hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エイコサペンタエン酸誘導体の構造と栄養学的意義との関連性の検討

機能性食品として注目されるエイコサペンタエン酸(EPA)及びその代謝産物の定量的評価法の確立と、生理的意義の解明を目的として、以下の検討を行った。3型のプロスタサイクリンの体内動態を解析する指標として、プロスタグランジンI_3(PGI_3)の安定代謝体Δ^<17>-6-keto-PGF_<1α>の大量分取を行った。同化合物の^<18>O標識化を行い、得られた^<18>O標識体を内部標準物質として用いる、Δ_<17>-6-keto-PGF_<1α>のGC/SIMによる超微量定量法を開発した。さらに、本方法を用いて血管内皮細胞のPGI_3産生能と糖尿病患者血清の添加効果の検討を行い、糖尿病時のEPA摂取効果の評価を行った。血管内皮細胞のEPA変換能と、EPAの変換に及ぼす健常人並びに糖尿病患者血清の添加効果並びにEPA添加効果を検討した結果、(1)確立したΔ^<17>-6-keto-PGF_<1α>の超微量測定法は、3型プロスタサイクリン産生量の解析に有用であること、(2)EPA添加培地を用いた培養により、血管内皮細胞が3型プロスタサイクリンを産生すること、(3)ヒト血清の添加により、2型のみならず3型プロスタサイクリンの産生能が上昇すること、(4)糖尿病患者血清は2型及び3型プロスタサイクリン産生能を有意に抑制すること、(5)糖尿病患者血清の添加時においても、EPAを添加することにより、プロスタサイクリンの産生量を健常人血清添加時のレベルに維持できること、等を明らかにした。プロスタサイクリンは、抗血小板凝集作用を有することが知られている。糖尿病患者血清が血管内皮細胞のプロスタサイクリン産生能を抑制するという事実は、糖尿病患者における血栓形成促進の一因をなすものと考えられた。また、そのプロスタサイクリンの産生抑制をEPAの添加(摂取)により産生される3型プロスタサイクリンで補うことが可能であることが示された。
Importin alphaによるSnailの細胞内局在制御機構の解析

本研究は転写因手であるSnailの細胞内局在が核輸送因子でめるimportin αによってどのように制御されているのかを分子レベルで解明し、その生理学的意義について検討することを目的としている。ここまでの研究により、Snailはそのzinc finger domainが核移行シグナルとして機能し、importin β1がそれを認識して核へ輸送する。一方で、核移行シグナル受容体であるimportin αもまた,Snailのzinc finger domainを直接認識して結合することが明らかになったが、importin α(特にα5)はimportin β1とは異なり、結合したSnailを核へ輸送する活性を示さなかった。このような阻害効果はin vitroだけでなく生細胞中でも観察されたことから、実際の細胞内で何らかの意味を持っていることが示唆された。Snailは細胞質から核へ移行することにより細胞接着に重要な役割を担うEカドヘリンの転写を抑制する転写制御因子である。いくつかのがん細胞ではimportin α発現量とEカドヘリン発現量との間には相関関係が見られたことから、がんなどにおいてimportin αの発現が少ない細胞はSnailの核移行が促進されてEカドヘリンの発現が減少するものと考えられる。以上のことから、importin αによるSnailの核移行阻害はがん細胞の転移性と関係しているものと思われる。本研究は転写因子であるSnailの細胞内局在が核輸送因子であるimportin αによってどのように制御されているのかを分子レベルで解明することを目的としている。ここまでの研究により、importin αの存在下においてSnailの核移行が顕著に阻害されるということを見いだした。Snailはそのzincfinger domainが核移行シグナルとして機能し、importin β1がそれを認識して核へ輸送する。一方で、核移行シグナル受容体であるimportin αもまた、Snailのzinc finger domainを直接認識して結合することが明らかになったが、importin αはimportin β1とは異なり、結合したSnailを核へ輸送する活性を示さなかった。一般的にimportin αとimportin βは基質蛋白質とともに3者の複合体を形成して核へ輸送していくことが知られている。しかしながらSnailの場合、importin αがSnailに直接結合できるにも関わらず核へ輸送されない(むしろimportin β1による核輸送を阻害する)のは、Snail/importin α/β1という輸送複合体が、形成されていない可能性が考えられた。実際、Snailはimportinとこのような3者の複合体を形成しないことが明らかとなったことから、importin αによるSnailの核移行阻害はimportin β1とimportin αがSnailの同じ部位に結合することに起因する競合的阻害であると考えられた。Importin αのSnail結合領域はArmと呼ばれるリピート構造であり、他の核移行シグナルを持つ蛋白質と大きく異なることはなかった。このようなことから、何故一般的な3者複合体を形成せず、競合的な結合を示すのかを明らかにするため、Snail、importin α、importin β1の結合に関係する部位の詳細な解析を行っている。
新規バイオポリマー吸着剤による膜閉塞抑制手法の開発

