hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非対称二極小ポテンシャルに関するトンネル異性化

基本的な有機分子を,高真空状態で,かつ,極低温に冷却したアルゴン固体の中に埋め込み,紫外線を照射したときに起こる水素原子の分子内移動の様子を詳しく研究した.赤外吸収スペクトルの測定および量子化学計算による分子構造,振動数などの計算結果を併用して解析したところ,水素原子は非対称な二極性ポテンシャル面上で,トンネル効果によって異性化障壁を超えて分子内を移動して,分子の形が変化することがわかった.基本的な有機分子を,高真空状態で,かつ,極低温に冷却したアルゴン固体の中に埋め込み,紫外線を照射したときに起こる水素原子の分子内移動の様子を詳しく研究した.赤外吸収スペクトルの測定および量子化学計算による分子構造,振動数などの計算結果を併用して解析したところ,水素原子は非対称な二極性ポテンシャル面上で,トンネル効果によって異性化障壁を超えて分子内を移動して,分子の形が変化することがわかった.2-クロロ安息香酸,2-クロロプロピオン酸,2-ニトロフェノール,2-ヒドロシ-3-ニトロピリジンの光異性化に関する実験と量子化学計算を行い,分子内水素原子移動がトンネル反応である可能性が高いことを突き止めた.また,これまでに,観測されていなかった準安定な反応中間体(回転異性体)を同定することができた.具体的には,0.1°Cの精度で温度制御のできる温度コントローラーを購入して,固体試料を過熱して得られる蒸気を希ガスと混合して実験を行った.加熱ノズルは高真空チェンバー内で不純物が発生しないように,無酸素銅を加工し,テープヒーターに電流を流して用いた.このようにして作成したマトリックス単離試料の赤外吸収スペクトルを測定した.一方,量子化学計算の一種である密度汎関数法で,可能性のあるすべての異性体のスペクトルパターンを予測した.得られた実測と計算のスペクトルを比較して同定を行った.次に,マトリックス単離試料の温度を変化させ,赤外吸収スペクトルの変化をモニターした.とくに,異性体間の相対強度ならびに新規準安定異性体のピークの出現を確認した.さらに,マトリックス単離試料に光照射を行い,光照射中および光照射後の赤外吸収スペクトルを測定し,光照射前のスペクトルと比較して,準安定異性体のピークを確認し,密度汎関数法で予測されるスペクトルパターンとの比較により同定を行った.スペクトルのピーク強度の時間変化から,安定異性体へのもどり反応速度定数を最小二乗法によって決定した.また,重水素化物を合成して同様の実験を行い,軽水素化合物と重水素化合物の反応速度定数の比較を行った.その結果,分子内水素原子移動がトンネル反応である可能性が高いことを突き止めた.固体アルゴンの中に埋め込んだ6-ヒドロキシキノリンおよび7-ヒドロキシキノリンがどのような光反応を行うかについて,赤外分光法と量子化学計算によって研究した.観測した赤外吸収スペクトルと計算したスペクトルパターンを比較することによって,ヒドロキシキノリンの水酸基の水素原子が選択的にキノリン環の外側に向いていることがわかった.波長が約300nmの紫外線を試料に照射すると,これまでにまったく知られていなかった化学種のスペクトルを観測することができた.未知物質の一つは,水酸基の水素原子が脱離することによって生成するキノリノキシルラジカルであることがわかった.もう一つの未知物質は,水素分子が脱離して,そのあとで分子内の電子の移動が起こって生成するケテン化合物であることがわかった.生成したケテン化合物の構造は出発物質のヒドロキシキノリンの水酸基の水素原子の向きに依存することもわかった.7-ヒドロキシキノリンでは,さらに,脱離した水素原子が分子内でキノリン環の窒素原子に移動して結合し,ケト形に異性化することがわかった.この異性化はポテンシャルの障壁の高さから考えて,トンネル異性化である可能性が高いことがわかった.以上のように,反応物質,反応中間体,反応生成物の幾何学的構造を正確に決定することのできる今回の研究方法は,とくに光反応機構の詳細な解明に有効であることが明らかになった.今回の研究成果については,ヘルシンキで行われた国際会議で招待講演として発表し,また,国内では分子科学討論会で2件の発表を行った.現在,50ページにおよぶ学術論文として,投稿準備がほぼ完成している.
負の増殖シグナルの異常と細胞増殖制御の破綻

