hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌患者の各種免疫調整剤(BRMS)に対する感受性スクリーニングに関する研究

-ト調査(昭和58、59年度胃癌症例を対象)によりT.P≧5.9,Alb≧4.0,Ly数≧1200(術前値)がBRMの至適投与条件と想定された。2.PSK腫瘍内投与の解析PSKの術前腫瘍内投与により1年生存率87.6%と、control群の74.5%にくらべ有意に良好であった。本治療法はOKー432同様リンパ節転移率を低下させていた。腫瘍増殖局所所見につき組織学的検討中であるがnaturalな反応としての局所浸潤リンパ球の多少により治療効果の差が予想された。3.BRMを用いた末梢血リンパ球の添加培養によるスクリ-ニングOKー432,PSK,MYー1等のBRMの患者末梢血リンパ球の添加培養上清中のγーIFN産生量、TNF産生量は癌の進行度によらず患者により差をみとめた。NK活性、LAK活性の上昇もみとめ、これらの上昇はγーIFN産生量との正の相関をみとめた。また、これは3種の皮内反応(PPD,SuーPS,OKー432)のスコア-と相関をみとめ皮内反応がスクリ-ニングに有効と考えられた。以上の成績をふまえ、癌免疫外科研究会を母体に胃癌症例を対象に免疫パラメ-タ(宿主要因)を再検討する目的でBRM至適投与に関する研究を本年5月スタ-ト予定としている。1.胃癌患者における末梢血リンパ球の各種免疫賦活剤添加培養によるcytokine産生からみたresponderの検出(1)各種免疫賦活剤(OKー432,PSK,MYー1)を調整リンパ球に添加、培養上清中のcytokine(TNF,ILー2,IFNーγ)を測定、OKー432は他剤に比し、有意にcytokine産生を促進したが、これらの内にも産生の高度のものと低い2群いわかれresponder,nonーresponderの選別に有効と考えられた。(2)皮内反応とcytokine産生能:皮内反応をPPD,SuPS,OKー432を用いて検討陽性度をスコア化し、cytokine産生能と相関を求めたところ、正の相関をみとめ、簡便な皮内反応がscreeningに有用と考えられた。PSK,MYー1等に関するresponder検出:PSKに関しては免疫抑制状態の解除が作用機序の本態といわれている。これらのresponderの検出には免疫抑制状態の定量化が必要と考えられ、現在、IAP等の定量とともに患者血清、正常人リンパ球、PSKを用いた系で抑制解除の可否によるscreening法を検討中。2.各種パラメ-タを指標とした癌患者治療への応用(1)皮内反応、IAP等を指標に免疫療法の選択の是否につき現在、2つのプロトコ-ルにより、全国レベル及び岡大第一外科関連病院においてrandomized trialを施行中である。結果については23年後に公表出来る予定である。
中国における各方言に対する言語評価及び言語政策

本研究は、中国人大学生の言語評価に関する研究である。調査対象地は北京・天津・上海・杭州の4都市、対象方言は普通話と主要方言、その他各調査地点の言語状況に合わせて幾つかの方言を設定した。評価語としては、「上品である」、「親近感を覚える」、「柔らかである」、「豪快である」、「細やかである」、「実用的である」、「美しい」、「かっこいい」、「好きである」という言語を評価する上で比較的イメージしやすいと思われる9項目を設定した。その統計結果を通して、以下の傾向を得ることができた。(1)北方方言群が豪快で、南方方言群が繊細であるといった地域言語間におけるイメージのステレオタイプの実態が明らかになった。(2)全体的に見ると、普通話には実用性、母方言には親近感を強く覚える傾向にあるが、母方言に対する評価では、北方は上品さを感じないのに対し、南方では豪快さを感じないと言うことが明らかになった。(3)言語威信には、伝統文化による影響や地域の政治や経済による影響などといった多様な側面が含まれることが明らかになった。(4)上海語のイメージは北へ行くほど低くなる、或いは湖南語に対する評価は南北で分かれるといった言語評価における地域変容の実態が明らかになった。(5)各方言の中心地までの物理的距離と中国人大学生が各方言に対して持つ心理的距離の関係には、等距離関係、疎遠関係、親近関係の3タイプがあることが明らかになった。(6)中国人大学生の言語使用は、インフォーマルな場面ほど母方言の使用が多く、フォーマルな場面ほど普通話の使用が多くなり、そして、杭州の大学生の言語シフト状況は同じく考何地域に位置する上海よりも北方の北京、天津に近いことが明らかになった。(7)普通話が全調査地点において高い言語威信を維持している実態が判明し、それは中国政府が進める教育、マスコミ、行政における普通話普及政策がもたらした結果を反映したものと見ることができ、今後の中国における言語政策の行方を予測する上でも重要な意味を持つものと思われる。(1)それぞれの方言に対する評価は、南北で一致を見せるものもあれば、全く異なるものもある。(2)言語評価には経済的威信の影響を色濃く受けるものと文化的威信の影響を色濃く受けるもの、そして心理的要因の影響を色濃く受けるものが存在する。(3)普通話に対する評価には4地点において共通するものがある。(4)ある方言に対する評価では、自己評価と他者評価との間に大きな差が見られる。(5)他者方言に対する心理的距離は、該当言語を母語とする地域との物理的距離と比較的密接に関わっている。(6)人々がイメージする「かっこいい」言語には、該当言語を母語とする地域が有する経済的威信を羨望したものと、該当言語を母語とする地域が有する歴史的背景からイメージされる「男性的な魅力」という2種類存在すると考えられる。(7)北京人大学生と上海人大学生のお互いの母語に対する相互評価にはかなりの差が存在する。

(7)普通話が全調査地点において高い言語威信を維持している実態が判明し、それは中国政府が進める教育、マスコミ、行政における普通話普及政策がもたらした結果を反映したものと見ることができ、今後の中国における言語政策の行方を予測する上でも重要な意味を持つものと思われる。
熱帯林再生のためのフタバガキ科樹木の造林技術開発に関する研究

