hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
REIC/Dkk-3遺伝子による前立腺細胞増殖制御機構に関する研究

平均寿命の延長に伴い、生活の質を低下させる加齢現象への対応が緊急の課題となっている。このうち、高齢男性に加齢現象として一般的に見られる前立腺肥大症(BPH)は排尿障害を高頻度で引き起こし、さらに残尿の増加にともなう尿路感染症や、夜間頻尿にともなう不眠症など2次的な疾患も誘発することが知られている。本申請研究で我々は、2000年に岡山大学で発見されたDickkoph family geneの一つで、Wnt signaling pathwayを介してembryonic developmentに関与する新規不死化関連遺伝子であるREIC/Dkk-3に注目している。本年度は、これまでの研究に引き続き、REIC/Dkk-3遺伝子および当該タンパク質が男性ホルモン(アンドロゲン)レセプターを介したBPH構成前立腺細胞の細胞増殖制御機構にどのように関わっているかの解明を目指す基盤的解析を行った。また、申請者らの研究により新たな展開として、REIC/Dkk-3タンパク質が、Actin線維-微小管細胞骨格制御に必須のタンパク質の一つを制御することが明らかとなった。我々は既に、REIC/Dkk-3タンパク質が微小管と密接な関係を持つDyneinモーターの一部を成すTctex-1と結合することを明らかにしており、REIC/Dkk-3はこれらタンパク質群の機能を通してActin線維-微小管細胞骨格制御に関与していると考えられた。これまでの研究成果と考察に基づき、前立腺肥大症を構成する前立腺細胞の細胞増殖シグナルについて、Actin線維-微小管細胞骨格制御の観点からの研究実施が可能となった。研究は、おおむね順調に進展している。前立腺肥大症(BPH)の発生・進展に関する研究として、我々は先行研究により既に、アンドロゲン感受性を有するヒト正常前立腺上皮細胞(PrEC)においてREIC/Dkk-3発現を特異的siRNAで抑制すると、活性化RasであるRas-GTPのレベルが上昇することを確認している。そこでBPH発生の観点から引き続き、PrEC細胞ならび繊維芽細胞等を用いたin vitro実験系で、REIC/Dkk-3とSGTAおよびTctex-1タンパク質が、アンドロゲンシグナルとRas-GTPレベルおよびActin線維-微小管細胞骨格制御にどのように関わるかを解析する。またこれらのタンパク質と同様に、今回明らかにしたActin線維-微小管細胞骨格制御に必須のタンパク質の一つについても、前述の観点から解析を加える。本年度の研究において、各種遺伝子コンストラクトおよび組み換えタンパク質作成等に関する研究を優先して遂行した。今回、PrEC細胞ならび繊維芽細胞を用いたin vitro実験系で、REIC/Dkk-3タンパク質が、アンドロゲンシグナルおよびRas-GTPレベル等にどのように関わるかの解析について、予定と比べて未使用額が生じたものである。今年度未使用額を平成31年度分にあてがい、今回明らかにしたActin線維-微小管細胞骨格制御に必須のタンパク質の一つについても併せて解析を行い、引き続き研究目的の達成に向け執行する計画である。
IL-17制御と免疫チェックポイント阻害のシナジー効果による新規癌免疫療法

がん微小環境における慢性炎症はIL-17/STAT3 pathwayを介して腫瘍浸潤免疫担当細胞の免疫チェックポイント発現を活性化し、腫瘍の増殖が促進されると考えられる。そのため、がん微小環境におけるIL-17/STAT3 pathway制御し、免疫チェックポイントを阻害することで免疫逃避機構を強力に解除し、癌免疫療法の効果増強が得られるとものと作業仮説を立て検証する。本年度はまず作製したIL-17 siRNA発現アデノウイルスベクター(Ad-IL-17 siRNA)を腫瘍内投与し、腫瘍局所でのIL-17発現抑制による免疫担当細胞における免疫チェックポイント分子の発現の検討した。in vivo実験であるため、再現性実験のために時間を要した。現時点での研究結果は仮説通りであるため、予定を変更せずこのまま研究を遂行する予定である。
黙読時文処理過程における要素の長さ及び韻律構造の影響

平成12年度から行っている本研究は、統語処理過程において要素の長さが関係節境界の位置の決定に関与していること、そしてそれは黙読時の統語処理における潜在的韻律構造に起因しているという仮説を、下にあげる現象をとおして検証することを目的としている。12年度の研究成果が雑誌『音韻研究』に掲載され、他の研究者からのフィードバック、助言が得られたことを踏まえ、平成13年度は,次のような計画にそって研究をを行った。1.self-paced reading実験で文節ごとの読み時間をパソコンを用いて1/1000秒単位で計測することにより,オンラインの処理過程をより正確に反映するデータを収集し,これまでの結果と照合するという実験を行った。この結果、統語構造の再分析が必要となった場合,初分析時に構築されたmajor phrase boundaryとマッチするような位置にclause boundaryが置かれるような構造がより選択されやすいという予測を支持する結果が得られた。2.さらに、観察の対象を、再分析時における構造選択のしくみから、初分析ガーデンパスに至るまでの過程に拡大し、1.と同様のパラダイムで実験をおこなった。この結果、黙読における統語処理過程においても,入力に対して初分析の段階で統語構造と同時に韻律構造(major phraseを含む)が構築され、これが、誤った初分析ガーデンパスを回避する効果があることもわかった。本研究では,次のような仮説を検証することを目的としている。1.黙読における統語処理過程においても,入力に対して初分析の段階で統語構造と同時に韻律構造(major phraseを含む)が構築される。2.統語構造の再分析が必要となった場合,初分析時に構築されたmajor phrase boundaryとマッチするような位置にclause boundaryが置かれるような構造がより選択されやすい。今年度は,1 minor phraseからなる名詞句(例:{森下})vs.2 minorphrasesからなる名詞句(例:{森下}{新二郎})のペアなどを用い,次のような実験を行った。(i)当該の1 minor phrase vs.2 minor phrasesにおいてのみ対立する名詞句で始まる刺激文のペアが,理論的に予測される位置に韻律境界を有するかどうか,不完全文朗読課題のいてデータを収集し,朗読時の音声のピッチパターンを分析した。(ii)(i)により,あらかじめ正確に朗読時の韻律パタンが予測しうることを確認した刺激文を用い,黙読による文完成課題を使った実験を行った。これは,研究の背景欄に示したような不完全文のセットを被験者に与え,これに語句を加えて文を完成させることにより,不完全文にどのような統語構造が与えられていたのかを明らかにする実験である。その結果,以下のことが明らかになり,仮説を裏付けるものとなった。これらの成果は別紙に記載したとおり2編の論文に発表した。(1)「森下が/森下新二郎が新薬を心から信用した友人達に...」のような節境界曖昧性において文頭から2 minor phraseめの位置に韻律境界が比較的おかれやすく,その結果この位置に節境界があるような統語構造が与えられ易いこと。(2)従って,文頭のガ格名詞句が2 minorphrasesからなる場合はこの直後に,そして文頭のガ格名詞句が1 minor phraseからなる場合はその後の,同じく1 minor phraseからなるヲ格名詞句の直後に節境界を有すような統語構造(前者では"[森下新二郎が[新薬を心から...",後者では"[森下が新薬を[心から...")が与えられ易いこと。さらに,現在,self-paced reading実験で文節ごとの読み時間をパソコンを用いて1/1000秒単位で計測することにより,オンラインの処理過程をより正確に反映するデータを収集し,(ii)での結果と照合するという実験を準備中である。刺激文中の個々の語の諸特性が生み出す誤差を排除するため,「日本語の語彙特性」データベースを利用し,刺激作成にも最新の注意を払う。
比較ゲノム解析による擬態斑紋の進化プロセスの解明

