hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リボソームサブユニット解離機構

リボソームはmRNAコドンの解読が行われる小サブユニットとペプチド結合の形成が行われる大サブユニットからなり、遺伝子の翻訳は両サブユニットがmRNA上で会合することで開始され、翻訳を終えたリボソームは再び各サブユニットへ解離して次の翻訳サイクルへとリサイクルされる。この反応は3因子とGTPの加水分解を必要とする反応であるが、GTPエネルギーの役割及びこの反応の順序について明らかにした。リボソームはmRNAコドンの解読が行われる小サブユニットとペプチド結合の形成が行われる大サブユニットからなり,遺伝子の翻訳は,両サブユニットがmRNA上で会合することで開始され,翻訳を終えたリボソームは再び各サブユニットへ解離して,次の翻訳サイクルへとリサイクルされる。この反応は3つの因子(RRF,EFG,IF3)とGTPの加水分解を必要とする反応であり,GTPエネルギーの役割等に関して以下の点について明らかにした。(1)GTP枯渇による影響にっいて検討するため,解離反応が認められる最低GTP濃度を決定L,このGTP濃度においてRRF/EFGの2因子による解離反応を行った後にIF3を添加することで,GTPエネルギー枯渇時の影響をについて検討を行ったところ,一度2因子により解離したサブユニットがGTP枯渇に伴い再結合していくこと・IF3を加えることでこの再結合が阻害されることが観察された。(2)ショ糖濃度勾配を用いた方法ではこの2因子のみによる反応は認められないが,前述の結果等から、これは解析時にサブユニットが再結合しているためと考えられた。そこでGTPを含む溶液でショ糖濃度勾配を作成して検討を行ったところ,これら2因子における反応でもサブユニットの解離が観察された。(3)実際の細胞内サブユニットの濃度は,上記の反応等で用いている濃度より約20倍高いことが知られている。反応時の基質サブユニットの濃度を細胞内の濃度まで増加させていくと,3因子添加時における解離反応が認められなくなる。一方反応時のGTP濃度を増加させることで,細胞内基質濃度の条件においてもサブユニットへの解離が観察された。リボソームはmRNAコドンの解読が行われる小サブユニットとペプチド結合の形成が行われる大サブユニットからなり、遺伝子の翻訳は両サブユニットがmRNA上で会合することで開始される。翻訳を終えたリボソームの複合体は、再び各サブユニットとmRNAおよびtRNAへ解離して次の翻訳サイクルへとリサイクルされる。この反応は3つの因子(RRF, EFG, IF3)とGTPの加水分解を必要とする反応であるが、その反応順序等に関して以下の点が明らかになった。複合体からのmRNA遊離と各サブユニット解離の反応速度は、反応をある一定時間後に阻害剤で止めた後、その中間産物をショ糖濃度勾配により解析することを繰り返すことで測定可能であった。その結果、これら2反応の速度に差は認められず、このことからmRNA遊離と各サブユニット解離の反応は同時に起こっていることが示唆された。mRNA遊離と各サブユニット解離の反応は、IF3を除く2因子のみでも観察され、IF3はこの系に必須ではないことはこれまですでに明らかとなっていたが、IF3存在下ではmRNA遊離の速度が速くなっていた。また、サブユニット解離反応の基質として、mRNA・tRNAとの複合体とそれらを含まないものとの比較を行ったところ、mRNA・tRNAの存在下でのサブユニット解離反応の方が早かった。ショ糖濃度勾配によりサブユニットそれぞれが出現(解離)する速度を比較したところ、ほぼ同じ速度で検出されてくることが明らかとなり、このことは、上記のmRNA遊離と各サブユニット解離の反応は同時に起こっていることをサポートする結果であった。
X線自由電子レーザーによる超高速ナノ構造解析用検出器

