hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重金属結合ペプチドの糸状菌細胞表層へのターゲッティング

微生物菌体に重金属を吸着させてバイオソルベントとして利用することを目的として、微生物に重金属結合能を付与する分子育種を試みている。これまでに筆者らは酵母の細胞表層GPIアンカー蛋白質Cwp1とHisクラスターをタカアミラーゼに組み込んだ融合蛋白質(TAA-His-Cwp1)および主として細胞壁に局在するインベルターゼとメタロチオネインとの融合蛋白質(Suc2-Cup1)を設計し、酵母の細胞壁中に発現することとNi,Cuイオンの吸着能が1.63.5倍に増加することを見出している。大きな菌塊を形成する糸状菌をバイオソルベントととして利用するため、我が国では産業的に重要な麹菌(Aspergillus oryzae)を宿主として用いた。糸状菌における細胞表層工学のシステムを構築するために、糸状菌の細胞表層に局在するハイドロフォービンをコードする遺伝子をA.oryzaeから2つクローン化し、それぞれhyPA,hypBと命名した。さらに麹菌からmRNAを調製し、hypA,hypBに対応するcDNAを単離し、塩基配列を解析した。予想されるHyPA蛋白質はN末端に21アミノ酸のシグナル配列を含む151アミノ酸、HypBは21アミノ酸のシグナル配列を含む145アミノ酸からなっていた。双方ともにハイドロフォービンに特有の一定の法則に従って並ぶ8つのCys残基および疎水性領域が保存されていた。Northern blot解析によりhypAおよびhypB遺伝子の培地による発現制御の解析を行ったところ、両遺伝子とも液体の富栄養培地では発現されなかった。小麦フスマを用いた固体培養およびグルコース欠乏培地で培養した時には大量のmRNAの発現が認められ、厳密な発現制御が行われていることが明らかとなった。ハイドロフォービンを細胞表層アンカーとして用い機能ペプチドの発現への道が拓けると期待している。
二核金属-活性酸素錯体の構造と反応性の精密制御

ビス(ピリジルエチル)アミン系3座配位子およびビス(ピリジルエチル)エチルアミン系2座配位子を用いて調製した一連の銅(I)錯体と分子状酸素との反応について詳細に検討を行った。その結果、3座配位子を用いた場合には、サイドオン型の二核銅(II)ペルオキソ錯体が生成するのに対して、2座配位子を用いた場合には、酸素-酸素結合が開裂して生成する高原子価のビス(μ-オキソ)二核銅(III)錯体が選択的に得られることを見いだした。3座配位子を用いて調製したサイドオン型の二核銅(II)ペルオキソ錯体はフェノラート誘導体と効率よく反応し、対応する酸素化生成物であるカテコール誘導体を定量的に与えた。詳細な速度論的検討の結果、本反応はペルオキソ種による芳香族求電子置換反応機構で進行することを明らかにした。本反応はチロシナーゼの反応機構に対して重要な知見を提供する世界で最初のモデル反応である。一方、2座配位子を用いて調製したビス(μ-オキソ)二核銅(III)錯体は脂肪族の効率的な水酸化反応やスルフィドおよびボスフィンへの効率的な酸素添加反応を行うことが分かった。これらの反応機能についても速度論的に検討を加え、それらの詳細を明らかにした。さらに、ビス(μ-オキソ)二核銅(III)錯体と10-メチル-9,10-ジヒドロアクリジンや1,4-シクロヘキサジエンなどとの反応では、酸素錯体の不均化によって生成する新規な(μ-オキソ)(μ-オキシラジカル)二核銅(III)錯体の関与が強く示唆され、メタンモノオキシゲナーゼの反応機構について重要な情報を提供した。さらに立体障害の小さいアルキル基を導入した2座配位子を用いた場合には、混合原子価の三核銅(II, II, III)錯体を得ることに成功し、マルチ銅タンパク質の機能解明に有用な情報を提供した。その他、中心金属としてニッケルを用いて同様の酸素錯体を得ることに成功すると共に、分子状酸素の同属体であるジスルフィド誘導体の還元的開裂過程の精密制御にも成功を収めた。二核銅-活性酸素錯体については、単核の銅(I)錯体と分子状酸素との反応が種々検討され、これまでにend-on型やside-on型のぺルオキソ種、およびbis-μ-oxo二核銅(III)錯体が合成されてきた。しかし、これらの構造を制御する因子については不明な点が多く残されている。また、我々はすでにピリジルエチル系三座配位子を用いて銅(I)錯体と分子状酸素の反応を行うと、side-on型のペルオキソ種が生成し、ここから酸素-酸素結合の開裂を経てアルカンの水酸化反応が進行することを見いだしている。この場合、酸素-酸素結合の開裂が律速となっているため、bis-μ-oxo二核銅(III)錯体の生成は分光学的には確認できない。そこで本年度は、ピリジルエチル系三座配位子に加え、種々の新規二座配位子を用いて、同様に銅(I)錯体と分子状酸素との反応について詳細に検討を加え、活性酸素種の構造と反応性に及ぼす配位子の電子的効果や立体的効果を明らかにすることに成功した。

特にこの場合、side-on型のペルオキソ種とbis-μ-oxo二核銅(III)活性種の平衡が釣り合っており、ピリジン環上の置換基の電子的効果や立体的効果を調べることにより、活性酸素種の構造と反応性の制御に関して重要な知見が得られた。さらに興味深いことに、ピリジルエチル系の二座配位子の窒素置換基として、メチル基の様な立体障害の小さい物を有する配位子を用いた場合、Bis(μ_3-oxo)型三核銅(II)銅(II)銅(III)混合原子価錯体が効率良く生成することを見いだした。これについても物性や反応性などについて系統的に検討を加えた。銅含有モノオキシゲナーゼの機能解明を目的として、主にピリジルエチル系三座配位子を用いて、銅(I)錯体と分子状酸素との反応について詳細に検討を行った。その結果、side-on型のペルオキソ二核銅(II)中間体から、酸素-酸素結合の開裂を経て生成するbis(μ-oxo)型二核銅(III)錯体が真の活性種となり、ここからアルカン類の水酸化反応が効率良く進行することを明らかにした。この場合ペルオキソ種のみが分光学的に検出可能であったが、ピリジルエチル基の一つを取り除いた二座配位子を用いるとbis(μ-oxo)型二核銅(III)錯体が検出可能となり、同様のアルカン水酸化反応が効率良く進行することを見出した。このような酸素-酸素結合の開裂を制御する因子や各活性酸素錯体の反応性を明らかにするため、配位子に種々の置換基を導入した新規な二座、三座および四座配位子を合成し、配位子の立体的効果や電子的効果について系統的に検討を加えた。得られた成果を基にして、活性酸素錯体の構造や物性について考察を加えるとともに、種々の外部基質との反応性について速度論的に検討を加え、それぞれの反応機構を明らかにした。さらに、各活性酸素錯体の構造と反応性の相関関係を明らかにし、酵素系における活性酸素種の構造と酸素添加反応機構の解明に着手した。また、他の遷移金属(特に、ニッケル)を用いた二核遷移金属-酸素錯体についても検討を加え、中心金属の役割を明らかにした。金属タンパク質による分子状酸素の運搬や活性化は生命維持の根幹をなすものとして、古くから多くの注目を集めてきた。ここ数年の生化学分野における分析手段の目覚ましい発展により、金属ポルフィリン以外の金属活性中心を有するタンパク質(非ヘム金属酵素)についてもその構造が次々と明らかにされ、それらの機能解明と応用が最近の重要な研究課題となってきた。このような非ヘム金属酵素の機能解明は、有機合成化学や有機工業化学などの分野における効率的な酸素添加触媒の開発にも繋がるものとしても重要である。そこで本研究では、配位子の精密な設計・合成に基づき、これまでに未解決であった数々の問題点について重点的に検討を加え、二核中心を有する非ヘム金属活性酸素種の構造と反応性の精密制御を達成することを目的として検討を行った。本年度は、これまでに得られたきた各種銅-活性酸素錯体(end-on型およびside-on型の二核銅(II)錯体、bis-μ-oxo型二核銅(III)錯体など)の酸化機能を明らかにするため、C-H結合活性化反応、およびフェノール誘導体や硫黄・リン化合物への酸素添加反応について詳細に検討を加え、それぞれの反応機構を明らかにすることに成功した。さらに各活性酸素錯体間で反応性や反応機構の違いを比較し、それについて理論的に考察を加えるとともに、酵素反応や合成反応における真の活性種を明らかにすることが出来た。上記の研究成果をふまえて、さらにヘテロ複核遷移金属-活性酸素錯体の創成を目指し、新規な多核化配位子の合成と、それを用いたヘテロ複核遷移金属-錯体の合成、構造、物性、反応性などについて系統的に検討を加え、多くの有用な情報を得ることが出来た。
p型半導体/色素自己組職化複合薄膜を用いる反転型太陽電池

