hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胚葉テクトニクス:隣接関係の動態に着目した器官形成の研究

この三年間の研究を通じ、紫(外)線照射によって、蛍光を発するようになるケージド蛍光色素や、もともと緑蛍光であるが赤に変色するタンパク質Kaede、蛍光を消去したり復活させたりできるDronpaなどをゼブラフィッシュの初期胚に導入して、時期、場所特異的に光転換させ、様々な細胞集団の振る舞いを、体系的に解析する方法を確立することができた。1.初期嚢胚に様々なパタンで紫(外)光を照射したのちに、4次元イメージングを行うことにより、いままであいまいだった器官形成過程を可視化することに成功した。たとえば、各種プラコードの形成は複雑であるが、その様子を観察することに成功した。2.中胚葉組織は、外胚葉組織を裏打ちするように移動していき、同時に、脊索・体節・腎節などに分化する。おのおのの組織どうしが、発生初期において、どのような位置関係にあり、それがどのように変化していくかを調べるため、私達は体節形成時期の胚を、光転換法によって縞状にラベルして、おのおののストライプの中の組織が互いにどのようにずれていくかを体系的に調べる方法を開発した。その結果、発生途上において、それぞれの組織がもともと隣り合っていた組織から、だんだんと離れていくことが観察された。このことは、それぞれの組織が持つ隣接関係や位置情報が次第にずれていくことを示している。3.初期嚢胚にレーザーをもちいて、座標軸を描き、それがどのように変形していくかを観察することにより、細胞集団の`座標変換'を明らかにする手法を開発した。また、この技法をもちいて座標変換に異常をきたす突然変異体の解析が可能となった。また、以上の技術はマウスでも応用可能であるとの結果を得ている。1.外胚葉と裏打ち中胚葉の位置関係の変化を、ケージド蛍光色素を用いて調べた。その結果、正中軸組織および孵化酵素細胞は、嚢胚初期において、シュペーマンのオーガナイザーに相当する胚盾と呼ばれる領域の中に存在するが、その後、すみやかに分離することが示された。また、正中軸組織と神経組織の前後軸に沿った隣接関係が極めて動的であること、例えば、発生後一日目の胚においては脊索の先端は後脳第4から5節に位置するが、嚢胚後期には後脳と中脳の境界に付近にあり、その後、後退していくことが証明された。2.Kaedeは紫外線照射によって緑から赤に蛍光色が変化するヒユサンゴのタンパク質であり、培養細胞での有用性が報告されている。私達はin vivo脊椎動物胚への初めての応用を試みるためゼブラフィッシュを用いて実験を行った。細胞の形態をより鮮明に見るため、Ga14のシステムを使って、神経細胞にKaedeと膜局在性GFP,核局在性YFPを共発現させた。単一神経細胞を選び、その細胞体に紫外線を照射したところ、赤い蛍光が軸索、樹状突起、成長円錐に広がった。赤い蛍光は比較的安定でその神経細胞の発生過程を数日にわたって観察できた。とくに、複数の神経突起が接触したり束なっていたりするところで、隣接する神経細胞との関係を可視化でき、神経ネットワークの形態的形成過程の研究に適していることが示された。もうひとつの重要な応用は、大局的形態形成運動の可視化である。Kaedeを発現させた胚に小さなUVスポットをあてると、その場所の外胚葉と裏打ち中内胚葉がカラム状に同時ラベルされる。私達は、それぞれの胚葉上のスポット間のずれを一定の時間間隔で観察することにより、ひとつの胚葉と隣接する胚葉が相対的にどう動いているかを解析できた。1.嚢胚初期にシュペーマンのオーガナイザーに相当する胚盾と呼ばれる領域は、その後、正中線組織(脊索・フロアプレート・ハイポコード)と孵化酵素細胞に分化する。私たちは、紫外線照射によって蛍光を発するようになるケージド蛍光色素と、緑から赤に蛍光色が変化するヒユサンゴの蛋白質であるKaedeを用いて、これらの発生過程を解析した。さらに、Notchの細胞内ドメインをモザイクに強制発現させると、これらの細胞の発生運命が、脊索からフロアプレート、または、ハイポコードに分化転換すると共に、それらの組織の区画に移動し、細胞選別を起こす現象を観察できた。このことは、細胞の発生運命決定と形態形成運動がリンクしていることを示している。2.Kaedeを注入した魚をもちいて、初期胚における発生運命地図をより正確に追うことができるようになった。その結果、今まで、単一細胞に色素を注入して細胞系譜を追跡する従来の方法では検出できなかった、細胞集団レベルでの様々な形態形成運動や、器官原基の分布を明らかにした。3.鳥類胚において、エレクロポレーション法を用いて、CAGGS-Kaedeを発現させた後、光転換をして神経発生を調べることに成功した。また、脊髄と体節由来の筋肉は、共に節の構造を持っており、そのおのおのの節は運動神経などによって、一対一の関係を維持している。しかし、この対応関係が発生のどの時期に起こるかはわかっていなかった。今回、両者の原基を同時にラベルすることにより、その関係は、かなり後期に、形態的に体節が形成される頃にできあがることが初めて明らかになった。また、培養条件下のマウス初期胚でも、光転換できることを示した。

この三年間の研究を通じ、紫(外)線照射によって、蛍光を発するようになるケージド蛍光色素や、もともと緑蛍光であるが赤に変色するタンパク質Kaede、蛍光を消去したり復活させたりできるDronpaなどをゼブラフィッシュの初期胚に導入して、時期、場所特異的に光転換させ、様々な細胞集団の振る舞いを、体系的に解析する方法を確立することができた。1.初期嚢胚に様々なパタンで紫(外)光を照射したのちに、4次元イメージングを行うことにより、いままであいまいだった器官形成過程を可視化することに成功した。たとえば、各種プラコードの形成は複雑であるが、その様子を観察することに成功した。2.中胚葉組織は、外胚葉組織を裏打ちするように移動していき、同時に、脊索・体節・腎節などに分化する。おのおのの組織どうしが、発生初期において、どのような位置関係にあり、それがどのように変化していくかを調べるため、私達は体節形成時期の胚を、光転換法によって縞状にラベルして、おのおののストライプの中の組織が互いにどのようにずれていくかを体系的に調べる方法を開発した。その結果、発生途上において、それぞれの組織がもともと隣り合っていた組織から、だんだんと離れていくことが観察された。このことは、それぞれの組織が持つ隣接関係や位置情報が次第にずれていくことを示している。3.初期嚢胚にレーザーをもちいて、座標軸を描き、それがどのように変形していくかを観察することにより、細胞集団の`座標変換'を明らかにする手法を開発した。また、この技法をもちいて座標変換に異常をきたす突然変異体の解析が可能となった。また、以上の技術はマウスでも応用可能であるとの結果を得ている。
膵移植における細胞間伝達分子シグナルの制御による免疫寛容誘導の解析

