hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
室内空気中化学物質による核内受容体を介した内分泌・ストレス・薬物代謝に及ぼす影響

室内空気中の化学物質を同定し、約200種類の有機化合物をリストアップした。そのうちの約100物質について、内分泌に関わるエストロゲン受容体α/β、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体α/βのホルモン受容体、ストレス応答に関わるグルココルチコイド受容体、薬物代謝酵素誘導に関わるプログネノロンX受容体、ペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体α/γ.、ダイオキシン受容体を介した作用をレポーター遺伝子アッセイ法により調べた。シックハウス症や化学物質過敏症患者宅の室内空気を捕集し、ガスクロマトグラフ/質量分析(GC/MS)法により約70種類の化学物質を同定するとともに、これまで文献上で報告されている約140種類の室内空気中化学物質と合わせて約200種類の揮発性有機化合物(VOCs)をリストアップした。これらの化学物質には、有機リン系や臭素系難燃剤、フタル酸エステル類、パラベン類、ベンゾフェノン類、有機リン系やピレスロイド系殺虫剤、木材から放出されるテルペン類が含まれている。標準品として入手可能であり、揮発性が極めて高い物質(沸点100°C以下)を除く約100物質について、内分泌に関わるエストロゲン受容体(ERα・ERβ)、アンドロゲン受容体(AR)、甲状腺ホルモン受容体(TRα・TRβ)の各種核内受容体及び薬物代謝酵素CYP1A誘導に関わるダイオキシン受容体(AhR)を介した作用をレポーター遺伝子アッセイ法により調べた。いくつかの物質からERα/βアゴニスト作用やARアンタゴニスト作用を検出した。とくに難燃剤・可塑剤の中には、ERα/βアゴニスト作用とARアンタゴニスト作用を併せ持つ物質が認められた。また、テルペン類には、ERβアゴニスト作用が認められた。一方、TRα/βやAhRを介する作用は、ほとんど認められなかった。さらに、本研究ではストレス応答に関わるグルココルチコイド受容体(GR)、薬物代謝酵素CYP3A誘導に関わるプログネノロンX受容体(PXR)、薬物代謝酵素CYP4A誘導に関わるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)α、脂質代謝に関わるPPARγの各種核内受容体活性を検出するためのレポーター遺伝子アッセイ法を確立した。最終年度に、これら受容体への作用を検討し、作用の強い物質についてはマウスへの投与によるin vivoでの影響も検討する予定である。室内空気中化学物質の中でも普遍的に検出されるポリブロモジフェニルエーテル類(PBDEs)及びリン酸エステル類(PEs)の難燃剤について10種類の核内受容体(ERα/β,AR,GR,TRα/β,RXRα,PPARα/γ,PXR)活性とダイオキシン受容体(AhR)活性をレポーター遺伝子アッセイ法により調べた。PBDEs8物質及びその代謝物(水酸化体4物質,メトキシ体4物質)の多くは、ERα/βアゴニスト・アンタゴニスト活性及びARアンタゴニスト活性を示した。また、GRアンタゴニスト活性やTRα/βアンタゴニスト活性を示す物質も認められた。RXRα、PPARα/γ及びAhRに対してはほとんど活性を示さなかったが、これらの化合物の多くに、PXRアゴニスト活性を認めた。PBDEs及び代謝物の化学構造とホルモン受容体活性との間には,いくつかの関連性が認められ、とくにPBDE水酸化体は、PBDEsやPBDEメトキシ体に比べ受容体活性が強く、パラ位水酸基の近傍にあるブロモ基の存在がホルモン受容体との相互作用に大きく影響することが示唆された。PEs11物質のうち、いくつかにERα/βアゴニスト活性を認め、さらにAR及びGRアンタゴニスト活性を認めた。これらの化合物にTRα/β、RXRα、PPARα/γ及びAhR活性は認められなかったが、7物質にPXRアゴニスト活性を認めた。PEsのうち構造的に側鎖の大きい物質は、相対的に疎水性が高く分子サイズが大きいことから核内受容体のリガンドとして機能し易いと考えられた。一方、PXRアゴニスト活性を示したいくつかのPBDEs及びPEsをマウスに投与し、肝臓におけるCYP3A11遺伝子の発現誘導をRT-PCRを用いて検討したところ、PBDEsは誘導能を有していたが、PEsは誘導能が認められなかった。このことから、PEsは生体内で代謝を受けやすく、リガンドとして機能しなかったことが推察された。
ウエストナイルウイルスの中枢神経系侵入メカニズムの解明

北アメリカで流行しているウエストナイルウイルス(WNV)NY株は患者の3040%に脳炎を引き起こす。WNVは蚊の吸血により感染し、血行性に中枢神経系(CNS)に伝播されるが、WNVが血管内皮細胞を通過し、CNSに侵入するメカニズムは明らかにされていない。本研究の目的はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単層培養系を用いて、WNVが血管内皮細胞を通過するメカニズムを明らかにし、WNVのCNSへの侵入メカニズムを考察することである。19年度は、WNVウイルス様粒子(VLPs)が血管内皮細胞を通過するメカニズムに焦点を当てた。HUVECをトランスウエルに単層培養し、WNV 6LP株の構造タンパク質を持つVLPs(6-LP VLPs)とEg株の構造タンパク質を持つVLPs(Eg VLPs)の透過性を評価した。その結果、6-LP VLPsはHUVECを通過するが、Eg株は通過しないことが示された。また、6-LP VLPsはlipid raft関連小胞によりHUVECを通過することが示唆された。20年度は小胞輸送に関与するウイルス側因子に焦点を当てた。6LP株とEg株のエンベローブ(E)タンパク質を入れ替えたキメラVLPsを作出し、HUVECの透過性を評価したところ、HUVECにおけるWNVの小胞輸送にEタンパク質に依存することが示された。また、6LP株とEg株で異なる4ヵ所のアミノ酸を1ヶ所(single mutant)または2ヵ所(double mutant)入れ替えた変異VLPsを作出し、HUVECの小胞輸送に重要なアミノ酸を決定した。その結果、WNVの小胞輸送にはEタンパク質の複数のアミノ酸が関与し、特に156番目のアミノ酸がセリン、159番目のがバリンという組み合わせが重要であることが示唆された。以上の結果より、WNVのCNSへの侵入経路の一つとして、血管内皮細胞の小胞輸送を利用している可能性が考えられた。また、血管内皮細胞におけるウイルスの輸送はEタンパク質のアミノ酸配列により決定されることが示唆された。WNVは蚊の吸血により感染し、血行性に中枢神経系(CNS)に伝播されるが、WNVが血液脳関門を通過しCNSに侵入するメカニズムは明らかにされていない。本研究の目的はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をTranswellに単層培養したin vitro Blood Brain Barrier(BBB)モデルを用いて、WNVのCNS侵入メカニズムを解明することである。WNV NY 6LP株Virus-like particles(6LP-VLPs)をin vitroBBBモデルに感染させた。24時間後にVLPsのBBB透過性を評価したところ、接種したVLPsの約1/10が通過した。VLPs感染細胞では子孫ウイルスは産生されないため、感染24時間後に検出された6LP-VLPsはin vitro BBBを通過したものであると考えられた。そのメカニズムとして(1)タイトジャンクションの構造変化、(2)血管内皮細胞のトランスサイトーシスが可能性として挙げられる。(1)の可能性を検討するために、HUVECに6LP-VLPsを感染させ、24時間後にタイトジャンクションのマーカーであるZO-1の免疫染色を行った。

