hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液を用いたp53変異遺伝子検出による口腔癌診断法の臨床応用

口腔は消化管の入り口であり、視認性は高い部位である。一方で、出現する疾患は歯牙に関連した炎症から、悪性疾患まで多様であり、鑑別には苦慮する。癌の診断を確定するためには生検が必要である。その外科的侵襲により癌細胞の播種、転移を促進する可能性が指摘され、早期発見、非侵襲的処置による診断が予後の向上に必要である。経時的に採取可能であること、非侵襲的に採取可能である唾液を特異的な腫瘍マーカーとして利用可能であるか基礎的研究を試みた。マウスに口腔癌由来細胞株HSC-3を同所性移植し顎下腺を摘出した。同時にHSC-3のp53遺伝子の変異部位を同定し、PCRに必要な特異的なプライマーを作製した。これを既知のβグロビン由来のプライマーとの検出感度の確認し同程度の感度を有することが確認できた。近年、早期癌での発見、加療が予後を向上させるため、種々の癌において早期診断の有用性が報告されている。一方、口腔癌は視認されやすい部位に存在するが、解剖学的に複雑であること、種々の粘膜疾患があり、専門家でなければ癌の診断に苦慮することも多い。また、確定診断を得るために病理組織診断を用いるが、癌に外科的侵襲を加えることは癌転移の促進につながる報告もあるため可能なかぎり非侵襲的診断にて確定診断ができることが望ましい。この非侵襲的検査を唾液中に存在する微量癌細胞を検出することにより有用な腫瘍マーカーであるか研究することを目的としている。平成21年度は、基礎研究を主体に行い。目的の口腔扁平上皮癌由来細胞株であるHSC-2,3,4を培養し,ヌードマウス舌に口腔扁上皮癌樹立細胞株(HSC-2,3,4)を各50匹に同所性移植しマウス顎下腺を採取した。この顎下腺に含有されている唾液よりβグロビン遺伝子を用いたPCR法での癌細胞の検出を試みている。これまで、担癌マウスからの血液中からの癌細胞は検出が確認されているため。唾液からの遊離癌細胞を検出することは口腔癌診断において有用性が高いと考えられる。また、口腔癌の約半数はp53遺伝子に変異を有する報告もあり、癌特異的遺伝子としてマウスに移植したHSC-2,3,4においてもSSCP法を用いてhot spot部位の塩基配列の解読し、どのような遺伝子変異を有しているか確認中である。22年度はp53遺伝子変異を用いた特異的なプライマーを用いた癌細胞の検出を試みる。HSC-2,3,4の変異特異的プライマーを作製に関しては21年度に断続して取り組み、PCRを用いてβグロビン遺伝子、遺伝子変異部位の検出を試みる。近年、癌の根治性を求めるためには、より早期での癌の発見、早期加療が予後の向上に寄与することが明らかとなり、各種がん検診や特異的な腫瘍マーカーを用いた検出、診断が試みられている。平成22年度は、基礎研究をさらに重ねて、平成21と同様に、口腔扁平上皮癌由来細胞株であるHSC-2,3,4を培養し,ヌードマウス舌に口腔扁上皮癌樹立細胞株(HSC-2,3,4)を各50匹に同所性移植しマウス顎下腺を採取した。また、口腔癌の約半数はp53遺伝子に変異を有する報告もあり、癌特異的遺伝子としてマウスに移植したHSC-2,3,4においてもSSCP法を用いてhot spot部位の塩基配列の解読し、どのような遺伝子変異を有しているか検討した。p53遺伝子変異を用いた特異的なプライマーを用いた癌細胞の検出を試みた。
省タングステンバインダーレス超硬材料の開発

WC、Mo2C、SiCとC粉末から、常圧焼結法によって(W, Mo)C-SiC硬質セラミックスを作製することを試みた。まず、最適な焼結温度を確定し、得られた焼結体の微細組織と機械的性質について調べた。出発原料として、WC、α-Mo2C、α-SiC、ケッチェンブラックの各粉末を使用し、W0.8Mo0.2C-x mol%SiC (x = 020)の組成になるように秤量し、ナイロン製ボールミルで混合した。粉末はCIP成形し、Ar雰囲気中で1800°Cと1900°Cで焼結した。得られた試料は、鏡面研磨後、XRD、SEM、TEMを用いて組織観察と分析を行い、機械的性質および熱伝導度を測定した。その結果、以下の点が明らかになった。SiCの添加により、(W, Mo)C硬質セラミックスの焼結性が大幅に改善され、1900°Cで常圧焼結によって緻密に焼結できた。SiCの添加は、反応焼結による(W, Mo)C相の生成を促進し、焼結後の未反応のMo2Cの残留はなかった。SiC添加量の増加に従って、焼結体のヤング率が僅かに低下したが、ビッカース硬さと破壊靭性値はほぼ変わらなかった。温度の上昇と焼結時間の増加による結晶粒の増大のため、常圧焼結により作製した試料は通電加圧焼結により作製した試料より硬さは低くなったが、ヤング率と破壊靭性値はほぼ同じであった。SiCの添加量が20 mol%までは、(W, Mo)C-SiC硬質セラミックスは600 GPa以上のヤング率, 20 GPa以上のビッカース硬さ, 5.5 MPa m1/2以上の破壊靭性値の優れた機械的性質を示した。20 mol%SiC添加により、SiC無添加に比べて熱伝導率は約1.6倍増加した。まず,WC-Mo2C-C混合粉末を反応焼結し,焼結体の組織と機械的性質を調べた。原料粉末にWC,Mo2C,Cの各粉末を用い,(1 - x)WC + x/2Mo2C + x/2C→W1-xMoxCの反応が生じるように秤量し,ボールミルにより混合した。焼結は,通電加圧焼結装置で,真空中,焼結温度1700°Cで行った。得られた焼結体は,密度,ヤング率,ビッカース硬さ,破壊靭性値を測定し,XRD,EPMAにより構成相の同定および微細組織の観察を行った。混合粉末は1700°Cで全て緻密に焼結した。反応は,完全ではなく,Mo2Cはx = 0.2までは少量残留し,それ以上では残留量が大きく増加した。ヤング率は,Mo2Cの増加に従って,x = 0.2までは少し低下する程度であったが,それ以上では,低下の度合が大きくなった。硬さもヤング率と同様に変化した。破壊靭性値はMo2Cの添加にほとんど影響を受けなかった。ついで,WC-Mo2C-C混合粉末にさらにSiCを加えて反応性通電加圧焼結し,組織と機械的性質に及ぼすSiCの効果を調べた。粉末の調整はWC-Mo2C-Cの場合と同様に行い,1600 °C1800 °Cで焼結し,同様の焼結体の評価を行った。SiCを添加すると,WC-MoCの焼結温度より低い1600 °Cで全てほぼ緻密に焼結した。SiCを添加しない時とは異なって,x = 0.2までは,残留するMo2Cがほとんどなく,反応が完全に進行した。ヤング率は,SiC量の増加とともに緩やかに低下した。焼結温度がヤング率に及ぼす影響はほぼなかった。ヤング率は,MoC添加量の増加に従って,x = 0.2まで緩やかに低下した。それ以上になると,低下の度合が大きくなった。硬さは,WC-MoCより少し低いが,2122 GPaの範囲にあった。破壊靭性値はSiCの影響を受けなかった。W0.7Mo0.3C粉末、V8C7またはCr3C2粉末から、通電加圧焼結法を用いて、(W, Mo)Cセラミックスを作製し、結晶粒成長防止剤としてのV8C7とCr3C2の微細組織と機械的性質に及ぼす効果を調べた。W0.7Mo0.3C粉末は、まず、WO3とMoO3粉末をWO3-30 mol% MoO3になるようにジルコニアボールのボールミルで混合し、混合粉末を水素中760°C還元して、予備的にW-30 mol% Mo固溶体粉末を作製した。これにカーボンブラックとV8C7またはCr3C2粉末を加えて1200°Cで直接炭化して試料粉末を作製した。得られた粉末を、1700°C、加圧力50 MPa、真空中で通電加圧焼結した。得られた試料は、切断研磨し、粉末X線回折、EPMAで分析した。また、各試料について、密度、弾性率、硬さ測定を行った。V8C7は、焼結性を著しく悪化させ、緻密なセラミックスが得られなかった。このため、結晶粒微細化に効果があるとしても、添加物として不適切であると判断された。

