hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニューカマー児童生徒の音楽的アイデンティティ形成の実態を踏まえた音楽教材の開発

複層的な文化的背景をもつ日系ニューカマーの子どもたちの音楽的アイデンティティ形成の実態を質問紙調査や聞き取り調査を通して探るとともに、ブラジル等の子どもの歌の収集と分析を行った。質問紙調査や聞き取り調査の結果からは、母国の歌を自分の子どもに覚えてほしいと考える保護者世代と、日本のマス・メディア等の影響を多大に受けて育っている子どもたちとの間に大きく異なった音楽的アイデンティティ形成の様相がみられることが推察できた。本研究の目的は大きく次の2つである。(1)複数の文化的背景を持つ、日本在住のニューカマーの子どもの音楽的アイデンティティ形成過程の実態と課題を実証的に明らかにする。(2)南米諸国の子どもの遊び歌等の収集を行い、(1)の調査結果も踏まえて、外国人児童生徒の在籍する小中学校における音楽科教育および国際理解教育において実践可能な音楽教材および指導方法を試行的に開発する。研究初年度である本年度は、(1)については、2008年9月の金融ショック後の雇用情勢悪化による滋賀県在住外国人の生活状況の変化についての研究協力者(滋賀県国際協会嘱託外国人生活相談担当者)からの情報提供を活かしながら、調査実施計画を立案し、2年目の調査実施に向けての検討を行った。(2)に関しては、ISME発行の"Songs of Latin America: from the Field to the Classroom"等、収集した歌の本から曲目を選び、それを教材として学校教員対象のワークショップおよび大学生を対象とした試行的活動を実施し、学校教育への導入可能性を探った。また、保護者の協力により、ニューカマー児童が視聴しているテレビ番組のビデオや歌の収集に着手した。研究2年目は、初年度からの調査研究(刊行されている南米諸国の子どもの遊び歌集の収集、外国人児童生徒への調査)を継続実施するとともに、外国人集住地域や学校での遊び歌の収集・整理を重点的に進める計画である。日本在住のニューカマーの子どもの音楽的アイデンティティ形成プロセスの実態と課題を、(1)学校外の生活空間、(2)学校、(3)出身国(地域)の音楽文化の親・祖父母世代からの継承、という視点から明らかにするとともに、出身国(地域)の子どもの遊び歌等の収集を行い、教材化することを目的としている。平成22年度には下記の調査研究を進めた。(1)ブラジル日系の子どもの親・祖父母・曾祖父母の世代の音楽文化について当時のブラジルの移民生活や教育に関する文献等から関連記事・資料を収集。(2)滋賀県内で多文化保育を行っている施設の訪問・参観、子どもの遊び歌のビデオ収録。(3)ブラジルで成人期まで生まれ育った現日本在住の日系三世からの聞き取り。(4)幼児期から日本で育ったブラジル人の若者の音楽活動(ライブ・コンサート)の観察。ニューカマーの子どもの文化的アイデンティティの形成には、言語的・認知的な領域だけでなく、感性に直接関わる音楽のような非言語的領域が深く関わっている。ライブ・コンサートの実演者であるブラジル人の若者と聴衆である日本人の若者との音楽を介したコミュニケーションの成立にはこうした非言語的な感性の領域が大きく作用していると考えられる。日常の生活空間においてポピュラー音楽をはじめ多様な音楽に取り囲まれているニューカマーの子どもや若者の音楽的アイデンティティの形成については、それにつながる時間軸上の視点(世代間の音楽文化継承)と空間軸の視点(現在の生活空間における音楽文化受容)の2つの視点から整理・分析することの必要性が明らかにされた。最終年度の平成23年度には22年度の調査の継続、収集した遊び歌資料の整理と分析、教材化を行い、報告書としてまとめる。本研究は、日系ブラジル人をはじめとする、いわゆるニューカマーの子どもたちの音楽文化の変容と複合化の様相を探り、国境を越えた移動が音楽的アイデンティティの形成にどのように作用するのかについて明らかにし、それを活かしてニューカマー児童生徒の在籍する学校における音楽科教育の実践につなぐことを目的として着手したものである。ニューカマーの子どもの文化的アイデンティティの形成には、言語的、認知的な領域だけでなく、感性に直接関わる音楽等の非言語領域が深く関わっている。とりわけ、日常の生活空間においてポピュラー音楽をはじめとする多様な音楽に取り囲まれている現代の子ども・若者にとって、その多様な音楽の世界からどのような音楽を選択し、自らの音楽的趣味・嗜好を形成していくかは、個人の文化的アイデンティティを確立する上で重要な要素の一つであり、このことはニューカマーの子どもや若者も同様である。しかしながら、ニューカマー児童生徒が保有する音楽文化や音楽に対する感性は可視的でないだけに、言語領域や認知的領域に比べて教育の場では等閑視されやすく、研究対象としても日本ではほとんど取り上げられていない。こうした問題意識にもとづき、本研究では、複層的な文化的背景をもつニューカマーの外国人児童生徒の音楽的アイデンティティがいかに形成されていくのかについて、質問紙調査や聞き取り調査を実施するとともに、ブラジルの子どもの歌の収集と分析を行った。質問紙調査や聞き取り調査の結果からは、国境を越えた家族移動に伴った子どもたちの文化的アイデンティティ形成に対する親世代の思いが垣間見え、また子どもたちの出身国の豊かな音楽文化の存在も具体的に知ることができた。
白血病治療薬の創製を指向した植物由来アルカロイドラピジレクチンの合成研究

