hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮質２／３層興奮性細胞の特徴的な形態・機能獲得における神経活動の役割

時期特異的に神経活動を抑制する実験系が確立でき、発達期のどの時期の神経活動が必須であるかを明らかにする実験を順調に進めている。また、神経活動の亢進により細胞移動が障害されるという新しい結果を得て論文投稿中であり、計画は順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。神経活動を抑制する実験、亢進させる実験ともに、計画通り研究を進める。
カルモデュリンキナーゼカスケードの動作原理と新しいリン酸化制御機構の解明

細胞内カルシウムイオンをセカンドメッセンジャーとする細胞内情報伝達機構においては、カルシウム受容タンパク質であるカルモデュリン(CaM)を活性化因子とする多機能性CaM-依存性タンパク質リン酸化酵素群(CaMK)がその中心的な役割を担っている。本研究においては、Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase betaの構造機能解析より、基質認識機構の詳細な分子機構が明らかとなった。本研究の対象とするCa2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase beta (CaMKKβ)の標的リン酸化酵素であるAMPK活性化リン酸化酵素AMPKについて、その活性化状態を細胞レベルで可視化する技術が開発され、AMPKは細胞内の様々なオルガネラにおいて異なる活性化状態をとることが明らかとなった。特に本研究では、細胞内でAMPK活性を阻害するペプチド阻害剤AIPについて阻害効果の詳細なメカニズムを検討した。その結果、AIPのAMPK活性阻害は基質分子との拮抗阻害であることが明らかとなった。本阻害ペプチドは細胞内に発現させることにより、特異的に細胞内AMPK活性を抑制できることも明らかとなっている。これまで、CaMKKの阻害化合物としてSTO-609を開発し、世界中でCaMKKシグナル伝達機構の解析に使用されている。一方問題点として、多くの酵素阻害剤がそうであるように特異性の確保がある。そこで、STO-609の細胞内における特異的阻害効果を検証するために、CaMKKアイソフォームのSTO-609抵抗性変異体を作成した。ついでこの変異体を安定的に発現させた培養細胞株(A549細胞)を樹立することに成功した。そこで、このSTO-609抵抗性CaMKKαおよびβ発現株をイオノマイシン処理することによりAMPKのリン酸化の上昇を確認した。このイオノマイシン依存性のAMPKリン酸化はSTO-609処理により抑制されるが、STO-609抵抗性CaMKKβ発現株では抑制されず、STO-609抵抗性CaMKKα発現株は抑制されなかった。この結果から、STO-609抵抗性CaMKKαおよびβ発現株を用いることで、STO-609の効果がCaMKKを介したものであることを確認するだけでなく、アイソフォーム特異性も明らかにできる方法となった。私たちはこれまで細胞内におけるCaMKKシグナル伝達経路を解明するためにCaMKK選択的阻害剤STO-609を開発し、用いてきた。CaMKKにはCaMKKαとCaMKKβの2つのアイソフォームが存在するものの、アイソフォームによるシグナル伝達経路の差異については明らかとなっていない。そこで本研究においてはCaMKKαとCaMKKβが異なるシグナル伝達経路を調節するのか、リダンダントな活性化因子であるのかを検証するために、STO-609非感受性CaMKKα/β変異体を作製し、これらの安定的発現細胞株を樹立することにより、CaMKKアイソフォーム特異的なシグナル伝達経路や細胞応答の調節機構の解明を目的とした。ランダム変異導入法によりラットCaMKKαA293Tの変異がSTO-609抵抗性を示すアミノ酸変異であることを同定した。また今回作製したSTO-609抵抗性CaMKK変異体は野生型と比べSTO-609による阻害効率が100-1000倍ほど低いことが明らかとなった。そこで、A549細胞を用いてCaMKIVのThr196のリン酸化を確認したところ、野生型CaMKKα/β発現細胞株ではCaMKIVのThr196のリン酸化がSTO-609依存的に低下したのに対し、STO-609抵抗性CaMKKα/β変異体発現細胞株ではThr196のリン酸化が維持されていた。このことから、この樹立細胞はSTO-609抵抗性を獲得するとともに、CaMKIVのリン酸化にはCaMKKα/β両酵素が関与することが示唆された。一方、AMPKのThr172のリン酸化はSTO-609抵抗性CaMKKβ変異体発現細胞株のみSTO-609存在下でもリン酸化が維持されていた。このことは現在までの知見と同様に、CaMKK/AMPK経路についてはCaMKKαではなくCaMKKβが担っていることが示唆された。本研究の一部は平成27年度に米国Biochemistry誌に発表済みとなっているため。Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase(CaMKK)の標的リン酸化酵素のひとつであるAMPK活性化リン酸化酵素(AMPK)を介したCaMKK/AMPK経路は代謝調節からがん細胞増殖に至る新たなカルシウムシグナル伝達経路を調節している。その結果、CaMKKアイソフォームにおいて、CaMKKαではなくCaMKKβがAMPK活性化酵素として同定され本リン酸化カスケード反応を構成していることが明らかとなっている。本研究においては試験管内におけるCaMKKαとCaMKKβによるAMPKの活性化ループに存在するThr172の時間依存的なリン酸化上昇について検討したところ、CaMKKβがCaMKKαより約14倍高いリン酸化酵素活性を示した。このリン酸化効率の差を生み出している一次構造上の特徴を明らかにするために、GST-CaMKKβ/αキメラ変異体またはGST-CaMKKβ/α/βキメラ変異体を用いた結果、CaMKKβSer357とLeu358(CaMKKαAla321とIle322)がAMPKの基質認識に関わっていることが示唆された。

