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ＰＲＲ発現調節に着目した癌抑制遺伝子ｐ５３による抗ウイルス免疫制御の分子基盤

昨年度までの研究では,発癌ウイルスによる自然免疫抑制機構の解明を目的に,発癌ウイルスにより機能が抑制される癌抑制遺伝子p53およびRbによる自然免疫制御機構を解明した.また病原ウイルス潜伏感染における自然免疫制御機構の機能解析を目的に,エイズ原因ウイルスHIV-1に着目し,HIV-1潜伏感染においてCOMMD1/Murr1発現誘導によりTLRおよびサイトカインシグナル応答が顕著に抑制されることを明らかにし,潜伏感染における自然免疫機構の関与を示した.本年度は,これまでHIV抑制因子として知られていたCOMMD1のHIV-1潜伏感染における機能解明を目的とした.その結果,COMMD1はHIV-1潜伏感染を安定化することが示された.特に興味深いことに,COMMD1の発現を抑制すると,潜伏感染していたHIV-1が再活性化し,潜伏感染細胞から放出されることを明らかにした.さらに,詳細な細胞内シグナル解析より,HIV-1潜伏感染細胞ではJAK/PI3Kシグナルの活性化によりCOMMD1が転写誘導されることを示した.以上,本研究では宿主の抗ウイルス自然免疫応答を切り口に展開してきた.その成果として,癌抑制遺伝子p53およびRbによるPRRの発現および機能制御系を示した(Mol. Cell. Biol., 2012).また,エイズ治療の最適化を目的としたART副作用研究より,副作用誘導性を考慮した創薬研究の可能性を示した(Free Radic. Biol. Med., 2013).さらにHIV-1潜伏感染に焦点を当てた研究は,HIV抑制因子の1つであるCOMMD1のHIV-1初回感染および潜伏感染における長短二面性を明らかにすることで, HIV抑制因子の定義そのものを再検証する必要性を示唆した( J. Virol., 2015;熊本大学プレスリリース;熊本日々新聞).26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。癌抑制遺伝子p53は免疫系とくにウイルス感染防御において個体の生存を左右する重要な機能を担うことは明確である(Takaoka A et al.,Nature,2003;Munoz-Fontela C et al.,Oncogene,2005).しかしその詳細な分子機構は不明な点が多く、特にTLRに代表されるPRRの発現および機能に対するp53の役割は皆無であった。これまでの研究より、我々はp53新規標的遺伝子としてPRRの中よりTLR3を同定し、TLR3の発現および機能制御におけるp53の役割を明らかにしてきた(Taura M et al.,Mol Cell Biol).さらに最近の報告より、p53はTLR3のみならず全てのTLRの発現を正に制御することが報告された(Menendez D et al.,PLoS Genet,2011).そこで本研究では、これまでの研究計画に追加してp53以外の癌抑制遺伝子としてRbに着目してTLR3の発現および機能制御における影響を検討した。Rbもp53同様にウイルス感染防御における重要性は示唆されていたが、詳細な制御機構は全く不明なままであった(Garcia MA et al.,PLoS One,2009)。Rbおよびp53は、HCVやHPV、HHV8などの発癌ウイルスにより発現および機能が抑制されることから、ウイルス初回感染のみならず感染ウイルスの潜伏化に伴う発癌においても、これら癌抑制遺伝子の機能低下を介した自然免疫制御機構の破綻が十分に予想された(Polager S et al.,Nature Rev Cancer,2009)。本研究では始めに、TLR3の発現および機能が確認されているヒト大腸がん細胞株HCT116にsi-Rbを処理し、RbノックダウンによるTLR3発現量に対する影響を検討した。その結果、TLR3のmRNAおよびタンパク質発現量が低下することが示された。さらにRbノックアウトマウス線維芽細胞においても野生型に比較してTLR3の発現量が低下することが示された。そこでTLR3の機能に対する影響をTLR3の人工リガンドであるpoly I:Cを用いて検討した結果、RbノックダウンおよびノックアウトによりTLR3下流シグナル分子の活性化およびサイトカインの誘導が抑制されることが明らかになった。Rbは転写因子E2Fと結合し、E2Fによる標的遺伝子の転写調節を負に制御することから、TLR3の発現に対するE2F1の影響を検討した。その結果、E2F1は直接的にTLR3 proximal promoter領域に結合し、TLR3の発現を負に制御することが示された。さらに、RbはE2F1の機能を抑制することによりTLR3の転写を正に制御することが確認された。以前の報告よりTLR3の活性化はp53の発現量を抑制することから、Rbに対する影響を検討した。その結果、興味深いことにTLR3の活性化はp53の発現量を抑制する一方でRbの発現量を誘導し、その発現誘導によりE2F1によるTLR3発現抑制が解除され、TLR3の発現が誘導されることが示された(Taura M et al.,Mol Cell Biol,2012)。本年度は,病原ウイルスHIV-1に着目し, HIV-1潜伏感染における自然免疫機構の制御ならびにp53の寄与を検討した. HIV-1は, TLR7/8およびCtype Lectin receptorにより認識されることが最近明らかにされ,さらにこれらPRRの活性化がHIV-1の転写・増幅を促進することが示されている(Meier A et al, Nat Immunol, 2009),

