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国際規範と国内政治：人権裁判実施の政治過程の分析

本研究は、体制移行直後には新政権の体制の安定を重視して過去の人権侵害の責任追及を行わない判断を下していた国々において、なぜ、1990年代半ば以降、旧体制下で行われた人権侵害の加害者を処罰する試み(人権裁判)が行われるようになったのかを明らかにすることを目的としている。本年度(平成29年度)は、各国における人権裁判実施の原動力となっている国際刑事裁判の法規範の性質について理論的考察を行った。国際刑事裁判の意義については、これまで様々な見解が出され論じられてきたが、現在、理論と実践の双方において中心的な考えとなっているのは、処罰の威嚇によって犯罪を防止するという抑止の論理である。これは今日の国際刑事裁判が紛争終結を待たずに紛争が継続しているさなかに紛争当事者の刑事訴追を行う傾向を強めるにつれて、国際刑事裁判に人権侵害のさらなる拡大と発生を防ぐことが期待されるようになるなかで強調されるようになった考えである。本研究では、国際刑事裁判についての現在の通説的見解である抑止論を批判的に検証することで、国際刑事裁判の法の支配について考察した。具体的には国際刑事裁判の法規範について強制力と規範的正統性の二つの側面から考察することで、国際刑事裁判の法の支配が中央集権的な法の執行体制を志向しているのではなく、規範的正統性を高め、各国の協力と自律的遵守を促す方向で進んできたことを示した。そのうえで、分権的な法の支配を体現する今日の国際刑事裁判が、基本的には主権国家の同質性を前提にしていることを確認し、国際的な重大犯罪者の処罰をめぐる根本的な問題が、国際刑事裁判の法の支配の射程外にある少数の逸脱国の扱いをめぐる政治的課題であることを指摘した。研究成果は日本国際政治学会研究大会で発表し、そこでの議論を踏まえて加筆修正した原稿を、学術誌に投稿した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本年度(平成28年度および繰越が承認された29年度)は比較政治学における民主化研究の先行研究を批判的に検討したうえで、国際規範と国内政治の関係を考察した国際政治学と国際法学の研究を取り入れる形で仮説を提示し、データベースに依拠した事例分析を行った。従来の民主化研究では、新旧両政権の力関係に着目し、民主化後に旧政権下で行われた強制失踪や拷問などの深刻な人権侵害の責任追及を行うことは、誕生したばかりの民主主義の安定を脅かしかねない問題だと捉えられてきた。これに対して本研究では、移行期正義に関するデータベースを利用して、1990年代半ば以降は、民主化後も必ずしも人権保障に積極的とは思われない権威主義体制の特徴を残す国々においても人権裁判が行われていることを確認したうえで、国際規範の変化が国内政治に与える影響に着目し、裁判の実施を求める被害者とその支援者、および裁判の実施を決定する政権の二つのアクターを中心に分析した。具体的には、冷戦終結後に国際社会が国内統治へ関与を強めるようになるなかで、加害者の責任追及を求める国内諸団体の発言力が強化され、また、政府の側でも加害者の責任追及がかつてのように民主主義の安定を脅かしかねないマイナスの要因から、国際正統性を確保することで政権の安定に資するプラスの要因に変化していることが、人権裁判行うインセンティブを高めていることを論じた。研究成果は日本平和学会春季研究大会で発表し、さらに事例研究をもとに考察を進め、学術誌に投稿した(現在、査読中)。本研究の核となる、なぜ1990年代半ば以降に人権裁判が行われるようになったのかについて、裁判の実施に繋がる政治過程の理論的解明に努め、成果を学会で発表することができた。但し、当初の予定では、28年度はまず特定地域(ラテンアメリカ諸国)の事例分析に着手する予定であったが、他の研究者から同地域以外の事例についても分析することでより説得的な仮説となることが指摘されたことから、同年度は各地域(ラテンアメリカ、中東欧諸国、アジア・アフリカ諸国)について概観的分析を行うこととし、より詳細な事例研究は翌年度に繰り越して行うよう研究計画を変更した。繰越分を用いて行ったさらなる事例研究により、「国際正統性を確保するために人権裁判を行う」という政権の動機の変化についての本研究の仮説については、冷戦終結後、法の支配の確立を加盟条件の1つに掲げられた中東欧の欧州連合(EU)加盟候補国や紛争解決に国際社会が関与した紛争経験国で特に顕著であるなど、地域差がみられることが明らかになり、人権裁判実施に関する政権の動機の変化についても理論的考察を深めることができた。

国際刑事裁判の意義については、これまで様々な見解が出され論じられてきたが、現在、理論と実践の双方において中心的な考えとなっているのは、処罰の威嚇によって犯罪を防止するという抑止の論理である。これは今日の国際刑事裁判が紛争終結を待たずに紛争が継続しているさなかに紛争当事者の刑事訴追を行う傾向を強めるにつれて、国際刑事裁判に人権侵害のさらなる拡大と発生を防ぐことが期待されるようになるなかで強調されるようになった考えである。本研究では、国際刑事裁判についての現在の通説的見解である抑止論を批判的に検証することで、国際刑事裁判の法の支配について考察した。具体的には国際刑事裁判の法規範について強制力と規範的正統性の二つの側面から考察することで、国際刑事裁判の法の支配が中央集権的な法の執行体制を志向しているのではなく、規範的正統性を高め、各国の協力と自律的遵守を促す方向で進んできたことを示した。そのうえで、分権的な法の支配を体現する今日の国際刑事裁判が、基本的には主権国家の同質性を前提にしていることを確認し、国際的な重大犯罪者の処罰をめぐる根本的な問題が、国際刑事裁判の法の支配の射程外にある少数の逸脱国の扱いをめぐる政治的課題であることを指摘した。研究成果は日本国際政治学会研究大会で発表し、そこでの議論を踏まえて加筆修正した原稿を、学術誌に投稿した。今後は、各国における人権裁判実施の原動力となっている国際刑事裁判の法規範の性質について、理論的考察を行う予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
10GHz超で動作するマイクロ波電磁界収束ハイブリッド薄膜材料の開発

