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切迫早産例に対する本邦独自の治療法を見直し、効率的な治療戦略を確立するための研究

切迫早産の治療転機を、早産(A群),治療終了直後分娩(B群)、治療終了後いったん退院(C群:over treatmentの可能性)に大別すると、A群では、子宮内炎症・感染が(高感度PCRで38%検出)主な原因であった。その子宮内炎症は、羊水中IL-8値によって組織学的絨毛膜羊膜炎の重症度を予測できることを初めて報告した。B群およびC群の相違点は、入院時の組織学的絨毛膜羊膜炎に満たない軽度の子宮内炎症であったため、まったく炎症がない症例ではより早期に治療を終了できる可能性が考えられた。maintenance tocoysis終了直後の分娩が、子宮内炎症と関連がある知見は初めてである。A群(早産群:より適切な治療と分娩時期を見直すことで早産予後を改善可能と考えられる群)の入院時羊水検査(患者同意のもと施行)結果から、病原微生物検出率は38%(41/108)であった。特にウレアプラズマ属・マイコプラズマ属が関与している場合には、子宮内の炎症が強く惹起されやすく、妊娠維持機構が破綻しやすいという大きな特徴があることがわかった。また、現在までに切迫早産例に対する抗菌薬の有効性は証明されていないが、病原微生物陽性例に対して適切な抗菌薬を投与し、陰性例には投与しないほうが、妊娠期間の延長効果につながる可能性を発表した(日本産婦人科学会シンポジウ2014.4.18)。B群およびC群に関しては、本邦独自のmaintenance tocolysisの有効性を直接示す検討に関しては、昨年までにまとめた結果(31.2%で治療終了直後に分娩に至っており、羊水中の軽度の炎症、頚管熟化が関与)のままであるが、頚管熟化を抑制する可能性としてプロゲステロン筋注が関与している可能性を見出せた。A群(早産群:より適切な治療と娩出時期を見直すことで早産予後を改善可能と考えられる群)の分娩前羊水検査で病原微生物検出率は32%(33例/103例)であった。特に、ウレアプラズマ属と細菌との重複感染症例(14例)では、子宮内炎症(羊水中IL-8)が有意に高い特徴がみられ、早産予後が不良(妊娠期間の有意な短縮が認められた。)であった。ウレアプラズマ属の子宮内感染症例に対しては通常使用するセフェム系あるいはペニシリン系の抗菌薬では効果がないため、アジスロマイシン系の抗菌薬を使用することで早産予後改善に期待できる可能性があると考察される。また、胎胞形成を認めるような頚管無力症は超早産の可能性が高いが、黄体ホルモン製剤の投与により妊娠期間の延長効果が認められる可能性があることを報告した。B群およびC群に関するmaintenance tocolysisの有効性に関する検討に関しては、31.2%の割合で治療終了直後に分娩に至っており、これらの症例こそ本邦独自のmaintenance tocolysis治療が有効であった切迫早産症例であるが、羊水中の炎症(IL-8)が軽度に上昇している可能性、および妊娠中期の最短子宮頚管長が10mmを切っている可能性が見いだせている。切迫早産の治療転帰は、早産(A群)、治療終了直後分娩(B群)、治療終了後いったん退院(C群:over treatmentの可能性)に大別される。A群では、子宮内炎症・感染が主な原因であり、胎児炎症反応症候群、感染症に注意した娩出時期を検討する必要があるが、その子宮内炎症を羊水中のサイトカイン(IL-8)を用いて具体的に組織学的絨毛膜羊膜炎のどの段階であるのかを予測する方法を報告し、また、病原微生物の存在は38.0%に認め、これらの有無を確認した上で抗菌薬を適切に使用することが妊娠延長期間に影響していた。さらに頸管熟化傾向が強い症例に対しては、黄体ホルモン製剤が早産予防に役立っている可能性が示唆された。B群およびC群においては、子宮内の軽度炎症(組織学的絨毛膜羊膜炎I度に満たない程度)が、maintenance(long-term) tocolysis終了直後の分娩(31.2%)と関連があることが示唆された。自然早産の分娩時期は、その組織学的絨毛膜羊膜炎(子宮内炎症)の重症度に最も影響を受けるとされるが、本研究からもそれを支持する結果が得られた。特に、maintenance tocolysis終了直後の分娩にも、この子宮内炎症が関与している点は、新しい知見である。また、この原因のひとつと考えられる子宮内病原微生物の存在する確率は、当院で開発した高感度PCR法によれば、38.0%であり、培養法が陰性であっても分娩予後は不良であることが確認された。

さらに、病原微生物陰性例に対する抗菌薬の使用はかえって妊娠期間を短縮させており、注意すべきと考えられた。切迫早産A群早産予後改善には、羊水中の病原微生物の有無を正確に把握し、陽性例に対して抗菌薬を使用し、反対に陰性例には使用しない管理方法が約2週間の妊娠期間の延長効果がある可能性を見出した。早産予後改善目的のA群に関しては、ウレアプラズマ属の感染例で予後不良であることが判明した。今後はこの迅速システムの特徴を活かし、ただちに治療を開始することで早産予後の改善に期待したい。また、プロゲステロン製剤は抗炎症効果が指摘されているため、炎症が少なからず存在している切迫早産症例に対して有益性が高い可能性があることを見いだせた。1.組織学的絨毛膜羊膜炎と羊水中IL-8値との相関に関して、英語論文にまとめている。3.切迫早産に対する抗菌薬の適切な投与による妊娠期間の延長効果(約2週間)は、本邦特有の切迫早産管理(諸外国に比べ比較的症状が軽いケースが対象となり、かつ、maintenance tocolysis施行がメイン治療)だからこそ、有益性が見出せる可能性があるため、症例数を増やして検討予定(可能なら多施設共同研究)。1.A群(早産群)の予後改善が可能かどうかを見極めれるように症例数を増やすと同時に、現在ウレアプラズマ属の子宮内感染に有効とされているアジスロマイシンの点滴投与を積極的に行い、子宮内炎症と感染という観点から結果を解析。2.プロゲステロン製剤が超早産予後の改善に寄与している可能性に関しても症例数を増やし検討すると同時に子宮内の炎症マーカーについても検討する。ほぼ計画に沿って使用できている。次年度で使用予定。該当なし
Bacillus brevisを用いたヒト・繊維芽細胞増殖因子の分泌生産