しかし,このような抗HIV-1自然免疫機構が存在するにも関わらず, HIV-1の潜伏感染が成立する分子機構はこれまで全く明らかにされていない.そこで, HIV-1潜伏感染成立において, HIV-1転写活性化を誘導する抗HIV-1自然免疫応答が抑制されているのではないかという仮説を立て検討を行った.その結果, HIV-1潜伏感染によりTLRシグナル応答が顕著に抑制された.また,その分子機構として転写因子NF-κBの抑制因子IκB-αタンパク質がHIV-1潜伏感染により安定化されていることを発見した,さらに, IκB-αタンパク質安定化は,宿主HIV-1抑制因子として以前報告されたMurr1のHIV-1伏,における発上により亀されることを発した(Ganesh L et al, Nature, 2003).以上より, HIV-1潜伏感染においてMurr1発現誘導を介したIκB-αのタンパク質安定化により,抗HIV-1自然免疫応答が抑制されることが明らかになった(Taura M et al,投稿準備中).さらに, HIV-1抑制因子の発現量を網羅的に比較検討した結果,癌抑制遺伝子p53の著明な標的遺伝子として知られるp21の発現量が, HIV-1潜伏感染に伴い上昇することを見いだしており,現在, HIV-1潜伏感染によるp21発現誘導のHIV-1潜伏感染への寄与を検討中である.また本年度は, AIDS治療の最適化を目的に,新たに研究課題を立ち上げ推進した.AIDS標準治療法cARTのkeydrugの1つであるHIV-1プロテアーゼ阻害剤(PI)は,小胞体ストレスを誘導することにより副作用を引き起こすことが示唆されている,そこで本研究では、FDAにより認可されている9種のPIを用い小胞体ストレス誘導性の比較を行い, Loinavirは性種(ROS)子的に細胞内シグナル分子JNKを活性化することによって,最も強力に小胞体ストレスおよび細胞障害を誘導することを明らかたした(Taura M et al, Free Radic Biol Med, 2013).昨年度までの研究では,発癌ウイルスによる自然免疫抑制機構の解明を目的に,発癌ウイルスにより機能が抑制される癌抑制遺伝子p53およびRbによる自然免疫制御機構を解明した.また病原ウイルス潜伏感染における自然免疫制御機構の機能解析を目的に,エイズ原因ウイルスHIV-1に着目し,HIV-1潜伏感染においてCOMMD1/Murr1発現誘導によりTLRおよびサイトカインシグナル応答が顕著に抑制されることを明らかにし,潜伏感染における自然免疫機構の関与を示した.本年度は,これまでHIV抑制因子として知られていたCOMMD1のHIV-1潜伏感染における機能解明を目的とした.その結果,COMMD1はHIV-1潜伏感染を安定化することが示された.特に興味深いことに,COMMD1の発現を抑制すると,潜伏感染していたHIV-1が再活性化し,潜伏感染細胞から放出されることを明らかにした.さらに,詳細な細胞内シグナル解析より,HIV-1潜伏感染細胞ではJAK/PI3Kシグナルの活性化によりCOMMD1が転写誘導されることを示した.以上,本研究では宿主の抗ウイルス自然免疫応答を切り口に展開してきた.その成果として,癌抑制遺伝子p53およびRbによるPRRの発現および機能制御系を示した(Mol. Cell. Biol., 2012).
運転支援システムの導入による行動変化の心的メカニズムの解明：視覚的注意の観点から

運転支援システムの導入により、道路利用者の行動や情報処理能力にどのような影響が及ぶかを検証する。特に、主体的なリスク回避行動の減少が認められるかどうかを検証する。ドライビング・シミュレータを用いて、仮想的な交通環境内で実験参加者に運転を行っていただく。交通環境内に運転支援システムを搭載した車両が存在する場合とそうでない場合で、実験参加者の運転パフォーマンスや運転中の情報処理能力を比較し、機序の解明を目指す。
炎症反応に呼応する神経外環境因子によるアミロイドβタンパク代謝制御機構の解明

アルツハイマー病(AD)は、進行性の認知機能障害を呈する神経変性疾患であり、高齢化社会が進んでいる現在、その根本的な治療法・予防法の確立が急務となっている。遺伝学、臨床病理学などの解析結果から、AD患者脳の病理学的特徴である老人斑の主要構成成分であるアミロイドβタンパク(Aβ)の産生および蓄積が、ADの発症に深く関係しているという、「アミロイド仮説」が強く支持されている。近年、急速に進んだゲノムワイド関連解析から、脂質代謝経路や神経炎症反応経路がAD発症に大きく寄与していることが明らかとなってきた。本研究においては、アストロサイトが関係する脳内炎症反応と脳内アミロイド代謝システム、という観点で研究を遂行し、これまでにアストロサイトが分泌する新規Aβ分解酵素KLK7を同定し、その解析を進めてきた。KLK7は組織カリクレインファミリーに属する、キモトリプシン型セリンプロテアーゼであり、末梢では皮膚などの炎症反応に関与することが知られているが、中枢神経系での生理的・病的機能は不明であった。そこでKLK7ノックアウトマウスを作出し、脳内Aβ濃度を測定したところ、ノックアウトマウスでは1.4-1.8倍の上昇が認められた。またKLK7ノックアウトマウス由来の初代培養細胞を用いた解析から、KLK7陽性の顆粒様構造はアストロサイトにおいてのみ観察されることが確認された。次に本マウスとADモデルマウスと交配させ検討したところ、ヒトAβ量が1.6-2倍上昇し、GFAP陽性の活性化アストロサイトが集積したチオフラビンS陽性アミロイド斑の沈着が三ヶ月齢で認められた。これらの結果から、KLK7はアミロイド蓄積病態に影響しうる新規Aβ分解酵素であることが確認された。27年度が最終年度であるため、記入しない。高齢化社会を迎え、アルツハイマー病(AD)は大きな社会問題となっている。これまでに申請者は、AD発症に関わるAβの代謝機構について研究を進めてきた。その過程で細胞外Aβ量が炎症性メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸(S1P)により変化すること、また初代培養神経細胞培養系と神経・グリア共培養系とでAβ量の変動が異なることを見出していた。そこでこれまでに本研究領域の公募班員としてこれらの分子機構について解析を行い、アストロサイトーマ培養上清に新規Aβ分解活性を示す、亜鉛感受性のキモトリプシン型セリンプロテアーゼが含まれていることを見出した。そこで各種阻害剤やノックダウン、過剰発現系などを用いて、その責任酵素として、組織型カリクレインファミリー分子の一つであるKLK7を同定した。これまでにKLK7の発現は皮膚に多く知られているが、脳における発現やその機能については全く不明である。そこで初代培養系を用いて発現および機能解析を行い、マウスやラット初代培養アストロサイトにKLK7が分泌顆粒様に多く発現していること、Aβ処理によってそのmRNA発現が上昇することを見出した。一方、LPS刺激ではKLK7発現量に変化はなく、特異的な炎症反応に呼応してKLK7の発現が変動している可能性が示された。そしてKLK7ノックアウトマウスを入手し、脳において内因性の可溶Aβ量が有意に上昇していることを見出した。これらの結果から、in vivoにおいてKLK7が脳内Aβ量を規定するアストロサイト由来の酵素であることを示した。これまで脳における機能が未知であったKLK7をアストロサイト由来新規Aβ分解酵素として同定し、実際にノックアウトマウスを用いて生体内での機能を明らかに出来た。極めて順調に研究が進展していると言える。KLK7ノックアウトマウスとADモデルマウスを交配し、アミロイド蓄積病理への影響を検討する。

またアストロサイトへ各種薬物刺激を行い、KLK7発現上昇による新規治療薬開発の可能性を検討する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
前癌病変のクローン性解析:ホルマリン固定病理標本からの長鎖遺伝子抽出法の検討

