hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
流体の抵抗減少効果を生ずる機能性壁面の創成に関する研究

その結果、表面の螺旋溝の本数が約150本、深さ0.10.2mmのものが最大15%低減する抵抗減少効果が明らかにされた。リブレットの表面と比較するとs^+100となり、それらの領域を越す。今後、その低減のメカニズムを明らかにするため速度分布測定や表面近傍の流れの可視化を行なう必要がある。近年,地球温暖化防止や省エネルギーの観点から流体抵抗低減化が注目されている。流体抵抗は流体とそれが接する固体境界との相互作用であると考えると,流体の物理的性質を変化させるか,固体境界を変化させるかの二つの方法に分類される.さらに,対象とする流れ場は乱流と層流域に分類される.通常工業的に見られる多くの流れは乱流であり,乱流域の抵抗減少効果はその乱れを緩和することによって得られ,それらに対する抵抗減少効果に関しては従来から非常に多くの研究がなされている.しかしながら,層流域のものは非常に少ない.一方,近年のナノ・マイクロ関連技術やマイクロマシンの発達により,流れ場のスケールが非常に小さい流れ場が注目されつつある.そこでは流れは層流であり,その流動抵抗は粘性損失が支配的であり,その抵抗低減を得ることは工学的および工業的に重要な課題となっている.良く知られているように,層流域の流れは乱れがない.それゆえ,抵抗低減を図るためには壁面における流体の滑りを利用することが効果的と言える.本研究は流体の滑りを生じさせ,層流域の流体の抵抗低減を図る新しい流路壁面の創成とその流れ場の様相を明らかにすることを目的として実施したものである.前年度において,層流域の比較的大きな抵抗減少効果を得るためには,表面が高い撥水性表面であることのみでは得られないことが明らかにされたので,今年度は表面をフラクタル構造にして撥水性をもたせることにした.今年度の本研究で得られた研究成果は以下の通りである.(1)シリコン製の供試壁面に感光性樹脂をスピンコートし,約10μm細溝を有する三種類の壁面を創成し,レイノルズ数Reが150770の範囲で,一側面が供試撥水性壁面の正方形管に対する管摩擦係数が最大約13%低減する抵抗減少効果を得た.(2)顕微鏡を用いた壁面近傍の流れの可視化によって,抵抗低減を生じている壁面では気液界面が形成されていることが明らかにされた.(3)安定した気液界面を有する撥水性球周りの流れが実験的及び解析的に明らかにされ,壁面と液体との間にある気液界面が流れに及ぼす影響が明らかにされ,滑りの境界条件や流動モデルが構築された.これらの結果は,層流域における流体の抵抗減少効果に新しい知見を与え,そのメカニズムの解明の一助となると考えられ,さらに今後詳細な研究が期待される.本研究は層流及び遷移域の抵抗低減を生ずる壁面を創成することを目的として実施した.研究対象とした流れ場は内部流である矩形管内流れと外部流の球周りの流れ、そして容器に閉ざされた回転円板回りの流れである.いずれも,実験を中心として見掛けの滑りや境界層特性に基づく抵抗減少効果を明らかにしたが,一方で滑りに対する境界条件の提案や新しい円板摩擦ポンプの試作を行い,これら壁面に関する基礎及び応用展開を図った.その結果は以下のようにまとめられる.(1)一辺が本研究で創成された超はっ水性壁である正方形管の150<Re<770の範囲において,管摩擦係数が最大約13%低減する抵抗減少効果を得た.(2)疎水性表面の球は渦の放出が抑制され,ストローハル数が減少する.また,見掛けのすべりによって,はく離点が後方に移動するため,球に作用する抗力が減少する.最大抵抗減少率はRe=7.2で28.5%であった.(3)固体表面にVOF法を利用して濡れ性を考慮した境界条件を与える手法を提案し,その検証を行った.その結果,気液界面形状や接触角が実験結果とよく一致することから,本手法は濡れ性境界条件を与える手法として有効である.
安定同位体自然存在比を利用した作物のシンク機能・生理ストレスの解析

炭素と窒素の安定同位体である13Cと15Nの存在比は作物体の器官間で異なっている。この差異は水ストレスや窒素欠乏ストレス,また窒素栄養源により大きく変動することが示された。またこれらの変動パターンは遺伝系統や生育時期などの影響を受けることが明らかとなった。安定同位体比の変動は光合成活性や硝酸還元,物質転流・蓄積作用などの生理機能と密接に関連していることが推察された。染色体部分置換系統群のイネを水勾配圃場で栽培し,根系の可塑性を地上部乾物生産への寄与度を定量的に評価した。その結果,根系発育に関わる可塑性程度は,土壌水分によって変化することが示された。また根系の可塑性程度の地上部乾物生産に対する貢献度は土壌水分により変化し,土壌含水率30%前後で最大となった。圃場に生育した4年生のウラルカンゾウの根系を土壌深度別に採取し,グリチルリチン(GL)含有率および15N自然存在比(δ15N)および13C自然存在比(δ13C)を求めた。根におけるδ15Nの分布パターンは主根と分枝根ともに根の土壌深度が深くなるほど高くなる傾向を示した。地上部では果実が最も高く,次いで,茎の順であり,ストロンでは最も低かった。δ13Cの植物体内の変異は少なく,δ15Nとδ13Cとの間には有意な相関が認められなかった。いっぽうGL含有率の根系における分布は,主根では深い部位で高く,これに対して分枝根では浅い部位で高かった。GLとδ15Nの間には根系全体としては相関が認められなかったが,主根と分枝根に分けた相関では主根において正の相関が,これとは反対に分枝根では負の相関が認められた。またGL含有率とδ13Cとの間には主根において正の相関が,分枝根で負の相関が認められた。以上のことから,GLの蓄積とδ15Nおよびδ13Cの間に密接な関係が存在することが示唆された。また主根と分枝根においてそれらの相関関係が異なっていたことは,同じシンクであっても主根と分枝根との間でGL蓄積のメカニズムが異なっている可能性を示している。1.ストレスがイネ体内における安定同位体自然存在比の分布に及ぼす影響について,土壌水分勾配法を用いて調べた。その結果,土壌水分が多い場合では日本晴,カラサスともに器官間のδ13Cの分布に有意な差違は認められず,光合成同化産物の分配に大きな差異はなかった。しかしδ13Cのレベルは全体的にカラサスの方が低く,気孔開度のちがいを反映していた。乾燥条件ではカラサスの穂におけるδ13C値が高くなり,穂への光合成同化産物の転流が阻害されたと推定された。一方日本晴では大きな変化が認められなかった。2.アンモニア栄養ではイネのδ15Nは葉よりも根で高く,硝酸栄養ではこの逆の傾向であった。3.カンゾウ根におけるδ15N濃度は根の先端部ほど高く,基部ほど低い傾向を示した。根のグリチルリチン含有率とδ15Nとの間に正の相関が認められた。以上のことからδ13Cとδ15Nの体内分布はダイナミックに変動し,植物のストレス応答性や物質蓄積機能と密接な関係を持つことが示唆された。生殖成長期のイネの同位体分別比(Δ:N源δ15N-植物δ15N)は硝酸区の2.5mM区で2.64‰,0.5mM区で0.020.12‰であり,アンモニア0.5mM区で2‰,2.5mM区で-1.7-2.1‰であった。アンモニア2.5mM区では負の分別比を示したが,これは植物体からのN流出によるものと推定される。器官間におけるδ15N値の変動幅は,アンモニア区よりも硝酸区で大きく,開花期よりも成熟期で大きかった。アンモニア区の変動幅は2‰以内であった。これは他の報告と同様であり,アンモニア同化が根に局在しているためと考えられる。水ストレスによりアンモニア区で変動幅がやや拡大したが,硝酸区では縮小した。これは活発な硝酸還元作用が器官間のδ15N変動幅の拡大をもたらすことを示唆している。各区を通じて高いδ15N値を示す器官は穂,止葉,葉などであったが,根が茎葉部と比較して常に低い傾向を示すとは限らず,とくに開花期硝酸2.5mM区では有意な差は認められなかった。いっぽう稈基部では処理にかかわらず常に低いδ15N値を示した。これは稈基部がN代謝・転流において特異的な役割を果たしているためと推察された。
覚醒剤の毒性発現に関与する遺伝子の特定と死因究明への応用

