hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機磁性体結晶の電子密度分布の研究

本研究は、X線回折強度の低温精密測定によって、強磁性的相互作用を示す有機ラジカル結晶や有機金属錯体結晶の結合電子、非共有電子対などの電子密度分布を実験的に明らかにすることを目的として、平成8年度から3年間の予定で行われている。本年度の研究成果は以下の通りである。1.TEMPOラジカル誘導体のうち、極低温で強磁性体に転移するPh-誘導体(1)、p-Cl-Ph-誘導体(2)について100Kで(1):2θ≦95°,(2):2θ≦120°の範囲で強度測定を行い、多極子展開により電子密度分布の精密解析を行なった。その結果、酸素原子の孤立電子対やフェニル基のC-C結合の結合電子などが明確に確認できた。また、価電子に配向性を持たせたOAM(Oriented Atom Model)との比較検討も併せて行ない、ラジカルの不対電子はN-O結合のπ軌道に非局在化していると示唆される結果を得た。2.極低温で反強磁性的相互作用を示す、pyrimidineを架橋配位子とする硫酸銅錯体の電子密度分布の測定を行った。現在Cu近傍のd電子の配向に関しての詳細を解析中である。3.強磁性的相互作用を示すpyrimidineを架橋配位子とするCo錯体のX線構造解析を行い、三次元ネットワーク構造を明らかにした。4.acridineやphenanthridineのN-oxyl誘導体の結晶構造を明らかにし、磁性との関連を明らかにした。以上の試料はすべて本学野上研究室で開発・合成されたものである。本研究は、X線回折強度の低温精密測定によって、強磁性的相互作用を示す有機ラジカル結晶や有機金属錯体結晶の結合電子、非共有電子対などの電子密度分布を実験的に明らかにすることを目的として、平成8年度から3年間の行われた。1.TEMPOラジカル誘導体のうち、極低温で強磁性体に転移するPh-誘導体、p-Cl-Ph-誘導体についての電子密度分布の研究成果について、各種シンポジウムや学会において発表を行った。2.極低温で反強磁性的相互作用を示す、pyrimidineを架橋配位子とする硝酸胴錯体の電子密度分布の測定・多極子展開法による解析を行った。Cu近傍の電子密度分布の詳細な検討から、不対電子の関与するd軌道についての定性的な知見が得られた。3.極低温で強磁性的相互作用を示す、pyrimidineを架橋配位子とする胴錯体やコバルト錯体の電子密度分布の測定・多極子展開法による解析を行った。d電子の軌道についての明確な議論は今後まだ検討の余地が残された。解析における位相の取り扱いが問題であることが分かった。4.phenanthridine-N-oxyl誘導体の電子密度に関する精密測定をイメージングプレートを用いたワイセンベルグ型の装置で行い、電子密度分布の解析に十分な精度、感度および測定範囲を持つことを明らかにした。なお、この物質には、固相中でラジカル不対電子が失活して水素結合を作る分子が混合した状態の結晶が存在することを明らかにした。以上の研究成果を通して、電子密度分布の面から磁性発現機構についての検討を行った。
人工細胞膜受容体としての機能をもつ二次元ナノ組織体の構築

1.安定な人工細胞膜を形成するための合成脂質として,複数のアミノ酸残基を導入したオリゴペプチド脂質を開発した。また,脂質頭部位にガラクトースなどの糖残基をもつ人工糖脂質も合成した。これらの脂質の水中での会合挙動について,種々の物理的測定法を用いて従来のモノペプチド脂質と比較検討し,人工受容体を埋め込むに適した会合特性を有することを明らかにした。2.人工細胞膜に組織化するための人工受容体として,有機リガンドや金属イオンに対する認識部位をもつ,いくつかのステロイド誘導体を開発した。また,膜の両側で金属イオンの認識が可能な膜貫通型人工受容体の合成にも成功した。3.上記の合成脂質とステロイド型人工受容体を用いて,人工膜受容体としての二次元ナノ組織体を構成した。この人工膜受容体の分子認識能を,蛍光光度法をはじめ種々の分光学的測定により評価したところ,均一溶媒中では見られない特異な分子認識能の発現が認められた。4.ステロイド型人工膜受容体によるシグナル伝達機能について,分光学的手法を用いて検討した。その結果,この人工膜受容体は一次シグナルとしての芳香族有機リガンドを認識し,その応答を二次シグナルとしての金属イオンを介して酵素に伝えることで、触媒活性を制御できるこを見い出した。5.従って,人工細胞膜受容体としての二次元ナノ組織体は,酵素の触媒作用という化学信号の贈幅現象をコントロールする分子スイッチとして機能することが明らかになり,今後は膜貫通型人工受容体を膜に組織化することで,より高次の人工シグナル伝達系への展開が期待できる。
栄養応答における新規転写後制御機構の解明