Bacillusbrevisを用いた繊維芽細胞増殖因子(FGF)の高効率分泌生産の検討をした。1.FGFにB.brevisの細胞壁蛋白質MWPシグナルペプチドを遺伝子レベルで融合した場合、FGFの有意な蓄積は認められなかったが、シグナルペプチドを改良(アミノ末端に2つのアルギニン残基、中央疎水領域に3つのロイシン残基を挿入)することにより初めて、FGFと思われる産物(抗FGF抗体と特異的に反応する)を確認することができた。この産物の分子量はFGF標品の分子量よりも1000ほど大きかった。シグナルペプチドの切断が予想とは異なる部位で起きており、FGFのアミノ末端に余分なアミノ酸配列が付加していると結論した。以後この産物をFGF'と呼ぶことにする。FGF'は培地画分ではなく、細胞画分に分画された。菌体表面に吸着している可能性を考え、他の蛋白質生産で効果のあった界面活性剤を培地中に添加したが、培地画分へのFGF'の遊離は認められなかった。存在状態を調べるために、菌体の外側からプロテアーゼを作用させる実験を行った。その結果、FGFと思われる産物は外側から加えたプロテアーゼに対し安定であることが明らかとなった。この産物は細胞壁あるいは細胞質膜の内側に存在し、分泌過程のいずれかの段階で止まってしまっていると考えた。FGFは典型的な分泌蛋白質とは異なり、元来シグナルペプチドを持たない。現在もなお、その分泌機構は不明である。FGFは分泌に適さない何らかの構造を有しているのかもしれない。2.FGF発現・分泌プラスミドを安定に保持する変異株の取得に成功し、この変異株を用いることにより、本研究を遂行することが出来た。3.B.brevis由来のプラスミドを用いた生産性の高いベクターの開発については行うことができなかった。4.培地組成、培養温度等、培養条件を検討した結果、5mg/l程度のFGF'の生産に成功した。
新規シグマー１受容体の機能解明と神経変性疾患治療への応用

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動神経障害を伴う神経変性疾患である。私達はALSの原因遺伝子シグマー1受容体のE102Q変異体が神経変性を誘導する機序を解析し、神経変性を抑制する候補化合物を探索した。シグマー1受容体(E102Q)変異体を発現した神経細胞ではミトコンドリアATP産生が低下し、小胞体ストレスが加わるとミトコンドリア機能低下による神経細胞死が誘導された。ATP産生を促進するために、メチルピルビン酸を処置するとミトコンドリアATP産生が回復し、神経細胞死も抑制された。シグマー1受容体(E102Q)変異体によるALSの障害はメチルピルビン酸により、治療できることが示唆された。若年性の筋萎縮側索硬化症(ALS)の原因タンパク質としてsigma-1受容体(R)(E102Q)の変異が見つかった。本研究では神経芽腫細胞neuro2A細胞にsigma-1R(E102Q)遺伝子を導入して、小胞体ストレスの誘導とミトコンドリアATP産生に対する変異体の影響を検討した。ミトコンドリアATP産生はsigma-1R(E102Q)の細胞内凝集に伴って、有意に低下した。さらに、通常は核内に存在するTDP-43が細胞質に漏出し、TDP-43のユビキチン化も促進された。原因として、ATP低下に伴い、プロテオソームによるタンパク質分解系が障害されていることが示唆された。一方、小胞体ストレスについて検討した結果、sigma-1R(E102Q)の過剰発現では小胞体ストレスマーカーであるPERK、IRE1の発現やリン酸化状態には変化がなく、変異体の凝集自体が小胞体ストレスを誘導することはないと考えられる。さらに、小胞体ストレスを誘導するtunicamycinの存在下においても、小胞体ストレスを増悪することはなかった。しかし、LC3-IIの発現を指標にしてautophagyを検討したところ、tunicamycin存在下でのsigma-1R(E102Q)の発現はautophagyを著しく促進し、その結果アポトーシスを誘導することが明らかとなった。最後に、ATP低下が神経細胞変性の引き金となることを確認するために、TCA回路の基質で解糖系も刺激するmethyl pyruvateの効果を検討した。予測した通り、methyl pyruvateの処置はsigma-1R(E102Q)誘導によるTDP-43の核外漏出とautophagyを有意に抑制した。本研究は、sigma-1R(E102Q)変異体の発現は徐々に細胞内ATP産生を低下させ、小胞体ストレス下において神経細胞死を誘導することを明らかにした。Sigma-1受容体アゴニストであるSA4503は脳血管性認知症の認知機能改善薬および抗うつ薬として臨床試験が行われている。しかし、Sigma-1受容体の神経系における役割と遺伝子変異による神経変性のメカニズムは不明である。本研究ではSigma-1部分欠失受容体(Sigma-1S受容体)の脳内分布と機能的役割について追究した。1)Sigma-1S受容体はSigma-1受容体と複合体を形成して、脳内では共局在した。2)Sigma-1受容体がIP3受容体と複合体を形成するのに対して、Sigma-1S受容体はIP3受容体と結合しない。3)Sigma-1S受容体はSigma-1受容体の機能であるミトコンドリアへのカルシウム輸送を抑制し、IP3受容体刺激に伴うミトコンドリアATP産生を抑制した。さらに、4)小胞体ストレスに伴う、ミトコンドリア障害とアポトーシスに対してSigma-1S受容体の過剰発現は増悪した。これらの結果から、Sigma-1S受容体はSigma-1受容体に対して、機能阻害する変異体であることが明らかとなった。しかしながら、IP3受容体以外のタンパク質に対するシャペロン機能に相違があるのか、さらにどのような病態でSigma-1S受容体が誘導されるのか不明である。私達はSigma-1受容体アゴニストがミトコンドリアへのカルシウム輸送を促進する一方で、細胞質へのIP3受容体依存性カルシウム放出を抑制することを発見した。この病態での意義についてさらに追究する。本研究の目的は、1)Sigma-1S受容体の神経細胞での発現の機能的な役割を明らかにすること。2)Sigma-1遺伝子変異による神経変性疾患と小胞体ストレスに伴うSigma-1S受容体の発現が神経細胞死を惹起するメカニズムを明らかにすることである。1)に関しては24年度で目的を達成した。2)に関しても8割以上達成しているが、Sigma-1S受容体が誘導される病態にすいては解明できていない。

私達は新たに筋萎縮性側索硬化症の家系に見つかったSigma-1遺伝子変異(E102Q)が機能異常を示し、神経細胞体で凝集体を作るメカニズムを発見した。この変異はSigma-1S受容体と同じような小胞体およびミトコンドリア障害を示すことから、病気発症の原因であると考えられる。これらの遺伝子変異体の機能を解明することは神経筋変性疾患の病態を解明する重要な手がかりとなる。1)Sigma-1遺伝子変異(E102Q)の神経細胞での局在とIP3受容体および他の分子に対するシャペロン機能の変化について追究する。2)アルツハイマー病、脳虚血、うつ病ではSigma-1受容体が発現低下することが知られている。Sigma-1アゴニストであるSA4503のアルツハイマー病、脳虚血、うつ病モデル動物での神経保護作用とSigma-1受容体の発現低下の病態との関わりを追究する。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額を合わせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
超対称性のない弦模型の物理と宇宙観測による検証

