hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病メダカを用いたアジア人型糖尿病発症機構の解明

H29年度は、そのメダカを利用し、血糖値異常前後の膵臓の遺伝子発現パターンを解析し、過食(栄養状態)が後の血糖値制御を混乱させるメカニズムを明らかにする。現在、メダカの生活習慣に関する表現型解析は20週間を1試験としている。H28年度末時点で、LepRKOメダカが糖尿病になるのに必要な飼育条件を1週間レベルで明らかにできた。メダカの膵臓は小さい。H28年度末時点で、目的の遺伝子解析に必要な蛍光標識メダカを作製完了している。したがって、H29年度中に飼育環境により影響を受け、かつ血糖値制御に影響を及ぼす遺伝子の特定が達成できる見込みである。研究計画はおおむね順調に進展している。申請者は、食欲中枢で作用するレプチン受容体の欠損(LepRKO)メダカの表現型にアジア人型2型糖尿病様症状、及び異常行動を見出した。前者は脂肪蓄積とインスリン抵抗性を伴わない慢性的高血糖である。後者はヒト不安症状に相当する行動である。両者は代謝量が減少する時期の連続した過食により遅発的に発症することも特徴的であった。メダカはマウスやラットと異なり皮下、内臓脂肪を蓄積しにくい生理的特徴をもつ。本件では、肥満を伴わない糖尿病の原因解明と、2型糖尿病と不安症を示す新たなモデル生物の確立を目指す。そのためには、LepRKOメダカの成長過程における1)空腹時血糖値、2)摂餌後の血中インスリン濃度、3)血糖調節組織における遺伝子発現、4)行動の追跡定量が必須である。申請時点では、1)と4)の定量比較は終了した。申請研究開始後、様々な給餌下における摂餌後のインスリン分泌量を測定し、2)の解析が終了した。それとともに、LepRKOメダカが過食給餌下ではインスリン分泌促進に関連する遺伝子発現が低下し、インスリン分泌不全を示し、一方で、過食給餌量の半分量では、インスリン分泌不全を示さないことが分かった。その後、pdx1遺伝子(膵臓で発現する遺伝子)の下流でGFPを発現し、また、インスリンプロモーター遺伝子の下流でmCherryを発現するメダカを作製した。現在、そのメダカを用いて、血糖調節組織における遺伝子発現を解析し、栄養状態が血糖値制御を混乱させるメカニズムの解明を進めている。H28年度末時点で、解析に必要な遺伝子組換えメダカの作製は完了しており、H29年度に本申請の目的を達成するための膵臓の遺伝子発現の解析を終了する予定だった。しかし、解析に必要な細胞数が不足したため、サンプルを取り直し、予定しいた計画より遅れてしまった。その後の解析は順調に進んでいる。H29年度からH30年度にかけて、トランスクリプトーム解析、及びその解釈を終了し、膵臓、脂肪組織、肝臓における血糖制御に関わる遺伝子挙動を明らかにした。また合併症として、不安障害だけなく、網膜症、白内障、腎症、Atubular glomeruliの特徴を見出した。本申請研究は、過剰な肥満ではなく、成育過程における過食時期が及ぼす血糖の制御機構を明らかにする目的とし、肥満を伴わない糖尿病の原因解明を目指した。過食時期としては、若齢期が重要であり、若齢期に過食を開始する飼育は血糖値異常を引き起こし、一方、成魚期に初めて過食を開始した場合、血糖値異常を引き起こさないことを明らかにした。過食開始時期が1週齢でも遅れると、その後の血糖値異常を誘発しないことから、血糖制御機構に関与する極めて重要な成育時期を特定できた。
新規遺伝子発現制御機構を介した植物ウイルスの生存戦略の解明

Melandrium yellow fleck virus (MYFV)のRNA3の5'非翻訳領域(UTR)が担う、RNA3の複製やサブゲノムRNA4の翻訳における制御機構を本解析することで、ウイルスの生存戦略の一端を明らかにすることを目的として、以下の二つの機能について研究をおこなった。前年度までに、この二本鎖構造はRNA3のマイナス鎖合成に重要であることを明らかにした。この構造に類似した構造が他のプロモウイルスにも見られた。Brome mosaic virus (BMV)の二本鎖構造がMYFVのRNA3の複製にも機能するか、この領域の置換体を作成してNicotianabenthamianaのプロトプラストに接種した。その結果、BMVの構造に置き換えたRNA3変異体も複製能を保持していたことから、BMVの構造も1姻A3の複製に対して機能しうると考えられた。RNA3の欠失変異体をBMVのRNA1,2とともに接種した場合、欠失変異体の蓄積量はある程度低下した。一方、MYFVのRNA1,2とともに接種した場合には欠失変異体は蓄積しなかったことから、この2本鎖構造の機能は複製酵素の種類に依存すると考えられた。RNA4の翻訳の実態について調べるために、ポリソーム解析やランオファッセイをおこない、翻訳の開始反応や伸長反応が阻害されているか検証した。しかし、年度内には明確な結果は得られなかった。今回得られた結果は、ウイルスの一細胞における増殖サイクルの理解に大きく寄与すると考えている。Melandrium yellow fleck virus(MYFV)のRNA3の5'非翻訳領域(UTR)が担う、RNA3の複製やサブゲノムRNA4の翻訳における制御機構を本解析することで、ウイルスの生存戦略の一端を明らかにすることを目的として、以下の二つの機能について研究をおこなっている。これまでにMYFVのRNA3の5'UTRに存在するDS1領域がRNA3の蓄積に影響することを明らかにした。脱液胞化タバコBY2プロトプラストin vitro翻訳複製系(BYL in vitro系、Komoda et al,.PNAS.,2004)を用いた実験の結果、マイナス鎖合成に影響していることが明らかとなった。このDS1領域について、他のブロモウイルスにおいても調査した結果、DS1領域の機能はプロモウイルス間で保存されている可能性が示唆された。5'UTRにある領域が3'UTRから開始されるマイナス鎖合成に影響していることから、5'UTRと3'UTRがRNA-RNAあるいはRNA-Protein-RNAによる相互作用によりマイナス鎖合成を制御するというモデルが考えられた。このような報告は数種類のRNAウイルスにおいてされるのみである。今後より詳細に解析することで、プラスセンスRNAウイルスのマイナス鎖合成における5'UTRの機能の解明に寄与するものと考えている。ショ糖密度勾配遠心法によりウイルス因子の細胞内局在を調査した結果、DS2の変異によるウイルスRNAやウイルスタンパク質等、ウイルス因子の局在の変化は見受けられなかった。次にDS2領域がトランスに供給されたRNA4(35Sプロモーターによる産物等)の翻訳をも制御するかNicotiana benthamianaにおいて検証したが、トランスに供給されたRNA4の翻訳に対する影響はなかった。このことから、DS2領域による翻訳制御には、鋳型となるRNA3からRNA4が合成されること、あるいはその後におこるRNA3とRNA4の相互作用が関与していることが示唆された。異なる植物種であるArabidopsis thalianaやN.tabacumにおいては、DS2領域の変異があってもRNA4の翻訳量は低下しなかったことから、この現象はN.benthamiana特異的である可能性が示唆された。DS2領域に変異を持つRNA3を鋳型として合成されたRNA4そのものの翻訳活性について解析した。N.benthamianaプロトプラスト内で新たに合成されたRNA4を抽出し、再びN.benthamianaに接種した。その結果、DS2領域に変異をもつRNA3から合成されたRNA4の翻訳活性が低下する傾向がみられたことから、翻訳に不適なRNA4が合成されている可能性が示唆された。5'UTRの変異によってサブゲノムRNAの質が変わること、およびそれがタンパク質の翻訳に影響することが考えられるが、この様な報告がされたことはなくウイルスの生存戦略を考える上で大変興味深い。