悪性腫瘍において同一腫瘍中に複数の組織成分が混在していることは決して稀な現象ではない。そして、組織成分相互間クローナリティの解明は腫瘍発生学における中心命題である。特に、肺癌では稀ではあるが小細胞癌及び非小細胞癌(扁平上皮癌或いは腺癌)が混在し、前記組織型は複合型小細胞癌と命名されている。しかし、複合型小細胞癌の組織成分相互間クローナリティに関する研究は乏しく、遺伝子学的知見の集積が現在必要とされている。故に、複合型肺小細胞癌症例6例を対象とし、それらの各々の組織成分から得られた遺伝子検体を用いて研究を行った。方法としては複合型肺小細胞癌6症例各々の組織成分から得られたDNAを使用し、癌抑制遺伝子p53の点突然変異及び第3染色体短腕の異種接合性欠失の検索を行った。検索部位は癌抑制遺伝子p53ではexon5からexon8まで、第3染色体短腕では3p14.2、3p14.3、3p21、3p21.2-21.3、3p21.3、3p22-24、3p25とした。複合型肺小細胞癌6症例すべてにおいて腺癌成分が存在し、うち3例においては扁平上皮癌成分も存在していた。5例の小細胞癌成分においては癌抑制遺伝子p53の点突然変異が認められ、5例中扁平上皮癌成分1例及び腺癌成分1例においても癌抑制遺伝子p53の点突然変異が認められた。同一症例間で扁平上皮癌成分は小細胞癌成分と同一部位に変異を認めたが、腺癌成分では小細胞癌成分と異なる部位に変異が存在した。また、第3染色体短腕の異種接合性欠失検索では扁平上皮癌成分3例全例の異種接合性欠失部位は同一症例の小細胞癌成分の異種接合性欠失部位に包含されていた。しかし、腺癌成分においては異種接合性欠失の存在した4例中3例は同一症例の小細包癌成分と比較して異なる部位の異種接合性欠失が認められた。以上により、複合型肺小細胞癌においては小細胞癌成分と扁平上皮癌成分ではクローン性の関連が認められたが、小細胞癌成分と腺癌成分とはクローン性の関連は乏しかった。当研究結果は複合型肺小細胞癌の腺癌成分は小細胞癌・扁平上皮癌成分とは腫瘍発生早期において異なった増殖経路を経ている可能性或いは両者の衝突の可能性を示唆している。
時間・空間分解分光法を用いた酸化チタン光触媒反応の構造特異性の解明

光エネルギーを有効利用した化学反応プロセスの開発は、昨今の環境・エネルギー問題とも関連する極めて重要な研究課題の一つである。これに関連して、TiO2ナノ粒子に代表される金属酸化物半導体ナノ材料は、環境浄化型光触媒や色素増感太陽電池など実用化レベルの研究が行われている。最近、球状のナノサイズの一次元構造体、二次元構造体、三次元構造体などの合成法が見出され、特徴的な光学的・電気的特性が見出されている。しかしながら、それらの特性、特に光触媒反応性の本質的要因についてはほとんど明らかになっていない。そこで、本研究では、反応選択性を有する蛍光プローブからの蛍光やTiO2からの欠陥発光を単一分子および単一粒子レベルで直接観測することで、TiO2などの金属酸化物半導体のナノ・マイクロ構造体における反応活性部位の空間分布と反応性や活性酸素種および有機分子の細孔内拡散過程を調べる。また、可視光領域に強い表面プラズモン共鳴を示す貴金属ナノ構造体の光応答性ナノ材料における、可視光誘起電荷分離、電荷移動、酸化還元などについて解明する。今年度は、可視光領域に強い表面プラズモン共鳴を示す金のナノ棒構造体に白金を付着させたナノ構造体について、可視および近赤外光照射による電荷分離、電荷移動、光触媒的水素ガス生成について明らかにした。白金を金ナノ棒の両端にのみ付着させると、全体に付着するより触媒活性が向上した。一粒子発光分光と透過型電子顕微鏡観察により、金の発光が白金により消光されることから、励起状態の金から白金への電子移動が起こった。次に、パラジウムを付着した金ナノ棒では、プラズモン共鳴触媒的蟻酸の脱水素化反応が、5°Cという低温でも起こった。これら貴金属ナノ粒子複合体の吸収、発光挙動については、単一ナノ棒の発光測定実験と計算機化学の手法から、金ナノ棒の縦方向プラズモンが効率よく消光されることを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。これに関連して、酸化チタン(TiO_2)ナノ粒子に代表される金属酸化物半導体ナノ材料は、環境浄化型光触媒や色素増感太陽電池などへの実用化レベルの研究が行われている。最近、球状のナノ粒子のみならず、ナノチューブなどの一次元構造体、ナノシートなどの二次元構造体、さらには、ナノ粒子が三次元的に配列したメソ結晶などの合成法が見出され、特徴的な光学的・電気的特性が見出されている。そこで、本研究では、反応選択性を有する蛍光プローブからの蛍光やTiO_2からの欠陥発光を単一分子および単一粒子レベルで直接観測することで、TiO_2などの金属酸化物半導体のナノ・マイクロ構造体における反応活性サイトの空間分布と反応性や活性酸素種および有機分子の細孔内拡散過程についての知見を得る。また、特定の結晶軸方向を成長させたTiO_2ナノ結晶やナノ粒子が三次元的に配列したメソ結晶や、可視光領域に強い表面プラズモン共鳴を示す貴金属ナノ構造体の光応答性ナノ材料における、可視光応答性、電荷分離、電荷移動、酸化還元反応などについて解明する。今年度は、金属酸化物ナノ材料の分散溶液に光を照射することによって生成する電子やホールを、蛍光ブローブを用いて単一分子レベルで検出し、分子拡散における細孔サイズの影響、反応活性サイトの空間分布などについて調べた。また、可視光領域に強い表面プラズモン共鳴を示す金のナノ棒構造体に白金を付着させたナノ構造体について、可視光照射による電荷分離、電荷移動、光触媒反応性について明らかにした。

これら貴金属ナノ粒子複合体の吸収、発光挙動については、単一ナノ棒の発光測定実験と計算機化学の手法から、金ナノ棒の縦方向プラズモンが効率よく消光されることを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画通りに酸化チタン光触媒反応の構造特異性に関する研究が進展している。加えて、金ナノ粒子の可視光応答光触媒反応について、単一粒子、単一分子観測に成功し、新たな知見を得ることができた。当初の研究計画に従って研究を遂行し、着実に研究成果を得て、学術雑誌に論文として発表する予定である。
血液房水柵破綻に対するα_2agonistの作用機序におけるカリウムチャネルの役割

