hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個人差・学力差に対応した,動機づけの低い学習者の動機づけを高める教育支援研究

これらのデータ収集は本年度も実施予定であり,それらのデータを総合して,研究成果とする予定である。またデータを分析する際に必要な質的研究手法の整備も同時に行った。本研究課題を遂行するには量的研究手法と質的研究手法を組み合わせる必要があったが,質的研究手法は未整備であったため,理論的裏付けから分析手法までの整備を行い,最終年度のデータ分析で使用できるように準備を整えた。本研究の目的は,学習者の多様な個人差や学力差を加味した上で,動機づけの低い学習者の英語学習への動機づけを高める授業実践法を確立することである。またWeb上にて公開する。研究1では質的研究にて,動機づけを高める方略の整備し,続く研究2では予備調査として,その方略の効果検証を行った。研究3では日本人大学生43名を対象に,本調査を行った。特に動機づけ要因の個人差を加味し,動機づけの低い調査協力者の動機づけと3欲求の記述統計量,プレ測定からポスト測定の変化値,効果量(r)4を算出した。その結果,特性レベルの動機づけはやや上昇し,効果量は中程度であった(Mdiff = 0.38, t (40) = 1.96, p = .06, r =.30)。一方,それ以外の動機づけは大きな上昇が見られた。英語授業レベルの動機づけ(Mdiff = 1.59, t (40) = 7.48, p = .00, r =.76),リスニング活動への動機づけ(Mdiff = 1.11, t (40) = 6.66, p = .00, r =.73)ともに,効果量も大きかった。またスピーキング活動への動機づけも上昇し,効果量は中程度であった。(Mdiff = 0.72, t (40) = 3.54, p = .00, r =.49)。同様に3欲求のすべてに上昇も見られた。自律性(Mdiff = 1.16, t (40) = 5.50, p = .00, r = .66),有能性(Mdiff = 0.68, t (40) = 3.24, p = .00, r =.46),関係性(Mdiff = 0.42, t (40) = 2.24, p = .03, r =.33)の変化値は5%水準で有意であり,効果量も中程度であった。よって,この方略は動機づけの低い学習者の3欲求と動機づけを高める効果が確認された。計画通りデータ収集を行なっており,おおむね順調に進展している24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は最終的なデータ収集を行った上で,結果の取りまとめを行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ガラスビーズ中で成長するＴＨＦハイドレートの形態形成

海底メタンハイドレートが堆積物中で形成する多様な形状の形成過程の理解を目的として、THF、水、ガラスビーズを混合した系におけるTHFハイドレートの形成実験(室内におけるモデル実験)を行った。本研究の方針は、現実の海底メタンハイドレートの生成過程の理解に重要なゲスト分子の拡散律速の影響や堆積物中の水分量(含水比)の影響および実験セルのサイズ効果の検証にあり、以下の知見が得られた。低THF濃度のサンプルを用いることでゲスト分子の拡散律速性の影響を顕在化させた場合、結晶はファセットを持った単結晶特有の形状を形成した。しかし、これは現実の海底下では見つかっていない形状であり、低濃度かつ低含水比のサンプルを用いることで現実の海底下の成長過程に近づけた。この結果、粒状、塊状という海底メタンハイドレート特有の形状を再現できた。結晶化に必要なTHF濃度を低下させた効果は、結晶の成長速度を低下させることで単結晶特有の形状を形成しやすくし、一方、含水比を下げることで異物質としての固形粒子の影響が強まり霜柱状の形状が形成されやすくなったと考察した。また、より大きなセルを用いることにより十分な溶液量を確保した実験を行った。特に、低速度実験では大きな霜柱状の結晶領域が形成されるため、溶液の取り込み量が多いためにセルのサイズ効果を回避する必要があった。この結果、低速実験では、塊状の結晶と層状の結晶が混在することが示された。成長速度とビーズの粒径分布という変数をもとに結晶形状を形のダイヤグラムに分類したときに、層状と塊状の境界付近の条件では、2つの形状が共存することが明確となった。この結果をもとに、結晶が一定の温度条件下で成長した場合においても、一つの霜柱状の結晶領域の形成後に、結晶周囲の含水比やゲスト分子濃度が変化することで、次の霜柱領域の形成時に異なる形状の形成が優位になる原因と考察した。海底メタンハイドレートは海底堆積物中に多様な形状で存在することが知られているが、それらの形状の形成機構はよく分かっていない。研究代表者は、多孔質媒体としてのガラスビーズとTHF水溶液を混合したサンプル中においてTHFハイドレートを成長させるというモデル実験を行い、すべての形状の再現に既に成功している。本研究では、このモデル系の問題点を克服し海底メタンハイドレートの形成の素過程により近づけるために、ゲスト分子の拡散律速の効果を顕在化させた実験を行い、ハイドレート形状やサイズに及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。多層のハイドレートが配列した構造が生成する条件において、THF濃度と含水比、成長速度を変数とした一方向凝固実験を行った。この結果、ハイドレートが生成しづらい条件である低THF濃度の方が、ハイドレート層の幅と間隔は大きくなること、そしてさらに濃度を下げる(条件を厳しくする)と粒状のハイドレートが現れるという新奇な結果を示した。このことは、低濃度条件のためにハイドレートの成長速度が遅くなることで、結果として脱水圧密距離(ビーズ中の溶液を吸収する距離)は大きくなり、より幅の大きなハイドレートが形成するとともに、低含水比領域の幅も大きいために層間隔が増大するものと考察した。低含水比における実験も行ったが、その結果は、臨界含水比(層構造を形成できない条件)は本実験の条件内ではほとんど差が生じないことが分かった。また、ハイドレートが成長中のその場観察画像と低温保持後画像の比較により、低THF濃度の場合には、分散状領域に未結晶化領域が存在することを示した。さらには、ガラスビーズサイズを変数とした実験も行い低THF濃度のサンプルではファセット状の形成が顕著となるという新奇な結果を得た。層構造が形成する条件において低THF濃度溶液を用いた実験により、ゲスト分子の拡散律速が層構造の幅や間隔に及ぼす影響が明らかとなり、その形成モデルを提案するという当初の目的をほぼ達成した。また、粒状や塊状ハイドレートが形成する条件を先取りして実施して、ファセット状成長という新奇な結果が得られている。本研究予算で購入したデジタルマイクロスコープにより、高解像度での結晶画像の撮影が可能となり、低濃度条件下において生成するコントラストの低い結晶の解析が可能となったことが進展の理由である。以上により、本研究はおおむね順調に推移しており、特筆すべき問題はない。研究代表者は、ガラスビーズとTHF水溶液を混合したサンプル中においてTHFハイドレートを成長させるというモデル実験を行い、すべての形状の再現に成功している。ところが、モデル実験は理想化・単純化された系であるため、本研究では、このモデル系を海底メタンハイドレートの形成の素過程に近づけた系において実験的研究を行った。具体的には、ゲスト分子の拡散律速の効果を顕在化させるために、前年度に続き、低THF濃度の溶液をガラスビーズと混合したサンプルを用いること(低濃度実験)にある。さらには、前年度の結果において、従来海底下では見られないファセット状結晶が低濃度実験において析出したことを受けて、低含水比における実験も行った。つまり、ビーズの効果を相対的に高めることで、単結晶特有の形状であるファセット状の成長を抑制できるのかを明らかにして、ファセット成長が海底下においても未発見なだけで起こり得るのか、あるいは、モデル実験上得られた形にすぎないかを見極めた。