非感染細胞と感染細胞のZO-1の局在には差がなく、WNV感染によりタイトジャンクションの構造は変化しないことが示唆された。次に(2)の可能性を検討するために、カベオラ小胞形成阻害剤であるFilipin、クラスリン小胞形成阻害剤であるChlorpromazineがWNVのHUVECへの侵入に及ぼす影響を検討した。その結果、Chlorpromazine処理によりWNV感染が有意に減少した。従って、WNVの血管内皮細胞への侵入および血液脳関門の通過にはクラスリン小胞によるトランスサイトーシスが関与することが示唆された。北アメリカで流行しているウエストナイルウイルス(WNV)NY株は患者の3040%に脳炎を引き起こす。WNVは蚊の吸血により感染し、血行性に中枢神経系(CNS)に伝播されるが、WNVが血管内皮細胞を通過し、CNSに侵入するメカニズムは明らかにされていない。本研究の目的はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単層培養系を用いて、WNVが血管内皮細胞を通過するメカニズムを解明することである。19年度の研究成果から、WNVは血管内皮細胞を小胞輸送により通過することが示唆された。20年度は小胞輸送に関与するウイルス側因子に焦点を当てた。WNV6LP株の構造タンパク質を持つウイルス様粒子(VLPs)はHUVECを小胞輸送により通過するが、Eg株は通過しない。そこで、6LP株とEg株のエンベロープ(E)タンパク質を入れ替えたキメラVLPsを作出し、HUVECの透過性を評価したところ、HUVECにおけるWNVの小胞輸送にはEタンパク質に依存することが示された。また、6LP株とEg株で異なる4ヵ所のアミノ酸を1ヶ所(single mutant)または2ヶ所(double mutant)入れ替えた変異VLPsを作出し、HUVECの小胞輸送に重要なアミノ酸を決定した。その結果、WNVの小胞輸送にはEタンパク質の複数のアミノ酸が関与し、特に156番目のアミノ酸がセリン、159番目がバリンという組み合わせが重要であることが示唆された。
映像への情報ハイディング技術に基づく効果的なＭＯＯＣｓ利用能動学習システムの開発

本研究では,授業の予習用に提供された動画データに電子透かしを埋め込み,学生の自学自習の状況を教員側で常にリアルタイムに把握できるオンライン自学自習システムを開発した。ウェブ形式の教材に学生がログインして動画を閲覧すると,動画像に埋め込まれたマーカが自動的に抽出され,ビデオ教材を閲覧したエビデンスとして教員側に送られる。埋め込まれたマーカは,動画を閲覧する際には人間の視聴覚ではほとんど認識できず,かつ,従来の動画電子透かし技術に比べて高速に抽出できるものとなった。電子透かしには画像特徴量を応用した方式を用い,高い抽出制度を保証することができた。従来まで研究してきたスペクトル拡散系列の相関特性を利用した電子透かし方式をビデオ映像に応用する方式について検討した。具体的には,ビデオ映像から特定のフレームを抽出し,これに画像電子透かしに類似した方式で情報を埋め込む方法を提案し,特性検証の結果,大きな問題なく動作することを確認した。さらに,情報抽出時に抽出すべきフレームが正しく抽出されない,いわゆるフレーム同期ずれの問題が発生することを指摘し,画像特徴量などを利用することでこれを回避する方法についても提案し,有効であることを確認した。また,悪意ある攻撃がステゴ動画データに加えられた場合にも正しく情報抽出が行なわれるかどうか,いわゆる攻撃耐性に関する検討も行なった。これについては,画像特徴量などを導入した効果で特定の攻撃については効果は認められたものの,完全に情報の抽出が行なわれない例などもあり,今後に課題が残された。マーカを自動的に埋め込む機能とすべてのマーカを抽出しなければ学習のエビデンスとはならない機能を付与することについては,今年度の研究成果でも十分対応可能であることが判明した。また,オンライン教材として公開する際に,独自で開発した動画ビューワにすべての機能を盛り込むのではなく,Blackboardなど既存のe-ラーニングプラットフォームを利用することも検討することとし,教材システムの全体像については2年目に検討を行うこととした。モデル授業としては研究代表者が担当する「情報理論」の授業を使用することとした。ただし,今年度中にビデオ教材を準備することができなかったため,2年目にビデオコンテンツの準備を行なうこととした。また,授業アンケートなどを利用して効果を検証することについても,2年目以降の課題とした。動画への電子透かし埋め込み方式については,ほぼ予定通りに検証することができた。また,攻撃耐性など,当初予定していなかった事項についても検証することができたのは大きな前進であった。一方,教材システムそのものの開発については,開発計画を立てるのみに留まったが,当初の研究計画でもオンライン教材システムの開発そのものは2年目の計画に含まれていたため,大きな遅れが生じているわけではない。当初の計画より遅れているのは,能動学習のための予習用教材を準備することであるが,3分程度のビデオコンテンツをスライド形式あるいは実写形式で数件準備する作業であるため,2年目に持ち越しても研究計画を大きく遅らせる要因にはならないものと考える。前年度に引き続き,ビデオ信号に導入する電子透かし方式の改良を行なった。具体的には,静止画像向けの電子透かし方式として知られるDCT-OFDM型電子透かし方式にロバスト性の高い画像特徴量を導入することにより,同期処理等を高速化し,ビデオ信号に導入してもコマ落ちなどの問題が生じないように改良することができた。また,画像用の電子透かし方式の改良として,従来のように埋め込み情報を単に周波数領域に換算するのではなく,ホスト信号の周波数スペクトラムを埋め込み系列を用いて近似し,置き換える方法を導入し,この効果を検証した。その結果,スペクトラムが一定の条件を満たしている周波数成分だけを選択して埋め込むことにより,高い性能を得られることが判明した。実際に本システムを導入するモデル授業科目として東京高専情報工学科5年の「符号理論」を採用し,同科目において事前予習を前提とした反転授業を実施した。事前予習用の教材は,ウェブページを通じて学生に公開し,その内容は授業概要を記したPDFファイル,あるいは板書を撮影した画像ファイルなどとした。映像データは28年度は採用せず,29年度に導入することとして,その効果を比較検証することとした。半期の授業終了後に受講学生を対象にアンケート調査を行なった結果,通常の座学の授業よりも関心を持って授業に臨んでいたこと,また,事前予習を行わなかった学生もいた反面,授業内容の習熟度は比較的高かったことが検証された。モデル授業で使用するソフトウェアの作成は予定通りに進まなかったが,通常のウェブページやBlackboardなど既存の遠隔学習システムを有効活用することで代用できることを検討した。このため,平成29年度の前期にソフトウェアに代わるウェブシステムを学生アルバイトなどを雇用して作成し,後期の「符号理論」の授業で導入してその効果を検証することとした。動画を対象とした電子透かし方式の改良に成功し,実用可能なレベルを達成することができた。教材システムの作成については,ゼロから構築するのではなく,ウェブページや既存のシステムを利用することで時間的労力的なコストを削減することを検討した。当初の予定よりシステム作成は遅れているが,3ヶ月程度で作成することは可能であり,次年度の前半で作成することで目標を達成できるものと考えている。前年度に引き続き,ビデオ信号に導入する電子透かし方式の性能検証および改良を行なった。具体的には,前年度開発した画像特徴量に基づく動画電子透かし方式において,動画の各フレームに同じ情報を埋め込み,複数フレームから多数決によって埋め込み情報を特定する方法を実装し,性能を検証した。