低圧MF/UF膜ろ過法は、従来の砂ろ過法と比較して精密な固液分離が望めることから次世代の浄水技術として注目されている。一方、膜ファウリングの発生が膜ろ過法の普及を阻む問題となっており、膜ファウリング原因物質を効率的に取り除く前処理技術の開発は喫緊の課題である。我々は、バイオポリマー吸着性能を有する新規樹脂を見いだし、膜ろ過の前処理としての有効性について確認した。また、新規樹脂及び市販の陰イオン交換樹脂についてバイオポリマー吸着能を比較検討した結果、開発樹脂は市販樹脂の4倍のバイオポリマー除去能を有し、不可逆的膜ファウリングの進行を75%抑制できることが明かになった。膜閉塞の抑制は、膜閉塞成分の素性を明らかにした上で、その成分にターゲットを絞った適切な前処理を実施することで達成できる。我々はこれまでに自然水中の親水性高分子成分(以後バイオポリマーと表記)が膜閉塞物質の主成分であることを明らかにしており、このバイオポリマーが効率的に除去できれば、汚染された原水(下水)でも水質を改善でき、膜処理技術の適用範囲の大幅な拡大が望める。本申請課題では、自然水に含まれる有機物からバイオポリマーを選択的に吸着する樹脂を開発し、膜閉塞の主成分であるバイオポリマーを膜の前段で吸着除去する新規膜前処理プロセスを提案する。具体的には、(1)バイオポリマーと親和性の高い官能基の探索、(2)官能基へバイオポリマー選択性の付与、(3)吸着剤の作成、(4)運転ソフトの開発、及び(5)プロセスの検証を目的として研究を実施した。平成24年度にはアルギン酸をバイオポリマー代替有機物として官能基の探索試験を行い、アルギン酸中に含まれるカルボキシル基と窒素を含む官能基間に静電気的な強い相互作用が存在することを見いだした。一方で、本研究により見いだした官能基はフミン酸とも強い相互作用を有すること回分吸着実験によって明かになった。この官能基にバイオポリマーへの選択性的吸着性能を保持させるために、バイオポリマーと親和性が高く、フミン酸との親和性が低い高分子材料によってアミン基を抱埋したものを作成し、吸着性能を評価した結果、有機物濃度3mg/L以下の領域において、バイオポリマーの選択的吸着性能を示した。茨城県W川より採取した湖沼水を用いて新規吸着剤による回分吸着実験・膜ろ過実験を行った結果、前処理により50%程度のバイオポリマーが減少し、不可逆的膜閉塞が40%程度抑制出来ることを確認した。既往の研究において、バイオポリマー(105Da以上の高分子量有機物)の濃度と不可逆的な膜ファウリングの進行度の間に高い相関が報告されている。我々はこれまでに、バイオポリマー吸着性能を有する新規樹脂を見いだし、膜ろ過の前処理としての有効性について報告している。しかしながら、新規樹脂が既存の吸着剤と比べてどの程度効果的であるかは未だ評価がなされていない。本研究では、新規樹脂及び市販の陰イオン交換樹脂についてバイオポリマー吸着能を比較検討するとともに、ラボスケールの膜ろ過装置を用いて不可逆的膜ファウリング抑制効果を評価した。多量のバイオポリマーを含む印旛沼表流水について吸着処理を行った結果、開発樹脂では46%のバイオポリマーが吸着除去された一方、市販のイオン交換材では10%の除去に留まった。このことから、開発樹脂は、通常のイオン交換樹脂にはない、バイオポリマー吸着性能を有していることが明かになった。さらに、バイオポリマー除去性能の異なる2種の樹脂(開発樹脂及びIRA400)を用いて回分吸着処理を行った水について、膜ろ過試験を行った結果、IRA400及び開発樹脂共に、不可逆的膜ファウリングの進行を抑制出来た。抑制効果は開発樹脂の方がIRA400よりも1.5倍高いことから、不可逆的膜ファウリングの抑制は、フミン酸の除去よりも、バイオポリマーの除去に起因するものと推測する。46%のバイオポリマー除去により、運転時間を約4倍延長できることが明らかになった。平成24能を持つ樹脂を開発することに成功した。当初の予定では、官能基単独でバイオポリマーとの高親和性、高選択性を持たせるつもりだったが、官能基単独では選択性に乏しいことが問題となり、ポリマーアロイ技術を応用した官能基のポリマーキャップにより選択性を付与する方法に至った。本研究で用いた手法は他に報告例がなく、官能基を変えることで様々な吸着剤に選択性を持たせることが出来ることから、これまでの吸着プロセスに革新をもたらす可能性がある。

以上の結果から、「想定を超えた成果が得られた」との自己評価に至った。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度には、バイオポリマー選択吸着剤を大量に作成し、埼玉県内の浄水場に設置したパイロット膜ろ過装置を用いて、長期安定性試験、繰り返し樹脂回復試験を実施する。年間を通して運転することで、水質の変化や樹脂の劣化など、実際の膜ろ過運転で使用する際の問題点を抽出すると共に、さらなる樹脂能力向上(低コスト化)に向けて、吸着性能や選択性を改良する。また、活性炭に変わるジオスミン、2-MIB吸着剤の開発を目的として、ポリマーキャップ型新規イオン吸着剤の開発に向けた基礎的検討を開始する。
ポリアミン一般合成法の開拓と展開

1.C-N結合生成の位置選択性・収率向上の条件の探求:本課題の達成の可否を決する最重要テーマとして鋭意検討の結果, -NHTs体を求核剤とする縮合反応は,相手がハロゲン体と,トシル酸エステル体とにかかわらず, DMF中炭酸セシウムの存在で,室温でゆっくり反応させると, -NHTs体の長さや分子量に拘わらず,ほぼ定量的にC-N結合を生成することが判明した.この手法を用い,メチレン鎖列が天然ポリアミンのみからなる,系統的に設計された構造をもつ分子を,安価なジアミン類を出発原料として両端で伸長する方法により,短段階で次々と鎖長を伸ばすことが可能となり,最大12個の窒素原子を一本鎖中に含む分子の合成に成功した.位置選択性のテーマは,本課題の遂行中に見出された新反応,すなわちジフタロイプロパンジアミンの新規な複素縮合環への高収率変換法の発見により望外の成果を生んだ.既に見出しているフタルイミド類のホルムアミド類への高収率変換法の反応機構の究明に関連して見出されたこの新反応生成物を酸処理すると,高収率でモノフタロイルプロパンジアミンを生成した.これを我々独自の手法で,一端が-NHCHO基他端が-NHTs基のものへと誘導でき,これに対する求電子剤の攻撃を検討したところ, -NHTs基のみが攻撃をうけることが判明した.この知見をもとに,天然トリアミン,テトラミンの1級, 2級アミノ基が完全に識別された有用な中間体の高収率合成法を確立することができた.今後,本中間体を活用したポリアミン複合体合成へと展開する.2.天然型配列をもつ種々の大環状ポリアミンの合成:1.のテーマの解決により大環状化の条件の検討を行った.設計された48個の窒素原子を含む1735員環状化合物が驚くべき高収率で生成する条件が判明した.本手法の拡張により12個の窒素原子を含む52員環からなる単環状スペルミン四量体の高収率合成に成功した.1.C-N結合生成の位置選択性・収率向上の条件の探求:本課題の達成の可否を決する最重要テーマとして鋭意検討の結果, -NHTs体を求核剤とする縮合反応は,相手がハロゲン体と,トシル酸エステル体とにかかわらず, DMF中炭酸セシウムの存在で,室温でゆっくり反応させると, -NHTs体の長さや分子量に拘わらず,ほぼ定量的にC-N結合を生成することが判明した.この手法を用い,メチレン鎖列が天然ポリアミンのみからなる,系統的に設計された構造をもつ分子を,安価なジアミン類を出発原料として両端で伸長する方法により,短段階で次々と鎖長を伸ばすことが可能となり,最大12個の窒素原子を一本鎖中に含む分子の合成に成功した.位置選択性のテーマは,本課題の遂行中に見出された新反応,すなわちジフタロイプロパンジアミンの新規な複素縮合環への高収率変換法の発見により望外の成果を生んだ.既に見出しているフタルイミド類のホルムアミド類への高収率変換法の反応機構の究明に関連して見出されたこの新反応生成物を酸処理すると,高収率でモノフタロイルプロパンジアミンを生成した.これを我々独自の手法で,一端が-NHCHO基他端が-NHTs基のものへと誘導でき,これに対する求電子剤の攻撃を検討したところ, -NHTs基のみが攻撃をうけることが判明した.この知見をもとに,天然トリアミン,テトラミンの1級, 2級アミノ基が完全に識別された有用な中間体の高収率合成法を確立することができた.今後,本中間体を活用したポリアミン複合体合成へと展開する.2.天然型配列をもつ種々の大環状ポリアミンの合成:1.のテーマの解決により大環状化の条件の検討を行った.設計された48個の窒素原子を含む1735員環状化合物が驚くべき高収率で生成する条件が判明した.本手法の拡張により12個の窒素原子を含む52員環からなる単環状スペルミン四量体の高収率合成に成功した.
食道癌に対する５ーアミノレブリン酸を用いた光線力学療法確立のための基礎的検討

