hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安全・安心なマルチフェロイック型センサ/アクチュエータ素子の開発

イオン照射機構(プラスチックの表面改質やDLC膜の合成にも用いられているPBII & D機構と基本構造は同じ)を取り付けた多元素同時スパッタリングシステムを開発した.本装置で得たDLC膜の硬さ及び基板追従性は,成膜条件によって広範囲に調整できた.また本装置を用いることで,基板温度が353Kであっても結晶化したTiNi合金薄膜を得ることができた.ポリイミド上にTiNi合金薄膜を付与した素子は,通電による加熱及びその停止による冷却で良好な二方向形状回復動作を示した.これらの結果によって,マイクロアクチュエータ素子の応用展開が期待できると考える.イオン照射機構(プラスチックの表面改質やDLC膜の合成にも用いられているPBII & D機構と基本構造は同じ)を取り付けた多元素同時スパッタリングシステムを開発した.本装置で得たDLC膜の硬さ及び基板追従性は,成膜条件によって広範囲に調整できた.また本装置を用いることで,基板温度が353Kであっても結晶化したTiNi合金薄膜を得ることができた.ポリイミド上にTiNi合金薄膜を付与した素子は,通電による加熱及びその停止による冷却で良好な二方向形状回復動作を示した.これらの結果によって,マイクロアクチュエータ素子の応用展開が期待できると考える.TiNi合金薄膜を得るスパッタリングとDLC膜を得る三次元イオン注入成膜を同一装置で実現するために,既設の多元素同時スパッタリング装置に,プラズマ生成ガス導入機構,プラズマ生成機構,パルス電圧印加機構などを取り付けてDLC膜を得るためのPBII&D(Plasma-Based Ion Implantation and Deposition)機構を追加した.このような装置構成の変更にともなって変化するであろう装置の基本性能(排気速度,到達真空度,スパッタリング時の成膜速度など)を確認するために,TiNi合金薄膜とDLC膜をそれぞれ単独で合成した.排気速度及び到達真空度に関しては装置構成変更前と同等の性能を有していること,TiNi合金薄膜の合成速度も変更前と同等であることを確認した.この装置構成によってTiNi合金薄膜の低温合成実験を行ったところ,基板温度が150°C程度であっても結晶化したものが得られ,良好な形状記憶特性を有していることを確認した.従来の装置より約50°Cも基板温度を低減することができたので,装置構成の変更と成膜プロセスの再検討が有効であったと考えている.また,新たに付与した機構によって得るDLC膜の成膜速度は15nm/min程度で,成膜時の基板温度は100°C以下であることも確認できた.本装置で得たDLC膜の密着強度,硬さなどの基本特性は,DLC膜合成専用装置で得たものと同等であることも確認できた.DLC膜を得るためのPBII&D(Plasma-Based Ion Implantation and Deposition)機構を追加した多元素同時スパッタリング装置(前年度に作製・基本特性評価を実施)を用い,TiNi形状記憶合金薄膜の保護膜として適切なDLC膜の成膜条件を検討した.TiNi形状記憶合金薄膜の形状回復量は約8%と大きいので,TiNi形状記憶合金薄膜との密着性及び形状回復動作を阻害しないフレキシビリティ(低弾性率,高変形能などのパラメータで表すことが可能な特性)とDLC膜の成膜条件との関連に着目した。基板にはSi及びポリイミドを評価目的によって使い分け,DLC膜の膜厚は250nmとした.Siに成膜後に割断し断面を現出して高倍率SEM観察したところ,割断時の衝撃でDLC膜がはく離していることはなく,十分な密着性があることが予測された.さらに,ポリイミド基板の場合は,DLC膜を成膜後に丸棒へ巻きつけ,DLC膜表面の割れやはく離などの損傷状況を評価した.いずれの成膜条件の場合もDLC膜のはく離は認められなかったが,DLC膜表面の割れと成膜条件に関連がある結果が得られた.すなわち,丸棒直径が同じであってもパルス状負バイアス電圧が大きいものの方が,DLC膜表面に発生した割れの個数及び総距離ともに高くなった.DLC膜のフレキシビリティと成膜時のパルス状負バイアス電圧が定性的に関連していることが明確になったので,次年度以降は弾性率などで定量的に評価する予定である.これと並行して,FIBを用いたTEM観察用試料の作製条件の探索を行い,電解研磨あるいはイオンミリングで作製した試料と同等の像質が得られる条件を明らかにした.前年度までの成果を活用して厚さ1μmのTiNi形状記憶合金薄膜上にDLC膜(目標膜厚250nm)を付与した.本DLCは光透過性が高いので,肉眼ではDLC付与の有無を判断できない.形状記憶合金薄膜との密着性も高く,割断程度でははく離しないことも確認している.素子用の基板材料には厚さ25μmのポリイミド箔を用い,素子作製プロセス中に電極材料(Cu膜,厚さ1μm)の付与を追加した.素子形状はコの字形(ダブルビーム形)カンチレバーで,二つのビームは電圧印加点として利用した.これに直流電源と任意波形発生器を接続して直流回路を形成し,電圧印加に伴う自己加熱を利用した形状回復動作を観察した.なお,回路中には通電状況を確認するためのLED及び電圧印加状況を確認するデータロガーを取り付けた.形状回復動作の観察は複数台のビデオカメラを用いて行った.素子はポリイミド基板が内側になるように湾曲しているので,素子側面を撮影した動画を用い,側面形状を最小自乗法で楕円に近似して形状回復動作を定量的に評価した.

素子に電圧を印加(加熱)することで直線状に形状変化し,電圧印加の停止(冷却)によって初期形状に回復する二方向形状回復動作を確認した.実験の範囲内では,形状回復能の劣化は認められず,当然,形状記憶合金薄膜,電極材料,DLC膜のはく離などの外観上の損傷はなかった.電圧印加サイクルが0.4Hz程度までは,二方向形状回復動作することを確認した.DLC膜を付与していないものについても同様の方法で動作を確認したが,形状回復量に明確な違いは認められなかった.さらに高いサイクルで同様の動作を実現するには,素子形状の小型が必要と考えている.
地形因子解析に基づく局所強風の予測に関する研究