Cr3C2の添加は、0.5 mol%までは焼結性に影響せず、1 mol%では若干低下させた。(W, Mo)C相の平均結晶粒径は、0.5 mol Cr3C2の添加で、無添加の場合の0.62 μmから0.27 μmに減少した。0.5 mol% Cr3C2の添加試料は、ヤング率は無添加の場合と同じで、硬さは22.9 GPaから24.3 GPaに向上し、破壊靭性値は6.08 MPa0.5から5.82 MPa0.5に若干低下させる程度で、機械的性質の向上に有効であった。硬さの向上は、Cr3C2添加による(W, Mo)C相の結晶粒微細化効果によると考えられる。セラミック材料工学本年度では、WC-Mo2C-C混合粉末へSiCを添加し、WC-MoCセラミックスの焼結性、組織、機械的性質へのSiCの効果について調べる計画であった。研究を推進した結果、計画で予想していたように、SiCは(W, Mo)C相の生成を促進するとともに焼結性を向上させることが明らかになり、当初予定していた研究についてはすべて終えることができた。研究が予想通りに進んだため、硬質材料を実用化するときに重要な物性の一つである熱伝導性についても評価した。その結果、SiC添加により熱伝導性が向上するという良好な結果が得られた。本年度では,WC-Mo2C-C混合粉末の反応焼結によるWC-MoCセラミックスの作製について調べる予定であった。この研究は,失敗なく順調に進んだため,平成25年度予定のSiC添加の効果についても続けて調べることにした。その結果,平成25年度研究予定の8割程度まで研究を進めることができた。WCに対するSiCの添加がWCの焼結性を向上させることを平成25年度に明らかにすることができた。しかし、一般的には、焼結性が向上すると、必ずWC結晶粒が成長し、ある程度粗大化する。機械的性質を向上するためにはWC結晶粒成長を防止する必要がある。バインダーレス超硬合金の場合のWC結晶粒成長防止剤については、V8C7とCr3C2が有効であることを本申請者らがすでに報告している。このため、V8C7とCr3C2に的を絞って添加効果を調べる。研究の進行と分担は、昨年度と同様に行う。WC粉末、Mo2C粉末、C粉末、SiC粉末、V8C7またはCr3C2粉末をボールミルを用いて混合し、1800°Cと1900°Cの温度で、常圧焼結する。反応後の試料を切断研磨し、粉末X線回折、EPMA、TEMで分析する。その後、焼結した各試料について、密度、弾性率、硬さ測定を行う。緻密化した試料については、3点曲げ試験片を切り出し、曲げ強度の測定を行う。得られた結果を基に、最適の粒成長防止剤と添加量を決定する。最後に、平成2426年度に得られた結果を総括し、最もWC量を削減できる組成範囲と焼結条件を決定する。平成24年度の研究で,SiCの添加により,WC-MoC固溶体生成の固相反応と焼結反応が促進されることが分かった。この研究では加圧焼結を用いたが,工業生産する場合には,生産性と製品の形状の自由度から,常圧焼結できることが好ましい。そこで,平成25年度では,WC-Mo2C-C-SiC混合粉末を常圧下で反応焼結し,組織と機械的性質に及ぼすSiCと焼結温度の影響を調べ,常圧焼結のための最適条件を見つける。原料粉末にはWC,Mo2C,C,SiCの各粉末を用いる。(1 - x)WC + x/2Mo2C + x/2C→W1-xMoxCの反応が生じるように秤量したWC + Mo2C + C粉末にさらにSiCを加え,ボールミルにより混合する。常圧焼結は,減圧Ar中,焼結温度18001900 °Cで行う。得られた焼結体は,密度,ヤング率,ビッカース硬さ,破壊靭性値を測定し,XRD,EPMAにより構成相の同定および微細組織の観察を行う。なし
神経損傷に対する移植治療の基礎及び臨床研究