この結果,多くの動画像において,正確に埋め込まれた情報を抽出できることが示された。また,反転授業形式の能動学習用教材として,教員が電子透かしを含んだ画像を公開したり,学習者が動画を閲覧したりできるようなプラットフォームをウェブ形式で開発した。このシステムでは,教員側では本研究で開発した方法で電子透かしを埋め込んだ動画教材をアップロードすることができる。学習者は,個別のIDとパスワードでログインした後,公開された教材を閲覧することにより,自動的に電子透かしが抽出され,閲覧の証拠として,教員側に抽出された電子透かしデータがフィードバックされる。これにより,学習者の事前学習状況が教員側で把握できるように設計されている。開発した学習システムを平成29年度中に実際の授業に導入して効果を検証することを計画していたが,十分な検証までは至らなかった。今後,研究代表者が担当している「情報理論」「符号理論」などの授業に段階的に導入し,授業アンケート等でその学習効果を検証して,結果については論文等の形式で公表することとした。研究機関全体を通じた成果としては,能動学習用の動画教材を作成するにあたり,性能の高い画像電子透かし方式および動画電子透かし方式を開発し,その成果を検証した。その結果,従来提案されていた方式と比較し,高速に処理することが可能で,動画像の再生品質への影響を低く抑えた上で,低い誤り率で情報が抽出可能であることが示された。また,動画教材を公開・閲覧するシステムを開発することができた。本研究では,授業の予習用に提供された動画データに電子透かしを埋め込み,学生の自学自習の状況を教員側で常にリアルタイムに把握できるオンライン自学自習システムを開発した。ウェブ形式の教材に学生がログインして動画を閲覧すると,動画像に埋め込まれたマーカが自動的に抽出され,ビデオ教材を閲覧したエビデンスとして教員側に送られる。埋め込まれたマーカは,動画を閲覧する際には人間の視聴覚ではほとんど認識できず,かつ,従来の動画電子透かし技術に比べて高速に抽出できるものとなった。電子透かしには画像特徴量を応用した方式を用い,高い抽出制度を保証することができた。今後は,当初の研究計画に基づき,動画コンテンツへのマーカ埋込方式を改良し,本システムで使用する方式を決定するとともに,既存のプラットフォームなどを利用したオンライン教材作成を進める。さらに,1年目で作成できなかったモデル授業におけるビデオコンテンツを作成し,これにマーカを埋め込んだステゴ映像コンテンツも作成する。モデル授業においては,本システムを利用した場合としない場合で学習効果にどの程度の違いが出るかなどを,授業前と授業後のアンケート調査などにより検証する。最終年度は,まず前期のうちに教材を公開し,成績情報を管理するウェブシステムまたはBlackboardを利用したシステムを開発する。開発にあたっては,学生アルバイトなどを雇用し謝金を支払うこととする。
業務知識の共有支援を行うワークフローシステムに関する研究

