hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己抗原に対する免疫寛容誘導に重要な遺伝子の同定

免疫寛容誘導には様々な細胞が密接に関与しているため、免疫寛容を維持するT細胞内のイベントを遺伝子プロファイルで比較するためには、in vivoで免疫寛容状態にある抗原特異的T細胞を大量に調整することが重要と考えられた。そのために、MBP特異的T細胞よりT細胞受容体(TCR)をクローニングし、トランスジェニックマウス(TCR-tg)を作成巾である。また、同時にPLP特異的T細胞よりクローニングされたTCRのTCR-tgを入手準備中である。現時点で、入手可能であったTCR-TgであるDO11.10マウスを用いて、TCR-tgから抗原特異的T細胞を分離し、NaiveのBalb/cマウスに移入した後に、上記の方法で抗原ペプチド特異的免疫寛容することによって、通常の数十倍量の免疫寛容状態の抗原特異的T細胞を得ることができるようになった。DNAマイクロアレイでの検索のため、cRNA合成過程までの条件設定を行い、アフィメトリックス社DNA Gene Chipを用いた解析の準備を行っている。探索した遺伝子の機能解析には、目的とする遺伝子を効率よくT細胞に導入することが重要であるので、新規のパッケージングコンストラクト(pCL-ECO)スピンインフェクション法を使用することにより、レトロウイルスベクターを用いてPrimary T細胞へ60-80%と非常に高率に遺伝子導入できる方法を確立した。TCR-tgのT細胞にも同様の効率で遺伝子導入するこに成功したので、EAEを起こすTCR-tgのT細胞を用いて、EAE制御に重要と思われる遺伝子の機能をin vivoで解析できるようになった。自己免疫を抑制する分子として、過剰発現系を用いて、Cbl、Cbl-b分子の機能解析を行った。両分子は、活性化されたLck, FynなどのSrcファミリーキナーゼをユビキチン化できるユビキチンE3リガーゼであることがわかった。
氷期に背弧にサンゴ礁はあったのか?-北限域サンゴ礁生態系の海洋変動との呼応-

琉球列島には,広く第四紀サンゴ礁性堆積物が分布している.このうち高緯度のサンゴ礁北限域のサンゴ礁は,第四紀の温暖化・寒冷化が周期的に繰り返された時期には,成立・発達・消滅を繰り返したと推定される.そこでトカラ列島小宝島東方沖の島棚域を対象にして,氷期(低海水準期)の礁性堆積物の発達状況を検討した結果,サンゴ礁発達北限域の氷期の背弧側にあっても,琉球列島主部と同様のサンゴ礁生態系が存在していた可能性が明らかになった.琉球列島には,広く第四紀サンゴ礁性堆積物が分布している.このうち高緯度のサンゴ礁北限域のサンゴ礁は,第四紀の温暖化・寒冷化が周期的に繰り返された時期には,成立・発達・消滅を繰り返したと推定される.そこでトカラ列島小宝島東方沖の島棚域を対象にして,氷期(低海水準期)の礁性堆積物の発達状況を検討した結果,サンゴ礁発達北限域の氷期の背弧側にあっても,琉球列島主部と同様のサンゴ礁生態系が存在していた可能性が明らかになった.平成22年度は,8月21日29日に,現世サンゴ礁北限周縁の琉球列島背弧側に位置するトカラ列島宝島・小宝島沖東方沖の島棚および島棚斜面上部について,小型船舶を用いて,ブーマー音波探査装置による表層礁性堆積物の分布・構造の検討,音響掃海機による高精度海底微地形調査による礁堆積体の識別,ならびに小型水中ビデオによる海底観察を行った.その結果,小宝島南東方東方沖の水深100120mの島棚域において,複数の礁岩群を見いだした.本島棚は,構造運動と火成活動により,不規則かつ複雑な地形を示し,一部には急崖が発達する.これらの不規則な海底面には,広く火山岩などの基盤岩が露出しているが,一部に比高10m程度の高まりが存在する.小型水中ビデオによる海底観察の結果,これらの高まりは,表面が数十cm程度のきわめて凹凸に富んだ形状を示すマウンド状の礁岩であることが判明した.これら礁岩は,粗粒な炭酸塩砂礫底中に点在しており,比高数10m,幅数数十mの規模を有し,種々の造礁生物により形成されている.また礁岩表面には,しばしば現世サンゴモなどの被覆性造礁生物が覆っているのが観察され,さらに少数ではあるが,マイクロアトール状の形態を示す塊状サンゴが認められる.以上より,これらの礁岩は,かつてのサンゴ礁,あるいは造礁サンゴの分布を示すものである可能性が指摘され,またこれらの分布水深,ならびに礁岩上に堆積物が皆無に等しいこと,さらには小宝島が最近1万年で約8mの速度で隆起していることから,これらの礁岩は最終氷期(約20,000年前)に形成された可能性が高い.このことは,琉球列島域における現在のサンゴ礁北限域近傍において,氷期にあっても前弧側の喜界島だけでなく背弧側にもサンゴ礁が存在していた可能性を示唆し,氷期における黒潮の流路に関し,大きな情報をもたらすものと考えられる.平成23年度には,平成22年度に現世サンゴ礁北限周縁の琉球列島背弧側に位置するトカラ列島小宝島東方沖の島棚上で発見した礁岩群について,10月13日17日に,研究船「なつしま」を用いて当該海域の詳細な地形調査,ならびに潜水艇「ハイパードルフィン3000」を用いて礁岩群の詳細な観察ならびに岩石試料の採取を行なった.その結果,対象海域の地形では,西北西-東南東方向,ならびに北北東-南南西方向の構造が確認され,複雑なブロック状地形を呈していることが判明した.また水深100m内外の平坦面の存在と,比高100m近くに及ぶ急崖の存在が明らかとなった.海底観察・試料採取では,対象海域において2潜航(HPD#1335・HPD#1336)を実施し,HPD#1335では,水深123mから108mの海底平坦面の観察を行った.その結果,複数のサンゴ礁性堆積物からなるマウンド状礁岩群が観察され,3個の岩石試料と1ヶ所の海底堆積物を得た.またHPD#1336では,水深129mから102mの海底平坦面の観察を行い,その結果,HPD#1335と同様に,複数のサンゴ礁性堆積物からなるマウンド状礁岩群が観察され,4個の岩石試料と3箇所の海底堆積物を得た.いずれの潜航でも得られた岩石試料は,主として生砕性の礁性石灰岩であり,海底堆積物はコケムシ質炭酸塩砂であった.今後,岩石試料・海底堆積物試料の構成造礁生物について検討を加えると共に,岩石試料については年代測定を行う予定である.本課題では,氷期・間氷期サイクルの気候・海洋環境変動に伴うサンゴ礁生態系の呼応について,現在のサンゴ礁北限周縁の琉球列島背弧側に位置する宝島・小宝島海域を対象域として,1)高分解能音波探査・微地形調査・ROV観察を通じて,琉球列島背弧側における氷期におけるサンゴ礁性堆積物の発達状況について明らかにする.

