hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミクロポーラスカーボンを原料としたカーボン固体酸の合成とその酸触媒活性

実際、この9か月の滞在で完遂できた仕事としてはモデル反応の構築のみであるがリグニンという巨大ポリマーの構造を司るある重要な結合(β-O-4結合と呼ばれる)をこの分光装置で見ることが出来き、それが分解反応の過程で減少していくことが観察された。また、リグニンでは複雑すぎ、実際の所多くのシグナルが混在しているため、観察をさらにシンプル化するために「モデル化合物」という非常に簡単な構造をした、しかしながらβ-O-4結合を有する芳香族二量体化合物の分解反応も同装置で観察を行った。やはり反応中に同結合の分解が見られ、さらに反応後に溶液中の内容物を分析したところ、出発物質は残っておらず分解生成物のみが観察されたことからもこの反応のin-situ観察はうまく機能したと言える。本来の予定ではバイオディーゼル合成における液相中の反応メカニズム観察も行う予定であったがそこまでは達成できなかった。当初の計画ではベックマン転位反など種々の有機合成反応において性能を試験する予定であった.合成した触媒を繰り返し用いたところ活性が低下してしまい,分析の結果細孔内に分子が詰まって性能を低下させてしまっていることが分かった.この欠点を逆手に取り,細孔に入りきらない大きさの分子を用いて反応を行ったところ,硫酸など既存の触媒と比べて活性が向上し,かつ繰り返しの利用にもほとんど性能を落とさずに耐えうることが分かった.現在,この触媒がバイオディーゼル合成のための油脂のエステル交換反応に有効に働く触媒であることを見出したところである.繰り返しの利用や不純物の存在下でも性能を発揮するこの触媒が反応を進行させるメカニズムを,反応速度論や分光学的アプローチから解明することが目標である.(抄録なし)
農学と工学の接点としての生物電気化学

平成12年3月開催の国際研究集会「21世紀における生物電気化学の展望」に関する企画調査を目的とした本研究において、農学と工学の研究者さらに理学の研究者も含めてそれぞれが、生物電気化学をどのような研究分野として認識しているかについて、相互の理解を得ることからスタートした。酵素反応や抗原-抗体反応の生化学に関する研究者と、これらの反応をセンサーとして利用する立場からの研究者間での意見交流、植物光障害、ストレス応答の立場からの活性酸素研究と電気分析化学的立場からの活性酸素反応研究との接点、生物機能の有効利用と電気化学、生物分析法としての分光電気化学研究、など個別の具体的研究事例に基づいた議論が行われた。その集約として、生物の基礎理解や有効利用において、生物現象の電気化学的把握、適切な分析技術の重要性が共通の認識となった。また、工学的立場から生物を扱う場合に、生物本来の性状や機能についての理解が大変重要であるとの結論に達した。今後生物を対象とする研究を進めるにあたって、特にその機能的側面の研究において、それが基礎的研究であれ、応用研究であれ、生物現象の電気化学的立場からの理解が不可欠であるとの合意を得た。このような共通認識をふまえて、国際研究集会の企画として、生物・生体機能解明、生物・生体機能利用、生体膜機能-電荷移動、の三つの柱をたて、それぞれについて具体的テーマの設定を行った。この企画研究による具体的研究調査、議論、総括によって生物電気化学の新しい研究領域の重要性が明確になった。
気管支喘息における免疫グロブリンの機能解析

気道粘膜におけるIgG輸送がFcRnを介して行われていることを示した。また、喘息モデルマウスに外因性にIgGを投与したところ喘息が軽減することが示された。この効果は特にIgG1型の免疫グロブリンで顕著であったが、FcγレセプターIIBを欠損させたマウスでは効果は認められなかった。これは肺の抗原提示細胞の活性化修飾によるもので、FcγレセプターIIB欠損マウスに野生型マウスの骨髄から誘導した抗原提示細胞を移植することで、野生型マウス同様にIgGの抑制効果を認めたことで証明された。1.マウスにrabbit IgGを静脈投与し血中および気道内のIgG濃度を経時的に観察したところ、FcRn欠損マウスでは野生型に比べ早期(24時間後)に血中、気道中ともに検出感度以下まで低下した。外因性のIgGに対してもFcRnは生存延長に働いていることが証明され、また、IgGが容易に血管から気道内に輸送されることも併せて示唆された。2.外因性IgG投与による喘息表現型への関与を見るため、OVA喘息マウスにrabbit IgGの投与を行ったところ、IgGの濃度依存性に気道炎症が抑制され、気管支洗浄液中の好酸球数、気道過敏性が抑制された。臨床で報告されている気管支喘息の大量免疫グロブリン(IVIg)療法をマウスモデル化したものと考え、以下の実験を行った。3.IVIg療法は自己免疫疾患ではFcRnを介する機序が報告されていることから、喘息に対するIVIg療法でのFcRnの役割を検討するため、FcRn欠損(KO)マウスに同様に、IgGの静脈投与療法を行ったが、効果に差は認められず、FcRnを介する機序は否定された。4.IVIg療法の作用機序として、他のIgGのFcレセプターを考慮し、各種FcRのKOマウスにIgG静注治療を行ったところ、FcRIIBKOマウスのみIVIgの効果が見られなかったことよりFcRIIBを介した機序を想定した。気管支喘息の抗原提示細胞である気道粘膜下の樹状細胞(DCs)に着目し、無治療喘息マウスとIgG投与喘息マウスに蛍光標識したOVAを気道投与したところ、気道所属リンパ節へのDCsによる抗原輸送がIgGにより抑制されること、また、同マウスより単離培養したDCsの活性化もIgGの存在下で抑制されることが明らかとなった。以上の知見から、外因性にIgGを静脈投与することで気道樹状細胞上のFcRIIBを介して気管支喘息を抑制することが証明された。平成19年度の研究により気管支喘息モデルマウスに非特異的なIgGを静脈投与したところ、喘息が軽減されることを見いだしたが、本年度は抗原特異的なIgGを気道投与することで、更に気道炎症が抑制されることを発見した。IgGのサブタイプ(IgG1, IgG2a, IgG2b)を喘息モデルマウスにそれぞれ投与したところ、IgG1型の免疫グロブリンが最も喘息を抑制することが明らかとなった。IgGのレセプターであるFcレセプターの内、Fcγ、FcRIIB、FcRnのノックアウトマウス(KO)を用い、同様の実験を行ったところ、FcγKOでは喘息が誘導されないことがわかり、一方、FcRIIBKOでは喘息の誘導には差がないものの、抗原特異的IgG投与による喘息の治療効果は消失することが判明した。また、FcRnKOは特に野生型と喘息の表現型には差が生じないことが証明された。外因性の抗原特異的IgGの治療効果の機序解明のため、喘息の抗原提示細胞であるCDllc陽性細胞に着目した。喘息マウスの肺組織よりCDllc陽性細胞を単離培養し実験を行ったところ、IgG治療マウス群ではCDllc陽性細胞のCD4T細胞への抗原提示能が低下しており、また、抗原提示細胞の機能である気道から所属リンパ節への抗原遊走能も低下していた。前述のごとく、IgG治療効果はFcR II BKOでは消失していることから、抗原提示細胞上のFcR II Bを介してIgGは抗原提示細胞の機能低下を起こすことが推定された。
細胞骨格制御タンパク質による肺胞構築恒常化機構の解明

