hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線虫の全脳イメージングによる探索型ナビゲーション神経基盤の解明

探索型ナビゲーションは、環境からの乏しい情報を元に目的地にたどり着くための手段であり、これには効率的な情報の抽出や蓄積、判断、行動の制御など、様々な脳活動が必要である。線虫C.エレガンスは、化学物質(匂いや味)に対して探索型ナビゲーションを行う事、わずか302個の神経細胞から構成される全回路構造が解明されている事、神経機能に必要な遺伝子はヒトなどと高い共通性を持つ事などから、探索型ナビゲーションを制御する神経細胞活動を明らかにするためのモデルとして優れている。本研究では、探索型ナビゲーションに関わる神経活動の全貌を解明するために、「課題1:刺激-行動対応解明のための半自動分析方法の確立」「課題2:全脳神経活動の同時イメージング」「課題3:刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定」「課題4:フィードバック介入実験によるモデルの検証」を目指している。H29年度は、課題13を中心に行った。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:A02前川班との共同研究として、線虫の行動状態を半自動的に分析する手法を確立した。課題2全脳神経活動の同時イメージング:人工知能技術の1つである深層学習を用いて、三次元時系列イメージ中の神経細胞を効率的に追跡するソフトウェアを開発した。課題3刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定:A02竹内班との共同研究として、刺激-脳状態-行動の時系列ベクトルデータを効率的に処理する手法を確立した。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:A02前川班との共同研究として、匂い刺激に対する線虫のナビゲーションデータからその行動状態を機械学習技術を用いて半自動的に分析する手法を確立し、投稿を開始した。また、線虫以外の野外動物の行動にも本手法を適応し、良好な結果を得た。課題2全脳神経活動の同時イメージング: H28年度に確立した独自の正倒立型顕微鏡システムからの三次元時系列イメージに対して、深層学習技術を用いて効率的に神経細胞を追跡するソフトウェアを開発した。本手法は、異なる光学条件下で測定された細胞の三次元時系列イメージに柔軟に対応する事ができた。現在、論文投稿準備中である。課題3課題3刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定:A02竹内班と共同して、刺激-脳状態-行動の時系列ベクトルデータから特徴的なパターンを抽出する方法、およびそれを効率的に視覚化する方向を開発した。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:現在投稿中の論文の受理を目指す。また、B01生態班が持つデータを用いて解析を行う。課題2全脳神経活動の同時イメージング:全脳神経活動を抽出するためのソフトウェアに関する論文の受理を目指す。また、神経活動の動的関連性を明らかにする。課題3刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定:A02竹内班との共同研究の成果に関する論文投稿および受理を目指す。H28年度は、課題1と課題2を中心に行った。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:H28年度は、発表済のデータを用いて、環境刺激と行動状態の時系列データから、「刺激と行動状態遷移の因果関係」に関する知識を抽出するための複数のデータ分析手法を検討した。具体的には、古典的機械学習分析手法「決定木」で使われる情報ゲインや識別パターンマイニングの手法を用いて、線虫ナビゲーションの学習依存的行動変化の特徴を野生株および変異株から抽出した。課題2全脳神経活動の同時イメージング: H28年度は独自の正倒立型顕微鏡システムを確立し、共焦点ユニットを用いて3次元イメージングのための準備を整えた。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立(A02前川班との共同研究):本研究課題では、環境刺激と行動状態の時系列データから、「刺激と行動状態遷移の因果関係」に関する知識を抽出するためのデータ分析手法を開発する事を目指している。具体的には、環境刺激と行動について高精度の計測が行える線虫のデータをモデルとして、機械学習技術を用いて、半自動的に特徴抽出のためのパラメータ設定やモデル化のための手法を検討する。H28年度は、発表済のデータを用いて、環境刺激と行動状態の時系列データから、「刺激と行動状態遷移の因果関係」に関する知識を抽出するための複数のデータ分析手法を検討した。ほぼ当初の予定通りに、古典的機械学習分析手法「決定木」で使われる情報ゲインや識別パターンマイニングを用いて、線虫ナビゲーションの学習依存的行動変化の特徴を野生株および変異株から抽出した。課題2全脳神経活動の同時

イメージング:課題1で明らかになった行動状態遷移を制御する神経活動を明らかにする。研究代表者木村は、これまでに仮想匂い勾配中をナビゲーションする線虫を自動追跡しながら、特定の神経活動を光学測定する実験系を確立した(Tanimoto et al., eLIFE 2017)。本研究課題では、この実験系を全脳イメージングに拡張することで、ナビゲーションに伴う全脳活動を明らかにする。具体的には、これまでに開発した自動追跡型顕微鏡システムを、より高速・高感度な画像取得カメラおよび共焦点システムと統合し、化学物質勾配空間を探索する線虫の全脳神経活動の同時イメージングを行う。H28年度はほぼ当初の予定通りに、独自の正倒立型顕微鏡システムを確立し、共焦点ユニットと共に3次元イメージングのための準備を整えた。探索型ナビゲーションは、環境からの乏しい情報を元に目的地にたどり着くための手段であり、これには効率的な情報の抽出や蓄積、判断、行動の制御など、様々な脳活動が必要である。線虫C.エレガンスは、化学物質(匂いや味)に対して探索型ナビゲーションを行う事、わずか302個の神経細胞から構成される全回路構造が解明されている事、神経機能に必要な遺伝子はヒトなどと高い共通性を持つ事などから、探索型ナビゲーションを制御する神経細胞活動を明らかにするためのモデルとして優れている。本研究では、探索型ナビゲーションに関わる神経活動の全貌を解明するために、「課題1:刺激-行動対応解明のための半自動分析方法の確立」「課題2:全脳神経活動の同時イメージング」「課題3:刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定」「課題4:フィードバック介入実験によるモデルの検証」を目指している。H29年度は、課題13を中心に行った。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:A02前川班との共同研究として、線虫の行動状態を半自動的に分析する手法を確立した。課題2全脳神経活動の同時イメージング:人工知能技術の1つである深層学習を用いて、三次元時系列イメージ中の神経細胞を効率的に追跡するソフトウェアを開発した。課題3刺激と行動を結ぶ脳機能のモデル化とシステム同定:A02竹内班との共同研究として、刺激-脳状態-行動の時系列ベクトルデータを効率的に処理する手法を確立した。課題1刺激-行動の対応解明のための半自動分析方法の確立:A02前川班との共同研究として、匂い刺激に対する線虫のナビゲーションデータからその行動状態を機械学習技術を用いて半自動的に分析する手法を確立し、投稿を開始した。また、線虫以外の野外動物の行動にも本手法を適応し、良好な結果を得た。課題2全脳神経活動の同時イメージング: H28年度に確立した独自の正倒立型顕微鏡システムからの三次元時系列イメージに対して、深層学習技術を用いて効率的に神経細胞を追跡するソフトウェアを開発した。本手法は、異なる光学条件下で測定された細胞の三次元時系列イメージに柔軟に対応する事ができた。
アデノシンによる慢性心不全の新しい薬物治療法の開発とその確立

