hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Wntシグナル経路を介したCdh1による大腸癌浸潤・転移の制御

Cdh1の生体での役割を検討するために、Cdh1の9つのリン酸化部位をすべて変異させたマウスを作製した。Cdh1は非リン酸化により活性化する性質があるため、ホモ変異マウスは生体すべてにおいてCdh1活性化状態にあると考えられる。また、コントロールマウスとしては、通常の野生型B6マウスでは厳密なコントロールマウスとは言えず、同じ遺伝子操作を経て作り出した野生型マウスを用意する必要があった。そして、その野生型コントロールマウスの作製にも成功した。これらのマウスに大腸癌発癌モデルであるAOM-DSS実験を行った。すなわち発癌物質であるAOMを腹腔内投与し、その1週間後2週間後に炎症作用のあるDSSを飲水させた。その結果、コントロールマウス、Cdh1活性型マウスともに短期間の下血が見られ、その後は一時的に減少した体重も回復し始めた。さらに10週以上の経過観察期間ののち、まずコントロールマウスについて開腹し、大腸について調べたところ、肛門に近い大腸にポリープを数個形成しており、本マウスにおいてもAOM-DSSの実験系が機能していることを確認した。現在、Cdh1ホモ活性型マウスについてはまだ経過観察期間中であり、大腸の解析ができていないが、コントロールマウスと比較すると体重減少率が大きいという結果が得られている。この結果より、コントロールよりも多くの大腸ポリープを形成している可能性が考えられる。一方、in vitro実験では、アレイ結果に基づいてCdh1発現を変化させた大腸癌細胞株における実際のWntファミリーの発現をqPCRで解析した。古典的Wnt経路であるWnt 3A、9Aの発現が上昇していることを確認した。Cdh1ヘテロ変異マウスの同士の交配により、ホモ変異マウスの作製を行った。しかし、産仔が生まれる確率が低く、さらに雄のCdh1ホモ変異型マウスには妊孕性がないことが判明した。これらの解析に時間を要したが、途中からホモ変異型の雌とヘテロ変異型の雄を交配することで、ホモ変異型産仔を得る確率を上げることができた。また、大腸癌発癌実験系であるAOM-DSSを行ったが、適切なDSS濃度を定めることに時間を要した。すなわち、一般的に用いられている2%DSSを飲水させたところ、早期にマウスが死亡し、本実験で使用するマウスにおいてはDSSの濃度が濃すぎる結果であった。その後、条件検討を行い、1.5%DSSであればマウスが死亡することなく腸炎を起こし、大腸腫瘍を形成することを確認した。現在、上記のCdh1リン酸化抑制型ヘテロ変異マウスが離乳している。今後は交配によりホモ変異マウスを選び出し、化学発癌物質であるアゾキシメタン(AOM)の腹腔内投与後、2%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を飲水させる大腸発癌実験を行う。Cdh1リン酸化抑制マウスとコントロールマウスの大腸に発生した腫瘍を詳細に比較し、大腸癌発生におけるCdh1リン酸化の役割を明らかにする。Cdh1ホモ変異型マウスと、コントロールとなるマウスを得る方法を確立したため、現在、順調に大腸癌発癌実験が進行中である。今後は、解析数を増やすことで、Cdh1の活性化が大腸癌発癌に及ぼす影響が明らかになることが予想される。Cdh1の活性化により大腸腫瘍の発生が増加するという結果が確かになった場合、その理由を明らかにする必要がある。
異核種同時分離画像化法による生体内レドックス動態解析

本研究は、これまでの研究成果をさらに発展させ、疾患モデル動物の生体内での機能の違いを如何に画像解析できるかに着目して研究を計画した。生体内細胞レベルでの機能の違いを画像解析するには、現段階では造影剤に種々機能を持たせ、その違いを画像解析することで達成できる。昨年度までに、性質の異なる造影剤の窒素核を14N、15Nでそれぞれ標識することで、異なる造影剤を同時に分離して画像解析できる可能性を示した。また、本手法が動物レベルでも応用可能であることも明らかにした。これらニトロキシルラジカルは、フリーラジカルと高い反応性を有し、生体内フリーラジカル反応を追跡するための造影剤や抗酸化剤として開発が進められている。しかしながら、ニトロキシルラジカルは、生体内還元物質であるアスコルビン酸とも反応するなどといった問題点があり、生体で用いるにはこれを回避した化合物の開発が必要である。そこで、本年度は、ニトロキシルラジカルのラジカル周辺部分の構造に着目し、ニトロキシルラジカルの新規合成経路の確立とその評価を目的とした。2,2,6,6,テトラメチル-4-ピペリドンとシクロヘキサノンなどのケトン体とを反応させ、2、6位置換基誘導体ニトロキシルラジカルを合成した。合成した化合物は、X-band ESR等を用いて・OHやアスコルビン酸との反応性を解析した。2,2,6,6,テトラメチル-4-ピペリドンの3,5-位の活性メチレンがカルボニル化合物と容易にアルドール反応し、続いて、Grob fragmentationによるピペリジン環の開裂、更にアンモニアの付加による新ピペリドン環のone step合成などにより、2,6置換ピペリドン体の新合成法に成功した。一方。アスコルビン酸や・OHとの反応性を検討した結果、アスコルビン酸とほとんど反応せずに、・OHラジカルと高い反応性を有する化合物、あるいは、アスコルビン酸と高い反応性を有する化合物を見いだした。以上の結果より、ニトロキシルラジカルの2,6位の置換基を誘導体化することで、フリーラジカルや還元物質と様々な反応性を有する化合物を開発できる可能性を示した。そこで、擬似試料としてアスコルビン酸含有リポソームを作成し、性質の異なる造影剤として膜透過性あるいは、非膜透過性造影剤の窒素核を14N、15Nで標識し、そのESR共鳴点を選択的に励起し、水素核でのオーバーハウザー効果を検出した。その結果、14N、15Nで標識した造影剤を区別して画像化でき、さらに膜透過性を持つ造影剤でのみ、経時的に画像強度が減少した。これは、膜透過性の造影剤がリポソーム内のアスコルビン酸と反応し、その機能を消失する過程を追跡できたことを意味する。すなわち、リポソーム膜内・外を区別して画像解析することに成功した。また造影剤であるニトロキシルラジカルの還元体であるヒドロキシルアミン体を合成し、14N、15Nで標識したところ、擬似試料中で酸化・還元の両反応を追跡できることを示した。さらに正常動物を用いて本手法が有用であることを示し報告した(PNAS)。また、さらなる高感度画像化を図るために、ニトロキシルラジカルの水素核を重水素化したところ、約30%の画像強度の高感度化に成功した。これは、水素と重水素の磁気回転比が約6倍であることとも一致し、Oxo-TEMPOの重水素体では他のものに比べ約3倍の高感度化ができた。一方、酸化ストレス疾患モデルとして、ニトロソアミン誘発肝癌モデルラットを作成し、酸化ストレスとフリーラジカルの関与を検討した。その結果、酸化ストレスの指標である脂質過酸化を生じる前に、ラット肝細胞内ミクロソーム中で炭素中心ラジカルが生成していることをIn vivo ESR法、In vivo spin trapping法で明らかにした。さらにスピントラップ剤、スピンプローブ剤を投与することで、その後の脂質過酸化を抑制することを明らかにした(Free Radic.Biol.Med.)。以上の結果から、細胞内外移行性などの機能を持つ造影剤を同時分離画像化できることが可能となり、今後部位特異性を持つスピンプローブ剤を合成し酸化ストレス性疾患モデル動物に適用することで、疾患の成因・進展に関与するフリーラジカル反応を解析できると考えられる。

