hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子移動過程の解析

多電子移動過程,とくに生体高分子及びそのモデル化合物における多電子移動過程の基本的性質の解明と触媒効果の発現機構の解析と目的として研究を行った.千田は,多電子移動酵素機能電極設計の基礎となるメディエータを用いる界面電子移動反応について,グルコースオキシダーゼを例として取りあげ,そのバイオエレクトロカタリシス電流を表現する式を導き,この式を特色ずけるパラメーターを明確にし, 15種のメディエータについてその電子移動物性と触媒活性との関係を明らかにした.これらの結果は酵素電極一般についての今後の設計原理の一端を明らかにするものである.またNADデヒドロゲナーゼの設計を試み,さらにジアホラーゼを同時に固定化することによりさらに実用性のあるセンサー用電極が出来ることを,アルコール,乳酸,グリセロールデヒドロゲナーゼについて示した.酵素-電極間直接電子移動について予備的測定を行った.仁木は,チトクロムCと電極間の電子移動について,全電極表面を4PyS吸着分子層で修飾した場合,電子移動が吸着分子層を通しておこることを始めて実証した.また4BiPy吸着の場合はチトクロムCとの混合吸着のおこることを示した.中村は,フェレドキシンとくに〔4F2-4Se〕クラスタを2, 4, 6-トリメチルベンゼン1, 3ジチオラート,また1.4ジチオラート配位子を用いてつなぎ合せたクラスタ集合体(1520FeySey2+クラスター1分子)を合成し,この高分子ドメイン中のクラスター構造と多電子移動反応の特性を,集合体中のH+イオンをNu(II)及びCu(II)イオンと置換した集合体を用いるなどして明らかにし,今後の触媒効果の見積を行った.村上は,ビタミンB12モデルとしてのCo錯体について,同様,電子移動特性をしらべ,電子移動と1.2転位反応触媒効果との関係を明らかにした.関は,共役系高分子(ポリチオフェン)素材の電子構造の測定を行い,これら新素材の基礎データを明らかにした.多電子移動過程,とくに生体高分子及びそのモデル化合物における多電子移動過程の基本的性質の解明と触媒効果の発現機構の解析と目的として研究を行った.千田は,多電子移動酵素機能電極設計の基礎となるメディエータを用いる界面電子移動反応について,グルコースオキシダーゼを例として取りあげ,そのバイオエレクトロカタリシス電流を表現する式を導き,この式を特色ずけるパラメーターを明確にし, 15種のメディエータについてその電子移動物性と触媒活性との関係を明らかにした.これらの結果は酵素電極一般についての今後の設計原理の一端を明らかにするものである.またNADデヒドロゲナーゼの設計を試み,さらにジアホラーゼを同時に固定化することによりさらに実用性のあるセンサー用電極が出来ることを,アルコール,乳酸,グリセロールデヒドロゲナーゼについて示した.酵素-電極間直接電子移動について予備的測定を行った.仁木は,チトクロムCと電極間の電子移動について,全電極表面を4PyS吸着分子層で修飾した場合,電子移動が吸着分子層を通しておこることを始めて実証した.また4BiPy吸着の場合はチトクロムCとの混合吸着のおこることを示した.中村は,フェレドキシンとくに〔4F2-4Se〕クラスタを2, 4, 6-トリメチルベンゼン1, 3ジチオラート,また1.4ジチオラート配位子を用いてつなぎ合せたクラスタ集合体(1520FeySey2+クラスター1分子)を合成し,この高分子ドメイン中のクラスター構造と多電子移動反応の特性を,集合体中のH+イオンをNu(II)及びCu(II)イオンと置換した集合体を用いるなどして明らかにし,今後の触媒効果の見積を行った.村上は,ビタミンB12モデルとしてのCo錯体について,同様,電子移動特性をしらべ,電子移動と1.2転位反応触媒効果との関係を明らかにした.関は,共役系高分子(ポリチオフェン)素材の電子構造の測定を行い,これら新素材の基礎データを明らかにした.
ヒトトランスコルチンの生合成過程及び遺伝子構造に関する研究

血漿中でグルココルチコイドと特異的に結合し,その作用発現や代謝に重要な役割を果たすトランスコルチン(Tr)の生合成過程,遺伝子構造を明らかにし,ホルモンの結合蛋白の意義の解明に資することを目的とした.(1)ヒトTr(hTr)の合成過程に関する研究ヒト肝組織によりRNAを抽出し,無細胞翻訳系で翻訳して得たpre-transcortinは約45,700daltonで, cortisol結合能をもつことが明らかになった.ヒト肝癌由来の細胞系Hep G2をパルスラベル後チェイスし,細胞,培養液中へのTrの生成を観察し, 56kdとして作られたTrが,分泌の段階で69kdになることが明らかになった.糖蛋白のglycosylationの阻害剤であるTunicamycinを加えると,細胞内及び培養液のTrがいずれも40Kdになる.即ちTrは40kdのペプチドとして合成された後2段階のglycosylationを受けること,又glycosylationはTrの分泌に必須でないことが明らかになった.(2)hTr-mRNAのcDNAのクローニングHep G2のmRNAを抽出,精製してcDNA libraryを作製し,大腸菌をトランスフォームし,約5,000個のコロニーを得たが, Trの陽性コロニーが得られなかった.バクテリオファージ入gtllに組み込まれたヒト肝細胞の遺伝子発現cDNA libraryを用い宿主菌に感染させ, 4個のTr陽性コロニーを得た.その中の1個の核酸配列は報告されたhTr^-cDNAに合致せず,現在他の3個について検討中である.(3)hTrの簡易測定法と生理作用に関する検討抗hTr血清のlgG分画をブレートにコートし,簡便なRIAが可能になった.単層培養ラット副腎細胞のACTH刺激に際し,培養液に加えたhTrはコルチコステロン産生に影響を与えず,ステロイドの分泌に対するTrの作用は否定的であった.(4)ラットTrに関し生化,生理,免疫学的な検討を,霊長類のTrの分子進化学的検討を行った.血漿中でグルココルチコイドと特異的に結合し,その作用発現や代謝に重要な役割を果たすトランスコルチン(Tr)の生合成過程,遺伝子構造を明らかにし,ホルモンの結合蛋白の意義の解明に資することを目的とした.(1)ヒトTr(hTr)の合成過程に関する研究ヒト肝組織によりRNAを抽出し,無細胞翻訳系で翻訳して得たpre-transcortinは約45,700daltonで, cortisol結合能をもつことが明らかになった.ヒト肝癌由来の細胞系Hep G2をパルスラベル後チェイスし,細胞,培養液中へのTrの生成を観察し, 56kdとして作られたTrが,分泌の段階で69kdになることが明らかになった.糖蛋白のglycosylationの阻害剤であるTunicamycinを加えると,細胞内及び培養液のTrがいずれも40Kdになる.即ちTrは40kdのペプチドとして合成された後2段階のglycosylationを受けること,又glycosylationはTrの分泌に必須でないことが明らかになった.(2)hTr-mRNAのcDNAのクローニングHep G2のmRNAを抽出,精製してcDNA libraryを作製し,大腸菌をトランスフォームし,約5,000個のコロニーを得たが, Trの陽性コロニーが得られなかった.バクテリオファージ入gtllに組み込まれたヒト肝細胞の遺伝子発現cDNA libraryを用い宿主菌に感染させ, 4個のTr陽性コロニーを得た.その中の1個の核酸配列は報告されたhTr^-cDNAに合致せず,現在他の3個について検討中である.(3)hTrの簡易測定法と生理作用に関する検討抗hTr血清のlgG分画をブレートにコートし,簡便なRIAが可能になった.単層培養ラット副腎細胞のACTH刺激に際し,培養液に加えたhTrはコルチコステロン産生に影響を与えず,ステロイドの分泌に対するTrの作用は否定的であった.(4)ラットTrに関し生化,生理,免疫学的な検討を,霊長類のTrの分子進化学的検討を行った.1)トランスコルチン(Tr)の合成・分泌における糖鎖の役割:ヒト肝癌由来の細胞系HepG2を培養し、confluentな状態に達した時点で、糖鎖付加阻害剤Tunicamycin(TM)5ug/mlを添加し、2時間インキュベートした後、【^(35)S】標職メチオニンで1時間パルスラベルした。パルスラベル終了時、過剰の非標職メチオニンを加えて新たな【^(35)S】の取込を阻止し、0,3,6時間インキュベートした後、細胞および培養液を採取した。対照はTMを加えず、同様の操作を行った。細胞内および培養液中のTrは、抗ヒトTr抗体とパンソルビンで沈殿させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。対照群では、細胞内には分子量56kdのTrが出現し、時間と共に減少したが、培養液中には70kdのTrが出現し時間と共に増加した。一方TM添加により、細胞内に40kdのTrが出現し、そのまま培養液中に分泌されていた。また、細胞内と培養液中のTrの和が、インキュベーションの時間と共に減少した。

