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核酸塩基アニオンを構築素子とする多核金属錯体の合成とその構造および機能の制御

特に、カルシウムイオンをテンプレートとする四核錯体では、硝酸イオンを含む場合には1,2,3-型架橋のみを生成するのに対し、過塩素酸イオンを含む場合は1,2,3-型と1,2,4-型が交互に積層した特徴的な結晶構造を示した。さらに、シアノ基とカルボキシル基を分子内に含む有機アニオンを共存すると、1,2,3-型架橋様式を持つカリックス[4]アレーン型環状四核ユニットを有機アニオンが連結した一次元鎖状高分子の合成に成功した。この成果は、金属フラグメントを基本構成素子とするカリックスアレーン型の環状多核錯体を、自己組織化的に自在に組み上げる方法の確立に寄与すると考えられる。本研究では、核酸塩基に由来する高選択的な分子またはイオン認識能と、遷移金属錯体フラグメントが有するd電子に由来する諸物性を組み合わせた多重機能性物質の開発を目指した。その成果のひとつとして、共存する金属イオンの種類に依存して結合様式を選択する、チミナト(2-)イオン架橋環状ロジウム四核錯体の合成に成功した。さらに、お椀型構造を有するこの環状四核錯体を立体制御しながら連結し、方向性の高い一次元鎖状構造体の構築にも成功した。一方、核酸塩基アニオンを含む新たな擬ヌクレオシド錯体の創製にも多数成功し、その分子構造および水素結合能を明らかにした。当初の研究計画で平成26年度までに実施予定としていた標的化合物の大部分を合成し、その分子構造および結晶構造の帰属、磁気的および電気化学的・分光学的性質の解明をすることができた。特に、一連のテンプレート金属イオンを含む環状ロジウム四核錯体については、その生成反応と結晶構造および溶存構造をまとめて、国際的評価の高い学術雑誌に発表した。一方、電気化学的手法により環状骨格内に不対スピンを有する多核錯体の合成を計画していたが、この化合物の電気化学測定および予備的な電解還元実験により、単離可能な還元種が得られないことがわかった。そのため、合成戦略を再考し骨格金属イオンの種類を代えることで目的とする不対スピン含有環状多核錯体を設計し、その合成実験に取り組んでいる。また、核酸塩基配位子を鍵とする機能性金属錯体複合体の構築に関しては、その新たな構築素子として、共存配位子を置換した擬ヌクレオチド錯体の合成に着手している。既にいくつかの新規核酸塩基錯体の単離・構造解析に成功していることから、研究は順調に進展している。錯体化学特定の分子機能を有する核酸塩基架橋環状多核錯体を構築するため、これまでに合成してきたテンプレート金属/ロジウム四核錯体に加え、不対d電子を有する遷移金属イオンをテンプレートとして用いた多核錯体や、環状骨格にロジウム以外のへテロ金属を段階的に組み込んだ多核錯体の構築を行い、不対電子スピンと異種金属核のsynergistic相互作用による新たな機能性の開拓を行う。また、核酸塩基間の水素結合を活用した金属錯体複合体の構築に関しては、共存配位子に対して架橋配位に適切な分子設計を施し、相補的な核酸塩基を単一分子中に組み込んだ二核錯体構築素子の開発に取り組む。この構築素子は外場に応答して、水素結合相互作用による自己集合(多核化)と解裂(分解)することが可能であり、さらに形成される内部空間に別のゲスト分子を取込むことも可能である。これらの利点によりこの種の化合物は本研究の最終目的物質のひとつともいえる。そのため、これらの合成と基本物性の解明に取り組む。
人工骨頭用材料の先進的サイマル表面改質加工プロセスの研究

現在,金属系インプラント材料としては,ステンレス鋼やTi合金,Co-Cr合金などが用いられているが,体重の約5倍程度の負荷が加わると言われる大腿骨・人工骨頭部には摺動性・耐摩耗性に優れたCo-Cr合金が多く用いられている.この部位に使用されるCo-Cr合金には優れた耐食性・耐摩耗性・腐食疲労特性等が要求されるうえ,化学的安定性を向上させるためにも,その表面には鏡面上の仕上がりが望まれる.本研究は大腿骨・人工骨頭部に使用されるCo-Cr合金のさらなる高品位化に際して,一層の精度と表面機能の両立を達成するため,"サイマルプロセス(同時工程内)"でナノ精度加工と所望の表面機能(耐食性,耐摩耗性,生体適合性)を付与するという,革新性の高い独創的な表面改質加工技術の開発を目指す.本申請では,新しいナノ表面加工におけるサイマル表面改質加エプロセスを用いたバイオインプラント材料の高機能化を最終目的とし,この実現に向けて,以下の2つの項目を重要な柱として研究期間内に実施している.1.人工骨頭用素材Co-Cr合金のナノ表面加工における先進的サイマル表面改質加工プロセスの確立2.生体内環境をシミュレートした材料評価システムによる摩擦摩耗・腐食挙動の解明具体的には,人工骨頭用Co-Cr合金に対する表面仕上げ法として超精密研削法を適用するための第一段階として,加工面の詳細な観察および分析を行った.その結果,#8000砥石による最終仕上げ加工によって,算術平均粗さRaで7nmという極めて良好な加工面粗さが得られた.さらに,アルミナ研磨材に比べてELID研削材は優れた表面硬さ,細胞毒性を示しており,その原因はELID研削がもたらすクロムの酸化現象および窒素の拡散現象であると示唆された.現在,金属系インプラント材料としては,ステンレス鋼やTi合金,Co-Cr合金などが用いられているが,体重の約5倍程度の負荷が加わると言われる大腿骨・人工骨頭部には摺動性・耐摩耗性に優れたCo-Cr合金が多く用いられている.この部位に使用されるCo-Cr合金には優れた耐食性・耐摩耗性・腐食疲労特性等が要求されるうえ,化学的安定性を向上させるためにも,その表面には鏡面上の仕上がりが望まれる.本研究は大腿骨・人工骨頭部に使用されるCo-Cr合金のさらなる高品位化に際して,一層の精度と表面機能の両立を達成するため,"サイマルプロセス(同時工程内)"でナノ精度加工と所望の表面機能(耐食性,耐摩耗性,生体適合性)を付与するという,革新性の高い独創的な表面改質加工技術の開発を目指す.本申請では,新しいナノ表面加工におけるサイマル表面改質加工プロセスを用いたバイオインプラント材料の高機能化を最終目的とし,この実現に向けて,以下の2つの項目を重要な柱として研究期間内に実施している.1.人工骨頭用素材Co-Cr合金のナノ表面加工における先進的サイマル表面改質加工プロセスの確立2.生体内環境をシミュレートした材料評価システムによる摩擦摩耗・腐食挙動の解明具体的には,改質加工と高温酸化処理の複合プロセスによる新しい表面改質法を開発する可能性について検討するため,改質研削を施した試験片と研磨仕上げを施した試験片に対して,大気中で高温酸化処理を行い,処理後の試料表面がどのように変化するかについて詳細な分析を行った.その結果,研磨材に比べて改質材は高品位な表面粗さおよび優れた摩耗特性を示した.改質材におけるこのような表面機能性の向上は,高温酸化処理により表面に形成されたスピネル型複酸化物FeCr_2O_4およびCr_2O_3が極めて緻密かつ均一な構造を有することが効果的に作用したものと示唆された.現在,金属系インプラント材料としては,ステンレス鋼やTi合金,Co-Cr合金などが用いられているが,体重の約5倍程度の負荷が加わると言われる大腿骨・人工骨頭部には摺動性・耐摩耗性に優れたCo-Cr合金が多く用いられている.この部位に使用されるCo-Cr合金には優れた耐食性・耐摩耗性・腐食疲労特性等が要求されるうえ,化学的安定性を向上させるためにも,その表面には鏡面上の仕上がりが望まれる.本研究は大腿骨・人工骨頭部に使用されるCo-Cr合金のさらなる高品位化に際して,一層の精度と表面機能の両立を達成するため,"サイマルプロセス(同時工程内)"でナノ精度加工と所望の表面機能(耐食性,耐摩耗性,生体適合性)を付与するという,革新性の高い独創的な表面改質加工技術の開発を目指す.本申請では,新しいナノ表面加工におけるサイマル表面改質加エプロセスを用いたバイオインプラント材料の高機能化を最終目的とし,この実現に向けて,以下の2つの項目を重要な柱として研究期間内に実施している.1.人工骨頭用素材Co-Cr合金のナノ表面加工における先進的サイマル表面改質加工プロセスの確立2.生体内環境をシミュレートした材料評価システムによる摩擦摩耗・腐食挙動の解明具体的には,人工骨頭用Co-Cr合金に対する表面仕上げ法として超精密研削法を適用するための第一段階として,加工面の詳細な観察および分析を行った.その結果,#8000砥石による最終仕上げ加工によって,算術平均粗さRaで7nmという極めて良好な加工面粗さが得られた.さらに,アルミナ研磨材に比べてELID研削材は優れた表面硬さ,細胞毒性を示しており,その原因はELID研削がもたらすクロムの酸化現象および窒素の拡散現象であると示唆された.
筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角に蓄積するヘパラン硫酸様物質の精製及び同定