10GHz超のマイクロ波の電磁界を収束する材料の開発を目的として,CoFeBおよびCoFe磁性薄膜を回転電極型スパッター法により試作した.その結果,10GHz超の高周波透磁率特性を有する磁性膜を得,さらにこれを誘電体(ポリイミド膜,SiO2膜)と積層した結果,誘電率特性と透磁率特性のハイブリッド効果すなわち電磁界収束効果が確認された.これによって,マイクロ波集積回路(MMIC)における伝送線路の短縮化,アンテナその他のLC素子の集積化を実現する電磁界束材料の設計・製作が十分に可能であることが明らかにされた.10GHz超のマイクロ波の電磁界を収束する材料の開発を目的として,CoFeBおよびCoFe磁性薄膜を回転電極型スパッター法により試作した.その結果,10GHz超の高周波透磁率特性を有する磁性膜を得,さらにこれを誘電体(ポリイミド膜,SiO2膜)と積層した結果,誘電率特性と透磁率特性のハイブリッド効果すなわち電磁界収束効果が確認された.これによって,マイクロ波集積回路(MMIC)における伝送線路の短縮化,アンテナその他のLC素子の集積化を実現する電磁界束材料の設計・製作が十分に可能であることが明らかにされた.平成18年度(初年度)は申請した研究計画に従い,ナノ結晶磁性膜の特性向上とナノ結晶磁性膜のナノ結晶磁性膜の試作(宗像),誘電体膜の試作(青木)を目標とし,二三の課題を残して目標の実績をほぼ達成した。ナノ結晶磁性材料については,筆者らの世界最高の強磁性共鳴周波数(FMR)6GHzを達成した(CoFeB)系ナノ結晶膜の磁気共鳴(FMR)周波数を,さらに高い10GHzに引き上げを図るため,Ru, Cu, NiFe等の下地層上にFeCo膜を試作した結果,磁気共鳴周波数が12GHzに相当する良好な一軸異方性磁界を得ることに成功し,これに伴う結晶配向や結晶粒子径を調査検討している(業績1,2).この成果を基盤にして高飽和磁化(24kG)を持つハイブリッド化磁性膜の要素開発を予定(EMRS conf.ストラスブルクin May.2007発表・投稿予定)している.また,誘電体膜の作製については,プラズマ支援型スパッタ装置の準備調整が完了し,低基板温度あるいは常温基板温度における誘電体膜試作を予定よりやや遅れて開始している.誘電体膜とのハイブリッド化の有効性については予備試験を信州大に依頼し,従来膜については有効性を確かめている(業績3.4).新誘電体膜の試作予定の遅れが若干の課題である.以上のように,若干の課題を残してはいるが,業績(1-4)においても他者の記録を世界的に上回る新規の特性が得られており,これらの結果をさらに材料開発およびそれらの基礎となる物性研究を,申請当初の目的と計画のとおり推進している。平成19年度(中間年度)においては申請した研究計画に従い、ナノ結晶磁性膜の特性向上と特性の発現についての構造解析を行い、さらに誘電体膜の試作開発を行いながら磁性膜/誘電体膜の2積層構造膜について試作準備を行った。その結果、ナノ結晶磁性膜については13GHz動作まで向上でき(論文業績1)、下地層に結晶配向の制御が特性を高めることを明らかにした。しかし、磁性膜/誘電体膜の二層膜の試作では、磁性膜の特性劣化が起こり、この対策として、基本的な磁区構造についても調べ、高周波での磁壁移動の検証結果(論文業績2,3,4)を得るとともに、誘電体膜上にコーティングする下地層の生成条件について調べた(Intermag 2008,5月サライト会議に発表予定)。以上の結果から、さらに下地層の生成条件を誘電体膜層に対して改善を行いながら、次年度は目的のハイブリッド材料の第一試作に入り、その効果として伝送線路短縮、挿入損失の評価と測定に入る予定である。その評価方法についても、周波数の特殊解析と測定理論の調整があり、多研究者の支援を得ながら行う予定である。平成20年度(最終年度)においては申請した研究計画に従い,ナノ構造磁性膜の特性向上と特性発現の機構について前年度に引き続き構造解析を行い,この結果をフィードバックすることによって第一次の積層ハイブリッド膜(マイクロ波電磁界収束材料)を用いた積層デバイスの試作を行った.その結果,誘電体膜(ポリイミド膜およびSiO_2膜)と開発磁性膜とのハイブリッド効果により,マイクロ波電磁界収束がほぼ理論通りに起こることが検証された.さらに,MMICデバイスとして伝送線路や方向性結合器を依頼共同研究で試作した結果,磁性材料薄膜の新しい機能と有効性を実証することができた.磁性薄膜材料の試作開発においても,CoFe膜に対するB添加効果や下地層の影響など,積層化やデバイス化に適した目的の高周波磁気特性(磁気共鳴周波数6-13GHz)を得,その独自の製膜方法の構築にほぼ成功した.開発材料の基本物性については申請時の計画通り,国内・外との依頼共同研究によって目的の新材料の改善と新たな応用について多くの知見と指針を得ることができた.以上の成果は,当初の研究目的をほぼ達成したと考えられ,逐次国際会議報告や論文発表を行う予定である.さらに当該磁性薄膜材料にはTHz帯応用への可能性があり,次期科研費(基盤研究(B))やその他の公募資金援助に申請する予定である.
新規蛍光プローブを用いたG蛋白質共役型脂肪酸受容体ファミリー活性化機構の解析

【分子内BRETによる受容体構造変化の探索】受容体のC末端にRlucを融合し、第三細胞内ドメインに蛍光プローブとしてvenusを挿入したコンストラクトを作成し、HEK細胞に発現させ、Rluc->venus間のBRET計測を行うことで、受容体の構造変化を検出する実験系を構築した。誘導発現細胞を懸濁した状態での蛍光分光器での検討および、共焦点顕微鏡を用いた検討を行った。この手法により蛍光プローブ間のトポロジーの解析を行う事が可能になった。さらに、多数のプローブ挿入部位について、上記の計測結果を比較することで、受容体構造のシグナル伝達系への寄与を明らかにすることが出来た。【新規蛍光プローブの開発と、受容体リガンド相互作用の解析】これまでG蛋白質共役型受容体(GPCR)である脂肪酸受容体GPR40, GPR120は、受容体-リガンド相互作用を直接的に調べる手法が確立されていなかったため、薬理学的な解析が行われてこなかった。今回我々はFLAGタグを結合した脂肪酸受容体タンパク質をSf9細胞に発現させ、可溶化し、免疫磁気ビーズに結合固定し、蛍光プローブであるC1-BODIPY-C12で標識するという方法で、脂肪酸受容体とリガンドの相互作用を直接的に検出できるフローサイトメトリーに基づいた結合分析法を開発した。この手法は、他の分析法ではモニターが困難だったGPCRsにも適用可能で、リガンドの高処理不クリーニング系に対しても有効であると考えられる。【脂肪酸受容体大量発現系の構築】脂肪酸受容体ファミリーそれぞれについて、大量発現が期待される昆虫細胞発現系および、生理的な調節機構の解明が期待される動物細胞での誘導発現系を構築した。【脂肪酸受容体特異的な蛍光プローブの開発とフローサイトメトリーを用いた結合実験】脂肪酸のアルキル鎖中に蛍光発色団としてBODIPYを挿入した構造の多種の化合物が市販されている。その中から蛍光プローブとして機能する化合物をスクリーニングした。受容体を大量発現した細胞に上記化合物を各種濃度で添加後、フローサイトメトリーで細胞の蛍光検出、結合の解析を行い、蛍光プローブとしての評価を行った。より詳細な受容体の結合実験にはビーズ上に固定した受容体と蛍光プローブを用いた相互作用の解析を行った。昆虫細胞発現系を用いて、受容体のN末端にFLAGタグを結合させた各脂肪酸受容体の発現系を構築した。得られた脂肪酸受容体発現細胞を可溶化し、抗FLAG抗体及びprotein G修飾されたビーズを用いて免疫沈降を行い、ビーズ脂肪酸受容体複合体を得た。この複合体に対して、上記の各脂肪酸の蛍光プローブを添加し、受容体に結合したプローブからの蛍光をフローサイトメトリーを用いて検出できた。この結合は受容体蛋白質存在下でのみ検出され、蛍光ブロー部濃度に対して飽和生を有し、また可逆的であった。さらに脂肪酸およびリガンドであることが報告されているMEDICA16等の化合物で特異的阻害が認められた。この実験系により、リガンドに対して低親和性の受容体について相互作用の解析手法が確立できた。
肝癌発生とB型肝炎ウイルス増殖に関する分子生物学的研究

