hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
行動量と自律神経機能同時測定デバイスによる介護支援システムの構築

高齢社会を迎え、認知症高齢者とそれに伴う介護・看護負担は増加の一途をたどっている。高齢者の認知症発症あるいは増悪因子として転倒・骨折が挙げられるが、その要因として、起立性低血圧(orthostatic hypotension: OHT)が頻繁に指摘されている。OHTは、運動負荷と自律神経機能調節の乖離が原因と考えられるが、自律神経機能は自覚されにくく、容易に変動してしまうため、評価が困難であった。一方近年のウェアラブル端末の発展により、日常生活中の様々な生理指標を継続計測できるようになった。本研究では、心拍変動(heart rate variability: HRV)と加速度を指標に、自律神経機能と運動負荷状況を経時的に定量評価し、自律神経障害の定量的評価を行う。これにより、OHTの発症リスクを適切に行い、ケアの最適化を行う。さらに、転倒予防を行うことで、健康寿命の増進を目指す。平成30年度は、レム睡眠行動障害の患者を対象に、臨床的情報の収集を行い、起立性低血圧試験を実施できた。今回収集した臨床的な情報(レム睡眠行動障害の重症度、認知機能低下、嗅覚障害の程度など)を参照することで、起立性低血圧をきたすリスク因子を同定していく。また、起立性低血圧試験時に記録した、活動量および心拍変動の情報を解析した。その際、高齢者特有の問題を検出した。すなわち、高齢者では高血圧や不整脈の併存症が多いため、心拍変動解析におけるエラーが生じる。このため、当初想定していた周波数領域の解析は不適と判断し、別の解析方法をとることとした。その際、不整脈による心拍変動検出エラーを除くためのプログラムを作成し、その妥当性を検証した。レム睡眠行動障害患者の臨床的な知見(認知機能低下とドパミン神経系の変性の関連)について、国内および国外での学会発表を行った。また国内の学術雑誌および書籍に臨床的知見を報告した。心拍変動解析に際して、高齢者特有の問題の解決に時間を要した。高齢者では高血圧や不整脈の併存症が多いため、心拍変動解析におけるエラーが生じたため、それを解決するためのプログラム作成に時間を要した。これまでの、高齢者を対象とした心拍変動解析に関する文献からは、エラー除去の方法を見つけることができなかった。ポワンカレ解析という、想定していた手法と異なる解析方法に着目することで、エラーに関する妥当性の確立された補正手法を適当することができた。現在、不整脈の検出よびエラー除去の問題は解決できたため、当初想定していたものと別の解析手法を用いて心拍変動解析にあたる予定である。以上、想定していなかったデータの補正に関する問題のため、研究は予定よりやや遅れる結果となった。今後、レム睡眠行動障害患者だけでなく、健常者における同様の実験を遂行していく。これにより、健常者および患者(自律神経障害を高率に合併する)で群間比較することで、軽微な自律神経障害が心拍変動および血圧低下に与える影響を検出する。また、起立前(すなわち臥位の状態)の心拍変動情報から、起立後の血圧低下の予想が可能であるかを検証する。また、患者群において、起立性低血圧に関連する臨床情報を探索的に検討することで、転倒のリスク因子を同定する。さらに、加速度系や心拍変動解析の情報がリスク因子となるかどうかも検討する。転倒のリスク因子を同定することで、将来必要な介護・看護負担の見積りに寄与するものと考える。ウェアラブルデバイスの介護場面での応用も期待される。これらの研究結果を学術誌に報告する予定である。平成28年度は健常被験者を対象に、「横になる」「立ち上がる」などの動作に応じた心拍変動を、ウェアラブルデバイスである専用の心電計を用いて記録した。データ取得のためにスマートフォンとそのアプリケーションを利用した。アプリケーションでは心拍変動だけでなく、加速度も同時に測定している。このため今後予定している行動量推定にも同デバイスの記録を利用する予定である。平成28年度に行った実験では、R-R間隔(心拍から次の心拍までの時間)から算出したLF/HFなどの自律神経指標を用いて、自律神経活動の定量的な評価を試みた。研究開始当初、自律神経活動の指標としての利用を想定していたLF/HFが、想定外に個人間での差や個人内での変動が大きい事が判明した。このため当初予定していたアルゴリズムでのLF/HFによる自律神経活動程度の判別が困難となった。今後、アルゴリズムの最適化を行うとともに、心拍変動から産出される別の指標(NN50など)を参照することも視野に入れ、改めて自律神経活動の定量化に取り組む。

高齢社会を迎え、認知症高齢者とそれに伴う介護・看護負担は増加の一途をたどっている。高齢者の認知症発症あるいは増悪因子として転倒・骨折が挙げられるが、その要因として、起立性低血圧(orthostatic hypotension: OHT)が頻繁に指摘されている。OHTは、運動負荷と自律神経機能調節の乖離が原因と考えられるが、自律神経機能は自覚されにくく、容易に変動してしまうため、評価が困難であった。一方近年のウェアラブル端末の発展により、日常生活中の様々な生理指標を継続計測できるようになった。本研究では、心拍変動(heart rate variability: HRV)と加速度を指標に、自律神経機能と運動負荷状況を経時的に定量評価し、自律神経障害の定量的評価を行う。これにより、OHTの発症リスクを適切に行い、ケアの最適化を行う。さらに、転倒予防を行うことで、健康寿命の増進を目指す。平成28年度は健常被験者を対象に、「横になる」「立ち上がる」などの動作に応じた心拍変動を、ウェアラブルデバイスである専用の心電計を用いて記録した。データ取得のためにスマートフォンとそのアプリケーションを利用した。アプリケーションでは心拍変動だけでなく、加速度も同時に測定している。平成29年度は、健常者、および自律神経障害を高頻度で有するレム睡眠行動障害患者を対象に、起立時の心拍変動解析・加速度の解析を行なった。同時に起立時の血圧変動を測定することで、従来の評価法との互換性を保つ事を意図している。参加者は120名を予定しており現在70名以上で試験を実施した。平成30年度は取得したデータから、従来の自律神経障害を定量的に評価する心拍変動の特徴量を、機械学習で求める事を課題とする。実験計画の策定および公募・試験の実施は概ね順調に進展している。一部の被験者で心拍データ取得に失敗する現象を確認した。姿勢変化時に起こる心電の大きい電位変化および波形が変わる事がその原因と考え、標準的な心電図系を用いることでトラブルシューティングを行っている。トラブルシューティングに実験の追加・解析の追加が必要となったため、当初予定していた行動推定実験は予定よりもやや遅れている。また、レム睡眠行動障害患者の疾患特性調査の一環として、発症後の経過年数による症状頻度の変遷を調べた。当初予想されていた関連(発症後年数が長いほど症状頻度が増加)とは異なり、経過年数2-8年で頻度はもっとも大きくなり、その後は頻度が減少することを確かめた。この知見を国際雑誌に投稿した。
AFMと光散乱法を用いた高分子単一鎖の観測と分子量分布による分子鎖長の評価

