hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖を認識する接着分子群(LECAM)の抗腫瘍免疫における役割とその分子的研究

ある種の腫瘍細胞は特定の糖鎖(シアリルルイスxやシアリルルイスaなど)を産生、分泌するが、これらは糖鎖を認識する接着分子群であるLECAM(セレクチン)分子群のリガンドそのものであることが知られている。LECAM分子群は白血球の局所への遊走に関与する分子群であることから、これらの糖鎖が抗腫瘍エフェクター細胞の局所へのホーミングが妨げる可能性が示唆されている。本研究ではLECAM分子群、特にリンパ球のホーミングレセプターといわれてきたLECAM-1の生理的意義、悪性腫瘍の転移および腫瘍に対するエフェクター細胞の局所への移動における意義を明らかにすることを試みた。その結果、LECAM-1分子は、白血球が血管外に移動する際におこなうrolling現象を直接的に司どる分子であり、決してリンパ球のみが用いる分子ではないということが明らかになった。また、LECAM-1のリガンドも予想されたよりはかなり広汎に発現されていることが明らかになった。そして、これらの分子はある種の炎症細胞浸潤においては直接的に細胞浸潤の標的となりうることが示された。腎における例がそれである。ここで興味深い事実は、腎癌はLAK療法に反応しやすい腫瘍として知られることである。一つの可能性は、腎におけるLECAM-1のリガンドがLAKエフェクター細胞の標的となり、腎にはエフェクター細胞が到達しやすいのかも知れない。今後の実験的証明が必要である。有効な抗腫瘍免疫の誘導を阻害する大きなファクターとして、腫瘍細胞、あるいは血管内皮細胞が産生、分泌する分子により、エフェクター細胞の局所へのホーミングが妨げられる可能性が強く示唆されている。LECAMファミリーは、最近その存在が確認された新しい接着分子ファミリーである。われわれ、有効な抗腫瘍免疫誘導のために必要なロジックを考えることを目的に、LECAM分子群、特にリンパ球のホーミングレセプターといわれてきたLECAM-1の生理的意義、悪性腫瘍の転移および腫瘍に対するエフェクター細胞の局所への移動における意義を明らかにすることを試みてきた。ます、(a)ラッとLECAM-1のcDNAクローニングを行った。そして、(b)獲得したcDNAを組替え、さらにバキュロウイルスを利用することにより、免疫グロブリンのFc部分を含む可溶型LECAM-1を大量に作製することに成功した。(c)そしてこの可溶型LECAM-1を免疫原として、ラッとLECAM-1に対する中和をモノクローナル抗体(HRL1、HRL3)および非中和モノクローナル抗体(HRL2、HRL4)を作製した。(d)HRLモノクローナル抗体、可溶型LECAM-1を用いた解析から、LECAM-1、およびそのリガンドともに細胞表面から遊離し、細胞外に放出されることが明らかになった。このことから、血中に可溶型LECAM-1分子が検出されるのでないかと考え、サンドイッチELISA法を考案して測定を試みたところ、炎症をおこしている動物においては、血精中に可溶型LECAM-1分子を検出することができた。(f)一方、さまざまな糖鎖に対する結合実験から、LECAM-1はシアリルルイスXやシアリルルイスaなどに結合するのみならず、スルファチドに強く結合することが示された。シアリルルイスXおよびaに対する結合はカルシウムイオン依存性であったが、スルファチドに対する結合はカルシウムイオン非依存性であった。
気候の時間的・空間的代表性に関する基礎的研究

気候と気象の時空間スケールに関するこれまでの研究について総合的に考察した。その結果、両対数グラフで両者の関係はほぼ直線的に並ぶ。ここで指摘されるのは、時間スケールに、周期をとるか寿命時間をとるか、また空間スケールにおいては、波長・周期をとる場合、全部をとるか、2分の1をとるか4分の1をとるかなど統一的にとらえる必要がある。さらに、気候は気象の積み重ねと言われるが、時間スケールではどうとらえるのか、必ずしも明らかでなく、大きな問題である。従来言われている気候の時空間スケールの関係は、環境・人間活動などの諸現象についても認められる。しかし、その直線の傾斜はほぼ同じだが位置(原点)が異なる。社会現象に対する時空間スケールの認識が今後重要であろう。本研究ではその第一歩として、種々の気象災害を統一的に時空間スケールでまとめてとらえる試みを行った。その結果、災害継続時間の長いものと短かいもので、時空間スケールの関係が異なること、また、その変動の幅が非常に異なることがわかった。大気現象の時空間スケールの具体的な例として、(i)メソスケールからローカルスケールについては中部日本の地上風系、東北地方のやませ、都市のヒートアイランド、(ii)リージョナルスケールからマクロスケールについてはブラジル北東部の乾湿、東アジアの気圧配置型の出現頻度、(iii)マクロスケールからグローバルスケールについては、北半球の地上気圧系をとりあげて論じた。また微気象観測による時空間スケールの把握は、長野県菅平盆地に形成される冷気湖において、詳しく行った。これらの結果、次のことが指摘された。すなわち、小さいスケールと大きいスケールの現象間の相互作用の重要性で、例えば持続性のやませは、上空のブロッキングというマクロスケールの現象と下層の冷気団の流出というローカルスケールの現象が結びついている。今年度の研究成果は次の通りにまとめられる。スモールスケールから大スケールの現象に順に述べる。(1)茨城県下館市においてヒートアイランド形成に及ぼす熱収支項の効果をそれぞれ観測した。特に地中坦流束に関する都市内外における分布の測定はユニークなもので、都心部と効外の差を明らかにし、その時本スケールとの関係を明らかにした。また、最低気温が高温な区域の広がりとその時間的スケールとの対応も明らかにした。(2)中規模スケールの現象に関しては、関東東山地球の降電分布を1931年から1980年までについて、まず全部の資料をまとめた。これから、その寿命時間と分布範囲の大きさとの関係を調べた。その結果従来知られていた群馬県南東部から関東平野を南東東に進むいわゆる電の道の他に、埼玉県に強風をともなう分布域があり、寿命時間は比較的短かいが、強くかつ狭い降電区域があることが新しくわかった。(3)シノプティックスケール(数百ないし2千3千km)の次象の解析は目下作業続行中で、結果をまとめて報告する段階にない。しかし、気圧配置ごよみを19711980年の10年間についてつくり、19411970年についてすでに解析してある結果と連結して統計的に研究した結果、各型気圧配置、変型気圧配置、梅雨型気圧配置について長期変動傾向がみられ、またそれぞれの持続日数(時間スケール)についても長期的に変化があることがわかった。(4)北東球天気図から、高気圧・低気圧の大きさと寿命時間との関係を統計的に解析する作業は現在続行中である。また、台風活動と、東部赤道太平洋の海面水温との高い相関があることと関連し、水温そのものの周期(時間スケールに対応する)の分析を行った。その結在、2年,5年、などの周期が卓越すると、および、その位置は東から西へ160°W付近までは移動していることがわかった。
糖尿病網膜症極前期の網膜内病態、その分子生物学的機序の解明

