hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内シグナル伝導系による血小板と白血球膜燐脂質代謝の制御

補助金交付の期間内に得られた新知見は次の通りである。1、プロテインキナ-ゼCの活性化により、膜燐脂質からのアラキドン酸遊離は亢進する。2、トロンビンやA23187刺激による血小板膜燐脂質からのアラキドン酸遊離の制御にはプロテインキナ-ゼCの活性化は関与しない。3、抗炎症剤であるインドメタシンは、血小板にトロンビンやA23187刺激を加えた時にみられるホスファチジルコリンやホスファチジルイノシト-ルからのアラキドン酸遊離を阻害する。また、A23187刺激時にみられるホスファチジルエタノ-ルアミンによるアラキドン酸の取り込みも阻害する。アスピリンにはそのような作用はない。4、血小板にトロンビン刺激を加えると、反応時間10秒ぐらいから124から135kDaと76kDaの蛋白バンドにチロシン燐酸化反応が認められ、反応時間30秒から1分で極大となり、その後は減少し、反応時間10分では、ほぼ元に復した。トロンビン刺激のかわりにA23187刺激を加えた場合も同様の結果が得られた。5、トロンビン刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は、GTP結合蛋白、細胞内外のカルシウムイオン、フィブリノ-ゲンとGPIIbIIIaとの結合、トロンボキサンA_2生成や放出されたADPに依存しない。6、A23187刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は、細胞内カルシウムイオンに依存するが細胞外カルシウムイオンには依存しない。さらに、ホスホリパ-ゼC、プロテインキナ-ゼC、ミオシン軽鎖キナ-ゼ、フィブリノ-ゲンとGPIIbIIIaとの結合、トロンボキサン生成や放出されたADPに依存しない。7、血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は、凝集能に関与するが放出反応には関与しない。8、トロンボキサン受容体を介する刺激によっても血小板は蛋白チロシン燐酸化反応を呈する。それは、細胞内カルシウムイオンに依存した反応である。研究計画の最初の目的であったホスホリパ-ゼA_2様活性による膜燐資質からのアラキドン酸放出機構とC-キナ-ゼ活性との関連については、当初予想していた程問題は単純ではない事が明らかとなった。即ち、血小板を予めC-キナ-ゼの活性化剤(ホルボルエステルなど)で処理し、C-キナ-ゼを活性化したところにカルシウムイオノフォアやトロンビンを加えて血小板を刺激するとアラキドン酸(AA)や血小板活性化因子(PAF)の放出は亢進するので、ホスホリパ-ゼA_2の活性亢進が生じる。しかし、逆にC-キナ-ゼ活性の阻害剤を加えてトロンビンやイオノフォア刺激を加えても予想される様なAAやPAFの放出の抑制は観察されない。この事から少なくともトロンビンやイオノフォア刺激によるホスホリパ-ゼA_2の活性化にC-キナ-ゼは関与していない事になる。

そこで、残された可能性としては、AA放出を刺激しないがC-キナ-ゼを活性化する何らかの刺激因子が存在し、トロンビンなどによるAA放出を協調的に制御する事、あるいはC-キナ-ゼはホスホリパ-ゼA_2の直接的な制御に関わっているのではなく、むしろG蛋白などの系などを制御し、間接的に関わっている事などがあり、これらを支持する所見が得られつつある。その他には、チロシンキナ-ゼ活性とホスホリパ-ゼA_2やC系との関連を検討中である。特にチロシンキナ-ゼ活性化機序に関しては、トロンビン受容体を介するがG蛋白を介しない系とカルシウム代謝により活性化する系とがある事を見出している。pp60^<C-Src>というチロンシンキナ-ゼは血小板膜に多く存在する事がわかっているが、我々の知見から既知の細胞内刺激伝導系とチロシンキナ-ゼとの接点が明らかになると考えられ、それらからC-キナ-ゼやチロシンキナ-ゼによるホスホリパ-ゼA_2やC系の制御を明らかにする方向を今後の研究計画に組み入れていく予定である。前年度の後半期より検討していた血小板の蛋白チロシン燐酸化反応について、本年度は研究の進展がみられたので、主にその方向に研究の力点を移すことになった。これまで血小板の蛋白チロシン燐酸化反応はトロンビンやコラ-ゲン刺激によって生じることが報じられていたが、その機序の詳細は明らかではなかった。そこでまずトロンビン刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応とGTP結合蛋白や細胞内カルシウムの関係を検討した。血小板をサポニンで処理し、膜に透過性を生じさせた後、GTP結合蛋白の阻害剤であるGDPBSを加えた。この操作でGTP結合蛋白が阻害された血小板にトロンビン刺激を加えたが蛋白チロシン燐酸化反応は全く阻害されなかった。次に細胞内カルシウムのキレ-ト剤であるBAPTAで血小板を処理し、細胞内カルシウムをキレ-トした血小板にトロンビン刺激を加えたが、蛋白チロシン燐酸化反応は全く阻害されなかった。これらのことから、トロンビン刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応はGTP結合蛋白や細胞内カルシウムに依存しないことが明らかとなった。しかし、カルシウムイオノフォア刺激により血小板は蛋白チロシン燐酸化反応を起こすことを見出した。このイオノフォア刺激による蛋白チロシン燐酸化反応は細胞外カルシウムをキレ-トしても阻害されなかったが、BAPTA処理により細胞内カルシウムをキレ-トすると完全に阻害された。このことから細胞内カルシウムの上昇により血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は生じることが明らかとなった。本年度は、この細胞内カルシウムに依存性と非依存性の血小板の蛋白チロシン燐酸化反応について、その機序の詳細と、細胞内シグナル伝導系との関連を検討してゆく計画である。前年度では、血小板において細胞内カルシウムに依存性と非依存性の蛋白チロシン燐酸化反応があることを見出したが、このうち細胞内カルシウムに依存性の蛋白チロシン燐酸化について、詳細に検討した。その結果、カルシウムイオノフォア刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は、細胞内カルシウムに依存するが、細胞外カルシウムには依存しないこと、ホスファチジルイノシト-ル代謝回転やプロティンキナ-ゼCには依存しないこと、トロンボキサンA_2生成や、放出されたADPに依存しないこと、フィブリノ-ゲンと血小板膜受容体との結合に依存しないこと、ミオシン軽鎖キナ-ゼにも依存しないことが明らかとなり、全く未知の機構によるものであることを見出した。次に、トロンビン刺激による血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は細胞内カルシウムに依存しないので、イオノフォアではなく膜受容体刺激による蛋白チロシン燐酸化反応のうち、細胞内カルシウムに依存するものを探索した。アラキドン酸刺激においても血小板の蛋白チロシン燐酸化反応は見られ、これはアスピリンにより阻害された。従って、トロンボキサンA_2刺激によるものと判明したので、そのアナログであるSTA_2刺激を加えたところ、血小板は蛋白チロシン燐酸化反応を呈した。
「ジスルフィドプロテオーム」による植物レドックス制御の包括的な解析