本研究は、熱帯アジアの草地、荒廃地等の無立木地への環境造林を想定し、現地の複合した環境ストレスに耐性のあるフタバガキ科樹木種を選び出し、種に適合した育苗・植栽法を提示することを目的とした。タイ国ナラティワート県の砂質土壌の荒廃地に設置した試験地での調査および実験室での解析により以下の成果を得た。(1)試験地の裸地とAcacia mangium林内に設置した各種の環境因子を測定するセンサーとデータロガーを用いて連続測定を行い、被陰によりAcacia mangium林内の環境が植栽木にとって改善されていることがわかった。(2)光硬化処理(苗畑で植栽前に日覆いを取り苗木に強い光にあてる処理)により、フタバガキ科樹木6種(Dipterocarpus obtusifolius, Hopea odorata, Shorealeprosula, S.roxburghii, Shorea sp., Neobalanocarpus heimii)の苗木の活着率を高められることがわかった。(3)Acacia属樹木6種の高温耐性を光合成や光阻害への適応により評価し、nurse treeの候補樹種が得られた。(4)フタバガキ科樹木のDipterocarpus obtusifoliusは、砂質土壌の荒廃地での成長が良く、露天光下での光合成能力が高いことがわかった。(5)先行造林法(裸地の環境ストレスに耐性のない目的樹種を造林するため、耐性があり成長が早い種をnurse treeとして先に植え、その樹間に目的樹種を植える方法)により、フタバガキ科樹木の苗木の活着率を高められることがわかった。本研究は、熱帯アジアの草地、荒廃地等の無立木地への環境造林を想定し、現地の複合した環境ストレスに耐性のあるフタバガキ科樹木種を選び出し、種に適合した育苗・植栽法を提示することを目的としている。本年度は、タイ国ナラティワート県の砂質土壌の荒廃地に、タイ国天然資源環境省国立公園・野生生物保護局のタニット・ヌイム氏と共同で試験地を設置し以下の成果を得た。(1)環境ストレスの推定および森林による環境緩和効果の解析のため、試験地の裸地と既存のAcacia mangium林内に、光合成有効光量子束密度、全天日射量、紫外線量、気温、湿度、土壌温度、土壌水分、地下水位のセンサーとデータロガーを設置し、連続測定を開始した。(2)光硬化処理(苗畑で植栽前に日覆いを取り苗木に強い光にあてる処理)の効果を明らかにするため、フタバガキ科樹木6種(Dipterocarpus obtusifolius, Hopea odorata, Shorea leprosula, S.roxburghii, Shorea sp., Neobalanocarpus heimii)の光硬化処理(4ヵ月)をした苗木としなかった苗木を育てた。2003年10月に、裸地と林内にそれぞれの苗木を植えた。その結果、どの種でも光硬化処理をすると植栽3ヵ月後の苗木の活着率が高くなった。(3)根切り処理(育苗の際、根を切って育苗ビニルポットに移すことにより、造林に適した根系を誘導する処理)の効果を明らかにするため、フタバガキ科樹木3種(Hopea odorata, S.roxburghii, Anisoptera sp.)の根切り苗と無処理苗を作り、4ヶ月間育苗した後、10月に裸地にそれぞれの苗木を植えた。その効果は今のところ明らかでない。(4)2004年度の光硬化処理試験、先行造林試験のための苗木の準備をした。

本研究は、熱帯アジアの草地、荒廃地等の無立木地への環境造林を想定し、現地の複合した環境ストレスに耐性のあるフタバガキ科樹木種を選び出し、種に適合した育苗・植栽法を提示することを目的としている。本年度は、タイ国ナラティワート県の砂質土壌の荒廃地に設置した試験地での調査および実験室での解析により以下の成果を得た。(1)環境ストレスの推定および森林による環境緩和効果の解析のため、試験地の裸地と既存のAcacia mangium林内に設置した各種の環壌因子を測定するセンサーとデータロガーを用いて、連続測定を行った。(2)光硬化処理(苗畑で植栽前に日覆いを取り苗木に強い光にあてる処理)の効果を明らかにするため昨年度に植栽したフタバガキ科樹木6種(Dipterocarpus obtusifolius, Hopea odorata, Shorea leprosula, S.roxburghii, Shorea sp., Neobalanocarpus heimii)の苗木の成長を測定した。その結果、どの種でも光硬化処理をすると苗木の活着率が高くなったが、樹高の成長の差は明瞭でなかった。(3)根切り処理(育苗の際、根を切って育苗ビニルポットに移すことにより、造林に適した根系を誘導する処理)の効果を明らかにするため昨年度に植栽したフタバガキ科樹木3種(Hopea odorata, S.roxburghii, Anisoptera sp.)の苗木の成長を測定した。根切り処理の効果はなかった。(4)先行造林法(裸地の環境ストレスに耐性のない目的樹種を造林するため、耐性があり成長が早い種を先に植え、その樹間に目的樹種を植える方法)の確立のため、Acacia属樹木6種の高温耐性を評価した。その結果、Acacia mangiumは、昼38°C、夜33°Cの高温条件でも昼30°C、夜25°Cの条件と比較して成長や光合成の低下が少ないことがわかった。(1)試験地の裸地とAcacia mangium林内に設置した各種の環境因子を測定するセンサーとデータロガーを用いて連続測定を行い、被陰によりAcacia mangium林内の環境が植栽木にとって改善されていることがわかった。(2)光硬化処理(苗畑で植栽前に日覆いを取り苗木に強い光にあてる処理)により、フタバガキ科樹木6種(Dipterocarpus obtusifolius, Hopea odorata, Shorealeprosula, S.roxburghii, Shorea sp., Neobalanocarpus heimii)の苗木の活着率を高められることがわかった。(3)Acacia属樹木6種の高温耐性を光合成や光阻害への適応により評価し、nurse treeの候補樹種が得られた。(4)フタバガキ科樹木Dipterocarpus obtusifoliusは、砂質土壌の荒廃地での成長が良く、露天光下での光合成能力が高いことがわかった。(5)先行造林法(裸地の環境ストレスに耐性のない目的樹種を造林するため、耐性があり成長が早い種をnurse treeとして先に植え、その樹間に目的樹種を植える方法)により、フタバガキ科樹木の苗木の活着率を高められることがわかった。
マウス胚の前後軸形成におけるBMPシグナルの役割とそのタンパク挙動の解明

遠位臓側内胚葉(以下DVE)の形成には、これまでBMPシグナルの消失とNodal/Activinシグナルの増加が働いていると示してきた。しかし、BMPシグナルが消失しているBMP受容体タイプ2型(BMPR2)欠損マウス(宮園浩平博士より供与)、BMPR2とActivin受容体タイプ2b型との二重変異マウスではDVEが消失する。この一見矛盾に見える結果の原因がprimitive endodermからviscera1 endoderm (extraembryonic visceral endoderm)を経てembryonic visceral endodermへの分化にBMPシグナルが必須であるためであることを明らかにした。また、これまで胚体外外胚葉からシグナルが出ており(以下ExEシグナル)、これがDVE形成を抑制していることが報告されていた。これまで我々はDVE形成時にBMPシグナルが消失していること・BMP4や:BMP8bなどが胚体外外胚葉で発現していること・BMP活性を有するKSRがDVE形成を抑制していることを示していた。これよりExEシグナルはBMPシグナルではないかと推測されたので、これを証明するためDVEを異所形成する実験系でBMPシグナルを経時的に観察、また移植実験を行うことによりBMPシグナルがDVE形成を抑制することを明らかにし、これまで謎であったExEシグナルの正体であることも明らかにした。BMP受容体タイプ2型(BMPR2)欠損マウス(宮園浩平博士より供与)、BMPR2とActivin受容体タイプ2b型との二重変異マウス、BMPR2とNodalとの二重変異マウスの解析を通し、Bmpシグナルが前後軸形成の最初である遠位臓側内胚葉(DVE)の形成に必須であることが示された。しかし、野生型胚でBmpシグナルをリン酸化型Smad1(p-Smad1)の免疫染色法を用いてモニターするとDVEの形成時期以前ではp-Smad1が存在するにもかかわらず、DVE形成開始とともにp-Smad1が消失していた。この時期部位特異的なBmpシグナルがDVEの形成に必須なのかを調べるため異所的なDVE形成が起こる野生型胚の胚体外外胚葉を取り除いた胚及びLefty1欠損マウス胚を用いてp-Smad1の染色領域を調べてみた。その結果、DVEが形成される部位ではp-Smad1が異所的に消失していることがわかった。これよりDVE形成にはBmpシグナルが時期部位特異的にON/OFFとなることの重要性が示された。更に、これまでの報告ではDVE形成にはNodalシグナルが重要であると示されてきていたが、Nodal系シグナル(ActivinやTGFβシグナル)をモニターするリン酸化型Smad2(p-Smad2)の免R染色法を用いて調べると臓側内胚葉全体で存在していることがわかり、Nodalシグナル特異的に阻害するLeftyが存在してもこのp-Smad2は存在していること。Lefty1が欠損しているとp-Smad2の量が多くなり、DVE領域が広がること。異所的なActivinによりDVE領域が広がること。これらよりDVE形成時にNodalシグナルはDVE細胞の量を制御し、DVEの形成にはActivinシグナルが働いていることが明らかとなった。
原子価異性を鍵段階とするオン/オフ型機能性有機ビスマス化合物の構築

