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浅熱水性金銀鉱化作用と酸性変質作用の特性および時空解析

本研究では,島弧の地質環境における若い火山活動に伴う浅熱水性金銀鉱床の成因と生成過程の解明に主眼を置き,フィールドワークと採取試料に於ける各種室内実験の実施結果から,金鉱床の形成場と元素濃集プロセスを鉱床学的,地球化学的,岩石学的観点から検討した.また,化学分析に於ける実験手法の改良と精度向上を目指して,基礎的な実験も併せて実施した.主な研究対象として,西南北海道および中部北海道の浅中熱水性環境に於ける低硫化型金鉱化作用及び高硫化型多金属性金鉱化作用に着目し,そこでの変質鉱物及び鉱石鉱物の組合せとその化学組成を基に,各金鉱床の物理化学的生成条件及び両鉱床タイプの時空的関係について検討した.また,研究対象をさらに東北日本およびインドネシアの同タイプの鉱床にも拡大し,比較検討を行った.本研究によって得られた成果を総合すると,高硫化型金鉱床の形成は関係火成岩と密接な因果関係を有し,マグマ起源の熱水の強い関与を受けていることが判った.一方,低硫化型金鉱床は天水起源の熱水が主体であることが明らかになった.前者では,後者に先行してその熱水活動が開始され,空間的には貫入岩体に対してより近傍に配置されるという時空的関係を有する.また,両タイプの金鉱床の形成にはマグマ活動が密接に関連し,そこから発生した高温熱水中に各種金属元素が硫化物錯体として地下浅所へ輸送され,減圧沸騰,或は天水との混合による冷却・希釈・酸化などの要因が,それぞれの金鉱床の元素固定に有効に働いた事が強く示唆された.本研究では,島弧の地質環境における若い火山活動に伴う浅熱水性金銀鉱床の成因と生成過程の解明に主眼を置き,フィールドワークと採取試料に於ける各種室内実験の実施結果から,金鉱床の形成場と元素濃集プロセスを鉱床学的,地球化学的,岩石学的観点から検討した.また,化学分析に於ける実験手法の改良と精度向上を目指して,基礎的な実験も併せて実施した.主な研究対象として,西南北海道および中部北海道の浅中熱水性環境に於ける低硫化型金鉱化作用及び高硫化型多金属性金鉱化作用に着目し,そこでの変質鉱物及び鉱石鉱物の組合せとその化学組成を基に,各金鉱床の物理化学的生成条件及び両鉱床タイプの時空的関係について検討した.また,研究対象をさらに東北日本およびインドネシアの同タイプの鉱床にも拡大し,比較検討を行った.本研究によって得られた成果を総合すると,高硫化型金鉱床の形成は関係火成岩と密接な因果関係を有し,マグマ起源の熱水の強い関与を受けていることが判った.一方,低硫化型金鉱床は天水起源の熱水が主体であることが明らかになった.前者では,後者に先行してその熱水活動が開始され,空間的には貫入岩体に対してより近傍に配置されるという時空的関係を有する.また,両タイプの金鉱床の形成にはマグマ活動が密接に関連し,そこから発生した高温熱水中に各種金属元素が硫化物錯体として地下浅所へ輸送され,減圧沸騰,或は天水との混合による冷却・希釈・酸化などの要因が,それぞれの金鉱床の元素固定に有効に働いた事が強く示唆された.本研究では,若い生成年代を有する島孤の火山活動に伴う浅熱水性鉱床の成因と形成過程を解明することを目的とし,フィールドワーク並びに各種室内実験結果を基に,金鉱床の形成プロセスを鉱床学的,地球化学的,岩石学的観点から検討する計画である.本年度は,ケーススタディとして設定された西南北海道(特に小樽赤岩および手稲金鉱床周辺地域)における既存或は探査中の浅熱水性金鉱床および付近鉱床母岩の熱水変質帯において,主として野外・坑内地質調査および試料採集を実施した.また,調査対象地域に分布する火山岩類について,K-Ar年代・化学組成資料の収集と整理を行い,鉱床母岩および関係火成岩としての火山岩類のキャラクテリゼーションおよび評価を行った.一方,変質帯については,鉱床母岩であるプロピライトおよび酸性・中性変質帯の分布と産状,並びに鉱物共生・全岩組成を明らかにし,関与熱水の化学的諸性質を明らかにするとともに,それら成因的相互関係や鉱化作用との関係を検討した.また,調査および試料収集結果に基づいて,本地域における金鉱床と中性・酸性変質帯,プロピライト等の時間的・空間的分布の概要の把握を行った.さらに,上述の浅熱水性金鉱化作用・中性酸性熱水変質作用およびプロピライト化作用に重要な役割を果たした流体(熱水)の特性とその挙動を解明するために,各種鉱物中の流体包有物の均質化温度・塩濃度測定を実施し,XRD・EPMAおよびガス質量分布装置を併用して,鉱物学的・地球化学的観点から今年度の本研究計画を遂行した.初年度に得られた成果を基に,平成10年度の研究計画を継続実施する予定である.島弧の地質環境における浅熱水性金鉱化作用は,成因的に主に低硫化型および高硫化型金鉱化作用の二つに区分される.従来,低硫化型金鉱床の研究はかなり詳細に行われてきたが、一方で高硫化型金鉱床はその胚胎母岩が塊状珪化岩で産状が不明瞭などの理由から,成因的な研究の立ち後れと低硫化型金鉱化作用との時空的・成因的関係が必ずしも明らかにされてはいない.

