hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉄二核錯体における配位子効果と集積化効果によるスピンクロスオーバー挙動の精密制御

さらに、五核ヘリケートのCVを測定したところ、多段階の酸化還元波を示した。X線結晶構造解析およびメスバウアースペクトルから、ヘリケートは、上下のトリス体ユニット([Fe^<II>(bpypz)_3]^-)のFe(II)とFe_3O^<4+>コア中に環境の異なる二種類のFe(II)を有することが明らかとなった。
エックス線による突然変異・発癌・加齢の分子機構

1.すでに全塩基配列が分かっている大腸菌のCAMPリセプター遺伝子を持つプラスミドにエックス線を照射して突然変異を起こさせ,どのような塩基配列の変化が突然変異の原因となっているかを調べた.エックス線照射したプラスミドで大腸菌を形質転換させ,乳糖を分解する能力を失った突然変異を選択した. 84個の突然変異について,遺伝子の全長の約3分の1に相当する5側から230塩基対について,それぞれの塩基配列をサンガー法で決定した.検出された変化は16個で,塩基置換型が8個とフレームシフト型が8個であった.変化が検出されなかった残りの約70個の突然変異に関しては,遺伝子の残りの3分の2の所に変化が生じていると考えられるので,現在解析中である.まだ例数は少ないが,塩基置換型突然変異はすべてGC塩基対が標的になっていることは大変興味深い.2.マウスの胎児から樹立した近2倍体細胞株をエックス線で照射し,細胞の癌化(トランスフォーメーション)と染色体異常の関係を調べた.生じたトランスフォーマントを24個分離し,染色体を観察すると,全体の70%に相当する17個に共通して第13番染色体のC2から末端領域を含む欠失が認められた.次にヌードマウスに移植した場合の悪性度は, 3個のクローンが強い造腫瘍性を示した.これらのクローンは染色体の部分的重複を持っていた.以上の結果から,第13番染色体の一部分の欠失がトランスフォーマントの形成に重要であり,更に悪性化するためには染色体重複などの二次的な変化が必要であることが分った.3.個体の加齢に伴ってDNAにどのような変化が生じているかを検討した.癌遺伝子の一つであるc-mycのメチル化の程度は,肝臓ではマウスの加齢と共に増加していることが分った.本研究は、エックス線の生体に及ぼす影響のうちで特に重要であると考えられる突然変異の誘発、発癌および加令(老化)について、これらの原因を分子レベルで解析しようとするものである。したがって研究を実施する大前提としてエックス線照射装置が必須である。残念ながら、当放射線生物研究センターはエックス線装置を持たなかったので、本研究によって生物照射用装置の購入を申請した。幸いにして昭和60年10月末に昭和60年度科学研究費補助金交付の第二次内定を受けることができたので、直ちにメーカー側と打合せを行ない、昭和61年2月初めにエックス線照射装置を設置することができた。今年度は、このエックス線発生装置について、種々の実験材料(プラスミドDNA,培養細胞,マウスなど)に最も適した照射条件を設定するために、エックス線管から照射台までの距離をさまざまに変えて線量率の測定を行い、それぞれの実験目的にかなった照射条件を決定した。この条件に従って、昭和61年度から本格的に生物材料を用いた実験を開始する。ただ、本研究課題に関して、生物材料を用いた研究を全くしなかった訳ではなく、他部局の好意でエックス線装置を使用させてもらって以下のような結果を得ている。マウス胎児から樹立した培養細胞株にエックス線を照射すると、線量に応じて癌化したトランスホーマントのフォーカスが生じた。フォーカスに由来するクローンの染色体をGバンド法で調べると、6番染色体の末端部にタンデムにくり返すバンドが見られた。これらの染色体異常と細胞の癌化との関係について、今後更に研究を進める予定である。1.すでに全塩基配列が分かっている大腸菌のCAMPリセプター遺伝子を持つプラスミドにエックス線を照射して突然変異を起こさせ,どのような塩基配列の変化が突然変異の原因となっているかを調べた.エックス線照射したプラスミドで大腸菌を形質転換させ,乳糖を分解する能力を失った突然変異を選択した. 84個の突然変異について,遺伝子の全長の約3分の1に相当する5側から230塩基対について,それぞれの塩基配列をサンガー法で決定した.検出された変化は16個で,塩基置換型が8個とフレームシフト型が8個であった.変化が検出されなかった残りの約70個の突然変異に関しては,遺伝子の残りの3分の2の所に変化が生じていると考えられるので,現在解析中である.まだ例数は少ないが,塩基置換型突然変異はすべてGC塩基対が標的になっていることは大変興味深い.2.マウスの胎児から樹立した近2倍体細胞株をエックス線で照射し,細胞の癌化(トランスフォーメーション)と染色体異常の関係を調べた.生じたトランスフォーマントを24個分離し,染色体を観察すると,全体の70%に相当する17個に共通して第13番染色体のC2から末端領域を含む欠失が認められた.次にヌードマウスに移植した場合の悪性度は, 3個のクローンが強い造腫瘍性を示した.これらのクローンは染色体の部分的重複を持っていた.以上の結果から,第13番染色体の一部分の欠失がトランスフォーマントの形成に重要であり,更に悪性化するためには染色体重複などの二次的な変化が必要であることが分った.3.個体の加齢に伴ってDNAにどのような変化が生じているかを検討した.癌遺伝子の一つであるc-mycのメチル化の程度は,肝臓ではマウスの加齢と共に増加していることが分った.エックス線が個体や細胞を殺したり、突然変異を誘発したり、実験動物に癌を発生したりすることはよく知られている。また、エックス線は動物の老化を促進させるのではないかとも考えられている。これらのエックス線,つまり電離放射線の作用に関しては、現象そのものはよく知られているがそれらがなぜ生じるかという分子レベルでの機構については、ほとんど何も分っていない。

本研究はこれらの分子機構を解明するためのアプローチの一つとして組織されたもので、本年度は以下の結果を得ることができた。1.全塩基配列がすでに決定されている大腸菌のサイクリックAMPリセプター遺伝子を含んだプラスミドのDNAをエックス線で照射して、生じた突然変異がいかなる塩基配列の変化によるものかを検討した。照射したDNAを大腸菌にトランスフェクションすることで形質転換させ、乳糖を分解する能力で突然変異を判定した。突然変異体からプラスミドを回収して遺伝子部分を切出し、その全塩基配列をシーケンスゲル上で決定する。すでに100個の突然変異体を集め、現在それらのDNA塩基配列を分折中であり本年秋頃には全ての解析を終える予定である。2.マウス胎児から樹立した近2倍体細胞株をエックス線で照射し、細胞の癌化(トランスフォーメーション)と染色体異常との関係を調べた。X線照射によって得られたトランスフォーマントの染色体を調べると、(a)染色体の部分的重複を持つもの、(b)第13番染色体の一部または全部が欠失したもの、が全体の4分の3を占めていた。ヌードマウスに移植した場合の悪性度はaの方が強く、細胞の癌化と染色体異常との関連を示唆した。3.ハムスター細胞のエックス線による潜在性致死損傷からの回復について、高張塩溶液中での回復の解析によって、この回復には細胞膜が深く関与していることが明らかとなった。
ナノ・マイクロ系への応用を目指したエネルギー局在現象の制御に関する基礎的研究