今回得られた結果は、ウイルスの一細胞における増殖サイクルの理解に大きく寄与すると考えている。RNA3の複製制御に関する研究は、論文を投稿するという目標には至ってはいない。これは当初はDS1領域がプラス鎖合成に機能していると予測していたものの、今回の研究の結果マイナス鎖合成に対して機能していることが判明し、研究計画を変更する必要があったためである。この機能の解析は現在順調に進行しており、間もなく論文としてまとめる予定である。一方、サブゲノムRNA4の翻訳制御に関する研究については順調に解析を進めており、ゲノムRNAの5'UTRがそこから転写されるサブゲノムRNAに何らかの化学修飾を行うことによって翻訳を制御している事を示唆するデータを得た。以上のことから、当初の予定に対しておおむね順調に進展していると考えている。DS1領域における研究については、この領域がマイナス鎖合成のどの段階で機能しているのか解析し、論文としてまとめる。DS2領域における研究については、RNA修飾の変化の有無や、それが翻訳に及ぼす影響について解析する予定である。ただ、in vitro翻訳系があるArabidopsis thalianaやN.tabacumではこの現象が起こらなかったため、ウイルス因子や宿主因子の詳細な解析については計画の変更を余儀なくされている。現在アグロバクテリウムを用いた再現系をN.benthamianaにおいて構築しており、今後解析を進める予定である。
植物振動子ネットワークにおける位相特異点群の生成消滅ダイナミクス

ルシフェラーゼ遺伝子を利用した時計遺伝子発現モニタ技術を用いてサーカディアンリズムを計測すると、植物の葉に様々な時空間パターンを観察することができる。スパイラル波の集団の挙動(位相特異点群の挙動)を解明することで、葉脈という長距離結合ネットワークが植物システムにおいてどのような影響力を持っているのかを明らかにすることができると思われる。前年度までに、遺伝子組換えシロイヌナズナCCA1::LUCの切除した葉に位相特異点を人工的に発生させることに成功している。本年度は、位相特異点群の自発的な生成・消滅ダイナミクスの観察と理論的考察を行う。具体的な研究内容は以下のとおりである。1.まず、これまでの実験で得た実験ノウハウを活かしながら、安定な実験条件(数週間に渡って安定にサーカディアンリズムを刻む実験条件)の確立を目指した。しかし、切除葉の活性を安定に保つ手法の開発は不完全であり、今後さらなる研究が必要である。2.長期間計測によって、葉組織の劣化(老化)に伴うスパイラル群の生成過程の観察し、解析を行った。3.劣化過程に伴うスパイラル群の自発生成現象を記述する数理モデルの構築とコンピュータ・シミュレーションを試みた。4.プロジェクタを用いた画像投影による初期位相の操作を行い、スパイラル波集団の人工生成を試みた。また、人工スパイラル群の生成・消滅ダイナミクスを観察し、構築した数理モデルにおけるコンピュータ・シミュレーションとの比較を試みた。5.植物におけるスパイラル群ダイナミクスの特性、特に、葉脈構造から受ける影響について定性的について整理した。ルシフェラーゼ遺伝子を利用した遺伝子発現モニタ技術を用いて植物のサーカディアンリズムを計測すると、植物の葉にスパイラル波、すなわち位相特異点が発生することが最近明らかになった。これを受け本研究では、サーカディアンリズムを外力で制御することで植物の葉に位相特異点群を人工的に生成し、これらの自発的な消滅ダイナミクスを実験的に調べることを試みた。特に、位相特異点群の生成消滅ダイナミクスが葉脈構造という長距離結合ネットワークからどのような影響を受けるかを解明することを試みた。本研究は、遺伝子発現という生命現象の最も根源的な現象に起源を持つサーカディアンリズムが、マクロスケールでどのような興味深いダイナミクスを呈するかを知るのに役立つ。本年度は主に実験システムの構築と位相特異点群の人工発生の予備実験を行った。具体的な成果は以下のとおりである。1.遺伝子組換えシロイヌナズナCCA1::LUCの切除した葉に光照射によって位相特異点を発生させることに成功した。さらに、人工発生させた位相特異点を光照射によって消滅させることに成功した。2.既に構築している数理モデルを改良し数値シミュレーションを行うための準備を行った。数理モデルを改良するためには、葉脈構造の詳細な情報と位相ダイナミクスの精密計測データが必要であるが、これらを取得するための長期間の安定した実験条件の確立、ならびに動画解析プログラムの修正を行った。特に、スパイラル波の集団の挙動(位相特異点群の挙動)を解明することで、葉脈という長距離結合ネットワークが植物システムにおいてどのような影響力を持っているのかを明らかにすることができると思われる。前年度までに、遺伝子組換えシロイヌナズナCCAL::LUCの切除した葉に位帽特異点を人工的に発生させることに成功している。そこで本年度は、実験手法の改良による実験効率と精度の向上、ならびに、数値シミュレーションによる位相特異点群の生成消滅ダイナミクスの特性解明の研究を行った。1.連続暗黒条件における葉サンプルの劣化は早い。劣化を遅らせる手法を確立することが計測精度向上に繋がる。そこで、葉サンプルの作製手法の改良を行った。その結果、サンプルによっては劣化を大きく遅らせることができたが、その成功率はあまり高くなかった。今後は、成功率が上がるように更なる改良が必要である。2.葉に発生した2つの互いに逆回転するスパイラル波のダイナミクスについて、数値シミュレーションを用いて調べた。その結果、(1)スパイラル波のコア、すなわち位相特異点は、葉脈に束縛される傾向があること、(2)位相特異点は葉脈に沿って移動する傾向があること、が分かった。これらは、位相特異点鮮の生成・消滅ダイナミクスを解明する上で重要な知見である。

