hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重度聴覚障害者のスピーチの明瞭さに及ぼす聴覚フィードバックの機序に関する基礎研究

個々の症例を見ると、ほぼ全評価者が同一と評価した音節でありながら、無声音のVOTが有声音に比べて明らかに長かった症例が認められると共に、一方で、評価者全員が同一と評価した音節であって、かつVOTに差が認められなかった症例も存在した。平均聴力レベル90dB以上の重度聴覚障害児75名について、母音受聴明瞭度、母音発音明瞭度並びに自己発話母音受聴明瞭度とそれらの相互関連性を検討した。その結果、それらの異聴には一定の傾向が見られること、聴能を高め、発話において聴覚フィードバックを有効に活用している聴覚障害児の有する聴覚的カテゴリーは、多少のずれは存在するものの、健聴児により近似するものであることが推察された。また、健聴児・者の正常な発音の聴取能を自己発話の受聴に生かし聴覚フィードバックを有効に働かせなければ、発音の明瞭さの向上にはつながらないことが示唆された。また、重度聴覚障害児の発話した破裂子音における有声・無声の対立(/p/⇔/b/,/t/⇔/d/,/k/⇔/g/)において、評価者全員(10名)が正しく無声と聴き取った無声破裂子音発話音声と、60%以上(10名中6名以上)の評価者がその無声破裂子音として聴き取った相対立する(調音部位の同じ)有声破裂子音発話音声について、両発話音声の音響音声学的特徴、具体的にはVOT(Voice Onset Time)の差異を分析・検討した。その結果、1)有声-無声破裂子音のVOTについて、/p/-/b/並びに/k/-/g/にあっては無声のVOTが有意に長かったが、/t/-/d/には有意差が認められなかった。2)無声と評価した評価者数と/t/-/d/間のVOT差との間には相関が認められたが、/p/-/b/間のVOT差並びに/k/-/g/間のVOT差との間には相関は認められなかった。これらのことから、聴覚障害児の単音節発話音声には、聴覚的には同一単音節と評価されるものであっても当該児の内では相異なる音節として発話されている可能性のあるもののあることが示唆された。また、音節によっては、有声・無声の識別の手掛かりの一つであるVOTの差が、無声と聴覚的に評価される割合を良く反映しているもののあることが示唆された。平均聴力レベル90123dBの難聴児を対象に,100音節の発語明瞭度,健聴児の発語による母音の受聴明瞭度,母音の発語明瞭度並びに自己の発語による母音の受聴明瞭度の相互関連性を検討した。その結果,母音の発語明瞭度が高くても語音聴取能の低い者は発語明瞭度が低いことが示唆され,子音を含む発語の明瞭さには,母音の発語の明瞭さに加えて聴覚フィードバックが重要であることが示唆された。更に,100音節の発語明瞭度と自己の発語による母音の受聴明瞭度に高い相関が認められたことからも,発語の明瞭さにおける聴覚フィードバックの重要性が示唆された。一方,健聴児の発語による母音の受聴明瞭度も母音の発語明瞭度も共に低いにも関わらず,自己の発語による母音の受聴明瞭度が高い者がいたことから,健聴者とは異なる独自の母音の音響・音韻的範疇を有する聴覚障害児の存在が示唆された。また,平均聴力レベル90dB以上の難聴児の発語のうち,無声音が全健聴評価者に正しく聴取され,その無声音と同一調音部位の有声音を,50%以上の評価者にその無声音として聴取された無声ー有声破裂子音を分析の対象とし,スペクトログラムからVOT(Voice Onset Time)を測定し,その差異と聴覚的評価との関連性を検討した。
トランスポゾンのゲノム進化動態に与える影響

本研究における重要な点は、トランスポゾンのコピー数変動動態に加えて同時にトランスポゾンの配列の進化動態を詳細に示せることにある。また、トランスポゾン配列からトランスポゾンの転移活性を定義することにより、コピー数変動と転移活性との関係を示すことができる。トランスポゾンが数を増やすことにより宿主の適応度を下げるような選択が強く働く場合、すなわち、コピー数が少ない場合、転移活性は高いまま維持されることが示された。逆に、選択が弱い場合、すなわち、コピー数が多い場合は、転移活性を失ったコピーがその大部分を占めることが示された。ただし、この結果には重大な問題点がある。現在のパラメタでは、一個体中でトランスポゾンが挿入可能なサイトの数が、選択が低い場合のコピー数の最大値の約二倍しかなく、現実的なモデルとはいえない。また、集団中では、ほぼすべてのサイトにトランスポゾンが挿入することになり、あるサイトにおけるトランスポゾンの固定確率が非常に高くなる要因ともなっている。この結果は、転移活性を失ったトランスポゾンが集団中に維持され続けるためには、ある程度そのサイトにおける頻度が高くなくてはならない事を示しているとも言える。ここから、転移活性の高いトランスポゾンは挿入多型を示すことが考えられる。実際に、Aluと言ったレトロトランスポゾンでは、コピー数とともに挿入多型を考慮してそのサブファミリーのエイジを推定している。また、出芽酵母での集団ゲノム解析からも同様の結果が示されている。以上、トランスポゾンの固定確率、トランスポゾンの頻度分布と転移活性の関係に関して結果をまとめ論文として執筆中である。シミュレーションプログラムのバグの修正等に時間がかかり、当初の計画より遅れが生じた。シミュレーションプログラムは構築済みであるため、解析に必要なデータの蓄積を行いつつ、解析を行い、順次論文へとまとめていく。パラメタ設定により非現実的な状態が作られる場合には、全てのデータを作りなおす必要性が出てくる。本年度では、トランスポゾンに対しての古典的モデルに配列情報を加えたモデルへの発展をおこなった。トランスポゾンの転移活性は主にトランスポゾン自身がコードする転移に必須な酵素に依存する。そのため配列情報を用いることでより現実的に転移活性を記述した。また、フレームシフト変異など一度の突然変異により転移活性を失う場合も考慮した。トランスポゾンに対する自然選択としては、そのコピー数と挿入座位に対しての二種類の選択を考え、両選択が働く座位と数に対しての選択のみが働く座位とに分けてモデル化した。以上を考慮したモデルを基にC言語を用いてシミュレーションプログラムを構築しシミュレーションを行った。その結果コピー数動態に関しては、コピー数がほぼ平衡状態であり転移活性が(1)高い状態を維持、(2)徐々に減少、(3)一気に減少と(4)コピー数が振動の4つのパターンに大別できた。また、近隣結合法を用いてトランスポゾン配列の遺伝子系譜を描き、星状度を用いてその系譜の形状を定量的に評価した。この星状度と集団中の平均転移活性、活性を持つコピー数の割合との間にそれぞれ負の相関が見られた。これは、転移活性が高いコピーでは突然変異によって自身の枝を残しつつ多くの分枝ができるが、転移活性が低いまたは無いと自身の枝が消失するとともに新しい分枝ができる確率のほうが高いからと考えられる。今後は、コピー数の振動(パターン4)を生む要因に関しての理論的解析を行うとともに、このモデルをもとに集団動態(種分化や集団サイズの変動)を考慮した研究を行いショウジョウバエにおける実データとの比較検討を行う予定である。本年度は、前年度に引き続きトランスポゾンの配列を考慮したシミュレーションプログラムの結果をもとに、トランスポゾンのコピー数動態とトランスポゾンの配列の進化動態の関係を研究した。前回報告した、トランスポゾンのコピー数に対する負の選択挿入位置による負の選択との力関係や負の選択が高いほどコピー数は少なくなるが、逆に活性の高いコピーが多く占めるといったコピー数動態と選択との関係、トランスポゾン配列の塩基置換率による活性の変化率が大きいほどコピー数が変動しやすいという結果を得た。前回報告したトランスポゾンの欠失率との関係も見られたが、変化率との関係ほど強い相関は見られなかった。またこのデータ群に対して、トランスポゾン全配列を用いた系譜および非同義置換率(Dn)と同義置換率(Ds)の比(Dn/Ds比)の解析を行った。系譜の枝長はその時点でのトランスポゾン集団の活性の構成を反映することが示された。コピー数動態との関係も見られ、コピー数が少ない場合、すなわちトランスポゾンに対する負の選択が強い時、系譜の形状は最初の配列を中心に星型となる傾向が見られ、コピー数が多い場合はそれぞれの枝長は活性を反映するために、全体的に渦を巻く様な形状がとなる傾向が見られた。さらにDn/Ds比においても、枝長とDn/Ds比との間に負の相関が見られた。ただし、コピー数が増加している場合では正の相関が見られる点もあり、コピー数動態の影響を少なからず受けていることが示された。以上の結果を論文としてまとめ、遺伝学分野のトップジャーナルであるGenetics誌に投稿するに至った。

