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光学活性有機ケイ素反応剤の固相合成と不斉合成への応用

近年の有機合成化学における光学活性有機化合物ライブラリーの迅速合成に対する需要の急速な高まりに応える,新しい合成化学手法の開発を目指し,固相合成試薬に代表される,ライブラリー構築の鍵中間体として機能する合成中間体・反応剤の開発を行った。以下にその成果を列挙する。(1)ポリスチレン担持光学活性アリルシランを,光学活性アリルアルコールを出発原料とする分子内ビスシリル化反応により固相合成すると共に,各種求電子剤との反応が立体選択的に進行し,光学活性アルコール類や光学活性環状エーテルを効率よく与えることを見出した。(2)シリルボランが遷移金属触媒存在下において様々な不飽和有機化合物に付加することを見出し,特に末端アレンに対するシリルホウ素化反応においては,光学活性配位子を用いることで不斉付加反応がエナンチオ面選択的に進行し,光学活性β-ボリルアリルシランが得られることを見出した。(3)シアノボランが遷移金属触媒の存在下でアセチレンに付加し,β-ボリルアクリロニトリル類の効率的合成法となることを見出した。(4)アミノボラン類が新しいイミニウムイオン発生剤として機能し,非酸性条件下におけるアルデヒドに対する様々なアミノ化C-C結合形成反応を進行させることを明らかにした。(5)光学活性有機パラジウム錯体を開始剤とする1,2-ジイソシアノベンゼン類のリビング重合が高いらせん方向選択性で進行することを見出し,有機パラジウム錯体の構造最適化を行って,最終的にほぼ純粋な片巻きらせんポリマーを選択的に合成する手法を確立した。これらの成果はいずれも,近い将来の有機合成における重要な方法論となることが予想される固相不斉合成の,基礎を築く重要な知見である。光学活性アリルシラン化合物の固相合成を行い、光学活性ホモアリルアルコール類及び、環状不飽和エーテル類の不斉合成への利用について研究を行った。最近本研究グループによってその合成法を確立された固相担持クロロジシランに対し、(R)-4-フェニル-3-ブテン-2-オールや(R)-3-デセン-2-オール等の光学活性アリルアルコールを塩基存在下反応させて、固相担持ジシラニルエーテルを得た。この化合物に対し、イソニトリル-パラジウム触媒存在下で分子内ビスシリル化を行って得られた混合物をブチルリチウムで処理することで、固相担持アリルシランが得られた。この固相担持アリルシランのエナンチオマー過剰率は、アルデヒドとの反応で得られたホモアリルアルコール誘導体の光学純度を定量することにより行った。いずれの光学活性アリルアルコールから得られたアリルシランも、-78°Cにおける脂肪族アルデヒドとの反応において、極めて高い光学純度を有するホモアリルアルコール生成物を与えた。このことから、光学活性アリルシランの生成過程において、出発アリルアルコールの光学純度がほぼ保たれることが明らかとなった。この方法を用いて、(R)-6-テトラヒドロピラニルオキシ-3-ヘキセン-2-オールの誘導化を行ったビスシリル化-ブチルリチウム処理を経て得られる光学活性アリルシランを酸処理することにより、末端に水酸基を有する光学活性アリルシランを得た。この化合物に対しトリメチルシリルトリフラート存在下でアルデヒドを反応させると、3,4-二置換-5-オキサシクロヘプテン誘導体が6070%の収率で得られた。いずれの生成物も出発アリルアルコールの光学純度を98%以上保っており、末端に水酸基を有するアリルシランが効率的に固相合成されていることのみならず、環化反応にも応用できることが示された。固相担持型官能性光学活性アリルシラン反応剤の合成をめざし、プロキラル不飽和有機化合物へのシリルボランの不斉付加反応、すなわち不斉シリルホウ素化の可能性について検討を行った。

中でも、合成化学的に有用なβ-ボリルアリルシランを与えるプロキラル不飽和有機化合物として末端アレンを選び、シリルボランの不斉付加反応について検討した。まず、ホウ素上に様々な光学活性置換基を有するシリルボランを合成し、5-フェニル-1,2-ペンタジエンとの反応を行った。トリフェニルホスフィンを配位子とするパラジウム触媒の存在下で反応を行ったところ、いずれのシリルボランを用いた反応においても末端アレンの二つの二重結合のうち内部二重結合でのみ付加反応が進行し、ホウ素上の光学活性置換基がピナンジオキシ基の時に62%d.e.の最も高い立体選択性が認められた。そこで、トリフェニルホスフィンに代えて様々な光学活性単座配位子を用いて、ピナンジオキシ基を有するシリルボランと5-フェニル-1,2-ペンタジエンとの反応を行った。その結果、2-ジフェニルホスフィノ-1,1'-ビナフチルを用いた反応で、89%d.e.の最も高い立体選択性が得られた。以上の検討から明らかとなった最適条件を用いて、種々の末端アレンに対する不斉シリルホウ素化反応の立体選択性について検討した。アレン上の置換基をメチル基から2-フェニルエチル基、シクロヘキシル基と嵩高くするに従い、立体選択性は86%から96%d.e.にまで向上した。また、芳香族置換基を有するアレンに対する付加反応も概ね92%程度の立体選択性で進行したことから、今回見いだしたアレンの不斉面選択的シリルホウ素化反応は、多くの末端アレンに適用可能な汎用性の高いものであることがわかった。不斉合成において有用反応剤として機能し,高分子担持剤に固定可能な新規有機ケイ素反応剤の創製を目指して新しい触媒反応の開発を行った。まず,光学活性β-ボリルアリルシランの効率的不斉合成を目的に,アレン類のパラジウム触媒シリルホウ素化を検討した。平成15年度の報告において,ホウ素上にキラル補助基を有するシリルボランによるアレンのシリルホウ素化が,光学活性ホスフィン配位子を有するパラジウム触媒を用いる二重不斉誘起の条件下,高いジアステレオ選択性で進行することを報告した。今回アキラルなシリルボランによる不斉シリルホウ素化を検討し,光学活性配位子の構造最適化を行うことにより,ピナコールシリルボランの反応とアレンの反応が最高で90%eeの不斉収率で進行することを見出した。反応の不斉収率はアレンの置換基のかさ高さに依存し,よりかさ高い置換基を有するアレンがより高い不斉収率を与えた。一方,より複雑な有機化合物の不斉合成に対応した反応開発も行った。特に,2重結合のα位に不斉点を有する末端アレンのシリルホウ素化反応について検討し,その立体選択性について明らかにした。例えばα位にアルコキシ基を有する1置換アレンの反応を二重不斉誘起条件下行うと,α位の絶対配置にかかわらずシリルホウ素化は一定の不斉面から選択的に進行した。matched pairにおいては立体選択性は96%d.e.以上に達し,特筆すべきことにmismatched pairにおいても8490%de程度に達した。このことは,不斉シリルホウ素化の立体選択性が試薬制御で行われていることを示しており,分子内に存在する不斉中心の立体配置にかかわらず望みの立体異性体を自由に合成できる可能性を示している。
消化器がん患者の手術後健康関連QOL低下に対する早期回復支援プログラムの開発