そこで本研究では,特に高硫化型金鉱床の成因と低硫化型金鉱床との時空関係の解明を目的として,小樽赤岩・札幌春香山・鹿児島赤石鉱山などを例に野外調査および各種室内実験を実施した.今年度は、主に赤石鉱山を対象に坑内観察および室内実験を行い,特に塊状珪化岩と金鉱化作用の時空的因果関係を明らかにすることを試みた.その結果,塊状珪化岩は空間的に上方に開くロート状を呈し,周囲は酸性変質帯に取り囲まれ,さらに外側の母岩側に向かい中性変質帯へと移化する傾向があることが判った.この事実は,塊状珪化岩を形成した活動熱水が初生的には強酸性条件であった事を示唆する.一方,金の沈澱を伴う玉随質ー陶器質石英脈は塊状珪化岩を切り,より後期の産物であることも明らかになった.これらの珪化岩および含金石英脈中の鉱染状あるいは塊状黄鉄鉱の硫黄同位体比は5‰前後と重く,活動熱水が天水起源ではなくマグマ起源である可能性を強く示唆している.小樽赤岩の事例では,同様に塊状珪化岩の形成は金鉱化作用に先行し,強硫酸酸性熱水による溶脱作用の産物であると推定された.しかし,金鉱化作用をもたらした後期活動熱水は弱酸性ー中性の天水起源と考えられる.春香山においても、高・低両硫化型金鉱化作用が近接(約500mの距離)して観察され,両鉱床の形成年代もおよそ5-6Maとほぼ一致している。ここでも高硫化型金鉱化作用が低硫化型に先行して生じていることから、熱水系が初期のマグマ性から後期の天水性のものへと次第に変化した可能性が強く示唆される.本研究では、島弧の地質環境における若い火山活動に伴う浅熱水性金銀鉱床の成因と生成過程の解明に主眼を置き、フィールド・ワークと採取試料における各種室内実験の実施結果から、金鉱床の形成と元素濃集プロセスを鉱床学的、地球化学的、岩石学的観点から検討した。本年度は本研究課題における研究最終年度にあたるため、これまでの研究対象地域の補足的な野外調査・サンプリング・室内実験に加え、データのとりまとめと成果の公表を行った。又、化学分析における実験手法の改良と精度向上を目指して、基礎的な実験も併せて実施した。補足的研究対象に加えた西南北海道春香山地域の新大豊鉱床及び中央北海道の中越鉱床では、特に中熱水性環境における高硫化型多金属性金鉱化作用について、鉱石鉱物組合せとその化学組成を明らかにし、物理化学的生成条件及び低硫化型金鉱床との時空的関係について検討した。その結果、空間的には高硫化型金鉱床が関係貫入岩(チタン鉄鉱系花崗岩類)の近傍に産し、一方低硫化型金鉱床はそれらから遠方に配置されることが明らかになった。安定同位体比(水素、酸素、硫黄)の検討からも、高硫化型金鉱化作用には著しいマグマ成分の寄与が認められるのに対し、低硫化型鉱化作用では天水の寄与が大きいことが明らかになった。又、浅熱水性金鉱床近傍に産する花崗岩類(大峠、新大豊)中に認められた二次流体包有物の検討では、比較的高塩濃度流体の活動が示唆された。これまでの研究成果を総合すると、金鉱床形成においてはマグマ活動と関係して、高温熱水により各種金属元素が硫化物錯体として輸送され、浅所における熱水の減圧沸騰、天水との混合に基づく冷却・酸化などの要因が金鉱床における元素の固定に有効に働いたことを示している。これらの研究成果を基に、関係学術雑誌等に印刷公表を行った(研究発表の項参照)。
鉄ケイ酸塩融体の高温レドックスメトリー開発

金属製精錬プロセスにおいて、ケイ酸塩融体は精練剤として利用されており、その精練能や物性は融体に含まれる鉄イオンのレドックス状態(Fe2+とFe3+の構成比)に大きく影響をうける。そのため、高温融体のレドックス状態を簡便かつ直接的に分析する技術を確立できれば、工業プロセスで扱われるケイ酸塩融体の状態理解につながる。本課題では、高温融体を対象とした測定が比較的容易なラマン分光法を利用することにより、高温融体のレドックス状態直接分析手法の確立を試みる。
日本と南アフリカにおけるリージョナル協力と国際人口移動-人間安全保障の展望

国際人口移動を単なる労働移民の問題にとどまらない複合現象として理解する視点にたち、日本とアジア、南アフリカと南部アフリカという二地域における国際人口移動の実態把握と比較分析を通じて、流出地域と流入地域において人間の安全が保障されるための課題は何であるのかを、人間安全保障の批判的摂取をふまえつつ解明した。具体的には、社会セクターにおける人口移動に焦点をあて、国際人口移動研究への理論的貢献を行った。今年度は、(1)フィリピンおよび南アフリカにおける現地調査、(2)オランダの国際会議への参加を通じた理論動向の調査、(3)定例研究会の実施を中心に研究を進めた。(1)フィリピン現地調査には、佐藤誠、カルロス、佐藤千鶴子が参加し、フィリピンからの看護・介護労働者移出の現状およびそれがフィリピン国内の医療サービスにどのような影響を及ぼしているのかについて、フィリピン保健省、海外雇用庁、看護協会、看護学校講師などへの聞き取りを通じて調査した。南アフリカでは、峯、坂田、ジワが同国の移民政策ならびに同国におけるアフリカ人コミュニティの動態について資料収集を行ったほか、カルロス、佐藤千鶴子が南アフリカ人医師・看護師の海外流出の現状について調査を行った。両国での調査を通じて、送り出し国・受け入れ国双方にとっての人間の安全保障の確保という視点の重要性を再確認すると同時に、医療労働者の国際移動を一つの焦点とするという方向性が確立された。(2)オランダで開催された国際人口移動と人間安全保障に関する国際会議(8月30-31日)に佐藤誠、峯が参加し、国際的な学界の動向について情報収集を行った。人間安全保障論には概念上のあいまいさという問題が存在するものの、国際人口移動の分析枠組みとしての有効性はいまだ失われていないことがわかった。(3)定例研究会は通年で5回実施した。小島、佐藤千鶴子、鄭らが日系ブラジル人の教育問題、看護師の国際移動の現状、韓国の移民政策の変遷などそれぞれの担当分野について報告したほか、南アフリカ・プレトリア大学から海外共同研究者であるフセイン・ソロモン教授およびニコラ・デヤヘル講師を招聘し共同セミナーを開催した。さらに、オクスフォード大学移民政策社会センターのビアオ・シャン研究員を招聘し、中国における出稼ぎ労働斡旋業者の活動と日本の入国管理政策の関係についての研究会を行った。本研究プロジェクトの中間年にあたる今年度は、1.南アフリカ、プレトリアにおける国際共同ワークショップの開催、2.国内における定例研究会の実施、3.人間の安全保障を理論的に再検討する国際ワークショップの開催を中心に研究を進めた。1.国際共同ワークショップは、南アフリカの海外共同研究者による協力のもと、2008年9月1-2日、同国プレトリア大学において「Human Security and Migration:Southern Africa and Japan in Comparative Perspective」をテーマに開催した。研究代表者、分担者を中心に日本から8名(佐藤誠、峯、シャーニー、カルロス、中村、佐藤千および2名の非プロジェクトメンバー)、プレトリア大学およびステレンボッシュ大学などから6名の南アフリカ側共同研究者(ソロモン、スクーマン、デヤヘル、コーネリッセン他2名)が報告を行い、アジアと南部アフリカそれぞれの地域における国際人口移動の特質と比較の視点について議論を深めた。また、ワークショップを通じて、「教育」と「保健医療」という人間の再生産にかかわる分野での国際人口移動に焦点を絞った形で最終的に研究成果をまとめることについて合意がなされた。2.定例研究会は通年で5回実施した。日本・インドネシア間での経済連携協定(EPA)によるインドネシア人看護師・介護士候補生の受入れが開始されたことを受けて、(1)外国人看護師・介護士受入れについての日本側ステークホールダーの対応や準備状況、(2)インドネシア、フィリピンといった日本に看護師・介護士を送出すアジア諸国側の状況に関する研究報告を受けて活発な議論が行われた。最終年度である今年度は、6月と10月に立命館大学において国際シンポジウムを開催し、最終報告書を兼ねて出版を目指す単行本の作成を念頭においた研究報告と議論を行った。(1)6月に立命館で開催した国際シンポジウム(2009年6月21日)では、佐藤誠が「人間安全保障からみた国際人口移動と社会的再生産」と題して本研究の理論的総括を行い、小島が在日定住外国人の子どもの就学問題について報告した。さらに韓国から(社)保健福祉支援研究院常任理事の崔〓淑(チェギョンスク)氏を招聘して、韓国における介護労働の現況と取り組みについて報告してもらった。当シンポジウムを通じて、高齢化の急速な進行に伴って社会的再生産の中核をなす社会的セクターの担い手も急速に越境化しつつあることがアジア地域に共通して生じていることが明らかになった。(2)10月に立命館で開催した国際シンポジウム(2009年10月17日)では、南アフリカのレオン・ハートウェル氏、イギリスのエイドリアン・ベイリー氏、フィリピンのマリア・エラ・アティエンサ氏、日本から竹野ユキコ氏が、各国の社会セクターにおける移民労働に関する報告を行い、再生産部門の越境化が世界規模で進展していることを明らかにした。これに対する本プロジェクト研究者との討論を通じて、移民労働者およびその家族だけでなく、送り出し社会、受け入れ社会という三つの場において安定的な再生産が保障されることが、人間安全保障の実現に不可欠だという示唆が得られた。

