hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エルシニア感染に対する病原性プラスミドの役割と宿主免疫応答について

Yersinia enterocolitica(エルシニア)の感染成立と宿主免疫応答には、病原性プラスミドが深く関与する。さらには、プラスミドにコードされ分泌される種々のYersinia Outermembrane Protein(Yop)は、宿主側に病原性をおこす因子であると同時に、Interferon-γ(IFN-γ)等のサイトカインを産生し、I型helper T細胞(Th1細胞)への分化、誘導する因子も担っていることが予想される。本研究は、エルシニアに対する宿主免疫応答と病原性プラスミドの関係についてサイトカイン誘導能、感染抵抗性の観点から研究を行うことを目的とした。本研究によって得られた新たな知見をまとめると、1、病原性プラスミド保有株(P+株)をマウスに生菌免疫(10^3 cfu)を行うと強いTh1が誘導される(死菌免疫では誘導されない)。2、プラスミドを保有していない株(P-株)をP+株と同じ菌数で生菌免疫した場合は、Th1の誘導は弱い。3、P+株もしくはP-株で生菌免疫したマウス脾細胞をin vitroにおいて加熱死菌抗原を用いて刺激し、培養上清中に分泌されるIFN-γの産生量と産生細胞数を測定すると、P+株で免疫した場合に大量の産生量と産生細胞数が見られた。4、3においての主要な免疫担当細胞を検討するため、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカインの検出を行ったところ、P+株において誘導されるTh1は抗原特異的なCD4^+T細胞とNKもしくはNKT細胞が産生していることが明らかとなった。しかし、その他にも多数のIFN-γ産生陽性細胞の集団が確認された。最近、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞(APC)が大量のIFN-γを産生するとの知見が得られているため、この陽性細胞集団もAPCの可能性が考えられ、今後明らかにしていく必要があると思われた。Yersinia enterocolitica(以下エルシニア)は病原性を規定する70kbの病原性プラスミドを保有する。この病原性プラスミド保有の有無が、感染後における宿主防御免疫の誘導にどの様な違いとして現れるかを明らかにするため、病原性プラスミド保有株(P+株)とプラスミドを欠損させた非病原性株(P-株)を用いてC57BL/6マウスに生菌免疫し、菌が完全に排除された14日後に再度致死量による攻撃感染を行った。そして、攻撃感染2日後の肝脾内生菌数より宿主の防御免疫機構について検討したところ、P+株を免疫した場合に強く防御能が誘導されることが明らかとなった。このP+株免疫による防御免疫の誘導が、抗原特異的なI型helper T細胞(TH I)によるものかどうかを検討するため、エルシニアを生菌免疫したマウスの脾細胞を加熱死菌抗原で刺激して培養上清中のinterferon-γ(IFN-γ)をELISA&ELISPOT assayにて検討したところ、IFN-γの産生細胞と産生量はともにP+株で免疫した場合で強く誘導された。また、各株で免疫したマウスのT細胞を移入した実験においても、P+株で免疫した細胞を移入した場合、致死量のエルシニアP+で感染すると強い防御反応が見られた。しかし、免疫マウスの血清を移入した場合では防御免疫な誘導されなかった。これらの結果より、エルシニアの持つ病原性プラスミドは、その菌の排除の過程でTH1を誘導すると推測された。今回の我々の研究において、エルシニア感染によって強い細胞性免疫が誘導されることを明らかにすることができた。今後は、病原性プラスミドがコードするいくつかのYoP (Yersinia outermembrane protein)が宿主側の防御免疫の方向性を規定している可能性があるため、ミュータント株を作製し検討する予定である。

最近、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞(APC)が大量のIFN-γを産生するとの知見が得られているため、この陽性細胞集団もAPCの可能性が考えられ、今後明らかにしていく必要があると思われた。
テロメアＤＮＡ変性過程の発光解析

円偏光発光を利用することでDNA四重鎖の極めて速いタイムスケールで誘起される超分子構造変化をリアルタイム追跡することを目的に研究した。その結果、DNA二重鎖と四重鎖とを識別する新規プローブの開発に成功した。また、これに関連して高い円偏光高度を有するキラル希土類錯体の開発、円偏光によるタンパクの識別、新規レシオメトリックセンサーを開発した。本申請研究の目的は円偏光発光(CPL)を利用して、ヒトテロメア末端で形成されるDNA四重鎖の超分子構造変化をリアルタイムに追跡することである。具体的にはグアニン四量体に相互作用した超分子発光プローブ(レポート分子)の円偏光発光(CPL)を測定する。この円偏光発光は発光プローブがキラルな超分子構造であるグアニン四量体と相互作用することで誘起される。本年度はDNA四重鎖の超分子構造変化をリアルタイムに追跡するためのプローブ開発を行なった。具体的には、亜鉛イオンと相互作用することで4量体を形成するカルバゾール誘導体の水溶化を試みた。同時にキラル物質と相互作用することで大きな左右円偏光強度差を生じることが知られているユーロピウム錯体にも着目し、DNA四重鎖と相互作用するユーロピウム錯体の合成を行なった。DNAとの相互作用部位としてビピリジン誘導体を、水溶性部位としてグリコール酸を有するユーロピウム錯体を分子設計し合成を行なった。その結果、このユーロピウム錯体が水系溶媒に対して高い溶解性を有し、水系溶媒中において高い発光量子収率を示すことを明らかにした。また円偏光発光(CPL)を測定する円偏光発光顕微鏡についても改良を行なった。具体的には溶液中でのDNA四重鎖のダイナミックな反応過程を追跡するために、円偏光発光顕微鏡にマイクロ流路系を組み合わせた測定系を構築している。この装置系の有用性を確かめるために有機溶媒中におけるキラルユーロピウム錯体の生成過程の追跡を行なっている。これまでにレポート分子として、発光性もユーロピウム錯体の合成を試みてきた。しかしながら、これらのユーロピウム錯体は水系の溶媒に対して溶解性が低いことが問題であった。本年度はこの点を解決するために、水系の溶媒に対して溶解性を有するユーロピウム錯体の合成を行なった。光増感部位としてスクシンイミド基を2つ有するビピリジンを合成した。錯体に水への溶解性を与える配位子としてグリコール酸を配位子として用いた。有機溶媒中におけるユーロピウムイオンと配位子との滴定実験から、ユーロピウムイオン2つに対してビピリジン配位子が1分子、グリコール酸が3分子配位した錯体が自発的に形成されることがわかった。このユーロピウム錯体は水に対して高い水溶性を示し、水中において高い発光量子収率を示した。またこの実験の過程で、ユーロピウム錯体に由来する発光スペクトル形状が、溶液の温度変化に対して等発光点をもって変化することを見いだした。このスペクトル形状変化は10°Cから60°Cの温度変化に対して高い可逆性を示した。このユーロピウム錯体が溶液の温度変化を発光スペクトルの形状変化によって計測することの出来る新規レシオメトリック温度センサーとして機能することを明らかにした(Chem. Commun., (2014), DOI:10.1039/c4cc00704b.)。本申請研究の目的は円偏光発光を利用することでDNA四重鎖の極めて速いタイムスケールで誘起される超分子構造変化をリアルタイム追跡することである。超分子構造の観点からヒトテロメア末端構造であるDNA四重鎖の持つ安定性の本質を分子レベルで明らかにし、ヒトテロメア末端構造の安定化を基盤とするテロメラーゼ阻害剤の開発に関わる有用な知見を得ることを目的に研究を行った。本年度は、研究計画に基づきDNA四重鎖を識別することの出来るプローブ分子の開発を行なった(後述)。DNA結合分子としてπ系の発光性分子であるカルバゾールに三重結合を介して2つのイミダゾリニームイオンを結合させた配位子(Im+)2Cz及びその他4種類の誘導体を合成した。このIm+2CzはDNAオリゴマーと静電的な相互作用によってDNAと複合体を形成する。Im+2CzはDNA四重鎖の場合は一段階で複合体を、DNA2重鎖の場合は段階的な複合体形成によって2種類の複合体を構築する。このような複合体形成の様式からDNA四重鎖とDNA二重鎖とを区別して識別することができた。またDNA2重鎖とIm+2Czとの2種類の複合体はDNAaseなどのDNAを加水分解する酵素に対する活性や変性温度が異なることを明らかにした。

