hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁性流体制振装置に関する試作的研究

1.磁性流体制振装置の試作とその特性評価に関する研究振動する円筒容器(シリンダ)内に磁性流体を満たし、その中にバネ-マス系でシリンダと連結させた非磁性の円筒(ピストン)を浸し、ピストンの上下端に非一様交流磁場を印加し、ピストンに加わる磁気圧力を制御してピストンの振動を抑制する制振システムを試作し、その制振性能についての検討を行った。その制御方式としては種々の方法を検討し、固有振動数4Hzのシステムにおいて低周波数(28Hz)域での完全制振を得る方法を確立した。2.磁性流体アクティブダンパの開発に関する基礎研究磁性流体の磁気圧をアクチュエータの駆動力とする新方式アクティブダンパの動特性を上記の制振装置を活用して検討した。なお、ダンパとしての振動特性を理論的に解析するためには、振動を抑制する物体に加わる流体力を評価する必要がある。磁性流体中の振動物体に作用する流体力を正しく評価する手法を確立するために構造の簡単な薄い平板の振動問題を取り扱い、平板の粘性減衰係数および付加質量係数の評価を行った。3.磁性流体アクチュエータとしての特性に関する研究管内の静止流体プラグに非一様交流磁場を印加し、流体に加わる磁気圧力を利用してプラグの運動を誘起させ、その周波数特性への磁場の強さ、プラグ長さおよび磁場と流体プラグとの相対位置の影響を検討した。円筒容器内に磁性流体と非磁性体の円筒を挿入し、内外の円筒をバネで接続した振動系を構成し、外筒を加振した時の内筒の振動を磁性流体部分に非一様変動磁場を作用させて制振させる試験装置を設計、試作した。まず、非一様定常磁場のもとで内筒にかかる粘性抵抗力の磁場依存性を理論的に検討し、内筒の振動特性への磁場の影響を求めた。ついで、非一様変動磁場の作用による磁気力を利用して、内筒の完全な振動停止を実現する制御法を理論的に検討した。すなわち、ピストンの運動方程式を解き、ピストンが流れ場から受ける力、磁場の作用による磁気圧力として加わる力の算定を行い、両者のバランスを考えることで制振装置の特性を求めた。その結果、制御法としては、内筒にかかる加振力の振動数に対し、制振力(磁気圧力)の振動数を僅かずらして与え、その位相差を時間的に変化させる方法を採用することにした。この設計指針に基づき、試験装置を製作した。制振特性に関する実験は、まだ予備実験の段階であるが、ほぼ予測通りの結果が得られることを確認している。以上の成果をもとに次年度には、磁性流体制振装置の特性を実験的に詳細に検討し、最適設計方針を確立するための開発研究を進める予定である。磁性流体制振装置は、磁性流体の圧力を交流磁場の操作で制御することにより、流体中に挿入した非磁性物体の振動を制御する新方式ダンパ開発のための基礎実験装置である。本研究では、振動する円筒容器内の磁性流体中に挿入した円筒形非磁性物体(ピストン)の往復運動を外部磁場印加による磁気圧力を利用して、制御するアクティブダンパとしての動特性を理論並びに実験の両面から検討したものである。また、振動抑制のために発揮し得る磁気圧の評価のため、磁性流体アクチュエータとしての特性についての検討も行った。本年度は、まず、振動抑制のために必要な制御力の発生機構として、磁性流体アクチュエータとしての周波数特性について実験的に詳細な検討を行った。ついで、アクティブダンパの基本特性として、各種制御則(変位フィードバック、速度フィードバック、最適レギュレータ、フィードフォワード補償付き最適レギュレータ、最小分散形STRの各制御則)を適用して、ピストンの制振効果についての検討を行った。その結果、ピストンの変位と速度を組み合わせてフィードバックし、フィードバック定数を入出力関係から求める方式が最適レギュレータによる設計よりも良い制振性能を示すことを明らかにした。
メソメトリック界面領域に局在化した温度応答性濡れシート―メカニズムの理解と制御

本研究では、(1)基板-液晶界面のメソスコピックな領域において液晶が作る、また、2次元的濡れ構造(界面濡れシート)の形成メカニズムを実験・理論の両面から理解し、さらにこの知見を元に界面濡れシートの生成・凍結・消滅を能動制御することで、界面濡れがもたらすユニークな機能性および応用の可能性を探究する。具体的には、(1)界面に局在した液晶濡れシートの形成過程において、バルクと界面付近それぞれにおける分子の静的・動的挙動をX線・プローブ顕微鏡・非線形光学などにより直接観察する。(2) (1)で得られた知見を元に、電場を中心とした濡れシートの積極的な誘起及びコントロールを試みる。(3) (2)の界面に存在する濡れシートを制御することで液晶バルクの配向および欠陥制御を行うことにより、光電場で制御できる表示/メモリーデバイスやセルフフォーマブルなトポロジカル周期パターンなどユニークな機能性の創出を行う。これまでの研究において、温度・光応答型(アンカリング)配向転移を引き起こす幾つかのモデル系において、界面付近に局在化したナノメートルスケールのスメクティック2次元濡れ構造が熱・光刺激に応じて生成(消滅)・成長(縮小)することによって、液晶材料のバルクの配向状態が変化することを明らかにしてきた。具体的には、液晶/基板界面付近において、垂直配向を示す濡れ構造と、ティルトまたは水平配向を示すドメインが共存し、界面付近に配向フラストレーションが溜まることで配向転移が発現する。今年度は、これらのナノメートルスケールの2次元濡れ構造を光によってアクティブコントロールできるようになり、界面濡れシートを光刺激により制御することで液晶の自己組織化トポロジカル構造の形成と制御を試みた。これまでの研究において、温度・光応答型配向転移を引き起こす幾つかのモデル系において、界面付近に局在化したナノメートルスケールのスメクティック2次元濡れ構造が温度変化または光照射に応じて生成(消滅)・成長(縮小)することがわかった。これらの界面構造変化は液晶材料のバルクの配向状態をモデュレートすることも明らかにした。これらの界面濡れ構造のコントローラビリィーについてさらに理解を深めることは重要である。そのために、光応答型配向転移を示す系にて光による界面濡れ構造の能動的な生成・破壊を試み、これに伴うバルク材料の配向等諸マクロ物性の変化を追跡する必要がある。今年度は、界面付近に局在化したナノメートルスケールの層状2次元濡れ構造が熱・光刺激によって、生成(消滅)・成長(縮小)をコントロールでき、液晶材料における動的極角配向制御可能な配向膜として利用できることを見出した。当光応答型転移の実験結果は、平成29-30年度に構築した配向転移のエネルギー状態を記述するモデルによって、半定量的に説明することができた。これまで、報告者は実験・理論の双方より、界面濡れ構造の形成・制御について研究を行ってきた。最終年度については、今までに積まれた知見を元に、界面濡れ構造の変化を介したメモリーデバイスなどの機能性デバイスの原理検証、作製及び評価に注力する。界面の局所構造が刺激を通じ,バルクの特性の大きな変化につながることは多々あるが,メカニズムについて不明な点が多い.本研究では,報告者が研究をつづけてきた明確な構造・配向変化を伴うアンカリング転移を起こす材料系をモデル系とし,界面に局在するメソスコピックな構造の形成メカニズムを明らかにする.さらに,この知見をもとに界面に局在した構造を能動的に制御することによってもたらされる新しい機能性を探求する.これまで,温度や電場に系がよく応答し,アンカリング転移の挙動をチューニングできることが明らかになっている.そこで,報告者はまず温度刺激を系に与え,界面に生成・消滅する濡れ広がった局所構造(濡れシート)がバルクでおこるアンカリング転移挙動との相関を調べた.すると,界面に局在化する濡れシートが温度の低下(上昇)とともに成長(消滅)し,一度生成した濡れシートは強く界面にアンカーされることが明らかとなった.このことは界面において,濡れシートの生成と消滅過程においてヒステリシス領域が存在することを意味する.驚くべきことに,このヒステリシス領域は,バルクのアンカリング転移のそれと一致し,アンカリング転移が界面の濡れシートの生成・消滅に起因することが明らかになった.さらに,実験を進める中,アゾデンドリマー液晶という材料においても,光誘起のアンカリング転移がおき,その原因に界面に局在した濡れシートが絡んでいることを見出した.これらの結果は,濡れシートが普遍的に液晶系における構造(あるいは配向)転移挙動に大きな影響を与えている可能性があることを示唆している.そこで,現在報告者はこれらの挙動に共通する点を明らかにすべく,測定及び解析を行っている.今年度は,主に不連続アンカリング転移をおこす系をモデルとし,界面近傍に形成される薄い濡れ広がり構造(濡れシート)の形成過程およびダイナミクスがアンカリング転移に与える影響について調べた.

