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ナノ結晶を介したエネルギー移動現象の解明と新奇光機能性発現に関する研究

本研究は、エネルギー移動現象の基礎的特性を明らかにするとともに、ナノ結晶の持つ新奇光機能性として定着させ、ナノサイエンスからナノテクノロジーへの展開を計ることを目的とする。ナノ結晶系として半導体ナノ結晶のみならず、表面プラズモン励起を伴う金属ナノ結晶も研究対象とし、エネルギー受容体としては希土類イオン、無機分子、有機分子をも研究対象とする。本年度は、まずSiナノ結晶とErをドーピングしたSiO_2薄膜において、Siナノ結晶からErへのエネルギー移動メカニズムについて研究を行った。特に、Siナノ結晶中にドナーまたはアクセプター原子が存在する場合に、それらの不純物原子とErイオンの相互作用について研究を行った。その結果、半導体ナノ結晶中にドーピングされた不純物(ドナーもしくはアクセプター)と希土類イオンの間でエネルギーの授受があることがはじめて明らかになり、Erの高効率発光のメカニズムに関して重要な知見をえることができた。次に、Siナノ結晶とErをドープしたSiO_2薄膜の近傍に金属薄膜を配置することによりエネルギー移動レートがどのように変化するかについて研究を行った。その結果、エネルギー移動レートは試料と金属膜の距離に強く依存して振動することを見出した。この結果は、エネルギーの授受が行われている系の近傍に金属構造を設置することによりエネルギー移動効率を増強できる可能性を示したものであり、応用上非常に重要な成果である。さらに、Erをドープしたガラス薄膜中に金ナノ粒子をドープするとErイオンの発光効率が大きく増大することを始めて見出した。また、その増大に金ナノ粒子の局在表面プラズモンが大きく関与していることを明らかにした。我々は,ナノ結晶を介したさまざまなエネルギー移動現象を見出し,ナノ結晶のエネルギー供給体,エネルギー伝達体としての機能を実証してきた.本研究は,エネルギー移動現象の基礎的特性を明らかにするとともに,ナノ結晶の持つ新奇光機能性として定着させ,ナノサイエンスからナノテクノロジーへの展開を計ることを目的とする.ナノ結晶系として半導体ナノ結晶のみならず,表面プラズモン励起を伴う金属ナノ結晶も研究対象とし,エネルギー受容体としては希土類イオン,無機分子,有機分子をも研究対象とする.本年度は,Siナノ結晶とErをドーピングしたSiO_2薄膜の近傍に金属薄膜を配置することによりエネルギー移動レートがどのように変化するかについて研究を行った.その結果,エネルギー移動レートはSiナノ結晶と金属膜の距離に強く依存して振動することを見出した.また,振動の様子が波長に依存して変化することを明らかにした.観測された振動構造を理論計算の結果と比較し定量的に評価することにより,Siナノ結晶からErへのエネルギー移動レートがフォトンの状態密度の二乗に比例することを見出した.この結果は,エネルギーの授受が行われている系の近傍に金属構造を設置することによりエネルギー移動効率を増強できる可能性を示したものであり,応用上非常に重要な成果である.
半導体三次元キラルフォトニック結晶を用いた円偏光レーザ

半導体三次元キラルフォトニック結晶と量子ドット光源との複合系を形成し、円偏光フォトニックバンド構造を利用して円偏光光源を実現した。この結果は、片方の円偏光に接続する真空場の状態密度を制御したことに起因し、各円偏光の発光強度の差だけでなく、発光寿命の差も観測することに成功した。また、片方の円偏光のみを閉じ込める共振器も実現した。本研究の成果は、キラル構造で守られたロバストな円偏光光源として、通信技術や化学、生物学などへの応用が期待される。本研究では、半導体三次元キラルフォトニック結晶またはその微小共振器に発光体を導入し、円偏光光源及び円偏光レーザを実現することを目的としている。当該年度では、目標達成の第一歩として、キラルフォトニック結晶に量子ドットを導入することで、円偏光フォトニックバンドおよびバンド端を利用した円偏光光源の実現を目指した。まず、近赤外光に対して円偏光フォトニックバンドが形成されるように、近赤外光の波長と同程度の周期のキラルフォトニック結晶を計算により設計した。これは、極低温でのInAs自己形成量子ドットの発光波長領域に合致する。次に、設計した構造をGaAsに対して、電子線リソグラフィー技術、ドライエッチング技術、ウェットエッチング技術、マイクロマニピュレーション技術を駆使することで作製した。作製した構造のキラリティは左巻きで、InAs量子ドットは構造内に高密度で埋め込まれている。これらの量子ドットを光励起し、発光する近赤外光を偏光を調べながら分光したところ、円偏光バンドギャップ内にて右回りの円偏光が50%の純度で検出され、かつ、円偏光バンド端では左回りの円偏光が50%の純度で得られた。これは、キラル構造によって左回り円偏光の真空場状態密度が大きく制御されたことによるものである。発光体の自然放出は、周りの真空場による誘導放出と捉えることができる。円偏光バンドギャップ内では、左回り円偏光の真空場状態密度が大きく抑制されたため、右回り円偏光が高い純度で発光し、円偏光バンド端では、左回り円偏光の群速度が小さく、状態密度が著しく増大したため、左回り円偏光が高い純度で発光したと考えられる。ここで得られた成果は、3件の国内学会で口頭発表により報告し、1件の国際学会で口頭発表予定である。本研究では、半導体キラルフォトニック結晶及びその微小共振器に発光体を導入することで、円偏光光源を実現することを目的とし、それを応用して、円偏光をもつ光のレーザ発振を目指してきた。本年度では、まず、昨年度に達成した円偏光光源に対して、円偏光した真空場状態密度を反映していることを裏付けるために、円偏光発光寿命の測定を行った。フェルミの黄金則により、励起子の発光寿命は周囲の真空場の状態密度に反比例する。本研究でのキラルフォトニック結晶における円偏光バンドギャップでは、左右一方の円偏光の状態密度のみが抑制されるため、一方の円偏光の発光寿命が長く、時間平均した発光強度は弱くなると予想される。実際に発光寿命を測定した結果、確かに状態密度を反映して、左回りと右回りの円偏光発光寿命に差があることを観測した。これによって、キラル構造によって円偏光状態密度が制御されていることが示され、構造によって守られたロバストな円偏光光源が実現されたと言える。また、本年度では、キラルフォトニック結晶内に意図的に欠陥を導入することで、円偏光共振器モードの形成にも取り組んだ。共振器構造として、キラルフォトニック結晶に平板を挟んだ面欠陥構造を採用し、円偏光フォトニックバンドギャップ内に共振器モードの発光を観測することに成功した。今後は積層数を増やすなど、共振器構造の検討を進めることで、共振器モードを利用した高効率な円偏光光源の実現が期待できる。なお、円偏光レーザ発振にも挑戦したものの、本年度中に発振を観測することができなかった。最近、利得媒質における利得が不十分であったことが判明したため、より高品質な量子ドットを利用したキラルフォトニック結晶の作製を進めており、実現には間もないと考えている。以上の成果は、1件の国際学会での招待講演及び3件の国際学会での口頭発表、2件の国内学会での口頭発表で国内外に発信した。当該年度では、当初の計画どおり、最終的な目標への第一歩として、キラルフォトニック結晶に量子ドットを導入することで、円偏光フォトニックバンドおよびバンド端を利用した円偏光光源の実現を目指した。その結果、InAs量子ドットを導入した、三次元キラルフォトニック結晶の作製に成功し、円偏光バンド構造による円偏光真空場の状態密度を制御することで、高純度な円偏光光源を実現した。

