hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胸部MDCT画像を用いた小型肺腫瘤経時変化定量コンピュータ支援診断システムの構築

研究実績の概要は以下の4項目にまとめられる.1.小型肺腫瘤のセグメンテーション小型肺腫瘤の三次元の画像データを用いて,血管や胸壁を除去して腫瘤だけを正確にセグメンテーションして抽出するアルゴリズムの開発をおこなった.この結果として,従来の単純な輪郭を持つ腫瘤に加えて,複雑な形状を持つ腫瘤やGGOとよばれる淡い輪郭を持つ腫瘤に対して正確な肺腫瘤のボリュームデータが得られるようになった.この結果は電子情報通信学会論文誌に発表した.2.小型肺腫瘤の特徴解析胸部X線CT画像において肺腫瘤陰影を読影する際,腫瘤の辺縁,内部構造などの形状や濃淡分布などの特徴に着目する.しかしその評価は読影医の経験や主観などにより判断基準が個々に異なる.主観的指標による画像診断を,コンピュータにより客観的かつ定量的な情報とし読影医に提供する計算機支援診断システムへの期待が高まっている.本研究ではフラクタル解析を用いて,肺腫瘤の特徴量解析を行った.この成果はEuropean Journal of Radiology誌に発表した.3.小型肺腫瘤の経時変化定量化4.胸部CT画像の経時的サブトラクション法胸部CT画像の診断においては,小型肺腫瘤を含めた胸部CT画像全体の経時的サブトラクション法が有用である.本研究においては肋骨の位置ずれ量からばねモデルにより位置ずれ量を推定し最後にワーピング処理をおこなうことにより胸部CT画像のサブトラクションを試みた.この成果は現在投稿中である.研究実績の概要は以下の4項目にまとめられる.1.小型肺腫瘤のセグメンテーション小型肺腫瘤の三次元の画像データを用いて,血管や胸壁を除去して腫瘤だけを正確にセグメンテーションして抽出するアルゴリズムの開発をおこなった.この結果として,従来の単純な輪郭を持つ腫瘤に加えて,複雑な形状を持つ腫瘤やGGOとよばれる淡い輪郭を持つ腫瘤に対して正確な肺腫瘤のボリュームデータが得られるようになった.この結果は電子情報通信学会論文誌に発表した.2.小型肺腫瘤の特徴解析胸部X線CT画像において肺腫瘤陰影を読影する際,腫瘤の辺縁,内部構造などの形状や濃淡分布などの特徴に着目する.しかしその評価は読影医の経験や主観などにより判断基準が個々に異なる.主観的指標による画像診断を,コンピュータにより客観的かつ定量的な情報とし読影医に提供する計算機支援診断システムへの期待が高まっている.本研究ではフラクタル解析を用いて,肺腫瘤の特徴量解析を行った.この成果はEuropean Journal of Radiology誌に発表した.3.小型肺腫瘤の経時変化定量化4.胸部CT画像の経時的サブトラクション法胸部CT画像の診断においては,小型肺腫瘤を含めた胸部CT画像全体の経時的サブトラクション法が有用である.本研究においては肋骨の位置ずれ量からばねモデルにより位置ずれ量を推定し最後にワーピング処理をおこなうことにより胸部CT画像のサブトラクションを試みた.この成果は現在投稿中である.【目的】本研究の目的は,MDCTにより撮影された末梢小型肺腫瘤の厳密な経過比較をおこない,その大きさや特徴量の経時的変化に対して客観的かつ定量的な情報を放射線科医に提供し,適切な診断を促すことを支援するシステムを開発することである.MDCTでは従来のCTに比べて,より薄いスライスで高解像な画像を高速に取得可能であり,肺小腫瘤の時系列データの比較診断には適切であり,今後のCT検査の主流となると考えられる.【実績】小型肺腫瘤の三次元の画像データを用いて,血管や胸壁を除去して腫瘤だけを正確にセグメンテーションして抽出するアルゴリズムの開発をすすめた.この結果として正確な肺腫瘤のボリュームデータが得られるようになった.アルゴリズムの開発には,研究代表者が整備したさまざまな種類の小型肺腫瘤例を含む高分解能X線CT画像データベースとあらたに整備したMDCTを用いた1mmスライスの肺腫瘤データベースを使用した.また放射線画像データに対するソフトウェア開発では画像に対する細かな設定や結果がすぐに確認できるインタラクティブな作業環境が必要であり,作業効率を高めるようなグラフィカル・ユーザーインターフェースの開発,放射線画像データベースに直接アクセスして画像が引き出せる環境の開発もおこなった.セグメンテーションの結果は,セグメンテーション領域に関する定量的評価ならびに放射線科医よる主観的評価をおこない精度を確認した.さらにフラクタル次元を用いた良性腫瘤と悪性腫瘤の鑑別のアルゴリズムの開発などもおこなった.またMDCTに限らず胸部単純X線写真における小型肺腫瘤の発見に関する支援診断の研究もおこなった.【目的】本研究の目的は,MDCTにより撮影された末梢小型肺腫瘤の厳密な経過比較をおこない,その大きさや特徴量の経時的変化に対して客観的かつ定量的な情報を放射線科医に提供し,適切な診断を促すことを支援するシステムを開発することである.MDCTでは従来のCTに比べて,より薄いスライスで高解像な画像を高速に取得可能であり,肺小腫瘤の時系列データの比較診断には適切であり,今後のCT検査の主流となると考えられる.【実績】小型肺腫瘤の三次元の画像データを用いて,血管や胸壁を除去して腫瘤だけを正確にセグメンテーシーンして抽出するアルゴリズムの開発を部こなった.この結果として正確な肺腫瘤のボリュームデータが得られるようになった.この結果は電子情報通信学会論文誌に"胸部X線CT像を用いた小型肺腫瘤の領域抽出"として発表した.またセグメンテーションの結果は,セグメンテーション領域に関する定量的評価

