hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
辺縁系による中脳ドーパミンニューロン制御機構の実験形態学的研究

ラットの辺縁下皮質に順行性標識物質であるビオチン化デキストランアミン(BDA)を電気泳動的に注入し、1週間後に潅流固定した。脳切片を作成して、BDA標識終末をアビジン-ビオチン複合体で検出後、チロシン水酸化酵素(TH)陽性ニューロン(DAニューロン)を免疫組織学的に検出した。その結果、中脳領域では、多くのBDA標識線維終末が黒質緻密部(A9領域)の最内側部から腹側被蓋野(A10領域)にかけて認められた。また、背外側被蓋領域から中心灰白質の腹外側部にかけてもBDA標識線維終末が分布していた。一方、TH陽性ニューロンは赤核後野、黒質緻密部および腹側被蓋野に多数存在していた。したがって、黒質緻密部の最内側部から腹側被蓋野にかけての領域において、BDA標識線維終末とTH陽性ニューロンは混在し、TH陽性ニューロンに近接して存在するBDA標識線維終末が数多く認められた。この領域を電顕下で観察すると、BDA標識線維終末は球形のシナプス小胞を有し、TH陽性ニューロンの樹状突起に非対称性のシナプスを形成していた。以上の結果から、中脳DAニューロン(とくに、腹側被蓋野のDAニューロン)への辺縁下皮質からの興奮性入力の存在が示唆された。
バセドウ病・橋本病発症とアポトーシス

バセドウ病と橋本病はよく見る疾患である。前者は甲状腺中毒症、後者は機能低下症の原因である。ともに自己免疫疾患であるが、その発症機構は不明である。バセドウ病、橋本病発症の分子機構を明らかにする。バセドウ病。自己成分TSH受容体に反応するリンパ球が異常に増殖し(アポトーシスの異常)、TSH受容体に対する抗体(TRAb)ができる。これは甲状腺刺激抗体(TSAb)である。このTSAbが甲状腺を刺激し、甲状腺細胞増殖・分化の異常増大を引き起こし、バセドウ病の原因になる。277人の未治療バセドウ病患者と686人正常人でTSAb、TBIIを測定し、解析し、報告した(Takasu etal : J Endocrinol Invest 20 : 452-461,1997)。橋本病:甲状腺細胞機能低下。甲状腺細胞に反応するリンパ球が異常に増殖し(アポトーシスの異常)、抗体ができる。この免疫異常が甲状腺細胞のDNA断片化(アポトーシス)を引き起こし、甲状腺機能を低下させ、甲状腺機能低下症になる。成人T細胞白血病ではリンパ球が異常に反応し、抗体ができる。この免疫異常が甲状腺機能を低下させることを明らかにした(Clin Endocrinol 45:461-466,1996)。またブロッキング抗体(TSBAb)による甲状腺機能低下症の発症機構を明らかにした(Clin Endocrinol 47:319-324,1997)。バセドウ病。甲状腺自己免疫疾患;バセドウ病と橋本病発症機構をアポトーシスの異常から明らかにする。バセドウ病の橋本病はよく見る疾患である。1.成人T細胞白血病(ATL)およびHTLV-I carrierでは橋本病が高頻度にみつかることを発見し、報告した。ATLはTリンパ球の異常である。このために免疫系に異常が起こり橋本病が発症するものと考えられる。バセドウ病もATLでは高頻度に発症する。現在、バセドウ病とATLの関係をまとめている。またATLとアポトーシスとの関係が注目されている。バセドウ病と橋本病の発症機構をATL患者をモデルに研究している。2.バセドウ病:甲状腺細胞増殖・分化の異常増大。自己成分TSH受容体に反応するリンパ球が異常に増殖し(アポトーシスの異常)、TRAbができ、甲状腺細胞増殖・分化の異常増大(バセドウ病)を引き起こすことを明かにしつつある。3.橋本病:甲状腺細胞機能低下。甲状腺細胞のDNA断片化(アポトーシス)-機能低下症を引き起こす。電気泳動装置を購入し、DNA解析を開始した。バセドウ病、橋本病の発症機構を明らかにする。バセドウ病。277人の未治療バセドウ病患者と686人正常人でTSAb、TBIIを測定し、解析し、報告した(Takasu et al.J Endocrinol Invest 20: 452-461,1997)。

この免疫異常が甲状腺細胞のDNA断片化(アポトーシス)を引き起こし、甲状腺機能を低下させ、甲状腺機能低下症になる。成人T細胞白血病ではリンパ球が異常に反応し、抗体ができる。この免疫異常が甲状腺機能を低下させることを明らかにした(Clin Endocrinol 45: 461-466,1996)またブロッキング抗体(TSBAb)による甲状腺機能低下症に発症機構を明らかにした(Clin Endocrinol 47: 319-324,1997)。
研磨象牙質に接着する光重合型ボンディング材の開発

平成9年度では、2-hydroxy acrylate、2-hydroxy methacrylateと無水マレイン酸、無水シトラコン酸、無水コハク酸から2AEM、2AECまた2MEM、2MESをそれぞれ合成し無色透明の液体を得た。蒸留水に2AEMあるいは2AEC、また、HEMA,MEAAを添加して調製したセルフエッチングプライマーに2MEM、2MES、BisGMAを添加した。これにカンファーキノン:0.10.5wt%、QTX:13Wt%、N-フェニルグリシン:0.53wt%の範囲で添加して調製した光重合型ボンデイング材が良好な硬化特性を示した。研磨象牙質への接着強さは、2AEM(2AEC)にMEAA、2MEMを添加した組成の光重合型ボンディング材で24時間水中浸漬後に16MPa以上の接着強さが得られた。しかし、セルフエッチングプライマー処理とボンディング剤の組み合わせでは25MPa以上の接着強さが得られている事実から考えてもまだ低い値であった。平成10年度は9年度で比較的高い接着強さが得られた光重合型ボンデイング剤グループの接着試料を3ケ月、6ケ月間の水中に浸漬し、また、サーマルサイクリングを1万回、5万回、10万回行って接着強さを測定した。水中浸漬の延長による接着強さの有意な低下は認められず、SEM観察においても樹脂含浸象牙質層近傍での破壊が認められた。一方、サーマルサイクリングの回数を10万回まで増加させると有意に接着強さの低下が認められた。以上の結果より、試作光重合型ボンデイング剤の接着強さや接着耐久性は現在のセルフエッチングプライマー+ボンディング剤用いた場合には及ばず、更に検討する必要があり、また、SEM観察から樹脂含浸象牙質層や、アンダーライニングデンチンとの接着性の強化が必要と考えられた。2-hydroxy acrylateに無水マレイン酸、無水シトラコン酸を付加させて2AEM、2AECを、また、2-hydroxy methacrylateに無水マレイン酸、無水コハク酸を付加させて2MEM、2MESをそれぞれ合成し無色透明のモノマーを得た。これらのモノマーについてそれぞれIR、NMRで構造を確認した。蒸留水に2AEMあるいは2AEC、また、HEMAあるいはMEAAを添加して調製したセルフェッチングプライマーに2MEM、2MES、Bis-GMAを添加して各種の組成を有する光重合型ボンディング剤を調製した。しかし、Bis-GMAは成分として多くのバリエーションをとれなかった。また、本研究に使用するモノマーは殆ど酸性モノマーで濃度も高いため、カンファーキノン、QTXと組み合わせる還元剤としてN,N-ジメチルアミノメタクリレートは適当でなかった。カンファーキノンは0.11.0wt%、QTXは13wt%とN-フェニルグリシンは0.53wt%の範囲で、良好な硬化特性を示した。また、カンファーキノンは非水溶性であるため、試作ボンディング剤中のモノマーの濃度比によっては使用できないこともあり、使用範囲が限られる結果となった。試作した光重合型ボンディング剤は、酸性モノマーである2AEM、2AECを含むためpH2pH3の酸性を示した。象牙質への接着性では、光重合型コンポジットレジンにZ100(3M社製)を用い24時間後の接着強さを測定した。2AEM、2AEC、HEMA、MEAAなどの水溶性のモノマーと2MEM、2MESを組み合わせると各種の濃度範囲を設定できた。

