hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋における流出油汚染の生態系への影響評価モデルの構築

海洋汚染,特に油流出による汚染に関して,その原因のうち,船舶の運航時のバラスト水の排出に伴う流出など日常的な汚染と,衝突や座礁などの事故による流出とが,海洋への油の全流出量の46パーセントを占めている。とりわけ船舶同士の衝突事故のような突発的な油流出は,その拡散防止や防除対策が遅れたり,対策方法の選択を間違うと,大量の油が広域に渡り拡散して,その周辺地域の生態系や環境に重大な影響を与え,近郊住民にも社会的・経済的影響を与える事になる。本研究では,従来まで行われてきた流出油事故際の回収を含めた動態シミュレーション技術を背景にして,これに加えて流出油事故に伴う汚染の生態系への影響のように,時間と共に状態が変化する多数の要因が複雑に関連する問題としてとらえて,ここでは動植物プランクトン,デトライタス,ネクトン,溶存酸素などを構成要因として,要因間の因果関係を考慮に入れたシステム・ダイナミクスに基づく生態系の動態分析のシミュレーションモデルを構築することを目的とした。平成元年の広島県水産試験場報告の広島湾における食物連鎖図を参考にして,この海域での生態系の構成要因の経時変化についてシミュレーションを試みた。シミュレーションでは,季節変動が大きく作用し,さらに油濃度に関連する流出油量,油の性状に関連する油種,さらに事故発生の違いによっても生態系への影響は大きく異なるため,これらに関連して条件を設定した。この結果油量と同様に油種の違いが環境への影響に対して大きな要因となることが明らかとなり,油の乳化分解率や毒性などの性状は油種により様々であり,生態系への影響を考える上で重要であると考えられる。今度は流出油の移流,拡散,構成因子の流入,流出,海域の富栄養化などに関連する栄養塩濃度などをモデルに取り入れて,さらに検討を進める計画である。海洋汚染のうち油流出による汚染は,船舶の運航時のビルジの排出に伴う流出など日常的な汚染と,衝突や座礁などの事故による流出が主な要因である。中でも船舶同士の衝突事故のような突発的な流出事故は,その拡散防止や防除対策が遅れたり,対策の選択を誤ると大量の油が広域に渡り拡散し,事故周辺地域の生態系や環境に重大な影響を与え,沿岸住民にも社会的・経済的に多大な影響を及ぼすことになる。特に,油汚染による生態系への影響は長期に渡り,種の絶滅も含めて重大問題となる。本研究では,流出油事故際の回収を含めた動態シミュレーション技術を背景にして,これに加えて流出油事故に伴う汚染の生態系への影響のように,時間と共に状態が変化する多数の要因が複雑に関連する問題としてとらえて,ここでは動植物プランクトン,デトライタス,ネクトン,溶存酸素などを構成要因として,要因間の因果関係を考慮に入れたシステム・ダイナミクスに基づく生態系の動態分析のシミュレーションモデルを構築することを目的としている。さらに,従来では,化学物質を規制する立場からは合理的な方法としてとられてきたEC50(Effect concentration)やLC50(Lethal concentration)あるいは特定生物20種への影響調査などの生物指標では,化学物質と対象生物の平衡存在量しか分からないという問題点があったが,これらに代わる新たに生態系リスク評価モデルの指標の構築にも繋がる。油汚染による生態系への影響分析だけでなくその他の環境負荷要因の影響分析が可能となり,さらにはその発展系モデルである,種が生態系全体,特に高等動物の絶滅に繋がるかを記述するモデルの構築へと発展できる可能性もある。今年度では,主に生態系の動態分析のシミュレーションモデルの構築と検討がなされた。

とりわけ船舶同士の衝突事故のような突発的な油流出は,その拡散防止や防除対策が遅れたり,対策方法の選択を間違うと,大量の油が広域に渡り拡散して,その周辺地域の生態系や環境に重大な影響を与え,近郊住民にも社会的・経済的影響を与える事になる。本研究では,従来まで行われてきた流出油事故際の回収を含めた動態シミュレーション技術を背景にして,これに加えて流出油事故に伴う汚染の生態系への影響のように,時間と共に状態が変化する多数の要因が複雑に関連する問題としてとらえて、ここでは動植物プランクトン,デトライタス,ネクトン,溶存酸素などを構成要因として,要因間の因果関係を考慮に入れたシステム・ダイナミクスに基づく生態系の動態分析のシミュレーションモデルを構築することを目的とした。平成元年の広島県水産試験場報告の広島湾における食物連鎖図を参考にして,この海域での生態系の構成要因の経時変化についてシミュレーションを試みた。シミュレーションでは,季節変動が大きく作用し,さらに油濃度に関連する流出油量,油の性状に関連する油種,さらに事故発生の違いによっても生態系への影響は大きく異なるため,これらに関連して条件を設定した。この結果油量と同様に油種の違いが環境への影響に対して大きな要因となることが明らかとなり,油の乳化分解率や毒性などの性状は油種により様々であり,生態系への影響を考える上で重要であると考えられる。今後は流出油の移流,拡散,構成因子の流入,流出,海域の富栄養化などに関連する栄養塩濃度などをモデルに取り入れて,さらに検討を進める計画である。
画像診断によるグリオブラストーマ腫瘍幹細胞の局在評価

代表的な成人の悪性脳腫瘍である膠芽腫(グリオブラストーマ)は現在の集学的治療をもってしても極めて予後不良の疾患である。本研究はグリオブラストーマの画期的な治療法を開発することを目的とする。具体的には、近年の腫瘍幹細胞の概念をもとに腫瘍幹細胞の局在を術前の画像診断で把握し、その部位を可及的に摘出することによって、再発を減らし効果的な治療に結びつけることを目的としている。
アポトーシス抑制蛋白質改良型の投与による虚血性神経細胞死抑制と治療への適用