X線自由電子レーザー(XFEL)を利用した構造解析は化学反応、生体分子の反応で重要なフェムト秒スケールの構造変化を追跡できる極めて有力な手法である。しかしながら散乱角の小さな極めて強いX線回折パターンと広角散乱部分の1光子に満たない極めて弱い散乱パターンを同時に、かつXFELの繰り返し周波数と同じフレームレートで高速に撮像する必要がある。これまでは技術的制約からこの目的に合致した検出器は存在しなかった。本計画班では新たに発明した電荷分割方式による高ダイナミックレンジ化を実現した検出器SOPHIASを開発し、この課題の解決に成功した。当該年度はまず試作センサーの詳細評価を実施した。このセンサー利用して、ノイズ、応答性、固定パターンノイズなど詳細解析を実施した。これらの知見にもとづき下期に実用センサーの設計と製造に取り組んだ。本研究の要である信号電荷の分割を実現するためのMulti-Via概念の定量的理解はセンサーの信頼性を担保するために重要である。当該年度で定量的理解を実現するための測定を行った。問題が顕在化する可能性の高い1光子検出機能について調べたところ、Cd線源の1光子を確実に検出できていることを確認することに成功した。また、このセンサーを実際に実験に使用すつためには検出器システムの開発が必要となる。そこで、センサーを高精度に冷却できるアルミニウムナイトライド製の多層セラミックパッケージを製作した。このセラミックパッケージに実際にセンサーを実装し、プラスマイナス0.5度の温度制御が可能であることを確認した。このセンサーパッケージを2個内蔵し、合計380万ピクセルを構成する検出器システムについても前倒し志手開発を実施した。その結果、カメラヘッド、読み出し基板、データ補正基板について開発を終了させることができた。また、XFEL実験で重要となるX線照射耐性についても大量のトランジスタを酵素に評価可能なシステムの構築に成功し、測定結果のデータを格納した可視化webサービスを立ち上げた。このサービスによって新学術領域に参加するすべてのメンバーにX線照射時のトランジスタ損傷に関する基礎情報を提供し、プロセス班(A01)、デバイス班(A02)を中心に損傷の理解と改善策の検討を開始した。当該年度は、本実験用のカメラシステムの構築をまずおこなった。このカメラシステムはセンサ2個を搭載できるシステムで、本実験で要求される低排熱、広帯域データ伝送、データ可視化、データ保存が可能なシステムである。効率的な開発を実施するため、データ可視化、データ保存はSACLA施設で使用している既存のフレームワークを活用した。次に、このカメラシステムの最適化を実施した。特に回路ノイズの低減を図った。上記カメラシステムと平行してセンサ性能の向上研究もおこなった。カメラシステムが低ノイズになると、センサ内のノイズ要因が明確となった。特にピクセル内回路に使用しているソースフォロア回路起因の低周波ノイズ(1/fノイズ)、およびフォトダイオードのアバランシュ高価による信号電荷の増幅由来のノイズが主たる原因であることが判明した。そこで、これらを解決知るためのシミュレーション、およびトランジスタ単体の特性を多数解析し、解決方法を決定した。これら解決方法を適用したセンサを試作したところ、当初目標のシステムノイズ性能200 e-を実現することに成功した。また、本カメラシステムの課題の一つとして、ピクセル単位で全ての回路特性を補正するという問題がある。可視光と異なりX線を用いて補正を行うため、工夫が必要となるが、マイクロフォーカスX線源を用いた補正方法を考案することによりこの課題を解決した。次に、このカメラシステムをSACLAビームラインに設置し、実際にX線自由電子レーザーパルスを照射し性能検証をおこなった。その結果、当初目標の2倍のピーク信号10000光子までを計測できることを実証することに成功した。昨年度はカメラシステムを実際に予備実験に使用し、カメラシステムの完成度を向上させるとともに実際に超高速ダイナミクス研究に展開するための予備実験を行った。本年度は、その結果をもとに下記改良を加えた。1)画像データの前処理プログラムの開発信号電荷はフォトダイオード中で拡散し、複数のピクセルにまたがって観測される。この効果を前処理段階で取り込んだ解析を行わないと、目標としていたデータの統計精度を実現できないことが分かった。そこで、種々の前処理アルゴリズムの性能を評価した。その結果、ドロプレットアルゴリズムが最も適切に前処理を実行できることが分かった。本研究で開発したセンサの場合、このドロプレットアルゴリズムを改良することで理論的限界に近い統計精度を得られることが分かった。さらに、この前処理プログラムをカメラ本体の制御プログラムに導入し、実験中に前処理をリアルタイムに近い速度で実施できる自動化ソフトウェアを整備した。その結果、超高速ダイナミクス研究の一つてある時間分解蛍光X線分析実験の予備実験をSPring-8で行い、実際に必要とされる統計精度が得られるという実験結果を得た。自動化ソフトウェアが並列計算処理で実装できる見通しが立ち、当初計画のFPGAへの実装がふようになった。この結果、より広範囲の実験に迅速に対応できる見通しが立った。また、センサの適用範囲をSPring-8でのミリ秒から秒オーダーの遅いダイナミクス測定にも適用し、従来技術に比べて飛躍的に良いデータが得られることを示すことができた。また領域内のD01斑に提供し、Tender X-ray領域の高分子ダイナミクス実験でもよい成果が得られることが判明した。昨年度は超高速ダイナミクス研究に展開するための予備実験を行った。

本年度は超高速ダイナミクス研究を実際に実施するためのカメラシステムの構築、および最終センサの開発と製造を実施した。1)画像データの前処理プログラムの開発昨年度は、ドロプレットアルゴリズムが最も適切に前処理を実行できることが分かった。本研究で開発したセンサの場合、このドロプレットアルゴリズムを改良することで理論的限界に近い統計精度を得られることが分かった。さらに、この前処理プログラムをカメラ本体の制御プログラムに導入し、実験中に前処理をリアルタイムに近い速度で実施できる自動化ソフトウェアを整備した。本年度はこの計算をリアルタイムに実行するため、各種計算手票補評価を実際に実装して行った。その結果、メモリアクセスパターンの最適化を行うことで、計算時間を12 ms以下に抑制することができ、リアルタイム計算を実現した。1)最終センサの開発と製造信号電荷はフォトダイオード中で拡散し、複数のピクセルにまたがって観測される。この効果を定量的に詳細に調べた。その結果、画素の端部分で電荷が失われていることが判った。これを防ぐためのイオン注入構造を作成しその性能を評価したところ、注入構造が画素領域全体に電気的に接続してしまい、画素領域の一部で動作しなくなる領域ができてしまった。そのため、放射光を用いた定量的な評価実験を行い、この部分についての検討を再度行った。センサの不具合が見つかったため、その原因究明に時間がかかっている。昨年度は超高速ダイナミクス研究に展開するための予備実験を行った。1)画像データの前処理プログラムの開発昨年度開発したデータ処理プログラムを利用して実際にSPring-8での利用実験を開始することができた。超高速ダイナミクス研究ではないが、極小角度散乱などの実験で利用可能となった。当初は、高ダイナミックレンジ性を活用するための補正パラメータ取得に難があり、補正結果の精度が不十分であったが可視光を用いた補正方法を考案することでこの課題を解決した。そのため、放射光を用いた定量的な評価実験を行い、この部分についての検討を昨年度行った。本年度は、引き続き詳細な検討を行いこの部分について一定の結果を得ることができた。その結果を利用して実際に最終センサを製造し、実利用に利用できるカメラシステムに組み込み利用実験を開始することができた。
舌癌の発生と進展におけるSPARCの役割