このようにプローブ分子との段階的な複合体形成によってDNA二重鎖の酵素活性や熱安定性を制御することが出来た。(Chem. Eur. J. 2013 in press)。円偏光を測定できる円偏光顕微分光システムが既に完成しているので、得られた希土類標識タンパクを効率良く測定することが出来る。一方で上述のように、DNA四重鎖と相互作用するプローブの水溶化が課題となる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究の目的は円偏光発光を利用することでDNA四重鎖の極めて速いタイムスケールで誘起される超分子構造変化をリアルタイム追跡することである。超分子構造の観点からヒトテロメア末端構造であるDNA四重鎖の持つ安定性の本質を分子レベルで明らかにし、ヒトテロメア末端構造の安定化を基盤とするテロメラーゼ阻害剤の開発に関わる有用な知見を得ることを目的に研究を行っている。具体的にはグアニン四量体に相互作用した超分子発光プローブ(レポート分子)の円偏光発光(CPL)を測定する。この円偏光発光は発光プローブがキラルな超分子構造であるグアニン四量体と相互作用することで誘起される。円偏光発光からは左右円偏光成分の発光強度差から与えられる物理量、g値を正確に求めることができる。g値は超分子発光プローブの光反応におけるキラリティー変化を明確に反映するため、DNA四重鎖の超分子構造変化に対して極めて敏感である。この発光プローブからレポートされるg値の経時変化を測定することでDNA四重鎖の超分子構造変化をリアルタイムに追跡する。そのため平成24年度までの研究では主にDNA四重鎖と相互作用するDNA結合プローブの開発に取り組んできた。π系の発光性分子であるカルバゾールに三重結合を介して2つのイミダゾリニームイオンを結合させた配位子(Im+)2Cz及びその他4種類の誘導体を合成した。このIm+2CzはDNAオリゴマーと静電的な相互作用によってDNAと複合体を形成する。Im+2CzはDNA四重鎖の場合は一段階で複合体を、DNA2重鎖の場合は段階的な複合体形成によって2種類の複合体を構築し、NA四重鎖とDNA二重鎖とを区別して識別することができるプローブとして機能することを明らかにした。以上のことから、本研究は概ね計画通りに進行している。上述のように、希土類錯体の水溶化が今後の大きな課題となる。その解決策として希土類の配位子として水溶性配位子(グリコール酸)を含む錯体やπ系分子に水溶性置換基を有するプローブを分子設計し、システマテックに合成評価を行なう。今後の研究の推進方向としては、当初の計画に基づいて迅速に研究を推進する。具体的には発光を評価するための円偏光発光顕微鏡システムの改良を行なう。具体的には、円偏光発光顕微鏡システムに対応出来る特殊な温度制御システムを導入することで円偏光発光の温度依存性を測定する。これにより、Folding及びUnfold状態における円偏光発光の違いを測定し、DNA四重鎖の構造安定性と得られる円偏光発光との相関を明らかにする。
内在性神経伝達物質受容体の選択的ケミカルラベルと時空間機能解析

AMPA受容体を選択的に蛍光標識するために新規化合物CAM reagentを設計および合成した。この化合物を培養神経細胞に添加した結果、複数のタンパク質が共存する中でAMPA受容体を選択的に化学修飾できることを見出した。化学修飾したAMPA受容体は本来のイオンチャネル活性を保持しており、受容体機能を損なうことなく標識できることを実証した。また、標識したAMPA受容体の神経細胞における動態をイメージング解析した結果、細胞膜上で高い拡散性を有する受容体の割合が従来考えられているよりもはるかに少ないことを初めて見出した。CAM reagentを脳組織のAMPA受容体の蛍光標識へと適用した結果、脳組織内のAMPA受容体に対しても選択的な蛍光標識反応が進行し、組織を損傷させることなく受容体蛍光標識できることを見出した。また、蛍光イメージング解析の結果からは小分子化合物であるCAM reagentが高い組織浸透性を有することが示された。さらに本手法を用いることで脳組織内在性AMPA受容体の動態解析に世界で初めて成功した。さらに、AMPA受容体の蛍光標識法をリガンドセンシング手法へと応用展開した。CAM reagentでAMPA受容体を蛍光標識しそこにリガンドとしてグルタミン酸を添加すると顕著な蛍光変化が見られ、蛍光標識した受容体がリガンドを蛍光検出するセンサーとして機能することが示された。リガンドに対する蛍光変化のパターンや大きさは修飾する蛍光色素の種類に大きく依存し、リガンドの機能を識別できるセンサーや高S/Nのセンサーの構築に成功した。さらにこれらのリガンドに対する蛍光変化はAMPA受容体表面に存在するトリプトファン(消光性アミノ酸)と修飾された蛍光分子の空間配置に大きく依存することを突き止めた。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳内においてグルタミン酸は興奮性の神経伝達物質として知られており、神経細胞はそれを受け取り電気信号へと変換するグルタミン酸駆受容体が複種類発現している。その中でもAMPA型グルタミン酸受容体は速い興奮性神経伝達の主な担い手である。さらにAMPA受容体は脳内記憶の増強や減弱に深く関わり、記憶の増強減弱の際にAMPA受容体の膜上ダイナミクスは大きく変化することが知られている。そのためこのAMPA受容体を可視化しその動態を解析することは、記憶の分子メカニズムの解明に非常に重要である。従来AMPA受容体を可視化する際には蛍光タンパク質を遺伝子工学的に融合させる方法が取られてきたが、この方法では外来性のAMPA受容体を過剰発現させてしまい神経細胞の恒常性とAMPA受容体の正常な動態をかき乱してしまう問題があった。そこで、本研究では遺伝子工学を全く使用することなく、化合物のみを利用してAMPA受容体だけを特異的に蛍光標識する技術開発を行なっている。遺伝子工学に依存しないため、神経細胞がもともと有している内在性のAMPA受容体を特異的に蛍光標識し、真の動態を解明することが可能である。すでに培養神経細胞だけでなく、脳組織においても特異的にAMPA受容体を蛍光標識できることを見出しており、さらにその動態を詳細に解析すると、従来提唱されてきたのとは大きく異なる、本来のAMPA受容体のダイナミクスを解明することに成功した。この研究は今後、神経科学研究における革命的な技術として用いられるだけでなく、医薬創生にも大きく貢献することが期待される。神経伝達物質受容体の特異的な蛍光標識技術の開発に取り組み、培養神経細胞だけでなく脳組織に対しても適用可能なことを見出している。また、この技術を用いることで既存の遺伝子工学的な蛍光標識法では不可能であった内在性受容体の動態を解析することに成功した。本手法を用いることで未知の生命現象の解明や難病の治療に役立つことが期待される。神経伝達物質受容体を化学的な手法で蛍光標識し、その本来の動態を解析するという難題であるが、精力的にこの研究に取り組むことで培養神経細胞だけでなく脳組織においても標的だけを特異的に蛍光標識し動態解析できるところまで研究を展開させた。

