hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線虫を用いた記憶・学習を制御するノンコーディングRNAの解析

ノンコーディングRNA(ncRNA)はタンパク質をコードしないRNAであり,さまざまな生体組織で多様な生理機能に関与することが明らかになりつつある.高等動物の記憶・学習などの神経活動は複雑な遺伝子発現制御を伴うと考えられ,ncRNAもその一端を担うという証拠が少しずつ報告されつつある.しかし,どのncRNAがどのように記憶・学習や神経の可塑性に関与しているのか,その制御機構については不明な点が多い.本研究では,シンプルな神経機能のモデルとして線虫C. elegansを用いて,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行い,高次神経機能における複雑な遺伝子発現制御機構の解明を目指す.これまでに,記憶・学習に関与するncRNA関連遺伝子を同定するため,ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体を用いて,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行ったが,顕著な異常を示す新規の変異体を同定できなかった.よって昨年度から本年度にかけて,別のアプローチとして,記憶・学習に関与するncRNAの候補を探索するため,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてRNAシーケンスを行い,再現性を確認した.その結果,野生型に比べて変異体で発現が上昇もしくは下降しているノンコーディングRNAを複数確認できた.今後は,これらのノンコーディングRNAのターゲット遺伝子や関連遺伝子の変異体,同様の表現型を示す複数の変異体を用いたRNAシーケンスによって記憶・学習に関与するncRNAの候補を絞り込み,それらがどのように記憶・学習に関与するか,行動アッセイなどを用いて解析する.ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行ったが,顕著な異常を示すものが見つけられなかったため.現在は,別のアプローチとして,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてRNAシーケンスを行い,解析を進めている.本研究では,線虫C. elegansを主なモデルとして,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行う.これまでに,記憶・学習に障害をもつ既知の変異体と野生型でRNAシーケンスを行ってncRNAの発現パターンを比較し,記憶・学習に関与するncRNAの候補を見つけた.これらのncRNA候補については,ncRNA自身の発現細胞や作用を調べ,記憶・学習における機能やターゲット遺伝子,作用機序などを解析し,より包括的な理解を目指す.non-coding RNA(ncRNA)は,タンパク質をコードしないRNAで,多様な生理機能に関与することがわかってきている.これまで,ncRNAは主に発生や分化などの「プログラム」における機能が解析されてきたが,最近になって記憶や学習など「変化」を伴う高次神経機能における役割も見い出されている.神経細胞は,経験を通して刺激に対する応答性を一時的に変化させ,環境に適した応答ができるようになる(これを広義の「学習」と呼ぶ).このような変化は,複雑な遺伝子発現制御を伴うと考えられ,ncRNAもその一端を担っていると予想される.しかし,どのncRNAがどのように記憶・学習や神経の可塑性に関与し,何のシグナルによって制御されているのかについては不明な点が多い.本研究では,線虫C. elegansを主なモデルとして,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行い,高次神経機能における複雑な遺伝子発現制御機構の解明を目指す.本年度は,これまでにncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,生育や運動そのものに異常を示すものを除き,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行った.今後は,さらに詳細なアッセイを行い,環境刺激応答や学習・記憶に異常を示す変異体を用いてRNA sequencingなどを行い,記憶・学習を制御するnon-coding RNAの解析を進める.ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行っているが,これまでのところ異常を示すものが少ない.環境応答については,複数のアッセイが知られているため,今後いくつか試し,それでも候補遺伝子を絞るのが困難な場合は,別のアプローチを検討している.ノンコーディングRNA(ncRNA)はタンパク質をコードしないRNAであり,さまざまな生体組織で多様な生理機能に関与することが明らかになりつつある.高等動物の脳活動の経験依存的変化(すなわち「学習」)は複雑な遺伝子発現制御を伴うと考えられ,ncRNAもその一端を担うという証拠が少しずつ報告されつつある.しかし,どのncRNAがどのように記憶・学習や神経の可塑性に関与し,何のシグナルによって制御されているのかについては不明な点が多い.本研究では,シンプルな脳機能のモデルとして線虫C. elegansを用いて,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行い,高次神経機能における複雑な遺伝子発現制御機構の解明を目指す.昨年度は,記憶・学習に関与するncRNA関連遺伝子を同定するため,ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体を用いて,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行った.しかし,顕著な異常を示す新規の変異体を同定できなかった.よって本年度は,別のアプローチとして,記憶・学習に関与するncRNAの候補を探索するため,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてsmall RNAシーケンスを行った.その結果,野生型に比べて変異体で発現が上昇もしくは下降しているsmall RNAを複数確認できた.

今後は,同様の表現型を示す複数の変異体を用いたRNAシーケンスによって記憶・学習に関与するncRNAの候補を絞り込み,それらがどのように記憶・学習に関与するか,行動アッセイなどを用いて解析する.ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行ったが,顕著な異常を示すものが見つけられなかったため.現在は,別のアプローチとして,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてsmall RNAシーケンスを行い,解析を進めている.ノンコーディングRNA(ncRNA)はタンパク質をコードしないRNAであり,さまざまな生体組織で多様な生理機能に関与することが明らかになりつつある.高等動物の記憶・学習などの神経活動は複雑な遺伝子発現制御を伴うと考えられ,ncRNAもその一端を担うという証拠が少しずつ報告されつつある.しかし,どのncRNAがどのように記憶・学習や神経の可塑性に関与しているのか,その制御機構については不明な点が多い.本研究では,シンプルな神経機能のモデルとして線虫C. elegansを用いて,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行い,高次神経機能における複雑な遺伝子発現制御機構の解明を目指す.これまでに,記憶・学習に関与するncRNA関連遺伝子を同定するため,ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体を用いて,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行ったが,顕著な異常を示す新規の変異体を同定できなかった.よって昨年度から本年度にかけて,別のアプローチとして,記憶・学習に関与するncRNAの候補を探索するため,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてRNAシーケンスを行い,再現性を確認した.その結果,野生型に比べて変異体で発現が上昇もしくは下降しているノンコーディングRNAを複数確認できた.今後は,これらのノンコーディングRNAのターゲット遺伝子や関連遺伝子の変異体,同様の表現型を示す複数の変異体を用いたRNAシーケンスによって記憶・学習に関与するncRNAの候補を絞り込み,それらがどのように記憶・学習に関与するか,行動アッセイなどを用いて解析する.ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行ったが,顕著な異常を示すものが見つけられなかったため.現在は,別のアプローチとして,環境刺激応答に異常を示す変異体を用いてRNAシーケンスを行い,解析を進めている.本研究では,線虫C. elegansを主なモデルとして,記憶・学習に関与するncRNAとその制御因子の解析を行う.これまでに,ncRNAの合成や輸送に関与すると報告されている遺伝子の変異体の中から,環境刺激に対する応答性を調べるアッセイを行った.
ゾニサミドの抗パーキンソン作用発現機序と新規同効薬の探索