2.長期間計測によって、葉組織の劣化(老化)に伴うスパイラル群の生成過程の観察し、解析を行った。3.劣化過程に伴うスパイラル群の自発生成現象を記述する数理モデルの構築とコンピュータ・シミュレーションを試みた。4.プロジェクタを用いた画像投影による初期位相の操作を行い、スパイラル波集団の人工生成を試みた。また、人工スパイラル群の生成・消滅ダイナミクスを観察し、構築した数理モデルにおけるコンピュータ・シミュレーションとの比較を試みた。5.植物におけるスパイラル群ダイナミクスの特性、特に、葉脈構造から受ける影響について定性的について整理した。
近現代中国における法の変容と国際社会

国際都市上海における刑事裁判の実態について、博士論文の内容を加筆修正しつつ、今後の研究の土台を固めるための作業を進めた。その概要を、上海で開催された都市史研究の国際会議で発表した。裁判記録や雑誌・新聞などを史料として、192030年代の中国の都市部において、旧来のやり方が利用されつつも、西洋近代的な法律にもとづく裁判が実施され始めていたことを示した。先行研究では、近代中国の裁判の具体像が十分に明らかにされておらず、法制改革の意義が軽視されがちであったが、本研究は、裁判の実態を実証的に分析したうえで、諸外国との比較も行ったことで、近代中国における法制改革の意味をより明確にした。(久保茉莉子「中国近代司法制度的建設和上海的刑事審判」、中国・上海城市研究新動向国際学術検討会、上海:上海社会科学院、2018年11月。)上海で国際会議終了後、その参加記を執筆して、都市史をめぐる日中間の学術交流の成果と課題について述べた。(久保茉莉子「参加記:中国・上海城市研究新動向国際学術研討会」『非文字資料研究センターニューズレター』41号(神奈川大学非文字資料研究センター)、2019年。)また、中国法制史をめぐる近年の学界動向を整理し、今後の研究課題をより明確にするため、2冊の著作について書評を執筆した。(久保茉莉子「寺田浩明著『中国法制史』」『史学雑誌』127編11号、pp56-62、2018年。書評:久保茉莉子「西英昭著九州大学出版会『近代中華民国法制の構築ー習慣調査・法典編纂と中国法学ー』」『中国研究月報』72巻10号、pp44-45、2018年。)翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
アルコール依存症治療薬の可能性としてのＮＫ１受容体拮抗薬が報酬機能に及ぼす効果

健常者を対象にプラセボおよびNK1受容体拮抗薬服用後に機能的核磁気共鳴画像検査を行い、報酬課題遂行時の側坐核の活動を調べた。プラセボ服用と比較すると、NK1受容体拮抗薬服用により有意に報酬予測時における側坐核の活動が減少した。次に、アルコール依存症の高リスク群である多量飲酒者における報酬課題遂行時の側坐核の活動を調べた。多量飲酒者では、報酬予測時における側坐核の活動とアルコール摂取量の間に正の相関がみられた。今後は、飲酒量と関連する報酬予測時の側坐核での活動に着目し、多量飲酒者に対するNK1受容体拮抗薬の効果を明らかにする必要がある。アルコール依存症は深刻な社会問題であるが、その病態機序がまだ明らかになっておらず、根本的な治療法が確立されていない。近年、サブスタンスPの受容体であるタキキニンNK1受容体に対する拮抗薬が、アルコール依存症患者の飲酒渇望を抑制すると報告されており、アルコール依存症の新しい治療薬として期待されている。本研究では、脳内ドパミン系で調節される報酬機能がアルコール依存症患者で障害されていることに着目し、機能的核磁気共鳴画像(fMRI)および陽電子断層画像(PET)検査によって、健常者およびアルコール依存症患者を対象にNK1受容体拮抗薬の報酬機能に対する効果およびドパミンの動態変化を調べる。昨年度は、健常成人を対象にプラセボおよびNK1受容体拮抗薬服用後にfMRI検査を行い、報酬課題遂行時の脳活動を調べた。プラセボ服用と比較すると、NK1受容体拮抗薬服用により報酬予測時の側坐核の活動が有意に減少していた。今年度は、健常者と比較してアルコール依存症患者で有意に脳活動が異なる領域を検出する予定であったが、患者のリクルートが困難であったため、患者の代わりにアルコール依存症の高リスク群である多量飲酒者を対象とし、さらに対照を少量飲酒者に変更して検査を開始した。未服薬において、少量飲酒者と比較して多量飲酒者の報酬予測時における側坐核の脳活動は増加している傾向がみられた。過去の研究では、側坐核における報酬予測時の脳活動とドパミン放出量が相関していることが報告されているため、本研究の結果より多量飲酒者の側坐核におけるドパミン放出量が増加している可能性がある。本研究の結果より、アルコールの過剰使用による側坐核の興奮が、アルコール依存への形成に関与する可能性が示唆された。今後、NK1受容体拮抗薬の服薬実験を行い、多量飲酒者の報酬機能に対する薬物の効果およびその効果に伴うドパミンの影響について検討する。近年、サブスタンスPの受容体であるニューロキニン1 (NK1)受容体に対する拮抗薬が、アルコール依存症患者の飲酒渇望を抑制すると報告されており、アルコール依存症の新しい治療薬として期待されている。本研究では、脳内ドパミン系で調節される報酬機能がアルコール依存症患者で障害されていることに着目し、機能的核磁気共鳴画像(fMRI)および陽電子断層撮像(PET)検査によって、健常者およびアルコール依存症患者を対象にNK1受容体拮抗薬の報酬機能に対する効果およびドパミンの動態変化を調べる。本年度は、健常成人を対象にプラセボおよびNK1受容体拮抗薬服用後fMRI検査を行い、報酬課題遂行時の脳活動を調べた。報酬課題は、monetary incentive delay課題を用いた。この課題は、報酬予測時における側坐核の脳活動増加を特徴とする。プラセボ服用では、報酬予測時に側坐核の活動増加が見られ、対照データとして用いるのに妥当な結果を得た。NK1受容体拮抗薬服用では、報酬予測時における側坐核の活動増加が見られなかった。プラセボ服用と比較すると、NK1受容体拮抗薬服用により有意に側坐核の活動が減少していた。過去のfMRI研究では、報酬刺激呈示時における側坐核の脳活動が、少量飲酒者に比べて多量飲酒者で亢進していることが報告されている。アルコールの乱用により、報酬回路の異常興奮が持続し、報酬回路の病的な可塑的変化が依存を形成することが考えられている。本研究の結果より、アルコール依存症でみられる脳活動の亢進を抑制することが予想され、NK1受容体拮抗薬が報酬機能に作用するアルコール依存症治療薬としての可能性が示唆された。

