hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁気共鳴画像による半側空間無視に対するプリズム適応療法の効果の神経学的基盤の解明

先行研究では半側空間無視の発症には腹側注意経路の器質的損傷が関与しており、背側注意経路の機能的結合性の異常は発症初期に見られるが、時間が経過すると回復することが報告されており、器質的に保たれている背側注意経路の機能が無視の回復に関与すると考えられる。今回、健常者において短時間のプリズム適応により背側注意経路のrsFCを変化させ得ることが確認され、プリズム適応による半側空間無視改善メカニズムの理解や新たな半側空間無視治療法の開発に役立つと考えられる。また、発症後6カ月以内の半側空間無視患者3名に対し、7-10日間のプリズム適応療法を行い、治療前後にfMRIを測定し、rsFCの変化を検証するとともに、我々が開発したタッチパネルを利用した無視の検査法や行動評価により評価し、無視の改善と機能結合の変化の関係を検証した。以上の成果の一部を国内学会、国際学会で発表した。半側空間無視(無視)に対するプリズム適応(PA)療法の効果メカニズム解明のため、核磁気共鳴画像(MRI)で注意ネットワークの安静時機能的結合(FC)を測定し、PAによる変化を検証した。健常者21名で単回のPA課題を行い、前後と1時間後の安静時FC、無視患者1名で1日1回10日間のPA療法を施行し、前後と2週間後の安静時FCを測定した。その結果、健常者ではPA後一時的に右頭頂間溝-前頭眼野のFC低下・右前帯状皮質-前頭眼野のFC上昇を認めた。無視患者ではPA療法後により注意ネットワークの複数の部位で変化を認めた。これらより、PA療法が注意ネットワークの機能的結合を変化させることが示唆された。回復期リハビリテーションに入院している半側空間無視患者を中心に被験者をリクルートし、プリズム適応療法介入による、臨床的変化とMRIによる脳機能、脳構造変化との関係を検証する。引き続き健常者でのrsFC撮像、半側空間無視患者に対するプリズム適応療法の症例数を進める。来年度には既に国内、国外の学会での発表を複数予定しており、論文化に向けた準備も進めていく。リハビリテーション医学小型視覚検査装置の購入を予定していたが、別資金で購入され施設に設置されているものが使用可能となったため。消耗品の値引き、出張時の宿泊費が限度額より安価であったため、少額の未使用金が生じた。消耗品、謝金及び成果発表に関わる費用に充当する。消耗品の購入に充てる。
神経回路から説明する網膜が行う高次視覚情報処理

網膜で「運動検出の予測」を行う神経節細胞として,私たちは,大きな樹状突起を持つ楕円形の細胞がこの予測をしやすいと示唆する結果を得ていた.本研究では,この細胞を高確率で発見することに成功した.この神経節細胞は,隣り合う同種の細胞とギャップ結合でつながっており,そこでは,Cx35/36が局在していた.またドーパミン受容体の関与を示唆する結果も得た.最後に,この神経節細胞はOFF型神経節細胞の形態を持ちながら,OFF型双極細胞だけでなく,ON型の双極細胞とも異所性シナプスを作ることを明らかにした.以上のように本研究では,この神経節細胞が作る局所神経回路のいつくかを形態学的に明らかにすることができた.私たちの網膜は,脳に視覚情報を送る前に既に,従来から考えられていたよりも多くの仕事を行っている.例えば,網膜が行った仕事の結果を最終的に脳に送る網膜神経節細胞は,約20種類のサブタイプを持ち,そのそれぞれが独自の視覚的側面に関する仕事を行い,その結果を脳に送っていると考えられている.この多様性を生み出すに際し重要なのは,神経節細胞につながるまでの神経回路の構成方法である.ところが現在の研究では,ある特定の神経節細胞につながる神経回路のみが詳細に研究されているだけで,未解決の部分が多いのが現状である.代表者はこれまでウサギ網膜を用いて新規神経節細胞や新規経路をいくつか発見してきた.これらの結果は,網膜が行っている新たな仕事を想像させるものであった.近年のトランスジェニック動物やウイルスなどを用いた遺伝子技術の発展により,特定の細胞を標識することが可能になってきた.しかしこれらの技術を用いても約20種類のサブタイプをすべて同定することはできていない.しかも,これらの技術を駆使することができるのはある特定の動物種に限られているという問題点がある.ところで,ある生命現象を追及する場合,研究者は最適なモデル動物を用いることを考える.代表者の研究では,本研究の目的に最適な脊椎動物のキンギョを用いているが,キンギョは遺伝子技術を駆使することができていない動物の一つである.そこで本年代表者は,細胞内色素注入法という古典的な技術を用いて様々な細胞に直接色素を入れて新規細胞の同定を集中して行った.現在代表者は,動物行動と結びつきそうな興味深い新規細胞の発見という結果を得つつある.また,機能は現状では不明であるが,新規回路網も発見しつつある.私たちがものを見るとき,まず網膜の神経回路が視覚情報処理を行い,その答えが活動電位(スパイク列)として脳に送られる.スパイク列を生み出す神経節細胞が脊椎動物では約20種類以上あり,各々が別々の特徴を持ったスパイク列を脳に送る(「1細胞=1機能」).それぞれの神経節細胞は,網膜の内網状層(IPL)の違う高さに樹状突起を伸ばし,同じ高さに軸索を伸ばしている双極細胞やアマクリン細胞からシナプス入力を受け,神経回路を形成し,回路ごとに仕事をする.つまり神経節細胞が行っている仕事を理解するためには,まずその神経節細胞が構成する局所神経回路をシナプスレベルで調べることが重要になってくる.本研究で注目した細胞は30年前に盛んに研究されていた細胞である.しかしその細胞が網膜全体でどのような分布様式であったのか,またどのような局所神経回路を形成しているのかということは不明のままであった.本研究では,注目した神経節細胞の分布様式と,その局所神経回路を共焦点顕微鏡を用いて形態学的に明らかにし,その機能を推測することを目的とした.本研究では,次の15のこと示唆する結果を得た.1逆行性輸送による全神経節細胞の標識後,ターゲットの細胞を確実に同定できるようになった.2ターゲットへの細胞内色素注入により,IPLのOFF層に樹状突起を伸ばすことがわかった.3網膜中心部では注目した細胞が眼球の水平軸に平行に並んでいた.4コネキシン35/36を介したギャップ結合で目的の神経節細胞同士がつながっていた.5OFF層に樹状突起を伸ばす神経節細胞は,通常OFF型双極細胞からの入力しか受けないはずだが,注目した細胞はON型双極細胞と軸索の途中のOFF層でも異所性にリボンシナプスを用いて興奮性入力を受けていた.これは30年間謎であった細胞内記録で偶然得られたON-OFF応答を証明する形態学的なデータとなった.本研究の大目標を達成するための,第一段階としての形態学的なデータがそろったので,現在論文投稿準備中である.次年度(3年目)の電気生理学的な実験を行うにあたって,次につながる重要な形態学的な結果が得られた.以下2つの仕事を行った.1論文投稿,2新たな実験手技についての学会報告である.1昨年度までに明らかにした形態学的な結果を論文投稿し,現在審査継続中である.私達は,目的の神経節細胞が直接,同サブタイプの神経節細胞とtracer couplingすることを明らかにした.そのギャップ結合にはCx35/36が寄与しており,両者の樹状突起の交叉部近くには,ドーパミンD1受容体(D1R)が局在していた.以上の結果から,網膜で放出されるドーパミンがD1Rを介して,ギャップ結合の開閉を調節しているものと示唆した.しかしD1Rのアゴニスト,アンタゴニストを用いた薬理学的実験を行ったが,顕著な差を得ることができなかった.