(3)以上のシンポジウムでの報告・議論をふまえて、2010年度の単行本出版を計画し、各人がそれぞれの研究課題に基づく論文の執筆に取り組んだ。
文書資料による南北朝・室町時代日本語書記体系の史的研究

本研究は、これまで国語文字史学的調査の蓄積の少ない、南北朝及び室町時代文書を調査することにより、私がこれまでに調査を行ってきた平安・鎌倉時代文書、近世地方文書の書記の実態と併せて、文書資料による日本語書記史の全体像を描くための基盤整備を目標とした。そのために、昨年度に引き続き、本年度は高山寺・随心院・大通寺・講御堂寺といった京都・奈良の真言宗・真言律宗寺院経蔵所蔵の文書(紙背文書を含む)を重点的に調査した。その他に、仁和寺文書・東大寺文書・東寺百合文書などについて、必要に応じて写真を撮影・現像し、これについても詳細に書記史的調査を行った。その成果は順次データベース化しつつある。また、本研究の調査の過程で解明されてきた書記史的事実について昨年度から今年度にかけて、論文や研究発表の形で公にしている。文書世界に於ける平仮名字体と漢字字体の緊張関係及びそのあり方の変遷を「『平仮名らしさ』の基準について-オの仮名を例として-」にまとめた。「候文における倒置記法の簡略化とその原理」では、漢文体文書の書記原理の変化を、近世文書の実態を一つの到達点とみて、遡及的に論じた。「漢文文書に於ける助詞の仮名表記の変遷」では、助詞表記から、漢文体文書と宣命体・仮名書文書など周辺の書記体との関連を論じた。「片仮名資料に見える草体仮名の性格について」は、片仮名文書と訓点資料などとを総合的にみて、その相違について考察した。「文字史研究に於ける「片仮名」「平仮名」「草仮名」」は、仮名文書の調査から、仮名の名称と定義についての再考を提起したものである。また活字化はしていないが、「中・近世の文書文体に於ける漢文的要素の和化について」(訓点語学会研究発表会)に於いて、文書文体に於ける助字用法や再読文字用法などの変化の実態とその原理について纏めた。本年度は、南北朝・室町時代文書の原本調査として、京都市高山寺・京都市随心院・京都府立総合資料館・奈良県五條市講御堂寺・仙台市博物館への調査旅行を行い、原本或いはそれに準ずる資料の調査・撮影等をした。また、仁和寺所蔵典籍文書・東大寺図書館所蔵東大寺未成巻文書・東京大学附属図書館所蔵資料について、約六〇〇〇枚分の撮影及び焼付を行った。その他、東京大学史料編纂所等、東京都所在の機関を中心として写真帖・影写本等により、東大寺文書・群馬県長楽寺文書・留守家文書・青方文書等の調査を行った。現在、それら収集した資料を書記上の特徴に注目して分類・整理し、南北朝・室町時代の日本語書記の特徴の記述を試みている。具体的には、仮名文書については仮名字体・踊字の用法・漢字の交用を中心に、漢文体文書については倒置記法・助詞表記・仮名の交用を中心に、両者に共通した点として宣命書の混入を中心に、まとめつつある。その結果の一部として、目下、南北朝・室町時代漢文体文書の助詞表記の特徴と近世漢文体文書との相違、その間の変化原理についての調査・考察を、「漢文文書に於ける助詞の仮名表記の変遷-「仁」の消滅と「江」の出現を中心として-」(『鎌倉時代語研究』23輯、二〇〇〇年五月刊行予定)として発表予定である。また、仮名文書の書記については、本研究計画の成果を直接利用したものではないが、その予備研究の結果をもとに「『平仮名らしさ』の基準について-オの仮名を例として-」(『国語と国文学』76巻5号、一九九九年五月)を発表しており、その後、本年度の調査成果を元に更に深度を高めた検証を行っている。

また活字化はしていないが、「中・近世の文書文体に於ける漢文的要素の和化について」(訓点語学会研究発表会)に於いて、文書文体に於ける助字用法や再読文字用法などの変化の実態とその原理について纏めた。
視床髄板内核侵害受容ニューロンに及ぼす笑気吸入の影響

本研究では、ウレタン・クロラローズ麻酔下のSD系ラットを脳定位固定装置に固定した後、ガラス毛細管微小電極を用いて、三叉神経系感覚入力の上位中継核の一つである視床髄板内核侵害受容ニューロンのスパイク発射活動を観察することを可能とした。ラットは、気管カニューレ挿入の後Pancuroninum投与により非動化し機械的人工呼吸を行った。今回は、視床髄板内核の外側中心核と束傍核から単一ニューロンのスパイク発射活動を細胞外電位(細胞外用高感度増幅器、専用プローブ:今回購入)として導出した。規格化した自然刺激(動脈クレンメによるピンチ、筆によるブラッシング等)を用いて、とらえた単一ニューロンの受容野を決定し、その機能的同定を行った。空気吸入時の電気刺激装置による一定刺激に対するスパイク発射を記録し、これをコントロールとした。その後、笑気吸入を開始しコントロールと同一の記録を行った。さらに、笑気吸入から再び空気吸入に戻して同様の記録を繰り返し経過を観察した。単一ニューロンのスパイク発射活動は、すべてデータレコーダーに記録した。実験終了後、イオン注入装置(今回購入)を用いて電極に通電しPontamine skyblueでマ-キングを行い、固定・保存した。後日、スパイク発射数のヒストグラムを作成し、最高発射数による比較検討を行った。また、連続凍結切片を作製し記録部位を組織学的に確認した。YokotaおよびNishikawaらのネコにおける報告と同様に、ラットにおいても両側の耳介、鼻背、口腔、上下肢先端部および体幹部の一部を受容野とする単一ニューロンのスパイク発射活動を観察することができた。本研究では、笑気吸入によりスパイク発射活動の抑制が認められたが、これは従来観察されていない新所見であり、笑気の鎮痛・鎮静作用の解明に貢献できるものと思われる。
インフルエンザウイルス子孫RNP複合体の可視化による核-細胞膜間輸送機構の解析

