hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質社会の研究の成果取りまとめ

公募班員を加えて2年目となり,順調に研究が進行している。本特定領域研究の公式ホームページ(http://protein.k.u-tokyo.ac.jp/index.html)においては,最新の成果をわかりやすく紹介するページを設け,情報発信を行っている。21年度には12のインパクトの大きい研究成果を紹介した。10月2日に中間ヒアリングが行われ,A(現行のまま推進すればよい)との評価結果をいただいた。大学院生,若手研究者の研究交流のために,20年度に引き続き,第二回の若手ワークショップを9月28-29日に京都で開催した。約50名が参加し。若手のみのワークショップであったにもかかわらず,極めてレベルの高い研究成果発表と,活発な討論が行われた。続いて11月12-14日に伊賀で全体班会議を行った。約140名が参加して,活発な研究成果報告が行われた。若手研究者のポスター発表と討論も活発で,優秀発表者にはポスター賞を授与した。分野全体の活性化と情報交換,若手育成という,特定領域研究の重要な使命が果たされていることを実感できた。この全体班会議時に評価班員と本特定領域研究担当の調査官(井関氏)を加えた総括班会議を行った。今後の特定領域研究の運営について打ち合わせると共に,特に22年度の国際会議の内容について検討した。本特定領域研究に関わる情報交換と情報発信,成果公開等を目的とする領域ニュースレターの第4号と第5号を発行した。編集者は田口英樹,発行人は遠藤が担当した。公募班員を加えて3年目となり,順調に研究が進行している。本特定領域研究の公式ホームページ(http://protein.k.u-tokyo,ac.jp/index.html)においては,最新の成果をわかりやすく紹介するページを設け,情報発信を行っている。大学院生,若手研究者の研究交流のために,21年度に引き続き,第3回若手ワークショップを7月1-3日に福岡で開催した。57が参加し,若手のみのワークショップであったにもかかわらず,極めてレベルの高い研究成果発表と,活発な討論が行われた。続いて9月13-16日に奈良で本特定領域主催の国際シンポジウム「The 3rd International Symposium on Protein Community」を開催した。海外から19名を招待し,講演47演題,ポスター発表137演題,参加者総数270名の大規模な国際会議となった。学生,ポスドクの発表を対象とするポスター賞の選考が行われ,大賞と優秀賞が選ばれた。わが国の学生・若手研究者と欧米の超一流の研究者との間で熱い議論が交わされ,本研究集会の重要な目的の一つである,世代を超えた理想的な交流が行われた。
歯周病理細菌に対する患者血清中抗体の性状および機能に関する研究

Actinobacillus actinomycetemcomitansの血清型bの菌株に対して高い抗体価を示す患者血清群には,血清型b野菌株のみに対して高い抗体価を示す血清と3つの異なる血清型の菌株すべてに対して高い抗体価を示す血清が存在することがこれまでの研究により明らかになった。今回の研究では,各々のグループの血清から血清型b抗原に対する抗体とリポ多糖に対する抗体をそれぞれ精製しIgGサブクラスの分布を調べる予定であった。しかし,保存している患者血清の容量はいずれも分析用には十分であったがIgG2画分を精製し分析するにはあまりにも少量であったでの,これまでに過去に高い血清抗体価を示した患者から新たに採血して被検血清を得るに至った。得られた血清はいずれも血清型bの菌株のみに対して高い抗体価を示す血清であったので,血清型b抗原に対するIgG2抗体画分を精製,分析し以下のような結論を得た。1.血清中のIgG2量は正常値の範囲でIgG1に次いで多かった。3.血清型b抗原に対するIgG2抗体は血清中総IgG2量の約1%であった。4.血清型b抗原に対するIgG2抗体画分中ではカッパ鎖がラムダ鎖に比べてわずかに多かった。5.精製した抗体について補体活性化を指標とした抗体の機能も検討する予定であったが,精製できた抗体量が少なく,予備実験において行った補体活性化実験系の確立が失敗したことなどから今回の研究ではその結果は得られなかった。
IgA 腎症における補体、特に MBL の関与の検討

IgA腎症における補体の関与を検討するために、IgA腎症自然発症モデルマウス"grouped ddY mouse (gddY)"における補体経路の関与を検討した。その結果、gddYでは血中多量体IgAおよびIgA-IgG免疫複合体が、補体活性化を介して腎障害の程度を規定していると考えられた。さらにgddYでは糖鎖不全IgAが、Balb/cマウス(Balb/c)よりも多く、IgAの糖鎖不全の程度が血中多量体IgAおよびIgA-IgG免疫複合体の形成に関係していると考えられた。以上より糖鎖不全IgAが血清中の多量体IgAおよび免疫複合体の形成に関与し、補体系を活性化し組織障害を惹起していると考えられた。IgA腎症は、メサンギウム領域にIgAと補体C3の沈着を認める。補体系のIgA腎症の発症・進展における病的意義については、いまだ明確ではない。いくつかの報告はされており、例えば、IgA腎症患者ではLectin Pathwayの鍵を握る分子であるMannose-Binding-Lectin (MBL)のメサンギウム領域への沈着が報告されている(J Am Soc Nephrol. 2006、Nephrol Dial Transplant. 1998)。しかしながら、IgA腎症の発症・進展に関してどの補体経路がより重要なのかは全く不明である。このことを明らかにし、さらにIgA腎症の発症リスク、予後との関連を検討することは、将来的にIgA腎症患者の補体成分の測定から診断、重症度の予測や治療応用を考えるうえで非常に重要である。基礎実験として我々が最近樹立したIgA腎症自然発症モデルマウス"grouped ddY mouse (gddY)"(J Am Soc Nephrol. 2005)における補体経路の関与を詳細に検討した。腎臓における各種補体成分の免疫染色を行った結果、このマウスではIgA・IgG2aがメサンギウム領域に共染色され、さらにMBL-A、-C、C4、C3およびMACも同様にメサンギウム領域に染色された。このことは、gddYでもヒトIgA腎症と同様に少なくともLectin Pathwayが活性化されていることを示唆している。さらに、gddYではClqも染色されているため、Classical Pathwayも同様に活性化している可能性が考えられた。血中多量体IgAおよびIgA-IgG免疫複合体の上昇を認め、これらによる両経路の活性化が腎障害の程度を着てしている可能性が考えられた。昨年度は基礎実験として、我々が最近樹立したIgA腎症自然発症モデルマウス"grouped ddY mouse(gddY)" (J Am Soc Nephrol.2005)における補体経路の関与を詳細に検討した。その結果、gddYでは血中多量体IgAおよびIgA-IgG免疫複合体が、補体活性化を介して腎障害の程度を規定している可能性が考えられた。IgAの多量体化および免疫複合体形成にはIgAの糖鎖不全が重要であると考え、本年度はIgAの糖鎖不全をより詳細にレクチンELISA(J Immunol.1997)を用いて測定した。対照として、gddYマウスと同様にcommercial ddYマウスから樹立された、IgA腎症自然発症モデルであり、高血清IgAではあるが腎症はgddYほど重症ではないHIGAマウスおよび、同じTh2型であるBalb/cマウスと比較したところ、gddYでは糖鎖不全の程度が大きかった。このことより、糖鎖不全の程度が血中多量体IgAおよびIgA-IgG免疫複合体の形成に関係していると考えられた。ヒトIgA腎症でも糖鎖不全IgAが血中に存在し、糸球体に沈着していることが確認されているため、今回の実験と類似の機序で血清中に多量体IgAおよび免疫複合体が形成され、補体系を活性化し組織障害を惹起していると考えられる。この結果を踏まえ、さらに本年度は、MBLノックアウトマウスにgddYの骨髄を移植することによりlectin pathwayのIgA腎症における役割を解明することを目的に実験を行った。まず、MBLノックアウトマウスを購入し、繁殖を行おうとしたが、購入したマウスが微生物に感染している疑いがあったため、微生物検査にて陰性を確認したのち繁殖を開始した。また、Genotypingを行い、実際にMBLがノックアウトされていることを確認し現在繁殖中である。次に本年度は、昨年度繁殖したマウスに対し骨髄移植を行う前段階として、コントロールであるWild TypeC57Bl/6に対してgddYの骨髄移植を行い、骨髄が置換されていることを確認する作業を行った。