さらには、実験の都合上、低速度での成長では、前年度よりも2倍長いセルを用いることで、セルサイズ効果を回避する工夫をした。また、形状の見極めが難しい高速度での成長実験も行い、本予算で購入した高解像度デジタルマイクロスコープにより従来よりも高精度に結晶形状を撮影することが実現した。本年度は、粒状や塊状が形成するビーズの混合比(2ミクロンビーズと50ミクロンビーズを等重量混合)を用い、低濃度低含水比実験を行った。その結果、含水比の低下にともない、ファセット状の結晶は現れなくなり、海底下で見つかっている層状、粒状や塊状が形成することを突き止めた。そして、低濃度実験におけるファセット成長の要因は、極めて緩やかな成長速度のために低指数面が形成されやすくなり、その形成を阻害する要因である固形粒子(ビーズ)密度が十分高くないことにより引き起こされたに過ぎないと結論付けた。さらには、低速度での結晶成長において、セルサイズの問題を検討した。拡散長がセルの端まで及んでしまうと、セルのサイズの影響が結晶成長過程に及んでしまう懸念があったためである。そこで、前年度よりもセル長が2倍長いものを制作して同様の条件での実験を行い、定常状態における結晶成長パターンの安定性に効果があるとする結果を得た。結晶形状の見極めが難しい高速成長での実験も行った。本研究予算で購入した高解像度のデジタルマイクロスコープによる観察によって、ビーズ中に形成する霜柱状のハイドレートパターンのコントラストが上がり、従来は分散状(結晶とビーズのコントラスト差がない)と判断していた条件が極めて微細な層状であったことを突き止めた。このことは、形状の分類のためのダイヤグラムの境界線を高精度に決定すること、および、成長条件と結晶のサイズスケールの議論をより精密に実施することに寄与する。以上の方針における系統的なデータ取得や詳細な解析はこれからであるが、重要な指針が得られたため本研究は概ね順調に進展していると考える。海底メタンハイドレートが堆積物中で形成する多様な形状の形成過程の理解を目的として、THF、水、ガラスビーズを混合した系におけるTHFハイドレートの形成実験(室内におけるモデル実験)を行った。本研究の方針は、現実の海底メタンハイドレートの生成過程の理解に重要なゲスト分子の拡散律速の影響や堆積物中の水分量(含水比)の影響および実験セルのサイズ効果の検証にあり、以下の知見が得られた。低THF濃度のサンプルを用いることでゲスト分子の拡散律速性の影響を顕在化させた場合、結晶はファセットを持った単結晶特有の形状を形成した。しかし、これは現実の海底下では見つかっていない形状であり、低濃度かつ低含水比のサンプルを用いることで現実の海底下の成長過程に近づけた。この結果、粒状、塊状という海底メタンハイドレート特有の形状を再現できた。結晶化に必要なTHF濃度を低下させた効果は、結晶の成長速度を低下させることで単結晶特有の形状を形成しやすくし、一方、含水比を下げることで異物質としての固形粒子の影響が強まり霜柱状の形状が形成されやすくなったと考察した。また、より大きなセルを用いることにより十分な溶液量を確保した実験を行った。特に、低速度実験では大きな霜柱状の結晶領域が形成されるため、溶液の取り込み量が多いためにセルのサイズ効果を回避する必要があった。
草本植物における遺伝的変異・サイズ構造と多様性

平成9-10年度の5月から9月にかけて以下の調査地で研究を行った。調査した植物材料はすべてマルハナバチ媒花である。(1)北海道および九州:多年生草本コバノギボウシのサイズ、マルハナバチの訪花パターン、種子生産量の測定(2)奥多摩:一年生草本ママコナの生長、種子生産量の測定(3)北陸から山陰地方:多年生草本イカリソウの生長パターン(株立ちタイプと地下茎伸長タイプ)の調査(4)会津田島:多年生草本クルマバハグマの生長、種子生産量の測定以上の調査地では各個体から葉のサンプリングも行い、酵素多型やDNAを用いて集団の遺伝的構造の解析を行った。生長パターンや種子生産量といった生態的特性に遺伝的特性がどの程度関係しているのかを解析した。また、コバノギボウシとイカリソウに関しては、広範囲の地域における調査とサンプリングを行ったので、これらの種の生態的特性と集団の遺伝的構造の地理的分化の関係も解析した。これらのデータ解析に基づき、モデリングなどの理論的研究も行った。研究成果は、8編の投稿論文としてまとめた。そのうち、1編がすでに印刷され、3編が印刷中、残り4編は平成12年3月現在投稿中である。本年度は5月から9月にかけて以下の調査地で研究を行った。調査には研究分担者ほぼ全員が参加した。(1)北海道および九州:多年生草本コバノギボウシのサイズ、マルハナバチの訪花パターン、種子生産量の測定(2)奥多摩:一年生草本ママコナの生長、種子生産量の測定(3)北陸から山陰地方:多年生草本イカリソウの生長パターン(株立ちタイプと地下茎伸長タイプ)の調査(4)会津田島:多年生草本クルマバハグマの生長、種子生産量の測定以上の調査地では各個体から葉のサンプリングも行い、酵素多型やDNAを用いて集団の遺伝的構造の解析を現在進めている。生長パターンや種子生産量といった生態的特性に遺伝的特性がどの程度関係しているのかを解析する予定である。また、コバノギボウシとイカリソウに関しては広範囲の地域における調査とサンプリングを行ったので、これらの種の生態的特性と集団の遺伝的構造の地理的分化も解明する予定である。多量のサンプルの遺伝的解析には膨大な時間が必要であり、現在その解析を進めているところである。したがって、それらの解析が終わり次第、詳しいデータ解析とそれに基づくモデリングなどの理論的研究を行う予定である。本年度も昨年度に続き5月から9月にかけて以下の調査地で研究を行った。生長パターンや種子生産量といった生態的特性に遺伝的特性がどの程度関係しているのかを解析する。また、コバノギボウシとイカリソウに関しては広範囲の地域における調査とサンプリングを行ったので、これらの種の生態的特性と集団の遺伝的構造の地理的分化も解明する。したがって、それらの解析が終わり次第、詳しいデータ解析とそれに基づくモデリングなどの理論的研究を行う。モデリングなどの理論的研究に関しては、研究分担者全員で討議しておおよそのフレームワークは考えてある。
血管における交感神経ー効果器の機構に関する薬理学的研究

