hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関節炎抑制蛋白によるリウマチ性疾患の病態解析と新規治療法開発に関する研究

本研究は、以前に見出した関節リウマチ(RA)の新たな自己抗体である抗カルパスタチン抗体と抗FRP抗体の対応抗原がいずれも関節炎抑制作用を示したことから、これらの自己抗体がRAの発症と増悪に関与する病原性自己抗体ではないかと考え、これら自己抗原および自己抗体の制御によって関節炎を治療できる可能性を追求した。カルパイン(カルシウム依存性中性プロテアーゼ)の特異的インヒビターであるカルパスタチンは線維芽細胞のIL-6産生を抑制するだけでなく、T細胞分化にも影響することが判明した。関節炎モデルにおいてはカルパスタチンは炎症を抑制しカルパインは増強した。フォリスタチン関連蛋白(FRP)はヒトとマウスで炎症の制御に関して異なる働きを有する可能性が示唆され、マウス関節炎に対してヒトFRPは抑制したが逆にマウスFRPは増強した。これらの炎症制御蛋白の解析により関節炎病態の理解と新たな治療法開発の可能性が示唆される。【目的】申請者らは関節リウマチ(RA)に特異的な自己抗体を見出し,その対応抗原として,カルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子カルパスタチン,およびホリスタチン関連蛋白(FRP)を報告してきた.申請者らはこれら自己抗原の炎症・骨破壊抑制効果を追究し,RAの新たな治療戦略の確立を目指している.本年度は,T細胞分化とサイトカイン産生におけるカルパインの関与,カルパスタチン遺伝子導入によるコラーゲン誘発関節炎、(CIA)の制御を検討した.【方法】1)Th1およびTh2細胞におけるカルパインとカルパスタチンの発現を免疫ブロット法で解析した.2)ヒトカルパスタチンcDNAを組み込んだレトロウイルスベクターをマウス脾細胞より分離したCD4+T細胞および3T3線維芽細胞にトランスフェクトさせた.このカルパスタチン導入T細胞をTh1およびTh2条件下で培養し,サイトカイン産生を検討した.3)カルパスタチン遺伝子導入T細胞をCIAマウスに移入し,関節炎発現への影響を検討した.【結果】1)カルパスタチンの発現はTh1細胞でTh2細胞よりも減少しており,特に活性化Th1細胞での減少が著しかった.2)カルパスタチン過剰発現CD4+T細胞ではインターフェロンg産生が減少し,IL-4およびIL-6の産生が増加した.線維芽細胞にカルパスタチンを過剰発現させるとIL-6産生は抑制された.3)カルパスタチン過剰発現T細胞を移入したマウスでは関節炎の発現が有意に抑制された.【結論】RA患者においてはカルパイン活性の亢進はCD4+T細胞をTh2からTh1へ分化誘導させることによっても関節炎症を増悪させる可能性がある.また,カルパスタチンは線維芽細胞ではIL-6産生を抑制することから,RA滑膜細胞によるIL-6を抑制して抗炎症作用をもたらす可能性が示唆された.カルパスタチンの関節炎発現抑制効果をin vivoでも証明した.【目的】申請者らは関節リウマチ(RA)に特異的な自己抗体を見出し,その対応抗原として,カルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子カルパスタチン,およびホリスタチン関連蛋白(FRP)を報告してきた.カルパインは炎症に関与する様々な因子の活性化を司り,RAの関節破壊に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられている.申請者らはこれら自己抗原の炎症・骨破壊抑制効果を追究し,RAの新たな治療戦略の確立を目指している.昨年度までに我々は,カルパスタチンは滑膜細胞でのIL-6産生を抑制すること,カルパイン活性の亢進はCD4+T細胞をTh2からTh1へ分化誘導させることによっても関節炎症を増悪させる可能性があることを示した.本年度は,実際にカルパスタチンまたはFRP遺伝子導入によるコラーゲン誘発関節炎(CIA)の制御を検討した.【方法】1)カルパインをコードするcDNA,カルパスタチンのドメインIVをコードするcDNA,およびマウスFRPをコードするcDNAをそれぞれmRNAよりRT-PCRで増幅し,レトロウイルスベクターに組み込んだ.2)マウス脾臓細胞よりCD4+陽性T細胞を分離し,遺伝子組み換えレトロウイルスを感染させた後にII型コラーゲン感作マウスに移入し,関節炎発現への影響を検討した.【結果】カルパインを過剰発現させたCD4+T細胞を移入したマウスではコラーゲン誘発関節炎の発現が有意に増強されたのに対し,カルパスタチン過剰発現T細胞移マウスでは関節炎の発現が有意に抑制された.FRP発現T細胞移入マウスにおいても関節炎の有意な減弱効果が確認された.【結論】

RAにおいてはカルパイン活性の亢進が関節炎を増悪させる可能性が考えられている.カルパスタチンはカルパスタチンのプロテアーゼ活性を抑制することによって関節炎の惹起あるいは進展を抑制する可能性がある.同様にFRPはRAにおける関節炎抑制作用が報告されている.これらの関節炎抑制蛋白の関節局所における過剰産生により関節炎をコントロールできる可能性が示唆された.【目的】申請者らは関節リウマチ(RA)に特異的な自己抗体の対応抗原としてカルパスタチンとフォリスタチン関連蛋白(FRP)を報告した.カルパスタチンは,炎症の活性化とRAの関節破壊にも関与するカルパイン(カルシウム依存性システインプロテアーゼの一種)の特異的内在性阻害因子であり,FRPは炎症抑制蛋白として知られる.申請者らはこれら自己抗原の炎症・骨破壊抑制効果を追究し,RAの新たな治療戦略の確立を目指している.昨年度までに,カルパスタチンは滑膜細胞でのIL-6産生を抑制すること,カルパイン活性の亢進はCD4+T細胞をTh2からTh1へ分化誘導させること,カルパスタチン遺伝子導入によりコラーゲン誘発関節炎(CIA)が制御されることを示した.FRPについては炎症への影響について相反する報告があるため,本年度はヒトおよびマウスのFRPの関節炎抑制効果を検討した.【方法】ヒトおよびマウスFRPをコードするcDNAをmRNAよりRT-PCRで増幅し,レトロウイルスベクターに組み込んだ.マウス脾臓細胞よりCD4+陽性T細胞を分離し,遺伝子組換えレトロウイルスを感染させた後にII型コラーゲン感作マウスに移入し,関節炎発現への影響を検討した.マウスFRPとFRPのレセプター候補として同定したA7(仮称)の配列からsiRNAを合成し,マウス線維芽細胞(NIH-3T3)に導入して,LPS刺激によるサイトカイン発現に対する影響を検討した.【結果】ヒトFRPを過剰発現させたCD4+T細胞を移入したマウスではCIAの発現が抑制されたが,マウスFRP導入CD4+T細胞移入マウスでは逆に関節炎は有意に増強した.マウス線維芽細胞のFRP発現をsiRNAによりノックダウンすると,IL-6産生は有意に抑制された.また,FRPのレセプター候補A7分子をノックダウンすると,IL-6産生は増強した.以上より,マウスではFRPが炎症増悪に働くが,そのレセプターの一つは炎症を負に制御する可能性が示唆された.【結論】申請者らは以前にヒトFRPがマウス関節炎に抑制的に働くことを報告したが,一方でマウスFRPがCIAを増強したとの相反する報告もある.今回の成績はヒトとマウスのFRPの生理活性が異なる可能性を示唆しており,関節炎発症におけるFRPの関与については考慮の必要がある.
イギリス演劇におけるリアリティ構築と観客反応に関する研究