逆に、選択が弱い場合、すなわち、コピー数が多い場合は、転移活性を失ったコピーがその大部分を占めることが示された。ただし、この結果には重大な問題点がある。現在のパラメタでは、一個体中でトランスポゾンが挿入可能なサイトの数が、選択が低い場合のコピー数の最大値の約二倍しかなく、現実的なモデルとはいえない。また、集団中では、ほぼすべてのサイトにトランスポゾンが挿入することになり、あるサイトにおけるトランスポゾンの固定確率が非常に高くなる要因ともなっている。この結果は、転移活性を失ったトランスポゾンが集団中に維持され続けるためには、ある程度そのサイトにおける頻度が高くなくてはならない事を示しているとも言える。ここから、転移活性の高いトランスポゾンは挿入多型を示すことが考えられる。実際に、Aluと言ったレトロトランスポゾンでは、コピー数とともに挿入多型を考慮してそのサブファミリーのエイジを推定している。また、出芽酵母での集団ゲノム解析からも同様の結果が示されている。以上、トランスポゾンの固定確率、トランスポゾンの頻度分布と転移活性の関係に関して結果をまとめ論文として執筆中である。シミュレーションプログラム中に致命的なバグが見つかり、プログラムの修正及び再度シミュレーション・データ解析をやり直したため。シミュレーションプログラムのバグの修正等に時間がかかり、当初の計画より遅れが生じた。すべてのコピーが転移を行えるトランスポゾンモデル(本研究では転移活性を有するものだけ転移を行う)に従うシミュレーションプログラムでも少数のマスタージーンまたはソースジーンのみが転移を行えるマスター/ソースジーンモデルに似た動態を示すことを示唆している。しかし、塩基置換率のみを基にした転移時期、特に一時期に多くのトランスポゾンが転移を行った時期(トランスポジション・バーストの時期)の推定には、変異を蓄積しながらコピー数が増加していくためにごさが生じることになる。この点に関してシミュレーションプログラムから得られたデータ群を用いて、統計学的に補正方法を提案するために解析を行っている。また、転移活性やゲノム中のトランスポゾンの挿入位置の分布などからマスター/ソースジーンとなりうる配列の特徴の解析も行なっている。さらに、本研究でのモデルは一種の生物集団を仮定しているが、この集団が分集団化(または種分化)した場合の配列の進化動態に関しても見る必要があるため、シミュレーションプログラムを改正している。シミュレーションプログラムは構築済みであるため、解析に必要なデータの蓄積を行いつつ、解析を行い、順次論文へとまとめていく。パラメタ設定により非現実的な状態が作られる場合には、全てのデータを作りなおす必要性が出てくる。
アジア発展途上地域における伝統農業技術の生態経済学的評価

この研究の目的は、伝統的な農法を静態経済学的な見地から評価することである。生態系を考慮して、ネパールのカトマンズ盆地および傾斜地農業、インドのシッキム州北部県の傾斜地農業、スリランカのタンク灌漑システム、パキスタンのシンド州の過剰湛水・塩害地域、バングラデシュの汽水域の水稲・エビ養殖システム(ゲールファーミング)、ラオスのメコン河氾濫地域および焼畑農業地域において農村経済調査を実施した。またGPSで作成した実態調査図と経年的な衛星デジタル情報をEARDASで解析し、調査対象地域のエコロジカルな視点からの開発経済分析における有効性を明らかにした。総合要素生産性(TFP)の計測により生態系と生産性増加の関係を分析した。伝統的な農法のTFPは低位にとどまるが、自然災害などのリスク変動を相殺すべく、より広域的な生態系を利用した農業(遊牧など)を組み合わせることによって農家収入を安定的なものにしている。これに対して、近代農法は長期的にTFPの上昇を相殺する負の環境効果が表れ、これを制御するために追加的な投資が必要になる。この時、多くの農家は経済負担に耐え得ない。労働集約度の高い農業地域では、外部不経済発生時の環境制御に大きな差が生じている。農民の自発的な行動は外部不経済を最小限にとどめ、伝統的な農法から近代的な農法への移行を容易にする。ネパールの馬鈴薯灌漑、ラオスの氾濫原における人力移動揚水ポンプ利用、ゲールファーミングはその好例である。伝統農法と近代農法の連続性に対する認識が今後、重要である。食糧問題を解決するためには、なによりも農業生産性を上昇させることが重要である。しかし、一方で、ムラの伝統農業システム(以下では伝統農業と略記する)が変わり、そのエコロジカルな特性が急速に失われつつある。とくに小国において、食糧問題が国際協力の枠組みのもとでの経済問題に変化しつつある今日、市場経済化のもとでの慣行農法の生産性再評価と、そのエコロジカルな特性の経済学的な評価が重要となっている。本年は、研究分担者が各担当地域、ラオスのメコン河流域、ネパールの丘陵地域、インドのシッキム州、スリランカにおいて予備調査を実施した。資本制約下での技術移転の過程おける伝統農法並存の重要性を明らかにするために、伝統農業と近代的農業とが並存するエコロジカルな小地域で農家経済調査の実施可能な地域を選定した(ここで、エコロジカルな小地域とは入会地なども含む広義の農業地域として定義される)。おおむね伝統的な農業は低位均衡の典型的な状態にあるが、市場アクセスが容易なところで「商品」作物が導入され、そこでは伝統的な農業システムを壊すことなく、労働などの余剰資源を有効に利用している。たとえばメコン河の堤防敷地内では家庭用電力を利用した小電動ポンプが利用され、集約度の高い農業が営まれるようになっている。またネパールでは既存水稲灌漑システムを利用して乾季の野菜作への水利用が急速に普及し、商品作物が増加し、農家所得に著しい改善がみられている。農民の投資負担を増加することなく、市場経済化によって生産性を増加させており、外部不経済は顕在化していない。これらの知見は慣行農法の頑健性について、再評価の必要があることを示唆するものである。なおGPSやGISなど、最新の手段を使い小地域を分析する方法を開発中である。本年度は、ネパールの丘陵地域、インドのシッキム州、スリランカ、パキスタンのシンド州、バングラデシュにおいて本調査を実施した。またラオスのメコン河流域については研究協力者が調査を実施した。方法論として、環境要因(外部不経済)を考慮した総合要素生産性(TFP)の計測方法を調査知見にもとづき理論的に検討した。伝統的な農法はTFPが低位で、長期的に一定であるが、自然災害などのリスク変動による年次効果がきわめて大きい。