植物におけるメチオニン合成の鍵となる段階を触媒するCGS酵素遺伝子(CGS1)はS-アデノシルメチオニン(SAM)に応答してSer-94コドンで翻訳を一時停止し,これと共役してmRNA分解をひき起こす。試験管内翻訳系を用いた解析により,翻訳停止に伴って新生ペプチドが縮んだコンフォメーションを取り、リボソーム出口トンネルとの相互作用が変化すること,および9コドン間隔で後続のリボソームが追突することを明らかにした。一般的なmRNA分解ではポリA鎖の短縮化が最初かつ律速段階とされる. SAMに応答したCGS1 mRNA分解ではこれとは異なり,ポリA鎖の短縮化が起らないことを見いだした。様々な環境条件下での植物の持続的成長には,環境変動に対して細胞内恒常性を厳密に維持する機構が不可欠であり,細胞内環境を機敏に感知し,それを即座に細胞の機能調節に反映させる分子メカニズムが必要である。シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は,植物においてメチオニン生合成の鍵段階を触媒する。メチオニンの生合成はCGSをコードするCGS1遺伝子の翻訳段階で,メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(SAM)に応答した翻訳停止と共役したCGS1 mRNAの分解によってフィードバック制御される。CGS1 mRNAのSAMに応答した翻訳停止機構の解析を行った。リボソーム出口トンネル内の新生ペプチドのコンフォメーション変化を調べるため,ペジレーション法を用いた。翻訳停止位置から様々な距離にシステイン残基を1つだけ持つように設計したCGS1 mRNAを用いて試験管内翻訳を行い,翻訳停止したリボソーム・新生ペプチド・mRNA複合体を回収してペジレーション解析を行った。その結果,SAM存在下では出口トンネル内のCGS1新生ペプチドがSAM非存在下と比べてよりコンパクトな構造を取ることが明らかになった。一方,MTO1領域内にアミノ酸置換を持ちSAMに応答したCGS1の発現制御が起こらないmtol変異を導入したmRNAでは,SAMの有無にかかわらず,出口トンネル内のCGS1新生ペプチドがコンパクトな構造を取ることはなかった。これらの結果より,SAMに応答した翻訳停止と出口トンネル内のCGS1新生ペプチドのコンフォメーション変化が密接な関係にあることが示された。低分子化合物の有無に応答して出口トンネル内の新生ペプチドがコンフォメーション変化を起こすことを示した最初の例である。SAMに応答した翻訳停止に際してリボソームは,転座の段階で停止していることを既に見いだしている。この時,翻訳停止位置であるSer-94のコドンまでを翻訳した翻訳停止産物であるペプチジル-tRNAは,リボソームのA部位を占めている。一方,翻訳阻害を引き起こすピュロマイシンは,リボソームのA部位に作用して,P部位のペプチジル-tRNAと反応し,ペプチジル-ピュロマイシンを遊離させる。従って,A部位がペプチジル-tRNAによって占められているリボソームにおいては,ピュロマイシンによるペプチジル-tRNAの離脱反応が起きにくいと期待される。コムギ胚芽抽出液の試験管内翻訳系を用いた解析により,SAMに応答してSer-94で翻訳停止したリボソームとピュロマイシンの反応を解析した結果,ペプチジル-tRNAがP部位を占めている状態(転座後/ペプチド転移反応前)のリボソームに比べて,ピュロマイシン感受性が低いことが示された。また,CGS1 mRNAのSAMに応答した翻訳停止に必要なシス配列であるMTO1領域のN末端側の領域の重要性をアラニンスキャニング等の塩基置換,および欠失の導入により解析した。その結果,MTO1領域のN末端側の10アミノ酸残基程度の領域には翻訳停止を助ける機能があると考えられた。様々な環境条件下での植物の持続的成長には,環境変動に対して細胞内恒常性を厳密に維持する機構が不可欠である。メチオニンの生合成はCGSをコードするCGS1遺伝子の翻訳段階で,メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(AdoMet)に応答したSer-94コドンでの翻訳停止と共役したCGS1 mRNAの分解によってフィードバック制御される。

AdoMetに応答した翻訳停止において,後続のリボソームの追突により数珠つなぎになる。昨年度までに、数珠つなぎになったリボソームの停止位置を同定し,追突したリボソームが非常にタイトにスタックしていることを明らかにした。数珠つなぎになったリボソームの停止状態を明らかにするため,昨年度に引き続き,ピュロマイシンによるペプチジル-tRNAの離脱反応(ピュロマイシン反応)の詳細な解析を行い,数珠つなぎになったリボソームが、翻訳伸長反応の殿段階で停止しているかを考察した。また,Ser-94コドンでの翻訳停止に至る過程でのピュロマイシン反応および,ペジレーションアッセイ法でリボソームの出口トンネル内での新生ペプチドの状態を解析した。さらに,リボソーム大サブユニットのrRNAについて,化学修飾法およびUVクロスリンク法による解析を行ない,翻訳停止に至る過程における,リボソーム側の状態の変化の解析も行なった。これら一連の解析により,AdoMetに応答した翻訳停止に至る課程でのmRNA:リボソーム:新生ペプチド複合体の状態の変化を考察した。様々な環境条件下での植物の持続的成長には,環境変動に対して細胞内恒常性を厳密に維持する機構が不可欠である。シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は,植物においてメチオニン生合成の鍵段階を触媒する。メチオニンの生合成はCGSをコードするCGS1遺伝子の翻訳段階で,メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(SAM)に応答したSer-94コドンでの翻訳停止と共役したCGS1 mRNAの分解によってフィードバック制御される。出口トンネルにはリボソームタンパク質L4とL22が突き出た狭窄部位がある。SAMに応答したCGS1 mRNAの翻訳停止における出口トンネルの関与を解析するため,L4タンパク質のβ-ループに変異を導入したトランスジェニック・シロイヌナズナを構築した。シロイヌナズナは,L4AとL4Dの2つのL4遺伝子を持つ。L4Dのβ-ループ頂点の両側に欠失を導入し,C末端にFLAGタグを付けて,L4Dノックアウト株に導入した。Western解析により,変異型リボソームが構築され,翻訳に与っていることを示した。これらの植物からシロイヌナズナ試験管内翻訳系(Plant Cell Physiol. 52:1443-53, 2011)を調製し,GST:CGS1-exon 1 mRNAを翻訳させた結果,SAMに応答した翻訳停止効率が対照株に比べて低下していた。一方,SAMに応答した翻訳停止に伴って,MTO1領域を含む新生ペプチドは,出口トンネル内で収縮したコンフォメーションを取る(J. Biol. Chem., 286:14903-12, 2011)。新生ペプチドのコンフォメーション変化を調べた結果,SAMに応答した新生ペプチドの収縮が起こりにくくなっていた。これらの結果は,SAMに応答したCGS1 mRNAの翻訳停止に,リボソーム出口トンネルの狭窄部位が関与することを示している。シスタチオニン
社会不安を中心とする精神病理傾向の高次－低次認知の相互作用の解明と介入

