hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強磁性絶縁体を用いたゲルマニウム中への純スピン流生成技術の開発

研究代表者は、有機金属分解法で用いる前駆体膜に電子線照射を行うことで、ドライエッチングプロセスを用いることなく、高品質なイットリウム鉄ガーネットの微細パターンを形成することに成功した。また、強磁性金属のパーマロイ(Py)と励起アンテナ間の距離を変調させることで、Py中を伝播する静磁表面波の非相反性の強さを変調できることを明らかにした。更に、金誘起層交換成長法により作製した擬似単結晶Geを用いて、薄膜トランジスタを作製し、400Cのポストアニールがその特性を改善させることを明らかにした。これらの基礎的な技術を組み合わせることで、強磁性絶縁体からGeのスピン注入技術の実現が可能となる。次世代スピンデバイスの創製には、ゲルマニウム(Ge)などの半導体材料中において高効率な純スピン流(電荷の流れを伴わない電子スピンの流れ)の生成が不可欠である。しかし、従来の強磁性体金属を用いた純スピン流の生成方法では、強磁性金属の低いスピン抵抗(純スピン流に対する電気抵抗のようなもの)に起因する純スピン流の逆流を抑制できないため、報告されている純スピン流の生成・検出効率は非常に低い値に留まっている[K. Kasahara et al. Appl. Phys. Express 7, 033002 (2014)など]。そこで、研究代表者は、スピン抵抗が半導体材料よりも十分に高い強磁性絶縁体中のスピン波(磁気モーメントの歳差運動の伝搬により形成される波動)を用いたGe中への高効率純スピン流生成技術の開発を着想した。本年度は、有機金属堆積(MOD)法によりSiO2基板上に作製した強磁性絶縁体イットリウム鉄ガーネット(YIG)薄膜を用いて、スピン波の観測を試みるも、YIG薄膜の質が悪いためスピン波信号の観測に至らなかった。そこで、まずはYIG薄膜の高品質化を図った。その結果、YIGと整合性が良いガドリニウムガリウムガーネット(GGG)基板上に塗布したMOD膜に電子線照射し、高温で熱処理することで高品質なYIG薄膜を得ることに成功した。この成果は、現在、論文として執筆中である。更に、これまで導波路の強磁性材料にのみ依存すると考えられて来た静磁表面波の非相反性の強さが、デバイス構造にも依存することを明らかにした。[K. Kasahara et al., Jpn. J. Appl. Phys. 56, 010309 (2017).]来年度は、この高品質YIG薄膜を用いてスピン波信号を観測した後、純スピン流観測用のデバイスを試作して、Geチャネル中への純スピン流生成・検出を試みる。予備実験で作製したSiO2基板上のYIG薄膜では、そもそもスピン波信号を観測することができなかった。X線回折法などにより、SiO2基板上のYIG薄膜の結晶詳細に調べたところ、YIG薄膜は無配向の多結晶膜という質の悪い薄膜であることわかった。これがスピン波信号を観測できなかった最大の原因であると考えられる。本研究では、YIG薄膜中のスピン波を利用して純スピン流を生成することを目標としているため、まずはスピン波信号が観測できるような高品質なYIG薄膜を得ることを目標に研究を進めた。その結果、YIG薄膜と整合性が高いGGG基板を用い、更に電子線を照射することにより、基板に配向した高品質なYIG薄膜を形成することに成功した。磁化曲線から得られた飽和磁化と保磁力の値は、これまで報告されているYIG薄膜と同等の値が得られている。このYIG薄膜を用いれば、スピン波信号の観測が期待できる。この成果については、現在、論文を執筆中である。一方、スピン波の中の一つのモードである静磁表面波は、その伝搬方向に対して信号強度が異なるという非相反性を有していることが知られており、これは自由なデバイス作製を阻害する要因となる。ごく最近、研究代表者は、パーマロイ導波路と励起アンテナの距離により静磁表面波の非相反性の強さを変化させることができることを発見した。これまでは、静磁表面波の非相反性の強さは、導波路の材料で決まるものと考えられて来たが、デバイス構造でもこれを制御できるということを示した非常に応用面で意義のある結果である。この結果は、Japanese Journal of Applied Physics誌に掲載され、高く評価を受けている。以上のように、純スピン流を生成する前の準備段階における問題が発生しており、これらを解決するのに時間がかかっている。このような理由から達成度は4とした。次世代スピンデバイスの創製には、ゲルマニウム(Ge)などの半導体材料中において高効率な純スピン流の生成が不可欠である。しかしながら、従来の強磁性体金属を用いた純スピン流の生成方法では、強磁性金属の低いスピン抵抗に起因するインピーダンスミスマッチによる純スピン流の逆流を抑制できないため、報告されている純スピン流の生成・検出効率は非常に低い値に留まっていた。そこで、研究代表者は、スピン抵抗が半導体材料よりも十分に高い強磁性絶縁体中のスピン波(磁気モーメントの歳差運動により形成される波動)を用いたGe中への高効率純スピン流生成技術の開発を着想した。初年度は、強磁性絶縁体材料であるイットリウム鉄ガーネット(YIG)の高品質な微細パターンを得ることができずに、純スピン流の検出に至らなかった。最終年度は、まず、有機金属分解法(MOD)法を用いたYIG微細パターンの高品質化に取り組んだ。

