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中世イギリス神秘文学の研究

本研究は、中世イギリス神秘主義作品と、それ以外の宗教散文作品のテクストに、語用論研究で提唱されたポライトネス・ストラテジーや談話ストラテジーの分析方法を応用することで、それらの作品の関係をマッピングしようとするものである。研究の結果、各作者が用いたストラテジーに共通点が見られるとともに、相違点も見られることが明らかになった。研究の過程で、神秘主義作品と他のジャンルとの関わりは、これら二つのストラテジーの分析だけではなく、より様々な側面からの分析を適用して考えるべきものであると考えるようになったので、筆者の読者に対する説得的ストラテジーの分析も研究対象に加えて研究を進めている。中世イギリス神秘主義作品と他のジャンルの作品との関係をマッピングするという本研究の目的を達成するため、二種類の具体的な研究を行った。まず、The Book of Margery Kempeと、中英語期に書かれた聖地巡礼に関する二作品とを比較し、その類似点と相違点を明らかにした。その成果は、ペーチ大学で行われた16th International Conference on English Histolical Linguisticsで発表した(標題等については「研究発表」の項目参照)。もう一つの研究、対象となる読者が女性に限られる作品と、そうではない作品とを比較研究することに関しては、Ancrene Wisseの談話ストラテジーの分析に着手し、その成果を7月12日に英国リーズ大学で行われたInternational Medieval Congress 2010において、"Discourse Strategies in Ancrene Wisse"の標題で発表した。本発表は、その談話ストラテジーを、女性隠修者であるJulian of Norwichによる作品Revelations of Divine Love(以後Revelations)のストラテジーと比較したものである。論理的な言い換え表現であるthat is(to say)をどちらの作品も多用するという共通点や、Ancrene Wisseには、修辞疑問等を多用するというRevelationsには見られない特徴があることが明らかになった。また、文体の違いを生じさせている原因を、Brown & Levinson(1987)のポライトネス理論に基づいて客観的に説明した。研究計画に従って、他の宗教散文ではよく用いられるにも関わらず、ノリッジのジュリアンの著作Revelations of Divine Love (以後Revelations)には読者を説得するための修辞疑問文がほとんど用いられない理由について考察を進めた。計画通り8月8日には、オスロ大学で行われたThe 21st International Conference on Historical Linguisticsに於いて、`Rhetorical Questions in Middle English Religious Prose: Their Illocutionary and Perlocutionary Acts, Textual Functions, and Related Genres'の題目で研究発表した。この発表では、Ancrene Wisse,『不可知の雲(The Cloud of Unknowing)』、チョーサーの『カンタベリ物語』の中の`The Parson's Tale'、ニコラス・ラヴのThe Mirror of the Blessed Life of Jesus Christといった宗教散文テクストで用いられる修辞疑問文を詳細に考察し、Revelationsのテクストとの違いを明らかにした。本年度は、まず実施計画の通り、英国スウォンジー大学のGregynog Hall (Newtown, Powys, Wales)に於いて開催されたThe 5th International Anchoritic Society Conferenceで`Julian of Norwich and Medieval Rhetorical Arts of Preaching'の題目で4月23日に研究発表を行った。Robert of Basevornが、その著作Forma Praedicandi(『説教の形式』)で、アウグスティヌスらの旧説教形式には見られず、13世紀以降の新説教形式で体系立って見られると述べている説得の技法を、ノリッジのジュリアンが彼女の著作Revelations of Divine Loveでどの程度用いているかを明らかにし、ジュリアンがそれらを意図的に用いたかどうかについて考察を加えた。また、米国アリゾナ州のフェニックスで開催されたTwenty-First Annual ACMRS Conferenceに於いても、`“As holy church techyth": Women Mystical Writers' Persuasive Devices which Demonstrate their Orthodoxy'の題目で2月6日に研究発表を行った。ノリッジのジュリアンの著作には、教会への言及や、彼女の啓示の解釈が教会の教えに矛盾しないことを示す表現が同時代の他の宗教散文と比較しても多用されていることを示して、これらが自分の著作の正当性を主張しようとする著者の意図の現れであることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。中世英語宗教散文の語用論的分析26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では、今年度は、読者に対する説得的態度を表す文体的特徴の有無を神秘主義作品とその関連作品で調べることに加えて、男性を含む全信徒を対象とした教化目的の書の調査にも着手する予定であった。しかしながら、読者に対する説得的態度を表す文体的特徴の調査分析を未だ分析を完全には終えていない状況であるので、男性を含む全信徒を対象とした教化目的の書の調査にまでは至らなかった。これが研究の遅れの理由である。

本科学研究費による研究課題は、予想していたよりも様々な側面と関連する大きな研究テーマであることが、課題を進めるうちに明らかになってきた。当初計画していたように、各テクストで用いられる談話ストラテジーを考察するだけで、中世イギリス神秘主義文学をその関連作品と位置づけることは難しいと現在では考えている。昨年度(平成25年度)は、中世イギリス神秘主義作品における当時の説教形式の影響を考えることが必要であることに気付いたため、Robert of Basevornの説教形式のマニュアルや、アウグスティヌスのDe Doctorina Christianaの内容とノリッジのジュリアンが実際に用いている修辞技法との比較に、年度後半全てを費やすこととなり、他の宗教散文テクストで用いられている読者を説得するためのストラテジーの考察を十分に行う時間がなくなってしまった。このことが、当初の研究目的を達成するための作業の遅れを引き起こす原因となった。しかしながら、当時の説教形式と、神秘主義文学テクストの文体との関連は、当然考えなくてはならないものであるので、今後はこのことも含めて、研究課題を遂行していくつもりである。本年度は、神秘主義作品と、それに関係する作品の談話ストラテジーの研究を総合的に進める予定であったが、、接続副詞nu (now)に関する調査研究だけしか調査を終えることができなかった。接続副詞の研究を進めるうちに、神秘主義作品とその関連作品の語彙的な特徴を先に調べる必要があることに気付き、調査対象作品の電子テクストをコンコーダンスソフトにかけて検索する調査を加えて行うこととなった。この語彙に関する調査研究の成果は、`How is a Text Classified in Mystical Writing?Typical Vocabulary and Expressions in Middle English Mystical Writing
バリスティック電子の回折をもちいるGaInAs超高速トランジスタの基礎研究

