hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃発がんリスク亢進に繋がるピロリ菌感染宿主細胞の分子特性解析

さらに、CAPZA1発現制御メカニズムの解析から、CAPZA1発現は、ヒストンアセチル化による制御を受ける事が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた検討並びに、ChIP assayの両面から明らかになった。これらの解析結果から、ピロリ菌感染胃粘膜における胃発がん過程での、CD44v9陽性がん幹細胞の発生過程並びにその前駆細胞となり得る細胞特性について新しい知見が明らかになり始めている。以上のことから、胃発がんリスクを規定する宿主細胞キャラクターの同定に向けて順調に計画が進行していると考えている。CD44v9陽性癌幹細胞は、オートファジー発現不全でありH. pylori由来癌蛋白質CagAを蓄積させることで胃癌の発生に強く寄与し、同時に、胃癌の再発にも関与することを報告してきたが、CD44v9陽性細胞がどの様に誕生するのかは明らかではなかった。前年度までに我々は、F-actin-capping protein subunit alpha-1(CAPZA1)過剰発現細胞では、LAMP1発現が抑制され、autophagyが抑制されるため、H. pylori感染を受けるとCagAが蓄積することを明確にした。さらに、CAPZA1過剰発現細胞は、CD44v9発現を誘導することを示した。本年度の成果から、CAPZA1過剰発現細胞では、H. pylori感染を受けることでSALL4及びKLF5のリプログラミング因子の発現も顕著に増強される事が示された。さらに、in vivo感染動物実験の結果から、CAPZA1過剰発現細胞は、H. pylori感染に伴う酸化ストレス刺激によって誘導され、かつ、CAPZA1過剰発現細胞からCD44v9陽性細胞が発生していることを確認した。さらに、ヒト胃癌組織検体を用いた解析により、胃癌部では、CAPZA1の過剰発現とCD44v9発現が共局在することも明らかにした。以上の結果から、H. pylori感染胃粘膜での胃発癌過程において、CAPZA1過剰発現細胞の発生とそこへのH. pylori感染が、CD44v9陽性癌幹細胞を誕生させる要因である事を示した。本年度の成果により、CapZA1過剰発現細胞では、ESRP1の過剰発現を誘導しており、そこにH. pylori感染により蓄積されたCagAによるβ-cateninシグナルの異常活性化が惹起されることで、CD44v9発現誘導に至ることを明らかにした。これらの成果から、H. pylori感染胃粘膜におけるCapZA1過剰発現細胞は、CD44v9陽性がん幹細胞のprogenitorcellとなり得ることが示唆された。研究代表者らは既に、in vivo解析から胃粘膜上皮におけるCapZA1発現は細胞間で異なり、CapZA1過剰発現細胞が存在することを見出している。そこで、今後、CapZA1発現制御機序を、エピジェネティクス制御、酸化ストレス応答性転写因子、miRNA発現制御機構に注目して解析し、CapZA1発現亢進に関わる要因を同定する。これにより、CD44v9陽性がん幹細胞の前駆細胞となり得るCapZA1過剰発現細胞の発生機構を解析する。
PCR-ELISAによるQ熱の診断に関する研究

BGM細胞に0.0010.1%濃度の界面活性剤Triton X-100 (TX100)を加え、鏡検により細胞の破砕を観察した。Coxiella burnetii Nine Mile II相菌(ATCC VR-616)の培養上清(細胞外の菌体が主体)、及び感染BGM細胞(細胞内の菌体が主体)を別々に回収した。培養上清について各々0.0010.01%濃度のTX100を加えた試料と無添加の試料を遠心後、PCRを行った結果、無添加の場合と検出感度に差は無かった。感染細胞では0.01、0.02%のTX100を加え遠心した試料、免疫鉄ビーズで菌体を回収した(この方法についてはVeterinary microbiologyに掲載決定)。試料、及びTX100添加後、免疫鉄ビーズで菌体を回収した試料でPCRを行った。0.01%濃度のTX100を加えた試料では、TX100無添加で免疫鉄ビーズにより菌体回収した試料と比べPCRの結果、検出感度の上昇が見られた。また、0.01%TX100は免疫鉄ビーズと菌体の反応を阻害しないことが判った。牛乳の場合、0.01%TX100のみ添加では遠心後に大量の堅固なpelletが残り、PCRサンプル調整の妨げになると共に検出感度が低下した。牛乳からのPCR-ELISAサンプル調整では0.01%TX100添加+免疫鉄ビーズによる菌体回収で検出感度が良かった。ウシ60頭の生乳から、この方法によりサンプル調整し、PCR-ELISAによりC. burnetii検出を行った。PCR-ELISAは先に提出した申請書に記載した方法に準じて行った。10頭が陽性で(陽性率16.7%)、うち5頭が強陽性であった。PCR-ELISAは高感度に、多数の試料の判定が出来る利点を持つ。(以上の結果について第121回日本獣医学会で発表予定。Appliedand environmental microbiologyに投稿準備中。)BGM細胞に0.0010.1%濃度の界面活性剤Triton X-100 (TX100)を加え、鏡検により細胞の破砕を観察した。)
A15型高磁場用超伝導材料の歪みによる反磁性および輸送電流特性劣化に関する研究