1.私どもはこれまでウサギ耳動脈をモデルとして、交感神経ー効果器の機構を研究してきた。そして、節前線維の切除(decentralization)により、血管平滑筋の薬物感受性が増大するのみならず、節後線維末端の興奮性も増高することを見いだした。本研究の目的は、^3Hーノルエピネフリン(^3HーNE)を用いて先の推論を直接的に証明し、更にその機序を追究して、交感神経による血管機能の調節機構をより明らかにすることである。2.雄性成熟ウサギの上頸神経節の節前線維を片側外科的に切除してdecentralizeし、他側は対照とした。手術から1、2、4あるいは8週間後に、耳動脈と上頸神経節を摘出して用い、以下の実験結果を得た。3.手術後8週間の血管では、低頻度の経壁電気刺激において^3HーNE遊離量が著しく増大していたが、手術後1、2および4週間では有意な変化は認められなかった。4.αーあるいはβーアドレナリン受容体の作用薬ならびに拮抗薬は、経壁電気刺激による^3HーNE遊離に対してあまり影響しなかった。5.^3HーNEの血管・神経への取り込みは手術後8週間の血管と対照血管との間で有意な差異はなかった。6.ラジオエンザイム薄層クロマトグラフィ法によって定量したカテコールアミン含有量(ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン)は、手術後8週間の血管および上頸神経節のいずれでも変化は認められなかった。7.以上の結果は、慢性的にdecentralizeされた血管で認められる低頻度の経壁電気刺激による^3HーNE遊離量の著しい増大は、カテコールアミン生合成の変化やノルエピネフリン取り込みの変化によるものではなく、刺激ー伝達物質分泌連関の変化によるものであろうことを示唆している。今後この点を追究する予定である。交付申請書に記載した研究計画に従って,成熟ウサギの上頚神経節節前線維を外科的に摘除(decentralization)して8週間後の摘出耳動脈潅流標本を用いて, 1.経壁電気刺激によって避難される^3H-ノルエピネフリンの量を測定した.そして,その変化の機序を調べる目的で, 2.α_2-アドレナリン受容体の作用薬とよび拮抗薬の効果,また, 3^3H-ノルエピネフリンの血管への取り込みを検討した.その結果, 1.まず(1)本実験方法によって,経壁電気刺激により血管支配交感神経終末から遊離される^3H-ノルエピネフリン量を適切に測定できることがわかった.そして,(2)低頻度(0.1-0.5Hz)の電気刺激による^3Hの遊離量は,節前線維を摘除された(decentralized)動脈の法が対照側よりも有意に増大していた.(3)中・高頻度(1Hz以上)の刺激においては,差がなかった. 2.(1)decentralized動脈,および対照動脈における^3H-ノルエピネフリン遊離は,選択的α_2-アドレナリン受容体拮抗薬クロニジンによって同程度抑制された.また,(2)選択的α_2アドレナリン受容体拮抗薬ヨヒンビンは,両血管からの^3H-ノルエピネフリン遊離を同程度増大した. 3.^3H-ノルエピネフリンの交感神経終末への取り込みは, decentralized動脈と対照動脈とで有意な差はなかった.以上の結果から,私どもが予想したようにdecentralizationによって血管支配交感神経の終末は,電気刺激に対して感受性が増大すること,すなわち,『キャノンの除神経の法則』は交感神経の節後線維においても適応するものであることが確認された.

しかし,当初予想したα_2アドレナリン受容体の感受性低下によるものではないようで,その機序の解析は,今後の問題である.なおまた,今年度中に時間的経過を十分に追うことができなかった.これも次年度に残された課題である.1.前年度において、慢性的にdecentralizeされたウサギ耳動脈からは、対照側よりも経壁電気刺激による^3H-ノルエピネフリン(^3H-NE)の遊離量が著しく増大していることが明らかになった。本年度は、その機序を明らかにする研究の一環として、以下の実験を行なった。2.Decentralization:雄性成熟ウサギの片側の上頸交感神経節の節前線維を切除し、他側は対照としてそのままに置いた。手術から1、2、4あるいは8週間後、耳動脈および上頸神経節を摘出した。3.経壁電気刺激による^3H-NE遊離増大の時間的経過:手術後8週間の血管では、低頻度の電気刺激において^3H-NE遊離量が著しく増大していたが、手術後1、2、および4週間では有意な変化は認められなかった。4.^3H-ノルエピネフリンの血管・神経への取り込みコカイン0.1mM存在下あるいは不在において、^3H-NE 10nMで37°C、1時間インキュベートして調べた。手術後8週間の血管と対照血管との間に、^3H-NE取り込みの差異は無かった。5.カテコールアミン含有量ラジオエンザイム薄層クロマトグラフィ法によって定量した。手術後8週間の血管および上頸神経節のドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン量に変化は認められなかった。しかし、除神経された血管ではこれらのカテコールアミン量は著しく減少していた。以上の結果は、慢性的にdecentralizeされた血管で認められる低頻度の経壁電気刺激による^3H-NE遊離量の著しい増大は、カテコールアミン生合成の変化やノルエピネフリン取り込みの変化によるものではなく、刺激-伝達物質分泌連関の変化によるものであろうことを示唆している。今後この点を追求する予定である。
STM/HrsによるTLRシグナル伝達制御