実験的側面では,当初計画していた実験手法よりも多くの手法で研究を行い,新しい知見を積むことができた.しかしながら,Cryo-TEMの測定が難しいことや,非線形光学測定法による界面近傍分子の構造・配光状態などの測定と解析が難しいことなどの理由から,明らかになっていない事項も残っている.他方の理論的側面では,濡れシートに起因する界面アンカリングのフラストレーション,すなわち,垂直配向と水平配向効果の拮抗により,不連続性を有するアンカリング転移がおきることを示した.全体の進捗状況に遅れはない.これまでの研究において、温度・光応答型(アンカリング)配向転移を引き起こす幾つかのモデル系において、界面付近に局在化したナノメートルスケールのスメクティック2次元濡れ構造が熱・光刺激に応じて生成(消滅)・成長(縮小)することによって、液晶材料のバルクの配向状態が変化することを明らかにしてきた。具体的には、液晶/基板界面付近において、垂直配向を示す濡れ構造と、ティルトまたは水平配向を示すドメインが共存し、界面付近に配向フラストレーションが溜まることで配向転移が発現する。これらの界面濡れ構造の空間分布を確認することは、現象をより良く理解し、提案した理論の可用性を検討するうえで重要であるが、明らかになっていない。さらに、界面フラストレーションの程度は、界面濡れ構造のダイナミクスに影響され、配向転移の前駆的な挙動を反映する。今年度はこれらを解明すべく、報告者は界面の濡れ構造観察および配向転移の前駆的なアンカリングエネルギー測定を行った。得られた結果によれば、バルクの液晶状態がA状態からB状態へと転移しょうとする際、界面付近ではA状態のアンカリング強度がべき乗的に弱くなり、臨界転移点においてゼロへ外挿されることがわかった。このことは昇温と降温のどちらの場合にも真である。一般的には、降温の場合には、特定配向状態のアンカリング強度は単調的に増加するため、このようなことは期待されないことを考えると、これは降温にともなう異常なアンカリング前駆現象と考えられる。この結果は、アンカリング強度を能動的に変化させることで、配向転移のコントロールの可能性を示唆するものでもある。この可能性についても、報告者は界面に濡れ構造を構築する光応答性アゾデンドリマー液晶材料を用いて、検証を行った。今年度は、温度・光に応答することより、不連続な配向(アンカリング)転移を引き起こす系において、界面近傍に形成される、ナノメートルスケールで薄く広がった濡れ構造がバルク液晶のアンカリング特性に与える影響を実験的に調べ、以前構築した理論との比較したところ、半定量的に一致することがわかった。さらに、光応答によって引き起こされる配向転移を示す分子系において、界面近傍の濡れ構造が光によって能動的に生成・破壊を行うことがわかった。これらの結果は、界面に局在化したナノ濡れ構造など微視的な構造のマニュピレーションによって、バルクの物性をチューニングできることを示唆する新しい知見である。本研究では、(1)基板-液晶界面のメソスコピックな領域において液晶が作る、また、2次元的濡れ構造(界面濡れシート)の形成メカニズムを実験・理論の両面から理解し、さらにこの知見を元に界面濡れシートの生成・凍結・消滅を能動制御することで、界面濡れがもたらすユニークな機能性および応用の可能性を探究する。具体的には、(1)界面に局在した液晶濡れシートの形成過程において、バルクと界面付近それぞれにおける分子の静的・動的挙動をX線・プローブ顕微鏡・非線形光学などにより直接観察する。(2) (1)で得られた知見を元に、電場を中心とした濡れシートの積極的な誘起及びコントロールを試みる。
ＩＬ－３３の皮膚組織細胞への作用に関する研究