水溶性の酸性モノマーである2AEM、2AECはどちらを用いても接着強さに大きな差は認められないが、HEMA、MEAAではMEAAを用いた方が高い接着強さを示す傾向が認められ、また、光重合型ボンディング剤の成分として有効であった2MEM、2MESでは2MEMを用いた方が高い接着強さを示す傾向が認められた。しかし、検索した組成の光重合型ボンディング剤で10MPa以上の接着強さは獲得できたものの、未だ20MPaを越えることはできていないので、さらに組成の詳細な検討を行う必要がある。平成9年度では、2-hydroxy acrylate、2-hydroxy methacrylateと無水マレイン酸、無水シトラコン酸、無水コハク酸から2AEM、2AECまた2MEM、2MESをそれぞれ合成し無色透明の液体を得た。蒸留水に2AEMあるいは2AEC、また、HEMA、MEAAを添加して調製したセルフエッチングプライマーに2MEM、2MES、BisGMAを添加した。これにカンファーキノン:0.10.5wt%、QTX:13wt%、N-フェニルグリシン:0.53wt%の範囲で添加して調製した光重合型ボンディング材が良好な硬化特性を示した。研磨象牙質への接着強さは、2AEM(2AEC)にMEAA、2MEMを添加した組成の光重合型ボンディング材で24時間水中浸漬後に12MPa以上の接着強さが得られた。しかし、セルフエッチングプライマー処理とボンディング剤の組み合わせでは25MPa以上の接着強さが得られている事実から考えてもまだ低い値であった。平成10年度は9年度で比較的高い接着強さが得られた光重合型ボンディング剤グループの接着試料を3ヶ月、6ヶ月間の水中に浸漬し、また、サーマルサイクリングを1万回、5万回、10万回行って接着強さを測定した。水中浸漬の延長による接着強さの有意な低下は認められず、SEM観察においても樹脂含浸象牙質層近傍での破壊が認められた。一方、サーマルサイクリングの回数を10万回まで増加させると有意に接着強さの低下が認められた。以上の結果より、試作光重合型ボンディング剤の接着強さや接着耐久性は現在のセルフエッチングプライマ-+ボンディング剤用いた場合には及ばず、更に検討する必要があり、また、SEM観察から樹脂含浸象牙質層や、アンダーライニングデンチンとの接着性の強化が必要と考えられた。
多段階逐次反応を触媒する複合酵素系の設計

細胞内が行なう多段階逐次反応を、精製酵素を用いて再現することは容易でない。胆汁酸合成における側鎖切断(II型β酸化系による)もその例である。我々はこの反応の第2段目以降を試験管内で再現することに成功した。成功の理由は、酵素本体と融合しているが反応には直接関与しないドメイン(通称のSCP2は実態を反映しないので、CLPと仮称する)が除かれた線虫の酵素を利用した点にある。本研究は多酵素複合体の自由な設計に資するため、CLPに関する次の諸点を明らかにした。(1)CLPの2量体形成:CLPの働きに関する作業仮説は、このドメインの2量体形成を前提にしている。そこで酵母CLPの相互作用を表面プラズモン共鳴法、およびMALDI-TOF法とESI法による質量分析、ならびに超遠心分析法によって解析した。その結果、少なくともその一部が室温の水溶液条件下で2量体を形成していること、その解離常数は10^<-5>M以下であること、が明らかになった。(2)CLP部分の切断酵素活性の検出と精製:ラット肝ペルオキシソームの破砕液中に、II型チオラーゼのCLP部分を切断する活性を検出した。II型β酸化系の2頭酵素もCLPとの融合蛋白質であり、活性な画分では大部分CPLを欠いているが、ラットII型チオラーゼ(通称はSCPx)を用いたアフィニティー法で部分精製されたCLP切断酵素標品は、2頭酵素には作用しなかった。(3)線虫のII型チオラーゼの解析:II型β酸化系の試験管内構築の鍵となった線虫のII型チオラーゼが、腸組織のペルオキシソームに局在し、胚の脂肪が消費された後の幼生期に強く発現し、αメチル側鎖をもつ薬剤で誘導されることを明らかにした。これらの結果は、本酵素が間違いなくラットII型チオラーゼの対応物であることを示す。
モダリティ表現の特徴及び分布: 機能範疇・補文標識の役割の視点から