本研究では,電磁機械系を用い,空間局在モードの制御に関する実験を行った.電磁機械系は,振動子である板バネと非線形性復元力を生じさせる永久磁石・電磁石からなり,全体で,1次元の非線形結合振動子を構成する.この電磁機械系において,空間局在モードを実験的に励起することに成功し,さらに,局所的なパラメータ調整によって空間局在モードの位置を操作することに成功した.また,数値計算において,系パラメータを時間周期的に変動させることにより,空間局在モードが不安定化し,移動することを見いだした.これにより,微小デバイスにおける空間局在モードの制御の実現可能が示唆された.本研究では,電磁機械系を用い,空間局在モードの制御に関する実験を行った.電磁機械系は,振動子である板バネと非線形性復元力を生じさせる永久磁石・電磁石からなり,全体で,1次元の非線形結合振動子を構成する.この電磁機械系において,空間局在モードを実験的に励起することに成功し,さらに,局所的なパラメータ調整によって空間局在モードの位置を操作することに成功した.また,数値計算において,系パラメータを時間周期的に変動させることにより,空間局在モードが不安定化し,移動することを見いだした.これにより,微小デバイスにおける空間局在モードの制御の実現可能が示唆された.本研究は,ナノ・マイクロ系におけるエネルギー局在現象(空間局在モード)の制御を目標としたものである.平成22年度は,空間局在モードの実験的な検討を目的とした電磁機械系の製作および基礎実験を行った.研究者の製作した従来の電磁機械系は,非線形振動子である板バネが弾性棒で結合されたものであった.本研究では,結合に非線形性を有する電磁機械系への改良を試みた.具体的には以下のようなことを行った.(1)従来機械系におけるパラメータ評価方法の改良および実証.(2)新たな電磁機械系の設計および数理モデル化.(3)数値計算による空間局在モードの存在性に関する検討.(4)計測回路などの周辺電子回路の設計・製作.(5)単一振動子を用いた非線形結合に関する基礎実験.(6)非線形結合力を有する電磁機械系の製作.上記実験系の製作に加え,実験系から導かれる運動方程式の理論的な解析にも取り組んだ.これは,空間局在モードの存在するパラメータ領域を予測するためである.簡単のため,減衰や外部励振などを除いた2自由度保存系を考えた.解析には平均化法などの種々の近似を用いた.結果として,2自由度保存系における周期解の分岐集合を求めることに成功した.また,8自由度保存系における空間局在モードの分岐集合へ拡張できることを確認した.本解析により,実験系の設計が容易になり,さらに他の系における空間局在モード存在パラメータ領域の推定にも応用できると考えられる.本研究は,ナノ・マイクロ系におけるエネルギー局在現象(空間局在モード)の制御を目標としたものである.平成23年度の研究成果を以下に示す.1.電磁機械系における空間局在モードの励起前年度に構築した電磁機械系のパラメータ調整を精密に行い,空間局在モードの励起を試みた.結果として,予想された波形の空間局在モードを実際に観察することに成功した.実験では,各振動子の時間波形を取得することができるため,定常的な空間局在モードや過渡的な現象について,各振動子間の位相差や振幅変化などを詳細に計測することが出来る.この計測機能により,空間局在モードの励起・移動・崩壊のダイナミクスを数値実験と比較できるようになった.2.電磁機械系のモデル化と空間局在モードの分岐解析電磁機械系をモデル化し,コンピュータを用いた数値実験を行った.数値実験では,どのようにエネルギーの局在した空間局在モードが存在するか,また,そのモードの安定性などを検討した.結果として,電磁機械系の結合力やエネルギーによる解の分岐構造を明らかにし,空間局在モードを制御するための実験系構築に設計の指針を与えた.3.空間局在モードの不安定化空間局在モードの安定性交替については,系のパラメータを時間周期的に変調することで空間局在モードの安定性が失われることを発見した.詳細な数値実験により,空間局在モードの不安定化はパラメトリック共振によるものであることを明らかにした.パラメトリック共振では,一般的に比較的低い周波数でパラメータを変調することで引き起こすことが可能である.このことは,制御回路として高い性能を要求されないことを意味し,実現容易性が高まることを示唆している.本研究は,ナノ・マイクロ系におけるエネルギー局在現象(空間局在モード)の制御を目標としたものである.平成24年度の研究成果を以下に示す.(1)パラメトリック共鳴現象による空間局在モードの不安定化:前年度に明らかにした空間局在モードのパラメトリック共鳴現象による不安定化について,さらに詳しく検討した.結果,系の非線形性の強さによっては,パラメトリック共鳴が生じ不安定化された空間局在モードが系全体を移動することを明らかにした.(2)パラメータ勾配を用いた空間局在モードのフィードバック制御:パラメトリック共鳴現象による空間局在モードの不安定化メカニズムを基に,空間局在モードの制御に関する数値検討を行った.結果,系のパラメータに空間的な勾配を生じさせ,その勾配の大きさを空間局在モードの位置と目標位置との差で変化させることで,空間局在モードの中心位置に関するフィードバック制御を達成した.ここで,パラメータ勾配とは,例えば振動子番号の増加と共に線形復元力係数が増加,または減少するようなものを言う.(3)マイクロカンチレバー

アレイを想定した観測系の構築:微小なカンチレバーの振動を観察するためには,光てこ法と呼ばれる手法がよく用いられる.光てこ法にはレーザを用いるため,そのための光学系が必要となる.また,通常,単一のカンチレバーに対する測定法を複数のカンチレバーの振動を測定できるよう拡張する必要がある.このための準備として,レーザを用いたマイクロカンチレバーの振動検出系を構築し,カンチレバーの振動を電気的信号で検出できることを確認した.当初の目的である空間局在モードの制御について,安定性交替の実証は未達成であるが,パラメトリツク共振による空間局在モードの不安定化の発見により,制御則の実現が可能となった.また,系パラメータを変調することによるフィードバック制御も数値的には成功している.また,ナノ・マイクロ系への検討は予定よりも早く進んでいる.24年度が最終年度であるため、記入しない。安定性交替の実証には,電磁機械系のさらなるパラメータ調整が必要である.そのための数値実験は今後も継続する.一方で,パラメトリック共振による空間局在モードの不安定化については出来るだけ早急な実現を目指す.空間局在モードの制御則については,数値的な実験を重ね,実装へ向けた検討を行う.また,実験による実証を目指す.ナノ・マイクロ系における適用可能性については,既に設計・製作済みのマイクロカンチレバーアレイについてモデル化や測定系構築などを行っていく.24年度が最終年度であるため、記入しない。
巡礼地ダーグ湖の〈聖パトリックの煉獄〉をめぐる文学の研究