そこで、CaMKKαAla321SerもしくはIle322Leu変異体を用いて、AMPKに対するリン酸化活性を測定した結果、CaMKKαIle322LeuがCaMKKβと同様のリン酸化活性を示すとともにAMPKに対するKm値は4.9μMと算出され、AMPKに対する親和性を上昇させた。細胞内においても同様の結果得たことから、CaMKKアイソフォーム間で異なる一アミノ酸の違いがAMPKに対する親和性の差を生み出し、基質特異性の差異に基づく酵素活性に影響を及ぼすことを明らかにした。細胞内カルシウムイオンをセカンドメッセンジャーとする細胞内情報伝達機構においては、カルシウム受容タンパク質であるカルモデュリン(CaM)を活性化因子とする多機能性CaM-依存性タンパク質リン酸化酵素群(CaMK)がその中心的な役割を担っている。本研究においては、Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase betaの構造機能解析より、基質認識機構の詳細な分子機構が明らかとなった。平成27年度の研究によりCaMKKアイソフォームの中でβアイソフォームのみが細胞内においてAMPKをリン酸化依存的に活性化することが明らかとなった。今後は、どのような分子機構にてCaMKKβがAMPKを特異的に認識しリン酸化することができるかについて明らかにすることを目標とする。方法としては、AMPKのリン酸化活性が低いCaMKKαとCaMKKβとのキメラ変異体を作成し、AMPKを基質として酵素活性を測定することにより、CaMKKβの特異的AMPK認識に必要な一次構造領域を決定する。さらにはこの特異的AMPKリン酸化反応に必須のアミノ酸残基を特定する。これらの研究はrecombinant proteinを用いた試験管内反応により行うが、細胞レベルにおいてもCaMKKβの特異的AMPK認識機構を確認することにより、CaMKKβの基質認識の分子機構を明らかにする。生化学AMPKの活性化状態の可視化技術と、AMPK活性化酵素であるCaMKKβの阻害剤を用いた研究手法を同時にもちいることで、CaMKK/AMPKカスケード反応のさらなる詳細な反応機構を明らかにする。さらにはCaMKKアイソフォームにおいて作成した阻害剤STO-609抵抗性変異体を用いることで、細胞内におけるCaMキナーゼカスケード反応の詳細な活性化機構を明らかにする。
多元的解析手法による園芸植物のCa欠乏症発生要因の解明

園芸植物のCa欠乏症は、「Ca吸収能」、「Caの移動性」、「成長速度」など、いくつかの要素が複合的に関与することで発生するが、これらの要素を数値化し、多元的に解析した事例はみられない。そのため、Ca欠乏症の発生要因と具体的な解決策は不明瞭のままである。そこで本研究は、経営学や心理学分野で利用されている「共分散構造分析」を用いて、トルコギキョウのCa欠乏症と植物の生理的・形態的特徴との関連性を多元的に解析する。これより、各要素のCa欠乏症への影響度を網羅的に解析し、Ca欠乏症の発生要因を明らかにする。
新しい自然発症糖尿病ラット(SDT)における原因遺伝子の遺伝学的解析

ごく最近、非肥満性の2型糖尿病を自然発症するSDTラットが、鳥居薬品研究所で確立された。この系統の特徴として、(1)雄では16週令以降に耐糖能低下、20週令以降に糖尿病発症を認める、(2)雌雄ともに非肥満でインスリン抵抗性の兆候も認められない、(3)発症後にはβ細胞数の著明な減少と膵管の増生や線維化が認められる、(4)発症後、50週令以降の全個体に白内障、網膜症が認められるなどがあげられる。本研究ではSDTラットにおける糖尿病形質に関与する原因遺伝子を連鎖解析とQTL解析によりラット染色体上にマッピングした。さらに、これらの原因遺伝子座と相同なヒトの染色体領域を推定した。以下にそれらの要点を述べる。戻し交配分離個体[(BN×SDT)×SDT]の雄319匹について、経口糖負荷試験を行い8.46%(27/319)が発症することを確認した。さらに膵組織の二重免疫染色標本を解析し、発症を確認した。耐糖能低下に関与する原因遺伝子の連鎖解析を行ったところ、ラット第1、2、11、18およびX染色体上に劣性遺伝子座の存在が強く示唆された。さらに、耐糖能に関する量的形質遺伝子座(QTL)解析を実施し、連鎖解析の結果とほほ一致して、Niddm/sdt1,2,3,4,および5のQTL遺伝子座が検出された。また、各QTLの組み合わせが、耐糖能低下に強く影響することが明らかとなった。耐糖能低下作用が強かったNiddm/sdt1はヒト15q14-26ならびに11cen-q15に、Niddm/sdt2は4q26に相同すると推察された。この領域には、これまでヒト2型糖尿病に関連した遺伝子が報告されていない。したがって、我々がSDTラットにおいて発見した耐糖能低下作用の強い劣性遺伝子Niddm/sdt1および2は、ヒトNIDDM1-3とは異なることが明らかとなった。研究の目的:現在、糖尿病のモデル動物を用いて、糖尿病形質(病態)の遺伝学的解析が盛んに行われている。しかし、多くの原因遺伝子が関与し多様な病態を示すヒト糖尿病のすべてに対応できるだけのモデル動物は開発されていない。ごく最近、II型糖尿病を自然発症するラットの近交系SDT系統が、鳥居薬品研究所で確立された。この系統の主な特徴として、(1)雌では100%(6-20週令)発症するが雌では約50%(2)雌雄ともに非肥満(3)発症後には膵β細胞数の著明な減少(4)発症後の全個体に白内障が認められる。これらの特徴は、モデル動物では新しいタイプであり、新しい複数の原因遺伝子の関与が推察される。本研究はSDTラットにおける原因遺伝子の数(複数)と遺伝様式を、二つの戻し交配系を作出して明らかにし、かつ連鎖解析によるラット染色体上へのマッピングを第一目的とした。さらに、原因遺伝子に関してヒトとラット間の比較地図を作成する。本年度の目的は、第一目的を達成するための一つ目の戻し交配系について、遺伝学的解析を行うことにあった。これまでに得られた研究実績は下記の通りである。