半導体内で高速電子が無衝突伝導する範囲内に極微構造を作り込み電子流を制御する新原理の超高速トランジスタ実現のための基礎を築くことを目指し、無衝突電子伝導、特にその波動性を実験的に調べ、電子波回折現象を理論的に解明しデバイス応用の可能性を探求し、以下の成果を得た。1.有機金属気相成長(OMVPE)法で極めて急峻なGaInAs/InPヘテロ接合界面を形成し、GaInAs結晶内へのホットエレクトロン注入を再現性高く達成した。2.ホットエレクトロン伝導を測定するためのデバイスを製作・測定し、GaInAs結晶はホットエレクトロンの平均自由行程が約200nmと、従来のGaAsの2ー3倍も大きく、バリスティック電子デバイスに向いた材料であることを明らかにした。さらにホットエレクトロンのエネルギーと注入電流との関係に特異な振動現象を見いだした。理論解析との比較から、この振動現象はエミッタ障壁とコレクタ障壁とで電子の波動関数が多重反射することに基づくものであり、電子波のコヒーレンス長が500nm以上のかなり長いものである可能性を明らかにした。3.電子波回折現象を観測するために必要な超格子を作製するための基礎として、電子ビーム露光法と我々が独自に開発した化学エッチングの手法によるInP半導体表面に70nm周期の周期構造形成を達成した。4.横超格子による電子波回折特性を解析し、GaInAs/InP結晶系中に形成したポテンシャル回折格子により90%の電子を0.1Vの電圧でスイッチできること、また77Kにおいても動作が可能であることを明らかにした。以上、ホットエレクトロンのバリスティっク伝導特性、特にその波動性観測に成功し、さらに理論的研究とあわせて高速バリスティック電子の波動性を動作原理とする電子デバイス実現のために重要な基礎的知見を得た。本研究は,半導体内で高加速電子が無衝突伝導する範囲内に極微構造を作り込むことによって電子流を制御する新原理の超高速トランジスタ実現のための基礎を築くものである.まず,初年度は,半導体内の無衝突電子伝導を実験的に調べ,また,電子波回折現象の理論的解明を進めてデバイスへの応用の可能性探求を行い,以下のような成果を得た.有機金属気相成長(OMVPE)法で,成長条件を注意深く把握することにより,極めて急峻なGaInAs/InPヘテロ接合界面を得て, GaInAs結晶内へのホットエレクトロン注入を達成した.さらに極薄結晶層を形成することによりその中でのほぼバリスティックな電子伝導を観測することに成功した.この実験から, GaInAs結晶はホットエレクトロンの平均自由行程が約200nmと,従来のGaAsの2ー3倍も大きく,バリスティック電子デバイスに向いた材料であることを明らかにし,この結果を学会論文誌に出版した.さらにGaInAs/InP超格子端面にショットキー接合を形成し,ホットエレクトロン注入時の電子波回折現象を観測した.目下,確認実験を行っており暫時公表の予定である.また,電子ビーム露光法の開発によりInP結晶表面に幅15nmの細線形成を達成し,電子波長オーダの構造加工に対して見通しをつけた.電子波回折現象を用いる超高速トランジスタの概念を学会論文誌に出版公表した.そして電子波回折現象のより詳細な理論解析を進め, GaInAs/InP結晶系中に形成したポテンシャル回折格子により90%の電子を0.1Vの電圧でスイッチできることを明らかにし,超高速トランジスタの可能性を示す基礎データを得た.一方,電子波の回折と光の回折との本質的な差異になど,半導体内における電子波回折を用いる新しいデバイスに関する学問的知見を得た.以上,電子波回折をもちいる新しい電子デバイスのための基礎的理解を深めた.

半導体内で高速電子が無衝突伝導する範囲内に極微構造を作り込むことによって電子流を制御する新原理の超高速トランジスタ実現のための基礎を築くことを目指し、第2年度は、半導体内の無衝突電子伝導、特にその波動性を実験的に調べ、電子波回折の理論的解明をさらに進めてデバイス特性および設計に必要なデータを求め、以下の成果を得た。2.ホットエレクトロン伝導を測定するためのデバイス製作工程を改良し高歩留まりで試料を得ることができるようにした。具体的には第1年度には歩留まりは1%以下であり再現性あるデータが取れなかったが、今年度は50%以上で解析に足るデータが得られるようになった。3.その結果、ホットエレクトロンのエネルギーと注入電流との関係に特異な振動現象を見いだした。理論解析との比較から、この振動現象はエミッタ障壁とコレクタ障壁とで電子の波動関数が多重反射することに基づくものであることを明らかにした。4.電子波回折現象を観測するために必要な超格子を作製するための基礎として、電子ビーム露光法と我々が独自に開発した化学エッチングの手法によりInP半導体表面に70nm周期の周期構造形成を達成した。5.横超格子による電子波回折特性について、有限動作温度に対応して波動の伝搬方向に広がりがある場合について解析し、77Kにおいても動作が可能であることを明らかにした。以上、ホットエレクトロンのバリスティック伝導特性、特にその波動性観測に成功し、さらに理論的研究とあわせて高速バリスティック電子の波動性を動作原理とする電子デバイス実現のために重要な基礎的知見を得た。
AFTE(ASEAN自由貿易地域)とベトナム-ASEAN域内経済協力の新展開とASEAN10への胎動-

