hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経発生過程における遺伝子発現動態の解明と神経分化の誘導

そこで我々は、海馬における静止状態の神経幹細胞を活性化させ、神経新生を誘導することを目的に研究を行っている。その結果、静止状態の神経幹細胞を活性化できる遺伝子発現の組み合わせが培養細胞レベルで見つかった。現在、マウス成体脳を用いてそれらの結果が再現できるか検証を行っている。平成26年度の研究計画に記載した内容を順調に遂行することができたため。今後もオプトジェネティクスの技術を応用し、マウス成体脳の海馬領域で休眠状態の神経幹細胞を活性化を目的とした検証を行う。また、胎児脳および成体脳由来の神経幹細胞の発現遺伝子の違いを細胞周期フェーズに分けて解読し、相関関係が明らかになった標的遺伝子の代表的なものについては同様にオプトジェネティクス技術を応用して成体脳神経幹細胞に発現を人為的に誘導させ、どのような変化が起こるか解析を行う。今後は活性型の神経幹細胞が極めて少ない老齢マウスの休眠状態の神経幹細胞を活性化させることを目標とし、最終的には、アルツハイマーのような進行性の脳変性疾患への臨床応用を目指す。神経発生今後はオプトジェネティクスの技術を応用し、マウス成体脳でMash1の発現パターンを胎児脳と同じような発現パターンに誘導し、休眠状態の神経幹細胞を活性化できるかどうかの検証を行う。さらに、活性型の神経幹細胞が極めて少ない老齢マウスの休眠状態の神経幹細胞を活性化させることを目標とし、最終的には、アルツハイマー病のような進行性の脳変性疾患への臨床応用を目指す。次年度は遂行予定の実験や学会発表を含め、更なる予算が必要と思われるため。次年度は遂行予定の実験や学会発表も含め、更なる予算が必要と思われるため。次年度はマウスを用いた解析が更に増え、多数のマウスを購入する必要があり、さらに遺伝子操作を行う際のプライマーや酵素など、様々な物品に使用する予定である。また、研究成果を発表するため、学会の発表を行う予定である。また、研究成果を発表するため、学会での発表を行う予定である。
スンクスの脳のStereotaxic Atlasの作成

1.本研究の目的は新しく実験動物として開発された、スンクス(ジャコウネズミ、食虫目)において、中枢神経系の線維結合の詳細や機能を研究する為に電極を任意の場所へ刺入する指標となるような図譜(Stereotaxic Atlas)を作成することである。そのためには、まずスンクスに適合した脳定位装置を考案し、これによるスンクスの保定方法を確定しなければならない。ついで、その装置によって決定された軸に対する、スンクスの脳の位置関係を図譜として明示する必要がある。2.初年度(昭和63年度)に於いては脳定位装置の作成を行った。スンクスも耳胞も外耳道も骨性ではなく、更に外耳孔の位置がげっし類に較べて甚だしく腹側にあるので、げっ歯類用のイア-バ-で頭蓋骨を固定しようとすると喉頭を圧迫して窒息させる。イア-バ-は基部径5mm、先端径3mm、長さ5mmとし基部に側頭稜を押える直径10mmの硬質ゴムまたは樹脂製のパットをつけることによって安定して保定出来ることを明らかにした。またTeeth-Barの高さを調節して頭蓋骨上面を水平に保った時、かなり安定してイア-バ-0の横断面が大脳縦裂の後端を通り充分実用化出来る程度に脳を定位出来ることも明らかとなった。3.最終年度(平成元年度)には前年度から引続き作成した3方向の連続切片により個体に依る脳の大きさの変異、標本作製時の収縮等を補正するとともに、定位装置に依る電極刺入によって保定の安定度を検討した。この結果、背腹方向の基準面としてはイア-バ-0は使用することが出来ず、脳表面を基準面として用いるのが実際的であることが明らかとなった。4.今後の研究の発展方向としては、作成した図譜を用いて実験神経学的に核や路の同定を行うと共に、画像解析ソフトを用いて核や路の位置を立体表示する方法を検討中である。なお、図譜については図書として出版することを計画している。昭和63年度に計画した本研究の要点は、新らしく実験動物として育成されたスンクス(食虫目、トガリネズミ科)の生理学的研究の爲の基礎研究として、脳定位保定装置を考案することと、これを用いた脳内への電極刺入方法の検討であった。脳定位法については、トガリネズミ科動物がその特性として骨性の外耳道と耳胞を有しないこと、吻部が長く突出していること、外耳道の位置が顎関節よりかなり後腹側に位置すること等げっ歯目動物とは大きく異なっているため、これまで広く用いられて来ているマウス、ラット用脳定位装置を用いることが出来ない。そのため軟X線撮影と解剖的手法により下記の改良点を明らかにした。1.頭蓋骨の定位はイアーバーのみでなくこれに突起物をつけ外耳道を指標としつつ頭蓋骨自体を固定する方法を考案した。2.外耳道の位置が尾腹側にあるため細く長いイアバーでは、咽頭を外側から圧追して気道を閉すため、イアバーはラット用のものより約0.7mm太く3mm短い必要があることを明らかにした。3.スンクスは吻が長くげっ歯目のように大きな切歯を有しないので切歯点の固定具を改良すると共に、背位、腹位の両方で保定できるよう改良を加えて現在装置の試作品を製作中である。

