hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
羊スクレイピー病原体(プリオン)の侵入門戸に関する研究

本研究では、スクレイピーやBSEの自然状態での主な感染経路である経口感染において、プリオンの侵入門戸を明らかにする目的で、リンパ節やパイエル板など二次リンパ系組織を欠く変異マウス[ALY(alymphoplastic)マウス]と、その野生型であるC57BL/6マウスを用いて、腸管付随リンパ装置が侵入門戸となる可能性について調べた。ALY/ALYマウスおよびその野生型マウスC57BLに、マウススクレイピー病原体を経口、腹腔、および脳内の各ルートで投与して、スクレイピーに対する感受性を調べた。脳内接種ではC57BLは165±5日、ALYでは159±8日でマウスはスクレイピー末期となった。マウス間で有意差は認められなかった。腹腔内接種ではC57BLは251土9日、ALYでは279±6日でマウスはスクレイピー末期となり、ALYマウスで20日程度潜伏期が延長した。経口投与ではC57BLは307±7日でスクレイピー末期となったが、ALYマウスは投与後640日でもスクレイピーを発症しなかった。っまり、ALYマウスは経口ルートではプリオンに感染しなかった。また、経口投与、および腹腔投与後20,40,80日でマウスの消化管、脾臓を採取して、各時点における組織中の感染価をマウスバイオアッセイにて調べた結果、C57BL/6マウスでは調べた全ての時点でプリオン感染価が検出されたが、ALYマウスでは検出されなかった。また、プリオンを経口ルートで投与したC57BL/6の脾臓、消化管(粘膜下リンパ濾胞)ではPrPScが検出された。これらの結果から、パイエル板などの消化管付随リンパ装置が侵入門戸として重要であると考えられた。最近、ALYマウスの原因遺伝子はNF-κB inducing kinaseであることが明らかにされた。これまでALYマウスは主に免疫研究に用いられてきた。プリオンの侵入門戸の一つとして、消化管神経が考えられている。そこで、ALYマウスが消化管神経の構築に異常を伴うか否かを調べたが、消化管神経の走行や密度はC57BLとALYマウスの間で差は認められなかった。本研究の成果から、経口的に取り込まれたプリオンは、消化管上皮に存在するM細胞を経て宿主体内に侵入し、濾胞樹状細胞を経由して、末梢神経へと侵入することが示唆される。プリオンに対する感受性が高い若齢反芻獣のパイエル氏板を覆うドームでは、M細胞が多数存在すること、また若齢反芻獣の回腸遠位部でパイエル氏板が発達していることなどから、回腸遠位部のパイエル氏板がブリオンの侵入門戸となる可能性が高いと考えられる。羊のスクレイピーやBSEなどの動物プリオン病は感染性プリオン病に分類される。これらの伝播は経口ルートが主な感染経路と考えられているが、自然感染経路における病原体の侵入門戸に関する知見は乏しい。近年、プリオンの体内伝播においてリンパ系組織の濾胞樹状細胞の関与が注目されており、扁桃、パイエル板、粘膜下リンパ濾胞など腸管付随リンパ装置が侵入門戸であることが示唆されている。一方、腸管には自律神経繊維、神経叢が密に存在しており、直接神経系へ侵入する経路も考えられる。この問題を明らかにするために、パイエル板など二次リンパ系組織を欠く変異マウス(alymphoplasitc,ALYマウス)に経口ルートを含む各種投与ルートでプリオンを感染させ、感染成立の有無、PrPScの蓄積状況を調べた。脳内接種においては野生型マウスであるC57BL/Jでは165±5日で、ALYマウスでは159±8日で死亡した。つまり、脳内接種では両マウスに感受性の違いは認められなかった。しかし経口ルートではC57BL/Jマウスでは307±7日で死亡したのに対し、ALYマウスでは現在まで(接種後400日)スクレイピーの発症は認められていない。神経線維特異的G蛋白質によるホールマウント免疫染色では、両マウスの消化管における神経線維の走行性および神経叢の出現頻度には大きな差が認められなかった。従って、経口ルートにおいては消化管付随リンパ系装置に侵入して、おそらくそこでプリオンの初期増殖がおこることが、最終的にプリオンが中枢神経系に到達するために必要であることが示唆された。現在、両マウスの各種組織、特に消化管と脾臓などのリンパ系組織におけるプリオン感染価を測定しており、またこれら組織における異常型プリオン蛋白質の検出を行っている。これらの結果が出揃うと、本研究の目的であるプリオンの侵入門戸が実験レベルで明らかになると思われる。

腹腔内接種ではC57BLは251土9日、ALYでは279±6日でマウスはスクレイピー末期となり、ALYマウスで20日程度潜伏期が延長した。経口投与ではC57BLは307±7日でスクレイピー末期となったが、ALYマウスは投与後640日でもスクレイピーを発症しなかった。っまり、ALYマウスは経口ルートではプリオンに感染しなかった。また、経口投与、および腹腔投与後20,40,80日でマウスの消化管、脾臓を採取して、各時点における組織中の感染価をマウスバイオアッセイにて調べた結果、C57BL/6マウスでは調べた全ての時点でプリオン感染価が検出されたが、ALYマウスでは検出されなかった。また、プリオンを経口ルートで投与したC57BL/6の脾臓、消化管(粘膜下リンパ濾胞)ではPrPScが検出された。これらの結果から、パイエル板などの消化管付随リンパ装置が侵入門戸として重要であると考えられた。最近、ALYマウスの原因遺伝子はNF-κB inducing kinaseであることが明らかにされた。これまでALYマウスは主に免疫研究に用いられてきた。プリオンの侵入門戸の一つとして、消化管神経が考えられている。そこで、ALYマウスが消化管神経の構築に異常を伴うか否かを調べたが、消化管神経の走行や密度はC57BLとALYマウスの間で差は認められなかった。本研究の成果から、経口的に取り込まれたプリオンは、消化管上皮に存在するM細胞を経て宿主体内に侵入し、濾胞樹状細胞を経由して、末梢神経へと侵入することが示唆される。プリオンに対する感受性が高い若齢反芻獣のパイエル氏板を覆うドームでは、M細胞が多数存在すること、また若齢反芻獣の回腸遠位部でパイエル氏板が発達していることなどから、回腸遠位部のパイエル氏板がブリオンの侵入門戸となる可能性が高いと考えられる。昨年度にALY/ALYマウスおよびその野生型マウスC57BLに、マウススクレイピー病原体を経口、腹腔、および脳内の各ルートで投与したマウスの経過観察を継続している。また、経口投与、および腹腔投与後20,40,80日でマウスの消化管、脾臓、および脳を採取した。各時点における消化管、脾臓における感染価を測定するために、10%組織乳剤を作製して、バイアッセイ用マウスに脳内接種した。脳内接種ではC57BLは165±5日、ALYでは159±8日でマウスはスクレイピー末期となった。マウス間で有意差は認められなかった。腹腔内接種ではC57BLは251±9日、ALYでは279±6日でマウスはスクレイピー末期となり、ALYマウスで20日程度潜伏期が延長した。つまり、ALYマウスは経口感染には完全に抵抗性であった。ALYマウスはプリオンの侵入門戸の一つと予想されるバイエル氏板を欠損する。この欠損により、プリオンの侵入門戸の可能性がある消化管神経に異常があるかを調べたが、消化管神経の走行や密度はC57BLとALYマウスの間で差は認められなかった。現在、経時的に採材した回腸のプリオン感染価を測定しているが、これまで、C57BLマウスの回腸からはプリオンの感染価が確認されているが、ALYの回腸からは感染価は確認されていない。従って、プリオンの侵入門戸は消化管のバイエル氏板のようなリンパ装置であることが示唆された。
多変量解析を用いた諸方言アクセント区画モデル化構築の研究