本研究課題では、細胞死抑制活性が強化されたタンパク質を生体に投与によって脳虚血による神経細胞死を抑制し、その病態を改善することを目的としている。本研究で投与しているタンパク質FNKは、抗アポトーシス抑制因子Bcl-xLの3個のアミノ酸を置換して作製されたFNKタンパク質で、カルシウムイオノホア、酸化ストレス、血清除去など種々の細胞死刺激に対してBcl-xLより強力な細胞死抑制活性を発揮する。このFNKを細胞内に取り込ませるために、HIV/Tatタンパク質の細胞膜を自由に通過することのできるタンパク質導入領域(PTD : protein transduction domain)をN末端に付加したPTD-FNKを作製した。本研究期間中に、PTD-FNKを培地に添加すると、初代培養神経細胞のグルタミン酸処理による細胞内カルシウム濃度の致死的な不可逆的上昇を抑制し、その毒性を顕著に軽減した。PTD-FNKをスナネズミ腹腔内に投与することで前脳虚血による海馬の遅発性神経細胞死を抑制することを明らかにした。さらに、ヒト脳梗塞の病態に近いラット中大脳動脈(MCA)閉塞(90分)モデルを用いて、再還流開始時の投与で、梗塞体積が対照群に比べて1/3に縮小され、24時間後では対照群はほとんど動けないのに対し、FNK投与群は自発的歩行が可能であった。PTD-FNKによって細胞死を免れた神経細胞は正常に機能していると考えられた。免疫抑制剤FK506との併用により、投与許容時間を3時間延長できた。このように、PTD-FNKが急性期の脳硬塞治療に効果を発揮することが示唆された。この他に、軟骨組織スライスにPTD-FNK処理すると軟骨細胞に取り込まれてその細胞死が抑制されること、PTD-FNK投与で四塩化炭素によるネクローシスを抑制することで肝炎の病態を軽減すること、凍結再融解による細胞死を抑制することなど、PTD-FNKの適用の有効性について多くのことが明らかになった。我々ははラットBcl-xL蛋白の3次構造を決定し、その構造を基に遺伝子工学的に3個のアミノ酸残基を同種のアミノ酸残基に置換することで、イオンチャンネル活性に関与している領域を安定化している3本の水素結合を破壊した。このようにして作製されたアポトーシス抑制蛋白質改良型FNKはアポトーシス抑制活性が増強されており、カルシウムイオノホア、酸化ストレスや血清除去など種々の細胞死誘導刺激に対しBcl-xLより強く細胞死を抑制した。HIVウィルスのTAT蛋白は細胞膜を自由に出入りできる蛋白質導入領域(PTD : Protein Transduction Domain)を持っている。PTDをFNKのN末に融合させたPTD-FNK蛋白は培地に添加すると培養細胞に取り込まれてミトコンドリアに移行することがわかった。PTD-FNK蛋白の投与によって虚血性神経細胞死による病態を改善することを目的とした本研究課題1年目では、PTD-FNK蛋白をスナネズミの腹腔内に投与し、3時間後に両側総頸動脈を5分間閉塞し、再灌流後7日目に灌流固定し、海馬CA1領域をヘマトキシリン・エオシン法で染色した。PTD-FNKは脳神経細胞内に運搬されて遅発性神経細胞死を抑制し、3080%の神経細胞が生き残った。虚血性神経細胞死ではカルシウムイオンやグルタミン酸が関与している。

ラット胎児由来の大脳皮質神経細胞の初代培養系で、PTD-FNKを培地に添加することでグルタミン酸の細胞毒性を顕著に軽減し、グルタミン酸処理による細胞内カルシウム濃度の不可逆的上昇を抑制した。培養細胞内に取り込まれたPRD-FNKは約2時間で半減した。以上の結果をProc. Natl. Acad. Sci. USA(2002)に発表した。これらの結果から、PTD-FNK投与で脳虚血後の梗塞巣を減少させることが期待され、また細胞内に取り込まれたPTD-FNKは速やかに分解されると考えられた。本研究課題では、細胞死抑制活性が強化されたタンパク質を生体に投与によって脳虚血による神経細胞死を抑制し、その病態を改善することを目的としている。本研究で投与している細胞死抑制活性強化タンパク質FNKは、抗アポトーシス抑制因子Bcl-xLの3個のアミノ酸を同種のアミノ酸に置換して作製されたFNKタンパク質で、カルシウムイオノホア、酸化ストレス、血清除去など種々の細胞死刺激に対してBcl-xLより強力な細胞死抑制活性を発揮する。さらに、このFNKを細胞内に取り込ませるために、HIV/Tatタンパク質の細胞膜を自由に通過することのできるタンパク質導入領域(PTD:protein transduction domain)をN末端に付加したPTD-FNKを作製した。本研究課題1年目では、PTD-FNKタンパク質をスナネズミ腹腔内に投与することで前脳虚血による海馬の遅発性神経細胞死を抑制することを明らかにした。さらに、PTD-FNKを培地に添加すると、初代培養神経細胞のグルタミン酸処理による細胞内カルシウム濃度の致死的な不可逆的上昇を抑制し、その毒性を顕著に軽減した。本研究課題2年目ではヒト脳梗塞の病態に近いラット中大脳動脈閉塞モデルを用いて、本蛋白質の神経細胞死抑制と病態の軽減の効果を検討した。雄SDラットの内頚動脈を1.5時間閉塞することで一過性中大脳動脈閉塞モデルを作製した。虚血/再還流24時間後ではPTD-FNK投与(静注)で梗塞体積が対照群に比べて1/3に縮小されていた。さらに再還流24時間後では対照群はほとんど動けないのに対し、PTD-FNK投与群は自発的歩行が可能であった。PTD-FNKによって細胞死を免れた神経細胞は正常に機能していると考えられた。PTD-Bcl-xLではこのような改善効果は認められなかった。PTD-FNKが急性期の脳硬塞治療に効果を発揮することが示唆された。
蛋白質の不可逆的な構造変化を解析するための時間分解赤外分光器の開発

本研究においては、蛋白質の構造変化を記述するための一般的なツールとして赤外分光法を位置付けるために、不可逆的な反応が測定可能な時間分解の赤外分光器を開発することを目指した。そのために民間企業の研究部門に所属する研究者を含む有機的な研究体制を組織し、特に「繰り返し反応」の測定に限定されてきた時間分解FTIR法を「不可逆(シングルターンオーバ)反応」に発展的に応用するために不可欠な測定系を開発した。具体的には、ステップスキャン時間分解赤外分光器と赤外顕微鏡を組み合わせた装置を作製した。特に、赤外顕微鏡にxy自動ステージを組み込み、不可逆反応を開始させた試料からのシグナルを積算するために、X-Yステージを分光器のStep pulseで同期駆動させる補助プログラムを作成した。制御・データ処理向上のため、32ビットソフトウエアWin-IR Proを導入し、データ処理を高速化した。レーザーによる光励起と同期して時間分解赤外スペクトル変化を測定するためのシステムを構築し、不可逆な反応過程における構造変化の解析が可能になった。一方、大腸菌末端酸化酵素のダイナミクスに関して、光還元による蛋白質の構造変化をbd型とbo型のそれぞれについて測定し、ユニークな変化を明らかにした。特にbo型については、変異蛋白質の測定も併せて行い、酸化還元に伴う構造変化の部位を同定した。さらに、不可逆反応の代表的な蛋白質分子である視物質ロドブシンに対してフェムト秒蛍光分光法を適用し、励起状態における異性化反応過程を明らかにした。同様に視物質の中で色覚を担う赤感受性色素や緑感受性色素をニワトリの網膜から単離、精製し、水和フィルムに対する赤外分光から、発色団レチナール分子の異性化に伴う蛋白質の側の構造変化を明らかにした。また偏光赤外分光を用いたバクテリオロドプシンの研究、細菌の光センサーであるイエロープロテインの研究を行った。本研究においては、蛋白質の構造変化を記述するための一般的なツールとして赤外分光法を位置付けるために、不可逆的な反応が測定可能な時間分解の赤外分光器を開発することを目指している。そのために民間企業の研究部門に所属する研究者(Bio-Rad社;中野)を含む有機的な研究体制を組織し、?特に「繰り返し反応」の測定に限定されてきた時間分解FTIR法を「不可逆(シングルターンオーバ)反応」に発展的に応用するために不可欠な測定系を開発する。そして本システムを用いて、分子ポンプとして働く大腸菌末端酸化酵素の微細構造変化のダイナミクスを分担者(茂木)と共に追跡し、この反応に関与するアミノ酸残基を同定することによって反応機構を明らかにする。3年間の計画の初年度は、以下のような研究を行った。ステップスキャン時間分解赤外分光器と赤外顕微鏡を組み合わせた装置を作製した。制御・データ処理向上のため、32ビットソフトウエアWin-IR Pfoを導入し、データ処理を高速化した。現在、このようにして構築したシステムを京都大学に設置し、その評価と最適化を行っている。また実際に測定を行うための準備として、レチナール蛋白質であるバクテリオロドプシンやロドプシンの赤外分光を行い、異性化やプロトン移動に伴う蛋白質の構造変化を明らかにした。

