hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
VEGF/VEGFR2経路遮断による制御性T細胞誘導抑制と腫瘍内集積制御

免疫系を負に制御する制御性T細胞(Treg細胞)は、種々の癌組織に集積し局所での抗腫瘍免疫を抑制していると考えられる。したがって、癌組織におけるTreg細胞集積を抑制すれば抗腫瘍免疫が高まると期待される。しかし、治療標的となる特異性の高い細胞表面発現分子は見当たらない。我々は、(1)免疫抑制機能の高いTreg細胞にVEGFR2が選択的に発現していること、(2) VEGFR2陽性Treg細胞が末梢血より癌組織中に豊富に存在すること、(3) VEGFR2抗体であるアバスチンがin vitroの系においてVEGFR2陽性Treg細胞の遊走を抑制すること、(4)大腸癌組織におけるVEGFR2陽性Treg細胞が無病生存期間および全生存期間の独立した予後不良因子であることなどを明らかにした。これら結果は、VEGFR2陽性Treg細胞が抗腫瘍免疫を負に制御しており、免疫療法の効果を高めるための治療標的となることを示唆している。本年度の研究計画と成果は次のようである。1.リンパ球におけるVEGFR2発現プロファイル作成:2. VEGFによるTreg細胞の誘導:VEGFR2陽性および陰性CD4+T細胞をセル・ソーターにより分離し、遺伝子組み換えVEGFによるTreg細胞誘導に及ぼす影響を解析した。用いたVEGF濃度(50-200mg/mL)では、VEGFR陰性細胞からのTreg細胞の誘導は確認されなかった。また、VEGFR2陽性細胞数の有意な増加は認められなかった。しかし、VEGF産生肝癌細胞との共培養でVEGFR2陽性T細胞が増加し、抗VEGF抗体であるアバスチンで抑制される症例があることから、現在、内因性VEGFの系を用いて追加実験中である。3. VEGFによるVEGFR2陽性Treg細胞の遊走試験:セル・ソーターによる分離したVEGFR2陽性CD4+T細胞および陰性CD4+T細胞を用いて、チャンバー法にて遊走試験を繰り返しているが、遊走亢進の場合と抑制の場合があり、一定の結果が得られていない。したがって、Treg細胞の遊走因子を下室に添加した系で同様の実験を継続中である。4.次年度の前倒し:1)手術摘出大腸癌組織をFOXP3およびVEGFR2の蛍光二重免疫組織染色し、VEGFR2陽性Treg細胞の浸潤を定量的に解析中である。現時点では、末梢血に比べ組織中ではVEGFR2+FOXP3+リンパ球の比率が高い傾向を示している。2) VEGFR2陽性Treg細胞の生物学的役割を推測するために、免疫細胞療法施行中の症例における臨床効果との関連解析をスタートした。本年度の研究計画に沿って成果の概要を順に記述する。1.手術時摘出大腸癌組織における浸潤Treg細胞上のVEGFR2発現解析。昨年度我々が開発した半定量的な蛍光免疫組織染色法(Kai et al、論文投稿中)を用いて、大腸癌組織に加え、胸腺、リンパ節におけるVEGFR2陽性Treg細胞の分布を解析した。その結果、末梢血中のTreg細胞に比べ胸腺、リンパ節および大腸癌組織においてVEGFR2陽性Treg細胞比は有意に高いという結果を得た。これは、Treg細胞の大腸癌組織への集積におけるVEGFR2の関与を支持するデータである。また、前年度確認することができなかった、アバスチンによる遊走能の抑制を確認した。2.大腸癌組織におけるVEGF発現とTreg細胞数の相関関係。大腸癌組織におけるVEGF発現症例のVEGFR2発現の程度(発現面積、発現強度)とVEGFR2陽性Treg細胞数との関連を解析したが、現時点において有意の相関は得られていない。現在、標本数を増やし再検討に入っている。3.VEGF産生腫瘍移植免疫不全マウスにおける投与Treg細胞の腫瘍局所への集積の確認。VEGFR2陽性Treg細胞の回収に難渋しており、本実験は来年度引き続き実施する。3.の実験が遂行できなかったため、並行して、大腸癌組織におけるVEGFR2陽性Treg細胞数と予後の解析を実施した。興味ある事に、新たな予後予測因子としての可能性を示唆する結果が得られつつある。また、新たにVEGFがVEGFR2陽性Treg細胞の生存期間を延長する可能性や、低酸素状態において樹状細胞がVEGFR2陽性Treg細胞を誘導する可能性を示すデータが新たに得られた。

本年度は、抗VEGF抗体であるアバスチン投与患者によるTreg細胞数と予後を通して臨床的意義を解析する計画であった。以下、本年度に得られた新たな成果を記述する。10症例の集積を想定していたアバスチン投与大腸がん症例数は予想数を越えたが、免疫療法などの併用症例の増加により、評価可能症例が4症例に留まり当初の本年度計画は達成できなかった。具体的には、解析可能であった4例中3例の末梢血Treg細胞に明らかなVEGFR2発現が確認され、うち2例においてアバスチン投与後末梢血Treg細胞数の減少が認められた。しかし、治療経過との関連解析はできなかった。
人口減少化社会における被規制企業のコストマネジメントに関する実証的研究