B型肝炎ウイルスのヴイリオンが感染・増殖できる系の確立は、本ウイルス研究の悲願ともいえるものであったが、我々はヒト胎児細胞の一次培養系を用いるとこれが再現性良く実現できることを示した。この系に感染するウイルスは、表面抗原に対する抗体に曝すことにより失活することも示され、ワクチンが作用する基本的機構をも同時に明らかにできた。この感染系を用いて、次にヴイリオン感染後僅か一週間後には本ウイルスのゲノムDNAが細胞DNA中に組込を起こしていることを発見した。本ウイルスがこのように早い時期に宿主染色体に組込まれるということは、これまで全く予期されていなかったことである。この組込みDNAをクローニングしたところ、ウイルスはそのDNA複製開始点を使って、ほぼ全長を組込ませた構造をしていることが明らかになった。全く独立に得られたもう一つの組込み体もほぼ同様な構造をとっているので、これにより、ウイルスが宿主に組込を起こす機作を推測する手懸かりをうることができた。さらに、本ウイルスによる肝炎の生起のしくみを解明し、あわせてその過程で肝癌が生じて来るプロセスを調べる目的で、本ウイルスゲノム1.2コピー分を組み込んだトランスジェニックマウスを作製した。このマウスは肝・腎の二臓器でウイルス成分を産生し、ヴイリオンと思われる粒子を血中に放出している。本系は、次年度以降適切なT細胞を導入することにより、肝炎を断起するモデル動物として所期の研究目的に活用できるものと考えられる。
オートファジ―を制御するmicroRNAを用いたポンペ病骨格筋の治療戦略

Pompe病の骨格筋ではライソゾーム内のacid alpha glucosidaseが欠損することにより、autophagyの機能障害が引き起こされることをこれまでの研究で示した。autophagyの機能障害により、autophagyに関連する小胞や本来autophagyによって分解される物質が罹患組織内に蓄積し、Pompe病の進行や治療効果を左右する病態を形成している。本研究ではPompe病の“異常なautophagy"病態に関与していると考えられるmicroRNAのPompe病骨格筋における役割を明らかにし、microRNAを用いた治療を臨床応用へ展開するための研究基盤を確立することを目的としている。ヒトPompe病骨格筋のmicroRNA発現解析では、autophagyを調整する主要な遺伝子であり、Pompe病骨格筋では過剰発現しているBECN1を標的とするmiR-30aの発現が低下している可能性が示唆された。また、autophagyとexocytosisを調整する遺伝子であり、Pompe病では過剰発現し、Pompe病の病態を左右する重要な因子である転写因子TFEBを標的とするmiR-128の発現が低下している可能性が示唆された。Pompe病モデルマウス[Gaa(-/-)]骨格筋におけるmicroRNAの発現解析(網羅的な解析およびリアルタイムPCR)を行い、次に、モデルマウス骨格筋を用い、Pompe病骨格筋で発現の変動が見られたmicroRNA (miR-30aとmiR-128を中心に)のin vitroとin vivoの機能調節実験、標的遺伝子発現解析を実施する計画であり、2018年度は、モデルマウス実験の準備を行った。さらに、ヒト疾患iPS細胞由来の培養筋管細胞を用い解析を行う予定であり、標的遺伝子発現や免疫組織などの発現解析、治療への影響を解析する。モデル動物の受け入れ準備に時間を要した。研究協力者と協力し、研究を遂行する予定である。Pompe病モデルマウス[Gaa(-/-)]骨格筋(特にautophagyの亢進が顕著はII型筋線維)におけるmicroRNAの発現解析(マイクロアレイによる網羅的な解析およびリアルタイムPCR)においては、これまでも共通する方法を用いた研究を行った経験があるため、過去の経験と同様に研究を推進する。モデルマウス骨格筋のmicroRNAのin vitroとin vivoの機能調節実験、標的遺伝子発現解析に関しては、microRNAの過剰発現と機能阻害の効率の確立に、困難が予想されるため、大学内外のネットワークを活用し、解決を図る予定である。ヒト疾患iPS細胞由来の培養筋管細胞を用いた系を用いた解析に関しても、同様であり、大学内外のネットワークを活用し、解決を図る予定である。2018年度はモデル動物の受け入れ準備に時間を要したため、2019年度に実験計画が持ち越しとなった。

2019年度には、実験動物、microRNA解析((マイクロアレイおよびリアルタイムPCR)、microRNAの標的遺伝子発現解析のための試薬、microRNA分離試薬、細胞培養のための消耗品、microRNAの機能阻害、およびmimic-miRNA導入、導入効率確認のための試薬、ウイルスベクター、組織化学による病態解析のため、LAMP,RAB,LC3などの免疫組織化学に用いる抗体などの試薬購入に研究費用を用いる計画である。
新規ルシフェリンを構造基盤とする新機軸発光性・蛍光性光機能物質の開発