本研究は、日本語で主動詞が従属節内に、主動詞の意味に応じ、特定のモダリティ表現を要求する統語現象に焦点を当て、研究を進めた。特に、モダリティ表現の解釈を決定するモーダル基盤を活用し、この種の主動詞が疑問詞節を導入する「か」や名詞節を導入する「の」と共起しないことに注目した。その上で、モーダル基盤とForceに密接な関係があるという先行研究(Portner 2009)に着目し、Forceと主動詞の関係が阻害されるので、上記の統語現象が導かれることを示した。CP領域の機能範疇であるForceがモダリティ表現の解釈に役割を果たしていることを示し、統語構造がモダリティ表現の解釈に関係することを示した。平成26年度は、モダリティ表現を要求する主動詞と補文構造内における周縁機能範疇及びモーダル基盤(modal base)と主動詞の関係に主眼を置いて、分析を進めた。特に、モーダル基盤の中で、義務的解釈をもたらす規範的モーダル基盤と可能性解釈をもたらす認識様態モーダル基盤に着目した。主文において、「法律を基に」などの副詞句を用い、規範的モーダル基盤を設定した場合、義務解釈を表す「べき」が許されるのに対し、「専門家の意見を基に」などの副詞句を用い、認識様態モーダル基盤を設定した場合、可能性解釈を表す「はず」が許されることを示した。次に、主動詞とモーダル基盤・周縁機能範疇の関係を明らかにするために、日本語でモダリティ表現を要求する動詞の選別を行い、「宣告する」などの動詞が補文構造内にて規範的モーダル基盤を要求し、義務的解釈になり「べき」を選択するのに対し、「信じ込む」などの動詞が、認識様態モーダル基盤を要求し、可能性解釈になり「はず」を選択することを明らかにした。更に、Saito (2013)の補文構造の分析を援用し、モダリティ表現を要する動詞と補文構造内部の周縁機能範疇の関係について精査し、「の」を主要部とするFinPではモーダル基盤を認可できないことを明らかにした。又、「か」を主要部とするForcePと共起できないことを示し、Portner (2009)が提案したように、モーダル基盤のタイプの決定には、Clause Type/Sentential Forceを認可するForceが要求されるので、ForcePを含むCPの最大領域が必要とされることを明らかにし、「か」が生じると、モーダル基盤の値が設定できないため、非文になることを示した。本分析はPortnerが示す普遍文法の性質と合致し、日本語の分析から他のアジア諸語に援用できるものであり、今後の進展が期待される。最初に、International Workshop on Syntactic Cartography 2015(北京語言大学:12/6)にて、発表し、日本語で主動詞が特定のモダリティ環境を補文構造内に要求する場合、補文構造の最上位にある機能範疇/Forceと関係を結び、必要なモーダル基盤の値を設定すると主張し、ゆえに疑問節の補文構造を導入し、ForcePの主要部に位置し、Forceの値を疑問に設定する「か」と共起できないことを示した。同様に、FinPの主要部の「の」が補文構造を導入する時、更に上に位置するForceまで統語構造が派生されないので、Forceが欠落するため、非文になることを提示した。質疑応答では、幅広く活発な議論を行い、今後の発展につながるものであった。又、ストーニーブルック大学のLarson教授等と情報交換を行い、貴重な知見を得た。次に、12/23に本学みなとみらいキャンパスにて、須藤講師(ロンドン大学)、阿部氏(東北学院大学)、上田教授(秋田大学)の3名を招聘し、ワークショップを行った。須藤講師は意味論の見地から従属節内のモダリティ環境が主語の解釈に与える影響について発表を行い、次に阿部氏が英語の従属節における省略現象における統語上のふるまいから機能範疇の役割を示し、最後に上田教授が日本語の統語構造において、モダリティ表現の統語上の性質が階層関係に色濃く反映されていることを発表をした。いずれも、本研究に示唆深い発表で、大変有意義な議論が行えた。又、須藤講師とは日本滞在中に3回面談を行い、メールを含め、大変有意義な情報提供を受け、研究内容が格段に前進した。予算の関係で、現地調査が行えなかったが、今までの研究成果の蓄積を活用し、研究を一層深められ、プロジェクトの方向性を定まり、今年度の進展により、将来的に大いに期待が出来る基盤を築けたのは貴重な成果であった。日本語のモダリティ表現に基づき、モダリティ表現に与えるモーダル基盤の影響を基に、モーダル表現を要求する主動詞とモーダル基盤の関係の研究を進めることにより、モダリティ表現の特徴の一端を明らかにした。

又、補文構造の周縁機能範疇とモーダル基盤の認可及びモダリティ表現の解釈と関係する周辺機能範疇の役割を分析し、モダリティ表現の解釈に必要な条件の一端を提示した。この分析でモダリティ表現を要求する動詞と補文構造内における機能周縁範疇との関係を分析を進めたことにより、モダリティ表現の統語構造上の特徴を明示した。以上のように、一定の研究成果が見られ、本研究プロジェクトは順調に前進している。又、様々な文献を網羅して精査することにより、諸言語のモダリティ表現の特徴及び分布状況を幅広く収集し、比較統語研究を行うための研究基盤を蓄積した。次年度以降のアジア諸語を中心とする比較統語研究を進め、日本語のモダリティ表現を基にした文法を汎用させる準備を十分に行えたので、次年度以降の研究を円滑に進展させることが可能になった。最後に、第149回日本言語学会にて、口頭発表を行い、本研究の成果を公表した。聴衆からの議論を基に、本研究プロジェクトの成果を深化することができ、次年度以降の研究につなげられた。理論言語学(生成文法統語論)前年度に構築した研究基盤を基に、以下の研究項目を中心に進める。第一に、日本語の補文内におけるモダリティ表現の分布をまとめる。特に、モダリティ表現の分布を周縁機能範疇から定義する。同時に、モーダル基盤によって生じるモダリティ環境について、研究を進め、モダリティ環境の特質を整理し、モーダル基盤が周縁機能範疇に与える影響を明らかにし、周縁機能範疇の機能を究明する。その上で、モダリティ表現の特徴を解明する。二番目に、補文構造に表出する周縁機能範疇を再検討し、補文の内部構造を調べ上げる。伝統的な日本語における従属節分類の理論的根拠を探索する。加えて、モダリティ表現と周縁機能範疇の位置関係から、補文標識の根本的な特徴を明らかにする。最後に、前年度に蓄積した日本語及び諸語の研究資料を用いて、アジア諸語・台湾客家諸語を中心とした諸外国語と日本語の補文構造・モダリティ表現の比較統語研究を推し進める。特に、現地の研究者と交流し、必要な追加の言語資料を集め、普遍文法の視点から一定の提案を行う。次に、海外から本研究に深く関係する研究を行っている著名な研究者1名と国内から研究者3名を招き、国際ワークショップを行う。他にも、国内から3名の研究者を招聘し、研究会を行う。研究会及び国際ワークショップでは、幅広い研究知見を得ることで、多角的に研究成果を検討し活発な議論を行うことで、本研究プロジェクトの大幅な進展につなげる。最後に、文献及び電子媒体の研究資料を収集することで、最先端の研究知見を得るとともに、引き続きモダリティ表現が豊富な言語の調査も同時に進める。本研究プロジェクトの研究成果を国内外に幅広く公表するために、学会にて主な成果を発表し、国際学術雑誌に論文を投稿する。加えて、ウェブページに本研究プロジェクトで最終的に得られた研究成果、論文、研究成果報告書等を掲載する。研究会に招待する予定だった研究者の都合により、研究会で予定していた発表数が足りなかったために研究会が一度も開催できなかったことにより、人件費を使用しなかった。又、本研究プロジェクトと緊密に関係する国際学会の日程が公務と重なってしまい、応募することが出来なかったため、研究口頭発表できなかったので、国際学会の発表を見送った。ゆえに、旅費を使い切ることができなかった。
CCN2による骨細胞機能を標的とした新規骨粗鬆症治療薬の開発