インフルエンザウイルスゲノムはRNA-タンパク質複合体(vRNP)として宿主細胞の核内で複製されたのち、細胞表面まで運ばれ子孫ウイルス粒子となる。本研究では、この子孫vRNP輸送が宿主細胞の微小管輸送系に依存していることを明らかにした。また、感染細胞のvRNPを生きたまま観察し、vRNPが微小管に沿って比較的速い速度(0.7-1.5μm/s)で間欠的に前後へ移動していることを見いだした。本研究は、インフルエンザウイルスRNA-タンパク質複合体(RNP)と優先的に結合するモノクローナル抗体(mAb61A5)を主要解析ツールとし、感染細胞核内で複製された子孫vRNPの選択的集合と粒子出芽の場である細胞膜への輸送について、分子レベルで解明する事を目的とした。蛍光標識したmAb61A5を、膜透過ペプチド法あるいはリポフェクション法に基づいたタンパク質導入技術により感染細胞へ導入し、共焦点レーザー顕微鏡によるリアルタイム生細胞観察を行った。膜透過ペプチドを用いた手法では凝集抗体による偽シグナルの割合が多く、メーカー推奨の手法のままでは子孫vRNPの動態解析には不適切であることが判明した。一方、リポフェクション法による導入で偽シグナルはほとんど検出されず、感染に依存して細胞質内に粒状のvRNPが観察された。GFP融合α-チューブリンを恒常発現する細胞株を樹立し同様の生細胞観察を行なった結果、細胞質に移行した子孫vRNPは緩急ある速度で時に進行方向を反転させつつ、微小管に沿って移動していることが判明した。子孫vRNP複合体の平均移動速度は12μm/s程度であり瞬間最大速度は5μmls以上に達することから、何らかのモータータンパク質を介して微小管上を輸送されていると考えられる。本研究の成果により、インフルエンザウイルス子孫vRNPの細胞質内輸送を初めて可視化することが可能となり、引き続き関連輸送因子とそのメカニズムを解明することで、新たな抗ウイルス剤作用点の発見が期待できる。本研究は、インフルエンザウイルスRNA-タンパク質複合体(RNP)と優先的に結合するモノクローナル抗体(mAb61A5)を主要解析ツールとし、感染細胞核内で複製された子孫vRNPの選択的集合と粒子出芽の場である形質膜頂端面への輸送について、分子レベルで解明する事を目的とした。蛍光タンパク質を融合した既知オルガネラマーカータンパク質を20種類作製し、それぞれ一過性発現細胞で意図した局在を示す事を確認した。これらマーカータンパク質を発現させたMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、mAb61A5を用いた間接蛍光抗体法により子孫vRNPの局在を観察したところ、程度の差はあるが3種類のマーカータンパク質と共局在することが確認できた。このうち2種についてエピトープタグを用いた免疫沈降を行なったところ、vRNPが共沈降することを確認した。これまで、核外輸送された子孫vRNPはHAなどのウイルス膜タンパク質輸送小胞と合流し形質膜頂端面へ運ばれると考えられていた。しかし、我々が作製したmAb61A5および抗HAモノクローナル抗体を用いた蛍光観察の結果、細胞質内の粒状vRNPシグナルはHAの細胞質内シグナルと共局在しない事が明らかとなった。一方、共焦点顕微鏡のZスタックモードにより感染細胞におけるvRNPおよびHAの分布を立体的に観察したところ、HAと子孫vRNPは感染後期の形質膜頂端面においては共局在することが確認できた。ただし両者の頂端面蓄積には時間差があり、vRNPが核外移送後速やかに頂端面へ移行するのに対して、HAは一時的に側底面を含む形質膜全体に局在する事が判明した。これらの観察結果よりvRNPとウイルス膜タンパク質(少なくともHA)の頂端面輸送経路の大部分が互いに異なる可能性が示唆された。
ディスクレパンシーと歯周病に関する総合的研究

ディスクレパンシーと歯周病との関連性やその解決策を把握する一助として、最近4年間に愛知学院大学歯学部歯周病科に来科した歯周病患者の実態調査を行うとともに、30歳以下の若年者の歯周病の臨床病態を検討し報告した。さらに、歯周病炎患者のなかで現在治療継続中の44人についての臨床所見の詳細を報告した。患者総数2677人中、30歳以下の歯周病患者は253人(9.5%)、そのうち79人が歯周炎であった。30歳以下の歯周炎患者の喪失歯は第1大臼歯が最大であった。限局性に切歯と第1大臼歯に歯槽骨吸収を認めたものは、3人と少なく、むしろ全顎的に歯槽骨吸収を認めたものが、36人(46.2%)と最大であった。すなわち、若年期に歯周炎が発症する早期発症型歯周炎が増加しつつあり、その歯周病変の破壊形相の多様性ならびに、早期治療、予防の必要性が示唆された。従って、現在若年者のさらに詳細な歯周病態や食生態さらに、ストレス度を把握するためのデータを蓄積させてきている。また、成人病を伴ったものや、歯周組織健全者をコントロールとして同様のデータを蓄積させている。一方、高齢者の歯周病態を把握するために、本大学歯周病科来院患者のうち平成4年度以降の65歳以上の患者群を詳細に調査している。さらに、愛知県常滑市で行われてきている80歳高齢者の歯周病態を直接訪問により調査を行なうための準備が進んでいる。高齢者の歯の延命に寄与した因子の分析結果を、ディスクレパンシーに苦慮する若年者の口腔健康に反映させていく予定である。歯周病患者の食餌日誌分析の結果は蓄積されてきているが、各病態についての個体数がやや不足しているのでデータを蓄積している。また、成人病(糖尿病や高血圧など)を伴ったものや歯周組織健全者のコントロールも不足しているので同時に蓄積させてきている。まず、20歳代や30歳代から分析していく予定である。心理テストの分析結果も蓄積されてきているので各年代ごとに分けて検討している。また、ストレス度や性格特性と病態の難易度・治療に対する反応などを検討中である。セファログラム分析に関しては、ようやく本年度備品にて分析ソフトを購入し、資料分析を行ないデータを蓄積させていく予定である。現在、歯周病の進行に伴う上顎歯列の離開と顔貌との関係や叢生歯列と歯周病の進行との関係について検討している。叢生歯列のメインテナンス良好群では、水平因子・垂直因子・密集度・回転度・傾斜度の5因子のうち、水平・垂直・密集度の因子が関与した歯列であること、一方、メインテナンス不良群では、回転度・傾斜度が関与した歯列であることが臨床データから示唆されてきている。従って、その傾向を模型において人工プラーク除去率を指標に確認しようとしている。しかし、模型予備実験において人工プラーク・人工歯・歯ブラシの選択段階の時点で、見直しをせまられているところである。ディスクレパンシーと歯周病との関連性やその解決策を把握する一助として、最近4年間に愛知学院大学歯周病科に来科した歯周病患者の実態調査を行うとともに、30歳以下の若年者の歯周病の臨床病態を検討し報告した。さらに、歯周炎患者のなかで現在治療継続中の44人について詳細を報告した。