色素増感太陽電池に用いられるTiO_2などのn型半導体光アノードについて、用いられる色素は硬いLewis塩基として振舞うカルボキシル基やスルホン酸基をアンカー基として有しており、これらが固いLewis酸点として振舞うTi(IV)サイトに安定な結合を形成することが重要と考えられる。固体型色素増感太陽電池のホール輸送材料としても用いられるp-CuSCNと色素分子間の結合形成には典型的軟らかいLewis酸点であるCu(I)サイトに対して、-NCSなどの軟らかいLewis塩基をアンカー基として含む色素が有効との考えから、Ru(dcbpy)_2(NCS)_2やFluorescein isothiocyanateなどの色素を共存させたCu(ClO_4)_2とLiSCN混合水溶液からの複合体電析を試みたところ、これらの色素で着色されたCuSCN/色素複合体薄膜が得られた。色素分子の吸着に伴い、膜の表面形態や結晶配向性が変化した。さらにNCSを色素で置換するのではなく、Cu(I)をカチオン性色素で置換することによる複合体形成を試みた。ローダミンやオキサジンなどの4級アンモニウム基を有する色素を共存させた溶液からの電析により、これらの色素で濃厚に着色された複合体薄膜を得る事に成功し、このアプローチの正しさも確認された。得られた複合体膜中の色素の蛍光は完全に消光されることが分かり、励起状態からのホール注入が示唆された。溶存酸素やメチルビオロゲンを電子アクセプタとして含む電解液中での光電気化学測定において、これらの複合体薄膜は色素分子の増感作用に基づく光カソード機能を示し、上述の考え方が光カソード系の構築に有効であることが分かったが、これらアクセプタの溶解度が限られるために光電流は最大で0.4mAcm^<-2>程度と小さく、起電力も100mV程度なため、光アノード系と同様な湿式電池の構成は困難であった。今後n型半導体との積層を試み、固体型電池としての評価を進めたい。色素増感太陽電池に用いられるTiO_2やZnOなどのn型半導体光アノードについて、用いられる色素は硬いLewis塩基として振舞うカルボキシル基やスルホン酸基をアンカー基として有しており、これらが固いLewis酸点として振舞うTi(IV),Zn(II)サイトに安定な結合を形成することが重要と考えられる。この考え方に基づき、固体型色素増感太陽電池のホール輸送材料としても用いられるp-CuSCNと色素分子間の結合形成には典型的軟らかいLewis酸点であるCu(I)サイトに対して、-NCSなどの軟らかいLewis塩基をアンカー基として含む色素が有効と考えられる。この様な色素の例として、Ru(dcbpy)_2(NCS)_2やFluorescein isothiocyanateなどの色素を共存させたCu(ClO_4)_2とLiSCN混合水溶液からの複合体電析を試みたところ、これらの色素で着色されたCuSCN/色素複合体薄膜が得られた。また、得られた複合体薄膜は色素分子の増感作用に基づく光カソード機能を示すことも確認され、上述の考え方が光カソード系の構築に有効であることが分かった。さらに反転のアプローチを一歩前進させ、NCSを色素で置換するのではなく、Cu(I)を色素で置換することによる複合体形成を試みた。ローダミンやオキサジンなどの4級アンモニウム基を有するカチオン性色素を共存させた溶液からの電析により、これらの色素で濃厚に着色された複合体薄膜を得る事に成功し、このアプローチの正しさも確認された。今後これらの複合体の光カソード機能評価を進める。

溶存酸素やメチルビオロゲンを電子アクセプタとして含む電解液中での光電気化学測定において、これらの複合体薄膜は色素分子の増感作用に基づく光カソード機能を示し、上述の考え方が光カソード系の構築に有効であることが分かったが、これらアクセプタの溶解度が限られるために光電流は最大で0.4mAcm^<-2>程度と小さく、起電力も100mV程度なため、光アノード系と同様な湿式電池の構成は困難であった。今後n型半導体との積層を試み、固体型電池としての評価を進めたい。
最適育苗環境制御のためのビジュアルフィードバックシステムの開発に関する基礎研究

