレージ、ビートパルプ、フスマ、大豆粕を制限給与した。その結果、飼料の乾物摂取量は3ー4月の間は低かったが、その後9月まで増加した。飼育成績では、体重は導入時期よりも4月解体では増加しなかったが、10月解体ではわずかに増加した。枝肉重量、正肉重量、枝肉歩留、正肉歩留は10月解体は4月解体より低く、歩留では有意差(P<0.05、P<0.01)が認められ、枝肉歩留は2011年度の試験における成雌ジカの値(50.8ー55.4%)よりも低かった。10月解体の枝肉成績が4月解体よりも低かった要因として、乾物摂取量中59.0%を占めた乾草の粗蛋白質含量が7.7%(乾物中)と低かったこと、本試験期間の平均気温が例年よりも高かったことなど、複数の要因が影響したものと推察された。飼料給与費の低減を想定し、デンプン粕とポテトプロテインにフスマを混合し調製したサイレージ(PPS)をトウモロコシと大豆粕の代替飼料としてエゾシカに給与し、飼育成績と肉の一般成分に及ぼす影響を検討した。試験期間は2013年2月15日から2013年10月1日までとし、2月15日から6月3日までを馴致期間、6月4日から10月1日までを本試験期間とした。供試動物は2013年23月に阿寒湖周辺で生体捕獲されたエゾシカ8頭とした。試験区は対照区と代替飼料区を設け、両試験区に平均体重が等しくなるようにエゾシカを4頭ずつ配置した。給与飼料は乾草、ビートパルプ(BP)、圧扁トウモロコシ(FC)、大豆粕(SBM)、PPSとした。給与量は2006年版NRCオジロジカ育成の値を参考に決定し、対照区はFCとSBMを乾物給与比で19.1%(FC:13.5%、SBM:5.6%)給与し、同様に代替飼料区ではPPSを19.4%給与した。本試験期間の乾物摂取量(DMI)は対照区が776.3gDM/頭/日、代替飼料区は883.7gDM/頭/日であった。増体量は対照区が12.6kg/頭、代替飼料区が11.0kg/頭、日増体量は対照区が106.6g/頭、代替飼料区が92.6g/頭となり、いずれも有意差は認められなかった。また、枝肉重量、枝肉歩留、正肉重量、正肉歩留も両試験区に有意差は認められなかった。ロース肉の一般成分は、水分含量と粗灰分含量において代替飼料区の方が対照区より有意に(P<0.05)高かった。以上のことから、PPSはトウモロコシおよび大豆粕の代替飼料として給与可能と考えられたが、肉の一般成分のうち粗灰分含量に有意差が見られたことから、給与飼料と肉のミネラル含量について検討を行う予定である。

また、成獣では飼育環境により解体時期による肥育成績の差は出ないことが推察された。代替飼料の給与について、製造副産物などの代替飼料の活用により生産費の低減が可能であることが推察された。北海道では野生エゾシカの個体数管理の一貫として、野生エゾシカを生体捕獲し一時肥育を行う、食肉生産システム(一時養鹿)が稼働している。生体捕獲では様々な性別や年齢のシカが捕獲されることから、性別および年齢別の増体量と枝肉成績の差異を調べた。供試動物は3月に前田一歩園財団所有地で生体捕獲したエゾシカ満1歳雌6頭、満1歳雄3頭、成雌6頭および成雄4頭とした。導入ジカは満1歳の雌雄と成雌を1群で、成雄は別施設に1群で飼育した。飼料は乾草を自由摂取させ、アルファルファ、ビートパルプ、圧扁トウモロコシおよび大豆粕を制限給与した。測定項目は飼料摂取量、増体量、枝肉成績およびロース肉成分とした。なお、肉成分分析は各区からランダムに3頭ずつ供試した。その結果、体重増加の推移は雌雄や年齢にかかわらず、9月から屠殺時まで停滞がみられた。また、出産した成雌ジカは出産後の体重増加が見られなかった。増体量と日増体量有意差(P<0.01)がみられ、満1歳が最も高かった。枝肉重量と正肉重量は雌雄と年齢に有意差(P<0.01)がみられ、性別では雄が高く、年齢では成獣が高かったが、枝肉歩留と正肉歩留は有意差が認められなかった。部位別の肉重量は雌雄と年齢に有意差(P<0.01、P<0.05)がみられ、成雄が最も高かった(P<0.01)。有意差はなかったが満1歳雄と成雌が同程度、満1歳雌が最も低かった。ロース肉の一般成分について、年齢および性別による有意差はみられず、平均して水分74%、蛋白質22%、脂肪2%であり、牛肉や豚肉よりも高蛋白質・低脂肪であった。肉のミネラル含量は、100g当たり鉄が3.4mg、亜鉛が2.9mg、銅が0.1mgであった。鉄の含量は他の家畜の肉よりも多かったが、野生ジカの肉の報告値に比べ低く、屠殺時の放血処理方法が鉄含量に影響したものと推察された。