【目的】SPARC/osteonectinは,分子量43-kDaのmatricellular proteinである.私達はこれまでに腫瘍の悪性化とSPARCの役割について検討してきたところ,SPARCが腎癌細胞の運動性を亢進すること,マウスB16メラノーマ細胞での転移性とSPARC合成が相関すること,VEGFが血管内皮細胞からのSPARC合成を誘導することなどを報告してきた.本助成金により平成13年度は,SPARCノックアウトマウスに形成された腫瘍および,SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞の形質転換細胞の性状を解析し,癌の発生と進展に関して検討した.【結果と考察】インビトロでのDMBA-TPAを用いる形質転換実験では,SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞で形質転換したコロニー形成が高率に観察された.化学発がん(DMBA-TPA)による腫瘍の形成は,SPARCノックアウトマウスにおいて早期に出現したが,SPARCノックアウトマウスにおいて形成された腫瘍は良性の乳頭腫であったのに対してワイルドタイプでは組織学的に悪性化を示していた.SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞では,DMBAによるDNA adduct形成量が多く,この理由はDMBA代謝能や初期の結合能の差に基づくものではなく,DNAの修復能の低下によるものと考えられた.このようにSPARCは,腫瘍の発生と進展において2面性の作用を持つことが示唆された.SPARC/osteonectinは、分子量43000の細胞外基質である。近年、種々の癌細胞においてSPARC発現が亢進していることが報告されている。頭頸部由来の扁平上皮癌細胞株20種についてSPARC mRNA発現をRT-PCR法にて調べたところ、舌癌8株全てに発現が認められた。その他の癌細胞では、喉頭癌1/2例、中咽頭癌2/3例、下咽頭癌0/1例、上顎洞癌1/3例、口腔底癌1/2例にSPARC mRNA発現が認められた。次に、臨床検体29例(舌癌16例、上咽頭癌9例、異形成4例)を用いて、SPARCの発現を免疫組織学的に検索した。舌癌におけるSPARCは、stageI-IIで43%、stageIII-IVで67%であり、特に隣接している血管内皮細胞での陽性率は、stageI-IIで57%、stageIII-IVで、78%と高値を示した。SPARC由来のKGHKモチーフが、血管新生を誘導することが知られていることから、SPARCは血管新生を介して癌の進展に関わると考えられた。そこで、この可能性を立証する為に、SPARCノックアウトマウスを用いて、まず、DMBAとTPAによる皮膚の2段階発癌モデルにより腫瘍を形成させ腫瘍の増殖について比較したところ、形成された腫瘍の体積は、SPARCノックアウトマウスで統計学的に優位に小さかった。一方、血管内皮細胞からのSPARC合成の誘導機構を調べる為、VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1βによる影響を調べたところ、これら4種の因子によってSPARCの合成が上昇することが明かとなった。特に、VEGFは舌癌において比較的合成能が高いことが知られているため舌癌に隣接した血管内皮細胞からのSPARC合成には、VEGFが重要な役割を演じていることが示唆された。さらに高転移性で知られているB16メラノーマとその亜株を用いた検索より、転移性の高いB16-F10細胞やB16-BL6細胞自身においてSPARC発現が高く、B16-F1や親株では、低いことが見い出された。以上のことから舌癌のインビボでの腫瘍の増殖にはSPARCが血管新生のステップで重要な役割を担っていることが示唆され、さらにSPARCの供給源としては、宿主の血管内皮細胞からのSPARC合成を癌細胞が誘導する場合と癌細胞から供給してしまう2つの可能性があることが考えられた。【目的】SPARC/osteonectinは,分子量43-kDaのmatricellular proteinである.私達はこれまでに腫瘍の悪性化とSPARCの役割について検討してきたところ,SPARCが腎癌細胞の運動性を亢進すること,マウスB16メラノーマ細胞での転移性とSPARC合成が相関すること,VEGFが血管内皮細胞からのSPARC合成を誘導することなどを報告してきた.本助成金により平成13年度は,SPARCノックアウトマウスに形成された腫瘍および,SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞の形質転換細胞の性状を解析し,癌の発生と進展に関して検討した.【結果と考察】インビトロでのDMBA-TPAを用いる形質転換実験では,SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞で形質転換したコロニー形成が高率に観察された.化学発がん(DMBA-TPA)による腫瘍の形成は,SPARCノックアウトマウスにおいて早期に出現したが,SPARCノックアウトマウスにおいて形成された腫瘍は良性の乳頭腫であったのに対してワイルドタイプでは組織学的に悪性化を示していた.SPARCノックアウトマウス由来線維芽細胞では,DMBAによるDNA adduct形成量が多く,この理由はDMBA代謝能や初期の結合能の差に基づくものではなく,DNAの修復能の低下によるものと考えられた.このようにSPARCは,腫瘍の発生と進展において2面性の作用を持つことが示唆された.
偏平上皮癌細胞の浸潤転移におけるプロテアーゼの発現様式と細胞外基質環境の影響

角化細胞のturn overや上皮創傷の治癒、あるいは偏平上皮癌の浸潤、転移にはプロテアーゼが関与している。この現象は上皮細胞自身の酵素活性の変異ばかりでなく、間葉細胞のプロテアーゼやその細胞外基質の性状変化が上皮細胞の増殖分化に強く影響をおよぼすことが考えられる。そこで、正常上皮細胞の増殖や分化あるいは癌細胞におけるプロテアーゼ発現は間葉系因子によっていかなる変異を示すかを検討した。正常角化細胞のPAの発現はLNで培養した場合のみ対照群と比較し、その発現が増強された。しかしながら、FN,GEおよびCMで培養した場合ではその発現が強く抑制された。一方、癌細胞ではC4,LMでは発現の促進、FNでは発現抑制を認めたが、CMでは正常角化細胞と違い、発現の抑制を認めた。正常角化細胞のMMPの発現は細胞外基質の性状変化ではその発現に差を認めなかったが、CMではMMP-2,3,9がいずれも強く発現していた。癌細胞ではFNで培養した場合ではMMP-2が、さらにCMで培養した場合では対照群と比較してMMP-2,3,9がいずれも強く発現していた。以上のことより、癌細胞におけるPAおよびMMPの発現態度は細胞外基質の性状が強い関与を示していることが判明し、癌細胞の浸潤、転移には細胞増殖因子の作用と共に、癌細胞周囲の細胞外基質の性状が強く影響されることが示唆された。
新生児糖尿病の分子基盤解明と診断・治療戦略の構築