血液房水柵破綻に対するアルファ2アゴニストの作用機序におけるカリウムチャンネルの役割についての研究を現在進めている。この過程で、アルファ2アゴニスト様作用を持ち、且つカリウムチャンネル遮断作用を持つ生薬由来成分であるtetramethylpyrazineに注目した。そこで今回、科学研究費を用いて、家兎眼において、prostaglandin(PG)E2及びEPアゴニストの経角膜投与により惹起されるaqueous flare及び眼圧の上昇に対するtetramethylpyrazineの抑制効果について調べた。Aqueous flareは、レーザーフレアーセルメーターで測定した。眼圧はノンコンタクトトノメーターで測定した。Aqueous flareの強さは前房フレアー値の時間曲線下面積(AUC)で算定した。結果:PGE2で惹起されたaqueous flare及び眼圧の上昇は、tetramethylpyrazineの静脈内投与(10mg/kg,30mg/kg)と0.1%点眼により有意に抑制された。EPアゴニスト(11-deoxy PGE1,17-phenyl trinor PGE2,sulprostone)の経角膜投与では、EP2アゴニストである11-deoxy PGE1によりaqueous flareの上昇がみられた。11-deoxy PGE1によるaqueous flareの上昇に対しても、tetramethylpyrazineの静脈内投与(10mg/kg,30mg/kg)により有意に抑制された。結論:PGE2及びEP2アゴニストである11-deoxy PGE1の経角膜投与で惹起される血液房水柵破綻に対してtetramethylpyrazineが抑制効果をもつことがわかった。Tetramethylpyrazineの眼炎症に対する有用性が示唆された。
透明な銅の抗菌フィルムの開発による新たな感染対策への応用

院内感染は医療現場で大きな問題となっている。私たちは、銅に強い抗菌作用があることに着目し、医療現場に応用することを考えてきた。院内感染の原因である医療機器を銅でコーティングすれば抗菌効果は得られるが、問題なのは銅には透明性がなく、医療機器の操作性を損ねることである。そこで私たちは、透明で薄い銅の抗菌フィルム(銅の抗菌フィルム)の開発を目指し、産学共同研究により、最近、世界で初めて開発に成功した。本研究では、この銅の抗菌フィルムを用いて、医療機器および医療環境の表面をコーティングすることにより、院内感染の予防効果、医療スタッフへの安全性、業務の効率を調べる。
大腸菌エンベロープ形成機構の解明

グラム陰性細菌は共通して生育に必須の外膜構造をもつ。代表的なグラム陰性細菌である大腸菌では、外膜の形成にリポ蛋白質が極めて重要なはたらきをしていると考えられる。大部分のリポ蛋白質は外膜に局在しているが、これは選別シグナルと、5種類のLol因子による輸送系で行われている。本研究は、リポ蛋白質の輸送機構を中心に、外膜を含むエンベロープの形成機構を解析したものである。大腸菌をはじめとするグラム陰性細菌の外膜には、リポ多糖、リン脂質、少数の膜貫通型βバレル型蛋白質、多数の膜アンカー型リポ蛋白質が存在している。これら4種類の外膜構成因子が、外膜に運ばれる機構は不明である。申請者らは、リポ蛋白質を外膜に運ぶ蛋白質ネットワーク"Lolシステム"の全体像を世界に先駆けて明らかにした。また大腸菌には少なくとも90種のリポ蛋白質が存在することを明らかにした。さらに、Lolシステムの阻害や、特定のリポ蛋白質遺伝子の破壊が、外膜形成を阻害する事を見いだした。外膜構成因子の輸送に中心的な役割を担っている因子は、表層構造に多数存在するリポ蛋白質の中にあり、エンベロープ形成のネットワークとなっている事を示している。本研究は、リポ蛋白質輸送機構の研究成果を一層発展させ、外膜形成機構の全容解明を目的とする。大腸菌のエンベロープを構成する因子の中で、リポ蛋白質の選別と外膜への輸送機構が最も詳しく明らかにされている。しかし、リポ蛋白質輸送因子LolAに特徴的なC末端領域の役割は明らかでなかった。LolAとLolBは全体構造が大変よく似ているがLolAにはLolBに無いC末端ループが存在する。このループの機能を欠失LolA変異体の作製により調べ、リポ蛋白質が内膜から遊離した後、再び内膜に戻ることを防ぐ機能があることを明らかにした。LolBは外膜に結合した因子であるが、LolAはペリプラズムに存在する可溶性の因子である。非特異的に膜にリポ蛋白質を組み込む機能がLolAに無いのは、C末端領域の作用であることが明らかになった。これまでに、LolAの疎水性キャビティーはリポ蛋白質の結合と解離により、開閉することを見いだしていたが、この実験系をさらに改良するとともに、変異体を用いてこれを証明した。疎水性キャビティーが開かないようにジスルフィド結合を導入したLolAは、大腸菌に致死的作用を与えることを見いだした。また、これらの成果を光架橋による因子間相互作用部位の解析に適用し、Lol因子間を効率よくリポ蛋白質が受け渡される機構について明らかにし、"口移し"モデルを提唱した。これは、LolAとLolBの疎水性キャビティーに存在する入り口部分を互いに結合させることにより、リポ蛋白質が、LolAからLolBへ一方向的に速やかに受け渡されるというものである。外膜を構成する要素の内、リポ多糖(LPS)を外膜に輸送する因子は遺伝学的に示されているのみである。内膜で働くとされているABCトランスポーターLptBFGは、サブユニットの遺伝子がオペロンを形成していないことが、他のABCトランスポーターと比べ際だった特徴であり、実際に複合体を形成するかどうか疑問であった。また、LptCは内膜を一回貫通する因子であるがその役割についてはまったく不明である。そこで、LptBFGをコードする遺伝子をクローニングし、大量発現させて膜から精製を試みた。その結果、LptBFGは、B:F:G=2:1:1の比率で構成されたABCトランスポーター複合体であることが明らかとなった。さらに、LptCも同時に大量発現すると、LptBFGと共に精製された。LPSを輸送する内膜装置は、LptBFGC複合体であることを強く示唆する結果である。一方、LptCの有無にかかわらずLptBFG複合体のATPase活性に変化は無かった。内膜装置の実態が明らかになったことから、どのような機構でLPSを内膜から遊離させるかが今後の課題である。内膜を構成する蛋白質が膜に挿入する機構は不明な部分が多い。既にジアシルグリセロールが非特異的な膜挿入を防ぐことを明らかにしている。さらに、特異的膜挿入には新規複合脂質が関与していることを明らかにし、その構造解明を進め大部分を明らかにした。また、SecGを対象とし、in vitroで膜内に挿入しその機能を検出する実験系を確立した。エンベロープの形成阻害が原因となって、一連の遺伝子発現を誘導するストレス応答システムが知られている。リポ蛋白質は、リポ多糖の外膜輸送やβバレル型蛋白質の外膜挿入など、エンベロープ形成に中心的で多面的な役割をしている。しかしこれまで、リポ蛋白質を外膜に輸送するLolシステムの阻害によってストレス応答系が活性化されることは見いだされていなかった。

