hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
災害をめぐる感染症危機管理に向けた包括的支援プログラムの構築

インタビューが困難な地域においては、保健所の記録物、写真、などを資料として収集した。現在、ICレコーダーに録音したヒラリング内容を、逐語録に起こし、感染症を中心として分析を行っている。これまでのインタビューでは、被災地で発症した感染症に、ノロウイルス,インフルエンザ,上気道感染症,水痘があり、特にノロウイルスの発生が高い頻度で認められた。これらは、すべてライフラインがストップしたことによる衛生環境の低下が原因であり、概ねは、隔離、手指衛生指導、食品管理、トイレ整備、トリアージなどにより対応されていた。災害大国である日本では、今後も大規模災害の発生は必須と思われる。被災地においては、災害の規模によっては発災直後から衛生環境が低下することから、ほとんどのケースで感染症が発生しており、二次災害としてのアウトブレイクのリスクは高く、その防止は極めて重要である。本研究では、国内を中心とした災害発生後の、超急性期から急性期、回復期をめぐる感染症の集団発生の危機に対し、被災者および支援者へ向けた感染防止のための包括的支援プログラムを開発することを目的とする。そのため、阪神淡路大震災、新潟中越沖地震、東日本大震災、奈良・和歌山の台風による水災害、九州北部豪雨災害を中心として、その実際をヒアリングおよび記録物等から質的データとして収集し、公衆衛生を切り口として2つの分析を実施し、被災地における感染症危機管理に向けた支援プログラムを作成中。1.既作成の「避難所生活における感染管理上のリスクアセスメント」に沿って、1避難所の形態2被災者の年齢構成3手指衛生4汚物処理5食品管理について6換気について7体調管理について8物品の確保状況9罹患状況10要介護・援護者の状況をコアとして、アセスメント後の対応策の実際および課題を抽出した。2.災害、避難所、被災者、感染症等に関連した要素を質的データとして、災害別、避難所の規模別、被災者別、感染症別に鍵となる要素およびその要素間の関連を、テキストマイニングにて分析中。今後は、支援プログラムに加え、介入および介入後の評価尺度の内容についての信頼性確保のために、量的調査を実施する。日本は災害大国である。4月に発生した平成28年熊本地震においても、過去に経験のない震度7が2回発生しており、今後も大規模災害の発生は必須と思われる。被災地においては、災害の規模に応じ、発災直後からライフラインの停止とともに衛生環境が低下することから、多くのケースで感染症が発生し、二次災害としてのアウトブレイクのリスクが高く、その防止はきわめて重要である。本研究では、国内を中心とした災害発生後の超急性期から急性期、回復期をめぐる感染症の集団発生の危機に対し、被災者及び支援者へ向けた感染防止のための包括的支援プログラムを開発することを目的とする。その為、阪神淡路大震災、新潟中越沖地震、東日本大震災、奈良・和歌山の台風による水害、九州北部豪雨災害を中心として、その実際をヒアリング及び記録物などから、質的データとして収集し、公衆衛生を切り口として2つの分析を実施し、被災地における感染症危機管理に向けた支援プログラムを作成中。1.既作の「避難所生活における感染管理上のリスクアセスメント」に沿って、クイックファイルを作成し、検索ワードを1トイレ2感染症の発生状況3食品の管理4衛生用品5水の管理6環境7避難所の形態として、アセスメント後の対応策の実際および課題を抽出した。
ファージディスプレイを用いた高親和性T細胞受容体の取得とがん治療への応用研究

がん抗原に特異的なT細胞から単離した抗原受容体遺伝子(TCR)を、レトロウイルスベクターなどを用いて患者Tリンパ球に導入する免疫療法は有望な治療法の一つである。治療効果を上げるためには、親和性の高いTCRを使用することが重要である。ヒトTCRのin vitro親和性増強においてファージディスプレイ法は代表的な方法である。そのため我々はまずファージディスプレイ法を習得し、既報告で用いられたTCR(HLA-A2/Tax)で親和性成熟実験の再現性を確認した。しかしながら、研究代表者が保有している3種類のHLA-A24拘束性TCR (hTERT, EpCAM, CMVpp65)を供した実験では、親和性の増加したTCRは得られなかった。この原因として、TCRによってはファージ表面に機能的蛋白が十分に表出しない可能性があると考えられた。今年度は、ファージディスプレイ法に変わり得る、293T細胞を用いた新規のTCRディスプレイ法を樹立した。この方法ではCD3遺伝子を導入した293T細胞表面に、任意の一つのCDR領域にランダムな変異を導入したTCRライブラリーを表出させ、HLA/ペプチド-テトラマーで染色をした。上記のhTERT特異的TCRについて16種類のライブラリーを作製しスクリーニングをした結果、このTCRではβ鎖CDR1および2ライブラリーの中に、CD8非依存的にテトラマーに結合するTCRの集団があることが判明した。さらにフローサイトメーターを用いたソーティングにより、多数の高親和性クローンを得た。レトロウイルスを用いてヒトT細胞株に個々のTCRを導入した実験では、高親和性クローンは野生型に比べてほぼ1,000分の1濃度の抗原ペプチドを認識した。新たに確立したヒト培養細胞を用いたTCR親和性成熟システムは、ファージ上に提示され難いTCRにも応用可能であり有用な方法と考えられた。我々の構築したTCR発現ファージミッドが機能するのか、実験条件は適切か等を判断するために、内部コントロールとなる試料を用いた予備実験が必要である。この目的で、英国のグループがファージディスプレイ法で親和性改良に成功したHLA-A*02:01拘束性HTLV-1Tax特異的CTLクローンA6のTCRを用いたコントロール実験を実施した。野生型A6およびファージディスプレイ法で得られた高親和性クローンc134(TCRβ鎖CDR3領域のアミノ酸4個が変異)それぞれを発現するファージミッドからファージ粒子を作製した。ストレプトアビジンがコートされたプレートに、ビオチン付加HLA-A2/Tax(コントロール抗原としてHLA-A2/EBV-LMP1を使用)を結合させた後、作製したファージを反応させた。検出は抗Fdファージ・ウサギ抗体で行った。A6およびc134、それぞれの親和性に相応した抗原への特異的結合を示す結果が得られた。次に、野生型A6のTCRβ鎖CDR3領域の当該アミノ酸部位にランダム変異を含有するライブラリーを作製し、ビオチン化HLA-A2/Taxペプチド複合体とストレプトアビジン磁気ビーズを用いたパニング法で、高親和性クローンを濃縮・回収した。変異部位のDNAにはc134に近似したアミノ酸が集積していた。すなわち、我々の設定した条件において、高親和性のTCRを濃縮・回収できることが示された。しかし、我々が保有している3種類のHLA-A*24:02拘束性TCR (hTERT, EpCAM, CMV pp65)を供した実験では、親和性の増加したTCRは得られなかった。TCRによっては、ファージ表面に機能的蛋白が十分に表出しない可能性があると考えられた。1)CD3発現293T細胞を用いたTCR解析:TCRが細胞表面に発現するには、4個のCD3サブユニットが必要である。このため、単離したTCR遺伝子の発現をする際には、通常、末梢血T細胞にレトロウイルス等で導入することが多い。本研究計画では、多数の変異TCRクローンを解析する必要があるので、簡易な方法を開発した。すなわち遺伝子導入が容易な293T細胞にCD3の4個のサブユニットを導入した293T-CD3細胞を作製した。pcDNAベクターに組込んだTCRα鎖とβ鎖を遺伝子導入すると、細胞表面にCD3およびTCR複合体が表出する。段階希釈したHLA-テトラマーで染色することで、親和性の増強および特異性についても解析できるので、この系を使用する予定である。2)リコンビナントTCR蛋白の作製と結合能の解析:pET発現ベクターの下流にα鎖およびβ鎖遺伝子をそれぞれ組込み、封入体として回収したTCRαおよびβ蛋白を8M尿素に溶解した。緩衝液中で希釈し、αβヘテロダイマーの形成を促した後、高速液体クロマトグラフィーで単離・精製した。将来的には、このリコンビナントTCR蛋白と、ビオチン化HLA/ペプチド複合体を試料とし、Biacoreシステムを用いた結合定数の算出を行う予定である。

