hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経口免疫寛容における制御性Ｔ細胞サブセットの機能解明と食品成分による調節

経口免疫寛容は、経口摂取した抗原に対する全身の免疫応答が抑制される現象であり、食物アレルギーの発症を抑制する一因であると考えられる。食物アレルギーの誘導にはIgE抗体の産生が関与することから、本研究では、経口免疫寛容の誘導に重要な抗原特異的T細胞のサブセットの中でも、抗体の産生に関与する濾胞性ヘルパーT(Tfh)細胞・濾胞制御性T(Tfr)細胞に着目して解析を行った。Tfh細胞は抗体の産生を促進する一方、Tfr細胞は制御性T細胞に発現する転写因子Foxp3を発現し、抗体産生を抑制すると考えられている。まず、抗原特異的T細胞を移入し、抗原の経口投与と共に粘膜アジュバントであるコレラトキシンを用いることで、経口免疫寛容と感作時における抗原特異的Tfh細胞の比較解析が可能なマウスモデルを作製した。このモデルを用いて解析を行ったところ、経口免疫寛容誘導時には抗原特異的IgE抗体がほとんど検出されないが、感作時には抗原特異的IgE抗体が産生されることが確認された。さらに、抗原感作時の腸間膜リンパ節の胚中心B細胞において、IgE+細胞が経口免疫寛容誘導時と比較して有意に増加していた。このとき、腸間膜リンパ節の移入由来細胞において、Tfh細胞に対するTfr細胞の割合を比較したところ、経口免疫寛容誘導時には、感作時と比較してTfr細胞の割合が有意に大きかった。本研究の結果から、経口免疫寛容においては、腸間膜リンパ節でTfr細胞が豊富に誘導され、過剰なIgE抗体産生が防がれていることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。経口免疫寛容の誘導においては、抗原特異的な制御性T細胞(Treg)が重要な役割を持つと考えられている。しかしながら、制御性T細胞のどのような機能が重要なのか未だ明らかでない。そこで、本研究では経口免疫寛容誘導時の抗原特異的T細胞をサブセットに分画して、その機能を詳細に解析した。なお、未感作状態の抗原特異的T細胞はほとんどCD62LhighCD44lowT細胞(62Lhigh細胞)であるが、経口免疫寛容誘導時の抗原特異的T細胞はCD62high/intCD44intおよびCD62LlowCD44high T細胞(62Lintおよび62Llow細胞)として分画されることを当研究グループで明らかにしている。62Lintおよび62Llow細胞の遊走活性を解析した結果、62Llow細胞はケモカインレセプターの一種であるCCR6を介して腸管に遊走する可能性が示唆された。また、62Lint細胞については抗原刺激によって62Llow細胞に変化することが示唆された。以上の結果は、62Lintおよび62Llow細胞が生体内で異なる機能によって経口免疫寛容の誘導に寄与することを示唆している。また、これらの細胞について解析する中で、経口免疫寛容の誘導時に濾胞へルパーT細胞(Tfh細胞)が誘導されることが明らかとなった。経口免疫寛容において誘導されたTfh細胞によって、IgAおよびIgG抗体産生が誘導されることが示唆された。今後は62Llow細胞が腸管に移動して免疫応答を抑制するのか、また経口免疫寛容で誘導されたTfh細胞が他の免疫応答で誘導されるTfh細胞と同様の機能を持つのか実験を行う予定である。平成27年度の実験計画にあったFoxp3-CD2マウスの導入は見送ったが、Foxp3発現による分画を行わなくとも、62Lintおよび62Llow細胞において機能の違いを確認することができた。この結果を複数の学会で発表した。また、実験の過程で経口免疫寛容においてTfh細胞が誘導されることが確認された。以上のことから、順調に進展していると評価している。62Lintおよび62Llow細胞に引き続き着目して、その機能が経口免疫寛容の誘導に重要かどうか解析を行う。

平成27年度には62Lint細胞が62Llow細胞に分化することを明らかにしたが、62Llow細胞のみでは経口免疫寛容を維持することができないのか解析を行う。また、62Llow細胞について、腸管に遊走した後、免疫応答を抑制しているのか、さらにどのような細胞をターゲットとしているのか解析を行う。平成27年度の実験で見出した、経口免疫寛容に伴って誘導されるTfh細胞については、他の免疫応答で誘導されるTfh細胞と同様の機能を持つのか解析を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
血液悪性腫瘍患者・医師間のコミュニケーションのあり方に関する研究

予後情報や治療選択に関する医師・患者間コミュニケーションの適切化により相互理解を深めることにより、医療の質を改善させる効果が得られるのではないかという研究仮説を検証するために必要な調査票開発に着手した。Dr. Butowらが豪州で乳がん患者を対象として開発した調査票原版の日本語版を作成し、67名の血液腫瘍性疾患患者を対象とした妥当性検討を行った予後情報や治療選択に関する医師・患者間コミュニケーションの適切化により相互理解を深めることにより、医療の質を改善させる効果が得られるのではないかという研究仮説を検証するために必要な調査票開発に着手した。Dr. Butowらが豪州で乳がん患者を対象として開発した調査票原版の日本語版を作成し、67名の血液腫瘍性疾患患者を対象とした妥当性検討を行った癌告知など悪い情報の開示は、医師・患者の双方にとり大変な苦痛であり、予後情報をいかに共有するかは依然として未解決の重要な課題である。血液悪性腫瘍患者と医師間の病状及び予後に関する認識に相違が存在するのか、もし両者の認識に相違があるならその要因は何かという原因を追求すること、及びこの両者の相違がその後の患者の身体的・精神的状態にどの様な影響を及ぼすかを評価することは極めて重要な課題である。患者・医師間の予後情報の認識に関する研究は、主に欧米の単施設・少数例の終末期固形癌患者を対象とした縦断的研究として行われてきており、国内には患者と医師の予後情報に対する嗜好などを測定する尺度が存在しなかった。本研究では、オーストラリアのDr-Butouらの研究グループが乳がん患者を対象として開発した調査票原本に、米国ダナファーバーがんセンターで行われた先行研究などを基にした調査項目を追加し、当該領域の調査を実現する為の尺度として、『患者・医師コミュニケーション調査票』を開発してきた。調査票開発に必要な計画書を作成し、施設の臨床研究審査委員会からの承認を得た後、調査票原本を翻訳した日本語版調査票を作成した。当該疾患領域の専門家や患者会への研究説明会・討議を行った後、妥当性検討のための調査を行った。76部の調査票を配布し、69名より回答が得られ(91%の回収率)、結果に基づく修正を加え、日本語版調査票の逆翻訳を実施し、原著作成者(Dr.Butou)へ調査票様式の確認を行った。患者・医師の両者が病状や予後に関する適切な情報共有を行う為に重要な知見を得る尺度として利用可能なツールの開発は国内初であり、極めて貴重な貢献となる。医師・患者(及び患者を取り巻く家族)の両者が満足できる質の高い医療の提供に大きく貢献する効果が期待できる。
ドイツ語圏の入試改革に関する総合的研究