我々は心血管疾患におけるアデノシンの役割に関する研究を継続して行っている。今回、虚血性疾患および心不全における病態においてアデノシンがどのような役割を演じているかを、基礎的検討及び臨床的検討の両面から検討を試みた。虚血性心疾患における基礎的研究として、従来はひとつひとつの物質の遺伝子発現レベルを個別に評価していたわけであるが、今回我々は一度に8000個の物質を一度に評価できる最新のDNAmicroarray法を用いて虚血によりどのような遺伝子群が変化するかを検討した。数十個の遺伝子発現レベルに変化が明らかとなった。さらにアデノシン受容体遮断薬を用いた実験により、虚血により変化した遺伝子発現のうち約半数の遺伝子がアデノシンにより調節されていることが明らかになった。虚血性心疾患に対する臨床的検討としては、急性心筋梗塞におけるアデノシン投与による梗塞サイズ縮小効果を臨床病院と共同研究にて検討している。急性心筋梗塞におけるアデノシンの冠動脈注入において梗塞サイズ縮小効果が明らかとなった。現在アデノシンの静脈内投与におい同様の効果が得られるか検討中である。次に心不全における基礎的研究は、ハムスター心不全モデルににおいてアデノシン産生酵素(ecto-5'-nuclotidase)誘導が如何に変化するかを検討した。心不全モデルにおいてアデノシン産生酵素が有意に低下することが明らかとなり、心不全においてアデノシン産生の低下が関与していることが明らかとなった。これらが臨床おいていかなるかを評価するために心不全症例の血中アデノシンレベルを見ると、代償期の心不全症例においてはアデノシンレベルが上昇しているが、非代償期の心不全においてはアデノシンレベルは逆に低下することが明らかとなった。このようにアデノシンにおける心疾患の関与は極めて大きく、現在ecto-5'-nuclotidase過剰発現ラットを作成し、圧負荷などのモデルにより解析を検討中である。平成10年度は、慢性心筋不全・心不全をモデルにおいてアデノシン及びその関連物質がその病態を改善するか否かを検討した。ビーグルイヌに直径15μmのマイクロスフェアを冠微小欠陥に栓塞したところ、4週間後に慢性心不全モデルが作製された。かかる実験動物において血中アデノシンレベルの増加、心筋・欠陥におけるアデノシン産生酵素(coto-5'-nuclcotidasc)誘導を認めた。さらに、アデノシン受容体遮断剤を投与すると、左室駆出率の低下、左室拡張末期容積の増加が増強し逆にアデノシン産生を増強させるジビリダモール投与にて慢性心不全の病態が改善することから慢性心不全では心・血管においてアデノシン産生が増加し代償的に作用していることが示された。また、臨床において慢性心不全症例22人に対しアデノシン産生増強剤であるジピリダモール・ジラゼップを投与したところNUHA心機能分類、左室駆出率、運動耐容能は改善した。このことより、臨床においても慢性心不全の病態にアデノシンが関与することが明らかになった。現在、さらにエントリー数を増やし、対照群をおいたcontrolstudyを計画中である。分子生物学的アプローチとして、ccto-5'-nuclcotidasc過剰発現ラットを作製中であり、現在ES細胞が完成し、あと2カ月にて過剰発言マウスが完成予定である。かかるラットを用い、圧負荷などにより心不全を作製し、その椎移を検討すればさらにアデノシンと心不全の関係が明らかになるものと期待される。我々は、心血管疾患におけるアデノシンの役割に関する研究を継続して行っている。今回、虚血性疾患および心不全における病態においてアデノシンがどのような役割を演じているかを、基礎的検討および臨床的検討の両面から検討を試みた。

虚血性心疾患における基礎的研究として、従来はひとつひとつの物質の遺伝子発現レベルを個別に評価していたわけであるが、今回我々は一度に8000個の物質を一度に評価できる最新のDNAmicroarray法を用いて虚血によりどのような遺伝子群が変化するかを検討した。数十個の遺伝子発現レベルに変化が明らかとなった。さらにアデノシン受容体遮断薬を用いた実験により、虚血により変化した遺伝子発現のうち約半数の遺伝子がアデノシンにより調節されていることが明らかとなった。虚血性心疾患に対する臨床的検討としては、急性心筋梗塞におけるアデノシン投与による梗塞サイズ縮小効果を臨床病院と共同研究にて検討している。急性心筋梗塞におけるアデノシンの冠動脈注入において梗塞サイズ縮小効果が明らかとなった。現在アデノシンの静脈内投与において同様の効果が得られるか検討中である。次に心不全における基礎的研究は、ハムスター心不全モデルにおいてアデノシン産生酵素(ecto-5'-nuclotidase)誘導が如何に変化するかを検討した。心不全モデルにおいてアデノシン産生酵素が有意に低下することが明らかとなり、心不全においてアデノシン産生の低下が関与していることが明らかとなった。これらが臨床においていかなるかを評価するために心不全症例の血中アデノシンレベルを見ると、代償期の心不全症例においてはアデノシンレベルが上昇しているが、非代償期の心不全においてはアデノシンレベルは逆に低下することが明らかとなった。このようにアデノシンにおける心疾患の関与は極めて大きく、現在ecto-5'-nucleotidase過剰発現ラットを作成し、圧負荷などのモデルにより解析を検討中である。
太陽光分子変換反応を指向した分子状光触媒の創成

