hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マクロファージによる結核菌の休眠への機構の解明

1.結核菌感染によるマクロファージでのHIF-1alpha発現機構の解明をする。結核菌の糖脂質および分泌タンパク質から発現調節因子を同定し、そのシグナル伝達機構を明らかにする。実験2.マクロファージの糖代謝による細胞内結核菌の増殖への影響を解析する。HIF-1alphaによって調節されている解糖経路を中心に、糖代謝酵素阻害剤およびsiRNAを用いて菌の増殖に影響を及ぼす糖代謝酵素を同定する。上記の計画に基づき、HIF-1alphaタンパク質の発現およびmRNAが結核菌感染に伴って増加することを定量解析した。そして、HIF-1alphaタンパク質の安定化ではなく転写活性化に伴った機構を見いだした。現在は、HIF-1alphaを誘導する主要因を明らかにするため、菌培養液から精製した分泌タンパク質や組換えタンパク質を用いて検討している。また、HIF-1alphaによって調節される酵素の阻害剤または糖代謝物を用いて、細胞内結核菌増殖に重要な糖代謝物を同定した。さらに、網羅的に細胞内の糖代謝物をTOF-MSで解析している。今後は、siRNAを合成して糖代謝酵素の役割を明らかにする。以上の通り、新規的で大変興味深い結果が得られており、大きな問題もなく計画通り遂行できていると考える。申請者は、肺結核肉芽腫の低酸素環境とマクロファージに発現するHIF-1alphaタンパク質が、宿主の糖代謝と菌の増殖へ及ぼす影響を明らかにするため、次の3つの実験内容を中心に研究を行う。実験1.結核菌感染によるマクロファージでのHIF-1alpha発現機構の解明。結核菌感染12時間後のマクロファージにHIF-1alphaの発現が増大させる結核菌由来の因子を同定する。これまでに菌体外に分泌されるタンパク質を組換え体として精製しており、これらによるHIF-1alphaの発現への影響を検討する。シグナル伝達機構については、TLR2,4,または9の各欠損マウスマクロファージを用いた解析を行う。また、酸素存在下でのHIF-1alphaの発現調節に関与することが知られているシグナル伝達機構(MAPキナーゼ、mTORなど)についても検討する。実験2.結核菌感染マクロファージでの糖およびその代謝物の定量。TOF-MS/MS法による網羅的な糖メタボローム解析を行う。HIF-1alpha欠損および野生型マウス骨髄由来マクロファージを用いて、感染による糖代謝物量を比較することにより、HIF-1alphaタンパク質の役割が明らかになると考える。本研究ではLysM-Creマウス(Cre-loxPシステム)を交配させて生まれてきた骨髄系細胞のHIF-1alpha欠損コンディショナルノックアウトマウスを用いる。実験3.低酸素による細胞内結核菌への影響。結核菌は、低酸素下で休眠期タンパク質の発現を増大するが、低酸素状態の細胞内での菌の形態(増殖または休眠)についての詳細はわかっていない。そこで、これまでに明らかにされている休眠菌に発現する遺伝子について、感染後の経時的発現変化をreal-time PCR法を用いて調べる。
多粒子系の集団励起状態における散逸過程の研究

本研究の主要な成果をいくつかの主要な点に絞って整理する。1)模型ハミルトニアンの応答関数における散逸効果原子核における集団励起の散逸機構として重要なものは、複雑な状態との結合による励起強度の分散がある。応答関数におけるエネルギー・運動量依存性を調べるために、非調和振動子を用いた模型的検討を行なった。状態の複雑性が強度の分散に大きく影響すること、一方でカオス的状態においても波動関数に規則性が残ることを見いだした。2)現実の原子核における巨大共鳴の強度関数のゆらぎ上記の模型的検討を基礎に、現実の原子核を対象とした考察を行なった。大規模計算に基づいてCa同位体の巨大四重極共鳴の強度関数を取り上げ、そのゆらぎの分析を行なった。局所スケーリング次元に基づく分析の結果、乱雑行列とは異なるゆらぎが発見した。また集団励起の典型例として、スピンに依存する共鳴と核反応の観測量との関連についても検討した。3)トラップされたボーズ・フェルミ混合凝縮系の集団励起最近、極低温でトラップされたアルカリ原子気体において、ボーズ・アインシュタイン凝縮系、フェルミ縮退系が実現された。これらは有限な量子多体系として原子核と共通であり、集団振動モードの存在とその散逸過程も研究されている。我々はボーズ・フェルミ混合系を取り上げ、その静的性質を平均場近似のもとで調べ、また、和則の方法を用いて、集団励起状態を調べた。とくにボソン・フェルミオンの逆位相双極子振動、強い引力のもとでの単極子励起による不安定性について新しい結果を得た。1.原子核の巨大共鳴を典型とする集団励起状態の散逸は、とりわけ、集団状態と背景の状態との結合による分散幅が主要な役割をはたす。この機構を模型化し、背景状態の統計的性質が、応答関数にどのように影響するかを検討した。数値計算結果の精度を確かめるため、和則との整合性を調べた。2.一方、上記の分散効果をより簡単な3状態模型を用いて検討した。この模型においては、背景状態に乱雑行列を用いることにより解析的な結果を得ることができ、カオティックな極限についての理解が得られた。また、数値計算結果との比較を行なった。3.また、散逸過程の新しい定式化として、転送行列法に基づく検討を行なった。とくに、一次元の散乱問題を、転送行列に対するコヒーレント状態経路積分に基づく方法を適用し、古典解と散乱データとの関係を調べた。1.原子核の巨大共鳴を典型例とした集団励起の散逸過程の検討として、とりわけ応答関数における運動量移行と散逸性との関連を模型的に調べた。とくに高運動領域において、集団性の散逸が顕著になることが見られた。この模型計算に基づく論文を完成し、投稿中である。2.最近、原子核以外にも、有限性が顕著な影響を与える量子多体系の研究が進んできている。その中でもポテンシャルにトラップされたアルカリ原子のボーズ凝縮系は、原子核と共通する性質が多く、理論的方法の試金石である。我々はとくにボーズ・フェルミの混合凝縮系をとりあげ、集団励起の性質を調べるとともに、粒子が自発崩壊を起こす場合の散逸性を検討した。論文は現在投稿中である。3.高密度ハドロン物質の準安定状態であるDCC状態に対して、真空への崩壊過程を粒子放出による散逸過程として扱う枠組みを提出し、とくに、物質の表面効果の役割を調べた。4.散逸過程における準位交差の役割を、時間依存性をもつハミルトニアンの模型を用いて数値的に調べた。1.有限系の応答関数の散逸性を調べるため,模型を用いて大次元対角化によってその特徴を解析した.(論文出版)2.上記の方法を視