蛋白質のレドックス(還元/酸化)制御は、リン酸化/脱リン酸化による制御と並んで生物の生理機構に重要な役割を果たす。研究代表者らは最近、レドックス制御を包括的に解析できるジスルフィドプロテオームを開発した。本研究ではこれを活用し、イネを材料に新しいレドックス制御機構を解析した。イネ種子アリューロン層から蛋白質を抽出し、これにNADPHとチオレドキシン活性化酵素NTRを添加するとESP(embryo-specific protein)-2が消失した。この実験をシステインプロテアーゼの阻害剤であるロイペプチン存在下で行うと、ESP2の消化が抑えられたことから、チオレドキシンがアリューロン層に内在し、これがESP2を基質とするシステインプロテアーゼを活性化することが分かった。また、ESP2は多くのS-S結合(392アミノ酸のうち、16個のS-S)をもつが、チオレドキシンはこれらを還元し、ESP2の分子構造をアンフォールドすることが示唆された。アリューロン層を単離し、ジベレリンとCaCl_2存在下で保温すると同様の実験結果が得られたことから、内在性チオレドキシンはイネ種子発芽の際にシステインプロテアーゼを活性化し、同時にESP2をアンフォールドすることで効率的に分解することが示唆された。発芽時にde novo合成され、Ca^<2+>存在下でチオレドキシンにより活性化されるセリンプロテアーゼ(チオカルシン)は、グロブリン等の貯蔵蛋白質を消化することが報告されている。システインプロテアーゼがin vivoでESP2を消化する際にグロブリンは未消化であったため、チオレドキシンは種子発芽時に複数のプロテアーゼを段階的に活性化し、その基質をそれぞれアンフォールドすることで蛋白質分解のファインチューニングを行うことが示唆された。本研究により、イネ種子発芽における新しいレドックス制御機構が明らかになった。本年度は研究代表者が開発した「ジスルフィドプロテオーム」により、イネ種子発芽における新規レドックス機構の解析を行い、新しいレドックスモデルを確立した。アリューロン層にあるチオレドキシンをNADPHとE.coliNTRにより活性化し、in vitroでendogenousなチオレドキシンのターゲット解析を行った。活性チオレドキシン存在下でESP(embryo-specific protein)のスポットが消失し、システインプロテアーゼの阻害剤であるロイペプチン存在下でスポットが復活したことから、チオレドキシンがシステインプロテアーゼを活性化し、これがESPを分解したと考えられる。また、チオレドキシンとロイペプチン存在下でESPが蛍光検出されたことから、チオレドキシンがESPのジスルフィドを還元し、分解されやすくした(アンフォールド)と示唆された。in vivo(種子発芽環境下)で同じレドックス反応が起こることを確認し、仮説を裏付けた。以上の結果から、チオレオドキシンは発芽の際にシステインプロテアーゼを活性化し、同時にその基質であるESPをアンフォールドすることで効率的に分解すると考えられる。アリューロン層に多いESPは貯蔵蛋白質にアミノ酸配列相同性が低くシステイン量が多いため(16S-S/392アミノ酸)、機能蛋白質の可能性が高い。また、発芽後に合成されカルシウム存在下でチオレドキシンにより活性化されるセリンプロテアーゼ(チオカルシン)により、種子発芽時に貯蔵蛋白質が消化されることが報告されている。

チオレドキシンは、複数の基質が異なるプロテアーゼを段階的に活性化することで種子発芽時に蛋白質分解のファインチューニングを行うことが示唆された。本研究成果はProteomicsに投稿中である。昨年度は、(NADPHとチオレドキシン活性化酵素によりイネ種子糠層に存在する内在性チオレドキシンを活性化することで、)イネ種子発芽において還元酵素チオレドキシンが糠層のシステインプロテアーゼを活性化し、同時にその基質である胚特異的蛋白質(ESP)をアンフォールドして消化しやすい構造に変化させることを示唆するデータを得た。本年度は、大腸菌リコンビナントチオレドキシンを用いて同じ反応が起こるか確認した。また、ESPをアンフォールドの状態で固定し、糠抽出物に加えて反応状態を観察することで、システインプロテアーゼがチオレドキシン依存的に活性化されるか調べた。リコンビナントチオレドキシンを糠抽出液に添加したところ、内在性チオレドキシンを活性化した場合や、糠をジベレリンとCaCl2存在下で浸水した際と同様に、ESPが消化された。また、ロイペプチン(システインプロテアーゼ阻害剤)存在下では消化が阻害されるとともにESPが還元(アンフォールド)型として同定された。アンフォールドされたESPは、糠抽出液内で安定であるが、内在性チオレドキシンを活性化させると分解され、ロイペプチン存在下では分解されなかった。チオレドキシンは発芽のこの後の段階で他の貯蔵蛋白質を消化するセリンプロテアーゼを活性化することが報告されている。以上のことから昨年度の研究結果と併せ、チオレドキシンはイネ種子の発芽の際に基質が異なる複数のプロテアーゼを段階的に活性化することで種子発芽時に蛋白質分解のファインチューニングを行うととが示唆された。本研究により、新しい発芽生理機構が明らかになった。また酵素Dienelactone hydrolase(DLH)をチオレドキシンの新しいターゲットとして同定し、基質誘導活性化型のバクテリアと高等植物では本酵素の活性化機構が異なることを明らかにした。昨年度投稿したProteomics誌(IP=5.5)に上記の研究結果を合わせ再投稿し、受理された。昨年度はイネ種子発芽の際、レドックス酵素チオレドキシンが基質が異なるプロテアーゼを段階的に活性化し、機能・貯蔵蛋白質分解のファインチューニングを行うことを明らかにした(Yano & Kuroda, Proteomics,2006)。本年度は、このメカニズムの工業的な応用を試みた。種子貯蔵蛋白質は分子内・分子間ジスルフィド結合を形成し、プロテインボディ等の貯蔵器官にコンパクトに収納されている。発芽の際にはチオレドキシンがジスルフィド結合を還元し、蛋白質構造をアンフォールドすることで、その後のプロテアーゼ消化を容易にする。一方、炊飯米や豆類・パン等の食品として種子加工品を摂取した際、ある種の貯蔵蛋白質がアレルギーを引き起こすのは、消化器官ではアンフォールドせずにプロテアーゼ消化を行うことが一因と考えられる。そこで、昨年までの研究成果を踏まえ、チオレドキシンをアレルゲンの低減化に工業利用することを試みた。イネ種子から臨床的にアレルゲンとされる塩溶性画分を抽出し、カタログ化した。抽出物をトリプシン処理すると、アレルゲンの一部が残存した。
体内埋込型全人工心臓のための高効率油圧アクチュエータの開発