植物生産における生体計測技術は,システム工学的には,制御対象としての植物生産システムにおけるフィードバック信号の検出技術を担っている.そこで,植物の状態を把握するためのセンサにはさまざまなものがあるが,植物が出しているどの情報を受け取るかにより異なる.本研究では,植物に対してできる限り侵襲が少ない方法で情報を得ることを念頭に,非破壊・非接触である光計測技術,つまり,可視領域外における画像計測により植物生体情報を,特に生育状態に関する情報を獲得することを目的とした.初年度に未完成であった育苗診断用画像計測システムの作業用アクチュエータと環境制御装置を製作した.計測対象物における茎・葉などの部位ごとの生長量・形態・色などから生育の状態を計測し.次に、個体毎における生体情報を計測し、画像データとの相関を求め、モデルを作成し,構成した画像計測システムを用いて,植物個体について作成したモデルを用いて、そのモデルの妥当性について評価した.その結果、生育状態が推定可能なモデルは再現性が乏しくモデルが未熟であり,ARモデルなどの検討の必要性が明らかとなった.次に,植物は品種系統,栽培履歴,現時点での環境により,その特性が決まる.そこで,前年度に作成したモデルについて、植物が今まで受けてきた栽培の履歴も考慮した上での植物生育状態計測認識システムモデル(ARモデル)へと進化させる.そのために、構築したデータベースを利用できるシステムを追加させた。さらに,育苗における生育診断で得られた結果を元に必要な操作を行う必要がある。この必要な操作とその量については、篤農家が持っている技術を科学化し、物理量に変換し、数値化を試みたが,十分な結果は得られなかった.植物生産における生体計測技術は,システム工学的には,制御対象としての植物生産システムにおけるフィードバック信号の検出技術を担っている.そこで,植物の状態を把握するためのセンサにはさまざまなものがあるが,植物が出しているどの情報を受け取るかにより異なる.本研究では,植物に対してできる限り侵襲が少ない方法で情報を得ることを念頭に,非破壊・非接触である光計測技術,つまり,可視領域外における画像計測により植物生体情報を,特に生育状態に関する情報を獲得することを目的としている.初年度は,育苗診断用画像計測システムの構成を行った.この計測システムは,植物が生育していく状態での形質および形態変化の情報を群落として計測するためのカラー画像計側システムおよび作業用アクチュエータ,その環境制御装置とから構成する予定であった.しかし、作業用アクチュエータと環境制御装置は未完成で、ただ今、製作途中である.また、画像計測のためのカメラを移動させる駆動制御回路の製作を行い、その動作確認を行った。画像入力対象は、128穴(8列×16行)のセル成型トレイで栽培された苗で、カメラを移動させる装置の構造は、リニアモーション駆動用ユニットとパルスモータ駆動を組み合わせたもので,1行内の各列のセル中心位置毎に等ピッチにて移動させるものである。また、行方向の移動はベルトコンベアによるセル中心位置毎に等ピッチにて移動させるものである。また、一度に2個までのトレイの画像入力ができ、ベルトコンベアは反転駆動を可能とし、パソコン等によるプログラマブルな駆動計画を可能となるように構成した。その結果、正常な動作が確認でき、カラー画像計測システムの構築ができた.今後は、作業用アクチュエータと環境制御装置を完成させ、育苗診断モデルの作成と生育状態の推定を行う予定である.植物生産における生体計測技術は,システム工学的には,制御対象としての植物生産システムにおけるフィードバック信号の検出技術を担っている.そこで,植物の状態を把握するためのセンサにはさまざまなものがあるが,植物が出しているどの情報を受け取るかにより異なる.本研究では,植物に対してできる限り侵襲が少ない方法で情報を得ることを念頭に,非破壊・非接触である光計測技術,つまり,可視領域外における画像計測により植物生体情報を,特に生育状態に関する情報を獲得することを目的とした.初年度に未完成であった育苗診断用画像計測システムの作業用アクチュエータと環境制御装置を製作した.計測対象物における茎・葉などの部位ごとの生長量・形態・色などから生育の状態を計測し.次に、個体毎における生体情報を計測し、画像データとの相関を求め、モデルを作成し,構成した画像計測システムを用いて,植物個体について作成したモデルを用いて、そのモデルの妥当性について評価した.その結果、生育状態が推定可能なモデルは再現性が乏しくモデルが未熟であり,ARモデルなどの検討の必要性が明らかとなった.次に,植物は品種系統,栽培履歴,現時点での環境により,その特性が決まる.そこで,前年度に作成したモデルについて、植物が今まで受けてきた栽培の履歴も考慮した上での植物生育状態計測認識システムモデル(ARモデル)へと進化させる.そのために、構築したデータベースを利用できるシステムを追加させた。この必要な操作とその量については、篤農家が持っている技術を科学化し、物理量に変換し、数値化を試みたが,十分な結果は得られなかった.
機械刺激自己伝播発熱素材の応力反応誘起メカニズムの解明と加圧瞬間接合技術の創出

本研究では,自己伝播発熱反応を機械刺激で誘起できるTi/Si多層膜の機械刺激反応誘起メカニズムをマイクロナノ実験力学独自技術で解明し,この新奇な瞬間発熱素材の特長を活かしたハンダ接合体の0.1秒瞬間製造技術を実現することを目的としてきた.スパッタ製膜したTi/Si多層膜に対して衝撃試験により機械刺激を付与し,応力印加に伴う原子拡散現象の可視化とそれ基づく化合物生成発熱反応の開始条件の特定を試みた.そして,Ti/Si多層膜を用いた機械刺激による瞬間ハンダ接合技術の確立に挑戦した.衝撃試験の結果,機械刺激で発熱反応を開始するTi/Si多層膜の反応誘起エネルギーを衝撃試験で求めることに成功した.バイレイヤーが薄くなるほど反応誘起に必要なエネルギーは少ないことがわかった.示差走査熱量計で発熱反応を分析した結果,バイレイヤーが薄いほど最初の発熱ピークの温度が低いことがわかった.これらの知見を用い,加圧力のみで発熱反応を誘起させて2枚のSiチップを瞬間はんだ接合することに成功した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,自己伝播発熱反応を機械刺激で誘起できるTi/Si多層膜の機械刺激反応誘起メカニズムをマイクロナノ実験力学独自技術で解明し,この新奇な瞬間発熱素材の特長を活かしたハンダ接合体の0.1秒瞬間製造技術を実現することを目標とし,研究に取り組んできた.スパッタ製膜した多層膜および斜め蒸着したナノコラム(いずれもTi/Si多層構造を持つ)に対してそれぞれ一軸/二軸面内引張ならびに電子顕微鏡内プローブ加圧で機械刺激を付与し,応力印加に伴う原子拡散現象の可視化とそれ基づく化合物生成発熱反応の開始条件の特定を目指した.Ti/Siナノコラム実験ではTiとSiの界面に応力集中させる3次元形状の実現を目指す.そして,ハンダ箔およびサブμハンダボールの表面にTi/Si多層膜を製膜し,表面平滑性の異なる試験体を加圧のみで瞬間ハンダ接合する製造技術の確立を目指す.研究初年度の平成28年度,まずは自作したデポダウン三源dcマグネトロンスパッタリング装置を用い,様々なTi/Si多層膜を作製した.具体的には,原子比,バイレイヤー厚,総膜厚を変化させてTi/Si多層膜を製膜し,発熱エネルギーや電気刺激・機械刺激による反応誘起の可否などを検討した.その結果,機械刺激で反応誘起可能な原子比やバイレイヤー厚などを特定できた.また,斜め蒸着法によるTi/Siコラム構造の作製を行い,この構造体の作製に成功した.しかし,機械刺激による反応誘起の実現は未到達であり,これからの課題である.さらに,粒子被覆用のバレルスパッタ装置の設計に着手し,概ね順調に進んでいる.申請当初,平成28年度の取り組み内容として,(3)斜め蒸着によるTi/Siナノコラムの作製(4)粒子被覆用バレルスパッタ装置設計を考えていた.上記(1)ならびに(2)は概ね順調に進んでいる.(3)はTi/Siコラムの作製には成功しているが,機械刺激による反応誘起実現には至っていない.(4)は粒子被覆用の新規スパッタ装置の設計が構想段階であるが概ね順調に進展している.以上の諸点より,本研究は総合的に概ね順調に進展していると判断できる.本研究では,自己伝播発熱反応を機械刺激で誘起できるTi/Si多層膜の機械刺激反応誘起メカニズムをマイクロナノ実験力学独自技術で解明し,この新奇な瞬間発熱素材の特長を活かしたハンダ接合体の0.1秒瞬間製造技術を実現することを目標とし,研究に取り組んできた.スパッタ製膜した多層膜および斜め蒸着したナノコラム(いずれもTi/Si多層構造を持つ)に対してそれぞれ一軸/二軸面内引張ならびに電子顕微鏡内プローブ加圧で機械刺激を付与し,応力印加に伴う原子拡散現象の可視化とそれ基づく化合物生成発熱反応の開始条件の特定を目指した.Ti/Siナノコラム実験ではTiとSiの界面に応力集中させる3次元形状の実現を目指す.そして,ハンダ箔およびサブμハンダボールの表面にTi/Si多層膜を製膜し,表面平滑性の異なる試験体を加圧のみで瞬間ハンダ接合する製造技術の確立を目指す.研究2年目の平成29年度,自作したデポダウン三源dcマグネトロンスパッタリング装置を用い,様々な原子比,バイレイヤー厚を持つTi/Si多層膜を製膜し,衝撃試験装置を改造した自由落下機械刺激印加装置を用いて各Ti/Si多層膜の機械刺激による発熱反応誘起の閾値を実測した.機械刺激の大きさはバイレイヤー厚と原子比の双方に関係があることを実験的に確認できた.この膜を使って機械刺激による反応誘起でSiウェハの瞬間ハンダ接合を実現するための圧子のデザインと作製を行った.単結晶Siの結晶異方性ウェットエッチングで曲率先端半径が100nm未満の鋭利なSiニードルを作り,それを使ってTi/Si膜に局所加圧刺激を加えることで,反応誘起できることを確認した.概ね順調に進んでいる.申請当初の2年目の研究計画は以下のとおりである.(1)デポダウン三源dcスパッタリング装置を用いた様々な仕様のTi/Si発熱多層膜の作製と,膜構造および発熱エネルギーと製膜条件の相関調査(2)機械刺激反応誘起メカニズムの特定と最小機械刺激エネルギーで反応誘起可能なTi/Si多層膜成膜条件の調査(4)粒子被覆用新規スパッタリングシステムの構築