エネルギー問題や環境問題の観点から、クリーンでグリーンなものづくりシステムの開発がのぞまれている。本研究では、可視光に応答して電子移動反応を起こすことが知られている[Ru(bpy)3]2+に代表される可視光増感性金属錯体(フォトレドックス触媒)に注目し、これを活用した可視光、とくに太陽光を利用した光化学プロセスの開発に取り組んだ。その結果、新しい高機能光触媒の分子設計に関して重要な知見を得るとともに、前例のない太陽光分子変換反応を見出した。得られた研究成果に関して、学会発表(10件)、論文発表(8件)、特許出願(1件)を行った。また、海外の研究者向けコミュニティーWebサイト(AdvancesinEngineering)においてその研究成果の一部が紹介されるなど高い評価を得た。光化学反応は、熱エネルギー(基底状態)では進行しない反応を、分子の電子励起状態を経由することで実現できる可能性がある。古典的な光化学反応は、光源として紫外光を使用する。これは、有機化合物の多くが可視領域に吸収を持たない、すなわち無色であり励起するために高エネルギーが必要なためである。しかし紫外光の使用は光反応の実用性、選択性を大きく損なう要因となっている。本研究では、光源として可視光とくに天然に無尽蔵に存在する太陽光に着目し、可視光で駆動する光触媒システムとその分子変換反応の開発を目的とした。光触媒として、可視領域に吸収帯を有する色鮮やかな遷移金属錯体に注目した。ルテニウムやイリジウムのポリピリジル錯体は可視領域に吸収帯を有し、可視光で励起されると金属中心のd軌道から配位子のπ*軌道に電子が移動した三重項励起状態を形成する。この光誘起電子移動に基づく触媒反応の開発と電子移動を促進可能な官能基を導入した新規な高機能化光触媒の創成をめざした。本研究では、太陽光を利用した精密な有機合成反応の開発を指向し、新規な光触媒の創成に取り組んでいる。本年度は、基質活性化部位を有する新しい2,2'-ビピリジン配位子の合成に成功した。またルテニウム錯体への導入も検討し、錯体化も確認した。引き続き、キラル光触媒創成へ、合成した高機能化光触媒の精製、分離に取り組んでいる。本年度はさらに、太陽光反応の開発にも取り組んだ。既往のルテニウム光触媒を用い、太陽光下でエナミンとシリルエノールエーテルの酸化的カップリング反応を見出した。本反応では、合成中間体として有用な非対称なγージケトン類を効率的に合成できる。今後、合成した新規なキラル光触媒を本反応に適用し、不斉光反応の開発に取り組む。触媒合成の第一段階である配位子の合成に取り組んだ。当初、計画していた配位子の合成にはまだ成功していないが、同様の活性化機能が期待できる配位子を設計し直し、合成することに成功した。今後は、錯体へ導入し、新規な光触媒を合成する。また、太陽光反応を行う上で、太陽光を十分に吸収するために重要と思われる反応容器を設計した。実際に設計した反応容器を用いた太陽光反応も開発した。今後、新しく合成した光触媒を用い、太陽光反応を検討する。本年度合成をめざした光触媒の分子設計を変更したため、購入する予定であった試薬を翌年に購入することにし、残額が生じた。また、高選択的な反応を達成するために必要と考えている低温光反応装置の設計と見積もりに時間を要したため、予算執行時期が遅れ残額が生じた。今後は、まず合成した配位子から新規な光触媒を合成し、その触媒機能を明らかにする。新しく購入予定の光反応装置も活用し、高選択的な反応の開発をめざす。本研究を進める上で、光反応装置は重要である。光源となるキセノンランプ、LEDランプを購入する予定である。さらに、低温光反応装置の購入も検討している。また、光触媒合成に必要な試薬も消耗品として予算に加えている。現在得られた成果を発表するための学会参加費、旅費を計上している。
網目状骨格を有する磁性カプセルの構造制御と薬剤送達システムに向けた機能化

本研究では薬剤送達システムへの実用化を目的として、1.網目状骨格を持つFePtカプセルの磁気特性の向上及びFePt網目状構造の形成過程解明、2.FePtナノ粒子のポリマー分子上への自己集積過程の解明についてそれぞれ成果を上げてきた。特に今年度は、超臨界エタノール中でのカプセル間凝集抑制のための溶液量、複合粒子の濃度等の最適化や複合粒子を酸化物またはオレイン酸などFeやPtと親和性の高い有機分子での被覆を行った。結果として、シリカシェルをFePtナノ粒子が集積したシリカ粒子表面上に形成させることで、超臨界エタノール処理後もカプセル間で焼結を起こさず、シリカ粒子上に網目状FePtシェルが形成することを明らかにした。また、酸化物被覆によって懸念されたFeの酸化も問題とならないことがわかった。さらに磁気誘導薬剤送達システムの評価として、血管を模したマイクロ流路内に血流速と同じ速度でリン酸緩衝生理食塩水を流し、流体中でFePtカプセルの捕捉実験を行った。マイクロ流路を用いた実験から、FePtカプセルが磁気捕捉に十分な磁気特性を持っていないことが明らかになった。薬剤送達システムへの応用には至らないものの、本研究で作製したFePt合金から成る網目状シェルは化学的に安定で、ナノ粒子のモルフォロジーを維持しながら多孔質で中空の構造を形成しているため高い比表面積をもつこと、また、焼結体であることから高温試験においても構造に大きな変化が生じないなどの特異的な構造と性質から、白金低減を目的とする燃料電池用電極触媒として大いに期待されることが明らかになった。現在、専門家との共同研究において、カプセル形状の制御や合金の構造制御等に向けた具体的な取り組みを行っている。今後は環境材料としての応用を考えながら微細構造や形態の制御を行っていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、磁性カプセルの細孔サイズや磁気特性、形状の制御のために、カプセルの基となる磁性ナノ粒子の生成や集積過程、超臨界流体中での焼結過程を電子顕微鏡観察などにより明らかにし、磁気誘導特性の評価などによって磁気誘導薬剤送達システムへ磁性カプセルを実用化することを目的としている。本年度では、FePtナノ粒子の集積密度、熱処理に用いる超臨界流体の溶媒、時間や温度などの反応条件、添加剤について検討した。その結果、集積密度80%程度のFePtナノ粒子と高分子修飾シリカ粒子から成る複合粒子を400°Cの流体中で熱処理することにより、FePtナノ粒子が3次元に融着した網状のナノシェルが得られることを明らかにした。FePtナノ粒子の集積密度が100%以上の場合、多孔質のシェルは得られず膜状のシェルが形成し、集積密度が50%以下では3次元に連続して融着した構造は得られず、鋳型となるシリカ粒子を溶解させた後に構造が維持できなかった。したがって、網目状構造の形成は接触している粒子間の焼結によるものである可能性が高く、焼結前のナノ粒子寸法、密度を調整することで、熱処理後の微細構造の制御が可能であることがわかった。流体中での熱処理条件の検討により、400°Cの超臨界エタノール中で1.5時間熱処理することによって、室温下で飽和磁化値25emu/g程度を持つ磁性カプセルを得た。このカプセルは直径20m程度の細孔が無数に存在し、かつ10nm程度の厚さを持つ非常に薄いFePt合金シェルによって構成されている。また、超臨界エタノール中で熱処理することによりFePt合金の規則化が促進されることが示唆された。これらの結果から、本研究の新規な手法を用いることで、嵩高い薬剤分子の搭載と放出が可能であり、かっ高い薬剤搭載能、磁気応答性を持つ磁性カプセルの作製が可能であることを示した。

現在、専門家との共同研究において、カプセル形状の制御や合金の構造制御等に向けた具体的な取り組みを行っている。今後は環境材料としての応用を考えながら微細構造や形態の制御を行っていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。超臨界エタノールを用いた熱処理によって得られたカプセルは凝集してしまう。これは反応中に複合粒子が反応容器中で高い頻度で衝突しているためであると考えている。この凝集を抑制しなければ・流路中での磁気誘導特性の評価、細胞毒性試験などを行うことができないため、磁気誘導薬剤送達システムに応用するためのカプセルの評価が進んでいない。超臨界エタノール中でのカプセル間の凝集を抑制するために、熱処理の処理条件の最適化、特に溶液量、複合粒子の濃度などの最適化を行う。また、熱処理前のFePtナノ粒子/高分子/シリカ複合粒子をSiやZnなどの酸化物、またはオレイン酸やオレイルアミンなどのFeまたはPtと親和性の高い有機分子で被覆することで、超臨界流体中で衝突した複合粒子の表面での焼結を防止し、高い分散性を持つカプセルを作製し、応用に向けた評価を行う。また、これらの表面修飾が超臨界エタノールと複合粒子、FePtナノ粒子界面での現象に対して与える影響を調べることで、高温高圧流体下でのナノ粒子の焼結機構に対する知見を得る。
細胞のイオン輸送体の機能解明を目的とした浸透圧刺激印加及び機械特性計測技術の開発