本研究ではがん発生過程に関わるTGF-βおよびWntシグナル分子の制御機能を解明するため、TGF-βおよびWntシグナルに関与する分子に相互作用する分子を単離し、研究を進めた。MAFbx/Atrogin1は筋萎縮に関与するユビキチンE3リガーゼである。我々はMAFbx/Atrogin1とTGF-βシグナルの関係を明らかにするため、その線虫相同遺伝子MFB-1を用いて遺伝学的機能解析を行った。MFB-1の生体内における機能を解析するため線虫mfb-1変異株を分離した。この変異体は単独では顕著な異常を示さなかったが、DAF-7経路においてシグナルを制御する遺伝子の変異体と二重変異にした際に、それらの変異体が単独で示す恒常的dauer形成(Daf-c)を顕著に増強させる表現型を示した。これに対して、dauer形成を制御するもう一つの経路として知られるDAF-2/インシュリン受容体様シグナル伝達経路におけるDAF-2変異体との二重変異では、そのDaf-c表現型に変化は見られなかった。逆にDAF-7経路のDaf-c変異体内でmfb-1遺伝子を過剰発現させた場合には、表現型を部分的に抑制できることも確認できた。また、DAF-7経路の変異体との二重変異で見られたDaf-cの増強は二重変異株へのmfb-1 cDNAの導入により、完全にレスキューされた。さらに、MFB-1におけるF-boxドメインを欠失させたmfb-1 cDNAについてレスキュー能を調べたところ、このcDNAはDAF-7経路の変異体との二重変異で見られるDaf-cの増強をレスキューできなかった。これはMFB-1のF-boxドメインが、機能上必須であることを示唆している。F-boxドメインはF-boxタンパク質がSCF複合体を形成する上で重要な領域と考えられており、MFB-1もユビキチンリガーゼとして機能していると考えられる。これらの結果からMFB-1は、遺伝学的にDAF-7経路のシグナルを正に制御し、線虫のdauer形成を抑制していることが明らかとなった。アフリカツメガエル胚オーガナイザー形成におけるWntシグナル伝達系の分子機構を検討した。1)オーガナイザー領域におけるWnt標的遺伝子Xtwnの発現誘導には、Smad4がXtwnプロモーターに結合することによって関与していることが明らかになった。2)内在性のSmad4とβ-cateninのWntシグナル依存的な複合体形成が確認された。さらに、Smad4はWntシグナル依存的に核移行することを明らかにした。3)Smad4はWntシグナル依存的にXtwn遺伝子発現に関与することが確認された。また、Smad4とβ-cateninはLEF1による転写を相乗的に活性化し、Xtwn遺伝子発現を協調的に誘導することを明らかにした。以上の結果から、Smad4はWntシグナルによって核移行し、LEF1やβ-cateninと複合体を形成することによりWnt標的遺伝子の転写を協調的に活性化することが示された。一方、Jab1による核外移行に着目し、Jab1によるp27分解制御機構に関する研究を行った。その結果、(1)Jab1による核外移行が正常細胞におけるp27の分解誘導に必要とされること、(2)p27の分解はJab1だけでなく他のCOP9 signalosome複合体の構成因子によっても誘導されること、(3)Jab1がCDKインヒビターを負に制御する過程で、核外輸送因子との間でアダプターとして働くこと、(4)Jab1により細胞質に輸送されたp27はGrb2と相互作用することにより分解へと導かれること、などを明らかにした。さらに、細胞レベル・個体レベルでのJab1の機能を解析するためにJab1の発現を人為的に誘導できる細胞株とノックアウトマウスの作製準備を行うとともに、Jab1を始めとする各種p27制御因子の特異的抗体を作製しヒトのがん細胞・がん組織におけるそれぞれの発現状態を調べる準備を整えた。TGF-βシグナルに関わる新規分子を取得することを目的として,yeast two-hybridスクリーニングによりBMP receptor associated molecule (BRAM)に結合する因子,BRAM interacting protein (BIP)を単離した。BIPホモログはヒト,アフリカツメガエル,線虫C. elegansに存在していた。C. elegansにはBRAMホモログ、BRA-1,BRA-2が存在し、C. elegans BIPがこれらと相互作用することが期待されたので,C. elegansを用いたBIPの機能解析を行った。C. elegans BIPとBRA-1,BRA-2の相互作用を検討し、C. elegans BIPはBRA-1,BRA-2の両者と結合することが明らかとなった。次にdouble stranded RNA interference (dsRNAi)を用いて検討した。野生型にBIP dsRNAをインジェクションし,F1を観察したところ野生型の体長は1.18±0.09mmであるのに対し,BIP dsRNAをインジェクションした群では1.00±0.09mmと,BIPの機能欠失によって体長の短いSmaの表現型を示すことが明らかとなった。

そこで,sma経路のリガンドであるDBL-1の過剰発現変異体dbl-1(++)に対するBIP dsRNAiを検討したところ,dbl-1(++)の体長は1.53mmであるが,これにBIP dsRNAをインジェクションした群では,体長が1.24mmまで短くなり野生型と同程度になる個体が認められた。さらに,sma経路の標的遺伝子であるlon-1機能欠失変異体にdsRNAiを行ったが,この変異体に対しては作用が全く認められなかったことから,C. elegans BIPはsma経路においてリガンドDBL-1より下流かつ標的遺伝子であるLON-1より上流に位置することが確認された。以上の結果よりBIPはBRA-2に作用してsma経路をポジティブに調節している可能性が高いと思われた。一方、Jab1によるp27分解制御機構に関する研究を行い、ドミナントネガティブJab1を増殖中のマウス繊維芽細胞株に導入すると、p27の発現量が上昇し細胞周期の進行がG1期に停止することを明らかにした。また、細胞・個体レベルでのJab1の機能を解析するため、Jab1の発現を人為的に誘導できる細胞株とノックアウトマウスの作製を行い、ヒトがん細胞におけるJab1の遺伝的変異検索を開始した。Wntシグナル分子が癌遺伝子や癌抑制遺伝子であることはよく知られている事実である。我々はMAPキナーゼ様分子NLKがWnt/β-catenin経路に対して抑制的に機能することを示してきた。本研究では、発生研究に適したアフリカツメガエル胚を用いて、初期発生におけるNLKの機能解析を行った。アフリカツメガエルのNLK相同遺伝子(xNLK)を単離し、xNLKの発現について調べたところ、xNLK mRNAが未受精卵から初期発生の過程を通して存在していることがわかった。また、神経形成期におけるxNLK mRNAの発現が神経領域に限局したことから、xNLKが神経発生に関与する可能性が考えられた。そこで、アニマルキャップアッセイを用いて検証したところ、予定外胚葉領域にxNLKを発現させると、前頭部の神経マーカー遺伝子Otx-2の発現が誘導されることがわかった。また、β-cateninとの結合能を持つHMG型転写因子であるSoxタンパク質に着目し、NLKとの機能的相互作用について検討した結果、xSox11がChordinにより発現誘導されること、xNLKとxSox11が協調して神経誘導を行うことが示され、また、xNLKとxSox11が複合体を形成することが確認された。さらに、xSox11やChordinによる神経マーカー遺伝子の発現誘導は、キナーゼ活性欠損変異型であるxNLK-KNの発現によって抑制されることがわかった。以上の結果は、NLKがSox11と協調して、神経形成において機能するという新たな機能を示している。また、酵母two-hybrid法を用いてNLKの周辺因子のスクリーニングを行い、NLKのC末端側領域と相互作用する、既知、新規を含む9種類のタンパク質を単離し、解析を進めている。本研究ではがん発生過程に関わるTGF-βおよびWntシグナル分子の制御機能を解明するため、TGF-βおよびWntシグナルに関与する分子に相互作用する分子を単離し、研究を進めた。NLKはMAPK様のセリン/スレオニンキナーゼで、TAK1の下流で転写因子であるTCF/LEFをリン酸化する事によりWnt/β-cateninシグナル伝達経路を負に制御する事が知られている。
哺乳動物における生体調節因子としての分岐鎖アミノ酸の生理機能