斑紋多型を示すナミテントウを用いた解析ミュラー型擬態を示すテントウムシ科内の種を用いた解析larval RNAi法による斑紋プレパターン遺伝子の機能解析を行い、成虫の表現型を観察した結果、ナナホシテントウとカメノコテントウでは、ナミテントウと同様にメラニン形成領域が完全に消失し、翅全体が赤いカロテノイド領域に変化する表現型が観察された。テントウムシと上科レベルで異なるヘリグロテントウノミハムシを用いた餌析ヘリグロテントノミハムシから、lac2、ebonyおよび斑紋プレパターン遺伝子をクローニングし、larval RNAi法による遺伝子機能解析を行った。その結果、lac2のRNAiではメラニン形成が体全体にわたって阻害されたことから、ヘリグロテントウノミハムシにおいてもlac2はメラニン形成およびクチクラの硬化において必須の役割を果たすことが判明した。一方、ebonyのRNAiでは赤色斑点が無色に変化したことから、ヘリグロテントウノミハムシの赤色斑点はebonyによって生じるクチクラの硬化反応に伴った着色によりもたらされることが判明した。斑紋多型を示すナミテントウをいた解析ナミテントウ斑紋のメラニン形成過程に関与する酵素遺伝子について、larval RNAi法を用いた機能解析およびin situ hybridization法を用いた発現解析の結果、tyrosine hydorxylase(th)、dopa decarboxylase(ddc)、laccase2(lac2)遺伝子は、メラニン形成に必須であり、いずれもメラニン形成領域に一致した発現を示すことが判明した。これらメラニン合成酵素遺伝子の転写開始点を同定するため、RACE法を行った。転写開始点が決定されたlac2遺伝子について、Vectorette PCR法を用い、プロモーターの上流域をクローニングした。ミュラー型擬態を示すテントウムシ科内の種を用いた解析ナミテントウで明らかになったメラニン形成過程で必須の役割を果たすフェノール酸化酵素の活性染色を、テントウムシ科の5種の蛹期の翅原基を用いて行った。その結果、いずれもナミテントウと同様にメラニン形成領域に一致した発現を示すことが判明した。テントウムシと上科レベルで異なるヘリグロテントノミハムシを用いた解析ナミテントウとヘリグロテントウノミハムシの斑紋形成の共通性・多様性を探るため、まず赤色を構成する成分の分析を行った。その結果、ナミテントウの赤色はカロテノイドが主成分であるのに対し、ヘリグロテントウノミハムシの赤色は色素によるものではなくメラニン形成が生じていないクチクラの硬化反応に由来する色であることが判明した。ヘリグロテントウノミハムシから、lac2およびebonyのクローニングを行った。ヘリグロテントウノミハムシから得られたcDNAの部分配列から推定されるアミノ酸配列は、ナミテントウの配列に対し、それぞれ70.1%および91.5%であった。
日常的な食材の機能性活用をめざす高フラボノイド食摂取と生体内炎症マーカーの検討

本研究では、疾病予防効果が期待されるフラボノイドの食品機能性を活用した食事を推奨するための科学的根拠の蓄積を目的に、平成30年度は、(1)フラボノイドなどの機能性成分に対する調理終了後から時間経過による影響、(2)調理操作によるフラボノイド類の体内動態の変化についてヒト介入試験を実施し検討した。(1)機能性成分に対する調理終了後から時間経過による影響では、調理操作を行ってから測定までの時間を変えて測定を行った。対象は、玉ねぎ、豆腐、大豆、黒豆とし、調理操作は生、炒め、煮(+煮汁)、電子レンジ調理とした。また測定するまでの保存時間を調理終了後0時間、24時間、48時間の3点に設定し、保存は4°Cの冷蔵庫内にて行った。食材の各保存時間におけるフラボノイド含有量、総ポリフェノール量、抗酸化活性を測定した。その結果、豆腐の煮汁以外では、時間経過による有意な変化は確認されなかった。このことから、調理から喫食まで時間のかかる中食であっても、フラボノイドの機能性は保持されていることが示唆された。(2)調理操作によるフラボノイド類の体内動態の検討では、玉ねぎ200 gに生、炒め、煮(+煮汁)、電子レンジ調理を加えたものを試験食とした。試験は、2日間のウォッシュアウト後、3日目の朝食に試験食の調理操作を加えた玉ねぎを摂取し、朝食摂取前、摂取後1、2、3、4、6時間に肘正中皮静脈より採血を行った。血中フラボノイド濃度は、血漿を酵素加水分解処理し、酢酸エチルにて抽出後、LC/MSを用いてフラボノイドアグリコンとして測定した。その結果、個人内における調理法と血中ケルセチン濃度の間に有意な変化はみられなかった。また、血中ケルセチン濃度、ピークまでの到達時間についても個人差が大きく調理法による有意差は確認されなかった。本研究では、疾病予防効果を有する食品機能性を活用した食事を推奨するための科学的根拠の蓄積を目的に、高フラボノイド食の調製に必要なデータベースの作成と、開発した高フラボノイド食を用いたヒト介入試験により、継続摂取後の疾病リスク低減効果について検討する。平成28年度は、(1)高フラボノイド食継続摂取における生体内抗炎症効果の検討、(2)食材別・調理法別のフラボノイド含有量の測定を、食品数を増やして行った。(1)では、BMI25以上の軽度肥満男性(22-38歳)を被験者とし、2日間のウォッシュアウト後、7日間高フラボノイド食またはフラボノイド低減食を継続的に摂取する試験を実施した。採血はウォッシュアウト後および7日間の継続摂取後に行った。また、FFQgにて被験者の習慣的な栄養摂取量を推定した。血球細胞中の炎症性サイトカインの遺伝子発現量をRT-PCRにて測定したところ、被験者6名中2名において、高フラボノイド食の摂取によりこれらの遺伝子発現量が低下した。肥満者では慢性的に生体内の炎症性サイトカインの発現量が高まっているとされるが、その発現量には個人差がみられ、この2名については日常的に抗酸化ビタミンの摂取量が高かった。抗酸化ビタミンがフラボノイドの機能性を増強させる報告もあることから、今回の高フラボノイド食摂取における炎症抑制効果の差は、日常的な抗酸化ビタミン摂取によるフラボノイドの機能性増強の影響があると考えられた。(2)では、赤パプリカ、気パプリカ、水煮大豆、セロリを対象に7種類の調理法(生、焼き、炒め、ゆで、煮、蒸し、マイクロ波加熱)におけるフラボノイド含有量を測定した。その結果「生」と比較しフラボノイド含有量の減少が低い調理方法は「焼き」「蒸し」「マイクロ波加熱」であった。H28年度は、ヒトにおける高フラボノイド食の継続摂取前後の生体内炎症マーカーの検討に着手した。また、食材別・調理法別のフラボノイド含有量、抗酸化能のデータベース作成のための測定については、新たに4種類の食材、7調理方法で検討することができた。しかしながら、当初の計画では、年度内に食材の種類を10種類程度に増やして検討を行う予定であったため、やや遅れていると言わざるを得ない。この原因として、年度途中で測定機器(LC/MS)に不具合が生じ、修理に時間を要したことが挙げられる。他研究室との共同利用機器であるため、使用にあたっては他の使用者との調整が必要となり、計画通りのペースで測定を進めることができなかった。フラボノイドは様々な機能性を有すことから疾病予防効果が期待され、保健機能食品等の開発が盛んに行われているが、それらの安全性についての知見は少ない。本研究では、食品機能性を活用した「食事」を推奨するための科学的根拠の蓄積を目的に、高フラボノイド食の調製に必要な食材別・調理法別のデータベースの作成と、開発した高フラボノイド食を用いたヒト介入試験により、継続摂取後の疾病リスク低減効果について検討する。平成29年度は、さらに食材を増やし、フラボノイド含有量、ポリフェノール含有量、抗酸化活性の調理法による変化について検討を行った。試料はジューシーケール、ソフトケール、プチヴェール、豆苗、ナス(皮付き)、ナス(皮無し)、大豆(水戻し)、黒豆(水戻し)、アーリーレッド、イチジクの10種類とした。これら試料に7種類の調理(生、焼き、炒め、ゆで、煮、蒸し、電子レンジ)を行い、各調理後のフラボノイド含有量、総ポリフェノール量、抗酸化活性を測定した。

