hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体レーザー維持プラズマの高効率化機構の解明と宇宙推進機への応用

本年度は,レーザー維持プラズマ(LSP)の生成条件を緩和させるために,シード材としてキセノンガスを利用したLSPの生成を試みた.その結果,キセノンガスをシード材に用いることで,キセノン・水素,キセノン・アルゴンLSP生成に成功した.LSPの生成閾値は,キセノンガス単体では圧力と共に単調に減少するのに対し,キセノン混合ガスでは圧力に対して最小値を持つように変化することが確認された.そして,LSP生成に必要なキセノンガスの最小の封入圧は,キセノン・水素LSPで40.0%,キセノン・アルゴンLSPで7.7%となり,この結果から推測された比推力は両者とも200 s程度となった.またレーザー光の吸収率は両者とも最大40%程度にまで増加した.次にメタンを用いたレーザー維持プラズマ生成条件を検証した.その結果,メタン単体ではLSPの生成に成功しなかったものの,メタン・キセノンではLSPを生成することができた.また圧力をパラメータとしてその生成しきい値を検証したところ純キセノンより低いことがわかった.これはメタンが解離して生成された炭素原子がレーザー光を吸収しているためだと思われる.次にペニング電離効果を狙ってヘリウム・アルゴンでLSP生成実験を行った.その結果,アーク放電中にレーザーを照射した時は発光領域が大きく広がるのを確認できたがアーク放電を切ると同時にプラズマも消滅した.したがって維持はできなかったがレーザープラズマは生成できていることが確認でき今後の高出力化による検証が期待できる.一方で並行して数値計算コードの構築を行い,二次元軸対称モデルでのアルゴンLSPの生成可能条件を検証した.その結果,CFDでは2MPa以上でのLSP生成が可能であったが,この結果は実験と矛盾(6.5MPaでもLSP生成はできていない)するため,ビーム形状などを検証し直す必要がある.本年度はシード剤効果(キセノン),原子線吸収効果(メタン),ペニング電離効果(ヘリウム)の全てを検証することができた.この結果は従来の1kW級半導体レーザーを用いて行ったものであり,本年度導入が完了した4kW級半導体レーザーを用いた実験での作動条件を決める上で非常に有用なものである.一方,数値計算コードに関して,結果は未だ実験と一致しないものの基盤となるコードの作成は終えており,今後はビーム形状,輻射モデルの再検討などより詳細なモデル化を詰めていく段階である.次年度は導入を終えた4kW級半導体レーザーを用いてLSP生成実験を試みる.まず計算コードの基準となる純アルゴンでの生成を試みる.次にキセノンを用いないメタン及びヘリウム・メタンでの生成条件を検証する.着火方法に関して,従来はアーク放電を用いていたが,宇宙機搭載に向けてより現実的な高周波放電,パルスレーザープラズマを用いた手法を検証する.この際,高速カメラにより着火状況を観察することでLSP生成条件を決めるのは何かを見極める.数値計算モデルはビーム形状をガウシアンから半導体レーザーの楕円に合うよう改良する.また4kW級半導体レーザーによりアルゴンLSPの生成に成功すれば閾値だけではなく,レーザー計測による温度,電子密度測定結果を用いて検証する.本年度は,レーザー維持プラズマ(LSP)の生成条件を緩和させるために,シード材としてキセノンガスを利用したLSPの生成を試みた.その結果,キセノンガスをシード材に用いることで,キセノン・水素,キセノン・アルゴンLSP生成に成功した.LSPの生成閾値は,キセノンガス単体では圧力と共に単調に減少するのに対し,キセノン混合ガスでは圧力に対して最小値を持つように変化することが確認された.そして,LSP生成に必要なキセノンガスの最小の封入圧は,キセノン・水素LSPで40.0%,キセノン・アルゴンLSPで7.7%となり,この結果から推測された比推力は両者とも200 s程度となった.またレーザー光の吸収率は両者とも最大40%程度にまで増加した.次にメタンを用いたレーザー維持プラズマ生成条件を検証した.その結果,メタン単体ではLSPの生成に成功しなかったものの,メタン・キセノンではLSPを生成することができた.また圧力をパラメータとしてその生成しきい値を検証したところ純キセノンより低いことがわかった.これはメタンが解離して生成された炭素原子がレーザー光を吸収しているためだと思われる.次にペニング電離効果を狙ってヘリウム・アルゴンでLSP生成実験を行った.その結果,アーク放電中にレーザーを照射した時は発光領域が大きく広がるのを確認できたがアーク放電を切ると同時にプラズマも消滅した.したがって維持はできなかったがレーザープラズマは生成できていることが確認でき今後の高出力化による検証が期待できる.一方で並行して数値計算コードの構築を行い,二次元軸対称モデルでのアルゴンLSPの生成可能条件を検証した.その結果,CFDでは2MPa以上でのLSP生成が可能であったが,この結果は実験と矛盾(6.5MPaでもLSP生成はできていない)するため,ビーム形状などを検証し直す必要がある.本年度はシード剤効果(キセノン),原子線吸収効果(メタン),ペニング電離効果(ヘリウム)の全てを検証することができた.この結果は従来の1kW級半導体レーザーを用いて行ったものであり,本年度導入が完了した4kW級半導体レーザーを用いた実験での作動条件を決める上で非常に有用なものである.

一方,数値計算コードに関して,結果は未だ実験と一致しないものの基盤となるコードの作成は終えており,今後はビーム形状,輻射モデルの再検討などより詳細なモデル化を詰めていく段階である.次年度は導入を終えた4kW級半導体レーザーを用いてLSP生成実験を試みる.まず計算コードの基準となる純アルゴンでの生成を試みる.次にキセノンを用いないメタン及びヘリウム・メタンでの生成条件を検証する.着火方法に関して,従来はアーク放電を用いていたが,宇宙機搭載に向けてより現実的な高周波放電,パルスレーザープラズマを用いた手法を検証する.この際,高速カメラにより着火状況を観察することでLSP生成条件を決めるのは何かを見極める.数値計算モデルはビーム形状をガウシアンから半導体レーザーの楕円に合うよう改良する.また4kW級半導体レーザーによりアルゴンLSPの生成に成功すれば閾値だけではなく,レーザー計測による温度,電子密度測定結果を用いて検証する.
先進的画像診断・血行動態検査による肺高血圧症の新たな肺循環、右心機能評価法の確立

