hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温高圧水中への無機化合物の溶解度および溶液構造の解明

昨年度までに高温高圧水に対する無機塩の溶解度の測定を目的として流通型の装置を用い,無機塩として塩化ナトリウム(NaCl)と塩化カリウム(KCl)の溶解度を測定してきた.そこで今年度は.無機塩として1価のカチオンによる違いの変化をみるため塩化リチウム(LiCl)を,価数の違いによる変化をみるために塩化カルシウム(CaCl_2)を選択し,それらの溶解度を測定した.実験は,温度350-400°C、圧力6-14MPaの条件下で行った.さらに,Pitzerらの状態方程式を用いて得られた溶解度データの相関を行い,それらの適用性について検討した.以前,本研究室において松本らにより同じ装置を用いて測定された塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの溶解度は,固気平衡領域であり,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は減少するという傾向を示した.しかし,本研究で測定した塩化リチウムおよび塩化カルシウムの溶解度は,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は増加するという異なる傾向を示した.Pitzerらによると,H_2O-NaClの気液平衡領域では,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は増加するという同様の傾向を示しているため,測定条件下において気液平衡になっている可能性が示唆された.また,得られた塩化リチウムおよび塩化カルシウムの溶解度データをPitzerの状態方程式に基づく相関式により相関を行った.状態方程式中のパラメータを最適化することで,相関結果は,塩化リチウムおよび塩化カルシウムの気液平衡領域で各温度,圧力において良好な結果を与えた.本年度は,高温高圧水に対する塩化リチウムの溶解度の測定を行った.測定に用いた流通型の溶解度測定装置は,これまでに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの溶解度を測定しており,測定装置および測定法の健全性が実証されている.測定条件は,温度350400°C,圧力912MPaの範囲で行った.分析にはイオンクロマトグラフィーを用い,サンプル中のカチオン濃度を分析することにより,溶解度を決定した.高温高圧水に対する塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの溶解度は,同一条件下でほぼ同程度であり,カチオンの違いによる溶解度差は観測されなかったが,カチオンをリチウムに変えることで,溶解度に変化が見られた.その結果,測定条件下において気液平衡となっている可能性が示唆された.これは,リチウムはナトリウムやカリウムと同様,アルカリ金属であるが,その融点はナトリウムやカリウムと比較して低く,物性としてはむしろアルカリ土類金属であるマグネシウムに似た性質を持っていることによるものと考えられる.また,測定と同時に既報の高温高圧水に対する無機化合物の溶解度データを収集し,各データの信頼性について検討を行った.さらに,これらのデータおよび本研究で得られた実測値に対して,溶液論による相関法および状態方程式を用いた水和モデルによる相関法,さらには経験的な状態方程式を用いた方法などを適用し,これらの相関法による高温高圧水中の無機化合物の溶解度の計算への適用性について検討を行い,工業的に有用な相関法の開発のための知見を得た.昨年度までに高温高圧水に対する無機塩の溶解度の測定を目的として流通型の装置を用い,無機塩として塩化ナトリウム(NaCl)と塩化カリウム(KCl)の溶解度を測定してきた.そこで今年度は.無機塩として1価のカチオンによる違いの変化をみるため塩化リチウム(LiCl)を,価数の違いによる変化をみるために塩化カルシウム(CaCl_2)を選択し,それらの溶解度を測定した.実験は,温度350-400°C、圧力6-14MPaの条件下で行った.さらに,Pitzerらの状態方程式を用いて得られた溶解度データの相関を行い,それらの適用性について検討した.以前,本研究室において松本らにより同じ装置を用いて測定された塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの溶解度は,固気平衡領域であり,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は減少するという傾向を示した.しかし,本研究で測定した塩化リチウムおよび塩化カルシウムの溶解度は,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は増加するという異なる傾向を示した.Pitzerらによると,H_2O-NaClの気液平衡領域では,一定圧力において温度の上昇とともに溶解度は増加するという同様の傾向を示しているため,測定条件下において気液平衡になっている可能性が示唆された.また,得られた塩化リチウムおよび塩化カルシウムの溶解度データをPitzerの状態方程式に基づく相関式により相関を行った.状態方程式中のパラメータを最適化することで,相関結果は,塩化リチウムおよび塩化カルシウムの気液平衡領域で各温度,圧力において良好な結果を与えた.
白血病細胞増殖制御におけるCa^<2+>/Calmodulin依存性リン酸化反応の役割

蛋白リン酸化反応は、血液細胞の増殖、分化の制御系において重要な役割を担っていることが考えられる。最近、私どもは免疫抑制剤サイクロスポリンA(CsA)やFK506がヒト骨髄性白血病細胞株HL-60細胞由来Ca^<2+>/カルモデュリン依存性脱リン酸化酵素Calcineurin活性を阻害を阻害し、HL-60細胞の増殖を促進することを報告した。一方、Ca^<2+>/カルモデュリン依存性リン酸化酵素(CaM KinaseII)の特異的阻害剤KN-62はHL-60細胞増殖を抑制することが知られている。今回、all-trans retinoic acid(ATRA)によるHL-60細胞の顆粒球系細胞分化におけるCalcineurin及びCaM KinaseIIの動態について検討した。(1).CsA及びFK506は1,25(OH)_2D_3による単球系細胞分化の場合と同様、ATRAによるHL-60細胞の顆粒球への分化誘導を抑制も促進もしないものの、ATRAによるHL-60細胞増殖抑制を解除した。(2).ATRA刺激による顆粒球系細胞分化に伴い、Calcineurin蛋白(A subunit及びB subunit)の発現は増加するが、カルモデュリン及びCaM KinaseIIの発現はほとんど変動しなかった。(3).FKBP12発現についてはATRA刺激による分化誘導に伴い増加したが、Cyclophilin Aについてはほぼ一定であった。ATRA刺激による顆粒球への細胞分化誘導によりHL-60細胞増殖は抑制されるが、この過程には主にCalcineurinが関与する可能性が示唆された。IP_3受容体は細胞内Ca^<2+>の調節を介して顆粒球機能を制御しておりHL-60細胞においてATRA刺激によりその発現が増加する事が報告されている。CalcineurinはFKBP12を介してIP_3受容体と複合体を形成しその機能を調節していることから、ATRAによるHL-60細胞の顆粒球系分化誘導に伴いCalcineurin/FKBP12/IP_3受容体の発現調節が巧みに制御されていることが示唆された。
ヒドロキシアパタイトの生成反応を活かした無機質複合木質材料の基礎的研究開発