この研究はイギリス演劇におけるリアリティ構築の過程を観客反応の観点から考察することを目的とした。研究対象としては特にルネサンス期の演劇作品を扱い、当時の舞台慣習や演劇観を参照しながら調査を行った。この時代の舞台における表象がいかに観客を引き付け、現実的なものとして彼らに認知されるかという問題について、主に、視覚的な側面と演技論の側面において検討し、特に演技に基づく現実性の構築が16世紀末において重要になっていくことを立証した。イギリス演劇におけるリアリティ構築の過程を観客反応の観点から考察することを目的として、ルネサンス期の演劇を研究対象とし、以下の研究を行った。1.妖精などの不可視の登場人物が舞台上でどのように再現されているかについて考察した。道徳劇及びエリザベス朝の三つの作品を比較しながら、演出方法の相違と変化について、上演の環境や衣装、演出家と観客の意識なども検討しながら分析を行った。成果として、"The Representation of Invisibility on the English Renaissance Stage"と題する論文を執筆した。2.ルネサンス演劇における自己言及性の問題を特に観客反応の観点から観察することを目的として、三つの演劇作品の通時的分析を行った。各作品が演劇的自意識を基盤としてどのような演劇性を構築していくかについて、当時の舞台の物理的特徴や観客世界と舞台の関係にも触れながら検討した。成果として、「自己言及性と観客反応-『マンカインド』、『スペインの悲劇』、そして『テンペスト』と題する論文を執筆した。(上記1,2の論文はどちらも今年刊行される図書に掲載される予定。)3.『アントニーとクレオパトラ』が建築の比喩を用いながらとのように政治の世界を描き出しているかについて、当時の建築理論を参照しながら考察した。その考察を元に、日本シェイクスピア協会の完国大会のセミナーで「『アントニーとクレオパトラ』における建築とローマ」と題する口頭発表を行った。上記の三つの作業は、劇場の物理的条件や観客の意識など複数の要因を踏まえた上で演劇におけるリアリティ構築の問題を観察していく試みであり、次年度以降他の時代の演劇作品も分析対象とする予定である。イギリス演劇におけるリアリティ構築の過程を観客反応の観点から考察することを目的として、ルネサンス期の演劇作品を研究対象とし、以下の研究を行った。1.ルネサンス演劇における実体性・現実性と虚構性という相反する二つの側面の相互作用に関して、同時代の演劇・演技に関する理論を参照しながら考察した。成果として、日本シェイクスピア協会主催の第47回シェイクスピア学会(於岩手県立大学)においで「ルネサンス演劇における演技と現実性」と題する口頭を行った。2.ルネサンス期の演劇作品においては、登場人物が悲嘆の台詞を述べる際に舞台に座り詠むという演出が多く見受けられる。このような形式的演技が同時代の、そして現代の劇場においてどのような観客反応を生起させるかについて、イギリスにおける演技論の通時的展開を参照しながら考察した。(その途中経過を現在、国際学会の口頭発表に応募中である。)上記の作業は、ルネサンス期における演劇理論や、現代の演劇理論と関連付けながら当時の演劇作品におけるリアリティ構築の問題と観客反応の問題を考察していく試みである。2.ルネサンス演劇において登場人物が悲嘆の台詞を述べる際に舞台に座り込む所作について、昨年度に引き続き、同時代の形式的演技と内面性の表象に関する問題を参照しながら考察した。その成果は平成22年に国内の学会で発表する予定である。3.シェイクスピア作品の異文化におはる翻案とそのリアリティの問題について考察し、その成果として文楽版『テンペスト』に関する劇評を執筆した。(日本シェイクスピア協会編Shakespeare Studies第47巻に掲載が決定している。)4.イギリス演劇におけるリアリティ構築と観客反応の問題について、これまでの研究の内容を確認かつ検討するため、British Shakespeare Associationの第4回学会(於ロンドン大学)に出席し、ワークショップ"Shakespeare in Performance"に参加して意見交換を行った。以上の研究とともに、これまで3年間の研究において得た成果を検討し、まとめて行く作業を行った。
次世代ブロードバンド無線通信システムを対象とした伝送特性改善に関する研究