本研究課題では、次世代の入学試験(高大接続の方法)における記述・口述試験の構想を、ドイツ語圏の入試改革を参照しながら基礎づける。ドイツ語圏の入試を参照する必要性は次のとおりである。ドイツ語圏の入試は、1中等教育の出口管理による非競争的試験であり、2記述・口述による試験方法が伝統的に実施されている。しかし、3日本とは異なる入試制度でありながら、日本と同様の問題群(評価の客観性、妥当性、公平性をめぐる問題、学生の学力低下の問題)の存在があり、そのために4オーストリアでは新しい入学試験制度を導入しているからである。本研究では、以上4点を分析の視点としながら取り組むことになるだろう。
高次神経機能に関与する糖鎖結合蛋白質の同定

最初に、成熟ラット小脳可溶化膜蛋白質中には、各ガングリオシドをリガンドとしたELISAとWestern blotによるアッセイからガングリオシドGT1b糖鎖を認識する膜蛋白質が存在することを確認した。次に、これら分子のより詳細な性状を明らかにするために、GT1b糖鎖結合蛋白質に対する特異的単クローン抗体の作製を行った。GT1b結合実験で得られた結果を基に、各蛋白質の分子量を指標とした抗体スクリーニングを行いYAK-2抗体(lgM)を得た。YAK-2抗体は、主に相対分子量160-、90-、58-、42-kDaの各分子と反応した。この抗体認識分子群はGT1b結合実験で検出した分子群と分子量的に極めて類似していた。そこで、YAK-2抗体認識分子とGT1b結合分子の同一性について検討した。各種ガングリオシド存在下におけるYAK-2抗体の小脳可溶化膜蛋白質に対する反応性について解析したところ、GT1b存在下で明らかにYAK-2抗体の小脳可溶化膜蛋白質に対する反応が阻止された。一方、他の糖脂質では反応阻止効果が認められなかった。この結果は、YAK-2抗体とGT1bが認識する分子群が同一であることを示唆する。YAK-2抗体の認識エピトープが各分子の蛋白質部分であることは各分子のメタ過よう素酸ナトリウム処理後の反応性から確認した。現在、これら分子の構造ならびに機能を明らかにするため、YAK-2抗体を用いた発現クローニング法により各分子(160-、90-、58-kDa)の遺伝子クローニングを遂行している。具体的には、ラット脳cDNAファージライブラリーを用いての抗体によるクローニングである。クローニング後、各組識や細胞に特異的に発現されるガングリオシド結合蛋白質の機能解析を予定している。
相対論的輻射流体計算による重力崩壊型超新星爆発からの早期高エネルギー放射の解明

本年度は、これまでに行ってきた研究の成果を論文にまとめ発表することに注力した。成果は大きく分けて3つあり、1.超新星ショックブレイクアウトの2次元輻射流体シミュレーション、2.低光度ガンマ線バーストの光度曲線モデル、3.中心エンジン駆動超新星の多次元モデル、である。まず、超新星ショックブレイクアウトとは、重力崩壊型超新星の最初期に付随する明るいUV/X線バーストである。この現象は大質量星の鉄コアが崩壊することで発生した衝撃波が星表面を突き抜けることで起こる。これまでの超新星ショックブレイクアウトに関する理論研究は球対称1次元を仮定したものがほとんどであったが、本研究により初めてショックブレイクアウト時の2次元シミュレーションが行われ、球対称モデルとの比較がなされた。その結果、多次元効果はショックブレイクアウト放射を暗く、長くする可能性があることが分かった。また、低光度ガンマ線バーストは、ガンマ線バーストの中でも暗いものである。一つの有望なシナリオとして、厚い星周物質で囲まれた大質量星が爆発した際に、相対論的な速度で伝搬する衝撃波が星周物質からブレイクアウトすることでX線やガンマ線を放射するというものがある。このシナリオに基づいて、超新星エジェクタによって駆動され、星周物質中を伝搬する衝撃波の運動を記述する準解析的モデルを構築し、光度曲線を計算した。その結果、このモデルで知られている低光度ガンマ線バースト(GRB 060218)の光度変化がよく説明できることが分かった。最後に、超高輝度超新星を説明するシナリオとして、何らかの中心エンジンが超新星エジェクタを明るく光らせるというものがある。このシナリオに関して、2次元の相対論的流体シミュレーションを行い、その結果、中心エンジンからのエネルギー注入による超新星エジェクタ内での物質混合が非常に重要な役割を果たす可能性を指摘した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、超新星shock breakoutの光度曲線モデリングに関する研究を推し進めた。この現象は、大質量星が重力崩壊によって起こす超新星爆発が最初の電磁波シグナルを発する段階であり、鉄コアの崩壊によって発生した衝撃波が親星大気の光球付近を通過する際に、衝撃波後面の高温領域からの光子が衝撃波面を追い越し、星表面から漏れだすことで起こる。このときのUV/X線フラッシュは非常に明るくなることが理論的に予想されており、近年の観測例においても、その予想を裏付ける結果が得られている。しかしながら、この現象に対する数値シミュレーションによる研究は未だ充分とは言えないのが現状である。超新星shockbreakoutが起こる際、衝撃波は親星表面の光学的に厚い領域から薄い領域へと通過しており、この過程を取り扱うためには、衝撃波後面において輻射と流体とが強く相互作用している状態からその相互作用が切れるまでの時間進化を適切に扱う必要がある。従って、この現象において、どのような放射が予測され、観測から超新星爆発の情報をどうやって引き出すのかといった研究には輻射流体力学に基づいたシミュレーションが非常に強力な手段となる。過去に行なわれた超新星shock breakoutの輻射流体力学シミュレーションでは、球対称1次元が仮定されている。そこで、世界に先駆けて超新星shock breakoutの多次元輻射流体シミュレーションを行い、光度曲線モデルを構築する研究を計画している。本年度は2次元特殊相対論的輻射流体コードの開発と超新星shock breakoutのテスト計算を行った。超新星ショックブレイクアウトは、重力崩壊型超新星の誕生に付随して起こる非常に明るく高エネルギーな電磁波放射現象であり、近年の可視光突発天体サーベイやX線全天サーベイなどによる検出が期待されている。しかしながら、過去のほとんどの理論研究では球対称性が仮定されており、重量崩壊型超新星において本質的に重要な多次元性の影響についてはこれまで詳しく調べられていなかった。本研究では、2次元球座標での輻射流体シミュレーションを行い、非球対称な爆発がショックブレイクアウトの光度曲線に与える影響を調べている。昨年度のテスト計算を終え、本年度は青色巨星の爆発におけるショックブレイクアウトの計算を引き続き行った。非球対称なショックブレイクアウトでは、衝撃波領域が楕円状に広がっていき、衝撃波が表面に到達する時刻が角度方向によって異なることが確認される。この違いは、ショックブレイクアウトを観測した際の光度曲線に違いに反映されるはずである。本年度は、数値シミュレーションのスナップショットからレイトレーシング法によって光度曲線を計算するコードを新たに開発し、これまでの計算結果に適用した。光度曲線における球対称モデルと非球対称モデルとの明らかな違いが確認でき、光度曲線は爆発の観測する方向にも大きく依存することが分かった。したがって、ショックブレイクアウト観測が、超新星爆発において爆発がどのくらい球対称からずれているかを探るプローブとして使用することができる可能性が示唆されたことになる。また、本結果は論文としてまとめられ、The Astrophysical Journal誌に投稿中である。今年度は2次元輻射流体シミュレーションコードを完成させ、テストを兼ねた計算を行った。計算結果は論文にまとめられ、査読誌に投稿中である。この進捗状況は研究を開始する前に設定した進度と同程度であるため、研究が順調に進展していると判断した。

