hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複雑液体の物理A02揺らぎと緩和過程

...前年度に発見した界面での前駆漏れ転移を定量的に研究し、その原因を検討。また、超臨界流体の金属-非金属転移での密度による大きな音速変化、臨界音波減衰が通常の絶縁性流体より著しく大きいことを発見。(2)カルコゲン(八尾、遠藤)...液体カルコゲン-ハロゲン混合系に速い緩和(分子内)と遅い緩和(分子全体の拡散)の2つの機構があることを発見。また、液体テルルは、アルカリ金属添加により金属から半導体に転移することを発見。(3)分子性液体(岡田)...溶融塩DyCl_3の電気泳動では存在種(陰イオン)とは異なる泳動種(陽イオン)が存在することを発見。MD実験よりメタケイ酸ガラス中のアルカリイオンの拡散は互いに同種イオンが連動して動く確率が大きいことを発見。2.ガラス転移を示すアモルファス物質系:(1)アモルファス高分子(梶)...ガラス転移領域の緩和(α緩和)と低エネルギー励起(ボソンピーク)の協同連動領域の相関長は、ほぼ等しく(1030Å)、両者は密接に関係していると予想されるが、このことを熱処理効果から支持する結果を得た。(2)メタル-メタロイド合金ガラス(鈴木)...この場合も上記の高分子の場合に対応する結果が得られた。(3)無機ガラス(新井)...超高圧で中間距離相関を変化させ、上の熱処理効果と類似の結果を得たが、その解釈については議論の余地がある。3.複雑な構造をもつ系(ソフトマタ-系):(1)高分子ブロック共重合体(橋本)...1次構造のもつ階層性を反映して熱雑音力誘起秩序・無秩序1次相転移が起こることを実験的に始めて解明。また、無秩序相の組成ゆらぎはスポンジ状構造であること、秩序化過程では、核生成・成長機構に変化し臨界核構造に階層性が生じることも発見。(2)両親媒子系(好村)...中性子スピン・エコー分光器の測定効率を3倍向上させた。これを用いて三元系のマイクロエマルション相やラメラ相のダイナミックスの測定に成功。これまで、複雑液体の示す種々の特性を「揺らぎと緩和過程」の立場から研究し多くの発見をしてきたが、本年度は最終年度であるため、これらの研究を発展させるとともに複雑液体の本質に関する議論をも行った。本年度の研究実績は、複雑液体の集団運動(運動の協力現象)と階層構造に関するもので下記のように要約される。1.液相-気相転移の超臨界現象:(1)液体水銀(八尾)...臨界点近傍における流体水銀のサファイア界面における前駆濡れ転移現象が1次転移であることを確認。偏光解析測定法により光学定数や濡れ層の厚さを正確決定。(2)カルコゲン(遠藤、八尾)...液体テルルの金属(融体)-半導体(ガラス)転移が長結合(2電子結合)と短結合(3電子結合)の混合状態から短結合のみの鎖構造への転移によることを解明。2.アモルファス中の集団運動:(1)ガラス転移(α緩和過程)(梶)...α緩和を特徴付けるフラジリティ指数(粘弾性測定から決定)と系の不均一性を表すノンガウシアン・パラメーター(非弾性中性子散乱から決定)の関係から強いガラスほど不均一であることを発見した。(2)低エネルギー励起(ボソンピーク)の起源...
超臨界流体の特異性を利用した新しい誘導体化法の開発

超臨界流体は、密度の関数で表される溶媒特性が温度と圧力により容易に微調整できるという従来の液体溶媒にはない特異な性質を有している。本研究の目的は、このような超臨界流体を反応媒体として使用して、迅速性と高い選択性を備えた新しい誘導体化法を開発することである。1)超臨界流体を用いる誘導体化システムを開発し、これを用いて各種のカルボン酸のメチルエステル化反応について誘導体化の最適化を行った。溶媒として二酸化炭素とメタノールの混合系を用い、温度、圧力およびメタノール濃度の影響を詳細に検討した。固体酸触媒を使うことにより、迅速で定量的な誘導体化が可能となった。本法を固相抽出法による濃縮と組み合わせることにより、水中のフェノキシ酢酸類の環境規制値レベルでの分析を迅速に行えることが明らかとなった。2)超臨界メタノール中において、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、全芳香族ポリエステルなどのエステル型ポリマー、およびポリカーボネートなどのプラスチックの分解およびカルボン酸成分のメチルエステル化を検討した。温度、圧力、分解時間などの条件を詳しく検討し、定量滴な反応が起きる条件を明らかにした。本法により、これらポリマーの迅速な組成分析が可能となった。また、微量試料を取り扱うことが可能な分析システムを開発した。本研究の目的は、このような超臨界流体を反応媒体として使用するとともに、濃縮や予備分離に用いることにより、迅速性と高い選択性を備えた新しい誘導体化法を開発することである。本年度は、主として固体触媒を充てんした容器を反応容器として用い、メチルエステル化を検討した。1超臨界流体を用いる誘導体化システムの構成とその基本特性の検討本研究で必要とする次のような機能を有するシステムを開発し、その特性を確認した。圧力制御が可能なこと。二酸化炭素に添加溶媒あるいは反応試薬を様々な濃度で混合できること。試料は、溶液および固体として、また固相抽出カラムを用いて導入できること。反応および反応物の回収は、連続的および回分的に行えること。2カルボン酸のメチルエステル誘導化の最適化二酸化炭素/メタノール混合液を用い、各種カルボン酸のメチルエステル化反応について、温度、圧力およびメタノール濃度の影響を詳細に検討した。触媒無しでも反応が進行することが確認できたが、触媒を使うことにより、迅速で定量的な誘導体化が可能となった。3水中のフェノキシ酢酸類への応用本法の応用として、除草剤として使用されているフェノキシ酢酸類の水溶液からの分析を検討した。固相抽出カラムによる濃縮法と本反応システムを組み合わせることにより、環境規制値レベルでの分析を迅速に行うことが可能となった。本研究の目的は、このような超臨界流体を反応媒体として用いることにより、迅速性と高い選択性を備えた新しい誘導体化法を開発することである。1)前年度に固体触媒を充てんした容器を反応容器として用いることにより、各種カルボン酸のメチルエステル化が迅速にかつ定量的に行えること。および本反応システムと固相抽出法を組み合せることにより、水溶液中の微量のフェノキシ酢酸類の分析に適用できることが分かった。これを基にして詳しく検討した結果は投稿中である。2)ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、全芳香族ポリエステルなどのエステル型ポリマー、およびポリカーボネートなどのプラスチックの組成分析を目的として、超臨界メタノール中での分解と誘導体化を検討した。温度、圧力、分解時間などの条件を詳しく検討し、これからのポリマーが迅速に分解すると同時に、カルポン酸が定量的にメチルエステルに誘導体化できる最適条件を見いだした。さらに、この反応を利用した微量試料を取り扱うことが可能な分析システムを開発した。現在その結果を投稿準備中である。
骨髄幹細胞を用いた腸管構成細胞の再生と炎症性腸管粘膜障害に対する治療への応用

