hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小管状高分子を基盤とする動的超分子マテリアルの創成と制御

生体系にみられる「分子を一方向に移動・回転する分子モーター」を人工系で可能にすることを目指し、本研究では微小管状高分子やロタキサンといった運動モードの異なる分子素子を組み合わせてマクロな運動系の構築を行った。具体的には1)剛直なキラルユニットの連結による微小管状高分子の構築と内孔の応用、2)ロタキサン素子の構築と複合化、3)分子モーターの創成、4)分子モーターと有機・無機材料との複合化による運動マテリアルの創成を行った。生体系で普通に見られる、分子を1方向に移動・回転する分子モーターを人工系で可能にすることは、化学における夢である。本研究ではロタキサンをらせん状に集積した微小管状高分子を創成し、ロタキサンの微細な運動ベクトルの効果的な増幅法の確立を目的に研究を行った。その結果、(1)剛直なキラルユニットの2点連結重合を基盤とする微小管状高分子の構築に成功した。特にC_2キラルユニットとしてビナフトールやスピロビフルオレンを平面スペーサーとしてサレン錯体を用いる配位結合型2点重合法に加え、アントラキノンユニットを平面スペーサーとして利用する全共有結合型2点連結重合法も見いだした。また(2)新しいロタキサン素子・スイッチの開発に向けて検討を行った結果、熱応答性型ロタキサンスイッチ((i)トリクロロ酢酸塩含有ロタキサンの脱炭酸駆動型スイッチと(ii)シクロデキストリン型ロタキサンのサイズ相補性末端置換基を利用した熱応答性スイッチシステム)を2点開発した。(i)については、溶液及びバルク中での分解・脱炭酸挙動を精査し、分解に伴い輪成分の位置が変化することを明らかとした。また(ii)については、シクロデキストリンのサイズ相補性置換基を発見し、それを用いる[3]ロタキサンを合成し、ユニークなデスリッピング挙動を明らかとした。そのほか、メカノクロミック材料創成にむけた基本骨格である力場応答性ロタキサン蛍光スイッチを創成し、その特性を評価した。その結果、1剛直なキラルユニットの2点連結重合を基盤とする微小管状高分子の構築に成功した。C2キラルユニットとしてスピロビフルオレンを使用し、平面スペーサーとしてアントラキノン誘導体を用いた全共有結合型2点連結重合法を見いだした。また、スイッチ可能な平面スペーサーとしてビチオフェン構造を導入し、その酸化・還元に伴う2点連結-1点連結のスイッチを達成し、フォルダマーとしての機能を見いだした。2新しいロタキサン素子・スイッチの開発に向けて検討を行い、熱応答性型ロタキサンスイッチを2つの視点から開発した。まず1つ目は化学的な熱応答性スイッチとしてトリクロロ酢酸塩含有ロタキサンの脱炭酸駆動型スイッチを確立した。これはトリクロロ酢酸塩の脱炭酸反応によりロタキサンが中和されるメカニズムで、中和に伴いロタキサンの輪成分が解放される系となった。もう1つは熱力学的な熱応答性スイッチで、シクロデキストリン型ロタキサンのサイズ相補性末端置換基を利用した熱応答性スイッチである。これはシクロデキストリンの内孔と同程度の嵩高さをもつ末端基を利用する方法で、末端基の構造のわずかな違いによりそのデスリッピング挙動が変化することを見いだした。このサイズ相補性ロタキサンの概念はシクロデキストリンだけでなくクラウンエーテル系でも適用が可能であるため、構造の明確なサイズ相補性ロタキサン架橋剤の合成およびその架橋体の熱応答性スイッチによる分解性について検討した。生体系に普通にみられる"分子を一方向に移動・回転する「分子モーター」"を人工系で可能にするという化学における夢の実現に向け、本研究では、ロタキサンをらせん状に集積した微小管状高分子を創成し、ロタキサンの微細な運動ベクトルの効果的な増幅法の確立を目指し、これまでに微小管状高分子の構築法法の確立とモーター素子となるロタキサン部位の簡便なスイッチ機構の構築および集積化を達成している。本年度は主に高分子に対し、モーター素子となるロタキサン構造を限定的に導入する反応および合成法の開発を行った。具体的には1)高分子をロタキサン結合で精密に連結したロタキサン連結高分子の合成法およびトポロジー変換系の構築、2)サイズ相補性置換基を利用したロタキサン構造の導入率や分解特性を制御したポリロタキサンおよびロタキサン架橋剤の開発、3)液晶エラストマーへのロタキサン構造の導入検討、4)アンビデント反応剤の開発と高分子反応特性の精査である。1)では高分子中に精密にロタキサン構造を導入するためにロタキサン型重合開始剤を開発した。これを用いてリビング重合を行い、高分子末端に精確にロタキサン構造を導入することに成功した。

また、2)では塩基や特定のイオン刺激により分解するサイズ相補性ロタキサン型架橋剤を開発し、ビニルモノマーの光重合反応系に添加して架橋ポリマーを得た。得られた架橋ポリマーは安定でありながら、塩基やフッ化物イオン存在下では速やかに解架橋し、高選択的に高分子中のロタキサン構造を除去する方法を確立した。3)では液晶エラストマーへのロタキサン構造の導入と液晶場への影響を明らかにし、4)では無触媒・無溶媒で種々の不飽和結合と反応するニトリルオキシド反応剤にケテン前駆体であるメルドラム酸誘導体を導入し、様々な機能性分子を簡便に集積するアンビデント反応剤を開発した。生体系に普通にみられる"分子を一方向に移動・回転する「分子モーター」"を人工系で可能にするという化学における夢の実現に向け、本研究では、ロタキサンをらせん状に集積した微小管状高分子を創成し、ロタキサンの微細な運動ベクトルの効果的な増幅法の確立を目指し、これまでに微小管状高分子の構築法法の確立とモーター素子となるロタキサン部位の簡便なスイッチ機構の構築および集積化を達成している。本年度は申請研究の最終年度であり、人工モーターの構築に向けて、前年度までに得た成果をもとに、伸縮と回転・変角系の運動動作系について検討を行った。具体的には1)分子モーターの創製およびその特性評価、2)スイッチ可能な微小管状高分子の内孔の応用と制御、3)人工分子モーターと有機・無機材料との複合化による運動性マテリアルの創製である。1)では、これまでの研究で確立した2点連結法による剛直らせん高分子の合成の応用として、光照射による1点連結ー2点連結を行ってきた。今年度はこの刺激応答スイッチを多様化すべく、酸化還元による1点連結ー2点連結スイッチ系を確立した。このような酸化還元場によって、ランダムなコンフォメーションを形成している高分子を方向性を有する剛直らせん上へと可逆的に変換することで、分子モーターの基本動作である伸縮系が構築できた。2)では1)で合成した微小管状高分子の内孔の利用について検討した。微小環状高分子の内孔はそのサイズや不斉による選択的包接場としての利用が期待される。そこでまずは金属イオンを包接するようにオリゴエチレン鎖を側鎖に有する微小管状高分子を合成し、金属イオンの包接による呈色や蛍光の変化について検討を行ったところ、特定の金属イオンに対する認識能を示し、蛍光の変化が観察された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していたチオインジゴの光異性化に伴う反転を利用した剛直ならせん状-ジグザグ平面構造の変換が可能な微小管状高分子の検討は、合成上の問題により十分に進展させることができなかったが、ロタキサン構造で高分子を連結したロタキサン連結型高分子の合成においては大きく進展した。ロタキサン構造で連結することにより、線状ポリマーを分岐ポリマーへと高分子トポロジーを変換できることを示し、ヘテロな高分子鎖を連結すれば、トポロジー変換が可能なブロックポリマーを創製できることを示した。また、液晶エラストマーへのロタキサン構造の導入も種々条件を検討した結果、重合系へロタキサン構造を添加することで適切にロタキサン構造を導入する方法を見出すことができた。さらに熱に応答してロタキサン構造が可動になる分子スイッチ機能が液晶場へ与える効果についても、初期的な知見を得ることに成功した。
多元素同位体比分析による古代西アジアにおける古環境復元