これを相殺すべく、広域的な生態系を利用した農業(遊牧など)に依存する傾向がある。これに対して、近代農法はTFPを上昇させる可能性は大きいが、TFPの上昇を相殺する環境効果が長期的に表れる。また調査の知見は、もともと土地利用度の低い地域における水資源開発がもたらした環境悪化と本来労働集約度の高い農業地域での環境悪化とでは、大きな差がある。外部不経済をコントロールする機構をどのように組み込むのかが、TFPの方法改善で重要であることを示唆する。ネパールの農民の自発的な行動による外部不経済を最小限にとどめる努力は、伝統的な農法を理解する上で示唆に富む。ラオスの氾濫原における人力移動式揚水ポンプ利用農業なども同様である。技術移転の過程における伝統農法並存の認識から、連続性へ認識への転換の重要性について確認できた。このほか、EARDASを使用して衛星写真を解析し、GPSにより作成した調査地域図と重ね、調査対象地域のエコロジカルな視点からの開発の特徴を経年的にとらえる方法の経済分析への適用可能性を明らかにした。ネパールのカトマンズ盆地および傾斜地農業、インドのシッキム州北部県の傾斜地農業、スリランカのタンク灌漑システム、パキスタンのシンド州の過剰湛水・塩害地域、バングラデシュの沿海低地の水稲・エビ養殖システム(ゲールファーミング)、ラオスのメコン河氾濫地域および焼畑農業地域において、生態系を考慮した農村経済調査を実施した。調査知見にもとづき、環境要因(外部不経済)の差を考慮して、総合要素生産性(TFP)の計測などにより、生態系と生産性増加の関係を分析した。伝統的な農法はTFPが低位であると考えられがちであるが、自然災害などのリスク変動を相殺すべく、より広域的な生態系を利用した農業(遊牧など)に依存する傾向がある。これに対して、近代農法はTFPを劇的に上昇させるが、TFPの上昇を相殺する環境効果が長期的に表れる。また、もともと土地利用度の低い地域における水資源開発がもたらした環境悪化と本来労働集約度の高い農業地域での環境悪化とでは、農民の環境の制御可能性に大きな差が生じてくる。外部不経済をコントロールする機構をどのように組み込むのかが重要である。技術移転の過程における伝統農法と近代農法並存の認識から、連続性へ認識を転換することが重要である。このほか、EARDASを使用して年代別の衛星写真を解析し、GPSにより作成した調査地域図と重ね、調査対象地域のエコロジカルな視点からの開発経済分析への適用可能性を明らかにした。
胃粘膜増殖因子REGの細胞内シグナル伝達機構と癌化との関連

Regは膵臓再生にかかわる増殖因子として発見され、我々はRegが胃粘膜障害の再生時にも病変部周辺に強く発現することなど、胃粘膜増殖因子である可能性を示唆するデータを報告してきた。本研究ではこれをさらに進め、胃粘膜細胞内でのシグナル伝達や癌化との関連、in vivoにおける増殖促進作用を解析した。申請時に一部記したとうり、我々は培養胃癌細胞を用いてRegによる細胞内シグナル伝達を解析した。結果、Reg刺激により早期に150Kdの蛋白質がチロシンリン酸化され、遅れて古典的MAPキナーゼのリン酸化が観察された。これに伴いH^3チミジンの取り込みが増大した。これらの結果は分化癌由来細胞を使った実験では得られず、未分化癌由来細胞に特異的であった。さらに、ヒト胃癌細胞組織、特に未分化癌において、Regは正常組織にくらべ高発現しており、発癌との関連が示唆された(FEBS Lett.2002)。この論文はSandvikらに高く評価され、コメントが同雑誌に掲載された(FEBS Lett.2003 553(3)P464-5)。また、Regの細胞内シグナル伝達研究をおし進めるため、受容体のクローニングをめざしている。Reg蛋白質をカラムに結合させ、胃癌細胞ライセートとインキュベートしたところ、in vitroのキナーゼアッセイにて上記分子量にだいたい一致する、自己リン酸化蛋白質が検出された。これをReg受容体と考え、さらに精製を進めている。また、Regのin vivoにおける増殖促進作用を評価するためにサイトメガロプロモーターを持つ発現ベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製した。このマウスの胃粘膜は、正常マウスに比べ2倍以上の厚さを示し、Regの胃粘膜幹細胞に対する増殖促進作用が示唆された。さらに、免疫染色により、増殖促進された細胞は壁細胞、主細胞のみであることが示され、新たにRegの胃粘膜細胞分化作用が示された。この成果はoncogeneに投稿し、現在in pressの状態である。また、Regはマウスでは、胃では発現が弱く、小腸で発現が強いためトランスジェニックマウスでは胃で、ノックアウトマウスでは小腸での機能が強く形質として出ると予想される。Regノックアウトマウスの消化管の組織形態を検討したところ予想どうり、小腸において明らかに形態の差が見られた。ホモノックアウトマウスの小腸絨毛において、ワイルドタイプに比べ細胞密度が減少していた。この結果により、Regは胃のみならず、小腸などの消化管腺組織全般において、増殖因子として働いている可能性が示唆された。Regは膵臓再生にかかわる増殖因子として発見された。Regは胃粘膜障害の再生時にも病変部周辺に高く発現することが知られており、また、in vitroの培養系で胃粘膜細胞の増殖を刺激することが示され、胃粘膜再生や胃癌発癌に関与していると予想された。