フラボノイド含有量は、酵素加水分解後、代表的なフラボノイドアグリコンをHPLCにて測定した。総ポリフェノール量、抗酸化活性はそれぞれFolin-Ciocalteu法、DPPHラジカル捕捉活性により測定を行った。その結果、今回測定した食材においては、調理操作によるフラボノイド含有量の増減について規則性はみられなかった。一方、総ポリフェノール量と抗酸化活性の間には、多くの食材で強い相関がみられ、炒め、蒸し、レンジ調理で保持または増加し、ゆで、煮で減少する傾向がみられた。水を熱媒体とするゆでや煮といった湿式加熱調理では、ゆで汁や煮汁にフラボノイドや抗酸化物質が溶出したと考えられ、これらの調理法を選択する際は、食材とともに煮汁も摂取できる汁物やスープであれば、フラボノイドの損失が少ないと考えられる。H28年度の機器の不具合による遅れを取り戻すには至っていないが、H29年度は計画通り、食材別・調理法別のフラボノイド含有量、総ポリフェノール量、抗酸化活性の調理過程での変化の検討においては、新たに10種類の食材で実施することができた。H30年度は、フードサービス産業(中食、給食)での食事の提供を想定し、食材別・調理法別のフラボノイド含有量、総ポリフェノール量、抗酸化活性について、調理後の経時変化の検討を行う計画であり、すでに食材の選定を終えている。さらに、食事由来フラボノイドの体内動態においても調理法の違いによる変化について検討する予定であるが、今年度の研究プロトコールでの研究倫理審査が通り次第、被験者の募集に入る。以上より、おおむね順調に進展しているといえる。本研究では、疾病予防効果が期待されるフラボノイドの食品機能性を活用した食事を推奨するための科学的根拠の蓄積を目的に、平成30年度は、(1)フラボノイドなどの機能性成分に対する調理終了後から時間経過による影響、(2)調理操作によるフラボノイド類の体内動態の変化についてヒト介入試験を実施し検討した。(1)機能性成分に対する調理終了後から時間経過による影響では、調理操作を行ってから測定までの時間を変えて測定を行った。対象は、玉ねぎ、豆腐、大豆、黒豆とし、調理操作は生、炒め、煮(+煮汁)、電子レンジ調理とした。また測定するまでの保存時間を調理終了後0時間、24時間、48時間の3点に設定し、保存は4°Cの冷蔵庫内にて行った。食材の各保存時間におけるフラボノイド含有量、総ポリフェノール量、抗酸化活性を測定した。その結果、豆腐の煮汁以外では、時間経過による有意な変化は確認されなかった。このことから、調理から喫食まで時間のかかる中食であっても、フラボノイドの機能性は保持されていることが示唆された。(2)調理操作によるフラボノイド類の体内動態の検討では、玉ねぎ200 gに生、炒め、煮(+煮汁)、電子レンジ調理を加えたものを試験食とした。試験は、2日間のウォッシュアウト後、3日目の朝食に試験食の調理操作を加えた玉ねぎを摂取し、朝食摂取前、摂取後1、2、3、4、6時間に肘正中皮静脈より採血を行った。血中フラボノイド濃度は、血漿を酵素加水分解処理し、酢酸エチルにて抽出後、LC/MSを用いてフラボノイドアグリコンとして測定した。その結果、個人内における調理法と血中ケルセチン濃度の間に有意な変化はみられなかった。また、血中ケルセチン濃度、ピークまでの到達時間についても個人差が大きく調理法による有意差は確認されなかった。
外来単生虫類相とその侵入機構解明による外来寄生虫の対策方法確立

