hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植医療における新しい薬力学解析の導入:免疫抑制薬のB細胞への効果の解明

リガンドによるB細胞の増殖は、CSAの影響を受けなかったことから、T細胞を特異的に増殖させる抗CD3/CD28抗体にて増殖させたB細胞に対する作用ではなく、T細胞の増殖抑制による効果であると考えられた。以上の結果から、B細胞の増殖機序の違いによりCSAの影響が異なることも示唆されたため、今後はこれを考慮した薬力学的解析を確立し、実際の患者血液を使ったretrospectiveな検討を行う予定である。今年度はこれまでに開発したT細胞のPD解析法の有用性について検討した。(1)Cyclosporine A(CSA)服用腎移植患者15名の移植前および移植後(3週間4年)において、免疫抑制薬に対する感受性をT細胞増殖を指標として解析し、移植前後での変化の有無を調べた。(2)74名のCSA服用腎移植患者[拒絶反応(n=16)、感染症(n=15)、臨床所見なし(n=43)]の感受性試験をレトロスペクティブに実施し、臨床所見との関連性を検討した。(1)CSAのT細胞増殖におけるIC50値は移植前後で65±39 ng/mLと68±35 ng/mL、bottom値(最小増殖率)は30±16 %と33±17 %で変化は認められなかった。(2)Cytomegalovirus(CMV)/ Varicellazoster virus(VZV)の再活性化とCSA高感受性群(bottom<25%)、T細胞性急性拒絶反応とCSA低感受性群(bottom≧25%)の有意な関連性が認められた。一方、抗体関連型拒絶反応を引き起こす可能性のある新規HLA抗体産生とCSA高感受性群との有意な関連性が認められ、その多くはCMV/VZVの再活性化を起こしていた。今回の結果より、CSAに対するT細胞の感受性は免疫抑制薬の服用により変化しないことが示唆された。CMV/VZVの再活性化、急性拒絶反応の発症および新規HLA抗体産生などの臨床症状とCSAのPDパラメーターとの関連性が認められたことから、PD解析法の有用性が明らかとなった。これまでに開発したB細胞およびT細胞のPD解析法を用いることで、抗体関連型拒絶反応のハイリスクであるABO血液型不適合移植やHLA抗体陽性(クロスマッチ陽性)移植における免疫抑制薬の選択や、慢性拒絶反応の予防などに関する有用な情報を提供できる可能性が示唆された。当初の計画通り、本年度までにB細胞における薬力学解析法の確立やその解析法を用いた免疫抑制薬の効果、個体間変動の解析までがほぼ完了している。したがって、次年度も当初計画してした通りに、患者の血液を用いたretrospectiveな検討へと進む予定であり、現在既にその準備にとりかかっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は当初の計画通り、これまでに検討してきたB細胞の薬力学解析法を用いて、B細胞解析およびT細胞解析を組み合わせた、より厳密な薬効評価法の確立を目指す。来年度は特に実際の患者検体を用いての検討を進める。患者血液は共同研究施設である名古屋第二赤十字病院移植外科の全面的な協力が得られることが決定しているため、研究の遂行に支障はない。
円筒燃料内への軸及び接線方向酸化剤噴射が成す旋回乱流燃焼場の解明

ハイブリッドロケットモータの流動と燃焼の時間的安定性特性を評価するための数学モデルおよび評価のためのプログラムを作成した。モデルは、1)流れ場シミュレーションのためのオイラー方程式を使用した準一次元気体力学モデル、2)化学平衡を用いた化学モデル、3)火炎から固体燃料への熱伝達に関する非定常熱フィードバックモデル、4)固体燃料内部の一次元熱伝導モデルからなる。非定常熱フィードバックに時間遅れ考慮することにより、燃焼・流動系の全モードを励起するとともに、適切なモデルパラメータの値を選定することによって、実験における非線形リミットサイクル振動の振幅を予測することが可能であることを示した。平成28年度に実施した燃焼試験で用いた機材を修正し、酸化剤として液体酸素を噴射器上流における熱交換器を通じて気化して旋回噴射した。燃料後退速度や燃焼状況が変化する様子を可視化実験によって収録し、昨年度より検討してきた輝炎の流速に基づいて燃料後退速度の関係式を導くことに成功した。また、事前気化の温度によって変化する燃焼の様子や燃料後退速の特性が把握できた。昨年度作成したWAX燃料を充填するための装置を用いて燃料グレインを成形する製造手順を確立した。酸化剤の軸及び接線噴射量を操ることでハイブリッドロケットの推力とO/F比をフィードバック制御するための制御則を作成した。レジリエントな宇宙旅行に適するハイブリッドロケットシステムについて検討した。これらの成果をハイブリッドロケットシンポジウム,ICFD,宇宙科学連合講演会において発表した。レジスタ型燃料後退速度センサーの実験のためのWAX燃料製造手法が確立したこと、簡易なCFDで特性を静的及び非定常の燃焼特性を評価するための手法が確立したこと、A-SOFT方式の制御のための制御則を導いたこと、液体酸素を事前気化した燃焼試験を開始したことなど、当初の計画に沿って概ね順調に進展している。今後は、ミラノ工科大学のレジスタ型燃料後退速度センサーを組み込んだ燃焼実験を実施すること、A-SOFT方式の制御則を用いたシミュレーションを実施し成果をまとめることを推進する。ハイブリッドロケットの非定常燃焼流解析技術の確立を目指して、数値解析及び燃焼実験の2つのアプローチで研究を進めている。数値解析については、複数の方法で、乱流燃焼場の解析用ソフトウェアを開発し、数種類の数値解析を実行した。酸化剤流旋回型ハイブリッドロケットにおける燃料後退速度の軸方向分布を実験値と比較することにより、それらの方法の妥当性を検証し、この種のハイブリッドロケットに対し妥当な解析を行えていることを確認した。燃焼実験については、内部燃焼の可視化が可能な透明アクリル樹脂製の燃焼室兼燃料グレインを備えたハイブリッドロケット燃焼器を設計・製作し、気体酸素の軸方向と接線方向の流量比を変数として5水準の条件について、大気開放圧力条件で燃焼実験を行った。その際、高速度カメラ2基(軸方向と横方向)によって、フレームレート30000fpsでの可視光撮像を実施した結果、軸方向と接線方向の2系統噴射による旋回燃焼流や旋回する筋状の火炎の形成に加え、接線方向流量比の高まりとともに、筋状火炎本数が増加すると共に、軸方向となす角度が増大することや、燃料後退速度が大きくなることが確認されている。今後さらに詳細な画像解析を実施することで、酸化剤噴射と流れ場特性の関係を詳細に分析する予定である。本研究の応用として、軸・接線2方向の酸化剤インジェクションの流量を独立に操作することによって、推力と酸燃比を同時に制御することを可能とするAltering-intensity Swirling-Oxidizer-Flow-Type (A-SOFT)ハイブリッドロケットに関して、その飛翔実証のためのミッション要求とシステム設計の内容を対外発表した。当初計画の仕様から色々な検討を経て変更する必要が生じたものの、今年度予定していた燃焼実験と可視化実験を行うことができたこと及び、旋回乱流燃焼流の数値解析について3種の手法で取り組む中、2つについては初期結果が得られていること等から、おおむね順調に進捗していると考えている。