本研究の目的は、人口減少化社会を迎えた日本における被規制企業のコストマネジメントに関する実証研究を行うことであった。この目的を達成するために、英国、スペイン、およびオーストラリアの現地調査を行った。また、米国とインドネシアから研究者を招聘し、勉強会を開催した。これらの調査結果をもとに、まず日本の水道事業のデータを使用した市町村合併が技術効率性に与えた影響に関する実証分析を行い、推計の結果、合併の効果の存在を明らかにした。次に、日本の損害保険業における範囲の経済性に関する実証分析を行い、推計の結果、範囲の経済性が存在し、特に労働節約的な技術進歩ならびに物件費利用的な技術進歩が確認された。本研究は、人口減少化社会を迎えた日本における被規制企業のコストマネジメントに関する実証研究を行うことを目的としている。我々の研究グループは、まずオーストラリアの規制産業に関する調査および有識者へのインタビューを行うためブリスベンにあるGriffith Universityを訪問した。次に、インドネシアの規制産業に関して聞き取り調査を行うため、ジャカルタにあるGadjah Mada Universityから研究者を招聘し、近畿大学にいて勉強会を開催した。さらに、日本の水道事業における近年の現状と今後の制度変更の方向性に関して、厚生労働省健康局水道課課長補佐松田尚之氏にインタビュー調査を行った。また、我々の研究グループではこれまでにも金融、保険、公益事業分野などの規制産業における実証分析に取り組んできており、その過年度分のデータに対して今年度取得・購入することができた最新データの追加入力作業を随時行ってきた。以上、平成26年度の研究実績として本研究プロジェクトは諸外国の規制産業に関する調査を中心に予定通り進められており、次年度に向けて順調に情報収集と実証研究の事前準備が行われている。本研究は、人口減少化社会を迎えた日本における被規制企業のコストマネジメントに関する実証分析を行うことを目的としている。我々の研究グループは平成27年度においてまず、米国ウィスコンシン大学ビジネススクール(Wisconsin School of Business)よりElla Mae Matsumura氏を招へいしコストマネジメントに関する研究に対して貴重な意見を得ることができた。また、分担研究者の浦上は日本の上下水道事業の実態調査として熊本県熊本市上下水道局においてインタビュー調査を行った。浦上は安酸と共に現在水道事業におけるコストマネジメントに関する実証研究に取り組んでおり、データベース(水道統計)を直近のものまですべて入手し、データセットの構築を終えたところである。今後、分析モデルの設定および計算を行い、平成28年度中には論文として取りまとめを行う。一方、稲葉を中心とする浦上および中岡のグループはすでに損害保険業における範囲の経済性および損保・生保間の相互参入に関する実証分析に取り組んでおり、これは現在英語論文として取りまとめを行っているところである。以上、平成27年度の研究実績として本研究プロジェクトは予定通り進められており、次年度は早期に論文化を行い、研究成果の発表を行っていく計画である。今年度は米国からの研究者の招へいおよびコストマネジメント分析のための情報収集が行われ、水道事業および損害保険事業・生命保険事業におけるデータベースの収集が完了したところである。さらに、これらデータベースを使用した実証分析に着手したところであり、本研究プロジェクトはおおむね順調に進展している。我々の研究グループは平成28年度において、まず近畿大学において水道事業研究セミナーを開催し、水資源機構経営企画部熊谷和哉氏、立命館大学清水聡行氏、桃山学院大学田代昌孝氏を招いて研究発表および講演を実施した。本研究セミナーにおいては学術的な研究成果を実務界へといかにフィードバックしていくか等についてもディスカッションを行った。また、研究分担者の浦上はスペインのナバラ国立大学を訪問し、ナバラ国立大学経済経営学部Pablo Arocena教授と英国ラフバラー大学経済学部David Saal教授へインタビュー調査を行った。本調査では日本の水道事業のデータを使用した市町村合併が技術効率性に与えた影響に関する実証分析について議論した。一方、稲葉を中心とする浦上および中岡のグループは日本の損害保険業における範囲の経済性および生損保の相互参入に関する実証分析に取り組んでおり、その研究成果の一部として2017年3月にイスラエルのテルアビブで開催された7th Economics & Finance Conferenceにおいて中岡による論文発表が行われた。さらに、中岡と上小城による研究成果として2017年3月に近畿大学『商経学叢』第63巻第3号において論文「多角化戦略の動機とその経済的帰結に関する既存研究の検討」を発表、安酸は2017年6月に出版予定の編著『販管費の理論と実証』(中央経済社)において研究成果の一部を公表する予定である。以上、平成28年度の研究実績は予定通り順調に進められている。また、本研究プロジェクトによって得られた研究成果の一部についても今年度から公表しており、今後も継続して研究成果を発表していく予定である。

今年度は、オーストアリアへの訪問調査とインドネシアからの研究者招聘による海外の情報収集および国内での有識者へのインタビュー調査、さらには実証分析の行うためのデータ収集が行われており、本研究プロジェクトはおおむね順調に進展している。平成28年度は研究成果発表を目指しており、まずは早期に実証分析を完了させ論文化の作業を行う計画である。また、損害保険事業における実証分析はおおむね方向性が定まった段階であり、英語論文として取りまとめが完了した段階でしかるべき学会もしくはワークショップにて研究成果の発表を行っていく計画である。保険論平成26年度に引き続き、文献調査およびデータ収集を行う。また、平成26年度の調査等で得た情報をもとに、海外からの研究者の招聘や国内規制産業の実務家へインタビュー調査も継続して行う。研究の進捗状況によっては、英語論文の校正費用として10万円相当の支出が予定されていたが、実証分析が年度末にかけて修正を余儀なくされたため英語論文の初稿完成にまで至ることができなかった。したがって、校正費用分を次年度に使用する。平成27年度4月に計画をしている海外からの研究者招聘費用が当初予算を上回ることが判明したため、今年度予算の未使用分を次年度に向けて使用する。水道事業および損害保険事業・生命保険事業の実証分析を英語論文として取りまとめ海外の学会もしくはワークショップにおいて報告する計画である。そのための英語論文の校正費用として使用する予定である。平成27年4月6日19日の14日間、アメリカのUniversity of Wisconsin-Madisonから研究者を招聘し、神戸大学、立命館大学、早稲田大学においてワークショップや講演会を開催する計画があり、その招聘費用として使用する予定である。
ゲノム編集を用いた多重変異体の作出による機能未知配糖体化酵素の生理的役割の解明