以上、Trのペプチド鎖の分子量は40kdで、これは細胞内で2段階の糖付加を受けて56kd、70kdと分子量が変化し、70kdになると直ちに分泌されること、また40kdのTrも培養液中に分泌されることから、糖付加はTrの分泌に不可欠でなく、分子の安定性を増すことが示唆された。2)ヒトトランスコルチンmRNAのcDNA作成経過:ヒト肝から抽出・精製したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、これをバクテリオファージλgt11に組み込んでヒト肝のcDNAライブラリを作成した。次いで抗ヒトトランスコルチン抗体でcDNAライブラリをスクリーニングし、25万個のファージクローンの中から5個のトランスコルチンcDNAを持つファージクローンを得た。現在トランスコルチンcDNAをM13mp18及び19RPに組み込んでその核酸配列を検討中である。
超長大吊橋の風による振動の空力的アクティブ制御

超長大吊橋の設計でもっとも重要な課題とされている風によるフラッターを制御し、振動発生風速を高めるためのアクティブコントロール手法について調べた。補剛桁の両端部に取り付けたフラップを桁の振動にあわせて能動的に駆動して制御空力を発生させる方法を採用した。吊橋のフラッターは桁の上下運動と回転運動とによりなる。両者による振動へ似をもとに効率的に制御できることがわかった。また、上下運動のみ用いてコントロールしても十分な制御効果があることがわかった。明石海峡大橋の1.5倍のスパン3000mを持つ吊橋のフラッターコントロールについて検討した。扁平な補剛桁の両端に桁の1/4の幅のフラップをつけた。コントロールのないときのフラッターは39m/sで発生。フラップに適当な位相と振幅のフィードバック駆動を与えたとき、フラッターは制御されることがわかった。コントロールシステムの信頼性について考察した。フェイルセイフシステムを構築するため、コントロール翼、駆動システム、風力発電装置を一体化したフラッターコントロールシステムをスパン方向に複数個区分して設置することが推奨された。超長大吊橋の設計で最も重要な課題とされている風によるフラッターを制御し,振動発生風速を高めるため,補剛桁の両端部に付けたフラップを桁の振動を検出することにより能動的に動かして制御空気力を発生させる方法を採用した。解析的に与えられる非定常空気力を利用して解析した結果,補剛桁のたわみ振動あるいはねじり振動に対して,いずれの場合も0π/2程度の位相進みを持つフラップの運動がフラッターの抑制に有効であることがわかった。模型を用いた非定常空気力測定実験を実施し,その空気力を用いて解析を繰返した。その解析結果は,フラッター実験の結果とほぼ一致するものであった。なお,フラッター実験では,制御をしないときのフラッター風速の約2倍の風速でダイバーゼンスが発生した。この制御方式をダイバーゼンスの制御にまで拡張して応用できるかどうか検討することが課題となる。補剛桁の両端部に取り付けたフラップを桁の振動にあわせて能動的に駆動して制御空気力を発生させる方法を採用した。吊橋のフラッターは桁の上下運動と回転運動とよりなる。偏平な補剛桁の両端に桁の1/4の幅のフラップをつけた。フラップに適当な位相と振幅のフィードバック駆動を与えたとき、フラッターは抑制されることがわかった。
超解析精度技術を応用した重力波の解析システムの開発とその評価に関する研究