申請者は,単一細胞の浸透圧適応機能の解明を目的とし,機械構造を統合化したマイクロ流体システムを用いた細胞の計測技術の開拓を進めてきた.本計測系は,環境の溶媒を制御しながら個別の細胞の特性を計測できる.マイクロ流体チップの中央には二対の機械式プローブを設計してあり,板バネ形状のはりのたわみから反力ー変形量特性を評価することが可能である.本研究初期構想では,浸透圧環境下での細胞の静的な特性を評価することを目標としてきた,しかしながら細胞内部の浸透圧に起因するダイナミクスをより定量的に解明するためには,細胞内部の流動室の特性を評価できるようにすることが重要であると判明した.そのため,研究計画を軌道修正し,必要な要素的基盤技術の追求を進めた.(1)マイクロ流体システム内部に細胞を滞留なく供給する流路加工技術.従来の細胞計測システムは,細胞を計測するための流路狭窄部において,急縮小部分をどうしても形成してしまうことから,高せん断速度領域が発生し,細胞が引き伸ばされ,節々に詰まるといった問題が発生する.そこで,ガラスの特殊ウェットエッチング技術により,平滑化された流路の狭窄部を作製する技術を確立した.これにより,細胞の流路内での変形,付着を抑制し,従来のコンセプトである連続的な細胞の計測を実現可能とした.(2)レーザ変位計による顕微鏡下観察物に対する高精度高速な変異計測技術.従来,力センサとなる梁構造のたわみの計測には,画像センサから得られた信号からモアレ縞を生成し,位相差検出を行う方法を用いてきた.しかしながら,画像センサを用いるため,変位計測の周波数が低く,またレイテンシーも大きかった.申請者は,計測アルゴリズムを変更し,レーザの一時回折光を用いた新しい干渉計の原理を開発し,実証した.これにより,実証実験においてフォトディテクタのサンプリングレートによる計測を可能とした.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。近年,細胞の機械的な特性に関連する細胞生理学的機能が,非常に重要な役割を果たすことが判明してきている.そのため,単一細胞レベルの機械的な特性の計測技術や,計測対象となる細胞機能を説明する機械的なモデルの構築は,細胞生理学現象の解明や定量的な評価を行う上で非常に重要な役割を果たす.申請者は,計測操作のハイスループット化や,計測環境の安定化,機能統合化を目的として,マイクロ流体チップ上における細胞の機械特性計測の技術開発を進めている.(1)計測レンジの拡大計測技術の高精度化は,詳細かつ信頼性のある計測を行う上で必須の要件である.本計測系において,細胞に対する圧縮変形の印加,およびそのときの反力の計測は,撮像時の走査モアレ縞を用いて高精度に構造物の変位を取得することにより実現している.しかしながら,高精度化に伴い変位計測レンジが限定されてしまう問題が発生した.そこで,複数の格子間隔の異なる構造体を用いて作動方式により計測レンジを拡大する手法を開発した.計測レンジが拡大したことによって,プローブ構造のゼロ点検出や.細胞に大変形を与えた際の挙動を詳細に分析することが可能となった.(2)変形特性の評価方法の開発従来の細胞特性評価方法では,細胞の物性や幾何的な変形挙動を十分に検討できていなかった.そこで申請者は,特に細胞が発現する弾性特性に着目し,高分子弾性理論による評価方法を確立した.細胞の構造は細胞骨格と呼ばれる高分子のネットワークから構成されていることから,基礎方程式をKuhnの高分子弾性論とし,幾何的拘束を考慮することで,本計測系における圧縮状態を再現する機械的なモデルを再現した.これにより,細胞の大変形領域において細胞の反力特性をうまく説明しており,今後細胞のメカニクスを議論する上で重要なものであると考えられる.申請者は,MEMS技術を基板とした,10 umオーダの細胞の,機械特性計測を可能にする実験システムを開発し,さらに実験結果を元にした解析的評価方法を確立した.マイクロ流体チップに搭載した接触式位置決め機構や,モアレ縞による高精度計測技術をさらに発展させ,高精度かつ広い計測レンジの細胞の押し込み時の変形量や反力を計測する手法を開発した.本計測技術のもと,動物性真核細胞を用いた実証実験を行い,その技術の有用性を示した.また,従来用いられていた微小変形領域での特性評価における問題を改善するため,細胞に大変形を与えた際の変形特性を物理的にモデル化することで,より詳細かつ信頼性の高い細胞の機械特性の計測方法を実現した.以上のとおり,学会における成果発表や学術誌への投函(査読中)などを達成しており,期待通りの研究の進展があった.生体機能の解明や医療応用,創薬試験などにおいて,単一細胞レベルの機械的な特性の計測技術は,細胞生理学現象の解明や定量的な評価を行う上で非常に重要な役割を果たす.そこで申請者は,計測操作のハイスループット化や,計測環境の安定化,機能統合化を目的として,マイクロ流体チップ上における細胞の機械特性計測の技術開発を進めている.従来の研究では,細胞の静的特性を計測してきたが,細胞内の浸透圧に起因するダイナミクスをより厳密に解明するには,細胞内部の流動質の特性,すなわち粘弾性を評価する必要が非常に重要であると判明した.そのため,計測システムの機構設計理論,実証実験に関して,集中的に研究を進めた.(1)細胞特性評価手法従来の細胞特性評価方法では,細胞の物性や幾何的な変形挙動を十分に検討できていないため,計測方法の妥当性や物理的意味付けが十分でなかった.