本研究においては、蛋白質の構造変化を記述するための一般的なツールとして赤外分光法を位置付けるために、不可逆的な反応が測定可能な時間分解の赤外分光器を開発することを目指している。そのために民間企業の研究部門に所属する研究者(Bio-Rad社;中野)を含む有機的な研究体制を組織し、特に「繰り返し反応」の測定に限定されてきた時間分解FTIR法を「不可逆(シングルターンオーバ)反応」に発展的に応用するために不可欠な測定系を開発する。そして本システムを用いて、分子ポンプとして働く大腸菌末端酸化酵素の微細構造変化のダイナミクスを分担者(茂木)と共に追跡し、この反応に関与するアミノ酸残基を同定することによって反応機構を明らかにする。本年度は、ステップスキャン時間分解赤外分光器と赤外顕微鏡を組み合わせた装置を作製し、京都大学に設置、その評価を行ったところ、ステージの駆動に伴う振動がシステムに影響を及ぼすことがわかった。そこで現在、振動その他の影響を考慮しながらシステムの最適化を行っている。一方、大腸菌末端酸化酵素のダイナミクスに関して、光還元による蛋白質の構造変化をbd型とbo型のそれぞれについて測定し、ユニークな変化を明らかにした。特にbo型については、変異蛋白質の測定も併せて行い、酸化還元に伴う構造変化の部位を同定した。本研究においては、蛋白質の構造変化を記述するための一般的なツールとして赤外分光法を位置付けるために、不可逆的な反応が測定可能な時間分解の赤外分光器を開発することを目指した。そのために民間企業の研究部門に所属する研究者を含む有機的な研究体制を組織し、特に「繰り返し反応」の測定に限定されてきた時間分解FTIR法を「不可逆(シングルターンオーバ)反応」に発展的に応用するために不可欠な測定系を開発した。具体的には、ステップスキャン時間分解赤外分光器、赤外顕微鏡、自動ステージを組み合わせた装置を作製し、レーザーによる光励起と同期して時間分解赤外スペクトル変化を測定するためのシステムを構築した。本装置により、不可逆な反応過程における構造変化の解析が可能になった。さらに本年度においては、不可逆反応の代表的な蛋白質分子である視物質ロドプシンに対してフェムト秒蛍光分光法を適用し、励起状態における異性化反応過程を明らかにした。同様に視物質の中で色覚を担う赤感受性色素や緑感受性色素をニワトリの網膜から単離、精製し、水和フィルムに対する赤外分光から、発色団レチナール分子の異性化に伴う蛋白質の側の構造変化を明らかにした。赤感受性色素であるアイオドプシンの実験結果からは、赤色領域の吸収を実現するために、塩素イオンは発色団レチナール分子に対して電気双極子として作用していることがわかった。また偏光赤外分光を用いたバクテリオロドプシンの研究、細菌の光センサーであるイエロープロテインの研究を行った。
完全整合回路を用いたキッカー電磁石システムの研究

円形加速器にビームを入出射するためには、高速でパルス的に励磁されるキッカー電磁石が用いられる。このキッカー電磁石には、高速励磁応答特性に加えて、パルス電源との間で反射が起きないようにインピーダンス整合特性が要求される。このため、複雑な構造を持つ分布定数型が従来から適用されてきたが、その構造に由来する多くの問題があった。そこで本研究では、新しい方式を提案し、モデルシステムを構築して試験を行い、結果期待通りの性能を得た。本方式は、円形加速器を小型化するためのブレークスルー技術のひとつに成り得ることが期待できる。近年、円形加速器の大幅な小型化が望まれている。それを実現するための検討課題の中でも、特に、ビーム入出射装置であるキッカー電磁石システムに対する要請は厳しく、分布定数型に代表される従来の方式を用いる限りそれを克服することは困難であり、こうした小型円形加速器の実現には至っていない。そこで本研究では、分布定数型のように複雑な構造によってインピーダンス整合の機能を持たせるのではなく、磁性体コアとコイルとで構成される単純な集中定数型電磁石を用い、これに外付けのインピーダンス整合回路を組み合わせてT架橋四端子回路網を構成し、原理的に完全なインピーダンス整合を実現する機能分離型システムを提案している。本年度は、そのモデルシステムを構築して、この方式の実証試験を行った。試験では、典型的なキッカー電磁石システムをモデルケースとし、フェライトをコア材質とする、口径:140mm(W)X55mm(H);長さ:400mmの窓枠型キッカー電磁石を負荷とした。これにセラミックコンデンサ(2nF)、空芯インダクタ(0.4micro H)、および終端抵抗(20 ohm)からなる整合要素を組み合わせてT架橋四端子回路網を構成し、完全整合方式とした。ここでは、既存のフェライト材を使用し、透磁率の周波数特性試験や励磁電流依存性試験などによる選定は行わなかった。また、各整合要素のパラメーターがデザインと若干異なっていたが微調整を行わなかった。こうして製作したモデルシステムに波高5kV、幅1.2micro secのパルス電圧を印加して試験を行ったところ、インピーダンス不整合による反射を原因とする不正磁場は一切見られず、この方式が有効に機能することを実証できた。但し、数%のリップルやオーバーシュートは見られ、整合要素の最適化を検討している。昨年度、モデルシステムを構築して本方式の実証試験を行ったところ、インピーダンス不整合による反射を原因とする不正磁場は一切見られず、この方式が有効に機能することを実証できた。しかしながら、励磁波形に数%のリップルやオーバーシュートが見られた。そこで本年度は、こうした不正磁場を改善するために整合要素の最適化を行った。まず、各整合要素のパラメーターがデザインと若干異なっていたので、ネットワークアナライザで測定しながら微調整を行った。このネットワークアナライザによるインピーダンス測定結果から、整合要素にわたる浮遊成分を見積もることができたので、それをシミュレーション計算の回路モデルに組み込んだ。その計算結果は、励磁波形および入力インピーダンスの測定結果を再現し、回路モデルの妥当性を確認できた。この回路モデルを用いて計算で検証しながら、特に励磁波形を悪化させる浮遊成分を軽減するように整合要素の物理的配置を調節し、再帰的に最適化を行った。その結果期待通りの性能を得て、本方式が円形加速器を小型化するためのブレークスルー技術のひとつに成り得ることを実証できた。
2次の非線形光学材料を目指した剛直高分子単結晶の調製