【研究目的】高性能原子間力顕微鏡(AFM)による高分子単一鎖の直接観察と、平均分子量分布を高精度で与える光散乱法による測定の比較を通じ、高分子単一鎖の長さ分布と分子量分布の整合性を評価する。標準的な高分子試料を用いて系統的な実験を行うことで、得られる知見の一般化を図る。この取り組みにより、新規に合成された高分子材料の構造評価を行う際、参考データとして有用な情報が得られると期待できる。【研究方法】高分子試料としては、標準的な高分子であるポリメチルメタクリレート(PMMA)を用い、高分子単一鎖の観測には、PMMAをマイカ基板上にキャストし、分散したサンプルを用意し、AFMで観察を行った。得られた画像データから高分子鎖径・長さを見積り、分布図を作成した。また、AFMで用いたPMMAの溶液中での粒径分布を光散乱法により測定した。PMMAの単量体の分子量と長さから推測される高分子鎖の粒径、光散乱法により得られる粒子径分布、AFMにより得られる高分子鎖径・長さ分布を比較することで、分子量情報から得られる粒子径・長さの推測値と、二つの測定方法から得られる実際の高分子鎖の粒子径・長さ分布の整合性を評価し、基板上での高分子単一鎖の形態を考察した。【研究成果】AFMと光散乱法の高分子鎖粒子径分布の比較を通じて、得られる分布の整合性の傾向に関する結果を得た。光散乱法は散乱光として可視領域のレーザーを用いているため、その波長程度の粒子に対しては、確かな統計的な分布を得ることができる。この対象となる領域(数10nm数100nmオーダー)では、二つの装置により得られるデータに整合性を得た。一方で、粒子径が数10nmに満たないものは、光散乱法による検出が困難になり、一方で微視的な形態を画像化できるAFMにより、光散乱法では十分に検出されない分子鎖の断片が基板上で確認でき、10nmオーダーの分子鎖・粒子径ではAFMによる基板上での観察が有効な手段であることを見出した。また、技術面では、AFMによる基板上の高分子鎖観察における分子量の範囲や溶液濃度の条件に関する知見が得られた。今後、これらの成果を活かした研究支援による成果を期待することができると考える。
沖縄先史時代の基層文化の検討(II)

昨年度、熊本大学考古学研究室によるナガラバル東貝塚(68世紀)に参加し、主に第III層よりイネを検出した。沖縄諸島・琉球列島最古のイネである。今年度もまた熊本大学によるナガラバル東貝塚発掘調査に参加し、主に第IV層より土壌のサンプリングを実施した。昨年度の約10倍の土壌サンプル(約800リットル)をサンプルした。その結果、イネ、タブノキ、および堅果類の破片を回収・同定した。層位的には、沖縄・琉球列島最古のイネである。しかしながら、昨年度の結論と同様に、今回の分析においてもイネが沖縄諸島で栽培された事を積極的に示すデータを得ることは出来なかった。おそらく、イネは交易によって入手したのであろう。また、前原遺跡(縄文時代後期相当期)より回収された植物遺体の分析を完了した。この遺跡から得られた植物遺体のサンプリングおよび解釈が正しければ、沖縄諸島においては、縄文後期農耕説も提唱されているが、この時代は狩猟採集の時代であったことになる。また弥生時代相当期には「貝の道」を通して、本土と交易を行ったことが知られているが、沖縄弥生時代人は水田稲作を受け入れなかったようである。さらに、68世紀にはイネを知っていた集団も存在したが、彼らも積極的にイネ(水田稲作)を受け入れなかった。考古植物学的資料および考古学的資料によると、沖縄諸島においては農耕は810世紀に開始されたようである。また、グスク時代の植物遺体を検討すると、この時代の農耕はイネを中心とした水田稲作ではなくアワやコムギ等の雑穀を中心とした畑作農耕であったようである。
心筋の発生分化機構

本研究課題では、Wntシグナルの調節因子をコードする遺伝子に着目し、その遺伝子改変マウスを用いた細胞の系譜を追跡し、左室側心筋に寄与する新たな細胞の起源を同定することを試みた。その結果、左心室までの領域に加えて、流出路領域にも寄与する新たな未分化細胞領域が存在することが明らかとなった。今回の解析から、"右心室以外に寄与する未分化細胞群と、左心室以外に寄与する未分化細胞群が、形成過程にある心筒内に流入することによって区画化された心臓が形成される"という新たな心臓形成モデルを提唱できるものと考えている。本研究は、Wntシグナルの調節因子をコードするSfrp遺伝子に着目し、遺伝子改変マウスを用いてSfrp5遺伝子を発現した細胞系譜を追跡し、左室側心筋に寄与する新たな細胞の起源を明らかにすると共に、Sfrp5の心筋分化における機能を同定することを目的としている。各発生段階におけるSfrp5遺伝子の発現領域をin situ hybridization法を用いて解析したところ、原腸陥入によって形成され前方へと移動していく中胚葉の一部に発現が最初に認められ、心臓原基の背側からやがて心外皮・静脈洞の前駆領域へ、最終的に静脈洞へと推移していくが、心臓を形成する領域には認められなかった。既に心外皮・静脈洞の前駆領域は、心外皮や心外皮を経由して形成される繊維芽細胞や心筋細胞の一部、さらに冠動・静脈の内皮や平滑筋細胞の前駆細胞が存在すること明らかにされているため、マーカー遺伝子との二重染色を行ったところ、これらのマーカー遺伝子の発現とほとんど一致しないことが明らかになった。また、Sfrp5遺伝子座にGFPを挿入したマウスの発現解析を行ったところ、左心室から心房の心臓心筋にもGFPの発現が認められた。さらに、Sfrp1/2/5重複遺伝子欠損マウスでは、ルーピングの途中で心臓の発生が停止し、GFP発現細胞が心外皮・静脈洞の前駆領域にとどまることができなく心蔵領域にのみ観察された。これらの結果から、1)Sfrp5遺伝子が静脈洞へと分化する領域に継続的に発現する新奇の遺伝子である、2)Sfrp5遺伝子を発現した細胞が左心室から心房の心筋の起源となっている可能性がある、3)Sfrpが心筋前駆細胞の未分化性の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。今後さらに解析を進めていき、左室側心筋の発生様式の理解に結びつけたい。これまでに、Sfrp5遺伝子の発現領域は、心臓原基の背側からやがて心外皮・静脈洞の前駆領域へ、最終的に静脈洞へと推移していくが、心臓を形成している領域には認められないこと、心外皮・静脈洞の前駆領域は、心外皮や心外皮を経由して形成される繊維芽細胞や心筋細胞の一部、さらに冠動・静脈の内皮や平滑筋細胞の前駆細胞が存在すること明らかにされているが、これらのマーカー遺伝子の発現とほとんど一致しないこと、Sfrp5遺伝子座にGFPを挿入したマウスの発現解析を行ったところ、左心室から心房の心臓心筋にもGFPの発現が認められることなどから、Sfrp5遺伝子を発現した細胞が左心室から心房の心筋の起源となっている可能性が示唆されている。より詳細に解析するために、Sfrp5遺伝子座にCreを挿入したマウスを新たに作出した。このマウスを用いて、Sfrp5遺伝子を発現した細胞が、心臓内のどの領域に移動し、どういった細胞へ分化するのか、分化マーカーを用いた解析を行っており、左室側心筋の発生様式の理解に結びつけたい。今回、着目した遺伝子の発現領域が、心臓原基の背側、心筒の尾側末端、更に心外膜・静脈洞の前駆領域、最終的に静脈洞へと推移していくが、心臓を形成している領域には認められないことを見いだした。これまでに、心外膜の前駆細胞は、心外膜や心外膜を経由して形成される繊維芽細胞や心筋細胞の一部、さらに冠動・静脈の内皮や平滑筋細胞の前駆細胞へと分化していくことから、心外膜原基に発現するマーカー遺伝子と共発現するか調べたところ、ほとんど一致しないことが明らかとなった。従って、この遺伝子の発現細胞は、心外膜・静脈洞の前駆領域に存在するが、心外膜前駆細胞とは異なる細胞群であることが明らかとなった。

