hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代替フロン類の輸送性質の測定

2)液相の熱伝導率については既存の非定常熱線型セルを用いてHCFC123およびHCFC1416の熱伝導率を温度298348K、圧力0.1100MPaの範囲で測定した。実測値に基づき種々の相関法と理論の有効性について検討した。3)気相の粘性率については転下球型粘度計を用いて、新しいフロンを含む2成分非共沸混合系(HCFC22+HFC134a)と(HCFC22+HFC143a)の粘性率を298348K、常圧で測定した。4)液相の粘性率については落下円筒型粘度計を用いて、HCFC123、HCFC123a、HCFC1416の粘性率を298323K、0.1120MPaの範囲で測定した。5)これらの新しい物性値デ-タは、従来使用されてきた環境問題に関わるフロン類の物性値と比較され、代替品としての可能性を検討した。前年度に引続き,本研究では成層圏におけるオゾン層の破壊などの環境問題に関与しない新しい代替フロン類の粘性率と熱伝導率を気液両相にわたり、精密に測定することを目的として研究を行った。気相の熱伝導率については、従来使用してきた装置に加えて、新しく非定常熱線型の装置を試作した。本年度の研究成果の概要は次の通りである。1)気相の熱伝導率を測定するために,新しく非定常熱線型のセルを試作し,装置の健全性を295K,0.1MPaにおける空気を用いて確認した。新しく製作した装置で絶対測定したところ,空気の熱伝導率の最確値と3%以内で一致することが判明したので今後高圧下での測定を行う予定である。2)同心円筒型セルを用いてHCFCー123および(HCFCー22+HCFCー141b)系の気相における熱伝導率を313343K,0.12.7MPaの範囲で測定し,熱伝導率と温度,圧力との関係を表現する相関式を作成した。3)気相の粘性率について,HFCー134aと(HFCー152a+HCFC142b)系について,常圧下293313Kで粘性率を測定し,混合気体の粘性率に関する推算法との比較を行った。4)HFCー134aとHCFCー123について,世界各国で報告されている粘性率,熱伝導率に関する実測値を収集,整理,解析し,デ-タの比較を行った。一般に熱力学性質と比較して,粘性率や熱伝導率のデ-タは乏しく,また測定者による不一致が著しいことが判明した。今後はさらに世界のデ-タ収集を続け,最も確からしいデ-タに基づいて新しい代替フロンの輸送性質に関する最確値および最良相関式を作成する。研究の成果は国際エネルギ-機関のワ-クショップや国際会議で報告し,世界的に認可され得る物性値を統一的に管理し,各国に流布する。
NMRスペクトルの画像化による脳の機能的代謝マップ

脳組織の生理的活動は、細胞の代謝活動を伴っている。したがって、脳組織の活動によって生じる代謝物質の変化を知ることは、脳の機能を明らかにするために、ぜひとも必要である。脳の活動に際して変化する代謝物質は、高エネルギー燐化合物、乳酸などの他に、グルタミン酸などの、伝達に関連する物質が挙げられる。NMRは生体内のリン化合物のほか、プロトンに由来する信号を検出することが可能であることから、脳組織の代謝活動を非侵襲的に研究するための方法として優れている。本実験では動物の脳を対象とし、プロトン信号をできるだけ限局した領域から検出することによって、脳組織における局所的代謝活動およびその変化を調べた。その結果、家兎の脳における視床核を含む局所領域(約8ミリメートル立方)から、Nアセチルアスパラギン酸(NAA)に由来する比較的強い信号を検出することに成功した。局所選択性については、ファントムモデルを用いることによって評価し、良い局所選択性能を示す事を確かめることができた。この方法に基づき、吸息気中の酸素分圧を減らすことによって、脳組織中の乳酸濃度が増大することを確かめた。一方、局所酸素分圧の減少によって、脳局所血液流量が変化することが予想されることから、対照部位にレーザードップラー血流計のプローブを刺入することによって、局所血液流量の変化を同時に測定した。その結果、酸素不足により脳局所血流量が増大することが明らかとなった。局所乳酸濃度の増大が直接あるいは間接に局所の血流量を調節していると考えられる。機能的に不均質な糸である筋肉及び脳の機能についてその局部的な機能を知るには、非侵襲的方法による研究の意義が大きい。脳の局在機能の非侵襲的な検出には、ポジトロンエミッション断層装置(PET)が成功を収めた。一方同様に非侵襲的方法であるNMR及びそれによるトモグラフィーは、放射性同位原素を用いることなく、生体内代謝及び機能物質を検出することができるという特徴を持っている。本研究ではこれまでに傾斜磁場を用いる局所選択^1H-NMRスペクトルによって、低酸素時のウサギの脳の代謝状態の変化を調べた。局所選択はStimulated Echo法(VOSYパルス系列)により、大脳基底核群を選び、その選択領域の大きさは約0.5mlであった。また必要に応じて水信号の抑制を行った。用いたエコー時間の範囲は200270ミリ秒である。その結果、水、Nアセチルアスパラギン酸、総クレアチン、コリン類、及び乳酸などの信号と、その低酸素による変化を観測することができた。レーザー血流計のセンサーを、スペクトル選択領域の反対側に刺入し、脳の同じ組織における血流速度及び流量を同時に測定した。その結果、局所における乳酸の増加は、低酸素及びそれに伴って生じる局所血液循環の低下の両者が同時に進行したことによって生じることが明らかとなった。すなわち循環血液中の酸素分圧の低下だけでは脳組織の乳酸量はあまり増大しない。このような知見は従来考えられてきたものと異なっている。今後はさらに機能的画像及びスペクトル変化の画像化を試みる予定である。機能的に不均質な系である筋肉及び脳の機能についてその局部的な機能を知るには、非侵襲的方法による研究の意義が大きい。局所選択はStimulated Echo法(VOSYパルス系列)により、大脳皮質および視床核群を選び、その選択領域の大きさは約0.5mlであった。また必要に応じて水信号の抑制を行い、水、Nアセチルアスパラギン酸、総クレアチン、コリン類、及び乳酸などの信号と、その低酸素による変化を観測することができた。