私達は,この結果から,実験を行う際の光環境(明所・暗所)やサーカディアンリズムを考慮する必要があることを示唆した.2本研究では,細胞内色素注入に用いる逆行性標識標本を作製する目的で,一晩リンガー液に浸漬した網膜を用いた.既にウサギ網膜神経節細胞から光応答が記録できる実績があるため(Hoshi et al., JNS 2009; JCN 2013),同方法を冷血動物のキンギョに適用した.キンギョは粘性に富む硝子体液を持つため,目的の細胞にガラス電極を近づけることが非常に困難で,全載標本を用いての神経回路網の研究がこれまでほとんど進んでいなかった.本研究では,過去誰も除去することができなかった粘性に富む硝子体液の除去に成功し,さらに細胞内色素注入法を用いた形態学的神経回路網の研究を可能とした.この手法を用いて,目的の神経節細胞とGABA作動アマクリン細胞とのシナプス結合様の結果を得た.しかし,GABAの動態は細胞の状態でかなり変化するため,今後,リンガー液に浸漬した網膜におけるGABAの動態を詳細に調べる必要がある.1の示唆と併せ,これらの研究も次の実験計画に組み込む予定である.網膜で「運動検出の予測」を行う神経節細胞として,私たちは,大きな樹状突起を持つ楕円形の細胞がこの予測をしやすいと示唆する結果を得ていた.本研究では,この細胞を高確率で発見することに成功した.この神経節細胞は,隣り合う同種の細胞とギャップ結合でつながっており,そこでは,Cx35/36が局在していた.またドーパミン受容体の関与を示唆する結果も得た.最後に,この神経節細胞はOFF型神経節細胞の形態を持ちながら,OFF型双極細胞だけでなく,ON型の双極細胞とも異所性シナプスを作ることを明らかにした.以上のように本研究では,この神経節細胞が作る局所神経回路のいつくかを形態学的に明らかにすることができた.メインテーマからの派生実験であるが,いくつかの発見をしつつある.代表者はキンギョ網膜において,新規細胞と新規回路網の発見を証明する形態学的な実験結果を得てきている.現在は論文作成のための詰めの形態学的実験を始めたところである.形態学的アプローチによる仕事をまず論文としてかたちにする.次に,形態学的データから推測される機能を神経回路網に注目して電気生理学的に証明する.そして形態学的,電気生理学的に明らかにした神経回路が実際にどのような視覚情報処理を行っているかを以下の13の実験で調べる.1神経節細胞につながる神経回路網をより詳細に調べるため,薬理学的に興奮性シナプス,抑制性シナプス,ギャップ結合などを阻害して電気生理学的に神経回路網を証明する.245度ごとに傾きの異なるバー刺激(静止・運動)を行い,注目している神経節細胞の方位選択性を調べる.3視覚心理学で用いられる視覚刺激を呈示して,注目した神経節細胞の機能を調べる.神経解剖学上記形態学的実験結果に関する論文をまず準備する予定である.その後,代表者が発見した新規細胞が行う視覚に関する仕事を,視覚心理学的手法を併用した電気生理学実験で明らかにしていきたい.これらの結果と形態学的な実験結果と合わせて論文を作成するかどうかについては現在検討中である.また,代表者が発見した新規細胞が,キンギョのみならず,ヒトを含めた動物で共通にみられる細胞であるのかを比較検討したい.さらに,新規回路網に関する研究も同時に進める予定である.本年度後半,論文執筆作業に集中したことにより,当初予定していた実験動物使用数が抑えられたことが次年度使用額が生じた原因の1つだと考えている.
芸術科書道におけるICTを活用したアクティブ・ラーニングの展開

1優れた演示装置iPad+プロジェクター=生徒の興味関心を引き出す優れた演示装置である。それは黒板になって字を書いたり、鮮明な写真を拡大したり、生徒作品を提示したりできる。本校の芸術科は音楽と書道からの選択なので、最初から興味を持って書道を選択している。それに、この演示装置によって更に興味関心を促すことができた。2キャビネット的使用と鏡的使用私の展覧会作品や書道部員の作品など、授業で身近な人の作品が提示されると自然と生徒は興味を持つ。このようにiPadに保存している資料を活用するキャビネット的使用はとても有効だ。また、私の範書をそのまま投影したり、授業時間内に書いている生徒作品をカメラで撮影して提示したりする鏡的使用も、持ち運びに適しているiPadならではの活用方法だ。3マルチ黒板写真を提示し拡大し、それに書き込みをすることは黒板にはできない。iPadを黒板的に使用するとこれらが可能である。そして、黒板は消してしまうと再現できないが、iPadではスクロールしてもう一度見ることもできるし、保存してまた見ることもできる。4授業ではできない書道パフォーマンス最近流行している書道パフォーマンスは高校の書道部では大変有効な表現手段であるが、授業ではその実現は難しい。本校書道部では書道パフォーマンスに取り組んでいるが、部員同士で話しあいテーマを決め紙面構成を考え、楽曲選定し演技プランを考えて一つの作品を完成させるために最低でも1ヶ月はかかる。授業時間内では時間がかかりすぎて、その取り組みは難しい。
関節鏡視下色彩色差計測による関節軟骨評価法の開発