培養食道癌細胞(TE-4, TE-8)を用いた5-アミノレブリン酸(5-aminolevulinic acid,以下ALA)投与後のLED光照射を行ったところ、TE-8についてはLED照射後24時間よりALA濃度依存性に増殖抑制および細胞周期抑制(G1 arrest)を認めた一方、TE-4では見られなかった。ALA+LEDにて細胞周期関連蛋白発現の明らかな変化を認めなかった。担癌マウスを用いた動物実験は検討不十分となったが、文献検索上、既存の光増感剤は欧米を含め早期食道癌の根治的治療及び進行食道癌の救済療法として有効との報告があり、ALAの食道癌に対するPDTも同等以上の有効性が期待される。培養癌細胞及びマウス可移植腫瘍へのALAの特異的集積を確認し、光増感作用にて抗腫瘍効果を発揮するかを検討する。そして、既存の光増感剤との比較による癌特異的集積・細胞死の強度を解析し、ALAの有効性についての基礎的データを蓄積・整理し、臨床試験に向けての準備を進めることを目標としている。平成2425年の計画は以下の3つの主軸である。1)正常食道上皮細胞と培養食道癌細胞へのALA集積および細胞死誘導の比較検討2)マウス皮下移植腫瘍及び同所性移植腫瘍へのALA集積の検出及び抗腫瘍効果の検討3)光線力学療法に用いる既存薬剤(フォトフィリン、レザフィリン)との優位性あるいは非劣性の比較検討アミノレブリン酸(以下ALA)は連携研究者の中島元夫博士より供与を受け、食道癌細胞および食道正常上皮細胞に対し、通常培養条件下でALAを培養液中に添加し、ALAそのものによる培養細胞の増殖への影響の有無について実験を行い、結果、ALAのみの細胞毒性は認めなかった。光照射のための設備準備を並行して行い、光照射によりALAがポルフィリンに変換されることによる細胞増殖への影響について検討する準備が整った。また、動物実験に向け、マウス可移植性食道癌細胞(TE-8, T.Tn)を用いた皮下腫瘍モデル及び同所性移植モデルの安定作成を行った。平成24年の計画は以下の3つの主軸である。1)培養食道癌細胞へのALA集積の検出及び細胞増殖抑制効果の検討2)正常食道上皮細胞と培養食道癌細胞へのALA集積および細胞死誘導の比較検討3)マウス皮下移植腫瘍へのALA集積の検出及び抗腫瘍効果の検討アミノレブリン酸(以下ALA)は連携研究者の中島元夫博士より供与を受け、食道癌細胞および食道正常上皮細胞に対し、通常培養条件下でALAを培養液中に添加し、ALAそのものによる培養細胞の増殖への影響の有無について実験を行い、その解析評価を行った。光照射のための設備準備を並行して行い、光照射によりALAがポルフィリンに変換されることによる細胞増殖への影響について検討する準備を進めている。細胞内分子生物学的解析・細胞死関連分子の検討のための実験手技の準備・構築を行った。また、次年度以降に予定する動物実験に向け、マウス可移植性食道癌細胞(TE-8, T.Tn)を用いた皮下腫瘍モデルの安定作成を行った。また、自然発生食道がんモデルを構築すべく、化学発癌モデル作成の準備を行った。1)培養食道癌細胞へのALA集積の検出及び細胞増殖抑制効果の検討2)正常食道上皮細胞と培養食道癌細胞へのALA集積および細胞死誘導の比較検討3)マウス皮下移植腫瘍へのALA集積の検出及び抗腫瘍効果の検討4)光線力学療法に用いる既存薬剤(フォトフィリン、レザフィリン)との優位性あるいは非劣性の比較検討5)マウス同所性移植腫瘍へのALA集積の検出及び抗腫瘍効果の検討6)蓄積したデータをもとにALAを用いた食道癌に対する光線力学療法についての臨床研究プロトコールの作製1)について、培養食道癌細胞(TE-4, TE-8)を用い、ALA投与後のLED光照射による細胞増殖抑制効果について検討したところ、TE-8についてはLED照射後24時間よりALA濃度依存性に増殖抑制効果が見られた一方、TE-4では明らかな増殖抑制が見られなかった。TE-8について、LED照射のみ、もしくはALA投与のみでは細胞増殖への影響はみられなかった。2)について、フローサイトメトリーを施行したところ、明確な細胞周期の変化

・細胞死の変化を認めなかった。ウエスタンブロットでの細胞周期に関わる蛋白発現変化を検討したところ、p53, p21に関してはALA+LEDにて明らかな蛋白量の変化を認めなかった。3)・5)及び6)に関し、担癌マウスを用いた実験が基礎的データをまとめるには至らず、検討不十分であった。4)について、フォトフィリンは既に欧米を含め食道がん治療の臨床応用の報告があり、早期食道癌症例の80%以上で有効な抗腫瘍効果が得られている。また、進行食道癌の化学放射線療法後の遺残に対する救済療法のとして、60%程度の抗腫瘍効果を認めることも文献上報告がある。ALAの食道癌に対するPDTも、それらに匹敵する有効性が期待されるが、今回動物実験での結果が得られなかったため、比較検討には至らなかった。医歯薬学レーザー励起光照射のための設備導入したが、至適照射量などの調節に時間を要している。また、動物実験用の担癌マウスモデルの安定作成に時間を要しているため、データ蓄積のための実験に取り掛かる前段階である。レーザー励起光照射のための設備導入が遅れている。ALAの実験の必要物品であるレーザー装置の導入が遅れており、実際に励起によりポルフィリン変換された際のALAの抗腫瘍効果の検討が十分になされていない。ただし、LED(発光ダイオード)ライトにて代用できるため、LEDライトを購入し、実験を開始することは可能である。培養食道癌細胞及び正常食道上皮細胞を用いて、ALA及び既存の光増感剤をそれぞれ培養液中に添加し、レーザー照射後の細胞死誘導を細胞増殖曲線の描出・IC50算出・細胞死検出実験・細胞死関連分子の発現解析を行い、マウス可移植性食道癌細胞(TE-8,T.Tn)をヌードマウスの頸部食道へ移植した同所性移植モデルを用いたALAの抗腫瘍効果を検討する。腫瘍は摘出して固定ないしは凍結し、細胞死関連分子の発現について検討する。培養食道癌細胞及び正常食道上皮細胞を用いて、ALA及び既存の光増感剤をそれぞれ培養液中に添加し、レーザー照射後の細胞死誘導を細胞増殖曲線の描出・IC50算出・細胞死検出実験・細胞死関連分子の発現解析を行い、マウス可移植性食道癌細胞(TE-8, T.Tn)をヌードマウスの頸部食道へ移植した同所性移植モデルを用いたALAの抗腫瘍効果を検討する。レーザー励起光照射の設備導入後、至適照射量などの調節に時間を要しているとともに実験用マウスの安定作成が未達成であり、結果動物購入が遅れているため。次年度使用額は26年度請求額とあわせ、現在取り組んでいるマウス可移植性食道癌細胞をヌードマウスの頸部食道へ移植した同所性移植モデルを用いたALAの抗腫瘍効果の検討のためのマウス購入に使用する。平成24年度はALAの実験の必要物品であるレーザー装置の導入が遅れているため残額が発生した。平成25年度の使用計画は以下のとおりである。・実験動物・細胞内情報伝達解析用試薬(抗体など)53万円・ファイバー照明セット一式(ウシオ電機株式会社製)152万円
遺伝性痙性対麻痺の新規原因遺伝子同定