<聖パトリックの煉獄>への贖罪巡礼が毎夏実施されるダーグ湖は、強烈な磁力をもった聖地として、アイルランド人の深層に刻みつけられている。本研究は、ダーグ湖の贖罪巡礼の800年以上におよぶ時間軸を意識しながら、主に19世紀前半から1980年代にかけて書かれたダーグ湖をめぐる諸作品を通して、アイルランド社会がいかに変遷したか分析を試みた。本研究は、以下の3つの観点から進められた。(1)ダーグ湖の贖罪巡礼をめぐる文学の文献研究。カールトンの『ダーグ湖巡礼』(1843)、ともに『ダーグ湖』と題された、カバナーとデブリンの1940年代に書かれたふたつの詩、ヒーニーの連作詩「ステーション・アイランド」(1984)を主に扱い、個人と国家のアイデンティティの問題、芸術的創造性の根源に関する葛藤の問題などについて分析し、ダーグ湖の巡礼が自己と社会を再考する上で、いかに大きな役割を果たしてきたかについて検討した。(2)今日のダーグ湖における賦罪巡礼の社会学的考察。ヒーニーの作品が書かれて20年が経過したが、その間、アイルランド社会がどのように変遷したか、分析検討した。対象としたのは、3日間にわたる巡礼の実体験と現地でのインタビュー(平成14年実施)、新聞記事、大衆文学(旅行記など)に描かれたダーグ湖巡礼などである。カトリック離れがさかんに論じられる現代アイルランド社会で、ダーグ湖への巡礼者の数が減っていない背景には、純粋な宗教体験とは別の、<ツーリズム>の要素があるのではないか、という仮説が導かれた。(3)日本における巡礼(特に四国八十八カ所遍路)、巡礼をめぐる文学との比較研究。ダーグ湖にみられるアイルランド贖罪巡礼の理解を深めるために、海外共同研究者のマッカートニー博士と四国遍路(の一部)をこ体験し、その体験が文学作品にどのようにあらわれているか(いないか)、共同討議をおこなった。1)本年度の研究は、Seamus Heaneyの連作詩、Station Islandのテクスト分析を中心に進められた。[Station Island]が執筆、出版されたのは1983年であるが、この連作詩に、当時の北アイルランド紛争に代表されるような社会的状況、教会の抑圧という形であらわれる宗教的背景がどのような影響をおよぼしているか、分析検討をおこなった。また、この作品には、ダンテの『神曲』からの影響が大きく、ダーグ湖の贖罪巡礼に赴くペルソナとしての詩人(ヒーニー)と、地獄におりていく詩人ダンテとは重ねられ、作品に大きな枠組みを与えている。さらに、次々に召喚される亡霊が体現するアイルランドの歴史的、文学的伝統が、ダンテの枠組みとは別の指標を与えていて、ヒーニー自身の個人的自我が、ヨーロッパ的文脈とアイルランド的文脈の相剋という緊張のうちとらえられることを検討した。2)平成14年8月に、アルスター大学のDr. Anne McCartneyとともに、ダーグ湖で3日間の現地調査を行った。ヒーニーが作品を執筆した1983年から20年が経過した今日も尚、多くの巡礼者を惹きつける3日間の贖罪巡礼を経験することで、ヒーニーの1980年代を中心に、ダンテの時代から現代に至るまでのパースペクティブを得ることができた。3)平成15年3月には、さらに、地理的な広がり、文化的比較を可能にするために、四国遍路のフィールドワークを実施する予定。(Dr. McCartneyとの共同調査)

1.昨年はシェイマス・ヒーニーの連作詩'Station Island' (1984)の分析を中心に行ったが、本年度は、ヒーニー以前に書かれたダーグ湖巡礼に関する文学作品の分析をおこなった。対象となった作品は、年代順に並べると、William Carltonの散文'Lough Derg Pilgrim' (1829) (Traits and stories of the Irish peasantryに収緑)、1940年代に書かれたPatrick KavanaghとDenis Devlinによる同名の詩'Lough Derg'2篇、1950年代に書かれたSean O'Faolainの短篇'Lovers of the Lake'である。また、ベストセラーとなった現代の旅行記McCarthy's Bar : A Journey of Discovery in Ireland (2001)なども視野に入れ、アイルランド社会の変化を概観した。一連の作品を俯瞰したとき、カールトン以降、ダーグ湖がいかにアイルランドの近現代文学のトポスとしての磁力を持ち続けてきたか、また、かの地における巡礼が、自己と社会を再考する上で大きな役割を果たしてきたかについて、比較検討をおこなった。2.Dr.Anne McCartneyと、日本とアイルランドとの巡礼の有り様を比較するための資料として、高群逸枝の『娘巡礼記』の一部を英訳した。平成15年8月に、三神はアルスター大学を訪問し、討論を進めた。3.アイルランド詩人、ポール・ダーカン氏、早稲田大学名誉教授虎岩正純氏を講師に招き、「ダーグ湖をめぐる文学」に関する研究会を行った。ダーカン氏のカヴァナーとデヴリンの詩の分析、虎岩氏の平成15年夏のダーグ湖での贖罪巡礼の報告がなされ、意見の交換が行われた。1)本年度は、研究の主たる対象を再びHeaneyの`Station Island'に戻し、平成14年度に検討したアイルランドの現代史と密接に関わるアイルランドの社会的文脈、ダンテの影響にあるヨーロッパ的文脈に加え、この連作詩の宗教的文脈について、<巡礼>という構造の中で再考察した。その際、文化人類学者のヴィクター・ターナーの「リミナリティ(境界性)」と「コミュニタス(原共同体)」という概念の枠組みを当てはめることで、ヒーニー描く詩の語り手が体験するダーグ湖の贖罪巡礼が、より一層明瞭なものとなった。ターナーによれば、「巡礼圏は日常生活の周辺部に形成され、その限りにおいて安定した社会秩序に対して反社会秩序を象徴する。...しかし、この巡礼圏は外在的な社会的勢力や権力によって制度化されるとともに商業資本によって観光化され、ふたたび既成の社会秩序のなかに組み入れられて「構造」化する」とあるが、ヒーニーの場合、贖罪巡礼を経て現世に戻った語り手は、<詩作>という活動を通して、その体験を詩人個人の秩序の中に組み入れ構造化していると考えられる。また、四国遍路に関するさまざまな言説との比較検討をおこなった。2)平成17年3月に、アルスター大学のDr.Anne McCartneyを訪問し、アイルランドと日本の巡礼に関する討論をおこなった。また`Literature & Religion : Comparative Study betweenIreland & Japan'というタイトルで、修士課程の学生を対象に上記の内容で講演を行った。(2005.3.3.)NHK製作によるテレビドラマ『花へんろ』、映画『旅の重さ』などの映像を示し、昭和期における四国遍路の有り様を理解してもらう手がかりとした。
分子分光法による薬物の膜への作用機構の研究