次に、この遺伝子座にGFPを挿入したマウスの発現解析を行った。心外膜・静脈洞の前駆領域の他に、左心室から心房の心臓心筋にもGFPの発現が認められたことから、この遺伝子を発現した細胞が左心室から心房の心筋の起源となっている可能性が示唆された。そこで、この遺伝子を発現した細胞の運命を同定するために、CreもしくはErt2Creをこの遺伝子座に挿入したマウスを新たに作出し、系譜解析を行った。その結果、期待された心房から左心室までの領域に加えて、流出路領域にも寄与することが明らかとなった。このことから、左心室心筋に寄与する未分化な細胞群が存在することが明らかとなった。今回の解析から、"右心室以外に寄与する未分化細胞群と、左心室以外に寄与する未分化細胞群が、形成過程にある心筒内に流入することによって区画化された心臓が形成される"という新たな心臓形成モデルを提唱できるものと考えている。Sfrp5遺伝子座にCreを挿入したマウスの作出に予想以上の時間を要したが、このマウスを用いた解析は時間の問題であるが、条件つきCreマウスについては、未だ作成中であり、このマウスを用いた解析は、遅れが見込まれる。24年度が最終年度であるため、記入しない。期間内に作出するはずの条件つきCreマウスがまだ作成中である。期間中に間に合わない場合は、このマウスを必要とする成体での解析を見合わせ、Creマウスを使ってできる胎仔期の解析に集中する。
糖尿病食から蛋白制限食に変更になった患者の食事療法への認識の再構築の試み

1.食事摂取量を把握するための質問項目と、認識を把握するための質問項目の抽出医学中央雑誌、Medlineを用いて「食事調査」「認識」について検索を行い、食事摂取量を簡単に把握するための質問紙の検討を行った。使い捨てカメラを用いて1週間分の食事をすべて撮影してもらい、終了時に作成した質問用紙に答えてもらい、質問紙の精度を確認した。認識については、文献の自尊感情など既存の尺度と昨年のインタビューの結果から検討し、糖尿病性腎症に特有な項目を加えて質問項目を抽出した。2.糖尿病外来における糖尿病性腎症患者の事例検討O大学附属病院の糖尿病外来に通院している糖尿病性腎症と診断された3名について、昨年のインタビューから得られた結果をもとに、介入を行った。認識について共通していたのは、この先どうなるのかという将来への不安、「不確かさ」であり、このことについては、医療者にも家族にも相談できないで一人で抱えていた。この不確かさが、内服を中止したり、食事を今までどおりの内容で摂取したりという行動に繋がっていることが明らかになった。3名のうち1名は、「不安はあるけどできるだけ生活を楽しみたい」と前向きに考えているため、病院で指導されたとおりでなく、まず食べたいものを少しは食べて、平均的に塩分の摂取量や蛋白質の摂取量を調節するなど工夫をしており、結果として病状は安定していた。糖尿病教室など患者間の交流が自己管理行動を継続するための大きな要素となるが、糖尿病性腎症を合併した人には患者がお互いに交流する機会がないことも自己管理行動の継続を困難にしている要因であると考えられる。また食事療法については、既存の報告と同様に、患者自身が受け入れて生活に取り入れるまで約3年の月日が必要であることが確認できた。3.今後の課題今後の課題として、保存期にある腎不全患者が、健康を維持するために医療者や患者間で気軽に悩みを話すことができる場が必要である。蛋白制限に変更になった患者に医療者の関わり方についても検討する必要が示唆された。糖尿病性腎症と診断された患者の自己管理の状況と治療に対する認識を明らかにすることを目的に以下の項目について実施した。1.文献検討医学中央雑誌、Medlineを用いて「糖尿病性腎症」に関する文献を検討した。糖尿病性腎症については、タンパク制限食の効果、低タンパクが腹膜透析導入後に及ぼす影響、タンパク制限食の効果について、食事療法の腎機能低下抑制効果、栄養評価法などについて研究されていた。すなわちタンパク制限が必要となる第3期以降の患者の食事療法を中心とした治療法については明らかにされていたが、自己理行動と糖尿病食から蛋白制限食に変更になった患者の認識については明らかにされていなかったので、今年度はこの点について明らかにすることを目的とした。2.糖尿病性腎症の患者への面接調査現在O大学医学部附属病院に通院している糖尿病患者のうち、糖尿病性腎症第4期の患者3名に食事の内容と食事についての認識について面接を実施した。食事療法について聞くと「女房がきちんとしています」「自分で気をつけている」「ちくわやハムはやめた」と3人とも以前の食事内容と比較して食事内容を改善していた。しかし、畜尿から食事の摂取タンパク量と塩分量を測定した結果、1名はほぼ指示通り、2名はタンパクも塩分も指示量の2倍ちかく摂取しており、本人が努力していることと目標とする治療が実施できるということは必ずしも一致しないことが明らかになった。また3名の共通点として、食事の摂取カロリーが指示量よりも不足していること、甘いものや油を食べてはいけないと思っていることであった。その原因として、腎症が出現するまでの糖尿病の食事療法を指示通り実施していなかったという後悔の念と今度は健康を回復するために努力したいという気持ちが強く、食事摂取量を少なくしていることが明らかとなった。3.来年度の予定来年度は、血糖値を気にするあまり摂取カロリーを控えるという行動から、必要なカロリーは摂取したうえでタンパク質と塩分を控えることができるよに食事療法についての意識の再構築を行う試みを実施するとともに、糖尿病性腎症と診断された2期4期の自己管理行動について調査票を作成し面接調査を実施する予定である。