2012年度の試験では肥育の効果について検証を行ったが、暑熱の影響と給与飼料の粗蛋白質含量が当初予測よりも低かった影響を受け、2011年度の肥育成績よりも低い成績となった。肉の成分値については、今後順次検証を行っていく予定であるが、成分分析値だけではなく、ヒトによる食味官能試験を実施し、鹿肉の味に違いが出るか検討したいと考えている。2013年度の研究については、給与飼料の代替を想定した試験を予定している。すでに地元JAから委託試験により、ヒツジによる消化試験の結果が得られていることから、デンプン粕を給与し肥育試験を行うこととした。デンプン粕は水分が高いことから、試験期間中の給与を考慮し、サイレージ調製を行って給与することにした。その際、水分調整が必要なことから、フスマを混合することにした。デンプン粕サイレージの調製に際し、原料のデンプン粕はJAの協力を得ることができた。また、調製後の発酵品質は良好であり、成分分析を基に飼料の給与設計を現在行っているところである。これらのことから、2012年度の試験については新たな視点での評価を検討し、実施していく方向で調整している。また、2013年度の試験についても、給与飼料の確保ができたことから、概ね順調に進展していると考えている。生体捕獲したエゾシカは、捕獲時に個体の選択が難しく、運搬時のストレスによる捕獲性筋症の発症や導入時の暴走により施設に衝突し骨折する事故などが生じる恐れがある。また、人に馴れていないため、導入から一ヵ月は取り扱いに注意が必要である。本年度は施設整備により衝突事故は生じなかったが、6月に妊娠していた雌ジカに起立不能が生じた。
近赤外光を用いたラット灌流脳の高次脳機能と酸素代謝の分光学的研究

(目的)低酸素になると脳の高エネルギー化合物濃度は解糖系などからも供給されるが最終的には減少する。ところが実測のATP濃度が減少する前に神経活動は低下する。酸素不足が誘起する脳機能低下を検討するために灌流脳を用いて分光学的にチトクロームオキシダーゼ(Cyt.ox.)の酸化状態を脳波とともに測定した。(方法)in situ灌流にした点を除いて、Inagaki and Tamura(1993)の方法に従ってモデルを調製した。(結果と考察)定流量灌流で酸素濃度を低下させたときの脳波の徐波化とHeme aa3の酸化状態の間に高い相関が認められた。また低酸素による脳波の消失後、ビククリンを投与するとてんかん発作を起こした。酸素不足による脳機能の低下は、ATP合成の低下によって通常の電気的神経活動の維持に必要なエネルギー需要を賄えないが、短時間の神経活動が可能なATP濃度を維持するというエネルギー保存機構の一面を表わすと考えられる。本研究の結果はDuffy et.al(1972)の神経活動の低下がエネルギー不足を回避するための応答であるという提案を支持するものである。灌流モデルでは頸動脈小体は機能していないので、考えられるエネルギー保存機構としては、酸素に対してCyt.ox.より高いkm値をもつ神経伝達物質の生合成系の活性低下やミトコンドリアの膜電位維持機構などが挙げられる。
mTOR の新規調節因子による神経皮膚症候群の神経と腫瘍病変の共通制御機構の解明

最近、Mammalian target of Rapamycin (mTOR)の神経病変および腫瘍形成における役割が注目を集めてきている。一方、mTOR系の異常の結果、中枢神経障害と全身の腫瘍発生を引き起こす一連の疾患群(神経皮膚症候群)がある。申請者はこの神経皮膚症候群の一つである結節性硬化症において減少し、てんかんや精神発達遅滞などの神経症状と腫瘍発生に重要な関連のある新規の蛋白質p40を見出した。そこで、本応募研究において、このp40がこれら神経皮膚症候群の神経病変と腫瘍形成の両方における共通のキーファクターであると考え、その機構を解明し、ひいては神経症状と腫瘍発生を同時に抑制できる方法を確立することを目的として、p40やTSC1,TSC2のノックダウン細胞を用いてp40とtuberin、hamartinおよびPI3k-AKT -mTOR系に関与する蛋白質との関係を調べた。その結果、p40はFKBP12、FKBP38の発現と強い相関関係を呈し、ラパマイシンや、FKBPs, tuberin, hamartinなどと同様にmTOR系の調節に関与する新規の蛋白質であり、hamartinと蛋白レベルで結合しtuberinとはhamartinを介してTH-complexと結合しており、お互いの安定化に関与している可能性が示唆された。