hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞骨格タンパク質と熱ショックタンパク質の相互作用

そこで、本年度はこの結合の特異性を検討した。失ず8Sグルココルチコイド受容体(グルココルチコイド結合タンパク質とHSP90の複合体)のアクチン繊維への結合が、Ca^<2+>・カルモデュリンによって阻害されることを示した。次に複合体の安定剤モリブデン酸を阻き、さらに高塩濃度液で抽出することにより4Sのグルココルテコイド受容体(HSP90から離れた)を得て、アクチンとの結合をみたが、予想したように結合はしなかった。HSP90を介してアクチン繊維と相互作用する機能タンパク質として新たにカゼインキナ-ゼIIを同定した。同定は、(1)その活性がヘパリンによって阻害される、(2)カゼインキナ-ゼII(CKII)の基質ペプチドをリン酸化する、ことによった。CKIIはマウスリンホ-マLS178Y細胞の粗抽出液よりHSP90と共精製されると同時に、粗抽出液より抗HSP90抗体によって共沈澱した。見かけ上完全精製したマウスHSP90の標品(SDSーPAGEで色素染色すると単一バンドになる)にも、γー^<32>PーATPと加温するとHSP90をリン酸化する活性があり、その活性はCKIIの特徴をすべて備えていた。HSP90ファミリ-に属するHSP100をマウス細胞より精製し性質を調べた。HSP100もアクチン繊維に結合し、その結合はCa^<2+>カルモデユリンによって阻害されることが明らかになった。熱ショックに応答し核内移行するアクチン結合タンパク質コフィリンのN端近傍にある核移行シグナル様の配列KKRKKの役割を検討した。その結果、この配列は核移行シグナルとして働く他に、アクチンとの相互作用にも必要であることが示唆された。1)精製したマウスHSP90を未変性ゲル電気泳動したところ、2本のダイマ-と1本のモノマ-に分れた。それぞれのバンドを切り出し、6%SDSーPAGEで調べたところ、α/αおよびβ/βのホモダイマ-とβモノマ-であることがわかった。細胞抽出液を未変性ゲル電気泳動し、抗HSP90抗体でウエスタンブロットすると、やはり2本のダイマ-と1本のモノマ-が検出された。2)比較的低イオン強度の緩衝液で抽出した細胞抽出物をショ糖密度勾配遠心し、特異的基質ペプチドを用いてカゼインキナ-ゼ(CKII)活性のサイズを調べた。CKIIのピ-クは約8Sで、抗HSP90抗体を加えると10Sにシフトした。この結果は8SーGRと同じように、CKIIもHSP90と複合体を形成していることを示唆する。さらに、精製したCKIIを但イオン強度溶液中に保つと会合体を作るが、HSP90を添加すると会合体は解離し、CKII活性は8Sになる。このとき、可溶化にともないCKII活性が著しく上昇することを認めた。3)熱ショックによって、おそらくアクチンを核内へ運ぶタンパク質であるコフイリンの分子的解析を行った。N端より30番目からはじまるKKRKK配列をKTLKKに改変し、マウスC3Hー2K細胞に発現させた。N端に9個のアミノ酸からなるペプチドが余計に付くように工夫がしてあり、そのペプチドに対する抗体で変異コフイリンを内在性コフイリンと区別して局在を調べた。KKRKKコフイリンが熱ショックによって核内移行するのに対し、KTLKK
葉酸依存性メチル化酵素群の機能と生理的意義の解明

高度好熱菌Thermus thermophilusにおいて、葉酸依存性tRNAメチル化酵素TrmFOがtRNA修飾ネットワークに与える影響と、TrmFOを介したtRNA修飾ネットワークとDNA合成系の関係性についての研究を行った。trmFO遺伝子破壊株を作成し、表現系を確認したところ、trmFO遺伝子破壊株は、50度の低温培養において生育遅滞が起こることを見出した。遺伝子破壊株のtRNAのメチル化頻度を測定したところ、Gm18とm1A58メチル化ヌクレオシドの含有量が変動していた。メチル化ヌクレオシドの含有量の変動が与える影響について、タンパク質合成速度を確認したところ、trmFO遺伝子破壊株のタンパク質合成の速度は、野生株と比べ低下していた。TrmFOによって生合成されるm5U54は、Gm18とm1A58のメチル化頻度を調節しており、低温適応に必要であることを明らかにした。この結果は、論文として出版された。貧栄養下では、trmFO遺伝子破壊株の生育速度が向上することを見出し、この表現系について、DNA合成の観点からの理解を試みた。trmFO遺伝子を破壊することによって、メチレンテトラヒドロ葉酸の消費量が変動し、メチオニン合成系とDNA合成系に正の影響を与えているのではないかと考えた。新規DNA合成量を確認したところ、trmFO遺伝子破壊株のほうがDNA合成量が増加していた。さらに培地にメチオニンやチミジル酸を添加して培養したところ、trmFO遺伝子破壊株の生育速度は、野生株と同等になった。また、TrmFOを含む3種類の葉酸依存性メチル化酵素を用いて、試験管内でメチル化反応の競争実験を行い、TrmFOの存在は、他の葉酸依存性メチル化酵素の反応速度を低下させることがわかった。以上、TrmFOによるメチレンテトラヒドロ葉酸の消費は、DNA合成系に影響し得ることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、高度好熱菌の葉酸代謝経路において、DNA合成系とRNA修飾系は、メチレンテトラヒドロ葉酸の代謝を介して互いに制御し合っているのではないかという仮説を検証することを最終目的として据えている。平成26年度の本申請計画では、(1)tRNA (m5U54) methyltransferase (TrmFO)の遺伝子破壊株における、tRNA修飾含有量の変化と影響を確認する。(2)trmFO遺伝子破壊によるDNA合成活性の変化を確認する。(3)細胞内の葉酸依存性メチル化酵素群の量的経時変化を確認する。という3つの目標を設定した。(1)の目標を達成するため、まずは、固相化DNAプローブ法を用いて、細胞から採取したtRNA混合物から特定のtRNAを単離した。単離したtRNAを用いてヌクレオシド分析を行ったところ、trmFO遺伝子破壊株では、いくつかの修飾ヌクレオシド含有量が変化していることを見出した。結果的に、この修飾ヌクレオシド含有量の変化は、低温環境下でタンパク質合成速度を低下させていることを突き止めた。(2)trmFO遺伝子破壊株のDNA合成活性を調べるために、RIを用いた培養実験を行った。培養後の菌体に由来するゲノムDNAを分析することによって、trmFO遺伝子破壊株のほうがDNA合成活性が高いことを明らかにした。(3)細胞抽出液中の葉酸依存性メチル化酵素群(TrmFO,チミジル酸合成酵素,セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ)の存在量を明らかにした。このように、当初設定していた目標を達成することができたため、予定を前倒しして、試験管内におけるTrmFOとチミジル酸合成酵素の競争実験を行った。その結果、TrmFOの酵素活性は、ThyX存在下で抑制されることがわかった。