本年度は、データ収集を目的として、フィールドワークを中心に行った。徳島県は勿論、隣県の香川県(島嶼部も含む)、また、山梨県・長野県・岐阜県・石川県・富山県・福岡県・佐賀県・鹿児島県(奄美大島)でも方言音声の収録を行った。●体系記述的研究「徳島県下に存在する京阪式・讃岐式・垂井式・山城谷式・出合式など様々な異体系アクセントの現在の体系を記述し、把握する」という目標に対して、京阪式・讃岐式・垂井式の体系記述及び比較分析を行った。成果物として2点の論文がある。一つは徳島県旧東祖谷山村に存在する垂井式アクセント(C型)について体系記述報告を行ったものである。もう一つは京阪系アクセント地域で今現在進行中のアクセント変化を、隣接する異体系アクセントの変化の状況も踏まえて記述したものである。これは日本学術会議傘下の学会誌である『音声研究』に掲載された。●統計的手法による研究「体系記述的研究によって得られた徳島県下のアクセントデータを用いて統計的処理を行う。多変量解析やSOM分析を使ってアクセント区画を再構築する。」という目標に対して、徳島県を東西に流れる吉野川流域を対象に、統計的分析を試みた。成果物として1点の論文がある。これはコレスポンデンス分析とクラスター分析を用いて、京阪式アクセントと讃岐式アクセントの境界がどこにあるのかを統計的に分析したものである。従来の主観的な分類に寄らず、境界地帯を客観的に区画出来た点に、先行研究にはないオリジナリティと意義がある。これは日本学術会議傘下の学会誌である『文理シナジー』に掲載された。
自己免疫疾患の分子機構に関する研究

自己と非自己の識別、及びその異常に起因すると考えられる自己免疫疾患の発症機構に関する研究は現在免疫学における最も中心的な命題の一つである。日米両国において第一線の研究者が以下の研究目標のもとに共同研究を行うことを決定しその目的を遂行するため本年度は本庶佑(京大)、奥村康(順天堂大)、笹月健彦(九州大)の3名がNIH、スタンフォード大、ハーバード大学に出張し共同研究立案、討論、情報交換を行った。この国際学術研究が目的とする研究テーマは1.自己トレランス獲得のためのpositive及びnegative sclectionの分子機構の解明2.免疫非応答の分子機構解析のためMHCとペプチドの相互作用、及びT細胞レセプターによるその認識、更にそれに引き続くサイトカイン遺伝子群活性化の解析3.HLA多重遺伝子族の発現制御とその異常による自己免疫疾患発症機序の解析であり、この目的に沿って共同研究が行われ、以下の成果が得られた。本庶教授はトランスジェニックマウスを用いたB細胞トレランス発現機構の解析データと自己免疫病の治療法に関する研究をW.E.Paul,M.Leonald,J.Ashwell,R.Schwaltz,P.Mezinger博士等と長期間に亘って討論を行い、その結果きわめて有益な示唆と実験計画に対する有益な批判を得た。具体的には自己免疫病の治療法として、腹腔内に蒸留水を投与することによって、CD5^+B細胞を死滅させ、自己免疫の治療を図る実験をおこなったところ、NZBマウスの溶血性自己貧血に関してきわめて驚くべき効果が現われた。すなわち、一週間ごとの蒸留水投与によって溶血性貧血の発症頻度および脾臓の重量の増大が著しく低下することが明かとなった。このデータの解釈と意義について充分な討論を行えたのはきわめて有益であった。一方、B細胞トレランスに際する細胞死機構の研究をめぐって、J.Ashwell博士、R.Schwaltz博士と議論をした結果、彼らのT細胞系中心の細胞死、もしくはアナジーによるトレランスと比較討論すること、また、他の多くの細胞死のメカニズムに関しては、現在、多くのグループが異なる系において様々な角度から知見を終結しているが、これを総合的な視点からまとめて議論する機会は必ずしも多いとは言えず、このような議論に基づいて、平成6年8月にNIHにおいて約20名の演者を集める国際シンポジウムを開催することを決定し、NIHがorganizerとなって計画することを提案し、最近これが承認された。奥村教授は免疫反応におけるT細胞活性化とその逆のアナジーの成立に関与する接着分子の役割を解明するための共同研究を行った。奥村らの研究室で、確立した未知の接着分子に対するモノクローナル抗体を用い、スタンフォード大学医学部遺伝子学教室、DNAXの研究者の協力を得、米国側のcDNAライブラリー等を用い、未知の接着分子で、休止期のT細胞の活性化に最も主要な分子B70を同定することが出来た。笹月教授はHLAによる免疫制御に関する最新の情報の交換、研究資料の交換、さらに共同研究の立案を目的としてJ.Strominger教授、D.Willey教授、C.Morimoto助教授(ハーバード大学、ボストン)、B.Dupont教授(スローンケタリング癌研究所、ニューヨーク)、およびH.O.Mcdevitt教授、M.Davis教授、G.Fathman教授(スタンフォード大学、スタンフォード)を訪ねた。J.Strominger教授、D.Willey教授と、HLAクラスII分子の結晶解析結果から、抗ペプチド結合部位の構造、結合する抗原ペプチドの備える条件、HLAクラスII多重遺子族のHLA-DR、DQ、DPの構造の差等につき、情報を交換した。C.Morimoto助教授と接着分子を介した免疫制御につき討議し、共同研究を立案した。B.Dupont教授と、HLAクラスII分子を介するシグナル伝達について新の情報を交換した。H.O.McDevitt教授、M.Davis教授、G.Fathman教授と、HLAトランスジェニックマウスを巧みに利用したT細胞レパトワ決定におけるMHCクラスII分子の役割についての共同研究の成果を示し、新しい考え方を提示し、今後の共同研究につき詳な打ち合わせを行った。