直交周波数分割多重(OFDM)方式は,種々の無線通信システムに採用されている.OFDM信号は,送受信機のキャリア周波数誤差(CFO)によりサブキャリア間の直交性が崩れ,キャリア間干渉を引き起こす.一方,小型化・低コスト化・省電力化を可能とするダイレクトコンバージョン受信(DCR)方式が非常に注目を受けているが,直流オフセット(DCO)及びI/Q不均衡問題等,非常に深刻な問題を生じる.本研究では, OFDM DCRにおけるアナログ歪み,すなわち, CFO, DCO及びI/Q不均衡を補正し,伝送特性を改善する新たな手法を提案した.直交周波数分割多重(OFDM)方式は,種々の無線通信システムに採用されている.OFDM信号は,送受信機のキャリア周波数誤差(CFO)によりサブキャリア間の直交性が崩れ,キャリア間干渉を引き起こす.一方,小型化・低コスト化・省電力化を可能とするダイレクトコンバージョン受信(DCR)方式が非常に注目を受けているが,直流オフセット(DCO)及びI/Q不均衡問題等,非常に深刻な問題を生じる.本研究では, OFDM DCRにおけるアナログ歪み,すなわち, CFO, DCO及びI/Q不均衡を補正し,伝送特性を改善する新たな手法を提案した.本研究では,ダイレクトコンバージョンOFDM受信機(OFDM-DCR)における時変直流オフセット(TV-DCO)下でのアナログ損失補償、すなわち、搬送波周波数オフセット及びI/Q不均衡を補正するための新たな技術を提案すると共に,提案手法の有効性を検証している.本研究では,OFDM通信方式におけるPAPR問題および受信機におけるアナログ損失補償を補正するための新たな技術を提案すると共に,提案手法の有効性を検証している.本研究では,MIMO-OFDMAシステムに対する,PAPR及びCFO,DCO,I/Q不均衡補正をFPGAを想定して回路設計を行い,試作システムを製作すると共に,試作システムの動作を検証している.
骨髄異形成症候群におけるビタミンK2療法の基礎的検討-ビタミンK2による白血病細胞のアポトーシス誘導効果を踏まえて-

我々はビタミンK2(以下VK2)が白血病細胞のアポトーシスを誘導することを独自に報告した。このアポトーシス誘導に際して,BCL-2の低下,BAXの増強,ミトコンドリア膜電位の低下ならびにcaspase-3の活性化が誘導される。一方,BCL-2を遺伝子導入により強制過剰発現させたHL-60bcl-2においては,VK2処理によりアポトーシス誘導はほぼ完全にブロックされたが、Glarrestは誘導され,かつ,単球系への分化が誘導された。これよりVK2はアポトーシス耐性クローンに対してはGlarrestを介して分化誘導効果をも発現することが示唆された。さらに,VK2とビタミンD3誘導体とを併用すると,HL-60のGlarrestはさらに増強し,かつ,単球系への分化誘導能が相乗的に増強した。また,この単球系への分化に連動して,VK2によるアポトーシス誘導は抑制された。よって,単球系への強制的分化誘導は,VK2によるアポトーシス誘導と拮抗することが示唆された。我々に基礎的データに呼応して,骨髄異形成症候群(MDS)におけるpilot testが全国の各施設で実施された。これら治療成績のアンケート調査を実施・集計したところ、RAEB-T, post-MDS AMLの約50%以上の症例で,VK2の投与により芽球の減少が,また、不応性貧血(RA)の約20%で血球減少の改善が報告された。MDSのRAは骨髄内でのアポトーシスを介した無効造血によるものと考えられている。これよりVK2による芽球のアポトーシスならびに分化誘導を介したアポトーシス耐性化という,一見相反する現象が,上記のMDSの治療成績を反映していると考えられる。これら現象についての分子機構に関する検討は現在も進行中である。骨髄異形成症候群(以下MDS)におけるビタミンK2(以下VK2)の臨床応用を目的として,以下の基礎的検討を行い,その成果を発表した。ヒト白血病細胞株HL-60にbcl-2geneを導入し,BCL-2過剰発現株HL-60bcl2を作成した。このHL-60bcl-2とコントロールベクターのみを導入したHL-60neoにおけるVK2の反応性を比較検討した。in vitroではHL-60neoではVK2の濃度依存性に効率良くアポトーシスを誘導するのに対して,HL-60bcl-2ではほぼ完全にアポトーシス誘導がブロックされた。また,HL-60bcl-2では,ミトコンドリア膜の脱分極は有意に抑制され,かつ,caspase-3の活性化も抑えられた。しかし,VK2はHL-60bcl-2に対して,細胞増殖曲線上は抑制的に作用することから,cytostaticな作用が示唆された。flow cytometryを用いた細胞周期解析を行うと,VK2処理によりHL-60bcl-2のG1 arrestが誘導されることが明らかとなり,また,その際にはCDK inhibitorの一つであるp27^<KIP-1>の発現増強が観察され,同時に単球系への分化が誘導された。以上よりVK2は,白血病細胞に対してアポトーシス誘導と分化誘導の両効果を発現することが示唆された。今年度の研究計画は概ね達成されたと考える。基礎的検討としては,白血病細胞株HL-60に遺伝子導入によりBCL-2を過剰発現させたHL-60bcl-2細胞では,ビタミンK2によるアポトーシス誘導に対して耐性を獲得した。しかし,細胞周期解析においてはG1 arrestが誘導され,かつ,単球系への分化が誘導された。

これより,ビタミンK2は白血病細胞のアポトーシスを誘導するのみならず,アポトーシス耐性クローンに対しては,Glarrestを介して分化誘導効果をも発現することが示唆された。同様な現象は,白血病患者由来の白血病細胞の初代培養系においても再現された。次に,我々はこのビタミンK2による分化誘導効果を踏まえ,同じ脂溶性ビタミンであるビタミンD3ならびにその誘導体のoxacarcitriolとの併用効果について検討した。興味深いことに,VK2とVD3との同時併用により白血病細胞株の分化誘導が相乗的に極めて強力に誘導されることが判明した。また,それと同時に細胞のGlarrestが,VK2あるいはVD3単独に比較して増強していた。現在,この現象について,さらに転写因子の相互作用の観点から検討中である。臨床面での検討では,全国の主要施設に骨髄異形成症候群(MDS)におけるVK2療法のpilot studyの結果のアンケート調査を実施した。驚くべきことにMDS症例の中のRAEB-Tでは70%の症例に,また,MDSから発症した2次性白血病においては約50%の症例でVK2の有用性が報告され,かつ,調査対象全例に副作用は全く認められなかった。VK2は芽球比率を現象させるだけでなく,MDSの不応性貧血患者のcytopeniaに対しては改善効果も観察された。この効果がVK2の分化誘導効果で説明できるか否か検討中である。さらにMDSを対象とするVK2療法のprospective randomized trialに向けて準備を進めている。我々はビタミンK2(以下VK2)が白血病細胞のアポトーシスを誘導することを独自に報告した。このアポトーシス誘導に際して,BCL-2の低下,BAXの増強,ミトコンドリア膜電位の低下ならびにcaspase-3の活性化が誘導される。一方,BCL-2を遺伝子導入により強制過剰発現させたHL-60bcl-2においては,VK2処理によりアポトーシス誘導はほぼ完全にブロックされたが,Glarrestは誘導され,かつ,単球系への分化が誘導された。これよりVK2はアポトーシス耐性クローンに対してはGlarrestを介して分化誘導効果をも発現することが示唆された。さらに,VK2とビタミンD3誘導体とを併用すると,HL-60のGlarrestはさらに増強し,かつ,単球系への分化誘導能が相乗的に増強した。また,この単球系への分化に連動して,VK2によるアポトーシス誘導は抑制された。よって,単球系への強制的分化誘導は,VK2によるアポトーシス誘導と拮抗することが示唆された。我々に基礎的データに呼応して,骨髄異形成症候群(MDS)におけるpilot testが全国の各施設で実施された。これら治療成績のアンケート調査を実施・集計したところ,RAEB-T,post-MDS AMLの約50%以上の症例で,VK2の投与により芽球の減少が,また,不応性貧血(RA)の約20%で血球減少の改善が報告された。MDSのRAは骨髄内でのアポトーシスを介した無効造血によるものと考えられている。これよりVK2による芽球のアポトーシスならびに分化誘導を介したアポトーシス耐性化という,一見相反する現象が,上記のMDSの治療成績を反映していると考えられる。これら現象についての分子機構に関する検討は現在も進行中である。
肝移植後肝癌再発に対する核酸シャペロンを用いた新規IL-12遺伝子治療の開発