代表的なA15型高磁場用超伝導材料であるニオブ・スズ(Nb_3Sn)超伝導線の、歪み状態での臨界電流(超伝導状態を維持することができる輸送電流の最大値)劣化を調べるためにウォルタースプリング型装置を設計・製作した。実用ニオブ・スズ超伝導線をハンダ付けした本装置を、18テスラ超伝導マグネットに設置し、液体ヘリウム(温度4.2K=-269°C)中で輸送電流特性、磁化特性を調べた。その結果、1.0%歪み印加により輸送電流特性の顕著な劣化が観測されたが、磁化には顕著な変化は観測されなかった。Nb_3Sn超伝導多重撚りケーブルを横圧縮して、通電法による臨界電流特性劣化について評価した。30MPa程度の横方向圧縮応力を印加することで、臨界電流が1/2以下になることを示した。しかし、本サンプルでは圧縮応力を印加できる長さが外径50mm、1ターンと短いため、磁化測定法には適さない。NbTi超伝導多重撚りケーブルを用いて12ターンサンプルを作製し、長尺サンプルに対して均等に横方向圧縮力を印加可能な機構を開発した。本装置により、約1mのケーブルに対して均等に横方向圧縮応力を印加できた。実際に応力が印加されていることは、ロードセルの出力のみならず、素線間接触抵抗の変化としても確認された。併せて、横方向圧縮による素線の変形挙動解析をANSYSを用いて実施した。素線を超伝導領域および安定化銅領域に分割し、圧縮冶具により横方向に圧縮する条件で計算した。ここで、素線および圧縮冶具表面にはギャップ要素を適用し、非線形解析を行った。素線長さ方向歪み印加機構については、Walter's Spring型装置の設計検討を行った。平成20年度では、Nb3Sn超伝導素線における歪(引張り/圧縮)状態での臨界電流劣化を調べるためのWalter's Spring型装置を製作し、室温での歪印加試運転を行った。本装置は、歪状態における臨界電流の劣化を通電法(外部印加磁場固定、通電電流掃引)および磁化法(外部印加磁場掃引、通電電流無し)により評価できる。評価を温度可変、強磁場環境で行うために、マグネットの温度可変インサートに収まる寸法(外径30mm)とした。本装置の心臓部であるWalter's Springは時効処理したベリリウム銅(CuBe)で製作した。Spring直径は23mmである。通電法での評価のためには数ターンもあれば十分であるが、磁化法評価のためには体積が必要であるため、15ターンとした。歪印加には室温で超音波モータを用いてロッドを回転させることで行う機構とした。このことで遠隔操作が可能となった。また、本装置で一様な歪を印加できることを調べるために、歪ゲージを貼付して室温で歪印加試運転を行った。平成19年度に設計検討を行い,20年度に製作,試運転を行ったWalter's Spring型装置を用いて,臨界電流(I_c)の歪依存性を調べた。内部スズ法によるニオブ・スズ(Nb_3Sn)線材を試料とした。未熱処理線材を熱処理用ボビンにWalter's Springの形状に合わせて15ターン巻き付け,650°Cx240時間の超伝導生成熱処理を行った。熱処理後の線材をWalter's Springに取り付け,電極部のハンダ付け,歪ゲージ貼付け,電圧端子取り付けを行った。このWalter's Springを装置に取り付けた。さらに,磁化法による測定のためにピックアップコイルおよびキャンセルコイルを製作し,取り付けた。実験は次の手順で行った。(1)ゼロ磁場で歪印加(2)15Tまで磁場を印加し,通電法によるI_c測定(3)ゼロ磁場まで減磁(4)0→5T→0のサイクルで磁化測定。この手順を,印加歪値を変化させて行った。通電法によるI_cは印加歪に対して単調減少し,1%引張り歪印加時は当初I_cの12.6%まで劣化した。再びゼロ歪に戻すと73%まで回復したが,不可逆であった。これは,本試料にとって1%引張り歪がI_c可逆限界を超えていることを意味し,超伝導フィラメントが破断していることを意味する。一方,磁化はキャンセルコイル信号が小さかったためにバックグラウンド磁化が残ってしまったために,ヒステリシス曲線からI_cを評価することは出来なかった。しかし初期状態(ゼロ歪),1%引張り歪印加時,1%引張り歪除荷後の磁化曲線に顕著な変化は見られなかった。

つまり,I_c可逆限界以上の歪によって超伝導フィラメントが破断しても,磁化に変化は見られず,Nb_3Sn結晶粒内の超伝導特性には変化がないことを示唆する。
癌遺伝子導入ヒト細胞を使用したシグナル伝達制御による抗癌剤感受性の解析

ヒト上皮細胞モデルであるHAG-1細胞に,ヒト癌で活性化している癌遺伝子群を導入し,抗癌剤感受性の変化とその機序を解析した.v-src,c-Ha-ras,v-rafなどシグナル伝達に関与している活性型癌遺伝子を導入し、細胞特性と抗癌剤感受性の変化を調べた.活性化rasは浸潤能や造腫瘍能とともにシスプラチン(CDDP)耐性を誘導したが,活性型rasにはこのような作用はなかった.このsrc導入細胞のCDDP耐性機序を,薬剤の取り込みや排出・細胞内解毒機構・DNA修復機構の面から解析を行った.その結果,srcによるCDDP耐性機序は,PKCやPI-3 kinaseと関連なく,DNA内架橋鎖修復の亢進によることが明かとなった.この耐性はsrcキナーゼ阻害剤であるHerbimycin Aで克服され,同時に架橋鎖修復能の低下が見られたため,srcキナーゼの活性化はDNA修復能を高める働きをもつことが示唆された.srcは乳癌・大腸癌に悪性度が高いほど強く発現しており浸潤能と転移能に相関がある.このため進行癌や転移癌におけるシスプラチン耐性にチロシンキナーゼ活性が関与している可能性が出てきた。またsrcは転写因子であるSTAT3を恒常性に活性化していることがわかり,耐性誘導機序にSTAT3と修復酵素,特に除去修復酵素ERCC1のmRNA発現との関与が示唆される.現在、ERCC1とsrcとの関連を調べている.更に,生体内で高効率に遺伝子導入できるアデノウイルスに抑制変異型分子(Dominant negative ras)や癌抑制遺伝子(wild type p53,Cyclin-dependent kinase inhibitor-p21WAF1/Sdi1を組み込んだ組み換えアデノウイルスベクターを使用し、各種癌遺伝子発現細胞に及ぼす影響を薬剤感受性やアポトーシスの面から解析することにより、遺伝子治療の化学療法への応用の可能性を探っている。
線条体のGABA作働性介在細胞の多様性

線条体の局所回路の解析を進めていく上で、個々の神経細胞の性質を明らかにすることは非常に重要なことである。本年度は、線条体に認められる介在細胞のうち、ホールセル記録法でFS細胞およびLTS細胞と同定した細胞のシナプス結合のターゲットに違いがあるかどうかに焦点をあてて検討した。その結果、下記の事がわかった。ホールセル記録の後、バイオサイチンを注入し、DAB反応処理を経て、ひとつの神経細胞の全体像を染色し、エポン樹脂で包埋し、電子顕微鏡で神経終末を観察した。FS cellとLTS cellの神経終末が形成するシナプスの微細構造を、電子顕微鏡連続切片像3次元再構築画像解析システムを使って、シナプスの構造に関して解析を行った結果、これら2種類の介在細胞のターゲットは主に中型棘細胞の樹状突起であることと、FS cellの方がLTS cellよりもより多く細胞体にシナプスを形成していることを認めた。また、FS cellは、ターゲットの樹状突起の太さに正比例してシナプス結合の面積を変化させるという所見を認めた。いわば、FS cellはインピーダンスマッチングという概念のもとに抑制性の電流をターゲットに送り、効率的にターゲットを流れる興奮性の信号に抑制をかけているのではないかと思わせる形態的な構造をとっている。この観察結果は、ターゲットである中型有棘細胞にFScellが効率的で強力な抑制をかける可能性を形態的な局面から示唆するものである。一方、LTS cellにはこの傾向は認められず、どのような大きさの樹状突起にも一定の面積でレナプス結合を形成していた。このことから、FS cellとLTS cellは、局所神経回路において、異なる機能をもつであろうということが示唆された。本年度は、線条体に認められる介在細胞のうち、ホールセル記録法でFS細胞およびLTS細胞と分類した細胞がGABAを伝達物質とするかどうかに焦点をあてて検討した。(1)ホールセル記録の後、バイオサンチンを注入し、DAB反応処理を経て、ひとつの神経細胞の全体像を染色した。光学顕微鏡での形態面からの観察と描画を行った結果、FS細胞とLTS細胞は形態的に異なった特徴を示す事がわかった。具体的には、FS細胞の軸索は、樹状突起の分布領域よりやや広い領域に密に分布しているが、LTS細胞の軸索は樹状突起の分布領域より数倍広い領域に軸索を疎に分布させているという違いがあった。(2)電子顕微鏡観察用として、軸索の一部を切りだし、超薄切を試みた。この超薄切片を抗GABA抗体(ウサギ血清)で反応し、さらに、コロイダルゴールド(15nm径)標識抗ウサギIgG抗体で反応する。電子顕微鏡を使用して観察した結果、注入神経細胞の軸索にコロイダルゴールドが観察されたことから、これらの介在細胞の伝達物質はGABAであろうということが推測された。また、両者の軸索終末とも、抑制性神経終末の特徴である、棘突起の根元の部分や樹上突起の幹の部分にシナプス接着していたことから、これらの介在細胞は、GABAを伝達物質とする抑制型神経細胞であることが示唆された。
光検出磁気共鳴の新しい手法の試み-ラマンヘテロダインビ-ト法によるC_<60>単結晶の励起三重項状態の分光-