2)ドレッジによるサンゴ礁性堆積物の採取を通じて,背弧側氷期の造礁生物の特徴・種多様性・種構成,礁性堆積物の特徴,ならびにその規制要因について核心域(石垣島・沖縄本島)と周縁域前弧側(喜界島)のサンゴ礁生態系と比較する.これらを基に,氷期・間氷期サイクルにおける,特に低海水準期における琉球列島の前弧側と背弧側でのサンゴ礁生態系の応答とその要因を解明することを目的としている.平成24年度には,平成22・23年度の海洋調査により検討された現世サンゴ礁北限周縁の琉球列島背弧側にあたるトカラ列島宝島・小宝島沖において得られたデータ・試料について,サンゴ礁性堆積物中の造礁生物群集(造礁サンゴ・石灰藻・底生有孔虫・コケムシなど)の種構成・群集構造の検討を行い,背弧側氷期の海洋環境の復元を行なうと共にサンゴ礁性堆積物の年代決定を行なった.これらの得られたデ-タについて,既存のサンゴ礁核心域のデータと比較するために,宮古島にて補足調査を行なった.その結果,氷期の低海水準期においても現在と同様に,サンゴ礁北限周縁の琉球列島背弧側にもサンゴ礁性堆積物の発達があることが明らかになった.平成22・23年度の海洋調査により,琉球列島背弧側においても氷期に形成された可能性の高い礁岩群を発見し,岩石試料を採取し,概ね順調に当初計画通りの目的を達成してきている.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に採取された岩石試料について継続して解析を進め,琉球列島背弧側の氷期の海洋環境について検討を実施する.現時点では,まだ試料の年代が確定してないので,早急に放射性炭素年代んらびに微化石により年代を確定する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
マラリア原虫における細胞内小胞輸送の分子機構

マラリア原虫の血球内生育サイクルにおいて,エンドサイトーシス・エクソサイトーシスといった細胞膜と細胞内小器官膜との間の小胞輸送過程が,原虫のエネルギー獲得と物質の取り込みに必須な役割を果たす.したがって,小胞輸送過程の分子機構の解明は,マラリア原虫の生育生理を理解する上で極めて重要であるのみならず,マラリア制圧に向けた新奇の戦略を構想する点においても重要である.しかしながら,本生物の細胞内小胞輸送の分子機構はほとんど明らかにされていない.細胞内小胞輸送に直接的に関与する分子として,N-ethylmaleimide sensitive fusion protcin(NSF)がPlasmodium falciparumのゲノム上に存在することを,Genomedatabaseの検索の結果,明らかにした.この分子の機能を,まず,出芽酵母発現系を用いて解析することを考え,酵母発現ベクターに遺伝子断片を組み込むことを進めている.しかしながら,Plasmodiumの遺伝子のAT-richである特性のため,通常の遺伝子操作法では特異的遺伝子断片の取得と同定が困難であり,現在のところ酵母での発現にまで至っていない.マラリア原虫の血球内生育サイクルにおいて,エンドサイトーシス・エクソサイトーシスといった細胞膜と細胞内小器官膜との間の小胞輸送過程が,原虫のエネルギー獲得と物質の取り込みに必須な役割を果たす.したがって,小胞輸送過程の分子機構の解明は,マラリア原虫の生育生理を理解する上で極めて重要であるのみならず,マラリア制圧に向けた新奇の戦略を構想する点においても重要である.しかしながら,本生物の細胞内小胞輸送の分子機構はほとんど明らかにされていない.細胞内小胞輸送に直接的に関与する分子として,N-ethylmaleimide sensitive fusion protcin(NSF)がPlasmodium falciparumのゲノム上に存在することを,Genomedatabaseの検索の結果,明らかにした.この分子の機能を,まず,出芽酵母発現系を用いて解析することを考え,酵母発現ベクターに遺伝子断片を組み込むことを進めている.しかしながら,Plasmodiumの遺伝子のAT-richである特性のため,通常の遺伝子操作法では特異的遺伝子断片の取得と同定が困難であり,現在のところ酵母での発現にまで至っていない.
学生・生徒のキャリアアップ支援策の高度化と産学パートナーシップの日米仏比較研究

1.我が国における学校と企業のパートナーシップの進行状況を把握するために、高等学校などの教育機関における「インターンシップ(就業体験)」の実施状況について、国内各地の大学等で資料収集を行ったほか、いくつかの都道府県で、高等学校での就業体験の実施上の問題について教員たちに聞き取り調査を行った。その結果、日本の専門高校における就業体験については、(1)生徒たちの評価は高いものの、(2)教師の負担感は強い等の傾向が指揮された。2.アメリカ合衆国における現地調査、さらに研究機関や専門職団体の出版物、連邦政府、各州の法令の分析に、基づき、同国における学校と企業のパートナーシップ促進に関する、連邦政府及びいくつかの州の政府の政策動向を調査した。同時に実際にハイ・スクールなどの教育機関を訪問し、教師や生徒たちに聞き取り調査を行った。その結果アメリカの教育機関では、ジョブ・シャドーイング、インターンシップなど目的や期間、内容などの点で多様な職場実習が取り組まれていることが明らかになった。3.フランスの職業教育における学校と企業とのパートナーシップ推進に関する政策の動向を把握するためにフランスにおける現地調査を行ったほか、フランス政府の政策動向について法令集等を用いて調査した。この結果、フランスでは政策レベルでリセなどの教育機関における企業実習を奨励する政策がとられ、実際にそれが多くの学校で実施されていることが明らかになった。1.高校・大学におけるキャリアアップ支援策の現状、それらに対する生徒・学生の意識・希望の調査・分析--文部科学省の学校基本調査報告書やその他の調査などを活用して、全国の高校・大学におけるキャリアアップ支援策の現状の把握を行った。2.高校・大学における産学パートナーシップの現状の調査・分析--岩手県と宮城県の高校と大学の数校を対象に、産学パートナーシップの現状や、その実施に関する生徒・学生・教員の要求や意識について、聞き取り調査を行った。3.アメリカ合衆国におけるキャリアアップ支援策と産学パートナーシップの現状に関する調査--アメリカ合衆国に赴き、(1)バージニア州アレキサンドリア市にある、キャリア・技術教育協会(Association of Career and Technical Education)の事務局において、全米レベルでのキャリアアップ支援策の動向について、関連研究者に聞き取り調査を行うとともに、(2)サンフランシスコ市近郊のハイスクール数校について、キャリアアップ支援策や産学パートナーシップ実施の実態及びその取り組みの課題・問題点についての聞き取り調査を行った。4.フランスにおけるキャリアアップ支援策と産学パートナーシップの現状に関する調査--フランスに赴き、パリ市にある国立教育研究所等において、キャリアアップ支援策の動向に関する資料収集を行った。1.わが国の職業教育における学校と企業とのパートナーシップの進行状況を把握するために、「インターンシップ(就業体験)」の実施状況について、各地の大学の研究者に聞き取り調査を行った。この結果、(1)多くの地域で専門高校について職場体験実習が実施されていること、(2)実施した結果、生徒たちには好評であること、(3)しかし受け入れ先を探すなどの点で、教師の負担増になっていることなどを明らかにすることができた。2.フランスの職業教育における学校と企業とのパートナーシップ推進に関する政策の動向を把握するため、平成14年度に引き続いて、近年の政府の政策動向を法令集等を用いて調査し、近年のフランス政府が生徒の職場体験実習を重視する政策を取っていることが明らかになった。3.アメリカ合衆国における学校と企業とのパートナーシップ促進に関する、連邦政府及びカリフォルニア州、イリノイ州などいくつかの州の政府の政策動向を法令集等を用いて調査した。また連邦教育省、全米キャリア・技術教育研究センター、キャリア・技術教育協会などの統計資料を用いて、パートナーシップ促進の政策の実態や課題・問題点について調査した。この結果、近年のアメリカでは、インターンシップなどハイ・スクールの生徒の職場体験実習を奨励する方策が様々な形で採られていることが明らかになった。1.我が国における学校と企業のパートナーシップの進行状況を把握するために、高等学校などの教育機関における「インターンシップ(就業体験)」の実施状況について、各地の大学で、資料収集を行った。その上で昨年度各地の大学の研究者に対して行った聞き取り調査の結果と併せて、結果をまとめた。その結果、1)就業体験に対する生徒たちの反応はよいものの、2)カリキュラム全体の中での位置づけが不明確であるとの問題点が明らかになった。2.昨年度に引き続き、フランスの職業教育における学校と企業とのパートナーシップ推進に関する政策の動向を把握するために、近年の同国政府の政策動向を法令集等を用いて調査した。