常染色体劣性遺伝性HSPでは、3家系4名の患者(孤発性HSP 1家系を含む)にVPS13D遺伝子変異が共通すること、その臨床像は成人発症の純粋型HSPと小児期発症の複合型HSPを呈することを見出した(論文投稿中)。また、常染色体優性遺伝性HSPでは、4家系6名の患者(孤発性HSP 1家系を含む)にUBAP1遺伝子の機能喪失型変異が共通すること、分子病態機序がエンドソームの機能障害であること、その臨床像はすべての家系で小児期発症の純粋型HSPを呈することを見出した(論文投稿中)。最初の1年間に予定していた研究内容がほぼ終了できているため。JASPACおよび国内共同研究施設に登録されている優性遺伝性HSP 8家系のindex patientに、exome解析にて新規原因遺伝子候補Xの変異が共通することを見出している(国内施設との共同研究)。今後は、direct sequencingにより本遺伝子の家系内共分離を確認する。その後、培養細胞を用いて原因タンパクの発現と機能解析を行う。ドイツの研究グループから、彼らが見出した劣性遺伝性HSPの新規原因遺伝子候補Yについて、共同研究を依頼されている。現在、JASPACに登録されている劣性遺伝性HSPのexome解析データを確認しているところである。新規原因遺伝子候補Yの変異がある本邦HSP家系が見出されれば、臨床・遺伝学的に解析を進める。Exome解析により既知の原因遺伝子変異がないことが判明している、そのほかの優性遺伝性HSP家系、劣性遺伝性HSP家系に関して、連鎖解析、aCGH解析、exome解析、Sanger法による解析を組み合わせて新規原因遺伝子の同定に向けての研究を継続する。予定していたアメリカでの米国人類遺伝学会への参加を見送ったため、外国旅費の支出がありませんでした。また、実験等に使用する物品の購入も予定していたより少なかったように思います。当初の計画にはなかった、UBAP1遺伝子についてknock-in mouseの作成費用に充てたいと思います。また、エクソーム解析等も積極的に行う予定です。
血糖上昇抑制成分1-デオキシノジリマイシンのラベル化体調製と吸収・動態解明

アザ糖である1-デオキシノジリマイシン(DNJ)は桑葉や大豆発酵食品などに含まれ消化管でαグルコシダーゼ阻害を示すことにより、食後の血糖値の上昇を抑制する。DNJは機能性表示食品の関与成分として認められているが、更なる科学的な安全性の検証が必要である。本課題において、DNJに含まれる窒素原子を安定同位体の15Nにラベル化した15Nラベル化DNJを作成しそれを動物に経口摂取させることで、DNJの吸収、排出と組織への移行を明らかにした。7週齢のSDラットを12時間絶食後、水(対照区)を経口投与したのち、経時的にフンと尿を採取した。なお、試験期間中は水およびエサは自由摂取とした。対照試験後、3日間ウォッシュアウトし、次にDNJ水を経口投与し、対照区と同様にフンと尿を採取した(DNJ投与区)。その後、血液、各種臓器、と体を採取した。得られたフンと尿、各種臓器は全窒素定量の後、15/14Nの比を測定し、15Nラベル化DNJの回収率を求めた。その結果、フン、尿、臓器中の15Nの回収率は102%であった。尿においては0ー5時間で15Nのほとんどが排出され24時間後には投与量の18%程度でプラトーに達した。フンでは尿におくれ0ー5時間ではほとんど排出されず、5ー10時間、10ー24時間にかけ漸次15Nが排出されたのち投与量の52%程度でプラトーに達した。各種臓器においては広く15Nが検出され臓器中に15Nが移行していることが明らかとなった。DNJは一部は吸収された後、すみやかに尿に排出されるものの、一部が組織に移行することが判明したことから更なる詳細な解明が求められる。アザ糖である1-デオキシノジリマイシン(DNJ)は桑葉や大豆発酵食品などに含まれαグルコシダーゼ阻害効果により、食後血糖値の上昇を抑制する。DNJを機能性食材として展開するためには科学的な安全性の検証が必要である。本年度は、安定同位体15Nでラベル化したDNJを動物へ経口投与し、DNJの吸収、排出、組織への蓄積を評価する技術を確立することを目的とした。6週齢SDラット(オス)を1DNJ投与群:15Nラベル化DNJを胃ゾンデ投与(投与量:10mg/匹)2対照群:生理食塩水を投与の2群(n=4)に分けた。代謝ケージにて飼育し、0-24時間および24-48時間の尿と糞を採取した。飼育終了後、肝臓、副腎、脾臓、膵臓、腸間膜脂肪、腎周囲脂肪、精巣周囲脂肪、脳、心臓、肺、生殖巣、胃、小腸、大腸を採取した。得られた尿、糞、各臓器の15Nを測定し、DNJの吸収、排出、蓄積を評価した。その結果、対照群における試料中15Nはすべて天然同位体比である0.368%であった。DNJ投与群(投与量10 mg)において、尿と糞を合わせたDNJ量は8.2-9.4 mgであった。未吸収量(糞中DNJ)は個体差が大きく1.1-3.8 mgであった。組織中DNJは肝臓に0.13-0.16 mg存在し、ついで小腸(0.06-0.09 mg)、腎臓(0.02-0.03 mg)で他の臓器もトレースであるものの15Nが存在したことから、DNJの組織への移行が示唆された。以上のように安定同位体15Nラベル化DNJにより精度と感度の良い評価法を確立した。安定同位体ラベルした15Nラベル化DNJで精度と感度の高い生体からの測定法が確立できた。本課題を達成する上での技術的な問題をクリアできたことから、次年度以降予定している種々の動物試験が順調に遂行できると期待される。アザ糖である1-デオキシノジリマイシン(DNJ)は桑葉や大豆発酵食品などに含まれ消化管でαグルコシダーゼ阻害を示すことにより、食後の血糖値上昇を抑制する。本年度は、昨年の予備的な試験により、安定同位体ラベル化DNJのマスバランス、組織蓄積の評価の有効性が確認できたところから、予備試験の結果を受け本試験を実施し、DNJの吸収・排出、組織蓄積の評価を行った。7週齢のSDラット(雄性、n=13)を12時間絶食後、水をゾンデ投与したのち、0ー5時間、5ー10時間、10ー24時間、24ー48時間、48ー72時間、72ー96時間のフン、尿を採取した(対照区)。対照試験後、3日間のウォッシュアウト時間を設け、次にDNJを40mg/kgBWになるようにゾンデ投与し、対照区と同様にフン、尿を採取した(DNJ投与区)。その後屠殺し、肝臓、腎臓、胃、小腸、大腸、膵臓、脾臓、肺、心臓、脳、精巣、精巣周囲脂肪、腎臓周囲脂肪、腸間脂肪、血球、血漿、と体を採取した。得られたフン、尿、各種臓器は全窒素定量の後、15/14Nの比を測定し、15Nの回収率を求めた。

