hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能性化合物の溶液・固体NMR法による分子間構造解析

ビスグアニジン型化合物と各種酸性化合物との複合体を用い、単結晶X線解析や溶液・固体NMRを組み合わせた機能性化合物の分子間相互作用を含む構造解析を行った。ビスグアニジン-ヒ酸複合体の固体NMRは想定される本数よりも多いシグナルを示した。これは複合体中のグアニジン部位が非等価であるというX線解析の結果を反映したデータであり、固体NMRが分子間相互作用を持つ複合体の構造解析に有効な手段となる可能性を示した。これまでに合成を行ってきたビスグアニジン型塩基について、その構造について密度汎関数法を用いた理論計算を行った。さらに,これらについて詳細なアプローチを行い,プロトンスポンジなどの既存の強塩基と比較して,より強い塩基性を有することを示唆する結果を得た(論文2)。一方,酸性分としてカルボン酸以外のリン酸やヒ酸などの無機酸に対するオルトビスグアニジノベンゼンとの相互作用について知見を得るために,ポリマーに固定化したビスグアニジンを新たに合成し,これらについての各種酸性分の取り込み実験を行ったところ,期待したとおりヒ酸などの酸性分と効果的に結合することを明らかにし,東南アジア等で問題になっているヒ酸中毒の解決の糸口を見出した(学会等で発表)。その他,光学活性なグアニジンを用いた不斉反応を検討した。特に,これまでに開発してきたキラルグアニジンのベンゼン環上にメチル基を導入したトルイル型キラルグアニジンを用いた場合,イミノ酢酸エステルとアクリル酸エチルとのMichael付加反応において,既存のグアニジンと比較して反応の加速がが見られた。このことについて,学会発表,および論文発表(論文3)を行った。さらに,オルトビスグアニジノベンゼン(BG)と安息香酸(BA)の複合体(1:1,1:2,1:3,1:4)を合成し,これら複合体の高分解能NMR ECA-600(4mmCP-MSプローブ)を用いて測定を始めた。詳細は,平成20年度引き続き行う予定である。これまでに合成を行ってきたビスグアニジン型塩基(BG)と安息香酸(BA)との複合体の構造について計算化学により評価した。すでに単結晶X線解析により求められているBG:BA=1:n(n=04)の複合体の結晶構造から計算される体積と、対応する複合体のNMRより求められる自己拡散係数との間に相関が見られ、この内容について論文を投稿した(Heterocycles)。一方、BGとリン酸やヒ酸などの酸との混合物のNMR解析により、水溶液中で1:1の安定な錯体を形成することを見出し、この水溶液を乾固したものを再結晶して安定なBG-酸成分錯体の結晶を得、単結晶X線解析によりその構造を決定した。さらにポリマーに固定化したビスグアニジンを合成し、各種酸性分が水溶液中より抽出可能であることを見出した(論文1)。その他、光学活性なグアニジンを用いた不斉反応やBGの不斉結晶化を検討し、学会発表、および論文発表を行った。
白血球血管外遊走制御分子GRIF-1の可溶性組み換え蛋白質投与による血行転移制御

癌の血行転移は多段階のステップから構成されているが、その全体像は未だ不明であり、また、このステップを阻止する事による血行転移の抑制も成功に至っていない。申請者は、白血球の細胞接着制御の研究の中から、インテグリン依存性の細胞接着と細胞運動を制御する細胞膜GPIアンカータンパク質を同定、この分子をGRIF-1と命名した。インテグリン依存性の細胞接着と細胞運動を制御する分子GRIF-1による癌細胞の血行転移抑制能について、その有効性を解析した。1.CHO,COS-7,HeLa細胞にGRIF-1遺伝子を導入し、GRIF-1を一過性に発現させると、細胞伸展が抑制された。2.GRIF-1 stable transformantにおいて、細胞接着が抑制された。その細胞接着抑制効果は、基質特異性は無かった。3.可溶型GRIF-1(sGRIF-1)の大量産生に適したtransformantを樹立できなかった。4.高転移系メラノーマ細胞株において、遺伝子導入によるGRIF-1分子の発現が、抑制されていると考えられた。(GRIF-1の命名の由来は、GPI-anchored regulator of integrin function-1であるが、integrinの機能以外にも同分子が制御する可能性が考えられたため、GPI-80と改名した。)癌の血行転移は多段階のステップから構成されているが、その全体像は未だ不明であり、また、このステップを阻止する事による血行転移の抑制も成功に至っていない。)
ヨーロッパの南太平洋像の変容と、現代太平洋文学における主体形成についての研究

本研究では、19世紀の西洋人が抱いた南太平洋のイメージを、イギリス文学作品を中心に検証する一方で、現代のポリネシア地域出身の作家がそうしたイメージを作品の中で、自分たちのアイデンティティとどのように折り合いをつけているかを分析した。また、環太平洋地域に属しながらも、太平洋に植民地を持った戦前の日本における太平洋世界へのまなざしの政治的意義も、併せて検証した。本プロジェクトの初年度は主に(1)歴史文献の収集と読解、(2)南太平洋文学作品の読解と分析、(3)南太平洋の作家とのコネクション作り、の3つを中心に行い、21年度、22年度のための基礎研究に注力した。歴史文献に関しては、19世紀から20世紀にかけての旅行記、とりわけBeatrice Grimshawによる南海文献を読み解いた。彼女のテクストは、19世紀中頃までに形成された南太平洋のイメージを表象方法や関わり方を変えながらも、本質的にはほぼそのままの形で20世紀へと移譲した点で注目に値し、特に20世紀半ばにかけて映画と観光産業が共謀した「南太平洋の楽園」というイメージの固定化を探るためには重要な資料となる。南太平洋作品はAlbert Wendtの作品を足がかりに、太平洋文学の第一世代にあたるEpeli Hau'ofa(小説)、Sudesh Mishra(詩)、Larry Thomas(戯曲)、現代女流作家であるSia Figiel(小説、詩)、Frances Koya(詩)といった作家の作品を読み進め、南太平洋文学の多様性とそこに通底するテーマを考察した。文学表象の多様性については当初予想していたよりも、バラエティに富んでいることを確認した。とりわけ、3月の3週間にわたる太平洋地域での滞在において南太平洋文学を訪問した際、多くの文学批評家や作家と親交を得、彼らとのインタビューや意見交換によって、新たな作品の発掘や、主題の変遷に関する世代間の態度の差異などを発見できたことは本年度の大きな収穫だった。また、オークランド大学での資料収集で得た知己を通じて可能となったAlbert Wendtとの親交は、今後の研究計画において重要な意味を持つと期待できる。平成21年度は前年度に引き続き、太平洋文学の関係者への個別接触、関連資料の収集と分析を中心に活動した。今年度の最大の成果は、太平洋世界に大きな影響をふるう作家と親交を持てたことである。申請者はオークランドとハワイにおよそ20日間滞在し、オークランドにおいては太平洋文学を代表する作家Albert Wendt、ハワイでは劇作家・映画監督のVilsoni Herenikoとのインタビューを行った。とりわけWendtへのインタビューは彼の作品の大半を網羅した内容で、太平洋文学の第一人者が自己の軌跡をどう表現し客体化しているかという点において貴重な資料となりうる。資料収集は、主にオークランド大学とハワイ大学で行った。ハワイ大学は文献もさることながら、太平洋関連のドキュメンタリーや映画などの映像関係についても数多くの収蔵があり、10日弱の滞在ではその一部を確認したにすぎないが、それでも太平洋世界の概要を把握するうえで有用な資料を入手することができた。こうした活動の一方で、学会発表と論文というかたちで具体的な成果を出した。第61回日本英文学会中部支部大会(2009年10月17-18日、愛知学院大学)においては、「太平洋文学の『語り』:Albert Wendtが描くポスト・コロニアリズム的主体の可能性」という題目で、Black Rainbow(1992)のナラティヴ手法と太平洋世界の政治性との関連を発表した。また、「太平洋文学の第一世代小説家:エペリ・ハウオファとアルバート・ウェント」(『言語文化論叢』、2010)では、太平洋文学の第一世代のWendtとHau'ofaを比較しながら、両者の作品に通底する西洋への態度を論じた。平成22年度は本研究期間の最終年度となるため、過去3年間の成果のまとめとその発表を中心に研究活動をした。本研究の目的は、ヨーロッパ植民地主義における南太平洋像の形成プロセスをイギリス文学作品やヨーロッパ思想を参照し検証すること、言説としての南太平洋に対する諸反応を20世紀後半の南太平洋作家による文学作品において探ることである。前者においては、実際にサモアから南太平洋の実情をヨーロッパに対して問いかけたR.L.スティーヴンソンを中心に研究を進めた。さらにはスティーヴンソンの著作にとどまらず、彼自身の南太平洋観を相対化する視点として、スティーヴンソンの伝記的小説を書いた中島敦を据え、受け継がれる言説としての「(南)太平洋」の一局面を明らかにした。これについては、2010年7月スターリング大学での国際スティーヴンソン学会において"Locating the Pacific : Stevenson in Japanese Literature"というタイトルで発表し、「太平洋を描く:中島敦のスティーヴンソンとスティーヴンソンのサモア」として研究論文にまとめた。他方、上で検証した南太平洋像に対する現地作家の反応については、前年度にまとめたエペリ・ハウオファとアルバート・ウェントについての研究成果をさらに発展させた。植民地主義における権力旨関係にロボットのメタファーを援用することで、英米文学史や思想史といったより広い脈絡における太平洋文学の意義を探った。