リソソームへの輸送ならびに分解に関与する分子であるSTAM1/2のTLR分解における役割について、STAM1/2コンデイショナル遺伝子欠損マウスを用いて解析を行った。その結果、STAM1/2はTLR4のリソソームへの輸送ならびに分解に関与して、TLR4を介する自然免疫を負に制御していることが明らかとなった。ユビキチン化タンパク質のリソソームへの輸送と分解は、プロテアソームでの分解と共に生体の恒常性維持に必須の機能である。申請者は自然免疫系でのSTAMs/Hrs機能を解明する目的で、マクロファージ特異的にSTAM1/2を欠損させたLysM-Cre/STAM1^<flox/flox>/STAM2^<-/->(LysM-Cre/STAMs-cDKO)マウスを樹立してTLR4の機能について解析を行った。その結果、LysM-Cre/STAMs-cDKOマウス由来腹腔マクロファージにおいては、LPS刺激によりTNFやIL-6の産生が増強した。また、この時TLR4のシグナル増強ならびにシグナルの遷延化が見られた。そして、これらの現象はリソソームを介したTLR4の分解遅延によるものであることを見出した。これらのことから、STAM1/2がTLR4の分解ならびにシグナル制御に重要な働きをしていることを明らかにした。蛋白質がユビキチン化された後、リソソームやプロテアソームに輸送され分解されことは生体の恒常維持に必須である。申請者は小胞輸送関連蛋白質であるSTAM/Hrsの免疫系、特に自然免疫系における役割を解析するために、マクロファージ特異的にSTAM1/2を欠損させたLysM-Cre/STAM1^<flox/flox>/STAM2^<-/->(LysM-Cre/STAMscDKO)マウスを樹立して、TLR4の機能解析を行った。LysM-Cre/STAMscDKOマウスならびに野生型マウスの腹腔マクロファージをLPSで刺激した後、炎症性サイトカインであるTNFαとIL-6の産生を調べた。その結果、LysM-Cre/STAMscDKOマウス由来のマクロファージのほうが野生型マウス由来のマクロファージに比べ、炎症性サイトカイン産生の亢進が認められた。そこで、次にin vivoにおける機能を調べるために、LysM-Cre/STAMscDKOマウスならびに野生型マウスにLPSを腹腔内投与して、エンドトキシンショックならびに血清中の炎症性サイトカイン量を調べた。その結果、LPS投与後、LysM-Cre/STAMscDKOマウスは野生型マウスに比べ高い致死率を示した。また、血清中の炎症性サイトカインであるTNFαとIL-6量も野生型に比べ、LysM-Cre/STAMscDKOマウスにおいて高かった。これらのことから、小胞輸送関連分子であるSTAM1/2はTLR4の機能に重要な働きをしていることが示唆された。そこで、このメカニズムを明らかにするために、TLRの下流のシグナル伝達ならびにTLRの分解について解析を行ったところ、Erkならびにp38のリン酸化が野生型マウスに比べLysM-Cre/STAMscDKOマウスにおいて上昇していた。また、IκBαのdownregulationが野生型マウスに比べLysM-Cre/STAMscDKOマウスにおいて亢進していた。次に、LPS刺激後のTLRの分解について経時的に調べたところ、LysM-Cre/STAMscDKOマウスにおいては野生型マウスに比べてTLRの分解の遷延化がみられた。このLysM-Cre/STAMscDKOマウスにおいてみられたTLRの分解の遷延化がリソソーム依存性であるのか、あるいはプロテアソーム依存性であるのかを明らかにするために、それぞれの阻害剤を用いて調べたところ、TLR分解の遷延化はリソソーム依存性であることが明らかとなった。以上のことから、小胞輸送関連分子であるSTAM1/2はTLR4のライソソームでの分解経路に関与することにより、LPS-TLR4シグナル伝達機構において重要な働きをしていることが明らかとなった。
超高速ハイブリッドカスケード光電荷変調による極限時間分解撮像デバイスの研究

ハイブリッドカスケード光電荷変調素子HyCAMをバイオメディカルイメージングに応用する上で,光電荷変調素子を用いた時間分解ピクセルの共通原理として,多窓時間分解の特徴を生かした計測アルゴリズム及び応用実験のための基礎的課題について先行して,研究を進めていくことが重要である.そこで,本年度は,本課題廃止までの約3か月の期間で,これらの観点で研究を実施し,以下の成果を得た.時間分解イメージセンサにより生体光散乱を計測する際,システム関数を補正するために既知の光学パラメータをもつファントムが必要になる.基材としてシリコーンを用い,散乱係数および吸収係数の制御にそれぞれ酸化チタン粉末,インディアインクを用い,均一で気泡を含まないファントムの製造法を確立した.時間分解イメージセンサを蛍光寿命イメージングに適用して動作検証するために,市販の実体顕微鏡に光ファイババンドルを介して任意波長の励起光短パルスを導入するための機構を開発した.波長375nm, 405nm, 450nmについて,顕微鏡下で試料を均一に照明できることを確認した.時間分解CMOSイメージセンサをナノ秒以下短パルス光と組み合わせることで,光飛行時間距離計測,光散乱計測,蛍光寿命計測を時間領域で行うことができる.イメージセンサにより得られた時間情報を画素単位で高速フーリエ変換し,ある時間周波数成分を正規化して複素平面上にプロットするフェーザプロットにより,視覚的に解釈しやすい表現が可能となる.システム関数の補正,反復投影法によるデコンボリューションの機能を内蔵した汎用的なフェーザプロットソフトウェアを開発し,その有用性を検証した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
骨膜細胞の３次元構造のためのタンパク質間ネットワーク