YIGは、ドライエッチングが難しく、微細加工の際、薄膜にダメージが入りやすいという欠点がある。そこで研究代表者は、ドライエッチングプロセスを必要としない微細加工技術として、電子線照射(EB-)MOD法に注目した。この手法は基板に塗布したMOD前駆体薄膜が電子線に対して感度を持つことを利用した手法であり、強誘電体や酸化物超伝導体などで多数の報告がある。研究代表者はこの手法をYIG用のMOD溶液に応用することで、ドライエッチングを用いることなく、高品質なYIG微細パターンをガドリニウムガリウムガーネット基板上に作製することに成功した。[K. Kasahara and T. Manago, Jpn. J. Appl. Phys. 56, 110303 (2017).]今後は、この高品質なYIG微細パターンを用いることで、Geなどの非磁性材料中への高効率なスピン注入が期待できる。研究代表者は、有機金属分解法で用いる前駆体膜に電子線照射を行うことで、ドライエッチングプロセスを用いることなく、高品質なイットリウム鉄ガーネットの微細パターンを形成することに成功した。また、強磁性金属のパーマロイ(Py)と励起アンテナ間の距離を変調させることで、Py中を伝播する静磁表面波の非相反性の強さを変調できることを明らかにした。更に、金誘起層交換成長法により作製した擬似単結晶Geを用いて、薄膜トランジスタを作製し、400Cのポストアニールがその特性を改善させることを明らかにした。これらの基礎的な技術を組み合わせることで、強磁性絶縁体からGeのスピン注入技術の実現が可能となる。来年度前半は、まずGGG基板上に作製した高品質YIG薄膜を用いてスピン波信号の観測を試みる。既にスピン波信号検出技術を確立しているPy導波路デバイスを参考にして、スピン波信号観測用のYIG導波路デバイスを作製する。電子線リソグラフィー装置とAr+イオンミリング装置を用いて作製し、ベクトルネットワークアナライザによりスピン波信号の観測を試みる。来年度前半中にスピン波信号を観測した後、Geチャネル中への純スピン流生成・検出を試みる。Geチャネルの形成は、研究代表者が改良した金誘起層交換成長法を用いる予定である。[H. Higashi, K. Kasahara et al. Appl. Phys. Lett. 106, 041902 (2015).など]検出用の電極は、当初の予定通り、スピンー軌道相互作用が強いPtを用い、逆スピンホール効果によって観測する。ここで、もし、いきなりGeチャネル中での純スピン流生成・検出が難しそうな場合は、スピン抵抗がGeよりもはるかに小さいCuやAlといった非磁性金属材料をチャネルとして用いることも視野に入れている。スピン抵抗が小さい材料の方が純スピン流の生成・検出が容易であると予想されるため、予めCuやAlなどの材料で多くの知見を得ておき、それらの知見をGeチャネルのデバイスに応用する。最終的には、Geチャネルを用いたデバイスにより、室温以上で励起したスピン波信号を反映した電圧変化をPt電極観測することで、強磁性絶縁体を用いたGe中での純スピン流生成技術の実証とする。スピントロニクス
淡明細胞肉腫におけるSHARPIN-PRMT5の機能解析と新規分子標的薬への応用

淡明細胞肉腫細胞株においてSHARPINおよびPRMT5の発現量をウエスタンブロットで検索したところHDF(human dermal fibroblast)と比較してSHARPINの発現量が5つの淡明細胞肉腫細胞株において増加していた。しかしながらPRMT5の発現量はほとんど差がなかった。今後SHARPINの発現量の増加がPRMT5の活性を増加させているかに関してウエスタンブロットなどで測定する予定である。またウエスタンブロットとqPCRでの実験系は確立したので臨床サンプルを使用してclear cell sarcomaおよびangiomatoid fibrous histiocytoma間でのSHARPINおよびPRMT5発現量の比較を行う予定である。SHARPIN発現が亢進していた細胞株においてSHARPINおよびPRMT5のノックダウンを行うため、レンチウイルスは作成終了し現在stable cell lineを作成中である。今後SHARPINおよびPRMT5ノックダウンによる細胞増殖への影響をcolony formationなどを用いて評価する。またSOX10, MITF発現をウエスタンブロットおよびqPCRにて測定する。Hela細胞にEWS-ATF1を導入し免疫染色を行ったところEWS-ATF1は主に核に局在し細胞質での存在は明らかではなかった。細胞株を変更し、現在はEWS-ATF1をレンチウイルス感染により淡明細胞肉腫に発現させ局在をV5tagを用いて確認する。こちらもstable cell lineを作成中である。まずはV5による細胞免疫染色にて細胞内局在を明らかにし、結合タンパク同定のため免疫沈降および質量分析へと進める前準備は完成しつつある。SHARPINおよびPRMT5の発現量はすでに測定できている。またEWS-ATF1の過剰発現株もほぼ作成済みであり、結合タンパク同定のため免疫沈降、質量分析へと進める準備が進行している。また今後臨床サンプルでのclear cell sarcomaおよびangiomatoid fibrous histiocytoma間でSHARPIN, PRMT5発現量を比較する準備もできており予定通りの進行と考える。上記通り進捗状況は順調と考えているが、今後の実験によりEWS-ATF1が核への局在のみとなった場合には細胞質での働きを解析する意味は少なくなるため研究の進め方には検討を要する。核内であっても免疫沈降し質量分析から結合タンパクを同定することは可能であるがすでに過去の論文でmicroarrayなど網羅的な解析はなされており、労力に見合った結果にならない可能性がある。この場合にはSHARPINおよびPRMT5の解析を中心に進めることを考えている。Preliminaryな実験ではclear cell sarcoma細胞株においてPRMT5阻害剤が増殖抑制および細胞死を誘導しているというデータもあるのでSHARPINおよびPRMT5のノックダウン細胞株でより詳細な評価を行う予定である。
界面活性剤溶液の表面流動現象