以上、TrmFOによるメチレンテトラヒドロ葉酸の消費は、DNA合成系に影響し得ることが示唆された。当初計画していた目標を予想よりも短期間で達成することができたため、来年度以降に予定していた実験に着手できた。また、本計画を遂行する上で必要不可欠であった固相化DNAプローブ法の改良を行った。この結果は、国際学術誌に共同著者として論文を掲載するに至った。よって、本研究計画は、おおむね順調に進展していると自己評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度に計画していた「試験管内におけるチミジル酸合成酵素の酵素活性測定系の確立と、TrmFOとの競争実験」は、平成26年度にすでに着手しており、仮説を支持する結果が得られている。しかしながら、ThyXの酵素活性がTrmFOの存在によって抑制されることは、未だ確認できていない。したがって、平成27年度は、ThyXの酵素活性がTrmFOによって、阻害されるかを確認する予定である。ThyXの酵素活性測定法の開発は、平成26年度にすでに完了しており、酵素反応の最適条件を見つけることに成功している。よって、短期間で研究計画を遂行できるものと考えられるが、生体内におけるThyXの基質(dUMP)量が不明であるため、dUMP濃度の検討が必要であると考えられる。場合によっては、細胞内のdUMP濃度を検討する手法の開発に着手する。
PDIを標的とした難治性固形腫瘍治療薬の開発

PDI阻害薬としての臨床応用が期待された新規化合物PACMA31であったが再現性が証明されずPDI阻害薬としての開発は断念した。しかしその誘導体であるPACMA5は以下の知見を得た。1)正常細胞には殺細胞効果を示さず、多種のがん細胞には殺細胞効果を示すこと、2)その殺細胞効果は活性酸素発生を介した非アポトーシス細胞死であること、3)臨床上難治性である卵巣癌腹膜播種のマウスモデルにおいて腫瘍増殖抑制効果を示すこと、4)PACMA5の標的タンパクは活性酸素発生に関与するProtein1(仮称)であることが明らかとなった。したがってPACMA5は難治性固形腫瘍の新たな治療薬の候補となりうる。OCCAの細胞株は既存の抗がん剤に耐性を示し、paclitaxel, cisplatinに対するIC50は10100μMであった。一方PACMA5はいずれのOCCA細胞株に対してもわずか1μMでほぼ100%の殺細胞効果を示し、有効な治療薬となりうる可能性が示された。また非がん肝細胞、非がん気管上皮細胞に対しては1μMで殺細胞効果を認めなかった。これはPACMA5ががん細胞に選択的な殺細胞効果を有している可能性を示している。この細胞死のメカニズムを明らかにするためにアポトーシス阻害剤の前投与後PACMA5の投与をおこなったが、細胞死は全く阻害されす、非アポトーシス性の細胞死が誘導されていることが明らかとなった。このことはPACMA5が既存の抗がん剤では見られない細胞死を誘導することでがん細胞のみを細胞死に至らしめることを示しており、新たな細胞死のメカニズムを発見できる可能性を示唆するものである。当初の研究対象であったPACMA31と同じアナログであるPACMA5が難治性固形腫瘍である卵巣明細胞腺癌(以下OCCA)に対し高い殺細胞効果を示し下記のごとくPDIを凌駕するようなターゲットが見つかる可能性があることがわかったため研究を継続している。昨年までの研究でPACMA5により既存の抗がん剤では見られない非アポトーシス性の細胞死が誘導されていることが明らかとなった。さらにProtein1(仮称)とPACMA5との特異的結合を同定し、このProtein1(仮称)は上記の細胞死を制御することが知られているため標的タンパクと考え、細胞死のメカニズム解明をおこなっている。またPACMA5腹腔内投与はOCCA腹膜播種モデルに対し腫瘍増殖抑制効果を示し、新たな治療薬の候補となりうる可能性を示している。PDI(Protein Disufide Isomerase)の阻害をすると考えられた新規化合物であったが、その後の追加実験で再現性が確認できなかった。しかしながら1)正常細胞にはほとんど殺細胞効果を認めず、卵巣癌細胞を中心とした多種多様ながん細胞株に低濃度で殺細胞効果を示すこと、2)その殺細胞効果は活性酸素発生を介して誘導されること、3)化合物の結合は活性酸素発生ドメインであるProtein1(仮称)であること、4)治療困難な卵巣癌腹膜播種モデルのマウスに対して治療効果を示したことより、新たな治療薬の候補となりうると考え研究を持続している。またこの細胞死はCaspase1阻害薬でも阻害されるpyroptosisであることもわかり、新たな細胞死を誘導する化合物として期待される。今後はこの細胞死のメカニズムを解明し同時に動物実験でも効果を示すがん種を検討する方針である。PACMA5を卵巣癌の中でも既存の抗がん剤に耐性を示す卵巣明細胞腺癌に着目し、5つの細胞株を用いてPACMA5の殺細胞効果を調べたところ、以下の知見を得た。1.いずれの細胞株に対しても著しく高い殺細胞効果を示した。2.細胞死は既存の抗がん剤によって誘導される細胞死とは全く異なる新しい細胞死であることを阻害剤、蛍光色素による染色で確認した。3.標的タンパクを同定すべく実験を進め、PACMA5とProtein1 (仮称)の特異的結合を確認した。Protein1は上記2の細胞死を制御することが知られている。4.卵巣明細胞腺癌腹膜播種モデルマウスに対し、PACMA5の腹腔内投与をおこなったところ、腫瘍量は無治療群の1/3に減じることを確認した。