一般に移植膵は拒絶されやすく、免疫寛容の得難いことが知られており、まだ、一旦始まった拒絶反応の進行を阻止することが極めて困難であると言われている。これは炎症細胞が膵の間質へと浸潤することによって膵炎が惹起され、その後炎症細胞が浸潤するという悪循環が形成される膵移植の特異性に起因すると考えられる。従って、膵移植における免疫寛容誘導には移植直前から移植直後早期にかけて強力かつ適切な免疫抑制を行うことで移植膵に対するアロ免疫応答の早期に関与する接着分子-リガンドの経路をブロックすることにより膵移植における免疫寛容を誘導することである。本年度は、まずmultiple non-MHC抗原が異なるF344からLEWラットの膵移植モデルにスルファチド、抗ICAM-1/LFA-1抗体、またはこれら両者を投与し、その生着延長効果を以下の4群に分けた。A群:無処置、B群:スルファチド投与(day-1,0に1mg/rat,iv)、C群:抗ICAM-1/LFA-1抗体投与(day1,3に2.5mg,ip)、D群:両者併用。その結果、生着日数がそれぞれA群:14±1.0日、B群:18.6±4.4日、C群:18.0±1.0日、D群:133.3±124.7日であった。免疫学的にもeffector細胞の誘導が認められた。スルファチドにより膵移植モデルにおけるグラフト延長効果を認め、さらに間質へのリンパ球浸潤に関与するICAM-1/LFA-1分子を制御することにより、グラフトの延長を認めた。以上、セレクチン阻害剤であるスルファチドと抗体ICAM-1/LFA-1抗体の併用により、有意な生着延長が認められた。一般に移植膵は拒絶されやすく、免疫寛容の得難いことが知られており、また、一旦始まった拒絶反応の進行を阻止することが極めて困難であると言われている。従って、膵移植における免疫寛容誘導には移植直前から移植後早期にかけて強力かつ適切な免疫抑制を行うことが必要たなる。そこで本研究の目的は、fully allogenic combinationで移植膵に対するアロ免疫応答の早期に関与する接着分子-リガンドの経路をブロックすることにより膵移植における免疫寛容を誘導することである。本年度は、まずmultiple non-MHC抗原が異なるF344からLEWラットの異所性心移植モデルにスルファチド、または抗ICAM-1/LFA-1抗体、またはこれら両者を投与し、その生着延長効果を以下の4群に分けた。A群:無処置、B群:スルファチド投与(day-1,0に1mg/rat,iv),C群:抗ICAM-1/LFA-1抗体投与(day1,3に2.5mg/kg,ip),D群:両者併用。その結果、生着日数がそれぞれA群:10.4±0.9日、B群:18.6±2.6日、C群:20.5±0.5日、D群:30.1±2.3日であった。組織学的にもB、C、D群で明らかな細胞浸潤の抑制効果が認められ、免疫学的にもeffector細胞の誘導が認められた。以上、心移植モデルにおけるグラフト延長効果を認め、さらに間質へのリンパ球浸潤に関与するICAM-1/LFA-1分子を制御することにより、さらにグラフトの延長を認めた。膵臓移植モデルにおいても同様の方法を試み、免疫寛容の誘導の可能性を検討中である。

これは炎症細胞が膵の間質へと浸潤することによって膵炎が惹起され、その後炎症細胞が浸潤するという悪循環が形成される膵移植の特異性に起因すると考えられる。従って、膵移植における免疫寛容誘導には移植直前から移植直後早期にかけて強力かつ適切な免疫抑制を行うことで移植膵に対するアロ免疫応答の早期に関与する接着分子-リガンドの経路をブロックすることにより膵移植における免疫寛容を誘導することである。まずmultiple non-MHC抗原が異なるF344からLEWラットの膵移植モデルにスルファチド、抗ICAM-1/LFA-1抗体、またはこれら両者を投与し、その生着延長効果を以下の4群に分けた。A群:無処置、B群:スルファチド投与(day-1,0に1mg/rat,iv)、C群:抗ICAM-1/LFA-1抗体投与(day1,3に2.5mg,ip)、D群:両者併用。その結果、生着日数がそれぞれA群:14±1.0日、B群:18.6±4.4日、C群:18.0±1.0日、D群133.3±124.7日であった。免疫学的にもeffector細胞の誘導が認められた。スルファチドにより膵移植モデルにおけるグラフト延長効果を認め、さらに間質へのリンパ球浸潤に関与するICAM-1/LFA-1分子を制御することにより、グラフトの延長を認めた。以上、セレクチン阻害剤であるスルファチドと抗ICAM-1/LFA-1抗体の併用により、有意な生着延長が認められた。
細胞膜マイクロドメインを足場とする配偶子間認識と融合の分子機構

アフリカツメガエル配偶子を用いた試験管内受精実験により、卵細胞膜マイクロドメインに局在するタンパク質の受精成立(アロ認証)にかかわる生理機能についての理解が深まった。具体的な成果(4項目)は以下の通りである。1.精子依存性の受精シグナルの受容体として卵ウロプラキンIIIが主要因子であることが示された。2.卵ウロプラキンIIIを発現するヒト培養細胞293から調製された膜マイクロドメインに精子受容機能が再構成されることが示された。3.未成熟卵母細胞から調製された膜マイクロドメインには成熟卵(未受精卵)に見られるような受精シグナル受容能(精子依存性の卵チロシンキナーゼSrcの活性化、カルシウム反応誘導能など)が欠落していることが示された。4.ウロプラキンIIIおよび他の膜マイクロドメイン構成タンパク質の発現状態(例えば卵表層外部への表出)に卵成熟の前後で違いのあることが示された。以上の結果について、論文の発表(3件:Mahbub Hasan et al. 2011, 2012a, 2012b)および発表準備をしている(2件:Ijiri et al. 2012、Sato et al.投稿準備中)。また、ヒトがん細胞をモデル系とするウロプラキンIIIおよびSrcを介するアポトーシス抵抗性増殖機構の理解も進んだ。すなわち、血清飢餓ストレスに対する抗アポトーシス機構の中核としてSrcの活性化→HB-EGFリガンドの発現亢進→ウロプラキンIIIの部分消化/EGF受容体キナーゼの活性化→Srcの活性化(陽性フィードバック)→HGF受容体キナーゼのリン酸化→抗アポトーシス機構の発動、といった一連の新規のシグナル伝達機構が働くことが明らかとなった。これらについても論文発表を準備している(2件:Kihira et al.2012、Mahbub Hasan et al. 2012c)。24年度が最終年度であるため、記入しない。アフリカツメガエルの卵細胞を用いて、配偶子間認識と融合の分子機構を明らかにするための以下の実験を行った。卵細胞膜マイクロドメインに局在する膜貫通型タンパク質ウロプラキンIII(以下、UPIII)の細胞内局在に関する生化学的・免疫組織化学的解析を行ったところ、UPIIIは卵巣組織における卵細胞形成初期からタンパク質発現をしている一方で、卵細胞表面における発現は排卵後の未受精卵に限られることを示唆する結果を得た。このことは、精子受容体の候補分子であるUPIIIの機能的発現メカニズムの観点から興味深い。今後はUPIIIの卵細胞状における発現の実体をさらに詳細に解析し、卵形成期のどの時点で精子を受容することが可能になるかという点と合わせて明らかにしていきたい。また、UPIIIのヒトホモログを発現する各種ヒトがん細胞株を用いて、血清飢餓抵抗性の細胞増殖機構を明らかにするための以下の実験を行った。膀胱4種、結腸1種、および腎臓1種のそれぞれのがん細胞において、血清飢餓環境下でのタンパク質リン酸化酵素Srcの活性化状態、および細胞増殖におけるSrc依存性を解析したところ、3種類の膀胱がんで、Srcの活性化とSrc依存的な細胞増殖が観察された。このことは、膀胱がん細胞がUPIII/Src依存的血清飢餓抵抗性メカニズムを普遍的に有している可能性を示唆しており興味深い。以上の研究成果の一部は、Zoological Scienceの原著論文1報として2011年中に公表される予定であるとともに(in press)、Molecular Reproduction and Developmentから招待されて作成中の総説論文1報として発表される予定である(投稿中)。これらについても論文発表を準備している(2件:Kihira et al.
初学者のためのVLIWプロセッサ教育用シミュレーション環境の開発と評価