本研究では濃度マランゴニ効果を表す数式モデルを開発することを目的とした。濃度マランゴニ効果とは、界面活性剤の水表面における濃度差により生じた表面張力差が引き起こす現象の総称である。この現象は水汚染、気液界面での物質移動あるいは浮遊選別など工学的にも様ざまな事項と関連が深いしかしながら現象が複雑なために今日まで余り調べられていない。本研究ではまず現象を記述する一般的な数式モデルを開発した。この数式モデルでは流体の質量、運動量の保存則の他に、活性剤のバルク流体中および水表面における保存則が考慮されている。また、水表面での活性剤の吸着にはLangmuir型の式を修正して用いている。そして、流下方向の表面張力勾配が流体運動の水表面における境界条件として作用する。界面活性剤の水溶液を用いて、非常に浅い水深での開水路からの流出に伴う表面加速現象をトレーサー法により測定した。使用した界面活性剤はドデシルベンゼンスルフオンサンナトリュウム、ドデシル硫酸ナトリュウムとテトラデシル硫酸ナトリュウムの三種類である。数式モデルの数値解は実験値を再現し、このモデルの妥当性が示された。とくにこのモデル中に含まれる吸着反応速度過程式のパラメータの値は物質に固有の値であると予想されているが、これまでこの値を物性値として特定するまでに至っていない。本研究では現象の特徴が現れやすく、手法的にも簡単な実験を繰り返し、同時に厳密な数値計算を行うことにより、上記三種類の活性剤に対してそれぞれ固有の値を推定することに成功した。このことはこの研究の成果である。ただし、計算開始時点での初期条件の設定にはなお検討の余地が残されている。また、界面活性剤の吸、脱着過程についてはさらに詳細な研究が必要である。この研究の目的は濃度マランゴニ効果の数式モデルを開発することである。このことについて昨年までに現象を表す基礎式を導いたこの式では、流体、界面活性剤それぞれの保存に加えて、流体運動時の力の釣り合いや界面活性剤の水表面における吸着反応速度過程などが考慮されている。今年度はこの数式モデルの妥当性を調べるため、開水路層流流れにおける流出現象に着目して検討した。流出端近傍における表面加速現象が、界面弾性効果によりさらに加速される現象をトレーサを用いて可視化し、ビデオ画像解析により実験値を求めた。活性剤としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム,ドデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウムの3種を用いた。実験の結果を先に開発した数式モデルによりシミュレーションして、このモデルが現象を再現し、有効なモデルであることを確認した。特にこのモデル中に含まれる吸着反応速度過程のパラメータの値は物質に固有の値であると予想されているが、これまでに発表されている研究ではこの値を物性値として特定するまでに至っていない。これは実験と数値計算の困難性によるものである。本研究では現象の特徴が現れやすく、また手法的にも比較的簡単な実験を繰り返し、同時に厳密な数値計算を行うことにより上記3種の活性剤に対してそれぞれ固有の値を推算することに成功した。このことはこの研究の大きな成果と考えられる。なお、当研究費で今年度に購入した表面張力計は、界面活性剤の濃度と表面張力との関係を求める為に利用した。この関係が本研究の最も基本となる実験データである。今後の課題としては、いろいろな表面弾性現象に対してここで導いた数式モデルを用いた解析を行うこと、多くの種類の界面活性剤を用いて実験を行い、それぞれの活性剤の吸着反応に対して考察を進める事である。本研究では濃度マランゴニ効果を表す数式モデルを開発することを目的としている。

濃度マランゴニ効果とは、界面活性剤の水表面における濃度差により生じた表面張力差が引き起こす現象の総称である。この現象は水汚染、気液界面での物質移動あるいは浮遊選別など工学的にも様ざまな事項と関連が深い。それにもかかわらず現象が複雑なために今日まで余り調べられていない。本研究ではまず現象を記述する一般的な数式モデルを開発した。この数式モデルでは流体の質量、運動量の保存則の他に、活性剤のバルク流体中および水表面における保存則が考慮されている。また、水表面での活性剤の吸着にはLangmuir型の式を修正して用いている。そして、流下方向の表面張力勾配が流体運動の境界条件として作用する。平成4年度に引きつずき、5年度も本研究で開発した数式モデルの妥当性の検討を行った。非常に浅い水深の開水路からの流出に伴う表面加速現象をトレサー法により測定した。用いた界面活性剤はSDBS(CH_3(CH_2)_<11>C_6H_4-SO_3Na,分子量348.48),SDS(CH_3(CH_2)_<11>-0SO_3Na,分子量288.38),およびSTDS(CH_3(CH_2)_<13>-OSO_3Na、分子量316.44)である。数式モデルの数値解は実験値を再現し、このモデルの妥当性が示された。ただし、計算開始時点での初期条件の設定にはなお検討の余地が残されている。また、界面活性剤の吸、脱着過程を正確に把握することがこのモデル完成のために不可欠であることが判明した。そこで、Langmuir型トラフを作成して界面活性剤水溶液の表面の伸縮に伴う表面張力の時間的変化を測定した。そして、その結果を本研究で用いた理論を応用して解析した。その結果、計算値のほうがやや早い挙動を示した。この傾向はこれまでに他の界面活性剤について報告されている事と一致するが、その原因は不明である。今後は界面活性剤の吸着反応速度過程についてさらに検討する必要が有る。
南極周回超伝導マグネット気球による高エネルギー宇宙線原子核の組成

本研究では当初南極の気球実験で長時間のSuperJACEEによる宇宙線の観測を考えていたが、延期されて9年度にアラスカで行われることとなった。SuperJACEE超伝導ソレノイド磁石は既にNASAに送られテスト実験も7年度に終わっていたので、今回実験に使われる消耗品の原子核乾板用写真乳剤が他の項目と比べて高価であった。この写真乳剤30kgと支持体用プラスチック乾板を購入し、米国に送った。3月から米国で湿布が行われ、4月にアラスカに送られ5月に気球実験が行われる予定である。もし気候が悪くて延期されれば、秋に行われることになる。気球実験終了後、乾板は解体され、現像処理後、米国と分担して乾板のデータ解析が行われる。一方、今までのデータ解析や、今後のSuperJACEE乾板解析のために、高速な画像処理ができる顕微鏡画像処理システムを構築するため、CCDカメラ、コンピュータ、画像処理ソフトを購入した。現在加速器実験で使われた乾板から珪素核、鉛核の原子核衝突の画像を取り出し、この中からトラックの情報が取り出せるようシステムの試験を行っている。このトラック情報の座標取得から、運動量や電荷の計測を行って、目的としている一次宇宙線原子核の成分比、エネルギースペクトルの観測や、原子核衝突より生じる可能性のある高温物質生成の研究に利用していく予定である。
リビング重合・異種共重合・配列制御重合の同時実現

