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生体時計に制御される新型アルドステロン酵素を標的とした新しい機序の降圧薬の開発

原発性アルドステロン症は内分泌性高血圧の中で最も頻度の高い病因であるが、その発症に関わる遺伝子の多くが不明なままである。特に、非腫瘍性の特発性アルドステロン症は未だに有効な根本治療法が確立されていない難治性疾患である。特発性アルドステロン症の疾患部、及び特発性アルドステロン症様の病態を示すモデルマウスでは、アルドステロン産生細胞である球状層細胞に特異的に発現する3β-HSD(3β水酸化ステロイド脱水素酵素)が過剰に発現しており、この酵素の過剰発現が副腎からの過剰なアルドステロン産生の原因であると考えられる(Doi et al., J Clin Endocrinol Metab., 2014、Doi et al., Nature Med., 2010)。しかしながら、この球状層特異的3β-HSDの発現制御機構については、その多くが未解明なままであった。申請者は、この酵素の発現制御機構の解明が特発性アルドステロン症の発症機構の解明、及び根本治療薬の開発につながると考えた。そこで申請者は、生体内でアルドステロン産生を亢進させる主要な因子であるアンギオテンシンIIに着目し、アンギオテンシンIIが本酵素の発現を誘導するのか、もし誘導されるのであればどのような分子機構を介するのかを調査した。マウスへのアンギオテンシンIIの投与や、ヒト副腎皮質由来のH295R細胞を用いた実験から、アンギオテンシンIIが本酵素の発現を一過性に亢進することを発見した。H295R細胞を用いたプロモーターアッセイやゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降により、核内受容体であるNGFIBが本酵素の発現に関与することを発見した。さらに、siRNAを用いたノックダウンやNGFIBのドミナントネガティブ体を用いた実験から、アンギオテンシンIIによる本酵素の誘導は、NGFIBを介して行われていることを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。高アルドステロン血症は内分泌性高血圧の中で最も頻度の高い病因である。しかし、アルドステロン合成阻害薬として唯一市販されているトリロスタンは、ステロイド合成の必須ステップを触媒する3β-HSDを非選択的に阻害するため、全てのステロイド産生を阻害する欠点が指摘されていた。そこで申請者は、アルドステロン産生細胞である球状層に特異的に発現している3β-HSDのサブタイプに注目した。本研究では、球状層特異的3β-HSDに対する選択的阻害薬の開発や、球状層特異的3β-HSDの発現調節機構の解明を通して、新しい機序の降圧薬の開発を目指した。まず、球状層特異的3β-HSD選択的阻害薬の創成に向け、3β-HSDの酵素活性測定系を構築した。内因性の3β-HSDをもたない哺乳類培養細胞に球状層特異的3β-HSDを強制発現させ、酵素を精製後、RI標識した基質を用いて酵素反応を行い、HPLCにより酵素活性を求めた。この酵素活性が精製タンパク質の濃度、及び基質濃度依存的に上昇したことから、球状層特異的3β-HSDの酵素活性測定系の構築を確認することができた。またさらに、in vivoでのマウス球状層特異的3β-HSD(Hsd3b6)の発現モニタリングに向け、Hsd3b6 promoter-lucトランスジェニックマウスを作製した。しかしながら、全てのラインのマウスにおいて副腎におけるルシフェラーゼの遺伝子発現を調査したが、発現は検出されなかった。一方、球状層細胞における分子時計の機能探索においては、マウス副腎スライス培養系を用い、副腎からのアルドステロン分泌の測定系を構築することができた。この培養系を用い、生体時計異常を示すCry-nu11マウスにおいて副腎のアルドステロン合成活性を測定したところ、アルドステロン分泌の亢進が両側の副腎で認められ、分子時計によるアルドステロン分泌の制御を見出した。まず、球状層特異的3β-HSDの発現解析に用いるため、マウスの球状層特異的3β-HSDであるHsd3b6に対する抗体を作製した。得られた抗体は免疫細胞化学、免疫沈降、免疫組織化学によりHsd3b6を特異的に認識することを確認した。さらに、球状層細胞の分子時計を標的とした高血圧治療の可能性を探るため、アルドステロン産生制御における分子時計の役割を探索した。AngIIに対する応答性に日内変動が存在するのかを確認するため、ラット球状層細胞の初代培養系を構築した。まず、培養した細胞が球状層細胞のマーカー遺伝子Cyp11b2の発現、及びAngIIに対する応答性を保持しているのかを確認した。

抗Cyp11b2抗体による免疫染色を行ったところ、約7割の細胞から陽性反応を得た。さらに、培養した細胞をAngIIにより刺激したところ、培地中へのアルドステロン分泌が有意に増加した。次に、ラット球状層細胞が初代培養系でも概日リズムを示すのかを調査した。するとmPer2promoter-lucトランスジェニックラットから分離した球状層細胞は100時間以上にわたり概日リズムを維持した。原発性アルドステロン症は内分泌性高血圧の中で最も頻度の高い病因であるが、その発症に関わる遺伝子の多くが不明なままである。特に、非腫瘍性の特発性アルドステロン症は未だに有効な根本治療法が確立されていない難治性疾患である。特発性アルドステロン症の疾患部、及び特発性アルドステロン症様の病態を示すモデルマウスでは、アルドステロン産生細胞である球状層細胞に特異的に発現する3β-HSD(3β水酸化ステロイド脱水素酵素)が過剰に発現しており、この酵素の過剰発現が副腎からの過剰なアルドステロン産生の原因であると考えられる(Doi et al., J Clin Endocrinol Metab., 2014、Doi et al., Nature Med., 2010)。しかしながら、この球状層特異的3β-HSDの発現制御機構については、その多くが未解明なままであった。申請者は、この酵素の発現制御機構の解明が特発性アルドステロン症の発症機構の解明、及び根本治療薬の開発につながると考えた。そこで申請者は、生体内でアルドステロン産生を亢進させる主要な因子であるアンギオテンシンIIに着目し、アンギオテンシンIIが本酵素の発現を誘導するのか、もし誘導されるのであればどのような分子機構を介するのかを調査した。マウスへのアンギオテンシンIIの投与や、ヒト副腎皮質由来のH295R細胞を用いた実験から、アンギオテンシンIIが本酵素の発現を一過性に亢進することを発見した。H295R細胞を用いたプロモーターアッセイやゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降により、核内受容体であるNGFIBが本酵素の発現に関与することを発見した。さらに、siRNAを用いたノックダウンやNGFIBのドミナントネガティブ体を用いた実験から、アンギオテンシンIIによる本酵素の誘導は、NGFIBを介して行われていることを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り球状層特異的3β-HSDの酵素活性測定系の構築を完了した。またさらに、従来困難であった副腎のスライス培養を成功させた。このスライス培養系を用いることで、副腎での生体時計機能の解明やアルドステロン分泌における時刻依存性の解析が可能になり、計画は順調に進んでいるといえる。予定通りマウス球状層特異的3β-HSDの抗体の作製を完了した。またさらに、ラット球状層細胞初代培養系を構築し、ラット球状層細胞が初代培養系でも概日リズムを保持することを確認した。このラット球状層細胞初代培養系を用いることで、副腎での生体時計機能の解明やアルドステロン分泌における時刻依存性の解析が可能になり、計画は順調に進んでいるといえる。球状層特異的3β-HSDに対する選択的阻害薬の開発においては、球状層特異的3β-HSDの酵素活性測定系の構築が完了したため、他のサブタイプの3β-HSDに関しても酵素活性測定系の構築を行う。
国際法における緊急状態理論の史的展開