ならびに放射線科医よる主観的評価をおこない精度を確認した.さらに臨床画像を用いた臨床評価を行い,その結果を国際学会に2件,国内学会に2件発表した.現在,作業効率を高めるようなグラフィカル・ユーザーイシターフェースの開発,放射線画像データベースに直接アクセスして画像が引き出せる環境の開発をおこなっている.さらに関連研究として胸部経時差分画像における腫瘤陰影の検出に関する研究を行っておりその結果を電子情報通信学会論文誌に"胸部単純X線写真におけるびまん性陰影得微量解析のための肋骨影の自動抽出"として発表した.【目的】本研究の目的は,MDCTにより撮影された末梢小型肺腫瘤の厳密な経過比較をおこない,その大きさや特徴量の経時的変化に対して客観的かつ定量的な情報を放射線科医に提供し,適切な診断を促すことを支援するシステムの開発することである.【実績】小型肺腫瘤の三次元の画像データを用いて,血管や胸壁を除去して腫瘤だけを正確にセグメンテーションして抽出するアルゴリズムの開発をおこなった.この結果として,従来の単純な輪郭を持つ腫瘤に加えて,複雑な形状を持つ腫瘤やGGOとよばれる淡い輪郭を持つ腫瘤に対して正確な肺腫瘤のボリュームデータが得られるようになった.この結果は電子情報通信学会論文誌に"胸部X線CT像を用いた小型肺腫瘤の領域抽出"として発表した.またセグメンテーションの結果に対して,セグメンテーション領域に関する定量的評価ならびに放射線科医よる主観的評価をおこない精度を確認した.さらに臨床画像を用いた評価を行い,その結果を国内外の学会に発表した.特に,The 2^<nd> international workshop on pulmonary functional imagingにおいては,これらの成果をCAD for lung cancer screeningとして特別講演した.また,同時に肺腫瘤をCTボリュームデータから検出するためのアルゴリズムの開発や,作業効率を高めるようなグラフィカル・ユーザーインターフェースの開発もおこなった.さらに関連研究として胸部経時差分画像における肺腫瘤陰影の検出に関する研究を行っておりその結果を電子情報通信学会論文誌およびME学会誌に発表した.また,われわれは三次元の画像データを用いた,びまん性肺疾患を対象とした局所病理形態理解に基づく知的CADシステムを実現するための研究をおこなっており,これらの結果を統合して,肺の限局性疾患(肺癌等)とびまん性疾患を幅広く対象とした疾病横断型のCADシステムを構築することを試みた.
D-GLの免疫寛容作用を利用した特定の抗原決定基に対する抗体の作製とその応用

NeurokininA(NKA)及びneurokininB(NKB)はC端6個のアミノ酸配列が同じであるため、各々に対して特異的な抗体を作製する事は困難であった。そのため、NKBの局在及び生理作用等に関する報告はほとんど見られなかった。そこで、我々はDーグルタミン酸とDーリジンの重合体(DーGL)の免疫寛容作用を利用した独自の免疫方法により、それぞれに対して特異的な抗体を作製する事を目的とした。NKA及びNKBに共通のアミノ酸配列を合子内にもつkassininとD-GLの結合物(K-D-GL)を免疫動物に投与して、その共通のアミノ酸配列に向った抗体の産生を抑制し、NKAとkeyhole limpet hemocyanin(KLH)の結合物(NKA-KLH)又はNKB-KLHで免疫を行った。得られた抗NKA抗血清のNKB、kassininとの交差性は12.6%と10.6%であり、K-D-GL処置を伴わない従来の免疫方法によって得られた抗血清(NKBと12.9%、kassininと42.5%交差)に比べて特異性が高かった。抗NKB抗血清の特異性は極めて高く、NKA及び種々の関連ペプチドとの交差性は、0.001%以下であった。これらの抗血清を用いてラジオイムノアツセイ(RIA)を確立し、ラット脳内での両ペプチドの分布を明らかにした。さらに、senktide(NKB受容体ペプチド)の孤束核への注入による血圧上昇、血圧反射を司る求心性神経を切断しても孤束核でのNKB量が不変な事及び高血圧ラット(SHR)の視索上核でNKBが有意に高濃度で存在する事がわかった。これらの事からNKBはNKAやsubstancepと異なり、陶束核から視床下部への経路を介し、バソプレシンを遊離して血圧を上昇させる事が示唆された。この点については、両RIAを用いてさらに検討を進めている。一方、本免疫方法の原理に従って作製した抗コレシストキニン(CCK)抗血清を用いて、肝性脳症のモデルであるEUK瘻犬の脳内でCCKが有意に減少している事を明らかにした。また、十二指腸からのCCKの分泌と他の消化管ペプチドとの関連を明らかにした。1.ソマトスタチン(S)-28のN端に特異的抗体の作製:種々のS分子型を特異的に認識する抗体を作製する目的のため、本免疫方法を実施する前に、S28(1-12)をハプテンとして用いて得られる抗体の特異性を検討した。m-male-imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide(MBS)架橋剤として用いてS28(1-12)とkeyhole limpet hemocyanim(KLH)の結合物を作製し、ウサギ2匹に免疫した。2匹で得られた抗体はいづれも、S28(1-12)と特異的に反応し、S28(1-12)のアミノ酸配列を分子内に持つS-28とS28(1-14)とは反応性を示さなかった。

この事は、ペプチド分子のある特定の抗原決定基に向った抗体を作製しようとして、その部分を分子全体より切り出して免疫しても、得られた抗体はもとのペプチド分子とは反応しない場合がある事を示した。そのような場合にはD-GLを用いた本免疫法が必要となる。ここで得られた抗S28(1-12)抗血清を用いたRIAとS-28とS-14を同等に測定するRIAを用いて、肝性能症のモデルとしてのEck瘻犬の脳内でのSの変動とその分子型を検討した。Eck瘻犬ではS28(1-12)及びSLI(S-28+S-14)の有意な減少が認められた。又、Eck瘻犬と正犬のS28(1-12)濃度とSLI濃度の間には高い相関が認められた。この事はS28(1-12)とS-14が大脳皮質で同じニューロンに共存する可能性を示した。1.抗Substance K(SK)及び抗newrokininB(NB)特異抗体の作製:両ペプチド及び関連ペプチドに共通なアミノ酸配列をもつKassinin(K)とDGLの結合物(K-D-GL)を家兎に投与し,その共通のアミノ酸配列に向った抗体の産生を抑制した後, SKとkeyhole limpet hemocyanin(KLH)の結合物及びNBとKLHの結合物でそれぞれ免疫した.得られた抗SK抗血清のKとNBとの交差反応性はそれぞれ6%と8%以下であった.又,関連ペプチドであるSubstanceP(SP),Physalemin(P)及びBombesin(B)との交差反応性は認められなかった.これに反し, K-D-GLを投与しない従来法で得られた抗SK抗血清はKとNBとそれぞれ87%と50%の高い交差反応性を示した.又, SPとは0.2%の交差反応性を示した.一方, K-D-GLとNB-KLHの組合せで得られた抗NB抗血清はNBに特異的で,検討した関連ペプチド(K,SK,SP,P及びB)とはいずれも交差反応性を認めなかった.従来得られた抗SK及び抗NB抗血清はNB及びSKと互いに高い交差反応性を示したため,それぞれの分別定量は容易でなく, SK/NBlike immunoreactivibyとして合計量で表わされる場合が多かった.しかし, D-GLの免疫寛容作用を利用した本免疫法により得られた抗血清はそれぞれに対して特異的で,これらの抗血清を用いたRIAによりSKとNBの分別定量が容易に可能となった.2.抗ソマトスタチン(S)-28(1-12)特異抗血清の応用:61年度に作成した特異S28(1-12)-RIAとS-14-RIAを用いて,犬の脳の各領域におけるS28(1-12)様免疫活性とS-14様免疫活性を測定した結果,大脳皮質と視床,中脳及び延髄とでは両免疫活性の存在比が異なる事が明らかになった.この事とゲルろ過クロマトグラフィでの検討により前記の両脳領域ではprosからsの各分子型へのprocessingに違いがある事が示唆された.3.本免疫法により作製した抗cck-8特異抗体を用いて,実験的肝性脳症(ECK瘻)犬の脳内CCKの減少を明らかにした.本免疫方法で得られた抗neurokininA(NKA)抗血清のneurokininB(NKB)との交差性は12.6%と従来の免疫方法で得られた抗血清(NKBとの交差性は129%)に比べ特異性が高かった。同様に、本法で作製された抗NKB抗血清の特異性は極めて高く、NKA及び種々の関連ペプチドとの交差性は0.001%以下であった。これらの特異抗NKA及び抗NKB抗血清を用いて確立されたラジオイムノアッセイ(RIA)によりラット脳及び脊髄での両ペプチドの濃度を測定した。その結果、NKAは延髄、視床下部、線条体、中脳及び脊髄に高濃度で存在し、NKBは視床下部と脊髄に高濃度で存在した。又、NKA/NKB比は各領域で異なり、延髄、線条体、中脳において高く、海馬においては両ペプチドは同濃度で存在した。
超高強度超短パルスボーティクス・ベクトルビームを用いた非線形光学の新展開