本研究では,自然界の生体高分子に迫るような高度な一次構造制御を可能とする高分子合成への挑戦として,リビング重合・異種モノマーの共重合・配列制御重合を同時に実現する重合系の構築を目的とした。長寿命生長種の生成を伴うビニルエーテルとオキシランのビニル付加・開環同時カチオン共重合系の開発,ABC型交互三元共重合に向けたビニル付加・開環・カルボニル付加同時カチオン三元共重合における単独連鎖抑制の検討,長寿命生長種の生成を伴うビニルエーテル・オキセタン・ケトンのカチオン三元共重合による連鎖順の制御されたマルチブロックポリマー合成法の開発を行い,3つの制御の同時実現に向けた反応設計指針を示した。本研究では,高度に一次構造が制御された高分子の合成への挑戦として,リビング重合・異種モノマーの共重合・配列制御重合が同時に進行するような重合系の構築を目的とする。本年度はおもに,(1)リビング重合と異種モノマーの共重合の両立を目指したビニルエーテルとオキシランのビニル付加・開環同時リビングカチオン共重合に向けた検討,(2)ビニル付加・開環・カルボニル付加三元共重合系における配列制御に向けた検討,(3)オキセタンを環状モノマーとして用いた三元共重合におけるリビング系の設計の3つのテーマに沿って研究を進めた。(1)では,トリフルオロメタンスルホン酸などの超強酸を用いることで,長寿命生長種の生成を伴うアルキルビニルエーテルとイソブチレンオキシドのカチオン共重合系を構築した。用いる超強酸の酸性度によって副反応の割合が変化し,生成ポリマーの分子量に影響することもわかった。(2)では,ビニルエーテル,オキシラン,ケトンのカチオン三元共重合を種々のケトンを用いて検討し,シクロヘキサノンなどの環状ケトンが効率的な交差生長反応を伴った重合に有効であることを見出した。また,各モノマーの単独生長反応および副反応の抑制に向けて,種々の反応条件が及ぼす影響についても検討した。(3)では,ビニルエーテル,オキセタン,ケトンのカチオン三元共重合において,非配位性の対アニオン種をもつトリチル塩を用いた開始剤系により,長寿命生長種の生成を伴った重合が進行してマルチブロック型のポリマーがすることを見出した。当初の研究計画に沿って研究を実施し,意義深い結果が得られてきていると考えている。本研究では,一次構造が精密に制御された高分子を合成する手法の開発に向け,リビング重合・異種共重合・配列制御重合が同時に進行する重合系の構築に挑戦することを目的とする。本年度は,昨年度に引き続き(1)リビング重合と異種モノマーの共重合の両立に向けたビニルエーテルとオキシランのビニル付加・開環同時リビングカチオン重合系の設計,(2)ビニル付加・開環・カルボニル付加同時三元共重合によるABC型交互三元ポリマー合成に向けた検討,(3)オキセタンあるいはオキシランを環状モノマーとするカチオン三元共重合における重合制御の3つのテーマに沿って研究を進めた。(1)では,昨年までに見出した超強酸の系において,β-プロトン脱離などの副反応の抑制を目的に種々の反応条件を検討し,ヘキサンなどの低極性溶媒中,-95 °Cなどの低温で行うことで,計算値と近い分子量をもつポリマーが生成する系を見出した。また,NMRによる生長末端の解析などから,長寿命生長種が生成する共重合の機構について調べた。(2)では,さらに多様なビニルエーテル,オキシラン,ケトンを用いて,単独生長反応の抑制に向けた検討をおこなった。例えば,低反応性ビニルエーテルである2-クロロエチルビニルエーテルと4-ビニルシクロヘキセンオキシド,メチルエチルケトンを適切な濃度比で用いた系では,各モノマーが約1個,約3個,1個ずつ順番に繰り返しつながったポリマーが生成した。(3)では,昨年見出したビニルエーテル,オキセタン,ケトンの三元共重合系の重合機構を詳細に調べ,開始剤由来の対アニオン種であるPF6-の分解生成物が長寿命生長種の生成に関与していることを明らかとした。さらに,オキセタンに代えてシクロペンテンオキシドなどのオキシランを用いた場合にも,長寿命生長種の生成,異種三元共重合,nA-mB-Cの配列制御が同時に可能であることを見出した。最終年度として,リビング重合・異種モノマーの共重合・配列制御重合の3つの要素のうちの2つの要素が両立する系の構築を行い,それらを組み合わせて3つの要素をすべて同時に満たす系の設計に向けて検討を行う。アルキルビニルエーテルとイソブチレンオキシドのカチオン共重合系では,β-プロトン脱離反応などの副反応の抑制を目指して,超強酸の種類をはじめとする反応条件が重合挙動に与える影響について検討する。

ビニルエーテル,オキシラン,ケトンのカチオン三元共重合では,さらに種々のモノマーを用いて検討し,単独生長反応が完全に抑制され,交差生長反応のみが進行してABC型の交互配列制御ポリマーが生成する系の設計を目指す。また,オキセタンを用いる系では,長寿命生長種が生成するために重要な要素について深く検討し,オキセタン以外のモノマーを用いた三元共重合系の設計を行う。高分子合成研究計画に沿って研究を進めた上で未使用額が生じたが,無理に使用する必要は無かったため,次年度に使用することとした。引き続き,研究遂行のための物品費等として使用する。
「新自由主義」的教育改革の日米比較ー資本主義の多様性論の批判的検討ー

本年度はまず、教育改革に関するアメリカの経営者団体の選好・戦略を明らかにするという目的の下、2001-2002年の連邦議会における「どの子どもも落ちこぼれにしない法(NCLB法)」の制定過程を分析し、(1)全米商工会議所、ビジネスラウンドテーブル、経済成長委員会など同国の主要な経営者団体が近年、相互に広範に連携し、連邦政府による教育関与および財政支援の拡大を求めて積極的に圧力を行使してきたこと、(2)経営者団体によるこうした運動は、共和党保守派や宗教・社会的保守派など他の保守系集団との間に先鋭な路線対立を生み出してきたことを明らかにした。以上の成果を一本の研究論文として刊行した。次に、こうした経営者団体の選好・戦略の歴史的起源を解明するため、より時代を遡り、20世紀初頭以降の経営者団体による教育改革運動とその後の変化についても分析した。この中では、1910年代は、アメリカの主要な経営者団体は「職業教育」を重視し、普通教育への連邦関与・財政支援については厳格に反対する傾向が強かったが、その後、1980年代半ば頃を境として、彼らが「普通教育」重視、およびそれへの連邦関与・財政支援を容認、ないし積極的に要求する方向へと大きく転換してきたことを明らかにした。本研究では、経営者団体が刊行した報告書、連邦議会公聴会で行った証言などの資料を分析し、上記のような1980年代の経営者団体の選好変化が、ポスト工業社会におけるアメリカの労働力需要および供給、両面での変化に対する経営者らの認知と関連して生じたことを明らかにした。以上の成果については学会発表を行った。比較分析のうち、アメリカの事例研究については当初の予定通り資料収集・論文執筆を行えたため。2019年度は、1980-1990年代の時期の資料を中心にアメリカでの資料・文献収集を継続し、教育改革に対する主要な経営者団体の選好形成・変容のプロセスをより詳細に分析する。2018年度に予定していたアメリカでの資料収集が実施できず、翌年度以降に延期となったため。
超深海の海洋計測用耐圧容器の開発