1.本課題平成10年度においては、複数のビスマス原子を分子内に有する有機ビスマス化合物の機能化をめざし、ひとつの展開として非イオン型水溶性ビスマス化合物を合成した。さらに、ビスマス原子上にキラリティを有するビスムチンおよびビスムトニウム化合物の合成法を確立し、キラルなビスマス化合物の基本的な物性を明らかにした。2.非イオン型水溶性ビスマス化合物は例えば造影剤や抗菌剤としての利用が期待されているが、これまでその合成例はなかった。芳香環にN,N-ビス(ヒドロキシエチル)アミノスルホニル基を有するトリアリールビスムチンを合成してその水溶性を調べた結果、オルトおよびパラ位に同官能基を持つビスムチンが中性条件下で高い水溶性を示すことが明かとなった。さらに、昨年度の本研究課題で確立した手法-スルホニル基のポリオルトリチオ化-を本系に適用して、上記官能基を有するフェニレン架橋型オリゴビスムチン(ビスマス原子;24個)をワンポットで合成し、その水溶性について評価した。3.ビスマス原子上のキラリティは学術的にも興味が持たれるが、今回、ビスマス上にキラリティを有する非対称テトラアリールビスムトニウム塩の合成法を確立した。オルト位にオキサゾリン置換基を有するビスムトニウム塩の場合、^1H-NMRではビスマス上のキラリティを反映したジアステレオトピックなシグナルが観測されるが、このシグナルをVT-NMRにより追跡することで、ビスマス上における立体化学的な挙動と対イオンや溶媒の極性との関係を明らかにした。1.本課題平成9年度においては、複数のビスマス原子を分子内に有する各種有機ビスマスオリゴマーの合成法を新たに開拓し、可視紫外吸収スペクトルの測定を指標として合成した化合物群の光学特性を検討した。2.分子内に2個のビスマス原子を有するアリールビスムタンの合成法を確立する目的で、ジメタロベンゼンとジフェニルビスマスハライドとの反応を詳細に検討した結果、反応条件および用いる塩基をうまく組み合わせることにより、ビスマスを2、3、4個含むフェニレン架橋型ビスムタンオリゴマーがワンポットで同時に得られることを見いだした。得られた3価化合物は塩化スルフリルとの反応によりそれぞれ定量的に5価ビスマスポリハライドへと変換される。3.スルホンアミド基のオルトリチオ化を利用した従来にないタイプのポリビスマス化合物合成法を確立した。すなわち、適当量の塩基をトリス(オルト-N,N-ジエチルスルファモイルフェニル)ビスムタンに作用させることにより、ビスマス原子を24個を含む放射状ビスマスオリゴマーが好収率で得られた。本反応をさらに展開し、分子内にビスマス原子10個を含むビスマスデンドリマ-の合成および単離に初めて成功した。4.得られた一連の化合物の可視吸収スペクトル測定の結果、3価、5価いずれの原子価においてもフェレニン架橋によるパイ電子の共役安定化はそれほど大きくないことが明かとなった。また、両原子価の間で吸収特性の顕著な変化は認められず、原子価異性によるスイッチ機能を発現するには置換基の修飾などの工夫が必要があると考えられる。
KLF4遺伝子が制御する脂肪分化抑制機構の解明と新規骨再生治療戦略の確立

体性幹細胞は、我々の体の様々な組織に存在し、組織の恒常性や機能の維持に寄与していることが知られている。体性幹細胞は、胚性幹細胞(ES細胞)やiPS細胞とは異なり、限られた細胞にのみ分化する能力を持っているが、自家移植が可能なこと、移植後もがん化のリスクがほぼないなどのメリットがある。中でも、本研究課題が研究対象とする間葉系幹細胞は、骨髄を始め脂肪組織、歯髄などに存在しており、脂肪、骨、軟骨への分化能を持つ体性幹細胞である。近年、再生医療への応用が期待され盛んに研究が進められている。研究代表者が所属する研究室では、ヒト骨髄由来単核球細胞からCD90およびCD271共陽性細胞を単一細胞として単離することで、増殖能、脂肪・骨分化能の異なる3つのサブタイプ(REC, MEC, SEC)が得られることを報告している。本研究課題では、それらサブタイプの中から、Kruppel-like factor 4(KLF4)遺伝子が最も高発現しているヒトMSCサブタイプ(MEC)を用いて、KLF4の機能を解析し、またそれによって制御される分化制御の分子メカニズムを解明することを目的とする。本年度は、当初の研究計画に沿い、KLF4の発現抑制実験を行った。その結果、KLF4の発現抑制により、細胞増殖速度の促進および脂肪・骨への分化の促進が観察された。これらのことから、KLF4はMECの細胞分裂、分化を抑制する役割を担っていることが示唆される。これまでの間葉系幹細胞におけるKLF4遺伝子の研究に関しての報告は少ない。特に、分化能との関係については、主にマウス脂肪前駆細胞株を用いた報告が多い。そこで、本研究では、報告のあるデータについても検証の必要があると考え、MECを用いて分化誘導時のKLF4遺伝子発現に関する基礎データの再検証を行った。その結果、概ね報告のあるデータと一致していることを確認した一方、細胞増殖や分化の抑制に関する知見は本研究で得られた知見である。したがって、本研究課題の目的に関して概ね順調であると判断する。今後の研究については、当初の計画どおり遂行する。具体的には、KLF4の発現抑制したMECにおいて活性化しているシグナルパスウェイを探索する。コントロールと比較し、差の見られたシグナルパスウェイに対する低分子化合物等を用いて当該パスウェイを阻害あるいは活性化することで検証する。
マウスにおける有効なコンディショナル・ジーンターゲッティング法の開発