我々は日本で開発された抗けいれん薬Zonisamide(1,2-benzisoxazole-3-methane-sulfonamide)がパーキンソン病に対し、顕著な症状改善作用があることを見い出し(Neurosci Res.2001:41:397-399)、この作用機序を明らかにしつつある。我々は今年度の研究でZonisamideが1)ドパミン合成の律速酵素であるtyrosine hydroxylasc (TH) mRNAの合成亢進を介してドパミン合成を亢進させている。2)ドパミン代謝の主な酵素であるMAOB (monoamine oxydase B)に対して軽度の阻害作用をもつ(IC50:28μM)3)Dopaminetransporter (DAT),ドパミン受容体(D1-05)に対する親和性はない。4)ドパミン系以外で抗パーキンソン病薬の作用点として想定されている、グルタミン酸受容体(NMDA, AMPA, kinate),セロトニン受容体(5HT1-7),アデノシン受容体(A1, A2A, A2B)に対しても明らかな親和性を示さない、ことを明らかにした。以上より、現時点ではzonisamideの抗パーキンソン作用はドパミン合成亢進および軽度のMAOB阻害作用を主体としていると考えられる。ZonisamideはT型Caチャンネル阻害作用を持つが、T型Caチャンネル阻害剤が黒質ドパミン細胞のバースト発火を増加させるという報告(Wolfalt & Roeper,2002)があり、ドパミン合成亢進及び抗パーキンソン効果発現に関与している可能性について現在検討中である。研究代表者は、わが国で開発された抗てんかん薬zonisamide(ZNS)が著明な抗パーキンソン作用を示すことを発見し、その臨床効果の確認と作用機序の解明を進めた。臨床効果については我々が中心になり開発元と協力して二重盲検試験を行ったが、それ以外に全国の神経内科専門医を対象にZNSの抗パーキンソン作用を期待しての使用実態調査を行い、著効例16.2%,やや改善を含めた改善例61.2%と高い効果を示すことを確認した。本薬剤はドパミン系刺激作用があることから、抗パーキンソン病薬にて幻覚などの精神症状出現の既往のある患者では副作用として、精神症状が出現する可能性があることが明らかになった。ただし一方で、すでにあった精神症状がZNS併用にて改善した例の報告もあり、注意して使用することが重要と考えられた。一方、作用機序については、すでにdopamine(DA)合成亢進と中等度のMAOB阻害作用を確認している。今年度はDA合成亢進の機序として、T-type Ca channelを介している可能性について検討した。T-type Ca channel阻害剤のNiCl_2(100μM)及びこれとリンクするSK channelの阻害剤であるapamin(300nM)が、特異的に黒質ドパミン細胞がburst firingを増加させることが報告されている。我々は昨年度ZNSがTH蛋白合成亢進に先行してTH mRNAを増加させることをSH-SY5Y細胞を用いて明らかにしたことより、同様の実験系を用い、ZNS, NiCl_2,apaminの作用について検討した。その結果、NiCl_2,apaminはZNSとほぼ同様に時間経過で同様にTH mRNA及びTH蛋白量を増加させたことより、ZNSがT-type Ca channelを介してDA合成亢進作用を示している可能性が高いと考えられた。
急性腎不全におけるアルギナーゼIIの役割と遺伝子治療に関する研究

一酸化窒素(NO)は血管拡張性物質で少量でその作用を持つが、大量に存在する場合には細胞毒素を生じ、炎症物質として作用することが知られている。急性腎不全の予防のためには、少量の血管拡張性を持つNOは重要であるが、細胞毒性を持つ大量のNOの発生は阻止しなければならない。そこでNOの基質であるアルギニンを尿素とオルニチンに変えるアルギナーゼについて検討した。まず腎におけるアルギナーゼII型に対する家兎抗体を作製し腎内存在部位の組織学的に検討した。腎では分子サイズがおよそ36kDaにバンドが認められた。アルギナーゼII型cDNAをサル腎臓由来細胞のCOS-7細胞に導入し、II型アルギナーゼタンパクの発現をウエスタンブロットで解析すると、2本のバンドが得られた。これらは、まだミトコンドリアに移行していない前駆体タンパクとミトコンドリアに移行してプレ配列部分が切断されて生じた成熟体タンパクに相当すると考えられた。尿細管部位別に検討すると、近位尿細管に強く染色された。細胞の染色パターンをみると、サイトゾルに小さな顆粒状を呈しており、ミトコンドリア酵素であることを示している。これらより、アルギナーゼII型は虚血性急性急性腎不全および薬剤性腎不全において最も障害されやすい近位尿細管に存在することがわかった。虚血性急性腎不全および薬剤性腎不全に於ける動態には、現在まではっきりした傾向が無く、障害の程度や部位により異なる可能性があり、現在さらに詳細な部位別の発現に関して、microdissectionによる検討や、laser capture microdissection法などのよる方法を検討している。血管拡張性物質である一酸化窒素(NO)は少量でその作用を持つが、大量に存在する場合には細胞毒性を生じ、炎症物質として作用する。従って、急性腎不全において血管拡張を目的としてNOを増加させることはかえって腎不全を増悪させてしまう恐れがある。そこでNOの基質であるアルギニンを尿素とオルニチンに変えるアルギナーゼを遺伝子レベルで活性化することにより、アルギニン量を減少させ、急性腎不全による細胞障害を未然に防ぐ方法を検討するため、まず腎におけるアルギナーゼII型に対する家兎抗体を作製し腎内存在部位の組織学的に検討した。アルギナーゼII型cDNAをサル腎臓由来細胞のCOS-7細胞に導入し、II型アルギナーゼタンパクの発現をウエスタンブロットで解析すると、2本のハンドが得られた。これらより、アルギナーゼII型は虚血性急性腎不全および薬剤性腎不全において最も障害されやすい近位尿細管に存在することがわかった。一酸化窒素(NO)は血管拡張性物質で少量でその作用を持つが、大量に存在する場合には細胞毒性を生じ、炎症物質として作用することが知られている。アルギナーゼII型cDNAをサル腎臓