脅威刺激への注意,すなわち注意バイアスは不安を高める要因と考えられ,訓練によって注意バイアスを防止することが不安の低減に効果があるとして注目されている。本年度は,その注意訓練の発展に寄与すべく,高次認知機能の1つであるワーキングメモリによる注意バイアスへの影響について詳細に調べた。実験参加者には,ある情報をワーキングメモリに保持してもらいながら,表情刺激(怒り表情など)を用いた視覚探索課題を行ってもらった。課題に応じて,保持するワーキングメモリの情報を操作した。その結果,記憶している表情と同じ表情が提示されると,より効率的にその表情から注意を離すことができる可能性が示された。例えば怒り表情を記憶すると,記憶している間は怒り表情が提示されてもすぐに他の刺激に注意を移動することができる。さらには,記憶している情報と同じ視覚的特徴を持った顔表情にすばやく注意が向くことも示された。今回の実験では,視覚探索課題においてそれぞれの顔が異なる色に塗られており(例えば赤い顔や青い顔など),実験参加者が事前にある色を記憶していると(例えば赤色),その色と同一の顔表情(赤い顔)にすばやく注意が向いた。この結果から,喜び表情などポジティブな顔に見られるある視覚的特徴を記憶することで,ポジティブな刺激へと注意が促される可能性が考えられる。また,このようなワーキングメモリによる注意の誘導は,不安得点が高いほどその効果が大きく,高不安・社交不安者に適用可能であると思われる。これらの結果より,高不安・社交不安者も事前にネガティブな刺激を記憶し,提示されることを予測していること,そしてポジティブな刺激に見られる視覚的特徴を事前に把握・意識しておくことで,脅威刺激から注意をそらすことが可能であると考えられる。この手法はすぐにでも注意バイアス修正法に応用可能であると考えており,不安低減にどれほどの効果があるか,長期間時間をかけて今後実施することが望まれる。本年度は,社会不安が高次認知機能の1つであるワーキングメモリに与える影響について,ワーキングメモリの量および注意の効果に着目し,主に以下の2点を明らかにした。第1に,社会不安が強いほどワーキングメモリ容量が多いことが複数の実験で明らかとなった。これまで,社会不安が強いほどワーキングメモリが低下していると考えられてきたが,今回視覚に特化した課題を実施したところ,むしろ社会不安の強い人ほどより多くの刺激をワーキングメモリとして保持していることが分かった。多くの刺激を保持する結果,本来の目的とは関連のない妨害刺激まで処理している可能性が考えられ,その点についても検討した。結果,不安が強いほど確かに妨害刺激を処理する傾向にあるが,その傾向はむしろ抑うつで顕著に見られた。つまり,社会不安者は多くの刺激を保持する一方,抑うつ者は目的とは関係のない刺激を抑制することが困難であるといえる。第2に,ワーキングメモリ課題を実施している際社会不安が強いほど注意制御能力が低下していることが明らかとなった。記憶している刺激と同様の刺激が提示されると,注意制御能力が低下している人ほどよりその刺激に注意を向けることが知られている。今回,初めて社会不安を対象にこの課題を実施したところ,社会不安が強いほど記憶している刺激に注意を向け,注意がそこから離れられないことが分かった。情動を伴わない刺激であるにも関わらず注意制御能力の低下が見られたことから,これまで言われてきた社会不安の"情動を伴う認知制御の低下"から一歩進み,情動を伴う以前に既に認知制御が低下していることが分かった。これは,社会不安の改善に情動処理ばかり着目していたこれまでの流れに一石を投じると考えられ,新たな治療方法を提言することが可能となるだろう。本年度は,高次認知機能の1つであるワーキングメモリと注意の相互作用が不安に与える影響について検討すべく,その基礎的なメカニズムについて調べた。先行研究より,生物はワーキングメモリとして一時的に保持されている情報に注意を向けやすいことが明らかになっている。しかし,保持されている情動情報が注意に与える影響については検討されていない。情動情報の記憶が注意に与える影響について検討することは,不安の注意研究にとって非常に重要である。近年,注意を操作することで高不安者の不安を低減する手法の効果が示されてきているが,注意の操作法については未だ十分な検討がなされていない。情動情報の記憶が注意に及ぼす効果について明らかにあれば,効果的な注意訓練法を提案することが可能となると考える。実験では,具体的には実験参加者に怒り表情もしくは喜び表情を各試行で記憶してもらい,記憶している間に表情刺激の視覚探索課題を行ってもらった。結果,記憶している表情と同じ表情が提示されると,より効率的にその表情から注意を離すことができる可能性が示された。例えば怒り表情を記憶すると,記憶している間は怒り表情が提示されてもすぐに違う刺激に注意を移動することができる。記憶することが重要な役割を果たしており,実験参加者に表情を記憶しないように指示すると上記の現象は見られなかった。今回は情動情報として顔表情を記憶してもらったが,他の情動情報でも同様の現象が見られるか検討する必要がある。そして,不安の高低に関わらず同様の結果が得られるか検討する。

実験参加者には,ある情報をワーキングメモリに保持してもらいながら,表情刺激(怒り表情など)を用いた視覚探索課題を行ってもらった。課題に応じて,保持するワーキングメモリの情報を操作した。その結果,記憶している表情と同じ表情が提示されると,より効率的にその表情から注意を離すことができる可能性が示された。例えば怒り表情を記憶すると,記憶している間は怒り表情が提示されてもすぐに他の刺激に注意を移動することができる。さらには,記憶している情報と同じ視覚的特徴を持った顔表情にすばやく注意が向くことも示された。今回の実験では,視覚探索課題においてそれぞれの顔が異なる色に塗られており(例えば赤い顔や青い顔など),実験参加者が事前にある色を記憶していると(例えば赤色),その色と同一の顔表情(赤い顔)にすばやく注意が向いた。この結果から,喜び表情などポジティブな顔に見られるある視覚的特徴を記憶することで,ポジティブな刺激へと注意が促される可能性が考えられる。また,このようなワーキングメモリによる注意の誘導は,不安得点が高いほどその効果が大きく,高不安・社交不安者に適用可能であると思われる。これらの結果より,高不安・社交不安者も事前にネガティブな刺激を記憶し,提示されることを予測していること,そしてポジティブな刺激に見られる視覚的特徴を事前に把握・意識しておくことで,脅威刺激から注意をそらすことが可能であると考えられる。この手法はすぐにでも注意バイアス修正法に応用可能であると考えており,不安低減にどれほどの効果があるか,長期間時間をかけて今後実施することが望まれる。申請書に記載した通り,高次認知・注意機能の相互作用が不安に与える影響について十分な研究ができた。また,これらの効果が,不安ではなく,他の精神病理傾向(例えばサイコパス)に与える影響についても十分検討ができ,申請書の通り研究が進んでいる。今後は,引き続き高次認知と注意の交互作用と不安との関連について,その詳細なメカニズムについて明らかにすべく実験を行う予定である。また,今後は申請書に書かれている介入についても検討。この23年で注意訓練による不安低減の効果を示した研究が数多く出版されてきた。それらの結果および具体的な注意訓練法をレビューし,次に考えられるより効率的で効果的な注意訓練について提案する。
標的遺伝子組換えによる変異マウスを用いたB細胞シグナル伝達の研究