IL-33は上皮細胞や血管内皮細胞等、バリア組織細胞中の核内に恒常的に発現するサイトカインであり、組織傷害により受動的に放出され機能を発揮する。皮膚組織細胞の中で、特に表皮角化細胞と皮膚微小血管内皮細胞にIL-33は作用し、主に好中球性炎症の誘導に関与する可能性が示された。さらに、In vitroの掻破刺激モデルを確立し、表皮角化細胞破砕液中に、intactな皮膚組織細胞に対して炎症応答を惹起する物質が含まれることを明らかにした。これらの結果は、アトピー性皮膚炎など炎症性皮膚疾患における“かゆみと掻破の悪循環"(itch-scratchサイクル)の分子メカニズムの一端を示唆するものである。IL-33は、上皮細胞や血管内皮細胞等、バリア組織細胞中の核内に恒常的に発現する核内因子として同定されたが、その生理作用については不明であった。最近になり、皮膚においてもIL-33は尋常性乾癬やアトピー性皮膚炎の病変部で増加していることが報告されているが、IL-33の皮膚組織細胞に対する作用については不明である。前年度は、皮膚組織細胞(表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、皮膚微小血管内皮細胞)をIL-33で刺激した際、発現変動する遺伝子についてGeneChipを用いてスクリーニングし、IL-33は皮膚組織細胞の中でも、特に表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞に作用して好中球性炎症に関与している可能性が示唆された。そこで本年度は、掻破刺激モデルとして表皮角化細胞の細胞破砕液でintactな表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞を刺激し、どのような遺伝子が発現誘導されるのか、検討を行った。細胞破砕液の抽出は、confluentまで培養した表皮角化細胞をPBSで2度洗浄し、表皮角化細胞の専用基礎培地(増殖因子等の添加因子は全て除いたもの)中にcell scraperで物理的にはがして回収し、液体窒素による凍結融解を5回行った。さらに15000rpm, 5min遠心した上清を増殖培地に10分の1量加えた培地で刺激を行った。その結果、表皮角化細胞に対しては影響を与えなかったが、皮膚微小血管内皮細胞に対しては、前年度に行ったIL-33による刺激の場合と同様、刺激後36時間をピークとするIL-8およびIL-6の顕著な遺伝子発現誘導が確認された。以上の結果は、掻破刺激が炎症性分子の誘導を引き起こし炎症悪化に繋がる機序の存在を示唆するものである。本研究課題の前年度までの成果により、1IL-33は皮膚組織細胞の特に表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞に作用して、好中球性炎症に関与している可能性、さらに2皮膚表面の掻破刺激モデルとして、表皮角化細胞の細胞破砕液でintactな表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞を刺激したところ、表皮角化細胞に対しては全く影響を与えなかったが、皮膚微小血管内皮細胞に対しては、IL-33刺激の場合と同様、刺激後36時間をピークとするIL-8およびIL-6の顕著なmRNA発現誘導が確認された。以上の結果は、掻破刺激が皮膚血管に炎症性分子の誘導を引き起こし、炎症悪化に繋がる機構の存在を示唆するものである。最終年度ではさらに、表皮角化細胞破砕液を皮膚線維芽細胞に作用させると、アレルギー疾患発症の鍵となるサイトカインIL-33、TSLP、さらには好酸球の遊走に関与するMCP-3などのケモカインmRNAが顕著に誘導されることを明らかにした。TSLP、MCP-3については蛋白産生も確認した。これらの結果は、かゆみのため皮膚組織を掻破すると、傷害された表皮角化細胞から放出される何らかの物質により、炎症性皮膚疾患の病態悪化を誘導する機構の存在を示すものであり、いわゆる“かゆみと掻破の悪循環"(itch-scratchサイクル)に関して、分子メカニズムの一端を示唆するものである。しかし、この掻破刺激モデルにおいて、表皮角化細胞に発現するIL-33が原因物質としてどの程度関与しているのか、あるいは破砕液中に含まれる炎症悪化の誘導に決定的な物質の同定には至らなかった。

最近になり、IL-33は様々な血球系細胞に作用してTh2免疫応答を強力に惹起すること、IL-33やその受容体ST2の遺伝子多型が様々なアレルギー疾患発症と関連すること、さらに皮膚においてもIL-33は尋常性乾癬やアトピー性皮膚炎の病変部で増加していることが報告されているが、IL-33の皮膚組織細胞に対する作用については不明である。本年度は、皮膚組織細胞(表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、皮膚微小血管内皮細胞)をIL-33で刺激した際、発現変動する遺伝子についてGeneChipを用いてスクリーニングした。その結果、以下の点が明らかとなった。(1)皮膚線維芽細胞にはST2が発現していないためIL-33の作用は認められなかった。(2)表皮角化細胞をIL-33で刺激すると、IL-8、GRO等の好中球遊走性ケモカイン群の発現誘導が認められた。(3)皮膚微小血管内皮細胞をIL-33で刺激すると、上記ケモカイン群に加えてIL-6等炎症性サイトカインの誘導・分泌を確認した。(4)IL-33による表皮角化細胞のIL-8産生は、ステロイド薬の添加により顕著に抑制された一方、皮膚微小血管内皮細胞からのIL-8、IL-6産生に対して抑制効果は部分的であった。以上の結果から、IL-33は皮膚組織細胞の中でも、特に表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞に作用することが初めて明らかとなった。皮膚組織におけるIL-33の作用は、主として好中球性炎症に関与している可能性が示唆されたが、特に皮膚微小血管内皮細胞におけるIL-33作用に対して、ステロイド薬の抑制効果が限定的であることから、IL-33/ST2は炎症性皮膚疾患における新たな治療標的をなる可能性がある。IL-33は特にバリア組織に恒常的に発現するアレルギー関連遺伝子であることから、皮膚組織におけるその作用標的細胞を同定することは、喫緊の課題であった。本年度の研究成果により掻破刺激がIL-33同様に皮膚微小血管内皮細胞に作用して、主に好中球性炎症に関与するサイトカイン・ケモカインを強力に誘導することが明らかとなった。このことは、当初の研究目的である皮膚バリア機能の傷害と炎症の増悪を結びつける機序の解明に対して、今後の研究の方向性・発展性を示唆するきわめて重要な成果である。この点で概ね目標を達成していると思われる。一方、ここにIL-33がどのように関与しているのかについては、明らかにするまでには至らなかった。本年度の研究成果によりIL-33は表皮角化細胞および皮膚微小血管内皮細胞に作用して主に好中球性炎症に関与するサイトカイン・ケモカインを強力に誘導することが明らかとなった。従って、当初の研究目的と照らし合わせても、概ね目標を達成していると思われる。一方、当初の研究計画に記載していた、IL-33応答により機能する分子の機能解析までは至らなかった。IL-33がマスト細胞や自然リンパ球などの血球系細胞に作用した場合、IL-13等Th2サイトカイン産生を強力に誘導することが知られているが、皮膚組織ではIL-33同様、掻破刺激モデルにおいてもTh2関連因子よりも、むしろ好中球関連因子の発現を顕著に誘導した。
乱流拡散火炎における微視的乱れ構造の時系列的変化が燃焼特性に及ぼす影響