覚醒剤の血中濃度が致死濃度に達していないにもかかわらず、他に明確な死因がない場合、死因の判定に苦慮する症例は多い。本研究では、特定の遺伝子の変異・多型あるいは発現量の変化が、覚醒剤の毒性に重要に関与していることを証明し、死因との因果関係を考察する。従来の中毒学的検査等に新たに遺伝学的検査を加えることで、覚醒剤中毒死の死因究明への応用を試みる。
ミトコンドリア内チロシンキナーゼc-Src調節とその生物学的意義に関する研究

ミトコンドリア内c-Src活性の阻害により著明に活性酸素の産生が増加する。c-Src活性維持および活性酸素産生抑制に関与する因子の一つflotillin-1を同定した。一方、c-Src基質であるコハク酸デヒドロゲナーゼAのリン酸化不可変異体をB細胞に発現し、恒常的に高レベルの活性酸素をB細胞内で産生するトランスジェニックマウスを作製した。このマウスにおいては、メスでは正常な液性免疫反応を示したが、オスでは免疫反応が顕著に抑制された。ミトコンドリアは細胞エネルギー生成の大半を担う細胞小器官であり、酸化的リン酸化によるATP合成を行う一方、酸素呼吸に伴って生じる活性酸素種(ROS)や他の代謝生成物の産生し、さらには細胞死因子の放出などを介してさまざまな細胞制御を行っている。本研究では、エネルギー産生効率や活性酸素生成に直接影響を与えるミトコンドリア内c-Srcの調節機構とその意義を明らかにすることを目的とする。以下の2テーマで研究を推進した。当該年度の研究成果を次に示す。テーマ1ミトコンドリア内c-Src活性化メカニズムを明らかにするために、さまざまな条件で培養した細胞よりミトコンドリア分画を調製し、それらより得たc-Src分子複合体を種々の生化学的方法で解析した。その結果、ミトコンドリア内のc-Src活性化機構は細胞質や形質膜における機構とは全く異なること、c-Src活性化に必要な分子が存在することなどが明らかになった。また、細胞質ゾルのシグナル系との連動メカニズムが存在することが判明した。テーマ2c-Src活性低下により発生した酸化ストレスが実際に病態を惹き起こすプロセスを解明するために、c-Srcリン酸化不可変異体(SDHAY215F)をB細胞特異的に発現させた独自のトランスジェニックマウスを作製した。この個体の脾臓細胞では、有意レベルの活性酸素が恒常的に産生されていることを確認した。また同個体においては、抗原刺激に伴う抗体産生能やB細胞活性化能が抑制されており、B細胞受容体のシグナル伝達系が減弱していることを見いだした。B細胞シグナル伝達系の主な分子の発現レベルには顕著な変化は認められなかった。当該年度の研究成果は次の通りである。テーマ11)c-Src複合体のプロテオーム解析:ミトコンドリアに限局してFLAG-c-Srcを発現するRPE細胞より抗FLAG抗体を用いてc-Src複合体を回収した。既報に則り得られたc-Src複合体からプロテオーム解析のためのペプチドサンプルを調製した。このサンプルをMS/MS解析し複合体構成タンパク質を同定すると共に、化学修飾の有無についても詳細に解析した。また、いくつかの異なる条件で培養した細胞を用いて、刺激に伴う複合体の変化を解析した。現在、MS/MS解析を進めている段階である。2)c-Src活性化の再構成:ミトコンドリア内c-Src活性化機構を明らかにするために、まず基質ペプチドを用いてin vitroでc-Src活性を測定した。その結果、正常な条件で培養した細胞のミトコンドリア内ではc-Src活性が常に高いレベルに維持されていることが判明した。現在、その分子基盤についてさらに詳しい解析を行っており、ミトコンドリア特異的なc-Src活性調節機構を明らかにする。テーマ2B細胞受容体シグナル伝達系の解析:c-Srcリン酸化不可変異体(SDHAY215F)をB細胞特異的に発現させた独自のトランスジェニックマウスの解析を詳細に行った。主な解析は、抗体産生能、FACSによる各種B細胞表面マーカーの発現解析、B細胞受容体のシグナル伝達に重様な受容体の自己リン酸化、PLCγ2のリン酸化、細胞内カルシウムイオン濃度の変化、などである。これらの解析により一定レベル以上の成果が得られたと判定できたので、論文を作成し投稿した。研究は全体的に進展していて、ほぼ計画通りの成果をあげている。テーマ1については、培養条件やある種の薬物処理によりミトコンドリア内c-Srcキナーゼの複合体や活性が変化することを見いだしている。再構成系確立テーマについては一部修正し、まずc-Srcキナーゼ活性が高く維持されるメカニズムを解明する。テーマ2については、論文投稿までこぎ着けたので順調に推移しているといえる。当該年度の研究成果1ミトコンドリア内c-Srcの活性制御機構解析:ミトコンドリア内にFLAG-c-Srcを発現するRPE細胞より抗FLAG抗体を用いてc-Src複合体を回収し、既報に則り、c-Src複合体から調製したペプチドをMS/MS解析した。同様に、チタンカラムにより濃縮したリン酸化ペプチドについても解析した。その結果、ミトコンドリア内においては、c-Srcは細胞質とは全く異なる分子機構で活性が維持されていることが判明した。また、各種病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアにおいては、c-Src複合体の構成成分が正常の場合と大きく異なることが明らかになった。現在、ミトコンドリア内c-Src活性を制御する分子基盤についてさらに詳しい解析を行っており、ミトコンドリア特異的なc-Src活性調節機構を明らかにし、早期に結果を公表したい。研究成果2ミトコンドリア内c-Srcの機能解析ーB細胞受容体シグナル伝達系の解析:c-Srcリン酸化不可変異体(SDHAY215F)をB細胞特異的に発現させた独自のトランスジェニックマウスの解析を詳細に行った。SDHAY215F発現