しかしながら、研究代表者が保有している3種類のHLA-A24拘束性TCR (hTERT, EpCAM, CMVpp65)を供した実験では、親和性の増加したTCRは得られなかった。この原因として、TCRによってはファージ表面に機能的蛋白が十分に表出しない可能性があると考えられた。今年度は、ファージディスプレイ法に変わり得る、293T細胞を用いた新規のTCRディスプレイ法を樹立した。この方法ではCD3遺伝子を導入した293T細胞表面に、任意の一つのCDR領域にランダムな変異を導入したTCRライブラリーを表出させ、HLA/ペプチド-テトラマーで染色をした。上記のhTERT特異的TCRについて16種類のライブラリーを作製しスクリーニングをした結果、このTCRではβ鎖CDR1および2ライブラリーの中に、CD8非依存的にテトラマーに結合するTCRの集団があることが判明した。さらにフローサイトメーターを用いたソーティングにより、多数の高親和性クローンを得た。レトロウイルスを用いてヒトT細胞株に個々のTCRを導入した実験では、高親和性クローンは野生型に比べてほぼ1,000分の1濃度の抗原ペプチドを認識した。新たに確立したヒト培養細胞を用いたTCR親和性成熟システムは、ファージ上に提示され難いTCRにも応用可能であり有用な方法と考えられた。我々の構築したファージディスプレイシステムはHLA-A2拘束性のHIV-taxに特異的なT細胞受容体(TCR)では問題なくワークした。しかし、HLA-A24拘束性の3種類のTCRを用いた親和性成熟実験では、これまでのところ高親和性のクローンを取得することができなかった。この点についてイギリスの先行研究者に相談した結果、一定以上の親和性を有する野生型TCRを使用する必要がある、という助言を得た。上記のHLA-A2拘束性HIV-tax特異的TCRはその条件を備えていると考えられた。そこで、比較的高親和性のCTLクローンをヒト末梢血から新たに樹立する実験を計画した。加えて、培養細胞を用いたTCRディスプレイシステムの着想を得た。すなわち、目的のHLA陰性のヒト末梢血から得た樹状細胞に目的のHLAのmRNAを電気穿孔法にて導入し細胞表面に発現させた後、がん抗原ペプチドをパルスして抗原提示細胞として使用する。同じドナーのCD8陽性リンパ球と混合培養して目的のHLA拘束性のがん特異的CTLを得る。このCTLはアロHLA拘束性であるため高親和性である可能性が高い。5'-RACE法を用いてCTLからTCR遺伝子を単離した後、ファージミッドベクターに組換えてファージディスプレイ実験に供する。2Aペプチド配列でタンデムにつなげた4個のCD3遺伝子をオーバーラッピングPCR法にて作製する。発現ベクターに組み込んだ後に、適切なヒト培養細胞に遺伝子導入する。任意の部位にランダムな変異を加えたTCRαおよびβ遺伝子をこの細胞に導入して、TCRを細胞表面に発現させる。テトラマーに強く染まる細胞をセルソーターにて分取する予定である。
生体膜の曲率・脂質パッキング状態変化を誘起する機能性ペプチド

細胞膜は、種々の脂質、タンパク質、糖などが密集する究極の分子夾雑環境である。この分子夾雑環境の中で細胞膜と特異的に相互作用し、膜の形や脂質パッキング状態を制御できれば、細胞の運動、分化、分裂、融合などを制御する分子ツールが得られる。研究代表者は、膜への曲率(膜の湾曲状態、curvature)誘導が膜のパッキング状態や流動性の変化と密接な関わりを有することを細胞内輸送小胞形成に関わるタンパク質エプシンN末端18残基に対応するペプチド(EpN18)を用いてすでに示している。本研究では、細胞膜という分子夾雑環境で、膜曲率誘導・制御を通して膜の形状や流動性、さらには膜に担持されたタンパク質の機能を制御するペプチドを創出すると同時に、新しい細胞操作技術としての生命化学分野における展開を目指している。膜曲率誘導・制御を通して膜の形状や流動性、さらには膜に担持されたタンパク質の機能を制御するペプチドの創出を狙い、本年度は(I)膜構造・脂質パッキング状態の制御のための曲率誘導ペプチドの構造要件の解析を行うとともに、(II)細胞膜とペプチドとの相互作用増強による膜曲率増大・膜構造変換を行う新手法を開発した。さらに、(III)細胞運動・分化を制御するペプチドの創出を行った。(I)曲率誘導ペプチドEpN18の種々の類縁体の調製を通して、膜構造・脂質パッキング状態の制御におけるペプチドのヘリックス構造ならびに膜との疎水性相互作用の重要性に関する知見を得た。(II)細胞膜上のペプチド間相互作用を利用したEpN18の膜近傍への集積と膜との相互作用の増強を通して、膜曲率増大・膜構造変換を行う新手法を開発した(投稿準備中)。さらに、(III)膜の構造変形能を有するペプチドのスクリーニングにより、膜張力を低下させるペプチドを選出し、このペプチドが、細胞遊走の抑制作用を有することや、神経突起を増加させるなど興味ある活性を有することを見出した(投稿中)。今後は、(I) EpN18の両親媒性構造を強めるアミノ酸置換やアミノ酸組成の単純化による類縁体設計に関して更に検討を行い、曲率誘導・膜構造変換を亢進するヘリックス構造要因に関する知見を得る。(II)EpN18の直鎖連結体、バンドル体による膜との相互作用の強化を行い、膜アンカーユニットの付加による膜相互作用向上と膜構造変換活性増強の手法との融合を諮る。また、(III)膜の流動性やパッキング状態の調節を通した細胞膜上の蛋白質や受容体の会合や活性化制御効果に関しても検討する。得られた結果のフィードバックと再検討により、曲率誘導能・脂質パッキング調整能の向上とその誘導原理の理解を深め、膜の形状や流動性の制御とそれを利用する細胞機能調節系の構築規範を得る。