代表的な三環系向精神薬であるChlorpromazine(CPZ)が、生体内で細胞に入り込んでいくメカニズムを詳しく調べた。CPZは、細胞膜との疎水的相互作用を原動力にして、膜中に入り込んでいくことがこれまで示唆されてきた。これを、このたび分光学的に初めて裏付けるため、モデル膜としてL-α-dipalmitoylphosphatidylcholine(DPPC)展開単分子膜を用い、水槽側からCPZを作用させ、CPZの膜への侵入の程度を、まず界面化学的に調べた。その結果、水槽側のCPZの濃度と、膜の薬物侵入による膨張の程度との定量的な関係が求められた。次いで、CPZが侵入した展開単分子膜をLamgmuir-Blodgett(LB)膜として、水晶板上に累積し、非偏光垂直入射の紫外吸収スペクトルを測定した。得られたスペクトルが、水溶液が示すスペクトルとは大きく異なる相対バンド強度を示したことから、CPZが薄膜中で配向して存在していることが示唆された。この分子配向の程度を定量的に求めるため、既に研究代表者が開発している、一軸異方性薄膜の光学理論を用いて、スペクトルを解析した。その際、CPZの長軸と単軸とにそれれ平行な二つの遷移モーメントの吸光係数を、水溶液中でのバルクのモル吸光係数から算出する新たな理論式を導出した。得られた複素屈折率からスペクトルを解析した結果、CPZの分子単軸方向の遷移モーメントは、膜法線方向からおよそ18度の傾きで一軸配向している様子が明らかとなった。これは、既に報告されているDPPCLB膜の膜分子主軸の傾きにほぼ等しく、CPZが膜に沿って侵入していく様子を初めて分光的に裏付けることができ、Langmuir誌に発表できた。今後は、脂質膜と糖との結合メカニズムも詳しく調べる予定で、現在準備を進めている。また、併せて、薄膜の二軸配向解析システムの構築も、展望あるテーマとして狙っていきたい。
教科教育・教科専門教員の連携体制確立をめざした社会科地域学習「津軽」の内容開発

最終年は、内容開発と附属学校を含めた共同研究体制確立の点検をした。前者の、内容開発では、津軽に関連する「白神山地」、「津軽平野・岩木川およびその開発」、「三内丸山」、「蝦夷(エミシ・エゾ)の歴史」、「北の国際貿易港十三湊」、「弘前城下町の形成と発展」をそれぞれ内容開発した。鰺ヶ沢・深浦の巡検調査を実施し、それらの討議をもとに、内容開発の素材を附属小中学校教員が開発したが、その具体的な授業開発、検証授業は十分ではなかった。第二の研究体制確立では、類型・理念型の検討、共同研究下における参与観察のまとめである。教科教育教員が考える内容開発と教科専門教員が考える内容開発に関する考え方や信念に関するインタビューでは、調査結果・発表結果を忠実に伝達することを是とし、その構成には否定的な考え方を持ち、教科教育教員は、内容をもとに、教育的観点から再構成すべきことを是とする信念を持つ。これらは明らかになったが、その溝を埋めることは出来なかった。附属小中学校の教員が内容開発を具体化する中で、教科専門教員の内容提示に対する、教材化、教具化の視点からの考え方・信念の表明や討論過程でも、同様の結果が導かれ、共同開発の難しさを再び確認するに至った。初年度は、内容開発と同時に、共同研究体制の構築およびその参与観察を行った。交付決定が年度後半になったが、研究体制構築と各人の内容開発は実施されていた。概要は、内容開発では、津軽に関連する「白神山地」、「津軽平野・岩木川およびその開発」、「三内丸山」、「蝦夷(エミシ・エゾ)の歴史」、「北の国際貿易港十三湊」、「弘前城下町の形成と発展」であり、研究体制構築では、類型・理念型の検討、共同研究下における参与観察である。前者は、全員のフィールド調査により、地理的調査とデータ収集(ビデオ・デジタルカメラ記録)、その解析、文献・絵図資料の収集と分析、考古学的調査データの収集と分析を行った。これらをもとに、附属学校の教員と共に内容開発を行うのは、次年度の課題となった。その間の、研究体制および共同開発に対して各研究者の参与観察をした。教科教育教員が考える内容開発と教科専門教員が考える内容開発に関する考え方や信念に関するデータが収集された(教科専門教員は、内容研究そのものを基本とし、その加工・構成には必ずしも関心がない。教科教育教員は、内容をもとに、目標・方法、すなわちどのような子どもをどのように育成するのかに関心が集約される)が、分析システムが、交付の関係で12月以降となったため、分析は次年度の課題となった。なお、内容開発を具体化する上で、附属学校との共同体制確立ももう一つの課題となった。交付二年目は、内容開発と、共同研究体制の対象化である。第一の、内容開発では、津軽に関連する「白神山地」、「津軽平野・岩木川およびその開発」、「三内丸山」、「蝦夷(エミシ・エゾ)の歴史」、「北の国際貿易港十三湊」、「弘前城下町の形成と発展」がテーマであった。しかし、多岐に亘るテーマを「日本海交易」の観点から見直し、津軽のとらえ直しを構成の基盤にした。そのため、鰺ヶ沢・深浦の巡検調査を実施し、それらの討議をもとに、内容開発の素材を附属小中学校教員に向けて、レクチャーした。来年度に、その具体的な授業開発、検証授業が行われる。第二の研究体制対象化では、類型・理念型の検討、共同研究下における参与観察の検討である。先に示した、フィールド調査では、地理的調査とデータ収集(ビデオ・デジタルカメラ記録)、その解析、文献・絵図資料の収集と分析、考古学的調査データの収集と分析から得られた成果を共有化した。その間、教科教育教員が考える内容開発と教科専門教員が考える内容開発に関する考え方や信念に関するインタビューを試みた。教科専門教員は、調査結果・発表結果を忠実に伝達することを是とし、その構成には否定的な考え方を持っ。教科教育教員は、内容をもとに、教育的観点から再構成すべきことを是とする信念を持つ。来年度、これらの信念は、附属小中学校の教員が内容開発を具体化する上で、再び問われることになる。すなわち、教科専門教員の内容提示に対する、教材化、教具化の視点からの考え方・信念の表明や討論過程の参与観察であり、それによって明らかになる両者のパーセプションギャップの実相である。

