hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両眼立体視による奥行知覚の時間特性の検討

2)比較する奥行きの面が逆方向に運動する刺激と同方向に運動する刺激の感度を比較すると、前者で顕著に低いことが明らかにされ、運動成分の立体視への影響も見いだされた。この相対運動による両眼立体視感度の低下は現段階で知られている両眼立体視のメカニズムの特性で説明することはできず、そのメカニズムに対して興味深い問題を提起している。次に奥行運動の実験では、そこにかかわる2つのメカニズムの特性の相違について、以下の点が明らかにされた。両眼視差の時間変化を検出するメカニズムでは、2次元の運動成分が水平方向であっても垂直方向であってもその影響は見られないが、両眼網膜像の速度差を検出するメカニズムでは、水平運動成分によって感度低下が生じる。これは、速度差のメカニズムが網膜上での2次元の運動に感度を持つ運動検出器の影響をうけることを意味する。
犯罪死の見逃しを防止する新しい薬毒物分析法の開発

犯罪死の見逃し防止のために薬毒物検査の実施は必須であるが,すべての検体について従来法で対応することは難しい.そこで改良型QuEChERS法とフローインジェクション-質量分析法(FI-MS/MS)を組み合わせて,全血試料の抽出から分析結果の報告までを10分程度で完了させる新しい分析法の構築を試みた.構築した分析法とLC-MS/MS(従来法)による定性結果の一致率は96%程度であり,この分析法は幅広い薬毒物に対して迅速かつ簡便に検査が可能であることがわかった.しかし,いくつかの事例で低濃度の薬毒物を取りこぼすこともあり,犯罪死見逃し防止にはさらなる改良が必要と考えられた.薬毒物を用いた犯罪は,解剖や死亡時画像診断のみで認知することは難しく,薬毒物検査の確実な実施が必須である.しかし,警察が扱う全ての死体に対して検査を実施するには,膨大な時間と労力が必要であり,現状の分析体制では困難である.そのため,改良型キャッチャーズ(QuEChERS)法とフローインジェクション-タンデム型質量分析計(FI-MS/MS)を組合せて,薬毒物の抽出から結果報告までを10分程度で完了させる迅速な分析法を開発することが本研究の目的である.本年度は測定時間の圧倒的な短縮を目指すため,カラムによる分離工程を排除したFI-MS/MS法の条件設定に着手した.具体的には,質量分析計における(1)各薬毒物のプリカーサーイオンQ1とプロダクトイオンQ3の選択,(2)取込み速度,(3)プロダクトイオンの取込み時間,(4)サーベイスキャン時のイオン取込み時間等を設定した。なお、全体の測定時間は1分析あたり1.5分以内に調整した.FI-MS/MS法では,QuEChERS法で抽出された全ての化合物が質量分析計に導入されるため,内因性物質によると思われる偽陽性が多数発生した.この偽陽性を抑えるため,得られた質量スペクトルから内因性物質を同定しライブラリーに登録した.さらに同定に至らない化合物であっても未知化合物としてライブラリーに登録することで偽陽性を大幅に減らすことができた.現在は従来法であるLC-MS/MS法との比較検討を行なっている.薬毒物による犯罪死の見逃しを防止するためには,確実な薬毒物検査の実施が必要である.しかし,現状の分析体制では膨大な時間と労力が必要であり,事実上全ての検体について検査を行なうことは困難である.本研究の目的は,全ての検体について検査が可能となるように,改良型キャッチャーズ(QuEChERS)法とフローインジェクション-タンデム型質量分析計(FI-MS/MS)を組合せて,薬毒物の抽出から結果報告までを10分程度で完了させる迅速な分析法を開発することである.昨年度は,測定時間の圧倒的な短縮を目指すため,カラムによる分離工程を排除したFI-MS/MS法の条件設定をおこなった.すなわち,(1)各薬毒物のプリカーサーイオンQ1とプロダクトイオンQ3の選択,(2)取込み速度(スキャンスピード10,000 Da/sに設定),(3)プロダクトイオンの取込み時間(Fill time 10 msに設定),(4)サーベイスキャン時のイオン取込み時間等を設定した.本年度はこのFI-MS/MS法の条件設定を利用し,実際の法医試料(全血)の分析おこなった.全血をQuEChERS法で処理した後,FI-MS/MS法による分析と同時に,従来法である高速液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計(LC-MS/MS)による分析を実施した.得られた結果から両分析法の一致率を算出した.一致率の評価には,3つの類似性指標を用いた.すなわち,ジャッカード係数,ダイス係数及びコサイン係数を算出し,客観的な比較検討をおこなった.一部の試料で一致率の低いものがあったが,両分析法の定性結果はおおむね一致することが分かった.本年度は,昨年度に設定したFI-MS/MS法の条件を用いて法医試料の分析を行なった.具体的には,改良型QuEChERS法を用いて法医試料(全血試料)から薬毒物を抽出した後,一部はFI-MS/MS法で分析を行ない,残りについてはLC-MS/MS法(従来法)で分析をおこなった.従来法は,装置立上から測定完了までに2時間程度掛かるのに対して,FI-MS/MS法では抽出操作も含めて約10分程度で完了することができた.両分析法の定性結果について,ジャッカード係数,ダイス係数及びコサイン係数で評価したところおおむね一致していた.薬毒物による殺人は,解剖や死亡時画像診断で認知することは難しく,薬毒物検査の確実な実施が必須である.しかし,警察が扱う全ての死体に対して検査を実施するには,膨大な時間と労力が必要であり,現状の分析法で対応することは難しい.本研究の目的は,(1)迅速に薬毒物抽出ができるQuEChERS法と(2)フローインジェクション分析法(FI),(3)イオントラップ機能をもつタンデム型質量分析計(MS/MS)の3つを組合わせて,全血試料の抽出から結果報告までを10分程度(装置の安定化,ブランク分析も含む)で完了させる「犯罪死の見逃しを防止する新しい薬毒物分析法」を構築することである.これまでにQuEChERS法とFI-MS/MS法を組み合せて使用した結果,薬毒物の抽出時間が短縮されたほか,装置の安定化時間が不要となり,測定時間も1.5分と短縮することができた.