緊急避難は、国家責任条文(国連総会決議56/83付属文書)第25条に国際法上の違法性阻却事由の一つとして規定されており、同条が示す緊急避難の定式は慣習法規則を反映するものとして広く受け入れられている。しかしながら、そこに規定された諸要件をどのように解釈適用するかについては議論の余地が多分に残されており、具体的な判断基準は明確になっていない。その背景には、これまで国際法上の緊急避難の機能についての検討が要件論と十分に結びついた形でなされてこなかったという問題があると考えられる。こうした問題意識に基づき、今年度は、20世紀前半における緊急状態法理の機能について研究を行った。裁判実行としては、主にロシア賠償事件(常設仲裁裁判所、1912年)とベルギー商事会社事件(常設国際司法裁判所、1939年)に焦点を当て、当時の緊急状態法理の機能を検討した。それをふまえて学説上の理解を整理し、20世紀前半の国際法秩序のあり方と緊急状態法理の機能との関連を分析した。その結果、国際法の実効性を維持するために緊急状態における国家の自己保存の要請に配慮することが必要と考えられていたことが明らかになった。
アカイカ科における複数の精子貯蔵器官の進化

近年、スルメイカの不漁が全国的なニュースとして報じられる等、イカ類の中でも水産資源として優良な種が数多く属するアカイカ科では、その漁獲量の動向は高く注目されており、資源の持続的利用を行うための再生産過程および生活史の解明は重要な課題である。沿岸性のイカでは口の周りに受精嚢と呼ばれる精子の貯蔵器官を一つ保有するが、アカイカ科だけは例外的に複数の受精嚢を持つことが知られている。一般的に資源変動が大きい生物において、遺伝的に多様な子を生むことは子供の全滅を避けるために有利になると考えられている。資源量の変動が激しいアカイカ科では、より多くの雄の精子を獲得し貯蔵するために、複数の受精嚢が進化したのかもしれない。この仮説を検証するため、スルメイカの精子貯蔵戦略と遺伝的多様性の影響について明らかにする。本年度は、産卵回遊のために南下してきたスルメイカを捕獲し、受精嚢の数に雌の体サイズや雄から渡された精子塊の数が関係するのかを調べた。その結果、受精嚢の数と雌の体サイズ間、受精嚢の数と付着精子塊数の間には関係性が見られなかった。また、7月に隠岐の島沿岸に回遊してきた雌の成熟スルメイカを捕獲し、付着精子塊のDNAを抽出すると共に、受精嚢内の精子を使って人工授精を行い、貯蔵精子の父性解析を行った結果、9個体もの雄の精子を貯蔵している事が分かった。このうち、付着精子塊の父性はたったの2個体だったことから、その多くは以前に交接した雄によるものであることが確認された。人工授精による受精嚢内の貯蔵精子の父性解析に成功したものの、一個体のみでしか実験を行う事が出来なかった。本年度は残念ながら、スルメイカの資源量が想像よりも少なく、繁殖個体の回遊が予想よりも早く終わってしまった事。また、冬季の来遊群についても成熟個体が見られなかったことから、追加実験を行う事が出来なかった事が原因である。本年度はサンプル数を稼ぐことは出来なかったが、実験自体は極めて上手くいき、手法については確立できた。また、今年度の採集結果から、来年度はスルメイカの来遊パターンについても把握することが出来た。この結果を参考に、次年度はスルメイカの採集を本年度よりも正確に予測することが期待出来るため、次年度も方針自体は変わらず、さらに実験例数を増やし、スルメイカの精子貯蔵パターンの理解を深くすることに尽力する。スルメイカの不漁に伴い、予定していたDNA実験を実施することが出来なかった。本年度はその分の実験を行うため、昨年消化しきれなかった予算の分を本年度に使用する予定である。
癌微小環境を標的化する革新的アルブミンナノ粒子の開発と難治性癌治療への展開

本研究の最終目的は、癌ー癌微小環境を標的化する包括的な抗癌剤DDSの開発と難治性癌治療への応用であるが、その鍵を握るのは癌細胞/TAM/CAFに対する三重標的化担体の開発とそのナノ粒子化になる。従ってまずは、アルブミン融合技術により、これまで作製してきたMonoPEG-rMan-HSAのPEG鎖をHSAで置換した2種類のHSA化rMan-HSAを作製する。このHSAの融合化部位の差異で、マンノース糖鎖の露出度が異なる結果、細胞認識性や動態特性に影響を及ぼすかもしれない。これらの点を細胞系及び動物実験により評価し、PEG化の代替性を確認する。
婦人科がん幹細胞研究と免疫療法の融合