細胞骨格制御タンパクのひとつであるモエシンは、免疫組織学的検討により、マウス正常肺の肺胞上皮細胞に強い発現を認めた。ブレオマイシン肺線維症モデルマウスを用いた検討では、モエシンが肺線維化過程において、肺間質内の線維芽細胞や浸潤細胞にも強い発現を示すことが示されたものの、その機能的役割までは解明できなかった。一方で、モエシンとの相互作用が報告されている中性エンドペプチダーゼ(NEP)の活性を調査し、ALI/ARDS病態下での血漿中の活性低下および気管支肺胞洗浄液中の活性増加を見出した。炎症反応過程に伴う不適切な肺損傷および肺線維化による機能的肺胞障害に対する臨床的に有効な治療法は未だ存在せず、肺組織の損傷・修復メカニズムの解明はALI/ARDSを含む重篤な炎症性肺疾患に対する治療法を確立する上でも重要である。本研究は、細胞骨格制御タンパク質であるモエシンが、肺組織において特異的発現を示す肺胞上皮細胞において内在性の肺胞構造維持タンパク質としての役割を探求することを目的とする。この目的を達するため、平成21年度は、主に野生型マウスならびにモエシン欠損マウスの肺組織よりII型肺胞上皮細胞を分離培養し、in vitroにおいて生体内での肺胞上皮構造を模倣することに主眼を置いた。しかしながら、モエシン遺伝子の改変マウスの繁殖が困難を極め、加えてマウスからのII型肺胞上皮細胞の回収率・生存率の低下が問題となり、予定していたプロトコールでの実験遂行は困難と判断した。このため、次年度では代替方法を用い、ヒト肺胞上皮細胞を使用し遺伝子ノックダウン技術を用いて、モエシン遺伝子発現を抑制することにより、研究計画の継続遂行が図れるよう努める。一方で、我々はモエシンとの相互作用が示唆されている膜タンパクである中性エンドペプチダーゼ(NEP)に着目し、臨床的ならびに実験的肺損傷時に、循環血漿中において、その活性が低下することを見出した。加えて一方で、気管支肺胞洗浄液(BALF)中においては、対照的にNEP活性の増加を認めた。現時点でALI/ARDS病態下での有効なバイオマーカーは存在せず、この事実はALI/ARDSによる肺胞障害の重症度マーカーとしての可能性を示唆するものである。炎症反応過程に伴う重篤な肺損傷や、その後の不適切な修復反応による肺線維化による機能的肺胞障害に対して、臨床的に有効な治療法は未だ存在しない。このため、肺組織の損傷・修復メカニズムの解明は急性肺損傷/急性呼吸窮迫症候群(ALI/ARDS)を含む重篤な炎症性肺疾患に対する治療法を確立する上でも重要である。本研究は、細胞骨格制御タンパク質であるモエシンが、肺組織において肺胞上皮細胞に特異的に発現を認めることから、肺損傷・修復過程における機能的役割を探求することを目的として開始された。われわれは、モエシンを含むERMタンパク質群と細胞膜上で相互作用を示すと考えられる中性エンドペプチダーゼ(NEP)に着目した。NEPはALI/ARDS病態下で炎症反応を制御しうるが、生体内での酵素活性が低く、このため詳細な生理活性変化は明らかにされていない。このため、高感度測定法であるHPLC蛍光法にて、NEP活性を測定した。NEP活性はNEP活性阻害剤thiorphanで抑制される水解活性を指標とした。これにより、食道癌根治術後にALI/ARDSを発症した患者血漿中で、NEP活性が低下することを見出した。また同様に、肺損傷モデルマウスの血漿中および肺組織中における活性低下を認めた。こうしたNEP活性の低下は、免疫組織染色あるいは免疫ブロッティング法におけるタンパク質の発現抑制を伴っていた。一方で、気管支肺胞洗浄液(BALF)中においては、NEP活性は対照的に増加していた。こうしたNEP活性の変化は、ALI/ARDSの病態に少なからず影響を与える可能性がある。またNEP活性の変化は、ALI/ARDSの重症度指標としての可能性を示唆するものであり、本研究内容を2010年のRespiratory Research誌に発表した。
遺伝子発現プロファイリング解析を応用した新規膵癌治療戦略

膵癌は予後不良な癌腫の1つであり、唯一の根治治療は外科的切除のみである。外科的切除をした膵癌患者の予後を最も規定する因子がリンパ節転移であることから、本研究では凍結膵癌切除標本を用いて、膵癌細胞のみをマイクロダイセクションし、そのRNAを用いて網羅的遺伝子発現解析を行った。そのマイクロアレイデータをリンパ節転移あり群となし群で比較し、リンパ節転移特異的な遺伝子群の同定を行った。その結果、膵癌においてリンパ節転移サンプルで高発現を認めたのが29遺伝子、低発現を認めたのが17遺伝子であった。これらの遺伝子群を免疫染色解析によるタンパク発現解析を行った結果、リンパ節転移あり群で高発現を認めたのはMUC17、LI-cadherin、XKであった。また低発現を認めたのはAP2αであった。さらに多変量解析においても、膵癌リンパ節転移に関与していたのは、MUC17高発現とAP2α低発現であった。膵癌は予後不利様な癌腫で、その唯一の根治可能な治療は外科的切除のみである。しかしながら外科的切除を受けた膵癌患者の5年生存率は、20%にも及ばないのが現状である。また外科的切除を行った膵癌患者の予後を規定する因子は、リンパ節転移のみであることは多くの報告より分かっている。そこでわれわれは、切除膵癌標本を用いて、膵癌リンパ節転移予測遺伝子の同定を試みた。対象サンプルは根治切除した膵癌組織50例で、リンパ節転移陽性群を25例、陰性群を25例とした。まず膵癌析出標本の一部を凍結包埋し、その組織を9μmに薄切した。続いてヘマトキシレン染色をした後、膵癌腫瘍部を選択的にマイクロダイセクションし、膵癌細胞のみを回収した。回収した膵癌細胞から、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。そのRNAをAgilent 2100Bioanalyzer(Agilent社)にてQualityをチェックし、RNAの質の指標であるRINが5.0以上であることを確認した。続いて膵癌組織RNA100ngを用いて、RNAマクロアレイアッセイ(Affymetrix社)を行った。逆転写酵素とpoly-Tプライマーを用いてcDNA合成を行い、T7RNAポリメラーゼを用い、2サイクル増幅させ、in vitro transcriptionを行った後、biotinにてラベル化した。15μg分のcRNAを35200ntになるように断片化し、Gene Chip Human U133 plus 2.0 array(Affymetrix社)に注入し、17時間hybridizationを行った。Fluidics Station(Affymetrix社)にてwash and stainを行い、Fluoronletric scannerにてスキャンし、シグナル強度をGene Chip Operating Software(GCOS)で解析した。そのマイクロアレイデーターをDNA Chip softwareを用いて、Normahzationし、その絶対値をリンパ節転移陽性群と陰性群で比較解析した。その結果リンパ節転移陽性群で高発現した遺伝子29個と低発現した遺伝子17個を同定した。これらの遺伝子群は膵癌のリンパ節転移に強く相関する遺伝子群であり、今年度はこれらの遺伝子群のタンパク発現解析を行い、立証する。回収した膵癌細胞から、RNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。そのRNAをAgilent 2100Bioanalyzer (Agilent社)にてQualityをチェックし、RNAの質の指標であるRINが5.0以上であることを確認した。