結果出力を含めても10分程度で分析を完了することが可能であった.また,多くの法医試料について,さまざまなクラスの薬毒物(向精神薬類,催眠薬,一般医薬品類など)を対象として検査を行ない,従来法である高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC-MS/MS)の分析結果と比較した.なおFI-MS/MSとLC-MS/MSによって得られた定性結果は類似性指標(一致率)を用いて評価した.法医試料150件程度について解析を行なったところ,その一致率は96%程度であった.FI-MS/MSの定性結果はLC-MS/MSとほぼ一致しており,幅広い薬毒物に対して迅速な検査が可能であることがわかった.しかし,いくつかの事例で低濃度の薬物を取りこぼす現象(偽陰性)も見られた.犯罪死見逃し防止のためには更なる一致率の向上が必要と考えられる.一方で今回開発したFI-MS/MS法は,救急医療分野における急性薬物中毒時の迅速診断には十分利用可能だと考えられた.犯罪死の見逃し防止のために薬毒物検査の実施は必須であるが,すべての検体について従来法で対応することは難しい.そこで改良型QuEChERS法とフローインジェクション-質量分析法(FI-MS/MS)を組み合わせて,全血試料の抽出から分析結果の報告までを10分程度で完了させる新しい分析法の構築を試みた.構築した分析法とLC-MS/MS(従来法)による定性結果の一致率は96%程度であり,この分析法は幅広い薬毒物に対して迅速かつ簡便に検査が可能であることがわかった.しかし,いくつかの事例で低濃度の薬毒物を取りこぼすこともあり,犯罪死見逃し防止にはさらなる改良が必要と考えられた.本年度の目的は、基本となるFI-MS/MS法の条件設定である。そのため、試料を繰り返し分析して最適値を求めた.具体的には、(1)約200種類の薬毒物のプリカーサーイオンとプロダクトイオンの最適化,(2)各イオンの取込み速度の設定,(3)イオン取込み時間の設定,(4)偽陽性の要因となる内因性物質の同定とライブラリー登録,(5)その他(スペクトル取得のトリガー条件設定,ライブラリー検索の条件設定など)を行なった.その結果、ライブラリー検索時の偽陽性、偽陰性を大幅に減らすことができ,研究全体としてみればおおむね計画通りである。今後はより多くの法医試料についてFI-MS/MS法で分析をおこない,従来法であるLC-MS/MSと比較してその定性能を客観的に評価する.また一致率が低下する場合、その原因についても考察をおこなう.法中毒学今後は,前年度に設定したFI-MS/MS条件を用いて試料を分析すると同時に,同一試料を従来法であるLC-MS/MS法でも分析を行う.開発した分析法と従来法の分析結果(定性能)を比較して,その有効性を評価する.定性結果の比較は,3つの類似性指標を用いて評価する.すなわち,ジャッカード係数,ダイス係数及びコサイン係数を算出し,客観的に比較検討を行なう.2つの分析法における一致率が低い場合,偽陽性又は偽陰性が原因であるため,その発生原因を考察する.現在までのところ,研究計画の大幅な変更はない.
焼畑農耕社会の定住化に伴う社会経済変化と熱帯森林環境変化の相互関係に関する研究

研究最終年度にあたる平成13年度は、前年度の研究において得られた基礎的分析枠組みを用いて、研究対象の空間スケールを広げてメソスケール(郡レベル)からの把握を試みるとともに、環境条件の異なる地域の比較分析をおこなった。具体的手順は以下のとおりである。1.GISツールを用いて、対象地域における5万分の1地形図を、UTM座標に準拠してベースマップ化した。2.1960年代から現在にいたる様々な時期の、利用可能な空中写真、リモートセンシング画像を適切な幾何補正をおこなった後にGIS上にフォーマットし、空間データを時系列上に整理した。3.さらに、集落別人口データ、市場の分布、各時期における森林域の植生分類をGIS上でおこない、時空間上の分析をおこなう準備をととのえた。4.60年代から現在までの、焼畑分布、集落分布、サバンナと森林の境界の動態、市場の拡大過程を定量的に明らかにし、さらに現在の各集落人口、市場距離、植生分布、焼畑土地利用規模について相関関係を分析した。以上の手続きによる分析の結果、対象地域の土地利用と森林環境の変化を促す要因について、いくつかの傾向性が認められた。とくに、定住化の前後で、市場に近接する集落とアクセスの困難な集落の間で、焼畑土地利用のパターンに顕著な変化が認められ、それが森林環境にも影響していることが明らかになった。また、研究全体を通して、GISツールを利用して焼畑土地利用を時系列に沿って分析することの有効性を示すことができた。これらの研究成果については、学会発表、論文、著書の形で公表をおこなった。また、本研究の分析手法は他地域においても応用可能であるとの見通しが得られたため、今後は同様の手法によって熱帯諸地域における比較研究をおこなう計画を立案する予定である。研究初年度にあたる平成12年度は、比較研究のためのフレームづくりとして、研究代表者がデータを持つエチオピアの熱帯湿潤林および焼畑社会を対象とする分析に焦点をあてることとした。具体的手順として、次の手順にしたがって研究を実施した。1.ミクロな森林環境・居住環境の動態の追跡のために、伝統的移動集落と定住化集落からそれぞれサンプルを選定し、空中写真、衛星データ、現地の土地利用・植生調査資料を併用して、今世紀初頭から現在までの集落と森林環境の動態を復原することを試みた。2.復原によって得られた集落および森林環境の動態に、聞き取りや参与観察によって得られた資料を重ねあわせて、伝統的移動集落と定住化集落の相違点・相同点を比較検討した。なお、1に関しては、研究代表者が過去に植生調査と土地の履歴調査をおこなった集落(エチオピア・ガンベラ州内のKumi村およびJaaman村)を対象として選定、分析作業をおこなった。また、2については、過去の現地調査時に収集された、集落移動史の聞き取り、土地利用調査、およびエチオピア中央政府や州政府・郡役所からの統計資料をデータとして用いた。これらの分析作業の結果、現地の人びとの森林利用の変化と定住化との関係、およびそれに伴う森林環境そのものの変化のプロセスに関するいくつかの知見が得られた。これらは、次年度におこなう比較研究とあわせて、雑誌論文の形で発表する予定である。なお、予察的な研究発表は、すでに本年度内に国際地理学会や国内の研究会でおこない、その際の情報交換によって研究手法に関する改良点も発見された。以上の作業から、次年度の研究の主眼となる広域(他地域を含む)の比較研究のための準拠枠が得られ、本年度の目的は十分に達成されたと思われる。
口腔粘膜のウイルス認識機構の解明と口腔粘膜炎症性疾患における意義