時空10次元の超弦理論に基づく模型の余分な6次元空間は現在の実験で観測できない程度に有限体積でかつ小さくなっていなければならず、さらにその大きさと形は時間変化せずに安定でなければならない。その安定性を超対称性のない弦模型におけるDブレーンの非自明な動力学によって実現する機構を提案した。また、弦模型における電弱ゲージ対称性の自発的破れを超対称性のない弦模型におけるDブレーンの非自明な動力学によって実現する機構も提案した。さらに、超対称性のない弦模型において宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分について予言を行い、さらに、宇宙観測の専門家と共に、その予言が実際に観測によって支持されることを示した。時空10次元の理論である超弦理論の余分な6次元空間は現在の実験で観測できない程度に有限体積でかつ小さくなっていなければならない。これを余分な6次元空間の「コンパクト化」という。さらに、その小さな有限6次元空間の体積や形状が時間変化しないように固定されていなければならない。これを「コンパクト空間の安定化」という。「コンパクト空間の安定化」が達成されていないと宇宙観測と矛盾する重力に似た多種の力が存在してしまうことになる。「コンパクト空間の安定化」について、特に超対称性のないDブレーンの配位によってそれを達成する可能性を追求した。磁気を帯びたDブレーン、および、複数のブレーンの間の引力と斥力のバランスの組み合わせによってそれを達成することを具体的な模型を構成して提案した。ある枠組みでの超対称性のないDブレーンの模型("brane supersymmetry breaking"によって超対称性が破れた模型)における、宇宙のインフレーションの始まりの現象についての予言を正確に行い、WMAP9やPLANCK実験のデータと比較して超対称性のないDブレーンの模型の可能性を示唆した。弦模型におけるゲージ対称性の自発的破れはその上にゲージ対称性を実現するDブレーンという物体の配位の変化によって起こる。もっとも単純な配位の変化(平行分離)では現実の素粒子の世界で起きているような複雑なゲージ対称性の自発的破れは実現できない。現実の現象を表現するためにはいくつかのDブレーンが「消える」ことに相当する物理が必要である。そこで弦模型の6次元コンパクト空間(現在の実験で観測されないほど小さく丸まった空間)における離散対称性を利用して、Dブレーンが移動した時に離散対称性によって複数のDブレーンが同一視されるような状況を提案した。例えば3回離散回転対称性を考えると回転中心から離れた3つのDブレーンがひとつのDブレーンに同一視され、現実の現象を表現する候補になる。超対称性があると、回転中心から離れた3つのDブレーンの中心からの距離は特定の値に決まらず、現実の世界を記述しない。そこで超対称性を破るような系を構成し、反Dブレーンによって中心に引きつけられるDブレーンがその中心の周りの公転による遠心力により、中心から特定の距離に落ち着くという機構を提案した。宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分が標準的な宇宙模型による予想よりも有意に少ないことを宇宙観測の専門家と共に明らかにした。このような現象は超対称性のない弦模型では自然に表現できることである。ゲージ・ヒッグス統一模型はヒッグス場とゲージ場の統一を試みる模型で、主に素粒子の電弱ゲージ対称性の自発的破れの問題の解決のための模型である。この模型に対して電弱ゲージ対称性の物理からではなく、強い相互作用の物理から制限を与え得ることを指摘した。弦模型におけるゲージ対称性の自発的破れの斬新な機構を提案することができ、より現実的な素粒子模型を弦理論において構成する可能性が開けたため。宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分が標準的な宇宙模型による予想よりも有意に少ないことを明確に指摘できたことは宇宙のインフレーションの理解において大変重要な情報を与えるため。時空10次元の超弦理論に基づく模型の余分な6次元空間は現在の実験で観測できない程度に有限体積でかつ小さくなっていなければならず(6次元空間は「コンパクト化」されていなければならない)、さらにその大きさと形は時間変化せずに安定でなければならない(「コンパクト空間の安定化」)。その安定性を超対称性のないDブレーンの配位とそれらの間に働く引力や斥力の釣り合いによって達成する機構を提案した。超弦理論におけるDブレーンの配位の変化によってゲージ対称性の自発的破れが起こる。現実の世界の電弱ゲージ対称性を表現するためにはDブレーンが「消える」ことに相当する物理が必要であり、それを余分な6次元空間が持つ離散対称性によるDブレーンの同一視によって実現する機構を提案した。超弦理論に基づく模型の中で特に超対称性が"Brane Supersymmetry Breaking"によって破れた模型において、宇宙のインフレーションの始まりの現象について予言を行った。そして、宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分が標準的な宇宙模型による予想からずれる可能性を指摘した。さらに、宇宙観測の専門家(PLANCK実験グループのメンバー)と共に、宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分が標準的な宇宙模型による予想よりも統計学的に有意に少ないことを明らかにした。これが真実であるならば、我々は宇宙のインフレーションの始まりを観測していることになり、宇宙の非常に初期の現象やそれを支配している法則を知る機会が与えられていることになる。超弦理論の有効理論としても考えることのできるゲージ・ヒッグス統一模型に加速器実験から制限を与える研究を行った。

また、古典的にスケール不変な物理系において強結合相互作用によってスカラー場に負の2乗質量が生成されて電弱ゲージ対称性が破れる機構を提案した。時空10次元の超弦理論に基づく模型の余分な6次元空間は現在の実験で観測できない程度に有限体積でかつ小さくなっていなければならず、さらにその大きさと形は時間変化せずに安定でなければならない。その安定性を超対称性のない弦模型におけるDブレーンの非自明な動力学によって実現する機構を提案した。また、弦模型における電弱ゲージ対称性の自発的破れを超対称性のない弦模型におけるDブレーンの非自明な動力学によって実現する機構も提案した。さらに、超対称性のない弦模型において宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分について予言を行い、さらに、宇宙観測の専門家と共に、その予言が実際に観測によって支持されることを示した。「コンパクト空間の安定化」を完全に実現した模型を構成することには成功していないが、それを部分的に達成する具体的な模型を提案し、さらに進むべき方向を提案することができたため。宇宙のごく初期に超弦理論が関与する現象が現れていた可能性を実験データから示唆することについて、相当程度に深く追求できたため。弦模型におけるゲージ対称性の自発的破れの新しい機構をより詳細に理解し、この機構を電弱対称性の自発的破れの機構として用いた現実的な素粒子模型の構成を試みる。これまでの模型の構成は電弱対称性の自発的破れをほとんど想定していなかったので、模型の構成の方向としては全く新しいものになる。宇宙背景輻射のゆらぎの大角度成分が少ないことを、観測データ(PLANCK実験による)のより詳細な検討を行うことによって、より有意なものになるかどうかを調べる必要がある。素粒子物理学(理論)今年度の研究によって、「コンパクト空間の安定化」を完全に実現した模型を構成することは非常に難しく、この問題については慌てずに一歩一歩着実に進む必要があることを教訓として得た。特に、超対称性のない状況でのDブレーンの物理が重要であるが、これについてはほとんど未知であり、これから明らかにすべきことが多い。そこで、見通しのよい簡単な系を構成して、超対称性のない状況でのDブレーンの物理を明らかにしつつ、その物理を利用した「コンパクト空間の安定化」の機構を提案する。
近代北欧文学における「脚部障碍」の表象-セルマ・ラーゲルレーヴを中心に