消化器がん患者の術後健康関連QOL維持は、がん再発率や生存率に関連する重要なクリニカルアウトカムとして世界的に指摘されている。予備研究において周術期消化器がん患者は、術後経過良好でも術後に健康関連QOLが低下していることが明らかとなったが、低下要因を検証した報告が無く、包括的に評価し分析する必要を考えた。本研究では、多施設共同で周術期消化器がん患者を手術前から在宅復帰後まで縦断的に身体面や機能面、心理面、社会面を評価し、術後早期に発生する健康関連QOL低下の低下要因を明らかする。これにより日本人消化器がん患者の術後健康関連QOL低下に対する早期回復支援プログラムの開発につなげることを目指す。
高速分離に基づくタンパク質の特異的な高感度検出法の開発

平成18年度は、先に報告した磁性粒子による特定タンパク質捕捉方法をキャピラリーゲル電気泳動法に適用した。タンパク質をキャピラリーゲル電気泳動で分離するためには、タンパク質をSDSにより変性させる必要がある。また、SDS存在下で、抗原抗体反応が起こるかどうかを明らかにしなければならない。そこでSDSにより変性させたタンパク質混合試料を、SDS存在下で抗体固定化磁性粒子と反応させ、抗原抗体反応が起こるかどうかについて検討した。変性タンパク質混合試料を、カルボニックアンヒドラーゼ(CA)の抗体を固定化した磁性粒子と反応させ、電気泳動を行ったところ、CAのピーク面積のみが減少した。このことから、SDS存在下においても、変性タンパク質は抗体と反応することがわかった。さらに、キャピラリーに二つの検出窓を設け、その間に抗体を固定化した磁性粒子を磁石により保持して、キャピラリーゲル電気泳動を行った。キャピラリーゲル電気泳動により三種のタンパク質混合試料を分離した結果、一点目の検出部では三つのピークが観測されたが、二点目の検出部ではひとつのピークが消失し、ふたつのピークのみが観測された。一点目の検出で得られた各ピークのマーカーに対する相対移動度を計算したところ、相対移動度と分子量の対数の関係には良好な直線関係が得られた。また、二点目で検出されたふたつのタンパク質の相対移動度の値を一点目で得られた結果と比較すると、消失したピークがCAであると同定できた。この結果は、タンパク質混合試料中のCAと磁性粒子の抗CAが特異的に反応して、CAのみが粒子上に捕捉されたことを示す。したがって、本手法は、ウエスタンブロッティングと同等の結果を迅速に獲得できるものであり、今後の発展が期待される。本研究ではキャピラリー電気泳動法を利用し、様々な共存物を含む試料中の目的タンパク質を短時間で分離し、特異的かつ高感度に検出できる新しい手法を開発する。この方法を実現するために、キャピラリーに二つの検出窓を設け、その間に抗体を固定化した磁性粒子を磁石により保持して、電気泳動を行った。抗体ウサギIgGを固定化した磁性粒子をキャピラリー内に保持し、ウサギIgGを試料として電気泳動を行ったところ、1点目の検出部で検出されたウサギIgGは磁性粒子重点部分を通過する際に、磁性粒子と結合し、2点目の検出部では検出されないことがわかった。そこでさらに、抗カルボニックアンヒドラーゼを固定化した磁性粒子をキャピラリー内に充填し、カルボニックアンヒドラーゼとラクトアルブミンを含む混合試料を電気泳動により分離した。このとき、1点目の検出部ではカルボニックアンヒドラーゼとラクトアルブミンは二つのピークとして観測することができた。一方、磁性粒子充填部を通過した後の2点目の検出部では、カルボニックアンヒドラーゼのピークは完全に消失し、ラクトアルブミンのピークのみが検出された。この結果はカルボニックアンヒドラーゼが充填された磁性粒子上の抗体と特異的に反応して補足されたのに対し、ラクトアルブミンは抗体とは反応せず磁性粒子充填部を通過したものと考えられる。この結果はキャピラリー電気泳動により、ウエスタンブロッティングと類似した結果を得ることが可能であることを示す。また、本手法によれば、電気泳動の分離過程において、特定のタンパク質のみを特異的に補足することが可能であることがわかった。本手法は電気泳動図から目的タンパク質を同定できるだけでなく、磁性粒子を回収することで、補足されたタンパク質を二次分析に利用できる可能性があり、今後の発展が期待できる。さらにゲル電気泳動と組み合わせた手法について、現在検討中である。
キラル分子の不斉全合成

複雑な不斉構造を有するキラル分子の完全立体選択的合成法の確立は、現代精密有機合成化学が果すべき最重要課題の一つであり、重点領域研究「キラル分子の不斉合成」の第4班「キラル分子の不斉全合成」は、この目的のため平成57年度の3年間、合成研究がなされた。本研究で合成されたキラル分子は多様で数多くの不斉中心、官能基を持った複雑な化学構造を有する機能性化合物で有用性も高く化学合成が強く期待されているものである。研究内容は、1)生体機能制御化合物、2)化学信号化合物、3)薬理・生理活性化合物、4)超微量天然有機化合物の4つに分けられ、それぞれで大きな成果があった。具体的には、プロスタサイクリン、プロスタグランジン類の新合成法の確立、多様なフェロモンの不斉合成と絶対配置の決定、理論計算を活用したエンジイン系化合物の合成とDNA切断活性の測定、シガトキシンのハプテン合成、タキソ-ル中間体の合成、テトラサイクリンの不斉合成、海洋産マクロリド類ではアプリロニンAの全合成の完成、テダノリドのラクトン環の合成、ハリコンドリンB中間体の合成、ヒグロリジン合成の完成などが主な成果としてあげることができ、極めてレベルの高い合成研究といえる。複雑な不斉構造を有するキラル分子の完全立体選択的合成法の確立は、現代精密有機合成化学が果すべき最重要課題の一つである。本研究で合成されるキラル分子は多様で数多くの不斉中心、官能基を持った複雑な化学構造を有する機能性化合物で有用性も高く化学合成が強く期待されているものである。具体的には、プロスタサイクリン類の合成ではベンゾカルバサイクリンおよび3-オキサ誘導体の合成、フェロモン合成ではチャバネゴキブリその他の集合フェロモンの合成、エンジイン系化合物の合成では理論計算を活用した抗がん制ダイナミシンアナログの合成、シガトキシンハプテン合成ではシガトキシンの絶対配置の決定とAB環に対するハプテン合成、海洋産マクロリド合成では抗腫瘍性アプリロニンAの全合成の最終段階にあり、ポリエーテルマクロリド合成ではハリコンドリンBの32個の不斉中心の構築が完了した。以上のように当初の計画により進んだ成果をえることができた。複雑な不斉構造を有するキラル分子の完全立体選択的合成法の確立は、現代精密有機合成化学が果すべき最重要課題の一つであり、重点領域研究「キラル分子の不斉合成」の第4班「キラル分子の不斉全合成」は、この目的のため平成5年度から発足した。2年目の平成6年度本研究で合成されたキラル分子は多様で数多くの不斉中心、官能基を持った複雑な化学構造を有する機能性化合物で有用性も高く化学合成が強く期待されているものである。具体的には、プロスタサイクリン、プロスタグランジン類の新合成法の開発、フェロモン合成では集合フェロモンなどの合成による作用とキラリテイの関係の解明、エンジイン系化合物の合成では理論計算を活用した抗がん制ダイナミシンアナログの合成、シガトキシンハプテン合成ではモデルハプテン合成、海洋産マクロリド合成では抗腫瘍性アプリロニンAの全合成の完成、ポリエーテルマクロリド合成ではハリコンドリンBの4つのフラグメントの合成が完了した。3年目の最終年の平成7年度、本研究で合成されたキラル分子は多様で数多くの不斉中心、官能基を持った複雑な化学構造を有する機能性化合物で有用性も高く化学合成が強く期待されているものである。