逆転写酵素とpoly-Tプライマーを用いてcDNA合成を行い、T7RNAポリメラーゼを用い、2サイクル増幅させ、in vitro transcriptionを行った後、biotinにてラベル化した。15μg分のcRNAを35200ntになるように断片化し、GeneChip Human U133 plus 2.0 array (Affymetrix社)に注入し、17時間hybridizationを行った。Fluidics Station (Affymetrix社)にてwash and stainを行い、Fluorometric scannerにてスキャンし、シグナル強度をGeneChip Operating Software (GCOS)で解析した。そのマイクロアレイデーターをDNA Chip softwareを用いて、Normalizationし、その絶対値をリンパ節転移陽性群と陰性群で比較解析した。その結果リンパ節転移陽性群で高発現した遺伝子29個と低発現した遺伝子17個を同定した。これらの遺伝子群は膵癌のリンパ節転移に強く相関する遺伝子群であり、これらの遺伝子群を立証するべく、免疫染色解析を行った。その結果4遺伝子(AP2α, MUC17, LI-cadherin, XK)が、リンパ節転移陽性群と陰性群で差を認めた。さらに網羅的遺伝子解析に用いなかった40例を用いても,同様の結果を得られ、これらの遺伝子群は膵癌のリンパ節転移に関与していることがわかった。今後これらの遺伝子群を用いて、さらなる研究を行い、膵癌の新規治療のtargetになりうることを証明する。
チラコイド膜脂質が光化学系IおよびII複合体の構築に果たす機能

ホスファチジルグリセロール(PG)は、光合成の初期反応が起こるチラコイド膜に存在する唯一のリン脂質である。これまでに、PGが光合成生物において必須要素である事は示されているが、PGが果たす具体的な機能についてはあまり解明されていない。本研究では、PG合成能を欠損する、ラン藻の変異株を用いた解析を中心に、光化学系II(PSII)複合体におけるPGの機能の解明を目的とした。昨年度までの解析において、PG含量が低下した変異株より精製したPSII複合体からは、酸素発生をつかさどるMnクラスターの安定化に必要な、表在性タンパク質の多くが解離している事を見出していた。この結果に対し、PG含量が低下した変異株では、表在性タンパク質が、細胞レベルにおいても解離しているのかどうかについては疑問が残っていた。そこで、PG含量が低下した変異株の細胞を熱処理し、酸素発生活性の変化を調べたところ、温度依存的に活性が低下することが確認された。この事から、変異株のMnクラスターは、細胞レベルにおいても、表在性タンパク質で保護されておらず、不安定な状態にある事が分かり、PGが表在性タンパク質の結合を介して重要である事が明らかとなった。また、野生株より精製したPSII複合体をホスホリパーゼ処理する事で、PG分子を分解し、その際の活性の変化を調べる事で、PGの機能を明らかにしようと考えた。ホスホリパーゼ処理により、水分子からQ_Aに依存する酸素発生活性は、それほど影響を受けなかったが、それに対して、水分子からQ_Bに依存した酸素発生は、70%程度減少した。この結果より、PGはQ_Bにおける電子伝達を維持するために重要である事が示された。以上、昨年度の結果と合わせ、PGはPSII複合体の酸化側においては、表在性タンパク質の結合を介し、また、還元側においては、Q_Bにおける電子伝達を正常化することで、PSIIの機能を維持するために重要である事が明らかとなった。ホスファチジルグリセロール(PG)は、光合成の初期反応が起こるチラコイド膜において唯一のリン脂質である。これまでに、PGが光合成生物において必須要素である事は示されているが、PGが果たす機能の具体的メカニズムについてはほとんど解明されていない。本研究では、PG合成能を欠損するラン藻の変異株を用いて、光化学系II(PSII)複合体におけるPGの機能の解明を目的とした。PG添加培地で培養された変異株を、PGを含まない培地に植え継ぐと、細胞分裂にともないチラコイド膜におけるPG含量が低下する。PG含量が低下した変異株よりPSII複合体を精製し、その特性を野生株のものと比較する事で、PGがPSII複合体の構築にどのように関与しているかを明らかにした。チラコイド膜においては14%程度を占めるにすぎないPGであるが、PSII複合体では、全脂質の30%近くに達する事が、野生株のPSII複合体を用いた脂質分析から明らかとなった。一方、変異株のPSII複合体では、PG含量が野生株に比較して、およそ50%程度であった。また、変異株のPSII複合体は、多くが二量体でなく、単量体であったことから、PSII複合体の二量体化におけるPGの重要性が示された。また、変異株のPSII複合体は、野生株の50%程度の酸素発生活性を有するのみであり、そのタンパク質組成を調べると、酸素発生をつかさどるMnクラスターの安定化に必要な、表在性タンパク質の多くが解離している事が明らかとなった。Mnの含量を分析したところ、変異株のPSII複合体では、野生株に比較して25%程度減少しており、Mnクラスターが不安定化しているものと推測された。また、PSII複合体に結合せず、チラコイド膜ルーメン内に蓄積していた表在性タンパク質は、PGによって複合体に再結合する事が示された。これらの結果から、PGはPSII複合体の主要な構成成分であり、Mnクラスターの安定化に必要となる表在性タンパク質の結合を介して、PSII複合体の形成に重要である事が明らかとなった。