資源に悪影響を与えるリスクを持つ魚類寄生性外来単生虫類相とそのリスク評価を始めとした生態的特性の解明,および在来生態系に与えている影響を明らかにし,外来単生虫類の侵入防除・駆除手法の確立を目的として研究を行った.本年度はこれまでに採集できなかった国外・国内外来魚の補助的な調査と,これまでに得られた外来単生虫類に関する総括を行い,以下の成果を報告,また発表を予定している.これまでの調査で合計31種の国外外来魚を十分に検査し,そのうち18種から約28種の外来単生虫類が採集された.そのうち,本年度はティラピア類に寄生していた外来単生虫類に関して国内学会で報告した.また,外来単生虫類の宿主は漁業資源として稚魚・成魚が輸入された魚種がほとんどを占めていることが明らかとなり,成果の総括は国内学会で報告し,また国際シンポジウムにおいて報告した.外来魚類調査の過程で得られた在来単生虫類のうち,ミナミメダカから得られた2種はそれぞれ宿主特異的であることが示唆され,ミナミメダカ自体が絶滅危惧種でありかつモデル生物として重要であったことからそれぞれの単生虫類について記載論文を執筆し,1種は新種として記載され,もう一種は現在記載論文を投稿中である.また,漁業資源となる魚種から得られた単生虫類2種は系統的および国内の単生虫類相を俯瞰するうえで重要と判断し,それぞれ新種として記載した.外来魚調査の過程で得られたコイ科魚類は国内でこれまでに正式に報告されていなかった国外外来種カワイワシであることが形態と分子データから判明し,正式に報告した.さらに,本研究で得られた外来単生虫類の情報を含め,過去日本で行われた単生虫類に関する研究を総括し,国内学会および国際シンポジウムにて報告,単後吸盤亜綱の情報を中心としてまとめた総説を出版した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。単生虫類は扁形動物門に属し,そのほとんどの種類が魚類の鰓や体表に寄生する.外来の単生虫類が引き起こす魚病被害は,養殖漁業のみならず天然資源に対しても大規模な悪影響を与える.現在,約50種もの国外外来魚が日本に侵入しているが,単生虫類の寄生が調べられた種類はごく一部に過ぎない.すでに定着している外来単生虫類相を把握することは,今後生じると予測される新たな魚病被害・天然資源減少に対する防除・対策方法および外来寄生虫防除・侵入阻止方法の確立に欠かせないものである.本年度は,西日本を中心とする20の県で採集された国外外来魚を検査し単生虫類相の把握に努めた.これまでに採集・寄生虫検査を行った国外外来魚類は25種に及び,本研究で目標としていた調査種数の半数を超えた.また,国内外来魚は10種に関して在来の水系および侵入をうけた水系で採集および寄生虫調査を行った.これらの魚類から約30種の外来生物と考えられる寄生虫が得られた.非常に多くの外来寄生虫が日本に侵入していることが今年度の調査により明らかとされた.沖縄県に定着しているマダラロリカリアに寄生していた単生虫類4種は同定が終了した.すべてが国外外来単生虫であり,その内の1種が未記載種であることが判明し,現在論文を投稿中である.外来魚類の採集の際に得られた在来魚からも多くの未記載と考えられる単生虫が得られており,その中でも絶滅が危惧される魚類の単生虫に関しては情報の重要性・緊急性が高いと判断し,記載論文を投稿している.また,調査中に得られたコウライギギに関しては新たな侵入水域を発見したため,現在報文を準備中である.得られた単生虫に関してDNA情報の蓄積を目的とした遺伝子の解析を進めている.多くの寄生虫では遺伝情報が得られておらず,これらの情報は今後の系統解析およびDNAバーコーディングに関する研究へ大きく寄与するものと期待される.本年度目標としていた、琉球列島における国外外来魚の単生虫類相調査をほぼ完了し,多くの国内外来魚類の移入元である琵琶湖・淀川水系における単生虫類相の把握することが出来た.また当初の目標を超えて,他の水域に侵入・定着していた外来魚類についても採集・寄生虫の検査を行うことが出来,結果として3年間で調査することを目標としていた外来種の数の半数以上を調査することが出来た.また、10種の国内外来魚に関して,在来の水系および侵入をうけた水系で採集を行い,寄生虫検査を行った.これらの魚類から約30種の国外外来寄生虫が得られ,非常に多くの外来寄生虫が日本に侵入していることが本年度の調査により明らかとなった.研究成果の発表に関して,マダラロリカリアに寄生していた単生虫類4種に関して,現在論文を投稿中である.また,調査中に得られたコウライギギに関しては新たな侵入地を発見し現在報文を準備中である.これまでに行っていた研究で発見した外来寄生虫に関しても研究を進め,論文の出版と国内学会での発表を行うことが出来た.外来寄生虫として霞ヶ浦産チャネルキャットフィッシュに寄生する単生虫Ligictaluridus priceiとウシガエルに寄生するウシガエルシャコウキュウチュウに関する論文,沖縄県産国内外来魚コイに寄生していたコイユビガタムシに関する報文を発表した.国内外来魚タモロコに寄生していたユビガタムシ科単生類の未記載種2属4種に関する研究報告を日本動物分類学会にて行い,ユーラシアおよびヨーロッパで外来魚として分布を拡大しているモツゴ(日本では在来種)に寄生する単生類に関して,日本における新記録および再記載を行った.

これらの予定以上の進捗状況を研究成果を鑑み,現在まで本研究は当初の計画以上に進展していると判断した.資源に悪影響を与えるリスクをもつ外来単生類相・生態的特性の解明,および在来生態系に与えている影響を明らかにし、国内外来魚の移入元・移入先双方の単生虫類相・遺伝的多様性を比較し、侵入状況・寄生動態を解明することで、外来単生虫類に対する侵入防除・駆除手法を確立することを目的に研究を行っている。本年度は国外・国内外来魚双方の調査に関して以下の結果が得られ、成果を報告した。利根川水系に生息する外来魚の調査では新たに3種の外来単生虫類と1種の外来寄生性カイアシ類を見出し、この成果を学会にて発表し、現在研究論文の原稿を執筆中である。また、渡良瀬遊水地において国外外来魚コウライギギの侵入を新たに発見したため、新産地記録として出版した。沖縄県に定着した外来魚マダラロリカリアに寄生していた外来単生虫類1新種を含む4種を同定し、その成果を国際学会にて発表、研究論文として公刊した.これは,観賞魚の放逐が外来寄生虫の侵入原因となることを日本で初めて明らかにした研究である.国内外来魚に寄生する単生虫類に関して,モツゴに寄生する日本初記録3種を報告し,在来種でありながら国内の他の水系に国内外来寄生虫として侵入している可能性を指摘した.オイカワに寄生していた単生虫類5種のうち4種が国内外来寄生虫として侵入していることを明らかとし,その成果を平成28年度日本水産学会中国・四国支部例会にて発表した.こうした外来魚の調査中に得られた絶滅が危惧される淡水魚カゼトゲタナゴを検査したところ,未記載の単生虫類1種が得られた.本種はその宿主特異性から宿主とともに絶滅の危機に瀕している可能性が示唆されたため,日本固有の絶滅が危惧される寄生虫として系統解析を行い,新種として記載した.さらにミナミメダカから得られた在来単生類も同様な状況にあることが示唆されたため,報の重要性・緊急性が高いと判断し、記載論文を投稿している.本年度は霞ヶ浦を中心とした関東圏・九州有明周辺の水系における単生虫類相の調査を中心に,国内外来魚に寄生する単生虫類の調査を行った.現在までに採集・寄生虫検査を行った国外外来魚類は31種に及び,これは外来魚調査種数目標の約8割に達しており,最終年度までの調査目標が達成できるものと考えられる.さらに国内外来淡水魚として13種を検査し,これまでに在来魚を含めて170種以上の淡水魚を検査することができた.これらの外来魚・在来魚から多くの未報告の単生虫類を確認している.研究成果の発表として,沖縄県に定着した外来魚マダラロリカリアに寄生していた外来単生虫類1新種を含む4種を同定し、その成果を国際学会にて発表、研究論文として公刊し,観賞魚の放逐が外来寄生虫の侵入原因となることを日本で初めて明らかにした.また,ハクレンに寄生していた外来単生虫と寄生性カイアシ類について学会発表を行った.国内外来寄生虫に関してもモツゴに寄生していた単生虫類に関する論文の刊行,オイカワに寄生する単生類に関して学会発表を行った.また絶滅が危惧されるカゼトゲタナゴ・ミナミメダカに寄生していた日本固有の単生虫類の記載など順調に成果を上げている.これまでの調査において採集された単生虫類は現在同定作業・DNA解析作業が順調に進行している.また,新たに侵入が確認された魚類に関する報告も並行して行うことができ,宿主と寄生虫の寄生動態・侵入生態が明らかとなってきている.
遠縁交雑における雑種胚崩壊の機構解析