本研究では,初学者でも使いやすく詳細な動作も理解しやすいことを目的としたVLIWプロセッサシミュレーション環境の開発と,その評価を行った.本研究で実装したシミュレーション環境は次のような特徴を持つ.1)現在,一般に利用可能なものがない,初心者向けのVLIWプロセッサシミュレーション環境とした.2)初学者にとって操作しやすい環境とするために,Microsoft社のWindows XP/Vista上で動作するものとした.3)プロセッサの各レジスタの値や,キャッシュヒット・ミス,パイプライン,メモリアクセスの状態などを,グラフィカルユーザインタフェースを用いてわかりやすく表示するものとした.4)命令セットは,スーパースカラプロセッサシミュレータの実質的な標準となっているSimple Scalar Tool Setで使用されているPISA(Portable Instruction Set Architecture)命令セットをベースにVLIW用の拡張を施したものとし,他のスーパースカラプロセッサとの動作比較を容易にした.実装においては,まず既に開発済みのLinux版のシミュレータをWindows上への移植をおこなった.Linux版ではネイティブシステムコールを用いてシミュレートしている部分をいかにWindows上で実装するかが問題であった.本シミュレータでは,Windows用のLinux APIエミュレーションライブラリのCygwinを利用し,このファンクションコールを呼び出すためのスタブDLLを開発することにより解決した.また,シミュレーションエンジンもDLLコンポーネントとして設計し,GUIとCUIの2種類のユーザーインターフェースから操作を行えるように工夫をしたとともに,今後の拡張性を確保した。さらにユーザビリティテストを重ねることにより,数種のデザインの中から,より理解しやすいダイアログレイアウトなどを採用し実装した。
対立遺伝子間相互作用が関与する新しい耐寒性制御モデルの検証と機構解明

リンドウのエステラーゼ遺伝子W14/15の機能を解析し、耐寒性を亢進(W15a型))および低下(W14b型)させる変異型アレルを同定した。遺伝子型W14b/W15aリンドウではW14b型がW15a型を抑制し耐寒性が低下する。この現象には両アレルで時期特異的に異なるクロマチン構造変換が関与することが示唆された。本成果は育種技術開発に有用な耐寒性に関わる新しいタイプの遺伝子制御の存在を示唆する。本研究の目的は越冬芽の耐寒性低下と相関するW14/15遺伝子バリアントの機能、遺伝様式及びクロマチン構造を解析して越冬芽の耐寒機構を解明することである。平成24年度はW14/15遺伝子の遺伝様式およびシトシンメチル化レベルからみたクロマチン構造の解析を行った。1.W14/15遺伝子の遺伝様式の解析耐寒性低下アレルW14b2と通常アレルW15a'を持つF1の自殖から得たF2集団の遺伝子型ー耐寒性相関を解析した結果、W14b2アレルは耐寒性低下にドミナントに働くことが確認された。2.休眠前後でのクロマチン構造ー発現量相関の解析W14b2遺伝子およびW15a'遺伝子をそれぞれホモに持つ系統の各器官におけるシトシンメチル化状態を転写プロモーター領域を中心に解析した。この領域にはMADS box転写因子AGL2結合配列および転写因子Myb結合配列がある。両遺伝子とも葉など発現量の少ない器官では高度にメチル化されていた。休眠誘導前後(10月)、休眠時(11月)、休眠越冬時(12月)の越冬芽でのW15a"遺伝子のメチル化は11月が最も低く、プロモーター全領域が低メチル化状態であった。その後(12月)、低メチル化領域は狭まり、転写開始点上流(-)600500bp領域、-300-200 bp領域(AGL2結合領域)およびmyb結合領域を含む-100+50領域が低メチル化領域として残った。このメチル化の変化は転写量の変化と相関した。W14b2遺伝子も同様の領域が低メチル化状態であったが、その変化はW15a'遺伝子と少しずれ、11月の越冬芽よりも12月の方が低メチル化であった。両遺伝子間でクロマチン構造の変換時期が異なることから、対立遺伝子間不均等発現はそれぞれの対立遺伝子が異なる時間的制御を受けることによる現象であることが示唆された。両遺伝子をヘテロに持つ系統で確認を進めている。本研究の目的はリンドウ越冬芽の耐寒性低下と相関するW14/15遺伝子バリアントの機能、遺伝様式及びクロマチン構造を解析して越冬芽の耐寒・越冬機構を解明することである。平成25年度は1. W14/15遺伝子の機能解析、2. W14/15遺伝子の発現とクロマチン構造変換との相関についての解析を行ない、以下のことを明らかにした。W14/15遺伝子の機能前年度までの交配実験から、W15a型アレルが越冬生存に不可欠であること、W14b型は越冬率低下にドミナントに働くことが示唆されていた。今年度は本遺伝子の発現を抑制することにより機能を直接解析した。リンゴ小球形ウイルス(ALSV)ベクターを用いてW15a遺伝子の発現を抑制した個体について、越冬芽の形成率と越冬後(5°C以下、約4ヶ月)の生存率(萌芽率)を調べた。この解析から、W15a型の発現は越冬芽の形成には影響しないが、越冬生存に直接関与することを明らかにした。W14/15遺伝子の発現とクロマチン構造変換との相関W14b型が越冬率低下に働く理由を解明するために、越冬生存率の低い品種PW(W15a/W14b)と高い品種LA(W14a/W14b)で各対立遺伝子の発現を解析した。その結果、両品種間で萌芽期前後の各対立遺伝子の発現比が異なっていた。PWでは両対立遺伝子はほぼ均等に発現していたが、LAではW14b型対立遺伝子の発現はほとんどなかった。この実験から、W14b型アレルの発現が越冬率低下にドミナントに働くことを確認できた。対立遺伝子による発現の違いをクロマチン構造から解釈するために、昨年度に引き続きシトシンメチル化レベルを解析した。その結果、メチル化の高低レベルは時期により変化すること、対立遺伝子型によって変化の時期がずれることが判明し、これによりW14/15対立遺伝子が時期特異的に機能することが示唆された。リンドウ越冬芽の耐寒機構に関与するタンパク質W14/15をコードする遺伝子には12種類の多型(バリアント)が存在し、耐寒性低下をもたらすバリアントアレルが存在すること、これを対立遺伝子にもつヘテロ2倍体では他方の対立