宿主細胞はウイルスの侵入を検知し防御応答を行っている.Retinoic acid inducible gene-I(RIG-I)は細胞内レセプターでウイルスRNAを認識しI型IFNを分泌するが口腔粘膜細胞での報告はなく,今回口腔粘膜が担う免疫応答メカニズムを解明するため,口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞のRIG-Iの発現と機能の検討を行った.結果,口腔粘膜上皮細胞(RT7)と歯肉線維芽細胞(GT1)はRIG-Iを発現しRIG-Iを介しdsRNAを認識しIRF3/STAT1経路でIFN-β,CXCL10を発現することを明らかにし,口腔粘膜がRIG-Iを介した特異的な免疫機構を持つことが示唆された.宿主細胞はウイルスの侵入を検知し防御応答を行っている.Retinoic acid inducible gene-I(RIG-I)は細胞内レセプターでウイルスRNAを認識しI型IFNを分泌するが口腔粘膜細胞での報告はなく,今回口腔粘膜が担う免疫応答メカニズムを解明するため,口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞のRIG-Iの発現と機能の検討を行った.結果,口腔粘膜上皮細胞(RT7)と歯肉線維芽細胞(GT1)はRIG-Iを発現しRIG-Iを介しdsRNAを認識しIRF3/STAT1経路でIFN-β,CXCL10を発現することを明らかにし,口腔粘膜がRIG-Iを介した特異的な免疫機構を持つことが示唆された.細菌やウイルス等の微生物感染に対する宿主の自然免疫防御機構としてToll-like receptor (TLR)やTLR非依存性にウイルスを認識する細胞内レセプター:Retinoic acid inducible gene-I (RIG-I)が存在する。RIG-IはウイルスRNAを認識し抗ウイルス作用を持つI型IFNを分泌することが報告されており、申請者らは、口腔粘膜上皮細胞と歯肉線維芽細胞でRIG-Iの発現を確認した。また、ウイルス由来のdsRNAを細胞内導入するRIG-I特異的リガンド(poly:IC/Lyovec)処理を口腔粘膜上皮細胞と歯肉線維芽細胞に行った結果、両細胞で抗ウイルス機能を持つIFN-βやT細胞遊走因子であるCXCL10の発現上昇を認め、口腔粘膜細胞における、RIG-Iの発現・機能が示唆された。さらにRIG-Iにより誘導されるI型IFNや炎症性ケモカインの詳細なシグナル伝達経路検討のため、各種シグナル伝達阻害剤を用いて予備実験を行った所、上皮、線維芽細胞ともにJAK2阻害剤でRIG-I ligandで誘導されるCXCL10の発現誘導抑制され、また線維芽細胞ではNF-KB阻害剤で抑制される等細胞による発現誘導経路の違いがあることが示された。また、これらの結果からRIG-I ligandにより誘導される細胞内伝達経路検索のため,特異的ligand処理後の蛋白を抽出し、レセプター認識後の細胞内伝達経路を各種リン酸化抗体(STAT1, ERK,c-JUN,IRF3)を用いてWestern blotting法によって検索したところ、STAT1, IRF3で経時的なリン酸化蛋白の発現が認められ、RIG-Iの抗炎症反応にはSTAT1, IRF3の関与が明らかとなった。口腔粘膜上皮細胞、歯肉線維芽細胞における特異的ウイルス由来成分によるウイルス認識レセプターを介した抗ウイルス遺伝子や炎症性遺伝子の発現の検討と細胞内伝達機構によるウイルス認識レセプターの活性や制御因子についての検討を行った。口腔粘膜の構成細胞である口腔粘膜上皮細胞と歯肉線維芽細胞でのRIG-I発現の検討を行うため、不死化口腔粘膜上皮細胞(RT7)、不死化歯肉線維芽細胞(GT1)におけるRIG-Iの発現検討したところ、両細胞においてRIG-Iの発現が確認された。RIG-Iのウイルス感染時の口腔粘膜細胞での機能を検討するため、RT7とGT1にRIG-IリガンドであるdsRNAを作用させたところ、抗ウイルス作用をもつI型IFNや各種炎症性ケモカインm-RNAや蛋白の発現が誘導される事を確認した。RT7とGT1のRIG-Iノックダウン細胞を作製し、詳細なシグナル伝達経路を検討したところ、RIG-IリガンドがRIG-Iを通じてIRF3やSTAT1をリン酸化し、その後IFNα、βやCXCL10が誘導されることが明らかになった。さらにRIG-Iにより誘導されるCXCL10の発現はRIG-Iリガンドにより誘導されたIFN-βがSTAT1のリン酸化を介して誘導されることが示唆された。RT7においては、RIG-Iの発現はIFN-γにより誘導され、誘導されたRIG-Iより炎症性ケモカインであるIL-8、CCL20、CXCL10の発現がさらに誘導されることが実験結果より示唆された。以上の結果から口腔粘膜上皮細胞と歯肉線維芽細胞は口腔粘膜のウイルス感染に対しRIG-Iを介した特異的な免疫機構を担っている事が示唆された。口腔外科口腔粘膜細胞(口腔粘膜上皮細胞、歯肉線維芽細胞)でのRIG-Iの発現やRIG-Iの抗炎症作用や反応経路などの機能の一部について確認することができ、研究計画通りにおおむね研究が進行しているため。

近年RIG-Iを介して誘導される遺伝子発現が他のウイルス認識レセプターによって互いに干渉されることや、TLR3の活性がRIG-Iの発現を増加させることが報告されているため、口腔粘膜細胞においてもTLR3によるRIG-Iの細胞内伝達経路の干渉を検討する。ウイルス認識レセプターを負に制御する内在性因子についても近年報告があり、RIG-Iに関しても負の制御遺伝子の存在が明らかとなっているため、口腔粘膜細胞での存在を確認し、ウイルス認識時の遺伝子発現の変化について検討を行う。現在までに頬粘膜擦過サンプルからRIG-Iの発現が検出されることを確認しているが、扁平苔癬、白板症など口腔粘膜疾患患者の頬粘膜擦過サンプル、試切サンプルからからウイルス認識レセプターmRNAの発現を検出し、健常人との比較を行う。
金属内包フラーレンの構造,物性,生成過程の解明

1.金属内包フラーレンの構造決定、電子状態、結合特性金属原子を1個内包するM@C_<82>(M=Ca,Sc,Y,La,Ce,Pr,Nd,Eu,Gd,Yb,Lu)および2個内包するSc_2@C_<84>とLa_2@C_<80>の構造と電子状態を解明した。また、理論計算より求めた電子密のトポロジカル解析より、金属内包フラーレンの結合の本性を一般的見地から明らかにした。金属を3個内包するSc_3@C_<82>の構造と電子状態に関しては、引続き検討中である。2.内包された金属の動的挙動金属原子はフラーレンの炭素ケージのなかで静止しているのかあるいは動き回っているのかを明らかにするために、La_2@C_<80>の温度可変^<13>C NMRの測定に成功した。その結果、内包された二個のLa原子は+3の電荷をもち、室温でも高速にサーキット運動していることを初めて見いだした。このことは、温度可変^<135>La NMR,測定と理論計算によっても確認した。3.金属内包フラーレンの新規な構造の理論予測金属内包ドープは、孤立5員環則を満足しない、あるいは7員環を含むなどの新しいケージ構造を大きく安定化させることを初めて見いだし、Ca@C_<72>やSc_2@C_<74>を代表例として提唱した。4.金属を内包したヘテロフラーレンの合成と電子的特性La_2@C_<80>とLa@C_<82>のケージ炭素の1個を窒素原子で置換したLa_2@C_<79>NとLa@C_<81>Nの合成を試みた。これらの電子的特性は、空のC_<79>NやC_<81>Nとは異なり、ケージ上に局在スピン密度をもたないことにある。5.まとめ金属原子は必ずしも豊富に単離されるフラーレンには内包されない。これは、金属からフラーレンに複数個の電子が移動するので、電子親和力が大きいケージ構造に内包されるためである。金属内包フラーレンの構造は、アニーリング過程において決定される。1.金属内包フラーレンの構造決定と生成機構炭素の5員環と6員環からなるフラーレンには多数の構造異性体がある。例えば、C_<80>,C_<82>,C_<84>では,それぞれ隣接5貝環排他則を満足する7,9,24種類の異性体がある。まず、金属を一個内包するCa@C_<82>を取り上げ、どのフラーレン異性体に金属が内包されているかを、我々が最近開発した方法により候補構造を予測した。そして、分子軌道計算と密度汎関数計算を併用して、C_<2v>,C_s,C_2,C_<3v>対称をもつ4種類の構造がエネルギー的に最安定であることを見いだした。次に、金属を二個内包するSc_2@C_<84>とLa_2@C_<80>を取り上げ、同様の手法により、前者に対してはD_<2d>,C_s,C_<2v>対称をもつ3種類の構造が、後者に対してはD_<2h>対称の構造が最安定であることを見いだした。これらの結果は、Ca@C_<82