その結果、フランスでは、近年職業リセなどにおける企業実習を奨励する政策がとられていることが明らかになった。3.昨年度に引き続き、アメリカ合衆国における学校と企業のパートナーシップ促進に関する、連邦政府及びいくつかの州の政府の政策動向を調査した。また全米キャリア・専門教育研究センターなどの研究機関、キャリア・専門教育協会などの専門職団体の資料を用い、アメリカのハイ・スクールなどの教育機関における企業実習の取り組み状況について調査した。その結果、アメリカでは、これらの教育機関で、目的、期間などで様々に異なる企業実習(ジョブ・シャドーイング、インターンシップ、連携制教育、青少年徒弟制)が取り組まれており、効果を上げていることが明らかになった。4.研究成果は、日本産業教育学会、日本インターンシップ学会などの全国大会で発表し、関係する研究者の助言を得ることができた。
非接触衝撃弾性波法によるコンクリート表層品質・内部欠陥の弾性波トモグラフィの開発

本研究では,あと施工アンカーボルト固着部の接着剤充填状況(内部欠陥)を対象として,解析により励磁コイルの理論設計を行い,この結果に基づき励磁コイルを試作した。続いて、励磁コイルとレーザドップラ振動計を組合わせた「非接触衝撃弾性波法」を開発し,接着剤充填状況の評価を試みた。その結果,アンカーボルト固着部の充填率が25%程度以下の低いものを検出できる可能性があることを明らかにした。同様の手順で,非接触衝撃弾性波法によりPCグラウト充填評価も試みた。その結果,励磁コイルの性能を適切に設定することができれば,グラウト充填率を評価できる可能性があることがわかった。本年度は,まず,コンクリート中に埋め込まれたアンカーボルトを対象として,その固着部の接着剤の充填状態(内部欠陥)を非接触衝撃弾性波法で評価するための励磁コイルの理論設計および弾性波特性(評価指標)について,衝撃応答解析を用いて把握することを目的として研究を行った。その結果,対象とした内部欠陥を評価するためには,リング状の励磁コイルが適切であることを把握した上で,評価指標としては伝搬時間および波形エネルギーが有効であることを明らかとした。また,解析結果に基づき励磁コイルを試作した上で,その性能を供試体での実験により把握することを試みた。その結果,試作した励磁コイルは,解析結果通りの性能を有していることが確認でき,かつ,対象とする内部欠陥(接着剤の充填状態)を適確に評価できることを明らかとした。昨年度の成果を踏まえ,非接触衝撃弾性波により,アンカーボルト固着部の接着剤の充填状況(内部欠陥)を評価する手法の検討を行った。適用した手法としては,ボルト頭部に設置した励磁コイルにより動磁場を励起し,生じたボルトの挙動をボルト頭部に設置したレーザードップラー振動計(LDV計)で受信する形の非接触衝撃弾性波法である。その結果,LDV計によりアンカーボルト頭部で受信する方法では,片持ち梁の振動モードに類似した挙動に加えて,ボルト軸方向を伝搬する弾性波の挙動(縦波共振周波数)も同時に捉えていることが明らかとなった。この縦波共振周波数を評価指標とすることで,充填率が低い場合のみを検出できることがわかった。続いて,上記の成果を踏まえて,非接触衝撃弾性波法によるPCグラウト充填評価への適用を試みた。まず,動磁場解析により,励磁コイルの導線巻付け位置,配置方法,コア寸法の違いがシースに作用する電磁力に与える影響について把握した。その結果,電磁力を大きくするには,銅線の巻き付け位置をコアの両端とした上で,励磁コイルをシース軸と直行させ,かつ,コア寸法を小さくすることが望ましいことがわかった。続いて,解析結果の妥当性を評価するための基礎実験も行い,解析結果と実験結果は概ね一致することがわかった。最後に,解析と実験の結果を踏まえて,PC桁を模擬した供試体を対象に実験を行った結果,コンクリート表面にセンサを設置する条件であれば,PCグラウト充填状況を適確に把握できることが明らかとなった。しかしながら,LDV計を利用して非接触で鋼製シースからの弾性波挙動を把握するためには,かぶりが小さい場合に限定される,あるいはコイルに与える電流をさらに大きくするなどの改善が必要であった。なお,本研究では,上記検討と併行して,弾性波トモグラフィ用プログラムも試作し,適用可能性の検討も行っている。工学本年度の当初目標であった「解析により計測対象に応じた装置(励磁コイル)の理論設計を行い,この結果に基づき装置を試作する方法論」を確立できたため,順調に研究は進展していると判断している。今後は,PCグラウト未充填の検出を対象とした装置(励磁コイルなど)を試作し,評価手法の確立を目指すとともに,弾性波トモグラフィ計測へと拡張する予定である。励磁コイルを無償で製作してもらったため,試作費が不要になった。また,次年度に励磁コイルの性能を向上する予定があるため,今年度はレーザドップラー振動計を無償レンタルすることにした。レーザドップラ振動計を購入する予定である。
窒素原子新導入法による含窒素環状化合物の効率的製造法の開発

