hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＡＩＤによるｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ１を介したゲノム不安定性誘導のメカニズム

Activation-induced cytidine deaminase (AID)による抗体記憶のゲノムへの刻印はDNA切断により開始される。DNA構造の維持に働くトポイソメラーゼ1 (Top1)がAIDに誘導され、そのDNA切断を遂行する分子機構を解析し、従来のDNA編集仮説を正した。AIDはDNA切断とDNA修復という2つの機能を有し、各々はアミノ基側とカルボキシル基側の別々のドメインに依存する。各々の機能に特異的かつ必須のAIDの共役分子、hnRNP KとhnRNPLの2つを同定し、それらの機能を解析した。AID突然変異と非常に似た病態の高IgM血症5型を示すウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)欠損症ではCSRが抑制されるもののSHMは保たれており、2者の差を分子機構のレベルで証明した。また、APエンドヌクレアーゼ1 (APE1)のCSRでの機能がDNA切断後修復に特化していることを証明した。AIDによるDNA切断とDNA修復の2つはそれぞれ、特異的なクロマチン構造を要求する過程であることを証明した。クロマチン構造変換因子SMARCA4や転写伸長因子Spt4/5複合体、ヒストンアセチル化リジンに結合するBrd4が免疫グロブリン遺伝子組換えにおいて重要な機能を果たすことを示した。昨年に発表したデータとして重要なことは、第一にAIDのプロモーター解析を行い、この中でAIDがBリンパ球に特異的になおかつ活性化されたときに発現される制御領域を同定し、培養細胞中でのそのエレメントの役割を報告した。第二に、AIDのN末端領域に点突然変異(G23S)を導入したノックインマウスを用いて、AIDによる体細胞突然変異が腸管における免疫レパートリー形成に不可欠であり、腸管内細菌との相互作用により腸管系の獲得免疫系のレパートは形成がはかられていることを明らかにした。第三に、クラススイッチにおけるターゲットの決定にヒストンH3K4トリメチルが不可欠であることを明らかにした。このヒストン修飾にはFACTコンプレックスと呼ばれるSSRP1とStp16複合体が不可欠であり、この両者いずれかをノックダウンしても領域の転写制御は低下しないが、クラススイッチにおけるDNA切断が著しく低下することを明らかにした。なお、未発表の成果としてAIDのターゲットをゲノムワイドに決定し、免疫グロブリン以外に未知のターゲット領域を十数個同定した。またAIDがTリンパ球に発現されることを明らかにし、これが加齢とともに上昇することを示した。最後にTopoisomeraseの翻訳がAIDで抑制されるしくみを明らかにするためにGFPとTopoisomeraseメッセンジャーRNAの複合体を作り、CH12細胞中で3'UTRにTopoisomeraseメッセンジャーRNAの翻訳抑制機能が存在することを明らかにした。A.AIDによるTop1蛋白質低下のメカニズムの解明Top1 3' UTRにAgo2タンパク質がシークエンス特異的に結合することを明らかにした。現在、この塩基配列を約20塩基対の領域に同定し、それぞれの点突然変異の導入によりどの塩基配列がマイクロRNAを介してAgo2と結合するかの検討を行っている。今回、Top1遺伝子のヘテロザイゴートマウスを作製し、このマウスで体細胞突然変異が著しく亢進していることを示し、AIDの作用にTop1の関与をさらにin vivoで確認した。B.AIDのターゲットがNon-B構造を取ることの証拠S領域などの反復配列がNon-B構造を転写の際に取り易いことはすでに多くのグループから報告がある。我々は、抗体遺伝子以外で高頻度にDNA切断を受ける新たな領域を4座同定し、その周辺にいずれも反復配列が多数存在することを明らかにした。C.FACT等のヒストンシャペロンにより、ヒストンH3K4me3がクラススイッチに必須であることの確認あらたにSPT6とSPT5のノックダウンを通じて、ヒストンH3K4me3がS領域のDNA切断ターゲット認識部位として不可欠なことを明らかにした。現在、H3K4me3トリメチル以外の修飾がいかに関与するか、また、これと体細胞突然変異における相関の研究を行っている。AIDのC末端ミュータントを用いてクラススイッチにおけるDNA結合の様式に大きな差が出ることを明らかにした。<AIDの構造と機能>AIDが一量体の他に二量体を形成し、それぞれ異なるRNA結合タンパク質(hnRNP)と結合することを発見した。すなわち、単量体はhnRNP Kと結合し、その結合はRNA依存的である。二量体はhnRNPLと結合し、その会合はやはりRNA依存的である。我々はすでにC末端の変異によりAIDが組換え反応を遂行できず、クラススイッチ阻害を引き起こすことを示している。C末変異体では二量体を形成できないので、二量体形成とhnRNP Lの結合によるRNA認識がクラススイッチ組換えに関わるタンパク質生成に必須と推定され、その検証を続ける。<AIDによる特異的DNA切断機構>我々はすでにtopoisomerase1 (Top1)がAID発現によって低下し、その結果反復配列の多い免疫グロブリン(Ig)遺伝子座にNon-B構造を形成すること、さらにIg遺伝子にヒストン修飾H3K4Me3やヒストンシャペロンFACTが集積することを示した。今回あらたにSmarka4と呼ばれるクロマチン制御タンパク質がH3K4me3-FACT Top1のコンプレックス形成に不可欠であることを発見した。また、Top1はAIDによりそのC末端にマイクロRNAが結合し、その結果翻訳が低下することを明らかにした。<AIDによるクラススイッチ組換えの仕組み>