これまでの研究によって、LolAとLolBの疎水性キャビティーは、リボ蛋白質の結合と遊離によって開閉すること、LolAに2個のCysを導入し、酸化によってジスルフィド結合を形成させ、キャビティーが開くのを人工的に阻害すると生育が強く抑えられることを見いだしていた。この時、ストレス応答機構の一つであるCpxAとCpxRからなる二成分ストレス応答機構が強く活性化されることを明らかにした。生育の阻害とCpx系の活性化は、内膜のABCトランスポーターLolCDEを大量に発現すると部分的に解除された。この時ジスルフィド結合を形成したLolAは本来存在するペリプラズムではなく、内膜画分に局在した。リポ蛋白質輸送の阻害によって、ストレス応答機構を活性化する実験系の構築を確立した。さらにキャビティーが閉じたLolAは、LolCDEと強く相互作用することが明らかになった。リポ蛋白質輸送からエンベロープの形成機構を探る上で、今後の新たな方向が開ける成果であると考える。MPIaseは蛋白質膜挿入反応や膜透過反応に必須の糖脂質である。MPIaseの構造をNMR分析、MS分析を明らかにし、構造機能相関を解析した。その結果膜蛋白質との相互作用にはアセチル基が重要であることが明らかになった。これまでに、LolAとLolBの疎水性キャビティーは、リポ蛋白質の結合と遊離によって開閉すること、LolAに2個のCysを導入し、酸化によってジスルフィド結合を形成させ、キャビティーが開くのを人工的に阻害すると大腸菌の生育が強く抑えられることを見いだしていた。前年度の研究で、このLolA変異株を発現すると、ストレス応答機構の一つであるCpxAとCpxRからなる二成分ストレス応答機構が強く活性化されることを見いだしていたが、染色体上にコードされたLolA自身の発現量も増加していた。この機構を調べ、別のストレス応答機構であるRcs系によることを明らかにした。さらにRcs系とLolA発現の関係を詳細に調べ、Rcs系の構成要素の一つである外膜リポ蛋白質RcsFはリポ蛋白質輸送が正常に作動しているかどうかをモニターする因子であることを明らかにした。リポ蛋白質の脂質修飾を触媒する酵素Lntはこれまで生育に必須と考えられていたが、主要外膜リポ蛋白質を欠損させ、LolCDEを過剰発現した大腸菌では遺伝子破壊できることを見いだした。Lntを欠損した大腸菌のリポ蛋白質は、トリアシルではなく、ジアシル基がシステインに結合していること、このようなリポ蛋白質の外膜輸送は効率が悪いことを示した。これらの結果は、Lnt欠損株が生育するためには、LolCDEの過剰発現が必要になる事を示している。細胞質膜をSecトランスロコンによって蛋白質が輸送されるときの1サイクル反応を詳細に解析し、SecGの構造変化とSecAの機能の関連を明らかにした。LolAの発現上昇は、エンベロープ形成に必須であるリポ蛋白質の外膜輸送をモニターするシステムによるものであった。これはエンベロープ形成の根幹に関わる重要な発見であると考える。本研究課題は今年度が最終年度であるが、最近見いだしたリポ蛋白質輸送をモニターするシステムの分子機構は継続して追求していくべきだと考える。特に外膜リポ蛋白質RcsFのモニター機能は重要である。どの様にして輸送の異常を感知するのかは大変興味ある課題である。これ迄に構造異常を感知するシステムはよく研究されているが、位置(局在場所)の異常を感知するシステムは例が極めて少ない。
「公共の秩序に対する犯罪行為」の比較法的検討

本研究は、基課題である「「社会の平穏を害する罪」の現代的再構築」(基盤C、課題番号16K03368)に基づいて、ドイツやオーストリアにおいて見られる「社会の平穏を害する罪」を、現代社会にふさわしい形で再構成し、日本での新たな立法提言の足掛かりとするために、とりわけドイツの刑法典各則第7章の「公共の秩序に対する犯罪行為」の章における犯罪類型について、ドイツにおいて在外研究を行い、集中的に文献・資料収集を行いつつ、共同研究者であるドイツの大学教授との議論・検討を行うものである。平成30年度は、平成31年度に行われる予定のドイツでの在外研究のための準備として、9月にドイツに渡航して、在外研究の受け入れ先教員であるクリスチャン・イェーガー教授(エアランゲン=ニュルンベルク大学)と在外研究のための打ち合わせを行った。これに基づいて、平成31年度に1年間ドイツで在外研究を行い、当該各犯罪類型の規定に関して研究を進めるための環境を整えることができたといえる。また、本研究を始めるきっかけとなった、日本における「業務妨害罪」の運用状況に関して、とりわけ虚偽犯罪予告行為に関して警察に対する業務妨害罪を認める際の問題点を再確認する論文を執筆した(野澤充「虚偽犯罪予告行為と業務妨害罪・再論」法政研究85巻3・4合併号285頁以下)。日本の業務妨害罪自体の分析・検討としてはまだ十分なものではないが、当該犯罪類型の、現時点での最も大きな問題点を明確化することができたものと考えている。本研究は、基課題を達成する目的で、比較対象となるドイツの各則規定の犯罪類型を分析・検討するために在外研究によって集中的に文献・資料収集を行いつつ、共同研究者であるドイツの大学教授との議論・検討を行うことをその内容としており、平成30年度はその在外研究のための準備段階としての年度にあたる。諸事情で書類手続が遅れるなどしたが、課題研究そのものに関しては、在外研究のための打ち合わせを在外研究受け入れ先の教授と行うことができており、また当該研究のきっかけとなった業務妨害罪に関する論考(野澤充「虚偽犯罪予告行為と業務妨害罪・再論」法政研究85巻3・4合併号285頁以下)も公表できており、予定されていたとおりの内容を進めることができている状況にある。平成31年度は、いよいよ本研究のメインとなる在外研究を行う年度であり、比較法の対象となるドイツの刑法典各則第7章の「公共の秩序に対する犯罪行為」の章における各犯罪類型について集中的に資料収集を行い、分析・検討して、在外研究受け入れ先教員であるイェーガー教授と議論・検討を行う段階に入る。その際には、1基課題との関連から、各犯罪類型の分析に際して「歴史的観点」からの検討を行う必要があるものと考える。「なぜそのような犯罪類型が現在のような形で作られたのか」ということが、当該規定の存在意義として重要であると考えるからである。さらに2本研究が「刑法各則に関する比較法研究」の足掛かりとなるものであるという観点からは、各則の各規定がどのような行為態様を、どのような趣旨で処罰しようとしているのかに関して、日本とドイツの差異を浮き彫りにして比較対照する、という比較法の方法論に関する基礎研究としての意義も前提にすべきものであると考える。内定年度:2017本研究は、基課題である「「社会の平穏を害する罪」の現代的再構築」(基盤C、課題番号16K03368)に基づいて、ドイツやオーストリアにおいて見られる「社会の平穏を害する罪」を、現代社会にふさわしい形で再構成し、日本での新たな立法提言の足掛かりとするために、とりわけドイツの刑法典各則第7章の「公共の秩序に対する犯罪行為」の章における犯罪類型について、ドイツにおいて在外研究を行い、集中的に文献・資料収集を行いつつ、共同研究者であるドイツの大学教授との議論・検討を行うものである。