1.新規に7例の新生児および乳児糖尿病を集積し、分子遺伝学的検討を行った。3例に染色体6q24異常を同定した。その内訳は、1例はpaternal uniparental isodisomy 6 (pUPD6), 1例はsegmentalpUPD6、1例は父由来の6q24 duplicationであった。SegmentalpUPD6はこれまで文献上2例の報告しかなく、新生児一過性糖尿病の病態に寄与する領域の限局化に寄与すると考えられる。また、今回同定した6q24 duplication症例は、父が片アリルの6q24重複を有しているのに対し、患者である子は父の6q24重複アリルがもう一方のアリルと交叉することで、両アリルの6q24が伝達されていた。このような発症機構を示した報告はこれまでになく、臨床上、遺伝カウンセリングの観点からも重要な知見と考えられた。先天性心疾患、精神運動発達遅滞を伴う膵形成不全例において、SNPアレイ解析により、微小重複領域を同定した。本領域には、2つの遺伝子があり、今後遺伝子解析により病態との関連を検討していく。2.原因不明症例についての網羅的遺伝子解析に関して、既知責任遺伝子を含む68遺伝子を搭載したパネルおよび膵β細胞機能に関わる65遺伝子を搭載した2つのパネルを作成した。今後、targeted next generation sequencingを行い、新生児糖尿病の新たな分子基盤を明らかにしていく。3.新生児糖尿病診断指標の確立について、網羅的パネル解析で遺伝学的に新生児糖尿病と確定した症例と、それ以外の未熟児における一過性高血糖について、血糖コントロールマーカーやC-ペプチド、インスリン値、発症時期を検討し、両者を鑑別するカットオフ値の設定を行う。4.原因遺伝子毎の臨床像を明らかにし治療指針を提案するため、予後調査に取り組んでいく。原因不明症例に対する網羅的遺伝子解析については、膵β細胞機能に関連する遺伝子の抽出とそのパネル作成に時間を要した。新生児糖尿病臨床診断基準の作成に関し、対照となる一過性高血糖患者の症例数が不十分であった。新生児糖尿病の予後調査について、現在のフォロー状況の確認に時間を要している。原因不明症例に対し、既知責任遺伝子を含む68遺伝子を搭載したパネルおよび膵β細胞機能に関わる65遺伝子を搭載した2つのパネルを用いて、targeted next generation sequencingを行う。網羅的パネル解析で遺伝学的に新生児糖尿病と確定した症例と、それ以外の未熟児における一過性高血糖について、血糖コントロールマーカーやC-ペプチド、インスリン値、発症時期を検討し、両者を鑑別するカットオフ値の設定を行う。これまで解析を行った症例の予後調査を行い、原因遺伝子毎の臨床像を明らかにし治療指針を提案する。次世代シーケンサー解析が未施行であったため。今後、DNAライブラリー作成および増幅、搭載するチップおよび稼働にそれぞれの試薬類に使用していく。
中赤外域における全固体CW可変波長コヒーレント光源に関する研究

本研究を行うにあたり、次のような実験と解析を行いました2)同調可能な差周波発生の実験とCO2ガスセンシングへの応用差周波発生には擬似位相整合を利用したLiNbO_3(PPLN : Periodically Poled LiNbO_3,グレーティング周期22.58μm)を用いた。Pump光(825-870nm)の波長とPPLN結晶の温度を変化させることで、発生した中赤外光の同調を行った。さらに、可変波長レーザーの波長を変化させ微小同調を行いCO_2の吸収分光測定を行った。可変波長半導体レーザーの波長825865nmの間で変化させて同調を行った結果、PPLN結晶の温度を60120°Cの間で変化させることで、1つのグレーティング周期で3.74.8μmの範囲で中赤外光の同調を行うことができた。また、差周波発生出力をCO_2の吸収線(λ=4.19μm)にあわせることで、大気中のCO_2の吸収スペクトルを確認できた。この研究を行うにあたり、まず予備実験として光ファイバを用いたCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの発振実験を行う。次にCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーと680nmの半導体レーザーをPPLN結晶に混合し、差周波発生による出力を測定する。その後Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザー発振器内部にPPLN結晶を用いて発振実験を行う。本研究では、差周波発生の重要な全固体Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの開発を以下のように行った。3)差周波発生のためPPLNの反転周期について解析を行った。本年得られた結果は以下の通りである。1)Multi-modeファイバー結合励起によるCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの発振が得られた。98%の出力ミラーを用いた時しきい値は225mWとなり、21%のslope効率が得られた。2)Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーのスペクトル幅は0.03cm^<-1>となり、830900nmの広い範囲での同調を確認できた。本研究を行うにあたり、次のような実験と解析を行いました1)光ファイバを用いたCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの同調特性実験と解析Multi-modeファイバー(コア直径62.5μm)結合半導体レーザー(660nm)励起によるCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの同調特性について調べた。同調可能な狭幅域光源のためCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーには回折格子とtuningミラーを組み合わせた外部発振器を用いた。98%反射率の出力ミラーを用いることで820nm900nmまでの同調範囲が得られた。また、理論解析により同調範囲は780nm950nmまで得られることが分かった。実験では得られる同調範囲は、波長に関する出力ミラーの反射特性と発振器と外部発振器のカップリングの影響で決まる。次は、Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザーの同調安定性と再現性を目指し、電気光学プリズム(Lithium Niobateプリズム)を用い電気スイッチングによる新しい同調法を提案した。この方法により、Lithium Niobateプリズムに電界を印加した場合は波長が同調されていることが確認できた。次は、Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザー(820-9OOnm)と半導体レーザー(1020nm)を組み合わせて、発振器外部に22.2μm周期のPPLN結晶(29mm長さ、0.5mm厚み)による同調可能な差周波発生が確認できた。Cr^<3+>:LiSrAlF_6レーザー発振器内部にPPLN結晶を用いた時損失が大きくなってしまい発振が得られなかった。これによりCr^<3+>:LiSrAlF_6レーザー発振器の設計を改善する必要がある。

Pump光(825-870nm)の波長とPPLN結晶の温度を変化させることで、発生した中赤外光の同調を行った。さらに、可変波長レーザーの波長を変化させ微小同調を行いCO_2の吸収分光測定を行った。可変波長半導体レーザーの波長825865nmの間で変化させて同調を行った結果、PPLN結晶の温度を60120°Cの間で変化させることで、1つのグレーティング周期で3.74.8μmの範囲で中赤外光の同調を行うことができた。また、差周波発生出力をCO_2の吸収線(λ=4.19μm)にあわせることで、大気中のCO_2の吸収スペクトルを確認できた。
Chemokineの間脳・下垂体・卵巣系に及ぼす影響