これらの事実はPACMA5が現存する抗がん剤に対して難治性である卵巣明細胞腺癌に対する新たな治療薬になりうると考え、研究を進めていく方針である。腫瘍治療学PACMA5処理後の細胞における各種シグナル伝達経路の活性化の有無を検証する。また、Protein1(仮称)と相互作用する分子を網羅的にスクリーニングすることで、細胞死へとつながる下流のシグナル伝達経路の同定を試みる。2)臨床検体におけるProtein1(仮称)の発現1TMA (Tissue Micro Array)を用いて卵巣癌におけるProtein1(仮称)の発現と病期および予後との相関を検討する。2他の難治性固形腫瘍(膵癌など)におけるProtein1(仮称)の発現と病期および予後との相関を検討する。3)既存の抗がん剤との併用効果の検討:さらに高い抗腫瘍効果の有無を検討する目的で治療薬であるpaclitaxel,siRNAによるPDIノックダウン細胞を用いてPDIの発現と細胞増殖能との関連を検討した。siRNA/PDI-OVCAR8細胞はウエスタンブロットにおいてPDIのノックダウンは確認できたが、細胞増殖能はコントロールベクター導入細胞と変わりなかった。そのためPDIは増殖能に寄与しないと判断した。またtissue arrayで膵癌および甲状腺未分化癌におけるPDIの発現と悪性度の関連を調べたが、臨床病期および予後との相関は認めなかった。ここで卵巣癌の中でも既存の抗がん剤に耐性を示す卵巣明細胞腺癌に着目し、5つの細胞株を用いてPACMAの殺細胞効果を調べたところ、いずれの細胞株に対しても著しく高い殺細胞効果を示した。またその細胞死は既存の抗がん剤によって誘導される細胞死とは全く異なる新しい細胞死であることを阻害剤、蛍光色素による染色で確認した。PACMAは現存する抗がん剤に対して難治性である卵巣明細胞腺癌に対する新たな治療薬になりうると考え、研究を進めていく方針である。次年度繰越理由:前述の如く本研究の主眼はPACMA5の標的探索および細胞死誘導のメカニズムの解明となった。細胞死誘導のメカニズム解明にあたり、既に同定済みのProtein1 (仮称)に関連する複数のタンパクを免疫沈降、siRNAで確認する。1)PACMAの酵母に対する作用の検証1酵母細胞の生育やミトコンドリアの形態と機能を解析する。2得られた表現型が他の酵母株でも見られるかどうかを確認するため、他の株でも同様の実験をおこなう。3PACMA5の作用にミトコンドリアとの関連が認められた場合は、さらに詳細な解析を実行する。2)PACMA5の標的タンパクの解明スクリーニングによる標的タンパクの同定をおこなう。3)卵巣明細胞腺癌腹膜播種モデルに対するPACMAの有効性自己複製能欠損レンチウイルスRedi-Fect-Red-Fluc-Puromycinで形質導入した株化ヒト卵巣明細胞腺癌細胞を免疫不全マウスに腹腔内移植する。ルシフェリン投与後の発光を小動物蛍光発光イメージング装置(IVIS)でモニタリングすることで腫瘍の成長を評価する。腫瘍が生着した時点で、PACMA5による治療実験を開始する。腫瘍量はの変化はIVISでモニタリングする。(使用計画)
マルチプラットフォームの大規模数値シミュレーションを支援するフレームワークの構築

電磁界問題,量子化学計算,数値流体計算の大規模数値シミュレーションに向けて,大規模行列計算に向けた高速化,高精度化,安定化を実現し,従来手法では解きにくい問題に対する新たな求解アルゴリズムを提案した.さらに,そのようなシミュレーションを支援するために,応用問題の特性に応じたデータ構造を決定する自動チューニング技術,ジョブスケジューラによる最適な計算機資源割当て方式,任意高精度線形代数演算パッケージも開発した.電磁界問題,量子化学計算,数値流体計算の大規模数値シミュレーションに向けて,大規模行列計算に向けた高速化,高精度化,安定化を実現し,従来手法では解きにくい問題に対する新たな求解アルゴリズムを提案した.さらに,そのようなシミュレーションを支援するために,応用問題の特性に応じたデータ構造を決定する自動チューニング技術,ジョブスケジューラによる最適な計算機資源割当て方式,任意高精度線形代数演算パッケージも開発した.本研究は,次の3グループから構成され,研究を実施した.【アプリケーション(APP)グループ】様々な数値シミュレーションを実施するグループ.【求解アルゴリズム(ALG)グループ】従来のアルゴリズムでは解きにくい問題に対する新アルゴリズムを開発する.【基盤ミドルウェア(MWI)構築グループ】求解アルゴリズムの特性の分析評価と計算効率向上のための解決方法の提案,及び,これまでに開発されてきた基盤ミドルウェアSPHEREを拡張して,上述の手続きを自動制御する機構を開発.本年度においては,APPグループとALGグループ間で,求解問題の特性データと求解アルゴリズムの性能や特性に着目しながら,両グループ間での求解にあたっての問題解決に向けた研究開発のための協議検討を行なった.その成果として,IDR(s)ベースのISOR法,積型解法の改良,前処理付きアルゴリズムに対する適切な品質改善を実施した.また,理研のスパコンRICCやT2Kオープンスパコン(東大版)も用い,超大規模な固有値問題の並列計算における性能評価を実施した.MWIグループでは,従来のSPHEREシステム内の拡張用インタフェース部分へのXabclibの実装設計まで進んだ.また,多倍長精度版のBLAS/LAPACKであるMPACKの開発が進み,オープンソースとして公開されている.さらに,マルチプラットフォームでの円滑なジョブ実行を支援するためのジョブスケジューラの将来予測ツール開発に向けた予備実験を行なった.本フレームワークを特徴付ける異分野間の研究者の交流の機会として,2009年8月と翌1月に内部メンバーでの進捗報告と今後の共同研究計画を実施した.また,自動チューニング研究会とも合流し,2009年10月22日には「自動チューニング技術の現状と応用に関するシンポジウム」を,本メンバー外からの意見交換の場として開催した.本研究は,次の3グループから構成され,研究を実施した.【アプリケーション(APP)グループ】様々な数値シミュレーションを実施するグループ.【求解アルゴリズム(ALG)グループ】従来のアルゴリズムでは解きにくい問題に対する新アルゴリズムを開発する.【基盤ミドルウェア(MWI)構築グループ】求解アルゴリズムの特性の分析評価と計算効率向上のための解決方法の提案,及び,基盤ミドルウェアSPHBREを拡張して,上述の手続きを自動制御する機構を開発.本年度においては,ALGグループとMWIグループにて開発されたアルゴリズムとユーザ支援環境にて,APPグループの問題や各研究者が所有するアプリケーション問題で性能評価を実施した.今年度の研究実施では,理研のスパコンRICC, GPUクラスタやT2Kオープンスパコン(東大版)も用い,マルチプラットフォームでの開発を進めた.そこでの成果として,マルチコア・マルチプラットフォーム環境に対応する固有値アルゴリズム開発,密行列対称固有値ソルバのデータ分散方法の提案,線形ソルバGPBiCG法に対する数種類の変種アルゴリズム開発,高精度線形代数ライブラリ(MPACK)開発,SPHEREの拡張,前処理付きアルゴリズムに対する適切な品質改善とその評価方法の提案が実施された.2010年10月に一般公開のワークショップを開催し,構成メンバー全員の進捗報告を実施すると共に,外部の方々も交えて意見交換した.また,自動チューニング研究会とも合流し,「第2回自動チューニング技術の現状と応用に関するシンポジウム」(2010年11月4日開催)では,研究分担者の小野が当プロジェクトの概要とSPHERE開発の状況について報告した.最終年度は,研究者間での研究成果の相互利用を念頭に置き,前年度までの個々の研究内容に対する完成度を高める方向で研究を実施した.●アプリケーショングループ:電磁界数値解析に関する研究では,設計領域の解像度を段階的に向上させる多段式進化型アルゴリズムを開発し,それをPCクラスタへ並列実装した.また,諸現象解析で必要な高精度計算手法や計算効率に関しては,基盤ミドルウェア(MWI)グループでの開発と連携した.●求解アルゴリズムグループ:IDR(s)法とGPBiCG法の長所を結び付け,丸め誤差の影響を数学的にコントロールし,高速でロバストなアルゴリズムを開発した.並列化では,行列ベクトル積のプロセッサー均等配分に注目し,行列の非零要素のブロック単位の均等法を考案した.大規模計算向け固有値ソルバーの性能を測定し,性能向上の問題点をキャッシュ,メモリ,マルチコアの観点から明らかにした.更に,MWIグループで構築した求解アルゴリズムの求解品質分析・評価ツールを用い,前処理付きアルゴリズムの改善を行った.●基盤ミドルウェア(MWI)グループ:固有値問題求解における性能を決定するベクトルの分散配置方式の研究,疎行列-ベクトル積での疎行列データ構造の実行時変換方式の研究を行った.また,任意高精度線形代数演算パッケージMPACKを開発し,ルーチンやライブラリ追加と,GPUも用いて行列-行列演算を理論性能値のほぼ限界まで最適化し,オープンソースとして公開した.ジョブスケジューラによる効率的な計算機資源活用やユーザビリティ向上の研究も行った。