レジスタ型燃料後退速度センサーの実験のためのWAX燃料製造手法が確立したこと、簡易なCFDで特性を静的及び非定常の燃焼特性を評価するための手法が確立したこと、A-SOFT方式の制御のための制御則を導いたこと、液体酸素を事前気化した燃焼試験を開始したことなど、当初の計画に沿って概ね順調に進展している。軸/接線方向の二系統酸化剤噴射が行われる固体燃料円筒流路内に生じる旋回乱流燃焼場の火炎・渦構造を研究する目的で、昨年度実施した可視化燃焼実験結果に対して基本画像解析、多重統計解析および適切な直交分解(POD)を燃焼室の前面と側面の両方から得た燃焼場の画像に適用し、接線方向対軸方向酸化剤流量比がハイブリッド燃焼場に及ぼす時間平均的及び周波数の特性を把握することに成功した。同様の問題に対して、非定常旋回乱流燃焼(LES)解析を実施し、酸化剤の軸-旋回流量比が異なる2ケースを比較することによって、実験で得た特徴を再現することができることを確認することができた。また、これまで理解が不十分だった燃焼室内部速度場と燃料後退速度、火炎高さの関係について理解を深めることができた。また、本解析によって乱流熱伝導率の評価、低周波燃焼振動の発生メカニズムの評価が可能であることが示唆された。既往研究の実験データに基づいて、固体燃料の破砕・粉塵化に着目したハイブリッド推進薬の爆発ハザード影響予測数理モデルを構築し、爆風に関する保安距離の評価方法を作成した。他実験と比較してこれらのモデルが良好に当てはまることを示した。これらの成果をISTS, EUCASS, ICFD,宇宙科学連合講演会等において発表した。第61回宇宙科学技術連合講演会「宇宙旅行実現への課題と対策」と題するオーガナイズドセッションにおいて、法律家、経済学、人文学、医学の専門家や、広告・芸能分野の方々による宇宙旅行に関わる発表がある中、ロケット推進系の専門家として宇宙旅行に適するロケットの検討結果を述べた。燃焼実験を可視化する手法を導入し、LES数値解析を実施できたこと、これらの比較を進められたことで当初のどおりに進捗しているのに加え、ハイブリッド推進薬の爆風予測のためのモデルづくりができたことは計画以上に進捗とも言える。数値解析については、旋回乱流用の乱流モデルの検討を進め、よりフットワークの良い数値解析法を取り入れる。それによって、軸方向・接線方向のインジェクタ設計や燃焼器及びノズルの設計の効率化に資する数値解析技術の確立を目指す。今年度取得した高速撮像データに対して、画像解析を実施することにより、筋状火炎の角度および形成位置の軸方向分布の取得を試みる。また、それらの時間的変化についても考察する。合わせて、画像解析により長手方向の2次元速度分布の取得も試みる。各条件に対してこれらのビックデータ解析を行い、軸方向と接線方向の流量比の変化に対する流れの状態の変化の知見を得る。今後は、ミラノ工科大学のレジスタ型燃料後退速度センサーを組み込んだ燃焼実験を実施すること、A-SOFT方式の制御則を用いたシミュレーションを実施し成果をまとめることを推進する。
核内受容体のアポ/ホロ構造の差構造解析による化学物質の受容体結合リスク評価法

内分泌撹乱化学物質・環境ホルモンの生態系への影響は、様々な化学物質がホルモン受容体と結合し、疑似(ニセ)の作用を引き起こすことに起因する。この受容体結合メカニズムを解明することは、化学物質の受容体結合性を判別する基礎的なデータとなる点で重要であるが、現時点ではリガンドが結合していないレセプター(アポ体)の立体構造はRXRレセプターのみが知られているに過ぎず、直接的な結合試験なしでは様々な化学物質の受容体結合特性を評価するのが困難な状況である。そこで本研究では、分子モデリングの手法を用いてエストロゲン受容体のアポ体タンパク質のリガンド結合部位(LBD)の立体構造を解析・構築することでリガンド結合部位の構造を決定し、種々の化学物質の結合性の予測を行なうとともに、環境ホルモンリスク評価法を確立することを目的に、以下を研究を実施した。まず、分子モデリングで作製したエストロゲン受容体LBDを鋳型としてドッキング計算プログラムを用いた結合性の予測を行った。その結果、高い精度で計算が可能なAffinityプログラムを用いると、複合体エネルギーの値から危険性物質のグルーピングが可能なことが判明した。しかし、ハイスループットを目指した高速ドッキング法では、計算方法の改良が必要であることが明らかとなった。一方、環境ホルモンリスク評価法として近年注目を集めている、核内受容体LBDのリガンド結合に伴う構造変化を認識する抗体を用いたセンシング法の作動機序を分子モデリングを用いて解析しところ、コンホメーション変化の効果的なセンシングには、1)リジッドなヘリックス構造を保持したまま、リガンド結合時に受容体と結合することで分子表面を隠すH12にN端側ループ領域を加えた部位、2)H12に附帯するループ領域、あるいはC末端のループ領域のみ、を抗原として用いることが必要なことを明らかにした。内分泌撹乱化学物質(いわゆる環境ホルモン)の生態系動物への影響は、様々な化学物質がホルモン受容体と結合し、疑似(ニセ)の作用を引き起こすことに起因する。この受容体結合メカニズムを解明することは、化学物質の受容体結合性を判別する基礎的なデータとなる点で重要である。しかしながら、現時点ではリガンドが結合していないレセプター(アポ体)の立体構造はRXRレセプターただ一つのみが知られているに過ぎず、様々な化学物質の受容体結合特性を評価するのが困難な状況である。そこで本研究では、(1)分子モデリングの手法を用いてエストロゲン受容体のアポ体タンパク質のリガンド結合部位(LBD)の立体構造を解析・構築し、リガンド結合部位の構造を決定し、(2)そのリガンド結合部位構造をテンプレートとして種々の化学物質の結合性の予測を行なうことを目的に、以下を実施した。分子モデリングで作製したエストロゲン受容体LBDにおいて、ヘリックスH12の構造的に安定な存在部位は、アゴニスト結合型とアンタゴニスト結合型のH12の位置に対してちょうど中間的な位置に存在することが判明した。これは、H12がアゴニスト結合型、もしくはアンタゴニスト結合型の位置に変化しうることを示しているが、リガンドの受容体への結合によってH12の位置が変化するためには好都合の位置取りと判断された。しかしながら、この状態を保証する分子構造的な構造要因は不明である。一方、リガンドの結合構造解析において、E2 (17βエストラジオール)の結合部位はアポ体とホロ体で大きな違いはないことが判明した。微細構造解析では、アポ体におけるE2とそのD環近傍に存在する受容体アミノ酸側鎖の間には空きスペースがあり、この方向からのリガンドのLBDへの進入が予想された。また、アポ体へのドッキングシュミレーションで大きな分子、小さな分子を含めて合計20種類の化学物質の結合構造を解析したところ、ほとんどの化学物質が結合可能であることが明らかとなった。
伝統野菜の評価と伝承に向けた実践研究