CINCがTiT/GF細胞においてMAP kinaseを刺激するかどうかを、MAP kinase抗体での免疫沈降後MAP kinaseの基質であるMyelin basic proteinへの^<32>Pの取り込みより検討した。TiT/GF細胞においてCINC分泌する事が知られているLPS,TNFとも濃度依存的に、一過性にMAP kinaseを刺激した。さらにLPS,TNFによるCINC分泌、合成にMAP kinase cascadeが関与しているかどうかをMAP kinase cascadeの特異的な阻害剤であるMEK inhibitorを用い検討した。LPS,TNFによるMAP kinase刺激を抑制するMEK inhibitorはLPS,TNFによるCINC分泌、合成を抑制した。この様にTiT/GF細胞におけるLPS,TNFによるCINC分泌、合成にMAP kinase cascadeが関与している事が明らかとなった。またラット下垂体初代培養細胞においてCINCによりMAP kinaseが刺激されるかどうかを検討した。CINCによりMAP kinaseが濃度依存的に、一過性に刺激された。さらにCINCのプロラクチン分泌促進作用はMAP kinase cascadeの特異的な阻害剤であるMEK inhibitorにより抑制された。これらの事よりCINCによるプロラクチン分泌促進作用にもMAP kinase cascadeが関与している事が明らかとなった。本年度は、まず下垂体前葉でのCINCの産生細胞の同定を試みた。既に我々は予備実験にてCINCが正常下垂体前葉で産生されていること、濾胞星状細胞の細胞株(TtT/GF)からCINCが分泌されていることを確認している。そこで、今回免疫組織化学的手法を用いて下垂体前葉細胞を観察したところ、全細胞の約3%にあたる、形態的に濾胞星状細胞に類似した細胞が抗CINC抗体で特異的に染色された。またTtT/GF細胞においても同様に胞体が抗CINC抗体により顆粒状に染色され、CINCの存在が確認された。次にTtT/GF細胞におけるサイトカインによるCINC分泌を検討した。リポポリサッカライド(LPS)及び腫瘍壊死因子(TNF-α)は、CINC分泌を濃度依存性及び時間依存性に促進した。他のサイトカインであるIL1-α、IL1-β、IL3、GCSF、SCF、GMCSFはCINC分泌に特に影響を及ぼさなかった。次に我々はCINCmRNAのCDNAを入手しているので、分子生物学的手法を用いて、CINCmRNAの存在の確認及びサイトカインの影響について検討した。TtT/GF細胞から細胞内RNAを抽出し、CINCmRNAcDNAをプローブとして、ノザンブロット分析を行ったところ、1.1kbに特異的なバンドを検出し、TtT/GF細胞においてCINCmRNAの発現を確認した。次にLPS(10ng/ml)でTtT/GF細胞を3時間共培養したのち細胞内RNAを抽出しノザンブロット分析したところ、コントロールに比べ約2倍にその発現が増加した。LPSはTtT/GF細胞において、CINC合成においても促進的に働くことが確かめられた。本年度は、CINCmRNAのCDNAを入手しているので、分子生物学的手法を用いて、CINCmRNAの存在の確認及びサイトカインの影響について検討した。TiT/GF細胞から細胞内RNAを抽出し、CINCmRNAcDNAをブロープとして、ノザンブロット分析を行ったところ、1.1kbに特異的なバンドを検出し、TiT/GF細胞においてCINCmRNAの発現を確認した。次にLPS(10ng/ml)でTiT/GF細胞を3時間共培養したのち細胞内RNAを抽出しノザンブロット分析したところ、コントロールに比べ約2倍にその発現が増加した。LPSはTiT/GF細胞において、CINC合成においても促進的に働くことが確かめられた。最終年度はCINCの下垂体ホルモン分泌作用に関する細胞内情報伝達機構の詳細について検討を加えたい。既にCINCのプロラクチン分泌促進作用が百日咳毒素及びCキナーゼやチロシンキナーゼ阻害剤で阻止されるという予備実験成績を得ているので、どのようなC蛋白がCINCのシグナル伝達に関与するのか、またどのようなキナーゼの活性化が関与しているのか、免疫沈降、in vitro kinase assayおよびphosphoamino分析その他等分子生物学的手法を用いてシグナル蛋白の同定をしたい。またCINCの細胞内カルシウムの動態に及ぼす影響についても、ジギタル・イメージング・マイクロスコーピック・システムを用いて検討する予定である。

CINCがTiT/GF細胞においてMAP kinaseを刺激するかどうかを、MAPkinase抗体での免疫沈降後MAP kinaseの基質であるMyelinbasis proteinへの^<32>Pの取り込みより検討した。TiT/GF細胞においてCINC分泌する事が知られているLPS,TNFとも濃度依存的に、一過性にMAP kinaseを刺激した。さらにLPS,TNFによるCINC分泌、合成にMAP kinase cascadeが関与しているかどうかをMAP kinase cascadeの特異的な阻害剤であるMEK inhibitorを用い検討した。LPS,TNFによるMAP kinase刺激を抑制するMEK inhibitorはLPS,TNFによるCINC分泌、合成を抑制し丸。この様にTiT/GF細胞におけるLPS,TNFによるCINC分泌、合成にMAP kinasecascadeが関与している事が明らかとなった。またラット下垂体初代培養細胞においてCINCによりMAPkinaseが刺激されるかどうかを検討した。CINCによりMAP kinaseが濃度依存的に、一過性に刺激された。さらにCINCのプロラクチン分泌促進作用はMAP kinase cascadeの特異的な阻害剤であるMEK inhibitorにより抑制された。これらの事よりCINCによるプロラクチン分泌促進作用にもMAPkinasecascadeが関与している事が明らかとなった。
イノシトールリン脂質情報伝達系を介したアディポネクチンの歯周疾患制御機構の解明