標題のラマンヘテロダインビ-ト検出のESRを行うためには、1.極低温の試料に2.単色光と3.ラジオ波を印加し、4.前方散乱光に含まれる数百MHzの微弱なビ-ト信号を検出しなければならない。本年度はこれら4つの条件のうち1から3を達成し、4については改善の後、来年度には本測定ができる状況に達した。以下に本年度の進渉状況を具体的に述べる。1.試料を極低温に冷やすために液体ヘリウムのクライオスタットを設計、制作した。さらに液体ヘリウム容器を数Torrに減圧することにより、1.3Kの超流動ヘリウムを得た。クライオスタットの液体ヘリウム容量は5リッターで、1.3Kを10時間維持できる性能を持つ。2.単色光はArイオンレーザー励起のTi:Sapphireリングレーザーを用い、波長7001000nmで単一モード発振できる。今年度、発振波長を知るための波長計、単一モード発振を確認するためのスペクトラムアナライザーを導入した。以上、1と2の条件が揃ったので予備的測定としてC_<60>単結晶の1.3Kにおける発光スペクトルを測定した。3.ラジオ波を試料に効率好く照射するために、容量可変のコンデンサーとコイルの直列共振器を制作した。共振周波数は90200MHzの範囲で変化させることができ、Q値は150であった。ラジオ波が実際試料に印加されていることは、1.3KでC_<60>単結晶のODMR信号を測定することによって確認した。4.1GHzの帯域を持つシリコン光検出器の出力の中から、ラジオ波と同じ周波数を持つビ-ト成分をスペクトラムアナライザーで検出する。現在、予備的な測定で、数mWの定常光に含まれる10_<-6>の強度のビ-ト成分を検出できることが分かった。実際の測定にはもう数十倍の感度の向上が必要であり、次年度にラジオ波の小信号増幅器を購入して本測定を行う。
アネキシンA5による腱・靭帯と骨付着部（enthesis）のリモデリングの制御

Enthesisは、腱と骨の間に線維軟骨が介在する線維軟骨性付着とこれらが介在しない線維性付着に分類される。このうち線維軟骨性付着部では、生後7週以降、野生型に比べてAnxa5機能欠損マウスで特異的な皮質骨面積と線維軟骨層の増大を認めた。軟骨層には野生型と比べてアルカリフォスファターゼ活性の強い細胞がより多く観察された。一方、線維性付着部ではAnxa5欠損による影響を受けなかった。siRNAによってATDC5のAnxa5遺伝子をノックダウンすると軟骨分化マーカーの遺伝子発現が増大した。これらの結果は、Anxa5が腱・靭帯付着部の線維軟骨の分化と石灰化を負に制御することを示唆する。骨と靭帯・腱との接合部(enthesis)における機械的刺激による骨形成や骨リモデリングの分子メカニズムについては不明な点が多い。Anxa5はメカニカルセンサー、アポトーシスシグナル伝達、細胞膜裏打ちタンパクとしての膜修復調節など多彩な機能が見出されている。我々の予備検討によりAnxa5遺伝子の下流にlacZを挿入したAnxa5機能欠損マウス(Anxa5-/-)においてenthesis周囲で特異的に骨が肥大していることを見出した。このことから、enthesisのリモデリングが腱・靭帯組織と骨組織のAnxa5を介した相互作用により調節されているという仮説を立てた。まず、成体マウスにおけるAnxa5の発現部位をlacZの組織染色で調べたところ、関節軟骨、骨膜、および骨と腱・靭帯付着部に特異的に発現していた。次にAnxa5欠損によりenthesisで生じる骨形態の変化をマイクロCTにより解析した。生後4週において、Anxa5-/-と野生型の間に骨の顕著な差は認められなかったが、生後7週以降のAnxa5-/-マウスにおいて、骨と腱・靭帯付着部において野生型に比べて特異的な肥大化を認めた。骨幹部における皮質骨断面積や骨密度には顕著な差は認められなかった。この表現型は脛骨、大腿骨、上腕骨、下顎骨など、調べた骨でいずれも共通していた。生後12週に前脛骨筋に付着する腱を切断し、運動機能を制限したところ、Anxa5-lacZマウスおよび野生型マウスのいずれにおいても、術後8週の腱付着部における脛骨皮質骨の縮小が認められた。これらの結果は、Anxa5が骨と腱・靭帯の付着部において、機械的刺激依存的なenthesis領域の骨形成に関与することを示唆するものである。昨年度までに、アネキシンA5(Anxa5)が骨と腱・靭帯付着部(enthesis)に発現すること、Anxa5機能欠損マウス(Anxa5-/-)のenthesisでは生後発達に伴い骨の増大を示すこと、この表現型が運動制限により消失することを見出した。本年度は、enthesisの生後発達過程におけるAnxa5の機能についてさらに解析を進めた。enthesisは軟骨を介する線維軟骨性付着とこれを介さない線維性付着とに分類できる。そこで両者の表現型を比較したところ、線維軟骨性付着である脛骨と腓腹筋腱、大腿骨と内転筋腱、および下顎骨と顎二腹筋腱の間の付着では、いずれも骨の増大を認めたのに対し、線維性付着である脛骨と内側側副靭帯の間においては、皮質骨の増大は顕著ではなかった。組織学的解析の結果、腓腹筋と脛骨の付着部において線維軟骨層の増大を認めた。この線維軟骨はAnxa5-LacZ陽性の細胞で構成されていたが、線維性付着部においてはAnxa5-LacZはほとんど検出されなかった。また線維軟骨層には、野生型と比べてアルカリフォスファターゼ活性の強い細胞が多く観察された。カルセイン標識の結果、これらの細胞が石灰化に寄与することが示された。一方、TRAP陽性細胞の数や分布に顕著な差は認められなかった。これらの結果は、Anxa5が腱・靭帯付着部の石灰化に対し抑制的な調節機能をもち、それは線維軟骨の機能制御を介する可能性を示唆する。EnthesisにおけるAnxa5発現細胞の大部分が線維軟骨層に分布すること、軟骨細胞を含まない線維性付着において顕著な表現型が認められなかったことなどから、Anxa5が軟骨細胞において重要な機能を果たすことが示唆された。今後の研究推進方策を絞り込むことができた。昨年度までに、骨と腱・靭帯付着部(enthesis)のうち、線維軟骨性付着部にアネキシンA5(Anxa5)発現細胞が豊富に存在しているのに対し、線維性付着部ではほとんど認められないこと、また、Anxa5機能欠損マウスの生後発達に伴い、線維軟骨性付着部では皮質骨の局所的な増大を示すが、線維性付着部においては顕著な表現型が認められないことを明らかにした。これらの結果から、Anxa5機能欠損マウスの腱・靭帯付着部における局所的な石灰化の増大が、線維軟骨を介する可能性が考えられた。そこで本年度は、軟骨細胞におけるAnxa5の機能を解析する目的で、軟骨系未分化細胞株ATDC5を用いたin vitroでの解析を試みた。ATDC5をDME/Ham's F-12培地に5% FBS、1/100 ITS添加条件で培養し、Anxa5遺伝子に対するsiRNA、あるいはControl siRNAをjetPrime試薬を用いて導入した。導入後の細胞増殖能をMTT法で、遺伝子発現量をAgilent社のSurePrint G3 Mouse GEマイクロアレイ、およびリアルタイムqPCR法で調べた。Anxa5 siRNA