本研究では、哺乳動物の必須アミノ酸である分岐鎖アミノ酸(BCAA)の分解を調節する酵素BCKDH複合体を不活性化する特異的キナーゼ(BDK)を、全身組織または組織特異的に欠損させることにより、BCKDH複合体がBCAA代謝の主要調節酵素であることを明らかにすると共に、BCAAの生体調節機構の解明を目的とした。これらのBDK欠損マウスでは、組織及び血中のBCAA濃度は有意に低下したので、BCAA代謝調節酵素としてBCKDH複合体の重要性が示された。さらに、これらのBDK欠損マウスを用いた研究により、筋タンパク質代謝、持久運動能力、エネルギー代謝におけるBCAAの重要性が示唆された。本研究では筋肉特異的にbranched-chain α-ketoacid dehydrogenase kinase (BDK)を欠損させたマウス(BDK-mKOマウス)を作製し、その特徴を解析することを目的とした。ControlマウスとBDK-mKOマウスの各群間において10週齢までの成長曲線及び組織重量に差は認められなかった。従って全組織でBDKをノックアウトした時に確認された発育不良は筋特異的にBDKをノックアウトした場合には起こらないことが判明した。また今回の実験で使用したマウスにおいて、尾懸垂における後肢の抱え込み動作は認められなかったので、筋特異的にBDKをノックアウトしても神経的な異常は起きないことが示唆された。BDK-mKOマウスのBCAA濃度がControlマウスと比較して筋肉(骨格筋及び心筋)で約40%に、血液で約70%に減少した。この結果より、筋肉のBCAA代謝は血液のBCAA濃度に強く影響することが明らかとなった。またBDK-mKOマウスの骨格筋においてアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンの濃度が増加し、心筋においてアラニンの濃度が増加したが、これはBCAAが分解される際に、アミノ基転移反応により生成されたアミノ酸であると考えられる。BDK-mKOマウスの心筋および骨格筋におけるタンパク質濃度は、コントロールマウスと同じであった。よって、筋中BCAA濃度が著しく低下しても筋タンパク質量を維持する機構がBDK-mKOマウスには作用している可能性が示唆された。一方、翻訳開始因子のサブユニットであるeIF2α量がBDK-mKOマウスにおいてControlマウスと比較し有意に減少したが、この減少が骨格筋におけるタンパク質濃度の維持に関与している可能性が示唆された。分岐鎖アミノ酸(BCAA:ロイシン、イソロイシン、バリン)は、タンパク質合成のための必須アミノ酸である。BCAA分解は、その分解系の第2反応を触媒する分岐鎖αケト酸脱水素酵素(BCKDH)により調節され、そのキナーゼ(BDK)はBCKDHを不活性化する調節酵素である。本研究では、筋組織特異的BDK遺伝子欠損(BDK-mKO)マウスを作製し、そのマウスに低タンパク質食を摂取させることによる筋組織への影響を解析した。8週齢の雄性BDK-mKOマウスとControlマウスにそれぞれ12週間、20%タンパク質(RP)食もしくは8%タンパク質(LP)食を自由摂取させた。12週間の飼育後に屠殺し、血漿および後肢筋を採取した。後肢筋重量を測定し、可溶性および不溶性筋原線維タンパク質濃度を測定した。さらに、タンパク質合成の調節系であるmTOR活性分析のためにS6K1, 4E-BP1のリン酸化状態を測定した。RP食群よりLP食群で摂食量が有意に増加したが、それぞれの群間で飼育中の体重増加に有意な差はなかった。また、それぞれの群間で後肢筋とヒラメ筋重量に差はなかったが、LP食摂取により、BDK-mKOマウスの後肢筋における不溶性筋原繊維タンパク質濃度が他の群に比べて有意に低下した。さらに、S6K1及び4E-BP1のリン酸化率はLP食/BDK-mKO群において有意に低下した。これらの結果より、BDK-mKOマウスでは、LP食摂取により十分量のBCAAを得られなかったため、骨格筋のタンパク質合成能が低下して筋原線維タンパク質濃度が低下したと推定された。よって、筋原線維タンパク質合成におけるBCAAの重要性が示唆された。一方、BDK-floxedマウスを用いて、脂肪組織特異的BDK遺伝子欠損(BDK-adKO)マウスの作製に挑戦し成功したので、その繁殖が可能になった。低タンパク質食による短期間の飼育では、骨格筋重量とそのタンパク質含量においてBDK-mKO群とControl群での差はなかったが、前者でタンパク質合成能力の低下の可能性が示唆された。このことより、BDK-mKOマウスでは、低タンパク質食を給餌することによりタンパク質合成の低下がおこり、それが長期間(12週間)持続することにより骨格筋における筋原線維タンパク質含量の低下が引き起こされることが示唆された。すなわち、骨格筋の長期BCAA不足が筋原線維タンパク質含量に影響することが証明され、当初想定していた結果が得られたので、研究は概ね順調である。また、脂肪組織特異的BDK-KO (BDK-adKO)マウスの作製法も完成したので、繁殖すればその特徴を分析できる状態になったので、この点についても研究は概ね順調である。分岐鎖アミノ酸(Branched-Chain Amino Acids: BCAA)は、タンパク質合成のための必須アミノ酸であるが、その他の生理機能を表す生体調節因子として作用する可能性が示唆されている。

本研究では、哺乳動物の体内でBCAA分解を抑制する酵素である分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素キナーゼ(BDK)を筋肉特異的に欠損させることにより、筋肉特異的なBCAA不足マウス(mKOマウス)を作製して、BCAAの生体調節機能を検討した。8週齢雄性mKOマウスとControl (Con)マウスにそれぞれ20%タンパク質食(Regular Protein diet: RP)と8%タンパク質食(Low Protein diet: LP)を12週間給餌した。その後屠殺して後肢筋(腓腹筋+足底筋)を採取し、その可溶性および不溶性タンパク質濃度を測定した。各群(Con/RP, Con/LP, mKO/RP, mKO/LP)マウス間の成長曲線または後肢筋重量において差はなかった。後肢筋における可溶性タンパク質濃度にも群間で差はなかったが、筋線維などの不溶性タンパク質濃度は、mKO/LP群においてのみ有意な低値を示した。すなわち、mKOマウスの骨格筋線維タンパク質濃度は、RP食給餌により影響されなかったが、LP食給餌により有意に低下した。これらの結果より、骨格筋線維タンパク質の維持におけるBCAAの重要性が示唆された。RPで飼育した11週齢雄性mKOマウスとConマウスに対してトレッドミルによる走運動トレーニングを2週間負荷して、持久力(走行可能距離)の上昇をConマウスとmKOマウスで比較した。トレーニング前の持久力は両マウスで同じであったが、トレーニング後の走行距離は両群共に2倍強に増加したものの、mKOマウスがConマウスよりも有意な低値(約12%低下)を示した。よって、BCAAは運動トレーニングに対する適応に重要であることが示唆された。本研究では、哺乳動物の必須アミノ酸である分岐鎖アミノ酸(BCAA)の分解を調節する酵素BCKDH複合体を不活性化する特異的キナーゼ(BDK)を、全身組織または組織特異的に欠損させることにより、BCKDH複合体がBCAA代謝の主要調節酵素であることを明らかにすると共に、BCAAの生体調節機構の解明を目的とした。これらのBDK欠損マウスでは、組織及び血中のBCAA濃度は有意に低下したので、BCAA代謝調節酵素としてBCKDH複合体の重要性が示された。さらに、これらのBDK欠損マウスを用いた研究により、筋タンパク質代謝、持久運動能力、エネルギー代謝におけるBCAAの重要性が示唆された。平成26年度の研究において、筋特異的BDK欠損(BDK-mKO)マウスとコントロール(正常)マウスを繁殖・飼育し、1012週齢のBDK-mKOマウスの基本的特徴を明らかにすることができた。また、これらのマウスを用いて、運動負によるBDK-mKOマウスの反応を解析する研究も進行中である。一方、BDK-mKOマウスに低タンパク質食を与えて長期に飼育し、その間3%BCAA水を飲料水として摂取させ、筋線維タンパク質含量が正常値に回復するかを検討する。これらの研究により、筋タンパク質維持におけるBCAAの重要性を証明する。BDK-adKOマウスでは、その基本的特徴について解析し、脂肪組織のBCAA代謝の変動が血中BCAA濃度に影響するか否かを明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
インターネットを利用した日本語遠隔教育の効果-教材構造、学習者特性との関係から