イノシトールリン脂質情報伝達系において重要な役割を果たすジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)がアディポネクチン刺激による機能に対して、どのように関与しているのか解析した。その結果アディポネクチン刺激による活性酸素種(ROS)と一酸化窒素(NO)を介するアポトーシスにDGKが関与していること、またアディポネクチン刺激によるIL-6の分泌にDGKが関与していることが明らかとなった。脂肪細胞から分泌される生理活性物質(アディポカイン)の1種であるアディポネクチンの細胞生物学的分子機構を明らかにするため実験を行った。既に申請者らはマウスマクロファージ様細胞(RAW264細胞)において、アディポネクチン刺激により活性酸素種(ROS)と一酸化窒素(NO)を介してアポトーシスを誘導することを明らかにした。さらにアポトーシスを抑制するBcl-2はアディポネクチン刺激により発現が抑制されることを明らかにした。本研究ではイノシトールリン脂質分解産物であるジアシルグリセロールをリン酸化してホスファチジン酸を産生させるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)に注目し、アディポネクチンとの関係を明らかにするため実験を行った。本年度は特にDGKとアディポネクチン誘導アポトーシスとの関係を調べた。その結果、RAW264細胞において、DGK阻害剤前処理によりアディポネクチン誘導ROSとNOの産生が抑制され、またアディポネクチン誘導アポトーシスが抑制された。さらにRAW264細胞において、DGKα,δ,γ,ζをRNA干渉によりそれぞれノックダウンし、その後アディポネクチン刺激を行った。その結果DGKαとDGKγのノックダウンによりアディポネクチン誘導ROSとNOの産生が一部抑制され、アディポネクチン誘導アポトーシスも一部抑制された。さらにDGKαのノックダウンにより、アディポネクチン刺激によるBcl-2の発現低下が部分的に解除された。以上の結果より、アディポネクチン誘導アポトーシスはDGKα,γを介して誘導されていることが示唆された。脂肪細胞から分泌される生理活性物質(アディポカイン)の1種であるアディホネクチンの細胞生物学的分子機構を明らかにするために、精製したリコンビナントマウス球状型アディポネクチンを用いて実験を行った。本研究ではイノシトールリン脂質分解産物であるジアシルグリセロールをリン酸化してボスファチジン酸を産生させるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)に注目し、DGKを介するシグナル伝達とアディポネクチン刺激との関係を解析した。マクロファージにおいて、アディポネクチン刺激によりIL-6を分泌誘導することが報告されている。そこで本年度は特にアディポネクチン刺激によって分泌されるIL-6とDGKとの関係を調べた。その結果、マウスマクロファージ様細胞株(RAW264細胞)において、DGK阻害剤(R59022)前処理によりアディポネクチン刺激によるIL-6mRNAの発現およびタンパク質の分泌が抑制された。つぎにR59022前処理による、アディポネクチン刺激によるシグナル伝達について検討した。その結果、R59022前処理によってアディポネクチン刺激によるC/EBPβおよびAktのリン酸化が抑制された。つぎにRAW264細胞において発現を確認しているDGKアイソフォーム各種(DGKα,δ,γ,ζ)をRNA干渉によりそれぞれノックダウンし、その後アディポネクチン刺激を行った。その結果DGKαをノックダウンした場合でのみアディポネクチン誘導によるIL-6mRNAの発現が抑制されていた。さらにDGKαをノックダウンしアディポネクチン刺激によるIL-6タンパク質の分泌を調べたところ一部抑制されていた。以上の結果から、アディポネクチソ誘導IL-6の産生はDGKαを介して誘導されていることが示唆された。
肺静脈隔離術後早期に出現する心房細動に対する抗不整脈薬の有用性の検討

心房細動に対するカテーテルアブレーション(肺静脈隔離術)後の短期間には,心房性不整脈の一過性再発が良く認められる.我々はアブレーション術後三ヶ月間のフレカイニド少量投与(150または100mg/日)の不整脈抑制効果を前向きに検討した.一次エンドポイントを術後三ヶ月以内に出現し30秒以上続く心房性不整脈とし,患者をアブレーション後に無作為にフレカイニド群(62人)と抗不整脈薬を服用しない対照群(64人)に割り付けた.その結果,一次エンドポイント発生率はそれぞれ37%と41%(P=0.76)で差がなく,術三ヶ月以降の慢性期不整脈再発率も同様であった(21%対25%,P=0.54).心房細動アブレーション後短期間のフレカイニド少量投与は短期および長期の不整脈再発率を軽減しなかった.心房細動に対するカテーテルアブレーション(肺静脈隔離術)後の短期間には,心房性不整脈の一過性再発が良く認められる.我々はアブレーション術後三ヶ月間のフレカイニド少量投与(150または100mg/日)の不整脈抑制効果を前向きに検討した.一次エンドポイントを術後三ヶ月以内に出現し30秒以上続く心房性不整脈とし,患者をアブレーション後に無作為にフレカイニド群(62人)と抗不整脈薬を服用しない対照群(64人)に割り付けた.その結果,一次エンドポイント発生率はそれぞれ37%と41%(P=0.76)で差がなく,術三ヶ月以降の慢性期不整脈再発率も同様であった(21%対25%,P=0.54).心房細動アブレーション後短期間のフレカイニド少量投与は短期および長期の不整脈再発率を軽減しなかった.心房細動に対する経皮的カテーテル心筋焼灼術は高い有効性を示すが、術後一ヶ月間に約50%の症例で一時的再発がみられる。この術後早期心房細動に対して個々の抗不整脈薬の有用性を検討した報告はなく、またこれら急性期の不整脈を抑制することで慢性期心房細動再発率を低下し得るかどうかもまた不明である。我々はこれらを明らかとするためにカテーテルによる肺静脈隔離術後の症例を、(1)偽薬,(2)flecainide,(3)d,1-sotalolに無作為割付けし、各群において術後早期薬物治療期間(3ヶ月間)および慢性期無投薬期間(9ヶ月間)における心房細動再発を評価する前向き試験を計画した。一次エンドポイントは早期薬物治療期間における心房細動出現とし3群間でその比較を行い、この時期の抗不整脈薬投与の有効性を検討。二次エンドポイントは慢性期無投薬期間における心房細動出現とした。これにより有効な抗不整脈薬が判明すれば、心房細動出現に伴う症状の改善や外来受診回数の低減が期待出来、また臨床に直結する抗不整脈薬の新たなエビデンスを提供することができる。今年度の科学研究費補助金交付を受けて、まず院内のInstitutional Review Boardから研究の承認を受けた。その後本研究遂行において最も重要な心房細動発生検知のための携帯型心電計を23台、および心電図保存のためのコンピュータを購入した。これらの研究準備に時間を要し、患者の研究組み入れは予定を4ヶ月遅れた11月から始まったが、現在30人の無作為割り付けが終了している。現時点では結果を解析できる段階ではないが、来年度終了時に100例に到達する予定であり、この時点で中間解析を施行する予定としている。心房細動に対する経皮的カテーテル心筋焼灼術(肺静脈隔離術)は高い有効性を示すが、術後三ヶ月間に約50%の症例で一時的再発がみられる。この術後早期に再発する心房細動に対して個々の抗不整脈薬の有用性を検討した報告はなく、またこれら急性期の不整脈を抑制することで慢性期心房細動再発率を低下し得るかどうかもまた不明である。我々はこれらを明らかとするためにカテーテルによる肺静脈隔離術後の症例を、(1)抗不整脈薬なし,(2)I群抗不整脈薬flecainide,(3)III群抗不整脈薬d,l-sotalolに無作為割付けし、各群において術後早期薬物治療期間(3ヶ月間)および慢性期無投薬期間(9ヶ月間)における心房細動再発を評価する前向き試験を計画した。一次エンドポイントは早期薬物治療期間における心房細動出現とし三群間でその比較を行う。これにより有効な抗不整脈薬が判明すれば、心房細動出現に伴う症状の改善や外来受診回数の低減が期待出来る。初年度に30人の無作為割り付けを行い、今年度はさらに組み入れ患者を増やし、現在110人の組み入れを終了した。しかし本研究はその後の経過観察が必要である。現状では一時エンドポイントを観察する三ヶ月間の早期薬物治療期間終了症例はまだ89名であり、中間解析では三群間で心房細動再発率に統計学的有意差は得られていない。本年9月には約120人の患者において早期薬物治療期間が終了する予定であり、この時点で再度中間解析を施行する方針である。