1.戻し交配分離個体(N2)の作出と糖尿病の発症:近交系のBNラット系統を用い、N2[(SDT×BN)Fl×SDT]を293匹(雄:179、雌=114)を作出した。Fl個体(雌雄)のすべては経口糖負荷試験(OGGT)随時血糖値ともに正常(BNタイプ)であったが、N2の雄では4.4%が糖尿病を示した。このことから、本ラットにおける糖尿病の原因遺伝子の数は56個存在すると考えられた。現在、雄における膵島の病理組織学的変化の解析、雌の糖尿病発症などについて解析を行っている。2.戻し交配分離個体(N2)における遺伝子型の判定:(1) SDTとBN系統間におけるDNA多型(SSLP)マーカーの検索;各染色体に分布するSSLPマーカー534個を検索し、うち307個のマーカーで両系統間に多型を検出した。このことはマーカー間の遺伝的距離が平均で4.9cMとなり、連鎖解析に十分なものと判断された。(2)連鎖解析のための遺伝子型判定;現在、全てのN2個体からゲノムDNAを抽出して、307個のマーカーについて、それぞれの遺伝子型を判定中である。以上が本年度の研究実績である。これらの成果は、SDTラットにおける糖尿病原因遺伝子のマッピングという本研究の第一目的が、研究期間内に達成できることを強く示唆している。研究の目的:現在、糖尿病のモデル動物を用いて、糖尿病形質(病態)の遺伝学的解析が盛んに行われている。しかし、多くの原因遺伝子が関与し多様な病態を示すヒト糖尿病のすべてに対応できるだけのモデル動物は開発されていない。ごく最近、2型糖尿病を自然発症するラットの近交系SDT系統が、鳥居薬品研究所で確立された。この系統の主な特徴として、(1)雄では100%(15-30週令)発症するが、雌では約30%(2)雌雄ともに非肥満(3)発症後には膵β細胞数の著明な減少(4)発症後の全個体に白内障、などが認められる。これらの特徴から、SDTラットの糖尿病は新しいタイプであり、複数の原因遺伝子の関与が推察される。本研究はSDTラットにおける原因遺伝子を、連鎖解析によりラット染色体上へマッピングすることを第一目的とした。さらに、マッピングされた原因遺伝子に関して、ヒト・ラット間の比較遺伝子地図を作製することを第二の目的とした。本年度は原因遺伝子の連鎖解析を行うことを目的とした。これまでに得られた研究実績は下記の通りである。1.連鎖解析のための戻し交配分離個体(N2)の作出と糖尿病病態の解析:これまでに作出した436個体(雄:322,雌:114)のN2について、経口糖負荷試験を行い雄では7.76%発症することを確認した。さらに糖尿病病態を詳細に解析するため、雄322個体の膵について、抗インスリン抗体(β細胞)と抗non-β抗体(抗グルカゴン、抗ソマトスタチンおよび抗PP抗体の混合)を用いた二重染色と、特殊染色(繊維化)の標本を作製した。現在、それらの詳細を検討するため、二次元画像解析を行なっている。2.連鎖解析のための遺伝子型判定:戻し交配分離個体(N2)のうち、全ての雄からゲノムDNAを抽出して、ラットの各染色体に分布する307個の多型マーカーについて、それぞれの遺伝子型の判定がほぼ完了した。マーカー間の遺伝子的距離が平均で4.9cMと推定され、連鎖解析には十分なマーカーと考えられる。3.連鎖解析:現在、戻し交配分離個体(N2)それぞれについて、糖尿病病態と多型マーカーのタイピング結果を基に連鎖解析を順次進めている。これまでの成績から、ラット第1染色体のアルビノ遺伝子座近傍のマーカーと強い連鎖が認められている。
新概念に基づくインプラント治療シミレーションシステム

申請時においては,スタディーモデルの3次元形態のデータと顎骨のCTデータを合成することで,コンピュータ画面上に具体的なイメージ画像を映写して,精度の高いインプラント埋入のシミュレーションが可能なソフトの開発を目的とした.結果,コンピュータシミュレーションはほぼ完成した.さらに,ソフトで有限要素解析を加えることにより,インプラントの力学的な安定性を予測できるソフトへ改良を手がけている.さらに,コンピュータシミュレーションに加えて,インプラントの外科手術までのトータルシステムとして,CAD/CAMによる手術用ガイドならびに手術支援用ジャイロも加えて,これらをベースとした基本的特許の申請を行った.以下にシステムの特徴を示すが,現在もシステム全体の研究を行っており開発中である.(1)コンピュータシミュレーション:模型データとCTデータの合成により金属のアーティファクトのない高い画像精度が得られ,安全な手術を可能とするシミュレーションソフトを開発できた.さらに,数値解析(有限要素法)によって予知性の高い安定したインプラントの埋入位置を予測可能なソフトへと修正中である.(2)CAD/CAMによる手術用ガイド:シミュレーションをCAD/CAMにより手術に反映させて,安全な手術の実行を目的する手術用治具.手術用ガイドは,アクリル樹脂をミリング加工することで作成されるが,そのCAD/CAMソフトを作成中である.(3)手術支援用ジャイロ:ガイドが使用できない場合やガイドとの併用によって,さらに安全を求めた小型の手術用装置.シリコンジャイロを原理としており,手術中のインプラント埋入角度のズレや手ぶれなどの人的エラーを検知可能であるが,その小型装置も開発しつつある.申請時においては,スタディーモデルの3次元形態のデータと顎骨のCTデータを合成することで,コンピュータ画面上に具体的なイメージ画像を映写して,精度の高いインプラント埋入のシミュレーションが可能なソフトの開発を目的とした.結果,コンピュータシミュレーションはほぼ完成した.さらに,ソフトで有限要素解析を加えることにより,インプラントの力学的な安定性を予測できるソフトへ改良を手がけている.さらに,コンピュータシミュレーションに加えて,インプラントの外科手術までのトータルシステムとして,CAD/CAMによる手術用ガイドならびに手術支援用ジャイロも加えて,これらをベースとした基本的特許の申請を行った.以下にシステムの特徴を示すが,現在もシステム全体の研究を行っており開発中である.(1)コンピュータシミュレーション:模型データとCTデータの合成により金属のアーティファクトのない高い画像精度が得られ,安全な手術を可能とするシミュレーションソフトを開発できた.さらに,数値解析(有限要素法)によって予知性の高い安定したインプラントの埋入位置を予測可能なソフトへと修正中である.(2)CAD/CAMによる手術用ガイド:シミュレーションをCAD/CAMにより手術に反映させて,安全な手術の実行を目的する手術用治具.手術用ガイドは,アクリル樹脂をミリング加工することで作成されるが,そのCAD/CAMソフトを作成中である.(3)手術支援用ジャイロ:ガイドが使用できない場合やガイドとの併用によって,さらに安全を求めた小型の手術用装置.シリコンジャイロを原理としており,手術中のインプラント埋入角度のズレや手ぶれなどの人的エラーを検知可能であるが,その小型装置も開発しつつある.本研究においては、まずパイロット的に、下顎の臼歯部片側遊離端欠損の患者を選んだ。手術前に、口腔内の状態を通法の印象にて採得し、患者の口腔の模型(以下、スタディモデルとする)を採得した。同時に顎骨の形態を把握するためにCT撮影を行い、下顎骨のデータを採得した。患者のスタディーモデルを非接触型高速3次元形状計測装置により光印象(光切断法)にてデータの採得を行った。スタディーモデルより得られたデータは膨大な容量であるため、空間点群処理(間引き)を行う必要がある。そこで、現時点では手作業ではあるがデータの軽量化を行った。その軽量化されたスタディーモデルのデータとCTから得られた顎骨と歯の座標データとの重ね合わせを、手作業にて行い3次元表示した。この3次元表示は、バーチャルに口腔と顎骨の同時に表示するものである。従来、スタディーモデルを目で観察しただけでは顎骨の状態が全くわからないため、最終補綴の状態を予測したステントを作成し、ステントを装着した状態で顎骨のCT撮影を行い、そのCTデータをアナログ表示することにより顎骨の形態を把握し、インプラント植立位置を検討している。しかし、作業が一部マニュアルではあるものの、本システムにより3次元計測装置より得られた正確な口腔内の画像の下方に、CTより得られた顎骨データが重ね合わせられ、明確な口腔内と顎骨の関係を観察できたことは、今年度の研究実績といえる。現在、手作業で行ったスタディーモデルのデータの軽量化を、ある程度代表点を設定の手作業で設定だけであとは自動で軽量化するするアルゴリズムの確立を行っている。また、CTデータと軽量化したスタディーモデルのデータの重ね合わせに関しても、同じく自動化を試行錯誤している。昨年度に引き続き,同じく下顎臼歯部片側遊離端欠損の患者を研究対象とした.昨年は,口腔内印象後歯列模型(研究用模型)の光印象採得を行い非接触

