hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工機能性分子の酵素修飾による蛋白質の細胞内および細胞膜への導入と細胞機能の改変

酵素を用いて蛋白質のC末端特異的に合成分子を修飾し、効率よく細胞膜および細胞質に蛋白質を導入する技術を開発した。PEG脂質を細胞膜上で目的蛋白質に修飾する技術を開発し、この技術を使って癌細胞上に抗体を導入して樹状細胞による癌細胞の貪食効率を向上することに成功した。また、ラジカル発生色素を含む細胞膜透過ペプチドを目的蛋白質に修飾し、光照射によって目的蛋白質を細胞質内へ導入する技術も開発した。蛋白質を自由自在に細胞に導入する技術が整えば、細胞機能の制御がより直接的に設計通りに行え、細胞資源の大量調製プロセスの効率が向上すると考えられる。しかしながら、蛋白質の生理活性を損なうこと無く細胞内に導入し、細胞内の目的の場所で機能させることは、既存の技術では容易ではない。そこで、酵素反応を用いて細胞内導入用合成分子を部位特異的に修飾し、目的蛋白質を失活させずに効率良く細胞内に導入する方法を確立すること、を目的とした研究を行った。近年、蛍光色素を修飾したポリアルギニンペプチドは、細胞内に取り込まれた後に強い励起光を照射すると細胞質に放出されることが報告されている。そこで、ポリアルギニンに蛍光色素を修飾し、ペプチド連結酵素によって連結可能な配列を付加した色素修飾ポリアルギニンを合成した。これをペプチド連結酵素によって蛍光蛋白質(EGFP)のC末端に修飾し、細胞に導入した。その結果、励起光を照射した場合のみ、EGFP蛍光が細胞質全体に拡がり、設計通りに目的蛋白質を細胞質に送達できることが示された。また、この方法は、細胞に与える毒性が低いことも確認した。これより、ペプチド連結酵素によって色素修飾ポリアルギニンを部位特異的に修飾する方法が、蛋白質の活性を損なうこと無く細胞質内に蛋白質を送達する簡便な方法であることが示された。次に、今回開発した技術の応用研究を開始した。iPS細胞関連遺伝子の発現産物である4つの転写因子を細胞外で調製して、今回開発した方法を用いて体細胞の核に導入するという方法に取り組むことにした。ヒト由来のiPS細胞関連転写因子Sox2、Oct4、Klf4、c-Mycの遺伝子を購入し、大腸菌を用いた大量発現・精製系を構築した。研究実施計画に従って、次年度に、これらの転写因子群を上記の方法を用いて体細胞に導入する予定である。蛋白質を自由自在に細胞に導入する技術が整えば、従来の遺伝子導入法よりも直接的に細胞機能が制御でき、細胞資源の大量調製や細胞を用いた治療の効率や安全性が向上すると考えられる。しかし、生理活性を損なうこと無く蛋白質を細胞に導入して目的の場所で機能させることは、既存の技術では容易ではない。そこで、酵素反応を用いて細胞導入用合成分子を部位特異的に修飾し、目的蛋白質を失活させずに効率良く細胞に導入する方法を確立すること、を目的とした研究を行った。本年度は、蛋白質連結酵素sortase A (SrtA)を用いて、蛋白質のC末端特異的にポリエチレングリコール(PEG)-脂質を修飾し、効率よく細胞膜に蛋白質を導入する技術を開発した。まず、緑色蛍光蛋白質(EGFP)のC末端にSrtA認識配列を付与して発現精製し、細胞膜に予め導入しておいたPEG脂質と細胞膜上でSrtAを介した連結反応を行った。その結果、子宮頸癌HeLa細胞の細胞膜上にEGFPを均一に導入することに成功した。この技術を用いて樹状細胞による癌細胞の貪食効率を向上させることを目的とし、抗体Fcドメインを細胞膜上に導入して貪食効率を評価したところ、IgG IIa型のFcドメインを導入した場合のみ、貪食効率が大きく向上した。この結果は、樹状細胞を用いたワクチン療法の効率向上につながる成果であり、現在投稿論文準備中である。また、同様にSrtAを用いて転写因子に細胞質導入分子を修飾し、細胞内への導入を試みた。iPS細胞関連転写因子を不溶性画分に大量発現し、リフォールディングすることによって大量調製した。その際に、モデル蛋白質を用いて、イオン液体や界面活性剤、さらに有機溶媒を組み合わせてリフォールディング収率を向上させる方法を開発した。SrtAを用いてラジカル発生型蛍光色素を付けたポリアルギニンを転写因子に連結し、細胞内への導入を検討した。
核膜へ輸送される細胞膜タンパク質の生理機能の解析: EGFファミリーを例として