>には4種類の、Sc_2@C_<84>には3種類の、La_2@C_<80>には1種類の構造異性体が安定に抽出単離されるという実験事実と完全に一致する。興味ある発見は、金属原子は必ずしも生成量が多い空フラーレンに内包されないことである。これらのことから、金属内包フラーレンの安定構造は、アニーリング過程において決定されることを提案した。2.内包された金属の動的挙動金属原子はフラーレンの炭素ケージのなかで静止しているのかあるいは動き回っているのかは、最近の興味ある話題である。我々は、La_2@C_<80>の^<13>C NMRの温度可変測定に成功し、内包された二個のLa原子は+3の電荷をもち、室温でも高速にサ-キット運動していることを初めて見いだした。このことは、温度可変^<135>La NMR測定と理論計算によっても確認した。金属を1個内包する最も代表的なM@C_<82>の構造決定は長年の課題であったが、理論計算によって初めて解明した。電子状態は、内包された金属の種類に大きく依存することを見いだした。2.金属内包フラーレンの新規な構造の理論予測金属内包ドープは、孤立5員環則を満足しない、あるいは7員環を含むなどの新しいケージ構造を大きく安定化させることを初めて見いだし、Ca@C_<72>やSc_2@C_<74>を代表例として提唱した。3.結合特性と電子分布のトポロジカル解析金属を1個内包するCa@C_<72>や2個内包するSc_2@C_<84>等の電子密度のグラジエントとラプラシアンのトポロジカル解析により、金属内包フラーレンの結合の本性を一般的見地から解明した。4.金属を内包したヘテロフラーレンの合成と電子的特性La_2@C_<80>とLa@C_<82>の炭素を窒素置換したLa_2@C_<79>NとLa@C_<81>Nの合成を試みた。これらの電子的特性は、空のC_<79>NやC_<81>Nとは異なり、ケージ上に局在スピン密度をもたないことにある。5. Sc_3@C_<82>の構造と電子状態Scを3個内包したフラーレンの電子状態、構造、および動的挙動を解明中である。6.まとめ金属原子は必ずしも豊富に単離されるフラーレンには内包されない。これは、金属からフラーレンに複数個の電子が移動するので、電子親和力が大きいケージ構造に内包されるためである。金属内包フラーレンの構造は、アニーリング過程において決定される。
矯正痛の発現機構解明と制御方法の探索

本申請では,動物実験モデルを用いた歯の移動を妨げない新規疼痛管理薬物の探索と投与スケジュールの立案を行う.これは,各種の薬物投与が開口反射誘発閾値変動,歯の移動量,多核破骨細胞浸潤,神経組織変性と合わせて評価することで可能である.本モデルでは,開口反射誘発閾値が矯正力負荷1週間後,ならびに,アスピリン投与1日後に矯正側よりも非矯正側で低下していることが認められた.歯矯正力が侵害受容機構の変調に寄与していることを示唆しており,矯正力が全顎的に負荷されるヒトに於いてはより広範かつ大きな変調の誘発が推測される.このことから矯正力負荷に由って生じる侵害受容機構変調の詳細を検討することを目的とした。
実特異点の解析とその情報数理への応用