富山県魚津市海岸でOdontosyllis属の発光ゴカイを採集し、メタンール抽出物を得た。一方発光ゴカイを10mM炭酸アンモニウムで抽出した。両者を混合すると、発光が観測された。発光スペクトルを測定したところ、天然の発光ゴカイと同様の発光スペクトルが得られたことから、この発光ゴカイの発光系はルシフェリンルシフェラーゼ反応を示し、ルシフェリンはメタノール抽出できることが判明した。予備試験的にルシフェリンの単離を試みた。HPLCでの分離条件を種々検討したところ、発光ゴカイのルシフェリンは水溶性が高く、また酸性解離基を有していることが示唆された。浜名湖にて発光ウミウシの一種、ベッコウヒカリウミウシを採集した。この発光ウミウシは刺激により、約510nm付近に発光極大を持つ発光性粘液の放出が観察された。予備試験的にルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を検討した。すなわちこの発光ウミウシを熱水抽出したものと、刺激により放出した発光粘液含む海水を、発光がおさまった後、混合したところ、発光が確認された。このことからベッコウヒカリウミウシの発光系はルシフェリンルシフェラーゼ反応を示すことが示唆された。また凍結保存したサンプルにも発光活性があることが確認された。八丈島で採取した発光キノコ、ヤコウタケの実験室栽培にも成功し、研究試料の確保に目処がついた。そこで発光キノコの発光している子実体から、510nm付近に蛍光性を示す物質の単離を試みたところ、リボフラビン様蛍光物質とルミクロームの存在が確認できた。今後は発光活性を示す物質の単離を進める。ホタル発光系とGreen FluorescenctProteinからなるBioluminescent Resonance Energy Transfer(BRET)システムの構築研究の一環として、青く光るホタルルシフェリンアナログの開発を試みた。その結果、天然ホタルルシフェリンより、約40nm短波長側に発光極大を有するアナログの合成に成功した。またイミダゾピラジノンを基本骨格に有する新規発光性分子の創成に成功した。幾つかの新規生物発光系についてルシフェリンの探索研究を進めた。まづ日本海で棲息する発光ゴカイ(Odontosyllis)の発光系について検討した。富山県魚津市海岸で発光ゴカイを採集し、ただちにドライアイスで凍結した。凍結資料をメタンール抽出し、粗ルシフェリンを得た。一方発光ゴカイを10mM炭酸アンモニウムで抽出し、粗ルシフェラーゼ溶液を得た。発光スペクトルを測定したところ、天然の発光ゴカイと同様の発光スペクトルが得られたことから、この発光ゴカイの発光系はルシフェリンルシフェラーゼ反応を示し、ルシフェリンはメタノール抽出できることが判明した.発光ゴカイの採集量は約100匹程度で、十分量とは言い難いが、予備試験的にルシフェリンの単離を試みた。一方、浜名湖にて発光ウミウシの一種、ベッコウヒカリウミウシを採集した。

すなわちこの発光ウミウシを熱水抽出したものと、刺激により放出した発光を粘液含む海水を、発光がおさまった後、混合したところ、発光が確認された。このことからベッコウヒカリウミウシの発光系はルシフェリンルシフェラーゼ反応を示すことが示唆された。これらの知見に基づき、ルシフェリンの単離をめざす。八丈島に棲息する海産発光巻貝ヨコスジタマキビモドキと浜名湖に棲息する発光ウミウシの一種、ベッコウヒカリウミウシの発光系の単離を試みた。その結果、ヨコスジタマキビモドキについてはルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を確認することができなかったが、熱水抽出物と生物試料のhomogenateを混合すると発光することを見いだし、ルシフェリンが熱水で抽出されることが判明した。一方、ベッコウヒカリウミウシはルシフェリンが熱水で抽出されること、ルシフェラーゼは冷水で可溶化できること、両者を混合することにより発光し、ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を示すことなどが確認された。また八丈島で採取した発光キノコ、ヤコウタケの実験室栽培にも成功し、研究試料の確保に目処がついた。そこで発光キノコの発光している子実体から、510nm付近に蛍光性を示す物質の単離を試みたところ、リボフラビン様蛍光物質とルミクロームの存在が確認できた。今後は発光活性を示す物質の単離を進める。一方新規自家化学発光性シュウ酸アミドの構築を試みた。シュウ酸エステルあるいはシュウ酸アミド類は蛍光性物質共存下、アルカリ性過酸化水素により共存する蛍光物質に依存した波長で増感型化学発光を示す。オワンクラゲ発光系の基本骨格であるアミノピラジンのアミドは蛍光性があることから、アミノピラジンを分子内に有するシュウ酸アミド類は他の蛍光増感剤が存在しなくても化学発光性を有することが期待できる。そこでアミノピラジンのシュウ酸アミド誘導体を合成し、その化学発光能を検討した。その結果、単純アミドでは化学発光性を示さないことが判明し、今後の分子設計に有意義な結果が得られた。
アジア諸国における双生児コホートの連携を構築するための企画調査

遺伝疫学・母子保健の資源として欧米先進国だけでなく近年ではアジア諸国でも精力的に双生児コホートが構築されている。欧米に比較しうる双生児コホート構築の可能性も含め、アジア諸国における双生児コホートの現状を調査し、併せて各国の連携関係を確認・強化することを目的に本研究を行った。1.国際共同研究の企画に向けての情報収集アジア諸国のツインコホートの現状分析を実施した。多胎児家庭の母子保健に関するアジア諸国の現状はほとんど知られていないので、併せてその実態を把握した。また、わが国でツインコホートの維持に要する具体的な金額的数値の評価とその概算を行った。関連諸学会との連携を通じて研究計画の全体的な推進およびアジアツインコホート構築の準備を行った。以上は研究組織全体で定期的にメールの交換・会議開催を行い、討論を重ね有機的な連動のもとに実施した。2.海外視察2005年8月にはシンガポール視察を行った。また、2005年6月29日7月2日にかけてカリフォルニア州で開催された国際双生児研究会議および国際行動遺伝学会に参加し、双生児研究の最新動向、ツインコホートに関する情報を収集し、併せてアジアツインコホート構築に向けての具体的な計画推進に関する打ち合わせを行った。3.特別講演とワークショップの企画・開催第20回日本双生児研究学会学術講演会(2006年1月、開催地:東京、大会会長:野中分担研究者)にアジアツインコホートに関わる研究者を招聴しシンポジウムを開催した。引き続き、日本を含め各国(韓国、中国、台湾、シンガポール、スリランカ)のTwin Registryや双生児研究の状況理解・情報交換をすべくワークショップを開催した。その結果、今後もアジア双生児研究会議を同様に開催するとともに、メーリングリストによる定期的情報交換、ホームページの作成など、今後に向けての前向きな連携を得ることができた。
薬物輸送リポソームを細胞に膜融合させるペプチドの開発研究