研究内容は、1)生体機能制御化合物、2)化学信号化合物、3)薬理・生理活性化合物、4)超微量天然有機化合物の4つに分けられ、それぞれで大きな成果があった。具体的には、プロスタサイクリン類の新合成法の確立、多様なフェロモンの不斉合成と絶対配置の決定、理論計算を活用したエンジイン系化合物の合成とDNA切断活性の測定、タキソ-ル中間体の合成、テトラサイクリンの不斉合成、海洋産マクロリド類ではアプリロニンAの全合成の完成、テダノリドのラクトン環の合成、ハリコンドリンB中間体の合成などが主な成果としてあげることができ、極めてレベルの高い合成研究といえる。
リン脂質代謝遺伝子の構造と機能

ホスファチジルコリンは生体膜の形成にあずかり、真核生物の種々の生理機能に深くかかわっている。その生合成がどのように調節されているかを明らかにするため、酵母とラット肝臓を材料に用いてホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路とCDPコリン経路の構造遺伝子の構造と機能、発現調節の研究を行ない、次のような成果を得た。1.酵母ホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路の構造遺伝子PEM1、PEM2の機能と発現調節。本経路の酵素は遺伝子PEM1、PEM2によってコ-ドされている。これらの遺伝子の機能と生理的役割を明らかにするため、それぞれの遺伝子座位の破壊を行ない、得られた変異株のメチル化能を調べた。その結果PEM1のコ-ドする酵素は1段目のメチル化に特異的であるのに対して、PEM2酵素はより広い特異性を示し2段目、3段目のメチル化に対して強い活性を示すことが明らかになった。つぎにPEM1、PEM2遺伝子はともにイノシト-ルとコリンにより抑制を受けるので共通の転写調節を受けていると考え、PEM1、PEM2遺伝伝子の発現調節領域の決定を行なった。その結果、両遺伝子の5'上流域に共通して存在する特定の塩基配列がこれらの遺伝子の発現と調節に重要な役割を果たしていることがわかった。その配列はPEM1遺伝子の場合にはオクタマ-配列CATRTGAAの繰り返しであり、PEM2遺伝子の場合にはCATRTGAAとGRFI結合部位の組み合わせであると同定された。酵母抽出液の中にこれらの配列に特異的に結合する蛋白質が同定された。2.ラットコリンキナ-ゼcDNAのクロ-ニング。コリンキナ-ゼはCDPコリン経路の初発酵素でいろいろな条件下に変動する。コリンキナ-ゼ遺伝子の発現調節を明らかにするために、酵素の精製、抗体の作成、およびcDNAクロ-ニングを行なった。ラット脳から15000倍の精製を行ない、均一な酵素標品を得た。酵素は44kDaのサブユニット2個から成るホモダイマ-であった。抗体を作成し、ラット肝臓のλ11cDNAライブラリ-からコリンキナ-ゼcDNAクロ-ンを得た。得られたcDNAを発見ベクタ-に挿入して大腸菌に導入したところコリンキナ-ゼ活性が発現した。構造解析の結果酵母コリンキナ-ゼ遺伝子との間に有意のホモロジ-が見出された。本年度はその生合成を行なうホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路とCDPコリン経路がどのように調節されているのかを知るため、本経路の構造遺伝子の構造と機能、発現の調節の解析を行なった。1.酵母ホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路の構造遺伝子PEM

1、PEM2の機能と発現の調節。本経路の酵素は遺伝子PEM1、PEM2によってコ-ドされている。既にこれらの遺伝子のクロ-ニングと構造解析は終わっているので、今回はこれらの遺伝子の機能と生理的役割を明らかにするため、それぞれの遺伝子座位の破壊を行ない、得られた変異株のメチル化能を調べた。その結果PEM1のコ-ドする酵素は1段目のメチル化に特異的であるのに対して、PEM2酵素はより広い特異性を示し2段目、3段目のメチル化に対して強い活性を示すことが明らかになった。つぎにPEM1、PEM2遺伝子は転写調節を受けると考えられるので、それぞれの遺伝子の発現調節領域の決定を行なった。その結果、5'上流域に存在する特定の塩基配列が重要な役割を果たしていることがわかった。その配列はPEM1遺伝子の場合にはオクタマ-配列CATRTGAAの繰り返しであり、PEM2遺伝子の場合にはCATRTGAAとGRFI結合部位の組み合わせであると同定された。酵母抽出液の中にこれらの配列に結合する蛋白が同定された。2.ラットコリンキナ-ゼcDNAのクロ-ニング。コリンキナ-ゼはCDPコリン経路の初発酵素でいろいろな条件下に変動する。コリンキナ-ゼ遺伝子の発現調節を明らかにするために、酵素の精製、抗体の作成、およびcDNAクロ-ニングを行なった。ラット脳から15000倍の精製を行ない、均一な酵素標品を得た。酵素は44kDaのサブユニット2個から成るホモダイマ-であった。抗体を作成し、λ11cDNAライブラリ-から対応するcDNAクロ-ンを得た。構造解析の結果酵母コリンキナ-ゼ遺伝子との間に有意のホモロジ-が見出された。ホスファチジルコリンは生体膜の形成にあずかり、真核生物の種々の生理機能に深くかかわっている。本年度はその生合成がどのように調節されているかを明らかにするため、酵母とラット肝臓を材料に用い、ホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路とCDPコリン経路の酵素遺伝子の発現機構の研究を行ない次のような成果を得た。1.<酵母ホスファチジルエタノ-ルアミンメチル化経路の構造遺伝子PEM1、PEM2の発現の調節>___ー。これらの遺伝子はともにイノシト-ルとコリンによって同じように調節されている。これは両遺伝子の転写が共通の機構によって制御されているためであると考え、両遺伝子の上流域の解析を行なった。その結果、5'上流域に存在する特定の塩基配列がPEM1、PEM2の発現と調節に重要な役割を果たしていることがわかった。その配列はPEM1遺伝子の場合にはオクタマ-配列CATRTGAAの繰り返しであり、PEM2遺伝子の場合にはCATRTGAAとGRF1結合部位の組み合わせであると同定された。酵母抽出液の中にこれらの配列に特異的に結合する蛋白質を同定した。2.<ラットコリンキナ-ゼcDNAのクロ-ニング>___ー。コリンキナ-ゼ遺伝子の発現調節を明らかにするために、コリンキナ-ゼのcDNAクロ-ニングを行なった。
細胞溶解毒素インターメディリシンの膜結合部位を用いた細胞膜機能の改変技術