本研究の目的である知識共有支援型ワークフローシステムを実現するために,平成16年度は蓄積ノウハウ及び業務履歴を元にフロー定義を改善する機構の設計・実現と評価実験を行った.本研究の方法によるワークフローシステムでは,ユーザが処理中の業務内容に関連する知識をノウハウデータベースから自動的に抽出し,ユーザに対話的に提示を行う.しかしながら,現実の業務では予め想定が困難な業務の委譲や差戻し等の例外処理が極めて多く,これにより業務の効率が低下することが問題となっていた.本研究では,例外が作業に及ぼす影響度に着目し,その値により最適な例外対処法の提供を行う方式の確立を行った.具体的には例外の原因を物・時・人の3種類に分類し,それぞれの場合の例外影響度を算出する.この値により一時的対処で例外を解決するか,またはボトルネックとなるフロー定義の個所を示し,その定義について再考を行うかの判断をシステムが行う手法である.また,本方式に基づく試作システムの実装を行い,実験環境において実際の業務に用いる実験を行った結果,フロー定義の中で影響の大きい問題箇所を割り出して通知できることが確認された.一方,各作業者側でも例外の対処を行う時間が大幅に削減されており,本方式によって業務効率の大きな向上が期待できる.以上の研究成果を,本研究に関連のある学会で発表した.本研究の目的である,業務プロセスの管理を行うワークフローシステムと知識共有支援システムの融合法の確立,および,本方法による知識共有支援型ワークフローシステムの試作システムの実現を達成するために,平成14年度はワークフローシステムとノウハウ共有支援システムの連携に関する研究を行った.具体的には,業務に関連する知識を蓄積し,業務処理中にインタラクティブに業務支援を行うための方法を提案し,ワークフローシステムと連係する試作サーバを実現した.実現にあたっては,業務処理に重大な支障を与えることなく業務プロセス管理支援を行うために,申請者がこれまで研究を行ってきた,実世界での処理に柔軟に対応する実世界指向ワークフローシステムをケーススタディシステムとして用いた.この実世界指向ワークフローシステムでは,これまでの既存ワークフローシステムに比べて,より多くの特殊な例外処理に適応可能である.そこで,例外処理が発生した業務プロセスの各段階において,処理中の業務状態に関するパラメータを抽出し,業務ノウハウデータベース内のリンク付けに利用することによって業務知識蓄積機能を実現した.また,処理中の業務状態やユーザの状況もパラメータ化し,業務ノウハウデータベース内から適合するノウハウを的確な場面でユーザに提示する業務知識提示機能も実現した.業務知識の提示にあたっては,さらに以下の点をさらに考慮する必要があることが分かった.スキルワーカーが現時点で参照するような業務知識は,その内容がかなり高度な知識であると推測される.そのため,新人ワーカーが参照を必要とするような初歩的な業務知識をスキルワーカーが参照する可能性は低い.以上の研究成果を,本研究に関連のある国際会議で発表した.本研究の目的である,業務プロセスの管理を行うワークフローシステムと知識共有支援システムの融合法の確立,および,本方法による知識共有支援型ワークフローシステムの試作システムの実現を達成するために,平成15年度は作業者の状況に適合する業務知識提示機能に関する評価実験を行った.本研究の方法によるワークフローシステムでは,ユーザが処理中の業務内容に関連する知識をノウハウデータベースから自動的に抽出し,ユーザに対話的に提示を行う.そのためには,現実の業務では予め想定が困難な業務の委譲や差戻し等の例外処理も多いが,その業務プロセスの各段階において処理中の業務の状態や作業者の状況に関するパラメータを抽出し,業務ノウハウデータベース内から適合するノウハウを的確な場面でユーザに提示する.即ち,作業者の状況を的確に捉えることが最も重要である.平成15年度は,業務知識提示機能に利用する作業者の状況を抽出する機構を完成させ,その状況情報の利用効果を検証するために試作システムの実装を行った.本研究の方式は,従来研究のように単に作業者の状況情報のみを考慮するのではなく,ワークフロ-システム側の状況,もしくは業務内容や提示されるノウハウの重要度など,様々なパラメータを用いることにより,システム全体の状況に適合させることを可能にした.また,試作システムを用いて実際に評価実験を行い,ユーザへのアンケート結果を解析することにより,本研究の方式は従来方式よりも的確に様々な状況に適合でき,本方式が有効であることが確認できた.以上の研究成果を,本研究に関連のある学会で発表した.本研究の目的である知識共有支援型ワークフローシステムを実現するために,平成16年度は蓄積ノウハウ及び業務履歴を元にフロー定義を改善する機構の設計・実現と評価実験を行った.本研究の方法によるワークフローシステムでは,ユーザが処理中の業務内容に関連する知識をノウハウデータベースから自動的に抽出し,ユーザに対話的に提示を行う.しかしながら,現実の業務では予め想定が困難な業務の委譲や差戻し等の例外処理が極めて多く,これにより業務の効率が低下することが問題となっていた.本研究では,例外が作業に及ぼす影響度に着目し,その値により最適な例外対処法の提供を行う方式の確立を行った.具体的には例外の原因を物・時・人の3種類に分類し,それぞれの場合の例外影響度を算出する.この値により一時的対処で例外を解決するか,またはボトルネックとなるフロー定義の個所を示し,その定義について再考を行うかの判断をシステムが行う手法である.また,本方式に基づく試作システムの実装を行い,実験環境において実際の業務に用いる実験を行った結果,フロー定義の中で影響の大きい問題箇所を割り出して通知できることが確認された.
細菌表層提示蛋白質を利用した改良型 IVET 法の開発

研究の成果について、その具体的内容感染過程において感染宿主内で特異的に発現する細菌遺伝子群探索を目的として改良型IVET法を開発した。本法は菌体表層に提示される標識蛋白質をコードする遺伝子上流にゲノムライブラリを挿入し、感染過程で発現するライブラリ導入菌株のみを選択的に回収し、マイクロアレイを用いた網羅的解析のための材料を提供する。本年度は、培地へのMgSO4添加により気管支敗血症菌の遺伝子発現が変動することを利用して本法の実験条件の最適化と有効性の検討を行った。その結果、MgSO4添加培地で培養したライブラリ導入菌株群からはMg2+イオンによって正に制御される鞭毛遺伝子群が、MgSO4無添加培地で培養したライブラリ導入菌株群からはMg2+イオンによって負に制御される病原性遺伝子群が、それぞれ選択的に回収されることを確認できた。さらに、既知の病原性遺伝子のプロモーターを導入した菌株とラット感染モデル実験系を用いて本法を行うと、感染動物の気管組織から病原性遺伝子のプロモーターを導入した菌株が選択的に回収されることも確認できた。研究の成果の意義、重要性本法により、これまで解析が困難であった宿主、組織および感染時間など実際の感染環境の様々な違いに応じて発現する遺伝子群の変化を網羅的に解析することが可能になった。得られた試料を用いてマイクロアレイ解析を行うことで、感染宿主内で特異的に発現する遺伝子探索のための全ての実験手法および実験条件の検討が終了した。具体的内容昨年度開発した改良型IVET法と気管支敗血症菌ライブリラリおよびラット感染モデル実験系を用いてマイクロアレイ解析を行った。ラット気管で発現するライブラリの感染後1,3,9,15,30日の経時的探索を行った結果、既知の病原性遺伝子は感染全日程において高発現する遺伝子群(bvgA,bvgR,fhaB,III型分泌装置関連遺伝子群)、感染経過とともに一過的な発現変動をする遺伝子群(cyaA,fim2)、試験管内培養と発現レベルに差が認められないあるいは低下する遺伝子群(ptx,dnt,tcfA,bipA,pertactinなど)に分類することができた。また、感染全日程においてラット気管で高発現する289の遺伝子間領域をRIL(rat trachea induced Ioci)として定義し、その制御下にある259遺伝子をラット気管で発現する遺伝子として抽出することができた。さらに、RIL制御下の遺伝子群から気管支敗血症菌特異的な28の遺伝子を同定した。研究の成果の意義、重要性本実験により初めて感染経過に伴う病原性遺伝子の発現消長が観察された。この結果は、発現に影響を及ぼす感染宿主内環境因子が存在することと因子の量的あるいは質的な変動があることを示唆している。これは、感染宿主と病原性細菌の相互作用が経時的に変化することを意味しており、本菌の感染病態を理解する重要な知見と考えられる。また、感染ラットの気管で恒常的に発現誘導される28の気管支敗血症菌特異的な遺伝子を同定することができた。得られた遺伝子群の機能解析から、宿主域の広い気管支敗血症菌と宿主をヒトに限局した百日咳菌の感染性の違いを明らかにする分子生物学的基礎知見が提供できると考えられる。具体的内容前年度までに改良型IVET法解析を用いてラット感染中に高発現する気管支敗血症菌特異的な28遺伝子を同定した。その中から6つの転写制御因子、1つの鉄輸送関連タンパク質に注目して、ラット気管への感染成立と病原性遺伝子発現に対する影響について検討した。各々の遺伝子を欠失した変異株を作製し、ラット気管への感染実験に供試し気管への定着菌数の比較を行ったところ、2つの制御遺伝子と鉄輸送関連タンパク質の変異株の定着菌数が野生株と比較して有意に減少した。一方、転写制御因子を強制発現するプラスミドを構築し、試験管内で培養中の気管支敗血症菌の病原性遺伝子発現への影響について野生株と強制発現株の比較を行った。その結果、強制発現株では病原性遺伝子(cyaA, fhaB, bipA)の発現上昇が観察された。さらに百日咳菌内で上記の転写制御因子の強制発現をさせた場合でも、病原性遺伝子(cyaA, fhaB)の発現上昇が観察された。研究の成果の意義、重要性本研究によりラット感染中に発現する気管支敗血症菌特異的な遺伝子の中から感染成立に影響する遺伝子を同定することができた。さらに、気管支敗血症菌特異的な転写制御因子の中から気管支敗血症菌および百日咳菌の病原性遺伝子発現に影響する遺伝子を同定する事ができた。以上の結果から、百日咳菌と気管支敗血症菌の宿主特異性を規定する原因の一つが両菌固有の遺伝子機能の違いであり、両菌の宿主内環境応答能の違いである可能性が示唆された。以上の成果は気管支敗血症菌特異的な遺伝子導入によって百日咳菌にラット感染能を付与できる可能性を示しており、百日咳菌感染モデル構築に重要な基礎知見であると考えられる。研究計画通り、平成22年度内に1)菌体表層に提示される標識蛋白質により選択的に菌体を回収する系の構築,2)菌体表層提示蛋白質を発現する菌体を動物感染モデルから回収する方法の確立を達成し、平成23年度は3)ラット感染時に発現する気管支敗血症菌の遺伝子の探索と4)病原性に影響する遺伝子および遺伝子発現制御の同定を達成した。