歯槽骨吸収は、全顎的に認めたものが36人(46.2%)と最大で、切歯と第1大臼歯に限局したものは3人と少なかった。すなわち、若年期に歯周炎が発症する早期発症型歯周炎が増加しつつあり、その歯周病変の破壊形相の多様性ならびに、早期治療、予防の必要性が示唆された。従って、現在若年者の食生態、ストレス度を把握するためのデータを蓄積させてきている。また、成人病を伴ったものや、歯周組織健全者をコントロールとしてデータを蓄積させている。一方、高齢者の歯周病態を把握するために、本大学歯周病科来院患者のうち平成4年度以降の65歳以上の患者群を詳細に調査している。さらに、愛知県常滑市で行なわれてきている80歳高齢者の歯周病態を直接訪問により調査を行なうための準備が進んでいる。高齢者の歯の延命に寄与した因子の分析結果を、ディスクレパンシーに苦慮する若年者の口腔健康に反映させていく予定である。
ヒスタミン受容体および合成酵素のイックアウトマウスを用いた神経可塑性の研究

ヒスタミンH1受容体遺伝子ノックアウト(KO)マウスの自発運動量、受動回避反応、T字型高架迷路法などにより、KOマウスは野生型に比して不安状態が強いことを明らかにした。また、脳内カテコラミン、セロトニン含量を測定し、KOマウスは、セロトニンを代謝回転が野生型より高いことを見いだした。これと関連して脳スライスからの高濃度K^+誘発セロトニン遊離が、は、野生型マウスではヒスタミンにより抑制されるが、KOマウスでは増強していることがわかった。従って、KOマウスの行動異常の一部はセロトニン神経系との相関性で説明される。ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子(HDC)KOマウスをHDCの補酵素であるピリドキサル5'ーリン酸の結合部位付近の配列を中心に、ネオマイシン耐性遺伝子を導入し、相同組み替えをおこさせ、常法により作成した。本KOマウスは、分娩、発育、成長において、また、外観上も野生型と相違を認めない。KOマウスの胃、脳などの臓器では、HDC活性はほとんど検出できないが、ヒスタミン含量は、KOマウスにおいても野生型の1030%存在した。現在、このヒスタミンの由来を明らかにしつつあり、さらにKOマウスの表現系の解析に着手した。その結果、KOマウスでは、野生型に比してやや自発運動量が低下していた。現在、HDC遺伝子の高発現トランスジェニック・マウスも準備中である。ヒスタミンH2受容体遺伝子KOマウスについては、現在、キメラマウスが得られている。
慢性脳低灌流状態における微小脳循環調節機構の解明

頚部内頚動脈分岐部はアテローム動脈硬化の好発部位であり、その末梢灌流領域に脳梗塞を来す大きな原因となる。灌流圧低下に対する生体防御機構として、代償性脳循環調節機構が存在すると考えられているが、そのメカニズムに関しては、ほとんど知見が得られていない。そこで、今回の研究では、頚動脈狭窄病変マウスモデルを作成し、二光子顕微鏡を用いて、その代償性脳循環調節機構の解明を行った。代償性脳循環調節機構として、灌流圧低下に伴いその末梢血管で血管拡張が起きることを認めた。しかしながら、高度の灌流圧低下状態では、逆に末梢血管は収縮を起こしてしまうことが認められた。頚部内頚動脈分岐部はアテローム動脈硬化の好発部位であり、この狭窄性病変による慢性脳低灌流状態では、血行力学的にwatershed infarctionや脳室周囲の深部白質にterminal zone infarctionを起こすことが知られている。その病態メカニズムに関しては、不明な点が多くまた確立した治療法もない。この灌流圧低下状態に対する代償性の反応とし末梢血管を拡張させ血管抵抗を減らすことにより血流を維持させようとする代償性脳循環調節機構の存在が推定されているが、この状態を直接観察した様な研究は皆無である。本年度は、マウス慢性脳低灌流モデルを作成して、動脈、毛細血管、静脈の各種血管がどの様に代償性血管拡張を示すのかを二光子顕微鏡を用いたin vivo imagingにて明らかにした。マウス慢性脳低灌流モデルは、総頚動脈の外側からmicro coilを装着させることにより、頚動脈狭窄性病変を作成した。micro coil(0.20mm、0.18mm、0.16mm)の径を変えることにより頚動脈狭窄率を変えて、種々の段階の低灌流状態を作成した。脳表細動脈、穿通動脈、毛細血管、静脈の血管径を狭窄病変作成前後で測定した。軽度から中等度の灌流圧低下状態では、(micro coil 0.20、0.18mm)では穿通動脈に明らかな代償性の血管拡張が認められた。高度の灌流圧低下状態(micro coil 0.20、0.18mm)では、むしろ血管が収縮様な所見が認められた。本年度の研究からは、代償性の血管拡張は、穿通動脈で著明であること、灌流圧低下が高度になると、代償性の血管拡張は起こらず、むしろ血管は収縮してしまうことを明らかにした。本年度は、代償性血管拡張反応を二光子顕微鏡を用いて直接観察することが可能であった。ただし、0.16mmのmicro coilを用いた高度脳灌流圧低下状態では、慢性脳低灌流病態よりは、むしろ急性脳虚血を反映した様な血管反応性が認められた。本年度は、micro coilを0.20mmから0.16mmまで使用したが、次年度はもう一段回狭窄程度の軽い0.22mmのCoilを使用する予定である。脳主幹動脈狭窄性病変に伴う慢性脳低灌流状態では、血管抵抗を減らし脳血流を維持する為、末梢血管に代償性の血管拡張が起きると考えられている(脳循環予備能)。本研究では、この脳循環予備能(血管拡張能)を二光子顕微鏡を用いて解明することを目的としている。マウス脳主幹動脈狭窄モデルは、両側の総頚動脈にmicro coilを装着させることにより作成した。前年度は、micro coilの内径を変えることにより(内径0.22mm、0.2mm、0.18mm、0.16mm)狭窄/灌流圧低下の程度が異なるモデルを作成して、脳表細動脈、穿通枝動脈、毛細血管、静脈の各血管の反応性を二光子顕微鏡を用いて明らかにした。本年度は、脳低灌流状態での血管拡張性物質(acetazolamide:ACZ)投与による血管拡張反応性を二光子顕微鏡と二次元レーザードップラー血流計を用いて明らかにした。臨床で用いられる脳血流シンチなどでは、脳循環予備能を直接評価することはできず、ACZなどの血管拡張性物資を投与して、残存する血管拡張能から脳循環予備能の評価を行っている。しかしながら、この評価方法が正確に脳循環予備能を評価しているのかどうかははっきりしていない。軽度の低灌流状態(micro coil 0.2mm)では、レーザードップラーを用いたACZ投与前後の血流測定においては、投与前の血流値とACZ投与後の血流増加量の間には有意な相関関係が認められた。二光子顕微鏡を用いた観察では、ACZ投与前の状態では、穿通動脈に代償性の血管拡張が認められたが、ACZ投与による血管拡張が、主に脳表の小血管に優位に起きていることが確認された。高度の低灌流状態(micro coil 0.16mm)でもACZ投与に伴う血流増加、血管拡張は認めら、ACZは生理的な血管拡張能を超えて血管拡張を来すことが確認された。今年度は、血管拡張性物質(acetazolamide)による血管拡張反応を正常状態と脳灌流圧低下状態で観察を行った。acetazolamideは、生理的な代償性血管拡張を超えて強力に血管拡張をさせることを明らかにした。概ね、当初の計画通りに進行している。内頚動脈起始部は、アテローム硬化の好発部位であり、末梢灌流圧低下により血行力学的に、また、塞栓性にその末梢領域に脳梗塞を起こす。脳灌流圧低下を代償する為の脳循環調節機構(脳循環予備能)として、末梢血管では血管拡張が起きる。