導入によって、Anxa5遺伝子発現は8090%抑制された(p<0.001)。Anxa5 siRNA導入4日後の細胞増殖能は、Anxa5ノックダウンにより約23%低下した(p<0.05)。一方、分化形質の遺伝子発現の変化を解析したところ、Anxa5ノックダウンによってtype II、およびtype X collagen、Aggrecanなどの遺伝子発現が1025倍増大した。これらの結果は、Anxa5が腱・靭帯付着部の線維軟骨の分化と石灰化を抑制的に制御する可能性を示唆するものである。Enthesisは、腱と骨の間に線維軟骨が介在する線維軟骨性付着とこれらが介在しない線維性付着に分類される。このうち線維軟骨性付着部では、生後7週以降、野生型に比べてAnxa5機能欠損マウスで特異的な皮質骨面積と線維軟骨層の増大を認めた。軟骨層には野生型と比べてアルカリフォスファターゼ活性の強い細胞がより多く観察された。一方、線維性付着部ではAnxa5欠損による影響を受けなかった。siRNAによってATDC5のAnxa5遺伝子をノックダウンすると軟骨分化マーカーの遺伝子発現が増大した。これらの結果は、Anxa5が腱・靭帯付着部の線維軟骨の分化と石灰化を負に制御することを示唆する。当初、Anxa5ー/ーおよび野生型マウスの頭蓋骨より骨芽細胞を分離培養し、各々の細胞増殖能や遺伝子発現解析を行う計画であったが、成体マウス頭蓋骨から分離した骨芽細胞の分離が安定せず、検討に時間を要した。現在は、MC3T3-E1などの骨芽細胞系cellにsiRNAによるAnxa5ノックダウンを行い、その影響を検討している。腱細胞については、培養条件が確立しており、Anxa5ー/ーおよび野生型の成体マウスから安定して腱細胞が得られている。これらの細胞を用いて引き続きEnthesisにおける骨隆起は腱細胞と骨芽細胞のいずれに起因するのか、共培養による解析を進める予定である。Anxa5が線維軟骨を構成する細胞に強く発現すること、またAnxa5-/-マウスの腱・靭帯と骨の付着部のうちでも線維軟骨を介する付着部位において特異的な骨の肥大が認められたことから、Anxa5の軟骨細胞における機能欠損が付着部における骨の肥大を生じることが推測される。よって本年度は培養軟骨細胞、および軟骨用細胞株であるATDC5を用いてAnxa5欠損による細胞の増殖と分化への影響を調べる。具体的にはAnxa5-/-と野生型マウスの肋軟骨から軟骨細胞を初代培養し、その増殖能と分化能をBrdUの取り込み、分化軟骨マーカーの細胞免疫染色、およびリアルタイムPCRによる分化マーカー遺伝子の発現解析により明らかにする。また、ATDC5にBMP等を添加した軟骨分化系を用いて、Anxa5遺伝子に対するsiRNAによりAnxa5遺伝子をノックダウンし、同様の解析を行う。特に後者の系では、siRNAによるAnxa5遺伝子ノックダウンを行った後、伸展刺激下におけるよる増殖と分化への影響を調べる。歯科学骨芽細胞系cell lineに対し、siRNA添加によりAnxa5をノックダウンする。また、Anxa5ー/ーおよび野生型マウスから各々分離した腱細胞を得る。これらの細胞を共
北極圏地球環境科学野外教育コースの設立