Iインターネット上で学習者が利用できる日本語遠隔教育システムの運用と改善(1)「初級文法」「基本語彙」「ひらがな・かたかな」「漢字」が学習可能な日本語遠隔教育用教材を運用(初年度は国内、次年度は海外も)し、システムやインターフェイスの改善を行なった。(2)研究のため、教材構造の異なる2種類の教材(教師コントロールが強く学習順序や項目を学習者が選べないもの/学習者コントロールが強く学習者が好きに項目を選べるもの)を開発した。II学習スタイルチェックシートの開発(1)学習者特性を明らかにするため学習スタイルを数値化するアンケート項目の開発を行なった。(2)認知スタイルについては、場独立・場依存のみを対象とすることとした。IIIデータ収集(1)実験に協力してくれる学習者の選択(2)被験者の学習者特性の調査(3)運用による学習効果の測定(4)学習履歴の収集(5)教材に対するアンケート調査(好き嫌い/面白い面白くない/有用かそうでないか)IVデータ分析(1)学習効果について、学習者特性及び教材構造の点から分析を行なった。(2)教材に対する学習者の反応をアンケート調査の結果から分析した。明らかになった点外国語としての日本語は、遠隔教育システムを利用してある程度可能であることが明らかになった。例えば、文法や文型、語彙、漢字、などについては、教室学習でなくても学習者の努力によってかなりの習得が可能であった。また、認知スタイルと学習効果については有意な効果の差は見られなかった。また、学習スタイルと効果についても同様であった。これは、今回は被験者が少なく、すべての被験者が熱心に学習に取り組んだため、あまり効果に差が見られなかったのではないかと思われる。また、初級段階の遠隔教材は、ある程度教師コントロールの強い構造をとった方が、学習効果が高く現れることが明らかになった。今後は中級・上級の場合の調査も必要であると思われる。1.学習者特性調査本システムを利用して日本語学習を行なう学習者の特性(認知スタイル-場依存・場独立)を調査した。2.システム運用インターネット上に構築した日本語学習サイトのテスト運用を行なった。まず、国内での運用(都内、沖縄、千葉)と本学間の運用を行い、現在はアメリカ間での運用を実施している。3.学習履歴の収集システムを利用して日本語学習を行なった学習者の学習履歴-学習者の学習時間(何時ごろ、何時間ぐらい)、利用した教材、利用したヒント、正解数、間違った回数(どのように間違ったか)など-をメール形式で収集した。現在のところ、30人弱分の履歴が収集できている。4.履歴の分析収集した学習履歴を分析した。(1)学習時間の長さと学習効果との関係(2)学習者特性と学習効果との関係(3)教材構造と学習効果との関係5.システムの改善運用の結果明らかになったシステムの不備(文字のずれ及び音声の不明瞭など)を改善するとともに、より学習者が使いやすいインターフェイスへの改良を行なった。今年度は平成17年度に運用を開始した日本語学習用遠隔教育システムの運用及び改善、その効果の検証を中心に研究を行なった。(1)昨年度の運用後の調査により明らかになった不具合及び使いにくい点の改善を行なった。*学習者が同時に多数アクセスした場合に起こるシステム稼動の遅さについて、サーバーの改善を行なうことで解決した。*学習者から漢字上の「ルビ」が小さくて読みにくいという指摘があったため、別ウインドウで「ルビ」を大きく表示できる機能を追加した。(必要に応じて)

*学習者が自分の学習を管理できる機能(どこまで修了しているか、どの程度の正解率か)を追加した(2)海外の学習者の運用を継続して行なった。(3)学習者履歴の分析を行なった。(4)学習効果の分析を行なった。(5)学習者特性(認知スタイル)と学習効果の検証を行なった。(6)教材構造と学習効果の検証を行なった。明らかになった点外国語としての日本語は、遠隔教育システムを利用してある程度可能であることが明らかになった。例えば、文法や文型、語彙、漢字、聴解などについては、教室学習でなくでも学習者の努力によってかなりの習得が可能であった。ただし、習得した語彙や文型を活用した会話については、今後の課題である。また、認知スタイルと学習効果については有意な効果の差は見られなかった。また、学習スタイルと効果についても同様であった。これは、今回は被験者が少なく、すべての被験者が熱心に学習に取り組んだため、あまり効果に差が見られなかったのではないかと思われる。今後、このシステムを多くの学習者が利用することで、学習スタイルによる効果の差は出てくると予想している。また、初級段階の遠隔教材は、ある程度教師コントロールの強い構造をとった方が、学習効果が高く現れることが明らかになった。今後は中級・上級の場合の調査も必要であると思われる.
スフィア形成法を駆使した膵癌幹細胞の機能解析と指標の確立

これまでの、スフィアを継代する事でスフィア形成率が増加する結果を受け、引き続き実験を行っていたが、その後スフィア形成率が極端に低下し、検討していた課題を進める事が困難であったため、一旦他の視点からの検討を行った。その中で、S100A4タンパクに注目した。S100A4は21種から構成されるS100familyの一つである。S100タンパクは、主に細胞質に存在するが、細胞外に存在しautocrineやparacrineによって他の細胞間で作用する場合もある。血流に入り遠隔にある細胞とも作用するもので、細胞表面レセプターと相互作用し、主に腫瘍の発生、転移、浸潤を促進する方向へ作用するとされている。S100A4はその中の一つで、乳癌、膵癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎細胞癌、脳腫瘍などでの発現が確認されている。既に作成していたスフィアのパラフィンブロックを用いて、本タンパクの免疫染色を行ったところ、スフィアの形状(いびつなものから完全な球形のもの)によってS100A4タンパク発現の局在が異なる事が分かった。いびつなスフィアは細胞質全体に存在する細胞が多いのに対し、完全な球形のものは細胞内の一部へ局在する傾向を示した。研究実績の概要で述べたように、スフィア形成率が極端に低下した事があり、本来予定していた研究を一時中断していたため。前記のようにスフィア形成率の低下は、培地の保存状態が一つの原因と考えられた。現在は良好な形成率を保てており、今後は新たな知見も加えながら、今年度に予定していた課題を進めていく。(理由)今年度は旅費の使用が無かったため、次年度使用額が生じたと考える。(使用計画)今年度に予定していなかったS100A4タンパクに関する研究も今後計画している。当該次年度使用額を用いる計画である。
鳥類時計遺伝子のクローニングと概日時計及び光周性測時機構の解析