本研究では,工学系で広く利用されているフーリエ変換(FFT)に比べ,10万100億倍以上の精度の向上が見込まれるNHA(Non Harmonic Analysis:申請者が考案した非周期信号のフーリエ変換式への最小二乗法の適用に基づく周波数分析法)を用いて,重力波検出・解析システムに関して,総合的なセンシング能力や情報解析技術の飛躍的向上に資する重力波信号解析技術の開発を行う。具体的には,センシング・ハードウェアの限界を極限まで向上させる時間ー周波数解析技術,リアルタイム解析技術,ノイズ源分離と重力波の微細な周波数変化を追従するための解析技術の開発を行った。一般に,周波数解析(Short Time Fourier TransformやWavelet含む)では,周波数分解能と時間分解能を両立させることは難しいが,NHAでは分析窓形状や分析長に依存しにくいため,周波数分解能と時間分解能の両立が他の手法に比べ容易で,高精度に重力波をはじめとした関連信号を解析できる可能性がある。連成信号以外のバースト波などの重力波で,NHAを用いて,ノイズ環境下での解析精度や時間周波数領域での可視化の可能性について検証した。また、申請者が発明したNHAは,超精度に時間・周波数空間を可視化できるが,計算時間が掛かることが大きな問題であった。そこで、フィルタバンクで、計測信号を複数の狭帯域の帯域に信号を分割することで,計算時間を大幅に削減することができる見通しを示し、リアルタイム計算に迫る計算ができることを示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。重力波に関する超高精度時間ー周波数解析技術のノイズ耐性の検討を行った。NHAを用いて超高精度に時間周波数空間で,計測信号特性を表現させる技術の開発を行う。従来のSTFTでは,解析窓の影響でサイドローブが発生してしまい,正確に解析することが出来ない。また,EMD(経験的モード分解)に基づくHHTでは,スペクトルの独立性が保証できず,ノイズ耐性が悪くことが知られている。一方,NHAは時間分解能と周波数分解能を両立でき,ほぼ音源信号の周波数特性を追従できることから、連成信号以外のバースト波などの重力波にも,NHAを用いて,解析精度や時間周波数領域での可視化の可能性について検証した。さらに,重力波を検出する際のノイズの耐性の,ノイズ耐性の評価も行った。NHAでは周波数分解能の高さから,ノイズも音源と独立したスペクトルとしてセンシングできるので,ノイズ環境下においても大きな成果が見込める可能性が高い。平成27年12月、重力波を解析するにあたり、計測時に混入するラインノイズの影響が、解析結果に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。研究の遂行上、LIGOで観測された実際のラインノイズの影響を白めるための検証・実験を行う必要が生じた。主として、以下の2点に関して検討を行う。(1)超高性能リアルタイム解析技術申請者が発明したNHAは,超精度に時間・周波数空間を可視化できる唯一の方法であるが,計算時間が掛かることが大きな問題である。既に,申請者の新学術公募研究で,KAGRAでの計測データのリアルタイム解析の予備検討を行ってきたが,フィルタバンクを応用し,狭帯域の帯域に信号を分割することで,計算時間を大幅に削減することができる見通しを得た。下の表にも示す通り,2秒程度の計測信号に対し、フィルタバンクを用いた帯域分割によってデータ数を縮小し,解析精度を落とさずにNHA計算をかけることでリアルタイムに迫る計算ができることがわかってきた。NHAの用途の多くはオフライン解析が主であるが,この帯域分割処理は並列計算と相性も良くオンライン解析や,オフライン解析の時間短縮のため,NHAの組み込み高速計算技術の開拓も行う。(2)重力波の微細な周波数変化を想定した検証実験

ドップラー効果などの複雑な環境で計測された信号に対し,環境変化に起因する微小な変化を捉えるための実験を行う。コンピュータシミュレーションにより,変化量を与え,解析できる変化量を定量に検証する。さらに,KAGRAの計測データなどの解析を行い,実証実験も行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
治療効果を指向した新規抗菌薬の創出

1.新規病原性遺伝子の機能解析:昨年度までに同定した14の新規病原性遺伝子のうち、文献調査の結果病原性への寄与が明らかになっていた遺伝子、及び、再現性が低かった株を除き11の遺伝子破壊株が再現よくカイコでの病原性が低下していた。さらにマウス全身感染モデルにおけるそれらの遺伝子破壊株の臓器における生菌数を測定したところ、9つの遺伝子破壊株が野生型株に比べ統計学的に有意に低下していた。それらの株のうち1株が溶血毒素の発現の低下が認められ、別の一株がプロテアーゼの発現低下が認められたが、それ以外については野生型と差がなく別の要因によると考えられた。さらに本研究カイコ感染モデルを用いて以前に見いだしていた病原性遺伝子SA0873の機能解析を行い、その酵素活性を明らかにし、活性のアッセイ系を確立した。2.真菌の病原性遺伝子の探索と同定:マウス全身感染モデルにおける真菌の発現解析の結果から、発現量が多い遺伝子の順からカイコモデルを用いた病原性の検証を行った。その結果、42遺伝子破壊株について検討した結果、16遺伝子について病原性の低下が認められた。3.病原性遺伝子の機能解析と阻害剤の探索:酵素活性測定系を確立した新規病原性因子について、阻害活性を指標とした化合物の探索のパイロット試験を実施した。4.病原性遺伝子ネットワークの解明:鉄獲得系のfhu系は時間経過によらず常に発現していたが、その他の3つのsir系を含む鉄獲得系は時間経過と共に発現量が増加していた。一方で、鉄欠乏時に発現量が減少するリプレッサーであるfurは時間経過と共に発現量の減少が認められた。fhu遺伝子やsir遺伝子のプロモーターにはfur boxが存在するが、両者で異なる挙動を示すことからin vivoにおいてはFurとは異なる制御因子が働いていると考えられる。宿主環境下における細菌及び真菌の網羅的な遺伝子発現解析手法は当初の見込み通り確立でき、さらに当初予定していない菌種に対する手法も確立できた。また、プロモーター領域の解析については、宿主環境下における発現変動が当初の予想よりも複雑で既存の知見が当てはまらない例が多いことがわかってきた。今後の解析により新しい知見が得られることが期待できるが、本研究計画においては当初の予想以上に難航している状況である。一方、本研究において細菌及び真菌について当初の想定以上の新規病原性遺伝子を多数見いだすことに成功できた。なお、本研究のように真菌について多数の病原性発揮に必要な因子を同定した例はなく、本成果は他の追随を許さない位置にいると考えられる。阻害薬のスクリーニングを行うためのアッセイ系についても複数確立でき、さらに今後も複数の因子について確立を見込むことができる。さらに、病原性因子を標的とする阻害薬探索のパイロット試験を実施できた。試験の結果を元に改善するべき点が見いだされたことから、大規模スクリーニングに至っていないが、検出系の改良により改善を見込むことが可能である。以上のことから、一部計画通りには進行してないものの、当初の研究計画で掲げたコンセプトの大半は確立したか確立しつつあり、全体としては概ね順調に進行していると判断した。(1)病原性発揮機構の解析:真菌のカイコモデルで同定された病原性遺伝子について、マウスモデルでの評価を実施する。同定されている遺伝子数が多いため種間での宿主環境下での発現量、種間での共通性などを勘案し絞り込んだ上で実施する。また、すでに同定された黄色ブドウ球菌の新規病原性遺伝子については機能解析を引き続き実施し、アッセイ法の確立を行う。(2)病原性を抑制する阻害薬の探索:見いだされた新規病原性遺伝子のうち病原性への寄与が最も高くアッセイ系が確立しパイロット試験を実施したものについて、パイロット試験で見いだされた問題を解決し化合物のスクリーニングを実施する。(3)病原性遺伝子ネットワークの解明:当初計画の網羅的な解析ではなく、新たなシグナル伝達経路の解析に絞り込む。具体的には、本研究において病原性遺伝子の探索によって見いだされた新規病原性遺伝子に着目する。本遺伝子破壊株では、溶血毒素やプロテアーゼなど複数の病原性因子の発現量が変わっており、また遺伝子発現段階での制御の可能性が見いだされていることから、遺伝子破壊株のRNA-Seq解析、Chip-Seq解析等を行い、発現制御機構を明らかにする。1.宿主臓器内における病原性細菌の遺伝子発現の網羅的解析による新規病原性因子の同定:次世代シークセンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析によって、宿主臓器環境での発現上昇した黄色ブドウ球菌の遺伝子群のうち、すでに病原性における機能が明確なものを除いた29の遺伝子について破壊株を樹立した。それらの株について、マウスにおける病原性を検討したところ、6つの遺伝子破壊株の病原性が低下していた。また、網羅的な病原性遺伝子黄色ブドウ球菌の機能未知の遺伝子について破壊株樹立を行った。また、真菌についても、臓器感染状態における真菌に遺伝子発現解析の解析条件を検討した。2.宿主側の感染時における網羅的遺伝子発現解析:1の黄色ブドウ球菌側の遺伝子発現解析を実施する際に、混入してくる宿主側の情報を用いて、宿主の遺伝子発現について解析できるか否か検討したところ、十分な有意水準で解析できることがわかった。その解析の結果、これまでに知られている炎症性のマーカーや、サイトカインなどの発現上昇が確認できた。さらに、細菌感染との関連が指摘されていない遺伝子についても発現上昇することがわかった。その因子は黄色ブドウ球菌が発現する毒素との関連している可能性が考えられなど、宿主と微生物の相互作用の一端を明らかにすることができた。