電極刺入法については、スンクスにおいて頭頂部まで伸びている厚い側頭筋の処理方法と、スンクスは絶食、断水に弱いため術後管理に配慮を要する。この点は外科用接着剤の適用と、電極を導くためのガラス細管で筋を貫通することにより解決できる見通しが立った。次年度においては、実際に改良した装置による電極刺入実験を行う予定で、現在図譜作製用の脳標本を製作中である。上記の研究成果は1989年5月の日本実験動物学会総会において、報告予定である。1.前年度作製したスンクス用脳定位装置を用いて、雌雄スンクスを麻酔下に保定し、保定の安定度を検討する為に電極を入れてその位置を確認した。この結果説吻-尾方向および正中-外側方向には安定した位置に定位していることが確認された。しかし、背-腹方向にはイア-バ-0を基準にする限り不安定であることがわかり、本研究では脳表面の高さを基準とする方が実用的であるとの結論に達した。2.麻酔下に動物を定位装置に保定後麻酔薬の過剰投与により屠殺し、歯科ドリルのカッタ-で正中面、種々のレベルでの横断面を作製し個体の大きさによる補正方法を検討した。検討は眼鼻長、頭長、頭幅を計測し、イア-バ-0面から前交連、小脳尾側端までの距離及び脳幅、脳高の値を比較することによって行った。その結果頭長-眼鼻長=(外後頭部眼中心の距離)の値で補正するのが最も良いとの結論に達した。3.横断、矢状断、水平断のセロイジン30μ、パラフィン10μの完全連続切片から写真を作製し、上記2によって得られた方法で補正したスケ-ルを記入して脳定位図譜を作製した。4.スンクスは嗅覚系、三叉神経系、顔面神経系等が巨大に発達している一方、新皮質、小脳、視覚系等の発達ははなはだ乏しい。このため脳神経核や神経路の配列がげっ歯目、食肉目等に比較して大きく異なっており、これらの同定、正しい命名については慎重を期さざるをえず今後の課題として残した。5.今後の研究の発展方向としては、作成した図譜を用いて実験神経学的に核や路の同定を行うと共に、画像解析ソフトを用いて核や路の位置を立体表示する方法を検討中である。なお、図譜については図書として出版することを計画している。
脳神経系で内分泌撹乱作用を示す環境ホルモンと核内受容体の同定・影響評価

本研究者らにより、プラスチック原料であるビスフェノールA(BPA)が、ヒト核内受容体の1つであるエストロゲン関連受容体γ型(ERRγ)に強く結合することが発見された。これにより、BPAがERRγを介して内分泌かく乱作用を示すことが考えられ、脳神経系に対する悪影響が懸念される。本研究では、こうした環境化学物質の影響を48種類のヒト核内受容体のすべてについて検討し、特に、ERRγを介した脳神経系での撹乱作用について詳細に解析することを目的とする。本年度は、ERRγの機能解明と、胎児の脳神経系の発達に対するBPAの影響解析を目的とし、ERRγと連関して機能する転写因子の同定と、妊娠マウスのBPA経口投与による胎仔脳内のタンパク質発現量の変動解析を行った。まず、ERRγと連関して機能する転写因子を同定するために、マウス胎仔脳を用いてクロマチン免疫沈降法による解析を行った。その結果、ニューロンの分化を制御する転写因子の1つがERRγの転写を促進することが明らかとなった。さらに、発現が誘導されたERRγは、ERRαの発現を促進することが明らかとなった。次に、BPAのERRγを介した具体的な影響を解析するために、妊娠マウスに妊娠1日目から16日目まで、200μg/kg/dayのBPAを経口投与し、12.5、14.5、16.5日の胎仔脳について、ERRγと連関して機能する遺伝子群のmRNA量をリアルタイムPCRで測定した。その結果、ERRγの機能を抑制するタンパク質や、脳神経系の発達に関わる核内受容体群のmRNA量がBPA投与によって有意に変化し、タンパク質としての発現量が変化していることが明らかとなった。こうしたタンパク質発現量の変化は、脳神経系の正常な分化や発達に影響を与える可能性が高く、成長にともなう脳の形態観察や行動解析などを行うことが強く求められる。本研究では、こうした環境化学物質の影響を48種類のヒト核内受容体のすべてについて検討し、特に、脳神経系での撹乱作用について解析することを目的とする。本年度は、まず、BPAとERRγの結合特性を調べるために、ERRγとトリチウム標識したBPAによる飽和結合試験を行った。その結果、BPAとERRγの結合定数は5.5nMであり、天然のホルモンとその受容体の結合親和性に匹敵することが判明した。さらに、BPA類似化合物を用いて構造活性相関解析を行った結果、ERRγへの結合は、BPAを構成する2つのフェノール性OH基のうち、一方のみが主要な結合要因であることが判明した。そこで、フェノール化合物について精査したところ、内分泌かく乱物質として疑われるアルキルフェノール類が、ERRγに結合することが明らかとなった。また、化学物質の「結合性」と「活性」の両方を同時に測定できる「センシング抗体法」を用いて、48種類のヒト核内受容体に対して化学物質の評価を行うために、ファージディスプレイ法によるセンシング抗体の作製を行った。本年度は、抗体作製系の確立に成功し、新たに4種の核内受容体についてセンシング抗体の作製に成功した。このセンシング抗体法は、独自に開発した評価法であり、48種の核内受容体を対象に膨大なアッセイを可能にする高効率的で独創性の高い手法である。これを多数の受容体において確立した功績は非常に大きい。これにより、BPAがERRγを介して内分泌かく乱作用を示すことが考えられ、特に、脳神経系に対する悪影響が懸念される。初年度にはERRγとBPAの構造活性相関解析を行い、ERRγに結合する化学物質を多く同定することに成功した。本年度は、まず、昨年までに同定された化学物質と、BPA代替化合物について、ERRγとERαへの結合選択性を解析した。その結果、アルキルフェノール類が、きわめて選択的にERRγに結合することが明らかとなった。一方、ERαに選択的に強く結合するBPA代替化合物が同定され、ERαを活性化することが判明した。これは、ERαを明確に標的とする初めての化学物質であり、きわめて重要な発見である。2つ目に、ERRγの機能解析を目的として、ERRγによって発現が制御されるタンパク質の解析を行った。マウスから摘出した脳や胎仔に対してChIP解析を行った結果、脳神経系の分化に関わるタンパク質の発現がERRγによって制御される可能性が示唆された。これにより、BPAがERRγを介して脳神経系に影響を与える可能性は極めて高いと考えられる。3つ目に、「センシング抗体法」を用いて、48種類のヒト核内受容体に対して化学物質の評価を行うために、ファージディスプレイ法によるセンシング抗体の作製を、初年度に引き続き行った。本年度は、センシング抗体を効率よく作製する手法の確立に成就し、最終年度にはすべての核内受容体においてスクリーニングに着手する予定である。