遠縁交雑は、異なる種間や属間の交雑によって、新たな遺伝子型を作出しようとするもので、種内交雑では得られない変異拡大の方法である。しかし、異なる種間の交雑のため、生殖隔離機構が働き雑種の育成が困難である。その主要な原因の1つとして雑種胚や雑種胚乳の崩壊がある。これに対し、雑種獲得のために胚培養等の様々な技術が開発され育種に貢献している。しかし、雑種胚等の崩壊の機構は不明のまま現在に至っている。本研究は、アブラナ科作物を材料に雑種胚等崩壊の機構を形態学及び分子生物学的手法を用い解析する。しかし、異なる種間の交雑のため、いわゆる生殖隔離機構が働き雑種の育成が困難である。Brassica napus(西洋ナタネ類)はB.campestris(菜類)とB.oleracea(キャベツ類)を両親とする複二倍体種である。このB.napusとその両親種の間の種間交雑はB.napusとB.campestrisの間は容易であるが、B.napusとB.oleracea間はほとんど雑種が得られないことが経験的に言われている。B.napus5品種を母本とし、B.campestris5品種及びB.oleracea3品種を父本とし、種間交雑を行ったところ、B.campestrisを父本としたときは1交配花当たり5-13個の種子稔性が見られたのに対し、B.oleraceaを父本としたときは0-0.5個の種子稔性で、ほとんどの組合せでは種子が得られなかった。母本についてはワックスレスの`はるの輝'を用いたとき、他の品種に比較し稔性は著しく低下した。形態観察を行ったところ、花粉管伸長は全ての組合せで正常であり、胚発達については、B.campestrisを父本に用いたときは、正常な胚発達とそれに伴う胚乳の崩壊が見られたが、B.oleraceaを父本としたときは、受粉後8日以後の胚は観察されず、また胚乳の崩壊も見られなかった。今後このステージをターゲットして、発現遺伝子の単離を行う予定である。昨年度B.napeusを母本とし、B.campestris及びB.oleraceaを父本とし、種間交雑を行いB.campestrisを父本としたときはある程度の種子稔性が見られたのに対し、B.oleraceaを父本としたときはほとんど種子が得られなかった。今年度も品種を変え、同様の実験を行なったところB.campestrisを父本とした時は、1交配花当たり9-19個の種種稔性が見られたのに対し、B.oleraceaを父本としたときは全く種子が得られず、昨年度の結果を実証した。さらに逆交雑でも同様のことが見られた。組織の透明化法により胚発達を調査したところ、前者の交配組合せや自殖では10日目に球状胚、13日目に心臓胚、16日目に魚雷胚に発達していたのに比較して、後者の交配組合せでは18日目で球状胚の状態であったり、13日目で致死も観察された。さらに両者の交配組合せの胚珠からmRNAの単離を行い、SSH法で遺伝子発現差異の調査を試みたが、mRNAの単離がうまく行かず、これについては2007年度に実施する予定である。
特定の病原体に対する易感染性に着眼した原発性免疫不全症の病因病態解明

抗酸菌に対して選択的に易感染性を示すMSMDと、カンジダに対して選択的に易感染性を示すCMCDを研究対象とする。未診断のMSMD、CMCD患者、および、MSMDとCMCDを合併した患者に対して全エクソーム解析、RNAシークエンスを併用した網羅的解析を行い、新規責任遺伝子を同定する。さらに、同定した遺伝子変異の病的意義を実験的に検証し、該当分子の障害による新規の原発性免疫不全症という疾患概念を確立する。並行して、リン酸化プロテオーム解析によって、CMCDの主要原因であるSTAT1機能獲得型(GOF)変異が細胞内リン酸化ネットワークへ及ぼす影響を明らかとする。
農業における外国人労働力の供給システムに関する研究　－派遣システムの解明を中心に

本研究では、日本の農業関連産業にたいして、外国人労働力を供給している主要送り出し国の派遣システムの現状と課題を明らかにする。本研究で、この点に注目するのは、派遣国の派遣システムの解明が、今後の中長期的な日本向け派遣の動向(派遣数の増減、失踪等の社会問題)に対応する際に必要不可欠であると判断したためである。研究方法としては、派遣国における派遣機関調査、派遣労働力を対象とした面接調査、外国人労働力受け入れ競合国の調査等を実施することによって、日本での現地調査だけでは知り得ない情報を入手し、今後の農業関連産業における外国人労働力受入体制を新たに構築するための有益な情報を得ることを目的とする。
大谷大学所蔵パーリ語貝葉写本におけるPannasajatakaの文献的研究