その成果め一部は「異種混交のロボット:現代太平洋作家における主体へのまなざし」という題名で、2010年10月に開催された日本英文学会中部支部のシンポジウムにおいて発表した。
含フッ素シランカップリング剤による繊維の表面フルオロアルキル化

一鎖型および二鎖型シランカップリング剤を使用して,各種温度および処理時間の熱処理によるPETフィルムを改質した結果、PETのTg点である80°C以上であれば表面自由エネルギーはγ_s^d=912mN/m,γ_s^p=38mN/mにまで大きく低下し改質効果は殆ど一定となり,時間も5分で十分であった.表面のESCA分析で,C_<15>スペクトルにおいて基質PETに由来するC=0に帰属される289eVのピークが明確に認められた.この事は,シラン層の厚みはESCAの深さ情報の極限である50Åよりも浅いことを示しており,数分子層のシロキサンネットワークと考えられる.本改質は耐薬品性に非常に優れ,ドデカン,キシレン,酢酸エチル,テトラクロルエチレンなどの有機溶剤および酸に浸漬放置をしても表面自由エネルギーおよびESCAスペクトルには変化が認められない.フロン系溶剤に長時間浸漬すると撥水性には殆ど変化の無いものの撥油性の明らかな低下が認められた.ESCAより,クラスター度の低いシラン成分の溶解除去に伴う表面フッ素量の低下が原因と考えられる.しかし,シロキサン結合はアルカリに弱く,短時間の浸漬でもシラン層のSi-0-Siネットワークが加水分解により破壊され,ESCAより表面フッ素量の低下は著しく,表面は大きく極性化(γSpの増大)され撥水性は低下したが,撥油性の低下は殆どなかった.これらの事から,シランカップリング剤の表面吸着や表面での強固なシロキサンネットワーク被膜形成あるいは表面に僅か存在する水酸基などの極性基との化学結合によるのではなく,熱処理によりシラン剤の-CH2CH2-部分がPETにアンカリング固着するのが改質機構であることが分かった.さらに、フルオロアルキル基のみならず親水基も有したシランカップリング剤の合成にも成功したので、今後これらを用いた繊維のFLIP-FLOP型表面改質についても検討したい。本研究では、新規な含フッ素シランカップリング剤により各種繊維織物の表面フルオロアルキル化を行い、表面改質(表面自由エネルギー制御)と洗浄性の関係を界面化学的立場から明らかにすることを目的として行った。平成6年度の研究の結果、以下に挙げる知見が得られた。1.若干時間がかかったものの、各種の新規含フッ素シランカップリング剤(1鎖型および多鎖型)を合成し、セルロース系繊維ならびにポリエステルを始めとする合成繊維の表面フルオロアルキル化改質を行ったところ、単純なシリコン系改質剤では得られない非常に優れた撥水・撥油性を示すことが明らかになった。2.各種表面改質フィルムを用いて接触角測定を行い、表面改質による表面自由エネルギー変化を定量したところ従来の含フルオロアルキルアクリレートポリマー樹脂による表面改質と比較して非常に優れた撥水・撥油改質効果の得られることが明確となり、本研究の含フッ素シランカップリング剤の表面改質剤としての優位性が明らかになった3.撥水・撥油性の立場から、接触角測定を基に各種有機溶剤に対する表面改質の耐久性を検討した結果、本研究のシランカップリング剤による改質は有機溶剤に優れた耐久性を示し、従って、ドライクリーニング耐性に優れていることが明らかになった。これらの結果をもとに、平成7年度は分光学的手法により表面分析を行い、表面フルオロアルキル基量を求めることにより、表面の化学的改質の定量化を行うとともに、表面自由エネルギー変化との関係を明らかにすることで表面自由エネルギー制御について統合的に解明していく計画である。