BおよびT細胞の抗原受容体(sIgMおよびTCR)が抗原により刺激されると、リンパ球はその成熟度、刺激の強さ、周囲の細胞の働きなどによって、活性化、増殖、分化、不応化、アポトーシスなど異なる反応を起こす。このような細胞反応を決定するシグナル伝達機構の理解は、免疫学的寛容、ひいては自己免疫発症機構の解明につながると思われる。sIgMやTCRが刺激されると、それらと会合するLyn,Blk,Syk,Zap70等の非受容体型チロシンキナーゼ(NR-PTK)が直ちに活性化され、さらに種々の細胞内蛋白のリン酸化が誘導される。血球系細胞特異的に発現する遺伝子HS1の産物はその中の一つであり、in vitroではLyn,Blk等Src型NR-PTKのSH2ドメインと強く結合する。また、非リン酸化HS1はSykのよい基質となる。よってHS1は抗原受容体のシグナル伝達に深く関与していると考えられた。標的組換え法にて作製したHS1欠損マウスでは、抗原受容体刺激によるB及びT細胞の増殖反応が不十分で、sIgM架橋による腹腔B細胞のアポトーシス誘導と胸腺T細胞の陰性選択が不完全なことが明らかになった。しかし、これらの欠陥はいずれも部分的であり、HS1以外の分子によるシグナルの経路が示唆された。あるいは、リンパ球分化の最初からHS1が欠失しているために他の分子が機能を代償した可能性もある。後者の問題を解決するためには、今後、組換え酵素Creとその標的配列lox-Pを用いた誘導性HS1遺伝子ノックアウトマウスを作製して、HS1欠失直後の発現形質を調べる必要がある。一方、Lyn遺伝子ノックアウトマウスでは、HS1,c-Cbl,Vav,PLCγ2といった細胞内蛋白のリン酸化が誘導されない、リンパ芽球様細胞およびプラスマ細胞の異常増加と脾臓リンパ節の腫大、血中抗体価の異常高値、自己抗体および自己免疫性腎病変などの異常が観察された。従ってLynは自己反応性B細胞の陰性選択とB細胞の最終分化の制御に重要な役割を果たしていると考えられた。
DNAの認識能を利用したナノ組織体の配列制御

オリゴヌクレオチド(一本鎖DNA断片)は,10量体でも4百万種の異性体が存在する.そのうちの一つはそれと相補的な一つだけを識別する.また,10量体は二重らせんを形成すると約3.4nmの棒状の堅い分子となる.これらの知見は分子をナノスケールで思いどおりに組織化する新しい手法を提供するものと期待される.従って機能分子にオリゴヌクレオチドを計画的に導入すれば,これらを溶液中で混合するだけで機能分子に予め導入した情報に従って二次元または三次元的に配置されたナノ組織体の自己組織的形成が期待される.当該年度では,この考えを実証するために以下の実験を行った.アデニン20量体を有するビピリジンを合成し,これを鉄(II)イオンと錯化させることによりアデニン20量体の三つのテ-ルを持つ鉄-ビピリジン錯体を合成した.同様の手法によりチミン20量体をテ-ルに持つ鉄-ビピリジン錯体も合成した.アデニン20量体とチミン20量体とはお互いに相補的で二重らせんを形成するのでこれら二つの鉄-ビピリジン錯体を混合するとそれらが交互に並んだネットワークの形成が期待される.実際これら二つを混合後,ゆっくりと冷やすことにより二重らせんの形成が確認された.また動的光散乱により集合体は900nmの平均粒径を有していた.また,鉄とルテニウムの異なった金属錯体を交互に配置させた集合体の調製も成功した.これらの研究結果はオリゴヌクレオチドをナノ組織体を構築するための柱として利用でき,しかも,オリゴヌクレオチドの相補性を利用することによって機能分子を空間上に思いどおりに配置できることを強く支持している.オリゴヌクレオチド(一本鎖DNA断片)は,10量体でも4百万種の異性体が存在する.そのうちの一つはそれと相補的な一つだけを識別する.また,10量体は二重らせんを形成すると約3.4nmの棒状の堅い分子となる.これらの知見は分子をナノスケールで思いどおりに組織化する新しい手法を提供するものと期待される.従って機能分子にオリゴヌクレオチドを計画的に導入すれば,これらを溶液中で混合するだけで機能分子に予め導入した情報に従って二次元または三次元的に配置されたナノ組織体の自己組織的形成が期待される.当該年度では,この考えを実証するために以下の実験を行った.アデニン20量体を有するビピリジンを合成し,これを鉄(II)イオンと錯化させることによりアデニン20量体の三つのテ-ルを持つ鉄-ビピリジン錯体を合成した.同様の手法によりチミン20量体をテ-ルに持つ鉄-ビピリジン錯体も合成した.アデニン20量体とチミン20量体とはお互いに相補的で二重らせんを形成するのでこれら二つの鉄-ビピリジン錯体を混合するとそれらが交互に並んだネットワークの形成が期待される.実際これら二つを混合後,ゆっくりと冷やすことにより二重らせんの形成が確認された.また動的光散乱により集合体は900nmの平均粒径を有していた.また,鉄とルテニウムの異なった金属錯体を交互に配置させた集合体の調製も成功した.これらの研究結果はオリゴヌクレオチドをナノ組織体を構築するための柱として利用でき,しかも,オリゴヌクレオチドの相補性を利用することによって機能分子を空間上に思いどおりに配置できることを強く支持している.
低酸素シグナルによる心臓再生