昨年度に引き続き,マレーシア産キョウチクトウ科植物Kopsia lapidilectaの葉から単離された多環性アルカロイドラピジレクチンBの合成研究を行った。昨年度はラセミ体を用いた検討により,Kopsia lapidilectaアルカロイド類共通の骨格である2,3-dihydroindole-2-spiro-1 ́-cyclohexane骨格の構築に成功した。すなわち共役ジエン側鎖3 ́位にアルコキシ基を有するn-メトキシカルボニル-2-置換インドール誘導体を用いた飴アシルイミニウムイオン-共役ジエンアザスピロ環化反応を鍵反応とするものである。今年度は同様の手法を用いた光学活性体によるラピジレクチンBの合成研究を行った。L-リンゴ酸を出発物質とし,ボラン還元の後数工程を経て導かれる共役ジエンを有する光学活性カルボン酸とσ-トルイジンを縮合させることにより光学活性な2-置換インドールを合成した。次いでインドール窒素をメトキシメチル基で保護した後,トリフルオロ酢酸を作用させたところスピロ環化反応が進行し,目的とするスピロ環化体を得ることができた。得られた光学活性スピロ環化体に対し,側鎖の酸化的開裂,インドール3位の酸化を行った後ビニルグリニャール試薬を作用させ,ベンジル位3級水酸基の構築を達成し,ラピジレクチンBの立体配置を有したビニル化体を立体選択的に合成することができた。現在,スピロ環化反応のさらなる収率の向上と,得られたビニル化体よりハイドロボレーション,続く光延反応によるアミノ基の導入等種々の反応の条件最適化を検討中であり,次いでラピジレクチンBの全合成を達成する予定である。マレーシア産キョウチクトウ科植物Kopsia lapidilectaの葉から単離された多環性アルカロイドラピジレクチンBの合成を行った。初めにKopsia lapidilectaアルカロイド類共通の骨格である2,3-dihydroindole-2-spiro-1'-cyclohexane骨格の構築について検討した。2,3-インドリンジオンより誘導した3位にアセタール,2位に共役ジエンを有する2-置換インドリン誘導体に対しギ酸を作用させ,N-アシルイミニウムイオン-共役ジエンアザスピロ環化反応を行ったところ,スピロ環化様の反応が進行するものの,3位アセタール酸素原子の影響により芳香環の転位反応が進行しアクリジン誘導体を与えることが明らかとなった。そこでN-Boc-2-置換インドール誘導体を用い同様にスピロ環化反応を検討したところ低収率ではあるが2,3-dihydroindole-2-spiro-1'-cyclohexane骨格を有するスピロ環化体が得られ,また共役ジエン側鎖3'位にアルコキシ基を有するN-Boc-2-置換インドール誘導体を用いた場合にも同様に4%の低収率ではあるがスピロ化合物を得ることができた。酸性条件下脱Boc化が進行することが低収率の原因と考えられたので,窒素保護基をメトキシカルボニル基に変更後トリフルオロ酢酸を作用させたところ,所望の立体配置を有するスピロ環化体が収率73%,1.9:1の生成比で得られることが判明した。次いで側鎖の酸化的開裂,インドール3位の酸化を行った後ビニルグリニャール試薬を作用させ,ラピジレクチンBの立体配置を有したビニル化体を立体選択的に合成することができた。現在,得られたビニル化体よりラピジレクチンBへの誘導を検討中である。
ゼブラフィッシュの覚醒・睡眠の分子機構に関する研究

多くの動物は眠るが、睡眠の分子メカニズムはまだ良くわかっていない。この状況は、Hypocretin/Orexin(Hcrt)とその受容体が発見され大きく進展した。本研究は、ゼブラフィッシュを用いて動物の睡眠と覚醒の分子機構を明らかにすることを目的としている。そこで蛍光カルシウムプローブG-CaMPを神経細胞に発現させ神経細胞の機能とゼブラフィッシュの行動との関係を探ることを計画した。本研究において蛍光カルシウムプローブG-CaMP2を改良したG-CaMP-HSを新たに開発した。G-CaMP-HSはG-CaMP2と比較して高感度であるとともに、細胞内でのタンパク質の安定性が増しており、安静時の蛍光強度が高いという特徴を持つ。これに関連して、蛍光カルシウムプローブの性能向上に関する特許を申請した。次にG-CaMP-HSをGal4-UASの下流につないだコンストラクトを作成し、ゼブラフィッシュに導入することにより遺伝子改変ゼブラフィッシュを作成した。このゼブラフィッシュと運動ニューロン(Caudal primary neuron : CaPニューロン)にGal4を発現するゼブラフィッシュ(SAIGFF213A)とを掛け合わせることによりCaPニューロンにG-CaMP-HSを発現するゼブラフィッシュを作成した。CaPニューロンの活動をイメージングにより解析したところ、CaPニューロンのバースト発火に伴い、G-CaMP-HSの蛍光強度が変化することが観察された。この成果はProc Natl Acad Sci USAに報告した。ゼブラフィッシュの神経細胞からG-CaMP-HSを用いて神経活動をイメージングにて解析することが可能となったことにより、今後HcrtニューロンにG-CaMP-HSを発現させ解析することにより睡眠覚醒のメカニズムの解明が進むと考えられる。多くの動物が睡眠することが知られているが、その分子メカニズムはまだ良くわかっていない。哺乳類と鳥類については脳波(EEG)が測定されており、睡眠状態ではEEGが徐波化することが知られている。また、レム睡眠、ノンレム睡眠の区別がある。鳥類や鯨類などでは左右の脳半球を交互に眠らせる動物も存在する。その他の動物でも、例えばショウジョウバエ、ゼブラフィッシュでは行動観察から活動が低下し、刺激に対する覚醒閾値が上昇することが知られており、これは睡眠状態と考えられている。これまで、ゼブラフィッシュでは脳波測定の報告はなく、行動観察より睡眠・覚醒の評価が行われてきた。そこで本研究ではまず光学的手法を用いた脳波測定(optical encephalogram OEG)を行いゼブラフィッシュにおける客観的・定量的睡眠・覚醒の評価法を確立する。そして、睡眠覚醒と関係があるとされるHypocretin/Orexin(Hcrt)についてmutantを解析し検討する。それによって、動物の睡眠と覚醒の分子機構を明らかにすることを目的としている。本研究は睡眠障害の治療、時差ぼけの効果的対処法などに発展する可能性がある。本年度は、客観的・定量的な睡眠・覚醒の評価法を確立することを行った。そのため、GFPを用いたカルシウムセンサー(改良型G-CaMP)を神経細胞のシナプス前部に限局して発現するcDNAを作成した。当初VAMPを用いてG-CaMPをシナプス前部にターゲティングさせる予定であったが、ごく最近synaptophysinをもちいた報告がなされたため、synaptophysinを用いたcDNAも合わせて作成した。本研究の採択後、モデル生物として優れている線虫が当研究室で利用可能となったため、作成したcDNAを線虫でテストし、結果を検討した。
日本風土の没食子インクの開発製造と美術教育への貢献