交付期間内において、インターメディリシン(ILY)とその近縁毒素の分子モデリングを行い、ILYの細胞膜結合部位の特定に重要となるILY構造情報を得た。この情報に基づいてILY細胞膜結合ドメイン4(ILY4D)の部分ペプチド(9-15mer)を多数合成してその競合阻害性を検討し、またILYと近縁毒素のキメラ体を作成してヒト細胞特異的結合に必要な最小構造の検討を行った結果、ILY4D後半56残基中(ただし11アミン酸領域は除く)に結合部位があることを特定した。しかし膜認識にはILY4Dの立体構造が必要で、その短鎖部分ペプチドやILY4DのC末56残基発現体は十分な結合親和性を示さず、細胞膜結合モジュールとしての利用は不適であった。一方、サイズは大きくなるが、ILY4Dの完全な構造を持つILY4D発現体及び分子内にSS結合を導入して立体構造を固定化した無毒性ILY全長組換え体(ILY-SS)の各N末端に架橋アンカー(Cys残基)を導入した細胞膜結合モジュールの作成を試み、2種類の長さのスペーサーを持つILY4D及びILY-SSモジュールの調製に成功した。ILY4D細胞膜結合モジュールを胎児性癌抗原特異抗体(抗CEA-Ab)の(Fab')2断片と連結した細胞膜結合型抗CEA-Ab分子とし、これを結合したヒト赤血球をCEA陽性癌細胞に作用させると赤血球が安定かつ高効率で癌細胞に特異的に結合することが確認された。従ってこれらの分子は活性化免疫細胞を用いた癌のミサイル免疫細胞療法に応用可能と考えられた。またILY-SSモジュールも同様に細胞膜改変技術に有用であることが示唆された。さらに両モジュールのN末端に望む蛋白質を融合蛋白質として発現できるベクターシステムも開発した。今後、これらを用いた癌の細胞ミサイル免疫療法や遺伝子治療用DDSの開発が期待される。インターメディリシン(ILY)のドメイン4(ILY-4D)の立体構造を、パーフリンゴリシンOの結晶構造を基にモデリングし、その分子形状を分析した。先ず分子の長軸端にある11mer領域ランダムループと、同族毒素に比べてILYに特徴的なC末端の突出ペプチド部分に変異あるいは欠失を導入した変異体を作成し、そのヒト赤血球溶血活性を比較した。11mer領域変異体の場合、活性低下が見られたが、3カ所もの変異を導入しても一桁程度の活性低下に止まっていることから、ここがヒト細胞膜のILY受容体との結合部位では無いことが考えられた。一方、C末端の3アミノ酸欠失変異体は活性が3桁以上も低く、また結合量も著しく低下していた。従ってこの領域がILYの細胞膜への結合に重要な箇所の一つであることが示唆された。次にILY4D外層部に位置する配列を持つペプチド9種類を合成し、ILYのヒト溶血活性におけるこれらの競合阻害性を検討した。11mer領域ペプチドは全く競合阻害を示さず、変異体での解析を裏付ける結果となった。C末端ペプチド及びそのペプチドと同一分子面に局在する3ペプチド共存下で活性を調べた結果、意外にも全く競合阻害活性が見られなかった。変異体での解析結果も考慮すると、C末端ペプチドはここ以外の構造と共同してILY受容体と相互作用している可能性も考えられた。さらにC末端ペプチドと逆分子面に局在する4種のペプチドについても同様に調べたところ、11mer領域ペプチドのN末端側に隣接するペプチドのみが低濃度で溶血活性を強く阻害した。またさらにそれと隣接したペプチドも弱いものの阻害活性を示した。

以上の結果を総合すると、C末端ペプチドと逆分子面の11mer領域のN末端側に隣接したペプチド近傍がILY受容体との結合に重要な箇所であり、C末端ペプチドもその結合に補助的な働きをしている可能性が考えられた。本年度は先ず、スペーサーを導入したインターメディリシン(ILY)の無毒性細胞膜結合ドメイン4(ILY4D)を細胞膜結合モジュールとして利用し、抗胎児性癌抗原(CEA)特異抗体とILY4Dの架橋体を結合した細胞をCEA陽性癌細胞に標的化できることを示した(論文印刷中)。また昨年ILY4D部分構造ペプチドによる活性阻害試験で反応阻害性ペプチドの同定に成功したが、その構造だけでは細胞膜への十分な結合親和性が認められず、より高次の構造がILY受容体との高親和性結合に必要な可能性が示唆された。そこで本年度はより高次構造が自然に近い実験系として、ILY(ヒト特異性有り)とストレプトリシンO(SLO)やニューモリシン(PLY)(ヒト特異性無し)のキメラ体を作成し、ILY4DのどこがILY受容体結合サイトかを検討した。その結果、ILY4DのC末端側56アミノ酸を持つPLYキメラ体において元来PLYにないヒト特異的活性が確認され、この領域内に受容体結合サイトが含まれることが確認された。この領域中の、SLOやPLY等のSLOファミリー毒素ではコレステロール結合部位と考えられるC末近傍のundecapeptide領域に相当する部位のILY配列をヒト特異性のないSLOやPLYと同じ配列に置換すると、コレステロール感受性を伴って他の動物細胞にも反応するようになった。しかしそこを特異的に化学修飾するとコレステロール感受性やヒト以外の動物での溶血活性が激減し、再度ヒト特異的活性を示すようになった。また同領域をILYの配列に置換したSLO変異体ではヒト特異性は見られなかった。従ってこの領域を除くC末端側56アミノ酸領域にILY受容体結合サイトがある可能性が強く示唆され(論文投稿中)、この結果と今後の結合領域構造の解析に基づいて細胞膜結合モジュールとして利用するILY4Dのサイズダウンを検討する予定である。これまでの結果として、インターメディリシン(ILY)活性に競合阻害性を示すILYの細胞膜結合ドメイン4(ILY4D)の部分構造ペプチド(9-15mer)についてヒト細胞膜との結合性を検討したところ、短鎖部分構造だけでは細胞膜に十分な親和性を示さず細胞膜結合モジュールとしての利用は不適であること、またILYのヒト細胞特異的結合部位であるILY4D後半56アミノ酸残基部分もそれだけでも立体構造に異常が生じて十分な親和性が得られないことが判明した。そこで本年度は、ILY分子内のドメイン2及び3の空間的に近接したアミノ酸各一残基をCysに置換して強制的にSS結合を形成させてILYの毒素活性を導く立体構造変化が起きなくし、昨年度開発したILY4Dの部分組換え体と同様に無毒性になると想定されるILY全長組換え体(ILY-SS)を細胞膜結合モジュールとして作成を試みた。その結果、細胞膜へはILY同様に高親和性で結合するものの、ヒト血漿中などの通常の体内条件では全く細胞毒性を示さない事、及びその分子N末端に導入したもう一残基のCys残基をアンカー部位として他の分子と連結させて細胞膜に様々な物質を安定的に固定できることが確認された。従ってこのILY-SS分子はILY4Dと同様に活性化リンパ球やマクロファージを用いた癌のミサイル免疫療法に応用可能と考えられた。
雰囲気の研究とそのEdTechへの応用