一鎖型および二鎖型シランカップリング剤を使用して,各種温度および処理時間の熱処理によるPETフィルムを改質した結果、PETのTg点である80°C以上であれば表面自由エネルギーはγ_s^b=912mN/m,γ_s^p=38mN/mにまで大きく低下し改質効果は殆ど一定となり,時間も5分で十分であった.表面のESCA分析で,C_<15>スペクトルにおいて基質PETに由来するC=Oに帰属される289eVのピークが明確に認められた.この事は,シラン層の厚みはESCAの深さ情報の極限である50Åよりも浅いことを示しており,数分子層のシロキサンネットワークと考えられる.本改質は耐薬品性に非常に優れ,ドデカン,キシレン,酢酸エチル,テトラクロルエチレンなどの有機溶剤および酸に浸漬放置をしても表面自由エネルギーおよびESCAスペクトルには変化が認められない.フロン系溶剤に長時間浸漬すると撥水性には殆ど変化の無いものの撥油性の明らかな低下が認められた.ESCAより,クラスター度の低いシラン成分の溶解除去に伴う表面フッ素量の低下が原因と考えられる.しかし,シロキサン結合はアルカリに弱く,短時間の浸漬でもシラン層のSi-O-Siネットワークが加水分解により破壊され,ESCAより表面フッ素量の低下は著しく,表面は大きく極性化(γSpの増大)され撥水性は低下したが,撥油性の低下は殆どなかった.これらの事から,シランカップリング剤の表面吸着や表面での強固なシロキサンネットワーク被膜形成あるいは表面に僅か存在する水酸基などの極性基との化学結合によるのではなく,熱処理によりシラン剤の-CH2CH2-部分がPETにアンカリング固着するのが改質機構であることが分かった.
宇宙における構造システムの動的不安定現象に関する研究

宇宙環境下では、構造システムは太陽輻射圧、重力傾度トルク、大気抗力、あるいは電磁気力などの宇宙環境外力をうける。またそれらと同時に姿勢変化に大きく依存する熱入力がある。構造の柔軟さとこれら諸外力や熱入力による連成効果により、宇宙構造システムの応答は大きな影響を受ける。特に応答が発散するような場合は、その制御性をも含めて設計の最初から十分な検討がなされなければならない本質的な研究課題である。実際の軌道上の構造物は上記の諸外力や熱入力の様々な組合せのもとに複雑な挙動をするわけであるが、本研究では、太陽輻射圧を受けるソ-ラ-セイルブレ-ドと重力傾度トルクを受けるテザ-システムを扱った。前者では理論解析により宇宙構造物システムにはそのような動的不安定現象が存在することを示し、複雑な不安定応答を十分に解明することができた。後者ではおもに実験解析によって応答をビデオ撮影して、そのような構造システムの挙動を具体的に視覚化することができた。研究実績を列挙すると、以下の通りである。1.太陽輻射圧のソ-ラ-セイルブレ-ドの構造変形に応じた数式表現の導出2.ソ-ラ-セイルブレ-ドの動的不安定現象存在の数値計算による証明3.ソ-ラ-セイルブレ-ドの不安定現象の的確な理解4.宇宙テザ-システムの地上実験装置の試作5.宇宙テザ-システムの応答の視覚化と理論解析結果との比較これらの成果は本研究分野における世界に先駆けた萌芽的な業績と言うことができると思われる。これらをふまえて、将来の大型宇宙システムの構成概念そのものの可否についての選択がはじめて可能となる。
アナログ-フーリエ変換を応用したレーザスペックル干渉計による実時間振動測定

面内振動を非接触かつ実時間で計測するために,2開口法レーザスペックル干渉計と,その干渉縞の光強度信号をアナログ電子回路により実時間でフーリェ変換して干渉縞の位相変化を求めるアナログフーリエ変換回路を組み合わせた新しい実時間面内振動測定機を試作し,その測定範囲および測定精度について理論的ならびに実験的な検討を加えた.得られた主な結果を以下に示す.1.アナログフーリエ変換の提案:2開口法レーザスペックル干渉計の干渉縞の周波数分析をアナログ電子回路により行うアナログフーリエ変換を提案した.この手法により,光学系に依存する干渉縞の空間周波数成分のみの位相を得ることができ,被測定体の面内変位を実時間で計測できることを示した.2.アナログフーリエ変換回路の試作:提案したアナログフーリエ変換手法に基づいて,クロックパルス発生器,正弦波・余弦波発生器,乗算器,積分器,逆正接関数発生器よりなるアナログフーリエ変換回路を試作した.3.アナログフーリエ変換回路の特性解析:試作した回路の位相出力特性を理論的ならびに実験的に検討した.その結果,縞周波数に依存する非線形感度や飽和特性を明らかにするとともに,高精度測定のために必要な縞周波数を求めた.また低周波や高周波の雑音が混入した信号に対しても正確に位相検出ができることを確認した.4.変位の測定実験:鋼製ブロックを積層圧電素子で駆動し,その静的変位ならびに振動変位を,試作した測定機により測定した.その結果,静的変位測定では,測定可能範囲15mumで測定誤差±0.5mumを達成した.また振動測定では,最高サンプリング周波数470Hzにおいて測定誤差±0.6mumを達成し,本研究の目的とする実時間での面内振動測定が可能であることを確認した.面内振動を非接触かつ実時間で計測するために,2開口法レーザスペックル干渉計と,その干渉縞の光強度信号をアナログ電子回路により実時間でフーリェ変換して干渉縞の位相変化を求めるアナログフーリエ変換回路を組み合わせた新しい実時間面内振動測定機を試作し,その測定範囲および測定精度について理論的ならびに実験的な検討を加えた.得られた主な結果を以下に示す.1.アナログフーリエ変換の提案:2開口法レーザスペックル干渉計の干渉縞の周波数分析をアナログ電子回路により行うアナログフーリエ変換を提案した.この手法により,光学系に依存する干渉縞の空間周波数成分のみの位相を得ることができ,被測定体の面内変位を実時間で計測できることを示した.2.アナログフーリエ変換回路の試作:提案したアナログフーリエ変換手法に基づいて,クロックパルス発生器,正弦波・余弦波発生器,乗算器,積分器,逆正接関数発生器よりなるアナログフーリエ変換回路を試作した.3.アナログフーリエ変換回路の特性解析:試作した回路の位相出力特性を理論的ならびに実験的に検討した.その結果,縞周波数に依存する非線形感度や飽和特性を明らかにするとともに,高精度測定のために必要な縞周波数を求めた.また低周波や高周波の雑音が混入した信号に対しても正確に位相検出ができることを確認した.4.変位の測定実験:鋼製ブロックを積層圧電素子で駆動し,その静的変位ならびに振動変位を,試作した測定機により測定した.その結果,静的変位測定では,測定可能範囲15mumで測定誤差±0.5mumを達成した.また振動測定では,最高サンプリング周波数470Hzにおいて測定誤差±0.6mumを達成し,本研究の目的とする実時間での面内振動測定が可能であることを確認した.
ＸＹ型からＺＷ型へ性決定機構の進化