地球上の深部は西太平洋に偏在している.日本近海は東の日本海溝,南の伊豆小笠原海溝,琉球海溝(南西諸島海溝)と1万メートル近い深部があり,いずれも数千kmの長さを持っている.地球全体で6000m以深の海域は全海洋の3%以下であり,多くの市販されている海洋測器の耐圧は6000m以下に限られている.そして,耐圧容器の材質の点でもアルミ容器の使用限界が6000m程度であるために,単に肉厚の増強では解決できない.非磁性体であることが,流速計の磁気コンパスや海底磁力計,その他に要求されるので鉄系の材質による容器は適用限界がある.本研究ではチタンを用いた深海用耐圧容器を開発し,流速計および音響切離装置の耐圧を増し,実際に海溝底の流速測定を行うことを目的とした.昭和61年度に流速計と音響切離装置を開発し, 1987年1月28日に伊豆小笠原海溝の中心軸附近に〓留系を設置し, 1987年5月11日に回収して104日間の記録を得た.小型軽量の耐圧容器が12000m以上の深度に耐えることが加圧試験によって確認され,チタンの非磁性のため多くの測器の容器として適用することができるので,本研究研の目標の1つは完遂された.海溝底の流動特性の解明は上記の104日間の資料解析により, 9205mの海溝底でも最大流速は10cm/sec,平均流速1cm/secと予想外に大きいことが世界で始めて明らかにされた.エネルギーレベルの高い変動流は半日周期の潮流,慣性振動流, 1日周期の潮流,にある.気象変動によって生ずる慣性振動が底層ほど大きいことは非常に興味あることである.半日潮と1日潮では潮汐波の進行方向に顕著な差違があることが示された.平均流も海溝を横断する成分も大きく,底上20から1620mの範囲では同一方向にほぼ同じ大きさで動いていることが明らかにされた.地球上の深部は西太平洋に偏在している.日本近海は東の日本海溝,南の伊豆小笠原海溝,琉球海溝(南西諸島海溝)と1万メートル近い深部があり,いずれも数千kmの長さを持っている.地球全体で6000m以深の海域は全海洋の3%以下であり,多くの市販されている海洋測器の耐圧は6000m以下に限られている.そして,耐圧容器の材質の点でもアルミ容器の使用限界が6000m程度であるために,単に肉厚の増強では解決できない.非磁性体であることが,流速計の磁気コンパスや海底磁力計,その他に要求されるので鉄系の材質による容器は適用限界がある.本研究ではチタンを用いた深海用耐圧容器を開発し,流速計および音響切離装置の耐圧を増し,実際に海溝底の流速測定を行うことを目的とした.昭和61年度に流速計と音響切離装置を開発し, 1987年1月28日に伊豆小笠原海溝の中心軸附近に〓留系を設置し, 1987年5月11日に回収して104日間の記録を得た.小型軽量の耐圧容器が12000m以上の深度に耐えることが加圧試験によって確認され,チタンの非磁性のため多くの測器の容器として適用することができるので,本研究研の目標の1つは完遂された.海溝底の流動特性の解明は上記の104日間の資料解析により, 9205mの海溝底でも最大流速は10cm/sec,平均流速1cm/secと予想外に大きいことが世界で始めて明らかにされた.エネルギーレベルの高い変動流は半日周期の潮流,慣性振動流, 1日周期の潮流,にある.気象変動によって生ずる慣性振動が底層ほど大きいことは非常に興味あることである.半日潮と1日潮では潮汐波の進行方向に顕著な差違があることが示された.平均流も海溝を横断する成分も大きく,底上20から1620mの範囲では同一方向にほぼ同じ大きさで動いていることが明らかにされた.日本海溝の中心軸地点(北緯34度,東経141度55分,水深9000m)での実験を2回行なった。6月の淡青丸航海ではワイヤーの先端にベントス社の音響切離装置とセラミック浮力球等を取り付けて7000mまで下ろした。その結果音響切離装置水中局の音響信号が弱く6000mを超えると交信ができないことが判明した。セラミック浮力球ならびにチタン容器製流向流速計は十分な性能があった。本研究で開発した流向流速計については日本海洋学会秋季大会で報告した(北川・平・ら)。音響切離装置についてもチタン容器を使用したものを開発することになり、日油技研工業の加圧タンク試験を繰り返して12月に完成することができた。音響出力の増大をはかり水中局のトランスジューサの指向特性を上方に集中するように工夫して大巾な性能向上をはかった。船上局のトランスジューサについても同様の工夫を行なった。12月に10000m相当の水圧を加えた実験水槽内に水中局を置いて外部から音響信号を送信して切離動作の確認を行った。また平面水槽にチタン容器使用の流向流速計を走行クレーンで曵航して応答試験を行った。

これらの周到な実験の後に1月の白鳳丸航海でワイヤー繰り出して9000m水深まで下ろして音響切離試験を行なった。音響信号も明瞭に受信でき、また切離動作も正常に行えた。1月28日に冒頭の日本海溝に流速計を3台係留した条を設置した。回収は5月の淡青丸航海を予定している。世界最初の試みである。
ゼブラフィッシュ胚で可視化されるトランスジーンサイレンシングに関する研究