環境変動は人類の移動・拡散、文明盛衰に深く関与する。本研究では環境に関する情報を骨や歯などの考古資料から直接引き出すための多元素同位体比分析法の確立を目指した。高融点金属炉を導入することで、これまで多くの研究で不完全であったリン酸、炭酸、硫酸態酸素の高精度同位体分析が可能になった。突発的な環境変動を引き起こす要因となり得る、火山活動、隕石衝突、宇宙線強度変調が生物活動にどのような影響を与えうるのか検討した。本年度は下記の[1]-[4]の研究を行った。[1]コラーゲン同位体比分析、特に、微小量資料の炭素、窒素、硫黄同位体比分析を進めるため、反応管などの改良を試みた。微量窒素同位体比測定における妨害となるCO2除去のために、アスカライトを詰めた反応管を設置し、有効に働くことが分かった。また、還元銅の純度が窒素同位体比の測定精度に影響を与えることを見出した。どのように同位体比測定に影響が出始めるのかに関する基礎データを得ることができた。特にm/z = 30を常時モニタリングすることが重要であることが分かった。[2]リン酸イオンの酸素同位体比測定用にタンタル炉を導入した。この炉により試料の2000°Cまでの加熱には成功したが、温度下降時の材質の収縮により真空漏れが生じることが分かった。炉材、ネジともに膨張するが、それが戻るときにネジが緩んだ状態になっている。ネジの材質の変更やネジとタンタル・フィラメント(熱源)の間に遮蔽板を置く処置を施した。これにより真空度の漏れの程度は低下した。温度を加工させるときの漏れなので1回の使用に関して言えば問題は生じないが、定常的な利用のためには改良が必要になる。これらのタンタル炉導入に関する基礎データを解析し、日本質量分析学会同位体比部会研究会において研究発表を行った。[3]Sr同位体比分析に向けての準備:次年度からアパタイトのSr同位体比分析を始めるにあたり、分析手順の確認など前準備を行った。[4]人類の拡散、絶滅(もしくは人口低下)に関わるような環境変動を検討し、それを化学的指標で読み解くための方法を検討した。これに関連して質量分析総合討論会や日本地質学会学術大会において研究発表を行った。本研究では下記の研究を行った。[1]リン酸-酸素同位体比分析装置の開発:リン酸イオンの酸素同位体比測定のために必要となるタンタル炉をH25年度に導入した。炉心管はタングステンであり、その周りを2000°C程度まで加熱する。タングステンは高融点の材質であるが、酸素雰囲気下での加熱では酸化されるために、真空容器内に炉心管を設置する必要がある。しかし、高温から冷却する時に炉心管接続部分で真空漏れが生じることがわかり、その対応が必要となった。同様の装置ではこれまでこのような真空漏れは生じていなかった。炉心管の堆積を小さくすることにより、発生した(測定に必要な)ガスの広がりを抑えることができると考え、炉心管を通常よりも短くすることにしていた。しかし、このことが問題であったと考え、炉心管を通常の長さに戻すことにした。これに伴って部品の交換などを行い、真空試験を行ったところ、2000°Cでの漏れはなくなり、実験が可能になった。酸素分析では固体物質に含まれる酸素をCOに変換することで同位体比分析が可能になる。市販装置の炉での1300°Cまでの加熱では、リン酸銀の酸素をすべてCOに変換することはできていなかった。10%以上の残存物質が炉の中に残っていた。この残存物質が後の測定に影響を与えたが、この新規導入したシステムでは、1600°C以上で100%の酸素の変換が可能になった。この間に得たデータを基に日本質量分析学会・同位体比部会研究集会で研究発表を行った。[2]低濃度硫黄試料の同位体比分析:硫黄は反応性が高いガスであり、低濃度になるほどその影響が如実に表れる。特に、発生したガスの分離に使うガスクロマトグラフィーカラムの設定に大きく依存することが分かってきた。この手法を用いて岩石試料の同位体比分析を進めた。骨コラーゲンにおいても扱える硫黄量は少ないので、このような手法の確立は不可欠である。[1]酸素同位体比分析装置の開発:リン酸イオンの酸素同位体比測定のために必要となるタンタル炉をH25年度に導入した。このとき高温から冷却する時に炉心管接続部分で真空漏れが生じることがわかり、H26年にはその対応として炉心管の長さを長くして熱源と接続部分の距離を大きくすることで漏れを防いだ。しかし、炉心管の体積を大きくしたことにより、ガスが拡がり、感度が低下した。これを解決するために、他の不要な配管の見直しなどにより、体積減少を試み、感度を上昇させることができ、高精度測定が可能になった。炭酸、硫酸の酸素同位体比分析にも着手した。それぞれの化学種によって酸素の抽出効率が異なる。特にCaCO3では、CO3のうちの2酸素原子は容易に抽出が可能であるが、残り一つの原子の抽出は本装置の最高温度の2000°Cにおいても難しいことが分かった。