本研究では、脳内ドパミン系で調節される報酬機能がアルコール依存症患者で障害されていることに着目し、機能的核磁気共鳴画像(fMRI)および陽電子断層画像(PET)検査によって、健常者およびアルコール依存症患者を対象にNK1受容体拮抗薬の報酬機能に対する効果およびドパミンの動態変化を調べる。一昨年度は、健常成人を対象にプラセボおよびNK1受容体拮抗薬服用後にfMRI検査を行い、報酬課題遂行時の脳活動を調べた。プラセボ服用と比較すると、NK1受容体拮抗薬服用により報酬予測時の側坐核の活動が有意に減少していた。昨年度以降、健常者と比較してアルコール依存症患者で有意に脳活動が異なる領域を検出する予定であったが、患者のリクルートが困難であったため、患者の代わりにアルコール依存症の高リスク群である多量飲酒者を対象とし、対照を少量飲酒者に変更して検査を行っている。今年度は被験者数を増やして検査を継続した。未服薬において、報酬予測時における側坐核の脳活動は、少量飲酒者と多量飲酒者との間に有意差はみられなかった。多量飲酒者において、報酬予測時における側坐核の脳活動とアルコール摂取量との間に正の相関がみられた。過去の研究では、側坐核における報酬予測時の脳活動とドパミン放出量が相関していることが報告されているため、本研究の結果から、より多くアルコールを摂取する多量飲酒者の側坐核では、報酬予測時にドパミン放出量が増加している可能性が示唆された。精神神経薬理学被験者および課題の条件検討に時間を費やしたため。多量飲酒者および飲酒量以外の条件が一致した少量飲酒者のリクルートは順調であるため、今後は計画通りに研究が進行すると思われる。本年度は、fMRIを用いてNK1受容体拮抗薬の報酬機能に対する効果を測定する手法を確立し、健常者におけるデータを得ることができた。この手法と同じプロトコール用いて、患者を対象にした検査を行うことが可能だと思われる。現在、未服薬における少量飲酒者および多量飲酒者の報酬課題遂行時の脳活動を調べているが、まだ少数例であり、例数を集めているところである。多量飲酒者の依存症状にばらつきがみられることから、症状と脳活動変化および薬物による影響との関連性を調べることで、アルコール依存への形成過程における報酬回路機能が明らかになる可能性があると考えられる。健常者で確立したfMRI検査を用いて、今年度はアルコール依存症患者を対象にして検査を行う。健常者と比較して患者で有意に脳活動が異なる領域を検出する。また、患者で検出された脳活動に対するNK1受容体拮抗薬の効果を捉える。本研究はアルコール依存症患者を対象するため、被験者のリクルートがうまく進まない状況が考えられる。患者のリクルートが進まない場合、健常者の中から多量飲酒者群を設定して検査を行う。多量飲酒者はアルコール依存症のハイリスク群であり、発症前におけるドパミン神経系の報酬機能について検討することができる。消耗品では、被験者が服用する薬物、MRI検査および採血時に使用する検査用品、MRIデータを保存するデータメディアに使用する。謝金として、検査に参加した被験者に対して負担軽減費を支払う。旅費では、成果発表を行う国内外の学会費用に使用する。
生物活性物質標的分子の新規同定法

生物活性物質の標的分子の同定は、生物活性物質の作用機構を解明する上で最も重要であり、それは生物活性物質が関与する未知の生命現象を分子レベルで明らかにするための手がかりを与える。本研究では、生物活性物質をダイマー化したプローブを用いて分子標的を同定する方法の開発を試みた。カビのマイコトキシン生産を特異的に阻害する化合物とキチナーゼ阻害物質アロサミジンをモデル化合物とした。各種誘導体の構造と活性をもとに、トリコテセン阻害物質であるプレコセンIIのダイマーを調製したが、活性を保持したダイマーを得ることはできなかった。そこで、既知の方法ではあるが最新の手法であるクリックケミストリーと磁気アフィニティービーズを用いる方法を適用し、旧来のフォトアフィニティプローブを用いる方法と比較しながら、標的分子の同定を進め、候補タンパク質の同定に至った。アロサミジンのダイマー化は、目的の部位でのダイマー化には至っておらず、現在さらなる実験を進めている。微生物や植物の二次代謝産物から種々の生物活性物質が得られる。新しい生物活性の場合、活性物質の作用機構は不明な場合が多い。作用機構の解明は基礎、応用両面から重要である。中でも標的分子の同定は最重要課題である。しかし現存の手法では非常に困難である。より簡便な方法の開発が強く望まれる。本研究では標的タンパク質の新たな同定法の開発に挑戦する。ポイントはリガンドをダイマー化したプローブを利用する点である。プローブと結合し分子量が倍化するタンパク質をプロテオーム解析により同定し標的分子をとらえる手法の開発を試みる。研究実施計画ではキチナーゼ阻害物質アロサミジンのダイマー化を本年度から開始し、赤カビ病Fusarium graminearum麦類に感染し蓄積するマイコトキシンであるデオキシニバレノールの生産を特異的に阻害する植物成分プレコセンIIについての研究を次年度から行う予定であったが、順序を入れ替え、本年度はプレコセンIIのダイマー化にまず着手した。プレコセンIIの7位のメトキシル基を各種アルコキシル基に置換した誘導体と、7位を水酸基とした誘導体2分子を水酸基の間にアルキルあるいはエチレンダリコールのスペーサーを導入して結合させたダイマーを調製した。それらのデオキシニバレノール生産阻害活性を調べたところアルコキシル基の鎖長が長くなるほど活性が低下し、またダイマーでは活性が失われていた。今後活性を維持したプレコセンIIのダイマーの調製を試み、またアロサミジンのダイマー化に着手する。キチナーゼ阻害物質アロサミジンをモデル化合物として実験を行った。アロサミジンのモノ脱アセチル化により得られたモノアミン体について、BM(PEG)_2をスペーサーにした2量体化を試みた。モノアミン体とBM(PEG)_2を種々のモル比で混合し、DMF中塩基性条件で反応させた。その結果、収率は良くないものの2量体の生成が認められた。今後収率の向上を検討し、得られた2量体のキチナーゼ阻害活性を調べる。さらにフォトアフィニティ部位を持ったスペーサーを検討する。トリコテセン化合物の特異的生産阻害剤であるprecocene IIの6位をアルキル基で修飾した誘導体を作製し、6位修飾により活性が比較的維持されることを見出した。今後、6位を足場に2量体化を行い、活性を調べ、標的タンパク質の同定に利用する予定である。