2011年9月に外部非公開にて大規模計算コロキウムを開催し,互いの研究成果に対する評価を行った.その際に,線形計算分野と電磁界解析分野における高速解法の研究者も招待し,専門的な観点での意見交換も行った.更に,一般公開のワークショップも開催し,構成メンバー全員の進捗報告を実施すると共に,外部の方々も交え意見交換した.
テルペンおよび前駆体合成酵素の活性進化

テルペンは香料、医薬品、農薬などとして広く利用される天然化合物群である。近年、有価テルペンを微生物に大量生産させる試みが盛んである。テルペンの前駆体であるプレニルニリン酸の供給を増やすと、テルペン生産性は向上する。大腸菌に構築されたテルペン合成経路は、ユビキノンやC55PPといった細胞増殖に必須のリソースの合成と、プレニルニリン酸消費において競合している。ゲラニオール合成酵素変異体(GESM53)は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害(コロニー形成の阻害)を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路(MEP経路)の改良を試みた。MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ,GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100%回復させた。一方,MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。本年度は、プレニルニリン酸の供給能のハイスループット探索系を適用する、対象酵素および経路のライブラリを構築する予定であった。実際には、MEP経路のすべての酵素に対して細胞増殖に基づく評価をおこない、その中でも特に重要な酵素であると示唆されたIspHのライブラリを作製して機能選抜をおこない、その機能改良まで完了させた。また、もう一つの計画であった前年度に取得したモノテルペン合成酵素のキャラクタリゼーションのための精製、生産物分析系の改良も進めた。テルペン合成酵素の進化工学には、所属研究室で開発した比色スクリーニングを用いてきた。文献調査の結果、テルペン合成酵素の活性にも「細胞増殖の有無に基づいて評価する」手法があり、この手法を改良して、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる可能性があることがわかった。テルペン合成酵素およびその前駆体合成経路の改良という両輪を回すには、スクリーニング系のさらなるハイスループット化が有効である。来年度は、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる「細胞増殖の有無に基づいて評価する」系の構築も試みたい。(1)燃料前駆体セスキテルペン合成酵素の進化工学ビサボランは既存のディーゼルと類似の物性を持つ。その前駆体であるビサボレンの大量微生物生産系の構築をめざして研究が進められている。しかし、ビサボレン合成酵素(BIS)は、テルペン合成酵素の中でも特に低活性かつ低安定性である。ビサボレン生産性の向上には、BISの活性向上が必須である。本年度は、この酵素の活性や安定性を向上させる進化工学を2世代おこなった。その結果、野生型に比べて安定性の向上が示唆される変異体を複数取得することができた。この研究は、修士2年の学生と共におこなっており、年度末の農芸化学会において口頭発表(共著)をおこなった。(2)有価モノテルペン合成酵素の進化工学ピネンは、香料や燃料前駆体として産業価値の高いモノテルペンである。モノテルペンはGPPを基質として合成されるが,この基質は大腸菌ではFPPに比べて細胞に蓄積しづらい化合物である。よって、大腸菌内で効率よく働くモノテルペン合成酵素を開発するには、低い基質濃度下で効率よく働く酵素への改変が重要であると予想される。そこで、モノテルペン合成酵素の活性評価用に、スクリーニングコンストラクトを調製し、これを用いてPSの進化工学をおこなった。細胞内活性の高いピネン合成酵素変異体を取得することができた。この変異体は、既存のプレニル二リン酸合成経路強化株とともに発現することで、野生型よりも2倍高い120 mg/Lのピネン生産性を示した。この生産量は、最近の改良型モノテルペンの生産系の標準的なモノテルペン生産量と同等である。改良型のピネン合成酵素は、すでに開発されているプレニル二リン酸供給経路を強化した大腸菌株の中で発現することによって、野生型のピネン酵素を発現する株よりも高い生物生産効率を示した。この成果を年度末の農芸化学会において口頭発表した。