従来のジーンターゲッティングでは、生殖細胞系列において導入された標的遺伝子の変異は、その個体の発生・発達を通じて全ての体細胞に伝搬される。そのため、発生において重要な機能を持つ遺伝子のノックアウトマウスは、胎生期に致死となり、成体における遺伝子機能の解析は困難であった。この問題点を解決するために、生体内の特定の組織・細胞、或いは発生の特定の時期に特異的に標的遺伝子に変異を導入するための手法の開発が、本研究の目的である。基本的な手法としては、PI_aファージ由来のCre組換え酵素とその認識配列であるloxPによるシステムを用い、トランスジーンCAG-SLacZを用いて、LacZ遺伝子の発現による組織・細胞の青染により、Creの発現によるloxP間の組換え・欠失を同定することにより、各種手法の有効性を解析した。まず、Cre遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスを作製し、これを感染させることにより、マウス成体内の各種組織特異的なジーンターゲッティング法の開発に成功した。この手法の樹立により、マウスの皮膚、消化管、肺、肝臓、膵臓の各組織の上皮細胞特異的に標的遺伝子に変異を導入することが可能となった。次に、我々はCre遺伝子を各種組織特異的に発現するトランスジェニック・マウスを作製し、これを用いることにより、皮膚の基底細胞(K14プロモーター)、小脳プルキンエ細胞(PCP2プロモーター)、嗅神経細胞(OMPプロモーター)等の各種細胞特異的に標的遺伝子に変異を導入可能なシステムの樹立に成功した。これらトランスジェニック・マウスを用いたシステムは、高い特異性を示すと同時に、その効率も極めて高いものであった。神経系における有効なコンディショナルジーンターゲティング法の確立のため、種々の実験を行った。その研究業績の主なるものは以下の通りである。リコンビナントアデノウイルスによるCre遺伝子の導入・発現法の確立SRαプロモーターの下流につないだCre遺伝子を持つリコンビナントアデノウイルスを作成した。次いでこれを2つのloxP配列にはさまれたlacZ遺伝子が、その染色体上に挿入された培養細胞に感染されることにより、Cre遺伝子発現と発現されたCre組換え酵素の活性を検討した。その結果、m.o.i30で感染を行ったところ、48時間以内に培養皿中の全て細胞でlox配列間の組換えが誘導されることを確認した。これにより、リコンビナントアデノウイルスによるCre遺伝子発現系が確立された。神経系特異的にCre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの樹立Cre遺伝子をネスチン遺伝子のプロモーター及びPCP2遺伝子のプロモーターの下流つなぎ、トランスジェニックマウスを作成した。現在、これらのマウスでCre遺伝子が神経上皮特異的(ネスチン遺伝子プロモーター)及び小脳プルキンエ細胞特異的(PCP2遺伝子)に発現していることを確認している。標的遺伝子へのloxP配列の導入IP3R遺伝子を始めとする数種の遺伝子のコンディショナルターゲティングを目的として、マウス染色体DNAライブラリーより遺伝子を単離し、loxP配列を持つコンディショナル・ターゲティングベクターの作成を行った。本研究は、従来のジーンターゲティング法にバクテリオファージP1のCre/LoxPシステムを応用し、任意に変異導入を誘導でき、且つ汎用性の高いコンディショナルジーンターゲッティング法を確立することを目的としている。そのために本年度は、全身多臓器に応用可能で、且つ高い発現を示す二つのCre遺伝子の導入法の開発を試みた。第一の方法はアデノウイルスベクターを用いるものである。マウスの体内の殆どの組織で、非常に高いレベルの遺伝子発現を誘導するCAGGS及びSRαプロモーターの顆粒にCre組換え酵素遺伝子を連結し、これを持つ組換えアデノウイルスを作成した。

次いでこのウイルスによるCre遺伝子の発現を、LoxP配列に挟まれたレポーター遺伝子を持つ培養細胞を用いて解析したところ、感染後48時間後には全ての細胞でLoxP配列間の切り出しが観察された。そこで、これらのウイルスをAPC遺伝子内に1対のLoxP配列が挿入された変異マウスの大腸内に注入し、その経過を観察したところ、約4週間で大腸腺腫の発生が高頻度で観察された。この腺腫ではLoxP配列に挟まれたAPC遺伝子が欠失していることが確認され、この組み換えアデノウイルスを用いたin vivoでのCre遺伝子導入法が確立された。第二の方法は、体内の各組織で発現可能なプロモーターの下流にCre遺伝子を繋いだトランスジェニックマウスと標的遺伝子内にLoxP配列を挿入したマウスを交配し、コンディショナルジーンターゲッティング用マウスを作成し、変異導入を誘導する方法である。この手法に関して本年度は、L7プロモーター、OMPプロモーター等、計8種のプロモーターの下流にCre遺伝子を連結し、トランスジェニックマウスの樹立を試みた。現在、これらのマウスを解析中である。本研究は、バクテリオファージPlのCre/loxPシステムを従来のジーンターゲティング法に応用し、標的遺伝子に任意に変異を導入でき、且つ汎用性の高いコンディショナル・ターゲティング法を確立することを目的としている。そのために全身多臓器に応用可能で、且つ高い発現を示す二つのCre遺伝子の導入法を開発した。第一の方法はアデノウイルスベクターを用いる方法で、昨年度この方法により消化管において遺伝子変異が導入可能であることを示したが、本年度はさらに対象を広げ、肝臓膵臓胆管上皮において変異導入が可能であることを示した。第二の方法は、Cre遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いる方法であり、ウイルス感染による方法に比べて特異性が高い手法である。本年度我々はK14(ケラチン14、皮膚特異的)、L7(プルキンエ細胞特異的),OMP(嗅神経上皮特異的)プロモーターの下流にCre遺伝子を連結したトランスジェニックマウスを作製し、さらにPO蛋白(シュワン細胞特異的)、MBP(オリゴデンドロサイト特異的)プロモーターを用いたマウスを他の研究室より導入し、これらのマウスでのCre蛋白による、組織特異的な変異導入を解析した。その結果、K14,L7及びPO蛋白プロモーターに連結したCre遺伝子を持つトランスジェニックマウスのいくつかで標的遺伝子に対し極めて特異性の高い変異導入が確認された。又、新たな標的遺伝子としてβ-カテニンを選び、コンディショナル・ノックアウトマウスの樹立に成功した。
ヒト食道癌における所属リンパ節での癌関連遺伝子メチル化の解析