今までに培養上清中に含まれるタンパク質を質量分析し、免疫染色(単染色)との組み合わせによりウシ骨膜由来細胞に発現しているタンパク質のグループを明らかにしてきたが、本研究課題ではタンパク質の相互作用を調べた。2重免疫染色によってタイプ1プロコラーゲン(青)とTMX2(赤)は発現部位が一致し、相互作用している可能性が示唆された。培養上清中のサンプルの質量分析と免疫染色の組み合わせも継続して行い、Fボックスタンパク質の1つ、FBXW2が培養細胞側ではなく、骨膜組織の内部で発現していることを明らかにした。さらに骨膜由来細胞の細胞質抽出液の質量分析を行い、候補タンパク質の免疫染色を行った。従来の研究で、ウシ骨膜細胞が培養シャーレ上で3次元構造を形成する際に発現するタンパク質を同定してきたが、タンパク質解析のサンプルに用いたのは培養上清であった。平成26年度から従来の培養上清ではなく、細胞質抽出液を用いて、質量分析によるタンパク質の解析を行った。培養上清を調べた時のコラーゲン以外のタンパク質の候補は、UACA、EXOSC9、TMX2、ベータ-チューブリン、F-box/LRR14などであり、のちに免疫染色によってこれらのタンパク質はすべてウシ骨膜細胞において発現していることを確認しているが、今回細胞質抽出液を用いて得られた候補タンパク質は数が少ないため、現在免疫染色によって確認中なのは、Rho GTPase activating protein 36 (ARHGAP36)のみである。従来調べていたタンパク質と異なり、ARHGAP36は細胞の核に発現しているのが特徴である。ウシ骨膜細胞において発現している複数のタンパク質の発現部位と時期の違いを明らかにするため、従来は培養シャーレの上側、下側、関係なく細胞をごちゃまぜにして作製していたパラフィン切片を改良した。培養細胞のシャーレの底面に接する部分と培養液側にあたる部分をコラーゲンゲルで覆い(ちょうどどら焼きのような状態になる)、コラーゲンゲルにマーカーをつけて上下方向が見えるように切片を作製した。この改良法によって、培養シャーレのどの位置にどのタンパク質が発現しているのか特殊な装置を使わずに明らかにすることができる。従来の研究において、培養したウシ骨膜由来細胞には、Fボックスタンパク質の1つであるFBXL14が発現していることを明らかにしてきた。今年度は以前、候補として挙がっていたにも関わらず、ウシ骨膜由来細胞において発現していることが証明できなかったもう1つのFボックスタンパク質FBXW2についての知見が得られた。従来の研究で明らかにしてきた結果と当該年度の研究成果を比較すると、従来は培養細胞のみの組織切片を作製していたのに対して、当該年度からはオリジナルの骨膜組織と培養骨膜由来細胞がつながった混合物を切片にして免疫染色を行ったため、FBXW2は培養細胞ではなく、骨膜組織の側に存在することが明らかになった。培養した骨膜由来細胞を生体に移植し、骨形成が行われる時期には、培養細胞に発現していたFBXL14も、骨膜組織に発現していたFBXW2も消失していくことがわかった。この研究結果は1編の英語論文としてまとめ、現在投稿中である。より多くのタンパク質の情報を得るため、タンパク質の抽出は、従来の研究で対象としていた培養上清から細胞質へと変更し、質量分析によってタンパク質の同定を試みた。従来の研究と同様にmatrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)およびliquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MSMS)の2種の測定法を試したが、安定した結果が得られず、今後の課題となっている。複数のタンパク質の相互作用に関しては、2重免疫染色によって相対的な発現部位が明らかになりつつある。従来の研究で、タンパク質の解析を行うときに対象としたのは培養上清であり、回収したタンパク質の量は質量分析法に用いるのに充分な量であったが、当該研究では培養細胞の細胞質からタンパク質を抽出しているため、従来と比較して充分な量のタンパク質が得られなかった。遅れが出た原因はタンパク質の抽出方法にあると考えている。しかし、複数の抗体を用いて2重免疫染色などを行い、タンパク質の相互作用について調べているところであり、従来の研究で発現していることがわかっているタンパク質については発現している複数のタンパク質がほぼ同じ部位に発現している様子が明らかになりつつある。従来の研究では、Fボックスタンパク質の1つFBXW2の存在を、培養上清の質量分析によって予測していたが、培養骨膜細胞での発現は明らかにできなかった。培養上清の分析結果をもとに、今年度はFBXW2がオリジナルの骨膜組織の中に存在していることを明らかにした。最終年度までの研究成果で、質量分析で得られたデータと免疫染色(単染色)との組み合わせにより、骨膜由来細胞および骨膜組織に発現しているタンパク質を明らかにしてきた。最終年度では骨膜由来細胞において発現している複数のタンパク質の相互作用を明らかにするために2重免疫染色を行った。まず、タイプ1プロコラーゲンC末端抗体を用いて発現部位をブルーに染色した切片をコントロールスライドとし、引き続き、UACA、EXOSC9、TMX2、β-チューブリンの発現部位をそれぞれの抗体を用いてレッドに染色した。2重染色で2種類のタンパク質が同じ部位に存在する場合、紫色に発色するが、タイプ1プロコラーゲンC末端とTMX2の組み合わせの場合のみ、単染色でブルーに染まった部位が2重染色によって紫色を呈した。