HepSS-1が認識する物質はALSの病態に関与している可能性がある。したがって、本研究では、HepSS-1が認識する物質をヒト脊髄から分離・精製し同定する。非神経疾患症例の脊髄ホモジネートを超遠心し、上清(TBS上清)と沈渣を得た。沈渣は8M尿素を含むTBSを用いてホモジナイズし、超遠心後、上清を回収した(8M尿素上清)。HepSS-1を一次抗体とするWesternblottingを行い、TBS上清画分に約24kDa、8M尿素上清画分に約18kDaの陽性バンドを認めた。SDAーPAGE、Western blotting、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび二次元電気泳動法を用い精製を進め、以下の結果を得た。1.TBS上清画分中の24kDa蛋白質のN末端アミノ酸配列はPVDLSKWSGPLSLQEVDEQPQHであった。これはneuropolypeptideh3のN末端アミノ酸配列と完全に一致した。2.特大二次元電気泳動装置を自作し、8M尿素上清画分中の18kDa蛋白質を単一スポットにまで分離・精製したがN末端はプロックされていた。3.18kDa蛋白質のN末端をプロックしている基は、アセチルセリン、アセチルトレオエンではなく、また、ホルミル基でもなかった。4.18kDa蛋白質はリシルエンドペプチダーゼによる消化に対して抵抗性を示した。HepSS-1により認識されるヘパラン硫酸プロテオグリカンを精製するため、IDPNを投与しスフェロイドを形成させたWistarラット30匹の脊髄をトリス塩酸緩衝液を用いてホモジネートし超遠心した。この沈査を8M尿素溶液でホモジネートし、8M尿素可溶性画分を回収した。この画分をSDS-PAGEし、Western blotにて検討した結果、HepSS-1に認識される約14.4kDaの細いバンドと、60100kDaの間に2本の太いバンドが認められた。2本の太いバンドはHepSS-1を反応させなくてもバンドが出現したので、非特異的なバンドと判断した。それに対して、14.4kDaバンドはHepSS-1の除去により完全にバンドは消失したので、HepSS-1が認識する特異的バンドと判断した。同様に、低分子ニューロフィラメント・トリプレットを認識する抗体で検討した結果、14.4kDaバンドとは異なった位置に陽性バンドが出現した。従って、Hepss-1が認識する物質はニューロフィラメントではないと判断した。上記の8M尿素可溶性画分をゲル濾過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを行って検討したが、クロマトグラフィーの各種条件設定が困難であったため、2次元電気泳動にて精製する方向に切り換えた。この間、ヒト脊髄凍結組織が入手できたので、IDPN投与ラットと同様の検索を行い、同様の結果を得た。従って、現在、ヒト脊髄(正常及びALS症例)を用いて2次元電気泳動により精製を行っている。研究経過ヒト脊髄組織を中性緩衝液でホモジネートし、超遠心後、沈渣を8M尿素溶液でホモジネートし、8M尿素可溶性画分を回収した。HepSS-1に認識されるヘパラン硫酸プロテオグリカンはこの8M尿素可溶性画分に存在することは既に昨年明らかにした。本年度は2次元電気泳動法を用いて、HepSS-1に認識されるスポットを同定し精製を試みた。しかし、目的とするスポットの近傍に多数の他の蛋白質のスポットが混在し、また、目的とするスポットの蛋白量が極めて微量であるため、いろいろと条件を変えて繰り返し行ったがアミノ酸配列決定には至らなかった。そこで、昨年度に試みて条件設定が困難であったクロマトグラフィー法に再度挑戦し、試行錯誤を繰り返した結果、イオン交換クロマトグラフィーの最適条件を決定した。

次に、この陽性画分をゲル濾過クロマトグラフィー法で分離し、全画分を0.1%SDS溶液で透析後、凍結乾燥を行い濃縮し、Western blotを行い陽性画分を得た。この時点で単一バンドに精製できた。
ヒストン脱メチル化酵素による造血幹細胞の自己複製・分化制御機構の解析