レーザー血流計のセンサーを、スペクトル選択領域の対側に刺入し、脳の同じ組織における血流速度及び血流量を同時に測定した。その結果、局所におけるエネルギー状態の変化は、低酸素及びそれに伴って生じる局所血液循環の変化の両者が関与して生じることが明らかとなった。すなわち循環血液中の酸素分圧の低下は、循環血液量の増大によって補われ、脳組織の乳酸量は低酸素によってもあまり急激には増大しない。今後は更に機能的画像及びスペクトル変化の画像化を試みる予定である。脳組織の生理的活動は、細胞の代謝活動を伴っている。したがって、脳組織の活動によって生じる代謝物質の変化を知ることは、脳の機能を明らかにするためには、ぜひとも必要である。脳の活動に際して変化する代謝物質は、高エネルギーリン化合物、乳酸などの他に、グルタミン酸などの、伝達に関連する物質が挙げられる。NMRは生体内のリン化合物のほか、プロトンに由来する信号を検出することが可能であることから、脳組織の代謝活動を非侵襲的に研究するための方法として優れている。本実験では動物の脳を対象とし、プロトン信号をできるだけ限局した領域から検出することによって、脳組織における局所的代謝活動およびその変化を調べた。その結果、家兎の脳における視床核を含む局所領域(約8ミリメートル立方)から、Nアセチルアスパラギン酸(NAA)に由来する比較的強い信号を検出することに成功した。局所選択性については、ファントムモデルを用いることによって評価し、良い局所選択性能を示す事を確かめることができた。この方法に基づき、吸息気中の酸素分圧を減らすことによって、脳組織中の乳酸濃度が増大することを確かめた。一方、同部位においてレーザードップラー血流計を用い、局所脳血流量の変化を同時記録した。この結果、局所乳酸濃度は局所脳酸素供給量の減少に応じて増加することが明らかとなった。また、増大した局所乳酸濃度が直接あるいは間接に局所の血流量を調節していることが示唆された。
レドックス代謝制御における核-細胞質クロストークとアポトーシス誘導機構の解明

細胞は、酸化ストレスによって惹起されるレドックス代謝制御により、様々な応答を引き起こす。そのひとつとして細胞死(アポトーシス)誘導があり、これまでの研究から、アポトーシスを制御するいくつかのキナーゼ群は細胞質から細胞核に移行すること、そして核に存在する細胞死関連因子をリン酸化することでアポトーシスを誘導することを見出した。さらにこの核移行を阻害するとアポトーシスが抑えられることから、これらキナーゼ群の核移行がアポトーシス誘導の本質であるという今までにない全く新しいモデルを提唱している。本研究では、この核移行が酸化ストレスで惹起されるアポトーシスの本質であるメカニズムの詳細を明らかにすることを通してレドックス代謝制御機構を理解し、その破綻ががんを始めとする酸化ストレス関連疾患とどのように関わっているかに迫り、さらにその知見を機軸とした診断と治療への応用の可能性を追求した。酸化ストレスにおけるアポトーシス誘導に関わる新規遺伝子の網羅的探索を目的として、shRNA発現ライブラリーを用いたスクリーニング系を構築した。様々な試行錯誤を経て、細胞にshRNA発現ライブラリーを導入後、酸化ストレス刺激によりアポトーシスから逃れた細胞を回収して、いかなる遺伝子に発現抑制が起きているかを調べていくという作業仮説で実験を進めた。その結果、アポトーシス関連遺伝子の候補として32クローンを同定し、そのなかで最も細胞死誘導に関与している遺伝子としてTAF1という分子を見出した。TAF1は基本転写因子の中核をなす分子であり、そのアポトーシス誘導における機能解析を進めるために、マイクロアレイによる発現解析を行った。その結果、TAF1に制御されている分子群においてp27の発現が細胞死誘導に関わっていることを見出した。また酸化ストレスによるc-Ab1の核-細胞質シャトリング機構についても研究を進めた。c-Ab1は14-3-3と結合することによって不活性の状態で細胞質にとどまっているが、細胞に酸化ストレスが加わると、14-3-3から解離し核に移行した後に活性化し、細胞死(アポトーシス)を誘導する。c-Ab1 Thr735のリン酸化は14-3-3結合モティーフでありc-Ab1の局在制御に重要であるが、Thr735をリン酸化するキナーゼが不明であった。そこで、Thr735特異的リン酸化抗体とcDNAライブラリーファージを用いたスクリーニングによりc-Ab1 Thr735をリン酸化するキナーゼの同定を試みた。その結果、TTKが細胞内でThr735をリン酸化するキナーゼであることを明らかにした。さらにTTKをノックダウンするとc-Ab1の核内集積が起こり、酸化ストレスによるc-Ab1依存的なアポトーシスが促進したことから、c-Ab1を細胞質内に留めることで酸化ストレスによるアポトーシスに抵抗性を示すというTTKの新たな機能が示唆された。腫瘍壊死因子TNF-αによって引き起こされる酸化ストレスを中心に、レドックス代謝制御におけるキナーゼの働きを引き続き検証した。その中で、PKCδがTNF-αの刺激に伴って、細胞質から核に移行することを見いだした。この移行はキナーゼ活性依存的であり、NF-κBの構成因子であるRelA/p65の活性に関わっていることを突き止めた、PKCδは核内でRelA/p65と複合体を形成し、その転写活性を正に制御している。またTNF-αによる細胞死誘導がPKCδの活性阻害によって有意に抑制された。以上のことより、PKCδはRelA/p65の活性を介して、サイトカインによる酸化ストレスによって惹起されたアポトーシス誘導を抑制するという新たな働きを見いだした。我々はさらにTNF-αによる細胞内シグナリングに中心的な役割を果たすRelA/p65の機能について、特にその活性化に必須であるSer276のリン酸化に着目した。まず、Ser276特異的リン酸化抗体とcDNAライブラリーファージを用いたスクリーニングによりRelA/p65 Ser276をリン酸化するキナーゼの同定を試みた。その結果、Pim-1が細胞内でSer276をリン酸化するキナーゼであることを明らかにした。興味深いことに、Pim-1はSer276をリン酸化することによってRelA/p65の活性を制御するだけでなく、その発現の安定性にも寄与していることが判明した。Pim-1はさらにRelA/p65 Ser276のリン酸化を介してTNF-αによって誘導されるアポトーシスを有意に抑制していることが明らかとなった。癌の進展と密接に関わっている細胞内シグナル経路の一つとして、NF-kappaBシグナルが知られている。この標的遺伝子の大部分が細胞生存に関与しており、多くの癌でこのシグナルが活性化している。