ただし、抽出比率は温度によらず一定であり(正確に2/3になる)、適切な標準試料を用いて測定し、炭酸カルシウムに限定するなどの方針で測定は可能になる。BaCO3では異なる傾向を示した。混合物を扱う場合や同じバッチに塩基の異なる炭酸塩を扱う場合などには注意が必要となる。これらの測定で得たデータをもとに日本質量分析学会・同位体比部会研究集会で「連続フロー型同位体質量分析装置による固体試料の酸素同位体比分析」というタイトルで発表した。[2]低濃度硫黄試料の同位体比分析:硫黄は反応性が高いガスであり、低濃度になるほどその影響が如実に表れる。特に、発生したガスの分離に使うガスクロマトグラフィーカラムの設定に大きく依存することが分かってきた。この手法を用いて岩石試料の同位体比分析を進めた。骨コラーゲンにおいても扱える硫黄量は少ないので、このような手法の確立は不可欠である。また、試料中のC/S比が測定値に影響を与える可能性が示された。この確認も不可欠になる。リン酸酸素分析用に導入した高温炉の感度改善に時間を多くの費やすことになった。必要のない体積を減少させつつ、ガスの流れを適切に保つ必要があり、トライアンドエラーを繰り返す必要があった。最終的には当初予想していた程度には感度を上げることができた。考古資料をできるだけ破壊せずに分析するためには、より少ない量での高感度分析が必要不可欠である。また、このような検討は、酸素以外の同位体比分析にも共通していることであり、無駄にはならない。本年度は下記の研究を行った。1.酸素同位体比分析装置の開発:H25年度に導入したタンタル炉を使用し、酸素同位体比分析を進めた。本装置では試料を最大2000°Cまで加熱することができ、試料中酸素をCOに変換する。COは質量分析計に導入され、その同位体比を決めることができる。これまでリン酸態酸素、硫酸態酸素の同位体比分析を確立し、0.1mgの酸素に対して0.3‰程度の精度で分析が可能になった。酸素同位体の標準試料として一般に使われている物質は炭酸塩鉱物(NBS19, NBS18)が多く、それと直接比較できるようにするため、炭酸塩態酸素の分析に着手した。CaCO3では、CO3のうちの2酸素原子は容易に抽出が可能であるが、残り一つの原子の抽出は本装置の最高温度の2000°Cにおいてもできなかった。毎回正確に2原子分がCOに変換できているが、残存した残り1原子分は完全に系から隔離されているわけではなく、次の試料以降に影響を及ぼすことが分かった(メモリー効果と呼ばれる)。このことは3原子の完全な変換ができなければ正確な測定が難しいことを意味している。試料は銀カプセルに包んで炉に導入されるが、ここにAgClを添加することで、CaCO3のすべての酸素をCOに変換することが可能になった。適切なAgCl添加量を見出し、余剰に出る塩素系ガスはアスカライトで捕獲できた。この方法により炭酸態酸素も、硫酸態、リン酸態酸素と同様の0.3‰程度の精度で分析が可能になり、標準試料の化学形態に関わらず、共通の検量線を作成することが可能になった。2.低濃度硫黄試料の同位体比分析:これまで確立した低濃度硫黄同位体比分析を用いて、火山性物質や堆積岩試料の硫黄同位体分析を進めた。Ikehata and Maruoka (2016)、Izumino et al. (2016)などにまとめることができた。本年度は下記の(1)-(5)に関する研究を遂行した。
SQUID-NMRによる1次元トンネルに吸着されたヘリウム3の基底状態の研究

多孔体FSM中の直径2.8nmの1次元細孔をヘリウム4で被覆しヘリウム3を浮かべた場合、ヘリウム3は高温で2次元古典理想気体の比熱を示し、0.1Kの温度近傍でピークを持ったあと、低温で縮退を示す温度に線形な比熱を持つことが実験で示されていた。我々のモデル計算との比較から、この比熱ピークが、1次元細孔の周方向運動の最低励起状態への熱励起によるもので、低温に1次元ヘリウム3流体が実在し高温で2次元気体へクロスオーバーしているとして解釈可能であることがわかった。まずこの解釈の妥当性を検証するため、本研究の初年度には、1次元細孔径を小さくした場合のヘリウム3比熱について測定を行い、熱励起による比熱ピークが高温へシフトするということが確認できた。この実験結果は、孔径を小さくするに従って最低励起エネルギーが大きくなることによるものと考えられ、ヘリウム3気体の次元性クロスオーバーの解釈を支持し、孔径を小さくすることでヘリウム3の1次元流体が実現できる温度範囲が広がることが明らかになった。今年度は、さらにこの次元性クロスオーバーを仮定したモデル計算の精度を高め、より広い密度範囲で、比熱の温度依存性の実験結果と計算の比較を行った。また、微視的な情報、特に1次元ヘリウム3の基底状態について知見を得るための、SQUID-NMR実験の核となる広帯域SQUIDセンサーを、実際に実験に使用する大型希釈冷凍機に設置し試験運転を繰り返し行った。このセンサーには希釈冷凍機の高真空空間における冷却に問題があることがわかったため、ノイズ対策や、回路を直接冷却する熱リンクの設置など、センサーの製作技術者と連絡をとり改良を進めている。今後、この冷却の問題を解決し、NMR法を用いて1次元ヘリウム3気体の基底状態の微視的情報を得るべく、研究を継続、発展させる。これまで、多孔体FSM中の2.8ナノメーターの直径の1次元トンネルをヘリウム4で被覆しその上にヘリウム3を浮かした場合、0.1Kの温度近傍で観測される比熱の山が気体ヘリウム3の運動状態の1次元から2次元へのクロスオーバーによるものと解釈されることがわかっていた。これは、1次元トンネルの周がナノメータースケールであるため、周方向の運動状態が離散的になり、その結果、最低励起状態への熱励起が比熱の山を形成することによる。これについて、孔径を2.2および1.8ナノメーターに変えた場合の比熱について調べた。この場合、最低励起エネルギーが孔径が小さくなるに従って大きくなり、比熱の山が高温にシフトすることが期待される。比熱実験の結果、この比熱の山の高温へのシフトを確認した。また、実験結果をモデル計算と比較することでよい一致が得られ、この系において100mKの温度域で、フェルミ粒子であるヘリウム3の1次元系が形成されていることが確認された。また、孔径の小さな多孔体を用いることで、この1次元領域を高温へ拡張できることがわかった。低温の温度に線形な比熱によって示唆された、ヘリウム3のこの1次元の縮退状態は、朝永ラッティンジャー液体など高次元の場合ののフェルミ縮退とは異なる状態であると考えられる。これを検証するための核磁気共鳴の実験を行うため、今年度の補助金で超流動線材など装置を組みあげるための材料を購入し、現在実験準備を進めている。
歴史天候情報システムの作成と古気候の復元