本研究では、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)のシリル化能および脱水能力に着目して、さらにHMDSを窒素導入試薬として用いる反応により、イミダゾリン、フタロシアニンなどの含窒素環状化合物の新しい高効率の製造法を開発した。(1)アルデヒドとHMDSとアルミナをマイクロ波照射5分間行い、ついで、DBNまたはDBUを加えて5分間照射すると、ほぼ定量的にcis-イミダゾリンを得ることができ、塩基としてt-BuOK/DBUを用いるとtrans-イミダゾリンが選択的に高収率で生成することがわかった。キラルジアミンに導くことができる複素現として有用なイミダゾリンは、これまで、多段階を経て得られてきたが、本研家により、cis-およびtrans-イミダゾリンを高収率、短時間で選択的に得る方法が確立できた。(2)フタロニトリルとHMDSとを金属塩の存在下、100°Cで反応させると金属フタロシアニンが高収率で得られることがわかった。金属塩を入れないで硫酸アンモニウムやP-トルエンスルホン酸を10モル%存在させると収率良く無金属フタロシアニンが得られる。150°Cで反応を行うと触媒量(30モル%)のHMDSでも良好に反応が進行する。フタルイミドや無水フタル酸とHMDSと金属塩を触媒量のp-トルエンスルホン酸を存在させて、封管中150°Cで加熱すると金属フタロシアニンが良い収率で得られた。HMDSの代わりに高沸点のジフェニル置換ジシラザンを用いれば封管中で反応を行うことなく、高収率でフタロシアニンが得られることがわかった。また、置換体、無金属フタロシアニンも効率よく穏和な条件で合成でき、本法は新規機能性色素の開発に必要な広汎なフタロシアニン誘導体の合成に役立つことが期待される。本研究では、安価なヘキサメチルジシラザン(HMDS)を用いて、有用な含窒素複素環化合物の工業的製法にも適合し得る合成法を開発する。本年度はイミダゾリン化合物のone-pot合成とフタロシアニン骨格の簡便な合成法を確立した。イミダゾリン化合物は生理活性物質として、また、不斉配位子となるジアミノ化合物の前駆体として有用である。イミダゾリンからイミダゾールヘの変換反応も知られている。本研究では、HMDSを用いて、無溶媒、無触媒という環境にやさしい条件下で、アルデヒドから途中生成するジイミン化合物を単離することなく、イミダゾリン環のone-pot合成法を確立した。通常の加熱下では120°C、約6時間でシス-イミダゾリン化合物を高収率で与える。この反応をマイクロ波照射下で検討したところ、アルデヒドとHMDSをアルミナとともに5分間照射し、ジイミン化合物に変換後、塩基を加えて数分照射すると環化が起こり、シス-イミダゾリンあるいはトランス-イミダゾリンを選択的に得ることができることがわかった。フタロシアニンは古くから高級顔料として用いられ、近年、安定な機能性色素としての発展が大いに注目されている。本研究ではHMDSを環化促進作用と同時に窒素導入試薬として利用するフタロシアニン骨格の新しい合成法の開発を目指している。本年度はフタルイミドとHMDSをp-TsOHのような酸を存在させて少量のDMFと150°Cに加熱すると各種金属フタロシアニンとフタロシアニン誘導体(Pcn)が良好な収率で生成することを見出した。
加齢性疾患にみられる蛋白質異常凝集の機構解明とその修復

加齢性疾患では、その原因蛋白質中のアスパラギン酸(Asp)残基の異性化が蛋白質の不溶化を惹起し、疾患発症に至る過程が共通している。本研究では、まず、蛋白質中のAsp異性体の迅速分析法の開発を行った。次に加齢性白内障の水晶体の不溶化蛋白質中では部位特異的にAsp残基が正常なL-α-Asp残基からD-α-, L-β-, D-β-体へ著しく異性化し、異常凝集や解離を惹起すること、紫外線照射が、異性化を促進することなどを明らかにした。さらにRNaseに3つの異常異性体を挿入すると、その活性が失われたことから蛋白質中のAsp残基の異性化は蛋白質の機能を著しく変化させることが初めて明らかとなった。蛋白質はL-アミノ酸のみから構成されているために正しい折りたたみ構造を形成し、その機能を発揮している。しかし、近年、白内障、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、加齢性難聴等、種々の加齢性疾患の原因蛋白質中にD-β-アスパラギン酸(Asp)が蓄積していることが明らかとなってきた。蛋白質中にD-β-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、蛋白質の変性や異常凝集が起こる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化→蛋白質の不溶化の過程が共通して生じている。本研究では蛋白質中でのD-β-Asp生成を加齢性疾患発症の一因と捉え、D-β-Asp含有蛋白質の微量定量分析の開発、異常凝集過程の追跡、修復機構の解析を行い、D-β-Asp生成機構の化学的解明、ならびにD-Asp含有蛋白質のみを特異的に分解する酵素(D-Aspartyl Endopeptidase、DAEP)の様々な生物種におけるDAEP活性のスクリーニングを行った。これらにより疾患の発症時期の予測、防御、修復、治療への道を探ることが可能となる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化、ならびに断片化→蛋白質の不溶化に至るが共通して生じている。本研究では蛋白質中でのD-β-Asp生成を加齢性疾患発症の一因と捉え、D-β-Asp含有蛋白質の微量定量分析の画期的な開発を行った。これにより、迅速、簡便な結合型D-アミノ酸分析が実現できた。また、水晶体蛋白質中の主成分であるα-クリスタリンにD-Aspが生成されると会合体として保持できず、解離することが判明した。蛋白質中にD-β-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、異常凝集が生じる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化→蛋白質の不溶化に至る過程が共通している。これにより、微量、迅速、簡便な結合型D-アミノ酸分析が初めて可能となった。本法により、水晶体蛋白質中の主成分であるαA-クリスタリン(Cry)のAsp58,84,151, αB-CryのAsp96、βA3- CryのAsp37残基が著しく異性化され、D-β-Asp体が生じていることが明らかとなった。正常な水晶体では、αA-, αB-サブユニットが会合したα-Cry会合体がβ- Cry, γ- Cryと弱い結合を介してsuper structureを構成し、レンズとして機能している。しかし、αA- CryのAsp58, 84,151, αB- CryのAsp96残基が著しく異性化されたこれらのCryは会合体を形成できず、モノマーへと解離することが明らかとなった。従来の研究でαA- CryのAsp58,84,151, αB-CryのAsp-36,62残基のD-β-Asp体がα- Cry会合体の異常凝集化を促進させることが明らかとなっている。本研究の結果からAsp残基に異性体が生じると適正な会合体を構成できず、これが白内障の一因となるということが示唆された。