この成果は、当初の予定どおりの進展である。27年度が最終年度であるため、記入しない。三次元フォトニック結晶を用いた光制御当該年度において、当初の計画どおり、円偏光光源の実現に成功した。今後は、まずこの円偏光発光が、真空場状態密度を反映した結果であることを裏付けるために、円偏光発光寿命の測定を行う。量子ドット内に形成される励起子(電子正孔対)は、ある時間を経て電子と正孔が結合して発光する。この発光寿命は、周囲の真空場状態密度の影響を受け、状態密度が低いほど遅くなり、時間平均して発光強度が弱くなる。このことから、円偏光バンドギャップ内での左回り円偏光の発光は、右回り円偏光の発光と比較して、発光寿命が長いと予想できる。このことが確認できれば、円偏光状態密度の制御が、キラル構造によって保証されるため、周囲の環境の変化に強い円偏光光源として今後の応用に期待できる。一方で、さらなる高純度な円偏光光源及び円偏光レーザの実現も目指す。まずは、円偏光フォトニックバンド端における状態密度の顕著な増大を利用した、円偏光レーザ発振の実現を目標とする。次に、キラルフォトニック結晶内に意図的に欠陥を導入することで、円偏光共振器モードの形成を目指す。適切な構造周期や周期数、導入する欠陥構造やそのサイズなど、最適な構造を計算で模索することには困難が伴うが、共振器モードはその狭い帯域のため、円偏光状態密度の差を著しく拡大することができる。このようなキラルフォトニック結晶微小共振器を作製し、さらに高純度な円偏光光源光及び低閾値円偏光レーザの実現を目指す。
核蛋白質の局在化に関与する核膜蛋白質群の蛋白質化学的・免疫化学的研究

タンパク質の核移行に関与していると考えられる核膜タンパク質のうち、本年度は主にラット肝の核膜孔タンパク質と、核移行シグナル結合タンパク質NBP60についてさらに研究を進め、次のような結果を得た。まずラット肝核膜より、糖鎖を持つ核膜孔タンパク質と考えられる144kのタンパク質を精製し、120kと86kのタンパク質も部分精製した。これらのタンパク質は、いずれも細長い棒状の分子であることがわかり、この分子形は核膜孔に特異的に存在する一群の糖タンパク質に共通の性質であることが示唆された。これらの結果は、J.Biochem.に発表した。またさらに糖鎖がほとんどないか、まったくない核膜孔タンパク質と考えられる50kと39kのタンパク質もラット肝核膜より精製しその性質を調べ、LifeSci.Adv.に発表した。核移行シグナル結合タンパク質NBP60に対する抗体を用い、細胞分画法と組織化学的方法でNBP60の細胞内局在を調べたところそのほとんどが核膜孔に局在していることが示されたことから、このタンパク質がタンパク質の核移行に関わっている可能性がさらに高くなった。またこのタンパク質は、細胞の分裂周期にしたがって、他の核膜孔タンパク質と同様に核膜孔に局在したり、溶けて細胞質全体に広がったりすることが明かとなった。現在組み換えDNA法でNBP60の構造解析を進めている。
キラリティーを利用した希土類クラスターの磁気光学特性に関する研究

本研究では、非偏光の吸光度が外部磁場の方向に依存して変化する磁気キラル二色性(MChD)を強く発現するキラル希土類(Ln)クラスターの創成を目的としている。この目的を達成するためにはキラル希土類錯体の自然光学活性が増大するメカニズムを明確にすることが重要となる。そこで、当該年度は電子状態の解析を容易にするため単核のキラルユウロピウム(Eu)錯体を合成し、電子状態の観点から自然光学活性増大メカニズムを評価した。カンファー誘導体を配位子としたキラルEu錯体において、発光に関する大きな自然光学活性(円偏光発光:CPL)が報告されている(J. L. Lunkley et al., Inorg. Chem., 2011)。この原因を検討するために、3-(+)-トリフルオロアセチルカンファー(+tfc)配位子とトリフェニルホスフィンオキシド(tppo)配位子から構成されるEu錯体を合成し、溶液中における外部環境に依存したCPLの評価を行った。アセトン溶媒中におけるEu錯体の構造はEu錯体の濃度およびアキラルなtppoの添加量によって変化することをNMRおよび発光特性より確認した。その溶液中では、+tfcを有するEu錯体にtppoが配位した構造とアセトン分子が配位した構造の平衡状態を形成することが示唆された。自然光学活性として、Euイオンの4f-4f遷移におけるCPLが観測され、その符号はtppoおよびEu錯体濃度に依存して反転した。CPLの非対称性因子はその外場に依存して100倍程度異なり、+tfcが配位したEu錯体のCPL特性はアキラル分子に依存して大きく変化することが明らかとなった。磁気双極子許容な4f-4f遷移におけるCPLはEuイオンの異なる準位間のミキシングに伴い値が増大することが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。この目的を達成するためには磁気光学特性とキラル光学特性がどちらも大きな値を示すことが重要となる。そこで、当該年度は電子状態の解析を容易にするため、始めに単核のキラルユーロピウム(Eu)錯体を合成することで、以下の2つの点から磁気およびキラル光学特性の増大とその解析を目標とした。1、磁気光学特性の向上に向けたEu錯体の合成配位子による結晶場の影響が小さいとき、Eu錯体は大きな磁気円偏光二色性(MCD)を示すことが報告されている。そこで、結晶場の影響が比較的小さいカルボキシレート基を配位部位として有するアミノ酸を用いたキラル配位子の合成、およびその配位子を用いた新規キラルEu錯体合成を試みた。カルボキシレート基による配位は溶液中でEuとの配位力が弱く分解しやすいが、配位子内に複数の配位可能部位を有するとき、溶液中でも錯体形成が保持されることが確認された。また、合成したキラルEu錯体の発光スペクトル形状より、配位子の結晶場の影響が比較的小さいことが示唆された。2、キラル光学特性の向上に向けたキラル配位子の合成有機分子は会合体を形成したとき、分子間相互作用によってキラル光学特性である円偏光二色性(CD)が増大する。このような有機分子を配位子としたとき、配位子由来の大きなCD特性がEu錯体のCD特性に影響を与えることが考えられる。そこで、会合性を有し、カルボキシレート基を配位部位として持つキラル配位子の合成を試みた。目的生成物は黒色の層状結晶として得られた。これより、配位子が会合体を形成していることが示唆された。本研究の最終的な目標はMChDを強く発現する物質を創成することであり、そのためにはMCDとCDが大きな値を示す分子の設計指針を確立することが重要となる。これらの測定はすべて溶液中での測定であるため、評価の際にLn錯体が溶液中で安定であることが必要となる。一方でMCD増大に向けたカルボキシレート基によるEu錯体の合成では、溶液安定性が低いことが問題となっていた。本年度はこの溶液安定性の問題に関して配位部位を複数与えることで解決し、MCDが大きいと予想されるEu錯体の合成に成功した。今後分光測定を行うことで、MCD強度がMChDに与える影響を評価できることが期待される。また、CD増大に向けた会合性キラル分子の合成にも成功している。この分子を配位子としたEu錯体を合成し、分光測定を行うことで、CD強度とMChD強度の関係性も議論が可能となる。この目的を達成するためには磁気光学活性と自然光学活性がどちらも大きな値を示すことが重要となる。そこで、当該年度は電子状態の解析を容易にするため、始めに単核のキラルユーロピウム(Eu)錯体を合成することで、以下の2つの点から磁気および自然光学活性増大に向けた解析を行った。