骨細胞は骨のリモデリングを調節する司令塔としての役割が知られているが、CCN2 /CTGFの作用は不明である。本研究課題ではCCN2刺激した骨細胞による破骨細胞への分化誘導能を解析した。組換えCCN2タンパク質を含むコラーゲンゲル内で3次元培養した骨細胞様細胞株MLO-Y4はOPGの産生を抑制することで、そのゲル上に播種したRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を促進させた。また、Ccn2欠失マウスから単離した骨細胞様細胞では、逆に破骨細胞への形成は抑制された。これらの結果からCCN2を介した骨細胞による破骨細胞形成の調節機構の存在が示唆された。本研究課題の目的は骨リモデリングの司令塔的役割を担う骨細胞に対するCCN family protein 2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)の役割を骨細胞による破骨細胞形成への影響の観点から解析し、新規骨粗鬆症治療薬としての可能性を検討することである。平成26年度は主にマウス骨細胞様細胞株であるMLO-Y4細胞を用いてin vitroにおけるCCN2の作用を明らかにした。(1)単層培養したMLO-Y4細胞は星状の形態を示したが、生体で見られる様な長い突起形成は見られなかった。そこで、コラーゲンゲル内で3次元培養したところ、細胞間に長い突起形成が見られ、より生体内に近い形態を示した。よって、CCN2の機能解析はMLO-Y4細胞を主に3次元で培養して行った。(2)組換えCCN2タンパク質(rCCN2)でMLO-Y4細胞を刺激すると、Ccn2の遺伝子発現レベルと骨細胞マーカーの一つであるSostの遺伝子発現レベルが上昇した。(3) MLO-Y4細胞に超音波刺激を加えると、Ccn2及びSost遺伝子の発現レベルの上昇が見られた。(4)3次元培養したMLO-Y4細胞上にマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を播種し、GST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導すると、rCCN2を添加したMLO-Y4細胞培養系で破骨細胞形成に必須な転写因子であるNFATc1の産生量の増加が見られた。(5) CCN2の老齢期マウスの骨細胞への影響を解析するために、京都大学から供与されたCCN2flox/floxマウスとJackson labから購入したCAG-CreER transgenicマウスを交配し、タモキシフェンによって誘導できるCcn2欠損マウスを作製した。本研究課題の目的はCCN family protein 2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)によって骨のリモデリング時に司令塔として働く骨細胞がどのような影響を受けるのかを骨細胞を介した破骨細胞形成の観点から解析することで、新規骨粗鬆症治療薬開発の可能性を検討することである。平成27年度は平成26年度に作製したタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの大腿骨からコラゲナーゼによる段階消化によって骨細胞様細胞を単離し、以下の解析を行った。(1)コラゲナーゼによる段階消化によって骨細胞様細胞が単離できているかを確認するために、骨細胞のマーカー分子の一つであるSost遺伝子の発現レベルを調べた結果、単離した骨細胞様細胞にSost遺伝子が非常に高く発現していることを確認した。(2)タモキシフェンを投与してもCCN2が欠失しないマウスから単離した骨細胞様細胞を対照群にして、2群の細胞をそれぞれコラーゲンゲル内で3次元培養し、細胞突起の伸長に影響が見られるかを調べたところ、CCN2の欠失に関係なく骨細胞様細胞の細胞突起の伸長は2群の細胞間で影響は見られず、共に十分細胞突起は伸長した。(3)3次元培養した骨細胞様細胞上にマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を播種し、GST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導すると、CCN2を欠失させた骨細胞様細胞上で破骨細胞形成を誘導した群で破骨細胞分化に必須の転写因子であるNFATc1と分化マーカー分子の一つであるカテプシンKの産生量が対照群と比較して共に減少した。(4)タモキシフェン投与によってCCN2を欠失させたマウス大腿骨の組織切片を作製すると、CCN2を欠失させていない対照群と比較して大腿骨の骨梁の減少が見られた。平成27年度の研究目的はタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウス由来の骨細胞様細胞の機能解析に主眼をおいているため、同マウスから単離した骨細胞様細胞を用いて、骨細胞を介した破骨細胞形成の低下を明らかにした点及びタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの大腿骨を採取し、組織化学的解析によって、大腿骨梁の減少を明らかにした点で、概ね本課題は順調に進展していると考えられる。本研究課題は骨細胞による破骨細胞形成に対してCCNファミリータンパク質2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)がどのような作用を果たすのかをin vitro及びin vivoの実験系を用いて解析することを目的としている。平成28年度は本研究課題の最終年度であり、これまでの研究成果を総括すると共に老齢化したタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの大腿骨から骨細胞様細胞を単離し、3次元培養後、破骨細胞形成における骨細胞様細胞を介したCCN2の役割を解析した。

(1)野生型及びタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスにタモキシフェンを投与し、6ヶ月後に骨細胞様細胞を単離した。それら細胞をコラーゲンゲル内で3次元培養したところ、野生型マウス由来の骨細胞様細胞と同様にCCN2欠失マウス由来の細胞においてもコラーゲンゲル内で細胞突起の伸長が見られた。(2)コラーゲンゲル内で3次元培養したCCN2欠損骨細胞様細胞上にCCN2欠損骨随細胞を播種し、M-CSF及びGST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導したところ、野生型同士が最も破骨細胞の分化に必須な転写因子であるNFATc1と分化マーカー分子であるカテプシンKの産生レベルが高く、CCN2欠損骨細胞様細胞及びCCN2欠損骨髄細胞の組み合わせが最もこれら分子の産生レベルの低下を引き起こした。(3)野生型骨細胞様細胞とCCN2欠損骨髄細胞の組み合わせの方が、その逆の場合よりもNFATc1及びカテプシンKの産生レベルが高いことを明らかにした。(4)タモキシフェン投与1ヶ月後にマウス大腿骨を採取し、組織切片を作製すると、CCN2を欠失させていない野生型と比較して脛骨の関節軟骨の下側に見られる二次骨化部の骨梁の減少が見られ、その表現型はタモキシフェン投与6ヶ月後に採取した脛骨の二次骨化部においても確認された。骨細胞は骨のリモデリングを調節する司令塔としての役割が知られているが、CCN2 /CTGFの作用は不明である。本研究課題ではCCN2刺激した骨細胞による破骨細胞への分化誘導能を解析した。組換えCCN2タンパク質を含むコラーゲンゲル内で3次元培養した骨細胞様細胞株MLO-Y4はOPGの産生を抑制することで、そのゲル上に播種したRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を促進させた。また、Ccn2欠失マウスから単離した骨細胞様細胞では、逆に破骨細胞への形成は抑制された。これらの結果からCCN2を介した骨細胞による破骨細胞形成の調節機構の存在が示唆された。平成26年度の研究目的は本課題に適したMLO-Y4細胞の培養条件の検討とその培養条件によるCCN2の作用を明らかにすることであるため、MLO-Y4細胞の3次元培養の確立とCCN2刺激されたMLO-Y4細胞によるRAW264.7細胞の破骨細胞形成に対する促進作用を明らかにしたことにより、概ね順調に進展していると考えられる。また、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの作製に成功しており、この点からも本課題は順調に進展している。しかしながら、平成27年度に予定している実験を遂行するためには上記マウスの匹数が十分ではないので、まず、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの匹数を増やす必要がある。平成28年度は老齢期に達したタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの表現型を解析することを目的としている。タモキシフェン投与によってCCN2を欠失させたマウスを老齢期まで飼育した後に、骨組織への影響をマイクロCT及び免疫組織化学的研究手法により解析する。また、平成27年度では破骨細胞形成の影響をマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を用いて解析したが、平成28年度ではRAW264.7細胞の代わりにタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの骨髄細胞を使って、破骨細胞形成への影響を調べる予定である。加えて、平成28年度は本課題の最終年度であるため、これまでの実験結果をまとめ、成果発表の準備を行う。口腔生化学細胞生物学平成27年度から昨年度作製した薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを長期飼育し始める。
誘電率あるいは透磁率が負から正の値まで電気的に可変なメタマテリアルの研究