3名のうち1名は、「不安はあるけどできるだけ生活を楽しみたい」と前向きに考えているため、病院で指導されたとおりでなく、まず食べたいものを少しは食べて、平均的に塩分の摂取量や蛋白質の摂取量を調節するなど工夫をしており、結果として病状は安定していた。糖尿病教室など患者間の交流が自己管理行動を継続するための大きな要素となるが、糖尿病性腎症を合併した人には患者がお互いに交流する機会がないことも自己管理行動の継続を困難にしている要因であると考えられる。また食事療法については、既存の報告と同様に、患者自身が受け入れて生活に取り入れるまで約3年の月日が必要であることが確認できた。3.今後の課題今後の課題として、保存期にある腎不全患者が、健康を維持するために医療者や患者間で気軽に悩みを話すことができる場が必要である。蛋白制限に変更になった患者に医療者の関わり方についても検討する必要が示唆された。
懸仏の製作技法に関する基礎的研究-自然科学的手法を用いた歴史研究の試み-

懸仏とは、日本古来の神が仏に姿を変えて現れるという本地垂迹説を具現化した資料である。一般的な懸仏は円形銅板に仏像を配したものであり、主に神社などに奉懸され、平安時代後期から室町時代にかけて最も盛行した。本研究では、岐阜県郡上市八幡町那比新宮神社に伝わる懸仏を中心に蛍光X線による元素分析と形態調査を行った。那比新宮神社懸仏の信仰の変遷について調査し、懸仏の形態、及び蛍光X線による元素分析結果を関連付けて考察した。また、那比新宮神社のほかに、大分県日田市老松天満社、長崎県対馬市霹靂神社などにも多くの懸仏が伝世しており、類似の形態を確認することができた。本研究は、懸仏の形態観察と蛍光X線による元素分析の結果から、懸仏の製作技術の変遷を人文科学的な側面と自然科学的な側面から明らかにするものである。那比新宮神社懸仏のうち直径50cmを超える大型のものが10点ほどあるがいずれも優品であり、表現形式や推定製作年代もさまざまである。しかし、懸仏の多くは量産型とも言うべき直径30cm以下の小型品である。これらの形態観察を行った。また、自然科学的分析方法は、蛍光X線分析装置を用いた。可搬型蛍光X線分析装置を那比新宮神社に持ちこみ、町仏の鏡面を中心に測定を行った。鏡面については、鋳造と思われるものからは、銅のほかに、鉛、錫等を検出した。一方、圧延造と思われるものは銅しか検出されないもののほかに、銅に加えて水銀を検出するものが多く存在した。水銀の性質から考えて、合金の段階で添加された水銀が残存しているとは考えにくい。水銀朱等の彩色、空気中の汚損物質の付着、鏡面表現のための鍍水銀等の可能性か考えられる。水銀が検出された理由については、今後、他の懸仏の分析、他の銅製品の製作技法などから考察することとする。また、那比新宮神社のほかに、大分県日田市老松天満社に、多数の伝世懸仏があることを確認し、調査を行なった。その他に、新潟県糸魚川市能生白山神社、香川県善通寺等の懸仏調査を行なった。本研究は、岐阜県那比新宮神社所蔵懸仏の形態観察と蛍光X線による元素分析を行い、その結果及び周辺史料から懸仏の変遷を追うものであり、人文科学的な側面と自然科学的な側面から懸仏の製作技術を明らかにするものである。分析方法としては蛍光X線分析装置を用いた。肉眼観察から、分析項目として表面の鍍金の状態、彩色顔料の同定、銅を初めとする金属同定などが考えられたためである。また、懸仏の多くは量産型とも言うべき小型品であり、これらの形態観察を行うことにより、製作技法の変遷傾向がわかると考えられたため、形態分類を行った。那比新宮神社懸仏のうち8面には銘文が残っており、これと同神社に伝わる大般若経の奥書から信仰の変遷を伺うことができた。それによると3期に分けることができる。これは懸仏の形態分類にも当てはめることができ、本尊の前立てとしての懸仏、仏教との結縁の具現化としての懸仏、現世利益願うものとして懸仏に分類することができる。また、形態のみではなく、懸仏の鏡面の元素分析からも3期に分類することができると考えられる。昨年度同様、過般型蛍光X線分析装置を那比新宮神社に持ちこみ、懸仏の鏡面を中心に測定を行った。さらに、那比新宮神社のほかに、大分県日田市老松天満社、長崎県上対馬市霹靂神社などに多数の伝世懸仏があることを確認し、調査を行なった。これらの懸仏には、那比新宮神社の懸仏と近似の特徴を持つものもあった。
酸味受容体候補の生理機能の検証と食品科学的応用に向けた分子基盤の解明

研究代表者らが世界に先駆けて発見した酸味受容体候補PKD1L3とPKD2L1の生理機能を検証する目的で、それぞれの遺伝子破壊(KO)マウスと二重KOマウスを作出した。KOマウスが、酸味や他の味覚受容に関してどのような表現型を示すかを調べるために、行動学的な2瓶嗜好テスト・リッキングテストと電気生理学的な味神経応答解析を行った。行動学的解析では、いずれのKOマウスも、全ての5基本味物質溶液に対して同腹子の野生型マウスと同様の嗜好行動や忌避行動を示した。一方、味神経応答解析では、PKD2L1 KOマウスと二重KOマウスのクエン酸、塩酸、酢酸に対する鼓索神経応答が、神経束全体と単一神経繊維の両方の場合で、野生型マウスと比較して有意に抑制された。PKD1L3 KOマウスでは酸刺激応答が野生型マウスと同様に観察された。また、舌咽神経ではいずれのKOマウスでも野生型マウスと同様の酸刺激に対する応答を示した。さらに、塩味、甘味、苦味、うま味物質に対しては、鼓索神経と舌咽神経の両方で、いずれのKOマウスも野生型と同様の応答を示した。以上の結果から、PKD2L1は生体内で実際に酸味受容体として機能することが実証され、また、体性感覚など味蕾組織以外を介する酸味受容機構の存在が示唆された。ヒト酸味受容体に関しては、カルシウムイメージング法を用いた機能解析において、クエン酸など酸味物質投与に対してオフ応答を示す機能的なPKD1L3のN末端細胞外領域とPKD2L1の全長領域を同定した。N末端細胞外領域がヒト由来でそれ以降はマウス由来のキメラPKD1L3を、ヒトPKD2L1と共にHEK293細胞に発現させた場合、クエン酸など酸味物質投与に対してオフ応答を示し、また、酸味を甘味に変える味覚修飾物質クルクリゴ果実抽出物存在下でも酸刺激に対する応答が観察された。この実験結果からクルクリゴの酸味抑制機構としては、PKD1L3のN末端細胞外領域以外の領域に対して作用するか、あるいは、味覚受容体レベルではなく、味細胞や神経レベルで抑制される可能性が考えられる。研究代表者らが世界に先駆けて発見した酸味受容体候補PKD1L3とPKD2L1の遺伝子破壊(KO)マウスに関しては、各ホモ変異マウス、及び、二重ホモ変異マウスの獲得に成功した。これらの変異マウスはいずれも生存可能で、発生段階における成長欠損は観察されなかった。また、味細胞の形態とPKD1L3やPKD2L1以外の味細胞マーカー分子の発現も正常であった。さらに、これらの変異マウスが、酸味や他の味覚受容に関してどのような表現型を示すかを調べるために、2瓶嗜好テストとリッキングテストによる行動学的解析を行った。その結果、全ての5基本味物質溶液に関して、同腹子の野生型マウスと同様の嗜好行動や忌避行動を示した。この結果を他のグループによる報告と合わせて考察すると、酸味に関しては、体性感覚など味蕾組織以外を介する受容機構が存在することが示唆された。現在、味蕾における酸味受容を調べることができる味神経応答解析を行っている。