乳癌細胞において、EGFファミリー分子amphiregulinの発現は亢進し、乳がんの悪性度とも相関する。しかしEGF受容体を介したシグナル伝達だけでは説明できない点が多い。そこで本研究では核膜局在化したamphiregulinが乳癌細胞において果たす機能を解析した。その結果、核膜局在化したamphiregulinにより、クロマチン構築が制御され、さらにそのシグナルが核膜タンパク質であるLINC complexを介して、細胞遊走能を活性化することが明らかになってきた。上皮増殖因子(EGF)ファミリー総てのメンバーはI型の膜タンパク質として合成され、細胞膜に発現する。そして刺激に応答し、細胞外領域がプロセシングを受けEGF様増殖因子を細胞外へ遊離する(ectodomain shedding)。遊離されたEGF増殖因子はEGF受容体を活性化し細胞内ヘシグナルを伝達する。このよく知られた機能に対して私達は、EGFファミリー分子がある状況下で、細胞膜から核膜へと局在変化すること、そして核膜において転写制御に関与することを明らかにした。そこで、その核膜局在化したEGFファミリー分子の生理的機能を明らかにするため、本研究を開始した。EGFファミリー分子であるamphiregulinは悪性度の高い乳がんにおいて発現が亢進していることが知られている。そこで、刺激非存在下において核膜へ局在化し転写を抑制するamphiregulin変異体を作成し、核膜局在化amphiregulinの機能を解析することにした。乳がん培養細胞株のamphiregulinの発現量を探り、発現量が低い株にamphiregulin変異体を強制発現させたところ、ゲノムワイドなヒストン修飾の変化および転写抑制がおこり、mRNA発現プロファイルの変化は観察されないにも関わらず、胞増殖が抑制され、細胞遊走能が亢進することが明らかになった。現在、核膜局在化したamphiregulinによる転写抑制、ヒストン修飾変化および、細胞運動能の亢進がどのような分子メカニズムにより引き起こされているのか、細胞骨格の変化を含めて探っているところである。私達は上皮増殖因子(EGF)ファミリーのHE-EGFおよびamphiregulinがある状況下で、細胞膜から核膜へと局在変化することを見出したため、核膜局在化したEGFファミリー分子の生理的機能を明らかにすることを目的として、本研究を行ってきた。昨年度までに、EGFファミリー分子amphiregulinが核膜に局在化することにより、ゲノムワイドにヒストンH3の9番目のリジンのメチル化(H3K9me3)が亢進すること、そしてさらに同時に遊走能が亢進することを見出していた。そこで今年度は、核膜局在化amphiregulhがどのように、細胞運動能を制御しえるのか、その分子メカニズムを探ろた。その結果、Boyden chamberassayおよび、wound healing assayにおいて、(1)H3K9のメチル化を誘導することにより細胞遊走が活性化されること、(2)H3K9のメチル化を阻害することにより細胞遊走が抑えられることを見出した。また、運動方向に対するゴルジ体の位置を指標として細胞極性を調べたところ、H3K9のメチル化酵素を阻害することにより、細胞運動に必須な細胞極性形成ができなくなることを見いだした。これらのことは、クロマチン構造変化そのものが、細胞遊走を制御していることを示すものでる。これは、これまでに報告のない、新規の細胞運動の制御機構であると考えられ、細胞生物学的に非常に意義が大きい。高等真核生物では細胞膜を介して細胞間の情報交換を行い個体の恒常性を維持している。細胞外より受け取った情報は多くの場合、遺伝情報発現の場である核へと伝えられる。私は、ある状況下において細胞膜に発現する膜貫通型増殖因子が、小胞輸送により核膜へ輸送されることを明らかにしてきた。細胞にとって外界との接点である細胞膜に存在する分子と、核との間にコミュニケーションが存在するという考えは生理的あるいは病理的な種々の現象に大きな意義を持っている。そこで核膜へ輸送される細胞膜タンパク質が、核膜において担っている機能を明らかにすることを目的として本研究を行ってきた。昨年度までに、EGFファミリー分子amphiregulinの核膜局在化により、ゲノムワイドにヒストンH3の9番目のリジンのメチル化(H3K9me3)が亢進すること、そしてさらに同時に遊走能が亢進すること、H3K9のメチル化に依存した細胞遊走調節が存在することを見出していた。そこで、今年度は、クロマチン構造変化による細胞運動調節の分子メカニズムを探った。その結果、クロマチン構造変化に応答して、ゴルジ体構造が制御されていること、その制御には核膜タンパク質SUNとnesprin (LINC complex)が関与していることを見出した。さらに、SUNタンパク質に結合するゴルジ体関連タンパク質を見出しており、これら複合体形成が、クロマチン構造により調節されていることが示唆される。

これらの結果は、これまで、細胞質の情報を核内に伝達すると考えられていた、LINC complexが、クロマチンシグナリングを細胞質に伝えていることを示唆しており、非常に興味深いものである。
計算幾何学における曲線・局面の解析的処理理論の萌芽

本研究の目的は、解析的曲線を取り扱える枠組みを計算幾何学に取り入れ、複雑度解析の理論と技法を作る事である。科学研究費の交付期間には、複数のテーマに関して、解析的曲線を扱う問題の解析と取り扱いを示し、国際学会での発表を通して研究の意義を啓蒙し、数学と計算理論からなる国内外での研究グループを設立することを目的とする。具体的には、中立地帯のあるボロノイ図(ゾーン図と命名する)で生じる解析曲線の計算複雑度解析、角度ボロノイ図で生じる解析曲線の性質の解析、最小周長重ね合わせで生じる非線形空間でのパラメタ制御などでの解析手法の研究と系統的な取り扱いを手がかりに、解析的手法を導入した計算幾何学の学問分野開拓を行う。本年度においては、京都において10人の招待講演者からなる国際ワークショップを開催した。さらにチェコ国カレル大学Matousek教授、トロント大学河村氏、中央大学今井桂子教授と共に共同研究を進め昨年度までの三等分線のK等分線への拡張、一般の次元での一般の物体の集合におけるゾーン図の存在の証明を達成した。河村氏の招聘およびワークショップ招待講演者謝金には本研究費を利用した。さらに、JAIST浅野教授、京都大学加藤教授、明治大学玉木教授との共同研究を行い、論文発表を行った。また、このテーマに関して講演やスクールなどでの啓蒙を行い、新たな学問の萌芽を成功させた。具体的には、中立地帯のあるボロノイ図(ゾーン図)で生じる解析曲線の計算複雑度解析、角度ボロノイ図で生じる解析曲線の性質の解析、最小周長重ね合わせで生じる非線形空間でのパラメタ制御などでの解析手法の研究と系統的な取り扱いを手がかりに、解析的手法を導入した計算幾何学の学問分野開拓を行う。平成18年度には基礎理論の展開を行い、格式ある国際学会での研究発表をいった。萌芽研究の費用を利用してJAIST浅野哲夫教授とチェコ国チャールス大学マトウセク教授との共同研究を行い、多くの進展を得た。具体的には、ゾーン図を描く時の基本コンポーネントとなる、2点間を3等分する曲線対の存在と一意性を示し、また解析的な性質を用いて、描画アルゴリズムの一次収束性を示した。また、ゾーン図の存在と一意性、その基本性質を示し、格式のある国際会議であるACM STOC, ACM-SIAM SODAで発表を行った。さらに日本OR学界RAMPシンポジウムでは、招待講演を行い、本萌芽テーマについての理論の概略を紹介した。具体的には、中立地帯のあるボロノイ図で生じる解析曲線の計算複雑度解析、角度ボロノイ図で生じる解析曲線の性質の解析、最小周長重ね合わせで生じる非線形空間でのパラメタ制御などでの解析手法の研究と系統的な取り扱いを手がかりに、解析的手法を導入した計算幾何学の学問分野開拓を行う。平成19年度には、基礎理論の拡張を行い、格式ある国際誌への2本の論文の採録があり、また、2件の国際会議論文を発表した。国内外での本研究テーマの関連研究も現れ、萌芽に成功しつつある。
皮膚悪性腫瘍の動物モデルの開発と遠隔転移機構に関する遺伝子工学的解析