ホスホリパーゼ処理により、水分子からQ_Aに依存する酸素発生活性は、それほど影響を受けなかったが、それに対して、水分子からQ_Bに依存した酸素発生は、70%程度減少した。この結果より、PGはQ_Bにおける電子伝達を維持するために重要である事が示された。以上、昨年度の結果と合わせ、PGはPSII複合体の酸化側においては、表在性タンパク質の結合を介し、また、還元側においては、Q_Bにおける電子伝達を正常化することで、PSIIの機能を維持するために重要である事が明らかとなった。
口腔癌における新たな癌抑制遺伝子(Headpin gene)異常の検索

HEADPIN遺伝子は染色体18q21.3に位置し、セリン・プロテイナーゼ阻害因子ファミリー(serpin)の一員である。これらの遺伝子ファミリーは腫瘍による血管新生、浸潤、転移を抑制する機能を有すると考えられている。HEADPIN遺伝子の発現はp16、RB、VHL、E-cadherin、KAI1などの腫瘍抑制遺伝子と同様にDNA変異だけでなくエピジェネティツクにより発現調整されている可能性がある。今回我々は、独自に開発した口腔疾患解析用cDNAマイクロアレイを作製し、口腔扁平上皮癌の遺伝子発現状況を検索したところ、HEADPIN遺伝子の発現が口腔扁平上皮癌において減弱していることを突き止めた。さらにHEADPIN遺伝子のmRNA発現状況、DNAメチル化状況の検索、さらに脱メチル化剤を使用した遺伝子の発現状況について検索を行った。その結果、RT-PCRにより原発口腔癌組織30例中17例(56.7%)において、9種類の口腔癌由来細胞株中6種類においてHEADPIN遺伝子の発現が減弱/消失していることが明らかになった。また、DNA脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidineで処理することにより、これらHEADPIN遺伝子発現減弱/消失していた6種類の細胞株のうち5種類においてHEADPIN遺伝子の再発現を認めた。以上のことから、HEADPIN遺伝子発現の減弱は口腔癌発生に関与し、その発現減弱の主要な、メカニズムの一つとしてDNAのメチル化が関与していることが示唆された。口腔扁平上皮癌39例を採取し、同組織より、DNA、RNAおよびタンパク質を抽出した。それぞれの核酸、タンパク質を精製して、以下の実験を行った。1)新規癌抑制遺伝子(headpin gene)の存在する染色体(第18番染色体長腕領域;18q21.3)のマイクロサテライト領域のヘテロ接合性の消失について検索を行った。2)headpin geneのexon配列を調べ、それぞれのexonに対応したプライマーを設計して、PCR-SSCP法を行い、DNAの異常について調べた。作製したプライマーを使用して、RT-PCR法を行い、mRNAの発現状況について検索を行った。以上の実験より以下の結果が得られた。1)マイクロサテライト領域におけるヘテロ接合性の消失(LOH)と、DNAの構造異常(mutation)はあまり認められなかった。LOH;2/39(5.1%)、mutation3/39(7.7%)2)headpin遺伝子のmRNA発現状況をRT-PCR法により検索したところ、口腔癌組織の31%にmRNA発現の減弱あるいは欠失を認めた。今後、症例数を増やすとともに、DNA methylationの影響やheadpin特異的抗体の作製について検討し、headpin geneのさらなる検索を続けていく予定である。さらに口腔扁平上皮癌10例を採取し、同組織より、DNA、RNAを抽出した。それぞれの核酸を精製して、以下の実験を行った。3)headpin geneのプロモーター領域の塩基配列を検索し、その部位に特異的なプライマーを設定し、DNAをメチル化処理し、遺伝子のメチル化状況について検索した。LOH;1/10、mutation 0/102)DNAのメチル化状況は10例中2例に認められた。

HEADPIN遺伝子の発現はp16、RB、VHL、E-cadherin、KA11などの腫瘍抑制遺伝子と同様にDNA変異だけでなくエピジェネティックにより発現調整されている可能性がある。今回我々は、独自に開発した口腔疾患解析用cDNAマイクロアレイを作製し、口腔扁平上皮癌の遺伝子発現状況を検索したところ、HEADPIN遺伝子の発現が口腔扁平上皮癌において減弱していることを突き止めた。さらにHEADPIN遺伝子のmRNA発現状況、DNAメチル化状況の検索、さらに脱メチル化剤を使用した遺伝子の発現状況について検索を行った。その結果、RT-PCRにより原発口腔癌組織30例中17例(56.7%)において、9種類の口腔癌由来細胞株中6種類においてHEADPIN遺伝子の発現が減弱/消失していることが明らかになった。また、DNA脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidineで処理することにより、これらHEADPIN遺伝子発現減弱/消失していた6種類の細胞株のうち5種類においてHEADPIN遺伝子の再発現を認めた。以上のことから、HEADPIN遺伝子発現の減弱は口腔癌発生に関与し、その発現減弱の主要なメカニズムの一つとしてDNAのメチル化が関与していることが示唆された。
ハイリスク造血器腫瘍の髄外病変に着目した新規ターゲットの探索と創薬研究