すなわち、一週間ごとの蒸留水投与によって溶血性貧血の発症頻度および脾臓の重量の増大が著しく低下することが明かとなった。このデータの解釈と意義について充分な討論を行えたのはきわめて有益であった。一方、B細胞トレランスに際する細胞死機構の研究をめぐって、J.Ashwell博士、R.Schwaltz博士と議論をした結果、彼らのT細胞系中心の細胞死、もしくはアナジーによるトレランスと比較討論すること、また、他の多くの細胞死のメカニズムに関しては、現在、多くのグループが異なる系において様々な角度から知見を終結しているが、これを総合的な視点からまとめて議論する機会は必ずしも多いとは言えず、このような議論に基づいて、平成6年8月にNIHにおいて約20名の演者を集める国際シンポジウムを開催することを決定し、NIHがorganizerとなって計画することを提案し、最近これが承認された。奥村教授は免疫反応におけるT細胞活性化とその逆のアナジーの成立に関与する接着分子の役割を解明するための共同研究を行った。奥村らの研究室で、確立した未知の接着分子に対するモノクローナル抗体を用い、スタンフォード大学医学部遺伝子学教室、DNAXの研究者の協力を得、米国側のcDNAライブラリー等を用い、未知の接着分子で、休止期のT細胞の活性化に最も主要な分子B70を同定することが出来た。笹月教授はHLAによる免疫制御に関する最新の情報の交換、研究資料の交換、さらに共同研究の立案を目的としてJ.Strominger教授、D.Willey教授、C.Morimoto助教授(ハーバード大学、ボストン)、B.Dupont教授(スローンケタリング癌研究所、ニューヨーク)、およびH.O.Mcdevitt教授、M.Davis教授、G.Fathman教授(スタンフォード大学、スタンフォード)を訪ねた。J.Strominger教授、D.Willey教授と、HLAクラスII分子の結晶解析結果から、抗ペプチド結合部位の構造、結合する抗原ペプチドの備える条件、HLAクラスII多重遺子族のHLA-DR、DQ、DPの構造の差等につき、情報を交換した。C.Morimoto助教授と接着分子を介した免疫制御につき討議し、共同研究を立案した。B.Dupont教授と、HLAクラスII分子を介するシグナル伝達について新の情報を交換した。H.O.McDevitt教授、M.Davis教授、G.Fathman教授と、HLAトランスジェニックマウスを巧みに利用したT細胞レパトワ決定におけるMHCクラスII分子の役割についての共同研究の成果を示し、新しい考え方を提示し、今後の共同研究につき詳な打ち合わせを行った。
虚数乗法論とKP方程式の関連について

主偏極CM型アーベル多様体がある代数曲線のヤコビ多様体となるための必要十分条件を対応するCM体の言葉で書き下すことが本研究のテーマである。そのために、京都大学の塩田氏により証明されたKP方程式に関するNovikov予想に着目し、KP方程式と虚数乗法論の関連を探ろうというのがアイデアである。本年度の目標は、引き続きコンピューターを使ってCM体からつくられるデータ関数のフーリエ係数を高い次数まで計算し、この計算結果とこれまで文献調査を通じて学んだ4つの事:「(1)代数曲線とKP方程式の関係を論じたKricheverの理論;(2)微分方程式の知識を駆使しNovikov予想を解決した塩田の理論;(3)塩田の理論から微分方程式に関するテクニックを極力排除し幾何的な証明を試みたArbarello, Concini, Mariniの理論;(4)KP方程式の解全体が普遍グラスマン多様体を形成するという佐藤理論」を用いて、KP方程式と虚数乗法論の関連、特にKP方程式とアーベル多様体の自己準同形写像との関連に関して深く考察する事であった。この目標についてはあまり著しい結果が得られなかったが、この考察の課程で新たな二つの研究課題:「(A)CM型楕円曲線のmodularityの定義体とその応用;(B)QM型アーベル曲面の場合のclass polynomial」が見つかった。(B)に関しては、このテーマで平成18年度の基盤研究(C)(一般)に申請中である。そのために、京大の塩田氏により証明されたKP方程式に関するNovikov予想に着目し、KP方程式と虚数乗法論の関連を探ろうというのがアイデアでる。本年度の目標は、Novikov予想・KP方程式に関連する文献を読み、それらに関する知識を深めることであったが、それはほぼ達成できた。具体的には、1.代数曲線から波動関数が構成され、その波動関数が満たす微分方程式を考えることにより、ある種の擬微分作用素が構成され、その作用素の係数にKP方程式の解があらわれるというKricheverの理論;2.テータ関数がヤコビ多様体からくる為の必要十分条件は、そのテータ関数がKP hierarchy (KP方程式を含む無限個の微分方程式)の解になることであるという事を示し、更に、KP方程式から残りの微分方程式が成立するようにうまくベクトル場がとってこれることを示すことにより、Novikov予想を解決した塩田の理論;3.塩田の証明から、微分方程式に関するテクニックを極力排除し、幾何的な証明を試みたArbarello, Concini, Mariniの仕事;4.KP方定式の解全体が普遍グラスマン多様体を形成するという佐藤理論等を学んだ。次年度は、これらの知識を基に、KP方程式と虚数乗法論の関連、特にKP方程式とアーベル多様体の自己準同形写像との関連に関して深く考察する予定である。本年度の目標は、コンピューターを使ってCM体からつくられるテータ関数のフーリエ係数を高い次数まで計算しKP方程式との関連を探ることと、昨年度に引き続きNovikov予想とKP方程式に関連する文献を読みそれらに関する知識を深めることであった。数値実験に関しては研究室のパソコンのハードディスクが壊れたせいもあり、思ったように進んでいない。17年度にかけて引き続き行う予定である。また、文献調査に関しては、昨年度学んだ4つの事:(1)代数曲線とKP方程式の関係を論じたKricheverの理論;(2)微分方程式の知識を駆使しNovikov予想を解決した塩田の理論;(3)塩田の理論から微分方程式に関するテクニックを極力排除し幾何的な証明を試みたArbarello, Concini, Mariniの理論;(4)KP方程式の解全体が普遍グラスマン多様体を形成するという佐藤理論をより掘り下げて勉強した。次年度は、これらの知識とフーリエ係数に関する実験結果を基に、KP方程式と虚数乗法論の関連、特にKP方程式とアーベル多様体の自己準同形写像との関連に関して深く考察する予定である。

この目標についてはあまり著しい結果が得られなかったが、この考察の課程で新たな二つの研究課題:「(A)CM型楕円曲線のmodularityの定義体とその応用;(B)QM型アーベル曲面の場合のclass polynomial」が見つかった。(B)に関しては、このテーマで平成18年度の基盤研究(C)(一般)に申請中である。
熱帯海草藻場における堆積物撹乱の影響評価:津波と局所的環境変動の複合効果