ピストン脱メチル化酵素は、発生、分化、幹細胞の維持などに重要な役割を果たしていることが報告されている。我々は、マウス骨髄より純化した造血幹細胞(CD34^-c-Kit^+Sca-1^+Lin^-:CD34^-KSL)、造血前駆細胞(CMP、GMP、MEP)や分化成熟細胞におけるピストン脱メチル化酵素遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて体系的かつ網羅的に解析した。これにより、ピストンH3K36特異的な脱メチル化酵素であるFbx110(Jhdm/b/Kdm2b)が、造血幹細胞を含む未分化な分画で発現が高く、分化とともに発現が低下していくことから、造血幹細胞の制御に関与する可能性が示唆された。レトロウイルスによる強制発現系を用いて、マウスCD34^-KSL造血幹細胞におけるFbx110の効果をin vitroおよびin vivoの系において検証した。造血幹細胞において、その強制発現を行った結果、多分化能を有するコロニー形成細胞数が亢進した。また、競合的骨髄再構築能をマウス骨髄移植モデルの系で評価した結果、コントロールと比べて、連続移植における造血幹細胞の長期骨髄再構築能の枯渇が妨げられた。クロマチン免疫沈降法において、造血幹・前駆細胞において、Fbx110はピストンの脱メチル化を介して、p16^<Ink34a>やp15^<Ink4b>を直士妾制御していることが確認された。これらの結果は論文において報告した。さらに、白血病幹細胞におけるその役割を中心に解析を進めている。論文発表が行われたため。ピストン脱メチル化酵素を含むエピジェネティック制御分子であるEzh2などが造血幹細胞と同様に肝がん幹細胞の自己複製を制御している知見が得られたことから、現在、白血病幹細胞におけるその役割を中心に解析を進めている。我々は、フローサイトメトリーを用いてマウス骨髄より純化した造血幹細胞(CD34^-c-Kit^+Sca^-1+Lin^-)、造血前駆細胞(CMP、GMP、MEP)や分化成熟細胞において、DNAマイクロアレイを用いてヒストン脱メチル化酵の遺伝子発現プロファイルを網羅的、体系的に解析した。この結果、H3K36特異的な脱メチル化酵素であるFbxl10(F-box leucine-richrepeat protein10)/Jhdm1b/Kdm2bが、造血幹細胞を含む未分化な分画で発現が高く、分化とともに発現が低下していくことから、造血幹細胞の自己複製や未分化性の維持に重要な機能を果たしている可能性が示唆された。造血幹細胞において、レトロウイルスベクターを用いてFbxl10を強制発現した場合、In vitroのコロニーアッセイ法では、多分化能を有するコロニー形成数が亢進することが観察された。また、In vivoにおける効果である競合的骨髄再構築能をマウス骨髄移植の系で評価したところ、連続移植では、コントロールと比較して、造血幹細胞の枯渇が妨げられることが示された。これらの効果を示す標的遺伝子を検索した結果、造血幹・前駆細胞においてもFbxl10の標的遺伝子の一つとしては、マウス線維芽細胞と同様にInk4a-Arf-Ink4b領域であることが明らかとなった。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP)において、H3K36m2の脱メチル化とともにH2Aのユビキチン化を介して、直接制御していることが確認され、Fbxl10は、造血幹細胞の制御分子であるポリコームタンパク質との機能的関連性が示唆された。これらの内容を、2010年の日本血液学会およびアメリカ血液学会において報告し、現在投稿準備中である。ヒストン脱メチル化酵素は、発生、分化、幹細胞の維持などに重要な役割を果たしていることが報告されている。我々は、フローサイトメトリーを用いて、マウス骨髄より純化した造血幹細胞(CD34^-c-Kit^+Sca-1^-Lin^-: CD34^-KSL)、造血前駆細胞(CMP、GMP、MEP)や分化成熟細胞におけるヒストン脱メチル化酵素遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて体系的かつ網羅的に解析した。これにより、ヒストンH3K36特異的な脱メチル化酵素であるFbxl10(Jhdm1b/Kdm2b)が、造血幹細胞を含む未分化な分画で発現が高く、分化とともに発現が低下していくことから、造血幹細胞の制御に関与する可能性が示唆された。レトロウイルスによる強制発現系を用いて、マウスCD34^-KSL造血幹細胞におけるFdxl10の効果をin vitroおよびin vivoの系において検証した。造血幹・前駆細胞におけるFbxl10の強制発現では、p16^<Ink4a>やp15^<Ink4b>の抑制を示し、これは、クロマチン免疫沈降法において、H3K36の脱メチル化を介して、直接制御していることが確認された。これらの結果から、ヒストンH3K36脱

メチル化酵素であるFbxl10が、造血幹細胞の自己複製能の維持に重要な役割を果たす新規のエピジェネティックな制御分子であることを、2011年の第16回ヨーロッパ血液学連合(EHA)学術集会や論文において報告した。ピストン脱メチル化酵素は、発生、分化、幹細胞の維持などに重要な役割を果たしていることが報告されている。我々は、マウス骨髄より純化した造血幹細胞(CD34^-c-Kit^+Sca-1^+Lin^-:CD34^-KSL)、造血前駆細胞(CMP、GMP、MEP)や分化成熟細胞におけるピストン脱メチル化酵素遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて体系的かつ網羅的に解析した。これにより、ピストンH3K36特異的な脱メチル化酵素であるFbx110(Jhdm/b/Kdm2b)が、造血幹細胞を含む未分化な分画で発現が高く、分化とともに発現が低下していくことから、造血幹細胞の制御に関与する可能性が示唆された。レトロウイルスによる強制発現系を用いて、マウスCD34^-KSL造血幹細胞におけるFbx110の効果をin vitroおよびin vivoの系において検証した。造血幹細胞において、その強制発現を行った結果、多分化能を有するコロニー形成細胞数が亢進した。また、競合的骨髄再構築能をマウス骨髄移植モデルの系で評価した結果、コントロールと比べて、連続移植における造血幹細胞の長期骨髄再構築能の枯渇が妨げられた。クロマチン免疫沈降法において、造血幹・前駆細胞において、Fbx110はピストンの脱メチル化を介して、p16^<Ink34a>やp15^<Ink4b>を直士妾制御していることが確認された。これらの結果は論文において報告した。さらに、白血病幹細胞におけるその役割を中心に解析を進めている。平成23年度は、ヨーロッパ血液学連合(EHA)学術集会における口演発表や論文において報告したため。論文発表が行われたため。ヒストン脱メチル化酵素を含むエピジェネティック制御分子であるEzh2などが造血幹細胞と同様に肝がん幹細胞の自己複製を制御している知見が得られたことから、現在、白血病幹細胞におけるその役割を中心に解析を進めている。ピストン脱メチル化酵素を含むエピジェネティック制御分子であるEzh2などが造血幹細胞と同様に肝がん幹細胞の自己複製を制御している知見が得られたことから、現在、白血病幹細胞におけるその役割を中心に解析を進めている。
脳神経手術シミュレーションシステムに関する研究