1、磁気光学活性の向上に向けたEu錯体の合成配位子による結晶場の影響が小さいとき、Eu錯体は大きな磁気円偏光二色性(MCD)を示すことが報告されている。そこで、結晶場の影響が比較的小さいカルボキシレート基を配位部位として有するアミノ酸を用いたキラル配位子、キラルEu錯体の合成、およびキラルEu錯体を用いた磁気光学活性と自然光学活性の評価を行った。カルボキシレート基による配位は溶液中でEuとの配位力が弱く分解しやすいが、配位子内に複数の配位可能部位を有するとき、溶液中でも錯体形成が保持されることが確認された。この錯体のMCDおよび円偏光二色性(CD)測定を行ったところ、比較的大きな値を示すことが確認された。2、自然光学活性に影響を与える要因の解析カンファー誘導体を配位子としたキラルEu(III)錯体において、発光に関する大きな自然光学活性(円偏光発光:CPL)が報告されている。この原因を検討するために、キラルなカンファーEu錯体を合成し、その光学特性を評価した。その結果、様々な溶媒中においてEu(III)イオンの発光に伴うCPLが観測された。また、そのCPL形状は溶媒に依存して変化した。このCPL変化は、各溶媒中におけるEu(III)錯体の立体構造、また、そのEu(III)錯体周りの外部環境変化に影響していることが示唆された。本研究の最終的な目標はMChDを強く発現する物質を創成することであり、そのためには磁気光学活性と自然光学活性が大きな値を示す分子の設計指針を確立することが重要となる。これまでに磁気光学活性増大に向け、カルボキシレート基を配位部位として持ったキラル有機分子によるEu錯体の合成、およびその磁気光学特性の評価を行うことに成功した。このキラルEu錯体の磁気光学活性および自然光学活性は比較的大きな値をとったことから、大きなMChDが期待される。また、自然光学活性に影響を与える要因の解析では、キラルEu錯体の立体構造および外部環境が自然光学活性に重要であることが明らかとなった。しかし、自然光学活性を増大させるための具体的な設計指針は未だ明らかにはなっていない。今後は、自然光学活性を強く示すキラルEu錯体を比較し、設計指針を見出すことで、MChD材料としての創製を目指す。本研究では、非偏光の吸光度が外部磁場の方向に依存して変化する磁気キラル二色性(MChD)を強く発現するキラル希土類(Ln)クラスターの創成を目的としている。この目的を達成するためにはキラル希土類錯体の自然光学活性が増大するメカニズムを明確にすることが重要となる。そこで、当該年度は電子状態の解析を容易にするため単核のキラルユウロピウム(Eu)錯体を合成し、電子状態の観点から自然光学活性増大メカニズムを評価した。カンファー誘導体を配位子としたキラルEu錯体において、発光に関する大きな自然光学活性(円偏光発光:CPL)が報告されている(J. L. Lunkley et al., Inorg. Chem., 2011)。この原因を検討するために、3-(+)-トリフルオロアセチルカンファー(+tfc)配位子とトリフェニルホスフィンオキシド(tppo)配位子から構成されるEu錯体を合成し、溶液中における外部環境に依存したCPLの評価を行った。アセトン溶媒中におけるEu錯体の構造はEu錯体の濃度およびアキラルなtppoの添加量によって変化することをNMRおよび発光特性より確認した。その溶液中では、+tfcを有するEu錯体にtppoが配位した構造とアセトン分子が配位した構造の平衡状態を形成することが示唆された。
実験的自己免疫性迷路炎モデルにおける内耳特異的抗体の機能解析