変形性関節症(OA)は高齢社会において患者数が増加し大きな社会問題となっている。病態の進行を抑制する有効な保存療法のエビデンスは少なく早期に(OA)を診断し進行抑制のための治療を行う方法の開発が必用である。われわれは終末糖化産物(AGEs)の軟骨内の蓄積がOAの軟骨変性と関連し、AGEsの褐色を測定することによってAGEsの軟骨内の含有量を評価できるのではないかという仮説をたてた。本研究の目的は色彩色差を測定にすることで軟骨変性を評価可能か解析することである。しかし軟骨の褐色性と軟骨変性およびAGEsの含有量の関連を確認できなかった。本年度は関節軟骨の色彩値・色差計測や関節軟骨中のAGEsの測定・検量線の作成を目標としていた。色彩色差計については当初の計画では市販品を購入する予定であったが、最終的な測定場所である関節内とは温度や湿度の条件が異なるため、得られた結果が次年度以降の研究計画である関節鏡下でのAGEsの色彩色差測定結果へそのまま利用できない可能性が判明した。そのため、まずは色彩色差計測の結果に影響を与える交絡因子の一部を関節内と同じ定状条件下で測定ができる装置を開発・作成する方針とした。その結果、関節軟骨中の終末糖化産物(Advanced Glycation End-products:AGEs)を測定するための色彩色差計製作に多大な時間を要し、当初の本年度の研究予定であった軟骨の色彩値・色差計測や関節軟骨中のAGEsの測定・検量線の作成は達成できなかった。しかし、関節内と同じ定状条件下でAGEsの色彩色素測定ができる装置の開発は今年度中に完了し、装置は既に納品されている。これにより、今後は光源・温度・湿度の一定条件下で色彩値・色差計測が可能な環境を整備することに成功した。本年度の研究成果により色彩色差に影響を与える交絡因子の一部を除外することが可能となり、より簡便に検量線の作成や関節軟骨中のAGEsが定量可能かを検討することが可能になったと考えている。本年度は昨年度に明らかにした適切な測定条件で引き続きヒト変形性膝関節症の人工膝関節手術症例における関節軟骨の色彩色度計測・終末糖化産物(AGEs)の生化学的定量・肉眼的変性度の関連を検討した。さらに関節軟骨における褐色性の局在についても調査した。年齢とAGEs量はゆるい正の相関(R=0.32)を認めた。褐色性は軽度から中等度の変性軟骨においては増加したが、変性末期には減少した。AGEs量と褐色性は相関を認めなかった。今回の研究では可視領域において関節軟骨中のペントシジン量と肉眼的な褐色性は相関せず、関節軟骨の褐色性の原因は軟骨基質に蓄積されたAGEsであるという仮説は実証されなかった。その原因としては蓄積するAGEs量は腎機能障害や糖尿病の有無に影響を受けると報告されているが、今回は検体数が少なくそれらの影響を完全に除去しきれていないことが一因と考えられた。javascript:onTransientSave();変形性関節症(OA)は高齢社会において患者数が増加し大きな社会問題となっている。整形外科平成26年度は、昨年度未実施であったAGEsが発する蛍光を色彩色差計で解析し関節軟骨中のAGEsが定量可能か検討することから研究を開始する。まずは人工膝関節置換術の際に採取される関節軟骨を検体として検討することから開始する予定である。その後、当初の平成26年度の研究計画である関節鏡下での色彩色差計測を行い、動物実験も併せて進行する予定である。動物実験に関しては当初の予定であったイヌACLT-OAモデルでは想定していた結果が得られない可能性が高いため、GA-ピリジンを関節注射するなど他の動物実験モデルを検討している。研究進行の遅延に伴い、当初予定していた消耗品や旅費などの費用の計上を行わなかった。そのため、平成25年度使用額に残金が生じた。本年度の残金は平成26年度の助成金と併せて、実験動物費や関節軟骨の組織標本化のための組織実験材料費や国内外での学会での発表費用として使用する予定である。
日韓製造実務国際比較

調査では、質問票を用いたアンケートを中心とした分析を行い、製造業の特徴、課題を抽出した。さらに、識者とのインタビューにより、その成果を補完した。調査実施内容は下記の通り。調査計画作成1994年7月1日- 7月30日質問票検討9月1日- 9月30日質問票翻訳、作成10月5日-10月20日質問票印刷10月20日-10月30日回答者リスト作成10月10日-10月20日質問票発送11月4日-11月8日データ入力12月20日-12月28日分析1995年1月10日- 2月15日報告書作成2月25日- 3月10日アンケート調査は、日本の製造業から500社をランダムサンプリングし、調査票を発送した。回収回答数は120通(回収率25%)であった。回答結果は、データベース化され、韓国の調査結果と同じファイルに記録されている。調査においては、期間が十分でなかったこと、また、日本のデータは94年11月に調査したものであり、比較に用いた韓国のデータは91年の10月から12月にかけて収集したものという時間的なズレがあること、業種構成においても一致していないことなどの問題があり、厳密な比較を行うには不十分である。このような条件はあるものの、日韓の製造業の一般的な特徴は明らかにできた。総体的に、現在においては、韓国の製造業は日本に比較して、遅れているといえるが、いくつかの点で日本に優る点も見い出せた。双方の特徴の概略をまとめると、次のようなことがいえよう。(1)製品計画日本では、製品の多様化が進んでいるが、生産工程は韓国に比べて、集約されている。この点から、日本ではより業績、コストに対する関心が高いと考えられる。韓国では、5年前に比べて、製品の多様化が進んでいるが、OEM製品が多く、設計変更などの問題を抱えている。日本と韓国は輸出が中心である点では似ているが、日本は製品品質、コストで競争力を確立しているが、韓国はOEM中心のため、仕様変更、納期厳守などの要因が競争要因として挙がっている。(2)工程管理工程管理では両国とも同じようなシステムであるが、設計のみが異なっている。韓国では設計は工場で行われているが、日本では工場外で行われ、工場は生産に特化している。他の目立った相違点は、韓国では部品の欠品が非常に多いことで、在庫管理がうまくできていないことが伺われる。このような点から、日本の現場主義の生産における優位が確立されているといえよう。(3)労務管理日本では、作業者の補助や機械のメンテナンスに多くの人手をかけている。これにより高い品質が保たれていると考えられ、戦略的な人材配置が行われているといえよう。一方、韓国では残業が多く、退職率も高いなど労務対策の必要性が感じられる。作業者の移動により、技能の維持の問題が発生し、ひいては製品品質にも影響がでる可能性がある。(4)生産性と管理韓国においては生産性の伸びは高いが、内容的には問題を抱えているようである。つまり、手直し率、在庫回転率はいずれも日本に対して大きく差が付いている。改善の方法を見ると、日本ではQCサークルがうまく機能しているのに対し、韓国では現場レベルの改善提案は少なく、現場の管理において問題があることが推測される。これらをまとめると、韓国製造業は製品の多様化を目指しているが、計画、在庫把握、設備、人的能力などが障碍となっており、戦略と戦術に乖離が見られる。設計と生産計画の連携不足により、在庫把握に問題が起こり、欠品が頻繁に発生する結果となっている。また、頻繁な設計変更に対応できる技能、設備が求められている。一方、日本では生産戦略と戦術が一致し、現場中心の方法が世界における競争力の要因となっている。しかし、スループットタイム、生産性の伸びが劣るという結果となっており、時間が重要性を増す環境下でスループットタイムの改善が今後の課題となろう。

