hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レ-ザ-顕微鏡による染色体および精子の形態学的研究

強拡大の精子では中間部のミトコンドリアのらせん構造もとらえることに成功した。これらの結果は3編の論文にまとめて発表した。レ-ザ-顕微鏡は1970年代初めに試作され、その後、Sheppardらにより理論的体系が築かれ、実用に耐えうる物が世に出始め、主として、半導体素子の観察とその品質検査の分野に使用されていた。我々は、レ-ザ-顕微鏡の特性、即ち(1)共焦点型光学系でレ-ザ-光で単一点光源を利用するので、理論的に一般の光顕より分解能が向上する。(2)不要散乱光が少いので、フレア-のない鮮明な像が得られる。(3)焦点深度が光顕より深いので、より立体的な像が観察できる。(4)熱線を含まないので生きた材料を長時間観察できるなどから、これを生物試料、特に無固定無染色の試料に応用できるのではないかと考えた。そこで、まず、分裂細胞染色体、ヒト体細胞染色体、ヒト精子の形態学的観察に応用し、好結果が得られたので、これを国際学会にて発表し、外国雑誌(Cytobios等)にも発表してきた。最近になり、染色体や精子のみでなく、赤血球の形態などが明瞭にとらえられることが分り、泌尿器科学的疾患でしばしば遭遇する血尿の鑑別に応用できることが分かった。即ち、次の通りである。膀胱腸瘍等の尿路疾患よりの血尿中の赤血球の形態はisomorphic(同形赤血球)であり、腎炎等の糸球体疾患よりの赤血球の形態はdysmorphic(変形赤血球)が一般的であるとされている。この赤血球の鑑別は従来、位相差顕微鏡でなされていたが、熟練を要し、かなり主観的な鑑別がなされていた。レ-ザ-顕微鏡により赤血球の形態は容易に鑑別でき、その血尿が、糸球体由来のものであるか、尿路由来のものであるかが客観的に観察でき、診断の有力な手がかりの1つとなり得ることが分った。この結果は泌尿器科学会に発表し、現在、論文をNephronに投稿中である。レ-ザ-顕微鏡はその優れた特性により次第に応用分野が広がり、現在我々が行っている生物分野での応用も、国内外で最近急速に盛んになってきた。我々はヒト、植物、双翅類の分裂細胞染色体やヒトの精子、赤血球、上皮細胞、癌細胞などを本研究費で購入した共焦点リアルタイムレ-ザ-顕微鏡およびカラ-レ-ザ-顕微鏡(レ-ザ-テック社で借用)で形態学的に観察した。その結果、観察対象によって無固定無染色で観察可能なもの(ヒトの染色体、精子、赤血球、上皮細胞、癌細胞など)と、固定染色を施した方が観察し易いもの(植物、双翅類の分裂細胞染色体など)とがあることが分かった。特に我々の保有しているリアルタイムレ-ザ-顕微鏡は、無固定無染色の試料の観察に威力を発揮することが分かった。なかでも、泌尿器科学的疾患である血尿の鑑別診断において、リアルタイムレ-ザ-顕微鏡による赤血球の形態観察法は、従来の位相差顕微鏡を用いる方法よりはるかに容易で確実であり、医療部門での画期的な手段として国内外で反響を呼んだ(1992年2月朝日新聞掲載)。この成果は日本泌尿器科学会(1991年5月)、日本腎臓学会(1991年11月)、レ-ザ-顕微鏡研究会(1991年11月)、国際フォ-ラム(1992年1月)および外国雑誌(Nephron59巻、1991年)に発表した。さらに、ヒト精子の中筋部ミトコンドリアや先体(acrosome)の形態異常を生きたままの状態でとらえられることが分かり、男性不妊症診断における指標の一つである精子受精能判定に有効な手段になる得ると考えられた。
メラミンとユリアの共縮合に関する基礎的研究とその応用

C-13をラベルしたアイソトープホルムアルデヒドを用いて各種のモデル化合物を合成し、中性下におけるメラミンとユリアのホルムアルデヒドによる共縮合反応をC-13核磁気共鳴(NMR)スペクトルを用いて解析した。この方法によると、ラベルしていない通常のホルムアルデヒドやそれが付加したメチロール基やメチレン基などは観察されない。従って、ラベルしたメチロール基をメラミンあるいはユリアに導入することにより、C-13 NMRスペクトルでは、これらのメチロール基の挙動だけが観察できる。この方法を用いて各種の縮合反応を行った結果は、以下のようにまとめられる。メラミンとユリアのメチレン結合とジメチレンエーテル結合に基づく共縮合生成を判定できることを明らかにした。メラミンのメチロール基は、ユリアの第一級アミノ基との共縮合によるメチレン結合を生成しやすく、メラミンのジメチレンエーテル結合生成による自己縮合に優先した。また、ユリアのメチロール基もメラミンの第一級アミノ基とメチレン結合により共縮合し、自己縮合に優先した。また、トリメチロールメラミンのメチロール基は第一級アミノ基を持たないメチロールユリアとの反応で、メチレン結合よりジメチレンエーテル結合の生成による共縮合が優先することが判明した。さらに、メラミン、ユリア、ホルムアルデヒドの三者を同時に反応させた系では、ジメチレンエーテル結合によるそれぞれの自己縮合と共縮合がメチレン結合によるそれらに優先することが確認された。以上の結果から、メチレン結合による共縮合を生成させるには、ユリアあるいはメラミンのメチルロール体をそれぞれ第一級アミノ基を残した相手と反応させることが必要であると確認し、この結果を基にして実用的かつ有効な共縮合樹脂の合成方法を開発した。C-13をラベルしたアイソトープホルムアルデヒドを用いて各種のモデル化合物を合成し,中性下におけるメラミンとユリアのホルムアルデヒドによる共縮合反応をC-13核磁気共鳴(NMR)スペクトルを用いて解析した。この方法によると、C-13の天然における頻出度は非常に低いためラベルしていない通常のホルムアルデヒドやそれが付加したメチロール基やメチレン基などは観察されない。以上の結果から、メチレン結合による共縮合を生成させるには、ユリアあるいはメラミンのメチロール体をそれぞれ第一級アミノ基を残した相手と反応させることが必要であると確認した。この結果を基にして実用的な合成方法を検討している。