3.病原性に関わるncRNA領域の推定:今回導入したシステムによって、黄色ブドウ球菌の遺伝子発現のゲノム上の向きが判明し、これまでに全く明らかになっていなかったnon-cording RNA領域と推定される複数の遺伝子が見いだされた。それらのncRNA領域の遺伝子発現について、網羅的な発現上昇解析を行ったところ、少なくとも3つのncRNAの発現量が有意に上昇していた。そのうち一つについて破壊株を樹立し、マウス全身感染モデルにおける病原性を検討したところ、有意な病原性の低下が認められた。本年度の研究により、複数のこれまでに知られていなかった新規病原性遺伝子や新規ncRNAが明らかとなったこと、及び、解析システムの導入と解析方法の確立が順調に進んだことから判断した。さらに、28年度以降に実施予定であった、真菌の感染モデルについても解析に着手できた点からも、研究は順調に進展していると判断できる。1.宿主臓器内における病原性細菌の遺伝子発現の網羅的解析による新規病原性因子の同定発現上昇した遺伝子の詳細なパスウェイ解析、及び機能分類を行い、黄色ブドウ球菌が宿主においてどのような環境におかれているかを明らかにすることができた。また、マウス臓器間で共通して発現上昇する機能未知の遺伝子についてマウスでの病原性について検討を実施し、3つの新規病原性遺伝子を見いだした。機能既知の遺伝子のうち病原性への寄与が知られていなかった4つの病原性遺伝子を同定した。前年度に見いだした新規病原性ncRNAの破壊株に対して、遺伝子の相補によって病原性が回復したことから、本ncRNAが病原性発揮に必要であることを初めて明らかにできた。また、一部の真菌についても宿主環境下における網羅的遺伝子発現変動を解析手法が確立できた。2.カイコを用いた新規病原性遺伝子の探索病原性への寄与が明らかでない機能未知遺伝子約200個について解析を実施し、新たに1つの新規病原性遺伝子の同定に成功した。残りの機能未知遺伝子については、遺伝子破壊ライブラリーを導入できたことから29年度の早い時期に解析を完了できる予定である。3.病原性遺伝子の機能解析と阻害剤の探索1で見いだした新規の病原性に関わるncRNAの遺伝子破壊株において、発現低下する遺伝子群を同定し、それらが臓器環境下で発現上昇する遺伝子群であることを明らかにした。従って、本ncRNAは病原性発揮に必要な遺伝子群の制御に関わると考えられる。また、カイコ・マウスにおいて病原性に関わることが明らかにした機能未知遺伝子について機能解析を行っており、1つについてその酵素活性、及び機能を明らかにした。さらに、化合物ライブラリーから見いだしていたカイコモデルで治療効果を示す抗菌化合物について、その標的がSigAであることを明らかにした。網羅的遺伝子発現変動の結果から、黄色ブドウ球菌の宿主環境下における振る舞いの全体像を明らかにすることができた。さらに、多数の新規の病原性因子が同定され、その機能解析が進んでおり、いくつかについては生化学的な酵素活性が明らかになりつつある。
超原子価硫黄の結合特性を利用した大環状化合物の新規合成法の開発

本研究では課題研究について以下のことを明らかにした。1)超原子価硫黄をもつテトラアザチアペンタレン誘導体(1)と諸種のジイソチオシアナート類との反応により、種々のスペーサーとペンタレン環2個をもつ大環状化合物(2)が高収率で得られた。2)1)の方法で合成した2個のペンタレン環と2個のピレン環をもつピレノファンはピレン環に基ずく典型的なエキシマー発光が観測された。3)大環状化合物(2)を水素化ホウ素ナトリウムで還元すると、超原子価硫黄が脱離し、尿素部位をもつ大環状化合物(3)に高収率で変換した。また、この大環状化合物の構造はX線結晶構造解析により決定した。4)化合物(2)のアルカリ加水分解ではC=S^<IV>の脱離を伴ってチオ尿素部位を4個もつ大環状化合物(4)が高収率で得られた。また、このアルカリ加水分解における環拡大反応の中間体は環状尿素誘導体であることを明らかにした。5)化合物(3)および(4)を用いて酢酸アニオンとリン酸アニオンの分子認識能についてしらべた。その結果、p-キシりレン基をもつ大環状化合物は酢酸アニオンと1:2錯体を、またリン酸アニオンとは、1:2錯体を形成することがわかった。6)スペーサーとしてアゾベンゼン官能基をもつトランス大環状化合物では酢酸アニオンに対して1:1の錯形成をすることがわかった。しかし、シス体では全く認識をしなかった。このことは、光によるON-OFF分子認識素子としての利用が期待される。5-tert-ブチm-キシレンを原料として6段階で分子内に2個の10-S-3テトラアザチアペンタレン環をもつ新規化合物(1)を合成した。化合物1の超原子価硫黄のアピカルおよびエクアトリアル結合特性を用いて諸種の大環状化合物への変換方法を確立した。1と剛直なp-キシリレンジイソチオシアナートや5-tert-ブチルm-キシリレンジイソチオシアナート類との反応では分子間反応がおこり積層型の大環状化合物(2)が高収率で得られることがわかった。一方、長鎖のエーテル結合をもつジイソチオシアナート類との反応では、選択的に分子内環化反応がおこり分子内に2個のクラウンエーテル部位をもつ大環状化合物(3)が得られた。化合物3をアルカリ加水分解するとC=S^<IV>部位の脱離により環拡大し、チオ尿素部位とエーテル結合鎖を併せもつ大環状化合物(4)がえられた。化合物4はリン酸アニオンレセプターとして有効であり、1:2の錯形成をすることがわかった。また3や4はカチオンに対しすぐれた補足能を有することがわかった。化合物4はアニオンやカチオンいずれにも分子認識能を示す極めて珍しい性質があることがわかった。1)超原子価硫黄をもつテトラアサチアペンタレン誘導体(1)と諸種のジイソチオシアナート類との反応により、種々のスペーサーとペンタレン環2個をもつ大環状化合物(2)が高収率で得られた。2)1)の方法で合成した2個のペンタレン環と2個のピレン環をもっピレノファンはピレン環に基ずく典型的なエキシマー発光が観測された。4)化合物(2)のアルカリ加水分解ではC=S^<IV>の脱離牽伴ってチオ尿素部位を4個もつ大環状化合物(4)が高収率で得られた。