植物中の有用二次代謝産物であるリグナン類については,その代謝関連遺伝子に関する情報が未だ十分に得られていない.研究代表者等はリグナン類の網羅的定量系を確立し,シロイヌナズナに適用した..本研究では,近年注目を集めているゲノム編集技術TALEN (transcrption activator-like effector nuclease)を用いて,シロイヌナズナ中のリグナン類の配糖体化酵素を明らかにすることを目的とし,このための形質転換体の取得を行なった.変異体などの解析からシロイナズナのUGT71C1はリグナン類のピノレジノールとラリシレジノールを基質とすることを明らかにした.本研究では,ゲノム編集技術として近年注目を集めているTALENs (transcription activator-like effector nucleases)を用いて,シロイヌナズナ中で植物の有用二次代謝物であるリグナン類の生合成に関わると想定される配糖体化酵素UGT71Cサブファミリーの生理的機能を明らかにすることを目的とする.UGT71Cサブファミリーのうち,UGT71C1およびUGT71C2は二番染色体上に,UGT71C3, UGT71C4,および, UGT71C5は一番染色体上に,いずれもタンデムに座位している.従って,従来の方法では,多重変異体の取得が困難であった.植物の染色体上には,これらのように機能が重複していると考えられる遺伝子群が隣接して存在する例が多数知られており,ゲノム編集技術によってこれらの解析が可能であることを示すことで,植物二次代謝研究への貢献が期待できる.本年度は,UGT71C1ーUGT71C5の五遺伝子のORFすべてについてエントリーベクター,および,大腸菌での発現ベクターの構築を終了した.さらに,これらの遺伝子産物を大腸菌内で発現させた.UGT71C1以外の遺伝子産物については,可溶性画分での発現が確認できなかったものの,不溶性画分における発現が確認できた.また,UGT71C1,および,UGT71C2をノックダウンするためのTALENsを導入するためのベクター二種の構築を終了した.アグロバクテリウムを介したフローラルディップ法により,これらのTALENsをシロイヌナズナに導入した.薬剤耐性マーカーを用いて,それぞれの形質転換体を取得した.これまでに,複数のT0ラインからT1種子を採取した.今後これらの形質転換体の代謝分析を進める.リグナンは植物に特徴的なフェノール性の二次代謝産物であり,その多様な生理活性から産業利用が期待されている.しかし,他の植物二次代謝産物と比較すると,リグナンの代謝については不明な点が多く代謝工学という観点からは情報が不足している.多くの二次代謝産物がそうであるように,リグナンも通常植物の細胞中では配糖体として蓄積している.従って,有用リグナンを代謝工学によって増産するには,リグナン配糖化酵素の制御が必要である.そこで本研究では,モデル植物であるシロイヌナズナ中でリグナンの配糖化に関わる酵素を明らかにすることを目的とする.申請者らはこれまでにリグナンの配糖化活性をもつ酵素UGT71C1をシロイヌナズナ中に見出している.その欠損変異体においてはリグナン量の有意な変化が確認できたが,変化量としては僅かなものであった.この原因として同じサブファミリーに属するUGT71C2からUGT71C5の四つの酵素がそれぞれの機能を重複させて働いていることが考えられた.しかし, UGT71C1およびUGT71C2,ならびに,UGT71C3からUGT71C5はそれぞれ染色体上で隣接して座位しているため従来の分子遺伝学の手法では,多重変異体を取得することが困難であった.そこで,本研究ではゲノム編集技術を使ってその多重変異体を取得することにした.UGT71C1とUGT71C2の共通配列を認識するように設計したTALENsを組込んだベクターをアグロバクテリウムを介してシロイヌナズナに導入した.得られた形質転換体についてPCRにより変異の有無を確認した.今後,二重変異体についてリグナンのプロファイリングを行い,UGT71C1およびUGT71C2の役割を明らかにする予定である.当初予定していたUGT71C1とUGT71C2の二重変異を有する形質転換体が得られつつある.一方,UGT71C5について他の研究グループにより,この酵素が乾燥ストレスなどに応答するための植物ホルモンであるアブシジン酸の代謝に関与することが報告されたため,今後作成するUGT71Cの多重変異体においてアブシジン酸の測定が必要となった.本研究では,ゲノム編集技術として近年注目を集めているTALENs(transcription acctivator-like effector nuclease)を用いて,シロイヌナズナ中で植物の有用二次代謝産物であるリグナン類の生合成に関わると推定される配糖体化酵素UGT71Cサブファミリーの生理的機能を明らかにすることを目的とした.UGT71C1サブファミリー遺伝子のうち,UGT71C1およびUGT71C2は二番染色体上に,UGT71C3, UGT71C4およびUGT71C5は一番染色体上に,いずれもタンデムに座位している.したがって,従来の遺伝学的な方法では,多重変異体の獲得が困難であった.本年度は昨年度に引き続きUGT71C1ーUGT71C5の五遺伝子の大腸菌何での異種発現を試みた.しかし,いずれの場合も不溶性画分での発現のみが確認されたため,大腸菌とは異なる宿主での発現系の構築の必要性が示された.

また,UGT71C1およびUGT71C2をノックダウンするためのTALENsを導入するためのベクターを,アグロバクテリウムを介したフローラルディップ法により導入した.薬剤耐性マーカーを用いてそれぞれの形質転換体の取得に成功した.これまでに複数のT0ラインからT1種子を採取しており,今後,これらのシーケンス解析を行うことで変異を確認するとともに,代謝分析および表現系の解析を進める.植物中の有用二次代謝産物であるリグナン類については,その代謝関連遺伝子に関する情報が未だ十分に得られていない.研究代表者等はリグナン類の網羅的定量系を確立し,シロイヌナズナに適用した..本研究では,近年注目を集めているゲノム編集技術TALEN (transcrption activator-like effector nuclease)を用いて,シロイヌナズナ中のリグナン類の配糖体化酵素を明らかにすることを目的とし,このための形質転換体の取得を行なった.変異体などの解析からシロイナズナのUGT71C1はリグナン類のピノレジノールとラリシレジノールを基質とすることを明らかにした.シロイヌナズナのリグナン類の生合成のうち,特に初期の配糖体化に関わることが想定されるUGT71C1, UGT71C2, UGT71C3, UGT71C4,および,UGT71C5の五遺伝子のORFすべてについてエントリーベクター,および,大腸菌での発現ベクターの構築を終了した.さらに,これらの遺伝子産物を大腸菌内で発現させた.UGT71C1以外の遺伝子産物については,可溶性画分での発現が確認できなかったものの,不溶性画分における発現が確認できた.可溶性画分での発現を達成するため,分子シャペロンとの共発現系などを構築した.しかし,現在までには可溶性画分における発現は確認できていない.また,UGT71C1,および,UGT71C2をノックダウンするためのTALENsを導入するためのベクター二種の構築を終了した.アグロバクテリウムを介したフローラルディップ法により,これらのTALENsをシロイヌナズナに導入した.薬剤耐性マーカーを用いて,それぞれの形質転換体を取得した.これまでに,複数のT0ラインからT1種子を採取した.研究課題開始当初からのゲノム編集技術の進展には目覚しいものがあり,現在ではTALENsよりもCRISPR/Cas9が主流となった.TALENsを用いる場合,ベクターの構築に時間がかかることから,今後,本課題においてもCRISPR/Cas9を用いることを検討する.CRISPR/Cas9では,複数の遺伝子切断部位用のgRNAを同一ベクター上に載せることが可能という利点も有する.今後,CRIPR/Cas9も用いながら,UGT71Cの多重変異体を網羅的に取得し,リグナンおよび上記で述べたアブシジン酸のプロファイリングを行うことで,これら配糖化酵素の生理的機能を明らかにする.並行して異種発現による酵素機能の解析を行うことで,その基質特異性やカイネティクスについても情報を得る.植物代謝工学大腸菌で発現させたUGT71C1ーUGT71C5について,それらのリグナン類に対する糖転移活性を評価する.
インドネシア発酵食品における有用微生物の探索とその機能利用