ゲラニオール合成酵素変異体(GESM53)は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害(コロニー形成の阻害)を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路(MEP経路)の改良を試みた。MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ,GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100%回復させた。一方,MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。本年度は、プレニルニリン酸の供給能のハイスループット探索系を適用する、対象酵素および経路のライブラリを構築する予定であった。実際には、MEP経路のすべての酵素に対して細胞増殖に基づく評価をおこない、その中でも特に重要な酵素であると示唆されたIspHのライブラリを作製して機能選抜をおこない、その機能改良まで完了させた。また、もう一つの計画であった前年度に取得したモノテルペン合成酵素のキャラクタリゼーションのための精製、生産物分析系の改良も進めた。当初の計画では、1年目はセスキテルペン合成酵素の進化工学を4-8世代に渡っておこなう予定であった。本年は、2世代の進化工学を進めた結果、可溶性や熱耐性の向上した変異体が得られた。また、これと並行してモノテルペン合成酵素の進化工学を1世代おこなった。得られた変異体は、微生物細胞におけるピネン合成活性が向上していた。今のところ、機能が向上した変異体を順調に得られている。異なる二種類の酵素から変異体を得られたことにより、これらの解析を進めることで、テルペン合成酵素の機能進化に関する知見が得られることが期待できる。テルペン合成酵素の進化工学には、所属研究室で開発した比色スクリーニングを用いてきた。文献調査の結果、テルペン合成酵素の活性にも「細胞増殖の有無に基づいて評価する」手法があり、この手法を改良して、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる可能性があることがわかった。テルペン合成酵素およびその前駆体合成経路の改良という両輪を回すには、スクリーニング系のさらなるハイスループット化が有効である。来年度は、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる「細胞増殖の有無に基づいて評価する」系の構築も試みたい。
大規模な連立非線形楕円型偏微分方程式の解の存在性を検証する計算機援用証明法の開発

本課題では「大規模な連立楕円型偏微分方程式の境界値問題の解に対する計算機援用存在証明法の確立」を主たる課題として研究を行った.大規模な連立楕円型偏微分方程式の計算機援用存在証明法には線形化作用素の逆作用素のノルム評価の開発が必須となる.線形化作用素の逆作用素のノルム評価は今まで,1992年に発表されたPlum氏による固有値を利用する方法や,1995年に発表された大石氏の巧みなノルム評価を用いる方法,2005年に発表された中尾氏の直交射影を利用する方法などが存在する.大石氏の方法や中尾氏の方法は線形化作用素が非自己共役作用素でも容易に利用できるメリットがあるが,評価が荒くなってしまうといった欠点があり,大規模な連立楕円型偏微分方程式には不向きである.また,Plum氏の方法は固有値問題に帰着しゲーリッシュの方法が利用できるため,非常に高精度な結果が得られるが,線形化作用素が非自己共役作用素の場合,重調和作用素が表れてしまい,非常に厄介な問題となる.特に,大規模な連立楕円型偏微分方程式の場合は特別な場合を除き,通常は非自己共役作用素となるため,困難となる.それに対し,本課題の最大の成果として,ラプラス作用素の分数冪をうまく利用することで,線形化作用素が非自己共役作用素の場合でも重調和作用素を避けて固有値問題に定式化する方法を考案し,ゲーリッシュの方法を利用することで,高精度な結果を得られる新しい手法を考案した.ラプラス作用素の分数冪を大規模な楕円型偏微分方程式の解の計算機援用存在証明法に導入すること自体が世界で初めての手法であった.さらに,本手法を用いて,実際の応用問題であるロトカ・ボルテラ方程式の解の計算機援用存在証明法に適用した.連立非線形楕円型偏微分方程式は様々な現象を表し,その解は現象の理解に非常に重要である.しかし,現在では解析的に解の存在を証明することも難しい.そのため,本課題では平成28年度の計画は定常Gray-Scott方程式の解に対する精度保証付き数値計算法を開発する予定であった.それに対し計画通り,定常Gray-Scott方程式に対する線形化作用素の逆作用素のノルム評価を考案し,精度保証付き数値計算法を構築した.その成果とし「関根晃太,田中一成,大石進一, "有界な凸領域における連立楕円型偏微分方程式の解の計算機援用存在証明法", Proceedings of the Twenty-Eighth RAMP Stmposium, Nigata University, (2016/10/13)」と「関根晃太,田中一成,大石進一, "ある無限次元固有値を用いた楕円型偏微分方程式の解の存在性に対する計算機援用証明法", RIMS講究録, (2016/10/21)」として公表した.この成果は,今まで困難であったL2-H10の線形化作用素の無限次元固有値を用いた厳密な評価法を,作用素の分数冪を用いて無限次元固有値問題に帰着することで解決した今までにない画期的な成果である.さらに提案した方法は,非自己共役作用素においてもH2レギュラリティを考慮せずに計算可能としていることも特徴である.また,無限次元固有値問題は劉-大石の定理を用いてダイレクトに評価できるため,結果として非常に良い精度良くなる.その結果,定常Gray-Scott方程式の解に対する計算機援用証明法の構築に成功した.今後定常Gray-Scott方程式に限らず,さらに一般化を行い拡張することで,課題の遂行を実現する.当初予定していた平成28年度の計画である定常Gray-Scott方程式の計算機援用証明法の開発に成功し,予定通り進んでいる.さらに,平成29年度は方程式の一般化を行い二元連立非線形楕円型偏微分方程式の計算機援用証明法の構築を行う.さらに,定常Gray-Scott方程式の計算機援用証明法の構築を行う際に利用した「作用素の分数冪」を用いて現状のフレームワークの見直しが可能であることがわかった.例えば,今まで見直す予定がなかった残差評価や補間誤差定数などの評価にも分数冪を利用することで非常に簡単に,かつ精度が向上することがわかった.そのために設置していた平成29年度のフレームワークの見直しを前倒しで平成28年度より行っていたため,当初の計画以上に進展しているといえる.本研究課題の目的はDirichlet境界条件を持つ大規模な楕円型連立偏微分方程式の解に対する計算機援用存在証明法を考案することである.その中でも中核である線形化作用素の逆作用素のノルム評価法の開発が重要となる.初年度であった平成28年度までには開発した定常Gray-Scott方程式のような楕円型連立偏微分方程式でも計算可能となる線形化作用素の逆作用素のノルム評価法を計画通り開発した.そこで2年目である平成29年度では,計画通り楕円型2元連立偏微分方程式に理論の一般化を行った.さらに,理論的な側面の拡張に加えて,この成果はより多くの人に簡単に利用できるようにVCPライブラリとして公表を行った.公表したライブラリを用いることで,気軽にユーザーが本研究課題で提案している線形化作用素の逆作用素のノルム評価法を用いた楕円型2元連立偏微分方程式の解の計算機援用存在証明法を可能としている.これにより計画書の平成29年度に記載していた「二元連立非線形楕円型偏微分方程式の解の存在性を証明する計算機援用証明法を考案」を達成しつつ,研究成果の発信方法で記載していた「作成したプログラムをサーバーにアップロードし全世界に発信する」も達成した.また,研究成果とライブラリの公表を多くの人へ認知していもらうために平成29年度には学会発表を3件行った.