本研究では、マウス頚動脈狭窄モデルを作成して、二光子レーザー顕微鏡を用いたin vivo imagingを行い、脳虚血病態下での代償性脳循環調節機構のメカニズムを明らかにした。頚動脈狭窄性病変は、両側の総頚動脈の外側からmicro coilを装着させるとこにより作成した。脳灌流圧低下の程度と代償性の血管拡張の関係を明らかにする為に、異なる径のmicro coilを用いることにより、狭窄率の異なるマウスモデルを作成した。灌流圧低下に伴い穿通動脈を中心に血管拡張が起こることを認めた。高度灌流圧低下状態では、むしろ血管収縮を起こしてしまうことを確認した。脳灌流圧低下状態下での、血管拡張性物質(ACZ:acetazolamide)による血管拡張性の評価を行った。臨床現場では、直接循環予備能を直接測定することができず、血管拡張性物質を投与して、残存する血管拡張性から脳循環予備能の評価を行っている。しかしながら、ACZが生理的な血管拡張能を正確に評価しているのかは、不明である。高度に灌流圧が低下し、血管収縮を来した状態でも、ACZは血管拡張を来すことを認め、ACZは生理的な血管拡張能を超えて血管拡張を来すことを確認した。脳循環調節機構としてアストロサイトが重要な役割を担っていることが数多く報告されている。脳灌流圧低下状態におけるアストロサイトの活性化をCa imagingを用いることにより検討した。アストロサイト内のCaシグナルは、灌流圧が低下状態ほど増加することを認めた。虚血状態では、アストロサイトの活性化と、血管の拡張が直接相関している訳ではないことを確認した。頚部内頚動脈分岐部はアテローム動脈硬化の好発部位であり、その末梢灌流領域に脳梗塞を来す大きな原因となる。灌流圧低下に対する生体防御機構として、代償性脳循環調節機構が存在すると考えられているが、そのメカニズムに関しては、ほとんど知見が得られていない。そこで、今回の研究では、頚動脈狭窄病変マウスモデルを作成し、二光子顕微鏡を用いて、その代償性脳循環調節機構の解明を行った。代償性脳循環調節機構として、灌流圧低下に伴いその末梢血管で血管拡張が起きることを認めた。しかしながら、高度の灌流圧低下状態では、逆に末梢血管は収縮を起こしてしまうことが認められた。1)血管拡張性物質を用いた代償性血管拡張の評価臨床では、代償性の血管拡張を直接評価することはできず、血管拡張性物質(Acetazolamide:ACZなど)を投与して、残存する血管拡張能の程度から脳循環予備能の評価を行ってきた。慢性脳低灌流状態での各血管のACZ血管反応性を二光子顕微鏡を用いて明らかにする。2)慢性脳低灌流状態におけるastrocyteの活性化慢性脳低下流状態におけるAstrocyteの活性化を二光子顕微鏡を用いたCa Imagingにて明らかにする。正常脳では、神経活動の増加に伴い局所脳血流が増加する(Functional hyperemia)。この血流増加のメカニズムとして、Astrocyteの活性化が大きな役割を演じていると報告されている。今後の研究予定としては、脳灌流圧低下状態におけるAstrocyteの活動性を明らかにする予定である。Astrocyteの活動性の指標として、Ca indicatorを用いたCa imagingを行う予定である。Ca indicatorとしては、Fluo4-AMを使用する予定である。
単離肝血管の収縮メカニズムから見たアナフィラキシーショック時の肝臓の役割の解明

モルモット肝静脈の単離標本では、経壁神経刺激(TNS)により、アドレナリン作動性神経性一過性の張力増大反応を起こした。これらの反応はニフェジピンによって抑制されなかったが、cyclopiaxzonic acid (CPA)またはY-27632の存在下では抑制された。TNSはまた、アドレナリン作動性の細胞内Ca2+増大反応を起こした。これらの細胞内Ca2+濃度の変化はCPAの存在下で抑制された。以上の結果からモルモット肝静脈では、α受容体を介して、細胞内貯蔵部位からのCa2+の放出とROKを介する経路を経て収縮を起こしていることが分かった。経壁神経刺激により刺激頻度依存的に一過性の収縮を観察した。この反応はTetrodotoxin (3 μM)存在下では見られなくなった。この収縮は、Phentolamine (3 μM)によって抑制され、Propranolol (3 μM)を追加投与すると増加した。NG-nitro-L-arginine(100 μM)では有意な変化は見られなかった。これらの収縮反応はニフェジピン(1 μM)では変化せず、CPA(10 μM)やY-27632(10 μM)によって抑制された。Phenylephrine (1 - 10 μM)またはAcetylcholoine (1-10 μM)はいずれも濃度依存的に収縮を引き起こした。これら両アゴニストによる収縮反応もY-27632により50%抑制された。以上の結果より、モルモット肝静脈は興奮性の神経支配を受けており、それは主にアドレナリン作動性で、一部コリン作動性のものが含まれることが分かった。その収縮メカニズムに電位依存性LタイプCa2+チャネルの関与は小さく、筋小胞体からのCa2+放出機構とROK経路を介する信号伝達経路が主であると考えられた。肝静脈細胞内カルシウム動態は蛍光色素fluo-4 AMを用いたカルシウム濃度測定方法の確立を目指した。fluo-8 AMのロード条件を濃度(1 - 10 μM)、ロード時間(5 - 30分)、ロード溶液(Ca2+濃度0 - 1mM)およびロード温度(室温または37度)について検討した結果、0.5mM Ca2+を含んだロード溶液と濃度1-3 uMのfluo-4 AMを用いて、室温で30分間ロード後37度で30分間ロードすることで肝静脈平滑筋細胞内Ca2+濃度による蛍光をとらえることができた。この蛍光はアセチルコリン(3 - 10 μM)によってわずかに増強することが確認できた。モルモット肝静脈平滑筋細胞内カルシウム濃度の測定方法を確立した。前年度確立したFluo-8 AMと倒立顕微鏡によるカルシウム濃度測定装置ではカルシウム指示薬の蛍光強度を長時間維持できず、10分を超える実験・測定ができなかった。実験漕の改良、アニオントランスポーター阻害薬(probenecid)併用、蛍光指示薬の細胞内ロード条件の変更を試行したが、最適なロード条件による蛍光指示薬Cal-520 AM (AAT Bioquest inc., CA)の使用により30分以上の肝静脈平滑筋細胞内カルシウム濃度測定を可能にした。無刺激状態において、モルモット肝臓平滑筋細胞内カルシウムはTetrodotoxin(3 μM)非感受性のわずかな自発的一過性カルシウム濃度上昇反応(頻度0.1 Hz)を繰り返していたが、この反応の細胞間同期は見られなかった。収縮実験において準最大収縮反応を起こした強度(頻度30 Hz、持続時間50 μs、1 s)で経壁的神経刺激を行うと、一過性カルシウム濃度上昇反応を起こした。この反応はα受容体拮抗薬のPhentolamine(3 μM)でほとんど抑制され、Tetrodotoxin(3 μM)で消失した。一方、Phenylephrine(10 μM)やAcetylcholine(10 μM)は持続的なカルシウム濃度上昇反応を起こした。以上の結果より、モルモット肝静脈の神経性収縮は主にα受容体を介した細胞内カルシウム濃度上昇を伴っていることが確認された。また、同平滑筋細胞にはムスカリン様受容体も存在し、その刺激により同じく細胞内カルシウム濃度上昇を伴って収縮に寄与することも確認された。モルモット肝静脈収縮に対する細胞内カルシウム濃度の役割について、カルシウム蛍光指示薬Cal-520を用いて検討した。静止状態において、一個一個の細胞内カルシウム濃度は一分間に一回の頻度で自発的に増減を繰り返していたが、それらが同期することはなかった。経壁神経刺激(持続時間30 μ秒の矩形波、頻度30 Hz、1秒間)を与えると、全細胞が同期して細胞内カルシウム濃度を一過性に増加させる現象が観察された。この現象はテトロドトキシン(0.1 μM)やフェントラミン(3 μM)によって抑制された。また、フェニレフリン(30 μM)、アセチルコリン(30 μM)によっても細胞内カルシウム濃度上昇が観察された。CPA(10 μM)を投与すると細胞内カルシウム濃度上昇が観察された。この状態の標本に経壁神経刺激、フェニレフリン、アセチルコリンを投与すると、それらの刺激によるカルシウム濃度上昇反応は抑制された。しかし、細胞外液のカリウムイオン濃度を40 mMに増加させてもフェニレフリンによるカルシウム濃度上昇の3分の1程度の反応しか見られなかった。