本研究の目的は、途上国間の経済協力として30年あまりの歴史を持つASEANが、90年代に入ると「拡大」と「深化」の目覚ましい新展開を見せるようになった背景を探り今後を展望することにあった。ASEANの「拡大」とは、従来のASEAN6(ブルネイ、インドネシア、マレーシア、フィリピン、シンガポール、タイ)にインドシナ4(カンボジア、ラオス、ミャンマー、ベトナム)が加入して「ASEAN10」を形成することであり、「深化」とはAFTA(BBCスキーム、AICO、AIA等)により域内経済協力を強化することであった。この「拡大」と「深化」を繋ぐものとして、AFTAとベトナムの関係に焦点を絞り研究する計画を立てた。本研究開始した1997年はASEANへ結成30周年という記念すべき年に当たり、ベトナムと他のASEAN諸国との経済関係は一層緊密化するものと予想されていた。が、同年7月2日のタイ・バーツ切り下げによるアジア通貨危機の発生によりその予想も本研究計画も修正を余儀なくされた。そこで私は、まず第1にASEANを含む東アジアの経済が「奇跡」から通貨危機へと急展開する原因を究明し、次いで第2にそのアジア通貨危機の中でベトナムを加えた拡大ASEANが如何にして危機を克服しようとしているのかを明らかにするように努めた。第1の点に関しては、ASEAN諸国に倣ってベトナムも採用した輸出指向型工業化(EOI)戦略の限界を強調した。また、第2の点については、ベトナムのハノイで開かれた第6回ASEANサミットで提起された「大胆な政策」(ASEAN緊急経済対策)に注目した。このような修正を加えることによって、AFTAとベトナムという本研究のテーマの-アジア通貨危機を経ての-最新の局面に接近し、地域協力機構としてASEANが有する特徴を解明することができたと考えている。本研究の課題として私は、(1)東南アジア地域の国際分業体制-それはASEAN現地資本と多国籍企業との協力という形をとって現在急ピッチで進められている-の中でベトナムの占める位置を明らかにすること、および(2)AFTA加盟がベトナムよりも経済発展が進んでいる他のASEAN諸国からの製造品の急増を招き、ドイモイ政策の下で開放政策と輸出指向型工業化政策と矛盾するのかしないのかを明らかにすること、の2つのテーマを設定した。1997年はASEAN結成30周年という記念すべき年に当たり、ベトナムと他のASEAN諸国との経済関係は一層緊密化するものと予想されていた。が、7月2日のタイ・バ-ツ切り下げを契機とするアジア通貨危機とリセッシオンによりその予想は修正を余儀なくされて来ている。私は上記の研究課題に関して文献渉猟を行うことにより、(1)1986年にドイモイ政策を採用して以来初めてFDI(外国直接投資)が減少した、(2)また輸出(米や労働集約的製品が主力)が伸び悩んでいる、(3)FDIの減少と輸出の停滞とは経済成長の低下をもたらすに違いない、(4)従って、早急に対策を講ずる必要があることを明らかにした。次に、考えられる政策としては、1)輸出促進、2)投資環境の整備、3)サポ-ティング・インダストリーの育成、とりわけ4)ASEAN域内での広域産業ネットワークの形成と5)市場経済化の促進が挙げられるが、それらは本研究課題と密接に結び付いている。次年度は、そのインパクトが本格化すると考えられるアジア通貨危機に関する深い分析を基礎にして、上記のテーマへの接近を行う予定である。本年度の研究活動を通じて得られた研究実績として、以下の事柄を挙げることができる。ベトナム経済は現在、ドイモイ(刷新)政策を1986年に採用して以来、最大の経済的困難に直面している。

その主な原因として次の3点を挙げることが出来る。第1は、大規模な自然災害に見舞われたことである。1997年から98年にかけて中部ベトナムが早魃にそれとは対照的にメコンデルタは洪水に見舞われ、米をはじめとする農業生産に大打撃を与えた。第2は、改革の遅れなかでも国有企業改革と金融部門の改革の遅れ、法制度の未整備等が経済発展の強い桎梏になってきた。ベトナム共産等指導部の改革能力に対する不信や汚職・不正等に対する反発は、97年春にタイビン省で大規模な「集団訴願」を引き起こすまでになっている。最後に第3点として、アジア経済危機のベトナムへの影響を挙げなければならない。東アジアの経済発展(輸出指向型工業化政策[EOI])の「成長のエンジン」が(1)外資導入とそれによる(2)輸出拡大の2つにあるとは良く言われてきたことだが、97年から98年かけてベトナムへの外国直接投資は大幅に減少し輸出は停滞し、経済成長は低下傾向を示している。この経済的困難からの脱却の道をベトナムはASEAN域内経済協力の強化に求めていることが一層明らかになった。98年12月にハノイで開催された「第6回ASEANサミット」のホスト国であったベトナムは、(1)カンボジアのASEAN加盟に道を開く上で努力し(ASEAN10)、また(2)「ASEAN緊急経済対策」(大胆な政策)を取りまとめる上でも大きな役割を果たした。(2)の「大胆な政策」の主な内容はASEAN域内の貿易と投資の自由化を加速(AFTAとAIA[ASEAN投資地域]、AICO[ASEAN産業協力計画]の前倒し実施)することにある。ASEANをめぐる経済状況はなお流動的であり、上記のようなASEAN域内経済協力の強化が成功するかどうか、今後の展開を慎重に観察していく必要がある。
超微細構造を有する透明多孔質体中における相関散乱ふく射過程の解明

シリカエアロゲルに450nmの一様光を照射させたときに生ずる境界散乱光データを、申請者の開発した反復的逆散乱問題ソルバーを用いて解析した結果、シリカエアロゲルの光学特性について以下の知見を得た。(1)シリカエアロゲルが、SiO_2の単分散粒子群より構成されているならば、その平均粒径は、1020nm程度であり、かつ体積分率は0.1程度である。従って、相関散乱は、無視できない。(2)シリカエアロゲルの散乱位相関数は、Rayleigh、散乱位相関数よりもやや前方散乱が強く、非対称性パラメータは、0.1程度である。また、散乱角pi/2近傍で、くぼみを生ずる。以上の結果は、単分散相関散乱理論では、説明できない。(3)可視機でのエアロゲルのアルベドは、1である。
カリフォルニア州における言語マイノリティ教育の多様性と質の確保に関する研究