心疾患は全世界における死因の第一位を占めており,有効な心臓再生法の開発は極めて重要な研究課題である.哺乳類の成体には心臓再生能がほとんどない.これは大部分の心筋細胞が細胞周期に入る能力を持たないためである.一方で胎仔期や新生仔期の心筋細胞には細胞周期に入る能力が保たれており,胎仔・新生仔には心臓再生能が備わっている.しかし心筋増殖能は生後すぐに失われる.われわれは,哺乳類の心筋細胞の細胞周期制御において,低酸素シグナルが中核的な役割を果たすことを明らかにしてきた.具体的には,新生児期の再生能をもつ心臓では,増殖可能な心筋細胞は酸素代謝を低く保っていることを示した.つづいて成体にわずかに存在する増殖能を保った心筋細胞は低酸素シグナルを活性化していること,そして成体のマウスを長期間酸素分圧7%の環境に置くことで,心筋梗塞後に心筋細胞増殖による心機能回復を誘導することに成功した.一方,成体の心筋細胞での低酸素シグナルの機能はまだ十分理解されていない.我々は酸素代謝および低酸素シグナルによる心筋細胞の細胞周期制御機構を解析し,代謝制御因子,ストレス応答因子,そして低酸素シグナルにより心筋細胞の細胞周期停止を誘導もしくは維持する機構を同定した.今後はこれらの因子の阻害や活性化により,損傷心における機能回復が誘導できるか検討する予定である.我々はこれまでにミトコンドリア代謝の制御に関連する因子に対しての介入により,新生仔の心筋細胞の細胞周期停止を延長することが可能であることを明らかにした.さらに,その下流で活性化されるストレス応答因子の阻害でも同様に心筋細胞の細胞周期停止の延長が可能であることが明らかになった.逆にこれらのストレス応答経路を活性化することで増殖能を維持した心筋細胞でも細胞周期停止が起こることが判明し,ストレス応答の細胞周期制御における重要性が明らかになった.また低酸素シグナルの活性化により心筋細胞の細胞周期再エントリーが起こることを示す結果を得た.今後はミトコンドリア代謝制御およびストレス応答に関わる因子の薬理学的もしくは遺伝学的な阻害・活性化によって梗塞心での心筋細胞増殖,そして心機能回復が誘導されるかどうか検討する.さらに低酸素シグナルが心筋細胞増殖において必要かどうかについて,心筋細胞特異的ノックアウトマウスを用いることで検討する予定である.これらの結果を受け,さらに薬理学的な介入による心筋細胞再エントリー誘導についての可能性について検討することを予定している.心疾患は全世界における死因の第一位を占めており,有効な心臓再生法の開発は極めて重要な研究課題である.哺乳類の成体には心臓再生能がほとんどない.これは大部分の心筋細胞が細胞周期に入る能力を持たないためである.一方で胎仔期や新生仔期の心筋細胞には細胞周期に入る能力が保たれており,胎仔・新生仔には心臓再生能が備わっている.しかし心筋増殖能は生後すぐに失われる.われわれは,哺乳類の心筋細胞の細胞周期制御において,低酸素シグナルが中核的な役割を果たすことを明らかにしてきた.具体的には,新生児期の再生能をもつ心臓では,増殖可能な心筋細胞は酸素代謝を低く保っていることを示した.つづいて成体にわずかに存在する増殖能を保った心筋細胞は低酸素シグナルを活性化していること,そして成体のマウスを長期間酸素分圧7%の環境に置くことで,心筋梗塞後に心筋細胞増殖による心機能回復を誘導することに成功した.一方,成体の心筋細胞での低酸素シグナルの機能はまだ十分理解されていない.我々は酸素代謝および低酸素シグナルによる心筋細胞の細胞周期制御機構を解析し,代謝制御因子,ストレス応答因子,そして低酸素シグナルにより心筋細胞の細胞周期停止を誘導もしくは維持する機構を同定した.今後はこれらの因子の阻害や活性化により,損傷心における機能回復が誘導できるか検討する予定である.我々はこれまでにミトコンドリア代謝の制御に関連する因子に対しての介入により,新生仔の心筋細胞の細胞周期停止を延長することが可能であることを明らかにした.さらに,その下流で活性化されるストレス応答因子の阻害でも同様に心筋細胞の細胞周期停止の延長が可能であることが明らかになった.逆にこれらのストレス応答経路を活性化することで増殖能を維持した心筋細胞でも細胞周期停止が起こることが判明し,ストレス応答の細胞周期制御における重要性が明らかになった.また低酸素シグナルの活性化により心筋細胞の細胞周期再エントリーが起こることを示す結果を得た.今後はミトコンドリア代謝制御およびストレス応答に関わる因子の薬理学的もしくは遺伝学的な阻害・活性化によって梗塞心での心筋細胞増殖,そして心機能回復が誘導されるかどうか検討する.さらに低酸素シグナルが心筋細胞増殖において必要かどうかについて,心筋細胞特異的ノックアウトマウスを用いることで検討する予定である.これらの結果を受け,さらに薬理学的な介入による心筋細胞再エントリー誘導についての可能性について検討することを予定している.
病原菌エフェクターによるイネの免疫抑制機構の解明

植物は病原菌の侵入を細胞膜上の受容体で検知し、MAPKカスケードの活性化を誘導し、様々な防御応答を発動する。一方で、病原菌はエフェクターを細胞内に注入し、宿主の免疫応答を阻害する。本研究では、イネ白葉枯病菌のエフェクターXopYのイネの標的因子OsRLCK185の機能解析を通じ、イネにおける病原菌認識受容体からMAPKカスケードへと情報が伝達される仕組みを明らかにすることができた。申請者はイネ白葉枯病菌のエフェクターXopYがイネの免疫を阻害すること、その標的として受容体型細胞質キナーゼであるOsRLCK185を同定した。OsRLCK185は病原菌認識受容体OsCERK1と相互作用し、リガンド依存的にOsCERK1によってリン酸化され、活性化する。本研究では、1)OsRLCK185によるMAPKカスケードの発動メカニズムの解析と2)XopYによるOsRLCK185の活性化阻害機構の解析を行う。OsRLCK185はMAPKKKであるOsMAPKKK18と相互作用することから、OsRLCK185によるOsMAPKKK18へのリン酸化を解析した。その結果OsRLCK185はOsMAPKKK18をリン酸化することを明らかにした。さらに、酵母ツーハイブリッド法によりOsMAPKKK18のキナーゼドメインはMAPKKであるOsMKK4と相互作用することを明らかにした。イネプロトプラストでのOsMAPKKK18のタンパク質の一過的な発現を試みたが、OsMAPKKK18のタンパク質を検出することはできなかった。しかしNicotiana benthamianaでOsMAPKKK18のタンパク質を一過的発現させることに成功した。この実験系を利用し、OsMAPKKK18の細胞内局在解析やOsRLCK185とOsMAPKKK18の相互作用解析などを進めている。2)XopYはOsCERK1によるOsRLCK185の活性化ループ領域へのリン酸化を阻害する。本年度は、XopYのOsRLCK185に対する認識機構に着目し研究を行った。OsRLCK185はサブグループのVIIに属している。XopYとサブグループのVIIに属しているRLCKとの相互作用を酵母ツーハイブリッド法を用いて解析した。その結果、XopYはOsRLCK185と近縁なRLCKと相互作用を示す一方で、系統樹で離れたRLCKとは相互作用を示さなかった。OsRLCK185の活性化ループ領域のアミノ酸配列をXopYが相互作用しないRLCKと比較すると、5つのアミノ酸残基に違いがあることがわかった。今後、それらのアミノ酸残基を置換し、XopYとの相互作用を酵母ツーハイブリッド法により解析することで、XopYによる宿主RLCKの認識機構を解明する。CRISPR/Cas9システムを用いて、OsMAPKKK18の遺伝子破壊株の作出を目指したが、現在のところよい結果が得られていない。しかし、OsMAPKKK18の遺伝子発現抑制株の作出が成功し、イネ免疫におけるOsMAPKKK18の機能の解析を計画通り進めることができる。そのため、本研究はおおむね順調に伸展していると考える。植物は、病原菌の侵入を細胞膜上の受容体で認識し、活性酸素の産生、MAPKカスケードの活性化を誘導し、様々な防御応答を発動する。一方で、病原菌はエフェクタータンパク質を植物細胞内に注入し、宿主の免疫応答を阻害する。申請者はイネ白葉枯病菌のエフェクターXopYがOsRLCK185を標的とし、イネの免疫を抑制することを明らかにした。本研究課題ではOsRLCK185によるイネ耐病性発動機構の分子メカニズムの解明とそれに対抗したXopYによるOsRLCK185の活性化阻害機構の解析を通じたイネ免疫の抑制機構の解明を目的とした。昨年度OsRLCK185がMAPKカスケードの最上流因子であるOsMAPKK11/18と相互作用することを報告した。最終年度では、OsMAPKK11/18発現抑制株を作出し、OsMAPKK11/18が病原菌に応答したMAPKの活性化に関与するかを解析した。OsMAPKK11/18発現抑制株では、キチンに応答したMAPKの活性化が野生株と比較して顕著に減少していた。一方で、OsMAPKK11の欠損株ではキチンに応答したMAPKの活性化は野生株と同等であった。タバコを利用した一過的発現系を利用し、OsMAPKKK18の細胞内局在を解析した結果、OsMAPKKK18は細胞質と膜に局在しており、さらにOsRLCK185と細胞膜上で相互作用していることを明らかにした。申請者は研究期間全体を通じて、OsCERK1- OsRLCK185- OsMAPKKK18- OsMKK4- OsMPK3/OsMPK6のリン酸転移による活性化調節機構を明らかにし、今年度、学術論文として報告した。また、申請者はシロイヌナズナでも同様なシグナル伝達経路が存在することを明らかにしており、本研究課題で明らかにしたMAPKの活性化機構が植物に広く保存されていることが考えられた。