昨年度までの研究において、インドネシアの伝統的エビ発酵食品テラシより食中毒細菌リステリア菌に対し強い抗菌性を示すP2株を分離し、抗菌物質がタンパク系であることを明らかとした。また、P2株は、16S rRNA遺伝子解析よりVirgibacillus属細菌と同定され、新種細菌である可能性が極めて高いことを明らかとした。さらに、国立遺伝学研究所データベース上での比較から、P2株は深海分離微生物NT N53株(広島大、長沼:未発表)と極めて近縁種と考えられた。本年度の研究では、NT N53株を入手してP2株と比較検討したところ、NT N53株もリステリア菌増殖阻害物質を産生していることを明らかとした。抗菌物質生産性はNT N53株のほうがP2株よりも若干優れていたので、NT N53株を使用して、抗菌物質の性状解明を行なった。本株をNaCl 5%-TSB培地で27°C、1日間振とう培養した。培養液上清の80%硫安沈殿を透析後、イオン交換クロマトグラフィー(CM-セルロファイン)に付して、リステリア菌に対する抗菌画分を分取した。さらに、限外ろ過で濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィー(S-200)に付したところ、2つの抗菌画分(活性A,活性B)を得た。各々をイオン交換クロマトグラフィー(Mono-S)に付し、抗菌画分を分取して精製品を得た。その結果、活性A,活性BともにトリシンSDS-PAGE上で1バンドとなり、分子量はいずれも約5kD程度と推定された。また、アミノ酸分析計で全アミノ酸組成を解析したところ、双方とも塩基性のアミノ酸を多く含有することが判明した。さらに、アミノ酸シーケンサーで解析したが、両物質ともにN末端側はブロックされていた。なお、培養上清の抗菌スペクトルの検討から、P2株、NT N53株双方がリステリア菌だけでなく魚病細菌の一部に対し抗菌活性を示すことも明らかとした。水産養殖における魚病細菌の制御に応用できる可能性が考えられたので、結果の一部を平成18年度日本水産学会において発表した。本年度の研究では、インドネシアの伝統的水産発酵食品のうち、エビペースト(テラシ"terasi")に焦点をあてた研究を行った。テラシについては2003年8月にインドネシア、スマランのディポヌゴロ大学で行われた国際セミナー参加の際、ジャワ島中部においてサンプリングを行った。バクテリオシン産生菌の探索は以下の要領で行った。入手テラシをホモジナイズ後、段階希釈し、寒天培地上に塗抹した。この上に食中毒細菌のListeria monosytogenes(リステリア菌)を含む寒天培地を重層した平板培地を培養した。培地上に出現したテラシ由来菌のコロニーの周囲に阻止円を形成したものを、抗菌物質の産生能を有すると判断し、ここから純粋分離を行い、約100株の候補株を得た。これら分離株の培養液と、この培養液のpHを中和した試料を用い、再度実験を行ったところ、未中和試料は阻止円を示したが、中和試料では阻止円が消失した。したがって当初見られた阻止円はpH(有機酸)の影響が大であったと考えられた。ただし、未中和培養液のpHを測定したところ、そのpHと阻止円の大きさの相関に乏しい試料もあったので、pH(有機酸)以外の抗菌物質の存在を伺わせることがあった。そこで、現在、培養液の濃縮を行い、解析を進めているところである。本年度はバクテリオシン産生株の絞り込みにいたらなかったので、早急に菌株の選択と産生物質特性の検討等を進める予定である。さらに、本研究の基礎的知見を深めるため、これまでの予備的実験で分離した乳酸菌を使用して、テラシにおける乳酸菌フローラも検討した。その結果テラシ中には高塩分(NaCl 15%)で発育できる乳酸球菌が生育しており、その16S rRNA遺伝子の検討等からTetragenococcus halophilusとTetragenococcus muriaticus好塩性乳酸菌からなることが判明した。これら乳酸菌フローラ解析についてはJournal of General Applied Microbiology誌に報文として掲載された。本年度(平成16年度)の研究では、インドネシア発酵食品由来の有用微生物(抗菌物質生産菌)の再スクリーニングを行った。すなわち、伝統的なエビ発酵食品テラシ等に由来する抗菌物質生産菌候補株(昨年度(平成15年度)の研究で分離)約200株を供試菌株とし、Lactobacillus属、Lactococcus属等の乳酸菌やListeria monocytogenesなどの食中毒菌を指示菌として抗菌物質生産菌の絞り込みを進めた。その結果、得られた15株の示す抗菌スペクトルは様々であり、乳酸菌に対する抗菌性が多く観察された。また、L.monocytogenesに対して抗菌性を示す株が得られ、この株がグラム陽性桿菌であり、食塩25%の存在下で増殖可能な好塩細菌であることが判明した。本株は、16S rRNA遺伝子の解析からビルジバチルス属の細菌と同定された。また、その抗菌活性は振とう培養でのみ検出され、培養上清の限外ろ過による結果から、分子量5万以上の抗菌物質を生産していると示唆された。これらの結果は平成16年度日本農芸化学会において発表した。