C末端に変異があるAIDでは組換えがうまくいかないのは、二カ所の切断DNA断端を相互に近傍に手繰り寄せるシナプス形成がでないことが原因であることを明らかにした。このシナプス形成にはUNGが足場タンパクとして必要であり。Brd4と呼ばれるヒストンγH2AXを認識する結合タンパクも関わることを明らかにした。以上の発見により、AIDの機能についての大筋が明らかとなった。<AIDによるTop1翻訳阻害のメカニズムの解明>本年度はAgo2タンパク質がTop1 mRNAに結合する特異的部位をPAR - CLIP法によって同定した。一箇所はAIDに依存しない領域であり、一箇所はAID刺激時のみに結合する領域であった。さらにこの結合部位の近傍でmiRNAが直接結合する塩基配列の決定を行い、現在これに結合するmiRNAの同定を進めている。<AID依存DNAターゲット切断の特異性決定メカニズムの解明>AIDによる切断ターゲット部位にはNon-B構造をとる塩基配列が存在することを明らかにした。さらにS領域の単鎖塩基配列に特異的に結合する人工タンパク質(TALE)を発現させると、転写を阻害せずにクラススイッチ(CSR)を阻害することを発見した。このことはS領域が部分的に単鎖構造をとり、それがCSRに重要なことを示し、我々のモデルと一致する。<AID依存切断後のUNGによる体細胞突然変異(SHM)とクラススイッチ組換えの制御>Top1切断によって生じる単鎖ギャップにおいて、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)が酵素でなく、正しく修復する酵素群(BER)の足場タンパク質として働きRev1を足場タンパク質とする変異を導入する酵素群(error - proneポリメラーゼ)と競合的に結合することを発見した。CSR組換えを起こすためにはメガベース領域の離れた二箇所のS領域間でシナプスを形成することが重要である。UNGはこの段階において53BP1とDNA PKcsと協調して働くことを明らかにした。UNGはさらにその後のDNA切断後の修復にも関与し、DNA断端の接近保持に重要な役割をすることを明らかにした。なお、AIDのC末端側によるRNA編集によるあらたな産物もこの段階で協調的に働く証拠を得た。我々はAIDの作用機作について10年以上にわたるRNA編集説とDNA脱アミノ説の論争に決着をつける2つの大きな発見を行った。第1にAIDが体細胞突然変異(SHM)とクラススイッチ組換え(CSR)を行うためにRNA結合たんぱく質hnRNPKおよびhnRNPLが不可欠であることを実証した。RNA編集酵素として確立しているAPOBEC1の共役因子であるACFはhnRNPタンパク質群と構造的に類似のタンパク質である。
訪問診療での使用を目的とした低膨張性レジン添加型グラスアイオノマーセメントの開発

液成分中に親水性の多官能性モノマーあるいはHEMAを加えた試作レジン添加型グラスアイオノマーセメントを用いて材料学的性質(機械的強さ,吸水率)と牛歯象牙質に対する接着強さの検討を行った.その結果,多官能性モノマーを用いたセメント(セメントA)はHEMAを用いたセメント(セメントB)より有意に大きな機械的強さならびに小さい吸水率を示した.被着面処理を行うことでセメントAのせん断接着強さはセメントBに比べ有意に大きな値を示した.以上より,レジン添加型グラスアイオノマーセメントに添加されるレジン成分は機械的強さ,吸水率ならびに接着強さに影響を及ぼすことが明らかとなった.従来のレジン添加型グラスアイオノマーセメントに添加されているレジン成分は一般にHEMAが含まれているが,今回HEMAを含まない水溶性の多官能性モノマーを用いたレジン添加型グラスアイオノマーセメントを試作し,その機械的性質を測定した.なお,レジン成分の添加量は水溶性の多官能性モノマーならびにHEMAとも10wt%とした.また,レジン成分を含まないセメントをコントロールとした.機械的性質として曲げ強さの測定を行った.その結果,水溶性多官能性モノマーならびにHEMAを用いたレジン添加型グラスアイオノマーセメントの曲げ強さはレジン成分を含まないコントロールと比較して有意に大きい曲げ強さを示した.また,水溶性多官能性モノマーを用いた場合ではHEMAを用いた場合より有意に高い曲げ強さを示した.吸水率に関してはレジン成分を含まないセメントをコントロールが最も小さい吸水率を示し,水溶性多官能性モノマーを用いた場合ではHEMAを用いた場合より有意に低い吸水率を示した.PRGフィラーはフルオロボロアルミノシリケートガラスとポリカルボン酸との酸ー塩基反応で生じた反応生成物であるグラスアイオノマー相を含んでいる.ガラス粒子の表層のみにグラスアイオノマー相を形成させるS-PRG技術(S-PRGフィラー)とガラス粒子全体にグラスアイオノマー相を形成させるF-PRG技術(F-PRGフィラー)に分類される.今回はこのS-PRGフィラーを含有した充填用レジン添加型グラスアイオノマーセメントを試作し,そのフッ素溶出量について検討を行った.実験には粉末の主成分がアルミノシリケートガラス,液成分に親水性多官能性モノマーを含んだ充填用レジン添加型グラスアイオノマーセメントを用いた.このセメント粉末中にS-PRGフィラーをそれぞれ1,3,5wt%添加し,3種類の試作セメントを使用した.直径20mm,高さ2mmの円板状試料を作製し37°Cの脱イオン水中(30mL)に浸漬保管した.フッ素溶出量の測定は水中浸漬1,2,3,4,5,6,7,8,9,10および14日後に行った.測定はイオン選択電極法にて行い,試料数は各5個とした.その結果,14日間を通してS-PRGフィラー5wt%含有試料は1wt%含有試料より有意に高いフッ素溶出を示した.レジン添加型グラスアイオノマーセメントにS-PRGフィラーを1 wt%から5wt%に増加させることで,14日目の累積フッ素溶出量が40%増加することが認められた.本実験条件より少量のS-PRGフィラーの添加によりフッ素溶出が増加することが認められた.交付申請書に記載した平成27年度の研究実施計画では,試作したレジン添加型グラスアイオノマーセメントの継時的添加の検討を行うことを予定していた.蒸留水中に4週間浸漬した検討を行ったが,サーマルサイクル試験による加速劣化試験後の機械的強さの測定に関しては当初の予定より遅れているのが現状である.それに対して,充填用への応用を考えているため,フッ素の溶出量の測定を新たに行うことを計画し,こちらの計画はおおむね順調に進行していると考えている.試作充填用レジン添加型グラスアイオノマーセメントの牛歯に対するせん断接着強さの測定を行った.実験には新鮮抜去牛歯を歯冠部で切断後エポキシ樹脂に包埋し象牙質面を露出させ,耐水研磨紙600番まで研磨した.その後,市販の歯面処理剤(10%ポリアクリル酸水溶液)を用いて20秒間処理を行い水洗・乾燥後被着面とした.また,比較対照として,被着面処理を行わない試料を作製した.試作セメントとして,レジン成分に親水性多官能性モノマー(セメントA),HEMA(セメントB)を用いたレジン添加型グラスアイオノマーセメントを用いた.なお,レジン成分の添加量をそれぞれ10wt%とした.なお,比較対照としてセメントAならびにBと同一成分でレジン成分のみ含まないセメント(コントロール)を用いた.各セメントの粉液比を4.5/1.0とした.被着面上に内径4mm,高さ6mmnテフロン製モールドを置き,セメント練和物を填塞し,定圧荷重装置で15kgの荷重を加えた.その後,光照射を20秒間行い,37°Cイオン交換水中に24時間浸漬保管した.せん断接着試験は室温大気中でクロスヘッドスピード1.0mm/minの条件で万能試験機を用いて行った.その結果,コントロールとセメントAおよびセメントBの間のせん断接着強さに有意な差は認められなかった.また,象牙質表面の処理の有無によるせん断接着強さにも有意差は認められなかった.