型高速3次元形状計測装置により光切断法にてデータの採得を行い,そのデータを手作業で空間点群処理(間引き)を行い,本年度はその自動化を試みたが難しく確実な成果には至っていない.一方,顎骨のCTデータを歯列模型データの上に歯列データの重ねを手作業ではある昨年度は行った.本年度はその自動化を試みたが同じく誤りのない処理ならびに高速化にはまだ至っていない.しかし,精度の検証は行い,その誤差には問題は無かった.先の自動化よりもむしろ本年度の研究成果は,それは顎骨のCTデータと歯列のデータの重ね合わせデータにおいて,コンピュータ画面上でバーチャルに最終的な歯のワックスアップを行うことができた.歯冠形態は抜去天然歯牙を1歯あたり10本のデータを採得しその平均的外形を求めた.それを利用して,反対側の大きさ,ならびに臨在歯に調和するような大きさに拡大ならびに縮小を行った.この歯冠の下部にインプラントフィクスチャーを設定するのであるが,円筒型の外形のフィクスチャーをコンピュータモデル内で手作業の設定ではあるが可能となった.現在は,さらに,下顎運動(咀嚼運動)を加味しその運動で生じる応力解析を行えるのではないかと駆使している.また,バーチャルで行えたインプラントの植立からその植立を可能とする手術用ジグの開発を行ってる.
半導体レーザにおける直交偏光モードカオスの励起とその応用

本研究においては、端面発光半導体レーザと面発光半導体レーザに着目し、直交する偏光成分へ戻り光を施し直交偏光モードを励起することにより、新しいカオス発生の原理・ダイナミクスを明らかにする。さらに、励起されたカオス振動を光乱数発生やカオス秘匿通信におけるランダムマスクキャリアとして応用する方法について理論および実験的研究を行う。研究の結果、偏光回転により多様なカオス同期の形態が明らかになり、この原理に基づくセキュリティ鍵を新たに追加することができ、より高度で安全性の高いカオス通信が可能であることが示された本研究においては、端面発光半導体レーザと面発光半導体レーザに着目し、直交する偏光成分へ戻り光を施し直交偏光モードを励起することにより、新しいカオス発生の原理・ダイナミクスを明らかにする。研究の結果、偏光回転により多様なカオス同期の形態が明らかになり、この原理に基づくセキュリティ鍵を新たに追加することができ、より高度で安全性の高いカオス通信が可能であることが示された本研究においては、端面発光半導体レーザと面発光半導体レーザ(VCSEL)に着目し、直交する偏光成分へ戻り光を施し直交偏光モードを励起することにより、新しいカオス発生の原理・ダイナミクスを明らかにする。本年度は、送受信機半導体レーザ間においてTE-TM相互光結合するシステムにおけるカオス同期について理論的検討を行い、実際にカオス発振、カオス同期が起こることを確認した。そして、カオス同期として使う二つのレーザ間のパラメータミスマッチが同期精度に及ぼす影響について理論的検討を行った。また、これにより両レーザに信号をのせ、同時双方向通信が原理的に行えることを確認した。また、VCSELにおいては、基礎的な実験において、レーザをカオス化させることにより、直交する偏光モードの同時励起が可能になり、カオス同期が理論的にも実験的にも実現できることが示された。ただ、VCSELの場合には、端面発光半導体レーザに比べ、直交偏光モードの同時発振が容易に起こるため、発振偏光モード結合の組み合わせ多様にわたるため、次年度において偏光結合の仕方とカオス同期の精度などについて詳細な検討が必要とされることがわかった。次年度では、逆にこれらの組み合わせの複雑さを信号伝送の秘匿性として使う方法についても検討していきたい。本研究においては、端面発光半導体レーザと面発光半導体レーザ(VCSEL)に着目し、直交する偏光成分へ戻り光を施し直交偏光モードを励起することにより、新しいカオス発生の原理・ダイナミクスを明らかにする。端面発光半導体レーザの直交変更戻り光カオスの研究においては、直交偏光戻り光によりカオス化した送信機のTEモードをさらに偏光回転させ、受信機のTMモードへ光注入しカオス同期を達成させる方法について検討した。この方式では、結果的に弱いTMモード励起させるために、かなりの強光注入が必要となる。そのため、弱光注入で有効であったカオス・パス・フィルタリングによるメッセイジ秘匿が十分に行われず、秘匿通信において問題が発生することがわかった。一方で、偏光回転した半導体レーザ間でTE-TM結合を行わせるシステムにおいても、カオス同期を起こさせることがわかり、このシステムは量子暗号などのアルゴリズムである交渉鍵のような通信方式がギガHzレンジで行えることがわかった。また、最初に意図していなかったが、このシステムではカオス通信において問題となるカオス遅延情報を非常によく隠匿できることがわかり、カオスを使ったランダム物理信号発生において有効な信号であることが判明した。また、VCSELにおいて、本年度は対称配置を用いた二つの偏光回転カオス同期システムについて検討した。この結果、対称なシステム配置で数学的に完全型のカオス同期システムが構築できる予定であったが、実験では不可避な雑音の影響によって完全型カオス同期から光注入型のカオス同期に移行し、不安定動作することがわかった。この不安定性は、システムに非対称性を導入することにより回避されることも判明した。端面発光半導体レーザの直交偏光戻り光カオスの研究においては、本年度は双方向光注入に着目した。まず、偏向回転させない系において、双方向光注入の場合にお互いのレーザ間での引っ張り合いが生じ、カオス同期ができない状況が生じることがわかった。これは、本来対称な結合系であったものが、統計的な雑音とみなせる自然放出光によってその対称性が崩れた結果である。自然放出光がない場合に零遅延で完全同期が達成されるはずであったものが、自然放出光によって乱されたと解釈できる。このことは、理論と実験によって確認された。さらに、偏光回転した場合の結合についても理論的検討が進み、現在実験を計画している。端面発光半導体レーザに限らず、VCSELの相互結合においても自然放出雑音は同様な役割を果たしていることがわかった。