強風の発生は気象学的規模のマクロスケール因子,地理学的領域のメソスケール因子,そして数十数百メートルの規模の局所地形に関わるミクロスケール因子に支配されている。本研究で,は対象地点周辺の局所地形因子等を画像と数値情報を利用して導入した結果,メソスケールレベルで予測された風速を対象地点の16方位別に地形因子に応じて増速・減速効果を与えることにより,高い精度で風向別強風特性を推定することが可能となった.さらに,地形因子解析を海岸部や谷筋部といった特徴的な地形区分における測点を抽出して行った結果,抽出した観測点に共通する地形因子の影響が弱められる結果となり,強風特性を支配していると考えられる地形因子のより詳細なモデル化が必要であることが判明した。また,局所強風に関わる新しい地形因子として丘状地形に注目した。丘の頂上部においては気流が鉛直方向に収束するために増速されることがよく知られており,この増速効果について単純化した丘状模型を用いた風洞実験を実施した。その結果,接近流の気流特性,丘の形状(法面勾配,丘頂部の長さ)ならびに丘の表面粗度によって,丘周辺部の風況特性が大きく変化することが明らかとなった。さらに,丘による増速効果を丘の形状パラメータ(法面勾配,丘頂部の長さ),丘の表面粗度,接近流の気流特性を用いて定量的に評価する推定式を作成した。さらに,丘の形状パラメータによって増速率が異なるメカニズムを模型表面の圧力測定実験から明らかにした。一方,高層気象データと地上6mの高さで観測されているアメダスの風向風速記録の比較検討から,局所地形のみならず,比較的大規模なメソスケールの地形特性により風況特性が大きく歪まされていることが明らかとなった。この風況特性に及ぼすメソスケールの地形特性を新たな地形因子としてモデル化し地形因子解析に取り込む必要があることも判明した。強風の発生は気象学的規模のマクロスケール因子,地理学的領域のメソスケール因子,そして数十数百メートルの規模の局所地形に関わるミクロスケール因子に支配されている.本研究では局所地形因子の評価に新しい手法を導入して,メソスケールレベルで予測された風速を対象地点の16方位別に地形因子に応じて増速・減速効果を与えることにより,任意地点の強風予測モデルを高い精度で確立することである.本年度においては,局所強風に関わる新しい地形因子として丘状地形に注目した.丘の頂上部においては気流が鉛直方向に収束するために増速されることがよく知られており,この増速効果について単純化した丘状模型を用いた風洞実験を実施した.その結果,接近流の気流特性,丘の形状(法面勾配,丘頂部の長さ)ならびに丘の表面粗度によって,丘周辺部の風況特性が大きく変化することが明らかとなった.さらに,丘による増速効果を丘の形状パラメータ(法面勾配,丘頂部の長さ),丘の表面粗度,接近流の気流特性を用いて定量的に評価する推定式を作成した.また,高層気象データと地上6mの高さで観測されているアメダスの風向風速記録の比較検討から,局所地形のみならず,比較的大規模なメソスケールの地形特性により風況特性が大きく歪まされていることが明らかとなった.この風況特性に及ぼすメソスケールの地形特性を新たな地形因子としてモデル化し地形因子解析に取り込む必要がある.強風の発生は気象学的規模のマクロスケール因子,地理学的領域のメソスケール因子,そして数十数百メートルの規模の局所地形に関わるミクロスケール因子に支配されている.本研究では対象地点周辺の局所地形を代表すると考えられる谷度,山度,走行,等の局所地形因子をビデオ画像と国土数値情報を利用して新たに導入した.

その結果,メソスケールレベルで予測された対象地点を代表する風速を16方位別に,ミクロ並びにメソスケール地形因子の特性に応じて増速・減速効果を与えることにより,高い精度で風向別強風特性が推定できた.しかしながら,海岸部や谷筋部といった特徴的な地形区分における測点を抽出して地形因子解析を行った結果,抽出した観測点に共通する地形因子の影響が弱められる結果となり,強風特性を支配していると考えられる地形因子のより詳細なモデル化が必要であることが判明した.また,局所強風に関わる代表的な地形因子として丘状地形に注目し,昨年度実施した丘による増速効果が丘の形状パラメータ(法面勾配,丘頂部の長さ),丘の表面粗度,接近流の気流特性によって支配されるメカニズムを丘状地形模型の表面に直径1mmの圧力孔を設置し,表面圧力測定実験から検討した.その結果,丘の上流側の法肩で剥離したせん断層によって形成される丘頂部の負圧の値と増速率が密接な関係があることが判明した.これによって,丘の法肩で剥離した流れが天端上に再付着する場合には剥離バブル内の負圧の絶対値は,剥離流が再付着しない完全剥離型となる丘における負圧の絶対値より高くなり,増速率が増加すること,また,丘の法面勾配によっても丘頂部の負圧が変化し,増速率の変化と対応していることが明らかとなった.
アトピー性皮膚炎の症状改善に対する運動効果の検討

昨年度の研究では、アトピー性皮膚炎(AD)患者を対象として、日常生活における身体活動量が皮膚バリア機能およびAD病態関連因子に及ぼす影響について検討を行った。対象者はAD患者19名(平均年齢:28.4±5.6歳,男性2名,女性17名)とした。AD病態関連因子として血中のthymus and actication-regulated chemokine(TARC)、好酸球数、IgE、自己回答式の病態調査としてPatient-Oriented Severity Scoring of Atopic Dermatitis(PO-SCORAD)、皮膚バリア機能として角質水分量、経皮水分蒸散量(transepidermal water loss; TEWL)、皮膚pH、安静時発汗量を測定した。身体活動量は、生活習慣記録機ライフコーダGS(スズケン)を2週間着用して測定した。その結果、血中のIgE値と角質水分量(r = -0.464, p < 0.05)、TARC値と安静時発汗量(r = 0.486, p < 0.05)、皮膚pHと好酸球数(r = 0.592, p < 0.01)、皮膚pHと総消費量(r = 0.581, p < 0.05)、PO-SCORADのスコアと運動強度5の身体活動量(r = -0.524, p < 0.05)において、有意な相関関係が認められた。以上の結果から、AD患者においては、血中IgE値が高いほど、皮膚の物理的バリア機能が低下しており、中強度の身体活動量が多い人ほどAD症状が軽症であることが明らかとなった。今年度は、AD患者の身体活動量とAD病態関連因子との関連性についてはさらに対象者を増やして詳細に検討し、継続的な運動介入によるAD病態への影響についても研究を行っていく予定である。AD患者の募集が難航していたが、被験者リクルートメント会社に依頼して被験者募集を行い、19名のAD患者の日常生活における身体活動量と皮膚バリア機能、AD病態関連因子の関係について横断的に調査した。実際には36名の応募があったが、事前または当日キャンセルが相次ぎ、当日参加した19名分の測定結果を解析している。昨年度測定に参加したAD患者を中心に、運動による皮膚バリア機能やAD病態関連因子への影響について、12週間の縦断的な運動介入を実施して調査を行う。昨年度実施した横断的な研究についても、対象者を増やしてより詳細な検討を行う。本研究では、適度な運動習慣による皮膚バリア機能の向上およびアトピー性皮膚炎(AD)症状改善効果を明らかにすることを目的とする。運動によるAD病態の増悪の危険性に関する研究はほとんど行われていないため、まず健常成人を対象に運動によるAD病態関連因子の変動を検討した。対象者は、皮膚疾患を有さない健常成人男女6名とし、低強度運動としてヨガを60分間実施した。AD病態関連因子として血中のthymus and actication-regulated chemokine (TARC)をヨガ前後で測定した。その結果、血中のTARC値はヨガ前(212.4±83.7 pg/mL)とヨガ後(224.8±81.3 pg/mL)で有意な変動を示さなかった。次に、皮膚疾患を有さない健常成人男性8名を対象とし、高強度運動として75%VO2max負荷の自転車ペダリング運動を60分間実施した。その結果、血中のTARC値は、運動前(245.1±57.6 pg/mL)と比較して運動後(260.0±58.9 pg/mL)に増加傾向を示したが、個別データを確認しても極端な増加を示した者はいなかった。以上の結果から、健常成人の血中TARC値は、一過性の低強度運動では変化せず、高強度運動であっても極端な増加は示さないことが明らかになり、本研究で予定しているAD患者へのトレーニング介入の際の有益な情報となった。今後、AD患者の身体活動量とAD病態関連因子との関連性について検討していくために、皮膚科の医師と連携しながらAD患者のリクルートを実施している。健常成人を用いて、AD病態関連因子である血中のTARCや皮膚のフィラグリンを測定する系を確立することができたが、対象者としてAD患者の募集が難航している。また、皮膚の角質水分量など季節や気候によって変動する指標があるため、対象者をまとめて測定する方法に苦慮している。