本研究では、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜に着目し、その評価と伝承に向けた実践研究を行う。今年度は、滋賀県伊吹の伊吹大根、高月の高月丸なす、甲賀の水口かんぴょう、杉谷の杉谷とうがらし、杉谷なすび、杉谷うり、草津の山田大根について、栽培状況と暮らしとの関わりについて聞き取り調査を実施し、種子あるいは収穫物をそれぞれ長年にわたり継続して栽培している農家から供与された。伊吹大根、山田大根を含む様々な大根品種と、高月丸なすを含む様々なナス品種を滋賀大学内農場で栽培した。これらの収穫物および供与物を供試し、クリープメータを用いた物性と、DPPHラジカル消去活性、総ポリフェノール量、ビタミン類、辛味成分、揮発性成分等について分析した。栽培した伝統野菜は、いずれも各地域で収穫されるものと同等の大きさ、形であり、一般の農場で栽培する方法が確立できた。また、高月丸なすの青枯病に対する抵抗性が他品種のナスに比べて高いことも明らかになった。各種科学分析の結果、いずれの伝統野菜も相当する一般野菜と比べて成分に大きな差はなく、物性面から、加熱調理向けや漬物向けなど、加工・調理特性があることが明らかになった。なかでも、水口かんぴょうには、高い吸水率と調味料の高い浸潤性を認めた。さらに、学校教育における伝統野菜の活用と継承について検討することを目的に、まず、滋賀県内の小学校における栽培活動の実態と授業や食育への活用状況について調査した。次に、杉谷地区の小学校で総合的な学習の時間において杉谷とうがらしと杉谷なすびを教材とした栽培学習プログラムを考案し、実践・評価を行った。また、滋賀大学教育学部附属中学校で技術・家庭科技術分野において、日野菜を教材とした栽培学習プログラムを実践し、評価した。本研究は、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜の栽培と暮らしとの関わりを調査するとともに、伝統野菜の栄養価、嗜好性、機能性について評価することにより、今後の伝承について検討することを目的にしている。今年度は、滋賀県内5地域の7種類の在来野菜を中心に研究を進めた。その結果、これらの野菜に関わる調査と種子の入手、栽培方法の確立、栄養価や嗜好性、機能性に関わる分析をおおむね実施することができた。また、小学校における栽培活動の実態と授業や食育への活用状況について把握するとともに、小学校における総合的な学習の時間と、中学校における技術・家庭科技術分野において、在来野菜を活用した授業を実践し、その効果の検証も実施した。以上のことより、本研究は、おおむね順調に進展していると考えている。今後も、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜の栽培と暮らしとの関わりの調査と、伝統野菜の栄養価、嗜好性、機能性の科学分析による評価を進める一方で、学校教育における伝統野菜を活用した教育プログラムを検討して実践し、その効果を検証することで今後の伝承について検討する。今年度は、一昨年度および昨年度検討した在来野菜だけでなく、滋賀県内の他地域の在来野菜についても検討をすすめるとともに、科学分析手法を昨年度より増やし、栄養価や嗜好性、機能性についてより詳細に検討する計画である。さらに、小学校および中学校での授業プログラムに関わる検討を発展的に進める予定である。今年度は、滋賀県伊吹の伊吹大根、高月の高月丸なす、甲賀の水口かんぴょう、杉谷の杉谷なすび、杉谷とうがらし、杉谷うり、下田の下田なす、弥平とうがらしの栽培状況と暮らしとの関わりについて聞き取り調査を実施し、種子をそれぞれ長年にわたり継続して栽培している農家から供与された。杉谷なすび、下田なすを含む様々な品種のナス類と、弥平とうがらしを含む様々な品種のトウガラシ類を滋賀大学内農場で栽培し、収穫物の科学分析を実施した。分析は、クリープメータを用いた物性と、DPPHラジカル消去活性、総ポリフェノール量、ビタミン類、揮発性成分等とした。栽培した伝統野菜は、いずれも各地域で収穫されるものと変わらない大きさ、形のものを収穫することができ、一般の農場で栽培する方法が確立できた。また、弥平とうがらしからは、辛味性トウガラシ類に共通する揮発性成分以外に、非辛味性トウガラシ類で検出される物質も検出され、弥平とうがらしの辛味性と非辛味性の両方の香り成分を持ち合わせている特徴を明らかにした。一方、ポリフェノール含量とDPPHラジカル消去活性に相関がみられ、抗酸化性にはポリフェノールが寄与している可能性が示唆された。さらに、学校教育における伝統野菜の活用と継承について検討することを目的に、小学校生活科において伝統野菜を含めた様々な品種のナスを栽培・観察する授業を展開した。授業により、子どもの気付きの質と学習意欲、ナスに対する嗜好性を向上させることができ、このような授業実践は、今後の伝統野菜の継承にも効果的であると考えられた。今年度は、滋賀県内5地域の8種類の在来野菜を中心に研究を進めた。