さらにこれらのリガンドに対する蛍光変化はAMPA受容体表面に存在するトリプトファン(消光性アミノ酸)と修飾された蛍光分子の空間配置に大きく依存することを突き止めた。培養神経細胞のみならず脳組織においても本系が機能することが明らかとなった。これは当初全く予期していなかった優れた成果である。これまで培養神経細胞や脳組織において本ケミカルバイオロジー的アプローチを適用できることを示してきた。今後は人の体内に化合物を打ち込むだけで、その脳内の神経伝達物質が蛍光標識できるところまで研究を発展させたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。本系の適用範囲を動物固体にまで拡張し、有用性を強く示す。この手法でしか解明できない複雑な神経機能を明らかにする。
新たな抗ウイルス戦略をめざしたヘルペスウイルス感染最初期過程の解析

本研究の目的は、HSV(HSV:herpes simplex virus)およびEBV(EBV:Epstein-Barr virus)感染直後に発現する制御因子およびウイルス特異プロテインキナーゼ(PK)の機能発現機構を解析し、新たな抗ウイルス剤開発や抗ウイルス戦略構築に向けての基礎的な知見を蓄積することにある。我々は本研究班において、EBVによるB細胞の不死化に大きな役割を果たしているEBNA-LPの機能が、EBV PKであるBGLF4によるSer-35のリン酸化によって制御されうることを明らかにしている。しかし、EBNA-LPは潜伏感染期に発現するのに対し、BGLF4は溶解感染期に発現することから、BGLF4が実際に感染細胞内でEBNA-LPを標的としているかは不明であった。本年度我々は、BGLF4がウイルス粒子中に存在し、生理学条件下においてカプシドよりリリースされることを明らかにした。また、BGLF4のカプシドからのリリースはリン酸化依存的であった。以上の結果は、EBVがB細胞に感染した際、BGLF4はウイルス粒子と共に細胞内に運び込まれた後、自己リン酸化依存的に細胞内にリリースされ、感染直後に発現するウイルス因子EBNA-LPのSer-35をリン酸化することを示唆している。HSVのPKであるUL13のノックアウトウイルスの解析から、UL13の機能の1つはICP0やUL41といった様々なウイルス因子の発現を制御していることが明らかにされている。しかし、UL13はウイルス特異PKとして機能するだけでなく、EBV BGLF4同様にウイルス粒子構成タンパク質としても機能している。よって、UL13ノックアウトウイルスで得られる知見が、UL13のPK活性の消失によるものか、PK以外の機能の欠失によるものかは不明であった。今年度我々は、UL13のinvariant lysine (Lys-176)に点変異を導入した組み換えHSV(YK403)を構築した。YK403は野生体と同様にUL13タンパク質を発現するが、PK活性を消失していた。興味深いことに、YK403感染細胞においては、UL13ノックアウトウイルス感染細胞で観察されるICP0やUL41といったウイルス因子の発現低下が観察されなかった。以上の結果は、UL13のPK活性は、ウイルス因子の発現制御には関与していないことを示している。つまり、UL13は、PK以外の未同定な機能を有し、その機能がウイルス因子の発現制御をしていることが明らかとなった。本研究の目的は、HSV(herpes simplex virus)およびEBV(Epstein-Barr virus)感染直後に発現する制御因子およびウイルス特異プロテインキナーゼの機能発現機構を解析し、新たな抗ウイルス剤開発や抗ウイルス戦略構築に向けての基礎的な知見を蓄積することにある。今年度は、EBNA-LPが発現することによって引き起こされる宿主細胞の変化を、マイクロアレイによって網羅的に解析し、EBNA-LPの新規機能の解明を試みた。結果は以下の通りである。(i)レトロウイルスベクターを用いて、EBNA-LPを安定に発現するB細胞株およびコントロールの細胞株を樹立した。コントロールの細胞株およびEBNA-LP発現B細胞株5クローンを混ぜたものよりRNAを抽出し、マイクロアレイに供した。(ii)13,440個のヒト遺伝子をスクリーニングした結果、EBNA-LPの発現によって14個の宿主細胞遺伝子の発現が有意に変化することが明らかになった。その中で、最も発現が増強されたTARC遺伝子に焦点をあてた。TARC遺伝子は、Th2 typeのT細胞を特異的に遊走させるケモカインをコードしている。(iii)Northern解析およびELISA解析の結果、TARC遺伝子の発現が、転写およびタンパク質レベルでEBNA-LPによって増強されることを確認した。また、EBVをB細胞に感染させると、TARCの発現が増強することが明らかになった。(iv)幾つかのEBV陽性B細胞株について、TARCの発現を解析した。その結果、各細胞株のTARCの発現量は、機能的なEBNA-LPの発現と相関していた。以上の結果より、EBVがB細胞に感染するとケモカインTARCの発現が誘導され、その責任ウイルス因子はEBNA-LPであることが明らかになった。前述のように、TARCはTh2 T細胞を特異的に遊走させるケモカインである。Th2 T細胞は、B細胞を活性化するサイトカインを産生する。また、Th2 T細胞が産生するサイトカインは細胞性免疫に主要な役割を果たすTh1 T細胞を抑制することが知られている。EBV感染細胞においてEBNA-LPがTARCを誘導することによってTh2 T細胞が引き寄せられ、間接的に感染B細胞の増殖が刺激され、さらに、Th1 T細胞を抑制することによって感染細胞が宿主の細胞性免疫より回避されることが想像される。

