hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
図的仕様記述からのデータ駆動型メディアプロセッサ用プログラムの自動生成手法

本研究の最終的な目的は、ハードウェア論理とプログラム処理とを柔らかなシステム仕様として統合的に記述し、これらを段階的に漸次詳細化とする過程を通して、自律分散型超並列ULSIシステムのソフトウェアとハードウェア実現法とを自動生成する手法、ならびに、その支援環境を確立することにある。本奨励研究では、その一環として、画像・通信分野をターゲットとした動的データ駆動型メディアプロセッサDDMPのための並列処理ソフトウェアの自動生成手法を確立し、実用的な応用分野への適用を可能にすることを目的としている。研究最終年度にあたる本年度は、多次元ストリームデータを対象とした処理の仕様記述体系をより実用的な水準に高度化する検討を進め、以下の研究成果が得られた。(1)仕様記述過程の支援手法:中間言語水準での検証結果を対話的にユーザに提示する観点から、多次元ストリーム処理に関する多面的な図的仕様記述形式相互間での変換手法を定式化した。(2)プログラムの最適化手法:仕様記述から変換された中間言語プログラムから、DDMP用プログラムを自動生成する手法を、ストリーム処理性能を最適化する観点から定式化した。(3)プログラム自動生成系の評価:上述の手法をGWS上のプロトタイプに追加実装し、その有効性を確認した。本研究の最終的な目的は、ハードウェア論理とプログラム処理とを柔らかなシステム仕様として統合的に記述し、これらを段階的に漸次詳細化する過程を通して、自律分散型超並列ULSIシステムのソフトウェアとハードウェア実現法とを自動生成する手法、ならびに、その支援環境を確立することにある。本年度は多次元ストリームデー夕を対象とする処理を中心に検討を進め、以下の研究成果が得られた。(1)多次元ストリーム処理の図的仕様記述法:多次元データストリームの情報は、標本化周期などの時間的な情報と、データ形式のような空間的な構造情報に分類できる。前者はパイプライン型並列処理に、後者は同時並行処理に関連して、アルゴリズムを左右する重要な情報である。従って、これらを分離して階層的に定義でき、信号流れ図や機能ブロックなどと容易に関連付けられる図的記法を定式化した。(2)中間言語の多次元ストリーム処理への拡張:多次元データストリームを受理する多重・並列プロセスの仕様記述に対して、その検証性・可搬性を保証するために、従来の動的データ駆動型処理モデルを拡張した。即ち、上述の図的仕様記述からの直接生成が可能な多次元タグ形式左その基本オペレータを導入しても、トークンの生成・消費に関する安全性を保証できるストリーム型処理モデルを定式化した。(3)仕様記述からのプログラム自動生成系の構築:(1)および(2)に基づく自動生成系の一部を、備品として購入したグラフィックス・ワークステーションGWS上に実現した。
日本における家禽の歴史の解明-遺跡試料の原子・分子・組織・器官レベルからの検討

ガン亜科とキジ科の遺跡出土試料を対象に、組織切片を用いた骨髄骨の観察、骨の発達段階や形態の観察・測定、古代DNA分析をおこない、野生集団と家畜化の各段階にある集団との識別方法を確立した。特に骨髄骨の分析では、日本ではじめてガン亜科家禽を同定した。今後、本研究で得られた知見に基づいてガン亜科やキジ科の遺跡出土試料を分析することで、日本における家禽の歴史をより鮮明に描けるようになると期待される。日本産キジ科・カモ亜科の野生個体と家畜個体の骨形態の相違の検出を目的として、山階鳥類研究所、我孫子市鳥の博物館(以上、千葉県我孫子市)、国立科学博物博物館(東京都新宿区)、森林総合研究所(茨城県つくば市)、奈良国立文化財研究所(奈良県奈良市)、スミソニアン博物館(米国・ワシントンDC)に所蔵されている骨格標本の観察および計測をおこなった。その結果、キジ科の上腕骨、手根中手骨、大腿骨、脛足根骨、足根中足骨では、ニワトリとキジ・ヤマドリの間で骨端の幅と長さの比が異なる傾向があり、試料がほぼ完全な状態で残存していればニワトリとキジ・ヤマドリの識別が可能なことが示唆された。カモ亜科では家畜個体と野生個体で顕著な相違を見出すには至らなかったものの、特にスミソニアン博物館での骨格標本の観察から、越冬地で採集された個体の足根中足骨でも骨幹の形成が不完全な場合があること、尺骨にも骨髄骨が形成されうること、髄腔の露出していない骨でもCTスキャンによって骨髄骨が簡便に検出できることなどが明らかになった。これらの知見は、今後キジ科やカモ亜科の遺跡出土試料の分析において、野生個体と家畜個体を識別する手がかりになると期待される。また、元町貝塚(神奈川県横浜市・縄文時代前期中期)、浦尻遺跡(福島県南相馬市・縄文時代前期晩期)、帝釈観音堂遺跡(広島県神石町・縄文時代早期晩期)、青谷上寺地遺跡(鳥取県鳥取市・弥生時代古墳時代)、巣鴨遺跡(東京都豊島区・江戸時代)、水野原遺跡(東京都新宿区・江戸時代)、幡羅遺跡(埼玉県深谷市・江戸時代)の各遺跡から出土した鳥類遺体を分析した。このうち青谷上寺地遺跡、巣鴨遺跡、水野原遺跡、幡羅遺跡では肉眼観察で骨髄骨と考えられる試料を確認し、巣鴨遺跡の試料ではレファレンス用に骨髄骨観察用組織切片を作成して、骨髄骨の確認をおこなった。1.和蘭商館跡遺跡(長崎県長崎市・江戸時代)から出土したキジ科とガン亜科の骨を対象に組織切片を作成し、産卵期の雌の骨中にのみ形成される骨髄骨の有無を調査した。その結果、両分類群の骨で骨髄骨が検出された。野生のガン亜科は日本で繁殖しないことから、この結果は当時出島でガチョウが飼育されていたことを示唆するものと考えられた。これは、管見の限り日本で最初に形態によって同定されたガン亜科家禽の例である。遺跡試料に含まれる骨髄骨の組織学的分析の方法については国際考古動物学会・鳥類学分科会で、和蘭商館跡で検出されたガン亜科家禽については動物考古学研究会で発表した。2.キジ科・ガン亜科の野生個体と家畜個体の骨形態の相違の検出を目的に、ミュンヘン人類学・古解剖学コレクション(ドイツ・ミュンヘン)に所蔵されている骨標本を調査した。その結果、ニワトリの原種であるセキショクヤケイの長骨は、現在のニワトリ各品種と異なったプロポーションをもち、日本に生息するキジやヤマドリと類似性が高いことなどが明らかになった。この知見は、家畜化のごく初期段階のニワトリはキジやヤマドリとの形態による識別が困難であり、これまで見過ごされてきた可能性があることを示唆するものである。3.古代DNAによるキジ科とカモ科の種同定を目的にPCR用プライマーを設計し、現生の羽毛および和蘭商館跡遺跡から出土した両科の骨を対象にDNA解析をおこなった。その結果、現生試料では両科ともに種の判別に成功した。遺跡試料では、キジ科の骨では種判別に成功したが、カモ科ではDNAの増幅が確認できなかった。分析した試料の残存状態が悪かったことが原因と考えられる。4.草刈貝塚(千葉県千葉市・縄文時代中期中近世)、宮ノ下遺跡(大阪府東大阪市・弥生時代古墳時代)、広島城跡遺跡(広島県広島市・江戸時代)など、各遺跡から出土した鳥類遺体を分析した。
行動コーディングシステムによる看護学生のコミュニケーション技法の解折-モデル化と教育評価に基づく指導法の開発-