本研究では、イネ白葉枯病菌のエフェクターXopYのイネの標的因子OsRLCK185の機能解析を通じ、イネにおける病原菌認識受容体からMAPKカスケードへと情報が伝達される仕組みを明らかにすることができた。蛍光タンパク質や細胞分画法を利用し、OsMAPKKK18の細胞内局在を解析する。さらに免疫沈降法を利用して生体内でのタンパク質間の相互作用を解析し、OsRLCK185とOsMAPKKK18を介したMAPKカスケードの発動メカニズムを明らかにする。また、OsMAPKKK18発現抑制株における耐病性応答の解析を行い、イネ免疫におけるOsMAPKKK18の役割を明らかにする。XopYによるイネのRLCKの阻害機構を解明するために、注目しているアミノ酸に変異を導入したRLCKを利用して、XopYとの相互作用に与える影響を解析する。さらにOsRLCK185によるXopYのリン酸化部位を同定し、OsRLCK185のリン酸化修飾がXopYの病原性に与える影響を解析する。植物免疫学
粘土鉱物の加熱の際の水の挙動の研究

高温試料台,温度コントローラーを購入し,その指示温度をKNO_3, KClO_4, K_1SO_4, K_2CrO_4の転移点を用いてキャリブレートした.ついで,福島県小高産バーミキュライト,新潟県白崎産,山形県月布産,宮城県川崎産モンモリロナイト,ニュージーランドCoalgate産バイデライトのLi, Na, K, Ca, Mgで飽和したhomoionic samplesにつき, 300°C, 500°C, 700°Cに加熱することによる脱水,および冷却後湿度100%に保持することによる復水に伴う底面間隔の変化の測定を行った.また,上記5試料について化学分析および熱分析を行い,鉱物学的性質を明らかにした.Liで飽和したモンモリロナイトの加熱物は復水しなくなり, Greene-Kellyの結果を裏付けた.それ以外のモンモリロナイト,バイデライトは300°Cあるいは500°C加熱後も復水した. 700°C加熱後は,モンモリロナイト,バイデライトは概して復水しなくなるのに対し,バーミキュライトはK飽和以外は大部分復水する.山形県月布産,新潟県白崎産,宮城県川崎産モンモリロナイト,ニュージーランドCoal-gate産バイデライト,および福島県小高産バーミキュライトの5試料につき, X線回折,化学分析,熱分析を行った.モンモリロナイト3試料の層荷電は0.450.50で,いずれも八面体陽イオンの置換によっている.バイデライトはFeが多く,層荷電の0.47は四面体陽イオンの置換によっている.バーミキュライトは3八面体型で,層荷電は0.82である.以上の5試料につき, Li, Ni, K, Ca, Mgで飽和してhomoionicsamplesを調製し,常温でのX線回折, 300°C, 500°C, 700°C,に加熱しながらX線回折,さらに,冷却後温度100%に10日間および30日間放置したあとX線回折を行い,底面間隔の変化を測定した.その結果, Li出飽和したモンモリロナイトの加熱物は復水しなくなり, Greene-Kellyの結果を裏付けた.それ以外のモンモリロナイト,バイデライトは300°Cあるいは500°Cの加熱後も復水した. 700°Cが加熱後はモンモリロナイト,バイデライトは概して復水しなくなるのに対し,バーミキュライトはK飽和以外は大部分復水するようになり,示差熱分析曲線と調和的な結果が得られた.高温試料台,温度コントローラーを購入し,その指示温度をKNO_3, KClO_4, K_1SO_4, K_2CrO_4の転移点を用いてキャリブレートした.ついで,福島県小高産バーミキュライト,新潟県白崎産,山形県月布産,宮城県川崎産モンモリロナイト,ニュージーランドCoalgate産バイデライトのLi, Na, K, Ca, Mgで飽和したhomoionic samplesにつき, 300°C, 500°C, 700°Cに加熱することによる脱水,および冷却後湿度100%に保持することによる復水に伴う底面間隔の変化の測定を行った.また,上記5試料について化学分析および熱分析を行い,鉱物学的性質を明らかにした.Liで飽和したモンモリロナイトの加熱物は復水しなくなり, Greene-Kellyの結果を裏付けた.それ以外のモンモリロナイト,バイデライトは300°Cあるいは500°C加熱後も復水した. 700°C加熱後は,モンモリロナイト,バイデライトは概して復水しなくなるのに対し,バーミキュライトはK飽和以外は大部分復水する.X線回折計(日本電子JDX-11P3A,モノクロメーター付)を購入設置し、ハードウェアの調整、コンピュータソフトウェアの整備を行った。コンピュータ制御により良好な記録を得られるようになった。また、X線回折を一定湿度の下で行うようにするため、硫酸水溶液を用いて一定の湿度の空気をつくり、回折計の試料部分に流すための装置をつくり、回折計に取りつけるようにした。福島県小高産バーミキュライト,新潟県白崎産,山形県月布産,宮崎県川崎産モンモリロナイトなどの試料につき、沈降法による精製の後、Li,Na,K,Ca,Mgの各陽イオンで飽和したhomoionic sampleを調製した。この各の方位試料につき、湿度50%の條件下でX線回折実験を行い、底面反射を記録した。以上で第一段階の研究を終り、明年度、高温試料台,温度コントローラーの購入をまって、加熱による脱水,冷却後の復水に伴う底面間隔の変化の測定を行う予定である。
接続可能社会へのグローバル・パートナーシップ-貧困克服とコミュニティ建設のための参加型アプローチ-