このシグナルを抑制することが出来れば、癌の進展や転移を抑えることが出来る可能性が高まる。NF-kappaBを構成する転写因子の一つであるRelA/p65はリン酸化などの多様な翻訳後修飾を受け転写活性が制御されている。なかでもセリン276残基のリン酸化はRelA/p65のDNA結合活性を亢進すると共に、転写コアロベーターCBP/p300との結合を誘導することから、RelA/p65の転写能を活性化する重要な修飾であることが明らかになってきた。しかしこのリン酸化を担うキナーゼははっきりしない。そこでこのキナーゼを同定するためにラムダファージによるSer276リン酸化特異的抗体を用いた発現クローニングを行い、候補となるキナーゼの同定を試みた。その結果Pim-1を同定した。Pim-1はTNFalphaなどのサイトカインによる酸化ストレス刺激によりRelA/p65をリン酸化し、その転写活性能を亢進するとともに、SOCS-1によるRelA/p65のユビキチン化を抑制し、安定化に寄与していることが明らかとなった。さらにPim-1によるNF-kappaBの活性化は、TNFalpha依存的な細胞死(アポトーシス)誘導を抑制していることが示唆された。以上の結果、Pim-1によるSer276のリン酸化は、RelA/p65の活性化のみならず安定化にも寄与することで、NF-kappaBシグナルを正に制御していることが示唆された。多くの癌でPim-1の過剰発現や活性化が報告されていることから、Pim-1が癌の分子標的となることが期待される。
死後脳DNA chip解析に基づいた神経新生関連統合失調症候補遺伝子の同定

DNA chip解析により、13qに位置し、転写因子をコードするKLF5遺伝子の発現量が、統合失調症死後脳前頭前野においてコントロール群よりも減少していることを見出した。さらに、その結果に基づき、378名の健常者および328名の統合失調症患者の血液サンプルを用いてKLF5遺伝子と統合失調症との相関研究をおこなったころ、KLF5遺伝子プロモーター上のSNPと統合失調症との有意な相関をみとめた。また、その相関をみとめた-1593T/CSNPについて統合失調症死後脳における発現量を検討したところ、-1593T/C SNPはKLF5遺伝子の発現量に影響を及ぼしていることを見出した。さらに統合失調症の血液サンプルを用いた遺伝子配列解析をおこなったところ、一つの一塩基変異はコントロール群においてはみられず、統合失調症においてのみみられた。さらにKLF5遺伝子の脳における発現分布について免疫組織学的な検討をおこなったところ、グルタミン酸ニューロンに多く発現していることを見出した。これまでにKLF5遺伝子は、MAPキナーゼカスケートに位置することが報告されており、MAPキナーゼカスケードは脳においてはシナプス可塑性に重要であることが知られている。これらのことは、KLF5遺伝子がグルタミン酸ニューロンのシナプス可塑性にかかわる可能性を示している。本研究において、KLF5遺伝子が統合失調症と相関したことは、統合失調症においてはグルタミン酸神経伝達に障害があるのではないかというグルタミン酸神経伝達仮説を支持するものであり、その障害にKLF5遺伝子が関わっていることを示唆するものである。以上の結果は、現在欧文雑誌に掲載予定である。これまでの統合失調症死後脳前頭前野を用いたDNA chip解析の結果から、統合失調症において発現が減少しており、かつ有力な統合失調症候補遺伝子座と考えられている8p、13q、22qに位置する遺伝子として、6つの遺伝子を同定した。さらに、統合失調症患者と健常対照者由来の血液サンプルから得られたDNAにより、既知のSNPを用いた遺伝子相関研究をおこなった結果、それらの遺伝子のうち13qに位置し、転写因子をコードしている遺伝子について、プロモーター領域に存在する一つのSNPと統合失調症との有意な相関をみとめた。さらに、そのプロモーター上のSNPは同遺伝子の発現に影響を及ぼしている可能性があることを、死後脳前頭前野を用いたタンパク定量により見出した。また、ダイレクトシークエンス法による遺伝子配列解析をおこない、同遺伝子のプロモーター及びエクソン領域について新たな遺伝子多型を検索した結果、プロモーター上に位置する一塩基の変異を二つ検出した。そのうち一つの変異については健常対照群にみられず、統合失調症患者にのみみとめた。また、同遺伝子のヒト脳における発現はこれまでに報告されていなかったため、死後脳切片を用いて組織学的な検討をおこなった。その結果、同遺伝子は、統合失調症の病態に大きく関わると推測されているグルタミン酸作動性ニューロンに豊富に発現していることを見出した。これらの手法については論文「DNAアレイと脳バンク」(分子精神医学、2006)に報告した。
Toll-like receptor 10のリガンド探索および機能解析

TLR10の機能を解析するためにTLR10を293T細胞に発現させた、その結果TLR10はリポプロテインによるTLR2を介したNF-κB誘導を阻害することが明らかとなった。このことからTLR10はTLR2を競争的に阻害し、炎症を抑制することが示唆された。Toll-like receptor(TLR)と呼ばれる一連の受容体ファミリーは、細菌の様々な菌体成分を認識し、炎症反応を誘導することが報告されている。これまでにTLR1からTLR11まで報告されているが、その中でTLR10はいまだにそのリガンドや機能が明らかとなっていない。本研究はTLR10の機能解析を目的としている。TLR10はリポプロテインを認識するTLR1, 2, 6に配列が近いことから、TLR10とリポプロテインの関連性をまず検討した。TLR10の全長を293T細胞に発現させ、リポプロテインで刺激したところ、炎症反応の誘導は見られなかった。TLR10のTIRドメインを欠損させたTLR10をTLR2と共に293T細胞に発現させたところ、TLR2を介したリポプロテインによる炎症反応の誘導が抑えられた。このことからTLR10はTLR2の補受容体として機能していると考えられた。TLR10の発現がTLR2を介したポプロテインの炎症誘導を促進するかを検討するために全長のTLR10をTLR2と共に293T細胞に発現させた。予想に反して全長のTLR10の発現はリポプロテインによる炎症誘導を阻害した。このことからTLR10はTLR2のリポプロテイン認識を阻害することが示唆された。TLR10の機能を解析するためにSiRNAによるノックダウンを試みたが、THP-1細胞、293T細胞においてTLR10をノックダウンするに至らなかった。またマイコプラズマの生菌がTLR2非依存的な経路でも炎症反応を誘導することを見出した。この反応がTLR10に関与しているかも今後検討したい。Toll-like receptor(TLR)は、細菌の様々な菌体成分を認識し、炎症反応を誘導する。TLR1からTLR11までが報告されているが、TLR10はいまだにそのリガンドや機能が明らかとなっていない。前年度の研究からTLR10はMycoplasmaのリポプロテインを認識し、リポプロテインがTLR2に認識されて起こる炎症誘導を阻害することが示唆された。本年度はTLR10の機能を解析するためにsiRNAによるノックダウンを試みたが、THP-1細胞、293T細胞においてTLR10をノックダウンするに至らなかった。またリポプロテインとTLR10の結合を表面プラズモン共鳴センサーで測定するためにFLAGタグをつけたTLR10を発現させたが、解析に必要な十分な収量を得ることが出来なかった。M.pneumoniaeの生菌がTLR2非依存的な経路でTNF-αやIL-1βを誘導することが明らかとなったため、TLR10の関与を検討した。IL-1βの誘導はinflammasomeに依存的で、TLR10に非依存的であった。TNF-αの誘導にTLR10が関与しているかを現在検討中である。Helicobacter pyroliは胃潰瘍などの炎症を起こすが、H.pyroliのLPSには炎症誘導能はなく、炎症誘導因子はわかっていない。我々はH.pyroliのリポプロテインがTLR2を介し炎症を誘導することを見出した。またMycoplasmaのリポプロテインと同様にTLR10はこのリポプロテインによるTLR2からの炎症誘導を阻害した。前年度までの研究からTLR10はMycoplasmaのリポプロテインを認識し、リポプロテインがTLR2を介して誘導する炎症誘導を阻害することが示唆された。本年度は昨年度に引き続きTLR10の機能を解析するためにsiRNAによるノックダウンを試みたが、THP-1細胞においてTLR10をノックダウンするに至らなかった。Mycoplasma pneumoniaeはヒトに肺炎を起こす細菌である。前年度の研究からM. pneumoniaeの接着がTLR2非依存的な経路でTNF-αやIL-1βを誘導することが明らかとなったため、TLR10の関与を検討した。しかしながら、M. pneumoniaeの接着が誘導する炎症誘導はTLR10非依存的であった。我々はこの接着による炎症誘導が、ATPとP2X7receptorに依存的であることを見出し、Immunologyに発表した。
間葉系幹細胞シートを用いた脳梗塞モデルに対する神経再生研究