私はヒートショックプロモータに、ある融合遺伝子(GFP遺伝子とバクテリアのメチル化酵素遺伝子の連結)を連結し、ゼブラフィッシュに導入したところ、この遺伝子がトランスジーンサイレンシングと呼ばれるDNAのメチル化を伴う発現抑制の標的となることを偶然見いだした。このトランスジーンサイレンシングのDNAメチル化を担うメチル化酵素遺伝子の同定を目指している。ゼブラフィッシュの維持メチル化酵素遺伝子dnmt1のオーソログは一つであるが、de novoメチル化酵素遺伝子は6つ存在し、それらは哺乳動物のdnmt3aのホモログであるdnmt3aa、dnmt3abと、dnmt3bのホモログdnmt3ba, dnmt3bb.1, dnmt3bb.2, dnmt3bb.3からなる。昨年度はゲノム編集技術作製によりdnmt3bb.2の欠損変異体を作製した。dnmt3bb.2胚性突然変異体(zygotic mutant)は生存可能であったことから、dnmt3bb.2変異体と上記トランスジェニックゼブラフィッシュを掛け合わせ、dnmt3bb.2ホモ接合変異体におけるGFPの蛍光を観察したが、トランスジーンサイレンシングによる蛍光の消失には異常が見られなかった。そこでもう一つのde novoメチル化酵素遺伝子dnmt3aaの変異体を共同研究者から入手し、dnmt3bb.2との二重突然変異体を作製した。この二重突然変異体も生存・繁殖可能であったことから、GFPトランスジェニックフィッシュと交配し、二重の母性胚性変異体胚でのGFPの発現を解析したが、やはりトランスジーンサイレンシングは正常に生じた。さらにdnmt1の機能低下型変異体ゼブラフィッシュも本年度後半に入手し、そのホモ変異個体におけるトランスジーンサイレンシングも解析したが、正常にサイレンシングは生じた。そこで、残りのde novoメチル化酵素遺伝子、dnmt3bb.3, dnmt3ab, dnmt3baについて変異体作成を開始し、現在それぞれについて欠損変異をヘテロに持つ個体を育成している段階である。動物の細胞に遺伝子を導入するとしばしばトランスジーンサイレンシングと呼ばれるDNAメチル化を介した発現抑制が生じる。本研究の目的はトランスジーンサイレンシングと呼ばれるDNAメチル化を介した遺伝子の発現抑制メカニズムを解明することにある。申請者が偶然得た、2系統のGFP遺伝子トランスジェニックゼブラフィッシュは、トランスジーンサイレンシングが胚発生時のほぼ24時間だけ、一時的に解除され蛍光を発するという特徴を持つ。本研究ではこの現象をトランスジーンサイレンシングのモデル系とし、そこにかかわる因子を同定することでトランスジーンサイレンシングのメカニズムを明らかにすることを目指す。本年度は、まず第一歩としてゼブラフィッシュの飼育システムの立ち上げを行った。循環型水槽システムを導入し水質の安定化を図った後、外部研究機関より上記トランスジェニックフィッシュや野生型ゼブラフィッシュの導入した。現在、安定して維持採卵ができるようになっている。次にトランスジーンのメチル化を担うゼブラフィッシュメチル化酵素を同定するため、CRISPR/Cas9による遺伝子破壊の系の立ち上げを開始した。ゼブラフィッシュにはトランスジーンメチル化酵素の候補として6つのde novo型メチル化酵素が存在する。まず哺乳動物のdnmt3bのオーソログ、dnmt3bb.2を標的とし、2種類のsgRNAをデザインし、それぞれCas9 mRNAとともに受精卵にインジェクションした。その結果、一方のsgRNAをインジェクションした胚(G0)において、そのゲノムDNAを抽出し、ターゲット領域をPCRで増幅したところ遺伝子破壊の結果生じたと推測されるfuzzyなバンドが検出された。クローニングの結果、目的領域に欠損変異が生じていることがわかったので、現在インジェクション配を継続飼育している。最大の理由は追加交付であったので研究開始が予定より半年以上遅れたため。導入した循環水槽も、当初は水質が悪く導入した魚が次々と死んでしまうというトラブルに見舞われた。また魚やCRISPR/Cas9などのベクターの入手にMTAの手続き等で12ヶ月を要し、さらに実験開始が遅れた。動物や植物の細胞に遺伝子を導入するとしばしばトランスジーンサイレンシングと呼ばれるDNAのメチル化を伴う発現抑制が生じる。私はヒートショックプロモータをもつある融合遺伝子(GFP遺伝子とバクテリアのメチル化酵素遺伝子の連結)をゼブラフィッシュに導入したところ、この遺伝子がトランスジーンサイレンシングの対象となることを偶然見いだした。本研究の目的はこのトランスジーンサイレンシングの生じるメカニズムを知ることにある。まず、このトランスジーンサイレンシングに関与するメチル化酵素遺伝子を同定するため、平成28年度はゼブラフィッシュのもつ6つのde novoメチル化酵素遺伝子の一つ、dnmt3bb.2の変異体をゲノム編集技術の作製を開始し、本年度(平成29年度)、最終的に三つの機能喪失型欠損変異を得ることができた。dnmt3bb.2の胚性突然変異体(zygotic mutant)はほぼすべての胚が正常に発生したが、母性胚性変異体胚(maternal-zygotic mutant)では血球分化の遅れが観察された。dnmt3bb.2変異体と上記トランスジェニックゼブラフィッシュを掛け合わせ、dnmt3bb.2ホモ接合変異体におけるトランスジーンサイレンシングの変化をGFPの蛍光をもとに解析したが、特に変化は見られなかった。そこでもう一つのde novoメチル化酵素遺伝子dnmt3aaの変異体を共同研究者(広島大学・菊池裕教授)から入手し、これまでに二重突然変異体を作製した。この二重突然変異体は生存・繁殖可能であったことから、現在上記トランスジーンと交配し、dnmt3bb.2, dnmt3aa非存在下でのトランスジーンサイレンシングを解析する準備を進めている。

ゼブラフィッシュの発生は早いが、性成熟にはマウスと同程度の期間、およそ3ヶ月を要する。したがって29年度初めにdnmt3bb.2のヘテロ突然変異体の稚魚を得たが、そこからホモ接合変異体を得るまでに半年、さらにdnmt3aaとの二重突然変異体を得るためにさらに半年、計一年かかった。これは短縮できないので仕方なかった。ゼブラフィッシュは6つのde novo型DNAメチル化酵素遺伝子を持つ。これらの遺伝子に対するアンチセンスモルフォリノオリゴ(MO)を一気に複数インジェクションしてトランスジーンサイレンシングの解除を調べるという方法もあるが、MOは必ずしも遺伝子の機能阻害に効く保証はなく、オフターゲットの心配があるので、今回、時間はかかったが二重突然変異体を作成した理由は、トランスジーンサイレンシングに関わる因子の同定をできる限り遺伝学的に進めていくべきと考えたためである。私はヒートショックプロモータに、ある融合遺伝子(GFP遺伝子とバクテリアのメチル化酵素遺伝子の連結)を連結し、ゼブラフィッシュに導入したところ、この遺伝子がトランスジーンサイレンシングと呼ばれるDNAのメチル化を伴う発現抑制の標的となることを偶然見いだした。このトランスジーンサイレンシングのDNAメチル化を担うメチル化酵素遺伝子の同定を目指している。ゼブラフィッシュの維持メチル化酵素遺伝子dnmt1のオーソログは一つであるが、de novoメチル化酵素遺伝子は6つ存在し、それらは哺乳動物のdnmt3aのホモログであるdnmt3aa、dnmt3abと、dnmt3bのホモログdnmt3ba, dnmt3bb.1, dnmt3bb.2, dnmt3bb.3からなる。昨年度はゲノム編集技術作製によりdnmt3bb.2の欠損変異体を作製した。dnmt3bb.2胚性突然変異体(zygotic mutant)は生存可能であったことから、dnmt3bb.2変異体と上記トランスジェニックゼブラフィッシュを掛け合わせ、dnmt3bb.2ホモ接合変異体におけるGFPの蛍光を観察したが、トランスジーンサイレンシングによる蛍光の消失には異常が見られなかった。そこでもう一つのde novoメチル化酵素遺伝子dnmt3aaの変異体を共同研究者から入手し、dnmt3bb.2との二重突然変異体を作製した。この二重突然変異体も生存・繁殖可能であったことから、GFPトランスジェニックフィッシュと交配し、二重の母性胚性変異体胚でのGFPの発現を解析したが、やはりトランスジーンサイレンシングは正常に生じた。さらにdnmt1の機能低下
定量的radioimmunohistochemistry法による組織中含量の検討