現在、本物質の精製を進めその性状の解析を進めており、今後、食品への添加試験も行い、食品の品質保持にどのように貢献できるかどうかについて検討する計画である。また、アジア発酵食品の有用微生物のひとつである好塩性乳酸菌Tetragenococcus属の有機酸による微生物制御についての基礎的検討も行った。好塩性乳酸菌の培養条件とその乳酸産生の関係について焦点をあてて検討したところ、Tetragenococcus属細菌2種間において、低pH、高食塩に対する感受性に大きな相違が有ることを明らかとなったので、その結果をJournal of Applied Microbiology誌に公表した。昨年度までの研究において、インドネシアの伝統的エビ発酵食品テラシより食中毒細菌リステリア菌に対し強い抗菌性を示すP2株を分離し、抗菌物質がタンパク系であることを明らかとした。また、P2株は、16S rRNA遺伝子解析よりVirgibacillus属細菌と同定され、新種細菌である可能性が極めて高いことを明らかとした。さらに、国立遺伝学研究所データベース上での比較から、P2株は深海分離微生物NT N53株(広島大、長沼:未発表)と極めて近縁種と考えられた。本年度の研究では、NT N53株を入手してP2株と比較検討したところ、NT N53株もリステリア菌増殖阻害物質を産生していることを明らかとした。抗菌物質生産性はNT N53株のほうがP2株よりも若干優れていたので、NT N53株を使用して、抗菌物質の性状解明を行なった。本株をNaCl 5%-TSB培地で27°C、1日間振とう培養した。培養液上清の80%硫安沈殿を透析後、イオン交換クロマトグラフィー(CM-セルロファイン)に付して、リステリア菌に対する抗菌画分を分取した。さらに、限外ろ過で濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィー(S-200)に付したところ、2つの抗菌画分(活性A,活性B)を得た。各々をイオン交換クロマトグラフィー(Mono-S)に付し、抗菌画分を分取して精製品を得た。その結果、活性A,活性BともにトリシンSDS-PAGE上で1バンドとなり、分子量はいずれも約5kD程度と推定された。また、アミノ酸分析計で全アミノ酸組成を解析したところ、双方とも塩基性のアミノ酸を多く含有することが判明した。さらに、アミノ酸シーケンサーで解析したが、両物質ともにN末端側はブロックされていた。なお、培養上清の抗菌スペクトルの検討から、P2株、NT N53株双方がリステリア菌だけでなく魚病細菌の一部に対し抗菌活性を示すことも明らかとした。水産養殖における魚病細菌の制御に応用できる可能性が考えられたので、結果の一部を平成18年度日本水産学会において発表した。
イノラートアニオンの機能開拓とその応用

申請者はイノラートアニオンの特性を生かした新反応の開発を目的に研究を行い、イノラートを用いたアシルシランの高立体選択的オレフィン化反応を開発している。そしてオレフィン化生成物である(Z)-β-シリルアクリル酸(ビニルシラン)がカルボニル酸素の分子内配位により超原子価構造を形成し、これによる炭素-ケイ素結合の活性化を利用するクロスカップリング反応を開発した。平成17年度では、第14族元素を用いてこれら両反応を検討し以下のような新知見を得ることができた。1.アシルゲルマンのオレフィン化を検討し、アシルシランの反応と同様に完璧な立体選択性で(Z)-β-ゲルミルアクリル酸を得た。アシルスズのオレフィン化反応も高立体選択的に進行し(Z)-β-スタニルアクリル酸を合成することに成功した。一方α-シリルケトンを基質に用いると、アシルシランの反応とは立体選択性が逆転しE体のオレフィンが優先して得られた。この立体選択性はβ-ラクトンエノラートの電子環状開環反応におけるtorquoselectivityを考察することで説明できる。2.イノラートとアシルシランの反応より得られるβ-ラクトンエノラートをプロトン化そして脱炭酸することにより多置換ビニルシランが立体選択的に得られることを見出した。本反応は、アルキル化も立体選択的に進行し、汎用性の高いビニルシランの合成法である。3.(Z)-β-ゲルミルアクリル酸もまた超原子価構造を形成することを明らかにし、そのクロスカップリング反応により四置換オレフィンを高収率で合成した。パラ位に電子吸引性基をもつヨウ化アリールを基質に用いると極めて効率的に進行することが分かった。4.カップリング生成物はHunsdiecker反応によりハロゲン化アルケンへと変換でき、これを用いて乳癌治療薬タモキシフェンを短工程で合成することに達成した。申請者はイノラートアニオンの特性を生かした新反応の開発を目的に研究を行い、すでにイノラートを用いたアシルシランの高立体選択的オレフィン化反応を開発することに成功している。さらに、オレフィン化反応生成物である(Z)-β-シリルアクリル酸の合成的有用性を探索したところ、ヨウ素との反応によりシララクトンが高収率で得られるという新反応を見出した。シララクトンの合成例は数例しかなく、その一般的合成法や物理的・化学的特性等その化学は限りなく未開拓に近い状態である。今回、本反応を詳細に検討した結果、以下のような知見を得ることができた。1,高い一般性。ケイ素上にメチル、エチル、イソプロピル、フェニル基を有する(Z)-β-シリルアクリル酸の反応はいずれもシララクトンを高収率で与えた。また、2-シリル安息香酸も同様にシララクトンへ変換された。2,(Z)-β-シリルアクリル酸の高配位ケイ素構造。X線結晶構造解析により、(Z)-β-シリルアクリル酸はカルボニル酸素がケイ素に弱く配位した五配位ケイ素構造を有していることが分かった。この分子内配位により活性化された炭素-ケイ素結合がヨウ素により求電子的に開裂し、シララクトンが生成したものと考えられる。3,シララクトンの反応性。シララクトンを還元反応に付すと、環状シリルエーテルが高収率で得られた。グリニヤール反応に付すと、ケイ素上で置換反応が進行し、ケイ素上に種々の置換基を有するβ-シリルアクリル酸を得ることに成功した。さらに、パラジウム触媒によるクロスカップリング反応により四置換オレフィンへと変換した。以上のように、申請者は本反応が初めての高い一般性を有したシララクトン合成法であることを明らかにした。さらに、シララクトンの合成的有用性も示すことができた。平成15年度には、この反応より得られた(Z)-β-シリルアクリル酸が超原子価ケイ素構造を示すことを見出し、これによって活性化された炭素-ケイ素結合の解裂反応を利用したシララクトンの新規合成法を開発した。平成16年度では、この超原子価ケイ素の活性な炭素-ケイ素結合を活用した合成反応の開発をさらに進め、パラジウム触媒を用いる(Z)-β-トリメチルシリル-アクリル酸の炭素-炭素結合形成反応を見出した。本反応を詳細に検討した結果、以下のような知見を得ることができた。1.本反応は、4位に電子吸引性基だけでなく電子供与性基を有するヨードベンゼン誘導体を基質に用いることが可能で、種々の四置換オレフィンを中程度から良好な収率で与えた。トリメチルビニルシランを用いたクロスカップリング反応は一般に困難であり、また、ビニルシランを用いた四置換オレフィン合成の例もなく、有機ケイ素化合物を用いたクロスカップリング反応において我々の見出した炭素-ケイ素結合の活性化法が非常に有用であることが示せた。2.有機ケイ素化合物を用いたクロスカップリング反応において炭素-ケイ素結合の活性化にフッ素試薬を用いることが定石となっているが、本反応はフッ素試薬を用いない点で特徴的である。3.改良型Hunsdiecker反応により生成物のアクリル酸をハロゲン化アルケンへと変換できることを明らかにした。さらに、これを用いて短工程で乳癌治療薬タモキシフェンの中間体合成への応用にも成功した。