1.各種皮膚腫瘍マウスの確立(1)BALB/C由来皮膚扁平上皮細胞株Pam212より、強い腫瘍原性を持つ亜株Pam-T株を樹立した。Pam-T株は、周囲組識への浸潤能が強く、担癌マウスに癌性腹膜炎を発症させ、100%致死効果を示した。(2)紫外線誘発マウスCB6F1(nu/nu(Balb/c×C57BL/6-nu/nu)腫瘍塊より、線維肉腫株とF-2と名づけた血管内皮細胞株を樹立した。F-2は、ヌードマウスの皮下に接種すると、急速に拡大しながら、ホストマウスを数週間以内に100%出血死せしめた。2.扁平上皮細胞癌株Pam-Tへのγ-IFN遺伝子の移入効果。Pam-T細胞にγ-IFNを発現したレトロウィルスを感染させ、γ-IFN産生株を樹立した。Invitroの増殖能や形態的性状は、コントロール株と差異はなかったが、担癌マウスの生存期間は、コントロール株を接種したマウスに比して、有意に延長した。病理組織学的に、γ-IFN産生腫瘍株がコントロールに比して周囲への浸潤能が抑制されていること、また。γ-IFNは、Pam-T細胞のフィブロネクチン接着能を特異的に増強されることが分ったので、γ-IFNは腫瘍細胞のインテグリン発現あるいは、機能に直接影響を与え、抗腫瘍効果を有することが示唆された。3.F-2誘導血管腫に対するリコンビナンとIL-2の抗腫瘍効果。F-2腫瘍担癌ヌードマウスにγIL-2を全身投与することにより、腫瘍の明らかな退縮傾向と、宿主の生存を認めた。またF-2腫瘍担癌CB6F1(Balb/c×C57BL/6)の移植実験においても、ヌードマウスの場合と同様に、γIL-2-投与群において有意な腫瘍形成の抑制と生存率の増加が観察された。これは、悪性血管腫瘍動物モデルを用いて、γIL-2の腫瘍抑制効果を検討した最初の試みである。1.悪性血管内皮細胞株Fー2の樹立紫外線誘発マウス(BALB/CxC57BL/6ーF1)腫瘍塊より、血管内皮細胞株Fー2のクロ-ン化に成功した。Fー2は、血管内皮細胞としての形態的特質(cobblestone appearance,アセチル化LDLの取り込み、GSAー1 binding,など)をinvitroにおいて、保持し、かつ、ヌ-ドマウスの皮下に接種すると、血管腫瘍を形成する全く新しい腫瘍原性株である。2.Fー2誘発血管腫瘍の性状Fー2はヌ-ドマウスの皮下に接種すると、血管内皮細胞腫を形成し、腫瘍は急速に拡大しながら、ホストマウスを、数週間以内に体内外への出血により死に至らせるという点からFー2の悪性度は強いと考えられ、悪性血管内皮細胞腫の動物モデルを供し得る。3.Fー2腫瘍に対するILー2の影響ILー2の悪性血管内皮細胞腫(MHE)に対する有用性は、よく知られている。Fー2は、有胸腺マウスに接種すると、最終的に誘発腫瘍は拒絶されるが、それまでの期間が、ILー2投与により有意に短縮されたことより、このモデルは、ILー2のMHEに対する臨床的有用性の機序解明にも有用である。

4.皮膚扁平上皮癌細胞株PAMーTを樹立BALB/c由来皮膚扁平上皮細胞株PAM212より、強い腫瘍原性を持つ亜株PAMーT株を樹立した。PAMーTは周囲への浸潤性が強く、ホストマウスを腹膜炎にて死亡させることより、PAMーTは皮膚扁平上皮癌動物モデルを提供すると考えられる。5.今年度は血管内皮細胞株Fー2と皮膚扁平上皮細胞株PAMーTの新たなる樹立とこれら両株による悪性血管内皮細胞腫と皮膚扁平上皮癌の動物モデルの作成に成功した。次年度はこれら腫瘍株のさらなる特性の解明及び動物モデルを用いた発癌制御機構の解析を開始する。ヌ-ドマウスCB6F1nu/nu(BALB/cxC57BL/6ーnu/nu)及び、C3H、BALB/c,C57BL/6などのマウスの剃毛部皮膚に中波長紫外線UVBを反復照射して誘導された皮膚腫瘍塊より、型通り限界希釈法を用いて、各種の腫瘍原性細胞株を樹立した。樹立株のほとんどは、fibrosarcomaであったが、その他、squamous cell carcinoma及びvascular endotheliomaを各1株得た。Fー2と名附けたVascular endothelioma株の性状を細胞生物学的に解析した結果、Vascular endothelial cell(EC)として多くの特性を保持していることが判明した。即ち、Fー2は敷石状形態をとって増殖し、アセチル化LDLの取り込み陽性、レクチンGriffonia simplicifolia I agglutininの結合陽性、基底膜ゲル(マトリゲル)上での管腔形成能陽性を示した。また、プロスタサイクリンの産生も陽性であった。さらに、コラ-ゲン、フィブロネクチン、ラミニンヘの強い細胞接着活性(インテグリン活性)も保持していた。しかし、正常のECのように培地にFGFなどの増殖因子の添加なしにFー2は増殖することより、何らかのautocrine機構が関与している可能性が示された。一方、Fー2はヌ-ドマウスの皮下に接種すると急速に腫瘍を形成し、100%hostを致死に導き、かつその組織像は血管腫瘍構築をとることから、悪性血管腫瘍マウスモデルの作成にも有用な細胞株である。また、正常マウスCB6Flnu/+においても、同様の腫瘍を4週間維持可能であった。そこで、このモデルを用いて、リコンビナントインタ-ロイキン2(rIL2)の抗腫瘍効果を検討した結果、これらin vivoの系において、rIL2のFー2誘導腫瘍増殖の著明な抑制をみた。これは、悪性血管腫瘍動物モデルをもちいて、rIL2の腫瘍抑制効果を検討した最初の試みである。
マトリックスメタロプロテアーゼを標的とするサルコグリカン欠損筋ジストロフィー治療