本研究では、ロールプレイング学習における看護学生のコミュニケーション技法を客観的に明らかにし、その要因を含めたモデル化を試みると共に、効果的な指導法を開発することを目的とした。(1)分析対象者:A看護系大学看護学専攻2年生の演習参加者82名のうち、事前に研究目的や方法と共に研究協力は自由意思であり、プライパシー保護について説明し同意を得た77名とした。(2)発話データ:ロールプレイング(以下RP)場面のビデオ撮影とカセットテープ録音によるデータを逐語録に再現した。また、RP1場面を1レコードとし、計39レコードを分析し、発話時間は行動コーディングシステム(DKH, PTS-107型)を用い、各役割の発話時間、沈黙等の出現頻度、持続時間を測定した。(3)不安度:STAIを用いて測定した。【結果の概要】1.発話時間:平均6.9±1.9分(2.7-9.7分)のRP実施時間で、ナース役の発話時間は、平均2.3±1.1分、クライエント役は2.5±1.1分、沈黙の時間は0.95±0.93分であり、出現率ではナースの発話0.33に対しクライエントの発話は0.38であった。RP開始2分間と終了前2分間の発話時間では、ナース役の発話時間には差がなかったが、視線をそらす、沈黙で有意に増加し、クライエントの発話時間は減少した(P<0.01)。出現回数では、後半に発話数の減少と沈黙の増加が見られた(P<0.01)。非言語的特徴としては視線をそらす回数が増加し、沈黙場面では、「視線をそらす」「無関係な笑い」が同時出現の傾向があった。RP実施時間と開始2分間の「無関係な笑い」の出現時間や持続時間、出現回数と負の相関が認められた(p<0.05)。2.発話内容:言語追跡では「話題の転換」があり、かかわり技法に関しては「開かれた質問」「閉ざされた質問」「最小限のはげまし」「いいかえ」「要約」等の12項目が見られた。3.不安度:状態不安は、ウォーミングアップ後が最も高く、演習前・ウォーミングアップ後、とそれ以後では有意に低下した(p<0.01)。4.不安度と発話時間の関連性:演習実施後の状態不安と有意な負の相関(-.557,p<0.01)が見られた。5.演習プログラムの検討:RP実施平均時間から教示した時間を演じきれない実態が明らかになった。また、沈黙や視線をそらす時間が後半に増加していた結果からも、初期段階のRPでは時間内に会話を持続すること自体が難しい。また「無関係な笑い」が前半にあることでRP実施時間が短くなっている傾向があり、演習プログラムとしては6分程度の実施時間を目安に設定し、規定時間を集中して演じる体験を重視する教育的働きかけが重要である。演習進行では、ウォーミングアップ後、不安度は低下せず、ウィーミングアップが効果をあげておらず、その位置づけを再検討する。本研究では、ロールプレイング学習を通して、看護学生のコミュニケーション技法を明らかにし、モデル化を試みると共に、評価指標を再構成して教育評価を行い、効果的な指導法を開発することを目的としたものである。I.看護学生のコミューケション技法に対する評価指標の検討と測定環境の確認:A看護系大学2年生75名で、演習開始に際し趣旨と質問紙への記入は自由意志である点を説明して同意を得た。(分析対象者:65名)また、演習中に使用するビデオ録画の有無により無作為に2群に分けた。評価指標を含む観察用紙には、治療的・非治療的技法(Hays & Larson,1963)等に基づいて、技法の実施程度を含めた。質問紙には、演習全般に対する学生の満足感等の質問項目を含め、学生の不安度についてはSTAIにより演習前後に測定し、技法とそれに関連する要因という視点から測定環境を検討した。II.評価指標に基づくコミュニーケション技法の評価とそれに関連する要因1)技法に対する自己・他者評価:全体的に同じ事例を討議実施後に反復すると、治療的コミュニケーション技法の実施程度は増加し、非効果的技法は減少する傾向が見られた。自己評価と他者評価の比較では、自己評価が低く、他者評価の方が高かった。2)不安度:ビデオ使用の有り無しで、特性不安、および直前の状態不安では、統計的な有意差はなかった。演習前と直後の状態不安の比較では、ビデオ使用有り・無しの両群ともに実施後に低下し、特にビデオ有り群で有意な低下が見られた。3)主観的とらえ方:最終演技後の他者評価では、ビデオ無し群では、「要約」と『負担感』、「探索」と『疲労感』で相関が見られ、ビデオ使用群では、「情報提供」と充実感、「共感」と学習満足感等で有意な相関が認められた。これらの結果から、ビデオ使用群では、治療的技法に対する評価と学習に対する積極的肯定的な捉え方との関連性が示された。ビデオの使用は、学生の不安感と関連しているが、自らの技術を客観視する訓練の場として取り組み、コミュニケーション技法の評価に基づく肯定的学習満足度に結びついていると考える。この結果に基づき、ビデオをいかに活用するか、客観的な振り返りの意味は何か等の指導での強調点を検討して導入することが必要である。また、評価指標に基づき録画データの分析を進めていくことが今後の課題である。