その結果、これらの野菜に関わる調査と種子の入手、栽培方法の確立、栄養価や嗜好性、機能性に関わる分析はおおむね実施することができた。また、小学校生活科において在来野菜を活用した授業を実践し、その効果の検証も実施した。以上のことより、本研究は、おおむね順調に進展していると考えている。本研究では、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜に着目し、その評価と伝承に向けた実践研究を行う。今年度は、滋賀県伊吹の伊吹大根、高月の高月丸なす、甲賀の水口かんぴょう、杉谷の杉谷とうがらし、杉谷なすび、杉谷うり、草津の山田大根について、栽培状況と暮らしとの関わりについて聞き取り調査を実施し、種子あるいは収穫物をそれぞれ長年にわたり継続して栽培している農家から供与された。伊吹大根、山田大根を含む様々な大根品種と、高月丸なすを含む様々なナス品種を滋賀大学内農場で栽培した。これらの収穫物および供与物を供試し、クリープメータを用いた物性と、DPPHラジカル消去活性、総ポリフェノール量、ビタミン類、辛味成分、揮発性成分等について分析した。栽培した伝統野菜は、いずれも各地域で収穫されるものと同等の大きさ、形であり、一般の農場で栽培する方法が確立できた。また、高月丸なすの青枯病に対する抵抗性が他品種のナスに比べて高いことも明らかになった。各種科学分析の結果、いずれの伝統野菜も相当する一般野菜と比べて成分に大きな差はなく、物性面から、加熱調理向けや漬物向けなど、加工・調理特性があることが明らかになった。なかでも、水口かんぴょうには、高い吸水率と調味料の高い浸潤性を認めた。さらに、学校教育における伝統野菜の活用と継承について検討することを目的に、まず、滋賀県内の小学校における栽培活動の実態と授業や食育への活用状況について調査した。次に、杉谷地区の小学校で総合的な学習の時間において杉谷とうがらしと杉谷なすびを教材とした栽培学習プログラムを考案し、実践・評価を行った。また、滋賀大学教育学部附属中学校で技術・家庭科技術分野において、日野菜を教材とした栽培学習プログラムを実践し、評価した。本研究は、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜の栽培と暮らしとの関わりを調査するとともに、伝統野菜の栄養価、嗜好性、機能性について評価することにより、今後の伝承について検討することを目的にしている。今年度は、滋賀県内5地域の7種類の在来野菜を中心に研究を進めた。その結果、これらの野菜に関わる調査と種子の入手、栽培方法の確立、栄養価や嗜好性、機能性に関わる分析をおおむね実施することができた。また、小学校における栽培活動の実態と授業や食育への活用状況について把握するとともに、小学校における総合的な学習の時間と、中学校における技術・家庭科技術分野において、在来野菜を活用した授業を実践し、その効果の検証も実施した。今後も、日本の伝統的な食事を支えてきた伝統野菜の栽培と暮らしとの関わりの調査と、伝統野菜の栄養価、嗜好性、機能性の科学分析による評価を進める一方で、学校教育における伝統野菜を活用した教育プログラムを検討して実践し、その効果を検証することで今後の伝承について検討する。
湿式法によるスクラップからの銅およびニッケルの回収

軟鋼棒に銅線を巻き付けて作成した模擬スクラップならびに実際のニッカド電池スクラップをアンモニア性水溶液で浸出し、銅、ニッケルおよび鉄の溶解性に及ぼす浸出条件の影響を検討した。用いた浸出溶液は、アンモニア-炭酸アンモニウム混合水溶液ならびにアンモニア-硫酸アンモニウム混合水溶液である。また、酸化剤の効果をみるため、過酸化水素添加-酸素ガス吹き込み、または硫酸銅添加-酸素ガス吹き込みを行った。アンモニア-炭酸アンモニウム混合水溶液で模擬スクラップを浸出すると、酸素ガス吹き込みを行っても、過酸化水素を添加しない限り、銅の溶解はみられなかった。過酸化水素は浸出初期における銅の溶出ならびに鉄の不動態化に効果的であり、酸素ガスは銅の溶出率の向上に効果があると判断された。銅の溶出速度は溶液中のアンモニウムイオン濃度に大きく依存し、アンモニウムイオン濃度の高い溶液を用いると、酸化剤の併用により、約1.5時間で銅はすべて溶解した。なお、いずれの場合も鉄の溶解は無視できる程度であった。ニッカド電池スクラップの湿式処理では、酸化剤として過酸化水素を用いても、ニッケルの溶解はみられなかった。過酸化水素の代わりに硫酸銅を添加すると、ニッケルが約80%まで溶解するようになった。酸素ガス吹き込み速度やアンモニウムイオン濃度の影響は、模擬スクラップからの銅の回収の場合とほとんど同じであった。いずれの場合も目的金属の溶解速度は溶液中での試料の回転速度に依存し、本反応が境膜内物質移動律速であることを暗示していた。模擬スクラップ処理で得られた溶出液の銅濃度は30g/L以上、ニッカド電池スクラップ処理で得られた溶出液のニッケル濃度は約50g/Lであった。本反応は反応速度が遅いという欠点はあるが、鉄に対する目的金属の選択浸出性が抜群なため、実際のスクラップ処理に応用できると考えられる。
網膜像直接撮影法による眼球運動の発達的検討

近年、発達初期の視覚情報処理能力に関して多くの実験が実施され、重要な知見が蓄積されるようになってきている。しかし発達初期の眼球運動を解明することを直接的な目的とする研究は数少ない。本研究は、3歳から5歳までの幼稚園児を対象として、運動する視標に対する追跡眼球運動の発達、静止した幾何学的刺激に対するスキャンパスを検討することを目的として企図された。被験者は私立大学付属幼稚園に通園する健常な幼稚園児を各年齢ごとに5名づつとした。幼児を被験児とした従来の研究の多くが、眼球運動の測定に成功しなかったのは、幼児の動機づけを充分に高めることができなかったことに起因すると考え、本研究では、視標提示装置を改良工夫して、視標を従来の単純な円形の白色単一光の光点だけでなく、種々の多様なパタ-ン(例えばアニメの登場キャラクタなど)を提示できるようにした。幼児の注意を惹起する力の強いこうした刺激を用いることで、これまでにない非常に良い眼球運動記録を収集することができた。デ-タは大量で多岐にわたっているため、現在のところ解析が終了したのはごく一部であるが、これまでの解析の結果、次の様な知見が得られている。すなわち、(1)3歳から5歳にいたる3年間に眼球運動はその定性的側面、定量的側面で加齢に応じて着実に発達する。(2)具体的には、滑動的追跡眼球運動の視標と眼球運動の間の位相遅れの改善、(3)矩形波運動をするタ-ゲットに対するサッケ-ド潜時の短縮などである。また(4)対照とした成人のデ-タではパタ-ンを持つ刺激の提示によると、従来認められていた視標に対する眼球運動の先回り現象が消失するという興味深い知見も得られており、これらの点のより詳細な分析にとりかかっている。なお網膜像の直視法については種々の技術的困難があって、ようやく予備的な検討が緒についたばかりのところである。
抗てんかん薬の作用機序と生体膜脂質の研究