まず、超新星ショックブレイクアウトとは、重力崩壊型超新星の最初期に付随する明るいUV/X線バーストである。この現象は大質量星の鉄コアが崩壊することで発生した衝撃波が星表面を突き抜けることで起こる。これまでの超新星ショックブレイクアウトに関する理論研究は球対称1次元を仮定したものがほとんどであったが、本研究により初めてショックブレイクアウト時の2次元シミュレーションが行われ、球対称モデルとの比較がなされた。その結果、多次元効果はショックブレイクアウト放射を暗く、長くする可能性があることが分かった。また、低光度ガンマ線バーストは、ガンマ線バーストの中でも暗いものである。一つの有望なシナリオとして、厚い星周物質で囲まれた大質量星が爆発した際に、相対論的な速度で伝搬する衝撃波が星周物質からブレイクアウトすることでX線やガンマ線を放射するというものがある。このシナリオに基づいて、超新星エジェクタによって駆動され、星周物質中を伝搬する衝撃波の運動を記述する準解析的モデルを構築し、光度曲線を計算した。その結果、このモデルで知られている低光度ガンマ線バースト(GRB 060218)の光度変化がよく説明できることが分かった。最後に、超高輝度超新星を説明するシナリオとして、何らかの中心エンジンが超新星エジェクタを明るく光らせるというものがある。このシナリオに関して、2次元の相対論的流体シミュレーションを行い、その結果、中心エンジンからのエネルギー注入による超新星エジェクタ内での物質混合が非常に重要な役割を果たす可能性を指摘した。本年度の研究は、計画以上に進行した。2年目に行う予定であった、2次元輻射流体コードの開発を本年度中にほぼ終えることができ、テスト計算を行っている。また、超新星ショックブレイクアウトの光度曲線モデリング以外にも、ロング・ガンマ線バーストの流体力学シミュレーションに基づく、元素合成計算を行っている。本年度は、主著論文2本が査読誌に掲載され、これまでに行った研究をまとめるという点でも大きな進展があったという認識である。現在遂行中の研究課題についても、結果をまとめる目処が立っており、さらなる進展が見込めることからこのような評価となった。今後は、これまでに開発したコードによる研究と、多波長での輻射輸送を解くことができるコードの開発を推し進めていく。前者の研究では、引き続き大質量星の重力崩壊における初期放射の光度曲線について計算を行う。現在は、マゼラン雲で発生した超新星1987Aを再現する星のモデルを用いて、球対称な爆発をした場合と双極的な爆発をした場合についての初期光度の計算を行っている。これからは、単極的な爆発をした場合や赤道面方向に強く爆発した場合など、異なった爆発の幾何形状の情報が初期放射の光度曲線から引き出せるかどうかを検討する。
イオン源プラズマを用いた原子内包フラーレンの生成・分離・表面修飾技術の開発

イオン源プラズマおよびそのイオンビームを用いて、1台の装置で実行可能な原子内包フラーレン生成・分離・表面修飾技術の開発を行い、フラーレン薄膜に対する低エネルギーイオンビーム照射による鉄原子内包フラーレン生成や水酸基による表面修飾を実験的に検証した。今後、応用研究等への展開へ重要となる原子内包フラーレンの効率的生成・表面修飾に対して新たな知見を与えた。本研究における2つの課題、1.電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証と2.プラズマを用いた処理による表面修飾技術の構築について、それぞれ以下の研究を行った。前者の課題については、塩化鉄を鉄源に用いたプラズマ生成についてとその鉄とフラーレンの混合プラズマを用いた鉄内包フラーレンの生成について試みた。塩化鉄の鉄源としての性能は高く、プラズマ中のイオンとしての主要な構成要素は鉄であった。そのようにして作った鉄とフラーレンの混合プラズマを生成し鉄内包フラーレンイオンの検出を試みたが検出することは出来なかった。後者の課題については、平成24年度に設計製作した、2.45GHzセミダイポールアンテナECRプラズマ源の性能評価を行い、水蒸気によるプラズマ生成とそのプラズマを用いたフラーレン薄膜の処理を行った。フラーレン薄膜の水蒸気プラズマ処理については、水の接触角により評価を行いプラズマ処理による接触角の減少を確認できている。原子内包フラーレンの生成、分離や表面修飾等のプロセスにおいて、その効率化が大きな課題となっているが、生成についてはプラズマを用いた手法が非常に高効率であることがわかってきている。本研究はプラズマ法を生成のみならず分離・表面修飾の手法として発展させることが目的である。本研究では1.電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成を実証し、さらに2.プラズマを用いた処理による原子内包フラーレンの表面修飾技術を構築する。以下に各課題に関しての当該年度の研究実績の概要を述べる。ECRイオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証については、アルゴンとC60を用いたアルゴン内包フラーレンの生成を試みた。アルゴンガスおよびC60蒸気をECRイオン源プラズマチェンバーに導入し混合プラズマを生成し、その中に含まれるイオンを分析したところ、アルゴン原子とC60分子の和の質量のイオンを確認出来た。プラズマを用いた原子内包フラーレン表面修飾技術についてはECRイオン源とそのビームラインに取り付け可能な表面修飾用プラズマ源を有する真空容器の開発を行った。2.45GHzのマイクロ波をダイポールアンテナにより供給する機構と低圧力でプラズマを維持するために永久磁石をダイポールアンテナ直近に配置し、ECR点を形成出来るように数値計算により構造や仕様を考え設計・製作した。原子内包フラーレンの最も効率的な生成法の一つであるプラズマを用いた生成手法を分離や表面修飾の手法として発展させるべく、本研究においては2つの課題、1.電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証と2.プラズマを用いた処理による表面修飾技術の構築について遂行した。1.電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証については、アルゴンガスとフラーレン(C60)蒸気もしくは塩化鉄蒸気とC60蒸気という2種の混合プラズマをECRチェンバー中で生成し、それぞれアルゴン内包フラーレンおよび鉄内包フラーレンの生成を試みた。結果としてアルゴンーフラーレン混合プラズマについては、ECRチェンバー中の混合プラズマから引き出したイオンビームの分析によりアルゴン原子とC60分子の和質量のイオンが検出できたものの、塩化鉄ーフラーレン混合プラズマについては、上記のようなC60と内包対象原子の和質量のイオンは検出できなかった。和質量イオンの検出の可否については、アルゴンや塩化鉄の供給量が影響していると考えられる。鉄蒸気供給量を増やすことが今後有効になると考えている。2.プラズマを用いた処理による表面修飾技術の構築については、イオンビームライン末端に2.45GHzECRプラズマ源を製作し、水蒸気プラズマによるフラーレンの表面修飾処理と、OHイオンビーム照射によるフラーレンの表面修飾について検討した。結果として、フラーレンの水酸基による置換を示唆するフラーレン表面の水接触角の減少が両方法で処理したフラーレン表面で観察できた。今後、処理条件等を詳細に検討することで、本処理手法がフラーレンの表面修飾法として有効な手法となり得る。ナノテクノロジー本研究の課題は前述の通り、1.電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証と2.プラズマを用いた処理による表面修飾技術の構築であるが、その両課題について計画の通りに検討を進めることが出来た。原子内包フラーレン生成の実証については当初、鉄とC60の混合プラズマによる生成を計画していたが、鉄蒸気供給のための誘導加熱蒸発源の不具合により鉄が使用出来なくなりアルゴンガスに変更した。鉄蒸気供給については、ハロゲン化鉄等を代替として用いるために準備を行い、ほぼ使用準備は完了した。使用に際しては、プラズ真生成条件等の検討を行う必要があり、それらが完了すれば本研究課題の鉄蒸気供給源として利用する。