このような相互結合したレーザ間でのカオス同期と、これに基づく双方向信号伝送に基づいた秘匿信号処理についても検討を進めた。本年度予定の研究項目については、ほぼ最初の計画に沿って進めることができた。しかし、結果はすべて予測した通りの展開ではなく、今後研究の多少の軌道修正が必要であることが分かった。しかし、研究の過程で、これまでの予想とは異なる有用な結果も得られ、この点を伸ばすことにより、今後さらなる研究の展開が可能であることがわかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度に向けて、TE-TM偏光モード結合した端面発光半導体レーザとVCSELにおけるカオス発生と同期について、このシステムの特性を生かした方式について検討を行う。これまでの研究結果を踏まえ、偏光回転システムが得意とするカオス同期、カオス通信方式への応用を考える。特に、偏光回転によって発生するカオスでは、他のシステムでのカオス発生に比べRF領域で比較的フラットな広帯域カオスを作ることができるため、この領域でのホワイト雑音のような取扱が可能になる。この利点は、クリーンな物理ランダム信号発生などにおいて有望である。
がん転移に関与する分子とその制御機構

転移性の高い癌細胞がどのようにして生じてくるかは、はっきりとわかっていない。そのメカニズムは発癌の過程とは明らかに異なっており、遺伝子レベルの変化よりも転移性に関係のある細胞形質の発現と調節機構の変化に由来している可能性が高い。本研究では、細胞間相互作用に関係のある接着分子、細胞の移動性に関係のある細胞外分子、特にスキャッター因子と走化性因子、癌細胞による組織破壊に関係する酵素、転移巣に於ける癌細胞増殖に関係する成長因子、宿主の細胞接着分子の発現を制御するがん細胞由来のサイトカイン、に関する生物学的な機能と調節機構、癌転移性決定のメカニズム、及び癌の進行に伴う発現変化を追及した。その結果以下の項目が達成された。L-selectinの新しいリガンドの発見。抗L-selectin抗体によるin vivoにおける細胞交通の改変。MUC1ムチンの抗接着分子としての機能の解明。MUC1ムチンコアペプチドの生合成を制御する遺伝子上流配列の解明および転写因子の精製。遺伝子強制発現によるスキャッター因子レセプター発現細胞の設立。スキャッター因子レセプターとFGFレセプターのキメラ遺伝子の作製と、それを用いたスキャッター因子シグナル伝達メカニズムの解明。IGF-1のがん細胞増殖因子としての役割の解明。そのシグナル伝達分子の発見。IL8及びMCAFを強制発現した癌細胞の作製とこれが高転移性であることの証明。転移性の異なる細胞株の各種アミノペプチダーゼ活性の比較検討。IL12の抗転移作用の解明。血管新生因子のシグナル伝達メカニズムの解析。以上である。以上である。
ナビエ・ストークス方程式に従う流体中の渦運動の解析的および数値的研究

本研究ではナビエ・ストークス方程式に従う流体の運動を渦運動に着目して解析的及び数値的に調べた。まず、最も簡単で基本的渦面、すなわち平面状の渦面の運動についてその非線形の時間発展を解析した。この渦面は微小攪乱に対して不安定(Kelvin-Helmholtz不安定)であり、2次元の場合についてはこれまで多くの研究がなされてきた。本研究では、Mooreによってなされた非線形解析を3次元の場合に拡張して、小さいけれど有限の大きさの攪乱の3次元的時間発展を解析した。その結果、初期に滑らかな渦面が非線形ダイナミックスによって自発的に滑らかさを失い、2次元では存在しない渦の伸展効果に起因する、3次元固有の特異性を生じることを見いだし、その特異性の性質を明らかにした。大きな攪乱の時間発展については、その解析的取扱いは現在困難であるので、数値的に調べた。そのために、まず2重周期(空間について2方向への周期を持つ)グリーン関数の効率的計算法を開発し、それを用いて3次元的渦分布の性質を明らかにした。さらに、渦面の形が平面状以外の場合についても、ラグランジュ的視点から一般的に安定性解析が行なえる新しい方法を開発した。また、一般的な流れの場に置かれた渦糸の定常な形についての新しい知見を得た。その他、線形化作用素のスペクトル解析によって、非有界領域における非圧縮生粘性流体のエネルギーが時間的に減衰することを示し、その臨界指数を求めた。また、同方法と摂動法により漸近安定である外部定常解のクラスを提唱し、抵抗との関係を解明した。
固形癌の低酸素環境を標的とした新規分子標的治療法の開発研究

今回われわれは、固形癌は、その腫瘍内が正常組織に比べて嫌気的環境であることに着目し、新しい腫瘍選択的治療として嫌気性菌に遺伝子を導入する事を着想した。ビフィズス菌の一種Bifidobacteriumbreve( B. breve)に抗がん剤の前駆物質5FCを5FUに変換する酵素であるサイトシンデアミナーゼ遺伝子を導入しタンパク発現を確認した。さらに、担癌マウスへB. breveを全身投与した結果、腫瘍選択的成育性を証明した。われわれは、固形癌は、その腫瘍内が正常組織に比べて嫌気的環境であることに着目し、嫌気性菌を用いて、新しいドラッグデリバリーシステムとして遺伝子を導入する事を着想した。現在までに、ヒト常在菌であるBifidobacterium longum(B. longum)菌を、担癌動物に静脈内全身投与すると腫瘍組織でのみ特異的に集積・増殖することを証明している。本治療法は腫瘍内に存在する菌濃度とその菌が産生する抗癌生理活性物質の量が治療効果に直結する。腫瘍内の末梢血管や細胞の間隙等限られた空間において選択的に成育すると考えられるこれらの菌は、菌自体が占める体積も菌濃度を考慮する上で重要な因子である。Bifidobacterium breve(B. breve)は、brief(短い)から由来するその名の通り、他のビフィドバクテリウム属と比較して短い菌形が特徴の菌である。今回われわれは、B. breveを用いたBEST-CD療法実現の可能性を検討する目的で、B. breveへのプラスミド導入とCDタンパクの発現系を確立し、担癌マウスへB. breveを全身投与した結果、腫瘍選択的成育性を証明した。現在までに、ヒト常在菌であるBifidobacterium longum(B.longum)菌を、担癌動物に静脈内全身投与すると腫瘍組織でのみ特異的に集積・増殖することを証明している。今回われわれは、Bifidobacterium breve(B.breve)を用いたBEST-CD療法実現の可能性を検討する目的でB.breve I-53-8w株にプラスミドpAV001-HU-eCDを導入。ウェスタンブロット解析にて組換え菌Bbr11-eCDのCDタンパク発現を確認した。さらに、プラスミド安定性試験で、50世代培養後も組換えB.longum菌に比べBbrll-eCDにおけるプラスミド保持率が100%であることを証明した。さらに担癌マウスへB.breveを全身投与した結果、腫瘍選択的成育性を証明した。B.breveは、他のビフィドバクテリウム属と比較して短い菌形が特徴の菌であり、BEST-CD療法の安全性を向上させる意義が高いと考えられる。
自食胞形成とその特異的融合過程の分子生物学的研究