本研究は、これまで製造は不可能と思われた、日本風土における西洋古典インク(没食子インク)の製造開発をし、それを完成させた。この独自のインクは、西洋インクの問題点(インクの固着力不足等)をも補ったものである。また、西洋古典インクの経年劣化等を50種の紙で比較し、この特性により適合する紙を選定した。さらに、羽根ペンによるインク線には、美を感じさせる周波数(1/fゆらぎ)が存在したことを発見した。これらの研究を踏まえ、自然由来の古典インクと羽根ペンによる素描授業を実践し、美術教育へ貢献した。■本研究は、西洋古典インク(没食子インク)をもとに、日本風土における没食子インクを開発し、美術教育への貢献をするものである。日本のデッサン(素描)は明治以降、木炭デッサンと鉛筆デッサンが主流である。インクと羽根ペンによる素描は近代の大学教育では忘れられかけている。輸入インクは大変高価である。日本国内でのインク製造を試みれば、教育の場に安価で高品質なインクを大量に供給できると着想し、西洋没食子インクの欠点を克服した和製没食指インクを独自に製造開発する事にした。西洋没食指インクの欠点〔1)ブルーブラック色の濃さが薄い。2)ブルーブラック色が年月と共に変色しビスタ色になる、3)酸化力が強く、紙が抜け落ちることがある、4)紙への付着力が弱く、乾燥後かすれ取れる〕を克服すべく製造開発する。日本風土を生かした独自のインクは、芸術へ深く貢献することのできるものであろうと考えた。研究手順は下記の通りである。1.インクの為のどんぐり種の虫こぶ採取を高知県、中国地方で行った。採取した虫こぶからタンニン酸液を加熱し、濃縮を行った。2.古代エジプトの装飾用の絵具処方(蜂蜜入り)にヒントを得て、蜂蜜をインクに添加し退色実験を行なった。3.インクの付着力強化のために膠水を混ぜる必要がある。20°C以下の外気温で使用可能な没食子インクにするために膠水のタンパク質限定分解をしなければならない。2種膠(つぶ膠、HM膠)のタンパク質分解実験のための基礎データを取り、新たな実験の処方を検討した。4.インクがブルーブラック色として安定する中性紙・和紙の限定を行なった。また、海外学術調査(アメリカ・メトロポリタン美術館)にて、インク資料収集を行う予定であった。本研究は、西洋古典インク(没食子インク)をもとに、日本風土における没食子インクを開発し、美術教育への貢献をするものである。1.インクの為のどんぐり種の虫こぶ採取を高知県、中国地方、九州地方で行った。20°C以下の外気温で使用可能な没食子インクにするために膠水のタンパク質限定分解を行った。3種の膠(三千本、つぶ膠、HM膠)の内、三千本の膠水へタンパク質分解に酵素(コラゲナーゼ)を使用し、タンパク質限定分解した膠水の粘度を測定した。上記の1、2、3が完了の後、高品質のインクの製造を行った。また、不燃紙に於いて使用可能か否かを評価した。海外学術調査(アメリカ・メトロポリタン美術館)にて、インク資料収集を行う予定であった。最終年度報告にあたり、本年度の研究成果を含めて研究概要を述べる。本研究は、西洋古典インク(没食子インク)の欠点を克服し、日本風土を生かした独自の没食子インクを開発することで、芸術作品の制作と美術教育への貢献をめざすものである。研究内容及び方法は以下の通りである:

1)高知県、中国地方及び九州地方で、どんぐり種の虫こぶを採取し、採取した虫こぶからタンニン酸を抽出し、加熱濃縮した。26年度は、種々の虫こぶ中のタンニン酸を定量し、虫こぶによる含有量の差異を明らかにした。2)古代エジプトの装飾用の絵具処方(蜂蜜入り)にヒントを得て、蜂蜜をインクに添加したが、乾燥が遅く不適であることが分かった。3)インクの付着力強化のために膠水を混ぜるが、20 °C以下の外気温で使用可能な没食子インクにするために、膠水のタンパク質限定分解物を用いた。4)製造したインクがブルーブラック色として安定する中性紙等の選定を行なった。また、不燃紙に於いて使用可能か否かを評価した。5)美術教育授業(附属中学校、教育学部等)において、没食子インクと羽根ペンの素描を行い、ペン画を体感することでその可能性や教育効果を見出した。6)本インクを用いた際の羽根ペンの筆感を調べるために、インク線による「1/fゆらぎ」の計測実験を行った。7)海外学術調査により、紙・羊皮紙・インク退色等の資料取集を行った。このように、和製没食子インクを独自に製造開発することが可能になったことで、美術教育の現場に安価で高品質なインクを供給できる道を開くことができた。洋画■25年度の研究目標は、やや遅れている。どんぐり種にできる虫こぶを調査採取したが、短所を改善した高品質の没食子インクの製造行えていない。中性紙・和紙での退色実験も行なった。1.没食子インク製造に必要な虫こぶは、岡山県で採取し、没食子インクの材料としてふさわしいものを選出した。岡山県のどんぐりの木は、今後の十分なインク製造開発にための鈴なりの虫こぶを保有してる。この木を見つけることができたことは大きな成果である。採取した虫こぶは脱イオン水を加え乳鉢ですりつぶし、濾過してタンニン酸液にし、加熱濃縮した。2.没食子インクの変色防止に、古代エジプトの装飾用絵具(蜂蜜入り)の手法を取り入れ、蜂蜜をインクに添加して退色実験を行なった。3.付着力強化のための膠水のタンパク質限定分解は、実験方法の検討をした。伝統的なアラビアゴムの替わりに、より接着力の強い膠水を使用する。20°C以下の気温で使用可能なインクにするために、膠水のタンパク質限定分解を行う予定であった。三千本膠の実験は昨年度に終えているが、つぶ膠とHM膠のタンパク質分解実験で、実験条件等を再検討したため、分解実験がなかなか上手く行っていない。4.インクがブルーブラック色として安定する中性紙・和紙の限定実験を行なった。また今後、不燃紙に於いて使用可能か否かを実験評価する。海外学術調査は行えていないが、今年度に実施予定である。昨年度の準備と成果を踏まえ、今年度はより高い成果を得られる可能性が高い。24年度の研究目標は、概ね順調に達成した。どんぐり種にできる虫こぶを多種に調査採取し、短所を改善した高品質の没食子インクの製造を行なった。1.没食子インク製造に必要な虫こぶを高知県、四国地方、九州地方で採取した。採取した虫こぶの中から、より没食子インクの材料としてふさわしいものを選出した。しかし、高知県内の山林では虫こぶ自体が少なく、量を確保できていない。岡山県、福岡県では多くの虫こぶを採取できたが、今後の十分なインク製造開発のためには、鈴なりの虫こぶを保有する木々が必要である。
細胞周期制御リン酸化酵素(PLK)の微小管形成における役割