ポイントはリガンドをダイマー化したプローブを利用する点である。プローブと結合し分子量が倍化するタンパク質をプロテオーム解析により同定し標的分子をとらえる手法の開発を試みる。キチナーゼ阻害物質アロサミジン類をモデル化合物として実験を行った。アロサミジンのモノ脱アセチル化により得られたモノアミン体について、BM(PEG)2をスペーサーにした2量体化を試みた。モノアミン体とBM(PEG)2を種々のモル比で混合し、DMF中塩基性条件で反応させた。その結果、収率は良くないものの質量分析で2量体の生成が認められた。現在酵素阻害活性の測定を行っている。一方、トリコテセン生産阻害物質であるプレコセンIIの二量体を調製したが残念ながら阻害活性が消失した。そこでプレコセンIIを磁気ビーズに固定化する方法で実験を進め、二次元電気泳動上で標的分子のスポットを特定した。現在標的分子の同定を進めている。キチナーゼ阻害物質アロサミジンの2量体化に成功した。トリコテセン生産阻害物質precocene IIについては2量体化の足掛かりが得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。アロサミジン2量体でキチナーゼ阻害活性を保持したプローブを作製する。プローブとキチナーゼの複合体をキチナーゼ2量体として検出し、2量体化プローブを用いた標的タンパク質検出のモデル実験系を完成させる。また、precocene IIの2量体プローブの作製を行い、標的タンパク質の同定に利用する。
多価イオンの局所的強クーロン場における分子の動力学

本年度は主として種々の有機分子を標的とする衝突実験を行い、解離断片の位置有感飛行時間測定から速度ベクトルの相関を求めた。まず、平面分子(エチレン、ベンゼン、およびそれらの重水素置換体)と非平面分子(エタン)を標的とする低速多価イオン衝突実験を行い、生成した解離断片の角相関を比較した。平面分子においては3つのベクトルは同一平面上に存在する傾向が強いが、非平面分子(エタン)ではこのような傾向は見出されなかった。この結果は、ベンゼンのような多原子分子でも、依然クーロン解離が優勢であることを示している。ベンゼンについてはC^+-C^<2+>角相関がシミュレーションとよく一致することも示した。この実験ではオージェ電子を飛行時間測定のトリガーとしていたため、非常に高価数の親イオンからの解離を観測していた。一方入射イオン検出をトリガーとしたAr^<8+>とベンゼン-d6の衝突実験では比較的低価数の多価分子イオンが生成し、そこでいくつかの選択的解離チャネルを見出した。さらにo-,m-,p-ジフロロベンゼンを標的として多価イオン衝突実験を行い、二つのF原子イオンの角度相関を調べたところ、元の分子構造を反映する強い相関が得られた。この結果、かなり複雑な有機分子においても、多価イオン衝突実験による分子構造の識別が可能であるということかわかった。以上の結果は2報の論文として発表し、さらに1報が投稿中である。この他、分子線と多価イオンの交差ビーム型クーロン爆発実験装置を製作し、2量体と多価イオンの衝突実験を開始した。また新しい位置有感飛行時間計側システムを開発した。
SI住宅技術を用いた在宅介護対応インフィルの開発研究

本研究は、住宅を長期の耐用性を有し、社会資産としての性格を強く帯びる「サポート」と、生活上の要求条件の変化等に対応して短期に更新、変更を施した方が良い部品「インフィル」とに明確に分けて、住環境の運営を考えようとする「SI住宅」の理論・技術面でのこれまでの成果の上に立ち、短期的にまた低コストで既存住宅と新築住宅双方に装備でき、また不要の折りには容易に撤去できるという革新的な「在宅介護インフィル」を以下の手続きによって、実現可能なかたちで開発しようとするものである。・新築・改装の双方で適用可能なサポートとインフィルのインターフェイス条件の決定・多様な在宅介護のあり方に対応したインフィルのバリエーション展開の検討・インフィル各構成部位への要求性能の明確化とその実現手法の開発・在宅介護インフィルのプロトタイプ開発と実用性評価・解体・再組立ての容易な在宅介護対応インフィルの保有・供給方式の立案具体的な成果は以下の通りである。平成13年度・在宅介護インフィル部品のプロトタイプの設計及び試作・既存集合住宅の開発インフィル部品による改装・開発インフィルの実用性評価平成14年度・前年度試作した在宅介護インフィルに関する評価と、これを改良し、一回り小さくしたインフィルの設計と一部試作、評価・前年度試作したインフィルの解体・回収施工実験とそれによる繰り返し部品使用の要件の把握・短期間の利用後利用者、据付場所を変更できるようなインフィルの保有・運用方式の代替案評価本研究は、住宅を長期の耐用性を有し、社会資産としての性格を強く帯びる「サポート」と、生活上の要求条件の変化等に対応して短期に更新、変更を施した方が良い部品「インフィル」とに明確に分けて、住環境の運営を考えようとする「SI住宅」の理論・技術面でのこれまでの成果の上に立ち、短期的にまた低コストで既存住宅と新築住宅双方に装備でき、また不要の折りには容易に撤去できるという革新的な「在宅介護インフィル」を以下の手続きによって、実現可能なかたちで開発しようとするものである。平成13年度・在宅介護インフィル部品のプロトタイプの設計及び試作・既存集合住宅の開発インフィル部品による改装・開発インフィルの実用性評価平成14年度・前年度試作した在宅介護インフィルに関する評価と、これを改良し、一回り小さくしたインフィルの設計と一部試作、評価・前年度試作したインフィルの解体・回収施工実験とそれによる繰り返し部品使用の要件の把握・短期間の利用後利用者、据付場所を変更できるようなインフィルの保有・運用方式の代替案評価本研究は、住宅を、長期の耐用性を有し、社会資産としての性格を強く帯びる「サポート」と、生活上の要求条件の変化等に対応してより短期に更新、変更を施した方が良い部分「インフィル」とに明確に分けて、住環境の運営を考えようとする「SI住宅」の理論・技術両面でのこれまでの成果の上に立ち、短期的にまた低コストで既存住宅と新築住宅双方に装備でき、また不要の折りには容易に撤去できるという革新的な「住宅介護用インフィル」を、以下の手続きによって実現可能なかたちで開発しようとするものである。・新築・改装の双方で適用可能な、サポートとインフィルのインターフェース条件の決定・多様な在宅介護のあり方に対応したインフィルのバリエーション展開の検討・インフィル構成各部位への要求性能の明確化と、その実現手法の開発・在宅介護対応インフィルのプロトタイプ開発と、実用性評価・解体・再組み立ての容易な、在宅介護対応インフィルの保有・供給方式の立案本年度は、具体的には以下の成果を得ている。・国内外の高齢者居住支援産業の事例調査・高齢者居住関連部品技術と再生技術に関する欧米調査(ポルトガル、デンマーク等)・国内における高齢者居住に関わる既存建物改造工事の実態調査(現地調査、図面分析等)・高齢者居住に関わる既存建物改造の試設計来年度取り組む予定の事柄は以下の通りである。・高齢者の自立可能性と介護作業に関する利用可能な実証的研究の整理・分析・開発対象とすべきインフィル構成部品の抽出、インフィル或いはその部分の試作・評価・開発するインフィルの適用範囲、適用条件に関する検討・インフィル産業の成立要件に関する研究、開発インフィルの適用方法に関する検討本研究は、住宅を長期の耐用性を有し、社会資産としての性格を強く帯びる「サポート」と、生活上の要求条件の変化等に対応してより短期に更新、変更を施したほうが良い部品「インフィル」とに明確に分けて、住環境の運営を考えようとする「SI住宅」の理論・技術面でのこれまでの成果の上に立ち、短期的にまた低コストで既存住宅と新築住宅双方に装備でき、また不要の折には容易に撤去できるという革新的な「住宅介護インフィル」を以下の手続きによって実現可能なかたちで開発しようとするものである。・新築・改装の双方で適応可能なサポートとインフィルのインターフェイス条件の決定・多様な在宅介護のあり方に対応したインフィルのバリエーション展開の検討・インフィル各構成部位への要求性能の明確化と、その実現手法の開発・在宅介護インフィルのプロトタイプ開発と、実用性評価・解体・再組み立ての容易な、在宅介護対応インフィルの保有・供給方式の立案本年度は具体的に以下の成果を得ている。・在宅介護インフィル部品のプロトタイプの設計及び試作・既存集合住宅の開発