radioimmunohistochemistry(RIH)法は、immunohistochemistry法の特徴である物質の局在・分布を知ることが出来ると共に、autoracliagraphyを用いることによってradioimmunoassay(RIA)法と同様に定量化が可能である。今回、一時的脳虚血ラットをモデルとしてエンドセリンーI(ETー1)の組織内含量をRIH法にて測定することが可能か検討した。4%パラホルムアルデハイドで還流固定した脳をcryostatで20μm切片を作製した。(A)最適条件の検討:1)1/2001/4000倍で一次抗体の最適希釈率を求める2)10分間48時間でincubation timeを求める3)4°C,22°C,37°Cでincubation温度を求める4)二次抗体としての^<125>IーproteinAの希釈率を求める(B)定量化:1)既知のETー1をnitrocelluroseにspotして^<125>IーproteinAとして反応させる2)incubationした組織切片および既知のリガンド量を含む^<125>Iーstandardsと一緒にhypertilmー^3Hに感光させてautoradiogramを得る3)computerized microdensitometryにてoptical densities(O.D)値を測定する4)結合した^<125>IーproteinA量をO.D.値, ^<125>Iーstandards, ^<125>IーproteinAのspecitic activityより求める5)結合したETー1と^<125>IーproteinA量の間に相関があるかを検定する。その結果、^<125>IーproteinA量とETー1量の間には相関係数0.98934で有意(p〈0.001)の相関が存在していた。これをstandord curveとして、組織切片のETー1量を算出すると3pg/mg8pg/mgのETー1量が見られ、これらの値は、以前PIA法を用いて報告されている値と同じrangeであり、今回、検討した定量的RIH法が有意な方法であると考えられた。Carreaらの報告(J.Histochem.Cytochem.36:13791386,1988)に基づいて、よりRIA法に近い定量性を有するradioimmunohistochemistry法を開発することを目的として研究を行なった。1)Carreaらの方法の追試実験:ラット脳を還流固定後、クライオスタットで10μmの厚さに薄切した切片を用いた。正常血清でブロックした後、一次抗体および二次抗体として^<125>Iーprotein Aをincubation。incubationした切片を^3HーUltratilmに感光させてオ-トラジオグラムを得、解析した。(結果)結合は、一次抗体濃度依存性にOD値は変化し、抗体の力価にもよるが、市販の抗体では、約2000倍希釈が適当と考えられた。しかし、同時に非特異的結合も抗体濃度依存性に変化し、しかも、polyclonal抗体の場合、非常に高い非特異的結合を有していた。2)非特異的結合を抑える試み:(1)incubation温度の検討を行ない、4°C,室温,37°Cでは、4°Cで、他の二つよりも非特異的結合は少なかった。

(2)acetylationを抗体とincubationする前に行なっても、非特異的結合を有意に抑えることは出来なかった。3)抗体の選択:ウェスタンブロッテングにて抗体をチェックした。市販品でpolyclonal抗体であるendothelin,substance P,IGFーIなどをチェックしたが、いづれも複数のbandが検出され、これが、非特異的結合を生じさせるものと思われ、かなり純化された抗体でないと、この方法には使用出来ないと考えられた。現在、チェックしているものでone bandのものは、monoclonal抗体であるprotein kinase C,small Gーproteinなどであり、今後の検討対象である。4)タン白量の検討:Millerらの報告(Brain Res.447:6066,1988)したものは、実際のタン白量と相関することを確認したが、Correaらの方法では、必ずしも相関性はなかった。前年度までエンドセリン(ET)の脳内分布および含量の測定を正常ラットで行なっていたが、有意な所見は見い出せなかった。ETの含量は組織内では微量なためと思われ、そこで、今年度はETの産生が増加すると考えられる一過性脳虚血負荷ラットをモデルとして検討を行なった。4%パラホルムアルデハイドで還流固定を行ない、20μmの凍結切片を作製した。非特異的結合を抑えるために、5%normal goat serumで処置する際に0.1%のTritonーXを加え、一次抗体の希釈率を1/2001/4000の間で、さらに、incubation time,incubation温度、二次抗体としての^<12厂>IーproteinAの希釈率を、それぞれ検討した。hypertilmー^3Hで感光して得られたautorodiogramをcomputeriged micndensitometryで測定した。定量化の際のstandard curveは以下の方法で作製した。1)既知のETー1をnitrocelluroseにspotし、^<12厂>IーproteinAと反応させoptical densities(O.D.)を測定する2)特異的に結合している^<12厂>Iーprotein Aの量を既知のリガンドを含む^<12厂>Iーstandardsおよび^<12厂>ーprotein Aのspecific activityより算出する3)結合した^<12厂>Iーprotein A量(pg/mg)とETー1の量(mg/mg)の間の相関を求める。この二者の間には相関係数が0.98934という有意(p<0.001)の相関が存在していた。これをstandord curveとして求められたETー1含量は、frontoporietal cortexで4.29±0.46pg/mg,pyramidal layerで3.89±0.45pg/mg,CA_4領域で7.92±0.55pg/mg,stratum lacunosum moleculareで3.67±0.25
上皮細胞の形態を制御する短鎖ペプチドの機能

