hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼吸困難の定量的解析

平成4年度において低酸素の暴露期間が呼吸困難感に及ぼす影響を検討した。本研究組織者は他の科学研究補助金(国際学術研究:課題番号02041047)ヒマラヤ地域の高所極低酸素下における人体の順応機構に関する総合的研究の分担者であり、呼吸調節の研究を分担する際に中国チベット自治区ラサ市(標高約3700M)において高所滞在中の検討を行った。すなわち、ラサ市に2-3週間滞在し、慢性低酸素状態で高所順応し得た平地居住民を対象に平成3年度と同様に息こらえ行い、呼吸困難感をVAS(Visual analog scale)スケールで測定した。その結果、1.二酸化炭素は息こらえ時間には影響を及ぼさなかったが、呼吸困難感に対しては関与の程度が軽減された。このことは末梢化学受容器への刺激が持続するような慢性低酸素下では呼吸困難感を軽減させる別の因予が関与している可能性が示唆される。2.急性の低酸素は換気亢進に伴い肺胞気の二酸化炭素を低下させ、その上昇率を鈍化させる。一方、高所順応した慢性の低酸素状態では肺胞気の二酸化炭素は低下したままであっても、その上昇率は回復する傾向にあった。このことはまた、軽減された二酸化炭素の呼吸困難感に対する効果を相殺し、息こらえ時間に影響を与えなかったとも考えられる。以上より、呼吸困難感には、低酸素、二酸化炭素あるいは両刺激との相互作用による末梢化学受容器活動の増加、さらに二酸化炭素の体内蓄積量が関与することが示唆された。息こらえ中に呼吸困難感が増加し、息がこらえ切れなくなっても、肺胞内のガスを吐き出し、その呼気を再び吸うと、また息こらえが続けられる。そこで、呼吸困難感の増加度や息こらえ時間を左右するものは血液ガス(化学因子)と、その他に胸郭運動の停止という機械的(非化学因子)の両方の因子の関与が考えられる。呼吸困難は主観的な感覚であり、客観的評価が困難である。本研究では、息こらえ中の呼吸困難の化学因子と非化学因子を定量的に評価するためにvisual analog scale(VAS)を用いた。1.方法論とくに測定結果の再現性について本研究で用いた方法(VASスケ-ル)では息こらえ開始直後の呼吸困難感が全くない時を0とし、息がこらえきれなくなった時を最大値の100として両端が固定されており、その間の感覚も目安になる感覚が表示されてあるため、被検者自身の感覚を表現する際に個人内の再現性が良好であり、被検者間のばらつきも少なかった。2.末梢化学受容器活動の呼吸困難に及ぼす影響について呼吸調節に重要な役割を果している末梢化学受容器を薬物で刺激し、一定の低酸素状態をシミュ-レ-トした。薬物として塩酸ドキサプラムを0、0.8、1.6、2.4および3.2mg/kg/hrで点滴静注し、最後の10分間に息こらえを行った。この用量による低酸素刺激の程度は動脈血酸素飽和度で9580%に相当するものであった。呼吸困難感をVASで測定しつつ、息がこらえきれなくなったbreaking-pointで最大呼気を行い、これに伴うVASの低下度より化学および非化学因子の評価を行った。その結果として、息こらえ中のCO_2上昇による呼吸困難感の増加度はドキサプラム注入により増加した。すなわち、末梢化学受溶器活動の増加は呼吸困難感に対するCO_2の影響(化学因子)を増強することが示唆された。平成4年度においては低酸素の暴露期間が呼吸困難感に及ぼす影響を検討した。

すなわち、サラ市に2ー3週間滞在し、慢性低酸素状態で高所順応し得た平地居住民を対象に平成3年度と同様に息こらえを行い、呼吸困難感をVAS(Visual analog scale)スケールで測定した。その結果、1.二酸化炭素は息こらえ時間には影響を及ぼさなかったが、呼吸困難感に対してはその関与の程度が軽減された。このことは末梢化学受容器への刺激が持続するような慢性低酸素下では呼吸困難感を軽減させる別の因子が関与している可能性が示唆される。2.急性の低酸素は換気亢進に伴い肺胞気の二酸化炭素を低下させ、その上昇率を鈍化させる。一方、高所順応した慢性の低酸素状態では肺胞気の二酸化炭素は低下したままであっても、その上昇率は回復する傾向にあった。このことはまた、軽減された二酸化炭素の呼吸困難感に対する効果を相殺し、息こらえ時間に影響を与えなかったとも考えられる。以上より、呼吸困難感には、低酸素、二酸化炭素あるいは両刺激との相互作用による末梢化学受容器活動の増加、さらに二酸化炭素の体内蓄積量が関与することが示唆された。
新規N4およびPNN配位子の卑金属錯体を用いる触媒的不斉水素化反応の開発