この方法によると、ラベルしていない通常のホルムアルデヒドやそれが付加したメチロール基やメチレン基などは観察されない。従って、ラベルしたメチロール基をメラミンあるいはユリアに導入することにより、C-13NMRスペクトルでは、これらのメチロール基の挙動だけが観察できる。この方法を用いて各種の縮合反応を行った結果は、以下のようにまとめられる。メラミンとユリアのメチレン結合とジメチレンエーテル結合に基づく共縮合生成を判定できることを明らかにした。メラミンのメチロール基は、ユリアの第一級アミノ基との共縮合によるメチレン結合を生成しやすく、メラミンのジメチレンエーテル結合生成による自己縮合に優先した。また、ユリアのメチロール基もメラミンの第一級アミノ基とメチレン結合により共縮合し、自己縮合に優先した。また、トリメチロールメラミンのメチロール基は第一級アミノ基を持たないメチロールユリアとの反応で、メチレン結合よりジメチレンエーテル結合の生成による共縮合が優先することが判明した。さらに、メラミン、ユリア、ホルムアルデヒドの三者を同時に反応させた系では、ジメチレンエーテル結合によるそれぞれの自己縮合と共縮合がメチレン結合によるそれらに優先することが確認された。以上の結果から、メチレン結合による共縮合を生成させるには、ユリアあるいはメラミンのメチロール体をそれぞれ第一級アミノ基を残した相手と反応させることが必要であると確認し、この結果を基にして実用的かつ有効な共縮合樹脂の合成方法を開発した。
根面象牙質保持性を有する再石灰化促進材の開発に関する研究

う蝕進行抑制を目的に根面象牙質に長期間定着することが可能な、フッ素徐放性コーティング材について、その効果を検討した。その結果、このコーティング材からはこれまでの歯根面に塗るタイプの材料に比較して多くのフッ素が溶出し、う蝕抑制効果の指標となる再石灰化量も多く認められた。また、フッ素を作用させると象牙質と歯科材料との接着力が向上することが認められ、接着された部分のイオン分析の結果、フッ素イオンの沈着が確認された。20年度では、再石灰化を促進する物質、成分の主なものであるフッ素イオンについて検討した。歯面に作用させたときにどれだけのフッ素量が浸透するのか、という視点から、材料より溶出するフッ素イオン量を測定し、目的に適した材料を見つけ出す指標とすることに主眼を置いた。使用した材料はフッ素含有のコンポジットレジン、フッ素含有のフロアブルレジン、フッ素含有ボンディング材、フッ素含有ワンステップタイプ接着システムの4種である。試料を脱イオン水または乳酸溶液中に浸漬し、1週ごとのフッ素溶出量を測定し、それを5週間行った。その結果、フッ素イオン溶出の経時的変化は、実験初期の段階で多くの溶出を認めたが徐々に低下し、開始23週には溶出量がほぼ一定となった。5週までの累積のフッ素イオン溶出量については、脱イオン水中のフッ素イオン溶出はワンステップタイプが一番多く、次いでボンディング材、コンポジットレジン、フロアブルレジンの順となった。乳酸溶液中では、フロアブルレジンが一番多く、コンポジットレジン、ワンステップ接着システム、ボンディング材の順となった。また、同じ材料における浸漬溶液によるフッ素イオン溶出の相違については、コンポジットレジンとフロアブルレジンの群で、乳酸溶液の溶出フッ素が脱イオン水に比較して高い値を示したのに対し、ボンディング材とワンステップ接着システムは溶液間に差を認めなかった。これらの結果から、再石灰化促進材に必要とされる性質であるフッ素徐放性について、フッ素溶出量の多い材料(素材)として、通常の場合ではボンディング材のようなものが適当と考えられ、う蝕感受性の高い患者に対しては、コンポジットレジンのようなものが適当であると示唆された。20年度において材料から溶出するフッ素の溶出様式について、検討を重ねた。そこで、21年度では、材料から溶出するフッ素がどのように歯質へ浸透し、影響を与えているのかという観点から研究を進めた。最近、当研究の目的に沿った、再石灰化を促進することが考えられる歯根面へのコーティング材が歯科材料メーカーより試作されたことから、この材料も含めて検討を行った。歯根面を想定し、象牙質を露出させた試料を作製した。試料の一部分を酢酸緩衝液にて脱灰させ、人工的にう蝕部分を作製した。そのう蝕部分に試作品の再石灰化促進コーティング材、フッ素徐放性を有するボンディング材、フッ素を含まないボンディング材を作用させ、一定期間ほぼ中性の溶液(再石灰化溶液)に浸漬、保存した。その結果、フッ素を含むコーティング材およびボンディング材を使用した群では、フッ素を含まない材料を使用した群と比較して,歯質の脱灰量が有意に少ないことが示された。しかし、脱灰進度(脱灰がどのくらいの深さまで進行しているか)については差を認めなかった。このことより、フッ素含有材料はフッ素を含まない材料と比較してう蝕進行抑制に効果が期待できることが示された。う蝕進行抑制と材料からのフッ素との関係を調べるため、上記コーティング材とボンディング材のフッ素溶出量を測定した。その結果、コーティング材からの溶出がボンディング材からのものと比較して大きい値を示した。このことから、う蝕進行抑制にはフッ素の溶出量が関係することが明らかとなった。今後は材料を保存する条件を変え、フッ素が外部から供給される状況でのう蝕進行抑制や、再石灰化の変化を観察、検討していくとともに、コーティング材の適正な使用条件を確立していくつもりである。20年度において材料から溶出するフッ素の溶出様式について、検討を重ね、21年度では、材料から溶出するフッ素の歯質への浸透について研究を進めた。そこで22年度は、材料を保存する条件を変え、フッ素が外部から供給される状況でのう蝕進行抑制や、再石灰化の変化を観察、検討した。また最近、当研究の目的に沿った、再石灰化を促進することが考えられる歯根面へのコーティング材が歯科材料メーカーより試作されたことから、この材料を中心に検討を行った。

また、一方で、再石灰化溶液に10ppmF相当のNaFを添加した溶液にも同様に試料を保存した。その結果、フッ素を含まない溶液に保存した場合、フッ素を含む試作コーティング材は、フッ素を含むボンディング材やフッ素を含まない材料を使用した群と比較して,材料に隣接する歯質の再石灰化度が有意に高いことが示された。さらにフッ素を添加した溶液に保存した場合でも、フッ素を含む試作コーティング材は他の材料と比較して高い再石灰化度を示す傾向にあった。このことより、フッ素含有試作コーティング材はう蝕進行抑制効果が期待できることが示された。また、歯科材料の象牙質接着とフッ素との関連性を検討したところ、高濃度のフッ素溶液を作用させた場合、高い接着強さを示した。そこで接着界面の元素分析を行ったところ高い接着強さを認めた群では、接着界面に多くのフッ素イオンの存在が認められた。このことから、フッ素溶液による処理が接着に影響を与えることが示唆され、う蝕進行抑制にも関わるものと推測された。
「循環」を問い直す―物質・文化・環境を繋ぐグローバルヒストリー