難治性造血器腫瘍である多発性骨髄腫は、相次ぐ新規薬剤の開発により予後は著しく改善した。その一方で、予後不良の染色体異常であるdel17(TP53遺伝子欠損)やt(4;14)を有するハイリスク症例は、髄外形質細胞腫の形成や治療抵抗性といった悪性形質を獲得し、新規薬剤を用いても未だに予後は絶対不良である。本研究では、ハイリスク染色体異常陽性の骨髄腫細胞では、N-cadherinを含む間葉系遺伝子発現が更新しており、細胞分化の異常を来し固形癌に類した形質を持つようになることが臨床的悪性化につながるという作業仮説を証明してゆく。さらに、ハイリスク骨髄腫の悪性形質を克服する創薬研究も展開してゆく。我々は、新規フタルイミド体TC11を見いだし、最適化体として水溶液に溶解性が高いPEG-TC11の合成にも成功した。実際マウスに腹腔内投与した際に、TC11に比べて最高血中濃度および血中消失半減期は著明に改善し、ヒト骨髄腫xenograft腫瘍に対して強力なアポトーシスを誘導することを観察している。またPEG-TC11は、その化学構造式がサリドマイド類に類似しているが、催奇形性に関与するサリドマイド類の結合分子cereblonには結合しないことも明らかになった。さらにPEG-TC11は、骨髄腫細胞に対して強いG2/M細胞周期停止作用を有することも判明した。すなわち、ハイリスク骨髄腫細胞ではしばしばTP53遺伝子が欠失しているが、G2/M細胞周期停止にはその関与が少なく、PEG-TC11は有効にハイリスク骨髄腫細胞に細胞死を誘導すると考えられる。本年度は免疫調節薬(IMiDs)長期暴露細胞を4株作成し、それらがIMiDs以外にもプロテアソーム阻害薬やHDAC阻害薬にも抵抗性を示すことを明らかにした。さらに、耐性細胞ではN-cadherinをはじめとするmesenchymal遺伝子の発現が亢進していることを見出した。一方、我々はリプログラミング遺伝子(山中遺伝子)群が骨髄腫細胞において高発現していることを見出した。OCT4およびSOX2遺伝子の高発現細胞を樹立し、薬剤耐性獲得、クローン増殖性、mesenchymal分子の発現亢進について検討が進んでおり、リプログラミング遺伝子の異所性発現が、薬剤耐性など臨床的悪性化を引き起こすのではないかという作業仮説を打ち立ててゆく。一方、これまでにPEG-TC11の効率の良い合成法を確立し、マウスに腹腔内投与した際に従来のTC11に比べ飛躍的に薬物動態(とくにCmax)が改善すること、さらに強い腫瘍増殖遅延効果がえられることがわかった。本年度は、PEG-TC11がtubulin分子に直接結合しその重合阻害をきたすことによって、骨髄腫細胞をM期細胞周期停止からmitotic catastropheに陥いらせることを明らかにした。ハイリスク骨髄腫細胞では腫瘍抑制遺伝子TP53がしばしば欠失しているが、M期細胞周期停止にはP53蛋白質は関与していない。したがって、P53蛋白質を欠損するハイリスク骨髄腫細胞に対してもPEG-TC11は有効な治療薬になりうると考えられた。この他にも、天然化合物であるコマロビキノンの誘導体ライブラリーのスクリーニングを行い、GTN024の合成に成功し、そのin vivoにおけるハイリスク骨髄腫細胞のアポトーシス誘導を報告した。2019年度においても、IMiDs長期暴露細胞の遺伝子発現について網羅的解析を推し進め、cereblonやその基質群以外に薬剤耐性に関わる遺伝子を分離してゆく。同時に、OCT4をはじめとするリプログラミング遺伝子高発現細胞を用いて、骨髄腫細胞が間葉系細胞に脱分化し薬剤耐性やクローン増殖性を獲得し、髄外形質細胞種形成に関わるという作業仮説を証明して行く。PEG-TC11について、結合分子であるnucleophosmin1(NPM1)の多量体形成やリン酸化への効果について検討を進めてゆく。とくにmitotic kinaseであるCDK1やPLK1を介したNPM1のリン酸化についてデータを蓄積し、G2/M期の細胞分裂の際に多核化や多極化を引き起こすかについて検討を進める。コマロビキノン誘導体においては、毒性が低いGTN057の合成にも成功し、in vivoでの有効性や薬物動態についてデータが蓄積されている。その薬理作用についても検討を進め、チロシンキナーゼ阻害や免疫学的効果を明らかにしてゆく。近年の多発性骨髄腫治療の進歩の陰で、髄外形質細胞腫の形成や治療抵抗性といった悪性化は、新規薬剤を用いても越えがたい治療の障壁となっている。予後不良の染色体異常であるdel17やt(4;14)を有する症例では、このような悪性形質を獲得しやすくハイリスク骨髄腫と称される。本研究では、その原因として骨髄腫細胞の上皮間葉系への脱分化仮説を打ち立てようとしている。骨髄腫細胞株パネルを用いて、t(4;14)を有する細胞では間葉系遺伝子発現が亢進しN-cadherinの発現が高い細胞、それ以外の細胞では上皮系遺伝子発現が亢進しE-cadherinの発現が高い細胞はSCIDマウスへの皮下形質細胞腫を形成しやすいことを見出した。この結果より、骨髄腫細胞は上皮間葉系細胞に脱分化し、固形癌類似の形質を獲得していると推測している。一方、ハイリスク骨髄腫克服薬の開発として、新規フタルイミド体TC11の薬物動態改善のために、PEG-TC11体の合成に成功した。186μmol/

kgのPEG-TC11をマウスに皮下注射した場合、同等量のTC11を投与した場合に比べて、最高血中濃度は2.6μMから24.4μMへ、血中消失半減期は1.4時間から2.2時間に改善した。それに伴いxenograftの増殖遅延効果も増大した。次にハイリスク骨髄腫に有効なTC11の分子機構を解析するために、構造が類似する免疫調節薬(IMiDs)の標的分子であるcereblonへの結合能をBiacoreを用いて検討したが、TC11、PEG-TC11はいずれもcereblonには全く結合しなかった。さらにこれらは、骨髄腫細胞に対して強いG2/M細胞周期停止作用があることが判明した。すなわち、ハイリスク骨髄腫細胞ではしばしばP53が欠失しているが、G2/M細胞周期停止にはその関与が少なく、TC11は有効に細胞死を誘導すると考えられる。全体として概ね研究は予定通り進行している。その中でも、我々が独自に開発したフタルイミド体TC11の可溶化体PEG-TC11の合成に成功し、マウスモデルにおける血中薬物動態の改善(Cmax値が8倍増加)が得られた。これによりマウスxenograftモデルにおいてTC11を凌駕する腫瘍増殖遅延とアポトーシス誘導が観察された。さらにPEG-TC11はin vitroにおいてもより強いアポトーシス誘導を来すことが分かった。PEG-TC11は、標的分子であるnucleophosmin1のSer4, Thr95, Thr199をTC11よりも低濃度でリン酸化することを見出した。我々はNPM1のSer4のリン酸化により、骨髄腫細胞が分裂する際に中心体が過剰複製することを見出し、その結果骨髄腫細胞がmitotic catastropheに陥り細胞死に陥ると推測している。一方、骨髄腫の悪性化の誘導因子として、リプログラミングによる上皮間葉系細胞への脱分化仮説を提唱している。現在、SOX2、Oct-4強制発現細胞を作製中である。また、骨髄腫治療薬の中で中心的な役割を果たしているレナリドミドに対して抵抗性を示す骨髄腫細胞の樹立に成功している。今後はこれらを用いてEMT関連遺伝子、山中遺伝子群の発現や機能を検討してゆく。上記の基礎的研究の臨床的意義を明らかにするために、TC11およびレナリドミドの結合分子であるNPM1蛋白質の骨髄腫細胞における発現を免疫組織学的に検討を進めている。また、EMT関連遺伝子シグナルの下流にあるE, N-cadherin蛋白質発現の臨床的意義についても免疫組織学的検討を開始している。以上を総括すると、研究の進行状況は概ね研究計画通りであると考えられる。難治性造血器腫瘍である多発性骨髄腫は、相次ぐ新規薬剤の開発により予後は著しく改善した。その一方で、予後不良の染色体異常であるdel17(TP53遺伝子欠損)やt(4;14)を有するハイリスク症例は、髄外形質細胞腫の形成や治療抵抗性といった悪性形質を獲得し、新規薬剤を用いても未だに予後は絶対不良である。本研究では、ハイリスク染色体異常陽性の骨髄腫細胞では、N-cadherinを含む間葉系遺伝子発現が更新しており、細胞分化の異常を来し固形癌に類した形質を持つようになることが臨床的悪性化につながるという作業仮説を証明してゆく。さらに、ハイリスク骨髄腫の悪性形質を克服する創薬研究も展開してゆく。
小腸上皮細胞の免疫機能を介する補中益気湯の薬効発現機構の解析