乱流拡散火炎は、工業的に最も多く利用され、熱エネルギーの生産に多大な貢献をしているにもかかわらず、その火炎構造と燃焼過程があまりににも複雑なため、基礎的な立場から明確に理解されていない部分を数多く残している。このため合理的な燃焼法の追求がなされぬまま実用に供されている機器も数多くあり、エネルギー有効利用・環境浄化の点から改善を迫られている。本研究では、円形バ-ナを用い軸対称乱流拡散火炎を炭化水素系燃料により周囲空気流中に形成し、超高速ビデオカメラにより空間火炎混合過程の時間的な変化を可視化し理解することを目的とした。さらに、乱流拡散火炎の階層構造に着目し、その巨視微視的な観察スケールでの混合過程とそのつながりを理解することを目的とし、基礎的なデータと新しい知見を報告する。巨視的観察スケールでは、瞬間火炎発光像より火炎形状を抽出し、幾何学的混合過程を定量解析するためにフラクタル解析および幾何学的固有値の変化より火炎形状の時間的変化を具体的に検討した。局所的観察スケールでは、レーザ・シート法によるラグランジュ的粒子追跡法と瞬間火炎発光像による火炎形状の抽出法の複合計測を行い、乱流拡散混合過程のパターンを周囲空気流と火炎形状の変化より可視化し運動学的観点から定量解析を試み、秩序構造の存在を示唆した。微視的観察スケールでは、周囲空気流中に添加した1粒子をラグランジュ的に追跡し、階層構造の存在を示唆した。さらに、乱流拡散火炎構造の階層的なつながりの本質を理解するために、微視的火炎構造がどの様に局所さらに巨視的火炎構造に影響を与えているのかを知るために、高速度ビデオシステムを用い従来1点計測で用いた測定体積内をLRSにより空間的に捉え、微視的火炎構造の定量的な解析を行った結果を報告した。実験は、微視的な瞬間2次元温度分布の時系列変化を捉え、1点計測結果と比較することによりその基本的構造の特徴を抽出した。さらに、テスクチュア解析およびテスクチュア勾配解析により空間火炎構造の各領域での特徴を定量解析し、情報エントロピー解析によりその存在確率を求め、空間火炎構造のつながりについて検討した。本研究は、乱流拡散火炎の燃焼特性に決定的な影響を与えているにもかかわらず、計測技術の点でこれまで取り上げなかった乱れの局所的な微細構造が示す時系列的変化を熱流体反応工学の立場から定量的かつ具体的に把握・解明し、乱流拡散火炎構造の本質を実験的に解明することを目的としている。そこで、本年度は、申請者らがこれまで実施してきた非接触温度測定法であるレーザレイリ散乱法をさらに発展させ、2次元レーザ光シートを光源とする2次元温度分布を高速VTRを用い時系列画像として得た。測定領域は、火炎の全体像から0.22×0.44mm^2の微小領域までにわたり、得られた時系列画像は画像処理して2次元時系列クラスタ解析を行った。さらに、乱流拡散火炎の燃焼特性に重要となる燃料流への空気の巻き込み挙動を可視化し、その巻き込み挙動と火炎領域の運動とを相関させた。空気の巻き込みを可視化する方法は、周囲空気流にLDV粒子を同伴させ、光源である2次元レーザ光シートへ粒子が通過する際に散乱するミー散乱光を用いた。この粒子の運動を時系列的に追い、粒子の主流方向速度および半径方向速度の2成分に分解した。

一方、火炎領域は火炎発光が識別できる輝度を画像処理により判定し、その値をしきい値として2値化処理することによりその位置を定めた。火炎領域の運動は、振動、並進および回転の3つの要素に分離し、それぞれ粒子の主流方向および半径方向速度成分と相関を取った。結果として、微小領域のクラスタ時系列クラスタ解析より、本実験条件のような微小領域においても高温のガス塊が存在し、微視的な火炎構造の存在が明らかとなった。空気の取り込みと火炎領域の運動の相関より、火炎領域の振動運動が減衰する際に空気が取り込まれること、火炎領域がバーナ中心方向へ速く移動するほど空気はバーナ中心方向へ取り込まれること、火炎領域が右回りに速く回転するほど空気はバーナ中心方向へ取り込まれることならびに回転方向に関係なく火炎の回転角速度が増加すると空気の主流速度は増加することなどが明らかになった。乱流拡散火炎は、工業的に最も多く利用され、熱エネルギーの生産に多大な貢献をいているにもかかわらず、その火炎構造と燃料過程があまりににも複雑なため、基礎的な立場から明確に理解されていない部分を数多く残している。このため合理的な燃焼法の追求がなされぬまま実用に供されている機器も数多くあり、エネルギー有効利用・環境浄化の点から改善を迫られている。本研究では、円形バ-ナを用い軸対称乱流拡散火炎を炭化水素系燃料により周囲空気流中に形成し、超高速ビデオカメラにより空間火炎混合過程の時間的な変化を可視化し理解することを目的とした。さらに、乱流拡散火炎の階層構造に着目し、その巨視微視的な観察スケールでの混合過程とそのつながりを理解することを目的とし、基礎的なデータと新しい知見を報告する。巨視的観察スケールでは、瞬間火炎発光像より火炎形状を抽出し、幾何学的混合過程を定量解析するためにフラクタル解析および幾何学的固有値の変化より火炎形状の時間的変化を具体的に検討した。局所的観察スケールでは、レーザ・シート法によるラグランジュ的粒子追跡法と瞬間火炎発光像による火炎形状の抽出法の複合計測を行い、乱流拡散混合過程のパターンを周囲空気流と火炎形状の変化より可視化し運動学的観点から定量解析を試み、秩序構造の存在を示唆した。微視的観察スケールでは、周囲空気流中に添加した1粒子をラグランジュ的に追跡し、階層構造の存在を示唆した。さらに、乱流拡散火炎構造の階層的なつながりの本質を理解するために、微視的火炎構造がどの様に局所さらに巨視的火炎構造に影響を与えているのかを知るために、高速度ビデオシステムを用い従来1点計測で用いた測定体積内をLRSにより空間的に捉え、微視的火炎構造の定量的な解析を行った結果を報告した。実験は、微視的な瞬間2次元温度分布の時系列変化を捉え、1点計測結果と比較することによりその基本的構造の特徴を抽出した。さらに、テクスチュア解析およびテクスチュア勾配解析により空間火炎構造の各領域での特徴を定量解析し、情報エントロピー解析によりその存在確率を求め、空間火炎構造のつながりについて検討した。
粘性土の変形を考慮した浸透特性の計測法の開発