基礎実験および臨床研究により神経損傷の評価、治療方法の開発を目的とした研究。基礎実験において現段階では、末梢神経損傷に対する移植療法では、Schwann細胞がdonorとしては優れ、神経幹細胞や骨髄幹細胞では、生着することが困難であった。はじめに:MRIの日本における普及率は他国と比較して格段に大きいといえる。外傷による中枢神経障害、特に脳損傷において、微小出血の評価はこれまで、CTによってのみ行われてきた。しかし、CTでは脳挫傷の描出に限界があり、また骨に囲まれた後頭蓋窩などの描出困難な場所が存在するなどの欠点があった。最近になりMRIを用いて、とくにT2^*強調画像によって微小出血の描出が可能であることが報告され、また、後頭蓋窩の微小な病変の詳細が明らかになってきた。今回、MRI、特に新しい撮像法であるsuseptability weighted imageを用いて、脳損傷患者の脳挫傷における微小出血をほかの画像と比較し、その有用性について検討した。結果:微小出血の検出度に関し、SWI法は常にCTおよびMRIのほかの撮像法よりも鋭敏であった。静脈との鑑別が困難であり、静脈を描出するほかの撮像法が確定診断には必要と考えられた。副鼻腔周辺、脳表では、SWIでの脳損傷の詳細な評価は困難であり、深部白質病変の検出に優れた方法であると考えられた。考察:SWIは脳実質内のdeoxyhemoglobinを鋭敏に描出する撮像法である。微小出血、出血後のhemogidelin沈着などの描出に適していると考えられた。しかし、末梢神経、脊髄に対する同様の評価は非常に困難と考えられた。研究実績(学会発表)第30回日本脳神経CI学会総会秋山幸功、原田邦明、南田善弘、實金清博19年度臨床研究,基礎研究経過報告1.臨床研究臨床研究においてSusceptibility weighted image(SWI)を重症頭部外傷患者に対して施行し,これまで通常のMRI、CTでは発見できなかった微小な脳挫傷(微小脳出血)の画像評価を行った。通常のCT、MRIでは異常なし(脳震盪などの診断)と診断されていた中に微傷出血を伴う脳挫傷が含まれている可能性が示唆された。これまでT2*-weighted imageが最も血腫め描出にすぐれていると考えられてきたが,最近開発されたSWI法の方が描出能に関して優れていた。ただ,頭蓋骨周囲や,頭蓋底部では,空気によるartifactsのため,SWIでは描出困難であった。今後さらにデータを蓄積し,SWIの外傷における有用性について検討したい。2.基礎研究それに対し,donor細胞を骨髄細胞(bone marrow stromal cells)とする移植実験では,骨髄細胞を損傷神経に直接移植してもマクロファージなどによる貪食が起こり,生着する細胞もほとんどなく,神経の再生にまではいたらないことが判明した。次の段階(平成20年度)では,donor細胞は,このまま骨髄細胞を用いるが,in vitroである程度神経系に分化させてから移植する必要性があることが示唆された。臨床研究これまでSusceptibility weightedimage(SWI)の重症頭部外傷患者に対する有用性について検討してきた。通常のMRI撮像、CTでは描出できない微小出血の検出にすぐれ、頭部外傷患者の病態把握に非常に有用であった。逆にSWIは、頭蓋底病変などの検出にはむかず、他の撮像とあわせて診断することが必要であった。臨床研究の結果は下記論文に発表した。基礎研究それに対し、donor細胞を骨髄細胞(bone marrow stromal cells)とする移植実験では、骨髄細胞を損傷神経に直接移植してもマクロファージなどによる貪食が起こり、生着する細胞もほとんどなく、神経の再生にまではいたらないことが判明した。末梢神経では、host由来のSchwann cell、fibroblastの活性が強く、donor細胞が生着することは、非常に困難であることが判明した。
歯胚発生におけるPTH関連ペプチドの役割の解析

PTHrPは種々の胎性組織で発現しているが、その組織発生における役割については不明は点が多い。本研究は、歯の発生におけるPTHrPの発現とその役割を解析することを目的としており、まずラット臼歯歯胚におけるPTHrPとその受容体の遺伝子発現を検索した。その結果、PTHrP遺伝子の発現は主に上皮性のエナメル器の細胞に、その受容体の遺伝子は主に間葉性の歯乳頭細胞や歯胚周囲の骨芽細胞に、それぞ時間および空間特異的な発現パターンを示し、PTHrPが歯の形成に深く関与していることが示唆された。次に、PTHrPの役割を明らかにするため、培養マウス歯胚を用いて以下の実験を行った。胎齢14日のマウス胎仔より蕾状期の歯胚を摘出し、Trowellの系で無血清BGJb倍地を用いて培養した。実験群の倍地には、PTHrPのmRNAに対するアンチセンスオリゴDNA20μMを添加し、2日目毎に倍地と共に交換した。その結果、培養56日目より歯乳頭への周囲の骨組織の侵入が始まり、培養1017日目ではエナメル器にも骨組織が侵入して歯胚が二分され、さらに培養を続けると歯胚は完全に破壊された。しかし、オリゴ無添加、センスオリゴ添加、アンチセンスオリゴ+組替えPTHrP添加の対照群ではいずれも正常な歯胚が形成された。また、PTHrP受容体のmRNAに対するアンチセンスオリゴ添加群では、PTHrPのアンチセンスオリゴ添加群と同様に、歯乳頭への骨組織の侵入が観察された。各群におけるこれらの所見には高い再現性が認められた。以上の結果から、PTHrPは周囲の骨組織の侵入から歯胚を防御する機構に関与しているものと考えられる。つぎに、アンチセンスオリゴ添加群における骨組織の歯胚への侵入の機構を解明するため、破骨細胞の酒石酸耐性酸フォスファターゼ(TRAP)活性に対するアンチセンスオリゴの影響を調べた。その結果、アンチセンスオリゴ添加群では、対照群に比べてTRAP活性が制御されていることが分かった。従って、アンチセンスオリゴ処理によって、破骨細胞の活性が抑制される為、歯胚への周囲から骨組織の侵入が容易になるものと考えられる。胎齢14日のマウス胎仔より蕾状期の歯胚を摘出し、Trowellの系で無血清BGJb培地を用いて培養した。

実験群の培地には、PTHrPのmRNAに対するアンチセンスオリゴDNA20μMを添加し、2日目毎に培地と共に交換した。その結果、培養56日目より歯乳頭への周囲の骨組織の侵入が始まり、培養1017日目ではエナメル器にも骨組織が侵入して歯胚が二分され、さらに培養を続けると歯胚は完全に破壊された。しかし、オリゴ無添加、センスオリゴ添加、アンチセンスオリゴ+組替えPTHrP添加の対照群ではいずれも正常な歯胚が形成された。また、PTHrP受容体のmRNAに対するアンチセンスオリゴ添加群では、PTHrPのアンチセンスオリゴ添加群と同様に、歯乳頭への骨組織の侵入が観察された。各群におけるこれらの所見には高い再現性が認められた。以上の結果から、PTHrPは周囲の骨組織の侵-入から歯胚を防御する機構に関与しているものと考えられる。本年度は、歯胚発生におけるPTHrPの役割をさらに詳細に解析することを目的として、培養マウス歯胚を用いて以下の実験を行った。胎齢14日のマウス胎仔より蕾状期の歯胚を摘出し、Trowellの系で無血清BGJb培地を用いて培養した。以上の結果から、PTHrPは周囲の骨組織の侵入から歯胚を防御する機構に関与しているものと考えられる。つぎに、アンチセンスオリゴ添加群における骨組織の歯胚への侵入の機構を解明するため、破骨細胞の酒石酸耐性酸フォスファターゼ(TRAP)活性に対するアンチセンスオリゴの影響を調べた。その結果、アンチセンスオリゴ添加群では、対照群に比べてTRAP活性が抑制されていることが分かった。従って、アンチセンスオリゴ処理によって、破骨細胞の活性が抑制される為、歯胚への周囲からの骨組織の侵入が容易になるものと考えられる。
正の選択を介して決定されるT細胞の生体防御機能