VEGFが糖尿病網膜症の発症にも重要な働きをしていることが強く示唆されており、本研究では虚血領域を形成していない糖尿病患者の網膜においてどのような分子機構によりVEGFの発現が亢進するのかを明らかにすることを目指した。白血球の内皮細胞への接着現象がVEGF発現亢進と相関することが知られているが我々の研究グループはLectin-like oxidized LDL receptor-1がこの接着現象に重要な機能を持つことを明らかにした(Proc Natl Acad Sci USA 2003)。また、statinがこのような接着現象を抑制する作用を持つことより初期網膜症治療に有用である可能性を見出しつつある(Arch Ophthalmol 2002)。一方、糖尿病患者での血中や硝子体内濃度が亢進しているレプチンの関与についても検討している。レプチンは血管新生因子でもあることが報告されたが、網膜血管にはレプチン受容体が顕著に発現しており、レプチンを欠損した遺伝性肥満マウス(ob/obマウス)及び野生型マウスをもちいて網膜血管新生への影響を検討した。ob/obマウスでは野生型マウスに比較して網膜血管増殖が抑制され、VEGF発現が抑制されていることを見出した。このような結果よりVEGF発現亢進にレプチンが関与する可能性が見出された(投稿中)。さらに我々はレニン-アンジオテンシン系の役割の検討を行なった。アンジオテンシンは周皮細胞からVEGF分泌を促進するだけでなく、網膜内皮細胞ではVEGF受容体とAng2を選択的に増加させることを見出した(Diabetes 2001;50:867-875)。こうした作用はAT1受容体を主に介しており、アンジオテンシン系が初期網膜症におけるVEGF発現亢進の一つの制御因子となっている可能性が見出された。以上の研究よりLDL受容体やレプチン、アンジオテンシンなどの分子機構を制御することにより網膜初期病変を阻害することが出来る可能性が推測された。VEGFが網膜症の発症にも重要な働きをしていることが強く示唆されており、本研究では虚血領域を形成していない糖尿病患者網膜においてどのような分子機構によりVEGFの発現が亢進するのかを明らかにする。我々は網膜症眼でのレニン-アンジオテンシン系の役割として網膜内皮細胞ではAng2を選択的に増加させることを見出した(Diabetes2001;50:867-875)。こうした作用はAT1受容体を主に介しており、さらにAT1受容体ノックアウトマウスを用いた検討を行っている。wild Type(C57BL/6J)とAT1受容体ノックアウトマウスをstreptozotocin(STZ)投与により糖尿病化し、網膜の変化を定時的に検索している。血圧はATIK0マウスにおいて有意に低下しており、VEGFの変化と白血球、血管透過性変化とを検討中である。今後網膜症初期病変におけるレニン・アンジオテンシン系によるVEGF発現制御の機構についての検討を展開する。レプチンは血管新生因子でもあることが報告されたが、網膜血管にはレプチン受容体が顕著に発現しており、レプチンを欠損した遺伝性肥満マウス(ob/obマウス)及び野生型マウスレプチン欠損マウスをもちいて網膜血管新生への影響を検討中である。

ob/obマウスでは野生型マウスに比較して網膜血管増殖が抑制された。網膜症進展への関与が示唆され、今後さらにマウス網膜モデルや培養網膜血管細胞を用いて、VEGF発現や、EGF細胞シグナル伝達に及ぼす影響を検討していく予定である。VEGFが糖尿病網膜症の発症にも重要な働きをしていることが強く示唆されており、本研究では虚血領域を形成していない糖尿病患者の網膜においてどのような分子機構によりVEGFの発現が亢進するのかを明らかにすることを目指した。白血球の内皮細胞への接着現象がVEGF発現亢進と相関することが知られているが我々の研究グループはLectin-like oxidized LDL receptor-1がこの接着現象に重要な機能を持つことを明らかにした(Proc Natl Acad Sci USA 2003)。また、stainがこのような接着現象を抑制する作用を持つことより初期網膜症治療に有用である可能性を見出しつつある(Arch Ophthalmol 2002)。一方、糖尿病患者での血中や硝子体内濃度が亢進しているレプチンの関与についても検討している。レプチンは血管新生因子でもあることが報告されたが、網膜血管にはレプチン受容体が顕著に発現しており、レプチンを欠損した遺伝性肥満マウス(ob/obマウス)及び野生型マウスをもちいて網膜血管新生への影響を検討した。ob/obマウスでは野生型マウスに比較して網膜血管増殖が抑制され、VEGF発現が抑制されていることを見出した。このような結果よりVEGF発現亢進にレプチンが関与する可能性が見出された(投稿中)。さらに我々はレニン-アンジオテンシン系の役割の検討を行った。アンジオテンシンは周皮細胞からVEGF分泌を促進するだけでなく、網膜内皮細胞ではVEGF受容体とAng2を選択的に増加させることを見出した(Diabetes 2001;50:867-875)。こうした作用はAT1受容体を主に介しており、アンジオテンシン系が初期網膜症におけるVEGF発現亢進の一つの制御因子となっている可能性が見出された。以上の研究よりLDL受容体やレプチン、アンジオテンシンなどの分子機構を制御することにより網膜初期病変を阻害することが出来る可能性が推測された。
魚類の鰓における血漿カリウムイオン調節機構