これらの成果をもとに平成30年度はより大規模な連立非線形楕円型偏微分方程式の解の存在性を証明する計算機援用証明法に着手し,さらに情報の公開も行っていく予定である.研究計画書に記載していた平成29年度の目標は「平成28年度に構築した定常Gray-Scott方程式の解に対する計算機援用証明法の特に重要となる部分である線形化作用素の逆作用素の評価法を二元連立非線形楕円型偏微分方程式」へ拡張することであった.この目標を達成し,さらに,学会発表を行い広く理論の公開を行った.さらに,理論の公開と共に二元連立非線形楕円型偏微分方程式の解に対する計算機援用証明法のライブラリの公開も行った.これらは予定で通り進んでいるため順調であるといえる.本課題では「大規模な連立楕円型偏微分方程式の境界値問題の解に対する計算機援用存在証明法の確立」を主たる課題として研究を行った.大規模な連立楕円型偏微分方程式の計算機援用存在証明法には線形化作用素の逆作用素のノルム評価の開発が必須となる.線形化作用素の逆作用素のノルム評価は今まで,1992年に発表されたPlum氏による固有値を利用する方法や,1995年に発表された大石氏の巧みなノルム評価を用いる方法,2005年に発表された中尾氏の直交射影を利用する方法などが存在する.大石氏の方法や中尾氏の方法は線形化作用素が非自己共役作用素でも容易に利用できるメリットがあるが,評価が荒くなってしまうといった欠点があり,大規模な連立楕円型偏微分方程式には不向きである.また,Plum氏の方法は固有値問題に帰着しゲーリッシュの方法が利用できるため,非常に高精度な結果が得られるが,線形化作用素が非自己共役作用素の場合,重調和作用素が表れてしまい,非常に厄介な問題となる.特に,大規模な連立楕円型偏微分方程式の場合は特別な場合を除き,通常は非自己共役作用素となるため,困難となる.それに対し,本課題の最大の成果として,ラプラス作用素の分数冪をうまく利用することで,線形化作用素が非自己共役作用素の場合でも重調和作用素を避けて固有値問題に定式化する方法を考案し,ゲーリッシュの方法を利用することで,高精度な結果を得られる新しい手法を考案した.ラプラス作用素の分数冪を大規模な楕円型偏微分方程式の解の計算機援用存在証明法に導入すること自体が世界で初めての手法であった.さらに,本手法を用いて,実際の応用問題であるロトカ・ボルテラ方程式の解の計算機援用存在証明法に適用した.今後の推進方策は計画通り平成29年度は方程式を一般化した二元連立非線形楕円型偏微分方程式の解に対する計算機援用証明法の構築に取り掛かる.さらに,定常Gray-Scott方程式の解に対する計算機援用証明法の経験より作用素の分数冪が計算機援用証明法に非常に効果的であることがわかったため,現存する計算機援用証明法のフレームワークの残差評価などの修正も行う.また,研究の公開方法としてあげている計算機援用証明法の一般ユーザへの配布として,ライブラリの公開を徐々に行っており,ライブラリの拡充も必要である.研究計画書通り平成30年度は「平成29年度の実施した二元連立非線形楕円型偏微分方程式の解に対する計算機援用証明法をN元連立楕円型偏微分方程式の解に対する計算機援用証明法へ拡張」することである.そのために,理論的な面では中核をなす線形化作用素の逆作用素のノルム評価の拡張を行う.
多次元符号化技術を用いる高機能アレイセンサの開発

1.超音波アレイセンサの作製プロセスの開発パターン電極上に高分子薄膜上を積層した構造の超音波アレイセンサの作製プロセスを開発し、3次元撮像用の2次元アレイを試作した。アレイセンサは比帯域が200%と広帯域であることを確認した。2.信号処理LSIの開発実数値や多ビット信号で与えられた波面を多次元量子化し、得られる高密度の1ビット群を同期して出力する符号化システム用のLSIの設計を行った。3.多次元オーバサンプリング符号化方式の確立超音波センサの場合に重要となる音場伝搬による空間的帯域制限フィルタの特性と、時間サンプリング周波数、アレイ間隔と量子化雑音レベルの関連を明らかにした。また、アレイの配置間隔を拡げるためのデシメーション処理を導入した。4.指向性制御の実験、システムの評価、今後の展望センサアレイを超音波撮像システムに組み込み、性能評価実験を行った。その結果、水中や生体模倣媒質中での物体のエコー像を再生可能であった。発生される音響波の強度、システムの空間分解能、画質なども評価し、システム全体の性能向上の方策を検討した。評価実験では、空間分解能は理論値通りの値が得られた。一方、視野角は全角20゚と狭く、画像のダイナミックレンジも12dBと実用的な観点からは低い値であった。この問題は素子数と素子配置密度の増加とともに、像再生の点拡がり関数の不要ピークを減らす信号処理手法の開発により実現されると考えている。さらに、本研究の過程で、多素子の2次元アレイを極めて低コストで実現する手法の着想が得られた。1.信号処理論理の設計実数値や多ビット信号で与えられた波面を多次元量子化し、得られる高密度の1ビット群を同期して出力する符号化システムの論理設計を行なった。シミュレーションによりSN比の検討を行ない、拡散波面の発生では、高い周波数の量子化雑音が発生するが、低域通過フィルタにより除去可能であることが確認された。2.超音波アレイセンサの試作と特性の評価圧電薄膜上にパターン電極を形成して、中心周波数1MHz、アレイ要素の幅0.3mm、要素間隔0.5mm、要素数32の1次元超音波アレイセンサを試作した。試作したアレイセンサを広い周波数帯域のパルスで駆動して特性を評価した。その結果、駆動回路のインピーダンスが高くケーブル長が長い場合、アレイ要素間のクロストークが無視できなくなり、等価的な要素幅の増大となって影響が現れることがわかった。また、周波数1MHzでは送信感度が低く、反射波を用いる撮像に応用するためには十分でないことがわかった。3.多次元オーバサンプリング符号化方式の安定化3次以上の多次元Δ-Σ変調符号化を安定動作させるため、空間的低域通過フィルタをループに挿入することを検討、安定動作を確認した。4.システムの評価と整備収束波を発生する駆動信号を時間1次空間2次の2次元ΔΣ変調で1ビット信号に変換し、2値駆動回路により試作した32要素アレイを駆動し、ビームパターンを評価した。その結果、アレイの正面の距離50mmの位置に焦点を形成することができた。一方、焦点の位置を正面からずらしていくとビーム形状が歪む。これは、高い空間周波数の量子化雑音の影響、及びアレイ要素間のクロストークの影響と考えられる。1.シミュレーションによる評価シミュレーションにより安定性の解析と、アレイの配置や駆動周波数のS/Nへの影響を評価した。その結果、空間的フィルタの挿入により、アレイ素子の間引き(デシメーション)が可能であり、素子数の減少と素子間隔の拡大、S/Nの改善に効果があることがわかった。2.回路の設計とLSIの論理合成空間フィルタ演算を行う受動電子回路を設計してSPICEにより検証した。また、LSIの設計データを基に、論理合成を行なった。3.多次元符号化システムの構成上記の信号処理回路にコンピュータとのインタフェースと駆動回路を自作し付加した。