本課題は、熱帯沿岸生態系の主要な構成要素である海草藻場を対象に、津波による大規模撹乱と局所的な環境改変の複合効果が生物群集に与える影響を解明する。一連の統合的アプローチにより、津波発生前後の海草藻場の変動パターンが明らかになると共に、津波による効果には、モンスーンや河川水による物質供給パターンの変動や、底生生物による生物撹乱等も複雑に関与していることが明らかになった。2004年12月26日にスマトラ島沖大地震に伴い発生した大津波は、インド洋沿岸一帯の人間社会および自然生態系に甚大な被害を与えた。このような極めてまれに起こる大規模撹乱が生態系に与える影響の定量的評価には、事前データの入手が困難であるという問題点がある。研究代表者らは、2001年よりタイ南西部の沿岸生態系を対象に、生物多様性および生態系機能の変動について調査してきた。その過程で、一部の調査地が上述の大津波で激甚な撹乱を受けた。しかし、他の調査地では津波の影響は軽微であった。これにより、撹乱の程度の異なる場所における事前事後の比較により津波の影響評価を行う非常に稀有な機会を得た。本研究課題は、熱帯沿岸生態系の主要な構成要素である海草藻場を対象に、カタストロフィックな大規模撹乱と局所的な環境改変の複合効果が生物群集に与える影響を解明することを目的とする。これを達成するため、群集・生態系生態学、リモートセンシング、地理情報学、生物地球化学を統合したアプローチにより、津波発生前後の広域かつ長期にわたる海草藻場の変動パターンを解析すると共に、野外操作実験と統計的解析により、大規模撹乱と局所的環境変動の複合効果の検証および予測を行う。具体的には、以下の課題について研究を行う。(1)生物群集の長期変動解析:津波および他の環境要因の影響が異なる複数の海草藻場において、海草群集および付随する動物群集の定期的な定量調査を行い、既存データと併せ、津波前後の10年間の長期変動パターンを明らかにする。(2)海草藻場の堆積物環境の変動解析:海草藻場の物理的・化学的観測により、モンスーンによる物理撹乱、および河川水流入に伴う物理的・化学的撹乱の影響を評価する。また、大深度の柱状コアを採集し、物理的・化学的分析を行うことにより、過去数年十数年スケールでの海草藻場の撹乱履歴を明らかにする。(3)現地リモートセンシング観測および既存リモートセンシング情報による広域動態の解析:気球等を利用した高解像度空中写真の撮影、および津波前後に撮影された航空写真および衛星画像より、海草藻場の空間分布と各種撹乱の関連性、海草藻場に対する津波の影響の強度および空間異質性を広域スケールで解明する。(4)野外操作実験:撹乱強度および頻度を操作した野外実験を行い、異なる強度・頻度で生ずる撹乱が海草藻場の群集構造に与える作用機構を解明する。(5)以上の解析より得られた知見を統合することにより、沿岸生態系における大規模撹乱と局所的環境改変の複合効果について解明する。本研究は、熱帯沿岸生態系の主要な構成要素である海草藻場を対象に、津波に代表されるカタストロフィックな大規模撹乱と局所的な環境改変の複合効果が生物群集に与える影響を解明することを目的とする。この目的を達成するため本年度は下記の研究調査を行った。1,海草藻場およびベントス群集の長期変動および遷移過程の追跡:現地調査を平成20年2月3月に,2001年より継続調査している6定点で行った。その結果,2004年に最も津波被害が大きかった海草藻場においても,海草類およびベントス群集が回復過程にあることが判明した。2,海草藻場環境の野外調査:上記の海草藻場周辺の堆積物底において地形および水深の測量,採水・採泥を行い,河川によって供給される懸濁物と陸起源有機物の流入範囲と堆積状況を解析するための資料を得た。3,コア採集による堆積物環境の時間変動の解析:小型コアを用いて,各海草藻場にて堆積物を深さ30cmにわたり採集した。この試料を用いて,堆積環境の推定,および安定同位体分析による海草と陸起源有機物の量の推定のための解析を進行中である。4,リモートセンシングによる海草分布の広域変動様式の現地計測と回復過程のモニタリング:凧による高解像度空中写真の撮影を,潮間帯から潮下帯の浅い部分の海草藻場を対象に行った。また,現地の航空写真を入手した。これらの映像はGISを用いて空間情報としてデータベース化し,海草の広域分布様式の変異機構を解析する予定である。

この目的を達成するため本年度は下記の研究調査を行った。1、海草藻場およびベントス群集の長期変動および遷移過程の追跡:現地調査を平成21年2月に、2001年より継続調査している6定点で行った。その結果、2004年の津波による撹乱から海草類およびベントス群集が引き続き回復しつつあることが明らかになった。2、海草藻場環境の野外調査:上記の海草藻場周辺の多数の堆積物底において採水・採泥を行うと共に、海草類の安定同位体および光合成活性を測定した。その結果、海草類の生産性が、堆積物の撹乱状態およびその安定性と密接に関連していることを示す予備的なデータが得られた。3、リモートセンシングによる海草分布の広域変動様式の現地計測:海草藻場において無人気球による高解像度空中写真の撮影を行った。得られた画像は、昨年度のカイトフォトグラフによる撮影結果、および過去の航空写真と合わせてGIS化して、海草の広域空間構造の変化について解析する予定である。4、コア採集による堆積物環境の時間変動の解析:海草藻場の堆積履歴を明らかにするための大型コアラーを製作し、東京湾富津干潟のアマモ場において試行調査を行った。その結果を元に、観測機器の改良を行うと共に、熱帯性海草藻場における採集、解析の方法を検討する予定である。本研究は、熱帯沿岸生態系の主要な構成要素である海草藻場を対象に、津波に代表されるカタストロフィックな大規模撹乱と局所的な環境改変の複合効果が生物群集に与える影響を解明することを目的とする。1、海草藻場およびベントス群集の長期変動および遷移過程の追跡:現地調査を平成22年1月に、2001年より継続調査している6定点で行い、長期データの収集を継続した。来年度の調査の後に、津波発生前後10年間の変動様式の解析を行う予定である。2、海草藻場周辺の環境条件の観測:上記の海草藻場の観測定点の周辺海域にて採水および採泥を行い、環境諸条件の変動を観測した。本結果についても上記項目と同様に来年度の調査の後に、津波発生前後10年間の変動様式の解析を行い、海草藻場の変動との関連性を解明する予定である。3、コア採集による堆積物環境の時間変動の解析:大型コアサンプラーによる海草藻場堆積物の大深度掘削を実施し、深度2mに達する堆積物の採集に成功した。現地における観測の結果、堆積物の層状構造は津波の影響だけでなく、アナジャコのような潜孔性生物による局所的撹乱や、モンスーンに伴う季節的な波浪による撹乱などの複合的な効果を受けて複雑に変動することが判明した。今後、堆積物の元素解析・同位体解析を進めることにより、海草藻場の埋没過程とその後の物質循環への影響を評価する予定である。4、リモートセンシングによる海草分布の広域変動様式の把握:昨年度までに現地で撮影した気球写真、航空写真をGISを用いてデータベース化するとともに、高解像度衛星画像(ALOS、JAXA)を用いた海草藻場の空間分布判別の予備的解析を行った。その結果、これらの異なるソースの画像を組み合わせることにより、海草藻場の広域長期変動について把握することが可能であることが明らかになった。1、海草藻場およびベントス群の長期変動および遷移過程の追跡:
ELAC2を用いた頭頚部扁平上皮癌のアポトーシスの研究