本研究は,ベイズ学習理論を情報セキュリティの分野へ応用するために,ある実代数的集合の特異点解析をすることで汎化誤差の理論値に関して考察し,Webアプリケーションの脆弱性を狙った攻撃の特徴を抽出して攻撃を自動検出するための確率モデルの開発手法について検討するものである.ベイズ学習理論を用いてWebアプリケーション攻撃を検出することの有用性を理論と実験の両面の側面から示した.本研究は実代数的集合における特異点の解析を行い,その性質とベイズ汎化誤差や自由エネルギーなどの理論値との関連について調べ,現実データを用いた場合のベイズ学習アルゴリズムの精度について評価・考察を行うものである.この研究において以下の研究成果を得ることができた.(1)2つの実係数多項式が与えられたとき,それぞれの多項式の特異点解消の情報を用いて2つの多項式の和で定義される実代数的集合の実対数標準閾値の上界と下界が得られる条件を得た.(2)本研究の情報数理への応用として情報セキュリティの分野のデータを解析し,SQLインジェクション攻撃に含まれる特殊記号を攻撃特徴とした混合ベルヌーイ分布を応用した確率モデルを提案し,2値分類で広く利用されているシグモイド関数を利用して攻撃検知するモデルと提案モデルの予測誤差の期待値の差を計算することで,提案モデルの予測誤差がシグモイド関数を用いたモデルより小さくなることを示した.さらに提案モデルの混合数を1とした場合,その最尤推定量は解析的に計算することは困難であるが,ニュートンラプソン法を用いて最尤推定量を計算した場合,アルゴリズムが収束するまでにかかる繰り返しの計算回数が小さくなることを実験で確認した.(3)SQLインジェクション攻撃の特徴を特殊文字で考えた場合,攻撃文字列とそうでない文字列の特徴空間の分布を2項分布を用いて表現したときにこれら2つの分布はまったく異なる傾向を持つことが確認できたため,これらの分布の特徴を元にSQLインジェクション攻撃を検出するための混合4項分布を提案し,混合数が2の場合に定義される実特異点を解消し,ベイズ汎化誤差の漸近展開の主要項の係数を導出した.本研究は,ベイズ学習理論を情報セキュリティの分野へ応用するために,ある実代数的集合の特異点解析をすることで汎化誤差の理論値に関して考察し,Webアプリケーションの脆弱性を狙った攻撃の特徴を抽出して攻撃を自動検出するための確率モデルの開発手法について検討するものである.ベイズ学習理論を用いてWebアプリケーション攻撃を検出することの有用性を理論と実験の両面の側面から示した.本研究の目的の一つは,実代数的集合における特異点解析を行い,その性質とベイズ汎化誤差や自由エネルギーなどとの関連を調べることである.学習モデルの実代数的集合のイデアルは特殊な特徴を持っていることが多い.平成24年度の計画では,学習モデルの実代数的集合を見出すことが難しい場合は,継続中の研究を遂行することによって上述のパターンのものについて解析して検討を行うとした.この計画を実行するために,ある特殊な学習モデルの場合であるが,実代数的集合のイデアルの特徴を式で表し,自由エネルギーを漸近展開したときの主要項の上界と下界を導けることを示した.これにより,特異点解消が難しい場合でも比較的容易に自由エネルギーの下界と上界が分かるようになった.一方で,現実データを適用した際の学習モデルの性能評価について考察を行うことが本研究のもう一つの目的である.情報セキュリティへのベイズ学習アルゴリズムの応用を目指し,webアプリケーション攻撃として有名なSQLインジェクション攻撃の自動検出問題に取り組んだ.平成24年度の研究計画では,データがもつ特徴を抽出してどのような確率モデルを学習モデルとして選ぶべきかを検討する予定であったが,既存の学習モデルのままでは容易に応用することができないことが分かった.この問題に対して,ベルヌーイ分布を応用してSQLインジェクション攻撃の自動検出に利用可能な確率モデルの提案を行った.SQLインジェクション攻撃の自動検出問題は入力された文字列が攻撃であるかそうでないかの2値判別を行うものであり,2値判別の分野ではシグモイド関数を利用した方法が広く応用されていることから,提案モデルとシグモイド関数を用いたモデルとの予測誤差の期待値を計算し,提案モデルの方が期待値を小さくできることを示した.これにより,ベイズ学習アルゴリズムの精度を評価するための準備を行った.本研究の目的の1つである,現実データを適用した際の学習モデルの性能評価についての考察を行うために,SQLインジェクション攻撃の実データをwebやテキストなどから収集し,データがもつ特徴を調べる検討を行ったが,検討の結果どのような学習モデルを当てはめるべきかという点が容易でないことが分かった.そこで確率モデルを改変するなどの作業を行っているが,平成24年度中にはフィッシャー情報量が退化しているような複雑な確率モデルを利用する価値があるかどうかというところまで検討が至らなかった.そのため,いまのところ新しい学習モデルの実代数的集合を調べるという段階には到達していないのが現状である.これが,現在までの達成度をやや遅れていると自己評価を行った理由である.年度が変わってから,これまで検討を行ってきたSQLインジェクション攻撃のデータの特徴抽出に関する検討に進展がみられてきた.これまでは,主にSQLインジェクション攻撃の特徴抽出に力を注いできたが,これまでの検討方法では攻撃ではないが攻撃として誤検出してしまう入力が容易に作れてしまうという問題が残っていた.このような入力は通常の入力ではまずありえないものであるが,攻撃でもないためわざとそのような入力をされてしまうと提案モデルは正常に検出の機能を働かせることができなくなってしまう.

この問題に混合モデルの考え方を取り入れることを検討することが,今後の研究の推進方策である.さらに,提案モデルを改良し,他のwebアプリケーション攻撃の自動検出を行うモデルについての検討も行う.国内・外国での研究成果発表,会議費,研究成果投稿料,印刷費のほか,情報セキュリティ分野の現実データの収集やこの分野の最新動向を知るために専門的知識をもつ技術者から知識やデータの取得とその設備設置にかかると考えられる費用として研究費を使用する計画である.
完全リサイクルコンクリートの実用化に関する研究

本研究により、得られた知見を以下にまとめて示す。1)完全リサイクルコンクリートに使用する石灰石砕石・砕砂の利用についての調査により、次に示すことが明らかになった。・石灰石砕砂の微粉量が増加すると必要な単位水量は若干大きくなった。また石灰石骨材コンクリートの単位水量は砂岩骨材コンクリートの場合に比べて小さくなった。・単位水量一定で石灰石砕砂の微粉量が増加すると、空気量は水セメント比に因らず小さくなった。・ブリーディング量は、どの水セメント比においても石灰石砕砂の微粉量に因らず増加した。・凝結時間は、どの水セメント比においても石灰石砕砂の微粉量に関わらず影響が認められなかった。2)石灰石骨材コンクリートの実用化に向けて、コンクリートレベルでの実験調査により、次に示すことが明らかになった。・圧縮強度は石灰石砕砂を用いた場合は水セメント比40%で同程度、50,60%でやや大きくなった。・耐火性能は水セメント比4060%の範囲で、加熱による強度低下率が若干大きくでるが、ほぼ同等の性能を帯びるといえる。本年度の研究により、得られた知見を以下にまとめて示す。1)完全リサイクルコンクリートの実用化の普及の第一歩として、石灰石砕石・砕砂の利用について、全国生コンクリート工業組合連合会および石灰石鉱業協会に対して調査を行った結果、次に示すことが明らかになった。・結晶質の石灰石は粗骨材には脆くて適さなく、細骨材としての利用可能性はあるが、FM、洗い試験、水分、粒形の点で品質管理が大変である。・石灰石骨材を多く販売すると、通常の骨材の販売業者との間に問題が発生する可能性がある。2)現在、市販または試作されている石灰石砕砂の品質について調査および実験を行ったところ、次に示すことが明らかになった。・現状の石灰石砕砂の粒度分布は、中間粒径の少ない状態のものがほとんどであり、コンクリートとした場合に、ワ-カビリティーのよくないものとなる可能性が高い。・石灰岩の粉砕方法によって、異なる品質の砕砂が得られる。3)石灰石砕砂の粒度分布を5段階に設定し、モルタルレベルで、石灰石砕砂が流動性に及ぼす影響および圧縮強度に及ぼす影響について検討した結果、次に示すことが明らかになった。・FMが大きいほど、また、砕砂の粒形がよいほどモルタルのフロー値は大きくなる。4)石灰石砕石・砕砂を用いたコンクリートでは、砕砂の微粒分は砕砂自体の粒度分布の変化がコンクリートの流動性に及ぼす影響を緩和するので、微粒分はある程度あった方がよい。ただし、多すぎると粘性が高くなり、流動性も悪くなる。1、完全リサイクルコンクリートの製造および性能評価完全リサイクルコンクリートの流動性、力学・物理特性に及ぼす石灰石砕砂の微粉分の影響を明らかにするために、微粉量を調整した砕砂を用いてコンクリートを製造し、実験を行った。その結果、微粉量が多過ぎる(砕砂の10%超)と幾分、流動性の低下、収縮の増大等を生じるが、市販されている石灰石砕砂程度の微粉量であれば、実用的な問題は生じないことがわかった。2、再生骨材の製造、性能評価および品質改善方法製造した完全リサイクルについて3種類の破砕方法により再生骨材を製造した。その結果、破砕器内でコンクリート塊を適当時間、滞留させることによって、品質の良い再生骨材が得られることがわかった。しかしながら、得られる骨材の粒度分布については、粗骨材では粒度分布曲線の下側に、細骨材では粒度分布曲線の上側に位置するものが得られ、破砕方法に改善の余地があることがわかった。3、再生セメントの製造および4、リサイクル回数とコンクリートの力学特性・耐久性との関係上記2課題については、今年度は、完全リサイクルコンクリートの普及に際して第一に解決すべき、石灰石砕砂の問題に傾注したため、未検討となった。5、完全リサイクルコンクリートの普及に伴う経済効果、資源・環境面への影響に関する将来予測生コンクリート製造業者、石灰石骨材供給者などにアンケートを実施し、完全リサイクルコンクリートの普及に関する問題点の抽出を行った。