インフィル部品による改装・開発インフィルの実用性評価来年度取り込む予定の事柄は以下の通りである。・「楽隠居(在宅介護インフィルの開発)」フォーラムの開設・開発インフィルの解体・再利用実験・現実のストックへの展開、要介護度進行による部品の追加・変更計画の検討・介護インフィルのリース・下取り等運用システムの検討本研究は、住宅を長期の耐用性を有し、社会資産としての性格を強く帯びる「サポート」と、生活上の要求条件の変化等に対応して短期に更新、変更を施した方が良い部品「インフィル」とに明確に分けて、住環境の運営を考えようとする「SI住宅」の理論・技術面でのこれまでの成果の上に立ち、短期的にまた低コストで既存住宅と新築住宅双方に装備でき、また不要の折には容易に撤去できるという革新的な「在宅介護インフィル」を以下の手続きによって実現可能なかたちで開発しようとするものである。・新築・改装の双方で適用可能なサポートとインフィルのインターフェイス条件の決定・多様な在宅介護のあり方に対応したインフィルのバリエーション展開の検討・インフィル各構成部位への要求性能の明確化とその実現手法の開発・在宅介護インフィルのプロトタイプ開発と実用性評価・解体・再組立ての容易な在宅介護対応インフィルの保有・供給方式の立案本年度は具体的に以下の成果を得ている。・前年度試作した在宅介護インフィルに関する評価と、これを改良し、一回り小さくしたインフィルの設計と一部試作、評価・前年度試作したインフィルの解体・回収施工実験とそれによる繰り返し部品使用の要件の把握・短期間の利用後利用者、据付場所を変更できるようなインフィルの保有・運用方式の代替案評価
Enteric nerve systemによる薬物吸収制御に関する研究

小腸には、中枢神経系とは独立したEnteric nerve system(ENS)が存在し、このENSが小腸の運動性や、水・電解質等の吸収を司っていることが知られている。しかしながら、ENSの薬物吸収挙動に及ぼす影響について検討した例は極めて少なく、現在、我々はその系統的な解析を進めている。その結果、受動拡散により吸収される薬物については、アドレナン作動性神経系の亢進により吸収抑制が、コリン作動性神経系の亢進により吸収促進が起こることを明らかにした。今回は、特殊輸送系を介した薬物吸収及び分泌へのこれら神経系の影響を検討することを目的として、まずβ-lactam系抗生物質などの輸送を担っていることの知られているoligopeptide transporter PEPT1に着目し、その典型的な基質のひとつであるcephalexin(CEX)の吸収に及ぼすENSの影響を検討した。その結果、非選択的なアドレナリン受容体作動薬であるepinephrineは、ラットin situ吸収実験およびヒト大腸癌由来細胞Caco-2を用いたin vitro透過実験において、CEXの吸収を促進させることが明らかとなった。このepinephrineの作用は、受容体を介するものであることがin situ吸収実験より、また上皮細胞への直接作用を含んだものであることが、Caco-2を用いた検討から示された。また、やはりPEPT1の典型的な基質のひとつであるglycylsarcosine(Gly-Sar)の共存が、epinephrineによるCEXの促進作用を消失させ、むしろGly-Sar共存下でのCEXの透過性を抑制する傾向を示した。この結果は、epinephrineがPEPT1活性を亢進させることによりCEXの吸収を増大させていること、また受動拡散による吸収を抑制していることを示している。また、α_2-受容体選択的作動薬であるclonidineが、上記のepinephrineによる作用に極めて類似した効果を示したことから、epinephrineの作用がα_2受容体を介するものである可能性が示唆された。次いで、比較的脂溶性の高い有機カチオン性薬物を管腔内に分泌することの知られているP-glycoprotein(P-gp)へのENSの影響を検討した。ここでは、消化管の機能に深く関わっていることの知られているneurotransmitterである5-HTの影響を検討した。5-HTの生合成阻害剤P-chlorophenylalanineによる前処理により5-HTを枯渇させたところ、P-gpの基質であるquinidineの吸収、分泌がともに亢進したが、分泌方向の膜透過の方がより亢進していた。そこで、verapamilによる阻害実験や、volgage-clamp法による検討の結果、transcellular routeを介するverapamil-sensitiveな機構、即ち、P-gpによる分泌が亢進していることが明らかとなった。