補中益気湯は免疫弱者の呼吸器感染症の罹患予防効果や抗がん剤による消化管での粘膜炎症に伴う食欲不振の改善に用いられるがその作用メカニズムは不明な点が多い。本研究では抗がん剤で誘発される小腸粘膜炎症に対し、小腸上皮組織において炎症性シグナルカスケードの制御性アダプター分子の発現増強を補中益気湯が起こすこと、本漢方薬の上気道粘膜免疫系に対する賦活活性活性発現の作用成分が含有されるオリゴ糖群であること、本オリゴ糖がパイエル板免疫細胞や小腸上皮細胞に対する免疫調節作用を示すこと、および本オリゴ糖群がメソトレキセート誘発小腸上皮障害を一部の制御性アダプター分子の発現増強を介して改善することを明らかとした。本研究ではメソトレキセート誘発小腸上皮傷害に対する補中益気湯の改善作用とその作用メカニズムの解析を行うことを目的とする。抗がん剤のメソトレキセートの前処置により作製した小腸上皮傷害モデルマウスへの補中益気湯の投与は上皮組織でのTNF-αやIL-1βのmRNA発現を抑制し、抗炎症作用を示すことが明らかとなった。本作用の発現に関与するメカニズムについて検討を行った結果、IL-1 receptorなどの下流のシグナルカスケードにおける制御性分子のIRAK-MのmRNA発現を補中益気湯の投与がメソトレキセート処置1日後に有意に増強していた。一方、別の制御性アダプター分子として知られるTollipに対しては本漢方薬は影響を与えす、抑制性のサイトカインであるIL-10の発現にも変化は観察されなかった。以上のことから、補中益気湯が炎症性シグナルカスケードの抑制アダプター分子であるIRAK-Mの発現増強作用を介して抗がん剤により惹起される小腸上皮組織での炎症反応を速やかに終息させることが強く示唆された。本研究ではメソトレキセート誘発小腸上皮傷害に対する補中益気湯の改善作用、その作用メカニズムの解析および作用成分の解明を行うことを目的とする。抗がん剤のメソトレキセートの前処置により作製した小腸上皮傷害モデルマウスへの補中益気湯の投与は上皮組織でのTNF-αやIL-1βmRNAや当該タンパク分子の発現を抑制し、抗炎症作用を示すことが明らかとなった。本作用の発現に関与するメカニズムについて検討を行った結果、IL-1 receptorやTLRなどMyD88介在性の下流のシグナルカスケードにおける制御性分子のIRAK-MのmRNA発現に加えA20、CyldおよびSIGIRR mRNAの発現を補中益気湯の投与がメソトレキセート処置1日後に有意に増強していた。以上のことから、補中益気湯がメソトレキセート投与により生成した変性DNAに起因する炎症性シグナルカスケードにおいてこれらの抑制アダプター分子の発現増強作用を介して小腸上皮組織での粘膜炎症を速やかに終息させることが強く示唆された。さらに活性成分の探索から補中益気湯に含有されるフルクトオリゴ糖類が小腸上皮細胞株(IEC-6)やマクロファージ細胞株(RAW264.7)でのIRAK-M mRNA発現や当該タンパクの発現に対する増強作用を示すこと、およびSIGIRR mRNAの発現増強を介してメソトレキセート前処置マウス小腸での粘膜炎症を改善する作用を有することを明らかとした。一方、補中益気湯の上気道粘膜免疫賦活化作用は脂溶性成分含有画分と多糖画分の組合せでは発現されず、これらの画分とオリゴ糖含有画分の組合せにより発現されることがあきらかとなった。また、オリゴ糖含有画分の経口投与はパイエル板での種々のサイトカインやホーミング受容体発現を変化させることも明らかとなった。本研究では補中益気湯のマウス小腸上皮細胞での抗菌タンパクやパターン認識分子の発現に対する調節作用についての解析を行うことを目的とする。本作用への補中益気湯含有成分の関与について検討した結果、脂溶性低分子成分群と水溶性の比較的低分子の成分群は関与するが、高分子成分群の関与は低いことが示唆された。また、脂溶性成分群では、IL-10 mRNAの発現を増強していた。一方、水溶性の低分子成分群では防御因子としての抗菌タンパク(MBP-CやRegIII-γ)の発現誘導には明瞭な影響を与えず、むしろtoll-like receptorの炎症性シグナルカスケードを負に制御するIRAK-MのmRNA発現を炎症後期において増強することが示唆された。