平成31年度は、いよいよ本研究のメインとなる在外研究を行う年度であり、比較法の対象となるドイツの刑法典各則第7章の「公共の秩序に対する犯罪行為」の章における各犯罪類型について集中的に資料収集を行い、分析・検討して、在外研究受け入れ先教員であるイェーガー教授と議論・検討を行う段階に入る。その際には、1基課題との関連から、各犯罪類型の分析に際して「歴史的観点」からの検討を行う必要があるものと考える。「なぜそのような犯罪類型が現在のような形で作られたのか」ということが、当該規定の存在意義として重要であると考えるからである。さらに2本研究が「刑法各則に関する比較法研究」の足掛かりとなるものであるという観点からは、各則の各規定がどのような行為態様を、どのような趣旨で処罰しようとしているのかに関して、日本とドイツの差異を浮き彫りにして比較対照する、という比較法の方法論に関する基礎研究としての意義も前提にすべきものであると考える。
光反応を用いた核燃料再処理に関する研究

本研究は使用済核燃料再処理に光化学反応を利用した最初の試みである。再処理において、最も重要なことはアクチノイドイオン、特にプルトニウムとネプツニウム、の原子価を調整することにある。それは、現行の再処理法であるPurex法において、TBP(リン酸トリブチル)による抽出を行うさい、PuとNpはそれらの原子価により著しく抽出率が異なり、それら元素を回収あるいは相互分離するさい、原子価を調整する必要があるからである。本研究では光反応を利用してPuとNpの原子価調整を試みた。その結果、Pu(IV)とNp(V)イオンを含む硝酸溶液中に高圧水銀ランプによる光照射を行うと、PuとNpはいずれも6価イオンまで酸化され、TBPにより共抽出されることが分かった。一方、抽出された有機相に光照射すると、Pu(VI)は全く還元されないが、Np(VI)は5価に還元され水相に逆抽出され、PuとNpを分離することができた。以上の結果、光反応を用いると、再処理溶液中に新たな添加物を加えることなく、PuとNpの原子価を調整することが可能であり、それによりPuとNpの回収と分離を効率良く行なえると結論された。本年度は、光反応を利用して、プルトニウムとネプツニウムを含む溶液からネプツニウムを分離するための研究を行った。使用済核燃料の溶解液をTBP(リン酸トリブチル)を用いて抽出すると、有機相にウランとプルトニウムが移行するが、有機相には、さらにネプツニウムも数10%移行する。このネプツニウムは、プルトニウムを有機相から水相に逆抽出する際に、水相(硝酸溶液)にプルトニウムと混在する。本年度は、プルトニウムとネプツニウムを含む硝酸水溶液から、それらを分離する実験を行った。方法は、最初に、ヒドラジンを用いて溶液を還元雰囲気にする。この状態では、プルトニウムはPu(III),ネプツニウムはNp(V)として存在する。次に、溶液にある一定量の光(高圧水銀ランプ)を照射すると、Pu(III)はPu(IV)に速やかに酸化化され、Np(V)はそのままの原子価を保つ。同じ条件で、光照射を行わない場合においても、長時間の加熱により、Pu(III)はPu(IV)さらにPu(VI)に酸化され、Np(V)もNp(VI)に酸化される。すなわち、Pu(IV)とNp(V)の原子価調整は暗反応では極めて困難であるが、光反応を用いると、原子価調整は敏速かつ効果的(ほとんど100%)であることが分かった。この原子価では、Np(V)はTBPに抽出されないが、Pu(IV)はTBPに抽出されるため、効率よい分離が可能である。本年度は、光反応を利用して、プルトニウムとネプツニウムの分離を共抽出を同時に行う方法を開発する研究を行った。プルトニウムとネプツニウムの分離は、前年度報告したように、Np(V)とPu(III)を含む硝酸水溶液において、Pu(III)だけをPu(IV,VI)に光酸化し、TBP(リン酸トリブチル)を用いて選択的に抽出することにより可能である。それは、Np(V)がTBPによって抽出されないからである。NpとPuの共抽出は、水溶液中での光強度を増すことにより、Np(V)とPu(III)を共に6価に光酸化することに可能であることが分かった。これらの6価イオンのTBPによる抽出率は非常に高い。興味深いことには、光照射と抽出を同時に行うとNpは酸化されることなく5価で存在する。その機構については現在検討中であるが、恐らく一度硝酸により光酸化されたNp(VI)が有機物の存在下では5価に光還元されたものと思われる。いずれにしても、同じ光照射装置を用いて、水溶液中で光照射してからTBP抽出を行うとPuとNpが共抽出され、光照射と抽出を同時に行うとPuだけが抽出される。

これによりシステムは著しく簡略化され、光化学法を実用化へと前進させることができた。近く、実証試験を行う予定である。また、この方法はウランを含む最初の分離工程にも応用することが可能である。本研究は核燃料再処理に光化学反応を利用する目的で始められた。具体的には、ウラン(U)、プルトニウム(Pu),ネプツニウム(Np)の原子価調整に光化学反応を利用し、これらを目的に応じて、分離あるいは共抽出するための研究を行った。例えば、PuとNpを分離するためには、Pu(III)とNp(V)を含む硝酸水溶液中において水銀ランプにより光照射すると、Puだけが選択的にPu(IV)に光酸化され、リン酸トリブチル(TBP)により抽出されることが分かった。また、PuとNpの硝酸溶液を強い光で照射すると、最終的にはこれらは6価イオンにまで酸化され、共にTBPにより有機相に抽出される。しかし、このPuとNpを抽出した有機相に光照射すると、Npだけが選択的に5価に還元され、水中に逆抽出されることを明らかにすることができた。これらの光反応はUと核分裂生成物を含む溶液にも適用できるため、実際の再処理工程にも利用することができると結論された。さらに、アメリシウムとキュウリウムを核分裂生成物中のランタノイド元素から分離するたにも極めて有力であることが分かった。本研究では、アメリシウムとキュウリウムの模擬物質として化学的性質の似たNdを用いて実験を行った。その結果、大環状配位子に配位したNdは、光照射により選択的に錯体から脱離して分離できることが明らかになった。
DNAマイクロディスク:円形チップで遺伝子発現計測システムを革新する