本研究では、ロールプレイング学習における看護学生のコミュニケーション技法を客観的に明らかにし、その要因を含めたモデル化を試みると共に、効果的な指導法を開発することを目的とした。(1)分析対象者:A看護系大学看護学専攻2年生の演習参加者82名のうち、事前に研究目的や方法と共に研究協力は自由意思であり、プライパシー保護について説明し同意を得た77名とした。(2)発話データ:ロールプレイング(以下RP)場面のビデオ撮影とカセットテープ録音によるデータを逐語録に再現した。また、RP1場面を1レコードとし、計39レコードを分析し、発話時間は行動コーディングシステム(DKH, PTS-107型)を用い、各役割の発話時間、沈黙等の出現頻度、持続時間を測定した。(3)不安度:STAIを用いて測定した。【結果の概要】1.発話時間:平均6.9±1.9分(2.7-9.7分)のRP実施時間で、ナース役の発話時間は、平均2.3±1.1分、クライエント役は2.5±1.1分、沈黙の時間は0.95±0.93分であり、出現率ではナースの発話0.33に対しクライエントの発話は0.38であった。RP開始2分間と終了前2分間の発話時間では、ナース役の発話時間には差がなかったが、視線をそらす、沈黙で有意に増加し、クライエントの発話時間は減少した(P<0.01)。出現回数では、後半に発話数の減少と沈黙の増加が見られた(P<0.01)。非言語的特徴としては視線をそらす回数が増加し、沈黙場面では、「視線をそらす」「無関係な笑い」が同時出現の傾向があった。RP実施時間と開始2分間の「無関係な笑い」の出現時間や持続時間、出現回数と負の相関が認められた(p<0.05)。2.発話内容:言語追跡では「話題の転換」があり、かかわり技法に関しては「開かれた質問」「閉ざされた質問」「最小限のはげまし」「いいかえ」「要約」等の12項目が見られた。3.不安度:状態不安は、ウォーミングアップ後が最も高く、演習前・ウォーミングアップ後、とそれ以後では有意に低下した(p<0.01)。4.不安度と発話時間の関連性:演習実施後の状態不安と有意な負の相関(-.557,p<0.01)が見られた。5.演習プログラムの検討:RP実施平均時間から教示した時間を演じきれない実態が明らかになった。また、沈黙や視線をそらす時間が後半に増加していた結果からも、初期段階のRPでは時間内に会話を持続すること自体が難しい。また「無関係な笑い」が前半にあることでRP実施時間が短くなっている傾向があり、演習プログラムとしては6分程度の実施時間を目安に設定し、規定時間を集中して演じる体験を重視する教育的働きかけが重要である。演習進行では、ウォーミングアップ後、不安度は低下せず、ウィーミングアップが効果をあげておらず、その位置づけを再検討する。
グルタミン酸レセプターmRNA表現型の多様性とRNAエディット

金魚視覚系は独特の神経再生機能を有しており、注目される研究材料の一つである。一度形成された視覚地図は、視神経の変性、再生後に改めてもとのそれと同じ地図を形成することがしられ、しかもそのメカニズムにグルタミン酸受容体が関与することが明らかになっている。しかし、金魚cDNAライブラリーからクローニングしたAMPA型受容体は視神経再生時に、遺伝子発現が逆に減少するなどの知見を得た。従って、この受容体の量的変化ではなく、質的変化こそそのメカニズムになるとの仮説をたて、mRNAの解析を行った。RNAプロテクションアッセイで解析すると、本来一本のバンドが得られるはずが、複数本、しかも脳と網膜でそのパターンが異なり、さらに神経再生に伴い新たなバンドが見い出されるなどの興味ある知見が得られた。このmRNAの多様性の原因として、最近注目されつつある、RNA編集機構を検討すべく、ゲノムDNAとcDNAの遺伝子配列をPCR法を用いて解析した。すると、ゲノムDNAの配列は一種類しか見い出せなかったのにかかわらず、配列が異なる複数のcDNAが得られた。しかも、それらはほんの数カ所のヌクレオチドが別のものに置き換わっているだけで、異なるゲノムDNA由来でないことが明らかであった。さらに、クローニングされたcDNAは5′末端にcDNA上で多様化している領域の上流に相当するエクソン部分と同じ配列が相補的に付加していることが明らかになり、この部分がガイドRNAとなり、RNA編集のメカニズムに関わる可能性を示唆することができた。
膠原病の治療に於ける多剤耐性遺伝子とその産物を指標としたテーラーメード医療の確立

膠原病に於いては、MDR-1の転写やP-糖蛋白質に注目した既報はなく、申請者らは健常人と全身性エリテマトーデス(SLE)および関節リウマチ(RA)患者のリンパ球を用いて、P-糖蛋白質の発現を検討した。その結果、健常人のCD4,CD8,CD19陽性リンパ球では、P-糖蛋白質の発現は全く認められないのに対して、SLEおよびRA患者のリンパ球では、一部の症例でP-糖蛋白質の発現が顕著に認められるとの成績を得た。さらに、P-糖蛋白質陽性の症例を解析したところ、長期間に亙って抗リウマチ薬やステロイド薬などの治療を受けてきた症例、ならびに、未治療であるが疾患活動性が極めて高い症例に於いて、P-糖蛋白質の発現が高いとの予備的成績が得られた。即ち、薬剤抵抗性は、従来から報告されてきた長期間の薬剤投与により齎される薬剤耐性(二次無効、エスケープ現象)以外に、疾患活動性が高いために薬剤に反応しない薬剤不応性に大別される可能性が示唆された。特に、リンパ球のP-糖蛋白質陽性で、疾患活動性の高いSLE症例に於いては、既存の治療に対しては不応性であり、ステロイドパルス療法や免疫抑制薬による強化療法を要し、その結果、疾患活動性の改善に伴い、P-糖蛋白質の発現が減弱し、既存の治療効果が回復するに至るとの予備的成績を得た。その機序として、研究分担者の河野との共同研究により、疾患活動性の高いSLE症例のリンパ球では、サイトカイン刺激によって、MDR-1の転写やP-糖蛋白質の発現が誘導されるとの予備的成績を得、今後、これらの機構の解明が進むものと期待できる。膠原病に於いては、MDR-1の転写やP-糖蛋白質に注目した既報はなく、申請者らは健常人とSLEおよびRA患者のリンパ球を用いて、P-糖蛋白質の発現を検討した。膠原病に於いては,MDR-1の転写やP-糖蛋白質に注目した既報はなく,申請者らは健常人と全身性エリテマトーデス(SLE)および関節リウマチ(RA)患者のリンパ球を用いて,P-糖蛋白質の発現を検討した。

その結果,健常人のCD4,CD8,CD19陽性リンパ球では,P-糖蛋白質の発現は全く認められないのに対して,SLEおよびRA患者のリンパ球では,一部の症例でP-糖蛋白質の発現が顕著に認められるとの成績を得た。さらに,P-糖蛋白質陽性の症例を解析したところ,長期間に亙って抗リウマチ薬やステロイド薬などの治療を受けてきた症例,ならびに,未治療であるが疾患活動性が極めて高い症例に於いて,P-糖蛋白質の発現が高いとの予備的成績が得られた。即ち,薬剤抵抗性は,従来から報告されてきた長期間の薬剤投与により齎される薬剤耐性(二次無効,エスケープ現象)以外に,疾患活動性が高いために薬剤に反応しない薬剤不応性に大別される可能性が示唆された。特に,リンパ球のP-糖蛋白質陽性で,疾患活動性の高いSLE症例に於いては,既存の治療に対しては不応性であり,ステロイドパルス療法や免疫抑制薬による強化療法を要し,その結果,疾患活動性の改善に伴い,P-糖蛋白質の発現が減弱し,既存の治療効果が回復するに至るとの予備的成績を得た。その機序として,研究分担者の河野との共同研究により,疾患活動性の高いSLE症例のリンパ球では,サイトカイン刺激によって,MDR-1の転写やP-糖蛋白質の発現が誘導されるとの予備的成績を得,今後,これらの機構の解明が進むものと期待できる。
抗腫瘍剤による白血病細胞のアポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼの同定