我々は脳神経外科疾患において、CT、MRIの二次元画像からcomputer graphicsの技法を用いて三次元画像を構築し、仮想的に頭蓋内構造を表現することで、脳室内や頭蓋底における手術シミュレーションシステムの開発を行ってきた。頭蓋底を表現するためには頭蓋内構造ばかりでなく、頭蓋骨、頭皮を含めた頭部の情報が全て含まれていることが必須となる。3D-CTは神経や脳表の描出が不充分であり、またMRI画像を用いた三次元再構成では骨の情報が欠落している。そこでcomputer graphicsの技法を用いて、CTから抽出した頭蓋骨の情報とMRIより得た脳表、脳神経、血管系のデータを合致させた三次元仮想頭蓋底モデル(electric skull base)を作製する手法を考案した。これにより、複数の開頭法やアプローチによる視野の差異などを術前に表現することができ、詳細な術前検討が行えるようになった。更には実際の術中視野に近似したsimulation画像の描画が可能なことから、術者のimage trainingという目的には大変有用である。我々は脳神経外科疾患において、CT,MRIの二次元画像からcomputer graphicsの技法を用いて三次元画像を構築し、仮想的に頭蓋内構造を表現することで、脳室内や頭蓋底における手術シミュレーションシステムの開発を行ってきた。しかし、従来よりの研究では汎用のcomputerを用いていた為、手術シミュレーションの画像は静止画が主体であり、手術進行に伴った視野の変化を表現する為にはコマ撮りアニメーションを作製する必要があった。これは多大な労力を必要とするばかりでなく、アニメーション作成者の思惑通りにしか画像を表現できない為、シミュレーションの基本である"interactive"という観点からも問題があった。今回これを解決すべく、ハードウェアの面ではwork stationを導入し、ソフトウェアでの解決策としてVRML(virtual reality modeling language)を応用することにより、real timeに三次元画像を作製することが可能となった。このことにより、頭蓋内の立体構造を術中操作に応じて表現することができ、術者が病変に対するアプローチを検討する際、術前にシミュレーションを繰り返すことで、より安全で確実な手術につながるものと考えられる。本研究は手術シミュレーションだけでなく、手術トレーニングにも応用が可能であり、特に神経内視鏡のトレーニングシステムは現実的と考えている。次年度ではこの実現に向けて更に研究を進める予定である。
ドル化経済における銀行業の資本構成の決定要因：カンボジア銀行業の計量分析

ドル化が進んだカンボジアでは、銀行部門の総資産残高と総負債残高の90%以上がドル建てとなっている。このため、中央銀行は、最後の貸手機能を果たせず、民間銀行は著しく高い流動性資産の保有比率と自己資本比率を維持している。このことがカンボジア銀行業の費用効率性を低下させ、市場競争度にも影響を与えている。しかしながら、カンボジアの銀行の資本構成決定に関する計量分析は皆無である。本研究は、先進諸国で利用されている銀行分析手法を用いて、カンボジアの銀行業の資本構成の決定要因の解明を試みる。更に、その結果を踏まえて、中央銀行の最後の貸手機能の欠如に対応するための政策立案上の問題点についても検討を進めたい。
戦後日本映画における児童観客の実態調査

本研究は、戦後の日本映画における児童の映画観客の映画受容の実態・動向を多角的に明らかにしたものである。さらに本研究では、そのために当時の観客や視聴者調査にまつわる言説群も参照した。1950年代から60年代にかけての児童映画観客の実態は、主に二つの劇場外の映像受容の文脈と密接に結びついていることが明らかとなった。第一に1920年代から活発化した「映画教室運動」や「学校映画会」と呼ばれる学校施設での映画上映、そして第二に国産のラジオドラマやテレビアニメーションといった新たな放送メディアとの関わりである。とりわけ本研究では、1960年代に国産テレビアニメが児童映画観客に与えた影響を分析した。本研究では、戦後日本における「児童の映画観客」の成立・進展の過程や実態を検討することを目的とした。近年、観客史研究が盛んになりつつあるものの、日本における「児童」を含む年少の映画観客を対象にした総合的な研究はまだほとんど存在しておらず、とりわけ戦後の時期にいたってはほとんど調査研究がなされていない。したがって、本研究では、主に占領期から60年代の高度経済成長期までを対象として、児童文化史や大衆文化史、あるいは比較メディア史的なアプローチを踏まえながら、当該時期の児童の映画観客の実態について多角的な調査分析を行う。平成26年度の実施計画では、基礎研究として貴重図書を含む文献資料の収集、資料・作品目録の作成を中心に行うとした。すでに研究代表者の継続的な研究成果として、戦前から戦中期にいたる児童観客及び映画教育関連の資料の収集があった。これを踏まえて、これまでは調査してこなかった戦後特有の児童向け大衆文化に関わる文献や言説資料などを調査することを目指した。当該年度では、実施計画のうち、国立国会図書館、国立国会図書館国際子ども図書館などが所蔵する1950年代の図書・雑誌類に掲載された児童観客関連の記事や言説資料、及び『視聴覚教育』『放送教育』などのバックナンバーの調査収集を行った。また、京都国際マンガミュージアムでのマンガ資料の収集、神戸プラネット映画資料館での東映教育映画の資料及び作品試写、大阪府立中央図書館国際児童文学館所蔵の児童書、映画台本、文献資料の収集などを行った。それらの資料を総合し、1、50年代を中心とした児童観客の映画受容をデータとして取りまとめた。2、児童向け映画と同種のラジオ、テレビなどの大衆文化との比較を行った。その結果、1950年代前後の日本の児童観客の映画受容の統計的な実態や周辺メディアとの影響関係などが、ほぼ初めて総合的・多角的に明らかになった。本研究課題は、戦後日本における「児童の映画観客」の成立・進展過程や実態の調査・分析を目的としている。映画史や視覚文化史、メディア史などの多角的な視点を踏まえた日本における「児童の映画観客」に関する総合的な研究は、これまでほとんど存在していない。研究代表者はこれまで映画史の草創期から戦前期までを対象として上記の研究を継続的に実施してきた実績がある。それらを踏まえて本研究では、主に占領期から1960年代の高度経済成長期にまで調査範囲を絞り、児童の映画観客の受容動向を広い文化・社会史的観点から明らかにしようと試みた。具体的には国産アニメーションや教育映画、漫画や児童文学などの多くの他ジャンルとの混淆的な関連性も視野に入れて、児童観客の史的・社会的研究を実施した。そのうち平成26年度では1950年代の状況に焦点を当て、全国各地の関連文献や映像作品を所蔵する機関での調査・試写を行い、いまだ網羅的な収集が進んでいない当該分野の1次資料群の分析収集と言説分析を進めた。その結果、50年代の児童観客の映画受容の実態が当時の文献から言説及び統計データといった複数の側面から多角的に明らかにしえた。最終年度となった平成27年度は、続く1960年代の児童観客について調査・研究を進めた。そこでは前年度の成果を踏まえて、この時期に児童文化の中で急速に台頭してくる国産テレビアニメーションとの関わりの重要性が明らかとなり、児童の映画観客とともにテレビ視聴者も加えた分析が必要となった。当該年度も引き続き、各機関での関連文献の収集や映像作品の鑑賞を行った。結果として、映画も含めた児童の視覚文化において国産テレビアニメーションの占める位置がきわめて大きなものとなり始めていたことが明らかとなった。以上のように、事業期間を通じて、5060年代における日本の児童の映画観客の受容の実態の多角的な検討を行った。予定していた出張機関への調査も実施し、研究課題に関する基礎的な成果は達成できたものの、研究計画に挙げた出張機関などに、当初想定していたほどの文献資料が確認できなかったために文献資料の収集が進まなかった。また、関連作品の試写閲覧なども充分に行えなかったため。