小腸には、中枢神経系とは独立したEnteric nerve system(ENS)が存在し、このENSが小腸の運動性や、水・電解質等の吸収を司っていることが知られている。現在、我々はENSの薬物吸収への影響について系統的な解析を進めているが、既に、アドレナリン作動性神経系の亢進により、受動拡散による薬物吸収の抑制が、コリン作動性神経系の亢進により、その促進が起こることを明らかにした。今回は、特殊輸送系を介した薬物吸収へのこれら神経系の影響を検討することを目的として、β-lactam系抗生物質などの輸送を担っていることの知られているoligopeptide transporter PEPT1に着目し、その典型的な基質のひとつであるcephalexin(CEX)の吸収に及ぼすENSの影響を検討した。非選択的なアドレナリン受容体作動薬であるepinephrineは、ラットin situ吸収実験およびヒト大腸癌由来細胞Caco-2を用いたin vitro透過実験において、CEXの吸収を促進させることが明らかとなった。このepinephrineの作用は、受容体を介するものであることがin situ吸収実験より、また上皮細胞への直接作用を含んだものであることが、Caco-2を用いた検討から示された。また、やはりPEPT1の典型的な基質のひとつであるglycylsarcosine(Gly-Sar)の共存が、epinephrineによるCEXの促進作用を消失させ、むしろGly-Sar共存下でのCEXの透過性を抑制する傾向を示した。この結果は、epinephrineがPEPT1活性を亢進させることによりCEXの吸収を増大させていること、また受動拡散による吸収を抑制していることを示している。同時に測定したphenol redの膜透過性およびtransepithelial electrical resistanceも、共にepinephrineが受動拡散による薬物吸収を抑制することを示唆していた。また、α_2-受容体選択的作動薬であるclonidineが、上記のepinephrineによる作用に極めて類似した効果を示したことから、epinephrineの作用がα_2受容体を介するものである可能性が示唆された。しかしながら、ENSの薬物吸収挙動に及ぼす影響について検討した例は極めて少なく、現在、我々はその系統的な解析を進めている。その結果、受動拡散により吸収される薬物については、アドレナリン作動性神経系の亢進により吸収抑制が、コリン作動性神経系の亢進により吸収促進が起こることを明らかにした。
膠芽腫における重粒子線治療効果に関する基礎的研究

本研究では、膠芽腫に対する重粒子線の治療効果を高めるために、まず、G2/M-blockを抑制すると考えられるキサンチン誘導体、caffeineとpentoxifyllineの重粒子線感受性に及ぼす効果を検討し、さらに膠芽腫細胞株におけるDNA修復酵素DNA-PKの発現と活性を解析して、その抑制物質であるwortmanninのガンマ線及び重粒子線に対する膠芽腫細胞株の感受性に及ぼす効果を解析した。膠芽腫細胞株(P53野生株と変異株)および線維芽細胞にガンマ線と高LET炭素線の照射を行い、照射前後の細脚を経時的に固定し、細胞周期の解析を行った。またcaffeine、pentoxifylline、wortmanninを培地に添加し細胞周期の変化と細胞障害性に及ぼす影響を検討した。その結果、caffineは、p53変異膠芽腫細胞株における照射後のG2/M-blockを抑制し、増感作用を示したが、p53野生株ではその効果は弱かった。一方、pentoxifyllineの放射線増感作用をコロニー形成法で評価すると、LETが高くなると減少するととが明らかとなった。細胞周期の変化ではP53変異株においてはG2/M-blockの抑制が認められたが、野生株では変化なかった。膠芽腫細胞株ではDNA2本鎖切断修復酵素DNA-PKの発現と活性が高く、その発現と活性の程度がガンマ線に対する感受性と相関することが示された。さらに、その特異的阻害物質であるwortmanninは膠芽腫細胞におきる放射線照射後のG2/M-blockを抑制するとともに、コロニー形成法でも放射線感受性を上げることが示されたが、その効果はp53変異株に対して強く野性株では弱いことが明らかになった。本研究では、膠芽腫細胞に対する重粒子線の治療効果を高めるために、重粒子線照射後の細胞に起きるG2-blockを抑制する作用を持つと考えられるpentoxifyllineの効果を明らかにするとともに、DNA修復関連酵素であるDNA-PKの抑制物質であるwortmanninの重粒子感受性に及ぼす効果を明らかにすることを目指している。平成12度においては、各種細胞にガンマ線と炭素線の照射を行い、経時的に蛋白を抽出してDNA-PKの発現をウェスタンブロットにて解析した。また同様に照射前後の細胞を経時的に固定し、flow-cytometer(FACS Sort)で細胞周期の解析を行った。またpentoxifyllineとwortmanninを培地に添加しその影響を同様の方法で検討した。その結果、ガンマ線照射後にはDNA-PKの発現は変化なかったが、炭素線照射では特に高いLETになるとその発現は低下する傾向を示した。これは正常のp53においても見られた現象であり、高LET粒子線照射によりDNA修復にかかわる酵素の発現が抑制されることは、細胞の高LET粒子線照射に対する放射線感受性が上昇する原因の1つであると推察される。また、照射後のG2-blockを抑制して放射線感受性を上げると予想されたpentoxifyllineは、0.25mM1mMの濃度では照射後のG2-blockを抑制する効果は認められず、細胞死を示すsub-G0,G1のfractionも増加しなかった。一方、DNA-PKの修復作用を抑制するwortmanninはむしろ明らかなG2-block抑制作用を示したが、そのメカニズムは現時点では不明である。次年度にはpentoxifyllineとwortmanninが、コロニー形成法による細胞の放射線感受性の変化に及ぼす影響をを検討し、各種放射線に対する増感作用を明らかにする予定である。