上記(1)は既に完了しており,(2)もほぼ実験完了して全体の傾向がつかめている.(3)は実験システムの不具合があり,若干遅れている.(4)は既存スパッタ装置の改良で進めている.以上のことから,本研究はおおむね順調に進展していると考えている.本研究では,自己伝播発熱反応を機械刺激で誘起できるTi/Si多層膜の機械刺激反応誘起メカニズムをマイクロナノ実験力学独自技術で解明し,この新奇な瞬間発熱素材の特長を活かしたハンダ接合体の0.1秒瞬間製造技術を実現することを目的としてきた.スパッタ製膜したTi/Si多層膜に対して衝撃試験により機械刺激を付与し,応力印加に伴う原子拡散現象の可視化とそれ基づく化合物生成発熱反応の開始条件の特定を試みた.そして,Ti/Si多層膜を用いた機械刺激による瞬間ハンダ接合技術の確立に挑戦した.衝撃試験の結果,機械刺激で発熱反応を開始するTi/Si多層膜の反応誘起エネルギーを衝撃試験で求めることに成功した.バイレイヤーが薄くなるほど反応誘起に必要なエネルギーは少ないことがわかった.示差走査熱量計で発熱反応を分析した結果,バイレイヤーが薄いほど最初の発熱ピークの温度が低いことがわかった.これらの知見を用い,加圧力のみで発熱反応を誘起させて2枚のSiチップを瞬間はんだ接合することに成功した.今後の研究推進方策として,下記を検討している.(1)デポダウン三源dcスパッタリング装置を用いた様々な仕様のTi/Si発熱多層膜の作製と,膜構造および発熱エネルギーと製膜条件の相関調査(2)機械刺激反応誘起メカニズムの特定と最小機械刺激エネルギーで反応誘起可能なTi/Si多層膜製膜条件の調査(4)粒子被覆用新規スパッタリングシステムの構築複数の学生と共にこれらを並行して進め,更なる成果を挙げていく.今後の研究推進方策として,下記を検討している.(1)ハンダ粒子表面へのTi/Si多層膜の均一被覆実験(2)加圧のみで瞬間ハンダ接合する実験技術の確立(3)機械刺激反応誘起メカニズムの解明これらの実験を複数の学生とともに強力に進め,更なる研究成果をあげていく.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
移植肺拒絶における自然免疫の役割の解明：マウス肺移植モデルによる試み

自然免疫系受容体の一つであるtoll-like receptor 4 (TLR4)の機能が欠損したマウスをレシピエントとした場合、移植気道の線維化が軽減されるという結果が得られた。このことは、移植気道に対する免疫応答と組織リモデリングプロセスが獲得免疫系のみによって引き起こされるのでは無く、TLR4のシグナル伝達によって修飾されていることを意味する。将来的には、既存の免疫抑制剤に加えTLR4阻害剤を使用することで移植片の線維化を抑制できるのではないか、という新たな治療方法の可能性を示唆する研究成果である。血中遊離ヒストンには血管内皮細胞を含めた細胞障害、肺を筆頭とした組織障害を引き起こす事が外傷症例やマウス脳梗塞モデルなどで報告されている。また脳死ドナーにおいてToll-like Receptors (TLRs)を介したinnate immunityが移植後の肺機能及び拒絶に関与している可能性が指摘されている。我々は脳死患者でも血中遊離ヒストンの上昇およびそのinnate immunityの関与が肺移植後の急性グラフト不全の要因であるという仮説をたて、ラットでのヒストン肺障害モデルの作成することを目的とした。方法は、Brown Norwayラットにcalf thymus histoneを投与し肺傷害の程度を観察した。炎症性サイトカインであるCXCL1はELISA, RT-PCRともにヒストンを投与する事で上昇し、組織学にもヒストンを投与する事で肺傷害を認めた。血中遊離ヒストンによる肺障害モデルは肺移植後急性グラフト不全のモデルとなりうることが示唆された。昨年度までの成果をふまえ、移植後気道リモデリングへの自然免疫の関与を同所性気管移植モデルを用いて解析した。主要組織適合抗原(MHC) major mismatch pairであるBalb/c(H-2d)→C3H/HeN(H-2k)の組み合わせでマウス同所性気管移植を行い、術後21日でグラフトの評価を行った。Balb/c→C3H/HeNの組み合わせで、気管上皮下の著明な線維化が観察され、移植気道における線維化を検討するに妥当なモデルだと確認された。C3H/HeJマウスをレシピエントに用いた気管移植においても、C3H/HeNマウスをレシピエントに用いたのと同様に気管上皮下の線維化は引き起こされた。従って、MHC major mismatchの組み合わせでは、たとえTLR4の変異があってもそれだけではグラフトの線維化は避けられないことが示唆された。免疫抑制剤を併用した場合では、C3H/HeJマウスをレシピエントとした群で、病理学的スコアリングで傷害の程度が有意に軽く(p<0.05)、αSMA染色陽性面積が有意に少なかった(p<0.05)。CD3陽性T細胞の数は有意な差が認められなかった。このことは、TLR4のシグナルは移植片の拒絶と線維化において補助的な役割を果たしており、獲得免疫系の影響を弱めた条件では、TLR4のシグナルを抑制することで移植片の線維化が軽減されうることが示唆された。胸部外科学平成25年度では当該動物モデルの作成から始まったが、平成26年1月の第30回肺および心肺移植研究会にて研究成果の発表を行った。ラット肺移植後急性障害モデルを確立し得たことを踏まえ、今後innate immunityの関与を中心に、当モデルドナー肺を用いた移植実験で検索していく予定である。また、当初の目標にあわせ、マウス肺移植モデルの確立、マウスモデルでの検討を進める予定である。
視斜角CEMSの開発と酸化スズ系半導体の層別状態分析