これまで、海水に馴致したティラピアにおいてK+の調節メカニズムを明らかにしてきた。一方、鯉だけでなく腎臓も体液調節に重要な働きを行う淡水中では、血漿K+の調節がどのように行われているかが不明であった。本年度は淡水中でのK+の調節機構と、K+の調節に重要な働きを行うROMKaの発現調節機構に着目し研究を進めた。淡水馴致ティラピアにおいて鯉によるK+排出の可能性と腎臓の寄与を検討するため、淡水馴致ティラピアを通常淡水と高K+淡水に1週間馴致し、鯉と腎臓におけるROMKaをはじめとした各種イオン輸送体のmRNA発現量を測定した。その結果、鯉でのROMKa発現量が約5倍に増加しており、鯉のROMKaが淡水中でもK+の排出に重要であると考えられた。また、鯉の免疫染色の結果、通常淡水群ではROMKaのシグナルが僅かであったが、高K+馴致群でROMKaの免疫反応が顕著に現れ、さらにROMKaがType-III塩類細胞の頂端膜に局在することが明らかとなった。次に、未だ不明である魚類のROMK発現調節機構を明らかにすることを目的とし、コルチゾルがROMKa mRNAの発現調節に関与するのかを、鯉の単離培養実験により検討した。その結果、淡水馴致ティラピアの鯉のみがコルチゾルに応答してROMKa mRNA発現量を上昇させた。一方、海水馴致ティラピアではコルチゾル単体の効果が見られなかったため、血漿K+濃度の上昇そのものが鯉ROMKaの発現に及ぼす影響を調べた。海水馴致ティラピア鯉の単離培養実験系を用いて、鯉のROMKa発現に及ぼす培養液K+濃度の影響を調べた。その結果、高K+培養液で培養した鯉でROMKa mRNAの有意な上昇が見られた。これらの結果から、淡水中ではコルチゾルが、一方で海水中では血漿K+濃度が、ティラピアの鯉ROMKaの発現を制御していることが示唆された。淡水中でのK+調節機構に着手し、ROMKaを介した鯉からのK+排出を明らかにした。さらに、淡水・海水のそれぞれにおけるコルチゾル・K+濃度によるROMKaの調節機構の概形も明らかになった。当初予定していなかった部分での新たな発見が多かった点で、計画以上の進展があったといってよい。魚類の鰓におけるK^+排出機構の解明K^+は脊椎動物の体内に最も多く存在する一価の陽イオンであり、また成長や神経・筋肉の活動など、多くの生命現象に密接に関与することが知られている。その大部分は細胞内に高濃度に蓄積されており、血漿での濃度は常に約4mMに保たれている。海水中には比較的高濃度にK^+が存在し、体内にK^+が過剰になる傾向にあるため、海産魚は積極的にK^+を排出する必要がある。私は主要な浸透圧調節器官である鰓に着目し、海水馴致ティラピアを用いて実験を行った。K^+と不溶性の沈殿を形成するテトラフェニルほう酸という化合物の性質を応用し、鰓から排出されたK^+を沈殿・可視化する新たな手法を開発した。この実験により、世界で初めて、鰓の塩類細胞がK^+を排出する事を証明した。さらに、陸上生物の腎臓等でK^+の輸送を行うことが知られるK^+輸送体renaloutermedullary K^+ channel (ROMK)、K^+ large conductance Ca^<2+>-activated channel (Maxi-K)、K^+/Cl^- cotransporter (KCC)1、KCC2、KCC4をティラピアにおいて同定し、淡水、海水、高K^+人工海水に馴致したティラピアの鰓における各遺伝子発現量を定量した。その結果、ROMKのみが環境K^+濃度依存的に顕著な発現上昇を示した。このROMKの特異抗体を作成し、免疫染色に供した結果、ROMKは塩類細胞の体外に面した頂端膜に存在し、更に高K^+環境に馴致したティラピアでは高密度に存在することが判明した。また阻害剤を用いた実験により、ROMKがティラピアの鰓において主要なK^+排出経路であることを証明した。これらの実験により、魚類の鰓におけるK^+排出機構の存在と、その分子メカニズムが初めて明らかとなった。K^+と同様の排出経路におけるCs^+排出の検討昨今、日本では放射性物質による汚染への懸念が広がっており、その生物圏への影響を調べることは重要である。この現実を踏まえ、申請者は生物の体内で同族のK^+と類似した挙動を示すことが知られるCs^+の研究を始めた。海水馴致ティラピアの入鰓動脈にCs^+または同族のRb+を含んだ平衡塩類溶液を注入し、K^+と同様の検出手法に供した。その結果、鰓の塩類細胞の開口部に排出されたCs^+およびRb^+が検出された。この結果は、K^+と同様に、魚類が放射性Cs^+を積極的に排出する可能性を示している。

淡水馴致ティラピアにおいて鯉によるK+排出の可能性と腎臓の寄与を検討するため、淡水馴致ティラピアを通常淡水と高K+淡水に1週間馴致し、鯉と腎臓におけるROMKaをはじめとした各種イオン輸送体のmRNA発現量を測定した。その結果、鯉でのROMKa発現量が約5倍に増加しており、鯉のROMKaが淡水中でもK+の排出に重要であると考えられた。また、鯉の免疫染色の結果、通常淡水群ではROMKaのシグナルが僅かであったが、高K+馴致群でROMKaの免疫反応が顕著に現れ、さらにROMKaがType-III塩類細胞の頂端膜に局在することが明らかとなった。次に、未だ不明である魚類のROMK発現調節機構を明らかにすることを目的とし、コルチゾルがROMKa mRNAの発現調節に関与するのかを、鯉の単離培養実験により検討した。その結果、淡水馴致ティラピアの鯉のみがコルチゾルに応答してROMKa mRNA発現量を上昇させた。一方、海水馴致ティラピアではコルチゾル単体の効果が見られなかったため、血漿K+濃度の上昇そのものが鯉ROMKaの発現に及ぼす影響を調べた。海水馴致ティラピア鯉の単離培養実験系を用いて、鯉のROMKa発現に及ぼす培養液K+濃度の影響を調べた。その結果、高K+培養液で培養した鯉でROMKa mRNAの有意な上昇が見られた。これらの結果から、淡水中ではコルチゾルが、一方で海水中では血漿K+濃度が、ティラピアの鯉ROMKaの発現を制御していることが示唆された。カリウムイオンの吸収機構については、予想外の結果が現れ、かつ技術的に困難な点が多かったため、現在は一度そのテーマに関しての研究を停止せざるをえない状況である。しかし、これまでに知られていなかった鯉におけるカリウムイオンの排出機構を分子メカニズムから明らかにできたことの成果は大きいと考えている。また、現在問題となっているセシウムの挙動を明らかにする上で重要な知見も得ることができた。淡水中でのK+調節機構に着手し、ROMKaを介した鯉からのK+排出を明らかにした。さらに、淡水・海水のそれぞれにおけるコルチゾル・K+濃度によるROMKaの調節機構の概形も明らかになった。当初予定していなかった部分での新たな発見が多かった点で、計画以上の進展があったといってよい。前述のように、カリウムイオンの吸収機構を調べる予定であったが、これは技術的難点が多いため現在は行う予定はたっていない。代替案として、カリウムイオンの排出活性を調節する内分泌因子の探索を現在進めており、ある程度の予備的データが得られている。また、カリウムの排出機構が放射性セシウムの排出に実際に関与すること、及び淡水産(又は淡水馴致)魚におけるカリウム/セシウムの排出メカニズムを明らかにし、水産業や漁業関係者が苦心している放射性セシウムの対策を考える上での知見を提供したい。
Ｍ１及びＳ９ファミリーに属する高分子量ペプチダーゼの構造解析