本研究は、これまでの日本において研究対象となることが少なかった北欧文学の主要作品の中から、ラーゲルレーヴ『モールバッカ』(スウェーデン、1920)およびアンデルセン『人魚姫』(デンマーク、1837)を取り上げ、「脚部障碍」モチーフに着目して分析することで、これらの作品をアカデミックな視点から批判的に論じ、近代北欧文学の枠を超えて、古代ギリシアに始まるヨーロッパ文化史の中に位置付けた。平成23年度は、ラーゲルレーヴの自伝的作品『モールバッカ』(l922)における脚部障碍の表象が、どのように障碍者・他者の排除に加担し、またそこからどのようにして離脱する可能性を示しているかを、同時代の優生学思想、福祉国家スウェーデンの断種の歴史、ラーゲルレーヴのドイツ民族主義における受容などと関連づけて研究し、日本独文学会秋季研究大会で発表した。ここでは、研究実施計画で予定したとおり、「女性」と「病/障碍」の関係に着目し、その表象に現れる他者排除のあり方と、女性障碍者の異世界との往還能力を指摘した。この研究の意義は、ドイツ文学界に対して、ドイツ民族主義という従来あまり顧みられてこなかった分野をカバーし、その中での北欧受容という、申請者ならではの視点を提示した上で、反・反ユダヤ主義・平和主義と民族主義がどのように共存したのかを知らしめることにある。更に、ジェンダー論、文明(批判)論を取り入れることで、「ドイツ文学」「北欧文学」という、言語による文学区分を離脱する可能性を示す。「北欧文学」の不活性や、近年の「ドイツ文学」研究の行き詰まりの一因は、一つの言語に限定された文学研究のあり方にある。本研究は、脚部障碍、伝説、ジェンダー、優生学など、各国文学に共通するテーマを、ドイツ文学界に身を置く北欧文学者として提示することで、北欧文学のみならず、ドイツ文学・各国文学が、他国語文学とつながり、相互に発展していく可能性を開くものである。「脚部障碍者」の一例としての「人魚」に着目し、アンデルセン『人魚姫』および「人魚」モチーフに着目した研究を行った。2012年度前半は、美しい声で船乗りを魅了し遭難させる水辺の魔物(ギリシア神話のセイレーン、ドイツのローレライ、スラブのルサルカ)、人間の男性との結婚によって魂を得る異類婚(ヨーロッパのウンディーネ、メリュジーヌ)、悲恋の表象としての鱗・蛇体(鬼女)など、『人魚姫』と関連付けられる、東西のさまざまな神話・伝説・作品を考察した。その成果は、中丸禎子「人魚姫のメタモルフォーゼ」(石井正己編『子守唄と民話』所収、三弥井書店、2013年3月)として刊行された。後半は、デンマークおよびアンデルセン研究が盛んなドイツで資料を収集し、『人魚姫』のテクスト分析的解釈を行った。その成果は、中丸禎子「越境する人魚」(北ヨーロッパ学会全国大会、2012年11月)で発表した。また、中丸禎子「アンデルセン『人魚姫』における脚部障碍の表象」(日本独文学会春季研究発表会、2013年5月)で発表が確定している。『人魚姫』は、従来、1デンマーク文学、2作家の伝記的研究、もしくは、3ドイツ・ロマン主義の人魚モチーフ文学研究の枠組みで研究されてきた。本研究は、『人魚姫』を、12を超えて、ヨーロッパの人魚モチーフ文学史の枠組みでとらえなおし、「脚部障碍」に着目して分析することで、3に収斂されないアンデルセン文学の特殊性を論じた。この結果、世界中で読まれ、他の作品との影響関係の強い『人魚姫』と、その他者排除のあり方について、新たな解釈を示すことができた。日本独文学会秋季研究発表会で、研究の意義・立場も盛り込んだ口頭発表を行い、聴衆から一定の評価を受けることができた。現在、発表会で得たコメントをもとに、当発表をもとにした論文を執筆中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、口頭発表・投稿論文に対する意見・批判をもとに、ラーゲルレーヴ作品および北欧文学の諸作品における「脚部障碍」論を引き続き発展させていく。研究遂行上のもっとも大きな問題は、現在の日本において、北欧文学研究者は、数が限られており組織化が困難なことである。このため、本研究の成果は、日本の北欧文学や文学研究全体に対して影響を与える機会が少ない。この状況を打開するため、「スタートアップ研究支援」終了後を見越して、ドイツ、ロシア、フランス、日本、中国各国文学の若手研究者と共に、共同研究を発足した。ここでは、「脚部障碍」者のヴァリエーションと捉えられるアンデルセン『人魚姫』を共通テクストとし、そこから論じうる様々なテーマを論じていく。
プロスタグランジンの短工程合成