その結果、尿においては0ー5時間で15Nのほとんどが排出され24時間後には投与量の18%程度でプラトーに達した。フンでは尿におくれ0ー5時間ではほとんど排出されず、5ー10時間、10ー24時間にかけ漸次15Nが排出されたのち投与量の52%程度でプラトーに達した。各種臓器においては広く15Nが検出され臓器中に15Nが移行していることが明らかとなった。臓器中の15/14Nについては大きな差は見られず、特異的な臓器に局在する傾向はなかった。フン、尿、臓器中のトータルの15Nの回収率は102%であった。昨年度の予備試験の結果を受け、今年度は試験設計を見直しラットn数を13匹に増やし、本試験を行った。本試験で得られた結果は、予想に反し15Nがラットの体に分布していることが判明したが、期待通りの結果であった。このため、研究の推進に大きな変更はなくおおむね順調に進展していると判断した。アザ糖である1-デオキシノジリマイシン(DNJ)は桑葉や大豆発酵食品などに含まれ消化管でαグルコシダーゼ阻害を示すことにより、食後の血糖値の上昇を抑制する。DNJは機能性表示食品の関与成分として認められているが、更なる科学的な安全性の検証が必要である。本課題において、DNJに含まれる窒素原子を安定同位体の15Nにラベル化した15Nラベル化DNJを作成しそれを動物に経口摂取させることで、DNJの吸収、排出と組織への移行を明らかにした。7週齢のSDラットを12時間絶食後、水(対照区)を経口投与したのち、経時的にフンと尿を採取した。なお、試験期間中は水およびエサは自由摂取とした。対照試験後、3日間ウォッシュアウトし、次にDNJ水を経口投与し、対照区と同様にフンと尿を採取した(DNJ投与区)。その後、血液、各種臓器、と体を採取した。得られたフンと尿、各種臓器は全窒素定量の後、15/14Nの比を測定し、15Nラベル化DNJの回収率を求めた。その結果、フン、尿、臓器中の15Nの回収率は102%であった。尿においては0ー5時間で15Nのほとんどが排出され24時間後には投与量の18%程度でプラトーに達した。DNJは一部は吸収された後、すみやかに尿に排出されるものの、一部が組織に移行することが判明したことから更なる詳細な解明が求められる。次年度以降は、動物の匹数を増やして、DNJの吸収、排出の本試験を行う。組織蓄積確認の試験はラベル化DNJをさらに培養、精製し、3か月の長期摂取による組織への蓄積を検討する。H30年度は長期摂取(3ヶ月)における臓器へのDNJの臓器蓄積を経時的に評価する。H29年度のマスバランス試験では、体全体に15Nが低濃度であるが広く分布していたことから、DNU以外の夾雑物の影響の懸念を排除するため、現状のDNJにさらに分取HPLCにより高度精製をしたものを使用する。次年度使用額は、研究費を効率的に使用して発生した額である。予算を適正に使用した結果、見積もり額よりも納入価格が安くなったため。安定同位体窒素分析にかかる試薬、消耗品の購入に使用する。次年度は、ラベル化DNJの長期投与試験に必要なラベル化DNJをDNJ産生微生物の発酵により、大量調製する。このため、安定同位体ラベル化硫安の購入に使用する。
大腸菌ｔＲＮＡにおけるｗｏｂｂｌｅ位ウリジンのヒドロキシル化修飾生合成機構の解明

転移RNA(tRNA)は遺伝子発現において重要な、翻訳のアダプター分子である。tRNAはtRNA修飾酵素によって、様々な化学修飾が施され、機能が微調整されている。大腸菌tRNAの34位(wobble位)にみられる修飾塩基5-カルボキシメトキシウリジン(cmo5U)及びそのメチルエステル誘導体(mcmo5U)はコドン拡張の機能を持ち、翻訳に影響を与えることがわかっているが、生合成機構には未解明な点が多い。本研究の目的は、cmo5U/mcmo5Uの生合成機構の初段階であるウリジンの5位のヒドロキシル化機構を明らかにすることである。2年目までにtRNAのヒドロキシル化に関わる2つの遺伝子を明らかにし、それぞれが修飾に必要とする低分子を1つずつ同定していた。一方、cmo5Uからmcmo5Uを合成するメチル化酵素の遺伝子を同定し、試験管内修飾再構成に成功していた。また、修飾遺伝子欠損株の形質を見出していた。最終年度は、前年度までに同定したヒドロキシル化遺伝子と低分子をもちいてヒドロキシル化修飾の生化学的同定を行うと共に、修飾遺伝子欠損株を解析してその生理的意義を明らかにすることを目指した。また、cmo5Uメチル化遺伝子について論文として発表する計画であった。その結果、1ウリジンのヒドロキシル化について、2つの遺伝子の一方で試験管内修飾再構成に成功し、その遺伝子が修飾酵素であることを証明した。3修飾の形質について解析し、ヒドロキシル化及びcmo5U修飾がそれぞれある塩基との対合に寄与していることを明らかにした。今後、1と3についてさらに研究を進めた上で論文に発表する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。転移RNA (tRNA)は遺伝子発現において重要な、翻訳のアダプター分子である。tRNAはtRNA修飾酵素によって、様々な化学修飾を施され、機能を微調整されている。大腸菌tRNAの34位(wobble位)に見られる修飾塩基5-メトキシカルボキシルウリジン(cmo^5U)及びそのメチルエステル(mcmo^5U)はコドン拡張の機能を持ち、翻訳に影響を与える修飾塩基である。cmo^5U/mcmo^5Uは複数の遺伝子が関わる多段階反応によって生合成される事がわかっているが、反応機構には未解明な点が多い。本研究の目的はcmo^5U/mcmo^5U生合成の初段階であるウリジンの5位のヒドロキシル化の生合成機構を明らかにすることである。初年度である2013年度は、ヒドロキシル化修飾を担う遺伝子やヒドロキシル基を与える基質など、修飾に必要な因子を生化学的な手法で探索するための実験系を確立し、発見した諸因子の生化学的な機能解析を行う予定であった。しかし、研究の過程でcmo^5U/mcmo^5U生合成に関連する遺伝子の発見が相次いだ事から、それら新規遺伝子の機能解析に重点を置いて研究を進めた。その結果、1当初の研究目標であるウリジンのヒドロキシル化については、2つの遺伝子を同定した。2 cmo^5Uからmcmo^5Uに至るメチル化については、遺伝子を1つ同定し、試験管内での修飾再構成に成功した。その成果は、2014年度中に論文や国際学会で発表する予定である。修飾塩基の生合成には新規遺伝子だけでなく、未知の代謝物が働いている場合がある。2013年度にも、正にcmo^5U/mcmo^5U生合成の中間部分の反応を担う基質として、新規の代謝物が大々的に発表されたばかりだ。今後1を追究する事で、cmo^5U/mcmo^5U生合成の最後の未解明部分を明らかにし、新たなヒドロキシル化機構を発見する事を期待している。大腸菌tRNAの34位(wobble位)に見られる修飾塩基5-カルボキシメトキシウリジン(cmo5U)及びそのメチルエステル(mcmo5U)はコドン拡張の機能を持ち、翻訳に影響を与える修飾塩基である。cmo5U/mcmo5Uは複数の遺伝子が関わる多段階反応によって生合成される事がわかっているが、反応機構には未解明な点が多い。本研究の目的はcmo5U/mcmo5U生合成の初段階であるウリジンの5位のヒドロキシル化の生合成機構を明らかにすることである。初年度は修飾を担う遺伝子の探索を行い、最初のヒドロキシル化に関わる2つの遺伝子を明らかにした。また、最後のメチル化に関わる遺伝子を同定し、試験管内修飾再構成に成功していた。二年目である2014年度は、初年度に2つの遺伝子を明らかにしたU→ho5Uのヒドロキシル化について、修飾に必要な基質の同定や、それらによる修飾再構成などの生化学的解析が課題であった。また、初年度に明らかにしたcmo5U→mcmo5Uのメチル化について、研究内容をまとめ、対外発表する予定であった。その結果、1ウリジンのヒドロキシル化について、基質を同定する事に成功した。但し、修飾再構成には至っていない。2 cmo5Uのメチル化について、国際学会で発表を行った。また専門誌に発表する準備中である。3 cmo5Uを欠損した株において、特定の条件下で生育が悪化する事を発見した。