DNAマイクロアレイは遺伝子発現解析の基本的計測装置として広く利用されているが、測定の手間や結果の信頼性、あるいは機器の大きさや価格など、臨床的に常用する検査機器とするために解決が必要な問題点が多い。そこで本研究では、従来の矩形スライドガラスのかわりに、円盤状の「DNAマイクロディスク」を用いることによって、スポッティング、ハイブリタイゼーションから蛍光観測に至るすべての過程を高速化し、信頼性が高くかつ安価な一貫計測システムの実現を目指した。本年度は、プロトタイプの組み合わせ実験・評価と一貫システムの設計を行った。1)プロトタイプシステムの実用可能性検証実験:前年度に作製したプロトタイプシステムを使って大腸菌ゲノムの検出実験を行い、DNAマイクロディスク実用化の可能性を検証する実験をおこなった。大腸菌ゲノム検出用のDNAマイクロディスクを試作するためにスポッター装置を用いて、ディスクを回転させながらスポッティングを行った。大腸菌ゲノム中のリボゾーマルRNAの検出を試みた。2)プロトタイプシステムの改良:プロトタイプシステムの検証実験結果に基づいて問題点を洗い出し、設計の改良を行った。またゲノム検出用DNAを光化学反応による合成法についても検討し、基板上で検出領域の分子を合成する方法について考案した。検出領域の分子としてPNAを用いることでDNAよりもハイブリダイゼーション時の分子選択性を高くできることが報告されており、DNAマイクロディスクでの検出を高感度化するのに有用であると考えられる。有機合成化学を専門とする共同研究者のチームと共同で本開発を行っており、合成経路を探索して現在合成実験中である。3)商品化、規格化の検討:プロトタイプ装置と改良版装置を検討し、アプリケーション調査の結果を踏まえて、商品化と規格化の可能性について検討した。DNAマイクロアレーは遺伝子発現解析の基本的計測装置として広く利用されているが、測定の手間や結果の信頼性、あるいは機器の大きさや価格など、臨床的に常用する検査機器とするために解決が必要な問題点が多い。この研究では、従来の矩形スライドガラスのかわりに、円盤状の「DNAマイクロディスク」を用いることによって、スポッティング、ハイブリタイゼーションから蛍光観測に至るすべての過程を、高速、安定かつ安価にできる可能性のある一貫システムを提案することを目的とする。平成16年度は、個別要素の検討と予備的な実験を実施した。ディスクの仕様に関しては、最終的なDNAマイクロディスクとして直径2インチの基板に幅5ミクロンのプリグルーブを設け長さ20ミクロンのスポットを80万個程度配置するものを想定したが、予備的には矩形ガラス基板上に20-50ミクロン間隔で直線状の溝を切ったものを作製して実験に用いた。スポッター方式、すなわち、ディスク上にDNA断片のプローブを貼り付ける手段として、インクジェット、金属針、ガラスマイクロピペットなどを比較検討した。結局、予備実験にはマイクロピペット型のスポティング装置を試作して、上述の溝を切ったガラス基板上に直径20ミクロンのスポットを作製できることを確認した。読み取り装置については、ディスク上の蛍光スポットを検出追尾し、30秒以下で全データを読みとるための光学系とサーボ機構を想定し、CDドライブの技術を適用して概念設計まで実施した。手間と時間の点で全体の律速要素となるハイブリタイゼーションの高速化については、フローセルの実験系を組み、ターゲットの濃度や流量を変化させて、最適なハイブリタイズ反応を実現するパラメータを実験的に検討した。なお、全体を組み合わせた予備実験は次年度の課題である。
一次元量子系における素励起の統計性の理論的研究

本研究では長距離型の相互作用を持つt-J模型に対して熱力学の厳密かつ解析的な定式化を行った。その結果、スピノンとホロンという2種類の素励起がエネルギー的に自由な素励起として存在する事、エントロピーを介して互いに統計相互作用する事がわかった。この2つの性質は多くの一次元強相関系において近似的に満たされている性質であるので普遍的なものである。各系の個性は素励起の種類とその統計相互作用の具体形に現れる。「統計相互作用」は有限温度において有用な概念であるので、有限周波数領域の動力学的性質にも反映すると期待できる。そのような背景のもとでSutherland模型といわれる一次元金属のモデルの動力学を調べた。その結果、内部対称性を持つSutherland模型のグリーン関数の解析的な表式を得た。これは格子モデルを除く強相関電子系において初めて得られた厳密な結果である。その研究によって、スペクトラルウェイトは素励起の状態密度と素励起間の統計相互作用によって決まることがわかった。この結果はHaldane-Shastry模型やハイゼンベルグ模型、一成分Sutherland模型の動力学にも適用できる強力なものである事が分かった。その知見を踏まえて動的密度相関関数、スピン相関関数についても解析的な表式を得た。現在はその結果に対して数学的な証明を試みている。なお研究として完結したグリーン関数の結果については11月に論文投稿済みである。本研究プログラムではそもそも素励起の統計性を熱力学から決定することを目的としていたが、結果として一次元量子系の熱力学と動力学が「素励起間の統計相互作用」をキーワードにして統一的に理解できることがわかった。これらの結果を踏まえて今後は一次元強相関金属のモデルとして超対称t-J模型の動的相関関数の解析解を求める予定である。銅酸化物一次元超伝導体の発見や光電子分光、中性子非弾性散乱など動力学的性質に対するプローブの精度向上を背景にし、可積分系に軸足を置いた「一次元強相関金属の動力学理論」の構築が将来にわたる目標である。
留学生日本語学習用教材とその提示システムの開発〜光ビデオディスクへの画像音声プログラム同時記録再生方式によるシステムの開発とその活用〜