得られた結果のフィードバックと再検討により、曲率誘導能・脂質パッキング調整能の向上とその誘導原理の理解を深め、膜の形状や流動性の制御とそれを利用する細胞機能調節系の構築規範を得る。
火災現場で焼損した石英管ヒータ式電気反射ストーブの使用判別法に関する研究

火災原因調査において、現場から採取した石英管ヒータ式電気反射ストーブが使用中であったか否かを判断する鑑定手法が求めちれている。本研究は、以前から火災鑑定従事者の間でよく知られていた「電熱コイルの形くずれ」に注目、その生成メカニズムを解明し、この現象がストーブを使用していた場合にのみできることを証明することで、その使用判別に供することを目的とする。これまでの研究で、石英管内の電熱コイルは、通電していない場合は勿論のこと、通電中であっても外部から火災熱を受けただけでは形くずれしないことが判明している。また、この現象に対して火災燃焼生成物の影響を調べたところ、煤と可燃性ガス(炭化水素ガス、一酸化炭素等)、そして、ガスの発生に伴う酸素濃度の低下が通電中の電熱コイルを異常発熱させることもわかっている。今回、この火災燃焼生成物の影響をより詳しく調査し、電熱コイルの形くずれ再現を目指す。なお、実験には可燃性ガスとして都市ガス(13A)を用いた。得られた結果及び知見は次のとおりである。通電させた石英管ヒータ内に都市ガスと若干の空気を混ぜた混合気を予加熱して流すと、電熱コイルの表面に十分量の煤が発生することがわかった。これは赤熱した電熱コイルの表面で都市ガス中の水素が先に燃焼して炭素が残るためと考えられる。そして、この状態のまましばらく放置すると、やがて電熱コイルの自壊が始まる。火災環境下における電熱コイルの形くずれは、通電で赤熱した電熱コイルの表面に煤が発生し付着することでその放熱が妨げられ、もって温度が上昇してコイルが軟化するためと考えられた。本研究により、火災環境下において、石英管ヒータ内の電熱コイルが形くずれを起こすメカニズムを解明することができた。今後、火災原因調査において、石英管ヒータを採用している電気反射ストーブの使用判別に供することができると考えられる。
磁性希薄合金におけるスピン反転散乱と超伝導近接効果の研究

本研究では、磁性不純物(Mn,Fe,Co,Ni)を微量に含む常伝導体(銅)を超伝導体(Nb)に近接したクラッド線を作成し、磁性不純物によるスピン反転散乱と温度との関係を詳しく研究することを第1の目的としている。研究の最初の段階において、クラッド線を焼鈍するときに一部の不純物が散乱効果を消失する可能性があることが分かり、これを検証するのにかなりの時間を要した。結論としては、Mnの場合は、600C、Ar雰囲気中または真空中で、アルミナ・ボ-トまたは石英ボ-ト上で焼鈍すると磁気的散乱が殆ど消失することが判明した。試行錯誤の結果、同じ雰囲気中で、銅のボ-ト上で焼鈍すると磁気的散乱が殆ど消失しないことが分かった。他方、Fe,Co,Niの場合は同じ条件下で焼鈍しても磁気的散乱効果は影響されないことが分かった。これらの結果を踏まえて、全ての試料を新しく焼鈍なおしてからマイスナー効果の測定をおこなった。実験の結果は、Mnについては全く新しいデータが得られた。すなわち、Mnを含む銅のマイスナー領域の長さρはおよそ0.5K以下の温度ではほぼ一定となった。これはスピン反転散乱の効果から期待されるもので、はじめて近藤効果によるク-パ-対破壊の効果を近接効果の測定でとらえた実験となった。この結果を解析した結果、スピン反転散乱の確率は電気抵抗に寄与する全散乱の約1/3であり、少なくとも、24mK以上では殆ど温度に依存しないことが分かった。また、データを近藤効果の理論と比較して、定性的にはよく一致することも分かった。Mnの近藤温度は約50mKとされているのでさらに温度を下げると対破壊効果が減少し、再び、ρが増加することが期待される。残念ながら今年度は時間がなくなったので、さらに低温の実験は平成8年度におこないたいと考えている。次に、近藤温度の高いFe,Co,Niについては豊田らの実験とよく一致した。これらの結果は平成8年夏に低温国際会議で発表し、また、欧文誌に発表する予定である。
上水汚泥と下水汚泥の混合処理に関する研究

上水汚泥が粘土系固形物を主体とし、凝集剤(アルミニウム水酸化物,鉄水酸化物)を含むことに注目して、上水汚泥と下水汚泥を混合処理することにより、下水汚泥の固形物濃度を高めてその沈降性・濃縮性を改善するとともに、嫌気性操作でのリン酸の溶出を抑えるための実験的研究を行い、以下のような結果を得た。(1)上水汚泥と下水汚泥を混合すると、混合汚泥の沈降性・濃縮性は下水汚泥と比べて著しく向上する。その向上度は上水汚泥の生成条件(特に凝集剤の添加率)と混合比に支配される。凝集剤添加率の低い汚泥は混合比が大きくなる程、混合汚泥の沈降性・濃縮性を改善できた。(2)上水汚泥と下水汚泥を混合すると、混合汚泥の脱水性は下水汚泥に比べて著しく良好となった。混合汚泥の比抵抗は下水汚泥の比抵抗の1/10程度となった。(3)上水汚泥はリン酸イオンを化学的に吸着した。この吸着機構は、上水汚泥を構成するアルミニウム水酸化物中の水酸イオンとオルトリンとのイオン交換反応である。この事は、酸・塩基滴定反応により証明された。(4)上水汚泥がリン吸着能力を有することにより、混合汚泥が濃縮プロセスや消化プロセスなどの嫌気的操作を受けても、汚泥中のリンが溶出してもただちに吸着されて、上澄水へのリンの再溶出が抑制された。(5)混合汚泥は通常の下水汚泥よりもリン含有量が多く、更に、凝集剤として鉄を用いた場合には、混合汚泥中に多量の鉄が含有されるので、混合汚泥は農地還元に適した特性を持つ。
自己免疫性膵炎発症における自然免疫の関与と自己抗原の解析