生物科学は細胞レベルでの生命現象の解明へ進み、医学領域でも疾患の発症機構の解明と治療法で細胞が標的となっており、薬物輸送リポソームを細胞に膜融合させることが研究されている。そこで、本研究では両者の膜融合を効果的に惹起させるペプチドを開発することを目的とし、明瞭な相転移を示すリポソームが膜融合したとき、脂質混合系のサーモグラムとなることを指標にして、示差走査熱量計により膜融合を測定した。細胞膜に作用して毒性を示すペプチドの蜂毒のメリチンのアミノ酸配列は疎水性が集中したアミノ末端側と塩基性アミノ酸5残基が局在するカルボキシル末端からなる。メリチンは中性リン脂質のリポソームとは疎水的に相互作用し、酸性リン脂質のリポソームとは静電的に相互作用し、膜融合を誘導することを示した。次いで、インフルエンザ・ウィルスの膜融合蛋白質であるヘムアグルチニンの膜融合活性部位の20残基の配列類似ペプチドを合成したものを京都大学の高橋敞教授から提供を受けて、膜融合を調べた。静電的な相互作用による膜融合を見るために負電荷をもつグルタミン酸を導入したペプチドを一方のリポソームに添加し、正電荷をもつリジンを導入したペプチドを他方のリポソームに添加すると、脂質膜の相構造に依存せず膜融合が進行した。一方、導入されたグルタミン酸をpH5.0の条件でプロトン化させた疎水性相互作用による膜融合は、静電相互作用に比較してその効率は著しく低下していた。このとき、ホスファチジルコリンに加えてコレステロールを添加すると、膜融合の効率が上昇することが示された。脂質膜の融合活性をもつペプチドとして蜂毒のメリチンを用い、リポソーム間の膜融合について、脂質の混合を示差走査熱量計により直接観測して検索する実験系を確立した。この方法を従来の方法であるリポソームに内包したでテルビウムのジピリコン酸による蛍光強度の増大およびリポソーム膜に添加した蛍光脂質の共鳴エネルギー移動を測定する方法と比較検討し、示差走査熱量計を用いた方法の有用性の確認した。また、メリチンは分子内に疎水性アミノ酸の領域と塩基性アミノ酸の領域をもつので、中性リン脂質と酸性リン脂質のリポソームの間で効率的に膜融合を惹き起こすことを見いだした。既にリポソームの融合活性をもつペプチドとして合成されているペプチドを京都大学化学研究所の高橋敞教授に提供して頂き、ここに確立した示差走査熱量計による測定法で各種リポソームに対する膜融合活性を測定した。さらに、ペプチド合成装置を購入して、これらの膜融合活性をもつペプチドのアミノ酸配列を参考にして、膜融合活性が予測されるペプチドの合成を開始した。一方、細胞へのリポソームの融合については、まず、ウイルスの膜融合タンパク質を発現した培養細胞に糖脂質を含むリポソームを融合させることに成功した。さらに、リポソームと細胞との直接の相互作用とエンドサイトシスについて、蛍光脂質で標識したリポソームを用いて蛍光顕微鏡下に観察し、ビデオに収録した後、画像解析により、膜融合と細胞内動態を検索するシステムを構築した。さらに、リポソームの脂質自身の細胞内の代謝についても放射性の脂質を用いて調べた。細胞膜に作用して毒性を示すペプチドの蜂毒のメリチンのアミノ酸配列は疎水性が集中したアミノ末端側と塩基アミノ酸5残基が局存するカルボキシル末端からなる。

メチリンは中性リン脂質のリポソームとは疎水的に相互作用し、酸性リン脂質のリポソームとは静電的に相互作用し、膜融合を誘導することを示した。次いで、インフルエンザ・ウィルスの膜融合蛋白質であるヘムアグルチニンの膜融合活性部位の20残基の配列類似ペプチドを合成したものを京都大学の高橋敞教授から提供を受けて、膜融合を調べた。静電的な相互作用による膜融合を見るために負電荷をもつグルタミン酸を導入したペプチドを一方のリポソームに添加し、正電荷をもつリジンを導入したペプチドを他方のリポソームに添加すると、脂質膜の相構造に依存せず膜融合が進行した。一方、導入されたグルタミン酸をpH5.0の条件でプロトン化させた疎水性相互作用による膜融合は、静電相互作用に比較してその効率は著しく低下していた。このとき、ホスファチジルコリンに加えてコレステロールを添加すると、膜融合の効率が上昇することが示された。
ソーシャル・キャピタルと学校教育の公共性・正統性に関する比較社会学的研究

公立学校の「信頼の低下」が言われ、その公共性・正統性が揺らいでいる近年の状況を踏まえ、パネル調査を含む4回の質問紙調査に基づき、ソーシャル・キャピタル(特に信頼)とコミュニティ意識や社会参加の関連構造について検討し、以下の諸点を明らかにした。(1)学校を含む種々の組織・団体の信頼が低下している。(2)それらの組織・団体の中で、大学や学校への信頼度は相対的に高い。(3)好ましい学校経験は、組織・団体への信頼や教育観、社会観、社会参加、地域への愛着、一般的信頼などの形成・促進に正の影響を及ぼす。本研究は、公立学校・教師の「信頼の低下」が言われ、学校教育の公共性が再審され、教育の新自由主義的・成果主義的な改革が進む今日の状況を踏まえ、ソーシャル・キャピタル(SC)を中核概念とし、初等・中等教育を中心に学校教育の意義・役割・要件とその再構築の可能性について、次の4つの検討課題を中心に、理論的・実証的に考察することを目的とするものである。(1)ソーシャル・キャピタルの概念・視座とその教育との関係に関する理論的検討(2)学校教育の意義・役割・機能と理念的・制度的要件に関する比較社会学的検討(3)公教育・公立学校・教育実践を支える基盤としてのソーシャル・キャピタル(SC:主に制度的・組織的信頼とコミュニティ)に関する実証的研究(4)国内における優れた教育改善の取組みとSCとの関係に関する事例研究と都道府県別・市町村別の計量的研究公立学校の「信頼の低下」が言われ、その公共性・正統性が揺らいでいる近年の状況を踏まえ、パネル調査を含む4回の質問紙調査に基づき、ソーシャル・キャピタル(特に信頼)とコミュニティ意識や社会参加の関連構造について検討し、以下の諸点を明らかにした。本研究は、公立学校・教師の「信頼の低下」が言われ、学校教育の公共性が再審され、教育の新自由主義的・成果主義的再編が進む今日の状況を踏まえ、ソーシャル・キャピタルを中核概念とし、初等・中等教育を中心に学校教育の意義・役割・要件とその再構築の可能性について、次の3つの側面に焦点化し、国際比較を含めて、理論的・実証的に考察することを目的とするものである。(1)ソーシャル・キャピタルの概念・視点及びその教育との関係に関する概念的・理論的検討(2)学校教育・公立学校の意義・役割・機能と理念的・制度的要件に関する比較社会学的検討(3)「ソーシャル・キャピタルとしての信頼・規範・社会的ネットワーク」と学校教育及び教職との関係に関する実証的・理論的検討以上3つの課題について、初年度の本年度は主に以下の作業を行った。(1)上記3課題についての文献研究と視察・研究会・学会大会等での討論・ヒアリングによる理論的検討(2)ソーシャル・キャピタルの概念・視点及びその教育との関係に関する理論的検討(3)2008年3月に実施した「信頼感に関する調査」結果の分析と報告書作成(09年7月刊行予定)(4)「教育の公共性と信頼感等に関する質問紙調査」の実施準備(09年5月-6月実施予定)(5)地域における教育改革の実施状況、教育・子どもの状況、学校教育に対する保護者・地域住民の意識・態度(信頼・期待・参加・協力・クレームなど)等についての視察・インタビュー調査2年目の平成21年度は、初年度に引き続き以下の三つの作業を行った。1.ソーシャル・キャピタルの概念・視点及びその教育との関係に関する概念的・理論的検討2.学校教育・公立学校の意義・役割・機能と理念的・制度的要件に関する比較社会学的検討3.ソーシャル・キャピタルとしての信頼・規範・社会的ネットワークと学校教育及び教職との関係に関する実証的・理論的検討の一環として2010年3月に「教育の公共性と信頼感等に関するインターネット調査」(2000標本)を実施(2008年3月の第1回調査の調査項目を約1/3入れ替えた継続調査)。2010年6月中に第一次研究成果報告書を印刷公表すべく準備中であるが、上記3の調査で、学校を含む社会的諸機関・組織・団体・企業や社会的影響力の大きい職業や年金制度などへ信頼感を調べた結果のごく一部を紹介すると、以下のとおりである。1.職業別では、特に「国会議員」は、『信頼できない計』(「信頼できない」と「あまり信頼できない」の合計)が89.8%と前回調査に続き高く、不信感が強い。以下、「不動産業者」(80.8%)、「評論家」(79.2%)、「新聞記者」(64.8%)に対する不信感が高く、「小中学校の教師」は52%となっている。それに対して、「学者・研究者」と「医者」は『信頼できる計』が67割で、前回調査に続き、信頼感はかなり高い水準にある。年代別にみると、「不動産業者」、「評論家」は40代、50代以上で、「新聞記者」は20代で不信感が高くなっている。