近年、グローバルヒストリー研究では、従来、移動・伝播・交換取引と表していた知・情報・モノの移動を、「循環Circulation」に替える傾向がみられるが、本研究は、この「循環」を主にモノの世界史や環境世界史の視点から再規定し、プロセスを可視化した歴史叙述の枠組みとして構築することを目指す。一方、グローバルヒストリー分野における革新的な国際共同研究方法として、国際共著論文からなる論文集を最初から目標においてチーム編成し、個々の共同研究の体験を全体に反映させる方法をとり、成果を広く発信する。また後進育成のための米独仏日サマースクールを共催する。
種痘様水疱症の重症化マーカーの検討

種痘様水疱症(Hydora vaccniforme; HV)は、日光露光部の皮膚を中心に水疱、痂皮や瘢痕のサイクルを繰り返す小児に認める疾患で、皮膚病変部にEpstein-Barr virus (EBV)を認める。本疾患は、皮膚症状のみの古典型(cHV)と、発熱、リンパ節腫脹あるいは肝機能障害等の全身症状を認める全身型(sHV)の2つの病型がある。古典型HVの治療は、遮光のみで経過観察だが、全身型の場合は、化学療法や骨髄移植が必要となる。申請者らは、慢性活動性EBV感染症の類縁疾患と考えられるHVや蚊刺過敏症患者の予後解析を行った結果、古典型HVは予後良好だったが、全身型HVは予後不良であった。予後不良因子は、1)発症年齢が、9歳以上であること、2)皮膚病変部にEBV再活性化マーカーであるBZLF1 mRNAが発現していることだった(Br J Dermatol, 2015)。一方、全身型でもBZLF1 mRNAを発現していない症例や古典型から全身型へ移行する症例もあり、重症化マーカーに関しては、不明な点も多い。今回我々は本研究で、HVの皮膚病変部と血漿中でのサイトカインを検討し、古典型と予後不良と考えられる全身型の診断基準を明確にすることを目的とした。1、αβ型とγδ型HV患者のEBV再活性化マーカーと予後の検討で、αβ型が予後不良であった。2、HV患者血漿中のEBV DNA量と皮膚症状、血液学的検査所見の検討において、血球中のEBVDNA量は種痘様水疱症の診断マーカーとなること、血漿中のEBVDNA量は診断マーカーとはならないが、血球貪食症候群の患者で上昇を認めており、EBV感染細胞に対する宿主の細胞性免疫応答の影響であることを報告し、現在論文投稿中である。1、αβ型とγδ型HV患者のEBV再活性化マーカーと予後の検討において、我々の検討では、EBVがαβ細胞に感染した方が、予後不良であることが分かった。さらに感染細胞後とのEBV再活性化マーカーとの統計学的解析を行っている。2.HV患者血漿中のEBV DNA量と皮膚症状、血液学的検査所見の検討において、血球中のEBVDNA量は種痘様水疱症の診断マーカーとなること、血漿中のEBVDNA量は診断マーカーとはならないが、血球貪食症候群の患者で上昇を認めており、EBV感染細胞に対する宿主の細胞性免疫応答の影響であることを報告し、現在論文投稿中である。3.HV患者の皮膚病変部と血清/血漿中のサイトカインの検討を行っている。患者の皮膚病変部でのサイトカインの検討では、古典型の場合は、重症型と比較して皮膚病変部ではIL6の発現が上昇を認めていた。一方IL4,IL18、IL12等のサイトカインの上昇は認めていなかった。またHV患者病変部では、IL1bやTNFの軽度上昇を認めており、皮膚病変形成機序に関わっている可能性を考えている。一方患者血漿中では重症型の方が、CCL3やCXCL9の上昇を認めていており、これらの検討を臨床症状と比較していく予定である。EBV陽性培養細胞株(γδ、T細胞、NK細胞)からRNAを抽出し、cDNAを作成。上記サイトカインの有意差がないかを感染細胞ごとにreal-time PCRにて検討を行っていく予定である。また可能であるならば上澄み液からELISAにてサイトカインの差がないかも行う予定である。さらに患者血液からγδ細胞培養樹立を現在も行っている。健常人からのγδT細胞の培養に関してはテクノスズタ会社(田中義信先生御指導の下)より販売されているキットを使用し、まずは自分自身の血液を使用してγδ細胞の培養を練習中である。2、HV患者血漿中のEBV DNA量と皮膚症状、血液学的検査所見の検討において、血球中のEBVDNA量は種痘様水疱症の診断

マーカーとなること、血漿中のEBVDNA量は診断マーカーとはならないが、血球貪食症候群の患者で上昇を認めており、EBV感染細胞に対する宿主の細胞性免疫応答の影響であることを報告し、現在論文投稿中である。1、αβ型とγδ型HV患者のEBV再活性化マーカーと予後の検討において、我々の検討では、EBVがαβ細胞に感染した方が、予後不良であることが分かった。さらに感染細胞後とのEBV再活性化マーカーとの統計学的解析を行っている。2.HV患者血漿中のEBV DNA量と皮膚症状、血液学的検査所見の検討において、血球中のEBVDNA量は種痘様水疱症の診断マーカーとなること、血漿中のEBVDNA量は診断マーカーとはならないが、血球貪食症候群の患者で上昇を認めており、EBV感染細胞に対する宿主の細胞性免疫応答の影響であることを報告し、現在論文投稿中である。3.HV患者の皮膚病変部と血清/血漿中のサイトカインの検討を行っている。患者の皮膚病変部でのサイトカインの検討では、古典型の場合は、重症型と比較して皮膚病変部ではIL6の発現が上昇を認めていた。一方IL4,IL18、IL12等のサイトカインの上昇は認めていなかった。またHV患者病変部では、IL1bやTNFの軽度上昇を認めており、皮膚病変形成機序に関わっている可能性を考えている。一方患者血漿中では重症型の方が、CCL3やCXCL9の上昇を認めていており、これらの検討を臨床症状と比較していく予定である。EBV陽性培養細胞株(γδ、T細胞、NK細胞)からRNAを抽出し、cDNAを作成。上記サイトカインの有意差がないかを感染細胞ごとにreal-time PCRにて検討を行っていく予定である。また可能であるならば上澄み液からELISAにてサイトカインの差がないかも行う予定である。さらに患者血液からγδ細胞培養樹立を現在も行っている。健常人からのγδT細胞の培養に関してはテクノスズタ会社(田中義信先生御指導の下)より販売されているキットを使用し、まずは自分自身の血液を使用してγδ細胞の培養を練習中である。
直線閾値なし（linear-no-threshold）仮説の放射線生物学的検証