光学活性化合物の実用的供給における「触媒的不斉水素化法」の有用性は言うまでもない.ルテニウム触媒を用いる野依不斉水素化を起点に、今では完全反応を実現したとしてよい.この流れの中で,貴金属錯体触媒から卑金属錯体触媒への転換が一つの課題となっている.本研究では,ジホスフィン配位子からの脱却を鍵として,その解決を目指す.独自に開発した窒素系配位子Ph-BINAN-H-PyおよびR-BINAN-Ph-PPh2のルテニウム錯体がケトン類の不斉水素化に高い機能を示すことを起点として,これら配位子をもつ各種卑金属錯体の合成,構造解析をおこない,触媒反応探索の物質基盤を確立した.最近,申請者らは「ピリジルメチルアミノ基( P y C H 2 N H-)」をビナフチル骨格に組み入れた,N 4型配位子P h - B I N A N - H - P y (Ph-N4)およびPNN型配位子Ph-BINA N-Py-PPh2 (Ph-PNN)を設計・合成し,cis-αおよびfac選択的に様々な正八面体金属錯体を形成することができることを見いだした.この特性は触媒活性種の単一化に有利に働くことが強く期待されるが,実際に.対応するルテニウム錯体が芳香族ケトン類やキレート性・非キレート性を問わず立体的に嵩高いケトン類を効率的に不斉水素化することにはじめて成功した.この化学を基盤とした卑金属錯体触媒の合成および高性能化を目的としている.本年度では,これら配位子をもつ卑金属錯体ライブラリーの構築およびその構造解析をおこなった.配位子のビナフチル骨格3位の置換基による反応性・選択性への影響は大きいと推測されるが,まずはフェニル基に定め, Ph-PNNをもつ各種卑金属錯体合成を試みた結果,鉄(II)において錯体を定量的に得ることに成功した.同時に,フェニル基を持たないH-PNNの鉄錯体の合成にも成功し,それらの錯体を結晶構造解析することによってフェニル基と錯体構造との関係性を明確にすることができた.H-PNN錯体においては,P,N,N配位原子と対アニオンの一つを底面とする四角錐構造をとるのに対して,Ph-PNN錯体では三方両錘をとる.Ph基とピリジルメチル基との立体反発によりこのような違いが見られ,触媒反応開発に向けた重要な知見が得られたと考えている.Ph-N4配位子に関しては,鉄(II)および銅(II)のM(OTf)2型錯体の合成に成功している.本研究課題では,研究のマイルストーンとして,卑金属錯体ライブラリーの構築,卑金属錯体の構造解析,不斉水素化条件の探索,機構解明を設定し,今年度では前半2項目の実施を計画した.上述の通りある種の卑金属錯体においてその合成,構造解析に成功しており,概ね順調に進展しているものと判断している.最近、申請者らは「ピリジルメチルアミノ基(PyCH2NH-)」をビナフチル骨格に組み入れた、N4型配位子Ph-BINAN-H-Py (Ph-N4)およびPNN型配位子Ph-BINA N-Py-PPh2 (Ph-PN(H)N)を設計・合成し、cis-αおよびfac選択的に様々な正八面体金属錯体を形成することができることを見いだした。この特性は触媒活性種の単一化に有利に働くことが強く期待されるが、実際に、対応するルテニウム錯体が芳香族ケトン類やキレート性・非キレート性を問わず立体的に嵩高いケトン類を効率的に不斉水素化することにはじめて成功した。本年度は、PNN-Ru錯体を用いる不斉水素化反応における反応機構解明研究を進め、その活性種構造を明らかとした。ジカチオン性PN(H)N-Ru錯体[Ru(PN(H)N)(dmso)3](BF4)2は過剰のDMSO存在下、fac構造をとる。これはπ受容性の高いDMSO同士がtransに配位しにくいことに起因する。この錯体を水素化類似条件で反応させると、定量的にヒドリドアミド錯体が立体選択的に生成する。これは3つの異なる配位原子のtrans影響の違いによって、位置選択的に活性化されるためである。CH3OHに溶解させると可逆的にヒドリドメトキシド錯体へと移行する。これらの配位様式が全てfac構造であることを、ピリジン部を15Nで標識することによって明らかにした。さらに、関連錯体からジヒドリド錯体の合成にも成功している。現状の反応探索において目的とする卑金属触媒開発には至っていないが、反応開発に向けた重要な知見が得られたと考えている。光学活性化合物の実用的供給における「触媒的不斉水素化法」の有用性は言うまでもない.ルテニウム触媒を用いる野依不斉水素化を起点に、今では完全反応を実現したとしてよい.この流れの中で,貴金属錯体触媒から卑金属錯体触媒への転換が一つの課題となっている.本研究では,ジホスフィン配位子からの脱却を鍵として,その解決を目指す.

独自に開発した窒素系配位子Ph-BINAN-H-PyおよびR-BINAN-Ph-PPh2のルテニウム錯体がケトン類の不斉水素化に高い機能を示すことを起点として,これら配位子をもつ各種卑金属錯体の合成,構造解析をおこない,触媒反応探索の物質基盤を確立した.今後は,錯体ライブラリを基盤として残りの2項目を実施する.DACat機構の働きやすいケトン類を第1候補基質とし.「キレート・非キレート型」と「立体要請度」をパラメータに基質を4種類に分類する.反応条件探索の標準条件を,基質触媒比100 ,50気圧とし,アルコール系プロトン性溶媒,ハロゲン系・エーテル系・ベンゼン系非プロトン性溶媒を検討する.反応性獲得後には,条件を最適化して,基質触媒比10000以上,水素圧5気圧以下の達成を目指す.各基質カテゴリーに対応する基質一般性を調査する.イミンやオレフィンにおいても,ケトン基質と同じ分類法に従う.イミン窒素原子上の置換基はベンジル基とフェニル基を限定する.オレフィン基質においては,Chirikの結果も参考に,デヒドロアミノ酸エステル基質を中心に反応条件を探索する計画である.反応性・選択性の獲得後は直ちに,速度論実験・速度式解析,重水素標識実験,同位体効果実験を中心に,これまでに得られた錯体の構造情報と組み合わせて反応触媒サイクルの全貌を把握し,作業仮説を修正するための糧としたい.現在,「卑金属ヒドリド」を活性種と想定している.このヒドリド体の電子的・軌道的特性の深い理解が性能向上に不可欠と考えているが,物質科学国際研究センターからの協力を得て対応する計画である.有機合成化学
膵島移植成績向上のための新規免疫抑制剤開発、および膵島再生療法の臨床応用化

平成17年度計画として以下の3点を研究目標にあげていた。膵島分離技術の向上を目指した薬剤開発:膵島分離時にかかるストレスにより膵島細胞の一部はアポトーシスに陥ることがわかっており、これが膵島移植成績の低下の一つの要因と考えられている。これを防ぐための薬剤開発を蛋白導入システムを用いて行う。蛋白導入システムの向上:申請者は蛋白導入システムのメカニズムを解明することに成功しており、この技術を応用したさらに機能の高い蛋白導入システムの開発を進める。体性幹細胞の単離・培養:膵島分離時に通常移植されない膵非内分泌細胞の中から、体性幹細胞の単離をFACSなどを用いて行う。また、その細胞の培養法を確立する。以上3点いずれもこの1年で達成することが可能であり、Diabetes(筆頭著者),Am J Transplant(筆頭著者、2報)、Nat Biotechnol(共著者)、Lancet(共著者)など、この1年間で11報の筆頭著者論文、13報の共著者論文での報告を行った。筆頭著者論文のうち、英語論文3報および、日本語論文3報は依頼論文であり、この分野の研究においては中心的存在となっていることが証明された。学会発表なども精力的に行い、シンポジウム、サージカルフォーラム、依頼発表など計28回の講演をおこなった。このような、研究実績を評価され、平成18年4月1日より、名古屋大学医学部助手として就任することとなった。
SIRT6によるオートファジーと細胞老化の制御のCOPDの病態における意義