自己免疫性膵炎の病態を解明をするために、マウス膵炎モデルを解析した。各種toll-like receptorリガンドを投与し血清サイトカインの動態と膵炎の発症を検討した結果、インターロイキン10が膵炎の発症抑制に重要と考えられた。さらに、膵分泌性トリプシンインヒビター(PSTI)に対する自己抗体がPSTIのトリプシン結合部と反応してその活性を抑制し、トリプシンの活性化を促進して膵炎を増悪させる可能性を明らかにした。toll-like receptor (TLR)3リガンドのpolyI:CやCpG (TLR9リガンド)投与でMRLマウスに膵炎が発症するが、LPS (TLR4リガンド)投与では膵炎が発症しないことより各群の血清サイトカインについて比較検討した。各群とも炎症性サイトカインは増加したが、膵炎を発症したpoly I:CおよびCpG投与群に比べ膵炎を発症しないLPS投与群では抗炎症性サイトカインであるインターロイキン(IL)-10の上昇がみられ、IL-10が膵炎発症を抑制していると推測された。C57BL6由来IL-10欠損マウスを用いてIL-10の作用を検討した結果、野生型マウスにpoly I:Cを投与しても膵炎は発症しなかったが、IL-10欠損マウスではpoly I:C投与により大腸炎の増悪とともに膵炎が発症し、膵炎発症抑制にIL-10が重要であることが示された。膵炎発症IL-10欠損マウス脾細胞をRag2欠損マウスに移入した結果、CD4陽性T細胞の移入で膵炎が発症したがCD8陽性T細胞の移入では膵炎が発症せず、CD4陽性T細胞がeffector細胞であることが示された。さらに、LPSをpoly I:CやCpGに併用投与した結果、LPSによる膵炎抑制はみられず、逆に膵炎の程度が増強した。血清サイトカインの検討では併用投与による炎症性サイトカインの増加がIL-10の増加を上回り、TLR刺激の結果生じた炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの不均衡が自己反応性T細胞の活性化を引き起こし、自己免疫性膵炎の発症に至ると考えられた。また、LPS併用投与群では膵炎に加え線維化も進行しており、LPS投与による血清TNF-α上昇が膵線維化に関与している可能性が示唆された。ヒト自己免疫性膵炎(AIP)では、血清IgG、IgG4上昇に加え炭酸脱水酵素(CA-II)やラクトフェリン(LF)などに対する自己抗体が検出される。Toll-like receptor3のリガンドであるpoly I:CをMRLマウスに投与して発症する膵炎はヒトAIPに類似したモデルであり、この膵炎マウスモデルにおける自己抗体産生について検討した。膵炎マウスでは、免疫グロブリン分画は全体に増加し、特異的IgGサブクラスの増加は認められなかった。免疫組織学的検討では、膵臓の炎症細胞浸潤の主体はB220陽性細胞(B細胞)で、濾胞形成を伴い膵実質内に広範に浸潤がみられた。CD138陽性細胞(形質細胞)は濾胞近傍と問質に浸潤がみられた。CD4及びCD8T陽性細胞は主に濾胞周囲に認められた。血清自己抗体の検討では、ヒトAIPと同様にCA-IIやLFなどに対する自己抗体が認められ、抗LF抗体は45.8%に陽性で、抗CA-II抗体は3.3%に陽性であった。抗PSTI抗体は91.7%と高率に認められた。グルタミン酸脱炭酸酵素に対する抗体産生は認められなかった。さらに、SPINK3(マウスのPSTIホモログ)の合成ペプチドを作製し、抗PSTI自己抗体の抗原エピトープの決定を行った。膵炎マウス血清は合成ペプチド1(アミノ酸1-25)に82.3%が反応し、合成ペプチド2(17-41)に75%が反応したが、合成ペプチド3(32-56)に対する反応性は認められなかった。膵炎マウスの血清の大半がSPINK3蛋白のトリプシン結合部位(18-21)を含む合成ペプチドに反応性を示したことより。AIPにおける抗PSTI抗体産生がPSTI活性の抑制を介してトリプシンの活性化を促進し、膵炎の進展に関与している可能性が示唆された。
動的スパースモデリングの理論とそのバイオメカニクスへの応用

また医療データは時系列信号であり,その生成モデルとして動的システムを仮定すれば,信号推定問題は動的スパースモデリングの問題として定式化される.特に,データが離散値を取る場合について,その動的スパースモデリングにもとづく定式化を行い,IEEE Transactions on Automatic ControlやIEEE Transactions on Signal Processing等の国際トップジャーナルで発表した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。さらに,動的スパースモデリングの理論から派生して,離散値をとる動的システムのモデリング法について絶対値和最適化という新しいスパースモデリングの方法を提案し,制御系設計や信号処理システム,無線通信などに有効であることを示した.これらの成果は,トップジャーナルであるIEEE Transactions on Automatic ControlやIEEE Signal Processing Letters,またトップコンファレンスであるIEEE CDCやIEEE ICASSP, IEEE ICCなどで発表された.動的スパースモデリングの理論構築は大きく進展し,ジャーナル論文や国際会議論文としての成果も順調に出ている.また東京大学との細胞運動の共同研究や産業医科大学との医療画像に対するスパースモデリングなど,共同研究も順調に進んでいる.さらに,インド工科大学ムンバイ校を始めとする海外研究機関との国際共同研究も大きく推進した.以上の理由からおおむね順調に進展していると言える.また医療データは時系列信号であり,その生成モデルとして動的システムを仮定すれば,信号推定問題は動的スパースモデリングの問題として定式化される.特に,データが離散値を取る場合について,その動的スパースモデリングにもとづく定式化を行い,IEEE Transactions on Automatic ControlやIEEE Transactions on Signal Processing等の国際トップジャーナルで発表した.今後は動的スパースモデリングの生物学および医学への応用,特に細胞運動の動的スパースモデリングや医療画像のノイズ除去と高精細化に重点を置き,動的スパースモデリングの研究課題を高いレベルで解決する.29年度が最終年度であるため、記入しない。
工具刃先に可変回転機構をもった内径旋削工具の開発