導波管型左手系線路および多層格子状金属パターンで構成される媒質を提案し,外部より電圧を加える等の方法でその誘電的あるいは磁気的特性を示す定数が符号も含めて変化するような線路や媒質を実現あるいは数値的に確認した.これにより波のエネルギとは逆方向への伝搬や減衰という性質を切り替える媒質の構造が示された導波管型左手系線路および多層格子状金属パターンで構成される媒質を提案し,外部より電圧を加える等の方法でその誘電的あるいは磁気的特性を示す定数が符号も含めて変化するような線路や媒質を実現あるいは数値的に確認した.これにより波のエネルギとは逆方向への伝搬や減衰という性質を切り替える媒質の構造が示されたまず遮断領域にある導波管内のリアクティブエネルギーが誘導性であることを利用して,遮断領域導波管を等価的誘電率が負となる構造として用いる.一方等価的に磁性体の性質を示す粒子あるいは構造として以下のような2種類のものを検討した.まずマイクロストリップ型共振器は、そのグランド導体と導体線路の間に鎖交するような磁界に対して共振周波数近辺で磁性体としての特性を示すことを示した.これまでに人工磁性体として報告されているスプリットリング共振器に比ベコンパクトな構造であり,共振周波数の付近で等価透磁率が正から負に変化することをシミュレーションにより確認した.この共振器を上記の遮断領域導波管内に置いて誘電率と透磁率が負となる周波数領域で左手系線路となることをシミュレーションおよび実験的に確認した.またこれを漏洩波アンテナに応用しバックワード方向への放射とその放射角度の周波数依存性を測定した.このマイクロストリップ型共振器にバラクタを接続し外部直流電圧により共振周波数を変化させた.この結果等価透磁率が変化し,電圧によって負から正まで変化する人工磁性体粒子が得られた.これと遮断領域導波管を組み合わせ電圧により負の透磁率となったときは左手系線路正の透磁率となったときは減衰率が大きく波の伝搬しない減衰器となるデバイスが得られた.またこのデバイスは電圧により伝搬する波の位相が大きく変わり,単一周波数においてバックワード方向への漏洩波の放射角度を大きく変えることが可能である.次に共振器を人工磁性体粒子として使う代わりに,遮断領域導波管にシャントの形で先端短絡導波管を接続した構造を提案した.損失の少ない左手系線路となることを確認した.この構造は線路であるが,これを2次元的に配置することで媒質への拡張可能性を持つ.等価誘電率が負となる構造中に等価透磁率の正負が周波数に対して変化する要素を付け加えて、左手型線路あるいは負屈折率媒質の基本構成法の提案を行い、また容量変化素子をこれに付け加えることで電気的に等価透磁率が可変となる線路を示した。具体的には(1)導波管を遮断領域で使用することで、その中では等価的に負の誘電率が得られる。このような導波管を2つ重ねその間をスタブで接続することでオープンスタブが作られる。スタブ中には容量性エネルギーがたまり導波管側からこれを見ると負の透磁率と同等の特性が得られる。これを利用し低損失な左手系線路が実現できた、このときスタブ間に電気的可変な容量素子を接続すると左手系モードの分散特性が周波数軸上を移動した、これは周波数を固定して考えると、透磁率が正から負へ、あるいは別の周波数では負から正へ変わることに相当する。(2)上記の導波管型左手型線路の考えを応用して、次のような負屈折率媒質構造を提案した。上下方向に周期的に並んだ導体線は縦方向に偏波した電磁波に対して先ほどの遮断領域導波管と同様に電磁波を遮断し負の誘電率特性が得られた。この導体線間の容量成分を利用して負の透磁率特性を持たせることで、バルク的負屈折率媒質を実現した。(1)により低損失な実用的左手型線路が示され、透磁率可変特性を持たせることが出来た。また(2)により波の進行方向に垂直な平面内に広がりを持つ負屈折率媒質構造が示され、媒質の透磁率誘電率を可変するための基本構造が得られた。多層の格子状パターンで構成される媒質とスタブを利用した導波管型左手型線路においてその等価的誘電率あるいは透磁率の可変性について検討した.多層格子状パターン媒質の等価回路において並列のインダクタンスとなる金属パターンに容量可変素子を接続することで,左手系モードの分散カーブを周波数軸上で電気的にシフトさせる媒質構造を提案した.この媒質へ入射する平面波の透過係数と反射係数から計算した媒質の等価誘電率が容量可変素子の値により負から正の値まで変化することを数値的に確認した.この性質は電磁波の透過あるいは遮断を切り替える媒質への応用が可能である。

またスタブを利用した導波管型左手型線路においては,その等価回路において直列に入るリアクタンスを変化させて左手系モードと右手系モードの分散特性を周波数軸上でシフトさせる構造を提案した線路の等価回路におけるこれらのリアクタンスは1次元媒質としての透磁率と誘電率に相当するもので,これらの分散カーブが移動することは等価的誘電率と透磁率が負から正の間で変化することに相当する.導波管中に挿入した誘電体の位置と右手系モード及び左手系モードの分散特性の関係を調べ,二つのモード間のバンドギャップが消えたまま二つの分散カープが移動するような特性を実現した,このように分散特性を変化させるには,二つのリアクタンスを調整する必要があるが,ここでは一つの誘電体の位置を変えるだけで可能にしたことに特徴がある.これにより透過する波の位相を正から負まで大きく変化する位相可変線路が実現できた.
1920年代後半ロシア演劇における「ファクト」の概念と方法論的展開の考察

本研究は、1920年代後半のロシア演劇におけるテキストによる同時代表象(戯曲)とそれに伴う実践(上演)を、「ファクト」の概念を軸に分析するものである。より具体的には、1917年の社会主義革命からおよそ10年を経て登場した「ソ連の日常」を描く新しい戯曲に対して、革命期に生まれた前衛的な演出手法の関わりとその展開を作家セルゲイ・トレチヤコフの活動を中心に考察する。戯曲と上演演出の関係、また上演計画と検閲の関係を考察・分析し、1920年代後半のロシア演劇における方法論的挫折と展開の可能性を明らかにすることを目指す。
非可換なガロア群を持つ代数体の拡大の計算的研究