正の選択は、胸腺細胞が発現する抗原受容体と胸腺皮質上皮細胞上の自己ペプチド-MHC複合体との親和性に基づいて、生体に有用な幼若T細胞を選別し、T細胞レパトアを決定する機構として知られてきた。しかし最近、胸腺皮質上皮細胞における自己ペプチドの産生を担い、正の選択に中心的な役割を果たす胸腺プロテアソームが発見されたことで、正の選択の意義を再考する機会が生じた。本研究は、胸腺プロテアソーム欠損マウスの胸腺で分化したモノクローナルT細胞の機能解析を通じ、正の選択がT細胞のレパトアのみならず、抗原応答性や記憶形成に影響を及ぼすことを見出した。これによりT細胞分化における正の選択の新たな役割が解明された。胸腺における正の選択は、抗原受容体(TCR)の構造に基づいて有用なT前駆細胞を選別し、T細胞の抗原認識特異性レパトアを決定する機構として長い間認識されてきた。しかし最近、正の選択を誘導する自己ペプチドの産生を担う胸腺プロテアソームが発見されたことで、正の選択の意義を再考する機会が生じた。本研究では、胸腺プロテアソーム欠損マウスの解析を通して、正の選択を介したT細胞の機能制御機構を明らかにすることを目的としている。本研究課題の初年度である平成26年度は、これまでの予備的知見に基づいて、胸腺プロテアソーム欠損下で分化した各種モノクローナルTCR発現T細胞の機能を詳細に解析した。抗原応答性を評価するために抗CD3抗体および抗CD28抗体、あるいは特異的MHCテトラマーによる刺激を加えたところ、活性化マーカーの発現が低下していた。さらに、刺激後のカルシウム流入とERKのリン酸化の低下、定常状態でのTCRzeta鎖の部分的リン酸化の低下が認められたことから、TCRシグナル経路の上流部分における異常が抗原応答性の低下につながっていると考えられた。また、胸腺細胞の各分化ステージにおいて、TCRシグナル強度の指標となるCD5の発現を解析したところ、胸腺プロテアソーム欠損下では、正の選択シグナルを受けた直後の細胞でCD5の低下が見られたことから、より低い親和性の自己ペプチドによって選択を受けていることが示された。さらに、胎仔胸腺培養によって、親和性の異なるペプチドによって分化誘導されたモノクローナルTCR発現T細胞の機能を検討したところ、TCR-ペプチド間の親和性と抗原応答性に相関が認められた。以上の成果をまとめ、現在専門誌に投稿中である。胸腺における正の選択は、生体にとって使用可能な抗原受容体を発現する胸腺細胞を分化段階で選別し、T細胞の抗原認識特異性レパトアを決定する機構として広く認識されてきた。しかし、その生理的意義については、未だ不明な点が多いのが現状である。本研究では、正の選択において中心的な役割を担う胸腺プロテアソームに注目して、正の選択の新たな意義を検討することを目的としている。平成27年度は、胸腺プロテアソーム欠損マウスを用いたこれまでの解析に基づいて、自己親和性マーカーであるCD5の発現レベルと、各種の改変抗原ペプチドを用いたマウス胎仔胸腺培養によって明らかにした。この結果から、正の選択が抗原受容体と自己ペプチド-MHC複合体との親和性に基づいて抗原応答性を規定することが示された。これまでに蓄積してきた、胸腺プロテアソーム欠損マウスのCD8T細胞における抗原応答性の異常、抗原受容体シグナルの異常、末梢における維持の異常、リステリア菌感染応答の異常といった知見と合わせて専門誌に報告した(Takada et al., 2016 Nature Immunology 16: 1069-1076)。以上の成果により、正の選択がT細胞レパトアのみならず、抗原応答性を規定することで獲得免疫系の形成に関与するという、正の選択の新たな生理的役割の一端が解明された。胸腺プロテアソームを介した正の選択の新たな役割を学術誌に報告したことで、一定の成果を得た。この報告は、主にin vitroでの抗原応答に着目したものであるため、現在、生体内免疫応答、生体防御において正の選択を介したT細胞の機能的教育がどのような役割を担っているかの検討に着手している。獲得免疫系は抗原特異的な免疫応答を引き起すことで、生体防御に不可欠な役割を果たす。その主役であるT細胞が非自己抗原に対して特異的に反応する能力は胸腺での分化過程で形成され、胸腺では、抗原提示細胞上の自己ペプチドに対して低い親和性をもった幼若T細胞のみが選択的に分化誘導される(正の選択)。正の選択は生体にとって有用な抗原特異性レパトアの形成に重要な機構として知られているが、正の選択の過程で惹起される微弱なTCRシグナルが成熟T細胞の抗原応答性に影響を与えることが、我々を含むいくつかのグループから最近相次いで報告され、正の選択の新たな役割として注目されている。一方、胸腺プロテアソームをはじめとする胸腺固有のタンパク質分解機構が、正の選択を誘導する自己ペプチドの産生を担うことが近年明らかとなってきた。本研究では、正の選択が分化段階で個々の細胞の抗原応答性を規定するという前年度までの知見に基づき、平成28年度は、正の選択を介したT細胞の機能的教育の意義を個体レベルで検討した。放射線照射した胸腺プロテアソーム欠損マウスにOT-I TCRトランスジェニックマウスから得られた骨髄を移入することで、胸腺プロテアソーム非依存的に正の選択を受けたOT-I T細胞を作成した。

このナイーブOT-I T細胞をレシピエントマウスに移入し、卵白アルブミン由来ペプチドでパスルした樹状細胞とCpGアジュバントを用いて、生体内で活性化させた。ドナーOT-I T細胞の数と表現系を経時的に観察したところ、記憶形成期において短命エフェクター細胞の分化亢進が見られた。また、in vivoでの二次刺激に対する記憶OT-I T細胞の増殖応答に顕著な障害が認められた。このことから、正の選択はT細胞の記憶形成能に影響することが推察され、さらなる詳細な検討を進めている。正の選択は、胸腺細胞が発現する抗原受容体と胸腺皮質上皮細胞上の自己ペプチド-MHC複合体との親和性に基づいて、生体に有用な幼若T細胞を選別し、T細胞レパトアを決定する機構として知られてきた。しかし最近、胸腺皮質上皮細胞における自己ペプチドの産生を担い、正の選択に中心的な役割を果たす胸腺プロテアソームが発見されたことで、正の選択の意義を再考する機会が生じた。本研究は、胸腺プロテアソーム欠損マウスの胸腺で分化したモノクローナルT細胞の機能解析を通じ、正の選択がT細胞のレパトアのみならず、抗原応答性や記憶形成に影響を及ぼすことを見出した。これによりT細胞分化における正の選択の新たな役割が解明された。胸腺プロテアソームの欠損下、すなわち正の選択が障害された条件下で、T細胞の機能にどのような機能的異常が生じるかについて明らかにすることができた。また、このようにして生じた機能異常の分子メカニズムについては、シグナル異常の一端を示すことができた。一方、マイクロアレイ解析から責任分子を見出すことができなかったため、当初の計画を一部変更して、現在解析を進めている。平成28年度は胸腺プロテアソーム欠損下で分化したモノクローナルCD8T細胞が生体内でどのように特異的抗原に応答するかをレシピエントマウスへの移入実験により検討する。すでにエフェクター細胞の分化について検討を開始しており、順調に進行すれば、記憶細胞の分化までを検討する予定である。免疫生体防御平成27年度は、正の選択が障害されることで生じるT細胞の機能異常の分子メカニズムの解明を目指す。これまでTCRシグナル制御分子の発現レベルの変化に着目して解析を進めてきたが、明快な答えが得られていないことから、過去の報告をもとに、細胞内分布との関連を検討する予定である。すでに実験に着手している。また、当初の計画通り、正の選択を引き起こす自己ペプチドの特性の解明を目的とした実験に着手する。こちらについてはすでに実験系を確立しており、必要な実験材料(マウス、ペプチド)は入手済みである。平成28年度3月の納品となり、支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。平成27年3月納品となり、支払いが完了していないため次年度使用額が生じた。平成28年度4月に支払い予定である。平成27年4月に支払い完了予定である。
網膜ジストロフィーマウスの発育過程における視物質の分布とその糖化