本研究は,従来ほとんどデータのない粘性土を対象とし,間隙比の変化を考慮した不飽和浸透特性を室内及び原位置で計測する方法の開発を目的とした。特に,不飽和粘土の体積含水率をFDRにより簡便かつ正確に計測する方法を開発し,その適用性を吟味した。(1)粘性土の飽和透水係数と間隙比の関係の計測加圧型飽和透水試験の実施により,飽和透水係数の間隙比に対する依存性を明らかにした。ただし,低透水性物質では,測定流量が微量になることから,精度上の問題が生じる場合があることが判明した。(2)粘性土の浸潤過程と排水過程の水分特性曲線を間隙比を考慮した計測粘性土の不飽和浸透特性を土柱法と加圧版法により測定した。そこで新たな水分特性曲線の評価法として,間隙比を含めた3要素的な評価法が有効であることがわかった。(3)FDR水分計測法の粘性土に対する適用性の検討粘性土供試体の体積含水率を計測する方法として,FDR計測法(Frequency Domain Reflectometry)の適用性の検討を行った。その結果,粘土試料に対してわずかなキャリブレーション曲線のずれが見られたものの,飽和度全般にわたり精度良い局所的な計測が可能で,その有用性が確認できた。しかし,ベントナイトのようなイオンを多く含む試料に対しては,干渉波を検出できず,従来の方法では測定不可能であった,そのため,電極を絶縁物質でコーティングした新しいプローブを開発し,ほぼ全試料に対する体積含水率の測定を可能にした。(1)粘性土の飽和透水係数と間隙比の関係の計測で低透水性の粘性土供試体の原位置でのサンプリング法の検討と,低透水性材料のフローポンプ法を用いた定流量透水試験を実地した。現在までの試験結果により,粘性土の飽和透水係数の感隙比に対する依存性が明らかにされた。ただし,低透水性物質では,測定流量が微量になることから,精度上の問題が生じるため今度検討が必要である。(2)粘性土の浸潤過程と排水過程の水分特性曲線を間隙比を考慮して計測した。粘性土の不飽和浸透特性を加圧版法により測定した。そこで新たな水分特性曲線の評価法として,関隙比を含めた3要素的な評価法が有効であることがわかった。土柱法を用いての浸潤試験を実地中で,体積含水率と負の圧力水頭の計測を行っている。また,低透水性物質の水分特性曲線を土柱法で測定するには長時間を要するため,今後,得られた非定常結果から水分特性曲線を評価する方法を検討する必要がある。(3)粘性土供試体の体積含水率を計測する方法としてRI計測法とFDR計測法の比較・適用性の検討を行った。現在,FDR計測法とRI計測法の比較を行っているが,局所的な計測におけるFDR計測法の有用性が確認できた。(1)粘性土供試体の体積含水率を計測する方法として,FDR計測法(Frcqucncy Domain Reflectometry)の適用性の検討を行った。その結果,粘土試料に対してわずかなキャリブレーション曲線のずれが見られたものの,飽和度全般にわたり精度良く測定できることを確認した。しかし,ベントナイトのようなイオンを多く含む試料に対しては,干渉波を検出できず,従来の方法では測定不可能であった,そのため,電極を絶縁物質でコーティング(1mm厚)した新しいプローブを開発し,ほぼ全試料に対する体積含水率の測定を可能にした。(2) FDR計測法を用いた室内試験における不飽和浸透特性を測定する方法として,瞬時水分計測装置を開発した。従来までのRI計測法と比較して,測定が瞬時で局所的な測定が可能であるため,精度良く求めることが可能となり,FDR計測法の有用性が確認できた。

(3)原位置での不飽和浸透特性の計測方法の開発を目的とし,浸潤過程の実験を原位置で行った。地盤内の体積含水率の変化をADR計測法(Amplitude Domain Reflectometry)により計測し,負の圧力水頭の変化を挿入型間隙水圧計(既開発装置)によって計測した。この結果より,浸潤過程の水分特性曲線を求めた。また,原位置で給水を十分に行い,給水を停止した後の体積含水率の変化と負の圧力水頭の変化を同様の方法で計測し,排水過程の水分特性曲線を求めた。これら2つの挙動より,場のヒステリシスを確認し,不飽和浸透に対して,その浸透の過程でそれぞれに合った水分特性曲線を用いなければならないことが判明した。(4)原位置よりサンプリングした試料を室内試験で水分特性曲線及び不飽和透水係数を計測した。計測法には改良型加圧板法を用い,浸潤過程での測定を可能とした。またサンプリング法の違いによる不撹乱試料の密度の違いを検討した。結果としてパーカッションボーリング法では孔底や孔壁の密度増加により採取試料の密度増加が,また,コアカッター法による採取試料は拘束圧の除去による密度の低下が見られたが,両者の差はわずかであり,その影響は無視できる程度であった。本研究は,従来ほとんどデータのない粘性土を対象とし,間隙比の変化を考慮した不飽和浸透特性を室内及び原位置で計測する方法の開発を目的とした。特に,不飽和粘土の体積含水率をFDRにより簡便かつ正確に計測する方法を開発し,その適用性を吟味した。(1)粘性土の飽和透水係数と間隙比の関係の計測加圧型飽和透水試験の実施により,飽和透水係数の間隙比に対する依存性を明らかにした。ただし,低透水性物質では,測定流量が微量になることから,精度上の問題が生じる場合があることが判明した。(2)粘性土の浸潤過程と排水過程の水分特性曲線を間隙比を考慮した計測粘性土の不飽和浸透特性を土柱法と加圧版法により測定した。そこで新たな水分特性曲線の評価法として,間隙比を含めた3要素的な評価法が有効であることがわかった。(3)FDR水分計測法の粘性土に対する適用性の検討粘性土供試体の体積含水率を計測する方法として,FDR計測法(Frequency Domain Reflectometry)の適用性の検討を行った。その結果,粘土試料に対してわずかなキャリブレーション曲線のずれが見られたものの,飽和度全般にわたり精度良い局所的な計測が可能で,その有用性が確認できた。しかし,ベントナイトのようなイオンを多く含む試料に対しては,干渉波を検出できず,従来の方法では測定不可能であった,そのため,電極を絶縁物質でコーティングした新しいプローブを開発し,ほぼ全試料に対する体積含水率の測定を可能にした。
インプラント術前予測のためのコーンビームＣＴを活用したヒト生体骨梁モデルの確立