実の原子核に適用し,RPA計算によって巨大共鳴の応答関数のふるまいと,その散逸性を検討した.3.有限量子多体系の例として,最近急速に研究が発展しつつあるボーズ凝縮系をとりあげ,とくにフェルミ粒子との混合系に焦点をあてて,a)その静的性質,b)集団励起状態,c)安定性を調べた.(論文出版)4.散逸性の機構の一つとして,準位交叉現象に伴う集団変数の変化を調べるため,厳密解を求めることが可能な原子核の単純な模型を考察した.この模型における.基底状態の相関,励起エネルギーを与えた時の集団運動の種類.波束の時間発展等を検討した.
地方公共団体職員が火山防災対応力を身につけるためのメカニズムの解明

本研究は,地方公共団体職員が防災対応力を身につけるメカニズムを解明するものである。その際,「低頻度」「複合災害」「長期化」「降灰による広域的なインフラ停止」等の他の自然災害とは異なる特徴をもつ火山災害に注目した。そのために,これまで体系的に構築されていない地方公共団体職員向けの火山防災研修プログラムを,インストラクショナルデザインのADDIEモデルに基づき構築し,火山防災担当職員として身につけるべき能力とそのメカニズムも明らかにする。
病弱児への教育的対応の分析とその効果検証ツールの開発

本年度(平成27年度)は、前年度(平成26年度)に開発された特別支援教育成果評価尺度(SNEAT)の信頼性・妥当性を検証することを目的とした。前年度に収集したデータは、沖縄県の特別支援学校10校において、縦断的に授業評価を実施し、93件のデータを回収することができたため、本年度は、それらのデータ分析を行うことを目的とした。分析の結果、信頼性の検証では、再検査法で級内相関係数と内的整合性法でクロンバックα係数を算出し、いずれも0.7以上となり、高い信頼性を得られることができた。また、妥当性の検証では、構造方程式モデリングを使用した。構造方程式モデリングの中でも縦断データを取り扱うことのできる潜在成長曲線モデルを使用し、良好な適合度を得られることができた。さらに、分析により、授業成果に影響を与える要因として、教師の基本属性(「特別支援学校教諭免許状保有の有無」「特別支援教育の経験年数」「担当する学年」「担当する子どもの障害種」)が関係することが明らかとなった。これらの研究結果は、論文として取りまとめ、The Tohoku Journal of Experimental Medicineに掲載された。また、Asian Society of Human Serviceや日本臨床運動療法学会の学術大会で発表した。さらに、Journal of Clinical Rehabilitationの依頼原稿を受け、掲載された。また、研究結果に関しては協力を得られた特別支援学校にフィードバック及び結果報告を行うことも計画した。協力が得られた沖縄県内の特別支援学校に書面でフィードバックし、その中でも5校の学校には訪問し、管理職や教員等を対象に口頭説明し、結果に関する情報交換を行うことができた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成26年度の計画では、教育効果検証ツール(教育成果評価尺度)開発のために、項目収集及び試案完成を予定した。研究実施状況としては、当初の計画より進展があり、試案完成、内容的妥当性の検討、教育効果検証ツールを開発、さらに、信頼性・妥当性の検証のための、データ収集まで実施することができた。開発された検証ツールは、特別支援教育成果評価尺度(Special Needs Education Assessment Tool; SNEAT)と名付けた。項目収集は、自立活動とQOLの共通概念を抽出し、研究者間で協議を行い決定した。内容的妥当性の検証は、平成26年6月7月に実施した。内容的妥当性の検証は、沖縄県立総合教育センター特別支援教育班や沖縄県教育委員会の研究協力もあり、沖縄県内における特別支援学校の学部主事23名と教員66名に対する専門家調査を行った。その結果、すべての質問項目において90%以上の教員がSNEATの構成及び内容が妥当であると回答し、SNEATの内容的妥当性が確認された。また、内容的妥当性の検証結果をもとに、特別支援教育の研究者、QOLの研究者、県教育研究機関の教員との協議により、言葉の表記や明確化等の試案の修正を行い、特別支援教育成果評価尺度(SNEAT)を完成させた。これらの結果については、学会誌への投稿および研究発表を行い、研究成果を広く公表した。信頼性・妥当性の検証のためのデータ収集は、平成26年10月11月にかけて、沖縄県内の特別支援学校10校でSNEATを使用した自立活動の授業評価を実施し、120件中100件(回収率83.3%)のデータ収集を行った。平成27年度は、収集したデータからSNEATの信頼性・妥当性を検証し、研究成果の発表を目指す。研究が計画以上に進展した理由として、現職教員との研究打ち合わせを蜜に行うことによって研究協力が得られ、多くのデータ収集が行えたためだと考えられる。

当初の研究計画では、尺度が測定できる対象児童を病弱児に限定し、院内学級でのデータ収集を予定したが、母数が少ないという現状でデータ収集が困難であったため、対象児童の障害種を拡大した。そのことにより、特別支援教育成果評価を測定するための尺度が完成し、より多くのデータ収集が可能となった。今後の推進方策としては、得られたデータより、特別支援教育成果評価尺度(SNEAT)の信頼性・妥当性を検証する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
血管壁内3次元応力・ひずみ分布に対する平滑筋収縮の影響の解析