ヒト酸味受容体の同定に関しては、PKD2L1は既に全長を獲得し、PKD1L3はN末端細胞外領域のみ同定できている。N末端細胞外領域がヒト由来でそれ以降はマウス由来のキメラPKD1L3を、ヒトPKD2L1と共にHEK293細胞に発現させた場合、クエン酸など酸味物質投与に対してオフ応答を示すことがCa^2+イメージング法を用いた機能解析から明らかになった。つまり、ヒトPKD1L3の機能的なN末端細胞外領域を獲得できたと言える。現在、このキメラPKD1L3をヒトPKD2L1と共にHEK293細胞に発現させて、味覚修飾物質を添加した場合に酸味応答が抑制されるかを解析している。また、ヒトPKD1L3全長の同定を引き続き試みている昨年度に獲得した酸味受容体候補PKD1L3とPKD2L1の遺伝子破壊(KO)マウスに関しては、それぞれのホモ変異マウスと二重ホモ変異マウスを用いて、酸味物質を含む様々な味物質を投与した際の味神経(鼓索神経と舌咽神経)の電気応答を記録する味神経応答解析を行った。その結果、PKD2L1ホモ変異マウスと二重ホモ変異マウスでは、クエン酸、塩酸、酢酸に対する鼓索神経応答が、神経束全体と単一神経繊維の両方の場合で、野生型マウスと比較して有意に抑制されたのに対して、PKD1L3ホモ変異マウスでは酸刺激応答が野生型マウスと同様に観察された。これは、鼓索神経が投射する茸状乳頭と口蓋の味蕾における両遺伝子の発現の有無を反映していると考えられる。一方、味神経以外の体性感覚神経などを鼓索神経よりも多く含む舌咽神経では、いずれの変異マウスでも野生型マウスと同様の酸刺激に対する応答を示した。さらに、塩味、甘味、苦味、うま味物質に対しては、鼓索神経と舌咽神経の両方で、いずれの変異マウスも野生型と同様の応答を示した。以上の実験結果から、少なくともPKD2L1に関しては、生体内で実際に酸味受容体として機能することが実証された。ヒト酸味受容体に関しては、カルシウムイメージング法を用いた機能解析において、クエン酸など酸味物質投与に対してオフ応答を示す機能的なPKD1L3のN末端細胞外領域とPKD2L1の全長領域を昨年度までに同定していた。N末端細胞外領域がヒト由来でそれ以降はマウス由来のキメラPKD1L3を、ヒトPKD2L1と共にHEK293細胞に発現させた場合、酸味を甘味に変える味覚修飾物質クルクリゴ果実抽出物存在下でも酸刺激に対する応答が観察された。この実験結果から酸味抑制機構としては、PKD1L3のN末端細胞外領域以外の領域に対して作用するか、あるいは、味覚受容体レベルではなく、味細胞や神経レベルで抑制される可能性が考えられる。
新しい抗AIDS剤に対する薬剤耐性株の樹立とその分子生物学的解析

研究室では研究代表者を中心として、年間1,000に及ぶ薬剤の抗HIV活性について検討してきた。その結果としてHIV-1に特異的できわめて活性の高い逆転写酵素阻害剤であるHEPT誘導体を発見、その臨床応用を目指して研究を発展させている。しかしながら,HEPT誘導体の性質として容易に薬剤耐性ウイルスの出現を許すことがわかり,今年度の本重点領域研究において、HEPT誘導体に対する耐性HIV-1の試験管内樹立と,そのウイルス学的および分子生物学的解析を試みた。その結果として,標準HIV-1株であるHTLV-111_Bおよび臨床分離株であるHE株より,それぞれにHEPT耐性ウイルスを樹立することに成功した。これら耐性株のウイルス学的性質は,それぞれの親株の性質とほとんど変わらないものの,薬剤に対する感受性では,HEPTを含めnevirapineやpyridinoneといった,いわゆる非核酸逆転写酵素阻害剤に対して全て交叉耐性を示すことが分かった。一方,AZTやDDIのような既存の抗体AIDS核酸誘導体に対しては耐性を示さず,これらの結果か,異なる種類の薬剤の組み合わせによる併用療法の可能性が示唆された。さらに現在のところまでの分子生物学的解析では,HEPT誘導体に対する耐性HIV-1では,逆転写酵素の遺伝子変異によるアミノ酸の変化(^<103>Lys→Arg,^<108>Val→lle,^<181>Tyr→Cys)が認められ,今後はこのアミノ酸変化がHEPT誘導体に対する薬剤感受性とどのように関わっているを解明する予定である。以上の研究成果を含め,研究代表者は今年度においてなされたHIVに関する研究成果を,日本ウイルス学会,日本エイズ学会,抗ウイルス化学療法研究会および国際ウイルス学会議(米国)で発表するとともに,数編の欧米科学雑誌において公表した。
マイクロ波減菌の基礎的研究

1.マイクロ波の吸収と加熱のメカニズムを解明した。母体となるセラミックスに膜厚の異なる金属コーティングを施しマイクロ波の吸収率を変化させ、温度上昇率の変化を調べた。膜厚を変えたフィルターに一定出力のマイクロ波を照射し、フィルターの温度をモニタリングすることによりマイクロ波の吸収と加熱のメカニズムを明らかにした。2.マイクロ波照射によるOHラジカルの発生メカニズムのメカニズムを解明した。シリカアルミナ系の母材にアナターゼ型のチタニアをコーティングし銀をコーティングしたフィルターにマイクロ波を照射し、OHラジカルの発生の有無を調べた。アナターゼをコーティングした後マイクロ波を照射すると、加熱とマイクロ波照射による相互作用によりOHラジカルが発生することがわかった。OHラジカルの発生を調べるために、アナターゼに銀及び五酸化バナジウムをナノコーティングし、薄膜の表面をXPSで分析を行い、異常酸素の発生を調べ異常酸素の発生を確認した。OHラジカルの発生メカニズムを明らかにした。3.OHラジカルによる減菌効果のメカニズムを解明した。OHが発生するフィルターを用いて減菌実験し、OHラジカルの減菌効果を調べた。マイクロ波照射とOHラジカルの相互作用により急速に減菌できたことを理論的に明らかにした。4.金属イオンによる減菌効果のメカニズムを解明した。銅イオンの減菌効果を調べた。銅フィルターに菌を滴下し、マイクロ波を照射せずに減菌実験を行い、銅イオンの減菌効果を確認した。
新たな炎症性腸炎モデルの確立