また、補中益気湯の主要含有成分の高分子多糖成分はメソトレキセート投与による小腸上皮障害モデルに対する抗炎症的な作用はほとんど示さないことが推定された。抗炎症作用を示した水溶性低分子成分は鎖長の異なる共通構造を有するオリゴ糖であることが明らかとなった。また、本オリゴ糖はIEC-6細胞を用いた検討からTLR9やNOD2の発現も増強させることを示唆した。そこで、本オリゴ糖群の補中益気湯の有する上気道粘膜免疫機構に対する賦活作用発現への関与について検討した結果、脂溶性成分群および高分子多糖群との共同作用により、上気道粘膜免疫機構に対する賦活化作用の発現に関与することが強く示唆された。補中益気湯の抗がん剤による粘膜炎改善効果の作用メカニズムとしては当初IL-10や抗菌タンパクなどの産生増強作用が関与するものと作業仮説を立てていたが、炎症性シグナルカスケードの制御性アダプター分子であるIRAK-MのmRNA発現を増強させる新規のメカニズムを有することが強く示唆された。IRAK-Mは創薬ターゲットして注目されるアダプター分子で、本分子の発現を調節する天然物由来の薬物はこれまでに開発されていない。補中益気湯が本作用を有する知見は本漢方薬の特性を明らかにする上で重要な情報を与えるものと期待される。補中益気湯の含有成分を用いた検討により、本漢方薬の有する抗がん剤による小腸上皮傷害に対する改善作用の多面的な作用メカニズムが明らかになってきた。また、薬効成分の一部を特定し得たこと、本活性成分が他の含有成分との共同作用により腸管から遠隔の上気道粘膜免疫機構に対する制御作用を示すことを明らかにできた点から、研究計画が円滑に進展していると評価できると考えられた。平成24年度までに得られた知見をもとに、IRAK-Mの発現増強作用に関与する薬効成分を明らかにする。また、補中益気湯およびIRAK-M発現増強成分を用いてパイエル板や腸間膜リンパ節の免疫細胞の機能(サイトカイン産生、ホーミング受容体発現など)に対する作用についてreal-time PCRやflow cytometricな分析を行う。補中益気湯の当該活性成分と多糖成分や脂溶性低分子成分の上気道粘膜免疫系賦活作用発現への関与について解析を行う。1.補中益気湯およびオリゴ糖がIRAK-Mを誘導するメカニズムについて腸ペプチドのmelanocortin発現の観点から解析を行う。2.腸管免疫系の制御に重要な免疫因子(サイトカイン、ケモカイン、酵素、接着因子、ケモカイン受容体)について、パイエル板および腸管膜リンパ節での発現に対する補中益気湯や含有成分の投与による変化について遺伝子およびタンパクの両面から解析することにより、補中益気湯の作用点を探索する。3.パイエル板からのCD40LやRANKL陽性リンパ球の腸管膜リンパ組織への移行は腸管膜リンパ節での自己反応性リンパ球の除去機構の誘導に重要な役割を果たすことが報告されている。そこで、補中益気湯やその含有成分の投与による影響について、パイエル板でのCD40L/RANKL発現および腸管膜リンパ節でのAire発現の観点から解析を行う。本研究課題の遂行においては、マウスへの投与実験を中心に検討を行う。このため、マウスの購入、飼育、解剖に要する経費として申請課題の研究費を充当する。また、多岐にわたる免疫関連因子の発現変化を追跡することを目的に、real-time PCRや特異抗体を用いたFlowcytometryによる解析を行う。
スペシャル・ポピュレーションに対する抗がん剤の至適投与量・用量調節指標の探索

進行・再発非小細胞肺がん患者の標準治療の1つである「ドセタキセル・カルボプラチン併用療法」について、高齢者に対するドセタキセルの至適投与量・用量調節指標の探索を行った。その結果、年齢の上昇に伴ってドセタキセルのクリアランスが低下する(曝露量が増加する)傾向が認められた。しかしながらクリアランスの個体間バラツキが大きいため、一概に高齢者での減量を推奨することはできない。またドセタキセルの効果および副作用は遊離形濃度に依存するため、血中α_1酸性糖蛋白質(α_1-acid glycoprotein;AGP)濃度に影響を受ける。以上より、ドセタキセルの高齢者への至適投与量を考慮する際の用量調節指標として、年齢のみならず血中AGP濃度も含む複数因子の妥当性が示唆された。スペシャル・ポピュレーション(special populations)とは薬物動態(Pharmacokinetics:PK)および薬物感受性(Pharmacodynamics:PD)が一般の患者集団とは異なることが予想される腎機能低下者、肝機能低下者、高齢者、小児、妊婦、授乳婦、肥満者などのことで、わが国での医薬品開発ならびに臨床薬理の領域では「特殊集団」または「特別な背景を有する患者」と訳されている。スペシャル・ポピュレーションに対する薬物療法においては、薬剤の特性に応じて投与量の調節を考慮する必要があるが、がん薬物療法においては各がん種に対しエビデンスに基づく標準治療が存在するため、個々の患者への用量調節すなわち匙加減はエビデンスからの乖離を意味し、治療の有効確率および安全性担保を不確実なものとする。そこで本研究では、スペシャル・ポピュレーションに対する抗がん剤の至適投与量・用量調節指標を探索することを目的とし、本年度は「ドセタキセル・カルボプラチン併用療法」が施行された進行・再発非小細胞肺がん患者を対象とした臨床試験におけるドセタキセルおよび遊離形カルボプラチンの血漿中濃度から母集団解析法によるPK/PD解析を行った。なお本解析は1996年に谷川原らにより報告(日本癌学会学術総会)された「日本人におけるドセタキセルの母集団薬物動態モデル式」を用い、さらに当時には検討されていなかったCYP3A5遺伝子多型の影響についても検討している。現在、最終的なデータのまとめを行っている段階であり、年齢、腎機能、肝機能などの因子とPKとの関係から、スペシャル・ポピュレーションへの至適投与量の提示を目指している。スペシャル・ポピュレーション(special populations)とは薬物動態(pharmacokinetics:PK)および薬物感受性(pharmacodynamics:PD)が一搬の患者集団とは異なることが予想される腎機能低下者、肝機能低下者、高齢者、小児、妊婦、授乳婦、肥満者などのことで、わが国の医薬品開発ならびに臨床薬理の領域では「特殊集団」または「特別な背景を有する患者」と訳されている。スペシャル・ポピュレーションに対する薬物療法においては、薬剤の特性に応じて投与量の調節を考慮する必要があるが、がん薬物療法においては各がん種に対しエビデンスに基づく標準治療が存在するため、個々の患者への用量調節すなわち匙加減はエビデンスからの乖離を意味し、治療の有効確率および安全性担保を不確実なものとしてしまう。そこで本研究では、肺がん患者を対象とした臨床試験において抗がん剤の血中濃度を測定し、PK/PD解析により、スペシャル・ポピュレーションに対する抗がん剤の至適投与量・用量調節指標の探索を行う。1.ドセタキセル・カルボプラチン併用療法試験ドセタキセルの血漿中濃度およびカルボプラチン投与後の白金濃度結果に基づき、母集団解析法によりPK/PD解析を行い、「CYP3A5遺伝子多型」「年齢」「腎機能」「肝機能」などの因子がPK、PD(副作用)に及ぼす影響について検討した。2.エルロチニブ療法試験血中濃度に及ぼす年齢の影響を明らかにすることを目的に、高齢者(65歳以上)および非高齢者(65歳未満)を対象とした臨床試験において血漿中エルロチニブ濃度測定のためのLC/MS/MS法による定量法を確立した。なお本行程では、過去の報告(Haouala et a1,J Chromatogr B 877,2009)を参考に当研究室保有の装置で定量法を再現し、一部変更を加えた上で米国FDAのGuidance for Industly;Bioanalytical Method validation (2001)にしたがったバリデーションを行った。