輪切りにした摘出血管の輪を切断すると円弧状に開くことが多い.これは摘出血管の内壁に圧縮,外壁に引張りのひずみが残留していたことを示し,血管壁が生理状態で壁内のひずみゃ応力を一様に保っている可能性を示唆する現象である.申請者は数年来この輪の開きが平滑筋の収縮・弛緩に影響を受けることを明かにしてきた.本研究では平滑筋収縮の血管壁内ひずみ・応力分布に対する影響を軸方向の変形を考慮して探っている.本年度は動脈の型の違いの影響を知るため,日本白色家兎より弾性動脈として総頚動脈,筋性動脈として大腿動脈を摘出し,これら試料の平滑筋収縮に伴う3次元形状の変化を調べた.摘出血管より円周方向および軸方向に夫々長軸を有する矩形試料を作製した.試料の長辺は円周方向試料の場合には円周長,軸方向試料の場合には総頸動脈は5mm,大腿動脈は3mmとし,短辺はともに1mmとした.平滑筋収縮にはノルエピネフリン(NE)を用い,濃度を10^<-9>Mから10^<-5>Mまで10倍ずつ上昇させた際の開き角(円弧両端と両端から円弧上で等距離にある点とのなす角)変化を計測した.円周方向試料の開き角は総頸・大腿動脈ともに最初約250°であった.NE濃度上昇に伴う変化は,総頸動脈の場合10^<-8>Mまで見られず,その後10^<-6>Mまで直線的に減少し150°程度となり,その後は変わらなかった.大腿動脈の場合には10^<-9>Mより開き角が直線的に減少し10^<-7>Mで150°になった後,安定した.弾性動脈に比べて筋性動脈には平滑筋の相対量が豊富だと言われる.大腿動脈が低濃度のNEに敏感に反応したのはこのような平滑筋量の差が原因かもしれない.一方,軸方向試料の場合,初期値は総頸動脈で約240°,大腿動脈では190°であり,NE濃度上昇に伴う変化は殆ど見られなかった.組織像を調べるとこれらの動脈には軸方向に走行する平滑筋が見られず,このことが軸方向への変形が見られなかった原因かもしれない.輪切りにした摘出血管の輪を切断すると円弧状に開くことが多い.これは摘出血管の内壁に圧縮,外壁に引張りのひずみが残留していたことを示し,血管壁が生理状態で壁内のひずみや応力を一様に保っている可能性を示唆する現象である.申請者は数年来この輪の開きが平滑筋の収縮・弛緩に影響を受けることを明かにしてきたが,この過程で軸方向の変形も無視できない場合のあることが明かとなってきた.そこで本研究では平滑筋収縮の血管壁内ひずみ・応力分布に対する影響を軸方向の変形を考慮して探ることを目的とし,初年度は平滑筋収縮に伴う家兎胸大動脈壁の3次元形状の変化を細かく調べた.摘出試料を血管軸方向に切開し,円局方向および軸方向に夫々長軸を有する矩形試料を作製した。試料の長辺は円周方向試料の場合には円周長,軸方向試料の場合には10mmとし,短辺はともに1mmとした.平滑筋収縮にはNorepinephrine(NE)を用い,濃度を10^<-9>Mから10^<-5>Mまで10倍ずつ上昇させつつ開き角(円弧両端と両端から円弧上で等距離にある点とのなす角)変化を計測した。円周方向試料の開き角は最初約80°で,NE濃度の上昇に伴い約40°減少(10^<-7>M)した後,増加に転じ,10^<-5>Mで初期状態から約15°増加した。一方,軸方向試料では初期値は約280°で,NE濃度が10^<-7>Mになるまでは変化なく,その後は濃度上昇に伴い増加して10^<-5>Mで約400°になった.組織を観察したところ中膜の内側4/5では平滑筋が通常の動脈壁と同様に円周方向に並んでいたのに対し,外側1/5では軸方向に配列していた.このような配向の場合,平滑筋収縮の初期段階では内側の平滑筋の収縮により輪が閉じる方向に変形し,その後,軸方向の平滑筋の収縮が強まると輪が開きつつ軸方向に反り返ることが考えられる。家兎胸大動脈の複雑な変形はこのような平滑筋走行に起因するのかも知れない。輪切りにした摘出血管の輪を切断すると円弧状に開くことが多い.これは摘出血管の内壁に圧縮,外壁に引張りのひずみが残留していたことを示し,血管壁が生理状態で壁内のひずみゃ応力を一様に保っている可能性を示唆する現象である.申請者は数年来この輪の開きが平滑筋の収縮・弛緩に影響を受けることを明かにしてきた.本研究では平滑筋収縮の血管壁内ひずみ・応力分布に対する影響を軸方向の変形を考慮して探っている.本年度は動脈の型の違いの影響を知るため,日本白色家兎より弾性動脈として総頚動脈,筋性動脈として大腿動脈を摘出し,これら試料の平滑筋収縮に伴う3次元形状の変化を調べた.

摘出血管より円周方向および軸方向に夫々長軸を有する矩形試料を作製した.試料の長辺は円周方向試料の場合には円周長,軸方向試料の場合には総頸動脈は5mm,大腿動脈は3mmとし,短辺はともに1mmとした.平滑筋収縮にはノルエピネフリン(NE)を用い,濃度を10^<-9>Mから10^<-5>Mまで10倍ずつ上昇させた際の開き角(円弧両端と両端から円弧上で等距離にある点とのなす角)変化を計測した.円周方向試料の開き角は総頸・大腿動脈ともに最初約250°であった.NE濃度上昇に伴う変化は,総頸動脈の場合10^<-8>Mまで見られず,その後10^<-6>Mまで直線的に減少し150°程度となり,その後は変わらなかった.大腿動脈の場合には10^<-9>Mより開き角が直線的に減少し10^<-7>Mで150°になった後,安定した.弾性動脈に比べて筋性動脈には平滑筋の相対量が豊富だと言われる.大腿動脈が低濃度のNEに敏感に反応したのはこのような平滑筋量の差が原因かもしれない.一方,軸方向試料の場合,初期値は総頸動脈で約240°,大腿動脈では190°であり,NE濃度上昇に伴う変化は殆ど見られなかった.組織像を調べるとこれらの動脈には軸方向に走行する平滑筋が見られず,このことが軸方向への変形が見られなかった原因かもしれない.
マウストランスクリプトミクス新戦略によるアルツハイマー病関連遺伝子同定と機能解析