そこで、本年度は、ニトロキシルラジカルのラジカル周辺部分の構造に着目し、ニトロキシルラジカルの新規合成経路の確立とその評価を目的とした。2,2,6,6,テトラメチル-4-ピペリドンとシクロヘキサノンなどのケトン体とを反応させ、2、6位置換基誘導体ニトロキシルラジカルを合成した。合成した化合物は、X-band ESR等を用いて・OHやアスコルビン酸との反応性を解析した。2,2,6,6,テトラメチル-4-ピペリドンの3,5-位の活性メチレンがカルボニル化合物と容易にアルドール反応し、続いて、Grob fragmentationによるピペリジン環の開裂、更にアンモニアの付加による新ピペリドン環のone step合成などにより、2,6置換ピペリドン体の新合成法に成功した。一方。アスコルビン酸や・OHとの反応性を検討した結果、アスコルビン酸とほとんど反応せずに、・OHラジカルと高い反応性を有する化合物、あるいは、アスコルビン酸と高い反応性を有する化合物を見いだした。以上の結果より、ニトロキシルラジカルの2,6位の置換基を誘導体化することで、フリーラジカルや還元物質と様々な反応性を有する化合物を開発できる可能性を示した。
遺伝性前立腺疾患発症リスクに関わる単塩基遺伝子多型および責任遺伝子の同定

2年間の研究期間の2年目である平成17年度では、単塩基遺伝子多型(SNP)のスクリーニングを引き続き行った。家族性前立腺癌の責任遺伝子として同定されたMSR1遺伝子は非家族性前立腺癌の発症リスクとなるが、この遺伝子について日本人の家族性および非家族性前立腺癌および非前立腺癌患者において解析を継続した。日本人に特異的なSNPは同定されなかったが欧米で前立腺癌感受性とされたSNPの頻度が日本人では異なっており、前立腺癌発症の人種差を説明する一つの要因であることが示された。また、やはり家族性前立腺癌の責任遺伝子の一つであり非家族性前立腺癌発症リスクとなるRNASEL遺伝子についても同様の検討を行ったがこちらでも日本人に特異的なSNPは同定できなかったものの、欧米で前立腺癌感受性遺伝子とされたSNPの頻度が日本人では異なっており、前立腺癌罹患率の人種差を説明する一つの要因であることが示された。これらの成果については現在投稿準備中である。米国ジョンズホプキンス大学病院泌尿器科のWilliam B.Isaacs教授の研究室との共同研究で行ったKLF6遺伝子についてその解析結果を報告した(Narla G and Komiya A et al., Cancer Research : 2005)が、日本人についても解析を行ったものの、この遺伝子については有意な結果は得られていない。以上の結果から欧米で家族性前立腺前立腺癌より同定され、前立腺癌感受性遺伝子とされている遺伝子群のSNPの頻度は日本人の家族性および非家族性前立腺癌では異なっており、疾患発症リスクをあげるとされるSNPは日本人の間では有意な結果は得られていない。これらから、日本人の前立腺癌発症のメカニズムは欧米とは異なっているということが推察されるがこのメカニズムの解明は今後の課題である。2年間の研究期間の1年目である平成16年度ではまず、単塩基遺伝子多型(SNP)同定のための主要な解析装置である自動シークエンサーの導入とセットアップ、操作方法の最適化を行つた。それと同時に家族性前立腺癌の責任遺伝子として同定したMSR1遺伝子について日本人の家族性および非家族性前立腺癌および非前立腺癌患者において解析を行った。前立腺癌に特異的なSNPは同定されなかったが欧米で前立腺癌感受性遺伝子とされたSNPの頻度が日本人では異なっており、前立腺癌罹患率の人種差を説明する一つの要因であることが示された。また、やはり家族性前立腺癌の責任遺伝子の一つであるRNASEL遺伝子についても同様の検討を行ったがこちらでは有意な結果が得られなかった。米国ジョンズホプキンス大学病院泌尿器科のWilliam B.Isaacs教授の研究室との共同研究で行ったKLF6遺伝子についてその解析結果を報告した(Narla G and Komiya A et al., Cancer Research:2005)。KLF6遺伝子はp53遺伝子を介さずにp21遺伝子を活性化することにより細胞増殖を抑制して癌抑制遺伝子として働くが、前立腺癌を始め複数の悪性腫瘍での遺伝子変異が報告されている。最も高頻度のSNPであるIVS1-27G>Aは、alternative splicingを引き起こすことにより2つのsplicing variantを生じこれらによりKLF6遺伝子の活性が低下し、続いてp21遺伝子の活性化を妨げることにより癌抑制遺伝子としての機能を失う。前立腺癌患者および非前立腺癌症例それぞれ1000例以上を対象とした症例対照研究を同時に行ったが、IVS1-27G>Aが家族性および非家族性の前立腺癌の発症リスクを実際に上昇させていた。
地球表層物質に吸着した重金属イオンの高分解能分析手法の確立とその吸着機構の解明