そこで,機械特性のうち,特に厳密な弾性変形を計測できる計測技術の開発を行った.本研究は,大域的な弾性変形の静特性を得ることができる.更に,本手法は粘弾性の計測を行う基礎となり,任意の平衡点において,正弦波入力を与えた際の発生力のモジュレーションをかける際のパラメータ同定に必須である.(2)マイクロ流体システム内部に細胞を滞留なく供給する流路加工技術.従来の細胞計測システムは,細胞を計測するための流路狭窄部において,急縮小部分をどうしても形成してしまうことから,高せん断速度領域が発生し,細胞が引き伸ばされ,節々に詰まるといった問題が発生する.そこで,流路となる硼珪酸ガラスの特殊ウェットエッチング技術により,平滑化された流路の狭窄部を作製する技術を確立した.これにより,細胞の流路内での変形,付着を抑制し,従来のコンセプトである連続的な細胞の計測を実現可能とした.本技術はマイクロ流体システムの研究において,広く波及効果を見込むことができる.申請者は,研究計画に基づき,浸透圧環境下での細胞の機械特性計測を可能にする計測系技術を前進,確立させた.研究を進める過程で,浸透圧ストレスは細胞内部の動的な現象であり,従来の静的な機械特性計測系から,動的計測系への拡張が必要であると判明した.そこで,マイクロ流体チップのロボット機構を高周波で駆動,制御が実現できるよう,機械的なインピーダンス整合のための理論的枠組,共振式力計測センサの計測原理,およびデバイス作製のフィジビリティ実験,高周波駆動時の非線形現象の解析,従来のモアレ計測を発展させたレーザ干渉による高速高精度変位計測技術の構築を進めた.これらは,従来技術と非常に親和性が高く,既に全体を取りまとめた実験のフェーズに差し掛かっている.上記の以上のとおり,学会における成果発表や学術誌への投函,および,次期成果創出に関する必要な研究結果を滞りなく創生しており,期待どおりの進展があった.また,現在上記の成果を学外に発信していく段階に差し掛かっており,残り1年の研究遂行期間で期待以上の進展を見込むことができる.申請者は,単一細胞の浸透圧適応機能の解明を目的とし,機械構造を統合化したマイクロ流体システムを用いた細胞の計測技術の開拓を進めてきた.本計測系は,環境の溶媒を制御しながら個別の細胞の特性を計測できる.マイクロ流体チップの中央には二対の機械式プローブを設計してあり,板バネ形状のはりのたわみから反力ー変形量特性を評価することが可能である.本研究初期構想では,浸透圧環境下での細胞の静的な特性を評価することを目標としてきた,しかしながら細胞内部の浸透圧に起因するダイナミクスをより定量的に解明するためには,細胞内部の流動室の特性を評価できるようにすることが重要であると判明した.そのため,研究計画を軌道修正し,必要な要素的基盤技術の追求を進めた.(1)マイクロ流体システム内部に細胞を滞留なく供給する流路加工技術.従来の細胞計測システムは,細胞を計測するための流路狭窄部において,急縮小部分をどうしても形成してしまうことから,高せん断速度領域が発生し,細胞が引き伸ばされ,節々に詰まるといった問題が発生する.そこで,ガラスの特殊ウェットエッチング技術により,平滑化された流路の狭窄部を作製する技術を確立した.これにより,細胞の流路内での変形,付着を抑制し,従来のコンセプトである連続的な細胞の計測を実現可能とした.
グリア・ニュ ロン相互作用による神経機能維持メカニズムとその加齢変化の解析

グリア・ニューロン相互作用の変化を解析するために,各種神経損傷モデルを用いて,神経・グリア相互作用に関係するミクログリアの作用と各種分子の同定を行った。本年度は(1)ミクログリアの応答と神経細胞死の関連,(2)ミクログリアに発現するGPCRの神経機能維持に関する解析,を中心に行った。(1)マウス運動神経は軸索損傷により半数以上が緩やかな細胞死をする。この時のミクログリアの動態を電子顕微鏡で観察した所,ミクログリアの接着のない運動ニューロンが存在し,それらは細胞死に至ることが新たに明らかになった。このことは,軸索損傷後ミクログリアは運動ニューロンを取り囲み生存のための環境を作りだしている可能性を示唆していると考えられた。(2)約300の蛋白共役型受容体のプライマーと,神経損傷側と健常側の神経核から抽出したRNAを用い,神経再生過程で発現が上昇するGPCRのスクリーニングを行った。この結果得られた遺伝子のうち,CCR5に注目してCCR5のリガンドであるRantesの発現動態を解析した。この結果受容体はミクログリアにリガンドは損傷運動ニューロンで発現していることが明らかになった。また,CCR5ノックアウトマウスでは運動ニューロンの細胞死が加速した。このことから,軸索損傷後にミクログリアで発現するCCR5は損傷運動ニューロンとリガンドを介して運動ニューロンの生存にポジティブに作用していることが推測された。10年ほど前から使用していたPCR用のPCR Thermal Cyclerとデータ取り込みのための顕微鏡デジタルカメラがいずれも老朽化のため何れも本研究中に修理不能となり,研究の取りまとめに多大な影響をきたしたので,当初予定していなかったが,主な物品として急遽購入した。損傷末梢神経が再生するには、周囲のグリア細胞との分子レベルでのインターラクションが重要であると考えられている。我々は、末梢神経損傷時の損傷ニューロン・損傷シュワン細胞間の情報交換に働くと考えられる液性因子Regファミリーについて末梢神経損傷時における機能解析を行っている。Regファミリーは、膵β細胞に対する増殖因子となる分泌蛋白で、膵炎等の消化管の炎症時に誘導されることが知られている。また、神経系における機能としては、ファミリーメンバーの1つPAP/Reg2が、末梢神経損傷時に損傷ニューロンで誘導され、シュワン細胞の増殖因子として再生促進に働くことが証明されている。また、PAP/Reg2は運動ニューロンの生存因子として機能するとの報告もある。そこで、我々は舌下神経損傷モデルを用いて、Ratで同定済みのRegI、PAP、RegIII、PAPIIIの4種類の遺伝子発現変動を検討した。損傷運動ニューロンにおいては、これまでの報告通りPAPの発現誘導確認が確認されたが、その他のメンバーの発現は確認出来なかった。一方、損傷神経においてPAPIIIの著明な発現を見出した。PAPIIIの発現は神経損傷後、12時間以内という非常に早期にシュワン細胞で誘導される。また、PAPIIIはマクロファージに対する強い誘引活性を有することが明らかになった。以上の事から、PAPIIIが損傷シュワン細胞から分泌され損傷部位にマクロファージをリクルートするファクターとしての機能を持つことが示唆された。膵炎の時に分泌される蛋白として同定されたPAPはRegとともにPAP/Regファミリーを形成する。このうち運動神経軸索損傷後に、損傷運動神経細胞でPAPが、損傷神経(シュワン細胞)でPAPIIIが発現することがin situハイブリダイゼイション法やPCR法で明らかとなった。このうちシュワン細胞で発現するPAPIIIについてはその役割が全く不明なので、機能解析のため抗体を作成した。また、リコンビナント蛋白を得るため、イーストを用いた蛋白発現・精製系を構築した。これらにより、PAPIIIの機能解析を行う上でのツールが確立した。次にシュワン細胞から放出されるPAPIIIの機能として、マクロファージのケモアトラクタントとし作用する可能性が出てきたので、その確認ための培養系の構築とそれを用いた実験を進行中である。この他、神経損傷後に発現が上昇する蛋白のプロテオミクス解析からAnnexinlll(ANXIII)が得られた。In situハイブリダイゼイション法を用いた検索によりAnnexin(ANX)ファミリーの中で、ANXIIIのみが、ミクログリアで発現していることが明らかになった。このことから、ANXIIIが損傷後に活性化するミクログリアで何らかの機能を有するものと考えられ、これについてもさらに次年度に研究を進める予定である。また、加齢動物を用いた実験では、プロテオミクス解析で得られた結果が、in situハイブリダイゼイション法などの組織学的検討では確認できなかったので、発現変化はかなり微妙であると考えられた。神経損傷後に発現が上昇する蛋白のプロテオミクス解析からAnnexinIII(ANXIII)が得られた。損傷後に活性化するミクログリアで発現が亢進するANXIIIの機能解析を進めたところ、ANXIIIは活性化ミクロダリアのラッフリング膜に存在することが明らかになった。さらに、カルシウム依存的にアクチン線維と結合することが証明できた。このことから、ANXIIIはミクログリアが活性化したときに生じるカルシウム濃度の上昇に応答し、アクチン線維を膜にアンカリングする役割を有していると考えられた。以上よりANXIIIはミクログリアの活性化や移動において重要な役割を担っていることが証明できた。