アルツハイマー病は複雑な多因子疾患である。その解明のため現在行われているヒトゲノムワイド関連解析(Genome Wide Association Study: GWAS)は膨大な研究リソースが必要である。また同定された疾患関連遺伝子の機能解析は難航している。本研究ではヒトの代わりにマウスを、ゲノム解析の代わり独自の発現解析を行った。DBA/2というマウス系統ではアルツハイマー病の中心病理であるAβ脳内蓄積量が低かった。DBA/2のどの遺伝子がAβ蓄積量を抑制している遺伝子産物KLC1vEを独自の2段階トランスクリプトームで同定した。この結果はヒト剖検脳や新競培養細胞でも確認された。KLC1vEのsiRNAによるノックダウンについては、ヴァリアントへの特異性及び効率の高い系を作ることができた。SY5Y細胞のKLC1vEのノックダウンするとAβ40およびAβ42の産生量が抑制された。一方KLC1vEの強制発現ではAβ40およびAβ42の産生量の産生は増加するものの、そのエフェクトサイズは小さかった。マウストランスクリプトームの再解析はすすんでいる。当初のクライテリアは極端に厳しいので、通常に近い厳しさのクライテリアでプローブの再抽出を行った。Aβが脳内に蓄積しにくいDBA/2で他のストレインに比べ発現量が異なるプローブをp<0.001で抽出した。こうして得られた373プローブを用いて、共同研究者らとのヒトGWASとの統合解析を開始している。mRNA解析のためのヒト末梢血の収集も順調にすすんでいる。診断未確定分を含めて過去の分も含め年度末までに合計100検体あまりが収集できた。アルツハイマー病の中心病理であるAβ病理を規定する遺伝子産物KLC1vEを同定しているが(Morihara PNAS 2014)、以下の関連する重要事項を当該年度に明らかにした。KLC1は多数のスプライシングバリアントがあるがヴァリアントE以外にAからDおよびHについても発現パターンをマウスとヒト脳およにヒト神経系培養細胞で検討した。KLC1vE発現量が低いとAβ産生量が低値になることが再現性よく示された。一方その他のバリアントではAβ産生量でもAβ蓄積量でもこのような関係は認められなかった。今回解析中に予想外の重要な発見があり、本研究から新たな研究が開始された。ヒトGWAS研究で同定されたアルツハイマー病のリスク遺伝子と、本研究を結ぶ発見であり、この事実を基にこれまで困難であった孤発性アルツハイマー病の発症分子メカニズムにせまりつつある。我々のマウストランスクリプトミクスデーターと共同研究者のヒトGWASの統合解析は予定通り進んでおり、論文を書き始めている。多重検定後も有意な候補遺伝子を同定することができた。ヒト末梢血の解析もすすんでいる。阪大精神科における臨床検体の収集は継続している。精緻な測定のための測定系や検体管理の改良にも着手した。PNAS 2014で報告した末梢血中でKLC1vEがアルツハイマー病で高値であることを新たに収集した臨床検体で再現できた。これらの結果を基にアルツハイマー病のバイオマーカー開発という新たな研究の準備を進めている。孤発性アルツハイマー病の関連遺伝子を独自の方法で同定、解析するというのが元々の目標だった。これ自体大変困難な目標であるが、我々はさらに次の段階に進む基盤となる結果も得ることができ、実際新たな研究の準備が進められている。統合Omics解析:マウストランスクリプトミクスとヒトGWASの異種データーの統合に成功した。統合的な統計解析によりアルツハイマー病に関与する3つの候補遺伝子を同定している。現在は非公開だが、論文作成準備中である。3つの遺伝子についてはヒト剖検脳も用いた機能的解析も行い、アルツハイマー病への関与を別の角度から支持する結果を得ている(投稿準備中)。末梢血RNAを含む臨床検体の収集は予定通りすすめられた。再現性の検討も進んでおり、現在のところ良好な結果を得ている。KLC1の機能解析については、培養細胞などを用いて行った。スプライスバリアントへより特異性を向上させたsiRNAの再設計など実験系をより洗練させた。これら新しい実験系でも再現性が確認された。KLC1の上流に関する検討を行った。ヒトゲノム解析も進め、KLC1の調整を行っている可能性のあるゲノム上のバリアント候補を見つけた。しかしこれらは決定的な結論が得られるほどの信頼性があるとは我々はまだ考えていない。一方全く異なる、かつ予定外のアプローチでKLC1の上流を考える上での重要な最初のデーターが得られており、新たな国際共同研究も始まった(未発表・非公開)。2つのOmics統合解析については論文作成中である。KLC1の機能については、当初予想していなかった別の遺伝子研究との関連が発見され、計画以上の進展がある(新たな国際共同研究がはじまっており、かつ知財の関係もあり内容は非公開)アルツハイマー病は複雑な多因子疾患である。発症分子メカニズムも複雑であるが、その解明はほとんでされていない。発症分子メカニズム解明の端緒をつかむためアルツハイマー病の疾患関連遺伝子の同定が大いに期待されている。

しかしながら現在行われているヒトゲノムワイド関連解析(Genome Wide Association Study: GWAS)は膨大な研究リソースが必要である。また同定された疾患関連遺伝子の機能解析は難航している。これらの問題を解決するため、我々は通常とは全く異なるアプローチ方法を考案し実行した。具体的には、ヒトの代わりにマウスを、ゲノム解析の代わり独自の発現解析を行った。DBA/2というマウス系統ではアルツハイマー病の中心病理であるAβ脳内蓄積量が低かった。DBA/2のどの遺伝子がAβ蓄積量を抑制している遺伝子産物KLC1vEを独自の2段階トランスクリプトームで同定した。この結果はヒト剖検脳や神経培養細胞でも確認された。アルツハイマー病の新たな発症分子メカニズムとしてKLC1のスプライス異常からはじまるAβ病理の形成を解明しつつある。本研究はアルツハイマー病だけでなく、他の解明が困難な多因子疾患にも応用可能であると考える。アルツハイマー病は複雑な多因子疾患である。その解明のため現在行われているヒトゲノムワイド関連解析(Genome Wide Association Study: GWAS)は膨大な研究リソースが必要である。本研究ではヒトの代わりにマウスを、ゲノム解析の代わり独自の発現解析を行った。この結果はヒト剖検脳や新競培養細胞でも確認された。一部の具体的計画については未達成なものもあるが、本研究の大目標については期待以上に信頼性の高いデーターを得ながら期待以上の成果を得ている。本研究では究極の大目標として「アルツハイマー病の新規メカニズム同定」と「complex diseaseの重要遺伝子同定の新戦略」という大胆で困難、しかし極めて重要な事項を挙げている。前者についてはマウストランスクリプイとミクス、ゲノミクス、ヒトジェネティクス、さらには培養細胞による機能解析という多角的研究手法により解明が進んでいる。後者については期待以上の統計学的信頼度および大胆かつ発展的な新しいアプローチがすすんでいる。本研究を継続しながら、新たな研究も必要に応じて新たな研究資金を得ながらスタートすることを準備している。継続事項としては臨床検体の収集、KLC1の各スプライスバリアントの機能解析である。新たな研究としてはGWASで同定されたアルツハイマーリスク遺伝子も基盤としたヒトゲノムからKLC1vEそしてAβ病理につながる新たな病理パスウエイの解明である。もうひとつは血液バイオマーカーの開発である。ヒト末梢血の解析については、バイオマーカーになる可能性が高まっている。信頼性の高いバイオマーカー開発のためには十分な基礎的な検討が必要であり、期間を延長して取り組む。KLC1については本研究の成果を基にした治療薬開発も目指す。老年精神医学強制発現系によるKLC1の機能解析には注意点も必要かもしれない。上述のようにノックダウンに比べ強制発現ではAβ産生への効果が観察されにくい。
資質・能力の育成と「科学の本質」の獲得に資する新しい初等理科カリキュラムの研究