附属小中学校の教員が内容開発を具体化する中で、教科専門教員の内容提示に対する、教材化、教具化の視点からの考え方・信念の表明や討論過程でも、同様の結果が導かれ、共同開発の難しさを再び確認するに至った。
若齢期における食育および体育のレガシー効果と肥満および運動記憶因子の探索

本研究では若齢期の食および運動習慣が成熟期の骨格筋・肝臓・脂肪組織の遺伝子発現に及ぼすレガシー(遺産,長期的)効果について,マウスを用いた検討を行った.本研究の結果から,若齢期の高脂肪食摂取や自発走運動の経験は,たとえ成熟期に同様の食・生活環境および体重であっても,骨格筋・肝臓・脂肪組織の遺伝子発現にレガシー効果を生じる可能性が示唆された.また一部の遺伝子発現においては,自発走運動経験によるレガシー効果にプロモーター領域のDNAメチル化によるエピジェネティックな機序が関与している可能性が示唆された.本研究課題では,肥満・運動の経験により長期に亘って体重(体脂肪量)を変化させるレガシー(遺産)因子を解明することを目的として,検討1若齢期の肥満・運動経験により変化する遺伝子の網羅的およびエピジェネティクス的解析,検討2健康・長寿を導く若齢期・成熟期の生活環境(食・運動・豊かな環境)の探索,の2点について検討を行う.平成24および25年度は検討1の「若齢期の肥満・運動経験によって発現が変化する因子の網羅的解析」を実施した.まずプロトコール1として,若齢期の高脂肪食摂取による肥満モデル動物の作成とサンプリングを行った.3週齢の雄性ICRマウス(32匹)を対象に,普通食にて集合ケージを用いた1週間の予備飼育を行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の4つに群分けして実施した.1)高脂肪食群(n=8),2)高脂肪食→普通食群(n=8),3)普通食群(n=8),4)普通食→高脂肪食群(n=8).またプロトコール2として,若齢期の回転ケージを用いた自発走運動による運動モデル動物の作成とサンプリングを行った.3週齢の雄性ICRマウス(8匹)をプロトコール1と同様に1週間の予備飼育を行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の2つに群分けして実施した.1)運動群(n=8),2)運動→普通食群(n=8).平成26年度は検討2のプロトコール4健康・長寿を達成する若齢期・成熟期・老齢期の生活環境(食・運動・豊かな環境)の探索を実施する.若齢期における肥満,運動,豊かな環境(EE)がその後の脂肪組織における遺伝子・蛋白発現,エピジェネティクス,糖・脂質代謝および寿命に与える影響について検討を行う.尚,各群4匹を対象に脂肪組織中の遺伝子発現,糖・脂質代謝を縦断的に評価する為,24,44,64週齢時に気化麻酔下にて採血と脂肪組織のバイオプシーを行う.本研究では若齢期の食および運動習慣が成熟期の骨格筋・肝臓・脂肪組織の遺伝子発現に及ぼすレガシー(遺産,長期的)効果について,マウスを用いた検討を行った.本研究の結果から,若齢期の高脂肪食摂取や自発走運動の経験は,たとえ成熟期に同様の食・生活環境および体重であっても,骨格筋・肝臓・脂肪組織の遺伝子発現にレガシー効果を生じる可能性が示唆された.また一部の遺伝子発現においては,自発走運動経験によるレガシー効果にプロモーター領域のDNAメチル化によるエピジェネティックな機序が関与している可能性が示唆された.本研究課題では,肥満・運動経験により長期に亘って体重(体脂肪量)を変化させるレガシー(遺産)因子を解明することを目的として,検討1若齢期の肥満・運動経験により変化する遺伝子の網羅的およびエピジェネティクス的解析,検討2健康・長寿を導く若齢期・成熟期の生活環境(食・運動・豊かな環境)の探索,の2点について検討を行う.平成24年度は検討1の「若齢期の肥満・運動経験によって発現が変化する因子の網羅的解析」を実施した.まずプロトコール1として,若齢期の高脂肪食摂取による肥満モデル動物の作成とサンプリングを行った.3週齢の雄性ICRマウス(32匹)を対象に,普通食にて集合ケージを用いた1週間の予備飼育を行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の4つに群分けした.1)高脂肪食群(n=8):4週齢より高脂肪食を与えて44週齢時にサンプリングを行った.2)高脂肪食→普通食群(n=8):4週齢より高脂肪食を与えて24週齢まで飼育した.24週齢時に高脂肪食を普通食へ変更し,44週齢まで飼育してサンプリングを行った.3)普通食群(n=8):4週齢より普通食を与えて44週齢時にサンプリングを行った.4)普通食→高脂肪食群(n=8):4週齢より普通食を与えて24週齢まで飼育した.24週齢時に普通食を高脂肪食へ変更し,44週齢まで飼育してサンプリングを行った.またプロトコール2として,若齢期の回転ケージを用いた自発走運動による運動モデル動物の作成とサンプリングを行った.3週齢の雄性ICRマウス(8匹)をプロトコール1と同様に1週間の予備飼育を行った.4週齢より回転ホイール付の個別ケージを用いて24週齢まで飼育する(運動→普通食群).24週齢時に回転ホイールにアクセスできないように敷居扉を閉鎖して運動を中止し,44週齢まで飼育してサンプリングを行った.本研究課題では,若齢期の肥満・運動の経験により長期に亘って体重(体脂肪量)を変化させるレガシー(遺産)因子を解明することを目的として検討を行った.