1)一個の老人性白内障の水晶体から蛋白質を精製することなく、トリプシン処理し、その断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS/MS)により、クリスタリン中のどのAsp残基がどの程度D-β-体化しているのかを微量試料で、簡便、迅速、精確に定量することに成功した。2)蛋白質中に生ずるAsp残基の異性体はLα, Dα, Lβ-, Dβ-体の4種類存在する。これらは互いにジアステレオマーであるためにLC上で分離する。従って同一質量でLC上で複数のピークに分離しているペプチドがAsp異性体含有ペプチドであるので、この性質を利用して異性体の発見に成功した。これらのペプチドの同定は当初、4種類のAsp異性体を導入したペプチドを標品として化学合成し、その溶出時間を比較することにより決定していた。しかし、一種類のペプチドに対して4種類ずつの異性体ペプチドを合成し、精製するのは時間とコストがかかる。そのためペプチド中のAsp異性体を特異的に認識する市販酵素を作用させ、4種類の異性体ペプチドの同定に成功した。すなわち、Lα体を含むペプチドにはAsp-N酵素、Lβ-, Dα-体を含むペプチドに関してはそれぞれ、Protein L-isoaspartyl methyltransferase(PIMT)paenidaseという酵素を作用させ、Lα-, Lβ-, Dα-, Dβ-Asp異性体の同定を可能とした。3)老人性白内障のα-クリスタリン、β-クリスタリンは通常、会合体を形成しているが、これらのクリスタリンはAsp残基が異性化することにより、会合体として存在できず、解離して単量体になることが初めて明らかとなった。4)老人性白内障の不溶性画分中に含まれるα-クリスタリン、β-クリスタリン中のAsp残基は可溶性画分中に含まれるα-クリスタリン、β-クリスタリン中のAsp残基よりも著しく異性化が進んでいた。5)3)と4)の結果からAsp残基に異性体が生じると適正な会合体を構成できず、これが白内障の一因となるということが示唆された。蛋白質はL-アミノ酸のみから構成されているために正しい折りたたみ構造を形成し、その機能を発揮している。しかし、近年、白内障、アルツハイマー病等、種々の加齢性疾患の原因蛋白質中にDβ-アスパラギン酸(Asp)が蓄積していることが明らかとなってきた。蛋白質中にDβ-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、異常凝集が生じる。上記の疾患では、Dβ-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化→蛋白質の不溶化→疾患発症に至る過程が共通している。本研究では、1)液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた蛋白質中のAsp残基の異性化部位を特定する方法を開発し、2)水晶体の不溶化蛋白質中で水晶体主成分のαA- αB-, βA3-クリスタリンの特定部位のAsp残基が正常なLα- Asp残基からLβ-、Dα-、Dβ-体へと著しく異性化していること、3)Asp残基の異性化がα-Cry会合体を不安定化させ異常凝集化やモノマーへの解離を惹起することを発見した。4)次にRNase A(1-124)中のAsp121残基に4種のAsp異性体を導入したRNase Aを作成をした。その方法はRNase Aの1-109までの配列を蛋白質発現法により合成し、RNase Aの110-124まではAsp121をLα-、Lβ-、Dα-、Dβ-体に置き換えたペプチドで化学合成し両者を連結させた。これら4種類のAsp異性体含有RNase Aの活性を測定したところ、Lα-Aspを導入したRNase Aのみが酵素活性を有し、Lβ-、Dα-、Dβ-Aspを導入したRNase Aでは活性が完全に失われることが明らかとなった。この結果から蛋白質中のたった1残基のAsp残基異性体の存在により、蛋白質の機能が劇的に変化することが初めて明らかとなった。加齢性疾患では、その原因蛋白質中のアスパラギン酸(Asp)残基の異性化が蛋白質の不溶化を惹起し、疾患発症に至る過程が共通している。本研究では、まず、蛋白質中のAsp異性体の迅速分析法の開発を行った。
食品に生成される長寿命ラジカル種の特定と生物個体中における挙動の解明

殺菌・殺虫や芽止めを目的として食品に放射線を照射する食品照射技術が世界的に拡がっている。生体成分に放射線照射すると照射誘導ラジカルが生成される。殆どのラジカルは1秒以内で消滅するが、照射生鮮果実や照射牛レバーでは1週間を超える長寿命の照射誘導ラジカルが検出される。食品中に生じた長寿命ラジカルは、食品が消化される過程で速やかに消滅すると推測されるが、直接的証拠はない。そこで食品中の何がラジカル化して長寿命となるかを明らかにしたうえで、線虫に対して、放射線照射した大腸菌を餌として与えて飼育後、電子スピン共鳴(ESR)測定することにより、体内での長寿命ラジカルの挙動を解明する。
細菌リポ多糖LPSによる傷害的活性の発現に対する調節機構の解明

細菌リポ多糖(LPS)はグラム陰性細菌の細胞壁構成成分で、宿主細胞に認識されるとTLR4を介して自然免疫を活性化させ、本来は宿主にとって有益な感染防御作用などの誘導に働くが、しばしば活性化が過剰に進み、有益な働きを障害し、むしろ宿主に有害な内毒素活性を発現してしまう。このような障害的活性の誘導を防止する調節機構の解明は重要であり、その機構について検討した。LPSの活性は多彩なメディエーターの活性を介して発現される。IL-12は代表的なメディエーターであり、その産生調節はサブユニットであるIL-12p40の産生量に大きく左右されると指摘されている。このサブユニットをコードする遺伝子のプロモーター領域には抑制性エレメント(GA-12)も存在し、それを働かせるためのシグナル伝達経路としてERK系(MAP系の一つ)の高活性化が重要な役割を担っていることを明らかにした。この抑制機構はマウス腹腔滲出細胞を高濃度LPSで刺激したときにも働くことを見出し、一般的な調節機構として機能している可能性を示した。一方、活性型LPSの働きを抑制するアンタゴニスト型LPSとして、リピドA部のアシル基数が減少したLPSを、Yersinia属細菌が37°Cで生育したときに産生することを見出した。この天然のアンタゴニスト型LPSはそこに含まれる主要リピドAの構造に相当すると考えられる化学合成リピドA類縁化合物の活性を大きく上回るアンタゴニスト活性を発揮した。この機構は、TLR4を介した細胞内へのシグナル伝達を一斉に抑えるものであると考えられた。本研究で得られた、TLR4の下流シグナルを一挙に抑える機構と、その下流の個々のメディエーターの産生を調節する機構の両者に関する理解を深めることは、LPSの障害的活性の発現を防止するためのより効果的な対策の開発に役立つものと考える。細菌リポ多糖(LIPS)の活性は、様々なメディエーターの作用を介して発現されるがIL-12は代表的なLPSメディエーターの一つである。産生量が適量であれば感染防御を始め生体にとって有益な活性を示すが、過剰になると傷害的な作用を引き起こしてしまう。我々は、LPSによるIL-12産生に対する抑制機構としてIL-12p40遺伝子のプロモーター領域に存在する抑制性エレメント(GA-12)の活性化が重要な働きをすることを株化細胞を用いた実験で示してきた。今年度の研究では、マウス腹腔浸出細胞を用いて生体反応に近付けた実験系で、LPS刺激に応じて産生されるIL-12量が高濃度LPSでは減少し、この抑制機構にもGA-12の活性化が重要な働きをしていることを見出した。この上流のシグナル伝達系として、MAPキナーゼ系の一つであるERK系の高活性化が重要な役割を担っていることを示す結果も得られた。IL-12産生誘導に至適な低濃度LPS刺激と共に、LPSとは異なる経路からERKを活性化する薬剤(PMA)を作用させ相加的にERKを高活性化させると、GA-12の活性化に伴いIL-12の産生が抑制される結果も得られ、このような薬剤を利用してIL-12の過剰産生を抑制できる可能性も見出せた。