方法としては、骨髄移植は、我々が従来から行っているプロトコル(Kidney Int. 2007)を用いた。骨髄が置換されていることの確認は、末梢血、脾臓および骨髄細胞を用いて、FACSにてC57Bl/6マウスのMHC-ClassII抗原のH2-Db陽性細胞が、gddYの細胞に置き換わり消失しているかどうかを確認した。結果としては、従来のプロトコルでは骨髄が置換されていなかった。原因として今まで我々が移植レシピエントとして使用していたマウスはBalb/cマウスであり、今回使用したマウスとは系統が違うため、放射線感受性の違いによるレシピエントの骨髄破壊が不十分であった可能性が考えられた。そのため、様々な線量をマウスに照射したところ、C57BlマウスはBalb/cマウスと比較し放射線感受性が低いことが判明した。この結果を受け、再度骨髄移植を行ったところ、レシピエントの骨髄はgddYの骨髄に置換されていることが確認できた。骨髄移植を確実に行える方法が確立したので、実際にMBLノックアウトマウスを用いgddYの骨髄を移植して、現在、移植後の経過を観察している。購入した、B6.129S4-Mb11^<tm1Kata> Mb12^<tm1Kata>/Jマウスが微生物に感染している疑いがあったため、すぐに当施設では繁殖が行えず、クリーニングを行ったため時間がかかった。最終的には微生物検査にて陰性を確認できたので繁殖を開始した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、コントロールであるWild TypeC57B1/6に対して実際に骨髄移植を行い、骨髄が置換されていることを末梢血および脾臓、骨髄細胞を用いて確認する。方法は、FACSにてC57B1/6マウスのMHC-Class II抗原のH2-D^b陽性細胞が、gddYの細胞に置き換わることにより消失していることを確認する。骨髄移植が確実に行えることを確認したのち、実際にMBLノックアウトマウスを用いgddYの骨髄を移植して、その表現型を解析することによりIgA腎症における補体レクチン経路の役割を調べる。
食道扁平上皮癌に対する変異p53機能回復薬の治療効果およびメカニズムの検討

食道扁平上皮癌では癌抑制遺伝子p53の変異頻度が極めて高く,p53変異の有無は腫瘍の悪性度および予後不良因子と言われている.今回,変異p53の機能回復により腫瘍増殖を抑制する変異p53機能回復薬に着目し,食道扁平上皮癌に対する有効性およびメカニズムについて検証した.食道扁平上皮癌細胞株パネル11株におけるp53の変異statusをsanger sequence法にて同定し,p53機能回復薬PRIMA-1単独投与において細胞増殖解析(MTT assay),Apoptosis assayを行い抗腫瘍効果について検討した.PRIMA-1投与で,p53 missence変異株において抗腫瘍効果を示し,Apoptosisが誘導された.またmRNAレベルでp53下流遺伝子の転写活性化を認め,蛋白レベルでNOXAの発現が上昇し,NOXAを介したApoptosis誘導が示唆された.NOXAのノックダウン実験から,PRIMA-1は主にNOXAを介したApoptosisを誘導することを明らかにした.一方,p53野生株およびp53 nonsense, frameshift株では,Apoptosisは誘導されず抗腫瘍効果も乏しく,PRIMA-1の治療効果は認められなかった.食道扁平上皮癌missense変異細胞株のXenograft mouseにおいて,control群と比較してPRIMA-1投与群で有意な腫瘍増殖抑制が認められ,p53下流遺伝子の発現においてもin vitroを反映した結果を得られた.研究者の異動に伴い本研究は終了となる。
金属錯体を用いた高選択的不斉反応系の開発