本研究では膠芽腫に対する重粒子線の治療効果を高めるために、照射後に膠芽腫におきる細胞周期の変化を解析し、G2-blockを抑制すると考えられるpentoxyphilineの重粒子線感受性に及ぼす効果を明らかにするとともに、DNA修復関連酵素であるDNA-PKの発現を解析してその抑制物質であるwortmanninの重粒子感受性に及ぼす効果を明らかにすることを目指している。初年度においては、各種細胞にガンマ線と炭素線の照射を行い、経時的に蛋白を抽出してウェスタンブロットを行った。また同様に照射前後の細胞を経時的に固定し、細胞周期の解析を行った。またpentoxyphilineとwortmanninを培地に添加しその影響を同様の方法で検討した。それに引き続き、今年度はpentoxyphilineとwortmanninが、コロニー形成法による細胞の感受性に及ぼす影響を検討した。その結果、膠芽腫におけるpentoxyphilineの放射線感受性に及ぼす影響は、細胞死のコロニー形成法においても明らかではなかった。一方、wortmanninは膠芽腫細胞におきる放射線照射後のG2-blockを抑制するとともに、コロニー形成法でも放射線感受性を上げることが示された。これらの研究から、膠芽腫細胞においてはDNA修復酵素であるDNA-PKの発現とともに、そのkinase activityも上昇しており、その程度が膠芽腫細胞株の放射線感受性と相関していることが明らかになった。さらに、その抑制物質であるwortmanninは感受性をあげる増感剤として作用するが、pentoxyphilineは放射線感受性に影響を及ぼさないことが示唆された。
ヒト抗体ライブラリを用いた網羅的配列解析によるガン細胞特異的ヒト抗体の創製研究

本研究は、ヒト抗体ライブラリー技術に、次世代シークエンサーを使った網羅的配列解析技術(NGS法)を組み合わせることによる、より短期間で確実な特異的抗体の単離システムの構築を目的とした。成果として、肝ガン細胞、並びに食道がん細胞を標的としたルテラン並びに抗原Aの組み換え型タンパク質に対する抗体の単離をNGS法によって行い、特異的な複数の結合クローンの単離に成功した。この結果は、NGS法が通常のクローニング/結合スクリーニングに比べ、多数の結合クローンの同定において有用であることを示している。ファージディスプレイによる抗体ライブラリ技術は、抗体開発の中心的な技術となっている一方で、ライブラリ構築やバイオパンニングと呼ばれる単離方法に、熟練した技術やノウハウが必要なことから、限られた研究グループの使用に留まっている。本研究は、ヒト抗体ライブラリ技術に、次世代DNAシークエンサーによる網羅的配列解析技術を組み合わせることによる、より短期間で確実な抗体ファージライブラリからのガン細胞特異的抗体の単離システムの構築を目的とした。25年度では、この方法の有用性を試験するため、以下の2点について検討した、1)肝ガン患者由来抗体ライブラリから得られた抗ルテラン抗体の網羅的配列解析ルテラン組み換え分子に対するパンニングにおける、網羅的配列解析の有用性を検討した。1回目のパンニングの前後で、次世代シークエンサーによる解析を行ったところ、全部で25クローン(種類として4種類)のクローンが同定された。通常の単離手法では、7クローン(CDRの相同性から種類としては2種類)しか得られておらず、網羅的配列解析手法が、迅速かつ、多様な特異抗体の取得に極めて有用であることが分かった。(2)肝ガン患者由来抗体ライブラリからのHep-G2細胞特異的な抗体ファージの分離と網羅的配列解析上記で検証した方法を、細胞パンニングによる特異的抗体の特定に応用した。肝ガン患者由来の抗体ライブラリを、SK-BR3(乳がん細胞株)で2回の吸収操作を行い、次にHEP-G2細胞(肝ガン細胞株)と反応させ、結合した抗体ファージを回収した。この細胞パンニング前後でのクローンの網羅的配列解析を行ったところ、配列の比較から、8種類以上の多様な結合抗体クローン候補の同定を達成した。現在、これらの抗体クローンの結合活性の評価を通して、実際に、この手法が、迅速なガン細胞特異的抗体の同定法として利用できるかどうか検討している。本研究は、ヒト抗体ライブラリ技術に、次世代DNAシークエンサーによる網羅的配列解析技術を組み合わせることによる、より短期間で確実な抗体ファージライブラリからのガン細胞特異的抗体の単離システムの構築を目的としている。25年度での(1)肝ガン患者由来抗体ライブラリから得られた抗ルテラン抗体の網羅的配列解析と(2)肝ガン患者由来抗体ライブラリからのHep-G2細胞特異的な抗体ファージの分離と網羅的配列解析の成果を受け、26年度では、以下の(3)(4)の項目を推進した。(3)抗ルテラン抗体クローンの特異性の解析並びに抗体調製:(1)でルテランに対するバイオパンニング後に得られたファージ上の抗体の網羅的配列解析を行ったところ、通常のスクリーニングによって得られた抗ルテラン抗体クローン(2種類)以外に、いくつかの特異的候補抗体配列が得られた。そこで、得られたVH配列のCDR3部分を基に設計したプライマーを用いて、全単鎖Fv遺伝子をPCRにて再構築を行った。これらの遺伝子をファージベクターに組み込み、ルテランに対する結合特異性を確認したところ、1つのクローンでルテランに対する結合特異性が見られた。(4)抗Hep-G2細胞特異的な抗体クローンの特異性の解析:(2)でHep-G2細胞に対するバイオパンニング後に得られたファージ上の抗体の網羅的VH配列解析を行ったところ、特異的と思われるクローンが20種類以上見つかった。これらについて、元の単鎖Fv遺伝子を再構築し、ファージに組み込み、Hep-G2に対する結合活性を細胞ELISAで確認したところ、約半数で、Hep-G2に対する結合活性が確認された。本研究は、ヒト抗体ライブラリ技術に、次世代DNAシークエンサー(NGS)による網羅的配列解析技術を組み合わせることによる、より短期間で確実な抗体ファージライブラリからのガン細胞特異的抗体の単離システムの構築を目的としている。25、26年度での成果を受け、27年度では、(1)単離同定した抗ルテラン抗体のガン細胞に対する結合活性並びにエピトープ解析を行い、(2)抗Hep-G2細胞特異的な抗体クローンの標的分子の解析、(3)新しいマーカーとしてFGF-RL1に対する抗体のNGS網羅的配列解析手法による単離を行い、本方法の有用性を評価した。具体的には、肝臓ガン患者由来の単鎖Fv抗体ライブラリーから、NGS網羅的配列解析手法により同定した3種の抗ルテラン抗体のうち2つについて、動物細胞での発現を行った。これらの抗ルテラン抗体は、肝ガン細胞株だけでなく、乳ガン細胞株など、比較的広いガン株に結合活性を示すことから、ガン細胞に対する新しい抗体医薬の候補として、特許申請を行った。一方、26年度にて、ガン細胞株HEP-G2に対して複数の結合抗体クローンを単離したが、それらの単鎖Fv抗体の大腸菌での発現がうまくいかず、予定していた抗体クローンの抗原同定を達成できなった。このような中で、新たながん細胞の抗原マーカーとしてFGF-RL1を標的に、NGS手法を用いた新規の抗体の単離を試み、4種の抗原