由来細胞のCOS-7細胞に導入し、II型アルギナーゼタンパクの発現をウエスタンブロットで解析すると、2本のバンドが得られた。これらは、まだミトコンドリアに移行していない前駆体タンパクとミトコンドリアに移行してプレ配列部分が切断されて生じた成熟体タンパクに相当すると考えられた。尿細管部位別に検討すると、近位尿細管に強く染色された。細胞の染色パターンをみると、サイトゾルに小さな顆粒状を呈しており、ミトコンドリア酵素であることを示している。これらより、アルギナーゼII型は虚血性急性腎不全および薬剤性腎不全において最も障害されやすい近位尿細管に存在することがわかった。虚血性急性腎不全および薬剤性腎不全における動態には、現在まではっきりした傾向が無く、障害の程度や部位により異なる可能性があり、現在さらに詳細な部位別の発現に関して、microdissectionによる検討や、laser capture microdissection法などのよる方法を検討している。
超高エネルギー領域に対応したはじき出し損傷モデルの構築

世界中で単位面積あたりの陽子の数を多くした(大強度化)、百GeVオーダーの超高エネルギーのビームを用いた素粒子物理実験施設の建設が計画されている。しかし、構造材等の交換頻度などを決定する、材料の寿命評価に必要な照射損傷量の計算モデルの検証・改良に必要な、原子はじき出しの起こしやすさを表す「はじき出し断面積」の実測データが全くない。そこで本研究では、独自に開発した小型極低温照射装置を用いて、120 GeV陽子照射による金属に対するはじき出し断面積を測定し、独自の照射損傷モデルを超高エネルギー領域に発展させる。本成果から材料の寿命評価が明確となり、陽子加速器施設の構造材等の安全な管理が可能となる。
好熱性古細菌の遺伝子

好酸好熱性の古細菌Sulfolobus ♯のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の遺伝子をクローニングし、一次構造を決定した結果に基づき、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素とイソクエン酸脱水素酵素の複合系統樹を作製した。Sulfolobusのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と真正細菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の間の根が付くことが分かった。すなわち全ての生物の共通の祖先から真正細菌と古細菌がまず第一に分岐したというこれまで、いくつかの双子の酵素から示されている、生物の系統樹を支持する結果であった。また、真核成分のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は、むしろ真正細菌に近縁であることが分かった。これは、翻訳に関連した遺伝子から得られている結果とは異なっているが、真核生物のイソプロピルリンゴ酸酵素がミトコンドリア由来である可能性を示している。Sulfolobus ♯7のrRNA遺伝子を染色対DNAからクローニングし、その塩基配列を決定した。Sulfolobusの他の種のrRNA遺伝子との系統樹を作製したところ、他の種と明らかに異なる、Sulfolobus属の新種であることが明らかとなった。そこで、Sulfolobus tokodaiiと命名した。登別の温泉より単離した、超好熱性の古細菌のrRNA遺伝子を染色対DNAよりクローニングしその塩基配列を決定した。その塩基配列を既知のCrenarchaeotaに属する古細菌の遺伝子と比較したところ、この菌は既知の古細菌と明らかに異なった古細菌であり、古細菌の中でも深い位置から分岐する全生物の共通の祖先の性質を残した古細菌であることが分かった。
血管内手術に用いるカテーテルシステムの開発とその安全性評価基準の設定

現在有機溶媒に高分子化合物を溶解させた液体塞栓剤が用いられている。これらを病変血管に注入したとき、溶媒が直接血管壁を障害する。ラット頸動脈からこれらの有機溶媒を注入して、血管壁に与える影響を評価した。血管壁への直接障害をなくすためには、ジメチルスルホキシドまたエタノールとも20%程度の低濃度で使用しなければならないことを明らかにした。20%以下の低濃度のエタノールに溶解した液体塞栓材料を開発した。今回合成した高分子素材はメタクリル酸メチルとメタクリル酸2-ヒドロキシエチル共重合体である。メタクリル酸メチルを20%含む共重合体が、エタノール/造影剤混合溶液に対する溶解性さらに血液中での析出速度も適当であった。臨床でも十分に使用に耐える塞栓剤であると考える。臨床的には、病変部位の血管を塞栓するのに有機溶媒が補助的な塞栓剤として働くのがいいのか、また有機溶媒の直接障害がないのが好ましいのかいまだ議論のあるところである。操作性のいいカテーテルを開発するために、カテーテル表面に親水性高分子をグラフトすることで潤滑性の付与が行われている。現在まで種々のグラフト法を開発してきたが、本年度は表面にマクロマ-を吸着後、放電処理を行うことで表面グラフトを行う方法を開発した。われわれが開発してきた方法で、カテーテルに用いられているほとんどの高分子材料に表面グラフトできるようになった。血管内手術に用いるカテ-テルシステム、即ちカテ-テル、血管内へ注入する塞栓材料、留置するバル-ン内へ注入する硬化剤等の開発・改良を試みた。カテ-テルやガイドワイヤ-の操作性をよくするために表面に、滑性の付与が試みられている。シリコ-ンはカテ-テルによく用いられているが、従来シリコ-ン表面に滑性を付与するのは困難であった。今回、シリコ-ンプライマ-の加硫と親水性モノマ-の表面グラフト重合を一度に行う、極めて簡便な滑性付与法を開発した。塞栓材料として、メタクリル酸-2-ヒドロキシエチル・イソプロピルアクリルアミド共重合体(CopolyHEMA-IPAAm)を検討した。モノマ-組成比7:3で重合したCoplyHEMA-IPAAmは、血管造影剤であるイオパミロン370に溶解し、一方血液に接触するとスポンジ状の沈澱を形成する。従来用いられてきた液状塞栓剤は、いずれも血管内皮細胞に障害を与えさらに脳血管障壁を破壊する。CoplyHEMA-IPAAmをイオパミロン370に溶解した液状塞栓剤は、安全性が十分確かめられているイオパミロン370を溶媒として用いた液状塞栓剤であるため、血管内皮細胞に障害を与えることもなく塞栓療法を行えると期待される。さらに、重合時に連鎖移動剤を添加し分子量を低下させ、カテ-テルから容易に注入でき血管内で十分塞栓効果の発揮できるCoplyHEMA-IPAAmを作成した。留置するバル-ン内へ注入する硬化剤として、従来よりHEMAをモノマ-とした硬化剤が用いられてきた。ラジカル重合を用いているため、小さいバル-ンを硬化させようとしたとき、バル-ン壁からの重合阻害剤である酸素の侵入し、バル-ンが硬化しなかった。今回、グルコ-ス酸化酵素を開始反応に組み込むことにより、酸素共存下で重合が促進するシステムを開発した。本硬化剤を用いると、小さいバル-ンも十分硬化できる。以前開発したものを含め上記したものは、動物を用いた安全性試験、さらに一部は臨床研究へと進んでいる。項目別の研究実績を記す。液体塞栓物質;エチレン-ビニルアルコール共重合(EVAL)は多くの臨床実績があるためなかなか捨てがたい。ただ、溶媒として用いているDMSOの体内代謝に一部疑問を投げ掛ける研究者もあり、エタノール等の他の有機溶媒に交換することが望まれていた。今回、難溶解性の静脈注射薬の溶媒として用いられているエタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールと水との混合溶媒にEVALを溶解させることが出来ることを見いだした。現在、その保存安定性や塞栓効果について検討を加えている。