昨年に続き、ラット腸管粘膜傷害モデル作製を安定化し、GFPラットの骨髄細胞を管腔内に移植して上皮が再生し得るか検討した。Wistarラットの遠位大腸腸間膜対側を切開し、腸間膜側の半周の粘膜のみを切除してラット賜管結膜傷害モデルを作製し、3日目にコラーゲンゲルに包含させたGFPラットの骨髄幹細胞を盲腸内に注入して移植し、移植後7日目にラットを犠牲死させ粘膜切除部を蛍光顕微鏡下に観察して発光を確認し、GFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮が再生しているかを検討した。粘膜切除の範囲を長く(3cm)すると腸管壊死や縫合不全でラットを失うことが多く、粘膜切除の範囲を短く(1cm)するとGFPラットの骨髄幹細胞を管腔内に移植する3日目にはすでに粘膜の再生がかなり進んでおり、犠牲死させたラットの粘膜切除部腸管を蛍光顕微鏡下に観察したが発光はみられず、GFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生は確認できなかった。粘膜切除の範囲を2cmではGFPラット骨髄幹細胞移植時でも潰瘍が存在し、GFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生が期待されたが、GFPラット骨髄幹租胞由来の粘膜上皮の再生は確認できなかった。そこでGFPラットの骨髄幹細胞移植をラット腸管粘膜傷害モデル作製の1日目、2日目に振って同様にGFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜再生を確認したが、生着を確認することはできなかった。Drug deliverysystemに問題があるとも考えられ、次にGFPラットの骨髄幹細胞が確実に粘膜切除部に暴露されるように、盲腸に比較的近い遠位上行結腸でモデルを作製した。同様にGFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生を確認したが、生着を確認できなかった。一旦、ラット腸管粘膜傷害モデルを用いた実験を中止し、DSSラット腸炎モデルを用いた治療実験を試みた。Wistarラットに5%DSS水溶液を7目間自由飲水させて大腸炎を誘発し、その後1$DSS水溶液を飲水させて大腸炎を持続させるモデルを作製した。5%DSS水溶液飲水開始8日目にGFPラジト骨髄幹細胞を盲腸内に注入して移植し、移植後7日目に同ラットを犠牲死させ、大腸を摘出して腸炎病変について、無治療のDSS腸炎モデルと比較した。結果は、大腸にGFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生は確認し得ず、肉眼的にも、病理学的にも無治療群と腸炎病変に差は認あられなかった。本年度は、ラット腸管粘膜傷害モデルを作製し、GFPラットの骨髄幹細胞を管腔内に移植して上皮の再生が認められるか否かについて検討した。1.ラット腸管粘膜傷害モデルの作製Wistarラットの遠位大腸腸間膜対側を切開し、腸間膜側の半周の粘膜のみを3cm切除した後、切開部を再縫合してモデルを作製した。

腸管の血流に十分配慮してモデルを作製したが、粘膜切除を行った腸管が壊死に陥ったり、また縫合不全を併発して感染症にて死亡するラットもみられた。モデルの作製の安定化のため、粘膜切除の長さを2cm,1cmとしてみたところ、やはり1cmのもので安定したモデルが得られた。また小腸を用いたラット腸管粘膜傷害モデルの作製も試みたが、やはり大腸よりは安定したモデルが得られた。以下の実験で用いるモデルとしては遠位大腸の粘膜を1cm切除したものを使用することに決定した。2.GFPラット骨髄幹細胞の同系ラットへの移植次に、腸管粘膜傷害モデル作製後3日目にコラーゲンゲルに包含させたGFPラット骨髄幹細胞を盲腸内に注入して移植し、さらに移植後7日目にラットを犠牲死させ粘膜切除部を観察した。粘膜切除部は再生上皮で覆われており瘢痕形成を伴っていた。肉眼的には移植ラットとコラーゲンゲルのみを盲腸内に注入したコントロールラットで粘膜切除部の形態に差はなかった。犠牲死させたラットの粘膜切除部腸管を蛍光顕微鏡下に観察したが発光は確認できず、骨髄幹細胞の生着を確認し得なかった。腸管粘膜傷害モデル作製後3日目にラットを犠牲死させ粘膜切除部を観察したところ、ラットの粘膜再生が早いため移植日までにかなり再生が進んでおり、骨髄幹細胞が十分生着し得ない可能性が示唆された。そこで粘膜切除を2cmとし再実験を行う予定である。昨年に続き、ラット腸管粘膜傷害モデル作製を安定化し、GFPラットの骨髄幹細胞を管腔内に移植して上皮が再生し得るか検討した。Wistarラットの遠位大腸腸間膜対側を切開し、腸間膜側の半周の粘膜のみを切除してラット腸管粘膜傷害モデルを作製し、3日目にコラーゲルに包含させたGFPラットの骨髄幹細胞を盲腸内に注入して移植し、移植後7日目にラットを犠牲死させ粘膜切除部を蛍光顕微鏡下に観察して発光を確認し、GFPラット骨髄幹綿胞由来の粘膜上皮が再生しているかを検討した。粘膜切除の範囲を長く(3cm)すると腸管壊死や縫合不全でラットを失うことが多く、粘膜切除の範囲を短く(1cm)するとGFPラットの骨髄幹細胞を管腔内に移植する3日目にはすでに粘膜の再生那かなり進んでおり、犠牲死させたフットの粘膜切除部腸管を蛍光顕微鏡下に観察したが発光はみられず、GFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生は確認できなかった。粘膜切除の範囲を2cmではGFPラット骨髄幹細胞でも潰瘍が存在し、GFPラット骨髄細胞由来の粘膜上皮の再生が期待されたが、GFPラット骨髄幹緬胞由来の粘膜上皮の再生は確認できなかった。そこでGFPラットの骨髄幹細胞移植をラット腸管粘膜傷害モデル作製の1日目、2日目に振って同様にGFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜再生を確認したが、生着を確認することはできなかった。Drug deliverysystemに問題があるとも考えられ、次にGFPラットの骨髄細胞が確実に粘膜切除部に暴露されるように、盲腸に比較的近い遠位上行結腸でモデルを作製した。同様にGFPラット骨髄幹細胞由来の粘膜上皮の再生を確認したが、生着を確認できなかった。一旦、ラット腸管粘膜傷害モデルを用いた実験を中止し、DSSラット腸炎モデルを用いた治療実験を試みた。Wistarラットに5%DSS水溶液を7日間自由飲水させて大腸炎を誘発し、その1$DSS水溶液を飲水させて大腸炎を持続させるモデルを作製した。
膜電位感受性色素を用いた光学的測定によるショウジョウバエ神経活動のパタ-ン解析