臨床応用可能な体内埋込型全人工心臓の実現のために、エレクトロハイドロ-リック方式全人工心臓の高効率油圧アクチュエータの開発を行った。主に、駆動用ブラシレスDCモータの改良および油圧ポンプである摩擦ポンプの流路断面寸法変更による効率改善を行った。ブラシレスDCモータは、ロータマグネットにネオジウム鉄ボロンの焼結マグネットを用い、外径70mm、3相4極24突極のモータを新たに設計した。これにより、使用回転域10002500rpm、トルク域5001000g・cmにて80%の効率を有した人工心臓専用組込ブラシレスDCモータの開発が図れた。摩擦ポンプに関しては、直径60mm、羽数40のインペラを用い、その周辺部の流路断面寸法を10x8(mm)18x12(mm)の間で変化させた6種類の摩擦ポンプを作成し、評価することによりその最適化を図った。その結果を基に、流路断面寸法14x10(mm)、一方向回転時、揚程150mmHgにて最大流量28L/min、最大効率31%の摩擦ポンプを開発した。開発したモータと摩擦ポンプを用いて外径80mm、厚さ68mmの油圧アクチュエータを作成し、ダイアフラム型血液ポンプと組み合わせ全人工心臓を組み上げ、In vitro、In vivo評価実験を行った。In vitro評価実験では、左心後負荷100mmHg、右心後負荷20mmHg、左右心前負荷10mmHgの条件にて、水を用いた駆動評価実験を行い、最大左心拍出流量8L/min、最大効率12%の結果を得た。In vivo評価では体重50kgの仔牛に本全人工心臓を植え込み、6時間以上にわたり循環維持を行い、アクチュエータ表面の温度上昇を観察した。その結果、アクチチュエータ表面における温度上昇は4°C以下であり、全人工心臓用アクチュエータとして十分な性能、効率を有したアクチュエータの開発が行えたこと確認した。
オリゴリン糖及びリン糖ヌクレオシドの合成と生理活性

1.4-デオキシ-4-C-ホスフィニル-D┣=┫-リボフラノース類の、より効率的かつ大量調製に適した合成方法につき研究を行い、従来得られていた4-C-(エチルホスフィニル)体の収率向上が実現しただけでなく、4-C-(ヒドロキシおよびフェニルホスフィニル)体も効率よく得られるようになった。また選択的にD-リボフラノース型化合物が得られる反応機構についても大体の解明がなされ、今後これらの化合物の調製法を考慮する際に大いに役に立つ情報が得られた。さらに2-デオキシ-D-リボ型リン糖も、未だ収率向上と合成段階短縮の余地は残されているが、2,4-ジデオキシ-4-C-(メチルおよびシクロヘキシル)-D-エリトロ-ペントフラノースが始めて合成できた。このようにして合成されたD-リボフラノース体のC-1位のOH基あるいはアセトキシ基をブロム体等の活性原子に変換する試みを数多く行ったが、環内に酸素原子を持つ糖類とかなり異り、置換反応を起しにくいことが分った。しかし、1-ジメチルホスフィニル-2、3-O-イソプロピリデン-D-グリセロールを用いたモデル実験で、塩化チオニルあるいは四塩化炭素-トリフェニルホスフィンを用いると1位の水酸基がクロル原子に置換することが判明した。この方法を現在上記D-リボ型リン糖に応用し検討している所である。2.5-デオキシ-5-C-(ヒドロキシホスフィニル)-D-グルコピラノース合成の全段階通算収率が以前のものより2倍に向上した改良法、5-デオキシ-5-C-(エチルホスフィニル)-L-イドピラノースの選択的合成法、および環内にP=S結合を含むリン糖として5-デオキシ-5-(エチルおよびフェニルホスフィノチオイル)-D-キシロピラノース合成法を始めて開発した。これらのC-1位の活性化並びに得られた種々のリン糖の生理活性については現在検討中である。
先天的な遺伝子多型の改善を可能とする安全で簡便な移植療法の開発

本研究では、先天的な遺伝子多型を輸血による赤血球の移植によって治療するという、ユニークなコンセプトの治療法を提案・検証することを目的とする。具体的には肝臓の代謝機能を付与した赤血球を血液中に移植することで、肝臓機能を回復・亢進させるシステムの可能性を検討する。従来の遺伝子治療よりも安全で簡便に移植が行えるため、例えば「お酒に弱い」などこれまで治療の対象にならなかった「体質」の改善にも活用でき、クオリティ・オブ・ライフを飛躍的に高める可能性を秘めた取り組みである。
セメント芽細胞分化誘導を基軸とした歯周組織再生型インプラントの基盤開発