2年間の研究により次の様な成果を得た.1.デヒドロオリゴペプチドの不斉水素化:Y-ΔPhe-(SorR)-AA-OH型デヒドロジペプチドの不斉水素化において分子内にアミノ基を持ち基質のカルボキシル基との静電的相互作用が可能なジホスフィンDPP-AEを開発し,そのRh触媒を用いてアミノ保護基Yの種類によらず1,4-不斉誘導により8496%d.e.の高い不斉収率を達成した.反応条件を詳細に検討し,配位子のアミノ基と基質カルボキシル基間の静電的相互作用が触媒の多点認識を可能とし高立体選択性をもたらす事を示した.本反応系は溶媒依存性が強く,極性の大きなアルコール中で高い選択性が得られる.DPP-AEに電子供与性基を導入すると基質特異性が強くなり,更に特異な温度依存性を示す様になることを明らかにした.2.環状アリル化合物の不斉アルキル化:Pd-ジホスフィナイト(POP)を中心に検討を行い, POP系がジホスフィン系よりも高いエナンチオ選択性を示す事を明らかにした.配位子の電子的・立体的要因を変えるため修飾を行い,リンについたフェニル基のm-位にメトキシル基を導入することや2ケのジホスフィノオキシ基を非対称化することによりエナンチオ場選択性が向上することを明らかにした.本反応系では求核試薬の構造も重要であり,アシルアミノ基を有するカルバニオンを用いて50%e.e.までエナンチオ場選択性が向上することを見出した.更にアルコール溶媒が高選択性を得るのに有効という興味ある事実を見出した.3.イミン化合物の不斉求核付加:種々のCo-アミノ酸錯体をキラルなイミノ酸錯体に誘導する手法を検討し,脱水素反応, β-脱離反応等構造に対応しての合成法を確立した. X線構造解析によりイミノ酸錯体がΛ-β_2配座を取り,イミノ酸キレート環が平面であることを明らかにした.キラルなイミノ酸錯体への求核付加としてNaBH_4による還元を行い,光学活性アミノ酸錯体が得られる事を示した.2年間の研究により次の様な成果を得た.1.デヒドロオリゴペプチドの不斉水素化:Y-ΔPhe-(SorR)-AA-OH型デヒドロジペプチドの不斉水素化において分子内にアミノ基を持ち基質のカルボキシル基との静電的相互作用が可能なジホスフィンDPP-AEを開発し,そのRh触媒を用いてアミノ保護基Yの種類によらず1,4-不斉誘導により8496%d.e.の高い不斉収率を達成した.反応条件を詳細に検討し,配位子のアミノ基と基質カルボキシル基間の静電的相互作用が触媒の多点認識を可能とし高立体選択性をもたらす事を示した.本反応系は溶媒依存性が強く,極性の大きなアルコール中で高い選択性が得られる.DPP-AEに電子供与性基を導入すると基質特異性が強くなり,更に特異な温度依存性を示す様になることを明らかにした.2.環状アリル化合物の不斉アルキル化:Pd-ジホスフィナイト(POP)を中心に検討を行い, POP系がジホスフィン系よりも高いエナンチオ選択性を示す事を明らかにした.配位子の電子的・立体的要因を変えるため修飾を行い,リンについたフェニル基のm-位にメトキシル基を導入することや2ケのジホスフィノオキシ基を非対称化することによりエナンチオ場選択性が向上することを明らかにした.本反応系では求核試薬の構造も重要であり,アシルアミノ基を有するカルバニオンを用いて50%e.e.までエナンチオ場選択性が向上することを見出した.更にアルコール溶媒が高選択性を得るのに有効という興味ある事実を見出した.3.イミン化合物の不斉求核付加:種々のCo-アミノ酸錯体をキラルなイミノ酸錯体に誘導する手法を検討し,脱水素反応, β-脱離反応等構造に対応しての合成法を確立した. X線構造解析によりイミノ酸錯体がΛ-β_2配座を取り,イミノ酸キレート環が平面であることを明らかにした.キラルなイミノ酸錯体への求核付加としてNaBH_4による還元を行い,光学活性アミノ酸錯体が得られる事を示した.本研究において得られた成果をテーマ毎に述べる。1.デヒドロオリゴペプチドの不斉水素化Y-△AA-(SorR)-AA-OH型デヒドロジペプチドの不斉水素化において、分子内にアミノ基を持ち基質のカルボキシル基との静電的相互作用が可能なジホスフィンを配位子とするRh触媒は保護基Y(Y=ZorAc)の種類によらず効率よい1,4-不斉誘導により90%以上の高い不斉収率を与えた。脱保護の容易なZ基を持つ基質について条件を検討し基質の取り込みおよび不斉誘導に対し静電的相互作用が重要な役割を果たす事を明らかにした。配位子の修飾を行ない、リン上フェニル基へ電子供与性基を導入した配位子および分子内の立体反撥により配位子内のアミノ基が基質カルボキシル基の方と向きやすい様にした配位子を合成した。次年度これらの配位子を用いてさらにデヒドロジペプチド及びトリペプチドの反応を行なう。2.環状アリル化合物の不斉アルキル化

Rd-ジホスフィナイト系による本反応において、配位子の2ケのジホスフィノキシ基の非対称化(【(4-CH_3OC_6H_4)_2】PO-基と【Ph_2】PO-基)によりシクロヘキセニルアセテートの反応でエナンチオ場選択性を向上させる事、より環の小さいシクロペンテニルアセテート系ではホスフィノキシ基とホスファミド基を持つ非対称配位子が有効である事が判った。リンについたフェニル基のm-位にメトキシル基を導入すると配位子の立体規制が強まりエナンチオ場選択性が大きく向上する事を明らかにした。3.イミンへの不斉求核付加種々のCo-アミノ酸錯体から効率良くキラルなイミノカルボン酸錯体を得る方法としてβ-脱離及び脱水素を検討した。β-ハロアミノ酸又はβ-ヒドロキシアミノ酸錯体からほぼ定量的にイミノカルボン酸錯体をβ-脱離による得る条件を見出した。X線構造解析によってイミノカルボン酸錯体の構造を明らかにし、次年度行われる求核付加のための重要な知見を得た。
ｍｉｃｒｏＲＮＡを高効率に発現するＶＡ欠失型アデノウイルスベクターの開発