「教育は雰囲気と勢いが勝負」といわれほど,雰囲気が重要である.従来は雰囲気に対する工学的な研究が十分とは言い難く,雰囲気を定量的に測定し評価する技術すら十分ではなかった.そこで本研究ではまず,雰囲気を定量的に表現する手法(雰囲気メトリクス)の研究に取り組み,雰囲気を工学的に扱う指標を構築する.その上で,学生の身体に装着するセンサーから集めるデータや,学生が発する言葉から集めるデータを使って,場の雰囲気を推定する技術を開発する.さらに,推定した雰囲気に応じて学生に的確な指示を自動的に与えることにより,雰囲気を改善して学習効果がアップするシステムの開発に取り組む.「教育は雰囲気と勢いが勝負」といわれほど,雰囲気が重要である.従来は雰囲気に対する工学的な研究が十分とは言い難く,雰囲気を定量的に測定し評価する技術すら十分ではなかった.そこで本研究ではまず,雰囲気を定量的に表現する手法(雰囲気メトリクス)の研究に取り組み,雰囲気を工学的に扱う指標を構築する.その上で,学生の身体に装着するセンサーから集めるデータや,学生が発する言葉から集めるデータを使って,場の雰囲気を推定する技術を開発する.さらに,推定した雰囲気に応じて学生に的確な指示を自動的に与えることにより,雰囲気を改善して学習効果がアップするシステムの開発に取り組む.
大脳皮質神経回路の生後発達に関わるメカニズムの解明

大脳皮質神経回路の生後発達過程を解析する為、脳梁ー皮質神経細胞間の興奮性シナプス伝達の生後発達変化に着目した。生後2-17日齢のC57BL6マウス脳梁膨大後部皮質(retrosplenial cortex)から冠状断切片を作成し、神経細胞からWhole-cell recordingを行った。脳梁膨大後部皮質の様々な層の神経細胞からパッチクランプ記録を行い、電気生理学的な性質の解析を進めた。その結果、皮質II層と、V-VI層に錐体細胞様の電気生理学的特性を示す神経細胞が存在することが分かった。また皮質III-IV層には、バースト状の発火特性を示す神経細胞が存在することが分かった。さらに、脳梁に設置した刺激電極から電気刺激を行い、各層に存在する神経細胞に誘発される興奮性シナプス伝達を解析した。皮質III-IV層の神経細胞には、脳梁刺激で興奮性シナプス応答は誘発されなかった。皮質VーVI層の錐体細胞において刺激強度に応じたステップ状のシナプス応答を比較的安定に誘発できることが分かったため、生後日齢を変えて入力線維数の生後発達変化を解析した。その結果、一つのV-VI層錐体細胞に入力する脳梁線維の本数は発達の過程で徐々に増加することが分かった。その後、入力線維の数が若干減少する時期が見られた。この結果は、retrosplenial cortexV-VI層錐体細胞では、一旦過剰に作られたシナプスが刈り込まれる可能性を示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。大脳皮質神経回路の生後発達過程を解析する為、脳梁ー皮質神経細胞間の興奮性シナプス伝達に注目し、実験系の確立を試みた。脳スライス作成に適した領域を探索した結果、脳梁膨大後部皮質から冠状断スライスを切り出すと入力線維が保存されやすいことが分かった。脳梁膨大後部皮質の様々な層の神経細胞からパッチクランプ記録を行い、電気生理学的な性質から神経細胞の同定を進めた。同時に、興奮性シナプス伝達を誘発して生後発達過程の解析に適した細胞を探索した結果、皮質VーVI層の錐体細胞が比較的安定してシナプス応答を誘発でき、解析に適していることが分かった。昨年度の解析により、大脳皮質シナプス発達の解析が可能な脳スライス実験系の候補として、脳梁膨大後部皮質が適していることが分かった。また脳梁からの入力線維を調べた予備実験より、特に皮質第V層の錐体細胞の入力線維については生後発達の解析が可能であるという結果を得た。ほぼ実験系としては固まってきており、計画は順調に進行していると思われる。昨年度までの解析を推し進め、本来の目的である脳梁ー大脳皮質線維の生後発達変化について主に電気生理学的な手法を用いて解析を行う。脳梁膨大後部皮質については細胞特性についても不明な点が多い為、皮質神経細胞の電気生理学的な性質の同定も同時に進める。
考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションとこれを活用した景観考古学の刷新