以上の結果から、モルモット肝静脈平滑筋細胞はα受容体とムスカリン様受容体を持ち、アドレナリン作動性神経の支配を受けており、その収縮は細胞内カルシウム貯蔵部位から細胞質へのカルシウム遊離を介する機構が主なもので、電位依存性カルシウムチャネルを介する細胞外液からのカルシウム流入経路はあまり関与しないという特徴を有することが分かった。モルモット肝静脈の単離標本では、経壁神経刺激(TNS)により、アドレナリン作動性神経性一過性の張力増大反応を起こした。これらの反応はニフェジピンによって抑制されなかったが、cyclopiaxzonic acid (CPA)またはY-27632の存在下では抑制された。TNSはまた、アドレナリン作動性の細胞内Ca2+増大反応を起こした。これらの細胞内Ca2+濃度の変化はCPAの存在下で抑制された。以上の結果からモルモット肝静脈では、α受容体を介して、細胞内貯蔵部位からのCa2+の放出とROKを介する経路を経て収縮を起こしていることが分かった。前年度確立したFluo-8 AMカルシウム蛍光指示薬による方法では、カルシウム濃度上昇をとらえることはできたが、蛍光反応の退色が速いので阻害剤、抑制剤を用いた比較実験を行えなかった。アニオン輸送阻害剤(Probenecid)の併用が有効であったり、分子量の大きいFluo-4 AMのほうが蛍光強度は弱くても退色が遅かったりしたことから、退色の原因が蛍光指示薬の細胞内からの排出にあると考えられた。そこで、アニオン輸送系による排出が少なくなるようデザインされた新しい蛍光指示薬であるCal -520 AM (AAT Bioquest inc., CA)を試用したところ、適切なロード条件下では有効な蛍光強度と30分を超える測定が可能となった。循環次年度はまず、モルモット肝静脈平滑筋細胞内カルシウム濃度測定実験の続きを行って、肝静脈平滑筋の特徴的な収縮機構を明らかにする。神経刺激による一過性収縮には外液カルシウムの寄与がほとんどないという結果を確認し、収縮に必要な細胞内カルシウムの動員先を明らかにするため、以下の実験を行う。nifedipineによる電位依存性カルシウムチャネルの阻害剤によって刺激による細胞内カルシウムイオン濃度上昇が阻害されるかどうかや、細胞外カリウム濃度増加による細胞膜脱分極状態によって細胞内カルシウムイオン濃度上昇が起こるかどうか、さらにCyclopiazonic acidによる細胞内カルシウム貯蔵部位からのカルシウム放出阻害によって細胞内カルシウムイオン濃度上昇が阻害されるかどうかを明らかにする。次にこれらの収縮メカニズムに対するアナフィラキシーショックの影響を明らかにするため、モルモット肝静脈の張力と細胞内カルシウム濃度に対するアナフィラキシーのメディエーターである血小板活性化因子とヒスタミンの影響を調べる。肝静脈平滑筋細胞内Ca2+濃度変化の検出に手間取っている。当初想定したよりも細胞内Ca2+濃度変化は小さいためと考えられる。蛍光指示薬をfluo-4 AMよりも感度の高いfluo-8 AMに変え、指示薬の濃度を高めたりロード条件を厳しくすることで検出に成功した。次年度は決定できた条件を用いて肝静脈平滑筋細胞内Ca2+濃度測定を行う。神経刺激による平滑筋細胞内Ca2+濃度測定を行うための実験装置の設計組み立てを行い、神経刺激による収縮に関与する細胞内Ca2+動態の検出を行う。
チオレドキシンは筋収縮時に骨格筋から分泌される新規マイオカインである