脳に豊富に存在するアミノペプチターゼが属するM1ファミリーやトリパノソーマ感染に重要なオリゴペプチダーゼBを含むS9ファミリー酵素群は、ペプチドの切断活性を担う領域を覆う特異な構造を有するため分子サイズが大きいのが特徴である。2種類の高分子量ペプチダーゼを材料として研究を行い、活性発現に重要ないくつかのアミノ酸残基の機能を明らかにするとともに、構造解明に不可欠な酵素結晶の作成条件を見出すことに成功した。これらの成果は、脳内アミノペプチダーゼ酵素群の役割の解明とある種の微生物感染症の新たな化学療法の可能性として重要である。平成24年度も引き続きM1ファミリー酵素であるピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ(hPSAP)とS9ファミリー酵素であるオリゴペプチダーゼB(OPB)を中心に研究を行った。低温発現により活性型酵素を得ているhPSAPについては、同属の酵素で、我々が結晶構造解析に成功した大腸菌アミノペプチダーゼN(eAPN)との一次配列比較からAla271に注目し、このアミノ酸残基をeAPN型にしたA271M変異体を作製した。eAPNのM260A変異体ではピューロマイシン感受性が低下したのに対し、hPSAPのA271M変異体ではピューロマイシン感受性に大きな変化は認められなかった。eAPNのMet260は幅広い基質特異性に重要な役割を果たすアミノ酸残基である。種々の合成基質を用いた速度論解析の結果からは、A271M変異体における基質特異性の変化が観察され、Ala271もeAPNのMet260同様に基質特異性に関与しているが、役割は異なっていると考えられた。結晶化についても検討を行ったが、現在までのところ構造解析には至っていない。一方、OPBについては、日和見感染菌として知られるSerratia、Xanthomonasとグラム陽性のRhodococcusおよびグラム陰性である大腸菌のOPBを発現、精製することに成功し、種々の合成基質を用いた詳細な速度論解析を行った。その結果、Serratia marcescensのOPB(SemOPB)が、OPBの大きな特徴である基質阻害現象を示さないことを明らかにした。この結果は、感染症のドラッグターゲットとしての価値を持つOPBの効率的な阻害剤をデザインするための有用な情報となる。また、これら細菌由来OPBについても結晶化の検討を引き続き行っている。平成25年度も引き続きM1ファミリー酵素であるピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ(hPSAP)とS9ファミリー酵素であるオリゴペプチダーゼB(OPB)を中心に研究を行った。hPSAPについて、大腸菌オルソログであるeAPNとの一次配列比較から、酵素活性発現に重要と考えられたeAPNのLys319とTyr376に対応するAsn337とPhe389の部位特異的変異体を構築して速度論的解析を行った。F389Y変異体のKm値は変化せずkcat値が大きく低下したことから、Phe389はミカエリス複合体形成ではなく触媒反応に関与していると考えられた。eAPNのTyr376はN末端アミノ基を認識するGlu121と相互作用しており、これは構造解明されているhuman leukotriene A4 hydrolase (LTA4H)でも同様であったが、もう一つの既知結晶構造であるThermoplasma acidophilum tricorn interacting factor F3 (TIF3)では反応中間体安定化残基であるTyr351(eAPNのTyr381)の方を向いていた。従って、hPSAPのF389Y変異体においては、Glu136またはTyr394残基(eAPNのGlu121かTyr381)との相互作用により代謝回転数が低下したのではないかと推測している。OPBについては、Rhodococcus erythropolisの酵素の結晶を得ることに成功し、結晶化条件の最適化を行い、X線回折データ収集を計画している。他の菌由来の酵素についてもいくつかの結晶が得られたが、解析に十分な大きさの結晶を得るための条件検索を継続中である。また、基質阻害現象を示さないユニークなSerratia marcescens OPBの解析に向けた部位特異的変異体の構築を行っている。平成23年度はM1ファミリー酵素であるヒトアミノペプチダーゼN(hAPN)とピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ(hPSAP)とS9ファミリー酵素であるオリゴペプチダーゼB(OPB)を中心に研究を行った。M1ファミリー酵素群には、脳に豊富に存在し神経ペプチドの分解に関わるピューロマイシン感受性アミノペプチターゼ(hPSAP)やコロナウイルスのレセプターとして機能するアミノペプチダーゼN(APN)等が含まれ、構造の解明によりこれらの重要な機能を制御する可能性が高まると期待できる。

また、ある種の微生物感染過程に重要な役割を果たしているOPBの構造解明により新たな化学療法の道が開ける可能性があり重要である。すでに構築していた大腸菌発現系を用いてhAPNとhPSAPの発現条件の検討を行い、hPSAPについては18°Cの低温条件において活性を有する可用性酵素の発現に成功した。Hisタグ付加酵素についていくつかの結晶を得ることができたが、さらに良好な結晶を得ることを目的として、タグなし酵素の発現系も構築し、精製酵素を得ることにも成功した。この酵素を用いて結晶化条件の検討を再度行う計画である。hAPNについては、少量を可溶性タンパク質として回収することには成功したものの、その酵素活性はきわめて低く、さらに条件を検討する必要がある。一方、OPBについて、数種類の細菌より遺伝子をクローニングして大腸菌発現系を構築した。ほとんどの酵素について活性を有する酵素を精製することにも成功した。種々の合成基質を用いて基質特異性を比較したところ、OPBの特徴とされている基質阻害現象を示さない酵素があり、その原因の解明を含めた構造解析研究を進めるため結晶化条件の検討を行った。現在までに複数の結晶を得ることに成功したので、これらの条件を最適化してX線結晶構造解析へと進展させる計画である。大学を異動したことにより、常用する機器の確保など、研究室のセットアップに時間を要したことと、新研究室での酵素タンパク質発現条件検討を行わねばならなかったため、研究の進展が若干遅れ気味である。すべての酵素についてではないが、発現酵素を得ることに成功して、構造解析に不可欠な結晶を得ることにも部分的にではあるが成功した。OPBについては、予期せぬ基質特異性を有する酵素を見いだすことができ、構造解析への準備を進めることができた。M1ファミリー酵素について、ヒトアミノペプチダーゼN(hAPN)の発現系の構築は現状の大腸菌系では難しいことがわかってきたので、適当な発現系の目処が立つまでは、大腸菌酵素(eAPN)を材料として、APNの研究を進める。具体的には、hPSAPについての研究と融合させ、eAPNの結晶構造情報と両酵素の一次配列の比較から部位特異的変異導入法を用いて各種変異酵素を作製し、eAPNとhPSAPとの比較研究を行い、M1ファミリーの基質結合および反応機構の解明を進めていく計画である。当面のターゲットはeAPNの活性部位で重要な役割を果たしていると予想されるLys319とTyr376に対応するhPSAPの残基(Asn337とPhe389)の変異体を作製して、速度論的解析を行うとともにX線結晶構造解析を含めて検討していく。OPBについては、未だ情報のない細菌由来OPBの結晶構造解析を目指して、現在までに得ている細菌由来OPBの結晶化条件の検討を行っていく。OPBの大きな特徴である基質阻害の原因の詳細を明らかにするため、その基質阻害現象を示さないSerratia marcescens OPB(SemOPB)をモデルとして研究を進めていく。具体的には、キメラ酵素や部位特異的変異体を作製し、それらの基質阻害の有無を詳細な速度論的解析を行うことで明らかにし、基質阻害現象に関わる領域あるいはアミノ酸残基を特定する。これらの変位酵素についてもX線結晶構造解析の可能性を含めて行っていく。
ビタミンDによる1α位水酸化酵素に対するネガティブフィードバックの分子機構の解明