サルコグリカン(SG)欠損筋ジストロフィーは、β-ジストログリカン(β-DG)のプロセッシングにより筋が変性すると考えられている。本研究はマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-2及び-9とγ-SGの三重欠損マウスを作出し解析した。β-DGはプロセッシングされ、γ-SG単独欠損マウスと同様に骨格筋変性が認められた。SG欠損によるβ-DGプロセッシングにはMMP-2及び-9以外のMMPも働いている。ジストロフィンやジストログリカンとともに筋細胞膜糖タンパク質複合体を構成するサルコグリカンが欠損することによって発症する常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィーは、正常骨格筋では認められないβ-ジストログリカン(β-DG)のプロセッシングが特徴的である。本研究はこのβ-DGプロセッシングをマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-2及び-9が担っていると仮説してこれを標的とした筋ジストロフィー治療法の開発を最終目的とする。MMP-2/MMP-9を共に欠損した二重欠損マウス(DKOMMP-2/MMP-9)にγ-SG欠損筋ジストロフィーモデルマウス(KOγ-SG)を交配してγ-SG/MMP-2/MMP-9三重欠損マウス(TKOg-SG/MMP-2/MMP-9)を作出し、三重欠損マウスではサルコグリカン欠損マウスで認められたβ-DGプロセッシングが消失するか?更には筋ジストロフィー病変が改善するか?について骨格筋を解析していく。本年度はKOMMP-2マウスとKOMMP-9マウスを交配した。前者ではMMP-2のエキソン2が、MMP-9のエキソン1がneomycinカセットで置換され欠損しているため、これに相当する内因性エキソンを増幅するプライマーとネオマイシン抵抗遺伝子を増幅するプライマーをそれぞれ設定しマウスの尾由来のゲノムからPCR法によって遺伝子型を解析した。交配F1世代でMMP-2ヘテロ欠損/MMP-9ヘテロ欠損マウス、F2世代でMMP-2/MMP-9二重欠損マウスの誕生に成功した。現在この二重欠損マウスとサルコグリカン欠損マウスを交配させて三重欠損マウスの作出を開始している。三重欠損マウスでサルコグリカン欠損マウスおけるβ-DGプロセッシングと筋ジストロフィーの改善が得られれば、MMP阻害剤による新規筋ジストロフィー治療法にむけての基盤となる。筋細胞膜のジストロフィン糖タンパク質複合体(DGC)を構成する蛋白質サルコグリカン(SG)の欠損に起因する常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィーの病態機構は解明されていない。SG欠損筋ではSGとともにDGCを構成するβ-ジストログリカン(β-DG)が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-2及び-9)によってプロセッシングされ、筋細胞膜一筋基底膜結合が破綻して発症に至ると推測されている。本研究はγ-SG/MMP-2/MMP-9三重欠損マウスを作出し、γ-SG欠損筋ジストロフィーモデルマウス(KOγ-SG)で認められたβ-DGプロセッシングが消失するか否かを検証する。本年度は昨年度作出したMMP-2/MMP-9二重欠損マウスにKOγ-SGを交配しγ-SG/MMP-2/MMP-9三重欠損マウスの作出に取り組んだ。交配F1世代でそれぞれのヘテロ欠損マウスが誕生した。このF1マウスの交配によってF2世代マウスを誕生させた。各ノックアウトマウスでは、γ-SGのエキソン1、MMP-2のエキソン2、MMP-9のエキソン1がそれぞれネオマイシン抵抗遺伝子で置換され欠損しているため、それぞれの内因性エキソンとネオマイシン抵抗遺伝子を増幅するプライマーを設定した。マウスの尾由来ゲノムからPCR法によって遺伝子型解析を行った。総計242匹のF2世代マウスの解析によって総計6匹(雄2,雌4)の三重欠損マウス作出に成功した。現在この三重欠損マウスで、β-DGプロセッシングが消失するか、筋ジストロフィー病変が改善するかについて解析を行っている。三重欠損マウスで、γ-SG欠損マウスで認められるβ-DGプロセッシングが消失し筋ジストロフィー病変の改善が得られればMMP阻害戦略による治療法開発の基盤となることが期待できる。筋細胞膜のジストロフィン糖タンパク質複合体(DGC)を構成する蛋白質サルコグリカン(SG)欠損に起因する常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィーの発症病態は不明である。SG欠損筋ではSGとともにDGCを構成するβ-ジストログリカン(β-DG)が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)によってプロセッシングされ、これによって筋細胞膜-筋基底膜の強固な結合が破綻して発症すると推測されている。またマトリックスメタロプロテアニゼ阻害剤によるin vitro解析の結果からは、MMP-2及びMMP-9がこのβ-DGプロセッシングを司ると推定されている。本研究はγ-SGIMMP-2/MMP-9三重欠損マウスを作出しMMP-2及びMMP-9によるβ-DGプロセッシングの有無を検証した。

本年度は昨年度誕生したγ-SGIMMP-2/MMP-9三重欠損マウスとγ-SG欠損マウスの骨格筋病変について比較解析した。三重欠損マウスは、骨格筋の肥大が認められ、筋束の一部では著しい筋線維の変性・壊死及び再生が認められ、γ-SG欠損マウスの骨格筋病変と差異は認められなかった。免疫組織染色では筋細胞膜のγ-及びα-SGは欠損していたが、細胞膜直下のジストロフィンと細胞膜のβ-及びβ-SG及び細胞外ラミニンα2の染色は正常であった。3種類のβ-DG抗体を用いたウエスタン解析では、三重欠損マウス骨格筋にはβ-DGの全長の他に35kDaのプロセッシング型も存在し、γ-SG欠損マウスと同様であった。三重欠損マウスで、γ-SG欠損マウスで認められるβ-DGプロセッシングが消失せず筋ジストロフィー病変の改善が得られなかったことから、β-DGプロセッシングにはMMP-2及びMMP-9以外のMMPが関与していると推定された。
蝸牛培養細胞における小胞体ストレス応答