その社会的重要性を考慮し,2011年3月の福島第一原発事故で発生した放射性セシウム(Cs)による土壌放射能汚染の鉱物学的解明を中心に研究を進めた。そして4年間の研究期間中に多くの重要な研究成果を得ることができた。特に新たなオートラジオグラフィと電子顕微鏡による分析手法を組み合わせることで、花崗岩中の黒雲母が一部バーミキュライト化した“風化黒雲母"が主要なCsの吸着・固定物質であることが明らかとなった。またアイソトープを用いた微量なセシウムの吸着実験もこの結果を支持した。さらにこの風化黒雲母に固定された放射性セシウムは、様々な電解質溶液によるイオン交換では取り出せないことが明らかになった。その社会的重要性・緊急性を考慮し,本年度は福島原発事故で飛散した放射性核種の土壌汚染について集中的に研究を進めた.事故で飛散した放射性の137Cs(セシウム)は,土壌中の粘土鉱物に強く吸着していると考えられているが,はたしてどのような物質あるいは鉱物種に吸着しているかは未だはっきりした知見が出ていない.そこで福島県飯舘村で採取した水田表層の土壌を乾燥・分級し,2045μmのサイズに分級した土壌粒子に溶液中でCsイオンを吸着させた.これを回収・乾燥させ,ハンドプレスでペレット状に成形した後,研究室ですでに確立しているEPMA→SEM-EDS→FIB→TEMという分析プロセスを用いて,Csを高濃度で吸着している鉱物粒子を同定・分析した.その結果Al-Fe系のスメクタイトと,おそらく黒雲母の風化で形成されたバーミキュライトに高濃度のCsが吸着していることが明らかになった.バーミキュライトでは層間にイオン交換の形でCsが取り込まれていることが高分解能TEM/STEMによって確認された.一方このように実験で高濃度のCsを吸着した鉱物種が,実際の福島汚染地域のように非常に低濃度の放射性Csを吸着している保証はない.そこでイメージングプレート(IP)を記録媒体としたオートラジオグラフィーにより,放射能性土壌粒子を特定・分析し,その鉱物種を決定する実験手法の確立に着手した.特にIPを感光させた土壌粒子を光学顕微鏡あるいは走査電子顕微鏡の下で同定するため、IP上に方眼の目盛りを形成する方法を検討中である。また高分解能TEM/STEMで、雲母中の層間にイオン交換で固定されたCsがどのようなコントラストで観察されるか理論的考察を行った。今年度は備品として導入した真空ピンセットとマニピュレータにより、IPオートラジオグラフィーで特定した放射性土壌粒子の迅速な採集が可能となった。この手法を用いて福島県森林の放射能の高い腐葉土中の放射性土壌粒子を観察・分析した。この結果、放射性粒子は大きく3つ(鉱物微粒子の凝集体、有機物ー粘土鉱物複合体、花崗岩起源の風化黒雲母)に分類できた。最初の鉱物凝集体においては、その解析の結果やはり粘土鉱物が主要な鉱物種と考えられた。次の有機物ー粘土鉱物複合体では、有機物を溶解した後に放射能を測定してもその強度があまり減じないことより、放射性Csは有機物ではなく、粘土鉱物に吸着していることが示唆された。最後に花崗岩起源の風化黒雲母については、形態は板状の単結晶のように見えるが、その断面を見ると風化により高密度の劈開をもつポーラスな構造を取り、そこにカオリン鉱物や水酸化鉄が沈着したものがほとんどであった。集束イオンビームにより板状結晶粒子のエッジ部分をトリミングしても放射能は大きく低下しないことから、放射性Csはこれまで提案されてきたように風化雲母のエッジ部分に多く吸着しているのではなく、おそらく劈開を通して板状粒子の内部にまで均一に吸着していると考えられた。これらの知見はまだ一地域の試料からのものに過ぎないが、放射性Csの土壌粒子への吸着の実態を微視的なレベルで初めて明らかにしたものであり、今後他の地域の試料等に対してもこのような解析を行うことで、福島の放射能汚染の実態がわかってくると思われる。一方今年度は福島花崗岩体の風化度の異なる風化黒雲母へのCs吸着実験を行い、溶液中のCs濃度が小さい場合はバーミキュライト層のみにCsが入ることを主に電子顕微鏡観察から明らかにした。また高分解能TEM/STEMによる雲母結晶中のCsの可視化方法について考察を加え、これを論文として公表した。今年度もIPオートラジオグラフィーと電子顕微鏡による観察・分析によって福島における放射性土壌粒子の特定とその解析を続けた。今年度は福島県大熊町の造成地から高放射線量の土壌を入手することができたので、その中の放射性土壌粒子を特定した。その解析の結果、半分以上の放射性土壌粒子は風化黒雲母であることが明かとなり、前年度までの結果とともに、この鉱物が放射性セシウムの吸着・固定物質として主要なものであることが明らかとなった。今年度はさらにJAEAとの共同研究によって、収集した放射性土壌粒子の構造や鉱物を、Spring-8の放射光を用いた微小領域X線回折により解析した。風化黒雲母の放射性粒子については、あまりバーミキュライト化していないものとバーミキュライト化が進んだもの、さらにカオリナイトが結晶方位を揃えて共存するものなど、様々な風化段階のものがあることが明かとなった。

また細粒な鉱物粒子の集合体となっている土壌団粒や有機物が主体の粒子において非常に微細なスメクタイトと考えられる回折パターンを確認することができた。このスメクタイトはその解析の結果2八面体型で鉄を含むと考えられ、2年前に福島飯舘村の水田土壌への吸着実験でセシウムをよく吸着したスメクタイトと同じものである可能性が高い。この他に今年度は東京大学大学院農学生命科学研究科の中西研究室の協力を得て、セシウムのラジオアイソトープを用いて福島の実汚染と同じような低濃度においてどのような粘土鉱物にセシウムがつくかを調べる実験に着手した。様々な粘土鉱物がひとつの溶液に共存した場合、風化黒雲母の中でも特に著しくバーミキュライト化したものが、他の粘土鉱物より圧倒的にセシウムを吸着することが明らかになり、これまでの実土壌で得られた結果を支持するものとなった。今年度は昨年度に引き続き、東京大学大学院農学生命研究科の施設を利用して、ラジオアイソトープ(137Cs)を用いて実際の放射能汚染と同程度の濃度で土壌中鉱物へのCs吸着実験を行い、IPオートラジオグラフィによってその吸着量を調べた。このときに数種類の土壌鉱物粒子を同じ基板上に並べ、これにCsを含む溶液を滴下するという条件(福島における雨滴から土壌へのCs吸着を想定したもの)で実験を行った。その結果、このような条件では福島で採取された風化黒雲母が他の一般的な土壌に比べ遥かに多くのCsを吸着することが明らかとなった。風化黒雲母以外では鉄含有スメクタイトが高い吸着能力を示したが、風化黒雲母と共存する場合はその吸着量は風化黒雲母に比べて圧倒的に少なかった。また風化黒雲母への吸着プロセスは、スメクタイト等に比べ時間をかけて進行することが明らかとなった。また137Csを吸着させた風化黒雲母と鉄含有スメクタイトから、さまざまな電解質溶液によってどのようにCsが溶脱するかを調べた。その結果、風化黒雲母に吸着したCsは酢酸アンモニウムや塩化セシウムなどではほとんど溶出せず、塩酸など珪酸塩層をある程度溶解することが予想される溶液でのみ、ある程度の溶出が認められた。これらの結果はスメクタイトと大きく異なり、一般的なイオン交換とは違う吸着・固定反応であることが明瞭となった。また風化黒雲母の塩酸によるCsの溶出は、その吸着時間が長いほど減少するという結果が得られ、時間とともにCsはより強く固定されていくことが示唆された。その社会的重要性を考慮し,2011年3月の福島第一原発事故で発生した放射性セシウム(Cs)による土壌放射能汚染の鉱物学的解明を中心に研究を進めた。そして4年間の研究期間中に多くの重要な研究成果を得ることができた。特に新たなオートラジオグラフィと電子顕微鏡による分析手法を組み合わせることで、花崗岩中の黒雲母が一部バーミキュライト化した“風化黒雲母"が主要なCsの吸着・固定物質であることが明らかとなった。またアイソトープを用いた微量なセシウムの吸着実験もこの結果を支持した。さらにこの風化黒雲母に固定された放射性セシウムは、様々な電解質溶液によるイオン交換では取り出せないことが明らかになった。「研究実績の概要」で述べたように、これまでのいろいろな学会等の研究発表を機会にしてJAEA、東京大学農学生命科学研究科や東北大学との共同研究が始まり、彼らのもつ研究手法を使うことにより様々な重要な結果を得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。鉱物学、物質科学
プロテオゲノミックスの創成

