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電磁力による新たなトルク計測技術に関する研究

当該年度の研究により、電磁力によるトルク発生装置を開発し、電磁力によるSIにトレーサブルなトルクの発生に成功している。今後は、電磁力による高精度なトルク計測技術を確立するために、電磁力と重力との同一性に関する実験的検証と、現在トルクの国家標準として用いられている小トルク発生装置との相互比較を実施する予定である。本装置では、現在1 mN・mから50 mN・mの範囲でトルクを発生することができる。今後の研究を実施するために、まずは電源や電流・電圧計測装置の改良等を行い、トルクの発生範囲を拡大していく。そして、小トルク発生装置で校正されたトルク計測機器を用い、電磁力によって発生したトルクとの比較を行う。また、既に設計済みである重力による方法でトルクを発生させる装置を新たに開発し、電磁力によるトルク発生装置に組み込むことで、トルクによる電磁力と重力との同一性に関する検証実験を行う予定である。機械工学初年度に製作を計画していたトルクによる電磁力と重力の同一性検証実験に必要な機械部品の見積もりをとったところ、残予算よりも僅かに高額であったため、製作を翌年度に行うこととした。初年度製作を予定していた機械部品について、2年目の助成金と合わせて製作することを計画している。
第14族元素の不飽和化合物への新規導入反応

本研究では,1,3-ジエン類に炭素置換基とケイ素置換基を同時に導入する1,3-ジエン類のカルボシリル化反応を行った。反応の触媒としては,トランスメタル化能の高いパラジウム錯体を用いた。本研究においては,中心金属の選択,配位子の電子的性質等が反応に大きな影響を与えると考えられるので,これらの影響を主として検討し,生成物を最も高収率,高選択的に与える触媒系を探索した。さらに,反応機構の解明を行い,これら等14族元素を含む化合物の錯体触媒反応に関する知見を得た。具体的な研究成果は以下の通りである。通常の反応条件下においてはケイ素-炭素結合は不活性であり,このケイ素-炭素結合を活性化し,この結合間に不飽和化合物を挿入させることは極めて難しいと考えられる。そこで,炭素置換基ならびにケイ素置換基を異なる源より導入する新規反応を試みた。我々のこれまでの知見によるとケイ素-ケイ素σ-結合は遷移金属錯体触媒により容易に活性化される。そこで,1,3-ジエン,ジシラン,酸塩化物を用いる三成分カップリング反応を試みた。酸塩化物は低原子価遷移金属中心に容易に酸化的付加することが知られている。反応には,中心金属の形式酸化数,配位子の電子的性質などが大きな影響を与えると考えられるので,最も触媒活性が高く,高選択的に生成物を与える触媒系を探索した。特に,配位子の電子供与性の影響が大きいと考えられるので,この点を中心に検討を加えた。その結果DBA(dibebzylideneacetone)を配位子として有するパラジウム(0)錯体が触媒前駆体として、極めて高い活性を示すことを見いだした。
光燃料電池の研究

光合成にならい、光酸化還元反応によりエネルギー変換を行う光機能性超薄膜の開発を目指した。光合成のエネルギー変換は生体膜(チラコイド膜)での光誘起電子移動に共役したプロトン輸送に依存しているところから、プロトン輸送機能をもつ高分子固体電解質(ナフイオン)と半導体光触媒の組み合わせによる光燃料電池の構成をまず試みた。光燃料電池用の半導体としては酸化チタンを用い、水性メタノールを燃料として2mA/cm^2に達する光電流を得るのに成功した。燃料としては種々の水溶性有機物が使用できる。光電流の発生機構はメタノールが水素に転換されて機能する場合と、酸化チタンの伝導帯に励起された電子が直接終電される場合が共存し、集電体が白金であれば水素への改質を経る反応が優先的に進行する。水素過電圧が高い金を集電体として蒸着した多孔質ガラス板上に酸化チタンを担持させ、メタノールを含む酸性水溶液に浸すと良好な光電流が得られ、伝導帯からの直接集電が起きていることが光電流の時間依存性から明らかである。多孔質ガラス板にナフイオンを含浸させると、光電流が減ることより膜中でのプロトンの輸送が律速過程になっていることが明白であり、イオン伝導性の高い超薄膜の開発が必要となった。上記の性能をもつ光応答性超薄膜の開発を目指し、高分子超薄膜の新規開発を行った。ポリ塩化ビニールなどの高分子物質と界面活性剤型構造をもつ金属錯体をテトラヒドロフランとトルエンの混合溶媒に溶かし、水面に展開すると厚さ25nm程度の超薄膜が得られた。ルテニウムトリスビピリジンを錯体として用いると、この超薄膜には光第二高調波発生(SHG)機能を示し、ルテニウム錯体が膜の片面に選択的に固定されていることが明確になった。上記の光機能性超薄膜として有望なことが、膜の厚さおよび光応答性から示された。プロトン導電体としてアニオン性フッソ樹指であるナフィオンを用いる燃料電池はすでに完成した製品となっているが、燃料は精製された水素に限られる所に難点がある。本研究では、メタノールなどの有機物が、光照射された半導体表面の正孔に電子を供与すると共に自身はプロトンを放出して分解する事に着目し、燃料電池の電極触媒として半導体を使用した。表面に白金を担持した酸化チタン粉末を低分子量のナフィオン溶液に懸濁させ、シート状ナフィオン膜上に展開、風乾した。この膜を二枚の白金メッシュで狭んで電極を構成した。酸化チタンを担持した陰極側に水とメタノールの1:1混合液体を置き、反対側は空気に接するようにして陰極側を超高圧水銀灯で照射したところ、両極の間に0.5mAに達する光電流が明確に観測された。混合液体中のメタノールの分率を増加させるにつれて電流値も大きくなるが、純メタノールでは白金を担持したナフィオン薄膜が溶解してしまうので混合には最適値があることが判明した。一方、陰極室の液体が水のみであれば電流はほとんど流れない。これらの事実から、光燃料電池の原理は実証されたと断定される。また、陽極室を水で満たすと電流は減少することも判明した。その他の因子については調査中である。今後、電極での光触媒活性を高めると共に、純有機溶媒に接しても破損しないナフィオン電極の開発に努力して、光燃料電池の基礎技術を確立する予定である。