本研究では、チオレドキシンが骨格筋から分泌されるマイオカインであるかを検証した。培養骨格筋細胞は刺激を与えない状態でもチオレドキシンを分泌した。細胞を低強度の電気刺激で収縮させた時はチオレドキシンの分泌は増加しなかったが、高強度で刺激すると有意に分泌が増加した。一方、高強度刺激では細胞障害活性も増加しており、漏出による分泌の増加であると考えられた。さらに、チオレドキシンがエクゾソーム経路で分泌されているかについて検証したが、エクゾソーム画分には検出されず、別の経路で分泌されていることが示された。以上よりチオレドキシンは構成性に分泌されるマイオカインであることが明らかになった。近年、骨格筋からホルモン様の蛋白質が分泌されることが示唆されており、総称してマイオカインと呼ばれている。申請者は、これまでに培養骨格筋細胞を血清を使用せずに分化させる培養条件を発見し、これらに電気刺激装置を組み合わせることで、培養骨格筋細胞を収縮させる系を立ち上げた。新規のマイオカインを発見するために、上記の系を用いて収縮後に培養液を回収し、プロテオーム解析に供したところ、複数の分子がマイオカインの候補として挙げられた。本研究では、発見されたマイオカイン候補分子の中からチオレドキシンに注目して、その分泌機序についての検証を行った。チオレドキシンの分泌が収縮依存的であるかについて、培養骨格筋細胞の収縮系で検証したところ、刺激を与えなくてもチオレドキシンが分泌されることが明らかとなった。細胞を低強度の電気刺激で収縮させてもチオレドキシンの分泌増加は観察されなかったが、高強度刺激時には有意な分泌の増加が観察された。一方、高強度刺激では細胞障害活性も増加しており、分泌増加は細胞の膜障害による漏出によると考えられた。チオレドキシンには、一般的な分泌蛋白質が持つ分泌シグナル配列が無いため、これまで知られている分泌蛋白質とは異なる新規のメカニズムで分泌されると考えられる。チオレドキシンの分泌が新規分泌メカニズムの一つであるエクソソーム経路によるかについて検証したが、チオレドキシンはエクソソーム以外の上清画分で検出された。また先行研究ではメチルアミン処理がチオレドキシンの分泌を阻害するとの報告があることから、メチルアミン存在下で分泌の検証を行ったが、チオレドキシンの分泌の阻害は見られなかった。従って、チオレドキシンは、これまで知られている経路とは別の経路を通して分泌されていることが示唆された。本研究は、骨格筋から分泌されるホルモン様の蛋白質であるマイオカインの新規発見とその生理作用の解析を行うことを目的としている。申請者はこれまでに、収縮させた骨格筋細胞の培養上清に抗酸化活性分子であるチオレドキシンが増加することを見出した。これまでは予備的な検討であったので、平成24年度はチオレドキシンの分泌のトリガーとなる収縮刺激条件の設定とチオレドキシン遺伝子のクローニングを同時並行で行った。マウス骨格筋由来C2C12細胞を10,30または60Vの電圧下で1Hz、3msecの電気刺激条件で1,3,6または24時間の電気的な収縮を与えた。それぞれの収縮刺激直後に培養上清を回収・濃縮し、チオレドキシン量をウェスタンブロッティング法によって検討した。その結果、収縮の有無にかかわらず培養上清にチオレドキシン分泌が確認できたが、予備実験の結果に反し、いずれの刺激時間においても収縮によるチオレドキシンの分泌増加は観察されなかった。一方、骨格筋に発現するチオレドキシン遺伝子(cDNA)をPCR法を用いてマウス骨格筋からクローニングした。得られたチオレドキシンは、既知の配列と同じで、骨格筋特異的なサブタイプは存在しないことが明らかとなった。またチオレドキシン遺伝子にHAタグをつけたcDNAも作成し、骨格筋細胞にHAタグ付きの遺伝子をエレクトロポレーション法で過剰発現させた細胞を作成し、電気的な収縮刺激を与え、収縮の有無によるHAタグつきチオレドキシンの培養上清への分泌の確認を行った。その結果、過剰発現させた細胞の培養上清には収縮の有無にかかわらずHAタグ付きのチオレドキシンが確認されたが、収縮による分泌の増加は観察されなかった。以上から、現在の刺激条件下では収縮による分泌調節はみられず、恒常的に分泌されるマイオカインの1つである可能性が示唆されている。当初の計画では平成24年度内に

(1)チオレドキシン遺伝子のクローニングし、骨格筋組織におけるスプライスバリアントの有無を確認し、さらに様々な遺伝子工学実験に使用するためのタグ付きのcDNAを作製すること、(2)チオレドキシンが骨格筋から収縮により調節されるメカニズムの解明に着手する予定であった。(1)に関しては当初の計画通り、マウス骨格筋からチオレドキシンのクローニングを行い、骨格筋に発現しているチオレドキシンが既報の配列と同じである事を確認した。さらに、HAタグを付けたチオレドキシンcDNAを作製し、遺伝子工学のツールとしての使用が可能になった。(2)に関しては、予備実験で得られた、筋収縮によるチオレドキシン分泌の制御が再現できなかったことから、戦略を変更して、チオレドキシンが筋収縮による分泌の制御を受けるか否かについて再検証した。分泌は、骨格筋細胞の収縮刺激パラメータのうち、時間、電圧、等を変化させ検討した。その結果、チオレドキシンは筋収縮刺激がなくとも骨格筋から恒常的に分泌されていること、また筋細胞が壊れた指標となるLDH活性が上昇しているときに分泌されることを明らかにした。当初の計画と方向性が変わってきたが、分泌の様式や解明に向かっていることから、研究は順調に進展しているといえる。平成24年度は効率的な予算執行で研究が推進できたこと、予定している学会には次年度に発表するために、残金が生じた。平成25年度はチオレドキシンの筋収縮による分泌調節について、より激しい刺激条件下での分泌を検討し、LDH活性上昇と分泌との関連性を明らかにする。また、近年、様々な細胞がプロテアーゼ等を分泌しているとの報告もある。これまで、細胞の収縮によって、チオレドキシンの分泌が観察されていない原因として、プロテーゼの同時分泌によりタンパク質が分解された可能性が考えられる。そこで、収縮後の培地中のプロテアーゼ活性の測定を行うとともに、プロテアーゼインヒビターを培地中に添加したのちに収縮刺激を加え、チオレドキシンの分泌が収縮により調節を受けるかについて検討する。いずれの刺激条件においても、収縮による分泌の調節が見られなかった場合には、チオレドキシンは収縮による調節はうけない、いわゆる恒常性に分泌されるマイオカインの一つであると判断できる。既報ではチオレドキシンは繊維芽細胞から分泌されることが明らかとなっているが、チオレドキシンは分泌蛋白質に共通に存在しているシグナル配列を持たないタイプの蛋白質であり、その分泌メカニズムの詳細は明らかにされていない。骨格筋に関しても、チオレドキシンの分泌に関する報告やそのメカニズムの詳細はこれまでに知られていない。チオレドキシンの骨格筋からの分泌メカニズムを検討するため、シグナルペプチドを持たないタンパク質の分泌の形態の1つとして近年注目されるようになったエキソソームの可能性について検討を加える。さらに、以前のプロテオーム解析ではチオレドキシンに関連するタンパク質も、骨格筋細胞の培養上清に存在していることから、これらの蛋白質についての分泌を、チオレドキシンの分泌の様式と比較する。以上の結果を平成25年度の終盤にむけてまとめ、論文にする予定である。本研究は生化学・分子生物学・細胞生理学などの消耗品を多く使用する実験が中心となるため、平成25年度の主な研究経費は消耗品に計上する。平成25年度は、本研究の成果発表および情報収集の場として3学会(日本体力医学会、日本運動生理学会、日本農芸化学会)および1研究会(分子骨格筋代謝研究会)を予定しており、学会費および旅費を200千円計上する。