本実験条件では,親水性多官能性モノマーを用いた試作レジン添加型グラスアイオノマーセメントの接着強さは従来レジン成分として用いられているHEMAと比較して,その接着強さに差がないことが明らかとなった.液成分中に親水性の多官能性モノマーあるいはHEMAを加えた試作レジン添加型グラスアイオノマーセメントを用いて材料学的性質(機械的強さ,吸水率)と牛歯象牙質に対する接着強さの検討を行った.その結果,多官能性モノマーを用いたセメント(セメントA)はHEMAを用いたセメント(セメントB)より有意に大きな機械的強さならびに小さい吸水率を示した.被着面処理を行うことでセメントAのせん断接着強さはセメントBに比べ有意に大きな値を示した.以上より,レジン添加型グラスアイオノマーセメントに添加されるレジン成分は機械的強さ,吸水率ならびに接着強さに影響を及ぼすことが明らかとなった.交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画では,試作したレジン添加型グラスアイオノマーセメントの機械的強さに関して検討を行うことを第一段階とした.機械的強さとして,曲げ強さを測定したところ,HEMAを用いたレジン添加型グラスアイオノマーセメントと比較して有意に高い値を示していた.また,吸水率は有意に小さい値を示していた.従って,現時点での達成度としてはおおむね順調であると考えている.試作したレジン添加型グラスアイオノマーセメントの機械的強さに加え,フッ素の溶出量についても検討を行ってきた.さらに,充填用への応用を目的としていることから牛歯を用いたせん断接着強さについて検討を行う予定である.歯科材料学試作したレジン添加型グラスアイオノマーセメントの曲げ強さの評価に加えて,その他の機械的性質に関しても検討を続けていく予定である.また,崩壊率ならびに吸水膨張量に関しても,検討していく予定である.レジン成分として添加する水溶性の多官能性モノマーの選定に時間を費やしたため交付申請書に記載した機械的性質の測定を継続していくと同時に,機械的性質の経時的変化(静的環境下ならびに加速劣化試験)について検討を行っていく予定である.
スクールリーダー(教育行政官・学校管理者)再教育カリキュラム開発の総合的研究

本年度は、共同研究者高見と研究協力者は、昨年度実施した教育系専門職大学院設置に関する調査I(教育行政官・学校管理職対象)および同II(学校事務官・事務職員対象)の集計作業と分析を実施した。専門職大学院設置を求める意見は根強いものがあるが、現状ではその内容・効果に疑問を呈する意見も少なからず見られた。また修学条件も在職者であるとの前提から遠隔教育システムの必要性、夏季・冬季休暇などのを検討すべきであるとの意見が出されていた。学費負担については、自己負担と公費負担の折半を求める意見が最も多く出されていた。さらに組織マネジメント能力は、教学管理・教育的識見の上に構築されるべきものであるとの意見も見られた。調査IIでは、勤務学校段階の違いによって回答結果に大きな違いがあることも判明した。このような調査結果を基に、米国における専門職大学院における実施プログラムの検討、学校管理職者の再教育プログラム実践の報告と分析、事務職員再教育プログラムの検討、福祉系専門職大学院のカリキュラムの検討、遠隔教育システムの構築の可能性の検討が行われた。日本において教育系専門職大学院を設置するには、多くの課題が残されておりさらなる研究が必要とされる。しかし、現時点における対象者の見解-需要状況についてはある程度把握できたといえる。具体的な教育系専門職大学院の制度設計を推進する上で、留意すべき点、外国の制度とわが国の制度の違い、教育行政官・学校管理職者と事務官・事務職員の意識・需要の違いなども判明し、一定の成果を上げることができた。今後は今回の研究を踏まえて、遠隔教育システム等の手段を組み込んだより具体的な制度設計に取り組みたいと考えている。本年度は、教育系専門職大学院への需要がどの程度あるのかを見るために、教育系専門職大学院設置に関する調査I(教育行政官、学校管理職対象)と、教育系専門職大学院設置に関する調査II(学校事務官、事務職員対象)の2種類を作成した。そして前者については、都道府県教育委員会47、政令指定都市教育委員会12、東京都特別区23、三重、滋賀、京都、兵庫、大阪、奈良、和歌山(以下7府県)の市町村158、7府県の公立小学校の校長・教頭・教務主任各150、中学校・高等学校の校長・教頭・教務主任各100、7府県私学校長・教頭・教務主任各100の計1500機関に調査票を郵送した。また後者については、都道府県教育委員会47、政令指定都市12、7府県市町村100、国立大学・短大の事務局114、公立大学・短大の事務局125、7府県公立高校・中学・小学校事務長計各200、私立大学・短大51、私立高等学校事務長144の計1500機関に調査票を郵送した。現在回収作業中であるが、回収後直ちにコンピュータにデータをインプットし分析作業に入る予定である。本年度は、教育系専門職大学院への需要がどの程度あるのかを見るために、教育系専門職大学院設置に関する調査I(教育行政官、学校管理職対象)と、教育系専門職大学院設置に関する調査II(学校事務官、事務職員対象)を実施した。各1500人を対象に調査表を配布し30%程度の回収率であった。専門職大学院の必要性は、教育行政官・学校管理職対象の調査では明確に出ていたが、事務官・事務職では明確とはいえなかった。特に前者は問題解決のための授業や教育目標・ねらいを見出す授業に高い関心をもっている傾向が見られた。後者では問題解決型の授業には高い関心が見られたものの、教育目標・ねらいに関する授業に対する関心はさほど高いとはいえない状況であった。それはやはり職務分担意識に起因するものといえる。また両調査とも企業等外部の組織における研修機会についても高い評価をしていた。

さらに給与、昇進等に専門職大学院における研究歴をリンクさせることには抵抗感を示していた。京大在職中から現場の管理職の再教育プログラムの実践に基づいたカリキュラム開発研究も実施しまた、米国における教育系専門職大学院の教育課程についての調査も実施した。ユニークな面白い実践に役立つプログラムが展開されていた。その他米国における教育福祉関係の専門家養成のカリキュラム・制度の実情、情報ネットワーク・産学連携のための事務部門における専門家養成のカリキュラム開発等についても調査検討を試みた。また専門職大学院の授業プログラムを遠隔教育で実施するための技術的条件等についても検討し、e-learning教材開発プラットフォームを創作し、それを利用したモデル授業の収録を試みた。
異常な細胞小器官から解き明かす脊髄小脳変性症15/16の発症機構