ガロア理論とは一言で言えば数の対称性の理論であり、中でも構成的ガロア理論は、狙った対称性を具体的明示的に作ることを主眼とする研究である。特に本研究課題では、非可換な対称性(ガロア群)を持つ場合を取り扱い、幾何的な対称性を利用する手法を中心として、主に5次・6次の多項式に関わる場合に対し、様々な特色ある対称性を持つ多項式を具体的に構成した。得られた多項式が簡潔な表示を持つことも意味があり、それにより幾らかの数論的性質も明らかにすることが出来た。本研究の全体構想は、非可換群をガロア群に持つ拡大(非可換ガロア拡大)について、主に明示的な例の構成や実験的な計算を通じて、様々な方面から具体的な知見を得ることである。特に、Noether問題および複比型Noether問題・簡潔な係数を持つ生成的多項式の構成・生成的多項式の整数環上の性質の探求などに取り組む。複比型ネーター問題からの構成的ガロア理論の研究に関しては、6次の複比型ネーター問題の解決を目指したが容易でなく、次の段階への足掛かりとして従来の結果を整理し見直している段階である。5次の場合については、本方法で単数を根とするA_5多項式が得られるという現象に焦点を当てて、2006年8月に角皆が講演「単数を根とするA_5多項式族」(福岡数論研究集会)により研究成果を発表した。これらに必要な計算機環境の整備と研究を梅垣氏と協力して行なった。5次の複比型ネーター問題で扱う2次元クレモナ群について、やや違う立場から星氏も同集会で講演「3次生成的多項式のチルンハウス変換から生じる2次元クレモナ群のインヴォルーションとその固定体」(福岡数論研究集会)により研究成果(論文[2])を発表した。本方法からも再構成されるBrumer氏によるD-5多項式について、与えられた拡大に対応するパラメタを具体的に計算したり、異なるパラメタに対して得られる拡大がいつ一致するかという問題に関して、陸名氏が部分的な解決を与え、2006年10月に講演「生成的多項式の変換問題について」(室蘭数論研究集会)により発表した。このような代数関数体の拡大を基本的な代数多様体の被覆として考察するという観点からの従来からの研究をまとめて、論文[4][5]として発表するに至った。保型形式側からの研究は都築・森山両氏との協力を中心に行なっているが、上述の問題との具体的な連携に関しては準備段階である。次年度以降にも研究を継続し更に充実させる為、研究補助者を含めた研究態勢の強化を行なっている。ネーター問題の研究では、研究補助者の太田雄介氏と共同で、6次の可能な可移部分群の複比型ネーター問題で残っていた場合のうち、一つを除いて肯定的に解決した。この結果は早稲田大学の橋本喜一朗氏も先んじて得ていたが、別の手法で独立に別の表示を得たものである。また、奇数次の場合には複比型ネーター問題が肯定的なら置換ネーター問題も肯定的であることを示した。一方、6次の全ての可移部分群について複比の体と差の比の体の夫々の固定体の間の相対拡大が非有理的なことを、研究補助者の渡邊雅則氏と共同で示した。また星氏が、或る種の2次のクレモナ変換の研究を進めた他、台湾の康明昌氏と共同で、置換作用を指標で捻った形の線型ネーター問題について進展を得た。生成的多項式の研究では、陸名氏が、Mestre-Brumerの5次二面体群多項式の同型類が或る楕円曲線の弱Mordell-Weil群によって分類されることを楕円曲線の数論と結び付けて示した。また小松氏が、或る種の生成的巡回多項式の分解体での素数の分解法則を記述した他、結び目理論や代数的組合せ論に現れる重要な多項式の数論的性質に応用した。正種数のGrothendieck dessinの研究では、種数1で6次以下の多くの場合と7次の一部の場合に、小松氏や研究補助者の倉繁章氏と共同で、曲線とBelyi射の方程式を計算しガロア軌道の決定やグラフとの対応付けを行なった。保型が式側からの研究は都築・森山両氏が中心であるが、上述の問題との具体的連携には至っていない。研究補助者の大学院生との共同研究では、必要な計算機環境の整備と研究には梅垣氏の協力を得た。その一部は修士論文になっているが、更に進めて原著論文として発表する予定である。ネーター問題の研究では、6次の可解な可移部分群の複比型ネーター問題で未解決だった場合を早稲田大学の橋本喜一朗氏の共同研究で肯定的に解決した。

また、複比型ネーター問題と置換ネーター問題とを結び付けるのに重要な、置換群の固定体の間への相対的有理性の降下の問題について、従来の研究を見直して計算が簡明になった他、例えば、次数が2冪の場合には、全ての可移部分群について複比の体と差の比の体の夫々の固定体の間の拡大が相対的に非有理なことを示した。これらの進展を含めて原著論文として発表すべく準備中である。正種数のGrothendieck dessinの研究は、本年度は従来得た結果を整理するに留まっている。連携研究者・研究協力者が中心となって進めた部分では、3次元の単項的作用による固定体の有理性に関して未解決であった場合が、星・陸名両氏により解決され出版に至った他、3次・5次の生成的多項式に関する共通部分体問題などについて、星氏が早稲田大学の三宅克哉氏との共同研究により得た結果を、原著論文として発表すべく準備中である。小松氏は、生成的多項式の数論に関する研究で得られた技術を活用して、アソシエーションスキーム理論や結び目理論など、他分野における重要な多項式の数論的性質を研究し出版に至った。梅垣氏は、有限体上の種数2の曲線の同型類について研究を進めており、5次式・6次式の数論との関連を期待している。保型形式側からの研究は都築・森山両氏が中心であるが、上述の問題との具体的連携には至っていない。本年度は、研究補助者として共に取組む大学院生を含めた研究態勢が取れず、研究の進展が停滞気味であった。来たる平成21年度ではこの研究態勢作りも重要な課題となる。連携研究者:梅垣敦紀:早稲田大学・高等研究所・准教授森山知則:大阪大学・大学院理学研究科・准教授陸名雄一:早稲田大学・理工学術院・助教(当該年度)星明考:立教大学・理学部・助教主な研究協力者:小松亨:上智大学・共同研究員(当該年度)ネーター問題の研究では、6次の可移部分群の複比型ネーター問題について、昨年度までに肯定的に解決した可解部分群の場合に続き、非可解部分群の場合に取組んだが、予想以上に困難で結果を得るには至らなかった。また、定数項が±1で各係数が助変数の整係数多項式である単多項式(単数を根とする多項式)の族の構成について部分的な結果を得たが、原著論文として発表するには更に進展が必要である。また、岡山大学の中村博昭氏・京都大学の安田正大氏との共同研究では、古典的な方程式論で重要な4次多項式の3次分解式を現代的な立場から見直し、4次アフィン空間から3次アフィン空間への射(Ferrari射)と見ることで、絶対ガロア群のGrothendieck-Teichmuellerパラメータの関係を得たので、この考えを更に進めて、5次多項式の6次分解式(Cayley-Weberの分解式)について、類似の議論を試みたが、困難な点が多くあることが分かり、今後の課題となっている。連携研究者・研究協力者を中心として進めた部分では、星氏が早稲田大学の三宅克哉氏や京都大学の北山秀隆・山崎愛一両氏との共同研究などにより、生成的多項式の同型問題及び(共通)部分体問題・同型問題に付随するThue方程式族とその整数解・有理関数体への有限群作用による固定体の有理性などに取組み、結果の出版に至った。小松氏は、1の冪根を含まない場合へのKummer理論の拡張を整備し、引続きガロア群が非可換な場合への拡張を試みた。陸名氏は、5次二面体群をガロア群とする多項式族に対するBrumer化の手法を応用して、古典的なKlein等の結果に較べて遥かに簡潔な「根の公式」の明示的な記述に成功し、更にその改良・応用について考察を進めている。本年度は、個々の研究はあったものの、研究グループとしての研究の進展が停滞気味であった。
一分子分光による相分離した液滴中タンパク質の構造揺らぎ追跡