腫瘍関連遺伝子メチル化の検索にあたり、超常磁性シリカビーズを用いてDNAを吸着し、同一チューブ内で全処理を行い、量子ドットを用いた定量的な測定を行う新たな手法を導入した。これによりDNA量の少ない検体での安定した検出が可能となった。食道扁平上皮癌の手術標本から腫瘍と正常組織、切除全リンパ節での4つの腫瘍関連遺伝子のメチル化率を検討したが、今回の症例数では統計学的に有為な結果は得られなかった。食道癌においては、腫瘍の悪性度が高く、局所が根治的に切除されリンパ節転移を認めなかった場合にも、早期に再発を来す症例を経験する。このような症例の予後を予測する上で、肺の腺癌などで指摘されている腫瘍関連遺伝子のメチル化の関与を明らかにする事を目的とし、2000年2004年の間に当院において根治的に食道癌切除術を施行した症例のうち、リンパ節転移を認めなかった症例を抽出し、再発を来した5例と年齢、性別、ステージなどを可及的にマッチさせた対象群5例を選択した。現在、腫瘍部、正常部、リンパ節の各々につき、食道癌で特異な腫瘍関連遺伝子のメチル化の有無をPCRを用いて解析中である。今後、各遺伝子のメチル化と再発、予後などの相関について検討を加える。また、食道癌のリンパ節転移に関しては、過去の手術切除症例において非連続的に進展することが知られ、他の癌腫では有用であるセンチネルリンパ節診断の精度は低いと考えられている。また跳躍転移の存在が、術前診断や治療方針、手術術式の決定を困難にしている。このようなリンパ節転移の進展様式の解明のため、上記症例の一部についてすべての切除リンパ節(平均約100個/症例)について、組織学的な診断に先駆けた変化の発見を目指し、病理学的に転移を認めないリンパ節での腫瘍関連遺伝子のメチル化をPCRを用いて検索中である。今後、リンパ節転移の進展様式を分子生物学的な見地から解析、検討を加える。1998年から2006年までに当院において食道切除術を施行された食道扁平上皮癌症例のうち、予後追跡可能な症例について検討した。一部解析結果が再現性に乏しかったため、研究協力者であるJohns Hopkins大学Dr. Malcolm Blockの協力のもと、新たな手法を取り入れ、同大施設を用いて行った。1)リンパ節転移に関与する腫瘍関連遺伝子のメチル化を検索するため、高度のリンパ節転移を認めた症例と、主病巣の深達度に対して比較的転移が少なかった症例を選択し、パラフィン包埋スライドからDNAの抽出を行い、対象腫瘍関連遺伝子についてMethylation Specific PCRを行った。2)複雑なリンパ流を持つとされる食道癌において、リンパ節転移の進展形式を分子生物学的に検索する事を目的に、頚、胸、腹3領域リンパ節郭清を行った症例(切除リンパ節数平均135個)のうち、1個のみに転移を認めた5症例について、全てのリンパ節での腫瘍関連遺伝子についてMethylation Specific PCRを行った。その結果、今回の解析範囲内で、腫瘍とリンパ節において転移と相関すると考えられる遺伝子のメチル化は指摘できなかった。腫瘍本体においてメチル化の見られた遺伝子自体が一定しなかったため、症例数を増やして追加解析を行う必要があると考えられ、対象症例の選択について検討中である。
胃粘膜上皮細胞type2シクロオキシゲナーゼの発現調節に関する分子生物学的検討

(1)マウスtype2シクロオキシゲナーゼに対する特異抗体の作製-type2シクロオキシゲナーゼのC端アミノ酸フラグメントを合成し、ラビットに免疫してポリクローナル抗体を作製した。ELISAでの検討では1万倍希釈にてペプチドフラグメントを認識しうる特異抗体であり、現在、ウエスタンブロット、免疫染色が可能か否か検討中である。(2)マウス胃粘膜粘液上皮細胞の単層培養系の確立-プライマリーカルチャー系の確立はきわめて困難であり、現在、温度感受性SU40LT抗原を用いた、トランスジェニックマウスから、上皮細胞の培養系を得るべく努力している。(3)マウスにおける実験潰瘍モデルの作成と、シクロオキシゲナーゼ発現の検討-マウス胃漿膜下に20%酢酸を注入し実験胃潰瘍を作製した。組織学的には潰瘍作製後2日5日目が活動期であり、10日20日目が治療期で3040日で瘢痕化した。実験潰瘍発症直後より40日目までtype1シクロオキシゲナーゼ遺伝子発現はノーザン分析でまったく変化を認めなかった。一方、ノーザン分析ではtype2シクロオキシゲナーゼの発現も認めないがpolymerase chaine reaction法を用いてmRNAの半定量も行うと、type2シクロオキシゲナーゼ遺伝子は、潰瘍の急性期に一致してその発現量が増加した。現在シクロオキシゲナーゼ活性及び特異抗体を用いたtypeシクロオキシゲナーゼ蛋白の発現について、解析中である。
食行動の制御に関わる脳内システム間神経連絡の役割

食べ物の記憶を思い出す際に、脳の中のどのような情報伝達経路が働くかを調べた。ヒトや動物は食後に体調不良を経験すると、その食べ物の味を危険なものとして記憶し、嫌いになる。これを味覚嫌悪学習という。この味覚嫌悪学習が成立すると、脳の中の情報伝達経路の活動が変化することがわかった。したがって、味覚嫌悪学習による食行動の変化(好き・摂取から嫌い・忌避へ)に、脳内での情報処理の変化が関わっていることが示唆される。食行動の脳内機構の解明を目指して、食行動の制御要因である食物記憶・おいしさ・栄養状態が相互に作用しあうメカニズムを明らかにすることを目的に研究を行った。本年度は食物記憶に関与する扁桃体とおいしさに関与する脳内報酬系との間の神経連絡に着目した。食物記憶の実験モデルである味覚嫌悪学習に、扁桃体から脳内報酬系への神経投射が関与しているかどうかを、マンガン造影MRI法を用いて検討した。まず、ラットの扁桃体基底外側核にガイドカニューレを留置した。回復後、ラットに味覚嫌悪学習を獲得させるために、味溶液を摂取させた後で、内蔵不快感を引き起こす塩化リチウムの腹腔内投与を行い、条件づけを施した。条件づけの2日後にテストを行った。扁桃体基底外側核にマンガンを注入し、30分後に条件刺激である味溶液を呈示して、味に対する嫌悪の記憶を想起させた。さらに30分後に麻酔を施し、MRI装置で撮像を行った。ガイドカニューレの刺入位置を起点に、0.5mm厚の冠状断MR像を取得したこの撮像を1時間毎に4回繰り返した。MR画像においてマンガンの存在部位の輝度は上昇する。またマシガンは活性化したニューロンによって、順行性に輸送される。本実験では、扁桃体中心核や腹側淡蒼球の輝度が時間とともに上昇する傾向を観察した。このことから、嫌な味の記憶を想起する際に、扁桃体基底外側核から中心核や腹側淡蒼球への投射経路が活性化することが示唆された。また、高精度のMR画像を得るために、ラットの頭部を固定する器具を開発した。来年度はこの固定具について特許の取得を目指す予定である。食物記憶の想起時における扁桃体遠心性投射経路の活動をマンガン造影MRI法で明らかにすること目的とした。マンガン造影MRI法は、MRIの造影剤の一つであるマンガンがCa^<2+>チャネルを介して活性化した神経細胞に取り込まれ、軸索に沿って運ばれるという特徴を利用したものであり、活性化したニューロンの遠心性投射を可視化することができる。前年度までにおいて、味覚嫌悪学習の記憶を想起した場合は、想起しなかった場合に比べて、扁桃体基底外側核から扁桃体中心核と腹側淡蒼球へのマンガンの移動が多いことを示す結果が得られた。これらの結果は、食物記憶の想起時に扁桃体基底外側核から扁桃体中心核や腹側淡蒼球へ投射するニューロンが活性化することを示唆している。今年度においてさらに実験を重ね、得られたデータをより詳細に解析したところ、腹側淡蒼球と考えていた領域が実際にはIPACといわれる脳部位と分界条床核であることがわかった。組織学的実験によって、扁桃体基底外側核からIPACや分界条床核へ密な投射が存在するが、腹側淡蒼球へは疎な投射しかないことがわかった。また、島皮質、嗅周囲皮質、梨状皮質といった大脳皮質領域への投射ニューロンも活性化することがわかった。IPAC、分界条床核、島皮質は味覚関連行動に関与することが報告されているが、嗅周囲皮質や梨状皮質については味覚への関与はこれまでに報告されていない。本研究課題によって、食物記憶(味覚嫌悪学習の記憶)の想起時に、扁桃体基底外側核から大脳基底核(側坐核、IPAC、分界条床核)と大脳皮質(島皮質、嗅周囲皮質、梨状皮質)という2つの大きな方向性をもって情報が伝達されることが明らかにされた。これらの結果は、食物記憶の想起による行動の表出には多様な神経情報伝達経路が関与していることを示しており、それぞれの経路がどのような役割を担っているのかを調べていく必要がある。
疾患関連リプログラミングによる前立腺癌不均一性の獲得機構