その結果、血中のIgE値と角質水分量(r = -0.464, p < 0.05)、TARC値と安静時発汗量(r = 0.486, p < 0.05)、皮膚pHと好酸球数(r = 0.592, p < 0.01)、皮膚pHと総消費量(r = 0.581, p < 0.05)、PO-SCORADのスコアと運動強度5の身体活動量(r = -0.524, p < 0.05)において、有意な相関関係が認められた。以上の結果から、AD患者においては、血中IgE値が高いほど、皮膚の物理的バリア機能が低下しており、中強度の身体活動量が多い人ほどAD症状が軽症であることが明らかとなった。今年度は、AD患者の身体活動量とAD病態関連因子との関連性についてはさらに対象者を増やして詳細に検討し、継続的な運動介入によるAD病態への影響についても研究を行っていく予定である。AD患者の募集が難航していたが、被験者リクルートメント会社に依頼して被験者募集を行い、19名のAD患者の日常生活における身体活動量と皮膚バリア機能、AD病態関連因子の関係について横断的に調査した。実際には36名の応募があったが、事前または当日キャンセルが相次ぎ、当日参加した19名分の測定結果を解析している。AD患者の日常生活における身体活動量と皮膚バリア機能、AD病態関連因子の関係について横断的に研究するために、対象者募集を皮膚科の医師と連携して実施するなど、リクルートの方法を工夫する。横断研究の際に抽出された活動不足のAD患者を用いて、12週間の身体活動量の増加が皮膚バリア機能、AD病態関連因子に及ぼす影響を検討していく。昨年度測定に参加したAD患者を中心に、運動による皮膚バリア機能やAD病態関連因子への影響について、12週間の縦断的な運動介入を実施して調査を行う。昨年度実施した横断的な研究についても、対象者を増やしてより詳細な検討を行う。AD患者のリクルートがうまくいかず、横断研究を次年度に延期したため、被験者謝金や解析用の予算を繰り越すこととした。次年度には、皮膚科の医師と連携してAD患者の横断研究と縦断研究を実施し、繰り越し分および次年度予算を使用する予定である。AD患者のリクルートメント費用について、被験者の当日キャンセルなどによって急遽減少したために、被験者謝金や解析用の予算を繰り越すこととした。繰り越し分の予算は、今年度の介入研究や昨年度の横断研究の続きにおいて、被験者謝金や検体解析の費用として使用する予定である。
人工衛星データを用いた水稲耕作地の二酸化炭素収支の広域推定