旋削による内径加工では、加工可能な最大内径が下穴径によって大きく左右される。入口径が小さく内部径が大きくなる様な袋形状の加工では、工具形状により切削可能な形状が限定されてくる為に、複数の工具を用いて、かつ挿入方法を工夫しながら加工しなければならない。その問題を解決するには、内径工具を下穴に挿入して、刃先位置を変形出来る工具が必要である。そこで、近年の工作機械の多軸化にならい、旋削工具の先端の角度位置を任意に調整できる旋削工具を開発することを目標として、工具の設計製作を行い、アクリル樹脂切削により工具の評価を行った。工具の設計開発として22.5°刻みの指定角度で刃先が回転する内径工具製作を行った。丸棒に先端角30度のハイス工具を丸棒の先端部にピンで固定し、回転出来る仕組みである。この工具を用いた切り込み量1.0mmのアクリル加工では、横切れ刃角が大きくなる大径加工の角度ほど、切削力による回転支持部へのモーメントが増大する為に、ハイス工具の振動が発生し、仕上げ表面が欠けた表面となった。しかし、切り込み量を0.2mmと小さくし、また先端工具の固定方法をネジ固定として改善したところ、綺麗に加工を行う事が出来た。これにより、切り込み量の多い切削では、回転支持部の剛性不足により難しく、また工具の角度位置決めの固定方法により、切削方向によっての表面粗さの低下や加工精度の低下を招く事が分かった。これらを解決する為には、コンパクトで高精度かつ剛性の高い回転機構と共に、切削条件の検証が必要である。それを踏まえ、任意角度で刃先切れ角を調整出来る機構設計を行い、刃先位置に影響する回転角度を精密に再現できるよう、市販の刃先交換式工具を改良した工具開発を行った。本開発では角度位置決め方法としてウオームギア方式とネジ機構とロッド棒でつなぐロッド方式の設計製作を試みた。しかし、設計した製作工具を内径切削が可能なサイズを製作出来るに至っておらず、今後の課題として研究を継続する予定である。
オレキシン神経活動に及ぼす麻酔薬の影響

PFHのOX細胞は、プロポフォール(Pro)静脈内投与(800 μg/kg/min)で単一活動電位(single unit activity; SUA)の頻度は有意に抑制(33.1±6 %; n=4)されたが、振幅は変化しなかった(96±10.6 %; n=4)。Proの投与量を変える(400 μg/kg/min)とSUAの頻度は有意に抑制(24±7 %; n=4)された。さらにProの投与量を減らすと(200 μg/kg/min)、SUAの頻度は変化しなかった(7.1±2.9 %; n=4)。このようにProを静脈内投与すると用量依存性にPFHのOX細胞のSUAの頻度は抑制された。これよりProはPFHのOX細胞活動を直接抑制することが示唆される。同様にα2受容体作動薬であるデクスメデトミジン(DEX)を静脈内投与(1.0 μg/kg/min)するとSUAの頻度(38.5±9.6 %; n=4)は有意に抑制された。DEX投与量を(2.0 μg/kg/min)に増加するとSUAの頻度(29.1±12.3 %; n=4)は有意に抑制されたが、用量依存性は認めなかった。吸入麻酔薬であるセボフルラン(SEV)を吸入(2%)させるとSUAの頻度は有意に抑制され(28.7±6.1 %; n=4)、その作用はGABA受容体拮抗薬であるgabazineによって拮抗された。SEV濃度を4%に変えるとSUAの頻度は有意に抑制された(35.1±10.9 %; n=4)。1%のSEVの吸入では、(8.7±4.4 %; n=4)変化なかった。このようにSEVのSUAのp頻度に対する影響は、濃度依存性を認めた。臨床が忙しくて研究時間の確保が困難であったが、実験時間が確保できるようになってきた。実験の成功率が低い。脳弓周囲視床下部(Perifornical hypothalamus; PFH)のOX細胞に関しては、静脈麻酔薬のケタミン以外の麻酔薬に関してはデータ取得できた。今後、ケタミンの作用に関して調べる予定。ORX細胞は、少ない発火頻度であるが自発活動電位がある。スパイク波長は150μm程度である。急性モデルの実験で、ORX細胞の多くは自発活動電位があり発火頻度は少ないことが分かった。このようにしてPFHおよび外側視床下部(Lateral hypothalamus;LH)に存在するORX細胞の活動電位の特徴と存在部位を把握することは4%)大体できた。慢性モデル(金属電極を用いたsingle unit activityの記録)の実験では、ラットを意識下自由行動下の状態にして単一活動電位記録を実施している。PFHに記録電極を設置した実験では吸入麻酔薬であるセボフルランに暴露すると1%の濃度では変化を認めなかったが、2%以上で活動電位が抑制される現象を認めた。この場合、PFHの変化より早く脳波の変化を認めた。この記録成功例は2例である。麻酔薬をプロポフォールに変えるとPFHの活動電位の抑制はセボフルランより弱かった。この記録成功例は6例である。プロポフォールの作用はGABA受容体拮抗薬であるgabazineによって有意に抑制(20±4%)された。臨床が忙しくて研究時間の確保が困難である。実験の成功率が低い。

このようにSEVのSUAのp頻度に対する影響は、濃度依存性を認めた。臨床が忙しくて研究時間の確保が困難であったが、実験時間が確保できるようになってきた。実験の成功率が低い。PFHやLHのORX細胞と確認できる細胞は少ない。成功率が低いので実験時間を確保しなければならない。研究計画通り、同定できたORX細胞へのセボフルラン、プロポフォール、デクスメデトミジン、ケタミンの影響について調べる予定である。新たに購入の必要がある設備品があるので使用を控えた。次年度使用額機器を購入予定であったが、予算額と購入したい機器の見積もり額が合わないため別の機器を探索中である。予算額に見合う購入可能な機器が見つかったら購入予定である。
胚発生の誘導シグナルとしてはたらく細胞増殖因子のレセプター系