卵巣がん細胞株OVCAR3、NOY1でCD133陽性と陰性細胞に分離し、ヌードマウスにおける腫瘍形成能を比較し、CD133陽性細胞で有意に腫瘍形成能の亢進を認め、癌幹細胞としの妥当性を証明した。マイクロアレイ解析を行いCD133陽性細胞で発現増強遺伝子群を同定し、新たな免疫療法のターゲット抗原の探索を行った。免疫療法の実践とし、腫瘍抗原Glypican-3(GPC3)およびHLA-classIの免疫組織染色を行った。82例の卵巣癌組織での結果、明細胞腺癌のみで陽性を示し、HLA-classIは全82例中72例で陽性であり、GPC3をターゲットとした、卵巣明細胞腺癌の免疫療法の妥当性を証明した。我々はGPC3をターゲットとした、卵巣明細胞腺癌の免疫療法の臨床試験をスタートさせ、臨床効果が得られた症例を2例経験した。十分なインフォームドコンセントと同意を得た後に、卵巣がんの手術で得られた腫瘍組織において、腫瘍抗原として我々が着目している、Glypican-3(GPC3)およびHLA-classIの免疫組織染色を行い、発現の有無や細胞内分布を検討した。82例の卵巣がん組織での検討の結果、明細胞腺癌のみで陽性を示し、31例中16例(51.6%)であった。HLA-classIの染色結果は全82例中、72例、明細胞腺癌31例中28例(90%)で陽性であり、GPC3をターゲットとした、卵巣明細胞腺癌の免疫療法の妥当性を証明した。さらに我々は卵巣がん幹細胞のマーカーとしてCD133に着目した。卵巣がん細胞株であるOVCAR3およびNOY1におけるCD133の発現を検討し、セルソーティングによりCD133陽性細胞と陰性細胞に分離を行い、ヌードマウスにおける腫瘍形成能を比較検討し、CD133陽性細胞において有意に腫瘍形成能の亢進を認め、CD133陽性細胞がこれらの細胞において癌幹細胞として妥当であることを証明した。また癌幹細胞の分離方法としてsphere形成細胞の分離を行い、sphere形成細胞の腫瘍形成能を確認した。また、sphere形成細胞におけるGPC3の発現を確認し、GPC3は卵巣明細胞腺癌の免疫療法のみならず、癌幹細胞における免疫療法のターゲットにもなる可能性が示唆される結果を得た。さらに、セルソーティングによりCDI33陽性細胞,陰性細胞をそれぞれ分取し,マイクロアレイ解析を行い.CD133陽性細胞で発現増強している遺伝子群を同定し、新たな免疫療法のターゲットとなる抗原の探索を行っている。研究実施計画内の、臨床研究において、卵巣明細胞腺がんのGlypican3(GPC3)ペプチドワクチン臨床試験を施行した。現在までのところ、寛解群に対するadjuvantを目的で11例、化学療法との併用を1例、再発・進行症例4例に対して投与を行った。ペプチドワクチンを投与された卵巣明細胞腺がん患者におけるEx vivol IFNγELISPOTアッセイを用いた免疫学的モニタリングにて17症例中16症例においてワクチン投与前に比べ、ワクチン投与後でGPC3特異的CTLが末梢血中に増加していることが確認できた。TC(パクリタキセル+カルボプラチン)療法と併用された1例のみではあるが、免疫抑制作用のある化学療法併用群においてもGPC3特異的CTLが誘導された結果が確認できた。現在までの登録症例は20例とまだ少数例ではあるが、注射部局所の発赤や硬結は全例にみられたものの、投与中止基準に相当するGrade4のような重篤な非血液有害事象の発生は1例もみられなかった。2012年1月末時点で、寛解群(ワクチン投与計10回のプロトコール終了7例およびワクチン投与中6例)の平均観察期間は7.6か月とまだ短いものの、全例において再発は認められていない。進行群5例中1例で、治療開始3か月時点でPRの臨床効果(肝転移、傍大動脈および右外腸骨リンパ節転移の縮小あり、新規病変なし)を認めた。また、この症例を含み進行群5例中3例で、ワクチン投与前に比べ腫瘍マーカーの低下がみられた。また、このPR症例の末梢血単核球よりGPC3特異的CTLの樹立を行った。今後、TCRの解析を計画している。卵巣がん細胞株におけるCD133の発現を検討し、セルソーティングによりCD133陽性細胞と陰性細胞に分離を行い、ヌードマウスにおける腫瘍形成能を比較検討し、CD133陽性細胞において有意に腫瘍形成能の亢進を認め、CD133陽性細胞がこれらの細胞において癌幹細胞として妥当であることを証明した。

さらに、セルソーティングによりCD133陽性細胞,陰性細胞をそれぞれ分取し,マイクロアレイ解析を行い.CD133陽性細胞で発現増強している遺伝子群を同定し、新たな免疫療法のターゲットとなる抗原の探索を行い、CXCR-4などがん幹細胞高発現因子の同定を行った。また、我々はCD133陽性および陰性細胞と腹膜中皮細胞との共培養の結果から、腹膜中皮細胞はCD133発現維持に関与するとともに、CD133陽性細胞においてのみ、コロニー形成能、腹膜浸潤能を亢進し、がん幹細胞ニッチとしての機能をもつことを証明した。さらに我々はCD133陽性細胞においてCXCR4の発現が亢進していることを確認し、CXCR4中和抗体投与したところ腹膜中皮細胞によって促進した、CD133陽性細胞のコロニー形成能、腹膜浸潤能は抑制され、ヌードマウスを用いた腹膜播種モデルにおいてもCD133陽性細胞の腹膜播種を抑制した。以上の結果からCXCR4は卵巣がん腹膜播種に対する新規治療のターゲットにも成り得ることを見出した。卵巣明細胞腺癌に対するペプチドワクチン療法の臨床試験はほぼ目標を達成しており、免疫解析にてもEx vivo IFNγELISPOTアッセイを用いた免疫学的モニタリングでは31症例中29症例(寛解群21例、化学療法併用群3例および進行群7例)において免疫学的有効性が確認できたことから我々の行っているペプチドワクチン療法の免疫学的有効性が確認された。卵巣がんにおける癌幹細胞の同定に関しての検討は昨年度の研究成果にて順調に進展しており、免疫療法に関する臨床試験も本年度は計画どおり進展した。現在は癌幹細胞をターゲットとした免疫療法を展開すべく新規がん抗原の同定が課題であるが、研究準備は順調に進んでいることから全体としてはおおむね順調に進展していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。上述のごとく今後は癌幹細胞とした新規抗原をいかにして同定するかが課題である。研究当初はCD133をターゲットにする計画を立てていたが、予備実験の結果、候補となるペプチドの同定には至っておらず、今後別の抗原を同定する必要性も考えられる。卵巣癌から分離した癌幹細胞の内因性HLA発現をshort interfering RNA(siRNA)によって完全に抑制し、日本人の中で最も頻度の高いHLA-A座であるHLA-A24のみを発現する人工抗原提示細胞aAPCを作製する。これを用いて、HLA-A24拘束性に卵巣癌幹細胞を認識するCTL linesを誘導・樹立する。特異性をIFN-γキャッチ法にて確認した後にCTLクローンの樹立を行う。複数の卵巣癌幹細胞に対して細胞傷害性を示すCTLクローンが樹立されれば、そのCTL、クローンが認識している腫瘍抗原が卵巣癌幹細胞に共通した特異的な新規抗原であるかどうかにつき、aAPCに用いた癌細胞株のmRNAからcDNAライブラリーを作製して同定を試みる。
摺動面潤滑液曝露時間を考慮した人工関節最適設計