また、表面修飾用プラズマ源に関しても当初、高周波放電によるプラズマ源を計画していたが、プラズマ源の仕様を再度検討した結果、イオンビーム輸送や試料の回収(堆積)やその後の分析等において低圧力下での実験が必要であると判断した。理由は主に本研究の特色である、1台の装置で原子内包フラーレンの生成と分離、さらに表面修飾を行う為に低圧力での放電によるメリットが大きいと判断したためである。従って、高周波放電ではなく2.45GHzのマイクロ波で永久磁石を設置し電子サイクロトロン共鳴により低圧力でも放電を維持出来るプラズマ源とすることとし、設計や製作を行った。本研究の電子サイクロトロン共鳴(ECR)イオン源プラズマ中での原子内包フラーレン生成の実証という課題については、平成24年度、25年度の検討では、実証が出来なかった。本研究の目的は「原子内包フラーレンの生成と表面修飾を連続的に行うこと」であるので、原子内包フラーレンの生成について当初計画を変更し、イオン照射法により原子内包フラーレンを生成し、その原子内包フラーレンに対して表面修飾を行うものとする。従って、今後は、鉄イオン照射による鉄内包フラーレンの生成と、鉄内包フラーレンの表面修飾という2つの技術開発を行う。特に、鉄イオン照射による鉄内包フラーレン生成については、多量に生成物を得るための連続プロセスについて既に検討済みであり、今後速やかに変更した研究計画を遂行することが出来る。原子内包フラーレン生成の実証については、アルゴンとC60の混合プラズマによるアルゴン内包フラーレン生成について更なる条件検討を行い、鉄とC60の混合プラズマによる鉄内包フラーレンの生成についても検討を開始する。生成したイオンはイオンビーム減速により基板上に堆積し回収する。回収した材料は液体クロマトグラフィーとレーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により分析評価する。プラズマを用いた処理による原子内包フラーレンの表面修飾技術を構築に関しては、水酸化フラーレンを作製するため、フラーレン薄膜に対して水蒸気プラズマ照射処理を行い、プラズマ処理した物質の評価は水溶性試験、および液体クロマトグラフィーにより行う。当該年度の研究の遂行において、研究目的達成のために研究計画の変更が有効であると判断し、次年度に当該年度と次年度予算を合わせて使用し、変更した研究計画を遂行するため、当該年度の使用額に変更が生じ次年度使用額が生じた。具体的には、当該年度は混合プラズマを用いた原子内包フラーレンの生成と、プラズマ処理によるフラーレンの表面修飾の大きく2つの個別課題について研究したが、特に前者課題について、原子内包フラーレンの生成手法を混合プラズマを用いた方法からイオン照射による方法へと変更することが有効であると判断した。イオン照射による効率的な生成法実現のため、当該年度と次年度の予算を合わせて使用する。なお当該年度は研究自体は行い成果を得たが、結果として研究費は使用しなかった。
インターロイキン１７産生ヘルパーＴ細胞への分化に伴う細胞表面糖鎖構造の変化