我々が既に明らかにしたTGF-βのもつアポトーシス作用を増強させるELAC2が頭頸部領域の扁平上皮癌でELAC2遺伝子に変異が起こり、癌のアポトーシスを阻害し癌の増殖が起こる一つの機構となっている可能性を研究していくことを目的としている。頭頸部扁平上皮癌組織10例中4例でELAC2の局在性が確認された。このことからELAC2が頭頸部扁平上皮癌においてアポトーシスに関連していることが示唆されたが、症例数が少なく今後さらに症例数を増やして検討を重ねていく予定である。TGF-βシグナルは、多くの細胞に細胞増殖抑制やアポトーシスを引き起こすことが知られている。TGF-βシグナルが癌抑制因子として働くことは、癌細胞においてそのシグナル伝達機構に異常が認められることからも明白である。そこで本研究ではTGF-βシグナルの頭頚部がんの発生進展における役割について明らかにしていきたい。具体的には我々が既に明らかにしたTGF-βのもつアポトーシス作用を増強させるELAC2が頭頸部領域の扁平上皮癌でELAC2遺伝子に変異が起こり、癌のアポトーシスを阻害し癌の増殖が起こる一つの機構となっている可能性を研究していくことを目的としている。まず、頭頸部扁平上皮癌組織採取を開始し、最終的に収集できた検体数は10例であった。次にELAC2抗体で免疫染色を行ったが、ELAC2抗体がポリクローナル抗体であったためELAC2に対する特異性が弱く、うまく染色されない結果となった。このために、抗体について検討を重ね、特異性の高いELAC2モノクローナル抗体を作成した。次に頭頸部扁平上皮癌組織をいELAC2モノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。結果、頭頸部扁平上皮癌組織10例中4例でELAC2の局在性が確認された。
自然免疫細胞を標的としたアトピー性皮膚炎における難治性痒みの新規治療法の開発

アトピー性皮膚炎(AD)は増悪と完解を繰り返す湿疹のある皮膚疾患であり、強い掻痒感を呈することが特徴である。AD病態は様々な要因が複雑に絡み合って引き起こされることから、その痒みには既存薬である抗ヒスタミン薬が奏功し難く、『難治性痒み』と言われている。申請者らの先行研究から、ADの炎症局所では感覚神経線維の稠密化が認められ、これにより外部からの痒み刺激や免疫細胞由来起痒物質に対する受容の増加に繋がり、痒み過敏や増強に関与することが示唆されており、難治性痒みの一因と言われる。一方、AD炎症局所には好酸球をはじめとする免疫細胞が浸潤することが知られているが、これらの痒みに対する役割は不明である。感覚神経線維と免疫細胞がAD皮膚局所で相互に作用している可能性が考えられるが、その詳細は不明瞭である。そこで本研究では、好酸球をはじめとする免疫細胞に着目し、感覚神経線維との相互作用の観点からADにおける痒みの発症メカニズムの解明及び新規治療・予防法の開発を目指し、研究を行った。平成30年度は前年度に引き続き、ADモデルマウス及びヒトAD患者皮膚病変部における免疫細胞と感覚神経の分布解析を行った。その結果、ADモデルマウス皮膚のFACS及び組織学的解析により、好酸球の浸潤が認められた。また、その好酸球は皮膚病変部において感覚神経と接触していることが明らかとなった。AD患者皮膚病変部においても同様に、好酸球と感覚神経との接触が認められた。以上のことから、AD皮膚局所において、好酸球が感覚神経に直接接触することで興奮し、痒みを引き起こすことが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アトピー性皮膚炎(AD)は、増悪と寛解を繰り返す皮膚疾患であり、その痒みは様々な遺伝及び環境因子が絡み合う複雑な機序で発症し、抗ヒスタミン薬が奏功し難い『難治性の痒み』を伴う慢性炎症性皮膚疾患である。これまで申請者の研究グループでは、ADにおける難治性痒みの原因の一つが表皮内への知覚神経線維の侵入であり、皮膚バリアの機能が破綻しているAD患者や乾皮症、またはそれらのモデルマウスの皮膚において、NGFやAREG等の神経伸長因子の発現亢進ならびに、神経線維を退縮させるSema3A等の神経反発因子の発現低下を見出した。この神経線維の稠密化は外部からの痒み刺激や炎症局所のケラチノサイト、マスト細胞、T細胞等免疫細胞が産生する起痒物質に対する受容の増加につながり、痒み過敏や増強に関与することが推定されるが、その詳細は明らかとなっていない。またADの炎症局所では、好酸球や2型自然リンパ球(ILC2)が浸潤していることも知られているが、ADの痒みにおけるこれら細胞の役割については不明である。そこで本研究では、免疫細胞と知覚神経線維の相互作用の観点から、ADにおける痒みの発症メカニズムの解明と新たな治療及び予防法の開発を目的とし、研究を行った。平成29年度は、ADモデルマウスを用いて皮膚病変部における免疫細胞の特性化を行った。また、免疫細胞と知覚神経線維の分布解析についても試みた。現在、AD患者における皮膚病変部の免疫細胞及び知覚神経線維の分布解析を進めている。一方、マウス後根神経節細胞(DRG)と好酸球及びヒトinduced pluripotent stem (iPS)細胞由来神経細胞とヒト末梢血由来好酸球の共培養系の条件を検討中である。次年度は引き続きAD皮膚病変における免疫細胞と知覚神経の相互作用を解析し、学会発表及び論文化する予定である。平成29年度の研究では、ADモデルマウス皮膚病変部における免疫細胞の分布を明らかにした。その結果好酸球はAD病変部に浸潤し、知覚神経線維と接触することが明らかとなった。これらの研究成果の一部は、2017年12月に高知県高知市で開催された第42回日本研究皮膚科学会で発表した。ほぼ予定通りに研究は進行していると考えられる。

AD患者皮膚病変部においても同様に、好酸球と感覚神経との接触が認められた。以上のことから、AD皮膚局所において、好酸球が感覚神経に直接接触することで興奮し、痒みを引き起こすことが示唆された。平成29年度の研究成果を踏まえ、平成30年度はAD患者皮膚を用いた免疫細胞と知覚神経線維の分布について、引き続き解析を進めている。また、免疫細胞と知覚神経線維の相互作用を明らかにするため、DRGと好酸球及びiPS由来神経線維及び好酸球の共培養系を立ち上げ、検討を引き続き進める。本研究成果の学会発表および論文化も予定している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
流水性種からみたボルネオ産両生類多様性の起源