摺動面潤滑液曝露時間が人工関節設計用パラメータとして非常に有効であることが証明され,これを用いた設計案を例示することができた.人工関節の摩耗は潤滑状態と深い関連があり,潤滑状態は二つの摺動面の接触面圧と滑り速度により決定されるという一般的見解にインパクトを与えることができた.設計パラメータはHard-on-PolymerとHard-on-Hard人工関節両方に適用できた.平成13年度の新たな具体的成果は以下め通りである.1.Hard-on-Polymer人工関節の代表例として超高分子量ポリエチレンとアルミナセラミックスまたはCo-Cr-Mo合金の摩耗試験を行った.両材料とも曝露時間が長いとポリエチレンの比摩耗量は一定値を示すが,曝露時間が短くなるに従い比摩耗量が増大した.比摩耗量は同じ表面粗さでもセラミックスの方が低値であり,この原因として粗さ形状の影響を提案した.,接触面圧が20.0MPa程度に上昇すると,境界潤滑膜の破断・形成不全→ポリエチレン凝着物の形成→ポリエチレン移着膜形成,という新たな低摩耗化機構が発現することが実験的に明らかとなった.2.Hard-on-Hard人工関節の代表例としてCo-Cr-Mo合金同士の摩耗試験を行った.全体的には曝露時間を短縮すると比摩耗量が増大した.これは,耐摩耗性を示す摺動面金属酸化膜が摩擦により損傷した場合,その修復に潤滑液中の溶存酸素を必要とするためと考えられた.しかし一方で,生体内程度の溶存酸素濃度の低下は摩耗を低下させるという事実が明らかとなった.この現象の説明として,酸素濃度の低下は摺動面同士の凝着部の増大をもたらし,高摩擦による金属組織の微細化や加工硬化が発現したためと考えられた.摺動面潤滑液曝露時間が人工関節設計パラメータとして非常に有効であることが証明された.人工関節の摩耗は潤滑状態と深い関連があり,潤滑状態は二つの摺動面の接触面圧と滑り速度により決定されるという一般的見解にインパクトを与えうる内容であった.設計パラメータはHard-on-PolymerとHard-on-Hard人工関節両方に適用できた.実験に供した模擬関節液が広範なバイオトライボロジー研究に有効であることも示せた.具体的な成果は以下の通りである.1.Hard-on-Polymer人工関節の代表例として超高分子量ポリエチレンとCo-Cr-Mo合金の摩耗試験を行った.曝露時間が比較的長いとポリエチレンの比摩耗量は一定値を示すが,曝露時間が短くなるに従い比摩耗量が増大した.接触面圧が12.0MPa以下では,非摩耗量と曝露時間の関係は一つの指数関数(r>0.99)で表現できた.成果をもとに13年度はポリエチレンの相手材をセラミックスに変更し,硬質摺動面の選択指針の確立も行う.2.Hard-on-Hard人工関節の代表例としてCo-Cr-Mo合金同士の摩耗試験を行った.全体的には曝露時間を短縮すると比摩耗量が増大した.これは,耐摩耗性を示す摺動面金属酸化膜が摩擦により損傷した場合,その修復に潤滑液中の溶存酸素を必要とするためと考えられる.この現象は酸素濃度が低下すると劣化が起こりやすいという金属インプラント材とほぼ同じ傾向である.しかし,人工関節特有と思われる現象も観察された.生体内程度の溶存酸素濃度の低下は,摺動面表層の金属酸化膜の修復を遅延させ,金属母材深部までの酸素の拡散を許容するようであった.その結果,金属母材深部まで厚く・傾斜的な金属酸化膜が形成され比摩耗量が低下すると考えられる現象が観察された.13年度はこの摩耗メカニズムを解明し,新たな設計指針を求める予定である.摺動面潤滑液曝露時間が人工関節設計用パラメータとして非常に有効であることが証明され,これを用いた設計案を例示することができた.人工関節の摩耗は潤滑状態と深い関連があり,潤滑状態は二つの摺動面の接触面圧と滑り速度により決定されるという一般的見解にインパクトを与えることができた.設計パラメータはHard-on-PolymerとHard-on-Hard人工関節両方に適用できた.平成13年度の新たな具体的成果は以下め通りである.1.Hard-on-Polymer人工関節の代表例として超高分子量ポリエチレンとアルミナセラミックスまたはCo-Cr-Mo合金の摩耗試験を行った.両材料とも曝露時間が長いとポリエチレンの比摩耗量は一定値を示すが,曝露時間が短くなるに従い比摩耗量が増大した.比摩耗量は同じ表面粗さでもセラミックスの方が低値であり,この原因として粗さ形状の影響を提案した.,接触面圧が20.0MPa程度に上昇すると,境界潤滑膜の破断・形成不全→ポリエチレン凝着物の形成→ポリエチレン移着膜形成,という新たな低摩耗化機構が発現することが実験的に明らかとなった.2.Hard-on-Hard人工関節の代表例としてCo-Cr-Mo合金同士の摩耗試験を行った.全体的には曝露時間を短縮すると比摩耗量が増大した.これは,耐摩耗性を示す摺動面金属酸化膜が摩擦により損傷した場合,その修復に潤滑液中の溶存酸素を必要とするためと考えられた.しかし一方で,生体内程度の溶存酸素濃度の低下は摩耗を低下させるという事実が明らかとなった.この現象の説明として,酸素濃度の低下は摺動面同士の凝着部の増大をもたらし,高摩擦による金属組織の微細化や加工硬化が発現したためと考えられた.
造像銘より見た唐代浄土思想の研究

本研究は唐代地域社会における浄土信仰の変容について、各地の造像銘を主要資料として探ることを目的としたものである。平成25年度は、当初の計画通り、北朝から唐代にいたる龍門石窟の有紀年造像銘を網羅的に収集し、そこから天や浄土に関する用語を抽出して整理分類し、北魏時代から唐代に至る変化を考察した。その結果、北魏では、様々な天に関する用語が使用されたが、唐代においては「浄土」の一語へ収斂する傾向が明瞭に見られることを明らかにした。また、浄土教の祖師である善導の著作を引用する造像銘も出現することを新たに発見し、6月に北京の中国人民大学で開催された国際会議においてその研究成果を発表した。また、会議参加と同時に北京大学図書館と中国国家図書館において資料調査を行った。さらに、8月には龍門石窟に赴き、浄土教関係の造像銘を調査した。9月には、造像銘拓本を多数所蔵する淑徳大学書学文化センターへ調査に赴き、唐代造像銘拓本の写真撮影と文字移録作業を行った。以上の調査の過程で、善導の影響が明瞭に見られる龍門石窟造像銘について、既存の著書に収録された録文には大きな過誤があることに気づき、新たに作成した録文とその内容に関する考察を『東アジア仏教学術論集』に掲載した。これまで、龍門石窟において、北魏時代は釈迦・弥勒の造像が中心であったが、唐代には阿弥陀造像が急激に増加する原因として、善導浄土教の影響があるということは既に指摘されていた。しかし、直接的にそれを示す具体的資料は提示されてこなかった。今回の調査に基づき新たに提示した資料により、唐代浄土信仰の変化に善導浄土教が果たした役割をより具体的に考察できる段階に入ったと言える。今回、研究代表者の海外研究機関への所属変更に伴い、助成事業は中途で廃止となるが、唐代の各地域における浄土信仰の変容について善導浄土教の影響を中心に考察を進めていく予定である。
上皮内因子が指揮する組織幹細胞ニッチ機構を焦点とした喫煙関連肺疾患の病態解明