本研究は国内外で初めて3次元有限要素法(3D-FEM)を用い、下顎のコーンビームCT(CBCT)画像およびインプラントのμCT画像に基づいた実際のインプラント予定部位に対し、インプラント埋入後の状態をシミュレーションしたヒト生体骨梁モデルの構築および応力解析が達成できた。将来的にインプラント植立の難易度が高い症例において、術前に植立予定部位のCBCT画像に様々な形態や寸法のインプラントのμCT画像を様々な角度で重ね合わせ、それぞれに対して精密な3D-FEMモデルを構築し、術後のインプラント周囲骨の応力やひずみを予測し、それらを最小化する治療計画を選択するシステムへの発展につながる。平成25年度は前年度に2012年納入コーンビームCT(以下CBCT)(AUGE SOLIO,アサヒレントゲン)を用いた下顎の乾燥骨の画像を基に作成した3次元有限要素モデル(CBCT-2012)を活用し、応力解析を行った。そのためにまず、RATOC社製3D骨梁構造計測ソフトTRI/3D-BONを用いて皮質骨・海綿骨の二値化された画像を修正し、モデルの精度を向上させた。完成したモデルに対し、RATOC社製有限要素法ソフトTRI/3D-FEMを用いて皮質骨、海綿骨およびインプラントそれぞれの物性値を定義した。次、荷重条件はモデルの底部を拘束し、インプラント上部にあるアバットメントに垂直に200Nの荷重を加え、同三次元有限要素ソフトを用いて応力解析を行った。その解析結果を、研究代表者・分担者らは以前より分析してきた同乾燥骨のμCT画像を基に得られた精密な3次元有限要素モデル(μCTモデル)の応力解析結果と比較し、その結果、両モデルのインプラントと骨の応力分布は概ね一致していた。結果から、力学の視点からCBCT-2012モデルはμCTモデルとほぼ同等のモデルであると考え、平成24・25年度で用いた3次元有限要素モデルの作成手順および解析方法を生体への臨床応用に繋げるために、臨床上必要なCT撮影画像を研究解析対象とする同意を患者から得るべく、研究代表者・分担者および連携研究者2名の体制で新潟大学歯学部倫理委員会へ倫理審査を申請し、本年2月24日に承認を得た。承認を得た研究実施計画に基づいて本年3月12日にインプラント治療予定患者1名より骨診断の目的で撮影されたCBCT画像を本研究へも用いる同意を得た。それらの画像データを用いて平成26年度に3次元有限要素応力解析モデルを作成・解析を進めていく。研究代表者・分担者らは以前より、下顎の乾燥骨のμCT画像を基に精密な3次元有限要素モデルを作成し、インプラント周囲骨を骨梁レベルまで応力分析できる方法を確立してきた。本研究ではこの方法を応用し、ヒトにも適応可能にすることを目指して、歯科用コーンビームCT(以下CBCTと略す)より得られるデータをベースに歯槽骨の精密な3次元有限要素モデルの構築・検証を行う。本研究はインプラント植立の術前段階で術後のインプラント周囲骨応力の分布予測を可能にするための基盤となる研究である。平成24年度は,以前より用いてきた、インプラント埋入ヒト乾燥下顎骨を用いてCT撮影を行った。撮影機器はμCT(ELESCAN,日鉄エレックス,東京)、2009年納入CBCT(CB MercuRay,日立メディコ,東京)、2012年納入CBCT(AUGE SOLIO,アサヒレントゲン,京都)の3機種であった。3機により撮影されたデータをそれぞれ「μCT」、「CBCT-2009」および「CBCT-2012」とした。3機により撮影された画像およびDICOMデータをマルチプルTIFFに変換し、RATOC社製3D骨梁構造計測ソフトTRI/3D-BONおよびRATOC社製有限要素法ソフトTRI/3D-FEMを用いて3つの3次元有限要素解析モデルを構築し、モデル構築プロセスにおける骨梁の再現性について撮影機器間の比較検討を行った。得られた画像より作成された3次元有限要素解析モデルの骨梁の再現性はμCT >CBCT-2012>CBCT-2009の順であった。その結果を踏まえて平成25年度以降、CBCT-2012を活用し、ヒト臨床応用に向けて、湿潤環境における結合織の影響を考慮しながら、生体を対象とすべく倫理規定に基づいたヒト骨梁での解析を進めていく。平成26年度は25年度にインプラントに垂直に荷重が加わった条件で比較した下顎の乾燥骨から得たコーンビームCT(以下CBCT)画像データを基に作成した3次元有限要素モデル(以下CBCTモデル)とμCT画像を基に得られた精密な3次元有限要素モデル(μCTモデル)を側方荷重下でのインプラント周囲骨応力を比較した。モデル間で皮質骨・海綿骨それぞれは同様な応力値と応力分布を示した。

それらの結果と前年度に得た垂直荷重下での結果によって、荷重方向にかかわらず、CBCTモデルは力学的視点において、精密なμCTモデルと類似した性質を有することを検証した。また、同様な方法において臨床応用可能な3次元有限要素(3D-FEM)骨梁応力解析モデルについても作成および解析を試みた。患者の同意のもと、歯科用CBCT装置(AUGE SOLIO,アサヒレントゲン)により撮影したインプラント治療前の下顎臼歯部の欠損部の画像データを用いた。また、μCT装置(ELESCAN日鉄エレックス)を用いてアバットメントを装着したネジ型のインプラント単体を撮影した。その後、ボリューム画像位置合わせオプションを付加したRATOC社製3D骨梁構造計測ソフト(TRI/3D-BON)を用いてCBCTデータから得た3D-FEM骨梁モデルに別当で撮影したインプラントのデータを重ね合わせてインプラント埋入後の状態をシミュレーションした3D-FEMモデルを構築した。完成したモデルに対し、RATOC社製有限要素法ソフトTRI/3D-FEMを用い、インプラント上部にあるアバットメントに垂直に200Nの荷重を加え、応力解析を行った。その解析結果、インプラント周囲の皮質骨と海綿骨の応力分布は骨梁レベルまで明かとなった。したがって、本モデルの作成方法・分析方法が術前の段階で術後のインプラント周囲骨応力の予測を可能にするための基盤となり、応力・ひずみを最小化する治療計画を選択するシステムへ臨床的な発展ができると考える。医歯薬学平成25年度は本研究を前年度の研究実施計画に従って実施し、得られた研究結果は平成26年度6月に開催される国際学会に口頭発表として確定済みであり、又平成24年度の研究結果と併せて国際雑誌に論文(1件)掲載されたことから現在までの達成度がおおむね順調に進展していると評価している。平成24年度は本研究を当初の研究実施計画に従って実施し、得られた研究結果は平成25年度に開催される国内学会(1件)と国際学会(2件、うち招待講演1件)に演題登録済みであり、現在までの達成度がおおむね順調に進展していると評価している。平成26年度は前年度にインプラント治療前の臼歯部下顎骨のCBCT画像データを用いてヒト生体からの下顎骨の3D-FEM骨梁応力解析モデルの作成を試みる。予見される課題として、顔面等の軟組織に含まれている水分により乾燥骨のCBCT画像に比較して生体のCBCT画像の質が劣ることである。そのため、撮影条件を変更しながら、画像の改善を図った上で得られた素画像を手作業で骨梁間の補間作業を行い、ヒト生体骨梁モデルを完成させる。その後、CBCTデータより得られた3D-FEM骨梁モデルに別当で撮影したインプラントのデータを位置合わせソフトにより重ね合わせてインプラント埋入後の状態をシミュレーションした3D-FEMモデルを構築する。3D-FEM骨梁モデルの構築が得られれば、インプラントに咬合力に相当する力を加えた上で応力解析を行い、インプラント周囲骨の応力分布を解析し、μCTデータより得たインプラント・骨梁モデルの解析結果と比較検討する。平成25年度は前年度に乾燥骨から得た3次元有限要素モデル(CBCT-2012)を活用し、応力解析を行い、その解析結果を同乾燥骨のμCT画像から得られた
膵β細胞に発現する脂質・アミノ酸反応性遺伝子の同定とその病態生理学的意義の解明