本研究はこれらのReg蛋白質のすでに得られている知見をもとに、これをさらに進め、胃粘膜細胞内でのシグナル伝達や癌化との関連、in vivoにおける増殖促進作用を解析する。申請時に一部記したとうり、我々は培養胃癌細胞を用いてRegによる細胞内シグナル伝達を解析した。結果、Reg刺激により早期に150Kdの蛋白質がチロシンリン酸化され、遅れて古典的MAPキナーゼのリン酸化が観察された。これに伴いH^3チミジンの取り込みが増大した。両事象の関連はMAPキナーゼ特異的阻害薬を用いて証明された。これらの結果は分化癌由来細胞を使った実験では得られず、未分化癌由来細胞に特異的であった。さらに、ヒト胃癌細胞組織、特に未分化癌において、Regは正常組織にくらべ高発現しており、発癌との関連が示唆された(FEBS Lett. 2002)。また、Regの細胞内シグナル伝達研究をおし進めるため、受容体のクローニングをめざしている。ヒスチジンtagを融合させたReg蛋白質をCOS細胞内で発現させ、これをニッケルカラムに結合させ、胃癌細胞ライセートとインキュベートしたところ、in vitroのキナーゼアッセイにて上記分子量にだいたい一致する、自己リン酸化蛋白質が検出された。これをReg受容体と考え、さらに精製を進めている。また、Regのin vivoにおける増殖促進作用を評価するためにサイトメガロプロモーターを持つ発現ベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製した。このマウスの胃粘膜は、正常マウスに比べ2倍以上の厚さを示し、Regの胃粘膜幹細胞に対する増殖促進作用が示唆された。さらに、免疫染色により、増殖促進された細胞は壁細胞、主細胞のみであることが示され、新たにRegの胃粘膜細胞分化作用が示された。Regは膵臓再生にかかわる増殖因子として発見され、我々はRegが胃粘膜障害の再生時にも病変部周辺に強く発現することなど、胃粘膜増殖因子である可能性を示唆するデータを報告してきた。本研究ではこれをさらに進め、胃粘膜細胞内でのシグナル伝達や癌化との関連、in vivoにおける増殖促進作用を解析している。本研究の前半の成果である胃癌細胞におけるRegの細胞内シグナル伝達および胃癌細胞における発現に関するデータをFEBS Lett.2002 530 p59-64に発表したが、この論文はSandvikらに高く評価され、コメントが同雑誌に掲載された(FEBS Lett.2003 553(3)P464-5)。また、Regのin vivoにおける増殖促進作用を評価するためにサイトメガロウイルスプロモーターを持つ発現ベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製したところ、このマウスの胃粘膜は、正常マウスに比べ2倍以上の厚さを示し、Regの胃粘膜幹細胞に対する増殖促進作用が示唆された。さらに、増殖促進された細胞は壁細胞、主細胞のみであることが示され、新たにRegの胃粘膜細胞分化作用が示された。この成果はoncogeneに投稿し、現在in pressの状態である。また、Regはマウスでは、胃では発現が弱く、小腸で発現が強いためトランスジェニックマウスでは胃で、ノックアウトマウスでは小腸での機能が強く形質として出ると予想される。
四次構造エンジニアリングによる人工サブユニットの開発

本研究では、全く新しい蛋白質機能の制御技術として四次構造エンジニアリングによる人工サブユニット構築を提案した。すなわち、新たに強相関インターフェイスを目的蛋白質に導入し、非共有結合によりde novo合成されたペプチドあるいは既存の蛋白質とのあいだに複合体を形成させることにより新機能を有する強相関ソフトマテリアルの構築をめざした。本研究ではグルコース-3-脱水素酵素をはじめとしたグルコース酸化還元酵素群を対象とし、基質特異性を制御する人工サブユニットならびに電子伝達を行う人工サブユニットを四次構造エンジニアリングにより構築することを目的とした。初年度は特にグルコース-1-脱水素酵素(GDH)を対象とし、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリを用いてこの基質特異性を制御するサブユニットの開発を試みた。数回のバイオパンニングの結果、GDHとの相互作用を指標として回収されたファージより、いくつかの7merと12merのGDH結合ペプチドが得られた。それらの合成ペプチドを用いて、ペプチド濃度がGDH活性におよぼす影響について調べたところ、7merであるNo.3-14および12merであるNo.12において、その存在下でGDHの活性の低下が見られた。このことから、これらの合成ペプチドは活性中心近傍に結合している可能性が示された。さらに12merのペプチドはグルコースおよびマルトースに対して、7merの合成ペプチドはラクトースならびにマルトースに対するGDH活性が低下し、同酵素の基質選択性が向上した。今回開発されたGDHの基質特異性を制御する人工サブユニットはGDHの基質認識近傍に結合することにより本酵素の活性を制御しているものと予想され、本研究で提案する手法により蛋白質の機能改良が進められることが示された。今後、ここで明らかになった人工ペプチドと相互作用を有するGDHの領域の構造を解析することにより、強相関インターフェイス、ひいては新規な強相関ソフトマテリアルが設計できるものと期待される。
新しい免疫抑制法による腎移植の研究

昨年でのリンパ球刺激シグナルの化学修飾による免疫寛容の実験で、この誘導機序解析の目的にて、T-cell associated cytokinesをRT-PCRにて調べた。移植後5日目のisograftでは、サイトカインのmRNAの発現はみられなかったが、無処置のallograftではIL-2,r-INF(Th1サイトカイン)、IL-4,IL-10(Th2サイトカイン)のすべてが見られた。しかし、化学修飾したドナー脾細胞を投与したものではIL-2mRNAの減少が見られ、Th1/Th2のimmunoredirectionが寛容誘導の機序と考えられた。最近、開発されたFTY720の免疫抑制効果をラット腎移植モデルで検討した。本剤は、リンパ球を特異的に減少させ、allograftの生着を延長させた。この効果は、術前投与で最も強力であった。この長期延長の機序を検索する目的で、脾細胞のapoptosisを調べたが、移植5日目のレシピエントの脾臓にapoptosisは見られなかった。むしろレシピエント脾細胞のサイトカイン分泌の機能変化に起因することが示唆された。臨床的研究では、新しい免疫抑制剤、FK-506の投与患者でこの血中濃度のpharmacokineticsおよび移植腎のserial biopsyがおこなわれた。本剤の血中濃度のmonitoringが腎毒性軽減には、重要であることが判明した。昨年に報告した長期生着腎移植患者の血中および皮膚のmicrochimerismを、ドナーとレシピエントのMLR indexと比較検討したが、有意な関係はみられなかった。これについては、免疫寛容の検索の意味でもさらなる研究が必要と思われる。腎移植患者の増殖因子、HGFを血中レベルで検討するに、拒絶反応では上昇する傾向があるが、有意なものではなかった。慢性拒絶反応では間質の線維化が一般的であり、拒絶反応におけるHGFの意義解明には、移植腎組織上の免疫染色での検討が必要であろう。申請した研究計画では、動物実験モデルでの免疫寛容の誘導、臨床的な腎移植の拒絶反応機序の解明に分けられる。動物実験モデルとしては、ラット同種心移植(BN-LEW)において、胸腺内へのdonor骨髄細胞注入と初期短期間免疫抑制(FK506)により移植心の特異的免疫寛容が得られた。この免疫寛容ラットでは、移植心へのrecipient細胞の移入、recipient各組織へのdonor細胞の移入がみられた。一方beagle犬の実験モデルでは、全身リンパ組織へのレ線照射、donor骨髄細胞の静注およびFK506投与(3カ月間)により移植腎の特異的免疫寛容が得られた。この際、免疫モニタリングで皮膚移植を試みると、皮膚移植片中のIa dendritic細胞のdonor,recipient由来細胞数の比較が、免疫不応答性や拒絶反応の予知に有効であることが判明した。腎移植の臨床に則した研究としては、この拒絶反応のモニタリング法として血清・尿中ネオプテリン、IL-8を測定し、血清ネオプリテリン、IL-8が拒絶反応中に上昇することが判明した。そしてこれらは、FK506投与による腎毒性の場合上昇せず、腎毒性と拒絶反応の鑑別に有効と考えられた。また、拒絶反応機序の解明として、腎移植患者の各種末梢血のリンパ球抗原測定、移植腎生検からのRNA抽出中での各種サイトカイン、接着分子をPCR法にて測定した。これらの解析が進行中であるが、腎尿細胞管由来の特異蛋白(PIVKA II)が拒絶反応中に尿に排泄されることが判明した。