調査においては、期間が十分でなかったこと、また、日本のデータは94年11月に調査したものであり、比較に用いた韓国のデータは91年の10月から12月にかけて収集したものという時間的なズレがあること、業種構成においても一致していないことなどの問題があり、厳密な比較を行うには不十分である。このような条件はあるものの、日韓の製造業の一般的な特徴は明らかにできた。総体的に、現在においては、韓国の製造業は日本に比較して、遅れているといえるが、いくつかの点で日本に優る点も見い出せた。双方の特徴の概略をまとめると、次のようなことがいえよう。(1)製品計画日本では、製品の多様化が進んでいるが、生産工程は韓国に比べて、集約されている。この点から、日本ではより業績、コストに対する関心が高いと考えられる。韓国では、5年前に比べて、製品の多様化が進んでいるが、OEM製品が多く、設計変更などの問題を抱えている。日本と韓国は輸出が中心である点では似ているが、日本は製品品質、コストで競争力を確立しているが、韓国はOEM中心のため、仕様変更、納期厳守などの要因が競争要因として挙がっている。(2)工程管理工程管理では両国とも同じようなシステムであるが、設計のみが異なっている。韓国では設計は工場で行われているが、日本では工場外で行われ、工場は生産に特化している。他の目立った相違点は、韓国では部品の欠品が非常に多いことで、在庫管理がうまくできていないことが伺われる。このような点から、日本の現場主義の生産における優位が確立されているといえよう。(3)労務管理日本では、作業者の補助や機械のメンテナンスに多くの人手をかけている。これにより高い品質が保たれていると考えられ、戦略的な人材配置が行われているといえよう。一方、韓国では残業が多く、退職率も高いなど労務対策の必要性が感じられる。作業者の移動により、技能の維持の問題が発生し、ひいては製品品質にも影響がでる可能性がある。(4)生産性と管理韓国においては生産性の伸びは高いが、内容的には問題を抱えているようである。つまり、手直し率、在庫回転率はいずれも日本に対して大きく差が付いている。改善の方法を見ると、日本ではQCサークルがうまく機能しているのに対し、韓国では現場レベルの改善提案は少なく、現場の管理において問題があることが推測される。これらをまとめると、韓国製造業は製品の多様化を目指しているが、計画、在庫把握、設備、人的能力などが障碍となっており、戦略と戦術に乖離が見られる。設計と生産計画の連携不足により、在庫把握に問題が起こり、欠品が頻繁に発生する結果となっている。また、頻繁な設計変更に対応できる技能、設備が求められている。一方、日本では生産戦略と戦術が一致し、現場中心の方法が世界における競争力の要因となっている。しかし、スループットタイム、生産性の伸びが劣るという結果となっており、時間が重要性を増す環境下でスループットタイムの改善が今後の課題となろう。
MHCクラスIII遺伝子の調節と進化

1マウス補体第4成分(C4)遺伝子群の転写調節:マウスの重複C4遺伝子、C4遺伝子とSex-limited protein(Slp)遺伝子は、95%以上の高い相同性を示すのに、その発現には著しい違いがある。C4遺伝子が構成的に発現するのにSlp遺伝子はアンドロゲンに誘導されてはじめて発現するのである。われわれは両遺伝子の転写活性に大きな違いがあることを見いだした。両遺伝子の5'上流領域から種々の長さのフラグメントを切り出してきてCATアッセイを行ってC4遺伝子では転写開始点と-380の間に強いプロモーター活性があるのにSlp遺伝子ではほとんど認められなかったのである。C4遺伝子ではこのプロモーター領域にNF・kB部位、NF1部位が存在するがSlp遺伝子では対応する部位には複数の変異が見られ、HepG2核抽出物とは結合しなかった。in Vitro mutagenesisによってそれぞれの部位に変異を与えたプロモーター領域を用いて、CATアッセイを行った結果、C4とSlpの転写活性の違いはNF・kBではなくNF1で大部分説明されることが明らかとなった。2ヤツメウナギからの補体B因子と補体第2成分の祖系遺伝子の分離:哺乳動物のB因子とC2に共通に保存されている配列をプローブとして用い、現存する最も原始的な脊椎動物種である円口類ヤツメウナギの肝臓から、B因子とC2の祖系遺伝子を分離した。cDNAクローンは2。6kb長で、哺乳動物のB因子、C2と同様に3種のドメイン(SCR反復配列、von Willebrand,セリンプロテアーゼ)からなるモザイク蛋白をコードしていた。蛋白全体としてのアミノ酸配列上の相同性は、マウスB因子に対しては33%、マウスC2に対しては29%であった。
下垂体前葉内濾胞星状細胞間のギャップ結合を介したネットワーク構築を実証する