喫煙による細胞老化の亢進は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)病態で重要で、脱アセチル化酵素のSIRT6は抗老化作用を示す。我々はSIRT6によるオートファジー制御が、喫煙誘導性細胞老化で果たす役割を検討した。結果COPD患者由来肺組織ではSIRT6発現が低下しており、喫煙刺激はSIRT6発現を低下させた。SIRT6がインスリン様成長因子(IGF)-Akt-mTORシグナル伝達系の抑制によりオートファジーを誘導し、気道上皮細胞における細胞老化制御に関与することが明らかとなった。SIRT6の発現調整によるオートファジー誘導は、COPDの新たな治療戦略となる可能性が示唆された。抗老化作用を持つSirtuin familyの特にSIRT6の、喫煙誘導性細胞老化の抑制における役割を、オートファジー制御の観点から明らかにすることを目的とした検討である。肺組織をCOPD、non-COPDsmoker、non-smokerに分け、ホモジナイザーを用いて肺組織の融解液を作成しSIRT6、老化の指標としてのp21、オートファジー分解の指標としてp62の発現をそれぞれ検討した。結果COPD肺ではSIRT6発現は有意に低下し、p21の発現からは老化の亢進が示唆された。またp62の発現亢進からは、オートファジーによる分解が不十分であることが明らかとなった。さらにSIRT6の発現量は呼吸機能の1秒率と正の相関を示しており、COPD病態へのSIRT6の関与が示唆された。手術肺より分離培養した、正常ヒト気道上皮細胞を用いて検討を行った。まず、喫煙刺激によるSIRT6の発現低下をみとめ、プロテアソーム阻害剤での抑制からは、傷害を受け分解が亢進していると考えられた。タバコ抽出液(cigarette smoke extract;以下CSE)刺激が誘導する細胞老化を、SIRT6が抑制することを過剰発現やノックダウンによる検討から明らかにした。またSIRT6がIGF-Akt-mTORシグナルを抑制し、オートファジーを亢進させることが、この抗老化作用を示す上で重要であることも明らかとなった。またSIRT6によるオートファジー制御にはHDAC作用が必要であることを、HDACのない変異型SIRT6の使用により確認した。喫煙刺激による細胞老化の亢進は、創傷治癒遅延や老化関連分泌現象(SASP)により慢性閉塞性肺疾患(COPD)病態で重要な役割を果たす。クラスIIIのヒストン脱アセチル化酵素であるSIRT6は抗老化作用を示す可能性がある。我々は、SIRT6により制御されるオートファジーの喫煙誘導性細胞老化での役割を検討した。結果、肺組織をCOPD、non-COPDsmoker、non-smokerに分け、ホモジナイザーを用いて肺組織の融解液を作成しSIRT6、老化の指標としてのp21、オートファジー分解の指標としてp62の発現をそれぞれ検討した。ヒト気道上皮細胞を用いて検討から喫煙刺激がSIRT6の発現を低下させることが明らかとなった。タバコ抽出液(CSE)刺激が誘導する細胞老化を、SIRT6が抑制することは、過剰発現やノックダウンによる検討から明らかになった。またSIRT6のHDAC活性を失った変異SIRT6(H133Y)過剰発現による検討から、SIRT6による抗老化作用にはHDAC活性が必要であることが明らかとなった。SIRT6はオートファジーを亢進させ、その機序の少なくとも一部はIGF-Akt-mTORシグナル伝達の抑制によることが明らかとなった。またオートファジーの亢進及びIGF-Akt-mTORシグナル伝達の抑制に、SIRT6のHDAC活性が必要であることも明らかとなった。LC3とATG5のノックダウンによるオートファジー阻害はSIRT6過剰発現による抗老化作用を消失させた。以上の検討から、SIRT6はIGF-Akt-mTORシグナル伝達の抑制により、オートファジーを調整し、COPD病態における細胞老化の制御に関与する可能性が示唆された。医師薬学以上のCOPD肺組織及び培養気道上皮細胞を用いた検討から、SIRT6が発現低下した場合、IGF-Akt-mTORシグナル系の亢進によりオートファジー活性が低下、喫煙刺激誘導性細胞老化が亢進し、結果としてCOPD病態の進展に影響している可能性が示唆された。

SIRT6によるオートファジー制御機序に関して、培養気道上皮細胞を用いてさらに詳細な検討を行う必要がある。その際HDAC作用がどのような蛋白の転写制御に関与するのかが重要な課題となる。マウスモデルを用いて、control siRNAもしくはSIRT6 siRNAを経鼻的に投与し、気道から肺胞にかけての上皮細胞におけるSIRT6のノックダウンを試みる。専用チャンバー内でタバコ煙を吸入させ、約4週間で肺気腫を評価する。それぞれ気管支肺胞洗浄液(BALF)の採取と肺の摘出を行う。ホルマリン固定標本とOCT compundを用いた凍結標本を作成する。ホルマリン固定肺はHematoxylin-Eosin(HE)染色により肺気腫を評価し、免疫染色によりオートファジーと細胞老化を検討する。凍結切片はSA beta-gal染色により細胞老化を検討する。IGFを経気道的に投与し、オートファジー抑制と細胞老化、さらにCOPD病態への影響をさらに検討する。IGF-1とインスリンはシグナル伝達経路を共有し、2型糖尿病はCOPDの主な併存疾患である。つまり高インスリン血症を伴う2型糖尿病におけるSIRT6発現低下は、IGF/インスリンシグナル系のさらなる活性化からオートファジー低下と細胞老化亢進を誘導し、COPD病態進展に関与している可能性がある。そこで、高インスリン血症を伴う糖尿病モデルマウスを用いて、SIRT6のノックダウンの影響を検討することも興味深い課題と考えている。
看護基礎教育におけるインタープロフェッショナル高等教育プログラムの開発と評価