しかし、EBNA-LPは潜伏感染期に発現するのに対し、BGLF4は溶解感染期に発現することから、BGLF4が実際に感染細胞内でEBNA-LPを標的としているかは不明であった。本年度我々は、BGLF4がウイルス粒子中に存在し、生理学条件下においてカプシドよりリリースされることを明らかにした。また、BGLF4のカプシドからのリリースはリン酸化依存的であった。以上の結果は、EBVがB細胞に感染した際、BGLF4はウイルス粒子と共に細胞内に運び込まれた後、自己リン酸化依存的に細胞内にリリースされ、感染直後に発現するウイルス因子EBNA-LPのSer-35をリン酸化することを示唆している。HSVのPKであるUL13のノックアウトウイルスの解析から、UL13の機能の1つはICP0やUL41といった様々なウイルス因子の発現を制御していることが明らかにされている。しかし、UL13はウイルス特異PKとして機能するだけでなく、EBV BGLF4同様にウイルス粒子構成タンパク質としても機能している。よって、UL13ノックアウトウイルスで得られる知見が、UL13のPK活性の消失によるものか、PK以外の機能の欠失によるものかは不明であった。今年度我々は、UL13のinvariant lysine (Lys-176)に点変異を導入した組み換えHSV(YK403)を構築した。YK403は野生体と同様にUL13タンパク質を発現するが、PK活性を消失していた。興味深いことに、YK403感染細胞においては、UL13ノックアウトウイルス感染細胞で観察されるICP0やUL41といったウイルス因子の発現低下が観察されなかった。以上の結果は、UL13のPK活性は、ウイルス因子の発現制御には関与していないことを示している。つまり、UL13は、PK以外の未同定な機能を有し、その機能がウイルス因子の発現制御をしていることが明らかとなった。
薬物排出の最終段階を担う新規有機カチオン輸送体の構造と機能及び相互作用

申請者は現在までにMATEのプロトタイプのVibrioParahaemolyticus由来のNorMに関して機能性アミノ酸残基を同定している(J Bacteriol,2005)。NorMの薬物輸送に関与する機能性アミノ酸残基は、膜貫通領域に存在している酸性アミノ酸残基であった。バクテリア由来のMATEトランスポーターのNorMは、ヒトMATE1とタンパク質レベルで23.6%の相同性しかないが、これらの酸性アミノ酸残基のうちの2つはヒト及びマウスのMATE1及びMATE2で保存されていた。以上のことから、哺乳類のMATEにおいてもこれらの酸性アミノ酸残基を含む極性アミノ酸残基が、MATEの基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構に直接関係していることが予想される。これらの予想を基にMATE1の点変異体を複数作製した。(MATEの極性残基部分:E278A,E319A,H386A,E389A等)。そして、TEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込み活性に与える影響をRIトレーサー実験により調べた。この結果より機能性アミノ酸残基を決定した。また、MATE1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を解明した。ヒトMATE1の膜貫通領域にある極性アミノ酸のうち、E273Qの点変異体を作成しHEK293細胞に発現させたところ、TEAの輸送活性は完全に消失した(PNAS 2005,)。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームへの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いた。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を構築した。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用した。そして輸送測定で基質とH^+の化学平衡か測定した。【目的】生体内に存在する様々な有機化合物は高度に発達した器官である腎臓や肝臓により体外に排出される。この排出を担うのは種々の有機化合物トランスポーターである。ここ10年で、これらのトランスポーターの大部分の分子実体は同定されてきた。しかし,排泄の最終段階を担うOC (organic cation)/H^+交換輸送系に関しては20年程前からその存在は知られていたが、いまだにその実体は解明されていなかった。最近申請者はこのトランスポーターのヒト及びマウスにおける分子実体を明らかにすることに成功した(PNAS,2005)。そのトランスポーターはバクテリアでは多剤耐性に寄与しているMATE (multidrug and toxin extrusion)ファミリーの輸送体のorthologueであり、このトランスポーターをMATE1と名付けた。申請者の研究目的はMATE1トランスポーターの機能と構造の決定及びその輸送メカニズムの解明である。また、MATE1と相互作用し、その輸送活性を調節するような機能タンパク質を探索する。【実績】MATE1の点変異体を複数作製し(膜貫通領域の極性残基部分)、HEK293細胞に発現させ、MATE1の基質であるTEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込み活性に与える影響をRIトレーサー実験により調べた。この結果より輸送活性及び機能性アミノ酸残基を推定した。また、MATE1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H^+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を考察した。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームヘの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いている。申請者の研究室ではすでに、哺乳類の小胞型グルタミン酸トランスポーターについて、昆虫細胞を用いた発現系を用い大量発現に成功している。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を既に構築済みである。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用し、多剤排出タンパク質としてのMATEの輸送機構の全貌解明に活用する。また、MATE

1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を解明した。ヒトMATE1の膜貫通領域にある極性アミノ酸のうち、E273Qの点変異体を作成しHEK293細胞に発現させたところ、TEAの輸送活性は完全に消失した(PNAS 2005,)。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームへの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いた。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を構築した。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用した。そして輸送測定で基質とH^+の化学平衡か測定した。
細胞周期制御の観点から骨吸収・骨形成を同時に制御する分子を探る