また、膵炎の時に分泌される蛋白として同定されたPAPはRegとともにPAP/Regファミリーを形成するが、このうち運動神経軸索損傷後に、損傷神経(シュワン細胞)でPAPIIIが発現することが前年度までに明らかにした。本年度は、PAPIIIの機能を検討した結果、PAPIIIはマクロファージやその細胞株であるBac細胞において、運動性を亢進しかつケモアトラクタントとし作用することが、in vitroで証明できた。さらに、アデノウイルスを用いて損傷末梢神経にPAPIIIを過剰発現させると、神経再生を促進させることができた。このことから、PAPIIIはマクロファージを介して神経再生を促進する因子であると位置づけられた。A.シュワン由来のPAP-IIIの機能解析PAP-IIIが中枢神経系損傷時に保護や修復に機能するかどうかを検討した。胸髄レベルで脊髄損傷ラットを作成し、ウイルスベクターでPAPIII遺伝子を導入し、運動機能の改善や神経保護再生効果を検討した。PAPIII投与群の脊損ラットにおいて実際に行動上の有意な改善が認められた。B.損傷神経とミクログリア間のGPCRの機能解析約300の蛋白共役型受容体のプライマーと、神経損傷側と健常側の神経核から抽出したRNAを用い、神経再生過程で発現が上昇するGPCRのスクリーニングを行った。この結果約10個の受容体が発現上1昇を示した。In situハイブリダイゼイション法でその発現細胞を同定したところ、6個の遺伝子はミクログリアでの発現であった。また、ミクログリアの培養系を用いて、一部の受容体のリガンドを投与する実験を行った。リガンド投与によりミクログリアの形態変化等は認められなかったが、PCR法により一部の炎症性サイトカイン発現の抑制が観察された。C.生後発達におけるミクログリア・損傷運動神経の連関成熟マウスの軸索損傷運動神経細胞を電子顕微鏡で観察してみると、傷害後状態の良くない運動神1経細胞はミクログリアに覆われておらず、比較的状態の良い神経細胞はミクログリアに覆われていた。ミクログリアの接触が見られなかった損傷運動ニューロンは異常なrERを有し変性してゆく像が観察された。このことは、ミクログリアの接触が保護的に作用していることを示唆する。また、幼若動物と成熟動物を用いてミクログリアの動態を電子顕微鏡で観察すると、幼若動物では、ミクログリアとアストロサイトの動態が成熟動物とは時間的に異なるという結果が得られつつある。発生過程での2種のグリアの成熟動物とは異なる機能が示唆された。グリア・ニューロン相互作用の変化を解析するために,各種神経損傷モデルを用いて,神経・グリア相互作用に関係するミクログリアの作用と各種分子の同定を行った。本年度は(1)ミクログリアの応答と神経細胞死の関連,(2)ミクログリアに発現するGPCRの神経機能維持に関する解析,を中心に行った。(1)マウス運動神経は軸索損傷により半数以上が緩やかな細胞死をする。
クールルーフの観点から熱性能を高めた瓦屋根の再構築～瓦及びその工法の開発

モックアップ実験やテストピースの分析を通して、粘土の純度や焼成温度、成型精度を下げることで、吸水率や熱伝導抵抗値の高い瓦ができることが明らかになった。これは手づくりによる伝統的製法が有する特徴である。また、沖縄の伝統的赤瓦屋根の研究を通して、伝統的な素材の組み合わせによって様々な換気口をデザインすることで、多孔質な屋根をつくり、そのことが涼しさのつながっていることが明らかになった。平成22年度に行った研究は大別すると三つあり、一つは(1)瓦の多孔性に関する分析、二つ目は(2)試験体を用いた瓦屋根の熱性能に関する比較分析、三つ目は(3)沖縄県大城地区の国指定重要文化財である中村家住宅における伝統的赤瓦屋根の熱性能評価である。以下、その成果の概要を示す。(1)水銀ポロシメーター及び電子顕微鏡による分析から、現代の製法(真空土練とガス窯)による瓦の方が昔の製法(有空土練とだるま窯)の瓦より、孔が小さいことや同じ土練で焼成が異なる場合、だるま窯は中も表面も同じ孔であるが、ガス窯は孔が中より表面の方が小さいことが明らかとなった。(2)試験体を用いた実験は、同一工法による瓦比較と3つの工法による熱性能比較を行った。同一工法による瓦比較では、現代の製法では瓦の裏温度が上がりやすく、昔の製法の方が熱しやすいが冷めやすい瓦であることが明らかになった。しかし、これは古瓦を用いたため、製法によるものか、瓦の経年変化によるものか、平成23年度、新しい試験体を用いて分析する必要がある。工法の比較では、瓦裏の空気層を設けることがクールルーフにとって有効であることが明らかになったが、棟部に設けた換気口は、あまり機能しなかったため、換気口の有効性について沖縄の中村家住宅の知見と合わせて検討する予定である。(3)中村家住宅は沖縄最古の伝統的赤瓦の住宅であり、沖縄の気候風土と素材で、どのようにクールルーフをつくることが可能であるかという技術の粋を集めた屋根を有している。竹と珊瑚を含む葺き土や雀口と呼ばれる大棟周辺に開けられた換気口が温度だけでなく、湿度のコントールに有効であるというデータが得られたが、測定が一部、不十分なため、平成23年度により、正確な測定を試みる予定である。研究成果は大別すると三点あり、それは瓦の製法と規格に関する再検討、モックアップを用いた熱性能実験、沖縄における伝統的瓦屋根の評価である。以下、その内容をまとめる。1)瓦の製法と規格1954年に瓦がJIS規格に制定されて以降、瓦は形状が53版(1坪あたり53枚使用)への収斂、高い寸法精度や低い吸水率への評価という今日の流れをつくった。これに加えて焼成温度の高い瓦を性能の良い瓦とするため、本来、どこでも採取できる粘土を用いた地域的建築素材ではなくなっており、かつ環境工学的視点による瓦の評価が含まれていないことが指摘できる。2)モックアップを用いた熱性能実験(関西大学千里山キャンパス)900×1800mmや1800×1800mmのモックアップ(実験体)を用いて、実験を行っている。八女の葺き替えで指摘された瓦裏の空気層や、二重野地板による空気層はともに効果的であることが測定され、乾式工法における下地のつくり方として推奨できる。砂入りのだるま窯による瓦が最も吸水率が高かった。また、焼成温度が低く、吸水率の高い瓦は、熱伝導抵抗が大きい、すなわち熱を伝えにくい瓦であることが明らかになった。3)沖縄における伝統的瓦屋根(国指定重要文化財中村家住宅)の評価琉球竹とサンゴを含む葺き土が遮熱だけでなく、吸湿としての性能を有しているのではないかということ、本葺き屋根でも丸瓦が高く、平瓦の幅の狭い、すなわち陰をつくる、ヒダの多い屋根形状であること、軒先や大棟に設けられた雀口とよばれる換気口、かまどの吹抜けや天井の工夫などによって空気の流れをつくりだすディテールの重要性が明らかとなり、その結果、小屋裏温度湿度はほぼ外気と同じ状態にあることがわかった。クールルーフの観点から瓦及び瓦屋根をどのように再構築するかについて、大阪府吹田市関西大学キャンパス内に設置した1.8m×0.9m、5寸勾配の切妻屋根であるモックアップ(試験体)を用いた分析を通して明らかになった、そのポイントは、下地・瓦の接点・瓦のつくりかたの三点である。瓦下地に関して、下地である野地板を二重にすることが最も効果的であるが、コスト面を考慮した縦桟木を用いて瓦裏に空気層をとる工法で、十分に小屋裏温度の上昇を抑制できた。また、瓦の寸法精度が高くない手づくり瓦と機械成型された寸法精度の高い瓦では、手づくり瓦が空気が動きやすく、小屋裏温度の上昇に関して効果的であった。すなわち、瓦を葺き重ね、瓦と瓦の接点が生まれる瓦屋根では、面外方向において通気が可能であるというその特徴を活かすべきであることが指摘できる。