硝酸カルシウムと各種リン酸塩を水に溶解させるとヒドロキシアパタイトに代表されるリン酸化合物が生成し、同時に硝酸塩や硝酸が副成する。過去の研究によると、副成物の硝酸塩や硝酸は木材を活性化させて自己接着をもたらすことが知られている。そこで、本研究では硝酸カルシウムと各種リン酸塩の懸濁液に木粉を混合し、木粉の自己接着による無機・木質複合成形体の作成を試みている。今年度は、リン酸水素二ナトリウムを用いた場合の成形体中の無機物の分布状態や成分を調べるとともに、新たにリン酸水素二アンモニウムを用いた場合の製造条件と成形体の物性との関係について検討した。硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムから作製した成形体のX線CT観察を行った結果、成形体中に約0.2mm以下の無機粒子が点在していることが分かった。また、モデル実験による無機物の定性分析の結果、ヒドロキシアパタイトではなくモネタイトや硝酸ナトリウムであることが明らかとなった。この結果、成形体中の無機物はモネタイトや硝酸ナトリウムである可能性が高いことが推察された。リン酸塩としてリン酸水素二アンモニウムを用いると、熱圧温度が180°Cの場合に曲げ性能が著しく向上することが認められた。また、煮沸繰り返し試験の結果、120°Cや140°Cで作製した成形体は耐水性を示さなかったが、160°Cや180°Cでの成形体は形状の維持が確認され、特に180°Cの成形体で高い耐水性を示した。これまでのリン酸水素二ナトリウムを用いた成形体と比較すると、180°Cでの曲げ強度は約2倍の値を示し、耐水性も優れていることが分かった。これは、副成物の硝酸アンモニウムが木材の自己接着を効果的に促進したためと考えられた。ヒドロキシアパタイトは硝酸カルシウムやリン酸水素二ナトリウムなどの無機化合物を水に溶解させると生成し、同時に硝酸ナトリウムや硝酸などが副成する。この副成物は木材を活性化させて自己接着をもたらす可能性があるため、木粉と混合して熱圧することでヒドロキシアパタイトとの無機・木質複合成形体の作成を試みた。硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムをモル比5:3として水に溶解後、木粉と混合した。木粉に対するこれら無機物の添加割合は060wt%した。混合物は一旦乾燥させた後に金型に投入し、180°C、10分、4MPaで熱圧した。成形体の物性に及ぼす無機物の添加割合の影響を検討した結果、曲げ性能は木粉への添加率が0wt%から20wt%へと増加するにつれて向上することが認められ、40wt%を超えると低下する傾向が見られた。この曲げ性能の低下は、過剰の副成物によって木粉が劣化したためと考えられる。20wt%での比曲げ強度と比曲げヤング率の平均値は、それぞれ8.8kN・mm/gと2.3MN・mm/gであった。煮沸繰り返し試験による耐水性評価では、無機物の添加割合が2060wt%の成形体は試験後も形状の維持が確認され、良好な耐水性を示すことが分かった。特に、40wt%や60wt%の成形体は、試験中の厚さ変化が小さいことが認められた。熱分析の結果、添加割合が高くなるほど重量残存率が大きくなり、成形体中に含まれる無機物の割合が多いことが示唆された。さらに、煮沸繰り返し試験後の試験片のFT-IRを測定したところ、リン酸イオン由来のピークが見られ、アパタイトの存在が確認された。本年度は、無機物と木粉との割合を変えて成形体を作成し、その物性を検討した。その結果、今後の指標となる最適添加割合を見出すことができたので、順調に進展していると考える。ヒドロキシアパタイトは、硝酸カルシウムと各種リン酸塩を水に溶解させると生成し、同時に硝酸塩や硝酸などが副成する。これらの副成物は、過去の研究によると木材を活性化させて自己接着をもたらすことが知られている。そこで、本研究では硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムなどを水に溶解させるとともに、木粉を加えて熱圧することで接着剤を用いずにヒドロキシアパタイトを含んだ無機・木質複合成形体の作成を試みている。今年度は、前年度の結果に基づいて硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物の添加率を20および40wt%の2水準とし、成形体の曲げ性能および耐水性に及ぼす熱圧温度や熱圧時間の影響について検討した。加熱温度は160220°C、加熱時間は520分とした。耐水性は、煮沸繰り返し処理による試験片の重量変化率から評価した。その結果、混合物添加率が20wt%の場合、最適熱圧条件は220°C、10分であった。一方、混合物添加率が40wt%の場合は180°C、10分であった。両者を比較すると、20wt%の成形体が全体的に高い曲げ強度を示した。また、煮沸繰り返し処理の結果、両者は処理後でも形状を維持し、良好な耐水性を示した。しかしながら、40wt%の成形体では、重量変化は小さいものの、乾燥時の重量低下率が大きいことから、無機成分の著しい溶出が示唆された。FT-IR測定の結果、カルボニル由来のピークの変化が確認され、副成物による木材の酸化が示唆された。また、煮沸繰り返し処理後でも硝酸イオンのピークやリン酸イオン由来のピークが強く現れた。