25-水酸化ビタミンD 1α-水酸化酵素(1α-水酸化酵素)は、腎臓においてビタミンDを活性化する重要な酵素である。本酵素は活性型ビタミンDによりネガティブフィードバックを受けることが酵素活性のレベルで証明されているが、遺伝子レベルでの調節機構は未だ不明である。本研究では1α-水酸化酵素遺伝子の上流解析を通じてビタミンDの負の調節に関する分子機構を解明することを目的とした。昨年度の我々の検討では、ルシフェラーゼアッセイやゲルシフトアッセイを使って、ヒト1α-水酸化酵素遺伝子の上流領域にビタミンDに反応するnegative vitamin D response element(nVDRE)を約20塩基の間に同定した。本年度は、この領域にどのような因子がビタミンD受容体と協調して関与するのかを酵母のtwo-hybrid法を用いて検討した。腎臓の近位尿細管由来のcDNA libraryを用いてtarget proteinを発現させ、bait proteinであるビタミンD受容体と相互作用をもつ因子を複数単離した。得られたcDNAには、既知のものも含まれていたが、bHLH型の転写因子と考えられる蛋白をコードする新たな遺伝子も得られた。それぞれの遺伝子につき、各臓器での発現パターンを検討した。さらには発現蛋白がnVDREに結合するかをゲルシフトアッセイを使って検討した。今後、ビタミンD受容体と共発現させることでビタミンDの遺伝子発現抑制が認められるのかを確認する予定である。25-水酸化ビタミンD1α-水酸化酵素(1α-水酸化酵素)は腎臓においてビタミンDを活性化する重要な酵素である。まず、ヒト1α-水酸化酵素遺伝子の上流領域の塩基配列を転写開始点の上流約4Kbにわたって決定した。この上流領域に関して様々な部分配列をルシフェラーゼベクターに組み込み近位尿細管細胞に遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、ビタミンDに反応してルシフェラーゼ活性が抑制される領域を見いだした。さらにその部位に関して遺伝子欠失や変異を入れたベクターを用いて詳細に検討することでビタミンDに反応するnegative vitamin D response element(nVDRE)を入れた約20塩基の間に同定した。次に、nVDREと考えられた塩基配列に関してゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイによって、この塩基配列と近位尿細管抽出蛋白とで形成される複合体のシグナルを複数検出した。そのうちの一つのシグナルは、抗ビタミンD受容体抗体でスーパーシフトすることからビタミンD受容体を含む複合体が関与しているものと考えられた。また、塩基配列に遺伝子変異を挿入するとこのシグナルは検出されなくなることからnVDREとして同定した塩基配列はビタミンDによる負の転写調節に重要であると再確認した。今後の展開としては、どのような転写因子がビタミンD受容体と協調してビタミンDの負の転写調節を行うのかについて、酵母のtwo-hybrid法を用いた系でビタミンD受容体と相互作用する蛋白を同定する予定である。
単一ヒト細胞核を含むピコリットル空間の１分子ｍＲＮＡカウンティング

本研究では、ヒトの細胞(体積:数pL)と同程度の大きさを有するピコリットル空間内に、ヒトの細胞から単離した核を単一核レベルで封入し、転写されて核外へ輸送されてくるメッセンジャーRNA(mRNA)を100分子レベルで高精度にカウンティングできる新しいマイクロデバイスと解析法を確立した。これにより、これまで発現量が極めて低く見落とされていたmRNAも高精度な定量が可能となるため、超早期に細胞の分化やがん化などの検出が可能となることが期待できる。本研究では、ヒトの細胞(体積:数pL(10^<-12>L))と同程度の大きさを有するピコリットル空間内に、ヒトの細胞から単離した核を単一核レベル封入し、転写されて核外へ輸送されてくるmRNA(メッセンジャーRNA)を1分子レベルで高精度にカウンティングできる新しいマイクロデバイスと解析法を確立する。これにより、これまでは発現量が極めて低く見落とされていたmRNAも高精度な定量が可能となるため、超早期に細胞の分化やがん化などの検出が可能となることが期待される。初年度は、マイクロチャンバーを用いた細胞内環境構築における技術的課題の解決を目的に研究を進めた。具体的には、壁面への吸着を抑制するマイクロチャンバーのコーティング法と、核のマイクロチャンバーへの封入法と細胞内環境の再現を狙った実験系の構築を行った。空間サイズの縮小に伴って比界面積(表面積/体積)が増大するため、マイクロチャンバーのような小さな空間においては、中に封入した分子の壁面への吸着も無視できないレベルになる。特に本研究のような「1分子レベルでのカウンティング」では、壁面への吸着によるmRNAの損失は致命的である。そこで、マイクロチャンバー壁面を生体親和性の高いPEG (poly(ethylene glycol))やMPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)ポリマーでコーティングすることにより、壁面への吸着を抑制し、再現性の高いカウンティングが可能な実験系を構築した。また、マイクロチャンバーのサイズと測定時間などを最適化することで、発現のカイネティクスに影響を及ぼさないよう実験系を検討した。本研究では、ヒトの細胞(体積:数pL)と同程度の大きさを有するピコリットル空間内に、ヒトの細胞から単離した核を単一核レベル封入し、転写されて核外へ輸送されてくるmRNA(メッセンジャーRNA)を1分子レベルで高精度にカウンティングできる新しいマイクロデバイスと解析法を確立する。25年度は、単一核から転写されるmRNAを1分子レベルで経時的にカウンティングするために必要な可視化技術の検討を進めた。具体的には、高S/N比を有するin stem型モレキュラービーコンの設計とモデル系での反応条件最適化、実サンプルを用いたmRNAの検出を行った。計測対象としてはGAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)など、比較的発現量の多いハウスキーピング遺伝子を中心に行い、相補的なオリゴヌクレオチドに対して特異的かつ高S/N比で結合することを明らかとした。また、HeLa細胞などから抽出したtotal RNAに対するin stem型モレキュラービーコンの反応性について検討したところ、オリゴヌクレオチドと比較してかなり反応性が低くなることが判明した。この原因として、反応溶液のイオン強度や共存するmRNAとの非特異的結合などが考えられた。精度は劣るが定量することも可能であったため、次年度は各細胞の細胞周期である24時間を目標に経時的かつ定量的データ取得を行う予定である。本研究では、ヒトの細胞(体積:数pL)と同程度の大きさを有するピコリットル空間内に、ヒトの細胞から単離した核を単一核レベル封入し、転写されて核外へ輸送されてくるmRNA(メッセンジャーRNA)を1分子レベルで高精度にカウンティングできる新しいマイクロデバイスと解析法を確立することを最終目的とした。これにより、これまでは発現量が極めて低く見落とされていたmRNAも高精度な定量が可能となるため、超早期に細胞の分化やがん化などの検出が可能となることが期待できる。26年度は、これまで構築してきたマイクロチャンバーを用いた実験系と、モレキュラービーコンによるmRNA検出の最適結果をもとに、細胞の分裂周期を同調させることで、本計測系の精度検証を行った。HeLa細胞を飢餓培養することで細胞周期をG0、G1期に同調してマイクロチャンバーとモレキュラービーコンを用いて核内mRNAを測定したところ、ほとんどmRNAは発現していないことを確認した。同調していないHeLa細胞を用いた場合は、幅広い蛍光シグナル強度分布が観察されたことから、核内mRNA量に応じて定量的に検出できていることがわかった。