本研究は、透明半導体電極膜や半導体ガスセンサーとして用いられる酸化スズ系機能材料の表面感度を選択的に高め、状態分析する方法として^<119>Snの視斜角転換電子メスバウアー分光法(CEMS)を開発することを目的とした。^<119>Snの内部転換電子のエネルギーが19.6keVと高いために固体の飛程が約2μmと大きくなる。そのため従来の方法では表面感度が低い。そこで23.8keVのγ線を低入射角(5°以下)で試料表面に照射し、より薄い表面層のメスバウアースペクトルが測定できるように視斜角CEMS用のガスフロー比例計数管検出器を試作し、測定シスメムを検討した。数100nmの試料に対してHeガスフロー比例計数管による電子検出によるCEMS測定は十分可能であることが確かめられた。測定時間が長いために固体試料から放出される転換電子のエネルギーを弁別しながら同時に最大4つのメスバウアースペクトルが得られるように測定システムを改良して、酸化スズ膜の層別分析膜の準備を行った。一方、透明電極半導体材料であるインジウム・酸化スズ(ITO)中に含まれるスズの化学的環境について再検討し、ITO中のインジウム原子に置換し得るスズ原子の電場勾配が異なる2種のダブレットピーク(bサイトとdサイト)及びインジウム原子に置換し得ないスズ原子のピークに分け、それらの強度とスズ含有量と関係を明らかにした。これらはキャリヤ-電子のド-ピング効果と対応した。また、酸化スズのガスセンサーについてはAuイオン及びFeイオンの注入効果について調べた。今後は、これらの試料の解析に視射角CEMSを応用する計画である。その他、CEMSのさまざまな応用についてレビューとしてまとめた。^<119>Snの内部転換電子のエネルギーが19,6keVと高いために23.8keVのγ線を低入射角で試料表面に照射できるようにゴニオと視射角転換電子メスバウアー分光(CEMS)のガスフロー比例計数管検出器を試作した。試作した検出器は、試料面から入射角5°以下で可変して23.8keVのγ線が入射できるようにX軸ゴニオメータ上に設置され、電子検出のためのHeチェンバーとX線検出のためのArガスチェンバーの二重構造型とした。800Åの試料に対して入射角5°でもHeガスフロー比例計数管による電子検出によるCEMS測定は、十分可能であることが確かめられた。ただし、共鳴散乱X線の検出では現在のところ統計的に十分なデータを得るまでに行かなかった。低入射角でγ線を照射するには、ある程度線源と検出器の距離を長くしなければならない。そのためにγ線のフラックスが減少する。そこで固体試料から放出される転換電子のエネルギーを弁別しながら同時にメスバウアースペクトルが得られるように線源のトランスジューサのコントロール信号を最大4つのマルチチャンネルスケーラに同期させ、データが入力できるようにシステムを改良した。金属スズと酸化スズの多層膜のエネルギー弁別によるCEMSの同時測定の準備を行った。透明電極半導体材料であるインジウム・酸化スズ(ITO)についてスズの化学的環境について検討し、薄膜試料の基礎解析の準備を行った。ITO中のインジウム原子に置換し得るスズ原子は、その電場勾配が異なる2種のタブレットピーク(bサイとトdサイト)に分離される。さらにインジウム原子に置換し得ないスズ原子のメスバウアーピーク成分を求め、これらの強度とスズ含有量との関係が求められた。スズ含有量が5%以上でbサイトのダブレットピーク強度は飽和し、dサイト及び置換していないスズ原子の割合が増加することがわかった。その他、CEMSの応用について広く文献調査し、レビーを行った。

^<119m>Snから放出される23.8keVのγ線を視斜角で試料表面に入射して、より薄い膜の転換電子メスバウアースペクトル(CEMS)が得られるようにガスフロー比例計数管の検出器を製作し、測定系の見直しを行った。金属スズの上に1500Å及び800Å厚さのSnO_2を有するの二層構造の試料を用いてその面に対して入射角5°以下(3°、2°、1°、0.5°)で、23.8keVのγ線をスリットを通して入射し、CEMS測定を行った。線源と検出器の距離を20cmに設定し、10mCiの線源を用いた場合、1個のメスバウアースペクトルを得るのに1週間を要した。0.2°の入射角では2週間要した。加振器のコントロール信号を最大4つのマルチチャンネルスケーラに同期させて、1個の線源で最大4つのメスバウアースペクトルが同時に得られるようにシステムを改良した。これら多層膜から放出される散乱電子のエネルギーを弁別してCEMSの測定を行ってSnO_2と金属スズのピーク強度比の変化から得られる表面深さを調べた。いわゆる深さ選択のCEMS(DSCEMS)を試み、その結果、低視射角でもDSCEMSの測定が行える見通しが得られ、より薄い層別分析が可能となった。透明電極半導体材料であるインジウム・酸化スズ(ITO)に含まれるスズの化学的環境について再検討し、薄膜試料の解析の準備を行った。ITO中のインジウム原子に置換し得るスズ原子は、メスバウアースペクトルにおいてその電場勾配が異なる2種のダブレットピーク(bサイトとdサイト)に帰属された。スズ含有量が5%以上で置換しないスズ原子のピーク強度の割合が増加することがわかり、これらは電気伝導電子のキャラリー濃度の増加に寄与しないことが明らかになった。今後はこれらの薄膜試料の層別解析に低視射角CEMSを応用する計画である。その他、Fe-Al-Si磁性膜や鋼表面硬化層のCEMS解析を行った。CEMSの応用研究と文献調査を実施し、さらに金属腐食研究におけるCEMSの解析についてもとめた。
中世考古学のための日本中世・近世初期の文献研究