抗てんかん薬フェニトインの特異的結合部位に対して生体膜のイノシトールリン脂質であるポリホスホイノシチド(PPI)が親和性を示すことを認めたため、抗てんかん薬の作用機序について膜脂質をはじめ生体膜の生化学的機能の面から検討を行った。まず材料としてのPPIをCMセルロースを用いて脳より効率よく調製する方法を開発した。次にPPIの水解によって生成し、細胞内Ca動員に関与するセカンドメッセンジャーIP_3を簡便に分離することに成功した。イノシチド(PI)レスポンスに対するけいれん関連物質の影響を検討すると、けいれん促進性とされるムスカリン性アセチルコリンレセプターのアゴニストであるカルバコール、高濃度K^+イオン、グルタミン酸が促進的に作用した。一方けいれん抑制性とされるノルエピネフリンによってもPIレスポンスは促進され、けいれん剤ペンチレンテトラゾールや興奮性アミノ酸のNMDAでは影響が認められず、これらの薬物はPIレスポンスを介してけいれんに関わっている可能性は少ない。またセカンドメッセンジャーであるサイクリックヌクレオチドに対する興奮性、抑制性物質の影響を検討したところ上述のすべての興奮性物質でサイクリックGMP(cGMP)が上昇したが、抑制性物質ではこのような作用は認められなかった。cAMPではこのような傾向は認められず、cGMPとけいれん発現との関連が示唆されたが、各種抗てんかん薬はcGMPレベルには影響を与えなかった。さらにPPI代謝により生成するセカンドメッセンジャーの一つであるIP_3に対するレセプターに対する抗てんかん薬の効果を検討した。フェニトイン等の抗てんかん薬はIP_3の本レセプターへの結合に影響を与えなかったが、IP_3による本レセプターを介した細胞内Ca遊離を阻害した。IP_3レセプターへの抗てんかん薬の作用機構については今後の研究が更に必要である。けいれん発現および抗てんかん薬作用とイノシチドレスポンスとの関連性を追究しつつある。われわれはラット脳の膜画分に、代表的抗てんかん薬の一つであるフェニトイン(PHT)の特異的結合部位を見出し、薬物の化学構造により結合選択性を示すことを見出した。またPHT以外の抗てんかん薬、神経伝達物質は結合親和性をほとんど示さないことを認めた。この膜画分に存在するPHT結合部位に対する脂質の影響を検討するため脳の各種脂質を分離した。従来ポリホスホイノシチド(PPI)の有効な分離法がなかったため、その精製法に留意した。まず本研究費により購入された固定型マイクロ波照射装置を用い、ラット脳の分解酵素を阻止した後、CM-セルロースおよびTMS-シリカなどのクロマトグラフィーを用い、トリホスホイノシチド(TPI)およびジホスホイノシチド(DPI)の分離、定量法を確立した。この方法を用いることにより、TPIは従来報告された値の約2倍量にあたる800nmol/g湿重量が脳に存在することを認めた。この方法を応用し、ラット脳の各脂質を分離し、PHT特異的結合部位に対する影響を検討し、PPI(TPIおよびDPI)のみがPHT結合部位との結合親和性を示すことを認めた。つぎに〔【^3H】〕-イノシトールを用いたイノシトールレスポンスに対するけいれん関連物質の影響を検討した。ムスカリン性アンタゴニストであるカルバコール、ノルエピネフリン、高濃度カリウムなどはレスポンスを著明に増強させることを認めた。一方けいれん惹起物質であるペンチレンテトラゾールはレスポンスを増強させなかった。このレスポンスによりTPIから水解されるセカンドメッセンジャー的作用をもっと提唱される

イノシトール三リン酸と細胞内カルシウムについて検討を行なう予定で、大量のTPIを分離する方法についても現在検討中である。焙けいれん発現と抗てんかん薬作用についてイノシチド(PI)レスポンスおよびその周辺の生化学反応の関連性を追究しつつある。我々がラット大脳の膜画分に見出したフェニトイン(代表的抗てんかん薬の一つ)の特異的結合部位に対する脂質の影響を検討し、脳の各種脂質の中でポリホスホイノシチドのみが上記結合部位と親和性を示すことを認めた。そこでPIレスポンスとその周辺の反応系について、けいれん発現と抑制との関係を追究した。まず大脳皮質のPIレスポンスはけいれん促進性とされるムスカリン性アセチルコリン(mAch)レセプターのアゴニストであるカルバコール(CCh),高濃度の【K^+】イオン,グルタミン酸により促進された。しかしけいれん抑制性とされるノルエピネフリン(NE)によってもレスポンスは促進され、一方けいれん剤ペンチレンテトラゾール(PTZ)や刺激性アミノ酸のN-メチルD-アスパラギン酸(NMDA)では影響が認められなかった。これはPIレスポンスがけいれん発現と直接に関係をもつものでないことを示唆する。しかしPTZ,NMDAはけいれん促進性のCChによるPIレスポンスの促進性を阻害し、けいれん抑制性のNEによるレスポンス促進には影響を示さなかった。一方PTZはmAchレセプター結合活性に対し阻害作用を示すが、NMDAではその作用が認められなかった。また最近イオンチャネルとの関連性が報告されているサイクリックGMPをNMDAが上昇させることを認めた。これらの所見からmAchレセプター,グルタミン酸レセプター,PIレスポンスなどが関連し合い、GTP結合蛋白,イオンチャネルを介して神経細胞内外のイオン動態を変化させる可能性があり、これがけいれん発現と関連することも考察される。またこれら関連物質の放射活性化物を脳内特定部位にMediobio oprical brain tracerを用いて注入し反応を検討する予定である。抗てんかん薬フェニトインの特異的結合部位をラット脳の膜画分に見出し,トリホスホーおよびジホスホーイノシチドがこの結合物質と親和性を示すことを認めた.そこでけいれんに対する興奮性および抑性性の種々の物質を用い,イノシチド(PI)レスポンスを検討したが,必ずしも一定の方向の結果が得られなかった.しかし興奮性のムスカリン性アセチルコリンによるPIレスポンスの促進がけいれん剤ペンチレンテトラゾール(PTZ)で阻害されることが認められ,抑制性のノルエピネフリンによるPIレスポンスの促進に対してはPTZの作用が認められなかった.さらにPIレスポンスの促進の際トリホスホイノシチドの分離によって生じるイノシトール三リン酸(IP_3)は,細胞内貯蔵Caを遊離させるとされているため,そのレセプターについても検討中である.
組織特異性を有する遺伝子導入ベクター(改変型アデノウイルス)の開発

生体内遺伝子導入による病態修飾が可能であることが動物モデルで実証されてきたが、細胞や組織特異的な遺伝子導入が可能となれば、副作用が減り導入の利便性が増加するためさらにその有用性は増す。本研究では選択的遺伝子導入を可能とする組織特異性を有する新規ベクター(組換えアデノウイルス)の開発を目的とした。具体的目標として組織因子に特異性を持つ改変型アデノウイルスの開発をめざした。組織因子は血栓形成、炎症、細胞浸潤・遊走、がん細胞の転移、組織修復、血管新生といったストレス・傷害に対する生体反応の場でその発現が亢進している。従って組織因子特異的な遺伝子導入が可能となれば、炎症や創傷治癒そして病的血管新生部位に選択性の高い遺伝子導入が可能となり、より安全で便利な遺伝子治療の開発に繋がる。以下の2つの方法を用いて開発を試みた。1)ファージライブラリーを用いて、組織因子に選択的に親和性の高いモチーフペプチドを同定し、同ペプチドを外套蛋白に発現する改変型アデノウイルスを開発する。2)アデノウイルスの外套蛋白に対する単鎖抗体と組織因子に対する単鎖抗体を融合した2価の単鎖抗体を作製し、これをアデノウイルス外套蛋白に架橋して細胞選択性を付与する。現在、組織因子への単鎖抗体は取れた段階でウイルス構築には至っていない。濱田はアデノウイルス受容体CARに結合しないAd40の短ファイバーの末端にNG2糖蛋白(黒色腫や脳腫瘍細胞で高発現)へのリガンドを付与したファイバーを持つアデノウイルスを構築した。このウイルスは静注しても肝臓には集積せず、NG2蛋白発現細胞への選択的遺伝子導入が達成された。組織因子への親和性リガンド付与により、静注で組織因子発現細胞へ選択的に遺伝子導入できるアデノウイルスの開発が可能であることを支持する結果である。
がん細胞の異型性の分子基盤(FXYD3の発現低下とミスセンス変異の関与)