20072009年の国際極年において,北極圏の地球環境科学を主題に,各国の大学院生を対象とする国際野外教育学校を企画・実施した.日本とノルウェーの永久凍土研究者で国際的な教授チームを組み,ノルウェー北部のスバルバール諸島を対象に,受講者に対し,(1)調査・観測法を取得させる,(2)2年間で得られた調査・観測データを解析させる,(3)国際学会や国際誌上で公表させる,という三段階の教育を行った.また,調査・観測法だけでなく,北極地域の調査活動に必要なサバイバル・危険回避の技術取得のための訓練も実施した.2年間で,日本,ヨーロッパ,アメリカの国々から,5名の教員,25名の大学院生が参加した.2年目となる2009年度は,8月中・下旬の2週間の期間に,スバルバールのロングイヤーベン地区(内陸)とカップリンネ地区(沿岸)において,セミナー,野外観測,試料採取,室内分析等を実施した.シロクマの出現により,野外活動の一部が制約されたが,充実した指導とデータ取得ができた.共同調査によって得られたデータに基づいて,学生各自がテーマを絞り,北極圏の陸域で起こる永久凍土環境変動の過去・現在・未来の諸側面について考察し,レポートを作成した.とくに,活動層厚の時空的変化,凍土の構成物質,凍土の化学的性質,多角形構造土の分布と内部構造,凍結割れ目の発達プロセスに関して,詳しい成果が得られた.最近の気候の年々変動と長期変動によって活動層厚の変化,永久凍土の部分融解,地形プロセスの年々変動が顕著に起こっており,今後も長期的なモニタリングの継続が必要なことが確認された.成果の一部は2008年7月の国際永久凍土学会で発表した.20072008年の国際極年において,各国の大学院生を対象とする,北極圏の地球環境科学を主題する国際野外学校の実践を企画した.永久凍土や氷河の専門家の国際的な教授陣でチームを組み,スバルバール諸島(ノルウェー北部)とグリーンランド東部の北緯80°付近の条件の異なる2地域をフィールドとして,(1)調査・観測法の取得,(2)2年間で得られた調査・観測データの解析,(3)国際学会や国際誌上での公表,という3段階の教育を行うものである.そして,2地域での調査・研究データの比較により,北極圏の陸域で起こる氷河・永久凍土変動の地域的な差異を解明することを目的とした.初年度は,スバルバール大学,マウント・ホリオケ大学(USA),筑波大学の合同で,スバルバールにおいて予備的な野外学校を実践した.2007年7月中・下旬に,2008年度の正式な野外学校の実施に先立って,2週間の予備調査と実験・観測地の設置と指導を行なった.教員5名,ティーチング・アシスタント4名,大学院生5名が参加した.スバルバール大学での野外活動基本実習の後,沿岸部(カップ・リンネ)と内陸部(アドベントダーレン)の2地点で,氷河・周氷河地形地形の観察と記載,各地形の地下構造の探査と計測,地形プロセスの観測機材の設置,土壌・凍土・氷・水試料の採取とデータ取得を行った.終了後,スバルバール大学で取得したデータの解析と,調査結果の報告会を実施した.調査結果の一部は,2008年67月にフェアバンクス(USA)で開催される第9回国際永久凍土学会で,2件の論文(受理済)として発表する.20072009年の国際極年において,北極圏の地球環境科学を主題に,各国の大学院生を対象とする国際野外教育学校を企画・実施した.日本とノルウェーの永久凍土研究者で国際的な教授チームを組み,ノルウェー北部のスバルバール諸島を対象に,受講者に対し,(1)調査・観測法を取得させる,(2)2年間で得られた調査・観測データを解析させる,(3)国際学会や国際誌上で公表させる,という三段階の教育を行った.また,調査・観測法だけでなく,北極地域の調査活動に必要なサバイバル・危険回避の技術取得のための訓練も実施した.2年間で,日本,ヨーロッパ,アメリカの国々から,5名の教員,25名の大学院生が参加した.2年目となる2009年度は,8月中・下旬の2週間の期間に,スバルバールのロングイヤーベン地区(内陸)とカップリンネ地区(沿岸)において,セミナー,野外観測,試料採取,室内分析等を実施した.シロクマの出現により,野外活動の一部が制約されたが,充実した指導とデータ取得ができた.共同調査によって得られたデータに基づいて,学生各自がテーマを絞り,北極圏の陸域で起こる永久凍土環境変動の過去・現在・未来の諸側面について考察し,レポートを作成した.とくに,活動層厚の時空的変化,凍土の構成物質,凍土の化学的性質,多角形構造土の分布と内部構造,凍結割れ目の発達プロセスに関して,詳しい成果が得られた.最近の気候の年々変動と長期変動によって活動層厚の変化,永久凍土の部分融解,地形プロセスの年々変動が顕著に起こっており,今後も長期的なモニタリングの継続が必要なことが確認された.成果の一部は2008年7月の国際永久凍土学会で発表した.
アルツハイマ-病の脳に沈着する異常物質の生化学的解析とその処理機構

老人斑を構成するβ/A4の前駆蛋白質であるAPPは、神経細胞の胞体内から突起内へ順行性に運ばれ,その流れが阻害される部位に集積することが各種の原因による軸索スフェロイドやクル斑にAPPが貯る所見から示された。β/A4の直前のAPP断片がアストログリアの突起内にも存在することや、β/A4以外のAPP断片が老人斑に存在することが報告された。β/A4の1517番アミノ酸を切断するAPPセレクタ-ゼ活性が,ラット肝臓から抽出したカテプシンBに認められた。ダウン症の動物モデルといわれるトリソミ-16マウス胎児脳を移植した正常マウスの脳内で、APPの発現増加と微量のβ/A4陽性細胞が証明された。ダウン症脳から分泌型APP,膜結合型APP、APPのC末端部およびβ/A4部が系統的に分離、精製された。西ドイツの122例の正常老人脳およびアルツハイマ-病(AD)脳を調べ、正常老人では原線維変化が海馬にほゞ限局するが、ADでは新皮質に広汎に出現し、日本人と大差がないことが判明した。幼若ラット脳では、MAP 1Bの多数のリン酸化分子種が存在し、PHF抗体はその一部とのみ反応することが判った。さらにラット胎児脳にPHFと共通抗原を持つ分子量70kDの胎児性蛋白質(P70)が存在し,それに対する抗体がラット脳内のcurly fiberよう構造およびPC12細胞の突起のgrowth coneを染めた。したがってこの新しい蛋白質は胎児脳とAD脳で神経突起の伸展と関連する可能性がある。PHFの成分であるタウたんぱくをリン酸化する酵素TPKI,IIについての広汎な研究が,公開シンポジウムで発表された。一方リン酸化されたタウを脱リン酸化する酵素としてプロティンホスファタ-ゼ2Aが同定され,その働きがアルミニウムにより阻害されることが報告された。
GISを活用した河川流域における災害の民俗の統合的分析-吉野川を事例として

本研究では、吉野川流域の自然環境、災害史、災害の民俗に関わる空間情報をGISを用いてデジタルマップに集約した上で、使い吉野川流域の自然環境と民俗事象の相関関係を統合的に検討する作業を行い、河川環境と災害の民俗の関連を客観的に論証した。こうした作業を通して、災害の民俗〓生活の中から生み出された伝統的な治水対策が、当地の自然環境にいかに適応的になされてきたものであるかを立証した。方法論としては、民俗分析におけるGISの有効性を示した。平成19年度は、徳島県等の河川流域における災害の民俗に関する主要文献を収集精読、我が国の河川流域における災害の特色と、災害に対処する民俗の特徴を把握した上で、1)吉野川流域の自然環境に関わるデジタルデータ(流域の土壌や植生、地域別の年間降水量、地点別河川流量、コンターデータ、土地利用、過去の洪水による浸水域、堤防の決壊地点などに関する資料)、2)吉野川流域の過去に洪水の被害に関わる空間データ(過去の洪水記録資料より作成)、3)築堤、防水竹林、高石垣造りの家、水神、不動尊、地蔵尊など「災害の民俗」に関わるデータを、文献調査および現地調査によって収集・整理し、吉野川流域のGISベースマップ上にデジタルデータとしてアップしていく作業を行った。平成19年度は、とくに吉野川中・下流域を中心として調査および作図作業を実施したが、全体を通して、過去に水害に襲われる頻度の高かった地域ほど「災害の民俗」が重層的な姿をもって立ち現れていること(板野郡藍住町、名西郡石井町など)、その対処のあり方として、技術的対応(築堤、高石垣造りの家、防水竹林など)、心意的対応(水神信仰、不動信仰、地蔵信仰など)の両面が併存していることが明らかになった。このような流域における災害の民俗の諸相を空間(地図)上に位置づけていく作業は、人々の生活の中から生み出された治水対策とハザードマップを再構成する作業という点でも大きな意味を持つものと考えられる。また、GISマップを援用して民俗事象の分析を行うという本研究の手法は、民俗の空間情報分析に新たなアプローチをもたらすという意義があるものと思われる。本研究の目的は、吉野川流域の自然環境、災害史、災害の民俗に関わる空間情報をGISを用いてデジタル化しGISマップを作成した上で、GISソフトや画像解析システムを使い、吉野川流域の自然環境と民俗事象の相関関係を統合的に検討する作業を行い、河川環境と災害の民俗の関連を客観的に論証することにある。作業としてはまず、2万5千分の1地形図(べースマップ)の上に吉野刀中下流域の自然地形、および過去の水害被害に関わる空間情報(破堤地点、浸水域など)を落としていった。その上で、別途文献調査・現地調査に基づきデータベース化した災害の民俗に関わる空間情報(築堤、防水竹林、高石垣造りの家、小祠、石造物、祭りや儀礼など)を入力、吉野川流域の自然環境に関わるデジタル地図、災害の民俗に関わるデジタルマップを作成した。地図の上では複数のレイヤー(層)を重ね合わせることによって、自然環境と民俗事象の相関関係を個別的、視覚的に検詞することができる。本研究では、GISソフトを用いることで、河道からの標高(洪水の被害域)と地蔵尊の台座の高さとの関係など、さまざまな要素間の関係性が浮かび上がってきた。こうした手法は、従来の要素限定的・静態的な民俗地図を用いた空間分析に比べ、多くの関係因子を重ねあわせる中から動態的・客観的・実証的に諸要素間の相関関係を分析できる点に特色がある。以上のような作業を通して、災害の民俗=生活の中から生み出された伝統的な治水対策が、当地の自然環境にいかに適応的になされてきたものであるかを立証した。方法論としては、民俗分析におけるGISの有効性を、河川流域の災害の民俗の分析を通じて明らかにした。
作曲領域における子どもの発達過程に関する研究