○研究目的研究代表者はこれまでの研究で,小学校理科において育成するべき資質・能力を明らかにし,「科学の本質」を取り入れたカリキュラムの開発を行ってきた。これらの特徴は,科学・技術の振興に理解を示す市民性の育成に資するものである。今後は,これまで編成したカリキュラムを,アクティブ・ラーニングや科学的リテラシーの育成といったわが国の小学校理科教育の文脈により適合するものにするための精査が必要となる。そこで,本研究では,編成したカリキュラムに,検討を加えて精査し,わが国の小学校理科教育の文脈に適合したものに改編することを目的とした。○研究方法上記の目的のために,まずは,「科学の本質」の概念規定を行った。その際には,「科学の本質」に関する諸外国の研究者の知見を参考にした。次に,主としてイギリスのカリキュラムを参考にして,概念規定に基づいた「科学の本質」がどのようにカリキュラムに組み込まれているかについて,イギリスのカリキュラムの分析から明らかにすることを試みた。○研究成果本研究の成果として,次の点が挙げられる。まずは,「科学の本質」の概念規定がなされたことである。「科学の本質」は,諸外国の研究者間で,捉え方に違いがあり,多様な議論が形成されている。そのような状況で,単に諸外国の知見をうのみにするのではなく,わが国の小学校理科の状況を考慮した概念規定を行うことで,よりわが国の小学校理科の文脈に沿ったカリキュラムを編成することができた。次に,科学と社会との関連について学ぶために,科学史を取り入れる必要性について言及できたことである。これまで小学校理科が大切にしてきた問題解決の過程に沿った授業展開を大切にしつつ,科学史を取り入れた授業を展開することで,科学と社会とのつながりをより一層明確になり,学ぶことが可能になると考える。
ドラッグデリバリーシステムによる歯の選択的移動法の検討

1.製剤用高分子素材の選択、薬物放出制御機構法の検討高分子が薬物の放出を制御する機構としては種々あるが、膜またはマトリックスとして薬物の放出制御の目的を達した後に、材料自体が生体内で分解してしまい、殻の回収を必要としないので、放出制御機構として理想的と考えられる高分子の溶解を薬物の溶解・放出の律速段階とする場合について検討を行った。具体的には、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルといった徐溶解性高分子、あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸といったポリエステル、熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチンのような生体内分解性高分子について、その物理化学的性質を比較検討した。2.組成およびin vitro放出(溶出)特性の検討高分子の溶解・分解を利用する場合には、薬物を膜で包む場合と高分子マトリックス中に薬物を溶解または分散させる場合がある。また、薬物放出は薬物分子が小さいときには高分子内透過による放出と高分子の溶解・分解に伴う双方が、比較的分子量の大きい薬物のマトリックスからの放出は高分子の分解速度と対応すると予測されたため、薬物の分子量および濃度とともに高分子膜、高分子マトリックスの組成より放出制御の設計を行い、物理的性質、薬物放出特性、溶解速度の点について検討を行った。in vivo放出(溶出)特性および歯の移動量に与える効果については検討できなかった。
受容体作動性Caチャンネル分子群の構造・機能の解明と特異的遮断薬の開発

本研究の目的は,エンドセリンタイプA受容体(ET_AR)により活性化されるCa^<2+>チャネル-受容体作動性およびストア作動性Ca^<2+>チャネル-のcDNAをクローニングし,その構造および機能を解明することである。これまでの研究により,アフリカツメガエル卵母細胞への^<45>Ca^<2+>の取り込みを指標としたスクリーニング系をほぼ完成できた。このように完成された系を用いて,ヒト脳および血管のcDNAライブラリーを10分割し,in vitroで合成した各画分cRNAとET_ARのcRNAを卵母細胞に同時に微量注入してスクリーニングを行った。対照群としては,ET_ARのcRNAだけを微量注入したものを用いた。cRNAの微量注入を行うと,50-60%の卵母細胞が死滅するので,最終的に少なくとも20個前後が残るように,一群として60個の卵に微量注入を行った。そのように大規模な実験を行ったにもかかわらず,一次および二次スクリーニングの段階では陽性画分を得ることはできなかった。そこで,酵母two-hybrid系およびGST pull-down系を用いて,ET_ARにより活性化されるCa^<2+>チャネルまたはCa^<2+>チャネル機能を修飾する分子群を網羅的に検索することにした。その結果,JAB1やDNAJB1などの転写調節因子,Annexin,TRDN,NISHなどの筋収縮調節因子,UBE2Nなどのユビキチン化酵素調節因子など合計26種類のクローンを単離することができた。現在,これらの分子について,ET_ARの細胞内シグナル伝達における役割,Ca^<2+>チャネル機能調節における役割,ET_AR刺激により誘発される細胞機能・形態などのフェノタイプにおける役割,などについて検討を加えているところである。本研究の目的は、強力な血管収縮性ペプチドであるエンドセリン(ET)の受容体刺激により活性化されるCa^<2+>透過性チャネル分子群のcDNAクローニングを行い、その構造および機能を解明することにある。この目的のために、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現クローニング法を用いる。卵母細胞には、組み換えET受容体cRNAおよび血管平滑筋から精製したmRNAを微量注入して、^<45>Ca^<2+>の単一卵母細胞への取り込みをスクリーニング系として用いることにした。この系では、ET受容体のみを発現した卵母細胞と、ET受容体とCa^<2+>透過性チャネルを発現した卵母細胞への^<45>Ca^<2+>取り込みの差を検定することになる。初期のスクリーニングでは、受容体とCa^<2+>透過性チャネルを発現した卵母細胞への^<45>Ca^<2+>取り込みの増加分は、受容体のみを発現した卵母細胞に比べ、10%前後と小さいことがわかった。さらに、微量注入という操作自身により卵母細胞の約半数が様々な程度に傷害を受け、その結果^<45>Ca^<2+>取り込みが起こり偽陽性となることもわかった。そこで、この細胞傷害による^<45>Ca^<2+>取り込みとチャネルを介した^<45>Ca^<2+>取り込みの両者を判別する方法を開発するために、傷害された細胞に特異的に取り込まれるプローブを検索した。このような化合物として、^3Hラベルされたイヌリン、p-アミノ馬尿酸、UDP-N-アセチル-D-グルコサミン、スペルミジン、チミジン、受容体リガンド(プラゾシン、スピペロン、ケタンセリン)、アミノ酸(ロイシン、アラニン)などを検討した。その結果、前3者は正常な卵母細胞には取り込まれず、傷害された卵母細胞にのみ取り込まれることがわかった。そこで、実験に際して、[^3H]イヌリンを使用したところ、傷害された卵母細胞を同定できるため、正確なスクリーニングを行うことが可能になった。