歯周組織再生療法に使われているエナメルマトリックスタンパク(EMD)で間葉系幹細胞を刺激するとセメント質形成に関与するCEMP-1の発現が亢進した。CEMP-1の発現には転写因子HIF-1が関わっている。歯根膜線維芽細胞(HPDLF)をEMDで刺激してもHIF-1の転写活性が上昇した。HIF-1の標的分子にSDF-1がある。SDF-1は間葉系幹細胞を誘導することからその産生について調べた。HPDLFをEMD刺激することでSDF-1の産生量が増加した。したがってSDF-1は間葉系幹細胞の誘導による歯周組織再生を促す可能性があり、EMDとSDF-1のインプラントへの応用が期待される。本研究は、歯周組織付着器官の獲得をインプラント周囲にも求め、歯周組織付着器官を具備した「歯周組織再生型インプラント」開発の基盤を確立することを目的としている。これまでに、我々はエナメルマトリックスタンパク(エムドゲイン(r))存在下で間葉系幹細胞(MSCs)を培養することでセメントが細胞マーカーの一つであるCEMP1の遺伝子発現が亢進することをリアルタイムPCR法にて確認した。更に、歯根膜由来細胞においてはBMP-2刺激によってCEMP1の発現が抑制されるとの報告があることから、エムドゲイン(r)に含まれるBMPの効果をキャンセルするために、BMPアンタゴニストであるNogginをエムドゲイン(r)存在下でMSCsを刺激するとエムドゲイン(r)単独刺激よりもCEMP1の遺伝子発現が亢進した。CEMP1のタンパク発現については細胞免疫蛍光染色にて解析したところ、細胞質内にCEMP1の発現を認めた。また、エムドゲイン(r)でMSCsを3週間刺激した後にAlizarin Red S染色することで石灰化物の沈着も確認された。以上のことから、エムドゲイン(r)はMSCsのセメント芽細胞への分化に関与していることが示唆された。上記研究内容と並行して、歯周組織付着器官がインプラント周囲に形成された後のホメオスタシス維持や再生療法についても検討する必要があると考え、MSCsの遊走や保持に重要な役割を果たすケモカインCXCL12に着目した。歯根膜由来細胞は無刺激の状態でもある程度のCXCL12を産生しているが、エムドゲイン(r)で刺激することでCXCL12産生は有意に亢進した。ところが、主要な炎症因子である生理活性分子PGE2の存在下では歯根膜由来細胞からのCXCL12産生は抑制されることがわかった。当初の研究計画に加え、更に検討すべき事項が生じたためにやや遅れた。しかしながら、研究自体は当初の目的を達成するために順調に進んでいるといえる。前年度までにエナメルマトリックスタンパクで間葉系幹細胞を刺激するとCementum protein 1 (CEMP-1)の発現が亢進することが分かった。CEMP-1はセメント芽細胞、歯根膜細胞に発現し、セメント質形成に関与しているといわれている。そのCEMP-1の発現には転写因子HIF-1が重要な役割を担っているとの報告がある。ヒト歯根膜由来線維芽細胞(HPDLF)をエナメルマトリックスタンパクで刺激してみたところ、HIF-1の転写活性が上昇することが確認できた。HIF-1の標的分子の1つにSDF-1がある。SDF-1は間葉系幹細胞を誘導することが知られていることからSDF-1産生についても調べてみた。HPDLFをエナメルマトリックスタンパクで刺激するとSDF-1タンパクの産生亢進が確認できた。興味深いことに組織の炎症の際に発現する生理活性物質PGE2を加えるとSDF-1タンパクの産生が抑制された。PGE2の存在下ではHIF-1の転写活性についても抑制されることがわかった。そのメカニズムについて詳細を検証した。PGE2のレセプターにはEP1、EP2、EP3、EP4があるが、この中でもEP2、4がSDF-1産生抑制に関与していることがわかった。PGE2によってcAMPの合成が促進されるが、このcAMPもSDF-1産生抑制に関与していることが確認できた。次にエナメルマトリックスタンパク刺激によってSDF-1発現に至るシグナルを検証したところ、PI3K/AKT経路が関与していることが分かった。AKTの活性化(リン酸化)についてはエナメルマトリックスタンパクで活性化し、それはPGE2によって抑制されていた。以上のことは、エナメルマトリックスタンパクを用いた歯周組織再生においてPGE2が存在することで間葉系幹細胞の遊走やセメント質形成が阻害されることを示唆している。本来の研究目的からはややそれているが、HIF-1に関連した新しい知見を得ることができた。最終年度はこれらの新しい知見と本来の目的を融合していく予定である。前年度までにエナメルマトリックスタンパク(EMD)で間葉系幹細胞を刺激するとCEMP-1の発現が亢進することが分かった。CEMP-1はセメント芽細胞、歯根膜細胞に発現し、セメント質形成に関与しており、CEMP-1の発現には転写因子HIF-1が重要な役割を担っている。ヒト歯根膜線維芽細胞(HPDLF)をEMDで刺激したところ、HIF-1の転写活性が上昇した。

SDF-1は間葉系幹細胞を誘導することからその産生についても調べた。また歯周組織再生療法として広く用いられているEMDの作用機序の中に歯周組織、血液から間葉系幹細胞を誘導するという仮説がある。そこでHPDLFを用いて、EMD刺激によるSDF-1産生ならびに炎症性メディエーターであるプロスタグランジンE2(PGE2)の影響について検討を行った。HPDLFをEMDで刺激することでSDF-1の産生量が増加し、そこにPGE2が加わることでSDF-1の産生が抑制された。mRNA発現についても同様であった。EMD刺激下で、PGE2の受容体であるEP1EP4のそれぞれのアゴニストを作用させると、EP2とEP4のアゴニストによってSDF-1の産生が抑制された。また、cAMPアナログであるジブチルcAMPを添加することでもEMDで促進されたSDF-1の産生が抑制された。一方、PI3KのインヒビターによってもEMDで誘導されたSDF-1の産生が抑制された。さらに、HIF-1の転写活性についてはEMDによって活性化し、PGE2が加わることで抑制された。非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)は、プロスタグランジンの産生を抑制する。したがって、NSAIDの服用はPGE2によるSDF-1産生抑制を解除することで、SDF-1による間葉系幹細胞の誘導による組織再生を促す可能性があるかもしれない。歯周組織再生療法に使われているエナメルマトリックスタンパク(EMD)で間葉系幹細胞を刺激するとセメント質形成に関与するCEMP-1の発現が亢進した。CEMP-1の発現には転写因子HIF-1が関わっている。歯根膜線維芽細胞(HPDLF)をEMDで刺激してもHIF-1の転写活性が上昇した。HIF-1の標的分子にSDF-1がある。SDF-1は間葉系幹細胞を誘導することからその産生について調べた。HPDLFをEMD刺激することでSDF-1の産生量が増加した。したがってSDF-1は間葉系幹細胞の誘導による歯周組織再生を促す可能性があり、EMDとSDF-1のインプラントへの応用が期待される。本研究では、間葉系幹細胞のセメント芽細胞への分化についてエナメルマトリックスタンパクの他に低酸素状態が必要であると考えている。マルチガスインキュベーターによらない低予算での低酸素環境のシステム構築が一つの課題ではある。現在酸素濃度の調整は可能なシステムはできているため、長期培養に耐え得る環境に工夫が必要である。HPDLFをエナメルマトリックスタンパクで刺激すると、PI3K/AKT経路を経由してHIF-1の転写活性が上昇し、PGE2の存在下ではHIF-1の転写活性が抑制されることがわかった。したがって、今後はまずPGE2からのシグナルがいかにしてHIF-1の転写活性を抑制しているのかを検証する。セメント芽細胞のマーカーの一つであるCEMP1の転写因子とされているHIF-1であるが、HIF-1はHRE(Hypoxia Response Element)に結合することで遺伝子の活性化が起きる。鉄のキレーターであるデスフェロキサミン(DFO)によっても、HREを経由して同様に遺伝子の活性化が起きることが知られている。
トランススケール解析による低合金鋼の水素－空孔－塑性ひずみ関連破壊現象の解明