牛内耳組織粗抗原蛋白から内耳特異的自己蛋白抗原の分離抽出をProtean II xi 2-D-cell電気泳動装置とWhole Gel Eluter電気泳動装置を用いて内耳膜様部粗抗原蛋白を分子量別に30分画した。各分画蛋白を実験動物に皮下感作し、血清内耳抗体産生の有無をwestern blot法にて検索した。その結果、19分画の蛋白抗原感作は内耳抗体の産生を誘導した。その発現陽性バンドの標的内耳抗原分子サイズは約14kDa、17kDa、42kDa、46kDa、55kDa、60kDa、64kDaの7種類であった。そこでこれらバンドの抗体産生を誘導した内耳抗原蛋白がCOCH遺伝子由来蛋白か否かをプロテオーム解析にて検討した。本実験では上記7種類の内耳蛋白を有する分画番号3、5、8、10、11、18、22、24の蛋白を解析した結果、分画3,5,8,10,11にはCOCH遺伝子由来蛋白を含有しており、特に、分画3,10,11は高純度のCOCH蛋白で、分画5,8には他の蛋白も混在し、18,22,24の分画蛋白はCOCH以外の蛋白であった。免疫組織化学検査ではこの内耳特異的蛋白を含有する分画5の内耳組織では血管条血管へのIgG,C3の沈着を認めた。SDS液中で細分化した牛内耳粗抗原溶液1.6gをWhole Gel Eluter装置にて一定の分子量ごとに分離して、分子量の異なる30分画の内耳蛋白を採取した。Eluter装置の蛋白回収率は50%であり、これまでの内耳粗抗原での感作実験結果によると78回分の感作が可能な量を採取した。従って、各分画内耳蛋白液を7等分し、1等分はプロテオーム解析に使用し、残りの6等分の内耳抗原蛋白は、マウス感作に使用した。今回の研究では30分画した内耳蛋白から分画3、4,5,6,7,8,9,11,12,16,17,18,20,21,22について検索した。各抗原の感作にはC57BL/6マウスを2匹ずつ用意し、2週毎に3度全身皮下注射した。最終感作後1週目に採血し、全身麻酔科にPLP固定液での心潅流固定にて側頭骨を採取した。血清の内耳抗体の検索は牛内耳粗抗原を対象としたwestern blot法にて検索した。その結果、分画5、6、7,8の内耳抗原で感作した動物血清には明瞭な陽性ブロットを66kDa付近に認めた。また33、70kDa付近にも淡い陽性ブロットを認めた。しかし、分画3、4、9、11、12、16、17、18、20、21、22で感作した動物血清や正常マウス血清においては66kDa付近の陽性ブロットは発現しなかったが、同様の淡い陽性ブロットが33、70kDa付近に発現することから、この内耳蛋白33、70kDaに対応する抗体は内耳非特異的と推察された。これらの結果、分画5,6,7,8には66kDa付近の内耳特異的抗原を含むことが推察される。18年度の研究においては残りの分画内耳蛋白1,2、10、13,14,15、19、23、24、25、26、27,28,29、30について検索する予定である。内耳蛋白Cochlinに対する抗体を用いて前庭組織のCOCH由来蛋白の局在を免疫検索組織化学的に検索した結果、平衡斑の間質や半規管膨大部に大量に認めた。内耳の炎症細胞発症機序の研究では異物蛋白の内耳へ再刺激時に内耳全域でのIFγが発現、次いでICAM-1が発現されて、その発現内耳部位へのリンパ球を含む炎症細胞浸潤を誘導することが明らかになった。

近年、内耳蛋白遺伝子COCHの存在が解明された結果、内耳蛋白はCOCH遺伝子由来の内耳特異的な蛋白と全身に共通な内耳非特異的な蛋白とから構成されていることが判明した。内耳自己免疫病は発症時には他の自己免疫疾患を合併しない内耳特異的な疾患とされている。従って、内耳自己免疫病(自己免疫性迷路炎)モデル動物開発研究には内耳特異的な抗原の採取が必須である。本研究の初年度にはSDS可溶性内耳蛋白をWhole Gel Eluter装置を用いて、分子量別に30分画した。各分画蛋をマウスに感作して、内耳抗体産生の有無をウェスタンブロット法を行い、それら分画の内耳抗原性を検討した。初年度の平成17年度は分画3,4,5,6,7,8,9,11,12,17,18,20,21,22の動物感作実験を行った。18年度には残りの分画1,2,10,13,14,15,19,23,24,25,26,27,28,29,30の動物感作実験を行った。その結果、分画5,6,7,8に66kDaの明瞭な陽性プロット発現が観察され、これらの分画蛋白を感作した動物の蝸牛血管条血管壁にIgGおよびC3の沈着を認めた。分画5,6,7,8での蛋白のプロテオーム解析では、これら分画の蛋白はCOCH遺伝子由来の蛋白であることが判明した。また分画3,18,22,24分画の感作動物血清に淡いプロットの発現を認めた。現在、分画3,18,22,24分画蛋白のプロテオーム解析を予定し、またこれら分画感作動物の内耳へのIgGおよびC3の沈着の有無を免疫組織学的に検討中である。Protean II xi 2-D-cell電気泳動装置とWhole Gel Eluter電気泳動装置を用いて内耳膜様部粗抗原蛋白を分子量別に30分画した。各分画蛋白を実験動物に2週毎に計3回全身皮下感作し、各動物血清中の内耳自己抗体産生の有無をwestern blot法にて検索した。その結果、分画30分画中19分画にブロット発現を認め、その発現程度は3通りで著明、中等度、軽微にわかれた。陽性バンドの標的内耳抗原分子サイズは約14kDa、17kDa、42kDa、46kDa、55kDa、60kDa、64kDaの7種類であった。そこでこれらバンドの抗体産生を誘導した内耳抗原蛋白分画番号3、5、8、10、11、18、22、24のプロテオーム解析を行った。その結果、分画番号3はCOCH蛋白、分画番号5はCOCH蛋白とglucose regulated protein、分画番号8はCoagulation factor C homolog, Cochlinとβactin、分画番号10,11はCOCH蛋白、分画番号18はcrystallinαB,分画番号22はhypothetical protein LOC614958, histone 2B, homeostatic thymus hormone α、分画番号24はhistone H4をそれぞれヒットした。この結果、分画3、10,11は高純度のCOCH遺伝子由来蛋白を含有することが明らかになった。分画3から11まではCOCH蛋白を含有している。が分画3,10,11はCOCH遺伝子由来蛋白のみで他の蛋白の混入は認めなかった。この結果、内耳粗抗原からの内耳特異的抗原の抽出率は4.4%と極めて少ないが、分画3から分画11まではCOCH遺伝子を含有する蛋白が11%を占めるため、このなかのCOCH以外の蛋白を抗体吸着法などにてさらに多量のCOCH遺伝子由来蛋白の分離回収が可能となろう。内耳自己免疫の発症にはT細胞性免疫が重要な役割を果たすことは我々は1999年代に報告したが、さらに内耳自己抗体が発症後の病態変化に重要な役割をはたしていると推察される臨床的証拠もあり、今後このモデルで内耳自己抗体の推移と病態との変化を詳細に検討していく予定である。
図書館を学習課程の中心に置く：探究型学習の方法に関する教育実験と評価