(1)IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1, BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12 p40 cDNAと1260bpのIL-12 p35 cDNAを挿入したプラスミドを用い、LB培地にて大量培養後、プラスミドを精製・回収し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。(2)PLL-g-HAの精製を高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。ヒアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。(3)PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl10mMPBS(-) (ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5,1,2,3,4,5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。更に30分間のインキュベーションを行い重合反応とした。アガロースゲルにて電気泳動し、プラスミドのバンド消失をもって重合の確認とした。N/P比=0.5よりバンドの消失が認められ、N/P比=3にて完全なるバンドの消失を認めた。(4)腫瘍接種モデルの確立:MH134肝癌細胞株を用いたC3H(H-2k)マウス皮下腫瘍モデルを確立し、IL-12遺伝子を組み込んだplasmidを、エレクトロポレーション法を用いて腫瘍内に100μg遺伝子導入した。Day28における各4群間での原発皮下腫瘍容積の比較を行ったところ、IL12群で有意に腫瘍抑制効果を認めた。1.IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1,BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12p40cDNAと1260bpのIL12p35cDNAを挿入したプラスミドが当科にて実験系にて使用され、その効果が確認されている。このプラスミドを用いE.coli JM109 competent cellを形質転換し、LB培地にて大量培養後、QIAGEN Mega kitを用いプラスミドを精製・回収し、その純度(0.D.260/280)が1.9以上である事を確認した。さらに、Hindlll、EcoR1にて酵素処理後、アガロールゲルにて電気泳動し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。2.PLL-g-HAの精製:共同研究施設である、九州大学先導物質科学研究所丸山研究室にて精製。高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。水酸化シアノほう素ナトリウム(NaBH_3CN)を還元剤とし、0.1MpH8.0のホウ酸ナトリウムバッファー内にてビアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、恒温撹拌槽(40度)にて5日間処理した後、限外濾過(MWCO:25000)にて重合できなかったピアルロン酸を取り除いた。さらに凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。3.PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl10mM

PBS(-)(ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5,1,2,3,4,5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。更に30分間のインキュベーションを行い重合反応とした。アガロースゲルにて電気泳動し、プラスミドのバンド消失をもって重合の確認とした。N/P比=0.5よりバンドの消失が認められ、N/P比=3にて完全なるバンドの消失を認めた。1. IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1, BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12 p40 cDNAと1260bpのIL-12 p35 cDNAを挿入したプラスミドが当科にて実験系にて使用され、その効果が確認されている。このプラスミドを用いE. coli JM109 competent cellを形質転換し、LB培地にて大量培養後、QIAGEN Mega kitを用いプラスミドを精製・回収し、その純度(O.D. 260/280)が1.9以上である事を確認した。さらに、HindIII、EcoR1にて酵素処理後、アガロールゲルにて電気泳動し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。2. PLL-g-HAの精製:共同研究施設である、九州大学先導物質科学研究所丸山研究室にて精製。高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。水酸化シアノほう素ナトリウム(NaBH_3CN)を還元剤とし、0.1M pH8.0のホウ酸ナトリウムバッファー内にてヒアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、恒温撹拌槽(40度)にて5日間処理した後、限外濾過(MWCO:25000)にて重合できなかったピアルロン酸を取り除いた。さらに凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。3. PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl10mMPBS(-)(ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5, 1, 2, 3, 4, 5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。腫瘍接種モデルの確立:MH134肝癌細胞株を用いたC3H(H-2^k)マウス皮下腫瘍モデルにて検討した。IL-12遺伝子を組み込んだplasmidを、エレクトロポレーション法を用いて腫瘍内に100μg遺伝子導入し(Day0)、その2日後にLPSにて活性化させたDCを腫瘍内に5×10^5個導入した(Day2)。DC導入後6日目(Day8)よりFK506の腹腔内投与(3mg/kg)を連日行って免疫抑制状態とし、Balb/c(H-2^d)マウスのスキングラフトを作製して、免疫抑制の指標とした。無治療群、DC単独群、IL-12単独群、IL-12/DC併用群の4群に分類し、遺伝子治療開始後28日目(Day28)まで各群で原発腫瘍に対する直接的な抗腫瘍効果と、肺及び肝の遠隔転移巣に対する腫瘍抑制効果を検討した。評価項目としては(1)Day28における原発皮下腫瘍容積の比較、(2)Day
幹細胞を用いた3次元的組織構築による新世代in vitro組織・臓器モデルの開発