低合金鋼において,水素存在時には破壊の前駆段階で局所的に多量の空孔が生成していること,それらが一度生成すると水素を放出させても延性が回復しないことが示されている.本課題では,空孔の分布状態と脆化率の関係を得ることで,水素脆化のクライテリオンを空孔分布の点から明らかにする.水素ー空孔ー転位(塑性ひずみ)間では強い相互作用を生じるため,空孔分布を知るためには三者の時間発展を同時に解く必要がある.そこで,統計熱力学と電子・原子レベル解析を駆使して水素存在時の転位と空孔の運動挙動をモデル化し,それらに基づいた非定常水素/空孔拡散ー弾塑性連成解析モデルを構築する.低合金鋼において,水素存在時には破壊の前駆段階で局所的に多量の空孔が生成していること,それらが一度生成すると水素を放出させても延性が回復しないことが示されている.本課題では,空孔の分布状態と脆化率の関係を得ることで,水素脆化のクライテリオンを空孔分布の点から明らかにする.水素ー空孔ー転位(塑性ひずみ)間では強い相互作用を生じるため,空孔分布を知るためには三者の時間発展を同時に解く必要がある.そこで,統計熱力学と電子・原子レベル解析を駆使して水素存在時の転位と空孔の運動挙動をモデル化し,それらに基づいた非定常水素/空孔拡散ー弾塑性連成解析モデルを構築する.
アルツハイマー病モデル細胞系の樹立と治療薬開発への応用

アルツハイマー病の原因の解明は現在の医学研究の最重要課題の一つである。アルツハイマー病の大脳では,変性ニューロンとともにアミロイド線維の沈着がみられる。このアミロイド線維の構成成分であるAβ蛋白質あるいはその前駆体蛋白質APPと,アルツハイマー病の本態をなす大量のニューロン死との関連については未だ結論をみるには至っていない。アルツハイマー病の病態を解析するためにはアミロイド関連蛋白質によって変性を起こすニューロン系を樹立することが重要である。そこで本研究では、ニューロンにAPP遺伝子を導入して、細胞変性死を起こすような細胞モデルを作製することを企図した。遺伝子導入系として分裂終了ニューロンに遺伝子導入が可能なアデノウイルスベクターを利用した。この系を用いて初代培養ラット海馬ニューロン内でのAPPの発現量を増加させると、グルタミン酸誘発性の細胞内カルシウム濃度の増加を増強することから、この変化がニューロン変性と結びつくことが推定された。また、胚性がん細胞由来のヒト分裂終了ニューロンを用いて、APPを強制発現させると数日以内に変性を起こすことを明らかにした。さらに、同じアデノウイルスベクターを用いて、実験動物の脳内ニューロンでも細胞体の萎縮とシナプスの異常を伴った変性が起こることを確認した。これらの一連の研究によってAPPのニューロン内での蓄積によるニューロン変性作用を検出できる系を樹立することができた。この系の開発により将来のアルツハイマー病の原因の分子レベルでの解明や治療薬の開発への応用が可能になった。ニューロンにアルツハイマー病アミロイド蛋白質(APP)遺伝子を導入して、細胞変性死を起こすような細胞モデルを作製することを試みた。本年度は主として発現制御(条件発現)ベクターの開発と、培養細胞での発現をスクリーニングした。ベクターとしてはラクトースオペロンのLacレプレッサー発現ベクターとLacオペレーター含有ベクターに全長型ヒトAPPまたは人工変異を行ったAPPを挿入し、培養細胞に同時に遺伝子導入した。この遺伝子導クローン化細胞に誘導物質であるIPTGを加えると、レプレッサーによる抑制が解除されて発現が誘導された。さらに、APPの転写を調節するプロモータとしてはニューロンに強力に発現することが知られているelongation factorの遺伝子プロモーターを用いることで、十分な量のAPPを発現させることを試みた。その他にも、種々の発現制御ベクターを選択し、同様の方法で遺伝子導入細胞を作製し、ニューロブラストーマやフェオクロモサイトーマなどに導入した。得られた培養細胞株は継代を繰り返し、安定的に発現が誘導され、かつ高発現がみられるクローンを選択した。樹立した細胞についてAPP代謝とニューロン変性を解析すると、APP誘導に伴って著しい細胞形態の変化を伴うものがあった。しかし、これらの細胞は分裂終了細胞ではないため、変性が余り顕著ではなかった。そこで、分裂終了ニューロンに遺伝子導入が可能なAPP発現アジノウイルスベクター系を作製し、分化した培養神経細胞に導入したところ細胞内にAPPを発現させることに成功した。アデノウイルスベクターを利用して,分化ニューロンにAPPの遺伝子導入を行い,その過剰発現による病理学的変化を観察した.APP発現組換えアデノウイルスはコスミドベクターpAxCAwtのCAGプロモーターの下流にLacZあるいはヒト全長型APP695cDNAを挿入して作製した.これをアデノウイルスゲノム両端に共有結合した末端蛋白を保持したゲノムDNAとを293細胞に共導入して,相同組換えによりAPPを発現するアデノウイルスベクターを得た.細胞としてはマウスおよびヒトの胚性がん細胞をレチノイン酸処理を行って分化させたニューロンを用いた.対照としたβガラクトシダーゼをレポータとするアデノウイルスでは,ほぼ100%のニューロンが感染する条件を設定した.その条件でAPP695遺伝子をもつアデノウイルスをニューロンに導入したところ,APPの過剰発現と共に,変性する細胞が出現することが判明した.この変性は特にヒト胚性がん細胞由来のニューロンにおいて顕著に見られた.また,同じAPP発現ベクターをラット海馬に注入したところ,同様に変性を示すニューロンが,多数認められた.

この変性はグリア細胞では見られず,ニューロンに特異的なものであった.これらのアデノウイルスベクターによる遺伝子導入モデル系を用いた研究により,APPの過剰発現に伴ってin vivoおよびin vitroにおいてニューロンの変性が短時間に起こることが示された.したがって,これらの系はアルツハイマー病における神経変性の分子機構や,その抑制機構を研究する上で有用であることが示された。
近世末イギリス消費文化とオークション：2つの役割の分析