前回の研究課題で、骨膜由来細胞の培養上清からサンプルを採取し、2次元電気泳動を行ったとき、プロコラーゲンC末端とTMX2は同じスポットから検出された(2014年印刷公表済み)。2次元電気泳動において同じスポットに存在する複数のタンパク質はパラフィン切片上でも同じ部位に存在することが示唆された。本研究課題の成果は、質量分析と2重免疫染色の組み合わせにより、タンパク質相互作用を明らかにするという方向性を新たに示すものである。従来の研究では、培養上清をサンプルとし、質量分析を行ってきたが、本研究課題では、細胞質抽出液の質量分析を行った。その結果、Rho GTPase Activating Protein 36 (ARHGAP36)の一部のペプチドを検出したため、候補タンパク質として注目し、骨膜由来細胞の免疫染色を行ってきたが、発現する場合としない場合があることがわかった。細胞の状態によって、結果が異なるタンパク質が存在することが示唆された。今までに培養上清中に含まれるタンパク質を質量分析し、免疫染色(単染色)との組み合わせによりウシ骨膜由来細胞に発現しているタンパク質のグループを明らかにしてきたが、本研究課題ではタンパク質の相互作用を調べた。2重免疫染色によってタイプ1プロコラーゲン(青)とTMX2(赤)は発現部位が一致し、相互作用している可能性が示唆された。培養上清中のサンプルの質量分析と免疫染色の組み合わせも継続して行い、Fボックスタンパク質の1つ、FBXW2が培養細胞側ではなく、骨膜組織の内部で発現していることを明らかにした。さらに骨膜由来細胞の細胞質抽出液の質量分析を行い、候補タンパク質の免疫染色を行った。平成26年度は質量分析によって得られた情報が従来よりも少なかった。その理由は細胞質から採取できるタンパク質量が少ないため、何度も質量分析を行うことができず、質量分析を行っても強いシグナルが得られずに測定が失敗に終わったこともあるからである。また、タンパク質の発現部位を明らかにするため、多層構造を形成している骨膜細胞の上にマーカーをつけようとして何度か失敗に終わったが、生体内の組織のように立体的な形をしているものと違い、培養シャーレ上の細胞は薄くて平べったい形をしているので、形を保ったまま、パラフィン切片を作製することが技術的に難しかったためである。培養細胞の細胞質内のタンパク質抽出液を用いて質量分析を行ってきたが、得られた量が少なかったため、測定およびタンパク質の同定に失敗した。次年度からは培養細胞およびオリジナルの骨膜組織の混合物からタンパク質全体(核、細胞質、細胞外マトリックス)を抽出し、質量分析装置で測定するタンパク質の増量を目指す。タンパク質抽出前の処理も、剪刀などを用いて物理的な力を加えるだけでなく、凍結粉砕するなど、さらに抽出効率のよい前処理法を試みる。2重免疫染色法では、抗体の相性や2色の色素で染め分けをしたときのコントラストの問題など技術的にまだ改善の余地があり、さらに最適な抗体の組み合わせと染色の条件を見つけ出す。再生医療
医療施設選択行動の時系列変化に関する数量的研究

地域医療施設計画の基本的な条件となる住民の医療施設選択行動は、施設の整備水準の変化や地域人口の高齢化などの要因により時系列的に変動している。そこで本研究は昭和48年と昭和59年の2時点において全県レベルの詳細な患者調査が実施された広島県を事例として、医療需要の変動および施設選択行動の変化を数量的に把握し、これら時系列的な変動を考慮した地域医療施設計画の計画技法を考究することを目的に以下の研究を実施した。1.2時点における千人あたり在院率の変化は全国デ-タで8.84から10.04に変化し広島県では8.96から10.78であり、広島県の変化は全国の動向と一致している。またその増分の75.0%から76.0%が人口構成の変化によって説明されることがわかった。つまり年齢階層に着目した解析をすることにより受療行動のの変化の要因を理解でると考えた。2.同時点の市町村別の人口、社会経済デ-タを収集し、上記変動を説明する回帰モデルを作成。その結果、老人の在院率は病床数や施設への移動距離といった医療施設側の要因ばかりでなく、老人の独居や核家族といった老人のおかれた家庭環境が大きく影響することが示唆された。3.2時点の患者調査磁気テ-プより市町村別・年齢病類別の入院医療需要変動を把握する。各年齢階層では老人、成人、小児の順で、各病類グル-プ別ではICD1、ICD2、ICD3の順で2時点ともに圏域が階層的に広くなることが確認された。またそれぞれの患者の利用施設までの平均移動距離は老人が7.71kmから7.53kmに成人が11.0kmから9.17kmに小児が18.44kmから15.92kmへとこの10年で小さくなる傾向にある。4.以上の結果から地域医療計画を行なうさいに考慮すべき点として、老人保健施設や老人病院などの設置による病床の有効利用や、老齢患者にたいする家庭介護への援助など考慮すべきであろう。地域医療施設計画の基本的な条件となる住民の医療施設選択行動は、供給側の医療施設の整備状況、需要側の地域人口の老令化、生活水準の向上に伴う医療要求水準の高度化、地域条件としての経済の変動、交通施設の向上などの様々な要因によって時系列的に変動している。そこで本研究は、二時点(昭和48年および昭和59年)において県レベルの詳細な患者調査の実施された広島県を事例として、医療需要の変動および住民の施設選択行動の変化を数量的に把握し、時系列的変動を考慮に入れた地域医療施設計画の計画技法を考究することを目的として、以下の調査を実施した。1.昭和48年と昭和59年の二時点における市町村ベースの広島県の地域データベースの作成。2.上記二時点で実施された患者調査データの磁気テープから患者住所地市町村ベースの集計を行い、性別年令別・病類別・医療圏別の医療需要変動データベースを作成。3.上記のデータベースを用いて、患者住所地×施設所在地の始終点テーブルを、性別年令別・病類別に作成。4.これによって数量的に把握された入院需要変動を、地域データベースによって時系列的に説明するといくつかの回帰モデルを作成。量的には60才以上の年令グループの挙動が大きく変動し、この捉え方が鍵であることが確認された。5.全県および医療圏ごとに施設選択行動を多項ロジットモデルを用いて分析し、その結果を検討中。

6.上記のプロセスをワークステーションの上でグラフィック表現を用いて実行するためのプログラム開発の準備。地域医療施設計画の基本的な条件となる住民の医療施設選択行動は、施設の整備水準の変化や地域人口の高齢化などの要因により時系列的に変動している。そこで本研究は昭和48年と昭和59年の2時点において全県レベルの詳細な患者調査が実施された広島県を事例として、医療需要の変動および施設選択行動の変化を数量的に把握し、これら時系列的な、昭和63年度においては需要の変動を、特に老人の在院率に着目して回帰モデルで分析した。平成元年度は入院患者の受療圏の変化を中心に以下の研究を実施した。1.2時点の患者調査磁気テ-プより市町村別・年齢病類別の入院医療受療圏の変化を把握した。各年齢階層では老人、成人、小児の順で、各病棟グル-プ別ではICD1、ICD2、ICD3の順で2時点ともに圏域が階層的に広くなることが確認された。また年齢階層別の患者の利用施設までの平均移動距離は老人が7.71kmから7.53kmに成人が11.0kmから9.17kmに小児が18.44kmから15.92kmへとこの10年で小さくなる傾向にあり、病類別でもICD1が7.05kmが6.75kmへ、ICD2では10.63kmが8.81kmへ、ICD3では19.15kmが18.61kmへと減少している。しかしながら59年時には備北地方の圏域が広島市に吸収され一極型の大圏域となった。一方福山市を中心とする県西部では昭和48年時と同様の階層型構造が観察された。2.昨年度の結果とあわせて、以上の結果から地域医療計画を行なうさいに考慮すべき点として、老人保健施設や老人病院などの設置による病床の有効利用や、老齢患者にたいする家庭介護への援助など考慮すべき点であろう。
新規芳香族酸トランスポーターの解明と次世代有用ポリマー原料生産への応用