下垂体前葉は、6種類のホルモンを産生する内分泌器官である。この前葉内にあるホルモンを産生しない濾胞星状細胞(FS細胞)と細胞外周囲に存在する細胞外マトリクス(ECM)との相互作用により、新たなFS細胞の性質と機能を以下の4点で明らかにした。1) ECMの一つであるラミニンが、FS細胞間に形成されるギャップ結合の形成を増加させること、2)ラミニンによるFS細胞分裂機構、3)ラミニンを分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ9を分泌すること、4) FS細胞間では、ギャップ結合を介し、電気的刺激を伝達するネットワークを形成する。そのネットワーク形成制御機構の解明である。本研究は、下垂体前葉の機能を明らかにする上で有用で、さらに、腫瘍形成機能の解明、及びその治療に役立つことが期待される。1.下垂体前葉細胞の一つである濾胞星状細胞(FS細胞)が、細胞外マトリックス、特に、基底膜成分であるラミニンとの相互作用(マトリクライン作用)によってFS細胞間ギャップ結合形成が促進されることを、FS細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラット(S100b-GFP rat)の初代培養のliving観察、電子顕微鏡観察等により明らかにし、学術論文に掲載された。2.FS細胞がマトリクラインによって発現変化を示す遺伝子群をマイクロアレイによって網羅的に解析した。その中から、細胞外マトリックスに対するレセプターであるインテグリンを介した、FS細胞内のマトリクラインシグナル伝達関連遺伝子候補をピックアップし、さらに、マトリクラインによって誘発されるFS細胞分裂に関わるシグナル伝達因子を同定し、そのシグナル伝達機構を実証した。3.FS細胞間では、ギャップ結合を介したネットワークを形成し、情報伝達系を有する。このネットワークは、初代培養によって、再構築することを我々は既に明らかにしている。そして、ネットワークを再構築する過程で、FS細胞が突起状の細胞質を伸長させ、正確に周囲FS細胞と結合する。この現象は、近隣のFS細胞に対する何らかの誘導因子の存在を強く示唆するものであった。現在、我々は、その誘導因子とレセプターの候補を選定し、それが、下垂体前葉の中でFS細胞特異的に産生されることを明らかにした。今後、誘導因子を同定し、マトリクラインによるFS細胞ネットワーク形成促進の制御機構を明らかにする。1.濾胞星状細胞(FS細胞)分裂を引き起こすシグナル伝達の解析ラミニンなどの細胞外マトリックス(ECM)コート上で下垂体前葉細胞初代培養を行うと、非コート上に比べFS細胞が細胞分裂を引き起こすことを既に報告している。本研究では、ラミニン存在下で、そのレセプターであるインテグリンβ1を介して、カベオリン3の発現を増加させ、それに伴い、MAPK経路が活性化され、サイクリンD1遺伝子発現量も増加し分裂が誘起されるシグナル伝達を明らかにした。2.FS細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ9(MMP9)の発現解析一般に、細胞はECMを認識後、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)により、ECMを消化して、移動することができる。FS細胞は、ラミニンを消化する酵素であるMMP9を発現し、その発現量はラミニンによって増加し、MMP9のsiRNA及び、インヒビター添加により、ラミニンによるFS細胞の移動、FS細胞同士の接着が阻害された。以上から、ECMによるFS細胞移動メカニズムを明らかにした。3.FS細胞ネットワーク形成誘導因子の解析FS細胞間では、ギャップ結合を介したネットワークを形成し、情報伝達系を有する。本研究では、FS細胞にCXCモチーフの一つであるCXCL12とそのレセプターCXCR4の高い発現を明らかにした。さらに、マトリゲルインベージョンチャンバーを用いてCXCL12に対する走化性、浸潤性アッセイ行なったところ、FS細胞だけが走化性及び浸潤性を示した。以上から、FS細胞は、CXCL12を発現し、パラクライン的に周囲FS細胞に作用させることで、FS細胞ネットワークを形成する、その制御機構を明らかにした。
経路分岐概念の反応経路地図への導入と反応制御の試み

固有反応座標IRCは反応物、遷移状態、生成物をつなぐ最小エネルギー経路として定義されるが、反応経路に直交する方向に関するポテンシャルの曲率が正から負に変化し、反応経路の分岐が起こる場合がある。IRC計算では複数の組の生成物を追跡できないため、反応経路の分岐に気がつくことは一般に難しい。本研究では、非調和下方歪追跡法(ADDF)とIRC計算によりグローバルな反応経路地図を生成し、各IRCに沿って振動解析を行って反応経路上で谷-尾根遷移点を探索することにより経路分岐が起こる条件や頻度を調べ、さらにAIMD計算により動力学効果や分岐比についても議論を行い、化学反応における分岐反応の重要性を明らかにすることを目的とした。対象とした金5量体については、5つの安定構造、14の遷移状態構造が得られ、5つの谷-尾根遷移点を見出し、谷-尾根遷移点の構造には構造が類似する遷移状態構造が存在していることを示した。さらに分岐ダイナミクスを解明するため、2つの構造間の3N次元座標空間の距離を見積もるアルゴリズムを開発し、AIMD古典軌道上の構造とIRC上の参照構造との距離の見積もりに適用した。本解析により、AIMD古典軌道がIRCネットワークの中をどのように進行していくかを評価できる。本手法を金クラスターの構造変化に適用することにより、IRC間の跳躍や分岐していく様子を見出し、分子系が必ずしもIRCに沿って運動していくわけではないことを明らかにした。さらに、古典的多次元尺度構成法の適用によりグローバル反応経路地図における各構造の配置に意味を持たせる手法の提案や、励起状態分岐反応を示すモノメチルスチルベンの光異性化反応の詳細な解析を行い、様々な分岐反応においてダイナミクスが重要な役割を果たすことを第一原理動力学シミュレーションにより示した。固有反応座標IRCは反応物、遷移状態、生成物をつなぐ最小エネルギー経路として定義されるが、反応経路に直交する方向に関するポテンシャルの曲率がIRCに沿って正から負に変化し、反応経路の分岐が起こる場合がある。IRC計算では複数の組の生成物を追跡することができないため、通常の反応経路解析では反応経路の分岐に気がつくことは一般に難しい。本研究では、いくつかのタイプの分子系に対して非調和下方歪追跡法(ADDF)とIRC計算によりグローバルな反応経路地図を生成し、各IRCに沿って振動解析を行って反応経路上で谷-尾根遷移点を探索することにより経路分岐が起こる条件や頻度を調べ、さらにAIMD計算により動力学効果や分岐比についても議論を行い、化学反応における分岐反応の重要性を明らかにすることを目的として研究を進めている。28年度は、比較的低いエネルギー障壁でつながれている金5量体のクラスター構造変化の反応経路を詳細に調べた。金5量体のグローバル反応経路地図には5つの平衡構造と14の遷移状態構造があり、14本のIRCのうち4本に谷-尾根遷移点が見つかっている。各谷-尾根遷移点には、構造が類似した遷移状態構造があることを確認し、経路分岐を考慮した反応経路地図を作成することに成功した。金5量体の最安定構造はC2v対称で同種核置換-反転異性体構造が60存在するが、反応経路地図ではこの異性体構造は考慮されていない。一方、ここで見出された谷-尾根遷移点はいずれも同種核置換-反転異性体構造を結ぶものであるため、分岐を考慮した反応経路地図の作成においてはこれら異性体構造を区別する必要がある。本研究では、同種核置換-反転異性体構造を区別した反応経路地図を作成し、さらにAIMD計算による古典軌道を反応経路地図に基づき解析する手法を開発して、金クラスターの構造転移のダイナミクスを詳細に調べている。金5量体のクラスター構造変化について、5つの安定構造、14の遷移状態構造を反応経路自動探索法により求め、反応経路地図を作製した。反応経路にそって振動解析を行い、経路に直交した振動モードの振動数を調べ、反応経路地図に5つの谷-尾根遷移点が存在することを見出した。ここで見出された谷-尾根遷移点は、いずれも金クラスターの同種核置換-反転異性体構造への分岐に関係することを見出し、これら異性体構造を区別したグローバル反応経路地図を作製した。また、各谷-尾根遷移点の構造には構造が類似する遷移状態構造が存在することを確認した。金クラスターの構造変化は電子基底状態で起こるが、電子励起状態で分岐反応を示す例としてシス-ジメチルスチルベンの光励起によるトランス体および環化体への分岐反応の研究にも取り組んだ。本研究は、以前に研究代表者らが取り組んだシス-スチルベンのトランス体および環化体への光異性化分岐反応の研究を発展させたものであり、分岐反応機構・ダイナミクスへの置換基効果を調べる、という意義もあわせもつ。本研究では、基底状態とスピン一重項励起状態との間の円錐交差領域を比較的低コストの計算で扱うことのできるスピン反転(SF)-TDDFT法を適用し、垂直励起構造からの最急降下経路ならびにダイナミクスの様子を調べ、スチルベンの場合との比較を行った。本計算の結果、シス-スチルベンへのメチル基の置換基効果により反応経路の向きが変化し、スチルベンではトランス体を向いていた経路がスムーズに環化体へとつながることを明らかにし、さらに、シス体とトランス体の間の構造にあたる垂直構造体の安定構造と円錐交差構造においてずれが生じ、実験で観測されている垂直構造体の長寿命化の起源を理論計算に基づき明らかにすることができた。本結果についてはすでに米国化学会のJ. Phys. Chem. Aに発表している。