貧困者自身による参加型スラム改善を支援するNGOやCBO(Community-based Organization)の経験交流とネットワーク化を図るために,平成9年度に,米国,タイ,インド,スリランカの貧困者支援団体を訪問して本研究プロジェクトの協力団体を組織し,平成10年度に,アジア3カ国の日米合同調査,平成11年度にはアメリカの日亜合同調査及び経験交流事業を実施した。その結果,次の諸点が明かとなった。1.社会経済条件の違いにもかかわらず,アジア途上国,合衆国のいずれにおいても,貧困者がコミュニティ開発の主体となりうること,参加型地域開発は今後も重要性を増すことが確認された。2.アジア途上国ではコミュニティメンバーのリスクシェアリングを基礎に貧困者の組織化に成功しているが,市場経済の浸透と居住者の要求や経済条件の多様化に対するマネジメントの発展が課題となっている。この課題に応える上で合衆国の経験を学ぶことは重要である。3.合衆国では,コミュニティ・デベロップメント・コーポレーション(CDC)が市場を活用し,開発リスクを居住者に転嫁することを避けながら,貧困地区の再生に貢献してきたが,他方で居住者参加が形骸化する傾向もある。アジア途上国のように,リスクシェアリングを基礎とするコミュニティ組織の機能化が求められる。4.南北の参加型貧困者支援活動が直面する課題を克服する上で,南北間の経験交流の持つ意味は極めて大きい。短期間の相互訪問にとどまらず,南北双方が相手方の活動家を受け入れて訓練し合うインターンシップ事業の創設や,相手方のコミュニティ開発事業に対する合同タスクフォースの組織化など,ワーク指向の交流の発展が期待される。貧困者自身による参加型スラム改善を支援するNGOやCBO(Community-based Organization)の経験交流とネットワーク化を図るために,アメリカ合衆国,インド,タイ,スリランカを訪問し,平成10年度に実施するアジア調査,平成11年度に実施するアメリカ調査の打ち合せを行った。2.インドでは,ボンベイで路上生活者の支援を行っているSPARCを訪問し,インドにおける貧困者の生活実態とスラム改善事業についてヒアリングを行うとともに,平成10年度に実施するインド調査のホストを要請し,快諾を得た。3.タイでは,スラム居住者の貯蓄組合の組織化を通じて生活改善を支援しているバンコクのUCDOを訪問し,UCDCの活動実績についてヒアリングするとともに,平成10年度に実施するタイ調査のホストを要請し,快諾を得た。4.スリランカでは,貧困女性の貯蓄活動と生活向上を支援しているWomen's Bankを訪問し,その活動及びコロンボ地区のスラムの実態についてヒアリングするとともに,平成10年度に実施するスリランカ調査のホストを要請し,快諾を得た。貧困者自身による参加型スラム改善を支援するNGOやCB○(Community-based Organization)の経験交流とネットワーク化を図るために,アメリカ合衆国からコミュニティ・デベロップメント・コーポーレーション(CDC)関係者6名(科研費で2名,日本福祉大学プロジェクト研究費等で4名)を招き,タイ,インド,スリランカを訪問して,日米合同調査及び経験交流事業を実施するとともに,平成11年度に実施するアメリカ調査の打ち合わせを行った。1.各国ごとに以下の団体,コミュニティを訪問し,その活動実体を調査するとともに,合衆国CDC関係者との経験交流を行った。タイ-UCDO(都市コミュニティ開発事務所)と,その支援を受けているバンコク,コンケーン,ソンクラーの貯蓄組合,関係NGO。インド-路上生活者の支援を行っているSPARCと,その支援を受けているボンベイ,プネのコミュニティ組織,関係NGO。スリランカ-貧困女性の貯蓄活動と生活向上を支援しているWomen'sBank,その支援を受けているコロンボ,キャンディのコミュニティ組織,及び関係NGO。2. 3カ国のいずれにおいても,マイクロ・クレジット等を手段として都市貧困者の組織化が図られ,貧困者自身による居住権の確立と生活向上,居住地改善の取り組みが活発に展開され,経済機会へのアクセスが保証されるなら,貧困者がコミュニティ開発の主体となりうることが確認された。3.全国レベルの経済不振に直面して,3カ国とも,コミュニティ・ビジネスへの投資が課題となっており,合衆国CDCの経験から得るものが多いと期待される。

また,コミュニティメンバーの参加やCBOのネットワーキングについては,むしろ途上国の方に優位性があり,合衆国CDCにとっても経験交流は有益であると考えられる。貧困者自身による参加型スラム改善を支援するNGOやCBO(Community-based Organization)の経験交流とネットワーク化を図るために,タイ,インド,スリランカから貧困者支援事業関係者各2名,計6名を招き,アメリカ合衆国を訪問して,日亜合同調査及び経験交流事業を実施するとともに,3年間に渡るプロジェクト全体の評価と総括を行った。1.社会経済条件の違いにもかかわらず,アジア途上国,合衆国のいずれにおいても,貧困者がコミュニティ開発の主体となりうること,参加型地域開発は今後も重要性を増すことが確認された。2.アジア途上国ではコミュニティメンバーのリスクシェアリングを基礎に貧困者の組織化に成功しているが,市場経済の浸透と居住者の要求や経済条件の多様化に対するマネジメントの発展が課題となっている。この課題に応える上で合衆国の経験を学ぶことは重要である。3.合衆国では,コミュニティ・デベロップメント・コーポレーション(CDC)が市場を活用し,開発リスクを居住者に転嫁することを避けながら,貧困地区の再生に貢献してきたが,他方で居住者参加が形骸化する傾向もある。アジア途上国のように,リスクシェアリングを基礎とするコミュニティ組織の機能化が求められる。4.南北の参加型貧困者支援活動が直面する課題を克服する上で,南北間の経験交流の持つ意味は極めて大きい。短期間の相互訪問にとどまらず,南北双方が相手方の活動家を受け入れて訓練し合うインターンシップ事業の創設が期待される。
ピロリ菌病原性に関わる新たなIV型分泌装置の解明