本研究は螺旋状位相と径偏光及び方位方向偏光を考慮したΔSパラメータによる非線形光学システムの簡易な光学設計法を確立した。非臨界位相整合方式のタイプI LBO結晶を用いて、径偏光基本波ビームが二枚の結晶を透過することで、基本波と同様なドーナツ型の第二高調波ビームが得られることを明らかにした。集光ビームがラインビームに近い楕円形ビーム生成システムの精密制御も行い、今後のベクトルビームを用いた材料加工への応用に関わる工学的な課題を評価した。楕円形ビームシステムの特性実験結果より回折限界レベルの集光特性が得られたことが示され、実用化に必要とするシステムの再現性、安定性及び正確性も確認された。平成25年度では、既に開発したガウシアンビームに対応する第二高調波発生及び光パラメトリック増幅に関するスカラー非線形波動方程式の数値計算コードを改良し、ベクトル量に対応することができた。微小な位相不整合を取り入れることによって、第二高調波発生によるドーナツ型レーザービーム発生の可能性を数値解析によって明らかにすることができた。ドーナツビーム発生の最適化においては、入射基本波強度、非線形光学結晶長による影響を定量的に明らかにした。具体的な数値結果としては、基本波波長が1064ナノメートル、強度が15ギガワット毎平方センチメートルのガウスビームを長さ2.3センチメートルの非臨界位相整合方式のタイプIリチウム・トリボレート(LBO)結晶に入射させ、結晶温度を0.01°Cに微小変化させることで、ドーナツ型の第二高調波ビームを生成することができた。また、光パラメトリック増幅における変換過程、飽和過程と逆変換過程の速さのレーザー強度に対する依存性を利用した新たなドーナツ型レーザービームの発生法を考案した。結晶長4.25センチメートルのタイプ1位相整合バリウム・ボーレート(BBO)結晶を用いて、励起光波長が532ナノメートル、励起光強度が3.5ギガワット毎平方センチメートル、シード光波長が1054ナノメートル、シード光強度が48ワット毎平方センチメートルの条件で、増幅したシード光強度の励起光、位相不整合角、結晶長に対する依存性を解析した結果、ドーナツ型レーザービーム分布を得ることができた。これらの研究成果によって、ボーティクス・ベクトルビームの空間分布と偏光分布及び方位方向の位相分布を含めた非線形光学の理論及び数値解析の基礎を築くことができた。平成26年度では、研究代表者が考案した二段階の非線形光学過程を用いたベクトルビームの第二高調波発生(SHG)と光パラメトリックチャープパルス増幅(OPCPA)方式の可能性を数値計算で評価し、ベクトルビームの短波長化と高強度化の道筋を明らかにした。径偏光と方位方向偏光のラゲールガウシアンビームは二つの直線偏光エルミートガウシアンビームに分解することが可能であり、非線形光学過程を二つの偏光成分にそれぞれ対応させる二段階に分けて実施すれば、高効率SHGと高利得OPCPAを得ることが期待できる。この考案に対して、前年度研究で完成させた非線形波動方程式を用いた数値計算コードで可能性評価を行った。波長1053ナノメートルのエルミートガウシアンビームを基本波とし、二枚のタイプI非臨界位相整合リチウム・トリボレート(LBO)結晶による波長532ナノメートルの第二高調波ラゲールガウシアンビームを発生させる。結晶長を二枚とも25ミリメートルにし、基本波の二つ偏光成分強度を2ギガワット毎平方センチメートルとした条件で、二枚目の結晶光軸を90度回転させることで、95%に近い高効率の第二高調波の発生可能性を明らかにした。従来の一段階タイプII位相整合方式と比較すると、非線形光学結晶の枚数が多いという欠点があるが、タイプI非臨界位相整合を利用することが可能であるため、結晶中におけるウォークオフが避けられ、高品質のベクトルビームを得ることも明らかにした。また、レーザービーム整形の光学系、計測系、電気機械制御系を構築し、ガウスビームからドーナツやフラットトップビーム等への変換に関する制御技術も確立した。本研究は、ボーティクス・ベクトルビームの高強度化と短波長化を目指して、ボーティクス・ベクトルビームの非線形光学の特徴を明らかにすることが目的である。平成27年度では、非線形波動方程式に基づいた二次の非線形光学過程における規格化された位相整合ファクターΔSと変換効率との解析関係を用いて、複雑な数値計算をせずに位相整合ファクター及び入射ボーティクス・ベクトルビームの先頭強度に対応する最適な非線形光学結晶の長さを解析的に設計することができるようになった。また、螺旋状位相分布と径偏光及び方位方向偏光分布を考慮したΔSパラメータによる非線形光学システムの最適化設計法を探り、それに関する課題をほぼ解決し、高強度サイクルパルスボーティクス・ベクトルビームに関するΔSパラメータ光学設計法を確立した。一方、高出力ボーティクス・ベクトルビームを用いた材料加工への応用では、レーザービームの集光サイズ及び集光場所に関する精密制御の技術開発を新たに行い、材料加工の実用化に欠かせないレーザービームの自動制御の再現性に関わる技術課題を明らかにした。ビーム自動制御の実例として半導体ウェハーのレーザーダイシングに用いる楕円ビーム自動制御システムの特性を明らかにし、レーザーパワーの調整及び楕円ビームの形成に自動制御を取り入れることによって半導体ウェハーに集光したレーザービームのスポットサイズとその位置を高精度にコントロールすることが可能になった。