腎の保存も移植腎の生着に重要であり、病巣指向型長時間作動性のラジカルスカベンジャーSMA-SODが、阻血腎の障害軽減に有効であることが、犬実験モデルにて判明した。動物移植モデルにて、各種免疫抑制法を検討した。Th2細胞のautocrinegrowthfactorであるIL-4を心臓にのみ発現するトランスジェニックマウスを作製し、この心臓を同種移植した。Th1/Th2細胞の拮抗作用から、移植心は有意に生着が延長した。ラット腎移植(BN→LEW)モデルにて、BN脾細胞をethylcarbodiimideによる処理にてcostimulatory signalを修飾し、この投与後に腎移植をおこなった。長期生着がみられ、これはanergyによるものと推測された。犬腎移植では、DRB1遺伝子不適合間の移植で検討した。移植前の全身リンパ組織のradiation後に腎移植をおこない、これと同時にドナーの腎髄移植とFK506投与をおこなった。有意に移植腎の生着がみられ、長期生着例ではchimerism donorspecific alloresponseを抑制する血清因子が確認された。臨床的研究として、腎移植患者の血液、生検組織で増殖因子(HGF,FGF)、HGF-receptorのc-METを検討した。c-METの免疫染色では、拒絶反応時のみ近位尿細管細胞で発現された。腎移植におけるNO生成を検討する目的にて、腎移植患者の血液・尿のNO_2+NO_3を測定した。急性拒絶反応時にNO生成の亢進がみられ、monitoringの指標としての有効性が示唆された。腎移植生着因子として腎移植患者のmicrochimerismを血液、皮膚にて検討した。DRB1領域に設定したnestedPCR法にて検討した。約50%の患者で、血液、皮膚ともmicrochimerismの発生を確認したが、移植腎予後との相関は不明である。合併症の検討として、FK-506の腎毒性の軽減を目的としてSMA-SOD投与の実験をおこなった。ラットにFK-506、SMA-SODを投与し、FK-506の腎毒性軽減がみられた。昨年でのリンパ球刺激シグナルの化学修飾による免疫寛容の実験で、この誘導機序解析の目的にて、T-cell associated cytokinesをRT-RCRにて調べた。移植後5日目のisograftでは、サイトカインのmRNAの発現はみられなかったが、無処置のallograftではIL-2,γ-INF(Th1サイトカイン)、IL-4,IL-10(Th2サイトカイン)のすべてが見られた。しかし、化学修飾したドナー脾細胞を投与したものではIL-2 mRNAの現象が見られ。Th1/Th2のimmunoredirectionが寛容誘導の機序と考えられた。最近、開発されたFTY720の免疫抑制効果をラット腎移植モデルで検討した。本剤は、リンパ球を特異的に減少させ、allograftの生着を延長させた。この効果は、術前投与で最も強力であった。この長期延長の機序を検索する目的で、脾細胞のapoptosisを調べたが、移植5日目のレシピエントの脾臓にapoptosisは見られなかった。
ヒト型HIV感染防御抗体・ヒト型エイズ発症防止抗体の創製のための生化学的基礎研究

エイズ発見以来、24年を経過したが、予防のための究極のワクチン開発を行う上で、とても厳しい状況が続いている。そこで、申請者らは、(Shoji et al.,J.Virol.,75,11614-11620(2001))HIV-1 coreceptor-based vaccineを提案し、国際的に評価されている。これまでに、HIV-1が宿主侵入の際に利用するレセプター(ケモカィンレセプター)の第2細胞外ループ(ECL-2)を構成するundecapeptidyl arch(UPA)に注目し、このUPA構造を基礎にしたミミックペプチド抗原を作製した。本抗原をマウスおよびカニクイザルに接種することにより、ケモカインレセプターに対する自己抗体を誘導でき、本抗体はin vitroにおいてHIV-1のさまざまなcladeに対して強力に感染を防止できるだけでなく、カニクイザルを用いたサルエイズモデルにおいて、静脈より攻撃接種されたウイルスの急性感染を抑えることを明らかにできた。そのような背景のもと、本ワクチン戦略をもって実用化ワクチンを開発する場合、アジュバンドが重要なファクターになる。最も、ヒトに対して安全性試験等で優れているアジュバンドタンパク質.として、イシフルエンザワクチンがあるので、インフルエンザタンパク質をキヤリアタンパク質として用いた。申請者等は、本年度UPA構造をもとにしたミミックペプチドとインフルエンザタンパク質とをコンジュゲートさせた抗原の抗原性の有無およびどの程度の免疫応答が誘導されるか検討した。その結果、キャリアタンパク質とUPAミミック抗原の結合比と免疫応答の関係を含め、ヒト抗体遺伝子を組み込んだゼノマウスを用いてケモカインレセプターを標的としたヒト型HIV感染防止抗体・エイズ発症防止抗体を創製するための基礎データを得ることができた。
家族性Moyamoya病の遺伝子発現解析による脳血管疾患の予防医療の確立