本研究ではアデノウイルスベクター(AdVs)を用いた高効率small RNA発現系の開発を行った。AdVsはvirus-associated RNA (VA)というRNAを発現しているためsmall RNA効果を減弱する可能性があるがVA欠失AdVsの作製は困難であった。我々は高効率VA欠失AdV作製に成功しsmall RNAを発現した結果、VA欠失することで効果が増大した。本研究により従来のAdVsから微量に発現しているVAはsmall RNAの効果を減弱することが初めて示され、より効率的なsmallRNA発現系として本系は有用性が高いと考えられる。microRNA(miRNA)は近年がん疾患のマーカーや治療のターゲットとして注目されている。miRNAの機能解析においてはRNAを細胞へ直接導入する方法が簡便であるが、本研究ではより低コストかつ定量的な方法としてアデノウイルスベクター(AdVs)を用いた高効率small RNA発現系の開発を行った。AdVsは多種多様な細胞へ高効率に遺伝子導入が可能であるためmiRNAやshort hairpin RNA (shRNA)などsmall RNAの発現システムとしても汎用されている。しかしAdVsはvirus-associated RNA (VA)というウイルス由来のsmall RNAを常に発現しており、VAはmiRNAやshRNAと同じ細胞内RNAi機構を介してプロセスされるため目的miRNAのmaturationを競合拮抗する可能性がある。ところがVA欠失AdVsの作製は世界的に困難であったため今まで検証されていなかった。申請者はVA高発現細胞株を樹立し、VAをtransに供給することでVA欠失AdVsの作製に成功したが目的遺伝子によっては作製が困難であったため、部位特異的組換え酵素を用いたより効率的な作製法を確立した(Maekawa et al., Sci. Rep., 2013)。そこでVA欠失AdVsの有用性を検討するため、shRNAを発現するVA欠失AdVsを作製しshRNAの効果を比較した結果、VA欠失AdVsは従来のAdVsのおよそ1/5量で同じshRNA効果が得られることを確認した(Pei et al., Sci. Rep., 2013)。これは大量のAdVsが必要な動物実験において非常に有用性が高いだけでなく、全ての実験においてAdVs感染による影響を最小限にするためにも意義があると考える。本研究により従来のAdVsから微量に発現しているVAによりshRNAの効果が減弱する可能性が初めて示されたことから、VA欠失AdVsは今後のsmall RNA研究をより効率的に行うために非常に有用性が高いと考えられる。microRNA (miRNA)はsmallnon-cording RNAで、動物細胞における全タンパク質の約30%の発現制御に関わっているとされており、基礎研究のみならずがん疾患のマーカーや治療のターゲットとしても注目されている。miRNAの機能解析においてはRNAを細胞へ直接遺伝子導入する方法が簡便であるが、本研究ではより低コストで定量的な方法としてアデノウイルスベクター(AdV)によりmiRNAをはじめとするsmall non-coding RNAの高効率発現系を確立することが最終目的である。AdVは様々な細胞種へ高効率に遺伝子導入が可能であるが、実はウイルスがコードしているsmall RNAであるVA RNAs (VA)は発現しており、近年VAがmiRNAとして機能していることも明らかとなった。そのためAdVを用いてmiRNAを発現するとVAにより本来のmiRNA機能がかく乱される可能性が高いと考え、VA欠失AdVの作製を進めている。VA欠失AdVの力価は極めて低く従来法での作製は困難であり、VAをtransに供給する必要があるため、既にVA発現細胞株の樹立化を行っており、平成24年度はまず複数樹立化した細胞株の評価を行った。VAに特異的なqPCR用primerの設計に成功したため、各々の細胞株のVA発現量を測定した結果、VAを非常に高度に発現する細胞株の作製は困難であることが明らかになった。これはVAが細胞へ何らかの影響を及ぼしているためと考えられたが、VA発現量が多い細胞株を用いることで、従来のVA保持型AdVと比較して生成効率は劣るものの、VA欠失AdV作製に成功した。また、目的遺伝子発現量は従来のAdVと変わらず高発現していたことからVA欠失が遺伝子発現に影響を与えないことが確認されたため、今後はVA欠失AdVにmiRNA発現単位を挿入していく。平成24年度はVA欠失アデノウイルスベクター(AdV)作製に必要な細胞株の検討を行うために2種類のVA RNA (VAI, VAII)に特異的なreal-time PCR用primer/probeの作製に成功したため、予定通り細胞株の解析を終了した。その過程で、VAの高発現細胞株の樹立が困難であることを見いだしたが、得られた細胞株のうちVA発現量の高い細胞株を用いることでVA欠失AdV作製に成功した。

また、作製した複数のVA欠失AdVを用いた発現解析を行った結果、VA欠失AdVの目的遺伝子発現量は従来型と同等であることを確認していることから、VAを欠失しても発現への影響は無く、AdVとして十分に機能すると考えられた。現在はmiRNA発現AdV作製用コスミドDNAの構築を進めている。以上より、本研究は予定していた通りおおむね順調に進展していると考える。現在までにVA RNA (VA)欠失アデノウイルスベクター(AdV)の作製に成功しているため、今後はVA欠失microRNA (miRNA)発現AdVを複数作製し、従来型AdVと細胞内での目的miRNA発現量の比較、定量を行っていく。また、導入ベクター量とmiRNA量の定量的解析、発現miRNAによる遺伝子制御を比較定量することで、本研究で作製したVA欠失AdVがmiRNA発現に優れているかの評価を進めていく。平成25年度の解析はmiRNA量を測定するためのqPCR用試薬やDNA/RNA抽出キットが必要である。VA欠失AdVの作製には一般的な遺伝子工学用試薬、プラスチック製品及び細胞培養用試薬が必要である。また、in vivoでのmiRNA発現VA欠失ベクター評価のためのマウスの購入も予定している。更に本研究の成果を学会等で発表するための旅費も必要である。
ＥＳ細胞における未分化状態の動的制御機構の解析

胚性幹細胞(ES細胞)における未分化維持機構の解明は、再生医療や細胞医薬に関する最重要課題の一つである。本研究は、マウスES細胞のOct3/4, Sox2, Cdx2, Nanogの4遺伝子に着目し、その発現動態のリアルタイム単一生細胞解析を目的として実施した。各遺伝子の発現制御ベクター、遺伝子産物タンパク質、発現可視化細胞等を開発した。ベクターやタンパク質をフェムトインジェクション法で単一ES細胞に導入後、タイムラプス・イメージング等によって、例えばNanogとCdx2の発現の関係、Oct3/4タンパク質量とOct3/4遺伝子の発現の関係、等の結果を得た。ES細胞を利用した技術に対する期待が高まるなか、ES細胞の性質の一層深い理解が求められている。本研究は、未分化性関連遺伝子群は、個々の遺伝子の発現レベルは絶えず変動しつつも、全体では準安定状態にある、という仮説を提唱し、それを検証するために、フェムトインジェクションを利用した単一ES細胞の動的解析プラットフォームを確立することを目的としている。初年度は、蛍光シグナルを指標とする単一ES細胞実験において、各遺伝子発現の動的解析のためのプラットフォームを確立するために、以下の課題を実施した。(1)EGFPとDsRedのES細胞内における蛍光レポータータンパクとしての定量性の検証:タンパク質としてのEGFPとDsRedを生合成で作成しES細胞内に導入し72h連続測定した。その結果、EGFP蛍光の半減期は23hであったが、DsRedでは12hまで蛍光強度を保持する場合もあった。EGFPは予想より代謝が速いことが分かった。(2)ES細胞内での蛍光シグナルの時空間変動の解析法の確立:人為的に細胞質から核への移動を促進させるような工夫をすることによって、蛍光タンパクが細胞内で時空間的に変動する様子、すなわち細胞質から核への移行が促進される様子を動画でとらえることができ、定量的議論ができる見通しが得られた。(3)遺伝子発現制御因子の中で特にタンパクの生合成・精製方法の最適化:既に予備的に検証していたOct3/4について、生成功率、純度に及ぼす因子についての基礎情報を得た。すなわち、可溶画分と不溶画分の処理条件の比較、GSTタグとHisタグの比較、8M Ureaでの変性処理、などである。(4)単一細胞蛍光強度変化を高精度に連続計測するための3次元細胞座標追尾システムの開発:ES細胞の位置を3次元座標として登録することによって、細胞ごとに焦点位置の異なる場合でも、複数の単一細胞の蛍光画像を高精度に連続計測できるようにロボットの改良を行い、所期の性能が得られるようになった。(1)ES細胞内の標的遺伝子として選択した4遺伝子の内、Oct3/4, Sox2の遺伝子産物であるタンパク質を合成した。Oct3/4タンパク質はOct3/4自身の転写因子の一つでもあるため、Oct3/4プロモーター活性に対する効果を調べた。すなわち元々Oct3/4を発現していない細胞株MIN6にOct3/4プロモーター活性可視化ベクター(pP-Oct3/4-EGFP)と共にOct3/4タンパク質をフェムトインジェクションで同時導入したところ蛍光が観察された。一方、元々Oct3/4を十分発現しているES細胞に導入した場合は、予想に反して蛍光強度が低下した。これは転写因子結合サイトを共有する他の因子、例えばSox2タンパク質の結合を、高濃度のOct3/4タンパク質が阻害した結果、全体でのOct3/4発現活性が低下したのではないかと推定した。Sox2タンパク質に関しては、合成タンパク質を精製し、結合サイトを有するDNAフラグメントとの結合活性をゲルシフトアッセイで確認し、細胞内での転写活性を調べる準備が整った。Nanog、及びCdx2に関してはタンパク質合成には至っていない。(2)4種の遺伝子の発現増強ベクター、4種の遺伝子の発現抑制ベクター、4種の遺伝子のプロモーター活性可視化ベクター、を前年度より継続して作製した。(3)4種の標的遺伝子のプロモーター活性を可視化した細胞株、4種の標的遺伝子の発現に伴って標的タンパクと可視化タンパクが同時に生成する細胞株を作製した。前者に関してはCre-loxP相同組換えにより作製したところOct3/4、Sox2、Nanogについては作製できたが、Cdx2については作製には至らなかった。(4)遺伝子発現レベルを制御するベクター、因子、タンパク質などのメニューを揃え、フェムトインジクションを利用した動的解析の準備を8割程度整えた。(1)外来タンパク質の細胞内寿命の再調査:制御因子として直接導入するタンパク質が、細胞内で安定に存在する時間を推定するために、EGFPおよびDsRedを例に、その蛍光寿命を調べた。既に初年度に得た結果は変動が大きかったので、今年度再調査した。その結果、EGFP、DsRedの蛍光強度は、ES細胞内で各々半減期24 h、13 hで減衰することが分かった。