カリフォルニア州の公立学校においてバイリンガル教育を事実上禁止した州民投票・提案227の可決後、同州の言語マイノリティ教育の多様性と質の確保において重要な要因として明らかになったのは、(1)各学校がおかれた社会的経済的状況を考慮したアカウンタビリティ基準および多様な評価者の設定、(2)高い専門性を有するバイリンガル教員の採用を可能とする人事上の裁量権、(3)学校の自律性とそれを実質化する大学等の専門的支援組織とのネットワークである。本研究の目的は、カリフォルニア州の言語マイノリティ教育の多様性に対して、英語による教育の質の保証を意図する学校評価政策が与える影響を明らかにすることである。平成20年度は、まず、カリフォルニア州教育局等のインターネットで公開されているデータを用いて状況把握を行い、その結果、NCLB法にもとづく学校評価において、継続して要改善校あるいは、要改善学区となっている学区が増加しており、本法の目標達成が困難な状況にあることが明らかとなった。このような状況を踏まえ、カリフォルニア州教育局での訪問調査を行った。その結果、NCLB法は、英語学習者(EL)の人数によって補助金が配分されるため、予算確保の安定性が高まったことが明らかになった。しかし、アカウンタビリティが強く求められており、目標達成の見通しについては、担当者も悲観的であった。また、要改善学区に対する技術的支援のパイロットプログラムを実施しており、州による学区の改善指導マニュアルを特別に入手することができた。また、次年度以降に本格的に調査する学校レベルでのバイリンガル教育(双方向イマージョン・プログラム: TWI)の実施状況を把握するために、予備的な調査として、サクラメント市のチャータースクール(CS)・Language Academy of Sacramento(LAS)校で訪問調査を行った。その結果、LASは、公立学校でのバイリンガル教育を事実上禁止した州民投票・提案227以降、CSに移行しており、多様な教育理念・方法を確保するためのCSの可能性を確認することができた。このことは、要改善校に認定されながらも、保護者・地域住民の支持・協力と、学区教育委員会との良好な関係のもとで、チャーターの更新が認められたことにも現れている。ただし、予算確保、施設確保といった課題を抱えていた。今年度は、昨年度予備調査を行ったバイリンガル教育(双方向イマージョン(TWI)プログラム)を実施しているサクラメント市のチャータースクール(CS)・Language Academy of Sacramento (LAS)校での再調査と、同じくTWIプログラムを実施するBowling Green Charter小学校、LASへの専門的な支援を行っているカリフォルニア州立大学サクラメント校およびカリフォルニアCS協会(CCSA)で調査を行った。LASおよびBowling GreenはともにCSであるが、LASは、独立型、Bowling Greenは従属型と呼ばれる。両者の違いは法律によって定義されたものではなく、多義的であるが、独立型であるLASは、Bowling Greenに比べてより大きな人事上の裁量権を有しており、TWIを実施するうえでより専門性の高いバイリンガル教員を採用できることが明らかとなった。ただし、LASはチャーターを更新し、そのアカウンタビリティを果たしているものの、LASおよびBowling Greenはともに、NCLB法にもとづく要改善校であり、英語と英語による学力向上のために様々な改善策を実施している。こうした状況のなかで学校改善の支援を行っているのが、カリフォルニア州立大学サクラメント校の教授陣である。教授らは、LASの教員養成、研修、児童・生徒の指導など、TWIを実施するうえでの専門的な支援を創設当初から継続的に行っている。さらに、LASはサクラメント校のバイリンガル教員養成の教育実習を引き受けると同時に、優れた教員の採用を確実にする相互協力の関係でもある。学区からの自律性の高い独立型CSでのTWIの実施には、サクラメント校からの専門的支援に加えて、CCSAが、その設立当初から学区との交渉、学校経営の法的、会計上の支援を行っており、教育の多様性を確保する手段としてのCSは、こうした専門的支援組織のネットワークによって支えられていることが明らかとなった。今年度は、昨年度調査を行った双方向イマージョン・プログラムを実施するチャーター・スクール(CS) Language Academy of Sacramento (LAS)と、同じプログラムを実施し、別の市が設置する公立学校2校(Beamer Park小学校、Cesar Chaves小学校)の訪問調査を行った。今年度、LASに加えて、公立学校2校を調査対象として比較考察した理由は、昨年度までの研究成果として、公教育における言語的多様性を確保するうえで、バイリンガル教育の専門性をもった教員の採用について学校(LAS)が人事権を有していることが重要であることが明らかになっていたからである。Beamer Parkの場合は、教員採用に関する人事権を校長が有しているわけではないが、教育長との「パイプ」を通じて専門性の高い教員が優先的に配置されるよう学区の人事に関するルールを変更していた。Cesar ChavesがあるDavis市の各公立学校の人事権は校長が有しており、専門性の高いバイリンガル教員の確保が可能となっていた。

また、平成20、21年度に続いて訪問調査を行ったLASは、過去、連邦のアカウンタビリティを果たすことができず、アカウンタビリティを重視する新しい教育長のもとでは次回のチャーターの更新が危惧されていたが、州のアカウンタビリティの達成が近隣の公立学校を大きく上回っていることから、学区からも信頼を得ていることが明らかとなった。しかし、連邦、州のアカウンタビリティの基準の違いとその意味について再検討することが今後の課題として残った。また、LASにおいては、双方向イマージョン・プログラムの実態調査のために授業観察と教員、保護者、校長等へのインタビューを行い、教育実践上の課題とその経営上での解決について検討を行った。
イオン液体を用いたアルミニウム‐塩素電池の開発

本研究では、イオン液体を電解液として、アルミニウムと塩素ガスによる大きな出力の電池の開発を目指した。この研究において、イオン液体電解液として1-エチル3-メチルイミダゾリウムクロライドとAlCl3との混合からなるものを用いた。この中でのAl-Cl2電池の開回路電圧は30°Cで2.1Vである事がわかった。また塩素電極の最適な形状を見出すために各種形状の電極を検討した。さらにアノード材料としてのアルミニウム合金における電池出力は純アルミニウムよりも低い値を示すことが明らかになった。本研究は、イオン液体を電解液として、アルミニウムと塩素ガスによる大きな出力の電池の開発を目指すものである。電極となるアルミニウムは、純アルミニウムの他にスクラップアルミニウムを想定しており、スクラップを処理しながらエネルギーを回収する事が出来るため、環境技術として期待できるものである。この電池は,イミダゾリウム系イオン液体、アルミニウム(アルミニウム合金)と炭素電極の下部に塩素ガスをバブリングさせた塩素電極からなる。1年目は塩素電極の形状の検討を行い、より多くの塩素ガスがイオン液体に溶解させる形状を模索した。2年目は、電極形状の検討の他にスクラップアルミニウムを想定した、電池性能に与えるアルミニウム合金元素の効果を調べた。電極形状の検討の結果、塩素ガスの停滞が抑制される形状として、円錐型の電極が考案され、その円錐の角度によっても塩素還元の効率が変化する事がわかった。アルミニウム合金における合金元素の影響については、Al-Mg合金では、純アルミニウムよりも開回路電池電圧が大きくなるが、閉回路時の電池電圧は純アルミニウムの時よりも僅かに小さくなった。Al-Si合金では、純アルミニウムに比較して開回路電池電圧、閉回路時の電池電圧ともに小さくなった。これらの結果は、スクラップアルミニウムを処理しながら、電池を作動させた場合、電池出力特性がどの程度低下するのかを見積もる際に有効な基礎データになると考えられる。本研究は、イオン液体を電解液として、アルミニウムの酸化反応と塩素の還元反応を組み合わせた電池反応により、大きな出力の電池の開発を目指すものである。アルミニウム資源は、国内に十分に存在しているため、安定した電極材料の供給が考えられ、レアメタルを用いる電池における状況とは異なり、これからの安定したエネルギーデバイスとして期待できるものである。1年目の検討課題は、電解液としてイミダゾリウム系のイオン液体を用いて、アルミニウムと塩素電池を構成し、その電池起電力と電極形状について検討した。実験装置は簡易ドラフトチャンバー内で組み立て、イオン液体の電解液が満たされている容器に、アノードとしてアルミニウム板、カソードとして円柱状の炭素材料の底部から塩素ガスを吹き込み電池を構成した。また電位の基準としてアルミニウム線を参照電極として用いた。平成24年度の実験計画では、主にイミダゾリウム系のイオン液体を用いた。参照電極を用いた電池反応における分極測定を行ったところ、アノードの溶解反応には、大きな分極は生じず、カソードの塩素の還元反応に大きな抵抗が生じている事がわかった。したがってカソードの塩素の還元反応をより起こりやすくするような電極の形状が必要であると考え、円筒状の炭素電極と二段の円筒を組み合わせた電極により、出力特性を調べた。その結果、二段の円筒を組み合わせた電極の方が単位面積当たりの出力が大きくなる事がわかり、電極形状の最適化を次年度に検討する。各種のイオン液体電解液を検討する予定であったが、最初に試したイミダゾリウム系のイオン液体が、ある程度の性能を示すことが分かったため、他のイオン液体の検討はしていない。電池の評価については計画通り進んでおり、順調に進捗していると判断した。二年目においては、アノードの材料としてスクラップアルミニウムを想定したアルミニウム合金を用いて電池を構成して電池特性を調べる。アルミニウム合金の候補としては、アルミニウムーマグネシウム合金(5000番系)、アルミニウムーシリコン合金(4000番系)、アルミニウムー亜鉛合金である。アルミニウムーマグネシウム合金では、マグネシウムがアルミニウムよりも卑な金属であるため、電池起電力をより大きくする効果があるかを確認する。アルミニウムーシリコン合金では、シリコンがアルミニウムに近い電位を示す元素であるため、アルミニウムの溶解反応にどのような効果があるかを調べる。アルミニウムー亜鉛合金では、亜鉛がアルミニウムよりも若干貴であるが、比較的近い電位であるため、電位が近い金属の混入の効果が調べる事ができる。該当なし
ALS病因タンパク質TDP-43と相互作用するタンパク質p47の病態への関与