本研究の目的は、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションとこれを活用した景観考古学の刷新である。この目的を達成するため、1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション、2)3次元ドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究、3)デジタルドキュメンテーションデータの公開と活用という重要な課題3点を柱とする研究を計画し、遂行した。1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションは、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションの手法を確立して、考古学だけでなく文化遺産学、文化財科学にも幅広く貢献するものである。2)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究の刷新は、取得した3次元デジタルドキュメンテーションデータに加えて、これまでの発掘調査・測量調査・地中物理探査・古環境調査などの成果や、航空写真・衛星画像・古地図などの資料をGIS(使用ソフトはArcGIS)を用いて統合し、遺跡の景観復元を行うものである。3)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション手法の伝達と成果の還元は、本研究で開発する3次元デジタルドキュメンテーションの方法を、調査や研究発表を通じて研究協力機関に伝達する。また、申請者が大学の講義で実践してきた安価な機材を用いた簡易な方法も伝えて、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションの普及と資料の蓄積に寄与するものである。研究は,当初の計画通り,これまでの調査で研究体制を整えてきた久米島グスク遺跡(日本)・ダブシア遺跡(ウズベキスタン共和国)・石人など石造物とこれに伴う遺構・遺跡(モンゴル国)を対象に実施した。これに加え、研究の進行に従い研究成果の発信を行ったところ、新たに協力者を得て,日本国内の複数の遺跡や文化遺産を対象に実施した。所属機関や受入研究者、および調査フィールドの研究協力者・研究協力機関の多大なる尽力を得て、当初の計画より充実した研究を遂行することができた。研究期間3年のうちに、日本・モンゴル国・ウズベキスタン共和国の3力国数地点でそれぞれに意義ある調査を実施できたことは非常に評価できる。また申請者の研究を知り、新たな取り組みの構想に取り入れようとする機関も現れた。これらの調査研究によって、本年度に計画していた研究は十分に達成できたと考えている。研究成果の未発表の部分については、引き続き国内外での発表を積極的に行う予定である。本研究課題は、十分な成果を挙げることができた。しかし、さらなる研究の深化のためには、今後も継続的に調査研究を展開する必要がある。また、本研究が対象とした考古資料を含む文化遺産全体での中で、本研究のような取り組みを実行する必要性を痛感した。そこで、その対応策として、平成26年度に開始する日本学術振興会科学研究費助成事業若手研究(B)に申請した。この申請が採択されたならば、さらに研究を深化させることができると考える。(1)本研究の目的は,考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションとこれを活用した景観考古学の刷新である。このため,研究実施計画には,1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション,2)3次元ドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究,3)デジタルドキュメンテーションデータの公開と活用という3つの柱を設けている。調査地は,久米島グスク遺跡(日本)・ダブシア遺跡(ウズベキスタン共和国シルクロード都市遺跡)・モンゴル国の石造物などの文化遺産である。(2)本年度の調査は,8月にモンゴル国で,9月にはウズベキスタン共和国で,2012年2月には沖縄県久米島で実施した。8月のモンゴル国アラシャーン・ハダ遺跡の調査では、モンゴル国文化遺産センターならびに同志社大学文化遺産情報科学研究センターと報告者の共同研究プロジェクトの下、報告者は遺跡の地形測量と,岩壁画のデジタル写真測量および位置情報付き高解像度パノラマ撮影を実施し,旧石器時代から継続して営まれた遺跡の景観の記録を実施した。また,奈良大学千田嘉博教授が代表である同国チン・トルゴイ城趾の発掘調査に参加し,検出された門跡および関連する遺構のデジタルドキュメンテーションを実施した。9月のウズベキスタン共和国ダブシア遺跡の調査では,ウズベキスタン共和国科学アカデミー考古学研究所と国際日本文化研究センター宇野隆夫教授の共同研究プロジェクトに同行し,報告者は発掘調査と位置情報付き高解像度パノラマ撮影を実施し,シルクロード都市遺跡のデジタルドキュメンテーションを実施した。2012年2月に実施した沖縄県久米島の調査では,久米島で多量に出土する青磁・白磁・褐釉陶器・染付などいわゆる貿易陶磁器を対象に,3Dレーザー計測を試行した。また,久米島内に分布するグスクを踏査し,位置情報を取得するとともに,相互の視認関係を確認した。(3)本年度の研究成果は,学会誌や学会発表などを通して公表している。また,本研究では比較的容易に導入できる調査方法も提案しているので,国内外・隣接学問領域の研究者らにも応用可能な点でも意義がある。本研究は、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションとこれを活用した景観考古学の刷新を目指す。そのための具体的な方策として、1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション、2)3次元ドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究、3)デジタルドキュメンテーションデータの公開と活用を遂行している。当初の現地調査の計画は、これまで研究体制を整えてきた久米島グスク遺跡(日本)、ダブシア遺跡(ウズベキスタン共和国)および岩画や石造物とこれに伴う遺構・遺跡(モンゴル国)を中心に研究を行うことであった。しかし研究を進めるうち、奈良県天理市の西山古墳、宮城県松島町の雄島や福井県勝山市の国史跡

平泉寺旧境内そして岐阜県下呂市など、国内での調査を充実させる機会を得たので積極的に参画し、資料と実践の蓄積を重ねている。初年度は、当初の年次計画通り、現地調査に注力し資料が蓄積した。したがって2012年度は、2011年度に得た資料をGISデータ化し解析することに注力しつつ、およそ研究計画の通り現地調査を継続した。2012年9月はウズベキスタン共和国に渡航し、シルクロード都市遺跡ダブシア遺跡の発掘調査および出土遺物の3次元レーザー計測を実施した。2013年3月は沖縄県久米島で調査を実施し、古琉球時代に盛行したグスクの景観記録や出土遺物と民俗文化財の3次元レーザー計測をおこなった。グスクの景観記録はGPSと高解像度パノラマ撮影を用いた。現在、この手法で得た資料とGISによる可視領域分析との比較検討を通じた新たな眺望分析手法を検討している。モンゴル国での調査は、現地調査は実施しなかったが2012年までに実施した調査成果をまとめ、複数の学会で発表した。本研究の目的は、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションとこれを活用した景観考古学の刷新である。この目的を達成するため、1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション、2)3次元ドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究、3)デジタルドキュメンテーションデータの公開と活用という重要な課題3点を柱とする研究を計画し、遂行した。1)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションは、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションの手法を確立して、考古学だけでなく文化遺産学、文化財科学にも幅広く貢献するものである。2)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションデータを活用した古景観の考古学的研究の刷新は、取得した3次元デジタルドキュメンテーションデータに加えて、これまでの発掘調査・測量調査・地中物理探査・古環境調査などの成果や、航空写真・衛星画像・古地図などの資料をGIS(使用ソフトはArcGIS)を用いて統合し、遺跡の景観復元を行うものである。3)考古資料の3次元デジタルドキュメンテーション手法の伝達と成果の還元は、本研究で開発する3次元デジタルドキュメンテーションの方法を、調査や研究発表を通じて研究協力機関に伝達する。また、申請者が大学の講義で実践してきた安価な機材を用いた簡易な方法も伝えて、考古資料の3次元デジタルドキュメンテーションの普及と資料の蓄積に寄与するものである。研究は,当初の計画通り,これまでの調査で研究体制を整えてきた久米島グスク遺跡(日本)・ダブシア遺跡(ウズベキスタン共和国)・石人など石造物とこれに伴う遺構・遺跡(モンゴル国)を対象に実施した。これに加え、研究の進行に従い研究成果の発信を行ったところ、新たに協力者を得て,日本国内の複数の遺跡や文化遺産を対象に実施した。受入機関や受入教官の御協力
「食育・食農教育の教育的効果の検証と教育モデルの実証的研究」