1)完全リサイクルコンクリートに使用する石灰石砕石・砕砂の利用についての調査により、次に示すことが明らかになった。・石灰石砕砂の微粉量が増加すると必要な単位水量は若干大きくなった。また石灰石骨材コンクリートの単位水量は砂岩骨材コンクリートの場合に比べて小さくなった。・単位水量一定で石灰石砕砂の微粉量が増加すると、空気量は水セメント比に因らず小さくなった。・ブリーディング量は、どの水セメント比においても石灰石砕砂の微粉量に因らず増加した。・凝結時間は、どの水セメント比においても石灰石砕砂の微粉量に関わらず影響が認められなかった。2)石灰石骨材コンクリートの実用化に向けて、コンクリートレベルでの実験調査により、次に示すことが明らかになった。・圧縮強度は石灰石砕砂を用いた場合は水セメント比40%で同程度、50,60%でやや大きくなった。・耐火性能は水セメント比4060%の範囲で、加熱による強度低下率が若干大きくでるが、ほぼ同等の性能を帯びるといえる。
病態局所での好中球の活性化機構とシグナル伝達

循環血液中の好中球の活性酸素産生能は低いが、起炎物質などでプライミングされると数十倍に活性化される。これまでに、腫瘍壊死因子(TNF-α)や顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)等によるプライミングにはチロシンキナーゼの活性化と115kDa蛋白チロシン残基のリン酸化が関与していることを報告してきた。今年度は口腔内好中球の、活性化に関わる因子について解析して以下の知見をえた。(1)健常人より末梢血好中球と口腔内好中球を単離し、NF-kBのp55とp65そしてIkBの発現をウエスタンブロッテングで解析した結果、いずれの好中球も発現が認められた。(2)転写活性をゲルシフトアッセイで解析した結果、無刺激では、末梢血好中球には活性が認められないが、ホーボルエステルなどで刺激すると活性化された。一方、口腔内好中球は、無刺激でも、強い活性が認められた。(3)蛍光Differential Display法を用いて、口腔内好中球に特異的に発現しているmRNAを解析したところ、数種のタンパク質の発現が見られた。これらのmRNAのうち、もっとも強く発現していたものを塩基配列を解析した結果、PAC418A9と70%のホモロジーの、未知のタンパク質である可能性が示唆された。(5)口腔内好中球は、自発性にミエロペルオキシダーゼとNOを放出するため、電気化学検出器を用いたHPLCによる解析の結果、ニトロチロシンよりもむしろクロロチロシンが生成される傾向が示されつつある。これまでに、腫瘍壊死因子(TNF-α)や顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)等によるプラミングにはチロシンキナーゼの活性化と115kDa蛋白チロシン残基のリン酸化が関与していることを報告してきた。今年度はHL-60細胞を用い、プライミングにおけるチロシンキナーゼの関与をさらに解析した。HL-60細胞を10%FCS添加RPMI640培養液で培養し、レチノイン酸あるいはdbcAMPによって好中球様細胞に分化させた。活性酸素産生能は新規高感度化学発光剤L-012により測定した。チロシンキナーゼ活性はモノクローナル抗リン酸化チロシン抗体PY-20を用いたウエスタンブロッテングにより解析した。(1)HL-60細胞の活性酸素産生能はレチノイン酸あるいはdbcAMPによる分化誘導により増強するが、FMLP刺激に対する応答はdbcAMPの方が著明であった。(2)いずれの誘導剤でもTNF-α依存性プライミングが見られるが、dbcAMPの方がより顕著であった。(3)いずれの誘導においてもプライミングより115kDa蛋白のチロシン残基のリン酸化が検出されたが、(4)TNF-αによるプライミング時のチロシンリン酸化はレチノイン酸方が顕著であった。(5)ウエスタンブロットおよび免疫沈降による解析の結果、115kDa蛋白はc-Cblであることが判明した。現在、115kDa蛋白質のアンチセンスを用いて本分子とプライミングとの分子関連を解析中である。
光遺伝学を用いた霊長類の視覚－運動変換系の神経経路選択的な伝達遮断法の確立

本研究課題においては,神経科学研究のツールとしての霊長類に対する遺伝子導入法の改善,および神経回路機能シフトの1つの典型的な現象と考えられる盲視(blindsight:大脳皮質第一次視覚野の損傷後に,視覚的な気付きvisual awarenessが失われるにもかかわらず視覚対象に対して視線を向けるような視覚運動変換を行うことができるという現象)の神経回路について明らかにすることを目的として研究を行った。具体的には当初はウイルスベクターを用いた遺伝子導入法の中でも光遺伝学的な手法を用いて盲視の神経経路と考えられている中脳上丘に関連する経路の機能について明らかにすることを目指した。しかし実験に用いるサルの負傷などもあり計画通りに研究を進めることが困難になったため,同じくウイルスベクターを用いた神経経路選択的な遮断法(順行性ベクターとしてアデノ随伴ウイルスを用い,逆行性ベクターとして高頻度逆行性ウイルスベクターを用いて,特定の神経経路に選択的に破傷風毒素遺伝子を発現させることで,経路選択的に神経伝達を遮断する手法)を用いて,片側の一次視覚野を損傷した盲視モデルのマカクザルの上丘から視床枕への神経伝達を遮断し,その前後で視覚刺激に対する急速眼球運動(サッケード)の成績変化について調べた。その結果,上丘ー視床枕経路の選択的遮断によりサッケードの成績低下を認めた。このことから盲視における第一次視覚野を介さない代償的な視覚情報処理の少なくとも一部はこの上丘ー視床枕経路が担っていると考えられる。この成果については現在論文投稿の準備中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。初年度においては第一次視覚野に注入して光照射によりその活動を抑制するための抑制性オプシンの遺伝子を搭載したウイルスベクターの検討を行い、ベクターの作成を大学共同利用機関法人生理学研究所ウイルスベクター開発室に依頼し、入手した。またマカクザルに対して実験、課題訓練に必要な手術を行い、訓練を行った。遺伝子導入したニューロンに対する光照射方法についての改良、検討を進めている。新規に課題訓練を始めたサルの訓練に想定よりも時間がかかり、やや遅れ気味ではあるが、ウイルスベクターおよび光照射方法についてはおおむね順調に進行している。サルの課題訓練については2頭目のサルを用いることも検討して加速し、当初計画に沿った実験の実施を目指す。平行して課題訓練の必要がない実験についても検討し実験を進める。
バル-ン搭載可能なサブミリ波ロ-カル発振源の試作