1.緒言:剛直構造からなる芳香族高分子は分子鎖方向に大きな超分極を示すために,2次の非線形光学材料としても注目され始めている。しかし,分子構造が剛直であるゆえに不溶不融であり,材料への成形加工が困難であるという問題を抱えている。そこで本研究では,非線形光学特性が期待できるポリアゾメチンエステル(PAME)の高次構造形成について検討した。2.実験:ポリマー換算で1.0wt/vol%になるように4-(4-アセトキシフェニル)イミノ安息香酸(APBA)と重合溶媒を反応容器に入れ,窒素雰囲気中所定温度で6時間重合した。3.結果と考察:流動パラフィン(LPF)と芳香族熱媒であるTherm S 1000(TS10,ジベンジルトルエン混合物)を重合溶媒とし,300°Cで重合を行った。LPFを用いて重合を行った場合,長さが7im,径が2.5imの紡錘型結晶が35%の収率で得られた。両端が尖っていること,ならびに対称的な形態を示したことより,スパイラル成長によるラメラ晶の積層結晶化により結晶が成長したと推察された。しかしながら,紡錘型結晶の表面がスムーズではなく,ラメラ晶間で,の後重合と再組織化によるラメラ晶積層構造の消失が起きていない。そこで次に,LPFに比べてオリゴマーとの相溶性が高いTS10中で重合を行った。その結果,結晶収率は10%以下と低いが,板状結晶の集合体とともに,長さが40im,径が2imの針状結晶が得られた。LPFに比べてTS10溶媒の方がアスペクト比が高く、長い針状結晶が生成することが分かった。効率的な後重合を起こさせるために,TS10中で温度を320°C,350°Cに上げて重合を行った。その結果,350°Cでは長さ方向に成長した長い針状結晶が生成し,その表面は非常に滑らかであった。重合温度を上げることによって,ラメラ晶間での後重合が効率よく起きたためと考えられる。4.結論:APBAをTS10中350°Cで重合することにより,PAMEの針状結晶が生成することを明らかにした。高分子2次非線形光学材料は,潜在的性能は期待されていながら,カットオフ波長の長波長シフトによる発生光強度の低下,分子鎖の配向,ならびに配向緩和に基づく性能の経時的低下などの問題をかかえている。本研究では,重合結晶化法を用いて芳香族縮合系高分子材料を調製し,分子鎖の化学構造,配向,結晶構造,ならびに形態とSHG活性との関係を明らかにする。平成12年度の成果を以下に要約する。1.新規ポリマー単結晶の作製SHG活性を持つと期待できるポリアゾメチン(PAz),ならびにポリ(アゾメチン-エステル)(PAzEs)単結晶の調製を試みた。PAzに関しては,自己縮合型である4-アミノベンゾニトリルを用い,流動パラフィン中180°Cで重合結晶化することにより,長さ数μのウィスカーを得ることに成功した。PAzEsでは,アゾメチン結合を内包したアセトキシカルボン酸をモノマーとし,ジベンジルトルエン中320°Cで重合結晶化を行いことにより,針状結晶が得られることが分かった。内包しているアゾメチン結合の方向性により,結晶形態に違いが現れることも見いだしている。但し,結晶形態の均質性に劣るため,更なる条件検討が必要である。2.共重合ウィスカーにおける共重合連鎖配列制御技術の開発ポリ(p-オキベンゾイル-co-p-メルカプトベンゾイル)について,ランダム,交互,並びに周期的連鎖配列が結晶形態と分子鎖配向に及ぼす効果について調べた。その結果,4-アセトキシ安息香酸と4-アセチル-S-メルカプト安息香酸とのランダム共重合では,針状結晶は生成しにくいことが分かった。これは,析出結晶化に預かるオリゴマーの結晶性が低下すること,ならびにオリゴマーの凝固曲線が低温へシフトするために相分離様式が結晶化から液-液相分離に変化する傾向にあることに起因している。そこで,4-(4-アセトキシベンゾイル)-S-メルカプト安息香酸や4-(4-アセチル-S-メルカプトベンゾイル)オキシ安息香酸などの規則的連鎖構造を持つモノマー群を合成し,流動パラフィン中で重合することにより,共重合体でもウィスカーが得られることを見いだした。分子鎖はウィスカーの長軸方向に配向していることが分かり,SHG活性を持つ構造と期待できる。

LPFを用いて重合を行った場合,長さが7im,径が2.5imの紡錘型結晶が35%の収率で得られた。両端が尖っていること,ならびに対称的な形態を示したことより,スパイラル成長によるラメラ晶の積層結晶化により結晶が成長したと推察された。しかしながら,紡錘型結晶の表面がスムーズではなく,ラメラ晶間で,の後重合と再組織化によるラメラ晶積層構造の消失が起きていない。そこで次に,LPFに比べてオリゴマーとの相溶性が高いTS10中で重合を行った。その結果,結晶収率は10%以下と低いが,板状結晶の集合体とともに,長さが40im,径が2imの針状結晶が得られた。LPFに比べてTS10溶媒の方がアスペクト比が高く、長い針状結晶が生成することが分かった。効率的な後重合を起こさせるために,TS10中で温度を320°C,350°Cに上げて重合を行った。その結果,350°Cでは長さ方向に成長した長い針状結晶が生成し,その表面は非常に滑らかであった。重合温度を上げることによって,ラメラ晶間での後重合が効率よく起きたためと考えられる。4.結論:APBAをTS10中350°Cで重合することにより,PAMEの針状結晶が生成することを明らかにした。
多関節構造体に対する共振の拡張とそれに基づく適応型制御法