プロスタグランジンは強力な生物活性を有数する天然有機化合物であり、その誘導体は医薬品として臨床で使用されている。我々はdophenylprolinol silyl ether触媒を用いるスクシンアルデヒドとニトロアルカンとの形式的不斉3+2付加環化反応を開発し、得られたシクロペンタンカルバルデヒドを単離する事なく、連続してリン酸エステルとのホーナー・ワズワース・エモンス反応を行い、ω-鎖を構築し、プロスタグランジンに必要な全炭素を導入した。以下の変換反応も少ないポット数で行い、3つの反応容器を用いるだけの効率的な位PGE1メチルエステルの合成法を確立した。多くの研究者によってその合成研究が行われている。実際に医薬品の製造に用いられているCoreyの合成では、例えばPGE1に関しては19段階のステップを必要とする。我々は短工程でのPGE1メチルエステルの合成を検討した。我々は既にdiphenylprolinol silyl ether触媒がアルデヒドとニトロアルケンのマイケル反応の優れた触媒であることを明らかにしている。今回、スクシンアルデヒドとニトロアルカンにこの触媒を作用させると、不斉触媒マイケル反応に引き続き、Henry反応が進行し、形式的不斉3+2付加環化反応が進行する事を見出した。アルデヒドを単離する事なく、連続してリン酸エステルとのホーナー・ワズワース・エモンス反応を行い、ω-鎖を構築し、プロスタグランジンに必要な全炭素を導入した。(-)-Diisopinocamphenyl chloroboraneを用いてα-鎖のC15位カルボニル基をジアステレオ選択的に還元し(dr = 96 : 4),アリルアルコールとした後、ニトロアルコールの脱水反応によりニトロアルケンを収率75%で合成した。エナンチオ選択性は94% eeと極めて高く,最初の不斉反応が立体選択的に進行している事が明らかになった。次にDABCOを作用させることにより、一挙にシクロペンテノンが生成した。以下、過酸化水素水によりエポキシドとした後,亜鉛によるエポキシドの開環反応によりプロスタグランジンE1メチルエステルを合成した。なお、最後の4段階は一つの反応容器内で行う事ができ、最終的には3つの反応容器を用いるだけの効率的なPGE1メチルエステルの合成法を確立する事に成功した。プロスタグランジンは強力な生物活性を有数する天然有機化合物であり、その誘導体は医薬品として臨床で使用されてきた。我々は昨年度の研究で、既にプロスタグランジンE1メチルエステルのわずか3ポットでの合成に成功している。この合成の途中で我々は予期していなかったニトロアルケンからのα,βー不飽和ケトンへの変換反応を偶然見いだした。この反応は前例がなく、有機合成化学的には重要な反応である。そこで反応機構に関する検討を行った。その結果、ニトロアルケンからはα,βー不飽和ケトンが生成するが、ニトロアルカンからはケトンが生成する事を見いだした。種々反応条件の検討を行った結果、反応には酸素が必須である事を明らかにした。ラジカルクロック実験を行い、反応系のNO2-とNO3-の濃度測定を行った。これらの実験を通して、以下の反応機構を明らかにした。ニトロアルカンに塩基を作用させるとニトロナートが生成し、酸素へ1電子移動が起こる。ラジカルカップリング反応が進行し、ジオキシランを生成する。ここで生成したジオキシランともう一分子のニトロナートが反応して、ケトンが生じる。本反応は広い一般性を有し、多くのニトロアルケン、ニトロアルカンから、α,βー不飽和ケトン、およびケトンが非常に温和な条件下生成する。さらに、プロスタグランジンE1メチルエステルで得られた知見を基に、慢性動脈閉塞症の治療薬であるベラプロストの合成に取り組んでいる。今回の研究で開発したスクシンアルデヒドとニトロアルケンの不斉形式的3+2付加環化反応を利用する事により、シクロペンタン骨格の合成に成功している。我々は本萌芽研究で、既にプロスタグランジンE1メチルエステルのわずか3ポットでの合成に成功している。この合成の途中で我々は予期していなかったニトロアルケンからのα,βー不飽和ケトンへの変換反応を偶然見いだし、その反応機構に関する詳細な検討を行った。昨年度は、プロスタグランジンの他の誘導体の合成を目的に、まず始めに、鍵反応とするスクシンアルデヒドとニトロアルケンの不斉形式的3+2付加環化反応の一般性の検討を行った。その結果、diphenylprolinol silyl etherを用いた、連続的不斉触媒マイケル反応、分子内Henry反応によるドミノ型形式的3+2付加環化反応が、広い一般性を有する事を明らかにすることができた。さらに、この反応を用いて、慢性動脈閉塞症の治療薬であるプロスタグランジン誘導体であるベラプロストの合成に取り組んだ。まだ全合成には成功していないが、基本となるシクロペンタン部位は高い不斉収率で得られる事を明らかにした。またω鎖を有する部分構造の合成に成功した。今後、αー鎖の不斉合成を行い、全合成を達成する予定である。

我々はdophenylprolinol silyl ether触媒を用いるスクシンアルデヒドとニトロアルカンとの形式的不斉3+2付加環化反応を開発し、得られたシクロペンタンカルバルデヒドを単離する事なく、連続してリン酸エステルとのホーナー・ワズワース・エモンス反応を行い、ω-鎖を構築し、プロスタグランジンに必要な全炭素を導入した。以下の変換反応も少ないポット数で行い、3つの反応容器を用いるだけの効率的な位PGE1メチルエステルの合成法を確立した。当初予定していたプロスタグランジンE1メチルエステルの合成を3ポットで達成する事ができた。さらに、その反応の過程で見いだした前例のない酸素を用いたNef反応の反応機構を明らかにするだけでなく、その反応の最適化を行い、一般性に関しても検討を行うことができた。予想していなかった多くの成果が得られ、研究が当初の計画よりも進展していると判断した。有機合成化学これまでプロスタグランジンE1メチルエステルを合成できたが、プロスタグランジン誘導体には実際の医薬品として使用されている化合物が他にも色々存在する。そのような化合物も今回開発した手法を利用すれば簡便に合成する事ができると考え、それらの化合物の短工程合成法に挑戦する。慢性動脈閉塞症の治療薬であるベラプロストは東レと科研製薬で共同開発されたプロスタグランジン誘導体であり、ラセミ体として臨床で用いられている。光学活性体の合成が求められている。プロスタグランジンE1メチルエステル合成で開発したスクシンアルデヒドとニトロアルケンの不斉形式的3+2付加環化反応を利用することにより、シクロペンタン環の合成を行い、昨年開発した酸素を用いるNef反応を適用する事により、シクロペンテノンに導き、その合成を達成する予定である。予定化合物のプロスタグランジンE1メチルの3ポット合成法を予定よりかなり早く確立することができた。研究計画段階では、できるだけ短工程での全合成を目指していたが、わずか3ポットで合成する事ができるとは予期していなかった。予想以上の成果であると考えている。昨年、プロスタグランジンE1メチルエステル合成の過程で見いだした酸素を用いるNef反応という、予想以上の成果が得られた。その一方で、プロスタグランジン誘導体の一つであるベラプロストの合成に取りかかったところであり、その合成に関しては予定よりも遅れている。次年度、ベラプロストの合成を達成するために、研究費を使用する。初年度の研究でプロスタグランジンE1メチルエステルを合成できたが、プロスタグランジン誘導体には実際の医薬品として使用されている化合物が他にも存在する。また本合成の途中で見いだした、不斉触媒3+2付加環化反応に関してもその一般性を検討する。新規光学活性シクロペンタン誘導体の合成手法としての確立を目指す。これまでの検討で、スクシンアルデヒドとニトロアルケンの不斉形式的3+2付加環化反応を利用する事により、シクロ
エピジェネティック変異発動システムによるリンゴ枝変わり品種の作出