ショウジョウバエ神経系のニュ-ロン活動を始学的に測定するためには、微小なショウジョウバエのニュ-ロンに対応する空間分解能の向上が不可欠である。そこで、これまでにわれわれの研究室で確立してきたニュ-ロン活動の光学的測定技術のショウジョウバエ神経系への適用について全般的見直しをおこなった。空間分解能を向上させるためには、光学系の高倍率化が必光要である。現在の光学系では最高670倍まで倍率を上げられ、これは2.1μm×2.1μmの分解能に対応するが、この光学系では、検光器あたりの光量が著しく低下し、実用的なS/N比は得られない。この問題を克服するために、i)より明るい光源、(ii)より明るい光学系、iii)より高効率の膜電位感受性色素、iv)より低ノイズの受光素子と電子回路、v)コンピュ-タによるノイズ低減化処理にポイントを置き、測定システムの改良をおこなった。特に高効率の膜電位感受性色素の探索には重点をおき、数種のメロシアニン・ロ-ダニン系色素を新たにデザインし、その内から4種の有望な膜電位感受性色素を選別することができた。一方、コンピュ-タ-処理の面で、S/N比向上に不可欠な光学的シグナルの加算平均処理の大幅な高速化を実現することができた。現状において、ショウジョウバエ神経系に対するニュ-ロン活動の光学的測定法の適用は、まだ予備的な実験の段階であるが、すでに、いくつかの問題点については解決の糸口を得ており、今後の研究の発展により、近い将来、実用化される可能性の見通しがついた。
複合シッフ塩基錯体によるDNAの選択的な切断に関する研究

一方、[12]aneN_3錯体の燐酸トリエステルカロ水分解能は,PH=7でCo(II)<Ni(II)<Zn(II)<Cu(II)の順に増加し,高活性なCu(II)錯体は燐酸ジエステルやDNAを加水分解により切断した。しかし,これら錯体をシッフ塩基錯体と複合させる試みは未だ成功しておらず,切断選択性の検討は今後の課題である。
ロボットを用いたバランス練習におけるバランス能力とアンクル／ヒップ戦略の変化

バランス障害を有する患者23名に対してBEARと従来バランス練習のCrossover studyを行った.BEAR介入前後では,快適歩行速度,TUG,FRT,中殿筋筋力,下腿三頭筋筋力に有意な改善を認めた.1名の患者においてはEqui testを行い,足関節戦略の関与が上昇を示した.健常者7名に対して,3種類のゲームで,4段階の難易度の練習を行い,この時の下肢筋活動を表面筋電図によって評価した.各ゲームの筋活動量は難易度の上昇に伴い増加した.前後への重心移動練習中の三次元動作解析・表面筋電図同時計測を健常者,患者各1名に対して実施した.患者においては,健常者よりも膝関節の運動が大きかった.在宅高齢者における転倒の年間発生率は約1020%とされており,転倒の510%に骨折が発生すると言われている.豊かな高齢社会を実現するために転倒予防の意義は大きい.我々は倒立振子制御を用いた立ち乗り型移動支援ロボットをバランス練習用に改良し,バランス練習アシストとした.このロボット上で行うバランス練習は,ヒトがバランスを保つための代表的な戦略であるAnkle/Hip strategyに類似しているため,転移性が高いと考えられる.我々は,効果的に練習を行うために3種類の専用ゲーム(前後への重心移動練習,左右への重心移動練習,外乱対処練習)を開発した.ゲームのパラメータを変えることにより練習の難易度は調整可能であり,患者はゲームを楽しむ感覚で練習に取り組むことができる.今年度は,左右への重心移動練習を,突発的な重心移動を行う内容から,連続的な重心移動を行う内容へと改良した.これにより,練習中には持続的な筋活動が必要となり,効果が高まることが期待された.また,練習レベルを自動的に変更するアルゴリズムを追加することにより,常に最適な難易度で練習を提供することが可能となった.在宅高齢者における転倒の年間発生率は約1020%とされており,転倒の510%に骨折が発生すると言われている.豊かな高齢社会を実現するために転倒予防の意義は大きい.我々は倒立振子制御を用いた立ち乗り型移動支援ロボットをバランス練習用に改良し,バランス練習アシスト(Balance Exercise Assist,以下BEARと略)とした.このロボット上で行うバランス練習は,ヒトがバランスを保つための代表的な戦略であるAnkle/Hip strategyに類似しているため,転移性が高いと考えられる.我々は,効果的に練習を行うために3種類の専用ゲーム(前後への重心移動練習,左右への重心移動練習,外乱対処練習)を開発した.ゲームのパラメータを変えることにより練習の難易度は調整可能であり,ゲームの成績によって難易度は自動的に変更されるため,常に最適な難易度で練習を提供することが可能である.2014度は, BEARと従来バランス練習の効果の比較を行ってきた.具体的には,バランス障害を有する患者に対してBEARと従来バランス練習をそれぞれ1回40分,週2回,8週間実施するCrossover studyを進めており,BEAR先行群5例,従来先行群5例への介入を終えている.BEARによる介入前後ではFunctional Reach Test,Time up and go test,重心動揺計を用いた静止立位検査(矩形面積,外周面積),中殿筋筋力において有意な改善を認めている.今後は更に症例数を増やして検討を進めていく.また,健常者5名に対して,3種類のゲームそれぞれにおいて,4段階の難易度の練習を行い,この時の下肢筋活動を表面筋電図によって評価した.各ゲームにおいては,難易度が高くなるほど,下肢筋活動が増加する結果が得られた.下肢筋全体では外乱対処練習において筋活動が高いが,前後への重心移動練習では腓腹筋が,左右への重心移動練習では長腓骨筋の活動が高かった.在宅高齢者における転倒の年間発生率は約1020%で,転倒の510%に骨折が発生すると言われている.豊かな高齢社会を実現するために転倒予防の意義は大きい.我々は倒立振子制御を用いた立ち乗り型移動支援ロボットをバランス練習用に改良し,バランス練習アシスト(Balance Exercise Assist,以下BEARと略)とした.BEARを用いたバランス練習は,ヒトの代表的なバランス戦略であるAnkle/Hip strategyに類似しているため,転移性が高いと考えられる.効果的に練習を行うために3種類の専用ゲーム(前後への重心移動練習,左右への重心移動練習,外乱対処練習)を開発した.ゲームパラメータ変更により練習の難易度は変更可能であり,パラメータは自動調整されるため,常に最適な難易度の練習を提供することができる.2015年度は,2014年度に開始したBEARと従来バランス練習のCrossover studyを継続し,23名の患者に対して介入を終えた.BEAR介入前後では,快適歩行速度,Timed up and go test,Functional Reach Test,中殿筋筋力,下腿三頭筋筋力に有意な改善を認めた.1名の患者においてはEqui testのSensory Organization Testを行い,足関節戦略の関与が上昇を示した.従来練習との比較では,BEARで高い改善効果を示す傾向を認めた.また,前後への重心移動練習中の三次元動作解析・表面筋電図同時計測を健常者,患者各1名に対して実施した.健常者においては,前方加速時に足関節背屈,後方加速時に股関節屈曲・足関節底屈が観察された.前方加速時には前脛骨筋,後方加速時には大腿二頭筋,腓腹筋の関与していた.