成形体の高い耐水性を考えると、副生成物による木材の酸化やそれに伴う自己接着が起こったと考えられ、さらに成形体中にはヒドロキシアパタイトや副生成物が残存していることが示唆された。本年度は、昨年度に引き続き硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムの用いた成形条件と物性との関連について検討を行った。これは、前年度に木粉に対する硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムの最適添加量が明らかになったために、この添加量による最適熱圧条件を検討する必要があったためである。しかし、最適添加量は評価項目によって異なったために1種類を選ぶことができず、ここでは2種類の添加量について検討し、実験に時間を要することになった。また、ヒドロキシアパタイトの分布や存在は、一般にはX線結晶構造解析などの機器分析で明らかにされる。そこで複数の機器分析業者に分析を相談したところ、本研究での成形体ではヒドロキシアパタイトが木粉中に薄く分布するために検出が困難であることが分かり、分析手法の検討に時間を要したこともやや遅れている原因である。硝酸カルシウムと各種リン酸塩を水に溶解させるとヒドロキシアパタイトに代表されるリン酸化合物が生成し、同時に硝酸塩や硝酸が副成する。過去の研究によると、副成物の硝酸塩や硝酸は木材を活性化させて自己接着をもたらすことが知られている。そこで、本研究では硝酸カルシウムと各種リン酸塩の懸濁液に木粉を混合し、木粉の自己接着による無機・木質複合成形体の作成を試みている。今年度は、リン酸水素二ナトリウムを用いた場合の成形体中の無機物の分布状態や成分を調べるとともに、新たにリン酸水素二アンモニウムを用いた場合の製造条件と成形体の物性との関係について検討した。硝酸カルシウムとリン酸水素二ナトリウムから作製した成形体のX線CT観察を行った結果、成形体中に約0.2mm以下の無機粒子が点在していることが分かった。また、モデル実験による無機物の定性分析の結果、ヒドロキシアパタイトではなくモネタイトや硝酸ナトリウムであることが明らかとなった。この結果、成形体中の無機物はモネタイトや硝酸ナトリウムである可能性が高いことが推察された。リン酸塩としてリン酸水素二アンモニウムを用いると、熱圧温度が180°Cの場合に曲げ性能が著しく向上することが認められた。また、煮沸繰り返し試験の結果、120°Cや140°Cで作製した成形体は耐水性を示さなかったが、160°Cや180°Cでの成形体は形状の維持が確認され、特に180°Cの成形体で高い耐水性を示した。これまでのリン酸水素二ナトリウムを用いた成形体と比較すると、180°Cでの曲げ強度は約2倍の値を示し、耐水性も優れていることが分かった。これは、副成物の硝酸アンモニウムが木材の自己接着を効果的に促進したためと考えられた。今年度の研究結果より、無機・木質複合成形体は一定の物性と良好な耐水性を示すことが見出された。これは副成する硝酸ナトリウムや硝酸が木材の自己接着をもたらしたことが要因ではないかと考えられる。しかし、それらの寄与については推測の域を出ない。そこで、これら副成物のみで木質成形体を作成し、接着性に及ぼす影響について検討したい。また、無機物と木粉との混合方法や、混合物の乾燥方法が材料物性に影響を及ぼすことも考えられるため、これらについても検討を行う。当初の研究計画では、次年度はリン酸塩の種類を検討する予定であったが、前述の基礎的検討が材料開発には重要と考えられるため、まずはこれらを先に進めたい。今年度までの結果、最適な添加量、熱圧温度、熱圧時間が見出せたので、これを基準として他のリン酸塩の検討を試みる。
市民の強剪定要望を克服する街路樹の維持管理システムと協働型の景観育成計画の構築

本研究の結果,以下の3つの知見を得た。1.街路樹の強剪定を中心とした市民要望は,テキストマイニングを用いて構造化できる。その結果を維持管理方針の立案に反映させることは有益である。2.市民要望は土地利用毎に異なる傾向をみせた。住居系土地利用では官民市民協働による居住環境の質を高めること,住工混合土地利用では商業空間の価値向上を踏まえた管理の役割分担,住工混合土地利用では低管理型の整備を基にした事業者の理解と協力が必要である。3.市民要望が多い路線においても,一般住民の街路樹への不満は特に大きくなく,今後の参加意欲や興味に至る意識構造を持っている。大阪府東大阪市の街路樹に対する市民要望カード(2012年度:171件,2013年度:176件)をテキストデータベース化し,テキストマイニングソフトを用いた質的分析を行った。重要キーワードの抽出およびそれらの関係性のマッピングの結果として,上位15の重要キーワードが45のカテゴリに分類され,多様な業務の中で個々の行政担当者による記録に頼らざるを得ない状況を踏まえても,比較的簡易なテキスト分析で市民要望の全体像を把握できることが明らかとなった。本研究で採用した手法を用いて,重要キーワードの抽出とマッピングを簡易に行うことができ,今後の市民要望の把握とそれを踏まえた街路樹の維持管理方針の立案に有益であると考えられる。加えて,本研究で採用した手法によって,具体の内容の差異が年度間でも読み取れることがわかった。本研究ではデータの制約上,2つの年度データ間での比較しかできなかったが,データの蓄積さえ行われておれば10年や30年といった樹木の生長スパンでの市民要望の比較検証が可能となる。数年で異動することが多い行政職員にとって,このように中長期に渡った街路樹への市民要望の傾向とそこからわかる街路樹管理の課題が把握できることは,中長期的な根拠と展望を持った維持管理計画策定に寄与するものと考える。これらの結果を地域住民と共有することで,数年で異動することが多い行政職員にとって,中長期に渡った街路樹への市民要望の傾向とそこからわかる街路樹管理の課題が把握できる素材となり,中長期的な根拠と展望を持った維持管理計画策定に寄与するものと考える。平成27年度に計画していた,街路樹に対する市民要望の質的分析,および街路樹に関する市民要望の記録方法の検証については,おおむね終えることができた。本年度の結果をもって平成29年度に市民要望の記録方法について自治体ヒアリングを実施すべく,継続して結果の整理とヒアリングシートの検討を行う。加えて,平成28年度に予定している市民要望の街路樹景観への影響評価について,東大阪市で一部のデータを収集し,分析を試行した。街路樹の植栽タイプ,架線の有無,車道幅員,歩道幅員,周辺土地利用,市民要望の有無を用いた多変量解析ではデータ全体を説明できる結果が得られなかった。データの追加収集を行いつつ,土地利用データの細分化など街路樹管理に影響を与える要因の検証を進めつつ,街路樹景観の評価指標を検討する。また,平成28年度に予定している協働による街路樹景観育成計画の枠組みの基礎調査について,対象事例の収集も進めている。現時点では,国内事例として市民・NPO・事業者との協働を街路樹景観整備計画に明記している大分県大分市,市民から街路樹の協働による育成に関する意見を募っている長野県伊那市,街路樹のあり方として「地域との連携による再生計画と育樹」を答申した愛知県名古屋市,街路樹指針において区民協働を掲げた東京都江戸川区,協働事業として「街路樹キーパー」を市民から募集している東京都日野市を想定している。海外事例としては,街路樹の植栽から管理まで行政・NPO・地域住民が連携して行っている米国サンフランシスコ市,シアトル市,フィラデルフィア市等を想定している。平成28年度は,中核市である東大阪市にて,市民要望の多い街路樹路線を抽出し,その樹木構成と空間的・環境的要因との関係性を土地利用区分毎に分析した。分析の結果,住居系土地利用に最も市民要望の数と割合が多く,次いで住商混合土地利用,住工金剛土地利用と少なくなる一方で,市民要望の内容は土地利用区分毎に異なるものであった。このことから,多種の土地利用が一定規模で存在する中核市では,土地利用区分を計画単位として,市民要望を基にした街路樹の維持管理計画の策定が可能であることが示唆された。具体には,住居系土地利用では官民市民協働による居住環境の質を高めること,住工混合土地利用では商業空間の価値向上を踏まえた利用者の管理における役割分担,住工混合土地利用では低管理型の整備を基にした事業者の理解と協力が必要であると考えられる。また,協働による街路樹景観育成計画の枠組みの基礎調査として,米国ワシントン州シアトル市およびカリフォルニア州サンフランシスコ市にてヒアリング調査を実施した。両市では街路樹の60%から70%が市民や事業者によって植栽および管理されており,協働による街路樹管理の先進的な事例であった。事業者に対しては,開発に伴う植栽Codeを細かく規定すると共に,デザインを確認・助言するアドバイザリーボードが権限を基にして適切に機能していることが明らかとなった。市民に対しても,詳細な植栽および管理のガイドラインを定めると共に,小学校の環境学習の一環として街路樹に関する授業を開催し,市民向けの講座をNPOと協力して実施するなど,管理作業の前段からの官民市民協働が確認できた。想定していた対象都市において,街路樹に対する市民要望が保管されておらず,広範囲での分析が送れている。また,海外事例の調査および分析に注力したため,国内事例の収集および分析に遅れが生じている。