自己免疫性炎症の成因の一つにTh17細胞の機能増進がある。βガラクトシド結合性動物レクチンであるガレクチン9はナイーブヘルパーT細胞からTh17細胞への分化を抑制する。その機構として、ガレクチン9は比較的特異的なO-結合型蛋白質に結合して抑制作用を発揮することが明らかとなった。さらにガレクチン9を表出するヘルパーT細胞がガレクチン9を高分泌しTh17細胞への分化抑制に関与していることも明らかとなった。βガラクトシド結合性レクチンであるガレクチン9はナイーブヘルパーT細胞から、Th17細胞への分化を抑制する。これまでの検討から、ナイーブヘルパーT細胞から、Th17細胞への分化誘導18から24時間後から現れたガレクチン9リガンド(糖鎖)とガレクチン9の結合により分化が抑制されることが明らかとなった。この際、既存の糖鎖が何らかの修飾受けた結果ガレクチン9リガンドとなる場合と、新たに合成された糖鎖がガレクチン9リガンドとなる可能性が考えられる。ほ乳類の場合、βガラクトシドの末端にシアル酸が結合している。シアル酸が結合したβガラクトシドの場合、ガレクチン9はほとんど結合しない。最近の報告で細胞膜表面にノイラミニダーゼと呼ばれるシアル酸解離酵素が存在することが報告されているため、Th17細胞への分化に伴いシアル酸が解離しガレクチン9結合性の高いリガンドとなることが考えられた。そこで該当年度ではまず、糖鎖末端のシアル酸に対して結合能をもつレクチンである、SNA等を蛍光色素でラベルしフローサイトメトリーにより、Th17細胞への分化に伴いシアル酸が解離しているかどうかを検討したところ、これは細胞表面全体のシアル酸解離状態に変化は見られなかった。一方、全体的な糖鎖のシアル酸解離ではなく、特異的な糖鎖に対するシアル酸解離がガレクチン9の作用を誘導することも考えられるため、ノイラミニダーゼの阻害剤を培養液に添加してTh17細胞への分化に対する影響を調べたところ、シアル酸の遊離を阻害してもTh17細胞への分化に対して影響を与えなかった。これらの結果からTh17細胞への分化にはシアル酸の遊離は影響を与えないことが明らかとなった。これまでの検討の過程で「単一細胞レベルでの細胞表面糖鎖の新規プロファイリング法によるTh17細胞分化過程での細胞表面の糖鎖構造変化の解析」のための予備実験も行われたが、レクチンは糖鎖に対する特異性が非常に低く、例えば一般にシアル酸に結合するといわれているレクチンであるSNAとβガラクトシドに結合するガレクチン9を同時に染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、その量比の違いにより染色性が異なった。つまりこれらのレクチンがお互いに同じ糖鎖も認識していることがわかり、マルチプルな解析にレクチンは不向きであることが明らかとなった。そこで本年度はシンプルに様々な種類のレクチン(DBA, PNA, RCA120, SBA, UEAI, WGA1, GSLI, LCA, PHA-E, PHA-L, PSA, sWGA)を単独で使用し、フローサイトメトリーにより、Th17細胞への分化に伴いそのレクチンの結合性が変化しているかどうかを検討した。その結果、すべてのレクチンによる染色でTh17細胞への分化を誘導した細胞とそうでない細胞との間で染色性に変化が見られなかった。この結果からTh17細胞への分化に伴う糖鎖構造の変化は、細胞全体の糖鎖の分布が変化するのではなく、非常に少ない糖鎖構造の変化が起こっていることが考えられ、ガレクチン9は比較的特異的な分子に結合することによりTh17分化抑制の作用を発揮することも予想された。この際、既存の糖鎖が何らかの修飾受けた結果ガレクチン9リガンドとなる場合と、新たに合成された糖鎖がガレクチン9リガンドとなる可能性が考えられた。該当年度では、Th17細胞分化誘導により新たに糖鎖が合成される可能性の検討を行った。糖タンパク質に対する糖鎖の結合様式には、N結合とO結合の2種類がある。そこナイーブヘルパーT細胞から、Th17細胞への分化誘導する細胞培養系に、N結合型糖鎖付加阻害剤(Swainsonine)またはO結合型糖鎖付加阻害剤(Benzyl-N-acetyl-α-galactosaminide)を添加することによりガレクチン9による分化阻害作用に対する影響を検討した。

培養液中にO結合型糖鎖付加阻害剤を添加した場合、ガレクチン9によるTh17細胞分化阻害が部分的に抑制された。しかしながら、N結合型糖鎖付加阻害剤を添加した場合、ガレクチン9によるTh17細胞分化阻害に影響はみられなかった。これらの結果から、ある新規に合成されるO結合型糖タンパク質とガレクチン9の結合によりTh17細胞への分化が阻害されることが示された。しかしながら、この作用が部分的なものあったことから、他の経路の存在つまり既存の糖鎖が何らかの修飾受けた結果ガレクチン9リガンドとなる可能性も浮上してきた。該当年度の目的である、「糖鎖構造の変化機構の解析(1)ノイラミニダーゼによる可能性の検討」について結果が十分に得られたため。さらにもう一つの課題「単一細胞レベルでの表面糖鎖のプロファイリング法の開発」に関しても当初の目的である、レクチンの調整および実験条件の検討を行い、研究の方向性にめどがついたため。該当年度の目的である、「糖鎖構造の変化機構の解析(その1)培養後、新たに糖鎖が合成される可能性の検討」について結果が十分に得られたため。さらにもう一つの課題「単一細胞レベルでの表面糖鎖のプロファイリング法の開発」に関しても当初の目的である、レクチンの調整や標識および実験条件の検討を行ったため。該当年度の結果により、ガレクチン9によるナイーブヘルパーT細胞からTh17細胞への分化抑制には、シアル酸の遊離は影響を与えないことが明らかとなった。その検討の過程で「単一細胞レベルでの細胞表面糖鎖の新規プロファイリング法によるTh17細胞分化過程での細胞表面の糖鎖構造変化の解析」のための予備実験も行われたが、レクチンは糖鎖に対する特異性が非常に低く、例えば一般にシアル酸に結合するといわれているレクチンであるSNAとβガラクトシドに結合するガレクチン9を同時に染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、その量比の違いにより染色性が異なった。つまりこれらのレクチンがお互いに同じ糖鎖も認識していることがわかり、マルチプルな解析にレクチンは不向きであることが明らかとなった。そこで本年度はシンプルに様々な種類のレクチンを単独で使用し、フローサイトメトリーにより、Th17細胞への分化に伴いそのレクチンの結合性が変化しているかどうかを検討する。変化が見られた場合、細胞表面糖鎖構造の変化がおこった細胞をセルソーターで分取し、その細胞がTh17細胞へ分化することを明らかにする。さらにガレクチン9により、その細胞のTh17細胞へ分化が抑制されることを示す。これらの結果により、Th17分化過程の細胞の糖鎖プロファイリングが明らかとなる。該当年度の結果により、ガレクチン9によるナイーブヘルパーT細胞からTh17細胞への分化抑制には、新たに合成されるO結合型糖鎖が原因であるものの他に、既存の糖鎖が何らかの修飾受けた結果ガレクチン9リガンドとなる可能性があげられた。ほ乳類の場合、βガラクトシドの末端にシアル酸が結合している。シアル酸が結合したβガラクトシドの場合、ガレクチン9の親和性は非常に弱い。最近の報告で細胞膜表面にノイラミニダーゼと呼ばれるシアル酸解離酵素が存在することが報告されている。そこでTh17細胞への分化に伴いシアル酸が解離しガレクチン9結合性の高いリガンドとなることが考えられた。
共生系を基本単位とする微生物多様性の保全