1)hiPS-CTSを用いたリエントリー型不整脈発生モデル:研究代表者は、ヒトiPS細胞から心臓を構成する細胞(心筋細胞、内皮細胞、壁細胞等)を誘導し、温度感受性培養皿(東京女子医大)を用いた細胞シート作製技術を用いて、それら細胞を含むhiPS-CTSの作製に成功している。この複数種細胞からなるミニ3D構造を持つ心臓組織が、より生体の心臓に近い反応を示しうる可能性を検討する。MEAが底面に配された培養皿での細胞外電位の測定とセルモーション解析システム(Sony Motion Vector)による2次元的細胞動態同時観察を行いながら、QT延長誘導薬剤であるIkrブロッカーE4031を投与し、QT延長作用により誘発される薬剤性不整脈の発生及びリエントリーの発生を観測する。2)hiPS-CTSを用いた致死性不整脈Torsade de Points(TdP)再現モデル:TdPは、心電図上で多形性の心室頻脈波形を示す。また2次元的細胞動態としては、回旋中心が移動するMeandering(さまよい)現象が認められるはずである。実際にhiPS-CTSを作製しE4031を投与したところ、TdPの心電図波形に類似した細胞外電位波形とともに回旋中心のさまよい現象が認められた。これらの現象は心筋細胞のみでは認められず、心筋を含む複数種の細胞と3D構造が重要であり、心臓組織のミニ3D構造を再現することにより、致死性不整脈の発生そのものを再現できるようになることを明らかにした。本研究は世界で始めてTdPを再現しうるin vitroモデルを示したものであり、Nature Communication誌に掲載された(Kawatou,Nat Commun,2017)。2018年度は同不整脈発生モデルを疾患iPS細胞研究等に発展的に応用した。MEAが底面に配された培養皿においてhiPSC-CTSを培養する。(細胞外電位の測定)セルモーション解析システム(Sony Motion Vector)同時観察(2次元的細胞動態解析)上記をSony Motion Vectorに設置の培養チャンバー内で行いながら、QT延長誘導薬剤であるIkrブロッカーE4031を投与し、QT延長作用により誘発される薬剤性不整脈の発生及びリエントリーの発生を観測する。TdP発生モデルの作製に世界に先駆けて成功し、同成果をすでに論文として発表した。現在は、さらに多様な現象を再現できるin vitroモデルの作製へと研究を進めている。

2018年度は同不整脈発生モデルを疾患iPS細胞研究等に発展的に応用した。さらに新しいin vitroモデルの開発を進める。3)hiPS-CTSを用いた心室細動誘発モデル:TdPは臨床上ではしばしば心室細動に移行する。TdPから心室細動への移行過程を再現しうるin vitroモデルの構築を目指す。4)hiPS-CTS多重積層心臓組織を用いた心収縮力解析モデル(薬剤性心不全モデル):不整脈のみならず、心臓の力学的異常を検出するモデルを作製する。研究代表者はすでに、ゼラチンハイドロゲル微粒子(GHM)をCTS間に挿入することにより、簡便にCTSを多重積層化することに成功している。厚さ1mm弱の心臓組織を用いて張力を測定することにより、薬剤性の収縮力障害モデルを作製する。薬剤性心不全モデルとしての応用が期待される。H29年度成果に加えてさらに新しいin vitroモデルの開発を進める。
アトピー網膜剥離の病態におけるアラーミン分子の役割

網膜剥離の中でも治療困難例の多いアトピー性網膜剥離の病態において、外傷性に組織から放出されるアラーミン分子がどのような働きを持っているのかを明らかにすることを目的に研究を進めた。代表的なアラーミンであるインターロイキン33(IL-33)が、網膜ミュラー細胞の細胞核に存在し、網膜外傷によって網膜硝子体内に放出されることを発見した。また、網膜硝子体内でIL-33は組織線維化を促進する遺伝子の発現を亢進させることを示した。IL-33は今後アトピー性網膜剥離の治療ターゲットとして検討する価値のある分子と考えられる。アトピー網膜剥離の手術治療の際に採取した前房水、網膜下液、硝子体液中の炎症性サイトカイン濃度の測定。本年度はアトピー網膜剥離の手術患者が予想より少なく、サンプルの収集が3例にとどまった。26年度に鋭意、サンプルを収集し、サイトカインの測定を予定している。IL-33ノックアウトマウスの硝子体内にリコンビナントIL-33を注射するモデルにおいて、変動する遺伝子の発現解析を施行した。TGF-beta遺伝子と1型コラーゲン遺伝子の発現誘導が確認された。アトピー網膜剥離のマウスモデル作成。マウス角膜に穿孔創を作成するモデル、網膜下にヒアルロン酸を注入するモデルを作成し、形態学的な解析とともに,剥離網膜におけるIL-33遺伝子の発現を定量し、網膜剥離モデル作成後72時間でIL-33遺伝子の発現上昇を認めた。本年度はアトピー網膜剥離の病態におけるアラーミンの役割の検証を動物モデルを用いた実験を主にして遂行した。具体的にはアトピー病態に関連するアラーミン分子の制御がアトピー網膜剥離の治療に有用か否かを検討するため、網膜剥離マウスモデルおけるアラーミン分子(IL-33)の役割をIL-33ノックアウトマウスを用いて検討した。網膜剥離モデルはマウス眼球に30G針を用いた穿孔創を作成することで樹立した。網膜剥離モデルでは通常ミュラー細胞の核に見られるIL-33の染色性が消失しており、外傷に伴いIL-33が網膜組織内あるいはその周囲に拡散・放出したことが示唆された。また網膜組織を凍結・融解することによってネクローシスを誘導するモデルを作成し、器官培養したところ、培養上清中にIL-33タンパクが放出されることをELISA法で確認した。網膜剥離モデルでは網膜組織の瘢痕化に関連する遺伝子群(tgfb1, alpha-sma, timp1, col1a1)の有意な発現上昇がwild-typeマウス(対照マウス)では確認されたが、アラーミンIL-33を欠く、IL-33ノックアウトマウスを用いたモデルでは有意な発現上昇を認めなかった。確認実験として、IL-33ノックアウトマウスを用いた外傷作成時にリコンビナントIL-33を500ngを注射針の先から補充投与すると、wild-typeマウスと同様の組織瘢痕化関連遺伝子の有意な発現上昇がみとめられた。以上のことから、網膜剥離モデルにおけるアトピー関連アラーミンIL-33が組織瘢痕化を増長させていることが示唆された。この内容は学会発表をへて、論文投稿を予定している。眼科学マウスモデルの作成、遺伝子解析実験は順調に進行している。ヒト臨床サンプルの数が不十分なため、ELISA等の解析はH26に行う予定とした。H25年度に作成したマウス網膜剥離モデルの解析を進める。またアトピー網膜剥離の臨床サンプルの収集を鋭意行い、基礎研究データとの対比をおこなう。
文化人類学における家族・親族領域を中心とするフィールドデータの処理と分析