人工衛星によって得られる地上植生変化、気温、日射量の広域データと地上農地における気象観測の長期間データを用いて、水稲耕作地生態系の二酸化炭素交換量を推定するモデルを構築した。モデルの妥当性を複数の地上観測データによって検証した上で、日本全体の水稲耕作地における二酸化炭素交換量の地域性および季節変化に関する特徴を見出すことができた。今年度は,(1)国内1サイトにおけるモデル構築研究の論文化、(2)国内3サイトを利用した植生指標の季節変化の検証、(3)国内水稲マップの作成準備、(4)国内サイトにおける放射計測装置の設置と測定の開始,の4つの内容わ実施した.既に提出した研究計画に準じて研究を遂行できていると言える.(1)においては,協力サイトである茨城県つくば市真瀬の単作水田において新しい植生指標としてGR (greenery ratio:可視光波長帯における緑色の放射強度)を導入し,同サイトにおける水稲の生理特性を表す指標として有効であることを示し,構築したモデルによって,生育期全体でのモデル出力値が,観測値に対してGPP(純生態系交換量)は102%, RE(生態系呼吸量)は95%となり,高い精度での実測値を推定できることが示された.この結果では,NEEは109%と過大評価になった.また(2)においては,岡山市の単作田において同様にGRを植生指標としてモデル計算を行った場合,つくば市のように,推定結果が必ずしも一致しない結果が得られた.これは,GRが岡山市における水稲植生の季節変化を精度高く推定できていないことに起因することが分かった.岡山市の単作田の場合,従来一般的に用いられてきたNDVIのほうが,植生の生理パラメータの季節変化を精度高く推定できていることが示唆された.(4)においては、中国揚州市江都におけるフラックス測定サイトでの連続測定に本補助金経費で購入した赤外線地表面温度計を8月に設置し、測定を開始した。順次データが蓄積されている状況であり、次年度以降に行う、同地におけるモデル検証用のデータとして、利用することが可能となる。本年度,実施した研究の概要は以下の通りである.○光合成モデル(Gpp)の再構築・既開発済みであった、プロトタイプの光-光合成モデルからLUE(光利用効率)モデルへの変更を行った。・光-光合成モデルでは,モデルパラメータの時定数の違いの限界により、光合成量の日極大値や季節変化に著しい差が出ることが散見されていた。・LUEのNDVIに対する依存関数が、太陽放射の大気透過率(≒晴天率)によって違うこと明らかにし、光合成モデルに反映した。○呼吸モデル(Re)の再構築・生態系呼吸量の温度依存係数が、各年度の水稲生育状況に比例して変化することを明らかにし、耕作期間の呼吸量モデルに反映した。○岡山水田における多年度検証・上記の改良したモデルを使用して、単作水田(八浜HCH)における2003-04,2006-09での精度検証を行った.・それぞれの評価精度は、GPPが-1+9%,Reが-13+14%,NEE(純生態系交換量)が,+3+9%の範囲であることを明らかにし、1測点についてのモデル評価では,極めて高い精度での予測が可能となった。○水田マップの再構築と検証・国内水稲マップ(環境省版植生図と国土交通省版道路・建造物データとの融合)を独自開発した(25m分解能).・ALOS,AVNIR2センサーによる高精度土地被覆図(50m分解能)を利用した.・上記両者を、250m分解能のマップに統一し、都道府県別の水田面積を算出し、総務省版水田面積(2010)との比較を行った。・北海道を除く46都府県の相関率で、前者が96.3%,後者が88.0%となり、独自開発した水稲マップの精度の高さが示された。・水田面積率の違いによって,NDVIの季節変化の様子が違うことに着目し、人工衛星のNDVIデータから、他植生の影響を除く手法の方向性を確認できた。前年度までに構築したモデルと水田マップを用いて、2003年度における日本の水稲耕作地における総一次生産量GPP、生態系呼吸量RE、純生態系交換量NEEの広域評価を行った。各地方でGPPの季節変化はそれぞれ正規化植生指数NDVIの季節変化に依存しており、短期的な変動で光合成有効放射フラックスPARの変動が反映されていた。NDVIの傾向と同様に、早い時期から稲作がおこなわれる寒地ほどゆるやかにGPPが上昇し、遅くから稲作が行われる暖地ほど急激にGPPが上昇していることが確認できた。またピーク値は暖地である中国、四国、九州地方が他地方より少し大きな値を示した。NDVIのピーク値はどの地方でも同程度だったため、これはNDVIピーク時期のPARの違いに起因することが示唆された。REについては気温Tairのピークが反映され、同時期にピークをとったが、GPPと比べると季節的な変動は少なかった。RE値は寒地ほどその値は小さく、暖地は大きな値を示した。結果としてNEEの季節変化は値の大きさからGPPの変動に依存していた。

NEEピーク値についてはどの地方も同程度であった。次にGPP、RE、NEEのそれぞれの積算値について沖縄県を除いた日本全国の地方別に解析した考察を行ったところ、生育期間中の積算値は、GPPが3170±700(gCO_2 m^<-2>)、REが1420±510(gCO_2 m^<-2>)、NEEが-1730±440(gCO_2 m^<-2>)という結果になった。これらの値への支配因子を調べたところ、GPP積算値は平均PARや平均NDVIとの関係性は弱く、生育期間日数に比例するという結果となった。つまり、GPP積算値は生育期間日数の長い寒地ほど値が高く、生育期間日数の短い暖地ほど値が低くなる傾向になった。RE積算値では生育期間日数や平均NDVIとの関係性は弱く、平均Tairに比例した。GPP積算値とは逆に、RE積算値は寒地で値が低く、暖地で値が高いという結果が得られた。上記のGPPとREの結果を反映し、NEE積算値は寒地で値が高く、暖地で値が低いという顕著な傾向が見られた。最後に構築したモデルを使って日本域の水稲耕作地にモデルを適用した結果、GPPが3170±700(gCO_2 m^<-2>)、REが1420±510(gCO_2 m^<-2>)、NEEが-1730±440(gCO_2 m^<-2>)という結果になった。
Olfactory Marker Proteinを発現する視床下部神経の運命追跡

嗅神経細胞に遍く存在するOlfactory Marker Protein(OMP)の中にcAMP結合部位を発見し、cAMPの結合定数を生化学実験で決定した。OMPは、cAMPの急速な吸着分子として機能し、Cyclic nucleotide-gated(CNG)チャネルの過度の活性化とその後のCa2+の過剰流入を防ぐ。OMPがノックアウトされた嗅神経では、頻回のcAMPの過剰負荷により持続するCNGチャネル電流による脱分極が進むことで細胞膜が過剰順応をし、神経発火が止まる。そのためOMP-knockout(KO)マウスの嗅上皮にcAMPを負荷すると、KOマウスは目の前の物体(エサ)に興味を示すもののSniffing行動ではエサとして認識できなくなる「無嗅覚症状」を呈することを証明した。このように、連続刺激に対しては神経応答が急速に順応してしまうが、一方で、単発刺激に対してはむしろ緩やかに長引く神経応答をすることが分かった。このため、OMPの発現量が少なければ、弱い刺激に対しては遅延応答をすることが明らかになった。そこで、OMPの発現量の調節について明らかにするため、まずゲノム配列を検索した。OMP遺伝子は、カルパイン5遺伝子のイントロン部に組み込まれたNested geneであることが分かった。OMPの発現とカルパイン5の発現を調べたところ、両者が排他的に発現している可能性が浮上した。OMPとカルパイン5の上流では、OMPの発現に関わるOlf-1結合部位に差異があることが関与するとみられる。以上について、現在論文投稿中である。OMPの機能と発現調節について、嗅覚受容神経からさらに中枢において検索をする予定であった。その過程で発現に関わるゲノム情報の検索にバイオインフォマティクスを利用することを新たに思いついた。その結果、予備的データではあるが新たに遺伝情報が活用できることとなった。この結果をもとに、さらに当初の予定である中枢での発現調節について、研究を進めていきたい。現在、中枢でのOMP関連神経の活動や、そのシグナルを受ける神経を可視化するための遺伝子コンストラクトを作成中である。今回、新たに関連が示唆されたカルパイン5の発現を可視化することも含め、研究を進める。本年度は、まず培養細胞レベルでの神経活動と運命の可視化を目指す。初年度に、関連する新規の研究を実施することとなったため、必要となる試薬、消耗品が変更となった。次年度は、遺伝子改変に必要なプラスミドを中心とした分子生物学消耗品および蛍光観察用のペプチド試薬を購入する計画である。実験が早く進行した場合は、蛍光観察用の光学系備品の購入、および遺伝子改変マウスの作成を計画している。
悪性脳腫瘍に対する熱作動性サイトカイン遺伝子導入による局所温熱遺伝子療法の開発