探究型学習は学習指導要領上はきわめて重要な位置づけになっているが,現実的にそれを実施する方法はきわめて多様である。本研究では,東京大学教育学部附属中等教育学校で行われている卒業研究に焦点をあてて,探究型学習の進め方について,研究のテーマ設定,研究の方法の選別と実施,研究の執筆と口頭発表の3つのプロセスを解明することを行い,そのなかでとくに,テーマ選定と図書館を利用した研究支援を中心とした。3年間の研究期間中の毎年度終わりに,執筆者への質問紙調査を行い,これらの支援がなかったときと支援が行われたときとを比較して,執筆者に一定の効果があったことを明らかにしている。東京大学附属中等教育学校において行われている卒業研究執筆という教育課程をテーマにして,これを図書館情報学的に支援することを中心に研究活動を行なっている。卒業研究の執筆過程は,「テーマ選定(4年生冬)→グループ決定・研究開始(5年生春)→研究活動(5年生夏秋)→中間口頭発表(5年冬)→論文執筆(6年春)→論文提出(6年夏)→最終口頭発表会(6年秋)」となっているが,このなかで,最初の過程の4年生のテーマ選定と,5年生の研究開始時期,6年生が最後の過程が終わった時期を中心に検討を行った。テーマ選定については、テーマ選定直前の1月の時期に大学院生のアドバイザーを入れるために,事前に研修を行い,また、アドバイスしたことおよび観察したことについて記録をつくり最終的にそれを分析した。テーマが決まった生徒が研究を始めるにあたって必要な文献資料を同校の学校司書が選定することを行った。また、昨年度同様に論文提出後の生徒にアンケート調査を行った。本年度は本校と類似の教育課程をもつ学校として,本校の卒業研究のモデルとなった茨城県つくば市の茗渓学園高校に加えて,近年高い進学率を誇る渋谷学園渋谷中学校・高等学校を訪問して担当者に話しを聞いた。現行の学校教育における学習課程のなかで探究型学習が何をすることなのかについては、きわめて多様な考え方と実践事例があり、必ずしも明らかになっていなかった。また、そこにおいて学校図書館がどのような役割を果たすところなのかについて、学校関係者のなかで必ずしも了解がとれているとはいえない状況であった。本研究は、東京大学教育学部附属中等教育学校で行われている探究型学習のなかでとくに、卒業研究執筆に焦点をあてて、これらの諸課題について、実験的な研究を行った。卒業研究執筆は,同校の4年生(高校1年生)の最後の時期から6年生(高校3年生)の夏休み前まで1年半かけて取り組む一大学習過程である。この研究では,併せて、研究のテーマ設定、研究の実施、研究成果の発表の3つの過程で、図書館関連の研究支援を行うことによって,教員のあいだにも支援者を増やすことも意図している。研究のテーマ設定については、2012年度に、大学院生による「卒業研究アドバイザー」の配置を行い、4年生のテーマ選定について実施することができた。4年生の教員がすでにテーマ選定に向けた指導を行なっていたこともありスムーズに進めることができた。その成果については、アドバイザーの記録を元に分析を行っている。卒業研究のための図書館の図書選定については、同校司書の支援を得て生徒が選んだテーマについて数冊の図書を選定して実際に図書館に配置した。また、発表については論文の執筆と一部の生徒による口頭発表が行われている。これらについては、卒業研究執筆後の生徒に対して質問紙調査を毎年行うことで、研究過程および執筆・発表過程を明らかにしている。また、これを3年間行うことで比較的な分析をし総合的な評価を行うことになる。連携研究者5名、附属学校教員6名、附属学校図書館職員1名の12名体制で研究を始めた。当初は、卒業研究を探究学習の一つのケースととらえてとくに学習情報環境の向上のために学校図書館を整備することの重要性について、参加者の合意をつくりあげることから出発した。とくに教員はそのような認識があまり共有されていなかったので、秋口には大阪府岸和田市の清教学園高校で進められている探究科の公開授業(卒業論文執筆のための授業)にメンバーのなかから3名が参加することにより、理解を深めようとした。その間、学校図書館の蔵書整備を行った。まず、百科事典等、学校図書館として必要な参考図書をまとめて購入した。また、過去数年の卒業研究のテーマを学校図書館担当者に分析してもらい、これをもとにして新たに150冊ほどの図書を購入してもらった。なお、この費用は、同時に参加している基盤研究(A)「社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーションの理論的・実践的研究」から支出してもらった。卒業研究の意義を分析するために、生徒および教員に対するアンケート調査を実施した。生徒用アンケートについては、テーマ選択の動機や文献や情報収集の方法、執筆過程での困難や自己評価について卒業論文提出者に尋ねるもので、今後毎年実施する予定にしている。

教員対象の調査は、教育課程全体における卒業論文執筆の意義や卒業論文を進めるにあたっての方法(体験中心か文献中心か)などについて尋ねるものである。最後に、図書館を学習環境の中心とするための環境整備の一環とし、また、本研究の共同研究のツールとしても使う電子黒板の配備を行った。卒業研究執筆は,同校の4年生の最後の時期から6年生の夏休み前まで1年半かけて取り組む一大事業である。このなかで,上記の3つの時点で図書館関連の研究支援を行うことによって,少しずつ教員のあいだにも支援者を増やすことができるようになっている。昨年度見合わせた大学院生による「卒業研究アドバイザー」の配置について,本年度は4年生を対象に実施することができた。4年生の教員がすでにテーマ選定に向けた指導を行なっていたこともありスムーズに進めることができた。また,図書選定についても生徒が選んだテーマについて司書が数冊の図書を選定して図書館に配置し,また,長期貸出を行う事業は2年度目に入ったことで生徒および教員の間にも図書館の存在が位置づけられようとしている。一つの点を除いて、順調に研究を進めることができた。一点というのは、卒業研究のテーマを生徒が選ぶときに気軽に相談ができる大学院生を「探究アドバイザー」として配備する予定であったが時期尚早ということで一年見合わせたことである。教員のあいだに十分な合意がないうちに新しい制度を実施してもなかなかうまくいかないことが予想されたために、合意形成に意を注いだ。上記の初年度の研究実績で書いたことはその概要であり、「図書館を学校の中心に置く」という意図についての理解は少しずつ進んできていると考えられる。25年度は最終年度であるので,これまでの研究過程を継続するだけでなく,まとめるための作業を行う予定である。まず,従来から実施している5年生が各自選んだ研究テーマに関わる図書選定を実施する。これには,同校司書の支援をいただく。また,卒業論文が終了した6年生に対するアンケート調査も従来通り行う。執筆の6年生はこの研究が始まった時期から支援を受けていた人たちなので,一昨年度,昨年度の同じ調査と比較することによって,図書館による支援がどの程度の効果をもっていたのかについて明らかにすることができる。また,3年間の研究成果を発表することを一つの目的とし,他の同様の探究型学習を実施している学校との比較や相互の意見交換の機会をつくることをもう一つの目的とした公開シンポジウムを実施する予定にしている。卒業研究の執筆過程は次のようになっている。「テーマ選定(4年生冬)→グループ決定・研究開始(5年生春)→研究活動(5年生夏秋)→中間口頭発表(5年冬)→論文執筆(6年春)→論文提出(6年夏)→最終口頭発表会(6年秋)」このなかで次の点について検討しながら研究を行うことにする。まず、テーマ選定について、大学院生のアドバイザーを入れる。アドバイザーには事前に研修を行う。また、アドバイスしたことおよび観察したことについて記録をつくり最終的にそれを分析する。そして卒業研究のための文献資料のリクエストについて対応できるようにする。
末梢性T細胞性リンパ腫におけるPD-L1発現の臨床病理学的意義