我々はTNFレセプターファミリーのアダプター分子であるtraf2^<-/->マウスは生後間もなく大腸炎を自然発症し、生後23週以内に死亡することを見いだした。そのメカニズムとして、TRAF2はTNFa依存性の腸管上皮細胞のアポトーシスを抑制し、腸上皮のアポトーシス亢進の結果もたらされる腸内菌フローラの変化を抑えて大腸のホメオスタシスを維持することにより、大腸炎の自然発症を防げることを明らかにした。TNFレセプターファミリーのアダプター分子であるtraf2^<-/->マウスは生後間もなく大腸炎を自然発症し、23週以内に死亡することを見いだした。組織学的な検討により、炎症は大腸に限局していて、主にB細胞が浸潤することが明らかとなった。また、野生型マウスと比べてtraf2^<-/->マウスの大腸では制御性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+)の比率の低下が認められず、一方B1細胞(B220+CD5+)の比率の有意な増加が認められた。traf2^<-/->マウスの骨髄細胞を野生型マウスに移入して作製したキメラマウスでは腸炎が認められなかった。16SrRNA系統解析を用いて大腸の常在菌を検討した結果、野生型マウスと比べてtraf2^<-/->マウスの腸内菌フローラの明らかな変化が認められ、また、traf2^<-/->マウスに授乳期より抗生物質を投与することで大腸の炎症細胞の浸潤が部分的に改善された。さらに、組織蛍光免疫染色法を用いた解析で、6mf2^<-/->マウスの腸管上皮細胞の活性化caspese3の発現亢進が認められた。以上のことより、traf2^<-/->マウスで認められる大腸炎は局所における腸管上皮の機能破綻とB1細胞の分化異常が強く関係することが示唆された。組織学的な検討により、炎症は大腸に限局しており、腸管上皮細胞のアポトーシスの亢進と粘膜下層におけるCD5+B細胞の浸潤が顕著であることが明らかとなった。また、野生型マウスと比べてtraf2^<-/->マウス腸管の抗菌ペプチドの発現は低下しており、腸内菌フローラの明らかな変化も認められた。一方、大腸における炎症性サイトカインのil-6, tnfα, il-17およびil-22の発現亢進が認められた。更に、traf2^<-/->マウスの腸管ではil-17やil-22を産生するLymphoidtissueinducer(LTi)-like細胞のパセンテージの増加が認められた。traf2^<-/->マウスとifn-γやil-17の欠損マウスを交配し二重欠損マウスを作製しても大腸炎の改善は見られなかったが、tnfr1ノックアウトマウスと交配することにより炎症性サイトカインや腸管上皮細胞のアポトーシスの亢進は抑制され、大腸炎もほぼ完全に改善された。以上のことより、traf2^<-/->マウスで認められる大腸炎は局所における腸管上皮のアポトーシス亢進とCD5+B細胞やLTi-like細胞の分化異常が強く関係することが示唆された。
温帯落葉果樹の休眠制御における低温シグナルの機能に関する研究

低温が落葉果樹の自発休眠期に及ぼす影響について明らかにするため、様々な低温量に遭遇させたニホンナシ`幸水'および`豊水'における代謝の変化を検討した。0時間から750時間の低温に遭遇させた花芽における一次代謝産物についてメタボローム解析を行い、代謝産物の変化について検討した。主成分分析を行った糖リン酸、有機酸などが低温遭遇に伴い変化していたこと、また0時間から300時間の代謝産物と600時間、750時間の芽の代謝産物とで大きな違いがあることが明らかになった。さらに、花芽における糖代謝関連酵素、および糖含量を解析するとともに、シアナミドや硝酸カリウム処理の影響について解析した。本研究では、温暖化や異常気象がもたらす果樹の発芽異常の原因とメカニズムの解明するため、ニホンナシなどの温帯落葉果樹の休眠導入や休眠打破における低温の役割について明らかにする。そのために、本年度は、異なる低温条件下においた休眠芽の代謝について調査した。(1)異なる低温遭遇条件においた際の花芽の萌芽とネクロシス休眠に必要な低温積算に寄与する7.2°C以下の低温遭遇開始時期をそれぞれ11月、12月、1月に設定した区を設け、休眠打破には不十分な600CHに遭遇させた芽の萌芽、およびネクロシスについて調査した。その結果、低温遭遇開始時期が遅くなるほど花芽中の小花のネクロシスが増加することが明らかになり、さらに、12月に低温に遭遇させ始めた花芽と1月に始めた花芽とでは、ネクロシスが発生する原因が異なる可能性が示された。(2)自発休眠導入初期のニホンナシ花芽におけるメタボローム解析低温に一定期間遭遇させた後、サンプリングした花芽のメタボローム解析を行った。その結果、低温に遭遇した花芽では、遭遇しなかったものと比べて、TCA回路を含む呼吸関連の代謝系の他、アミノ酸代謝等に変化が認められることが明らかになった。2.休眠芽における植物ホルモン関連遺伝子の発現解析および5'上流域の単離と解析(1)アブシシン酸生合成および代謝酵素遺伝子の上流域の単離ニホンナシおよびモモよりゲノムDNAを単離し、genome walker kitにより、アブシシン酸の生合成酵素9-cis epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)遺伝子およびABA8'水酸化酵素遺伝子の上流域のクローニングを試みた。また、モモの休眠芽におけるNCED遺伝子の発現様式について定量PCRにより解析した。本研究では、温暖化や異常気象がもたらす果樹の発芽異常の原因とメカニズムの解明するため、ニホンナシなどの温帯落葉果樹の休眠導入期や休眠打破期における低温の役割について明らかにする。このため、本年度は、ナシの休眠芽における代謝変化をより詳細に確認し、芽において発現している休眠関連遺伝子について解析することを目的とした。1.休眠打破時における芽の代謝変化について平成23年度に引き続き、異なる低温遭遇量のニホンナシ花芽について、メタボローム解析を行った。具体的には、低温量が不足した花芽(約600CH)、および十分な低温量に遭遇した花芽(750CH)について基本的な代謝産物、アミノ酸などについて比較検討した。その結果、各処理区における代謝物は、個体差が大きく、エネルギー代謝関連の化合物などにおいて、一部変動があるものの、休眠打破期の基礎代謝は低温蓄積量による違いは大きくないことが示唆された。2.ニホンナシゲノムからのレドックス関連遺伝子上流領域の単離と解析シアン耐性呼吸末端酸化酵素(Alternative Oxidase:AOX)遺伝子の発現制御因子を明らかにするため、ニホンナシの'豊水'の幼葉より、ゲノムを単離し、Genome Walker kitを用いて、アダプターの付加されたライブラリーを作製した。それらを鋳型にAOX2の遺伝子配列を含むプライマーを用いて、遺伝子の上流域を含む断片のクローニングを行い、遺伝子配列を解析した。本研究では、温暖化や異常気象がもたらす果樹の発芽異常の原因とメカニズムの解明するため、ニホンナシなどの温帯落葉果樹の休眠導入期や休眠打破期における低温の役割について明らかにすることを目的に、ナシの休眠芽における代謝変化をメタボローム解析等を行った。平成24年度においては、平成23年度、24年度において行った解析について詳細な解析を行った。特に、異なる低温量(0CH, 300CH, 600CH, 750CH)に遭遇したニホンナシ`幸水'花芽のメタボローム解析結果について、多変量解析を行い、主成分解析、階層的クラスター分析を行った。その結果、0CH、300CHと比較して、600CH, 750CHに遭遇した芽では、大きく代謝物のパターンが変化していることが明らかになった。中でも、多くの核酸や糖リン酸において、増加傾向が認められた。