本課題の目的は、FXYD3の発現低下およびミスセンス変異の細胞形態への影響を解析し、異型性の責任分子としての可能性を追求することであった。肺癌細胞株にFXYD3の発現を回復させると、細胞骨格の整然化が認められた。また変異型FXYD3は、核形の歪化を来した。肺癌切除材料では、非腫瘍肺上皮細胞に比し、腫瘍細胞では有意にFXYD3蛋白の発現が低下し、また悪性度の増加に伴いその発現は更に低下した。これらの結果、FXYD3の発現低下(および変異)は、がん細胞の異型性を引き起こす分子基盤の一つであり、肺癌の進展に関与することが示された。形態異常(異型性)はがん細胞に共通にみいだされる特徴である。本研究の目的は、その分子基盤の一端を明確にすることである。当該研究者は、がん遺伝子KRASの導入によりヒト気道上皮細胞に著しい形態変化が誘導されることを示し、マイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的検索から、このような形態変化への関与が示唆される複数の候補分子を抽出し、それらの発現解析・機能解析を行った。特にイオンチャンネル制御因子のひとつであるFXYD3は、複数のがん細胞株で極度の発現低下がみられ、ミスセンス変異もみいだされた。また、FXYD3は、核膜や細胞質内の網状構造(中間径フィラメント)に局在を示し、形態制御への関与が示唆された。本課題の達成目標は、FXYD3の発現低下およびミスセンス変異の細胞形態への影響を解析し、異型性の責任分子としての可能性を追求することであった。研究の結果、遺伝子導入によってがん細胞株にFXYD3の発現を回復させると、細胞骨格、特にコルチカルアクチンの整然化が認められた。さらに、変異型のFXYD3は、核のアウトラインの歪化を来した。肺癌切除材料おける免疫組織学的発現解析では、非腫瘍部気管支・肺胞上皮細胞に比較して、腫瘍細胞では有意にFXYD3発現が低下しており、また悪性度の増加に伴ってその発現は更に低下した。96例の肺癌切除材料においては遺伝子変異を見いだすことはできなかった。これらの結果から、FXYD3の発現低下(および変異)は、がん細胞の異型性を引き起こす分子基盤の一つであり、肺癌のプログレッションに関与することが示唆された。研究成果は、国際誌に掲載された(American Journal of pathology, December 2009)。また変異型のFXYD3は、核のアウトラインの歪化を来した。肺癌切除材料において、非腫瘍部気管支・肺胞上皮細胞に比較して、腫瘍細胞では有意にFXYD3蛋白発現が低下しており、また悪性度の増加に伴ってその発現は更に低下した。研究成果は、国際誌に掲載された(American journal of pathology, December 2009)また、この成果をもとに国際誌に総説を公表した(Pathology International, October 2010)。
性腺・副腎系ホルモンによる脳内ステロイド受容体発現とモノアミン作動系の制御

1)ラット脳内アロマテース(AROM)は発現のピーク時期の違いにより、胎生仔型、胎生新生仔型、若年成獣型の三型が分類される。本研究では、免疫組織化学法(IHC)とin situ hybridization法(ISH)を用いてタンパクとmRNAレベルで発現の局在分布を比較し、またADXとOCXを施したラットに性ホルモンを投与し、IHCにてAROMの発現制御の領域特異性を調べた。胎生仔型、胎生新生仔型ではタンパク・mRNAの発現レベルは一致したが、若年成獣型ではラット卵巣由来AROM mRNAの発現を示さなかった。また脳内最大のAROMグループである胎生新生仔型はアンドロゲンとエストロゲンの両者からup-regulationを受けるが、若年成獣型は何れからも制御を受けないことが明らかにされた。結果から、脳内には、mRNAの由来が違い、制御の異なる少なくとも2種類のAROMが発現することが示唆された。これらは英文論文としてJ. Comp.Neurol.に受理/掲載された。2)in vitroでHAPlのcDNAの細胞内導入によりstigmoidbody(STB)を細胞質に形成し、またアンドロゲン受容体(AR)の各種フラグメントとHAPlの同時強制発現実験により、HAPlがLBD結合性にARを吸着し核移行を制御することが明らかにされた。また、HAPlはARのpolyQ長に依存して結合性を増し、脊髄球筋委細症SBMA由来の異常伸張polyQ-ARが引き起こすアポトーシスを抑制することが示され、SBMAの病態解明と治療に新しい知見をもたらされた。この結果は英文論文として、Human Molecular Geneticsに受理/掲載された。3)GPR30がエストロゲン膜受容体であることがin vitroで示され、ラット海馬錐体細胞の膜に局在することが、免疫組織化学法を用いて光頭レベルと電頭レベルで証明された。この結果は英文論文としてBBRCに受理/掲載され、世界で初めて脳内にエストロゲン膜受容体の発現があることを報告した論文となった。本年度の初期に、ARの核移行をHAP1が制御するという興味深いデータが得られたため、一部研究内容がそちらにシフトしたが、性ステロイド受容体(ERα,ERβ,AR)、アロマテース(AROM)、及びHAP1の発現の脳内分布とこれらの性ステロイドによる制御についての研究が行われ、以下の結果が得られた。1)in vitroでARとHAP1が細胞内で複合体を作り、ARの核移行がHAP1により制御されることを見出した。さらにdeletion mutant ARを用いた実験でこれがARのLBDを介して行われ事も明らかにした。また、HAP1はARのpolyQ長に依存して結合性を増し、異常伸張polyQ-ARが引き起こすアポトーシスをHAP1が抑制することを示し、脊髄球筋委縮症SBMAの病態解明と治療に新しい知見をもたらした。これらの結果は、平成17年12月の分子生物学会で発表し、英文論文作成を終え、現在投稿中である。2)正常Wistarラットにおける脳内性ステロイド受容体(ERα,ERβ,AR)の免疫組織化学的発現分布については、マッピングを終え、HAP1との共存関係についてもほぼ終わり、これらの結果は平成18年3月の解剖学会で発表した。現在英文論文作成中である。3)脳内性ステロイド受容体(ERα,ERβ,AR)、アロマテース(AROM)、及びHAP1に対する性ステロイドの影響を明らかにするため、sham-operation、ADX+OCX+oil、+testosterone,+17β-estradiol,+dihydrotestosteroneのラットを作成し、5個体間で脳内ステロイド受容体(ERα,ERβ,AR)とHAP1の免疫組織化学的発現強度を比較。性ステロイド受容体の発現制御については現在解析中だが、AROMの制御には領域特異性があり、主たる内側視索前野分界条床核内側扁桃体核のAROMニューロン群は全ての性ステロイドでup regulationを受け、成獣型である中心扁桃体核等では性ステロイドに非感受性であることが明らかにされた。この結果は平成18年3月の解剖学会で発表し、英文論文作成を終え、現在投稿中である。HAP1については性ステロイドから有意な制御を受ける所見は得られていない。4)グルココルチコイドによる脳内性ステロイド受容体(ERα,ERβ,AR)、アロマテース(AROM)、及びHAP1に対する発現制御については現在実験中である。