また、このアルカリ加水分解における環拡大反応の中間体は環状尿素誘導伝下あることを明らかにした。5)化合物(3)および(4)を用いて酢酸アニオンとリン酸アニオンの分子認識能にっいてしらべた。その結果、P-キシリレン基をもつ大環状化合物は酢酸アニオンと1:2錯体を、またリン酸アニオンとは、1:2錯体を形成することがわかった。6)スペーサーとしてアゾベンゼン官能基をもつトランス大環状化合物では酢酸アニオンに対して1:1の錯形成をすることがわかった。しかし、シス体では全く認識をしなかった。このことは、光によるON-OFF分子認識素子としての利用が期待される。
暑熱環境不適応による初期胚死滅の分子機構解明と熱帯畜産への応用

熱帯という地域の自然的・社会的諸条件(在地性)を出発点とする新しい畜産学の体系化、すなわち熱帯畜産学の創成を求め、本研究では家畜繁殖学領域からの一つの試みとして、熱帯畜産の潜在的制約要因である高能力家畜の暑熱環境不適応による母体の体温上昇に起因する初期胚死滅現象を取り上げ、その分子機構を明らかにしようとした。前年度に確立したマウス実験モデルを用い、本年度は、過体温に附随する酸化ストレスの亢進によって初期胚死滅が誘発される可能性についての検証と2細胞期での発生停止の分子機構解明を目指した。1.初期胚死滅に関わる胚と卵管組織との相互作用に関する解析まず、交配直後12時間の母体暑熱感作(気温35°C、相対湿度60%)によって2細胞期以降での胚死滅が誘発されることを確認し、同一条件下で胚及び卵管組織の酸化還元状態を比較した。その結果、暑熱感作を受けた初期胚(1-2細胞期)では胚中のグルタチオン量が減少し、卵管組織では過酸化水素量の増加が観察された。一方、卵胞内卵子に暑熱感作を加えた場合には、胚中グルタチオン量の減少は起こらなかった。これらの結果から、母体暑熱感作による初期胚死滅は卵管との相互作用を介する酸化ストレスの増大によって誘発されるという仮説の客観性が裏付けられた。2.母体暑熱感作を受けて2細胞期で発生を停止する初期胚の細胞周期制御因子の解析母体暑熱感作によって死滅する胚の大半が2細胞期で発生を停止することから、細胞周期調節因子の動態を解析することにより、分子機構の解明を試みた。G2期前後におけるCdc2の活性型/不活性型分子の動態を調べたところ、暑熱感作を受けた胚ではCdc2の活性化が阻害され卵割停止に至ることが明らかになった。これらの結果は、熱耐性欠如という初期胚の細胞学的特徴が主要因であるとする定説を覆すものであると同時に、新たな防御技術が開発できる可能性を示すものである。熱帯という地域の自然的・社会的諸条件(在地性)を出発点とした新しい畜産学の体系化、すなわち熱帯畜産学の創生を求め、本研究では家畜繁殖学領域からの一つの試みとして、熱帯畜産の潜在的制約要因である高能力家畜の暑熱環境不適応による母体の体温上昇に起因する初期胚死滅現象を取り上げ、その分子機構を明らかにしようとした。本年度は、まず、家畜において観察される母体暑熱感作に起因した初期胚死滅の誘発を、実験動物のマウスで再現する解析モデルを構築し、この案験動物モデルを用いて、母上体暑熱感作が卵管環境および初期胚発生をどのように阻害するかについて解析した。1.初期胚の発生能を阻害する母体暑熱感作実験モデルの確立についてまず、マウスの直腸温度を1°C2°Cの範囲で上昇させる母体暑熱感作条件について検討し、次いで、この母体暑熱感作条件を交配直後の各時期のマウスに感作し、その後、適時に胚を回収して発生段階を比較した。その結果、交配直後の12時間の母体暑熱感作(気温35°C・相対湿度60%)によって、著しい初期胚発生阻害を示すことが明らかとなり、この実験モデルの有効性を確認した。2.母体暑熱感作に起因した初期胚死滅の生理的な機序についてまず、母体暑熱感作を受けた1細胞期胚と体外培養下で直接暑熱感作を受けた1細胞期胚を培養し、初期胚死滅誘発の作用経路について検証した。さらに、初期胚死滅が誘発される各段階で胚の酸化ストレスおよび細胞周期制御因子の動態について解析した。その結果、暑熱感作による初期胚死滅の誘発は、母体の体温上昇そのものに起因するのではなく、胚と卵管環境との相互作用を介した酸化ストレスの亢進が関与することが明らかになった。また、暑熱感作による起因する初期胚死滅の直接的な引き金は、細胞周期のチェックポイント機構を介した2細胞期での発生停止であること示唆する実験的証左が得られた。

2.母体暑熱感作を受けて2細胞期で発生を停止する初期胚の細胞周期制御因子の解析母体暑熱感作によって死滅する胚の大半が2細胞期で発生を停止することから、細胞周期調節因子の動態を解析することにより、分子機構の解明を試みた。G2期前後におけるCdc2の活性型/不活性型分子の動態を調べたところ、暑熱感作を受けた胚ではCdc2の活性化が阻害され卵割停止に至ることが明らかになった。これらの結果は、熱耐性欠如という初期胚の細胞学的特徴が主要因であるとする定説を覆すものであると同時に、新たな防御技術が開発できる可能性を示すものである。
環境を考慮した都市内物流システムの合理化に関する研究