【目的】天然の鉱石から作られ低線量のα、β、γ線を放出するシート(商品名:ヌーシート)は、Ac-228やBr-77を含有していると考えられ、変形性関節症などによる慢性疼痛の軽減効果が報告されている。我々のグループは、このシート上で飼育した蚕の幼虫の成長が、コントロール群に比べて促進されることを報告した。今回はこのヌーシートについて、蚕の成長促進をもたらす至適線量(率)、幼若マウスに対する成長促進の有無、腫瘍細胞のマウスへの可移植性の変化などを検討した。【方法】ヌーシートは2週類あり、重ねることにより1.722.4μSV/hの線量率が得られた。蚕は卵の時点から、コントロールシート群(0.3μSV/h)とヌーシート群に分けて飼育した。別の実験では、比較のため、孵化直後の蚕幼虫にX線を0.150Gy照射し、その後の成長を観察した。また3週齢Balb/c雌マウスを同様の2群に分けて飼育し、体重の変化を観察するとともに、10週の時点でEMT6細胞を1000個皮下移植し、生着率を観察した。【結果】蚕では、13.4と22.4μSV/hの線量率において体重増加促進が認められたが、それより低い線量率やX線の0.1または0.6Gyの1回照射では体重増加促進は見られなかった。マウスにおいてはヌーシートによる体重増加促進は観察されなかったが、EMT6腫瘍の生着までの日数が延長した。【考察・結論】低線量放射線を放出するヌーシートは、蚕の成長を促進したが、マウスではその効果は認められなかった。マウスでは0週齢から飼育することが困難であることや、動物の大きさによる線量低下などの問題があり、蚕と同じ条件で実験することができなかったが、他の研究者からも報告されているように、腫瘍細胞の生着遅延効果は示唆された。低線量放射線持続被曝の影響については、今後さらに研究する価値があると考えられた。2018年に英文原著論文と総説をそれぞれ1報ずつを国際雑誌に掲載することができたため、概ね順調と考えている。さらには、もう1報の論文も準備中であり、計3報以上の英文論文を見込んでいる。今年度は培養細胞を用いた研究に重点を置く。蚕の成長促進のメカニズムを検討するため、培養HSG細胞を用いて増殖刺激の有無を検討する。HSG細胞を2群に分けて、細胞数とコロニー形成率を経時的に比較する。また2、4、6週後に28Gyの照射を行い、細胞生存率を比較し、適応応答反応が見られるかどうかを検討する。さらには、4週間培養してから、2Gy照射後の1核あたりのγH2AX fociを数え、DNA二重鎖切断に対する効果を検討する。また20100mGy程度の一回照射の後、間隔をおいて2Gyの照射を行い、その後のγH2AX fociの発生を検討する。

蚕の成長促進のメカニズムを検討するため、培養HSG細胞を用いて増殖刺激の有無を検討する。HSG細胞を2群に分けて、細胞数とコロニー形成率を経時的に比較する。また2、4、6週後に28Gyの照射を行い、細胞生存率を比較し、適応応答反応が見られるかどうかを検討する。さらには、4週間培養してから、2Gy照射後の1核あたりのγH2AX fociを数え、DNA二重鎖切断に対する効果を検討する。また20100mGy程度の一回照射の後、間隔をおいて2Gyの照射を行い、その後のγH2AX fociの発生を検討する。他の研究費の余剰があったため、それを先に使用した。今年度は高価な試薬などの購入によりで予定どおりの支出が見込まれている。
飛行時間差法を用いた低エネルギー電子衝撃による分子の非弾性散乱閾値の精密分光

本研究では、低エネルギー電子散乱実験で広く普及している従来の静電型エネルギー選別器を用いた手法とは異なる手法で非弾性散乱閾値の精密分光実験を行う目的で装置開発を行ってきた。これは、従来行われてきたクロスビーム法と飛行時間差法を組み合わせた手法(飛行時間差型分光器と呼ぶ)である。低エネルギー電子ビームのパスル化と散乱電子の検出時間までの飛行時間差の関数として散乱電子を検出することにより、電子の工ネルギー損失スペクトルに対応した飛行時間差スペクトルを測定する。今年度は、昨年度製作した装置で測定準備を行ってきた。まず、動作テストして最も単純な2原子分子であるN_2を標的として用い、弾性散乱と電子励起を区別した飛行時間スペクトルを入射エネルギー約30eV、散乱角度90度で測定した。パルス間隔200 nsec、パルス幅5 nsecの条件で測定することにより弾性散乱と電子励起による非弾性散乱した散乱電子の検出に成功し、動作を確認することが出来た。本実験装置の開発状況は、平成19年度イギリスのレディングで開催された電子・分子・スウォームの国際会議において発表された。さらに、今後飛行時間差による閾値周辺の極めて低エネルギー領域の散乱電子の微分断面積と比較・規格化するために、本申請と同時並行で電子励起過程の測定を従来から用いてきた静電半球型エネルギー選別器により行ってきた(研究発表1-4)。この実験結果では、閾値より比較的高いエネルギー領域における電子励起過程の断面積を測定していることから本申請の飛行時間差法と相補的な関係があり、広範囲の電子励起過程の断面積測定に必要不可欠である。今回、本申請において実験装置が完成したことから、今後入射エネルギーを閾値近傍まで下げた低エネルギー領域で断面積測定を行うことが可能となった。今後、電子励起過程について様々な分子に対して測定する予定である。なお、本装置の開発状況は投稿論文として準備中である。低エネルギー電子ビームのパスル化と散乱電子の検出時間までの飛行時間差の関数として散乱電子を検出することにより、電子のエネルギー損失スペクトルに対応した飛行時間差スペクトルを測定する。今年度は、上智大学に新たに飛行時間差型分光装置を設置するにあたり、回転機構および電子制御部の製作から、真空槽・ガス導入部・排気系の開発を行った。電子制御部についてはパルス電子線を生成するためのパルスジェネレータを設備備品として購入した。パルスジェネレータから出力される信号と擬似パルス信号を用いての計測テストを行い、計測回路および検出部の動作確認を行った。また、低エネルギー散乱電子を輸送するためのドリフト管を設計・製作し、消磁のためミューメタルの加工を行い、真空排気を開始した。次年度には今年度製作した各部分を組み合わせることにより実際に測定可能となる。まず初めに、He原子を標的として用い弾性散乱と電子励起を区別した飛行時間スペクトルを入射エネルギー約40eV程度で測定し、閾値までエネルギーを下げる予定である。また、今年度は飛行時間差法による閾分光を行うための準備の一環として、従来から用いている半球型静電エネルギー選別器を動作確認のため取り付け、閾値よりエネルギーの高い領域における規格化のための測定をさまざまな標的に対して製作と同時並行で行った。本実験結果は論文として報告した(研究発表1-6)。本実験結果に基づき、飛行時間差で得られた弾性散乱から閾値近傍における断面積の絶対値化が次年度以降可能となる。

今回、本申請において実験装置が完成したことから、今後入射エネルギーを閾値近傍まで下げた低エネルギー領域で断面積測定を行うことが可能となった。今後、電子励起過程について様々な分子に対して測定する予定である。なお、本装置の開発状況は投稿論文として準備中である。
低線量・低線量率放射線発がん高感受性モデルマウスの開発と発がんリスク評価