本研究では、ロボットなどの多関節構造体に対してエネルギー効率の良い運動制御を実現するため、多関節構造体に対して共振概念を理論的に拡張した。このとき、従来の共振概念の重要な点が、拡張した共振概念でも成立することを示した。この拡張版の共振概念を用いることで、複雑な数値計算や制御対象のパラメータを用いない適応型の制御法を提案した。制御系の大域的な安定性は、数学的に証明した。本手法を応用すれば、エネルギー効率の高い歩行補助システムや、産業用ロボットの省エネルギー化に貢献できると考えられる。平成20年度において、本研究では多関節構造体に対する共振概念の理論的拡張を実現した。本概念では、多関節構造体のダイナミクスが非線形で多自由度になるにも関わらず、トルク最小を実現する最適制御が関節速度の線形フィードバックの形で達成されることが解析的に導き出された。この性質は、従来の線形系におけると一致しており、共振概念のある種の拡張であることがわかる。この性質を用いることにより、従来のように膨大な数値計算を用いることで最適制御を求めるのではなく、簡単な計算によりトルク最小で周期運動の生成が可能となる。また、本解析は基本的な力学解析でもあり、人間などの多関節構造体の運動を理解するためにも重要な役割を果たす可能性がある。更に、本研究では本拡張版共振概念に基づいた適応型の制御法を提案した。本制御法の大きな特徴は、制御対象の詳細なパラメータや複雑な数値計算を用いないことである。提案制御則は、これまで我々が提案してきた剛性最適化制御に加え、遅延フィードバック制御を用いることで、関節剛性と運動パターンの同時適応を実現している。これにより、粘性の無いマニピュレータ型ロボットに対しては、トルクを必要としない周期運動を生成できることをシミュレーションにより確認した。また、脚構造ロボットの歩行運動に対しても、拡張版共振状態を実現することが可能となり、省エネルギー歩行ロボットが実現可能となりつつある。制御系の安定性は、収束点近傍で線形化したダイナミクスに対して行い、運動パターンと関節剛性が同時に最適化されることを確認しつつある。機械システムにおいて、エネルギー効率を向上することは最も基本的な要求のうちの一つである。共振は、機械システムの周期運動のエネルギー効率を最適化するための概念として、200年以上用いられてきた。しかしながら、従来の共振概念は、線形で1自由度の単振動運動を主に取り扱っていた。これに対し、ロボットや人間などの多関節構造体のダイナミクスは、複雑な非線形性を持ち、自由度も複数となる。そこで本研究ではまず、多関節構造体に対して共振概念を理論的に拡張した。本共振概念は、エネルギー解析やハミルトン・ヤコビ・ベルマンの方程式を用いて解析を行うことで、従来の共振を多関節構造体に自然に拡張したものである。この重要な点とは、最小のトルクで周期運動を生成する点と、アクチュエータトルクが速度の線形フィードバックとなる点である.この特徴は、物理的意味が明確であるのと同時に、制御則の構築に役に立つ。実際、本件研究ではこの性質を用いることで、複雑な数値計算や制御対象のパラメータを用いない適応型の制御法を構築した。関節剛性を適応的に最適化する制御法においては、制御系の大域的な安定性を証明した。本共振概念や適応型制御法を工学的に応用すれば、高エネルギー効率で人間の歩行を補助するロボットシステムや、産業用ロボットの省エネルギー化に貢献できると考えられる。また、提案共振概念や適応型の制御法の有効性は、製作したロボットシステムを用いて確認した。
次世代IoT環境のための超分散エッジコンピューティング技術の開発

本年度は、エッジコンピューティング環境において、アプリケーション層における計算のスケジューリングとネットワーク層のルーティングを同時に制御するためのアーキテクチャを設計を目的として、異なる指標の制御が混在する状況を数学的にモデル化し、それに基づいて発見的な制御手法を設計した。さらに、IoT環境におけるエッジコンピューティングを促進するための基盤技術として、情報指向ネットワーク(ICN)において、高速かつ低消費電力なフォワーディングを実現するためのPIT (Pendint Interest Table)の並列処理の解析を実施した。まず、スケジューリングとルーティングのモデル化については、負荷分散を目的関数とするルーティングと消費電力の削減を目的関数とするルーティングの制御の方針が相反することに着目し、それらを同時に満たす解を得ることを目的として、2つの異なる制御を協力ゲームとしてモデル化した。2つの目的関数を結合した最適化モデルをラグランジュ分解法で分解したサブ問題を分析することで、2つの目的関数を満たすための方針を検討した。検討結果にもとづいて、2つの目的関数を満たす発見的手法を設計した。次に、ICNにおける高速かつ低消費電力なフォワーディングを実現に向け、フォワーディング処理の並列化の課題となるPITの処理の解析を実施した。ICNのフォワーディングには、エンド端末の識別子を利用しないため、要求者にDataパケットを返送するために各ルータでは、PITと呼ばれるテーブルにDataパケットの返送情報を記録する。フォワーディング処理の並列化をする際には、PITに対する書き込みの排他制御が転送速度と消費電力の点で課題となる。これに対して、排他制御を実施しない場合に発生しうる課題を分析し、一部の場合は排他制御をせずのパケット再送で対応できることを明らかにした。本研究課題は、1)ルーティングをスケジューリングを同時に制御するアーキテクチャとアルゴリズムの設計、2) IoTデバイス向けの高速・消費電力フォワーディングエンジン、3)利用者端末の計算資源供与のためのインセンティブ機構の設計の3つの課題から構成される。本年度は、1)について概ね達成し、さらに、2)については計画より前倒しで着手しており、おおむね順調に進んでいると言える。以下、具体的に進捗を説明する。1)については、研究実績の概要で議論したように、複数の制御目的を有する制御が混在した状況の解析と、それに基づいた発見的手法の開発が完了している。ただし、制御としてスケジューリングを考えた場合、どの計算をどのノードに展開するかという制御が整数変数、つまり、最適化モデルが整数問題になり求解と分析が困難である。これに対して、現状は整数の条件を緩和した上でモデルを分析している。シミュレーション評価により、緩和の誤差は小さいことは確かめているが、一般的な環境下でも通用するかを評価する課題が残っている。2)については、フォワーディング処理を並列化する際に生じる排他制御の課題について分析が完了した。ICNではInterestパケット転送時にDataパケットを要求者に返送するための情報をPITに書き込むため、排他制御が必要不可欠である。しかし、排他制御にはアトミックなロック処理が必要であるが、これは一時的に全CPUコアのデータへのアクセスを停止してしまう。したがって、排他制御を必要最低限にすることがパケット転送高速化の鍵である。これに対して、排他制御を実施しない場合に処理の一貫性が満たされなくなる状況を分析し、プログラム停止に繋がる一貫性破綻の課題は一部の処理でしか発生しないことを明らかにした。これにより、排他制御を削減し、フォワーディングの高速化と省電力化の目処が付いた。2018年度の実施した研究開発成果を、以下の通りに拡張する。1)ルーティングをスケジューリングを同時に制御するアーキテクチャとアルゴリズムの設計:上記の『進捗状況』において議論したように、スケジューリングを考えた場合に2018年度に開発した協力ゲームのモデルが整数問題となる課題を解決する。具体的には、それに対する整数緩和の影響を分析するとともに、緩和にともなう誤差の影響がない領域を評価によって明らかにする。2) IoTデバイス向けの高速・消費電力フォワーディングエンジン:2018年度には、PITの処理に関して排他制御をしない場合に、処理の一貫性は保てなくなるもののパケットの再送でリカバリーできる処理が存在することが分かった。これに対して、真に排他制御が必要な処理の組み合わせのみに排他制御をするフォワーディングのプロトタイプを設計し、パケット転送速度の向上と消費電力の削減効果を検証する。さらに、真に排他制御が必要な処理が発生する確率を解析的に分析し、排他制御の影響が小さいことを示す。3)利用者端末の計算資源供与のためのインセンティブ機構の設計:インセンティブ機構の初期設計を実施する。具体的には、エッジコンピューティング事業者とIoTデバイスの振る舞いをシュタッケルベルグ競争としてモデル化し、インセンティブを分析する。エッジコンピューティング事業者が先導者としてIoTデバイスにある種のインセンティブを付与し、IoTデバイスは追従者としてインセンティブと自身の制御目的関数を最大化するように合理的に振る舞う環境を想定する。これにより、エッジコンピューティング事業者は間接的にIoTデバイスを制御することが可能になる。この環境において、計算時間などの目的関数を最大化するインセンティブの決定を検討する。