緑色植物のチラコイド膜で発生した電子と正孔は膜の表裏に分割輸送されて電気化学的エネルギーの蓄積を実現するが、この過程と共役して膜を介するプロトン輸送が進行する点が太陽電池との根本的な違いである。この点に着目して、本研究では光化学的に生成した酸化還元エネルギーを利用して膜を介するプロトン輸送を行なう手法を開発し、人工光合成へ応用することを目的とした。膜を介するプロトン輸送をエネルギー変換デバイスの構成に組み入れた好例は高分子固体電解質であるナフィオンを用いた燃料電池である。我々は本研究において、ナフィオンを固体電解質とし、改質触媒として酸化チタンの光励起種を使用することにより、水性メタノールを燃料に用いた光燃料電池が駆動できることを実証した。この電池の光電流発生機構はメタノールが酸化チタンの光触媒機能で水素に転換され水素電池として機能する場合と、酸化チタンの伝導帯から直接集電される場合に分かれるが、最高で2mA・cm^<-2>の電流を取り出すことができた。我々の発明した光応答機能をもつ高分子超薄膜を光反応の場として用いることを意図し、とくに超薄膜一水界面の特性評価を中心に光機能材料としての検討を行なった。まず、光非線形第二高調波発生(SHG)を利用して、界面活性剤型構造をもつ金属錯体が超薄膜表面に選択的に濃縮配向することを実証した。さらに、金属錯体としてルテニウムのトリスビピリジン錯体を用いれば、可視光を用いて水中の基質に対する電子移動型酸化還元反応を駆動できることを明らかにした。
燃料液滴パージ法によるパルスデトネーションエンジンのkHz高周波数作動

デトネーションサイクルは,燃焼サイクルで最大の理論熱効率と燃焼器小型化を同時に実現する.パルスデトネーションサイクル(PDC)は,燃焼器中でデトネーションを間欠的に生成し,この繰り返し周波数増加によって推力密度が増加する.本研究では,独自の手法である燃料液滴パージ法に,新たに酸化剤高速充填手法(特願2015-251952)を導入した.内径10mm、全長100mmの燃焼器での1010ヘルツのPDC作動実験を実施し、酸化剤供給圧力を242%増加させることで、DDT距離・時間を約50%短縮されることに成功した。最終的に,1916ヘルツの繰り返し周波数を達成し,従来の周波数のオーダーを1桁向上させた.本研究の最終的な目的は、研究者独自の手法「液体燃料を用いた液滴パージ法(燃料液滴パージ法)」を用いてパルスデトネーションエンジン(PDE)の作動周波数(推力密度)のオーダーを1桁向上させることである。初年度は、第一の課題である「液体燃料(エチレン)を用いた300 HzのPDE作動による燃料液滴パージ法の実証」に特化した実証実験を行った。実証実験では、ガスエチレンー純酸素を爆発性混合気として、液体エチレンをパージ物質として用いた。内径10 mmで全長の異なる三種類のデトネーション管(300,400,510 mm)を用いた100 Hzのバルブレスパルスデトネーション作動を試みた。その結果、間欠燃焼が確認された全ての条件で、純酸素燃焼時の理論デトネーション伝播速度の110 ±4%となり、燃料液滴パージ法によるPDE作動を実証した。また、PDE作動に必要な液体エチレンの最小液滴噴霧量は、デトネーション管長さで決定する圧力プラトー時間(閉管端で高圧既燃ガス状態が維持される時間)における液滴蒸発量に強く依存していることが明らかになった。本研究成果によって、燃料と純酸素のみを用いたPDEシステムが構築可能であることが実証された。PDE作動させるための最小液滴噴霧時間は0.75 msでありPDE1サイクル当たりの時間(10 ms)に対して十分短かい。そのため、目標作動周波数である300 Hz(3.33 ms)も十分実現可能であると考える。デトネーション波を利用したエンジンは高い熱効率、自己圧縮燃焼による圧縮機構単純化、極超音速燃焼による燃焼器ダウンサイジングが実現可能だと考えられている。近年ではAerojet-Rocketdyne(米国)、Air Fore Research Laboratory(米国)、MBDA(フランス)に代表される企業・研究機関を中心に精力的に研究が進められており、デトネーションエンジン研究は激しい競争下にある。デトネーションエンジンの自立作動は実用化へのブレイクスルーであり、パルスデトネーションエンジン(PDE)の繰り返し周波数を気体力学的上限値まで増加させることが必須である。本研究の最終目標は、独自の手法である燃料液滴パージ法を用いて従来の繰り返し周波数を1オーダー向上させることである。本年度、新たにパージガスを必要としない準バルブレスPDEを提案した[特願2015-251952]。本PDEでは、酸化剤は電磁バルブや回転バルブなどの機械的なバルブ機構を必要としないバルブレス方式で燃焼器に供給される。バルブレス方式では、デトネーション波によって生成した既燃ガスの圧力が一時的に酸化剤供給圧力よりも高くなることでガス供給を停止する。一方、液体もしくは超臨界燃料は燃焼器側面からインジェクタで適切なタイミングで噴霧され、酸化剤と混合することで爆発性混合気を生成する。ガス酸素ー液体エチレンを用いた実証実験を実施し、これまでに800Hzの高周波数作動を達成し、従来の作動周波数を1オーダー向上させることに成功した。同時に、燃焼器軸方向に配置した多数のイオンプローブによりバルブレスPDEにおける既燃ガス逆流過程の時間スケールを明らかにした。本研究1年目での達成周波数は100ヘルツであった。2年目には高周波数作動用として新たに実証機を製作し、本研究課題である高周波数作動実証に集中し実験を行った。その結果、燃料・酸化剤以外のパージ物質を用いない洗練された準バルブレスパルスデトネーションエンジン(PDE)によって800Hz作動を実証した。3年間の研究期間における最終目的(キロヘルツPD作動)に対して2年目までに80%を達成した点から、計画以上に進展したと判断した。燃料・酸化剤の混合ガス(爆発性混合気)中を超音速で伝播するデトネーション波は,最も激しい燃焼形態である.このデトネーション波を利用した内燃機関の理論熱効率は既存燃焼サイクルで最大であり,同時に超音速伝播による燃焼器の小型化を実現する.パルスデトネーションサイクル(PDC)は,筒状燃焼器中でデトネーション波を間欠的に生成する.このPDCの繰り返し周波数を増加させることによって推力密度や推力重量比が増加する.本研究は,燃焼器の全長で決定する気体力学上限周波数を達成することが最終目標である.本研究では,独自の手法である「燃料液滴パージ法(特願2013-001246)」に,新たに酸化剤高速充填手法(特願2015-251952)および高速燃料噴霧用としてピエゾインジェクタを導入した.本研究期間内では,気体力学上限周波数を達成するための基礎研究として,燃焼器内部可視化および爆発性混合気高圧充填の2種類の実験を実施した.繰り返し周波