遺伝的にオスとメスを決める性決定の仕組みには、大きく2つが存在する。哺乳類に代表されるXX/XY型と鳥類に代表されるZZ/ZW型である。近年、2つのタイプは相互変換が可能であることがわかってきた。我が国に生息するツチガエルは2つのタイプが地域集団に別々に存在しており、性決定機構変換の仕組みを解明する上で、最適な研究材料と言える。本研究では、2つのタイプが接触した近畿地方において、性決定の仕組みがZW型に収束した集団を発見し、その変換の遺伝学的、進化学的仕組みを明らかにした。その際、既に遺伝子退化が始まっていたW染色体がX染色体と入れ替わり、新しいW染色体として若返る現象も明らかにした。遺伝的な性決定の仕組みには、XX/XY型とZZ/ZW型の2つのタイプが存在する。我が国に生息するツチガエルはその2つの性決定機構を有しており、タイプは地域集団よって異なる。とくに関ヶ原付近では両タイプの集団が近接し、まさに雌雄を決する戦いが展開されている。近年、その周辺において、既に両タイプが接触した結果、性決定の仕組みがZW型にに収束した集団を発見した。本研究では、この集団を遺伝学的、実験発生学的に解析し、接触によって展開された性決定機構変換の実態を解明する。そして、XY型とZW型相互変換の進化仮説を提唱することを目的とする。平成25年度は以下の結果を得た。ZW型とXY型の人為交雑による接触の再現。昨年度行った2通りの交配、XX♀x ZZ♂とZW♀x XY♂について、その子孫の性染色体構成と性を調べた。XZはその多くが♀であった。他方の交配で得た子孫では、ZYが♂、WXが♀、ZXは同様に多くが♀となり、WYは♂ないしは♀となったが、その比率はシリーズによって異なっていた。WWおよびYYの作成による遺伝子退化の確認。ZW♀x WY♂の交配を6シリーズ行ったところ、全てにおいてYYが受精後10日目で死亡した。一方、WY♀x XY♂の交配を行ったところ、YYは死亡せず変態まで発生した。しかし、成熟後YY個体の比率を調べたところ、期待値より有意に低かった。以上の結果から、WYは雌雄に分化すること、そしてW染色体には致死遺伝子が存在する一方、Y染色体には明確な致死遺伝子が存在しないこと、しかし、YYの生活力は弱いことがわかった。ZW集団とXY集団が交雑した場合、XZの多くが♀となり、W染色体が集団から消失し、Y染色体の比率も低下することが実験によって証明された。我が国には、性決定機構がXY型とZW型のタイプを地域集団に有するツチガエルが生息しており、近年、両タイプの境界地域において接触が生じた結果、性決定の仕組みが一方に収束した集団(新ZW集団)を発見した。本研究では、この集団を遺伝学的、実験発生学的に解析し、接触によって展開された性決定機構変換の実態を解明することを目的とする。平成24年度は、以下の結果を得た。1.XY型とZW型の集団が接触している地域を中心として合計27集団について、ミトコンドリアCyt-B遺伝子と性決定型を調べた。その結果、琵琶湖西岸から南へ下る6つの集団が新ZW型集団として確認された。2.次に性連鎖遺伝子Sox3遺伝子の上流に存在するマイクロサテライトを解析し、新ZW集団の性染色体の起源を推測した。その結果、まず、W染色体とX染色体については、ZW集団のW染色体はすべて1つの対立遺伝子M4をもち、XY型集団のX染色体はM16までの6つの対立遺伝子を有していた。新ZW型集団のW染色体はM1、3、5の対立遺伝子を持っていたことから、そのW染色体はXY型集団のX染色体由来であることを示している。一方、新ZW型集団のZとY染色体については、ZW型集団のZ染色体の対立遺伝子が多く見られ、わずかにXY型集団のY染色体の対立遺伝子が確認された。これは、新ZW型集団のZ染色体は主にZW型集団のZ染色体に由来し、わずかにXY型集団のY染色体が導入されたことを示している。3. ZW型2集団とXY型2集団を選び、相互交配を行い、性比を調べた。ZW♀xXY♂の5つの交配では、♀の比率が22.2-56,1%、平均41.4%と雄に性比が傾き、XX♀xZZ♂の4つの交配では、59.2-100%、平均79%と性比が雌に大きく偏った。

性比偏りの原因は、平成25年度に各個体の性染色体構成を調べる事で推測が可能になると予想される。性が遺伝的に決定する仕組みには、XY型とZW型の2つの代表的なタイプが存在する。我が国には、2つのタイプを地域集団に有するツチガエルが生息する。とくに関ヶ原付近では両タイプの集団が近接し、まさに雌雄を決する戦いが展開されている。近年、その周辺において、既に両タイプが接触した結果、性決定の仕組みが一方に収束した集団を発見した。本研究では、この集団を遺伝学的、実験発生学的に解析し、接触によって展開された性決定機構変換の実態を解明する。そして、XY型とZW型相互変換の進化仮説を提唱することを目的とする。平成26年度には以下の結果を得た。1.ZX♀x ZZ♂の交配による新ZW型性決定機構進化の再現:琵琶湖周辺に発見した新しいZW型集団は、もとのZW型集団とそれに隣接するXY型集団が交雑した結果、性決定機構がZW型に収束したというのが私達の仮説である。昨年度までの実験により、この新しいZW集団のW染色体はもとのZW集団由来のW染色体ではなく、XY集団のX染色体由来であることがわかった。それゆえ、ZX♀x ZZ♂(ないしはZY♂)が新ZW型性決定機構の原型であると予想される。そこで、実際に実験室でその交配を再現した。3つの交配シリーズでは、それぞれ子供のZXの多くがメス、多くがオス、オスとメスがほぼ半分となり、ZXがほぼ全てメスになるという私達の予想とは異なる結果となった。2.混在地帯における野外交配の観察:滋賀県甲賀市の集団では、現在、ZW型とXY型が接触する状態にあると予想される。実際、この集団で5つの卵塊を採集し、そこから発生した幼生の性連鎖遺伝子マーカーを調べ、親の性染色体構成を推定した。その結果、いずれの親も、ZW型メスとXY型オスの組み合わせであることが予想された。以上の結果と昨年度までの結果を加え、性決定機構変換の仮説を構築した。遺伝学本年度は研究計画に従い主に2つの実験を行い、ほぼ予想された次の結果を得た。1)XY型とZW型集団の正逆交配によって得た個体について、性染色体の遺伝子型と性を調べた。その結果、XZは多くが♀に分化すること、一方、ZYは♂、WXは♀、WYは雌雄両方に分化し、その比率は交配シリーズによって異なった。2)WWとYY個体を作成し、性染色体上の遺伝子退化を調べた。その結果、WW個体は受精後10日ですべて死亡したことから既に遺伝子退化が進んでいることがわかった。一方、YY個体は成熟したことから致死遺伝子が存在しないことがわかったが、成熟後の比率が低かったことから生活力は低いと予想される。以上の結果により、2つのタイプ間で交雑が生じた場合、W染色体が消失し、Y染色体の比率も低下する要因が証明できた。本年度は、次の3つの実験計画を立て、その概ねを達成できた。1)ツチガエルのXY型集団とZW型集団、そしてその間に位置する新ZW集団を合計27集団からカエルを採集し、それぞれのミトコンドリアCyp-B遺伝子と性決定型を解析した。2)27集団について、性連鎖遺伝子Sox3の上流域に存在するマイクロサテライトを解析し、新ZW集団の性染色体の由来を推測できた。3)XY型とZW型集団の交雑を行い、正逆で性比の偏りが異なることを明らかにした。当初の計画に従い実験を遂行する。平成26年度は、XZ♀x ZZ♂の交配を行い、その遺伝子型と性を調べることで、W染色体を必要としない新たな♀へテロ型の性決定機構が成立するかどうかを確認する。
末梢神経系に存在するマクロファージの起源と機能の解明