今回の研究でPD-L1発現によりPTCLの一種であるATLLにおいて臨床病理学特徴が異なることが示唆された。臨床的、生物学的な意義に関してさらなる検討が期待される。症例の集積および免疫染色が比較的順調に進み、統計解析において良好な結果が得られたため。さらに、その後の検討によりPD-L1陽性細胞が微小環境に存在する症例で腫瘍免疫において重要な役割を果たすと考えられるHLA、β2MGが腫瘍細胞の細胞膜に発現する症例では、極めて予後良好となる結果を見出した。ATLLにおいては腫瘍免疫の果たす役割は極めて重要だと考えられ、ATLLの病態進展の解明および治療戦略の拡充を目指し今後のさらなる検討が期待される。現時点で、PTCLの1亜型であるATLLについての検討がほぼ終了しているが、他の亜型についても検討を行う予定である。血液病理学
各種ミトコンドリア脳筋症における中枢神経系病変の発生機序

我々はこれまで剖検例の検索によりMELAS(mitochondrial myopathy,encephalopathy,lactic acidosis,and strokeーlike episodes)の脳血管,脈絡叢,脳下垂体前葉に著明なミトコンドリア異常の存在することを見い出し,これらが本症における脳病変の発生と病態に密接に関与していることを明らかにしてきた。本研究では,MELASと共にミトコンドリア脳筋症の代表的疾患であるMERRF(mitochondrial encephalopathy with raggedーred fibers)についても検索を拡げ,下記の新しい知見を得ることができた。1.MERRFにおける脳血管のミトコンドリア異常2剖検例の脳血管系をMELASにおけると同様に検索した結果,血統平滑筋組胞,内皮細胞に軽度ながらMELASと同質のミトコンドリア異常の存在することを見い出した。この所見はMERRFの症例の約30%に認められるとされている脳卆中様症状の発生に関与していると考えられる。2.MERRFにおける脳下垂体前葉のミトコンドリア異常MERRFの脳下垂体前葉にも,MELASと全く同質の変化が,同程度に存在することが判明した。この変化は本症患者に共通する低身長や発育不全,および種々の内分泌異常の原因をなすと考えられる。3.MELASおよびMERRFにおけるミトコンドリア心筋症各々2例の剖検心の検索の結果,心筋細胞の著明なミトコンドリア異常,筋原線維の減少,心筋組胞の変性が存在し,このため心臓は求心性肥大を来たすことを明らかにし得た。4.MELASおよびMERRFの外眼筋のミトコンドリア異常MELASおよびMERRFでは,骨格筋や心筋,および血管平滑筋とならんで外眼筋にも著明なミトコンドリア異常の存在を明らかにした。
神経回路形成を制御する新規カルシウム依存的リン酸化シグナリング機構の解明

発生・発達期に生じる神経細胞内Ca2+流入が神経回路形成において重要な役割を果たすと考えられるが、Ca2+上昇によって活性化される分子イベントが、いかにして神経回路形成を制御するのかは未だ不明である。申請者は、培養神経細胞において、軸索・樹状突起発達を、Ca2+依存性蛋白質リン酸化酵素、CaMKIαならびにIγが担うことを発見した。本研究では、この独自知見を発展させ、in vivoにおけるCa2+-CaMKI依存的新規回路形成メカニズムの解明を推進した。独自に作出した遺伝子改変マウスを用い、神経回路形成におけるCaMKIアイソフォームの機能を新たに見出し、その細胞基盤の一端解明に成功した。本研究は、Ca^<2+>依存的な神経回路形成過程を、カルシウム依存的リン酸化酵素(CaMK)I経路が制御するという可能性に着眼し、多彩な刺激によって惹起される細胞内Ca^<2+>上昇が、如何にして細胞を変化させ、応変かつ柔軟な回路装飾を行うのか、新規の神経回路形成機構を解明することを目指している。この目的を達成するために、H23年度は下記の項目についての研究を実施した。(1)CaMKIファミリーに属する複数のアイソフォームの遺伝子欠失マウスの作出を推進し、null変異体の作出を完了した。本null変異体は、解剖学的な顕著な異常はなく、通常通り系代可能であることを確認した。また、作出したnull変異体において、標的とする遺伝子断片が確かに欠失していることを、qPCR法により確認した。(2)(1)で作出したnull変異体を用いて、各アイソフォームを検出する抗体について評価を行ない、内在性のリン酸化酵素を検出できる抗体を見出した。(3)神経回路形成に関わると考えられる複数のリガンドについて、CaMKIの活性化リガンドとして機能する可能性を検討した結果、複数の候補リガンドを同定した。(4)精製リン酸化酵素を用いて、in vitroにおける基質候補の探索を推進するとともに、至適基質配列の同定を行い、酵素活性化機構についての検討を行った。(5)神経回路形成中の神経細胞における自発的なCa^<2+>上昇を観察するための実験系の確立を進めた。本研究は、Ca2+依存的な神経回路形成過程を、カルシウム依存的リン酸化酵素(CaMK)I経路が制御するという可能性に着眼し、多彩な刺激によって惹起される細胞内Ca2+上昇が、如何にして細胞を変化させ、応変かつ柔軟な回路装飾を行うのか、新規の神経回路形成機構を解明することを目指している。この目的を達成するために、H25年度は下記の項目についての研究を実施した。1複数のCaMKIアイソフォームについて、独自に作出を行った遺伝子改変マウスを用いた表現型の探索。2新たに見出したCaMKIを介した神経回路形成過程の、スライス培養を用いた、細胞内機構の解明。3初代培養系を用いたCaMKIシグナリングネットワークの探索と、in vitroにおける活性化機構の解明。この目的を達成するために、H24年度は下記の項目についての研究を実施した。1CaMKIファミリーに属する複数のコンディショナルノックアウトラインの作出を推進し、Creリコンビナーゼを、プラスミドならびにAAVウイルスを用いて、胎児脳または成体脳に導入することで、確かに標的領域においてDNA組み換えが起き、遺伝子を欠失させることが可能であることを確認した。2上記コンディショナル系統を用いて、時期特異的なノックアウトを、細胞種選択的に行い、カルシウム依存的リン酸化酵素(CaMK)Iの関与する新たな表現系を見出し、詳細検討を行った。32に関わる表現系の詳細を、スライス培養にて検討する実験系の確立を行った。4昨年度に引き続き、神経回路形成中の神経細胞における自発的なCa2+上昇を観察するための実験系の確立を進めた。本研究は、独自のこれまでの知見によって導き出した、Ca2+依存的な神経回路形成過程をカルシウム依存的リン酸化酵素(CaMK)I経路が制御するという可能性に着眼し、多彩な刺激によって惹起される細胞内Ca2+上昇が、如何にして細胞を変化させ、応変かつ柔軟な回路装飾を行うのか、新規の神経回路形成機構を解明することを目指した。特に、独自に遺伝子改変マウスを開発し、その神経回路形成異常の表現型探索により、新規回路形成機構の解明を推進した。最終年度である、平成26年度は、これまでの研究成果に基づき、既に表現型を見出した、コンディショナルノックアウトに焦点を当て、回路形成異常をもたらす分子・細胞基盤について詳細に検討を行った。