さらにマイクロチャンバー内にモレキュラービーコンをターゲットオリゴを導入した際の蛍光強度をもとに検量線を作成し、GAPDHの核内mRNAの定量を行ったところ、4,500-7,700分子の核内mRNAを確認することができた。これらの量は、すでに報告されている文献値(数千分子)と同程度の値であり、定量測定可能な計測系であることが実証できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。ナノバイオテクノロジー26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度計画通りの実験を遂行し、おおむね当初期待していた実験項目の検討を終えたため、本研究はおおむね順調に進展していると言える。当初の計画通りの実験を遂行し、おおむね期待していた実験項目の検討を終えたため、本研究はおおむね順調に進展していると言える。当初の予定通り、1分子mRNAの定量的可視化法と経時的可視化法について検討を進めていく。当初の予定通り、1分子mRNAの定量的可視化法と経時的可視化法について、細胞の同調培養により核分裂周期を整えることで、より精度の高い評価系構築の検討を進めていく。当初予定していたデバイス作製に伴う消耗品費用が、予定よりも節約できため残額が生じた。当該経費は、次年度経費とともに物品費としてデバイス作製、核抽出に必要な分子生物学実験試薬の購入に使用する。当初、蛍光顕微鏡観察に使用する光学フィルターや対物レンズなどの光学部品の購入を検討していたが、既有蛍光顕微鏡からの流用が可能である事が分かったため、次年度使用額が生じた。蛍光顕微鏡によるマイクロチャンバーアレイのスキャニング・イメージングには、光学系のさらなる最適化が必要であるため、これらの光学部品に使用する予定である。
培養血管内膜細胞の機能発現における細胞膜レセプターと細胞外基質の役割

1.ヒト培養血管内皮細胞の機能発現に及ぼす細胞外基質の影響を検討した。フィブロネクチンやI型コラーゲン上では、内皮細胞は、0.5-1時間後には接着、伸展し、24時間後には高い接着率を示し、その後5日目まで直線的に増殖した。一方、V型コラーゲンを基質とした時、内皮細胞は一時的にはI型コラーゲンと同様に接着、伸展し、6時間後に最大接着率を示すが、その後次第に基質面から剥離し、細胞増殖は観察されない。この現象は内皮細胞に特異的であり、平滑筋細胞ではいずれの基質上でも同様に接着し、増殖した。次に、この現象を解明するために細胞膜レセプター及び細胞内骨格タンパク質の役割を検討した。フィブロネクチンやI型コラーゲン上の内皮細胞では、0.5-1時間後に細胞周辺部と中心部にF-アクチン線維が形成され、接着斑の形成部位にはβ1インテグリンが発現していた。3-6時間後には細胞周辺部のF-アクチン線維、接着斑、及びβ1インテグリンは消失していた(細胞の中心部にのみ見られた)が、12-24時間後には再び細胞周辺部にも観察された。一方、V型コラーゲン上では、6時間までの現象はI型コラーゲン上と同様に観察されたが、9-24時間後には細胞周辺部のみならず細胞中心部からもF-アクチン線維、接着斑、及びβ1インテグリンが消失していた。この様に、V型コラーゲン上からの内皮細胞の離脱は、細胞外基質-β1インテグリン-F-アクチン線維系が再形成出来ないことに起因している。2.血管平滑筋細胞の機能発現に及ぼす細胞膜レセプター及び細胞外基質の影響を調べた。収縮型平滑筋細胞はα1β1及びα3β1インテグリンを介してI型コラーゲンに接着し、一方、フィブロネクチンとはα5β1インテグリンを介して結合して、中間型に移行し、増殖因子(PDGFやIGF-I)に反応し合成型に移行し、増殖を開始した。ヒト培養血管内皮細胞の機能発現に及ぼす細胞外基質の影響を検討した。20%牛胎児血清存在下で,プラスチックディッシュを対照とした時,細胞接着に対しては,ラミニン,V型コラーゲンおよびエラスチンは抑制した。フィブロネクチン,I,III,およびIV型コラーゲンはほとんど影響しなかった。細胞増殖に対しては,フィブロネクチンとI型コラーゲンは促進したが,エラスチンは内皮細胞の増殖をも抑制した。ところが,V型コラーゲンを基質として用いた時,内皮細胞は培養時間の経過と共に基質面から剥離し,細胞増殖は観察されなかった。しかし,これらの結果は,血清中に存在するフィブロネクチンや増殖因子の影響を受けている可能性がある。そこで,これらの影響を避けるために低血清条件下(1%)で検討した。フィブロネクチンやI型コラーゲン上では,ヒト内皮細胞は0.5-1時間後には接着,伸展し,24時間後には高い接着率(75-78%)を示した。その後5日目まで直線的に増殖した。一方,V型コラーゲン上の内皮細胞は,一時的には接着、進展するが,次第に基質面から離脱し,24時間後の接着率は41%であった。これに対し,ヒト血管平滑筋細胞は何れの基質上でもよく接着,進展し,増殖した。次に,F-アクチン線維および接着斑の形成を調べた。