昆虫と共生する微小生物の生物多様性は、森林タイプなどの生態系の多様性と明確な相関関係を示さず、共生生物の種の多様性と相関していた。これは微小生物がパッチ状の生息地を利用するため便乗寄主を利用しており、マクロハビタットの差などの影響は顕在化しにくいためと考えられた。これらのことから便乗性の微小生物の多様性保全には、便乗寄主の生息場所の保全が重要であると考えられる。微生物多様性の保全手法として共生系の保全の意義を解明し森林の生物多様性保全管理に資するため、微生物と便乗者の相互関係の解明を行った。落葉広葉樹林できのこ子実体からダニおよび昆虫を採集し、解析した。ダニの種の多様性ときのこの種数との間には高い相関が認められた。従ってきのこ生息性のダニの多様性は生態系の多様性に関係があるという従来の仮説が支持された。またきのこ生息性のダニの移動分散様式ごとの種数の割合は、便乗と自力で移動との間でほぼ等しかった。このことからパッチ状のハビタットであるきのこを利用するためには風等の偶然の移動分散はほとんど成功せず、ハビタットの連結性が重要であることが示唆された。生木(樹液)、枯死木(朽ち木)を利用する昆虫の代表として、クワガタムシ科の8種に関して、線虫検出調査を行った。この結果、11タイプの線虫を検出し、いずれも微生物食性の昆虫嗜好性線虫であり、クワガタ成虫に便乗し、幼虫のハビタットで自由生活するものと考えられた。便乗昆虫特異性は全般に低く、昆虫の多様性との相関は低いと考えられた。昆虫便乗性菌類の採集、分離のため、樹皮下穿孔性キクイムシ、養菌性キクイムシを中心に採集を行った。そして分離された菌類のうち特にキクイムシの適応度に影響を及ぼすオフィオストマトイド菌類、アンブロシア菌類の多様性を調査したところ、カラマツヤツバキクイムシの随伴するオフィオストマトイド菌類で最も多様な種類が検出された。一方、アンブロシア菌類の種数はナガキクイムシでは複数種あったものの、その他養菌性キクイムシでは少なかった。便乗微小生物の多様性は便乗寄主の多様性と強く相関するという仮説を検証するために、便乗寄主ごとの便乗及び共生微生物の多様性を明らかにした。同一のランドスケープ内で土壌性のダニと、きのこ生息性のダニを比較したところ、それぞれの種構成は大きく異なり、共通種は46%程度だった。またきのこ性のダニは67%が便乗性だった。きのこのサイズ(バイオマス)が大きくなるほどダニ種数が増加する傾向があったが、きのこの種類ではサルノコシカケのような寿命の長いタイプのきのこで有意に種数が多かった。また昆虫が生息するきのこではダニの種数が有意に多いことがわかった。従ってこれらのダニはハビタットに特異的で、移動分散を特定のグループの昆虫に依存していることが示唆された。キクイムシに便乗するオフィオストマ科菌類や酵母、線虫の種類相は複雑で独自の種類相であり、未だ多くの未記載種を含んでいた。また、クワガタに関して、便乗者や、それに寄生する微生物の多様性調査を行った。この結果、国内産の8種類のクワガタムシより複数の未記載種を含む8種の線虫が確認され、これらの多くは細菌食性自由生活線虫であった。また便乗線虫には種特異性はほとんど見られなかったことから、比較的広い範囲のクワガタムシを媒介昆虫として利用していると考えられた。菌類についても未記載の複数種が含まれていることがわかった。これらのことは生物間相互作用に関する定量的評価を妨げる要因となると思われたが、保全対象を考慮する上で重要であると考えられた。微小生物を保全するための「保全共生系単位」を解明し、生物多様性保全における共生系保全の重要性を明らかにするために研究を行った。各種キクイムシからの随伴菌の検出を行ったところ、糸状菌だけでなく酵母でも多様な随伴関係が成立していると考えられた。シデムシ随伴酵母はYallowia lipolyticaとその近縁群であり、さらには各種シデムシの随伴酵母の優占種はシデムシ種特異的な随伴関係が成立していると考えられた。また、各種シデムシから線虫の分離同定を行ったところ、亜社会性の種で、線虫保持率、保持種数とも非常に高く、自由生活者ではほとんど線虫の検出が見られないことが明らかになった。同様にシデムシ便乗ダニを調べたところ、亜社会性の種で種数個体数ともに多いことが分かった。これら共生生物は森林タイプによる明確な差がなかったことから、安定的なハビタットを利用する種で共生生物の多様性が高い傾向が示唆された。シデムシと一部の便乗ダニの間では相利共生が発見されているが、キクイムシやシデムシの便乗菌類、線虫類、ダニ類で高い便乗

寄主特異性が認められたことから、これらの共生系が相利共生を基盤にしている可能性が示唆された。またキノコに生息するダニの種の多様性は、キノコのタイプと昆虫の有無と相関しており、キノコの大きさとは明確な関係が認められなかった。キノコに対する種特異性は不明であったが、枯死木に発生するキノコで種数が多かったことから、ダニの多様性保全には枯死木が安定的に供給される老齢林の保全が有効であることが示唆された。これらのことから、微小な生物にとって生息地の分断化はごく普通の状態と考えられ、分断化によるデメリットは便乗寄主などの共生生物によって補われていることが示唆された。従って一般には微小な生物の保全はより大型の共生生物のハビタット保全を行うことが有効であると考えられた。全国各地で調査を行うと共に特定のプロットでは年変動を示すデータを収集し、ダニについては保全単位を明らかにするための定量化を行ったことから、計画通りに順調に伸展していると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。保全のためのハビタットのスケールを明らかにするために、微小生物の種の多様性維持に重要なマイクロハビタットの特性とその分布確率のデータがほぼ入手できたので、今後はこれらを解析する。さらにパッチ状のマイクロハビタットを利用するために不可欠な、便乗寄主の保全スケールを解明し、両者の情報から微小生物の保全に重要な基本単位の提言を行う。
顎関節におけるアミロイド骨関節症発症に関する研究