IP3R1は脊髄小脳失調症(SCA)の原因遺伝子の一つであるが、IP3R1の異常がどのようにSCAを起こすのかは不明である。本研究では、脳特異的IP3R1欠損マウスを用いて、IP3R1欠損により、カルシウム結合タンパク質であるカルビンデインの発現がプルキンエ細胞において顕著に低下することを明らかにした。また本研究では、SCA29患者に新たに見出したIP3R1のサプレッサー領域に存在する点変異の生化学的解析に関してもおこなった。その結果、この変異型のIP3R1は、IP3に対して高い親和性をもち、持続的な多くのカルシウム放出を示す事を明らかにした。本研究はタイプ1型IP3受容体(IP3R1)の小脳・脳幹特異的欠損マウス(Wnt1-Cre:Itpr1flox/floxマウス)を用いてプルキンエ細胞の経時的形態変化を明らかにし、SCA15/16の発症メカニズムを明らかにすることを目的とした。一方、本年度はヒト脊髄小脳変性症の患者に新たに見つかったIP3R1の点変異に関する実験もおこなった。この家系の患者は、IP3R1遺伝子の細胞質に存在する領域に点変異をもっていることが明らかになった。この点変異体を作成し、IP3受容体を持たないR23-11細胞に発現させ、M4刺激に対するカルシウム動態を測定した所、野生型のカルシウム動態に対して、変異型のIP3R1は異常なカルシウム動態を示す事が明らかになった。今後は、IP3に対するアフィニテイなどを明らかにしていく予定である。15ヶ月齢Wnt1-Cre:Itpr1 flox/floxマウスのプルキンエ細胞においてカルビンデインの欠失はみられているものの、電顕レベルでのプルキンエ細胞の変性および脱落は確認出来ていない。ヒト疾患SCA15/16は発症が遅いという特徴をもつ為、マウスのプルキンエ細胞の変性脱落にさらに長い期間を要する可能性も考えられる。マウスをより高週齢にすることを進める一方、今後はWnt1-Cre:Itpr1 flox/floxマウスのプルキンエ細胞において、IP3受容体からのカルシウムにより活性化される標的分子のシグナル異常を積極的に明らかにしていくことが必要と考えている。脊髄小脳失調症(SCA)は、歩行時のふらつきや手の震え等の運動失調を主症状とする神経変性症の病気である。小脳や脳幹の萎縮がみられるという特徴がある。日本ではおよそ3万人の患者がいるとされ、遺伝性のSCAはその原因遺伝子により約40種類に分類されている。このうち、SCA15とSCA16の原因遺伝子が1型IP3受容体(IP3R1)であることが近年報告された(Hara et al. Neurology, 2008)。また、SCA29の原因遺伝子もIP3R1であることが明らかになった(Huang et al. 2012)。さらに近年、他の脊髄小脳失調症の様々な原因遺伝子がIP3R1を介した細胞内カルシウム動態と何らかの関わりを持つことが示唆され(Ataxin2,3, PKCγ, TRPC3など)、IP3R1からのカルシウム動態異常が脊髄小脳失調症発症の中心的役割を果たすという仮説が唱えられている。そこで、本年度はIP3R1からのカルシウム放出の制御に関わる上流や下流シグナルを明らかにする目的で、SCA関連遺伝子の解析を進めることにした。まず、機能未知遺伝子のマウス脳での発現形式をin situ RNAハイブリダイゼーションをおこない明らかにした。その結果、この遺伝子の発現は、小脳のプルキンエ細胞や顆粒細胞、海馬の錐体神経細胞に多いことが明らかになった。また様々な年齢のマウスの小脳のRNAを用いてqRT-PCRを行った結果、その発現は生後P1より生後3週まで上昇し、その後成体までほぼ一定であることを明らかにした。また、培養細胞に過剰発現させ、機能未知遺伝子の細胞内局在を明らかにした。また、この遺伝子のGST融合タンパク質を作成して、ウサギを用いて抗体を作成した。本年度は、SCA関連遺伝子のin situ RNAハイブリダイゼーションをおこないマウス脳内での発現様式を明らかにした。その結果、この遺伝子の発現は、小脳(プルキンエ細胞や顆粒細胞)、および海馬の錐体神経細胞に高いことが明らかになった。また様々な組織のRNAを用いてqRT-PCRを行った結果、脳特異的に発現することを明らかにした。また小脳での発現レベルは生後P1より生後3週まで上昇し、その後成体までほぼ一定であることを明らかにした。また、培養細胞に発現させ、そのタンパク質が小胞体に存在することを明らかにできた。さらに現在までに、このタンパク質に対する抗体を2種類作成した。今後は、このタンパク質とIP3受容体からのカルシウムシグナルとの関わりを明らかにしていく予定である。近年、脊髄小脳失調症の様々な原因遺伝子がIP3R1を介した細胞内カルシウム動態と何らかの関わりを持つことが示唆され、IP3R1からのカルシウム動態が脊髄小脳失調症発症の中心的役割を果たすという仮説が考えられている。そこで、SCA原因遺伝子とIP3R1カルシウム動態との関連を明らかにすることを試みている。本年度はSCA関連遺伝子Xの解析を進め、次の知見を得ることができた。

遺伝子Xは、細胞において多量体を形成してクラスター状に分布しており、それがレドックス依存的に制御されるメカニズムを明らかにした。また、遺伝子Xは、海馬や小脳の神経細胞においてリン酸化されていることを発見し、そのリン酸化は、リン酸化酵素Yにより担われていることを明らかにした。実際、海馬神経細胞に酵素Yの阻害剤を投与するとそのリン酸化が有意に低下することを明らかにした。また一方、遺伝子Xの機能については現在までに全く明らかにされていないため、のヒト変異型遺伝子Xをマウスに過剰発現させて、マウスの行動、神経細胞の機能に与える影響を明らかにすることにした。まず、ヒト変異型遺伝子XをマウスBac cloneの遺伝子Xプロモーターの下流に挿入したコンストラクを作成し、そのDNAをマウス受精卵にインジェクションしてトランスジェニックマウスを作製した。その結果、ヒト変異型遺伝子Xトランスジェニックマウスは、生後10週齢くらいから歩行異常を示すことを明らかにした。このトランスジェニックマウスはgeneXの生理的機能を明らかにする上で有用なモデル動物となると考えている。IP3R1は脊髄小脳失調症(SCA)の原因遺伝子の一つであるが、IP3R1の異常がどのようにSCAを起こすのかは不明である。本研究では、脳特異的IP3R1欠損マウスを用いて、IP3R1欠損により、カルシウム結合タンパク質であるカルビンデインの発現がプルキンエ細胞において顕著に低下することを明らかにした。また本研究では、SCA29患者に新たに見出したIP3R1のサプレッサー領域に存在する点変異の生化学的解析に関してもおこなった。その結果、この変異型のIP3R1は、IP3に対して高い親和性をもち、持続的な多くのカルシウム放出を示す事を明らかにした。近年SCA関連遺伝子が次々と明らかになり、PolyQ型Ataxin2, 3がIP3R1に結合してカルシウム動態を異常にすることが報告された。また、PKCガンマやTRPC3がそれぞれSCA14およびSCA41の原因遺伝子と明らかにされ、TRPC3の活性はPKCガンマによるリン酸化により抑制されることも報告されている。これらの分子はIP3R1の下流のターゲットとなる可能性があるため、今後はWnt1-Cre:Itpr1 flox/floxマウスのプルキンエ細胞のPKCやTRPC3チャネルの活性異常を明らかにしていくことなどを含め、IP3受容体と他のSCA関連遺伝子の関連を明らかにしていき、IP3受容体のSCA発症における役割を総合的に明らかにしていく。近年およそ40のSCA関連遺伝子が次々と明らかにされ、そのうちのいくつかの原因遺伝子がIP3R1となんらかの関係をもつことが明らかになってきた。このため、IP3受容体と他のSCA関連遺伝子の関連を明らかにしていくことが今後重要な課題であり、IP3受容体のSCA発症における役割を総合的に明らかにしていくことを考えている。
日本語音声における韻律的特徴の実態とその教育に関する総合的研究ー国語教育における音声教育の方策に関する研究ー