今回、淡路島津井集落の瓦師の協力を得て、伝統的な手づくりの瓦製造の復元を行った。それによって、かつてだるま窯で焼成された古瓦が現代の機械成型の瓦に比べて、多孔性を有していることは、今回の手づくり瓦においても、科学的に確認された。さらに、高温焼成ではない、機械成型の真空土練とは異なる有空土練の手づくりの瓦は、吸水率が高く、瓦裏温度が表温度に較べて上昇しにくい瓦であること、すなわちクールルーフとしての性能を有していることが明らかになった。以上のことから、瓦裏に空気層をとり寸法精度の高くない低温焼成で有空土練の瓦で葺かれた瓦屋根は、熱伝導率が低い、つまり熱を伝えにくい性能を有しているといえる。しかし、その一方で、だるま窯焼成とガス窯焼成による差異とは何か、さらには手づくりでつくる瓦は極めて高コストになるため、一般的普及を考慮した場合、瓦製造の工程における手づくりと機械の組み合わせや原料である土の成分をどのように工夫するかという二点の課題が残った。瓦の熱性能をどのように高めるかという切り口が瓦の製法に関する研究、モックアップによる実験、伝統的な瓦屋根建築の分析から明らかになった。それは、1)瓦の粘土成分、練り方および焼成手法、2)下地の空気層、面外方向の空気の移動、3)換気口のデザインとディテールの三点である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の今後の進め方は、二点ある。一点は、瓦の粘土成分、練り方、焼成方法をかえながら、吸水率が高く、熱伝導抵抗の高い、すなわち熱をとおしにくい瓦の試作を行うことである。もう一点は、より薄い瓦を制作し、瓦を重ねることで、瓦それ自体の孔でも下地の空気層でもない、瓦間の空気層の果たす役割を実験することである。また、沖縄の伝統機瓦屋根の熱性能の研究に関しては、ブックレットにまとめることを最終成果としたい。
高分解能固体ＮＭＲを用いたアルミノケイ酸塩ゼオライトのＡｌ置換サイトの特定

ゼオライトZSM-5(MFI型)に対し、Alが存在しているTサイトの解明,Tサイトと酸性質の関係解明, Tサイトを自在制御したゼオライト合成手法の開発に取り組んだ。Alが存在しているTサイトの解明には高分解能固体27Al MASならびに27Al MQMAS NMR法により行った。Alの置換サイトを変化させることを目的にゼオライト合成時に用いる有機構造規定剤の種類について検討した。ZSM-5の合成において、嵩高いアルコールであるペンタエリスリトールをOSDAと用いることで、Al原子をインターセクション以外の狭い部分に面するサイトに選択的に存在させることが可能であることが分かった。H25年度において、Alの置換サイト(Tサイト)を自在制御したゼオライト合成手法の開発に取り組んだ。Alの置換サイトを変化させる手段としては、Al源の種類、Al源を導入するタイミング(直接法and/orポスト法)、ゼオライトの水熱合成条件(温度、時間、回転下or静置下)を精査した。これらの手段に加え、本年度は有機構造規定剤の種類、使用の有無について検討した。ZSM-5(MFI型ゼオライト)はアミンの他にアルコールをOSDAとして合成できることが報告されている。アルコールはAlのカウンターカチオンとならないため、共存するアルカリ金属カチオンのみがカウンターカチオンとなる。直鎖のアルコールだけでなく、グリセリンやペンタエリスリトールなどの嵩高いアルコールを用いた合成も報告されており、特に、TPAカチオンと類似するアルコールであるペンタエリスリトールを用いた場合、ZSM-5生成時にペンタエリスリトールの周りにインターセクションが形成されると考えられる。その際に、Naカチオンはインターセクション内に存在できず、インターセクション以外の部分でカウンターカチオンとなるのではないかと考えた。また、アルコールはカウンターカチオンとなりえないためAlはインターセクション以外の狭い部分に面するサイトに選択的に存在することが予想される。そこで、嵩高いアルコールであるペンタエリスリトール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタンをOSDAとし、ZSM-5の合成を試みた。調製したゼオライトを高分解能NMRや接触分解反応より評価した結果、これらのアルコール系の分子をOSDAと用いることで、Al原子をインターセクション以外の狭い部分に面するサイトに選択的に存在していることが分かった。27AlMQMAS NMR法により正確なケミカルシフト値を求め、文献を参考にケミカルシフトと平均T-O-T角度を関連づけた。すなわちTサイトをおおざっぱに割り当てた。次に、Al含有量の異なるZSM-5を調製し(Si/Al比=201000)同様の解析を行った。MFI型ゼオライトにはAlの置換サイトは12個のTサイトがあるが、Al含有量が少ない場合と多い場合では、Alの分布に違いがあるのかを検討した。その結果、Alは12種類のTサイトの均一に導入されていくのではなく、あるサイトに選択的に導入されていることを示唆するNMR結果が得られた。またBetaは水熱合成法以外にもフッ化物法やドライゲルコンバージョン法などいくつかの合成ルートが確立され、合成ルートにより得られるゼオライトの物性が異なっている。そこで、Betaゼオライトを異なる調製法で合成し、Al種の解析をNMRにより行った。ケミカルシフトと平均T-O-T角度を関連づけた。その結果、調製法によりAl置換サイトが異なっていることが示唆された。また酸処理による脱Al過程を詳細に検討した結果、均一にAlが骨格から脱離するのではなく、あるサイトのAlが選択的に除かれるという結果も得られた。さらに触媒性能とも関連づけ考察を行った。このような知見はこれまで計算化学的手法を用いて提案されていたが実際の実験データとして得られたのは初めてであると考えている。高分解能固体NMRによるゼオライトの基本となる測定手法を確立できた。またMQMAS法やDQMAS法の測定シーケンスの開発に成功しており、様々なパラメータを得ることに成功した。これらの測定手法を用い、H24年度の計画通り、ZSM-5のAl状態の解析を実施し、ケミカルシフトとTサイトの関係を明らかに出来た。ただし、27AlDQMAS NMR測定についてはAl含有量が少ない(Si/Alで50以上)場合、困難であることも分かった。これらの成果を次年度に活かすことで、当初の計画を遂行可能で有り、目標を達成できると考えている。H24年度の成果をもとに、Al置換サイトを制御したZSM-5(MFI型)、MCM-22(MWW型)、Beta(*BEA型)ゼオライトの合成に取り組む。Alの置換サイト(Tサイト)を変化させる手段としては、Al源の種類、Al源を導入するタイミング(直接法and/orポスト法)、ゼオライトの水熱合成条件(温度、時間、回転下or静置下)を検討していく。これらの手段に加え、H25年度では新たに有機構造規定剤の種類、使用の有無について検討する。