概日リズムは一日の環境サイクルに対する適応で、生物の生活リズムの根底をなす機構である。生体の生理機能は、ほとんどが概日時計の支配下にあり、代謝、生理、摂食、生殖など動物の生産性に関連する要因の多くが概日時計の影響を強く受けている。概日時計は、時を知らせるだけでなく、一日の昼の長さを測り、それに応じて生殖腺活動が変化させる光周性反応や季節繁殖などの制御にも重要な役割を果たしている。概日時計の分子機構の研究は、ショウジョウバエやアカパンカビなどで進んでいたが、高等動物についての研究は遅れていた。しかし、近年ショウジョウバエの時計遺伝子ホモログ(PeriodやClockなど)がマウスで次々にクローニングされ、それらの遺伝子を用いた研究により、哺乳類の概日リズムの制御機構が急速に解明され始めた。一方、鳥類では研究が遅れていたが、最近我々は、世界に先駆けてウズラでPeriod(qPer2及びqPer3)とClock (qClock)遺伝子をクローニングし、その特性を明らかにした。本研究は、これらの時計遺伝子を利用して、鳥類概日機構と光周性測時機構について解析したものである。得られた成果は以下のようにまとめることができる。(1)時計遺伝子の発現解析:時計遺伝子は、松果体、網膜さらに多くの末梢組織に発現し、特にqPer2,3には明確な概日リズムが見られることがわかった(Molecular Brain Res,2000)。(2)視交差上核の同定:長い間不明であった鳥類の視交差上核を時計遺伝子の発現を指標として同定した(Am J Physiol,2001)。(3)視交差上核の時計遺伝子発現に及ぼすメラトニンの影響:メラトニンは鳥類の概日リズムの制御に重要である。そこで視交差上核の時計遺伝子の発現に及ぼすメラトニンの影響を検討した。その結果、メラトニンは時計遺伝子の転写に影響せず、視交差上核細胞間のカップリングに影響するものと推測できた(Eur J Neurosci,2002)。(4)光周性反応における時計遺伝子の関与:光周性測時機構における時計遺伝子の関連を調べるために、長日及び短日条件での時計遺伝子の発現リズムを視交差上核、松果体、漏斗核などについて調べ、視交差上核や松果体では時計遺伝子の発現パターンが変化するが、光周性反応の中枢である漏斗核では変化しないことを明らかにした(投稿中)。(5)卵巣における時計遺伝子の機能:卵巣における時計遺伝子の発現リズムを調べ、卵巣時計が排卵を制御する可能性を示唆した(投稿中)。(6)時計遺伝子の発生:ニワトリ胚を用いて時計の発生過程を調べた。その結果、恒暗条件下ではリズムの発振が生じないことを明らかにした(投稿中)。(7)光周性を制御する新規遺伝子:光周性反応に関わる新規遺伝子を発見し、その機能について明らかにした(投稿中)。

(6)時計遺伝子の発生:ニワトリ胚を用いて時計の発生過程を調べた。その結果、恒暗条件下ではリズムの発振が生じないことを明らかにした(投稿中)。(7)光周性を制御する新規遺伝子:光周性反応に関わる新規遺伝子を発見し、その機能について明らかにした(投稿中)。ウズラの時計遺伝子のクローニングを試み、世界に先駆けてウズラでPeriod(qPer2及びqPer3)とClock(qClock)遺伝子を単離することに成功した(Molecular Brain Research,2000)。クローニングした時計遺伝子を染色体上にマッピングし、時計組織である松果体、網膜における発現リズム及び光による発現誘導、さらに末梢組織における遺伝子発現などについて検討した。その結果、クローニングした遺伝子はいずれも時計組織である松果体や網膜に強く発現し、それには明確な概日リズムが見られること、さらに多くの末梢組織にも発現することが明らかになった。末梢における発現リズムも松果体や網膜と同じ時刻に発現のピークを示した。光によって発現誘導が起こるのはqPer2遺伝子だけで、概日リズムの明暗周期への同調メカニズムがこの遺伝子の光応答により説明できた。また、哺乳類では、視床下部の視交差上核(SCN)が概日リズムの振動体であることが知られているが、他の脊椎動物ではSCNの解剖学的所在については明確ではなかった。そこで、時計遺伝子の発現を利用してSCNを同定した(American J Physiology,2001)。その結果、従来から想定されていた部位とは異なる神経核がSCNであることが明らかとなった。この成果は、非哺乳脊椎動物でSCNを同定した始めての例であると共に、現在コンセンサスとなっている哺乳動物を含めた脊椎動物の概日制御モデルに再検討を促す結果となった。クローニングしたウズラの時計遺伝子(qPer2, qPer3, qClock)の発現を調べ、以下の点を明らかにした。(1)これまで不明であった、鳥類の視交差上核を同定した。(2)ウズラの視交差上核における時計遺伝子の発現に及ぼすメラトニン投与及び種々の光条件の影響をを検討した。その結果、メラトニンは、時計遺伝子の転写に影響せず、視交差上核細胞間のカップリングに影響を及ぼすものと推測された。また、恒明条件でqPer2のリズムは消失するが、qPer3のリズムは継続することを示した。(3)末梢組織における時計遺伝子の発現を調べ、特に、卵巣に明暗周期ではなく排卵周期と連動する時計遺伝子の発現リズムが存在することを見いだした。これらの結果は、排卵・放卵のタイミングが、明暗に同調するオシレーターと、卵巣に存在するオシレーターとの相互作用により決定されることを示した。(4)光周性反応に関与する正中隆起及び漏斗部において時計遺伝子が概日リズムをもって発現していることを見いだした。我々は、世界に先駆けて鳥類の時計遺伝子(qPer2,qPer3,qClock)をウズラを用いてクローニングした。本研究は、時計遺伝子を中心として、鳥類概日機構と光周性測時機構について解析し、以下の成果を得た。(1)時計遺伝子の発現
血管新生・再生の制御を目的とした『広帯域光音響画像』による血管径の定量化技術