慢性閉塞性肺疾患と特発性肺線維症におけるII型肺胞上皮(alveolar type 2: AT2)内分子の意義を、組織幹細胞ニッチを制御する細胞老化/細胞移動調節機構という独創的な観点から解明し、両疾患に対する治療戦略を創出することが本研究の目的である。本年度はSftpcCreERT2マウスとPtenfloxマウスを交配し、8週齢より週3回タモキシフェン(TMX, 250mgkg-1)を腹腔内投与し、AT2特異的Pten欠損マウスを作製した。並行して、Magnetic enrichmentとFACS sortingを組み合わせ、AT2と肺間葉細胞それぞれの単離プロトコルを確立した。AT2でのPten遺伝子の欠失効率について単離AT2(CD31 neg CD45neg CD16/32negTER119negEPCAMpos)のqPCRで確認したところ、AT2での90%強のPten発現低下を確認した。FACS解析の結果、AT2特異的Pten欠損マウスではAT2の割合が有意に減少し、肺間葉細胞の割合が増加していることを見出した。エラスターゼ気管内投与による肺損傷モデルにおいて、AT2特異的Pten欠損マウスでは気腫性病変が増悪することを見出した。現在、AT2特異的Pten欠損マウスに30週齢まで週1回TMXを腹腔内投与することで、加齢性の肺気腫自然発症の有無について検討を進めている。また、肺胞ニッチ細胞(mesenchymal alveolar niche cell: MANC)の標識に必要なPdgfra-EGFPマウス, Axin2-TQマウスについて遺伝子組換え実験委員会の承認を得た。動物実験委員会に申請中である。来年度以降、AT2の細胞老化の有無、AT2でのミトコンドリア機能、単離AT2と肺間葉細胞のRNAシーケンスを用いたAT2-肺間葉細胞間シグナル解析を進捗する。研究実績の概要にあるように研究計画はほぼ順調に進んでいる。(1) AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損マウス作製による肺気腫、肺線維症自然発症の解析-SftpcCreERT2:RhoAfloxマウス、SftpcCreERT2:Ror2floxマウスまたはSftpcCreERT2:Ptenfloxマウスに8週齢より週1回TMXを腹腔内投与する。10週齢と30週齢の各遺伝子欠損マウスを用い、肺気腫自然発症の有無をmicro-CT (Voxel Count)と肺組織HE染色(平均肺胞径(MLE)と断片指数(DI))で、肺線維症自然発症の有無をM-T染色、肺組織中コラーゲン値測定で解析する。AT2の細胞骨格変化をファロイジン-アクチン染色で評価する。基底膜とAT2, AT1の接着とAT2-AT1間連結を電子顕微鏡で解析する。(3)AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損によるAT2-MANC間の距離変化-上記実験(2)のマウス肺組織を用い、AT2をSftpcで免疫染色する。Z-stacksによる三次元的共焦点画像解析により、AT2の核とMANC(Axin2+-PDGFRα+)の核間の距離を測定し、AT2内分子が与えるニッチの空間分布への影響を解析する。(1) AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損マウス作製による肺気腫、肺線維症自然発症の解析-

SftpcCreERT2:RhoAfloxマウス、SftpcCreERT2:Ror2floxマウスまたはSftpcCreERT2:Ptenfloxマウスに8週齢より週1回TMXを腹腔内投与する。10週齢と30週齢の各遺伝子欠損マウスを用い、肺気腫自然発症の有無をmicro-CT (Voxel Count)と肺組織HE染色(平均肺胞径(MLE)と断片指数(DI))で、肺線維症自然発症の有無をM-T染色、肺組織中コラーゲン値測定で解析する。AT2の細胞骨格変化をファロイジン-アクチン染色で評価する。基底膜とAT2, AT1の接着とAT2-AT1間連結を電子顕微鏡で解析する。(3)AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損によるAT2-MANC間の距離変化-上記実験(2)のマウス肺組織を用い、AT2をSftpcで免疫染色する。Z-stacksによる三次元的共焦点画像解析により、AT2の核とMANC(Axin2+-PDGFRα+)の核間の距離を測定し、AT2内分子が与えるニッチの空間分布への影響を解析する。ニッチ細胞標識マウスの動物実験計画書の承認が2019年5月となったため。次年度に次年度使用額を合わせてニッチ細胞標識マウスを購入する。
フェイトマッピングによる象牙芽細胞分化因子の解明と象牙質再生療法への応用

これまで硬組織の再生医療を視野に、破骨細胞による骨吸収によって骨細胞の分化段階が影響を受けることや、骨細胞周囲の骨基質の石灰化が骨細胞のsclerostin発現に先行することを示してきた。最近は歯の硬組織、歯周組織の再生を視野にその研究分野を広げている。象牙質形成に関しては、これまでに歯髄組織において、分化度の異なる象牙芽細胞系譜細胞が存在することを明らかにしてきた。近年、形態形成に必須なヘッジホッグシグナリングの下流にある転写因子Gli1を発現する歯髄細胞が幹細胞特性を有し、歯髄傷害時に象牙芽細胞へ分化することが報告された。このことを受け、1)誘導性Cre/loxPシステムを導入した細胞系譜(フェイトマッピング)解析が可能なマウスを用い、Gli1陽性歯髄幹細胞から硬組織形成細胞・象牙芽細胞へ分化していく過程を検討している。これまでに生後4週でタモキシフェンを投与した後のマウス第一臼歯歯髄でGli1を発現する歯髄細胞を確認した。さらに生後6週でもその数に大きな増減は見られなかった。一方で、Gli1発現細胞は生後4週の第一臼歯歯根膜にも存在した。これらラベルされた細胞は生後6週で増加していた。次にタモキシフェンを投与した生後4週マウスの第一臼歯を抜去し、同腹子に移植すると歯髄内に硬組織形成がみられ、Gli1発現細胞の子孫細胞がその硬組織の表面に配列していた。さらに根分岐部に新生骨形成を認め、その表面にラベルされた細胞が配列していた。このことから、生後4週のマウス第一臼歯歯髄、歯根膜にみられるGli1発現細胞は硬組織形成細胞に分化する能力を持った細胞であることが示された。歯髄におけるGli1陽性細胞の分布を確認した。移植実験ではこの細胞が硬組織形成にかかわることが示唆された。一方で歯根膜のGli1陽性細胞は線維芽細胞、骨芽細胞などに分化し、歯周組織の再生に関わることがわかった。今後、これら系譜細胞の象牙質形成を検討するとともに段階的に採取し、発現遺伝子の比較・機能解析から、象牙芽細胞の分化決定因子を同定する。またGli1-GFP Tg;p53-/-マウスの歯根膜からGli1陽性細胞を分取し,株化することを試みている。株化により多量なGli1陽性歯根膜細胞が得られたら,以下の実験を行うことを計画している。1.Gli1陽性細胞と陰性細胞における幹細胞マーカーの発現を比較検討する。2.In vitroにおいて,Gli1陽性細胞を骨芽細胞,軟骨細胞,脂肪細胞,神経細胞に分化誘導し,多分化能を持つことを証明する。
低エネルギーイオンの分子との電荷移行衝突における解離過程の解明