24年度が最終年度であるため、記入しない。RIL制御下かつ気管支敗血症菌特異的な28の遺伝子に含まれる6の転写制御関連遺伝子の破壊株および大量発現株を構築し、病原性に対する影響を系統的に解析する。また、RIL制御下の259遺伝子の中から、新規病原性遺伝子候補の探索を行い、気管支敗血症菌と百日咳菌の病原性相違の原因と考えられる遺伝子および遺伝子発現制御機構の実証を行う。
細胞内シグナルとしてのプロテアソームを標的とした口腔癌の浸潤・転移抑制の試み

前年度まで、口腔扁平上皮癌細胞株を用いて、癌細胞をTNFαで刺激すると転写因子NF-κBが活性化され、MMP-9の発現が上昇することを示した。さらに癌細胞のプロテアソームをプロテアソームインヒビターで抑制することによってMMP-9発現を強力に抑制できたため癌細胞の浸潤がプロテアソームインヒビターで制御できる可能性がひらけた。本年度はさらにボイデンチャンバーを用いて癌細胞の運動能に、対するプロテアソーム/NF-κB系の関与を調べた。その結果、1)癌細胞をTNFαで刺激するとその運動能が促進された。2)癌細胞の運動能はプロテアソームインヒビターによって抑制された。3)癌細胞の運動能は線維芽細胞が共存することによってさらに強力に亢進した。4)癌細胞と線維芽細胞を共存培養するとNF-κBの活性化、MMP-9発現が増強された。5)プロテアソームインヒビターは線維芽細胞の効果も抑制した。以上の結果から、癌細胞のMMPを介した運動能にプロテアソームが関与し、プロテアソームを抑制することは、癌浸潤の制御に効果があると考えられた。また、線維芽細胞の存在は癌細胞の浸潤に寄与するが、その線維芽細胞の作用もプロテアソームインヒビターによって抑制され、プロテアソームが癌浸潤抑制のターゲットの1つになりえることが示唆された。7種類の既存の口腔扁平上皮癌細胞株に、口腔癌患者の転位リンパ節より新たに樹立された細胞株TU-4を加えた8種類の細胞株を用いて以下の結果を得た。1.培養癌細胞株をサイトカインTNFで刺激すると運動能が亢進した。2.同じく癌細胞をTNFで刺激すると基底膜破壊に関わるプロテアーゼMMP-9の産生が著明に増加することがゼラチンザイモグラムにより解析された。また、RT-PCR法及びノーザンブロット法によってMMP-9mRNAの発現が上昇することがわかった。3.MMP-9遺伝子発現に関わる転写因子NF-kBの活性をゲル移動度シフトアッセイにて解析すると、癌細胞中のNF-kBがTNF添加によって活性化された。また、活性化されたNF-kBが細胞質から核へ移行する現象を免疫染色にて確認した。4.NF-kBが活性化されるためにはインヒビターであるlkBが分解されなければならない。このlkBの分解をウエスタンブロットで確認した。5.プロテアソームインヒビターであるALLNやラクタシスチンで癌細胞を前処理すると、MMP-9発現とNF-kB活性化が抑制され、プロテアソームがNF-kB活性化に関わっていることが考えられた。6.また、プロテアソームインヒビターにより癌細胞の運動能が著明に抑制された。以上より、口腔内癌細胞の基底膜破壊と運動能がプロテアソームインヒビターによって抑制され得ることが示唆された。
北海道戦前期の建設業者に関する研究

1.明治前期の建設業者については、北海道立文書館所蔵の開拓使関連簿書のうち、建築仕様書を含む一件書類21件から、建設関連業者104名について、職種、生・没年、住所、出身地、請負建物・所在地、関係者、資料名・経歴の項目を、データとしてまとめることができた。2.明治中期以降の建設業者を探る方法として採用した戦前期主要紙からの建築関連記事の収集は、作業に膨大な時間がかかってしまった。北海道毎日新聞(明治2030年)、函館新聞・函館毎日新聞(明治20年大正3年)、小樽新聞(明治37昭和2年)、北海タイムス(明治34昭和10年)、十勝新聞(昭和8年13年)、十勝毎日新聞(昭和8年12年)の6紙を対象に、建設業者および施工作品を収集し、新聞ごとに建設関連年表を作成した。3.明治中期以降の建設業者に関しては、新聞調査から請負業者256名が得られ、うち戦前期に刊行された紳士録、人名録、人名辞書など14文献および他文献からデータを捕捉できる業者59名について、生・没年、職種、大工経験、来道年、生家家業、創業までの足どり、創業年、創業地、住所、公職、請負建物、所在地、関係者、縁籍、資料名、経歴の項目で、データとしてまとめることができた。4.明治中期以降の建設業者59名については、生没年を年表化し、さらに出身地の判明した45名分について県別にまとめた。上位から新潟県(12名)、石川県(7名)、福井県(4名)、青森県(3名)、富山県(3名)となっている。収集した建設業者は、上述のように一応データベース化したが、明治前期と後期以降で収集情報量が異なり、データ項目を揃えることが難しかったので、本研究では2種類のデータとしてまとめている。それぞれの個人情報の収集、業者の追加方法、さらに各個人に関する詳細調査などは、今後の研究課題として残された。1.明治前期の建設業者については、北海道立文書館所蔵の開拓使関連簿書のうち建築仕様書を含む一件書類21件を閲覧し、32名(大工職を含む)を収集した。さらに塗師、レンガ職、屋根葺職などの関連職人名13名も明かになり、これら関連職人も関連データとして採集した。2.明治中・後期以降の建設業者を知る方法として採用した主要紙からの建築関連記事の収集は、作業に膨大な時間がかかったが、北海道毎日新聞(明治2030年)、小樽新聞(明治37昭和2年)、北海タイムス(明治34昭和10年)の3紙を対象に建設業者および施工作品を収集した。北海道毎日新聞から31名、北海タイムスのうち、明治37年大正15年分についてとりまとめ、約156名の請負業者名(土木請負業者は一応除いた)が明らかになり、年表としてまとめることができた。北海タイムスの昭和初期分と小樽新聞については、建築関連記事の収集は終了したが、年表形式のまとめおよび建設業者名のチェック等の作業は現在も進行中である。3.戦前期に刊行された人名辞書などから、『北海道人物誌』(明治26年)、『北海立志編第壱巻』(明治35年)、『北海立志編第五巻』(明治42年)、『札幌紳士録』(明治45年)、『札幌之人』(大正3年)、『北海道人名辞書』(大正12年)、『北海道市町村総覽第一巻旭川市上川支廳管内編』(昭和2年)、『現代札幌人物史』(昭和6年)8冊の資料を収集し、通覧した。