平成24年度および25年度には,3週齢の雄性ICRマウスを対象に1週間の予備飼育を実施し,4週齢時に平均体重が一致するように以下の5つに群分けした.1)普通食(ND-ND)群:4週齢より普通食を与えて24週齢時にサンプリングを行った.2)高脂肪食(QF-QF)群:4週齢より高脂肪食を与えて24週齢時にサンプリングを行った.3)高脂肪食→普通食(QF-ND)群:4週齢より高脂肪食を与えて14週齢まで飼育し,14週齢時に高脂肪食を普通食へ変更して24週齢時にサンプリングを行った.4)運動(EX-EX)群:4週齢より回転ホイール付のケージを用いて24週齢まで自発運動が可能な環境で飼育した.餌は普通食とした.5)運動→普通食(EX-ND)群:4週齢より回転ホイール付ケージを用いて14週齢まで飼育し,14週齢時に運動を中止して24週齢時にサンプリングを行った.餌は普通食とした.平成26年度は,-80°Cで凍結保存した副睾丸周囲脂肪,肝臓,下肢骨格筋組織からTotal RNAを抽出し,マイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現データの解析を実施した.約3万個の遺伝子を対象に解析を行った結果,QF-ND群およびEX-ND群はND-ND群と同様の体重であり,10週間に亘って同様の食・生活環境であったにも拘わらず,両者ともND-ND群とは発現の大きく異なる遺伝子を多数有していた.以上の結果から,4週齢から14週齢までの若齢期の食・生活環境が24週齢時の脂肪,肝臓,骨格筋組織における遺伝子発現に対して長期に亘って影響を及ぼし,レガシー効果を生じる可能性が示唆された.生理学,運動生理学,病態生理学当初の予定通り,平成24年度は検討1のプロトコール1として,若齢期の高脂肪食摂取による肥満モデル動物の作成とサンプリングを行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の4つに群分けして実施した.1)高脂肪食群(n=4),2)高脂肪食→普通食群(n=4),3)普通食群(n=4),4)普通食→高脂肪食群(n=4).またプロトコール2として,若齢期の回転ケージを用いた自発走運動による運動モデル動物の作成とサンプリングを行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の2つに群分けして実施した.1)運動群(n=4),2)運動→普通食群(n=4).尚,平成25年度はサンプル数を増やす為に,平成24年度に行ったプロトコール1および2と同じ実験を第二クールとして実施した(各群n=4).平成25年度に実施予定であった副睾丸周囲脂肪組織の網羅的遺伝子発現データ解析は平成26年度に実施する.この変更は当初より予想されたことであり,平成26年度に予定通りAffymetrix社のGeneChip Mouse Gene 1.0 ST Arrayを用いた網羅的遺伝子発現データの解析を実施することから,研究計画はおおむね順調に進展していると言える.当初の予定どおり,平成24年度は検討1の「若齢期の肥満・運動経験によって発現が変化する因子の網羅的解析」を実施した.まずプロトコール1として,若齢期の高脂肪食摂取による肥満モデル動物の作成とサンプリングを行った.3週齢の雄性ICRマウスを対象に,普通食にて集合ケージを用いた1週間の予備飼育を行った.4週齢時に個別ケージに移動させ,平均体重が一致するように以下の4つに群分けした.1)高脂肪食群:4週齢より高脂肪食を与えて44週齢時にサンプリングを行った.2)高脂肪食→普通食群:4週齢より高脂肪食を与えて24週齢まで飼育した.24週齢時に高脂肪食を普通食へ変更し,44週齢まで飼育してサンプリングを行った.
血小板内ｍｉｃｒｏＲＮＡ発現の違いが心肺補助循環時の血小板機能低下へ及ぼす影響

心肺補助装置使用時に、血小板機能低下のため止血凝固能傷害に悩まされる。我々は血小機能低下の原因となる血小板内Bax上昇とGlycoprotein Ib低下に個人差があり、その原因として血小板内microRNA発現の程度と相関があるとの仮説の元、実験を行った。In Vitro系での実験結果を元に心臓手術予定患者を対象に臨床研究を施行した。周術期に採血した血液より血小板のRNAを生成後microRNAの発現を定量解析して、心肺補助装置使用による血小板機能低下、血小板数低下及び周術期の出血量、輸血量と相関関係を調べた。Baxを標的遺伝子とするmiR-886-5pがこれらの現象と強い相関関係があった。我々は最近の研究結果により、心臓手術患者における人工心肺離脱直後にトロンビン刺激に対する血小板不応性現象の原因として、血小板活性化(Hyperreactivity)に伴う血小板細胞内p38MAPKリン酸化、Bax、Bakの発現亢進と血小板膜表面GPIb, PAR-1の発現低下にあると考えた。つまり、血小板活性化(Hyperreactivity)後の血小板細胞死の過程が、周術期の血小板機能低下と血小板数減少に関与することが示唆された。最近の報告によると血小板作動薬に対する血小板の反応性の違いに、血小板内のmicro RNA(miRNA)発現の違いが関与していることが示唆されている。本年度においては、人工心肺下心臓手術患者の周術期の血小板内のmiR-886-5p変化と、血小板内Baxの変化を観察した。実験結果として、血小板内のmiR-886-5pが上昇している患者の方が、血小板内Baxの発現が抑制されている事が分かった。次に、細胞培養系の実験で、洗浄血小板溶液を作成し、miR-886-5pを遺伝子導入すると、血小板内Baxの発現が抑制される事が分かった。以上の結果から、周術期の血小板内のmiR-886-5p変化と、血小板内Baxの変化が負の相関関係を示していることが分かった。また、これらの実験経過から血小板から放出されるmicroRNAの網羅的解析を行うため、次世代シーケンサーを共同購入した。これらで得た実験結果は、今後学会等で報告する予定にしている。血小板刺激薬に対する血小板反応性の個体差に関しては以前より報告されており、動脈硬化症、脳梗塞、末梢動脈性疾患発症の危険因子として知られているが、その機序の詳細はよく知られていなかった。その原因として、血小板に遺伝子改変等の分子生物学的手技の応用が困難であるためであった。本年度は、健常人から採取した血小板のRNAよりmiRNA (miR-96, miR-886-5p, miR-128が候補のmiRNA)の発現を定量し、トロンビンによるBax、Bak発現上昇と血小板膜表面GPIb, PAR-1の発現の低下との相関関係を示し、分子生物学的手技を用いて、介在する細胞内情報伝達系を解明することを研究計画として立案した。はじめに研究実施計画として、健康成人(約N=50)より血小板を採取し、血小板高反応者、低反応者の選定し、血小板作動薬に対する血小板凝集曲線をよりHigh Responder(高反応者)とLow Responder(低反応者)のリスト作成した。また、人工心肺下心臓予定手術患者を対象に、術前の血小板から得られた血小板内のmiR-96, miR-886-5p, miR-128等の定量により、高反応者と低反応者に振り分け、In Vitro系で測定したヒト血小板の細胞内情報伝達系の周術期変化の違いを時系列で観察する。また、周術期の出血量との関係を考察する。予想される結果としては、術前よりmiR-886-5pが強発現している患者は、血小板が極度に活性化れず、細胞死が起き難いため、血小板機能が保持され、周術期の出血量が少なくなる可能性があると考えている。本年度は、網羅的micrRNAプロファイリングをするための受託実験が高額なため、相当分の研究費を使用する予定にしている。また、血小板細胞内情報伝達系の変化を調べる実験のためのフローサイトメトリー用の抗体、ウェスタンブロット用の抗体、microRNA発現の定量評価のためのプローベ付きプライマーも高額なため研究費を使用予定である。
シメプレビル併用療法における治療効果関連因子とリバビリン不耐容例への適応の検討