フィブロネクチンやI型コラーゲン上の内皮細胞は,24時間後にはF-アクチン線維を形成し,接着斑の形成部位にβ1インテグリンを集合していることが観察された。しかし,V型コラーゲン上の内皮細胞は,一時的には基質面に接着するが,24時間後に細胞内骨格が再構成されず,接着斑も形成されず,さらにβ1インテグリンも発現できないために,基質面から剥離する。しかし,離脱した細胞をI型コラーゲン上で再培養すると接着し,増殖することなどが判明した。1.ヒト培養血管内皮細胞の機能発現に及ぼす細胞外基質の影響を検討した。フィブロネクチンやI型コラーゲン上では、内皮細胞は、0.5-1時間後には接着、伸展し、24時間後には高い接着率を示し、その後5日目まで直線的に増殖した。一方、V型コラーゲン上では、6時間まではI型コラーゲンと同様に接着、伸展するが、その後基質面から剥離し、細胞増殖は観察されない。この現象を解明するために細胞膜レセプター及び細胞内骨格タンパク質の役割を検討した。フィブロネクチンやI型コラーゲン上の内皮細胞では、0.5-1時間後に細胞周辺部と中心部にF-アクチン線維が形成され、接着斑の形成部位にはbeta1インテグリンが発現していた。3-6時間後には細胞周辺部のF-アクチン線維、接着斑、及びbeta1インテグリンは消失する。(細胞の中心部にのみ見られた)が、12-24時間後には再び細胞周辺部にも観察された。一方、V型コラーゲン上では、6時間までの現象はI型コラーゲン上と同様に観察されたが、9時間以後は細胞周辺部のみならず細胞中心部のF-アクチン線維及びbeta1インテグリンも消失していた。この様に、V型コラーゲン上からの内皮細胞の離脱は、細胞外基質-beta1インテグリン-細胞内骨格タンバク質系の再形成の失敗に起因している。2.血管平滑筋細胞(SMC)の機能発現に及ぼす細胞膜レセプター及び細胞外基質の影響を調べた。血管中膜より酸素法で単離したSMCの表現型は収縮型(G0期)であり、フィブロネクチンやI型コラーゲン上で培養すると、I型コラーゲンとはalpha1beta1及びalpha3beta1インテグリンを介して、また、フィブロネクチンとはalpha5beta1インテグリンを介して結合して、中間型(G1A期)に移行した。この時始めて中間型SMCは増殖因子(PDGF及びIGF-I)に反応でき、合成型(G1B,S,G2+M期)に移行し、増殖を開始することができた。
3D及び2.5D-ICに適用可能なバリヤレス絶縁膜の低温作製

半導体分野では、従来のムーアの法則に則った微細化が困難になりつつあり、微細化に頼らない3次元集積回路にシフトし始めている。その実現にはチップあるいはウェハ間を最短で接続するシリコン貫通ビア配線(TSV)が欠かせない。我々は、歩留まり良く3次元集積回路を実現するには、LSIを先に作製して、後からTSV配線にプロセスを行うビア・ラストプロセスが理想的であると考え、絶縁バリヤを200°C以下で成膜し、かつ低温でも良好な特性を示す優れたバリヤとして機能することを目的に検討を行った。その結果、拡散バリヤ材料を介在させない状態でも、Cuの拡散を抑制し、低温でも優れた絶縁バリヤを開発することに成功した。2.5D及び3D集積回路において、ウェハあるいはチップ間を最短で接続するシリコン貫通ビア配線(TSV)が注目されている。中でも、LSIを作製した後、TSVプロセスを行うビア・ラストプロセスでは、ビア配線として低抵抗なCuを使用できるというメリットがある。その一方、CuはSi中を低温でも容易に拡散することが知られており、その拡散制御及びビアの電気的な分離のため、拡散バリヤと絶縁バリヤが必要である。さらに、既に形成されたLSIを劣化させない低温でこれらのバリヤ膜を作製しなければならないという制約がある。そのような中で、我々はSiNx膜を低温で作製することを念頭におき、全く非加熱でSiNx膜を作製することに成功した。一般に、低温作製されたSiNx膜はCuの拡散を抑制することが困難であり、バリヤ性が期待できないことが知られている。そこで我々は、得られたSiNx膜のCu拡散に対するバリヤ性を検討するため、Cu/SiNx/Si構造、いわゆるバリヤレス構造を作製し、熱処理を行うことで、Cuの拡散の挙動を評価した。その結果、SiNx膜は20nmの膜厚という絶縁バリヤとしては薄い膜厚を用いたものの、700°C程度以上の熱処理後においても、Cuの顕著な拡散が見られないことを確認した。この結果は、低温作製SiNx膜の特性として極めて有用であることが明らかになり、今後引き続きこの有用な特性が得られたメカニズム等の詳細を検討することとした。一方、拡散バリヤを介した系についても検討を進めており、様々なバリヤ材料をラジカル窒化にて成膜することにより、室温での作製に成功した。さらにそれらのCu拡散に対するバリヤ性についても検討を行った。ビア・ラストプロセスに適用可能な低温でのSiNx膜の作製に成功し、かつバリヤレスの状態であっても、Cu/SiNx間の顕著なCu拡散を700°C程度以上の高温熱処理後においても抑制できている。さらに、バリヤレスとの比較のための拡散バリヤ材料を用いた系についても検討も進んでいる。3次元集積回路において、チップあるいはウェハ間を最短で接続するシリコン貫通ビア配線(Through Silicon Via:TSV)が注目を集めている。これまでは、デバイスサイズを微細化することでさらなる集積化や多機能化などを達成してきたが、現行以下のデバイスサイズにすることにより、量子効果などの望まない問題が発生すること等があり、さらなるサイズの微細化は極めて難しい状況にある。しかしながら、さらなる集積化・多機能化を達成するという動きは止まらないため、3次元集積回路を構成することによって、微細化に頼らず、集積度の向上を達成しようとしているからである。そのための方策の一つとして、低温でかつ良好な特性を示すSiNx膜の作製方法が焦眉の急を要する課題となっている。なぜなら、2.5Dや3D-LSIでは、先にLSIを作り込んでから、シリコン貫通ビアを作るというビア・ラストプロセスが最も歩留まりよくLSIを作製できるという理想的なプロセスであるため、バリヤ絶縁膜となるSiNx膜とバリヤメタルとなるTiNx膜等の成膜温度を200°C以下とすることが求められる。しかしながら、単純に低温にして作製すると、膜特性は顕著に劣化することから、低温でも良好な膜特性を保持するような方策が必要となる。本研究においては、主にスパッタによって、SiNx膜を作製することにより、全く非加熱状態でもSiNx膜が得られること、さらには、その膜特性がPECVDと比べて格段によいことを報告すると共に、バリヤメタルを介在させないバリヤレスな状態においても、絶縁膜としてのSiNx膜が良好な特性を示すことから配線であるCuの拡散をも抑制することができた。研究成果は概ね順調に進展している。ここで、学会誌に投稿した研究成果論文が極めて有用であるとの視点から、378件の投稿論文の中で、2編の我々の論文が論文奨励賞を受賞した。また、国内外からの反響も大きく、我々が思っている以上の成果となっていることが実感できた。「TSVプロセスに適用可能な反応性スパッタ法を用いたSiNx膜の低温作製」佐藤勝、武山真弓、小林靖志、中田義弘、中村友二、野矢厚(Vol.135, No.7, 2015)の特性評価」小林靖志、中田義弘、中村友二、武山真弓、佐藤勝、野矢厚(Vol.135, No.7, 2015)これらの論文は平成28年9月に受賞が決定し、表彰された。ムーアの法則に則った微細化によるさらなる集積度の向上が量子効果などの理由により困難になりつつある現状において、さらなる集積度の向上を満足させるためには、3次元集積回路の実現が不可欠となっている。