本研究の目的は、文化人類学的なフィールドワークによつて得られる多様なデータをパーソナルコンピュータをもちいてフィールド現地で一次処理するための支援ツールを開発することにある。本研究の研究者が対象としている社会(オーストラリア・アボリジニ、南インドやスリランカのタミール)では、個々人がどのように親族ネットワークに関連づけられるかがとりわけ重要である。特定の集団に帰属していることにくわえて、個人と個人の関係性が焦点となる。個人の家族関係・親族関係を記録してゆくと、またたくうちに、関係が重複して読みとりが困難になってゆく。特定の個人と個人を指定すると、両者の関係が明らかになり、両者を含む家族(あるいは親族)集団が家系図のような具体的なイメージをむすぶ姿で表示できないだろうか。さらに、フィールドの現場で、ノートを取るような手軽さでそうした作業を実現できないであろうか。3年目を迎え、ツールも完成間近ではあるが、なお未解決の問題点が様ざま存在することがわかってきた。たとえば「最適化」の問題である。複雑な親族関係を、モニタに視覚的に理解可能な大きさで映し出し、同時、に輻輳する関係・(親子・キョウダイ・配偶の諸関係)をできる限り交差することなく表示しなければならない。しかも、必要となる親族空間の大きさはあらかじめ限定することはできないのである。現在取り扱おうとしているコミュニティー・データは、3700名あまり、4-5世代にわたる。これらの人々は,かれらの親族システムの中で何らかの関係を持っているのである。次年度以降の新しいバ-ジョンでは、こうした「最適化」の問題や表示範囲の問題、カテゴリカルな親族関係の取り扱いなど、検討を要する課題も多い。
マラリアのヒートショックタンパクおよびコールドショックタンパクの分子生物学的研究

マラリアは、寄生中疾患の中でも、生命・健康にたいする被害がもっとも大きく、経済的損失も甚大である。マラリア原虫は、蚊とヒトの間を移行する。体温の異なる2宿主を移行する過程においてヒートショックタンパク(hsp)が果たす役割を解明することは、寄生現象の研究の中でも最も本質的な課題の一つである。今回、我々は、熱帯熱マラリア原虫について、hspのひとつであるdnaJホモログ4種の分析を行い、興味深い結果を得た。1)第4クロモソームに存在するpfj-1遺伝子は、dnaJに特徴的にみられる3要素、(1)J領域、(2)G/F領域、(3)システインを含む4回繰り返し領域、の全てを含み、典型的ホモログと考えられた。N端にはミトコンドリア移行シグナルが存在することから、ミトコンドリアに輸送され機能すると推定された。2)他の3種のホモログについては、部分アミノ酸配列を決定し、相互比較した。4種すべてが、異なる遺伝子で、それぞれ、第4、第8、第10、第11クロモソーム上に、独立して存在していた。3)RT-PCR法を用い、4種の遺伝子の発現をmRNAレベルで検討した。すべてが、赤内型で発現しており、一定の機能を果たしているものと考えられた。詳細な検討を行ったpfj-1については、熱刺激で増加、後期栄養体で発現が極大化することが示された。マラリア原虫には、2種類のミトコンドリアが存在するが、両者の関係は不明な点が多い。pfj-1がどちらで機能するのか、等、今後検討したい。以上マラリア原虫のdnaJの研究はこれまでに報告がなく、全く新規なもので発表原稿を準備中である。hspの研究は、マラリア原虫の生物学に貢献するだけでなく、原虫の蚊からヒトへの伝播阻止を通じ、予防にも寄与するものと期待される。今後、dnaJを中心に、さらに研究を続けていきたい。
超らせん応力による鋳型DNA構造変化と転写開始活性

原核生物においてプロモ-タ-領域内のRNAポリメラ-ゼ認識部位である-35、-10配列が明らかにされているが、各プロモ-タ-の強さを決めている分子的機構ならびに生体内での鋳型構造である超らせん形成に伴う強度変化の分子的機構は明らかでない。この研究では、まず、大腸菌ラクト-スプロモ-タ-の野生型ならびに変異型について、それらの試験管内転写活性を超らせん密度0から-0.09の範囲で測定した。その結果、超らせん非導入時には弱いプロモ-タ-ほど、負の超らせん導入に伴う転写活性の増大が顕著なこと、ならびに、弱いプロモ-タ-においては、超らせんの導入に伴って、新しい部位から開始していると思われる転写物が現れることがわかった。さらに、-59部位に(CG)n配列を挿入して、その効果をみると、正規の転写物については効果はみられなかったが、弱いプロモ-タ-において前記の新しい部位からの転写物が超らせん非導入時にも見られることがわかった。このような、転写開始活性に及ぼす超らせんの効果は一体DNAのどのような立体構造変化によってひきおこされているのかを探る第一歩として、DNAのヘリックス軸が立体空間内でどのように曲がっているかを算出するプログラムを用い、10数個のプロモ-タ-の立体構造を推定した。その結果、殆どの場合、-35配列と-10配列との間でDNAがたわんでおり、さらに、その方向は、+1を基点にした場合に、Dickersonの規約で言って、y軸のマイナス方向であることが示された。この知見は、-35と-10領域間に発生したストレスが二重鎮DNAの融解をひきおこすという仮説と関連して興味深く、このたわみの強さやより詳細な方向とプロモ-タ-強度との関係を更に解析する必要がある。なお、この研究は、R.D.wells、西村善文両博士との協同研究である。プロモーター部DNAの塩基配列の多様性に対応して、その立体構造、ならびに超らせん応力の発生に伴う立体構造変化もまた多様であると考えられる。この研究の第1の目的は、配列上の特徴をもつ、いくつかのプロモーターについて、それらの転写活性の超らせん密度依存性を測定することである。そのために、今年度は、ラクトース・オペロンのプロモーターの野生型ならびに変異型(L8UV5)。さらにそれらの上流にシトシン・グアニン交互配列が挿入されたもの等について、各プロモーター部分以外は共通の配列をもつプラスミドを各々作製し、それらの転写活性を測定した。その結果、負の超らせん密度の増加に伴う転写活性の増大、ならびに一部のプロモーターにおいては、超らせん応力の発生に伴い、新しい部位から開始していると思われる転写物が見られた。今後、この新しい部位の確認ならびにトリプトファンオペロンやりボゾームRNAオペロンのプロモーター等についても同様のプラスミドを作製して、転写活性を測定する予定である。第2の目的は、各種のプロモーターの立体構造を、それらの塩基配列から理論的に推定することである。このために今年度はまず、大腸菌のプロモーターのうち約100種について、その上・下流域も含めた塩基配列のデータベースの作製、ならびに、10種の独立のジヌクレオチドの立体構造に基礎をおいて、ポリヌクレオチドの立体構造を生成するプログラムの作製を行った。現在までの所、複数個の転写開始点を含むプロモーターの扱い、また立体構造の表示方法等にいくつかの問題が残った。今後は、予測立体構造よりプロモーター群がどのように分類され得るか、またその分類が一次構造を指標とした分類や、プロモーターの属する遺伝子の機能を指標とした分類とどのような関連を持つか、そしてそれが各プロモーターの超らせん応力への応答とどのように関連するかの解析を行う予定である。この知見は、-35と-10