数1000ヘルツでの可視化実験では,シュリーレン光学観測および既燃ガス自発光観測を行った.その結果,PDCサイクルの各過程を高時間分解することに成功した.特に,酸化剤および爆発性混合気の充填速度が,燃料蒸発を考慮した充填モデルと一致した点,PDCの繰り返し周波数を支配する既燃ガス排気の特性時間を評価できた点は大きな成果である.混合気高圧化実験では,スロートも持たない筒状燃焼器でのPDC作動で初めて,混合気充填圧力を増加できることを示した.実験の結果,混合気圧力を2倍にすることで,点火からデトネーション波への遷移に必要な時間・距離を約半分まで短縮できることを示した.最終的に,1916ヘルツの最高繰り返し周波数を達成し,従来の周波数のオーダーを1桁向上させた.デトネーションサイクルは,燃焼サイクルで最大の理論熱効率と燃焼器小型化を同時に実現する.パルスデトネーションサイクル(PDC)は,燃焼器中でデトネーションを間欠的に生成し,この繰り返し周波数増加によって推力密度が増加する.本研究では,独自の手法である燃料液滴パージ法に,新たに酸化剤高速充填手法(特願2015-251952)を導入した.内径10mm、全長100mmの燃焼器での1010ヘルツのPDC作動実験を実施し、酸化剤供給圧力を242%増加させることで、DDT距離・時間を約50%短縮されることに成功した。最終的に,1916ヘルツの繰り返し周波数を達成し,従来の周波数のオーダーを1桁向上させた.初年度の主な課題である「提案した燃料液滴パージ法の実証」を100%達成した。100HzでのPDE作動は、目標作動周波数300 Hzに対して達成度33%である。しかしながら、燃料液滴噴霧量の最小化は、主に燃焼器全長で支配される特性時間(プラトー時間)に支配されていることが明らかになっっており、本実験結果から、300 Hz作動も十分可能であると考えられる。初年度は、混合気質量流量の制約によって300 Hz実験を行っていないため、供給システムの強化が必要である。2年目に達成した800ヘルツは燃料噴霧インジェクタの応答性の限界である。そのため、より高応答インジェクタおよびそのドライバを導入する。また、酸化剤供給流量を現在の1.5倍まで増加させ、燃焼器内酸化剤充填速度を音速まで増加させる。以上、2点の改善を行い、1000ヘルツの繰り返し周波数を達成する。現在までに、デトネーション波によって生じる高圧既燃ガスの逆流によって繰り返し周波数が制限されてしまう問題が浮上した。燃焼器内の既燃ガス流動を検知可能なイオンプローブを多数配置し、数値計算との比較を行いながら燃焼器内部流動を理解・モデル化する。航空宇宙推進工学本年度の課題は、「既燃ガスのパージ過程および燃料蒸気と酸化剤の混合過程のメカニズムの理解」および「液体燃料供給量・混合方式の最適化(モデル化)」である。前者に対しては、300-500 Hz程度の高周波数作動実証と並行して、イオンプローブおよび高速度カメラを用いた燃焼器内可視化実験によってパージ機構の解明を行う。既に、初年度において、既燃ガスパージに失敗した条件での大まかな自着火位置・時間を特定しており、高精度化する。また、蒸発した燃料と酸化剤との混合・両論混合気の生成では、1)燃料リーン混合気と蒸発燃料との混合、2)燃焼器側面からの純酸素供給・混合の2つの手法を試みる。
光学的繰り返し写像変換の実現と画像の記録・検索・暗号化への応用

本研究は、空間的に非線形な作用を有するフィードバック光学システムを構築し、画像の記録やキ-画像による複数画像の検索、画像の暗号化への新しい手法を提案し、実証することを目的としていた。実際、システムを構築し、その出力を観測すると、多彩な現象がそこに存在することが解ってきた。そこで、応用研究を行う前に、非線形光フィードバックシステム、そのもの研究を行う必要があること考えられた。特に、興味深いことは、双安定現象や自発的パターン形成と呼ばれる現象であり、本研究では、それらの研究を重点的に行った。非線形光フィードバックシステムは、平行配向液晶空間光変調素子を含むフィードバック光学系により構成される。光双安定性が素子への印加電圧を制御することにより制御できること、および、フィードバック光学系内の相互作用の変化により制御可能であることを明らかにした。自発的パターン形成の研究では、相互作用が光の回折現象に基づく場合、自然発生的に六角状やロール状のパターン形成が起こることを示し、そのパターンピッチが光フィードバックの光路長変化の1/2乗に比例することが解った。さらに、自然形成されるパターンはビーム形状に強く依存し、六角状やロール状とは異なるパターンが形成される。正方形のビーム形状の場合、形成されるパターンはビームサイズと回折距離の関係によって定まる正方状の輝点列が発生し、円形のビーム形状の場合、同心円上に円周の長さと回折距離に応じて多角形の輝点列が発生することをそれぞれ実験的、数値解析的に示した。これらの研究成果は、第57回応用物理学会学術講演会(予稿集No.3,8p-ZS-9p.802)及び光学連合シンボジウム福岡'96(予稿集7pC04 pp.245-246)で口頭発表を行い。第44回応用物理学関係連合講演会で口頭発表の予定がある。現在、英文誌に投稿中が1件、投稿予定が1件ある。
高圧反応速度論を用いた液相電子移動過程の機構論的研究

昨年度の研究により、窒素原子上にベンジル基を有するN,N'-dibenzyl-4,4'-bipyddinium塩は有機溶媒にある程度可溶であり、紫外線を照射することによって対アニオンからの電子移動が起こりラジカルカチオンを与えることが確認できた。従ってN,N'-dibenzyl-4,4'-bipyridinium chlorideについて逆電子移動過程(back electron transfer)の速度論的測定を行った。溶媒はアセトニトリル(AN)および炭酸プロピレン(PC)とした。得られた結果は以下のように要約できる。1.反応は1次速度式に従って進行した。よってこの逆電子移動過程は塩素原子とpyridinylラジカルから成るラジカル対が原系であり、並進拡散によるラジカルの会合は速度論的に重要ではない。2.1 atmではAN,PC何れの溶媒においても電子移動過程は圧力の増加によって促進され、活性化体積は25°Cにおいて-17cm^3 mol^<-1>(PC),-57cm^3 mol^<-1>(AN)であった。この事実は電子が移動した後の極性が高い状態を安定化するように溶媒分子が再配列された状態で電子が移動し、しかもその状態が原系と平衡状態にあると考えてよい、言い換えれば反応が非断熱的である、ことを示している。AN中の活性化体積の値がPC中より大きいのは両溶媒の等温圧縮率の違いによると考えられる。3.AN,PC何れの溶媒においても速度定数が150-250MPaで極大値に達し、その後圧力の増加とともに減少した。これは、圧力の増加に伴って溶媒の粘度が増加して溶媒分子の並進拡散が遅くなったため、溶媒再配列が律速になったことを示唆する。しかし、本電子移動がmsの時間領域で進行する"遅い"反応であることを考慮すると、この解釈の妥当性には疑問が残る。以上の結果を踏まえ、今後1)対アニオンとして塩化物イオン以外のイオンを用いる、2)窒素原子上の置換基としてベンジル基以外の炭化水素基を用いる、3)より高粘度の溶媒を用いる、などの変更を測定系に加え、新たな測定を行う必要がある。
癌の悪性化におけるGLO1の役割の解明