近年、脳梗塞に対する新規治療法として幹細胞移植は期待されており、失った神経機能を回復させる可能性が示唆されている。これらの多くは移植細胞浮遊液の経静脈・経動脈・直接脳内注入として報告されているが、細胞浮遊液を用いた移植方法は移植細胞を罹患部に十分に生着させることの困難さや、肺や肝臓における移植細胞のトラップ現象などの問題点が挙げられる。中枢神経系における細胞治療において、移植細胞を罹患部に非侵襲的に十分移植することは重要な課題であり、適切な移植方法は依然として不明である。罹患部に十分な移植細胞を生着維持させるための新たな新規治療方法の開発は、中枢神経領域における再生治療の進歩につながる。新規細胞移植治療として、我々は温度応答性培養皿を用いて他家脂肪由来間葉系幹細胞シートを作成した。一過性中大脳動脈閉塞ラットによる脳梗塞モデルラットを作成し、罹患虚血脳に対して細胞シート移植を行った。細胞シート移植群と対照群を作成し行動解析を行い、細胞シート移植による神経機能の改善の有無を評価した。また、移植後の脳組織における血管新生、神経再生、移植細胞の挙動を組織学的に評価した。細胞シート移植群で対照群と比較して行動解析における神経機能の有意な改善が認められた。細胞シート移植において罹患側の脳表に有意な機能的血管新生が認められた。移植した脂肪由来間葉系幹細胞は移植脳表から罹患脳深部へ遊走し、ホスト脳内の新生血管壁にペリサイトとして生着した。温度応答性培養皿を用いて作成した細胞シートは、scaffoldを用いることなく温度変化のみで細胞シート化が可能である。従来移植方法と異なり、多臓器で細胞がトラップされず、罹患部に直接非侵襲的に移植可能である。脳梗塞モデルに対する間葉系幹細胞シート移植は血管新生と神経再生を有意に誘導し、障害された神経機能を有意に回復させた。2019年3月末の時点で、本研究において当初より予定していた実験内容の施行は計画通りに進められている。現時点までに得られたデータをもとに国内外の学会で発表を行い、現時点での課題や問題点を確認した。また、得られたデータをもとに、国際学術誌へ投稿を行い、2018年9月にJournal of Neurosurgeryに受理された。得られた実験データをもとに結果を考察し、起こった結果に関するメカニズムの更なる究明を行う。今後は、新規データをもとに、学術雑誌への投稿を行う予定である。また、本研究成果で得られた事実を基礎として、基礎実験の拡大、新規疾病への応用拡大を検討していく。我々は、ラット脂肪由来の間葉系幹細胞シートを用いて、脳虚血モデルに対する神経再生に関して検討を行った。また、ASC細胞シート移植により惹起された新生血管はホストの脳内血管と吻合しており、機能血管であることが示唆された。神経再生の観点からも、DCX陽性細胞を染色してみると、細胞シート移植群はVehicleと比較して有意にSVZとSGZにおけるDCX陽性細胞が増加していた。同様に脳表におけるDCX、SOX2陽性細胞を染色し、移植後の脳で神経再生が起こっている可能性を発見した。神経再生、血管新生の半定量的評価、経時的評価として、移植後の脳(細胞シートを含む)を採取し、RT-PCRによる血管関連mRNAや神経再生関連のmRNAの測定を行った。結果として、移植翌日から神経再生や血管新生を誘導するようなmRNAの上昇が認められており、細胞シート移植がそのinitiationを行っている可能性がある。また、慢性期である移植後28日目においてもこれらのmRNAの上昇が有意に認められており、他家移植ではあるものの比較的長期にも治療効果が維持されている可能性があることが分かった。2018年3月末の時点で、本研究において当初より予定していた実験内容の施行は計画通りに進められている。現時点までに得られたデータをもとに国内、国際での学会発表を行い、現時点での課題や問題点を確認した。現在は、不足していると思われる実験データや、得られた結果に対する課題、考察を踏まえて、更に必要な実験データの収集、実験計画の修正などを行っているところである。移植した脂肪

由来間葉系幹細胞は移植脳表から罹患脳深部へ遊走し、ホスト脳内の新生血管壁にペリサイトとして生着した。温度応答性培養皿を用いて作成した細胞シートは、scaffoldを用いることなく温度変化のみで細胞シート化が可能である。従来移植方法と異なり、多臓器で細胞がトラップされず、罹患部に直接非侵襲的に移植可能である。脳梗塞モデルに対する間葉系幹細胞シート移植は血管新生と神経再生を有意に誘導し、障害された神経機能を有意に回復させた。2019年3月末の時点で、本研究において当初より予定していた実験内容の施行は計画通りに進められている。現時点までに得られたデータをもとに国内外の学会で発表を行い、現時点での課題や問題点を確認した。また、得られたデータをもとに、国際学術誌へ投稿を行い、2018年9月にJournal of Neurosurgeryに受理された。得られた実験データをもとに結果を考察し、それらの得られた結果を肯定することができるような追加実験データ、起こった結果に関するメカニズムの究明に関して更なる追加実験を行う。本研究における脳梗塞に対する神経再生能に関して、学会発表を行う。また得られた結果をもとに論文化を進めていく。得られた実験データをもとに結果を考察し、起こった結果に関するメカニズムの更なる究明を行う。今後は、新規データをもとに、学術雑誌への投稿を行う予定である。また、本研究成果で得られた事実を基礎として、基礎実験の拡大、新規疾病への応用拡大を検討していく。支払い請求額を前倒しする必要が無いよう、本年度使用できる範囲での使用計画を立てて研究を行った。その結果、適切な範囲での残額となった。次年度に繰り越し、実験に必要な物品、学会発表費用などにあてることで更なる実験の発展を期待する。
繰り返しによらずに時空間を同時分解する軟X線イメージングスペクトロスコピーの開発