4.収集した建設業者のデータベース化は、カード型データベースを使用し、データベースの構築を思考中であるが、検索する際のキーワードやデータ項目に関してはさらに改良工夫を要し、次年度の課題として残された。1.明治中、後期以降の建設業者を探る方法の一つとして、先年度に引き続き新聞からの建築関連記事の収集を採用した。本年度は、北海道大学付属図書館所蔵の新聞から、函館新聞・函館毎日新聞(明治20年大正3年)、十勝新聞(昭和8年13年)、十勝毎日新聞(昭和8年12年)の3紙を対象に、建設業者および施工作品を収集した。函館毎日新聞から明治大正期の建設業者75名、十勝新聞、十勝毎日新聞から昭和期の建設業者32名、および前年度収集の北海タイムスから昭和期の建設業者8名、小樽新聞から明治大正昭和期の建設業者133名について、年表化した。2.開拓使建築関連簿書を中心に『道南の槌音』(昭和57年)を補助資料として収集した明治前期の建設関連業者104名について、職種、生・没年、住所、出身地、請負建物・所在地、関係者、資料名、経歴の項目で、データベースとしてまとめた。3.明治中期以降の建設業者に関しては、新聞調査から得られた業者256名のうち、戦前期に刊行された紳士録、人名録、人名辞書など14文献および他文献からデータを補足できる業者59名について、出身地、生・没年、職種、大工経験、来道年、生家家業、創業までの足どり、創業年、創業地、住所、公職、請負建物・所在地、関係者、縁籍、資料名、経歴の項目で、データベース化を試行した。4.明治中期以降の建設業者59名について、生没年を年表化し、さらに出身地の判明した45分については県別にまとめた。上位から新潟県(12名)、石川県(7名)、福井県(4名)、青森県(3名)、富山県(3名)となっている。
機能未知天然変性タンパク質の細胞医療への応用

天然変性タンパク質(IDP)には、その共通の分子機能として、フライキャスティングメカニズムや「フォールディングに協調した標的結合」という機構が知られている。また植物のストレスタンパク質dehydrinのコア配列と絹由来sericinがIDPであること、酵素や細胞の凍結保護保護活性があることが報告されている。IDPの機能がその基本物性に由来し、配列や起源に依存しないならば、同様の機能性IDPがヒトゲノム内にもあるはずである。酵素の凍結保護活性を指標に、ヒト由来IDPの探索・最適化を行った。そのうちの一つ、20アミノ酸のIDPペプチドはNHDF細胞の凍結保存において、有意な保護効果を示した。本研究はヒトゲノム由来の天然変性タンパク質(IDP)から医薬品ないし医療用細胞の添加剤・保護安定剤を開発することを目的とした研究である。特にES細胞・iPS細胞などの多能性幹細胞の凍結保護液を開発することを目的としている。本研究の着想は、ヒト由来の5種類のIDPが、乳酸脱水素酵素LDHの酵素活性に対して、高い凍結保護活性を示したという申請者独自の研究結果に基づいている。本申請を行ってから採択されるまでの期間に、LDHに対する凍結保護活性・凍結乾燥保護活性を確認できたため、国内特許出願を行った。更に、この5種類のIDPの凍結保護活性が、より一般性を持つ活性であることを示すために、別の酵素であるグルタチオンS転移酵素、酵素ではないタンパク質のモデルである緑色蛍光タンパク質の、それぞれに対して、標品であるウシ血清アルブミンと同等ないしそれを上回る凍結保護活性を見出した。更に、医療用(タンパク質製剤・細胞製剤)への添加物としての使用を容易にするために、将来のGMP準拠の生産を念頭において、既に得られている5種類のIDPの部分ペプチドを計9種用意し、それらすべてのLDHに対する凍結保護活性を測定した。その結果20アミノ酸のペプチドで、同党の凍結保護活性を示すものを同定した。これらの結果を実施例として追加し、2015年1月に、国内優先権に基づく新たな特許を出願すると同時にPCTによる国際出願を完了した。一方、細胞の凍結保存液への応用のための予備実験も開始した。COS7、HeLa、NIH3T3などの確立された培養細胞株では、申請者の予測とは異なり、DMSOが2.5%以上あれば、培地中の血清は0%にでき、対照品であるセリシン添加の効果は見られなかった。そこで、評価系を、より保存条件の設定が難しいとされている、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)の条件検討を開始した。本研究は、ヒト由来の5種類のIDPが、乳酸脱水素酵素LDHの酵素活性に対して、高い凍結保護活性を示したという申請者独自の研究結果に着想を得て開始された。ヒト由来IDPを利用した凍結保護剤の国内特許について、本研究採択までに出願済みであった。研究開始後、別の酵素であるグルタチオンS転移酵素、酵素ではないタンパク質のモデルである緑色蛍光タンパク質の、それぞれに対して、標品であるウシ血清アルブミンと同等ないしそれを上回る凍結保護活性を確認した。更に、既に得られている5種類のIDPの部分ペプチドを計9種用意し、それらすべてのLDHに対する凍結保護活性を測定した。その結果、同等以上の凍結保護活性を示す20アミノ酸のペプチドFK20を同定した。更に、IDPによる凍結保護のメカニズムが、一般的な高分子クラウディング効果における、分子盾効果によるものであるとの仮説を立てた。高温で動作する酵素、耐熱性DNAポリメラーゼの経時的活性低下に対してもヒト由来IDPの一つが保護効果を持つことから、前記仮説の一部が検証できた。一方、細胞の凍結保存液への応用研究を行った。COS7、HeLa、NIH3T3などの確立された培養細胞株では、DMSOが2.5%以上の条件で、モデル天然変性タンパク質であるセリシン添加の効果は見られなかった。しかし、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)の系では、DMSOのみでは十分な凍結保存ができず、FK20の添加(終濃度0.1%)が有効であった。この凍結保護効果はセリシンよりも顕著であった。本研究は、当初の計画に比して、特に凍結保護活性を有する実用的なペプチドの取得と、その知財化の観点においては、当初の計画以上に順調に進展している(例えば、当初計画では、知財化は平成27年後半に予定していた)。