最近我々が見いだした酵母における活発な自食作用の分子レベルでの理解のための研究の緒が開かれた。本年度の主なる成果は以下の通りである。(1).自食作用胞がその外膜と液胞膜との融合の結果生じるオ-トファジックボディの蓄積条件として、最も重要な要因は液胞内プロテイナ-ゼBの欠損であることを、遺伝学的解析及びPRB遺伝子の被壊実験により明らかにした。(2).液胞内プロテイナ-ゼ欠損株を用して、オ-トフィジックボディを多数蓄積した液胞を単離する条件を確立した。(3)、オ-トフィジックボディの蓄積に伴い、細胞質の指標酵素であるG6PDHの潜在性の活性が経時的に液胞内に増加することが明らかとなった。(4)自食作用により取り込まれた細胞質成分の生化学的な分析により、栄養飢餓によって誘導される分解が非選択的であることが強く示唆された。(5).ミトコンドリアも又自食作用によって液胞内へと一定の割合で取り込まれることが生体染色によって明らかとなった。(6).オ-トファジックボディに特異的に現われる膜タンパク質を、二次元電気泳動法によって同定することに成功した。このタンパク質を指標として自食作用胞の起源とその誘導条件を分子生物学的に追跡することが可能となった。(7)自食作用の瞬間凍結・凍結置換法により電子顕微鏡観察から、自食作用における膜の動態に関するモデルを提出した。液胞の欠損株を用いることにより、自食作用胞と考えられる細胞内二重膜構造が自食作用の確かに中間体であることが明らかとなった。本年の設備備品費として計上されたプログラムテンプコントロ-ルシステムは遺伝子のクロ-ニング等に極めて有効に用いられている。本年度の成果は現在J.Ceu Biol.に一報、J.Biol.Chemに2報の論文として投稿準備中である。
スピンカオス運動による磁気損失とノイズ

磁壁のカオス運動に関する実験結果と非線形スピン動力学モデルによるシミュレーション結果とを比較した。磁壁は、外部磁界の大きさと周波数により、一つの束縛ポテンシャル内においても、また複数のポテンシャル間のいずれでも、不規則で複雑なカオス運動を行う。シミュレーションにおいても同様な運動が再現できた。しかし、実際の試料では、複数の磁壁が存在する事と試料の大きさが有限であるためのエッジ効果が運動に影響する。したがって、運動の時系列に関する実験とシミュレーション結果の定量的な一致に関する十分な精度を得るため、上記の点を考慮した更なるモデルの改善が必要であることがわかった。磁性体の磁気損失とカオス運動については、規則運動と比較してカオス運動の方の損失が大きい場合と小さい場合の二通りある事がわかった。すなわち、外部磁界の周波数を増加させていった場合、規則運動から間欠ルートによってカオス運動になるときは、カオス運動の方が損失が大きくなる。一方、さらに外部磁界の周波数を増加させていった場合、カオス運動が周期性の窓と呼ばれる規則運動領域に入り、規則運動状態のほうが損失が大きくなる。この規則性の窓の領域では、外部磁界の周波数増大とともに周期倍分岐が起きて、やがてまたカオス運動となる。この時は、カオス運動の方が、損失が小さくなる。このような複雑な損失現象の原因を明らかにするため、カオス状態の時のリターンマップを作成し、位相空間での固定点の分布を調べた。この結果を用いて、磁壁運動をOGY法により制御し損失の分析を行い、損失の低減方法に関して、一定の見通しが得られた。これらの成果を第8回3M-Intermag合同国際会議で発表し、この分野の世界的な権威者であるP.E.Wigen教授や研究者と討議して、世界的な視野からの評価を受けた。計算機シミュレーションにより、磁壁が規則的な運動をする領域とカオス運動する領域とをパラメータ空間において予想した。磁壁運動を支配するパラメータには、磁壁質量、制動係数、復元力係数、外部磁界振幅と周波数があげられる。工学的に最も重要な制御パラメータである外部磁界の振幅と周波数からなる2次元空間では、カオス運動領域と規則運動領域が交互に現れることがわかった。また、磁性材料の種類に依存する復元力係数と磁界振幅からなる2次元空間においても、カオス運動領域が、規則運動領域の中に分布することが、明らかになった。これらの領域図により、デバイスのノイズや誤動作を避けるための設計に役立つ基礎資料が得られた。次に磁壁の運動に重要な関連を持つ、磁壁の微細構造を調べるため主要設備である磁気力顕微鏡ヘッド(MFMヘッド)を購入し、立ち上げを行った。この装置により磁壁が、ブロッホ磁壁かネール磁壁かを、またブロッホラインの数と配置について調べた。また、材料中のポテンシャルの変動の測定を行った。これらの予想とデータに基づいて、磁壁を外部磁界により駆動し、運動を調べた。周波数が低い領域では、磁区観察装置を用いて実際の磁壁運動の位置と速度を観察した。高周波数領域では、磁壁の運動をリアルタイムで観察することは困難なので、磁壁運動の振幅を計測し、運動状態を推測した。以上により、次年度の目的である、高精度の磁壁運動モデル構築のための基礎資料が得られた。

したがって、運動の時系列に関する実験とシミュレーション結果の定量的な一致に関する十分な精度を得るため、上記の点を考慮した更なるモデルの改善が必要であることがわかった。磁性体の磁気損失とカオス運動については、規則運動と比較してカオス運動の方の損失が大きい場合と小さい場合の二通りある事がわかった。すなわち、外部磁界の周波数を増加させていった場合、規則運動から間欠ルートによってカオス運動になるときは、カオス運動の方が損失が大きくなる。一方、さらに外部磁界の周波数を増加させていった場合、カオス運動が周期性の窓と呼ばれる規則運動領域に入り、規則運動状態のほうが損失が大きくなる。この規則性の窓の領域では、外部磁界の周波数増大とともに周期倍分岐が起きて、やがてまたカオス運動となる。この時は、カオス運動の方が、損失が小さくなる。このような複雑な損失現象の原因を明らかにするため、カオス状態の時のリターンマップを作成し、位相空間での固定点の分布を調べた。この結果を用いて、磁壁運動をOGY法により制御し損失の分析を行い、損失の低減方法に関して、一定の見通しが得られた。磁壁のカオス運動に関する実験結果と非線形スピン動力学モデルによるシミュレーション結果とを比較した。磁壁は、外部磁界の大きさと周波数により、一つの束縛ポテンシャル内においても、また複数のポテンシャル間のいずれでも、不規則で複雑なカオス運動を行う。シミュレーションにおいても同様な運動が再現できた。しかし、実際の試料では、複数の磁壁が存在する事と試料の大きさが有限であるためのエッジ効果が運動に影響する。これらの成果を第8回3M-Intermag合同国際会議で発表し、この分野の世界的な権威者であるP.E.Wigen教授や研究者と討議して、世界的な視野からの評価を受けた。
超音波分光法による環境低負荷型水系セラミックス湿式製造プロセスの基礎的研究