オス個体のB細胞が、正常レベルの3倍程度の活性酸素を恒常的に産生していることを確認し、抗体産生能及び各種B細胞表面マーカーの発現解析を行い、B細胞受容体シグナル伝達系が低下していることを見出した。さらに、活性酸素の増加によりB細胞受容体と共役するCD19分子の発現レベルが有意に低下することを明らかにした。メス由来B細胞ではこれらの変化は観察できなかった。これらの成果をEur J Immunol誌に公表した。ミトコンドリア内c-Src活性の阻害により著明に活性酸素の産生が増加する。c-Src活性維持および活性酸素産生抑制に関与する因子の一つflotillin-1を同定した。一方、c-Src基質であるコハク酸デヒドロゲナーゼAのリン酸化不可変異体をB細胞に発現し、恒常的に高レベルの活性酸素をB細胞内で産生するトランスジェニックマウスを作製した。このマウスにおいては、メスでは正常な液性免疫反応を示したが、オスでは免疫反応が顕著に抑制された。研究は大きな障害もなく順調に進展していて、ほぼ計画通りの成果をあげている。テーマ1については、c-Srcキナーゼ活性を測定する段階をほぼ終了し、プロテオーム解析ができる段階に移っている。さまざまなストレス刺激の中で、細胞あたりのミトコンドリア数に影響を与える刺激があることを確認できたのは有意義であった。テーマ2については、計画を越えた研究進行の状況で、B細胞受容体のシグナル伝達系に異常があることが明らかになった。今のところB細胞の分化発達異常を観察することはできていない。テーマ1c-Src複合体の解析:正常細胞のミトコンドリア内においてc-Src活性が高いレベルに維持される分子基盤を理解する。また、いくつかの異なる条件で培養した細胞を用いたMS/MS解析の結果を総合して、c-Src活性がどのような条件で低下するのかを明らかにする。これらにより、ミトコンドリア特異的なc-Src活性調節機構を明らかにする。また、c-Src活性低下による活性酸素産生の経路を明らかにする。テーマ2B細胞受容体シグナル伝達系の解析:論文を出版する。論文アクセプト後、トランスジェニックマウスの移設または保存方法を検討し、できれば28年度内に完了する。シグナル伝達テーマ11)c-Src複合体のプロテオーム解析:ミトコンドリアに限局して効率よくFLAG-c-Srcを発現する技術を確立することに成功したので、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降法によりc-Src複合体を容易に回収することができ、効率よく解析することができる。2)c-Src活性化の再構成:ミトコンドリア内c-Src活性化に直接関与する分子を同定し、それぞれのリコンビナントタンパク質をin vitroで構成することによりc-Src活性が再現できるかどうかを試みる。これにより、ミトコンドリア特異的なc-Src活性調節機構が存在することを証明する。テーマ2B細胞受容体シグナル伝達系の解析:上記トランスジェニックマウスの脾臓および腹腔洗浄液よりB細胞分画を得る。
ミエリン形成障害を主病変とする神経疾患の分子生物学的研究

本研究の目的:1.マイクロサテライト多型マーカーを利用した連鎖解析を行い、疾患遺伝子のマッピングを行う。2.PLP、P_O、PMP22のいずれかの遺伝子と連鎖していると考えられる家系について、DNAシークエンスを行い、遺伝子異常を明かとする。3.上記の3遺伝子と連鎖していない家系例については、全染色体を対象とした連鎖解析を行い、疾患に連鎖する遺伝子のマッピングを行う。4.新たにマッピングされた遺伝子のクローニングを行い、原因遺伝子を解明する。結果:1)沖縄県に多発する遺伝性運動感覚神経障害家系の原因遺伝子が、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーと連鎖することを明らかにした。2)この8家系20例は、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーの特定のalleleを高率にもっており、この領域での連鎖不平衡が認められた。さらに、DNAマーカーD3S1591の特定のalleleを全例がもっており、本症の創始者効果が示唆された。3)他の家族性の末梢または中枢ミエリン障害を示す例についても、遺伝子連鎖解析を行い、既知の遺伝子座(P_OまたはPMP22)と連鎖する家系および連鎖しない家系を明らかにした。これらの遺伝子座と連鎖しない家系について、新たにマッピングを開始した。本研究の評価:沖縄県に多発する遺伝性運動感覚神経障害の原因遺伝子が、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーと連鎖することを明らかにし、本症が新しい疾患単位であることを臨床的、遺伝学的に示した。今後、原因遺伝子のクローニングを目指したい。また、他の家族性の末梢または中枢ミエリン障害を示す例についても遺伝子連鎖解析を進めており、いくつかの家系例については原因遺伝子座が明らかになりつつある。以上より、本研究は、ミエリン形成障害を示す疾患の原因解明をすすめる上で、非常に有益であったと考えられる。本年度の研究目的(1)ミエリン形成障害を示す19家系90例(罹患者45例、非罹患者45例)の末梢血よりDNAを抽出し、マイクロサテライト多型マーカーを用いて、遺伝子マッピングを行う。(2)PLP、P_0、PMP22の遺伝子との連鎖について検討する。連鎖は認められない場合は、全染色体を対象に連鎖解析を行う。結果PLP、P_0、PMP22の3遺伝子と連鎖していない末梢神経障害を示す大家系例について、全染色体を対象としてマイクロサテライト多型マーカーを利用した連鎖解析を行い、疾患に連鎖する遺伝子のマッピングに成功し、平成7年度の研究計画を達成することが出来た。今後、この遺伝子がマッピングされる領域をさらに絞り込み、positional candidate methodなどの方法を用いて、原因遺伝子のクローニングを目指したい。また、他の家族性の末梢または中枢ミエリン障害を示す例についても、遺伝子連鎖解析を進めている。現時点で解明できる範囲で検討を行った症例については、個別に報告した。本年度の研究の目的:(1)平成7年度の研究にて、末梢神経障害を示す家系例の遺伝子座のマッピンクに成功したが、本年度はその遺伝子座を絞り込み、原因遺伝子のクローニングを目指す。(2)原因遺伝子のクローニングに成功した後、原因蛋白を明かとし、その病態生理を解明する。(3)遺伝子異常が明らかとなっていない家族性の末梢または中枢ミエン障害を示す例の解析を進める。結果:沖縄県に多発する遺伝性運動感覚神経障害の8家系20例について、その原因遺伝子が、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーと連鎖することを明らかにした。この8家系20例は、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーの特定のalleleを高率にもっており、この領域での連鎖不平衡が認められた。