本研究は、大谷大学図書館に蔵されている東南アジア地域所伝の膨大な南方仏教貝葉写本(以下<大谷貝葉>)の中で、特に稀覯写本と思われる一連のPannasajataka(50ジャータカ)といわれるパーリ語文献群の体系的、文献的研究である。この50ジャータカのうち、大谷貝葉には26種のジャータカが収められているが、そのうちの9ジャータカをローマナイズし、田辺博士招来のバンコック国立図書館所蔵のマイクロフィルムと校合して校訂及びその翻訳研究をほぼ完成することができた。それをもとにして、代表者を中心に、分担者、協力者の協力を得て、以下のような作業を実施し、成果を得た。1)上記資料のローマナイズ対校版と試訳作成。2)クメール文字によるジャータカに関する資料収集。3)タイにおけるジャータカ等の仏教文学の伝播地域と<大谷貝葉>流伝地域の関係研究、関連資料収集。5)パンニャーサジャータカに関するタイ語による研究文献の翻訳。6)毎月研究会を実施し、代表者・分担者それぞれ研究論文を発表。上記成果をとりまとめて、研究成果報告書として提出する。本研究は、これまでの準備的研究はなされていたものの、平成10年10月の中途採択であるため、本年度は主として大谷大学図書館所蔵の「パンニャーサ・ジャータカ」クメール文字貝葉写本の研究資料収集と整備が中心的作業となり、分担者・協力者による校訂作業に着手した。1.資料の収集と整備:「パンニャーサ・ジャータカ」大谷貝葉の全葉を写真撮影、本フィルムと分担者田辺和子の所持するマイクロフィルムとをプリント・コピー、両フィルムのマイクロデジタルコンバートによるCD-Rの作成(パソコンで貝葉文字を拡大して、校訂作業を容易にするため)。併せて、現地を含めて内外の関連する資料を収集した。2.研究打合会と研究会の開催:校訂作業には多くの研究者との共同作業を要するため、頻繁に打ち合わせと研究会をもった。代表者・各分担者が研究会においてこれまでの研究経過を報告した。また、来日中のPeter Skilling氏(タイにおける貝葉写本の収集と研究の権威)と打ち合わせ、来年度末の本研究への招聘を約束した。さらに、来日中のハンブルク大学教授L.Schmithausen博士を招き、ジャータカに関する公開研究会を開催、本研究を近隣学界に周知し、協力を求めた。3.テキスト校訂作業:「パンニャーサ・ジャータカ」は50の物語よりなるが、大谷貝葉にはそのうちの26の物語が含まれている。本年度はその中の9編を選び、分担者・協力者が校訂作業に着手し、2月末までにそのローマナイズを完成した。この後、田辺所持のマイクロフィルム(AG本)との対照・校訂作業に入りつつある。4.代表者吉元は、本研究準備段階で完成したSurupa-jataka、また分担者田辺は、Sattadhanu-jatakaとSirivipulakitti-jatakaの校訂をもとにして、その訳注及び文献的・文化史的・思想的研究を実施し、多くの知見を得た。本研究では、昨年度に続き、基礎作業として、大谷大学図書館所蔵のパーリ語貝葉写本中の「パンニャーサ・ジャータカ」のローマナイズ作業を実施し、本学に所蔵する26ジャータカすべてのローマナイズを完了した。その内の9種のジャータカを選び、田辺博士将来のバンコック市立図書館所蔵の貝葉写本数種との校合作業を実施し、以下のような経過と成果を得た。1.東南アジア貝葉写本研究の権威Peter Skilling氏の招聘:約10日間の招聘期間中に、貝葉校訂上の諸問題について相談し、多くの知見を得た。Skilling氏は、本研究に関連する多数の現地で収集した稀覯資料を将来し、提供した。3.研究会の開催:月1度の定例研究会と数回の研究打合会を実施し、各担当者の発表と作業上の諸問題の打ち合わせをした。4.校訂作業の実施:各自分担部分の校訂作業を実施し、担当部分の翻訳も実施しつつある。5.研究成果の発表:代表者吉元は、スイス・ローザンヌで開催された国際会議に出席し、下記の口頭発表を行い、さらに別紙のごとく日本語による論文発表も行った。また、分担者長崎、田辺、高井もそれぞれの分野から研究をなし、口頭・論文発表を実施した。

本研究は、大谷大学図書館に蔵されている東南アジア地域所伝の膨大な南方仏教貝葉写本(以下<大谷貝葉>)の中で、特に稀覯写本と思われる一連のPannasa jataka(50ジャータカ)といわれるパーリ語文献群の体系的、文献的研究である。この50ジャータカのうち、大谷貝葉には26種のジャータカが収められているが、そのうちの9ジャータカをローマナイズし、田辺博士招来のバンコック国立図書館所蔵のマイクロフィルムと校合して校訂及びその翻訳研究をほぼ完成することができた。それをもとにして、代表者を中心に、分担者、協力者の協力を得て、以下のような作業を実施し、成果を得た。1)上記資料のローマナイズ対校版と試訳作成。2)クメール文字によるジャータカに関する資料収集。3)タイにおけるジャータカ等の仏教文学の伝播地域と<大谷貝葉>流伝地域の関係研究、資料収集。5)パンニャーサジャータカに関するタイ語による研究文献の翻訳。6)毎月研究会を実施し、代表者・分担者それぞれ研究論文を発表。上記成果をとりまとめて、研究成果報告書として提出する。
ウイルスの生活環における脂質の役割に関する解析

本研究ではC型肝炎ウイルス(HCV)粒子の感染、粒子形成における脂質の役割を明らかにすることを目的とした。成熟HCV粒子表面にはコレステロール、スフィンゴ脂質が存在したことから、HCV粒子が脂質ラフトを含む膜を被っている可能性が示された。HCV粒子形成過程における脂質の関与を解析したところ、ウイルスが存在する分画は脂肪滴分画と一致した。HCV蛋白を含む脂肪滴近傍の脂質に富んだ生体膜分画と精製脂肪滴分画で比較プロテオーム解析を行うことで、HCV粒子形成の"場"に存在する蛋白が検出された。本研究で見いだしたウイルス粒子関連脂質および蛋白質はC型肝炎治療薬開発の新たな標的となる可能性がある。本研究では培養細胞で作製した感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子の膜脂質の性状を調べ,HCVの感染,粒子形成におけるウイルス膜脂質の役割を明らかにすることを目的とした。Huh-7細胞で産生されたHCV JFH-1株を,培養上清から限外濾過法,ショ糖密度勾配超遠心法,親和性クロマトグラフィ法により粗精製した。HCV粒子に含まれる脂質を生化学的に解析すると,HCV粒子にコレステロールが濃縮されている可能性が示唆された。そこで,膜からコレステロールを除去するメチル-β-シクロデキストリン(B-CD)でHCV粒子を処理すると,HCV粒子の密度が増加し,感染性が顕著に低下した。B-CD処理後のHCV粒子にコレステロールを添加したところ,HCV粒子の密度および感染性が回復した。また,膜のスフィンゴミエリンを加水分解する作用のあるスフィンゴミエリン分解酵素(SMase)でHCV粒子を処理すると,感染性が減弱した。これらの薬剤のウイルス感染の初期過程に与える影響を解析した。粒子をB-CD処理,あるいはSMase処理しても,HCV粒子の細胞へのBindingには影響を与えなかったものの,B-CD処理,SMase処理いずれもInternalization効率が著名に低下した。以上から,ウイルス粒子の膜脂質のコレステロールとスフィンゴミエリンが感染初期過程に重要な役割を果たしていることが示された。これらの脂質はラフト様マイクロドメインの主要構成成分であることから,HCV粒子が脂質ラフトを含む膜を被っている可能性が示唆された。成熟したHCVの粒子表面にはコレステロール,スフィンゴ脂質が存在し,ウイルス感染に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。ウイルス粒子関連脂質はC型肝炎治療薬開発の新たな標的となる可能性がある。本研究では培養細胞で作製した感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子の膜脂質の性状を調べ、HCVの感染、粒子形成におけるウイルス膜脂質の役割を明らかにすることを目的とした。昨年度の研究において、Huh-7細胞で産生された成熟したHCVの粒子表面にはコレステロール、スフィンゴ脂質が存在し、ウイルス感染に重要な役割を果たしていることを明らかとした。これらの脂質はラフト様マイクロドメインの主要構成成分であることから、HCV粒子が脂質ラフトを含む膜を被っている可能性が示唆された。今年度はHCV粒子形成過程における脂質の関与をさらに解析した。HCV粒子の生成過程には細胎内の脂肪滴の関与が報告されている。そこで感染細胞の生体膜をショ糖密度遠心勾配法で分画に分けたところ、HCV蛋白は本来生体膜が存在する密度の分画以外に軽い分画にも検出された。この分画は脂肪滴分画と一致したことから、脂肪滴近傍の脂質に富んだ生体膜を含む可能性がある。さらに、この分画から脂肪滴の精製を行うと生体膜蛋白とHCV蛋白が外れ、脂肪滴成分だけになった。HCV蛋白を含む脂肪滴近傍の脂質に富んだ生体膜分画と精製脂肪滴分画で比較プロテオーム解析を行うことで、HCV粒子形成の"場"に存在する蛋白の同定行い、約50個の候補蛋白が検出された。現在siRNAによるスクリーニングを進め関与する宿主因子の固定を試みている。ウイルス粒子関連脂質および蛋白質はC型肝炎治療薬開発の新たな標的となる可能性があると考えられた。
光感受性黒色素胞の光受容色素の検出