(背景)浸潤性膵管癌の5年生存率は1-4%と非常に予後不良である理由のひとつとして膵癌の高転移能、高浸潤能が挙げられる。我々はこれまで(1)膵癌組織中のGlyoxalase I(GLO1)が周辺の非癌部組織と比較して有意に高発現していること、(2)腎細胞癌の高転移クローンでのGLO1の高発現、(3)慢性炎症誘発の実験的マウスの線維肉腫悪性化進展モデルでのGLO1の高発現、(4)GLO1が癌細胞の動きを促進し、核内に移行して機能していることを明らかにして報告してきている。(目的)本研究では蛋白質レベルでGLO1の核移行の機序を明らかにし、さらに核内でどのような蛋白質と相互作用をしているかの検討を試み、阻害による転移抑制を検討することが目的である。(結果)(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定を試みたが結果が得られなかった。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定をQRsP11細胞からNE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagentsを用いて核内蛋白質を抽出しDynabeads Co-Immunoprecipitation Kit(Novex)と抗GLO1抗体によるCo-IPを試みたが、有意な蛋白バンドを検出できなかったため、膵癌細胞株KLM1とマウスプログレッションモデル線維肉腫株QRsP11へのトランスフェクションによってGLO1高発現株を作製した。また、Bio-IDを付けたGLO1高発現株も同様に作製した。(3)分担研究者が膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養を試みたが成功していない。2017年4月から山口大学医学系研究科から北海道医療大学がん予防研究所に転勤になった。がん予防研究所の専任研究員は申請者ひとりであり、機器、実験室等の環境が整っておらず基本的な研究の遅れが目立っている。しかしながら、就任2年目でようやく実験ができる環境が整って来て課題研究を進める事ができた。(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定は進めたがうまくいかなかった。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定を再度試みたが、明らかな共沈と思われるバンドを検出する事ができなかったため、ヒト膵癌細胞株KLM1とマウスプログレッションモデル線維肉腫株QRsP11にGLO1を強発現させる株を作製した。また、細胞内での蛋白-蛋白相互作用の解析のためにBio-IDを付けたGLO1を発現させる株も作製した。(3)膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養は分担研究者がオルガノイドの樹立を試みているが、未だ樹立に成功していない。(1)GLO1強発現株のKLM1とQRsP11細胞、またはBio-IDをGLO1に付けて強発現させたKLM1とQRsP11を用いて、核内でGLO1と結合して機能していることが予想される蛋白質を同定して、GLO1のプログレッションした癌細胞での役割を明らかにする。(2)膵癌のオルガノイド樹立は申請者からの手を離れて研究分担者に頼ることになるが、ノウハウがあるので、山口大に出向いて何度か共同で実験を行う。(3)ChIP-seqは、試みたものの未だ成功しておらず、北海道医療大学の研究環境的に施行困難なため共同研究や受託でなんとか進めていく。浸潤性膵管癌の5年生存率は1-4%と非常に予後不良であり、発見時に手術不能症例が大多数を占める。その理由のひとつとして膵癌の高転移能、高浸潤能が挙げられる。そこで、膵癌の高転移能、高浸潤能に関与する蛋白質同定を目的として膵癌組織のプロテオーム解析を行ったところ、膵癌組織中のGlyoxalase I (GLO1)が周辺の非癌部組織と比較して有意に高発現していることが明らかとなった。GLO1は解糖系の中間代謝産物methylglyoxalを乳酸に分解して解毒する酵素である。これまでの数年間の癌組織と癌細胞のプロテオーム解析の研究から、膵癌組織でのGLO1の高発現、腎細胞癌の高転移クローンでのGLO1の高発現、また慢性炎症誘発の実験的マウスの線維肉腫悪性化進展モデルでのGLO1の高発現を明らかにしてきた。また、GLO1が癌細胞の動きを促進していること、核内に移行して機能していることを明らかにしてきている。本研究では蛋白質レベルでGLO1の核移行の機序を明らかにし、さらに核内でどのような蛋白質と相互作用をしているかの検討を試み、阻害による転移抑制を検討することが目的である。(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定を試みた。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定をQRsP11細胞からNE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagentsを用いて核内蛋白質を抽出しDynabeads Co-Immunoprecipitation Kit (Novex)と抗GLO1抗体によるCo-IPを試みた。(3)膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養を試みた。

しかしながら、就任1年が経過して来ておりようやく実験ができる環境が整って来つつある。(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定は、実験環境がかなり異なり当該年度は全く進められなかった。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定を試みたが、明らかな共沈と思われるバンドを検出する事ができず、同定に至っていない。(3)膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養は申請者本人は医学部附属病院が併設していた山口大学を退職したことで膵癌組織の入手が困難となったため断念したが、分担研究者が引き続きオルガノイドの樹立を試みている。しかしながら、未だ樹立に成功していない。(背景)浸潤性膵管癌の5年生存率は1-4%と非常に予後不良である理由のひとつとして膵癌の高転移能、高浸潤能が挙げられる。我々はこれまで(1)膵癌組織中のGlyoxalase I(GLO1)が周辺の非癌部組織と比較して有意に高発現していること、(2)腎細胞癌の高転移クローンでのGLO1の高発現、(3)慢性炎症誘発の実験的マウスの線維肉腫悪性化進展モデルでのGLO1の高発現、(4)GLO1が癌細胞の動きを促進し、核内に移行して機能していることを明らかにして報告してきている。(目的)本研究では蛋白質レベルでGLO1の核移行の機序を明らかにし、さらに核内でどのような蛋白質と相互作用をしているかの検討を試み、阻害による転移抑制を検討することが目的である。(結果)(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定を試みたが結果が得られなかった。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定をQRsP11細胞からNE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagentsを用いて核内蛋白質を抽出しDynabeads Co-Immunoprecipitation Kit(Novex)と抗GLO1抗体によるCo-IPを試みたが、有意な蛋白バンドを検出できなかったため、膵癌細胞株KLM1とマウスプログレッションモデル線維肉腫株QRsP11へのトランスフェクションによってGLO1高発現株を作製した。また、Bio-IDを付けたGLO1高発現株も同様に作製した。(3)分担研究者が膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養を試みたが成功していない。2017年4月から山口大学医学系研究科から北海道医療大学がん予防研究所に転勤になった。がん予防研究所の専任研究員は申請者ひとりであり、機器、実験室等の環境が整っておらず基本的な研究の遅れが目立っている。しかしながら、就任2年目でようやく実験ができる環境が整って来て課題研究を進める事ができた。(1)ChIP-Seq法によるGLO1結合DNA断片の同定は進めたがうまくいかなかった。(2)GLO1のCo-IPによる核内蛋白質の同定を再度試みたが、明らかな共沈と思われるバンドを検出する事ができなかったため、ヒト膵癌細胞株KLM1とマウスプログレッションモデル線維肉腫株QRsP11にGLO1を強発現させる株を作製した。また、細胞内での蛋白-蛋白相互作用の解析のためにBio-IDを付けたGLO1を発現させる株も作製した。(3)膵癌組織からのオルガノイド樹立と培養は分担研究者がオルガノイドの樹立を試みているが、未だ樹立に成功していない。
リンパ腫におけるDNA組み換え修復異常の解析-慢性炎症との関連性について-