4)以上まとめると、導入細胞により加温後のhsp 70 promoterの下流遺伝子の発現のパターンは異なるものの、U251-MG以外の細胞では、明らかに加温直後48時間後にピークをもつ発現を示した。それゆえ、これらのhsp 70 promoterを用いた遺伝子発現システムは、heat shockをswitchとしたheat-inducible genetherapyとして有用である可能性が示された。また、これらのplasmidをhuman(U251)およびrat(C6、RSV、SRB)のglioma cellに導入して、熱刺激による発現率を検討しているところである。至適温度、加温条件については、39°C43°Cまでの間、1°C間隔で、時間は15分、30分、45分、60分、90分、120分とし、これらを組み合わせて最もよく発現する条件を検討している。この後、IL-12、IFN-γ、p53などを導入し、熱刺激による殺細胞効果を検討する予定である。また、Glioma細胞の他にmelanoma細胞でも同様の検討を行う予定である。2)上記で得られた細胞が産生するcytokineの量を測定し、Cytokineの発現がglioma細胞に及ぼす効果を細胞増殖能、apoptosis発現の有無、MHC分子、接着因子などの面から検討する。この後、遺伝子導入細胞をratの脳内、皮下に接種し、生着後温熱治療を行い、腫瘍組織の変化、殺細胞効果について検討する。1)in vitroの実験系として、熱刺激で発現することを確認したhsp-lacZ,のplasmidをhuman gliomacell lineのU251-MG, T98G, NP2に導入し、加温(41°C2時間,42°C1時間,43°C1時間)後3h, 6h, 12h, 18h, 24h, 48h, 72hのlacZ reporter geneの発現をbeta-galactosidaseを測定することで37°Ccontrolと比較した。その結果、NP2では加温12時間後に43°C群でcontrolの9倍、加温12時間後に42°C群で6倍の発現がみられた。T98Gでは加温6時間後に42°C群で4倍、12時間後に43°C群で4倍の発現がみられたが、NP2に比して低い発現であった。U251MGでは、加温24時間後に43°C群で5倍、48時間後に42°C群で3倍の発現がみられたが、37°Cでも発現していた。41°C群では加温直後から発現がみられており、NP2では18時間後に27倍と最高値を示した。U251MG, T98G群の発現は2倍程度であったが、72時間後まで持続した。この結果より至適加温条件を検討して実験を進めていこうと考えている。また、加温後発現までに時間を要する理由として、細胞に内在するhspのcytoprotection system, CTL誘導などもかかわっていると考えられる。上記の実験と合わせ、検討を加える。4)上記で得られた細胞が産生するcytokineの量を測定し、cytokineの発現がglioma細胞に及ぼす効果を細胞増殖能、apoptosis発現の有無、MHC分子、接着因子などの面から検討する。<結果>IFN-γは加温24時間後に最も強力に発現した。37°Cでは、発現を認めなかった。
分岐鎖アミノ酸の血糖値低下作用の機構解析とその糖尿病治療への寄与

分岐鎖アミノ酸の血糖値低下作用に注目して、分岐鎖アミノ酸が血糖値を低下させるメカニズムを探り、分岐鎖アミノ酸の血糖値低下作用の糖尿病治療への応用の可能性を探ることを目的とした。17年度は、分岐鎖アミノ酸が血糖値を低下させるメカニズムの解明を目指し、1.分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進能の評価、2.取り込まれたグルコースがエネルギーを産むか否かについての検証、3.分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進機構の解析を行った。その結果、1.イソロイシンは骨格筋へのグルコースの取り込みを促進することで血糖値を低下させるが、ロイシンは骨格筋へのグルコースの取り込みを有意に促進しないこと、2.ロイシンは骨格筋でのグリコーゲン合成を刺激するがイソロイシンは刺激せず、イソロイシンによって骨格筋に取り込まれたグルコースはエネルギー源として利用されているであろうこと、3.分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進機構に、細胞内エネルギーセンサーであるAMPKは直接関係していないことを明らかにした。18年度は分岐鎖アミノ酸の糖尿病治療への貢献の可能性を探ることを目的として、1.摂食にともなう一過性の血糖値上昇の抑制に有効な分岐鎖アミノ酸の投与量の決定、2.糖尿病に対する分岐鎖アミノ酸投与の有効性の検証を行った。その結果、1.摂食開始前に体重100g当り135mgのロイシン、あるいはイソロイシンを投与した場合、摂食にともなう一過性の血糖値の上昇は抑制され、且つ成長阻害がおこらないことから、この投与量が摂食にともなう血糖値上昇の抑制に有効であること、2.2型糖尿病モデルラットに正常ラットの試験で効果が実証された量のロイシン、あるいはイソロイシンを投与した場合にも摂食にともなう血糖値上昇の抑制が見られたことから、ロイシン、あるいはイソロイシンの食前投与は糖尿病治療に有効である可能性が示唆された。本年度は分岐鎖アミノ酸が血糖値を低下させるメカニズムの解明を日指して以下のような研究を行った。(1)分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進能の評価ロイシンとイソロイシンは骨格筋へのグルコースの取込みを促進することで血糖値を低下させるものと考えられる。そこで、分岐鎖アミノ酸を投与したラットに2-[1,2-^3H]-deoxyglucoseを尾静脈から投与して、骨格筋内の2-[1,2-^3H]-deoxyglucose-6-phosphateを測定することで、分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進能を評価した。18時間の絶食にしたラットに135mg/100g bwのロイシンを経口投与した場合、1時間後に血糖値は減少する傾向がみられたものの対照群との間に統計的な有意差はなく、骨格筋へのグルコースの取込みはわずかに促進されたものの対照群との間に統計的な有意差はなかった。一方、同量のイソロイシンを投与することで血糖値は有意に減少し、骨格筋へのグルコースの取込みが有意に促進された。(2)取り込まれたグルコースがエネルギーを産むか否かについての検証骨格筋に取り込まれたグルコースは代謝されエネルギー源として利用されるのか、あるいはグリコーゲンに合成されて蓄積されるのかを明らかにする必要がある。そこで、分岐鎖アミノ酸を投与したラットに[U-^<14>C]-glucoseを尾静脈から投与して、骨格筋内のグリコーゲンに取り込まれた[U-^<14>C]-glucoseを測定した。その結果、ロイシンを経口投与することで骨格筋でのグリコーゲン合成が有意に増加したが、イソロイシンを経口投与してもグリコーゲン合成は刺激されなかった。このことはイソロイシンが骨格筋へのグルコースの取り込みを刺激し、取り込まれたグルコースはエネルギー源として利用されていることを暗示している。(3)分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進機構の解析