患者においては,健常者よりも膝関節の運動が大きく,膝関節運動がバランス戦略に関与していることが示唆された.バランス障害を有する患者23名に対してBEARと従来バランス練習のCrossover studyを行った.BEAR介入前後では,快適歩行速度,TUG,FRT,中殿筋筋力,下腿三頭筋筋力に有意な改善を認めた.1名の患者においてはEqui testを行い,足関節戦略の関与が上昇を示した.健常者7名に対して,3種類のゲームで,4段階の難易度の練習を行い,この時の下肢筋活動を表面筋電図によって評価した.各ゲームの筋活動量は難易度の上昇に伴い増加した.前後への重心移動練習中の三次元動作解析・表面筋電図同時計測を健常者,患者各1名に対して実施した.患者においては,健常者よりも膝関節の運動が大きかった.バランス練習アシスト(BEAR)を用いることにより,従来のバランス練習と全く異なる練習を提供することが可能である.BEARで行う練習は,Ankle/Hip strategyへの転移性が高く,難易度が調整可能で,楽しみながら練習を行うことが可能であることから,運動学習の観点からも有効であると考えられる.今年度進めてきた健常者における実験において,難易度が高くなるほど,下肢筋活動が増加する結果が得られた.BEARにおいては,専用ゲームのパラメータによって難易度を調整しているが,我々のパラメータ設定が妥当であることを示す結果であった.また,3種類の専用ゲームにおいて,異なった筋活動が得られたことから,それぞれの専用ゲームは異なる運動を強化していると考えられ,複数の専用ゲームが存在する意義を示唆していると思われる.BEARと従来バランス練習の効果を比較するためのCrossover studyも順調に進んでいる.まだ症例数が少ないため,BEARが従来バランス練習よりも有意に効果的であることを示すには至っていないが,BEARの介入前後では複数のバランス指標が有意な改善を認めており,BEARの有効性は確認できた.今後は更に症例数を増やして,BEARの従来バランス練習に対する有意性についての検証を進める.リハビリテーション医学バランス練習アシスト(BEAR)の従来バランス練習に対する有意性についての検証を進める.具体的には,BEARと従来バランス練習をそれぞれ週2回,8週間実施するCrossover studyを継続する予定である.BEARの作用機序解明も進める.健常者におけるBEAR練習中の筋活動計測と同時に3次元動作解析を実施する.3種類の練習においてそれぞれ計測を行うことにより,各練習の作用機序を検討することが可能である.健常者の評価が終了後は,バランス障害を有する患者において,バランス練習アシストによる練習介入前後に,3次元動作解析と筋活動計測を行う予定である.これにより,患者におけるバランス戦略の変化が明らかになると考えられる.練習経過と照らし合わせることにより,各練習の作用機序の解明にも有用であると思われる.バランス練習アシストを用いることにより,従来のバランス練習と全く異なる練習を提供することが可能である.
呼吸酵素における、酸素還元と一酸化窒素還元の機能変換と分子進化

一酸化窒素還元酵素(NOR)は、嫌気呼吸の鍵となる呼吸酵素であり、細胞毒性の高い一酸化窒素NOを亜酸化窒素N_2Oに変換する鉄含有膜内在性酵素である。P. aeruginosaのcNORとG. stearothermophillusのqNORの結晶構造を明らかにした。これら構造を基盤に、酵素反応の分子機構ならびに触媒プロトン移動機構を提案した。また、好気呼吸酵素との構造機能比較より、呼吸酵素の分子進化を議論した。一酸化窒素還元酵素は、微生物の嫌気呼吸のキー酵素であり、一酸化窒素NOを還元して亜酸化窒素N_2Oに変換する(2NO+2H^++2e^-→N_2O+H_2O)。反応物NOが大気汚染気体NOxの一種であり非常に細胞毒性が強いこと、生成物N_2Oが二酸化炭素CO_2の約310倍の温室効果があり、なおかつオゾン層を破壊する気体であることから、環境科学の側面からも注目されている酵素である。さらに、cNORは好気呼吸の鍵酵素であるチトクロム酸化酵素と、共通の祖先を有していると考えられており、呼吸酵素の分子進化を考える上でも重要な酵素である。Pseudomonas aeruginosaのcNORとGeobacillus stearothermophilusのqNORの分子構造の決定、ならびにこれらの構造を基盤にして、呼吸酵素の機能変換をめざしている。cNORはNorBとNorCの2つのサブユニットからなるヘテロ二量体であり、アズリン(銅タンパク質)を電子供与体とする。qNORは一つのポリペプチドからなり、メナキノールを電子供与体とする。cNORとqNOR共に、結晶化に成功し、約2.4A分解能のX線回折像が得られたので、構造解析を進めた。一方、部位特異的な変異導入による機能変換に必要な、cNORの大腸菌における発現系の構築も開始した。酵素は発現し、その可視光吸収スペクトルはnative酵素と類似であったが、一酸化窒素還元活性を確認できなかった。緑膿菌Pseudomonasaeruginosaの一酸化窒素還元酵素cNORの結晶構造解析に成功した。cNORは、微生物の嫌気呼吸のキー酵素であり、一酸化窒素NOを還元して亜酸化窒素N_2Oに変換する(2NO+2H^++2e-→N_2O+H_2O)。反応物NOが大気汚染気体NO_xの一種であり非常に細胞毒性が強いこと、生成物N_2Oが二酸化炭素CO_2の約310倍の温室効果があり、なおかつオゾン層を破壊する気体であることから、環境科学の側面からも注目されている酵素である。本酵素は、膜結合性酵素であり、結晶化を開始してから7年後の成果である。全体構造は、12本の膜貫通αヘリックスからなるNorBサブユニットと、親水性のチトクロムcフォール度と1本の膜貫通αヘリックスからなるNorCサブユニットで構成されていた。触媒反応中心は、ヘムbと非ヘム鉄の2つと鉄からなる複核中心であり、非ヘム鉄には、3つのHisイミダゾールと1つのGluカルボン酸が配位子として配位していた。また、酵素反応に使われるプロトンおよび電子の輸送経路に関して議論した。以上の分子構造の情報が得られたことにより、酵素反応機構の議論を開始することができた。チトクロム酸化酵素と構造を比較することにより、「呼吸酵素が進化の過程においていかにプロトンポンプ機能を獲得したか」に関しても議論を開始する事ができるようになった。昨年の緑膿菌、Pseudomonas aeruginosaに引き続き、好熱性細菌(Geobacillus stearothermophilus)がもつ一酸化窒素還元酵素NORの構造解析に成功した。NORは、微生物の嫌気呼吸のキー酵素であり、一酸化窒素NOを還元して亜酸化窒素N_2Oに変換する(2NO+2H^++2e^-→N_2O+H_2O)。病原菌もNORを有し、感染先のマクロファージが産生するNOを無毒化している。さらに、NORは好気呼吸の鍵酵素であるチトクロム酸化酵素と、共通の祖先を有していると考えられており、呼吸酵素の分子進化を考える上でも重要な酵素である。サブユニットの組成(cNORはヘテロ二量体、qNORは単量体)と電子供与体(cNORはc型ヘム、qNORはキノール)であるにもかかわらず、その全体構造は両NORで類似であった。しかし、触媒反応に用いられるプロトンの輸送経路は全く異なっていた。cNOR