時分割軟X線スペクトロスコピーと2次元空間イメージングを両立させた,「時分割イメージングスペクトロスコピー法」の開発を行った。波長分散した(位置によって波長の異なる)軟X線を試料に照射し,光電子顕微鏡を用いて試料上のそれぞれの位置から放出される電子の2次元強度分布を測定することによって,分光器を掃引することなく,軟X線吸収スペクトルの2次元空間分布を一度に得ることができる。この手法を,大気中であらかじめレーザーを照射したPt/Co/Pt薄膜に適用したところ,レーザースポットの内外で異なる吸収スペクトルが得られ,開発した手法の妥当性が確認できた。軟X線イメージングスペクトロスコピー法を開発するために,以下の研究を実施した。(1)集光光学系の構築2.5:1の縮小率をもつトロイダルミラーを製作し,既存のミラーホルダーと組み合わせることによって,出射スリットの位置において1.5 mm程度の範囲に波長分散した軟X線を,試料位置に500μm程度に集光する光学系を構築した。(2)軟X線イメージングスペクトロスコピーの実証Si基板上に10μm間隔でCuグリッドが描かれたテスト試料に,集光光学系によって集光した波長分散軟X線を照射し,放出される電子を光電子顕微鏡でイメージングすることによって,軟X線イメージングスペクトロスコピーの実証を行った。(1)集光光学系の構築予定通りトロイダルミラーの製作とミラーホルダーへの組み込みが完了し,出射スリット位置における軟X線を試料位置に正しく集光できることが確認された。また,既存のミラーホルダーの調整機構はこの目的に対して十分な精度を有することが確認できた。(2) X線イメージングスペクトロスコピーの実証光電子顕微鏡によって10μm間隔のグリッドが明瞭に観測されるとともに,Cu L吸収端付近の軟X線に対し,Cuグリッドから放出される電子の強度が,吸収端前後で大きく変化することが確認された。軟X線イメージングスペクトルスコピー法の実証実験として,大気中であらかじめレーザーを照射することで,場所によって異なる化学状態になっていることが予想されるPt/Co/Pt薄膜を用いた測定を行った。300μm程度の視野の中に780 eV付近(CoのL吸収端に対応する)で10 eV程度のエネルギー幅を有する波長分散した軟X線を照射し,薄膜上のそれぞれの位置における軟X線の吸収量に比例して放出される電子を,光電子顕微鏡を用いて位置分解して一度に取り込んだ。これによって,軟X線吸収スペクトルを分光器を掃引することなく測定することができる。得られたデータを,レーザースポットの内側と外側,それぞれについて足し合わせ,軟X線のエネルギー(軟X線が鉛直方向に波長分散しているので,試料上の上下方向の位置に対応)に対してプロットすることによって,レーザースポットの内外それぞれに対する軟X線吸収スペクトルを得た。得られたスペクトルは,レーザースポットの外側では典型的なCo金属の特徴を示したのに対し,内側では高エネルギー側に特徴的なサテライト構造が見られ,レーザーによるCoの酸化を強く示唆している。このようなレーザースポットの内外での軟X線スペクトルの違いは,通常の単色光と光電子顕微鏡を用いた位置分解吸収スペクトル測定でも確認され,今回開発した軟X線イメージングスペクトロスコピー法の原理を実証することができた。さらに,この手法を化学反応の時空間同時分析に応用するために,100μm程度のドメイン構造を有することが知られているPdRh合金に対して,PdおよびRhの吸収端近傍で位置分解した軟X線吸収スペクトルの測定を行った。静的なイメージングスペクトルスコピー法の実証に引き続き,最終的な開発目標である時分割測定の実現を目指して,光電子顕微鏡のカメラの高速化を行う。これによって,10 ms以下での連続測定を可能にする。さらに,開発した軟X線時分割イメージングスペクトロスコピー法を表面化学反応の時空間同時観察に応用する。具体的な測定対象としては,Rh上における一酸化窒素(NO)と水素(H2)の反応,もしくはCuの酸化反応を予定している。放射光科学,表面科学トロイダルミラーの製作に予定以上の金額が必要となったが,現有のミラーホルダーがそのまま利用できたことによって,真空部品等の支出が抑えられたのと,打合せ等の旅費が比較的少額で済んだため。実験のための単結晶試料や反応ガス,真空部品の購入に充てる。
アゾラ(アカウキクサ)の交雑と突然変異系統の遺伝・分子生物学的研究

1.オオアカウキクサ(A.japonica Franch et Sav.)は日本固有種と思われる。Azolla属の同定には生殖器官の携帯が重要であるけれど,多くのアゾラはなかなか生殖器官をつくらない。そこで,酵素のアイソザイムやDNAの多型性による化学分類によって日本各地から集めたオオアカウキクサの種別を試みた。平成6年度は三重県と愛知県から集めたものと国際稲研究所のコレクションを用いてRAPD(Random primer Polymorphic DNA)でDNAの相似性を調べた。その結果,本邦産オオアカウキクサには少なくとも2種類のものがあることがわかった。一つはA.filiculoidesに近いもので,もう一つはA.rubraに近かった。兵庫県と自然博物館の鈴木武は我々とは独立にアイソザイム分析をに基づいて本邦産オオアカウキクサには少なくとも2種類があること見つけていた。そこで鈴木武と共同研究を行った。採集株の交換を行い,供試株を増やした。RAPDの分析結果はアイソザイム分析結果と一致し,A.filiculoidesに近いものは,大阪,奈良,京都南部,筑後に分布し,A.rubraに近いものは関東,北陸,山陰,四国に分布していた。2.A.filiculoides大阪株が5月に多数の大小胞子のう果をつけたので,それからF1個体を採取した。その後生存できた約50株についてSKD(shikimic dehydrogenase),PGI(Phosphoglucoisomerase),PCM(Phosphoglucmutase),EST(Esterase)のアイソザイムを調べた。ESTについては親と異なったアイソザイム型を示し,ヘテロ接合体であることが判った。1・本邦産アゾラ...オオアカウキクサ(A.japonica NAKAI)のコレクションのアイソザイムを調べた結果、三重県南部、愛知県南部で採取したものは西日本から採取したものと違いA.filiculoides(ヨーロッパ産)よりA.rubra(New Zealand産)に近いことがわかったので、採集地域をさらにひろげるとともにDNAの分析をRAPD(Random Amplification Polymorchic DNA)法で分析した。これは10くらいの塩基を持つプライマーでDNAをPCRで増殖してから、電気泳動でDNA断片を分け、いろいろなバンドの有無でDNAの相同性を調べる方法である。この結果アイソザイムの分析で示されたと同様に、本邦産A.japonicaにはすくなくとも2の系統があることがわかった。ひとつは関西・九州からのもので、A.filiculoidesに近く、もうひとつは三重県南部、愛知県南部で採取したもので、A.rubraに近い。今後さらに系統を集め、両者の分布を調べる予定である。2・アゾラの突然変異株をうる目的でアゾラのX線照射を行った。3000-4000Rが適当であることがわかった。3の生き残り個体が得られたので、同様な研究行っている大阪府立大学に送って、選択圧をかける予定である。3・A.filiculoidesの自家受粉によるF1世代個体をIRRI(国際稲研究所)より取り寄せた。まずこのDNAのRAPDによる分析をおこなったが、差がなかった。これは取り寄せた株がA.filiculoidesであったことを確認するもので、今後特定の遺伝子DNAの分析で分離比などの検討行う予定である。1.オオアカウキクサ(A.japnica Franch et Sav.)は日本固有種と思われる。Azolla属の同定には生殖器官の形態が重要であるけれど,多くのアゾラはなかなか生殖器官をつくらない。そこで,酵素のアイソザイムやDNAの多型性による化学分類によって日本各地から集めたオオアカウキクサの類別を試みた。平成7年度は三重県と愛知県から集めたものと国際稲研究所のコレクションを用いてRAPD(Random primer Polymorphic DNA)でDNAの相似性を調べた。