抗腫瘍剤による白血病細胞のアポトーシス誘導機構に関して、特にアポトーシスに密接に関与すると考えられるエンドヌクレアーゼおよびプロテアーゼ同定することを目的として、検討を実施し、以下の結果が得られた。【結果】1)抗腫瘍剤VP-16処理によるMg^<2+>依存性endonucleaseの活性化:HL-60細胞を20uM VP-16と共に3時間培養するとladder DNA fragmentationが認められた.この時点における細胞内に依存するMg^<2+>依存性endonucleaseの活性を^3H-E,Coli DNAを基質として測定したところ、無処理のcontrol細胞と比して6倍の上昇が認められた.2)プロテアーゼ阻害剤によるアポトーシス阻害効果:【結論と考察】白血病細胞HL-60にetoposideを作用させアポトーシスを誘導した際には、Mg^<2+>依存性endonuclease活性化されapoptosisが誘導されることが示唆される.また、このendonucleaseの活性化過程においては、ICEまたはICEと類似の酵素、およびセリンプロテアーゼが関与していると考えられる.抗腫瘍剤による白血病細胞のアポトーシス誘導機構に関して、特にアポトーシスに密接に関与すると考えられるエンドヌクレアーゼおよびプロテアーゼ同定することを目的として、検討を実施し、以下の結果が得られた。【結果】1)抗腫瘍剤VP-16処理によるMg^<2+>依存性endonucleaseの活性化:HL-60細胞を20uM VP-16と共に3時間培養するとladder DNA fragmentationが認められた.この時点における細胞内に依存するMg^<2+>依存性endonucleaseの活性を^3H-E,Coli DNAを基質として測定したところ、無処理のcontrol細胞と比して6倍の上昇が認められた.2)プロテアーゼ阻害剤によるアポトーシス阻害効果:【結論と考察】白血病細胞HL-60にetoposideを作用させアポトーシスを誘導した際には、Mg^<2+>依存性endonuclease活性化されapoptosisが誘導されることが示唆される.また、このendonucleaseの活性化過程においては、ICEまたはICEと類似の酵素、およびセリンプロテアーゼが関与していると考えられる.
EW加群におけるDemazure加群の半無限LSパスを用いた研究と幾何的応用

2020年度2021年度前半:半無限旗多様体の同変K-群における線束と半無限Schubert多様体の構造層の積,半無限Schubert多様体の構造層同士の積の展開公式を求める.2021年度後半2022年度:Lenart-前野やLenart-Postnikovによる旗多様体の量子K-群における予想を解決する.2020年度2021年度前半:半無限旗多様体の同変K-群における線束と半無限Schubert多様体の構造層の積,半無限Schubert多様体の構造層同士の積の展開公式を求める.2021年度後半2022年度:Lenart-前野やLenart-Postnikovによる旗多様体の量子K-群における予想を解決する.
タンパク質品質管理機構の心不全病態形成への関与

心不全発症進展には心筋の肥大や細胞死(アポトーシス)といった心臓リモデリングの制御が深くかかわっている。今回我々は、骨格筋のサイズを制御する筋特異的ユビキチン連結酵素MAFbxの心臓リモデリングにおける役割の検討を行った。圧負荷モデル(大動脈縮窄モデル,イソプロテレノール持続投与)により誘導される心肥大および心機能低下は、MAFbx遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して抑制されていた。種々の検討からMAFbx遺伝子欠損マウスでのリモデリング抑制効果にNF-κB経路の抑制が関与していることが明らかになった。MAFbxを制御することは病的心筋肥大を減じることにより、心不全への進展を抑制する可能性が示唆された。本年度は、骨格筋のサイズを制御する筋特異的ユビキチン連結酵素MAFbxの心臓リモデリングにおける役割を明らかにすることを目的に研究を進めた。心不全病態形成における心臓リモデリングの進展には、心肥大形成が重要な初期応答と考えられている。心肥大形成のため、マウスを用いて圧負荷モデル(大動脈縮窄モデル、イソプロテレノール持続投与モデル)、容量負荷モデル(心筋梗塞モデル)を作成した。野生型マウスにそれぞれの負荷モデルを作成し、組織学的検討を行ったところ、負荷により心筋細胞肥大が作成されていることを確認した。圧負荷により誘導される心筋肥大形成における、内因性のMAFbxの役割を検討するために、MAFbx欠損マウスにイソプロテレノール持続投与モデルを作成した。イソプロテレノール投与により、野生型マウスとMAFbx欠損マウス間での、心拍数および体血圧に有意差は確認できなかった。この結果からMAFb欠損マウスにおいて、イソプロテレノールに対する心拍数増強作用および陽性変力作用は保たれていると考えられる。イソプロテレノール投与後、1週間にて野生型マウスでは有意に左心室重量が増加したが、MAFbx欠損マウスではその増加が抑制された。同様の傾向は、左心室心筋断面積の検討でも示された。胎児遺伝子ANPの発現レベルも、野生型マウスではイソプロテレノール投与により増加したが、MAFbx欠損マウスで増加抑制が見られた。以上の検討から、ユビキチン連結酵素MAFbxの制御が、圧負荷に伴う心臓リモデリングに対して新たな介入点となる可能性が示唆された。本年度は、筋特異的ユビキチン連結酵素MAFbxの圧負荷による心臓リモデリングの役割を中心に検討を行った。マウスに圧負荷モデル(大動脈縮窄モデル、イソプロテレノール持続投与モデル、アンジオテンシンII持続投与モデル)を作成した。野生型マウスとMAFbx遺伝子欠損マウスにそれぞれの負荷モデルを作成し、組織学的検討を行った。これらの検討から、圧負荷により誘導される、心肥大(心重量の増加、心筋細胞断面積の増加)がMAFbx遺伝子欠損マウスでは野生型マウスを比較して、有意に抑制されていることが明らかになった。大動脈縮窄モデルで作成した心臓よりmRNAを抽出し、DNA microarrayを用いて網羅的解析を行い、野生型マウスとMAFbx遺伝子欠損マウスの遺伝子発現パターンを検討した。野生型マウスでは、圧負荷により転写因子NF-kappaB結合配列を持つ遺伝子群の発現が増強していたが、MAFbx遺伝子欠損マウスではその増強効果が抑制されていた。これらの結果から、MAFbx遺伝子欠損マウスではNF-kappaB pathwayが抑制されている可能性が示唆された。野生型マウスでは、圧負荷によりNF-kappaBの活性化がおこるが、MAFbx欠損遺伝子マウスでは活性化が抑制されていた。野生型マウスでは、圧負荷により、NF-kappaBの活性阻害タンパクであるI-kappaBの発現が減少していたが、MAFbx遺伝子欠損マウスでは、I-kappaBの発現低下が抑制されていた。また、野生型マウスと比較してMAFbx遺伝子欠損マウスでは、I-kappaBのポリユビキチン化が低下していた。以上の検討から、MAFbxはI-kappaBの圧負荷による発現調整に関与しており、圧負荷による心肥大・心臓リモデリングに重要な役割を持つ可能性が示唆された。
植物の多様な一次細胞壁形成を制御する転写ネットワークの解明