本研究は先進的画像診断・血行動態検査による肺高血圧症の新たな肺循環、右心機能評価法の確立を目的とする。研究成果として(1)肺高血圧患者において右室自由壁糖代謝の亢進は生命予後と関連することを報告した。また慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者において、バルーン肺動脈形成術は、(2)肺動脈圧と正相関する主肺動脈渦流を減少させ、(3)両心室機能を改善し、更に(4)右心不全に伴う多臓器機能障害を改善することを解明し論文報告した。本研究の目的は、先進的な放射線画像診断および侵襲的血行動態検査を行い右室心筋代謝、右室肺血管力学的特性、肺循環の形態・機能の観点から肺高血圧と右心不全の病態を解明し、肺高血圧症患者の予後改善に寄与することである。研究は脂肪酸シンチとFDG-PETによる右室脂質・糖代謝の評価、圧-流量ワイヤーによる肺動脈インプットインピーダンスの測定、3次元フェーズコントラスト法による肺血流のベクトル解析の3点からなる。研究1に関連し、継続研究を行っている27名の肺動脈性肺高血圧症患者の右室自由壁FGD取込み亢進と長期予後について学会報告を行った。また新たに慢性血栓塞栓性肺高血圧症、特発性肺動脈性肺高血圧症患者の右室自由壁BMIPPとFDGの取込みが亢進が、治療により改善することが認められた。また同時に評価した血中マーカーの検討で、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者には中等度以上の腎機能障害、インシュリン抵抗性が合併しており、肺動脈バルーン形成術によってそれら指標に改善が認められ、更にそれらの改善率と6分間歩行の改善率に有意な相関が示された。研究3では当院放射線科大田助教との共同研究として行われている。7名の肺動脈性肺高血圧症、18名の慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者をリクルートした。MRIの4D flowを行い、主肺動脈内の渦流を評価した。多変量解析では渦流の程度と右心カテの主肺動脈圧との間に有意な相関が認められ、渦流の評価が新たな肺高血圧症のバイオマーカーとなる可能性があった。本研究の目的は、先進的な放射線画像診断および侵襲的血行動態検査を行い、右室心筋代謝、右室肺血管の力学的特性、肺循環の形態・機能の観点から肺高血圧の右心不全の病態を解明し、肺高血圧患者の予後改善に寄与することである。研究は脂肪酸シンチグラムとFDG-PETによる右室脂質・糖代謝の評価、圧流量ワイヤーによる肺動脈インプットインピーダンスの測定、3次元フェーズコントラスト法による肺血流のベクトル解析の3点からなる。研究1に関連し、肺動脈性肺高血圧症と慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者27名の右室自由壁FDG取り込み亢進と予後の悪化が関連していることをEur Heart J Cardiovasc Imaging誌に論文報告した。平24年度、FDG-PETを肺動脈性肺高血圧症患者に18件、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者に28件施行した。BMIPPシンチはそれぞれ19件、21件であった。また慢性肺血栓塞栓性肺高血圧患者では、糖代謝や栄養などの全身代謝障害が存在していることを見出し、米国胸部学会、欧州心臓病学会および米国心臓病学会で報告した。研究3は当院放射線科大田助教との共同研究として行われている。肺動脈バルーン形成術を施行した慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者では、主肺動脈の渦流が縮小したことをEur Heart J誌へ症例報告した。H26年度、MRIによる4D flow解析を、肺動脈性肺高血圧患者20件、慢性血栓塞栓性肺高血圧患者50件、施行した。研究1に関連し、肺動脈性肺高血圧症と慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者27名の右室自由壁FDG取り込み亢進と予後悪化が関連していることをEur Heart J Cardiovasc Imaging誌に論文報告した。平25年度、FDGPETを肺動脈性肺高血圧症患者に18件、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者に28件施行した。また慢性肺血栓塞栓性肺高血圧患者では、糖代謝や栄養などの全身代謝障害が存在していることを見出し、欧州心臓病学会および米国心臓病学会で報告した。平成27年度、それらをまとめ研究代表者建部らがCirculation Journal誌へ論文報告した。PET, BMIPPシンチの解析は現在、進行中でまとまり次第、論文報告の予定である。平成26年度、MRIによる4D flow解析を、肺動脈性肺高血圧患者20件、慢性血栓塞栓性肺高血圧患者50件、施行した。

平成27年度、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者での2DFlow解析を行い、肺動脈バルーン形成術が両心室機能の改善をもたらすことを当科大学院生佐藤らがCirculation Journal誌へ報告した。4D flowは現在、解析中であり、結果をまとめて論文報告の予定である。本研究は先進的画像診断・血行動態検査による肺高血圧症の新たな肺循環、右心機能評価法の確立を目的とする。研究成果として(1)肺高血圧患者において右室自由壁糖代謝の亢進は生命予後と関連することを報告した。また慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者において、バルーン肺動脈形成術は、(2)肺動脈圧と正相関する主肺動脈渦流を減少させ、(3)両心室機能を改善し、更に(4)右心不全に伴う多臓器機能障害を改善することを解明し論文報告した。研究対象となる肺動脈性肺高血圧症、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者は、当研究機関が脳死肺移植の認定施設である大学病院であるため、紹介が多い。肺高血圧症引き続き、積極的に対象患者のリクルート活動を関連施設に働きかける。また学会、研究会、論文作成も積極的に行い、認識を高める努力を行う。紹介された患者に関しては、フォローアップデータの取り忘れないように共同研究者、他科医師、照会先などとの連絡を密にしてゆく。研究対象となる肺動脈性肺高血圧症、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者は、当院が脳死肺移植の認定施設である大学病院であるため、比較的紹介が多い。また左心疾患による肺高血圧症は肺動脈性肺高血圧と比べ頻度が高い。引き続き、対象患者の紹介を関連施設に働きかける。また学会、研究会、論文の発表を積極的に行い、認識を高める努力を行う。紹介された患者に関しては、特にフォローアップデータ取り忘れのないように共同研究者、他科医師、紹介先などとの連絡を密にしてゆく。想定していた学会参加旅費が国内のみとなり、経費が抑えられたため。平成26年度は海外学会への参加を予定しており、平成25年度分と併せて執行を行う予定である。
メンブレンエアレーション法を応用した新しい水処理技術の開発