ヒドロキシル化の試験管内再構成のみ成功していないものの、1960年代から研究されていたcmo5U/mcmo5U生合成の全容をほぼ明らかにできた。今後、1について追加研究を行った上で、専門誌や学会で体外発表する予定である。転移RNA(tRNA)は遺伝子発現において重要な、翻訳のアダプター分子である。tRNAはtRNA修飾酵素によって、様々な化学修飾が施され、機能が微調整されている。大腸菌tRNAの34位(wobble位)にみられる修飾塩基5-カルボキシメトキシウリジン(cmo5U)及びそのメチルエステル誘導体(mcmo5U)はコドン拡張の機能を持ち、翻訳に影響を与えることがわかっているが、生合成機構には未解明な点が多い。本研究の目的は、cmo5U/mcmo5Uの生合成機構の初段階であるウリジンの5位のヒドロキシル化機構を明らかにすることである。2年目までにtRNAのヒドロキシル化に関わる2つの遺伝子を明らかにし、それぞれが修飾に必要とする低分子を1つずつ同定していた。一方、cmo5Uからmcmo5Uを合成するメチル化酵素の遺伝子を同定し、試験管内修飾再構成に成功していた。また、修飾遺伝子欠損株の形質を見出していた。最終年度は、前年度までに同定したヒドロキシル化遺伝子と低分子をもちいてヒドロキシル化修飾の生化学的同定を行うと共に、修飾遺伝子欠損株を解析してその生理的意義を明らかにすることを目指した。また、cmo5Uメチル化遺伝子について論文として発表する計画であった。その結果、1ウリジンのヒドロキシル化について、2つの遺伝子の一方で試験管内修飾再構成に成功し、その遺伝子が修飾酵素であることを証明した。3修飾の形質について解析し、ヒドロキシル化及びcmo5U修飾がそれぞれある塩基との対合に寄与していることを明らかにした。今後、1と3についてさらに研究を進めた上で論文に発表する予定である。申請時の当初の計画では、今年度はヒドロキシル化の因子探索を終える事が目標であった。また、昨年度の研究経過から、メチル化修飾の対外発表も目標であった。計画通り、ヒドロキシル化部分については、ho5U生合成に必要とする基質の特定に成功し、メチル化の部分についての国際学会で対外発表も行う事ができた。専門誌への発表準備も最終段階である。更に、cmo5U欠損株に特殊な負荷をかける事で、生育が悪化する事を見出し、ヒドロキシル化修飾の意義を考える手がかりを得た。以上の事から、当初の計画以上に進展していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初研究の目標としていたヒドロキシル化については、計画時の予定通り、ほぼ全ての因子がそろい、試験管内修飾再構成によって修飾に必要十分な条件を同定するのみとなっている。2015年度はこれを成功させる事を目標とする。また、この修飾の機能について、特定生育条件下で生育速度が低下する事を見出しており、その原因を明らかにする事によって、本修飾の意義を解明する事を目指す。更に、最終年度である今年は、これらの内容を専門誌に論文として発表する事を目標とする。加えて、メチル化修飾部分について、現在最終段階にある論文発表を達成する。
診断学研究におけるパラダイムの確立