(1)DAT録音機による小・中・高校の児童・生徒の音読・朗読の実態調査(東北-秋田、関東-東京、関西-大阪・京都・兵庫、九州-佐賀)を継続し、その結果の一部を、音読データベース「小学生の朗読ーその実態と指導ー」(コンパクトディスク)に収録した。(2)音読データベース「小学生の朗読ーその実態と指導ー」(コンパクトディスク)を作成した。その内容は、1.朗読を始めるにあたって/2.朗読の実態(1)/3.朗読の実態(2)/4.朗読指導の実際/5.外郎売りというものであり、朗読の音声資料として用いるだけでなく、実際の音読・朗読指導に具体的方法を提示するものとした。(3)幼・小・中・高校における音声教育の資するカリキュラム・指導法・指導例を〈幼稚園・小学校部門〉、〈中学校部門〉、〈高等学校部門〉、に分けてD2班平成4年度研究成果報告集に収録した。また、大学における音声言語教育、演劇教育に資する指導計画・指導法を報告書の〈大学部門〉に収録した。さらに、音読データベース「小学生の朗読ーその実態と指導ー」(コンパクトディスク)の内容を文字化したものを報告集に収録するとともに、音声資料の一部をパソコン高速音声処理システム「音声録聞見」によって分析した結果も収録した。
一般学生が映像によりメッセージを伝える力を修得するための学習パッケージの開発

本研究では、映像制作に対して専門知識を持たない一般学生が、メッセージを伝えるための映像制作スキルを習得するための学習パッケージ(学習プログラム、教材、評価手法)を開発することを目的としている。平成29年度は学習パッケージの内、20時間で企画・撮影・編集といった映像制作の全行程を学ぶ学習プログラムの開発を行っなった。平成30年度は、前年度の実験で得られた知見を基に、映像表現のための教材(テンプレート)の試作を行なった。テンプレートとは映像表現を行う際に用いる雛形で、題材に合わせて手直しすることで、素人でも映像表現を行うことを容易にするための教材である。本研究の最終目標は一般学生向けの学習パッケージ開発であるが、第一段階として講演やギャラリートーク等、映像化する題材を有する博物館学芸員向けの学習パッケージの開発を行なった。学習パッケージの可能性を評価し、開発手法を構築した後、一般学生向けに学習パッケージの一般化を目指す戦略である。平成30年度は、テンプレート開発の容易化と有効性評価の精度向上のため、対象を歴史系博物館の展示解説映像に絞り込みテンプレートを試作した。北区立飛鳥山博物館ならびに松本市立博物館と共同で評価実験を実施した。前年度の課題であった学習効果の評価手法に関しては、企画、撮影、編集の各工程を対象としたルーブリックを試作し評価をおこなった。上記テンプレート並びにルーブリックを用いて、茨城県立高校生12名、筑波大学生を対象にい実験を行い学習プログラムの有効性を評価した。歴史系博物館を題材に、学芸員向けテンプレートの開発と有効性評価を行なった。歴史系博物館の代表的資料である「復元ジオラマ・古地図」「古写真・絵葉書」「古文書」「民俗行事」について、既存の展示映像や歴史系放送番組をリサーチし、それぞれの特徴を分析しテンプレートを試作した。実際に学芸員がテンプレートを利用して展示映像を制作し、その体験を基にテンプレートの使いやすさ等を五件法と自由記述アンンケートにより評価した。さらに、その展示映像を来館者に提示し、鑑賞支援効果の評価を行なった。学芸員による自己評価結果からは、テンプレートの有効性が示唆された。一般来館者による鑑賞支援効果に対する評価も肯定的な結果が示された。学習到達度評価を目的として、企画、撮影、編集の3つの評価観点によりルーブリックを作成した。3名の映像制作経験者を対象に、ルーブリックの妥当性評価を行なった。3名による評価の一致率は0.75であり、ルーブリックの妥当性が示唆された。高校生10名、大学生40名を対象に、前年度作成した学習プログラム、今年度前半に作成したテンプレート(教材)とルーブリックを用いて、学習パッケージの有効性評価と課題抽出を行なった。その結果、学習パッケージは映像制作の学習に有効であることが示唆された。一方、学習パッケージは撮影や編集の学習には効果的であるが、企画に対しては、網羅生や具体性が不足していることが明らかになった。最終年度は、これまで学芸員向けに開発した学習パッッケージを基に、一般学生向けに、学習パッケージの一般化を目指す。一般学生は学芸員と比較して、映像の題材に対する知識や情報に乏しい。今年度は映像制作の行程の中でも企画法、特に取材・調査手法の学習パッケージの開発を重点的に行いたい。平成30年度の実験では、テンプレートと併せて、例示のためのサンプル映像を提供した。サンプル映像は、テンプレート作成のために収集・分析した約100本の放送番組・展示映像の中から選定した。平成31年度は学習プログラムの公開・一般化に向けて、例示用映像の自作をを行う。学習パッケージの有効性評価に向けては、これまで2年間実験を行なってきた筑波大学での実験を重ね、形成的評価を行う一方、他大学での実験を実施する。博物館展示映像については、歴史系博物館に加え芸術系博物館(美術館)に対象を広げ、学習パッケージの一般化手のモデル構築を行いたい。一連の研究成果については、日本教育工学会、日本教育メディア学会、日本展示学会等での発表を計画している。本研究では一般学生がスマートフォンによりビジネスや教育で利用する数分程度のPR映像を1人で制作する能力を修得するための、学習パッケージ(教材、学習プログラム、評価手法)の開発をめざしている。今年度は、映像教材の学習項目分析や既存の映像制作学習プログラム分析を基に14時間の学習工程から構成される映像制作学習のプログラムを設計した。このプログラム案を用いて木更津市郷土博物館金のすず、久留里城址資料館、袖ヶ浦市郷土博物館所属の学芸員5名を対象に映像制作学習の実験を行なった。その結果、本研究で開発した映像制作学習プログラムを用いて博物館職員が映像制作を学ぶことで、知識・スキルに対する自己評価の向上、及び展示映像の自作に対する肯定感が変容することが明らかになった。また制作された作品の中には貝塚の利用方法を伝えるため実際に貝を煮炊きするカットや、城の防御設備である堀切を超えることの難しさを伝えるため自ら甲冑を着た状態で堀切を越えようとするカットなど、展示内容に精通した博物館職員ならではの発想が活かされた内容が見受けられた。学芸員等の研究者は、自己の研究対象に対する高度な知識や豊富な情報を有しており、それらを活用することで、質の高い映像の制作が期待できることが示唆された。しかし、その一方で、既に有する知識・話題が多いことが要因となり、映像の長さに対して伝えようとする話題が多い傾向が全ての参加者で見られた。これらの多くの話題から最適な話題に絞り込むことが今後の課題と言える。上記学習プログラムを基に、大学院生13名を対象に映像制作学習の実験を行なった。事前事後の質問