一つはA.filiculoidesに近いもので,もう一つはA,rubraに近かった。兵庫県「人と自然博物館」の鈴木武は我々とは独立にアイソザイム分析をに基づいて本邦産オオアカウキクサには少なくとも2種類があること見つけていた。そこで鈴木武と共同研究を行った。採集株の交換を行い,供試株を増やした。RAPDの分析結果はアイソザイム分析結果と一致し,A.filiculoidesに近いものは,大阪,奈良,京都南部,筑後に分布し,A.rubraに近いものは関東,北陸,山陰,四国に分布していた。2.A.filiculoides大阪株が5月に多数の大小胞子のう果をつけたので,それからF1個体を採取した。その後生存できた約50株についてSKD(shikimic dehydrogenase), PGI(Phosphoglucoisomerase), PGM(Phosphoglucmutase), EST(Esterase)のアイソザイムを調べた。ESTについては親と異なったアイソザイム型を示し,ヘテロ接合体であることが判った。
「あかり」近赤外線分光データに基づく氷の変性過程の研究

新しい波長較正を適用して「あかり」IRCの銀河面星生成領域を中心とした近赤外線スペクトルの解析を行った。まずIRCのslit-less分光による銀河面サーベイにより発見された2つの若い天体候補の赤外線スペクトルを詳細に解析した。この結果、H2OおよびCO2氷の吸収線の他に、4.6ミクロン帯にみられる幅広い吸収は、150K程度の一酸化炭素のガスの吸収とXCNと同定される物質の吸収でよく説明されることがわかった。これらの特徴は若い天体に固有のものであるが、一方、Herschel衛星による観測では遠赤外線では放射が検出されておらず、近赤外線から遠赤外線にかけてのエネルギー分布は背景星である可能性を示唆する。この2つの天体が存在する領域には、特に星生成領域は検出されていない一方、深い吸収を示すような濃い星間雲も存在せず、若い星か背景星かを確定するには、さらに高い波長分解脳の観測が必要であるとの結論に達した。これらと並行して、新しい波長較正に基づくスペクトルを用い、銀河面内の複数の星生成領域の氷に吸収バンドの解析を行い、星生成過程の進行とともに、CO2氷がH2O氷と比較して減少していく傾向があることを示す結果を得た。さらに3.3, 3.4ミクロンにみられる、芳香族および脂肪族に起因する輝線バンドと進化の関係を調べ、脂肪族が進化とともに減少している傾向があることも得た。星生成の進行とともに、星間の氷および有機物が変成していくことを観測的に初めて示す結果を得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、まずIRC分光データの波長較正を改善し、より精度の高い波長較正を得たスペクトルの導出を可能とした。これに基づき、「あかり」IRCの銀河面星生成領域を中心とした近赤外線スペクトルの解析を進めた。この中で、Extended Green Object (EGO)と呼ばれる4ミクロン帯に超過放射のある一つの天体の解析を行い、一酸化炭素(CO)の基底振動遷移輝線がこの超過の原因であることを明らかにした。また輝線を生じているガスには水素が少ないことが示めされ、同時にCOの輝線が1000km/sを超える速度で青色偏移していることが示唆された。これらの特徴は超新星残骸Cas Aでみられたスペクトルの特徴と類似しており、この天体が超新星残骸である可能性が示唆される。しかし、当該の領域には電波で超新星残骸の兆候がみられるものの、赤外線の分布には超新星残骸とみられる構造的な特徴はなく、本天体の同定はさらに詳細な観測が必要であると結論づけられた。また「あかり」IRCのslit-less分光による銀河面サーベイにより、2つの若い天体候補を発見した。これらの天体は、H2OおよびCO2氷の吸収線の他に、150K程度の一酸化炭素のガスの吸収とXCNと同定される4.6ミクロンを中心にした幅広い吸収バンドが存在する。現在この天体のスペクトルの詳細解析を進めている。これらの研究と並行して、「あかり」IRCの銀河面星生成領域の近赤外線分光観測データの解析を進め、進化とともに氷の組成が変化している可能性を見出した。現在さらに詳細な解析を進めている。IRC分光データの波長較正を見直し、より精度が高く、信頼性の高い波長較正を導いた。この新しい波長較正に基づいた分光データを基に解析を順調に進めている。この解析の中で、超新星残骸と示唆される天体を見出し、そのスペクトルの詳細解析を行い、学術雑誌に査読論文として発表した。また2つの若い天体候補を発見し、詳細解析を進めている。同時に近赤外線スペクトルの解析も行い、星生成領域の進化に伴い、氷の組成が変化している可能性を見出すなど、今後詳細解析が必要なものの、順調に成果を上げている。

さらに3.3, 3.4ミクロンにみられる、芳香族および脂肪族に起因する輝線バンドと進化の関係を調べ、脂肪族が進化とともに減少している傾向があることも得た。星生成の進行とともに、星間の氷および有機物が変成していくことを観測的に初めて示す結果を得た。若い星候補のIRC近赤外線スペクトルに対して実験室データに基づいた詳細な吸収線のフィットを行い、他の観測データも加えて、その天体が真に若い天体であるかを十分に吟味する。また、星生成領域の近赤外線分光スペクトルのより精密なモデルフィットを進め、これまで示唆されている傾向を定量的に確認する。新しく較正されたより精度の高いスペクトルを用いて、銀河系内星形成領域のIRCスペクトルデータの詳細な解析を進め、氷の変成過程等を定量的に明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
パーキンソン関連疾患のレボドパ治療抵抗性症状に対する磁気刺激治療の開発