本研究では、神経細胞がシナプスを形成する過程をin vivoで可視化し観察出来るゼブラフィッシュを用いて、精神遅滞の原因遺伝子の一つであるIL1RAPL1が嗅神経細胞軸索の終末におけるシナプス小胞の集積と形態変化を制御していることを明らかにした.さらに、IL1RAPL1と結合する蛋白質をプロテオミクス解析で同定した.ゼブラフィッシュ機能解析系との組み合わせによるプロテオゲノミックス分野の開拓は、創薬の標的となる機能分子を提示することにより脳の機能障害や脳の発達障害などの克服に貢献するものと思われる.本研究では、神経細胞がシナプスを形成する過程をin vivoで可視化し観察出来るゼブラフィッシュを用いて、精神遅滞の原因遺伝子の一つであるIL1RAPL1が嗅神経細胞軸索の終末におけるシナプス小胞の集積と形態変化を制御していることを明らかにした.さらに、IL1RAPL1と結合する蛋白質をプロテオミクス解析で同定した.ゼブラフィッシュ機能解析系との組み合わせによるプロテオゲノミックス分野の開拓は、創薬の標的となる機能分子を提示することにより脳の機能障害や脳の発達障害などの克服に貢献するものと思われる.シナプス形成に伴い軸索終末が成熟する際にはシナプス小胞の軸索終末への集積や,形態変化が伴うことが知られている。シナプスの成熟期のゼブラフィッシュ嗅神経細胞軸索の終末では,Vesicle-associatedmembraneprotein2(VAMP2)-EGFP融合タンパク質によって可視化したシナプス小胞が集積し,GAP43-EGFPによって可視化した軸索終末の形態が複雑な形から単純な形へリモデリングする。すでに,軸索終末へのシナプス小胞の集積はAキナーゼ/CREBシグナルによって調節され,軸索終末分化に伴う形態変化(リモデリング)はカルシニューリン/NFATシグナルによって制御されることを明らかにしたが,これらを統御するシグナルを探求した。嗅神経細胞内でカルモジュリン阻害ペプチドを発現させるとシナプス小胞の集積とリモデリングの双方が阻害されることを見いだした。さらに内向き整流性カリウムチャンネルを発現させ神経細胞の発火を抑えるとりモデリングが抑制された。一方,イノシトール3リン酸5ホスファターゼを発現させ,小胞体からのカルシウム放出を抑制すると,シナプス小脳の集積が選択的に抑制されることがわかった。これらのことから,神経細胞の発火に伴う電位依存性カルシウムチャンネルを介したカルシウムシグナルがリモデリングを調節し,イノシトール3リン酸受容体を介した小胞体からのカルシウムシグナルがシナプス小胞の集積を調節することが示唆された。ゼブラフィッシュを用いた嗅神経細胞特異的分子操作法を開発し神経終末可視化法と組み合わせることにより、軸索終末へのシナプス小胞の集積と軸索終末分化に伴う形態変化(リモデリング)は異なるカルシウムシグナルにより制御されていることを明らかにした。また、精神遅滞の原因遺伝子であるInterleukin 1 receptor accessory protein like 1(IL1RAOL1)のゼブラフィッシュ相同遺伝子IL1RAPL1bを単離し、モルフォリーノアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてIL1RAPL1bの翻訳を抑制するとシナプス小胞の集積と軸索終末の形態変化が共に阻害されることを見いだした。さらに、TIRドメインからのシグナル伝達を阻害する点変異を導入したIL1RAPL1b(IL1RAPL1-P455H)を発現させると軸索終末の形態変化は阻害されたが、シナプス小胞の集積は阻害されなかった。野生型IL1RAPL1bの発現はシナプス小胞の集積を顕著に増加させたが、IL1RAPL1-P455H変異を導入してもシナプス小胞の集積の増加は影響されなかった。一方ドメイン構造のよく似たInterleukin 1 receptor accessory protein(lL1RAcP)とC末端ドメインをスワップした変異体はIL1RAPL1bによるシナプス小胞の集積を増加させる効果を消失した。これらのことから、lL1RAPL1はTIRドメインを介して軸索終末の形態変化を、一方C末端ドメインを介してシナプス小胞の集積を調節することが示唆された。さらに、IL1RAPL1と結合する蛋白質を単離し、質量分析系を用いて解析することにより10数個の結合分子を同定した。機能解析を進めており、プロテオミクス解析とゼブラフィッシュ機能解析の組み合わせが有効であることが示され、プロテオゲノミックスへの道を開くことができた。
マウスのインターロイキン8遺伝子のクローニング

マウスにおけるIL-8の遺伝子のクローニングによって明らかにすることを目的とした。1.^<32>PでラベルしたヒトおよびイヌIL-8遺伝子断片をプローブとして用い、制限酵素EcoRIで切断したマウス染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ヒトIL-8遺伝子にホモロジーのある断片(3.0kb)が検出された。2.一方、ヒト、イヌ、ブタおよびウサギIL-8遺伝子塩基配列の比較から、最もホモロジーの高い部分に対するPCR用プライマーを3対作成した。3.上のプライマーを用いて、マウス染色体DNAに対してPCRを行った。4.増幅された断片を^<32>Pでラベルし、マウス染色体に対しサザンハイブリダイゼーションを行ったが、1.で検出されたバンドと一致するものは検出されなかった。5.そこで、1.検出されたバンドをゲルから切り出し、E.coliにクローニングした。6.得られたクローンの塩基配列を決定したが、ヒト、イヌ、ブタおよびウサギIL-8のいずれともホモロジーは認められなかったマウスにおけるIL-8の遺伝子のクローニングによって明らかにすることを目的とした。6.得られたクローンの塩基配列を決定したが、ヒト、イヌ、ブタおよびウサギIL-8のいずれともホモロジーは認められなかった
コナジラミ伝搬性ウイルス激発のインドネシアに学ぶ総合防除法の確立とわが国への応用