光音響イメージングに定量的な情報を付加するために、検出信号の広帯域な周波数特性に着目した。具体的には圧電材料にP(VDF-TrFE)フィルムを用いる広帯域センサーを開発し、開発センサーを利用した集音型光音響イメージングシステムを構築した。さらにそのシステムの性能を検証するために、ファントム実験、動物実験を行なった。血液中のヘモグロビンを対象にした血管画像は非侵襲な光音響イメージングである。この具体的な医療への応用について検討し、脳神経外科分野、泌尿器科分野、形成外科分野での研究について防衛医科大学校倫理委員会の承認が得られ医師主体の探索的臨床研究を開始した。光音響イメージング法では,光を吸収した分子が光熱変換過程を経て音響波を発生することを利用し,生体内の深さ方向の光吸収体分布を断層情報として画像化する。生体組織において音響波が効率良く発生する条件はナノ秒オーダーのパルス光で励起した場合で,この場合に発生する音響波は超音波領域までの広帯域である。光音響イメージングにおいて超音波画像と異なる点はこの周波数帯域である。本研究ではこの光音響波特有の周波数帯域に着目し,光音響画像の要素技術として大きく性能を決める音響波センサーの開発を中心に実施した。本研究で開発するのはP(VDF-TrFE)フィルム製のセンサーであり,超音波画像診断装置で一般的に使用されているPZT製の超音波探触子と比較する事で,開発センサーの広帯域性を評価した。また,センサーを設計する段階で予備実験をしたところ,センサー材料が持つ圧電性(光音響波を受信する性質)と焦電性(光音響信号のノイズ減となる性質)のうち,圧電信号に影響なく焦電信号を抑制できるセンサー仕様に関する知見が得られた。この知見とセンサーの焦点化を併せると,より精度の高い血管系の定量化が可能になることが分かった。次に開発したセンサーで血管ファントムを網羅的に測定したところ,全ての血管ファントム径に対して有効ではなく,測定可能範囲を設定する必要があることが分かった。原理的裏付けに基づく測定可能範囲の設定を含めて測定信号の解析及び処理方法を検討した結果,周波数の解析方法を時間ー周波数解析法であるウェーブレット変換法を採用することで,光音響波の周波数情報を活用できることが実証できた。また,動物実験では測定セットアップを工夫することで,より広い測定可能範囲となった。臨床研究について医師主体の臨床研究を開始するための防衛医科大学校倫理委員会への申請書類作成中である。血管を直接治療する,あるいは血管の分布を利用する治療において,血管に関する定量的かつ機能的情報は有用である。生体内の主要な光吸収体であるヘモグロビンを撮像分子とした光音響イメージングでは血管の分布画像が得られるが現在のところ定量性がない。本研究では,光音響信号から疾病診断や治療方針の決定に寄与する定量性を抽出できるような要素技術開発と,開発技術を用いたin vitroからin cells,in vivo実験,医師主体の臨床研究の実施を目的としている。光音響信号は,入力側としてレーザーのエネルギー,パルス幅,波長のパラメータがあり,出力側として,超音波の強度や周波数のパラメータがある。血管の分布画像に血管径の定量性を付加するには,生体内,特に血管内の光音響信号伝搬を正確に反映するハードウェアの開発とそれを解析する技術が必要である。本研究では光音響信号の広帯域性に着目し,光音響信号の時間波形を正確に測定することを目的にP(VDF-TrFE)フィルムをセンサ材料にしたセンサを開発し,PZTセンサと併せてデータ取得している。本年度は光音響信号から血管内ヘモグロビン由来の信号を抽出するために励起波長をマルチスペクトル化し,スペクトルアンミキシング解析を導入した。具体的には,ヌードマウス,ウサギ,摘出ヒト組織,ヒト腕を対象に測定した。ヌードマウス及びウサギは防衛医科大学校動物実験倫理委員会の承認を得て,摘出ヒト組織及びヒト腕は防衛医科大学校倫理委員会の承認を得て実施した。すべての対象においてセンサをスキャンすることで血管網として画像を描出することができた。特に摘出ヒト組織の場合において病理画像との参照の結果,微小血管まで描出できていることがわかった。一方で,血管径を反映したデータが取得できない条件があった。最終年度は要素技術開発とデータ解析の両面から精度向上を目指す。ヘモグロビンの光吸収にあわせて励起波長を設定することで光音響イメージングにより血管の位置情報や機能情報が得られる。機能情報に定量性を加えることを目的に研究を実施した。研究計画の最終年度,昨年度までの成果のフィードバックのために動物実験と医師主体の臨床研究の症例数を蓄積した。動物実験においては,生体の生理学的状態を直接反映する血液酸素飽和度状態を変化させるモデルを対象に実施した。血管径が超音波画像から把握できる範囲の血管を対象に測定した。医師主体の臨床研究では泌尿器科領域として前立腺癌,脳外科領域として脳腫瘍を対象に測定した。脳腫瘍は摘出した組織に対しての測定を実施した。前立腺癌組織に比べて脳腫瘍組織の方がより深部の光音響信号が検出できる感触が得られた。病理学的評価として常法のヘマトキシリンーエオジン(HE)染色に加えてCD34の免疫染色で検証する。昨年度に引き続き,医師主体の臨床研究の症例数を重ねるうちに,病理画像と微小血管の相関については,様々なケースがあることが判明した。すなわち,昨年度報告した,摘出ヒト組織(前立腺癌組織)において血管内皮の免疫染色画像と光音響信号の分布が一致している例の他に,炎症由来の可能性があるケース,栄養血管を捉えている可能性があるケースなどである。