平成29年度は,まず市民要望を把握できた東大阪市において,市民要望と空間的・環境的要因の関係性について,路線毎の傾向を調査した。その結果,都市部における街路樹の維持管理に関して,「1住居系地区では,良好な居住環境のために樹種特性に即した維持管理を行う。2住商混合地区では,多い大型車両や歩行者に配慮し,見通し確保や落ち葉清掃,殺虫など計画な維持管理を行う。3住工混合地区では,制約が最も大きく車両の見通しに配慮した低木の維持管理を行う。」といった知見を得た。続けて,管理者は市民要望の多い路線を「問題のある街路樹」と認識し,強選定などの対応をしているが,それが一般的な近隣住民の意識,特に今後の街路樹管理への参加意向にどのような影響を及ぼすか,アンケート調査を行った。その結果,市民要望が多い路線においても,一般住民の街路樹への不満は特に大きくなく,むしろ管理に満足しており,今後の参加意欲や興味に至る意識構造を持っていることが明らかとなった。以上の結果から,苦情を中心とした市民要望に直接対応するのではなく,街路樹の正しい知識を一般市民に伝え,満足度を高める管理作業を行うことが,官・民・市民協働の街路樹管理の実現への有効なシナリオであると言える。これを踏まえて,官・民・市民協働の維持管理システムを検討した。本研究の結果,以下の3つの知見を得た。1.街路樹の強剪定を中心とした市民要望は,テキストマイニングを用いて構造化できる。その結果を維持管理方針の立案に反映させることは有益である。2.市民要望は土地利用毎に異なる傾向をみせた。住居系土地利用では官民市民協働による居住環境の質を高めること,住工混合土地利用では商業空間の価値向上を踏まえた管理の役割分担,住工混合土地利用では低管理型の整備を基にした事業者の理解と協力が必要である。3.市民要望が多い路線においても,一般住民の街路樹への不満は特に大きくなく,今後の参加意欲や興味に至る意識構造を持っている。平成28年度に予定している市民要望の街路樹景観への影響評価については,データの追加収集を行いつつ,土地利用データの細分化など街路樹管理に影響を与える要因の検証を進めつつ,街路樹景観の評価指標を検討する。特に街路樹景観の評価指標については,単純に街路樹の大きさで判断せず,自治体毎の維持管理目標の把握や,総合計画で目指しているまちづくりの質など,街路樹の価値から定めることを目標とする。協働による街路樹景観育成計画の枠組みの基礎調査については,担当の1人が28年度に米国滞在するメリットを活かし,調査対象の海外事例比率を増やし,より詳細な調査を行うことを検討する。米国には多数の街路樹管理を支援する組織が存在し,街路樹にPrivate TreeやNeighborhood Forestが含まれるなど区分も多様であるため,計画当初よりより充実した調査が実施できると考えられる。最終年度となる29年度に向けては,27年度および28年度の成果を基にして,自治体の担当部局職員にヒアリング調査を実施し,市民要望を適切に分析でき且つ実務の用に耐えうる街路樹の維持管理システムを提案する。
光学活性1,1'-ビ-2-ナフトールの高分子化とその高次構造及び機能の研究

本研究では、光学活性6,6'-ジブロモ-1,1'-ビ-2-ナフトール誘導体が合成の容易な点に着目し、-位で縮合させたポリアリール型高分子の合成を行った。まず、100%e.e.の(R)-BINOLをCramらの方法に従って6,6'-ジブロモ体に変換した。続いてt-BuMe_2SiClを用いるビスシリルエーテル化を行い、BINOLから98%の単離収率でモノマーとなる6,6'-ジブロモ-1,1'-ビ-2-ナフトールのビスTBDMSエーテル1を得た。重合は1と当量のNi(cod)_2に、PPh_3、2,2'-bpy、1,5-codを加え、DMF中60°Cで24時間行った。生成ポリマーは通常の有機溶媒に可溶であり、GPC(PSt基準)から求めた数平均分子量は19000、多分散度は1.88であった(収率89%)。水酸基の再生はn-Bu_4NFをTHF中で用いる常法により行い、目的とする光学活性ポリ(2,2'-ジヒドロキシ-1,1'-ビナフチル-6,6'-ジイル)を収率92%で得た。このポリマーは、DMF、DMSOのような非プロトン性極性溶媒以外の通常の有機溶媒には溶解しなかった。又、モデル化合物6,6'-ビス(6-ヒドロキシナフタレン-2-イル)-2,2'-ジヒドロキシ-1,1'-ビナフチルとのCDスペクトルの比較を1%DMF/CH_3CN中で行ったところ、ポリマーでは第二コットン効果が二つに分裂し、第一コットン効果の極大波長が14nm長波長シフトすることが分かり、溶液中で何らかの高次構造を形成している可能性が示唆された。本ポリマーをシリカゲルにコーティングしてHPLC用不斉固定相としての不斉識別能を調べた結果、種々のタイプのラセミ体サンプルに対して不斉識別能を示すことを見出した。又、キャスト膜の調製も試みたが、脆い膜しか得られなかった。
低分子代謝物質の網羅的解析を応用した急性ウイルス性脳症の新規バイオマーカーの探索