紙調査の結果等から、知識・スキルに対する自己評価の向上、及び研究紹介映像の自作に対する肯定感が変容することが明らかになった。映像制作の一連の工程の内、映像制作の初学者にとって映像の企画立案は難易度が高いことが確認された。平成29年度は学芸員を対象とした実験の他、大学院生を対象とした学習プログラムの評価実験を行なった。映像制作学習の中で、撮影・編集を2サイクル行う場合と1サイクルのみの従来手法との比較、2サイクルのプログラムに反転授業を応用した拘束時間短縮型の学習プログラムとの比較について予備実験を行なった。これにより、本研究では、撮影・編集を2サイクル行うことで学習効果を高め、反転授業の応用により学習者の負担を低減する学習パッッケージを目指しているが、学習プログラムの概要については、基本形の策定が完了した。また述べ80人の実験協力者が作成した映像が得られており、教材映像制作のためのサンプルと知見が蓄積できた。以上により計画は概ね順調に推移していると言える。本研究では、映像制作に対して専門知識を持たない一般学生が、メッセージを伝えるための映像制作スキルを習得するための学習パッケージ(学習プログラム、教材、評価手法)を開発することを目的としている。平成29年度は学習パッケージの内、20時間で企画・撮影・編集といった映像制作の全行程を学ぶ学習プログラムの開発を行っなった。平成30年度は、前年度の実験で得られた知見を基に、映像表現のための教材(テンプレート)の試作を行なった。テンプレートとは映像表現を行う際に用いる雛形で、題材に合わせて手直しすることで、素人でも映像表現を行うことを容易にするための教材である。本研究の最終目標は一般学生向けの学習パッケージ開発であるが、第一段階として講演やギャラリートーク等、映像化する題材を有する博物館学芸員向けの学習パッケージの開発を行なった。学習パッケージの可能性を評価し、開発手法を構築した後、一般学生向けに学習パッケージの一般化を目指す戦略である。平成30年度は、テンプレート開発の容易化と有効性評価の精度向上のため、対象を歴史系博物館の展示解説映像に絞り込みテンプレートを試作した。北区立飛鳥山博物館ならびに松本市立博物館と共同で評価実験を実施した。前年度の課題であった学習効果の評価手法に関しては、企画、撮影、編集の各工程を対象としたルーブリックを試作し評価をおこなった。上記テンプレート並びにルーブリックを用いて、茨城県立高校生12名、筑波大学生を対象にい実験を行い学習プログラムの有効性を評価した。歴史系博物館を題材に、学芸員向けテンプレートの開発と有効性評価を行なった。歴史系博物館の代表的資料である「復元ジオラマ・古地図」「古写真・絵葉書」「古文書」「民俗行事」について、既存の展示映像や歴史系放送番組をリサーチし、それぞれの特徴を分析しテンプレートを試作した。実際に学芸員がテンプレートを利用して展示映像を制作し、その体験を基にテンプレートの使いやすさ等を五件法と自由記述アンンケートにより評価した。
構造安定化と抗体との複合体化によるロイコトリエンB4受容体の結晶化

ロイコトリエンB_4受容体(BLT1)の結晶構造解析を目標に、BLT1の安定化変異体を構築し、立体構造認識型抗BLT1モノクローナル抗体を作製した。合理的設計により計画した2残基変異により、熱安定性が5°C向上し、発現量が6倍向上した(Bmax=311pmol/mg)。SDS変性BLT1は認識しないが非変性BLT1には結合するモノクローナル抗体を作製した。現在結晶化を進めている。ロイコトリエンB4受容体(BLT1)の結晶構造解析を目標に、BLT1の安定化変異体を構築し、立体構造認識型抗BLT1モノクローナル抗体を作製し、結晶化を行った。変異体の安定性解析は動物細胞での一過性発現系を用いることにした。そのため、多数の変異体の解析を迅速に行えるようになった。安定性が向上した変異体の大量発現はメタノール資化酵母で行った。合理的設計により計画した2残基変異導入により、熱安定性が5oC向上し、発現量が6倍向上した(Bmax=311pmol/mg)。また、GPCRの結晶化では一般的な方法になったT4リゾチームとの融合体を作成した。N末端、または膜貫通ヘリックス56の間にT4リゾチームを挿入した。その際、挿入部位とリンカーの長さをパラメーターとし、もっとも安定性が高かったそれぞれ1種の融合体を選択した。いずれもT4リゾチームとの融合体化したことによるリガンド親和性影響はなかった。立体構造認識型抗BLT1モノクローナル抗体を2種作成した。いずれも、ELISA、ドットブロット、免疫沈降法では、SDS変性BLT1は認識しないが、ELISAと免疫沈降法で非変性BLT1を認識する。うち1種の抗体は、BLT1と複合体化後に1M硫酸アンモニウム中で20oCで4日間インキュベートさせた後も、解離していないことをゲル濾過分析で確認した。安定化BLT1変異体単独、安定化BLT1と抗体Fabドメインとの複合体、T4リゾチーム融合体単独、N末T4リゾチーム融合体と抗体Fabドメインとの複合体について、蒸気拡散法とメソフェーズ法にて結晶化を行った。Fab複合体は、メソフェーズ法ではFab複合体単独での結晶化が析出してしまった。T4L融合体について、針状の結晶様物質が析出したが、再現性が取れていない。メタノール資化酵母を使用して、ロイコトリエンB4受容体(BLT1)の大量発現を実現した。合理的設計に基づいた変異体設計計画により2残基変異を導入し、熱安定性が5°C向上した。その結果、1Lの酵母培養から1mg以上の精製受容体を調製することができた。構造既知のGタンパク質共役型受容体は、T4リゾチーム(T4L)とのキメラとして発現・結晶化させている。BLT1もその方法に従って、上記熱安定化変異体のN末または膜貫通ヘリックス5-6間のループ領域にT4Lを挿入した変異体を構築した。BLT1とT4Lの連結部位には、GlyとSerからなるリンカー領域を挟んだ。N末T4L融合体は、Gly, Gly-Ser, Gly-Ser-Glyの3種類のリンカー配列を挿入した変異体を構築した。5-6ループ間にはGly-Serリンカーを挿入したが、BLT1への挿入箇所をヘリックス5,6でそれぞれ3カ所設定し、それらを組み合わせて合計9種の変異体を構築した。いずれの変異体もリガンド結合親和性は野生型BLT1と同じであること、T4Lを挿入しても熱安定性が大きく低下しないことを確認した。既にBLT1に対するモノクローナル抗体を作製済みである。Fab化に、熱安定化BLT1変異体またはT4L融合BLT1と反応させた。複合体はゲルろ過精製操作によって解離しないことを確認した。ただし、5-6ループ間にT4Lを挿入するとFabとの複合体は形成しなかった。熱安定化BLT1単独、T4L融合BLT1単独、BLT1-Fab複合体、N末T4L融合BLT1-Fab複合体の結晶化を蒸気拡散法とキュービックフェーズ法にて行った。得られた結晶をSPring-8のにて回折実験を行った。現在までにBLT1を含んだ結晶は得られていない。2012年4月から結晶化を開始した。酵膜画分可溶化から結晶化まで2日で完了する結晶化調製方法を確立したので、週に2回独立した結晶化実験を行えるようになった。そのため、通常の結晶化方法である蒸気拡散法での結晶化と、膜中での結晶化方法であるキュービックフェーズ法での結晶化について、熱安定化BLT1単独、T4L融合BLT1単独、BLT1-Fab複合体、N末T4L融合BLT1-Fab複合体の結晶化の初期スクリーンから条件最適化、回折実験による結晶評価まで行うことができた。