わが国を含めた世界各地でコナジラミ伝搬性のジェミニウイルスとクリニウイルスによるウイルス病が大問題となっている。特に、露地でトマトやトウガラシを周年栽培しているインドネシアでは激発しているので、その病原ウイルスの解明と防除法の確立を目指した。その結果、わが国およびインドネシアでは未記載のトマトクロロシスウイルスを見出した。また、インドネシアではわが国の病原とは別種のウイルスも見出された。コナジラミ伝搬性ウイルスについて、激発するインドネシアと日本とを比較しながら最終的には有効な総合防除法を確立することを目的とし、平成20年度は初年度で以下の成果が得られた。(1)まずインしドネシアへ採集に赴き、タバユユナジラミ伝搬でジェミニウイルス科ベゴモウイールス属のべッパー黄化葉巻ウイルス(Peppery yellow leaf curl indonesia virus:PepYLCIDV)と、オンシツコナジラミ伝搬でクロステロウイルス科クリニウイルス属のトマインフェクシャスイエ。ロースウイルス(Tomato infectious chlorosis virus:TICV)を採集した。(2)インドネシアで圃場試験を行った。これには西部ジャワ・ボゴール市・ボゴール農科大学のグディ・スアスティカ博士と、中部ジャワ・ジョクジャカルタ市・ガジャマダ大学農学のセディヨ・ハルトノ博士が海外共同研究者として参画している。この中で、タバココナジラミとオンシツコナジデミ'を採集じだ。また3箇所の異なった場所で実験圃場を設げ、コナジラミの飛来を防ぐための障壁植物の種類、高さ、密度、および防虫ネットの高さ、目の細かさなどの農業資材について、インドネシア産の資材を多数用いで防除法を検討している。さちに抵抗性の6品種を定植した。また、弱毒株の選抜を試みている。(3)本研究実施の過程で、初年度に日本やアジアでは未報告のトマトクロロシスウイルス(Tomato chlorosis virus: ToCV)を栃木県で発見して分離した。このToCYはクリニウイルス属で、TICV:と近縁である。そこで急遽、栃木県産ToCVについついても宿主範囲や病原性などを締し、インインドネシアでの発生状況に関して調査を開始した。コナジラミ伝搬性ウイルスについて、激発するインドネシアと日本とを比較しながち有効な総合防除法の確立を目的とし、平成21年度は初年度に引き続き研究を遂行し、以下のような成果が得られた。(1)インドネシアヘ採集に赴き、タバココナジラミ伝搬でジェミニウイルス科ベゴモウイルス属のペッパー黄化葉巻ウイルス(Pepper yellow leaf curl Indonesia virus : PepYLCIDV)と、オンシツコナジラミ伝搬でクロステロウイルス科クリニウイルス属のトマトインフェクシャスイエロースウイルス(Tomato infectious chlorosis virus : TICV)ならびにトマトクロロシスウイルス(Tomato chlorosis virus : ToCV)を採集し、塩基配列を決定した。(2)本年度もインドネシアで圃場試験を行った。これには西部ジャワ・ボゴール市・ボゴール農科大学のグディ・スアスティカ博士と、中部ジャワ・ジョクジャカルタ市・ガジャマダ大学農学部のセディヨ・ハルトノ博士が海外共同研究者として参画している。この中で、2箇所の異なった場所で実験圃場を設け、コナジラミの飛来を防ぐための障壁植物や防虫ネットの高さ、目の細かさなどについて、インドネセア産の資材で防除法を検討した。さらに抵抗性トマト5品種を定植し、抵抗性の差を確認した。(3)インドネシアにおいてPepYLCIDVの弱毒株の選抜を試みた。そこで、弱毒株の塩基配列も決定し、弱毒性を決定しているウイルス遺伝子を推定した。(4)初年度に日本やインドネシアで未報告のToCVを栃木県で発見し、分離した。そこで、栃木県産ToCVについて接種試験を行い、宿主範囲や媒介昆虫を明らかにし、RT-PCRでの検出方法を確立し、論文を投稿した。また、インドネシアではTICVより発生が少ないことを明らかにした。コナジラミ伝搬性ウイルスについて、激発するインドネシアと日本とを比較しながら有効な総合防除法の確立を目的とし、平成21年度は初年度に引き続き研究を遂行し、以下のような成果が得られた。(1)インドネシアへ採集に赴き、タバココナジラミ伝搬でジェミニウイルス科ベゴモウイルス属のペッパー黄化葉巻ウイルス(Pepper yellow leaf curl Indonesia virus:PepYLCIDV)と、オンシツコナジラミ伝搬でクロステロウイルス科クリニウイルス属のトマトインフェクシャスイエロースウイルス(Tamato infectrous chloros virus:TICV)ならびにトマトクロロシスウイルス(Tomato chlorosis virus:ToCV)を採集し、塩基配列を決定した。(2)本年度も引き続きインドネシアで圃場試験を行った。

この中で、コナジラミおよびウイルスの拡散を防ぐための障壁植物を検討したところ、インゲンマメなどよりもナスが最も効果が高いことが判明した。コナジラミの飛来を防ぐための防虫ネットは効果がなかった。さらに抵抗性トマト5品種を定植し、抵抗性の差を確認し、今後の品種育成に利用することとした。(3)インドネシアにおいて選抜したPepYLCIDVの弱毒株の塩基配列を決定し、弱毒性を決定しているウイルス遺伝子を推定した。現在はその感染性クローを作製して弱毒性の確認を行っている。(4)初年度に日本やインドネシアで未報告のToCVを栃木県で発見し、分離した。そこで、栃木県産ToCVについて接種試験を行い、宿主範囲や媒介昆虫を明らかにし、RT-PCRでの検出方法を確立し、論文を投稿した。また日本農業新聞にも掲載された。
象牙芽細胞の分化を決定する転写調節因子の遺伝子クローニング

象牙質形成因子(GDF11)の上流で特異的に転写を調節し象牙芽細胞への分化を決定づける転写調節因子の遺伝子クローニングを行った。すなわち、DNA結合ドメインの相同性の高い配列を基にしてホメオボックス遺伝子およびジンクフィンガープロテイン遺伝子のプライマーを各々3セット作製した。ラット切歯歯髄からRT-PCRを行い、遺伝子をクローニングし、遺伝子配列を決定した。その結果、ホメオボックス遺伝子としてLim3およびL3が、ジンクフィンガープロテインとしてGli1および新規の遺伝子、G23/Gli5が得られた。G23/Gli5はGliメンバーとジンクフィンガー領域で65%の相同性がみられた。ノーザンブロットの結果、歯牙の他に腎臓にも発現がみられた。whole mount in situではマウス胎生期の10.0日から上顎弓、下顎突起、四肢の前方部に発現し、11.5日ではwhisker follicleにも発現がみられた。歯牙の発生期においては鐘状期の歯髄に特異的に発現し、他のGliメンバーとは全く異なる発現パターンがみられた。G23/Gliの蛋白構造から、象牙芽細胞への分化を抑制している可能性が示唆された。一方腎臓においてはG23/Gli5の発現は12.5日からみられ、BMP7の発現と一致するも分化した糸球体ではG23/Gliの発現は消失し、やはり分化抑制因子としての機能が示唆された。さらに、マウス染色体遺伝子の配列からジーンターゲッティングを行い、このG23/Gli5の歯牙発生における機能を解析することを試みたが、単独のホモ欠失マウスでは表現型がみられなかった、これはGliメンバーは機能の相補性を有するためと考えられるため、現在、他のメンバーとのダブル欠失マウスの解析を行っている。象牙質形成因子(DMP-63/GDF11)の上流で特異的に転写を調節し象牙芽細胞への分化を決定づける転写調節因子の遺伝子クローニングを行った。4週齢のラット切歯歯髄からpo1y A^+ RNAを精製し、オリゴdTプライマーを用いて逆転写を行いfirst strand cDNAを得た。このcDNAを用いてPCRを行い、TA cloningsystemにより遺伝子をクローニングし、オートシーケンサーにて遺伝子配列を決定した。その結果、ホメオボックス遺伝子としてLim3およびL3が、ジンクフィンガープロテインとしてGli1および新規の遺伝子がクローニングされた。この新規の遺伝子(G23と命名)はGliメンバーとジンクフィンガー領域で65%の相同性がみられた。G23はDMP-63/GDF11の発現部位に隣接していることから、象牙芽細胞への分化を抑制している可能性が示唆された。一方腎臓においてはG23の発現は12.5日からみられ、BMP7の発現と一致するも、分化した糸球体ではG23の発現は消失し、やはり分化抑制因子としての機能が示唆された。現在マウス染色体遺伝子の配列からジーンターゲッティングを行い、このG23の歯牙発生における機能およびGDFllとの関連性をより詳細に検討している。