中でもZSM-5とBetaについては有機構造規定剤を使用しなくても合成する手法が確立されており、有機構造規定剤を使用した場合と比較しながらAl置換サイトを制御する手法を検討していく。また、水熱合成法において、ZSM-5、MCM-22、Betaの結晶化過程を、高分解能固体NMRを用いて詳細に追跡することにより、Al種が骨格内に取り込まれていく機構を解明し、Al置換サイトを制御したゼオライト合成手法の開発につなげる。H24年度はNMRの測定条件の確立に重点的に取り組んだため、一部ゼオライト合成の実験はH25年度に行うこととした為、残額が生じた為。
自己腫瘍特異的CD4+Tリンパ球の樹立とその認識する腫瘍抗原の同定

当科で樹立されHLAクラスI分子とともにHLAクラスII分子を細胞表面に発現した腫瘍細胞株を用いて、平成14年度より腫瘍特異的CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞(cytotoxic T-lymphocyte : CTL)の解析を進めてきた。腫瘍特異的CD4陽性T細胞はサイトカインを産生し、CTLの誘導および活性化に関与していると推察されている。昨年度までに悪性黒色腫G613症例において腫瘍特異的CD4陽性T細胞を4クローン、腫瘍特異的CTLを7クローン樹立した。本年度は悪性黒色腫細胞株G613MからmRNAを採取しcDNAライブラリーを作成するとともにHLAクラスII遺伝子とインバリアント鎖をクローニングし、cDNA発現クローニング法を用いてCD4陽性T細胞が認識する腫瘍抗原の同定を行っている。同様に肺癌症例A529症例においても腫瘍特異的CD4陽性T細胞を1クローン、腫瘍特異的CTLを3クローン樹立した。一方、SEREX法を用いて、液性免疫の認識する複数の腫瘍抗原を単離することができた。すなわち肺大細胞癌症例(A904)において、22種類の腫瘍抗原を同定した。また、肺多形癌症例(G603)においても、3種類の腫瘍抗原が同定され、うち1つは癌精巣抗原(MAGE-B2)であった。このように液性免疫に認識される抗原は、CD4陽性T細胞も認識する腫瘍抗原であるといえる。今回の研究において、悪性黒色腫症例および肺癌症例において、複数の腫瘍特異的CD4陽性T細胞クローンを樹立できた。また、SEREX法により、液性免疫に認識される多数の腫瘍抗原を同定することができた。腫瘍免疫における抗腫瘍エフェクターの中心は細胞障害性Tリンパ球(CTL)と考えられるが、CTLの感作・活性化にはサイトカインヘルプが必要となる。そのサイトカイン産生細胞の中心がCD4+T細胞であるが、本研究は腫瘍特異的なCD4陽性Tリンパ球の樹立・解析のために本年度は以下の実験を行った。(1)肺癌切除症例から癌細胞株の樹立を試み,19細胞株を得た。細胞表面にMHC class II分子を表出する株を3株認めた。腫瘍特異的Tリンパ球の誘導効率を上げるために、得られた腫瘍細胞株にCD80分子をstable transfectionした細胞株を樹立した。以上の結果より、肺癌患者生体内には腫瘍細胞のMHC class II分子に提示される、自己抗原と腫瘍特異抗原を認識するCD4陽性細胞が存在することが証明された。そのサイトカイン産生細胞の中心がCD4+T細胞であるが、腫瘍特異的なCD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の樹立・解析のために本年度は以下の実験を行った。悪性黒色腫腋窩リンパ節転移巣より腫瘍細胞株、G613Mを樹立した。腫瘍細胞のHLA class I及びclass IIの発現をフローサイトメトリーで調べたところ、両者ともに有意な発現を認めた。次に、患者末梢血リンパ球をIL-2,IL-4,IL-7存在下に、放射線照射した自己腫瘍細胞で週1回、計5回刺激培養した後、限界希釈法を行ない11個のT細胞クローンについて解析を行なった。フローサイトメトリーにより7クローンはCD8陽性T細胞であり、4クローンはCD4陽性T細胞であった。CD4陽性T細胞は自己腫瘍に反応しMHCclass II拘束性にIFN-γを産生した。さらに7クローンのCD8陽性T細胞についてさらに機能解析を行ない以下の結果を得た。(2)得られたCTLが他家腫瘍を認識するか、サイトカイン産生により検討したところ、得られたCTLは以下の3つのパターンに分類された。1.HLA-Cw1203拘束性に自己腫瘍及び他家肺癌細胞株を認識する2.HLA-Cw1202拘束性に他家melanoma細胞株、他家肺癌細胞株を認識する3.自己腫瘍のみ認識し、他家腫瘍を認識しない当科で樹立されHLAクラスI分子とともにHLAクラスII分子を細胞表面に発現した腫瘍細胞株を用いて、平成14年度より腫瘍特異的CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞(cytotoxic T-lymphocyte : CTL)の解析を進めてきた。

すなわち肺大細胞癌症例(A904)において、22種類の腫瘍抗原を同定した。また、肺多形癌症例(G603)においても、3種類の腫瘍抗原が同定され、うち1つは癌精巣抗原(MAGE-B2)であった。このように液性免疫に認識される抗原は、CD4陽性T細胞も認識する腫瘍抗原であるといえる。今回の研究において、悪性黒色腫症例および肺癌症例において、複数の腫瘍特異的CD4陽性T細胞クローンを樹立できた。また、SEREX法により、液性免疫に認識される多数の腫瘍抗原を同定することができた。