では、細胞外領域(cytoplasmic side)から活性中心に向かってプロトン輸送チャネルが認められたのに対し、qNORでは、細胞内領域からの水チャネルが発見された。qNOR構造におけるこの発見は、今までcNORの実験からの予想とは全く異なるものであり、呼吸酵素の分子進化を議論する上で、重要な発見である。当初の目的通りに明らかにした脱窒菌の一酸化窒素還元酵素の結晶構造を基に、その酵素反応の分子機構を議論できた。平成24年度は、当初の酸化休止型に加えて、還元型、還元シアン結合型、還元一酸化炭素結合型さらに酸化アルドキシム結合型の構造も解析できた。既に、他のグループが我々の提案した機構に対して、支持や反論を展開始めているので、これらの成果は、我々の酵素反応機構を検証するうえで大いに役立った。また、構造を基盤にした分子動力学シミュレーションにより、呼吸酵素におけるプロトンポンプ機構の分子進化に関する議論を深める事ができた。好気呼吸のチトクロム酸化酵素との構造比較から、2つの疎水性のアミノ酸残基が親水性の残基に変異すると、水チャネルが形成し、細胞内から酵素の活性中心までのプロトン輸送経路が形成できる事を示唆した。大腸菌をホストとする組換え酵素の作成が可能となったので、今後は酵素反応機構とともに、プロトン輸送経路に関する議論を検証していきたい。4年間の研究で、酵素分子内あるいは細胞内での一酸化窒素の伝搬に関しては、新たな問題点として明らかになった。一酸化窒素のモデルとしてキセノンを結合させた酵素の構造と、一酸化窒素産生酵素(亜硝酸還元酵素)と一酸化窒素還元酵素の超分子複合体の構造解析も試み、その構造を得る事にも成功した。2つの酵素が超分子複合体を形成し、細胞毒性の高い一酸化窒素を細胞内に拡散させない機構が存在する事が示唆できた。今後、学会、論文等でその成果は報告する。当初の計画では、NORと共に、微好気呼吸酵素の結晶構造解析を計画していたが、ドイツのグループが2009年度にその構造を報告した。しかし、本申請者も予想外に2つのNORの構造を明らかに出来たので、反応機構解析と分子進化の議論は予定通りに進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。cNORとqNORの2つのNORについて、結晶解析と分光解析によって各種配位子結合型や各種酸化型の構造情報を得る。加えて、NORの構造を基盤にして、分子動力学シミュレーションによるプロトンチャネルの働きの検証を行う。
LaCoO_3系の高スピン・低スピン転移と磁気的性質

LaCoO_3系の磁気的性質は,Coイオンの特異なスピン状態に強く支配されている。しかし、母物質のLaCoO_3でさえ,そのスピン状態は解明されていない。本研究では,LaCoO_3の高スピン・低スピン転移とスピン状態について核磁気共鳴法を用いて研究を行った。^<59>Co核,^<139>La核,^<17>O核のナイトシフトを4.2Kから300Kの温度範囲で測定した。低温で絶対値が小さく温度変化しないナイトシフトが観測され,確かにCoイオンの低温での基底状態は,非磁性の低スピン状態(^1A_<1g>)であることが明らかになった。また,ナイトシフトは温度の上昇とともに約100Kの温度でピークをとった後,減少する振る舞いが観測された。スピン転移は約500Kの高温で起きるとする光電子分光の結果に基づき,解析を行った。特に,高スピン間の交換相互作用を取り入れた,trigonal結晶場とスピン軌道相互作用を考慮した高スピン状態(^5T_<2g>)が最低エネルギーの励起状態であるとするイオンモデルを用いて,帯磁率とナイトシフトの温度変化を計算し,実験結果との比較を行った。その結果,約200Kの反強磁性的な交換相互作用を仮定すると,実験結果は概略説明できることが明らかになった。しかし,このイオンモデルでは理解しきれない中性子散乱等の実験結果があり,スピン状態については完全に解明されたとは言いがたい。中間スピン状態が低温での最低エネルギーの励起状態であり,スピン転移はこの中間スピン状態と低スピン状態との間で起きるとする理論モデルが最近提案されており,さらなる実験研究が必要である。
HAPとセメント質内蛋白複合化が新付着形成に与える影響について

最近我々は、新付着形成膜材料としてセメント質粒子複合化ゼラチン膜を開発し、この膜がセメント質形成能ならびに根面への骨細胞付着抑制能を有することを明らかにした。そこで本研究では、人工歯根へのセメント質粒子ハイブリッドがインプラント周囲に歯根膜組織を形成させ得るかその可能性を追及した。実験には2頭の成猿を用いた。インプラント植立部を確保するため、サルの上下顎左右第1、第2小臼歯ならびに第1大臼歯を抜去した。3カ月後に、3種類の濃度のセメント質粒子ハイブリッドしたハイドロオキシアパタイト(HA)歯根(2-step typeアパセラム^<(R)>人工歯根:歯根部と支台部が別々となったインプラント体)3本と無処置のHA歯根1本を各部に埋入した。術後12週に、同サルを屠殺、インプラント体を含む組織の非脱灰研磨標本を作製した。そして同切片に、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、組織学的観察を行った。その結果、セメント質粒子をハイブリッドさせなかったHA歯根では、新生骨が歯根に直接接するアンキロ-シス部が多くみられた。一方、セメント質粒子ハイブリッドHA歯根では、アンキロ-シスはみられず、新生骨とインプラント間に一定の幅(約0.2mm)を有した血管を伴った線維性結合組織がみられた。この組織内の線維、細胞の配列方向は、歯根長軸に対して並行であったが、インプラント体表面の一部には、蛋白合成活性の活発な細胞とセメント質様物質の沈着がみられた。以上の所見から、セメント質粒子ハイブリッドインプラントは新生セメント質の形成を伴った歯根膜組織を形成する可能性の高いことが示唆された。種々な材質からなるインプラント体のなかで細胞親和性の最も高いハイドロオキシアパタイト人工歯根に、我々が開発したウシセメント質粒子ゼラチン膜を付着させた新しい人工歯根を作製した。本研究は、このインプラント人工歯根を無菌顎部に移植した後に、セメント質形成を伴った理想的な付着が形成できるかを検索した。実験にはサルを用い、その第1、第2小臼歯および第1大臼歯を抜去、4カ月間抜歯窩を治癒させた。インプラント体は歯冠-歯根が一体となったアパセラム^<(R)>人工歯根(one step type)を用い、その歯根部にウシセメント質粒子ゼラチン膜を付着させたインプラント体と、対照としてゼラチン膜のみを付着させたインプラント体を作製した。そしてサルの下顎左右無菌顎部にそれぞれ移植した。しかし、この人工歯根の移植後1週までの間に、インプラント体の移植部からの脱離がみられた。これは、術後の食物摂取によりインプラント体を脱離させる力が働いたり、また、サル自身がインプラント体を引き抜いた可能性が考えられた。このため、インプラント体の形状の再考を行い、移植後機械的外力が加わらない歯根部のみのインプラント体(2step-typeアパセラム^<(R)>人工歯根:歯根部と歯冠部構造が別々となったインプラント体)を選んだ。そして現在、このタイプのインプラント体にセメント質粒子複合化ゼラチン膜とゼラチン膜を付着させ、サル無菌顎部に移植、再実験を行っている。本研究は、人口歯根へのセメント質粒子ハイブリッドがインプラント周囲に歯根膜組織を形成させるかその可能性を追究した。