淡水魚カワムツZaccotemminckiの黒色素胞は光感受性をもつ。この光反応の誘起には520nm波長光が最も有効であった。このことは光受容色素としてロドプシン様物質の関与を示唆する(Naoraetal.1988)。本実験では、カワムツ黒色素胞にロドプシン様色素が存在するかを生化学的、免疫化学的に検討した。1.レチナールの検出:黒色素胞が顕著な暗反応を示すカワムツ12個体から、黒帯より背側の鱗をすべて摘出し、試料とした。Groenendijk等(1980)の方法により、膜分画、メラノソーム分画を作製し、高速液体クロマトグラフィにより、レチナールの検出を試みた。その結果では、レチナール様物質は確認できなかった。2.ロドブシン再生実験:膜分画にハーシスレチナールを加え、ロドプシンの再生がみられるかを、差スペクトル測定により検討した。この実験からも、ロドブシン様物質は検出されなかった。3.免疫組織学的手法による検出:本実験では、ロドプシン抗体の作製が遅れたため、ニワトリ・アイオドプシンモノクロン抗体を用い、免疫パーオキシターゼ法による免疫染色を行った。本抗体は、当然のことながら、ニワトリ錐体外節部を認識したが、本処理では、カワムツ網膜視細胞、黒色素胞はいずれも染色されなかった。この結果は、カワムツ視細胞の光受容色素はアイオドプシンではないこと。黒色素胞もアイオドプシンを含まないことを示す。本年度の実験からはカワムツ黒色素胞にロドプシン様物質の存在を実証することは出来なかった。今後の課題:1.分析に用いる試料の量を増やして再実験.2.試料中にβカロチンが含まれ(黄色素胞由来と思われる)、これがレチナールのピークを隠している可能性がある。試料中よりβカロチン除去法の検討。3.ロドプシンモノクロン抗体を用いての免疫組織学的実験.視細胞とも黒色素胞が同一光受容色素を利用している可能性は高い。本実験が最も急務な課題である。
知覚情報間「干渉構造」に着目した「マルチモーダル評価モデル」提案に関する実証研究

本研究は、嗅覚情報と視覚情報という複数の知覚情報による「マルチモーダル干渉」に着目した、「マルチモーダル評価モデル」の提案と妥当性検証を目的とした。課題1では、視覚情報と嗅覚情報刺激の定量化、および、主観的好みや経験の有無による付加的干渉要因の影響について検討した。課題2では、課題1で定量化した視・嗅覚情報刺激を用いて、知覚情報間の干渉による相互影響および範囲を明らかにした。結果では、「マルチモーダル評価モデル」に基づく、視・嗅覚といった複数の知覚情報の評価にて、好みや経験による影響は認められず、嗅覚情報の干渉が視覚情報より優先的に影響していることを明らかにした。本研究は、嗅覚情報と視覚情報という複数の知覚情報による「マルチモーダル干渉」に着目し、嗅覚刺激と視覚刺激が一致する際の知覚情報の影響(正の効果)並びに、嗅覚刺激と視刺激間の不一致による影響(負の効果)について検証することで、知覚情報の処理過程における嗅覚と視覚情報間の相互関係を明確に表す「マルチモーダル評価モデル」の提案、並びに、視覚情報における嗅覚刺激の活用に関する有効性の検討を目的とする。H28年度には、知覚情報間干渉に着目した評価モデルを提案する為に、嗅覚刺激と視刺激間の一致および不一致による(1)視覚情報に対する嗅覚情報の影響(2)色と形間の影響について検証した。具体的には、4種類の香り(シトラス類、フローラル類、ハーブ類及びウッド類)を用いて、味覚評価関連項目(甘さ、爽やかさ、酸っぱさ)視覚評価関連項目(重さ、明るさ)とともに好み、経験の有無との関連性について評価した。結果、嗅覚知覚における視覚情報の干渉は、好みや経験有無による影響はなく、視覚関連評価および味覚関連評価に影響することが分かった。H29年度には、当初予定した計画に(色と形の視覚要素間の干渉における知覚優先順位およびバイアスの影響検証)(3)嗅覚刺激のみの評価および視覚刺激のみの評価を検証に加え、嗅覚と視覚情報の影響の程度を定量化することで、嗅覚刺激と視覚刺激間の一致程度が知覚情報の評価に影響するか、影響するとしたら知覚情報の評価にどの程度の一致(もしくは不一致)条件から影響するかについて明確にすることを目指す。当初予定していた(1)視覚情報に対する嗅覚情報の影響(2)色と形間の影響度比較に加え、嗅覚刺激と視覚刺激間の一致程度に関する(3)嗅覚刺激のみの評価と視覚刺激のみの評価を検証に追加実施による知覚情報間干渉に着目した評価モデル提案の妥当性確認を計画しているため。本研究は、嗅覚情報と視覚情報という複数の知覚情報による「マルチモーダル干渉」に着目し、嗅覚刺激と視覚刺激が一致する際の知覚情報の影響(正の効果)並びに、嗅覚刺激と視刺激間の不一致による影響(負の効果)について検証することで、知覚情報の処理過程における嗅覚と視覚情報間の相互関係を明確に表す「マルチモーダル評価モデル」の提案、並びに、視覚情報における嗅覚刺激の活用に関する有効性の検討を目的とした。H29年度の研究では、知覚刺激ごと(嗅覚刺激のみと視覚刺激のみ)の影響度を定量化し、嗅覚刺激と視覚刺激が一致する際の知覚情報の影響(正の効果)並びに、嗅覚刺激と視刺激間の不一致による影響(負の効果)について(1)知覚情報間の一致程度による知覚情報の評価への影響有無(2)一致(もしくは不一致)条件との相関による影響を検証した。検証では、初年度の研究で使用した嗅覚情報と同様な4種類の香りと、香りのもととなる植物や果実等の写真を用いて、味覚評価関連項目(甘さ、爽やかさ、酸っぱさ)、視覚評価関連項目(重さ、明るさ)、主観評価関連項目(好み)について評価した。結果(1)嗅覚情報の中でも、視覚情報の評価へ影響するものは、よくないと評価した酸っぱい香り、よいと評価した甘い香り、よいと評価した明るい香りが、知覚情報の処理過程における評価に影響することがわかった。(2)よいと評価した甘い香りは、甘さに関する評価を除いた、全ての評価に干渉していることが明らかになった。なお(3)有意差の観られた3つの嗅覚情報(よくない酸っぱさ、よい甘さ、よい明るさ)の影響は、知覚情報間の一致可否に関わらず、知覚情報の処理過程における評価に影響して、マルチモーダル評価へ干渉していることが確認された。H29年度の研究では、基本的にH28年度に実施した視覚情報に対する嗅覚情報の影響に関する検証の継続実施に、色と形の視覚要素間の干渉における知覚優先順位とバイアスの影響、並びに、知覚情報間干渉への影響度の定量化を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。感性情報学29年度が最終年度であるため、記入しない。
血中マラリア原虫感染細胞を同定する赤血球アレイのためのマイクロ流体デバイスの作製