流水性種からみたボルネオ産両生類多様性の起源を探るため、マレーシア領のマレー半島とボルネオ島のサラワク州において野外調査を行い、得られた標本や組織サンプルから形態・音声・分子に基づく系統分類学的な解析を行った結果、ボルネオの両生類ファウナは高度の固有性をもち、極めて古い時代に周辺地域から孤立して独特の進化を遂げたこと、マレー半島の両生類相の固有性が高いことが明らかになった。流水性種からみたボルネオ産両生類多様性の起源を探るため、平成20年度はマレーシア領のマレー半島とボルネオ島のサラワク州において野外調査を行った。得られた標本や組織サンプルから系統分類学的な解析を行ったところ、主に以下の成果が得られた。1)コオロギヒキガエル属の各種の標本を山地渓流において採集してミトコンドリアDNAの塩基配列をもちいた分子系統解析を行った。その結果、ボルネオ島内の種多様性は近隣のフィリピンやマレー半島との間での侵入や分散の歴史が深く関わっていることが明らかになった。この成果は論文としてまとめ、専門誌に投稿予定である。2)ホソウデナガガエル属についてはボルネオから大陸までを含む多くの地点からのサンプルを入手して同じく分子系統解析を行って、ボルネオに分布する本属の種間の系統関係を調査して生物地理学的な解析に取り組んで成果が得られつつある。また、マレー半島のキャメロンハイランドにおいて本属の新種を夏に発見して、既に記載論文をZoological Science誌に掲載。またこれまでマレー半島のタイ領にしか知られていなかった本属の1種が半島南部のマレー領にも広く生息していることも音声学的、形態学的、分子系統学的な手法から明らかにした。3)マレー半島の小河川で採集したアシナシイモリ幼生の分子系統解析を行ったところ、半島部の複数の地点で2種が同所的に生息していることが明らかとなった。半島マレーシアで複数種が同所的に生息していることが初めて明らかになった。また、サラワク州のクバ国立公園でも2種のアシナシイモリを採集したが、そのうち1種は1965年に記載されて以来、初めて採集された個体である可能性が高い。流水性種からみたボルネオ産両生類多様性の起源を探るため、平成21年度もマレーシア領のマレー半島とボルネオ島のサラワク州において野外調査を続行した。1)ウデナガガエル属の各種の標本を山地渓流において採集してミトコンドリデDNAの塩基配列をもちいた分子系統解析を行った。その結果、ボルネオ島産の種は近隣のフィリピン産と姉妹関係にある群に代表され、一部がやマレー半島にも分布するが、分断の歴史は古いこと、ボルネオ島内に未記載の隠蔽種が存在することが明らかになった。この成果は専門誌に投稿し,現在印刷中である。2)ホソウデナガガエル属について、昨年度よりさらに多くの地点からのサンプルを入手して分子系統解析を行い、ボルネオ島産は大陸産とは独立の系統であること、未記載の隠蔽種が存在することを確認した。3)サバ州産のボルネオハヤセガエル属の形態学的、分子系統学的解析結果から、1新種をZoologicalScience誌に記載した。4)また、マレー半島南部のチョボクチガエルは、これまで広域分布種の一部とされてきたが、未記載の隠蔽種であることを音声学的、形態学的、分子系統学的に確認した。4)ボルネオ及びマレー半島産のアシナシイモリ類の追加標本の採集に成功し、現在、分子系統解析を行っている゚半島部の複数の地点で2種が同所的に生息していることは、ますます確実になっている。5)サラワク州のクバ国立公園で、現在ボルネオヒメアマガエルとされている種が大小2種からなし、繁殖生態が大きく異なることを発見した。1種は未記載の新種となる。6)これまで無視されてきた、マレー半島の両生類相の固有性の高さについて総括し、学会発表した。流水性種からみたボルネオ産両生類多様性の起源を探るため、最終年度もマレーシア領のマレー半島とボルネオ島のサラワク州において野外調査を続行した。1)ボルネオハヤセガエル属の形態学的、分子系統学的解析結果から、1隠蔽種を見出し、新種記載した。2)さらにもう1種のボルネオハヤセガエル属の隠蔽種を見出し、印刷中である。3)ボルネオ島を含む広汎な地域でのウデナガガエル属のミトコンドリアDNAの塩基配列をもちいた分子系統解析の結果を専門誌に発表した。4)タイ産のクールガエル属の新種記載を行ったが、その過程で、現在クールガエルとされているボルネオ産の個体群には複数の隠蔽種の含まれることを明らかにし、現在、さらにミトコンドリアDNAの塩基配列をもちいた分子系統解析を行っている。

5)サラワク州のクバ国立公園から新種として報道されたカエルは既知のボルネオヒメアマガエルであり、同種とされていた大形の種が新種であることを確認し、記載した。6)これまで広域分布種の一部とされてきたマレー半島南部のチョボクチガエルが、未記載の隠蔽種であることを音声学的、形態学的、分子系統学的に確認し、現在投稿準備中である。7)ボルネオ及びマレー半島産のアシナシイモリ類の追加標本の採集に成功し、分子系統解析を終えて、現在投稿準備中である。8)ホソウデナガガエル属について、今年度もさらに多くの地点からのサンプルを入手して分子系統解析を行い、ボルネオ島産は大陸産とは独立の系統であること、未記載の隠蔽種が存在することを再確認した。この成果を学会発表し、現在投稿準備中である。9)3年にわたる研究成果から、ボルネオの両生類ファウナは高度の固有性をもち、極めて古い時代に周辺地域から孤立して独特の進化を遂げたことが明らかになった。
洪水流航空写真の画像処理による高水敷環境保全に関する研究