化学反応過程を量子化学計算に基づき調べる場合、固有反応座標IRCが計算される。IRCは反応物、遷移状態、生成物をつなぐ最小エネルギー経路として定義されるが、反応経路に直交する方向に関するポテンシャルの曲率がIRCに沿って正から負に変化し、反応経路の分岐が起こる場合がある。IRC計算では複数の組の生成物を追跡することができないため、通常の反応経路解析では反応経路の分岐に気がつくことは一般に難しい。本研究では、いくつかのタイプの分子系に対して非調和下方歪追跡法(ADDF)とIRC計算によりグローバルな反応経路地図を生成し、各IRCに沿って振動解析を行って反応経路上で谷-尾根遷移点を探索することにより経路分岐が起こる条件や頻度を調べ、さらにAIMD計算により動力学効果や分岐比についても議論を行い、化学反応における分岐反応の重要性を明らかにすることを目的として研究を進めている。本年度は比較的低いエネルギー障壁でつながれている金5量体のクラスター構造変化を対象として、反応経路地図に基づきダイナミクスの効果を調べる新しい手法の開発を行った。AIMD計算により得られる古典軌道上の構造に対し、IRCネットワーク上の参照構造からの3N次元における距離を計算し、その距離の時間変化を追うことにより古典軌道が反応経路ネットワークの中のどの位置を進行しているかを評価することができ、たとえば、分子系がIRC間を跳躍する様子や分岐する様子を調べることができる。本年度は本手法の定式化とプログラム化を完成させ、金5量体の構造変化へと適用した。研究成果は2018年1月にPhys.Chem.Chem.Phys.に出版された。金5量体のクラスター構造変化について、5つの安定構造、14の遷移状態構造を反応経路自動探索法の1つである非調和下方歪み追跡法(ADDF)により求め、反応経路にそって経路に直交した振動モードの振動数を調べ、5つの谷-尾根遷移点を見出した。ここで見出された谷-尾根遷移点は、いずれも金クラスターの同種核置換-反転異性体構造への分岐に関係しており、これら異性体構造を区別したグローバル反応経路地図を作製した。各谷-尾根遷移点の構造には構造が類似する遷移状態構造が存在することを確認した。続いて金クラスターの2つの構造間の距離を評価するために、荷重デカルト座標空間における3N次元の距離を最小化するx,y,z座標軸回転のアルゴリズムを導入し、古典軌道上の構造とIRC上の参照構造との距離を見積もることのできるプログラムを開発した。古典軌道に沿って多数の参照構造からの距離を評価することにより、古典軌道がIRCネットワークの中のどの領域を進行しているかを評価することができる。本手法を金クラスターの構造変化に適用することにより、IRC間の跳躍する現象を明らかにし、分子系が必ずしもIRCに沿って運動していくのではないことを第一原理シミュレーションに基づき明らかにした。固有反応座標IRCは反応物、遷移状態、生成物をつなぐ最小エネルギー経路として定義されるが、反応経路に直交する方向に関するポテンシャルの曲率が正から負に変化し、反応経路の分岐が起こる場合がある。IRC計算では複数の組の生成物を追跡できないため、反応経路の分岐に気がつくことは一般に難しい。
孤立分子系コヒーレント超高リュードベリ状態のパルス電場による寿命制御

本研究課題は、ナノ秒パルスレーザーによる共鳴多光子励起で生成したコヒーレシトな超高リュードベリ状態の寿命を、パルス電場をもちいて制御するための基礎的な実験をおこなうことを目的として開始された。任意波形パルス電場発生装置の開発をおこない、それを用いてNO分子等の小分子およびベンゼン等多原子系を対象として、超高リュードベリ状態の寿命のパルス電場依存性、イオン濃度依存性等を詳細に調べた。その結果、ベンゼン誘導体等の多原子分子系では振動回転状態の異なるリュードベリ系列間での遷移がNO分子等の小分子系と比べて顕著に起こることが新にみいだされた。この原因として振動準位密度および回転準位密度が関係していると予想されるが、低振動モードの振動数の異なるベンゼン誘導体についてリュードベリ系列間遷移を調べたところ、ほとんど差がみられないことから主に回転準位密度が関係していることが示唆された。申請者らは、ゼロ運動エネルギー(ZEro Kinetic Energy,ZEKE)光電子分光法と呼ばれる、新しい超高分解能レーザー光電子分光法を用いて、超音速ジェット冷却された分子の断熱イオン化ポテンシャルの精密決定や、分子カチオンの構造研究を進めている。ZEKE光電子分光法の原理は、パルスレーザー光により、分子をイオン化状態より数cm^<-1>以内の低波数側に存在する主量子数nの非常に大きい高リュードベリ状態(n>100)(以下、超高リュードベリ状態という)に共鳴多光子励起し、数マイクロ秒後にパルス電場により、超高リュードベリ電子をパルス電場イオン化(Pulsed Field Ionization,PFI)するとともに電子増倍管へ導くものである。このために、ZEKE光電子分光法は、ZEKE-PFI分光法と呼ばれることも多い。申請者らは、独自に開発した、パルス電場を2つ用いる2段階パルス電場イオン化(2PFI)法を用いて、ZEKE-PFI分光をおこなっている。2PFIでは、レーザー励起直後に弱いパルス電場により、電場イオン化以外の機構で発生した電子を省き、第二のパルス電場でPFI電子のみを選択的に集めることができる。このことは、超高リュードベリ状態のダイナミクスを調べる上で大きな利点である。また二つのパルス電場の相対強度を調整することにより特定のエネルギー領域の超高リュードベリ状態を選択的に検出することも可能である。2PFI法により、多原子分子においてRydberg系列間でエネルギー移動が起きることを新たに見出した。
コンパクトな高速度カメラによる声帯振動の観察と臨床応用