キュービックフェーズに再構成することにより、BLT1とFabが解離してしまうこと、アルコールを含む結晶化条件ではBLT1のアンタゴニストが結晶化してしまうことなど、ネガティブデータであるが今後の結晶化実験の方向性を決定できる結果が得られたことは、BLT1の結晶化実現に向けて必要な結果であったと考えている。本年度も、熱安定化BLT1単独、T4L融合BLT1単独、BLT1-Fab複合体、N末T4L融合BLT1-Fab複合体について、結晶化実験を繰り返す。前年度に、ネガティブな結果が得られた方法については、その方法は本年度は行わない。結晶化を実現させるための具体的な方策を以下のとおりである。(i)リンカーの長さをさらに長くする。(ii)BLT1のN末と膜貫通ヘリックス5-6間のループ領域の双方ににT4Lを挿入したキメラ体を構築する。(iii)立体構造が不安定であると予想されるC末領域をプロテアーゼ処理することにより除去して結晶化を行う。さらに、析出した結晶がBLT1の結晶であることを確証するために、結晶が得られた条件で蛍光ラベル化したBLT1の結晶化も行う。本申請研究で申請した研究費は、結晶化サンプル調製と結晶化に使用する消耗品と共同研究先での実験をするための旅費のみである。次年時使用額の\27,290も含め、引き続き24年度に結晶化のための消耗品の購入と、RI実験を東京大学で行うための旅費の支出に当てる。
皮膚腫瘍におけるWntシグナル構成分子の発現異常の検討および遺伝子導入による治療

我々は皮膚腫瘍におけるWntシグナル構成分子の発現異常を検討するため、石灰化上皮腫におけるβ-cateninの発現異常に注目した。石灰化上皮腫は毛母由来の皮膚腫瘍であるが、分子生物学的手法を用いた研究により石灰化上皮腫の発生にWntシグナルが関与していることが示唆されている。石灰化上皮腫から取り出したDNA内に高率にβ-catenin遺伝子の異常が見出されており、この遺伝子変異はβ-cateninのリン酸化部位をコードする部分に認められる。リン酸化部位はβ-cateninの分解に重要であるため、腫瘍細胞内にβ-cateninが過剰に蓄積し、その結果としてWntシグナルが活性化している可能性が示唆されている。しかし、現在まで石灰化上皮腫の腫瘍細胞にβ-cateninの蓄積の証明をした報告はない。そこで、我々は石灰化上皮腫における腫瘍細胞へのβ-catenin蛋白の蓄積を検索した。患者より摘出した石灰化上皮腫のホルマリン固定後のパラフィン切片を用いて免疫組織染色を施行した。使用した抗体は抗β-cateninモノクローナル抗体で、ABC法によりβ-catenin蛋白を検出した。その結果、検索した石灰化上皮腫全てにおいてbasophilic cellの核にβ-catenin蛋白が蓄積していることが証明された。さらにβ-catenin蛋白の蓄積量はshadow cellに移行するに従い減少していった。マウスの毛母細胞にβ-catenin蛋白を過剰に発現させると石灰化上皮腫様の腫瘍が発生することは報告されていたが、ヒト石灰化上皮腫でβ-catenin蛋白が蓄積していることを直接的に証明した報告はなされていなかった。今回、我々は免疫組織学的にこのことを証明することに成功した。この結果はWntシグナル伝達系と皮膚腫瘍の発生の関係を直接的に結びつける興味深い結果と考えられる。すでに我々は、in vitroのシステムにおいてWnt遺伝子の発現について検討を加えた。それによると、表皮においては、Wnt-4遺伝子のうち、Wnt遺伝子の発現が多量に認められており、その他、Wnt-10bの発現も毛包付近に認められていた。さて、Wnt遺伝子はクローニングされた当初より、proto-oncogeneとして考えられており、その臓器の腫瘍化に関与する重要な遺伝子の1つではないかと考えられている。そのデータによれば、in vitroでは、正常表皮細胞においては、Wnt-4遺伝子の発現は明らかに陽性所見を認めていたが、adenoma細胞では、その発現は半減していた。また、epithelioma細胞では、その発現はさらに減少し、carcinoma細胞では、ほとんどその発現は、認められなくなっていた。このように、細胞の悪性化にともないWnt-4遺伝子の発現の消失が認められた。今後は、Wnt-4遺伝子発現ベクターを作製し、これら細胞に導入しそのフェノタイプの変化をまず観察していきたいと考えている。
肺腺癌の発生および進展におけるK-ras-Akt/PKB経路の意義の検討