なお、本研究のために今回科学研究費補助金により購入した携帯心電計26台の詳細な経過観察データから、本研究に組み入れられた対象患者において(1)肺静脈隔離術中のアデノシン三リン酸投与による責任肺静脈同定の有用性や、(2)肥大型心筋症に合併した心房細動に対するアブレーションの有用性などが、明らかになっている。それらは本体研究に先駆けて既に学会発表を終え論文作成段階にはいっている。心房細動に対する経皮的カテーテル心筋焼灼術(肺静脈隔離術)は高い有効性を示すが、術後三ヶ月間に一時的再発が多い。この予防目的でよく抗不整脈薬が投与されるが、その効果を検討した前向き研究はほとんどなく、また急性期の不整脈抑制が慢性期再発率低下に結びつくか否かも不明である。我々は肺静脈隔離術後の症例を、1抗不整脈薬なし, 2フレカイニド150mg/日(体重50kg未満は100mg), 3ソタロール120mg/日に無作為に割付けし、各群において術後早期薬物治療期間(3ヶ月間)および慢性期無投薬期間における心房細動再発を評価する前向き試験を計画した。一次エンドポイントは早期薬物治療期間における不整脈出現とした。初年度における患者組み入れ数が計画を下回ったため、当初の計画通り抗不整脈薬なし群とフレカイニド群の二群で研究を継続した。その結果、2013年2月中旬までに目標症例数を上回る126例の割付にこぎ着けた。現時点で一次エンドポイント発生率はそれぞれ36%と38%で差がなく(P=0.95)、また慢性期の心房細動再発回避率もそれぞれ24%と23%と同様であった(P=0.88)。今回の結果より、心房細動に対する肺静脈隔離後の三ヶ月間に中等量のフレカイニドを投与しても、投与期間中および投与後慢性期の不整脈再発率は低下せず、有益ではないことが判明した。この結果は三月の日本循環器学会学術集会にて英語で発表された。現在論文執筆中である。なお本研究にあたり科学研究費補助金で購入した、携帯心電計、統計解析ソフト、およびパーソナルコンピュータを用いて、本年度も1不整脈合併心不全症例に対する緊急アブレーションの有用性、2肺静脈隔離術後の無石性胆嚢炎発症例の検討、3肺静脈隔離術に左房線上焼灼を追加した場合の有効性などが明らかになっており、特に1は本体研究に先駆けて英語論文が受理されている。本年度の組み入れ患者数は、80例とほぼ研究計画時の予定どおりであったが、初年度は僅か30例であった。この理由は主に院内の治験審査委員会での研究承認や、本研究遂行において最も重要な心房細動発生検知のための携帯型心電計購入に時間を要し、研究開始が遅れたためである。このままの進行状況では、当初の予定での180人の組み入れにはおそらく最終年度いっぱいまでかかってしまう24年度が最終年度であるため、記入しない。いままで以上に患者組み入れを積極的に行って行くが、術後一年間の慢性期無投薬期間の終了を待たず、術後三ヶ月間の早期薬物治療期間のデータを一旦まとめて論文科することを検討している。また、180症例の組み入れ前に治療群間で有意差が出た場合、研究グループに統計専門科も交えて、さらなる組み入れを中止しても結果が変わらないか否かを判定し、変わらないと判断された場合はその時点で結果を論文化する。さらに、今回の補助金で購入した携帯心電計を用いた観察データから、上記のごとく新たな知見が複数得られており、これを積極的に発表、論文科してゆく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
高齢期におけるライフイベントのメンタルヘルスおよび外出頻度への影響に関する研究