実験には成猿を用い、その上下顎左右第1,第2小臼歯ならびに第1大臼歯を抜去し、インプラント植立部を確保した。3カ月後に、各濃度のセメント質粒子ハイブリッドしたハイドロオキシアパタイト(HA)歯根(2-step typeアパセラム^<(R)>人工歯根:歯根部と支台部が別々となったインプラント体)3本と無処置のHA歯根1本を各部に埋入した。術後12週に、同サルを屠殺、インプラント体を含む組織の非脱灰研磨標本を作製した。そして同切片に、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、組織学的観察を行った。その結果、セメント質粒子をハイブリッドさせなかったHA歯根では、新生骨が歯根に直接接するアンキロ-シス部が多くみられた。一方、セメント質粒子ハイブリッドHA歯根では、アンキロ-シスはみられず、新生骨とインプラント間に一定の幅(約0.2mm)を有した血管を伴った線維性結合組織がみられた。この組織内の線維,細胞の配列方向は、歯根長軸に対して平行であったが、インプラント体表面の一部には、蛋白合成活性の活発な細胞とセメント質様物質の沈着がみられた。以上の所見は、セメント質粒子ハイブリッドインプラントは新生セメント質の形成を伴った歯根膜組織を形成する可能性の高いことを示唆した。
反転対称性の破れに起因する表面ナノ構造体の巨大スピン分裂バンド構造

半導体表面上に作製した低次元ナノ構造体での巨大スピン分裂など、特異なラシュバ効果の観測とその起源の解明を目的に実験と理論の両面より研究を遂行した。その結果、固体表面の対称性に起因した、表面垂直方向に100%偏極したラシュバスピンや、不可欠だと思われていた時間反転対称性がなくてもラシュバ効果が起こることなど、それまでの常識を覆すようなラシュバ効果を報告した。また、ラシュバスピンの向きが原子核近傍の電荷分布の非対称性により決定されることも示した。本年度の研究成果は以下の通りである。Si(lll)表面上に1原子層のタリウム(T1)吸着によって形成される(1x1)構造の電子構造を角度分解光電子分光で、スピンの情報をスピン・角度分解光電子分光で測定した。その結果、これまで固体物理学においてどのような二・三次元物質においても観測されたことのない不思議な電子バンド分裂を観測し、このバンド分裂のところでのみ電子スピンの偏極ベクトルが表面垂直方向を向ぐことがわかった。これまでは、理想的な二次元電子系においてラシュバ効果によって面内にのみスピンの偏極ベクトルが向くとされてきたが、元素の特性、具体的にはT1のスピン軌道相互作用、を加えた「拡張ラシュバ効果」を理論的に考察することにより、表面の対称性が電子スピンの屹立の要因であることがわかった。異方性を有することから種々のナノワイヤーを形成するテンプレートして用いられているSi(110)表面は、重元素吸着によって異方的なスピン分裂バンド構造が期待される系である。しかしながら、このような興味深い研究対象であるにもかかわらず、その清浄表面の物性さえも理解されているとは言い難い。そこで角度分解光電子分光を用いてSi(110)-(16x2)表面を調べた結果、バンドギャップ中に分散のほとんどない表面準位が4つあることをもとめ、走査トンネル顕微鏡より得た局所電子密度の結果と合わせて、この表面の新しい構造モデルを提案した。本研究は、非磁性固体表面やその上に形成した非磁性低次元ナノ構造体など、空間反転対称性の破れた系においてスピン軌道相互作用により生じるスピン偏極電子バンドに関する詳細な知見を得ることを目的としている。そのために、(1)Si表面上にTl、Pb、Biなどの重元素を1ML以下吸着させて形成される一・二次元量子ナノ構造体の原子構造を明らかにし、(2)新たに立ち上げた高角度分解能・高エネルギー分解能光電子分光装置とスピン・角度分解光電子分光装置を用いて実験的に得られるこれらナノ構造体のスピン偏極電子バンドの分散を半導体表面上に作製した低次元ナノ構造体での巨大スピン分裂など、特異なラシュバ効果の観測とその起源の解明を目的に実験と理論の両面より研究を遂行した。Si(111)表面上に1原子層のビスマス(Bi)を吸着させて形成されるβ(√<3>×√<3>)再構成表面の電子構造を高分解能角度分解光電子分光で、スピンの情報をスピン分解光電子分光で測定した。その結果、半導体表面でこれまで報告のない巨大なラシュバ効果を観測したのみでなく、ラシュバ効果の発現に不可欠であると考えられていた"時間反転対称性"のない表面ブリルアンゾーンの対称点において"特異な"ラシュバ効果が発現することと、"時間反転対称性"のある対称点においても通常は閉じているスピン構造が閉じていない"特異な"ラシュバ効果が発現することを観測した。これらの結果は、時間反転対称性はあるが空間反転対称性が破れることによって発現するとしてきたこれまでのラシュバ効果の概念を覆すものである。また、第一原理計算などより、これら特異なラシュバ効果が表面の二次元構造の対称性に由来することも明らかにした。面内の異方性がラシュバ効果に与える影響を明らかにするためには2回対称性を有する試料でのラシュバ効果の測定が不可欠である。そこで、2回対称性を有するSi(110)-(1×1)表面にタリウム(Tl)を吸着させ、Tl/Si(110)-(1×1)表面を作成することを試みた。基板温度を400K程度に保ちながらTlを蒸着することでTl/Si(110)-(1×1)表面が作成可能であることを低速電子線回折などで確認し、その回折パターンを解析することによって表面原子構造に関する知見を得た。特異なラシュバ効果の起源の解明に原子構造の決定は不可欠である。Si(111)表面にBiを吸着させると吸着量に依存して異なる2つの(√<3>×√<3>)再構成表面が形成されることが知られており、低速電子線回折(LEED)などで構造の周期性を観測したのみではどちらの相を得ているのかがわからない。そこで、Biの吸着量に依存したLEEDのI-V測定より、2つの相のLEEDパターンにおけるスポット強度の振る舞いの違いをもとめるとともに、両相の原子構造を決定した。