最終年度である本年度は、偏性細胞内寄生体である原虫細胞を用い,宿主細胞内への過程を観察するマイクロ加工デバイスを二種類、作製した。用いた原虫はトキソプラズマ原虫と呼ばれる寄生性細胞であり、培養が非常に困難なマラリア原虫と同じ類に属することから、細胞内外で発現されるタンパク質と類似性が高く、マラリア原虫の感染モデルとして研究が行われている。原虫は感染性微生物であり、特別な実験培養設備が必要であるため、東京慈恵会医科大学熱帯医学講座研究室における研究設備の使用を申し出、許諾されている。宿主細胞を生体適合性の高いポリマーであるポリパラキシレン(Parylene)を微細加工技術を用いて、ナノサイズの厚みとマイクロサイズの幅を持つ構造体を作製し、細胞接着性タンパク質をパターニングした。宿主細胞にはヒト由来繊維芽細胞であるHFF細胞を用い、マイクロ構造体の平面上においてパターニングできるか否かを試みた。また磁場応答性の金属を蒸着してパターニングすることにより,外部磁場を与えることで遠隔的に細胞の位置や向きなどの制御とハンドリングが可能なデバイスに加工した。形状として二種類あり、一つは単一細胞をハンドリングする直径50μm以下のマイクロプレートと多細胞をハンドリング可能なマイクロディスクである。これにより原虫が宿主細胞内へ侵入し、感染する現象を顕微鏡下で観察でき、かつ単一細胞レベルでも多細胞レベルでも両方ハンドリングできるデバイスを作製した。本研究の成果により、これまで不可能であったマイクロサイズの非常に小さな微生物の宿主細胞への侵入過程の詳細な映像と侵入中に宿主細胞の細胞骨格と相互作用を行うことを示す共焦点顕微鏡画像を取得に成功した。本研究の成果は、これまで細胞内に溶け込み血中内抗体などの攻撃を回避する性質をもつことで困難であった細胞内寄生性微生物の観察に秀でており、今回用いたトキソプラズマ原虫にとどまらず、マラリア原虫やバベシア原虫などの他の寄生虫、また赤痢菌などの細菌類の細胞内寄生メカニズムの解析にも応用が可能である。また研究のための実験系の確立だけでなく、さらなる光学系の付加により感染診断キットへの応用の基礎となることが期待される。(抄録なし)(抄録なし)本年度は、偏性細胞内寄生体である原虫細胞を用い、宿主細胞内への過程を観察するマイクロ加工デバイスを作製した。また磁場応答性の金属を蒸着してパターニングすることにより、外部磁場を与えることで遠隔的に細胞の位置や向きなどの制御とハンドリングが可能なデバイスに加工した。これにより原虫が宿主細胞内へ侵入し、感染する現象を顕微鏡下で観察できるデバイスを作製した。本研究の成果により、これまで不可能であったマイクロサイズの非常に小さな微生物の宿主細胞への侵入過程の詳細な映像取得に成功した。また研究のための実験系の確立だけでなく、さらなる光学系の付加により感染診断キットへの応用の基盤となることが期待される。本年度での研究成果として、寄生虫がいかに宿主細胞に侵入していくかを解析するマイクロ加工デバイスを二種類作製した。これまで、寄生虫感染メカニズムの解明のため、様々な角度から侵入を観察することが求められてきた。ただ既存の細胞培養の手法では細胞はディッシュなどの二次元上に培養され、培養液中に懸濁された寄生虫体が膜に垂直に侵入していくため、顕微鏡の光軸と侵入方向が同軸上に存在し、細胞間の境界面を捉えることが困難であった。そこで我々は接着性細胞の接着性を保存しつつハンドリングし、培養方面を自由自在に変化させることが可能な培養基盤を作製した。これは二種類の大きさをもっており、宿主細胞を多細胞レベルと単一細胞レベルのどちらでもハンドリングが可能となるよう設計されている。一方は細胞培養平面がガラス基板とヒンジにより結ばれており。培養平面内に磁場応答性の金属であるパーマロイをパターニングすることにより外部磁場に応答することによって任意の方向に細胞が多細胞体として同一のタイミングでアラインされる「マイクロフラップ」と呼ばれるデバイスである。またもう一方のデバイスでは、細胞の生育面積を制限することにより単一細胞のみがそこに接着し培養される「マイクロプレート」を作製し、一つの細胞を隔離しながらその培養面積の制限を行い、かつ細胞の形状を変化させた状態を維持しながらハンドリングを行うことに成功した。