常染色体優性家系の連鎖解析によって17q25.3に連鎖領域を同定し、Raptor遺伝子上流の新規SNP (ss161110142)のマイナーアリルが家族性Moyamoya病に共通することを明らかにした。Positional cloningを更に進めた結果、新規遺伝子MysterinをMoyamoya病の感受性遺伝子として同定した。Mysterin遺伝子は、591kDaの巨大タンパクをコードし、その機能は不明である。しかし、Mysterinの発現を抑制するとZebra fishの頭蓋内動脈の異常を生じることから、MysterinはMoyamoya病の主たる病変部位である血管において重要な役割を果たすことが強く示唆された。家系および症例の拡大を試みた結果、日本で39家系の参加を得て、孤発例については83名、韓国では4家系8名、孤発例38名、中国例では孤発例24名、ヨーロッパでは29名の孤発例を得て、合計43家系で387人の参加を得た。本年度は、常染色体優性家系を用いた連鎖解析によって17q25.3に連鎖することを証明し、Positional cloningによりRaptor遺伝子上に存在する新規SNP(ss161110142)のマイナーアリルが家族性Moyamoya病に共通することを明らかにした(EHPM, 2009)。日本国内において、Moyamoya病患者におけるss161110142マイナーアリルは相関研究により極めて高い相関が認められた(アリル頻度の検定:患者26%、対照1%,odds比51.5、P=2.08x10^<-29>)。同様に、韓国、中国においてもss161110142マイナーアリルの高い頻度での相関が認められた(韓国患者33%、対象1%、オッズ比84.09、P=9.42×10^<-22>;中国患者4%、対象0%、オッズ比NA、P=3.37×10^-2)。対してヨーロッパではss161110142マイナーアリルは患者群でも対照群でも認められなかった。ss161110142が東アジアにおけるMoyamoya病感受性遺伝子であることが示唆された。さらに欧米と比較したアジアにおけるMoyamoya病の有病率の高さにss161110142の分布の違いが関与する可能性が示された。家系の分析では、Moyamoya病のみならず、片側Moyamoya病や内頚動脈終末部狭窄・閉塞の患者もこのリスクアリルを有しており、一連の狭窄病変についても関与が推定される。さらに浸透率が低いことから、遺伝子以外の関与についても想定される。Moyamoya病患者と対照者集団の収集を日本、韓国、中国を含む東アジアとヨーロッパ諸国において本年度も継続して行った。その結果、現在までに東アジアにおいて家系例患者については日本41家系、韓国1家系、さらに日中韓合計で209名の孤発例患者および757名の健常者に参加いただいた。ヨーロッパ諸国においてはチェコの1家系および7名の孤発例患者、ドイツの42名の孤発例患者および384名の健常者に参加いただいた。常染色体優性家系を用いた連鎖解析によって17q25.3に連鎖することを昨年度報告している。Positional cloningによりRaptor遺伝子上に存在する新規SNP (ss161110142)のマイナーアリルが家族性Moyamoya病に共通することを明らかにした。ss161110142のマイナーアリルは、東アジアでもMoyamoya病患者と高い相関が認められたが、ヨーロッパでは患者群でも対照群でも認められなかった。そこでRaptor遺伝子の近傍にMoyamoya病の原因となる他の変異が存在する可能性を考慮して、Raptor遺伝子の周辺約150kbpの領域に対して、日本人Moyamoya病患者から樹立した不死化末梢リンパ球を用いてBACクローンの作成を行った。
海洋性超好熱菌に由来する超耐熱酵素の分子生物学的解析とその応用

超好熱菌Thermococcus profundusに由来するグルタミン酸脱水素酵素(GDH)のアミノ末端アミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして本酵素遺伝子をクローン化した。本酵素遺伝子の塩基配列をPCRを用いたcycle sequencing法によって決定した。構造遺伝子は419アミノ酸のポリペプチドをコードしており、その上流には古細菌の典型的なプロモーター配列であるTTTATATA配列、下流には転写終結因子として働くと考えられるpyrimidinerich配列が存在していた。本GDHは中温菌Clostridium difficileのGDHと53%の相同性を有しており、アミノ末端側54-253残基の領域(Domain I)とカルボキシ末端側314-401残基の領域(Domain II)で特に両者間に高い保存性が認められた。Domain Iでは、超好熱菌の酵素においてα-helix領域でのアラニン残基の増加とグリシン残基の減少、loop領域へのプロリン残基の導入が顕著であり、これらのアミノ酸置換によって本GDHが安定化されていると考えられた。一方、Domain IIでは安定化に関わると考えられるアミノ酸置換は認められず、本酵素の特徴である高温下でのα-helixのunfoldingを伴う活性化には、Domain IIが関わっていると推定された。本GDH遺伝子をlacプロモーターの制御下に置き大腸菌で発現させた。生産されたGDHは、元菌由来の酵素と異なりアミノ末端のメチオニンを有していたが、元菌由来の酵素とほぼ同じ性質を示した。また、抗体を用いた解析から大腸菌で発現させた酵素も6量体構造を保持していることが確認された。したがって、本研究により超好熱GDHの超耐熱性と温度依存の活性化機構を大腸菌を用いて蛋白工学的手法により解析することが可能となった。
温度ジャンプスペクトロスコピーによる高分子の焦電ダイナミクスの研究

分極処理を加えた強誘電性高分子にナノ秒YAGレーザパルスによる温度ジャンプを与えると、焦電性に起因する電荷応答が広い時間帯にわたって観測される。本研究はこのような電荷応答の時間スペクトルを定量的に解析することによって、焦電ダイナミクスの機構を解明することを目的に行われた。測定システムとして現有のYAGレーザ(Surelite I)と高速デジタルオシロスコープ(TDS620)に加え2倍波結晶を購入し、プリアンプ部と測定及び解析ソフトウェアを開発した。その結果7nsの温度ジャンプに対し、電荷応答の1ns10sにおける広い時間帯の時間スペクトルの測定が可能となった。試料としてフッ化ビニリデン(VDF)と三フッ化エチレン(TrFE)の75/25mol%共重合体を用い、光熱変換用色素を混入後キャスト法による成膜を行った。フィルムの両面に薄い金電極を蒸着し、分極処理の後測定を行った。得られた電荷応答の時間スペクトルは、温度ジャンプと同時に現れる瞬間成分、厚みおよび長さ方向の熱膨張と圧電性の結合による2つの振動成分および外部への熱拡散による減衰成分からなることがわかった。曲線当てはめによりこれらの成分を分離した結果、瞬間成分は全体の2030%程度であり、熱膨張と圧電性の結合によるいわゆる二次効果が焦電応答の主体であることが明らかとなった。試料の温度を変化させて測定を行ったところ、キュリー点近傍で焦電応答が増大した後、転移とともに減衰、消失した。その際、まず振動成分が先に消失したのち、瞬間成分がより高温において消失することがわかった。この方法で得られる焦電応答は、分極量の温度変化を直接測定して得られる準静的な焦電率測定と比較して温度変化が小さい。このことは,今回測定した焦電応答曲線の時間範囲より長時間側にゆっくりした過程が存在することを示している。今年度は現有していたレーザ瞬間加熱電荷応答測定システムの改良として、2倍波発生用結晶システムを導入し、また測定システム全般の高精度化をおこなった。まず、今年度購入設備備品である2倍波結晶を現有のYAGレーザSurelite Iに組み込み、波長532nmの可視レーザーパルスの発生を可能とした。また、波長の変更に対応してフィルター、反射鏡等の光学系を変更した。この波長域の可視光を吸収する色素を試料に混入することによって試料全体を均一に加熱することが可能である。さらに、測定および解析ソフトウェアの改良を進め、焦電応答測定の精度を高めた。焦電応答曲線は、瞬間的な加熱による温度変化に伴う焦電一次効果、熱膨張による圧電効果(焦電二次効果)の各過程を含む。均一加熱が可能となったことによって温度変化の立ち上がりがレーザー幅と同等となり、10ns以下の時間分解能が実現した。これによって、瞬間加熱により生じる試料の急激な膨張により誘起される振動が、温度の立ち上がりと分離されて、焦電一次効果と二次効果の分離が可能となった。試料として強誘電性高分子であるフッ化ビニリデン共重合体を用い、この装置を用いて焦電応答曲線測定をおこなった結果、レーザーパルスに対応して立ち上がる過程とそれに引き続いて生じる振動過程が分離され、この振動過程にパルスプロファイルから計算された振動曲線をあてはめることによって、焦電一次効果と二次効果の比率を決定することができた。次年度は、より詳細な解析をおこなうとともに、種々の試料にこの方法を適用する。さらに、瞬間加熱によって相転移を誘起し、そのダイナミクスの研究をおこなう予定である。