さらに、DNAマーカーD3S1591の特定のalleleを全例がもっており、本症の創始者効果が示唆された。他の家族性の末梢または中枢ミエリン障害を示す例についても、遺伝子連鎖解析を行い、既知の遺伝子座と連鎖する家系および連鎖しない家系を明らかにした。平成8年度の研究の評価:沖縄県に多発する遺伝性運動感覚神経障害の原因遺伝子が、第3染色体セントロメア近傍のDNAマーカーと連鎖することを明らかにしたことは、本症の原因解明のための着実な一歩となった。今後、この遺伝子のクローニングを目指したい。また、他の家族性の末梢または中枢ミエリン障害を示す例についても遺伝子連鎖解析を進めており、いくつかの家系例については原因遺伝子座が明らかになりつつある。以上より、本研究は非常に有益であったと考えられる。
新規p53標的遺伝子の単離とその機能解析

ヒトの癌で最も高頻度に変異が認められる癌抑制遺伝子p53は特異的なDNA配列に結合し、転写活性を制御する転写因子であり、複数の標的遺伝子の発現制御を通して、その生理機能を発揮する。これら標的遺伝子の解析を通して、癌化のメカニズムの解明のみならず、癌の診断や治療へ発展することを最終的な目標とし、研究を行った。我々はcDNAマイクロアレイの技術を用いることにより数万もの遺伝子の発現動態を体系的、網羅的に解析してきた。今回、これまで利用してきた23040遺伝子に加え、新たに機能未知遺伝子を中心に9216遺伝子を配置したcDNAマイクロアレイを利用することにより、これまでのスクリーニングからもれていた新たなp53標的遺伝子群の単離・機能解析を試みた。方法としては、p53を欠失した脳腫瘍細胞株に、アデノウイルスベクターを用いて正常型p53を導入し、遺伝子発現の変化を時系列で調べるものである。その結果、コントロールであるLacZ導入時と比較し、p53によって有意に発現上昇する遺伝子をスクリーニングした。またこのように単離・同定された遺伝子が実際に癌化にどの様に関わっているのかはこれまで充分に解析されていなかった。今回、得られたp53標的候補遺伝子に関して、各癌の臨床検体における網羅的遺伝子発現解析の結果と比較・検討した。種々の癌で発現低下が認められる遺伝子は腫瘍抑制に関係する標的遺伝子群と推測され、p53の腫瘍抑制効果の中心的な役割を担う可能性が高いと思われる。また逆に発現上昇が認められる場合、その遺伝子が、MDM2のようにp53の機能を抑制するように働く結果、細胞の癌化を誘導している可能性も考えられる。このように臨床検体を用いることにより、p53標的遺伝子を機能解析することが、p53の癌化抑制能の解明のみならず、発癌機構の解明、さらには癌の診断・治療へと発展することを期待したい。ヒトの癌の約半数で変異の見られる癌抑制遺伝子p53は、転写因子として機能し、標的遺伝子の発現誘導を介し、細胞周期の停止、アポトーシスの誘導、DNA修復といった様々な機能を発揮することが知られている。従って、p53の全貌解明には個々の標的遺伝子の機能解析が必須である。これら解析が、発癌機構の解明のみならず、癌の診断や治療へ発展することを最終的な目標とする。アンチセンスオリゴによりp53RDL1の発現を抑制すると、p53導入によるアポトーシスを抑制し、また、アデノウイルスを用いたp53RDL1遺伝子導入は、Glioblastoma細胞様に対して顕著にアポトーシスを誘導した。このことから、p53RDL1はp53依存性のアポトーシス誘導に関与する新しい因子であることが推測された。そのメカニズムを解析するために、p53RDL1がレセプターあることに着目した。リガンドを解析することで、p53RDL1の細胞社会における役割を解明するとともに、細胞社会において生死が選択・決定される機序を解析する手段とすることを考えた。リガンドであるNettin-1のリコンビナント蛋白質を作製したところ、p53RDL1とNetrin-1は確かに結合し、その結合はp53依存性アポトーシスを顕著に抑制した。このことは、ラットのUnc5H2がDependence receptorとして機能することと矛盾しないだけでなく、p53が、p53RDL1の発現誘導を介して、細胞の生死のバランスを決定している可能性を示唆するものである。アンチセンスオリゴによりp53RDL1の発現を抑制すると、p53導入によるアポトーシスを抑制し、また、アデノウイルスを用いたp53RDL1遺伝子導入は、Glioblastoma細胞株に対して顕著にアポトーシスを誘導した。また、リガンドであるNetrin-1のリコンビナント蛋白質を作製したところ、p53RDL1とNetrin-1は確かに結合し、その結合はp53依存性アポトーシスを顕著に抑制した。この生死の決定機構を解明するため、リガンドであるNetrin-1の制御機構に関して解析を進めた。さらに新規のp53標的遺伝子を単離するため、cDNAマイクロアレイ法を用いて、p53により発現誘導を受ける遺伝子群を探索中である。

今回、これまで利用してきた23040遺伝子に加え、新たに機能未知遺伝子を中心に9216遺伝子を配置したcDNAマイクロアレイを利用することにより、これまでのスクリーニングからもれていた新たなp53標的遺伝子群の単離・機能解析を試みた。方法としては、p53を欠失した脳腫瘍細胞株に、アデノウイルスベクターを用いて正常型p53を導入し、遺伝子発現の変化を時系列で調べるものである。その結果、コントロールであるLacZ導入時と比較し、p53によって有意に発現上昇する遺伝子をスクリーニングした。またこのように単離・同定された遺伝子が実際に癌化にどの様に関わっているのかはこれまで充分に解析されていなかった。今回、得られたp53標的候補遺伝子に関して、各癌の臨床検体における網羅的遺伝子発現解析の結果と比較・検討した。種々の癌で発現低下が認められる遺伝子は腫瘍抑制に関係する標的遺伝子群と推測され、p53の腫瘍抑制効果の中心的な役割を担う可能性が高いと思われる。また逆に発現上昇が認められる場合、その遺伝子が、MDM2のようにp53の機能を抑制するように働く結果、細胞の癌化を誘導している可能性も考えられる。このように臨床検体を用いることにより、p53標的遺伝子を機能解析することが、p53の癌化抑制能の解明のみならず、発癌機構の解明、さらには癌の診断・治療へと発展することを期待したい。
野菜の消化プロセスで生じる創傷治癒ホルモンによる消化管創傷修復