まず、スケジューリングとルーティングのモデル化については、負荷分散を目的関数とするルーティングと消費電力の削減を目的関数とするルーティングの制御の方針が相反することに着目し、それらを同時に満たす解を得ることを目的として、2つの異なる制御を協力ゲームとしてモデル化した。2つの目的関数を結合した最適化モデルをラグランジュ分解法で分解したサブ問題を分析することで、2つの目的関数を満たすための方針を検討した。検討結果にもとづいて、2つの目的関数を満たす発見的手法を設計した。次に、ICNにおける高速かつ低消費電力なフォワーディングを実現に向け、フォワーディング処理の並列化の課題となるPITの処理の解析を実施した。ICNのフォワーディングには、エンド端末の識別子を利用しないため、要求者にDataパケットを返送するために各ルータでは、PITと呼ばれるテーブルにDataパケットの返送情報を記録する。フォワーディング処理の並列化をする際には、PITに対する書き込みの排他制御が転送速度と消費電力の点で課題となる。これに対して、排他制御を実施しない場合に発生しうる課題を分析し、一部の場合は排他制御をせずのパケット再送で対応できることを明らかにした。本研究課題は、1)ルーティングをスケジューリングを同時に制御するアーキテクチャとアルゴリズムの設計、2) IoTデバイス向けの高速・消費電力フォワーディングエンジン、3)利用者端末の計算資源供与のためのインセンティブ機構の設計の3つの課題から構成される。本年度は、1)について概ね達成し、さらに、2)については計画より前倒しで着手しており、おおむね順調に進んでいると言える。以下、具体的に進捗を説明する。1)については、研究実績の概要で議論したように、複数の制御目的を有する制御が混在した状況の解析と、それに基づいた発見的手法の開発が完了している。ただし、制御としてスケジューリングを考えた場合、どの計算をどのノードに展開するかという制御が整数変数、つまり、最適化モデルが整数問題になり求解と分析が困難である。これに対して、現状は整数の条件を緩和した上でモデルを分析している。シミュレーション評価により、緩和の誤差は小さいことは確かめているが、一般的な環境下でも通用するかを評価する課題が残っている。2)については、フォワーディング処理を並列化する際に生じる排他制御の課題について分析が完了した。ICNではInterestパケット転送時にDataパケットを要求者に返送するための情報をPITに書き込むため、排他制御が必要不可欠である。
多波長レーザースペックルを用いた血管厚さと血流速さの同時計測に関する研究

本研究では,血管厚さと血流速さの同時計測の実現を目的として,複数の波長のレーザースペックル情報から,血管厚さと血流速さの情報を分離することにより,血管厚さと血流速さの同時計測を可能とする計測方法を開発する.また,開発した計測方法を用いて,人体に負荷をかけることなく手軽に血管厚さと血流速さの計測が可能な血管情報計測プローブを開発する.本研究では,血管厚さと血流速さの同時計測の実現を目的として,複数の波長のレーザースペックル情報から,血管厚さと血流速さの情報を分離することにより,血管厚さと血流速さの同時計測を可能とする計測方法を開発する.また,開発した計測方法を用いて,人体に負荷をかけることなく手軽に血管厚さと血流速さの計測が可能な血管情報計測プローブを開発する.
固体NMRによる光受容蛋白質ロドプシンのレチナール結合部位の精密構造解析法の開発