本研究者らにより、プラスチック原料であるビスフェノールA(BPA)が、ヒト核内受容体の1つであるエストロゲン関連受容体γ型(ERRγ)に強く結合することが発見された。これにより、BPAがERRγを介して内分泌かく乱作用を示すことが考えられ、脳神経系に対する悪影響が懸念される。本研究では、こうした環境化学物質の影響を48種類のヒト核内受容体のすべてについて検討し、特に、ERRγを介した脳神経系での撹乱作用について詳細に解析することを目的とする。本年度は、ERRγの機能解明と、胎児の脳神経系の発達に対するBPAの影響解析を目的とし、ERRγと連関して機能する転写因子の同定と、妊娠マウスのBPA経口投与による胎仔脳内のタンパク質発現量の変動解析を行った。まず、ERRγと連関して機能する転写因子を同定するために、マウス胎仔脳を用いてクロマチン免疫沈降法による解析を行った。その結果、ニューロンの分化を制御する転写因子の1つがERRγの転写を促進することが明らかとなった。さらに、発現が誘導されたERRγは、ERRαの発現を促進することが明らかとなった。次に、BPAのERRγを介した具体的な影響を解析するために、妊娠マウスに妊娠1日目から16日目まで、200μg/kg/dayのBPAを経口投与し、12.5、14.5、16.5日の胎仔脳について、ERRγと連関して機能する遺伝子群のmRNA量をリアルタイムPCRで測定した。その結果、ERRγの機能を抑制するタンパク質や、脳神経系の発達に関わる核内受容体群のmRNA量がBPA投与によって有意に変化し、タンパク質としての発現量が変化していることが明らかとなった。こうしたタンパク質発現量の変化は、脳神経系の正常な分化や発達に影響を与える可能性が高く、成長にともなう脳の形態観察や行動解析などを行うことが強く求められる。
前庭眼反射における交連抑制と小脳性抑制の相互関係

〔目的〕同一平面内にある左右半規管相互間で抑制性神経機構がある。この交連抑制は、頭の角加速刺激に対する前庭神経核中継細胞の反応の感度を高める働きをすると同時に、片側迷路破壊のいわゆる中枢性代償の主体をなしている。3つの半規管系について交連抑制のかかり方をみると、前半規管,後半規管あるいは水平半規管入力をうける中継ニューロンは、それぞれ反対側の後半規管,前半規管又は水平半規管刺激によって抑制される。しかし、この前庭核中継ニューロンの軸索投射様式が不明であった。そこで前庭動眼反射にかかわる中継細胞にかぎって交連抑制のかかり方を調べた。〔方法〕麻酔ネコを使用した。眼窩内で必要な外眼筋支配神経を双極性に刺激し、外眼筋運動ニューロンプールを逆行性に同定し、その部位に金属電極を固定した。左右前・後半規管神経を合計4本、100μステンレス線をはり合わせた電極で刺激した。記録した前庭核ニューロンはFast Green FCFを満した2MNaclガラス微小電極で記録した。〔結果・考察〕前半規管入力を受け軸索を対側下斜筋運動ニューロンプールに送る興奮性前庭核中継細胞は、内側核と下核にあり対側のMLFを上行する群、と上核にあり深部網様体を通る2群に分かれる。前後者ともそれぞれ大部分(32/36:89%)と(20/23:87%)が対側の後半規管神経刺激によって抑制を受けた。前半規管入力を受け同側の滑車神経核に軸索を送る抑制前庭核中継細胞も上核にある。この抑制性前庭動眼細胞の内わずか9%(3/35)だけが交連抑制を受けた。一方後半規管入力を受ける興奮性・抑制性前庭動眼細胞全てが対側の前半規管神経刺激によって抑制を受けた。前半規管入力を受ける抑制性中継ニューロンだけがなぜ交連抑制を受けないかについて現在十分説明が出来ない。小脳片葉からも抑制性機構に差があると見られるので、両機構を統合して考えるために現在実験中である。
リンパ球表面抗原CD38-NADaseの生理機能

本研究では、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の分化で誘導され、NAD分解(NADase)活性をもつエクト型酵素のCD38について、伊国トリノ大学Malavasi博士及び米国テキサス大学Mehta博士らとの共同研究により、CD38を介する細胞内シグナル伝達機構、CD38の酵素化学的特性、及びCD38の転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、抗CD38モノクローン抗体(IgG1)でHL-60細胞を刺激すると、癌遺伝子産物p120^<c-cbl>を含む細胞内蛋白質がチロシンリン酸化され、さらにG蛋白質と共役する化学遊走因子受容体刺激を介する活性酸素産生が増強された。この活性酸素産生の増強は、CD38抗体のFc部分がFc_γII受容体を刺激して、G蛋白質を介するイノシトールリン脂質3キナーゼの活性化を増強した結果であった。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を作製して中枢組織での局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化されることが明らかにされた。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に同定し、CD38のNADase活性がレクチンとの結合により阻害されることを見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でカクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によって担わていることを明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38について、イタリア・トリノ大学Malavasi博士らとの共同研究により、CD38を介する細胞内シグナル伝達機構、CD38の酵素化学的特性、及びCD38の転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、IgG1サブクラスに属する抗CD38モノクローン抗体でHL-60細胞を刺激すると、癌遺伝子産物p120^<c-cbl>を含む数種類の細胞内蛋白質がチロシンリン酸化され、さらにG蛋白質と共役する化学遊走因子受容体刺激を介する活酸素酸生は著しく増強された。この活性酸素産生の増強は、CD38モノクローン抗体のFc部分がFcγII受容体を刺激して、G蛋白質を介するイノシトールリン脂質3キナーゼの活性化を増強した結果であることが明らかにされた。2、ラット脳の初代培養法により各種のグリア、神経細胞を分取して、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体によりその局在を解析した。抗体陽性の46-kDa CD38はアストロ細胞に強く発現しており、またその細胞表層には顕著なNADase活性が認められた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、アストロ細胞のCD38は斑点(cluster)状の構造をとり、基質NADの添加によって細胞内陥入(internalizaation)することが明らかにされた。3、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。

先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によって担われていることを明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38について、伊国トリノ大学Malavasi博士及び米国テキサス大学Mehta博士らとの共同研究により、CD38を介する細胞内シグナル伝達機構、CD38の酵素化学的特性、及びCD38の転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、CD38の基質特異性について検討し、CD38はNAD以外に、ニコチンアミドを有するNMNなどの多様な化合物のN-グリコシド結合を切断することが示された。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を作製して中枢組織での局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化されることが明らかにされた。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に同定し、CD38のNADase活性がレクチンとの結合により阻害されることを見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。
Qdotのインターナリゼーションを利用した生体内細胞可視化と癌診断