利根川の河道にそう約5kmの範囲にわたって洪水流航空写真解析を行い、その流況を解析した。同時にその地域の高水敷の標高を検討することによって堆積状況を判読し、流況解析結果と比較検討した。その結果、高水敷には2種類の堆積構造があることが判明した。一つは河道湾曲部凸岸近傍の低水路内に生じる堆積で、低水路河岸に沿って細長くかつ厚く発達している。この堆積は、低水路湾曲部凸岸で形成される強せんだん層が河岸から剥離して大規模渦列を形成し、それらが下流へ移流されながら低水路中の高土砂濃度の流れを巻き込んで河岸近傍に取り込むために生じるものであることが判明した。もう一つの堆積構造は、低水路の流れが高水敷上に乗り上げ、高水敷上を流下することにともなって形成されるものである、高水敷上への乗り上げ部の直下流部には比較的高い畝状の堆積があり、それより下流に行くにつれて堆積厚さは徐々に減少している。この畝状の堆積は、流れの高水敷への乗り上げによって洪水流の流速が急激に低下するためであることが洪水流の流況解析から明らかにされた。高水敷周辺の局所洗掘機構に関しても洪水流況との関連で検討がなされた。これらの検討結果に基づいて、湾曲複断面流れの最適平面形状に関する実験的研究を現在進めつつある。1.洪水流航空写真の画像解析によって得られる流速ベクトルを用いて二次元発散の分布を計算することにより、河床の凹凸の状況まである程度把握できることが明らかになった。すなわち、二次元発散の負の領域が河床砂州などの凹凸の縁辺に対応することが判明した。洪水流航空写真は言うまでもなく洪水流の表面の流況を示すものであるが、それから河床状況まで把握できるということは、洪水流航空写真の利用範囲を拡大したことになる。2.高水敷河岸の水衝部における複雑な流れの構造を写真撮影し、流れの構造の特性を検討した。その結果、そこでは強い下降流と湧昇流が生じ、それが水衝部深堀れに重要な役割を果たしていることが判明した。3.高水敷上の植生や構造物などの障害物と流れの関連を検討し、それと高水敷上の土砂堆積との関連を明らかにした。さらに高水敷の凸岸近傍に発生する大規模渦によりその付近に土砂堆積が生じる機構を検討した。4.洪水流況を橋の上から近接して連続撮影し、ボイルや渦などを詳細にわたる洪水流の乱流構造の経時変化を検討した。その結果、洪水時における土砂輸送に重要な役割を果たすと考えられるボイルは逆U型の渦により形成されることが判明した。5.今後は、上記の知見を実験的手法をも用いて検討してゆく予定である。
高マッハ数・高エンタルピー流の乱流遷移

宇宙科学研究所が2002年に打ち上げを予定しているMUSES-C小惑星サンプル回収機は、大気圏再突入時に、熱防御のために設けられたアブレータの表面で、流れが乱流に遷移し、熱伝達率が2から3倍に上昇して、熱防御に失敗する恐れがある。そのため、研究代表者はこれまでに構築したCFDコード(レイノルズ平均ナビエストークス方程式+K-Epsiron乱流方程式)を用いて、実際の再突入条件で乱流遷移の可能性に関して調査を行った。その結果、アブレーターからのアブレーションガス吹き出し率が100g/s/m2以下であれば、乱流遷移は起こらないという結論が得られた。またミネソタ大学のGrahm Candler教授らのグループの乱流直接シミュレーション研究の結果から、壁面乱流遷移で重要な境界層内での化学反応と擾乱増幅率の関係は、その場所で支配的な化学反応が再結合発熱反応であり、温度の上昇は再結合速度の減少をもたらすため、温度擾乱の増幅率が減少し、乱流遷移を遅らせる方向に働くのではないかという示唆を得た。この傾向は、カリフォルニア工科大学で行われた高温衝撃風洞実験の結果にも一致する。これら3つの解析・実験結果を総合すると、MUSES-Cの熱防御アブレーターは、アブレーション率を100g/s/m2以上に設計しない限り、乱流遷移の心配はないとの結論を得ることができた。この結論は、平成12年度に宇宙科学研究所で計算されている再突入機打ち込み試験で確認することができるものと期待されている。一般に,乱流遷移は100万程度のレイノルズ数で起こるとされているが,宇宙往還機等が経験する高マッハ数・高エンタルピー流においては,主として機体耐熱材のアブレーションによる表面噴き出し効果や2次振動モード「マックモード」の発達、化学反応による温度摂動の成長あるいは減衰等が原因で、遷移条件がレイノルズ数だけでは予測できないことが指摘されるようになってきた.研究代表者はCFD(数値流体力学)を用いて,耐熱材表面のアブレーション率と遷移レイノルズ数の関係を調べた.2方程式乱流モデル(k-epsilonモデル)と,極超音速流の解析スキーム(ASUM)を組あわせた計算は,オーソドックスなアプローチながら,世界でも初めての試みであったが、1万程度のレイノルズ数で遷移が起こるという実験結果を数値計算でも再現することができ、新しい流体的な遷移促進メカニズムを提案することができた.本研究は,将来の日本の再突入カプセルやHOPEの様な有翼宇宙往還機の耐熱材開発において,乱流遷移による加熱率上昇の危険性を予測する基礎の理論となるものと期待されている。本研究の成果の一部は数値流体力学シンポジウムや宇宙航行の力学シンポジウム、国際宇宙技術および科学に関するシンポジウム、アメリカ航空宇宙学会の熱物理および熱伝達に関する会議(AIAA Paper 98-2941)等で発表され、日本航空宇宙学会誌(1999年1月号)に掲載された。
Pf75を標的とする新規熱帯熱マラリア伝搬阻止ワクチンの開発