近交系マウス020/A系には網膜変性症をともなうrdsというミュータントマウスが存在する.このマウスの網膜視細胞は発育初期から変性し,外節を派生しない.本研究ではヒトの網膜色素炎のよきモデルとなるこのマウスを用いて,視物質(オプシン)の合成が発育とともにどのような変化をし,また視細胞のどこに存在するかを,免疫生化学,免疫細胞化学により調べた.網膜細胞膜分画のimmunoblotによる研究では,正常マウスでは,生後10日目よりオプシン合成ははじまり,その後,生長とともにその量は増加する.しかし, rdsマウスでは,同様に生後10日目よりオプシンは合成されるが15日目頃をピークとして,徐々に減少し, 20日目以降ではback groundレベルにおちてしまう.また,全体量も正常マウスにくらべると非常に少ない.一方免疫細胞化学による研究では,正常,ミュータントとも生後5日目よりのびたばかりの結合線毛上にオプシンを検出する.正常マウスでは10日目頃より結合線毛の先端よりラメラ状の外節が形成されはじめ,そこにオプシンの集積が観察される.この傾向は発育とともにより一層強くなる.しかし, rdsマウスでは, 10日目以後も外節は形成されず,オプシンはもっぱら結合線毛に集積するが,それと同時に内節形質膜にも拡散し,その局在は正常とは全く異る線を与えている.また, rdsマウスでは結合線毛の先端に外節が形成されないかわりに,そこから,形質膜のvesiculationがはじまり,細胞外への離脱が観察された.そして, 20日目以降ではどこにもオプシンは認めらなかった.^3Hマンノースを用いオプシンの糖化度を調べた結果, rdsオプシンの方が多くのマンノースを付着させていることがわかった.近交系マウス020/A系には網膜変性症をともなうrdsというミュータントマウスが存在する.このマウスの網膜視細胞は発育初期から変性し,外節を派生しない.本研究ではヒトの網膜色素炎のよきモデルとなるこのマウスを用いて,視物質(オプシン)の合成が発育とともにどのような変化をし,また視細胞のどこに存在するかを,免疫生化学,免疫細胞化学により調べた.網膜細胞膜分画のimmunoblotによる研究では,正常マウスでは,生後10日目よりオプシン合成ははじまり,その後,生長とともにその量は増加する.しかし, rdsマウスでは,同様に生後10日目よりオプシンは合成されるが15日目頃をピークとして,徐々に減少し, 20日目以降ではback groundレベルにおちてしまう.また,全体量も正常マウスにくらべると非常に少ない.一方免疫細胞化学による研究では,正常,ミュータントとも生後5日目よりのびたばかりの結合線毛上にオプシンを検出する.正常マウスでは10日目頃より結合線毛の先端よりラメラ状の外節が形成されはじめ,そこにオプシンの集積が観察される.この傾向は発育とともにより一層強くなる.しかし, rdsマウスでは, 10日目以後も外節は形成されず,オプシンはもっぱら結合線毛に集積するが,それと同時に内節形質膜にも拡散し,その局在は正常とは全く異る線を与えている.また, rdsマウスでは結合線毛の先端に外節が形成されないかわりに,そこから,形質膜のvesiculationがはじまり,細胞外への離脱が観察された.そして, 20日目以降ではどこにもオプシンは認めらなかった.^3Hマンノースを用いオプシンの糖化度を調べた結果, rdsオプシンの方が多くのマンノースを付着させていることがわかった.
核酸塩基の自己組織化に基づく配位プログラムを活用した高次配列制御

本研究では、相補的な水素結合能および不斉会合特性を有する核酸塩基の自己組織化に基づく配位プログラムにより発光特性や触媒能を有する機能性金属錯体の機能創発的な緻密配列制御を行い、本来の機能物質の機能を越えた、または全く別の機能を有する機能性超構造分子システムの創製を目的とする。本年度は昨年度の知見をもとに、ウラシル部位を有するピンサー型パラジウム錯体の設計合成と会合特性について検討を行った。金属導入部位として、三座のNCNピンサー型配位子に着目した。ピンサー型配位子をウラシル誘導体に導入し、パラジウム塩と錯形成させることでウラシル部位を有するパラジウム錯体を合成した。得られたパラジウム錯体の補助配位子を変化させ、会合特性について検討を行った。パラジウム中心にアセトニトリルが配位したカチオン性パラジウム錯体Pd-MeCN、および水が配位したカチオン性パラジウム錯体Pd-H2Oの結晶構造では、ウラシル部位間での水素結合に基づく二量体の形成が確認された。また、ウラシル部位やベンゼン環部位でのπーπ相互作用により、二量体がπスタックにより配列制御されていることが明らかとなった。一方、補助配位子としてトリフラートアニオンを有するパラジウム錯体Pd-OTfにおいては、ウラシル部位と配位子のトリフラートアニオンが水素結合を形成し、ウラシル部位間での水素結合による二量体の形成は見られなかった。以上の結果から、補助配位子の効果により、会合制御が可能であることが明らかとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、高次構造および不斉会合特性を有する生体分子を土台分子として着目し、自己組織化に基づく配位プログラムにより発光特性や触媒能を有する機能性金属錯体の緻密配列制御を行い、機能性超構造分子システムを創製することを目的とする。本年度は、ウラシル部位を有するピンサー型金属錯体の設計合成と会合特性について検討を行った。ピンサー型金属錯体は特異的な配位形態により金属中心が安定化され、触媒活性や発光特性を示すことが知られている。ウラシル部位を有するNCNピンサー型金属錯体を合成し、固体状態における構造特性について検討を行った。ピンサー型配位子と6位にエチニル基を導入したウラシル誘導体をカップリングすることにより、ウラシル部位を有するピンサー型配位子を合成した。ピンサー型配位子と白金あるいはパラジウム塩との反応により、対応するNCNピンサー型金属錯体Pt-MeCNおよびPd-MeCNを得た。NCNピンサー型白金(II)錯体Pt-MeCNのX線結晶構造解析を行った結果、ウラシル部位間の水素結合に基づくダイマーが形成されていることが明らかとなった。また、NCNピンサー型金属錯体Pt-MeCNおよびPd-MeCNの細胞増殖抑制作用に関して、ヒト癌細胞株を用いて検討を行ったところ、高い細胞毒性を示すことが明らかとなった。本研究では、高次構造および不斉会合特性を有する生体分子を土台分子として着目し、自己組織化に基づく配位プログラムにより発光特性や触媒能を有する機能性金属錯体の緻密配列制御を行い、機能性超構造分子システムを創製することを目的としている。これまで、相補的な水素結合能、不斉会合特性および配列・組合せが可能な核酸塩基に着目し、自己組織化に基づく配位プログラムにより機能性金属錯体の高次配列制御および機能特性について展開してきた。特に平成24年度は、触媒や発光特性を有するピンサー型金属錯体部位を導入したウラシル誘導体を設計合成し、固体状態における会合特性について明らかにしている。平成25年度に展開を予定している機能性金属錯体の配列制御に基づく触媒機能化のための重要な知見が得られており、目的達成にむけ順調に研究が進展していると考えられる。