その結果、カルシウム-CaMKI経路を介した、新規回路形成過程の同定と、その細胞基盤の一端解明に成功した。本結果は、研究代表者がこれまで見出してきた、「CaMKIは培養系において神経形態制御に寄与する主要なCa2+エフェクター分子である。」という知見の、in vivoにおける意義付けを行うもので、世界に先駆けた新規知見である。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子改変マウスの樹立が順調に進み、抗体など必須研究材料の評価が進んだ。独自に作出した遺伝子改変動物を用いて、新たな表現型を見出し、その細胞内メカニズムの解明を進めている。また、並行して培養系にて実験を行いシグナリングネットワーク解明を推進するとともに、in vitroにおける新規CaMKI活性化機構を明らかとした。今年度は、これまで順調に樹立が進んだコンディショナルノックアウトマウスを用いて、実際にどのような神経回路形成に、CaMKIファミリーが関与するのか、時期特異的なコンディショナルノックアウトにより検討し、新たな表現系を見出すという、研究課題全体の進展に大きく影響を与える結果を得ることができた。また、検出が難しいと言われる、神経回路形成中の神経細胞における自発的なCa2+上昇についても、安定した計測が可能となり、新規表現系とCa2+上昇との関連を検討するための実験系を順調に確立することができた。樹立したnull型遺伝子改変マウスの解析を計画どおり進めるとともに、コンディショナルノックアウトマウスの作出を推進する。最終年度となる今年度は、これまでの研究結果に基づき、既に表現型を見出している、コンディショナルノックアウトマウス表現型に焦点を当てた研究を推進する。特に、初期神経回路形成過程について、スライス培養および分散培養を用い、細胞骨格制御に着目した細胞内メカニズムの詳細解明を推進する計画である。CaMKIファミリーが関与する新規表現系の同定・詳細解析に並行し、今後は分散培養や、スライス培養を用いて、見出した表現系を引き起こす、細胞・分子機構の解明を推進する計画である。具体的には、CaMKIの上流、下流で神経細胞形態制御に関わる細胞・分子機構の探索を進める。特に、これまでの研究で、CaMKIが影響を与えることを見出している、アクチン細胞骨格制御に関わるシグナリングネットワークに焦点を当てた検討をすすめる計画である。また、精製リン酸化酵素を用いたin vitroにおける基質候補の探索を並行して進めることで、分子機構の解明を推進する。
大腸菌におけるO抗原の変換メカニズムの解析

本研究では、O抗原コード領域とその周辺領域を株間で比較することにより、水平伝播領域の特定および入れ換わった領域の特徴を調べた。その結果、複数の大腸菌株でO抗原コード領域を含む大きな領域が水平伝播により入れ換わったことが明らかとなった。細菌ゲノム中には多くの外来性遺伝子(群)が含まれることが分かってきたが、構造的にmobile elementとは認められないケースも多く、そういった外来性遺伝子の伝達メカニズムはほとんど明らかになっていない。大腸菌におけるO抗原の変化はO抗原コード領域が外来性のそれと入れ換わることにより起こると予想されるが、その一般的メカニズムも明らかになっていない。本研究では、以下の方法に従って大腸菌のO抗原コード領域が入れ換わる遺伝的なメカニズムの解明を試みた。まず、異なる進化系統に属しているにも関わらず同じO抗原型を示す菌株は、それぞれが共通するO抗原コード領域を水平伝播により獲得した可能性があると考えた。そこで本研究室で保有する大腸菌株とデータベース上の配列を用いて、MLST解析により系統とO抗原型の関係を調べた。そして異なる3つの進化系統群に属するO55抗原型株を見出した。それぞれの代表株について、O抗原コード領域周辺の塩基配列(約65kb)を決定して比較解析を行った。その結果、明らかな変異頻度の違いから、それぞれのO55抗原型株は共通するO抗原コード領域(約20kb)を含む40kb以上の領域を水平伝播により獲得し、O55抗原型株へと変化したことがわかった。組換え予想部位にはISや繰り返し配列など特別な配列は見出されなかった。以上の結果から、環境中ではO抗原の変換が比較的頻繁に起こっていると予想された。今後、「異なる進化系統に属しているにも関わらず同じO抗原型を示す菌株」や「進化系統的には極めて近縁であるが異なるO抗原型を示す菌株」の比較解析をおこなうことによりO抗原変換メカニズムの特異性や共通性が明らかになると期待された。細菌ゲノム中には外来性遺伝子(群)だと予想される領域が多く含まれるが、構造的にmobile elementとは認められないケースも多く、そういった外来性遺伝子の伝達メカニズムはほとんど明らかになっていない。大腸菌におけるO抗原の変化は、O抗原コード領域が外来性のそれと入れ換わることにより起こると予想されるが、その一般的メカニズムも明らかになっていない。MLST解析により系統的に近縁であることが明らかな大腸菌O157株とO55株を用いて解析を行った。O157株の全ゲノム配列を基に作製したマイクロアレイを用いてCGH解析を行った結果、O55株では主に複数のプロファージ領域とO157抗原コード領域を保有していなかった。加えて、O抗原コード領域周辺(約120kb)では他の領域と比べてシグナルが明らかに弱く、配列の多様化が予想された。O55抗原コード領域とその周辺領域(計170kb)の塩基配列を決定し、比較解析を行った結果、O抗原コード領域(約20kb)を含む約130kbもの領域が水平伝播により入れ換わったことが明らかとなった。以上の結果と昨年度に報告した結果を踏まえて考えると、O抗原の変換はO抗原コード領域のみが入れ換わるのではなく、その周辺領域を含む大きな領域が相同組換えにより入れ換わることにより起こると予想された。
シスプラチンの細胞内画像化,定量化に関する基礎的解析