本研究の目的は、保健医療実践現場で患者や利用者など当事者主体の安全で安心な質の高い保健医療サービスを提供する専門職の育成のために、個々の学科や専攻を超えたインタープロフェッショナル(Interprofessional)教育(IPE)プログラムを開発・評価することである。研究手法はアクションリサーチ(AR)である。平成17年度は、本学における実施可能なIPEプログラムの開発のために、教務学生委員会の協力を得、(1)IPEの定義と考え方、(2)本学科におけるIPEの位置づけ、(3)IPEプログラム開発の要素:目的・目線の明確化、IPE科目と内容の選択、教授-学習方法の創造、(4)学年進行におけるIPE科目の実施時期・期間・場所等具体的なIPEプログラム開発のための課題や検討事項を明確にした。また、ファカルティ・ディベロップメント(FD)小委員会の協力を得、FD研修会としてIPE実施のための教員研修を実施した。平成18年度は、検討の結果、平成19年度開始の新カリキュラム内のIPEプログラムとして「現代医療と生命倫理」「保健学慨論」「IPW概論」「初期体験実習」「国際・災害保健諭」「国際・災害保健活動論」「IPW演習」の7科目を決定し、その一部を試行した。開発中の学生のIPEに対する学習レディネスを測定するための指標案を用いて評価・検討を加えた。平成19年度は、IPEプログラムの1年次生対象科目を実施・評価した。IPEプログラムを評価する指標の開発は、IPE評価として広く活用されている学生のIPE学習レディネスを測定するRIPLESの日本語版作成のための信頼性・妥当性の検討中である。IPEプログラムの多面的な評価指標の開発研究を継続して進める必要がある。本研究の目的は、保健医療実践現場で患者や利用者など当事者主体の安全で質の高い保健医療を提供する専門職の育成のために個々の学科や専攻を超えたインタープロフェッショナル(IPE)教育プログラムを開発・評価することである。本年度は、国内外のIPEの文献レビューを行い、IPE開発における重要事項を明確にした。その結果、IPE教育理念の組織内共有化、IPEプログラムの目的、目標を明確にすること、IPEのコンテクスト(実習を含むコア共通科目の設定、教育実施時期の決定、教授-学習方法の検討および教員のトレーニングの実施)について教員間で認識の共有をすることが重要であることがわかった。そのために、研究協力機関FD(ファカルティ・ディベロップメント)を中心に、上記の事柄を共有するFD研修会を開催した(FD研修会開催日時:平成18年3月8日(水)10-16時、内容:IPEの考え方と展開、インタープロフェッショナルモデル、インタープロフェッショナル演習・実習に関する知識の共有とワークショップによるIPE体験)。共同研究者、研究協力者間でのディスカッションをまとめると、参加者の反応は、ワークショップによる教授-学習方法の利点とそれを専門の異なる教員が実際にグループワークという協働作業を体験することで、開発するIPEプログラムの具現化の一助になり、今後ワークショップ形式での教員トレーニングを実施する必要性が確認された。一方、本年度予定していたIPEレディネス評価尺度の開発は、海外で開発された尺度の日本語版での適用を目的としている。そのため尺度の日本語への翻訳および英語へのバックトランスレーション、日本語での表現の妥当性は確認したが、尺度開発者との連絡が必要であり現在調整中である。さらに、IPE参加学生への予備調査は、当初面接を予定していたが、自記述式質問用紙による調査に変更した。データは、現在集計中である。

アクション・リサーチの手法を用いたIPEプログラムの開発は、本学保健学科FD活動に参画し、正規の各専攻独自のカリキュラムに有機的に組み込むために、IPEプログラムの目的・目標、講義科目と演習・実習科目のバランスを考慮した共通科目ならびに年次の設定、IPEプログラムの実施に必要な条件整備を行った。その結果、平成19年度新カリキュラムに4専攻の共通科目群として7科目:「現代医療と生命倫理」「保健学概論」「IPW概論」「初期体験実習」「国際・災害保健論」「国際・災害保健活動論」「IPW演習」を体系的に配置できた。また、「現代医療と生命倫理」「初期体験実習」については医学科学生との協働学習が可能になった。平成19年度は1年次生へのIPEプログラム科目の教育の実施と評価、次年度に向けた改善のための課題の明確化が焦点となる。最終年度に向け、開発したIPEプログラムの評価指標をより多面的に行う方法を検討する。さらに海外における類似のIPEプログラム実施大学学生との比較研究を進める予定である。平成19年度の研究目的は、開発したIPE教育プログラムの実施ならびに評価であった。開発したIPEプログラムは、医学科・保健学科学生が合同で学ぶ3科目「現代医療と生命倫理」「初期体験実習」「IPW演習」と保健学科4専攻の学生が合同で学ぶ4科目「保健学概論」「IPW概論」「国際・災害保健論」「国際・災害保健活動論」である。これらを1年次から4年次まで正課の科目として組み込んだ。平成19年度は、1年次生対象の「現代医療と生命倫理」「保健学概論」「IPW概論」「初期体験実習」の4科目を実施した。評価は、各授業科目の学生による授業評価を基本と前年度から開発していたRIPLS(IPE学習レディネス尺度)の日本語版の尺度案と自由記載を用いて調査した。その結果、IPEプログラムに対する学生の評価は、おおむね肯定的であった。また、専攻による受け止め方の差は見られなかったが、結果の十分な分析に至っていないので、引き続き分析をする必要がある。さらに、本年度が初年度なため、年時進行にそって縦断的な調査が必要である。一方、評価指標の開発は、RIPLSだけでは一側面の指標であるため、多面的指標の開発へと進める必要がある。
自己免疫疾患におけるCD31分子の役割の解析

本研究においては、CD31欠損マウスに自己免疫疾患のモデルを誘導し、自己免疫疾患におけるCD31分子の役割を解析することを目的とした。実験的脳脊髄炎(EAE)については1回の実験を行ったが、疾患の発症が悪く、現在はコラーゲン関節炎(CIA)に関してのみ実験を行っている。実験の結果1.マウスの作製CD31欠損マウスをDBA/1マウスに6世代戻し交配を行い、CD31+/-マウスを交配してCD31+/+、CD31+/-、CD31-/-マウスを作製した。2.CIAの発症II型コラーゲンを2回免疫してCIAを誘導した。いままでに3回の実験を行った。関節炎の発症率は+/+76.2%、+/-89.3%、-/-95.5%と、CD31-/-マウスではCD31+/+マウスに比べて高い発症率を示し、CD31+/-マウスはその中間であった。また、関節点数(重症度を表す)は最終で+/+4.10、+/-4.71、-/-5.64であり、有意差はないがやはり-/-マウスでより重症の傾向がみられた。関節の組織の検討では、発症したマウスでは有意な差は認められなかった。3.抗体価抗II型コラーゲン抗体価は+/+、+/-、-/-マウスで有意な差は認められなかった。現在、リンパ節細胞のコラーゲンに対する反応を検討中である。4.まとめ現在までの結果では、CD31-/-マウスはコントロールに比べてCIAがより高頻度に発症し、その程度も強い傾向が見られる。今後も実験を繰り返し、そのメカニズムを解析していく予定である。本研究は自己免疫疾患におけるCD31分子の役割を解析するため、マウスにおけるヒト疾患モデルであるコラーゲン関節炎および実験的脳脊髄炎をCD31欠損マウスに誘導する、あるいは正常マウスに抗CD31抗体を投与する実験を行うものである。1. CD31欠損マウスをコラーゲン関節炎に感受性のあるDBA/1マウスに4世代戻し交配を行った後、+/-マウスをかけ合わせてCD31+/+、+/-、-/-のDBA/1マウスを作製した。いままでに1回の関節炎の実験を行った。II型コラーゲンでマウスを2回免疫して関節炎を誘導した。その結果、関節炎の発症率は+/+マウスで8/9(89%)、+/-マウスで11/12(92%)、-/-マウスで6/9(67%)であった。-/-マウスでやや発症率が低い傾向であった。しかし、関節炎を発症したマウスで比較した場合、各遺伝子型で重症度の差は認められなかった。現在2回目の実験を施行中である。今回は、組織学的検討も行う予定である。また、抗II型コラーゲン抗体を測定するため、血清を経時的に保存しており、後日ELISA法で抗体測定を行う予定である。今後の予定として、リンパ節細胞の抗原に対する反応性をインターフェロン-γ産生等にて検討する予定である。2.実験的脳脊髄炎に関しては、現在疾患感受性のあるPL/Jマウスに3世代戻し交配し、+/-マウスの交配を行っているところである。近日中に最初の実験を開始できると考えている。
衝突銀河団における銀河団ガスの熱力学の研究