さらに、3次元集積回路は異なる基板を積層させることも可能であることから、システムオンチップ(SoC)などと比べて自由度が大きいという新たな利点もあり、今後の進展が期待されている。そのような中、チップあるいはウェハ間を最短で接続するシリコン貫通ビア配線(Through Silicon Via:TSV)が注目を集めている。TSVは、一般的にSiのビアの側壁にまずは絶縁バリヤ、そしてCuの拡散を抑制する拡散バリヤそしてCuという構造になっている。ここで、最も用いられている絶縁バリヤ材料としてのSiNx膜は350°C程度の成膜温度が必要であり、拡散バリヤ材料として知られるTiNx膜なども350400°Cの成膜温度が一般的である。しかしながら、歩留まり良く3次元集積回路を実現するには、LSIを先に作製して、後からTSV配線にプロセスを行うビア・ラストプロセスが理想的である。ただし、絶縁バリヤと拡散バリヤの両方を200°C以下で成膜しつつ、かつその性能を劣化させないという過酷な条件をクリアしなければならない。本研究では、その理想的なビア・ラストプロセスを実現させるために、絶縁バリヤを200°C以下で成膜し、かつ低温でも良好な特性を示す優れたバリヤとして機能することを目的に検討を行い、拡散バリヤ材料を介在させないバリヤレスの状態においても、Cuの拡散を抑制し、低温でも優れた絶縁バリヤを開発することに成功した。半導体分野では、従来のムーアの法則に則った微細化が困難になりつつあり、微細化に頼らない3次元集積回路にシフトし始めている。その実現にはチップあるいはウェハ間を最短で接続するシリコン貫通ビア配線(TSV)が欠かせない。我々は、歩留まり良く3次元集積回路を実現するには、LSIを先に作製して、後からTSV配線にプロセスを行うビア・ラストプロセスが理想的であると考え、絶縁バリヤを200°C以下で成膜し、かつ低温でも良好な特性を示す優れたバリヤとして機能することを目的に検討を行った。その結果、拡散バリヤ材料を介在させない状態でも、Cuの拡散を抑制し、低温でも優れた絶縁バリヤを開発することに成功した。現状では、スパッタターゲットの処理を工夫することで、高性能な低温SiNx膜が得られているが、今後膜表面にラジカル処理を加えることにより、得られたSiNx膜の特性変化について検討する予定である。一方、拡散バリヤはラジカル処理にて、全く非加熱で成膜可能なことが明らかとなり、Cu拡散に対するバリヤ性を検討し、最終的には拡散バリヤの有無によるCu拡散の挙動の違いを明らかにする予定です。低温でSiNx膜を作製し、かつ良好な膜特性を示すことについては、実証できた。今後は、CVDでも同様に良好な膜特性を示す膜が得られるのかどうか、またラジカル窒化やラジカル処理を行うことで、膜特性の改質ができるかどうかを検討していく予定である。電気電子材料工学本年度導入を予定していたラジカル発生装置であるが、当初計画以上に良好な絶縁膜を全く非加熱で成膜することができ、その特性評価を主目的としたため。また、拡散バリヤ材料の成膜に関してはラジカル処理を導入し、どのようなラジカル発生装置とすべきか、基礎的なデータを取得することを優先したため。ラジカル発生装置の物品費の分で使用額が異なっているが、現在のラジカル発生機構において、ラジカルの発生する確率を高める研究を行っている。
クラウドセンシングを用いた電波伝搬環境の統計化による周波数高効率利用に関する研究

まず、観測結果に基づく自己組織的電波伝搬モデル化に関する検討を行なった。車車間通信環境では、車両間に存在する車両の有無やその大きさなどによって瞬時受信電力の確率分布の形状が大きく変化する。そこで、周辺環境情報に応じて本確率分布の分類を予め行ない、データベース側で遮蔽車両台数ごとに確率分布を推定する手法について検討した。計算機シミュレーションにより、それぞれの確率分布を精度よく推定できることを示した。次に、データベースを用いて推定した瞬時受信電力の確率分布に基づく送信電力制御手法について検討した。ここでは、推定した受信信号電力の確率分布をもとに所望の受信信号電力で通信が行なえる確率を保証する送信電力制御手法を提案した。計算機シミュレーションにより、従来の伝搬モデルに基づく手法と比較して平均送信電力を抑制しつつも所望の通信品質を確保でき、本手法が周波数共用効率の向上に寄与しうることがわかった。また、実際の車車間通信実験を通して取得したデータセットを用いて、電力制御に関する評価を行なった。その結果、実環境においても周波数共用効率の向上が可能であることを示した。最後に、車車間通信を通して取得した瞬時受信電力値のデータセットを用いて、提案するデータベースの性能評価を行なった。ここではUNIX系のデータベースサーバを用いて、観測エリアを数m四方にメッシュ化した上で送信メッシュごとの平均受信電力値マップの構築を行なった。既存の伝搬モデルとの推定精度の比較を行ない、任意の送信位置において、その受信信号電力の場所依存特性を精度よく推定できることを示した。これまで実測値に基づくデータベースの適用対象は固定送信局のみに限られていたが、本検討を通して、車車間通信のように送信者が移動する環境へも拡張可能であり、多くの無線通信システムにおける伝搬予測の精度向上に寄与しうることがわかった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
アブラナ科植物の相補的に機能する病害抵抗性遺伝子の単離と育種基盤の整備

本年度は、根こぶ病抵抗性遺伝子Crr1bとCrr2の候補ORFを単独で有する形質転換体の作出を行った。Crr1bの候補ORFであるORF1とORF2の全長を含むゲノム断片を増幅し、根こぶ病抵抗性遺伝子Crr1aプロモーター下流に連結したコンストラクトをシロイヌナズナに形質転換した。選択培地上を用いて導入遺伝子をもつ個体を選抜し、T2種子を採種した。また、Crr2の候補ORFであるORF3とORF4について、5'上流域約900bpを含むゲノム断片を含むコンストラクトを構築し、シロイヌナズナに形質転換した。Crr2の候補を導入した形質転換体をT3まで世代促進し、導入遺伝子をホモ接合で有する系統を各ORFについて2系統ずつ選抜することができた。候補ORFを単独で有する系統を用いて根こぶ病接種検定を行ったところ、全ての系統が罹病性を示し、Crr1bとCrr2が単独では抵抗性を誘導しないとする先行研究の結果が確認された。Crr1bとCrr2の候補ORF導入個体間で交雑を行い、F1種子を採種した。Crr1bとCrr2の候補ORFを有する形質転換体を得ることができた。Crr2については導入遺伝子をホモ接合でもつ系統が選抜できた。Crr1bとCrr2の候補ORF形質転換体間で交雑を行い、2つのORFをもつF1種子を採種した。各ORFを単独で有する形質転換体における導入遺伝子の発現を確認する。また本年度得られたF1系統を用いて根こぶ病接種検定を行い、抵抗性誘導の有無を検定する。