量子ドット(Qdots)とポリクローナルおよびモノクローナル抗体の結合方法を確立した。結合効率は、細胞をQdot結合抗体で染色する細胞染色法により調べた。この染色は蛍光標識二次抗体を使用せずに可視化することが可能である。Qdot結合抗体は迅速で効果的な染色に適していただけでなく、高解像度かつ光安定性の高い画像を得ることができた。次に、ヒト細胞における抗体のインターナリゼーションを試行し、モータリンタンパク質に対する抗体がインターナリゼーション特性を有することを確認した。コントロールとして様々なタンパク質に対する抗体を用いたが、モータリンのようなインターナリゼーションは示さなかった。抗モータリン抗体のインターナリゼーションは、様々なヒト癌細胞において確認された。このインターナリゼーションがアーチファクトでなく、特異的な表現型であることを確認するために、パルス・チェイス実験、細胞のリアルタイムイメージング、3D再構成解析を含む様々な対照実験を行った。その結果から、我々のインターナライズ抗体が細胞内にQdotsを取り込むことができることを明らかにした。さらに、Qdotsは複数の分裂後においても細胞内で観察されたことより、in vitroおよびin vivoにおける細胞の長時間画像解析に適していることが認められた。Qdotsの毒性は様々な構造および機能解析により調べ、我々のインターナライズ抗体が細胞に対し毒性がないことを確認した。本研究予算により、長時間画像解析に用いることができるインターナライズQdotsを産出することができた。本研究成果は、国際学術誌に2報、国内および国際学会においても発表し、非常に高い評価を得ることができた。
海面上昇によって助長される巨大氾濫災害に関する基礎的研究

海面上昇の実態とその長期傾向の推定については,諸外国において研究されている長期的な気候変動の原因を総括し,太陽活動の変化や二酸化炭素濃度の上昇に伴う長期的な気温の上昇やそれによる氷床の融解が長期的な海面上昇をもたらすことを示すとともに,わが国における絶対的な海面変動を明らかにDするため,潮位および地盤の長期的な観測資料の解析から,最近では数/年程度の経年的な海面上昇が考えられ,将来予測される二酸化炭素の蓄積に伴う気温上昇を考慮すれば, 2100年には約4-4.5mも海面が上昇すると予測された,つぎに,高潮による氾濫災害の予測では,高潮の数値予知および極値統計の基本となる観測潮位の信頼性について,詳細な検討を加えた,すなわち,太平洋沿岸,とくに高潮の常襲地域である,伊勢湾,大阪湾,紀伊水道及び土佐湾における高潮特性について,関係のデータベースを構築し,収集したデータに基づいて解析を行った結果,従来発生機構が不明確であった高潮の前駆波は,黒潮による1-5ヶ月の時間スケールを有する海面変動の一部が重畳される場合が多いことを示すことができた,さらに,津波による氾濫災害の予測では,大阪湾における津波の変動計算を実施し,大阪における津波の高さが1,9mとなって,史料解析の結果と一致することを明らかにし,それらの成果を総合して復元を行った.その計算過程で,大阪湾では津波の周期が長くなると湾奥で増幅されることを見いだし,従来の南海津波やチリ地震津波の痕跡高の沿岸方向の変化を説明できることがわかった.ついで,大阪に来襲するもっとも危険な津波を求め,また,海面上昇の一例として約6000年前の縄文海進を取り上げ,海面が現在より約3m高くなった状態で,安政南海津波クラスの巨大津波が来襲した場合の,大阪平野における氾濫特性を考察した.海面上昇の実態とその長期傾向の推定については,諸外国において研究されている長期的な気候変動の原因を総括し,太陽活動の変化や二酸化炭素濃度の上昇に伴う長期的な気温の上昇やそれによる氷床の融解が長期的な海面上昇をもたらすことを示すとともに,わが国における絶対的な海面変動を明らかにDするため,潮位および地盤の長期的な観測資料の解析から,最近では数/年程度の経年的な海面上昇が考えられ,将来予測される二酸化炭素の蓄積に伴う気温上昇を考慮すれば, 2100年には約4-4.5mも海面が上昇すると予測された,つぎに,高潮による氾濫災害の予測では,高潮の数値予知および極値統計の基本となる観測潮位の信頼性について,詳細な検討を加えた,すなわち,太平洋沿岸,とくに高潮の常襲地域である,伊勢湾,大阪湾,紀伊水道及び土佐湾における高潮特性について,関係のデータベースを構築し,収集したデータに基づいて解析を行った結果,従来発生機構が不明確であった高潮の前駆波は,黒潮による1-5ヶ月の時間スケールを有する海面変動の一部が重畳される場合が多いことを示すことができた,さらに,津波による氾濫災害の予測では,大阪湾における津波の変動計算を実施し,大阪における津波の高さが1,9mとなって,史料解析の結果と一致することを明らかにし,それらの成果を総合して復元を行った.その計算過程で,大阪湾では津波の周期が長くなると湾奥で増幅されることを見いだし,従来の南海津波やチリ地震津波の痕跡高の沿岸方向の変化を説明できることがわかった.ついで,大阪に来襲するもっとも危険な津波を求め,また,海面上昇の一例として約6000年前の縄文海進を取り上げ,海面が現在より約3m高くなった状態で,安政南海津波クラスの巨大津波が来襲した場合の,大阪平野における氾濫特性を考察した.
芳香族CH結合を直接CC結合に変換する触媒反応の開発

本研究の目的は、芳香族CH結合を直接CC結合に変換する新しい実用的な触媒反応を開発するものである。これまでに当研究室では、フェノールとアニリンをアセチレンガスで直接エテニル化する反応の開発に成功している。本年度、エチン類を用いたフェノールの直接エチニル化を目的として詳細に検討した。その結果、シリル化したクロロエチンを用いると、触媒量のGaCl_3によってフェノールのオルト-エチニル化が行えることを見出した。o-クレゾール(10mmol)に0°Cでブチルリチウム(3mmol)、GaCl_3(1mmol)および2,6-ジ-(t-ブチル)-4-メチルピリジン(1mmol)を加えた後、クロロトリエチルシリルアセチレン(10mmol)と120°Cで3時間反応させた。水を加えて反応停止し、2-メチル-6-トリエチルシリルエチニルフェノールを収率91%(触媒回転率TON=9.1)で得た。置換フェノール類でも塩化ガリウムと基質の触媒回転率(TON)は810となる。本反応は、ガリウムフェノキシドがクロロエチンに付加した後、塩化ガリウムがβ-脱離を起こす機構で進行すると考えている。これは、芳香族CH結合を直接エチニル化する触媒反応である。
In situ Raman分光法による酸化鉄薄膜の構造解析とスピン構造