これは、予備データの段階から、申請者が所属する名古屋大学の学術研究・産学官連携推進本部(知財グループ)担当者ならびに弁理士、更には本学と共同研究関係にある幹細胞を取り扱うベンチャー企業である株式会社Clioの吉田社長に相談し、的確な助言に従い、研究を展開してきたことによる。特に、まず基本特許を国内で出願し、より実用的なデータを短期間で追加し、優先権出願制度を利用して、追加出願をするという、従来のアカデミアにおける研究スタイルよりも踏み込んだ展開を行うことが出来た。PCT/JP2015/050131「タンパク質凍結保存用保護剤」ただし一方で、特に医療応用時の実用性を重視し、部分ペプチドの評価を優先したため、当初の計画書にある「更に新規のIDP約15種をヒトゲノムから探索する」件については、予定よりも遅延が生じている。両者を総合して自己評価し、「概ね順調に進行している」と評価した。なお学術論文の発表については、IDPの大腸菌を用いた生産法について、既に一報出版しており、更に凍結保護活性について現在投稿中であることから、順調に推移している。物理系薬学前述のように、平成26年度中に、現有の5種類のヒトゲノム由来IDPに加えて、新規のIDPを15種類準備して、それを評価することを、平成27年度の研究目標の中核とする。また、その部分ペプチドなども含めて計50種類程度のIDPの凍結保護活性と、アミノ酸配位列の相関に関する研究を行う。特に、活性の定量的評価が容易なLDHの凍結保護活性について注力し、アミノ酸配列の特徴や規則性について解析し、IDPによる凍結保護のメカニズムを詳細に解明する。併せて、細胞保存液の開発に着手する。具体的には(1)既取得済みのIDPならびにその部分ペプチド、新規に得たペプチド、および既取得済みのIDPの部分ペプチドの配列改変体について、多変量解析などの統計解析を行い、凍結保護活性とアミノ酸組成など活性の相関を見る。(2)NHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)などの分化能をもった細胞を用いて、IDP添加細胞保護溶液・無添加保護溶液・DMSO・アセトアミド等(対照実験)を用意し、凍結処理時間(15秒、60秒)を変えて凍結し、二週間保存したのちの細胞生存率をMTT細胞アッセイ等により評価する。更にマウスES細胞、間葉系幹細胞(MSC)、造血幹細胞、神経幹細胞などについても性能評価を行う。(3)論文発表を行う。
良渚文化における石器の生産と流通に関する研究

平成12年度から14年度にかけて計5回の実地調査を実施した。調査日数は延べ115日間に及ぶ。その内容は、石器の観察(金属顕微鏡を用いた使用痕観察を含む)と記録(写真・実測図・文字記録)といった考古学的調査と、石材鑑定ならびに石材産地踏査といった岩石・鉱物学的調査からなる。その結果得られた主な学術的成果は以下のとおりである。1)穿孔器、切割器、石犂側板など、従来良渚文化石器の器種として認定されていなかったものを独立器種として確定することができた。2)ほとんどすべての石器器種につき器種と石材との間に明確な対応関係が存在することが判明した。例を挙げれば、鎌はホルンフェルス、犂は粘板岩、片刃石斧は流紋岩、鏃は凝灰岩といった具合である。また、鉞と一括される穿孔石斧類の中でも、形態と用材とがほぼ一対一で対応することが確認された。こうした現象と岩石産地踏査から知られる石材産地の限定性とを併せ考える時、器種ごとの石器専業生産地の存在が強く示唆された。3)金属顕微鏡観察の結果、これまで中耕・除草具と考えられていた耘田器が実は収穫具であること、また、溝切り具とされていた破土器が何らかのイネ科植物の伐採具であることが判明した。4)石材産地の踏査結果から、杭州市半山=砂岩、余杭市瓶窯=流紋岩・凝灰岩、呉県光福=ホルンフェルス等々の石材産地の候補地をピックアップすることができた。今年度は、特に武器・儀器としての石鉞、農具としての耘田器・破土器・石犂を中心に良渚文化石器の生産と流通の機構を解明することを目的とした。平成12年夏と13年冬の2回訪中し、計44日間を調査に費やした。日本からの参加人員は延べ12人に達する。具体的には、浙江省文物考古研究所、良渚文化博物館、余杭市博物館、海塩県博物館、桐郷市博物館、平湖市博物館に収蔵される良渚文化石器約700点につき実測、写真撮影、石材鑑定を実施した。また、杭州市、余杭市、海寧市、海塩県の計6ヶ所の採石場で石材を採取し、その鉱物学的特徴を明らかにし、出土石器原材との比較を行った。石鉞については、多数副葬例として知られる横山2号墓132点、匯観山4号墓48点、反山20号墓36点のすべてにつき綿密な調査を行った。いずれもこれまでに出土品のごく一部は報告されているが、全体像については不明であった。今回の調査により、石鉞の分類がほぼ確定し、各種ごとの使用石材、形態、着柄の有無、副葬位置などの対応関係を明らかにすることができた。この種の研究は中国においても従来行われていない。一方、農具類については、使用痕と着柄痕を詳細に観察することによって、これまでに議論の多かったその使用法についてかなりの確度で復元が可能となった。また、桐郷市博物館に収蔵される耘田器1点に線刻のあることを発見した。線刻が施された良渚文化石器はこれまでに例がなく、土器や玉器に施される文様との対比が可能となった。石材産地の踏査結果からは、多数副葬される石鉞の場合、その大多数は現地産の手近な材料を用いるが、丹念に研磨された例については遠隔地産の可能性が高いという見通しを得ることができた。特に、ホルンフェルス製のものについては海塩県六里近辺に石材産地が存在する可能性を指摘しうることとなった。