リゾボスファチジン酸(LPA)は脂質性増殖因子で、創傷治癒に関わるとされる。これまでの研究から、キャベツのような生野菜を食べると、植物ホスホリパーゼDと膵液ボスホリパーゼA2が連続的に働き、消化管でLPAが作られる可能性が見出された。本研究ではこのプロセスで生じるLPAが胃潰瘍に効く可能性について調べた。LPAやLPAを含む野菜の脂質抽出物は胃上皮様HGC-27細胞の運動性を促進した。さらに、胃壁にはボスファチジン酸(PA)をLPAへ消化する細胞外ホスホリパーゼA2が存在する可能性がありPAの摂取が胃潰瘍の形成を抑制する可能性が見出された。抗潰瘍や整腸作用を謳う野菜は高いPA含量やボスホリパーゼD活性を示すものが多いことも判明し、経験的に知られる緑黄色野菜の胃腸への効果にLPAが関与する可能性が示唆された。申請者らは、ある種の野菜が増殖因子様リン脂質・リゾボスファチジン酸(LPA)を多量に含んでいることを見出した。このLPAは創傷治癒に関わることから、LPAを含むあるいはLPA産生をもたらす植物素材から抗潰瘍性食を作ろうと研究を開始した。以下に本年度の研究結果を示す。・ホスホリパーゼD活性を有する食品素材の検索ホスホリパーゼDは天然に豊富に存在するリン酸ジエステル型グリセロリン脂質に作用してホスファチジン酸を作る酵素である。生成するホスファチジン酸は消化管内で消化酵素ホスホリパーゼA2によりLPAへと変換される。従って、この酵素活性が高い植物は抗潰瘍性食の素材候補である。調べた結果、キャベツ、ダイコン、ヨモギ、ニンジンなどに高い活性がみられた。・潰瘍モデル動物の作成0.3規定塩酸/60%エタノールの経口投与でラットの胃潰瘍を作成することができた。今後、この胃潰瘍モデル動物を用いて各種素材の抗潰瘍試験を行う予定である。・培養細胞系を用いた抗潰瘍性試験胃上皮様の3種の培養細胞株を用いて増殖試験、創傷治癒試験およびムチン産生試験を行った。その結果HGC-25細胞が最もよくLPAに応答すること、キャベツ脂質はこの細胞に対して、創傷治癒活性を持つことなどが確認できた。HGC-25細胞とAZ521細胞についてムチン産生試験を行い、LPAはmRNAレベル、蛋白レベルで共にムチンを産生する傾向が観察され、胃粘膜保護の観点から継続してこれを検討する。1.食物の消化に伴うLPAの生成胃は潰瘍の発生しやすい部位である。胃における食物消化の際にリゾホスファチジン酸(LPA)が生成するかどうかを検討した。ラット胃の内腔洗浄液にホスホリパーゼA(PLA)活性が検出された。本酵素活性はホスファチジン酸(PA)をよい基質とした。また、摘出胃中でPAを1時間インキュベートするとその5%程度がLPAに変換され、胃中は有意なLPA濃度となった。以上より、PAを摂取すれば、胃の粘膜層でLPAが生じる可能性が考えられた。2.PA含有食の抗消化管潰瘍効果(モデル動物による検討)大豆レシチンに粗精製したキャベツ由来ホスホリパーゼDを作用させることで、PA含量を2.5%から25%にまで高めることに成功し、グラム単位の反応系を構築した。これにより、モデル動物でPA-rich食の抗潰瘍効果を試験する準備が調った。現在、急性潰瘍における抗潰瘍実験をマウスにて行っている。3.LPAの粘液ゲル分泌効果(培養細胞による検討)胃上皮様HGC-27細胞およびAZ521細胞をLPAで刺激するとムチン産生が誘導されることが蛋白質レベル、mRNAレベルで観察された。この効果については引き続き検討し、LPAが潰瘍治癒だけでなく、胃粘膜防御を促進する可能性を試験する。4.ホスホリパーゼD(PLD)活性の高い食材の検索PA-rich食は胃内にLPAをもたらすため、抗潰瘍候補になりうる。PA含量の高い食材を捜したところ、キャベツだけでなく、トマト、ジャガイモ、里芋が高PA食であった。里芋にはLPAも存在する可能性があった。今後、さらに多くの食材、薬草について試験する予定である。
農林業生産の日韓共通国際的課題に対処する新技術開発に関する研究