本研究者は、数年前、α-Al_2O_3単結晶基板上に成長したエピタキシャルα-Fe_2O_3薄膜のスピン構造が、バルク結晶のものと大きく異なっており、温度により膜面内から垂直方向へと興味あるスピンフリップ転移を示すことを見出し、注目された。この原因として、α-Fe_2O_3薄膜の成長過程に由来する格子歪みの発生が考えられる。本研究では成摸時にin situ Raman分光測定を行い、エピタキシャルα-Fe_2O_3薄膜の薄膜成長過程における構造変化を、連続的にとらえることを試みた。しかし、昨年度に引き続きRaman分光装置の光学系の改善を試みたが、膜厚が数原子層程度しかない超薄膜のRamanスペクトルを測定することはできず、薄膜成長初期の構造変化をとらえることには残念ながら成功しなかった。またその研究と並行して、活性化反応性蒸着法によりα-Al_2O_3(001)単結晶基板上にFeTiO_3-α-Fe_2O_3固溶体のエピタキシャル薄膜を作製した。基板温度500°Cの低温で成膜した薄膜は、FeイオンとTiイオンが陽イオンサイトをランダムに占有したコランダム構造であった。一方、基板温度700°Cで成膜したFe_<2-x>Ti_xO_3膜は、x≧0.4の組成範囲でFeイオンとTiイオンが規則的に配列したイルメナイト構造をとった。FeイオンとTiイオンか規則配列した薄膜のみかフェリ磁性を示した、しかしその自発磁化はイオンが完全に規則配列した場合に期待される値の半分以下であった。さらに、固溶体薄膜の比抵抗は、Fe^<2+>-Fe^<3+>イオンの混合原子価状態をとることにより10^<-1>Ωcmまで低下した。よって本系固溶体薄膜は、新しい酸化物磁性半導体薄膜の有力な候補となることを明らかにした。本研究者は近年、α-Al_2O_3単結晶基板上に作製したエピタキシャルα-Fe_2O_3薄膜のスピン構造が、薄膜の配向方位に依存し、しかもバルク結晶のものとは大きく異なることを見出した。これはα-Fe_2O_3薄膜成長過程に由来する格子の乱れあるいは歪みが原因であると考えられるが、不明な点も多い。そこで本研究では、in situ Raman分光法を用いることにより、エピタキシャルα-Fe_2O_3薄膜の薄膜成長過程における構造変化を明らかにし、それが薄膜のスピン構造に及ぼす影響を明確にすることを目的としている。しかし、膜厚が数原子層以下の超薄膜においてはRaman強度が非常に微弱であり、既設のRaman分光装置での測定は非常に困難であった。そこで本年度は、Raman分光装置の光学系及び信号系を改善することにより、検出感度の向上を現在試みている。またそれと並行して、元素置換によりα-Fe_2O_3薄膜の電子構造やスピン構造を制御する目的で、Tiドープ・エピタキシャルα-Fe_2O_3薄膜の作製を行なった。バルク結晶の場合、α-Fe_2O_3-FeTiO_3は全率固溶体を形成し、また両端組成の化合物は反強磁性体であるにもかかわらず、中間組成の固溶体は強いフェリ磁性を示すことが知られている。反応性蒸着法を用いることにより、同様のエピタキシャルα-Fe_2O_3-FeTiO_3固溶体薄膜の作製に成功した。しかし、基板温度が700°C以下と低い場合にはFeイオンとTiイオンの配列が規則化されず、フェリ磁性を示さなかった。一方、基板温度が800°Cと高い場合にはFeイオンとTiイオンの配列が規則化され、固溶体薄膜はFe_<2-x>Ti_xO_3(0.5<x<0.9)の組成範囲でフェリ磁性を示すことを見出した。また、このFeイオンとTiイオンの配列が規則化は、X線回析法によっても確認することができた。FeイオンとTiイオンか規則

配列した薄膜のみかフェリ磁性を示した、しかしその自発磁化はイオンが完全に規則配列した場合に期待される値の半分以下であった。さらに、固溶体薄膜の比抵抗は、Fe^<2+>-Fe^<3+>イオンの混合原子価状態をとることにより10^<-1>Ωcmまで低下した。よって本系固溶体薄膜は、新しい酸化物磁性半導体薄膜の有力な候補となることを明らかにした。
新規サイトカインIL-35の歯周病態への関与とその治療応用に関する基礎的研究