最終年度(2018年)は、18世紀イギリスの競売の、「1.人々の生活様式、文化、趣味を社会に伝える役割」「2.弁済方法としての役割」の補足的研究と最終年度としてのまとめを計画した。以下1,2.それぞれの概要である。1.データベース使用上の変更などが原因で、研究期間(H2729)中に予定した必要なオークション目録、遺産目録すべてを収集検討できなかった。よって、収集済みの目録等と他の種類の関連史料を用いて、予定していた「オークション目録と遺産目録の、商品/遺産(所有物)記載のパターンの近似性の度合い」を予備的に分析した。その結果、暫定的に、オークションの商品と遺産目録の品物の記載が似ており、オークションという方法で市場にでた品物(元の所有物)の目録表記は、実生活の中の品物の所有の仕方(家内での配置など)の参考になっていた面があることを確認した。ただし、国際シンポジウム(29年)では、所有品の商品化というコンセプト自体への疑問と、オークション目録と遺産目録の記載方法に関する重要な助言を受けたため、予定していた英専門雑誌への投稿を保留し、内容を再検討することにした。2.有効活用できる史料の数が想定していたほど存在しなかったことが、研究計画上の大きな反省点である。ただし、反省点をふまえて特定の地域の特定の人間関係に条件を限定して検討すると、「債務者と債権者」の双方がオークションを利用した理由を、近世末社会の文脈で示しうる史料を確認することができた。その結果、暫定的に、オークションが、当時、人間関係の維持に重要な「信用」を確認する手法であったという見解にいたっている。4年間の研究によって、近代以降とは異なる、近世固有の消費社会の一面が明らかになりつつある。その点を含め、現在、著書(『オークションの時代ー18世紀イギリスの消費社会の一側面』慶応大学出版会)の執筆作業に入っている。本研究では、近世イギリスのオークションの、1.生活様式、文化、趣味を社会に伝える役割、2.弁済方法としての役割、を検討し、消費社会成長期の近世社会においてオークションという「中古」市場がはたした、特殊な経済文化的役割の解明を進めている。1.に関する作業は以下の4点である。1:居宅開催のオークションでの商品(所持品)レイアウトを目録から分類整理し、商品の目録上の記載パターンをデータ化する。2:遺言書付帯遺産目録の所持品記載と1で確認した記載パターンを照合する。3:12をふまえて、オークション(市場)での商品記載形式と、実生活での品物の所持パターンの近似性有無を調査する。4:3の結果から、市場で提案された商品所持の型が、実生活における品物所持のしかたに影響したかしなかったかをデータ化することで、鳥瞰的に把握する。2.に関する作業は、債務者の所持品がオークションされる場合されない場合の条件の検討である。H27年度は、1.の12と、2.を部分的に進め、それぞれ、今後の作業に必要な見とおしを立てた。1については入手済みのデータとロンドン地方文書館で遺産目録を一部取集し、市場(オークション)で商品を販売するさいに作成される目録の商品記載のパターンが、商品購入後の生活のなかでの品物の所持の型に呼応するケースを一程度確認した。これには市場経済が拡大する時期に、人々の消費生活が、家族を中心とした世代間で遺産等の継承時に示される情報だけではなく、市場という外部が与える情報をもとに形成されていた可能性が高いことを示しており、今後の研究を進めるうえで重要な成果である。2については、主に、ロンドンの文書館で債務者処理にあたった弁護士の記録を検討し、修正箇所を含め、基礎作業を行った。詳細は以下「進捗状況」に示すとおりである。H27年度は、「研究実績」に記載した作業の、1.の12と、2.をそれぞれ部分的に進めた。その結果、1.1から、オークション市場で商品を売るさいの目録記載形式に、一定のパターンが確認された。また1.2では、商品購入後の実生活において品物所持様式が、11で検討した目録記載と酷似するケースを見出した。112に以上の相互関係を確認したことは、消費社会成長期の近世社会に、各種商品を生活にとりいれるさいに、市場、とくに中古市場における提案が積極的に参照されていた可能性があることを示唆するものとみることができる。よって、今後も同様作業を進める意義を確認できたといえる点で、計画はおおむね順調に進んだと判断する。2.については、ロンドンの弁護士の営業記録から、借金返済にオークションを用いることができたケースとできなかったケースがあったことを確認し、初期的には一定の成果を得た。ただし現状では、一部の特定例の確認にとどまっている。また、H27年に検討した史料では、借金返済にオークションを利用できた、できなかった条件の違いを明確にすることはできなかった。この点をふまえて、今後は、条件の検討を、自治体の役職関連記録や裁判記録、顧客のやりとりなど、債務者の人物評価を示す史料を開拓して行う必要があると考えている。よって総合的には、作業は順調であるが、今後多少の変更も必要であると考える。本研究では、近世イギリスのオークションについて次の2側面を検討している。1.生活様式、文化、趣味を社会に伝える役割、2.弁済方法としての役割。これらをふまえ、商業と消費活動の面で著しい成長期にあったイギリスの近世社会において、オークションという「中古」品市場が担った、経済文化的役割の解明を進めている。

1.を明らかにするための主な作業は以下4点である。1:居宅で開催されたオークションにさいして発行された目録の、商品(=所持品)記載のされかたを分類・整理し、商品の目録上の記載パターンをデータ化する。2:1の作業を、遺言書付帯遺産目録上の所持品記載において行い、1で分類整理した記載パターンを照合する。3:12をふまえ、オークション(商品売買現場=市場)での商品の記載と実生活上の品物所持のしかたの近似性の有無を調査する。4:3の結果から、市場において提示された商品記載が、生活のなかでの品物の所持のしかたと何らか影響しあっていたかどうか、データをつうじて、連関性を把握する。2.を明らかにするための作業は、債務者の所持品がオークションされる場合とされない場合の条件、環境の検討である。作業は2つの方法で進めている。1:債務者を扱った弁護士(現状ではロンドン)の業務記録から、オークションを開催された、されなかった債務者を割り出し、両者の違いの条件を精査する。2:18世紀に生きた人間の日記から、とくに、特定の地域社会で借金を理由に開催されたオークションの事例をとりあげ、地域社会に関連して残された公的・私的文書と、それらのオークションにかかわった弁護士の業務記録などから、オークションが開催された・されなかった背景を探る。H28年度は、1.については予定より作業の進行が遅くなった(詳細は次項を参照のこと)。2については、前年度に比べて、個別の事例の調査検討をふくめ新しい作業を進めることができた。H28年度は、前年度と同様、前項「研究実績」記載の、検討課題1.-1と2、2.の作業をそれぞれに進める予定だった。ただし、とくに前年度(H27)に検討課題1.についての作業が一定度進んだこともあり、本年度は2.に作業の多くを割いたため、全体の作業は遅れた。また、1.については、本研究の内容にも大きく関連する研究論文において、オークション目録上の商品レイアウトと、遺産目録上の所持品レイアウト自体が、要検討の課題であるとの示唆があったため、慎重に検討を進める必要があると考え作業自体をペンディングにしたことも、全体の作業が遅れた理由である。他方、2.はH27年度までに進めたロンドンの弁護士関連の調査以外に、負債者の所持品オークションが地方の(半農村)共同体のなかでで開催された事例の周辺を一程度解明することができた。これにより、共同体の成員を擁護しサポートしようとする互助的性質に類似するものの一部を確認することたできた。この新たな確認は、前年度までに解明していないロンドンのケースの調査をすすめ、考えるさいの有効材料になると考えることができる。ただし、いずれにしても事例が少ないので、さらに同様の作業を進める予定である。経済発展期の近世ヨーロッパ、とくにイギリスでは、商品と消費者が各種の方法や場面で密接になった。これを前提に、本研究では、古来の売買方法オークションが、近世イギリスの社会経済環境に深く関わっていた実態を、1.消費が形成した個々人の生活様式と文化、趣味を社会に伝える役割(消費財の社会化)、2.消費から生じた借金の弁済方法としての役割、の二面から検討を行った。
脳血流SPECT画像フラクタル解析による軽度認知障害の予後推定に関する研究