本研究は、「すざく」およびASTRO-H衛星によって、銀河団ガスの衝突・合体を通じた進化を研究するものである。これまでの実績としては、ASTRO-H衛星搭載硬X線検出器(HXI)の完成と、「すざく」のデータを用いた銀河団の系統的な研究がある。HXIは、銀河団同士が衝突・合体したときに銀河団ガス中でおこる加熱や粒子加速を観測するために必須の検出器である。私は主に、HXIの電源管理部や高圧電源部の開発を担当してきた。これまでに、ヨーロッパから輸入されてきた高圧電源モジュールの不具合など、さまざまな課題を乗り越え、スケジュール通りに電源管理部や高圧電源部を完成させることができた。これらをHXIにくみ上げた後の動作試験や振動試験、熱真空試験などの環境試験に私は参加し、HXIが所期の性能を発揮しつつ宇宙での使用に耐えることを確認した。「すざく」のデータ解析では、今年度までに下田優弥氏(埼玉大学博士課程卒業)と協力して、今までに観測された銀河団を網羅的に研究した。この成果は天文月報2015年4月号(EUREKA)に掲載されている。z=0.372までの22個の銀河団から、鉄属とアルファ元素の重元素組成比を個別に求めたところ、鉄の量は、衝突銀河団では宇宙年齢とともに増え、緩和している銀河団では、すでにある一定の量に達していることがわかった。鉄を銀河団ガスに供給するIa型超新星爆発は、銀河団衝突によって励起されるようである。また、シリコン(およびアルファ元素)の量は、主に銀河団形成期に重力崩壊型超新星爆発の活動度が上がったことで増えることがわかった。このことから、「あすか」の時代から示唆されていたように、系が小さくなるとシリコンは重力ポテンシャルから逃げている可能性が高い。このように、銀河団衝突に伴う銀河団ガスの化学的進化について、重要な進展を見ることができた。本年度は、ASTRO-H衛星搭載硬X線イメージャー(HXI)の開発と、衝突銀河団に関する研究を前進させることができた。HXIは、本年度中に、2式あるフライト品のうち、1式を完成させた。もう1式も現在製造中である。とくに私は、HXI用の高圧電源の開発を担当した。高圧電源はヨーロッパ宇宙機関(ESA)と協力して、イタリアの会社に特注して開発したものであるが、ポッティング方法の不備により放電が起こってしまうなど、大小さまざまなトラブルを現地まで行って解決し、正常に動作する信頼性の高いフライト品の高圧電源を完成させた。銀河団については、銀河団外縁部の温度やエントロピーについて、Abell 1835 (Ichikawa et al. 2013)について、Abell 1689 (Kawaharada et al. 2010)と同様に非対称性が見られ、銀河団ガスは外縁部で静水圧平衡にはないことがわかった。また、「すざく」で観測した62個の銀河団について、銀河団ガス中に含まれる鉄とシリコンの量について調べたところ(Shimoda et al. 2013;下田博士論文)、鉄の量は、主に銀河団同士が衝突したときに増加し、すでに力学的に緩和している銀河団では、ほとんど変化しないことがわかった。シリコンの量は、銀河団形成期や銀河団衝突のときに増加するが、小さな銀河団では、できたシリコンの一部が銀河団の外に逃げてしまうことがわかった。このシリコンに関する結論は、すでに「あすか」の時代に指摘されていたが(Fukazawa et al. 1998)、それを「すざく」で確認し、さらに鉄に関する新たな知見を得ることができた。このような研究は、重元素をプローブとすることで、銀河団がいつ、どれくらい衝突したのかについて調べることができるようになったという点で、本研究の目的にとって非常に重要な成果である。

また、シリコン(およびアルファ元素)の量は、主に銀河団形成期に重力崩壊型超新星爆発の活動度が上がったことで増えることがわかった。このことから、「あすか」の時代から示唆されていたように、系が小さくなるとシリコンは重力ポテンシャルから逃げている可能性が高い。このように、銀河団衝突に伴う銀河団ガスの化学的進化について、重要な進展を見ることができた。本年度は、ASTRO-Hの機器開発という点では、衛星搭載のフライト品を、若干の遅延やトラブルはありつつも開発できているので、ほぼ順調に進展していると言えよう。銀河団の研究については、Abell 1835の研究と、重元素をプロープとした進化の研究が進んだものの、所期の計画よりは少し遅れている。ただし現在、有名な衝突銀河団である弾丸銀河団(Bullet cluster)について、「すざく」のデータから、外縁部のガスの温度やエントロピーの解析を進めており、空間的な非対称性など、興味深い結果が得られつつある。以上を総合的に勘案すると、研究の進展は「おおむね順調」が妥当なところと考える。本年度は、ASTRO-Hの開発の点では、衛星搭載のフライト品をすべて完成し、必要な環境試験や較正試験を行ったうえで衛星を完成させる非常に大切な年である。とくに年度の前半は、HXIなどの観測機器の完成と試験のための山場であり、ほとんどの時間をそこに割くことになろう。私は高圧電源のほかにも、ESAと協力して開発している、X線マイクロカロリメータ(SXS)用のループヒートパイプの開発にも携わっており、ヨーロッパ側と密にコンタクトをとりながら開発を進めていきたい。銀河団研究については、現在進行している、「すざく」の弾丸銀河団のデータ解析を進めて、論文にまとめたい。これが、今後その他の衝突銀河団を系統的に研究していくための重要なベンチマークになると考えている。物品費として予定していた物のうち、一部が予定より低価格で調達できたため、差額が2,543円だけ生じた。この金額を年度内に無理に使うよりは、次年度の経費として使用したほうが有効に利用できると判断した。次年度分に、物品費として使用する計画である。次年度請求分の直接経費700,000円に対して2,543円が占める割合は小さいので、次年度の経費の使用計画に変更はない。
臨床心理士養成大学院の現職教員及び社会人院生の現状と資格取得後の活用について