日本映画史本研究課題の今後の研究の推進方策に関しては、1、主に1960年代の児童の映画観客における映画受容の実態調査と、2、当該時期の児童に関連する大衆文化、とりわけアニメーション文化と児童観客との関わりを、比較メディア論的な視点からの分析調査として行っていく予定である。前年度の研究成果において、戦後日本映画の児童の映画観客の実態の概況が明らかになったため、それを踏まえて、さらに続く年代におけるその推移や展開の分析を進めていくためである。また、研究計画においても、平成27年度は戦後国産アニメーションとの影響関係の分析を課題としていた。本研究課題においては、占領期以降のさまざまな映画教育運動(映画教室運動や東映教育映画など)の動向が一貫して児童の映画受容と密接な関わりを持ってきたことに注目してきたが、今後の研究においても、そうした従来の関係が60年代以降の国産アニメーションの発展とどのように関係していたのかという点に焦点を当てていきたい。また、同時に、アニメーション以外のマンガ、ラジオなどの児童向けの大衆文化との比較分析も行っていく予定である。教育関係文献を所蔵している大阪教育大学付属図書館、明星大学戦後教育史研究センター、成城大学教育研究所などの機関への調査は予定通り実施するが、他に教育映画祭関連の資料が所蔵されていると考えられる外交史料館などの調査も予定している。また、当初研究計画に盛り込んでいた児童観客関連資料の図像データベースを含む目録化作業であるが、関連文献が当初の予定よりも体系的に収集しにくい(例えば、京都国際マンガミュージアムのように写真撮影や複写を禁止している機関などもある)面などがあり、本研究課題で調査収集した文献をどのような形で成果として示すかは再度検討したいと考えている。当該年度の研究課題に関連する経費を支出する過程で、やむを得ず、未使用額が発生した。次年度では、前年度に生じた未使用額と併せて、1、前年度から継続する関連文献・資料の購入・調査と、2、関連機関への出張を含んだ調査分析の経費に使用する予定である。1に関しては、国立国会図書館、杉並アニメーションミュージアム、明治大学米澤嘉博記念図書館、外交史料館などでの関連資料の複写・撮影、また、貴重図書、DVDなどの購入、国立近代美術館フィルムセンターでの特別試写代金などに充てる(40万円)。2に関しては、教育関係文献を所蔵している大阪教育大学付属図書館、明星大学戦後教育史研究センター、成城大学教育研究所などの機関への国内出張と複写・撮影の経費に充てる(25万円)。
ルネサンス期フィレンツェ繊維工業とオスマン帝国

本研究では、フィレンツェ繊維工業とオスマン帝国との経済的な関係を解明するため、フィレンツェ各古文書館やアメリカ、さらにはわが国に所蔵されるさまざまな経営記録を調査した。その結果、オスマン帝国もふくむ地中海の東西からフィレンツェに輸入される赤色染料の流通や、フィレンツェの会社とオスマン帝国に滞在する駐在員との関係、毛織物工業を展開するメディチ家やヴェントゥーリ家が行ったオスマン貿易について、具体的なデータとともに明らかにすることができた。本年度では、まず昨年度に引きつづき、15世紀フィレンツェの赤色染料輸入にかんする論文を学術誌に掲載すべく原稿の手直しを行った。論文で取り上げたカンビーニ商会にとって、イベリア半島(とりわけポルトガル)はバルカン半島とならびもっとも重要な赤色染料の輸入先となっていた。そこでこの時期のポルトガル経済にかんする論考を調査し、これまで研究してきたフィレンツェと東地中海との経済的関係にくわえ、西地中海との関係も視野に入れつつフィレンツェ国際商業の広範な活動を考察しようと試みた。しかしながら課題も多く、修正稿を作成したものの、その掲載には至らなかった。つぎにフィレンツェ繊維工業史にかんする文献を調査し、入手可能なものを収集した。近年、フィレンツェ(さらにはトスカーナ)経済史研究の分野では多くの研究が公表されている。フィレンツェの経済活動において、毛織物工業および絹織物工業を軸とする繊維工業は重要な地位を占めていた。そこで繊維工業史について調査するには、これらフィレンツェ経済史にかんする研究を網羅的に集めていく必要がある。本年度は、近年の重要な研究であるリヨンにおけるゴンディ家の活動にかんする研究(S.トニェッティ著)やブリュッヘにおけるトスカーナ商人の活動にかんする研究(L.ガロッピーニ著)、リスボンにおけるある有名なフィレンツェ商人の活動にかんする研究(F.グィーディ=ブルスコリ著)などを収集した。そして、フィレンツェ繊維工業およびこれと密接に結びついていたフィレンツェ・オスマン貿易の展開を、ヨーロッパ=地中海世界を舞台に行われたフィレンツェ経済活動全体の中に位置づけるべく、これらの文献を調査した。最後に、来年度夏に入稿する予定の原稿の構想を練り、関連する文献を収集し、史料(G.マリンギ書簡)の解読を進め、原稿の執筆を開始した。以上が、本年度の研究実績の概要である。本年度はおもに以下の2つの研究を実施した。まず1つ目は、15世紀後半のフィレンツェが行った赤色染料輸入にかんする研究である。この研究は前年度から継続して行ったものである。本年度は、関係する研究文献をさらに収集・調査することにより研究を深化させていった。研究内容の概要は以下の通りである。カンビーニ商会の備忘録に登場する赤色染料のデータをすべて収集し整理したところ、「グラーナ」と記される染料は地中海世界の東西から輸入され、高級原料としての価格を維持していた。他方で「ケルメス」と記される染料はもっぱら東地中海から輸入されていた。また赤色染料輸入の時代別変化を追うと、リスボンからの輸入の増大という特徴がはっきりした。カンビーニ商会は、さまざまな種類の赤色染料を地中海の東西から適宜調達することで、フィレンツェの繊維工業を支えていたのである。以上の研究内容は、2016年4月に刊行される学術誌に掲載される予定である。つぎに2つ目は、オスマン帝国内に滞在していたフィレンツェ商人ジョヴァンニ・マリンギの書簡の研究である。マリンギはいくつかの会社や商人から商品を委託され、帝国内で販売する「オスマン貿易商」であった。研究では彼の書簡を丁寧に解読し、彼とフィレンツェの商人企業家ネーリ・ヴェントゥーリとの関係に着目しつつ書簡の内容を整理した。その結果、以下のことが判明した。マリンギはネーリにたいし、一方では彼の人脈を通じて毛織物を調達する貿易商としての役割を、他方では多くの製品をつくらせる織元としての役割を期待した。マリンギは、これら2つの役割を果たすネーリをビジネス上の重要なパートナーととらえていたのである。以上の研究内容は、次年度刊行予定の共著に掲載される予定である。以上が、研究実績の概要である。【研究実績の概要】で述べたように、本年度では2つの研究を中心的に進めてきた。1つ目の赤色染料輸入の研究については、研究計画では1年目に調査を終了させるとしていたものの、2年目である本年度まで調査を継続させた。しかしその結果、当該テーマにかんしていっそうの知見を得ることができ、それを盛り込んだ研究内容を公表できる予定となった。2つ目のジョヴァンニ・マリンギ書簡の研究については、研究計画ではこの書簡をメインの調査史料としていなかった。これまで会計帳簿を主たる調査対象としてきたため、研究計画でも帳簿を主要史料としたからである。しかし商業書簡はフィレンツェ商人の考えを具体的に知ることのできる史料群であり、とくにマリンギ書簡はオスマン貿易にかんする商人の貴重な証言となっている。そこで本年度は、このマリンギ書簡を主要な調査対象とすることにした。その結果、これまでの会計帳簿の調査からはわからなかったような新しい事実を見いだすことができた。そしてその事実を公表できる予定となった。この研究は、商業書簡という申請者があまり扱ってこなかった史料のジャンルを開拓する契機となるはずである。もっとも、本年度計画していたフィレンツェ繊維工業史研究の調査については、上記のテーマとかかわるものにかぎり行ったものの、単独のテーマとして調査結果を報告するには至らなかった。ただ研究文献を幅広く収集することができたので、次年度の研究テーマとしていきたい。