リン酸化合物の中でもADP, 3PGAなどは、低温処理依存的に増加している可能性が見出された。また、有機酸の中に、低温処理により増加しているものが複数見出され、代謝の変化が起こっていることが予想された。休眠芽におけるアミノ酸含量については、低温処理により減少するものが多数見出された一方で、メチオニンなどの増加するアミノ酸も見出された。今回の解析の結果からは、0CHと300CHとの間の違いは大きくなかったが、300CHから600CHとの間には大きな代謝変化があることが考えられた。低温量が約600CHでは、低温遭遇量が正常な萌芽に不十分だとされたが、今回の結果からは、十分な低温量に遭遇した花芽(750CH)の代謝物との違いは個体差も大きく明確ではなかった。メタボローム解析による花芽全体の代鮒物の量的ばらつきが個体間で大きく、植物材料の再調整や、処理区の再検討を行う必要が出てきたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。代謝の変動、およびABA生合成・代謝関連酵素、レドックス関連遺伝子の上流域の特性解析については、引き続き解析を進め、より上流域の配列決定を目指す。代謝変動を比較する試料の調整を人工的な環境下で行い、温度の影響を単純化する。
損傷修復過程における遺伝子発現を指標とする受傷後経過時間推定に関する研究

本研究は受傷後経過時間の推定,すなわち創傷の陳旧度の判定および受傷時期の生前・死後の鑑別に有用なマーカーの検索とその評価を目指したものである。実験モデルの作成にあたり,侵襲形態として切創・熱傷・電撃等について検討を行ったが,侵襲量定量化が容易であること等からマウス切創モデルを採用することとした。血管増殖に関わるサイトカインとされているbasicfibroblast growthfactor(bFGF)およびvascular endothelial growthfactor(VEGF)の発現動態を免疫組織化学的に観察し,さらにその遺伝子の発現についてin situハイブリダイゼーションやリアルタイム定量PCR法などの技法を用いて検討した。その結果bFGFは受傷後0.51時間後の線維芽細胞と24144時間後の表皮細胞において,VEGFは72,144時間後の表皮細胞において発現を認め,これらの染色像は死後変化に対して比較的耐性があり,また死後損傷によっては発現されないことが確認された。特に前者は表皮細胞のみならず線維芽細胞でも発現が確認できること,受傷後早期にタンパク発現を認めることなどから,受傷後経過時間推定にとってより有用なマーカーたりうると考えられた。そこでさらに,bFGFおよび線維芽細胞から発現しているとされるfibronectinについてその遺伝子発現について検討したところ,bFGFは受傷後早期に遺伝子発現量が増加するが,fibronectinは受傷後発現量は増加するものの特徴的な経時的変動を認めなかった。またbFGFについて他臓器の損傷に対しても同様に検討を進めたところ,肝損傷・腎損傷では受傷後遺伝子発現量の変動を認めなかったが,脳損傷においては受傷後経時的に遺伝子発現量が変動していることが明らかになった。以上の知見より,bFGFの遺伝子発現パタンは外胚葉系組織の損傷において,受傷後急性期の指標となりうる可能性が示唆された。実験モデルの作成にあたり,侵襲形態として切創・熱傷・電撃等について検討を行い,侵襲量定量化が容易であること等から,マウス切創モデルを採用することとした。なお,後二者については,表皮細胞核の形態的変化のメカニズムについて検討し,核伸張現象の原因が真皮膨張による圧迫機転によるものと考えられることを示した。5週齢のDDY雄性マウスにペントバルビタールで腹腔内麻酔後,背部に長さ2cmの皮膚全層にわたる切創を作成し,30分240時間後にマウスを屠殺し,皮膚を採取した。これを試料として,血管増殖に関わるサイトカインとされているbasicfibroblast growthfactor(bFGF)およびvascular endothelial growthfactor(VEGF)の発現動態を免疫組織化学的に検討した。その結果,損傷組織においてはbFGFは8144時間後の線維芽細胞と72,144時間後の表皮細胞において発現が認められ,VEGFは72,144時間後の表皮細胞において陽性であった。これらの染色像は死後変化に対して比較的耐性があり,また死後損傷によっては発現されないことが確認された。さらに炎症細胞浸潤とほぼ同時に皮膚での発現が増強しており,その関連が示唆された。bFGFとVEGFとを比較した場合,前者は表皮細胞のみならず線維芽細胞でも発現が確認できること,早期にタンパク発現を認めることなどから,受傷後経過時間推定にとってより有用なマーカーであることが示唆された。そこで,今後bFGF遺伝子発現につきin situ hybridization法,およびRT-PCR法を用いて検討を行うこととし,これに着手した。本年度は,前年度に引き続き各種血管修復因子の受傷後発現について免疫組織化学的検討を行うとともに,それらの因子のmRNAの動態を検索し,受傷後経過時間推定への応用の可能性について検討を行った。損傷モデルは切創とし,雄性マウスに切創作成後経時的に受傷組織を回収した。

遺伝子発現については,発現量の定量にリアルタイム定量PCR法を,発現部位の同定にin situ hybridization法を用いて検討した。前年度の検討でbasicfibroblast growthfactor(bFGF)は0.51時間後の線維芽細胞と24144時間後の表皮細胞において,vascular endothelial growth factorは72,144時間後の表皮細胞において発現を認めていたが,受傷部位からの距離との関係についてさらに検討したところ,いずれの因子も受傷部位から5mmまでの部位を中心に発現していたので,同部においてサイトカインが特に変動しているものと考えられた。血管修復因子の受傷後の遺伝子発現の経時変化について,まず皮膚損傷の発現動態を検索した。検討する因子は免疫組織化学において良好な結果が得られたbFGFと線維芽細胞から発現しているとされるfibronectinとした。その結果,bFGFは受傷後早期に遺伝子発現量が増加するが,fibronectinは受傷後発現量は増加するものの特徴的な経時的変動を認めなかった。そこでさらにbFGFについて肝損傷・腎損傷・脳損傷に対しても同様に検討を進めたところ,肝損傷・腎損傷では受傷後遺伝子発現量の変動を認めなかったが,脳損傷において受傷律経時的に遺伝子発現量が変動していることが明らかになった。以上の知見より,bFGFの遺伝子発現パタンは皮膚損傷・脳損傷において,受傷後経過時間推定の指標となりうる可能性が示唆された。今後ヒト剖検例についての検討を進める。
カルモデュリンとの相互作用から見た神経制御物質の機能の解明と新物質の探索