前立腺の上皮細胞は平滑筋細胞からのパラクライン刺激により形態的・機能的に成熟した分化状態を維持している。しかし、間質リモデリングが生じると上皮細胞の分化状態が二次的に破綻し、前立腺癌の発生に寄与すると考えられる。ヒト前立腺癌患者由来線維芽細胞との共培養によりヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1における癌抑制遺伝子GSTP1 mRNA発現量は有意に低下した。また、去勢により誘導される間質リモデリング周囲の管腔構造が崩壊したエリアにおいてもGSTP1 mRNA発現量は低値を示した。間質リモデリングの誘導が上皮細胞における癌抑制遺伝子発現を減少させ、前立腺癌の発生に寄与している可能性が示唆された。本年度は、前立腺間質における線維芽細胞の多様性がヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1に与える目的で、複数の前立腺癌患者の組織から初代培養して得られた線維芽細胞とBPH-1細胞とのin vitro共培養実験を施行した。実験には市販されている正常ヒト前立腺間質細胞PrSCを比較対象細胞とし、摘出手術材料より初代培養にて単離したヒト前立腺癌患者由来線維芽細胞pcPrF-M5, pcPrF-M6, pcPrF-M7を用いた。Falconセルカルチャーインサートを用いたin vitro共培養実験では、BPH-1に対してPrSC, pcPrF-M5, pcPrF-M6, pcPrF-M7それぞれを組み合わせて4日間の共培養を行った後に、BPH-1細胞の細胞増殖率、分泌タンパク質量の変化を比較検討した。その結果、pcPrF-M5とpcPrF-M7はBPH-1細胞の増殖率を有意に促進させた。BPH-1細胞からのTGFb1産生量はpcPrF-M6との共培養群で有意に増加した。BPH-1細胞からのVEGF産生量はpcPrF-M6との共培養群で有意に増加した。しかし、pcPrF-M5, pcPrF-M7との共培養群ではBPH-1細胞からのVEGF産生量が有意に低下した。BPH-1細胞からのIL-6産生量は全ての共培養群で有意に増加した。その中でもpcPrF-M6と共培養したBPH-1細胞からのIL-6産生量はBPH-1細胞単独群に比較して10倍以上に増加した。以上の結果より、我々が独自に作製した癌患者由来線維芽細胞はヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1に対してパラクライン的に作用することが判明した。我々は、複数の前立腺癌患者の組織から初代培養して得られる線維芽細胞を独自のCAFsパネルとして収集している。これらCAFsパネルに含まれる線維芽細胞の性状は極めて不均一であり、ヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1に対するパラクライン作用も細胞毎に異なると考えた。結果は予想通りで、我々は正常ヒト前立腺間質細胞PrSCはBPH-1細胞との相互作用が生じないものの、癌患者由来線維芽細胞はBPH-1細胞に対して細胞増殖刺激を与えたり、細胞分化にも影響することを見出した。つまり、本検討で示された前立腺上皮細胞が共培養する線維芽細胞の性状に強く影響を受けるという事実は、前立腺癌の発生に疾患関連リプログラミングが重要な役割を担っていることを示唆する、非常に有用な知見となった。昨年度に引き続き本年度も、複数の前立腺癌患者の組織から初代培養して得られた線維芽細胞とヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1細胞とのin vitro共培養実験を施行した。前立腺癌組織からの線維芽細胞の初代培養は継続して行っており、昨年度に使用した線維芽細胞とは異なる6つの線維芽細胞を追加検討した。Falconセルカルチャーインサートを用いたin vitro共培養実験では、BPH-1細胞に対してpcPrF-M10, pcPrF-M11, pcPrF-M18, pcPrF-M23, pcPrF-M24, pcPrF-M26それぞれを組み合わせて4日間の共培養を行った後に、BPH-1細胞の細胞増殖率、分泌タンパク質量の変化を比較検討した。その結果、pcPrF-M11およびpcPrF-M18はBPH-1細胞の増殖率を有意に促進させた。その中でもpcPrF-M11と共培養したBPH-1細胞からのIL-6産生量はBPH-1細胞単独群に比較して15倍以上に増加した。癌抑制遺伝子TP53 mRNA発現量は、PrSCおよびpcPrF-M7との共培養群で有意に減少した。一方、pcPrF-M11およびpcPrF-M24との共培養群でTP53 mRNA発現量は有意に増加した。癌抑制遺伝子PTEN mRNA発現量は、pcPrF-M7との共培養群でのみ有意に減少した。一方、pcPrF-M18, pcPrF-M24, pcPrF-M26との共培養群でPTEN mRNA発現量は有意に増加した。以上の結果より、癌患者由来線維芽細胞が産生・分泌するパラクライン因子には、BPH-1細胞の増殖を促進する細胞増殖因子やサイトカインとは別に、癌抑制遺伝子の発現変化のようなBPH-1細胞の分化状態に関与する何らかの因子が存在している可能性が示唆された。