本研究は情報化社会に欠くことの出来ない電子材料用セラミックスの新規な水系製造プロセス開発の基礎研究として位置づけられるもので,具体的には低環境負荷型セラミックス製造プロセスの設計指針を提案することを目的としている.対象とするセラミックスはアルミナおよびチタン酸バリウムで,1)分散性制御の際に重要な因子となる粒子表面特性の評価法として電位差滴定法を,2)製品としての薄膜特性やスラリーの粘性制御に必要な情報となるスラリー中の粒度分布の評価法に超音波減衰分光法を、それぞれ用いている点が本研究の最大の特徴である。とくに後者の超音波減衰分光法は実際の製造プロセスと同じ粒度濃度である高粒子濃度系のまま希釈することなしに粒度分布が測定できる新しい手法で,このようなプロセス開発の研究に本手法が用いられて成果が公表されるのは世界的にも例がなく、多くの新規な知見が得られた画期的な試みであると自負している.いかに平成1213年度に行った研究により得られた成果を箇条書きに示す.1.アルミナ微粒子の特性評価...アルミナ基盤用の原料には微量のアルカリ土類金属が含まれているが,元々表面に存在水酸基の量とそれらの酸・塩基的性質、さらには表面に存在するアルカリ土類等の微量元素が分散性に与える影響を明らかにする事が出来た.また,その際用いた電位差滴定法はロット間の微小な差を区別する方法としても活用できることが明らかとなった.2.チタン酸バリウム微粒子の表面特性評価...チタン酸バリウムから溶出するバリウムイオンのpH依存性や分散剤添加量依存性を明らかにする事が出来た.その結果,粒子の分散性を維持しつつバリウムイオンの溶出を抑えることの可能な添加量は微粒子表面を半分程度分散剤高分子が覆っている条件であることが分かった(申請費で購入した原子吸光分光光度計の活用による成果).また、粒子の分散性の指標としてよく測定されるゼーター電位や等電点の測定方法には誤りがあることが判明した。上記の分散剤の影響に関する研究は、この測定法の誤りを考慮したもので、今後のこの分野の研究に対してひとつの重要な方向性を示すものと思われる。3.非水系溶媒から水系溶媒に転換して行く際に問題となるのが,バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオンの溶出を抑えながら,微粒子を解逅・分散する技術の指針確立である.本研究では超音波減衰分光法を用いることでin situで分散性を評価でき結果,スラリーの粘性は粒度分布とあまり関係がなく,粒子表面の分散剤高分子のコンフォメーションに注目すれば良い事が判明した.このことから上記問題点である指針の確立も基本的には微粒子表面の高分子のコンフォメーション制御に注目すれば良いことと結論づけられた.今年度は複数種の分散剤高分子を用いて試験を行ったが,カルボキシル基のような微粒子表面にアンカーを下ろす官能基の数がコンフォメーションを制御する因子の1つである事が分かった.本研究は情報化社会に欠くことの出来ない電子材料用セラミックスの新規な水系製造プロセス開発の基礎研究として位置づけられるもので,具体的には低環境負荷型セラミックス製造プロセスの設計指針を提案することを目的としている.対象とするセラミックスはアルミナおよびチタン酸バリウムで,1)分散性制御の際に重要な因子となる粒子表面特性の評価法として電位差滴定法を,2)製品としての薄膜特性やスラリーの粘性制御に必要な情報となるスラリー中の粒度分布の評価法に超音波減衰分光法を、それぞれ用いている点が本研究の最大の特徴である。3.非水系溶媒から水系溶媒に転換して行く際に問題となるのが,バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオンの溶出を抑えながら,微粒子を解逅・分散する技術の指針確立である.本研究では超音波減衰分光法を用いることでin situで分散性を評価でき結果,スラリーの粘性は粒度分布とあまり関係がなく,粒子表面の分散剤高分子のコンフォメーションに注目すれば良い事が判明した.

このことから上記問題点である指針の確立も基本的には微粒子表面の高分子のコンフォメーション制御に注目すれば良いことと結論づけられた.今年度は複数種の分散剤高分子を用いて試験を行ったが,カルボキシル基のような微粒子表面にアンカーを下ろす官能基の数がコンフォメーションを制御する因子の1つである事が分かった.本研究では,情報化社会に欠くことの出来ない電子材料用セラミックスの新規な水系製造プロセス開発の基礎研究として,低環境負荷型プロセスの指針を提案することを目的としている.対象とするセラミックスはアルミナおよびチタン酸バリウムで,主に表面特性評価法として電位差滴定法を,スラリー中の粒度分布評価法として超音波減衰分光法を用いて研究を行った.とくに後者の超音波減衰分光法は実際の製造プロセスで用いられているような粒子濃度が非常に高いスラリー中であっても希釈することなしに粒度分布が測定できる新しい手法で,このようなプロセス開発の研究に本手法が用いられて成果が公表されるのは世界的にも例がないものと自負している.以下に測定項目ごとに得られた成果をまとめる.1.セラミックス微粒子表面のキャラクタリゼーション(1)アルミナの表面特性評価・・・一般に酸化物表面には水酸基が存在し,それらは酸・塩基的挙動を示す.この酸・塩基的性質は微粒子-水溶液二相系に対してアルカリを添加する毎にpHを測定するpH電位差滴定法によって評価できる.純度,組成,1次粒子径がほぼ同じ2種類のアルミナ微粉末に対しキャラクタリゼーションを行った結果,大きな差を見出すことができた.この結果を踏まえて複数のロットが異なる原料粉末を入手し,同様にpH滴定法で評価するとこの場合でも表面特性の違いが検出できた.(2)チタン酸バリウムの表面特性評価・・・上述のアルミナと同様の評価をチタン酸バリウム粉末に対しても行った.以前より粒子分散性のパラメータとしてゼーター電位やそれがゼロになるpHとして知られている等電点が報告されているが,まず測定法に誤りがあることが見出された.本研究ではその点を改良し適正な特性評価が出来る方法論を確立するところまでは完成させることができた(2001年度セラミックス協会年会にて発表予定).現在,複数種の原料の評価を行っているところである.さらに本年度申請費で購入した原子吸光分光光度計を用いて機能特性上問題となるバリウムイオン溶出のpH依存性を調べた結果,表面の酸・塩基特性と溶出量とに強い相関性があることが見出された.2.セラミックス微粒子表面への分子認識能の付与プロセス(途中経過報告)粒子を分散させるために添加する分散剤の添加量と表面吸着密度,分散性,スラリー粘度,成形体の特性との相関性を調べた.
6番染色体長腕に位置する新たなリンパ腫関連遺伝子TFLの機能解析