H^+,O^+-C_2H_6,C_3H_8の各衝突系における電荷移行反応の全断面積がまだ測定されてなかったので,従来からの一個もMCP-PSDを用いた生長率法でまずこれらを測定した。なお入射イオンのエネルギー範囲は,H^+イオン衝突系に対しては0.24.0keVで、またO^+イオン衝突系に対しては0.24.5keVでそれぞれ測定が行なわれた。その結果、H^+イオン衝突系の断面積値は,入射エネルギーの増加と共に緩やかに減少していく傾向が認められた。またO^+イオン衝突系の断面積値は約1keVまでは入射エネルギーの増加と共に緩やかに減少し、約1keV以上の領域ではほぼ一定となる傾向が認められた。過去に測定された標的CH_4分子に対する断面積値の入射エネルギー依存性と、それぞれの衝突系で大変類似している。このことは、これらの衝突系は何れも発熱反応であり、CH_4分子も含め,反射前後のポテンシャルエネルギー曲線の構造が類似していることで定性的に説明できる。更に01son-Demkov理論に基ずく計算結果との比較から、O^+イオン衝突系では基底状態よりも第一励起状態への電子捕獲が支配的であり,またH^+及びO^+イオン衝突系共に反応後の二次分子イオンの振動励起過程が重要であると示唆された。代表者らが開発してきた2パラメータの波高分析システム(2D-MCA)と二次イオン引き出し装置(TOF型)を使用し,入射イオンと標的の二次イオンの同時測定を行った。しかしTOFスペクトルの時間分解が十分でなく、コンスタントフラクションディスクリを用いたが、改善されなかった。この結果2D-MCAシステムなどに問題があるのではなく、圧力のやや高いガス衝突室内で二次イオンを検出することに問題があると考え,キャピラリープレートを用いたノズルビーム方式の引き出し装置に変更した。設計製作は終了したので、新しい装置で再度同時測定を行い,標的分子の解離過程の解明を続けていく予定である。
国内産業構造変化が起業活動に与える影響について：フィンランドの事例から

本研究は社内の資源を活用し、従業員に対し起業活動を提供する教育・育成方法を明らかにすることを目的にしている。このような問題意識の下、フィンランドのノキア社が自社の従業員に提供したブリッヂ・プログラムの起業トラックに着目し、そのプログラムの運営側(ノキア社)が行ったサーベイ・データを用いて分析を行った。同時に、フランスとフィンランドの研究者の協力を得ながら、研究を行った。最終年度の実績は以下の二点にまとめられる。1)研究内容修正を行った。アントレプレナー教育の効果が受講生のバックグラウンド(専門、仕事経験、など)によって異なることが分かった。例えば、研究開発部門出身であるか否か、またマネジメント経験があるか否かを考慮し、受講生のバックグラウンド毎に分析を追加的に行い、その内容を論文に反映した。2)研究成果を日本国内外のワークショップで発表した。参加者から、サーベイ内容の独自性・貴重性について指摘を受け、本研究で用いるデータの基調を再認識した。一方で、サーベイは研究代表者と協力研究者が作成したものではないことから、アカデミック研究で用いるための限界点も再度指摘された。なお、本研究成果はディスカッション・ペーパーとして出版されている。出版以後、国際学会やワークショップの場で得たコメントを反映し、ドラフトを大きく書き直した。また、本研究成果を国際英文学術誌に投稿した。第2次査読のプロセスにある。本年度は、研究を進めるため必要な知識を身に着けることに専念した。まず、フィンランドの起業活動に関する先行研究・資料のレビューを行った。フィンランドの起業活動は2010年前までにヨーロッパで最も低い水準であったが、2010年以降急激に伸びたことを先行研究・資料が裏付けていた。次に、フィンランド固有のビジネス環境・文化について調べ理解を深めた。フィンランドは過去40年で、農業社会から工業社会へ、また工業社会から情報社会へと急速な変化を経験していることが分かった。最後に、定性的研究に必要なフィールド・ワークの技法について調べた。インタビュー調査の方法、定性分析方法、定性的研究論文の仕上げ方などについて分かった。上記の活動を通じ、効率よく研究を進めるための準備ができた。まず、本研究を実施するために必要な知見を得ることができた。現在フィンランドで行われている活発的な起業活動は脱工業社会から情報社会に移る過渡期の現象ととらえる必要があることが分かった。したがって、すべての起業活動を模範にするには問題があり、マクロデータを使用する際、また調査対象を選定する際には注意が必要であることが分かった。また、先行研究・資料のレビューを通じ、現地調査で実施する調査項目を具体化できただけでなく、本研究に知見をもたらしてくれる研究者を探すことができた。すでに何名かにはコンタクトを取っており、本研究に対する助言を頂いただいた。さらに、本研究の分析対象として適切なインタビュー対象候補者(企業家)を複数名紹介された。現在まで、予期していないことが起こらず、当初の計画通りに進んでいるため。今年度の研究実績は以下のとおりである:【起業プログラム提供者と起業家へのインタビュー実施】現地を二度訪れ、インタビュー調査を行った。起業プログラムに参加し、その起業プログラムから起業教育と助成を受けたフィンランドのスタートアップ起業家らを対象にインタビュー調査を行った。また、過去に起業プログラムを運営した代表者もインタビューした。インタビュー調査を通じて、その起業プログラムに関する基礎的な知識を得ることができた。【研究データの入手、及び共同研究者(共著者)の追加】フィンランドでインタビュー調査を進めていたところ、上記の起業プログラムの参加者に対して行われたサーベイデータが存在することを知った。そのサーベイデータの所有権を持つ機関から、そのサーベイデータを本研究で使用する許可を得ることができた。しかし、研究代表者にはそのデータへのアクセス権が与えられなかった。従って、そのサーベイデータへのアクセス権を有する研究者を共同研究者に追加し、研究を進めることにした。その共同研究者は最終成果物に共著者として追加する予定である。【記述統計分析の実施、及びデータの適切性の確認】上記のサーベイデータを使って、記述統計分析を行った。記述統計分析を通じて、そのサーベイデータは本研究の趣旨に適切であり、本研究での問題意識に対する答えを得られるデータであることを確認した。従って、本研究でそのサーベイデータを本格的に使用することにした。【2年目までの研究計画】当初の計画では、2年目に三つの内容を行うことを計画していた。1)現地調査:スタートアップ起業家インタビュー実施(フィンランド出張)、2)インタビュー結果のデータベース化及び研究データ整理、3)計量モデルの設定、データ処理方法修正、研究デザイン変更を実施。【現在までの進行具合】今年度まで、計画していた三つの内容を行うことができた。具体的には、1)2016年6月と2017年2月にヘルシンキでスタートアップ起業家インタビューを実施した。2)インタビュー結果をまとめ、データベース化を行った。さらに、スタートアップ起業家のサーベイデータを得ることができた。3)インタビュー結果から得た知見を基に、サーベイデータの記述分析を行った。追加的に、同データを用いて簡単な計量モデルを設定し、分析を行った。本研究は、社内の資源を活用し、起業活動を教育し・支援する方法を明らかにすることを目的にしている。上記の問題意識に対する答えを得るために、ノキアが自社の従業員に提供したブリッヂ・プログラムの起業トラックに着目し、そのプログラムの運営側が行ったサーベイ・データを用いた分析を行っている。