平成13年度は、12年度の研究成果をふまえて引き続きフィールドワークを行い、グループ活動による子どもの作曲作品及びその形成過程での言語的・非言語的・音楽的ディスコースをデータとして得た。ロンドン大学およびミラノISU大学において子どもの音楽作品の評定を行い、評定結果の分析をKappa及びPage Test for Alternativeを用いて統計的に分析した。それによって、数回の授業を通した各グループ毎の作曲作品の向上(発達)の変化を明らかにした。また、小・中学校間での発達の違いも明らかにした。統計学的に明らかにした各グループの発達の違いを指標として、その違いの背景にある「形成過程」を、主として言語的ディスコース分析の手法を用いて明らかにした。その際、非言語的・音楽的ディスコースも副次的に併せて分析することで、発達の違いの背景を明らかにした。以上の分析から、以下の点が明らかになった。1.グループによる子どもの作曲作品の形成には、主として言語的ディスコースが関わっていること。特に、モノローグとダイアローグの交代が見られ、それによって子どもが個人思考と社会的相互関係の交代を行っていること。2.上記2者の交代を通して、子どもは同一レベルでその交代を繰り返しているのではなく、ディスコース上の質的向上(発達)を行い、スパイラル的に発達していること。同時に、ディスコース上の発達は、Swanwick/Tillmanによる、作曲作品の発達モデルに対応していること。3.作曲作品及びディコースの発達には、道具としての音楽的要素(Musical Features)の使用、教師の指導性、グループ・リーダーの役割、音楽的な先行経験を持っている子ども・持っていない子どもの役割等、幾つかの要因が作用していること。2年間にわたる研究の初年度に当たる平成12年度は、主として研究計画の立案及びパイロット研究の実施とその結果の分析に当てた。4月に自費にて渡英し、ロンドン大学教育研究所のKeith Swanwick教授と研究計画の立案を行った。同時に、先行研究の検討と本研究に関わる資料の収集を行った。5月に松江市内の小・中学校と、本研究のための実験授業及びフィールドワークについて交渉及び説明を行った。その結果、6-7月の2ヶ月間にわたり、松江市立の小・中学校各1校においてそれぞれ5時間(2時間は予備授業)1単元の授業を、3クラスずつ実施した。その結果得られたデータ(子どもの音楽作品及びディスコース)を、8-9月間に整理した。特に子どもの音楽作品のため、10月2-22日間、ロンドン大学教育研究所に出向き、9人の評定者による分析を依頼した。この結果を、統計的に処理し、以下に挙げるような結果を得ることが出来た。この成果を生かし、10-11月に第1期の本フィールドワークを実施した。12月以降は、子ども間・子どもと教師間のディスコースのトランスクリプト化を実施中である。パイロット研究及び第1期本フィールドワークで得られた成果は次の通りである。9人の評定結果の相関関係を統計的に調べ、その結果を因子分析により9人の判定者の傾向を明確化し、特に相関の高い判定者6人の結果をKendallのW検定(カイ2乗検定)、対数線形検定により分析した。その結果、全体の傾向として、小・中学校共に3時間の本授業で子どもの音楽作品が有意に向上したことが明らかになった。同時に、同じ条件下(これまでに作曲の授業の経験があまりない子ども)でありながら、全く同じ授業を行ったにもかかわらず、小学校と中学校間に有意な発達差が確認できた。現在は、有意に子どもが発達した要因を、ディスコースから明らかにする作業を進めているところである。
単一イオンイベントによる高分子ナノ構造体の形成と機能