音声障害(嗄声)の原因は多岐にわたるが、その本態は規則的な声帯振動の障害であり、適切な診断や治療を行うためにはその病態、特に声帯振動様式を患者毎に把握することが極めて重要である。本研究では、(1)発声時の声帯振動を汎用性の超高速度カメラを用いて観察する手法を確立する。(2)声帯振動の動態を2次元動画解析ソフトにより定量的に解析するための解析プログラムを作成する。これにより、音声障害の病態を高速度カメラにより簡便かつ定量的に評価する手法を確立して普及させ、診断および治療への応用を図る。
食品及び生体における脂質過酸化反応の定量的評価法に関する体系的研究

1.脂質過酸化反応の指標として、最も古くから取り上げられているマロンジアルデヒド(MDA)の特異的、高感度分析法を確立した。2.ナタネ油、及び大豆油を170°C、40°C(ラジカル開始剤を用いる)で酸化した場合のTBAー反応性物質(TBAーRS)とMDAを追跡し、その差を検討した。また、トコフェロ-ルの減少を測定し、過酸化の指標としての意義を検討した。3.脂質過酸化の指標として最も信頼できるのは酸素消費量である。大豆油の酸化を行い、TBAーRS、MDA、トコフェロ-ルなどを測定し、それぞれの適用限界を明らかにした。4.ラジカル反応で肝障害を起こすことが知られている、四塩化炭素をラットに投与し、生体側の防御機構として起こる、肝再生の機構を検討した。四塩化炭素による肝再生も部分肝切除後の肝再生同様、αー受容体を介して調節されていることが明かになった。5.ビタミンCは生体内の代表的な抗酸化剤であるが、このものの、特異的かつ高感度定量法は存在しない。今回、化学誘導とHPLCを用いる方法を確立した。6.老化はラジカル反応でおこるとする仮説があるが、いまだ化学的に検証されていない。それは、指標となるものが確立していないからである。われわれは、1つの可能性として、過酸化物をとりあげ、極低濃度の過酸化水素、及びヒドロペルオキシドを、化学発光法を用いて定量する方法を確立した。7.カドミウムの肺に対する毒性発現機構が脂質過酸化であることを、グルタチオンの動態から明らかにした。1.脂質過酸化反応は、食品学、栄養学における重要テ-マであるが、現在のところ、過酸化を定量的に評価する方法は存在しない。そこで、従来から脂質過酸化の指標とされながら、特異的定量法が存在しなかった、マロンジアルデヒド(MDA)を、化学誘導と高速液体クロマトグラフを用いて定量する新しい方法を確立した。2.大豆油の酸化において、上記の方法で測定されるMDAとTBAー反応性物質との比較を行った。その結果、高温(170°C)での酸化においては、MDAとTBAー反応性物質の生成は似た挙動を示し、酸化のもう一つの指標と考えられるビタミンEの減少とも、よく相関した。一方、37°Cでラジカル開始剤を用いた酸化反応では、MDAとTBAー反応性物質の量は対応せず、MDAは徐々に増加したが、後者は急増した後、一定値を保持した。ビタミンEはMDAと似た挙動を示したことから、生体内のように37°C程度の低温で起こる酸化反応については、TBAー反応性物質より、MDAの方がより正確な指標となることが示唆された。3.ナタネ油につても同様の実験から、上と同様の結果を得た。過酸化の指標として、化学発光や酸素消費量も測定し、どれが過酸化の指標として、適当であるのか、体系的に検討している。4.ラジカル反応による広汎な脂質過酸化反応は、細胞を破壊する。最も古くから研究されているのが四塩化炭素による肝障害である。最近、我々は、肝部分切除後に起こる肝再生は、肝蔵のα_1ー受容体が関与するシグナルネットワ-クにより調節されることを明らかにしてきた。四塩化炭素による障害に続いて起こる生体側の防御機構としての肝再生は、肝部分切除後に起こるものと同様、α_1ー受容体を介することを証明した。ラジカル反応により、生体に障害を与える環境汚染物質のいくつかについて、その作用機構の検討を開始した。1.脂質過酸化反応の指標として最も信頼できるのは、酸素消費量である。今回、大豆油を170°C及び40°Cの二つの条件で酸化した。

その際、酸素計を用いて、閉鎖系で酸化反応を行わせることにより、酸素消費量を測定した。同時に、MDAとTBAー反応性物質(TBAーRS)、トコフェロ-ルの減少を測定し、酸素消費量との関係を検討した。その結果、170°Cにおいては、MDA、TBAーRS共、酸素消費量が500μmol/l以下であれば、酸素消費量と良好な線形関係を示したが、それ以上酸素消費が進行しても、MDA、TBAーRS共、増加せず、一定値もしくは減少する傾向を示した。このことは、これまで指標と考えられてきた値にはっきりとした適用限界があることを示している。一方、トコフェロ-ル類は、酸素消費が2000μmol/lまで増加するに従って、減少した。このことは、高温での過酸化の指標としては、トコフェロ-ルが優れていることを示している。40°Cで開始剤を用いて大豆油を酸化した実験では、酸素消費量と、MDAおよびTBAーRSともに、良好な線形関係を示すことが判明した。2.ビタミンCは生体内の代表的な抗酸化剤であるが、このものの、特異的かつ高感度定量法は存在しない。今回、化学誘導とHPLCを用いる方法を確立した。3.老化はラジカル反応でおこるとする仮説があるが、いまだ化学的に検証されていない。それは、指標となるものが確立していないからである。われわれは、1つの可能性として、過酸化物をとりあげ、極低濃度の過酸化水素、及びヒドロペルオキシドを、化学発光法を用いて定量する方法を確立した。4.カドミウムの肺に対する毒性発現機構が脂質過酸化であることを、グルタチオンの動態から明らかにした。
小胞体内腔カルシウム含量とCa^<2+>遊離速度との関係-骨格筋、心筋、平滑筋の比較