本研究では、細胞周期制御との関連が強いRunx2と同じruntファミリーに属するRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進機能を有すること、ならびに、高分化能を有する間葉系細胞において古典的Wnt経路の抑制によってサイクリンD1発現が抑制されており、サイクリンD1が骨軟骨分化の振り分け機能を有すること、を明らかとした。さらに細胞周期制御において重要な機能を果たしていると想定された分子の中から、破骨細胞分化の際に発現が上昇する一方で骨芽細胞分化の際に発現が低下する分子、逆に破骨細胞分化の際に発現が低下する一方で骨芽細胞分化の際に発現が上昇するという発現変動パターンを示す分子を複数同定した。骨代謝は骨形成と骨吸収のバランスによって成り立っている。そこで、骨形成と骨吸収を同時にコントロールして骨形成に有利な骨代謝条件をもたらす分子が同定出来れば、その分子を利用した治療法(治療薬)の開発が可能となり、顎顔面骨折や腫瘍摘出後の骨移植等、骨再生が必要な口腔疾患の治療において優れた効果が期待できる。本研究では、細胞周期制御の観点から骨吸収・骨形成を同時に制御する因子を検索・同定し、さらにその機能メカニズムを解明することで新規骨再生治療法開発の礎を築くことを目的とする。本年度は、動物モデルでの実験に先立ち、実験に有用な、ある特定の遺伝子を欠損させたマウスを共同研究機関から入手し、それらマウスのクリーニングを行った。現在は実験に必要な数のマウスを得るために交配を進めているが、必要数が揃った時点で骨折モデルを作成し、骨折部位とコントロール部位(反対側脛骨)とを実体顕微鏡による観察のもとに分離してmRNAを抽出し、マイクロアレイに供する予定である。また、動物モデルの基礎検討として、細胞レベルで骨形成と骨吸収を同時にコントロールする可能性のある分子を検索すべく、骨芽細胞分化が時期特異的に促進・抑制されるという特殊な形質を有する遺伝子操作マウス由来の骨芽細胞を用いて、様々な遺伝子の発現をReal timeRT-PCRで確認している。さらに、同細胞からタンパクを抽出して細胞周期関連因子の発現パターン、細胞内局在の確認も行っており、細胞周期を正に制御する因子の局在が時期特異的に変化することを見出した。骨代謝は、1破骨細胞による骨吸収、2骨芽細胞による骨形成、この両者のバランスによって成立している。そこで、骨形成と骨吸収を同時にコントロールして骨形成に有利な骨代謝条件をもたらす分子を同定出来れば、その分子を利用した治療法(治療薬)の開発が可能となり、顎顔面骨折や腫瘍摘出後の骨移植等、骨再生が必要な口腔疾患の治療において優れた効果が期待できる。本研究では細胞周期制御と骨代謝制御の観点から、骨吸収・骨形成を同時に制御する分子を検索・同定し、さらにその機能メカニズムを解明するとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的としている。今年度は細胞周期制御において重要な機能が報告されている遺伝子を操作した遺伝子操作マウス由来の骨芽細胞(この細胞は分化が時期特異的に促進あるいは抑制されるという特殊な形質を持っていることを我々が独自に確認済)と対照細胞(同胞野生型マウス由来骨芽細胞)を用いて、その遺伝子操作に関連して発現が変動する分子を網羅的に探索した。さらにバイオインフォマティクスと我々の過去の知見とを組み合わせて、有力な制御因子の絞込みを行った。そのうちのいくつかに関しては過剰発現実験・発現抑制実験を通じた細胞内機能解析を実施した。また、動物を用いたin vivoの実験のために前年度から遺伝子操作マウスの交配を行っているが、対照となる同胞野生型マウスの出生確率が予想よりも低く(原因は不明)、適切な実験条件が整っていないため、引き続き交配を継続中である。本研究は、1細胞周期制御と骨代謝制御という二つの観点に着目して、複数の骨系統細胞の分化と機能を同時に制御する分子を検索・同定し、その機能メカニズムを解明すること、2さらに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うこと、を目的として企画されたものである。今年度は、骨軟骨分化能が促進している細胞株(この細胞株は、間葉系細胞に特定の遺伝子を導入することで、われわれが独自に樹立した細胞株である)と対照細胞を用いて、遺伝子操作によってもたらされた骨軟骨分化能促進に伴い、細胞内の発現が変動する分子を網羅的に探索し、そこで得られたデータをバイオインフォマティクス解析に供して、細胞周期制御と骨代謝制御の両者において重要な機能を果たしていると想定される分子の絞込みを行った。次いで、選択された複数の分子に関しては、それらの分子の過剰発現実験・発現抑制実験を通じた細胞内機能解析を実施した。その結果、ある特定の細胞周期制御因子が間葉系細胞の骨方向への分化と軟骨方向への分化振り分けに関与していること、ならびにその機能の一部はRunx2、Osterix、Sox9等の骨軟骨分化において中心的役割を果たす転写因子群の発現をコントロールすることで発揮されていることを見出した。また、骨形成におけるマスター遺伝子であり、細胞周期制御メカニズムへの関与が指摘されているRunx2と同じruntファミリーに属する転写因子であるRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進に関係していることを報告した。骨系統細胞の分化段階において、複数の細胞の分化を調節している細胞周期制御因子を同定することが出来たため。骨代謝は破骨細胞による骨吸収、骨芽細胞による骨形成、この両者のバランスによって成立している。

そのため、単一の分子で両者のバランスを同時にコントロールして骨形成に有利な骨代謝条件をもたらす分子を同定出来れば、その分子を利用した治療法の開発が可能となり、骨再生が必要な口腔疾患の治療において優れた効果が期待できる。本研究は破骨細胞ならびに骨芽細胞分化において中心的役割を果たすG1期のセルサイクルファクターを網羅的に解析することによって、細胞周期の観点から、骨吸収・骨形成制御機構を解明するとともに、それを利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として計画された。代表的な研究成果としては、破骨細胞分化の際には発現レベルが上昇する一方で、骨芽細胞分化の際にはその発現レベルが低下する分子、またそれとは逆に破骨細胞分化の際に発現レベルが低下する一方で、骨芽細胞分化の際にはその発現レベルが上昇する分子を複数同定した。さらに、非常に高い骨軟骨分化能を有する間葉系細胞ではRunx3とβ-cateninが協調的に機能して古典的Wnt経路を抑制することで細胞内のCyclinD1発現が抑制されていることを発見し、細胞にCyclinD1を導入した際には軟骨分化マーカー遺伝子の発現が一部抑制され、骨分化マーカー遺伝子の発現が一部促進されることも明らかとした。以上の結果から、高い骨軟骨分化能を有する間葉系細胞において、古典的Wnt経路を介したCyclinD1の発現調節が骨分化と軟骨分化のバランスを制御していると結論付けるに至った。なお、これらの成果の一部は国際学会・国内学会で発表するとともに、国際一流誌に投稿中である(現在2回目のリバイスを行っている)。本研究では、細胞周期制御との関連が強いRunx2と同じruntファミリーに属するRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進機能を有すること、ならびに、高分化能を有する間葉系細胞において古典的Wnt経路の抑制によってサイクリンD1発現が抑制されており、サイクリンD1が骨軟骨分化の振り分け機能を有すること、を明らかとした。さらに細胞周期制御において重要な機能を果たしていると想定された分子の中から、破骨細胞分化の際に発現が上昇する一方で骨芽細胞分化の際に発現が低下する分子、逆に破骨細胞分化の際に発現が低下する一方で骨芽細胞分化の際に発現が上昇するという発現変動パターンを示す分子を複数同定した。動物を用いたモデルの解析が遅れているため。骨系統細胞の分化段階において、複数の細胞の分化を調節している細胞周期制御因子を同定することが出来たが、その詳細な機能については、より詳細な解析が必要である。そこで、今後は同定された分子の機能解析を進め、研究成果を学会・論文発表につなげる予定である。分子細胞生物学十分なコントロールマウスを得るために交配を継続する。動物を用いたモデルの解析が遅れているため最初の目的である候補分子のスクリーニングに当たって、スクリーニングのための実験系の立ち上げに予想以上に時間を要し、それ以降の実験に充当すべき研究費の使用が遅れたため。動物実験結果を評価するために必要なコントロールとなる同胞野生型マウスの出生確率が科学的な予想値と比較して低く、実験を計画した当初の予定よりも進行が遅れているため。候補分子のスクリーニング系が確立し、解析対象となる分子が複数選択されたため、それらの分子に関して詳細な解析を遂行するための試薬・機器の購入費用に充当する予定である。
せん断流中のナノ微粒子の熱挙動とクラスター形成に関する研究