2.官庁、学校など30の組織・団体に対する不信感=『信頼できない計』は、「政党」(87.5%)、「政府」(81.3%)が高く、「中央省庁」(69.2%)、「生命保険会社」(61.0%)なども高くなっている。3.年金制度への信頼感では、前回調査に比べてやや改善したが、依然として『信頼できない計』が87.8%となっている(「信頼できない」43%、「あまり信頼できない」44.8%)。本研究は、公立学校・教師の「信頼の低下」が言われ、学校教育の公共性が再審され、教育の新自由主義的・成果主義的再編が進む今日の状況を踏まえ、ソーシャル・キャピタルを中核概念とし、初等・中等教育を中心に学校教育の意義・役割・要件とその再構築の可能性について、次の4つの検討課題を中心に、理論的・実証的に考察することを目的とするものである。(1)ソーシャル・キャピタルの概念・視点及びその教育との関係に関する概念的・理論的検討(2)学校教育の意義・役割・機能と理念的・制度的要件に関する比較社会学的検討(3)公教育・公立学校・教育実践の基盤としてのソーシャル・キャピタル=社会資本(社会的ネットワーク・互酬性規範・信頼)に関する実証的研究(4)国内における優れた教育実践と社会資本との関係に関する事例研究以上4つの課題について、3年目の本年度は主に以下の作業を行った。(1)文献研究と視察・研究会・学会大会(国内・国際)でのヒアリング・意見交換による理論的検討(2)全国各地における教育改革・教育改善の取り組みに関する調査(情報収集)と都道府県別・市区町村別データベースの作成作業(3)第3回調査(Web調査「生活環境と信頼感に関する調査」、2500サンプル、一部パネル調査)の準備と実施(2010年3月)(4)第1回調査「信頼感に関する調査」結果を中心とする成果報告書の作成・印刷(2011年3月)本研究は、公立学校の「信頼の低下」が言われ、その公共性・正統性が揺らいでいる近年の状況を踏まえ、ソーシャル・キャピタル(特に制度・機関・担い手に対する信頼)とコミュニティ意識や社会参加の関連構造について検討し、公立学校の信頼の回復と学校教育の公共性・正統性の再構築の可能性について探究するものである。そのために、パネル調査を含む4回の質問紙調査(サンプル数1、2回目2000、3、4回目2500で、4回目は東日本大震災関連を含む)を実施し、以下の知見を得た(ごく一部記載)。1)組織・団体に対する信頼では、政党と政府に対する信頼度が最も低く、信頼できない計(信頼できない+あまり信頼できない)の4回平均は政党88%、政府83%で、かつ大きな変化はない。次いで中央省庁が低く、信頼できない計・平均は69%だが、3、4回目はやや改善。次いで低いのは生命保険会社59%と市役所50%だが、両者とも年ごとに改善し4回目は前者54%、後者44%となった。信頼度が最も高いのは大学と病院で信頼できない計・平均33%、次いで公立中学校が同35%だった。2)好ましい学校体験(楽しさ、いい教師、いい友人)は、教育組織への信頼や、教育観、生活観、社会観、社会参加、地域への愛着、一般的信頼などに正の効果を示した。3)東日本大震災関連では、次の諸傾向が確認された。(1)「震災前から重要・大切だと思っていた」割合が5割以上の「家族・親戚」と「仲間・友人」を除く10項目で4割6割が「震災をきっかけに重要・大切だと思うようになった」と回答(ボランティア、故郷、地域交流、消防団、自治体、自衛隊は5割以上)。
Yeast Functional assayによる膀胱癌におけるp53変異の検討

BBN誘発膀胱腫瘍では26頭中12頭(46%)で変異が検出されたが全例で赤コロニーの比率は50%を下回った。BBN誘発膀胱腫瘍においてp53の変異があると判定された12頭の病理診断では組織型は全例移行上皮癌であった。BBN中止後短期経過群と長期経過群に分けると悪性度と深達度は長期経過群で進展している傾向が認められた。短期経過群では7頭中2頭のみクローナルな変異が同定されたのに対し、長期経過群では5頭すべてにクローナルな変異が同定された。クローナルな変異以外に非クローナルな変異も含めたすべての点突然変異は塩基別ではチミンに生じた変異が31例中17例を占めたがDNA鎖でチミンと結合しているアデニンに生じた変異は1例も認めなかった。クローナルな変異ではプリン塩基からピリミジン塩基へのトランスバージョンは検出されなかった。クローナルな変異の内訳はGからA、CからTのトランジションかそれぞれ1サンプルと2サンプルにみられTに関する変異が3サンプルにみられた。非クローナルな変異を加えるとCからTへの変異がGからAへの変異より多く(7対3)、Tに関する変異がAに関する変異より多かった(17対0)。以上の結果はBBN中止後、短期間経過したグループではラットの多発性膀胱腫瘍では非クローナルな変異が含まれており、皮膚癌にみられる発癌の1つの形態である場の癌化説の仮説に一致するものであった。しかしBBN中止後、長期間経過したグループにはクローナルな変異が検出された。すなわち、BBN誘発膀胱腫瘍においてp53の変異は発癌過程で早期に生じるものの、腫瘍の発育には重要な意味をもたないものと考えられた。(本研究では酵母を用いたp53 Yeastfunctional assayを発癌実験系が確立されているラット膀胱癌のp53の変異の検出に応用した。まず、F344ラット26匹に0.05%BBNを自由飲水させ膀胱癌を発生させた。生じた膀胱癌は、全例多発性の膀胱癌であった。膀胱癌ラットをBBN中止後短期間経過した群(S群)と長期間経過した群(L群)の2群に分けた。それぞれの腫瘍組織で全RNAを抽出し逆転写酵素を用いてp53 cDNAを得た後、PCR法によりDNA結合領域を含むp53cDNAを増幅した。得られたp53 PCR断片を酵母に導入し、Yeast functional assayを行った。プレート上のコロニー数をカウントし、赤(変異型p53)と白(野生型p53)コロニー数から赤コロニーの百分率を算定した。また、正常F344ラット膀胱組織をコントロールとしYeastfunctional assayを行い、p53の変異があると診断できる赤コロニーの比率を求め、変異の有無を判定した。その結果S群では15匹中7匹(47%)に、L群で11匹中5匹(46%)にp53の変異が検出され、全体では26匹中12匹(46%)がp53の変異があると判定できた。組織学的には悪性度、深達度ともL群で増悪する傾向があった。以上の結果よりラット膀胱癌ではp53が関与しない悪性進展の経路の存在が考えられた。またp53の変異があると判定した12匹のラットについては今後、赤コロニーを複数採取しp53cDNAを単離しそれぞれの塩基配列を同定し現在報告されているヒトのp53遺伝子の変異との関係、及び多発性膀胱癌のクローン性について考察する予定である。
煉瓦窯の記録、現場保存、公開に関する研究