ApcMin/+マウスは、自然に多数の小腸腫瘍を発症し、放射線被ばくにより、さらに多数の小腸腫瘍を誘発することができる。本研究では、この特徴を利用して放射線発がんにおける線量率効果とそれに及ぼす遺伝的背景の影響について解析した。その結果、放射線発がんにおける線量率効果には、遺伝的背景が大きく影響することが明らかにされた。一方、低線量・低線量率放射線発がんを解析できるモデルマウスの開発を試みた結果、ApcMin/+マウスは、複製後修復機構に関与する因子を欠損させることで、放射線に対して、より高発がん性を示すことが明らかにされた。現代社会では、医療、産業等での放射線利用が激増し、低線量放射線の健康影響問題は人類共通の課題である。さらに、東京電力福島第一原子力発電所事故(福島原発事故)では、低線量・低線量率放射線被ばくにおける科学的なリスク評価が緊急の課題となっている。本研究では、ヒト家族性大腸腺腫症のモデルマウス(Minマウス)が、放射線により高感度に小腸腫瘍が誘発され、誘発腫瘍にはゲノム欠失が同定できることを利用して、低線量・低線量率放射線による発がんモデルを開発する。同時に、低線量率発がんにおける線量効果関係を解明し、ゲノム欠失を誘発する線量効果関係と「しきい値」の有無を同定する。初年度である今年度は、バックグランドの違う2種類のMinマウスを準備した。同週齢のMinマウスに異なる線量率の放射線照射を行い、発がん実験を行った。Minマウスでは、小腸、大腸腫瘍の進行に伴い、出血による貧血、脾臓の肥大がみられる。そのため、屠殺時には、小腸、大腸腫瘍の個数、大きさだけでなく、脾臓重量の測定、末梢血の採血を行った。その後、末梢血中のヘモグロビン値を測定した。また、採取した小腸、大腸は、固定後、それぞれ、アルカリフォスファターゼ染色、アルシアンブルー染色を行い、腫瘍の数を計測した。その結果、脾臓重量の増加、血中ヘモグロビン値の低下が観察されたマウスでは、腫瘍の数が多い傾向がみられた。また、今回用いた線量率においては、2種類の系統により、その線量率効果が異なる結果が得られた。本研究では、ヒト家族性大腸腺腫症のモデルマウス(Minマウス)は、放射線により高感度に小腸腫瘍が誘発され、誘発腫瘍にはゲノム欠失が同定できることを利用して、低線量・低線量率放射線による発がんモデルを開発する。今年度は、昨年度の実験から得られた腫瘍組織試料からDNAを抽出し、分子学的手法を用いることにより、ApcMin/+遺伝子座における遺伝子変異パターンを検出することを試みた。具体的には、定量的PCR解析、LOH解析を行うことにより、対側アリルの変異が、自然発症型、高線量率放射線誘発型なのか、あるいは、新たな変異なのかを同定した。その結果、遺伝的バックグラウンドにより、検出される遺伝子変異頻度が異なることが明らかにされた。現代社会では、医療、産業等での放射線利用が増加し、低線量放射線の健康影響問題は人類共通の課題となっている。さらに、東京電力福島第一原子力発電所事故(福島原発事故)では、低線量・低線量率放射線被ばくによる健康影響の科学的なリスク評価が緊急の課題となっている。本研究では、マウスモデルを用いて、低線量・低線量率放射発がんリスクを解析するための発がんモデルを開発する。実験では、ヒト家族性大腸腺腫症のモデルマウス(Minマウス)を用いる。Minマウスは、放射線により高感度に小腸腫瘍が誘発され、誘発腫瘍にはゲノム欠失が同定できることを利用する。さらには、DNA損傷修復関連遺伝子を欠損したマウスとMinマウスを交配させることにより、放射線発がんにおける損傷応答機構の関与を解明する。今年度は、複製後修復機構で中心的な役割を担う因子に着目をし、その遺伝子を欠損させたマウスとMinマウスの交配を行った。交配により得られたF1マウスと、DNA損傷修復機構関連因子欠損マウスをもう一度交配させることで得られるF2マウス(候補遺伝子野生型; Minマウス、候補遺伝子ホモノックアウト; Minマウス)を用いて、自然発症する小腸腫瘍へのDNA損傷修復機構関連因子の寄与について検討した。その結果、複製後修復機構を欠損させたMinマウスは、Minマウスと比較して、自然発がんの頻度が増加することを明らかにした。さらに、放射線発がん実験を行った結果、複製後修復機構を欠損させたMinマウスにおける放射線誘発腫瘍の数は、Minマウスと比較して、有意に高いという結果を得た。このことから、複製後修復機構に関与する因子は、自然発症および放射線発がんに関与することが示唆された。

一方、低線量・低線量率放射線発がんを解析できるモデルマウスの開発を試みた結果、ApcMin/+マウスは、複製後修復機構に関与する因子を欠損させることで、放射線に対して、より高発がん性を示すことが明らかにされた。遺伝子変異を検出するための実験系の確立が当初予定していたよりも順調に進行した。また、安定した実験結果を得るために、予定していたよりも多く時間を費やしたが、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。放射線生物学,放射線発がんヒト家族性大腸腺腫症のモデルであるMinマウスは、片側の染色体にApc癌抑制遺伝子変異(Min)を有し、小腸腫瘍を多発する。この際、自然発症がんの多くは、正常Apc遺伝子が座位する染色体(1本)の欠損と、ApcMinアレルの増幅が観察される。一方、高線量率放射線照射によって誘発された小腸腫瘍では、正常Apc遺伝子領域の部分欠失が特徴的に検出されるという報告がある。すなわち、Minマウスを用いることにより、高線量率放射線誘発がんにおける遺伝子変異パターンを高感度に検出することができる。これまで、このMinマウスを用いて発がん実験を行い、線量率効果について検討を行った。また、得られた腫瘍組織試料を用いて遺伝子変異解析を行った。今年度は、DNA損傷応答関連遺伝子欠損マウスとMinマウスを交配した放射線高感受性マウスを開発し、低線量率放射線発がんにおける放射線の爪痕、さらには低線量率放射線発がんにおける損傷応答機構の関与を解明する。最終的には、発がん高感受性マウスを用いて、低線量・低線量率放射線発がんのリスク評価を行う。実験を開始する前に、目的の線量率での照射実験を行うための線量評価を行った。線量評価を行うにあたって、動物飼育ラック、動物飼育ケージを用いた条件下で、正確な線量評価を行うために、当初予定していたよりも多くの時間を費やした。だが、実験に必要なマウスの準備を予定よりも早めに準備をすることができたため、その後の発がん実験は順調に進み、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。今年度の遺伝子解析を行うにあたり、より精度の高い系の改良を行うことができたため、当該次年度使用額が生じた。ヒト家族性大腸腺腫症のモデルであるMinマウスは、片側の染色体にApc癌抑制遺伝子変異(Min)を有し、小腸腫瘍を多発する。一方、高線量率放射線照射によって誘発された小腸腫瘍では、正常Apc遺伝子領域の部分欠失が特徴的に検出されると報告されている。昨年度は、このMinマウスを用いて発がん実験を行い、線量率効果について検討を行った。今年度は、その腫瘍組織試料からDNAもしくはRNAを抽出し、分子生物学的手法を用いることにより、ApcMin/+遺伝子座における遺伝子変異パターンを検出することを試みる。
アドレノメデュリンとPAMPの中枢作用の解明