感音難聴は未だ有効な治療法に乏しく、病態生理の解明と有効な治療戦略の確立が急務である。これまでのモデル動物や臨床試験から、一部の難聴の発症機序に酸化ストレスが関与することが明らかとなっているが、抗酸化剤antioxidantによる治療効果は動物実験レベルですら十分でない。そのため酸化ストレス以外の病態生理も難聴の発症に関与している可能性が考えられる。小胞体ストレスは異常タンパクが小胞体に蓄積することで細胞死を引き起こす致死的ストレスの一種であり、内耳性難聴の病態生理に関与している可能性が考えられるが、いままでに十分な検討がなされていない。そこで本研究では、蝸牛培養細胞の細胞死における、小胞体ストレスの関与を明らかにすることを目的とした。2年度までに、小胞体ストレスの各pathwayであるPERKpathway, IRE1 pathway,およびATF 6 pathwayの評価を行った。当初予定していたMath1-nGFPマウスを用いた検討は、安定した結果を得るのが難しく、一般購入ができるCBA/Jマウスの系統を用いて評価検討を行った。その結果、IRE 1 pathwayはapoptosisなどの細胞死評価を行うのが可能であったが、その他の2つのpathwayは蝸牛培養細胞上では適切な染色が難しく、評価は困難であることが判明したため、最終年度は、IRE 1 pathwayに解析対象を絞り、データ解析を行った。小胞体ストレスを惹起するtunicamysin投与により、IRE 1 pathwayにおけるapoptosisマーカーであるCHOPの発現は確認できたが、小胞体ストレスを軽減する薬剤投与による有効な有毛細胞死を防ぐ系を確立することができず、感音難聴における小胞体ストレスの関与について新たな知見を得ることができなかった。そこで本研究では、蝸牛培養細胞の細胞死における、小胞体ストレスの関与を明らかにすることを目的としている。まず初年度において、蝸牛由来細胞培養系を確立すべく、当研究室で維持しているMath1-nGFPマウスを用い、生後2ー3日の同マウスからコルチ器およびラセン神経節細胞を摘出した。そして現在の施設環境における最適の培養条件を決定させるため、様々な培養条件を試みて最適の条件の決定を目指した。Math1-nGFPマウスは当研究室にて確立したマウスであり、有毛細胞の核がEGFPにより蛍光を有することから、細胞死のリアルタイムモニタリングを行うことができる。培養条件の決定後、小胞体ストレスを惹起する薬剤として広く用いられているtunicamycinを蝸牛細胞培養系へ投与し、細胞死の有無を観察した。薬剤濃度依存性に細胞死が生じることが確認でき、経時的変化について詳細に観察検討を行った。想定していたよりもまず用いたマウスの系統にて生後2ー3日のマウスを得るのに時間がかかり、培養の最適条件を決定するまでに比較的多くの時間を要した。そして薬剤投与による細胞死の観察に進んだが、幅広い薬剤濃度の投与を試したため、その容量依存性の時系列カーブを得るのにも想定よりも多くの時間を要した。その結果、IRE 6 pathwayはapoptosisなどの細胞死評価を行うのが可能であったが、その他の2つのpathwayは蝸牛培養細胞上では適切な染色が難しく、評価は困難であることが判明した。最終年度は、IRE 6 pathwayに解析対象を絞り、データ解析を行う予定である。小胞体ストレスの各pathwayであるPERKpathway, IRE1 pathway,およびATF 6 pathwayの評価を行った。

その結果、IRE 6 pathwayはapoptosisなどの細胞死評価を行うのが可能であったが、その他の2つのpathwayは蝸牛培養細胞上では適切な染色が難しく、評価は困難であることが判明した。感音難聴は未だ有効な治療法に乏しく、病態生理の解明と有効な治療戦略の確立が急務である。これまでのモデル動物や臨床試験から、一部の難聴の発症機序に酸化ストレスが関与することが明らかとなっているが、抗酸化剤antioxidantによる治療効果は動物実験レベルですら十分でない。そのため酸化ストレス以外の病態生理も難聴の発症に関与している可能性が考えられる。小胞体ストレスは異常タンパクが小胞体に蓄積することで細胞死を引き起こす致死的ストレスの一種であり、内耳性難聴の病態生理に関与している可能性が考えられるが、いままでに十分な検討がなされていない。そこで本研究では、蝸牛培養細胞の細胞死における、小胞体ストレスの関与を明らかにすることを目的とした。2年度までに、小胞体ストレスの各pathwayであるPERKpathway, IRE1 pathway,およびATF 6 pathwayの評価を行った。当初予定していたMath1-nGFPマウスを用いた検討は、安定した結果を得るのが難しく、一般購入ができるCBA/Jマウスの系統を用いて評価検討を行った。その結果、IRE 1 pathwayはapoptosisなどの細胞死評価を行うのが可能であったが、その他の2つのpathwayは蝸牛培養細胞上では適切な染色が難しく、評価は困難であることが判明したため、最終年度は、IRE 1 pathwayに解析対象を絞り、データ解析を行った。小胞体ストレスを惹起するtunicamysin投与により、IRE 1 pathwayにおけるapoptosisマーカーであるCHOPの発現は確認できたが、小胞体ストレスを軽減する薬剤投与による有効な有毛細胞死を防ぐ系を確立することができず、感音難聴における小胞体ストレスの関与について新たな知見を得ることができなかった。初年度は基本的条件の設定に時間を要したが、条件がようやく定まったため、今後は予定していた実験を着実に進めるように心掛けたい。最終年度は、IRE 6 pathwayに解析対象を絞り、データ解析を行う予定である。想定よりも実験の進行が遅かったため、消耗品などの支出額が少なく、次年度使用額が生じた。想定通りに動かない実験系があり、結果的に実験系を絞る形になった。そのため、消耗品などの支出額が少なく、次年度使用額が生じた。次年度は、得られた実験データを解析するための実験助手も新たに雇い入れ、年度内にデータの解析を済ませる予定である。実験の遂行に伴って、消耗品などの支出が自然と増えることが想定される。
森林資源の利用技術としての畑作と野生動物の管理に関する民俗環境史的研究