遺伝子が抑制され、これが耐寒性低下をもたらす。対立遺伝子間相互作用が関与する耐寒機構は他に例がない。本研究はW14/15遺伝子バリアントの遺伝様式、バリアントタンパク質の機能およびクロマチン構造の解析を行い、新しい耐寒機構を解明することを目的とした。平成23年度は(1)交配実験による耐寒性低下をもたらすバリアントアレルの確認と遺伝様式、(2)対立遺伝子間相互作用とクロマチン構造について解析した。(1)については、耐寒性低下アレルを持つ品種GSW (遺伝子型:W14b2/W14b2)とそれを持たない品種Aki-6PS (W15a'/W15a')を交配したヘテロ2倍体(W14b2/W15a')を萌芽させ越冬率を解析したところ、親株Aki-6PSよりも低い越冬生存率を示した。この系統の越冬前の対立遺伝子各々のmRNA発現量をqRT-PCRで測定した結果、個体差が大きいものの、全体として対立遺伝子間不均等が見られた。また、この交配系統の遺伝子のクロマチン構造を解析する目的(上記(2))で、対立遺伝子各々のW14/15遺伝子バリアント(W14b2およびW15a')のプロモーター構造の詳細な解析とシトシンメチル化状態を解析した。その結果、転写開始点上流部約700 bpの一時構造にも塩基置換や数ヌクレオチド欠失等の違いがあることが判明し、これが発現強弱やクロマチン構造に反映される可能性が出てきた。メチル化状態については、重亜硫酸塩による化学修飾法で解析した。予備的な結果であるが、メチル化レベルが有意に異なる領域が存在した。クロマチン構造(メチル化)変換の解析は多少遅れているがほぼ順調といえる。しかし、W14/15タンパク質の生化学的解析が思うように進行していないので全体としては3とした。理由は多数のバリアントタンパク質作成・変異導入に時間と労力を要すること、簡便なアッセイ系がないことである。9で述べた(1)および(2)については予備的結果を得た段階であるがほぼ順調といえる。しかし、当初目的のW14/15タンパク質の生化学的解析が思うように進行していないので全体としては(3)とした。理由は多数のバリアントタンパク質作成に時間と労力を要することである。当初の計画どおりに研究を遂行するうえで特に障害や問題点はなくこのまま進める。分子遺伝学的な解析はほぼ順調に進んでいるが、生化学的な機能解析がやや遅れているので、今後これに重点をおきたい。当初の計画どおりに研究を遂行するうえで特に障害や問題点はない。また、研究計画変更の必要性も今のところない。該当しない。当初の計画どおり消耗品が主であるが、謝金(研究補助)、論文投稿料、および学会等出張費を申請したい。
平安時代出土文字資料の動態的歴史分析―〈荷札の終焉〉にみえる木簡の機能

本申請研究は、平安時代になると木簡が急速に減少する事実を、律令制の変質との関係で明らかにすることを目的としている。まず、現在出土している平安時代木簡4251点を網羅的に集成した。次いで、その機能と内容を検討し、木簡が減少する要因は、都城木簡の減少、荷札の消滅、削屑の減少に求められ、その背景に文書木簡の可視化・大型化した利用を見出した。以上を踏まえ、平安時代における木簡の減少は、文書行政の深化、紙の文書の日常化と、それに対応して広まる木の堅牢性を重視した使用によるものと理解した。本申請研究は、平安時代木簡の性格と機能を律令制の変質過程のなかで合理的に説明することを課題としている。今年度は、全国出土の平安時代木簡の全体像を把握することを主要な課題とし、出土情報の収集、整理を目的とした作業を進めた。具体的な調査対象として、奈良文化財研究所が保管する平安時代木簡のリスト作成を開始するとともに、兵庫県深江北町遺跡・三宅遺跡、静岡県伊場遺跡群・赤土政所遺跡、鳥取県鳥取市内遺跡・青谷横木遺跡、滋賀県能登川石田遺跡、福岡県大宰府跡・井上薬師堂遺跡、熊本県田中城周辺地などから出土した平安時代木簡・墨書土器の熟覧調査と写真撮影をおこなった。上記の調査・作業を踏まえ、以下の研究成果をまとめた。aこの10年余りの全国の木簡出土情報と調査研究の動向を整理した「近年の木簡調査研究の動向」(『考古学ジャーナル』649号、2013年11月刊)を著した。b 2004年に刊行した前著『全国木簡出土遺跡・報告書綜覧』以後の出土情報の網羅的収集を木簡学会の協力を得て行い、その成果をもとに『全国木簡出土遺跡・報告書綜覧II』(埋蔵文化財ニュース154号、2014年2月刊)を編み、3000を超える研究・調査機関、木簡調査担当者、古代史等研究者に配布した。c平安時代木簡を含む古代以降の木簡の特徴をまとめ、奈良文化財研究所東京講演会「歴史の証人木簡を究める」(2013年9月)において「木簡を広げるー古代以外の、さまざまな地域の木簡」と題する講演をおこなった。2014年度は、平安時代木簡の全体像の把握を踏まえ、本申請研究の素材となる資料の抽出を課題とした。2013年度に引き続き、平安時代を中心とした木簡・墨書土器など出土文字資料の熟覧調査・写真撮影を実施した遺跡は以下の通りである。大阪府安堂遺跡・玉手山II遺跡、三重県田丸道遺跡、兵庫県但馬国分寺跡・宮内黒田遺跡・袴狭遺跡・川岸遺跡、埼玉県、静岡県、秋田県払田柵跡・厨川谷地遺跡・家ノ浦遺跡・谷地中遺跡・根子荒田遺跡・中谷地遺跡、鳥取県良田平田遺跡・同常松大谷遺跡・下坂本清合遺跡・鳥取城下町遺跡・大御堂廃寺・桂見遺跡・陰田小犬田遺跡・因幡国府跡・青谷上寺地遺跡・青谷横木遺跡、熊本県八代市内遺跡。新出資料の釈読及び撮影、再釈読の調査を踏まえ、以下の研究成果をまとめた。a 2014年度までに全国から出土した平安時代木簡2699点の情報を集成整理した。その上で、申請研究にかかわる資料の抽出・検討をはじめた。b『全国木簡出土遺跡・報告書綜覧』(2004年)、『同II』(2014年)に集成した木簡出土情報を一書にまとめ、誤植などを修正したうえで、『全国木簡出土遺跡・報告書綜覧2014』(私家版)としてあらたに編集した。c鳥取県内出土資料の悉皆調査を行ったほか、都城出土の因幡国伯耆国関係資料について全点熟覧調査をおこない、古代因幡伯耆関係木簡の釈文集成を公表した。最終年度にあたる2015年度には、奈良県橿原市・桜井市・天理市、兵庫県神戸市・豊岡市、愛知県豊橋市、静岡県磐田市、群馬県前橋市、秋田県大館市、鳥取県鳥取市、熊本県八代市等から出土した木簡・墨書土器等の熟覧調査および撮影を行い、資料収集した。平安時代木簡の調査成果として、鳥取県岩吉遺跡・青谷横木遺跡・大御堂廃寺の最新の釈読成果を公表したほか、荘園木簡などによる平城遷都後の藤原宮周辺にかかわる論考、重要文化財嘉禄本・暦仁本古語拾遺の書誌にかかわる論考などを著した。また、これまでに正式報告された藤原宮京出土木簡1,324点全点の樹種を調査し、そのうち科学的な成果が未公表のままであった1,064点につき樹種を整理した結果、ヒノキ系が9割を超え圧倒的に多いことを確認した。3年間の探訪調査と過去の記帳ほか調査記録の精査を踏まえ、約2800点に及ぶ全国出土平安時代木簡を集成した『平安時代木簡集成(稿)資料編』を編み、全国の出土状況を網羅し、そこで示した内容分類により、令前木簡や奈良時代木簡との比較から導かれる平安時代木簡の特徴を明らかにすることができた。