筋小胞体からのCa^<2+>遊離はCa^<2+>による細胞内情報伝達の枢要な過程である。我々は既にカエル骨格筋筋小胞体内腔のCa^<2+>結合部位量を評価し、そのCa^<2+>遊離の時間経過に及ぼす影響について報告した。この結論を補強するにはCa^<2+>放出チャンネルの性質が均一であることの確認が重要である。ウシガエル骨格筋にはα-RyRとβ-RyRと呼ばれる二種類のリアノジン受容体(RyR)アイソフォームがほぼ等量ずつ混在することが知られている。我々は既にこれらのアイソフォームはそれぞれ哺乳類のRyR1、RyR3と相同であり、精製アイソフォームのCa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離(CICR)活性は区別できないほど酷似していることを報告した。しかし筋小胞体膜上のnativeな状態のRyRの性質については検討が必要である。免疫沈降法と[^3H]ryanodine結合の特性を応用して検討した結果、α-RyRの最大活性はβ-RyRの数%に抑制されており、生筋でのCICR活性は主にβ-RyRにより担われていることが示唆された。また小胞体内腔は機能的に均質であり、単一コンパートメント見なせた。しかしmitsugumin29欠損骨格筋では複数のコンパートメントからなると考えられる。平滑筋や非筋細胞でのIP3によるCa^<2+>遊離の複雑な時間経過についていろいろと議論されているが、いずれもが我々が展開した視点に欠けている。即ち、Ca^<2+>遊離の基本的な駆動力は遊離Ca^<2+>濃度差であり、しかしながら内腔Ca^<2+>結合部位が存在するため、小胞体の充填程度が高い状態の方が低い状態より遊離Ca^<2+>濃度差が大きく寄与すると言う点である。これを更に確立するには内腔Ca^<2+>濃度を直接測定することが必要であるが、信頼性の高い、適したCa^<2+>指示薬を見出せずにいる。今後も継続して努力する。また小腔体内腔Ca^<2+>が枯渇すると形質膜を介するCa^<2+>流入(ストアー作動性Ca^<2+>流入)が増すことが平滑筋や非筋細胞で報告されており,IP3受容体が深く関わっていると考えられている。IP3受容体のCa^<2+>homeostasisへの関与が殆どない骨格筋でもストアー作動性Ca^<2+>流入が起こるか否かを検討したところ、攣縮刺激、high K^+刺激、caffeine刺激にも反応しない状態にまで枯渇出来た。この状態ではCa^<2+>流入による小胞体の再補充、Mn^<2+>流入の増加が見られ、その性質はCRACチャンネルと多くの点で酷似していた。

IP3受容体のCa^<2+>homeostasisへの関与が殆どない骨格筋でもストアー作動性Ca^<2+>流入が起こるか否かを検討したところ、攣縮刺激、high K^+刺激、caffeine刺激にも反応しない状態にまで枯渇出来た。この状態ではCa^<2+>流入による小胞体の再補充、Mn^<2+>流入の増加が見られ、その性質はCRACチャンネルと多くの点で酷似していた。筋小胞体からのCa^<2+>遊離はCa^<2+>による細胞内情報伝達の枢要な過程である。我々は既に小胞体内腔のCa^<2+>結合部位量(Ca^<2+>-buffer site)を評価し、そのCa^<2+>遊離に及ぼす影響について報告した。この結論を小胞体内腔の[Ca^<2+>]濃度変化を直接測定することにより確認することを計画した。小胞体内腔Ca^<2+>濃度は10mMにも達することが予想されるので、Ca^<2+>親和性の低いCa^<2+>指示薬を選定しなければならない。幸いFluo-3のほかにCa^<2+>親和性がもっと低いFluo-4,Fluo-5など種々の蛍光性指示薬が市販されるようになったので、現在検討中である。一方Ca^<2+>によるCa^<2+>遊離は重要なCa^<2+>遊離機構の一つと考えられ、アデニンヌクレオチドにより促進され、Mg^<2+>により抑制されることが知られているが、この定量的検討が不十分であった。そこで、種々の濃度のCa^<2+>,Mg^<2+>存在下でのCa^<2+>放出チャネル活性を測定し、定量的考察を行った。Ca^<2+>放出チャネルには高親和性Ca^<2+>活性化部位(A-site)と低親和性Ca^<2+>不活性化部位(I-site)とが存在し、Mg^<2+>は前者にはCa^<2+>の競合的拮抗薬として、後者にはアゴニストとして働くこと、各部位のCa^<2+>,Mg^<2+>親和性は精製リアノジン受容体より筋小胞体中のCa^<2+>放出チャネルの方が約5倍強いこと、ATPは各部位のCa^<2+>,Mg^<2+>親和性を変えず、最大活性を濃度依存的に数百倍まで増加すること、カフェインはA-siteのCa^<2+>親和性のみ増加し、I-siteのCa^<2+>,Mg^<2+>親和性を殆ど変えないこと、また最大活性を増すことなどが判った。以上の結果から骨格筋ではCa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離が生理的な脱分極によるCa^<2+>遊離には関与しないことが結論された。またmisugumin29欠損マウス骨格筋は正常骨格筋と比較し、extrajunctional ryanodine receptorが検出されないのに脱分極感受性Ca^<2+>ストアーとカフェイン感受性Ca^<2+>ストアーとが合致しないことがわかり、形態的にも機能的にもコンパートメントが存在することがわかった。なお正常筋では単一均質な空間と考えられた。小胞体内腔のCa^<2+>
リン脂質を認識するタンパク質の脂質二重膜における配向に関する構造生物学的研究

本研究は、リガンド脂質を認識し脂質二重膜に直接相互作用するタンパク質が、本来の姿で相互作用し機能する様子を正確に決定する方法の開発を目的とする。当研究室の開発した、NMRを用いた転移交差飽和法によるタンパク質複合体相互作用界面決定法は、不均一な巨大分子との相互作用解析を可能とした。転移交差飽和法を、NADPHオキシダーゼに存在するp47PXドメインと、そのリガンドであるホスファチジルイノシトール(3,4)2リン酸(以下PI(3,4)P2と表記する)を含むリポソームとの相互作用解析に適用して検討を進めている。まず、p47 PXドメインの発現・精製系を確立して安定同位体標識タンパク質を取得し、三重共鳴NMRの測定とアミノ酸選択的標識による主鎖連鎖帰属を終了した。次に、p47 PXドメインにおけるPI(3,4)P2含有リポソームとの相互作用部位を転移交差飽和法に基づいて同定した。明らかになった相互作用部位は、変異体と表面プラズモン法のみを用いたWilliams RLらのグループの結果とは全く異なった部位であった。さらに、Williamsらはホスファチジン酸結合部位を示しているが、我々の結果では、ホスファチジン酸の結合はPI(3,4)P2に比較して非常に弱く、PI(3,4)P2存在下ではp47 PXドメインとは相互作用しない。また、他のPXドメインにおいて、detergentを用いた結合実験によって示されたmembmne insertion loopは、p47 PXドメインにおいてはリポソームとの相互作用が観測されなかった。データ精度の向上と変異体を用いた検討をさらに進めている。