北上山地山村では、自給的な部分の大きい生計維持活動が森林環境を改変し、焼畑や畑、採草地、放牧地、薪炭林として利用されてきた。これらの変化の過程を聞き取り、観察、文献により調査した。この結果、山村の周辺で生物多様性が維持され、生計活動に再利用しやすい森林環境が形成維持されてきたことがわかった。北上山地でニホンジカ、イノシシが分布を拡大し、農林業被害が増加しつつある。しかしこれらは明治期には生息していた動物であり、生息域の再拡大である。かつての山村では、これらが衣食や道具等の資源として積極的に利用されていた実態を明らかにした。1森林を畑や焼畑、採草地、放牧地、薪炭林へ改変し利用するための民俗技術について、現在、逆にこうした土地利用が放棄され、森林に戻ろうとしている点に着目し、それらの利用放棄の時期やかつての利用実態についての聞き取りによる復元を行った。2畑、焼畑、採草地、放牧地、薪炭林などと森林との境界ゾーンの管理について聞き取りを重ねてきたが、実際に境界の維持を主目的とする行動はあまり見られず、田盛業の営みの結果としてこれら境界の維持が図られるという傾向性があることが明らかになりつつあり、調査結果を分析中である。3森林を改変した土地利用の放棄状況と、当該地域の植生調査については、引き続き今年度も調査を継続するが、放棄された土地は50年前に比べてかなりの面積になることがわかってきた。4野生ニホンカモシカの分布と食害調査の影響把握についても、北上山地全域での把握は困難であり、調査地点を絞って聞き取りを進めている。5明治・大正期の野生動物の利用と商品化については、文献調査中であるが、ニホンシカについての皮を中心とした商品化について、多くの情報が収集されている。また、これまで言及されてこなかった、岩手県において明治期に公文書に記録のあるニホンオオカミに似たという「カセキ」という動物について注目し、これについての情報を収集中である。以上に加えて、6雑穀の商品価値の時代的変遷については文献を調査中である。7戦後すぐの時期における焼畑の跡地の現在の土地利用状況については、調査に着手し、現在のところ山林になっている場所が多いが、一部耕作地として利用されている例もあることがわかってきた。これまでの調査で、森林を畑や焼畑、採草地、放牧地、薪炭林に改変する技術については、文献、聴き取りによって多くの資料を集めることが出来た。ただ文献は、未見の資料が地方図書館に埋もれている可能性もあり、今後も調査を続行していく。畑や焼畑、採草地、放牧地、薪炭林などと森林との境界ゾーンや、土地利用の実態については、あらかじめ想定した時代(50年前、昭和15年頃など)における復元が困難であり、いくつかの航空写真も活用しても、その精度は納得のいくものになかなか至らない。むしろ個人の記憶にある、境界ゾーンがはっきりしていた時代の特定を行い、その時代の利用について聴き取りを重ねた。マッピングについても、復元の過程で話者の記憶の違いが露呈し、むしろその齟齬にムラの社会関係が立ち現れているともいえるのだが、地図としては若干クリアではない部分を含まざるを得ないようである。ニホンジカの分布については、各地区の森林管理署へ問い合わせを行い、北上山地に限らず、岩手県北部広域に分布・繁殖していることがわかってきた。この分布が、ある程度鹿踊りの残存する地域と重なるのも興味深い。市町村でもシカの被害が深刻化しはじめ、町単独の補助事業でシカの捕獲に乗り出すところもあらわれはじめた。予想以上に早いペースでニホンジカが繁殖・増加しており、森林管理署も森林の植生がシカによって改変されてしまうことへの危機感を強め、調査に乗り出している。明治・大正期の野生動物、特にニホンジカの利用状況、雑穀の商品価値については、資料が集積されているが、さらに文献と各地の資料館、博物館の調査を進める。焼畑跡地の利用についても調査を進め、山林だけではなく、畑やゴルフ場への利用なども見られることがわかった。1.森林を人里に改変する民俗技術についてヒアリングを進め、多くに事例を収集した。例えば、毎年火入れを行って植生を草地の状態に管理する採草地は、山菜などの自給食料の採集地でもあり、凶作時には、焼畑耕作地や、救荒食であるワラビやクズの根茎採集地ともなる重層的な利用が行われおり、山村の環境管理の技術としての、火入れの重要性が確認された。2.畑、焼畑、採草地、放牧地、薪炭林など人里と、森林との境界ゾーンの管理については、ヒアリング・データを蓄積した。境界ゾーンにおいて、野生動物の侵入を防ぐ管理技術として除草が重視され、その労働は家族のうち高齢者によって担われる傾向があった。また焼畑では、人が管理できない時間帯には、沢に設置したシシ脅しで獣害の防除を行った。3.耕作地や採草・放牧地の放棄状況については、設定した1960年代の利用について記憶があやふやな人が多く、まず航空写真などから可能な範囲で復元した図を示して思い出してもらう方法に変更した。この航空写真による土地利用の復元図を、現在制作中である。放棄は昭和60年代以降に拡大していくことが判明し、この時期に進んだ人口構成の高齢化との関係性を分析中である。

4.ニホンジカは、各調査地における林業労働者らからの聞き込みによって、昭和40年代までは岩手県南の五葉山が北限であったのが、現在は岩手青森県境を突破してさらに北上しつつあり、少なくとも生息北限が100km以上北上したことが明らかになった。5.岩手県庁の保存文書から、調査地安家地区を含む岩手県の明治期のオオカミ猟の実態が明らかになった。明治10年代に安家のマタギが一人で、親子のオオカミを一部生捕の形で数回捕獲していたことや、オオカミ猟の方法を図解した絵図も発見した。またその他の野生動物の狩猟方法についても、記述があり、捕獲地点のマッピングなど分析を進めている。これまでの調査で、森林を畑や焼畑、採草地、放牧地、薪炭林に改変する技術や生業活動、改変に至る経緯などを、文献、聴き取りによって明らかにしつつある。また明治初め頃の北上山地山村を復元可能な文献として「岩手県管轄地誌」を購入した。初期の森林利用についての文献として、分析を進めている。また聴き取りは今年度も続行する。森林と人里との境界ゾーンについては、可能な聞き取り調査はほぼ終了し、データをまとめている。境界ゾーンがなぜ揺らぐのか、その分析を中心に据える方針である。ニホンジカの分布は急速に北上し、青森県境は突破した。シシ踊りとの関係性や被害の実態、駆除についての市町村ごとの対応などについて、この数年でニホンジカの分布とそれへの新たな市町村の対応が拡大しつつある現状に鑑み、資料をさらに集積している。また、江戸、明治、大正、昭和初期までのシカの民間利用についての資料についても、予想外に資料が少ないことがわかってきたが、さらに収集中である。焼畑跡地の利用についても資料を収集し、地図に落としつつある。かつて江戸時代に野生動物の農業被害に対処していた村犬の存在に注目し、現代これと同様の機能を果たすモンキードッグについて、下北半島のむつ市、大間町、佐井村で現地調査を継続してきた。モンキードッグの効果とそれを支える要因について明らかにし、北上山地でも予想される野生動物の農業被害への応用の基礎資料としたいと考えている。また、かつての山村を支えた自治組織として消防団は大きな機能を果たしていた。こうした組織の存在が、山村の広大な山域における山菜やキノコなどの採集活動を保障していた部分がある。しかしこれも過疎化・高齢化によって機能しなくなりつつある。今日これに代わるものとして災害救助犬が利用されつつあり、モンキードッグと同様にこれら使役犬の山村への応用の可能性を視野に調査中である。森林を焼畑や切替畑、常畑、採草地、放牧地、薪炭林に改変する生態民俗知や技術、生業活動、他の活動による副次的改変等の経緯を、文献、聴き取りによって明らかにした。北上山地山村において自給を含む生業活動が、森林の植生を必ずしも意識的ばかりではなく変え、結果として多様な自然環境が形成されてきた。こうしたヒトの干渉によって作られた二次的な環境が、イヌワシや草原性の昆虫、また古くは明治期のイノシシの例に見られるように、生物の多様性維持にも寄与していたことは興味深い。また明治前期の「岩手県管轄地誌」の分析によって、北上山地の近代における山村の生業活動や野生動物の分布が明らかになった。明治期には北上山地ほぼ全域でシカ、イノシシが生息しており、今日のシカ、イノシシの北限分布の拡大は、かつての生息域に戻ろうとするものととらえられる。現在、野生動物の農林業被害への取り組みとして、モンキードッグやジビエとしての利用などがある。
表皮におけるヒアルロン酸合成の制御