象牙質形成因子(GDF11)の上流で特異的に転写を調節し象牙芽細胞への分化を決定づける転写調節因子の遺伝子クローニングを行った。すなわち、DNA結合ドメインの相同性の高い配列を基にしてホメオボックス遺伝子およびジンクフィンガープロテイン遺伝子のプライマーを各々3セット作製した。ラット切歯歯髄からRT-PCRを行い、遺伝子をクローニングし、遺伝子配列を決定した。その結果、ホメオボックス遺伝子としてLim3およびL3が、ジンクフィンガープロテインとしてGli1および新規の遺伝子、G23/Gli5が得られた。G23/Gli5はGliメンバーとジンクフィンガー領域で65%の相同性がみられた。ノーザンブロットの結果、歯牙の他に腎臓にも発現がみられた。whole mount in situではマウス胎生期の10.0日から上顎弓、下顎突起、四肢の前方部に発現し、11.5日ではwhisker follicleにも発現がみられた。歯牙の発生期においては鐘状期の歯髄に特異的に発現し、他のGliメンバーとは全く異なる発現パターンがみられた。G23/Gli5の蛋白構造から、象牙芽細胞への分化を抑制している可能性が示唆された。一方腎臓においてはG23/Gli5の発現は12.5日からみられ、BMP7の発現と一致するも分化した糸球体ではG23/Gli5の発現は消失し、やはり分化抑制因子としての機能が示唆された。さらに、マウス染色体遺伝子の配列からジーンターゲッティングを行い、このG23/Gli5の歯牙発生における機能を解析することを試みたが、単独のホモ欠失マウスでは表現型がみられなかった。これは、Gliメンバーは機能の相補性を有するためと考えられるため、現在、他のメンバーとのダブル欠失マウスの解析を行っている。
食品中のアミノ酸成分による脳機能の増強と修復に関する研究

日常的に摂取される食品成分群の中に、生体高次機能を司る様々な細胞に対して作用し、我々の健康増進に貢献する機能性成分が数多くあることを、我が国の食品生化学者を中心とするグループが世界に先駆けて次々と明らかにしている。本研究において、発達期のマウス大脳組織を用いた神経生理学的スクリーニング解析を行い、含硫アミノ酸の一種であるタウリンに、脳回路の形成に対する促進作用があることを世界で始めて見出した。これまでは、脳のはたらきは、年をとるとともに衰える一方であると考えられてきたが、大人の脳回路においても、発達し続ける潜在能力が備わっていることを、我々も含め、多くの発達脳科学者らが示してきている。このため、発達期の脳において見出されたこの種の現象は、大人の脳においても十分にあてはまる普遍的な原理であると思われる。大人においても、タウリン投与により脳回路の発達あるいは再生が誘導されることが推定される。通常、脳血管関門のために、アミノ酸は脳内に拡散的に侵入することはできないが、タウリンに限っては、特異的な輸送体タンパクが、脳血管関門に存在しているため、容易に脳内に移送される。すなわち、経口的に摂取されたタウリンは、腸管・門脈系を経て血流に移行し、そして脳脊髄液中に容易に取り込まれることが推定される。食事中からのタウリン摂取により、加齢により衰えた神経ネットワークの機能が、再生可能であると思われる。少子高齢化社会を向かえた我が国において、高齢者の健康管理が重要な問題として位置付けられている。体力とともに、脳のはたらきも高いレベルで保っておきたいと、老いを前にした人たちの多くが、そう願っている。本研究によって、含硫アミノ酸の一種であるタウリンに、脳回路の再生を誘導するはたらきがあることが示唆されたことは、食品科学・栄養科学分野の研究として、非常に意義深いものと思われる。日常的に摂取する食品中に存在する成分が、生体高次機能を司る様々な細胞群に作用することにより、我々の健康増進に貢献することを、我が国の食品生化学者を中心とするグループが世界に先駆けて次々と明らかにしている。本研究では、食品中に存在するアミノ酸成分による脳機能の増強効果の解明を試みた。実験材料としてマウスの大脳皮質を用い、神経回路の形成過程に及ぼすアミノ酸成分の働きを解析した。神経回路の形成機構において、グルタミン酸受容体の一種であるNMDA型受容体が主要な役割を果たしていることが既に知られている。ただし、この受容体は通常不活性型となっているため、活性化に際して2次的なシグナルを必要とする。この2次的なシグナルを誘起するアミノ酸受容体として、γアミノ酪酸受容体およびグリシン受容体が候補として挙げられた。実験の結果、グリシン受容体の拮抗薬であるストリキニーネを用いた場合にのみ、NMDA型受容体を介した細胞シグナリングが阻害されることが判明した。本研究により、大脳皮質神経回路の形成過程において、アミノ酸受容体の一種であるグリシン受容体が必須の役割を果たしていることが世界で始めて示された。このグリシン受容体に結合するアミノ酸としてグリシンのほかにもタウリンおよびβアラニンが知られている。これらのアミノ酸が神経回路の形成過程を促進することにより脳機能の増強に貢献していることが推察される。

本研究において、発達期のマウス大脳組織を用いた神経生理学的スクリーニング解析を行い、含硫アミノ酸の一種であるタウリンに、脳回路の形成に対する促進作用があることを世界で始めて見出した。これまでは、脳のはたらきは、年をとるとともに衰える一方であると考えられてきたが、大人の脳回路においても、発達し続ける潜在能力が備わっていることを、我々も含め、多くの発達脳科学者らが示してきている。このため、発達期の脳において見出されたこの種の現象は、大人の脳においても十分にあてはまる普遍的な原理であると思われる。大人においても、タウリン投与により脳回路の発達あるいは再生が誘導されることが推定される。通常、脳血管関門のために、アミノ酸は脳内に拡散的に侵入することは、できないが、タウリンに限っては、特異的な輸送体タンパクが、脳血管関門に存在しているため、容易に脳内に移送される。すなわち、経口的に摂取されたタウリンは、腸管、門脈系を経て血流に移行し、そして脳脊髄液中に容易に取り込まれることが推定される。食事中からのタウリン摂取により、加齢により衰えた神経ネットワークの機能が、再生可能であると思われる。少子高齢化社会を向かえた我が国において、高齢者の健康管理が重要な問題として位置付けられている。体力とともに、脳のはたらきも高いレベルで保っておきたいと、老いを前にした人たちの多くが、そう願っている。本研究によって、含硫アミノ酸の一種であるタウリンに、脳回路の再生を誘導するはたらきがあることが示唆されたことは、食品科学、栄養科学分野の研究として、非常に意義深いものと思われる。
タイにおける小動物の進化に関する研究(第2次)