以上の諸点を総合するならば、現在までの本研究課題の進捗状況は、まだ課題が残されているもののおおむね順調に進んでいると考えられる。以上が、現在までの進捗状況である。今年度における研究は、一橋大学が所蔵する「メディチ家文書」の調査、メディチ家の毛織物製造・販売に関する調査、そしてフィレンツェでのヴェントゥーリ家文書の調査、の3点にまとめられる。以下、それぞれについて概要を記す。まず「メディチ家文書」の調査である。この文書は、一橋大学社会科学古典資料センターが所蔵する貴重な史料である。報告者はこの史料を丁寧に解読した結果、これがフランチェスコ・ディ・ジュリアーノ・デ・メディチによってオスマン帝国で記録された会計帳簿であると確認した。そこで報告者は、本研究課題と直接的に関わるこの貴重な史料を紹介し、フランチェスコの活動内容をまとめた論文を執筆し、センター年報に掲載した。つぎにメディチ家の毛織物製造・販売に関する調査である。前述のフランチェスコはメディチ家のある一族「ジョヴェンコの家系」に属していた。この家系は長い間毛織物工業に携わっていたことが知られている。そこで報告者はこの家系の経済活動について調べ、同家が毛織物を製造しつつそれをオスマン帝国で販売もしていた(つまり「貿易する織元」であった)事実について整理し、『経済系』(関東学院大学)で公表した。そして、フィレンツェでのヴェントゥーリ家文書の調査である。報告者は9月にフィレンツェの国立古文書館およびインノチェンティ捨児養育院古文書館において史料調査を行った。その結果、国立古文書館が1500年前後におけるヴェントゥーリ家の経営記録を多く所蔵していることを確認できた。ヴェントゥーリ家は前述の「ジョヴェンコの家系」と同じく、毛織物を製造しつつ販売する「貿易する織元」であった。今回の調査でヴェントゥーリ家の活動の詳細を物語る多くの経営記録が見つかったことにより、来年度以降に取り組むべき課題が明確になった。今年度は、以上の3点にまとめられる研究を進めた。本研究では、フィレンツェ繊維工業とオスマン帝国との経済的な関係を解明するため、フィレンツェ各古文書館やアメリカ、さらにはわが国に所蔵されるさまざまな経営記録を調査した。その結果、オスマン帝国もふくむ地中海の東西からフィレンツェに輸入される赤色染料の流通や、フィレンツェの会社とオスマン帝国に滞在する駐在員との関係、毛織物工業を展開するメディチ家やヴェントゥーリ家が行ったオスマン貿易について、具体的なデータとともに明らかにすることができた。【研究実績の概要】で最初に述べた15世紀フィレンツェの赤色染料輸入の研究については、修正稿を完成させたものの学術誌への掲載にまでは至れなかった。しかしこのテーマにかんしては、上述のF.グィーディ=ブルスコリによる研究のほか、イタリアとイベリア半島との経済的関係を論じた論文集(L.タンズィーニおよびS.トニェッティ編著)を入手し、調査することができた。さらには、染色史にかんする重要な研究も入手することができた。
代数多様体上の代数的サイクルの研究

筆者は代数多様体XのChow群C^r(X)の研究に対し代数幾何学的または数論的な異なったコンテクストにおいて多角的なアプローチを押し進めてきた。そこで道具として使われるべき理論も様々なものがある。Xが複素多様体の場合Xのホッヂ構造と代数的サイクルの関係が一つの大きなテーマであった。筆者は依然より混合モチーフの哲学に触発されBeilinsonによって予想されたChow群上の自然なフィルターを定義することに成功しさらにこれが多様体のホッヂ構造に深く影響されることを示した。この研究を更に押し進め同様の考察を多様体の族の上のサイクルの族にホッヂ構造のvariationがいかに影響を及ぼすかという問題にまで発展させることを現在押し進めている。この研究は多様体上の混合モチーフの層の圏の構成といった一般論の研究にも応用されることが期待される。一方数論的なコンテクストにおける代数的サイクルの研究も進めてきている。数論的な体上定義された多様体のChow群の研究にはその多様体に内在する深い数論幾何学的性質を理解することが大切である。筆者は特にそのような多様体のChow群のねじれ部分の有限性の問題(これはH.Bassによって提出された問題である)に取り組んできた。これに関してはXが数体上定義された多様体でH^2(X,O_X)=0の仮定のもとCH^2(X)_<tor>は有限群であるというColliot-ThelneとRaskindの定理が知られていたが筆者はそれを精密化してCH^2(X)_<tor>の有限性のみならずサイクル写像によりエタールコホモロジーと結び付けることに成功した。更に上の定理の証明で決定的である仮定H^2(X,O_X)=0を取り除くことも試みた。実際上の有限性定理をモヂュラー楕円曲線の積多様体の場合に示すことに成功した。これはこの種の有限性定理としてH^2(X,O_X)≠0の場合のものとしては始めての例である。証明の構成要素としてモヂュラー曲線の整数論とp進ホッヂ理論といった本質的に新しいアイデアが使われている。
パッチフルオロメトリー法を用いた機械刺激によるパネキシン1の活性化機構の解析