植物細胞壁は、どの植物細胞にも普遍的に存在する細胞構造である一方、その構成成分は細胞の種類や発達ステージによって極めて多様であり、ダイナミックに変化することが知られている。本研究では、申請者が発見した一次細胞壁形成を制御する転写因子の転写ネットワークとその転写因子の働きによって形成される細胞壁構成成分との連関解析を通して、植物が細胞・発達ステージごとにどのように植物細胞壁を作り分けているかを明らかにする。
歯周組織再生へのエンドセリン-1の関与

骨シアロタンパク質(BSP)は石灰化初期に発現し,石灰化後期に発現するオステオカルシンとは異なる遺伝子発現パターンを示すと考えられた。そこで,BSP遺伝子プロモーターを挿入したルシフェラーゼプラスミドを用いて,エンドセリン-1(ET-1)のBSP遺伝子発現に対する影響を究明することを目的に研究を行なった。(1)骨芽細胞様細胞ROS17/2.8細胞におけるBSPmRNAの発現に対するET-1の影響を検索した結果,ET-1刺激(10ng/ml)24時間後にBSPmRNAの発現量が抑制された。一方,オステオポンチンのmRNAの発現は経時的上昇し、刺激24時間後に最も上昇した。またET-1刺激による濃度依存的効果を検索した結果、ET-1濃度100ng/ml刺激(12時間後)で最も減少した。タンパク質合成阻害剤であるサイクロヘキシミドを併用してET-1刺激を行ったがBSPmRNAの発現に影響は認められなかった。(2)BSPプロモーター中のどの塩基配列がET-1による転写の調節に重要であるかを解析するために様々な長さのBSPプロモーターを用いてルシフェラーゼアッセイを行った結果、特異的に応答する配列を検索することができなかった。以上の結果よりET-1がBSPmRNAの発現に影響があることが明らかとなったが、特異的に応答する配列、核内タンパク質の同定はできなかった。さらにET-1刺激によってオステオポンチンmRNAの発現が上昇が認められ、何らかのタンパク質の発現がBSPmRNAの発現を間接的に抑制している可能性が示唆されたが、サイクロヘキシミドによりBSPmRNAの発現に影響は認められなかったことや、応答する配列が存在しなかったことからET-1がヒストンのアセチル化などの遺伝子のマクロな調節に関与している可能性も検討する必要がある。1.ROS17/2.8骨芽細胞様細胞に,塩基性線維芽細胞成長因子(FGF2;10ng/ml)またはプロスタグランジンE2(PGE2;3μM)を添加後,全RNAを抽出しノーザンブロットを行った結果,刺激12h後にBSPmRNA量の増加が認められた。エンドセリンは,血管収縮作用および血管平滑筋増殖作用を持つポリペプチドである。エンドセリン1(ET-1;10ng/ml)にてROS17/2.8細胞を刺激すると,12h後にBSPmRNA量は減少した。2.ルシフェラーゼベクターに種々の長さのBSPプロモーター遺伝子を挿入し,ROS17/2.8細胞に導入した。FGF2,PGE2またはET-1で刺激すると,BSP遺伝子プロモーターの-116塩基上流域を含むコンストラクトで,FGF2およびPGE2は,ルシフェラーゼ活性を12h後に上昇させた。一方,ET-1はBSPの転写活性を変化させなかった。-116塩基上流までのBSPプロモーター配列中には,逆方向のCCAAT配列,cAMP応答配列(CRE),FGF2応答配列(FRE)が存在する。FRE配列に2塩基の変異を挿入するとFGF2の効果が消失し,CREおよびFRE配列の両方に変異を挿入するとPGE2の効果が消失した。以上の結果より,BSPプロモーター中のFRE配列を介してFGF2による転写調節が,CREおよびFRE配列を介してPGE2による転写調節が行われていると考えられた。現在,EI-1の効果に関して検討を行っている。3.BSPプロモーター中のCREおよびFRE配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性を検索した結果,CRE配列とROS17/2.8核内タンパク質との複合体はPGE2刺激により増加し,FRE配列に結合する核内タンパク質はFGF2およびPGE2刺激により増加した。
RBタンパク質のリン酸化と分解を介した標的遺伝子選択的制御機構

[研究目的]本研究では、癌抑制遺伝子産物の分解亢進による細胞悪性化機構の解明を目指す。特にRB経路を制御する癌抑制遺伝子産物RBタンパク質の細胞内での分解機構を明らかにする。さらに、これらの癌抑制遺伝子産物の分解実行因子の発現亢進や、分解亢進に伴い発現が変化する細胞悪性化や予後不良のキー遺伝子を解明することを目指す。[方法と結果]我々はRBタンパク質に結合するタンパク質に注目し、RBタンパク質をユビキチン化する活性を持つものをin vivoのユビキチン化アッセイで検索した。その結果p53のユビキチンリガーゼであるMdm2がRBタンパク質に結合し、ユビキチン化することを見出した。興味深いことにMdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化しp107やp130はしなかった。また、癌抑制遺伝子産物ARFはMdm2の活性を阻害し、RBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進した。プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2あるいはMdm2のsiRNAによってRBタンパク質の分解が阻害された。また、RBタンパク質はMdm2ノックアウ卜MEFで蓄積し、ARFノックアウトMEFで発現低下(分解亢進)していた。SaO2細胞を用いたRB経路の機能アッセイで、Mdm2によりRB経路が抑制されることが判明した。また、RBタンパク質をユビキチン化できない変異型Mdm2はソフトアガーフロニー形成能が低下していた.さらにMdm2が高発現しているヒト癌検体において、RBの発現量が低く、Mdm2によりRBの分解亢進が細胞癌化に寄与していることが判明した。[研究目的]RB経路とp53経路は2大癌抑制経路と呼ばれ、その異常は細胞癌化に深く関与している。p53タンパク質はリングフィンガーを持つ癌遺伝子産物Mdm2によってユビキチン依存的分解を受けARFがそれを抑制的に制御している。一方でRBタンパク質の分解機構はほとんど不明であった。本研究ではRBタンパク質のユビキチンリガーゼの同定を目指し、RBタンパク質の分解機構を明らかにすることを目的とする[方法と結果]RBタンパク質のユビキチン化を解析するためにin vivoおよびin vitroアッセイを構築した。この細胞内および再構成系でMdm2はRBタンパク質と結合してRBタンパク質を効率よくユビキチン化した。興味深いことにMdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化した。また、ARFはRBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進し、プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2で分解が阻害されることがわかった。さらにSaO2細胞を用いたRB経路の機能アッセイで、Mdm2によりRB経路が抑制されることが判明した。現在この新経路の細胞癌化における機能を検討している。Mdm2はRBタンパク質とp53のユビキチンリガーゼとして両タンパク質の分解を亢進し、RB経路とp53経路の撹乱を引き起こして効率よく細胞を癌化すると考えられる。一方でARFはその両方の分解を抑える機能を持つことから、さらにその重要性が確認された。RNAi法などを用いて今後さらに解析を進める予定である。
豊かな感動体験を保障する理科教育