ガス透過膜内側から外側に付着したバイオフィルムに直接酸素を供給可能なメンブレンエアレーション法を導入し,有機物・窒素・リンの同時除去が可能なSBMBfR(Sequencing Batch Membrane Biofilm Reactor)プロセスの構築を目指した。本プロセスはバイオフィルム内のみで好気環境を創製することが鍵となるため,ガス透過膜上に形成されるバイオフィルム内の活性および生態構造を制御する操作因子を明らかにすることが必要不可欠である。そこで,1次元バイオフィルムモデルを構築し,バイオフィルムの性能を制御することが可能な操作因子の解明を行った。まず,モデルの構築によりバイオフィルム内の酸素およびアンモニアに関する物質移動現象をシミュレートでき,処理性能を容易に予測することが可能となった。また,供給酸素とアンモニアの流束比(J_<O2>/J_<NH4>比)が硝化能を左右する最も重要な因子であり,J_<O2>/J_<NH4>比の制御により安定した硝化能を維持できる可能性を示唆した。以上の検討よりガス透過膜上に固定化した硝化細菌のバイオフィルムをSBMBfRに適用した。約120日間の連続運転において窒素・リンともに安定した除去が行われていることが示唆され,有機物・窒素・リンの平均除去率はそれぞれ97,96,86%に達した。この結果より,SBMBfRを用いることで有機物・窒素・リンを単一槽にて同時除去できることが示された。また,SBMBfR内の各部位における微生物生態分布を追跡した結果,硝化細菌がガス透過膜複合体上に,バルク液中にはリン蓄積能を有する細菌(脱窒性リン蓄積細菌を含む)がそれぞれ維持されていることが明らかになった。以上より,SBMBfR内の環境が異なる部位において異なる機能を有する細菌群が維持され,コンセプト通りに有機物・窒素・リンの除去が進行していることが示唆された。本研究では中空糸膜外側表面に微生物を付着させ,中空糸膜の内側から特定基質を直接供給するメンブレンエアレーション法において処理に寄与する生物膜を多角的に解析し,処理予測が容易で高効率な生物膜の設計手法の提案,および複合汚染の単一槽内除去に対応可能なリアクタの開発を目的としている。中空糸膜の表面改質による微生物付着促進効果の検討本手法を効率的に達成するために中空糸膜に御生物が均一に付着することが重要である。そのために微生物と付着サイトの親和性を高くする必要がある。そこで,ポリエチレン製中空糸膜に放射線を照射し,エポキシ基を有するグリシジルメタクリレートを導入し,微生物と親和性の高い官能基を有するジエチルアミン(DEA)を反応させDEA膜を作成した。この膜を用いることで硝化細菌の中空糸膜への初期付着速度を約10倍高めることに成功した。また,付着促進の要因として中空糸表面の膜電位と表面のラフネスが微生物の付着速度に依存していることを明らかにした。メンブレンエアレーション法の適用性評価中空糸膜表面に付着した微生物群のみが中空糸内側から供給する酸素を利用できれば,生物膜の内側だけ特異的な環境を創製させることが可能となり,複合汚染に対応できる新規なリアクタの実現につながるものと考えられる。硝化反応をモデルとしてこのコンセプトが実現可能かどうか評価した。中空糸膜内側からの酸素供給量(OSR)は空気圧の変化により制御可能であり,硝化速度はOSRに比例することを明らかにした。また,付着生物膜の酸素利用効率はほぼ100%であり,バルク液への溶存酸素のリークが見受けられなかったことから,中空糸膜に付着した生物膜内でバルクと異なる環境が創製され,汚染物が除去されていることを明らかにした。この結果は,本手法を用いることで汚染物質を生物膜内において特異的に分解できるコンセプトの妥当性を示唆している。本研究はガス透過膜外側表面にバイオフィルムを形成させ,その内側から特定基質を直接供給するメンブレンエアレーション法を応用することで,新規水処理プロセスの創成を目的としている。1.微生物の材料表面への付着促進因子の解明本手法を効率的に達成するために,ガス透過膜表面への微生物付着を促進させることが重要である。そこで,放射線グラフト重合法を用いて物理化学性状の異なる様々な材料表面を準備した。各微生物による材料表面への微生物付着試験より,付着に影響を及ぼす最も大きな因子は材料表面の電位であることが明らかになった。さらに,微生物の材料表面への付着速度は材料表面の物理的性状に対して定量的に評価できることが示された。2.微生物固定化のためのストラテジーと水処理プロセスへの応用上述した結果より微生物との付着が促進される物理的性状を有する繊維材料をガス透過膜に被覆し,ガス透過膜-繊維複合体作製した。この複合体を用いることによりバイオフィルム形成が困難であった硝化細菌および独立栄養性脱窒細菌の迅速・簡便な固定化が可能となり,以下の2つのプロセスに応用した。2.1.単一槽内有機物・窒素・リン同時除去システムの開発ガス透過膜-繊維複合体に硝化細菌を固定し,膜内側より酸素を供給することで,複合体部位のみに好気的部位を創製した。この局所環境の創製により,既存のプロセスでは困難であった単一槽内による有機物・窒素・リンの同時除去を可能にするコンセプトの確立に成功した。また,長期運転試験により安定して有機物・窒素・リンを除去できることを実証した。2.2.水素供与型メンブレンバイオフィルムリアクタの開発

水素ガスをガス透過膜から供給し,独立栄養性脱窒細菌を固定化した複合体を用いることで,既存の水素供与型バイオフィルムリアクタを超える硝酸性窒素除去速度を達成し,長期間にわたる安定した除去が可能となった。ガス透過膜内側から外側に付着したバイオフィルムに直接酸素を供給可能なメンブレンエアレーション法を導入し,有機物・窒素・リンの同時除去が可能なSBMBfR(Sequencing Batch Membrane Biofilm Reactor)プロセスの構築を目指した。本プロセスはバイオフィルム内のみで好気環境を創製することが鍵となるため,ガス透過膜上に形成されるバイオフィルム内の活性および生態構造を制御する操作因子を明らかにすることが必要不可欠である。そこで,1次元バイオフィルムモデルを構築し,バイオフィルムの性能を制御することが可能な操作因子の解明を行った。まず,モデルの構築によりバイオフィルム内の酸素およびアンモニアに関する物質移動現象をシミュレートでき,処理性能を容易に予測することが可能となった。また,供給酸素とアンモニアの流束比(J_<O2>/J_<NH4>比)が硝化能を左右する最も重要な因子であり,J_<O2>/J_<NH4>比の制御により安定した硝化能を維持できる可能性を示唆した。以上の検討よりガス透過膜上に固定化した硝化細菌のバイオフィルムをSBMBfRに適用した。約120日間の連続運転において窒素・リンともに安定した除去が行われていることが示唆され,有機物・窒素・リンの平均除去率はそれぞれ97,96,86%に達した。この結果より,SBMBfRを用いることで有機物・窒素・リンを単一槽にて同時除去できることが示された。また,SBMBfR内の各部位における微生物生態分布を追跡した結果,硝化細菌がガス透過膜複合体上に,バルク液中にはリン蓄積能を有する細菌(脱窒性リン蓄積細菌を含む)がそれぞれ維持されていることが明らかになった。以上より,SBMBfR内の環境が異なる部位において異なる機能を有する細菌群が維持され,コンセプト通りに有機物・窒素・リンの除去が進行していることが示唆された。
高次機能蛍光プローブの開発に基づく、メゾスコピック脳機能イメージング手法の確立