C型慢性肝炎に対するシメプレビル・ペグインターフェロン・リバビリン療法において多施設共同研究を行い、治療効果関連因子を検討し、治療効果向上に繋がる方策を考案した。未治療例ではIL28B-non-TT例にリバビリン高用量投与、ペグインターフェロン・リバビリン無効例では治療開始2週時HCV-RNA陽性例に48週までのペグインターフェロン・リバビリン延長投与を行うことにより著効率が高率となり、テラプレビル非著効例ではシメプレビル交叉耐性は認めず、テラプレビル薬剤耐性変異に関わらず著効が得られた。我々は、大阪大学を中心とした多施設共同研究において、Pegylated interferon (Peg-IFN)/Ribavirin (RBV)が施行された約4500例、Telaprevir(TVR)/Peg-IFN/RBVが施行された約250例のC型肝炎症例を用いて、治療効果に関連する因子について検討してきた。また、Peg-IFN/RBV施行例を用いて肝発癌に関する因子を検討し、著効例において肝発癌リスクを有意に抑制すること、治療終了後AFP高値例で発癌が高リスクであることを報告した。現在、C型肝炎の抗ウイルス療法では、第二世代のNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤であるSimeprevir(SMV)/Peg-IFN/RBV療法がIFN適格例に対する第一選択となっており、同療法の著効例および非著効例の臨床的特徴やウイルス学的特徴、発癌抑制効果について、多数例での検討により宿主因子、ウイルス因子、薬剤因子の観点からそれらを明らかにすることを目指して検討を行っている。また、RBVを併用する抗ウイルス療法はヘモグロビン低値例や腎不全合併患者では使用が困難であるが、SMV/Peg-IFN/RBV療法においてRBVを減量することにより良好な治療効果が得られる可能性があると考えられ、その治療効果・安全性について検討を行っている。さらに、C型肝炎に特異的に作用する抗ウイルス薬併用療法では薬剤に対する耐性変異ウイルスが出現することが問題であるが、TVR/Peg-IFN/RBV非著効例やPeg-IFN/RBV無効例において、SMV/Peg-IFN/RBV療法での治療効果へ薬剤耐性ウイルスが及ぼす影響についてdeep sequence法を用いて検討を行っている。大阪大学を中心とした多施設共同研究において、2014年度末までにSMV/Peg-IFN/RBVが施行された約700例、ASV/DCVが施行された約300例が登録されており、前向き検討を行っている。SMV/Peg-IFN/RBV療法において、IL28B遺伝子多型およびRBV投与量が治療効果に関与することを見出し、論文発表した。また、安全性について、ビリルビン上昇や肝酵素上昇について、その特徴や関連因子を見出し、論文発表した。RBV減量投与例についても治療効果・安全性について検討し、学会発表予定である。TVR/Peg-IFN/RBV非著効例における薬剤耐性ウイルスの検討について、論文投稿中である。Peg-IFN/RBV無効例において、治療後再燃が長期投与によって抑制されることを見出し、論文作成中である。ASV/DCVでは、著効率に治療前NS5A耐性変異は関与するが、NS3-D168変異は関与しないこと、前治療SMV非著効例では著効率が有意に低下し、治療開始時のNS3-D168E/V変異クローン数が6log IU/ml以上で著効が得られにくいこと、治療開始時に存在したminorなNS5A-L31-Y93二重変異が治療効果に影響することを明らかにした(論文作成中)。SOF療法は、80歳以上の高齢者で副作用による治療中止率が高率であるが若年者と同等の著効率を認め、肝線維化や肝予備能の改善が認められることを明らかにした。大阪大学を中心とした多施設共同研究において、2014年度末までにSMV/Peg-IFN/RBVが施行された約700例が登録されており、前向き追跡を行っている。SMV/Peg-IFN/RBV療法の安全性について、ビリルビンや肝酵素の上昇が見られたことより、その特徴や関連因子について検討を行い、論文化を目指している。治療効果が判定可能な症例を用いた中間解析では、宿主因子としてIL28B遺伝子多型や前治療反応性、薬剤因子としてRBV投与量などが治療効果に関与することを見出し、論文化を目指している。RBV減量投与例についても治療効果・安全性について検討を行っている。TVR/Peg-IFN/RBV非著効例やPeg-IFN/RBV無効例において、deep-sequence法による薬剤耐性ウイルスの検討を行っており、対象症例の治療前の評価はほぼ終了しており、論文化を目指している。SOF/RBV、LDV/SOF療法施行例において、治療効果関連因子、安全性について検討する。発癌に関与する因子について検討する。

医学C型肝炎ウイルスC型慢性肝炎治療前年に引き続き、SMV-Peg-IFN/RBV施行例のコホートを用いて、治療効果関連因子について検討を継続する。さらに、SMV/Peg-IFN/RBV療法で非著効となった症例において、薬剤耐性ウイルスの存在および経時的変化についてdeep sequence法を用いて検討し、新規治療薬への治療適応を検討する。
ヒトの社会性・利他性を支える神経基盤の検討

申請者は平成20年度から行っていた実際の社会的意思決定時(e.g.,人前での寄付をするかどうかの判断)における線条体の役割を検討した研究、他者が自分に対してどのような印象を抱いているかという評判の処理における脳活動を検討した研究をそれぞれ海外学術雑誌に発表した(Izuma,Saito,&Sadato,2010;in press)。単純なギャンブル課題を用いた意思決定中の脳活動を報告した研究は過去にいくつもあるが、申請者の研究は我々が日常的に体験するような実際の社会的意思決定場面中の脳活動を検討し、その際の特に線条体といわれる脳部位の役割を明らかにした世界初の研究と考えられる。また平成21年度より玉川大学脳科学研究所に異動したのち、社会的報酬の処理に関するfMRI実験を新たに立ち上げた。我々ヒトの日常における行動も多くの場合報酬に基づいて行動の選択が行われていると考えられるが、ヒトの場合は食べ物やお金などの物質的報酬だけでなく、他者からの賞賛や良い評判といった抽象的・社会的な報酬も重要な役割を果たしていると考えられる。申請者はfMRIというヒトの脳活動を非侵襲的に計測できる装置を用い、ヒト特有の社会的報酬に対する脳活動をより詳細に検討し、さらにそれが社会的態度の形成にどのような役割を果たしているかを検討した。我々がある特定の他者に対してどのように振舞うかを決定する場合には、その他者に対してどのような印象・態度をもっているかは重要な要因のひとつであり、ヒトの社会性の神経基盤の解明に向けて重要なステップであると考えられる。既に25名ほどの被験者からデータを取得した。現在それぞれデータ解析を終え、論文を執筆中である。申請者は平成20年度において、ヒトの利他的行動(寄付)についての意思決定における社会的報酬の処理に関して機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて研究を行ってきた。利他的行動の一つである寄付行動を実際にfMRI内で行なわせ、その際の脳活動を計測し、その際に他者が寄付するかしないかの行動を観察している条件とそのような観察者がいない条件を用意し、他の人から良く思われたいという社会的報酬の獲得動機が実際の行動および脳活動にどのように影響を与えるかを観察した。まず予備実験においてfMRI本実験で使用する慈善団体78個を選別し、6月頃から本格的にデータを取り始めた。最終的に計26名からfMRIデータを収集した。その後のデータ解析の結果、社会的意思決定時において金銭報酬と社会的報酬という異なる報酬は線条体の同一部位において処理されているということを見出した。これは異なる種類の報酬を同じ軸上で比較し、行動の選択を行なっている、つまり脳内に「共通の通貨(common neural currency)というものが存在するという考えを支持するものである。この研究結果は今までの神経科学の分野では、食物報酬や金銭報酬を使ってしか検討されてこなかった意思決定の神経基盤について、それをヒトの実際の社会的行動に拡張し、あらたな知見を提供しているという点において非常に意義のあるものである。この研究結果は既に論文にまとめられ現在投稿中である。
難分解性環境汚染物質分解酵素創製のための新規メタ開裂酵素の構造と機能解析