フタル酸類分解菌Comamonas sp. E6株によるテレフタル酸(TPA)の細胞内取り込みに、tripartite tricarboxylate transporter(TTT)と類似する新規のトランスポーターが関与することを明らかにした。本トランスポーターは、TPA結合タンパク質TphC、大膜タンパク質成分TpiAおよび小膜タンパク質成分TpiBから構成される。また本トランスポーターは、プロトン駆動力をエネルギーとして要求することが示された。工業的に安価且つ大量に生産されるテレフタル酸(TPA)からプロトカテク酸を経由して生分解性・高機能性有機材料の原料となる2-ピロン-4,6-ジカルボン酸(PDC)を生産するバイオプロセスを構築する上で、基質の細胞内取り込みが障壁となることが示唆されている。これまでにTPA分解菌Comamonas sp.E6株において、TPA分解系遺伝子群(tph遺伝子群)の機能が明らかにされてきたが、TPAの細胞内への取り込み系についてはほとんど知見が得られていなかった。しかしtph遺伝子群中のtphCが、2つの膜タンパク質成分と基質結合タンパク質(SBP)から構成されるtripartite tricarboxylate transporter(TTT)familyのSBPと20%以上の同一性を示したことから、E6株のTPAの取り込みにTTT familyに属するトランスポーターが関与することが示唆された。本研究では、E6株のTPA取り込みに関与する遺伝子の単離と解析を行った。はじめにComamonas testosteroni KF-1株のゲノム配列中に、TTTシステムの膜成分遺伝子tctBAと相同性を示す2セットの遺伝子を見いだした。KF-1株の配列情報を利用して、E6株から2セットの相同遺伝子tctBAとtpiBAを単離した。tctAとtpiAの破壊株を作製し、解析した結果、tctA破壊株は、TPAでの生育能を失わず、クエン酸での生育能を欠損した。一方、tpiA破壊株は、TPAでの生育能を完全に失った。^<14>C標識したTPAの取り込み実験から、E6株のTPA取り込みにtpiAが必須な遺伝子であることが明らかとなった。Comamonas sp.E6株のテレフタル酸(TPA)取り込みシステムは、TPA結合タンパク質(TphC)と膜タンパク質成分(TpiA-TpiB)から構成されることを昨年度明らかにした。今年度は、TPA取り込みシステムの生化学的特性について解析を行った。TPAで培養したE6株のTPA取り込み系の至適pHは7.5であった。TPAの取り込みに要求されるエネルギーを明らかにするために各種阻害剤の影響を調べた。その結果、carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazoneを添加した際に阻害が観察された。一方、バリノマイシンやATPase阻害剤を用いた時には影響は見られなかった。以上から、TPAの取り込みはプロトン駆動力に依存していることが強く示唆された。TPAの取り込みが他の芳香族カルボン酸の存在下で阻害されるか否かについて調べた。非標識のTPAを競合させた時に90%以上の[^<14>C]TPA取り込みの阻害が観察されたのに対して、イソフタル酸(IPA)及びフタル酸(OPA)の存在はTPAの取り込みに影響しなかった。本実験の培養条件では、TPA代謝系遺伝子群の転写が誘導されているが、IPA代謝系遺伝子群はほとんど発現しないことから、IPA共存下でTPAの取り込みが阻害されなかったという事実は、TphCがIPAを捕捉できないことを示唆している。一方、PCAの添加時に約60%のTPA取り込みの阻害が見られた。TPA培養時には代謝中間体であるPCAの代謝系遺伝子群が発現することから、本培養条件において未同定のPCA結合タンパク質が生成し、TpiA-TpiBと相互作用したことによってTPAの取り込みが阻害されたものと推察された。以上の結果から、TpiA-TpiBと相互作用する基質結合タンパク質がTphC及びIphC以外にも存在することが示唆された。昨年度までに、Comamonas sp. E6株のテレフタル酸(TPA)取り込みシステムが、TPA結合タンパク質のTphCと膜タンパク質成分のTpiA-TpiBから構成されることが強く示唆された。本年度は、TPA取り込みシステムが、真にTpiA-TpiBとTphCから構成されることを調べるために、TPAの取り込み能がなく、さらにTPA変換活性がないPseudomonas putida PpY1100株を宿主として、tphCとtpiBA遺伝子およびTPAをプロトカテク酸へと変換する酵素遺伝子群(tphA2A3BA1)を導入した組換え体を作製し、TPAの変換能に基づいてTPA取り込み能を評価した。