昨年度に引き続き、本年度も順調に前立腺癌組織からの線維芽細胞の初代培養を継続し、独自のCAFsパネルで使用可能な線維芽細胞が10種類を超えた。これら複数の線維芽細胞との共培養によりBPH-1細胞がどのような挙動を示すのか、細胞増殖への影響、サイトカイン産生量への影響、そして癌抑制遺伝子の発現への影響を予定通り検討することができた。癌抑制遺伝子の発現に影響した線維芽細胞とBPH-1細胞の組み合わせについてBPH-1細胞からDNAを抽出し、現在、TP53およびPTEN遺伝子のDNAメチル化解析を施行中である。本年度は、ヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1細胞とラット胎生期泌尿生殖洞間充織細胞rUGMとのin vivo共移植実験を施行した。移植から12週間目にホストマウスを去勢した後、7, 14, 28日目にマウスを屠殺した。また、マウスを去勢してから14日目に20 mg DHTペレットを皮下に埋設し、7日目にマウスを屠殺した。前立腺様の管腔構造を構築したBPH-1細胞における癌抑制遺伝子のmRNA発現量はLCMを用いて、正常腺管および管腔構造が崩壊したエリアを分取し、mRNA抽出後にTaqMan probeを用いたデジタルPCRを施行した。その結果、去勢後速やかに間質リモデリングが誘導されたものの、アンドロゲン付加後7日目には間質リモデリングの割合が有意に低下した。次に、BPH-1細胞により構築される前立腺様の管腔構造は去勢後速やかに崩壊し始め、その割合は経時的に増加した。なお、アンドロゲン付加後7日目でも管腔構造の崩壊は回復しなかった。前立腺様の管腔構造を構築したBPH-1細胞における癌抑制遺伝子のmRNA発現量であるが、正常腺管に比較して管腔構造が崩壊したエリアではTP16およびGSTP1 mRNA発現量が低値を示した。次に、体内アンドロゲン濃度との関係を検討したところ、正常腺管におけるTP16およびGSTP1 mRNA発現量は偽手術群よりも去勢群で低値を示した。一方、管腔構造が崩壊したエリアにおいてはGSTP1 mRNA発現量だけが去勢群で低値を示した。以上の結果より、前立腺増殖性疾患で観察される間質リモデリングのような構造的変化が生じると、正常腺管を構築する上皮細胞に対して周囲の間質(線維芽細胞)が産生・分泌するパラクライン因子が、上皮細胞の増殖を刺激するだけでなく、上皮細胞の分化状態をも変化させてしまう可能性が示唆された。前立腺の上皮細胞は平滑筋細胞からのパラクライン刺激により形態的・機能的に成熟した分化状態を維持している。しかし、間質リモデリングが生じると上皮細胞の分化状態が二次的に破綻し、前立腺癌の発生に寄与すると考えられる。ヒト前立腺癌患者由来線維芽細胞との共培養によりヒト前立腺幹・前駆細胞モデルBPH-1における癌抑制遺伝子GSTP1 mRNA発現量は有意に低下した。また、去勢により誘導される間質リモデリング周囲の管腔構造が崩壊したエリアにおいてもGSTP1 mRNA発現量は低値を示した。間質リモデリングの誘導が上皮細胞における癌抑制遺伝子発現を減少させ、前立腺癌の発生に寄与している可能性が示唆された。
細胞外べシクルGPMVs の生化学的特徴の解析と生体機能素材への応用

これまでに確立した大量調整法を用いて作製した大量のGPMVsについて、精製および濃縮方法を検討し、核酸(RNA)、タンパク質、糖鎖、の網羅的解析を行っている。また、GPMVsの生細胞への作用の解析も並行して進めている。今後はさらに、GPMVsへの核酸やタンパク質等の導入方法の検討も考えており、GPMVsの保健医療分野への応用を期待している。
意識活動におよぼす視床網様核の役割

(目的)ForelーH野は上位痙攣中枢からの下向性インパルスの伝導路であること、他方、脳幹賦活系と密接な関係を持ち新皮質の発作性興奮に対して促進機能を有することが陣内、六川によって報告されている。FFHは解剖学的には神経線維束が主体をなし、神経細胞(subthalamic reticular nucleus)も少数存在する。我々はこのFFH細胞に投射する神経細胞を皮質・皮質下核・小脳・脳幹部にわたって解剖学的に調べる一方、電気生理学的に確認した。(方法)1.逆行性軸索輸送法(HRP法)成熟ネコ7匹のFFHにHRPを定位的・電気泳動的に注入し、全例Mesulam( ́82)によるテトラメチルベンチジン法を行い逆行性に標識される細胞の局在を調べた。2.電気生理学的アプロ-チ生熟ネコ16匹の前S状回、ForelーH野、中脳網様体、吻側橋網様核、Nucl. reticularis gigantcellularisに刺入し、刺激および記録を行った。(結果および結論)1.ForelーH野細胞は新皮質および脳幹網様体から投射を受ける。2.新皮質からの投射は同側の前・後S状回第V層で、十字溝の中点部分に多い。3.中脳網様体からの投射は同側のみであるが、4.橋および延髄網様体からの投射は両側性である。5.てんかん性興奮に重要な役割を有するとして説明されている脳幹網様体のefferent pathwaysへのForelーH野の介在が示唆される。ラット視床網様核の構造と細胞の特徴について調べた。250gから300gの体重のラットを1%パラフォルムアルデハイドと1%グルテアルデハイド固定液で潅流固定した後、50mmの厚さで切片を作製した。H-E染色後、鏡検し、同定した。視床網様核は外髄板との形態を成しており、視床の外側、背外側、および前面を取り囲んでいた。大きさは、約2.5×3.0×2.5mmであった。この大きさは定位脳手術台の上ではBregmaから後方へ1.3から3.8mm、正中から外側へ0.9から3.9mm、骨表面より深さ4.6から7.1mmに位置していた。視床網様核は内包を経由する大脳皮質への求心線維および遠心線維によって不規則な形状に分割され、この網状構造がこの核の名称の由来であることが理解できる。視床網様核は形状が複雑で、吻側における前核群との境界は不明瞭であり、尾側においては背外側から視床後核群に移行していた。また腹側では狭を介して不確帯に移行していた。これらの区別には、視床網様核が粗な細胞密度であるのに対して他方は密であることが鑑別となった。視床網様核の細胞の形状や大きさにはバリエーションがあるが、最も一般的と思われる特徴は以下のごとくであった。約15×10mmの小さな紡鍾形をしており枝は中心部に位置していた。各細胞は極性があり、ほぼ全て視床と皮質との結線に直交するように配列していた。細胞密度は1.39×10^5/mm^3であり、不確帯が1.74×10^5/mm^3であるのに対して、来年度より、上記核内にガラス微小管を挿入し、神経標式物質を注入し、神経連絡を調べる予定である。今回われわれは視床網様核の尾端に位置してこの核と解剖生理学的な関係で注目されているForel-H野を研究対象とした。すなわちForel-Hの神経線維連絡をHRPを用いた逆行性標識により調べた。成熟ネコ4匹のForel-