動物の胚発生において、種々の細胞増殖因子が形態形成の誘導因子として認識されてきている。本研究では、これら形態形成誘導シグナルとして中心的な役割を演じている増殖因子とそのレセプター系に焦点を当て、シグナルを受け取る側の認識機構から見た作用メカニズムの解明を目的とした。1.BMPのレセプター系:この研究を通して私達は3種のBMPレセプターを同定した。BRK-1、BRK-2はBMP-2/-4に対するI型レセプターであり、一方BRK-3はBMP-4と極めて高親和性の結合を示す脊椎動物で最初に同定されたII型レセプターである。BMPファミリーはI型とII型のレセプターの共存下でBMPと極めて高親和性の結合を示し、I型とII型のヘテロテトラマ-の形成によってリン酸化のシグナルが細胞内の基質タンパク質Smadへ伝えられて行く。さらに、BRK-2+BRK-3の細胞外ドメインがBMPと高親和性の結合をすることを利用して、これらBRKのキナーゼドメイン欠損型をニワトリ胚で異所的に発現し、BMPシグナルの特異的遮断を試みた。これらをレトロウイルスベクターで過剰発現することによって、間充織細胞の軟骨化と軟骨細胞の成熟が抑制され、その結果、肢芽で位置特異的に軟骨形成が阻害されることを証明した。2.WntファミリーとShhのレセプター:この研究で新規のWnt-11とWnt-4、Wnt-5a、Wnt-7a、およびShhをニワトリ胚から同定し、肢芽での発現パターンを調べた。さらに、Shhのレセプター系であるPatchedとSmoothenedの発現パターンから肢芽前後の軸性決定とShhの関係を調べた。Wntファミリーのレセプターと考えられているFrizzledファミリーのメンバーを同定し、その発現パターンから個々のWntファミリーが背腹、基部先端部、前後の位置価の決定に複合的に関与している可能性を示唆した。本研究課題では四肢の発生系を舞台にした分泌シグナル分子のレセプター系の同定を通して、形態形成の誘導因子としての役割を解明することができ、胚発生における細胞間シグナル分子の重要性が再認識された。脊椎動物の胚発生に種々の細胞増殖因子が誘導シグナルとしてはたらく。その中で、TGF-βスーパーファミリーのアクチビン、BMP-2、BMP-4、WntファミリーのWnt-11、Wnt-8、hedgehogファミリーのShhなどは背腹軸、前後軸のパターン形成に重要な役割を演じている。1.BMPレセプターの構造と機能:BMP-2、BMP-4のタイプIレセプター(BRK-1、BRK-2)、タイプIIレセプター(BRK-3)をニワトリ胚で同定した。これらは対応するヒト、マウスのレセプターと比べ、そのアミノ酸配列が90%以上保存されている。これらのBMPレセプターのうち、BRK-1は中枢神経系で、BRK-2は肢芽中心部の凝集した間充織および軟骨膜で局所的に発現している。BRK-3は肢芽先端部の肥厚した外皮および指の間で発現している。軟骨分化にはBRK-2/BRK-3のヘテロマ-がBMPのレセプター系として機能していると考えられる。kinaseドメインを欠失したレセプターをニワトリ胚の肢芽で強制的に発現すると、レセプターによって異なる効果が現れる。

肢芽の中心部の将来軟骨細胞に分化する間充織で強く発現するレセプターでは、そのシグナルをブロックすることによって軟骨分化が抑制される。その結果、位置特異的に指の骨の欠失が起こる。2.Wntファミリーの四肢形成における役割:Wntファミリーのレセプターはまだ同定されていないが、肢芽の背側間充織で特異的に発現するWnt-11を用いて、その四肢パターンの形成に対する影響を調べた。Wnt-11を過剰に発現すると軟骨分化が促進される。軟骨分化が早期に進行するために指の骨が短縮し、その結果先端が背側に湾曲する。3.Shhの四肢パターン形成における役割:Shhは細胞外へ分泌後2つのペプチドに切断される。そのうちのN末端側のペプチド(Shh-N)に誘導活性がある。Shh-Nを肢芽の前部で異所的に発現したときに、重複肢が形成される。このとき、BMP-2、BMP-7、およびBRK-2の発現が誘導され、Shhシグナルの下流でBMPが機能していると推定される。細胞間相互作用にかかわるシグナル分子の胚発生における役割を理解するために、Wntファミリー、BMPレセプターなどをニワトリ胚の肢芽で異所的に発現し、四肢形成に対する効果を調べた。BMPファミリーの役割を理解するために、BMPレセプターをニワトリ胚で同定した。タイプI(BRK-1、BRK-2)、タイプII(BRK-3)レセプターのうち、BRK-1は肢芽間充織で弱く発現し、BRK-2は肢芽中心部の凝集した間充織で発現し、一方BRK-3は指の間の間充織および頂堤で発現が見られる。キナーゼドメインを欠失した優性欠損型(DN)のレセプター、BRK-2-DN/BRK-3-DNをレトロウイルスベクター(RCAS)を用いて肢芽全体で発現させると軟骨分化が抑制され、その結果四肢の骨のパターンに異常が見られる。骨の欠損は後部側先端部で優先的に見られる。これらは単独では顕著な効果が見られないので、BRK-2/BRK-3のレセプター系が指骨の形成に関与していることが確認された。一方、BRK-1-DNを後肢の肢芽で過剰発現すると、指の間で見られる細胞死が選択的に抑制されることが確認された。従って、BRK-1/BRK-3のレセプター系はBMPで誘導される細胞死に関与していると考えられる。肢芽ではBMP-2、BMP-4、BMP-7などが領域特異的に発現し、またこれらはホモダイマーとしてのみならずヘテロダイマーとしても作用し、特異的なBMPシグナルを担っていると考えられる。肢芽で発現するWntファミリーには、腹側先端部で発現するWnt-5a、背側外皮で発現するWnt-7a、背側間葉で発現するWnt-11などがある。これらのうち、Wnt-5aをRCASで肢芽全体で強制発現すると、主に前腕の尺骨、橈骨の短縮、異形成が起こるが、HoxA13、HoxD13、Msx1、Msx2などの発現には変化が見られない。Wnt-11の過剰発現では指骨が背側に湾曲し、また先端部の指骨、中手骨の短縮と融合が見られる。このように、Wnt-5aとWnt-11はどちらも骨形成に影響するが、その効果は完全に同じではなく、これは複数のfrizzledファミリーによる固有のシグナル認識系を持つためと考えられる。動物の胚発生において、種々の細胞増殖因子が形態形成の誘導因子として明らかにされてきている。
ハイリスク児の認知情動発達-可塑性と予後-