世界的に日本での報告例が多いインフルエンザ脳症、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)脳症について、生体内の約3,000種の低分子代謝物質を網羅的に解析するメタボローム解析を応用し、病態解明・バイオマーカーの探索を試みた。血清検体を用いたメタボローム解析からキヌレニンとキノリン酸がバイオマーカー候補と考えられた。組織モデルでの検討から、キノリン酸は血液脳関門における透過性亢進を引き起こすことが示唆された。日本における小児期の急性脳炎・脳症においては、インフルエンザ脳症、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)脳症が、この順に頻度が高い。この2つの脳症は、世界的に日本からの報告例が多いことが特徴である。インフルエンザ脳症では、炎症性サイトカインなどを介して神経障害を起こすことが報告されているが、病態解明は進展していない。メタボローム解析とは、生体内の約3,000種の低分子代謝物質を網羅的に解析する手法である。この解析を応用し、日本での頻度が相対的に高い2つの急性脳症の新規バイオマーカーを発見し、病態解明・診療の向上に役立つことを目指す。メタボローム解析で抽出された新規バイオマーカー候補の血清検体を用いたメタボローム解析からインフルエンザ脳症患児では3種類の代謝物質が有意に上昇し、2種類が有意に低下していた(計5種類)。HHV-6脳症では4種類の代謝物質が有意に上昇し、9種類が有意に低下していた(計13種類)。インフルエンザ脳症、HHV-6脳症の解析で抽出した新規バイオマーカー候補のうち、キヌレニンは共通であり、神経毒性が報告されている代謝経路の中間代謝物であるため、病態との関連が示唆された。この下流の代謝物質であるキノリン酸は、HHV-6脳症では有意差を認めたが、インフルエンザ脳症では、有意差が検出されなかった。そのため、血清検体をさらに増やして検討したところ、有意差を認めた。キノリン酸をさらに多くの検体で測定するための簡便な検出法が開発可能かどうかをさらに検討を加える必要がある。キヌレニン・キノリン酸は、炎症性サイトカインがその生成に関与する報告があるため、血清検体中のサイトカイン(IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α)を測定し、キヌレニン濃度との相関を調べたが、有意な相関を示す結果は得られなかった。インフルエンザ脳症では、炎症性サイトカインなどを介して神経障害を起こすことが報告されている。その他、特定の遺伝子の関与や代謝異常との関連を示唆する症例報告はあるが、病態は十分に解明されていない。HHV-6脳症でも炎症性サイトカインと病態との関連が示唆されているが、病態解明は進展していない。脳症患者血清検体を用いたメタボローム解析からインフルエンザ脳症患児では3種類の代謝物質が有意に上昇し、2種類が有意に低下していた(計5種類)。インフルエンザ脳症、HHV-6脳症の解析で抽出した新規バイオマーカー候補のうち、昨年度の解析で、キヌレニン・キノリン酸がバイオマーカーの有力候補と考えられた。キヌレニンおよびキノリン酸の髄液・血清における濃度は低いため、症例を蓄積し、臨床応用を目指すために簡便なアッセイ系の開発が必要である。キヌレニンは分子量208、キノリン酸は分子量167と低分子であり、ELISA法でのアッセイ系の構築を試みているが、現時点でプロトタイプ測定キットが構築できていない。1.インフルエンザ脳症、HHV-6脳症の血清検体を用いたメタボローム解析を行い、新しい疾患関連バイオマーカーの候補として、キヌレニンおよびキノリン酸を抽出した。特に、キヌレニンの濃度が2種類の急性脳症に共通して有意差があることから、インフルエンザ脳症の血清検体数を増やして検討した結果、キノリン酸も2種類の脳症に共通のバイオマーカー候補であると考えられた。2.最もバイオマーカーの可能性があると考えられたキヌレニン・キノリン酸について、簡便に測定するためのキット検出系の構築を進めている。これらの代謝物は低分子であるため、ELISAキットの構築に至っていない。3.キヌレニン・キノリン酸以外に、それぞれの脳症でバイオマーカー候補が抽出されている。これらの代謝物については、脳症における病態への関与を想定する報告が不足しており、解析は進んでいない。

その他、特定の遺伝子の関与や代謝異常との関連を示唆する症例報告はあるが、病態は十分に解明されていない。HHV-6脳症でも炎症性サイトカインと病態との関連が示唆されているが、病態解明は進展していない。メタボローム解析とは、生体内の約3,000種の低分子代謝物質を網羅的に解析する手法である。この解析を応用し、日本での頻度が相対的に高い2つの急性脳症の新規バイオマーカーを発見し、病態解明・診療の向上に役立つことを目指す。インフルエンザ脳症、HHV-6脳症の解析で抽出した新規バイオマーカー候補(それぞれ5種類、13種類)のうち、対象例を増やした検討から、キヌレニン・キノリン酸をバイオマーカーの有力候補と考えた。本年は、髄液中のキヌレニン・キノリン酸濃度の上昇が神経障害に至る機序の解析を行った。2つの脳症では、血液脳関門の傷害(透過性亢進)により脳浮腫が惹起される機序が想定されるため、サルの初代培養細胞によるin vitro血液脳関門組織モデルを応用して実験を行った。その結果、キノリン酸は血液脳関門における透過性亢進を引き起こすことが示唆された。症例を蓄積し、臨床応用を目指すためにアッセイキットの作成を継続している状況である。世界的に日本での報告例が多いインフルエンザ脳症、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)脳症について、生体内の約3,000種の低分子代謝物質を網羅的に解析するメタボローム解析を応用し、病態解明・バイオマーカーの探索を試みた。血清検体を用いたメタボローム解析からキヌレニンとキノリン酸がバイオマーカー候補と考えられた。組織モデルでの検討から、キノリン酸は血液脳関門における透過性亢進を引き起こすことが示唆された。(1)インフルエンザ脳症、HHV-6脳症の血清検体を用いたメタボローム解析を行い、新しい疾患関連バイオマーカーの候補として、キヌレニンおよびキノリン酸を抽出した。特に、キヌレニンの濃度が2種類の急性脳症に共通して有意差があることから、インフルエンザ脳症の血清検体数を増やして検討した結果、キノリン酸も2種類の脳症に共通のバイオマーカー候補であると考えられた。(2)注目した代謝経路で最も神経毒性を示すと考えられるキノリン酸は、簡便に測定することができない。そのため、今後、検体数を増やした解析を行うにあたり、定量系の構築が望ましい。検出系の構築は、成果が得られておらず、今後も検討を継続する予定である。(3)キヌレニン・キノリン酸以外に、それぞれの脳症でバイオマーカー候補が抽出されている。これらの代謝物については、脳症における病態への関与を想定する報告が不足しており、解析は進んでいない。(4)キヌレニン・キノリン酸は、炎症性サイトカインがその生成に関与する報告があるため、血清検体中のサイトカイン(IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α)を測定したが、中枢神経局所の濃度と血清中の濃度との乖離があるためか、有意な結果は得られなかった。髄液検体で検討したり、in vitroの実験系で検証する必要があると考えられる。1.今年度、明らかな進捗の見られなかった、キヌレニン・キノリン酸の測定系の構築、および、他のバイオマーカー候補に関する検討を継続する。2.解析症例を今後も蓄積していくことにより、メタボローム解析で抽出したキヌレニン・キノリン酸を含めたバイオマーカー候補について、さらに検討を進めたい。
アレルギー性鼻炎に対するスマートフォン向けアプリを使用した最適化医療への挑戦