近年のナノテクノロジの急速な発展に伴い,マイクロ流路内の流れ場解析が盛んに行われ,その多くはトレーサ粒子の動きを解析するマイクロPIVが用いられている.本研究では金属・生物顕微鏡で使用されている暗視野法をマイクロPIVに応用し,従来の方法では困難であった,より小さな微粒子挙動を可視化することを可能するとともに,流れ場中の強磁性ナノ微粒子のクラスター形成を初めて可視化した.以下,本研究の実績を示す.(1)前年度使用した以外の高分子溶液および磁性流体の密度,粘度,磁化率等の物性値の測定を行った.(2)マイクロキャピラリーおよびマイクロチャンネルを用いて磁性微粒子クラスタの形成過程を調べた.せん断速度に応じて,クラスタの破断が予想される中,その時のせん断応力と印加磁場,磁性流体濃度,高分子濃度等の関連を明らかにした.(3)現有の高速度カメラを用いて画像データを取得し,得られたデータに画像処理解析を行った.サンプルによっては,クラスタの分離・合体がおこるので,膨大な画像データを統計処理し,クラスタ形成を特長づけるパラメータを見出す事を試みた.(4)マイクロテイラー渦流れを形成可能なマイクロ容器を作成し,本システムに適応すると同時に,テイラー渦流れのマクロ容器での実験を行い,マイクロ流れとの流れ場の相違を調べた.(5)マイクロテイラー渦流れの容器に磁性流体を注入し,暗視野法にて可視化出来ることを確認した.(6)得られた結果に基づき,総合的検討を行う.本研究では金属・生物顕微鏡で使用されている暗視野法をマイクPIVに応用し,従来の方法では困難であった,より小さな微粒子挙動を可視化することを可能とした.以下,本研究の実績を示す.1.高分子溶液および磁性流体の密度,粘度,磁化率等の物性値の測定を行った.2.顕微鏡せん断ユニットを暗視野法が適用できる様に改良し,マイクロせん断流可視化装置を作成する.ここで,レーザー光源を利用した暗視野システムを構築した.3.流れ場のない状態で,微粒子のブラウン運動を観察すると共に,マイクロPTVを用いて拡散速度を計測し,拡散速度の温度依存性を確かめると共に,標準ナノ微粒子を用いてアインシュタインの関係式から粒径を求め,本システムの有効性を確かめた.また,マイクロ流れでは奥行き方向の位置決めが重要であり,被写界深度が理論値と実験値で相違ないか確かめた.4.3.で用いた拡散速度からの粒径測定手法を,粒径が未知なナノ微粒子に適用できるかどうか確かめるために,高分子粒子や磁性流体に適応し,粒径を決定した.ここで得られた粒径を,従来提唱されている値と比較検討した。5.続いて,磁性流体の場合の強磁性ナノ微粒子の二次クラスタ形成について調べた.二次クラスタ構造は,磁性流体濃度,印加磁場によって大きく変化するとものと予想される.そこで,磁性流体を希釈して様々なサンプルを作製した.また,サンプル磁性流体に磁場を印加し,その時のクラスタ形成状態をCCDカメラによって撮影し,ビデオテープに録画した.磁場強度,サンプル磁性流体を変えて,様々な画像データを入手し,得られたデータを画像処理して解析を行った.また,クラスタの長さ,クラスタ形成微粒子数,クラスタ形成時間等と印加磁場との関連を明らかにした.6.せん断流においても,暗視野法が有効であるか標準ナノ微粒子を用いて,実験を行った.ここで,せん断速度とブラウン運動の関係を調べ,マイクロPIV計測に与えるブラウン運動の影響を明らかにした.7.せん断流用の高分子粒子や強磁性微粒子等のナノ微粒子が本システムで可視化可能か確認し,被写界深度や温度範囲等本システム仕様を決定した.近年のナノテクノロジの急速な発展に伴い,マイクロ流路内の流れ場解析が盛んに行われ,その多くはトレーサ粒子の動きを解析するマイクロPIVが用いられている.本研究では金属・生物顕微鏡で使用されている暗視野法をマイクロPIVに応用し,従来の方法では困難であった,より小さな微粒子挙動を可視化することを可能するとともに,流れ場中の強磁性ナノ微粒子のクラスター形成を初めて可視化した.以下,本研究の実績を示す.(1)前年度使用した以外の高分子溶液および磁性流体の密度,粘度,磁化率等の物性値の測定を行った.(2)マイクロキャピラリーおよびマイクロチャンネルを用いて磁性微粒子クラスタの形成過程を調べた.せん断速度に応じて,クラスタの破断が予想される中,その時のせん断応力と印加磁場,磁性流体濃度,高分子濃度等の関連を明らかにした.(3)現有の高速度カメラを用いて画像データを取得し,得られたデータに画像処理解析を行った.サンプルによっては,クラスタの分離・合体がおこるので,膨大な画像データを統計処理し,クラスタ形成を特長づけるパラメータを見出す事を試みた.(4)マイクロテイラー渦流れを形成可能なマイクロ容器を作成し,本システムに適応すると同時に,テイラー渦流れのマクロ容器での実験を行い,マイクロ流れとの流れ場の相違を調べた.(5)マイクロテイラー渦流れの容器に磁性流体を注入し,暗視野法にて可視化出来ることを確認した.(6)得られた結果に基づき,総合的検討を行う.
インフルエンザウイルスタンパク質NS1の二本鎖RNAマスキング機構の解析