特定のsiRNAを産生するコンストラクトを導入した個体を穂木とし、これに接ぎ木した台木へ篩管輸送によりsiRNAを供与して、台木の篩管周辺組織に特定遺伝子の転写型遺伝子サイレンシングを発動させることができる。このサイレンシングはDNA複製を通して維持されることから、サイレンシング発動組織より再分化体を獲得すれば、サイレンシング個体を作出することができる。本研究はこの系を栄養繁殖性果樹であるリンゴ樹に適用すべく各工程に関する実験を行い、その成果を得たものである。塩基配列変化を伴わない遺伝子発現抑制機構、転写後型ジーンサイレンシング(Transcriptional Gene Silencing,TGS)が知られている。これはエピジェネティック(後成遺伝)現象であり、TGSは遺伝子のプロモーター領域と相同な配列を持つ二本鎖RNAの存在下で誘導され、一般にメチル化を伴う。この機構により誘導された発現抑制が自殖後代でも維持されることが判っていることから、その発動は植物育種にも活用できると指摘されている。さらに、植物においてsiRNAは篩管を介して全身に運ばれる事実が明らかにされている。そこで、siRNAを接ぎ木輸送させることで、接ぎ木のパートナー個体にTGSを発動できるかどうかを検討した。siRNAを篩管特異的プロモーターで発現させたタバコに、そのsiRNAに相同配列を有するプロモーター(35S)にGFPを連結した人工遺伝子の導入タバコを接ぎ木して、GFPの発現抑制を解析した。その結果、TGS発動が確認された。その発現抑制は、台木から穂木へよりも、その逆の穂木から台木に対して強く表れた。これは、siRNAの篩管輸送が茎や葉から根の方向へより多く輸送されることを意味する。さらに、抑制は根の側根で極めて強く発動する事実が観察された。側根は主根の内部、篩管周辺組織である内生細胞より形成されることから、そこから分化する側根ではTGSが全細胞で発動するものと考察された。リンゴなどの果樹では根生不定芽が形成することから、このTGS発動システムの果樹での実用が期待される。また、より多くのsiRNAシグナルを篩管輸送させる専用ベクターの作製を試みた。このベクターは伴細胞特異的プロモーターによる転写と増幅系を有している。さらに、複数の制限酵素認識配列を設けて、その部位へ任意の遺伝子を挿入するだけで、その挿入遺伝子のsiRNAを産生できるという汎用性を持たせた。siRNA長距離輸送の導入個体を接ぎ木し、その接ぎ木相手にTGSを発動できることが我々の実験により明らかにされた。そこで、このシステムをリンゴにおいて実用するため、そのターゲット遺伝子として当該研究室で解析してきたMdACS3aを選択した。その理由としては、MdACS3aがリンゴ果実において日持ち性と大きく関わるものと判断されたことによる。すなわち、果実ライプニングに関わるACC合成酵素遺伝子の一つであるMdACS3aの発現は、リンゴ果実におけるMdACS1によるエチレン生成バーストの開始に重要な役割を果たしている。そこで、転写型サイレンシング発動を目的としたコンストラクトはMdACS3aプロモーター領域の-65-403をinverted RepeatとしたMdACS3aPro-IRとしして、リンゴの台木品種マルバカイドウに形質転換中である。さらに、リンゴ品種の日持ち性はエチレンシグナルより下流にあるβポリガラクツロナーゼにより規定される事実を過去において発表してきた。そこで、この遺伝子にTGSを発動させることが極めて有効であるものと判断された。PGプロモーターの-bから-bまでをインバーテド繰り返し配列として、MdPG1ProIRをプロモーターをCoYMVとしたコンストラクトを作製した。また、これをリンゴに形質転換するには時間を要することから、タバコ(N.benthamana)葉におけるアグロインフィルトレーションを実施して、一過的に産生されるsiRNAをこのタバコとリンゴを幼苗にて接ぎ木させることで、タバコ穂木からリンゴ(王林)台木へと輸送させて、王林にTGSを発動させて、その発動組織からの再分化を図る。これらのシステムを現在検討している。篩管を介して接ぎ木相手にsmall RNAを送り込むことで、接ぎ木相手の一部の組織における相補なDNA配列にメチル化を介してジーンサイレンシングを発動させることができる事実がタバコとトマトとの間で証明できた。そこで、このシステムをリンゴで行うための技法を検討した。先ず、siRNAを産生できる導入用コンストラクトを構築した。リンゴのターゲット遺伝子としてポリガルクツロナーゼMdPG1を選んだ。この遺伝子産物は果実の後熟過程で特異的に発現し、細胞壁を分解・果肉を軟化させる酵素である。このプロモーター配列約1 kbを得て、これの逆位反復配列を構成することで2本鎖RNAを経てsiRNAを産生させることができた。このコンストラクトをリンゴ栽培種に接ぎ木可能な野生種Malus sieversiiの子葉からの培養組織に導入した。