タンパク質や核酸を含む溶液は、条件を整えると液-液相分離し、濃い相は液滴となって分散する。細胞内にも液滴があり、様々な過程に関わっている。液-液相分離を起こすタンパク質であるLAF1-RGGドメインを蛍光色素で二重標識し、これに対して二種類の装置を用いて蛍光分光測定を試みる。一つは独自開発した高時間分解能一分子FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)測定装置であり、マイクロ秒時間分解能でタンパク質の構造変化をとらえることができる。もう一つは新規開発する顕微分光装置である。新規装置では液滴のFRET効率や、蛍光スペクトルを測定することができるようになる計画である。
脳障害修復におけるアポE遺伝子の発現制御機構

脳に傷害がおこると、アストログリア細胞が反応してapoEの合成が高まりHDL粒子として放出される。我々は、これが傷害の修復に重要な役割を果たすこと、またapoE-HDL産生/放出は、脳の傷害によりアストログリア自身が合成/放出するFGF-1によるオートクリン/パラクリン反応により刺激されることを示した。アストログリアではFGF-1の刺激は、コレステロールの合成にはMEK/ERK、apoE-HDLの細胞内輸送と分泌にはPI3K/Aktでそれぞれ伝えられ、apoEの転写促進にはさらに独立の情報伝達系の関与が示唆される。本研究では、アストロサイトにおけるFGF-1によるapoE遺伝子の制御機構について、FGF-1は、LXR発現及びLXR ligand生合成によって、apoE発現を誘導することを解明した。脳の傷害による損傷を修復するために、アストロサイトによるapoE-HDLの産生放出は重要な役割を果たしている。アストロサイトにおけるFGF-1によるapoE遺伝子の制御機構を解明することは、脳障害修復機構とその促進技術開発へ重要な意義をもっている。我々は以前、脳の損傷部周辺のアストロサイトはFGF-1を産生放出し、そのautocrine作用によりapoE-HDL産生を著明に高める。さらにFGF-1はMEK/ERK pathwayを活性化することによりコレステロール生合成を促進し、Akt pathwayを活性化することによりapoE-HDL分泌を促進することを示した。これに基づき、アストロサイトにおけるFGF-1によるapoE遺伝子の制御機構を研究課題として取り組んだ。実施した研究内容と成果;RatapoE promoterをクローニングし、FGF-1受容体からの情報伝達に関連した転写因子反応部位を標的にFGF-1によるapoE promoterの転写活性を調べた。まず、FGF-1によるLXRα及びapoE mRNA levelはtime-dependentに増加し、FGFR1 inhibitorによって、LXRα及びapoE mRNA level完全に抑制されるが、MEK/ERK inhibitorによって部分的抑制され、PI3K/Akt pathwayinhibitorでは影響ないことを明らかにした。siRNA法で、FGF-1誘導したapoEの発現はLXRαdependentであることを証明した。次に、rat apoE gene promoterをクローニングし、六つのreporter gene constructionを作成し、luciferase assayを行って、FGF-1に反応するapoE promoter領域を同定し、これがLXR reactive element (LXRE)であることを証明した。さらに、Chip assay実験で、FGF-1は、rat astrocyteにおいて、内因性apoE promoterのLXREとLXRのassociationを促進することを証明した。ここまでの実験結果は、FGF-1はLXRαを活性化し、apoE promoter領域にあるLXREとのinteractionを介して、apoE geneの発現をenchanceすることを示した。当該年度は、私たちは、(1)FGF-1によりLXR ligandのproductionについて調べた。結果としては、FGF-1はcholesterol生合成を促進し、HMG-CoA reductase geneの発現を促進する。FGF-1はSRE-reporter assaysystemを活性化することから、これらの促進は、SRE binding protein systemによるものと考えられる。さらに、FGF-1は25-hydroxycholesterolへの転換を促進することを証明した。これらのFGF-1の一連の効果はすべてMEK/ERK inhibitorによってblockされた。これらの結果から、FGF-1はLXR ligandであり25-hydroxycholesterolを増加させ、apoE gene発現を促進することを考えられる。(2)FGF-1のapoE転写の促進は、PI3K/Akt inhibitorとMEK/ERK inhibitorに影響されないことを報告した。これらのinhibitorがある条件下で、FGF-1に対するapoE reporter geneのresponseを調べた。FGF-1は転写を活性化しますが、FGFR1 inhibitorによって、その活性化はcancelされた。Akt inhibitorは全然影響ないが、MEK/ERK inhibitorでは、その活性化を部分的抑制した。LXREを含んでいないreporter geneでは、これらのresponseは消失した。まとめると、アストロサイトにおけるFGF-1によるapoE遺伝子の制御機構について、FGF-1は、LXR発現及びLXR ligand生合成によって、apoE発現を誘導することを解明した。
神経系成立の基盤としてのSOX因子群の制御と相互作用