イオンビームの物質への照射は、イオントラックと呼ばれる極めて高い活性種濃度の化学反応場を与える。高分子薄膜へイオンビームを照射した際には、飛跡に沿ったイオントラック内でのみ選択的に高分子の架橋反応が引き起こされる。照射後に有機溶媒で現像を行うことによって架橋反応を起こした部位のみを単離することができ、1次元の量子細線(ナノワイヤー)が得られる。イオントラック内でのエネルギー付与分布と、反応機構を解明することを目的とし、照射時に薄膜中で形成される動径方向での活性種濃度分布をナノワイヤーとして原子間力顕微鏡で可視化し定量評価する方法を確立した。この方法を用いて、LET・分子量のナノワイヤー径に及ぼす影響を比較・検討することにより、そのサイズを決定する理論モデルを提案した。さらに、ナノワイヤー表面の表面粗さと高分子の形状を比較することにより、ナノワイヤー表面近傍の高分子鎖の形状が、表面の粗さとして反映することを明らかにした。また、デバイス応用などを行う際に重要となるナノワイヤーの空間的な位置を制御することを目的に、基板の表面処理を行うことによりナノワイヤーを選択的に脱着すること、及び、重イオンマイクロビームを用いて基板上に等間隔にナノワイヤーを形成することに成功した。さらには、多層膜を用いることにより、それぞれの高分子セグメントから構成された多段式ナノワイヤ己の形成に成功すると共に、3層膜においては、親水・疎水性を利用した溶媒中での選択的な自己凝集性を見出した。イオンビームの高分子薄膜への照射によって引き起こされるイオントラック内での高分子架橋反応は、ナノメートルスケールの量子細線(ナノワイヤー)を与える。1)ナノワイヤーの長さは、ターゲットとなる薄膜の厚みを正確に反映する、2)ナノワイヤーの太さは入射するイオンのLET及びターゲットの分子サイズにより制御可能、3)ナノワイヤーの一端は基板上に化学結合によって固定され、その基板上の数密度が入射したイオン数を正確に反映する。即ち、一度の反応操作でナノワイヤーの3次元構造を規定する、長さ・太さが同時に、かつ自由に制御可能である事を実証した。また、ポリシラン・ポリカルボシラン及びポリカルボシランとポリビニルシランのブレンドポリマーで形成されるナノワイヤーを比較することにより、ナノワイヤーの太さは、ターゲットとなる高分子材料によっても制御可能であることを、さらに、その高分子の違いによるナノワイヤーの太さサイズの違いを、定量的に解析することによりエネルギー付与密度と高分子の架橋のG値との間の相関関係を明らかにした。ワイヤー末端が化学結合により固定されている点に着目し、1)基板処理によって形成されたナノワイヤーを選択的に着脱する、2)溶媒による未架橋部分の処理過程において、その溶出を利用してナノワイヤーの単一方向に配行させる、点に成功した。高分子薄膜ヘイオンビームを照射した際には、飛跡に沿ったイオントラック内でのみ選択的に高分子の架橋反応が引き起こされる。形成されたナノワイヤーを原子間力顕微鏡(AFM)により測定することは、イオントラック内中での「化学コア」を可視化するという側面を含む。形成されたナノワイヤーの断面半径は、高分子の分子量・イオン種によるLiner Energy Transfer(LET)に依存して変化するため、ナノワイヤーの断面半径をAFMで定量的に測定し、トレースしていくことによりイオントラック内でのエネルギー付与分布と高分子の架橋効率・分子量との間に相関関係を見いだし、定式化することに成功した。ポリシラン・ポリカルボシラン等の無機骨格を有する高分子は高い効率でSiCへの転換反応を引き起こす事が知られている。イオンビーム照射によりこれらの高分子ナノワイヤーを形成した後、雰囲気制御熱転換反応を行うことにより、無機骨格を有する高分子ナノワイヤーが1000度を超える温度条件において安定に焼成され、セラミクスナノワイヤーへ転化すると同時に、極めて高い耐熱性を有することが確認された。また、これまで行っていた単層膜を用いたナノワイヤー形成から、異種の高分子を組み合わせた多層膜を用いた多段ナノワイヤーの形成に成功すると共に、高分子の組み合わせを生かした溶媒中での自己凝集性という新たな機能を付加することに成功した。さらに、照射量を制御することによって凝集体の形態は大きく変化していくことを明らかにした。

さらに、ナノワイヤー表面の表面粗さと高分子の形状を比較することにより、ナノワイヤー表面近傍の高分子鎖の形状が、表面の粗さとして反映することを明らかにした。また、デバイス応用などを行う際に重要となるナノワイヤーの空間的な位置を制御することを目的に、基板の表面処理を行うことによりナノワイヤーを選択的に脱着すること、及び、重イオンマイクロビームを用いて基板上に等間隔にナノワイヤーを形成することに成功した。さらには、多層膜を用いることにより、それぞれの高分子セグメントから構成された多段式ナノワイヤ己の形成に成功すると共に、3層膜においては、親水・疎水性を利用した溶媒中での選択的な自己凝集性を見出した。
ジェミニ型脂質による人工細胞膜モルフォロジー制御

本研究では、アミノ酸残基を含む脂質がスペーサーを介して二分子連結された特徴的なジェミニ型構造を有する人工脂質を用いて、多細胞膜モデルなどの多彩な人工細胞膜モルフォロジーの制御を行うことを目的として研究を推進し、今年度は以下の研究成果を得た。基板上へのベシクルの集積溶液中において、ジェミニ型脂質を含む脂質二分子膜ベシクルの集積挙動を、ジェミニ型脂質のイオン認識挙動により制御できることを見出してきた。この系を基板上に展開し、詳細な検討を行った。具体的には、交互積層法により作製した高分子電解質膜上にジェミニ型脂質を含む平面二分子膜を作製し、この膜上に金属イオン添加をトリガーとしてベシクルを集積した。水晶発振子法および蛍光ラベルしたベシクルが集積した基板の蛍光測定および蛍光顕微鏡観察から、外部刺激をトリガーとして、ベシクルが基板に集積されていることが示された。様々な外部刺激をトリガーとする基板上へのベシクル集積の制御これまでに、様々なジェミニ型脂質を用いることで、異種の金属イオン(銅イオン、カルシウムイオンなど)をトリガーとして溶液中および基板上へのベシクルの集積挙動を制御できることを見出してきた。そこでこの系を用い、異なる種類のイオン認識能を持つジェミニ型脂質を含むベシクルを数種類混合した溶液から、あるイオン種を添加することで、選択的に目的とするベシクルを基板上に集積できる系を構築できることを見出した。脂質膜の相転移がベシクル集積に与える効果脂質集合体としてのベシクルは特徴的な相転移挙動を示すことが知られている。この相転移挙動を利用することで、ジェミニ型脂質へのイオン認識挙動を制御した。さらにこの挙動を利用し、温度によるベシクル集積挙動を制御できることを見出した。1.ジェミニ型ペプチド脂質の開発ペプチド残基としてヒスチジン、アスパラギン酸を有するペプチド脂質2分子を、オリゴエチレンオキシドおよび長鎖アルキル基を介して連結したジェミニ型脂質を合成した。これらのアミノ酸部位は金属イオンの結合サイトを提供し、オリゴエチレンオキシド鎖はアルカリ金属イオンに対するホストとしての擬クラウンエーテルとして機能する。参照化合物としてジェミニ型構造を有しないペプチド脂質の合成も行った。2.外部刺激をトリガーとする人工細胞膜ベシクルの会合制御上述のジェミニ型脂質を、天然由来のリン脂質からなる人工細胞膜ベシクルに導入したハイブリッドベシクルを調製した。このベシクルは銅イオンないしはカルシウムイオンに応答して、そのベシクル間での会合が可逆的に制御されることが示された。ジェミニ構造を有さない参照化合物ではこのような結果は得られないことから、この挙動がジェミニ型の脂質構造に起因しているものであることがわかった。種々の分光測定の結果から、脂質二分子膜間がジェミニ型脂質により架橋されたベシクル間会合が誘起されていることが示唆された。3.固体基板上へのベシクルの集積溶液中におけるベシクル間の会合挙動を基板上に展開した。交互積層法により作成した高分子膜上にジェミニ型脂質を含むリン脂質からなる平面二分子膜を作成し、この膜上に金属イオン添加をトリガーとしてベシクルを集積しうることを見出した。この基板上への、ベシクルの集積挙動は原子間力顕微鏡および水晶発振子法により確認した。
代謝調節型グルタミン酸受容体の神経変性防護作用に関する研究