理論構築のために参考する既存研究として、起業家の特性と育成・教育に関する研究とスピンオフ戦略に関する研究を参考した。起業家は教育により育成可能であるとされるが、起業家育成に有効な教育内容については議論がまだまとまっていないことが分かった。また、スピンオフ戦略は有効的であるが、企業が縮小しているときに有効であるかはまだ分析されていないことが分かった、以上の既存の研究を踏まえ、これまでのサーベイ・データ分析を通じて明らかになった重要点は以下の三つにまとめられる:1)専門性をさらに強化する教育が起業活動につながったこと、2)「戦略概論」「市場分析」等の基礎的な経営系の科目の教育が企業活動につながったこと、3)かりに、企業が縮小しているとしても、スタートアップに資金を提供すれば、そのスタートアップ企業とのビジネス連携が発生し、ビジネス・エコシステムが形成できること。これらの分析は、ある企業がスピンオフ戦略を実施する際、あるいはビジネス・エコシステムを形成する際に活用できる知見を提供している。最後に、これまでの研究成果をいくつかの国際学会とワークショップの場で発表し、参加者からフィードバックを得た。参加者からは本研究の実務性を高く評価された他、サーベイ内容の限界点を指摘された。研究発表を行った内容と他の研究者から得たフィードバックに対する追加分析をまとめ、ディスカッション・ペーパーを執筆した。当初の計画通り、研究発表、ディスカッション・ペーパーの執筆ができた。本研究は社内の資源を活用し、従業員に対し起業活動を提供する教育・育成方法を明らかにすることを目的にしている。このような問題意識の下、フィンランドのノキア社が自社の従業員に提供したブリッヂ・プログラムの起業トラックに着目し、そのプログラムの運営側(ノキア社)が行ったサーベイ・データを用いて分析を行った。同時に、フランスとフィンランドの研究者の協力を得ながら、研究を行った。最終年度の実績は以下の二点にまとめられる。1)研究内容修正を行った。アントレプレナー教育の効果が受講生のバックグラウンド(専門、仕事経験、など)によって異なることが分かった。例えば、研究開発部門出身であるか否か、またマネジメント経験があるか否かを考慮し、受講生のバックグラウンド毎に分析を追加的に行い、その内容を論文に反映した。2)研究成果を日本国内外のワークショップで発表した。参加者から、サーベイ内容の独自性・貴重性について指摘を受け、本研究で用いるデータの基調を再認識した。一方で、サーベイは研究代表者と協力研究者が作成したものではないことから、アカデミック研究で用いるための限界点も再度指摘された。なお、本研究成果はディスカッション・ペーパーとして出版されている。出版以後、国際学会やワークショップの場で得たコメントを反映し、ドラフトを大きく書き直した。
脂肪細胞の質的異常モデルを用いた代謝異常症およびNASHの分子機構の解明

インスリンによる代謝作用の発現に中心的な役割を担う分子PDK1の脂肪細胞特異的欠損マウスはインスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を呈する。一方、PDK1下流の転写因子FoxO1を脂肪細胞において追加欠損するマウスにおいてこれらの病態は改善する。代表者は両マウスを用いたオミックス解析により脂質メディエーターLTB4がインスリン抵抗性とNASHの病態に関与すること、脂肪細胞のインスリンシグナルがPDK1-FoxO1経路を介して5-LO-LTB4軸を負に制御することを同定した。脂肪細胞の5-LO-LTB4軸はインスリン抵抗性と関連疾患に対する治療標的に資する可能性がある。インスリンによる代謝作用の発現に中心的な役割を担う分子PDK1の脂肪細胞特異的ノックアウトマウス(Adipo-PDK1KOマウス)は、脂肪細胞の広範な機能不全により、インスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を呈する。一方、インスリンシグナルにおいてPDK1下流に位置する転写因子FoxO1を脂肪細胞特異的に追加欠損する脂肪細胞特異的PDK1/FoxO1ダブルノックアウトマウス(Adipo-PDK1/FoxO1DKOマウス)において、インスリン抵抗性とNASHは顕著な改善を示す。すなわち、脂肪細胞のPDK1-FoxO1経路は、これらの病態に密接に関与するものと考えられる。代表者は、インスリン抵抗性とNASH発症・進展のメカニズムを明らかにするために、Adipo-PDK1KOマウスとAdipo-PDK1/FoxO1DKOマウスを用いたオミックス解析を行い、発現量の変化する液性因子を探索した。その結果、Adipo-PDK1KOマウスにおいて脂肪組織中および血中濃度が増加し、Adipo-PDK1/FoxO1DKOマウスにおいてその増加が回復する液性因子を同定した。さらに両マウスの脂肪組織を用いたマイクロアレイ解析を行い、この液性因子の量の調節に関与する遺伝子発現がAdipo-PDK1KOマウスにおいて増加し、Adipo-PDK1/FoxO1DKOマウスにおいて回復することを見出した。代表者らが作製した2つのモデルマウスのオミックス解析により、インスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎に関与することが示唆される液性因子とその産生に関与する遺伝子を当初の計画通り同定した。インスリンによる代謝作用の発現に中心的な役割を担う分子PDK1の脂肪細胞特異的ノックアウトマウス(A-PDK1KOマウス)は、脂肪細胞の広範な機能不全を示しインスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を呈する。一方、PDK1の下流に位置する転写因子FoxO1を脂肪細胞特異的に追加欠損する脂肪細胞特異的PDK1/FoxO1ダブルノックアウトマウス(A-PDK1/FoxO1DKOマウス)においてインスリン抵抗性とNASHは顕著な改善を示す。すなわち、脂肪細胞のPDK1-FoxO1経路によって制御される何らかの液性因子がインスリン抵抗性やNASHの病態に関与するものと考えられる。代表者は、このような液性因子を同定するために、A-PDK1KOマウスとA-PDK1/FoxO1DKOマウスを用いたオミックス解析を行った。脂肪組織のトランスクリプトーム解析において、アラキドン酸に由来するある特定の脂質メディエーターの産生酵素の発現がA-PDK1KOマウスにおいて増加し、A-PDK1/FoxO1DKOマウスにおいて正常化していた。この結果と一致して、脂肪組織と血液を用いたリピドーム解析において、アラキドン酸由来の特定の脂質メディエーター濃度がA-PDK1KOマウスにおいて増加し、A-PDK1/FoxO1DKOマウスにおいて正常化することを見出した。この脂質メディエーターの受容体アンタゴニストをA-PDK1KOマウスに投与することでA-PDK1KOマウスのインスリン抵抗性は顕著な改善を示した。以上の結果から、この脂質メディエーターが、A-PDK1KOマウスのインスリン抵抗性を惹起することが明らかとなった。本研究は、インスリン抵抗性とNASHを呈するA-PDK1KOマウスとこれらの病態が改善するA-PDK1/FoxO1DKOマウスを用いたオミックス解析により、インスリン抵抗性とNASHの病態形成のメカニズムの解明を目的としたものである。現在までに上記マウスを用いたオミックス解析により、アラキドン酸に由来するある特定の脂質メディエーターの量が脂肪組織と血液中において変化することを見出した。さらにこの脂質メディエーターの受容体アンタゴニストを用いた解析によりこの因子が実際にインスリン抵抗性に関与することも明らかとした。さらに、この脂質メディエーターの産生酵素や受容体の遺伝子改変マウスについてもすでに当大学への搬入を完了し解析の準備を進めている。以上より、本研究計画は当初の計画通りおおむね順調に進展していると評価することができる。インスリンによる代謝作用の発現に中心的な役割を担う分子PDK1の脂肪細胞特異的ノックアウトマウス(A-PDK1KOマウス)は脂肪細胞の広範な機能不全を示し、通常食環境において全身性のインスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を呈する。一方、PDK1下流の転写因子FoxO1を脂肪細胞において追加欠損する脂肪細胞特異的PDK1/FoxO1ダブルノックアウトマウス(A-PDK1/FoxO1DKOマウス)においてインスリン抵抗性とNASHは顕著な改善を示す。