昨年までの研究で、PLK(Polo-like kinase)が細胞周期、特にM期において重要な役割を果たしている事以外に、卵巣や子宮においての何らかの機能をもつことが、PLKの免疫染色法において示された。今年度は、昨年までの事実を基にして、子宮癌患者の標本をPLKの特異的抗体を用いて免疫染色法を行った。その結果、1)組織学的に悪性度のgradeの高い標本において、PLKの強い染色パターンを示した。2)癌組織が近傍へ浸潤している部分により強いPLKの染色を認めた。3)癌組織が血管内腔へ浸潤している部位ではPLKは強く染色された。他方、我々はNIH3T3正常線維芽細胞にPLKを過剰発現させて、ヌードマウスに移植したところ、ヌードマウスに腫瘍形成が観察されたことを報告した。この形成された腫瘍から標本を作成し、PLKの免疫染色を行うと周辺組織に浸潤している部位でPLKの強い染色パターンが観察されている。我々が子宮癌患者とヌードマウスにおいての腫瘍で観察したPLKの染色パターンと合わせて考えると、PLKの発現の程度が強いほど、浸潤しやすく転移を起こしやすい可能性が示唆された。このことは、子宮癌患者におけるPLKの発現の程度が強いほど、臨床的悪性度が高かった事実と一致している。子宮癌ではPLKの発現の程度によって、患者の予後が評価できるのかもしれない。我々の得た標本の患者は術後生存中であり、今後再発や5年生存率をPLKの発現の程度と比較検討していきたい。昨年までの研究で、PLK(Polo-like kinase)が、培養細胞を用いた実験系において分裂(M)期、特に微小管形成において重要な因子の一つであることを報告してきた。他方、抗癌剤タキソールの作用機序の一つが微小管形成の阻害である。これらの事実に基づいて、膀胱癌培養細胞よりタキソール耐性株を樹立した。親株とタキソール耐性株でPLKのmRNAの発現を比較したところ、有意にタキソール耐性株でPLKmRNAの発現の増強を認めた。よってPLKmRNAの発現上昇がタキソール耐性の獲得に関与しているかを確かめるために、親株にPLKの過剰発現細胞をクローニングしてタキソールに対する感受性を比較した。その結果、親株とPLK過剰発現株の間でタキソールに対する感受性は有意な差を認めなかった。このことによりタキソール耐性株のPLKの過剰発現という現象はタキソール耐性獲得に直接的には働いていなかった。一方、マウスの胎盤を卵巣におけるPLKの発現の局在を免疫染色法にて検討した。細胞増殖のマーカーであるProliferating celluarunclear antigen(PCNA)の発現が強い多細胞において、PLKの発現で認めた。また、卵巣の増殖していない間質細胞や黄体にもPLKの発現を認めた。このことより、PLKは特殊な細胞においては、分裂期以外の機能をもつことが示唆された。
有限混合モデルの統計的推測理論の開発

本研究は、有限混合モデルにおける統計的推測の理論を発展させた。有限混合モデルの分析においては、モデルを構成する要素の個数をデータから決定することが、特に重要である。しかしながら、要素の個数に関する統計的推測は、有限混合モデルの特殊な構造のため、非常に困難であることが知られている。本研究は、有限混合モデルの尤度関数を分析する新しいアプローチを構築し、それに基づき、有限混合モデルの要素の個数に関する、幅広いモデルに適用可能である新しい統計的推測の手法を構築した。さらに、コンピュータ・シミュレーションによって、本研究によって提唱された手法が、実用上有用であることが確認された。有限混合モデルは、観測されない多様性を柔軟にモデルにすることが可能なため、実際の応用において非常に幅広く使われている。有限混合モデルの分析においては、モデルを構成する要素の個数をデータから決定することが重要であるが、そのための統計的推測については、いまだに実用的な手法が確立されていない。平成24年度は、パラメターがベクトルである有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論を構築し、小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、漸近理論の有限標本下での妥当性を検証した。本研究は、平成23年度に、この問題に対する、帰無仮説に対応するパラメター空間を分解して新しいパラメターの変換を用いるアプローチを構築した。平成24年度は、このアプローチをパラメターがベクトルである場合に拡張し、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する統計量を構築した。Li et al. (2009)は、有限混合モデルの要素の個数に関するEM-testを提唱し、EM-testが実行の簡単さ・漸近分布の簡単さ等の点で、尤度比検定統計量よりも優れていることを示した。本研究では、Li et al. (2009)のEM approachを拡張し、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合のmodified EM-testを構築した。Modified EM-testは、ペナルティ項の必要がない点において、EM testよりも優れている。さらに、小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、modified EM-testの漸近分布が有限標本下の分布の良い近似となっていることが確認され、提唱されたmodified EM-testの実用性の高さを確認した。平成24年度には、このアプローチを用いて、パラメターがベクトルである有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論を構築し、小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、漸近理論の有限標本下での妥当性を検証した。平成25年度は、平成23・24年度に得られた結果を拡張し、混合正規分布モデルの分析を行った。正規分布の密度関数は、平均のパラメターに関する2次の微分係数と分散のパラメターに関する微分係数が線形従属となる特殊な構造を持っている。本研究では、新しいパラメータ変換と尤度関数の8次のテイラー展開を用いて、対数尤度関数が漸近的に変換されたパラメターの二次関数で近似できることを示した。さらに、本研究は、Chen, Li and Fu (2012)のEM approachを拡張し、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合のmodified EM-testを構築した。平成23年度は、パラメターがスカラーである有限混合モデルに焦点を置いて、有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論を構築し小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、漸近理論の有限標本下での妥当性を検証した。有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測、すなわち要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定することが困難である理由は帰無仮説(要素の数がm個)に対応するパラメター空間が特殊な形状をしていること、そして情報行列が特異であることである。

平成23年度の研究では、帰無仮説に対応するパラメター空間を適切に分解し、さらに新しいパラメターの変換を用いるアプローチを開発した。このアプローチを用いて、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合の局所的尤度比検定統計量の漸近分布を求めた。実際の検定においては、Li et al. (2009)が提唱したEM-testが、実行の簡単さ、漸近分布の簡単さ、仮定の弱さ等の点で、尤度比検定統計量よりも優れていることを示している。本研究では、Li et al. (2009)のEM approachを適用し、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合のEM-testを構築した。さらに、小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、EM-testの漸近分布が有限標本下の分布の良い近似となっていることが確認され、提唱されたEM-testの実用性の高さを確認した。本研究の目的は、有限混合モデルにおける統計的推測の理論を発展させることである。平成24年度は、パラメターがベクトルである有限混合モデルにおいて、以下の二つを達成することを目的とした。(1)有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論を構築すること。(2)小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、漸近理論の有限標本下での妥当性を検証すること。(1)有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論の構築に関しては、当初の目的通り、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合の局所的尤度比検定統計量の漸近分布を求めることに成功した。さらに、Li et al. (2009)が提唱したEM-approachを拡張し、要素の数がm個である帰無仮説をm+1個である対立仮説に対して検定する場合のmodified EM-testを構築した。(2)コンピュータ・シミュレーションによる漸近理論の有限標本下での妥当性の検証に関しては、小規模のコンピュータ・シミュレーションによって、本研究によって提唱されたmodified EM-testの漸近分布が、有限標本下の分布の良い近似となっていることを確認し、modified EM- testの実用性の高さを確認した。平成23年度は、パラメターがスカラーである有限混合モデルに焦点をおき、以下の二つを目的とした。(1)有限混合モデルの要素の個数に関する統計的推測の漸近理論の構築に関しては、当初の目的通り、帰無仮説に対応するパラメター空間の適切な分解ならびにパラメターの変換を用いるアプローチを確立した。
ウサギ生体由来多能性幹細胞（Muse細胞）を利用した気管再生