ALSの原因遺伝子であるTDP-43は、ALSの病態に普遍的に関与していると考えられているが、TDP-43による運動ニューロン変性の分子機構は未だ不明である。代表者はTDP-43と相互作用する新規タンパク質p47を同定し、ALS疾患由来の変異TDP-43との親和性が低下することを明らかにした。また、野生型TDP-43と疾患由来のTDP-43では、タンパク質の半減期が顕著に異なっており、疾患の発症年齢と負に相関していることを明らかにした。本年度は、野生型TDP-43と家族性ALS患者由来の変異TDP-43との違いを検討するため、マウス神経芽細胞腫(Neuro 2A細胞)を用いた実験系で詳細に解析を行った。まず、野生型と変異TDP-43の局在と界面活性剤に対する可溶性を調べた。その結果、野生型と同様に、変異TDP-43は核に局在しており、ALS患者病巣で見られる細胞質での異常局在と凝集体の形成は見られなかった。一方、変異TDP-43において、イオン性界面活性剤であるSarcosy1に不溶性となる傾向が得られた。しかしながら、野生型の性質と比べ、それほど有意な差がないことから、変異の導入により不溶性が極端に高まる訳ではないと考えられた。次に、Neuro 2A細胞内で新規合成されたTDP-43の半減期を、メチオニンアナログAHA(L-azidohomoalanine)およびPEG-ビオチンを用いた実験系で測定した。その結果、変異TDP-43は野生型と比較して顕著に長い半減期を有していた。本年度に行った一連の解析により、TDP-43に変異が導入されると、局在や可溶性には影響を及ぼさないが、細胞内(核内)で野生型よりも安定に存在するということを明らかにすることができた。申請者が見いだしたTDP-43と相互作用するタンパク質p47は、野生型TDP-43とは強い相互作用を示すが、ALS患者由来の変異が導入されると相互作用が弱くなる。このことと本年度の研究で得られた結果より、p47はTDP-43の局在機構よりも細胞内での安定性に関与している可能性が高いと考えられる。p47に対するペプチド抗体の作製、およびRNAiにより効率良く発現を抑えられる配列の決定は、本年度完了している。これらのものを用いて、p47が変異TDP-43の安定性にどのように関与しているのかを明らかにし、病態への関与を明らかにすることを来年度の目標とする。今年度の研究は、昨年度得られた結果に基づき、さらに詳細に解析することから開始した。局在と凝集体形成能に関して、野生型と家族性ALS由来の変異TDP-43間で、有意な差は見られなかった。しかし、TDP-43タンパク質の半減期をパルス-チェイス法により決定したところ、興味深いことに、変異体の半減期が野生型よりも長く、変異体の半減期の長さがALSの発症年齢と負に相関していた。一方で、半減期と罹病期間には相関は見られなかった。つぎに、TDP-43の機能に着目し、exon-skipping活性およびmRNA制御活性をモニターできる実験系を構築し、野生型との活性の比較を行なった。その結果、exon-skipping活性は野生型と変異体での差は見られなかったが、全ての変異体でmRNAの制御活性に低下が見られた。タンパク質の半減期が野生型と変異体で顕著な差が見られたことから、タンパク質の安定性を低分子化合物で制御できるタグをTDP-43に付加し、細胞内で安定化させることを試みた。その結果、TDP-43の安定化により、界面活性剤に対する溶解性の低下とmRNA制御活性の低下が見られた。また、安定化したTDP-43の蓄積により、細胞内のプロテアソーム活性の低下と、細胞死が認められた。TDP-43の安定化により惹起される生化学的異常は、ALS病巣におけるTDP-43の生化学的特性と一致する点が多く、TDP-43の安定化がALS発症の重要な要因であることを示唆していると考えられる。p47は野生型TDP-43とのみ結合し、変異TDP-43とは結合しない。このことから、p47はTDP-43の安定性に関与していると考えられる。現在、一連の解析結果を論文として纏め、投稿準備中である。
神経幹細胞が持つグリオーマ浸潤増殖抑制因子の解明とex vivo遺伝子療法の開発