1.14世紀代に漆器の木胎がケヤキからブナヘと転換し、さらに集落内で漆器生産の痕跡が認められなくなることから、この時期にそれまで利用価値のなかった深山のブナ材が漆器の木地に使用され、木地師と塗師の分業体制が成立したことを明確にした。さらに、深山のブナ林の乱伐が15世紀以降頻発する洪水の一因であることを明確にした。2.安濃津遺跡群(三重県津市)の発掘調査結果により、1498年の明応地震もしくは1707年の宝永地震の津波による堆積土の可能性がある地層の存在を明確にした。3.従来の研究では摂津のハマグリの生産と販売は今宮(大阪市浪速区)という販売人が集まる地点だけで考えられていたが、天王寺(大阪市天王寺区)に隣接する怜人町遺跡がハマグリの集散地であること、13世紀後半に天王寺とハマグリが深く関連づけて認識されていたことがわかる史料が存在することから、ハマグリの生産と販売は、今宮を中心に考えるのではなく、天王寺を中心に考えるべきであること、また、天王寺と今宮は一体のものとして考えるべきであることを明確にした。4.蓬左文庫所蔵の遠江国絵図は、正保郷帳の石高と一致することから、従来存在が知られていなかった正保国絵図である可能性が高いことを明らかにした。5.文書史料により、1707年の宝永地震により土地が隆起したこと、土地の隆起により船が湊に入ることができなくなり遠江の横須賀湊(現在の静岡県掛川市横須賀付近)は湊の機能が低下していったことを明らかにした。6.遠江正保国絵図など、1707年宝永地震以前の文書・絵図を検討することにより、横須賀湊・中島湊が中世遠江中部低地の中心的湊である可能性があることを明らかにした。また、1707年以前作成の文献・絵図の検討は太平洋と遠江国を結ぶ中世の物資集散地研究の発展につながることを明確にした。1.14世紀代に漆器の木胎がケヤキからブナへと転換し、さらに集落内で漆器生産の痕跡が認められなくなることから、この時期にそれまで利用価値のなかった深山のブナ材が漆器の木地に使用され、木地師と塗師の分業体制が成立したことを明確にした。

5.文書史料により、1707年の宝永地震により土地が隆起したこと、土地の隆起により船が湊に入ることができなくなり遠江の横須賀湊(現在の静岡県掛川市横須賀付近)は湊の機能が低下していったことを明らかにした。6.遠江正保国絵図など、1707年宝永地震以前の文書・絵図を検討することにより、横須賀湊・中島湊が中世遠江中部低地の中心的湊である可能性があることを明らかにした。また、1707年以前作成の文献・絵図の検討は太平洋と遠江国を結ぶ中世の物資集散地研究の発展につながることを明確にした。
ヒマラヤ高山帯植物相の起源と形成過程についての比較研究

ヒマラヤ高山帯の植物相および植生の特性を認識するために、極地の植物相および植生との比較を行った。極地としてはスウェーデン北西部を調査地に選んだ。この地域で高山帯に対比できる植生は標高約700m以上に成立する。この地域の主となる植物相は、属レベルではヒマラヤ高山帯と共通するが、種レベルでは共通性は乏しい。また、種多様性もヒマラヤ高山帯と比較すると著しく低い。この地域の主要な植物群落は湿地などの特殊立地を除けばガンコウラン、コケモモ、イワウメ、ミネズオウ、チョウノスケソウなどを含む矮性常緑低木群落である。そして雪田の草原が発達することによって風上側・風下側斜面(概略的に西・東向き斜面に対応)の間の植生の分化が認められる。このような植生パターンの基本的構造は植物群落の組成的な近似性も含めてユーラシア大陸に広く共通するものとみられる。一方、陽なた・陽かげ斜面の植生の分化(南・北向き斜面に対応)はほとんど認められない。このような植生のあり方は、陽なた・陽かげ斜面での植生の分化が明瞭である一方で、雪田による植生の分化(一般に東向き斜面)がほとんど認められないヒマラヤ高山帯の植生パターンと大きな違いを示している。形態的解析・細胞遺伝学的解析のために、資料約500点を日本に持ち帰り、現在ヒマラヤ高山帯から得られた資料との比較研究を進めている。キュー植物園標本館(イギリス)およびパリ自然史博物館植物標本室(フランス)では、これまでに採集した資料の同定および分類学的研究を行った。ヒマラヤ高山帯に関する調査では、これまで調査が行われていず、その植物相・植生が不明であった東ネパール、フンク-・ヒンク-川上流域で調査を行った。イグサ属で1種、トウヒレン属で3種の新種を確認した。またネパール産ムカゴトラノオ属の全貌を把握することができた。さらに、トウヒレン属では細胞遺伝学的解析を行った。ツリフネソウ属・シオガマギク属で行った細胞遺伝学的解析ではこれまで知られていなかった種の染色体数をそれぞれ3種・9種について明らかにし、昨年度の調査の結果と合わせて解析を行っている。キジムシロ属については、昨年度調査を行ったガネッシュ・ヒマ-ルで新品種、Potentilla tristis f.coliata、新変種P.peduncularisvar.ganeshii、新雑種P.micropeduncularisがみつかり、それぞれ専門誌に発表した。昨年度調査を行った云南省西北部で採集したキジムシロ属との比較を形態学的および細胞遺伝学的に行い、形態の多様性と染色体の倍数化が大きく関連していることが明らかになった。イヌナズナ属に関しては、Arabidopsis himalaicaについて形態学的解析と系統関係の解析を行った。その結果、A.himalaicaはA.thalianaとの間に様々な形態学的違いをもち、それらのうちのいくつかは単一遺伝子の変異では説明できないこと、しかしながら両者はそれほど遠縁ではないことが明らかとなった。その結果は専門誌に投稿中である。また、ガネッシュ・ヒマ-ル産A.himalaicaは'ecotype Tokyo'と名付け、今後世界で広く利用されるよう、日米二箇所のアラビドプシス種子バンク(SENDAI ARABIDOPSIS SEED STOCK CENTER)および(OHIO ARABIDOPSIS BIOLOGICALRESOURCE CENTER)に寄贈した。これまでの調査で収集した資料と合わせユキノシタ属とマンネングサ属の細胞遺伝学的解析を進め多様性を生む興味深い成因を見出した。それは異質および同質倍数化で、形態学的分化をともなうケースもあり、高山帯での新しい種の形成のメカニズムのひとつとして注目される。