最近の研究でAMPK(AMP-activated protein kinase)が細胞内エネルギーを消費する経路とエネルギーを生産する経路の主要な調節因子であることが示された。このAMPKが骨格筋内でグルコース輸送を導くエネルギーセンサーとして機能しているようである。そこでAMPK(AMPKα1、AMPKα2)が分岐鎖アミノ酸によってどのような調節を受けているのかを調べた。その結果、イソロイシンを投与した場合はAMPKα2の活性が減少し、ロイシンはAMPK活性に影響を及ぼさなかった。以上のことから、分岐鎖アミノ酸のグルコース取り込み促進機構にAMPKは直接関係していないことが示された。昨年度得られた「分岐鎖アミノ酸の中でもイソロイシンが最も強い血糖値低下作用を有し、この作用は骨格筋へのグルコースの取込み促進に起因している」等の知見をもとに、本年度は分岐鎖アミノ酸の糖尿病治療への貢献の可能性を探ることを目的とした。1.摂食にともなう一過性の血糖値上昇の抑制に有効な分岐鎖アミノ酸の投与量の決定6時間の時間制限給餌に馴致したWistar系雄ラットを5群(ロイシン群、イソロイシン群、バリン群、生理食塩水群、無投与群)に分け、毎日摂食開始直前に生理食塩水およびそれぞれの分岐鎖アミノ酸溶液を経口投与した。分岐鎖アミノ酸の投与量は、ラットが1日に摂取する食餌中に含まれるロイシン量を基準としてラット体重100g当り135mgとした。1日おきに摂食開始から1時間後に尾静脈より血液を採取し、血糖値を測定した。その結果、ロイシン、イソロイシン投与によって摂食にともなう血糖値の上昇が抑制された。いずれの群においても体重、摂食量に差は見られなかったことから、分岐鎖アミノ酸の食前投与によって成長が阻害されることはないことが示された。2.糖尿病に対する分岐鎖アミノ酸投与の有効性の検証幼若時より高血糖を示し、非肥満で2型糖尿病を発症するGKラットに、正常ラットの試験で効果が実証された量の分岐鎖アミノ酸を投与して、正常ラットで見られたのと同様な摂食にともなう血糖値上昇の抑制効果が見られるか否かを調べた。その結果、摂食開始1時間後の血糖値上昇はロイシン投与で抑制され、イソロイシン投与によってもわずかに抑制される傾向が見られた。結論:ロイシン、イソロイシンの食前投与によって摂食にともなう血糖値上昇が抑制され、またこれらの食前投与は糖尿病治療に有効である可能性が示唆された。
エッセンシャルオイルの抗アレルギー効果

日本では食物アレルギー、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などの即時型アレルギーが増えている。本研究では抗アレルギー作用をもつ成分をみつけるためにまずマスト細胞の脱顆粒を抑制する物質の検索を行った。その結果、β-グルカンが脱顆粒抑制効果、受動皮膚アナフィラキシー反応の抑制を示した。花粉症患者を対象としてβ-グルカンを経口投与したところ、鼻づまりや涙が出るといった花粉症特有の症状が軽減された。また精油について調べたところ、ゼラニウム精油およびその主要成分であるシトロネロールにマスト細胞脱顆粒抑制効果、炎症性サイトカインの産生抑制効果、MAPキナーゼであるERKのリン酸化の阻害効果があった。近年、日本では花粉症、食物アレルギー、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患に罹患する人がますます増えている。アレルギー性疾患にかかると日常生活に多大な影響を与えるのでその対策は急務である。この即時型アレルギー性疾患の発症には免疫グロブリンEを介したマスト細胞の脱顆粒が必須である。従って、この脱顆粒反応を抑えることができればアレルギー反応の軽減あるいは予防ができる可能性がある。そこで、マスト細胞の脱顆粒抑制効果を指標としてスクリーニングを行った結果、レモングラス精油にその効果があることが判明した。レモングラス精油はマスト細胞の生存率には影響を与えないので細胞が死んで脱顆粒反応が抑制されるわけではない。また、生体内での即時型アレルギー反応のモデルとして受身皮膚アナフィラキシー(PCA)反応がよく使われる。レモングラス精油はマウスを用いたPCA反応も抑制することがわかった。次に、レモングラス精油に含まれる有効成分について検討した。レモングラス精油の主成分はゲラニアールとネラールの異性体が1:1の分子比で構成されているシトラール、ゲアニオール、酢酸ゲラニル、リナロール、カンフェンである。これらの成分について検討した結果、シトラールが強い脱顆粒抑制効果とPCA反応抑制効果を示した。レモングラス精油の抗アレルギー効果はこれらの成分によってもたらされると考えられる。このようにレモングラス精油はin vitroとin vivoの実験系で抗アレルギー効果が示されており、今後アレルギーを軽減あるいは予防する物質として期待される。わが国では、食物アレルギー、花粉症、気管支喘息などの即時型のI型アレルギーが増えている。このI型アレルギーは抗原刺激を受けたマスト細胞が脱顆粒して、顆粒に含まれるヒスタミンなどの生理活性物質が体内で放出されることによって起こる。申請者のグループは植物由来のエッセンシャルオイルに焦点をあてて、マスト細胞の脱顆粒を抑制する物質の検索を行った。マスト細胞の脱顆粒抑制効果は顆粒に含まれているβーヘキソサミニダーゼの酵素活性をマーカーとして測定して調べた。細胞はラット好塩基球性マスト細胞株RBL-2H3を用いた。脱顆粒反応はRBL-2H3細胞をカルシウムイオノフォアA23187で刺激して行った。A23187を加える前にサンプルとして用いたエッセンシャルオイルを添加して脱顆粒反応が抑制されるかどうかを検討した。その結果、カモミールやレモングラスに強い脱顆粒抑制効果が認められた。次に、カモミールやレモングラスをRBL-2H3細胞に加えた場合の生存率を検討した。脱顆粒抑制効果を示す濃度のカモミールやレモングラスを加えても、RBL-2H3細胞の生存率は低下することはなく、脱顆粒反応の抑制は細胞が死ぬことによって起こるのではないことが確認された。動物の皮膚をあらかじめ抗体で受動感作した後、抗原を投与して誘発される皮膚局所のアレルギー反応を受身皮膚アナフィラキシー(PCA反応)という。この反応において、抗原投与時にエバンスブルーなどの色素をマウスの尾静脈から注射しておくと、皮膚血管の透過性亢進による色素の漏出量でアレルギー反応の程度を調べることができる。カモミールはPCA反応を阻害しており、生体内でもアレルギー反応を抑制することが示された。近年、日本では食物アレルギー、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などの即時型アレルギー性疾患に罹患するヒトが増加している。アレルギー性疾患に罹患すると日常生活に多大な影響を与えるのでその対策は急務である。この即時型アレルギー性疾患の発症にはマスト細胞の脱顆粒が必須である。そこで、マスト細胞の脱顆粒を抑制できればアレルギー反応の軽減あるいは予防が出来ると考えた。マスト細胞の脱顆粒を抑制することができる物質のスクリーニングを行った結果、βーグルカンにその効果があることが判明した。βーグルカンはマスト細胞の生存率には影響を与えない。またβーグルカンは生体内での即時型アレルギー反応のモデルとして一般的に使われる受動皮膚アナフィラキシー反応もマウスで抑制することがわかった。次に、ヒトに対しても効果があるかどうかを検討した。花粉症患者を対象としてβーグルカンを経口投与したところ、鼻づまりや涙がでるといった花粉症に特有の症状が軽減されることが示された。これらのことからβーグルカンには即時型アレルギー性疾患を抑制する作用があると考えられる。さらに、精油の脱顆粒抑制効果を調べたところ、ゼラニウム精油がマスト細胞の脱顆粒抑制効果を有することがわかった。ゼラニウム精油はマスト細胞の生存率には影響を与えない。さらに、ゼラニウム精油は炎症性サイトカインであるTNF-alphaの産生を抑制することがわかった。現在、ゼラニウム精油の有効成分の特定と脱顆粒抑制効果あるいは炎症性サイトカイン産生の抑制作用のメカニズムの検討を行っている。最近、日本では食物アレルギー、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などの即時型のI型アレルギーが増えている。