インターロイキン(IL)-35の歯周病態への関与を明らかにするために歯周病巣および末梢血における遺伝子発現を調べた。その結果,歯周病患者の病巣部のEBI3およびIL12A遺伝子発現量は対象部歯肉に比較して高い傾向が見られた。さらに,患者の病巣由来T細胞と末梢血由来T細胞におけるEBI3およびIL12A発現パターンは,その活性化時に大きく異なった。これらの結果から,IL-35は歯周病の病態に関わる可能性が示唆された。基盤Cインターロイキン(IL)-35の歯周病態への関与を明らかにするために歯周病巣および末梢血における遺伝子発現を調べた。歯周病巣局所に集積するヘルパーT(Th)細胞は,歯周病の病態形成に深く関わる。Th細胞は産生するサイトカインのプロファイルからTh1, Th2, Th17, Treg細胞などのサブセットに分類されるがそれぞれの機能,相互作用において, IL-35が関わっていることが近年明らかになった。IL-35は,免疫抑制作用を有する新規サイトカインであり,炎症性組織破壊に関与するTh17細胞の分化を抑制し, T細胞の抑制に関わるTreg細胞の分化増殖を誘導する機能があることが報告されている。本研究はIL-35の歯周病態への関与を明らかにし,さらにその応答性を人為的に調整する可能性を評価することを目的とした。本年度は,様々な病型の歯周病患者15名を対象として,歯周外科手術実施時に炎症および組織破壊の程度が異なる歯周病巣局所から歯肉サンプルを採取し, IL-35発現を定量した。IL-35分子はEpsteir-Barrvirus-induced gene3(EBI3)とIL-12 p35の2量体からなるため,それぞれの分子をターゲットとしてEBI3, IL12A遺伝子のmRNA発現をリアルタイムRT-PCR法を用いて定量解析した。その結果,多くの歯周病患者の病巣部では健常部と比較してEBI3, IL12Aともにその発現量が高い傾向が見られた。このことから, IL-35が歯周病の病態に関与する可能性が示された。今後さらにサンプル数を増やすとともに,その局在を免疫組織学的に解析する必要がある。また, Th17, Treg細胞および, Th1, Th2細胞の分化誘導に関わるサイトカイン群の遺伝子発現プロファイルもあわせて定量し,各歯肉サンプル群間で比較することによって, IL-35の歯周病態への関与および,組織破壊あるいは防御に関わる免疫機構を明らかにしていく予定である。本研究の目的は,IL-35の歯周病態への関与を明らかにし,さらにその応答性を人為的に調整する可能性を評価することである。昨年度は,様々な病型の歯周病患者を対象として,歯周外科手術実施時に炎症および組織破壊の程度が異なる歯周病巣局所から歯肉サンプルを採取し,IL-35発現を定量した。IL-35分子Epstein-Barr virus-induced gene 3(EBI3)とIL-12p35の2量体からなるため,それぞれの分子をターゲットとしてEBI3,IL12A遺伝子のmRNA発現をリアルタイムRT-PCR法を用いて定量解析した。その結果,多くの歯周病患者の病巣部では健常部と比較してEBI3,IL12Aともにその発現量が高い傾向が見られた。このことから,IL-35が歯周病の病態に関与する可能性が示された。今年度は,これらの歯周病歯肉でTh17,Treg細胞および,Th1,Th2細胞の分化誘導に関わるサイトカイン群の遺伝子発現プロファイルを調べた。その結果,Th17細胞の誘導に関わるIL-23およびそのレセプターであるIL23RのmRNA発現が病巣部において健常部と比較して高いこと,Th1細胞の誘導に関わるIL-12のレセプターであるIL12RB2の発現が病巣部に比較して健常部で高いことが明らかとなった。このことは,Th17細胞が歯周病巣において組織破壊に関わる可能性を示唆している。IL-35はIL-23およびIL-12のサイトカインファミリーの一つであるが,その産生細胞は抗原提示細胞のみでなく,T細胞であることが明らかにされている。そこで歯周病の病巣局所において集積するT細胞のIL-35産生性を評価するために,歯周病患者から病巣部歯肉と末梢血を採取し,それぞれに含まれるT細胞が産生するIL-35レベルを定量する実験系を確立した。今後この実験系を用いて各サンプル群間を比較することによって,IL-35の歯周病態への関与および,組織破壊あるいは防御に関わる免疫機構を明らかにしていく予定である。IL-35はIL-23およびIL-12のサイトカインファミリーの一つであり,その産生細胞はT細胞および抗原提示細胞であることが明らかにされている。

本年度は,歯周病病態におけるIL-35の関与を調べることを目的とした研究の一環として,歯周病患者の病巣局所に集積するT細胞と末梢血T細胞との間でIL-35の産生性の違いを調べた。倫理委員会承認の方法によって同意を得た歯周病患者から,病巣部歯肉と末梢血を採取し,それぞれに含まれる単核球を分離し,抗CD3抗体および抗CD28抗体を結合させたビーズを用いてCD3^+T細胞の活性を誘導した。48時間後のIL-35遺伝子発現量をリアルタイムRT-PCR法を用いて定量解析した。なお,IL-35分子はEpstein-Barr virus-induced gene 3(EBI3)とIL-12p35の2量体からなるため,EBI3とIL12Aのそれぞれの遺伝子について調べた。その結果,末梢血から採取したT細胞を活性化させた場合,EBI3発現量は約4倍に増加するのに対して,IL12A発現量は約1/10^6に減少した。一方,歯肉から採取したT細胞を活性化させた場合,EBI3発現量の増加はわずかであり,またIL12Aについても末梢血由来T細胞と異なり,その発現量が減少する傾向は見られなかった。Th1タイプのサイトカインであるIFN-γ遺伝子については,同刺激による遺伝子発現の上昇が,歯肉および末梢血から採取したT細胞のそれぞれにおいて大差なく観察されたことから,歯周病局所に集積するT細胞のIL-35産生様態は末梢血由来T細胞のそれと異なる結果が示された。以上の結果から,歯周病の病巣局所に集積するT細胞の活性化に伴って産生されるIL-35は,歯周病の病態に関わる可能性が示唆された。基盤C
生涯学習における健康教育のあり方　ー広島県と宮城県の現状と課題よりー

広島と宮城の公開されているデータ、特に健康自己管理に関連するようなデータをもとに地域差について整理している。主に総務省の「患者調査の概況」、広島市、仙台市等のデータヘルス計画、厚生労働省の「国民生活基礎調査の概況」、各市町村国保の特定健康診査・特定保健指導実施状況概況報告書などである。このデータをとりまとめ、日本医療福祉学会で発表している。宮城は受診率が低く、医療費が低い、健診および検診受診率がともに高い。広島は受診率が高く、医療費も高いが、健診および検診受診率がともに低い。これらのことから広島県は受療率が高い医療型、宮城県は健康診査などを利用する予防をしっかりとしているデータにみえるが、平均寿命は広島よりも低い非医療型としての傾向があることを示した。これに関連する食生活などの文化的な要因も含め、2つの地域差を見ることができたといえる。本研究の全体像としては生涯学習の現状と課題を健康教育の視点で整理するものであるため、地域差のあるこうした傾向は把握しておく必要があると考えた。この地域差の現象の原因をみつけることが研究目的ではないが、どのようなメカニズムでその可能性をもつのかを見いだせる可能性を見いだせるかもしれない。昨年度は広島県と宮城県の地域的特性を公開されているデータをもとに調べておくことが、本研究における、第1段階として位置づいている。広島県と宮城県の違いについて、一定の整理はできたが、これからは、現地へ行き質的なインタビュー調査を行い、生涯学習のニーズ、日常の関係性と生涯学習への参画との関係、および健康自己管理との関連性を分析をする予定である。昨年は過去に、まとめた情報をもとに、理論的枠ぐみ、先行研究を整理した。予定ではアンケート調査をする予定でいたが研究方法を検討した結果、質的調査に切り替えたため、アンケート調査をしていない。訪問調査とMGTAによる分析を行う方向に切り替えた。質的な調査を実施する。そのための倫理審査委員会への審査を提出し、広島、宮城のデータをとり、分析を行いまとめる。広島県は広島市、宮城県は仙台市が主であるが、人口の少ない村落も含め調査を実施する方向である。本研究は生涯学習の現状と課題を健康教育の視点で整理するものである。特に健康情報を得る過程、健康情報活用の実践で人と人との関係性が必要であり、効果的であると考え、現状と課題のほか、関係性づくりの効果に関する可能性について実証研究するものである。測定方法については、健康寿命に影響しうるセルフマネジメント、、関係性、年齢をもとに3次元モデルを構築する。調査は国保の健康診査受診率の最も高い宮城県と最も低い広島県を比較し、関係性等の地域差を視野に入れ、生涯学習の実習状況とそれにかかわる課題、関係性構築による健康教育効果の可能性、生涯学習の場のサロン化への必要性について吟味するものである。整理する点は大きく3点で、第1に現状分析として健康情報の処理過程における人の行動のモデル化である。第2に既存セ生涯学習プログラムの実態と問題点の整理、第3にサロン化する場の可能性を探る。昨年度の研究の成果については、先行研究の整理を実施。プレ調査の実施としては、仙台市へ訪問し、仙台市における公的機関、図書館や生涯学習センターの担当者に問題意識などについて、聞き取り調査を行っている。プレ調査の段階では、図書館の健康教育についての積極的な実践はみられなく、図書館が健康情報を得る場になっているとは考えらえるが、関係性構築の場、講習などの場としての機能は十分とは考えにくい。広島市においては、図書館職員への聞き取りでは図書館がサロンの場の機能を持つことに関して、必要性、期待をしているような発言があった。本格的調査になる前の基礎調査のための情報を収集を行った。昨年はプレ調査として、仙台市の行政機関、図書館を訪問し、健康教育の実施状況や認識を確認している。記録をまとめた段階で活動は中断している状態で、昨年予定している広島での行政機関のプレ調査等はできていない。先行研究の整理については、まだ不十分で、今後も先行研究の整理と併行して行う必要がある。個人的事情(入院とリハビリ等)で6か月相当の遅れとなっている。