新に臨床応用を開始したオイドラギッド-エタノール系の塞栓物質は、全てのカテーテルに用いることができるという利点がある判面、従来のEVALと比較して血管内での硬化速度が若干早い。今後、この点は改良すべき点であるのかあるいは単に手技的に解決すべきなのか症例数を重ねる必要があると考える。粒状塞栓物質;表面が+に荷電した多孔質セルロースビーズは、血管造影剤に均一分散し微細なカテーテルから容易に病変部位に注入できることを見いだした。現在、犬腎動脈から注入し、その塞栓効果と急性期さらに慢性期の組織反応をしらべている。バルーンカテーテル用硬化剤;小児化領域で、動静脈開存症の治療にバルーンカテーテルの使用検討されている。硬化剤は小児科と共同研究を進めている。カテーテル表面の改質;化学反応でカテーテル表面に高分子電解質をグラフトしその表面の滑り性を向上させる検討を行なった。フィルムを用いた基礎研究は終わり、実際にカテーテル表面に滑り性を付与する検討を行なっている。安全性評価基準;現在ワーキンググループで原案を作製中である。現在有機溶媒に高分子化合物を溶解させた液体塞栓剤が用いられている。これらを病変血管に注入したとき、溶媒が直接血管壁を傷害する。ラット頚動脈からこれらの有機溶媒を注入して、血管壁に与える影響を評価した。血管壁への直接障害をなくすためには、ジメチルスルホキシドまたエタノールとも20%程度の低濃度で使用しなければならないことを明らかにした。20%以下の低濃度のエタノールに溶解した液体塞栓材料を開発した。今回合成した高分子素材はメタクリル酸メチルとメタクリル酸2-ヒドロキシエチル共重合体である。メタクリル酸メチルを20%含む共重合体が、エタノール/造影剤混合溶液に対する溶解性さらに血液中での析出速度も適当であった。臨床でも十分に使用に耐える塞栓剤であると考える。臨床的には、病変部位の血管を塞栓するのに有機溶媒が補助的な塞栓剤として働くのがいいのか、また有機溶媒の直接障害がないのが好ましいのかいまだ議論のあるところである。操作性のいいカテーテルを開発するために、カテーテル表面に親水性高分子をグラフトすることで潤滑性の付与が行われている。現在まで種々のグラフト法を開発してきたが、本年度は表面にマクロマーを吸着後、放電処理を行うことで表面グラフトを行う方法を開発した。われわれが開発してきた方法で、カテーテルに用いられているほとんどの高分子材料に表面グラフトできるようになった。
分子インプリント法を用いた蛋白質のリフォールディングおよび耐熱化システムの構築

当該研究は,分子インプリント法を応用して,蛋白質のリフォールディングの促進および耐熱化蛋白質のセレクションを行うことを目的とする。本研究では,まず3-Aminophenylboronic acidを加えて重合させることにより,リゾチームと特異的に結合する分子インプリンティングポリマー(MIP)を作成した。このMIPを用いて,尿素変性したリゾチームのリフォールディングに対する効果を解析した。その結果,MIPを加えない場合よりリゾチームのリフォールディング効率は低下してしまった。その原因として,変性したリゾチームがMIPの疎水性の部分に結合した可能性が考えられる。そこで,より親水的なアクリルアミドを用いて作成したMIP存在下において変性還元リゾチームのリフォールディングを行い,活性の回復を測定した。その結果,MIPを加える量の増加に伴いリフォールディング率も増加し,最終的に約90%のリフォールディングがみられた。これに対し,リゾチーム無添加条件下で作成したnon-MIPを加えてもリフォールディングはみられなかった。従って,MIPが変性還元リゾチームと特異的に結合し,リフォールディングを促進したと考えられる。一方,同様に変性還元ペプシンのリフォールディングを行ったところ,CDスペクトルはほぼネイティブ状態と同様のところまで回復したが,活性の回復は15%にとどまった。従って,正しくリフォールディングした分子の割合は少ないと考えられる。さらに,RNase HI耐熱化変異体のMIPへの選択的結合実験を行った。野生型,変異体混合蛋白質溶液を調製し,5065°Cの範囲で加熱したところ,室温では両蛋白質ともMIFとの結合がみられたが,加熱温度60°C以上においては,変異体のみ結合がみられた。従って,熱変性しない変異体のみがMIPが選択的に結合することが示された。当該研究では,分子インプリント法を応用して,蛋白質のリフォールディングの促進および耐熱化蛋白質のセレクションを行うことを目的とする。今年度は,Lysozymeに対する分子インプリンティングポリマー(MIP)の作成を行い,Lysozymeのリフォールディング促進効果を解析した。3-Amino-phenylboronicacid (APBA)100mMを含むリン酸緩衝溶液(pH 5.0)にLysozymeを溶解し,Lysozyme/APBA混合溶液を調製した。この混合溶液にスチレンビーズ200mg,過硫酸アンモニウム溶液50mMをそれぞれ加えて重合させ,その後,10mM塩酸で洗浄しMIPを作成した。MIPにLysozyme溶液を加え,重合条件(Lysozyme濃度)が異なるMIPへのLysozymeの特異的結合を,抗Lysozyme抗体を用いたELISA法により解析した。Lysozymeを加えず重合したMIPでは,MIP量が増加しても基質の発色には変化が見られず,Lysozymeは結合していないと考えられる。これに対し,Lysozymeを加えて重合したMIPではMIP量の増加に伴い基質の発色も増加した。従って,これらのMIPにはLysozymeが特異的に結合していると考えられる。そこで,このMIPを用いて,尿素変性したLysozymeのリフォールディングに対する効果を解析した。その結果,MIPを加えない場合よりLysozymeのリフォールディング効率は低下してしまった。その原因として,変性したLysozymeがMIPの疎水性の部分に結合した可能性が考えられる。今後は界面活性剤により変性したLysozymeのMIPへの結合を防いだり,より親水性のMIPを作成してリフォールディングを試みる予定である。