ウサギ脂肪由来MSCからSSEA-3陽性細胞を分離可能であり、得られたSSEA-3陽性細胞からヒトMuse細胞同様のクラスター形成が確認できた。また、得られたクラスターをゲラチン上で接着培養することにより、外胚葉、中胚葉、内胚葉にそれぞれ自発的に分化することが確認できた。樹立したMuse細胞を人工気管に付加し、気管欠損モデルのウサギに移植した。移植後1週間毎に内視鏡による気管内腔の評価を行い、エンドポイントを2週間とした。人工気管のみを移植した群をコントロール群とし、上皮化について、Muse細胞群と比較した。コントロール群では上皮化を認めなかったが、Muse細胞群では、上皮化を認めた。ウサギ生体由来多能性幹細胞(Muse細胞)の樹立とコントロールモデルの作製、評価を行った。[ウサギ脂肪由来Museの樹立]ウサギ脂肪組織から脂肪組織由来間葉系細胞を樹立可能であった。樹立した細胞をMuse細胞のマーカーである抗SSEA-3抗体で染色後、フローサイトメトリーを用いて、SSEAー3陽性細胞を選択的に回収可能であった。また単離できたSSEA-3陽性細胞をsingle cellで浮遊培養し、クラスターを形成後、接着培養にて得られた細胞を用い自己増殖能と3胚葉への分化を確認できた。[コントロールモデルの作製]気管欠損モデルを作製した。また気管欠損部に人工気管を移植後、1週間ごとに、全身麻酔下に内視鏡を用いて気管内腔の移植部位を観察することができた。平成25年度に樹立したウサギMuse細胞を懸濁させた細胞懸濁液を人工材料のコラーゲンスポンジ中に注入し、ゲル化させた再生誘導型人工気管をウサギの気管欠損モデルに移植した。気管内腔面の上皮化について、細胞を付加していないコントロール群と比較した。経時的に気管の治癒を評価するために,移植後1週間ごとに、全身麻酔科に内視鏡を用いて気管内腔の移植部位を観察した。Muse細胞を移植した群では、人工気管の露出は見られず、被覆されているのが確認できた。安楽死後に気管欠損部を含むよう前頸筋、食道などの周囲臓器を含めて標本を摘出し、標本を作製し、上皮化の有無、上皮細胞形態、線毛の有無などの観察・評価を行った。Muse細胞2万の群では、一部線毛を伴う重曹扁平上皮がみられた。Muse細胞6万の群では、2万の群に比較して、上皮構造としてはより成熟した未熟な多列線毛上皮を認めた。コントロール群では上皮化を認めなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。気管再生26年度が最終年度であるため、記入しない。[ウサギ脂肪由来Museの樹立]ウサギから全身麻酔下に脂肪組織を採取し、脂肪組織を細片後、コラゲナーゼ処理を施し、10%FBS含有DMEMによる培養を経て、ウサギ脂肪組織から脂肪組織由来間葉系細胞を樹立可能であった。また単離できたSSEA-3陽性細胞をsingle cellで浮遊培養し、クラスターを形成後、接着培養にて、自己増殖能を確認することができ、得られた細胞を用い、ヒトES細胞の自発的分化の誘導に用いられる方法にて、免疫染色をすることにより内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化を確認できた。[コントロールモデルの作製]全身麻酔を行い、前頸部の組織を正中で切離し、頸部気管を露出させ、メスにて気管前壁に縦12mm×横5mmで切除し、気管欠損モデルを作製した。得られたウサギ脂肪由来Muse細胞を導入した再生誘導型人工気管を気管欠損モデルに移植を行う。コントロール群としては細胞を付加しない人工気管のみ群を設定する。目標とする細胞数は2×10^4個と6×10^4個とする。移植後1週間ごとに全身麻酔下に気管内視鏡を行い、上皮化の程度や狭窄の有無などを確認する。エンドポイントは2週間とし、固定後、H-E染色や免疫染色を用いて、上皮化の程度を評価する。
下水2次処理水の塩素消毒に及ぼすCO_2ガス吹込みの効果に関する研究

(1)下水2次処理水へのCO_2ガス吹込みにより、塩素消毒の効果が促進されることが、大腸菌(E.Coli)およびコリファ-ジによって明らかになった。しかし、グラム陽性菌である腸球菌(S.faecalis)の場合は、CO_2吹込みの効果はH_2SO_4添加に較べて効果が少なくあまり期待できないことも明らかになった。(2)細菌学的な実験を行なう場合、細菌数の測定値には種々な実験誤差が含まれるので、細菌数の統計的分布特性を調べた。その結、大腸菌群および腸球菌群の純粋培養によって得られた試料水の両細菌群数の統計的分布は正規分布をすることがわかった。すなわち、人為的な実験誤差は白色雑音のような分布となることが知られた。一方、生下水、下水一次処理水、下水二次処理水、塩素消毒後の放流水および河川水のそれぞれの試料水中における両細菌群の分布特性は正規分布とはならず、他の分布である対数正規やポアソン分布などの分布となることが明らかとなった。すなわち、これらの試料は試料水中に含まれる懸濁物質やpH、BODなどの水質が異なるので、これらが細菌群数の分布に影響を与えたものと考えられる。下水放流水における大腸菌群の水質基準は平均値で3000個/mlとされているが、この場合、大腸菌群数の分布を正規分布と仮定した場合と他の分布を仮定した場合では、その危険率に大きな差が生じることになり、本研究で得られた結果は今後種々な水域において細菌群数の統計的な分布を明らかにし、水質基準の見直しをする必要があることを示している。(3)F特異RNAファ-ジの増殖には、宿主菌が道好に増殖し得る基質が充分にあること、水温が25°Cより高いか、35°C程度から25°Cになって1時間以内であることが必要条件であることが明らかになった。
魚油の作用機序におけるインクレチンの役割とその分泌調節による糖尿病食事療法の検討