本研究は臨床心理士資格取得をめざす現職教員や社会人が有意義な大学院での学びを獲得し、資格を有効に活用するための養成大学院の在り方について研究した。資料による養成大学院の現状分析と在院生、修了生へのアンケートの結果から、現職教員や社会人は、資格取得後、スクールカウンセラーなどの教育分野や児童養護施設での心理士など臨床福祉分野での活動を目指す傾向があるので、それらの領域のカリキュラムの充実が急務であることが示された。まず,研究代表者と研究分担者は分担して,臨床心理士の資格は持たないが長年教育現場でカウンセリングを担当している現職教員や,資格を持たないがスクールカウンセラーとして,臨床活動を行っている社会人の方など,本研究に関連する職業の方への個別面接によって,実態把握に努めた。また,臨床心理士の資格は取得したものの,校務分掌ではその資格を生かせないまま,教師として校務についている臨床心理士資格保有者にもインタビューした。その結果,予測したように,前者の資格未取得者では,資格の有無によって,職域が限定されていることに矛盾を感じているが多数語られた。また資格保有者では,教師とカウンセラーという二重のアイデンティティによって,中途半端な気持ちを抱きながら日々活動していることなどが吐露された。彼らの中には心理臨床家としての確かなアイデンティティを確立しないままに臨床心理士資格を取得したものの,結局のところ,その資格は「ペーパー資格」化し,先に獲得していた教師や他の職種の職業アイデンティティのみで職場で活動する場合が現状では,圧倒的に多く見受けられることが予測された。次に学会や研究会を利用して,1種指定大学院担当の大学教員らの聞き取りをおこない,大学側が抱えている問題点についても把握してきた。このような準備段階を経て,インタビューで知己となった現職教員や大学教員の方々と,大学院生,修了生を加えて研究会を立ち上げた。この研究会での話し合いに基づいて,これまでの1種指定大学院の学びの成果と問題点、改善点を具体化してきた。この結果から,より広く現状を把握するための調査研究に着手し,今年度前期の実施を目指している。今年度の成果については以下の各項目があげられる。1,臨床心理士養成大学院における教育内容・教育環境について、学会や研究会、あるいは出張によって、20数校の担当教員に学内実習の方法や病院実習の期間や実習先との連携、卒後教育の実施の有無など具体的な情報を聞き取った。2,研究代表者及び研究分担者が直接指導している大学院生に協力を得て、所属大学院を修了した現職教員や社会人の修了後の社会的な立場について実態を調査し、大学院在籍中に感じていた所属大学院の教育体制への率直な意見を聴取した。3,中学校で教育相談を担当している現職教員、臨床心理士資格を取得しないでスクールカウンセラーとなっている社会人、カウンセラーを開業クリニックで雇用している精神科医にそれぞれの立場から、臨床心理士に期待することなど、継続して討論し、また事例研究を通じて、臨床心理士の活用の具体的な方法について討議し、社会が求めている臨床心理士のあり方についてまとめた。4, 2で得られた結果に基づいて、臨床心理士養成大学院のこれまでの状況と現状、および修了後の状況について、研究会で中間発表をおこなった。5,上記14をふまえて、現在の教育内容や教育環境、修了後の進路などについてアンケート調査を作成し、予備調査を実施した上で、全国の臨床心理士養成大学院160校に在籍している大学院生各10名総数1,600名に対して本調査の用紙を郵送し、返送を求めた。6, 5のアンケートの結果をまとめる作業に入った。今年度の成果について、以下の5つの研究班による研究経過を記述し、報告とする。1.臨床心理士資格試験の受験に必要不可欠である指定大学院の授業カリキュラムの現状を知り,そのカリキュラムにおいて重視されている領域や分野にはどんなものがあるのかを明らかにすることによって,今日の指定大学院における傾向を探ることを目的し活動した。各大学院の実態を知るため、インターネットでの情報や教育実践総合センターに送付されている各大学の紀要,パンフレット,電話や訪問による聞き取りによって調査を進めた。全体研究会での検討後,「臨床心理士養成大学院におけるカリキュラムに関する一考察」として論文にまとめた。その際には,2の質問紙調査の結果も参考とした。2.2009年1月に研究会を母体に作成した質問紙を全国の養成大学院160校に送付し,回答を依頼した。回答のあったものについて,結果をまとめ検討を加えた。結果としては、臨床心理士養成大学院の実態を知ることができ,現状での課題が明らかとなった。結果から養成大学院の更なる充実や進路選択に寄与する具体的な方法を明示することができた。3.養成指定大学院を修了後スクールカウンセラーとして活動している人たちと,養成指定大学院を修了せず,この制度以前に資格を取得してスクールカウンセラーとして活動している人たちにインタビュー調査を実施し,修正版グランデッドセオリーを用いて,検討を加えた。4.実際に社会人あるいは現職教員として,養成指定大学院を修了し,スクールカウンセラーとなった人にテーマを提示して研究協力員を募った。

該当者に研究会で自らの体験を発表してもらい,最後に論文としてまとめた。5.2008年11月に実施したシンポジウム「スクールカウンセラー活用と臨床心理士養成大学院の現状」の記録を題材として、院生の研究員スタッフで現状の課題についてまとめた。
MAPキナーゼカスケードを構成するシグナル分子を標的とした細胞増殖阻害物質の探索

1.ERK-MAPキナーゼ系が恒常的に活性化されている癌細胞株において、MEK阻害剤(PD98059、U0126等)処理でそれを選択的に遮断した際、顕著なG1期集積に伴う増殖停止を認めた。なお、上記細胞においてはDNA含量の少ないSub-G1細胞が出現し、そこではアポトーシスに特徴的な幾つかの現象(核の分断化、クロマチンの凝縮、核DNAのヌクレオソーム単位への断片化)が誘導されていることを見出した。MEK阻害剤はヒト二倍体繊維芽細胞に対してもある程度の増殖阻害作用を示したが、それは薬物の除去によって速やかに回復し、またアポトーシスを誘導することはなかった。すなわち、ERK-MAPキナーゼ活性が顕著に上昇している癌細胞に対して、その特異的遮が実際に「制がん」につながることを明らかにした。2.PD98059処理した上記癌細胞において特徴的に、CDK阻害蛋白質の一種であるP27^<Kip1>の発現量上昇、p27^<Kip1>のサイクリンE-CDK2複合体への結合、サイクリンE-CDK2キナーゼ活性消失、Rb蛋白質のリン酸化レベルの低下を認め、これが上記癌細胞の増殖停止、さらにアポトーシス誘導の分子機構であることを明らかにした。3.PD98059の基本骨格をもとに合成した様々な2^1-アミノチオフラボン誘導体の中に、ERK-MAPキナーゼ系が恒常的に活性化されている癌細胞に対して、顕著、かつ選択的な増殖阻害効果を示す新規化合物を見出した。4.PD98059等のMEK阻害剤を、他の作用機構を持つ抗癌剤と組み合わせてその作用が増強される可能性を検討したところ、チューブリン重合阻害作用を持つ抗癌剤との併用によってのみ、極めて顕著な相乗効果の発現を認め、これよりERK-MAPキナーゼ系遮断剤を基盤とした新規がん化学療法の開発に向けて大きな契機をつかむことができた。
ヤン・ミル場の構成とそのモジュライの研究