今年度は,卵白リゾチームおよびペプシンに対する分子インプリンティングポリマー(MIP)の作成を行い,リフォールディング促進効果を解析した。また,大腸菌リボヌクレアーゼHI (RNase HI)に対してMIPを作成し,変性した蛋白質と構造を形成した蛋白質のMIPへの吸着能の差を利用した耐熱化蛋白質の探索法の開発を目指した。MIPは各蛋白質にアクリルアミド誘導体およびビスアクリルアミド誘導体を加えて重合させることにより作成した。リゾチームに対して作成したMIP存在下において変性還元リゾチームのリフォールディングを行い,活性の回復を測定した。その結果,MIPを加える量の増加に伴いリフォールディング率も増加し,最終的に約90%のリフォールディングがみられた。これに対し,リゾチーム無添加条件下で作成したnon-MIPを加えてもリフォールディングはみられなかった。従って,MIPが変性還元リゾチームと特異的に結合し,リフォールディングを促進したと考えられる。一方,同様に変性還元ペプシンのリフォールディングを行ったところ,CDスペクトルはほぼネイティブ状態と同様のところまで回復したが,活性の回復は15%にとどまった。従って,正しくリフォールディングした分子の割合は少ないと考えられる。さらに,RNase HI耐熱化変異体のMIPへの選択的結合実験を行った。野生型,変異体混合蛋白質溶液を調製し,5065°Cの範囲で加熱したところ,室温では両蛋白質ともMIPとの結合がみられたが,加熱温度60°C以上においては,変異体のみ結合がみられた。従って,熱変性しない変異体のみがMIPが選択的に結合することが示された。
原子層物質の共鳴ラマン分光

原子層物質は原子1個分の厚さの膜からなり、膜の数、種類、重ね方などの積層構造に物性が依存するため、これまでの物質にはない性質の発現や物性の制御法の発見が期待されている。炭素原子からなる原子層物質のグラフェンにおいて、2枚のグラフェンを膜面に垂直な軸に対して角度θだけ回転して重ねた2層グラフェン(TBG)はθに依存して物性が変化することが知られている。グラフェンを始めとする原子層物質の物性と積層構造の関係の解明は重要であり、また原子層物質の積層構造を判別する手法の研究も必要とされている。共鳴ラマン分光はグラフェンの物性研究に広く使われている光学測定法であり、他の原子層物質においてもラマンスペクトルの解析から原子層物質の積層構造と物性に関する知見を得られると期待される。本研究では、共同研究者による実験と佐藤による数値計算からTBGのラマンスペクトルのGバンド強度の増強が起こる励起光エネルギーと層間隔の関係を明らかにした。TBGの層間距離が狭まるにつれてGバンド強度の増強が起こる励起光エネルギーが増加し、その後に減少するという数値計算の結果は共同研究者による実験結果の傾向を説明している。また、TBGのGバンドについて共同研究者による実験と佐藤による数値計算との比較からGバンド強度の増強についての解析を詳細におこない、TBGのモアレパターンとの関連およびラマン散乱過程における光励起キャリアの寿命を解析し、θが10度から15度では顕著な角度依存がないことを示した。さらにTBGにおけるラマン散乱過程、ラマンピーク強度とラマンシフトおよび積層構造と励起光エネルギーとの関係、数値計算プログラム群の開発についての研究を推進した。本研究で得られた知見は原子層物質の基礎研究や将来の光学デバイス開発などへの応用が期待される。原子1個分の厚さの膜からなる原子層物質は、層の枚数、種類、重ね方といった積層構造で物性を変えられるため、新規物性や新規機能の発現が期待されている。グラフェンは炭素原子からなる原子層物質であり、グラフェンを別のグラフェン上にある角度(ねじれ角)だけ回転して重ね、2層とした原子層物質を積層構造がねじれた2層グラフェンという。積層構造がねじれた2層グラフェンの物性はねじれ角に依存するため、ねじれ角と物性の関係解明は重要であり、また他の原子層物質の物性を理解する際の知見も得られると期待される。共鳴ラマン分光は炭素材料の物性探究に広く使われている光学測定法であり、ラマンスペクトルの理論解析から積層構造と物性解明についての知見が得られると期待される。佐藤健太郎は積層構造がねじれた2層グラフェンのラマンスペクトルのStokes-anti-Stokes散乱におけるStokes散乱とanti-Stokes散乱の相関の解明をおこなうために、積層構造がねじれた2層グラフェンのラマンピーク強度とラマンシフト、ねじれ角、励起光エネルギーとの関係を求める計算プログラム群の開発と改良を進めた。計算プログラム群を用いて、共同研究者らによる積層構造がねじれた2層グラフェンのラマンスペクトル中のRやR'バンドの励起光エネルギーとねじれ角の関係、結晶構造が変化した場合のGバンド強度変化の実験結果について、佐藤健太郎による数値計算を用いた解析と議論をおこなった。本研究では、積層構造がねじれた2層グラフェンのラマン散乱過程および結晶構造によるラマン強度変化を解明するための知見が得られた点において重要である。本研究の目的は理論と数値計算から原子層物質である積層構造がねじれた2層グラフェンのStokes-anti-Stokes散乱におけるStokes散乱とanti-Stokes散乱の相関の解明し、また励起子効果と結晶構造の関係の説明をおこない、原子層物質における共鳴ラマン分光の理論を展開することである。平成27年度における研究実施計画では積層構造がねじれた2層グラフェンの励起子エネルギーを求める計算プログラム群の開発が平成28年度以降のために主に計画されていた。佐藤健太郎は研究実施計画に基づき、積層構造がねじれた2層グラフェンにおける励起子エネルギーを求める計算プログラム群の準備を進めていたが、共同研究者らによる本研究に関する重要な新規実験結果の解析をおこなう必要が生じた。本研究を遂行する上での研究計画・方法に従って平成28年度は主に共同研究者らによる実験結果について積層構造がねじれた2層グラフェンにおけるGバンドだけではなくRやR'といった積層構造がねじれた2層グラフェンに特徴的なラマンピークの結晶構造や励起光エネルギーとの関係、またラマン散乱過程の議論を数値計算を用いて進めてきた。研究成果は論文として共同研究者らと発表準備中である。本研究の目的、研究推進方策と平成27年度における研究進捗状況を比べると、これまでの研究成果は本研究課題の推進方策におおむね基づいており、また本研究課題の目的を達成するために必要である。原子1個分の厚さの膜からなる原子層物質は、層の枚数、種類、重ね方といった積層構造に物性が依存するため、積層構造を工夫することにより新規物性の発現や応用が期待される。炭素原子からなり原子1個分の厚さを持つ膜であるグラフェンを2枚重ねた物質は2層グラフェンと呼ばれる原子層物質であり、その層に垂直な軸に対して一方の層が標準的な重なり方からある角度だけ回転して重なった状態を積層構造がねじれた2層グラフェン(TBG)という。TBGは層間の角度により光学的性質などの物性を制御できる原子層物質の一種である。