平成10年度は前年度に行った透析患者のスクリーニング調査をもとに、顎関節画像所見を中心とした調査と顎関節における実験的アミロイド沈着に関する実験を中心に研究遂行した。画像診断の検討は顎関節における何らかの症状を訴え、新潟市信楽園病院において慢性腎不全血液透析療法中の患者25名を対象とした。画像診断は、側斜位経頭蓋撮影法(Schuller法)を中心に施行し、顎関節における骨変化を検討した。x線所見において明らかな骨変化を認めた症例にはCT、MRI、骨シンチグラフィーを施行し、総合的に骨変化を検討した。画像所見の検討では、骨変化を有する患者群の透析年数が有意に高く(P<0.05)18.33±9.11(平均±SD)年であった。骨変化は25例中16例に下顎頭のsurfaceerosionを認め、以下concavityとbonecystが6例であった。また骨変化別に年齢、透析年数、生化学データを検討した。erosionを有した患者の平均透析年数は、20.19±7.52年で有さない群に比して有意に高かった(P<0.01)。さらにbonecystを有する患者の平均透析年数も、25.50±2.43年で有意に高く(P<0.05)、骨変化別では最も長い平均透析年数を示した。生化学的データの比較検討ではいずれも有意差は認められなかった。この2つの変形所見は、透析に伴う進行性退行性変化の可能性があり、今後もさらに症例を重ね、検討を要すると思われた。アミロイド沈着に関する実験は前年度の予備実験をもとに生後6週齢のLEW/SsN Slcラットを用い、平成11年2月現在遂行中である。前年度Trenthanらの方法に従い、ラット顎関節におけるII型コラーゲン関節炎の作製を試みたが、顎関節において関節炎の発症が十分でなかったため、Zanmaらの方法によるアジュバント関節炎を作製し行っている。本研究は、透析患者の顎関節変形所見、とりわけ骨嚢胞所見についてのスクリーニング調査ならびに、腎不全ラットを用いて、顎関節に実験的アミロイド沈着を発症しうるかを検討することにより、顎関節におけるアミロイド骨関節症の発症状況の把握、発症のメカニズムを解明する糸口とすることを目的とする。平成9年度は主として患者のスクリーニング調査と顎関節における実験的アミロイド沈着に関する予備実験を中心に研究遂行した。新潟市信楽園病院において慢性腎不全透析療法中の患者267名を対象とし、顎関節症状に関する疫学的調査を行い、異常の認められた患者83名に対し、現在順次、画像診断を中心としたスクリーニング調査を施行中である。本年度は、予備実験として生後6周齢のLEW/SsN SIcラットを用い、Platteらの方法による5/6腎臓摘出により腎不全ラットに陥らせたものを作成、6週間飼育し、生存可能であることを確認した。犠牲死時に腹大動脈より採取し、BUN、CRE、β2-ミクログロブリンを測定、残存腎機能の指標とした。BUNは平均61.2±16.24mg/dl、CREは平均1.1±0.12mg/dl、β2-ミクログロブリン18.8±10.1μg/dlであった。ラットの関節包内注射法を確認するためにラット外眼角と外耳道前縁を結ぶ直線上の中点に27G注射針を刺入し、強制開閉口運動により刺入針の上下動を確認し、関節包内への刺入の確認とした。なお、関節滑液の採取は困難であった。武藤らの確立した強制過剰開口により実験的滑膜炎の発症を試みた。6週後に犠牲死させ顎関節の組織標本をHE染色し、上関節腔前方部の滑膜における軽度な炎症所見を確認した。またTrenthanらの方法に従い、ラット顎関節におけるII型コラーゲン関節炎の作製を試みたが、四肢関節における関節炎発症は確認し得たが、顎関節に著明な変化は認めなかった。

アミロイド沈着に関する実験は前年度の予備実験をもとに生後6週齢のLEW/SsN Slcラットを用い、平成11年2月現在遂行中である。前年度Trenthanらの方法に従い、ラット顎関節におけるII型コラーゲン関節炎の作製を試みたが、顎関節において関節炎の発症が十分でなかったため、Zanmaらの方法によるアジュバント関節炎を作製し行っている。
子ども虐待のケアの質向上をめざす多職種連携による協働（IPW)促進モデルの開発

複雑な背景や要因をもつ子ども虐待の対応においては、多職種連携による協働が重要である。日本では職種が関与していたにも関わらず、虐待の重症化や子どもの死亡など深刻な問題に発展した事例が報告されている。そのため、子ども虐待ケアの実践での実用化を図ることを目的とし、専門職連携による協働(IPW)を促進するモデルの検討、開発を進めている。日本国内の研究論文では多職種が協働するため共通のアセスメントシートはあるが、支援目標・支援方法やモニタリングを行う共通シートに関する文献は「連携における会議進行フレームシート」(高岡,2013)がある。イギリスではWorking TogetherにおけるThe Assessment Frameworkが使われ、専門職共通のアセスメントの枠組みにより、共通の視点でアセスメントし、共通の用語を使い協議することができる。これまで保健師へのインタビューから、子ども虐待事例におけるIPWについて、「関係機関と目標、情報共有することへの難しさ」「関係機関の役割分担の難しさ」「他職種連携・協働における保健師の立ち位置への戸惑い」等が抽出されていた。さらにインタビューを追加し、子ども虐待事例の対応における関係機関との協働の方法について「タイムリーな情報共有」「ニーズに合わせた連携」「先を見越して支援者を支えるネットワークを準備する」が抽出された。2018年度はこれらの結果をもとに子ども虐待の処遇検討の場において、試行的にツールを活用し、改善を図った。先行研究及びインタビュー、試行から検討したツールを用いて多職種メンバーによる事例検討会を開催し、チームワーク分析指標を用いて評価を実施していく予定である。文献およびインタビューからIPWの阻害要因、促進要因について分析を進めてきたが、実践への試行の可能性の検討や事例検討会開催の準備に時間を要し、実施が遅れているため、今年度の早期の実施を検討していきたい。検討したツール、方法を用いた多職種による事例検討会を開催し、検討内容、検討結果を検証するとともに、チームワーク分析等により評価を行っていく予定である。日本では連携のための具体的な方法論が確立しておらず、多職種が関与していたにも関わらず、虐待の重症化や子どもの死亡など深刻な問題に発展した事例が報告されている。本研究では子ども虐待のケアの質向上のために、「多職種連携による協働(Inter professional Work:以下、IPWとする)」を促進するモデルを開発することである。2016年度は研究の第一段階として、年度計画どおり、国内外の子ども虐待に関するIPWの文献を中心に入手し、分析を進めている。子ども虐待のIPWの枠組みや構成要素に関する国内文献がほとんど見られないことから、海外文献でIPWの枠組みや構成要素を示している文献を中心に検討しており、概ね順調に進んでいると考えられる。日本では多職種が関与していたにも関わらず、虐待の重症化や子どもの死亡など深刻な問題に発展した事例が報告されている。また、保健師8名へのインタビューから、子ども虐待事例におけるIPWについて、「関係機関と目標、情報共有することへの難しさ」「関係機関の役割分担の難しさ」「他職種連携・協働における保健師の立ち位置への戸惑い」等が抽出された。活用できる文献が少なく、検索、精読に時間を要した。また、入手できた海外文献に示されている子ども虐待におけるIPWの枠組みを、日本の保健医療福祉システムにおける虐待事例の支援にどのように適用できるかについての検討に時間を要したことと、インタビューの実施が遅れている。