魚油の作用機序に及ぼすインクレチンの役割について、in vitroおよび糖尿病患者を対象として検討を行った。in vitroにおいては魚油に含まれる脂肪酸であるEPA、DHAにDPP4活性阻害効果がみられ、これが魚油の作用機序の一因である可能性が示唆された。このことは、DPP4阻害剤の効きをEPA、DHAによって高められる可能性も示している。糖尿病患者を対象とした研究は現在継続中で、現在までに50名の患者から本研究への同意が得られている。この解析結果が得られれば魚油摂取が及ぼすDPP4活性への影響を検証できると考える。糖尿病予備軍あるいは糖尿病と診断された患者の血清DPP4量および活性と身体組成、食物摂取、HbA1cとの関連性について検討した。対象者は男性11名、女性13名の計24名。うち1名がインスリン注射、1名がビデュリオン(持続型GLP-1製剤)注射を行っていた。その他の患者は糖尿病治療薬の内服あるいは無投薬であった。内服薬として、DPP4阻害薬、DPP4活性に影響を与えるとされるメトホルミンおよびチアゾリジンの使用者は対象外とした。対象者の平均年齢は68.2±10.2歳(男性65.9±12.2歳、女性70.1±8.1歳)、BMI23.2±4.2(男性25.0±4.3歳、女性21.7±3.5歳)であった。HbA1cの平均は6.6±0.7(男性6.6±0.8歳、女性6.7±0.5歳)であった。DPP4量と活性の間には有意な相関が認められなかったため、DPP4活性を用いて、以後の検討を行った。まず、DPP4活性と身体組成との関連性について検討した。DPP4活性と体脂肪量に有意な相関が認められたが、骨格筋量との間には有意な相関関係はなかった。次に、DPP4活性と食物摂取との関連性について検討した。DPP4活性とエネルギーおよび穀類摂取量とは有意な相関関係があったが、魚油摂取量、n-3系脂肪酸摂取量との間に有意な相関は認められなかった。DPP4活性とHbA1cにも有意な相関は認められなかった。これらの結果から、DPP4活性は骨格筋量に関わらず体脂肪量に正相関することが示唆された。エネルギー摂取量や穀物摂取量は体脂肪量に大きく影響することからDPP4活性との関連性が見られたと考えられるが、魚油やn-3系脂肪酸との関連は見いだせなかった。HbA1cに関しては、対象者間のばらつきが少なく検討が難しかったと考えられる。今回用いたFFQの精度や対象者数も加味してさらに検討が必要だと思われる。魚油には、体重増加抑制、血中脂質低下作用、脂肪肝改善作用などの多岐にわたる効能が知られるが、その機序はいまだ明確ではない。魚油の主成分であるEPA、DHAは、小腸のGPR120を受容体のひとつとしていることが知られる。一方、GLP-1も、小腸のGPR120を介して分泌され、魚油と似通った効能を有する。GPR120をノックアウトした報告では、GLP-1の分泌低下と肥満が生じ、この受容体が食事性油脂のセンサーとして働き、身体のエネルギー状態をコントロールしていることを示唆している。また、魚油を多量摂取している人では、DPP4阻害薬の効きがよいとの報告やEPA、DHA摂取によって脂肪から分泌されるDPP4が低下するとの報告もある。よって、魚油の作用機序にGLP-1が関与している可能性あり、近年使用頻度の高まっているDPP4阻害薬と魚油との相互作用が示唆される。そこで本研究では、魚油の作用機序に及ぼすインクレチンの役割について検討を行うことを目的とした。まず、上部消化管および下部消化管のプライマリー細胞を用い、脂肪酸添加によるインクレチン分泌への影響を検討しようと試みたが、実験系が上手く立ち上がらず明確な結果を得ることができなかった。そこで次に、DPP4活性に及ぼす脂肪酸の影響をin vitro系で検討した。DPP4に各種脂肪酸を添加したところ、パルミチン酸、リノール酸、DHA、EPAの順にDPP4阻害活性が高値を示し、パルミチン酸以外では濃度依存性が認められた。また、EPAとDPP4阻害剤を同時添加したところ、相加効果が認められた。これらの結果から、EPA、DHAは高いDPP4阻害活性を有しており、魚油の作用機序の一因である可能性が示唆された。また、DPP4阻害剤の効きをEPAによって高められる可能性も示された。平成24年度、25年度の結果を踏まえ、平成26年度に施設数と対象者数を増やして糖尿病患者を対象とした臨床研究を実施する予定であった。しかし、研究場所が平成26年度から変更となったため、研究体制の整備および研究実施施設の選択に時間を要し研究開始準備に終始したため、臨床研究実施に至らなかった。それに伴い研究最終年を1年延長し、予定研究を平成27年度に実施することとした。糖尿病および糖尿病予備軍と診断された患者の血清DPP活性および身体組成、食物摂取、HbA1cとの関連性について検討した。平成25年度に実施した24名では人数が少なく明確な結果を得ることが難しかったため、今年度は人数を増やすため、同様の研究を他病院にて実施した。