実行計画書に記した通り、本研究は今後の国際地球生物圏計画(IGBP)と関連した「歴史時代の古環境の復元」の一つとして「歴史時代の気候復元」の準備を目的として計画された。1歴史天候情報システムに関連して(1)従来の歴史天候デ-タベ-スは、大学間、大学内の通信、デ-タの修正に関して不都合の存在が判明。このため、パソコンと光磁気ディスクを利用した新規システムを設計。1700ー1890年にかけて、コ-ド化した天候情報をのべ800713レコ-ド入力し、天気分布図等の図型出力等の応用プログラムを作成した。(2)長崎・都城・鳥取について資料の解読。横浜・多度津等について仮入力をした。また、木更津・銚子等の新資料を発見。2に関連しテキストデ-タベ-スの基本設計をした。2古気候の復元方法に関する研究(1)冬から春にかけての日々の天気図型の推定には,天気分布以外に風に関する記述が有効であること。天気図型のシ-ケンスを参考にする必要があることが判明。(2)大阪を例に天保期の3月の月平均気温を,推定した気圧配置型の頻度,天気別日数、桜の開花日の記録から,それぞれ独立に推定し比較した。各々の推定値はかなり平行するものの、値に差が認められた。(3)日光と盛岡について長期の自然季節の変動が調査された。日光では10年の移動平均値上で,各季節の入りは平均に対し前後10日でおさまる。今日的な自然季節の状能に入ったのは1840年以後。盛岡では季節の変動に、季節を異にする前駆現象の存在が明らかになった。3その他購入した設備備品は新期作成しているデ-タベ-スの拡充と運用、研究分担者に対する資料提供に使用されており、今後もさらに研究に役立て行く。研究分担者の研究成果は本年9月に計画されている、国際シンポジュウムに発表予定でいる。
余剰汚泥を触媒とした下水処理場における化成品製造ポテンシャルの検討

平成30年度は、課題1『余剰汚泥の化成品生産ポテンシャルの評価及び効率的生産条件の検討』について、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)、グリコーゲン(GLG)、トリアシルグリセロール(TAG)を化成品の候補として取り上げ、以下の研究を実施した。下水処理場より採取した汚泥を用いて、種々の炭素源からのPHA、GLG蓄積の可能性を調査するとともに、各炭素源からの合成経路を推定した。その結果、脂肪酸からは主にPHAが合成され、糖類からはGLGとPHAが合成されることが確認され、純菌レベルで知られているPHA・GLG合成経路から、それらの合成の大小をある程度把握することが可能であることが明らかとなった。また、PHAのうち、ポリヒドロキシ酪酸の合成には酪酸とピルビン酸、ポリヒドロキシ吉草酸の合成にはプロピオン酸が有用であることも明らかとなった。しかし、PHA、GLGの蓄積率はいずれの炭素源でも30%を下回ったことから、実用化を想定した蓄積方法の改良が必要であることも明らかとなった。他方、TAG蓄積についても検討し、純菌ではグルコースを基質として蓄積し得ることが明らかとなったが、汚泥による蓄積はわずかであることが確認され、余剰汚泥への高蓄積にはさらなる検討が必要であると考えられた。また、汚泥中への高蓄積の可能性があるPHAを対象として、余剰汚泥中のPHA蓄積微生物の短期間での集積方法について検討を行った。その結果、炭素源の過剰ー欠乏状態を繰り返すFeast-famine法の原理と、PHA蓄積に伴う細胞密度上昇を踏まえたPHA蓄積後の短時間沈殿を組み合わせることにより、数日間の集積期間でPHA蓄積能を大幅に向上させることが可能であることが見出された。また、微生物叢解析により、本集積法によってRhodoccyclalesの一部の微生物が選択的に増加することが明らかとなった。平成30年度の研究では、種々の典型的な炭素源から合成され得る化成品候補を明らかにし、その合成経路を推定することを通じて、有望な基質をある程度選定することができた。また、PHA蓄積微生物を対象として、短期間集積の可能性を明らかにすることができた。これらにより、予定した研究内容を概ね達成し、次年度の研究の進展につながる有用な知見を得ることができた。現在のところ問題なく進展しており、研究計画について特段の変更等は必要ないことから、当初予定の通り研究を推進し、また研究成果の積極的な公表を進めていく。
miRNA標的遺伝子スクリーニング系の開発

蛍光タンパク質遺伝子の非翻訳領域に、miRNAと完全に相補的な配列を挿入したウイルスベクターを構築し、miRNAの発現を生きた細胞内で検出する方法を構築した。筋肉特異的に発現するmiR-133について、幹細胞から筋管細胞へと分化する際に発現上昇するmiR-133の様子を生きた細胞内でレシオイメージングすることにより定量的に捉えることに成功した。本系はmiRNAの標的配列探索にも展開することが可能である。マイクロRNA(miRNA)は,22塩基程度の小さなノンコーディングRNAであり,遺伝子の発現を特異的に抑制することが知られている。部分的な相補性を持つ標的mRNAの翻訳を抑制することで遺伝子発現を抑制している。これまでの解析で,多くのmiRNAは生体の発生段階で時期,組織特異的に発現し,生体の発生分化をコントロールしていることが明らかとなっているが,詳細な機構は分かっていない。これまでの予備研究において,緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子の3'非翻訳領域にmiR-133の標的配列を挿入したウイルスベクターを構築した。このベクターにはGFPとは独立して発現する赤色蛍光タンパク質(RFP)を同一ベクターに搭載してある。GFPの下流に挿入された標的配列が,miR-133の添加によって翻訳阻害を受けると,レポーター遺伝子であるGFPの発現が抑制されることを確認している。また,筋芽細胞における筋肉への分化誘導時に,miR-133の発現上昇とともにGFPの蛍光が減少し,筋肉分化への指標としてmiRNAを利用することができることを示した。この方法は,生体内でリアルタイムにmiRNAの活性を観察できる方法としても有用であり,多くのmiRNAに対して適用できる可能性がある。また,生体内でリアルタイムにmiRNAの発現を直接的に検出できる方法についても取り組んでいる。本研究では,miRNAが標的とする遺伝子の探索システムを開発することを最終的な目的とし,今後は標的配列ライブラリーを作成し,遺伝子のスクリーニングが可能な系を構築に取り組む。マイクロRNA(miRNA)は、22塩基程度の小さなノンコーディングRNAであり、遺伝子の発現を特異的に抑制することが知られている。これまでの解析で、多くのmiRNAは生体の発生段階で時期組織特異的に発現し、生体の発生分化をコントロールしていることが明らかとなっているが、詳細な機構は分かっていない。本研究では、miRNAを生体内で定量的に観測する技術を用い、これまで明らかとなって来なかったmiRNAの作用機序の解明を試みている。昨年度までに、2色(緑色および赤色)の蛍光タンパク質発現カセットを搭載した独自のレトロウイルスベクターを用いて、筋肉細胞特異的に発現するmiR-133を生きた細胞で観測することに成功している。しかし従来のレトロウイルスベクターには、複数の遺伝子発現カセットが近接する場合、それらの遺伝子発現が干渉してしまうという問題点があった。そこで本年度では新たなアブローチを試み、2つの遺伝子の発現が完全に相関するレンチウイルスベクターの構築に成功した。この新しいレンチウイルスベクターを用いることにより、生きた細胞内でのmiRNAの発現の定量的解析し、なおかつイメージングすることに成功した。フローサイトメトリー解析の結果から、1細胞に1ウイルスだけ感染する条件を見つけ出し、これらの条件下でも定量的にmiRNAの発現を解析できることが明らかとなった。本ベクターを用いることによりmiRNAの標的遺伝子のような遺伝子発現が調節される配列を網羅的に探索することが可能となった。
二次共生成立に関与する遺伝子と遺伝子産物の網羅的解析