昨年度は広島県と宮城県の地域的特性を公開されているデータをもとに調べておくことが、本研究における、第1段階として位置づいている。広島県と宮城県の違いについて、一定の整理はできたが、これからは、現地へ行き質的なインタビュー調査を行い、生涯学習のニーズ、日常の関係性と生涯学習への参画との関係、および健康自己管理との関連性を分析をする予定である。昨年は過去に、まとめた情報をもとに、理論的枠ぐみ、先行研究を整理した。予定ではアンケート調査をする予定でいたが研究方法を検討した結果、質的調査に切り替えたため、アンケート調査をしていない。訪問調査とMGTAによる分析を行う方向に切り替えた。本調査を行うための準備を行う。準備については、プレ調査の補足と本調査の内容吟味の後に、年内にアンケート調査を行う。質的な調査を実施する。そのための倫理審査委員会への審査を提出し、広島、宮城のデータをとり、分析を行いまとめる。広島県は広島市、宮城県は仙台市が主であるが、人口の少ない村落も含め調査を実施する方向である。郵送アンケート調査と分析を今年実施するため、人件費、郵送料が必要となる。まだ本格的調査をしていないため、広島、宮城への旅費が必要。次年度は調査と分析に時間と費用をかける予定
大規模集客施設における医療需要の解析と適切な医療対応システムの構築

(1)大規模集客施設の現状や催事の分析など、施設や催事への医療支援に関する事項近隣の大規模集客施設の医療対応状況を調査し、各施設での傷病者数とその内容、治療状況、施設ごとの特性(医寮対応能力など)を明らかにした。結果公開に同意を得た野球場の状況を論文にまとめた(KJM 2007;56:85-91)が、野球場の医療対応に関する論文は本邦初で海外でも稀少である。催事に合わせ開催場所近隣の医療機関に救急医療対応を文書で依頼する「慣習」を分析し、催事内容や主催者の医療に対する考え方を論文にまとめた(JJDM 2005;10:10-18)。Mass-gathering medicineをこのような観点で捉えた報告は国内外を通じ皆無で、催事参加者、とくに観客の安全担保が不十分な国内の催事事情が判明し、実効性のない文書のみの医療対応要請を廃して主催者/施設責任者と医療機関双方でより具体的な準備を行うための貴重な資料となった。(2)教育体制や医療従事者側の意識向上など、傷病者への医療対応に関する事項大規模集客施設の救急医療需要に対応する医療者側の意識向上も不可欠で、研究代表者所属機関で一層の院内教育充実を図り、新規入職者(医療職・事務職すべて)への災害医療講演、初期臨床研修医への災害医療に特化したoff-job training(OJT)、医学部学生への講義、などを実施した。とくに0JTは教育対象者から好評で、その内容を学会で発表した。(3)現時点での本研究に対する評価と今後の展開以上の研究姿勢が評価され、研究代表者は平成19年度から都医師会の救急委員を委嘱されたため、行政側・消防庁などの諸機関と一層の連携強化を図った。本研究の成果に今後の分析を加え、都が誘致中の2016年夏季オリンピックを含む、さらに大きな催事への医療対応システムの確立を目指し、国内で恒常的に開かれる催事での参加者の安全確保に努める。1.まず、当院近隣の大規模集客施設のうち、国立霞ヶ丘競技場、秩父宮ラグビー場、明治神宮野球場、明治神宮外苑アイススケート場、東京体育館を訪ね、その施設を見学し、運営状況と医療対応状況を把握した(医療資材の確認、医療対応記録の閲覧、管理者の安全意識や医療に対する考え方の聞き取りを含む)。また、これらの施設から当院に救急搬送された傷病者の治療状況を、当院の診療録で調査した。この結果、各々の施設で過去数年間に発生した傷病者の実数とその内容、および治療状況(現場および救急搬送を含む)を知ることができ、施設ごとの特性(傷病の発生状況、医療対応の実際)が明らかになった。結果は施設ごとに論文として投稿の予定である。2.また、当院に救急医療対応を依頼してきた過去3年間のすべての催事を、「医療対応の依頼(お願い)」の文書から分析し、催事主催者の医療に対する考え方を調査した。この結果、医療対応を依頼する文書には、文面から催事の概要(催事の内容、集客規模、想定される医療上の問題点、現場における医療資材の準備の有無と内容、医療従事者の待機の有無、など)が全く把握できないものが多数あり、中には主催者への連絡先すら明記されていないなどの問題点が明らかとなった。結果を英文論文にまとめたものが、今年度の日本集団災害医学会誌に掲載された(H.Ishikawa, etal. Problems with written requests formedical supportfrom event organizers. J.J.Disast.Med. 2005,10,10-18