マウス培養膵β細胞株であるβHC9細胞を用い、まず脂肪酸輪送タンパク(FATP)とアシルCoA結合タンパク(ACBP/DBI)について、発現アイソイフォームを確認した。前者はFATP4が主なサブタイブで、他にFATP1及び2が発現、後者はdegenerate-PCRを行ったが既報の遺伝子のみであった。次にβHC9細胞を、1mMパルミチン酸を含む培養液及び含まない培養液で72時間培養した。グルコース刺激に対するインスリン分泌をみると、低濃度グルコースでは抑制、高濃度グルコースでは分泌が亢進していた。この系で細胞からtotalRNAを調製し、蛍光ディファレンシャルディスブレイ(FDD)法(HIEROGLYPH, GENOMYX社)およびマイ・クロ・アレイ(GeneCbipシステム、マウスアレイU74セットA、B、C)法にて、発現に差のある遺伝子を系統的に探索した。パルミチン酸添加により発現が上昇・低下した遺伝子は、ESTやアノテーション不明の配列も含め、FDD法で解析可能だったものが全部で31個、一方マイクロアレイ法では、上昇44個・低下66個、であったが、方法論の違いを反映してか両者の結果にオーバーラップはみられなかった。この中には脂質代謝酵素なども認めたが、これまで脂質代謝やインスリン分泌に関係が報告されていなかった遺伝子も認められた。なおGeneChipについては、変動上位10遺伝子・ESTについては定量RT-PCR法(TaqMan)を用いて発現変化の確認作業を行った。新生児期に高インスリン血性低血糖症(PHHI)を生じ、高アンモニア血症をともなう症例で、グルタミン酸脱水素酵素の遺伝子異常を同定した。切除膵の組織学的検討では、膵内分泌細胞のびまん性増殖がみられた。アミノ酸代謝と糖代謝、インスリン分泌のリンクとして興味深いと考え、若干の検討を行った。まず脂肪酸輸送タンパク(FATP)について膵β細胞での発現を検討し、FATP4が主なサブタイプで、他にFATP1及び2が発現することを示した。このパターンは、培養グルコース濃度の変化や脂肪酸刺激によっても明らかな変化がなかった。膵と発生学的に近縁な小腸での主要サブタイプもFATP4と報告されており、栄養素と消化吸収器官との関連から興味深い。次にアシルCoA結合タンパク(ACBP/DBI)について、既知のアシルCoA結合部位のアミノ酸配列をもとにdegenerateオリゴを作成してRT-PCRを行い、膵β細胞に発現する新規のサブタイプのクローニングを試みたが、得られたものはすべて既知のACBPであった。膵β細胞で脂肪酸に反応して発現が変化する遺伝子群を系統的に調べるため、培養細胞(βHC9細胞)を0.3μM、3μMのパルミチン酸で48時間培養した後RNAを抽出した。現在このRNAを用いてデファレンシャルディスプレー(DD)法を行い、発現に差のあるバンドを切り出して遺伝子の同定を進めている。アミノ酸代謝の重要なステップをになうグルタミン酸脱水素酵素(以下GLUD1)の異常により新生児の高インスリン血性低血糖症(PHHI:Persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy)を生じた症例を同定した。本酵素異常は世界で10例程度しか報告がないが、切除膵の組織学的検討を行い、膵内分泌細胞のびまん性増殖がみられることを明らかにした。βHC9細胞に、GLUD1および変異GLUD1のcDNAを一過性あるいは恒常的に過剰発現させたが、グルコース、ロイシンなどの代謝性刺激に対するインスリン分泌には明らかな影響を認めなかった。しかし膵β細胞におけるアミノ酸代謝の重要性を示すものと考え、現在さらにアンチセンスを過剰発現させ、その影響を検討している。

マウス培養β細胞株であるβHC9細胞を用い、パルミチン酸を含む培養液及び含まない培養液で72時間培養した後、RNAzol試薬を用いてtotal RNAを回収した。GENOMYX社の蛍光ディファレンシャルディスプレイシステム(HIIEROGLYPH)用キットを使用し、アンカープライマーを用いてcDNA断片を合成、5'-arbituary primerと3'-蛍光アンカープライマーとでPCRを施行し増幅した。電気泳動および画像解析は、ベックマンコールスター社のFluoroDDを用いておこない、発現に差の見られたバンドを切りだして回収し、アダプター配列を利用してPCRで再増幅したのち、直接シークエンス法あるいはプラスミドサブクローニングにより、それぞれの塩基配列を決定した。増幅した断片の長さは100450bpであった。現在までに28クローンを切りだし、24クローンの塩基配列を決定した。既知クローンが14(うちミトコンドリアDNA由来が6クローン)、未知あるいはESTの報告のみのものが10クローンであった。現在、ノザン法あるいは定量RT-PCR法を用いて発現量の変化を確認するとともに、変化を認めたクローンの生理学的意義について検討中である。またヒトにおいてグルタミン酸脱水素酵素異常による新生児高インスリン血症の症例を同定し、臨床像と比較しながらアミノ酸の膵β細胞への影響を解析した。マウス培養膵β細胞株であるβHC9細胞を用い、1mMパルミチン酸を含む培養液及び含まない培養液で72時間培養した。グルコース刺激に対するインスリン分泌をみると、低濃度グルコースでは抑制、高濃度グルコースでは分泌が亢進していた。細胞を回収してtotal RNAを調製し、cDNA、さらにビオチンラベルしたcRNAを作成し、断片化した後アマシャムGeneChipシステムにて解析を行った。チップとしてはAffymetrix社製マウスアレイU74セット(A、B、C)を用いた。これにより、UniGene登録の既知遺伝子(完全長)約6,000種、及びEST約30,000種をスクリーニングしたことになる。パルミチン酸添加により遺伝子発現が2.5倍以上増加した遺伝子・ESTを44個、2.5倍以上低下したものを66個得たが、この中には脂質代謝に関連するものも認められたほか、これまで脂質代謝やインスリン分泌に関係が報告されていなかった遺伝子も認められた。GeneChipシステムの問題点として、発現変化の定量性を他の方法で確認する必要があることが指摘されており、ESTも含めて定量RT-PCR法(TaqMan)を用いて確認作業を行っている。今回の結果を、当研究において平成12年度に、同様のRNA試料を用いて蛍光ディファレンシャルディスプレイシステム(HIEROGLYPH, GENOMYX社)にて行った解析結果と比較した。得られた遺伝子群は必ずしも一致しないが、方法論の違いによるものと考えている。いずれにしても、膵β細胞においてグルコース以外の栄養素により発現が変化する遺伝子を2つの全く異なる方法で網羅的にスクリーニングできたと考えており、現在各遺伝子の生理的意義を解析している。
脱リン酸化を介したオートファジーアテニュエーションシステムの統合的理解