協力者は在胎37週未満で出生した25名の児とその母親である。母親に本研究の趣旨を説明し,あらかじめインフォームド・コンセントを得た。NBAS・心拍・脳波測定を退院前1週間以内,退院後1週間以内,退院日を基点として1,2,3,6,9,12ヶ月目にそれぞれ1回,家庭内において施行した。ただし,NBASは退院3ヵ月迄施行した。心拍と脳波は児の睡眠中に行われた。脳波の測定ポイントは10-20法に基づき,Fp1,Fp2,C3,C4,01,02,T3,T4の8点である。NBAS,心拍,脳波の測定結果を独立変数,母子分離再会実験におけるアタッチメント行動を従属変数として重回帰分析を行った。心拍データはスペクトル値,脳波データはスペクトル値を基にして算出した右脳優位性を用いた。その結果,第5・8エピソードにおける回遊行動に有意差が見られ,回避行動が強い児は前頭前野に右側優位性を示した。第5,8エピソードは母親と児とが再会する場面である。従ってこの結果は,睡眠時に右脳優位な児は,覚醒時の母子再会場面において抑制的であることを示唆している。B群児の認知・情動発達は良好で,A群児のそれは良好ではない,と米国では報告されている。A群児は母親に対する回避行動が高い群である。本研究にて得られた脳波データと回遊傾向との関連性は従って,将来の認知・情動発達を予測させる。これは母子に対して臨床的介入のための資料となり得るものである。現在,1歳以降の追跡調査を継続中であり今後,認知・情動発達との関連性をより詳細に検討する予定である。平成13年2月末現在、2名の協力者を得て追跡調査中である。既報(斎藤・多田、2000)の通り、新生児のブラゼルトン検査結果と心拍変動値には大きな個人差が見られる。本協力者2名の間にも同様に個人差が検出された。また、深睡眠時に脳波を測定した結果、alpha波はほとんど出現せず、beta波がまれに出現する。主に検出されたのはdelta波、theta波である。この結果は新生児に関する多くの先行研究の結果と一致してしる。delta波の出現パターンは必ずしも一定しておらず、多様な時系列的変動が見られた。ただし、Fp1-Fp2間のラテラリティが明らかに認められた。今後は、脳波ラテラリティの個人差とブラゼルトン検査結果・心拍変動値・アタッチメント行動との関係を検討する予定である。これによって、ハイリスク児の諸特徴と認知情動発達との関連性を検討する基礎的データを提供することになる。平成14年2月末現在,9名の協力者を得て追跡調査中である。満期産児と早産児との最大の相違点はNBAS結果の方位反応である。早産児は退院後13ヶ月して満期産児と同レベルの反応を示すようになる。また満期産児の場合は出生直後から啼泣性の高い児が多いが,早産児の場合,退院後12ヶ月における啼泣性は非常に低く,3ヶ月になり啼泣性が高まる児が多い。この満期産児データにキャッチアップするまでに要する時間には個人差があることが示された。睡眠中に測定した脳波は各測定ポイントごとパワースペクトル分析を行い,デルタ波,シータ波,アルファ波,ベータ波の4周波数を抽出した。その結果,加齢と伴にデルタ波,シータ波が次第に減少し,アルファ波が増大することが示された。

そして退院後半年を経過すると,多くの測定ポイントにおいてアルファー波の占める割合が10%を超えるようになり,中には30%を超える児も出現した。人生最初期におけるこれらNBAS結果と脳波周波数の個人差が環境との相互交渉にどのような影響を与えるかを今後,検討する予定である。平成15年2月末現在,計14名の協力者を得ている。退院後18カ月に達した者3名,12カ月に達した者9名である。18ヵ月の時点でベイリー発達検査,を12カ月の時点でアタッチメントの母子分離再会実験を施行した。昨年度報告と同様に,満期産児と早産児との最大の相違点はNBAS結果の方位反応と啼泣性である。早産児は退院後13ヶ月で満期産児と同レベルの方位反応を示すようになる。また早産児の退院後12ヶ月における啼泣性は非常に低く,3ヶ月になり満期産児と同様の啼泣性を示す。ただし,この満期産児のレベルに到達するパターンには大きな個人差が示された。心拍,脳波は児の自然入眠を待って測定した。心拍データはパワースペクトル分析を行った。いずれの児も退院後3ヵ月になると高周波成分,すなわち副交感神経成分の急増を示した。脳波は児の睡眠中に10-20法を用いてFp1,Fp2,C3,C4,O1,O2,T3,T4,の8ポイントにて測定した。サンプリング周波数は200Hzである。各測定ポイントごとパワースペクトル分析を行い,デルタ波,シータ波,アルファ波,ベータ波の4周波数を抽出した。その結果,加齢に伴い,特にC3,C4においてアルファ波の顕著な増大を示す児が多数見られた。新生児期におけるNBAS結果心拍,及び脳波周波数の個人差が環境との相互交渉を経て,認知・情動発達にどのような影響を与えるかを現在検討中である。満期産児と早産児との最大の相違点はNBAS結果の方位反応と啼泣性である。早産児は個人差あるが,退院後13ヶ月で満期産児と同レベルの方位反応を示した。また多くの早産児の啼泣性は生後2ヶ月迄非常に低く,3ヶ月以降,満期産児と同レベルの啼泣性を示した。生理学的指標である心拍・脳波を児の睡眠中に測定した。まず,心拍はサンプリング周波数1Kzにて測定し,パワースペクトル分析にて解析した。退院後1週間以内に測定した心拍データから抽出された高周波成分,すなわち副交感神経成分はNBASの注視と相関を示した。注視は将来の認知発達を予測させる項目である。これは,心拍データが将来の発達を予測させる,というFox and Porges(1985)の結果を支持するものである。脳波はサンプリング周波数200Hzにて,Fp1,Fp2,C3,C4,O1,O2,T3,T4の8点を測定した(10-20法)。各測定点ごとにパワースペクトル分析を行い,デルタ波,シータ波,アルファ波,ベータ波の4周波数成分を抽出した。その結果,多くの児は加齢に伴い,特にC3,C4においてアルファ波,ベータ波成分の顕著な増大を示した。そして,各測定点におけるパワー値の左右差等には大きな個人差が見られた。以上が平成15年度の実績である。尚,平成16年2月末現在,計20名の協力者を得ている。退院後12ヵ月に達した者14名中,11名から母子分離再会実験の参加を得,残り6名は16年度中に完了する予定である。この実験結果を情動的データとし,そしてその後2歳までをデンバー発達検査とベイリー発達検査にて追跡調査し,これを認知発達的データとする。最終的には,新生児期におけるNBAS結果,心拍,及び脳波周波数の個人差が,環境との相互交渉を経て,生後2年間の認知・情動発達にどのような影響を与えるかを検討する予定である。
地下深部未利用資源開発のためのジオメカトロニクス技術の高度展開に関する研究