したがって、外来タンパク質は半減期14時間で減衰する場合が多いと推論した。(2)転写因子(Oct3/4、Nanog、Sox2、Cdx2)の発現可視化ベクターの作製:既にOct3/4発現可視化ベクター(p-proOct3/4-EGFP)を作製しているが、新たにVenusをレポーターとする可視化ベクターを作製することとした。骨格ベクターとしてpCS2-Venusを用い、これに元々入っているCMVプロモーターを各転写因子のプロモーターとSalI - BamHIサイトで入れ替えることとした。Nanogに対しては、プロモーターが正しく挿入されたベクターp-proNanog-Venusが得られた。しかし、他の転写因子に関してはまだ成功していない。(3)転写因子のタンパク質生合成:最初にOct3/4タンパク質の生合成を行った。Oct3/4遺伝子は自身の産物であるOct3/4タンパク質で発現することが知られているので、作製したタンパク質をp-proOct3/4-EGFPと共にMIN6細胞に導入したところ、わずか1細胞であるが、EGFPの蛍光を発する細胞が得られた。これに対して、p-proOct3/4-EGFPのみを導入した場合は全く蛍光細胞が得られなかった。本研究は、マウスES細胞の未分化維持に関わる主要な転写因子、Oct3/4、Sox2、Cdx2、Nanogに着目し、1転写因子-EGFPの強制発現ベクターの開発、2転写因子に対する発現抑制遺伝子(shRNA)-EGFPの強制発現ベクターの開発、3転写因子タンパク質の開発、4プロモーター活性可視化ベクターの開発、5プロモーター活性可視化細胞株の開発、6開発した細胞株への13の直接導入と、それに伴う、転写因子発現の動的解析、の実施を目的としている。本年度は、昨年度までに十分実施できなかった2、4を実施した。すなわち、2として特にOct3/4に対するshRNAを検討した。4種類の候補配列からコントロールに対して50%以下にノックダウンできる最適配列を選び、これをEGFPと共に組み込んだベクターを作製した。また、4としてはこれまで滞っていたCdx2のプロモーターのクローニングを成功させ、これを導入した細胞株の開発にも成功した。そこで、6としてフェムトインジェクションいより、次の3例を実施した。1の例として、Cdx2-EGFP強制発現ベクターをNanog-Venus細胞へ導入した。51個中、EGFPを発現した細胞は1個のみであったが、その細胞ではVenus蛍光強度は弱く72時間でコロニー形状も不定形の分化した状態になった。2の例では、shOct3/4-EGFP強制発現ベクターをOct3/4-Venus細胞に導入した。導入後、48時間まではVenus蛍光強度が増大したが、その後72時間後までに蛍光強度が急激に減少する事例が観測できた。3の例では、Oct3/4タンパクをOct3/4-Venus細胞に導入した。Venus蛍光強度が、導入後3時間以内に減少することが観察された。高濃度のOct3/4タンパクによるOct3/4遺伝子発現のフィードバック阻害であると推定された。
がん血管新生へのEGF/EGF受容体の関与とその分子制御

受容体型チロシンキナーゼは細胞の増殖、分化の制御において重要な役割を果たしており、ヒト癌の進展にその異常発現は大きく貢献している。特にEGF受容体は癌細胞のみならずヒト微小血管内皮細胞にも発現していることよりEGF受容体チロシンキナーゼ標的薬剤を用いてEGF/TGF-α/EGF受容体の腫瘍血管新生に対する効果を検討した。その結果がんの進展にEGF/TGF-α/EGF受容体誘導の血管新生も一部関与していることを明らかにした。すなわちEGF受容体チロシンキナーゼ標的薬剤は1)EGF受容体を発現している血管内皮細胞に直接作用することによってEGF/TGF-α誘導によるin vitroの増殖、遊走、管腔形成を阻害した。2)in vivoのマウス角膜法を角いてEGF/TGF-α誘導による血管新生を阻害した。なおこの血管新生はVEGF受容体チロシンキナーゼ標的薬剤により部分的にしか阻害されないことより、直接的な阻害作用もあると考えられる。3)癌細胞に作用することによりEGF誘導による血管新生促進因子(VEGF, IL-8)の産生誘導を阻害することを観察した。
学習教授メディアとしての文字言語・音声言語の実証的比較文化的研究