本研究の目的は、食育・食農教育の教育的効果の検証と教育モデルについて実証的に研究することである。研究対象を全市の小学校で農業体験学習を授業で取り組んでいる、喜多方市小学校農業科と、美唄市農業体験学習とした。二つの市とも、「市の基幹産業は農業である」という認識を基礎にして教育行政をおこなっている。研究方法は、授業参観、聞き取り調査、作文分析、アンケート調査等である。研究の結果、農業体験学習の効果、支援員の役割、教員の認識と課題、地域との連携、行政の取り組み、そして、二つの市に共通する特徴などが明らかになった。1.「食育・食農教育」についての教育的効果とその検証A.喜多方市立小学校における「農業科」...下記123の調査研究を行った。1平成24年3月に小学校6年生対象にアンケート調査を実施した。結果は日本農業教育学会で発表した。発表題目は「農業体験におけるサポート役(農業支援員)が子どもに及ぼす教育的影響ー喜多方市立小学生の食農体験活動アンケート結果より」「農業体験の深まりと子どもの意識に及ぼす影響ー喜多方市立小学生の食農体験活動アンケート結果より」である。2「喜多方市小学校農業科作文コンクール」の『平成22年度作品集』に掲載された作文の分析をおこない、その結果は教育実践学会大会で発表した。題目は「農業科」における農業体験が子どもの食意識に与える影響ー喜多方市立小学校農業科作文コンクール『作品集』分析」である。3平成25年3月に、農業科を教える校長・教員と支援員を対象に「喜多方市における食農体験活動に関する校長アンケート」「同教員アンケート」「同支援員アンケート」をおこなった。分析は平成25年度にする予定である。B.美唄市立小学校...平成23年度に、全市で取り組む「農業体験学習」の実施前の「農業体験学習についてのアンケート」を実施したが、平成24年12月に事後のアンケート調査をおこなった。また、子どもたちの作文分析もおこなった。2.地域支援体制モデルについての調査...美唄市の学校を訪問し、学校長と担当者、支援する農業者からの聞き取りをおこなった。喜多方市については、3月実施した支援員アンケート結果を分析し、地域支援体制の有効性と課題を明らかにする予定である。3.教育的位置づけについて分析...喜多方の校長・教員アンケート分析から、教育的位置づけをついての分析を行う平成25年度におこなう予定である。平成24年度に実施した、「喜多方市小学校農業科」に関する「支援員アンケート」「教員アンケート」「小学生・中学生アンケート調査」の結果を、発表・論文投稿を行った。「支援員アンケート」結果明らかになったことは、1支援員制度は、高齢者が頼りである、2地域に支えられた学びである、3支援員の活動は「農業科」の授業に多くの貢献をしている。4児童にとって、祖父母や父母の仕事を見直し、尊敬の念がうまれるきっかけになっている、5支援員にとって、児童との活動が生き甲斐になっている、等である。「小学生・中学生アンケート調査」結果、栽培体験作物によって児童に対して、農業体験の深まりとその教育的な持続性に影響を及ぼすことがわかった。1一貫性<持続性・継続性>、2集団の作業、3土を体感できる、4収穫後に食べることができるなどその要素である。また、作物が持っている特徴などが様々な形として子ども達に学びを提供している事も明らかになった。「教員アンケート」では、「農業科」は、教員にとって、大きな負担ではあるが、充実感あるものとして捉えつつも、一方で充実度と必要性に対して疑問をもっていることが明らかとなった。また、現場では、多くの負担があるものの、一定の教育的価値があると捉えおり、教員にとっても多くの学びも提供していることが明らかとなった。共通して、指導の在り方と学びの内容の関連、支援員と教員の連携、体験学習を行う適正規模の問題等の課題が明らかになった。児童だけでなく教員にとっても意義あるもり、児童・教員の学びの共有をいかに図るかが今後の課題であるといえる。1.「食育・食農教育」についての教育的効果とその検証(1)喜多方市立小学校における「農業科」...「総合的学習の時間」の中で農業科の授業内容を実施している喜多方市では開始後5年目の平成23年度で、全小学校で「農業科」の授業を行えるようになった。そこで、下記(1)(2)(3)の調査研究を行った。(1)すでに「農業科」の授業を履修した生徒と未履修の生徒の混在する喜多方市立中学校2年生を対象にアンケート調査を行い、結果は日本農業教育学会で発表した。引き続き詳細に分析する予定である。(2)3月に小学校6年生対象にアンケート調査を実施した。分析は平成24年度に行う。

(3)「喜多方市小学校農業科作文コンクール」の『平成21年度作品集』に掲載された作文の分析をおこない、その結果は日本農業教育学会で発表した。さらに平成22年度・23年度の『作品集』掲載作文の分析を行う予定である。(2)美唄市立小学校...全市で取り組む「農業体験学習」の実施前に、「農業体験学習についてのアンケート」を実施した。引き続き取り組みの情況を調査する予定である。(3)練馬区立Y中学校...都市部の中学校における農業体験と「うどん作り教室」の取り組みを調べ、論文「食農教育の可能性と課題」が「帝京大学教育学科紀要」に掲載された。2.地域支援体制モデルについての調査本年度は、美唄市と喜多方市の農業者・支援員数名から聞き取りした。教育委員会・農産課・農協などとの連携についても平成24年度に聞き取りをする予定である。3.教育的位置づけについて分析「生活科」「家庭科」「技術科」「社会科」などの教育カリキュラムの観点からも体系的に捉え直し、教育的位置づけをついて分析を行うことは、平成24年度におこなう予定である。1研究調査環境について...喜多方市、美唄市ともに教育委員会が全面的に調査に協力を得る事ができている。2研究目的1(教育的効果)、研究目的2(「地域性からの視点」による調査)ともに、アンケートを実施し、聞き取りもおこない、学会発表はおこなっている。平成25年度には分析したものを論文化する予定である。3研究目的3について...「地域社会と学校」について、喜多方、美唄、地域と学校の連携・連携システムの構築情況について聞き取りをおこなっている。平成25年度には分析し論文化出来るように努力したい。(1)研究調査環境について...喜多方市、美唄市ともに教育委員会が全面的に調査に協力を得る事ができている。また、都市部の練馬区においても、農業者、区役所都市農業係、などの協力を得ることが出来ている。(2)研究目的1について...教育的効果については、すでに中学2年生、小学6年生を対象にアンケート調査を実施した。中学生調査の結果については、一部を日本農業教育学会で発表した。(3)研究目的2について...「地域性からの視点」による調査は、教育委員会、学校関係者、農業者、農業協同組合関係者などからの聞き取りをおこなってきた。24年度も引き続き実施する予定である。(4)研究目的3について...「地域社会と学校」について、喜多方、美唄、東京都練馬区で、地域と学校の連携・連携システムの構築情況について聞き取りをおこなっている。東京都練馬区の事例は「帝京大学文学部教育学科紀要」に発表した。美唄、喜多方については更に聞き取りを行い検討する。1アンケート調査の分析・検討をし、学会発表、投稿論文の作成をおこなう。2「作品集」掲載の作文の質的分析をおこない、学会発表、投稿論文作成をおこなう。3地域との連携、地域性の視点から、アンケート調査を分析し、論文化する。4報告集を出せるように、本研究全体をまとめる。(1)アンケート調査の分析・検討をし、学会での発表、投稿論文の作成をおこなう。(2)「作品集」掲載の小学生の作文を質的に分析する。
プロテオーム解析による口腔癌の分子標的の探索とそのオーダーメード医療への展開