研究者らは研究期間の初期にワークステーション上で脳血流SPECT画像を解析するソフトウェアとして機能的三次元フラクタル解析法を完成させた。これを用いて、研究者らはまず脳血管性認知症患者で脳血流分布のフラクタル次元(FD)数が健常者に比較して高い、すなわち脳血流分布の不均一性が高いことを見いだした。また同様のFD値を示すアルツハイマー病との鑑別にはFD値の脳前後での差を比較することが有効であることも見いだした。軽度認知障害(MCI)の患者は14名が見つかり、18名の同年代と比較した。MCI患者の脳血流SPECT画像は視覚的に評価すると全体的に斑状のわずかな血流低下を示し、健常者との鑑別は困難であった。FD値で評価すると健常者の0.853±0.062に対し、MCI患者では1.071±0.194と有意に高い値を示し、やはりMCIでは脳血流分布が不均一であることが示された。FD=0.92未満を正常とするとFDを用いた時のMCIの検出は感度78%、特異度83%であった。次にこれまで使用したTc-99mHMPAOよりも病変描出力が高いとされるI-123 IMPを使用して新たに健常者、MCI患者とも9名ずつでフラクタル解析を行ったところ両者のFD値は健常者0.855±0.105、MCI患者0.95±0.112であり有意差はなかった。トレーサーの挙動や解像度の差が両者のFD値の差がなかった原因として考えられた。最初に登録したMCI患者を研究期間中追跡したところ、14名中4名(28.6%)がアルツハイマー病に進展した。登録時の状況を遡って検討するとこれら4名の患者はMCIのまま変化しなかった患者に比較して認知機能など明らかな臨床上の差はなく、FD値も有意な差を認めなかった。長期的結論は対象患者数および観察期間をさらに多くして検討する必要がある。研究者らは本年度の初期に、ワークステーション上で脳血流SPECT画像を解析するソフトウェアとして機能的三次元フラクタル解析法を完成させた。このソフトウェアを使用し、研究者らはまず脳血管性痴呆患者で脳血流分布のフラクタル次元(FD)が正常者に比較して高い、すなわち脳血流分布の不均一性が高いことを見いだした。さらにこれらの患者では脳血流分布の不均一性が脳の前部で高いことが推定され、脳の前後で別個にフラクタル次元を求められるよう解析ソフトを改良した。その結果痴呆の二大原因である脳血管性痴呆とアルツハイマー病では脳前後部間でも脳血流不均一度がそれぞれ異なることがわかり、鑑別診断に応用可能であることが示された。これらの結果は本年度欧文雑誌に発表した。記銘力障害が軽微である軽度認知障害(MCI)の患者は14名が見出されて検査され、18名の同年代健常者と比較した。MCI患者の脳血流SPECT画像は視覚的に評価すると前頭葉がわずかに低血流を示すか、全体的に斑状のわずかな血流低下部位が認められたが健常者と区別することは困難であった。

一方、健常者ではFD値が0.853±0.062(平均値±標準偏差)であったのに対し、MCI患者ではFD値は1.071±0.194と有意に(p=0.001)高い数値をとることが明らかとなった。この結果は脳血流SPECTの視覚的な診断ではとらえにくいMCIの脳血流分布異常をフラクタル解析法が敏感に検出したことを意味している。FD=0.92未満を正常とするとFD値を用いて感度78%、特異度83%でMCIを検出できることが判明し、フラクタル解析法がMCIの画像診断として有用であることが示された。この研究成果は第43回日本核医学会総会にて発表した。研究者らは昨年度、軽度認知障害(MCI)患者の脳血流SPECTにおいてフラクタル解析を行い、健常者と比較してフラクタル次元数が有意に高いことを見出した。MCI患者では健常者に比較して局所脳血流分布が不均一であることを意味し、フラクタル次元数によりMCIの診断が可能であることを示した。この結果は第51回米国核医学会年次総会(2004年6月)にて発表した。本年度は上記の結果を踏まえ、まずフラクタル解析結果のトレーサー依存性について検討した。あらたに9名のMCI患者および9名の健常者についてI-123 iodoamphetamine(I-123 IMP)による脳血流SPECTを行い、フラクタル解析を行った。その結果MCI群のフラクタル次元数は0,95±0.112であったが健常者群のそれは0.855±0.105であり、MCI群のフラクタル次元数は健常者に比較して高い傾向を示したが、有意差はなくI-123 IMP SPECTでは両者の鑑別が困難であるという結果になった。トレーサーの挙動の差異の他に解像度の問題などが原因として考えられた。I-123 IMPを使用する場合は参照部位や閾値の範囲などを最適化しなおす必要がある。次に昨年度登録したMCI患者について本年度追跡調査を行った。登録した14名のMCI患者はのうち2年度内に4名(28.6%)がアルツハイマー病に進展した。登録時の状況を遡って検討するとこれら4名の患者では未変化群に比較して明らかな臨床上の差はなく、脳血流SPECTのフラクタル次元数も有意な差を認めなかった。フラクタル次元数単独ではMCI患者の予後の推定は難しい可能性がある。
アミロイド性蛋白質を用いた抗アミロイドーシス性カテコール誘導体の分子モデリング