オートファジーは真核生物に備わる分解系で、飢餓時に細胞質成分を液胞やリソソームに輸送し分解する。オートファジーによる分解は非特異的かつバルクであることから、その活性は厳密に制御される。オートファジー活性にリン酸化酵素が参画していることが知られているが、どの脱リン酸化酵素が、どのように関与するか、は全く不明である。本研究では、PP2AとカルシニューリンがAtg13を基質としてオートファジーの開始に、Msg5とSdp1がSlt2を基質として負の制御に寄与することを見出した。また、オートファジーに必須な、新規PI3キナーゼ構成因子Atg38が複合体形成に寄与することを明らかにした。オートファジーは真核生物に普遍的に備わる大規模なタンパク質分解系である。オートファジーは生体内物質のリサイクルシステムとしての機能を持っており、外部の栄養環境によって活性が制御される。その際、関連因子のリン酸化や脱リン酸化がその誘導あるいは抑制のスイッチとして機能している。オートファジー制御に必須な二つのタンパク質キナーゼTorとAtg1が同定されているのに対し、脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼについては、未だに知見が得られていない。オートファジー関連因子Atg13は富栄養条件下でTorキナーゼにより高度にリン酸化されている。この修飾はオートファジー活性の抑制に寄与する。逆に、飢餓時ではAtg13は脱リン酸化されるが、その脱リン酸化を担うホスファターゼは未同定である。従って、本年度ではオートファジー活性状態を司るAtg13のリン酸化制御に関与するホスファターゼの同定を目的とした。Atg13のリン酸化状態に異常を生じる酵母変異株を探索した結果、PP2Aホスファターゼ不全株では、飢餓時にAtg13が高度にリン酸化されていた。また、遺伝学的解析より、この変異株では、飢餓時にAtg13はTorではなくAtg1キナーゼによりリン酸化されることが示唆された。さらに精製標品を用いた試験管内アッセイでもAtg13がAtg1の基質となったことから、生体内においてAtg13がAtg1キナーゼの直接の標的であることが明らかとなった。以上の結果から、野生株においてはオートファジー誘導条件下で活性化されたAtg1がAtg13をリン酸化する一方で、PP2AがAtg1キナーゼに拮抗したホスファターゼとして、Atg13の脱リン酸化状態を維持していると考えられる。オートファジーは生体内物質のリサイクルシステムとしての機能を担っており、外部の栄養環境によって活性が制御される。オートファジー制御に必須な二つのタンパク質リン酸化酵素(キナーゼ)、TorとAtg1が同定されているのに対し、脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼの知見は未だに得られていない。出芽酵母には141のキナーゼに対しホスファターゼは38しか存在せず、各ホスファターゼの機能が重複している。このためホスファターゼの機能を探ることが非常に困難となっている。オートファジー関連ホスファターゼの同定を目的に、複数のホスファターゼを同時に欠損した酵母株を用い、機能喪失から“必要性"を検証するアプローチと、ホスファターゼの機能亢進によるオートファジー活性への影響から“十分性"を検証するアプローチを試みた。前者のアプローチからPP2Aホスファターゼとカルシニューリンを共に欠損した酵母においてAtg13のリン酸化状態に異常を生じることを見出した。Atg13はリン酸化-脱リン酸化サイクルを介してオートファジー活性のオンオフを担うスイッチとして機能することから、この二つがオートファジー活性を制御するホスファターゼであると考えられる。また後者のアプローチから、細胞内発現量を増加することによって、外部の栄養状態非依存的にオートファジーを誘導するホスファターゼ、飢餓条件下においてオートファジー活性を抑制するホスファターゼを同定した。これらは共にAtg13のリン酸化状態に異常が見られないことから、リン酸化を介した未知のオートファジー活性制御経路に寄与すると考えられる。オートファジーは真核生物に普遍的に備わる大規模なタンパク質分解系であり、生体内物質のリサイクルシステムとしての機能を担っている。外部の栄養環境による活性制御には、関連因子のリン酸化や脱リン酸化がその誘導あるいは抑制のスイッチとして機能している。オートファジー誘導に必須な二つのタンパク質リン酸化酵素(キナーゼ)、TorとAtg1が同定されているのに対し、負の制御を担うであろう脱リン酸化酵素(ホスファターゼ)の知見は未だに得られていない。このため機能喪失をもとにしたホスファターゼの同定が非常に困難となっている。オートファジー関連ホスファターゼの同定を目的に、機能亢進によりオートファジーを抑圧するホスファターゼの探索を出芽酵母をモデル系に用いて行った。最近構築されたヒトホルモンを誘導剤とした強制発現誘導系を用いることにより、飢餓条件下においてオートファジー活性を抑制する二つのホスファターゼMsg5とSdp1を見出した。Msg5とSdp1はともにキナーゼであるSlt2を負に制御していることが知られている。

Slt2欠損株が、二つのホスファターゼの強制発現で観察された表現型、即ちオートファジー活性の低下、Atg8の発現量の低下、Atg13の脱リン酸化の亢進、を示した。Slt2のキナーゼ活性は飢餓後早い時間で活性化されることを鑑みると、Slt2はオートファジーを誘導を正に制御するのに対して、ホスファターゼであるMsg5とSdp1はこれに拮抗していると考えられる。本研究により、これまでのオートファジー研究に適用されていなかった強制発現による“機能亢進"を用いた網羅的検索により、これまで看過されたオートファジー関連新奇因子が同定され、分子機構に新たな一面を明らかにした。オートファジーは真核生物に備わる分解系で、飢餓時に細胞質成分を液胞やリソソームに輸送し分解する。オートファジーによる分解は非特異的かつバルクであることから、その活性は厳密に制御される。オートファジー活性にリン酸化酵素が参画していることが知られているが、どの脱リン酸化酵素が、どのように関与するか、は全く不明である。本研究では、PP2AとカルシニューリンがAtg13を基質としてオートファジーの開始に、Msg5とSdp1がSlt2を基質として負の制御に寄与することを見出した。また、オートファジーに必須な、新規PI3キナーゼ構成因子Atg38が複合体形成に寄与することを明らかにした。オートファジー活性のスイッチ蛋白質Atg13は富栄養条件下でTorキナーゼにより高度にリン酸化され、オートファジー活性の抑制に寄与する。飢餓に呼応してAtg13が脱リン酸化されることで抑制が解除されオートファジーが誘導されるが、この脱リン酸化を担うホスファターゼは未同定であった。平成25度、ホスファターゼ欠失酵母株を多数探索することにより、リン酸化Atg13のホスファターゼとしてPP2Aを同定した。その後の解析でPP2A欠失した酵母でもAtg13の脱リン酸化が弱く起こり、有意なオートファジー活性を有することが明らかとなり、Atg13を基質とする他のホスファターゼの寄与が示唆された。PP2Aと生育に非必須である36のホスファターゼの二重変異株を検索し、カルシニューリンを候補として見出した。出芽酵母には141のタンパク質キナーゼに対し、タンパク質ホスファターゼは38しか存在せず、各ホスファターゼの機能が重複している。この重複は単独破壊株を用いる機能喪失から必要性を検証するアプローチを困難にしている。従って、本年度はホスファターゼの機能亢進、具体的には過剰発現によるオートファジー活性への影響から、十分性を検証することを新たに試みた。外界の酵母の既存の発現系は栄養変化、金属イオンを利用するが、オートファジー自身がこれらに左右される。そこでオートファジーへ全く作用することなく遺伝子発現できるベータエストラジオール誘導系を構築した。38種のホスファターゼの発現量を増加したときのオートファジーへの影響を検証し、1.富栄養条件下でAtg13の脱リン酸化を促進する2.富栄養条件下でAtg13の脱リン酸化を介さずオートファジーを活性化する、3.飢餓条件下でオートファジー活性を阻害する、以上三つのカテゴリーのホスファターゼを同定している。細胞生物学Atg13