分極処理を加えた強誘電性高分子にナノ秒YAGレーザパルスによる温度ジャンプを与えると、焦電性に起因する電荷応答が広い時間帯にわたって観測される。本研究はこのような電荷応答の時間スペクトルを定量的に解析することによって、焦電ダイナミクスの機構を解明することを目的に行われた。測定システムとして現有のYAGレーザ(Surelite I)と高速デジタルオシロスコープ(TDS620)に加え2倍波結晶を購入し、ブリアンプ部と測定及び解析ソフトウェアを開発した。その結果7nsの温度ジャンプに対し、電荷応答の1ns10sにおける広い時間帯の時間スペクトルの測定が可能となった。試料としてフッ化ビニリデン(VDF)と三フッ化エチレン(TrFE)の75/25mol%共重合体を用い、光熱変換用色素を混入後キャスト法による成膜を行った。フィルムの両面に薄い金電極を蒸着し、分極処理の後測定を行った。得られた電荷応答の時間スペクトルは、温度ジャンプと同時に現れる瞬間成分、厚みおよび長さ方向の熱膨張と圧電性の結合による2つの振動成分および外部への熱拡散による減衰成分からなることがわかった。曲線当てはめによりこれらの成分を分離した結果、瞬間成分は全体の2030%程度であり、熱膨張と圧電性の結合によるいわゆる二次効果が焦電応答の主体であることが明らかとなった。試料の温度を変化させて測定を行ったところ、キュリー点近傍で焦電応答が増大した後、転移とともに減衰、消失した。その際、まず振動成分が先に消失したのち、瞬間成分がより高温において消失することがわかった。この方法で得られる焦電応答は、分極量の温度変化を直接測定して得られる準静的な焦電率測定と比較して温度変化が小さい。このことは,今回測定した焦電応答曲線の時間範囲より長時間側にゆっくりした過程が存在することを示している.
敗血症におけるインスリンシグナル調節機構の解明

敗血症時のインスリンシグナルについて、モデルマウス脳および肺組織で解析した。敗血症時には、受傷からある一定期間までは何らかの自己防衛的機序によりシグナルが増大するが、その後減弱に転じ組織傷害も増大させると考えられた。一方、シグナルを持続的に増加させる活性化薬は組織傷害を軽減させた。生体内には酸化・ニトロ化ストレスを軽減させるため、インスリンシグナルを介した組織損傷保護機構があり、それをうまく利用できれば、症状軽減に役立つと期待された。多菌性敗血症マウスモデル(CLPマウス)で、組織染色法を用いた解析を中心に、脳、肺、心臓の各組織に生じる変化を検討した。敗血症を代表とする全身性炎症時には意識混濁などの神経症状が生じているが、脳組織の形態学的変化についてはこれまで不明な点が多かった。CLPマウス脳組織でHE染色を行いその組織像を解析すると、大脳皮質および海馬の神経細胞を中心に、細胞核の濃染色、およびその委縮変形像を認めた。加えて、酸化ストレスの指標として反応性窒素酸化物による蛋白質チロシン残基ニトロ化を組織免疫染色法で解析すると、脳血管周囲にニトロチロシン陽性像を認めた。以上のことから、全身性炎症によるストレスを受けると、脳血液関門のバリア機構が障害され、かつ脳組織実質の神経細胞は有害物質による影響によりその機能が障害を受けることが示唆された。一方、肺組織においては、炎症軽減作用が知られているスタチン系薬剤を予め投与しておくと、組織損傷が軽減されることを認めた。その分子基盤を解析してみると、肺胞マクロファージが増加、加えてそのグルココルチコイド受容体発現が増加していた。心臓組織においても、スタチン系薬剤が炎症による組織リモデリングを改善する効果を認めた。スタチン系薬剤は、インスリンシグナル経路のPI3K-Aktシグナルを増強することが知られている。各組織のインスリンシグナルについては、時間経過に伴いそれぞれ変動していることを認めたが、この全身性炎症病態モデルとの関連については、未だ解析途上である。多菌性敗血症マウスモデル(CLPマウス)で、分子生物学的手法、組織免疫染色法を中心とした組織形態解析を、脳、肺、心臓等の組織で行った。CLPマウス脳組織では、脳血管透過性の亢進を認めるとともに、大脳皮質および海馬の神経細胞を中心に、細胞の委縮変形像、濃染色像を認めた。加えて、酸化/ニトロ化ストレスに関して検討すると、CLPマウス脳組織では、脳血管周囲にニトロチロシン陽性像を認めるとともに、ラジカルスカベンジャー処置により細胞傷害度の減少が認められた。これらのことから、全身性炎症による酸化/ニトロ化ストレス増加は、脳血液関門のバリア機構を傷害し、脳組織実質の神経細胞機能にダメージを与えることが示唆された。一方、肺組織においては、炎症軽減作用が知られているスタチン系薬剤を予め投与しておくと、組織損傷が軽減されること、またその分子基盤を解析すると、肺胞マクロファージ増加、グルココルチコイド受容体発現増加、加えてインスリンシグナル経路のPI3K-Aktシグナルが増強していた。さらに心臓組織においても、スタチン系薬剤が炎症による組織リモデリングを改善する効果を認めた。以上のことから、各組織のインスリンシグナルは、糖尿病疾患と同じく、敗血症においても、組織傷害の進行度を防止する過程で何らかの影響を及ぼすことが示唆された。盲腸穿孔敗血症マウスモデル(CLPマウス)の脳、肺、心臓組織において、組織傷害度とインスリンシグナルを、分子生物学的手法、組織免疫法などを用いて解析した。CLPマウス各組織におけるインスリンシグナル分子AktおよびGSK-3βのリン酸化は、モデル作成後いったん増加するものの、その後減少に転じることが確認された。特にCLPマウス肺組織において、オルプリノン、コルホルシン処置により細胞内cAMP濃度を上昇させると、組織傷害度を減じさせたが、その細胞内機序を解析すると、Aktリン酸化レベルは増強持続していた。一方CLPマウス脳組織においては、ルシゲニンの化学発光を用いてNADPH oxidaseの酵素活性を測定すると、時間経過とともに増加していた。さらに組織免疫染色法による解析では、脳血管周囲にニトロチロシン陽性像が増加、色素を用いた解析では脳血管透過性が増加していたことから、脳血管内皮細胞の傷害が示唆された。さらに、脳実質の神経細胞についてHE染色による顕微鏡観察を行うと、CLPマウス群において多数の細胞委縮変形像、濃染色像を認め、ラジカルスカベンジャー、エダラボン処置でそれらが減じることから、酸化/ニトロ化ストレス増加によって、脳血液関門はもとより最終的には脳神経細胞が傷害され、敗血症性脳症の発症につながることが示唆された。その一方では、CLPモデル作成からの時間経過とともに血液中のインスリン濃度が上昇してくることから、酸化/ニトロ化ストレス増加はインスリン作用不全に関連することが示唆された。