申請者はイノラートアニオンの特性を生かした新反応の開発を目的に研究を行い、イノラートを用いたアシルシランの高立体選択的オレフィン化反応を開発している。そしてオレフィン化生成物である(Z)-β-シリルアクリル酸(ビニルシラン)がカルボニル酸素の分子内配位により超原子価構造を形成し、これによる炭素-ケイ素結合の活性化を利用するクロスカップリング反応を開発した。平成17年度では、第14族元素を用いてこれら両反応を検討し以下のような新知見を得ることができた。1.アシルゲルマンのオレフィン化を検討し、アシルシランの反応と同様に完璧な立体選択性で(Z)-β-ゲルミルアクリル酸を得た。アシルスズのオレフィン化反応も高立体選択的に進行し(Z)-β-スタニルアクリル酸を合成することに成功した。一方α-シリルケトンを基質に用いると、アシルシランの反応とは立体選択性が逆転しE体のオレフィンが優先して得られた。この立体選択性はβ-ラクトンエノラートの電子環状開環反応におけるtorquoselectivityを考察することで説明できる。2.イノラートとアシルシランの反応より得られるβ-ラクトンエノラートをプロトン化そして脱炭酸することにより多置換ビニルシランが立体選択的に得られることを見出した。本反応は、アルキル化も立体選択的に進行し、汎用性の高いビニルシランの合成法である。3.(Z)-β-ゲルミルアクリル酸もまた超原子価構造を形成することを明らかにし、そのクロスカップリング反応により四置換オレフィンを高収率で合成した。パラ位に電子吸引性基をもつヨウ化アリールを基質に用いると極めて効率的に進行することが分かった。4.カップリング生成物はHunsdiecker反応によりハロゲン化アルケンへと変換でき、これを用いて乳癌治療薬タモキシフェンを短工程で合成することに達成した。
高解像度磁気共鳴画像と神経心理学的検査による思春期における脳の発達の検討

思春期には、高次脳機能がほぼ完成すると同時に、自我や社会性が発展するが、これらの背景にはこの時期における脳の発達的変化が存在すると考えられている。また精神分裂病の発症は、思春期から青年期に多く、思春期における脳の発達になんらかの異常が生じている可能性が示唆される。このため、思春期健常者で脳のどの領域が発達するかを明らかにすることは、人間の脳と心を理解する上で興味深いものであるだけでなく、分裂病の発症メカニズムを解明するためにも大きな意義を有すると考えられる。そこで、思春期における脳灰白質変化を三次元MRIとstatistical parametric mapping(SPM)を用いて検討した。対象は、思春期前期(1314歳)の健常者20名、思春期後期(1821歳)の健常者30名で、全例が右利きであった。対象者に検査に先だって検査の目的、内容などを説明し、書面による同意を得た。また、18歳未満の対象者からは、本人および保護者の書面による同意を得た。また、本研究は富山医科薬科大学倫理委員会の承認を得た。全例に、全脳の三次元撮像を行い、高解像度MRI T1強調像を得た。MRI画像の解析はSPM99を用いて処理した。統計解析は、思春期前期群と思春期後期群との間で、脳灰白質体積をANCOVA modelを用いて比較した。結果、思春期後期群の灰白質は、左側の内側側頭葉で思春期前期群に比べて有意に増大していた。一方、左側の内側前頭葉では、思春期前期群に比べて有意に減少していた。今回の結果では、左側の内側側頭葉の灰白質の増大が認められた。内側側頭葉の灰白質増加は思春期における脳の発達的変化の一つの特徴と考えられた。
血液メタボロミクス・定量脳波解析を応用した術後せん妄予測因子の探索的縦断研究

せん妄は、身体の病気に伴う急性発症の脳機能低下で引き起こされる病態と考えられている。近年、せん妄の発症自体が、その後の認知症リスクの上昇や退院後の予後や経過にも悪影響を及ぼすことが報告されている。しかし、せん妄の生物学的な発症メカニズムや予測可能なバイオマーカーはまだ発見されていない。本研究の目的は、せん妄発症の生物学的な発症メカニズムの解明、および、生物学的な予測因子を発見することである。手法としては、術前・術後・せん妄終了後の3時点で、診察・神経心理テスト・脳波測定・血液メタボロミクス(血液中の代謝物を網羅的に解析する手法)を行い、包括的に本病態にアプローチしていく。
原虫由来細胞外ヌクレオチド酵素による宿主免疫調節機構の解析