a mammaliantarget of Rapamycin (mTOR)には細胞の分化や増殖など、種々の作用があり、最近は腫瘍形成のみならず、神経系に対する作用にも注目が集まっている。一方、mTOR系の異常の結果、中枢神経障害と全身の腫瘍発生を引き起こす一連の疾患群、神経皮膚症候群、がある。そこで、神経皮膚症候群の一つである結節性硬化症(TSC)や神経線維腫症(NF1)などにおける、mTORあるいは種々の既知、新規のmTOR関連物質の作用を検討することにより、mTOR系の神経病変と腫瘍形成の共通のキーファクターを確定し、その機構の解明目指した。まず、TSCで低下しており、mTOR系の新規関連物質の可能性が考えられるp40のSiRNAを用いてHeLa細胞をノックダウンした。P40のノックダウンにより、細胞の増殖能が低下し、移動能が促進した。また、P40をノックダウンしたHeLa細胞では,チュベリン、ハマルチン、RhoBのmRNAレベルは低下しており、RhoA, mTORとcaspase3のmRNAレベルは増加していた。一方、caspase8のmRNAレベルの変化は認められなかった。これらの結果はTSC患者由来培養細胞やTSC1, TSC2をノックダウンした細胞に認められる結果と類似であった。同時にこれらの結果はラパマイシンで処理した細胞に認められる変化とも類似しており、p40もmTORやチュベリンハマルチンと同様にmTOR系に作用して細胞の増殖に関与するファクターの一つである可能性が示唆された。一方、mTOR系の異常の結果、中枢神経障害と全身の腫瘍発生、皮膚の色素異常を引き起こす、神経皮膚症候群と呼ばれる一連の疾患群がある。そこで、神経皮膚症候群の一つである結節性硬化症(TSC)や神経線維腫症(NF1)、伊藤白斑などにおける、mTORあるいは種々の既知、新規のmTOR関連物質の作用を検討することにより、mTOR系の神経病変と腫瘍形成との共通のキーファクターを確定し、その機構の解明目指した。我々は既にTSCなどの患者由来繊維芽細胞や表皮細胞におけるmTOR関連物質の変化を調べてきた。今回は、神経系の細胞においても同様の変化が認められるか否かの検討を試みた。ところで、皮膚の色素細胞は、発生学的には神経細胞と同様に神経堤より発生し、神経細胞と類似の性質を備えている。一方、前述の神経皮膚症候群ではTSCの葉状白斑や、NF1のカフェオレ斑など、しばしば皮膚の色素異常を伴う。そこで、神経細胞のモデルとして皮膚の色素細胞を用いて研究を進めた。まず、患者由来色素細胞の培養方法は確立していないので、患者由来色素細胞の培養方法の確立を目指した。ヒト

正状メラノサイトにmTOR阻害剤を作用させての検討と同時に、ヒト正常メラノサイトにTSC1, TSC2のsiRNAを導入し、TSC1, TSC2のモデル色素細胞を作製し、これを用いて、今まで繊維芽細胞や表皮細胞で調べてきたのと同様に、mTORC1, mTORC2, FKBP12, 38BCL2, MITF, caspase3, Rhoなどの変化を検証した。その結果メラノサイトにおいも、mTOR、BCL2の変動が確認されたと同時に、MITFの変化も確認できた。mammaliantarget of Rapamycin (mTOR)には細胞の分化や増殖など、種々の作用があり、腫瘍形成のみならず、神経系に対する作用にも注目が集まっている。一方、mTOR系の異常の結果、中枢神経障害と全身の腫瘍発生を引き起こす一連の疾患群、神経皮膚症候群、がある。そこで、mTOR系の異常の結果、中枢神経障害と全身の腫瘍発生を引き起こす結節性硬化症(TSC)をモデルとして、既知、新規のmTOR関連物質の作用を検討することにより、mTOR系の神経病変と腫瘍形成における共通のキーファクターの解明を試みた。まず、TSCで特異的に減少し、TSCの神経症状と関連があり、さらにアポトーシスの誘導に関与することが知られているp40に注目し、p40とmTOR,あるいはtyberin, hamartinとの関係の解明を試みた。HeLa細胞をp40のSiRNAを用いてノックダウンしたところ、細胞の増殖能が低下し、同時に細胞の移動能が促進していた。さらに、P40をノックダウンしたHeLa細胞では,tuberin, p-Tuberin(939,) p-Tuberin(1462), hamartin, RhoBのmRNAレベルは低下しており、RhoA, mTORとcaspase3のmRNAレベルは増加していた。一方、p-tuberin(1254), caspase8のmRNAレベルの変化は認められなかった。