また、これまで報告のない、1/3MLの吸着量で形成されるα(√<3>×√<3>)相の電子構造を角度分解光電子分光により測定した。これまでの研究でC_3、C_<3v>、C_<1h>対称性を有する表面ブリルアンゾーンの対称点は特異なラシュバ効果が発現する可能性を有することがわかった。そこで、LEEDのI-V測定よりTi/Si(110)-(1×1)表面の原子構造を決定したところ、この表面がC_<1h>対称性を有することわかった。この結果は同表面のブリルアンゾーンのГ点で、これまで報告のない、例えば渦構造を示さない特異なラシュバ効果が発現する可能性があることを示す結果である。角度分解光電子分光によりTl/Si(001)-(2×1)とSn/Si(111)-(2√<3>×2√<3>)、-(1×1)表面の電子構造を測定し、その結果を理論計算と合わせることにより、表面準位の起源を解明した。スピン軌道相互作用と空間反転対称性の破れによって固体表面で生じるラシュバ効果はこれまで、そのスピン分裂の大きさは詳細に調べられてきたものの、ラシュバ効果の完全な理解に不可欠であるスピン偏極電子バンド中のスピンの向きに関する研究はなかった。自由電子的な表面準位と巨大ラシュバ効果を有するビスマス吸着銅(111)表面の電子状態を高分解能角度分解光電子分光とスピン分解光電子分光を用いて詳細に調べ、実験的に得られた同表面のラシュバスピンの向きなどを第一原理計算と合わせることによって、ラシュバスピンの向きが原子核近傍の電荷分布の非対称性によって決まるをもとめた。この結果は、ラシュバスピンの向きを示すラシュバパラメータの正負の符号が実空間における表面準位の局在性に関する情報を与えることを意味していることから、得られた結果がラシュバ効果だけでなく吸着子-基板間の相互作用など吸着系に関する他の知見をも与えることを示している。シリコン(110)表面にタリウムを1原子層吸着させるとC_<1h>対称性を有するTl/Si(110)-(1×1)表面が形成される。C1h対称性を有する表面が特異なラシュバ効果を発現する可能性があることからこの表面のスピン分解電子構造を高分解能角度分解光電子分光とスピン分解光電子分光を用いて測定した。その結果、これまで報告のない擬一次元的なスピン構造を有することがわかった。Tl/Si(111)-(1×1)表面にタリウムをわずかに追蒸着すると、金属的な電子バンドが表面ブリルアンゾーンのK点に現れることを角度分解光電子分光によりもとめた。また、正・逆スピン分解光電子分光を用いて、スピンが表面垂直方向に向いていること、K点とK'点でスピンが逆向きであることをもとめた。この結果は、この表面上で後方散乱の確率が非常に低いスピン流が発現する可能性があることを示している。本年度の研究成果は以下の通りである。1原子層よりわずかに多い量のタリウムを吸着させて作製したTl/Si(111)-(1×1)表面は金属的なバレー電子状態を有する。C3対称性を有する表面ブリルアンゾーンのK点に現れるこのバレーがスピン偏極しており、そのスピンは偏極度が100%で表面垂直方向を向いていることをスピン分解光電子分光より求めた。通常のラシュバ効果ではスピンは表面平行方向でその偏極度が100%になることはなく、本研究で得られた特異な偏極度とスピンの向きはC3対称性に起因するものであることを理論計算よりもとめた。また、スピン偏極バレーが電子スピンの後方散乱を抑制する可能性を秘めていることから、走査トンネル顕微鏡を用いた準粒子干渉パターンを観測した。
全身性エリテマトーデスにおける制御性B細胞の役割

全身性エリテマトーデスのマウスモデルにおいて、制御性B細胞の存在を明らかにし、その存在と役割に関する研究内容をThe Journal of Immunologyに報告した。本研究では、全身性エリテマトーデスにおける制御性B細胞の役割を検討する目的で、平成20年度にNew Zealand Black-New Zealand White F1におけるCD19欠損マウス(NZBWF1/CD19、欠損マウス)を作成した。NZBWF1野生型とCD19欠損マウスにおいて両者のB細胞シグナル伝達系の相違を検討したところ、C57BL/6J系と同様に、BWF1においてもCD19欠損に伴いB細胞受容体刺激に対する反応性が低下することが判明した。さらに、CD19欠損が個体レベルにおける疾患発現にどのように影響するかを評価する目的で、BWF1野生型、CD19欠損マウスにおいて経時的に採血を行い、抗核抗体、抗DNA抗体の出現時期を検討、また、経時的に腎臓を採取し腎炎の発症を評価している。生存期間に関しても、両者で比較している。その結果、現在まだnが小さいため正確な有意差は得らでれていないものの、大変興味深いことにBWF1/CD19欠損マウスにおいて抗核抗体、抗DNA抗体の発現が遅れる一方で、腎炎発症時期が早まり、生存期間も短い傾向が得られている。また、NZBWF1マウスにおいても、CD19欠損に伴い脾臓marginal zone B細胞が著明に減少することも判明した。したがって、B細胞の反応性が減弱し抗核抗体出現も遅れるNZBWF1/CD19欠損マウスが逆に腎炎を早期に発症し生存期間も短縮する原因として、MZBWF1/CD19欠損マウスにおいて制御性B細胞が欠如していることが考えられ、今後解析するマウスを増数し、より詳細な検討を続けていく。元来CD19は、B細胞の応答を促進性に制御する反応制御分子とみなされてきたが、平成20年度の研究において、マウスSLEモデル(BWF1)において、CD19を欠損させると抗核抗体の出現が遅延する一方で腎炎の発症が早まり、生存期間が短縮することが判明し、SLEにおいてCD19が促進性、制御性双方の作用を有することが示唆された。また近年、脾臓marginal zone B細胞と表現型が類似したCD1dhiCD5+B細胞の分画内にIL-10分泌を介して抑制性作用を呈する制御性B細胞(B10細胞)の存在が報告され(Yanaba, K., et al., 2008.Immunity 25 : 639)、CD19欠損マウスではB10細胞が欠損することが判明した。そこで、BWF1の系でも野生型とCD19欠損マウスにおいてB10細胞が疾患発現に関与している可能性を考え、この分画を経時的に検討したところ、野生型では疾患発現に伴いB10細胞分画が増数する一方、CD19欠損マウスではこの分画が欠如することが判明した。IL-10発現レベルも野生型ではSLEの疾患進行に伴い増加するのに対しCD19欠損マウスでは低値のままであった。さらに、BWF1野生型マウスのB10細胞を単離しBWF1・CD19欠損マウスに移入したところ、CD19欠損マウスの腎炎発症が遅延し、生存期間が有意に延長することが判明し、CD19がB10細胞の分化を通してこのマウスSLEモデルにおける疾患発現を抑制性に制御していることが示された。さらに、このB10細胞の移入により、BWF1・CD19欠損マウスにおいて(CD19がB細胞特異的分子であるにもかかわらず)減数していた制御性T細胞の分画が回復することも示され、B10細胞が制御性T細胞の分化にも関与している可能性が示唆された。
低線量放射線による中枢神経系細胞の遺伝子損傷修復についての研究