Toxoplasma gondiiが細胞膜表面に発現・分泌するNTPaseが好中球やマスト細胞への影響を、これらの細胞のATPと原虫の精製NTPaseとの共存下での炎症に関与する因子の遺伝子発現を指標に解析した。ATP単独曝露においては、好中球やマスト細胞のTNF-α, IL-8の遺伝子発現は抑制されたが、NTPaseの共存下ではATPの抑制効果が相殺された。好中球のecto ATPase分子CD39の遺伝子発現もNTPaseの共存により相殺されコントロールと同等であった。Adenosineの受容体であるAdoRA2aはNTPaseの共存により抑制された。CD73の発現は影響されなかった。細胞内寄生原虫トキソプラズマは感染した細胞内にParasitophorous vacuoleを形成し、宿主の免疫機構を回避しながら増殖や慢性感染を持続させている。この原虫が感染し細胞が傷害や破壊をうけると、細胞からは細胞質内のATPが漏出し周囲の細胞はATPに曝露されることになる。一般にATPは炎症亢進因子であり、生体内では高状勢維持のために細胞表面に発現しているCD39,CD73が細胞外ヌクレオチド分解酵素が炎症因子であるATPを分解していることが報告されている。トキソプラズマはNTPaseと呼ばれるCD39に似た、ecto-apyrase活性を有する酵素タンパクを有しており、この酵素タンパクがimmunomodulatorとして免疫細胞やその他の細胞に対する可能性について培養細胞や末梢血分離好中球などを用いて解析することが本研究の目的である。インビトロにおいて好中球様に分化させた好中球やマスト細胞株であるLAD2はATP曝露により、炎症性サイトカインであるTNF-aの遺伝子が増強した。そこで、細胞にATPと、原虫から生成したNTPaseを混合して、細胞外ATPの分解がみられるカどうかについてHPLCを用いて解析を行っているところである。ATP,ADP,AMP,Adenosineの各ヌクレオチドのスタンダード検出ができるカラムの選定と分離条件を設定し、現在NTPaseを加えられた細胞の遺伝子発現量変化について解析継続中である。細胞内寄生原虫であるトキソプラズマ(T.g)はマクロファージやその他の細胞内にparasitophorous vacuoleを形成し、その中で宿主免疫機構を回避しながら増殖し、感染細胞を破壊して新たな宿主細胞への感染を繰り返す。傷害をうけた細胞からは細胞質内のATPが漏出し、周囲の細胞は高濃度のATPに暴露されることになる。ATPは炎症亢進因子であるため、生体内では恒常性維持のため、細胞表面に発現しているCD39, CD73が細胞外ヌクレオチド分解酵素として作用し、細胞外ATPを分解している。T.gはマクロファージ以外にも好中球やマスト細胞を刺激してIL-12やTNF-aなどを産生させ、炎症惹起を起こしているが、その一方で原虫自体が有するNTPaseが免疫細胞に及ぼす影響については解明されていない。そのため、この原虫のNTPaseの宿主細胞に及ぼす影響について、この分子がimmunomodulatorとして働く可能性について、培養細胞や末梢血分離好中球などを用い、原虫由来精製NTPaseやリコンビナントNTPaseを用いて解析することを目的とした。原虫由来の精製NTPase量がまだ十分でないため、細胞外ATP暴露による遺伝新発現変化を先行した。好中球様に分化させたHL-60細胞に10mM-100uMのATPを暴露させ、1時間、4時間後における炎症性サイトカイン遺伝子発現をreal-time PCRで解析した所、1ー10mMATP暴露においてはTNF-aの遺伝子発現がコントロールの10%以下に抑制されていたが、IL-6の発現は増強していた。CD39, CD73やADORAなどの膜型受容体の発現量変化について現在解析継続中である。細胞内寄生原虫であるトキソプラズマは感染細胞内にParasitophorous vacuoleを形成し、その中で宿主免疫機構を回避して増殖し、感染急性期には増殖した細胞が感染細胞を破壊して次の細胞に感染を起す。原虫感染により傷害されたり、necrosis, apoptosisを起した宿主細胞からは、細胞質内のATPが漏出し、周囲の細胞は高濃度のATPに曝露されることになる。ATPは炎症亢進因子であることから、生体内では恒常性維持のため宿主細胞表面発現しているCD39, CD73などの細胞外ヌクレオチド酵素(NTPDase)がこれらの高濃度ATPを分解し、炎症発生を制御している。トキソプラズマはマクロファージ、好中球、マスト細胞を刺激てIL-12, TNF-aなどのTh1サイトカイン産生を誘発し炎症惹起を起すが、トキソプラズマ自身が有しているNTPDaseが免疫細胞に及ぼす影響については解明されていない。原虫由来のNTPDaseはin vitroで好中球様に分化させたHL60に1-10 mMのATPを曝露させた場合に増強するIL-6の遺伝子発現を減少させる傾向を示した。HL60のCD39, CD73は膜型受容体でもあるが、これら分子の遺伝子発現量変化については顕著な差違がなかった。遺伝子発現よりも、これら分子を介したシグナル伝達の方が直接の効果を示すことが考えられる。また、原虫のNTPDaseに対するモノクローナル抗体を用いた免疫電顕で観察した所、このNTPDaseが宿主細胞内に形成されたparasitophorous vacuole内と原虫の細胞膜上に発現していることが示された。

NTPDase欠失や部分変異が原虫の生存や病原性に与える影響ならびに宿主細胞の免疫応答に与える影響について解析を継続している。トキソプラズマは細胞内に寄生し増殖原虫が新たな宿主細胞に感染する際に、破壊された細胞から細胞質内のATPを漏出する。傷害細胞からの高濃度ATPは炎症惹起因子となる。細胞は表面にecto apyraseを発現し細胞外ATPの分解を行い恒常性を維持する。本原虫のNTPaseはApyrase conserved regionsと相同性が高く、ATPをADP, AMPへと分解する。本研究では原虫のNTPaseが与える影響を主に炎症性サイトカイン遺伝子発現変化で解析した。0.1mMATPでマスト細胞を刺激後、10分でTNF-aの遺伝子発現が0.8倍と抑制されたがATPとNTPaseが存在した場合には著しく抑制されていた。30分後にはATP刺激およびATP, NTPase添加細胞において、各々1倍0.9倍のTNF-a発現がみられ、細胞外ATPに曝露後の速やかな抑制後に回復することが示唆された。CCL4は、ATP刺激で10分後に0.5倍と抑制されNTPaseも添加した細胞はコントロールと同等であった。30分後には0.5倍に抑制され、NTPaseの存在によりCCL4発現抑制の遅延が示唆された。好中球では0.1mMATPは0.6倍、0.1mMアデノシンは0.5倍にTNF-aの遺伝子発現を抑制していた。NTPase共存ATP刺激好中球では0.8倍に抑制していた。CCL4遺伝子も同様であった。IL-8遺伝子は、ATP刺激は0.7倍に抑制されたが、NTPase共存好中球では1.1倍とコントロールと同等であった。アデノシン受容体AdoRA2Aの発現はATP刺激は約1倍であったが、アデノシン刺激、ATPとNTPase刺激細胞では各々、0.7倍,0.6倍と抑制されていた。以上の結果より、NTPaseは細胞周囲微小環境のATP濃度を減少させ、マスト細胞・好中球などの免疫細胞調節作用をもつことが示された。Toxoplasma gondiiが細胞膜表面に発現・分泌するNTPaseが好中球やマスト細胞への影響を、これらの細胞のATPと原虫の精製NTPaseとの共存下での炎症に関与する因子の遺伝子発現を指標に解析した。ATP単独曝露においては、好中球やマスト細胞のTNF-α, IL-8の遺伝子発現は抑制されたが、NTPaseの共存下ではATPの抑制効果が相殺された。好中球のecto ATPase分子CD39の遺伝子発現もNTPaseの共存により相殺されコントロールと同等であった。Adenosineの受容体であるAdoRA2aはNTPaseの共存により抑制された。CD73の発現は影響されなかった。H25年度以降、原虫培養とNTPaseの精製を行いHPLCでの酵素活性測定を開始したが、最適なカラムの選定と分離条件の設定に時間がかかってしまったことと、共通機器のためHPLCの使用回数が限られていたことにより当初予定していた実験が遅れてしまった。また分担研究で行っていた細菌感染実験も時間を要したため当初より遅れが生じてしまった。
ヘリカルプラズマの内部輸送障壁形成に果たす有理面の役割