本研究ではヒト癌細胞へのシスプラチンの取り込み,引き続きおこる核への分布,細胞からの排泄を,大気マイクロピクシー技術により画像解析し,抗腫瘍効果の発現との関係について明らかにする.大気マイクロPIXEによるPtの定量性を確認するために,標準試料(Pt濃度を変化させた寒天を20μmに薄切し凍結乾燥したもの)を作成し,測定を行った.細胞はヒト肺腺癌細胞であるA549を用いて,10μMのBrdUでパルスラベルした対数増殖期の細胞を5μm厚のマイラーフィルム上で培養し,生着したことを確認した後,1mMのシスプラチンを接触させた.接触時間は30分から24時間とした.薬剤に接触後,THAMバッファーで6回洗浄した後,急速凍結乾燥した.解析は日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所の大気マイクロPIXE測定装置を用いた.標準試料を用いた解析では,試料内のシスプラチン濃度と測定されたPtの間に直線性が明らかであった.培養細胞試料では,P,K,Clなどの細胞の局在を示す元素,BrdUでラベルした核内Brおよび細胞に取り込まれたPtが検出可能であった.シスプラチン接触時間の延長とともに,細胞内Ptおよび核内Ptのカウントの増加が観察され,直線性が認められた.大気マイクロピクシーは生物試料に応用可能であるが,さらに検出感度をあげる工夫により,詳細な観察が可能と考えられた.また,このシステムにより肺組織内の重金属の検出ができた症例を経験し,この領域における今後の病理組織診断の一端を担う可能性が示唆された.個々の癌細胞の取り込んだシスプラチンが画像化,定量化できれば,シスプラチン感受性やシスプラチン耐性機構の解析のために,重要な情報をもたらすと考えられる。本研究ではヒト癌細胞へのシスプラチンの取り込み,引き続きおこる核への分布,細胞からの排泄を,大気マイクロピクシー技術により画像解析し,抗腫瘍効果の発現との関係について明らかにする。大気マイクロPI)EによるPtの定量性を確認するために,標準試料(Pt濃度を変化させた寒天を20μmに薄切し凍結乾燥したもの)を作成し,測定を行った。,細胞はヒト肺腺癌細胞であるA549を用いて,10μMのBrdUでパルスラベルした対数増殖期の細胞を5μm厚のマイラーフィルム上で培養し,生着したことを確認した後,1mMのシスプラチンを接触させた。接触時間は30分から24時間とした。薬剤に接触後,THAMバッファーで6回洗浄した後,急速凍結乾燥した。解析は日本原子力研究開発灘高崎量子応用研究所の大気マイクロPIXE測定装置を用いた。標準試料を用いた解析では,試料内のシスプラチン濃度と測定されたPtの間に直線性が明らかであった。培養細胞試料では,P,K,Clなどの細胞の局在を示す元素,BrdUでラベルした核内Brおよび細胞に取り込まれたPtが検出可能であった。シスプラチン接触時間の延長とともに,細胞内Ptおよび核内Ptのカウントの増加が観察され,直線性が認められた。大気マイクロピクシーは生物試料に応用可能であるが,さらに検出感度をあげる工夫により,詳細な観察が可能と考えられた。本研究ではヒト癌細胞へのシスプラチンの取り込み,引き続きおこる核への分布,細胞からの排泄を,大気マイクロピクシー技術により画像解析し,抗腫瘍効果の発現との関係について明らかにする.大気マイクロPIXEによるPtの定量性を確認するために,標準試料(Pt濃度を変化させた寒天を20μmに薄切し凍結乾燥したもの)を作成し,測定を行った.細胞はヒト肺腺癌細胞であるA549を用いて,10μMのBrdUでパルスラベルした対数増殖期の細胞を5μm厚のマイラーフィルム上で培養し,生着したことを確認した後,1mMのシスプラチンを接触させた.接触時間は30分から24時間とした.薬剤に接触後,THAMバッファーで6回洗浄した後,急速凍結乾燥した.解析は日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所の大気マイクロPIXE測定装置を用いた.標準試料を用いた解析では,試料内のシスプラチン濃度と測定されたPtの間に直線性が明らかであった.培養細胞試料では,P,K,Clなどの細胞の局在を示す元素,BrdUでラベルした核内Brおよび細胞に取り込まれたPtが検出可能であった.シスプラチン接触時間の延長とともに,細胞内Ptおよび核内Ptのカウントの増加が観察され,直線性が認められた.大気マイクロピクシーは生物試料に応用可能であるが,さらに検出感度をあげる工夫により,詳細な観察が可能と考えられた.また,このシステムにより肺組織内の重金属の検出ができた症例を経験し,この領域における今後の病理組織診断の一端を担う可能性が示唆された.
平滑筋細胞におけるムスカリン受容体サブタイプの新たな機能発現モデルの構築

本研究では、腸管平滑筋細胞におけるM2およびM3ムスカリン受容体サブタイプ間に存在する相互作用を明らかにし、ムスカリン受容体の新たな機能発現モデルを構築することを目的とした。得られた研究成果の概要は次の通りである。(1)M2サブタイプに連関した非選択的陽イオンチャネル(NSCC)の活性化には、M3サブタイプも同時に刺激されることが必要であるという仮説が考えられている。この仮説を検証するため、各種GTP結合蛋白質(G蛋白質)抗体および情報伝達阻害薬を用いてNSCCに対する影響を検討した。その結果、M3受容体に連関したG蛋白質、イノシトール三リン酸、ジアシルグリセロールなど下流の情報伝達分子よりもむしろ、M3自身から送られる何らかのシグナルがNSCCの活性化に必要であることが明らかになった。この結果を説明するためのモデルとして、M3受容体とM2受容体がヘテロダイマーを形成することによりNSCCの活性化を制御している可能性が考えられた。(2)3種のムスカリン受容体作動薬を用い、各作動薬で生じる収縮反応と収縮反応に対する各種受容体拮抗薬の影響、細胞内Ca^<2+>濃度の変化、収縮蛋白系のCa^<2+>感受性の変化および膜電位変化を比較・解析した結果、これらの作用が上述したM3-M2ヘテロダイマーモデルでよく説明できることを明らかにした。(3)M2またはM3受容体の欠損マウスを用いてNSCCの活性化を検討した結果、M2とM3のどちらの受容体が欠損してもNSCCは活性化されないことが明らかとなった。この結果もM3-M2ヘテロダイマーモデルを支持しており、NSCCには、これまでのモデルとは異なる新しい活性化機構が存在すると考えられる。以上の成果は、2編の学術論文および2編の総説として公表するとともに、第2回キエフ国際平滑筋シンポジウムの招待講演にて発表した。各サブタイプのノックアウトマウスの到着が遅れたため、一部計画を変更したものの、研究はおおむね順調に進展した。この仮説をさらに追求するため、各種G蛋白質抗体および情報伝達阻害薬を用いてNSCCに対する影響を検討した。その結果、M3受容体に連関したG蛋白質、イノシトール三リン酸、ジアシルグリセロールなど下流の情報伝達分子よりむしろ、M3自身から送られる何らかのシグナルがNSCCの活性化に必要であることが明らかになった。(2)3種のムスカリン受容体作動薬を用い、各作動薬で生じる収縮反応と収縮反応に対する各種受容体拮抗薬の影響、細胞内Ca濃度の変化、収縮蛋白系のCa感受性の変化および膜電位変化を比較・解析した結果、これらの作用が上述したM3-M2ヘテロダイマーモデルでよく説明できることを明らかにした。以上の成果は、2編の論文としてBritish Journal of Pharmacology誌に投稿中である。また、成果の一部は、Recent Research Developments in Physiologyに総説として公表した。