平成24年度までに得られた知見をもとに、自己組織化に基づく配位プログラムによりオクタマーやカラム状超構造体を構築するとともに、超構造体形成に基づく発光や触媒特性などの特異機能を解明する予定である。さらに、不斉組織化オクタマーを配位子とする不斉組織化反応場の開発を行う。また、自己組織化に基づく配位プログラムによって金属活性中心やπ共役系部位が分子レベルで精密制御された人工DNA型超分子錯体を開発するとともに、不斉二重らせん構造に起因する不斉場を利用した不斉反応空間場としての位置づけを行いたいと考えている。pH変化や外部刺激に基づく発光特性や触媒能の動的機能制御を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
開発途上国における人口動態と農村の持続的開発

この研究は、ナイル川上流のエジプト国アシュート州の農村を対象とし、人口動態と発展持続性の相互関係の解明を目指すものである。そして、人口の動態の理論に空間の概念を組み入れることをもう一つの目的としている。平成17年度は、以下の調査研究を実施した。人口動態と発展持続性に関する過去の研究事例から、特に発展途上国間の地理的配置に関する研究に焦点を当てて文献を調査した。出生率と越境労働に関する聞き取り調査の結果をデータベース化した。エジプト国のセンサスデータを購入し、データベース化した。Landsat/TMならびにLandsat/MSSデータを複数の年次について購入し、GIS化したうえで、調査対象の土地利用/土地被覆の抽出に最適な分類手法を探索した。これら一連の調査研究の結果、以下のことが明らかになった。1976年から1996年の間にアシュート州の農村の人口はおよそ2倍に増加したが、村落間の人口密度の格差は約1/4に減少したことが明らかになった。この地域の人口の分布は、人口増加に伴いより一様化、等質化していると考えられる。アシュート州の農村の人口動態は、相互に関連した社会構造要因と環境要因との混合によって説明づけられるが、とりわけ、肥沃な土壌と、数百年におよぶ農村の伝統によって形成された低い教育水準と女性の労働参加、高い出生率、高い人口密度をもつこの調査地では、農地の開拓が人口動態に決定的に影響を与えている。また、農地の分布形態が村落間の人口格差の一因になっている可能性が示唆された。さらに、土地利用区分図と人口分布図を結合させて実施した解析から、人口分布のクラスター構造が、土地利用の境界効果の影響を受けている可能性が示唆された。H16年11月29日に来日以来,4ヶ月間に実施したことは下記の通りである.1)人口動態に関する文献調査2)現地調査(H17年3月2日3月16日)現地調査はエジプト・アシュート州で実施した。社会経済的データおよび人口データを収集するとともに,アンケート調査を実施した.その他に,地理的情報に関するデータも収集した.この研究は、ナイル川上流のエジプト国アシュート州の農村を対象とし、人口動態と発展持続性の相互関係の解明を目指すものである。
動的・多方向載荷実験に基づく柱の残留傾斜角を用いた建物の残存耐震性能の解明

本研究は,地震動を受ける鉄骨造建物に生じる被害状況から各被害レベルに対応する建物の残留変形角の関係を詳細かつ明快に示すこと,またそのツールについて検討を行うことを目的とする.前者については応答解析の結果,(1)FAランクであっても50kine,75kineの入力に対して大きな残留変形角が生じた,(2)BMu/Mpc=1.3や1.1の場合,比較的大きな残留変形角が生じた,(3)大きな残留変形角を生じる入力波に明確な傾向はない,ことが判明した.後者に関しては,応力発光塗料が大きな応力を生じた瞬間に発光し,それを保持することが難しいこと,カメラ等の検出システムや発光状況の数値化が必要と思われる.柱の残留傾斜角は建物の損傷を直接表す計測しやすい項目であり,被災度区分判定などでも,過去の研究例や地震被害事例をふまえて設定された柱の残留傾斜角の値により,建物の被害状況を判断する指標の1つとして使用されている.しかし,実のところ柱の残留傾斜角の値が建物全体としてどのくらい深刻な被害程度を示しているのかはよくわかっていない.より正確に建物の被害程度を見極め,速やかで的確な復旧に資するためには柱の残留傾斜角の値がどの程度の建物の残存変形性能を表すのかを明確にする必要がある.本年度は,柱の残留傾斜角と建物の損傷度を包括的にとらえるため,既往の骨組実験を元に作成した骨組応答解析により,建物の最大層間変形角と梁端の損傷度との関係を検討した.梁端の損傷度は,層ごとの損傷として梁端における等価累積塑性変形倍率を用いた.柱脚が保有耐力接合である柱脚耐力比BMu/Mpc=1.3のモデルの解析結果と,柱脚が非保有耐力接合であるモデルの代表として柱脚耐力比BMu/Mpc=0.7のモデルの解析結果(入力地震動のPGVを極大地震動に相当するPGV=75[cm/s]に基準化した入力地震動6波分に対する解析結果の平均値,部材種別FAの場合)を比較する.3層モデルでは,柱脚が保有耐力接合である柱脚耐力比BMu/Mpc=1.3のモデルと比較し,柱脚が非保有耐力接合である柱脚耐力比BMu/Mpc=0.7のモデルのθmaxが全層で小さくなっているが,これは解析モデルの部材断面が柱脚耐力比BMu/Mpc=0.7のモデルがBMu/Mpc=1.3よりも大きいためであると考えられる.6層モデルでは上層のどこか特定の層のθmaxが大きくなるということはない.9層モデルでは,部材断面の切り替わり位置である7層のθmaxが大きい.初年度から実験を行い,柱の残留変形角と建物の損傷程度の関係性を検討しようとしていたが,実験で実施すべきパラメータが多岐にわたること,それら全てを実験で実施するのが困難であることから,本年度は地震応答解析にによるアプローチとなった.この検討により,残留変形角と関連性のある最大層間変形角に関して,低層と中層での応答の違い,部材種別の影響の大きさ,柱脚の固定度と設計時での割り増し係数がどのように影響するかなど,重要な部分を確認することができた.元々,研究の後半は解析による残留耐震性能の評価を図ることとなっていたので,先取りして進行していると考えられる.柱の残留傾斜角は建物の損傷を直接表す計測しやすい項目であり,被災度区分判定などでも,過去の研究例や地震被害事例をふまえて設定された柱の残留傾斜角の値により,建物の被害状況を判断する指標の1つとして使用されている.しかし,実のところ柱の残留傾斜角の値が建物全体としてどのくらい深刻な被害程度を示しているのかはよくわかっていない.より正確に建物の被害程度を見極め,速やかで的確な復旧に資するためには柱の残留傾斜角の値がどの程度の建物の残存変形性能を表すのかを明確にする必要がある.柱の残留傾斜角を用いて建物の残存耐震性能を評価するためには,既往の研究のような層単位での検討でなく,建物の崩壊型や部材種別の違い,入力される外力の変化などによってどの程度の値が生じるのか,具体的に把握する必要がある.本研究は,立体鉄骨造骨組模型を用い,崩壊型や部材種別,載荷の振幅や周波数などを変化させて一方向動的載荷実験及び水平二方向載荷実験を行い,立体骨組に動的載荷や水平二方向載荷をすることでどのように柱の残留変形角が生じるか検討する.2016年4月に発生した熊本地震により,被害調査や状況把握のための作業を優先するために研究活動に充てる時間が減少した.また,実験を予定していた東京工業大学すずかけ台キャンパスの動的実験装置,および千葉大学建築実験棟内の振動台実験装置が相次いで故障したために2016年度での実験が困難となった.さらに,どちらの実験装置を用いて実験可能か不明であったので,試験体設計製作も滞った.建物の残存耐震性能の関係を把握するため,立体骨組の動的載荷実験を行った.柱の残留変形角だけでは最大変形角の推定が難しいことがこれまでの検討でわかってきているので,残留変形角と併せて骨組が経験した最大変形角を明示するために,塑性化する部材端に土木分野で用いられている実績のある応力発光塗料を使用して変形量の可視化を図ることも併せて行った.