センサ基板にインピーダンス変換回路等を実装した。デジタル信号とアナログ信号の同時観測が可能なミックスドシグナルスコープにより回路の動作チェックと調整を行なった。4.高分子薄膜センサアレイの構成平成10年度のデータを基に、新たに超音波センサアレイを試作した。新しい方法により作製した素子は直径1.2mmの円形の電極を持ち、従来のニードルハイドロホンと同等の性能であった。1.センサアレイの組み込みこれまでの研究成果に基づいて新たにセンサアレイと新たな2値駆動回路を作製し、超音波符号化送信システムに組み込んだ。このシステムは厚さ50μmの圧電性高分子フィルムに直径2mmの電極を積層することで32個の送信素子と16個の受信素子アレイを構成し、インピーダンス変換回路と終端用抵抗をアレイ上に実装している。また、CPLDにより入力信号を2値駆動回路の制御信号に変換する回路を実装した。2.性能評価手法の確立収束音場や発散音場の発生について、波形歪の空間的分布を評価する手法を検討した。またシミュレーションにより、2値駆動回路の立ち上がりと立ち下がりの遅れ時間の差の影響を検証した。2値回路の遅れ時間の差は、2値駆動波形の正と負のパルスの幅が異なることになり、送信された波形が伝搬して重ね合わさった際に打ち消されずに残る成分が雑音となる。3.動作試験水中および寒天中での3次元撮像により性能評価実験を行なった。視野角や撮像可能距離、解像度などの性能を評価した。試作したシステムは、距離150mmにある直径3mmのスチールボール、直径3mmのシリコンロッドなどの3次元像を、1回の送受信で得ることが可能であった。一方、送信素子の感度の向上と、素子および電子部品の実装の高密度化が今後の課題であることがわかった。
ヒト免疫不全症ウイルスの転写制御機構に関する研究

生体高分子は生体内で様々な分子と相互作用し、相互に調節もしくは作用を及ぼし合っている。そこで、我々はHIVの感染細胞内での転写活性を正に調節するNF-kBの主要サブユニットp65と直接に相互作用する宿主蛋白因子を酵母を利用したtwo-hybrid screen法で分離同定し、さらにその機能解析を進めてきた。これまでに既に7つの新しいp65相互作用因子を同定した。この数は単独研究期間としては世界一である。今年度はそのような因子の一つとしてAKIP1蛋白を同定した。AKIP1はPKAに結合して核に局在する蛋白として以前に報告されていたものであるが、p65との結合が酵母two-hybrid screenで見つかり、in vitro pull down assayおよび生細胞内でもIP-Western blot法で確認された。AKIP1が存在することによってp65(NF-kB)の核内への移行が促進され、かつNF-kBの転写因子としての活性を正に調節するp65の中央部位Ser276のPKAによるリン酸化が促進されることがわかった(Gao, et. al.J Biol Chem 283:7834-7843,2008)。また、AKIP1の発現量は細胞ごとに著しく異なるが、AKIP1が多い細胞ではPKAシグナルとNF-kB活性化シグナルは相乗的に作用するが、AKIP1がほとんど発現しない細胞ではPKAシグナルによってNF-kB活性化シグナルの抑制が起こる事が分かった(論文準備中)。今後は、感染細胞内でのHIV潜伏感染の維持におけるAKIP1の役割を追求してゆく予定である。他方、1999年に報告した別のp65相互作用蛋白RAIは胎盤組織に発現し、trophoblastの分化に重要な役割を演じており、その際に別の転写因子Sp1と相互作用していることを明らかにした(Minekawa, et. al.Endocrinology 148:5803-5810,2007)。これらの研究は、HIVの潜伏感染の維持と活性化にAKIP1やRAIなどのp65相互作用因子が重要な役割を持つ事を示し、これらの分子過程を制御していることを示唆する。平成18年度の研究計画に従い、TatとNF-κBによるHIVの転写制御機構を追究した。まず、HIVのTatとTAR, P-TEFbからなる複合体立体構造を計算化学の手法により予測した。その後、TARやCuclin T1との接触部位のアミノ酸残基の変異体を作成し、実際に活性を失うことを確認したところである(論文準備中)。また、遺伝子発現プロフィール解析を実施し、Tatが酸化ストレスDNA傷害に対する修復酵素であるOGG1を転写誘導することを明らかにした。TatはOGG1の転写を負に調節するAP-4に作用し、TatはAP-4と結合し、OGG1プロモーターからAP-4を引き離すことによってその転写を促進することが分かった。

OGG1をノックダウンするとHIV感染によるDNAの酸化修飾の結果8-OH-dGが多量につくられるが、TatがOGG1を誘導することによってその蓄積が抑制されることを示し、Tatはfeed-forwardのメカニズムによりOGG1を産生し、HIVゲノムの変異を未然に防いでいることがわかった[Imai, K.et al.: J.Biol.Chem.280:126701-26713,2005.]。さらに、AP-4はHIV潜伏感染細胞のHIVプロウイルスのTATAボックス近くに結合し、しかもHDACをリクルートすることによってHIV転写を著明に抑制し、NF-κB活性化により直ちに遊離することを明らかにした[Imai, K : J.Biol.Chem.,281:12495-125]6,2006.]。他方、NF-κB相互作用分子については、そのp65サブユニットの中央部分やC末部分と結合する蛋白の遺伝子クローニングを進め、すでに報告した6種類の蛋白とは別の蛋白を見出し、現在そのうちの2種類を詳細に調べている。HIVの複製の律速段階は転写の段階であるので、主に宿主細胞中の転写因子、NF-kBとAP-4、によるそれぞれ転写活性化と転写抑制(潜伏感染)の分子機構を追求した。(1)NF-kBは誘導型転写因子であり、種々の細胞内シグナル伝達分子による活性制御を受けている。我々は、NF-kBを構成し転写活性化ドメインを持つp65サブユニット蛋白と相互作用する宿主因子を酵母two-hybrid screeningにて遺伝子クローニングを行ない、今年度は第7番目の因子としてAKIP1を同定した(J Biol Chem 283: 7834-43, 2008)。核内因子AKIP1はp65およびPKAcと結合し、PKAcによるp65のSer276リン酸化を促進してその転写活性化能を高め、p65の核内移行を著しく促進することを見出した。(2)Noraristeromycin(NAR)は、NF-kB活性化に必要なIKKαを特異的に阻害することによって細胞内に慢性潜伏感染するHIVの複製を抑制することを見出した(論文投稿中)。(3)TatによるHIV-1転写活性化機構を分子および原子レベルで解明するために、計算化学の各手法を用いてTat-TAR-Cyclin T1の分子複合体の立体構造を予測し、相互作用を阻害する化合物がTat作用を部分的に抑制することを初めて見出した(投稿準備中)。
造血幹細胞移植後のアデノウイルス感染症に対する細胞療法の開発