本研究では、バル-ン搭載可能な小型軽量のロ-カル用サブミリ波発振源の設計、試作により、その実用化を模索することを目的とした。(1)周波数逓倍器の試作と性能限界の考察逓倍器動作のコンピュ-タによるシミュレ-ションを行い、逓倍回路の最適条件を模索し、その出力限界を明らかにした。そして、サブミリ波帯逓倍器を試作し、2逓倍器については、ほば予想通りの特性結果を得ることができた。ただし、3逓倍器以上の出力電力測定については、サブミリ波電力計の開発が必要となり、パイロ検出器を液体窒素冷却デュア-内にセットして、サブミリ波電力計を試作したが、直読で1μW程度の感度であり、電力の校正が正確でないなど、高感度化と併せて今後の課題として残った。(2)フラックスフロ-発振器の開発Nb/AlO_X/Nb接合によるフラックスフロ-発振器(FFO)の開発を行い、発振器出力をアンテナにより放射し、387GHzにて1μWの発振出力を得た。また、高周波数化として、NbN/MgO/NbN接合によるFFOの試作を行い、バイアス電圧2mV以上で速度整合ステップが得られ、1000GHzの発振を確認した。ただし、注入同期とピュリティ-の測定は、今後の課題となった。今後、さらに、FFOとアンテナの整合回路の低損失化、発振周波数の安定化、出力ビ-ム系の改良等の開発を進めれば実用的なサブミリ波発振源になるものと考える。以上により、本研究においては、ほぼ計画どうり目標を達成することができた。これにより、サブミリ波発振源の実用化の見通しを得ることが出来た。本年度は注入同期系の設計製作、サブミリ波回路系の設設計、フラックスフロ-素子の製作プロセスの検討および微細加工の能率化の4項目について研究を行なった。以下にその概要を述べる。1.注入同期系:同期発振源は水晶発振器の出力を用い、1GHz帯の位相同期発振器(PLO)を駆動し、この出力を10逓倍して10GHz帯のガン発振器に注入した。このガン発振器を使用してミリ波ガン発振器を同期させる予定であるが、安全を考慮し、50GHz帯の注入同期ガン発振器の設計製作も行なった。2.サブミリ波系:100GHzを入力した2から4倍までの逓倍器のシミュレ-ションを行ない、最適なエッベディングインピ-ダンスを求めた。また、バラクタ-ダイオ-ドの接合径とウィスカ-の影響を考察し実用化のための寸法の限界を求めた。この値は来年度にサブミリ波逓器を開発するための基本デ-タとなる。この結果、導波管系の損失を考慮しても、5逓倍器までは低雑音SIS受信機を駆動できる性能が期待できそうである。3.フラックスフロ-素子:Na/Alx/Nbの発振素子の試作を行ない、1/4波長形変成器およびボ-タイアンテナにより、外部にサブミリ波発振電力を取り出し得ることを確認できた。また高周波化を進めるため、NbN/MgO/NbNの接合の試作により、ギャプ構造の見える特性が得られた。ただし、かなり、リ-ク電流が多いため、来年度プロセスの見直しが必要となっている。4.微細加工:試作の繰り返しを能率化を図るため、光学のアライナ-を購入し、露光条件を求めた。この結果、光源の平行度をより良くするための改良が必要となり次年度の課題となった。以上により本年度の研究目標をほぼ計画通り達成することができた。本年度はガン発振電力注入による逓倍器の試作とフラックスフロ-発振器の開発を行なった。

1.ガン発振電力注入による逓倍器ガン発振器のマウントはレデュ-ス・ハイトの導波管型とし、バイアスチョ-クはカットオフ15GHzとした。ガンダイオ-ドは日本鉱業K.K製のインジュ-ムリン(ImP)のダイオ-ドを用いた。周波数94GHzで70mW以上が得られた。同期電力はバイアスポ-トよりXバンドのマイクロ波を注入したが、同期効率が悪く、今後チョ-クフイルタ-周辺の改良が必要である。一方、サブミリ波逓倍器については、基板回路と逓倍器マウントの製作を行なった。現在、アセンブリ-を行なっており、入出力特性の測定は次年度に行なう予定である。2.フラックスフロ-発振器Nb/AlOx/NbのSIS接合を用いたフラックスフロ-発振器を試作し特性測定を行なった。この結果、200GHzから600GHzに対応したベロシティマッチングステップの直流特性が得られ、かつ100GHzから450GHzまでの発振ビ-ム出力を確認し、150GHzにおいて最大発振電力1.4μWが得られた。一方、高周波化のために窒化ニオブを用いたNbN/MgO/NbNのSIS接合の製作プロセス改良を進めた。この結果、ストレスフリ-で良質なNbN薄膜の上にはMgOが一様に蒸着し難く、歪みの多い膜がMgOのカバ-リングの良いことが明らかとなった。そこで良質な膜上に200A^^°の歪の多い膜をつけた構造のSISを作り、リ-ク電流の減少を図った。なお、このSISは発振出力をビ-ムで放射させるために、クオ-ツ基板上に作った。以上のように、本年度の研究目標はほぼ計画通り達成することができたが、逓倍出力特性や発振スペクトルの評価は次年度の課題となった。本年度はサブミリ波逓倍器の組み立て、サブミリ波電力計の試作、およびNbN系SIS接合による磁束フロ-型発振器の試作等を行なった。1.サブミリ波逓倍器の組み立て光露光、金メッキおよびエッチングにより、分布定数線路型のRFチョ-クを、厚さ30μmの石英基板上につくり、これをダイシングソ-より切り出す。その先端に太さ10μmの白金線をエッチグして、長さ80μmで熱圧着する。一方、100μm角のGaAsのショットキ-ダイオ-ドをポストにつけ、直径1μm中のハネカムにウィスカリングする。2.サブミリ波電力計の試作パイロ検出器を液体窒素冷却のデュア-内にセットして、サブミリ波電力計を試作した。直読で1μWまで測定でき、チッパ-を用いれば0.1μWまで検出できた。3.サブミリ波逓倍器の特性測定100GHzのガンダイオ-ド発振器を入力として逓倍特性を測定した。2逓倍においては3mWで、S/Nが40dB以上の予想通りの出力が得られた。しかし、3逓倍以上では電力の校正が正確にできなかったため、今後の課題となった。4.磁束フロ-発振器の高周波数化石英基板上にNbN/MgO/NbN接合を製作するプロセスを開発し、これにより磁束フロ-発振器を試作し、高周波数化を試みた。その結果、バイアス電圧2mV以上で速度整合ステップが得られ、1000GHz以上の発振を確認した。ただし、注入同期とピュリティ-の測定は今後の課題となった。以上により、最終年度の研究において、ほぼ計画通り目標を達成することができた。これにより、サブミリ波発振源の実用化の見通しを得た。
PD-1/PD-L1システム遮断と非ペプチド性抗原を用いた新規抗腫瘍免疫療法の開発