肺腺癌におけるK-ras遺伝子変異の意義を明らかにする目的でPI3K-Akt経路に着目し検討を行い、平成13度はK-ras変異が同経路介して気管支上皮細胞の走化性の亢進を引き起こすことを明らかにしてきた。昨年度は、1)抑制変異型Akt(dnAkt)膜貫通蛋白質tatとdnAktの融合蛋白質を作成し同様の検討を試みた。1)dnAkt導入気管支上皮細胞株は細胞走化性の低下を示した。また、数回の経代を繰り返すと、導入したdnAkt遺伝子の発現が徐々に低下した。このことから、Aktが細胞の恒常性(生存)の維持に重要な意義を持つ可能性が示唆された。2)tat-Aktを細胞に発現させるとその局在がnativeなAktと異なり細胞内に瀰慢性に位置した。また、tat-Aktやtat-GPFを陰性対照として導入したが、何れも細胞内に瀰慢性に位置し、導入された細胞に変性や細胞死を引き起こした。以上から、tatがAktの機能に異常を与えている可能性が考えられ、dnAktの効果を純粋に評価することが困難であった。また、tat自身が細胞傷害性を有する可能性が示唆された。Tat-融合蛋白の治療への応用については更に詳細な検討が必要と考えられた。本研究の目的は、肺腺癌におけるK-ras-PI3K-AKT/PKB経路の意義を明確にし、同経路の阻害剤による治療への可能性を検討することである。1.変異型K-ras遺伝子をSV40形質転換ヒト末梢気道上皮細胞株(HPL)に導入することによってAkt活性の増加と細胞走化性の亢進が引き起こされた。2.この走化性の亢進は、ras阻害剤によってほぼ完全に、MEKあるいはPI3K阻害剤によって部分的に、両者の併用によってほぼ完全にブロックされた。また、変異K-ras導入HPL(HPLD12)に抑制変異型Akt(dnAkt)を遺伝子導入することにより走化性の抑制が観察された。また、HPLD12にdnAktを導入した細胞株は安定化せず、3回ほど継代すると死滅した。3.肺腺癌の臨床検体では25例中4例にリン酸化型Aktの発現が検出され、非浸潤性の早期病変にも陽性例が見られた。以上の結果から、K-ras-PI3K-Akt経路は細胞の生存を支持するばかりでなく、走化性の制御にも関与することが示唆された。また、同系路は実際のヒト肺腺癌でも作動しており、発癌過程おいて重要な意義をもつ可能性が示唆された。
アビジン-ビチオン標識酵素累積膜の方向規則性制御と酵素センサーへの展開

アビジンを金属電極表面に吸着させるとほぼ単分子層の表面修飾層が形成され、このアビジン修飾表面にビオチン標識酵素を作用させるとアビジンはビオチン部位を特異的に認識し、表面に酵素分子が単分子膜を形成する。また、この操作を繰り返すことより、蛋白質累積膜を形成することが可能で、バイオセンサーの感知電極の微小化に革新的な意味を持っている。アビジンの金属表面の吸着はほぼ単分子膜に形成できたが、吸着方向はたて、とよこ両方ある。よこの方向で吸着されると、単分子膜の累積に不利である。本研究はチオール類の自己集合膜を金表面に形成させ、チオールの長さ、末端残基の電荷、親水性などの違いによって、一層目のアビジンを分子レベルで規制した量ですべてたての方向に吸着させ、単分子膜を作製することに成功した。水晶振動子ミクロバランス(QCM)法で上記の膜の形成状態を評価した。さらに、新規的なアビジン、ストレプトアビジンの単分子膜の上でCholine OxidaseとCholine Esteraseの累積、交互累積によってコリンセンサーとセチルコリンセンサーを作製しQCM法により酵素の単分子膜の形成をこの方法によりコントロールできたことをかくにんし、その性能について調べた。この操作を繰り返すことにより、累積膜を形成できる。本研究ではまずこの方法を用いて、Choline OxidaseとCholine Esteraseの累積、、交互累積によってコリンセンサーとアセチルコリンセンサーを作成しその性能について調べた。アビジンの金属表面の吸着はほぼ単分子膜に形成できたが、吸着方向は縦と横の両方ある。横の方向で吸着されると、単分子膜の累積に不利である。本研究では、まずチオール類の自己集合膜を金表面に形成させ、チオールの長さ、末端残基の電荷、親水性などの違いによって、一層目のアビジンを分子レベルで規制した量ですべて同じ縦方向に吸着させ、単分子膜を作製した。金で被覆した水晶振動子上に累積膜を作製し、その際に1回の操作で吸着されるアビジン、ストレプトアビジンの重量をナノグラムレベルで測定し、単位面積当たりの分子数を算出し、吸着されるアビジン、ストレプトアビジンの方向を評価した。また、新規なアビジン、ストレプトアビジンの単分子膜の上で、累積膜を作製し、評価した。金電極表面に一層目に同じ方向でアビジン、ストレプトアビジンを単分子膜で修飾し、さらに累積膜形成に際して、単分子層の形成をコントロールできた。
蛋白質の基本構造に対する圧力効果

蛋白質の基本構造に対する圧力の効果を知る目的で、申請者の研究室で開発した加圧試料セル型超高磁場高分解能NMR(750MHz)を用いて、12000気圧の範囲で圧力を変化させ、(1)典型的なヘリックス、(2)典型的なランダムコイル構造、及び(3)β-シートをもつ小蛋白質(35残基)について、加圧による構造変化、水との水素結合変化、及びダイナミックスの変化を1H、15Nの化学シフトとスピン緩和に基づいて研究した。1。ヘリックス及びランダムコイル状態の蜂毒蛋白質メリチンの加圧による水素結合の変化メリチンのへリックス構造(メタノール中)の主鎖アミドプロドン(NH)とプロトンの信号が、圧力に対して直線的にかつ可逆的にしかも部位特異的にシフトすることが明かとなった。これらのシフトは、加圧による二次構造(ヘリックス)の変化、特にアミドとカルボニル基との分子内水素結合(NH...O=C)の短縮を示す。またランダムコイル構造(酸性軽水溶液中)について同様の実験を行い、加圧に伴いポリペプチド鎖と水との水素結合が強化されることを明かにした。2。バクテリオロドプシンヘリックスの加圧によるダイナミックスの変化15N同位体で均一標識したbacteriorhodopsinのhelix(1-36残基)を対象として、軽水溶液中(90%H20/10%D20)で主鎖アミドの15Nスピン緩和とNOEの測定を行った。解析の結果、302000barの範囲でヘリックス構造の速いゆらぎには大きな変化がないことが明かとなった。3。水溶液中の小蛋白質グルマリン(甘味抑制蛋白質;35残基)について、加圧による1H化学シフトの測定を行い、加圧に伴うβ-シートの構造変化、溶媒の水との水素結合の短縮を明らかにした。1。2。3。