アドレノメデュリンとPAMPの神経内分泌及び神経系に対する作用を調べるために、ヒト下垂体腺腫細胞とラット神経由来細胞株を用いて、電気生理学的研究をおこなった。1.アドレノメデュリン(AM)はヒトプロラクチン産生腺腫からのプロラクチン分泌を用量依存的に促進した。分泌促進の作用機構を電気生理学的手法を用いて調べたところ、AMはこの細胞の膜を脱分極し、活動電位の発火頻度を増加させた。脱分極のイオン機構を調べたところ、非選択性陽イオン電流の活性化により生じていることが判明し、活性化はGs蛋白質とPKAを介していることが明らかになった。AMはヒトに静注した場合プロラクチン濃度を増加させることが知られているが、これがプロラクチン産生細胞に対する直接作用であることが明らかになり、その作用機構が明らかになった。2.PAMPはヒトACTH分泌下垂体腺腫細胞からのACTH分泌を抑制した。この抑制は、PAMPによる膜の過分極反応によっていることが明らかになった。過分極のイオン機構は、内向き整流性カリウム電流の活性化によっていることが明らかになった。過分極反応により、活動電位の発火が減少し、電位依存性カルシウムチャネルを介するカルシウム流入が抑制されることで、ACTH分泌が抑制されると考えられた。3.NGF処理を行い神経細胞様に分化したPC12細胞に対するPAMPの作用を検討した。PAMPはこの細胞において、内向き整流性カリウム電流を活性化して過分極を引き起こした。このカリウム電流活性化の刺激伝達系路を検討した。GDPβSを細胞内にmicroinjectionした細胞や百日咳毒素処理した細胞では、PAMPによる活性化は消失し百日咳毒素感受性G蛋白質の関与が考えられた。G蛋白質のαサブユニットのC末端アミノ酸配列に対する特異抗体を用いた実験により、このG蛋白質がGi3であることが明らかになった。下垂体細胞に対する作用。アドレノメデュリン(AM)がヒトACTH産生下垂体腺腫細胞からのACTH分泌に対し、低濃度で抑制、高濃度で促進の作用を有することを初めて明らかにした。促進の作用機序について電気生理学的手法を用いて検討したところ、AMが非選択性陽イオン電流を活性化し、膜を脱分極させることで細胞内へのCa^<2+>流入を促進する事によることを明らかにした。このことによりFura2で測定した細胞内Ca^<2+>濃度は細胞外Ca^<2+>依存性に増加した。このことによりACTH分泌の促進が生じているものと考えられる。またこの作用にはPKAの活性化が関与していることを明かにし、内分泌学会で発表した。現在投稿準備中である。PAMPについてはいくつかの下垂体細胞系で検討中である。中枢神経細胞に対する作用。AMは青斑核由来神経細胞株において膜を脱分極させ、活動電位の発火頻度を増加させた。この神経細胞株はノルアドレナリン作動性であり、AMによる細胞の興奮現象はノルアドレナリン分泌の増加につながると考えられる。この興奮性の増加の機序を検討したところ、AMはこの細胞の非選択性陽イオン電流を活性化する事が明かとなった。この作用にも、cAMP増加とPKA活性化が関与していることが明かとなった。この現象の生理的意義については次のような考察を行っている。AMを中枢投与すると、末梢投与の場合とは対照的に昇圧反応が生じる。

この際に脳脊髄液中のノルアドレナリンの濃度が増加していることが示されている。AMによるノルアドレナリン作動性神経細胞の活動性に対する刺激は、AMの中枢投与による昇圧反応の機序の解明や、中枢作用の解析に役立つものと考えられる。この結果についても現在投稿準備中である。アドレノメデュリンとPAMPの神経内分泌及び神経系に対する作用を調べるために、ヒト下垂体腺腫細胞とラット神経由来細胞株を用いて、電気生理学的研究をおこなった。1.アドレノメデュリン(AM)はヒトプロラクチン産生腺腫からのプロラクチン分泌を用量依存的に促進した。分泌促進の作用機構を電気生理学的手法を用いて調べたところ、AMはこの細胞の膜を脱分極し、活動電位の発火頻度を増加させた。脱分極のイオン機構を調べたところ、非選択性陽イオン電流の活性化により生じていることが判明し、活性化はGs蛋白質とPKAを介していることが明らかになった。AMはヒトに静注した場合プロラクチン濃度を増加させることが知られているが、これがプロラクチン産生細胞に対する直接作用であることが明らかになり、その作用機構が明らかになった。2.PAMPはヒトACTH分泌下垂体腺腫細胞からのACTH分泌を抑制した。この抑制は、PAMPによる膜の過分極反応によっていることが明らかになった。過分極のイオン機構は、内向き整流性カリウム電流の活性化によっていることが明らかになった。過分極反応により、活動電位の発火が減少し、電位依存性カルシウムチャネルを介するカルシウム流入が抑制されることで、ACTH分泌が抑制されると考えられた。3.NGF処理を行い神経細胞様に分化したPC12細胞に対するPAMPの作用を検討した。PAMPはこの細胞において、内向き整流性カリウム電流を活性化して過分極を引き起こした。このカリウム電流活性化の刺激伝達系路を検討した。GDPβSを細胞内にmicroinjectionした細胞や百日咳毒素処理した細胞では、PAMPによる活性化は消失し百日咳毒素感受性G蛋白質の関与が考えられた。G蛋白質のαサブユニットのC末端アミノ酸配列に対する特異抗体を用いた実験により、このG蛋白質がGi3であることが明らかになった。
咀嚼嚥下時の顎位に関与する末梢性ならびに中枢性神経機構の解明