4次元リーマン多様体のanti-self-dual接続にあたるヤン・ミル接続が四元数ケーラー多様体上のベクトル束にも考えられ我々はそれをインスタントンと呼んでいるが、それらのモジュライ空間につきこの一年で次の三つの結果を得た。まず4n次元の四元数ケーラー多様体上には4次元リーマン多様体のディラック作用素、ツィスター作用素の一般化された2つの作用素があるが、それらの間に成り立つ三つの関係式を得た。一つはその2つの作用素の間の交換関係にあたるもので残りの2つはそれらの作用素と四元数ケーラー多様体特有の2-formとの交換関係である。それら三個の交換関係を用いると2つの作用素のコホモロジーについて消滅定理を示せた。またこれらのコホモロジーはツィスター空間のドルボーコホモロジーに1対1に対応していることが知られているのでそれらについての消滅定理も得られた。次に複素グラスマン多様体G_2(C^<n+2>)は四元数ケーラー多様体の例だが、その上のインスタントンについてはモジュライ空間を得ていた。そこで更にくわしくその境界を調べた。境界はCP^l(l=(n+1)(n+2)/_2-1)だが、ちょうどその実形IRP^lで低い次元の複素グラスマン多様体への曲率の集中がおきそこで接続のbubbling-offが生じる。それらの状況はHP^nにつき以前調べたのと良く似て四元数ケーラー部分多様体で曲率の集中がみられた。最後にHP^n上の1-インスタントのモジュライ空間は球になる事が知られているが、その中心でのリーマン計量を調べると計量もこめて接空間はIR^p【symmetry】H^qと直和分解されることを示した。以上の研究は3つの論文(投稿中)にまとめられ2つの国際学会で発表された。
免疫系細胞の膜輸送を制御する新規分子の発見とその病態の解明

免疫細胞では細胞内部で精密な膜輸送や分泌機構が機能している。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で増大する遺伝子Rab44を発見した。Rab44遺伝子をノックダウンした破骨細胞は活性化・巨大化し、逆にRab44を過剰発現した細胞では活性化が抑制され、エンドゾームの粒子数が増大した。従って、Rab44は細胞形態と膜輸送の制御を行っている遺伝子であると予測される。本研究の目的は、我々が独自に見出した新規遺伝子Rab44の機能を破骨細胞のみならず免疫系細胞を用いて明らかにする事である。1)破骨細胞での新規Rab44遺伝子の発見:破骨細胞は骨を分解する多核細胞であり、骨吸収時には“分泌リソソーム"を骨面に放出する。分泌リソソームはミネラルを溶解するプロトンや有機質成分を分解するタンパク質分解酵素が含まれる。我々は破骨細胞におけるリソソーム機能を制御する新規遺伝子を同定するため、分化前のマクロファージと破骨細胞とのmRNAを抽出し、逆転写DNAマイクロアレーを行なった。発現レベルに差異のあった遺伝子を分類し、膜タンパク質群と膜輸送調節因子群に分けた。この方法で全く論文報告されていないRab44遺伝子が同定できた。2)破骨細胞におけるRab44遺伝子ノックダウンの解析:Rab44遺伝子をマクロファージから破骨細胞に分化する間、siRNAでノックダウンしてTRAP染色を行なった。Rab44ノックダウン破骨細胞は細胞同士の融合が活発になっており、巨大化・多核化した。さらにRab44ノックダウン破骨細胞は殆どのマーカー遺伝子の発現レベルが上昇していたことなどからRab44が欠損すると破骨細胞が活性化することが明らかとなった。1)Rab44結合タンパク質の同定:昨年度と同様に結合タンパク質の解析を行っている。一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定を試みた。まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認した。次にRab44過剰発現細胞を用いて、Rab44プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質を質量分析法により同定した。現在まで少なくとも3つの分子が結合していることが明らかとなっている。ここでは詳細は省略するがいずれもあまり解析が進んでいないタンパク質のようである。2)Rab44制御による分泌のバイオイメージングRab44により細胞内での膜輸送機構や分泌機構に特徴が観察されると予想していた。そこで蛍光顕微鏡を用いてリソソーム酵素の細胞内輸送機構や分泌する様子のバイオイメージングを試みた。そのためにC末端にモノマーRedFluorescentProtein(mRFP)を結合させたニューロペプチダーゼY(NPY-mRFP )を入手しアデノウイルスベクターにてRab44欠損破骨細胞あるいはマスト細胞と正常細胞にそれぞれ発現させた。発現させた細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡あるいは全反射蛍光顕微鏡で観察している。1)Rab44遺伝子欠損マウスの作成:本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みる。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行した。ホモマウスも順調に増加している。現在個体の変化の観察と個体から免疫細胞を取り出し、野生型と欠損マウス由来の細胞での比較解析を行っている。2)Rab44遺伝子欠損マウスでの骨組織・骨代謝の変化:Rab44は破骨細胞では発現しているが、骨芽細胞では発現していない。Rab44ノックダウン破骨細胞が活性化していることから、Rab44欠損マウスは骨粗鬆症を呈する可能性が考えられる。そこで胎生期マウスあるいは生後数日後のマウスの透明骨格標本を作製する。アルシアンブルー染色で青色に染まった軟骨組織とアリザリンレッドで赤色に染まった石灰化硬組織の範囲を比較し、マウス個体レベルでの硬骨形成の比較を行う。さらに成長したマウスの大腿骨、椎骨等のX線解析を行い、固定後脱灰パラフィン切片や非脱灰樹脂切片を作製し、HE染色、TRAP染色を行い、骨形成を比較する。またカルセインを2回投与し、非脱灰樹脂標本を作製し骨組織形態計測を行う。またμCT解析により骨量、海綿骨数、海綿骨厚を測定する。1)破骨細胞での新規Rab44遺伝子の発見破骨細胞は骨を分解する多核細胞であり、骨吸収時には“分泌リソソーム"を骨面に放出する。