TBGなどの原子層物質の物性を調べるには光の非弾性散乱を利用するラマン分光が広く用いられており、TBGでは散乱光中のGバンドとよばれるピークの強度と入射光や角度との関係から物性が調べられてきた。本研究ではTBGの積層構造と物性の関係のうちTBGのグラフェン層間の間隔にも注目し、共同研究者による層間方向に圧力を加えてグラフェン層間距離を変えることによりGバンド強度の変化を調べる実験および佐藤健太郎によるTBGの電子構造の数値計算から層間間隔とGバンド強度変化の関係を示した。TBGは特定の角度と入射光エネルギーでGバンドの強度が増強することが知られている。数値計算は層間距離が減少するとGバンドの強度が増強するのに必要な入射光エネルギーが増え、その後にゆるやかに減少する傾向を示し、共同研究者による実験結果の傾向と一致している。本研究により層間間隔とGバンド強度の増強が起こる入射光エネルギーとの関係が明らかとなり、このようなTBGの積層構造に強く依存する特性は光学デバイスなどへの応用に有用であると期待される。平成28年度において共同研究により明らかにした原子層物質である積層構造がねじれた2層グラフェンにおける層間距離とGバンド強度の増強が起きる入射光エネルギーの関係を明らかにすることは当初の研究実施計画には明示されていなかった。しかし、共同研究者による本研究に関する新規実験結果の解析および考察が必要とされたため、当初の本研究課題を推進する上での研究計画および方法に基づいて優先度を組み替えて研究を推進した。平成28年度の研究成果は原子層物質のラマンスペクトルにおける励起光エネルギー、結晶構造との関係を明らかにするという本課題の研究目的に一致しており、また原子層物質である積層構造がねじれた2層グラフェンの積層構造と光学特性に新たな知見を与えている。本研究の目的、研究推進方策と平成28年度における研究進捗状況を比べると、これまでの研究成果は本研究課題の推進方策におおむね基づいており、また本研究課題の目的を達成するために必要である。グラフェンは原子1個分の厚さの炭素原子からなるシート状の物質である。グラフェンが2枚重なった2層グラフェンのうち、層に垂直な軸に対して片方の層が回転して重なったものが積層構造がねじれた2層グラフェンである。積層構造がねじれた2層グラフェンは原子層物質の一つであり、2層のなす角度に光物性が依存するという特徴を持っているため、光エレクトロニクスへの応用などが期待されている。本研究では、積層構造がねじれた2層グラフェンのラマンスペクトル中のGバンドについて、強束縛法を利用した数値計算結果と共同研究者らによる実験結果との比較および考察から、積層構造がねじれた2層グラフェンのGバンド強度の増強効果に関する現象についての詳細な解析をおこなった。積層構造がねじれた2層グラフェンのモアレパターンと関連があり、状態密度中に現れるファン・ホーブ特異点のエネルギーを測定されたラマン励起プロフィールから解析し、またラマン散乱過程における光励起キャリアの寿命を解析した。光励起キャリアの寿命は積層構造がねじれた2層グラフェンの2層のなす角度が10度から15度という中間的な角度の時には顕著に角度に依存しないことを示した。
日本人スペイン語学習者の書記コミュニケーションに関する中間言語語用論的研究

現在は電子メールやスマートフォンアプリなど、書記によるコミュニケーションが頻繁に用いられる時代となっており、外国語教育においても、上記のような媒体を使用したコミュニケーション技術の教育に目を向ける必要がある。このことから本研究は、日本における語用論的側面を加味したスペイン語作文教材・教授法の開発を目標とし、具体的にはいくつかの課題についてスペイン語で書いたメッセージを日本人スペイン語学習者とスペイン語圏各国のスペイン語ネイティブ話者から収集し、分析・比較対照することより、日本人が陥りやすい語用論的誤りを洗い出し、それらを考慮に入れたスペイン語作文教材および教授法の開発へと繋げる。
ＮＬＲＰ３およびＮＬＲＣ４のリガンドの探索、同定

NLRP3およびNLRC4タンパク質に直接結合して活性化する分子を探索し、これらを同定することを目指した。研究遂行の過程で、複数の問題点が生じ、結果的に、研究期間内には、目的に近づくことすらできなかった。しかし、NLRP3の活性化機構をさまざまな視点から解析する過程で、いくつもの新しい知見を得られた。NLRP3経路活性化に伴ってセラミドが増加すること、塩素イオンの動態がNLRP3活性化に関与すること、成熟IL-1βの細胞外輸送を阻害する化学物質が存在することなどを明らかにできた。本研究ではふたつの細胞内シグナル伝達タンパク質、NLRP3およびNLRC4のリガンドを同定することを目指し、当初、(1)無細胞系におけるNLRP3/NLRC4活性化系の確立、(2)セミインタクト細胞におけるNLRP3/NLRC4活性化系の確立、そして(3)マクロファージ由来の脂質によってNLRP3/NLRC4が活性化される可能性の検討、を計画した。平成24年度も前年度に引き続き(1)および(2)のための条件検討を進めたが、無細胞系あるいはセミインタクト細胞中でのNLRP3/NLRC4の活性を制御することはできず、目標の実現に困難を感じている。(3)については平成23年度の検討で既に当初の仮定が否定されたため、継続を中止した。(3)の実験は中止を余儀なくされたが、従来よりNLRP3の活性化には何らかの脂質代謝の関与が示唆されているので、NLRP3活性化に並行して生起する脂質代謝の変化を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)により解析してみた。その結果、NLRP3活性化に並行して細胞中のセラミドが増加し、さらにはセラミド種(脂肪酸鎖長)のパターンに特徴的変化が生じることが判明した。現在、この現象とNLRP3活性化との因果関係を検討している。また、平成24年度からは当初の計画に加えて、表面プラズモン共鳴センサーを応用したリガンドの探索を目指した実験を開始した。現在、培養細胞を用いてNLRP3タンパク質の合成し、その純化を進めている。前年度までの研究結果に従って当初の計画を大幅に変更したが、平成25年度もNLRP3の活性化機構の解析を継続し、以下のことを行った。(1)NLRP3の活性化に並行して細胞内のセラミドが増加することが判明したので、セラミド合成系の阻害剤を用い、セラミドの増加とNLRP3の活性化の因果関係を検討した。しかし、de novo経路およびスフィンゴミエリンからの経路によるセラミド合成がNLRP3活性化の原因となることを示す証拠は得られなかった。(2)NLRP3活性化経路はホスホリパーゼ阻害剤で阻害されることが知られているので、NLRP3活性化に伴って細胞内で遊離する脂肪酸を検出することを計画した。予備的に、ガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸組成を網羅的に検討することを試み、NLRP3活性化刺激に伴って細胞内遊離脂肪酸組成にわずかな変化が生じることを観察した。(3)NLRP3活性化へのミトコンドリアの関与を検討することにした。マクロファージ系細胞株を用いてミトコンドリア欠損状態を作り、NLRP3活性化の有無を検証することにした。現在、従来知られる複数のミトコンドリア破壊法を検討している。また、ミトコンドリアDNAとNLRP3との結合を表面プラズモン共鳴センサーを利用して確認すべく、材料を準備した。(4)NLRP3活性化経路を阻害する新規天然化合物を探索したところ、NLRP3活性化を阻害するものを見い出すことはできなかったが、caspase-1の活性化には影響しないにも関わらずIL-1betaの消化を阻害する化合物を見いだした。本研究ではふたつの細胞内シグナル伝達タンパク質、NLRP3およびNLRC4直接活性化する分子(リガンド)の同定を目指している。リガンドの探索のため、平成23年度は(1)無細胞系においてNLRP3およびNLRC4を活性化する系の実現性、および(2)セミインタクト細胞においてNLRP3およびNLRC4を活性化する系の実現性を検討した。(1)の目的のために細胞を溶解する際の界面活性剤の種類や溶存する塩類を検討したが、その過程で、NLRP3およびNLRC4の共通の下流因子であるASCタンパク質を活性化するためには細胞の構造がある程度保持されている必要があることが示唆され、完全な無細胞系においてNLRP3およびNLRC4活性化経路を構成することは困難であると考えられた。(2)の目的のために、必要な細胞株など材料を準備したが、セミインタクト細胞を調整し、シグナル伝達経路の再構成を検討する段階にまで至らなかった。(1)および(2)に加えて、(3)マクロファージ由来の脂質によってNLRP3およびNLRC4が活性化される可能性を検討した。