各種遺伝子改変マウスを組み合わせ、前駆細胞と考えられる細胞を蛍光ラベルすることで、末梢神経内マクロファージの起源と末梢神経内への侵入時期と経路を同定する。さらに、発生期、発達期や成獣において、時期特異的に末梢神経内マクロファージを除去することで、末梢神経内マクロファージの新たな機能を見出す。単離した末梢神経内マクロファージの発現遺伝子をRNAシークエンスで解析することで、機能に重要と考えられる分子を予想する。その分子の機能をコンディショナルノックアウトマウスやインヒビターなどで阻害することで、見出した新たな機能を分子レベルで考察する。
知的情報圧縮による自然環境の記号化に関する研究

計測データから物体を復元する“Xからの物体復元"では計測データからの形状の復元に注意が払われるため,画像面上のデータからいかに形状を復元するかが問題となり,復元したデータを利用して何をするかには余り問題とされてこなかった.しかし,“Xからの物体復元"を形状認識・理解のための第1段階を考えれば,計測データから復元される形状のパラメータは形状の類似性などを判定するためのデータとなる.本研究では,形状認識・理解のための“Xからの物体復元"としての影からの形状復元を取り扱う.人間が形状の類似性を判定する場合,厳密に類似性を判定するのではなく,「だいたい似ている」と判定することが行われる.ここでは,「だいたい似ている」を形状の凸包の類似性と考えることにする.そこで,物体を3次元ユークリッド空間の凸閉領域と考え,影からもとの物体が復元できるための十分条件を導いた.まず,3次元空間における接線極座標による物体の記述法を提案した.次いで,中心投影による影からの物体の復元公式を導くと共に,この影から物体が完全に復元できるための十分条件を証明した.また,3次元運動に不変な物体の類似尺度を物体の記述子から構成した.計測データから物体を復元する“Xからの物体復元"では計測データからの形状の復元に注意が払われるため,画像面上のデータからいかに形状を復元するかが問題となり,復元したデータを利用して何をするかには余り問題とされてこなかった.しかし,“Xからの物体復元"を形状認識・理解のための第1段階を考えれば,計測データから復元される形状のパラメータは形状の類似性などを判定するためのデータとなる.本研究では,形状認識・理解のための“Xからの物体復元"としての影からの形状復元を取り扱う.人間が形状の類似性を判定する場合,厳密に類似性を判定するのではなく,「だいたい似ている」と判定することが行われる.ここでは,「だいたい似ている」を形状の凸包の類似性と考えることにする.そこで,物体を3次元ユークリッド空間の凸閉領域と考え,影からもとの物体が復元できるための十分条件を導いた.まず,3次元空間における接線極座標による物体の記述法を提案した.次いで,中心投影による影からの物体の復元公式を導くと共に,この影から物体が完全に復元できるための十分条件を証明した.また,3次元運動に不変な物体の類似尺度を物体の記述子から構成した.
ヒト卵子流産因子としてのオーロラ蛋白機能と関連因子の相互作用：卵子老化抑制の試み

ヒトの生殖の特徴は自然妊娠における出産率が約23%と著しく低い上に、母体年齢があがるにつれて更に10%程度まで減少する点です。この現象は卵子の老化として知られ染色体異常が大きく関わっていますが、原因が明らかではなく現時点では克服が困難です。そこで、私たちは生殖医療の過程で得られる成熟不良な卵子をヒト老化卵子モデルとして研究を行った結果、ヒト卵子特有の老化メカニズムを見出しました。これには、オーロラ蛋白とコーヒシン蛋白が密接に関わっており、これらの量を人為的に変化させることで老化現象を緩和することが可能であることが明らかになりました。本研究の目的は、抗がん剤の一種であるタキソール処理によってヒト卵子に引き起こされる卵子老化現象の抑制メカニズムを明らかにすることである。具体的には1細胞分裂をコントロールするオーロラ蛋白の機能が経時的・空間的にどのように変化するか、2染色体異常増加は卵子老化現象の中でも流産につながる要因として最も影響が大きいが、タキソールにより染色体異常が抑えられる際にどのように染色体接着・分配機能が変化するか、3卵子老化抑制にこれまで判明していないメカニズムがあるか、マイクロアレイ法を用いて検索する、の3点である。本年度、卵子成熟途中のヒト卵子をタキソール処理した前後においてマイクロアレイのデータを比較した結果、以下の事実が得られた。1)オーロラ蛋白のmRNA発現量はタキソール処理によって変化せず、翻訳調節によってタンパク発現量が増加している。したがって、さらに蛋白量をコントロールしている因子に注目する必要がある。2)コーヒシン蛋白複合体は、染色体の異常な分離を抑制するために染色体同士を接着する働きを担っている。この蛋白複合体の構成要素に増加が認められることから、タキソールによって染色体同士の接着が高められている可能性がある。3)細胞分裂に関わる遺伝子群が活性化していることが確認され、染色体の安定性に加えて細胞増殖も高まっている可能性が考えられる。以上、1)3)の関連性は依然として不明なため、これらの結果をつなぐメカニズムの解明という検討課題が生まれ、研究の新たな展望が開けた。研究に必要な数のヒト廃棄卵を計画的・安定的に確保するのが難しいことは事前に予測していたが、予想以上に得られた数が少なかった。したがって、今後は当初の研究計画に変更を加えながら並行して研究を遂行する。特に、実験動物による課題を前倒しする。現在、ヒトにおいて母体年齢が上がるにつれて流産やダウン症などの染色体異常児の出産が増加することは一般的にもよく知られるところとなった。これらの現象は、加齢とともに卵子が老化し、これに伴って卵子成熟途中に起こる染色体分配に異常が増加することが主原因と考えられているが、そのメカニズムの詳細は必ずしも明らかではなく、またこれを克服する手段は今の所見出されていない。その理由として以下の二つの点が挙げられる。一点目は、不妊治療の発達によりヒト卵子の研究利用がある程度可能になっているが、比較的高齢な女性からの卵子は極めて貴重で研究利用が不可能であることである。二点目には、ヒト卵子の代わりに用いられるげっ歯類では、短命であるがゆえに卵子の老化が顕著ではなく、そのメカニズムがヒトとは全く異なる可能性がある。この研究では、これらの問題点を解決するために不妊治療で廃棄対象である未熟なヒト卵子を「老化卵子モデル」として利用し、ヒト卵子の老化メカニズムを明らかにすることを試みている。これまでの成果として、モデル卵子の成熟中に染色体の分配を安定的に行う物質(オーロラタンパク質)が減少していること、この減少がモデル卵子を特定の化学物質で処理することにより抑えられ、最終的に染色体異常が減少して「老化現象」が軽減されることを見出している。また、新たに染色体接着に関わる複数タンパク質がモデル卵子では異常な塊を形成しているのに対し、上述の化学物質で処理することにより塊が消失していることが確認された。この現象は、げっ歯類の卵子では確認できないことから、ヒトに特有の卵子の老化現象であると考えられる。今後は、このような複数のタンパク質の変化がどのように関連するかをさらに明らかにすることで、人為的に安全な卵子の若返りの可能性を探索していく予定である。当初の計画では、モデル卵子にオーロラタンパク質をノックダウンまたは過剰発現させて老化現象の変化を確認すると同時に、モデル卵子を授精させた後にマイクロアレイにより網羅的に遺伝子発現調査する予定であった。しかし、実績概要に記した通り、老化現象に関わる新たなタンパク質が確認されたことから、このタンパク質と関連する分子を広範囲に検証する必要性が生じた。この結果、ノックダウン、過剰発現、マイクロアレイ実験に使用する卵子が確保できず、施行を延期した。ヒトにおいて母体年齢が上がるにつれて流産やダウン症などの染色体異常児の出産が増加することは一般にもよく知られるところとなった。これらの現象は、加齢と共に卵子成熟中に生じる染色体異常の頻度が増加するためと考えられているが、そのメカニズムは不明な点が多い。本研究は、ヒト老化卵子に生じる高頻度の染色体異常に関わるヒト特有の現象を見出すことでヒト卵子老化のメカニズムを明らかにするとともに、卵子老化を克服することを目的としている。本年度は、1すでに見出した数種類あるオーロラ蛋白群の変動を個別に確認すること、2ヒト老化モデル卵子を用いたマイクロアレイで新たな老化関連因子の抽出し、それらの変動を確認すること、3オーロラ蛋白注入により卵子におこる変化をマイクロアレイおよび免疫染色により確認することを目的とした。