H野に定位的に電気泳動法を用いてHRPを注入し、以下の部位に標識を認めた。前S状回、後S状回、視索上核、視床下部前野、視床下部背側野、中脳網様体、吻側橋網様核、橋中心灰白質、下前庭核そして疑核に細胞が認められた。また下視床脚に標識神経線維を認めた。すなわち大脳皮質運動知覚野、視床下部、網様体賦活系と解剖学的連絡を有する。このうち運動野(分野4)および運動前野(分野6)である前S状回、一次体知覚野である後S状回に着目し、1匹のネコで逆行性標識細胞の局在を調べた。矢状断で観察し以下の結果を得た。1.標識細胞は総計105個でうちわけは前S状回81個(77%)、後S状回24個(23%)であった。2.十字溝全長(約7.50mm)を含む注入側皮質を矢状断にて4等分し、正中から外側へ向けてA,B,C,Dとすると標識細胞の比率はそれぞれA47.6%、B39.0%、C6.7%、D6.7%と内側部に比較的限局していた。3.同様の矢状断にて非注入側皮質には標識細胞は認められなかった。4.細胞は主に第V層に標識された。5.皮質を表面皮質と溝皮質に分けると前S状回に標識された81個の細胞は表面皮質11個、溝皮質70個、後S状回の24個は表面皮質1個、溝皮質23個であり、したがって総計105個中12個(11%)のみが表面皮質で93個(89%)は溝皮質すなわち内部に分布していた。錐体路の起始細胞は分野4とその背側に続く一次体知覚野に多く、分野4では十字溝の内部に最も多いといわれる。われわれの得た結果との類似は興味深い。(目的)ForelーH野は上位痙攣中枢からの下向性インパルスの伝導路であること、他方、脳幹賦活系と密接な関係を持ち新皮質の発作性興奮に対して促進機能を有することが陣内、六川によって報告されている。FFHは解剖学的には神経線維束が主体をなし、神経細胞(subthalamic reticular nucleus)も少数存在する。我々はこのFFH細胞に投射する神経細胞を皮質・皮質下核・小脳・脳幹部にわたって解剖学的に調べる一方、電気生理学的に確認した。(方法)1.逆行性軸索輸送法(HRP法)成熟ネコ7匹のFFHにHRPを定位的・電気泳動的に注入し、全例Mesulam( ́82)によるテトラメチルベンチジン法を行い逆行性に標識される細胞の局在を調べた。2.電気生理学的アプロ-チ成熱ネコ16匹の前S状回、ForelーH野、中脳網様体、吻側橋網様核、Nucl.reticularis gigantcellularisに刺入し、刺激および記録を行った。(結果および結論)1.ForelーH野細胞は新皮質および脳幹網様体から投射を受ける。2.新皮質からの投射は同側の前・後S状回第V層で、十字溝の中点部分に多い。3.中脳網様体からの投射は同側のみであるが、4.橋および延髄網様体からの投射は両側性である。5.てんかん性興奮に重要な役割を有するとして説明されている脳幹網様体のefferent pathwaysへのForelーH野の介在が示唆される。
脳科学の飛躍的な発展を目指す次世代信号処理技術の開発

視覚刺激や聴覚刺激の伴う脳活動の変化をEEGによって計測し、BCIなどのインターフェースへ応用されている。しかし、脳解析で利用されているFFTでは、信号の微小変化を可視化するための時間分解能と周波数分解能が不足している。NHAは、申請者等が発明した解析法で、フーリエ変換に比べ、10万100億倍以上の精度向上が見込まれている。そこで、ASSRでよく利用されている40Hzの帯域で、微小変化する聴覚刺激に起因するEEGの計測信号を用いてFFTとNHAで比較実験を行った。その結果、NHAを用いると40Hz41Hzで連続的に微小変化する変調信号の影響を誤差が1%以下の精度で解析できることがわかった。本研究では、工学系で広く利用されているアナログ信号のフーリエ変換(FFT)に比べ、10万100億倍以上の精度の向上が見込まれるNHA(Non Harmonic Analysis:申請者等が考案した非周期信号のフーリエ変換式への最小二乗法の適用に基づく周波数分析法)を拡張し、1次元をはじめとした多次元の不等間隔データを正確に解析する信号解析ソフトウェアを開発し、脳科学の分野でも利用されている光トポグラフィーや、脳波計(Electroencephalogram:EEG)などの脳機能マッピング装置に応用する。特にこのようなソフトウェア技術によって、不等間隔計測データを正確に解析し、生体内部の様々なノイズに強く、特定の動作に伴う信号を抽出するための信号解析法を確立ため、当該年度は以下の項目に関して検討を行った。11次元不等間隔サンプリングデータの信号解析法の開発現在の等間隔サンプリングデータで成功したNHAを不等間隔のサンプリングデータに応用する。NHAは最小二乗法を用いたカーブフィッテングの手法を取り入れているが、目的値に近い周波数を初期値として与えなければならず、これは連続信号のフーリエ変換を数値解析的に、台形積分を用いることで解決した。22次元不等間隔サンプリングデータへの拡張2次元では、連続信号のフーリエ変換式が2重積分になる。これは数値解析的に、隣接する3点の離散データの体積を求める問題と等価になるため、領域分割問題のドロネー三角形分割を用いて、初期値を計算し、任意の不等間隔サンプリングデータにも対応した2次元NHAを開発した。本研究では、工学系で広く利用されているアナログ信号のフーリエ変換(FFT)に比べ、10万100億倍以上の精度の向上が見込まれるNHA(Non Harmonic Analysis:申請者等が考案した非周期信号のフーリエ変換式への最小二乗法の適用に基づく周波数分析法)を拡張し、1次元をはじめとした多次元の不等間隔データを正確に解析する信号解析ソフトウェアを開発し、脳科学の分野でも利用されている光トポグラフィーや、脳波計(Electroencephalogram:EEG)などの脳機能マッピング装置に応用した。特にこのようなソフトウェア技術によって、不等間隔計測データを正確に解析し、生体内部の様々なノイズに強く、特定の動作に伴う信号を抽出するための信号解析法を確立した。総合領域当初予定していた、計測装置のチャンネル間の冗長性の集約に関しては、次年度に行うことにした。以下の検討を行う。3計測装置のチャンネル間の冗長性の集約・・・一般に、計測装置の各チャンネル間の中心点を中心に感度分布が得られるため、中心点から離れた位置の脳情報ほど観測し難くなり、また計測信号間に情報の重なりが見られてしまう。これを2次元NHAによって周波数特性を正確に解析し、各チャンネル間の冗長性を集約する。4空間的分解能を補う正確な補間技術・・・冗長性を集約した各チャンネルの計測データから、チャンネル間に非定常的な空間方向の変動を仮定し、NHAによって空間的な波の形状を決定することで空間的分解能を補う、より正確な補間技術を開発する。5客観評価と連携した新しい脳の反応モデルの検討・・・発火反応部位を正確に推定するためには、ある部位の発火によって時空間的に広がる微小な反応を追跡する必要がある。4によって得られる空間的に密な信号に対して、時間方向にもNHAを適用することで微小な変化を検知し、信号源を推定する技術を開発する。また、脳波情報に対して本手法を適用することで得られた信号源の位置と、解剖学的知見等から特定されている信号源の位置を比較することで、客観的に脳の反応モデルの妥当性を検討する。計測装置のチャンネル間の冗長性の集約を行う実験計画を遅らせたため。次年度以降に遅れが生じた実験を行う予定である。