2016年度に検討を進めたIPW概念枠組みや構成要素を精選し、子ども虐待事例のケアを行っている保健師(15名程度)を対象にインタビューを実施し、子ども虐待対応事例のIPWの実施状況を把握するとともに、IPW概念枠組みと構成要素の適用について検討する。さらに、「IPWが効果的に実践された事例」と「IPWが効果的に実践されなかった事例」から促進要因・阻害要因を検討し、IPW促進モデル(仮)を作成する予定である。虐待事例に対する保健師のケア内容、IPWの実践状況、IPWの促進要因・阻害要因等について、保健師へのインタビュー調査を実施し分析を行うと共に、試行的に作成した分析シートの活用可能性を検討する。検討したツール、方法を用いた多職種による事例検討会を開催し、検討内容、検討結果を検証するとともに、チームワーク分析等により評価を行っていく予定である。インタビュー調査の実施が遅れているため、旅費、テープ起こし費用の支出が少なかった。30年度はこれらの費用に使用するとともに、試行的な事例検討会の議事録についてのテープ起こし費用、旅費に充てる予定である。子ども虐待事例検討会を開催しなかったため、実施にかかる謝金等が不要となった。次年度に実施を予定しており、使用予定である。
ウエルシュ菌β毒素の分子生物学的手法、並びに、X線解析による構造と機能の解析

ウエルシュ菌β毒素は、壊疽性腸炎の原因毒素である。我々は、β毒素の感受性培養細胞であるHL-60細胞(ヒト急性前骨髄性白血病細胞)に対する作用、さらに、本毒素のマウス皮膚血管透過性亢進活性を検討した。HL-60細胞にβ毒素を作用させると急速な細胞からのK^+イオンの遊離が認められ、毒素処理約2時間後には、ほとんどの細胞が膨化し、その後破壊が認められた。次に、β毒素のHL-60細胞への結合を解析するため、[^<32>P]-ラベル毒素とHL-60細胞をインキュベーション後、SDS-PAGEとオートラジオグラフィーを行うとラベルβ毒素のオリゴマーが認められた。次に、種々の直径を持つポリエチレングリコール(PEG)を用いて検討した結果、本毒素の細胞膨化作用は、PEG600の処理で阻害され、この結果から、1.55nmのポアーが形成されると推察される。以上から、β毒素はHL-60細胞に結合後、オリゴマーを形成して、細胞内へのイオンや水分の流入を促進し、細胞の膨化を引き起こすと考えられる。次に、本毒素のマウス皮膚血管透過性亢進活性測定すると、本毒素5から50ngの投与で用量依存的なブルーイング活性を示した。本毒素の作用は、ヒスタミンH1レセプターアンタゴニストであるジフェンヒドラミンで阻害されたが、β毒素をマウス肥満細胞腫P-815細胞に作用させてもヒスタミン遊離は示さず、β毒素は間接的にヒスタミン遊離を示す可能性が考えられる。そこで、一次知覚神経から遊離するサブスタンスP(SP)の効果を検討するため、SPレセプターアンタゴニストを投与すると、本毒素の透過性亢進活性は、SPアンタゴニストで抑制された。さらに、皮膚の一次知覚神経末端に存在するSPをカプサイシン処理で枯渇させると本毒素の透過性亢進活性は阻害された。以上から、β毒素は皮膚表面の一次知覚神経末端からSPを遊離させ、このSPが肥満細胞を刺激し、ヒスタミン遊離を促進させ、遊離したヒスタミンが毛細血管に作用し、最終的に血管透過性亢進を引き起こすと考えられる。これまでに、β毒素が作用する細胞に関する報告はほとんどない。我々は、β毒素に対する感受性培養細胞系としてヒト急性前骨髄性白血病細胞であるHL-60細胞を見いだし、この細胞に対する本毒素の作用を解析した。HL-60細胞にβ毒素を作用させて約5分後に,K^+イオンの遊離、その後遅れてCa^<2+>イオンの細胞内への流入が認められ、いずれも30分で最大となった。この時、顕微鏡で細胞の形態を観察すると、毒素処理約30分後、細胞の膨化が観察され、約2時間後ほとんどの細胞が膨化し、その後、破壊が認められた。β毒素処理したHL-60細胞からのLDH遊離を測定すると、本毒素処理後、約2時間でLDH遊離が始まり、その後、時間に依存して増加した。次に、β毒素のHL-60細胞への結合を解析するため、β毒素のN末端側に付加した領域を[^<32>P]-ATP存在下キナーゼでリン酸化した。

このラベル毒素とHL-60細胞を37°Cでインキュベーション後、種々の界面活性剤で可溶化し、SDS-PAGEとオートラジオグラフィーを行った。ラベルβ毒素のモノマーの結合が認められ、この結合は過剰のcold毒素の存在下で阻害された。一方、ラベルβ毒素オリゴマーは、いずれの界面活性剤を用いた場合も認められなかった。次に、種々の直径を持つポリエチレングリコール(PEG)を用いて検討した。その結果、本毒素のCa_<2+>イオン流入と細胞膨化作用は、PEG600の処理で阻害され、この結果から、1.55nmのポアーが形成されると推察される。以上から、β毒素はHL-60細胞に結合後、おそらく、界面活性剤に不安定なオリゴマーを形成して、K^+イオンの遊離とCa^<2+>イオンの細胞内への流入、そして、細胞の膨化を引き起こすと考えられる。ウェルシュ菌β毒素の作用機構解析の糸口を見つけるため、本毒素のマウス皮膚血管透過性亢進活性を種々の濃度のβ毒素を皮内に投与し、次にエンバンスブルーを静注して、血管からの色素の漏出量を測定すると、本毒素5から50ngの投与で用量依存的にブルーイング活性の上昇を示し、本毒素は、マウス皮膚において血管透過性亢進活性を示すことが判明した。毛細血管の透過性の亢進は、肥満細胞からのヒスタミン遊離が関与している可能性が考えられるので、ヒスタミンH1レセプターアンタゴニストであるジフェンヒドラミンとβ毒素をマウスの皮膚に同時投与し、透過性亢進活性に対する影響を検討するとβ毒素の透過性亢進活性は阻害された。以上から、β毒素の透過性亢進活性には、ヒスタミンが関与している可能性が考えられる。次に、β毒素が、肥満細胞に直接作用し、ヒスタミン遊離を引き起こすかどうかを明らかにするため、マウス肥満細胞腫P-815細胞にβ毒素を作用させると、細胞からのヒスタミン遊離は殆ど観察されなかった。次に、一次知覚神経から遊離する神経ペプチドの効果を検討するため、種々のサブスタンスP(SP)レセプターアンタゴニストとβ毒素を、同時にマウスに投与すると、本毒素の透過性亢進活性は、全てのアンタゴニストで抑制された。さらに、皮膚の一次知覚神経末端に存在するSPをカプサイシン処理で枯渇させると本毒素の透過性亢進活性は殆ど阻害された。以上からβ毒素は皮膚表面の一次知覚神経末端からSPを遊離させ、このSPが肥満細胞を刺激し、ヒスタミン遊離を促進させ、遊離したヒスタミンが毛細血管に作用し最終的に血管透過性亢進を引き起こすと考えられる。この結果は、本毒素が、神経系を介して血圧上昇を示す結果からも支持される。