放射線による神経系細胞の遺伝子損傷修復を検討するため、妊娠17日目のラット胎児脳より培養6日目において全体の約40%がMAP2陽性の神経細胞、約40%がGFAP陽性のアストロサイトからなる混合培養系を確立した。また、対照として、同じラット胎児腹部から線維芽細胞を樹立した。まず、線維芽細胞をガラスボトムディッシュで培養後、0.52Gyの種々の線量でX線照射した。照射後、固定したサンプルにおいて、DNA二本鎖切断で誘発されるヒストンリン酸化(γ-H2AX)および細胞核DNAを免疫蛍光染色した。その結果、種々の大きさ・濃淡からなるドット状のγ-H2AXが細胞核上に出現し、その数は線量に依存して増加した。つづいて、混合培養系の神経系細胞にも同様にX線照射した後、免疫染色を行った。その結果、驚くべきことに、MAP2陽性の神経細胞およびGFAP陽性のアストロサイト共にγ-H2AXが全く染色されないことが判明した。この結果は、線維芽細胞は誘発されたDNA二本鎖切断に対し修復あるいは損傷応答できるが、神経系細胞はその能力が低いことを示唆している。同様な結果は、DNA二重鎖構造を大きく歪めるDNA損傷の修復に関わるヌクレオチド除去修復の場合にも観察された。つまり、神経細胞およびアストロサイトは、同じラット胎児由来の線維芽細胞に比べ、モデル損傷である紫外線DNA損傷の修復能が有意に低下しており、その原因として修復蛋白量の発現低下が示唆された。以上の結果より、神経細胞およびアストロサイトはDNA二本鎖切断に対する修復・応答およびヌクレオチド除去修復の能力が共に減少しているため、これらの関係するDNA損傷を誘発する外的・内的要因に対し脆弱であると考えられ、要因の作用量によっては中枢神経機能に悪影響する可能性も充分考えられる。妊娠17日目のラットより培養6日目において全体の約40%がMAP2陽性の神経細胞、約40%がGEAP陽性のアストロサイトからなる混合培養系を確立した。培養6日目にRI実験施設内において、電離放射線発生装置によりガラスボトムディッシュごと電離放射線1mGy2Gyの線量(低線量の照射に関しては1mm厚銅板ないしは1mm厚アルミ板をフィルターとして用いた)の照射を行った。照射後、固定したサンプルはTriton X-100を含むPBSにて処理した後、抗γ-H2AX抗体(TREVIGEN、ウサギポリクローナル抗体)及び、抗MAP2抗体、抗GRAP抗体などの細胞を染め分けるマウスモノクローナル抗体を1次抗体として用い、蛍光波長の異なるアレキサなどの2種の蛍光標識2次抗体を用いて二重染色を行った。抗MAP2抗体陽性の細胞(神経細胞)の核(DAPIで染色される)内の抗γ-H2AX抗体陽性の輝点数を細胞毎にカウントし、各照射量毎に平均値を求め、細胞毎の抗γ-H2AX抗体陽性の輝点数と照射線量のグラフを作成した。その結果、抗γ-H2AX抗体陽性の輝点数と照射線量に直線性がることを確認した。抗γ-H2AX抗体陽性の輝点数はDNA損傷量(double strand breakの量)と比例関係にあることから、神経細胞において線量依存性にdouble strand breakが生成されることが判明した。また、同様の検討を抗GFAP抗体陽性の細胞(アストロサイト)にて行い、アストロサイトにおいて線量依存性にdouble strand breakが生成されることが判明した。また、妊娠16日目のラット胎児脳よりオリゴデンドンドロサイトの培養を開始し、現在約90%がオリゴデンドンドロサイトである初代培養系を確立した。妊娠17日目のラット胎児脳より培養6日目において全体の約40%がMAP2陽性の神経細胞、約40%がGFAP陽性のアストロサイトからなる混合培養系を確立した。

また、対照として、同じラット胎児腹部から線維芽細胞を樹立した。まず、線維芽細胞をガラスボトムディッシュで培養後、0.52Gyの種々の線量でX線照射した。照射後、固定したサンプルにおいて、DNA二本鎖切断で誘発されるヒストンリン酸化(γ-H2AX)および細胞核DNAを免疫蛍光染色した。その結果、種々の大きさ・濃淡からなるドット状のγ-H2AXが細胞核上に出現し、その数は線量に依存して増加した。つづいて、混合培養系の神経系細胞にも同様にX線照射した後、免疫染色を行った。その結果、驚くべきことに、MAP2陽性の神経細胞およびGFAP陽性のアストロサイト共にγ-H2AXが全く染色されないことが判明した。この結果は、線維芽細胞は誘発されたDNA二本鎖切断に対し修復あるいは損傷応答できるが、神経系細胞はその能力が低いことを示唆している。同様な結果は、DNA二重鎖構造を大きく歪めるDNA損傷の修復に関わるヌクレオチド除去修復の場合にも観察された。つまり、神経細胞およびアストロサイトは、同じラット胎児由来の線維芽細胞に比べ、モデル損傷である紫外線DNA損傷の修復能が有意に低下していた。以上の結果より、神経細胞およびアストロサイトはDNA二本鎖切断に対する修復・応答およびヌクレオチド除去修復の能力が共に減少しているため、これらの関係するDNA損傷を誘発する外的・内的要因に対し脆弱であると考えられ、要因の作用量によっては中枢神経機能に悪影響する可能性も充分考えられる。
細胞内小胞による能動的物質移動のマイクロバイオメカニクス

動脈内表面に分布している内皮細胞の挙動に着目し、内皮細胞に微視的なレベルでの力学的環境を制御することによって、細胞による生理活性物質の分泌や物質の取り込みを行う.その際の細胞近傍の流れという力学的環境を明確にすることにより、物質を選択的に捉える受容体や結合部位の存在及び分布が明らかになる可能性があり、バイオメカニクスの流域では大きなインパクトを与える成果となる。そこで、本研究では、生理活性物質の分泌や物質の取込を行っている細胞の状態をレーザー共焦点顕微鏡によって捉え、その画像から細胞モデルを構築し、細胞モデル近傍の流れを顕微鏡下での流れの計測を行って、細胞への流れによる力学的刺激と機能変化との対応を付け、メカノバイオロジカル相互作用について検討を行った。実験はブタの内皮細胞を用い、内皮細胞へのアルブミンの取り込み、ミトコンドリアの活性、さらに微小管のアルブミン取り込みに対する寄与について、細胞に負荷されたせん断応力刺激との関連性に焦点を絞った。アルブミンや微小管の状態は蛍光物質の蛍光強度の画像から定量化した。その結果、アルブミンの取り込みは低せん断では促進され、高ぜん断では抑制されるという二相性を示し、ミトコンドリアの活性もそれに同調して変化した。微小管はアルブミン小胞の経路と考えられるが、微小管上をアルブミンが取り込まれる様子が二重蛍光像から得られた。