我々は破骨細胞におけるリソソーム機能を制御する新規遺伝子を同定するため、分化前のマクロファージと破骨細胞とのmRNAを抽出し、逆転写DNAマイクロアレーを行なった。発現レベルに差異のあった遺伝子を分類し、膜タンパク質群と膜輸送調節因子群に分けた。この方法で全く論文報告されていないRab44遺伝子が同定できた。2)破骨細胞におけるRab44遺伝子ノックダウンの解析Rab44遺伝子をマクロファージから破骨細胞に分化する間、siRNAでノックダウンしてTRAP染色を行なった。Rab44ノックダウン破骨細胞は細胞同士の融合が活発になっており、巨大化・多核化した。さらにRab44ノックダウン破骨細胞は殆どのマーカー遺伝子の発現レベルが上昇していたことなどからRab44が欠損すると破骨細胞が活性化することが明らかとなった。1)Rab44遺伝子の免疫担当細胞における機能Rab44遺伝子をマクロファージ系RAW-D細胞に過剰発現させて細胞内局在を調べると、エンドソーム・リソソームに局在することが分かった。さらにRANKL刺激を行って、破骨細胞分化させると、単核細胞に留まる細胞が多く、破骨細胞分化が抑制されていた。この知見はRab44遺伝子ノックダウンと逆になっていた。さらに過剰発現細胞の細胞内オルガネラを観察すると、Rab44過剰発現マクロファージはコントロール細胞に比べて、特にリソソームの影響は少なく、むしろ初期エンドソーム(EEA1陽性コンパートメント)の粒子数が増大していた。従って、Rab44はエンドソーム・リソソームでの膜輸送を制御していると予想される。マスト細胞でのRab44の機能を解析する目的で、マウス非腫瘍性細胞株NCL-2細胞やP815細胞を用いてsiRNAによるノックダウンと過剰発現系を作成して解析した。特に過剰発現細胞ではEGFPーRab44を発現させて、細胞内局在を解析した。また分泌顆粒の電子顕微鏡像を観察した。2)Rab44結合タンパク質の同定一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定を試みた。まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認した。次にRab44過剰発現細胞を用いて、Rab44プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質を質量分析法により同定した。現在まで少なくとも3つの分子が結合していることが明らかとなっている。免疫細胞では細胞内部で精密な膜輸送や分泌機構が機能している。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で増大する遺伝子Rab44を発見した。Rab44遺伝子をノックダウンした破骨細胞は活性化・巨大化し、逆にRab44を過剰発現した細胞では活性化が抑制され、エンドゾームの粒子数が増大した。従って、Rab44は細胞形態と膜輸送の制御を行っている遺伝子であると予測される。本研究の目的は、我々が独自に見出した新規遺伝子Rab44の機能を破骨細胞のみならず免疫系細胞を用いて明らかにする事である。1)破骨細胞での新規Rab
ＧＰＩアンカー型タンパク質の輸送シグナルの提示と検知の構造生物学

本研究では、小胞体積荷受容体によるGPIアンカー型およびN結合型糖タンパク質の分子認識および細胞内輸送機構の構造基盤の解明を目的としている。糖タンパク質の細胞内輸送は、p24ファミリータンパク質やERGIC-53などの積荷受容体より担われていることが知られている。その中でも、ERGIC-53はカルシウム結合タンパク質MCFD2と複合体を形成することで、糖鎖とポリペプチド鎖を二重に認識していることが想定される特徴的な積荷受容体である。平成24年度は、主にERGIC-53による糖鎖認識の構造基盤を明らかにすることを目標とした。そこで、ERGIC-53、MCFD2、糖鎖リガンドモデル(α1-2マンノビオース)からなる三者複合体のX線結晶構造解析を行った。その結果、MCFD2および糖鎖リガンドと結合したERGIC-53の分子複合体の立体構造解析に成功し、本積荷受容体による糖鎖認識の構造基盤を初めて明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)GPIの構造変化と積荷受容体p24によるGPIアンカー型タンパク質輸送の制御機構の解明GPI糖鎖のPGAP1による脱アシル化およびPGAP5による脱リン酸化が、GPIアンカー型タンパク質の小胞体からゴルジ体への「輸送シグナル」となり、p24タンパク質がその糖鎖シグナルを特異的に認識することで、積荷受容体として機能することを明らかにした。(2)GPIアンカー型糖鎖の化学合成法の確立GPI糖鎖3-5糖ユニット(エタノールアミンリン酸化マンノース3糖-グルコサミン-イノシトール)の化学合成に成功した。現在、収率を向上させるべく、反応条件の検討を行っている。GPIアンカー糖鎖はタンパク質のC末端部分と結合するが、合成基質の非還元末端には、in vitro、in vivoの活性試験において精製と検出を容易にするように疎水性の蛍光分子を導入した誘導体を合成した。(3)積荷受容体ERGIC-53/MCFD2複合体による血液凝固第V/VIII因子の分子認識機構の解明本研究では、小胞体積荷受容体によるGPIアンカー型およびN結合型糖タンパク質の分子認識および細胞内輸送機構の構造基盤の解明を目的としている。リガンドの調製は、最長の5糖ユニットからなるGPIアンカー型糖鎖誘導体の化学合成に成功しており、計画通りに進んでいる。また、p24ファミリータンパク質の小胞体内腔領域および各ドメイン(GOLDドメイン、コイルドコイルドメイン)の発現・精製に成功している。さらに、N型糖タンパク質輸送系では、輸送レクチンと血液凝固因子との相互作用部位をNMR解析により明らかにしている。以上、総合的に判断しておおむね順調に進展している。平成24年度(第15回)日本糖質学会奨励賞受賞p24タンパク質の結晶化およびX線回折データ収集・立体構造決定を行う。また、p24タンパク質と合成したGPIアンカー型糖鎖3-5糖ユニット複合体のX線結晶構造解析およびNMR解析を行う。PGAP5に関しては、大腸菌に加えて哺乳動物細胞を用いた発現系も併せて検討を行う。N型糖タンパク質の分子認識機構についても併せて検討し、小胞体品質管理機構の包括的な理解を目指す。前年度のNMR解析の結果を基に、血液凝固因子の相互作用部位ペプチドとERGIC-53/MCFD2との複合体のX線結晶構造解析を行う。相互作用部位ペプチドは溶解度が非常に低いことが判明したため、融合タンパク質として結晶化を行う予定である。