脳内の神経ネットワーク内でどのように情報が処理されているのかを明らかにする上で、特定の細胞群における細胞活動を可視化する手法の開発は必須である。本研究では有機小分子蛍光プローブ技術と遺伝子工学技術を組み合わせた研究アプローチに基づいて2つの蛍光可視化手法を開発した。1カルシウムダイナミクスの細胞選択的な可視化手法:レポーター酵素により機能化する蛍光プローブを開発し、細胞選択的にカルシウムダイナミクスを可視化することに成功した。2シナプス小胞放出ダイナミクスに着目した神経活動の可視化手法:細胞選択的に標識可能な酸性pH蛍光プローブを開発し、神経活動を可視化することに成功した。脳における統合的な働きを理解する上で、神経回路においてそれぞれの神経細胞間でどのような時空間パターンで情報が伝達されるのかを解明することが必要である。本研究では新たな蛍光プローブの開発に基づき、従来困難であった神経活動ダイナミクスの可視化を実現する蛍光イメージング手法の開発を目的とした。以下、開発した2つの手法について報告する。1細胞選択的カルシウムダイナミクスの可視化手法:神経活動に付随する細胞内カルシウム濃度変化を可視化することで神経活動を観察可能であるが、多種類の細胞が存在する脳内では蛍光プローブの非特異的染色により細胞選択的なカルシウムダイナミクスの可視化は極めて困難である。本研究では、レポーター酵素として汎用されるβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)による酵素反応を受けることでカルシウムセンサーとして機能化する蛍光プローブを開発した。lacZ発現/非発現細胞に応用したところ、lacZ発現細胞で選択的にカルシウムシグナルの検出に成功し、細胞選択的にカルシウムダイナミクスを可視化できることを実証した。2神経細胞におけるシナプス小胞放出ダイナミクスの可視化手法:神経活動の際に神経伝達物質の放出を担うシナプス小胞放出現象は神経情報伝達の基本機能単位である。本研究ではシナプス小胞放出現象に着目し、そのダイナミクスを可視化する蛍光プローブの開発を行った。開発した蛍光プローブはHaloTagラベル化技術を利用することによりシナプス小胞へのターゲティングを実現した。さらに、培養神経細胞において神経活動に付随するシナプス小胞内のpH変化を蛍光変化として捉えることで神経活動を可視化することに成功した。脳における統合的な働きを理解する上で、個々の神経回路における神経活動の時空間ダイナミクスを解明することが必要である。これまでに磁気共鳴機能画像法(fMRI)によりマクロな脳機能解析が、電気生理学的手法からミクロな神経細胞機能解析が行われているが、そのメゾ(中間的)スケールとなる神経ネットワークにおいて、それぞれの神経細胞間でどのような時空間パターンで情報が伝達されるのか統合的な理解は為されていない。本研究では、複雑な神経ネットワークの中から特定の神経活動を選択的に可視化する基盤技術を確立するため、レポーター酵素として汎用されるlacZ(β-ガラクトシダーゼ)を発現する細胞でのみ神経活動に付随するCa2+シグナルを検出する蛍光プローブの開発を目的とする。平成24年度では、分子内スピロ環化反応および光誘起電子移動現象を利用して蛍光OFF/ON機能を制御する分子設計の下、3種類の蛍光プローブ(Gal-RhoCaシリーズ)を開発した。開発した蛍光プローブのうちGal-RhoCa2およびGal-RhoCa3について、lacZとの酵素反応生成物となるRhoCa2およびRhoCa3がCa2+に応答して蛍光強度が顕著に増大することをin vitroにおいて確認した。さらに、Ca2+応答時により明るい蛍光特性を示したGal-RhoCa3を基に、蛍光プローブの細胞応用のためアセトキシメチル(AM)化を施したGal-RhoCa3, AMを開発した。本蛍光プローブを培養細胞へと応用した結果、lacZを発現する細胞で選択的にCa2+シグナルの可視化に成功した。これらの結果は、本研究の提案するコンセプトであるlacZ発現細胞における選択的Ca2+シグナル検出が可能であることを実証するものである。平成24年度の研究目標としていた高次機能蛍光プローブの開発に成功した。具体的には、当初の計画通り、研究提案時に分子設計していた蛍光プローブGal-RhoCa1を全17ステップで合成し、in vitroにおける蛍光特性を評価した。しかしながら、本蛍光プローブのCa2+に対する応答特性が望ましくなかったため、実験結果を分子設計にフィードバックし、蛍光団とCa2+キレーターをつなぐリンカー部位を改変した。その結果、β-ガラクトシダーゼとの反応後にCa2+に対して感度良く応答するGal-RhoCa3の開発に成功した。さらに、開発した蛍光プローブを用いて、平成25年度の研究計画としていた蛍光プローブのlacZ細胞応用についても一部前倒しして実行し、目標としていたlacZ発現細胞において選択的にCa2+シグナルを検出することに成功した。

以上のように、現在までの達成度として平成24年度および平成25年度の一部の研究目標を達成し、本研究の最終目標である「特定の神経細胞群における神経活動を選択的に可視化する基盤技術の確立」に向けて順調に研究を遂行している状況である。平成24年度における研究目標を順調に達成したため、平成25年度は当初の研究計画通り、開発した蛍光プローブを神経実験系へと応用し、神経ネットワークにおける特定の神経活動の可視化・解析を行う計画である。この際、研究を円滑に推進していくため、平成24年度に前倒しして取得した実験結果を利用しつつ、蛍光プローブをin vitro実験系から培養細胞実験系、脳スライス実験系へと段階的に複雑な実験系へと応用して評価を行うことで、目的とする蛍光イメージングを達成する上での技術的な問題点を順次洗い出して解決を図る計画である。平成25年度の研究費の使用について以下のように計画している。神経細胞や脳スライスなどを用いた生物学実験を行うため、細胞や実験動物を購入し(300千円)、それに付随して、培養・飼育などに関連する試薬や器具を購入する計画である(200千円)。特に、実験動物に関しては、初代培養神経細胞を取得するため通常マウスを購入する他、研究計画に盛り込んでいるin uteroエレクトロポレーション実験を円滑に行うため高価な妊娠マウスを定期的に購入する計画である。また、培養細胞や動物を用いた実験評価系を構築する上で、いくつかの発現ベクターの作製やトランスフェクションなどが必要であるため、分子生物学・生化学実験の試薬の購入を計画している(300千円)。さらに、蛍光イメージング実験では、阻害実験や染色実験に用いる試薬などの支出を計画している(200千円)。また、実験に使用する蛍光プローブの合成、また、必要に応じて蛍光プローブの改良を行うため、合成試薬や有機溶媒、ガラス器具なども購入する計画である(300千円)。特に合成試薬に関しては、パラジウム触媒など一部高価な試薬も含まれる。その他には、研究成果発表のための学会参加旅費(200千円)、論文投稿に際する英文校閲費(100千円)の支出を計画している。
生薬由来がん浸潤阻害分子標的治療薬の開発