熱帯熱マラリア原虫の生殖体表面分子(Pf75)が伝搬阻止ワクチン候補抗原である可能性を検定する目的で本研究を実施した。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成した組換えPf75を抗原として、ウサギを免疫して12種の抗血清を作製した。間接蛍光抗体法において3種の抗血清が熱帯熱マラリア原虫の生殖体に強い反応性を示した。抗Pf75抗血清を添加した感染血球を吸血させた蚊と抗GST抗血清添加群の蚊の中腸とに形成されたオーシスト数を比較して原虫の発育阻害効果を検定した。6種の抗血清の添加群においてオーシスト数の有意な減少が認められ、抗Pf75抗体が伝播阻止活性を有することが示された。マラリア伝搬阻止ワクチンは、マラリア制圧の有効な手段として期待が寄せられているにも関わらず、実用化が期待される候補抗原は非常に限られている。申請者らは、ネズミマラリア原虫のミクロガメート表面に局在する新規分子(Py75)が伝搬阻止抗原となることを明らかにした。本研究は、熱帯熱マラリア原虫の相同体(Pf75)の、伝搬阻止ワクチン抗原としての有用性を検討することを目的として以下の研究を実施した。まず、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いた組換えタンパク質の大量合成:熱帯熱マラリア原虫の相同体(Pf75)遺伝子をNF54株の生殖母体含有感染赤血球から抽出したcDNAを鋳型としてC末端側の膜貫通ドメインとN末端側の分泌シグナルを除くほぼ全長の配列をPCR増幅した。増幅した遺伝子産物をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて、GST融合組換えタンパク質(rPf75)として大量合成した。合成したrPf75を用いてウサギまたはマウスを免疫して抗血清を作成した。アフィニティ精製した抗体を用いて、熱帯熱マラリア原虫(NF54株)の生殖母体を抗原とするWestern blotting法および間接蛍光抗体法を実施し、作製した抗体がPf75に特異的に反応することを確認した。また、熱帯熱マラリア原虫(NF54株)の赤血球期原虫を培養して誘導したStage Vの生殖母体および鞭毛放出誘導培地を加えて10分間培養した生殖体を含む感染赤血球を材料として、LR-White Resinを用いた免疫電子顕微鏡用サンプルを作製した。超薄切片を作製し、抗Pf75抗体を用いた免疫染色を行ない、電子顕微鏡を用いた標的分子(Pf75)の詳細な局在解析を実施している。当初に予定した研究のうち、標的分子であるPf75の組換えタンパク質の合成を行い、それを用いてウサギおよびマウスを免疫して特異抗体を作製した。また、熱帯熱マラリア原虫の成熟生殖母体(ステージV)の培養法を確立し、また鞭毛放出誘導培地を用いた生殖体を誘導することにも成功した。Pf75の詳細な細胞内局在を明らかにするため、これらの虫体を材料とした免疫電顕用サンプルの作製を行なうなど、ほぼ予定した研究計画を実施することができた。熱帯熱マラリア原虫の雄性生殖体および生殖体に発現するタンパク質(Pf75)のC末端側領域をコードする遺伝子をNF54株遺伝子を鋳型としてPCR増幅した。増幅した遺伝子産物をコムギ胚芽無細胞タンパク質発現プラスミドベクターに挿入してタンパク質発現用コンストラクトの構築を行なった。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて、GST(Glutation-S-transferase)融合タンパク質として大量合成を行った。合成したrPf75-D5を用いて、マウスおよびウサギの免疫を行って抗血清を作製した。作製した抗血清の熱帯熱マラリア原虫の生殖母体への反応性を確認した。ステージVまで培養により発育させた熱帯熱マラリア原虫の生殖母体を含む感染赤血球に、作製した特異抗体を添加し、更に生殖体への分化を誘導する培養液を加えた後に、顕微鏡下で雄性生殖体形成に対する影響を観察した。具体的には雄性生殖母体から放出される雄性生殖体が周囲の赤血球を巻き込んで活発に運動する部位の単位面積当りの数のコントロールとの比較検討を行なったが、両者に優位な差を見いだすことは出来なかった。熱帯熱マラリア原虫感染赤血球に抗Pf75-D5抗体を混合して再構築した血液を、人工吸血装置を用いてマラリア媒介蚊に吸血させた。十分に吸血した蚊のみを分別し、室温で砂糖水を与える条件で約8日間飼育した後に、蚊を解剖して中腸の外壁に形成されたマラリア原虫のオーシスト数の算定を顕微鏡下で行なった。抗Pf75特異抗体添加群とコントロールとした抗GST抗体添加群で形成されたオーシスト数を比較したところ、マウスの特異抗体において虫体数に有意の差が認められ、伝播阻止活性を有することが示された。本年度に予定していたワクチン候補抗原部位に対する組換えタンパク質の作製、それを用いた特異抗体の作製を順調に行なうことが出来た。また、抗血清と感染赤血球を混合して再構築した血液を人工吸血装置を用いて吸血させた媒介蚊の体内で特異抗体による伝播阻止活性の有無についての検討を行った結果、一部の血清ではあるが伝播阻止活性を有するものが誘導できることを示すことが出来た。ネズミマラリアで伝搬阻止活性が確認された雄性生殖体表面に発現するタンパク質の熱帯熱マラリア原虫における相同体(Pf75)をコードする遺伝子を、熱帯熱マラリア原虫NF54株から抽出した遺伝子を鋳型としてPCR増幅した。

増幅した遺伝子産物をコムギ胚芽無細胞タンパク質発現プラスミドベクターに挿入してタンパク質発現用コンストラクトを構築し、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成を行った。N末端側の変異領域を欠損、あるいはその部位に、GST(Glutation-S-transferase)またはSUMOなどのタグを付加するなどして12種類の組換えPf75を融合タンパク質として合成した。これらを用いてマウスおよびウサギを免疫して抗血清を作製した。作製した抗血清の熱帯熱マラリア原虫の生殖母体への反応性を確認したところ、3種の組換えPf75に対する抗体が熱帯熱マラリア原虫の生殖母体を抗原とする間接蛍光抗体法で強い反応性を示した。さらに、培養によってステージVまで発育させた熱帯熱マラリア原虫の成熟生殖母体を含む感染赤血球に作製した抗体を添加して再構築した血液を、人工吸血装置を用いてマラリア媒介蚊に吸血させた。十分に吸血した蚊のみを分別し、室温で砂糖水を与える条件下において約8日間飼育した後に、蚊を解剖して取り出した中腸の外壁に形成されたマラリア原虫のオーシスト数を顕微鏡下で算定した。抗組換えPf75特異抗体添加群とコントロールとした抗GST抗体添加群の蚊の中腸に形成されたオーシスト数を比較したところ、検定を行った9種の抗体うち1種の抗体を用いたものにおいてオーシスト数に有意な低下が認められ、伝播阻止活性を有することが示唆された。熱帯熱マラリア原虫の生殖体表面分子(Pf75)が伝搬阻止ワクチン候補抗原である可能性を検定する目的で本研究を実施した。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成した組換えPf75を抗原として、ウサギを免疫して12種の抗血清を作製した。間接蛍光抗体法において3種の抗血清が熱帯熱マラリア原虫の生殖体に強い反応性を示した。抗Pf75抗血清を添加した感染血球を吸血させた蚊と抗GST抗血清添加群の蚊の中腸とに形成されたオーシスト数を比較して原虫の発育阻害効果を検定した。6種の抗血清の添加群においてオーシスト数の有意な減少が認められ、抗Pf75抗体が伝播阻止活性を有することが示された。標的タンパク質であるPf75の組換えタンパク質から特異抗体の作製を継続し、抗血清による熱帯熱マラリア原虫伝播阻止活性の検定をめざす。特に、ネズミマラリアの系において相同体であるPy75のC末端領域が伝播阻止活性の高い領域であることが判明したので、Pf75のC末端領域についても組換えタンパク質を合成および抗血清の作製に取り組む。また、これらの抗血清を用いて雄性生殖体の鞭毛放出に対する影響の検討をおこなう。抗Pf75抗血清の伝播阻止効果を明らかにするための人工吸血装置を用いた検定系の構築に取り組む。更にはPf75の熱帯熱マラリア原虫における機能解析を進めるために、Pf75遺伝子欠損原虫の作出にも着手する予定である。引き続き伝播阻止活性を有する抗体の作製を継続して、抗血清による熱帯熱マラリア原虫伝播阻止活性の検定を行なう。また、標的分子の機能を解析するためPf75遺伝子欠損マラリア原虫の作出を継続する。1)コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いた組換えPf75タンパク質と特異抗体の作製:熱帯熱マラリア原虫のPf75の全長および一部の組換えタンパク質を複数作製し、それらを抗原としてマウスおよびウサギを免疫して抗血清を作製する。