Pannexin 1は脱分極、機械刺激、酵素による切断、P2X7受容体との相互作用によって活性化し、アポトーシス時の"find-me"シグナルとしてのATP放出に関与することが知られている。Panx1活性は電位依存性を示すが、詳細な開閉機構については謎である。本研究では、パッチクランプ法を用いて、Panx1の電気生理学的特性について検討を行った。その結果、Panx1の開閉速度の膜電位依存性は逆転電位を境にして著しく異なることが示唆された。これらのことより、「charge carrierの移動方向及び単位時間当りの移動量がチャネル開閉速度の膜電位依存性を制御している」という可能性を見出した。ヘミチャネルであるパネキシン1(Panx1)は、低浸透圧や静水圧などの機械的な刺激で活性化され、ATPの放出に深く関与していると考えられているが、Panx1の生理的な役割や機械刺激に対する活性化機構についての詳細は謎である。本研究は、機械刺激に対してどのようにPanx1チャネルが活性化されるのか、その分子機構の解明を目指している。具体的にはHEK293細胞に過剰発現させたPanx1の機能特性および機械刺激に対する応答の解析をパッチクランプ法を用いて検証する。平成26年度は、cell-attached patch clamp単一イオンチャネル電流記録法を用いて、マウスPanx1チャネルの基本的性質(単一イオンチャネルコンダクタンス)を測定した。その結果、単一イオンチャネルコンダクタンスは内向き電流では約20 pSおよび外向き電流では約80 pSという外向き整流性を示した。今後は、機械刺激に対する単一イオンチャネル開閉制御機構をパッチクランプ法を用いて明らかにしていきたい。ヘミチャネルであるパネキシン1(Panx1)は、静水圧や低浸透圧などの機械的な刺激で活性化され、細胞外へのATP放出に深く関わっていると考えられている。しかしながら、Panx1の生理的な役割や機械刺激に対するチャネルの活性化機構についての詳細は未解明なままである。本研究の目的は、機械刺激に対してどのようにPanx1チャネルが活性化されるのかを明らかにすることである。平成27年度は、HEK293細胞にPanx1を大量発現させた細胞を用いて機械刺激に対する単一イオンチャネル開閉機構をパッチクランプ法を用いて検討した。その結果、機械刺激に対するPanx1チャネルの単一イオンチャネル電流の記録に成功した。一方、Panx1チャネルは膜貫通領域に電荷を持ったアミノ酸残基が存在しないにも関わらず、電位依存的なチャネル活性を示した。これらの結果は、チャネルの活性化には機械刺激および膜電位変化の両刺激によって制御されている可能性を示唆している。当初のH.27年度実施計画通りに研究が進行しているため。ヘミチャネルであるパネキシン1(Panx1)は、静水圧や低浸透圧などの機械的な刺激で活性化され、細胞外へのATPの放出に深く関わっていると考えられている。しかしながら、Panx1の生理的な役割や機械刺激に対するチャネルの活性化機構についての詳細は未解明のままである。これまでの研究において、Panx1チャネルは膜貫通領域に電荷を持ったアミノ酸残基が存在しないにも関わらず、膜電位の変化に対して電位依存的なチャネル活性を示したことを報告した。このことは、機械刺激に対するチャネル活性との判別が困難であることを示しており、平成28年度は膜電位の変化に対するPanx1チャネルの単一イオンチャネルゲーティングのキネティクス解析に焦点を置いて検討を行った。その結果、単一イオンチャネルコンダクタンスは内向き電流では約20 pSおよび外向き電流では約80 pSという外向き整流性を示し、単一イオンチャネル開閉速度の膜電位依存性は逆転電位を境にして過分極側および脱分極側で著しく異なることが示唆された。これらのことより、「charge carrierの移動方向および単位時間あたりの移動量が単一イオンチャネル開閉速度の膜電位依存性を制御している」という可能性を見出した。ほぼ順調であるが、機械刺激に対するパネキシン1のゲーティング機構を解明するには更なる電気生理学的な解析が必要である。これまでの得られた結果に基づき計画を進め、機械刺激に対するPanx1チャネルの活性化機構の解明を進める。また、Panx1チャネルは陰イオン選択性があり膜電位の変化によってもチャネルの開閉が制御されていることから、様々な陰イオン(Cl-、NO3-、SCN-、F-、Br-、Gluconate-)を用いて単一イオンチャネルレベルでのキネティクス解析を行う。機械受容チャネルこれまでの得られた結果に基づき計画を進め、パッチクランプ法を用いて機械刺激に対する単一イオンチャネル開閉制御機構について詳細な検討を行うと共に、Panx1チャネルの精製を行う。

人工脂質二重膜に再構成されたPanx1チャネルの機械刺激感受性についても検討を開始する予定である。当初購入予定であった機器を購入する必要がなくなったため。最終年度の実験では消耗品の購入がこれまでより多くなることが予想されるため、次年度使用額で消耗品の購入を考えている。
筋収縮中のミオシンの分子運動の蛍光標識および蛍光抗体標識による検出と解析

ミオシン頭部重鎖の高反応性システイン残基(SH_1)に選択的に導入した蛍光色素ロ-ダミンが硬直状態にある筋線維中で一定の方向を向いており、ADPの添加に伴ってその向きを変えることは先にBorejdoらによって報告されている通りである。SH_1基の極近傍にあるSH2基に選択的にロ-ダミンを今回導入することに成功した。その選択性は、ミオシンのEDTA(K^+)-ATPase活性、Ca^<++>ーATPase活性などのパラメ-タの変化およびペプチドマッピング法による局在により確認された。SH_2基上にロ-ダミンを導入したミオシン頭部部分をグリセリン処理筋に加えると硬直状態ではロ-ダミン色素は筋線維の長軸に対して42度の角度で配向した。この筋肉に十分濃度のMgADPを加えた場合でもロ-ダミン色素は同じく42度に配向していた。この頭部部分はアクチン線維と結合しさらにADPとも結合できることも確かめられた。この頭部のSH_1基上に別のラベルが入っているかどうかはこれらの結果に関係しなかった。SH_2基上のロ-ダミンのADPに対する反応はADPに対する感受性が化学修飾によって変化したためでなく、SH_1基上のそれともともと異なるためであると結論した。このように極近傍にある二つのアミノ酸残基のADPに対する対応の不一致はそれらの残基の相対的位置が変化していること、言い替えると少なくともその周辺には然るべきフレキシビリティが存在し、特定の基質類似体の存在下では検出できることを示唆している。
膵の発癌過程で異常高発現する反復配列RNAによる細胞恒常性破綻の分子機構の解明