具体的には、tphA2A3BA1に加えてtphCとtpiBAをpJB866に導入したプラスミド、tphA2A3BA1に加えてtpiBAを導入したプラスミド、tphA2A3BA1に加えてtphCを導入したプラスミド、そしてtphCとtpiBAだけを導入したプラスミドを作製し、これらのプラスミドをPpY1100株に導入し、形質転換体を得た。各形質転転換体の細胞抽出液を用いてTPA変換活性を調べた結果、tphA2A3BA1を含むプラスミドを導入した形質転換体においてTPA変換能が見られた。一方、各形質転換体の休止細胞のTPA変換活性を調べた結果、tphA2A3BA1に加えて、tphCとtpiBAの両者を導入した形質転換体だけに活性が観察された。tphCとtpiBAの導入によってP. putidaがTPA取り込み能を獲得したことから、E6株のTPA取り込みシステムがTphCとTpiA-TpiBから構成されることが明らかとなった。本研究により、TPA変換系遺伝子を発現させた異種宿主によるTPA変換が可能となり、TPAからの有用物質生産系を構築するための基盤が整った。今年度の研究においてテレフタル酸(TPA)の取り込みシステムの生化学的特性を明らかにすることができた。さらに、本取り込みシステムの膜成分であるTpiA-TpiBがTPA結合タンパク質およびイソフタル酸結合タンパク質に加えて、未同定のプロトカテク酸の結合タンパク質と相互作用する可能性が示唆され、一つの膜タンパク質装置が複数の基質結合タンパク質と相互作用する可能性を示唆する重要な知見を得た。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度までの研究によってテレフタル酸(TPA)の取り込みシステムの全体像が明らかになってきた。最終年度においては、代謝系遺伝子とオペロンを組み誘導的に発現する基質結合タンパク質遺伝子に対して、膜タンパク質成分をコードするtpiBA遺伝子が構成的に発現するのか或は誘導的に発現するのかを明らかにする。またtpiBA遺伝子とTPA結合タンパク質であるtphC遺伝子をPseudomonas又は大腸菌において発現させることによってTPA取り込み能を再構成し、さらに代謝系遺伝子を共発現させることによりTPAからの高機能性有機材料の原料化合物である2-ピロン-4,6-ジカルボン酸(PDC)の生産性の向上を図る。
スピン分極をもった短寿命反応中間体の電子・核二重共鳴法による時間分解測定

電子・核二重共鳴法の時間分解測定に先だち、マイクロ秒領域で安定な時間分解ESR測定が可能な、デジタルオシロスコープを組込んだ装置の立ち上げと、また強いスピン分極が得られる系に関する予備的実験を主に行なった。従来、電子・核二重共鳴法用に用いてきたESRキャビティーは光励起用の窓をもたない。したがって窓のあるTE_<011>型キャビティーを用い、RFコイルを直接試料流動セルに取り付けて測定する方針を固め、この装置により強いCIDEPが可能な系を用い研究を行なった。(1)まず芳香族カルボニル化合物(主にキサントン)の金属アルコキンドによる光還元の系に着手した。光励起された三重項キサントンはアルコキシド反応し、能率良くアニオンラジカルが生成した。その時間分解ESRスペクトルの解析から、このアニオンラジカルは生成直後から金属カチオンと相互作用をしていることが明らかとなった。また初期に生成するアルコキシルラジカルはナノ秒よりも短寿命であることも判明した。この系は各スペクトル線幅内に金属核の超微細構造が隠れており、今回の題目の手法の対象として有望と考えられる。さらに(2)無水マレイン酸の光増感反応により生じる異常スピン分極、(3)AIBN(重合開始剤)の励起一重項状態からの分解機構、(4)TMPDの励起一重状態からの光イオン化過程等に関しても研究を行ない、それぞれ反応機構およびスピン分極に関して新しい知見が得られた。特に(2)の系は有望と期待できる。電子・核二重共鳴法を実際に(1)、(2)の系に試みたが、現時点では信号強度が弱く、またラジオ波の検出系への漏れ等の問題があり、再現性が得られていない。現在はコンピューターによる積算等のデータ処理、さらに装置の感度向上、レーザーの改良等を、予備的な時間分解ESR測定と平行して行っている。
急性骨髄性白血病予後不良因子の機能解析

その高発現が白血病の予後不良因子として認識されながら、機能が知られていないBAALC (brain and acute leukemia, cytoplasmic)について、私はBAALCの遺伝子改変マウスを作成し、その生体内での役割について解析した。BAALCconventionalノックアウトマウスの胎生期造血細胞は、cell cycleが亢進しており、colony assayではcolony数の増加を認め、骨髄移植を行うとレシピエントマウスにおけるキメリズムの上昇を認めた。以上から、in vitro、in vivoの両方においてノックアウトマウスの胎生期造血細胞では増殖能の亢進をきたすことが明らかとなった。次に、BAALCconditionalノックアウトマウスを作成した。BAALCfloxマウスとMx-Creマウスを交配し、PIPC投与により造血細胞でBAALC欠失を誘導する系である。このノックアウトマウスは成体期において定常状態で血算の異常は認めないが、5FU投与後の骨髄回復が有意に速く、CFU-S (colony forming unit spleen)アッセイではコロニー数の増加を認めた。以上からノックアウトマウスでは短期骨髄再構築能は亢進していることが明らかとなった。一方で、このノックアウトマウスでは造血幹細胞分画は減少しており、serial competitive bone marrow transplantation assayでは長期骨髄再構築能は低下していることが明らかとなった。以上から、BAALC造血幹細胞のstemness維持に寄与しており、その欠失が短期での増殖亢進と長期骨髄再構築能低下をもたらすものと考えられた。独創的な実験から得られたこれらの成果は、BAALCの造血における生理的役割を知る上で非常に重要な知見である。その高発現が白血病の予後不良因子として認識されながら、機能が知られていないBAALC(brain and acute leukemia, cytoplasmic)について、私はBAALCの遺伝子改変マウスならびにレトロウイルスによる過剰発現の系を作成し、その生体内での役割について解析した。レトロウイルスによりBAALCを導入した骨髄細胞のメチルセルロース半固形培地におけるコロニー形成能、過剰発現させた骨髄細胞の骨髄移植モデルの解析から、BAALCがin vitro、in vivoの両方において、血液細胞の増殖を負に制御することを明らかとした。さらに、BAALCの生理的な機能をより明確にするために、BAALCの遺伝子改変マウスを作成した。BAALCのconventionalノックアウトマウスは、胎生11.5-12.5日で胎盤の形成不全により、胎生致死となることを明らかとした。この表現型には性差があり、メスの方が強い表現型を呈した。胎生11.5日における胎盤のHE(Hematoxilin-Eosin)染色による病理組織像を調べたところ、ノックアウトマウスでは海綿状栄養膜細胞の胎盤迷路への侵入がほぼ認められず、また、迷路細胞の成熟度合いを示す、迷路細胞の癒合傾向もノックアウトマウスでは阻害されていた。以上から、メスのノックアウトマウスでは海綿状栄養膜細胞、迷路細胞の成熟がwildマウスと比較して遅れていることが明らかとなった。独創的な実験から得られた以上の成果は、BAALCの造血、発生における生理的役割を知る上で非常に重要な知見である。