このI型アレルギーは抗原刺激を受けたマスト細胞が脱顆粒して、顆粒に含まれていたヒスタミンやセロトニンなどの生理活性物質が体内で放出されることによって起こる。そこで、抗アレルギー効果のある成分をみつけるためにマスト細胞の脱顆粒を抑制する物質の検索を行った。その結果、β-グルカンに脱顆粒抑制効果があることが判明した。また、β-グルカンは生体内での即時型アレルギー反応のモデルとして一般的に使われる受動皮膚アナフィラキシー反応をマウスで抑制した。さらに、人に対しての効果があるかどうかを検討した。花粉症患者を対象としてβ-グルカンを経口投与したところ、鼻づまりや涙が出るといった花粉症特有の症状が軽減されることが示された。これらのことから、β-グルカンは即時型アレルギー性疾患を抑制する可能性があると考えられる。次に、精油の脱顆粒抑制効果を調べたところ、ゼラニウム精油がマスト細胞脱顆粒抑制効果を示した。ゼラニウム精油の有効成分を調べたところ、シトロネロールが主な成分であった。シトロネロールは脱顆粒抑制効果に加えて炎症性サイトカインの産生を抑制した。またMAPキナーゼであるERKのリン酸化を阻害した。これらのことより、ゼラニウム精油及びその主成分であるシトロネロールは抗アレルギー効果を持つことが期待される。日本では食物アレルギー、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などの即時型アレルギーが増えている。本研究では抗アレルギー作用をもつ成分をみつけるためにまずマスト細胞の脱顆粒を抑制する物質の検索を行った。その結果、β-グルカンが脱顆粒抑制効果、受動皮膚アナフィラキシー反応の抑制を示した。花粉症患者を対象としてβ-グルカンを経口投与したところ、鼻づまりや涙が出るといった花粉症特有の症状が軽減された。また精油について調べたところ、ゼラニウム精油およびその主要成分であるシトロネロールにマスト細胞脱顆粒抑制効果、炎症性サイトカインの産生抑制効果、MAPキナーゼであるERKのリン酸化の阻害効果があった。本研究の目的は抗アレルギー効果を示す物質を探索して、その作用機序を調べることである。マスト細胞の脱顆粒は即時型アレルギー反応に必須であるのでこの脱顆粒を抑制する物質を探索した結果、ゼラニウム精油がマスト細胞の脱顆粒を抑制することを見出した。ゼラニウム精油は細胞の生存率には影響を与えない。このことはゼラニウム精油がマスト細胞の生存に影響を与えて脱顆粒を抑制しているわけではないことを示している。また、ゼラニウム精油は炎症性サイトカインの産生も抑制することを見出した。今後は有効成分の特定と作用機序について検討する予定である。これまでの実験結果からカモミール精油、レモングラス精油、ゼラニウム精油がマスト細胞の脱顆粒抑制効果を有することがわかった。これらのことは、さまざまな精油及びその成分に抗アレルギー効果があることを示しており、当初の目的は概ね果たしていると考える。
社会教育指導者研修プログラムの開発におけるレジェンシー原理定着の可能性

2005年6月7月神戸大学発達科学部で社会教育主事講習をモデル事業として実施した。そのために2004年度2005年5月までの期間は、基礎的な調査研究やプランニングにあてた。研究についての打ち合わせや概念の共有については、ほぼ週1回のミーティングを開催して行った。個別の研究が中心であったが、共同研究者間での共通した認識が増した。社会教育主事講習では、社会教育指導者である受講者が自らエンパワーメントし、相互に学習をファシリテイトしていくプロセスを支援すること、またそうした学習成果が外部効果となることを目標とした支援を柱としたプログラムを構成し、結果を評価した。こうした研究にあたって、次の各点を参照しながら作業を進めた。第一に、学校教育と社会教育との関係の中でのレジリエンシー原理の追究。第二に、成人教育の文脈におけるレジリエンシー原理の追究。第三に、人権教育に関わったレジリエンシー原理の追究。第一の点(学校教育と社会教育の関係)は、社会教育指導員の多くが学校関係者であることから、モデル事業の中でも重要な位置を占めたが、その後も継続的に追究し、共同研究者の伊藤篤が2006年2月に東京都練馬区での研究会に出席し、意見交換を行った。第二の点(成人教育の文脈)は、本研究での基本的視点として措定したところであり、実践評価等の場面でさらに深い議論を要求された。研究代表者の末本は、この視点から、2005年10月にフランスナント大学の研究会に出席し、グローバルな場で情報交換や討議を行った。第三の点(人権教育)は、レジリエンシー原理の基本構成要素として認識され、モデル事業でも一貫して重視したポイントである。研究代表者、共同研究者各人がそれぞれに追究したが、特に共同研究者の朴木佳緒留が2005年12月に開催された女性学研究会シンポジウムで、幅広い討議のための話題を提供した。2005年6月7月に神戸大学発達科学部で実施される予定の社会教育主事講習を当座のモデル事業とするために、本年度はその基礎的な調査研究にあたった。個別の研究が中心であったが、共同研究者間での共通した認識が増したことも、今年度の大きな成果である。個別の研究としては以下の通りである。伊藤らは、レジリエンシー原理が実践的に応用可能な概念であることを神戸市内の児童館におけるドロップインセンターの試みを通して実証した。この事業は、子どもを遊ばせたり預かったりする機能、アウトリーチの機能、親をエンパワーする機能、支援者を育成する機能、情報や日用品を交換する機能、子育てのあり方も含めて家族・家庭の悩みや問題が相談できる機能をもつもので、その複合機能のゆえに、立ち寄る(ドロップインする)ことによって、子育て・子育ちに関する多様なニーズを同じ時間に同じ空間で満たすことができるため、地域の親子にとって非常に有用な場になるというものである。朴木らは、ジェンダー問題学習の視点から社会教育関係職員に必要な研修内容の情報収集を行った。特に、ジェンダー問題に取り組む学習者(研修生)が、社会教育の実践現場に戻った際に、学習した内容を生涯学習の観点からさらに学習プログラム化していくことから生まれる学びの豊かさ(レジリエンシー)について追究した。末本は、9月23日25日に、フランスのもるばん地方のモルバンの家で開かれた、国際教育生活史研究協議会(ASHIVIF)のシンポジウムに参加し、報告を行ったほか、ワークショップでは生活史を成人教育の応用を体験した。報告は、論文として整理し『沖縄の集落公民館に関する実証的研究(第3集)』(2005.3)に収録予定)。