文部省科学研究費の援助を受けて平成6年からタイで行った第一次調査研究を引き継ぎ、本調査研究は、平成8年から9年の2年間にわたって同じくタイで実施された。今回の調査期間中、京都大学を中心とする調査隊は、平成8年10月6日11月3日(29日間)、平成9年1月5日26日(22日間)、平成9年5月21日6月1日(12日間)、平成9年8月17日9月7日間(22日間)の4回にわたってタイを訪れ、合計3ヵ月近くを費やして、チュラロンコン大学とタイ科学技術研究所の協力のもとに、甲虫類や陸貝、両生・爬虫類などの小動物の進化を探るため、種多様性に関する野外調査研究を行った。今回は特に、タイの諸地域の中でも、マレーシアやミャンマー、ベトナムやラオス、カンボジアなどの周辺諸国との関連において重要な地域を調査対象として選択することにより、第一次調査研究で得られた成果の一般性、特殊性を検討し、アジア熱帯域全体における小動物の進化の様相を明らかにする研究過程を前進させることを試みた。調査地域では両棲・爬虫類や昆虫類相を調査し、その多様性の現状を把握するとともに、カエル類の音声コミニュケーション、両生・爬虫類の体温調節と温度環境、核型調査、甲虫類の生活史と生息環境などを調査した。採集した標本試料は形態学的な比較検討を行ったほか、酵素やDNAを用いた遺伝・系統学的な研究にも用いられた。また、平成9年10月にはチュラロンコン大学のスタッフを日本に招へいし、調査研究の取りまとめを行うとともに、タイの小動物の多様性に関する研究集会を開催した。会議では、京都大学内外の多数の研究者の参加のもと、活発な議論が展開された。2年間にわたる詳細な調査研究によって、微小な昆虫類から巨大な蛇類に至る多様な生物における進化的多様性の実態に関する多くの興味深い事実が明らかとなった。平成8年度は秋季と冬季の2度に渡って、チュラロンコン大学、タイ王立森林省、タイ科学技術研究所の協力を得て、タイにおける小動物の進化に関して継続的な研究を行った。秋季は10月にラオス国境に近いタイ東北部(プウパン国立公園周辺)と中部(ケンカチャン国立公園周辺)で、また、冬季には1月にマレーシア国境に近いタイ南端部(カオチョン・カオルワン国立公園周辺)で野外調査と標本・試料の採集を行った。野外調査では、両棲・爬虫類や昆虫類相を調査し、その多様性を把握するとともに、カエルの音声コミュニケーションに関するデータや両棲・爬虫類の体温データを記録し、昆虫類、特にクワガタムシやクロツヤムシ類の生活様式を調査した。採集された両棲・爬虫類やクワガタムシ、クロツヤムシは核型を調べ、さらに酵素やDNAを用いた遺伝・系統学的な研究のために組織を冷凍保存し、日本へ持ち帰った。クワガタムシとクロツヤムシについては、幼虫と成虫の対応や生活史の解明のため、一部を農林水産省の許可を得て日本に持ち帰り飼育を続けている。こうした調査・研究によって現在までに、以下のような成果が得られ、すでに論文として投稿されている。1)タイ北部に産するヒキガエル科のコオロギヒキガエル(Ansonia)属の1種が北インドに生息する種に近い新種であることが判明した。この発見は生物地理学的にも大変興味深い。2)タイ東北部に産するミズトカゲ属の1種がベトナム産の種に近い新種であることが判明した。3)タイ中部に産するクロツヤムシ科Pelopides属の1種を新種として記載した。この他、多くのカエル、トカゲ、ヘビ類やクワガタムシ、クロツヤムシに関する分布や生活史などにおける新知見を得ている。

平成8年度のタイ東北部と中部の調査に引き続いて、平成9年度は、5月下旬のミャンマー・ラオス国境に近いタイ北部の亜熱帯照樹林域(ドイチェンダオ国立公園)を皮切りに、8月中-下旬にミャンマー国境の西端部の熱帯モンスーン域(ケンカチャン国立公園周辺)で、さらに9月上旬にはマレーシア国境の南部半島部の湿潤熱帯域(ヤラ-森林保護区周辺)で野外調査と標本試料の採集を行なった。これらの地域において、両棲・爬虫類や昆虫類相を調査し、その多様性の現状を把握するとともに、カエル類の音声コミュニケーション、両生爬虫類の体温調節と温度環境、核型調査、クワガタムシ・クロツヤムシの生活史と生息環境などを調査した。採集した標本試料は形態学的な検討を行うほか、一部の標本からは酵素やDNAを用いた遺伝・系統学的な研究のために組織を取り出し冷凍保存して日本へ持ち帰った。クワガタムシとクロツヤムシについては、生活史を詳しく解明するために一部を農林水産省の許可を得て日本に持ち帰り飼育実験を継続している。こうした調査・研究によって現在までに以下のような成果が得られ、論文にまとめられている。1)タイ北部からヒキガエル科のコオロギヒキガエル属の1新種を採集・記載し、北インド産の近縁種との関係をもとに同属の生物地理に関して論じた。2)タイ東北部よりベトナム産のものと近縁なミミズトカゲ属の1新種を採集・記載した。3)タイ各地から2種のマダラクワガタ属の新種を採集・記載し、同属の生物地理に関して論じた。4)タイ北部に生息するミツノクロツヤムシの1種のコロニー構成と生活史を報告し、同属の生息環境についてまとめた。このほか、カエル、トカゲ、ヘビ類やクワガタムシ、クロツヤムシの分布や生活史に関する多くの新知見を得ている。
光音響イメージングを用いた脳組織酸素飽和度画像化による脳虚血予測への応用

脳虚血再灌流の病態に対して、光音響画像による組織酸素の画像評価を行い、脳実質組織障害予測への有用性を明らかにするとともに、的確な治療を行うマーカーとしての意義を検討する予定であった。しかし、当初の予定よりも本研究に割けるエフォートが低下し、学会参加や文献調査等にて情報収集をおこない計画の練り直しを行うこととなった。近赤外光を用いた脳実質内ヘモグロビン酸素飽和度の測定に関しては、新生児領域では古典的に用いられており、酸素代謝量の関係から血流とは異なるパラメーターとしての知見が得られている。近赤外光及び超音波画像は、いずれも臨床的には経皮的に頭蓋内に到達可能であることから、近年注目されている新たな近赤外評価法である光音響画像を用いれば、脳酸素飽和度を画視化できる点から臨床普及の際に有利である。本年度はこのように光音響画像が最も有利に働く条件を模索した上で、側頭窩や耳介上部前方など骨の隙間から、あるいはコインサイズの穴を開けるなどの方法を脳解剖教室からの助言を仰ぎながら行う計画を再構成した。再計画では、動物モデルも、マウスかラットいずれかを検討したが、サイズの観点からやはりラットを用いることにした。虚血再灌流には助言を受けた上で、頭蓋内開頭による中大脳動脈のクリッピング、あるいは頚部皮膚切開により内頸動脈を確認した上でのクリッピングによるモデルを作成する計画とした。虚血後再灌流モデル作成の後、適宜血管造影撮像による血流画像の観察及び光音響画像による酸素飽和度の画像定量化、組織との対比を行う計画を再考した当初の予定よりも本研究に割けるエフォートが低下しており、さらに情報収集やラットの飼育環境整備に予定より多くの時間を費やし研究に遅れを来している。助言あるいは本年度の学会参加により得られた情報を参考に、光音響イメージングによる酸素飽和度の画像定量化を行い、脳組織を取り出し、ヘマトキシリンーエオジン染色、及びピモニダゾールによる低酸素免疫染色を行うことで、酸素飽和度による組織障害と光音響イメージングによる酸素飽和度、血管造影による血流画像の対比を行っていく。また、再灌流時にニトログリセリンやプロスタグランジン製剤といった血管拡張薬を投与した上での変化を評価し、その値を比較していきたいと考えている。研究計画の練り直しが必要となったことより実験計画からの遅れが生じ、次年度使用額が生じた。次年度には、本実験に用いるラットや抗体等の購入費用、学会参加のために使用したいと考えている。
肺葉切除ラット・モデルにおける肺胞再生機序に関する研究