Aβ,ApoAII,ヒト型シスタチン及びステフィンを標的アミロイドとして,天然中に存在する種々のカテコール基を有するフェノール化合物の抗アミロイド効果を広く調べるとともに,酵素を利用して長さや性質の異なる脂肪アルコール鎖や糖鎖を付加し,それらの修飾が抗アミロイド効果に及ぼす影響を調べた。また,セサミンのカテコール誘導体も実験に用いた。その結果,標的アミロイドに共通して,カテコール基が有効であること,フェノール化合物への糖鎖導入効果はないが,脂肪アルコール鎖については導入効果があり,その鎖長が重要であることが明らかにされた。本研究は,種々のフェノール化合物にアミロイド線維の形成と沈着を阻害・抑制する効果があることが示されていることを手掛かりに,カテコール基を有するフェノール化合物をベースに炭素鎖や糖鎖を導入したり,亜臨界水処理による部分加水分解によってフェノール化合物にカテコール基を導入したりして,食品衛生学的に安全な抗アミロイドーシス性食品素材を創製しようとするものである。H24年度は,ヒト型シスタチンL68Q及びステフィンAの大量調製に成功し,またアミロイド線維形成型蛋白質ApoAIIを用いた抗アミロイド実験のアッセイ系確立にも成功した。そこでこれまでに調製した種々のアシル化カテコール誘導体の抗アミロイド効果をAβ,L68Q,ステフィンA,及びApoAIIの系を用いて詳細に調べた。その結果,標的とするアミロイド型蛋白質のタイプによってフェノール化合物に導入すべき炭素鎖長を最適化しなければならないことが明らかにされた。次に,平成23年度の研究結果では糖鎖の導入効果が見られなかったので,天然中に存在する朝鮮人参ジンセノサイド(配糖体)をモデルにした研究を実施した。すなわち,Ra1,Ra2,Ra3,Rb1,Rc,あるいはRdといった配糖体とプロトパナキサジオールあるはプロトパナキサトリオールといったアグリコンの抗アミロイド効果の比較を行った。その結果,付加している糖鎖の数と位置によって抗アミロイド効果は著しく異なることが明らかにされた。また,平成23年度に実施したセサミンの亜臨界水処理実験と同様に,セサミノールの亜臨界水処理によるモノカテコール体及びジカテコール体誘導体の調製も試みた。その結果,カテコール化によってセサミノールの抗アミロイド効果は,有意に上昇することが明らかにされた。このことは,老化促進モデルマウスSAMを用いた生体実験によっても確認された。本研究は,Aβ,ApoAII,ヒト型シスタチン及びステフィンを標的アミロイドとして,より効果的かつ安全な抗アミロイドーシス食品素材を創製することを目的としている。すなわち本研究では,天然中に存在する種々のカテコール基を有するフェノール化合物の抗アミロイド効果を広く調べるとともに,酵素を利用して長さや性質の異なる脂肪アルコール鎖や糖鎖を付加し,それらの修飾が抗アミロイド効果に及ぼす影響を調べた。大豆イソフラボン類及び朝鮮人参シンセノサイド類についての実験結果から,付加している糖鎖の数と位置によって,また標的アミロイドの種類によって,抗アミロイド効果は著しく異なることが明らかにされた。一方,クロロゲン酸類及びその代謝物を用いた実験によって, IC50とLogP(疎水性度)との間には正の相関関係があることが認められ,疎水性度の高いフェノール化合物の方がより強い抗アミロイド効果を示すことが明らかにされた。そこで,桂皮酸類への糖鎖及び脂肪アルコール鎖導入効果を調べた。その結果,標的アミロイドに共通して,糖鎖の導入効果は認められなかったが,脂肪アルコール鎖については,特徴的な導入効果が認められた。すなわち,Aβに対しては鎖長が長いほどより強い効果を示すが,ヒト型ステフィンに対しては至適鎖長があることが明らかにされた。脂肪アルコール鎖導入効果は,培養細胞を用いたバイオアッセイ及び老化促進マウスSAMP8を用いた動物実験においても追認された。抗アミロイド効果を示したフェノール化合物については食品衛生学的な検証も行った。その結果,エイムズテスト及びレックアッセイのいずれにおいても変異原性陰性であることが確認された。また,マウスを用いた毒性試験によって脂肪アルコール鎖の導入は供試フェノール化合物のLD50を低くし,糖鎖導入はLD50を上昇させることが明らかにされた。アルツハイマー病や透析アミロイドーシスなどアミロイド線維の沈着によって引き起こされる疾病が社会問題化している。種々のフェノール化合物にはアミロイド線維の形成と沈着を阻害・抑制する効果があることが示されているが,構造生化学的には不明な部分が多く残されているのが現状である。本研究は,カテコール基を有するフェノール化合物を骨格に,長さや性質の異なる脂肪アルコール鎖や糖鎖を付加し,アミロイド線維形成型蛋白質であるAβやシスタチン等の線維状化抑制効果を調べ,ヒトに安全な抗アミロイドーシス食品素材の創製へと繋げることを目的としている。

まず,カフェ酸,ケルセチン及びクロロゲン酸にリパーゼ(Novozyme 435)を用いて長さの異なる脂肪アルコール鎖を付加したカテコール誘導体を作成した。Aβペプチドの線維形成阻害活性を調べたところ,より長い炭素鎖が付加されることで,高い活性が得られることが明らかにされた。次に,韃靼そば由来のルチナーゼを用いてルチノース糖鎖を導入したカテコール誘導体を作成し,抗アミロイド効果を調べたが,現時点では有意な改善効果を認めることができなかった。一方,これまでの研究で,Pichia pastoris発現系により,ヒト型シスタチン及びステフィンを大量発現させることに成功したので,今後は,これらの組換え蛋白質を用いて上述したカテコール誘導体の抗アミロイド効果を調べることが可能となった。また,ゴマセサミンを亜臨界水処理することによって,セサミンのモノ及びジカテコール誘導体を調製することに成功した。セサミンの抗アミロイド効果は,モノ及びジカテコール化によって飛躍的に上昇することが明らかにされた。また,杏中の天然化合物にも抗アミロイド効果を示すものがあることが確認できた。次年度以降,これらの知見を取り入れて,本研究を総合的に発展・深化させることが可能となった。H24年度は,ヒト型シスタチンL68Q及びステフィンA&Bの大量調製に成功し,またアミロイド線維形成型蛋白質ApoAIIを用いた抗アミロイド実験のアッセイ系確立にも成功したので,様々な標的蛋白質を用いた実験を行うことができた。アミロイド前駆体蛋白質(APP)発現P19細胞(マウス胚性腫瘍細胞)細胞株を用いた実験は,現在,継続し実施中である。当初の予定通り,カテコール基を持つ種々のフェノール化合物に長さや性質の異なる脂肪アルコール鎖や糖鎖を付加し,Aβを用いた抗アミロイド効果を調べることができた。また,ヒト型シスタチン及びステフィンの大量調製にも成功し,今後はこれらの組換え蛋白質を用いた抗アミロイド効果を実施することが可能となった。電子顕微鏡を用いた構造生化学的解析及び老化促進モデルマウス(Senescence Accelerated Mouse, SAM)を用いた効果についても調べており,本研究はおおむね順調に進展しているといえる。これまで本研究はおおむね計画通り順調に進展している。平成25年度は,培養神経細胞を用いた実験と老化促進モデルSAMマウスを用いた実験を重点的に行う。また,新規物質の安全性の評価と食生活への利用形態についての検討も加え,ヒトに安全な抗アミロイドーシス食品素材の創製に資することができるようにする。上述したように,本研究は,おおむね順調に進展しているので,今後は,アミロイド線維形成型蛋白質ヒト型シスタチン及びステフィンを用いた実験,培養細胞や老化促進SAMマウスを用いた遺伝子レベル・生体レベルでの詳細な実験を展開し,また,天然食材中の抗アミロイド効果を示すフェノール化合物についても検討を加え,ヒトに安全な抗アミロイドーシス食品素材の創製への基盤形成の役割を担いたい。平成24年度に引き続き,カテコール誘導体の構造と効果との関係についての構造機能相関解析を行い,更なる高機能化を試みる。