1.TFL遺伝子・蛋白の発現解析:マウスでは脾臓で最も強い発現が認められ、T細胞、B細胞の間に発現の差はみられなかった。悪性リンパ腫の臨床検体においては、T細胞性、B細胞性いずれでも発現を認めた。しかし症例により高発現から低発現まで大きな差が見られ、TFLが特定のリンパ腫の発症や病態の変化に関与している可能性が示唆された。またペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作成し、TFL蛋白を認識することを確認した。2.TFLと細胞増殖:BaF3細胞にTFL/GFP発現ベクターを導入してTFLを過剰発現させることにより、BaF3細胞の増殖は抑制されGFPの発現が減少した。またTFL導入群では有意にチミジンの取り込み低下が認められた。すなわちTFLの増殖抑制機能が示唆された。3.TFLの細胞内局在:このベクターをNIH3T3細胞に導入し二重蛍光染色でTFL蛋白の細胞内局在を解析したところ、主に核内に存在しており、さらにDNAの集積が疎な部分に核内の局在が偏っていた。4.TFL変異体の機能:TFLはC末端領域にzinc finger motif(Zn)を有している。Znを欠失させたTFLZn-/GFPベクターを構築し、上述の実験を行った。TFLZn-を導入したBaF3細胞では増殖の抑制が解除され、コントロールとほぼ同様の細胞増殖を示した。さらに核内に局在化していたTFLは、その局在化は見られなくなった。つまりZnはTFL機能発現において必須のmotifであり、Znを介してその機能を発揮することが示唆された。5.ノックアウトマウスの作成:TFL遺伝子の翻訳開始コドンがあるエキソン2を含む領域を、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたターゲッテイングベクターを作成してES細胞に導入し、相同組み換えES細胞を樹立した。ES細胞のスクリーニングを行い、インジェクションの結果キメラマウスが得られた。現在F1マウスの交配を作成しており、個体レベルでのTFLの解析を行う方針である。1.TFL遺伝子の発現解析マウスの正常組織では脾臓で最も強いTFL遺伝子の発現が認められた。しかし脾臓のT細胞、B細胞では、両者の間に発現の差はほとんどみられなかった。ヒトの末梢血リンパ球についても、B細胞、T細胞それぞれに同程度にTFL遺伝子は発現していたが、CD34陽性細胞では発現は弱かった。しかし症例により高発現から低発現まで大きな差が見られ、TFL遺伝子が特定のリンパ腫の発症や病態の変化に関与している可能性が示唆された。2.TFL蛋白の発現解析ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体を作成し、ウエスタンブロット法でTFL蛋白を認識することを確認した。その後TFL遺伝子は数種の遺伝子とfamilyを形成していることが判明したため、より特異的な配列を用いて新たな抗体を作成中である。3.血液細胞株へのTFL遺伝子導入またはノックダウンによる機能解析BaF3細胞にTFL遺伝子を組み込んだGFP発現ベクターを導入した。TFLを一過性に過剰発現させることにより、BaF3細胞の増殖は抑制された。

またこのベクターをNIH3T3細胞に導入し二重蛍光染色でTFL蛋白の細胞内局在を解析したところ、主に核内に存在することが明らかとなった。次にTFL遺伝子をsiRNAを用いてノックダウンするために、BaF3の代わりに最も発現の強い脾細胞を用いた。ノックダウンの効率は定量RT-PCRにて確認中である。4.TFL欠失ES細胞株の樹立マウスTFL遺伝子の翻訳開始コドンがあるエキソン2を含む領域を、ネオマイシン薬剤耐性遺伝子に置き換えたターゲッテイングベクターを作成した。これをES細胞に導入し、TFL遺伝子の欠失の有無をサザンブロットでスクリーニングして相同組み換えES細胞を樹立した。1.TFLと細胞周期:ヒトのTFLとGFPの融合遺伝子を発現するベクターを構築し、TFLを発現していないマウスpro-B細胞株BaF3に遺伝子導入した。するとTFLを導入した細胞はGFPの発現が減少した。これらの細胞でチミジンの取り込みを調べたところ、TFL遺伝子導入群で有意に取り込み低下が認められた。またBrdUの解析において、細胞同調後のアッセイではTFL導入群においてG0/G1期の細胞を多く認め、S期の細胞は有意に減少していた。これらの結果から、TFLはリンパ球のG1期からS期への移行を抑制し、細胞をG1期に留めておくことが明らかになった。2.TFLの細胞内局在:TFL/GFP融合ベクターをNIH3T3細胞に導入し、発現の局在化の有無を共焦点蛍光顕微鏡にて観察したところ、明らかにTFLは核に集積していた。またHoechest33342によるDNAとの二重染色において、DNAの集積が疎な部分に核内の局在が偏っていることも示した。3.siRNAによるTFLのノックダウン:ヒト、マウスのTFLに対して、ノックダウン効率の良いsiRNAをリアルタイムPCRで確認し、最も優れたsiRNAにAlexa488の蛍光標識を行い追跡できるようにした。このTFL siRNAをマウスの脾臓細胞に導入しCD3,CD28でT細胞を刺激したところ、細胞の増殖を抑制できることを確認した。4.TFL変異体の機能:TFLはC末端領域にzinc finger motif(Zn)を有している。そこでZnを欠失させたTFL(TFLZn-)/GFPベクターを構築し、上述の実験を行った。するとTFLZn-を導入したBaF3細胞では増殖の抑制が解除され、コントロールとほぼ同様の細胞増殖を示した。さらに核内に局在化していたTFLは、その局在化は見られなくなった。つまりZnはTFL機能発現において必須のmotifであり、Znを介してターゲットの核酸に結合することでその機能を発揮することが示唆された。5.TFLノックアウトマウスの作成:ターゲッテイングベクターの作成からES細胞のスクリーニングを終了し、インジェクションの結果キメラマウスが得られた。現在F1マウスの交配を作成しており、個体レベルでのTFLの解析を行う方針である。