.)。1.昨年度に引き続き、近隣の大規模集客施設における医療を必要とする傷病者の発生状況や医療対応状況の把握に努めた。調査対象とした施設のうち、医療対応の過去の記録が比較的よく保存されていた明治神宮野球場の状況を論文にまとめることができたため、医学雑誌に英文で投稿した。プロ野球場における医療対応に関する論文は、海外でも稀少であり、国内では初めての報告となる。この成果をもとに、より円滑な医療対応を具体化する提言を行う予定である。2.大規模集客施設における医療需要を受け入れる立場として、院内教育の一層の充実を図ることとした。その端緒として、(1)初期臨床研修医・新規入職者(医療職・事務職とも)に対し、災害時の医療を周知する講演を平成18年4月に初めて行った。この活動は平成19年度以降も継続される予定で、既に本年も4月に終えている。(2)さらに初期臨床研修医に対しては、災害医療に特化したoff-the-job trainingを救急研修中に組み込み、その中でトリアージ・多数傷病者発生時の患者動線の確保などを机上シミュレーション形式で行いながら、当大学病院の地理的位置から生ずる社会的責任を周知する機会を設けた。このうち(2)の活動に関しては、教育対象となった研修医諸氏から好意的に受け止められたため、その研修内容や研修医の受容の状況を、第11回日本集団災害医学会(平成19年1月於名古屋市)で口演発表した。1.前年度に引き続き、近隣の大規模集客施設における医療を必要とする傷病者の発生状況や医療対応状況の把握に努めた。調査対象のうち、過去の医療対応記録が比較的よく保存されていた明治神宮野球場の状況を英文論文にまとめ公表した。プロ野球場における医療対応に関する論文は海外でも稀少であり、国内では初の報告となる。この成果をもとに、類似する諸施設に対して、より円滑な医療対応を具体化する提言を、積極的に行う予定である。2.大規模集客施設における医療需要を受け入れる立場として、院内教育の一層の充実を図った。(1)病院の全職員を対象に、災害時の医療を体験する訓練を平成19年11月の平日・日中に初めて行った。この活動は平成20年度以降も継続される予定で、さらに職員向けの講習会も計画している。(2)大学病院の初期臨床研修医に対しては、多数傷病者の発生を想定したoff-the-job trainingを救急部門研修中に継続したが、教育対象者には他のOJTに比してもたいへん好評で、研修内容や研修の受容状況を、第13回日本集団災害医学会(平成20年2月於つくば市)ほかの学会で口演発表した。(3)非常勤講師として医学部学生に講義する際、研究の成果を披露しつつmass-gathering medicineの周知を図った。3.以上の研究姿勢が評価され、平成20年度から東京都医師会の救急委員に委嘱された。これを契機として、都をはじめとする行政側・消防庁などの諸機関と一層の連携強化を図った。平成19年11月には三宅島バイクレースで、平成20年2月には東京マラソンで医療支援を展開したが、そのデータ分析を元に、さらに大きな催事に対する医療対応システムモデルの確立に努める所存である。
インターロイキン27と自然免疫応答のクロストークによるウイルス増殖抑制

インターロイキン-27(IL-27)はTh1誘導に中心的な役割を果たすサイトカインであるが、抗ウイルス自然免疫応答への関与は知られていない。我々はIL-27が心筋細胞に直接作用してencephalomyocarditis virus(EMCV)の感染および増幅を強力に抑制することを見出した。そのメカニズムとして、IL-27シグナルが細胞内ウイルスセンサー分子の制御と、感染早期のインターフェロン誘導の増強に寄与することを明らかにした。本研究の成果は、新しいワクチンの開発などにつながる可能性がある。脳心筋炎ウイルス(EMCV)を感染させたマウスにIL-27遺伝子をin vivo導入し、その後のマウスの生存を観察したところ、遺伝子非導入群は感染後10日以内に全例死亡したのに対して,IL-27遺伝子を投与したマウスは100%が生き延びた。この抗ウイルス効果の機序についてin vitroの感染実験を行なって検討を加えた。その結果、IL-27は、獲得免疫機構を介するのではなく、ウイルス感染した心筋細胞に直接作用することによってウイルス複製を抑制する可能性が示唆された。そこで、研究代表者らは、IL-27による抗ウイルス機構が、ある転写因子を介している可能性を検討した。胎生16日目のマウスより心筋細胞の初代培養を樹立し、IL-27で刺激したところ、ある転写因子が、メッセージレベルで著明に亢進した。さらに、IL-27処理された細胞は、無処理の細胞と比較して、感染直後から多量の抗ウイルス因子を産生することが観察された。これらの結果から、IL-27シグナルが心筋細胞内に入力されると、転写因子との発現が亢進し、ウイルス感染によって惹起されるある転写因子の活性化が増強され、その結果、感染初期からの強力なインターフェロン産生の誘導と、ウイルス複製の抑制がもたらされたことが示唆された。ウイルスRNA→RIG-I/MDA5→IPS-1→TBK1・IKKε→IRF→I型IFN→ウイルス抑制効果というパスウェイについてはすでに多くの報告がある。さらに前述のように、研究代表者らは最近、IL-27シグナルがRIG-I/MDA5の発現を亢進すること、I型IFNの産生を誘導すること、抗ウイルス作用を惹起することを見出した。しかしながら、IL-27レセプターを介するシグナルが如何にしてRIG-I/MDA5の発現誘導にリンクするのかに関しては、未だブラックボックスである。そこで本研究では、まずこのブラックボックスに関与する可能性が想定しうる既知の分子群について、分子生物学的手法によって解明した。IL-27刺激細胞、または非刺激細胞に、非感染、またはEMCVを感染させて培養後、RNAと蛋白を調整する。WSX-1、gp130下流のシグナル分子群であるSTAT1、STAT3、SOCS3、p38MAPK、T-bet、LFA-1、ERK1/2の発現量の変化と活性化を、リアルタイムRT-PCRとウェスタンブロッティングをもちいて、また分子間の相互作用を免疫沈降法等で解析する。さらに、これらの分子をターゲットとしたsiRNAを、初代培養心筋細胞に導入後、EMCVを感染させることにより、IL-27の抗ウイルス作用における各分子の貢献度を検証する。それらの結果を総合し、IL-27がRIG-I/MDA5を亢進させる細胞内シグナル伝達機構の理解につなげる。さらに、クリティカルと思われる分子について、その遺伝子のノックアウトマウスより初代心筋細胞を樹立し、上記と同様の解析を行う。"ウイルスRNA→RIG-I/MDA5→IPS-1→TBK1・IKKε→IRF→I型IFN→ウイルス抑制効果"というパスウェイについてはすでに多くの報告がある。