歯周炎罹患歯肉から、コラーゲンゲル三次元培養するとコラーゲンを極度に分解する歯周炎関連線維芽細胞(PAF)を分離した。この線維芽細胞を口腔がん細胞の浸潤モデルに使用したところその浸潤を顕著に促進したため、「生体外口腔がん浸潤モデル」を確立することができた。このモデルを用いてスクリーニングを行ったところ、延べ60種類の生薬の中から、オウゴン等15種類の生薬に口腔がん浸潤阻害効果が認められた。さらに、口腔がん細胞の浸潤開始時と浸潤期の浸潤モデルをマイクロアレイ解析した結果、浸潤には細胞外マトリックスタンパク関連遺伝子が中心的な役割を果たすことが示唆された。がんによる死亡は、浸潤・転移によるものが約9割を占めるということから、安全かつ有効な浸潤阻害薬が求められている。口腔癌もその例外ではなく、浸潤・転移が起こり、その好発部位は肺であることがわかっている。申請者らは予備実験として、生体外がん浸潤モデルを用い、安全性が確立されている生薬の浸潤阻害効果を調べたところ、ある種の生薬に顕著な阻害効果があることを見出した。そこで、入手可能な生薬すべてを用いてスクリーニングを行い、癌細胞の浸潤を阻害する生薬をリストアップし、その作用機序を分子レベルで解明し、最終的には口腔癌細胞の浸潤を阻害する生薬のライブラリーを構築することを目的とした。将来的には、他のがんにもこの手法が応用できると考えている。本年度は、口腔がんの研究によく用いられている口腔扁平上皮がん(Ca9-22)および舌がん(HSC-3)の株細胞を用いて、3次元培養法により、がん細胞の違いによる浸潤に差があるかを検討した。3次元培養ゲル中に播種するアグレッシブ線維芽細胞を数種類試し、がん細胞を高度に浸潤させるアグレッシブ線維芽細胞を見い出せたことにより、「口腔がん浸潤モデル」が確立できた。このモデルを用い、熱水またはメタノール抽出の生薬延べ60種類をゲルに作用させ、浸潤阻害作用を検討した。スクリーニングの結果、扁平上皮がんおよび舌がんの両方に浸潤抑制効果が認められた。歯周炎罹患歯肉から、コラーゲンゲル三次元培養すると口腔癌細胞の浸潤を顕著に促進するアグレッシブ線維芽細胞を分離し、「生体外口腔癌浸潤モデル」を確立した。オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウ、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンズコン、サンソウニン等の33種類の生薬から、熱水またはメタノール抽出を行い、凍結乾燥した成分を生薬のサンプルとして、口腔がん浸潤阻害効果のある生薬をスクリーニングした。実験に用いた細胞は口腔扁平上皮癌(Ca9-22)および舌癌(HSC-3)で、浸潤阻害の程度は三次元培養ゲルからHE標本を作製し、浸潤細胞数を計数してコントロールとの比率により評価した。用いた線維芽細胞や癌細胞の違い、また生薬の抽出法の違いで結果は異なったが、概ね顕著な浸潤阻害効果がみられたのは、オウゴン、ケイヒ、オンジ、サンソウニン、シャクヤクであった。また用いた生薬の中には、浸潤を却って促進したものもあった。さらに、経日的にゲルからRNAを抽出し、マイクロアレイ解析によって浸潤に関与する候補遺伝子を検索したところ、cancer-associated fibroblasts(CAFs)で高発現が報告されている30種類の遺伝子が発現上昇していた。このことはアグレッシブ線維芽細胞とCAFsとの類似性を示唆していると考えられる。また、以下達成度の項で述べるとおり、アグレッシブ線維芽細胞のCAGEデータ解析により、アグレッシブ線維芽細胞の成り立ちが解明できる可能性が出てきたことから、口腔癌細胞の浸潤阻害に有効な生薬をスクリーニングするための手段として活用できる可能性がある。このモデルを用いて、延べ60種類の生薬のスクリーニングを行ったところ、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ボウフウ、エンゴザク、オウレン、オンジ、ケイガイ、ゲンチアナ末、ゴシユ、サンショウ、センコツに口腔癌浸潤阻害効果が認められた。この口腔癌浸潤モデルは、歯周炎罹患歯肉から得られた歯周炎関連線維芽細胞を用いることを特徴としており、口腔癌の浸潤と歯周炎の進展に共通項が見出せる可能性がある。そこで、この口腔癌を顕著に浸潤させる歯周炎関連線維芽細胞の成り立ちを解明することが先決と考えた。幸いにも理研FANTOM5プロジェクトにおいてこの歯周炎関連線維芽細胞が解析対象となり、健常歯肉線維芽細胞と歯周炎関連線維芽細胞のCAGEデータを比較した結果、ある遺伝子の転写開始点に顕著な差があることが判明し、歯周炎関連線維芽細胞は特殊な歯肉線維芽細胞であることが示唆された(投稿準備中)。また、癌浸潤モデルを用い、口腔癌細胞の浸潤開始時と浸潤増悪期のコラーゲンゲルからRNAを回収し、GeneChip解析を行った結果、浸潤に関与する遺伝子として、CENPF, TOP2A, FMOD, PLK1, CCNB2, VCANなど、既知、未知を含む多く遺伝子発現の変化がみられた。

またGO解析の結果、浸潤に関与するのは、糖鎖が付加した細胞外マトリックスタンパクとその受容体分子が中心的な役割を果たすことが示唆された。これらの歯周炎関連線維芽細胞による浸潤促進能のある細胞外マトリックス産生を生薬によってコントロールできれば、がん浸潤阻害剤として臨床応用できる可能性もある。同時に歯周炎罹患歯肉で見つかった歯周炎関連線維芽細胞が、口腔がんの浸潤にも関与していることが示唆された。歯周炎罹患歯肉から、コラーゲンゲル三次元培養するとコラーゲンを極度に分解する歯周炎関連線維芽細胞(PAF)を分離した。この線維芽細胞を口腔がん細胞の浸潤モデルに使用したところその浸潤を顕著に促進したため、「生体外口腔がん浸潤モデル」を確立することができた。このモデルを用いてスクリーニングを行ったところ、延べ60種類の生薬の中から、オウゴン等15種類の生薬に口腔がん浸潤阻害効果が認められた。さらに、口腔がん細胞の浸潤開始時と浸潤期の浸潤モデルをマイクロアレイ解析した結果、浸潤には細胞外マトリックスタンパク関連遺伝子が中心的な役割を果たすことが示唆された。理研FANTOM5プロジェクトに研究分担者の大島が参画しており、浸潤を顕著に促進するアグレッシブ線維芽細胞のCAGE解析を依頼していた(Forrest AR et al., Nature 507, 462-70)。このデータベースから、東大呼吸器内科・堀江先生の協力を得て解析を進めたところ、ある重要な遺伝子に関して、アグレッシブ線維芽細胞に特異的なプロモーターの使用状況が明らかになった(特許申請中で公開前につき、遺伝子名は伏す)。さらに、この遺伝子のプロモーター別PCR用primerの設計が成功したことにより、アグレッシブ線維芽細胞かノーマル線維芽細胞かを、二次元培養細胞を用いたRT-qPCRで判別する方法を確立することができた。現在この遺伝子とその上流の遺伝子に対するmiRNA transfectionによるRNAi実験を行っており、transfectできた細胞が得られ次第、口腔がん浸潤モデルを用いた実験を始めることになっている。これがうまくいけば、口腔がん細胞の浸潤を促進するアグレッシブ線維芽細胞の原因候補遺伝子が判明することになり、腫瘍間質をターゲットにした、新しい口腔がん治療法が開発できると考えている。また、浸潤を阻害する生薬のスクリーニングがRT-qPCRで行うことができるようになり、生薬ごとに三次元培養で2週間かかっていたその有効性の判定が、わずか数日で行うことが可能となった。細胞生物学前述したとおり、アグレッシブ線維芽細胞による口腔がん細胞浸潤促進遺伝子が明らかとなれば、その遺伝子発現を調節する生薬をRT-qPCRで迅速にスクリーニングできるようになる。今後は、全ての生薬を二次元培養したアグレッシブ線維芽細胞に作用させ、浸潤促進遺伝子の発現を調節できたものをリストアップし、三次元培養でも浸潤を阻害するかどうかを確認する。この方法で、RT-qPCRによるスクリーニングの有効性が証明できれば、生薬のみならずさまざまな浸潤阻害薬の候補を短期間でスクリーニングできることになり、腫瘍間質をターゲットにした新規口腔がん治療法開発に対する貢献は非常に大きなものとなるであろう。3次元培養法を用い、複数の口腔がん細胞株と複数のアグレッシブ線維芽細胞の組み合わせでスクリーニングし、口腔がん浸潤モデル作製のための有効な組み合わせを見いだすことができた。
細胞間接着分子CEAおよびBGPの大腸腺管形成における役割と癌化に伴う異常