繊毛虫ミドリゾウリムシの細胞内には約700個のクロレラが共生している。本研究課題は、二次共生成立に関与する遺伝子と遺伝子産物を網羅的に解析することを目的として行った。クロレラが共生前後の細胞からRNAを抽出し、Illumina HiSeq2000によるシークエンスをおこなった。その結果、クロレラとの共生による宿主側の遺伝子発現の変化が初めて明らかになった。発現が変化する遺伝子数は6,698であり、その中には、ストレスタンパク質遺伝子や抗酸化作用をもつグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子などが含まれていた。さらに、細胞内共生成立機構に関与する細胞生物学的なデータをいくつか得た。ミトコンドリアや葉緑体を生み出した細胞内共生は現在でも多くの生物同士で見られ、新たな機能と構造の獲得による真核細胞の進化の原動力となっている。しかしその成立機構は明らかにされていない。研究代表者らは繊毛虫のミドリゾウリムシとその共生クロレラ用いて、真核細胞同士の細胞内共生が成立するプロセスを明らかにした。このプロセスは次の4つからなる。1)クロレラが宿主食胞内でリソソーム消化酵素耐性を示す。2)クロレラが宿主食胞膜から細胞質へ脱出する。3)クロレラを包む食胞膜が、リソソームが融合しないPV膜と呼ばれる共生胞へ分化する。4) PV膜に包まれたクロレラが宿主細胞表層直下へ定着する。本研究は、細胞内共生成立に必須な上記の4つのプロセスに関与する重要分子の解明を目的としている。本研究では、クロレラが細胞内に共生しているミドリゾウリムシとクロレラを除去したミドリゾウリムシからRNAを抽出し、それぞれのcDNAライブラリを作成し、そのcDNAを用いて、Illumina HiSeq2000による宿主細胞側の遺伝子発現の変化の解析を行った。平成25年度は、Biological replicatesのシークエンスのデータも含めて3回のシークエンスのデータ解析を行い、DDBJへの登録が完了した(Kodama et al., 2014)。今年度は以下の成果を得た。1.クロレラの再共生過程におけるクロレラの細胞分裂の開始時期を明らかにした。さらに、クロレラの細胞分裂に与える宿主の餌の有無の影響を調べた結果、共生が成立して72時間以内には、PV膜を介した宿主とクロレラの物質交換が可能になることが明らかになった。2.クロレラは宿主細胞表層直下のどの部分にも均等に接着しているのではなく、宿主の背側・腹側、後端、前端の順に接着しやすく、この逆の順に外れやすいことが明らかになった。3.クロレラが共生している状態のミドリゾウリムシとクロレラを除去したミドリゾウリムシからRNAを抽出し、それぞれのcDNAライブラリを作成し、Illumina HiSeq2000によるシークエンスをおこなった。Biological replicatesのシークエンスのデータも含めて3回のシークエンスのデータ解析を行い、DDBJへの登録作業を行った。現在執筆中の論文は近日中に国際誌に投稿予定である。実験は、交付申請書に記載した計画どおりに進展している。また、学会発表や論文による成果の発表もおおむね順調である。平成25年度は、昨年の成果を国際誌に投稿する。また、交付申請書に記載したとおり、前年度中のトランスクリプトーム解析で重要な機能が予測された遺伝子の機能をRNAiで明らかにする。ミドリゾウリムシではまだRNAiは行われていないが、ヒメゾウリムシ(Paramecium tetraurelia)とゾウリムシ(P. caudatum)では、山口大学で最適条件が開発済みであるため、同様な条件で実施できることが期待できる。該当なし
グリア新生と血管新生の両者を標的としたＡＬＳ脊髄再生誘導

進行性運動神経変性を特徴とする筋萎縮性側索硬化症(ALS)における神経再生誘導療法開発のための基盤研究を行った。胎生期と異なり、成体脊髄では神経新生が生じていないが、発症後ALSモデル成体脊髄では神経前駆細胞の増殖と未成熟ニューロンの出現を認めた。中心管周囲でも有意な新生細胞増加が認められ、多くはグリア増生・グリア炎症に関与する中、未分化神経前駆細胞も増加した。血管新生調整作用をもつ因子の髄腔内持続投与で、グリア増生抑制と部分的再生現象促進が得られた。また、新たに再生反応を検出しやすいALSモデル動物の作出を行った。グリア新生および血管新生の制御が新たな治療標的となり得ると考えられる。本研究は、成人発症かつ35年で呼吸不全をきたす過酷な神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)を念頭に、脊髄における進行性の運動ニューロン変性に対して不十分ながら成体中枢神経系が本来もっている内在性再生能を有効に活用した神経再生誘導療法開発を目的としている。細胞補充のみを目的とした場合、外来性の細胞移植と内在性神経幹/前駆細胞活性化という2つのアプローチがあるが、本研究はそのいずれにとっても重要な「再生の場」すなわち微小環境に重きをおいている点が特徴である。一方、変性脊髄における内在性再生能は、成体脊髄に内在する神経幹/前駆細胞のみならず、再生や可塑性を許容または制限し得る細胞外微小環境によって規定されている。本年度の研究により、ALSモデルラット脊髄運動ニューロンの変性が進行する中で、生理的条件下では検出されない表現形質をもつグリア系細胞が病変の主座(脊髄前角)を中心に新生・増殖していること、それらがいわゆる神経炎症を増悪している可能性が明らかとなった。さらに、新生血管を安定化する外来性因子の選択的な脊髄腔内持続投与という治療戦略が、神経炎症を抑制し、神経保護につながる可能性を見出した。将来的なALS再生誘導療法開発においては、単なる運動ニューロン補充ではなく、再生の場である微小環境を形成する細胞因子として新生グリア細胞、新生血管のコントロールもまた重要と考えられ、さらなる本研究の進展が期待される。進行性の運動ニューロン変性に対して、不十分ながら成体脊髄がもつ内在性の再生能力を活性化させる効果的な神経再生誘導法を開発するための基盤研究を行った。本研究では、筋萎縮性側索硬化症(ALS)変性脊髄における内在する神経幹/前駆細胞を単に増殖させるだけでなく、過度なグリア新生の抑制、ニューロン新生の促進、そのために必要な微小血管新生のコントロールを効果的に行って再生の場を形成する治療戦略を見出すことを目的としている。前年度までに、発症後のALSモデルラット脊髄に未分化神経前駆細胞の増殖と未成熟ニューロンのマーカーを発現するニューロンの出現を確認した。さらに、ALSモデルラット骨格筋においても運動ニューロン軸索変性に伴う神経原性筋萎縮が慢性に進行する中で、内在性の骨格筋再生機転が存在していることが明らかとなった。本年度、ALS脊髄運動ニューロンの変性脱落に伴う新生細胞の増加を潜在的な神経新生環境とみられる脊髄中心管周囲においても解析した。脊髄中心管周囲では、運動ニューロン病変から離れているにもかかわらず発症早期から活発な新生細胞増加が認められた。その多くはグリア増生とグリア炎症に関与している中で、少ないながら内在性未分化神経前駆細胞の増殖も認められた。このALSモデルラットで再生誘導因子、とくに微小血管新生調整作用をもつ因子の髄腔内持続投与を発症後に行うと、部分的な内在性再生機転の促進が認められた。このような神経再生誘導が新たな治療戦略となる可能性がある。一方、新たに内在性再生を検出しやすいALSモデルラットの作出を試みた。現在、ALSモデルラットとしての妥当性、および胎生期から生後、ALS様症状の発症期に至るまで、内在性神経幹/前駆細胞を中心に縦断的な組織学的解析を行っている。本研究では、進行性の運動ニューロン変性に対して不十分ながら成体中枢神経系が本来もっている再生能力(内在性再生能)を生かし、効果的な神経再生誘導療法を開発するための基盤研究を行う。したがって本研究は、既存研究から示唆されるような筋萎縮性側索硬化症(ALS)変性脊髄における内在性再生能の存在と、介入なしにはなし得ない限界をふまえ、十分な神経再生につながらない要因、すなわち微小環境と成体脊髄に内在する神経幹/前駆細胞そのものの特性を解明することを目的としている。本年度の研究により、ALSモデルラット骨格筋では運動ニューロン軸索変性に伴う神経原性筋萎縮が慢性に進行する中で、内在性の骨格筋再生機転が存在していることが明らかとなった。