今年度、研究に同意してくれた対象者は、男性12名、女性14名の計26名(今後あと1名協力予定)である。平均年齢は、男性68.0(SD 9.6)歳、女性63.4(SD 12.9)歳であった。現在、男性9名、女性11名の調査が終了しており、5月末で全ての対象者の調査が終了予定である。食物摂取状況は順次解析を進めており現在13名分の解析が終了、DPP4活性については全ての調査が終了した後に測定する予定である。ここでは、調査、解析の終了した者についてのHbA1c、身体状況、食物摂取状況について報告する。調査終了者の平均HbA1cは、男性6.9(SD 0.9)%、女性6.5(SD 0.8)%であった。調査終了者の身体状況について検討すると、平均BMIは、男性24.3(SD 3.9)、女性23.5(SD 5.4)であり、男女とも肥満者(BMI25以上)は4名(男性44%、女性36%)、やせの者(BMI18.5未満)は女性でのみ2名(18%)存在した。食物摂取状況についての解析が終了している13名について検討すると、エネルギー摂取量は男性1916(SD 617)kcal、女性1958(SD 243)kcalであり、魚介類摂取量は男性59.0(SD 28.7)g、女性78.9(SD 31.3)gであった。血清DHA濃度と魚介類摂取量との相関を検討すると、R=0.674(p=0.018)と有意な相関関係を示したことから、食物摂取状況調査による魚介類摂取量の算出は妥当であることが示唆された。魚油の作用機序に及ぼすインクレチンの役割について、in vitroおよび糖尿病患者を対象として検討を行った。in vitroにおいては魚油に含まれる脂肪酸であるEPA、DHAにDPP4活性阻害効果がみられ、これが魚油の作用機序の一因である可能性が示唆された。このことは、DPP4阻害剤の効きをEPA、DHAによって高められる可能性も示している。糖尿病患者を対象とした研究は現在継続中で、現在までに50名の患者から本研究への同意が得られている。この解析結果が得られれば魚油摂取が及ぼすDPP4活性への影響を検証できると考える。研究場所が平成26年度から変更となり、研究体制の整備および研究実施施設の選択に時間を要し研究開始準備に終始したため、臨床研究実施に至らなかったため。臨床栄養学平成24年度、25年度に細胞および人を対象とした予備的研究を実施し、平成26年度に変更となった研究体制の整備と研究実施施設の目途をつけたため、平成27年度には糖尿病患者を対象とした臨床研究を実施できる状況となっている。そのため、未使用額を研究実施費用(DPP4活性測定費、血糖値測定費、謝金等)に当て、計画通りに実施予定である。当初の計画通り、糖尿病患者を対象としてDPP4量・活性と身体組成および魚油を含めた食物摂取状況との検討が実施できた。しかし、調査実施先病院との折衝や倫理審査等により調査開始が遅れ、対象者数が少なくなってしまったことが反省すべき点である。課題申請時と課題採択時の研究施設が異なっていたため、課題目的は同じであるものの、新規研究施設で実施できる研究手法を手探りしながら課題研究に取り組むこととなった。その結果、上部消化管および下部消化管のプライマリー細胞を用い、脂肪酸添加によるインクレチン分泌への影響を検討しようと試みたが、実験系が上手く立ち上がらず明確な結果を得ることができなかった。
ヒト骨軟部腫瘍の病理組織学的診断と染色体及びDNA分析

前年度に行った軟骨肉腫の染色体分析の結果、#12q13を含む相互転座のみられた2症例については、その詳細をまとめたものが国際誌に掲載された。昨年度にひき続き症例をさらに増し、軟骨肉腫16例についてp53蛋白の過剰発現を免疫組織化学的にp53遺伝子の点突然変異をダイレクトシークエンシングで検索した。パラフィン切片を用いた抗p53蛋白ポリクローナル抗体による免疫組織化学的染色では、16例中、悪性度III度の2例にのみ陽性所見を得た。また新鮮生材料が得られた14例についてエクソン59に関し、PCR後ダイレクトシークエンスを行った結果、やはり悪性度III度の2例に点突然変異を認めた。通常型軟骨肉腫ではエクソン5、コドン157、淡明細胞型ではエクソン5、コドン237に変異を認めた。これらの結果より、軟骨肉腫ではp53遺伝子の変異は生物学的悪性度の高い亜型において認められ、それらの生物学的性状とp53遺伝子の関連が強く示唆された。一方、骨軟部腫瘍の診断をより正しい確実なものとするために、以下の検索を種々行った。筋小胞体ATPase及び骨巨細胞腫瘍に対してモノクローナル抗体を作製し、骨軟部腫瘍を免疫組織化学的に検索したところ、筋小胞体ATPaseは横紋筋肉腫以外にも脊索腫や軟骨肉腫で陽性となること、また、破骨細胞の前駆細胞と考えられる単核の細胞も骨巨細胞腫瘍と同様の反応を示すことが明らかとなった。その他、類上皮肉腫、骨アダマンチノーマ、脊索腫、骨原発悪性リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、滑膜肉腫を免疫組織化学的並びに電顕的に検索し、それらの特徴をより明確にした。また、骨軟部腫瘍の画像解析も併せ行い、悪性度或は組織型別の腫瘍細胞核の差異を明らかにした。1.通常型7例、淡明細胞型2例の計9例の軟骨肉腫について、短期組織培養を行いQ分染法により染色体分析を行った。#12q13を含む相互転座が2例、#1pの欠失及び転座が3例(うち1例は淡明細胞型)、#11qの転座が1例に、それぞれクロ-ン性の構造異常として認められた。検索した軟骨肉腫9例に共通した染色体異常はなかった。また、これら9例の軟骨肉腫よりgenomic DNAを抽出し、第7エクソンをはさむ30塩基のプライマ-を用い、PCR法で増幅した。さらにそのDNA断片を抽出し、3種の制限酵素で消化して検索したところ、点突然変異はみられなかった。また、5例について第7エクソンのシ-クエンスを調べたが、点突然変異はみられなかった。2.骨肉腫肺転移巣15例及び原発巣3例のパラフィン切片より、PCR法を用いDNAを抽出し、dot blot hybridization法を用いKーras geneのcoden12における点突然変異の有無を調べた。Ras geneの突然変異が種々のヒト腫瘍で報告されているが、本研究により骨肉腫ではそれがみられないことが明らかになった。3.Ewing肉腫を中心に骨小円形細胞腫瘍について、これまでの研究成果をまとめ、今後は神経への分化或いは上皮への分化が実際にどの程度みられるかを検討する必要のあることを示唆した。4.骨肉腫には種々の亜型のあることが最近明らかになってきたので、それらを定型及び非定型骨肉腫として疾患概念を整理し、今後の本研究の推進のための基礎をかためた。
海馬神経細胞におけるヒポカルシン・NAIP複合体によるアポトーシス抑制機構の解析