膿胸関連リンパ腫(PAL)は、慢性炎症を基盤に発症するリンパ腫である。PAL細胞株、臨床検体を用いてDNA鎖切断修復遺伝子ATM, ATRの遺伝子異常を解析した。1.PAL由来細胞株8例および臨床検体5例から抽出したRNAを用い。ATR、ATM遺伝子のORF全長について遺伝子変異の有無を調べた。細胞株ではATM5例とATR2例の変異を認め、臨床例ではATR変異を2例に認めた。2.ATR変異を認めた細胞株(OPL-2,Pal-1)を用いて、電離放射線(IR),紫外線(UV)によるDNA損傷に対する反応を機能的に検討したところ次のような結果が得られた。A)IRによる二重鎖切断の修復能を解析したところ、DNA二重鎖修復能の遅滞を認めた。B)UVによる一重鎖切断の修復能を解析したところ、DNA一重鎖切断修復能の遅延、消失を認めた。C)IR, UVによるDNA損傷後の細胞周期の変化をフローサイトメトリーを用いて解析したところ細胞周期のG1-S checkpointの異常を認めた。また、細胞周期制御に重要なp53蛋白の蓄積能の低下を認めた。ATMとATRの変異はPALにおいて高率に認め、DNA鎖切断に対する応答異常をもたらすことから、リンパ腫発生に関与している可能性がある。鼻腔リンパ腫、慢性活動性EBV感染症はアジアに比較的多く見られる予後不良のリンパ腫である。鼻腔リンパ腫では8例中2例、慢性活動性EBV感染症は3例中1例の細胞株にATR変異が見られた。臨床例でも10例中4例に変異が見られた。細胞株において、PALと同様の機能異常を認めた。ミスマッチ修復は塩基損傷修復のひとつであり、発癌への関与が知られている。われわれは血液系細胞株50例の解析からミスマッチ修復異常のある細胞株では、DNA組み換え修復の主要遺伝子であるATM, MRE11にsplicing異常が生じる可能性を示した。炎症巣で発生する活性酸素は細胞のゲノム損傷をもたらすが、DNA修復異常があると、ゲノム変異の蓄積から癌化をもたらす可能性がある。PAL細胞株、臨床検体を用いてDNA鎖切断修復遺伝子ATM,ATRの遺伝子異常を解析し、新たな視点からリンパ腫発生機序を検討した。A)IRによる二重鎖切断の修復能をパルスフィールド電気泳動法で解析したところ、DNA二重鎖修復能の遅滞を認めた。B)UVによる一重鎖切断の修復能をComet-assay法で解析したところ、DNA一重鎖切断修復能の遅延、消失を認めた。C)IR,UVによるDNA損傷後の細胞周期の変化をフローサイトメトリーを用いて解析したところ細胞周期のG1-S checkpointの異常を認めた。

ATMとATRの変異はPALにおいて高率に認め、DNA鎖切断に対する応答異常をもたらすことから、リンパ腫発生に関与している可能性がある。ミスマッチ修復は塩基損傷修復のひとつであり、発癌への関与が知られている。われわれは血液系細胞株50例の解析からミスマッチ修復異常のある細胞株では、DNA組み換え修復の主要遺伝子であるATM,MRE11にsplicing異常が生じる可能性を示した。膿胸関連リンパ腫(PAL)は、慢性炎症を基盤に発症するリンパ腫である。PAL細胞株、臨床検体を用いてDNA鎖切断修復遺伝子ATM, ATRの遺伝子異常を解析した。1.PAL由来細胞株8例および臨床検体5例から抽出したRNAを用い。ATR, ATM遺伝子のORF全長について遺伝子変異の有無を調べた。細胞株ではATM5例とATR2例の変異を認め、臨床例ではATR変異を2例に認めた。2.ATR変異を認めた細胞株(OPL-2,Pal-1)を用いて、電離放射線(IR),紫外線(UV)によるDNA損傷に対する反応を機能的に検討したところ次のような結果が得られた。A)IRによる二重鎖切断の修復能を解析したところ、DNA二重鎖修復能の遅滞を認めた。B)UVによる一重鎮切断の修復能を解析したところ、DNA一重鎖切断修復能の遅延、消失を認めた。C)IR, UVによるDNA損傷後の細胞周期の変化をフローサイトメトリーを用いて解析したところ細胞周期のG1-Scheckpointの異常を認めた。また、細胞周期制御に重要なp53蛋白の蓄積能の低下を認めた。ATMとATRの変異はPALにおいて高率に認め、DNA鎮切断に対する応答異常をもたらすことから、リンパ腫発生に関与している可能性がある。鼻腔リンパ腫、慢性活動性EBV感染症はアジアに比較的多く見られる予後不良のリンパ腫である。鼻腔リンパ腫では8例中2例、慢性活動性EBV感染症は3例中1例の細胞株にATR変異が見られた。臨床例でも10例中4例に変異が見られた。細胞株において、PALと同様の機能異常を認めた。われわれは血液系細胞株50例の解析からミスマッチ修復異常のある細胞株では、DNA組み換え修復の主要遺伝子であるATM, MRE11にsplicing異常が生じる可能性を示した。
分子認識相互作用と高分子材料のダイナミックスのカップリング

構造のはっきりとした結合サイトを有し、コンフォーメーション変化によってその構造が変化しうるような人工レセプターとして、ポルフィリン骨格に分子認識部位を組み込んだ分子をモノマー分子と共重合させることによって、ゲルレセプターの合成を検討した。このようなゲルレセプターは、高分子鎖のコンフォーメーション変化によってレセプター部位の構造が変化し、ゲスト分子に対する親和性のオン・オフが可能になり、外部パラメーターで親和性を変化させうる新しいタィプの人工レセプター・人工酵素分子になりうると期待できる。ゲルレセプターは、meso-位にフェニル基を有するポルフィリンにベンゼン環を介して長鎖アルキル差を結合させ、その末端に、アクリルアミド基を結合させた誘導体をまず、合成した。このポルフィリンを亜鉛錯体に変換し、疎水性のアミノ酸、アミンを水中から吸着しうる人工レセプターゲルの前駆体を合成した。これをアクリルアミド、または、N-イソプロピルアクリルアミド、架橋剤のメチレンビスアクリルアミドと供重合させることで、均一で透明なゲルを得ることができた。このゲルの紫外・可視吸収スペクトルは、シャープなポルフィリンのソーレーバンドを示し、ポルフィリンが単分子で分散していることが示された。このゲルの相転移挙動、異なる相状態における分子認識挙動について、今後検討し、生理活性物質に対して、強い親和性をもち、かつ、ゲストの脱着が温度、イオン強度、pHなどの変化で行えるような機能性ゲルの合成を目指す。
細胞レベルでの解析による骨髄細胞移植治療の心機能改善機序の解明