嚥下運動における顎位(顎運動)を制御している末梢性神経および中枢性の神経機構の解明をめざす本申請研究において、顎運動を支配する三叉神経運動ニューロンを直接制御している孤束核内の三叉神経運動前ニューロンの様態、ならびにそれらの運動前ニューロンへの一次求心性神経ならびに大脳皮質からの投射様態について、形態学的に解明した。結果、同運動前ニューロンが、嚥下などを誘発する咽頭・喉頭の粘膜感覚などの末梢性入力や、最高次中枢である大脳皮質、特に情動や自律神経機能に関わる島皮質からの中枢性入力によって制御されていることが示唆された。本研究は、嚥下運動における顎位(顎運動)を制御している末梢性および中枢性の神経機構を、斬新な視点からの動物実験で明らかにし、咀嚼嚥下機能の回復をめざす口腔治療に有益な情報を提供することを目的としたものである。孤束核に存在する開口筋運動前ニューロンと閉口筋運動前ニューロンへの、一次求心性神経からの入力様式の解明を平成24年度の課題とし、また大脳皮質からの入力様式を平成25年度の課題とした。平成24年度は、ラットを用いて、運動核への逆行性トレーサーの注入で標識した孤束核に存在する開口筋および閉口筋運動前ニューロンと、咽頭などの粘膜に分布する一次求心神経に越神経節トレーサーを取り込ませて標識した軸索終末とのコンタクトを検索し、入力様態を解明した。開口筋運動前ニューロンおよび閉口筋運動ニューロンの存在部位は多くの研究で記されているが、孤束核に多く存在することを示しているのは私たちのグループのみであり、この点で本研究の独創性は極めて高い。開口状態で嚥下することが困難なことは日常経験する所である。しかし、この嚥下の開始時に必要な顎位(顎運動)の制御に関わる神経機構に着目した研究はほとんどない。本実験によって、孤束核に存在する開口筋または閉口筋運動前ニューロンと一次求心性神経の終末とが作るコンタクトの分布を調べたことで、嚥下時の顎位置(顎運動)を決定している末梢性の神経機構の一つが解明された。開口状態では嚥下の開始は難しく、閉口して舌骨が顎方向に挙上され固定される事が嚥下の開始に必要なことはよく知られた事実であるが、それに関与する神経機構が明らかになれば、この分野の研究者ばかりでなく臨床家にとっても、極めて有益な情報となると考えられる。本研究結果については、現在、論文投稿準備中である。嚥下運動における顎位(顎運動)を制御している末梢性および中枢性の神経機構の解明をめざす本申請研究において、平成25年度は、平成24年度で得られた成果、すなわち、顎運動を支配する三叉神経運動ニューロンを直接制御している孤束核内の三叉神経運動前ニューロンの様態ならびにそれらの運動前ニューロンへの一次求心性神経からの入力様式について論文まとめた。さらに、孤束核内の三叉神経運動前ニューロンに対する大脳皮質、とくに島皮質からの投射様態について、逆行性と順行性神経トレーサを用いて、形態学的に解明した。結果、孤束核内の三叉神経運動前ニューロンが最も密集する存在部位へ投射する皮質ニューロンは、主に、顆粒性島皮質と不全顆粒性島皮質の吻側部に、両側性に認められた。以上より、孤束核内の三叉神経運動前ニューロンには、島皮質、とくに顆粒性島皮質と不全顆粒性島皮質などからの投射があり、情動や自律神経機能に関わる高次脳からの入力があることが示された。研究実施計画のとおり実験を遂行することができ、期待通りの結果を得ることができた。結果について、Neuroscience2012で、ポスター発表を行った。現在、平成24年度の結果について論文作成中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の結果について論文にまとめ、投稿予定である。論文投稿と並行して、平成25年度の課題である孤束核に存在する開口筋運動前ニューロンと閉口筋運動前ニューロンへの大脳皮質からの入力様式を動物実験で明らかにする。
メナキノンの微生物合成と細胞外漏出の機構の解明

メナキノン(ビタミンK_2)の微生物をもちいる合成プロセスを開発する研究の一環として、メナキノン合成能の増強されたスルホンアミド耐性変異株の誘導に成功した。本株は、親株と同様に界面活性剤添加培養により菌体外へメナキノンー4を漏出する.メナキノン生産のための培養条件に関する最適化を行ったところ、培養液1リットル当り280mgのメナキノンを生産し、工業的プロセスを開発するための基盤を確立することができた.次いで、上述のスルホンアミド耐性変異株におけるメナキノン合成能の増強の要因を生合成系の酵素活性とその制御の変化から追求するために、野生株及び親株であるヒドロキシナフトエ酸耐性変異株と比較して検討した.その結果,2,3の酵素において明らかなメナキノン合成促進の要因が認められた.さらに、メナキノンの細胞外漏出現象の解析のために休止菌体系を設定し、メナキノンー4が低濃度の界面活性剤添加により漏出するのに対し、メナキノンー6は高濃度添加によっても漏出しないことを認めた。次に、細胞を分画し、メナキノンー4とメナキノンー6の局在性について検討したところ、両メナキノンに差異は認められずともに膜画分に存在していた.休止菌体系における漏出は界面活性剤と接触後直ちに起こることから、膜組成の変化が原因ではない.スフェロプラストからはメナキノンー4のみが漏出し、膜画分からは両メナキノンとも容易に漏出した.すなわち、メナキノンー4の選択的漏出には細胞壁及び膜との親和力は関係がないと考えられる、一方、シクロデキストリンの添加及び細胞の水洗によってもメナキノンー4の選択的漏出が認められた.これらの結果より、細胞膜透過性の差異を界面活性剤が増強している機構を結論とするに至った.メナキノン(ビタミンK_2)の微生物をもちいる合成プロセスを開発する研究の一環として、メナキノン合成能の増強されたスルホンアミド耐性変異株の誘導に成功した。次に、細胞を分画し、メナキノンー4とメナキノンー6の局在性について検討したところ、両メナキノンに差異は認められずともに膜画分に存在していた.休止菌体系における漏出は界面活性剤と接触後直ちに起こることから、膜組成の変化が原因ではない.スフェロプラストからはメナキノンー4のみが漏出し、膜画分からは両メナキノンとも容易に漏出した.すなわち、メナキノンー4の選択的漏出には細胞壁及び膜との親和力は関係がないと考えられる、一方、シクロデキストリンの添加及び細胞の水洗によってもメナキノンー4の選択的漏出が認められた.これらの結果より、細胞膜透過性の差異を界面活性剤が増強している機構を結論とするに至った.
藻類成長促進因子を分子標的とした革新的防藻剤の創製