研究代表者、共同研究者各人がそれぞれに追究したが、特に共同研究者の朴木佳緒留が2005年12月に開催された女性学研究会シンポジウムで、幅広い討議のための話題を提供した。
植物のタンパク質分解系を応用した細胞内での条件特異的標的タンパク質分解技術の開発

本年度は本研究課題で達成された、植物ホルモンオーキシン分解経路を出芽酵母および動物培養細胞に移植することで、特定の目的タンパク質を分解により発現コントロールする新たな手法(auxin inducible degron ; AID)を論文公表するために多くの時間を割いた。その結果、投稿した論文はNature Methods誌12月号にArticleとして掲載された。使用した出芽酵母およびプラスミドはバイオリソースセンターNBRPに寄付したが、論文公表以後非常に多く研究者からサンプルリクエストを頂いている。また論文公表に伴い、日経産業新聞11/16朝刊やNature Chemical Biology誌1月号でもニュースとして取り上げられた。また、本手法に関連する特許を行ったが、複数の海外の企業から共同開発のオファーを頂いており、現在今後の開発方針を検討中である。また基礎的な研究分野においては、AID法を用いて出芽酵母において複数の複製因子のコンディショナル変異株を作成した。それらを用いて複製因子Mcm10の機能解析を進めている。現在までMcm10はCDKとCdc45に依存するかたちで、複製開始点に呼び込まれることが明らかになった。この結果はこれまで考えられていたMcm10の挙動と異なっており、今後の研究によりMcm10の詳細な複製反応における機能が明らかにできるものと期待している。平成19年度目標とした出芽酵母を用いたオーキシン誘導タンパク質分解による変異株の作製法を確立することに成功した。出芽酵母にシロイヌナズナ由来TIR1と、GFPのN末端もしくはC末端にシロイヌナズナ由来IAA17を融合したタンパク質を発現する株を作製した。培地中に植物ホルモンオーキシンとして知られる、インドール酢酸もしくはナフタレン酢酸を添加すると30分以内にGFPタンパク質の発現が消失した。この反応はTIR1非存在下では起こらないこと、またプロテアソーム阻害剤で阻害されることから、細胞内で形成されたSCF^<TIR1>のユビキチン化反応による分解により標的GFPタンパク質が消失するものと考えられる。この結果は、植物特有のオーキシン分解反応を出芽酵母に導入することに成功したことを示している。また分解誘導後、オーキシンを含まない培地に細胞を戻すとGFPタンパク質が再発現することから、この分解反応は可逆的であることが示された。つぎに、実際の内在性因子にこの分解反応を応用することで、条件特異的変異株が作製できるか実験をおこなった。染色体複製因子Mcm4のN末端もしくはC末端にIAA17を付加した細胞は、正常に生育するがTIR1を発現させた時にオーキシンを添加した培地上ではコロニー形成ができなかった。さらに液体培養をおこない細胞周期を調べたところ、オーキシン添加時によりG1期からS期への移行ができない細胞の集積が観察された。すなわち、オーキシンの添加によって制御可能な条件特異的変異株作成が可能となった。他の細胞周期因子にも応用したところ、キネトコアタンパク質であるAsk1の場合はM期の移行が、サイトキネシス因子のMyo1の場合は細胞質分裂の過程が阻害されたことからも、この方法が多くの因子に応用可能であることが示された。昨年度までは植物ホルモンオーキシンを用いた、出芽酵母レベルでのタンパク質発現調節法の確立、およびその方法を用いた条件特異的変異株作成をおこなった。そこで、本年度は本手法を動物培養細胞レベルにおいて機能させるための研究を遂行した。研究の過程で、この植物ホルモン分解系を利用したタンパク質発現制御は、出芽酵母において24度付近ではよく機能するが、37度では機能しないことが明らかになった。それまでの分解系に用いてきた植物ホルモン受容因子はシロイヌナズナ由来のものであるが、これをイネ由来のものに変更すると熱耐性が付与させることを見いだした。この結果を受けて、改良をおこなったオーキシン分解システムを動物培養細胞に導入したところ、動物細胞内でオーキシン添加により、GFPが15分以内に分解除去できることが分かった。また、分解誘導後、オーキシンを培地から除去することで発現の回復もみられ、オーキシンの濃度依存的にGFP発現量のコントロールも可能であることが明らかになった。この結果はHeLa,HEK293,COS1,CHO,NIH3T3細胞などの多くの細胞種で確認されたことから、今後幅広い培養細胞種に応用されることが期待される。本手法をauxin inducible degron (AID)法と名付け、現在論文公表にむけた準備を進めるとともに、本手法の特許出願に向けて用意を進めている。

現在までMcm10はCDKとCdc45に依存するかたちで、複製開始点に呼び込まれることが明らかになった。この結果はこれまで考えられていたMcm10の挙動と異なっており、今後の研究によりMcm10の詳細な複製反応における機能が明らかにできるものと期待している。