本研究は、鳥取大学と韓国忠南大学校との学術交流が主であり、両大学が交互に訪問しあい、研究技術と情報交換を行い、自身の研究の進展に役立てることを目指した。この訪問機関を利用して初年度(1999)と最終年度(2001)に以下のような合同シンポジウムを開催し、何れもプロシーディングを作成した。1999年度シンポジウム名:農業問題における韓日共同研究セッション1(ルームA)環境ストレスと形質転換植物・除草剤解毒代謝と選択性における植物シトクロムP450の役割・グルタチオン還元酵素活性を変えた形質転換タバコの光酸化ストレスと高塩ストレス耐性セッション2(ルームA)植物遺伝学・トウモロコシ側芽と外皮のない茎生成と関連した遺伝子の染色体部位・ライ麦ゲノムに分散した新奇多重遺伝子のクローニングと染色体部位セッション1(ルームB)ストレス生態学と生理学・柳植樹における肥料、クローン、カットサイクル、空間配置の炭素貯蔵の効果・ストレス条件下の杉における花芽形成へのジベレリン、アブシジン酸の生理的影響セッション2(ルームB)農業経済学・有機農業家における最適有機農業システムの研究・日本の農業問題と期待される方向性2001年度シンポジウム名:日韓の農業問題における最新話題セッション1.農業市場・丘陵と山域における第3セクターの管理問題・韓国と日本農業の構造変化の比較調査セッション2.農業機械・パンニンニク植えつけ機の自動操縦、赤外光による運転システムの改善・細菌クローンの検出のバイオロボットの改善セッション3.環境工学・湖山湖の酸素欠乏層生成に関する研究・垂直排出による軟粘土の最終沈着予測法の比較研究セッション4.線虫学と昆虫学・線虫のインシュリン様ペプチド・てんとう虫によるアリマキの生物学的制御戦略の保存と毒性効果本研究は、鳥取大学と韓国忠南大学校との学術交流が主であり、両大学が交互に訪問しあい、研究技術と情報交換を行い、自身の研究の進展に役立てることを目指した。1999年度シンポジウム名:農業問題における韓日共同研究セッション1(ルームA)環境ストレスと形質転換植物・除草剤解毒代謝と選択性における植物シトクロムP450の役割・グルタチオン還元酵素活性を変えた形質転換タバコの光酸化ストレスと高塩ストレス耐性セッション2(ルームA)植物遺伝学・トウモロコシ側芽と外皮のない茎生成と関連した遺伝子の染色体部位・ライ麦ゲノムに分散した新奇多重遺伝子のクローニングと染色体部位セッション1(ルームB)ストレス生態学と生理学・柳植樹における肥料、クローン、カットサイクル、空間配置の炭素貯蔵の効果・ストレス条件下の杉における花芽形成へのジベレリン、アブシジン酸の生理的影響セッション2(ルームB)農業経済学・有機農業家における最適有機農業システムの研究・日本の農業問題と期待される方向性2001年度シンポジウム名:日韓の農業問題における最新話題セッション1.農業市場・丘陵と山域における第3セクターの管理問題・韓国と日本農業の構造変化の比較調査セッション2.農業機械・パンニンニク植えつけ機の自動操縦、赤外光による運転システムの改善・細菌クローンの検出のバイオロボットの改善セッション3.環境工学・湖山湖の酸素欠乏層生成に関する研究・垂直排出による軟粘土の最終沈着予測法の比較研究セッション4.線虫学と昆虫学・線虫のインシュリン様ペプチド・てんとう虫によるアリマキの生物学的制御戦略の保存と毒性効果本研究は鳥取大学農学部と韓国忠南大学校農科大学が日韓に共通する国際的課題について情報・技術を交換し、お互いの研究の進展をはかり、世界の農業生産に貢献することを目指している。そのために、両大学の同一の専門分野の研究者同士がカウンターパートになり、両国で交互にセミナーを開催するとともに、互いの研究室を訪問し、研究技術・情報を交換する。本研究は3年間行われる予定であるが、本年度は鳥取大学から、5人の教官(作野、田中、富田、能美、本間)が忠南大学校を訪問し、セミナー等を行った。予定では、安室が訪韓責任者として参加する予定であったが、都合により、作野が以前から、忠南大学校農科大学と共同研究をしてきたこともあり、代理にその責務を果たした。セミナーの内容は以下のようであった。セクション1.農作物の環境耐性機構と遺伝子工学的品種改良(発表者:下鐘英、田中浄)。セクション2.農作物の優良品種選抜への分子生物学的手法の応用(発表者:李喜鳳、富田因則)。セクション3.大本植物のストレス生理生態学(発表者:権遠、本間環)。セクション4.日韓の農業経済・経営の現状と将来の方向性(発表者:金再洪、能美誠)。セミナー以外にはカウンターパートの研究室を訪問し、研究のアドバイス、今後の共同研究の打ち合わせなどについて討議した。平成12年10月11日から14日まで、鳥取大学農学部から、5人の研究者(田辺賢二、吉田勲、河野強、松村一膳、竹田洋志)が忠南大学を訪問し、忠南大学のカウンターパート(金泰哲、李相祐、権容大、林治換)達と1.土壌の生物学的改良、2.農産物収穫の機械化、3.土壌の水質、管理方法、4.日韓の大規模畑作地帯の経営転換の問題点について、共同研究を実施した。

平成13年度は逆に忠南大学側が鳥取大学を訪問し共同研究、共同シンポジウムを実施することになっている。平成12年11月8日から11日まで、韓国側から5人の研究者(宇永、卞鐘英、朴寛添、金再洪、李喜鳳)が鳥取大学を訪問し、鳥取大学のカウンターパート達(安室喜正、作野友康、田中浄、能美誠、富田因則、本間環)と1.農産物の環境耐性機構と遺伝子工学的な品種改良、2.農作物の分類、優良品種選抜への分子生物学的手法の応用、3.森林と環境保全、4.日韓の今後の農業経営の方向性について、共同研究を実施した。この日韓両グループは平成11年に忠南大学で共同研究、共同シンポジウムをした教官達で、そこでの議論を発展させるための再会であった。共同研究の内容はそれぞれのカウンターパートの研究室を訪問し、研究内容を調査し、研究情報交換、技術のアドバイス、研究データーについてコメントし、将来の研究の方向性について論議することであった。鳥取大学来学2日目に、崔宇永、卞鐘英両氏は鳥取大学農学部において、(1)韓国の農学部の組織再編、(2)韓国における化学物質の生体影響という演題でそれぞれ講演を行ない、鳥取大学農学部教官とそれぞれの演題について、質疑応答を行った。本年度は韓国忠南大学校農科大学から、11月7日から10日まで、5人の教官(崔、宇永、権容大、林治換、李相祐、金泰〓)が訪日し、鳥取大学農学部の関連分野のカウンターパート教官(吉田勲、河野強、松村一善、竹田洋志)と農業問題についてシンポジウム(名称:01日本-韓国共同セミナー日韓の農業研究の最新のトピックスについて)を開催し、以下のような内容で研究情報交換を行った(これらの発表は88ぺージの英文の要旨集にまとめられた。セッション1.農業市場・丘陵と山域における第3セクターの管理問題・韓国と日本農業の構造変化の比較調査セッション2.農業機械・パンニンニク植えつけ機の自動操縦、赤外光による運転システムの改善・細菌クローンの検出のバイオロボットの改善セツション3.環境工学・湖山湖の酸素欠乏層生成に関する研究・垂直排出による軟粘土の最終沈着予測法の比較研究セッション4.線虫学と昆虫学・線虫のインシュリン様ペプチド・てんとう虫によるアリマキの生物学的制御戦略の保存と毒性効果また、来日中に、韓国側の教官は鳥取大学側のカウンターパートの教官の研究室を訪問し、研究技術の実施と交換を行った。
日本語話者と英語話者の質問行為の対照研究