アデノウイルス(AdV)感染症は、造血幹細胞移植後などの高度な免疫不全状態では致死的となることがある。AdVに対して十分な有効性を有する抗ウイルス剤は現在のところないため、健常人の末梢血中に存在するAdV抗原特異的T細胞を、体外で増幅してAdV感染症の患者に投与するAdV抗原特異的T細胞療法の研究が行われている。健常人の末梢血中のAdV抗原特異的T細胞の頻度は低いため、AdV抗原特異的T細胞療法の実用化には、AdV抗原特異的T細胞を効率よく体外で増幅する方法が必要である。T細胞の活性化には、T細胞受容体を介した抗原特異的な刺激に加えて、共刺激分子を介した刺激も必要であるため、ウイルス抗原特異的T細胞を効率よく体外で増幅するために、共刺激分子を発現する抗原提示細胞を使用することがある。しかし、抗原提示細胞の準備には時間と労力を要する。一方で、共刺激分子に対する抗体(抗CD28抗体や抗4-1BB抗体など)は、必要な時に細胞培養系に添加するだけでいい利点がある。そこで、これらの抗体の有用性について検討したところ、抗4-1BB抗体を用いることにより、抗原提示細胞を使用せずに、簡便かつ効率よく健常人の末梢血単核球からウイルス抗原特異的T細胞を誘導できることが明らかになった。また、AdVのヘキソン蛋白全体をカバーするオーバーラップペプチドプールを用いて、AdV抗原特異的T細胞を誘導する系を確立した。ウイルス蛋白由来の単独のペプチドでは、特定のHLAをもつドナーからしかAdV抗原特異的T細胞を誘導できないが、この系ではHLAの種類に関係なく、AdV抗原特異的T細胞を誘導することができ、汎用性が高い利点がある。これらの研究成果は、AdV以外のウイルス感染症に対する細胞療法にも応用可能であり、造血幹細胞移植後のウイルス感染症に対する細胞療法の実用化に向け、非常に重要な知見が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。アデノウイルス(AdV)は51の血清型に分類されるDNAウイルスであり、造血幹細胞移植後などの高度な免疫不全状態では、致死的な感染症となることがある。AdVに対して十分な有効性を有する抗ウイルス剤は現在のところないため、AdV抗原特異的T細胞を用いた細胞療法の研究が行われている。欧米ではAdV血清型5に特異的なT細胞を用いた細胞療法が試みられ、その有効性が報告されている。一方、本邦における移植後のAdV感染症としては、AdV血清型11によるものの報告が多いため、本研究ではAdV血清型11感染症に対する細胞療法を実現することを目的とした。その第一歩として、日本人に最も多いHLAである、HIA-A^*24:02に拘束されるAdV抗原特異的T細胞が認識するエピトープを同定することを目的とした。まず、AdV血清型11のhexon蛋白からできうる、nonamer peptideの内、HLA-A24 (A*24:02)に結合するペプチドを、BIMAS解析ソフトウエアおよびMHC stabilization assayにより10種類選択した。次に、HLA-A*24:02を有する健常人より分離した末梢血単核球をこれらの10種類のペプチドで刺激したところ、3種類のペプチドに対して特異的なCD8^+T細胞が誘導された。その内、TYFNLGNKF (TYF)ペプチドに対して特異的なT細胞のみがAdV血清型11を感染させた、HLA-A*24:02を有する細胞に対してIFN-Yを産生した。また、TYF特異的CD8^+T細胞は、TYFペプチドを添加したHLA-A*24:02を有する細胞に対して細胞傷害活性を示したが、同ペプチドを添加したHLA-A*24:02を有しない細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった。以上より、TYFペプチドがHLA-A*24:02拘束性AdV血清型11抗原特異的T細胞のエピトープであることが明らかになった。さらに、HLA-A*24:02を有するAdV血清型11感染症患者において、末梢血中にTYF特異的CD8"T細胞が出現するとともに、AdV感染症が軽快した。従って、TYF特異的CD8^+T細胞はin vivoにおいてAdV血清型11を排除でき、AdV血清型11感症にしてTYF的CD8^+T細胞を用いた細胞が用である可能性が示された。

一方で、共刺激分子に対する抗体(抗CD28抗体や抗4-1BB抗体など)は、必要な時に細胞培養系に添加するだけでいい利点がある。そこで、これらの抗体の有用性について検討したところ、抗4-1BB抗体を用いることにより、抗原提示細胞を使用せずに、簡便かつ効率よく健常人の末梢血単核球からウイルス抗原特異的T細胞を誘導できることが明らかになった。また、AdVのヘキソン蛋白全体をカバーするオーバーラップペプチドプールを用いて、AdV抗原特異的T細胞を誘導する系を確立した。ウイルス蛋白由来の単独のペプチドでは、特定のHLAをもつドナーからしかAdV抗原特異的T細胞を誘導できないが、この系ではHLAの種類に関係なく、AdV抗原特異的T細胞を誘導することができ、汎用性が高い利点がある。これらの研究成果は、AdV以外のウイルス感染症に対する細胞療法にも応用可能であり、造血幹細胞移植後のウイルス感染症に対する細胞療法の実用化に向け、非常に重要な知見が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。第一の目標である、アデノウイルス抗原特異的T細胞のエピトープを同定することに成功した。HLA-A^*24:02拘束性のアデノウイルス抗原特異的T細胞のエピトープを同定することに成功した。しかし、その末梢血中の頻度が極めて低いことが明らかになったため、HLA-A^*24:02を有する健常人の末梢血単核球より、アデノウイルス血清型11抗原特異的T細胞をstreptamerを用いて分離し、直接患者に輸注する細胞療法を行うことは困難であることが明らかになった。そこで、現在は、アデノウイルス抗原特異的T細胞を体外で効率よく増やすことを目的とした研究を行っている。