2)in vitroでHAPlのcDNAの細胞内導入によりstigmoidbody(STB)を細胞質に形成し、またアンドロゲン受容体(AR)の各種フラグメントとHAPlの同時強制発現実験により、HAPlがLBD結合性にARを吸着し核移行を制御することが明らかにされた。また、HAPlはARのpolyQ長に依存して結合性を増し、脊髄球筋委細症SBMA由来の異常伸張polyQ-ARが引き起こすアポトーシスを抑制することが示され、SBMAの病態解明と治療に新しい知見をもたらされた。この結果は英文論文として、Human Molecular Geneticsに受理/掲載された。3)GPR30がエストロゲン膜受容体であることがin vitroで示され、ラット海馬錐体細胞の膜に局在することが、免疫組織化学法を用いて光頭レベルと電頭レベルで証明された。この結果は英文論文としてBBRCに受理/掲載され、世界で初めて脳内にエストロゲン膜受容体の発現があることを報告した論文となった。
ネコ免疫不全ウイルスに対する宿主防御機構の解明

ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、後天性免疫不全症候群(エイズ)様症状のネコから分離され、ヒト免疫不全ウイルスと同じくレトロウイルス科レンチウイルス属に分類される。本研究はFIV感染防御上大きな役割を担っていると考えられるCD8陽性細胞およびNK細胞を中心に、そのphenotypeと抗FIV活性を解析することを目的としている。当該研究期間において以下の項目について研究を行い、新たな知見を得た。1.NK細胞マーカーの解析:ネコFcγRIII-Aの膜貫通型分子のクローニングとネコCD56抗原のバキュロウイルス組換え発現に成功した。CD56についてはモノクローナル抗体(MAb)も作製した。3.ネコCD2の性状解析:免疫応答において重要なT細胞表面抗原CD2のネコホモローグをクローン化してその塩基配列を決定した。解析したcDNAには1008塩基対の翻訳可能領域が含まれており、336アミノ酸をコードし、その配列は他の動物と4657%の相同性を有していた。さらに、抗ネコCD2MAbを作製したところ、得られた抗体はネコCD2のEロゼット形成を阻止し、フローサイトメトリーによるネコ末梢血中のCD2陽性細胞の検出に有用であることが示された。4.ネコCD11aの抗体作製:CD2と同様、免疫応答に重要な接着分子CD11aのネコホモローグのcDNAをバキュロウイルスにより組換え発現させ、抗ネコCD11aMAbを作製した。T細胞の活性化に伴うCD11aの発現量増加が認められ、ネコ末梢血中の活性化T細胞の解析に有用であった。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、後天性免疫不全症候群(エイズ)様症状のネコから分離され、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と同じくレトロウイルス科レンチウイルス属に分類される。本研究はFIV防御上大きな役割を担っていると考えられるCD8陽性細胞およびNK細胞を中心に、そのphenotypeと抗FIV活性(細胞傷害活性、FIV増殖抑制因子)を詳細に分析することを目的とする。今年度は基礎的研究として以下の成果を得た。1.ヒトNK細胞マーカーであるFcγRIII-AとCD56抗原のネコ相同体の解析を行った。ネコのFcγRIIIの膜貫通型分子のクローニングとバキュロウイルスを用いた組換えネコCD56の作出に成功した。さらにネコCD56に対するモノクローナル抗体を作製した。2.ネコCD3ε相同体をコードするcDNAをPCR法により単離し、バキュロウイルス系を用いて組換えタンパクを発現した。ヒトCD3εの細胞ドメインに対するポリクローナルを用いての間接蛍光抗体法、western blotting法により、その発現が確認されるとともに、単離した遺伝子がネコのCD3ε相同体をコードしていることが示された。3.近年、FIV感染ネコにおいてCD8α+β-or low細胞群が増加することが見いだされ、さらにCD8α+βlow細胞群はFIV増殖を抑制する活性を持つことが明らかになっている。ネコCD3εに対するモノクローナル抗体を作製し、フローサイトメトリーによる解析を行った。その結果、CD8α+β-or low細胞群はCD3εを発現していることから、T細胞系だと考えられた。本研究はFIV防御上大きな役割を担っていると考えられるCD8陽性細胞およびNK細胞を中心に、そのphenotypeと抗FIV活性(細胞傷害活性、FIV増殖抑制因子)を詳細に解析することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。1.健康なネコの胸腺由来mRNAより、アダプター連結2本鎖cDNライブラリーを作製した。

ヒト・マウスSDF・1αあるいはβcDNAの3'非転写領域間で保存されている配列を基に設計したプライマーと、アダプターに特異的な2種類のプライマーを用いてのsemi-nested PCRにより、約0.3kbpの増幅産物を得、T-ベクタークローニングし塩基配列を決定した。その結果ネコ及びヒトSDF-1α/βの予想される成熟蛋白のアミノ酸配列は完全に一致していた。2.ネコの胸腺細胞をConAで刺激し組換えヒトinterleukin2存在下で培養後、mRNAを回収し、cDNAを合成した。これを鋳型として、ヒト、マウスなどのCD45 cDNA間で高く保存されている塩基配列をもとに作製したプライマーを用いてのPCRを行い、ネコCD45分子相同体をコードするcDNAをクローニングし、全塩基配列を決定した。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、後天性免疫不全症候群(エイズ)様症状のネコから分離され、ヒト免疫不全ウイルスと同じくレトロウイルス科レンチウイルス属に分類される。本研究はFIV感染防御上大きな役割を担っていると考えられるCD8陽性細胞およびNK細胞を中心に、そのphenotypeと抗FIV活性を詳細に解析することを目的としている。本年度はT細胞表面の接着分子に関して解析を進め、以下の成果を得た。1.ネコCD2の性状解析:免疫応答において重要な役割を果たすT細胞表面抗原CD2のネコホモローグを同定するために、ネコCD2cDNAをクローン化してその塩基配列を決定した。解析したcDNAには1008塩基対の翻訳可能領域が含まれており336アミノ酸をコードしていた。アミノ酸配列は他の動物と4657%の相同性を有していた。さらに、ネコCD2cDNAをCOS細胞に組換え発現させ、抗ネコCD2モノクローナル抗体を作製した。得られた抗体はネコCD2のEロゼット形成を阻止し、フローサイトメトリーによるネコ末梢血中のCD2陽性細胞の検出に有用であることが示された。2.ネコCD11aの抗体作製:CD2と同様、免疫応答に重要な接着分子CD11aのネコホモローグのcDNAをバキュロウイルスにより組換え発現させ、抗ネコCD11aモノクローナル抗体を作製した。T細胞の活性化に伴うCD11aの発現量増加が認められ、ネコ末梢血中の活性化T細胞の解析に有用であることが示された。
低温複分解を用いたキタエフ型磁性体のスピン軌道結合効果の制御と異常物性探索