目的:地下深部に賦存する未利用資源・エネルギーの有効利用のためには,如何に安全に,かつコストを抑えて賦存地点まで到達し,効率的に開発するかが重要なポイントになり,そのための新たな地殻マシーニング技術の開発が望まれている.「ジオメカトロニクス」は,岩盤・地盤工学,機械工学,電子工学を融合させた,本研究で提案する新たな造語であり,本研究では「ジオメカトロニクス」の学問体系の基礎を構築する要素を調査するとともに,次世代地殻マシーニング技術の確立に必要な要素技術および課題を洗い出し,共同研究へ発展させるための調査研究を行うことを目的とする.研究結果:・第1回現地研究会を,住友大阪セメント(株)唐沢鉱業所にて開催し,重機の稼動状況を調査するとともに,自動化クローラドリルによる自動削孔の様子を見学し,今後の自動化技術に関して聞き取り調査を実施した.また重機のロボット化への問題点を全員で検討し,作業環境の認識技術および土砂・岩盤の原位置物性値計測技術が,次世代地殻マシーニング技術に必要不可欠であることを確認した.・第2回現地研究会を地下資源開発現場である豊羽鉱山(札幌市)で開催し,地下の作業現場に導入されている重機の稼動状態を調査した.本現場の岩盤温度は100度以上あることから,高温岩盤の掘削技術について全員で検討を行った.・第3回現地研究会を雲仙普賢岳普及作業現場で開催し,無人化重機による作業状況を調査した.オペレータの方からの聞き取り調査により,遠隔操作は必ずしも十分に作業員の負担軽減にはなっていないこと,また知能化ロボットの期待が大きいことを確認した.・第4回研究会を東京で開催し,今までの検討結果を総括するとともに,共同研究に発展させるための検討を行った.目的:地下深部に賦存する未利用資源・エネルギーの有効利用のためには,如何に安全に,かつコストを抑えて賦存地点まで到達し,効率的に開発するかが重要なポイントになり,そのための新たな地殻マシーニング技術の開発が望まれている.「ジオメカトロニクス」は,岩盤・地盤工学,機械工学,電子工学を融合させた,本研究で提案する新たな造語であり,本研究では「ジオメカトロニクス」の学問体系の基礎を構築する要素を調査するとともに,次世代地殻マシーニング技術の確立に必要な要素技術および課題を洗い出し,共同研究へ発展させるための調査研究を行うことを目的とする.研究結果:・第1回現地研究会を,住友大阪セメント(株)唐沢鉱業所にて開催し,重機の稼動状況を調査するとともに,自動化クローラドリルによる自動削孔の様子を見学し,今後の自動化技術に関して聞き取り調査を実施した.また重機のロボット化への問題点を全員で検討し,作業環境の認識技術および土砂・岩盤の原位置物性値計測技術が,次世代地殻マシーニング技術に必要不可欠であることを確認した.・第2回現地研究会を地下資源開発現場である豊羽鉱山(札幌市)で開催し,地下の作業現場に導入されている重機の稼動状態を調査した.本現場の岩盤温度は100度以上あることから,高温岩盤の掘削技術について全員で検討を行った.・第3回現地研究会を雲仙普賢岳普及作業現場で開催し,無人化重機による作業状況を調査した.オペレータの方からの聞き取り調査により,遠隔操作は必ずしも十分に作業員の負担軽減にはなっていないこと,また知能化ロボットの期待が大きいことを確認した.・第4回研究会を東京で開催し,今までの検討結果を総括するとともに,共同研究に発展させるための検討を行った.
遺伝子DNAの塩基配列を利用した双口吸虫の虫卵による種の鑑別

本研究の目的は、1.形態学的には種の識別が困難な双口吸虫卵を遺伝子DNAの塩基配列から識別が可能であるか否かを明らかにすること、2.識別法として、より簡便なPCR-linked RFLP法を確立することである。本年度は2.についての実験を行ない、次の結果を得た。3種類の双口吸虫、すなわちCalicophron calicophorum,Orthocoelium streptocoelium,Homalogaster paloniaeを用いてリボソームDNAのITS-2の塩基配列を決定し、配列の違いを調べた。ITS-2の塩基対数はC.calicophorumおよびO.streptocoeliumで284bp、H.paloniaeで285bpと種間による差異は低かった。また配列の違いについても、C.calicophorumとO.streptocoeliumの間で4.2%、H.paloniaeとO.streptocoeliumで4.6%、H.paloniaeとC.calicophorum5.3%といずれの値も低い値であった。これらの塩基配列に基づいて制限酵素地図を作成したところ、3種類の制限酵素、すなわち、AccII,MflIおよびHhaIの認識部位が3種の双口吸虫で異なっていた。実際に各種双口吸虫の単一虫卵から抽出したゲノムDNAを用いてPCR-RFLPを行ったところ、特に制限酵素AccIIの切断パターンから3種の虫卵は容易に識別することが可能であった。以上のことから、ITS-2領域のDNA塩基配列をマーカーとして利用したPCR-RFLPによって虫卵からの双口吸虫種の鑑別が可能であることが明らかとなった。本年度は、1.日本に存在する双口吸虫を採集すること、2.双口吸虫の種類を同定すること、3.虫体からゲノムDNAを抽出すること、4.リボソームDNAのinternal transcribed spacer(ITS)のITS-1およびITS-2、またはミトコンドリアDNAのCOl、ND1遺伝子を増幅するプライマーを設計し、PCRによる増幅を確認すること、5.増幅産物の塩基配列を決定し、制限酵素切断地図を作製することによって、双口吸虫の種をDNAの塩基配列から識別できるか否かを明らかにすること、を目的として研究を行い、次の結果を得た。2.これらの双口吸虫種からItagaki et al.(1995)の方法によってゲノムDNAを抽出することが可能であった。3.リボソームDNAのinternal transcribed spacer(ITS)のITS-1およびITS-2を増幅するためのプライマーを設計し、抽出した双口吸虫のゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ、ITS-2だけが増幅された。4.増幅されたITS-2の塩基配列を決定し、その制限酵素切断地図から、制限酵素AccllおよびDdelの切断パターンの違いによって、4種の双口吸虫を識別できることが明らかとなった。1.双口吸虫の虫卵から効率良くゲノムDNAを抽出する簡便法を検討するため、ボイル法、凍結融解法、アルカリ法の比較を行った。その結果、それぞれの方法を単独で実施した場合には虫卵からのゲノムDNAの抽出は一定せず、そのためPCRの増幅効率も不安定であった。その原因として卵殻の破壊が不完全であると考えられたため、第1に虫卵をホモジナザーで機械的に破壊した後に凍結融解-ボイル法を行ったところ、DNAの抽出、PCR増幅効率が改善された。

2.双口吸虫虫卵1個から上述の方法で抽出したゲノムDNAを用いて、リボソームDNAのinternal transcribed spacer 2(ITS-2)領域のPCR増幅は可能であり、しかも次のRFLP解析に用いるのに十分な量の増幅産物が得られた。3.簡便なPCR-linked RFLP法を確立するためには、ゲノムDNAの抽出とその後のPCR反応を同一のチューブで行う必要がある。そこでPCR増幅が虫卵数によって影響されるかを明らかにするため、110個の虫卵からDNAを抽出しPCRを行ったところ、虫卵数が3個以上になるとPCR増幅産物が減少し5個以上ではPCR増幅産物は得られなかったことから、一度に検査可能な虫卵数は4個まであることが分かった。また2種類の双口吸虫(C.calicophorum、O.streptocoelium)の虫卵がそれぞれ4個:0個,3個:1個,2個:2個の割合で含まれている場合でも、PCR-linked RFLP法で両種を識別できた。