医師の頭脳が行なっている診断過程を定式化して記述し,定式の構造を操作して診断の精度を上げる試みは,ようやく緒についたばかりで,研究の進展に対する期待は大きい.本研究は,診断過程の研究にあたり全体観を確立するための視座を探ることを目標として,いわゆる計量診断に関心を持つスペシャリストを挙り,近年注目を集めている2つのアプローチを候補として,様々な調査と経験の分析を行なった. 2つの主要なアプローチとは,知識工学的接近と,逆問題概念である.その結果,いずれの研究も,目標は医師を凌ぐ予測能力を科学的に開発することであるが,この目標は標的を限定した場合にほヾ達成されている.知識工学的接近では,臨床診断陽のエキスパートシステムの多くは,医師と同等以上の判断能力を有し,一部のものはすでに実用水準に達していると考えられた.逆問題解法は,すでに各種のCT(コンピュータ断層法)の基礎理論として,有効性が確かめられており,さらに生体内の電場や音響場の逆問題解が,体表面心電位分布図からの心電源推定や,超音波伝達特性からの人体内部諸器官の物性的特徴量の推定などに応用され始めている.しかしこれらのいずれも,単独では診断学の拠って立つパラダイムとしてなお不完全である.現時点での最良の戦略は,古典的統計論,多変量解析モデル,シミュレーション,意志決定樹などと,あらゆる手法を動員することが必要である.この際,人工知能を診断システム全体の統括に充てれば,人間・機械系それぞれの能力を結び最大限に発揮させることも可能と考えられる.また一つの戦略目標として,診断画像の情報処理に何らかの有効な寄与を発見することが,診断学研究に対する支持を強化するのに望ましいプロジェクトであり,そこにも人工知能ないし知識ベースによる帰納的推論の応用に期待されるとの結論に達した.医師の頭脳が行なっている診断過程を定式化して記述し,定式の構造を操作して診断の精度を上げる試みは,ようやく緒についたばかりで,研究の進展に対する期待は大きい.本研究は,診断過程の研究にあたり全体観を確立するための視座を探ることを目標として,いわゆる計量診断に関心を持つスペシャリストを挙り,近年注目を集めている2つのアプローチを候補として,様々な調査と経験の分析を行なった. 2つの主要なアプローチとは,知識工学的接近と,逆問題概念である.その結果,いずれの研究も,目標は医師を凌ぐ予測能力を科学的に開発することであるが,この目標は標的を限定した場合にほヾ達成されている.知識工学的接近では,臨床診断陽のエキスパートシステムの多くは,医師と同等以上の判断能力を有し,一部のものはすでに実用水準に達していると考えられた.逆問題解法は,すでに各種のCT(コンピュータ断層法)の基礎理論として,有効性が確かめられており,さらに生体内の電場や音響場の逆問題解が,体表面心電位分布図からの心電源推定や,超音波伝達特性からの人体内部諸器官の物性的特徴量の推定などに応用され始めている.しかしこれらのいずれも,単独では診断学の拠って立つパラダイムとしてなお不完全である.現時点での最良の戦略は,古典的統計論,多変量解析モデル,シミュレーション,意志決定樹などと,あらゆる手法を動員することが必要である.この際,人工知能を診断システム全体の統括に充てれば,人間・機械系それぞれの能力を結び最大限に発揮させることも可能と考えられる.また一つの戦略目標として,診断画像の情報処理に何らかの有効な寄与を発見することが,診断学研究に対する支持を強化するのに望ましいプロジェクトであり,そこにも人工知能ないし知識ベースによる帰納的推論の応用に期待されるとの結論に達した.知識工学的接近によってコンピュータ診断の実現可能性が見直されているのを機に、さらに根源的な研究のパラダイムについての総括研究に着手した。初年度はもっぱら専門研究者相互の意見の開陳と討論を行い、各自の意見を要約した資料について再び討論を行った。[1]計算機診断の研究思想として、専門研究者はかつての統計理論,多変量解析,シミュレーションが人工知能とひとしく重要視しており、相対的な重要度は逆問題解や意志決定樹のような新しい手法より大きい。[2]人工知能についての研究は活発であるが、ほとんどは実用段階に至らっていない。その理由は次の改良目標として列挙できる。[3]人工知能の医学応用に際しての改良目標は、認知論的基礎研究とともに知識ベースの自己更新機能の付与、入出力装置のマン・マシン・インタフェイスの改良、次世代コンピュータの開発など、あらゆる課題に重要度が分散する傾向が見出された。[4]第二世代エキスパートシステムに対しては、上記の欠点を解決し、とくに知識ベースの充実が急務である。[5]わが国の人工知能研究は、応用開発に偏り、ユニークな研究が少ない欠点を早急に解決すべきである。[6]人工知能の医学応用対象は、診断の機械化と並んで、画像処理、治療制御に関心が向けられている。[7]研究の隘路はもっぱら研究者の不足で、専門施設設置とともに研究費の確保に配慮を必要とする。[8]研究の国際化を念頭におくと、上記の研究環境の整備とともに優れたテキスト編纂が急がれる。次年度は各課題についてさらに詳細検討を加え提言をまとめる予定である。
医療訴訟事例の専門職連携教育における教職員に対する能力開発教材活用可能性の検討

本研究は、専門職連携教育に携わる教職員を対象に、医療訴訟事例を用いた教職員能力開発のための教材(演習用シナリオ、ワークシート、ファシリテーションガイド)の試作、及び試作版教材の有用性を評価することを目的としている(研究期間:平成2426年度)。1年目は、能力開発教材の素材に適した医療訴訟事例の選択とシナリオの作成(試作版教材第1版)、2年目でそれらを用いた模擬演習を実施、演習構成と試作版教材の有用性について評価を行い、問題点を抽出した。3年目では、先の問題点に基づき、演習構成、及び試作版教材を修正、改訂版第2版を作成した。平成25年度では、医療訴訟事例、特に薬剤に関する訴訟事例を基に、問題解決型教材(シナリオ、グループワークシート、ファシリテーションガイド)の試作版を作成した。その後、試作版教材を用いて、研究協力者6名を募り、模擬演習を行い、模擬演習及び試作版問題解決型教材についての評価を行った。試作版問題解決型教材について、教材のコンセプトと構成(シナリオ構成、グループワークの構成)については高い評価を得られたが、ファシリテーション方法については試作版ガイドの内容では実際の演習を支援しにくい場面もあり、ガイドだけでなく事前の説明会(Faculty Development)も必要との意見が挙げられた。試作版教材についても、それぞれの専門職の視点で問題を捉えそれを専門職連携に活かすためには、単に時系列で事象を追うことでは不十分との指摘を得た。これらの評価、指摘を踏まえ、試作版教材のシナリオ構成の変更とファシリテーションガイドの修正を行った。平成26年度では、この修正版問題解決型教材(修正版シナリオ、ワークシート、ファシリテーションガイド)を用いて、実際の専門職者研修での試用に向けて再度模擬演習を行い、教材内容を確定する予定である。平成24年度では、まず医療訴訟ベース及び裁判所データベースから、本研究が目指す「専門職連携」をテーマにした能力開発教材にふさわしいと思われる事例の検索・抽出作業から開始した。事例については、訴訟件数の多い外科、他科連携の重要な皮膚科・薬物障害・歯科、更に今後訴訟が増えると予測される臨床試験の分野に限定して、2000年2011年(適した事例が少ない場合は、なるべく対象年に近いもの)の訴訟事例を対象に抽出を行った。現時点で、外科;2例、皮膚科;1例、歯科;3例、薬物障害;2例、臨床試験;1例を抽出した。平成25年度においても、症例検索は継続する。一方で、訴訟事例をもとにした教材をどの様に使用するかについて、専門職者及び大学教員におけるワークショップを想定し、ワークシートの原案を作成した。本研究では「問題解決型教材」の開発を目指しているので、ワークシートが本研究の開発目的に即しているか、また、ワークシートと教材が学習目標や目的に合致しているかどうかについて検討・修正を行っているところである。平成25年度では、これらの教材を実際に使用し、教材の評価とその効果を検証する。その結果については論文化等で公表する予定である。平成24年度では、問題解決型教材に適した医療訴訟事例の抽出と選択、平成25年度ではそれらの事例から特に薬剤に関する訴訟事例を基に、問題解決型教材(シナリオ、グループワーク、ファシリテーションガイド)の試作版を作成した。また、その試作版教材を用いて、研究協力者6名を募り、模擬演習を企画・実施し、模擬演習及び試作版問題解決型教材についての評価を行った。試作版問題解決型教材について、教材のコンセプトと構成(シナリオ、グループワークの構成)については高い評価を得られたが、ファシリテーション方法については、試作版ガイドの内容では模擬演習の支援をしにくい場面もあり、事前の説明会(Facuty Development)も必要であるとの意見を得た。試作版教材についても、単に時系列で事象を追うことでは問題解決型教材としては不十分との指摘を得た。平成26年度では、先の指摘を踏まえ、試作版教材のシナリオ構成とファシリテーションガイドの改訂を行った。まず、シナリオ構成の改訂としては、時系列に事例を把握することを基本に、完成されたシナリオではなく、1事象・1専門職・1カードとしたカード形式の教材を作成した。これを用いて演習を行い、ストーリーを完成させる方法を採用した。これにより前年度は3段階のプロセスを踏まえて学習目標(医療訴訟を引き起こす原因を、専門職連携の視点から明らかにし、解決策を立案する)を達成させる構成から、ディスカッションの過程でこれらの学習目標を達成させる構成へ変更した。これに伴い、ファシリテーションガイドも学習支援方法を改訂し、試作版教材第2版を完成させた。専門職連携教育模擬演習実施に際し、実施スケジュールについて研究協力者間の調整が困難であったため、計画時より模擬演習実施が遅れてしまった。しかしながら、模擬演習実施から試作版教材までの評価は出来たため、次年度における研究実施計画には大きな支障はないと考える。事例の検索・抽出に予想以上に時間がかかった。