本研究では、微生物型タンパク質であるロドプシンの発色団レチナールの結合部位の精密構造解析のために、レチナールオキシム体からアルデヒドへの変換反応の探索と高度好塩菌由来のバクテリオロドプシンから13C標識レチナールの抽出および固体NMRを用いたレチナール結合部位の構造解析を行った。その結果、オキシム体からレチナールへの効率的な変換反応の構築を達成し、13Cセグメント標識レチナールの生成に成功した。また、固体NMRを用いてセンサリーロドプシンIIやクロキノバクターロドプシン2などのレチナール結合部位の構造を明らかにした。さらに、光照射固体NMRによるセンサリーロドプシンIIの光中間体を観測した。光を利用して機能するロドプシンタンパク質の機能や吸収波長などを制御した分子設計を目指すにあたって、発色団レチナールが結合しているレチナール結合ポケットの動的構造の理解は極めて重要である。レチナールの13C NMR信号を基にした固体NMRによるレチナール結合部位の精密構造解析の研究を展開するため、本年度は高度好塩菌H. salinarumの紫膜に発現したバクテリオロドプシンから安定同位体標識レチナールの抽出・精製を試みた。有機溶媒を用いた標準的な方法によって紫膜からレチナールを抽出し、LC-MSによる分析でFractionのひとつに部分的に13Cが導入されたレチナールを確認した。今後、大腸菌発現系で利用していくに当たって、LC-MSの分画の分解能や標識率の算出などの問題点が出てきた。一方、微生物型ロドプシンを対象として、そのレチナール結合部位に高く保存されているTyr、AspやLysなどのNMR信号を選択的に観測する実験を行い、レチナール近傍のアミノ酸残基との相互作用を高い分解能で測定することに成功した。13C複数標識レチナールを用いた固体NMR構造解析の基礎条件の検討は十分に進めることができた。さらに先の段階で使用することになるIn-situ光照射-固体NMR法によって、バクテリオロドプシンY185F変異体の光中間体の観測やセンサリーロドプシンIIのシッフ塩基のプロトン化・脱プロトン化を反映する15N Lysの光誘起信号変化の観測にも成功した。紫膜からのフラクションの分離がやや低い分解能であることと、MSによる解析から安定同位体標識の割合にやや分布があり、高い同位体標識率のレチナールが得られていない。一方で固体NMRを用いた部位特異的標識レチナールを用いた実験では、十分にレチナール結合ポケットのアミノ酸残基の信号が観測できているため、次の展開である複数の炭素がラベルされたレチナールを用いて、双極子相互作用の強さの計測によってレチナールのねじれと周辺アミノ酸残基との相互作用の相関などの測定準備はできている。レチナール結合型タンパク質は光を吸収して、発色団レチナールが異性化し、タンパク質構造変化によって機能する。そのためレチナールとタンパク質の間の相互作用は機能を制御する上で極めて重要な部分である。そのような反応中心の構造を理解するために、固体NMRを用いたレチナールおよびその周辺残基を含めたレチナール結合ポケットの精密な構造解析法の開発を進めている。本年度は、レチナール結合部分の固体NMR構造解析法の開発とレチナール誘導体の変換法の構築を行なった。レチナールとの相互作用を見るためにいくつかの微生物型ロドプシンに空間的な原子間距離に基づいた測定法を適用し、レチナール結合部位選択的に信号を観測することに成功した。極大吸収波長と化学シフトの相関関係、近傍Tyrの水素結合とロドプシンの機能のタイプとの相関、周辺アミノ酸残基との相互作用が発色団の配座に及ぼす影響などを検討することができた。さらに、安定同位体標識戦略などを再検討することができ、新たなNMR実験計画を考案することができた。また、研究分担者の五東准教授と引き続き協力して研究を進め、レチナール誘導体の変換法として、マイクロリアクターを利用した反応系を構築し、モデル化合物で効率的かつ選択的に進行することを証明した。この反応系は次年度の研究の推進に重要なものである。レチナールと周囲のアミノ酸の相互作用の観測に成功し、NMR情報からわかる機能との関係を示した(I. Kawamura, et al. A. Shigeta et al. (2017) Biochemistry)。また、特にロドプシンタンパク質の構造解析に有効な光照射-固体NMRの研究を2つの著書にまとめてきた。マイクロリアクターなどを用いた実験系を構築し、非標識レチナールオキシムをもとにしたレチナール誘導体からレチナールへの変換反応について、その効率を向上させることに成功した。固体NMRを用いたロドプシンタンパク質のレチナール結合部位の精密構造解析法に関する研究を行ない、次のような成果を得ることができた。1.光照射型-固体NMR法を用いて、センサリーロドプシンIIの光中間体におけるレチナール構造を明らかにした。特に、M中間体、O中間体、N'中間体由来のレチナールのNMR信号を区別して観測し、それぞれの中間体の配座を決定した。また、DFT計算による化学シフト値と配座の関係を示し、より詳細なレチナール配座を提唱した。この方法論を著書にまとめた。2.光駆動型ナトリウムイオンポンプロドプシンのNa+とそれ以外のアルカリ金属イオンにおける構造の違いを明らかにし、特にレチナール結合ポケットの変化を示した。

3.セグメント13C標識レチナールの抽出やオキシム体からアルデヒド型への再転換法の確率、及びそのようなレチナールの大腸菌発現系への組み込みを行い、ロドプシン結合型レチナールの構造解析への展開を示した。本研究では、微生物型タンパク質であるロドプシンの発色団レチナールの結合部位の精密構造解析のために、レチナールオキシム体からアルデヒドへの変換反応の探索と高度好塩菌由来のバクテリオロドプシンから13C標識レチナールの抽出および固体NMRを用いたレチナール結合部位の構造解析を行った。その結果、オキシム体からレチナールへの効率的な変換反応の構築を達成し、13Cセグメント標識レチナールの生成に成功した。また、固体NMRを用いてセンサリーロドプシンIIやクロキノバクターロドプシン2などのレチナール結合部位の構造を明らかにした。さらに、光照射固体NMRによるセンサリーロドプシンIIの光中間体を観測した。培地の炭素源を変更するなど培養条件の改良および工業生産されているベータカロチンを酵素で切断処理することで生成する方法を試み、標識レチナールの合成を行う。引き続き、固体NMR測定に関しては新たな手法を取り入れ、実施していく。固体NMR測定による13C-13C双極子相互作用を利用した膜タンパク質内部の発色団の二面角の解析など固体NMRの実験計画は引き続き進めていく。高度好塩菌培養過程でセグメント標識レチナールを抽出することは難しい状態であるため、すでに微生物型ロドプシンに埋め込まれているレチナール誘導体として抽出し、それを再変換する反応系の構築に研究計画を変更する。これにより、微生物型ロドプシンにおけるレチナール-タンパク質間相互作用の固体NMR解析を網羅的に実施するために、大腸菌発現系のロドプシンに適用できるようなレチナール誘導体-レチナール変換反応系を構築し、研究を進めていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
母体、胎児免疫相関から見た妊娠維持機構ならびにその破綻