筋萎縮性側索硬化症の病因の一部に興奮性アミノ酸による神経細胞死のメカニズムが関与していることが示唆されているが、グルタミン酸受容体のサブタイプである代謝調節型グルタミン酸受容体を刺激すると神経細胞死が抑制されることが近年示されている。このことをinvivo系で明らかにするために、代謝調節型グルタミン酸受容体アゴニストである(2S,1'R,2'R,3'R)-2-(2,3-dicarboxycyclopropyl)glycine(DCG-IV)を微小浸透圧ポンプを用いて長時間(10時間以上)持続的に脳室内または脊髄くも膜下腔に前投与したあと、カイニン酸、アクロメリン酸をそれぞれ脳室内、脊髄くも膜下腔に投与し、引き起こされる神経細胞死に対するDCG-IVの防護作用を検討した。DCG-IVの前処理により、これらの興奮性アミノ酸による行動変化・神経病理学的変化が用量依存性に著明に軽減した(最大効果は8-27pmol/hで投与したときに得られた)。DCG-IVの前処理のみでは脳室投与では800pmol/h以下、脊髄くも膜下腔投与では80pmol/h以下の投与量ではラットには行動・病理変化はみられなかった。このin vivo実験の結果は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブタイプの活性化が興奮性アミノ酸の神経興奮作用・神経毒性と関係するのに対し、ある種の代謝調節型受容体サブタイプの活性化は、神経興奮抑制及び神経防護に関与し、神経細胞死の予防・治療が期待できることを示している。代謝調節型グルタミン酸受容体アゴニストは、興奮性アミノ酸の神経毒性を抑える可能性があり、筋萎縮性側索硬化症の治療法の開発の上で検討に値する。
酵母のDNA複製を調節する核蛋白の精製とその機能解析

酵母のDNA複製を調節する70Kdの核蛋白(p70)に対するモノクロ-ナル抗体を用い、発現ベクタ- λgtllに作成した酵母gene libratyよりこの抗体と反応する融合蛋白を生産するクロ-ンを取得した。さらに遺伝子全体を含むクロ-ンを酵母ゲノムライブラリ-より取得し得られたDNA 5.1KbのDNA塩基配列の決定を行ない、この配列中に4.1KbのORFの存在を見いだした。核酸および蛋白のデ-タベ-スに対しホモロジ-検索を行ない、本遺伝子が新規なものであることを確認した。解析の結果、本遺伝子はN末端近傍約250bp内にp70と同一のエピト-プを持つ130Kdの核蛋白をコ-ドするものであることが明らかになった。本遺伝子の発現は酵母の生育と強く関連しており、また本遺伝子を破壊した株は劣性致死の形質を示したことから、本遺伝子は酵母の生育に必須なものであることを見いだし、この遺伝子をNPSI(nuclear protein of Saccharomyces)と命名した。本遺伝子の破壊株内で遺伝子をGALIプロモ-タ-の支配下に発現させて生育させたのち、グルコ-スを含む培地に移して遺伝子の発現を停止させると細胞は核が一つで大きな芽を持った形態に揃って生育を停止した。このことから本遺伝子は細胞周期のS期またはM期の調節に関わるものであることが明らかになった。また本遺伝子の破壊をホモに持つ二倍体の条件致死株を作成し、NPS1遺伝子の胞子形成過程における作用の有無を調査した結果、NPS1は胞子形成にも必須であることを明らかにし、その作用時期は減数分裂前DNA複製期の当たりであることを示す結果を得た。さらにnps1蛋白にはDNA結合活性、蛋白リン酸化酵素活性があることを生化学的に明らかにした。以上の結果により、NPS1はDNA結合能、蛋白リン酸素酵化活性を持ち、酵母の生育・胞子形成に必須な核蛋白をコ-ドする新しい細胞周期調節伝遺子であることを明らかにできた。酵母のDNA複製を調節する70kdの核蛋白(p70)に対するモノクロ-ナル抗体を用い、発現ベクタ-λgt11に作成した酵母gene libraryよりこの抗体と反応する融合蛋白を生産するクロ-ンを取得した。このクロ-ンに挿入されたDNAが酵母ゲノム由来であることを確認し、さらに遺伝子全体を含むクロ-ンを取得した。得られたDNA5.1kbのDNAが塩基配列の決定を行ない、この配列中に4.1kbのORFの存在を見いだした。解析の結果、本遺伝子はN末端近傍約250bp内にp70と同一のエピト-プを持つ130kdの核蛋白をコ-ドするものであることを明らかにした。本遺伝子の発現は酵母の生育と強く関連しており、また本遺伝子を破壊した株は劣性致死の形質を示したことから、本遺伝子は酵母の生育に必須なものであることを見いだした。本遺伝子の破壊株内で遺伝子をGAL1プロモ-タ-の支配下に発現させて生育させたのち、グルコ-スを含む培地に移して遺伝子の発現を停止させると細胞は核が一つで大きな芽を持った形態に揃って生育を停止した。そこでこの遺伝子の産物に対して調製した抗体を酵母の核抽出液を用いたin vitro

DNA複製系に作用させたところ、dose dependentな活性の阻害が認められた。以上の結果により、本遺伝子は酵母のDNA複製に関わる新しい細胞周期調節遺伝子であることを明らかにできた。昨年度、本研究補助金を受けて研究を行ない、酵母の新しい細胞周期調節遺伝子NPS1(nuclear protein of Saccharomyces)のクロ-ニングに成功した。今年度はこの遺伝子の酵母の生育における機能、ならびに本遺伝子産物の生化学的活性の解析を行ない、以下の事を明らかにした。1)NPS1は酵母の生育に必須でその破壊は細胞に劣性致死の形質を与える。今回、本遺伝子の破壊をホモに持つ二倍体の条件致死株を作成し、NPS1遺伝子の胞子形成過程における作用の有無を調査した。この結果、NPS1は胞子形成にも必須であることを明らかにし、またその作用時期は減数分裂前DNA複製期の当たりであることを示す結果を得た。2)nps1蛋白に対する抗体を調製し、間接蛍光抗体法によって細胞の抗体染色を行ない、nps1蛋白が酵母の核にのみ局在していることを明らかにした。また同様に、細胞の各オルガネラを単離しその蛋白を電気泳動で分離後ウエスタンブロット解析でnps1蛋白の検出を行なった結果、この蛋白が核内のクロマチンまたは核骨格蛋白に結合した状態で存在する事を明らかにした。3)NPS1の推定アミノ酸配列中にヒストンH1とホモロジ-のある部分、および蛋白リン酸化酵素の活性領域との類似部位が存在した。そこでNPS1遺伝子を高発現させた酵母より、nps1の部分精製標品を調製し、これについてDNA結合活性、および蛋白リン酸化酵素活性の同定を行なった。この結果、本蛋白にはこの両方の活性が存在する事を明らかにした。