数多い神経細胞の中で運動ニューロンは長大な軸索をもつ最も大きな細胞体を有している。その細胞外微小環境として中枢神経系の細胞体周囲のみならず、末梢の支配骨格筋における軸索終末周囲にも注目すべきと考えられる。将来的なALS再生誘導が機能再生をめざすものであるゆえに、運動ニューロン再生のみならず骨格筋再生促進と筋萎縮抑止による末梢からのアプローチもまた重要と考えられる。試薬類の再購入、ALSモデルラットの繁殖・コロニー復元、アッセイ系の再構築と対照凍結サンプルの再取得を達成した。研究推進体制は円滑に稼働しており、既に新規の研究成果を得ている。2011年3月11日の大震災により研究代表者の施設も甚大な被害を受け、復旧作業は数ヶ月以上にわたった。実際、本研究に使用する見込みであった既存の冷凍・冷蔵試薬類、アッセイ系の構築に必要な対照凍結サンプル(脳・脊髄組織,脳脊髄液等)などは数週間にわたる停電により、超低温庫や冷凍冷蔵庫が機能しなかったためすべて融解あるいは失活し喪失した。本研究に使用するため系統維持していたALSモデルラットも動物実験施設内で一定の期間飼育管理が困難となり、動物数の縮小を余儀なくされた。以上の理由により当初の計画に比して進捗はやや遅れているが、その後は施設復旧後、試薬類の再購入、ALSモデルラットの繁殖・コロニー復元に努め、アッセイ系の再構築と対照凍結サンプルの取得を進めることができ、上記の成果を得るとともに、次年度研究推進の準備は整えることができた。当初研究計画に則り、運動ニューロン変性によるALSモデルラット神経幹/前駆細胞挙動解析を完遂すると同時に、介入研究として神経幹/前駆細胞、微小血管、グリア系前駆細胞をそれぞれ標的とした脊髄腔内投与実験を行い、神経変性に対する保護効果を検証する。当初計画で平成23年度実施予定であった「神経幹/前駆細胞に蛍光蛋白EGFPを発現するラットとALSモデルラットの交配」によるダブル・トランスジェニックラットの作製を実施し、運動ニューロン変性による神経幹/前駆細胞の挙動解明を行う。その後、当初計画で平成24年度実施予定であった研究を実施する。「該当なし」当初計画(平成24年度)の通り、上記推進方策に記載のダブル・トランスジェニックラットの組織学的解析と同ラット由来の神経幹/前駆細胞に関する細胞生物学的解析に使用する。
ＡＤＨＤの抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果