ペスト菌のLPSに関する別の研究では、菌の培養温度を27°C(環境温度)から37°C(宿主体温)に変化させるとLPSの構造や活性に変化が見られ、37°C-LPSは27°C-LPSに比べアシル基数が減少しており、ヒトのマクロファージ系細胞(U937)に対する活性は大きく低下するが、その代わり27°C-LPSの活性に対して抑制的に働くアンタゴニストとしての活性を強く発現することを見出した。これはペスト菌のLPS間だけの作用ではなく、活性の強いサルモネラ菌のLPSに対する抑制効果も見られた。この抑制機構の解明は、LPSの傷害的作用に対する有効な抑制法の開発に結びつく可能性が考えられる。グラム陰性細菌の共通成分である細菌リポ多糖(LPS)は、宿主細胞が発現するTLR4によって認識され自然免疫を活性化させる。この活性化は本来、宿主にとって有益な感染防御作用などの誘導に働くが、しばしば活性化が過剰に進み、有益な働きを障害し、むしろ宿主に有害な内毒素活性を発現してしまう。このような障害的活性の誘導を防止する調節機構の解明は重要であり、その機構について検討した。IL-12はLPSの活性を仲介する代表的メディエーターであり、単独でも適量産生されれば有益な活性に繋がるが、過剰に産生されると有害な活性の誘導に向かって行く。活性型IL-12の産生調節はサブユニットであるIL-12p40の産生量に大きく左右されると報告されている。このサブユニットをコードする遺伝子のプロモーター領域には抑制性エレメント(GA-12)が存在し、LPS過剰刺激時にそれを働かせるためのシグナル伝達経路としてERK系(MAP系の一つ)の高活性化が重要な役割を担っていることを本研究で明らかにした。また、この調節機構は様々な細胞に広く存在すと思われるが、IL-12特異的で他のLPSメディエーターの産生調節には関与しないようであった。一方、37°Cで生育したペスト菌のLPSは、この菌の生育至適温度である27°Cで生育した場合の活性型LPSとは構造的に変化し、活性型LPSの働きを抑制するアンタゴニストとしての作用を強く発現し、特に、ヒトの細胞系ではこの作用が著しいことを見出した。それはTLR4のアダプター分子であるヒトMD-2との相互作用に起因することが考えられる。この場合は、TLR4の下流にシグナルを伝えられなくなり、LPSメディエーターの産生誘導を一斉に抑えることが分かった。数種のメディエーターをグループ毎に調節するような中間的な調節機構が見出せれば、応用価値はより高くなると考えられる。
膵全摘術後の糖質、アミノ酸、脂質代謝の制御とグルカゴン点鼻薬の開発

膵全摘術後には,血糖コントロ-ルの不安定化の他,高アミノ酸血症,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪酸血症などアミノ酸,脂質代謝にも不全が生じる.これらの障害の一因としてグルカゴンの欠落が考えられるが,我々は膵全摘症例に対して試験的にインスリンとグルカゴンの併用投与を行い,糖質,アミノ酸,脂質の代謝に対する影響を解析した.またグリカゴンの血中半減期がきわめて短時間であるため,頻回投与が必要となるが,侵襲が少なく,頻回投与が可能な投与法をめざして点鼻薬の開発を行った.解析の結果,膵全摘後の術後急性期にはグルカゴンを持続静注することにより血糖の安定化が達成でき充分なエネルギ-投与が可能であることが確認された.また,開腹期ー社会復帰期においてはグルカゴンの皮下投与によりアミノ酸,脂肪代謝が円滑化することが確認された.しかし,単回投与ではその効果は一過性であり,より作用持続時間の長い製剤あるいは患者の苦痛が少なく頻回投与可能な製剤として,グリカゴン点鼻薬を開発した.グリカゴンをリン酸緩衝液で溶解し,吸収促進剤として,カプリン酸ナトリウム(NaーCap),グリココ-ル酸ナトリウム(NaーGch),グリチルレニン酸(GAHSーNa_2),グリチルレニン酸誘導体GAーHPh,同GAーMHS,同DGーDHPh,同HomADーDHPhと7種類の経鼻薬を試作して,基礎的,臨床的検討を加えた結果,NaーCap加経鼻薬は刺激臭があるが,GAーHPh加経鼻薬は刺激臭は少なく,他の副作用もなく,グルカゴンの吸収も良好で,経鼻吸収促進剤として臨床応用が可能であり,膵全摘症例の開腹期ー社会復帰期の使用は血糖コントロ-ルや,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪血症の予防に有用であった.膵全摘術後には,血糖コントロ-ルの不安定化の他,高アミノ酸血症,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪酸血症などアミノ酸,脂質代謝にも不全が生じる.これらの障害の一因としてグルカゴンの欠落が考えられるが,我々は膵全摘症例に対して試験的にインスリンとグルカゴンの併用投与を行い,糖質,アミノ酸,脂質の代謝に対する影響を解析した.またグリカゴンの血中半減期がきわめて短時間であるため,頻回投与が必要となるが,侵襲が少なく,頻回投与が可能な投与法をめざして点鼻薬の開発を行った.解析の結果,膵全摘後の術後急性期にはグルカゴンを持続静注することにより血糖の安定化が達成でき充分なエネルギ-投与が可能であることが確認された.また,開腹期ー社会復帰期においてはグルカゴンの皮下投与によりアミノ酸,脂肪代謝が円滑化することが確認された.しかし,単回投与ではその効果は一過性であり,より作用持続時間の長い製剤あるいは患者の苦痛が少なく頻回投与可能な製剤として,グリカゴン点鼻薬を開発した.グリカゴンをリン酸緩衝液で溶解し,吸収促進剤として,カプリン酸ナトリウム(NaーCap),グリココ-ル酸ナトリウム(NaーGch),グリチルレニン酸(GAHSーNa_2),グリチルレニン酸誘導体GAーHPh,同GAーMHS,同DGーDHPh,同HomADーDHPhと7種類の経鼻薬を試作して,基礎的,臨床的検討を加えた結果,NaーCap加経鼻薬は刺激臭があるが,GAーHPh加経鼻薬は刺激臭は少なく,他の副作用もなく,グルカゴンの吸収も良好で,経鼻吸収促進剤として臨床応用が可能であり,膵全摘症例の開腹期ー社会復帰期の使用は血糖コントロ-ルや,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪血症の予防に有用であった.膵全摘術後は、血糖コントロ-ルの不安定化の他、高アミノ酸血症、高アンモニア血症、脂肪肝、高脂肪酸血症などアミノ酸、脂質代謝にも不全が生じる。これらの障害の一因としてグルカゴンの欠落が考えられるが、我々は膵全摘症例に対して試験的にインスリンとグルカゴンの併用投与を行い、糖質、アミノ酸、脂質の代謝に対する影響を解析した。またグルカゴンの血中半減期がきわめて短時間であるため、頻回投与が必要となるが、侵襲が少なく、頻回投与が可能な投与法をめざして点鼻薬の開発を進めている。解析の結果、膵全摘後の術後急性期にはグルカゴンを持続静注することにより血糖の安定化が達成でき十分なエネルギ-投与が可能であることが確認された。また、回復期社会復帰期においてはグルカゴンの皮下投与によりアミノ酸、脂質代謝が円滑化することが確認された。しかし、単回投与ではその効果は一過性であり、より作用持続時間の長い製剤あるいは頻回投与可能な製剤の必要性が示された。しかし、膵全摘術は種々の代謝上の問題をひきおこすため、できるだけ避けるよう努めている。そのため症例数が少なく、臨床例では未だ十分な解析には至っていない。グルカゴン点鼻薬については、三種類の製剤が開発され、健常人ボランティア、膵全摘症例において、点鼻投与によるグルカゴンの吸収、体内での活性発現が確認され、頻回投与可能な製剤として臨床応用が期待された。しかし、グルカゴン自体が高価な薬剤であるので、さらに吸収促進剤に工夫を加え、吸収効率の良好な製剤の開発をめざす必要がある。