申請者はこれまでに、インフルエンザウイルスのリボヌクレオタンパク質がin vitroでループ状の二本鎖RNAを合成することを明らかにしてきた。本課題ではまず、NS1欠損ウイルス感染細胞内で二本鎖RNAがマスクされることなく検出されるかどうかを確認する。次に、組み換えNS1タンパク質を用いてNS1の二本鎖RNAへの結合・マスキングに重要なアミノ酸を同定し、そこで得られた情報をもとにNS1変異ウイルスを作成して二本鎖RNAが検出されるかを解析する。さらに、NS1の二本鎖RNAへの結合の過程を原子間力顕微鏡を用いてリアルタイムでイメージングすることによって、そのマスキング機構の解明を試みる。
核タンパク質の核内移行活性の制御とタンパク質リン酸化反応の関係に関する研究

SV40 large T抗原の核局在化シグナル(Nuclear Location Signal;NLS)とその周辺部を含む合計34個のアミノ酸残基からなる長い合成ペプチド(long Tペプチドと呼ぶ)を用いることにより、IgMのような巨大な分子をも核内に移行させることができることがわかった。従来は、NLSだけを含む合成ペプチドを結合させてもIgMのような巨大な分子は核に移行できず、NLSによって核内に入り得る核タンパク質の大きさに制限があると考えられていた。本研究で得られた上記の結果は、この概念を打ち破るもので、感染過程でのSV40ウィルス粒子の核への移行や、RNAポリメラ-ゼのような巨大なタンパク質複合体を形成している分子の核への移行のメカニズムを考える上で、重要な示唆を与えるものと思われる。このlong Tペプチドをウシ血清アルブミン(BSA)に結合させ、赤血球ゴ-スト法を用いて細胞内に導入すると同時に、32pーorthophosphateでタンパク質を標識して解析することにより、long Tペプチドが特異的にリン酸化を受けていることがわかった。リン酸化の効果をみるため、long Tペプチドの中で、リン酸化され得ると考えられる4個のSerine/Threonine残基をAlanineに置換させた変異型long Tペプチドを新たに作製した。これをIgMに結合させて核への移行を調べてみると、効率は低下するものの、IgMを核へ移行させる活性は保持されていた。また、上記と同じ方法を用いて、変異性long Tペプチドは実際にリン酸化を受けないことが確認された。さらに詳細に時間経過を追ってペプチドーIgM結合物インジェクション後の細胞内局在を観察したところ、変異型long TペプチドーIgM結合物は、野生型long TペプチドーIgM結合物と比べて、核膜周辺部で長時間留まっていることを示唆する結果が得られた。このことから、リン酸化は、核膜孔通過あるいは、その直前のステップでの効率に何らかの役割を果たすのではないかと推測される。
ナノ接合での非弾性電流、局所加熱、熱散逸の第一原理シミュレーション

弾性電流、非弾性電流を含む第一原理伝導計算理論の開発とプログラム実装を行った。電子ーフォノン散乱による振動励起だけでなく、電圧印加により生じる非平衡電流がイオンに作用する(断熱近似による平均力場)「電流誘起力」の計算も行った。これらの理論を実装したプログラムを用いて、以下のシミュレーションを行った。(1)金属錯体分子積層膜の長距離コヒーレント伝導の解明。有機分子では、伝導度は長さ(膜厚)に対しコンダクタンス指数関数的に減少するが、金属中心を分子内に含んだ「有機錯体分子」でワイヤーあるいは積層膜をつくると、伝導度が長さに対しあまり変化しない。通常これは電子がひとつひとつの分子をホッピングする電子移動と考えられてきたが、第一原理電気伝導計算結果をもとに解析的モデルを構築し、長距離で電子の量子性をたもった伝導が、錯体内での金属中心の酸化還元作用により可能である事を示した。また、錯体系では、伝導度の長さ依存性は指数関数的減少になるとは限らず、電子ーフォノン相互作用によるdephasing効果が「見かけ上の」指数関数的減少を引きおこしている可能性を示した。(2)ゲート電圧により電気化学的にコントロールすることで炭素ー金電極を直接接合した、分子コンタクト系での、接合強度と伝導度の相関を理論計算し、最新の計測実験と比較した。通常考えられてきたものとは異なり、接合強度は伝導度の相関は分子の内的性質と伝導軌道経路に依存し、かならずしも正の相関があるとは限らないことが明らかになった。25年度が最終年度であるため、記入しない。第一原理非平衡伝導計算プログラムを開発した。電気伝導とともに、電子ー分子振動散乱による非弾性電流、分子振動励起を最低次数展開で近似的に評価する方法についても開発・実装を完了した。以下にこれを用いたシミュレーション研究成果をまとめる。(1) pn接合模倣型分子の整流性を示した。バルクpn接合とは異なり、電圧に対する応答として、伝導性軌道と電極電子状態とのカップリングのと軌道位相の協奏効果が整流方向を規定していることを明らかにした。(2)半導体有機分子膜と金属界面の電気伝導が、電極表面と分子の弱い結合やcharge donation/back donationによりI-V特性が大きく変化することを定量的に示した。(3) pn接合型分子整流素子で、(電流の整流性はでているにも関わらず)非弾性電流はbias-polarityに対する非対称性が抑制されるうることを明らかにした。(4)分子整流素子において、分子の電子相関効果が、電圧が高くなると整流性を増強する場合があることを、第一原理から抽出したモデルを用いた非平衡電子状態計算から示した。(5)有機金属錯体をユニットにした分子積層膜において長距離伝導が計測されてことから、計測結果と併せて、理論計算でこの長距離伝導がコヒーレント伝導であることを示すことに成功した。非平衡グリーン関数効率計算アルゴリズム開発、アルゴリズム実装、シミュレーション、繰り込み理論方法の開発、局所加熱定量計算を行い、これを広く実在系へ適用し、精密計測や分子合成との共同研究をシミュレーション主導で展開していく基盤をつくることが目的であった。今年度においては、基礎理論においては、当初予定したレベルでの簡易な近似手法について、第一原理プログラムへの実装もほぼ完了した。また。同時進行で進めている、分子接合系の非平衡電流現象へのシミュレーションの適用についても、国内・国外の精密計測実験グループと積極的に共同研究を展開を行った。理論計算から、より統一的観点からの分子ダイオード特性の解析、整流性と局所発熱の関係といった、計算によるアプローチが重要な問題について挑戦し、一定の成果を得、国際学会や国際論文誌にも公表できた。従って、当初計画に対し、現時点で順調な達成度にあると考えられる。今後の研究については、現在開発しているプログラムの高速化により、より大規模なナノコンタクト系への第一原理シミュレーション適用を図っていく。