初年度は、まず煉瓦造窯の保存状況を悉皆的に調査し現状を把握することを目的とし調査研究に取り組んだ。初年度研究計画として提示していた愛知県常滑市に所在する煉瓦造窯2件での調査は十分に実施することができた。1件目のINAXライブミュージアムでの調査は、当科研以前より実施していたことから、保存環境データや壁面の劣化状態、析出塩類の種類と分布を把握できていたため、初年度調査ではその情報に基づき、保存環境の年次変化と壁面の劣化進行を詳細に考察することができた。また、前年末より実施中であった修復作業が完了したことで、その前後での保存環境の評価ならびに修復による壁面状態への影響の検討を進めている。特に塩類析出に対して実施された薬剤塗布については、その効果と今後の影響を検討する必要があることをINAXライブミュージアム担当者との打ち合わせで確認した。2件目は、レストランとして活用されている共栄窯で、空調による保存状態への影響と同型の窯であるINAXライブミュージアムの窯との比較を通して、活用方法とそのための保存方策を検討している。塩類の析出状況も保存環境もINAXライブミュージアムとは異なることを確認し、その要因を考察した。また、比較調査として予定していたもののうち、埼玉県深谷市ホフマン煉瓦造窯と栃木県下野市ホフマン煉瓦造窯の基本調査も実施することができた。どちらも一般公開されている比較的保存状態の良好な大型の煉瓦造窯であり、これまでに保存修復措置も講じられてきた。そうした基礎情報と煉瓦造窯の保存・活用事例の収集を進めたことで、次年度に調査すべき煉瓦造窯を選定することができ、比較検討すべき項目もはっきりとした。初年度に得られたこれらの調査成果に基づき、学会発表と論文投稿を準備中である。また、次年度以降の調査研究でも使用できる機材も購入することができた。比較調査をより多数実施したいと考えていたが、2件にとどまった。また、INAXライブミュージアムでの修復作業が予定以上に長期化したため、修復後の状態確認はこれからが本番となる。比較調査を進め、対象とする煉瓦造窯ならびに煉瓦造建造物も随時追加していく。また、引き続きINAXライブミュージアムと共栄窯の調査を実施し、修復を伴う保存方策の検討と、煉瓦造窯の活用方策と保存方策の検討も進める。次年度は煉瓦造窯の修復事例についても情報収集し、INAXライブミュージアムの修復評価に役立てたい。INAXライブミュージアムでの修復作業が長期化し、修復後に予定していた調査が3回程度できなくなった。また、勤務校での授業および他研究活動のため、予定していた比較調査も実施できなかった。これら調査費用の次年度繰り越しを希望する。次年度は、繰り越し金をもとに初年度に実施できなかった比較調査を実施する。また、計画書に記載した他の比較対象の調査を実施するとともに、関連する煉瓦造建造物の選定と調査も実施する予定である。さらに、初年度の成果を論文投稿する予定である。
昆虫における植物ホルモン合成能の獲得が植食性の進化に及ぼしたインパクトの検証

近年の研究から、様々な昆虫が体内でオーキシンを合成する能力があることが明らかになってきており、昆虫における植物ホルモン合成能の獲得とゴール形成性や植食性との関連について注目が高まっている。昨年度に引き続き、クモ綱(クモ類、ダニ類)やヤスデ綱(ヤスデ類)、昆虫綱を含む様々な陸生節足動物におけるオーキシン(IAA)とサイトカイニンの内生量を分析した。その結果、IAAは昆虫の様々な目の他、ダニ目、クモ目、オビヤスデ目を含め、分析したすべての陸生節足動物分類群において確認された。とりわけ、ダニ類やヤスデ類ではIAA濃度が著しく高い傾向が認められた。一方、植物体内で活性を持つ2種類のサイトカイニンiP、tZのうち、tZあるいはその前駆物質tZRは昆虫綱においては無翅昆虫,旧翅類,多新翅類でほぼ認められず、準新翅類と完全変態昆虫でのみ、一定量以上の内生量を持つ種が確認された。一連の分析結果を、節足動物の食性(植食性あるいはその他)や高次分類群(クモ綱、ヤスデ綱、無翅昆虫,旧翅類,多新翅類、準新翅類、完全変態昆虫)と植物ホルモン内生量の関係を比較した所、IAAではいずれの間でも明確な関連性は認められなかったが、サイトカイニン(特にtZ)に関しては、植食性やゴール形成性の分類群で増加する傾向が認められ、ダニ目を含め、ゴール形成性が進化している分類群では高い傾向がみられた。一方、植食性の分類群でも、tZが見られないグループでは、いずれもゴール形成性が進化していないことが判明した。以上より、サイトカイニン合成能の獲得が植食性やゴール形成性の進化に関連している可能性が考えられた。前年度に実施予定であった実験(繰越新成分)を含め、当該年度に実施予定であった内容を予定通りに実施できたため。当初の計画通りに研究を継続し、成果を発表する予定である。昆虫における植物ホルモン合成能の進化的起源をさぐる目的で、クモ綱(クモ目)や昆虫綱の様々な目における植物ホルモンオーキシンとサイトカイニンの内生量を調査した。その結果、オーキシンはクモ目、トンボ目、カゲロウ目、バッタ目、ナナフシ目、シロアリ目、カメムシ目、コウチュウ目、トビケラ目、チョウ目など、分析したすべての分類群で確認された。一方、植物体内で活性を持つ2種類のサイトカイニンiP(前駆物質iPR)、tZ(前駆物質tZR)のうち、iPあるいはiPRは多くの昆虫類で確認されたが、tZあるいはtZRは植食性の目であるバッタ目やナナフシ目を含む多新翅類ではほぼ認められず、カメムシ目の一部の分類群や、完全変態昆虫でのみ、ある程度の内生量が検出された。興味深いことに、植食性の目の中でも、ゴール形成性が進化している分類群では、tZあるいはtZRを一定量体内に保持している傾向が認められた。一連の結果から、節足動物は進化のかなり早い段階でオーキシン合成能を獲得していた可能性があること、一部の植食性昆虫は、オーキシン合成能を増強して摂食の際に利用している可能性があること、及び、tZR/tZ合成能は、昆虫の中の一部の分類群でのみ獲得されている可能性が高いことなどが判明した。また、ホソヘリカメムシ幼虫の体内にはIAAが高濃度で含まれており、花期にホソヘリに吸汁されると、ツルマメでもダイズと同様の反応がみられた。両種ともホソヘリに吸汁された種子で発芽率の低下が認められ、全般的にツルマメよりもダイズの方が高かった。