1コオロギは「なぜ、小さな体で音を出し、音を大きく響かせることができるか。」の展開コオロギは羽をこすり合わせて音を出すことによって、子孫を残すことが有利なように進化してきている。そこで、コオロギの音色を素材に、モデル実験を駆使した3年「昆虫の育ち方」の発展教材を考え展開した。(1)仲間同士のコミュニケーション:子供たちは、鳴き方をしらべ、けんかと交尾するときの鳴き方の違いがあることを知った。(2)小さな羽から大きな音を出す秘密:子供たちは、図鑑で"やすり"として紹介している発音体(羽をこすり合わせるところ)の写真をもとに、発音体をあらゆる方向から観察して、トタンで発音体の立体的なモデルを作った。そして発音体をこすり合わせてコオロギの音色に近づける工夫をしたが、コオロギの音に近づけることはできなかった。子供たちはこすり合わせる回数も関係しているかもしれない、と考えた。高速連写カメラで撮影し検討したが、はっきりした結論は出せなかった。また、発音体から羽全体に広がっているすじとその間にはられた、薄い膜がよい響きをつくり出しているのではないかと想像し発音体を小太鼓、羽全体に広がるすじを細い針金、すじの間の薄い膜をトレーシングペーパーというように適当な素材を選んでモデル実験を繰り返し、確認した。さらに、コオロギは音を出すとき羽を持ち上げる。そうすると羽の折れ曲がりが響きをよくするのに有効に活かされることになると想像し、これも適当な素材、トタンを選んで折れ曲がりがある場合とない場合とでモデル実験をして、確かめた。(3)こすり合わせていい音色を響かせるバイオリンとの整合性:こすり合わせてきれいな音を響かせる天然の代表がコオロギなら、人造物の代表はバイオリンである。子供たちは、イソップの「ありとこおろぎ(その他、キリギリス・セミなどに代えられていることがある)」のイメージからバイオリンとの比較観察をした。子供たちは高速連写カメラの写真を解析して、両者が同じような構造をしていることを知った。2「やじろべえは重さがちがってもなぜつりあうか。」の展開6年理科「てこのつりあい」は、左右の腕の長さ×おもりの重さが等しい場合につり合うことを学習する。この学習の上で、やじろべえで左右の重さが違ってもつり合うわけを考えさせた。子供たちは、自然のうちに左右のうでの長さを調節するので、おもりの重さが違ってもつり合いをつくることを知り、うまくできている自然に感嘆したようすであった。その後、人間が乗れるような「人間やじろべえ」を作って実際に乗りながらそのことを体感した。
高度知能化船の無人航行の研究

船舶の知能化に関連する分野は極めて広く,ただ単に船舶自身が知能を持つだけでは安全なる運航はできず,陸上からの支援や,海図データ,海気象データなど数多くのデータの収集と伝送などが必要となる.本研究ではまず船舶自身の知能化に関する基本的問題を研究し,大よその指針を得ることができた.本研究は1988年オーストラリアで開催されて国際航法学会で発表され,世界中から注目されるところとなった.また航海,特に知能化無人航行に必要であるディジタル海図,いわゆる電子海図については,海岸線や等深線までの距離計算の高速処理のためには海図データのフォーマットを緯度経度表示ではなくラジアン表示の方が良い.また,レーダ映像との比較には大圏図法で行うべきだが高速処理には特に高精度を必要としないなら漸長緯度図法の方が良い.高度知能化船では,海象気象情報は正確で高精度であることが要求されるが,海洋観測衛星(MOS-1)の現状の性能では不充分である.MSRアンテナパターンと偏波回転によるひずみ補正の基礎的研究を行った.その結果偏波回転の影響を補正した上で逆フィルタをかければ,沿岸部や島などにおいてメインローブのみの画像を上回る分解能が得られ,しかも海域の輝度温度もメインローブのみの画像に近いものとなった.これらを総合した実験は,実験規模の制約から一部の実験にとどめたが初期の目的は達成できた.今後,海運界と造船界では現状の改革の面から知能化少人数船の建造要求は強くなり,研究が盛んになると思われるが,その際本研究がその基礎をなすものとして大いに参照されることと思われる.しかし研究は完成したものではないので,かえって残された問題や今後鋭意研究しなければならない事項が数多く浮上してきているので,さらに一層の研究を続けていく予定でいる.船舶の知能化に関連する分野は極めて広く,ただ単に船舶自身が知能を持つだけでは安全なる運航はできず,陸上からの支援や,海図データ,海気象データなど数多くのデータの収集と伝送などが必要となる.本研究ではまず船舶自身の知能化に関する基本的問題を研究し,大よその指針を得ることができた.本研究は1988年オーストラリアで開催されて国際航法学会で発表され,世界中から注目されるところとなった.また航海,特に知能化無人航行に必要であるディジタル海図,いわゆる電子海図については,海岸線や等深線までの距離計算の高速処理のためには海図データのフォーマットを緯度経度表示ではなくラジアン表示の方が良い.また,レーダ映像との比較には大圏図法で行うべきだが高速処理には特に高精度を必要としないなら漸長緯度図法の方が良い.高度知能化船では,海象気象情報は正確で高精度であることが要求されるが,海洋観測衛星(MOS-1)の現状の性能では不充分である.MSRアンテナパターンと偏波回転によるひずみ補正の基礎的研究を行った.その結果偏波回転の影響を補正した上で逆フィルタをかければ,沿岸部や島などにおいてメインローブのみの画像を上回る分解能が得られ,しかも海域の輝度温度もメインローブのみの画像に近いものとなった.これらを総合した実験は,実験規模の制約から一部の実験にとどめたが初期の目的は達成できた.今後,海運界と造船界では現状の改革の面から知能化少人数船の建造要求は強くなり,研究が盛んになると思われるが,その際本研究がその基礎をなすものとして大いに参照されることと思われる.しかし研究は完成したものではないので,かえって残された問題や今後鋭意研究しなければならない事項が数多く浮上してきているので,さらに一層の研究を続けていく予定でいる.無人航行システムの研究に関し、大洋および沿岸航行の無人化について概念設計ができた。無人航行の困難さは沿岸航行と荒天中の航行にあり、衝突回避と乗り揚げ回避および的確な海象・気象の情報が収集できることは極めて重要なことである。東京商船大学で新しく建造された練習船を使用して実船実験を実施する計画で準備を進めているが、同船の位置決定システム,衝突予防システム,機関制御システムおよび操舵システム相互間のデータ収集・制御系のソフトウエアの作成を鋭意実施中である。衛星による情報収集系については、去る昭和62年2月に打ち上げられた我国初の海洋観測衛星MOS-1に塔載の各種センサ(MESSR,VTIR,MSR)において、特にMSRデータから海水温度,風等の物理量を推定する際の精度向上に関する検討を行なった。また位置決定システムと乗り揚げ回避の研究については、乗り揚げつまり船舶が海岸線に接する現象を論ずるには、(1)船の位置の測定,(2)海岸線の情報が必要である。(1)については、ロランC,GPSおよびレーダ等の船位測定システムの位置測定精度について検討し、それらの情報からの速度,針路の検出等について検討した。(2)については、いわゆる電子海図、つまりディジタル化された海図の利用法、その表示方法について検討した。その結果、船の移動に併なう表示域の移動のアルゴリズム及び、ジョルダンの法則による船が海上にあるか陸上にあるかの判定方式が確立できた。船舶の無人航行には船舶をとりまく全ての情報を総合的に評価判断することが重要であり、人工知能による評価判断アルゴリズムについて検討中である。
小児の顎口腔機能診断基準の確立