領域間に発生したストレスが二重鎮DNAの融解をひきおこすという仮説と関連して興味深く、このたわみの強さやより詳細な方向とプロモ-タ-強度との関係を更に解析する必要がある。なお、この研究は、R.D.wells、西村善文両博士との協同研究である。原核生物のプロモ-タ-部塩基配列に関しては、-35・-10配列の存在、ならびにプロモ-タ-の転写強度とコンセンサス配列への一致度との相関が指摘されている。しかし、生体内での自然な存在状態である超らせん状態下での解析は十分でない。ここでは負の超らせんの導入に伴う転写強度変化の測定を行った。その結果、昨年度見られた転写活性の増大は、超らせん非導入時に弱いようなプロモ-タ-において、より顕著なこと、また、そのような弱いプロモ-タ-において負の超らせん導入時に出現した、正規のものと異る位置から開始していると思われた転写物は、プロモ-タ-上流部にある配列を挿入すると超らせん非導入時にも現われることがわかった。これらの点は、DNAの一次構造のみを考えていては説明困難である。そこで、DNAの立体構造を推定するプログラムを用い、まず、-35、-10、+1部位の立体空間上での位置関係を調べた。その結果、殆どの場合、-10と-35配列との間で、DNAがたわんでいること、そのたわみの方向は、+1部位塩基対でDickersonの規約どおりにx・y軸を定め、z軸のプラス方向に-10、-35配列をプロットした場合に、y軸のマイナス方向であることがわかった。このことがどの程度一般的なものかどうか、また、プロモ-タ-により、さらにx軸のプラスの方向にたわんだり、マイナスの方向にたわんだりしているので、このようなたわみの方向ならびに強さと、各プロモ-タ-転写活性強度との相関について、現在さらに調べている所である。なお、この研究は、西村善文、R.D.Wells両博士との共同研究である。
微小試験法と逆問題解析を用いた原子力プラント構造材料の高精度強度予測技術の開発

本研究の目的は,微小試験法の一つであるシェアパンチ試験法と,有限要素法を用いた逆問題解析技術とを融合することにより,微小試験法のみを用いた従来の強度特性評価では成しえなかった,標準試験片による単軸引張試験と同等な材料の弾塑性変形挙動データが取得することのできる評価手法を開発し,手法を大型溶接構造部材の構造強度評価に適用し有効性を実証することにある.平成19年度は,シェアパンチ試験の実データとシェアパンチ試験を模擬した有限要素解析とにより,対象材料(オーステナイトステンレス鋼SUS316鋼)の短軸引張試験による応力-ひずみ曲線を予測しうる逆問題解析アルゴリズムの構築を試みた.シェアパンチ試験については,試験機の出力である荷重-変位曲線のほかに,破断までの変形過程における変形量,変形様式などを試験片の断面観察により求めた.有限要素解析においては,要素としては軸対象要素を,材料データとしては前述の短軸引張試験データを,主な接触部位には摩擦係数を変数とする接触要素を適用し,初期の境界条件は平成18年度最適化した条件を用いた.その結果,変形量が比較的小さい弾性変形領域および降伏直後程度までについては,繰返し計算による境界条件の最適化により,応力-ひずみ曲線が比較的精度良く取得できることが明らかとなった.しかし,変形量が比較的大きい塑性変形領域では,局所的に大きな変形が生じている領域において微小き裂の発生が断面観察により確認され,その影響により一意の解を得ることが出来なかった.これについては,き裂開口条件の定量的導出により,き裂開口に伴うエネルギー変化を解析条件として導入し,モデルを再構築する必要があると考えられる.本研究の目的は,微小試験法の一つであるシェアパンチ試験法と,有限要素法を用いた逆問題解析技術とを融合することにより,微小試験法のみを用いた従来の強度特性評価では成しえなかった,標準試験片による単軸引張試験と同等な材料の弾塑性変形挙動データが取得することのできる評価手法を開発し,手法を大型溶接構造部材の構造強度評価に適用し有効性を実証することにある.平成18年度は,まずシェアパンチ試験システムの整備を進め,オーステナイトステンレス鋼SUS316鋼の非溶接材のシェアパンチ試験データ(荷重一変位曲線)を取得した.また,比較のため同材料の短軸引張試験データ(応力-ひずみ曲線)を取得した.シェアパンチ試験は,試験片厚さ方向の結晶粒の数を変数として実施し,試験片寸法効果のない試験条件としては,(試験片厚さ/結晶粒径)が約5以上であることを明らかにした.次に,本補助金により有限要素解析のためのプリ・ポストプロセッサ等を購入し,有限要素解析のためのシステムを整備した.有限要素法プログラムとしては,現有のANSYSを用いた.シェアパンチ試験を模擬した有限要素解析においては,要素としては軸対象要素を,材料データとしては前述の短軸引張試験データを用い,主な接触部位には摩擦係数を変数とする接触要素を適用した.有限要素解析結果と前述のシェアパンチ試験データを比較検討することにより.解析における境界条件の最適化を実施した.その結果,パンチと試験片および試験片と固定冶具の接触面の摩擦係数を適切な値に設定することにより,比較的精度良くシェアパンチ試験結果を模擬できることを明らかにした.この最適化した境界条件による有限要素解析により逆問題解析アルゴリズムの構築を開始し,平成19年度における完成の見通しを得た.本研究の目的は,微小試験法の一つであるシェアパンチ試験法と,有限要素法を用いた逆問題解析技術とを融合することにより,微小試験法のみを用いた従来の強度特性評価では成しえなかった,標準試験片による単軸引張試験と同等な材料の弾塑性変形挙動データが取得することのできる評価手法を開発し,手法を大型溶接構造部材の構造強度評価に適用し有効性を実証することにある.平成19年度は,シェアパンチ試験の実データとシェアパンチ試験を模擬した有限要素解析とにより,対象材料(オーステナイトステンレス鋼SUS316鋼)の短軸引張試験による応力-ひずみ曲線を予測しうる逆問題解析アルゴリズムの構築を試みた.シェアパンチ試験については,試験機の出力である荷重-変位曲線のほかに,破断までの変形過程における変形量,変形様式などを試験片の断面観察により求めた.有限要素解析においては,要素としては軸対象要素を,材料データとしては前述の短軸引張試験データを,主な接触部位には摩擦係数を変数とする接触要素を適用し,初期の境界条件は平成18年度最適化した条件を用いた.その結果,変形量が比較的小さい弾性変形領域および降伏直後程度までについては,繰返し計算による境界条件の最適化により,応力-ひずみ曲線が比較的精度良く取得できることが明らかとなった.しかし,変形量が比較的大きい塑性変形領域では,局所的に大きな変形が生じている領域において微小き裂の発生が断面観察により確認され,その影響により一意の解を得ることが出来なかった.これについては,き裂開口条件の定量的導出により,き裂開口に伴うエネルギー変化を解析条件として導入し,モデルを再構築する必要があると考えられる.
色素性乾皮症患者由来iPS細胞を用いた感音性難聴発症機構の解析と疾患モデルの開発