また、この野生種と栽培リンゴ王林との接ぎ木を継代培養シュート間で成立させる技術を確立した。siRNAを接ぎ木相手に輸送させるのは穂木から台木方向が大きいこと、さらに側根にはサイレンシングが全域に起こる事実から、培養体の根からの再分化体を獲得することで、サイレンシング個体が獲得される。そこで根生不定芽を得るためにフェノール系化合物のフロログルシノールを含む培地上に根を置床することで、再分化体が獲得できることに成功した。一方、リンゴの場合、継代培養シュートの基部よりカルスを経て不定芽が形成されることから、siRNA産生個体を穂木、王林を台木として接ぎ木し、そのシュートの基部より新生シュートを得ることで、直接エピゲノミックの変化による枝変わりが獲得される系が考案された。リンゴは永年生栄養繁殖性作物であり、長い成長期間においては様々な突然変異がおこる。突然変異の原因はトランスポゾン転移説が有力であったが、この数年でエピジェネティックな変化が関与している例も知られてきた。すなわち、接ぎ木などによってもエピジェネティックな変化が確認されている。そこで、接ぎ木でsiRNAを接ぎ木相手に輸送させて、接ぎ木相手にエピ変異を発動させることをリンゴで行うシステムに挑戦した。リンゴでのある内生遺伝子のプロモーター配列を得て、それを逆位反復配列としこれを恒常的発現プロモーターCaMV35Sにてドライブするコンストラクトを完成させて、タバコの葉へのアグロインフィルトレーションにて一過的に強発現させたところ、21-24nt small RNA産生が確認された。上記のコンストラクトをリンゴのRNA篩管輸送ターミナルである伴細胞で発現させるべく、伴細胞特異的な機能を示すCammelina Yellow MottoleVirusのプロモーター(CoYMV)を用いた。その伴細胞特異的発現はCoYMV:GUS導入リンゴの3年木においても強力に機能することを確認した。そこで、リンゴにおいてサイレンシングを受けると有用形質になると考察された複数の遺伝子の二本鎖RNAをCoYMVにて産生するためのコンストラクトを作製し、実際にそのsiRNAが確認されるかを調査したところ上述のタバコの系で検出できた。しかし、実際のリンゴの形質転換体の作出は、リンゴ培養体のコンタミが拡大したため、本格的に取り組めなかった。予備実験において、タバコ間ではTGSの発動は接ぎ木個体で明確に認められている。スターターであるsiRNAコンストラクトは作製されている。さらに、ターゲット遺伝子を保有するリシゴ(王林)の準備もできている。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年5月から、実験材料であるリンゴ茎頂より得たシュート培養に部屋単位の大規模なコンタミが発生し、それらを廃棄処分した。このため、冷保蔵していた少数の材料より増殖を開始して、コンタミ問題は約5カ月後(10月)に解決した。しかし、研究は予定していた実験を行うことに至らなかった。
ラット胸腺原基移植により発症するヌードマウスの多発性臓器局在性自己免疫病の解析

自己免疫病の発生原因の一つとして,胸腺上皮細胞の機能不全が想定されるが,これまでこの仮説を直接的に支持する実験系はなかった.われわれはこの仮説を実証すべく,免疫能のないBALB/Cヌードマウスの腎被膜下にラットの胸腺原基を移植することを試みた(TCヌード)ところ,その原基は上皮はラット,リンパ球はマウス由来のキメラ胸腺として,ほぼ正常の構築を保って発育し,ホストTリンパ球依存の免疫能の回復を認めた.しかしながら,早期から多くの臓器で多彩な臓器局在性の自己免疫病が発生してきた. TCヌードの免疫・病理学的な解析から以下の事が明らかとなった.1.TCヌードのヒツジ赤血球に対する抗体産性能は正常マウスの約半分まで回復していた.同系マウス及び胸腺ドナーラットの皮膚移植片は完全に生着したが,第三者のそれは直ちに拒絶した.2.移植胸腺はマウス/ラットのキメラ構築を形成していた.すなわち,上皮細胞はラット由来であり,ラットのIa抗原を発現していた.リンパ球は全てマウス由来であり, Thy-1.2, L3T4やLyt-2の発現は正常マウスのそれらとほぼ同じであった.胸腺髄質の上皮細胞以外の多くの細胞はマウスのIa抗原を強く発現していた.3.TCヌードには臓器局在性の自己免疫病が多発した.発病臓器は,甲状腺,唾液腺,眼,胃,副腎,卵巣,睾丸,前立腺,等である.このTCヌードは免疫系の中枢である胸腺の機能を詳細に解析したり,さらに自己と非自己の認識機構を解析する大変優れた実験モデルになると期待できる.自己免疫病の発生原因の一つとして,胸腺上皮細胞の機能不全が想定されるが,これまでこの仮説を直接的に支持する実験系はなかった.われわれはこの仮説を実証すべく,免疫能のないBALB/Cヌードマウスの腎被膜下にラットの胸腺原基を移植することを試みた(TCヌード)ところ,その原基は上皮はラット,リンパ球はマウス由来のキメラ胸腺として,ほぼ正常の構築を保って発育し,ホストTリンパ球依存の免疫能の回復を認めた.しかしながら,早期から多くの臓器で多彩な臓器局在性の自己免疫病が発生してきた. TCヌードの免疫・病理学的な解析から以下の事が明らかとなった.1.TCヌードのヒツジ赤血球に対する抗体産性能は正常マウスの約半分まで回復していた.同系マウス及び胸腺ドナーラットの皮膚移植片は完全に生着したが,第三者のそれは直ちに拒絶した.2.移植胸腺はマウス/ラットのキメラ構築を形成していた.すなわち,上皮細胞はラット由来であり,ラットのIa抗原を発現していた.リンパ球は全てマウス由来であり, Thy-1.2, L3T4やLyt-2の発現は正常マウスのそれらとほぼ同じであった.胸腺髄質の上皮細胞以外の多くの細胞はマウスのIa抗原を強く発現していた.3.TCヌードには臓器局在性の自己免疫病が多発した.発病臓器は,甲状腺,唾液腺,眼,胃,副腎,卵巣,睾丸,前立腺,等である.このTCヌードは免疫系の中枢である胸腺の機能を詳細に解析したり,さらに自己と非自己の認識機構を解析する大変優れた実験モデルになると期待できる.自己免疫病の発生原因の一つとして、胸腺上皮の機能不全が相定されるが、これまでこの仮説を直接的に支持する実験系はなかった。本申請者はこの仮説を実証すべく、免疫能のないBALB/cヌードマウスの腎被膜下にラットの胸腺原基(胎生15日)を移植することを試みた(TGヌード)ところ、その原基は上皮はラット、リンパ球はマウス由来のキメラ胸腺として、ほぼ正常の構築を保って発育し、ホストT細胞依存免疫能の回復をも認めたが、早期から多くの蔵器で多彩な蔵器局在生の自己免疫病が発生してくることを見いだした。今年度はこのTGヌードの特性として以下のことが明らかとなった。1.TGヌードは一年以上生存し、ヒツジ赤血球に対する抗体産生能は正常マウスの約半分まで回復した。同系マウスおよび胸腺ドナーラットの皮膚移植片は完全に生着したが、第三者のそれはただちに拒絶した。3.TGヌードの組織学的検索で、唾液腺,甲状腺,胃,副腎,卵巣,睾丸,前立腺等に、高度の組織損傷を伴う炎症反応を認めた。これらの病変は、胸腺原基移植後2ケ月ですでに高率に多発性にみられ、加齢とともに増悪した。4.臓器病変をもつTGヌードの血中には、蛍光抗体間接法により臓器炎に対応する正常組織切片と特異的に反応する自家抗体(IgG)が検出された。5.TGヌードに発症する病変は、末梢のTリンパ球を同系ヌードマウスに注射することにより高率に移入することができた。以上の所見から、TGヌードに発症する多発性の病変は自己免疫病であると判断できる。今後の研究として、病変のトランスファーに有効なTリンパ球のサブセットの解析、病変の発症を予防あるいは治療できるサプレッサーTリンパ球の検索を主に行いたい。ラットの胸腺原基をヌードマウスの腎被膜下に移植しておく(TGヌード)と,ほぼ正常な胸腺の形態を示す発育がみられる.