現在、この方法を用いて、スクリーニングを進めている。本研究の目的は,エンドセリンタイプA受容体(ET_AR)により活性化されるCa^<2+>チャネル-受容体作動性およびストア作動性Ca^<2+>チャネル-のcDNAをクローニングし,その構造および機能を解明することである。前年度の研究により,アフリカツメガエル卵母細胞への^<45>Ca^<2+>の取り込みを指標としたスクリーニング系を完成してきた。本年度の研究では,ET_ARのcRNAおよび10分割したヒト脳cDNAライブラリーの各画分cRNAを卵母細胞に微量注入した。これらのcRNAはいずれも,in vitroで合成した。対照群としては,ET_ARのcRNAだけを微量注入したものを用いた。注入48時間後,卵母細胞をエンドセリンで刺激するとともに,細胞外液に^<45>Ca^<2+>を添加し,刺激後1時間あたりに1個の卵母細胞に取り込まれた放射能を測定した。^<45>Ca^<2+>の取り込みを計測し,ET_ARのcRNAだけを注入した群と受容体とライブラリーcRNAを注入した群と比較した。それぞれの群には約15個の卵が含まれるようにした。その結果,一次スクリーニングの段階では,陽性クローンを得ることはできなかった。方法の感度を高める必要があると思われる。一方,受容体作動性およびストア作動性Ca^<2+>チャネルの候補分子と考えられているTRPチャネル分子(1-7のサブタイプ)のcDNAクローニングを行い,単独あるいはET_ARとともに卵母細胞に発現させ,^<45>Ca^<2+>の取り込みを計測した。TRP1,3はサプシガーギン刺激でのみ活性化されるのに対して,TRP4はET_AR刺激でのみ活性化されることがわかった。今後,TRPチャネルの活性化機構および薬理学についても検討していく予定である。これまでの研究により,アフリカツメガエル卵母細胞への^<45>Ca^<2+>の取り込みを指標としたスクリーニング系をほぼ完成できた。このように完成された系を用いて,ヒト脳および血管のcDNAライブラリーを10分割し,in vitroで合成した各画分cRNAとET_ARのcRNAを卵母細胞に同時に微量注入してスクリーニングを行った。cRNAの微量注入を行うと,50-60%の卵母細胞が死滅するので,最終的に少なくとも20個前後が残るように,一群として60個の卵に微量注入を行った。そのように大規模な実験を行ったにもかかわらず,一次および二次スクリーニングの段階では陽性画分を得ることはできなかった。そこで,酵母two-hybrid系およびGST pull-down系を用いて,ET_ARにより活性化されるCa^<2+>チャネルまたはCa^<2+>チャネル機能を修飾する分子群を網羅的に検索することにした。
日本で医師を目指す外国人留学生の医学日本語能力の獲得に関する研究

本研究では、医学授業と連携した日本語授業を行い、何をどのように指導すれば効率的に留学生の専門日本語能力を向上させ、スムーズに医学専門教育に橋渡しができるのかを明らかにする。まず、医学で必要な日本語能力をコミュニケーション能力や読解力などの面から多角的に評価できる評価方法を開発し、それらを用いて留学生の医学日本語能力を経時的に分析する。さらに、医学日本語能力の獲得に影響する文化社会的背景などの要因を特定し、これらの結果を基に、医学専門日本語教材開発の指針を作成する。
地域内の全小中学校・幼稚園・保育所を対象にした異年齢間交流学習の実践研究

本年度は、最終年度ということで、これまで幼保小中学校の交流をはかるために実施してきたことを振り返り、まとめを行ってきた。まず、高志地区では、保育所が中心となって活動を展開した実践について、映像でまとめを行い、地域の方々に報告した。また、松岡町では幼稚園と保育所が統合されて幼児園となり、積極的に小中学校と交流を行うようになった。公開保育を定期的に実施し、小中学校の教員が参観するようになった。今立地区では、幼保小中学校が4月当初に年度計画を作成し、年間を通して交流を実現するようになった。おもに小学校の生活科・総合的学習の時間、中学校では家庭科の保育の単元での交流が中心である。最初は、保育所が中心となって、交流学習を学校に働き変えてきた。しかし当初は学校がなかなか身動きがとれず、交流の回数は少なかった。しかし、今年度の様子を見ると、学校のカリキュラムの中に位置づいたこともあり、交流そのものを論議するよりも実践を積み重ねる姿勢が現れるようになった。これらの実践を踏まえ、最終報告書を作成した。これまでの実践の中からいくつかを選び出し、報告集に載せることができた。これらの実践は、新しく保母になった人たちに読んでもらうことも研修の中に盛り込むことができた。本研究の目的は、世代別の機能を踏まえつつも、子育ての持つ構成員のすべてを育てるはたらきを回復するための実践研究をしようとするものである。特に、従来家族に委ねられてきた機能を地域社会の中に回復し、学校や保育所や老人施設などが連携して、相互育ちのネットワークを形成しようとするものである。具体的には、老人が保育所に出かけ保育を行い、中学生が保育所で幼児と交流し、小学生が中学校の活動に参加する等の異年齢間交流を実現するために、小中学校における総合的な学習のカリキュラム作り、中学校家庭科における保育実習との連携、福祉施設でのボランティア活動の整備等を行い、これらの活動を連携して実施していくための組織作りを行うことである。平成13年度は福井県の今立町の研究会を組織することと、高志地区の実践を継続的に進めることを中心に、下記の研究計画にそって2地区別々に研究を進めた。高志地区(1)異年齢間交流についての年間カリキュラムを作成し、実施した。(2)地域の老人と年間を通した交流活動によってうまれた老人の学びと幼児の学びの様子を記録したが、分析は実行できていない。(3)保護者が保育活動に参加する機会を増やし、活動に参加する中で変化する保護者の意識を調査するための、質問紙を制作した。次年度、調査を実施する。今立地区(1)今立地区内の4地区ごとに小中学校と保育所・幼稚園との異年齢間交流活動を試験的に実施し、研究発表会を年3回実施した。(2)今立地区の全小中学校・保育所・幼稚園が参加する交流学習についての研究会を組織し、大学としてどのようなコンサルテーションができるのかをを検討した。今回は保育所の保育研究を中心に参加したが、交流を効果的に実施していくためには、学校に対して授業研究を進めていく機会が必要であることが分かった。特に、年度始めの段階で交流計画を立てないと、学校という組織は外部との接触に臨機応変に対応できない。これまで福井県高志地区(松岡町・永平寺町・美山町・上志比村)と今立町内の保育所を中心に研究を進めてきた。これらの地区では全保育所が集まって、地域交流について定期的に検討する会が成立した。今年度は、両地区とも研究発表会を開催することができた。研究発表は、(1)地域の老人と保育所の交流を組織的に年間行うことができた。(2)保護者や祖父母が保育活動に参加する機会を増やし、家族全体が交流できる活動ができた。(3)幼稚園と保育所が年間を通じて活動を実施することができた。(3)保育所と地域内の小学校との交流学習が定着した。(4)中学校と保育所の交流を定期的に行うことができた。平成15年度研究最終年度でもあり、これまでの交流活動の成果をまとめて公表する。