日本の授業では、音声言語とともに、文字言語も頻繁に用いられており、黒板が重要な授業コミュニケーションのツールとなっていた。イタリア、スロベニアでは、文法の授業を除けばアメリカ以上に音声言語のやりとりによる授業展開が多い。アメリカの授業では教師と生徒がほぼ1対1でやりとりをすることがほとんどであるが、イタリアとスロベニアはそれに加えて、教師の発言に対して複数の生徒が同時に反応するというコミュニケーションパタンが多く見られ、教師が質問し生徒がそれに答えるといった枠組みではなく、生徒自身が音声言語で理解の内容を表現する、それを教師が支援するといった枠組みでとらえるのが適切であるとの知見をえた。日本の小学校5-6年生の国語と算数それぞれ2クラス、中学校2年生の国語と数学それぞれ2クラスのビデオ撮影をし、分析を行った。いずれも、音声言語とともに、文字言語も頻繁に用いるという日本の授業の特徴を表しており、本研究の仮説をさらに補強するデータとなった。また、昨年度撮影したイタリアとスロベニアの授業につき、授業中に語られた教師と生徒のイタリア語とスロベニア語を補助員の助けを借りて日本語に翻訳し分析を行った。アメリカの授業でも音声言語中心であったが、それは教師と生徒がほぼ1対1(教師Initiation→生徒response→教師evaluation)でやりとりをするコミュニケーションパタンがほとんどである。しかし、イタリアとスロベニアはそのようなパタンに加えて、教師の発言に対して複数の生徒が同時に反応するというコミュニケーションパタンが多く見られた。今回、授業内容が日本語に翻訳されたことで、そのやりとりの文脈を詳細に把握することができた。イタリア・スロベニアの授業では、教師が質問し生徒がそれに答えるといった枠組みではなく、生徒自身が音声言語で理解の内容を表現する、それを教師が支援するといった枠組みで授業コミュニケーションをとらえるのが適切であるとの知見をえた。本研究は音声言語や文字言語の使用率を定量的に比較することを方法論としているが、その定量的差異を質的差異と関連づけて考察する必要性を再確認できた。日本比較教育学会でイタリアとスロベニアの授業分析(一部)に基づき発表を行った。スロベニアやイタリアの教育の専門家から両国の授業コミュニケーションの特徴につき貴重な助言を得た。イタリアでは、5年生と7年生の合計7コマの授業を観察し、うち、7年生のイタリア語2コマ分、数学2コマ分の授業をビデオ撮影して授業担当者にインタビューを行い、スロベニアでは、1年生、5年生、6年生の合計8コマの授業を観察し、うち、6年生のスロベニア語2コマ分、数学4コマ分の授業をビデオ撮影して授業担当者にインタビューを行った。授業中に語られた教師と生徒のイタリア語・スロベニア語を補助員の助けを借りて日本語に翻訳し分析を行った。アメリカについては、5年生の合計5コマの授業をビデオ撮影して分析した。また、2009年度に撮影した8年生の数学の授業合計4コマのビデオの英語を補助員の助けを借りて日本語に翻訳した。日本では、小学校5-6年生の国語と算数それぞれ4コマ、中学校2年生の国語と数学それぞれ2コマのビデオ撮影し、授業担当者にインタビューを行い、分析を行った。イタリア、スロベニアでは、文法の授業を除けばアメリカ以上に音声言語のやりとりによる授業展開が多いことが観察できた。アメリカの授業では教師と生徒がほぼ1対1でやりとりをするコミュニケーションパタンがほとんどであるが、イタリアとスロベニアはそのようなパタンに加えて、教師の発言に対して複数の生徒が同時に反応するというコミュニケーションパタンが多く見られた。今後は、授業中における文字言語のうち、生徒が使うノートに着目して研究を進めていく計画である。イタリアでは、ミラノのクオコサシ総合制学校において、5年生と7年生の合計7コマの授業を観察し、うち、7年生のイタリア語2コマ分、数学2コマ分の授業をビデオ撮影した。ビデオ撮影をした4コマの担当教員4名にはそれぞれ撮影後に授業についてのインタビューを行った。また、Angelo Salvo校長に対して、授業における音声・文字言語の役割とイタリアの授業文化についてインタビューを行った。スロベニアでは、リュブリアナのタボル小学校において、1年生、5年生、6年生の合計8コマの授業を観察し、うち、6年生のスロベニア語2コマ分、数学4コマ分の授業をビデオ撮影した。ビデオ撮影をした6コマの担当教員6名にはそれぞれ撮影後に授業についてのインタビューを行った。さらに、ビズマルイェ小学校において、スロベニア語1コマ、数学2コマ分の授業見学およびビデオ撮影を行い、ビデオ撮影をした3コマの担当教員3名にそれぞれ撮影後に授業についてのインタビューを行った。日本においても小学校5年生の国語と算数の授業をビデオ撮影し、授業担当者にインタビューを行った。イタリア、スロベニア共に、音声言語のやりとりによる授業展開が多いことが観察できた。

国語の中でも文法の授業では黒板をある程度使うことが見受けられたが、音声による問答も同時に行われていた。詳細な分析は平成24年45月に行うが、その分析結果を踏まえ、6月の日本比較教育学会大会で発表する予定である。イリノイ州におけるビデオ集録を実現することができなかった。イタリア・スロベニアの授業の継続分析は予定通り進んでおり、日本における集録もできた。また、来年度のヴァーモント州でのビデオ集録の目処がついた。イタリア、スロベニアにおいて当初の予定通り授業のビデオ撮影ができ、授業担当教員への面接調査も無事終了した。日本については、小学校5年生の国語と算数についての授業のビデオ撮影ができている。分析結果は6月に行われる日本比較教育学会大会で発表予定である。アメリカンのヴァーモント州で、新たに数学2クラス、国語2クラスの授業をビデオ撮影し、分析を行う。日本、アメリカ、イタリア、スロベニアにおける数学、国語の授業分析につき総合的な考察を行う。総括を行い、日本の音声言語指導に資する知見を見出す。(平成24年度)日本の小学校5年生と中学校2年生のそれぞれ6クラスずつビデオ撮影を行い、授業担当者の聞き取り調査を行う。アメリカのイリノイ州で、6クラスの国語の授業のビデオ撮影を行い、聞き取り調査を行う。ビデオ分析、聞き取り調査についても平成23年度と同様に分析を行う。6月に行われる日本比較教育学会大会で平成23年度分の調査分析の成果を報告する。(平成25年度)アメリカのヴァーモント州で、6クラスずつの国語の授業のビデオ撮影を行い、聞き取り調査を行う。4か国のビデオ分析と聞き取り調査を踏まえ、学習教授メディアとしての文字言語・音声言語からみた日本の教育文化の特質を明らかにする。また、音声言語を中心とした授業展開が日常化している3国の教員への聞き取り調査から、日本の音声言語指導に資する知見を見出す。以上で得られた知見をもとに、日本比較教育学会等で研究発表するとともに、成果をインターネットで公開する。ビデオ撮影された授業につき、授業中に語られた教師と生徒の英語を日本語に翻訳する際、補助員に手伝ってもらう。アメリカのイリノイ州に出向いてビデオ撮影を行う。報告集を刊行する。発表用・授業分析用のプロジェクタを平成23年度に購入する予定であったが、残高が購入金額に満たない可能性があっため、残高を平成24年度に繰り越し、平成24年4月上旬に該当機器を購入する。購入時期が1か月遅れることになるが研究計画には支障がない。
転写因子制御による遺伝子放射線治療