自己骨髄細胞の心筋内投与によって、虚血心筋の血流や心機能が改善することが報告されている。しかしながら、その機序の詳細は不明である。我々は、移植された骨髄細胞から分泌される因子が血管新生や心機能改善に寄与すると考え、この仮説を証明することを本研究の目的とした。Wistarラットから単離した骨髄単核球細胞(BMC)は、通常酸素(20%O_2)および低酸素(1%O_2)条件下で培養した。24時間培養後の上清を以下の実験に用いた。なお、BMCを培養していない培地をcontrolとした。同ラットより成獣心筋細胞(CMC)を単離し、先に採取した各培養上清を添加し培養を行った。apoptosisに陥ったCMCは、control群で有意に高値であった(培養72時間後)。また、CMCのCell lengthやCa^<2+>transientの測定を行うと、control群に比べて通常酸素、低酸素群では収縮能が良好であった(培養48時間後)。さらに、培養上清中にはVEGF,IL-1β,bFGFなど様々な因子が分泌されており、いくつかの因子は低酸素培養による有意な上昇が認められた。左前下行枝(LAD)結紮によりラット心筋梗塞モデルを作製した直後に各培養上清20μlを左室自由壁5カ所に、結紮2、4、6日後には0.5mlを腹腔内に投与した。経胸壁心エコーによる心機能の評価では、通常酸素および低酸素群の左室収縮率はcontrol群に比べて有意に増加していた(結紮7日後)。さらに、梗塞心の組織学的解析では、control群と比較して通常酸素および低酸素群における毛細血管密度の増加と線維化面積の減少が認められた(結紮28日後)。以上の結果から、骨髄単核球細胞から分泌される様々な因子が血管新生を促進すると共に、心筋細胞に直接作用することによって低下した心機能の改善に寄与すると考えられた。骨髄細胞移植後の心機能改善効果の作用機序は虚血心筋の血流改善作用、骨髄細胞から産生された液性因子の心筋保護作用、心筋remodelingの抑制作用、直接に機能的な心筋再生作用などによるものが考えられる。しかし、今までの研究報告ではほとんどが骨髄細胞移植後の臓器レベルでの分析に留まっており、細胞レベルでの作用機序の解明はまったく進んでいないのが現状である。本研究ではin vitroで単一心筋細胞レベルでの解析を行い、生体内の組織因子の影響を受けない液性因子による心機能改善効果の作用機序(paracrine mechanisms)を調べる。Wister Ratより骨髄単核球細胞(BMC)を採取し、通常酸素(5% CO_2,95% air)と低酸素(1% O_2)下で24時間培養を行った。両培養上清のみを採取し、以下の実験に用いた。同Ratより成獣心筋細胞(CMC)を単離し、先に採取した上清とそれに対してBMCを培養していないcontrol mediumを用いて、72時間培養した。培養後、Tunnel法でapoptosisに陥った細胞を測定した。同様に48時間培養したCMCの電気刺激下でのCell、lengthおよびCa^<2+> transientを測定した。骨髄単核球細胞の培養上清中にはVEGF, bFGE PDGF, IGF-1,IL-1beta, TGF-betaなど様々な因子がELISAあるいはWestern blot法で検出された。

Apoptosisに陥ったCMCは、control群で有意に高値であった。CMCのCell length, Ca^<2+> transientの測定では、通常酸素、低酸素群がcontrol群に比べて収縮能が良好であった。骨髄細胞の培養上清では培養心筋細胞のapoptosisを有意に抑制し、心筋細胞の収縮機能を有意に温存することができた。今後はラット心筋梗塞モデルを用いて、骨髄細胞から産生される因子(培養上清)の心機能改善効果の有無を調べ、その作用機序を明らかにする。骨髄細胞移植後の心機能改善効果の作用機序は、移植細胞から産生された液性因子による血流改善作用、心筋保護作用、心筋remodeling抑制作用などによるものと考えられる。しかし、今までの研究報告のほとんどが骨髄細胞移植後の臓器レベルの分析に留まっており、細胞レベルの解析による作用機序の解明はまったく進んでいない。本研究ではin vitroで単一心筋細胞レベルでの解析を行い、生体内の組織因子の影響を受けない液性因子による心機能改善効果の作用機序(paracrine mechanisms)を調べることを目的とした。本年度はラット心筋梗塞モデルを用いて、骨髄細胞から産生される因子(培養上清)の心機能改善効果の有無を調べ、その作用機序について検討した。Wistarラットから採取した骨髄単核球細胞は通常培養(95%air、5%CO_2)あるいは低酸素培養(1%O_2)を行い、24時間後に両培養上清を採取した。左前下行枝(LAD)結紮によりラット心筋梗塞モデルを作製した直後に通常培養および低酸素培養後の上清20μlを左室自由壁5カ所に、結紮2、4、6日後には0.5mlを腹腔内に投与した。なお、骨髄細胞を培養していない培地をcontrolとして投与した。経胸壁心エコーで心機能を評価したところ、結紮7日後において通常酸素および低酸素群の左室収縮率はcontrol群に比べて有意に増加していた。結紮28日後の心臓標本を用いての組織学的解析では、control群と比較して、通常酸素および低酸素群における毛細血管密度の増加と線維化面積の減少が認められた。以上の結果から、骨髄単核球細胞から分泌される様々なサイトカインは血管新生を促進するだけでなく、直接心筋細胞に働きかけ、梗塞で低下した心機能の改善をもたらすと考えられた。
RNA結合能を有するGTP結合タンパク質ERAの生理機能解明

昨年度の当該研究において、ERAはミトコンドリアに局在するGTP結合タンパク質であることが判明した。そこで、本年度はミトコンドリアにおけるERA複合体の同定および昨年度に引き続いてERA欠損マウスの作製を行った。1、ERAを含むタンパク質複合体の精製およびその構成因子の同定FlagおよびHisを付加したERAの安定発現HeLa細胞株を樹立し、その細胞からミトコンドリア粗抽出液を調整した。その後、抗Flag抗体を用いた免疫沈降、Niレジンを用いたアフィニティ精製を行うことで、高精製度のERAタンパク質複合体を得ることに成功した。さらに、その複合体をSDS-PAGEで分離し複数の複合体構成分子由来のバンドを検出したのち、ゲルよりそれら構成分子を単離しMALDI-TOF-TOF/MSを用いた質量分析を行うことで、ERA複合体構成因子の同定に成功した。その結果、ERAはミトコンドリアでのタンパク質合成や細胞死制御に関与する因子と複合体を形成していることが判明した。2、ERA欠損マウスの作製昨年度、マウスERAゲノムのクローニングを行った。本年度は、Cre-loxP systemを用いたERA遺伝子のコンディショナルターゲッティングベクターを作製した。作製したターゲッティングベクターをマウスES細胞に導入し相同性組み換えを起こさせ、ERAヘテロ欠損ES細胞の樹立に成功した。現在、樹立したES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。1、ERAの細胞内における局在の決定抗ERA抗体を用いた蛍光免疫法および細胞分画法により、ERAはミトコンドリアに局在する結果を得た。そこで、ミトコンドリアにおけるERAの局在の決定を行った。HeLa細胞より単離したミトコンドリアに対して、濃度を変えた界面活性剤処理により外膜、内膜を段階的に破砕しproteinaseK処理を行ったところ、ERAはマトリクスタンパク質HSP70が分解する濃度の界面活性剤処理で分解した。さらに、ミトコンドリアを超音波破砕し、膜と可溶性画分に分けたところ、ERAは膜画分に存在していた。これらの結果より、ERAはミトコンドリアマトリクス側の内膜に結合していることが判明した。2、ERAを含むタンパク質複合体の精製およびその構成因子の同定FLAGおよびHis-tagを付加したERAの安定発現HeLa細胞株を樹立し、その細胞からミトコンドリア抽出液を調製した。その後、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降、Niレジンを用いたアフィニティ精製の2段階精製を行うことで、高精製度のERAタンパク質複合体を得ることに成功した。さらに、その複合体をSDS-PAGEで分離し、複数の複合体構成成分由来のバンドを検出した。今後、ゲルより結合タンパク質を単離し、MALDI-TOF-TOF/MSで複合体構成成分の同定中である。3、ERA欠損マウスの作製マウスゲノムライブラリーを用いて、マウスERA遺伝子のクローニングを行った。
閉塞性睡眠時無呼吸フェノタイプ診断プログラムの構築および診断機器の開発