神経幹細胞は、その分化能のみならず増殖や運動能の面でも特異な性格を有している。我々はこのような性格の解明がグリオーマの治療に新しい展開が開ける可能性を求めた。結果、マウス培養神経幹細胞のconditioned medium(NSC/CM)を用いてグリオーマ細胞を培養すると、その増殖がNSC/CM濃度に依存して抑制されることをMTT assayにより明らかにした。また、NSC/CMの存在下ではグリオーマ細胞の運動能が抑制されることをBoyden Chamber法で明らかにした。その運動抑制作用は、実際の脳環境に近いbrain slice cultureモデルでも証明され、NSC/CM存在下でグリオーマ細胞の拡散や脳切片内深部への細胞浸潤が抑制されることを共焦点レーザーで証明した。以上より、神経幹細胞はグリオーマの増殖や運動に干渉するなんらかの生理活性物質をNSC/CM中に産生することを明らかにした。フィルターを通したところ、NSC/CMの5万から10万MWLの分画にその因子が存在することを明らかにした。高圧クロマトグラフィーでのタンパク抽出精製を行ったが単離するに至らなかった。次に、培養マウス神経幹細胞をグリオーマ細胞と同時にマウス大槽内に投与すると、神経幹細胞を投与しないコントロール群に比べて投与した群での生存期間は有意に延長し、in vivoでも神経幹細胞からグリオーマの増殖を抑制するなんらかの活性物質が産生されることを明らかにした。以上より、神経幹細胞自体が細胞療法として有用である可能性が示された。さらにその細胞が細胞増殖抑制因子の運搬担体となることを期待し、IL12発現ベクターを入手しIL12cDNAをGFP発現ベクターに組み込み、神経幹細胞にtransfectさせ、その発現が確認された。これは将来的にはex vivo遺伝子療法としての成果が期待できると考える。神経幹細胞は、その分化能のみならず増殖や運動能の面でも脳内で特異な性格を有している。我々はこのような性格の解明がグリオーマの治療にまったく新しい展開が開ける可能性を求めた。その結果、マウスあるいはラットに由来する培養神経幹細胞のconditioned medium (NSC/CM)を用いてラット、マウス、ヒトグリオーマ細胞を培養すると、その増殖が有意に抑制されることがMTT assay法により判った。その抑制はNSC/CMの濃度に依存した。また、NSC/CMを用いてグリオーマ細胞を培養すると、Boyden Chamber法によりその運動能は有意に抑制されることが判った。その作用は、器官培養を応用した三次元構築脳組織培養モデル(brain slice culture)上でグリオーマ細胞の浸潤がNSC/CM存在下で抑制されることでも証明された。すなわち、NSC/CM神経幹細胞はグリオーマの増殖や運動に干渉するなんらかの生理活性物質を産生し、NSC/CM中に存在することが明らかになった。また、NSC/CMをフィルターに通し分画に分けると、5万から10万MWLの分画のNSC/CMにその活性が残ることが明らかになり、その分画に、グリオーマの増殖、浸潤ともに抑制する多機能をもつ未知の因子があることを確認した。次に、培養マウス神経幹細胞をグリオーマ細胞と同時にマウス大槽内に投与すると、神経幹細胞を投与しないコントロール群に比べて投与した群での生存期間は有意に延長した。すなわちin vivoでも神経幹細胞からグリオーマの増殖を抑制するなんらかの活性物質が産生されることが明らかになった。それらより、神経幹細胞自体が細胞療法としてきわめて有用な媒体である可能性が考えられた。初年度は、神経幹細胞の分泌する因子が腫瘍細胞増殖抑制に働くことを培養細胞、および動物実験で明らかにした。

すなわち、神経幹細胞はグリオーマの増殖に干渉するなんらかの生理活性物質を産生し、その細胞培養液(NSC/CM)中に存在することが明らかになった。本年は、NSC/CMのグリオーマ細胞に対する運動能の抑制に着目した。昨年度に引き続きNSC/CM存在下でBoyden Chamber法により種々のグリオーマ細胞を培養すると、いずれの細胞でもその運動能は有意に抑制されることを明らかになった。そこで、実際の脳環境に近い器官培養を応用した三次元構築脳組織培養モデル(brain slice culture)上でグリオーマ細胞の浸潤がNSC/CMにより干渉されるか否かを検討した。その結果、NSC/CM存在下で脳切片上でのグリオーマ細胞の拡散を観察することによりその運動能が抑制されていることが明らかになり、また脳切片内深部に細胞が浸潤する時間経過を共焦点レーザーで観測することによってグリオーマ細胞の浸潤能の抑制が証明された。またその浸潤抑制の時期は増殖抑制の時期より早期に誘導されることも明らかになった。NSC/CMをフィルターに通し分画に分けると、5万から10万MWLの分画にその浸潤抑制活性が残ることが明らかになり、その分画に、グリオーマの増殖、浸潤ともに抑制する多機能をもつ未知の因子があることを確認した。高圧クロマトグラフィーでの抽出精製はその分離精製を継続中である。次に、神経幹細胞自身の作用だけでなく、その細胞が細胞増殖抑制因子の運搬担体となることを期待し、IL12発現ベクターを入手しIL12cDNAをGFP発現ベクターに組み込み、神経幹細胞にtransfectさせ、その発現が確認された。将来的にはex vivo遺伝子療法としての成果が期待できると考える。
実環境を想定した寒冷地コンクリートの塩化物イオン浸透メカニズム