ヘリコバクター・ピロリの病原因子dupAは遺伝子変異の有無で大きく二つに分類できる。さらにdupAは5'領域の600bpの存在によりlong-typeとshort-typeに分けられる。dupAの領域の前後には、各種vir遺伝子が存在しておりIV型分泌機構を形成していると考えられる。我々は変異を有さないintactなlong-type dupAの陽性率が疾患により異なることを発見した。さらにdupAかつすべてのvir類似遺伝子を有するcompletedupA clusterの陽性率は十二指腸潰瘍株で有意に高かった。平成23年度1. dupA遺伝子のタイピング:dupA遺伝子の有無を確認するため2,500bpのlong dupA、ならびに1,800bpのshort dupAを認識するプライマーを作製しPCRで検出。2. dupA遺伝子陽性例については、dupA配列が現時点で最も長いShi470の配列をもとにシークエンスプライマーを設計し、DNAシークエンスを行うことでdupAの全長の解明。3. dupA下流のvir類似因子(virB8、virB9、virB10、virB11、virD4、virD2)の6つの遺伝子に対し設計したプライマーを使用し、PCRでそれらの遺伝子の有無を確認しtfs3のタイピングを行った。これらの結果から、dupA陽性の中でもlong dupAが重要であること、さらにその周辺のvir遺伝子群をすべて有し完全型clusterを形成しているものがIV型分泌装置を形成し、病原性に関係していると考えられる。平成24年度1. dupAと組織学的胃炎の検討:Update Sydney Systemにより活動度、炎症、菌量、萎縮、腸上皮化生についてデータベースへの入力が完了した。2.臨床分離ピロリ菌を用いた培養細胞への感染実験:それぞれのdupAタイプを発現する臨床分離株を用い胃上皮細胞株からのIL-8産生能の違いを検討。胃上皮細胞株としてAGS細胞を培養中であり、IL-8産生に最も適した条件の検討中である。3.抗DupA抗体を用いたDupA蛋白の検討:DupAの合成ペプチドをウサギに接種しウサギ血清中で抗DupA抗体が産生されるかを検討。現在それらの抗体がDupA特異的かを検討中。まずdupA遺伝子のタイピングを行った。dupA遺伝子の有無を確認するため2,500bpのlong dupA、ならびに1,800bpのshort dupAを認識するプライマーを作製しPCRで検出を行った。次にdupA遺伝子陽性例については、dupA配列が現時点で最も長いShi470の配列をもとにシークエンスプライマーを設計し、DNAシークエンスを行うことでdupAの全長の解明を行った。その結果、long dupAを有する割合は胃潰瘍、十二指腸潰瘍で有意に胃炎群より高かった。dupA下流のvir類似因子(virB8、virB9、virB10、virB11、virD4、virD2)の6つの遺伝子に対し設計したプライマーを使用し、PCRでそれらの遺伝子の有無を確認しtfs3のタイピングを行った。その結果、すべてのvir遺伝子を有している割合は胃炎群よりも十二指腸潰瘍群で有意に高かった。これらのタイプと組織学的胃炎についても現在検討中である。平成23年度に目的としたdupAのタイプの確認、tfsのタイプの確認、さらにはそのタイプと疾患の関係の検討も順調に遂行できている。完全型clusterの形成と疾患の関係については英文論文に掲載され、dupAのタイプと疾患の関係についても米国の学会で発表を行った。これらの成果より、本研究も目的の達成度は高いと考えている。平成24年度は臨床分離ピロリ菌を用いた培養細胞への感染実験を行う。dupAおよびvir類似因子によるタイピングが可能であることを平成23年度は示したが、このタイプの生物学的機能解析を行うために、それぞれのタイプのdupA、tfs3を持つピロリ菌を培養細胞に感染させ、培養上清中のサイトカイン濃度測定および生着率の観察を行う。dupA、tfs3のタイプの違いによるサイトカイン産生能の解析では、胃上皮細胞株として、AGS細胞およびMKN45細胞を用いる。単球はヒト末梢血単球細胞を用いる。それぞれのdupA、tfs3のタイプを有するピロリ菌を培養細胞に感染させ、感染後6時間、12時間、24時間における培養上清中のIL-8、IL-12等のサイトカイン濃度をELISA法を用いて検討する。また、培養細胞への生着率の解析も行う。

それぞれのタイプのdupA、tfs3をもつピロリ菌をAGS細胞およびMKN45細胞に感染させ、洗浄にて遊離のピロリ菌を除去した後、抗H. pylori抗体にて認識させる。その後蛍光標識した2次抗体で発色させることで細胞に生着した菌の量を数値化することが可能である。もうひとつの課題は抗DupA抗体を用いたDupA蛋白の大きさの検討である。dupAには長さの異なるタイプが存在するため、DupA蛋白のサイズを調べるためにはウェスタンブロットを行う必要がある。合成ペプチドをウサギに接種するとウサギ血清中で抗DupA抗体が上昇することが確認できている。この抗体を使用することでDupA蛋白の有無および大きさの検討も可能となる。dupA遺伝子のタイプとDupA蛋白の関係を比べることで、抗DupAペプチド抗体の精度が推測され、さらにDupA蛋白のサイズの測定も可能となる。H24年度には新たにマイクロプレート吸光度リーダー(Bio-Rad, 168-1002E)を購入したい。消耗品費として、IL-8、IL-12等のサイトカイン濃度測定ELISAキット、PCR用酵素、プライマー合成、培養細胞用の培地、血清を計上している。成果報告としての学会発表(東京2泊3日、2回)は、学内旅費規程に基づいた概算額を計上した。菌の培養や培養細胞の培養について、現状では時間の制約上困難であるため、実験補助員に手伝ってもらうこととし、その謝金を平成24年度も20週分計上した。その他には、英語論文の校閲料および投稿料を計上した。平成23年度のPCRの検討では残高が発生したため、平成24年度に繰り越し、ELISA用の試薬に充てる予定である。