本研究は、留学生日本語学習に利用できる新しいシステムと教材の実用化を目指し、3年間進められてきた。その結果、新しい視聴覚メディアである追記型光ビデオディスクを利用した教材、並びにその学習システムの開発に成功した。また複合シラバスを採用する新しい試みによる教材の開発も行った。成果は次の4項目にまとめることができる。1.動画・静止画のみならず、光ビデオディスクの同一媒体上に静止画用ディジタル音声、プログラムデータを記録し再生利用する新しい方式の開発に成功した。2.上記の開発に基づいて記録再生制御装置及び再生制御装置を開発し、教材製作システム及び個別学習機を構築した。追記型光ビデオディスクにより、教材製作・改訂が柔軟に行える。場面提示が任意且つ速やかに行え、学習者のレベル・進度に応じた学習が行える特徴を持つ。3.教材制作用及び個別学習用のソフトウェアを制作した。教材実行プログラムの機能と使用言語の仕様を決め、必要なユーティリティ、学習実行プログラムを開発した。汎用のワープロ、エディタも活用した。4.教材面では、複合シラバスを本格的に採用し、新しい試みのテキスト教材及び音声教材として開発した。動画像提示の特徴を生かした初級日本語学習用教材「書店で本を買う」及び静止画・音声による「電話を掛ける」を開発した。動画、静止画、音声、プログラムを同一のディスクに記録し再生できるハイパーメディア機能を組み込んだ教材及びその提示システムを留学生日本語学習のために開発できたということは、本研究の大きな成果である。本研究は、新しい留学生日本語教育用として利用できるシステムと教材の実用化をめざし、光ビデオディスクとマイコンによる対話型の教育システムの開発と教材制作を行うものである。本年度は、このための教材制作用システムの開発と、日本語教育用教材の制作を行った。1.教材制作システムは、追加記録可能な光ビデオディスク装置、マイコンVTR、及び新たに本研究で開発した記録・再生用制御装置他から構成されている。この制御装置は、マイコンからのコマンドにより光ビデオディスク、VTR他を制御すると共に、静止画にともなう音声の記録・再生も行う。制御コマンドは確定し、所定の動作が行えている。静止画音声は、映像信号と同形式で記録・再生させる様にしたもので、光ビデオディスクの信頼度の問題から何回かの試作を行い、現在音質、雑音にわずかの問題を残すものの一応使用できる段階に達した。2.当初学習プログラムも、光ビデオディスクに記録する方針であったが、エラー率の点から、より一層の検討を行うこととし、当面これにはフロッピーディスクを使用することとした。3.教材としては、主としてシステムの評価を目的とした聴解練習用のものを制作した。。近く留学生を対象として試行を行うための準備を進めている。4.本システムの開発に関連ある他のシステム、新技術について、調査比較を行い、いくつかの参考となる知見が得られた。5.本年度についてはほぼ計画通り作業が進んだが、その中で見出された若干の問題点の解決、および最近の新しく開発された技術の取入れが今後の課題となった。特に、学習プログラムの記録方式、再書込型光ディスクの採用、学習専用機の開発、教材の充実などが主となる。本年度は、62年度までに開発されたシステムに改善を加え、コンパクトな個別学習機を製作した。また、複合シラバスを採用した全30課からなる教材を制作した。1.62年度までに開発が行われていた、光ビデオディスクに対する静止画用音声の書き込み及び読み取り方式に音質改善の変更を行うとともに光ビデオディスクに対するデジタルデータの書き込み及び読み出しの方式を開発し、記録再生用制御装置、及び再生用制御装置にこの機能を付加した。2.コンパクトな再生用制御装置を製作した。光ビデオディスク装置と制御装置は、ビデオ画像とマイコン画面のスーパーインポーズ機能を持つマイコンと組み合わせて使用できる。本研究では、2機種のマイコンを用いて個別学習機を構成した。

3.1機種のマイコンを用いて制作されていた教材実行プログラムを、別の機種に移植した。マイコンの機能上の違いによりプログラムの仕様が若干異なるが、教材ファイルの移植は容易である。4.留学生日本語教育用の初級教材として、ひらがな、音声、日本語文法入門等の導入のための1課、新しい教授項目を含む23課、及び6課の復習課からなる教材を、テキスト教材・音声教材として開発した。5.シナリオ作成、ビデオ撮影・写真撮影、音声収録編集、ビデオ編集、マイコンによるコース作成等にわたる教材制作技術により、4の教材の一部を映像化した。6.研究のとりまとめを行い、報告書を作成した。
SARS及びマウスコロナウイルスの細胞侵入の分子機構と病原性発現に関する研究

SARSコロナウイルス(SARS-CoV)は細胞に感染する時、宿主細胞のプロテアーゼを利用することが知られている。細胞に吸着したウイルスにトリプシンなどのプロテアーゼが作用し、スパイク(S)蛋白が解裂されることにより、直接細胞膜から侵入する。また、プロテアーゼにより感染細胞は融合することも報告されている。プロテアーゼの非存在下では、エンドゾーム経由で感染するが、プロテアーゼ存在下と比べると、感染効率は低い。コロナウイルスの中ではSARS-CoVのみならず多くの種がプロテアーゼ依存性に感染し、細胞融合を引き起こす。その中でも、豚の下痢症ウイルス(PEDV)はプロテアーゼ依存性が高く、トリプシンなどのプロテアーゼが存在しないと感染拡大が極めて弱い。今年度は、PEDV感染におけるプロテアーゼの役割について検討した。トリプシン存在下或いは膜貫通型プロテアーゼTMPRSS2発現Vero細胞では、感染性ウイルス粒子が細胞外に効率よく放出され、プロテアーゼ非存在下と比べ、その感染性は100-1000倍高かった。我々は、トリプシン非存在下のVero細胞とプロテアーゼ阻害剤を加えたTMPRSS2発現細胞では、電子顕微鏡による観察で、ウイルス粒子が細胞表面に付着してクラスターを形成しているが、トリプシン付加により、また、プロテアーゼ阻害剤のないTMPRSS2発現細胞では、細胞表面のウイルス粒子のクラスターは消失していることを観察した。これらのことから、PEDV感染におけるプロテアーゼの役割は、細胞外へのウイルスの放出であり、それは、感染細胞外で細胞膜に付着しているウイルス粒子を細胞膜から剥がすのに重要であることが判明した。今後、どのような細胞分子がウイルスと細胞膜との結合に関与しているのかを検討したい。SARS-CoVのスパイク(S)蛋白は細胞表面のレセプター(ACE2)に結合後、トリプシンやエンドソーム内にある「カテプシン」などのプロテアーゼによって解裂されて活性化し、細胞膜とウイルスエンベロープを融合させることが報告されてきた。今回我々は、細胞膜貫通型プロテアーゼであるTMPRSS2がS蛋白を活性化する可能性を検討した。TMPRSS2を発現させた細胞(VERO-TMPRSS2)にSARS-CoVのS蛋白を発現させると細胞融合が見られ、プロテアーゼ阻害剤のロイペプチンによりこの細胞融合は抑制された。更に、この細胞へのウイルス侵入は、バフィロマイシンやESTといったエンドソーム/カテプシン阻害薬では阻止できず、ヘプタッドリピートペプチド(HRP:細胞表面で活性化されるS蛋白のみを阻止する)により阻止できることから、TMPRSS2は細胞表面でS蛋白を活性化していると考えられる。一方、このVERO-TMPRSS2で作られたS蛋白は解裂されておらず、感染価にも変化はみられなかった。これらのことから、TMPRSS2は細胞に侵入するウイルスのSを活性化することは出来るが、この細胞で生産放出されるウイルスのS蛋白には影響を及ぼさないと考えられる。我々はTMPRSS2のS蛋白に対する空間的な方向がS蛋白の活性化に影響していると考え、S蛋白を発現させた緑色蛍光細胞とオレンジ蛍光細胞の双方にそれぞれTMPRSS2を発現させ、細胞融合の有無を調べることにより、TMPRSS2とS蛋白の方向関係を調べた。その結果、TMPRSS2は同じ細胞に発現しているS蛋白を活性化することはできないが、向かい合った反対側の細胞に発現したS蛋白を活性化できることがわかった。つまり、TMPRSS2は細胞に侵入しようとするウイルスのS蛋白に対しては方向が反対なので働くが、出て行くウイルスでは方向が同じなので働かないことを示唆している。この結果は、SARS-CoVの肺での強い病原性にTMPRSS2が関与する可能性を示唆している。