Carcinoembryonic antigen(CEA)はin vitroでホモフィリックな細胞間接着分子として機能することが明らかにされているが、生体内における機能は不明である。本研究班は大腸腺管形成のin vitroモデルを用いてCEAおよびCEAファミリーの腺管形成過程における細胞間接着分子としての機能、生体内における意義を明らかにすることを目的とした。まず、放射線照射コラーゲンを用いることにより、コラーゲンゲル内での三次元細胞培養系を確立した。手術時に得られた正常乳腺および乳癌組織による検討から、培養初期正常乳腺はCEAを産生しないが、培養中に細胞内および培養液中にCEAを産生し、同時に腺管形成が認められた。一方、乳癌組織では高分化型乳癌組織がCEAを大量に産生し、腺管形成が認められた。当初、大腸組織を用いてコラーゲンゲル内での腺管形成モデルの作成を試みたが、混入する腸内細菌の影響があり、培養系の確立は困難であった。そこで、大腸組織と同様にCEAを産生していると予想される乳腺および乳癌組織を用いて培養系の確立をめざした。その結果、コラーゲンゲル内での腺管形成を観察しうる培養系を確立することができた。さらに、分化能を保持して培養可能なヒト大腸癌細胞株CaCo-2を用いた実験においても腺管形成を認めている。最近、CEAおよびBGP(CEAファミリー)のtransfectantを用いてコラーゲンゲル内での培養も可能となり、腺管形成におけるCEAおよびBGPの機能を分子生物学的手法で解析できる可能性がでてきた。
神経回路網からみた分裂病の認知障害に対する非定型抗精神病薬の作用機序に関する研究

統合失調症の認知障害は、患者の社会機能に深刻な影響を及ぼすため、その病態生理の理解と治療メカニズムの解明が求められる。本研究では、認知障害の責任部位として、内側前頭前野に焦点を絞り、ラットを用いて検討してきた。その結果、以下の知見を得た。1)ヒトに統合失調症ときわめて類似した精神症状や認知障害を惹起するphencyclidineをラットに投与すると、内側前頭前野でグルタミン酸放出が亢進し、移所運動が増加する。これらの変化は、5-HT2A受容体遮断能を有する薬物やclozapine投与によって阻止できる。2)内側前頭前野にグルタミン酸系ニューロンを投射している背内側視床を神経化学的に破壊すると、phencyclidineと同様にNMDA受容体遮断能を有するMK-801による内側前頭前野でのグルタミン酸放出の程度や移所運動の亢進が惹起される。3)Olanzapineを慢性投与するとラットの内側前頭前野でのdopamine D1受容体のタンパク発現量が増加し、同時に放射状迷路を用いた作業能力の亢進がみられる。以上より、分裂病の認知障害と密接に関連する前頭前野でのNMDA受容体機能低下に関連するグルタミン酸放出の亢進やdopamine D1受容体機能の低下を修正しうる非定型抗精神病薬が、この認知障害を改善する可能性がある。非定型抗精神病薬のうちでも、NMDA受容体機能を促進する効果を有するとされるclozapineやolanzapineが、分裂病の認知障害を改善する可能性が示唆される。内側前頭前野は統合失調症の認知機能障害の責任部位の1うど考えられる。Phencyclidine (PCP)精神病では、統合失調症類似の陽性症状、陰性症状および認知機能障害が認められることから、PCP精神病は統合失調症の有用な病態モデルである。PCPが内側前頭前野での興奮性アミノ酸伝達に与える影響と、この神経伝達の変化へ非定型抗精神病薬であるclozapineの効果を検討し、以下の結果を得た。1.PCPの腹腔内投与は内側前頭前野での細胞外グルタミン酸濃度の急峻な増加を惹起した。2.この急峻なグルタミン酸濃度の増加とPCPによる移所運動増加という異常行動には相関が認められた。3.PCPによる細胞外グルタミン酸濃度の急峻な増加はclozapineにより阻止された。4.clozapineの腹腔内投与により、内側前頭前野で、細胞外グルタミン酸濃度は遅発性に増加し、この遅発性グルタミン酸濃度の増加は、ドパミンD1受容体遮断薬であるSCH23390あるいはNMDA受容体遮断薬であるCPPの同部位の局所灌流により阻止された。PCPによるグルタミン酸濃度の急峻な増加は、GABAニューロン上のNMDA受容体遮断を介していることを考えると、clozapineはNMDA受容体機能を亢進させることで、PCPによるグルタミン酸濃度増加を阻止した可能性がある。ドパミン仮説のみでは説明不能な統合失調症の病態を説明するNMDA受容体機能低下仮説がある。Clozapineは、NMDA受容体機能亢進作用により、ドパミン受容体遮断を主作用とする定型抗精神病薬で改善不十分な病態に影響する可能性がある。Clozapineによる内側前頭前野で遅発性のグルタミン酸濃度の増加は、NMDA受容体刺激及びD1受容体刺激の結果である可能性がある。D2型dopamine受容体遮断能を主作用とする定型抗精神病薬に対して治療抵抗性を示す統合失調症に対して非定型抗精神病薬の代表であるclozapineが有効であり、その作用メカニズムの検討は、新たな作用メカニズムを有する抗精神病薬の開発と、治療抵抗性の病態理解に有益である。NMDA受容体の機能低下は、この治療抵抗性の病態メカニズムの1つと想定されている。我々は、NMDA受容体遮断能を主作用の1つとするPhencyclidineを用いて以下の結果を得た。