立体骨組試験体はアルミ材からなり,矩形柱と矩形梁で構成したフレーム上に,錘を搭載した1×1スパンとした.主たるパラメーターは崩壊型と入力特性である.崩壊型は柱を細くし,梁の剛性をあげた1層崩壊型と,梁端に切れ込みをいれて塑性化させやすくしたことによる全体崩壊型とその中間と考えられる部材サイズの3種類とした.入力については主要な地震波を5波(神戸波,ElCentro波,Taft波,八戸波,仙台波)とした.動的載荷実験は,千葉大学建築構造実験棟内の振動台装置を用いて実施した.同一入力波に対して,加速度倍率で10%程度から段階的に大きくしていきながら,各層における荷重変形関係と柱の残留傾斜角を計測し,その対応関係を直に把握することで,骨組みが有する耐震性能に対して柱の残留変形角がどのように対応しているのか確認した.また,部材端に塗布した応力発光塗料が加振中にどのように発光するかを,目視と輝度計で計測し,土木分野よりも大きいひずみが繰り返し生じる中での損傷の可視化の様子を検討した.応力発光塗料の部分に設置したひずみゲージと輝度計の計測値を照合させ,明るさでひずみの程度を感知することで,より簡単に建物に生じた変形を把握するシステムの構築への基礎となるものと考えられる.本研究は,地震動を受ける鉄骨造建物に生じる被害状況から各被害レベルに対応する建物の残留変形角の関係を詳細かつ明快に示すこと,またそのツールについて検討を行うことを目的とする.前者については応答解析の結果,(1)FAランクであっても50kine,75kineの入力に対して大きな残留変形角が生じた,(2)BMu/Mpc=1.3や1.1の場合,比較的大きな残留変形角が生じた,(3)大きな残留変形角を生じる入力波に明確な傾向はない,ことが判明した.後者に関しては,応力発光塗料が大きな応力を生じた瞬間に発光し,それを保持することが難しいこと,カメラ等の検出システムや発光状況の数値化が必要と思われる.今後は立体骨組を用いた実験により,柱の残留変形角と建物の損傷度,耐震性能について検討する予定である.崩壊型や部材種別,載荷の振幅や周波数などを変化させて静的・動的載荷実験を行い,立体骨組に様々な力が加わることでどのように柱の残留変形角が生じるか検討する.更に実験結果により初年度に行った応答解析手法を校正し,建物の残存耐震性能に対応した柱の残留傾斜角の指標値を検討する.千葉大学の振動台実験装置は復旧したため,この装置を用いることとして試験体の設計を再開する.早急に製作を行った上で,一方向及び二方向の振動台実験を実施し,残留傾斜角と骨組の安全性について検討する.鋼構造実験装置の故障のため,試験体製作ができなかったことに起因する.使用する装置が決まったため,早急に骨組試験体の制作を行い,その費用に充てる.また試験体製作等の旅費に一部充てる.
歯髄および根興歯周組織疾患の病態生理学的研究