本研究においては、環境を考慮し,都市内の物流システムを合理化するための方策として提案されているシティロジスティクスをとりあげた。シティロジスティクスの中でも重要な位置を占める都市内集配トラックの配車配送計画について、そのモデル化、ヒューリスティクス手法を用いた解法、および動的交通シミュレーションとの統合モデルの開発を行った。それらのモデルを仮想道路ネットワークに適用し、モデルの適用性を検討するとともに、環境への影響について考察を加えた。都市内集配トラックの時間指定付き配車配送計画モデルの定式化を行った。これは、物流の総費用を最小化するような最適化モデルである。このようなモデルは、NP-困難な大規模な非線形最適化問題であり、厳密解を求めることが困難である。そこで、遺伝的アルゴリズム、シミュレーテッド・アニーリング、タブー・サーチの3種類のヒューリスティクス手法を適用した。時間指定付き配車配送計画問題の解を比較した結果、3つとも、比較的良い解を与えることがわかった。時間指定付き配車配送計画と動的交通シミュレーションを組み合わせた統合モデルを開発した。このモデルにおいては、各企業の最適配車配送計画と、ネットワーク上における交通流の変化の相互作用を考慮している。このモデルを仮想道路ネットワークに適用した。その結果、高度な配車配送計画の導入、共同化、トラックの積載率規制を実施することによって、企業にとっては、コスト削減の効果があり、また地域にとっては、交通混雑の緩和、CO_2排出量の削減の効果があることが明らかになった。特に、共同化を実施した場合、貨物の需要量が2倍に増加したとしても、CO_2排出量は、ほとんど同じレベルに留まることがわかった。したがって、これらの方法は,シティロジスティクスの実現に向けて,有力な手段となり得る.本研究においては、環境を考慮し,都市内の物流システムを合理化するための方策として提案されているシティロジスティクスをとりあげた。したがって、これらの方法は,シティロジスティクスの実現に向けて,有力な手段となり得る.本研究においては、企業におけるビジネスロジスティクスと、社会的な観点から見た都市計画・交通計画を融合させた「シティロジスティクス」の構築を目指している。特に、時間指定がある場合の、都市内の集配トラックの交通行動に着目し、それを数学モデルを用いて記述し、さらにシミュレーションを行うことによって、都市内の物流システムの社会的な最適化の方法論、トラックを対象とした各種の交通管理施策の効果を明らかにしようとするものである。今年度は、時間指定がある場合の都市内の集配トラックの交通行動をモデル化し、その最適解を、ヒューリスティク手法によって求める方法を開発した。以下にその成果を述べる。(1)時間指定がある場合の都市内の集配トラックの交通行動のモデル化時間指定がある場合の都市内の集配トラックの集荷・配送活動について、複数のトラックが、デポを出発し、顧客のところを巡回して貨物を集荷あるいは配送してまたデポに帰ってくる場合を考える。このような場合におけるトラックの顧客への割り当ておよび訪問順序を決定するモデルを構築した。このモデルにおいては、トラックの庸車費、運行費、荷役費、顧客の指定時刻への早着・遅刻ペナルティーの総和を最小化するようなトラックの顧客への割り当ておよび訪問順序を決定する。(2)ヒューリスティク手法による解法の開発(1)において構築したモデルは、NP困難な大規模な組み合わせ最適化問題となるため、厳密解を求めることが困難である。そこで、遺伝的アルゴリズム(GA)、シミュレーテッド・アニーリング(SA)、タブー・サーチ(TS)の3種類のヒューリスティク手法を用いて最適解を求める方法を開発した。この解法を用いる場合の各パラメータを試行錯誤によって決定し、これを仮想ネットワークにおける問題に適用した結果、いずれの方法も良い近似解が得られることが分かった。特にTSを用いることによって、良い解を比較的短い計算時間で得られた。また、SAによる解は、初期値の変動に対しても比較的安定していることが分かった。研究第2年度の平成11年度においては,以下の2点について研究を行った.

(1)都市内集配トラックの交通行動を組み込んだシミュレーション手法の開発昨年度作成した都市内集配トラックの交通行動に関するモデルは、一つの企業における、積載量に制限がある複数のトラックの集荷・配送行動の最適化モデルとなっている。しかし、今この研究で目指すところは、ある地域全体におけるトラックの行動の最適化モデルの構築である。そこで、ある道路ネットワークにおいて、乗用車の交通も考慮し、上記のトラックの交通行動モデルを組み込んだシミュレーション手法を開発した。シミュレーションの方法としては,基本的にトラックおよび乗用車を車群として扱うマクロシミュレーションとするが,一台ずつのトラックのODを考慮できるマクロ・ミクロのハイブリット型とした。具体的には、ボックスモデルによる交通シミュレーションと都市内集配トラックの配車配送計画を組み合わせたモデルを開発した。(2)環境改善のためのトラックに対する各種の交通施策の効果の把握上記のシミュレーション手法を用いて、環境改善のためのトラックに対する各種の交通施策の効果の把握を行った。具体的には、都心地区へのトラックの流入制限、共同輸送の推進、積載率のコントロール等のトラックに対する各種の交通施策を実施した場合の交通渋滞の変化、およびそれによってもたらされる沿道環境の改善効果について、定量的に把握した。特に、CO_2の総排出量の削減効果について、定量的な検討を行った。同時に、上記の交通施策を実施した場合の、物流コストの削減についても評価した。従って、ここでは、物流の効率化に役立ち、かつ社会的に交通渋滞の緩和や、環境改善に役立つような交通施策について、検討を行った。
高温超伝導ケーブルの動的複合ストレス環境を考慮した高信頼度化に関する研究