パーキンソン病の非薬物治療としての磁気刺激療法に関する研究を行い以下の成果を得た。歩行障害について客観的な測定系を確立し早期の患者さんでもあるパラメータに異常が出ることを発見した。磁気刺激による効果はばらつきが大きいためより効果的な刺激方法を探索を試みた。即ち、単一部位刺激でなく多数部位刺激や、脳の賦活状態を変えて刺激するなど様々な方法を試みたがこれまで以上に効果が出る方法は見出すことができなかった。この原因を探索するためにも磁気刺激で何が刺激され、どのように効果が出るのかという科学的疑問に答えるための研究も行った。その結果、刺激する強度を微調整することでよりよい効果出ることを見出した。本年度はパーキンソン病におけるレボドパ治療抵抗性症状の一つである歩行障害についての生理学的な計測システムの確立を行った。運動障害において歩行障害は一つ重要な臨床指標である。歩行についてより客観的な測定を目指すため歩行解析システムを構築しパーキンソン症候群を呈する患者において試験的に歩行解析を実施した。使用したシステムは圧センサーシート(ウォークWay MW-1000(アニマ社):120 x 480 cm)である。歩行の時間・距離因子の評価のみならず圧計測により設置部位や足圧中心の軌跡も評価可能ある。さらに通常の4倍のサイズのシートを用いることでより長距離での評価(進行方向のブレなど)が可能となる。下図は健康成人とパーキンソン症候群の歩行の差である。パーキンソン症候群ではストライドの減少、歩隔の増加が認められており、歩行障害を定量的に評価することが可能となっている。また磁気刺激効果のメカニズム解明のためコントローラブル経頭蓋磁気刺激装置を用いた基礎的な生理学実験を行った。神経修飾法の一つである連合性対刺激について同装置を用いて探索的に条件検索を行い一次運動野内の異なるシナプス回路がどのように神経可塑性誘導に関わっているか検討している。これにより効果的な神経修飾プロトコール開発のための生理学的基盤が明らかにできると考えている。効果的なプロトコールの開発と、難治性の神経症状の測定方法の確立に関して研究を進めており概ね順調に進行している。本研究ではパーキンソン病・パーキンソン関連疾患におけるレボドパ治療抵抗性症状に対する磁気刺激治療の開発を目的としている。そのためレボトパ治療抵抗性症状などのパーキンソン関連運動脳症状の客観的測定方法の開発、効果的刺激プロトコールの探索、多数部位刺激による効果の検討、磁気刺激効果のメカニズムの解明という4つのアプローチにより研究を行っている。昨年度までにレボドパ治療抵抗性症状の一つである歩行障害の客観的測定方法を確立し発表した(Yozu, Hamada et al, 2017)。また磁気刺激効果のメカニズムの解明の一環として新しい強力な磁気刺激法(QPS)を用いた改善機序を解明するためにQPSによる使用依存的運動学習への効果を検討した。結果はQPS5という運動野興奮性を上昇させる方法では使用依存的運動学習が促通された。多数部位刺激については探索的に行ったものの単部位刺激とくらべ著明な効果を認めなかった。さらにより効果的な刺激プロトコール探索として新しいコントローラブル経頭蓋磁気刺激装置を用いた基礎的な生理学実験により一部の運動学習への経頭蓋磁気刺激による効果は、連合性ペア刺激を用いた場合に限ってコントローラブル刺激装置を用いてもあまりかわらないという結果が得られた。従ってコントローラブル刺激装置による効果は少なくとも使用依存的な運動学習については従来の装置を用いても変わらないことが示された。また国際共同研究としてイギリス・オーストラリアの研究機関とともに磁気刺激効果に関するばらつきの研究を行いBrain stimulation誌に発表した。被験者リクルートを含め概ね順調に進展していると考える。本研究の目的はパーキンソン病・パーキンソン関連疾患におけるレボドパ治療抵抗性症状に対する磁気刺激治療開発である。そのためレボドパ治療抵抗性症状について、パーキンソン病における客観的測定方法の開発、効果的刺激プロトコールの探索、多数部位刺激による効果の検討、磁気刺激治療効果のメカニズム解明という4つのアプローチによる研究を行った。昨年度までに歩行障害の客観的測定方法を確立し、今年度は探索的にパーキンソン病・パーキンソン病関連疾患において同測定系を用いて歩行障害について検討した。その結果、ある課題においてパーキンソン病では比較的早期から歩行パラメータに変化があることが分かった(未発表データ)。これが意味するところの検討は継時的な変化を追うことが必要であるとともに、今回の結果は少数例の検討であり今後も症例を蓄積して検討を進める予定である。多数部位刺激による効果の検討についていくつかの刺激部位の組み合わせで探索的に検討したものの、より強力な効果を得ることはできなかった。効果的刺激プロトコール探索ならびに磁気刺激治療効果メカニズムの解明の一環として、刺激強度が神経修飾法の効果に与える影響を検討し、最適刺激強度が個々人で異なることが判明した(Sasaki et al., Brain Stimulation, 2018)。以上の探索的結果を踏まえ、実際に治療効果が最も得られる刺激法の探索を行い治療応用に向けた基礎的研究を今後も検討するための画期的な示唆が得られた。

即ち、単一部位刺激でなく多数部位刺激や、脳の賦活状態を変えて刺激するなど様々な方法を試みたがこれまで以上に効果が出る方法は見出すことができなかった。この原因を探索するためにも磁気刺激で何が刺激され、どのように効果が出るのかという科学的疑問に答えるための研究も行った。その結果、刺激する強度を微調整することでよりよい効果出ることを見出した。本年度に確立した歩行解析装置を用い、さらに明らかとなった神経修飾の神経生理学的基盤に基づき、今後はパーキンソン病をはじめとする神経疾患患者において神経修飾法による歩行障害への影響を検討する予定である昨年度までに当初予定していたとおりQPSによる運動学習効果があることを確かめた。最終年度は予定通り効果的な刺激プロトコールの探索の一貫としてコントローラブル刺激装置を用いたQPSによる運動学習効果を検討する。また磁気刺激効果のメカニズムの解明の一つとして小脳適応学習および使用依存的学習両者への効果を連合性ペア刺激を用いて検討し磁気刺激による運動学習改善・阻害効果について明らかにする。さらに歩行障害を呈するパーキンソン病患者に対して探索的に刺激を行い歩行パラメタに変化を認めるか検討することを予定している。神経内科当初予定していた解析ソフト購入について他の研究費で賄うことができたため当初予定していた物品費購入について他の研究費で賄うことができたため被験者謝金、消耗品の購入に充てる予定被験者謝金、消耗品購入に充てる予定
臨床応用を目指したエンドセリンの基礎的研究