本研究では、質問行為を相手の発話を聞いて反応する「聞く行為」の一部として位置付け、日本語とアメリカ英語の「教師と学生」および「学生同士」の会話における質問行為を分析した。日本人の質問は、教師が学生の話を膨らませるように問いかけるなど、相手との社会的役割関係に応じて用いられるのに対して、アメリカ人の質問は、情報や意見を引き出しあうことで相互の対等性を維持するように発せられる。英語コミュニケーション教育においては、日英語の異なる会話スタイルへの理解を促し、質問など積極的な反応を用意する聞き方を訓練する必要がある。本研究は、「質問行為」を相手の話を聞いて反応する「聞く行為」の一部と位置付けて、日本語と英語の自然談話における質問行為を分析し、日本語と英語の質問の型、及び、インターアクションの型を明らかにすることを目的としている。主な研究実績は以下の通りである。(1) 2013年9月7日、「日本語話者と英語話者の聞き手行動ーミスター・オー・コーパスに基づく一考察」を社会言語科学会第32回研究大会(於信州大学)にて口頭発表。日本語話者と英語話者の聞き手行動を対照分析し、日本人とアメリカ人のインターアクションの型について論じた。(2)2014年3月2日、「日本人とアメリカ人の質問行為ーグローバル人材を育成する英語教育のためにー」を日本英語教育学会第44回年次研究集会(於早稲田大学)にて口頭発表。日本人とアメリカ人の質問行為を分析し、異文化接触場面でなぜ日本人が質問をしないと指摘されるのか、その理由を探った。さらに研究結果を英語コミュニケーション教育に活用することを提案した。(3) 2014年3月、「問いかけ発話に見られる先生と学生の社会的関係ー日英語の対照を通して」を『解放的語用論の挑戦ー文化・インターアクション・言語』(井出祥子・藤井洋子編、くろしお出版、pp.91-121)に執筆。先生・学生ペアによる日・英語会話における問いかけの使用を分析し、観察された異なりについて社会文化的観点から考察した。2014年度は、以下の研究活動を行った。1.日本語と英語の自然談話における質問行為の特徴を、話者の役割認識、及び、自他認識という観点から考察した。Sociolinguistic Symposium 20(2014年6月、フィンランド)、第7回場の言語・コミュニケーション研究会定例会(2014年6月、早稲田大学)、日本認知言語学会第15回全国大会(2014年9月、慶應大学)において研究発表を行った。これらのうち、日本認知言語学会で発表した論文は現在印刷中である。2.質問行為を相手の話を聞いて反応を返す聞く行為の一部として捉え、日本語と英語の自然談話における質問を含む多様な聞き手行動を分析した。2015年3月、聞き手行動についてのワークショップ(「リスナーシップとその役割の諸相をめぐって」(岡山大学))を、若手研究(B)「現代日本社会におけるリスナーシップの役割:世代・ジェンダー・異文化との交差」(課題番号:26770142、研究代表者:難波彩子)との合同で開催し、研究発表を行った。3.質問行為、及び、聞き手行動の日英対照研究から得られた成果を英語コミュニケーション教育に活かす試みとして、日本英語教育学会第45回年次研究集会(2015年3月、早稲田大学)において研究発表を行った。また、2014年3月、同学会研究集会で発表した論文が、2015年3月、日本英語教育学会第44回年次研究集会論文集に掲載された。2015年度は以下の研究活動を行った。(1)質問行為、および、聞き手行動の日英対照研究から得られた成果を英語コミュニケーション教育に活かす試みとして、日本英語学会(2015年11月、関西外国語大学)にてワークショップを開催し、研究発表を行った。(2)日本語と英語の質問行為、および、聞き手行動に見られる特徴を「自他認識」という観点から考察した。日本語用論学会(2015年12月、名古屋大学)にて研究発表を行った。日本語用論会で発表した論文は、現在印刷中である。国内外の学会における研究発表を通じて、「日英語自然談話における質問発話を分析し、日本語と英語の質問行為の型、及び、インターアクションの型を明らかにする」という目的に向けて進展した。特に、質問行為の分析から、日英語話者のインターアクションの型を形成する自他認識、役割認識について議論を発展させたことは大きな成果であった。また、日本英語教育学会における口頭発表、及び、論文集への論文掲載により、研究結果の英語教育への活用についても成果が得られた。社会言語学・語用論1.国内外の語用論・社会言語学分野の学会における研究発表、及び、他の研究者との連携によるワークショップ開催等を通じて、データ分析、考察を進展させる。2.国内外ジャーナルへの投稿を行う。

3.英語教育分野の学会における研究発表、及び論文執筆を行い、研究成果の英語教育への活用を目指す。2014年3月、「問いかけ発話に見られる先生と学生の社会的関係ー日英語の対照を通して」『解放的語用論の挑戦ー文化・インターアクション・言語』を執筆したことは、「日本語と英語の質問の型、及び、インターアクションの型を明らかにする」という研究目的の達成に向けて大きな一歩となった。また、2014年3月、英語教育分野の学会において研究発表を行い、研究成果の英語教育への活用という目標に向けて前進した。26年度以降は、以下の計画を推進する。(1)より妥当な方法論、データ解釈を追究するため、国内外の文献にあたるとともに、研究会や学会での議論を通じて、知見を深める。(2)国内外のジャーナルへの投稿を行う。(3)国内外の学会で研究発表を積極的に行う。社会言語学、語用論の分野のみならず、英語教育分野での研究発表を行い、研究成果の英語教育への活用を目指す。2013年7月、国際語用論学会(インド)における研究発表を予定し、出張費を予算に計上をしていたが、校務により実現しなかった。
気道粘液線毛輸送の攪乱因子となる肺microbiome由来抗原の同定とその制御