イグサ属で1種、トウヒレン属で3種の新種を確認した。またネパール産ムカゴトラノオ属の全貌を把握することができた。さらに、トウヒレン属では細胞遺伝学的解析を行った。ツリフネソウ属・シオガマギク属で行った細胞遺伝学的解析ではこれまで知られていなかった種の染色体数をそれぞれ3種・9種について明らかにし、昨年度の調査の結果と合わせて解析を行っている。キジムシロ属については、昨年度調査を行ったガネッシュ・ヒマ-ルで新品種、Potentilla tristis f.coliata、新変種P.peduncularisvar.ganeshii、新雑種P.micropeduncularisがみつかり、それぞれ専門誌に発表した。昨年度調査を行った云南省西北部で採集したキジムシロ属との比較を形態学的および細胞遺伝学的に行い、形態の多様性と染色体の倍数化が大きく関連していることが明らかになった。イヌナズナ属に関しては、Arabidopsis himalaicaについて形態学的解析と系統関係の解析を行った。その結果、A.himalaicaはA.thalianaとの間に様々な形態学的違いをもち、それらのうちのいくつかは単一遺伝子の変異では説明できないこと、しかしながら両者はそれほど遠縁ではないことが明らかとなった。その結果は専門誌に投稿中である。また、ガネッシュ・ヒマ-ル産A.himalaicaは'ecotype Tokyo'と名付け、今後世界で広く利用されるよう、日米二箇所のアラビドプシス種子バンク(SENDAI ARABIDOPSIS SEED STOCK CENTER)および(OHIO ARABIDOPSIS BIOLOGICALRESOURCE CENTER)に寄贈した。これまでの調査で収集した資料と合わせユキノシタ属とマンネングサ属の細胞遺伝学的解析を進め多様性を生む興味深い成因を見出した。それは異質および同質倍数化で、形態学的分化をともなうケースもあり、高山帯での新しい種の形成のメカニズムのひとつとして注目される。本研究は、ヒマラヤ高山帯の植物相が土着種由来であるか、他の地域からの移入種由来であるのかを明らかにし、さらに植物相のその後の発達過程を明らかにすることを目的としたものである。本年度は、ヒマラヤ高山帯での現地調査を行うこととし、ヒマラヤの中心ともいえるネパールとヒマラヤの東端とされる中国云南省西北部で現地調査を行った。期間はネパールが1994年7月から8月、中国が9月から10月である。現在上記の目的の具体化に必要な分類学的、生物地理学的、細胞遺伝学的、分子系統学的に解析を進めている。Impatiens、Juncus、Potentillaについては形態的多様性と細胞遺伝学的多様性が明らかになり、両地域間で対応する種間で比較検討を行い、分類学的、生物地理学的な解析を進めている。Pedicularisについては形態解析と細胞遺伝学的解析が進みつつある。また、Arabidopsisについては、従来知られていた種と、葉緑体DNAの塩基配列の比較を行っている。得られた結果については、それぞれ専門雑誌などに投稿し印刷中または投稿中である。
鳥類の音声コミュニケーションにおける文法能力の発達機構

ダーウィン以来140年以上にわたって、動物の発する鳴き声は「求愛」や「威嚇」など単純な情報しか伝えず、意味をもつ音声を組み合わせて文をつくる文法能力はヒトに固有に進化したと考えられてきた。それに対して申請者は、鳥類の一種・シジュウカラが異なる意味をもつ鳴き声を一定のルールに従って組み合わせ、より複雑な情報を伝えていることを発見した。しかし、本種がこの文法能力をどのようにして発達させるのか未だに明らかでない。そこで、本研究では、シジュウカラのヒナが、音声を組み合わせたり語順を認識したりする高度な情報処理能力を、どのような過程・機構によって発達させるのか明らかにする。本課題は、動物における文法能力の発達機構を野外において解明する国内外で初めての試みであり、ヒトの言語の習得機構の適応・進化理論に対しても生態学的根拠を与えうる学際的な研究である。2018年は、巣箱を利用して繁殖したシジュウカラのヒナを対象に、発声能力や音声認識能力の発達過程に関して野外調査・実験をおこなった。しかし、当該年は例年と比べて気象状況が好ましくなく、繁殖に失敗するつがいが多かった。そのため、解析に足るデータを得ることができなかった。2019年は、設置する巣箱の数を倍に増やし、2018年と同様の録音調査・野外実験を遂行する予定である。このことでデータ数を増やし、成果を論文として発表する計画である。長野県北佐久郡に位置する冷温帯落葉樹林において野外研究をおこなった。本調査地に木製の巣箱を50個仕掛け、それを利用したシジュウカラを対象に研究をおこなった。まず、シジュウカラのヒナが、発声能力(音声の組み合わせや文法)をどのような過程を経て発達させるのか明らかにするために、録音調査をおこなった。多くのスズメ目鳥類と同様に、シジュウカラは巣箱のなかでは餌乞いの声しか発さず、音声の組み合わせなどの複雑な発声は、巣立ち後2ヶ月ほどかけて発達する。そこで、巣箱のなかだけでなく、巣立ち後もヒナを追跡し、1週間おきに音声の録音をおこなうことで、その発達過程を明らかにしようと試みた。捕食者に対する警戒声の録音は、捕食者(モズ)の剥製を用いて捕食者の襲撃を模すことでおこない、コントロールとしては捕食者でない鳥類(キジバト)の剥製を提示した。次に、各音声から情報を読み解く能力や、音声の組み合わせに文法のルールをあてはめる能力が、どのような過程を経て発達するのか明らかにするために、音声再生実験をおこなった。孵化後5日目、11日目、17日目のシジュウカラの巣箱において、警戒声、集合声、それらの組み合わせ音声をスピーカーから再生し、巣箱内部に仕掛けた小型カメラの映像をもとに、ヒナの反応を記録した。また、ヒナが語順を認識するかどうか明らかにするために、人為的に語順を入れ替えた合成音(文法ルールに反する音声)も再生し、反応を検証した。コントロールとしては、音声を含まない背景の音(風音)を再生した。巣立ち後もヒナを追跡し、1週間おきに上記の音声を再生することで、ヒナの反応(警戒行動や接近行動)がどのように発達するのか明らかにしようと試みた。2018年は、4月半ばの温暖な気候から一転し、4月下旬に気温が一気に低下したため、繁殖に失敗したシジュウカラが多かった(全営巣つがいのうち56%が失敗)。繁殖失敗の原因のうちわけは、抱卵の放棄(失敗した巣のうち80%)とヘビによる捕食(20%)であった。本研究は、繁殖に成功した巣箱におけるヒナを対象に実施する。上記の録音調査・音声再生実験は試みたものの、繁殖失敗の多さゆえに、解析するに充分な数のデータを得ることができなかった。2019年は設置する巣箱の数を100個に増やし、その上で上記の研究を再度おこなうことで、解析に足る数のデータを集める計画である。2019年、例年通りに繁殖がおこなわれた場合は、充分なデータ数を得ることができるだろう。その場合、発声能力や音声認識能力の発達が、学習によるものなのか生得的に備わったものなのか検証するために交叉養育実験をおこなう計画である。シジュウカラの卵を他種の巣箱に1つ人為的に移し入れ、他種(ヤマガラ)の親に抱卵・育雛させる。そして、交叉養育したシジュウカラのヒナを対象に、前述と同様の録音・実験をおこなう。シジュウカラとヤマガラの音声は明瞭に異なることから、これら2種の巣で育ったシジュウカラのヒナを比較することで、育った音声環境(学習の機会)の違いが文法能力の発達に与える効果を検証することが可能である。これらの研究成果は論文化し、学術誌に投稿する。また、国内外の学会においても発表する。研究内容は、プレスリリースや一般向けの解説記事の執筆などを通して、積極的に社会に発信してゆく。