膵全摘術後には,血糖コントロ-ルの不安定化の他,高アミノ酸血症,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪酸血症などアミノ酸,脂質代謝にも不全が生じる.これらの障害の一因としてグルカゴンの欠落が考えられるが,我々は膵全摘症例に対して試験的にインスリンとグルカゴンの併用投与を行い,糖質,アミノ酸,脂質の代謝に対する影響を解析した.またグルカゴンの血中半減期がきわめて短時間であるため,頻回投与が必要となるが,侵襲が少なく,頻回投与が可能な投与法をめざして点鼻薬の開発を行った.解析の結果,膵全摘後の術後急性期にはグルカゴンを持続静注することにより血糖の安定化が達成でき充分なエネルギ-投与が可能であることが確認された.また,開腹期ー社会復帰期においてはグルカゴンの皮下投与によりアミノ酸,脂肪代謝が円滑化することが確認された.しかし,単回投与ではその効果は一過性であり,より作用持続時間の長い製剤あるいは患者の苦痛が少なく頻回投与可能な製剤として,グルカゴン点鼻薬を開発した.グルカゴンをリン酸緩衝液で溶解し,吸収促進剤として,カプリン酸ナトリウム(NaーCap),グリココ-ル酸ナトリウム(NaーGch),グリチルレニン酸(GAHSーNa_2),グリチルレニン酸誘導体GAーHph,同GAーMHS,同DGーDHph,同HomADーDHphと7種類の経鼻薬を試作して,基礎的,臨床的検討を加えた結果,NaーCap加経鼻薬は刺激臭があるが,GAーHph加経鼻薬は刺激臭は少なく,他の副作用もなく,グルカゴンの吸収も良好で,経鼻吸収促進剤として臨床応用が可能であり,膵全摘症例の開腹期ー社会復帰期の使用は血糖コントロ-ルや,高アンモニア血症,脂肪肝,高脂肪血症の予防に有用であった.
魚類耳石の微細輪紋形成機構-耳石有機基質合成と内リンパ液イオン組成からの解析

耳石に刻まれる日周輪やチェックリング読みとりの正確性を増し、さらなる情報を解読するためには、内耳内リンパ液の微量採取法、イオン組成測定法、耳石有機基質産生活性測定法を確立し、それらが日周輪・チェックリング形成に果す役割を解明することが必要である。昨年度に確立した方法を用いて、ニジマスの内リンパ液のイオン組成と炭酸カルシウムアラゴナイトに対する過飽和度を求め、内リンパ液の過飽和度とpH、二酸化炭素分圧、炭酸イオン濃度、Caイオン濃度との関係を解析した。その結果、過飽和度は内リンパ液のpHに比例していることを明らかにした。このことは、内リンパ液のpHの調節により耳石成長量が調節されていることを示す。現在この成果について学術論文を執筆中である。次に、ストレスとチェックリング形成との関係を明らかにする目的で、追い回しストレスが内リンパ液イオン組成に与える影響を調べた。短時間の追い回しストレスは血液の酸性化を引き起こしたが、内リンパ液のイオン組成、過飽和度には大きな変化がなかった。このことから、短時間のストレスはチェックリング形成の原因とならないものと結論できた。現在、繰り返しストレス、長時間のストレスの影響を調べている。OMP-1は、我々のグループが世界に先駆けてその構造を明らかにした、耳石の可溶性有機基質であり、その成果を学術雑誌に論文として発表した(裏面参照)。また、現在OMP-1遺伝子発現量を競合PCR法を用いて調べている。さらに、耳石有機基質の性質とその産生機構を明らかにする目的で、OMP-1の電顕的分布を調べるとともに、耳石に含まれる糖成分の解析を行った。これらの成果も学術雑誌に論文として発表した(裏面参照)。以上の成果をまとめる目的で、耳石形成機構に関する二つの総説を学術雑誌に発表した(裏面参照)。耳石に刻まれる日周輪やチェックリング読みとりの正確性を増し、さらなる情報を解読するためには、内耳内リンパ液の微量採取法、イオン組織測定法、耳石有機基質生活性測定法を確立し、それらが日周輪・チェックリング形成に果す役割を解明することが必要である。今年度はニジマス内リンパ液の微量採取法を確立し、1個体のニジマスの左右の内耳内リンパ液を用いることにより、内リンパ液の総カルシウム濃度、重炭酸イオン濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、pHを測定することができるようになった。これらから、炭酸カルシウム結晶に対する内リンパ液の飽和度の計算が1個体ごとに可能になった。また、内リンパ液中の基質タンパク濃度の測定法を現在開発中である。この方法を用いて内リンパ液イオン組成の日周変化を調べた。カルシウム濃度には有意な日周変化が確認されたが、重炭酸濃度はカルシウム濃度が高い個体では低い傾向が認められ、結果として計算される飽和度には有意な日周変化はなく、非常に安定していた。また、55kDa耳石有機基質タンパク(OMP-1)の発現の日周変化をノザンブロット法で調べたが有意な差を確認できなかった。次にニジマスを海水に移行した時の内リンパ液イオン濃度の変化を調べた。移行後5日目、海水群において有意にカルシウム濃度が高く、逆に重炭酸イオン濃度が低かった。その結果飽和度には有意な差が認められなかった。以上二つの実験の結果は、内リンパ液のカルシウム濃度と重炭酸濃度には逆相関が存在し、結果として内リンパ液の飽和度が常に一定に保たれていることを示唆する。今後各種ストレスの影響を更に比較し、内リンパ液のカルシウム・重炭酸濃度と飽和度の関係を詳細に調べ、日周輪およびチェックリング形成との関係を解明する予定である。また、OMP-1遺伝子発現量のもっと感度の高い定量法、たとえば競合PCR法などを開発する必要がある。
FIB加工を駆使した超微小試験片強度評価による先進SiC繊維の照射効果の解明