動物モデルについては多波長を使用できるようにハードウェアとソフトウェアの両面から成熟化を図ることで,測定対象に応じて定量化に優位な波長があること,多波長測定において,ある程度波長数が絞られることがわかった。一方で測定深度による信号の変化が顕著であり,径,深さの両方をパラメータにする必要があるとの結論とした。これらは最終的なシステム構築に有用な知見である。得られた研究成果は研究分担者も含めて,積極的に発表する。光音響イメージングに定量的な情報を付加するために、検出信号の広帯域な周波数特性に着目した。具体的には圧電材料にP(VDF-TrFE)フィルムを用いる広帯域センサーを開発し、開発センサーを利用した集音型光音響イメージングシステムを構築した。さらにそのシステムの性能を検証するために、ファントム実験、動物実験を行なった。血液中のヘモグロビンを対象にした血管画像は非侵襲な光音響イメージングである。この具体的な医療への応用について検討し、脳神経外科分野、泌尿器科分野、形成外科分野での研究について防衛医科大学校倫理委員会の承認が得られ医師主体の探索的臨床研究を開始した。実用的なシステム開発には,実際にデータを取得してその結果をフィードバックすることが必須である。本研究で目指している定量性の概念を取り入れた光音響イメージングシステム開発においても,精度,感度,ロバスト性を明確にしつつ,研究開発を進めている。本年度,ヌードマウス,ウサギ,摘出ヒト組織,ヒト腕を対象に測定ができたことは,最終的なシステム仕様を決定するための網羅的な解析や分析ができるようになり,研究を効率的に進める上で重要であった。すなわちある程度予測はできていたものの,測定対象及び目的によって至適なハードウェアの仕様は異なり,各々の仕様が明確になりつつあること,所望の信号を抽出できるようになったことなどが大きな成果と考えている。特にヌードマウスやウサギ,及び摘出ヒト組織を対象にした実験では実験後に病理解析ができ,加えて動物実験の倫理委員会承認下で動物側の生理的条件を変更できるため,システム性能の信頼度が高められる成果につながった。本年度の具体的成果として,P(VDF-TrFE)フィルムセンサの高感度化及び耐ノイズ性の向上を図りつつ,周波数や感度分布(指向角)について設計通りの結果が得られ,感度が2.5倍以上増加した。さらにPZTセンサと定量的な比較検討ができ,光音響信号の周波数特性に応じたP(VDF-TrFE)フィルムセンサの強みが明確になった。データ解析の1つであるスペクトルアンミキシング法については,Spectral fitting法に加えて演算速度の速いSavitzky Golay法を新たに導入し,目的に応じて使い分ける,つまり相補的な解析ができるようにした。以上より,計画以上に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。医用工学研究計画の最終年度,目標達成に向けて研究を更に推進する。
化学療法・放射線治療を促進するエンドセリンＢ型受容体アゴニストの創薬展開

ETBRが高い親和性を保持しているET-1の8-21残基のペプチドに相当するペプチドN-acetyl-[Ala11,15]ET-1(8-21)を基礎として、各アミノ酸をアラニンに変換したペプチド11種類を調製して、3量体Giタンパク質の活性化能を測定した。評価系には、昆虫細胞から発現精製したETBRと組み換えapo-A1、リン脂質からなるナノディスク、過剰の3量体Giタンパク質を再構成させたシステムを用いた。この結果、D8, F14, I20の変異は、Gi活性化のpotencyを著しく低下させ、Y13, L17, D18の変異は、efficacyを60%程度に低下させた。ET-1のC末領域は膜貫通領域における水分子の水素結合ネットワークの再構築によって、活性型構造を誘導する一方、ヘリカル領域にあるD8はリガンド結合親和性に重要であり、Y13,F14も活性化のpotencyやefficacyに大きく影響することが明らかとなった。さらに、これらの側鎖と相互作用するETB受容体側の残基の変異体解析を行った。この結果、受容体のN末テールの膜近傍領域やヘリックス7の細胞外近傍領域とアゴニストとの相互作用が受容体の活性化に重要であることが明らかとなった。また、ヘリックス6の相互作用残基の二重変異体は親和性を大きく低下させ、結合性に影響するこちが判明した。これらのリガンドー受容体間の相互作用の役割は、今後の新たなアゴニスト設計に重要な情報となる。エンドセリンは21残基のペプチドリガンドであり、8-21残基部分が全体にわたり受容体にすっぽりと包まれて広く相互作用する。また、N末端領域も膜貫通領域と相互作用する。このような多数の相互作用の中から、受容体活性化に重要な相互作用、リガンド結合性に重要な相互作用を特定することができ、ETBRアゴニストの開発設計に生かせると考えられる。ET-1とET-3は、ETBRに対して同等の親和性を示し、同じように結合する非常に類似した内在性ホルモンであるが、ETBRの変異に対する感受性が大きく異なる。なぜ、このような違いが起きるのかは不明であり、今後、完全活性型構造の解明が必要である。この知見はアゴニスト設計において、重要な情報となる。サブタイプ選択性に関する追及ができておらず、ETBRで解明された各部分の役割が、ETARにおいてはどのように果たされているのかを今後、検証する必要がある。解析したETBR・ET-1複合体構造から相互作用に関わる重要残基を同定し、これらの変異体の結合実験によって、立体構造がほぼ正しいことを確認した。しかしながら、20残基前後が相互作用に関わるために、どの残基によるどの相互作用がリガンド認識や結合に寄与が大きいのかが明確に理解できなかった。この点を明らかにするために、ETBRが高い親和性を保持しているET-1の8-21残基に相当するペプチド(N-acetyl-[Ala11,15]ET-1(8-21))を基礎として、各アミノ酸残基をアラニン等に変異した17種類のペプチドを調製して結合実験を行い、各Ki値を測定した。その結果、ET-1のC末L17, D18, I20, W21のアラニン置換が100倍以上、親和性を低下させることが明らかとなった。また、I19L変異においても同様なことが観察され、結合部位には立体構造上、極めて厳密な制限があることが判明した。構造解析した、リガンドフリー状態とET1結合状態の構造を比較すると、ヘリカルバンドル内に形成される複数の水分子を含む水素結合ネットワークに再編が起こっていることがわかった。この再編成によって、N119, D147, N382らは直接水素結合する。これらの水素結合形成が、実際のETBRの活性化に重要であることを確認するために、これらの変異体について、昆虫細胞で大量発現させ精製後、apoA-1や脂質と混合してナノディスクに再構成した。これらの組み換えナノディスクを用いてGi活性化を調べたところ、N119A, D147A, N382Aにおいて、ほぼ活性化能は消失した。これらのことから、ET1結合構造は、細胞内第3ループがT4lysozymeで固定されているために最終的な活性化構造に変化できなかったが、活性化の途中の過程には進んだ構造であろうと考えられる。結晶化に必要な熱安定化受容体をリガンドーフリー状態でスクリーニングしたことで、その熱安定化受容体(Y5-ETBR)については、アンタゴニスト(ボセンタン)結合状態でも結晶構造解析ができ、現在、論文改訂中である。肺性高血圧症の治療薬であるBosentanおよびBosentan誘導体のK8794を結合したETBRの結晶構造をそれぞれ3.6Å、2.2Åの分解能で解明し、Nature Structuraland Molecular Biologyに発表した。K8794結合型ETBでは5残基の熱安定化変異を含む変異体を用い、Bosentan結合型では1残基を野生型に戻して4残基の変異を持つ受容体を使用することで結晶解析に成功した。これらのアンタゴニスト結合構造では、以前に観察したリガンドフリー構造と同様に膜貫通ヘリカル領域にNa+結合が観察されなかった。ETAサブタイプとは異なり、ETBのET1結合は生理的濃度のNa+によって阻害されず、ETBの不活性構造はNa+の変わりに水分子を介する水素結合ネットワークによって安定化されていると考えられた。