免疫寛容が存在するため、胎児・胎盤は母体免疫系から拒絶されずに、妊娠が維持される。これまで胎児染色体正常流産ならびに妊娠高血圧腎症(PE)では、免疫寛容を誘導する制御性T細胞(Treg)が減少する事を報告してきたが、平成30年度の村口との共同研究により、Treg細胞に発現するT細胞受容体(TCR)を1つの細胞毎にシークエンスした。その結果、流産脱落膜では免疫抑制活性の強いeffector Tregの割合が低下するが、胎児抗原特異的と考えられるクローナルなTregは減少しなかった。一方、妊娠高血圧腎症脱落膜では、effector Tregの減少は軽微であったが、クローナルなTregの著明な減少を認めた。即ち、胎児染色体正常流産例では子宮でのeffector Treg細胞の低下に起因し、妊娠高血圧腎症では胎児抗原特異的Tregの減少に起因する事が、初めて判った(Front Immunol. 2018, 2019)。次に胎児(父親)抗原特異的Tregの誘導機序をマウス(BALB/C×DBA/2)で検討した。その結果、正常DBA/2♂マウスとの交配で、子宮にMHC class IIlowCD86lowのimmature DCが増加する事、このDCはMLR反応を抑制する事、in vitroで子宮DCと脾臓由来のT細胞を共培養しIL-2、TGF-β添加培地で培養するとVβ6+Tregが選択的に増加した。一方、精嚢除去し精漿分泌がないDBA/2♂マウスとの交配では、子宮のDCはVβ6+(父親抗原特異的)Tregを誘導させなかった。この事より精漿のプライミングが父親抗原特異的なTreg誘導に必要である事が証明された(論文投稿中)。この結果は、同棲期間が短い妊娠、避妊でコンドームを使用するカップル、初産婦で妊娠高血圧腎症発生リスクが高まる疫学的事実を良く説明できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、母体、胎児免疫相関からみた妊娠維持機構ならびにその破綻につき検討した。(1)妊娠中、母体末梢血NK細胞は胎盤由来マイクロRNAを取り込んでおり、分娩後は、これらのマイクロRNAが数日でクリアランスされることを明らかにした。バイオインフォマティクス解析から、妊娠後期NK細胞ではNK細胞の細胞傷害性が活性化する方向に制御されており、分娩との関連性が示唆された。(2)妊娠初期の脱落膜中より、NK細胞を純化し、マイクロRNAと遺伝子発現の網羅的解析を正常妊娠5例、胎児染色体正常流産5例、胎児染色体異常流産5例で、データを集積した。(3)流産例では染色体正常例に限って、脱落膜中のfunctional Treg細胞が減少しeffector T細胞が増加し、胎児拒絶反応が生じていることが判明した。(4)制御性T(Treg)細胞をsingle cell sortingし、mRNAからcDNAを作成後、RT-PCR法を行なった。約9割でTregのマーカーであるFoxp3 mRNAが検出され、T細胞受容体(TCR)のレパトア解析を行なった。妊娠6週までの人工妊娠中絶検体では末梢血、脱落膜ともTreg細胞におけるクロナリティーの集束は認められなかった。一方、妊娠7週以降はTreg中のクロナリティー集束が脱落膜中に認められた。即ち、ヒト妊娠において、胎児抗原特異的Treg細胞が着床局所に集簇している可能性を示すことができた。(5)ヒト羊膜細胞の肝硬変モデルマウス(CCL4投与)に1回投与したのみで、肝線維量が有意に減少した。さらに多発性硬化マウスに羊膜細胞を1回投与したのみで24時間後には跛行が消失し、運動が速やかとなった。さらに組織や臓器移植した際に羊膜細胞を同時に移植すると、拒絶反応が抑えられることが判明した。すなわち羊膜細胞には拒絶反応を抑制する効果があることが判った。(1)胎盤由来のマイクロRNAが母体NK細胞の機能を制御していること、ならびに妊娠末期にマイクロRNAが変化し、細胞傷害活性を強め、拒絶(分娩)を誘発している可能性を示した。これらのことは胎盤由来のマイクロRNAが分娩を誘発するという新しい概念を生み出したことになり、高く評価できる。(2)胎盤由来マイクロRNAが妊娠初期の流産に関与するかを検討するため、すでに脱落膜、末梢血よりNK細胞を純化して、正常例、胎児染色体正常流産、胎児染色体異常流産、各5例ずつでマイクロRNAの網羅的解析を終了した。同時にNK細胞のmRNA発現を網羅的に解析したので、現在、3群間の差を検討し、さらに胎盤由来マイクロRNAとNK活性の活性化につき解析を加えている。(3)ヒト流産で拒絶反応が起こっているかは、永年に渡り不明であったが、胎児染色体正常流産では拒絶反応を抑制するfunctional Treg細胞が子宮で減少し、さらに拒絶反応を引き起こすeffector T細胞が増加することは、ヒト流産でも拒絶反応が起こっていることを示すものである。一方、胎児染色体異常例では胎児事態の異常により流産が起こっており、母体免疫系は拒絶反応を示していないことが明らかとなった。(4)ヒトにおいてはマウスと異なり、父親(胎児)抗原特異的Treg細胞は同定できない。これまでのマウスの実験系では我々を含め特定の胎児抗原を認識するT細胞受容体を持つTreg細胞が妊娠子宮に集積することが判っている。

今回、初めてヒト妊娠においても妊娠7週以降になると特定のT細胞受容体を持つTreg細胞が子宮に集積することが証明された。(5)羊膜細胞が拒絶反応や炎症反応を抑制することが明らかとなった。以上より、胎盤由来マイクロRNA、羊膜細胞、胎児特異的Treg細胞が胎児拒絶を防いでいることが明らかとなった。不育症例60例より、初診時、妊娠7週、妊娠10週、28週、36週に末梢血、分娩時には末梢血と脱落膜よりリンパ球を分離し、20例の流産例も同様にした。Treg細胞をsingle cell sortingし、TCRα、TCRβ、Foxp3のmRNA発現をRT-PCR法で増幅した。その結果、正常妊娠では妊娠7週以降では脱落膜でTCRαのクロナリティーの集積が認められ、分娩時では2030%のTreg細胞にクロナリティーが認められた。流産例では脱落膜でのTCRαのクロナリティーは正常妊娠に比し低率であった。一方、末梢血ではTregのTCRクロナリティーはいづれの場合でも認めなかった。2.クローナルに増加した脱落膜Effector TregのTCRと、抗原特異性の検証クローナルに増加した脱落膜Effector TregのTCR α鎖とβ鎖のペアの発現ベクターを作成した(3症例分6種類)。脱落膜由来TCR発現ベクターをパッケージング細胞(Phoenix A)に導入し、レトロウイルスを作成した。レトロウイルスを母体PBMCに感染させTCRを発現させた。TCR遺伝子導入効率は約30%であった。脱落膜由来TCR導入PBMCをresponderとし、臍帯血と自身のリンパ球をstimulatorとしてリンパ球混合培養試験を行った。3.胎盤から産生されるmicro RNAが母体リンパ球に存在することの証明母体末梢血NK細胞のmiRNA-mRNAの網羅的発現解析により母体NK細胞には胎盤由来miRNAであるC19MC miRNAが存在し、妊娠週数とともに増加した。in vitroモデルで絨毛癌細胞BeWo細胞由来のC19MC miRNAがエクソソームを介して、T細胞株であるJurkat細胞に取り込まれ、PRKG1の発現を抑制することを示した。すなわち母体免疫細胞が胎盤由来のエクソソームを介して胎盤由来miRNAを取り込み、内在遺伝子の発現を修飾していることを初めて明らかにした。・CD4+CD25+CD127lo/-細胞として制御性T細胞を単一細胞で抽出し、mRNA発現を単一細胞毎に検出するシステムを構築した。90%の確率で単一細胞に純化したCD4+CD25+CD127lo/-から制御性T細胞の転写遺伝子であるFoxp3 mRNA mRNAが検出され、手技が確立していることを確認した。・すでに流産例10例、正常妊娠例10例の解析は終了しており、増幅したT細胞受容体(TCR)を母体末梢血リンパ球にレトロウイルスを用いて30%の高率で導入する系を確立した。その結果、正常妊娠ではTreg細胞のTCR発現に集積があったが、流産例ではなかった。・現在、これらのTCR発現細胞と臍帯血との混合リンパ球培養試験(MLR)を3例に施行した。これら集積しているTCRの一部が臍帯血上の抗原を認識していた。・胎盤から産生されるmiRNAを網羅的解析し、これら胎盤