文書木簡の大型化と内容の充実、題籤(軸)など文書の保管にかかわる木簡の増加、呪符木簡の全国的展開、呪符や仏教関係史料(卒塔婆、笹塔婆、こけら経など)の出現など文書木簡が内容的に充実していく反面、荷札木簡の退&#39002;は八世紀末にすでにはじまっていることが明らかになった。また墨書曲物のある井戸枠が畿内にのみみられる点、仮名を記した木簡が畿内から東国に顕著である点など、地域的特質ともいえる現象を見出し、木簡の分類的把握に一定の見通しをえたほか、当該期の文字文化の時代的特質を概観する手掛かりをえることができた。本申請研究は、平安時代になると木簡が急速に減少する事実を、律令制の変質との関係で明らかにすることを目的としている。まず、現在出土している平安時代木簡4251点を網羅的に集成した。次いで、その機能と内容を検討し、木簡が減少する要因は、都城木簡の減少、荷札の消滅、削屑の減少に求められ、その背景に文書木簡の可視化・大型化した利用を見出した。以上を踏まえ、平安時代における木簡の減少は、文書行政の深化、紙の文書の日常化と、それに対応して広まる木の堅牢性を重視した使用によるものと理解した。計画当初に予定していた、平安時代木簡の総数2699点を確認し全体像を明らかにする作業を終え、検討素材の抽出をはじめるなど具体的な検討が可能になった。古代因幡国・伯耆国の木簡集成など、地域に着目した検討をはじめている。日本古代史今年度も、全国から出土した木簡等出土文字資料の熟覧調査、撮影による資料収集を継続する。本務で開始した豊岡市教育委員会但馬国府・国分寺館との連携研究などとも協力し、効率的な調査研究を遂行する。年紀のある荷札木簡に検討を集中し、荷札の終焉についての検討を進める。当初計画に掲げた『全国木簡出土遺跡・報告書綜覧II』を予定通り刊行したほか、平安時代木簡の全体像を明らかにする作業を鋭意進めることができた。全国出土木簡の調査は予定通り進んでいると評価できる。木簡の調査にあたりご協力いただいた関係機関・個人への配布分を確保するため、上記刊行物の増刷費用(400冊)を科研費で支出することにしたため、予定していた謝金支出を伴う作業を平成26年度に延期したが、この作業も今年度4月からすでに開始しており、研究期間内に遂行可能と思われる。本務でおこなっている発掘調査の担当が年度末の1月から3月までで、資料調査の予定が年度末まで確定しなかったため、旅費等に残額が生じた。今年度も、全国から出土した木簡等出土文字資料の熟覧調査、撮影による資料収集を継続する。すでに今年4月、三重県、鳥取県、秋田県において出土木簡、墨書土器、漆紙文書などの調査をおこなっているほか、6月には兵庫県豊岡市での調査、秋には、島根県出雲市、静岡県浜松市、熊本県八千代市での調査及び撮影をそれぞれ予定している。これまで通り、全国の調査機関のご理解とご協力により、出土文字資料の高精細画像による資料収集をすすめる。今年度上半期で予定している平安時代木簡の確認作業を踏まえ、新たに調査・撮影の計画をたてつつ、平安時代出土文字資料の歴史的意義の解明を進める予定である。上記予定していた調査は、2015年度に入り、年度当初の4/7(火)、4/23(木)、5/8(金)の3度にわたり実施し、すでに執行している。謝金支出を予定していた作業を26年度に実施することとしたため、若干の残額が生じた。予定していた謝金を伴う作業は、26年4月7月(予定)に実施するものとし、すでに作業にはいっている。
賃貸住宅市場シミュレータの開発:その具体応用と経済理論・ゲーム論の基礎の検証

本年度は本プロジェクトの最終年度にあたり、本プロジェクトの基礎的部分から応用までを研究した。具体的には、賃貸住宅市場の均衡論的分析の計算機シュミュレータを発展させて、計量経済学的な考察へのつながりを研究してきた。シミュレーションのための計算機プログラムの発展に力をいれ、賃貸住宅市場シミュレータはかなり構成できてきた。多分、もう数年で具体的使用に耐えるシミュレータが完成されると期待している。また計量経済学的へのつながりも明確になってきており、残る課題はそれをどこまで応用して、具体的な賃貸住宅市場のデータに応用するかである。このためには、東京近郊の通勤路線の賃貸価格調査が必要であり、その調査を現在行っている。また、理論的な研究として、効用関数の形状をどの程度許すかが問題になる。最終年度の研究成果として、現在、住宅市場についての論文を執筆中である。本論文ではシミュレーションの結果の他に、計量経済学的な意味でどのように結果を評価するかなどに関しての成果が上がっている。しかし、まだ計量経済学的な背景の経済構造を記述していないという意味において、不十分である。この目的のため内容を拡張する必要があり、また、その計算のためにもシミュレーションが必要不可欠である。これによって、現在、執筆中の論文の貢献はより大きなものになると考えている。以上の研究のレビューなどを受けるため、研究代表者は何度か国際集会に出席した。また筑波大学でゲーム論の国際集会を開催した。これらの集会で本プロジェクトの推進のために貴重なコメントをもらった。本年度は本プロジェクトの1年目にあたり、本プロジェクトの基礎的部分から応用までを研究した。計量経済学的な部分へのつながりも明確になってきており、残る課題はそれをどこまで応用して、具体的な賃貸住宅市場のデータに応用するかである。このためには、東京近郊の都心への通勤路線の賃貸価格の調査が必要であり、その調査を現在行っている。これに関しても他文献などとの関連で、調査中である。第1年度の研究成果として、現在、"An Equilibrium-Econometric Analysis of Rental Housing Markets with Indivisibilities"(Tamon Ito)を執筆中である。さらに、賃貸住宅の各カテゴリーでの平均家賃が統計学的意味において最適な推定量になっている。しかし、それは計量経済学的な意味においては、背景の経済構造を記述していないという意味において不十分である。そのために、計量経済学的に意味のある推定値を尤度比検定を用いてテストするのが現在の目標である。そのためには、尤度比検定の理論を拡張する必要があり、また、その計算のためにもシミュレーションが必要になる。このシミュレーションは乱数を発生させるモンテカルロ法が有効であり、高次元のt-分布のヒストグラムを描き判定する。
特異なスピン共役系の関係と展開