更に回折限界レベルの集光特性が得られ、実用化に必要とする自動制御システムの再現性及び正確性も確認されたことで、ボーティクス・ベクトルビームへの応用の道筋をつけた。本研究は螺旋状位相と径偏光及び方位方向偏光を考慮したΔSパラメータによる非線形光学システムの簡易な光学設計法を確立した。非臨界位相整合方式のタイプI LBO結晶を用いて、径偏光基本波ビームが二枚の結晶を透過することで、基本波と同様なドーナツ型の第二高調波ビームが得られることを明らかにした。集光ビームがラインビームに近い楕円形ビーム生成システムの精密制御も行い、今後のベクトルビームを用いた材料加工への応用に関わる工学的な課題を評価した。楕円形ビームシステムの特性実験結果より回折限界レベルの集光特性が得られたことが示され、実用化に必要とするシステムの再現性、安定性及び正確性も確認された。当初予定した二段階の非線形光学過程によるボーティクス・ベクトルビームの短波長化と高強度化の試みを数値計算を通して行い、その実現可能性を明らかにすることができた。具体的には、径偏光のようなベクトルビームにおけるすべての偏光を常線方向と異常線方向に分けることにより、一枚目結晶での常線方向での第二高調波発生と二枚目結晶での異常線方向の第二高調波発生が可能となり、ベクトルビームの高効率化が可能となった。レーザー工学と非線形光工学径偏光ベクトルビームの短波長化を行うにあたり、第二高調波発生時の結晶内での常線方向のビームと異常線方向のビームとの間に生じる位相変化の影響を評価し、二枚結晶間の間隔などの最適化を行っていきたい。また、これまでの複雑な数値計算による非線形光学系の最適化設計をより簡単化したうえで、当初の研究実施計画の通り、自己位相変調や自己収束への評価も行う。当初予定したボーティクス・ベクトルビームの非線形光学の理論基礎の構築はほぼ完了することができた。主な研究成果として、位相不整合を取り入れた第二高調波発生によるドーナツビーム発生や逆変換過程を利用した光パラメトリック増幅によるドーナツビーム発生を新たに考案し、数値解析を通してその可能性を明らかにした。これらの新たなドーナツビーム発生法はベクトルビーム発生の基礎であり、今後のベクトルビーム発生と増幅に繋げるものである。今後研究の推進方策としては、SHG及びOPAによって発生したドーナツビームの増幅と短波長化の研究を重点にして行いたい。また、これまでの複雑な数値計算による非線形光学系の最適化設計を解析的に行えるよう、簡易な設計法の開発にも取り組みたい。さらに、当初の研究実施計画の通り、超高強度超短パルスボーティクス・ベクトルレーザービームの短波長発生や、自己集束・自己位相変調効果への評価を行う。
等質空間のSinger不変量

リーマン多様体の本質的な局所不変量である曲率テンソルR及びその共変微分∇R,∇^2R,...,∇^iR,...と等質性もしくは局所等質性に関わる次のような課題を追求し、成果を得た。1.Singer不変量:局所等質空間に対し、曲率テンソル及びその共変微分のデータから定まる非負整数があり、これを研究の先駆者の名をとりSinger不変量と呼ぶ。具体的な等質空間についてそのSinger不変量を求めることを課題のひとつとし、Generalized Heisenberg groupsと呼ばれる左不変計量をもつ冪零リー群のあるクラスについて、そのSinger不変量を求めることができた。これまで求められている等質空間のSinger不変量は0か1であり、Singer不変量が2以上となる等質空間の例を見出すことをひとつの目標として研究を進めてきた。最近、Meusersによって、任意の自然数に対してそれをSinger不変量としてもつ等質空間の例が構成された。これは可換リー群を1次元拡張した可解リー群上に左不変計量を導入したもので、冪零リー群の次に挑むべき対象であった。その意味で先を越されたことは残念である。この例の曲率テンソル及びその共変微分は興味深い構造をもつており、Singer不変量の立場からMeusersの構成した例を特徴付ける問題は興味深い研究課題である。2.対称性の大きい曲率テンソルをもつ局所等質空間あるいは曲率等質空間の分類曲率テンソルRに対しRを保つような線形等長変換全体のなすLie群の単位連結成分をG_0とする。このとき、次のような問題に取り組み、成果を得た。"G_0が大きいような曲率テンソルをもつ局所等質空間あるいは曲率等質空間を分類せよ"G_0=SO(r)×SO(n-r) or So(n-2)あるいはG_0が単位球面に推移的に作用する場合などに解答を与えることができた。SO(n-2)の場合が特に興味深い結果となっている。この研究は論文としてまとめられ、Comment. Math. Univ. Carolinaeに発表された。本研究の対象は、リーマン幾何学の範疇での等質空間並びに局所等質空間である。リーマン多様体の本質的な局所不変量である曲率テンソルR及びその共変微分▽R,▽^2R,...,▽^iR,...と等質性に関わる次のような課題を追求し、合わせて曲率テンソルのより深い理解に寄与することを目的に研究を進めた。局所等質空間に対し、曲率テンソル及びその共変微分のデータから定まる非負整数があり、これを研究の先駆者の名をとりSinger不変量と呼ぶ。具体的な等質空間についてそのSinger不変量を求めることを課題のひとつとした。Generalized Heisenberg groupsと呼ばれる左不変計量をもつ冪零リー群のあるクラスについて、そのSinger不変量を求めることができた。研究課題として挙げた他の等質空間のSinger不変量の計算に引き続き取り組み、これらの結果をまとめ論文としたい。つい最近、Meusersによって、任意の自然数に対してそれをSinger不変量としてもつ等質空間の例が構成された。

先を越されたことは残念であるが、Singer不変量の立場からMeusersの構成した例を特徴付けることを課題に研究を進めたい。2.対称性の大きい曲率テンソルをもつ局所等質空間あるいは曲率等質空間の分類曲率テンソルRに対しRを保つような線形等長変換全体のなすLie群の単位連結成分をG_0とする。このとき、次のような問題に取り組み、成果を得た。"G_0が大きいような曲率テンソルをもつ局所等質空間あるいは曲率等質空間を分類せよ"G_0=SO(r)×SO(n-r)orSO(n-2)あるいはG_0が単位球面に推移的に作用する場合などに解答を与えることができた。この結果は論文としてまとめられ、Comment. Math. Univ. Carolinaeに発表される予定である。リーマン多様体の本質的な局所不変量である曲率テンソルR及びその共変微分▽R,▽^2R,...,▽^i,...と等質性もしくは局所等質性に関わる次のような課題を追求し、成果を得た。1.Singer不変量:局所等質空間に対し、曲率テンソル及びその共変微分のデータから定まる非負整数があり、これを研究の先駆者の名をとりSinger不変量と呼ぶ。具体的な等質空間についてそのSinger不変量を求めることを課題のひとつとし、Generalized Heisenberg groupsと呼ばれる左不変計量をもつ冪零リー群のあるクラスについて、そのSinger不変量を求めることができた。これまで求められている等質空間のSinger不変量は0か1であり、Singer不変量が2以上となる等質空間の例を見出すことをひとつの目標として研究を進めてきた。最近、Meusersによって、任意の自然数に対してそれをSinger不変量としてもつ等質空間の例が構成された。これは可換リー群を1次元拡張した可解リー群上に左不変計量を導入したもので、冪零リー群の次に挑むべき対象であった。その意味で先を越されたことは残念である。この例の曲率テンソル及びその共変微分は興味深い構造をもっており、Singer不変量の立場からMeusersの構成した例を特徴付ける問題は興味深い研究課題である。"G_0が大きいような曲率テンソルをもつ局所等質空間あるいは曲率等質空間を分類せよ"G_0=:SO(r)×SO(n-r)orSO(n-2)あるいはG_0が単位球面に推移的に作用する場合などに解答を与えることができた。SO(n-2)の場合が特に興味深い結果となっている。この研究は論文としてまとめられ、Comment. Math. Univ. Carolinaeに発表された。
オーキシン不均等分布に依存しない偏差成長誘導機構の解析