代表者は、脂肪細胞のPDK1-FoxO1経路によって制御され全身のインスリン抵抗性とNASHの病態に関わる液性因子を明らかにするために、A-PDK1KOマウスとA-PDK1/FoxO1DKOマウスの血漿および脂肪組織を用いた統合的オミックス解析を行った。その結果、アラキドン酸から産生される脂質メディエーターleukotriene B4 (LTB4)濃度が、A-PDK1KOマウスにおいて増加しA-PDK1/FoxO1DKOマウスにおいて正常化することを見出した。またこの変化と一致して脂肪組織のマイクロアレイにおいてLTB4の産生酵素5-lipoxygenase (5-LO)の発現変化が認められた。実際に、単離脂肪細胞を用いた検討において、インスリンシグナルがPDK1-FoxO1経路を介して5-LO-LTB4を負に制御することを明らかとした。脂肪細胞のインスリン-PDK1-FoxO1経路は5-LO-LTB4軸の抑制を介して全身のインスリン抵抗性とNASHの病態に関与する可能性が示された。インスリンによる代謝作用の発現に中心的な役割を担う分子PDK1の脂肪細胞特異的欠損マウスはインスリン抵抗性と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を呈する。一方、PDK1下流の転写因子FoxO1を脂肪細胞において追加欠損するマウスにおいてこれらの病態は改善する。代表者は両マウスを用いたオミックス解析により脂質メディエーターLTB4がインスリン抵抗性とNASHの病態に関与すること、脂肪細胞のインスリンシグナルがPDK1-FoxO1経路を介して5-LO-LTB4軸を負に制御することを同定した。脂肪細胞の5-LO-LTB4軸はインスリン抵抗性と関連疾患に対する治療標的に資する可能性がある。今回同定した液性因子が、実際にインスリン抵抗性や非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の病態に関与するかどうかを検証する。具体的には、この液性因子の産生酵素の阻害剤や受容体に対する拮抗剤を脂肪細胞特異的ノックアウトマウス(Adipo-PDK1KOマウス)に投与し、インスリン抵抗性やNASHに対する効果を検討する。また、今回同定した液性因子の産生酵素の脂肪細胞特異的トランスジェニックマウスを作製し、インスリン抵抗性やNASHの発症・進展における同酵素の意義を明らかにする。今回同定した脂質メディエーターがインスリン抵抗性を惹起することを明らかとしたが、NASHの病態形成にも関与するかどうかを受容体アンタゴニストを用いた解析により検討する。また脂質メディエーターの産生酵素や受容体のノックアウトマウスを用いた手法により、本脂質メディエーターの病態への関与を明らかとする。さらに、ヒトのサンプルを収集して脂質メディエーター濃度を評価することで、ヒトのインスリン抵抗性やNASHの病態に本脂質メディエーターが関与するかどうかを検討する予定である。代謝学本年度予定していた論文発表を延期したため英文校正費用が不要となったため。次年度以降の論文発表の際の英文校正費用に充てる。
両生類の初期発生における形態形成に関する新規遺伝子の探索と解析

脊椎動物の発生過程におけるオーガナイザー形成のメカニズムを明らかにすることを目的とし、研究材料としてアフリカツメガエルの初期胚を用いて、胚の中で背側化シグナルを受け一番最初に転写され、かつ強いオーガナイザー様の活性を持つノーダル関連遺伝子Xnr5とXnr6に着目し、これらの遺伝子がオーガナイザー形成因子の実体として働いているとの仮定に基づき、これらの遺伝子のより詳細な機能解析実験を行った。これまでにXnr5とXnr6の機能を阻害すると考えられる改変遺伝子cleavage mutantを作成し、これらを用いることによって、脊椎動物の発生過程において、オーガナイザー形成、内胚葉および中胚葉の形成がノーダル関連遺伝子Xnr5とXnr6の機能に依存しているという新しいモデルが提唱できた。そこで、この改変遺伝子の初期胚への影響をマイクロインジェクション法、RT-PCR法、ウェスタンブロッティング法、等を用い詳しく調べることにより、この改変遺伝子がXnr5とXnr6以外のTGF-betaタンパク質とも相互作用することが明らかになり、このことによって、Xnr5とXnr6が、その構造から予想されこれまでに証明されてきた機能の他にも、より複雑で多彩な機能を有しているという新しい知見を打ち出すことが出来た。この新規の機能についてはそのメカニズムの解析とともに現在、論文を作成し発生学の国際専門誌に投稿中である。また、これらの新たに得られた知見は、第35回日本発生生物学会大会において発表した。