その結果、1ヒト卵子老化に伴う染色体異常の増加に関わるオーロラ蛋白は、主に一つであることが確認された。この現象は短命なマウスでは確認できす、ヒト特有のものであった。2染色体異常が高頻度におこる老化モデル卵子では細胞周期に関わる特定蛋白が核小体に集積しているのに対し、染色体異常を抑制した老化モデル卵子ではそのmRNA発現は上昇するにもかかわらず、核小体への集積は消失し特定部位への集積が認められなくなった。これらの現象は、やはりマウス卵子では認められない現象であった。3卵子老化に関与が認められたオーロラ蛋白を老化モデル卵子に顕微注入した場合でも、卵子成熟が正常に起った。この顕微注入卵子のマイクロアレイの結果をすでに得られている老化モデル卵子、老化改善卵子のマイクロアレイの結果と比較し発現量の変化をいくつかの遺伝子で確認した。ヒトの生殖の特徴は自然妊娠における出産率が約23%と著しく低い上に、母体年齢があがるにつれて更に10%程度まで減少する点です。この現象は卵子の老化として知られ染色体異常が大きく関わっていますが、原因が明らかではなく現時点では克服が困難です。そこで、私たちは生殖医療の過程で得られる成熟不良な卵子をヒト老化卵子モデルとして研究を行った結果、ヒト卵子特有の老化メカニズムを見出しました。これには、オーロラ蛋白とコーヒシン蛋白が密接に関わっており、これらの量を人為的に変化させることで老化現象を緩和することが可能であることが明らかになりました。本年度のマイクロアレイ結果の評価から、タキソールによる卵子老化抑制現象には当初の予想以上に複数の反応経路が密接に関連していることが示唆された。したがって、それらの反応経路に関与する因子の情報を十分に集めて今後検討すべき対象の拡大と選別を行う必要が生じると予想される。特に、ガン細胞の増殖に関与する因子が多く含まれることから、ガン細胞研究への派生も視野に入れて検討因子を取捨選択する。マウス卵子を用いた実験の利点は多数の卵子を入手できる点にある。したがって、マウス卵子を用いた検討では、ヒトでの結果からピックアップされた因子を補充することによって卵子老化がキャンセルされるかをスクリーニングする事を中心に行っていく。実績概要に示した通り、卵子老化の主因である染色体異常と関連するタンパク質の幾つかがヒト卵子のみで予想外な挙動を示すことが確認された。そこで、これらのタンパク群と関連する分子についてもヒト卵子とマウス卵子で発現の変化を確認し、ヒト卵子老化現象に関わるタンパク質群の全体像を明らかにする。さらに、これらの関連タンパク質の発現を人為的に変化させることにより、卵子老化抑制効果がどのように変化するかを確認する。当該年度に施行できなかった実験も次年度に繰り越して実施する。計画変更に伴って特段の課題・障害は生じない。発生遺伝学本年度に、オーロラ蛋白の変化をタイムラプス撮影により解析することを予定し、必要な機材を予算に計上していた。しかし、タイムラプス撮影に必要な装置を設置する蛍光顕微鏡(他予算で購入)の設置が遅れたためにタイムラプス装置の購入を延期したため繰越予算が生じた。
ソフト界面で修飾されたプラズモニックチップ上の高感度蛍光バイオセンシング

プラズモニックチップ(=金属薄膜でコーティングした波長オーダーの周期構造をもつチップ)を用いた増強蛍光法によるバイオセンシングでは、表面プラズモン共鳴法(ビアコア)と比べ、5桁ほど高感度な抗原抗体反応の検出が可能である。本研究では、さらに高S/N・高感度なマーカー検出を目指し、銀コーティングされたプラズモニックチップに、非特異吸着を抑制し、様々な種類の抗体に対して高密度な抗体修飾が可能なソフト界面を形成し、サンドイッチアッセイによる高感度なマーカー計測を行う。周期構造は石英モールドを用いて光ナノインプリント法により作製し、銀薄膜(膜厚3040nm)と消光抑制層としてSiO2やZnO薄膜(膜厚20nm)、および銀薄膜との界面には接着層として膜厚1nm以下のCrなどの接着層をrfスパッター法により成膜し、プラズモニックチップとした。サンドイッチアッセイにするために、抗体をシランカップリング剤を用いて結合した。マーカーを炎症性サイトカインの一つであるIL-6とし、両末端がスクシイミド基(NHS基)であるPEGのクロスリンカーを用いて捕獲抗IL-6抗体をチップに結合し、BSAをブロッキング剤に、tween20を含むリン酸緩衝液を洗浄溶液をすると、2pg/mLまで定量的な計測を実現することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、さらに高S/N・高感度なマーカー検出を目指し、酸化亜鉛でコーティングされたプラズモニックチップに、非特異吸着を抑制し、様々な種類の抗体に対して高密度な抗体修飾が可能なソフト界面を形成し、サンドイッチアッセイによる高感度なマーカー計測を行う。周期構造は石英モールドを用いて光ナノインプリント法により作製し、銀薄膜(膜厚3040nm)とZnO薄膜(膜厚20nm)、および銀薄膜との界面には接着層として膜厚1nm以下のCr薄膜をrfスパッター法により成膜し、プラズモニックチップとした。プラズモニックチップ界面はZnOであるが、ZnOはシリカと異なり、UV照射による洗浄ができなかったため、成膜後そのまま2種類のシランカップリング剤を用いて、ビオチンを標識したPEGをリンカーとするソフト界面を作製した。1ステップでビオチン修飾するほうが、2ステップの化学反応によるビオチン修飾よりも、結合した蛍光標識ストレプトアビジンからの蛍光強度は大きく、ビオチンの結合密度において1ステップのほうが修飾率が大きいことによるものであると考えられた。酸化亜鉛へのシランカップリング反応は効率よく行うことができた。PEGによる表面修飾での非特異吸着抑制とともに、酸化亜鉛の効果により、十分な非特異吸着抑制ができたと考えられる。プラズモニックチップにリンカーで形成したソフト界面に抗体を修飾し、マーカーを結合させ、cy5蛍光標識検出抗体を結合させるサンドイッチアッセイとし、サンドイッチアッセイ下で、本チップの感度を評価するとともに、非特異吸着の抑制効果を評価する。非特異吸着抑制のため、界面活性剤やブロッキング剤を検討する予定であるが、これらのアッセイプロトコールに耐えうるチップ構造をつくることも必須である。非特異吸着抑制の界面評価にはFTIR-ATR法を用いることも検討している。
網膜色素変性症により引き起こされる視細胞死の機序解明と新規治療法開発への応用