本研究は、閉塞性睡眠時無呼吸の成因に基づいたフェノタイプ診断プログラムの構築・診断機器開発・治療法確立を目的としている。呼吸ドライブおよび呼吸努力度評価のため胸腔内圧モニタリンセンサーとして平成29年度に開発したピエゾフィルムセンサーの測定仕様を確立した。フィルムセンサーは、胸骨上窩に貼付し、胸腔内圧をモニタリングすることとし、その発生電圧の較正として、800mlの定容量バッグを、口腔内圧を測定するセンサーを介した回路に装着し、被験者に吸気呼気を繰り返させることで発生する電圧と口腔内圧、そして800mlの容量との関係を試験前に記録することとした。姿勢により発生電圧が変化することから、仰臥位、右側臥位、左側臥位の3姿勢それぞれで較正を行うこととした。睡眠中の呼吸調節反応度については、CO2、O2、上気道抵抗、覚醒反応と無呼吸後の再開呼吸時の換気量との関連性を検討する必要がある。換気量に関しては、先ほどのピエゾセンサー発生電圧から評価可能となる。CO2に関しては、睡眠時無呼吸低呼吸時の呼気終末CO2について検討した。閉塞性無呼吸時は、閉鎖回路となることから、無呼吸再開直後の呼気終末CO2はPaCO2に一致する。呼気終末CO2の無呼吸イベント時の変化を換気障害のない閉塞性睡眠時無呼吸患者のPSGデータから検討した。呼吸再開直後の呼気終末CO2はイベント前後の中で最高値を示していた。今後は、換気応答検査をおこなうことで、PSGデータでの換気応答反応と一致するか検討する予定である。本研究は、閉塞性睡眠時無呼吸の成因に基づいたフェノタイプ診断プログラムの構築・診断機器開発・治療法確立を目的としており、平成28年度は、フェノタイプ診断プログラムの構築のため、PSG検査において測定できる指標の検討および測定法について検討してきた。上気道機能を評価する指標として吸気開始圧を用いることとし、吸気圧を測定するためにピエゾ素子を胸郭に貼付し、胸腔内圧(食道内圧)および口腔内圧との関係について基礎的データを収集した。この指標を利用することにより、呼吸ドライブおよび吸気開始時の胸腔内圧・口腔内圧が評価可能となる。PSG検査時においては、睡眠時の吸気流速が生じるための吸気圧が明らかとなり、閉塞時の上気道機能の状態を評価することが可能となる。また、無呼吸再開後の呼吸ドライブを評価することが可能となり、呼吸調節機能を評価するために必要な指標ともなりうる。呼吸調節機能を評価する指標として呼吸調節反応度を用いることとし、呼吸調節反応度は、閉塞性無呼吸直後の再開呼吸時の、最大呼気CO2および最低酸素飽和度と、最大呼吸量および呼吸ドライブとの関係から求めることとした。そのために、酸素飽和度とともに、PSG検査時に連続的に安定した呼気CO2記録を行う必要があり、そのための測定技術の改良をおこなってきた。呼気CO2は、圧センサーの鼻カニューラから、呼気ガスの一部を呼気CO2測定器に流す回路を製作した。呼気CO2は、有効換気量の他に、換気血流不均等や肺循環が影響するため、呼気CO2評価の意味を明らかにするために、呼気CO2とともに、呼気O2およびスパイログラムで評価できる機器を製作し、現在データ収集中である。上気道機能評価として、PSG検査とは別に、安静吸気時の陰圧負荷による吸気速度の変化を利用することを考えており、現在開発中の陰圧負荷安静呼気測定機器の改良を検討しているところである。閉塞性睡眠時無呼吸症候群患者のフェノタイプを明らかにすることを本研究の目的の一つとしているが、そのデータの収集はまだ行われていない。口腔内圧・胸腔内圧・呼吸ドライブの指標として考えているピエゾ素子センサーによる測定方法および貼付部位について現在も検討中であるためである。平成29年度は、ピエゾフィルムセンサーを胸骨上窩、胸骨剣状突起下、両側鎖骨上窩、両側下部肋骨の6か所に貼付し、呼吸抵抗負荷時の、胸腔内圧(食道内圧)、口腔内圧変化と、各ピエゾセンサー発生電圧との関係を検討した。結果、食道内圧と口腔内圧がほぼ同値であり、ピエゾセンサー発生電圧は、胸腔内圧および口腔内圧の変化に伴って変化する知見が得られた。部位においては、胸骨上窩からの発生電圧が最も高く、それに次ぐのは胸骨下部からの発生電圧であった。こと知見から、PSG測定前に口腔内圧と胸骨上窩部位のピエゾセンサー発生電圧との関係を記録しておくことで、口腔内圧・胸腔内圧(口腔内圧とほぼ同値であったので)をピエゾセンサーから推測することが可能であることが確認された。PSGに胸骨上窩部位のピエゾセンサー発生電圧を入力するシステムを構築し、睡眠時の姿勢変化に追随することを確認している。上気道機能評価のためには、ピエゾセンサーから推定する口腔内圧・胸腔内圧と、口鼻からの気流速度が必要である。PSG測定に用いている圧フローセンサーの精度を確認する必要があるものの、圧フローセンサーから気流速度を測定し、口腔内圧との関係から、睡眠中の気道抵抗変化を測定することが可能となる。