実験動物における残存肺の代償再生の機序には不明の点が多い。本研究では以下の点の解明を目的とした。1)肺葉切除後,早期における代償性変化の形態学的,生化学的解明。2)代償性変化における年齢的影響の検討。3)代償機転の局所解剖学的反応差の検討,肺葉切除後,DNA polymerase活性は術後24時間で最も高く,以後,経時的に低下した。DNA polymeraseの分子種をpcクロマト法で解析すると肺葉切除群ではDNA polymerase αおよびβ活性の上昇がみとめられた。代償は変化を成熟ラット(4週齢)と幼若ラット(2週齢)の間で比較すると形態学的には差はなく,またDNA合成酵素系の活性にも差はみとめられなかった。S期細胞を同定する目的で抗Brdu抗体による色疫組織化学を実施した処,切除群で術後1日目では胸膜中皮細胞の染色率が対照群に比し有意に高く,次いで2日目では内皮細胞,間貭細胞の染色等の増加がみられた。このような細胞増殖に伴い,DNA量の増加がみられた。また肺elaston量の増加も平行し,術後3週目で1週目の約1.5倍となった。collagen量にも同様な傾向がみとめられた。肺葉切除(PNX)後,残存肺にみられる代償機転については不明の点が多い。PNX後の代償は年齢依存性であり老齢期よりも幼若期の方がより完全なる代償が成立することが知られている。そこで成熟肺胞が形成される以前の幼若ラットを用いてPNXを実施,代償機転の形態学的,生化学的検討を行った。(方法):生後2週齢のラットに左肺葉切除術施行(P群)。術後1,2,3,4週目に屠殺。対側肺(右側のみ)を対照群(両側肺)(C群)と比較した。(結果):体重は術後4週目までP,C間に有意差認めず。湿肺重量は1週目,肺容量は術後3週目にP,C群が略一致した。この時点での形態計測では平均肺胞壁間距離,肺内各構成成分の容積地率にはP,C両群間に差はなかった。また抗Brdu抗体による細胞増殖をみると術後1週目ではP群の胸膜中皮細胞の標識率がC群より高く,次いで2日目では内皮細胞,間質細胞の標識率の増加がみられた。DNA polymeraseはP群は術後1日目に鋭い増加をみとめ,更に術後1週目に再度の活性上昇をみた。DNA量はP群の術後3日目より増加,術後3週目でP,C群は一致した。collagen,elastin含量も同時期に両群で一致した。(考察及び結論):1)生後2週目ラットのPNXでは成熟ラットの場合と異なり代償された肺胞構造は正常に近いことが形態学的,生化学的に判明した。2)術後早期にみられる胸膜中皮細胞の増殖は,これが代償刺激の第一作用部位であることが示唆された。3)術後24時間でDNA polymerase活性の増加を認めたことから代償作用が術後早期に開始されることが推定された。肺葉切除後における残存肺の代償再生は年齢依存性であるといわれている。これまでの大部分の研究では成熟動物が実験に使用されていたため年齢の影響を明確にし得ないと考えられた。そこで本研究では生後2週目の幼若ラットに肺葉切除術を施行,残存肺における再生機序を検討した。残存肺の湿重量は術後1週目にて切除群(P群)の残存肺が対照群(C群)の両肺に一致。一方,肺容量は術後3週目で一致した。形態計測によって組織学的にも代償が行なわれていることが判明した。抗Brdu抗体によりS期細胞を同定した処,術後1日目ではP群の胸膜中皮細胞の摂取がC群よりも有意に多く,次いで2日目では内皮細胞,間貭細胞の摂取増加をみた。残存肺組織中のDNA polymerase活性はP群で術後1日目に鋭い増加を認め,その活性はC群の51%増(p<0.01)であった。更に術後1週目に再度活性上昇をみた。これは先の活性の68%であった。

DNA量は,P群がC群に比して術後3日目より1週目までに著明な増加がみられた(31.6%,p<0.01)。術後3週目にはP群残存肺とC群両肺のDNA量は一致し,細胞数での代償が示唆された。elastin含有量は比例して増加傾向を示し,P群では術後3週目で1週目の約1.5倍となった。肺乾燥重量当りのelastin含有量をみると,術後の経過時間に無関係にP群,C群とも一定であった。collagen含有量にもelastinと同様の傾向がみとめられた。
巨大磁気抵抗効果を示す金属間化合物の熱測定

遷移金属人工格子系で発見された巨大磁気抵抗効果が、近年、幾つかの希土類元素を含んだ金属間化合物でも観測されることが明らかとなってきた。両者に類似性があることから、その起源として同じメカニズムが考えられていた。本研究では、人工格子系では事実上不可能であるが金属間化合物では有力な研究手段となりうる比熱測定により、その巨大磁気抵抗効果を調べた。本研究では、巨大磁気抵抗効果が観測される金属間化合物として、UNiGaを中心に調べた。この化合物では、磁場印加によりその積層状態が、反強磁性的→強磁性的と変化するメタ磁性転移において約90%もの大きな負の巨大磁気抵抗が観測される。このメカニズムが何なのかが重要な問題であり、これまでに以下の二つの提案がなされた。つまり、(ア)同様な巨大磁気抵抗が観測されている人工格子系で提案されているスピン依存散乱、(イ)反強磁性状態でのフェルミ面上のスーパーゾーンギャップの形成である。本研究における大きな発見は、この転移で電子比熱係数が強磁性相で10%ほど増大することを初めて見出したことである。この変化は、明白にフェルミ面が変化していることを意味しており、後者の機構の直接的な証拠である。さらに、極低温で核比熱を観測し、Ga原子の核の有効磁場を求めた。この磁場から、反強磁性相での磁気構造を裏付けた。さらに本研究を、Eu、Smの希土類を含む金属間化合物に適用した。(「研究発表」参照)さらにこの様なメタ磁性転移における熱物性研究のため、定量的な磁気熱量効果測定方法の開発を進めた。CeRu2Si2における試験的実験により、磁気エントロピーの磁場依存測定が可能であることを示した。