磁気位相空間を応用した6自由度顎運動測定器を用いてHellmanの歯年齢IIA期の女児1名、IIIA期の女児4名、IIIB期の女児1名について顎運動の測定を行った。測定は、各種限界運動、および習慣性開閉口運動、左右側方滑走運動等についておこなったが、低年齢児では限界運動を再現性良くおこなうのは困難であり、データのばらつきが目立ったので、比較的再現性の良い最大開閉口運動、前方滑走運動、左右側方滑走運動を解析対象をした。各種運動からの解析項目は、最大切歯点移動量、最大顆頭移動量、最大下顎回転量(矢状面内)、側方限界咬合位における切歯点移動量、顆頭移動量、下顎回転量(矢状面内)、3mm側方咬合位における下顎回転量(矢状面内)、切歯路角、および各種側方咬合位における下顎の平行移動量と回転量等である。各解析項目の成人データとの比較から、小児と成人では前方咬合位における矢状歯路角、側方咬合位における矢状切歯路角、水平面展開角に違いが認められた。すなわちこの年齢の小児の滑走運動は比較的緩い角度で行われていた。これについては過去の報告と一致するものである。しかし顆路角については成人と大きな違いは認められず、また小児では切歯点の運動量が小さいわりには、顆頭の移動量が大きい傾向が認められた。この点については形態的な側面から考察しても小児の顎関節部の可動性を裏付けるものと考えられる。そこで小児と成人との下顎運動の違いを端的に表現する手段として、顎間軸モデルを用いて表現することを試みた。その結果、側方滑走運動において下顎の回転量は変わらないが、平行移動量は小児の方が大きいことが認められた。以上の結果については、まだデータ数が少なく不明な点も多いことから、今後データ数をふやして検討を続けていく予定である。
骨親和性ナノテクチャーインプラントの開発とその骨形成の遺伝子ネットワークの解析

本研究では,高強度フェムト秒光レーザーをチタン表面に照射することによりナノ表面チタンを作成し,この表面にラット骨髄間質細胞の培養を行い,増殖および分化を検索した。ナノ表面チタンは,機械表面チタンに比べ,表面粗さが大きく増大し,細胞培養では培養後7日目および10日で増加が認められ,免疫組織化学においては培養後10日目ではオステオカルシン陽性細胞はコラーゲン陽性細胞よりも増加が認められた。チタンと骨芽細胞の親和性を高めるために、チタン表面にレーザー照射を行った。レーザーはチタンサファイヤ再生増幅器からの高強度フェムト秒光パルス、中心波長200800nm、パルス幅50fs、パルスエネルギー200μJ、繰り返し周波数1khzで、直径5mm・厚さ1mmチタン表面に照射した。チタン表面に深い溝によって囲まれた直径約220μmの半球状のミクロンサイズの隆起を多数形成すると共に、溝および半球状隆起の表面全体に、平均250nmのナノサイズの微細球状突起と微細嵌凹から成る表面構造がみられた。チタン表面に骨芽細胞系細胞の培養を行い、細胞数と細胞外マトリックスの発現を観察した。細胞数は、培養後1日目では9.6×10^4、培養後5日目では48×10^4で、培養後7日目では124.6×10^4であった。機械加工チタン表面における同培養では、培養後1日目では3.3×10^4、培養後5日目では3.8×10^4、培養後7日目では4.0×10^4であっな。ナノ表面加工チタンでは、機械加工チタン表面よりヒト骨芽細胞系細胞の増殖を促進することが示されている。同様に、本発明医療用ナノ表面加工チタンに培養し、コラーゲンおよびオステオカルシンを用いた蛍光免疫組織化学を行った。培養後1、5、7日目ではそれぞれ、85、68、36%がコラーゲン陽性を示し、オステオカルシン陽性細胞では同様に15、32、64%が陽性を示す。ナノ加工チタンでは培養の経過とともに、コラーゲン合成が減少し、オステオカルシン合成が増加する傾向が認められた。チタンは、歯科用インプラントなどの材料に最も多く用いられている生体材料である。機械加工したチタン表面は、骨芽細胞との親和性が低く、osseointegrationを高めるために様々な改質方法が行われている。本研究では高強度フェムト秒光レーザーをチタン表面に照射することによってナノ表面チタンを作成した。レーザー照射によりチタン表面にはナノサイズの縞状構造が観察された。走査型レーザー顕微鏡による観察では、ナノ表面チタンは機械加工に比べ、約2倍の表面粗さ(Ra)を示した。この表面にラット骨髄間質細胞を培養し、細胞の増殖と分化を観察し機械加工表面と比較検討した。ナノ表面加工チタンでは、培養後7日目では細胞数は約培養後3日目の細胞数の2倍、培養後10日では約3倍に増加した。一方、機械加工チタン上に培養したものでは培養後10日目においても細胞数の増加は認められなかった。ナノ表面加工チタンを用いて培養を行い、コラーゲンとオステオカルシン抗体を用いた免疫組織化学を用いた観察では、培養後3日目では、コラーゲン陽性反応を示す細胞はオステオカルシン陽性細胞よりも多かった。培養後10日目ではオステオカルシン陽性細胞コラーゲン陽性細胞との割合は逆転し、オステオカルシン陽性細胞はコラーゲン陽性細胞が増加する傾向が認められた。機械加工表面ではコラーゲン陽性細胞は10日目においてもオステオカルシン陽性細胞の数を超えることは無かった。本ナノ表面加工チタンは、骨芽細胞系細胞の増殖分化を促進することによって分化骨増殖を促進することが可能であるものと考えられた。チタンは人工関節や,歯科用インプラントなどの材料に最も多く用いられている生体無機材料である。しかし,機械的加工を行ったままのチタン表面は,骨芽細胞との親和性が低いために様々の方法でチタン表面を改質してosseointegrationを高める試みが行われている。本研究では高強度フェムト秒レーザーをチタン表面に照射することによってナノ表面チタンを作成した。この表面に骨髄間質細胞を培養し,細胞の増殖および分化を観察し機械表面チタンと比較検討した。走査型レーザー顕微鏡による観察では,ナノ表面チタンは機械表面チタンに比べ,約2倍の表面粗さを示した。ナノ表面チタンを用いた細胞培養では,培養後7日目では細胞数は培養後3日目の約2倍,培養後10日では約3倍に増加した。機械表面チタンを用いて培養したものでは培養後10日目においても細胞数は増加しなかった。ナノ表面チタンを用いて培養を行い,コラーゲンおよびオステオカルシン抗体を用いた免疫組織化学においては、培養後3日目では,コラーゲン陽性細胞はオステオカルシン陽性細胞よりも多く,培養後7日目ではほぼ等しかった。培養後10日目ではオステオカルシン陽性細胞とコラーゲン陽性細胞との割合は逆転し,オステオカルシン陽性細胞はコラーゲン陽性細胞よりも増加した。