最終年度は各調査・実験について必要に応じて追加調査,追加実験を実施すると共に,成果を論文としてまとめた。1. ADHD診断について:日本の心理臨床における自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder: ASD)の過剰診断の可能性を確認するために児童を取り巻く大人を対象として行った調査研究について,追加調査を実施した。本研究では,日本人のセラピストは,他の国のセラピストと比較してASDに敏感であり,ASDであると診断する可能性が高い。本研究は,文化的バイアスが臨床医のADHDとASDの診断に影響を与える可能性があることを示した。2.抑制機能におよぼす報酬と罰の効果の発達的変化(1)児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:発達障害や精神障害のない児童・青年における報酬と罰が抑制機能におよぼす影響の発達的な変化について行った行動実験について追加実験を実施し,再分析を行った。本研究は,報酬とフィードバックタイプの反応抑制に対する効果が発達的に異なることを示した。3.抑制機能におよぼす報酬と罰の効果の発達的変化(2) ADHD診断のある児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:ADHDのある児童・青年の抑制機能に対する報酬と罰の効果を検討するため,ADHDのある児童・青年,および発達障害の診断も精神疾患の診断もない児童・青年を対象に行った行動実験について分析・考察し,学会発表を行った。本研究は,ADHDにおける反応抑制に対して,報酬ではなく罰の効果が統制群と異なる可能性を示した。また,ADHDと統制群の間の非金銭的フィードバックの効果の差異が青年期に現れる可能性が示された。29年度が最終年度であるため、記入しない。AD/HD(注意欠陥/多動性障害)のアセスメントは主に面接と質問紙を用いて行われ,観察者の主観に依存する。AD/HDとASD(自閉症スペクトラム)は類似した併存症状を呈し,区別が難しい。しかし両者の適切な介入法は異なることから,正確なアセスメントが求められる。客観的に測定可能なアセスメント法を作成するためにはAD/HDの病態メカニズムを解明することが重要であることから,心理学的アプローチを用いて病態メカニズムの解明を目指した。また,ここ数年で愛着障害がAD/HDと類似した抑制機能の問題を呈する可能性が示唆され始めていることから,愛着の問題と抑制機能の関連についても検討した。まず,日本の心理臨床におけるASDの過剰診断の可能性を確認するため,こころの支援に関わる専門家や保護者を対象として発達障害等に関する理解を調査した。本研究は,発達障害を含むこころや行動上の問題の支援に重要な役割を担う専門家や保護者側の特性を知るものであり,基礎研究の結果を実践につなぎやすくする一助となると考える。続いて,AD/HDのある児童の抑制機能に対する報酬と罰の効果を検討するため,AD/HDのある児童を対象として実験を実施している。本実験は現在順調に進行している。さらに,AD/HDと類似した対人的な衝動性を示す愛着障害とAD/HDとを対比させることでAD/HDへの理解が深まると考え,成人を対象に,抑制を含む実行機能の複数のコンポーネントと愛着との関連を検討している。本研究の実施は終了し,現在分析段階にある。AD/HDのある児童を対象とした実験にかかる課題は順調に作成され,本研究課題を遂行するために必要な行動指標を抽出するための準備を整えた。一方,より児童の特性を正確に把握するために必要な行動指標以外の情報の収集にあたって幾つかの問題について協力機関との検討に時間を要し,参加者の募集開始が遅れた。しかしながら,これはより精度の高いデータを収集するために必要なコストであったと考えられる。この問題はすでに解決されており,当初より遅れながらもAD/HDのある児童を対象とした実験を開始している。また,愛着の問題と実行機能についての実験および一部の分析を終えるところまで進捗している。2.健康な児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:8歳から15歳の児童・青年を対象に反応抑制を測定する行動実験2種を行った。行動実験は,パフォーマンスに応じた報酬と罰を設定したものであり(すなわち,成功に対するポイントの加算,失敗に対するポイントの減少),報酬と罰には金銭的なタイプと非金銭的なタイプ(他者との比較によるランキング)の2種類があった。本研究の解析を終え,国際大会にて発表を行った。論文の執筆を終え,現在投稿手続きを進めている。3.AD/HD診断のある児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:AD/HDのある児童・青年(以下AD/HD児)の抑制機能に対する報酬と罰の効果を検討するため,7歳から15歳の男児を対象に,上記2と同様の手続きで行動実験を行った。本研究の解析・考察を終え,論文の執筆は順調に進んでいる。4.AD/HD診断のある児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化(縦断研究):発達的な効果を検討するため,上記2,3と類似した方法で縦断データの1時点目を取り終えた。今年度は,報酬・罰が反応抑制に及ぼする効果及び発達的な変化について定型発達の児童及びAD/HDのある児童を対象に検討することができており,課題は順調に遂行されている。しかし,これらの研究は横断研究であり,発達的な効果についての妥当性の低さは否めない。

そこで,ここで見出された結果の詳細を検討するために研究計画において縦断研究を予定した。この第1段階を終了しており,来年度に2時点目を取得する準備ができている。また,昨年度実施した研究について論文を完成させることができた。今年度行った研究についても解析は終了しており,執筆状況は順調である。最終年度は各調査・実験について必要に応じて追加調査,追加実験を実施すると共に,成果を論文としてまとめた。1. ADHD診断について:日本の心理臨床における自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder: ASD)の過剰診断の可能性を確認するために児童を取り巻く大人を対象として行った調査研究について,追加調査を実施した。本研究では,日本人のセラピストは,他の国のセラピストと比較してASDに敏感であり,ASDであると診断する可能性が高い。本研究は,文化的バイアスが臨床医のADHDとASDの診断に影響を与える可能性があることを示した。2.抑制機能におよぼす報酬と罰の効果の発達的変化(1)児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:発達障害や精神障害のない児童・青年における報酬と罰が抑制機能におよぼす影響の発達的な変化について行った行動実験について追加実験を実施し,再分析を行った。本研究は,報酬とフィードバックタイプの反応抑制に対する効果が発達的に異なることを示した。3.抑制機能におよぼす報酬と罰の効果の発達的変化(2) ADHD診断のある児童・青年の抑制機能に及ぼす報酬と罰の効果の発達的変化:ADHDのある児童・青年の抑制機能に対する報酬と罰の効果を検討するため,ADHDのある児童・青年,および発達障害の診断も精神疾患の診断もない児童・青年を対象に行った行動実験について分析・考察し,学会発表を行った。本研究は,ADHDにおける反応抑制に対して,報酬ではなく罰の効果が統制群と異なる可能性を示した。また,ADHDと統制群の間の非金銭的フィードバックの効果の差異が青年期に現れる可能性が示された。今後は,AD/HD診断のある児童とない児童を対象とした実験を実施し,データの収集と分析を重点的に実施する見通しである。加えて,昨年度に得た研究結果を学会で報告するとともに論文を執筆・投稿する。今後は,本年度取得した縦断データ1時点目に対応する2時点目のデータを取得・解析し,学会において他の研究者との議論の上,論文の執筆を進める。また,今年見出された報酬・罰が反応抑制に及ぼする効果についての神経基盤の解明にも試みる予定である。このための設備はすでに整っており,実験準備も順調に進んでいる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Rap1欠損による大腸炎発症機構の解明