口腔癌34症例に対しては,ビタミンA(ショコラA6万単位/日)の経口投与の併用を行った。その結果,臨床的治療効果および病理組織学的治療効果(大星・下里分類)とビタミンA投与に相関関係を認めた(p<0.05)。特に化学療法+ビタミンA+免疫療法を併用した群ではほとんどの症例で臨床的治療効果がCR(完全消失)を示し,高い治療効果があることが明らかになった。その結果を科学的に解明するために,ETAN-DIGEシステムを用いた2次元電気泳動およびそれに続くMALDI-TOFMS解析法を用いたプロテオーム解析にてビタミンA処理により癌細胞表面で発現亢進する細胞膜タンパクを分離・同定した結果,ナチュラルキラー細胞活性化受容体として最近明らかにされた,NKG2DのリガンドであるMajor histocompatibility complex class I chain-related molecule A (MICA)の発現が亢進することが明らかとなった。そこで,ビタミンA(100nM)処理後のMICAmRNAの発現を定量PCR法で検討した結果,口腔癌細胞をビタミンA(100nM)処理すると処理後3時間をピークにMICAmRNAの発現が上昇した。また,FACS解析にて,ビタミンA処理癌細胞表面ではMICA蛋白の発現が上昇することが明らかとなった。したがって,ビタミンAの経口摂取により口腔癌細胞表面でのMICA蛋白の発現が上昇し,NK細胞の活性化を誘導していると考えられた。MICAの遺伝子多型と口腔癌感受性について:NK細胞の活性化との関連性およびベーチェット病やI型糖尿病の疾患感受性に関与していると考えられているMICA遺伝子の遺伝子多型(膜貫通領域をコードするexon5におけるGCTの繰り返し配列:4回;4型,5回;5型,Gのインサーションを含む5回;5.1型,6回;6型,9回;9型)について,100名の口腔癌患者および103名の健常人についてChi-square methodおよびfisher's P valuetestを用いて統計学的に検討した結果,5.1型のMICA遺伝子型を持つ個体の口腔癌感受性は有意に高い(X^2=16.203,Pvalue=0.00006)ことが明らかとなった。ヒト癌においては、種々の増殖因子や受容体の発現異常が伴うことが報告されており、これらの分子を標的とした分子標的治療薬に大きな期待が集まっている。EGFRの過剰発現は、頭頚部癌、乳癌、肺癌をはじめとした多くの癌において報告されており、EGFRを標的とした癌治療の有用性が期待されている。そこで、本研究では、EGFRに対する中和抗体による唾液腺癌の分子標的治療の可能性について検討するとともに、その分子機構について研究を行った。cDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動法およびMALDI-TOFMS法を用いたプロテオーム解析法を用いて、12-93抗体処理により変動する遺伝子群および蛋白群の解析を行った。また、ヌードマウス背部皮下移植系を用いたin vivoでの腫瘍増殖に及ぼす影響を検討し、以下のことが明らかとなった。1.12-93抗体処理48時間後より、Caspase-3、7、8、9の切断をみとめた。

また、処理48時間後までBcl-2の発現低下とBaxの発現上昇および著しいPARPの切断を認めた。3.プロテオーム解析の結果、検討した3,000種類の蛋白群のうち、Heat shock protein-70など161種類の蛋白群の発現亢進と、VimentinおよびLaminA/Cなど126種類の蛋白群の発現低下を認めた。以上の結果から、12-93抗体はErk1/2、Aktリン酸化活性の抑制およびp18、p27遺伝子発現を促進し、G1期からS期への細胞周期の進行を阻害することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することが示唆された。また、JNKリン酸化活性および,その下流のCaspase-3、7、8の活性の促進を介して、Lamin A/Cの切断を誘導し、Caspase-9の活性を介してVimentinの切断を誘導することで、細胞のアポトーシスを引き起こすと考えられた。さらに、12-93はHeat shock Protein-70を誘導し、アポトーシス後の細胞修復をおこすと推測された。また、VEGF-A、-C、MMP-1、-7およびFGF-1の発現抑制は増殖抑制および造腫瘍能を低下させたもう一つの要因であると考えられた。EGFR抗体を用いた唾液腺癌の分子標的治療の有用性が示唆された。また、DNAマイクロアレイ・プロテオーム解析を用いた遺伝子・蛋白発現プロファイリングは分子標的治療の標的分子および治療効果を予測する上で有用性が高いと考えられた.口腔癌34症例に対しては,ビタミンA(ショコラA6万単位/日)の経口投与の併用を行った。その結果,臨床的治療効果および病理組織学的治療効果(大星・下里分類)とビタミンA投与に相関関係を認めた(p<0.05)。特に化学療法+ビタミンA+免疫療法を併用した群ではほとんどの症例で臨床的治療効果がCR(完全消失)を示し,高い治療効果があることが明らかになった。その結果を科学的に解明するために,ETAN-DIGEシステムを用いた2次元電気泳動およびそれに続くMALDI-TOFMS解析法を用いたプロテオーム解析にてビタミンA処理により癌細胞表面で発現亢進する細胞膜タンパクを分離・同定した。その結果,ナチュラルキラー細胞活性化受容体として最近明らかにされた,NKG2DのリガンドであるMajor histocomatibility comlex class I chain-related molecule A(MICA)の発現が亢進することが明らかとなった。そこで,ビタミンA(100nM)処理後のMICAmRNAの発現を定量PCR法で検討した結果,口腔癌細胞をビタミンA(100nM)処理すると処理後3時間をピークにMICAmRNAの発現が上昇した。また,FACS解析にて,ビタミンA処理癌細胞表面ではMICA蛋白の発現が上昇することが明らかとなった。したがって,ビタミンAの経口摂取により口腔癌細胞表面でのMICA蛋白の発現が上昇し,NK細胞の活性化を誘導していると考えられた。MICAの遺伝子多型と口腔癌感受性について:NK細胞の活性化との関連性およびベーチェット病やI型糖尿病の疾患感受性に関与していると考えられているMICA