このTGヌードは免疫能を獲得する.しかしながら,早期から多発性に臓器局在性の自己免疫病が高率に発症する.発病する臓器は,甲状腺,唾液腺,胃,副腎,卵巣,睾丸,前立腺,等である.本年度はTGヌードの病変発症におけるエフェクターとなるリンパ球の同定をトランスファーの系で解析し,以下の事が明らかとなった.1.供与体に用いたTGヌード(n=95)には,卵巣炎(95%),甲状腺炎(70%),胃炎(70%),等が発症した. TGヌードの病変は,同マウスの脾臓より得た未処理リンパ球分画を同系のヌードマウスに注射することにより,高率にトランスファーすることができた.病変の中で卵巣炎が最も高率にトランスファーすることができ,リンパ球5×105個以上の注射で14日後から高率(80%)に発症した.2.TGヌードの脾細胞をThy-1.2 L3T4及びLty-2抗原に対する単抗体を用いての細胞障害試験により分画し,それぞれをヌードマウスに注射したところ,抗Thy-1.2あるいはL3T4抗体処理によりエフェクター効果が消失した.一方,抗Lht-2抗体処理した細胞では高率に病変をトランスファーすることができた.3.Flowcutometer(FACS)を用いて, TGヌードの脾細胞よりL3T4及びLyt-2抗原陽性細胞をそれぞれ選択的に回収し,ヌードマウスに注射したところ, L3T4抗原陽性細胞がエファクター細胞であることが明らかとなった.以上より, TGヌードにおいて,移植ラット胸腺内でラットの胸腺上皮細胞との相互作用により発育・分化したホストのTリンパ球,その中でもL3T4抗原陽性細胞んどサブセットが,臓器局在性の自己免疫病を引き起こすエフェクターであることが明らかとなった.
Wntシグナル経路の制御による骨形成促進薬の可能性検証

Wnt/Fzdシグナルは、骨芽細胞分化における中心的な役割を担うことが示唆されていたが、その詳細は必ずしも明瞭ではなかった。本研究において、過去に報告されていたβ-catenin経路活性化のみならず、同時にJNK経路阻害が相侯って、骨芽細胞分化を促進することが明らかとなった。さらに、β-catenin経路およびJNK経路の活性化のバランスは、Wntリガンドを受容可能なLRP分子の量により統一的に制御されている可能性が示唆された。また、LRP分子の細胞内動態は、Wnt分子により制御されている可能性が想定された。今後、Wntシグナル伝達とLRP局在制御の連関の解明が、骨芽細胞分化におけるWntシグナル全容解明につながると考えられた。骨代謝疾患の創薬概念として、骨吸収抑制および骨形成促進が想定されるが、特に後者に関しては明確な分子基盤に基づいた創薬は少ない。本申請研究においては、まず骨形成促進の分子機構の解明を行い、効率的な創薬標的の探索、更には候補化合物のスクリーニングを目指す。本年度は、骨形成分子機構の一端の解明を試みた。骨形成を担う骨芽細胞が、造骨作用を発揮する際には、細胞表面上の受容体Frizzledおよび共受容体LDL receptor related protein (LRP)5/6に、リガンド分子Wntが結合し、β-cateninシグナル伝達経路が活性化することが明らかになっていた。このことから、受容体FrizzledおよびLRP5/6は、骨芽細胞表面に発現することが必要であることが想定され、まず基底状態にけるこれら分子の細胞内局在に注目した。非骨芽細胞系細胞のHeLa細胞やNIH3T3細胞においては、いずれの受容体も細胞表面に発現するが、骨芽細胞系細胞のMC3T3-E1細胞およびST2細胞においては、Frizzledが細胞表面に局在する一方でLRP5/6は主としてリソソームに局在していることが、各種オルガネラマーカーとの共染色および密度勾配遠心を用いたオルガネラ分画により観察された。これらのことから、Frizzledが細胞表面に常在型の受容体で、LRP5/6が刺激に伴い細胞表面へ移行し、機能発揮するというシステムを想定した。刺激剤として、β-cateninシグナルを活性化させる代表的リガンド分子Wnt3aを用いたところ、刺激後1時間でLRP6の細胞表面上発現量が上昇した。このようなLRP5/6の細胞表面への刺激依存的なトランスロケーションは骨芽細胞特異的な現象であると考えられ、この機構が造骨作用発揮に重要であると予測される。今後、複数種あるリガンド分子Wntの種類によるLRP5/6の細胞内挙動の違い、下流のシグナル伝達様式の違いを解明し、造骨作用に中心的な役割を果たす分子群をより詳細に同定することを試みる。本申請研究においては、特にWntシグナル伝達経路に着目して、骨形成を制御する分子機構の解明を試みた。Wntはファミリー分子が19種類、Fzdは10種類からそれぞれ構成されており、いずれのアイソフォーム同士が相互作用するか?と言った基本的な情報も含めて不明な点が多い。平成23年度は骨芽細胞に発現するWnt/Fzdを網羅的に解析し、Wntファミリーは10種類、Fzdファミリーは9種類のアイソフォームが発現していることが確認された。そこでこれらすべての分子に関して、アデノウィルスを用いた遺伝子導入系を構築した。さらに、Fzdの共受容体として働くLRP5/6およびLRPの抑制分子であるDKK1に関しても、同様にアデノウィルスによる遺伝子導入系を構築した。次いでこれらアデノウィルスを全ての組み合わせで骨芽細胞株に感染させ、骨芽細胞分化マーカーであるALPの発現に与える影響を網羅的に測定した。さらに、Wntシグナルの細胞内伝達経路としてこれまでに知られている古典経路(b-catenin経路)および非古典経路(JNK,NFAT,CRE)の活性化をルシフェラーゼ・アッセイを用いて評価した。これら一連の検討の結果、骨芽細胞の活性化には従来指摘されてきた通り、b-catenin経路の活性化が中心的に寄与する一方で、JNK経路の活性化はむしろ骨芽細胞の活性化を抑制することが明らかとなった。さらに古典経路と非古典経路の活性化バランスは、DKK1の発現量によって中心的に制御されており、抗DKK1抗体などによってDKK1の機能を抑制した場合、b-catenin経路の活性化とJNK経路の抑制の双方が生じ、非常に効率的に骨芽細胞の活性化に至ると考えられた。