神経系原基(神経板)は脊椎動物胚で最初につくられる体細胞組織である。その成立に対応して発現されるSox2遺伝子が、神経系原基の領域ごとに異なったエンハンサーよって制御されることに注目して、個々のエンハンサーの活性化機構を研究した。その結果、神経板は、前部、中間部、後部で全く異なった制御機構に基づいて形成されること、特に後部神経板は、沿軸中胚葉組織と共通の前駆体から生ずることが明らかになった。中胚葉から分離した後の外胚葉から神経板が誘導されるという、古典的なモデルは否定される。SOX2は、POU因子と相互作用しながら、神経系原基形成に関与する多くの遺伝子を制御していることを示した。脊椎動物の初期胚でおきるめざましい細胞分化は神経系原基である神経板の形成である。神経板の形成はSox2遺伝子の活性化を伴い、そして、Sox2の発現は成体の神経幹細胞にまでひきつがれる。これまでの研究で、神経系の発生のさまざまな領域や発生時期特異的にSox2遺伝子を制御する多数のエンハンサーを同定してきたが、これらのエンハンサーは、エンハンサーごとに異なった細胞間シグナルに応答する転写制御因子の結合配列を持っており、これらのエンハンサーの制御を明らかにすれば、同時に神経板の生成と領域化の機構も解明できる。Sox2エンハンサーのうちN-1とN-2は、最も初期から、神経板の後部と前部で活性をもち、神経誘導の過程にかかわると考えられる。エンハンサーN-1は、ノード(オーガナイザー)に近接した近位原条領域から分泌されるWnt8cとFGF8bによって活性化されるのに対し、エンハンサーN-2はWnt非依存的で、胚盤葉下層からのシグナルによって活性化される。このことから、前部神経板と後部神経板とでは異なったシグナル機構によって神経板が誘導されることが明らかになった。これらのエンハンサーが作用した後にさらに、N-3、N-4、N-5などのより領域特性を持ったエンハンサーが作用する。エンハンサーN-1の活性は、神経系と中胚葉の分離機構にもかかわっている。エンハンサーN-1のE領域に突然変異を導入すると、エンハンサーN-1は神経系前駆体だけでなく、中胚葉前駆体でも活性を示すようになる。エンハンサーN-1のE領域を介した抑制機構によって、Sox2が中胚葉で発現して中胚葉を神経化する作用を遮断している。脊椎動物の初期胚における大規模な細胞分化・形態形成過程である神経系原基(神経板)の形成は、転写制御因子遺伝子Sox2の発現を伴う。その過程におけるSox2遺伝子の制御を分析することによって神経系成立の基盤となる機構を明らかにする。Sox2遺伝子は領域特異性や発生時期特異性を異にする多数のエンハンサーによって制御されることを明らかにしたが、特に神経板形成期に作用する4つのエンハンサーN-1,N-2,N-3,N-4に関する研究をすすめた。FGF, Wntシグナルによって活性化されるエンハンサーN-1は、同時に神経系と中胚葉の共通の前駆体である「ステムゾーン」を標識することがわかった。Wnt3aノックアウトマウスではステムゾーンの調節の異常によって、中胚葉組織内でのSox2発現がおきる。神経板前部の成立と対応して活性化されるエンハンサーN-2は、Ofx2とPOU因子の共存によって活性化される。Ofx2の発現が胚盤葉下層からの分泌因子に依存するために、エンハンサーN-2の活性化は胚盤葉下層による制御をうける。視覚系の発生におけるSox2の発現を制御するエンハンサーN-3は、Pax6との相互作用に依存するSox2の自己活性化機構を担っている。感覚器前駆体と中枢神経系の双方に活性をもつエンハンサーN-4は2組織で共有される制御と、個々に固有の制御の複合によって活性をもつことが明らかになった。マウスの遺伝子操作によって、これらのエンハンサーの各々を欠失できるマウスを作製した。その過程におけるSox2遺伝子の制御を分析することによって神経系成立の基盤となる機構を、本研究によって明らかにする。特に神経板形成期に作用する4つのSox2遺伝子のエンハンサーN-1,N-2,N-3,N-4の研究を中心において研究する。エンハンサーN-2はマウス胚の胚盤葉上層から神経板前部にかけてのSox2遺伝子の活性化を担うことを確認した:エンハンサーN-2ノックアウトマウスでは、それらの組織に限ってSox2の発現の活性化がおきない。

エンハンサーN-2の活性化に関与する制御エレメント群の中には、POU結合配列とOTX結合配列が見出された。各発生ステージでのPOU因子(Oct3/4)、OTX因子(Otx2)のN-2活性化への関与を分析した結果、胚盤葉上層では、このエンハンサーの活性がOct3/4に強く依存するのに対して、神経板前部では、N-2エンハンサーはOct2依存的に活性化されるようになった。この主要な転写制御因子の切換えが、胚盤葉上層から神経板への発生の進行と対応している。中胚葉原基から神経管を生ずるWnt3a、T(Brachyury)、およびTbx6遺伝子の欠損マウス胚において、Sox2が異所的に発現されることを見出した。これがエンハンサーN-1の活性化によるものである可能性を検討している。エンハンサーN-1ノックアウトマウス胚では、神経板後端でのSox2の活性化が起きていなかった。この胚での中胚葉組織の産出を解析中である。エンハンサーN-4のノックアウトマウスは小眼であった。初期胚の頭部外胚葉におけるSox2発現の低下が、正常よりも小さな水晶体を発生させて、それが小眼の発生の起源であると考えられる。脊椎動物の初期胚における大規模な細胞分化・形態形成過程である神経系原基(神経板)の形成は、転写制御因子遺伝子Sox2の発現を伴う。その過程におけるSox2遺伝子の制御を分析することによって神経系成立の基盤となる機構を、本研究によって明らかにする。特に神経板形成期に作用するSox2遺伝子のエンハンサーの制御機構から、神経板の領域毎、あるいは神経板形成の段階毎の転写制御機構、そして更にその上流の細胞間シグナルについて研究する。平成20年度は特に初期胚で活性を持つ2つのエンハンサー、すなわち、マウス胚の胚盤葉上層から前部神経板にかけての発生段階でSox2遺伝子の活性化を担うエンハンサーN-2と、後部神経板と中胚葉の共通の前駆体で活性を持つN-1について研究を進めた。エンハンサーN-2は、胚盤葉上層では、Zic2/3と複数箇所に結合するOct3/4の協同的な作用によって活性化されるが、前部神経板では、POU因子のOct3/4(Class V)からOct6/Brn2(Class III)への切換わりとともに、エンハンサーN-2の活性化がOtx2依存的になる。初期胚におけるClassIII POU因子とOtx2の発現はこのN-2の制御の進行と対応して変化する。正常マウス胚では、後部神経板と中胚葉の共通の前駆体(ステムゾーン)でひとたび活性を持ったエンハンサーN-1は、中胚葉組織ではその活性を失う。しかし、中胚葉組織である体節前駆体から異所的に神経管が生み出されるTbx6ノックアウトマウスでは、エンハンサーN-1が中胚葉で活性を持ち続け、それが中胚葉原基でのSox2の発現を活性化し、その結果異所的な神経管が生み出される。このマウス胚でエンハンサーN-1をノックアウトすると、異所神経管は生じなくなる。同様に中胚葉原基から神経管を生ずるWnt3a、Tの欠損マウス胚においても、エンハンサーN-1の制御異常が異所神経管の原因となっている。エンハンサーN-1の制御が、後部神経板と中胚葉という2つの組織分化の分岐に中心的な役割を果たしている。神経板形成の機構は胚の前部と後部で大幅に異なり、それがSox2遺伝子を制御するエンハンサーの領域特異性に反映されている。