グリーンタイドとは、一般的に、沿岸部等を真緑もしくは黄緑色に変える現象で、数種の微細緑藻類やアナアオサなどの緑藻類が異常増殖した状態である。グリーンタイドは、毎年、漁業や水産業等に甚大な被害や影響を及ぼすことから、今回、その発生を予防・防止するための防藻剤の創製を試みた。そして、緑藻類の成長必須因子であるサルーシンの構造活性相関研究を通じて、サルーシンに競合拮抗する防藻剤候補化合物を見出した。また、独自開発した酵素分割法を用いて、防藻剤候補化合物の不斉合成法を確立し、光学活性体およびその蛍光標識体の不斉合成を達成した。世界各地の海洋や湖沼を生息域とした緑藻類は水質の浄化と維持に極めて重要な役割をにない、水生生態系の主要な歯車として機能してきた。しかしながら、近年では、温暖化に伴う水温上昇や人的な水質汚染が引き金となって異常増殖し、ある海域ではグリーンタイド(緑潮)とよばれる異様な緑海を作りだし、また、時には、ため池や湖水等を真緑色に染めるアオコの原因の一つとなっている。これらの爆発的な増殖現象は、自然環境への打撃はもちろんのこと、他の水棲生物や魚の死滅腐敗をまねくことから、漁業をはじめ取水源としての利用や衛生管理等にも甚大な被害を与え、近隣住民への健康被害も懸念されている。しかしながら、現段階において有効な防止予防策はない。最近では、東北地方の湖やため池の放射能汚染を除染する際にも作業を苦しめる要因になった。このような背景のもと、今回の申請課題では、緑藻類の成長促進因子として発見された超高活性天然物サルーシンに着目し、これを模造した類似体を化学合成することで、藻類の成長を抑制する防藻剤の創製を目指す。初年度に相当する26年度は、サルーシンの基本骨格となるテルペン骨格に着目した類似体を系統的かつ網羅的にラセミ合成して、緑藻類の一種であるマキヒトエに対する効果を確認した。合成した類似体はどれもAおよびC環部に着目した構造・立体異性体であったが、本合成研究を行う過程で、テルペン骨格特有の全く新しい反応性を見出すこともできた。これまで報告者は、緑藻類の成長促進因子サルーシンに着目し、これを模造した類似体を化学合成することで、水質汚染の原因となる爆発的な藻類の増殖を抑制できる新規防藻剤(アンタゴニスト)の開発を目指してきた。初年度に相当する26年度は、サルーシンの基本骨格となるテルペン部位に着目し、その類似体を網羅的かつ系統的にラセミ合成した。そして、マキヒトエ(緑藻類の一種)を用いたアッセイ試験を通じて、防藻剤の候補化合物となるアンタゴニストを選定した。二年目に相当する27年度は、光学活性体が藻類の成長抑制効果に与える影響を確認するため、選定した防藻剤候補化合物の不斉合成に取り組んだ。両エナンチオマーの調製を大前提として、報告者が独自開発した酵素分割法を活用することで、光学的に純粋な防藻剤候補化合物の合成を目指した。そして、様々な分割条件を検討することで、防藻剤候補化合物の合成中間体となるデカリン誘導体から新規光学分割法を新たに開発し、99%ee以上の光学純度で両エナンチオマーの合成を達成した。現在、スクリーニングに用いたラセミ体と共に、その効果を確認中である。また、それらと並行して、サルーシンに対する競合拮抗抑制作用についても効果を確認中である。現在、世界各地で問題となっているグリーンタイド(ある種の緑藻類が爆発的に増殖する海洋汚染の一種)には、海水中に存在するサルーシン産生バクテリアの影響が示唆されてきた。したがって、サルーシンに競合拮抗する物質の創製は、今後の海洋汚染を防止・予防するための有力な知見へと繋がる可能性が高い。現在の途中経過では、報告者が選定した防藻剤候補化合物は、濃度依存的にサルーシンに対して拮抗しており、期待の広がるデータが得られている。二年目のなる27年度の到達目標は、選定した防藻剤候補化合物を95%ee以上の光学純度で不斉合成することであった。今回、様々な検討をくり返すことで、ほぼ純粋な光学活性体(99%ee以上)の合成に成功し、また、アッセイ試験においても期待以上の極めて良好な効果および活性が確認できている。報告者は、緑藻類成長促進因子(サルーシン)に着目し、その構造をミミックした類似体を化学合成することで、第三の水質汚染とよばれるグリーンタイド(藻類が爆発的に増殖する現象)を抑制する新規防藻剤の開発に取り組んできた。そして、平成27年度までに、藻類成長因子に拮抗する効果的なサルーシン阻害剤を見出し、その不斉合成(99%ee)に成功した。最終年度に相当する昨年度28年度は、見出したサルーシン阻害剤(防藻剤候補化合物)の作用をより詳細に解析するため、主に、その蛍光標識化合物の合成研究を行った。その成果として、塩析効果の強い海水中においても十分な溶解性と安定性を示す蛍光標識剤(ラベリング化合物)の絞り込みに成功し、それを光学活性なサルーシン阻害剤に導入し、蛍光標識化した。今後、この合成した蛍光標識体を分子ツールとして活用することで、未だ明らかにされていないグリーンタイドの発生メカニズムや緑藻類の生活環を正確に分析、追跡することができる。

近い将来、画期的な防藻剤が開発されることを期待すると共に、新たに見出したサルーシン拮抗剤を有用な防藻剤として実応用するため、本研究を継続する。グリーンタイドとは、一般的に、沿岸部等を真緑もしくは黄緑色に変える現象で、数種の微細緑藻類やアナアオサなどの緑藻類が異常増殖した状態である。グリーンタイドは、毎年、漁業や水産業等に甚大な被害や影響を及ぼすことから、今回、その発生を予防・防止するための防藻剤の創製を試みた。そして、緑藻類の成長必須因子であるサルーシンの構造活性相関研究を通じて、サルーシンに競合拮抗する防藻剤候補化合物を見出した。また、独自開発した酵素分割法を用いて、防藻剤候補化合物の不斉合成法を確立し、光学活性体およびその蛍光標識体の不斉合成を達成した。計画したほぼ全て化合物の合成を達成することができた。そして、それらを用いた活性スクリーニングを通じて、藻類の成長を効果的に抑制する防藻剤候補化合物を見出すことに成功した。現在は活性の再現性を確認している最中である。本課題研究は、当初の予定とおり順調に進展しており、今後もその計画に準じて研究を進める予定である。最終年度に相当する28年度は、当初の予定通り、活性メカニズム解析に向けた分子ツールの合成を目指す。これまでに確認した構造-活性相関を基盤として、蛍光標識化したサルーシンと防藻剤候補化合物を合成する予定である。合成化学次年度となる27年度は、選定した防藻剤候補化合物のエナンチオマーを不斉合成して、活性評価を行う予定である。報告者は、これまでも光学活性なサルーシンの合成に取り組んできたことで、独自の光学分割法を開発し、昨年2014年に化学系論文誌(The Journal of Organic Chemistry)に報告した。したがって、その間に培ったノウハウや技術を応用すれば、問題なく選定した防藻剤候補化合物の不斉合成も達成できると考えている。