また、アゴニストET-1のC末領域はリガンド親和性に大きく寄与する領域であるが、Bosentanはこの結合ポケットによく重なって結合していることが判明した。これらの知見は、アゴニスト設計にとって非常に重要である。活性構造形成の評価系としてGタンパク活性化能を調べるアッセイが、動物細胞に各種変異受容体とGiアルファサブユニットを共発現させた細胞膜を用いてGTPgammaS35の取り込みを検出することで可能になった。変異受容体の濃度は、saturation bindingにおけるBmaxから推定し、Giアルファは膜タンパク量を揃えることで受容体に対しておおよそ同等量が存在するように調製して、野生型と比較した。この手法で、すでにナノディスクでGタンパク活性可能を測定している水分子水素結合ネットワークの変異体の評価を行ったところ、ナノディスク評価系とよく一致することが明らかになった。アンタゴニスト結合構造が得られたことで、アゴニスト結合構造との比較が可能となり、アゴニストの分子設計において、どのような相互作用が受容体にとって必要なのかを絞りこめるようになっている。ETBRが高い親和性を保持しているET-1の8-21残基のペプチドに相当するペプチドN-acetyl-[Ala11,15]ET-1(8-21)を基礎として、各アミノ酸をアラニンに変換したペプチド11種類を調製して、3量体Giタンパク質の活性化能を測定した。評価系には、昆虫細胞から発現精製したETBRと組み換えapo-A1、リン脂質からなるナノディスク、過剰の3量体Giタンパク質を再構成させたシステムを用いた。この結果、D8, F14, I20の変異は、Gi活性化のpotencyを著しく低下させ、Y13, L17, D18の変異は、efficacyを60%程度に低下させた。ET-1のC末領域は膜貫通領域における水分子の水素結合ネットワークの再構築によって、活性型構造を誘導する一方、ヘリカル領域にあるD8はリガンド結合親和性に重要であり、Y13,F14も活性化のpotencyやefficacyに大きく影響することが明らかとなった。さらに、これらの側鎖と相互作用するETB受容体側の残基の変異体解析を行った。この結果、受容体のN末テールの膜近傍領域やヘリックス7の細胞外近傍領域とアゴニストとの相互作用が受容体の活性化に重要であることが明らかとなった。また、ヘリックス6の相互作用残基の二重変異体は親和性を大きく低下させ、結合性に影響するこちが判明した。これらのリガンドー受容体間の相互作用の役割は、今後の新たなアゴニスト設計に重要な情報となる。エンドセリンは21残基のペプチドリガンドであり、8-21残基部分が全体にわたり受容体にすっぽりと包まれて広く相互作用する。また、N末端領域も膜貫通領域と相互作用する。このような多数の相互作用の中から、受容体活性化に重要な相互作用、リガンド結合性に重要な相互作用を特定することができ、ETBRアゴニストの開発設計に生かせると考えられる。ETBRの変異体の発現精製、ナノディスク(HDL)への再構成は、Gタンパク質活性化を検定できる重要なアッセイ系であるが、変異体によっては精製再構成に耐えられず部分変性の可能性もある。この点を補うために、精製せず細胞膜そのままでGタンパク質活性化を測定するシステムを検討する。HDLと細胞膜系の両方を検討することで、定性的定量的な比較が可能となる。
カゼインホスホペプチドのIgA産生増強作用に関与する細胞及びレセプター分子の解明

本研究は、乳カゼインのトリプシン消化により生じる機能性ペプチド「カゼインホスホペプチド(CPP)」の免疫増強作用に関与する受容体の特定を目的として以下の知見を得た。まず、マウス脾臓細胞培養系においてCPPに直接作用するサブセットを明らかにするため、磁気細胞分離システム(MACS)を用いて、CD4^+、CD8^+、CDI9^+の細胞集団をそれぞれ分離し、各集団に対するCPPの作用について検討を行った。その結果、特にCD19^+細胞集団の細胞増殖応答およびサイトカイン発現(IL-6等)に有意な促進作用が観察され、これらの作用がCPPのIgA促進作用に重要な影響を果たしているものと推察された。そこで、同様の作用を持つB細胞マイトージェンの受容体であるToll-like receptor (TLR)に着目し、TLR2、TLR4、TLR9のシグナル伝達阻害抗体存在下でのCPPの作用について検討を行ったところ、抗TLR4抗体存在下では細胞増殖応答、サイトカイン発現がともに阻害されることが明らかとなった。CPPの活性に対するTLR4の関与は、TLR4に遺伝的点変異をもち、シグナル伝達を欠損しているC3H/HeJ系マウス脾臓由来のB細胞培養系においてCPPの作用が観察されないことからも示唆された。TLR4はグラム陰性細菌の構成成分であるリポ多糖(LPS)の受容体として知られており、試料中のLPS混入により、誤った報告が過去に多くなされていると指摘されている背景がある。そこでLPSの活性阻害物質であるポリミキシンB存在下でのCPPの作用についてさらに確認を行ったところ、活性に影響は観察されないことが示された。また、本実験で用いた試料をLPS検出試薬であるリムルステストで試験した結果も陰性であり、本研究結果が試料へのLPSの混入によるものである可能性は低いものと推察される。本研究は、乳中のカルシウム感受性カゼインが消化酵素の作用を受けることにより生成するカゼインホスホペプチド(CPP)のIgA産生促進作用の研究成果を受けて、そのターゲットとなる細胞およびレセプター分子の解明を目指すものである。平成15年度の研究業績として、マウス脾臓細胞より磁気細胞分離システム(MACS)を利用し分離したCD4^+(Th1細胞)、CD8^+(Th2細胞)、CD19^+(B細胞)のリンパ球サブセットに対するCPPの影響について検討を行った。CPPの存在下において、顕著な応答はCD19^+細胞サブセットにおいて観察され、主要なターゲット細胞としてB細胞が候補に挙げられることを明らかにした。この研究結果を受けて、レセプターの探索ではマウス脾臓由来のB細胞を以降の検討に用いた。CPPの作用にはホスホセリン(SerP)集中域を構成するSerP-X-SerPのトリペプチド配列が必要不可欠であることが明らかにされているものの、特定のレセプターの関与を示唆する情報は得られていない。そこで、レセプター候補となる分子の推定にあたって、一定の間隔で複数のリン酸基が配置されるというホスホセリン集中域に類似した構造を持つマイトージェンである非メチル化CpG-DNAのレセプター分子であるToll-like receptor9(TLR9)、テイコ酸のレセプターであるTLR4に焦点をあてた。現在、CPP存在下におけるリガンド・レセプターの結合に対する競合作用および抗レセプター抗体によるCPPのB細胞の結合阻害を指標に、CPPのこれらのレセプター分子への関与について検証を進めている。