主な研究実績は以下の三つに大別することができる。新しい安定スピン共役電子系の開発:立体保護により、半減期が室温で10分近くに及ぶ非常に安定な三重項カルベンを開発した。安定なラジカル種により構成される単一成分分子性金属が見い出された。また、キラルな構造を有する不斉ラジカル種の開発に成功し、不斉分子磁石の構築への指針が提示された。集合体としてのスピン共役電子系の設計と性質:窒素二座型配位子を中心に、スピン共役電子系を配位子とする自己集積型金属錯体による高スピン種の開発が行われ、配位子におけるスピン伝達の様式が解析できた。また、室温をまたいで磁気的双安定性を示すラジカル集合体結晶が発見され、室温での磁気的性質のスイッチング現象を実現させた。外部応答を示す動的なスピン共役電子系の研究:プロトン濃度に依存して双極イオン構造とビラジカル構造との平衡が成立する分子開発した。酸性度を磁性をプローブとして計測する方法論の基礎が検討された。電気化学的反応系でも、このようなイオン反応が絡む電子構造スイッチング反応が見い出された。電荷移動を固体摩砕により誘起できることが分かった。固相中に開殻分子種を発生させる手法へと展開が計られ、さらに固相反応の触媒的役割が明らかになった。年度始めの研究計画に述べた以下の三つのアプローチにおいて、それぞれ研究成果が得られた。1。安定スピン共役系:低温マトリクス中に発生したジアントリニルカルベンの挙動を明らかにし、200K付近でビラジカル種に変換する現象を見出した。このビラジカル種の三量体を単離し、結晶構造解析に成功した。ラジカル中心を嵩高い置換基で立体的に保護し、分子のもう一方に機能性官能基をもたせたスピンシールド型の安定ラジカルを各種合成し、それらの磁性を明らかにした。共役により安定化された新しいラジカル種を各種合成し、酸化還元挙動を検討した。また、電子移動によりビラジカル種を生成するパイ共役系を開発した。これらは、エレクトロミズム系としても興味深く、その色調変化などを詳細に検討した。2。集合系:ラジカルがニッケルに配位した錯体を使ってスピンラダー系の構築に成功した。磁気測定の結果、940Kのスピンギャップをもつことが明らかになった。キラルな安定ラジカル種を合成し、その集合化した結晶により不斉分子磁石の構築に成功した。3。外部応答系:プロトン授受によりビラジカルの発生と消滅をスイッチングできるような分子を設計・合成して、酸化還元電位、酸性度依存性、熱力学パラメーターなどの検討を行った。これは、新しいタイプのスピン・クロスオーバー系の構築に一歩近づくた成果である。電子供与性の基質と電子受容体を固体状態で直接に摺り混ぜることにより、局所的に電荷移動が達成されてアモルファスの電荷移動固体が得られることが分かった。ここで固体中に生じたラジカルカチオンにアルコールの蒸気に曝すことにより求電子置換反応を固相で実現することができた。新しい開殻構造をもつ分子種が数多く開発され、それらの磁気的な性質が明らかにされた。その中で、安定ラジカル1,3,5-trithia-2,4,6-triazopentalenylの結晶が、室温をまたいで常磁性と反磁性との磁気的双安定性を示すことが見い出されたのは特筆に値する。このほか、酸性度により分子内の磁気的相互作用が規則的に変化するビラジカル種、光照射にたいしてphotochromismを示すビラジカル種などが設計、合成された。これらはいずれも磁気的性質を外部刺激によりスイッチングすることができる新しいスピン共役系である。反応中間体と知られる開殻分子種を安定化する試みも多くの成功を修めた。例えば、三重項カルベンを立体保護により安定化しその寿命を著しく延ばすことができた。ケイ素、鉛、ゲルマニウムなどのヘテロカルベン種が補足され、これら化学種の存在を証明した。開殻分子の発生という点でも、新しい反応が開拓された。カチオン種が還元されやすい共役系が設計されelectrochromismへ展開がはかられた。また、固相での混合摺り合わせによりアモルファスな固体中での電荷移動が確認され、その発展として、固相求核置換反応が実現された。

酸性度を磁性をプローブとして計測する方法論の基礎が検討された。電気化学的反応系でも、このようなイオン反応が絡む電子構造スイッチング反応が見い出された。電荷移動を固体摩砕により誘起できることが分かった。固相中に開殻分子種を発生させる手法へと展開が計られ、さらに固相反応の触媒的役割が明らかになった。
「中央アジアにおける人的移動と経済格差-人的資源開発の視点から」