アレルギー性鼻炎は国民の約4割が発症している国民病であり、その経済損失は日本全体で年間4兆3966億円と推計されている。アレルギー性鼻炎の治療において治療薬は数十種類以上存在するが、症状や治療の副作用の評価は質問紙や診察時の症状日誌を除いて存在しない。一回の診察における診療時間は限られており、治療に対する効果や患者の症状・状態について、患者と医療者間で十分に共有できていない現実がある。患者側からも主体性を持って医療に参加してもらうことで、より適切な医療を施す「患者参加型医療」が注目されており、アレルギー性鼻炎においても患者参加型医療を加味した治療評価法の発展が求められている。本研究では、アレルギー性鼻炎患者における患者参加型医療を推進するために、アレルギー性鼻炎患者の臨床情報・生体情報・内服状況を収集するためのアプリケーションを開発することを目的とする。収集されたデータは、花粉飛散量、PM2.5、気温や気圧などの気象データと統合することにより、症状悪化につながる既知・未知の関連の同定につなげることができる。今年度は、先行研究と鼻アレルギー診療ガイドライン、更に臨床医から意見を聴取して質問項目リストを作成した。現在は他施設と連携しアプリ開発を行っている。次年度は試作版の作成後、耳鼻科専門医や患者から意見を聴取することによりアプリを修正する。更に完成後は試験的な導入を行い、診療時間や患者満足度の変化について調査を行う予定である。Apple社が公開しているiPhone用のアプリケーション開発のためのAppのフレームワークであるReseach kitを採用することを決定した。先行研究と鼻アレルギー診療ガイドライン、更に臨床医から意見を聴取して質問項目リストの作成はほぼ終了している。アプリ表示の画面についての基本的な骨格(画面)と生体情報等の収集項目についての最終的な調整を行っている。Apple社が公開しているiPhone用のアプリケーション開発んためのAppのフレームワークであるReseach kitを採用し、アプリケーション開発を進める。既存のスマートフォン向け睡眠アプリから睡眠深度や時間などのデジタル情報を取得する。花粉、PM2.5などの環境データは環境省花粉観測システム(http://kafun.taiki.go.jp/)、PM2.5サイト(https://pm25.jp/)などから取得し、患者の臨床データ、生体情報と複合して表示させることも検討する。試作版の作成後、耳鼻科専門医や患者から意見を聴取することによりアプリを修正する。本研究ではアプリケーション開発を目的としているが、そのフレームワークの作成のために時間を要したため次年度への繰り越しを行った。
電力系統に多数分散して接続され相互の高調波を低減し合うスイッチング電源の研究

高性能・高機能化を要求する時代の流れに伴い、各種家電機器・OA機器をはじめ電力容量の増加する産業用に至るまで半導休電力変換装置の応用が盛んとなり、これにともない高調波電流、特に低次成分による電力系統の電圧ひずみが増大し、電力用機器の障害が報告されるようになった。問題となっているこれらは主として整流画路が多いが、今後ともあらゆる分野での増加が予想される。以上の現況を背景に、本研究は電力系統における、半導体電力変換装置に基ずいて発生する高調波の低減化を目的としており、高調波問題の解決を目指している社会に対し新しい観点の指針を示すとともに、その研究の一翼を担って行くことを目的としている。本研究では高調波低減を目的にパッシブ素子の共振を提案し、コンデンサCを種々変化させて、あるいは他のパッシブ素子のリアクトルの値を種々変化させて多くの実験的方式あるいは又理論的方式でも検討を行った。従来より電力系統の高調波を低減する方式は、そのほとんどがいわゆるアクティブフィルタ方式であり、単体の機器より発生する高調波をほぼゼロとする高力率方式である。この方式は専用の制御回路が別に必要となる、などの問題もありコスト増等を考えると必ずしも充分な解決方法とは言えない。貴科研費による本研究方式では、コンデンサ容量やリアクトルの回路定数の選定だけにより、高調波発生特性を改善できることに特長があり、独創性を有しており、別紙の学会雑誌等で報告した。しかしながら、制御系も含めた方式での検討も今後の課題となろうが、本提案の方式は新たな制御素子は必要ではなく、極めて低コストで実現できるため利点が大きい。研究およびその結果の発表を重ね、社会的にも早急に本高調波低減方式のコンセンサスを得るべく更に検討を重ねて行きたい。本研究におけるスイッチング電源では高調波の位相を異にする他の電源と電力系統で多数分散して接続される場合においては、これら電流高調波は互いに低減し会うことができる。このようなことから多数分散したスイッチング電源等の負荷装置が必要である。これらの特性は電力系統のインピーダンスで大きく左右されるため試作を含めた実験的検討が極めて重要になる。本研究では入力コンデンサCを種々変化させて、あるいは他のものはリアクトルの値を種々変化させて多くの実験的方式あるいは又理論的方式でも検討を行った。しかしながら,Cの減少の場合ではDCリンク電圧回路の電圧波形には電圧リプルが生じ,この影響による出力電圧に対するリプルも発生した。すなわち、このリプル電圧は外乱として出力波形に加わり、出力電圧のリプル補償をトランス巻数比増加による方式を確立して行った。また電力容量を大幅に変化させた場合の同様な効果も検証した。これまで報告してきた研究においては、PWM方式やフィードフォワード方式、トランスの巻数比を増加する方式等で検討されているが、新たなリプル補償を行う方式等も開発した。これらの結果をもとに本申請方式においては、これら装置の試作・開発を行った、実験において多数分散して存在する負荷の相互干渉の実験を行った。以上の方針のもと、新しい回路方式の試作・開発を行い、これらを多数台系統に接続し実験を行うとともに、検証と評価を行った。高性能・高機能化を要求する時代の流れに伴い、各種家電機器・OA機器をはじめ電力容量の増加する産業用に至るまで半導体電力変換装置の応用が盛んとなり、これにともない高調波電流、特に低次成分による電力系統の電圧ひずみが増大し、電力用機器の障害が報告されるようになった。問題となっているこれらは主として整流回路が多いが、今後ともあらゆる分野での増加が予想される。