肺の微生物叢由来抗原が気道分泌制御不全およびCOPD増悪に及ぼす影響は未解明である。本研究により、Toll様受容体(TLR)のなかでTLR4、TLR5は気道分泌増加、TLR7は気道分泌低下、その他のTLRsは影響がないことが明らかとなった。同時にCOPDにおけるTLR7の発現低下も確認され、ウイルス感染および細菌による二次感染において複数TLRsの制御障害が過分泌と疾患病態の増悪を招く可能性が想定された。本研究成果は、COPD増悪予防の新規治療戦略に寄与し得ると考える。高齢者喘息やCOPD合併喘息などの難治例の存在が喘息死減少を妨げる大きな要因となり、また喀痰の多いCOPD症例では呼吸機能の経年低下が大きく、増悪の頻度を増やし、健康関連QOLを悪化させ、医療費の過剰な消費をもたらす。これらの病態には気道過分泌の持続および粘液線毛運動の破綻が深く関与しており、近年注目される肺微生物叢(microbiome)の質的・量的変化が影響していることが予想されるが詳細は未解明である。申請者らは気道分泌と粘液線毛運動の2つの解析法を用いたアプローチにより、病的に変化する肺microbiomeによって破綻する気道防御調節機構の病態生理の解明を行う。本研究成果により難治性喘息やCOPD増悪頻回例に対する新規治療戦略の基礎を提供することが可能である。今年度は、微生物抗原を認識するToll様受容体(TLR)7シグナルについて、その気道分泌に対する機能解析、気道分泌上皮細胞・分泌腺細胞上での発現および細胞内メカニズムを解析した。ブタ気道粘膜下腺細胞に対して生理的水分分泌を再現するため低濃度アセチルコリン(ACh 30nM)刺激下でパッチクランプ法(Whole cell mode)を適用することで分泌反応をCl-イオン電流量に変換し、TLR7リガンドの効果を確認したところ、細胞内カルシウム濃度([Ca2+]i)低下を伴ってイオン電流を抑制することが分かった。気道粘膜下腺細胞におけるTLR7発現はWestern blotting法およびRT-PCR法を用いてそれぞれ蛋白およびmRNAレベルでの十分な発現を確認した。近年、慢性好酸球性気道炎症を伴う喘息気道粘膜において、TLR7の発現低下および機能不全が病態増悪に寄与することが報告されており、今回明らかとなったTLR7による気道分泌抑制効果は、喘息気道におけるTLR7機能不全が気道過分泌を惹起する可能性を示唆する。以上の研究結果は平成28年4月の日本呼吸器学会総会および同年5月の米国胸部疾患学会国際会議で成果発表予定である。平成27年度の当初の計画であった、TLR7シグナルの気道分泌に対する機能解析、気道分泌上皮細胞・分泌腺細胞上での発現および細胞内メカニズムの解析を行うことができた。細胞内メカニズムとしてFura-2を[Ca2+]i蛍光プローブして検討することもできた。また、気道上皮細胞の線毛輸送運動の観察および周波数、振幅などを観察し定量化が可能な高速度カメラ付き顕微鏡システムを用いて、肺microbiomeに多く含まれると推測されるTLR2, 3, 5, 7の各リガンドによる攪乱効果を予備実験にて確認し、今後更なる研究進展のための基礎も構築できた。COPD増悪は多くの追加治療や入院を要し、医療資源を多く消費しつつ患者の生命予後を悪化させることからその予防は重要である。COPDに対する新規長時間作用性気管支拡張薬がCOPD増悪を軽度減少させるエビデンスが蓄積してきているが、慢性気管支炎や日常的に喀痰の多い症例では、依然として頻回のCOPD増悪を来たし治療に難渋している。コントロール不良の高齢者喘息やこのようなCOPD患者では、ウイルス感染後の気道過分泌が病態増悪に結びつくことが知られている。本研究では、COPD患者のウイルス感染後に、肺微生物叢の質的・量的変化が生じることおよび結果として軌道過分泌が惹起されるとの仮説のもと、気道分泌腺細胞と粘液線毛細胞に対する機能解析を用いて、病的状態で破綻する気道防御調節機構の病態生理の解明を行う。今年度は、微生物抗原を認識するTLR7シグナルについて、気道分泌に対する機能解析、気道分泌上皮細胞・分泌腺細胞上での発現および細胞内メカニズム解析を実施した。2種類のTLR7リガンド(R837, CL264)が、気道粘膜下腺からの生理的水分-電解質分泌を反映する微小イオン電流を抑制すること、その際に細胞内カルシウム濃度の速やかな低下を伴うこと、さらに細胞内小胞体へのカルシウム再取り込みに重要なSERCA2の阻害剤であるThapsigarginによってその抑制効果が消失することを新たに解明した。昨年明らかにした気道分泌腺細胞上でのTLR7の豊富な発現と合わせると、ウイルス感染時にTLR7による機能不全が存在することで遷延する気道過分泌を惹起する可能性が示唆される。以上の研究結果は平成28年4月の日本呼吸器学会総会および同年5月の米国胸部疾患学会国際会議で発表した。本研究をさらに発展させることにより難治性喘息やCOPD増悪頻回例に対する新規治療戦略の基礎を提供することが可能である。平成28年度の当初の計画であった、TLR7シグナルの気道分泌に対する機能解析、気道分泌上皮細胞・分泌腺細胞上での発現および細胞内メカニズムの解析を行うことができた。

細胞内メカニズムとしてFura-2(細胞内Ca2+蛍光プローブ)を用いた詳細な検討が可能となり、またSERCA2に着目した機序を新たに発見できた。すでに実施可能である気道上皮細胞の線毛輸送運動の観察および周波数、振幅などを観察・定量化を高速度カメラ付き顕微鏡システムを用いて行い、本研究の主題である肺microbiomeに多く含まれると推測されるTLR2, 3, 5, 7の各リガンドによる攪乱効果を確認するために、今後更なる研究を発展させる基盤も構築できた。長時間作用性気管支拡張薬の登場によりCOPDの治療成績が向上しつつあるが、慢性気管支炎や日常的に喀痰の多い症例では依然として頻回のCOPD増悪を来たし治療に難渋している。近年、肺にも微生物叢が存在しその量的・質的変化が喘息やCOPDの病態との関連を示唆する報告が相次いでいる。これまで申請者は、気道粘膜下腺細胞にToll様受容体(TLR)システムを利用した即時的な分泌増強作用が存在することを報告してきた。本研究では、COPD患者のウイルス感染後に、肺微生物叢の質的・量的変化が生じ気道過分泌が惹起されるとの仮説のもと、気道分泌腺細胞に対する詳細な機能解析を行い、病的状態で破綻する気道防御調節機構の病態生理の解明を行う。今年度は、微生物抗原を認識するTLR7シグナルの気道分泌に対する機能解析、気道分泌腺細胞上での発現に加えて、細胞内カルシウム調節機序に対する影響を確認した。またCOPD患者気道におけるTLR7発現を定量化し、TLR7シグナルの機能不全の可能性を探った。2種類のTLR7リガンド(R837, CL264)が、細胞内小胞体へのカルシウム再取り込みに重要なSERCA2の機能亢進によって早期に細胞内カルシウム濃度を低下させ得ること、またCOPD気道ではTLR7発現が健常人に比して有意に低下していることを明らかにした。本研究期間全体を通じて、COPDではTLR7による機能不全が存在することでウイルス感染時に遷延する気道過分泌が惹起され、細菌感染などの二次感染を来すことで容易に増悪を発症する可能性が示された。TLR7の機能回復を可能とする新規治療薬の開発によりCOPD増悪予防が可能となり得る。以上の研究結果は平成29年4月の日本呼吸器学会総会および同年5月の米国胸部疾患学会国際会議で発表した。また本研究成果のまとめを英語論文化し、現在欧州生理学雑誌に投稿中である。肺の微生物叢由来抗原が気道分泌制御不全およびCOPD増悪に及ぼす影響は未解明である。本研究により、Toll様受容体(TLR)のなかでTLR4、TLR5は気道分泌増加、TLR7は気道分泌低下、その他のTLRsは影響がないことが明らかとなった。同時にCOPDにおけるTLR7の発現低下も確認され、ウイルス感染および細菌による二次感染において複数TLRsの制御障害が過分泌と疾患病態の増悪を招く可能性が想定された。本研究成果は、COPD増悪予防の新規治療戦略に寄与し得ると考える。TLR7シグナルの気道分泌に対する機能解析、気道分泌上皮細胞・分泌腺細胞上での発現および細胞内メカニズムの解析については概ね当初計画通りに進んだ。しかし、高速度カメラ付き倒立顕微鏡を用いた気道上皮細胞の線毛輸送運動の観察およびTLR2, 3, 5, 7の各リガンドによる攪乱効果については、実施数がまだ少なく統計学的解析を行うのに必要な数を満たしていない。