寒冷地域におけるコンクリート構造物は複合劣化を受けやすい環境にあり,その耐久性,特に塩分浸透性に対しては,周辺の環境作用(凍結融解や乾湿繰返し)の影響を含めた検討が必要となる。本課題の目的は,凍結融解環境における塩化物イオン浸透メカニズムを明らかにすることである。まず,塩化物イオンが浸透した硬化体中において凍結融解作用に伴う凍結性状の差異を確認することを目的とした要素試験を行い,潜熱積算温度と硬化対中の全塩化物イオン濃度の関係について検討を行った。次いで,事前塩分浸透により硬化体中に塩化物イオン濃度勾配が生じたコンクリートを対象として,凍結融解環境における塩化物イオン浸透性について検討を行った。これにより,凍結融解環境における塩化物イオン浸透性は,事前浸透があることにより表面部で高い濃度を示すものの,硬化体内部では事前浸透の違いによる差は少ないことが確認された。ただし,硬化体中における塩化物イオン濃度の変化割合に着目すると,凍結融解作用を受ける際には,硬化体内部での濃度変化割合が高くなることが明らかとなった。さらに,コンクリート中への塩化物イオン浸透において,凍結融解および乾湿繰返し作用を受ける影響について検討を行った。検討結果より,各種作用を受けた後の全塩化物イオン濃度分布は,いずれも同様の傾向を示すことが確認された。ただし,その濃度は作用環境により大きく異なり,特に凍結融解および乾湿繰返し作用を受ける際には,温度一定環境におけるそれの35倍程度の値を示すことが明らかとなった。なお本研究の範囲内では,環境作用に伴う表面劣化(スケーリング)は軽微なものであったことから,塩化物イオン浸透に及ぼす影響として,表面劣化の影響は少なく,環境作用に伴う硬化体中での移流(凍結融解作用時の硬化体中の未凍結水の移動および,乾湿繰返し作用に伴う水分移動)の影響が大きものと推察される。積雪寒冷地域におけるコンクリート構造物は,その気象的特徴から凍害と塩害の複合劣化を受けやすい環境にある。研究代表者の既往研究において,凍結融解環境での塩化物イオン浸透性は,温度一定環境におけるそれよりも促進されることがこれまでに明らかとなっている。これは凍結融解作用に伴う外部からの水分移動や硬化体内部での凍結性状の差異によるものと推察されているが,詳細なメカニズムの解明には至っておらず,凍結融解環境における塩化物イオン浸透の促進メカニズムを明らかとすることを本研究の目的としている。平成28年度の検討において,まず塩化物イオンが浸透した硬化体中において凍結融解作用に伴う凍結性状の差異を確認することを目的とした要素試験を行った。硬化体中の塩化物イオン濃度が既知となるよう調整したNaCl溶液を用いて,塩化物イオン濃度の異なるφ100×10mmの薄片試験体を作製した。作製した供試体を用いて,凍結融解環境における潜熱の測定を行い,潜熱積算温度の違いから凍結性状(凍結水量)の差異について検討を行った。その後,円柱供試体を用いて,NaCl溶液を試験溶液とした一面凍結融解試験を実施し,試験面から異なる深さ位置における潜熱発生状況および潜熱積算温度から硬化体内部の凍結性状の違いについて検討を行った。検討結果より,凍結潜熱が確認される温度は硬化体中に含まれる全塩化物イオン濃度により異なることが確認された。また,潜熱積算温度から推定される凍結水量は,硬化体中の全塩化物イオン濃度が高いものほど,少ないことが明らかとなった。これらの結果から,塩化物イオン存在下で凍結融解作用を受けた際,硬化体内部の塩化物イオン濃度分布により凍結水量に差が生じ,未凍結水の移動およびそれに伴う塩化物イオンの移動が生じることが明らかとなった。平成28年度の検討において,まず要素試験として,塩化物イオン濃度の異なるφ100×10mmの薄片試験体を用いて,凍結融解環境における潜熱の測定を行い,潜熱積算温度の違いから凍結性状の差異(凍結水量の差異)について検討を行った。平成28年度の検討より,凍結潜熱が確認される温度は硬化体中に含まれる全塩化物イオン濃度が3kg/m3時に最も低い値を示すことが明らかとなった。つまり,凍結融解環境において,硬化体内部の塩化物イオン濃度により凍結水量の違いが生じ,硬化体内部で未凍結水の移動およびそれに伴う塩化物イオンの移動が生じることから,凍結融解環境下での塩化物イオン浸透が促進されるものと考えられる。積雪寒冷地域におけるコンクリートは,凍害と塩害の複合劣化を受けやすい環境にある。

研究代表者の既往研究において,凍結融解環境での塩化物イオン浸透性は,温度一定環境におけるそれよりも促進されることがこれまでに明らかとなっている。本課題の目的は,凍結融解環境における塩化物イオン浸透の促進メカニズムを明らかとすることである。平成28年度の検討では,塩化物イオンが浸透した硬化体中において凍結融解作用に伴う凍結性状の差異を確認することを目的とした要素試験を行った。硬化体中の塩化物イオン濃度が既知となるよう調整した試験体を用いて,潜熱積算温度から凍結性状の差異を検討するとともに,一面凍結融解試験を実施し,潜熱積算温度と硬化対中の全塩化物イオン濃度の関係について検討を行った。平成29年度は,硬化体中に塩化物イオン濃度勾配が生じたコンクリートを対象として,凍結融解環境におけるその後の塩化物イオン浸透性について検討を行った。検討結果より,凍結融解環境下での塩分浸透性は,温度一定環境下におけるそれよりも促進される傾向を示すことが示された。ただし,硬化体中の全塩化物イオン濃度分布は,一般的に知られている分布と同様の分布,つまり表面からの深さに伴い,濃度が減少する分布を示すことが確認された。また,事前浸透の有無の違いに着目すると,表面から10mm以内の位置では,事前浸透を行った供試体の方が高い濃度を示すものの,20mm以深では,事前浸透の違いによる差は少ないことが確認された。さらに,暴露環境の違いに着目すると,凍結融解環境における濃度変化割合は,温度一定環境におけるそれよりも高く,特に表面から20mm程度の位置でその差が顕著となることが確認された。これは,硬化対中の塩化物イオン濃度により凍結水量に差が生じ,凍結融解に伴う水分移動によって,より内部で塩化物イオンの移動が生じているためと考えられる。積雪寒冷地域におけるコンクリートは,凍害と塩害の複合劣化を受けやすい環境にある。これまでの検討により,凍結融解環境では,温度一定環境下よりも塩化物イオン浸透が促進される傾向を示すことが明らかとなっており,その促進メカニズムの解明が本課題の目的である。平成28年度および平成29年度の検討において,潜熱から推定される凍結水量と全塩化物イオン濃度の関係を確認するとともに,一面凍結融解試験および事前に塩化物イオン濃度勾配が生じたコンクリートの凍結融解環境における塩化物イオン浸透性について検討を行った。これらの結果から,硬化体中の塩化物イオン濃度に伴う凍結水量の違い,事前浸透あるいはその後の塩分浸透による濃度変化とそれに伴う凍結水量の変化が,凍結融解環境における塩化物イオン浸透性に及ぼす影響が明らかとなった。次年度,さらに条件を追加するととともに,これらの成果の整理・取りまとめを行い,凍結融解環境における塩化物イオン浸透性の影響要因の明確化あるいは予測式の提案を行う予定である。寒冷地域におけるコンクリート構造物は複合劣化を受けやすい環境にあり,その耐久性,特に塩分浸透性に対しては,周辺の環境作用(凍結融解や乾湿繰返し)の影響を含めた検討が必要となる。本課題の目的は,凍結融解環境における塩化物イオン浸透メカニズムを明らかにすることである。まず,塩化物イオンが浸透した硬化体中において凍結融解作用に伴う凍結性状の差異を確認することを目的とした要素試験を行い,潜熱積算温度と硬化対中の全塩化物イオン濃度の関係について検討を行った。
時分割X線結晶解析によるグルタチオン合成酵素の動的構造研究