換気量に関しては、先ほどのピエゾセンサー発生電圧から評価可能となる。CO2に関しては、理論的には呼気終末CO2がPaCO2と一致するが、閉塞性換気障害などではPaCO2に比べて呼気終末CO2値は低くなることから、呼気終末CO2値を含めた呼気CO2値とPaCO2との関係を検討してきた。閉塞性睡眠時無呼吸症候群患者のフェノタイプを鑑別できる測定方法の構築を本研究の目的としているが、今回、上気道機能評価に必要な口腔内圧(胸腔内圧)を、胸骨上窩部位のピエゾフィルムセンサーから推定することが可能であることを確認でき、上気道機能を評価する方法が構築された。しかし、呼吸調節機能においては、呼気CO2からPaCO2を推定する方法が構築できていない。本研究は、閉塞性睡眠時無呼吸の成因に基づいたフェノタイプ診断プログラムの構築・診断機器開発・治療法確立を目的としている。呼吸ドライブおよび呼吸努力度評価のため胸腔内圧モニタリンセンサーとして平成29年度に開発したピエゾフィルムセンサーの測定仕様を確立した。フィルムセンサーは、胸骨上窩に貼付し、胸腔内圧をモニタリングすることとし、その発生電圧の較正として、800mlの定容量バッグを、口腔内圧を測定するセンサーを介した回路に装着し、被験者に吸気呼気を繰り返させることで発生する電圧と口腔内圧、そして800mlの容量との関係を試験前に記録することとした。姿勢により発生電圧が変化することから、仰臥位、右側臥位、左側臥位の3姿勢それぞれで較正を行うこととした。睡眠中の呼吸調節反応度については、CO2、O2、上気道抵抗、覚醒反応と無呼吸後の再開呼吸時の換気量との関連性を検討する必要がある。CO2に関しては、睡眠時無呼吸低呼吸時の呼気終末CO2について検討した。閉塞性無呼吸時は、閉鎖回路となることから、無呼吸再開直後の呼気終末CO2はPaCO2に一致する。呼気終末CO2の無呼吸イベント時の変化を換気障害のない閉塞性睡眠時無呼吸患者のPSGデータから検討した。呼吸再開直後の呼気終末CO2はイベント前後の中で最高値を示していた。今後は、換気応答検査をおこなうことで、PSGデータでの換気応答反応と一致するか検討する予定である。ピエゾ素子センサーについては、早急に測定方法および貼付部位について、結論を出し、PSG検査時に、ピエゾ素子センサーを用いて、呼気CO2とともに評価する予定である。それと平行して、覚醒時の呼吸調節検査を行い、PSG検査時の呼吸調節機能と比較する予定である。上気道機能においても、覚醒時に安静吸気時の陰圧負荷時の吸気速度の変化の測定を、機器の改良が済み次第おこない、PSG測定時の上気道機能指標と比較検討する予定である。ピエゾフィルムセンサーを加えたPSG検査を実施する予定である。呼気CO2とPaCO2との関連性を検討し、PaCO2を推定する方法を構築する予定である。PSG検査による閉塞性睡眠時無呼吸の患者での測定が行われていません。そのため、次年度使用額が生じました。呼気CO2測定装置がまだ完成されておらず、その費用も次年度初めに使用する予定ですまた、PSG検査による閉塞性睡眠時無呼吸の患者での測定が行われていません。そのため、検査謝金として計画されている費用については次年度以降に使用することとなります
肥満症および肥満関連疾患改善のための新しい内視鏡治療法の開発

平成30年度は、平成31年度に行うミニブタモデルを用いた動物実験(内視鏡的胃筋層切開術の有効性および安全性評価)に向けた準備を行った。動物実験を行う神戸医療機器開発センターと打ち合わせを行い、実験の流れ・使用するミニブタの種類・生後日数、血液・組織の採取及び保管方法を決定し、作成した実験プロトコールを動物実験倫理委員会に提出した。また、下記の実験の実施および検体の採取・測定に必要な項目の調整を行った。日本クレア株式会社と協議し肥満ミニブタモデル作成のための高脂肪食の調整を行い、肥満ミニブタモデル作成に適した高脂肪食中の脂質含有量・総カロリーを決定した。血糖値・血中脂質値・血中胆汁酸・消化管ホルモン・肝臓及び胃組織中の脂質値、の測定に関しては、株式会社スカイライト・バイオテックと協議し試薬・測定法を決定し、ミニブタモデルの検体を用いて上記項目を測定できる状況を確立した。胃筋層切開術によるアウエルバッハ神経叢の切断状況を評価するための病理評価に使用する免疫組織化学染色の試薬、胃・肝臓組織中の脂質量・線維化を評価するための試薬を病理医と協議し決定した。便中腸内細菌叢、血清酸化ストレスマーカーを測定するための試薬・経路の決定も行った。上記、実験および検体の測定法の調整とともに、内視鏡的胃筋層切開術に使用する内視鏡デバイス(三角ナイフ)の購入を行い、平成31年度の研究費を受け取った後、速やかに実験が開始できる状態を整えた。当初の予定通り、動物実験を行うためのプロトコール作成、動物実験で使用するミニブタモデルの調整、実験で得られる各種検体の測定方法の確立および試薬の準備、はできており、今後予定している平成31年度のミニブタモデルを用いた動物実験及び得られた検体からの各種項目の測定ができる状態が整っているため。実験で得られる検体(血液・便・胃や肝臓組織)中の項目を測定するための試薬の購入はまだ行っていないが、上述したように試薬の決定および試薬を取り扱う業者との調整は終了しており、速やかに実験開始可能な状況は整っているため、当初の計画通り順調に進展している。平成31年度にミニブタモデルを用いた動物実験を行い、肥満ミニブタモデルに対する内視鏡的胃筋層切開術の有効性および安全性評価を行う。有効性評価は飼育中(4週間)の体重変化および各種検査項目(血液、便、胃・肝臓組織)の変化で評価する。各種項目を測定するための試薬を上記動物実験と同時期に購入し、動物実験終了後、速やかに試薬を用いて各種項目を測定し、結果を評価する。安全性評価は4週間の飼育中のミニブタモデルの活動状況および、4週間の飼育後の胃周囲の状況(安楽死の際に腹腔内の状況を確認し、胃周囲の癒着状況や周囲の臓器への影響を確認する)、4週後に摘出する胃組織の病理評価で行う。平成32年度に研究結果をまとめ、学会報告・論文作成を行う予定であるが、各種検査項目の測定および結果の解釈が速やかに進めば、平成31年度中に研究結果をまとめ始め、学会報告・論文作成の準備を行う。

有効性評価は飼育中(4週間)の体重変化および各種検査項目(血液、便、胃・肝臓組織)の変化で評価する。各種項目を測定するための試薬を上記動物実験と同時期に購入し、動物実験終了後、速やかに試薬を用いて各種項目を測定し、結果を評価する。安全性評価は4週間の飼育中のミニブタモデルの活動状況および、4週間の飼育後の胃周囲の状況(安楽死の際に腹腔内の状況を確認し、胃周囲の癒着状況や周囲の臓器への影響を確認する)、4週後に摘出する胃組織の病理評価で行う。平成32年度に研究結果をまとめ、学会報告・論文作成を行う予定であるが、各種検査項目の測定および結果の解釈が速やかに進めば、平成31年度中に研究結果をまとめ始め、学会報告・論文作成の準備を行う。平成31年度に行う動物実験で用いる高脂肪食の配合決定・取り扱い業者との調整、実験で得られる検体(血液・便・胃や肝臓組織)中の項目を測定するための試薬の決定・試薬取り扱い業者との調整、は終了しているが、実際の上記の購入は、平成31年度の動物実験開始時が望ましいと判断したため、次年度使用額が生じた。当初は上記項目を平成30年度に購入する予定であった。平成31年度の交付予定研究費と平成30年度の残額(次年度使用額)を用いて、上記動物実験(高脂肪食の購入含めて)および各種項目の測定を行う。