エンドセリンの小動物(イヌ)循環器疾患における役割を明らかにするために、遺伝子およびペプチドレベルから包括的に解析を行った。1)遺伝子レベルでの解析:エンドセリンの3つのisoform(ET-1、ET-2、ET-3)の全長cDNAをクローニングし塩基配列の決定を行った。その結果、イヌの3つエンドセリンisoformのペプチド構造(アミノ酸配列)はヒトのものと一致した。また、臓器におけるmRNAの発現パターンもヒトのものに類似しており、ET-1は肺でET-2は消化管で高発現が認められた。2)循環器疾患の病態へのエンドセリン(ET-1)の関与:種々の循環器疾患(心臓糸状虫症、僧帽弁逆流、三尖弁逆流、心室中隔欠損症、および動脈管開存症)に罹患した犬の血中ET-1濃度を測定したところ有意に高値を示した。特に心臓糸状虫症罹患犬の血中ET-1濃度は6.9±2.7pg/m1で、健常犬の1.4±0.3pg/mlに比べ約4倍の高値を示した。僧帽弁逆流、三尖弁逆流、心室中隔欠損症、および動脈管開存症罹患犬の血中濃度は、それぞれ、4.9±2.3pg/ml、3.6±0.7pg/ml、4.1±1.5pg/mlおよび2.6±1.Opg/mlであった。血中ET-1濃度が高値を示した心臓糸状虫症罹患犬において、各臓器におけるET-1mRNAの発現解析をReal-time PCR法により行ったところ、肺と心臓において発現量の著しい増加が確認された。ヒトの一部の肺や心疾患において、その病態の増悪に先行して血中ET-1濃度の上昇が観察されている。この上昇は、肺の毛細血管内皮や心筋でのET-1発現量・産生量の増加によるものと考えられており、また、増加したET-1は肺毛細血管壁や心筋壁のリモデリングを惹起させ、病態のさらなる増悪に関与していると考えられている。従って、ヒトの肺や心臓疾患において、血中ET-1濃度は予後判断の1つのマーカーとして有望視されている。今回の研究において、イヌの肺や心疾患においてもヒトと同様にこれらの臓器でのET-1発現量の増加、血中濃度の上昇が認められ、イヌにおいてもET-1の病態への関与が示された。また、血中ET-1濃度がヒトと同様に予後判断マーカーとして用いられる可能性が指摘された。今年度は犬のエンドセリンcDNAのクローニングを5'および3'-RACE PCR法により行った。1)犬エンドセリン-1(ET-1)cDNAクローニングで得られたET-1 cDNAはpoly(A)配列を除き1,935bpであり、202アミノ酸残基から成る前駆体タンパク質をコードする606bpの翻訳領域を含んでいた。この前駆体タンパク質には、ET1領域に加え、endothelin familyの前駆体タンパク質に共通して認められるbig formおよびendothelin-like peptide領域が確認された。

RT-PCR法により臓器におけるPPET2 mRNAの発現解析を行ったところ、検索した十二指腸、結腸、胃、肺、肝臓、脾臓、子宮、卵巣、精巣および腎臓で発現が確認された。2)犬エンドセリン-2(ET2)cDNAクローニングで得られたET-2 cDNAはpoly(A)配列を除き1,195bpであり、178アミノ酸残基から成る前駆体タンパク質をコードする537bpの翻訳領域を含んでいた。この前駆体タンパク質には、ET2領域に加え、endothelin familyの前駆体タンパク質に共通して認められるbig formおよびendothelin-like peptide領域が確認された。RT-PCR法により臓器におけるPPET2 mRNAの発現解析を行ったところ、検索した十二指腸、結腸、胃、肺、肝臓、子宮、卵巣、精巣および腎臓で発現が確認され、脾臓では確認されなかった。犬エンドセリン-3(ET3)cDNAのクローニングについては現在行っている。<イヌにおける検討>1.イヌエンドセリン-3(ET-3)のクローニングイヌET-3の全長cDNAはpoly(A) tailを除き1976bpから構成されていた。コンピューターによる解析からcDNA上には198アミノ酸をコードする594bpのオープンリーディングフレームが確認された。3'非翻訳領域にはmRNAの不安定性に関わるATTTA配列が1コピー存在していた。塩基配列から想定されたET-3前駆体タンパク質上には、ET-3、bigET-3、ET-3 like peptide領域が確認された。イヌET-3前駆体タンパク質のアミノ酸レベルでの相同性は、ヒト、マウスおよびラット間でそれぞれ65.6、59.8および58.8%であった。2.イヌ臓器におけるreal-time PCRによるET mRNA発現量の定量イヌET-3 mRNAの発現は検索したすべての臓器(心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、大腸、小腸、子宮、精巣)で確認された。特に肺では、その他の臓器に比べ101000倍高値を示した。3.イヌ循環器疾患におけるETの役割イヌ心臓糸状虫症に罹患したイヌの各臓器におけるETのmRNA発現量を健康犬のものと比較検討した。ET-2およびET-3では、各臓器おける発現量は健康犬と罹患犬の間に有意な差は認められなかったが、ET-1では心臓と肺で罹患犬が有意に高値を示した。血中ET-1濃度も罹患犬で有意に高値を示した。<ネコにおける検討>1.ネコエンドセリンcDNAのクローニングネコET-1、ET-2のcDNAのクローニングを行い塩基配列からペプチドの構造を検討したところ、ネコET-1ペプチドは他の哺乳動物のET-1ペプチドと比較し1アミノ酸異なっていることが明らかになった(ET-2は同一)。2.腎不全ネコの腎臓におけるETの発現得られた塩基配列の情報を基にプライマーを設計した後、PCR法により腎疾患(慢性腎不全)に罹患したネコの腎臓におけるET-1およびET-2 mRNAの発現レベルを解析し、健康なネコの腎臓での発現と比較した。その結果、慢性腎不全に罹患したネコの腎臓では双方のmRNAの発現が増加していた。ヒトにおいてETは、循環器疾患や腎疾患の病態増悪因子の1つとして考えられているが、今回得られた結果から、ETがイヌやネコの疾患においても同様の役割を果たしている可能性が示された。1)特異性の高い抗エンドセリン抗体の作製と高感度迅速アッセイ系の検討イヌET-1ペプチドのアミノ酸配列はヒトやマウスと同一であることが明らかになっている。