本研究の目的は、世代別の機能を踏まえつつも、子育ての持つ構成員のすべてを育てるはたらきを回復するための実践研究をしようとするものである。特に、従来家族に委ねられてきた機能を地域社会の中に回復し、学校や保育所や老人施設などが連携して、相互育ちのネットワークを形成しようとするものである。老人が保育所に出かけ保育を行い、中学生が保育所で幼児と交流し、小学生が中学校の活動に参加する。これらの異年齢間交流を実現するために、小中学校における総合的な学習のカリキュラム作り、中学校家庭科における保育実習との連携、福祉施設でのボランティア活動の整備等を行い、これらの活動を連携して実施していくための組織作りを行うことである。平成13年度より福井県の特定の地域に限定し、総合的に研究活動を実施してきた。特に、今立町と高志地区の実践を継続的に進めてきた。平成15年度は高志地区全体で保育の研究発表会を実施することができた。その中では、(1)異年齢間交流、(2)地域の老人と年間を通した交流活動、(3)保護者が保育活動に参加する活動について報告することができた。今立地区では、地区内の4地区ごとに小中学校と保育所・幼稚園との異年齢間交流活動について、実践しその結果を報告しまうことができた。以上の結果を小冊子にまとめて関係機関に配布し、これまでの活動の振り返りとこれらの活動のテキストとして利用することになった。これまで幼保小中学校の交流をはかるために、2つの地域で実践を重ねてきた。まず、高志地区では、保育所が中心となって活動を展開した。その中の松岡町では幼稚園と保育所が統合されて幼児園となり、積極的に小中学校と交流を行うようになっている。公開保育を定期的に実施し、小中学校の教員が参観するようになった。また他の園でも学校に限らず地域の老人会や施設との交流を年間行事の中に組み込み、実践を重ねている。一方、今立地区では、幼保小中学校が4月当初に年度計画を作成し、年間を通して交流を実現するようになった。おもに小学校の生活科・総合的学習の時間、中学校では家庭科の保育の単元での交流が中心である。両地域の特徴は、散発的な交流ではなく、年間を通して実施されるようになっていることである。そして、その実践が重ねられることで、文化として定着してきている。ただし、今立地区では市町村統合の影響で、保育組織が解散すること、小中学校の組織も変わること等が決定されており、このような文化を継続できるか、瀬戸際にきている。しかし、子どもたちが交流することは、次世代育成の意味でも再評価され、その計画の中に盛り込まれることができた。このような交流を継続していくためには、交流の意味を子どもの発達の中で捉えなおすことが必要であり、報告書に掲載したような発達の捉え方についての学習会を繰り返し実施する必要が合った。また、教員組織の中でも、日々の教育実践ではなく、ロングスパンで子どもの成長記録を整理し物語ることが行われることが必要であった。そのために、報告書で触れたような実践の記録のとり方に関する研究会を行う必要があった。
日本語諸方言の準体に関する類型論的研究

本研究の対象である「準体」とは、文法操作によって、名詞相当に振る舞う(体言に準ずる)句節のことである。準体については、その存立基盤など、未だ不明な点が多い。本研究の目的は、日本語諸方言の多様な準体を観察し、類型論的観点から体系的に捉えることで、準体現象のメカニズムを明かにすることである。本研究の特徴は、1日本語の伝統的な準体研究と、通言語的な名詞化類型論を融合させる点、2日本語諸方言のデータを効率的に分析するために、フィールド研究・文献研究・コーパス研究の手法を駆使する点、3現在消滅の危機にある日本語諸方言の多様性を活かした研究であり、今しかできない研究であるという点にある。
植物の脂肪酸は細胞質でも合成されるのか?

[目的]植物には2種類のアセチル-CoAカルボキシラーゼがある。葉緑体に存在するものと細胞質に存在するものとである。従来の研究で、葉緑体において脂肪酸が合成されることは証明されているので、葉緑体局在の本酵素は脂肪酸合成に必要なマロニル-CoAを供給する役割がある。しかし細胞質の本酵素の役割は判然としない。本研究では細胞質の本酵素の役割を知るため、細胞質でも脂肪酸が合成されるか調べることを目的とした。[結果]ラベルした酢酸をエンドウ葉に塗布し、酢酸を脂肪酸に取り込ませ、生成した脂肪酸の分析を試みた。若い葉ではかなり取り込まれたが成熟葉ではあまり取り込まれなかった。取り込まれた脂肪酸が微量であったため、分析するには至らなかった。塗布法で高度に取り込むような手法を開発することが、まず必要である。次に細胞質の本酵素はフラボノイドなどの合成に必要なマロニル-CoAを供給すると推定されているので、フラボノイド量と本酵素量との相関性を調べた。フラボノイドはUV-B照射により多く合成される。UV-B照射下での本酵素の消長を調べたところ、本酵素量はUV-B照射下で増加することが明らかとなった。この結果は本酵素がフラボノイド合成の前駆体を供給していることを示唆している。新規脂肪酸合成が細胞質で行われていることを示す結果は、現在のところまだ無い。今後塗布法を改良することにより、この問題を解決できると考える。
インフルエンザウイルスNPのアセチル化修飾から見たウイルス－宿主間攻防の機構解析