世界各国の高温超電導ケーブル開発プロジェクトでは,実験室レベルの研究を脱して実規模のフィールド試験が実施・計画されている.高温超電導ケーブルの開発・実用化のためには,その運転中に想定される各種のストレス環境を考慮した電圧・電流設計が必要となる.そこで,本研究では,高温超電導ケーブルにおける熱/電界ストレス,静的/動的ストレスなどの複合ストレス環境を想定した絶縁特性を取得・評価することにより,高信頼度かつ合理的・実用的な高温超電導ケーブルの絶縁設計に資することを目的とし,以下の研究成果を得た.(1)熱/電界複合ストレス下における部分放電現象の基礎特性高温超電導ケーブルの通電・絶縁構造を模擬した液体窒素/積層テープ複合絶縁系を構成し,大気圧液体窒素中および減圧過冷却液体窒素中において,クエンチ時の熱/電界複合ストレス下における部分放電(PD)特性について検討するとともに,部分放電開始電圧(PDIV)の熱/電界複合ストレス依存性を明らかにした.(2)液体窒素/積層テープ複合絶縁系におけるインパルス部分放電特性液体窒素/積層テープ複合絶縁系からなる平行平板電極モデルおよび同軸円筒電極モデルにおいて,ハイパスフィルタ(HPF)を用いることによりインパルス電圧印加時に発生するPDを検出し,インパルスPD開始特性および絶縁破壊(BD)特性を明らかにした.(3)交流/インパルス重畳電圧印加時における部分放電特性高温超電導ケーブルの常規交流電圧運転時における雷サージ等の過渡過電圧の侵入を模擬するため,平行平板電極モデルにおいて交流/インパルス重畳電圧下におけるPD特性を取得し,印加電圧ストレスに基づいてPDの発生条件および継続時間特性を明らかにした.世界各国の高温超電導ケーブル開発プロジェクトでは,実験室レベルの研究を脱して実規模のフィールド試験が実施・計画されている.高温超電導ケーブルの開発・実用化のためには,その運転中に想定される各種のストレス環境を考慮した電圧・電流設計が必要となる.そこで,本研究では,高温超電導ケーブルにおける熱/電界ストレス,静的/動的ストレスなどの複合ストレス環境を想定した絶縁特性を取得・評価することにより,高信頼度かつ合理的・実用的な高温超電導ケーブルの絶縁設計に資することを目的とし,以下の研究成果を得た.(1)熱/電界複合ストレス下における部分放電現象の基礎特性高温超電導ケーブルの通電・絶縁構造を模擬した液体窒素/積層テープ複合絶縁系を構成し,大気圧液体窒素中および減圧過冷却液体窒素中において,クエンチ時の熱/電界複合ストレス下における部分放電(PD)特性について検討するとともに,部分放電開始電圧(PDIV)の熱/電界複合ストレス依存性を明らかにした.(2)液体窒素/積層テープ複合絶縁系におけるインパルス部分放電特性液体窒素/積層テープ複合絶縁系からなる平行平板電極モデルおよび同軸円筒電極モデルにおいて,ハイパスフィルタ(HPF)を用いることによりインパルス電圧印加時に発生するPDを検出し,インパルスPD開始特性および絶縁破壊(BD)特性を明らかにした.(3)交流/インパルス重畳電圧印加時における部分放電特性高温超電導ケーブルの常規交流電圧運転時における雷サージ等の過渡過電圧の侵入を模擬するため,平行平板電極モデルにおいて交流/インパルス重畳電圧下におけるPD特性を取得し,印加電圧ストレスに基づいてPDの発生条件および継続時間特性を明らかにした.本研究では,高温超電導ケーブルの高信頼度かつ合理的・実用的な電気絶縁設計に資する絶縁データを取得・体系化することを目的としている.本年度は,クエンチ環境を想定した熱/電界複合ストレス下における絶縁特性について検討を行った.高温超電導ケーブルの通電・絶縁環境を模擬した液体窒素/積層テープ複合絶縁系により,大気圧液体窒素(77K,0.1MPa)中および減圧過冷却液体窒素(65K67K,124hPa234hPa)中におけるクエンチ環境下の部分放電(PD)特性を取得した.その結果,以下の知見が得られた.(1)Bi2223超電導テープを銅テープとともに巻枠上に巻回したケーブルモデルにおいて,超電導テープに臨界電流(Ic)以上の過電流を通電してクエンチを発生させ,液体窒素/積層テープ複合絶縁系に熱/電界複合ストレスを与えた.その結果,クエンチを発生させない定常的(静的)なPD開始電圧以下の電界ストレス下においても,クエンチによる過渡的(動的)な熱ストレスの重畳によってPDが発生することを示した.(2)過冷却液体窒素中におけるPD開始電圧はI/Ic=1.8付近において減少し始め,熱/電界複合ストレスの増加に伴って最大で約1/14まで減少した.大気圧液体窒素中においては,PD開始電圧の減少傾向が見られる電流域に差異はあるが,I/Ic=3付近において動的なPD開始電圧が静的なPD開始電圧の約1/3まで低下する共通の傾向が得られた.(3)PD開始後のPD信号が印加電圧位相のゼロクロス付近にシフトしていることから,PD形態はボイド型であると考えられる.また,PD信号が継続的に発生した後に消滅したことから,超伝導テープのクエンチによる熱ストレスが積層テープ間の液体窒素に伝搬して気泡(ボイド)を発生させてPDを誘発し,その気泡が液体窒素によって冷却・縮小してPDが消滅したと考えられる.本研究では,高温超伝導ケーブルの高信頼度かつ合理的・実用的な電気絶縁設計に資する絶縁データを取得・体系化することを目的としている.本年度は,高温超伝導ケーブルの絶縁環境を模擬した液体窒素/積層テープ複合絶縁系の部分放電(PD)/絶縁破壊(BD)測定により,以下の知見が得られた.

(1)ハイパスフィルタ(HPF)を用いることにより,インパルス電圧下のPDを電気的に検出することを可能とし,インパルスPD開始電圧(PDIV)特性およびBD電圧(BDV)特性について検討した.また,HPFを用いた電気的/光学的PD計測によるPD開始特性から,PD開始時のインパルス比として1.5を得た.さらに,交流電圧および2種類のインパルス電圧印加時におけるPDIVおよびBDVの波頭長依存性から,波頭長が短いほどPDIVおよびBDVともに上昇することを示し,インパルスPD開始およびBD特性において,波頭長に基づく定量的評価が可能であることを示した.(2)高温超伝導ケーブルの常規交流電圧運転時における雷サージ電圧の侵入を模擬するために,交流/インパルス重畳電圧発生回路を構築するとともに,重畳電圧下におけるPD特性を取得し,印加電圧ストレスに基づいてPDの発生条件および継続時間特性について検討を行った.その結果,交流電圧にインパルス電圧が重畳することにより,PDIV以下の交流電圧下においてもPDが発生することを明らかにした.また,交流PDを誘発するトリガーストレス(交流/インパルス重畳電圧瞬時値)および定常ストレス(交流電圧)に基づいて,交流PD発生の有無を定量的に境界づけた.さらに,PD継続時間の印加電圧ストレス依存性から,PD継続時間はトリガーストレスである重畳電圧瞬時値よりも定常ストレスである交流電圧に依存しており,交流電界が支配的であることを示した.
マウス歯胚発生に関与するcDNAの単離・同定と、ヒト歯原性腫瘍におけるその局在

今回の研究目的は、歯胚のtotal mRNAからRT-PCRで調整したcDNAを標識し、各々をプローブとしたIn situハイブリダイゼーションを同一ステージの歯胚に施行することによって、各cDNAの生物学的意義を組織内局在の特異性によりスクリーニングすることである。妊娠確定マウスの胎児(E13-16)から歯胚、およびDifferential displayの対照として正常歯肉を摘出し、それぞれから調整したtotal RNAを鋳型とし、ランダムプライマー法によってRT-PCRを施行し、Differnetial displayにより歯胚特異的なcDNAを単離した。これにUV照射し、TTダイマー化プローブとしてIn situハイブリダイゼーションを歯胚に施行し、局在が特異的であったものの塩基配列を決定したところ、amelogenin等が同定された。そこで、これらのプローブをもちいたIn situハイブリダイゼーションを種々の歯原性腫瘍パラフィン切片に施行することによって、腫瘍胞巣内での局在を検討した。硬組織を含む歯原性腫瘍パラフィン標本は、そのほととんどが塩酸ベースの脱灰液で処理されていたためにmRNA保存度が低く、シグナルの検出はできなかったが、未脱灰の歯原性腫瘍胞巣内(Ameloblastoma等)では、amelogenin等、歯胚特異的mRNAの発現が確認された。これらの結果は、容易、かつ安価にプローブをハプテン化できるT-Tダイマー法が、組織特異的mRNAの検出のためのスクリーニングに応用可能であることをしめした。現在まで、妊娠確定マウスの胎児(E14-17)から歯胚を摘出し、調整したtotal RNAを鋳型とし、ランダムプライマー法によってRT-PCRを施行、cDNAを調整した。これを電気泳動してそれぞれのバンドを分離したのち、ゲルから切り出し、抽出した。それぞれのcDNAに10000Jの紫外線を照射、T-Tダイマーを形成させることによりcDNAはハプテン化した。一方、マウスを灌流固定したのち、下顎骨を摘出、10%EDTA(pH7.4)で8日間脱灰したのち通報どおり包埋し、6μm厚の切片を作製した。これにハプテン化したcDNAをもちいてIn situハイブリダイゼーションを施行した。局在が特異的であったものの塩基配列を決定した。現在までにその局在の特異性を確認できたものはBMPファミリーである。現在、臼歯部歯胚のトリプシン処理によって上皮-間葉成分を分離し、それぞれを比較するdifferential dysplayによってプローブの絞り込みを行うことをこころみているが、上皮、間葉それぞれの組織にコンタミネーションがあり、より正確な条件設定が必要であり、条件の決定を急いでいる。硬組織を含む歯原性腫瘍