研究の目的:癌細胞は複数の分子にまたがる変異の蓄積によって悪性度を獲得していることが多い。NF-κB,STAT1,Ets1などいくつかの転写因子は,癌細胞において免疫応答・抗アポトーシス・細胞増殖に関与するタンパク質群を制御し,結果として癌細胞を治療抵抗性に導いている。本研究では,癌細胞の治療抵抗性に関わる転写因子群を同定することを目的とする。研究の内容:放射線抵抗性の癌細胞モデルとして膠芽腫・前立腺癌・膵癌などを使用し,対照として同じ臓器由来の放射線感受性の癌細胞を用いて実験を進めた。転写因子アレイによって放射線照射前後における転写因子発現の網羅的解析を行ったが,細胞間での違いが多く有意な因子を見い出すことが困難であった。同じ臓器からの癌腫であっても,多様なバックグラウンドを有することがその原因と考えられた。研究期間中に癌幹細胞に関する報告が相次ぎ,中でも癌幹細胞は放射線抵抗性を示すことが示唆された。本件研究にても同一の癌細胞株を用いた幹細胞(放射線抵抗性)と非幹細胞(放射線感受性)との比較は有用性が高いと考え,研究に適した癌幹細胞の樹立を行うことを目標とし,解析を行っている。研究の意義:様々なたんぱく質群を制御している転写因子は,癌細胞の生死の方向を定めるいわば司令塔の役割を担っていると考えられている。鍵となる転写因子を同定・制御することで,従来とは異なったメカニズムの癌治療開発に繋がることが期待される。癌細胞は複数の分子にまたがる変異の蓄積によって悪性度を獲得していることが多い。なかでも転写因子は、癌細胞において免疫応答・抗アポトーシス・細胞増殖に関与するタンパク質群を制御し、結果として癌細胞を治療抵抗性に導いており、癌細胞の生死の方向を定めていると考えられている。本研究では、癌細胞の転写因子群を遺伝子治療技術を用いて制御し、放射線抵抗性癌の克服に繋げることを全体構想として開始した。放射線抵抗癌モデルの樹立脳神経膠芽腫・前立腺癌・骨軟部腫瘍など種々の癌細胞株を対象に2-10Gyの放射線照射を行い、コロニーフォーメーションアッセイとMTTアッセイにより放射線感受性を調べた。この結果、同じ前立腺癌の細胞株であるPC3とLNCaPをそれぞれ放射線抵抗性と放射線感受性のモデルとして使用することとした。癌幹細胞株の樹立研究期間中に癌幹細胞に関する報告が相次ぎ、中でも癌幹細胞は放射線抵抗性を示すことが示唆された。本件研究にても同一の癌細胞株を用いた幹細胞(放射線抵抗性)と非幹細胞(放射線感受性)との比較は有用性が高いと判断し、乳癌細胞を用いCD44+CD24-幹細胞の樹立を行うこととした。放射線抵抗性に関わる転写因子群の同定上記により樹立された放射線抵抗性/感受性の細胞株を使い、転写因子アレイによって放射線照射前後における転写因子発現の網羅的解析を順次、行っている。この作業により放射線抵抗性に関わる、1つまたは複数の転写因子を同定していく。
シリンギルリグニン生成に関与するペルオキシダーゼのcDNAクローニング

ポプラ若枝の形成層を含む細胞をTris-HCl緩衝液(50mM,pH7.5)と共にホモジナイズし、可溶性ペルオキシダーゼ画分(SPO)を抽出した後の細胞壁残渣からNaClおよびCaCl_2の濃度を変えて細胞壁にイオン的に結合したペルオキシダーゼ画分(IPO)の抽出を行った結果、0.6 M NaClを用いた場合が最も抽出効率が高く、酵素活性が長期間安定であることが明らかとなった。IPO画分からシリンギル核に特異性が高いペルオキシダーゼを単離する目的で、イオン交換クロマトグラフィーを行ったが、目的とするペルオキシダーゼは希薄な塩溶液中ではきわめて不安定であり、イオン交換クロマトグラフィーによる分画は不可能の判断した。また疎水クロマトグラフィーでは、酵素活性が安定に保持できる塩濃度では吸着が起こらないことから、目的アイソザイムは疎水性が低く、大きな糖鎖を有していることが予想された。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分取したIPO画分の主要ペルオキシダーゼはSPO画分と比べてシナピルアルコール高い特異性を示し、その分子量は約38,000と推定された。しかしながら完全な精製にはいたらなかったため、cDNAスクリーングのための抗体作成には用いることはできなかった。この画分のNativeアニオンPAGEを行った結果、全く泳動されなかったことから、シナピルアルコールに特異性の高いペルオキシダーゼはカチオン性と予想された。一方、ポプラカルスを用いてmRNAの抽出、cDNAの合成、ベクターへのライゲーション、ホストセルへの導入等の条件を詳細に検討し、最適条件を用いてcDNAライブラリー作成し、一次スクリーニングを行った。現在、樹木ペルオキシダーゼのcDNAライブラリー作成と、ポプラカルスより単離したシリンギル核特異的ペルオキシダーゼのシークエンスを元に合成プローブを作成しスクリーニングを進めている。
平面状および球面状の金属基盤上に真空蒸着した異種金属薄膜の結晶学