本研究を提案する前に行った予備実験においてこの可能性が示唆されていたが、当該予備実験の結果を確実に再現することはできなかった。実験結果に影響を及ぼす未知の因子があることが示唆されたが、いまだそれが何であるかは不明である。平成23年度は論文や学会発表として公表できる成果を挙げることはできなかったが、提案していた3つの可能性の検討を行うことができ、今後の方針を決める判断材料を得た。さらにこの結果を踏まえて、研究の新たな方向性を探り始めた。研究代表者が平成23年4月に所属施設を替わり、新規に研究室を立ち上げたため、研究は当初の計画通りには進展していない。しかし平成24年度にはだいたい研究環境が整い、従来行っていた実験を遂行できるようになった。さらには新たな手法を導入することもできるようになった。実験の結果、当初の研究計画を軌道修正しなければならなくなっているが、着実に新たな知見を積み上げている。本研究提案の代表研究者は平成23年4月に所属施設を替わり、新しい所属施設において新規に研究室を立ち上げ、新たに研究環境を整備しなければならなかった。そのため、研究計画の開始が予定よりも遅くなった。また、予定外の支出があり、予定した研究のための物品を揃えることができず、計画の一部を遂行することができなかった。NLRP3およびNLRC4のリガンドを同定することを目指してきたが、本研究計画の最終年度である平成25年度は、主にNLRP3に注目して解析したい。特に次の2つの計画を実施する。(1)NLRP3の活性化に並行して観察される構成セラミド種の変化とNLRP3活性化との関係を明らかにしたい。まずスフィンゴミエリナーゼ阻害剤あるいはNLRP3のRNA干渉などを用いることで、両者の因果関係を検討したい。特に、もしセラミド代謝の変化がNLRP3活性化の原因であるならば、これを手がかりとしてNLRP3リガンドの探索を進めたい。(2)表面プラズモン共鳴センサーを応用したNLRP3リガンドの探索を進めたい。まず培養細胞で合成したNLRP3タンパク質を精製し、それをセンサーに結合させ、NLRP3活性化刺激を加えられた細胞中にNLRP3タンパク質に結合するような分子を検出できるか確認したい。もしそのような分子の存在を確認できるなら、NLRP3リガンドである可能性を検証し、単離へと進めたい。また他の研究室からミトコンドリアDNAがNLRP3リガンドとして働くとする報告があるが、これを検証したい。NLRP3およびNLRC4のリガンドを探索・同定するために(1)無細胞系によるシグナル伝達系の再構成、(2)セミインタクト細胞におけるシグナル伝達系の再構成、(3)マクロファージ由来脂質によるNLRP3またはNLRC4の活性化、の可能性を探っていたが、平成23年度の検討の結果(1)および(3)の実現は困難であることが示唆された。したがって(1)および(3)のこれ以上の検討を中止し、平成24年度は(2)に絞って、検討を継続する。
新規抗ワクモワクチン開発のためのワクモ中腸特異的抗原の網羅的解析