ショウジョウバエpolished rice(pri)遺伝子がコードしている、11および32アミノ酸のごく短いペプチド(PRIペプチド)は、細胞外に分泌されない新しいタイプの活性ペプチドと考えられている。PRIペプチドの作用機構を明らかにするため、遺伝的相互作用を示す遺伝子を探索したところ、転写因子をコードするshavenbaby(svb)遺伝子が同定された。SVBタンパク質は上皮細胞の形態形成を制御するマスター因子であるが、PRIペプチド存在下ではSVBタンパク質の活性化が起こることが明らかになった。(1)成虫原基におけるpri遺伝子の生理機能pri遺伝子は変態期の成虫原基に強く発現しており、成虫原基におけるpriの機能欠失は、剛毛や微小毛などの細胞突起の欠損を引き起こすことが明らかになっている。成虫原基におけるpri遺伝子産物の作用点を明らかにする。(2)細胞内におけるPRIペプチドの挙動PRIペプチドに対する抗体を作製し、あるいはPRIペプチドを各種分子タグとの融合ペプチドとして発現するトランスジーン系統を用いることにより、胚発生後期あるいは成虫原基細胞におけるPRIペプチドの細胞内における挙動を解析する。(3)PRIペプチドと相互作用する因子の同定PRIペプチドに対する抗体を用いた免疫沈降法により、あるいは上述したタグ融合遺伝子を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりPRI結合タンパク質を部分精製し、マススペクトログラフィーによりその同定を行う。また、PRI結合タンパク質をコードする遺伝子について突然変異系統を作製し、その表現型の解析を行うことにより、上皮細胞の形態形成におけるPRIペプチドの分子機能を明らかにする。pri遺伝子がコードする短鎖ペプチド(PRIペプチド)は、シグナルペプチドを持たない新しいタイプの遺伝子産物である。本研究ではPRIペプチドの生理機能を明らかにするため以下の研究を行った。1)成虫原基におけるpri表現型の解析pri変異の遺伝学的モザイク解析および新規に単離した機能欠失型pri変異系統の解析により、pri遺伝子が変態期の形態形成に必須の遺伝子であることが明らかとなった。その作用機構の詳細については継続して解析を行う予定である。2)細胞内におけるPRIペプチドの挙動の解析合成PRIペプチドを抗原とした抗PRIペプチド抗体および融合PRIペプチドを発現するトランスジェニック系統を用いた解析を行ったが、いずれの場合も期待したシグナルが得られず、これらの実験系ではPRIペプチドの細胞内局在を解析することは困難であることが明らかとなった。3)胚発生期におけるPRIペプチドの機能pri変異体の表現型を詳しく解析した結果、歯状突起細胞の運命決定を行う転写因子であるSVBタンパク質が翻訳後プロセシングを受けること、このプロセシングにはPRIペプチドの活性が必須であることが明らかとなった。PRIペプチドの生理機能を明らかにするため、以下の研究を行った。1)変態期におけるpri遺伝子の機能20年度までにpri遺伝子が変態期の形態形成に必須の遺伝子であることを示したが、21年度では、pri変異系統ではエクジソン応答性遺伝子であるE74およびE75の遺伝子発現時期が遅れること、また、エクジソン受容体のドミナントネガティブ型タンパク質の強制発現表現型が、pri遺伝子の強制発現により回復することを示した。これらの結果はpri遺伝子が変態期におけるエクジソンシグナルの下流で重要な役割を担っていることを示している。2)PRIペプチドの分子機能20年度の解析から、PRIペプチドが、歯状突起細胞の運命決定を行う転写因子であるSVBタンパク質の活性化に必須であることが示されていたが、この活性化機構が、SVBタンパク質の限定分解による転写抑制ドメインの除去であること、限定分解を受ける部位のアミノ酸が節足動物で高度に保存されていることが明らかとなった。1)変態期におけるpri遺伝子の機能21年度までに、pri遺伝子が変態期の形態形成に必須の遺伝子であり、エクジソン応答性遺伝子の発現に重要な役割を果たしていることを示した。22年度では、エクジソン受容体(EcR)の活性の変化とpri遺伝子の過剰発現を組み合わせて、EcR遺伝子とpri遺伝子との遺伝学的な相互作用を解析した。pri遺伝子過剰発現時には、ドミナントネガティブ型EcRの過剰発現と、EcR RNAiとの間に顕著な表現型の差異が認められ、pri遺伝子がEcRを直接あるいは間接的に制御していることが強く示唆された。2) PRIペプチドの分子機能PRIペプチドの生化学的性状を解析することを目指し、培養細胞における標的分子の一つであるSVB転写因子を指標に、合成PRIペプチドの活性の検定を行った。SVB-GFPを発現する培養細胞株に合成PRIペプチドを添加したところ、SVBの核内局在にはある程度の影響が見られたものの、SVBの転写活性化能の上昇はまったく見られなかった。また、合材ペプチドを蛍光標識し、細胞内への取り込みおよび細胞内局在を観察したところ、合成PRIペプチドは培養上清に添加しただけで細胞内に取り込まれ、エンドソームに取り込まれることが明らかになった。

Pri遺伝子がコードする短鎖ペプチド(PRIペプチド)は、シグナルペプチドを持たない新しいタイプの遺伝子産物である。PRIペプチドの生理機能を明らかにするため、以下の研究を行った。1.ギャップジャンクションを介したシグナル伝達の可能性の検討PRIペプチドのうち、もっとも小さなものは分子量わずか1000Da程度であり、ギャップジャンクションを介して細胞間を移動している可能性が考えられる。この仮説を検討するため、ギャップジャンクションの構成因子の一つであるinnexin2の変異系統を用い、PRIペプチドの過剰発現表現型がギャップジャンクションの異常により影響を受けるかどうかを検討したところ、inenexin2がpriの細胞非自律的な活性に重要であることを示差する結果が得られた。2.PRIペプチドの分子機能PRIペプチドの分子活性を明らかにする第一歩として、細胞内におけるPRIペプチドの構造決定を試みた。タグ付き融合ペプチドとして培養細胞で過剰発現させたpriペプチドは予想よりもやや小さな泳動度を示すバンドとして検出されたため、原在庫のバンドが修飾を受けているかどうかについて、質量分析計を用いた解析を行っている。