また、得られる大量の計算データから、より本質的パラメータを取り出し、簡便なモデルを再構築し、これをもとにしたより進んだレベルの近似計算による補正項評価といった、多角的シミュレーション基礎理論の構築へも進んでいく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
腰痛セルフマネジメントに特化したモバイルヘルスの開発と効果検証

本研究は腰痛セルフマネジメントに特化したモバイルヘルスの開発と効果検証を目的とした研究であり、平成30年度においては、本実験前の足がかりとして、モバイルヘルスの改良開発やサンプルサイズの見積もりのためにプレ実験を実施した。平成30年度に実施した具体的な内容としては、1研究計画の立案、2倫理委員会・UMINへの臨床試験登録、3研究フィールドの獲得および研究協力者のリクルート、4介入実施、5ベースライン評価・中間評価(介入開始3ヶ月時)、6ベースライン中間評価の中間解析、7中間解析結果の国際学会への演題登録、8プレ実験の論文執筆、9モバイルヘルスの改良開発、10本試験実施先フィールドとの協議である。介入後3ヶ月時点における中間解析の結果、コントロール群と比較して、介入群(モバイルヘルス群)は有意に腰痛の程度に改善が見られた。しかしながら、セカンダリーアウトカムである労働生産性などに関しては、有意な改善効果は観察されなかった。本中間解析結果は、平成31年度に開催予定の欧州疼痛学会に採択され、演題発表をする予定であり、様々なディスカッションができると考えている。今回の結果は、プレ実験での中間解析における結果である。プレ実験において生じたアプリや研究デザインの課題を改善した上で、今後の研究計画においては、6ヶ月時点での最終フォローアップにおける効果検証により、長期効果やセカンダリーアウトカムへの影響を検討する。また、本実験での効果検証を行うことで、プレ実験の結果をより頑健性の高い形で提示していく予定である。13に関しては、複数のステークホルダーとの連携を密に取りながら、事前準備を徹底した。その結果、概ね予定通りに研究計画を進めることができた。20名の介護職から研究参加の同意が得られ、予定通りのサンプル数を集めることができた。しかしながら、ベースライン調査中に1名が離職を理由にドロップアウトした。4に関して、3ヶ月の中間評価時点で、19名中の1名ドロップアウトとなったが、5に関して、アンケート回収率はドロップアウトを除いて100%となった。6, 7に関しては、中間評価のデータ解析を実施した。結果、コントロール群と比較して、介入群(モバイルヘルス群)は有意に腰痛の程度に改善が見られた(β[95%CI] = -1.35 [-2.27 to -0.43])。しかしながら、セカンダリーアウトカムに関しては、有意な効果は観察されなかった。本解析結果は、平成31年度に開催予定の欧州疼痛学会にて発表予定である(採否済み)。8に関して、プレ実験が5月に終了後、国際誌に投稿予定であり、論文執筆を進めている。9に関しては、株式会社バックテックとの議論の上、ユーザビリティ向上や、痛み記録の項目の精査、活動記録のリマインド頻度の調整機能などの機能改善を実施した。合わせて、セラピスト向けのサポートガイドラインの変更も随時行っていった。10に関して、研究実施先フィールドとの協議を行っている最中である。今後に関しては、プレ実験終了後、サンプルサイズを積算し、本試験に実施に移っていく計画である。本試験はより大きなサンプルサイズで実施することから、研究開始にいたるまでにリードタイムがかかることが想定される。研究開始がスムーズに進行するように、意思決定者を含めた上での会議をするようにする。また、サンプルサイズが多くなる分、多くの対象者に参加してもらうために、興味をもってもらいやすいようなマーケティングの手法を考慮した上で、リクルートを実施する。

結果、コントロール群と比較して、介入群(モバイルヘルス群)は有意に腰痛の程度に改善が見られた(β[95%CI] = -1.35 [-2.27 to -0.43])。しかしながら、セカンダリーアウトカムに関しては、有意な効果は観察されなかった。本解析結果は、平成31年度に開催予定の欧州疼痛学会にて発表予定である(採否済み)。8に関して、プレ実験が5月に終了後、国際誌に投稿予定であり、論文執筆を進めている。9に関しては、株式会社バックテックとの議論の上、ユーザビリティ向上や、痛み記録の項目の精査、活動記録のリマインド頻度の調整機能などの機能改善を実施した。合わせて、セラピスト向けのサポートガイドラインの変更も随時行っていった。10に関して、研究実施先フィールドとの協議を行っている最中である。今後に関しては、プレ実験終了後、サンプルサイズを積算し、本試験に実施に移っていく計画である。本試験はより大きなサンプルサイズで実施することから、研究開始にいたるまでにリードタイムがかかることが想定される。研究開始がスムーズに進行するように、意思決定者を含めた上での会議をするようにする。また、サンプルサイズが多くなる分、多くの対象者に参加してもらうために、興味をもってもらいやすいようなマーケティングの手法を考慮した上で、リクルートを実施する。
金属アルコキシドの加水分解同時結晶化による酸化物超微結晶の合成とその物性制御

チタンのアルコキシドを種々のアルコールやトルエンなどの無極性の有機溶媒に溶解し、これをオートクレーブ中、高温高圧下、気相からの有機溶媒に溶け込む少量の水を用いて加水分解するとともに結晶化させる手法を検討した。この手法によりアナタ-ス型酸化チタンが生成することを見いだし、また、これが結晶子径約9mmの超微結晶の集合体からなっていることをX線回析、透過型電子顕微鏡(TEM)観察から明らかにした。酸化チタンの有機溶媒に対する溶解度がかなり小さく、結晶成長が抑制されるためこのような酸化チタンの微結晶が生成したと考えられる。水を溶媒に用いる水熱法では微結晶合成は困難である。本手法で得られた酸化チタンの大きな特徴として、高温で焼成しても結晶成長が小さいことが挙げられる。通常のアルコキシド法で得られる無定形水和酸化チタンを400500°Cで焼成するとアナタ-スが結晶化し、その結晶径も大きくなるのに対し、本手法で得られた酸化チタンは500°Cで焼成しても1115nmの結晶子径を保ち、また、これに対応して、100m^2g^<-1>以上の表面積を維持した。細孔経分布も結晶の間隙に由来すると考えられるシャープな分布のピークが10nm付近にみられた。以上のことにより本手法で得られた酸化チタンは常法では合成困難な種々の優れた物性を示すことが明らかとなり、現在、J.Mater.Sci.Lett.に投稿中である。さらに、この酸化チタンを触媒担体および光触媒材料として利用することを現在検討している。