hyaluronic acid biding protein(HABP)を用いた蛍光染色を行ったところ、海綿状態皮膚では表皮細胞間のHABPに対する結合性が増強していた。次に、培養ヒト角化細胞を用いてIL-4、IL-13、IFN-・処理によりヒアルロン酸合成酵素3のmRNA発現の上昇とヒアルロン酸(HA)の産生増強をを認めた。以上の結果より、接触皮膚炎局所に浸潤するT細胞が分泌する炎症性サイトカインが、HA産生を調節し海綿状態を形成していることが示唆された。現在、接触皮膚炎の特徴的病理変化である海綿状態において、どのようにして表皮細胞間に浮腫が生じるかは明らかにされていない。これまでに、我々は、IFN-γ処理角化細胞が、生体内水分の移動、分布を調節するヒアルロン酸(HA)の産生を亢進することを報告してきた。そこで、海綿状態の組織、健常皮膚を対象に、Texas Red標識したhyaluronic acid biding protein(HABP)を用いた蛍光染色を行ったところ、海綿状態皮膚では表皮細胞間のHABPに対する結合性が増強していた。また、in situ hybridizationでも海綿状態皮膚ではhyaluronic acid synthase 3(HAS3)の増強を認めた。次に、培養ヒト角化細胞(NHEK)を用いて、接触皮膚炎の病態形成に関与することが知られている種々のサイトカインによるHA産生の調節を検討した。その結果、real-time PCRでIL-4、IL-13、IFN-Y処理によりHAS3のmRNA発現の上昇を認めた。さらに、IL-4、IL-13、IFN-γ処理によりNHEK細胞表面のE-cadherin発現が低下した。以上の結果より、接触皮膚炎局所に浸潤するT細胞が分泌する炎症性サイトカインが、HA産生とE-cadherin発現を調節し海綿状態を形成していることが示唆された。その結果、real-time PCRでIL-4、IL-13、IFN-γ処理によりHAS3のmRNA発現の上昇を認めた。さらに、培養上清を用いたサイトカインの定量でIL-4、IL-13、IFN-γがHAの産生を増強させた。また、接触性皮膚炎以外で表皮に変化を認める皮膚疾患(乾癬、類乾癬、天疱瘡)についても、同様に、組織の免疫染色を行いHABPの発現を検討したところ、接触皮膚炎とは異なり、HABPの発現増強は見られなかった。
サイエンスにおける知識生産プロセスとイノベーション創出の研究

日米の科学者を対象として「サイエンスにおける知識生産プロセス」にかかる大規模質問表調査(世界初の調査)を成功裏に実施し(2001年から2006年の論文対象。日米でそれぞれ2100人、2300人から回収)、パスツールの象限研究の重要性と成果、研究チームにおける若手研究者の役割、研究チームの国際化の原因と効果、研究とマネジメントの分離によるトレードオフ効果、プライオリティー競争の認識とその効果、等多くの新規の知見を得た。日本のサーベイの質問票を設計し、同時に発送名簿を完成させ、科学者約7500名による研究プロジェクトを対象とするサーベイを行い約2000名から回答を得ることが出来た。そのうち約3分の1が引用頻度において上位1%の論文を生み出したプロジェクトである。暫定的な集計結果は、米国のNSF、文部科学省科学技術政策研究所と共同の国際ワークショップで報告し、高い評価を受けた。回答科学者の属性:約80%の回答者が大学の研究者であり、10%強が政府系の研究機関、民間企業を含めてその他が10%弱であった。また約80%の回答者が研究プロジェクトのマネジメントに関与していた。回答発明者の流動性:約35%の科学者が調査対象論文の執筆以前5年間の間に組織を移動していた。また約50%の科学者が1年以上海外に研究滞在したことがある。研究プロジェクトの動機:基礎原理の追求が約50%、現実の具体的な問題解決が約25%であり、前者の割合は上位1%の論文でより高かった。両者の動機がともに非常に重要な研究(パスツールの象限に属する研究)は全体で約9%存在し、その割合は材料科学で特に高かった。研究過程:約5%のプロジェクトで研究プロセスが当初の予定と異なり、また約2割のプロジェクトで研究成果は当初の予定を大きく上回る結果であった。また、研究成果が当初提起していなかった研究課題に回答を見出すことにつながった(セレンディピティ)割合は7割とかなり高かった。こうした不確実性はいずれも上位1%の論文でより高く、サイエンス研究における不確実性の積極的な重要性を示している。研究競争:研究プロジェクトを開始した際の認識として海外の競争相手を認識していた場合は、約4分の3あり、その割合は上位1%の論文でより高かった。プライオリティー競争を非常に心配していた研究の割合は9%であり、上位1%の論文では17%と高かった。パフォーマンス:基礎原理の追求、異分野の融合、若い学者の参加、研究コミュニティーの発展と高い相関がある。「サイエンスにおける知識生産プロセス」に関する日本のサーベイ結果からの最初の知見をとりまとめ、2010年10月の文部省科学技術政策研究所との共同ワークショップで結果を公開した。英文報告書も作成し、研究成果を国際セミナー、国際ワークショップで発表した(OECD、2010年8月、4th BRICK-DIME-STRIKE Workshop、2011年2月)。後者のトリノ大学でのワークショップでの発表は10倍を超える倍率の中、招待論文として選ばれた。ジョージア工科大学と協力して米国のサーベイを順調に実施することができた。米国の科学者の8,900名に送付し、2,300名を超える回答(完全な)を得ることができ、日本と同様に、約3分の1が引用頻度において上位1%の論文を生み出したプロジェクトである。日米の回答者のプロファイルを比較すると、(1)回答科学者の属性:日米とも約80%の回答者が大学の研究者であり、10%強が政府系の研究機関、民間企業を含めてその他が10%弱であった。(2)研究プロジェクトの動機:上位1%の論文において、基礎原理の追求が非常に重要な割合は、米国では約8割に対して日本が約6割、現実の具体的な問題解決が非常に重要な割合は米国では4割強であり日本では約3割であった。日米とも基礎原理の追求の動機が上位1%の論文でより強かった。パスツールの象限に属する研究(両者の動機がともに非常に重要な研究)は米国では32%存在し、日本の14%より高かった。(3)研究過程:上位1%の論文で日米とも約6%のプロジェクトで研究プロセスが当初の計画と全く異なり、また約3割のプロジェクトで研究成果は当初の予定を大きく上回る結果であった。(4)研究競争:研究プロジェクトを開始した際の認識として海外の競争相手を認識していた場合は、上位1%の論文で米国は7割、日本で約85%、その割合は上位1%の論文でより高かった。プライオリティー競争を非常に心配していた研究の割合も、上位1%の論文でより高かった。ジョージア工科大学のJohn Walsh教授と協力して、日米の回収サンプルを比較できるように集計し、日米のサイエンスにおける知識生産プロセスの詳細で構造的な比較分析を行った。また、日本において、セレンディピティー、プロジェクトの段階別の資金利用状況等についてフォローアップサーベイを行った。