ヒポカルシンは海馬錐体細胞に特徴的に高濃度に分布するカルモジュリンスーパーファミリーに高親和性カルシウム結合蛋白質で,長期可塑性の入力依存性誘導カスケードの調節因子であるとともに,カルシウム濃度の変動に基づくアポトーシス誘導を抑制している可能性が示唆されている.昨年度は,ヒポカルシンが細胞死に及ぼす効果について,欠損マウス海馬初代培養系を用いて生存率を比較検討し,グリア細胞では差異は認めなかったが,神経細胞では著しい生存率の低下を認めた.過剰発現培養細胞と欠損マウス海馬神経細胞初代培養を用いた侵害刺激による細胞内カルシウム濃度の継時変化の計測から,ヒポカルシンは細胞内カルシウムの単なるバッファーではなくカルシウムチャネルの活性化に働くとともに,カルシウムポンプに対しても活性化に働いており,積極的な細胞内カルシウムの調節因子であることを示した.また,海馬スライスを用いた実験から,欠損マウスでは侵害刺激に対してJNKの活性化亢進を認め,ヒポカルシンは細胞内カルシウムの蓄積からJNKカスケードの異常活性化,細胞死シグナルの活性化機構を抑制していることを示した.本年度は,ヒポカルシンの作用点を同定する目的で,酵母two-hybridシステムを用いてヒポカルシンをbaitとしてマウス脳cDNAライブラリーをスクリーニングしヒポカルシン標的分子の同定を試み,MLK3,Protein 1B, NAIP3,complexinを候補として同定した.親和性はMLK3が最も強かった.これらのうちNAIP3は神経系に特異的なIAPファミリーの分子で,カスパーゼカスケードを抑制してアポトーシスの抑制に働くことが知られている.MLK3はJNKカスケードを担うMAP-KKKファミリーの主要な分子で,アポトーシスの誘導に働くことが知られている.今後,これらの標的分子の活性に対する作用を明らかにしていく予定である.ヒポカルシンは海馬錐体細胞に特徴的に高濃度に分布するカルモジュリンスーパーファミリーに高親和性カルシウム結合蛋白質で,長期可塑性の入力依存性誘導カスケードの調節因子であるとともに,カルシウム濃度の変動に基づくアポトーシス誘導を抑制している可能性が示唆されている.昨年度は,ヒポカルシンが細胞死に及ぼす効果について,欠損マウス海馬初代培養系を用いて生存率を比較検討し,グリア細胞では差異は認めなかったが,神経細胞では著しい生存率の低下を認めた.過剰発現培養細胞と欠損マウス海馬神経細胞初代培養を用いた侵害刺激による細胞内カルシウム濃度の継時変化の計測から,ヒポカルシンは細胞内カルシウムの単なるバッファーではなくカルシウムチャネルの活性化に働くとともに,カルシウムポンプに対しても活性化に働いており,積極的な細胞内カルシウムの調節因子であることを示した.また,海馬スライスを用いた実験から,欠損マウスでは侵害刺激に対してJNKの活性化亢進を認め,ヒポカルシンは細胞内カルシウムの蓄積からJNKカスケードの異常活性化,細胞死シグナルの活性化機構を抑制していることを示した.本年度は,ヒポカルシンの作用点を同定する目的で,酵母two-hybridシステムを用いてヒポカルシンをbaitとしてマウス脳cDNAライブラリーをスクリーニングしヒポカルシン標的分子の同定を試み,MLK3,Protein 1B, NAIP3,complexinを候補として同定した.親和性はMLK3が最も強かった.これらのうちNAIP3は神経系に特異的なIAPファミリーの分子で,カスパーゼカスケードを抑制してアポトーシスの抑制に働くことが知られている.MLK3はJNKカスケードを担うMAP-KKKファミリーの主要な分子で,アポトーシスの誘導に働くことが知られている.今後,これらの標的分子の活性に対する作用を明らかにしていく予定である.ヒポカルシンは海馬錐体細胞内においてカルシウム濃度の変動に基づくアポトーシス誘導を抑制している可能性が示唆されている.本年度は,まずヒポカルシンが細胞死に及ぼす効果について,欠損マウス海馬初代培養系を用いて生存率を比較検討した.ヒポカルシンを発現していないグリア細胞では差異は認めなかったが,神経細胞では著しい生存率の低下を認めた.このことから,ヒポカルシンは細胞死抑制シグナルの維持に必須の因子であることが確認された.ヒポカルシンは高親和性カルシウム結合蛋白質で,海馬錐体細胞内の濃度は30μM以上で存在することから,細胞内カルシウムを緩衝することによって細胞死シグナルを抑制しているとも考えられる.そこでヒポカルシン過剰発現培養細胞と欠損マウス海馬神経細胞初代培養を用いて,高カリウム,カルシウム・イオノフォア,グルタミン酸などの刺激による細胞内カルシウム濃度の継時変化をFra2AMを用いて計測した.欠損細胞ではカルシウムの流入速度が遅くピーク値も低いが,排泄速度も遅く細胞内へのカルシウムの蓄積が認められた.一方,強制発現細胞ではピーク値は低い傾向にあるが排泄速度が速く速やかな回復が認められた.このことは,ヒポカルシンが細胞内カルシウムの単なるバッファーではなくカルシウムチャネルの活性化に働くとともに,カルシウムポンプに対しても活性化に働いており,積極的な細胞内カルシウムの調節因子であることを示している.また,海馬スライスを用いた実験から,欠損マウスではNMDA刺激によりJNKの活性化が認められた.これらのことから,ヒポカルシンは細胞内カルシウムの蓄積からJNKカスケードの異常活性化,細胞死シグナルの活性化機構を抑制していることを示しており,解析を進めている.ヒポカルシンは海馬錐体細胞に特徴的に高濃度に分布するカルモジュリンスーパーファミリーに高親和性カルシウム結合蛋白質で,長期可塑性の入力依存性誘導カスケードの調節因子であるとともに,カルシウム濃度の変動に基づくアポトーシス誘導を抑制している可能性が示唆されている.

本年度は,ヒポカルシンの作用点を同定する目的で,酵母two-hybridシステムを用いてヒポカルシンをbaitとしてマウス脳cDNAライブラリーをスクリーニングし,ヒポカルシンと相互作用する分子の同定を試みた.Two-hybrid陽性クローンとして,MLK3(7 clones),Protein 1B(3 clones),NAIP3(2 clones),complexinが単離された.β-galactosidase assayによる検定では,ヒポカルシンとの親和性はMLK3が最も強かった.一方,ヒポカルシン相同分子であるneural visinin-like protein(NVP)1,2,3にはMLK3との相互作用は認められなかったことから,ヒポカルシンとMLK3の結合は特異的で,それぞれの相同分子に特異的な標的分子が存在するものと思われる.ヒポカルシンはMLK3のC-末端近傍のPro/Ser/Thr-rich region上流域と結合することが明らかとなった.ヒポカルシンのEF-ハンド領域ごとに断片化した発現蛋白質にはMLK3との相互作用は認められず,立体構造とアミノ末端領域が結合に関与することが示された.今回見いだされたNAIP3は神経系に特異的なIAPファミリーの分子で,カスパーゼカスケードを抑制してアポトーシスの抑制に働くことが知られている.MLK3はJNKカスケードを担うMAP-KKKファミリーの主要な分子で,アポトーシスの誘導に働くことが知られている.今後,これらの標的分子の活性に対してどのような作用を持つかを明らかにしていく予定である.