1本研究に用いた大腸菌のグルタチオン合成酵素は、アミノ酸残基315、分子量3650の等価な4つのサブユニットからなる4量体で、その立体構造は、本研究(X線結晶解析法)によって初めて明にされた。本酵素には基質結合部位付近に電子密度を与えないGly残基に富んだ17残基からなるフレキシブルなループ領域が存在し、このループが活性発現に重要であることが判明した。2本酵素の触媒反応における反応中間体生成過程の時間分割X線結晶解析を行なうため、次の(1)(2)の各項目について実験研究を行なった。(1)変異酵素の作成:時間分割測定のためには、結晶中で酵素反応が反射データ収集に要する時間よりもゆっくりと進行させなくてはならない。この条件を充たすため、本酵素の基質結合部位周辺部にある極性アミノ酸残基を他の残基に置換した変異体酵素を種々作成した。それらの反応動力学的定数を測定し、基質に対する高い親和性(1/Km)を維持したまま、触媒定数(kcat)が小さな変異体酵素を検索した。その結果、Arg210残基をLys残基で置換したR210Kを選抜した。またフレキシブルループを4つのGlyで置き換えた変異体酵素DELについても検討することにした。(2)結晶状態における酵素反応の検討:結晶状態でも酵素反応が進行することを確かめるため、R210K変異体酵素とcaged-ATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶を作成した。cagedATPはフラッシュフォトリシスで、きわめて短時間で基質ATPを生成することから、光照射によって酵素反応を同調的に開始させることができることがわかった。また、結晶中でR210K変体酵素はきわめてゆっくりと(t1/2=55h)酵素反応が進行していることもわかった。また、フローセルを用いた方法についても同時に検討した。(3)ラウエ測定条件の検討:ラウエ測定法では、白色X線の照射による結晶の損傷や、結晶のモザイク性の増加による反射斑点のストリークができるだけ少なくなるような測定条件を選ばなくてはならない。測定は、米国ブルックヘブン研究所(station x-26c:focus<1.0mm,4-20kev)と、英国ダラスベリ-研究所(station 9.7:wiggler three pole 0.2-2.6A)で行なった。その結果、(1)変異体酵素DELの結晶は放射光に対してきわめて安定であること、(2)変異体酵素DELの結晶をセファデックス中に埋めて固定して(フローセル法)、ATP(50mM)とγ-Glu-Cys(50mM)を含む緩衝液をゆっくりと(約1ml/hr)流して結晶中に拡散させた場合、セファデックスのサイズが大きいと、また、結晶の厚さが薄いと回折斑点がストリークすること、などが判明した。このことから、フローセル法は、本研究目的に適しないことがわかった。(4)反応中の酵素結晶のラエウ測定:変異体酵素DELの結晶をフローセルに固定して基質溶液を流すと、基質溶液が結晶に到達してから約16-20分後にストリークがあらわれた。R210K変異体とcagedATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶をキャピラリーを入れてフラッシュフォトリシスした場合にはストリークはそれほど顕著にあらわれなかった。(5)データ処理の検討:ラウエ法でのデータ処理は、共同研究者であるHajduが、本研究のために開発したLAUEGEN及びLEAPを用いた。その結果、R210Kのラウエ法によって5170の独立の回折斑点の強度データを得ることに成功した。これらの回折斑点を用いて得られた電子密度図は、主鎖及び側鎖を当てはめてモデリングを行なうことができる明瞭なものであった。3以上の結果、現状の時間分割X線結晶解析法では、10秒の時間分割で行なうことができることがわかった。これは、R210K変異酵素の結晶中での反応速度に比べて十分に短い時間である。したがって、グルタチオン合成酵素の時間分割X線結晶解析による動的構造研究に、R210Kを用いると、従来から指摘されていた同法の問題点を全てクリアすることができることが判明した。また、DEL変異酵素についても中間体生成過程の動的構造解析に利用し得ることも判明した。

またフレキシブルループを4つのGlyで置き換えた変異体酵素DELについても検討することにした。(2)結晶状態における酵素反応の検討:結晶状態でも酵素反応が進行することを確かめるため、R210K変異体酵素とcaged-ATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶を作成した。cagedATPはフラッシュフォトリシスで、きわめて短時間で基質ATPを生成することから、光照射によって酵素反応を同調的に開始させることができることがわかった。また、結晶中でR210K変体酵素はきわめてゆっくりと(t1/2=55h)酵素反応が進行していることもわかった。また、フローセルを用いた方法についても同時に検討した。(3)ラウエ測定条件の検討:ラウエ測定法では、白色X線の照射による結晶の損傷や、結晶のモザイク性の増加による反射斑点のストリークができるだけ少なくなるような測定条件を選ばなくてはならない。測定は、米国ブルックヘブン研究所(station x-26c:focus<1.0mm,4-20kev)と、英国ダラスベリ-研究所(station 9.7:wiggler three pole 0.2-2.6A)で行なった。その結果、(1)変異体酵素DELの結晶は放射光に対してきわめて安定であること、(2)変異体酵素DELの結晶をセファデックス中に埋めて固定して(フローセル法)、ATP(50mM)とγ-Glu-Cys(50mM)を含む緩衝液をゆっくりと(約1ml/hr)流して結晶中に拡散させた場合、セファデックスのサイズが大きいと、また、結晶の厚さが薄いと回折斑点がストリークすること、などが判明した。このことから、フローセル法は、本研究目的に適しないことがわかった。(4)反応中の酵素結晶のラエウ測定:変異体酵素DELの結晶をフローセルに固定して基質溶液を流すと、基質溶液が結晶に到達してから約16-20分後にストリークがあらわれた。R210K変異体とcagedATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶をキャピラリーを入れてフラッシュフォトリシスした場合にはストリークはそれほど顕著にあらわれなかった。(5)データ処理の検討:ラウエ法でのデータ処理は、共同研究者であるHajduが、本研究のために開発したLAUEGEN及びLEAPを用いた。その結果、R210Kのラウエ法によって5170の独立の回折斑点の強度データを得ることに成功した。これらの回折斑点を用いて得られた電子密度図は、主鎖及び側鎖を当てはめてモデリングを行なうことができる明瞭なものであった。3以上の結果、現状の時間分割X線結晶解析法では、10秒の時間分割で行なうことができることがわかった。これは、R210K変異酵素の結晶中での反応速度に比べて十分に短い時間である。したがって、グルタチオン合成酵素の時間分割X線結晶解析による動的構造研究に、R210Kを用いると、従来から指摘されていた同法の問題点を全てクリアすることができることが判明した。また、DEL変異酵素についても中間体生成過程の動的構造解析に利用し得ることも判明した。本研究のために蛋白質工学的手法によって作製したグルタチオン合成酵素の人工変体のうち、生化学的および結晶学的予備研究の結果、最も成果が期待されると思われたループ欠損型およびR210K変異体の2種類の結晶について、白色X線(波長0.52.5A^°)を用いたラウエ法の測定条件を、米国ブルックヘブン国立研究所および英国ダラスベリ放射光実験施設で検討した。