そこで、本研究では、シジュウカラのヒナが、音声を組み合わせたり語順を認識したりする高度な情報処理能力を、どのような過程・機構によって発達させるのか明らかにする。本課題は、動物における文法能力の発達機構を野外において解明する国内外で初めての試みであり、ヒトの言語の習得機構の適応・進化理論に対しても生態学的根拠を与えうる学際的な研究である。2018年は、巣箱を利用して繁殖したシジュウカラのヒナを対象に、発声能力や音声認識能力の発達過程に関して野外調査・実験をおこなった。しかし、当該年は例年と比べて気象状況が好ましくなく、繁殖に失敗するつがいが多かった。そのため、解析に足るデータを得ることができなかった。2019年は、設置する巣箱の数を倍に増やし、2018年と同様の録音調査・野外実験を遂行する予定である。このことでデータ数を増やし、成果を論文として発表する計画である。長野県北佐久郡に位置する冷温帯落葉樹林において野外研究をおこなった。本調査地に木製の巣箱を50個仕掛け、それを利用したシジュウカラを対象に研究をおこなった。まず、シジュウカラのヒナが、発声能力(音声の組み合わせや文法)をどのような過程を経て発達させるのか明らかにするために、録音調査をおこなった。多くのスズメ目鳥類と同様に、シジュウカラは巣箱のなかでは餌乞いの声しか発さず、音声の組み合わせなどの複雑な発声は、巣立ち後2ヶ月ほどかけて発達する。そこで、巣箱のなかだけでなく、巣立ち後もヒナを追跡し、1週間おきに音声の録音をおこなうことで、その発達過程を明らかにしようと試みた。捕食者に対する警戒声の録音は、捕食者(モズ)の剥製を用いて捕食者の襲撃を模すことでおこない、コントロールとしては捕食者でない鳥類(キジバト)の剥製を提示した。次に、各音声から情報を読み解く能力や、音声の組み合わせに文法のルールをあてはめる能力が、どのような過程を経て発達するのか明らかにするために、音声再生実験をおこなった。孵化後5日目、11日目、17日目のシジュウカラの巣箱において、警戒声、集合声、それらの組み合わせ音声をスピーカーから再生し、巣箱内部に仕掛けた小型カメラの映像をもとに、ヒナの反応を記録した。また、ヒナが語順を認識するかどうか明らかにするために、人為的に語順を入れ替えた合成音(文法ルールに反する音声)も再生し、反応を検証した。コントロールとしては、音声を含まない背景の音(風音)を再生した。巣立ち後もヒナを追跡し、1週間おきに上記の音声を再生することで、ヒナの反応(警戒行動や接近行動)がどのように発達するのか明らかにしようと試みた。2018年は、4月半ばの温暖な気候から一転し、4月下旬に気温が一気に低下したため、繁殖に失敗したシジュウカラが多かった(全営巣つがいのうち56%が失敗)。繁殖失敗の原因のうちわけは、抱卵の放棄(失敗した巣のうち80%)とヘビによる捕食(20%)であった。本研究は、繁殖に成功した巣箱におけるヒナを対象に実施する。上記の録音調査・音声再生実験は試みたものの、繁殖失敗の多さゆえに、解析するに充分な数のデータを得ることができなかった。2019年は設置する巣箱の数を100個に増やし、その上で上記の研究を再度おこなうことで、解析に足る数のデータを集める計画である。2019年、例年通りに繁殖がおこなわれた場合は、充分なデータ数を得ることができるだろう。その場合、発声能力や音声認識能力の発達が、学習によるものなのか生得的に備わったものなのか検証するために交叉養育実験をおこなう計画である。
インテグリンリンクドキナーゼ不活化遺伝子導入による神経原線維変化モデルの開発

インテグリンリンクドキナーゼ(ILK)の遺伝子操作により神経原線維変化をマウス脳に形成させることで、アルツハイマー病などの神経変性疾患で確認される神経脱落像ならびにそれに基づく神経活動の異常に即した病態を忠実に再現した動物モデルの作製を試みた。ILKの活性不活化変異体(DN-ILK)を3週間にわたり導入発現した急性期マウスの海馬では、ILK酵素活性の有意な低下が認められ、それに伴い神経原線維変化病変に高頻度に出現するタウタンパク質のSer^<199>とSer^<202>の異常リン酸化量ならびにそれらを触媒するGSK-3βの活性型(Tyr^<216>-p)が増加した。ところが、12週後の慢性期になると、内在ILKの発現が誘導され、ILKならびGSK-3βの酵素活性が正常レベルにまで回復するとともに、急性期で認められたタウの異常リン酸化量の増加も回復した。DN-ILKを発現したマウス海馬では、生理機能を維持するため内在ILKの発現誘導を促進する適応機構が生じ、ILKならびGSK-3βの酵素活性を正常レベルにまで回復させ、タウタンパク質の機能を維持していることが示唆された。このように、培養細胞の場合とは異なりin vivoの動物個体では、長期間ILK活性を阻害したことに起因する代償機構が出現するため、神経原線維変化の発生には至らず、病態モデルを完成することが出来なかった。今後、ILK酵素活性を阻害した場合に生じる代償機構の詳細を解明し、それら適応機序を阻止する方法を見出すことが出来れば、ILKの遺伝子操作により神経原線維変化の動物モデルを作製することが十分可能でると考える。一方、逆の視点から見れば、アルツハイマー病の初期では、ILKの活性を高める薬物の投与が神経原線維変化の進行阻止に有効である可能性を強く示唆している。平成16年度は、野生型integrin-linked kinase(ILK)およびその不活化変異体(DN-ILK)の遺伝子を脳・神経細胞に導入する方法の選択・改良ならびに、導入発現効率の指標となるマーカーを選定するための予備的実験を行った。脳神経細胞への導入には、分裂・新生神経細胞をターゲットにしたレトロバイラスシステム発現系と、神経回路網を構成する成熟神経細胞をターゲットにした非バイラスシステム発現系の両者を比較し、両系の単独あるいは併用することで、神経原線維変化モデルに適した発現系の確立を目指して検討を重ねている。また、導入発現効率の指標となるマーカーとしては、green fluorescent protein (GFP)あるいはβ-galactosidase遺伝子の導入を考慮に入れ、脳神経細胞への発現効率の評価に適したマーカー遺伝子を検討している。レトロバイラスシステム発現系においては、野生型ILK、DN-ILKならびにGFP遺伝子をマウス白血病ウイルス(MLV)由来のウイルスベクターに構築後、ecotropicウイルスのenvを導入したパッケージンク細胞に導入することによりパッケージングしたウイルス粒子を回収した。回収したウイルス粒子は、マウスの第三脳室に投与することにより脳内に感染させ、感染一週間後に海馬歯状回部に新生する神経細胞のGFP由来蛍光強度を観察することにより発現効率を調べている。さらに、各遺伝子を脳内に導入したマウスにおいて記憶・学習テストならびにホールボードテストを行い遺伝子導入が脳神経機能に及ぼす影響を調べている。成熟神経細胞をターゲットにした非バイラスシステム発現系としてはin vivo用の遺伝子導入試薬を用いて、第三脳室に投与し、CMVプロモーターによる発現系を導入している。発現効率の評価は、β-galactosidase遺伝子を導入後、投与一週間後にX-gal染色を行い評価している。