現在、研究の進められている難分解性化合物分解菌のほとんどは土壌、活性汚泥から単離された陸生のものであり海洋性の難分解性化合物分解菌の研究はほとんどされていない。しかしながら、タンカーの座礁事故や難分解性化合物の河川から流入により海洋は汚染されており、これらの浄化は急務である。海洋性微生物は海水中を浮遊しているため菌濃度が薄く、海水中に含まれる微量成分の存在比率により生育に影響を受けるため非常に難培養であるものが多い。これらを克服するために菌源の海水を濃縮することや培地の成分を検討することで、多くの海洋性カルバゾール、ジベンゾフラン資化菌の取得に成功した。また、カルバゾール分解菌としては報告例の無いLysobacter sp.OC7株や既知の菌と非常に相同性が低く新目の菌と考えられるOC6S株の取得にも成功した。これらの分解系遺伝子を取得するためにCA10株のカルバゾール分解酵素の遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったが検出することはできなかった。メタ開裂酵素を指標としたショットガンクローニング法にて海洋性細菌の難分解性化合物分解遺伝子の取得に成功した。カルバゾールやジベンゾフラン等の難分解性化合物の上流の代謝に2サブユニットメタ開裂酵素は深く関与していることは知られているが、これらの酵素の立体構造は明らかとされていない。しかしながら、様々な基質に対して活性を持たせたり、分解効率を向上させた変異酵素を創製するためには酵素の立体構造を解明することは必須である。Pseudomonas resinovorans CA10株由来の2サブユニットメタ開裂酵素CarBaBbを精製、結晶化し、空間群P2_12_12、分解能1.6Aのデータを得ることができ、SIRSの手法を用いて初期位相を決定した後、モデル分子を構築し、立体構造を明らかにした。この結果を用いて、海洋性細菌の持つ難分解性化合物分解酵素と陸生細菌の持つ難分解性化合物分解酵素の構造と機能を比較して変異酵素を創製するため、取得したメタ開裂酵素についても立体構造を明らかにすることを目的として研究を進めている。CarBaBb_<CA10>の結晶化条件を再検討した結果非常に良好な結晶を得ることに成功した。この結晶を用いることで分解能1.6Å、R factor 19.7%、R free 22.1%のX線回折データが得られた。その後、Ptを用いて重原子誘導体を作成しSIRAS法による構造解析を試みた。その結果、分解能2.6Åのデータが得られ、初期位相の決定に成功した。現在、2つのデータセットを用いてモデルの精密化を行っている。(2)Rodoccus sp. DFA3株のメタ開裂酵素(FlnD1D2_<DFA3>)のX線結晶構造解析大腸菌を用いてFlnD1D2_<DFA3>を大量に得ることのできる発現用プラスミドを構築した。また、精製の簡便さを考慮しFlnD1D2_<DFA3>はHis融合タンパク質として発現させた。最適な培養条件、誘導条件を決定し現在、精製条件の検討を行っている。(3)新規カルバゾール、ジベンゾフラン分解菌のスクリーニング海水、海洋生物(海藻、貝)を菌源に用い集積培養にてスクリーニングを行った結果カルバゾール、ジベンゾフランを分解可能な集積培養液を得ることができた。

この集積培養液からPaenibacillus属細菌、Caulobacter属細菌、Pseudomonas属細菌、Vibrio属細菌の分解菌を単離する事に成功した。現在、既知の分解系遺伝子との比較により分解系遺伝子の取得を試みている。最終的なCarBaBb立体構造はRefmac5(CCP4)を使用して精密化し決定した(分解能:1.6Å、R因子:19.7%、R_<free>因子:22.1%)。また、精密化された分子モデルをProcheckで評価した結果、全てのアミノ酸残基が理想値の範囲であった。立体構造を明らかにした結果、CarBaBbは非対称単位中にα_2β_2の状態で存在しており、その大きさは約80×60×65Åであった。CarBaはCarBbの上に蓋のような形で存在しており、相互作用領域の解析結果より、tetramer中でCarBaは59-69および75-87の領域でCarBbと結合しており、2つのCarBb同士は59-65および100-112の領域で結合していた。一方、CarBa同士は直接的な結合を形成しでいなかった。αβサブユニットを1つの構成単位(dimmer)として、非対称単位中に存在する2つのdimerを重ね合わせた結東、Cα(347aa)におけるrms deviationは0.009Å、ems angleは1.182°であった。基質導入時の活性中心近傍の変化を明らかにするため、現在ソーキング法にて基質の導入を試みている。(2)新規カルバゾール、ジベンゾフラン分解菌のスクリーニングカルバゾール、ジベンゾフラン等の難分解性化合物を唯一の炭素源に用い、様々な地域の海水を菌源として集積培養し純化した結果、11菌株の海洋性難分解性化合物資化菌を単離することに成功した。その中のWA株とOC4株の16SrDNAを解析した結果、それぞれAlpha proteobacterium属とErythrobacter属に最も高い相同性を示した。WA株、OC7株で生育基質特異性を確認した結果、数種類の難分解性化合物での生育が確認された。サザンハイブリダイゼーションを行った結果、OC5S株は既知のカルバゾール分解初発酸化酵素とハイブリダイズした。海洋性カルバゾール資化菌CAR-SF株のカルバゾール分解に関与する今だ、あまり報告のない遺伝子を取得するためにメタ開裂酵素を指標に用いてショットガンクローニング方を行った結果、pUSF01、pUSF09の2種類の遺伝子クラスターの取得に成功した。得られた遺伝子断片を解析した結果、pUSF01からはカルバゾール上流の代謝に関与するcarAa、carBaBb、care遺伝子の取得に成功したがその周辺に初発酸化酵素の電子伝達を担うフェレドキシンcarAc、フェレドキシンレダクターゼo∂拐徽その重要性にもかかわらず見つからなかった。これらの遺伝子は陸生のカルバゾール資化菌Pseudomonas resinovorans CA10株と高い相同性を示した。また、pUSF09はカルバゾール下流の代謝に関与するanto、antB,antC,c23D遺伝子の取得に成功した。本研究の特色である、陸生細菌の持つメタ開裂酵素と海洋性細菌の持つメタ開裂酵素の違いを明らかとすることでメタ開裂酵素の構造変化や進化についての知見が得られることが期待できる。