養鶏業に多大な被害をもたらしているワクモに対する新規ワクチンの開発を目指して、その候補抗原としてワクモ中腸に発現する分子の探索を行い、3種の分子を同定し、これら分子がワクモの中腸や卵巣で発現していることを確認した。また既に我々が同定した候補抗原であるカテプシンD様タンパク質について解析した結果、この分子が発育ステージ等に関わらず恒常的に発現し、吸血鶏由来の血清に反応しないことから非暴露型抗原であることが示された。今回同定した分子のより詳細な性状解析を行い、ワクチン抗原として有用性を評価していく必要がある。ワクモ(Dermanyssus gallinae)は、吸血による鶏の削痩や貧血、産卵率の低下や汚卵の発生など養鶏業に大きな被害をもたらしており、さらに近年は駆虫剤に対する耐性ワクモの出現や薬剤の残存による環境汚染が問題となっており、抗ワクモワクチンなど新規防除法の確立が必要となっている。そこで本研究では、ワクモ中腸等に発現する非暴露型抗原の網羅的解析を行い、新規抗ワクモワクチン候補因子の探索を目指して研究を実施した。今年度は、既に申請者の研究室で樹立したワクモ発現配列タグライブラリーより、マダニ等で既に非暴露型抗原として報告されているものとの相同分子の探索・同定を行った。その結果、候補因子としてEpdermal Growth Factor Receptorなど、いくつかの分子を同定し、全長遺伝子のクローニングに成功した。さらにレーザーマイクロダイセクション法にて、同定した遺伝子のワクモ体内における発現部位の特定を行った結果、同定したEpdermal Growth Factor Receptorは卵巣に、さらに他の因子の中には、中腸および卵巣に特異的に発現しているものがあることが示された。そこで、これらの因子について、その詳細な機能やワクモの吸血阻止効果などを検討するために組換えタンパクを調製した。次年度以降、さらに多くの抗ワクモワクチン候補因子の探索を行うとともに、同定した因子について、in vitro feeding assayにて、ワクチンとしての有用性を検討していく。抗ワクモワクチン候補因子として、Epdermal Growth Factor Receptorなどいくつかの分子を既に同定し、さらにこれらの因子が、ワクモ体内の臓器・組織等に特異的に発現する因子であることを示した。さらのその後の詳細な解析のための組換えタンパクの調製も行ったので、概ね順調に進展していると判断した。ワクモ(Dermanyssus gallinae)は、吸血による鶏の削痩や激しい貧血、産卵率の低下や汚卵の発生など養鶏業に大きな被害をもたらしており、さらに近年はその駆除に使用されている駆虫剤に耐性を持つワクモの出現や駆虫剤の残存による環境汚染が問題となっており、抗ワクモワクチンなどの新規防除法の確立が必要となっている。そこで本研究では、昨年度に続き、ワクモ中腸等に発現する非暴露型抗原の網羅的解析を行い、新規抗ワクモワクチン候補因子の探索を目指して研究を実施した。昨年度は、候補因子としてEpidermal Growth Factor Receptorの解析を実施したが、今年度は、さらに他の非暴露型抗原としての候補因子を我々の研究室で吸血ワクモより作成したワクモ発現配列タグライブラリーを用いて探索・同定した。その結果、非暴露型抗原の候補因子として、いくつかの因子を同定し、その中でも、その構造からワクモ中腸の細胞膜表面に発現していると考えられるAdipocyte Plasma Membrane-associated Protein (APMAP)の全長遺伝子のクローニングに成功した(全長1,212 bp)。そしてワクチンとしての効果を検討するため、ブレビバチルス発現系による組換えAPMAPの発現に成功した。今後、in vitro feeding assayによるワクチンとしての有用性を、ワクモの吸血阻止能を指標として、検討を検討すると同時に、ワクモ体内における発現部位の特定を行う予定である。ワクモは吸血時間が短いため、暴露型抗原を用いた抗ワクモワクチンの効果はあまり期待できない。また今回、非暴露型抗原として、いくつかの抗ワクモワクチン候補因子を同定したが、他にも有用な因子が存在する可能性が大きく、また単一抗原でのワクチンの防御効果には限界があると思われる。そこで、さらに、将来、カクテルワクチンへの応用等を目指して、同定した因子の詳細な解析とともに多くの抗ワクモワクチン候補因子(非暴露型抗原)を同定していく。また、ワクモの基礎研究基盤の確立のため、全ゲノム解析に着手する。獣医学当初実施予定であった次世代シークエンサーを用いたワクモの全ゲノム解析を実施できなかったため、次年度での計画として実施することとしため。ワクモ試料の厳選を行い、ワクモの基礎研究基盤の確立を目指して、国内分離ワクモに関して、次世代シークエンサーを用いたワクモの全ゲノム解析を実施する。
迅速な裁判のための証拠収集手続論

本業績「提訴前手続きにおける相手方の協力義務に関する一試論」(香川法学27巻3・4号65頁)では、迅速な裁判手続の実現には、提訴前の段階を含めた証拠収集手続が重要な意義を持つということを前提とし、提訴前の証拠収集手続において、相手方に証拠収集に応じるべき義務を課すことができるかという問題について考察を行った。民事訴訟法は、平成8年の改正以降に証拠収集手段の拡充を図ってきた。このなかで、提訴前及び提訴後の照会、提訴前の証拠収集処分等が新たに設けられた。しかし、これらの手続において、情報や証拠を有する相手方がなぜ手続に応じなければならないのか、という問題についての理論的な検討は不十分なままであった。そのため、実効性が期待できないこの手続の利用は芳しくない。本業績は、このような状況について、証拠収集手段の拡充のためには、これらの手続において相手方の協力義務を理論的に基礎づける必要があることを主張している。そのうえで、提訴後において証明責任を負わない相手方が協力すべき義務として従来論じられてきた、事案解明義務をめぐる議論を参考として、提訴前の証拠収集手続における相手方の義務を導き出すことを試みている点に本業績の意義がある。すなわち、本業績は、提訴後に証明責任を負わない相手方が主張・立証過程で協力すべき義務と結びつけて、この義務を相手方に課しうるか否かの判断の際に、提訴前手続において協力義務を果たしていたかを遡及的に判断することを唱えている。このように提訴後の時点で遡及的に判断を行うことで、提訴前の段階だけでは大きな義務違反の効果を生じさせることができないという従来の課題も解決可能となる。今後、この理論的基礎づけにより提訴前の証拠収集手続の利用が進めば、より迅速な裁判手続が期待できることから、本業績は、この問題についての議論の契機として、迅速で適正な裁判の実現にとって意義を有する。平成18年度は、「迅速な裁判のための証拠収集手続論」の課題について、年度当初にあげた目標達成のため、1、日本国内における証拠収集手続をめぐる具体的問題についての検討と、2、証拠収集手続にかかる問題を検討するにあたり参考とすべき外国(おもにドイツ)の同様の制度についての情報収集と分析を行った。平成18年度においては、特に日本国内における証拠収集手続に関する問題として、文書提出義務をめぐる近年の判例の分析と先行研究のとりまとめを行った。この過程で、判例(最高裁判所平成17年11月10日第一小法廷決定)を取り上げて考察を行い、判例研究を福岡民事訴訟判例研究会(2007年1月開催)において報告した。この判例研究および関連する文書提出義務にかかる問題の考察は、判例研究として、法政研究(九州大学法政学会)74巻1号においてその成果を発表予定である。上記の判例研究は、日本における近年の民事訴訟法改正に伴い、証拠収集手続のなかでももっとも大きな改正がなされた文書提出義務に関する最高裁決定についての考察である。本判例は、市議会の会派所属の議員が政務調査費を用いて行った出張に関する報告書の文書提出をめぐる事例である。この判例についての考察を通し、本研究の課題である「迅速な裁判のための証拠収集手続論」について、日本の証拠収集手続における具体的問題状況の一端を事例とともに明らかになった。19年度は、考察の範囲をさらに広げ、日本における証拠収集手続きにおける具体的な問題状況を明らかにしつつ、外国の制度との比較法的考察を試みる予定である。