本研究では、キタエフ模型を有する新物質の開発および新奇物性開拓を目指すことを目的とし、その方法としてトポケミカル反応やメタセシス反応などの低温合成法を用いる。本研究では次の3つの目標を掲げ、実行する。(1)低温合成法が可能な新たな前駆体を探索し新しいキタエフ型磁性体を合成し、さらに、(2)超高圧反応や水熱反応などとの組み合わせによる新しい低温合成法を開発しさらなる対象物質の拡張を図り、また、(3)低温合成に基づく特異な配位構造によってスピン軌道結合の効果を制御し、異常物性の開拓を行う。
抗がん剤による細胞周期停止を利用した腫瘍標的新規遺伝子デリバリー戦略の確立

低濃度のdoxorubicin (DXR)による、遺伝子発現に適したG2/M期での細胞周期停止により遺伝子発現活性の上昇が起こるという仮説を検証するため、DXRにより遺伝子発現活性が改善するか、またその際に細胞周期の停止が起きているかについて評価を行った。その結果、DXRによりliposomal pDNA (LD)の遺伝子発現活性の上昇は起きるものの、G2/M期の細胞の割合の増加率は少なく、遺伝子発現の上昇に寄与している主要な原因は他に存在することが予想された。そこで共焦点画像を用いて検討した結果、DXR処置によって核の断面積が有意に増大し、LDの核移行が促進される傾向がみられた。1.抗がん剤による遺伝子発現活性上昇条件の探索種々の濃度のDoxorubicinに曝露したcolon26細胞に対して、カチオン性リポソームに封入したEGFP発現プラスミドDNAをTransfectionし、遺伝子発現活性(EGFP蛍光強度)の評価を行った。その結果、至適濃度のDoxorubicinを処置した際に、無処置群と比較してEGFP蛍光強度が56倍程度上昇することが明らかとなった。本Doxorubicin濃度において、無処置群と比較して20%程度の増殖抑制が起きており、G2/M期にある細胞の割合の増加が確認された。本Doxorubicin濃度を用い、以下の検討を行った。2. DNAの核移行のイメージング共焦点レーザースキャン顕微鏡を用い、Doxorubicin処置を行った細胞と未処置細胞におけるプラスミドDNAの細胞内局在の評価を行った。その結果、Doxorubicin処置を行った細胞において、未処置群と比較して核内にプラスミドDNAのシグナルが存在する細胞の割合の増加が認められた。なお、当初の計画では単離核の核膜孔の染色を行い、プラスミドDNAとの共局在の評価も行う予定であったが、単離核が再懸濁困難な凝集塊を形成するという問題が起きたため、前述の生細胞を用いた観察のみを行った。3.プラスミドDNAの核移行量の定量核移行率を定量的に評価するため、細胞全体に含まれるDNAと核フラクションに含まれるEGFP遺伝子をリアルタイムPCR法を用いて定量した。その結果、細胞内遺伝子量に対する核内遺伝子量の割合(核移行率)において、Doxorubicin処置群と無処置群の間に有意な差は認められなかった。平成27年度に予定していた内容のうち、遺伝子発現上昇条件の探索は予定通りに終了し、核移行のイメージングは、技術的な問題により一部内容を変更して行った。また、当初平成28年度に予定していたリアルタイムPCRを用いた核移行率の検討を前倒しして開始した。よって、本研究全体の計画のうち、平成27年度に行うべき分量は消化していると考えており、おおむね順調に進展していると評価した。前年度までの研究で、G2/Marrestを引き起こす抗がん剤であるドキソルビシンを処置した細胞において、リポソームとプラスミドDNAの複合体(liposomal pDNA)の遺伝子発現活性が向上したことを示した。一方、遺伝子発現活性の上昇が観察される濃度のドキソルビシンを処置した際、G2/M arrestは細胞集団の一部のみで確認されたため、ドキソルビシン処置による遺伝子発現活性の上昇の主要因はG2/M arrest以外の作用によるものである可能性が示唆された。本年度は、遺伝子発現活性の向上に寄与する要因を探索するため、ドキソルビシン処置時に細胞集団全体で起きている事象に注目して画像解析を行った。画像解析の結果、ドキソルビシン処置時に核の断面積が2倍以上になっていることが明らかとなった。そこで、ドキソルビシン処置による核の肥大に伴う核の物質透過性の上昇により、liposomal pDNAの核移行量が増加し、遺伝子発現活性が高まったという仮説を立てた。本仮説の検証のため、ドキソルビシン処置群と無処置群における、liposomal pDNAの核移行量を比較した。その結果、ドキソルビシン処置細胞において、liposomal pDNAの核移行が促進されていることが示唆された。次に、本現象が核の肥大と関連しているかについて確かめるため、ドキソルビシン処置群・無処置群それぞれの核の断面積とliposomal pDNAの核移行量の相関を評価した。その結果、核内へ移行したliposomal pDNA量と核のサイズの間に相関がみられた。本結果より、ドキソルビシン処置による核の肥大がliposomal pDNAの核移行を促進させ、これが遺伝子発現活性の上昇に寄与している可能性が示唆された。本年度に得られた結果より、遺伝子発現活性上昇がみられる条件において、DoxorubicinによるG2/M arrestや、導入遺伝子の発現・核移行は細胞集団の中の一部において起きている現象であることが示唆された。

この場合、細胞集団全体を対象にしたアッセイではこれらの現象が過小評価されやすいと考えられるため、本現象の解明のためには、特定の特徴を有する細胞集団を対象とした解析が適していると考えられる。そこで平成28年度は、具体的に以下の実験を行う。まず、フローサイトメトリーを用い、Doxorubicin処置細胞の中でG2/M期にあるものとそれ以外の細胞周期にあるものにおける遺伝子発現や核移行を比較する。また、in vivo腫瘍では、遺伝子発現細胞やG2/M期の細胞などの分布が培養細胞と異なることが予想されるため、colon26細胞をマウス皮下に移植することによって作製した腫瘍から腫瘍細胞を採取し、抗がん剤による細胞周期の変化や導入遺伝子発現の変化を評価する。