以上から、吸汁によるこれらの生理的変化は昆虫側の積極的な操作によるものであり、その結果植物側に負の影響が及んでいること、および、ダイズでより感受性が高いことなどが示唆された。一部の実験において、申請時の予備調査の結果が再現されないという問題が生じたため、再度解析をやり直した。それに伴い、予算の一部を繰越申請し、当初2017年度に実施予定であった一部の実験を2018年度に後ろ倒しにする必要が生じたため。当初の計画通りに研究を継続し、成果を発表する予定である。2017年度に実施予定であった一部の実験を、繰越申請により翌年度に実施することとした。繰越予算により2018年度に技術補佐員を1名雇用し、2018年度に実施予定の実験と並行して、2017年度に実施予定であった実験も遂行することにより、当初の計画通りに研究を進めることとした。
分裂期染色体凝縮におけるコアヒストン・ヌクレオソームの役割

ヒストンは染色体に含まれるタンパク質のおよそ半分もの質量を占める。しかし、分裂期の染色体構築においてヒストンがどのような役割を果たすのかという問題は、適切な実験方法がないため、十分な検討がなされてこなかった。本研究では、この本質的な問題を解くために、ヒストンをほとんど含まないマウスの精子クロマチンをカエルの卵抽出液中でインキュベートする無細胞系を考案した。この実験系では、ヒストンやコンデンシンなど卵由来のタンパク質をクロマチンに取り込ませ、試験管内で染色体を作ることができる。興味深いことに、ヒストンシャペロンであるAsf1を卵抽出液から除くと、ヒストンのクロマチンへの取り込みが完全に阻害された。このヒストンを含まないクロマチンは全体として凝縮度が低く不鮮明な形状を示すものの、その内部にはDAPIで強く染色される明瞭な軸が観察された。この特徴的な染色体様構造において、コンデンシンIIはもっぱら軸に局在するのに対し、コンデンシンIは軸だけでなくその周囲のクロマチンループにも検出された。これらの結果から、コンデンシンIIはヒストン非依存的に染色体軸の形成を促進するのに対し、コンデンシンIはヒストンと協調してクロマチンループの組織化に関与することが示唆される。また、今回考案した無細胞系を発展させることにより、DNA複製や損傷修復、核形成など、クロマチンの関与する様々な現象においても、ヒストンが果たす機能の詳細な解析が可能になると期待される。この新しい実験系の開発は、東京大学の大杉美穂博士との領域内共同研究として行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。分裂期染色体の構築は遺伝情報の正確な分配に不可欠なプロセスである。しかし、ヌクレオソームやコアヒストンが染色体構築にどのように関与するのかという本質的な問題の理解は殆ど進んでいない。この疑問を解くための第一歩として、今年度、私は、試験管内で分裂期染色体を再構成する画期的な実験系を確立した。この再構成系では、6種類のタンパク質(コアヒストンH2A-H2B、3種類のヒストンシャペロン[ヌクレオプラズミン、Nap1、FACT]、コンデンシンI、トポイソメラーゼII)を、ATP存在下でカエル精子クロマチン(コアヒストンH3-H4を含む)を混和するだけで染色体構築のプロセスを再現できる。上記の因子をひとつでも欠くと染色体は作られないことから、3種類のヒストンシャペロンそれぞれが異なる役割を果たし、H3-H4だけからなるテトラソームは染色体の基本構造になり得ないと考えられる。また、C末端の変成領域が酸性アミノ酸に富むH2Aバリアント(H2A.X-F)を用いる必要があったことから、DNAとヒストンの相互作用の不安定化が染色体構築に重要である可能性が示唆される。さらに、染色体構築に必要かつ十分な翻訳後修飾は、サイクリンBーCdk1によるコンデンシンIのリン酸化のみであることが明らかになった。これらの結果から、分裂期における染色体構築というダイナミックな現象は、驚くほどシンプルなメカニズムによって制御されていることが強く示唆される。染色体再構築に不可欠な未同定因子の探索が順調に進捗したことによって、当初の目標であった再構成系の確立まで順調に漕ぎ着けられた。この再構成系は現在考えられうる最少の因子で構成されており、おのおのの因子の機能、これらの協調的効果をこれまでにない詳細なレベルで解析できるようになった。事実、再構成系を用いたからこそ明らかになった知見がいくつも得られている。また、これまでの成果は、国際学会で発表し、関連分野の研究者からきわめて高い評価をもって迎えられた。一見すると複雑に見える染色体構築という現象を、新たな視点から捉え直し、より詳細な理解に資する視座を得たことは、今日の細胞生物学研究において極めて大きな価値を持つと考えられる。

本年度は、染色体再構成系をさらに洗練しつつ、染色体内でクロマチンがどのように折り畳まれるのかという古典的問題を解明するために、以下に挙げる3つの目標の達成を目指す。(1)染色体を再構成する条件の最適化:反応液中のイオン強度や緩衝塩の種類(HEPES,リン酸ナトリウム)に変化させる、または、PEGなどのcrowding agentsを加えて細胞内の分子混雑度を模倣するなどの改変によって、再構成染色体の形状が卵抽出液で作られる染色体に近づけられるかを検討する。Mg2+イオン濃度がDNAやヌクレオソームアレイの水溶液中での振舞い(凝集度)に影響するという古くから知られる観察にも着目し、周辺の環境がヌクレオソームや染色体に与える影響を検討する。(2)ヒストンH2Aが染色体構築に果たす役割の理解:現行の再構成系では、受精卵・初期胚に特異的なH2Aバリアント(H2A.X-F)を用いなければならない。まず、H2A.X-Fに変異体を導入することで、どの領域が染色体構築に積極的な関与をしているのかを明らかにする。これと並行して、カノニカルH2Aを用いた場合でも染色体を再構成できる条件(特に、現行の実験系では何らかの因子が足りない可能性)を検討し、H2A.X-FとH2Aの染色体構築における機能差を解明する。(3)すべてのヒストンを操作できる再構成系の確立:カエルと異なり、4種類のすべてのコアヒストンを殆ど含まないヒトやマウスの精子クロマチンを出発材料にして、染色体を再構成する方法を検討する。現行の6種類のタンパク質とH3-H4以外のタンパク質が必要である可能性を想定し、カエル卵抽出液の分画によって候補因子を検索する。こうした試みが成功すれば、まず、ヒストンH3をバリアントや変異体に置き換えたときの影響を解析する。27年度が最終年度であるため、記入しない。