平成14年度の実験において、CHSに設置されたm(ポロイダルモード数)=2、n(トロイダルモード数)=1の磁気島生成用摂動磁場コイル(真空容器上下部に計2個設置)を用いて、磁気島生成のプラズマパラメータ依存性を調べた。低密度(0.5×10^<19>m^<-3>)、高電子温度(1-1.5keV)のECHプラズマでは、摂動磁場の印加時においても電子温度分布に磁気島は観測されず、この結果は、有限β且つ低衝突周波数の領域では、ブートストラップ電流のポロイダル方向非一様分布による小半径方向の磁場によって磁気島のヒーリングが見られることに対応していると考えられる。内部輸送障壁は低密度・高電子温度の電子ルートプラズマにおいて観測されているが、そのようなパラメータ領域では外部摂動磁場による磁気島はプラズマによって消し去られることになる。このため、明確な磁気島存在時での内部輸送障壁の議論は出来なくなった。平成15年度の実験では、低密度(0.2-0.6×10^<19>m^<-3>)、高電子温度(0.5-3keV)のECH+NBIプラズマを生成し、これに対し摂動磁場を印加した14ショットと印加しない13ショットとで、内部輸送障壁が形成される密度の大小を調べた。即ち、印加した場合に、より高い密度での輸送障壁形成を期待した。これは、摂動磁場が輸送障壁の形成を助けるのではないかと考えたためである。多数ショットを必要とする理由は、低密度でのトムソン散乱データを蓄積するためである。印加した場合には密度はより低くなり、電子温度はより高くなったが、輸送障壁が形成される密度がより高いという期待した結果は明確ではなかった。しかしながら、中性粒子入射加熱による駆動電流がある値になり、m=1/n=1の磁気島が形成されるであろう場合に、周辺での輸送障壁形成を示唆する結果が得られた。CHSにおいて、m(ポロイダルモード数)=2、n(トロイダルモード数)=1の磁気島を生成するための摂動磁場コイルを、真空容器上部に2個設置した。プラズマ生成時の磁気島の存在は電子温度分布に平坦な部分が生じることによって知ることができる。低密度(0.5×10^<19>m^<-3>)、高電子温度(1-1.5keV)のECHプラズマでは、摂動磁場印加時においても電子温度分布に磁気島は観測されなかった。ECH+NBIプラズマ(1.0×10^<19>m^<-3>、500eV)では、磁気島の兆候が見られた。NBIプラズマ(1.5-2.0×10^<19>m^<-3>、200-300eV)では、電子温度分布に5-10cm幅の平坦部が見られた。内部輸送障壁は低密度・高電子温度の電子ルートプラズマにおいて観測されている訳であるが、実験結果は外部摂動磁場による磁気島がプラズマによって消し去られている。これは、有限β且つ低衝突周波数の領域では、ブートストラップ電流のポロイダル方向非一様分布が作る小半径方向の磁場によって磁気島のヒーリングが見られることに対応していると考えられる。この結果によって磁気島とプラズマパラメータとの関連が明らかになった。2台の重イオンビームプローブ(HIBP)の同時運転に世界で初めて成功した。2台はトロイダル方向に90度離れて設置されているが、プラズマ中心のポテンシャルの時間的振舞いは全くと言っていいほど重なっている。ポテンシャルの脈動の小半径方向

2ケ所(ρ=0,0.8)での同時測定では、パラボラ分布に凹みが生じる時には周辺部のポテンシャルが上昇することが示された。これらの実験結果によって、研究課題に対する準備が出来たと考えている。平成14年度の実験において、CHSに設置されたm(ポロイダルモード数)=2、n(トロイダルモード数)=1の磁気島生成用摂動磁場コイル(真空容器上部に2個設置)を用いて、磁気島生成のプラズマパラメータ依存性を調べた。低密度(0.5×10^<19>m^<-3>)、高電子温度(1-1.5keV)のECHプラズマでは、摂動磁場の印加時においても電子温度分布に磁気島は観測されず、この結果は、有限β且つ低衝突周波数の領域では、ブートストラップ電流のポロイダル方向非一様分布による小半径方向の磁場によって磁気島のヒーリングが見られることに対応していると考えられる。内部輸送障壁は低密度・高電子温度の電子ルートプラズマにおいて観測されているが、そのようなパラメータ領域では外部摂動磁場による磁気島はプラズマによって消し去られるとになる。このため、明確な磁気島存在時での内部輸送障壁の議論は出来なくなった。平成15年度の実験では、低密度(0.2-0.6×10^<19>m^<-3>)、高電子温度(0.5-3keV)のECH+NBIプラズマを生成し、これに対し摂動磁場を印加した14ショットと印加しない13ショットとで、内部輸送障壁が形成される密度の大小を調べた。即ち、印加した場合に、より高い密度での輸送障壁形成を期待した。これは、摂動磁場が輸送障壁の形成を助けるのではないかと考えたためである。多数ショットを必要とする理由は、低密度でのトムソン散乱データを蓄積するためである。印加した場合には密度はより低くなり、電子温度はより高くなったが、輸送障壁が形成される密度がより高いという期待した結果は明確ではなかった。しかしながら、中性粒子入射加熱による駆動電流がある値になり、m=1/n=1の磁気島が形成されるであろう場合に、周辺での輸送障壁形成を示唆する結果が得られた。