以上の現況を背景に、本研究は電力系統における、半導体電力変換装置に基ずいて発生する高調波の低減化を目的としており、高調波問題の解決を目指している社会に対し新しい観点の指針を示すとともに、その研究の一翼を担って行くことを目的としている。本研究では高調波低減を目的にパッシプ素子の共振を提案し、コンデンサCを種々変化させて、あるいは他のパッシプ素子のリアクトルの値を種々変化させて多く,の実験的方式あるいは又理論的方式でも検討を行った。従来より電力系統の高調波を低減する方式は、そのほとんどがいわゆるアクティブフィルタ方式であり、単体の機器より発生する高調波をほぼゼロとする高力率方式であるこの方式は専用の制御回路が別に必要となる、などの問題もありコスト増等を考えると必ずしも充分な解決方法とは言えない。貴科研費による本研究方式では、コンデンサ容量やリアクトルの回路定数の選定だけにより、高調波発生特性を改善できることに特長があり、独創性を有しており、別紙の学会雑誌等で報告した。しかしながら、制御系も含めた方式での検討も今後の課題となろうが、本提案の方式は新たな制御素子は必要ではなく、極めて低コストで実現できるため利点が大きい。研究およびその結果の発表を重ね、社会的にも早急に本高調波低減方式のコンセンサスを得るべく更に検討を重ねて行きたい。
皮膚筋炎で見出された抗CADMー140抗体の臨床応用に関する研究

臨床的に筋炎症状に乏しい皮膚筋炎(C-ADM)に見出された抗CADM-140抗体の対応抗原がMDA5(Melanoma Differentiation-Associated Gene 5)であることを明らかにし,同抗体測定ELISAを確立した.同抗体陽性例は,急速進行性間質性肺炎(RP-ILD)を有意に併発していた.今回の研究成果は,予後不良のRP-ILD併発C-ADMの早期診断に有用で,予後の改善につながることが期待される.臨床的に筋炎症状に乏しい皮膚筋炎(C-ADM)に見出された抗CADM-140抗体の対応抗原がMDA5(Melanoma Differentiation-Associated Gene 5)であることを明らかにし,同抗体測定ELISAを確立した.同抗体陽性例は,急速進行性間質性肺炎(RP-ILD)を有意に併発していた.今回の研究成果は,予後不良のRP-ILD併発C-ADMの早期診断に有用で,予後の改善につながることが期待される.1.抗CADM-140抗体の対応抗原の追究皮膚筋炎(DM)で見出された抗CADM-140抗体の対応抗原の追究を試みた.大腸菌C(XL1-BlueMRF)発現λZAPファージを用いて作製したHeLa細胞cDNAライブラリーを使用し,大腸菌に抗原蛋白質を発現させ,ニトロセルロース膜に転写.抗CADM-140抗体陽性血清と反応させ,陽性クローンを単離した.陽性cDNAクローンの塩基配列を決定するために,陽性クローンの得られたファージDNAからプラスミドDNAの切り出しをおこない,プラスミドDNAを精製して,塩基配列を決定した.最後に,得られた塩基配列について,ホモロジーサーチをおこなった.その結果,9つのペプチドがCADM-140抗原の対応抗原の候補としてあがった.現在,それらのペプチドとC-ADMを含む膠原病患者および健常人血清との反応性の検討および質量分析を用いた蛋白質同定で対応抗原の確定をおこなっている.2.抗CADM-140抗体の臨床的意義これまでの検討で,抗CADM-140抗体は,DMのサブタイプであるClinically amyopathicDM(C-ADM)患者血清で主に見出され,急速進行性間質性肺炎(rapidly progressive interstitial lung disease:急速進行性ILD)併発例が高頻度であったことが特徴であった.そこで,これまで経験した急速進行性LDを併発したDMの治療について検討した.全例で,パルス療法を含む大量ステロイド療法にシクロスポリン,シクロホスファミド,タクロリムスなどの免疫抑制薬の併用による強力な治療がおこなわれたが,治療法と予後の間に一定の傾向は認められなかった.しかしながら,症例ごとに検討すると,治療法にかかわらず,早期に治療を開始し,初期に炎症の進展を抑えた症例の予後が良い傾向であった.この観点から,抗CADM-140抗体は,急速進行性ILD併発の予測のみならず,治療開始時期すなわちThe window of opportunityを逃さないという点からも有用性が示唆される.1.抗CADM-140抗体の対応抗原の追究バキュロウィルス発現リコンビナントMDA5を抗原とし,簡便・迅速な測定な可能なELISAを確立した.抗CADM-140抗体陽性DM患者血清は,陰性DM患者,他の膠原病患者および健常人と比較してより大きな反応性を示した.健常人血清の平均値+標準偏差の10倍を正常のカットオフ値とするとanalytical sensitivity88%,analytical specificity100%であった.3,抗CADM-140抗体測定の臨床的意義今回確立したELISAにおいても抗CADM-140抗体陽性例は陰性例と比較して,急速進行性間質性肺炎併発が有意に高頻度であり(82%対3%;P<0.0001),これまでの検討と同様の結果であった.すなわち,抗CADM-140抗体測定は,DMの重要な予後規定因子である急速進行性間質性肺炎併発予測という観点からその有用性が十分期待できると考えられた.
ゲノム編集技術を用いた新たなレット症候群の治療法開発に向けた基盤研究