旧ソ連の体制の下で中央アジアの教育システムは発展し、かなり高い水準になっているが、市場経済化の進展の下でより有効に機能する教育システムに改善してゆく必要性に直面している。基礎教育の面では教育の質的な改善と教員の質の改善が必要とされている。また、旧ソ連の計画経済体制下において中等レベルの職業教育が発達していたが、従来の職業教育は市場経済の下では必ずしも有効でなかった。移行経済において、職業教育の収益率は大学教育に比べると極めて低く、職業教育と大学教育の今後の発展に対して提言するための基礎的な研究が必要とされている。人的資源開発研究の視点からの本研究の目的は、教育の質や効率性を深く分析することにより、グローバル・イシューである人的移動に伴う社会問題を明らかにすることである。最終年度となる22年度は、ウズベキスタンにおける人的移動に関する文献調査を行うと共に、アンケート調査を行った。また、ウズベキスタンの労働省や国連機関が持っている人的移動や労働市場の現状やソ連から独立後の人的資源開発計画をレビューした。これまでどのような政府の開発計画のもとで、どのように移行経済と人的資源開発が平行して、または優先順位をつけられ開発が行われてきたのかを政府、研究機関および援助機関の二次資料により明らかにした。また、今後の経済発展の優先課題と、国家の理想とする経済型について現状から把握できる方向性を指摘できるように、産業構造や教育機関と労働市場の関連性についてもマクロ経済的な視点から分析を行い、国家の優先課題と開発計画の誤差を分析した。今後、本研究結果を学術論文にまとめる予定である。平成20年度はカザフスタン(力国)における人的移動に関する文献調査を行うと共に、アンケート調査の準備をし、フィールド調査を開始した。力国の労働省や国連機関が持っている人的移動や労働市場の現状やソ連から独立後の人的資源開発計画をレビューし、これまでどのような政府の開発計画のもとで、どのように移行経済と人的資源開発が平行して、または優先順位をつけられ開発が行われてきたのかを政府、研究機関および援助機関の二次資料により明らかにした。また、今後の経済発展の優先課題と、国家の理想とする経済型について現状から把握できる方向性を指摘し、産業構造や教育機関と労働市場の関連性についてもマクロ経済的な視点から分析を行った。更に、現地調査のデザインやサンプリング手法を確定する。対象地域、サンプル数の算出、労働市場訪問先等を決定するに当たり、現地のカウンターパート機関を決定した。また、個票を用いた調査を実施するに当たり、調査員を雇用し、訓練を実施するための計画を立てた。また、各国の研究協力者とともにインタビュー先の省庁、研究機関、援助機関等の対象機関、対応者についても検討した。アメリカ合衆国に本部をもつ国際期間(世界銀行)にてカザフスタン、キルギスタン、ウズベキスタンの人的資源開発と経済発展、人的移動に関する資料を収集し、各国の担当者にインタビュー調査を行った本研究の目的は、人的資源開発の視点から教育の質や効率性を深く分析することにより、グローバル・イシューである人的移動に伴う社会問題を明らかにすることである。経済格差や貧困削減など中央アジアで最も大きな問題に挙げられる点について教育や職業訓練を分析することは貧困と人材育成というグローバル・イシューの分析の深化という意義がある。今年度はカザフスタンにおける人的移動に関する文献調査を行うと共に、アンケート調査を行った。また、カザフスタンの労働省や国連機関が持っている人的移動や労働市場の現状やソ連から独立後の人的資源開発計画をレビューした。現地調査の実施にあったて、デザインやサンプリング手法を確定すし、対象地域、サンプル数の算出、労働市場訪問先等を決定するに当たり、現地のカウンターパート機関を決定した。また、個票を用いた調査を実施するに当たり、調査員を雇用し、訓練を実施するための計画を立て、インタビュー先の省庁、研究機関、援助機関等の対象機関、対応者についても検討した。アメリカ合衆国に本部をもつ国際機関(世界銀行)にてカザフスタン、キルギスタン、ウズベキスタンの人的資源開発と経済発展、人的移動に関する資料も収集した。

これまでどのような政府の開発計画のもとで、どのように移行経済と人的資源開発が平行して、または優先順位をつけられ開発が行われてきたのかを政府、研究機関および援助機関の二次資料により明らかにした。また、今後の経済発展の優先課題と、国家の理想とする経済型について現状から把握できる方向性を指摘できるように、産業構造や教育機関と労働市場の関連性についてもマクロ経済的な視点から分析を行い、国家の優先課題と開発計画の誤差を分析した。今後、本研究結果を学術論文にまとめる予定である。
Exploring novel magnetoelastic coupling via polyhedral or molecular rotation in unusual quantum spin systems

多面体および分子の回転に関係された独特な自己-格子結合を研究するため、ペロブスカイトと超酸貨物を研究した。結晶構造と磁気構造分析は現在進行中だ。超高分解能中性子回折装置を使用して、CoF3とFeF3の常温磁気構造を確認して、40 K以下でCoF3の約強磁性相転移を発見した。Co反強磁性スピン方向とDM相互作用から、Co反強磁性スピン回転による約強磁性メカニズムが予想される。
Runx2遺伝子の転写制御機構の解明と、骨粗鬆症・変形性関節症治療薬の開発

骨粗鬆症の治療において、骨吸収抑制剤は、ビスフォスフォネート、SERM、抗RANKL抗体とかなり充実してきた。一方、骨形成促進剤は、注射薬であるPTH製剤のみで、投与期間も2年間と制限されている。したがって、長期投与できる経口の骨形成促進剤が不足している。Runx2は、骨芽細胞分化のマスター転写因子であるとともに、軟骨細胞の後期分化にも必須な転写因子である。Runx2の骨芽細胞での発現上昇は、骨芽細胞分化を促進し骨量を増やすが、軟骨細胞でのRunx2発現誘導は、軟骨の破壊、すなわち変形性関節症を引き起こす。したがって、副作用なく骨形成を促進させるためにはRunx2を骨芽細胞でのみ発現誘導する必要がある。Runx2遺伝子領域のBACクローンを用いたGFPレポーターマウスを作製し、Runx2の生理的発現を再現、その後ゲノムを順次欠失させたGFPレポーターマウスを作製することにより、骨芽細胞特異的エンハンサーを同定した。さらにこのエンハンサーを用いて化合物のハイスループットスクリーニングを行い、エンハンサーを活性化し、骨芽細胞でのみRunx2を発現誘導する化合物を同定した。骨芽細胞にこの化合物を添加すると、ポシティブコントロールとして用いたBMP2と同程度に、骨芽細胞分化(アルカリホスファターゼ活性、石灰化、骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現誘導)が促進された。この化合物あるいは溶媒のみを卵巣摘出を行ったマウスに5週間投与し、マイクロCTで観察した。化合物投与群は溶媒投与群に比較し、海綿骨、皮質骨ともに有意な上昇を認めた。血清の生化学的検査で肝機能異常、腎機能異常等は認められなかった。軟骨細胞特異的エンハンサーは、当初1領域と想定していたが、実際は複数領域にわたっていた。高頻度で全身の成熟軟骨細胞でGFPを発現するマウスを得るために、P1, P2プロモーターを含む様々な領域を組み合わせたGFP tgマウスを作製・解析する必要があった。また、生理的重要性を判断するために、それぞれの領域の欠失マウスも作製・解析したため、時間はかかったが、同定に成功することができた。Runx2 mRNAを上昇させ、骨芽細胞分化誘導能を持つ非常に有望な化合物を得ることができた。その周辺化合物にも活性の高いものが多く、当初の期待以上の化合物であった。その化合物の生体内投与で、海綿骨、皮質骨ともに増加させることができた。さらに、Runx2 mRNAを著明に低下させ、骨芽細胞分化を抑制する化合物が得られたことは、予定以上の結果である。その作用機序を解明し、その分子標的が明らかにできれば、Runx2 mRNAを上昇させ、骨芽細胞分化誘導能を持つ新たな化合物を見出すことも可能になる。また、骨代謝研究に非常に有用なツールとなる。骨芽細胞・軟骨細胞特異的エンハンサーkoマウスの作製は、当初それぞれ1領域を想定していた。しかし、両者ともに複数存在することが判明したため、エンハンサーに特徴的なクロマチン修飾を持ち種間で配列が保存されている領域を、独自に行ったChIP sequence及びデータベース解析により選定、網羅的に欠失マウスを作製していくことにした。当初は、ES細胞を用いて欠失マウスを作製していく予定であったが、CRISPR/Cas9システムを導入し、網羅的な欠失マウスの作製を可能にした。さらに、複数の領域を同時に欠失させることも可能になり、当初の予定以上の成果が見込まれる。発現cDNAライブラリーのスクリーニングにより、軟骨細胞特異的エンハンサーを活性化する分子を同定する。同定した遺伝子の発現ベクターを導入し、エンハンサーのレポーターアッセイを行い、エンハンサー活性化を確認する。また、それらのコンビネーションによるレポーター活性を調べ、転写因子複合体の構成分子を絞り込む。ChIP解析により、上記の転写因子・共役因子がエンハンサー領域に結合しているか調べる。また、EMSAによりDNA結合を、プルダウンアッセイにより蛋白ー蛋白結合を調べる。直接DNA結合している転写因子の結合配列に変異を導入し、レポーター活性を調べるとともに、変異を導入したトランスジェニックマウスを作製、軟骨細胞での発現が消失するか調べる。さらに、enChIP法でエンハンサーおよびプロモーターに結合する転写因子群を同定する。これらの結果をもとに、転写因子・共役因子複合体の構成分子を決定する。また、capture Hi-C法により、どのエンハンサーとどのプロモーターが会合しているか明らかにする。軟骨細胞特異的エンハンサーを用いて化合物ライブラリースクリーニングを行う。さらに初期培養軟骨細胞のマイクロマス培養を用いて、Runx2 mRNAレベル及び軟骨細胞分化を調べ、促進、抑制する化合物を選定する。変形性関節症実験モデルマウス及び自然発症STR/ORTマウス、そしてコントロールマウスに上記で選定した化合物を投与し、高解像度マイクロCTで関節軟骨破壊を比較する。単一のエンハンサー欠失マウスの受精卵に別のエンハンサー領域を認識するガイドRNAとCas9を導入し、2つのエンハンサー領域を同時に欠失させたマウスを作成する。これを繰り返し、全てのエンハンサー領域を欠失するマウスを作成、解析する。Runx2は骨形成において中心的な役割を果たす一方、関節軟骨等に対しては破壊的な作用を持ち、変形性関節症の原因分子となる。Runx2遺伝子の発現制御領域を特定するために、BACクローンを用いて、エクソン1上流130 kb、イントロン1,エクソン2を含む約200 kbのゲノムDNAの下流にGFPをつないだコンストラクトを構築、生理的な発現パターンを再現できるトランスジェニックマウスの作製に成功した。