HamartinをノックダウンしたHeLacellでもRhoBの発現が増加しており、これらの変化はTSC1, TSC2ノックダウン細胞と類似の変化と考えられた。以上より、P40もtuberin hamartinと同様にmTOR系に関与する新規関連物質の一つであり、神経病変と腫瘍形成における共通のキーファクターの可能性が示唆された。予想したデータとことなるデータが出てきたため、新しい実験の追加が必要となってきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、TSC, NF1などの、神経皮膚症候群の患者由来繊維芽細胞や表皮細胞だけでなく、色素細胞に関しても、p40、mTOR, BCL2、FKBP12、FKBP38, caspase類,アポトーシスやオートファジーの変化を見ていく。同時に、siRNA,を用いて、TSC1, TSC2, p40などをノックダウンした神経皮膚症候群のモデル細胞(繊維芽細胞、表皮細胞および色素細胞)を用いて同様の変化を検証する。
心筋炎.心筋症の免疫.ウイルス学的研究 心筋in situ.培養心筋を用いた検索

[1]モデル動物における研究:マウスのcoxsackie B3 virus性心筋炎の心筋病巣では多数のT細胞(CD4,CD8)、asialo GM_1^+細胞、マクロファージが浸潤する。リンパ球とマクロファージとの接縦像、及びリンパ球と心筋細胞との接触像並びにemperipolesisも認められた。MHC classI抗原は最初心筋細胞のSRに出現し、次いで形質膜にみられた。この様な心筋細胞にT細胞が近接する像もみられた。また、MHC class II抗原はマクロファージ及び血管内皮細胞に発現する。これはウイルス等の外来抗原提示はマクロファージ様の抗原提示細胞が担当し、抗原情報をhelperT cellに伝達することが示唆される。ウイルス抗原は心筋細胞のSRや形質膜に認められる。一部の心筋細胞では介在板が開大し、その領域の形質膜にウイルス抗原が存在する。リンパ球やマクロファージにもウイルス抗原が陽性であった。coxsackie B virus cDNAを用いたinsitu hybridizationではC3Hマウスにおいてはウイルス遺伝子は急性期の心筋病巣に陽性であり、AJマウスまたはハムスター心筋炎ではより長期に心筋内に認められた。〔2〕in vitroにおける免疫学的検索:本検索では培養心筋細胞は成熟マウスの心筋より採取し、培養を試みた。この際、心筋細胞障害を検討するのに十分な量の心筋細胞を一定に採取することが困難なため、胎児心筋より培養心筋を得る方法で検討を行っている。[3]心筋炎、心筋症患者の生検心筋を用いた免疫組織学的検索:ヒトのウイルス性または特発性心筋炎の生検心筋ではT細胞の浸潤が優位であるが、Leu7またはLeu11陽性細胞の浸潤も認められた。壊死病巣周囲に多数の細胞障害性T細胞の浸潤を認める症例もある。拡張型心筋症ではT4/T8比は一般に低下する症例が多い。心筋症、心筋炎患者の生検心筋におけるウイルス遺伝子の検索はPCR法を用いると32%に陽性結果がみられた。in situ hybridization法での検索を継続中である。[1]モデル動物における研究:マウスのcoxsackieB3 virus性心筋炎の心筋病巣では多数のT細胞(CD4,CD8)、asialo GM_1^+細胞、マクロファージが浸潤する。本研究は、心筋炎、心筋症モデル動物(マウスのcoxsackie B3 virus性心筋炎)、並びに心筋症患者の心筋で、心筋病変を検索し、それらの免疫学的背景を各種の抗リンパ球抗体、抗組織適応抗原(class I、II)抗体で染色し、心筋in situで検討した。また、心筋病変におけるウイルスの役割を明確にするために、coxsackie B virus cDNAを用い、in situ hybridization法で、ウイルス遺伝子の心筋内局在性を検討した。[I]マウスのcoxsackieB3 virus性心筋炎における研究(1)免疫組織学的検索。心筋壊死病巣にはT細胞、ことに多数のCD4陽性細胞、asialo GM1陽性細胞の他、少数のCD8陽性細胞並びにMac陽性細胞を認める。これらが心筋細胞壊死に重要な役割を演じていることが明らかにされた。また、MHC class I抗原の発現が著明であることより、心筋壊死の発現にはcytotoxic T細胞の関与が強く示唆された。(2)in situ hybridizationによるウイルス遺伝子の検索。微量高速冷却遠心機でcoxsackie B