申請者らは,ウイルス増殖過程においてNPが宿主細胞のヒストンアセチル化酵素GCN5とPCAFにより,アセチル化されることを報告した(J Biol Chem, 2018).本研究では,特にアセチル化NPと相互作用するタンパク質に焦点を当て,NPに対するアセチル化修飾の生物学的意義を解明する.インタラクトーム解析により,SMARCA2やSMARCA4といったブロモドメインタンパク質がNPと結合することが示されている.ブロモドメインはアセチル化リジンと結合する性質を持ち,これらのタンパク質とNPとの相互作用は,NPのアセチル化が担っていることが予想される.そこで,共免疫沈降の手法を用いて,これを確かめることを目的として実験を開始した.2018年度は,FLAGタグを付加したSMARCA2,SMARCA4,NPの組換えタンパク質を作成した.SMARCA2,SMARCA4は大腸菌を用いて作成した.NPは,以前大腸菌で作成したが,発現の課程において既にNPがアセチル化されてしまった.そこで今回は,無細胞系のPUREflexシステムを用いて発現させることに成功した.現在,この組換えタンパク質がアセチル化されないことを確認中である.また,NPの研究遂行中にPAのアセチル化修飾も発見した.PAのエンドヌクレアーゼ活性は,ウイルス増殖過程において必要不可欠な反応である.我々の研究により,1PAが宿主細胞のアセチル化酵素によってアセチル化を受けること,2PAアセチル化によってエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されること,3アセチル化を受けるアミノ酸は19番目のリジン(K19)であること,4PA-K19をグルタミンに変異させ(K19Q),定常的なアセチル化をミミックするとエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されることなどを示した.アセチル化によってPAのエンドヌクレアーゼ活性が調節されることが示唆された.アセチル化NPと,SMARCA2およびSMARCA4の相互作用を生化学的に検討するに当たり,昨年までは,ヒスチジンタグを用いて免疫沈降を行う予定であった.しかし,ヒスチジンタグでは抗体や磁気ビーズとの親和性が低く,良好な実験結果を得ることができなかった.そこで,FLAGタグを付加した組換えタンパク質の作成に切り替えた.現在までに,SMARCA2,SMARCA4,NPなど,全7種類の組換えタンパク質にFLAGタグを付加することに成功している.また,PAアセチル化修飾についても,アセチル化によってエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されることを示し,アセチル化されるリジン残基(K19)を同定することに成功した他,K19を,恒常的なアセチル化リジンの模倣であるグルタミンに置換(K19Q)すると,同様にエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されることを明らかにした.翻訳後修飾によってPAエンドヌクレアーゼ活性が調節されることを報告した例は過去に無く,ウイルス学分野のみならず,生化学・分子生物学の分野にも大きなインパクトを与えられるものと考えている.NPアセチル化の研究に関しては,今後は,作成した組換えタンパク質を用いて共免疫沈降を行う.まずは,PUREflexで発現させたFLAGタグ付きのNPがアセチル化されていないことを確認する.これは,抗アセチル化リジン抗体を使用したウェスタンブロッティングで行う.その後,抗FLAG抗体でアセチル化NPを磁気ビーズに結合させ,さらに,SMARCA2およびSMARCA4がプルダウンされるかどうかを調べる.また,同様の手法を用いて,SMARCA2やSMARCA4以外のタンパク質が,アセチル化NPと相互作用するかどうか網羅的にスクリーニングすることも計画している.PAアセチル化の研究に関しては,まずはPA-K19QおよびPA-K19Rの変異をもつ組換えウイルスを作成し,ウイルス増殖効率の変化を解析する.その後は,上記のNPと同様,FLAGタグ付きのPA組換えタンパク質も既に作成済みであるので,アセチル化PAと相互作用するタンパク質のスクリーニングを行う.タンパク質は様々な翻訳後修飾を受け,その構造や機能の調節を受けることが知られている.中でも最もよく知られているのが,真核細胞のゲノムDNAと相互作用するヒストンであり,そのアセチル化修飾は転写活性を促進させる.一方,インフルエンザウイルスの一本鎖RNAゲノムはヌクレオプロテイン(NP)と相互作用することから,NPは機能的に「ヒストン様タンパク質」であると言うことができる.そして申請者らは,ウイルス増殖過程においてNPが宿主細胞の異なる2種類のヒストンアセチル化酵素GCN5とPCAFにより,アセチル化修飾を受けることを発見した.さらに,RNAi処理に伴うウイルスRNA転写量を測定したところ,GCN5の発現抑制処理により転写量は減少し,PCAFの発現抑制処理により転写量は増加するという大変興味深い結果を得た.以上より,NPのアセチル化修飾は,ウイルスと宿主細胞の攻防を制御する要因の一つと考えられる.そこで,本研究では,特にアセチル化NPと相互作用するタンパク質に焦点を当て,NPに対するアセチル化修飾の生物学的意義を解明することを目的とする.NPとのインタラクトーム解析により(渡辺ら,Cell Host Microbe, 2014),SMARCA2やSMARCA4といったブロモドメインタンパク質がNPと結合することが示されている.ブロモドメインはアセチル化リジンと結合する性質を持つことから,これらのタンパク質とNPとの相互作用はNPのアセチル化リジンが担っているのではないかと考え,生化学的およびウイルス学的な解析を行っている.また,NPの研究遂行中に偶然PAのアセチル化修飾の存在も発見した.

そこで,PAに対するアセチル化修飾の生物学的意義の解明も平行して進める.アセチル化NPと,SMARCA2およびSMARCA4の相互作用を,生化学的に検討するに当たり,SMARCA2およびSMARCA4のサイズの異なる部分組換えタンパク質(7種類),およびヒストンアセチル化酵素PCAFとGCN5の部分組換えタンパク質の作成を完了した.プルダウンアッセイを行うに当たり,ヒスチジンタグを除いた部分組換えタンパク質を新たに作製する必要があったためである.また,PAに関しては,上記のPCAFとGCN5が,PAもアセチル化することを見出した.さらに,PAは宿主細胞のmRNAから5'-capを切り取るためのエンドヌクレアーゼ活性をもつが,その酵素活性は,PCAFによるアセチル化修飾で賦活され,GCN5によるアセチル化修飾で抑制されることを発見した.申請者らは,ウイルス増殖過程においてNPが宿主細胞のヒストンアセチル化酵素GCN5とPCAFにより,アセチル化されることを報告した(J Biol Chem, 2018).本研究では,特にアセチル化NPと相互作用するタンパク質に焦点を当て,NPに対するアセチル化修飾の生物学的意義を解明する.インタラクトーム解析により,SMARCA2やSMARCA4といったブロモドメインタンパク質がNPと結合することが示されている.ブロモドメインはアセチル化リジンと結合する性質を持ち,これらのタンパク質とNPとの相互作用は,NPのアセチル化が担っていることが予想される.そこで,共免疫沈降の手法を用いて,これを確かめることを目的として実験を開始した.2018年度は,FLAGタグを付加したSMARCA2,SMARCA4,NPの組換えタンパク質を作成した.SMARCA2,SMARCA4は大腸菌を用いて作成した.NPは,以前大腸菌で作成したが,発現の課程において既にNPがアセチル化されてしまった.そこで今回は,無細胞系のPUREflexシステムを用いて発現させることに成功した.現在,この組換えタンパク質がアセチル化されないことを確認中である.また,NPの研究遂行中にPAのアセチル化修飾も発見した.PAのエンドヌクレアーゼ活性は,ウイルス増殖過程において必要不可欠な反応である.我々の研究により,1PAが宿主細胞のアセチル化酵素によってアセチル化を受けること,2PAアセチル化によってエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されること,3アセチル化を受けるアミノ酸は19番目のリジン(K19)であること,4PA-K19をグルタミンに変異させ(K19Q),定常的なアセチル化をミミックするとエンドヌクレアーゼ活性が賦活化されることなどを示した.アセチル化によってPAのエンドヌクレアーゼ活性が調節されることが示唆された.アセチル化NPと,SMARCA2およびSMARCA4の相互作用を生化学的に検討するに当たり,昨年までは,ヒスチジンタグを用いて免疫沈降を行う予定であった.しかし,ヒスチジンタグでは抗体や磁気ビーズとの親和性が低く,良好な実験結果を得ることができなかった.そこで,FLAGタグを付加した組換えタンパク質の作成に切り替えた.