これは教材候補となる事例が控訴・上告など複数回の審議が行われている場合、すべてを確認するのに時間を要したためである。また、なるべく新しい事例(現在の医療事情にあまり差異のない事例)を対象としているが、まだデータベースに反映されていないなど事例数が少ないことから、ある程度の年数を遡って事例を検索する作業にも時間を要した。しかしながら、この手順は事例を選択する上では必要な手間であり、今後も時間を要する作業になると考える。平成26年度では前年度の模擬演習実施時の評価を受け、修正版の問題解決型教材を用いて、本研究の対象者である医療専門職者に向けた研修を実施、再評価を行い、修正版から確定版へ本問題解決型教材を完成させる。また、そのプロセスと成果について、学会発表及び論文化する予定である。平成25年度は、前年度作成した教材の評価を行い、成果を論文化する。年度のできるだけ早い時期に教材の試作版を作成し、年度中盤以降に教材評価のため、研究代表者所属機関または他施設でワークショップを開催し、本研究開発の教材の試用とアンケート調査による評価を行う。その結果を論文化し、公表を行う予定である。当初計画していた、医療専門職者対象の研修会の実施、問題解決型教材の内容確定とその成果の発表、成果物の作成(論文や報告書印刷等)、が、研究計画遅延のため実施出来ず、予定していた経費を支出出来なかったため。平成26年度では、上記の示した計画(研修会の開催、問題解決型確定版の作成、学会発表、論文発表、成果物の作成)を実施し、次年度使用額はそれに充てるものとする。平成24年度では、教材を開発するための機材・資料等を入手するため、それらの購入が主な支出となった。平成25年度は、開発教材試用のための打ち合わせやワークショップ開催についての経費(旅費・賃借料等)、論文を発表するための校正や印刷への経費が主なものとなる。図書については、必要に応じて購入する予定である。
胃粘膜に誘導されたCOX-2による粘膜保護作用の解析と選択的COX2阻害剤の影響

胃粘膜内に発現させたCOX2と粘膜保護作用との関連を明らかにするとともに,胃粘膜傷害を回避するために開発された選択的COX2阻害剤の胃粘膜に対する安全性を検討した.マウス胃内への酸性化エタノール(AE)(60% ethanolin 0.15M HC1)を経口投与することにより,胃粘膜内にCOX2蛋白を発現させた。COX-2の発現は、正常胃粘膜ではほとんどみられず、AEによるびらん周囲の間質系細胞を中心にみられた.AEを投与し,経時的観察により最もCOX2蛋白が発現すると考えられる24時間後に,95%エタノール(Et)を経口投与した群と,AE投与後,選択的COX-2阻害剤(NS398,20mg/kg)を腹腔内投与した群およびインドメタシン(IM,10mg/kg)を腹腔内投与した群に分けた.Et投与後,1時間後の胃粘膜障害を比較検討した.AEによりCOX-2が誘導された胃粘膜では,NS398により,その後のEtによる粘膜傷害が助長される。一方,COX-2が誘導されていない正常胃粘膜では,NS398はEtの胃粘膜傷害に影響を与えなかった。またCOX-1および2両者を阻害するIMは,COX-2が誘導された胃粘膜ばかりでなく、正常胃粘膜においても,Etによる胃粘膜傷害を増悪した。ヒト胃線維芽細胞に発現するCOX-2とVEGFの発現の検討を,培養系,およびヒト胃潰瘍組織標本において検討した。胃潰瘍底の線維芽細胞は,PGE2を産生することによりオートクリン,あるいはパラクリンにVEGFの産生を誘導し,血管新生を促進していることを示唆した。また,潰瘍周辺組織の線維芽細胞にCOX-2が発現しており,COX-2介したVEGFの発現を示唆した。従来のNSAIDに比べ、選択的COX-2阻害剤は胃粘膜傷害が少ないと考えられているが、COX-2が発現した、粘膜障害を有する症例では、治癒が遷延する可能性があるばかりでなく、粘膜障害が増悪する可能性が示唆された。In vitroにおける実験では、ヒト胃腺維芽細胞(CRL-7215)とヒト胃癌細胞(MKN-1)をFCS存在下において、RPMI1640にて培養.培養プレート上にて,IL-βおよびPGE2により刺激.24時間後,培養上清のCOX-2,VEGFの遺伝子および蛋白発現を確認している.さらに選択的COX-2阻害剤(NS-398)により前処置したグループと比較し,炎症のメカニズムに重要なICAM-1や粘膜の恒常性の維持や修復過程に重要なVEGF産生におけるCOX-2の役割を明らかにする.胃粘膜内に発現させたCOX2と粘膜保護作用との関連を明らかにするとともに,胃粘膜傷害を回避するために開発された選択的COX2阻害剤の胃粘膜に対する安全性を検討した.マウス胃内への酸性化エタノール(60% ethanol in 0.15M HCl)を経口投与することにより,胃粘膜内にCOX2蛋白を発現させた。COX-2の発現は、正常胃粘膜ではほとんどみられず、酸性化エタノールによるびらん周囲の間質系細胞(線維芽細胞、単核球)を中心にみられた.さらに経時的観察では,24時間後にCOX2蛋白発現のピークがみられた。マウスに酸性化

エタノール0.15mlを経口投与し,最もCOX2蛋白が発現すると考えられる24時間後に,95%エタノール0.1mlを経口投与した群と,同様の処置に加え酸性化エタノール投与後,選択的COX-2阻害剤(NS398,20mg/kg)を腹腔内投与した群およびインドメタシン(10mg/kg)を腹腔内投与した群に分ける.いずれの群ともに95%エタノール投与後,1時間後の胃粘膜障害を,肉眼的および病理組織学的手法により比較検討した.酸性化エタノールによりCOX-2が誘導された胃粘膜では,NS398により,その後の95%エタノールによる粘膜傷害が助長される。一方,COX-2が誘導されていない正常胃粘膜では,NS398は95%エタノールの胃粘膜傷害に影響を与えなかった。またCOX-1および2両者を阻害するインドメタシンは,COX-2が誘導された胃粘膜ばかりでなく、正常胃粘膜においても,95%エタノールによる胃粘膜傷害を増悪した。従来のNSAIDに比べ、選択的COX-2阻害剤は胃粘膜傷害が少なく、安全性が高いと考えられているが、COX-2が発現した、粘膜傷害を有する症例では、治癒が遷延する可能性があるばかりでなく、粘膜傷害が増悪する可能性もあることが示唆された.