スペシャル・ポピュレーション(special populations)とは薬物動態(pharmacokinetics:PK)および薬物感受性(pharmacodynamics:PD)が一般の患者集団とは異なることが予想される腎機能低下者、肝機能低下者、高齢者、小児、妊婦、授乳婦、肥満者などのことで、わが国の医薬品開発ならびに臨床薬理の領域では「特殊集団」または「特別な背景を有する患者」と訳されている。スペシャル・ポピュレーションに対する薬物療法においては、薬剤の特性に応じて投与量の調節を考慮する必要があるが、がん薬物療法においては各がん種に対してエビデンスに基づく標準治療が存在するため、個々の患者への用量調節すなわち匙加減はエビデンスからの乖離を意味し、治療の有効確率および安全性担保を不確実なものとしてしまう。そこで本研究では、非小細胞肺がん患者におけるドセタキセル/カルボプラチン併用療法時の血中薬物濃度を測定し、NONMEM(Nonlinear Mixed Effect Model:非線形混合効果モデル)による母集団薬物動態解析により、スペシャル・ポピュレーションに対する抗がん薬の至適投与量・用量調節指標の探索を行なうことを目指した。81症例におけるドセタキセル血中濃度、遊離形白金濃度に対する患者の年齢、肝機能、腎機能、血清アルブミン濃度、血清α1酸性糖蛋白質濃度の影響、および1クール目に発現した骨髄抑制(白血球減少、血小板減少)との関係について、個々の薬剤ではなく本併用療法としてのPK/PD解析を行った。そして本併用療法における「スペシャル・ポピュレーションでの至適用量」を腎機能、肝機能、年齢に応じた用量調節指標として提示した。エルロチニブ療法試験の進捗状況が、予定より遅れているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。「ドセタキセル・カルボプラチン併用療法試験」では、PK/PD解析結果をもとに、年齢、腎機能、肝機能に応じたスペシャル・ポピュレーションへの至適投与量について論文化し発表する。また「エルロチニブ療法試験」では、血漿中エルロチニブ濃度測定に向け、採取された血液の前処理(遠心分離、必要に応じて限外濾過)を行い、症例登録終了ならびに観察期間終了時のPK/PD解析に備える。
Gaze-cueingによる潜在的な行動誘導効果の解明と実務的応用手法の確立

人の視線はときに矢印のように、人の注意を自然とその方向に向かわせる。視線手がかり(Gaze-cueing)と呼ばれるこの効果は、認知心理学分野で研究が進められている。本研究では、その視線手がかりが、実際の人間の顔ではなく、顔線画、顔のように見える他の物体(パレイドリア)でも生じうるかを検証し、どちらも同様の効果があることを確認した。また、視線手がかりは短時間の注意シフトにとどまらず、意識的な判断を伴う人の行動にまで影響を与えうるという、従来指摘がなされていない視線手がかりの「行動誘導」の可能性を発見した。平成26年度中、gaze-cueing効果を確認するための実験を行った。実験では、画面の中央に凝視点が500ms呈示された後、視線の無い顔が呈示された。900ms後、左右のいずれかを向いた視線が呈示された(視線手がかり、有効性は50%)。その後、ドット(標的)が顔の左右いずれかに呈示された(視線手がかりと標的のSOAは117msか700ms)。実験参加者(N = 17)の課題は、標的の位置をできる限り速くかつ正確に報告することであった。視線の方向に標的が出現する試行を一致条件(128試行)とし、視線の逆方向に標的が出現する試行を不一致条件(128試行)とした。なお、実験参加者が反応を抑制するキャッチトライアルとして、顔の輪郭円のみが呈示される試行も混在していた(128試行)。実験後、反応時間の中央値を条件ごとに求め、全実験参加者の平均反応時間を算出した。2要因2(条件:一致、不一致)×2(SOA:117、700ms)の分散分析を行ったところ、条件とSOAの交互作用が有意であった(p < .05)。SOAが117msの条件において、一致条件では不一致条件よりも平均反応時間は有意に短かった(p < .05)。SOAが700msの条件では、有意な差は見られなかった(p > .10)。この結果から、非意図的な注意のシフトを促すgaze-cueingの有効性は117msという短い時間では保たれる一方、700msでは持続しないことが分かった。いずれにしても、gaze-cueingの効果が確かめられたことで、今後の発展的研究に希望が見いだせた。なお、この実験に関連する知見は共同研究者の有賀によって第13回日本認知心理学会にて報告予定である。gaze-cueingの効果について顔の線画を用いた実験(コンピュータベース)を行った結果、cueとなる画像を117ms提示した場合には、cueとターゲットが一致する条件においてその方向の同定時間が有意に早くなることがわかった。一方、提示時間が700msになるとその効果は見られなかった。このgaze-cueingの効果と被験者の一般的信頼性得点の相関係数を算出したところ、提示時間が117msの条件で弱い正の相関(r = .27),700msの条件で正の相関が認められた(r = .48)。つまり、線画であっても視線的手がかりがターゲットを同定する反応時間を早めるか否かは、当事者が他者を信頼する傾向にあるかどうかに左右されることがわかった。上記に加えて、購買状況を背景とした場合のgaze-cueing効果について明らかにするための実験を行った。その結果、gaze-cueingの効果は購買場面では消失することがわかった。これは被験者が刺激の多い購買意思決定の局面では視線認知を抑制している可能性があることを示唆している。最後に、人の顔に見える対象としてのパレイドリア(顔様刺激)が顔刺激と同様の効果をもたらすかどうかを検証する実験を行った。パレイドリアを妨害刺激として用いた結果、顔刺激条件ならびに統制条件に比べて有意に課題遂行時間にマイナスの影響を及ぼすことがわかった。この結果はパレイドリアが被験者の注意を捕捉したことを裏付けている。以上の実験より、gaze-cueingは一定の条件下で確実に効果を持つことが明らかになるとともに、パレイドリアも効果発生の時間的ラグがあるものの顔刺激同様の効果を有することがわかった。コンピュータベースの実験室実験はおおむね完了しているが、当初設定した仮説とは結果が異なる部分もあり、大規模なフィールド実験の実施に影響が出ている。夏に人が多く集まる場所にて、フィールド実験を行う予定だが、大きなコストを要するため、慎重に実験計画を作成している段階である。本研究では、gaze-cueingの効果を確認するとともに、その効果の実務的適用範囲を検討し、実験的に検証した。gaze-cueingは、他者の視線に基づく注意の定位と定義され、ある対象が他者の視線方向に出現する場合、ほかの場所に出現する場合よりも観察者が素早く認知することができるといわれている。そして、この効果は現実の人間の顔でなくとも、イラストや人物写真を用いても生起し、無意識的に生じることが先行研究により明らかにされている。この効果を確認するため、次のような実験を行った。パソコン画面に視線手がかり(右か左)を有した人の顔の線画を出現させ、その後画面に現れるターゲット画像の出現位置を実験参加者に正確に報告させるというものである。視線手がかりとの表示からターゲット画像の出現時間(SOA)は117msと700msに設定し、また視線手がかりとターゲットが一致する条件、不一致の条件の2つを設けた。