今年度は、平成13年9月と14年23月の2回にわたり訪中し、計40日間を調査・研究に費やした。農具類と玉器製作用工具類を中心に網羅的な資料収集を行い、観察・分析を進めた。具体的には、浙江省の浙江省文物考古研究所、海塩県博物館、平湖市博物館、嘉興市博物館、湖州市博物館、舟山市博物館、馬〓博物館、上海市の上海博物館、青浦県博物館に収蔵される良渚文化石器約600点につき実測、写真撮影、石材鑑定、使用痕観察を実施した。また、浙江省内5ヶ所で石材を採取し、その鉱物学的特徴を明らかにし、出土石器原材との比較を行った。農具類については、金属顕微鏡を使用しての詳細な使用痕観察を行った結果、これまで、中耕・除草用具と想定されていた「耘田器」が実は収穫具であることを明らかにしえた点は特筆すべき成果といえる。また、破土器と石犂についても、擦痕の分布範囲と方向を丹念に観察することで、着柄法と使用法についてのより明確な復元案が提出可能となった。さらに、桐郷新地里、上海広富林、同亭林の諸遺跡の墓葬内出土品を実見する機会を持ち、共伴土器から該当石器型式に確実な年代を与えうることになった点は編年研究上の大きな進展である。玉器製作用工具類については、未報告の玉器製作址である余杭市塘山遺跡出土品を中心に精査を進めた。同遺跡出土の擦切用石器、砥石、彫刻用打製石器等を調査することで、玉器表面の製作痕跡のみからする従来の製作技法復元の欠を補うことができた。石材産地については、これまでの調査から浙江省嘉興地区にホルンフェルス原材産地が存在するとの見通しを得ていた。海塩県と平湖市における石鉱踏査の結果、ホルンフェルスそのものの露頭は発見できなかったが、地質学的にはそれが存在する可能性が十分あることが判明した。今年度の研究は、前半は中国江蘇省内における遺物調査、後半は3年間に及ぶ研究全体の整理・総括と成果報告書の作成を主に行った。まず、平成14年9月の1ヵ月間、研究代表者、研究分担者、研究協力者計7名が訪中し、中国側研究者と共同で良渚文化石器の観察・記録を進めた。具体的には、江蘇省の常熟市博物館、呉江市博物館、昆山市文物管理所、蘇州博物館、呉県文物管理委員会、常州市博物館に収庫される良渚文化石器約400点につき実測、写真撮影、石材鑑定、使用痕観察を実施した。また、浙江省文物考古研究所においても玉器製作用工具類を中心に補足的な調査を行った。さらに、江蘇省呉県において、かつてホルンフェルス製石器未製品が大量に採集されている嶺脚下遺跡を踏査し、その付近の山地にホルンフェルスの露頭が存在する可能性がきわめて高いことを確認した。年度後半における研究のとりまとめとしては、平成14年11月に研究代表者が浙江省文物考古研究所、上海博物館、蘇州博物館を訪問し、各機関所属の海外共同研究者と研究成果報告書作成に関わる意見交換を行った。平成15年1月には上海博物館から、2月には蘇州博物館から海外共同研究者を日本へ招聘し、報告書内容の検討を推し進めた。それと同時に、研究成果報告会を開催し、成果の概要につき発表した。3年間に及ぶ調査を通じ、良渚文化石器の石材選択にはかなり厳密な規則性があること、石材産地の分布はかなり限定されていること、農具とされる石器の機能については従来の見解を大幅に修正しなければならないことなど数多くの研究成果を挙げることができた。
G0期(静止期)細胞の維持に必要なユビキチン依存的タンパク質分解経路の解明

本研究は、分裂酵母をモデル生物として用いて、G0期(静止期)の維持に必須なユビキチン依存的タンパク質分解経路(以下、UPS)を明らかにすることを目的としている。平成18年度までに、G0期細胞の長期生存維持に、ユビキチン活性化酵素(El)と26Sプロテアソームが必須であることを明らかにした。また、G0期の長期生存維持に必要なユビキチン共役酵素(E2)のスクリーニングを行い、Ubc3がG0期長期生存維持に必須であることを明らかにした。これらの結果を受けて平成19年度は以下の解析をおこなった。G0期におけるUPS欠損が引き起こす異常を詳細に解析するため、透過型電子顕微鏡による形態観察をおこなった。その結果、G0期のプロテアソーム失活は、(1)部分的な核膜の破綻(2)核内での凝集物蓄積(3)核内での小胞様構造の形成(4)ミトコンドリアの消失を引き起こすことが明らかになった。これらはG0期でのプロテアソーム変異体特異的な表現型であったことから、G0期でのUPSの必須機能はこれらの表現型と密接に関わることが示唆された。次にG0期プロテアソーム変異体でのプロテオーム解析を行った。その結果、G0期でUPSが破綻すると、(1)酸化ストレスによって誘導される蛋白質の量が増加する、(2)ミトコンドリア蛋白質が大幅に減少することが明らかとなった。電子顕微鏡の結果からもミトコンドリアの消失が示されているため、ミトコンドリアに注目し解析をすすめた。その結果、G0期のUPS欠損では、ミトコントリアの選択的な分解が異常に亢進していることが明らかとなった。G0期におけるUPSの必須機能のひとつはミトコンドリアの維持であることが示唆された。以上の結果をもって、現在、投稿準備中である。本研究は、分裂酵母をモデル生物として用いて、G0期(静止期)の維持に必須なユビキチン依存的タンパク質分解経路を明らかにすることを目的としている。研究の基礎として、まずG0期細胞の長期生存維持に、ユビキチン活性化酵素(E1)と26Sプロテアソームが必須であることを、条件致死変異体を用いて明らかにした。この結果はG0期生存維持にはユビキチン依存的タンパク質分解が大きく寄与することを示唆する。この結果をふまえて平成18年度は以下の解析をおこなった。(1)G0期維持に必須なE2・E3酵素同定の試み分裂酵母に存在するE2酵素(ユビキチン共役酵素)の遺伝子破壊株・条件致死変異株を用いて、G0期長期生存に必要なE2酵素を同定することを試みた。G0期での生存維持に寄与するものに関しては、エピトープ・タギング株を作成し、免疫共沈タンパク質の同定や細胞内局在の観察などに必要な準備をおこなった。(2)G0期でプロテアソーム機能欠損が引き起こす異常蛍光顕微鏡や電子顕微鏡を用いて、プロテソーム条件致死変異株のG0期における表現型を観察した。細胞増殖期におけるプロテアソーム欠損との違いに特に注目して観察した。また、質量分析機をもちいて、G0期におけるプロテアソームの基質を同定する試みを開始した。(3)分裂酵母G0期で使用できる遺伝子発現制御システムの導入分裂酵母でもっとも一般的に使用されるnmt1プロモーターを用いた遺伝子発現制御システムは、G0期においてはnmt1プロモーターが不活性化されるために、本研究においては使用が難しい。そのため、シロイヌナズナで開発されたステロイドホルモン受容体を用いた発現制御システムの分裂酵母への導入を進めた。