レット症候群患者はX染色体上のMECP2遺伝子の変異によって引き起こされる神経発達障害で、罹患率は女児1ー2万人あたり1人で、女児の知的障害の原因としてはダウン症に次いで2番目に多い原因となっている。レット症候群患者の女児は実はゲノム上に正常なMECP2遺伝子を1コピー持っているという事実をもとに、近年進歩が著しいゲノム編集技術を用いて、不活性化している正常なMecp2遺伝子を再活性化させることを目標にした。平成30年度は、前年度に引き続き、評価系の細胞として、一方のMecp2遺伝子に変異を挿入して破壊し、もう一方のMecp2遺伝子座に蛍光蛋白GFPをin frameでノックインしたモニター用のマウスES細胞の樹立を目指した。研究に使用されているマウスのES細胞のほとんどはオス由来で、X染色体を1つしか持っていない。しかしこの研究課題においては不活性化しているX染色体のMecp2の再活性化を解析する必要があり、理研バイオリソースセンターよりBRC6というメスのマウスES細胞株を入手し使用した。CRISPR/Cas9技術を使い、まず1アリールのMecp2遺伝子の破壊した。変異挿入の確率は高かったものの、in frameの変異が多かったが、最終的に1塩基対の挿入変異が入ったES細胞株を単離することができた。そのES細胞株に対して、Mecp2遺伝子のストップコドン付近にdouble strand breakを生じさせるためのCRISPR/Cas9コンストラクトと、ノックインさせるためのGFP遺伝子を含むドナーベクターを導入し、PCR法にて陽性クローンの検出に成功した。レット症候群患者は正常なMECP2遺伝子を1コピー持っているという事実をもとに、近年進歩が著しいゲノム編集技術を用いて、不活性化している正常なMecp2遺伝子を再活性化させることを目的にしている。この研究計画の第1段階として、平成28年度は評価系として一方のMecp2遺伝子座に蛍光蛋白GFPをノックインし、もう一方のMecp2遺伝子を破壊したマウスES細胞を樹立と、Mecp2遺伝子のプロモーター領域に結合する人工転写因子dCas-VP64の作製を行った。評価系のマウスES細胞を作製については、理研バイオリソースセンターよりBRC6というメスのマウスES細胞株を手に入れた。それと並行して、Mecp2遺伝子を破壊するCRISPR/Cas9コンストラクトとMecp2遺伝子のストップコドン付近にdouble strand breakを生じさせるためのCRISPR/Cas9コンストラクトと、ノックインさせるためのGFP遺伝子を含むドナーベクターを作製した。次に1つのMecp2遺伝子の破壊のため、BRC6細胞にMecp2遺伝子を破壊するCRISPR/Cas9コンストラクトをトランスフェクションにて導入した。その結果、Mecp2遺伝子の標的遺伝子にdeletion変異が挿入されたES細胞を得られたが、9塩基対の欠損であったため、MeCP2蛋白のうち3アミノ酸のみが欠損した蛋白ができることが予想され、MeCP2蛋白の機能はおおよそ維持されてしまうことが予想されたため、現在、再度同じ実験を繰り返し、1つのMecp2遺伝子が破壊されたES細胞株作製を継続している。Mecp2遺伝子のプロモーター領域に結合する人工転写因子dCas-VP64作製についてはSanta Cruz Biotechnology社が提供しているものを使用することにした。平成28年度は、Mecp2遺伝子のプロモーター領域に結合する人工転写因子dCas-VP64の作製と、Mecp2-GFP/-のモニター用のES細胞樹立を計画していた。前者はSanta Cruz Biotechnology社から提供されるものを使うことにしたため達成できたが、後者のモニター用ES細胞については完成に至らなかった。その理由として、メスのマウスES細胞株の取得に予想以上に時間がかかったことが挙げられる。研究の理由によりX染色体を2つ持つメスのマウスES細胞である必要があったが、研究で使われているマウスES細胞の多くがオス由来であり、メスのES細胞を探すのに多くの時間を要した。最終的に理研バイオリソースセンターに寄託されていたメスのES細胞株BRC6を見つけたが、寄託者からの承諾やMTAの手続きにも時間を要してしまった。更に、初めて使うES細胞株であったため、培養方法や遺伝子の導入方法の最適化なども行う必要もあり、本実験のための予備的実験に多くの時間を使ってしまった。最終的にMecp2-GFP/-のES細胞株樹立には至らなかったが、この細胞樹立に必要なプラスミドは既に作製を終え、コンストラクトが機能していることは細胞系で確認されたので、平成29年度の早い段階で樹立を完了するものと思われる。レット症候群患者は正常なMECP2遺伝子を1コピー持っているという事実をもとに、近年進歩が著しいゲノム編集技術を用いて、不活性化している正常なMecp2遺伝子を再活性化させることを目標にしている。平成29年度は、前年度に引き続き、評価系として一方のMecp2遺伝子座に蛍光蛋白GFPをノックインし、もう一方のMecp2遺伝子を破壊したモニター用のマウスES細胞の樹立を目指した。評価系のマウスES細胞作製については、理研バイオリソースセンターよりBRC6というメスのマウスES細胞株を入手し、我々の培養法でも問題なく継代および凍結ストックを作ることを確認できた。まず1アリールのMecp2遺伝子の破壊のため、BRC6細胞にMecp2遺伝子を破壊するCRISPR/Cas9コンストラクトをトランスフェクションにて導入した。

1回目のトランスフェクションでは、Mecp2遺伝子の標的遺伝子にdeletion変異を導入したES細胞を得られたが、9塩基の欠損であった。この変異によりMeCP2蛋白のうち3アミノ酸のみが欠損した蛋白ができることが予想され、MeCP2蛋白の機能はおおよそ維持されてしまうことが推測されたため、再度同じ実験を繰り返した。2回目のトランスフェクションでは1塩基の挿入変異が入ったクローンが確認された。そこで1塩基の挿入変異が入ったES細胞株を単離・増幅し、Mecp2遺伝子のストップコドン付近にdouble strand breakを生じさせるためのCRISPR/Cas9コンストラクトと、ノックインさせるためのGFP遺伝子を含むドナーベクターをトランスフェクションした。標的配列に挿入された場合に検出されるPCRで陽性クローンを獲得した。現在、目的としている方のアリールにノックインされているか、標的配列以外にドナーベクターが挿入されていないか確認を行っている。平成29年度は、平成28年度に引き続きMecp2-GFP/-のモニター用のES細胞樹立を行った。モニター用ES細胞については概ね樹立を完成し、現在、最終的な確認を行っている。モニター用のES細胞樹立に多くの時間を費やした理由として、CRISPR/Cas9によるDouble Strand Breakを引き起こす確率は非常に高いガイドRNAをスクリーニングで得られたが、変異が3塩基や9塩基の欠失など3の倍数のため変異が生じてもin frameになってしまい、MeCP2の機能がほぼ温存されてしまうことになるため2回スクリーニングを行い直した。その中で1塩基挿入されたES細胞が含まれていること見いだし、複数回の絞り込みで1塩基挿入されたES細胞を単離・増殖したため、予定より長い時間がかかった。このクローンを元にもう1つのアリールにGFPをノックインする実験を行った。理論上、ドナーベクターがノックインされる確立より、変異が挿入される確率が高い上、1塩基挿入されていない方のアリールにGFPのコンストラクトがノックインされる必要があり、このスクリーニングにも多くの時間を要した。最終的にMecp2-GFP/-のES細胞株樹立まであと一歩までに達した。平成30年度の早い段階でモニター細胞を樹立し、神経誘導に向かいたいと考えている。レット症候群患者はX染色体上のMECP2遺伝子の変異によって引き起こされる神経発達障害で、罹患率は女児1ー2万人あたり1人で、女児の知的障害の原因としてはダウン症に次いで2番目に多い原因となっている。レット症候群患者の女児は実はゲノム上に正常なMECP2遺伝子を1コピー持っているという事実をもとに、近年進歩が著しいゲノム編集技術を用いて、不活性化している正常なMecp2遺伝子を再活性化させることを目標にした。