本研究室で作製したT細胞特異的Rap1欠損マウスは、生後数週間で高度異型腫瘍を伴う激しい大腸炎を発症することがわかっている。本年度は、この大腸炎自然発症モデルを用いて、ILC3の大腸炎における役割について検討を行った。近年、ILC3は腸管粘膜固有層において腸内細菌を取り込み、腸管リンパ節において腸内細菌反応性T細胞へMHC classIIを介して抗原提示することでアポトーシスを誘導し、腸内細菌に対する免疫寛容を誘導していることが報告されている。大腸炎モデルマウスでは、CD4+ ILC3でRap1が欠損していたことから、腸管リンパ節並びに大腸粘膜固有層においてCD4+ ILC3の細胞数に影響が及ぼされている可能性を、フローサイトメトリーを用いて検討した。その結果、大腸炎発症後には腸管リンパ節において細胞数が減少していたが、発症前の4週令においては野生型とほとんど差は認められなかった。また、MHC classIIの発現についても検討したが、Rap1欠損による影響は認められなかった。以上の結果より、CD4+ ILC3の腸管粘膜固有層から腸管リンパ節への移動にRap1は関与していないことが判明した。ILC3はIL-22を産生することで腸管上皮細胞からの抗菌タンパクの発現を高めることで粘膜感染菌の排除に重要な役割を果たしていることが報告されている。そこで、Rap1の欠損により大腸粘膜固有層に存在するCD4+ ILC3のIL-22の産生量を検討したが、野生型との間に差は認められなかった。低分子量Gタンパク質Rap1をT細胞特異的に欠損したマウスでは、リンパ球ホメオスタシスの破綻により、リンパ球増殖性疾患を引き起こし、生後数週間以内に激しい大腸炎を発症することがわかっている。Rap1のT細胞のホメオスタシスにおける役割を解明し、大腸炎・がんの発症を防いでいる仕組みを明らかにすることを目的として研究を進めている。Rap1欠損T細胞はtether様の突起が顕著に増加することでローリングが亢進することを見出している。本年度はRap1-GDPによるローリング抑制のメカニズムとその分子機構について検討した。Rap1欠損によってtetherの形成に重要な役割を果たすと考えられるERMのリン酸化レベルが低下したことから、リン酸化酵素であるLOKの活性にRap1が関与する可能性を検討した。その結果、Rap1欠損T細胞ではケモカイン非存在下でLOKのキナーゼ活性が低下しており、Spa-1発現細胞では、ケモカイン刺激後もほとんどリン酸化レベルは低下しなかったことから、Rap1-GDPはLOKの活性化を介してERMのリン酸化に重要な役割を果たしていることがわかった。次にERM及びLOKがローリング及び大腸炎発症に関与する可能性を検討した。ERMの擬似リン酸化変異体(T567E)、LOKの優性活性型変異体を作製し、Rap1欠損T細胞へ導入し、ローリング及び大腸へのホーミング活性を測定したところ、コントロール細胞に比べて有意に低下することがわかった。また、放射線照射した正常マウスへの移入実験による大腸炎発症への影響を検討したところ、T567E発現細胞を移入したマウスでは体重減少が抑制された。これらの結果より、Rap1-GDPはERMのリン酸化を介してローリングの挙動を抑制しており、T細胞の大腸への移動を抑制することで大腸炎の発症を抑制していることが示唆された。Rap1-GDPによるローリング抑制のメカニズムとその分子機構の解明を目指してきた。本年度は、Rap1-GDPがリン酸化酵素であるLOKを活性化することで、細胞膜とF-アクチンを結び付ける働きをしているERMをリン酸化し、休止期の細胞においてtether形成を抑制することで、ローリングの挙動を抑制していることが明らかとなった。また、Rap1-GDPはローリングを抑制することでT細胞の大腸へのホーミングを抑制し、大腸炎の発症を抑制していることが示唆された。我々は、T細胞特異的にRap1を欠損したconditional knockoutマウス(Rap1 KOマウス)を作製したところ、生後数週間で大腸炎及び高度異型腫瘍を自然発症し、速やかに大腸がんへ進展することがわかった。本年度はこの大腸炎自然発症モデルマウスを用いて、γδT細胞の大腸炎発症における役割について解析を行った。近年IBDにγδT細胞の関与を示した報告が数多くあるが、大腸炎の促進または抑制のどちらに働くのかは不明な点が多く、既存のDSSモデルでは大腸炎発症の初期においてγδT細胞がどのように機能するのかはわかっていなかった。Rap1 KOマウスではγδT細胞が腸管関連組織で顕著に増加していたことから、大腸炎の発症にγδT細胞が関与している可能性が考えられた。そこで、γδT細胞が、大腸炎の促進または抑制のどちらに働いているのかを検討するため、Rap1 KOマウスとTCRγKOマウスを掛け合わせ、全身でγδT細胞を欠損させたdouble knockoutマウス(DKOマウス)を作製した。DKOマウスとRap1 KOマウスの体重と炎症スコアを比較したところ、DKOマウスでは大腸炎の発症時期が遅れたことから、γδT細胞は大腸炎の発症初期の悪化に関与している可能性が示唆された。続いて増加していたγδT細胞のサブセットを、フローサイトメトリーを用いて解析した結果、腸管膜リンパ節ではVγ4が増加し、大腸粘膜固有層ではVγ6が減少していた。この二つのサブセットはIL-17Aを産生するサブセットとして知られている。そこで、Vγ4とVγ6のIL-17A

産生細胞の割合に変化が生じている可能性を検討した。その結果、どちらの組織においても、Rap1 KOマウスのVγ4とVγ6サブセット中のIL-17A産生細胞の割合が増加していることがわかった。本年度は大腸炎自然発症モデルマウスを用いて、γδT細胞の大腸炎発症における役割について解析を行った。その結果、γδT細胞は大腸炎の発症初期において促進的に働く可能性が示唆された。また、増加したγδT細胞のサブセット解析を行ったところ、腸管関連組織におけるVγ4、Vγ6の割合が変化しており、それぞれのサブセット中のIL-17A産生細胞の割合は増加していることが明らかとなった。今後はγδT細胞とT細胞との関係性について検討していくことで、IBDの発症原因・病態形成機構の解明へとつながっていくことが期待される。本研究室で作製したT細胞特異的Rap1欠損マウスは、生後数週間で高度異型腫瘍を伴う激しい大腸炎を発症することがわかっている。本年度は、この大腸炎自然発症モデルを用いて、ILC3の大腸炎における役割について検討を行った。近年、ILC3は腸管粘膜固有層において腸内細菌を取り込み、腸管リンパ節において腸内細菌反応性T細胞へMHC classIIを介して抗原提示することでアポトーシスを誘導し、腸内細菌に対する免疫寛容を誘導していることが報告されている。大腸炎モデルマウスでは、CD4+ ILC3でRap1が欠損していたことから、腸管リンパ節並びに大腸粘膜固有層においてCD4+ ILC3の細胞数に影響が及ぼされている可能性を、フローサイトメトリーを用いて検討した。その結果、大腸炎発症後には腸管リンパ節において細胞数が減少していたが、発症前の4週令においては野生型とほとんど差は認められなかった。また、MHC classIIの発現についても検討したが、Rap1欠損による影響は認められなかった。以上の結果より、CD4+ ILC3の腸管粘膜固有層から腸管リンパ節への移動にRap1は関与していないことが判明した。ILC3はIL-22を産生することで腸管上皮細胞からの抗菌タンパクの発現を高めることで粘膜感染菌の排除に重要な役割を果たしていることが報告されている。そこで、Rap1の欠損により大腸粘膜固有層に存在するCD4+ ILC3のIL-22の産生量を検討したが、野生型との間に差は認められなかった。Rap1-GDPによるローリング抑制のメカニズムはわかったが、Rap1欠損T細胞の大腸へのホーミングが亢進する原因として、大腸へのホーミングに重要な、α4β7のMadCAM-1への接着活性と構造変化の関係、及びRap1-GTP及びGDPが与える影響を明らかにする必要がある。インテグリンの機能を阻害せず構造変化を検討できるPA-Tagをβ7鎖へ導入し、ケモカイン存在下、非存在下及びRap1-GTPが生じないリンパ球、Rap1欠損リンパ球等を用いて、PAーTagの発現を検討することでRap1のα4β7の構造変化への影響を明らかにする。また、Rap1欠損によって大腸炎を誘導する病原性T細胞が生成するメカニズムを明らかにするため、Rap1欠損T細胞のサイトカイン産性能や、増殖能、分化に関わるシグナル伝達経路及び転写因子誘導への影響を検討する。