2年間にわたって実験的、理論的研究を行い、下記のような成果をあげることができた。1.補助金の設備・備品費により、改良型の真空蒸着装置を作製し、従来より高真空の、清浄な環境下での蒸着が可能となった。2.銅と鉄の一方を平面状の基盤、他方を蒸着金属として用いた研究によって、次のことが明らかとなった。(1)基盤面方位が低指数面のときは、Kuradjumov-Sachs(K-S)関係などのよく知られたエピタキシャル関係が観察されたが、高指数面基盤を用いたところ、いくつかの新しい方位関係が現れることを見出した。(2)銅基盤上の鉄は、ドメイン構造をもって一様な厚さで蒸着されていたが、鉄基盤上の銅は、基盤方位によらず多くの微細な島状に蒸着されていた。3.銅の[001]方位を長手方向にもつ電界イオン顕微鏡(FIM)用の針状試料上に鉄を蒸着した後、試料先端の半球状の基盤の上に蒸着された鉄をFIM観察した。その結果、鉄薄膜は[001]極のまわりに4つの領域に分かれ、K-Sの方位関係をもって蒸着されていることがわかった。4.実験結果を解析し、エピタキシャル関係の決定要因について考察した。その結果、(1)蒸着結晶と基盤結晶との間のBain対応、(2)2つの結晶の界面の対応性の良さ(不変線をもつ条件)、(3)ミスフィット歪エネルギ-を小さくしようとする効果、が3つの主要因であると結論した。5.バルク試料の異相界面の結晶学についても小変形理論を基に解析した。この場合も、上の4の(1)(3)((2)については不変面をもつ条件となる)が2つの結晶の方位関係や界面方位を決めていることが多いことを指摘し、それらを理論的に予想する手法を提案した。1.本年度の設備・備品費により、新しく改良型の真空蒸着装置を作製した。この装置の到達真空度は、今までのもの(10^<-6>torr)よりはるかに良い、10^<-9>torr台に達するものである。これによって、より清浄な環境下での蒸着が可能になった。2.本年度の実験研究としては、f.c.c.金属である銅とb.c.c.金属である鉄を用いた。まずこれらの単結晶から種々の面方位をもつ透過電子顕微鏡(TEM)用試料を作製し基盤とした。銅基盤上には鉄を、鉄基盤上には銅をそれぞれ平均厚さが数十nmとなるように真空蒸着させた。試料のTEM観察の結果、以下のようなことを見い出した。(1)銅基盤上に鉄を蒸着した試料では、鉄はドメイン構造をもって銅の上にほぼ一様の厚さで蒸着される場合が多かった。基盤面方位が(001)や(111)などの低指数面の場合は、Kurdjumou-SachsNishiyama Pitschなどのよく知られたエピタキシャル方位関係が銅と鉄の間に見られたが、たとえば銅(102)面を基盤方位としたときは、銅(102)と鉄(111)が平行となり界面を形成するといった新しいエピタキシャル関係が出現することがわかった。(2)鉄基盤上に銅を蒸着した試料では、銅は多くの微細な島状に蒸着されていた。

鉄の低指数面基盤を用いたときは、やはりよく知られた方位関係が観察されたが、たとえば比較的高指数面である鉄(123)面上に銅を蒸着すると、鉄(123)と銅(112)が平行となり界面を形成するという新しいエピタキシャル関係がこの場合にも観察された。3.交付申請書には記載していないが、本年度はバルク試料での異相界面の結晶学に関する理論的研究も行った。すなわち、母相と変態生成物(析出物やマルテンサイト)の間の方位関係や結晶学を、弾性エネルギー最少条件に基く小変形理論を用いて解析する手法を提案した。1.昨年度の設備・備品費で完成された改良型真空蒸着装置は、本年度も順調に稼動している。この装置の保守や、他の関連実験に必要な消耗品を、本年度の補助金より購入した。2.平面状の基盤を用いる研究としては、おもに銅の高指数面基盤上に鉄を蒸着させる研究を、昨年度より継続して行った。基盤が高指数面になると、それとBain対応で結ばれ界面を形成すべき候補となる蒸着金属の結晶面の数が増すが、詳細な透過電子顕微鏡観察によって、確かに1つの基盤上に複数のエピタキシャル関係をもつ蒸着結晶が生成されていることを見出した。3.球面状の基盤を用いる研究としては、銅の[001]方向を長手方向とした電界イオン顕微鏡(FIM)用針状試料の上に、FIM装置内に組み込んだ改良型の真空蒸着装置によって、鉄を蒸着させた。この試料の球面状の先端部をFIM観察し、蒸着鉄の形態やエピタキシャル関係を調べた。その結果、鉄薄膜は銅基盤とKurdjumov-Sachsの方位関係をもつ4つの領域よりなり、この4つの領域が[001]極のまわりに半球面のほぼ1/4ずつをしめて存在していることがわかった。4.以上の結果をまとめ、本研究で観察されたいくつかの新しいエピタキシャル関係が何によって決まっているのかを考察した。平面状および球面状の基盤を用いた研究の結果を合せて考えると、エピタキシャル関係を決めている因子として(1)基盤結晶と蒸着結晶との間のBain対応(2)2つの結晶の界面での対応性(不変線をもつ条件)(3)ミスフィット歪を小さくする効果が考えられ、これらの因子によって実験結果が合理的に説明できることがわかった。
元代石刻史料実地調査のための文献的情報の整理と研究

本研究は、私が1988年、中国の河北・山西地方で元代石刻史料の実地調査を行った経験から取り組むことになった。中国の近代化にともない石碑類は急速に失われつつあるが、その歴史史料としての価値は大きく、早急な調査が必要である。しかし、県レヴェルの文物を管理する文物管理所の設備予算は貧弱で、管轄地方に過去にどのような石碑が存在し、現存しているものは、どれかについて十分把握しているわけではなかった。そこで本研究では実地調査を効率よく行うために『中国方志叢書』の大量の地方志を中心的に利用し、そこに収められている元代石刻史料に関する文献的情報を県別に収集整理することをめざした。平成元年度は、東洋文庫を中心に調査し、1988年の実地調査で筆写して帰った51の元代石刻史料が、従来利用可能な文献史料の中にはない新史料であることを確認した。平成二年度は、北京で、北京図書館蔵の拓本について調査した。そして、1990年出版の『北京図書館蔵中国歴代石刻拓本涯編』元代部分に収録済の463種の拓本以外に391種の元代石刻の拓本を所蔵していることがわかり、閲覧カードにより、その所在地、題名を抄写した。なお、1988年に実地調査した51の元代石刻史料の大部分について、北京図書館は拓本を所蔵していなかった。平成三年度も、国際蒙古学学術討論会に参加したついでに、北京図書館で前述の『拓本涯編』未収録分の拓本について史料的価値を調査した。この三年間で『中国方志叢書』河北・河南、山東、山西、陜西の549種の地方志を調査し、各県別に元代石刻史料の所在地、その内容が従来利用可能な文献史料に収録済か否かを調査した。報告書では、『元代石刻集録』の作成をめざし、河北省についての研究成果をまとめた。内容は、石刻史料目録の外に、調査した地方志にのみ、本文内容が記録されていた元代石刻史料92種を収録した。当初、夏に予定していた中国の河北・山東での石刻史料調査は、中国情勢を考慮して実施せず、夏に一ケ月ほど東洋文庫を中心として地方志類から元代石刻史料に関する情報の収集に努めた。東洋文庫では、私が1987年から1988年にかけて中国の河北・山西地方で収集した石刻史料が地方志類に収録されているか否かを確認し、大部分が未収録史料であることがわかった。東洋文庫所蔵の拓本は元代に関しては貧弱な所蔵量であった。多数の地方志を調査し、33点の地方志については、必要箇所を複写した。備品として購入した宗譜・族譜の目録類、石刻題跡索引、拓片目録などは、目録作りに利用している。作業としては、『石刻史料新編』第1輯3輯、筑波大学蔵『中国方志叢書』などから収集した史料を中心に整理を行っている。河北・山東・山西・河南地方については、石刻史料題銘と撰文者のカ-ドを作成し、石刻史料撰文者別題銘目録の作成にとりかかっている。