パラフィン標本は、そのほとんどが塩酸ベースの脱灰液で処理されていたためにmRNA保存度が低く、シグナルの検出はできなかったが、未脱胚の歯原生腫瘍胞巣内(Ameloblastoma等)では、amelogenin等、歯灰特異的mRNAの発現が確認された。これらの結果は、容易、かつ安価にプローブをハプテン化できるT-Tダイマー法が、組織特異的mRNAの検出のためのスクリーニングに応用可能であることをしめした。
癌の標的遺伝子治療に向けた癌特異抗原の分離と機能解析のための共同研究

フーンとサレーは腫瘍特異的な癌特異抗原として、PCRを用いてヒトメラノーマ組織よりMAGE-1,MAGE-3,gp-100,TRP-2の遺伝子を単離した。金田は腫瘍抗原を遺伝子ワクチンとして生体組織で効果的に発現させるための、デリバリーシステムの開発・改良を行い、改良型HVJ-liposome(AVE型と正電荷型)を開発し、さらに組織内での遺伝子発現を高めるため、Epstein-Barr virusのコンポーネントを用いたレプリコンベクターを開発した。フーンと金田はまず、MAGE-1,3の発現ベクターをHVJ-liposomeによってマウス骨格筋に注入して発現させると特異的な抗体が産生され、1年後にもブースターをかけて抗体をマウス体内で活性化できることを確認した。ヒトgp100遺伝子をHVJ-liposomeによってC57BL/6マウスの骨格筋に2回注入し発現させると、gp100に対する抗体とマウスメラノーマ細胞株B16の細胞障害性T細胞(CTL)マウス脾臓中に産生された。そこでgp100発現ベクターで2回免疫したC57BL/6マウスの足底に2500個のB16細胞を接種した。gpl00で免疫したマウスにおいて腫瘍の形成が遅延と生存の長期化がえられたが、最終的に全例死亡した。さらに効果的な免疫を得るため、一過性に強い発現をおこせるベクターとしてセムリキ森林ウイルスベクターを用いて試験管内で合成したmRNAをHVJ-liposomeで組織で発現させることにした。またその注入部位として骨格筋ではなく抗原提示細胞が豊富と考えられる脾臓を選択した。同様の免疫実験を行い、抗体、CTLに誘発を確認し、腫瘍形成に対する効果をみたところ、gp100mRNAで免疫したもののみ、160日後においても6匹中2匹が生存し、腫瘍の再投与でも腫瘍形成を認めなかった。Boonらによって単離された腫瘍抗原ペプチドMAGE-1(melanoma antigen gene 1)はHLA-A1上のペプチドEADPTGHSYをコードしておりこれが腫瘍細胞障害性T細胞により認識される。しかしフーン博士のもとでMAGE-1のexon3を発現させたメラノーマ細胞をワクチンとしてメラノーマ患者に接種したところHLA-A2の患者においてもMAGE蛋白に対する免疫反応がHLA-A1患者における以上に惹起された。このことは抗腫瘍ペプチドはHLA-A1拘束性の上記のもの以外にもより効果的なペプチドが存在する可能性を示唆している。そこでより有効な癌遺伝子ワクチンの開発のために、MAGE-1,MAGE-3遺伝子導入マウスにおける抗腫瘍効果の基礎的検討を行った。導入法としては我々が開発したHVJ-liposome法を用い、マウス骨格筋に遺伝子を導入した。HVJ-liposome法はベクターなしのnaked DNA注入と比べ骨格筋での導入遺伝子の発現開始時期がはるかに早くその発現量も高かった。MAGE-1のexon3或いはMAGE-3のcDNA全長を発現ベクターに組込みHVJ-liposome法によりマウス骨格筋に注入すると全例においてMAGE-1,MAGE-3に対する抗体が産生され、それぞれの抗体は相互に交差反応をおこした。抗体産生は1年後の再注入によってブ-スター効果を認めた。抗原性の増強のためジフテリア毒素のBフラグメントの16残基をMAGE-1のexon3に付加した融合遺伝子の注入によってわずかながらの抗体産生増強を認めた。現在pg100,TRP2の遺伝子をHVJ-liposome法を用いて同様に発現させ、これらの抗原が由来するマウスメラノーマ細胞B16を用いた癌遺伝子ワクチンによる腫瘍予防効果、治療効果を検討している。

メラノーマ特異抗原で細胞障害性T細胞(CTL)を惹起できることが期待されるgpl00の遺伝子をマウスに発現させ、宿主の免疫学的反応の解析と、実際に担癌マウスでの腫瘍抑制効果を検討した。ヒトgp100遺伝子をCMVプロモーターの下流につなぎHVJ-liposomeによってC57BL/6マウスの骨格筋に2週間隔で2回注入すると、gp100に対する抗体が産生されていることが免疫沈降法により確認された。マウスメラノーマ細胞株B16を攻撃できるCTLがマウス牌臓中に産生されていることも明らかになった。次に、gp100発現ベクターで2週間隔で2回免疫したC57BL/6マウスの足底に2500個のB16細胞を接種した。gp100を用いなかったマウスでは約3週間で腫瘍の形成を認め、腫瘍注入後70日以内に全例死亡した。gp100で免疫したマウスにおいて腫瘍の形成が遅延し、生存の長期化がえられたが、130日後に全例死亡した。さらに効果的な免疫を得るため、一過性に強い発現をおこせるベクターとしてセムリキ森林ウィルスベクターを用いて試験管内で合成したmRNAをHVJ-11posomeで組織で発現させることにした。またその注入部位として骨格筋ではなく抗原提示細胞が豊富と考えられる牌臓を選択した。同様の免疫実験を行い、抗体、CTLに誘発を確認し、腫瘍形成に対する効果をみたところ、gp100mRNAで免疫したもののみ、160日後においても6匹中2匹が生存し、腫瘍の再投与でも腫瘍形成を認めなかった。以上のことは、gp100遺伝子がメラノーマワクチンとしてはたらくこと、gp100のRNAはより安全なワクチンとして効果が期待できること、投与部位を筋肉ではなく抗原提示細胞が豊富と考えられる組織(牌臓やリンパ節)を選択する必要があることを示唆している。