2018年4月6月に、秋田県A町(高齢化率42.0%)内のB地区に居住する65歳以上95歳未満の2373人のうち、施設入所者を除く2273人を対象に自記式質問紙調査を実施し、1367人から有効回答を得た(60.1%)。調査は健康推進委員による配布、回収は郵送(一部、保健センター持参及び健康推進委員による回収)によって実施した。性別、年齢、メンタルヘルス(K6)、外出頻度、ネガティブ・ライフイベント5項目(1身近な人を亡くした、2自身の大きな病気やけが、3家族の大きな病気やけが、4経済的に厳しい状況になった、5自身の役割が無くなった)を用いて解析した。メンタルヘルスはK6質問票により測定評価し、9点以上を「抑うつ傾向あり」とした。ネガティブ・ライフイベントとメンタルヘルス、外出頻度との関連についてカイ二乗検定を行なった。分析の結果、最近1年間の身近な人の喪失については、「とても辛く将来に希望を持てない」群は、「辛かったが元気を取り戻しつつある」群、「死を受けとめ、普通の日常生活を送っている」群と比較して、ほぼ毎日外出している割合が低かったものの、統計学的に有意な差は認められなかった。自身の大きな病気やけがについては有意差が認められたが、家族の病気やけが、経済的に厳しい状況になった、役割の喪失については外出頻度と有意差は認められなかった。また、ネガティブ・ライフイベント5項目は全て、メンタルヘルスと有意な関連が認められた(p<0.01)。高齢期のネガティブ・ライフイベントのうち、外出頻度の低下に影響していたのは自身の病気やけがだけでであったが、いずれもメンタルヘルスへの影響が認められた。抑うつ状態やうつ病などの精神障害との関連も含めて、ネガティブ・ライフイベントを経験した高齢者の心理的支援や、閉じこもり予防の支援が重要と考えられる。初年度に行う予定であった調査が本年度の実施となったため、分析および論文化がやや遅れている。ベースライン調査の結果については、横断研究として早急に論文化し、学術雑誌への投稿を行う。最終年度は、フォローアップ調査を計画通りに実施し、縦断研究によってネガティブ・ライフイベント曝露のメンタルヘルスおよび外出頻度への影響について明らかにする。本研究は、高齢期におけるライフイベントの、メンタルヘルスおよび外出頻度に及ぼす影響について、縦断研究によって明らかにし、高齢者の閉じこもり予防、介護予防に活用することを目的とする。初年度は高齢期におけるライフイベントとメンタルヘルスおよび外出頻度との関連を分析する目的で、地域高齢者を対象としたベースライン調査を実施するために、文献調査および調査項目の検討を行った。秋田県山本郡三種町(総人口16,337人,高齢化率42.0%)の山本地区に在住する65歳以上の高齢者約3,000人を調査対象とし、行政保健師と協働で質問紙を用いた悉皆調査の準備を行った。閉じこもりに関する質問項目は、先行研究(新開他:2005;安村,2006)を踏まえた外出の頻度に加え、閉じこもり予備軍も把握するために、「誰かのサポートなしで外出しているかどうか」、「一人で外出することは困難かどうか」の補助的な質問項目を設定した(Orstein et al. 2015)。メンタルヘルスについては、K6質問票日本語版(Kessler psychological distress scale)を用いた。高齢期のライフイベントについては、配偶者や身近な人の喪失・死別の有無、家庭・職場・地域での役割の喪失の有無(全て過去1年以内)とした。また、基本的属性(性別、年齢、要介護認定、家族構成、学歴)、身体的項目として、老研式活動能力指標、現在の体力、心理社会的項目として、主観的健康感、外出に対する自信の程度などを、研究分担者と検討の上で決定した。調査対象者には、調査の目的などを十分に説明する文書を準備し、書面にてインフォームド・コンセントを得ることとした。調査方法は、地域の健康推進員の協力を得て留置回収法により実施することとした(一部、郵送による配布回収)。実際の調査は平成30年4月下旬より実施した。研究代表者の所属が変更になり、そのため、当初予定していた地域において調査を実施することができなくなった。また、調査を10月11月に実施する予定で準備を進めていたが、自治体からの要望により、次年度の健康診断の申込み時期に行うこととしたため、初年度に調査を実施することができなかった。

分析の結果、最近1年間の身近な人の喪失については、「とても辛く将来に希望を持てない」群は、「辛かったが元気を取り戻しつつある」群、「死を受けとめ、普通の日常生活を送っている」群と比較して、ほぼ毎日外出している割合が低かったものの、統計学的に有意な差は認められなかった。自身の大きな病気やけがについては有意差が認められたが、家族の病気やけが、経済的に厳しい状況になった、役割の喪失については外出頻度と有意差は認められなかった。また、ネガティブ・ライフイベント5項目は全て、メンタルヘルスと有意な関連が認められた(p<0.01)。高齢期のネガティブ・ライフイベントのうち、外出頻度の低下に影響していたのは自身の病気やけがだけでであったが、いずれもメンタルヘルスへの影響が認められた。抑うつ状態やうつ病などの精神障害との関連も含めて、ネガティブ・ライフイベントを経験した高齢者の心理的支援や、閉じこもり予防の支援が重要と考えられる。初年度に行う予定であった調査が本年度の実施となったため、分析および論文化がやや遅れている。平成30年5月18日現在、既にベースライン調査は終了し、現在、回収した調査票の入力作業中である。調査で得られたデータを迅速に分析し、外出頻度(閉じこもり)と抑うつとの関連性を検討し、明らかにする。また、外出頻度の低下している者(閉じこもり)に対しては、効果的な外出支援について検討する。ベースライン調査については、まず、横断研究として、研究成果を論文にまとめ、学術誌への投稿を準備する。ベースライン調査の結果については、横断研究として早急に論文化し、学術雑誌への投稿を行う。最終年度は、フォローアップ調査を計画通りに実施し、縦断研究によってネガティブ・ライフイベント曝露のメンタルヘルスおよび外出頻度への影響について明らかにする。研究代表者の所属施設変更及び自治体の要望により、調査の実施が次年度となってしまったため、調査にかかる経費の支出を一部行わなかったために次年度使用額が生じた。次年度に、データ入力会社に入力を委託するため、助成金を使用する予定である。また、調査対象地域の住民に対しては、研究結果をリーフレットにまとめ、結果を還元するする。研究の成果を国内外の学会にて発表し、学術誌への論文投稿を行う。業者に委託したアンケート調査の入力作業費が、想定よりも安価であった。また、調査地域の住民に対して、結果をリーフレットにまとめ配布する予定であったが、広報によって結果を還元した。さらに、予定していた国際学会での成果発表が行えなかったために、次年度使用額が生じた。次年度は、追跡調査を予定しており、調査票等の印刷費、およびデータ入力費、学会誌への論文投稿に係る経費として助成金を使用する予定である。