網膜色素変性症(RP)の原因の1つに視細胞ホスホジエステラーゼ6(PDE6)サブユニットの変異が挙げられる.本研究は, Pde6aに変異を持つRPモデルマウスであるnmf363,およびPde6bに変異を持つRPモデルマウスであるnmf137において,活性酸素産生酵素の1つであるNADPHオキシダーゼの阻害薬であるアポシニンや,抗酸化能を併せ持つCa^<2+>チャネルブロッカーであるニルバジピンが,それぞれ視細胞保護効果を示すことを明らかにした.これらの薬物はRP患者の治療に用いることができる可能性がある.網膜色素変性症(RP)の原因の1つに視細胞ホスホジエステラーゼ6(PDE6)サブユニットの変異が挙げられる.本研究は, Pde6aに変異を持つRPモデルマウスであるnmf363,およびPde6bに変異を持つRPモデルマウスであるnmf137において,活性酸素産生酵素の1つであるNADPHオキシダーゼの阻害薬であるアポシニンや,抗酸化能を併せ持つCa^<2+>チャネルブロッカーであるニルバジピンが,それぞれ視細胞保護効果を示すことを明らかにした.これらの薬物はRP患者の治療に用いることができる可能性がある.[1]各種網膜色素変性症(RP)モデルマウスで見られる視細胞死の機序解明Pde6aに変異を持つRPモデルマウス2種およびPde6bに変異を持つRPモデルマウス1種を米国より輸入した.来年度の実験に供するため,繁殖及び動物のSPF化を行っているところである.現在のところ1系統のSPF化が終了しており,今後残りの系統のSPF化を続けて行う予定である.また,SPF化の完了した系統を用いた実験を開始する予定である.[2]候補化合物がRPモデルマウスの視細胞死に与える影響申請者が見いだしたRPマウスモデルは,上記[1]に述べたように現在SPF化を行っているため,それまでの間に実験技術を確立するために,市販のRPマウスモデルであるC3H/HeJを用いて実験を行った.生後7日から21日にかけて,薬物を毎日投与し,眼球を摘出した.固定後,パラフィン包埋し,薄切組織切片を作成した.視細胞の脱落はHE染色を行った切片で評価した.薬物を投与した群と溶媒を投与した群とを比較し,投与した薬物に視細胞保護作用があるかどうかを組織学的かつ機能的に検討した.Ca^<2+>チャネルブロッカーのシルニジピンやニルバジピン,あるいは抗アルツハイマー病薬のドネペジルは,NMDAにより惹起した網膜傷害モデルラットや網膜虚血・再灌流モデルラットにおいては視神経保護作用を示したものの,C3H/HeJの視細胞脱落には顕著な影響を与えなかった.今後は[1]に述べた動物のSPF化が完了次第,これらのモデルマウスを用いた実験を開始する予定である.[1]各種網膜色素変性症(RP)モデルマウスで見られる視細胞死の機序解明Pde6aに変異を持つRPモデルマウス2種およびPde6bに変異を持つRPモデルマウス1種を昨年度米国より輸入した.現在のところ1系統のSPF化が終了しているが,実験動物施設の都合により残りの系統のSPF化が遅れている.SPF化の完了した系統を用いた実験はすでに開始しており,準備ができ次第,残りの系統のSPF化を進め,その後実験を行っていく予定である.[2]候補化合物がRPモデルマウスの視細胞死に与える影響Pde6aに変異を持つRPモデルマウスの1つであるnmf363のSPF化が完了したため,いくつかの化合物が本モデルマウスで認められる視細胞死に与える影響を検討した.生後16日から26日にかけて,薬物を飲水に混和して投与し,生後26日目に,視機能を評価するために網膜電図を測定した後に,眼球を摘出した.固定後,パラフィン包埋し,薄切組織切片を作成した.視細胞の脱落はHE染色を行った切片で評価した.薬物を投与した群と溶媒を投与した群とを比較し,投与した薬物に視細胞保護作用があるかどうかを組織学的かつ機能的に検討した.その結果NADPHオキシダーゼ阻害薬であるアポシニン(20mg/kg/day)を飲水に混和して投与すると,nmf363で認められる錐体細胞死が組織学的に有意に抑制され,網膜電図を用いた機能的評価においても,nmf363で認められる明順応網膜電図の消失を抑制することが明らかとなった.今後,さらにアポシニンの作用機序に加えて,nmf363で認められる錐体細胞死の機序を検討していく予定である.網膜色素変性症(RP)の原因は遺伝子の変異であり,中でも視細胞ホスポジエステラーゼ6(PDE6)サブユニットの変異は古くから知られている.本実験では,Pde6aに変異を持つRPモデルマウスであるnmf363,およびPde6bに変異を持つRPモデルマウスであるnmf137を用いて,種々の薬物の視細胞保護効果を検討した.Ca^<2+>チャネルブロッカーのシルニジピン,あるいは抗アルツハイマー病薬のドネペジルはこれらのマウスにおいて視細胞保護効果を示さなかったが,活性酸素産生酵素の1つであるNADPHオキシダーゼの阻害薬であるアポシニンや,抗酸化能を併せ持つといわれているCa^<2+>チャネルブロッカーのニルバジピンがこれらのマウスモデルにおいて視細胞保護効果を示すことが明らかとなった。(1)nmf363

マウスの錐体細胞死に対するアポシニンの影響P16P26の間,アポシニンを飲水に混和して投与したところ,溶媒投与群で見られた視細胞死や錐体細胞の機能低下が有意に抑制された.さらにPl6P36の間,アポシニンを飲水に混和して投与したところ,溶媒投与群で見られた視細胞死が有意に抑制され,錐体細胞の機能低下にも抑制傾向が認められた.(2)nmf137マウスの錐体細胞死に対するニルバジピンの影響P7P17の間に母体を介してニルバジピンを投与したところ,溶媒投与群で見られた視細胞死や錐体細胞の機能低下が有意に抑制された.本研究は,活性酸素の発生を抑制したり,活性酸素を消去したりすることによって,RP患者において桿体細胞の脱落に引き続いて起きる錐体細胞の脱落を抑制できる可能性を示している.錐体細胞死を抑制することによって明環境下における視機能を保持できれば,RP患者の生活の質は飛躍的に向上すると考えられる.今後,本研究の成果がRP患者を対象とした視細胞保護薬の開発につながることが期待される.
TLRシグナル抑制因子を用いた蛋白質療法の開発に関する基礎的研究