これらの研究成果は、「科学における知識生産プロセス日米ワークショップ」(文部科学省科学技術政策研究所との共催、米国のNSF(全米科学財団)の後援、2011年6月23日に実施)において報告し、ボーラ・ステファン教授(ジョージア州立大学教授)およびデイヴィッド・マワリー教授(カリフォルニア大学バークレイ校/全米経済研究所)等から高い評価を得た。日米比較分析の結果は、一橋大学のイノベーション研究センターのワーキング・ペーパー("Knowledge Creation Process in Science:Key ComParative Findings from the Hitotsubashi-NISTEP-Georgia Tech Scientists' Survey in Japan and the US")として公表した。また、関連データの整備も進めて、テーマ別の分析を実施して、その中間成果を以下の研究報告にまとめ、4つの学会等で報告を行った。1.「パスツールの象限における研究:その重要性」、2.「科学のマネジメント、セレンディピティー、研究業績:日米における科学者調査より得られたエビデンス」、3.「科学における知識生産に対する研究チーム組織および研究資金の影響」および4.「科学的発見の商業化プロセス」。日米サーベイから構築したデータを利用して、次のテーマで研究を実施した。1.チームベースの科学研究への若手研究者の参加、2.国際共同研究の効果、3.国立大学法人化による知的財産権の機関所有の影響、4.研究のマネジメントとセレンディピティー、5.パスツールの象限における研究の特徴,6.サイエンスにおける競争)の研究に取り組み、それぞれ新しい知見が得られた。例えば、若手研究者(ポスドク)が研究チームに参加する可能性は、(1)プライオリティ競争の脅威に直面している研究チーム、(2)新規性の高いテーマについて研究を行っている研究チーム等で高く、また著者が貢献度の順で記載されている調査対象論文に注目すると、博士研究員が筆頭著者になる確率は、(1)プライオリティ競争の脅威に直面している研究チーム、(2)外国生まれの博士研究員がメンバーとなっている研究チーム、(3)最先端の研究施設・設備を有効に活用している研究チームにおいて高くなることが明らかになった。また、国際共同研究については、(1)多人数を要する大型プロジェクトや基礎的な研究で重要性が高まるが、(2)コオーディネションコストが一層高まる学際的な研究ではむしろ重要性が低いこと、また(3)国際共同研究の効果は日本で米国よりも高いこと等が明らかになった。更に、パスツールの象限における研究は、(1)エディソンの象限の研究と比較して発明の実績で劣ることなく、同時にボーアの象限の研究と比較してサイエンスの成果でも劣ることはなく、パフォーマンスが高い。しかしながら、(2)直接的な産学連携(共同著者)の効果にその原因を見いだすことはできず、他(例えばリード科学者の視野の広さやプロジェクトのセレクション過程など)を求める必要性が示唆された。このような研究成果を、4つの国際学会で講演、発表するとともに、国際ジャーナルに投稿を進めつつある。日米の大規模サーベイは、科学技術政策研究所、ジョージア工科大学との協力を得て、順調に実施することができた。
原発癌と頸部リンパ節転移癌の免疫学的heterogeneityに関する基礎的研究

頭頸部癌患者12例の原発巣と頸部リンパ節転移巣癌細胞の間に抗原性の違いがあるかどうかを、癌キラー細胞に対する感受性によって検討した。キラー細胞は、自己癌とリンパ球を混合培養して、自己癌抗原に応答するリンパ球を更に組換え型インターリューキン2(rIL-2)で活性化して誘導した。このキラー細胞はOKT3+8+とOKT3+4+のphenotypeをもつ、少なくとも2つの群から成っていることが示唆された。又、そのキラー活性は、いわゆるLAK細胞活性とは異なることが照明された。1人の患者で原発巣および頸部リンパ節転移巣から共に癌細胞分離ができた症例は12例で内10例が扁平上皮癌、2例が腺癌であった。自己原発癌で刺激誘導されたキラー細胞(CLP)は12例中7例にみられ(58.3%)、自己頸部リンパ節転移癌で刺激誘導されたキラー細胞(CLm)は12例に4例のみであった(33%)。CLPもCLmも共に誘導に成功した3例について、CLPの原発癌および転移癌の障害活性、CLmの原発癌および転移癌の障害活性を検討し、又、交互にcold target inhibition testを行った結果、2つの示唆が得られた。1.転移癌のキラー誘導のための免疫原あるいは刺激原のpotencyは原発癌のそれに比し低い。2.原発巣癌細胞は組織学的に単一にみえても、キラー細胞誘導の免疫原性は単一ではなく、heterogeneityが存在することが示唆され、その中のある細胞群が転移を起す可能性が示唆された。本研究は自己癌細胞とリンパ球の混合培養によって誘導されるキラー細胞を用いた癌の免疫療法の実際に重要な知見を与えたと考えられる。現在までに12名の頭頚部癌患者(舌癌1例、中咽頭癌1例、下咽頭癌6例喉頭癌2例、耳下腺癌2例)から原発および頚部リンパ節転移癌の分離に成功した。これらの癌細胞をマイトマイシンCで処理し、自己末梢血リンパ球と混合培養した。更にrIL2で培養をつづけ、このキラーT細胞を実験に用いた。実験計画は(1)原発癌で誘導したキラーT細胞(CLp)が原発癌と転移癌をどの程度障害するか(2)転移癌で誘導したキラーT細胞(CLm)が転移癌と原発癌をどの程度障害するか(3)CLpの原発癌障害の系に【^(51)Cr】を標識していない転移癌を混合した時、CLpの原発癌障害活性が抑制されるか(4)CLmが転移癌を障害する系に【^(51)Cr】を標識していない原発癌を混合した時、CLmの転移癌障害活性が抑制されるかを検討することである。(1),(2)はdirect tilling assayで、(3),(4)はcold target inhibition testである。上記12例の検討結果は以下の如くである。(1)誘導されたCLm,CLpは共にOKT【3^+】【8^+】,OKT【3^+】【4^+】のリンパ球を持っていた。(2)CLmは全体として障害活性が低かった。(3)CLpは原発癌も転移癌も障害するが、全体として原発癌に対する障害活性が高く転移癌との間に障害活性の差がみられた。(4)採取できた癌細胞数に限界があって【^(51)Cr】を標識していない癌細胞の数をいろいろに変えて検討することができたのは2例であった。