この200 kbの領域を6つに分け、それぞれを欠失する6種類のtgマウスを作製し、その1つの領域から、1.3 kbの骨芽細胞特異的エンハンサーを特定した。さらに、軟骨細胞特異的エンハンサーを含む7.2 kbを同定した。この7.2 kbにHsp68 minimal promoterにつないだGFPトランスジェニックマウスでは、軟骨細胞に発現を認め、骨芽細胞には発現を認めなかった。骨形成作用のある化合物を同定するため、骨芽細胞特異的エンハンサーを4つタンデムに並べたルシフェラーゼベクター(pGL4.23-4x343)を用い、東京大学創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9600のハイスループットスクリーニングを行った。1次スクリーニングの結果167(1.74%)化合物で活性を示した。2次スクリーニング、3次スクリーニングを行い3化合物に絞り込んだ。7.2 kb軟骨細胞特異的エンハンサーは、相同性の高い3つの領域のみを組み合わせたコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスでは、ミニマルプロモーター、P1、P2プロモーターいずれを用いても、軟骨細胞特異的発現が得られなかった。また、1.3 kbプロモーターと組み合わせても軟骨細胞特異的発現は得られなかった。したがって、7.2kb全体が必要であることがわかった。骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスの作製は順調に進んだ。このエンハンサーのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスも作製した。化合物ライブラリーのスクリーニングは順調に進んでおり、活性の高い化合物も得られている。Runx2は骨形成において中心的な役割を果たす一方、関節軟骨等に対しては破壊的な作用を持ち、変形性関節症の原因分子となる。Runx2遺伝子の発現制御領域を特定するために、BACクローンを用いて、エクソン1上流130 kb、イントロン1,エクソン2を含む約200 kbのゲノムDNAの下流にGFPをつないだコンストラクトを構築、生理的な発現パターンを再現できるトランスジェニックマウスの作製に成功した。この2つの領域以外にエンハンサー領域がないか調べるために、Runx2遺伝子の上流、イントロン、下流領域で種を超えた相同性が認められる領域を探索した。このうち2領域に関し、その領域を欠失させたノックアウトマウスを新たに作製した。Runx2 ObEnfl/+ (ObEn: osteoblast-specific enhancer, fl: flox)マウスで、germline transmissionを得た。さらに、サザンブロット解析により、1.3kbの欠失を確認した。
生体活性を有する骨修復材料の設計

本研究代表者らは先に、セラミックスが生体の骨と結合する生体活性を示すための条件は、生体内でその表面に骨類似のアパタイト層を作ることであり、このアパタイト層の形成は、セラミックスから溶出するCa(II)とSi(IV)イオンと液体中のP(V)イオンの反応によって生じることを明らかにした。この結果に基づけば、種々の基板をCa(II)とSi(IV)を溶出し易いガラスと向い合せて擬似体液中に浸漬すれば、それら基板表面にも骨類似のアパタイト層を形成させることができるのではないかと考えられる。この方法によれば、加熱処理を経ないので有機高分子材料にもアパタイト層をコ-ティングすることができ、しかもそのアパタイト層は体内に似た環境下で作られるので、従来の加熱処理を経て作られるアパタイトより優れた生体活性を示すと期待される。そこで本研究では、シリカ(SiO_2)ガラス、スライド(Na_2O-CaO-SiO_2)ガラス、アルミナ(Al_2O_3)セラミックス、ジルコニア(ZrO_2(Y_2O_3))セラミックス、SAS316ステンレス鋼、チタン(Ti)、Ti-6Al-4V合金、白金(Pt)、金(Au)、ポリメチルメタクリレ-ト、ポリエチレンの10×15×2(または0.1)mmの大きさの板状試料をMgO4.6,CaO44.7,SiO_2,34.0,P_2O_516.2,CaF_20.5wt%の組成ガラスの12×18×2mmの大きさの板と0.2mmの距離を隔てて向い合せ、無機イオン濃度だけをヒトの結漿のそれにほぼ等しくした(Na^+142.0,K^+5.0,Ca2^<+2>.5,Mg^<2+>1.5,Cl^-147.8,HCO_3^-4.2,HPO_4^<2->1.0,SO_4^<2->0.5mM)、PH7.25,温度36.5°Cの水溶液に浸漬し、7日後それら基板のガラスと向い合った表面を、薄膜X線回折、フ-リエ変換赤外反射分光法及び走査電子顕微鏡観察により調べた。その結果、上記いずれの基板表面にも、厚さ約1μmの均質で連続した、格子欠陥が多いか結晶子の小さい炭酸イオン含有アパタイトの層が形成されていることが確められた。