Phencyclidineを実験動物に投与した際に生じる移所運動量の増加などの異常行動と、この異常行動の基盤と考えられる内側前頭前野でのグルタミン酸濃度の増加が、D4型dopamine受容体および5-HT2A受容体遮断能を有する新規物質NRA0045により抑制されたが、選択的D4型dopamine受容体遮断作用を有するNRA0160ではこのような抑制効果は得られなかった。Clozapineは、phencyclidineによって誘発される異常行動とその基盤と考えられる内側前頭前野でのグルタミン酸濃度の増加を抑制する。Phencyclidineによる内側前頭前野でのグルタミン酸濃度の増加は、同部位でのNMDA受容体刺激により阻止された。D1型dopamine受容体刺激のみでは,phencyclidineによるグルタミン酸濃度の増加は、かえって増強された。D1受容体とNMDA受容体を同時刺激すると、D1受容体刺激は、NMDA受容体刺激による上記阻止効果を促進した。以上より、clozapineはD1受容体刺激とNMDA受容体刺激の相互作用を介して、phencyclidineによる内側前頭前野での細胞外グルタミン酸濃度の上昇を阻止することで、異常行動抑制作用を発揮している可能性がある。統合失調症の認知障害の責任部位の1つとされる内側前頭前野は、背内側視床からグルタミン酸性ニューロンの投射を受けている。背内側視床の機能を低下させると内側前頭前野と関連した作業記憶が障害されることが、動物実験により示されている。我々は、背内側視床をイボテン酸を用いてexocitotoxicに破壊し、この破壊が、D2ドパミン受容体遮断薬反応性のモデルとされる覚醒剤による異常行動と、D2遮断薬抵抗性のモデルとされるNMDA受容体遮断薬による異常行動に与える影響を検討した。背内側視床破壊動物では、対照群と比較して、覚醒剤による移所運動などの異常行動には変化がないが、NMDA遮断薬であるMK-801による異常行動が増強した。MK-801による異常行動増強の際には、内側前頭前野からグルタミン酸ニューロンの投射を受けている側坐核でのグルタミン酸濃度の増加が亢進していた。MK-801による移所運動惹起の責任部位は、内側前頭前野であるとの報告から、背内側視床の障害は、統合失調症患者における前頭前野の機能障害に関与している可能性が示唆される。
色彩画像における黒みの感性的役割とその心理物理学的定量化

「見た目の黒」すなわち「知覚的黒み」を研究対象として,色彩画像における知覚的黒みの程度とその画像がもたらす感性的印象の関係を明らかにすることを大きな目的とし,色彩画像における特定の黒領域の輝度とその周辺輝度の輝度コントラストと知覚的黒みの程度の関係について調査・検討を行った.心理物理学実験の結果に基づいて,輝度コントラストと知覚的黒みの関係式を導出し,「知覚的黒み」の心理物理的尺度を構築した.「見た目の黒」すなわち「知覚的黒み」を研究対象として,色彩画像における知覚的黒みの程度とその画像がもたらす感性的印象の関係を明らかにすることを大きな目的とし,色彩画像における特定の黒領域の輝度とその周辺輝度の輝度コントラストと知覚的黒みの程度の関係について調査・検討を行った.心理物理学実験の結果に基づいて,輝度コントラストと知覚的黒みの関係式を導出し,「知覚的黒み」の心理物理的尺度を構築した.色彩画像における黒みの深さや強さは,見た目の印象や迫力感への重要な要因と言われている.色彩画像における黒みの物理的な特性は,画素のRGB値とそのディスプレイの表示可能な最低輝度に依存する.従って,RGB値およびディスプレイ輝度と黒みの視覚的認識や見た目の印象との関係を明らかにすることは,芸術的な画像においては特に重要な問題である.本研究では,上記の関係性を調査するために,以下の2つの実験を行った.実験1は,観測者が黒い表面を「黒」として知覚し始めるRGB値と,観測者が同じ領域を「深みのある黒」と知覚するRGB値について調査した.実験2は,画像内の黒い物体表面のRGB値を,灰色から深い黒まで変化させ,各々の画像についてSD法(Semantic Differential method)による主観評価を行い,因子分析により共通因子を抽出した.両実験共に,美術教育科と工学部の2つの学生群を被験者とし,結果を比較検討した.実験1の結果では、「黒らしい黒」と認識させるには原画像よりRGB値を下げる必要がある画像があった.実験2では黒み評価において,「上質軸」「雰囲気軸」「質感軸」が抽出された.画像内の物体表面の黒みが増すとその感性的評価が上がる形容詞対と,原画像の方が評価の高い形容詞対があることが確認された.また工学系学生群の結果と美術系学生群の結果を比較したところ,黒みの変化に伴う評価の変動は同様の傾向を示していたが,「上質軸」と「雰囲気軸」については美術系学生群の方が,「質感軸」については工学部学生群が,より明瞭な主観評価を行うことが示唆された.本研究により,電子色彩画像における黒みの持つ感性的役割について,ディスプレイの物理特性や画素情報との定量的関係に基づいた解明への可能性が示された.色彩画像における黒みの深さや強さは,見た目の印象や迫力感への重要な要因と言われており、対象領域を単純に黒であると認識させるだけでなく,鑑賞者に対象の持つ零囲気や芸術的価値を伝えうる黒の再現力が求められている。色彩画像における黒みの物理的な特性は,画素のRGB値とそのディスプレイの表示可能な最低輝度に依存する。従って,RGB値およびディスプレイ輝度と黒みの視覚的認識や見た自の印象との関係を明らかにすることは,芸術的な画像においては特に重要な問題である。本研究は、色彩画像における画像工学的・測色学的な値と黒み知覚や画像全体の感性的評価の関係性を明らかにするために,以下の4つの実験を行った。平成19年度は実験1と実験2を実施した。実験1では,観測者が黒い表面を「黒」として知覚し始めるRGB値と,観測者が同じ領域を「深みのある黒」と知覚するRGB値についで調査した、実験2では,雫SD法(Semantic Differenti method)により実験画像を主観的に評価させ因子分析を行った結果、「上質軸」「雰囲気軸」「質感軸」が抽出できた。平成20年度は実験3と実験4を実施した。実験3では,明るい周辺視野に囲まれた暗い中心視野の黒みを「明るい灰」から「深い黒」まで6段階で観測者に主観評価させ、単純な形状での黒みと中心一周辺輝度対比の関係を調査した。この実験のために製作した周辺輝度と中心輝度を独立に制御できる装置を黒みマッチングボックスと呼ぶ。実験4では国立西洋美術館所蔵の絵画10点を刺激とし、画中の黒領域の黒みと実験3で用いた黒みマッチングボックスで適宜設定した視野を被験者に提示し、強制二者選択法によりどちらがより黒いか判断させて、黒みが等しい輝度対比を調査した。
薬剤圧変遷に伴うクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫選択淘汰の集団遺伝学的検討

マラウイではクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の著増により1993年クロロキンの投与が全面的に中止された.その後本研究者らが行った追跡調査により、クロロキン感受性の回復、および耐性原虫の著減と周辺諸国に比して有意に低いpfcrt K76T変異率が明らかになった.本研究では事象:「選択因子のない環境下における変異原虫の淘汰」につき、分子生物学的および集団遺伝学的手法を用いて検証した.パプアニューギニアの患者から得られたサンプルを用いて、以前よりクロロキン耐性との関連が示唆されているpfmdr1遺伝子変異の役割について探索を行った.結果、pfmdr1のN86Y、F184Yいずれの変異もクロロキン耐性能獲得と関連していなかった.また、これらの変異はpfcrtK76T変異原虫におけるクロロキン耐性レベル増強効果も起こさなかった.以上よりこれらの変異がクロロキン耐性メカニズムに直接関与している可能性は否定された.しかし、pfcrtK76Tとpfmdr1N86Yの間に強い連鎖不平衡が見られ、pfmdr1N86Yは、K76T変異原虫の生存にとって不都合なcostを代償するような働きをしていることが推察された.クロロキン圧消失後におけるK76T変異率の減少のメカニズムとして、仮説1:「K76T変異原虫の相対適応度が野生型に比して低下している」仮説2:「耐性原虫の76位にback mutationが起こった」を立て、その検証を行った.結果、マラウイにおいてはback mutationを起こした原虫は見られず、K76T変異原虫は野生型原虫に比べ、0.76と著明に低いrelative fitnessを示していた.強力なクロロキン圧により選択されたK76T変異原虫は、クロロキン中止により淘汰されていったと推察された.選択と淘汰は集団遺伝学の基本原則である.本研究では、流行地域におけるクロロキン投与中止によるその感受性の回復という公衆衛生学上重要な事象に対し、基礎的研究により解明を試みた.この知見が流行地における抗マラリア薬休薬を応用した治療戦略構築に応用されることが期待される.マラウイではクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の著増により1993年クロロキンの投与が全面的に中止された.その後本研究者らが行った追跡調査により、クロロキン感受性の回復、および耐性原虫の著減と周辺諸国に比して有意に低いpfcrt K76T変異率が明らかになった.本研究では事象:「選択因子のない環境下における変異原虫の淘汰」につき、分子生物学的および集団遺伝学的手法を用いて検証した.パプアニューギニアの患者から得られたサンプルを用いて、以前よりクロロキン耐性との関連が示唆されているpfmdr1遺伝子変異の役割について探索を行った.結果、pfmdr1のN86Y、F184Yいずれの変異もクロロキン耐性能獲得と関連していなかった.また、これらの変異はpfcrtK76T変異原虫におけるクロロキン耐性レベル増強効果も起こさなかった.以上よりこれらの変異がクロロキン耐性メカニズムに直接関与している可能性は否定された.しかし、pfcrtK76Tとpfmdr1N86Yの間に強い連鎖不平衡が見られ、pfmdr1N86Yは、K76T変異原虫の生存にとって不都合なcostを代償するような働きをしていることが推察された.クロロキン圧消失後におけるK76T変異率の減少のメカニズムとして、仮説1:「K76T変異原虫の相対適応度が野生型に比して低下している」仮説2:「耐性原虫の76位にback mutationが起こった」を立て、その検証を行った.結果、マラウイにおいてはback mutationを起こした原虫は見られず、K76T変異原虫は野生型原虫に比べ、0.76と著明に低いrelative fitnessを示していた.強力なクロロキン圧により選択されたK76T変異原虫は、クロロキン中止により淘汰されていったと推察された.選択と淘汰は集団遺伝学の基本原則である.本研究では、流行地域におけるクロロキン投与中止によるその感受性の回復という公衆衛生学上重要な事象に対し、基礎的研究により解明を試みた.この知見が流行地における抗マラリア薬休薬を応用した治療戦略構築に応用されることが期待される.クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の蔓延はマラリア対策上大きな問題となっているが、クロロキンは安全性および経済性などの点から今なお重要な抗マラリア薬である.1999年Wellemsらは原虫第7染色体上にpfcrt遺伝子を発見した。76位リジンからトレオニンへの置換(K76T)は、培養原虫だけでなく、流行地におけるフィールドサンプルにおいても、クロロキン耐性能獲得とほぼ完全に相関していることが報告されている.アフリカ東部のマラウイ国は、1980年代後半からのクロロキン耐性原虫の著明な増加(80%)により1993年クロロキン使用を全面的に中止した世界で初めての国である。

我々は、クロロキン薬剤圧の消失が薬理効果あるいは当地における熱帯熱マラリア原虫集団にあたえた影響を検討するため、サリマ地区において1998および2000年クロロキン薬剤耐性試験を実施、耐性原虫およびK76T変異率(9%)の有意な減少を明らかにした(Mita et al. Am J Trop Med Hyg 2003).本年度我々は、当地においてK76T変異原虫の減少を起こしたメカニズムとして、二つの作業仮説(A, B)を立て、これらを検証した.(A)「pfcrt76位におけるback mutation」によるK76T変異原虫の減少(B)「K76野生型原虫の相対的増加」によるK76T変異原虫の減少マラウイにおけるクロロキン感受性の回復は、フィールドにおける強力なクロロキン圧下で選択された耐性原虫が、クロロキン圧の消失により原虫集団から淘汰されたためと考えられる。耐性能を獲得した原虫は、その一方でなんらかのcostを負うことになったのではないか。クロロキンという選択因子のない環境下では、そのcostにより、耐性原虫の相対的減少をきたした可能性が高い。マラウイではクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の著増により1993年クロロキンの投与が全面的に中止された.その後本研究者らが行った追跡調査により、クロロキン感受性の回復、および耐性原虫の著減と周辺諸国に比して有意に低いpfcrt K76T変異率が明らかになった.本研究では事象:「選択因子のない環境下における変異原虫の淘汰」につき、分子生物学的および集団遺伝学的手法を用いて検証した.パプアニューギニアの患者から得られたサンプルを用いて、以前よりクロロキン耐性との関連が示唆されているpfmdr1遺伝子変異の役割について探索を行った.結果、pfmdr1のN86Y、F184Yいずれの変異もクロロキン耐性能獲得と関連していなかった.また、これらの変異はpfcrtK76T変異原虫におけるクロロキン耐性レベル増強効果も起こさなかった.以上よりこれらの変異がクロロキン耐性メカニズムに直接関与している可能性は否定された.しかし、pfcrtK76Tとpfmdr1N86Yの間に強い連鎖不平衡が見られ、pfmdr1N86Yは、K76T変異原虫の生存にとって不都合なcostを代償するような働きをしていることが推察された.クロロキン圧消失後におけるK76T変異率の減少のメカニズムとして、仮説1:「K76T変異原虫の相対適応度が野生型に比して低下している」仮説2:「耐性原虫の76位にback mutationが起こった」を立て、その検証を行った.結果、マラウイにおいてはback mutationを起こした原虫は見られず、K76T変異原虫は野生型原虫に比べ、0.76と著明に低いrelative fitnessを示していた.強力なクロロキン圧により選択されたK76T変異原虫は、クロロキン中止により淘汰されていったと推察された.選択と淘汰は集団遺伝学の基本原則である.本研究では、流行地域におけるクロロキン投与中止によるその感受性の回復という公衆衛生学上重要な事象に対し、基礎的研究により解明を試みた.この知見が流行地における抗マラリア薬休薬を応用した治療戦略構築に応用されることが期待される.