細胞膜透過性SOCS-1, 3およびIRAK-M蛋白質の大腸菌発現系(pET28a)の構築を試みた。SOCS-1は極めて低発現であった。SOCS-3は良好に発現し、精製及びリフォールディング系も確立した。この精製タンパク質は本来のSOCS-3機能を保持していたことから、発現系の確立に成功した。IRAK-Mの発現は良好であったが、大腸菌内で部分分解が見られ、完全精製に至らなかった。また、SOCS-3とDP-1の相互作用について、その詳細な相互作用領域と組織内での相互作用を確認した。PCRクローニングで得たマウスSOCS-1,3,IRAK-M及びA20cDNAの上流にMTMタグを融合した各蛋白質の発現プラスミドベクター(pET28a)を構築する。PCRクローニングで得たマウスSOCS-3,IRAK-McDNAの上流にMTM(membrane-transducing motif)タグを融合した各蛋白質の発現プラスミドベクター(pET28a)を構築した。各遺伝子組み換え型細胞膜透過性蛋白質の精製を試みた。すなわち、Ni-NTAアガロースカラムに可溶性蛋白抽出液を注ぎ、吸着後、非付着性蛋白質を洗浄、除去した。その後、イミダゾール緩衝液を用いて付着性蛋白質を溶出、回収した。その溶出蛋白質の精製度をSDS-PAGEで確認し、単一バンドになるまで精製を試みることにより各精製組み換え型蛋白質標品の調製を試みた。その結果、MTH-humanSOCS3の精製組み換え型標品を精製することができた。その非凝集画分を実験に用いた。一方、組み換え型のMTH-IRAK-Mの精製を試みたところ、大腸菌でのその発現過程で強い蛋白質分解酵素により分解された。この点については現在詳細に検討中である。MTH-humanSOCS3に関しては、FITC標識しHEK293細胞を用いて細胞内に導入されているか否かについて共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析したところ、その細胞質に明らかにその蛍光が観察された。このことはMTH-humanSOCS3が細胞内に速やかに導入されたことを示す。MTM融合SOCS-1を大腸菌BL21(DE3)に発現させたところ、非常に低発現であった。大腸菌種、発現誘導温度、IPTG濃度について様々な条件を検討したが改善されなかった。MTM融合SOCS-3を大腸菌BL21(DE3)に発現させたところ、Hawiger博士等の報告同様の発現が見られた。本発現蛋白質(封入体に含まれる)を変性条件下で精製し、透析によりリフォールディングを行なった。このリフォールディングで可溶化した蛋白質を用い、細胞導入実験を行なったところMTMタグ融合SOCS3は細胞内に導入された。更に、JAK-STAT抑制能を調べるため、LIF刺激を行ないSTAT3を活性化(チロシンのリン酸化)を行なう条件に、本MTM融合SOCS-3を添加したところ、STAT3のリン酸化が抑制されたことから、MTM融合SOCS-3は細胞内導入後JAKキナーゼを抑制することが確認できた。またMTM融合SOCS-3がJAKを抑制する条件下にDP-1を発現させたところMTM融合SOCS-3のJAK抑制能が阻害されたことから、本MTM融合SOCS-3はDP-1相互作用能を保持することも判明した。MTM融合IRAK-Mは発現は良好であったが、大腸菌内で部分分解が見られ、完全精製に至らなかった。
サルモネラのプラスミド性ビルレンス蛋白質の細胞局在性,精製および機能

1 Spvタンパク質の機能; SpvR、SpvA、SpvB、SpvCタンパク質のうち、SpvRはspvABC遺伝子の発現を正に調節するポジティブ調節因子であることを既に明らかにしている。本研究では、spvRの発現はSpvRによって正に調節され、SpvAまたはSpvBによって負に調節されていることが明かになった。また、spvRの発現は培養の定常期に活性化すること、その発現はRpoSに依存していることが明かになった。2 Spvタンパク質の分離と精製; S.Choleraesuis RF-1株(50kbビルレンスプラスミド保持株)の培養菌体をフレンチプレスで破壊して出発材料とした。種々のカラムを用いてSpvタンパク質の分離精製を試みた結果、SpvR、SpvA、SpvB、SpvCは他のSpvタンパク質から分離された。Spvタンパク質の分子量はSpvR;31kDa,SpvA;26kDa,SpvB;73kDa,SpvC;24kDaであった(SDS-PAGEによる)。また、SpvBは疎水性に富み、SpvCは塩基性に富む蛋白質であることから明かになった。3 Spvタンパク質の細胞局在性;最初に、大量発現系(spvRABC遺伝子クローン化プラスミドを保持する大腸菌株)を用いて免疫電顕の条件を検討した。次に、この条件を用いて親株(S. Choleraesuis RF-1株)のSpv蛋白質の細胞局在性を調べた。その結果、SpvCは細胞質および外膜に存在する蛋白質であることが明かになった。今後はこの方法を用いて他のSpvタンパク質の局在を調べるつもりである。Salmonella serovar Choleraesuis (S.Choleraesuis)などのサルモネラはビルレンスプラスミドを保持している。このプラスミド上のビルレンス遺伝子(salmonella virulence gene、spv)がコードする4種類のタンパク質(SpvR、SpvA、SpvB、SpvC)の機能、精製および細胞局在性を明かにすることが本研究の目的である。平成5年度の研究で得た成果は以下の通りである。1 Spvタンパク質の機能;SpvR、SpvA、SpvB、SpvCタンパク質のうち、SpvRはspvABC遺伝子の発現を正に調節するポジテイブ調節因子であることを報告した(Mol.Gen.Genet,1993)。本年度はspvR遺伝子の発現に及ぼすSpvタンパク質の影響を調べた。先ず、spvR -lacZ融合体プラスミドを作成し大腸菌を形質転換した。次に、このプラスミドとシスまたはトランスにspvRABC遺伝子を共存させ、融合体プラスミドのbeta-ガラクトシダーゼ産生に及ぼすSpvタンパク質の影響を調べた。その結果、spvRの発現はSpvRによって正に、SpvAまたはSpvBによって負に調節されていることが明かになった。(Mole.Microbiol.1994,in press)。SpvCタンパク質の機能は不明である。2 Spvタンパク質の精製;S.Choleraesuis RF-1株(50kbビルレンスプラスミド保持株)をM9培地で培養して得た菌体をフレンチプレスで破壊して精製の出発材料とした。種々のカラムを用いて粗精製Spvタンパク質を得た。これらの標品と合成ペプチド抗体とのウエスタンプロッテイング解析を行った。その結果、SpvR、SpvA、SpvB、SpvCのそれぞれは他のSpvタンパク質から分離されていることが明かになった。しかし、これらにはまだ夾雑タンパク質が混入していた。平成6年度は更に精製を継続する。3 Spvタンパク質の細胞局在性;M9