核融合炉機能構造材料として先進SiC/SiC複合材料の実現にあたり急務となるのは、知見が極めて限られている主構成要素の先進SiC繊維の光線量での照射下挙動の解明である。そのため、1)これまでの知見が限られている先進SiC繊維に対する高線量下での微細組織に及ぼす照射効果を明らかにするとともに、2)集束イオンビーム(FIB)装置を駆使した超微小試験片を用いる評価手法を開発し、これまで実施が極めて困難であった先進SiC繊維の強度特性に及ぼす照射効果を調べることを本研究の主目的に据えた。先進SiC/SiC複合材料の主構成要素をなし、近化学量論組成・高結晶性を特徴とし、かつ一般的に商業購入可能な先進SiC繊維に対し、核融合原型炉の機能材料として想定される条件で照射実験を行い、微細組織安定性を評価した。その結果、2種類の先進SiC繊維のうちHi-Nicalon Type-S繊維について、高結晶性かつ化学量論組成のSiCマトリックスとは異なり、顕著な収縮挙動を示すこと、その収縮挙動の温度依存性と線量依存性を明らかにした。また、FIB装置を用いて超微小試験片を作製し、強度評価を実施した結果、照射材において有意な強度変化が得られた。核融合炉構造材料として先進SiC/SiC複合材料の実現にあたり急務となるのは、知見が極めて限られている主構成要素の先進SiC繊維の高線量での照射下挙動の解明である。そのため、1)これまでの知見が限られている先進SiC繊維に対する高線量下での微細組織に及ぼす照射効果を明らかにするとともに、2)集束イオンビーム(FIB)装置を駆使した超微小試験片を用いる評価手法を新規に開発し、これまで実施が極めて困難であった先進SiC繊維の強度特性に及ぼす照射効果を調べることを本研究の主目的に据えた。本年度については、先進SiC/SiC複合材料の主構成要素をなし、近量論組成・高結晶性を特徴とし、かつ一般的に商業購入可能な先進SiC繊維に対し、核融合原型炉の機能材料と想定される条件で照射実験を行い、微細組織安定性を評価した。その結果、2種類の先進SiC繊維のうち、Hi-Nicalon Type-S繊維について、段差測定評価からは、同繊維がSiCマトリックスよりも小さいスウェリング挙動を示していること、また微細組織評価からは、同繊維の結晶粒界(あるいはサブ結晶粒界上)に存在する、プロセス由来の残留カーボンが粒内に移動したと思われる結果が得られたことから、同繊維が高線量照射後において、高結晶性かつ化学量論組成のSiCマトリックスと挙動が異なることが示唆される結果が得られた。微細組織評価に関しては、まず最終目標としていた高線量の照射実験が完了し、TEMによる観察を概ね完了することができた。また、FIBを用いた超微小試験片での強度試験についても具体的な評価法について検討を進めることができた。以上のことから、研究はおおむね順調に進展しているといえる。微細組織評価に関し、EELS等を含めた分析を加える。それとともに、参照材として豊富な照射データを有するモノリシックCVD-SiCの結果を参考にしながら、超微小試験片を用いた強度評価を実施することで、40-70 dpa付近でのSiC繊維の強度が担保できる「しきい線量」を特定しつつ、その劣化機構を解明する方針である。当初、強度試験治具の製作を想定していたが、精密な評価のためにはさらなる改良が必要となり完全な治具製作に至っていないこと、ならびに、予定していた海外発表を取りやめたのが主な理由である。本年度の検討で適切と判断された強度試験治具を製作するとともに、より積極的に海外発表し広く成果を発信していく、さらには照射実験を増やす方針である。
複合フラビン酵素の高次構造

1.前年度結晶が一方向は単一の回折パタ-ンが得られたが、もう一面が二重であり、所謂単結晶ではなかったため、結晶条件を吟味しよりよい結晶をうるため相当苦労したが、酵素精製を吟味し比較的よい結晶がえられた。しかし、結晶はXー線に弱く、一般に大きな分子量(サブユニット15万、合計30万)の結晶はそのような傾向を示す場合がある。これを克服するためサイクロトロンを用いた解析が必要となった。実験の進行は当初計画より遅れているが次年度中に基本的デ-タを集めたい。また、今までの酵素が牛ミルク酵素であったが、精製途中にプロテア-ゼを含むため酵素の性質が分子的に均一でない可能性があり、現在ラット由来の酵素の結晶化を試みている。2.cDNA発現系の開発は順調に進行中である。ラット酵素cDNAを大腸菌で発現させたところ酵素蛋白の大量発現はみられたものの、活性は示さずおおくは不溶性蛋白となってしまった。そこで、バキロビ-ルス・昆虫細胞の発現系を用いた結果、蛋白は可溶性となった。しかし、酵素活性は殆ど示さなかった。培養液の組成を吟味した結果、金属の取り込みに問題があることがわかった。培養液にモリブデン、鉄を加えることにより酵素活性の発現をみた。しかし、精製酵素ほどの比活性は示さず、完全活性型の約10%程度であった。その大部分はモリブドプテリンに異常があった。このことは酵素の補欠分子族のモリブデン、非ヘム鉄の形成に関係しており興味深い結果である。現在cDNAの塩基配列を一部改変した変異酵素の作成に取り掛かっている。1.一次構造はcDNAクロ-ニング及び酵素蛋白のエ-ドマン分解法により確認すること(600アミノ酸以上)により決定した。全アミノ酸は1319からなることが明らかになり、分子量は14万5千と計算された。アミノ酸配列及び決定済の重要アミノ酸の位置より各補欠分子族の位置が予想できた。非ヘム鉄はN末端に近い位置に、モリブデンは比較的後ろよりに存在しFADはその中間に存在し全体として各補欠分子族は広く一次構造上に分布し、三次構造形成が酵素機能に重要な役割であることが予想できた。また、蛋白分解酵素により、またSH基の修飾により、脱水素酵素から酸化酵素への変換がおこるが、その切断位置・修飾位置を蛋白化学的に同定した。得られたcDNAをベクタ-に組み込み大腸菌の系で発現実験を行った。ウエスタンブロッテイングにより発現蛋白を同定したところ蛋白の発現は見られたが、相当の蛋白分解による崩壊が見られた。現在システムを検討中である。2.既に得られた結晶につき回折実験を行い次の結果を得た。(1)一つの軸については明らかな回折現象が観察され分解能は約3オングトロ-ムであった。(2)もう一つの軸については回折現象が見られたが、それぞれのスポットが二重になり、結晶構造が所謂twinの状態であった。その原因は蛋白そのものがミルクから精製し、パンクレアチン処理により蛋白分解による不均一なためと考えられた。蛋白質精製をパンクレアチン処理しない方法で精製し結晶化を試みている。