我々はこれまでゲノム上のジャンク領域と考えられてきた反復配列領域の中で、膵癌組織で異常高発現している反復配列RNAについて検討を加え、発癌における重要な分子生物学的意義を解明した。マウスの反復配列RNAは発癌過程早期の良性腫瘍の段階から高発現しており、良性腫瘍由来の細胞に反復配列RNAを過剰発現させると細胞のDNA修復機能が低下し、ランダムな突然変異率が上昇して易発癌性を高めるという、いわゆる「細胞内変異原」としての機能を持つことを報告した。非コード反復配列RNAを強制発現する細胞において細胞分裂時の染色体分配異常、DNA損傷増加といった発癌に関わる表現型の変化を惹起するという知見をもとに、その生物学的機序として、酸化ストレスによる塩基損傷とその修復機序に着目した。ストレス刺激後の損傷塩基を経時的に解析したところ、反復配列RNA発現細胞において塩基修復の遅延を認めた。現在各遺伝子経路における各修復因子の発現について解析を行い、target因子の道程を試みている段階である。また、我々が反復配列RNAと結合することを見出したYBX1タンパク質はmRNAと結合して翻訳制御や分解抑制に関わるRNA結合タンパク質としても知られており、YBX1とmRNAの結合比が増減することで翻訳を正負両方向に調節する機能が報告されている。大量発現した反復配列RNAと結合しYBX1がtrapされることにより、正常な翻訳調節機構が阻害される可能性について検討するため、ビーズ抗体を用いてRNA免疫沈降(RNA-IP)したRNAを用いて、cDNA microarrayによる網羅的解析を行った。この結果、YBX1と結合する遺伝子には選択性があり、またストレス刺激によってその結合動態が変化することを見出した。in vivoの実験系としては、恒常的プロモーター下に反復配列RNAを発現するトランスジェニックマウスの作成に成功し、癌化に関与する表現型の変化について観察継続中である。非コード反復配列RNAを強制発現するマウス前癌病変由来細胞において、発癌の促進に寄与するランダムな突然変異の割合が倍増していることを次世代シークエンス技術を用いて示した。またこのような突然変異の増加は核DNAのみならずミトコンドリアDNAにおいても起こっていることを見出し、結果的にミトコンドリアコピー数の低下によるミトコンドリア機能異常を惹起している可能性も示唆された。これらの原因として、反復配列RNAと多機能タンパクであるYBX1が特異的に結合するという知見をもとに、反復配列RNA発現によるYBX1機能の影響について検討を加えた。その結果、転写調節因子、翻訳調節因子としての変化、すなわちcDNAのprofile、およびDNA修復に関わるタンパク質の発現量に有意なものは認めなかったものの、ストレス刺激後のYBX1の核内移行が阻害され、核内での塩基除去修復機能が低下することを見出した。またこれらの表現型はYBXの過剰発現によってレスキューされることを確認した。これに伴い、高感度の核酸プローブを用いたRNA in situ hybridizationおよびYBX1の免疫染色を共染色し、局在を観察することに成功した。in vivoの実験系としては、恒常的プロモーター下に反復配列RNAを発現するトランスジェニックマウスとKras変異によって膵特異的に前癌病変を形成するマウスモデルの掛け合わせを行い、その腫瘍形成能の変化について検討を加えているところである。昨年の課題であったYBX1強制発現によるDNA塩基損傷修復遅延に対するレスキュー実験のデータが得られたこと、また新たにミトコンドリアDNAの変異増加という予期していなかった表現型が得られたことから反復配列RNAによる発癌促進メカニズムについての一端が解明されたと考える。平成28年度に続き、非コード反復配列RNAを強制発現するマウス前癌病変由来細胞において、発癌の促進に寄与するランダムな突然変異の割合が倍増していることを次世代シークエンス技術を用いて示した。またこのような突然変異の増加は核DNAのみならずミトコンドリアDNAにおいても起こっていることを見出した。これらの原因として、反復配列RNA発現細胞ではDNA損傷修復タンパク質であるYBX1の機能阻害によって、酸化ストレス後の塩基損傷修復が遅延していることを、塩基除去修復活性をin vitroで定量する系を確立することで示した。さらに、高感度の核酸プローブを用いたRNA in situ hybridizationおよびYBX1の蛍光免疫染色を共染色を用いて両者の局在変化を同一視野で観察することにより、ストレス刺激後のYBX1の核内移行が阻害されることを見出した。さらに、反復配列RNAと結合しない変異型YBX1を導入することによって、反復配列RNA発現下でもYBX1が核内に移行する系を樹立し、変異型YBX1がDNA損傷修復の回復を高め、さらには突然変異率を改善させることを示した。これらの結果は、癌化の過程の早期から、反復配列RNAがいわば「細胞内変異原」として機能し、発癌プロセスを進める機構として重大な働きをしていることを示唆しており、発癌機序の解明、発癌予防という観点からも重要な成果であると考える。以上の成果をまとめて論文として発表した(Kishikawa T et al. Satellite RNAs promote pancreatic oncogenic process via thedysfunction of YBX1. Nat Commun.2016;7:13006)。

DNA塩基損傷修復遅延に対する核内移行型YBX1を用いたレスキュー実験についてはさらなる検討が必要な状態であるが、YBX1の翻訳制御機能についての新たな知見が得られており、反復配列RNAがもたらす発癌に関わる表現型についての生物学的機序の解明において一定の進捗が得られていると考える。in vitroの系においては次世代シークエンスの結果においても発癌促進を示唆するデータが得られたが、in vinoにおいても発癌促進効果があるのか、トランスジェニックマウスにおいて病理学的、分子生物学的に検討を加えていきたい。またYBX1における反復配列RNAの結合部位を特定し、変異を導入することによって変異増加の表現型が改善するかどうかについても検討を加えていきたい。消化器内科ストレス後のDNA塩基損傷修復に関与する反復配列RNAのtargetを同定するために、修復因子の発現量、活性についてスクリーニングを行い、その生物学的機序についてレスキュー実験等を用いて検討を加える。また、作成したトランスジェニックマウスと、当研究室で飼育する前癌病変(PanIN)を形成する膵特異的活性型Krasマウス(Ptf1a cre/+; LSL-Kras G12D/+)を交配させ、発癌促進に関与する可能性についても検討を加える。