我々はシロイヌナズナの根の光屈性がオーキシン不均等勾配非依存的に誘導されることを明らかにしたが、一方でオーキシン応答転写因子ARF7が根の光屈性に働くことが既に報告されていた。そこでオーキシンシグナル伝達因子の根の光屈性への関与についてさらに遺伝学的解析を行った。その結果、ARF7・ARF19転写因子に加え、AXR3/IAA17転写調節因子及びTIR1オーキシン受容体が根の光屈性に正に働くことを明らかにした。本研究成果をまとめ、論文発表した(Kimura et al. [2018]PCP, in press)。pin3 pin4 pin7多重変異体及びd6pk多重変異体は連続光照射誘導の胚軸二次正光屈性をほとんど示さないという報告がある。我々は独自に開発したチューブ法を用いて、pin3 pin4 pin7及びd6pk0123多重変異体の表現型観察を行った。その結果、我々の観察方法においては、どちらも屈曲の抑制が観察されるものの、未だ連続光照射の胚軸二次正光屈性の反応を示すことを明らかにした。すなわち、胚軸においてもオーキシン不均等勾配非依存的な光屈性誘導機構の存在が示唆された。本研究成果をまとめ、論文発表した(Haga et al. [2018]PCP, in press)。オーキシン不均等勾配非依存的な光屈性誘導機構を明らかにすべく、pin/d6pkの表現型を促進するエンハンサー突然変異体6株を選抜し、その原因遺伝子探索を進めた。その結果、3株が同じPP2C遺伝子の変異を示した。PP2C遺伝子にT-DNAが挿入された突然変異体を収集し、シングル突然変異体における表現型解析を行った。その結果、pp2cシングル突然変異体においては、赤色光前照射の胚軸光屈性促進効果に異常が観察された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の芽生えは発芽後、効率よく光合成を行うために地上部を光源方向に向かって成長させ、根は発芽後の乾燥を避け水分や栄養を吸収するために光源方向を避けるように大地方向に向かって成長させる、いわゆる光屈性を示す。我々は、モデル植物シロイヌナズナ芽生えの胚軸光屈性がオーキシン不均等勾配に依存した偏差成長に加え、オーキシン不均等勾配形成に依存しない偏差成長によっても誘導されることを最近明らかにした。また、根の光屈性はオーキシン不均等分布を形成せず、オーキシンを介さない遺伝子発現調節が関与することが示唆された。そこで本研究は、第一に光屈性誘導に働く青色光受容体フォトトロピン活性化に依存した遺伝子発現調節を網羅的転写産物解析によって明らかにすることを試みた。恒常的活性型phot1発現誘導に依存した転写調節の網羅的解析をRNA-seq法により行った。その結果、およそ30遺伝子についてphot1シグナルに応答した転写制御を発見した。第二に、オーキシン不均等勾配非依存的光屈性誘導に関与する新しい遺伝子の同定を新たな突然変異体選抜による分子遺伝学的解析によって行うことを試みた。選抜した9株のエンハンサー突然変異体の突然変異の網羅的解析を、次世代シークエンサーを用いたゲノムリシークエンスにより行った。その結果、2株が同じPP2C遺伝子のナンセンス変異を示した。ラフマッピングの結果も当該遺伝子が原因遺伝子である可能性を示唆した。また他の株のうち2株は既存の光屈性関連遺伝子nph4/arf7の変異を示した。残り5株については変異箇所を複数特定できたものの原因遺伝子特定には更なる検証を必要とした。(1)フォトトロピン活性化に依存した遺伝子発現調節の解析恒常的活性型phot1発現誘導に依存した転写調節の網羅的解析をRNA-seq法により行った。(2) pin3 pin7/d6pkエンハンサー突然変異体の分子遺伝学的解析選抜した9株のエンハンサー突然変異体の突然変異の網羅的解析を、次世代シークエンサーを用いたゲノムリシークエンスにより行った。

我々は独自に開発したチューブ法を用いて、pin3 pin4 pin7及びd6pk0123多重変異体の表現型観察を行った。その結果、我々の観察方法においては、どちらも屈曲の抑制が観察されるものの、未だ連続光照射の胚軸二次正光屈性の反応を示すことを明らかにした。すなわち、胚軸においてもオーキシン不均等勾配非依存的な光屈性誘導機構の存在が示唆された。本研究成果をまとめ、論文発表した(Haga et al. [2018]PCP, in press)。オーキシン不均等勾配非依存的な光屈性誘導機構を明らかにすべく、pin/d6pkの表現型を促進するエンハンサー突然変異体6株を選抜し、その原因遺伝子探索を進めた。その結果、3株が同じPP2C遺伝子の変異を示した。PP2C遺伝子にT-DNAが挿入された突然変異体を収集し、シングル突然変異体における表現型解析を行った。その結果、pp2cシングル突然変異体においては、赤色光前照射の胚軸光屈性促進効果に異常が観察された。phot1活性化に応答した転写制御を受ける遺伝子については、およそ15遺伝子程度をピックアップし、プロモーター・レポーター融合遺伝子の作成及び発現解析を行う。根の光屈性誘導時に光照射側、陰側での発現パターンに違いが見られるか、またその転写制御がphot1依存的か検証する。またピックアップした遺伝子のシロイヌナズナ遺伝子破壊株の表現型観察によって、光屈性反応への関与を検証する。7株のpin3 pin7/d6pkエンハンサー突然変異体で原因遺伝子候補について、それぞれの遺伝子破壊株を収集し表現型を観察することによって原因遺伝子特定を行う。また今回同定されたPP2C遺伝子については、今後遺伝子機能解析を進め、光屈性応答に関与する新たな因子の詳細を報告したい。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
再生医療用ナノファイバー構造体の多元制御と角膜再生への応用