つまり、敗血症病態においては、その侵害刺激に対応するため各組織においては反射的にインスリンシグナルを増加させる機構が備わっているが、徐々にインスリン作用不全の状態になり、その保護効果が減弱していくことで病態が進行していくものと予想された。
アイドリング状態の脳における情報処理メカニズム

マウスを用いて、「脳海馬の記憶エングラム細胞とノンエングラム細胞のそれぞれを同定しつつ、神経細胞の活動を自由行動下で測定できる新規技術」を確立した。この技術を用いて、学習時・想起時、さらには睡眠中の神経活動をカルシウム動態を指標として計測し、記憶エングラムとなる細胞特有の神経活動パターンを抽出した。得られた大規模な活動データを数理解析し、同期活動したエングラム細胞の集団(セルアンサンブル)を同定した。一つの記憶エングラムは、時間的には少しずつ離れて活動した数多くのセルアンサンブルの集合体であることを見いだした。また、学習時に活動した数多くのサブアンサンブルのうち、引き続く睡眠時に再活動したものが、その記憶の想起時にも優先的に活動することを見いだした。これらの結果は、睡眠中のエングラムサブアンサンブルの再活動が記憶の固定化などの重要な機能を担っていることを強く示唆している。さらに、マウスが複数の情報間の関係を推論する報酬学習課題を開発した。推論が睡眠中に行われているか否かを検討中である。MiLSS/U-FEISを用いて脳活動を計測中に、特定の数個のセルアセンブリ活動を検出し、直ちにトリガー信号を出すクローズドループ光操作系を開発した。大脳皮質の神経回路を単純化したモデルを用いて、自発発火に含まれるセルアセンブリを自動的に学習・検出できることを人工データで検証した。また井ノ口グループが測定した海馬CA3の活動データの数学的手法による解析を開始した。またCA3によるエピソードの時系列学習に関して、最新の実験結果に基づき新しいモデルを提案した。積極的な脳アイドリングである瞑想の動物モデルを確立するため、自由行動下のマウスで呼吸を安定してモニターできる装置を開発した。精神疾患のモデルマウスでは総じて呼吸の異常がみられた。1.アイドリング中の脳内活動:マウスを用い学習時やその後のニューロン活動を超小型内視顕微鏡を用いカルシウム動態を指標として計測した。記憶エングラムとなる細胞が形成するセルアセンブリ活動の推移を数理解析により調べた。学習時に形成された数多くのサブアセンブリは睡眠時にも再活動(リプレイ)していた。リプレイしたセルアセンブリが、その後の記憶想起時に優先的に活動することを見いだし、リプレイが記憶の固定化に重要であることを強く示唆した。また、学習課題を与える前にプレプレイ活動を示したセルアセンブリが優先的に学習後のリプレイや想起時に現れたことから、プレプレイセルアセンブリが記憶エングラムに優先的に取り込まれることが明らかになった。2.技術開発MiLSS/U-FEISを用いて脳活動を計測中に、特定の数個のセルアセンブリ活動を検出し、直ちにトリガー信号を出すクローズドループ光操作系を開発した。3.数理モデル:セルアセンブリの検出が可能なのは、記録した細胞集団がセルアセンブリに参加するニューロンを一定数以上(3040程度)含む場合であることがわかった。この条件はカルシウム蛍光法であれば十分達成可能である。CA3の神経回路は、従来考えられているアトラクター記憶とは様相を異にする活動パターンを示すことがわかってきた。またモデルはアトラクター間の時間的な相関の長さが、複数の抑制メカニズムでかなり広範囲に調節される可能性を示唆した。4.瞑想モデル:自由行動下のマウスで呼吸を安定してモニターできる装置を開発し、呼吸の特性を計測した。さらに呼吸の速度情報をフィードバックするシステムを開発し、呼吸速度を変更させる訓練を試みている。アイドリング中の脳神経活動が行っている機能を明らかにするために、それに適したマウスの学習課題の開発をさらに進める。特にアイドリング中に行っていると思われる脳機能として、「選択的固定化」、「選択的忘却」、「推論」、「情報の統合」、「意思決定」、「共通性抽出」などを取り上げ、それぞれの脳機能を独自に判定できる学習課題の開発を進める。確立できた個々の学習課題を用いて、アイドリング脳がそれぞれの機能を果たしているか否かを検討する。さらに、超小型内視顕微鏡を用いカルシウム動態を指標として、上記課題を遂行前後のアイドリング中の脳神経活動を計測し数理解析を行う。また、セルアセンブリのアイドリング中プレプレイ活動を指標として、記憶エングラムの生成原理を探る。MiLSS/U-FEISを用いて脳活動を計測中に、特定の数十個程度のセルアセンブリ活動を検出できる系を開発し、実用に供することができるように技術開発を進める。CA3の記録データの解析をさらに進め、モデルの予言との整合性を検証する。また同時に発火率ニューロンを用いる現在の回路モデルをスパイクニューロンのモデルに拡張する。またセル・アセンブリ検出に用いた大脳皮質回路モデルを、領野間の情報連絡を記述できるような階層的計算モデルに拡張する。昨年度までに開発したマウスの呼吸速度情報をフィードバックさせるシステムを用いて野生型マウスの呼吸の操作を試み、呼吸の速度を調節させるパラダイムを開発する。平行して、各種環境による呼吸速度の変化の検討や、各種の疾患モデルマウスの呼吸特性についても検討を行う。