γδ型T細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)CD8陽性αβ型T細胞などの腫瘍細胞障害性を有するエフェクター細胞において、負の制御因子であるPD-1分子が発現すると、腫瘍細胞上にPD-L1やPD-L2分子が発現している場合に負の調節を受け、細胞障害性が著しく低下する。従って、このリガンド/受容体相互作用を遮断することにより負の制御が遮断され、抗腫瘍作用が増強されることが期待される。この相互作用の遮断のためには抗体、リガンドあるいは受容体の細胞外領域とIgFcとのキメラタンパク、細胞外領域のリコンビナントタンパクなどを用いることが可能である。しかし、抗体やキメラタンパクを用いた方法では実際の臨床応用に際して様々な制限がある。そこで本研究課題においては、PD-1およびPD-L1の細胞外領域の可溶性分子を調製し、抗腫瘍作用を増強させるための新規がん免疫療法開発のための基盤を確立することを目的とした。マウスの系において、PD-1分子、および、PD-L1分子の細胞外領域を大腸菌において封入体として発現させ、グルタチオンを酸化還元試薬として用いたアルギニンベースの緩衝液中でリフォールドを行った。また、ヒトのPD-1分子の調製も行い、それぞれの活性をビアコアにより確認した。これらの分子を用いることにより、新たながん免疫療法が可能になると考えられる。
新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼの構造と機能調節及び病態時の役割

ATPとDithiothreitol(DTT)により活性が調節される新規の膜結合型グアニル酸シクラーゼ(ATP/DTT-stimulated GC)をラット肺に見い出し、その性質と活性調節機構の一部を明らかにした。ラット肺より調製した膜分画、さらにATP/DTTにより促進される性質を有したまま可溶化した標品、親和クロマトグラフィーの溶出分画でのGCなどを実験に用いた。このGCにはATP/DTTにより活性が促進される状態、すなわちsensitive stateと、活性が促進されないinsensitive stateの2つの状態が存在することを見い出した。Sensitive stateからinsensitive stateへの変換は、protein phosphataseによる脱リン酸化反応によると考えられ、次いでinsensitive stateからsensitive stateへの変換は、protein kinaseによるタンパク質のリン酸化反応によると考えられる。阻害薬の実験結果より、insensitive stateへの変換には、protein phosphatase-1が部分的に関与し、またsensitive stateへの変換にはCaM kinase IIが関与している可能性が考えられる。一方、WGA-agaroseの溶出分画のGCは、粗可溶化標品に含まれる因子の共存下でpreincubateすることにより、sensitive stateへ変換される可能性を示す結果を得た。一般に膜結合型の活性タンパク質の抽出および精製にデタジェントをはじめ、安定化のためにbuffer系に添加される物質は、多くのタンパク定量法に対して、妨害物質となる場合が多い。我々はDOC-TCA法では除去できない妨害物質の影響をほぼ完全に除去する方法を考案した。即ちDOC-TCA-washing法を実施したMicro BCA(bicinchoninic acid)反応により、O.05μg1.6μgの極めて微量のタンパク質を感度良く、正確に、再現性良く、迅速に定量することができた。可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)のβ2サブユニットの2種類のバリアント(β2aおよびβ2b)のcDNA断片が、3'-RACE法によってラット脳cDNAライブラリーから分離された。β2aの推定アミノ酸配列は既知のβ2サブユニットの配列と一致したが、β2bの配列は既知のβ2サブユニットよりC末端が46残基短く、C末端に含まれているイソプレニル化/カルボキシメチル化のコンセンサス配列を欠いていた。RT-PCR法による解析では、腎臓、肝臓、および脳を含む様々な組織に両バリアントのmRNAが存在することが示された。私共が発見した2つの新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼ(以下GCと略記)、すなわち、1)SH感受性ATP依存性GC(略称SAT-GC)2)GTP,Ca要求性不飽和脂肪酸依存性GC(略称CFG-GC)について、酵素分子としての性質を明かにすると共にcDNAクローニングとタンパク構造の解析を行う。特にSAT-GCは膜からの可溶化と高度精製が容易でないが成功させることを今年度の第一の目標とした。A.SAT-GCの膜からの可溶化に成功したが、可溶化標品は不安定であり、氷中12hでSAT-GCとしての性質が完全に消失する。

そこでSAT-GCとしての性質を安定に保持できる条件を精力的に検討し、4日以上安定に保持できる条件を確立できた。この条件下にて3種類の親和クロマトを連続的に実施し、高収量でSAT-GCの高度精製標品を得ることに成功した。現在得ているSAT-GC精製標品は、可溶化前の本酵素と同様に、活性化因子により活性が促進され、氷中3日以上安定である。さらに、もう一方のGCであるCFG-GCの精製過程で私共が発見したCFG-GCのmodulator(38K)(GCMと命名)は膜結合状態のSAT-GCには無効果であるが、精製したSAT-GCでは、このGCMが活性を著明に促進することが判明した。従ってSAT-GCの活性調節機構にGCMが関与する可能性がでてきた。B.精製酵素量が微量であることが予想されるため、既知のGCの触媒領域のアミノ酸配列に基づいてディジェネレートプライマーをデザインし、脳のcDNAライブラリーに対して3'-RACEを、さらにネスティッドPCRを行い、得られた262クローンについて検索したが、新規のGCは見つからなかった。現在ラット肺のライブラリーに対して同様のクローニングを行い、得られた302クローンの解析を行っているところである。私共が発見した2つの新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼ(以下GCと略記)、1)SAT-GC 2)CFG-GCについて、その性質および機能調節機構を明かにする。1.SAT-GC系は膜から可溶化すると、極めて不安定である。そこで、安定化条件を検索し、部分的に精製することに成功した。本酵素は可溶化前ではATPにより約20倍活性が促進されたが、部分精製標品では約2倍促進された。活性化の倍率の減少の原因について実験結果を考察し、SAT-GCにはactive formとinactive form或は活性化因子に対してsensitive form,insensitive formの存在を想定し、条件により両form間の変換が起ると仮定して、その条件の検索を行った。その結果上記の想定が大概正しいと考えられる結果が得られ、両form間の変換に必要な因子および条件を明らかにした。今後、両formの本体を解明する予定である。2.膜タンパク質の微量定量法:Micro BCA法を採用し、DOC-TCA法に引き続いて、washingを行うことにより、妨害物質の影響をほぼ完全に除去する方法を考案した。この考案を採用した定量法により、0.05μg1.6μgの極めて微量の膜タンパクを感度良く、正確に、再現性良く、迅速に定量することができる。3.ラットの脳と肺のcDNA libraryより新規GCの探索を試みた。