本研究では、これまでに研究を行ったコラーゲン・シルクなどの素材を組み合わせることで、角膜の構造にきわめて類似した構造体構築のための基本技術の研究を行った。電界紡糸技術を用い、上皮基底膜類似ナノファイバー足場材料の開発、ナノファイバーの透明性を向上し実質再生への活用、高強度デスメ膜構造再生に関する基礎的なデーターを得た。ファイバー材料の弱点である光の透過性は、ファイバーサイズをナノのレベルまで細くすること、ファイバー空間が細胞ニッチェとなり、再生組織(コラーゲン等)で埋まることで著しい向上が認められた。上皮、実質細胞とも、繊維足場の構造、硬さ、表面などに影響を受けることが判明した。全層角膜に対応できるように上皮再生、実質再生の研究の要素技術を集積化組織化できるよう改良を進めるとともに、本研究の基盤技術であるデスメ膜類似組織再生技術を作り上げるためのナノ-ミクロ足場材料の開発を中心に行った。角膜上皮基底膜足場材料の構築に関しては、絹、コラーゲンなどを原材料としてエレクトロスピニングによるナノファイバー作成技術等を活用してナノファイバーからなるシート状生成物を作成した。角膜上皮の接着増殖などに関して検討した結果、ナノファイバーの構造のみならず、与えるテンションにより細胞接着、増殖に大きな差が生じることが判明した。デスメ膜様構造再生のためのナノファイバーのミクロ構造制御材料の構築に関しては、初期的に足場となるナノファイバーに対して張力を加えた系と加えない系において検討を加えた結果、足場としての硬さが増すようにナノファイバー不織布に張力を加えた系でより良い細胞接着、増殖、分化が起こることが示唆される予備的結果を得た。次年度以降、よし詳細な検討を加えて最適値を見出すステップに移行する。実質再生に関しては、フィプロイン等のナノ繊維化を行い、さらに切断機、ホモジナイザーなどを用いた短繊維合成に着手した。短繊維化には成功しているが、収率などの問題を解決する必要がある。全層角膜類似構造体の構築に向けた準備として、上記の結果から、装置の設計を行い、プロトタイプの試作に取り掛かった。兎の角膜内へポケットを作製してナノファイバー基材の予備的な埋入を行った結果、フィルムより優れた物質透過性が示される結果となった。本年度も引き続き角膜全層の再生に対応するための要素技術である上皮再生、実質再生の足場研究の要素技術の改良を進めるとともに、本研究の基盤技術であるデスメ膜類似組織再生技術を作り上げるためのナノーミクロ足場材料の開発を中心に行った。角膜上皮のキャリア(基底膜材料)の候補として、配向絹フィブロインナノファイバーフィルムに関する検討を行った。角膜上皮を単独で播種した場合はナノ繊維の間隙に上皮の潜り込みが観察され、角膜上皮のバリア性を考慮すると最適な構造とはならなかった。そこで、配向絹フィブロインナノファイバーフィルムの裏側にあらかじめ角膜実質細胞を播種し、2週間培養を継続し、その後、上皮の播種を行いその状況を組織学的に検討を行った結果、ファイバー内への上皮の落ち込み現象が軽減され、最外層に上皮層の形成が認められた。免疫染色の手法を用いて、細胞の状態を検討した結果、角膜上皮は、増殖の指標であるPCNA(proliferating cell nuclear antigen)陽性細胞が多数観察されたのに対して、実質細胞は陰性となり、正常な角膜上で起こっている鎮静化した実質の上で角膜上皮がターンオーバーしている状況に類似した構造組織体の形成が起きていることを伺わせる所見を得た。また、角膜上皮では基底膜成分であるコラーゲンタイプ7およびラミニンの産生が確認され、実質細胞では、ビメンチン陽性、SMA-α陰性、プロコラーゲン、クリスタリン陽性となり、それぞれ上皮、実質細胞とも良好な分化状態をとることが示された。デスメ膜様構造再生のためのナノファイバーのミクロ構造制御材料の構築に関しては、絹フィブロインの電界紡糸法に改良を加え、液体浴に対して紡糸を行う手法を取り入れることで、透明性を向上し、かつ、これまでより強度のあるフィブロインナノファイバー構造体の作製法を考案することができた。昨年度までに、ボウマン膜、デスメ膜の代替え材料として絹フィブロインの有用性が示されたので、26年度は、実用化に近づくため材料の透明性向上関する技術開発を進めた。フィブロインファイバーの細線化と配向性を向上させるとともに、ファイバー形状を失わない程度にナノファイバーの部分的な溶解処理を行うことで材料の透明性の向上が認められた。また、これらの間隙にコラーゲンゲルを充てんすることで、フィブロインナノファイバーとファイバー間隙に生ずる屈折率の違いを解消することで界面における光の乱反射が抑えられ更なる透明性の向上が認められた。透明化処理を施したフィブロインナノファイバーを家兎角膜内へポケットを作製し、埋入試験を行った。

埋入後、3か月間経時的な観察を続けた結果、重篤な組織反応や拒否反応は認められず、透明化処理材料の応用の可能性も示唆された。一方、透明化処理を施さないフィブロインナノファイバー材料に関してその長期安全性試験のために2羽の家兎を用いて1年間の埋入試験を行った。埋入したサンプルは、初期的には可視光の透過性が80%程度と不透明な材料であったが、一羽においては術後3か月程度で、もう一羽に関しては3週間という超早期に埋入したサンプルの確認が難しいほど著しく透明性が増した。この結果は、初期的に透明性が不十分な繊維材料でも、埋入部位における繊維材料の再配列や実質細胞から分泌されるコラーゲン等のタンパク生体成分が繊維間隙に充填されるなどの要件を満たせば、埋入後に透明化が起こることを示した。このメカニズムに関しては、一部組織学的検討を行った結果から傍証を得ているが更なる検討が必要である。全層角膜移植への対応に関しても、強度的にはいまだ不十分であり、さらなる検討が必要である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生体材料学26年度が最終年度であるため、記入しない。予定していたそれぞれの研究項目に関して、一定の知見が得られており、初年度としては概ね順調に進行している。一部予定を変更してin vitroの追加試験などを行ったが、2年目としては一定の知見が得られており、最終年度に向け概ね順調に進行していると考えている。初年の研究の中で、ナノファイバーの配向性と初期的なテンションが角膜実質細胞の接着、増殖・分化に大きく影響することが判明したため、使用する基材の材質、初期的に加えるテンションの条件を詳細に検討する必要が生じた。使用する基材の材質、初期的に加えるテンションの条件の最適化を行う。本年度の研究において、ボーマン膜、デスメ膜の代替材料として絹フィブロインファイバーの有用性が示唆されたので、この結果を受け、次年度は最終年度でもあり、これまで研究してきたそれぞれの要素技術を利用して全層に対応できる高次構造形成に関する検討を行う。また、本年度進捗が得られなかった動物実験を進め中長期の安全性を担保できるデータどりを行う。本年度は、各パーツの機能を詳細にチェックすることに重きを置いたため、in vitroでの実験に終始し、当初計画していた動物実験を行わなかった。このため、人件費として確保した予算の一部を次年度に使用することとした。次年度は、動物実験を進めるために、予算を用いて補助的な人員を確保し研究を加速する。特に、材料の中長期の安全性を担保できるデータどりを行う。
脊椎動物のボディープランの分子的基盤(総括班)