本年度はフェノチアジン類,メリチン,マストパランおよび合成マストパラン誘導体についてCaMとの相互作用様式を結晶学的,物理化学的に解析し、HPLCによる複合体の分離,生体膜との結合性,溶血作用を検討した。1.各種複合体の結晶化条件を改良した。例えば母液のpHを下げること,ポリエチレングリコール8000を用いること,複合体をHPLCで分離してから結晶化するなどである。【Ca^(2+)】-CaM-クロルプロマジン複合体結晶については【K_2】Pt【Cl_4】,Pb【(CH_3COO)_2】による重原子同型置換の条件を確立し、4【A!°】分解能の回折強度データを集めた。構造因子の相対変化は1314%であった。2.マストパランT誘導体(T′-11,T′-14)を液相法で合成し、【Ca^(2+)】-CaMとの相互作用をCDスペクトルにより解析した。両ペプチドともCaMとの複合体形成時に見られるのと類似のスペクトルが3075%TFE添加により200300nm附近に観測された。その絶体値はマストパランの場合より小さい。3.【Ca^(2+)】-CaM-ペプチドの複合体のイオン交換HPLCによる分離を試みた。メリチンと【Ca^(2+)】-CaMのモル比を順次変えて混合し、DEAE-5PWカラムに添加してから0-0.4Mの食塩濃度直線勾配により溶出した。CaMの溶出位置より前に複合体が溶出された。複合体の確認は逆相カラムで行った。ただし、マストパランおよび誘導体ではCaMとの複合体は認められなかった。4.上記ペプチドとCaM-Sepharose4Bおよび赤血球膜との結合活性を比較した。メリチン,マストパランは前者に関してはマストパラン誘導体より結合能は大きいが、赤血球膜との結合性に関しては有意な差はなかった。5.溶血活性はメリチン80に対してマストパラン10,マストパラン誘導体で両者とも0であった。このように各ペプチドはCaMとの相互作用,赤血球膜との結合性,溶血活性に関して明らかに異なる挙動を示し、相互作用様式の違いを示唆していると思われる。
遺伝子発現誘導型の癌モデル動物における癌性カヘキシア発症の分子メカニズム

癌活性型K-ras遺伝子(K-rasG12V)を条件的に発現するがん動物モデルを用いて、骨格筋特異的K-rasG12V発現により多形型横紋筋肉腫が誘導され、これが癌性カヘキシアモデルとなることを示した。由来する腫瘍細胞株の移植動物の表現型解析と腫瘍の解析により、炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン6(IL-6)、脳性ナトリウム利尿ポリペプチド(BNP)、副甲状腺ホルモン関連蛋白の重要性を示唆し、これまで癌病態との関連性がよく知られていないBNPが、カヘキシアの発症に関連する可能性を示した。さらに交配実験から、転写因子FoxN1が宿主の癌性カヘキシアの感受性関連因子であることを示した。我々は、自ら開発したモデル動物を用いて、癌性カヘキシアについてがん細胞と宿主の両面から解析してきた。炎症性サイトカイン・インターロイキン6(IL-6)と脳性ナトリウム利尿ポリペプチド(BNP)がカヘキシアを誘発する能力の極めて低いがん細胞をカヘキシア高誘発細胞に悪性転換する知見から、カヘキシー誘導能の獲得にIL-6とBNPがそれぞれのシグナル伝達系でクロストークする可能性を想定しin vitro系にてその可能性をテストした。まず、特殊加工シャーレ内3次元培養によって、カヘキシー誘発細胞(RMS3)がスフェロイドを形成し、IL-6を強く発現誘導することを示した。次にある新規物質が、正常脾臓細胞のリポポリサッカライド(LPS)刺激依存IL-6誘導発現を阻害せず、腫瘍細胞スフェロイド形成に伴うIL-6誘導発現を抑制することを見出した。スフェロイド形成でBNPも誘導され、新規物質によって濃度依存的にスフェロイド形成に伴うIL-6誘導発現の抑制の傾向も認められ、今後の解析の方向性を示唆する結果を得た。がん性悪液質発症は、がん細胞の性質のみならず、宿主側の因子によっても規定されることをFoxN1ミュータントC57BL/6ヌードマウスにおいても実証した。RMS3皮下移植後、野生型C57BL/6では筋肉・脂肪量低下を伴う強い悪液質症状を示すが、C57BL/6ヌードマウスは強い抵抗性を示した。FoxN1がどのようなメカニズムで悪液質症状に寄与するかは全く不明であるが、われわれの系がtumor-host相互作用の観点から悪液質発症を捉えるよいモデルであることを示している。血清タンパク質の二次元電気泳動と質量分析によるプロテオミクス解析によりカヘキシア血清特異的なたんぱくの複数同定が進んだ。がん経過中に起こるがん性悪液質は、主として栄養失調に基づく病的な全身の衰弱状態であり、がん死の約20%において直接的原因となっており、がんの異常増殖や浸潤・転移などと並ぶがんの悪性化の指標となりえる。しかしながら、その分子基盤は大部分が未解明である。申請者らは自ら確立した条件的遺伝子改変型の横紋筋肉腫モデル動物と樹立した細胞株を用いて、がん性悪液質の発症機序を腫瘍因子とホスト因子およびその相互作用の観点で解析してきた。過年度まで、炎症性サイトカインIL-6と脳性ナトリウム利尿ポリペプチド(BNP)が、カヘキシアを誘発する能力の極めて低いがん細胞クローン株RMS6をカヘキシア高誘発細胞に悪性転換する知見を得た。今年度はこれらの分泌因子のシグナルクロストークの可能性についての解析を行った。肉腫由来のカヘキシア高誘発株を移植し、腫瘍形成後、腫瘍のBNPのRNA量は腫瘍のIL6のRNA量と血清IL-6たんぱく濃度のいずれにも有意に正の相関を示した(それぞれF=0.0024、F=0.01)。しかしながら、抗IL-6受容体抗体によって、腫瘍細胞株移植時からIL-6シグナルを遮断しても腫瘍のBNPのRNA量に変化はなかったことから、BNPシグナル伝達系がIL6シグナル伝達系の上位であることが示唆された。このことは、RNA干渉により、IL-6またはBNP遺伝子を部分的サイレンシングを行った結果、BNPサイレンシングはIL-6のRNA量を減少させたが、IL-6サイレンシングによってはBNPのRNA量は変化しなかったことからも支持される。さらにRMS6とBNP遺伝子導入細胞株RMS6-BNPに由来する腫瘍の発現mRNAについてマイクロアレイ解析を実施し、新たに副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)遺伝子を見出した。癌性カヘキシアはがん患者の食欲減退・栄養失調を伴う全身衰弱、骨格筋と体脂肪の著明な減少を伴う「るいそう」、浮腫、貧血などの症状を引き起こし、患者の治療の障害となるばかりか、Quality of Lifeを低下させ、さらに予後を不良とする。