色素性乾皮症A群(XPA)の患者は進行性の感音性難聴を発症する。この難聴は内耳性でなく聴神経性であるが、その発症は紫外線曝露と相関が無く発症メカニズムは不明である。XPAノックアウトマウスでは難聴は再現されなかったため、治療法の確立にはヒト由来の細胞を用いた新たなモデルが必要である。そこで本研究ではXPA患者由来iPS細胞から分化誘導した聴神経を用いて分子レベルでの難聴発症メカニズムの解析と治療モデルの開発を目指した。本研究を行うために、申請者が産業技術総合研究所で樹立したXPA患者由来iPS細胞を必要な手続きを経て供与いただき研究を開始した。聴神経変性モデル作製のため、以前申請者らが報告していたグルタミン酸作動性神経細胞への分化誘導法を用いて誘導した神経細胞と感覚上皮の共培養をおこない感覚上皮への神経突起の伸長を確認した。さらに誘導した神経幹細胞が、内耳組織との共培養後、機能的な神経へ分化するかどうか確認するため蝸牛と同様に有毛細胞を含む内耳組織である前庭組織との共培養を行い、電気生理学的解析と組織学的解析を行った。その結果、iPS細胞由来神経細胞はナトリウムチャネルを発現しており、自然発火を認めた。さらに内耳の神経により近い神経細胞の分化誘導法を用いたモデルの作製のため、ヒトiPS細胞から内耳前駆細胞、内耳神経へと分化誘導することを計画した。誘導条件の検討を行った結果、複数のマーカーの発現がRNA,タンパク質レベルで確認できる、ヒトiPS細胞由来内耳前駆細胞を得ることに成功した。平成27年度の研究計画は、XPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性メカニズムの解析と聴神経変性モデルの作製である。この目的の為、産業技術総合研究所よりXPA患者由来iPS細胞及びコントロール細胞を入手した。入手までに日数を要したため、まずは一般に使用されている201B7株などを用いて神経細胞と内耳感覚上皮細胞共培養系の検討・確立を行った。マウス蝸牛から感覚上皮細胞を採取し組織培養する系を確立し、201B7株由来のneurosphereと共培養を行い、神経細胞が分化でき、なおかつ、有毛細胞が正常に保たれる期間と培地条件について検討を行った。ある条件下で5日間培養した時に、感覚上皮の生存と神経細胞の軸索伸長が確認できた。XPA患者由来iPS細胞入手後は聴神経への分化誘導について検討した。聴神経はグルタミン酸作動性ニューロンであり、我々が既に確立したヒトiPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンの分化誘導法は、神経幹細胞の時点で細胞増殖と凍結ストックの作製が可能であるため、のちの実験に同じストック由来の神経細胞を用いることができ、毎回iPS細胞から分化誘導したものを用いるより安定した結果が期待できる。そこでXPA患者由来iPS細胞とコントロールiPS細胞からこの分化誘導法を用いて、神経幹細胞、神経細胞への分化誘導を行った。それぞれのマーカーの発現を免疫染色法で検討したところ、神経幹細胞、神経細胞への分化は認められたが、先行文献で用いた株よりも神経細胞への誘導効率が低かった(<50%)。ヒトiPS細胞の分化誘導においては株間の差が大きいため、ある分化誘導法を用いる際に、試薬の濃度などを検討し、使用する細胞に合うよう調整が必要な場合がある。このため誘導に用いる因子の濃度や処理期間について検討中である。本研究を行うために、産業技術総合研究所からXPA患者由来iPS細胞を供与いただく必要があったが、予想外に先方の倫理審査に時間を要したため、細胞を入手できたのが2015年の12月であった。それに伴い研究計画が大幅に遅れたため、今年使用するはずであった研究費の一部を来年に持ち越した。現在までに、1聴神経変性モデルの作製に用いる神経細胞の分化条件の検討、2シナプス形成を見るための神経ー感覚上皮共培養系の確立の2点を行った。1はXPA患者由来iPS細胞に合わせた誘導因子の検討が必要であることが分かったが、誘導効率の違いは10%-20%程度であるため、早期の問題解決が見込めると考えている。2のシナプス形成を見るための神経ー感覚上皮共培養系の確立は一般に普及しているヒトiPS細胞株で条件検討ができているため、1の検討が終了すれば2の系も確立できると考えている。後は時間的な問題であるため、来年度以降の進捗次第で研究期間の延長を検討するつもりである。平成28年度の研究計画は、XPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性メカニズムの解析と聴神経変性モデルの作製である。昨年度XPA患者由来iPS細胞からグルタミン酸作動性神経への分化誘導が可能であることを確認し、iPS細胞由来神経幹細胞と内耳組織の共培養系の検討を行った。今年度は1「ヒトiPS細胞から聴神経への分化誘導法の検討」と2「iPS細胞由来神経幹細胞とマウス内耳組織の共培養後におけるiPS細胞由来神経細胞の解析」とを行い以下の結果を得た。昨年度、XPA患者由来iPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンが分化可能であることを確認したが、より生体に近い解析を行うため、iPS細胞から聴神経への分化誘導法の検討を行った。聴