今年度は平成9年平成12年度までのこの「ボディープラン」の班の総まとめを行った。その結果、この班ではこの4年間にNature, Cell, Science, ProNASなど、いわゆる国際的に超一流といわれるjournal(impact factor 10以上のもの)に354編、また、Moleculer Cell Biology, J. Biol. Chem., Develop. Biol.,など一流雑誌(impact factor 5.0以上)のものに700編発表しており、国際的レベルでの研究が一段と進んだといえる。この領域研究では2つの「シグナル班」と「形態形成班」に分かれているが、各班とも次々と新しい成果を出し、国際誌に多数発表が行われている。「分子シグナル班」では上野、多羽田らのTGF-βファミリーの中でのBMP、ノッチの解析が一段と進み、それらのSmadを通してのクロストークも明らかにされてきている。浅島らは新規のノーダル5,6を解析し、wnt系係との関係が明らかとなっている。また、佐藤と内山はT-box遺伝子と形態形成の関係を証明した。また、岡野は神経幹細胞におけるMsi 1とNotchシグナルとの関係を明らかにした。一方、「形態形成遺伝子班」では黒岩らの四肢形成におけるSix 2の発現ととHoxa-13との関係がまたそれにBMPシグナルの関与なども明らかにされてきている。近藤らは目の形成のためのPax 6とSEF-3およびSox 2の遺伝子の解析を行って、遺伝子間と組織間との関係を解析した。鍋島らは神経発生におけるstef遺伝子およびRho類似Gタンパク質をクローニングし、それがシナプス形成に関与することを示した。このようにして当初、計画した「シグナル分子班」と「形態形成遺伝子班」の相互関係が非常にうまくかみあって、両輪となって「ボディープラン」の理解を一段と深め、目的をほぼ達したといえる。そして、全体的にはここにきて分子シグナルとそれによる形態形成遺伝子の相互作用によるボディープランの全体像がみえてきたと考えている。計画班ではそれら班のあり方や班員との研究関係、今後の展望などについて話し合った。その結果、この班ではこの4年間にNature, Cell, Science, ProNASなど、いわゆる国際的に超一流といわれるjournal(impact factor10以上のもの)に354編、また、Moleculer Cell Biology, J. Biol. Chem.,Develop. Biol.,など一流雑誌(impact factor5.0以上)のものに700編発表しており、国際的レベルでの研究が一段と進んだといえる。浅島らは新規のノーダル5,6を解析し、wnt系との関係が明らかとなっている。計画班としては、上記のように充分に機能したと考えている。この重点領域「ボディープラン」は、今年度発足して一年目であるが、計画班員が中心に公募班員も含めて、非常にアクティブに研究が進められている。シグナル分子班では、アクチビンやBMP、FGF、Wnt、インターロイキン、chordin、shh、nogginなど動物の初期発生に関わる細胞内情報伝達のしくみと、各々のファミリーに属する新現の遺伝子がクローニングされ、機能解析がなされた。その結果、それらの遺伝子群は単独で細胞分化や形態形成に関与しているというよりは、むしろ相互のネットワーク上に結びつけられてフィードバックシステムの上にあることも、次第に明らかになってきている。この班においては、脊椎動物だけでなく遺伝子解析が進んでいるショウジョウバエや線虫、ホヤなどの無脊椎動物において、解析が進められている研究成果も積極的に取り入れて、動物の初期発生におけるボディープランの理解を更に深めている。一方、形態形成遺伝子班は、様々な種類と発現様式をもつホメオボックスの詳細な研究に一段と進み、初期発生や、肢芽形成、神経形成などの分野で、新しい知見が見つけられている。またbHLHやOtxなどにおいても解析が一段と進み、それらの形態形成遺伝子を制御する上流および下流の遺伝子の解析がなされた。

そして、これらの形態形成をもつかさどる転写遺伝子群は、胚発生過程で時間的空間的にコーディネートされていることが、いくつかの遺伝子、例えばポリコ-ム遺伝子Mel、Xlim、Msx、inv、Pax-6などでも明らかになってきている。このことは、更に発生や肢芽形成などのパターン形成や細胞分化とも直接に結びついていることがノックアウトマウスやドミナントネガティブなどの研究からも明らかにされてきている。このようなシグナル分子班も形態形成遺伝子班も、着実にかつ発展的にその成果を上げているといえる。この班について、今年度2回の班員による発表会と総括班会議が開催され、総括班員の評価委員の先生からは極めてレベルの高い、勢いのある研究領域であり、これが本来の重点領域研究のあり方であるとの発言であり、ここから、今後、世界に向けてオリジナリティーの高い研究成果を発信してほしい、との一年目の評価をいただいた。この特定領域研究「ボディープラン」は、今年度発足して2年目であるが、計画班員を中心に公募班員も含めて、非常にアクティブに研究が進められている。特に今回は2年目のあたるので班員、全員による発表の他に公開シンポジウムも開催した。このシンポジウムには全国の若手の研究者が沢山あつまり会場に立ち見も沢山でたほどであった。シグナル分子班では、アクチビンやノーダル、BMP、FGF10、Wnt、Pitx-2、argos、chordin、nogginなど動物の初期発生に関わる細胞内情報伝達のしくみと、各々のファミリーに属する新現の遺伝子がクローニングされ、機能解析がなされた。その結果、それらの遺伝子群は単独で細胞分化や形態形成に関与しているというよりは、むしろ相互のネットワーク上に結びつけられてフィードバックシステムの上にあることも、次第に明らかになってきている。また、この班においては、脊椎動物だけでなくショウジョウバエや線虫、ホヤ、プラナリアなどの無脊椎動物において、解析が進められている研究成果も積極的に取り入れて、動物の初期発生におけるボディープランの理解を更に深めている。今回の一つの大きな変化はヒトなどのゲノムプロジェクトとの相互関係がしだいにみえてきたこともある。一方、形態形成遺伝子班は、様々な種類と発現様式をもつホメオボックスや核内転写因子の詳細な研究に一段と進み、初期発生や、肢芽形成、神経形成などの分野で、新しい知見が見つけられている。これらの形態形成をつかさどる転写遺伝子群は、胚発生過程で時間的空間的にコーディネートされていることが、いくつかの遺伝子、例えばポリコーム遺伝子Xlim、Msx、inv、Otx、HLHなどでも明らかになってきている。特に左右軸に関するPitx-2とinvの解析がこの班員によって世界に先がけて明らかにされた意義は大きい。この班について、今年度は2回の班員による発表会と総括班会議が開催され、総括班員の評価委員の先生からは極めてレベルの高い、勢いのある研究領域であり、これが本来の特定領域研究のあり方であるとの発言であった。今後、更に各班員が研究の質を高めて当初の目的を達成すべく、順調に研究が進んでいるといえる。
C型肝炎ウイルス株間での感染性キメラウイルスの作製と解析