機械表面チタンではコラーゲン陽性細胞は10日目においてもオステオカルシン陽性細胞の数を超えなかった。以上のことから本ナノ表面チタンは,骨芽細胞系細胞の増殖および分化を促進するものと考えられた。
神経管閉鎖におけるFkbp38分子機構の解明

FKBP38はイムノフィリンに属する分子シャペロンであり、細胞質で合成されたBcl-2やBc1-xLをミトコンドリアにリクルートし、アポトーシスを抑制する。我々は、Fkbp38ノックアウト(KO)マウスを作製したところ、このマウスは二分脊椎症(神経管閉鎖不全)を発症し生直後に死亡することがわかった。この二分脊椎症の詳細な分子メカニズムは現在のところ不明であるが、KOマウスではソニックヘッジホッグ(Shh)シグナルの下流が活性化されており、Shhシグナルの異常が二分脊椎症を引き起こす可能性がある。我々は生体内で実際にFKBP38に結合するタンパク質を網羅的に同定するため、Histidine-FLAGタグを付加したFKBP38をPrionプロモーター下流で脳に発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。このマウスの脳抽出液を二段階免疫沈降による精製を行い、質量分析によってFKBP38結合タンパク質を探索したところ、ANKMY2を同定した。In vivo及びin vitroのタンパク質結合実験より、FKBP38のN末端56アミノ酸とANKMY2のZn2+finger domainとが結合することが明らかとなった。MEF細胞においてANKMY2をノックダウンするとShhシグナルの減弱を認め、逆にANKMY2を過剰発現するとShhシグナルの増強を認めたため、ANKMY2がShhシグナルの正の制御因子である可能性が考えられた。さらにゼブラフィッシュの発生過程におけるankmy2の発現パターンをin situハイブリダイゼーションにより解析したところ、発生初期及び神経管領域での発現を認めた。モルフォリノオリゴヌクレオチドを用いてankmy2をノックダウンすると、Shhシグナルの阻害によって起こるU字型体節の表現型を認めた。さらに蛍光タンパク質の発現により生体内でShhシグナルの可視化が可能なTgゼブラフィッシュにおいてankmy2をノックダウンすると、蛍光シグナルの減弱を認めた為、ANKMY2はゼブラフィッシュ個体内においてもShhシグナルを正に制御することが示唆された。申請者の課題は神経管閉鎖におけるFKBP38分子機構の解明である。現在までにその解明の糸口となる新規結合タンパク質を発見し、そのタンパク質が細胞・個体レベルでShhシグナルを制御するということまで明らかにできたことはかなりの進展だと考える。さらにマウス遺伝学を用いた証明のために、ノックアウトES細胞を購入し、現在はキメラマウスまで作製できたことから進展は(2)おおむね順調に進展していると言える。本研究の目的は神経管閉鎖における...分子機構の解明である。神経管閉鎖の解析は主にマウスを用いて行われるが、今回は新規因子を発見した後にマウスで解析するということから、長時間必要となる。そこで現在までに、マウス以外のモデル生物で、Shhシグナルがよく研究されているゼブラフィッシュを用いて、解析を行った。その結果、ゼブラフィッシュにおいても新規FKBP38結合因子ANKMY2がShhシグナルを制御することが明らかとなった為、今後はマウスを用いた解析を行う。さらに、FKBP38とANKMY2の上下関係を探索するために、ダブルノックアウトマウスを作製して実験を行う。1Fkbp38コンディショナルノックアウトマウスの作製発生工学技術を用いてFkbp38コンディショナルノックアウトマウスの作製に成功した。現在は、このマウスとCre recombinaseトランスジェニックマウスとの交配を行うことでFKBP38の臓器特異的不活化マウス、時期特異的不活化マウスを作製している。2Fkbp38トランスジェニックマウスを用いたFKBP38結合タンパク質の同定Histidine-FLAGタグを付加したFKBP38をPrion-promoterを用いてマウス脳に発現するトランスジェニックマウスを作製し、Histidineタグ、FLAGタグの二段階精製を用いてFKBP38の結合タンパク質を質量分析計によるプロテオミクス解析法によって解析を行った。その結果、新規結合タンパク質としてANKMY2(ZMYND20)を同定することに成功した。ANKMY2(ZMYND20)はN末端にAnkyrin repeat domainをC末端にZinc finger MYNDdomainを持つがほとんど機能が分かっていない分子である。最新の知見ではC.elegansにおいてciliaへのタンパク質輸送を担うことが明らかとなった。Ciliaは神経管閉鎖時にSonic hedgehogシグナル伝達にとって重要な場であることが分かっているため、FKBP38との関係が示唆された。そこでANKMY2(ZMYND20)に対する抗体を作製し、マウス組織間の発現を比較した結果、ANKMY2は中枢神経系で発現が高いことを明らかにした。さらに結合を確認するために、マウス脳のライセートにおいてFKBP38抗体を用いた免疫沈降を行ったところ、ANKMY2(ZMYND20)が共沈降したことから、両者は神経組織で生理的に結合していることが明らかになった。<新規FKBP38結合タンパク質ANKMY2の機能解析>申請者の課題は神経管閉鎖におけるFKBP38分子機構の解明である。昨年度までに、FKBP38の機能を明らかにするため、神経特異的にHis-FLAG-FKBP38を発現するトランスジェニックマウスを作製し、FKBP38結合タンパク質を探索した。その結果、新規結合タンパク質候補としてANKMY2を同定した。今年度はANKMY2とFKBP38の結合の確認とANKMY2との機能解析を行った。