1.砂田はネコの歯髄に実験的炎症を惹起させ,単一歯髄神経から経時的記録を行い,個々のニユットの電気的刺激に対する闘値の変化および反復興奮の発生機序について検索した.2.三条はレーザードプラー血流計を歯髄血流の定量的測定に応用した.その結果,歯髄血流は全身的要因である血圧の変動に影響されやすいことと歯髄血流の定量的測定による歯髄炎の鑑別診断の可能性が示唆された.3.米田は感染根管内容物に含まれる起炎物質のうち,ポリアミンに着目して高速液体クロマトグラフィーによる同時微量定量法の確立を行った.4.松本は象牙質知覚過敏症例に対し,Na:YAGレーザー,GaALAsレーザー,およびHeーNeレーザー照射を試みた.その結果,レーザー照射群は非照射群と比べて統計学的に有意に症状が改善した.5.岡田は根端切除術時に響取した根尖病巣を用いて,免疫学的手法により免疫担当細胞の同定を行った.また感染根管より分離同定した細菌と,各種臨床症状との関連性を解析し,同時に根管拡大に伴う生菌数および細胞叢の変動も検討した.6.村山は根尖性歯周組織疾患者11名の病巣に棲息する細胞を分離同定し,その細胞叢を調べた.また疾患関連細菌19菌種のIgG抗体レベルを病巣局所ならびに末梢血で測定した.7.青野はラットの下顎第一臼歯に根尖性歯周炎を発症させ,得られた試料から,PGE,合成酵素の局在について8,11,14ーeicosatrienoic acidを基質として検索した結果,骨髄および膿瘍中に局在を認めた.8.永澤は成犬の切歯に生活断髄を施して神経線維の変化を透過型電顕で観察した.その結果,歯髄神経線維においても切断後に軸索の腫大を伴う再生現象の生じることが確認された.1.砂田はネコの歯髄に実験的炎症を惹起させ,単一歯髄神経から経時的記録を行い,個々のニユットの電気的刺激に対する闘値の変化および反復興奮の発生機序について検索した.2.三条はレーザードプラー血流計を歯髄血流の定量的測定に応用した.その結果,歯髄血流は全身的要因である血圧の変動に影響されやすいことと歯髄血流の定量的測定による歯髄炎の鑑別診断の可能性が示唆された.3.米田は感染根管内容物に含まれる起炎物質のうち,ポリアミンに着目して高速液体クロマトグラフィーによる同時微量定量法の確立を行った.4.松本は象牙質知覚過敏症例に対し,Na:YAGレーザー,GaALAsレーザー,およびHeーNeレーザー照射を試みた.その結果,レーザー照射群は非照射群と比べて統計学的に有意に症状が改善した.5.岡田は根端切除術時に響取した根尖病巣を用いて,免疫学的手法により免疫担当細胞の同定を行った.また感染根管より分離同定した細菌と,各種臨床症状との関連性を解析し,同時に根管拡大に伴う生菌数および細胞叢の変動も検討した.6.村山は根尖性歯周組織疾患者11名の病巣に棲息する細胞を分離同定し,その細胞叢を調べた.また疾患関連細菌19菌種のIgG抗体レベルを病巣局所ならびに末梢血で測定した.7.青野はラットの下顎第一臼歯に根尖性歯周炎を発症させ,得られた試料から,PGE,合成酵素の局在について8,11,14ーeicosatrienoic acidを基質として検索した結果,骨髄および膿瘍中に局在を認めた.8.永澤は成犬の切歯に生活断髄を施して神経線維の変化を透過型電顕で観察した.その結果,歯髄神経線維においても切断後に軸索の腫大を伴う再生現象の生じることが確認された.
微生物細胞内共生工学の基盤技術開発

本研究は、糸状菌細胞に有用細菌を内生させて有用共生微生物体を作出する新技術の開発を目的とする。まず、内生細菌保有糸状菌から内生細菌を除去して、細菌を受容する宿主糸状菌を調製する方法を開発した。また、土壌糸状菌Mrtea elgatoierllonaに内生する細菌のゲノム解析に成功し、硫黄代謝系の遺伝子を欠いている特徴を明らかにした。微生物細胞内共生のメカニズムとして、細菌側のこのような硫黄代謝系の欠失が示唆された。本研究は,先に,研究代表者らが報告した「土壌糸状菌への細菌内生現象」を解明し,その成果を微生物工学的技術の展開に生かすことを目的とするものである.平成24年度は,昨年度に構築した糸状菌コレクションから,微生物共生エンジニアリングの実験に適する内生細菌保有糸状菌株を選抜して,(1)宿主糸状菌から内生細菌を除去する技術および内生細菌の感染(内生化)・安定化に関する技術の開発,(2)内生細菌が宿主糸状菌のライフサイクルに与える影響の観察,(3)内生細菌のゲノム解析による内生細菌のゲノム遺伝子の特徴の解明,を行った.(1)については,糸状菌胞子をクロラムフェニコールで処理することによって,内生細菌を保有しない糸状菌株を作出することに成功した.また,当該糸状菌から内生細菌画分を調製する技術も開発した.次に,これらの分別した標品を用いて再内生化の条件を検討した.これまでの実験では,一時的に細菌を糸状菌菌糸内に内生化させる条件を確立したが,経代培養で内生化が維持されない課題が残った.(2)については,内生細菌除去糸状菌株では,内生細菌保有株に比べて気中菌糸が増加するなど,コロニー形態が変化すること,内生細菌の存在によって糸状菌の亜硝酸イオンへの感受性が高まることを見出した.(3)では,内生細菌保有のMortierella elongata FMR23-6 I-B1株から内生細菌ゲノムDNAを調製し解析した.その結果,供試菌株に内生する細菌の推定ゲノムサイズは約2.8 Mb,推定ORF数は2,300程度であり,システイン合成系とシスチン輸送タンパク質およびグルタチオン合成系の遺伝子を欠いていることを明らかにした.なお,(3)の研究成果は,第28回日本微生物生態学会豊橋大会において公表した結果,最優秀ポスター賞に選ばれた.本研究は、糸状菌細胞に有用細菌を内生させて有用共生微生物体を作出する新技術の開発を目的とする。先に、研究代表者らは、土壌からの糸状菌分離株(多くはMortierella elongata)の菌糸内部に新規細菌種(Burkholderia属細菌)が内生していることを見出した。本研究は、宿主糸状菌と内生細菌との宿主特異性および内生機構の解明を目的とし、宿主糸状菌細胞に有用内生細菌を感染・安定化させて有用微生物共生体を作出する「微生物共生エンジニアリング」という新しい技術の確立をめざすものである。本年度は、1)宿主糸状菌について内生細菌の網羅的な検出と、2)宿主糸状菌のライフサイクルおよび世代間を通じた内生細菌の分布様式・伝搬機構の解明に向けた基礎実験を行った。1)については、様々な糸状菌株について検討した結果、農業生産上重要な病原菌として知られているPythium aphanidermatum OPU344株、Pythium nun OPU640およびUZ2041株に関して、顕微鏡下および遺伝子シークエンスによって細菌様構造物を確認した。2)については、Burkholderia属細菌を内生するMortierella elongata FMR23-6株から内生細菌を除去する手法を開発した。これによって宿主糸状菌株を確立したことになる。これまでに様々な実験を行ったが、Mortierella elongata FMR23-6株から内生細菌を純粋分離することには成功していない。そこで内生細菌のDNAを分画・単離する方法を開発した。単離した内生細菌DNAについて、現在、ゲノム解析を行っている。また、亜熱帯地域から分離した、植物根部エンドファイト(糸状菌)、Veronaeopsis simplexについても内生細菌を見いだした。現在、植物の生育温度がエンドファイトと内生細菌のポピュレーションに与える影響を検討している。様々な糸状菌株で内生細菌の存在を示した点、特に、農業上の利用が期待されているエンドファイトについて内生細菌を見いだした点が評価される。また、現在進めている「内生細菌のゲノム解析」の結果によって、特定の細菌が糸状菌に内生するメカニズムの遺伝子レベルでの解明が、次年度の研究で大いに期待される。内生細菌のゲノム解析の結果を元に、細菌を糸状菌に内生させる技術の開発に重点をおいて研究を進める計画である。遺伝子解析用の試薬の購入、成果発表のための旅費、実験補助の謝金にあてる計画である。