C型肝炎ウイルス(HCV)のJFH-1株を用いることにより、これまで不可能であった、培養細胞で安定し、再現性のある増殖が可能なウイルス感染・複製系の構築が可能になった。本研究では、HCVのキメラウイルスを作製し、JFH-1株以外のウイルス株の構造蛋白質をもつウイルス粒子を回収し、キメラウイルスの複製と感染様式、共通の抗原性、中和活性などを解析して、新たな抗ウイルス戦略の構築に供することが目的である。遺伝子型1a、1b、2a、2bのウイルス株の構造領域遺伝子をクローニングし、JFH-1株の非構造領域遺伝子(NS2-NS5B)とJFH-1株以外のHCV株の構造領域遺伝子を用いてキメラを作製した。キメラウイルスのトランスフェクション細胞内でのRNA複製はJFH-1の野生株と同等だが、同じ遺伝子型でもウイルス株によりウイルス粒子の分泌に差があることが判明した。さらにキメラウイルスの感染細胞の培養を継続するとウイルス粒子の分泌効率が向上する事が明らかとなった。これはウイルスの適合変異によると考えられたため、ウイルスゲノムの塩基配列を解析したが、ダイレクトシークエンス法では変異を同定できなかったため、現在クローニングによる解析を行っている。また、キメラウイルスの感染性は野生型JFH-1ウイルスと同じ特異性(CD81,SRB1への依存性)をみとめた。さらに、JFH-1株に対する抗体で共通の中和活性を検出できた。共通の中和エピトープの存在が予想される。また、JFH-1ウイルスおよびJ6/JFH1キメラウイルスを継代培養したところ、E2に共通の変異を検出した。この変異部位の意義を現在解析中である。遺伝子型1a、1b、2a、2bのウイルス株の構造領域遺伝子をクローニングし、JFH-1株の非構造領域遺伝子(NS2-NS5B)とJFH-1株以外のHCV株の構造領域遺伝子をキメラを作製した。試験管内で合成した全長のウイルスRNAをエレクトロポレーション法で培養細胞中に導入した。ウイルスRNA導入後、経時的に細胞および培養上清を回収しウイルス蛋白質とウイルスRNAを定量した。さらに、細胞中でのウイルスの複製はRNAを抽出して、ウイルスゲノムRNAをノーザンブロットおよび定量的RT-PCR法で解析した。また、ウイルスのタンパク質発現をウエスタンブロット法、免疫染色法で検出した。以上の検討によりキメラウイルスのトランスフェクション細胞内でのRNA複製はJFH-1の野生株と同等だが、ウイルス粒子の分泌に差があることが判明した。ウイルス粒子の分泌にはNS2領域遺伝子が重要であると考えられた。分泌されたウイルス粒子はHuh7細胞に感染性があることを確認した。今後は、キメラウイルスの効率よい分泌に重要な因子の解明や、キメラウイルスの中和活性の交差性などを検討していく。遺伝子型1a、1b、2a、2bのウイルス株の構造領域

遺伝子をクローニングし、JFH-1株の非構造領域遺伝子(NS2-NS5B)とJFH-1株以外のHCV株の構造領域遺伝子を用いてキメラを作製した。キメラウイルスのトランスフェクション細胞内でのRNA複製はJFH-1の野生株と同等だが、同じ遺伝子型でもウイルス株によりウイルス粒子の分泌に差があることが判明した。さらにキメラウイルスの感染細胞の培養を継続するとウイルス粒子の分泌効率が向上する事が明らかとなった。これはウイルスの適合変異によると考えられたため、ウイルスゲノムの塩基配列を解析したが、ダイレクトシークエンス法では変異を同定できなかったため、現在クローニングによる解析を行っている。また、キメラウイルスの感染性は野生型JFH-1ウイルスと同じ特異性(CD81,SRB1への依存性)をみとめた。さらに、JFH-1株に対する抗体で共通の中和活性を検出できた。共通の中和エピトープの存在が予想される。また、JFH-1ウイルスおよびJ6/JFH1キメラウイルスを継代培養したところ、E2に共通の変異を検出した。この変異部位の意義を現在解析中である。
接着接合の界面の力学特性と強度評価

本研究では衝撃引張り荷重および衝撃曲げモーメントを受ける単純重ね合せ接着継手の特に接着界面での応力伝幡状況及び最大主応力を、有限要素法(DYNA3D)により三次元弾性解析を行い,次の結果が得られた。1.衝撃引張り荷重を受ける被着体が異種材料異寸法の場合、上部被着体の縦弾性係数が大きくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなった。上部被着体の被着体厚さが小さくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなった。上部被着体の縦弾性係数をさらに大きくすると、被着体厚さをさらに小さくすると,最大主応力σ_1が最大となる位置は上部接着界面の端部移ることが分かった。2.衝撃曲げモーメントを受ける被着体が同種材料同寸法の場合、被着体の弾性係数、重ね合せ長さ及び被着体厚さが大きくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなり、接着層厚さが小さくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなった。また、被着体厚さが小さくなるにつれて,最大主応力σ_1が最大となる位置は上部接着界面の端部に移ることが分かった。3.衝撃曲げモーメントを受ける被着体が異種材料異寸法の場合、上部被着体の縦弾性係数が大きくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなり、上部被着体の被着体厚さが小さくなると最大主応力σ_1の最大値は大きくなった。上部被着体の縦弾性係数がさらに大きくなると,最大主応力σ_1が最大となる位置は上部接着界面の端部に移る上部被着体の被着体厚さが小さくなると最大となる位置は下部接着界面の端部に移ることがわかった。4.衝撃引張り荷重及び衝撃曲げモーメントを受ける単純重ね合せ接着継手のひずみ応答に関する実験を行い、解析結果と実験結果はかなりよく一致し,本解析の妥当性を示した。衝撃荷重を受ける接着接合の応力伝播状況及び強度評価上重要な最大応力を数値解析的に調べることを主目的とし,本年度は(1)同種材料T形突合せ接着継手に衝撃引張り,衝撃曲げモーメント及び衝撃引裂き荷重が作用する場合,及び(2)衝撃せん断荷重を受ける重ね合せ接着継手の場合,を計算コードDYNA3Dを用いて,三次元弾性計算を行った。突合せ接着継手に関して得られた結果は,(1)衝撃引張り荷重を受ける場合には,衝撃荷重を受ける被着体側界面で最大主応力が最大になった。さらにウエッブ長さが長くなるにつれ,界面の中心から端部に最大主応力の生じる位置が移動した。ウエッブ長さがフランジ長さに等しい特別な場合には,界面端部で特異応力が発生した。この特別な場合には被着体と接着層の縦弾性係数比が大きくなると,界面端で発生する最大主応力は小さくなり,静荷重が作用する場合と逆の特性を示すことが分かった。T形継手の場合にも縦弾性係数比及び接着層厚さの影響も調べた。ひずみ測定実験を行い,解析結果の妥当性を示した。(2)衝撃曲げモーメントを受けるT形突合せ接着継手の場合にも解析及び実験の両面から検討した。最大主応力は界面において発生し,ウエッブ端と中心の半分の距離の引張り側の位置であった。ウエッブ長さがフランジ長さに等しい特別の場合には界面端部で特異応力を生じた。T形突合わせ接着継手の場合には被着体と接着層の縦弾性係数比が大きくなると,最大主応力は大きくなり,特別の場合には小さくなった。静荷重が作用する場合と逆の特性を示した。接着層厚さの影響も調べた。