hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミミズ体壁筋を用いた微小流路内流体制御・物質輸送システムの創出

マイクロ流路を含むチップは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製し、逆止弁もPDMS薄膜で形成した。また、ミミズ体壁筋の張力を効果的にダイヤフラムに伝えるため、力変換機構であるプッシュバーは高め(2mm)に設計した。結果、肉眼で十分確認できるレベルの高流量(5 μL/min)が実現でき、ポンプ機能が実証できた。今後の細胞デバイス発展にとって意義深い結果である。当該年度は、実際にミミズの体壁筋を用いたポンプを実現することができ、まずは当初の計画を達成できたといえる。さらに、それだけにとどまらず、その流量が当初想定していたnL/minオーダーではなく、肉眼で容易にリアルタイムに流れが確認できるレベルのuL/minオーダーまで出ていることも明らかになったことから、研究代表者らが以前に開発した心筋細胞ポンプなどの従来の細胞デバイスの性能を遥に凌駕するデバイスが作製でき、当所の目的以上に進展がみられたといえる。掌サイズの基板上の微細流路に化学・生化学プロセスを集積したマイクロ流体チップは次世代型実験ツールとして注目されているが流体や物体の駆動には流路に比べ大きく煩雑なシステムが必要である。一方、生体の筋組織は精緻な化学・力学的機能が集約された流体制御素子であり、これを組み込むことで飛躍的に高集積・高機能なデバイスを実現可能との着想のもと、申請者は以前心筋を用いたポンプを開発したが、外部制御が困難という問題があった。そこで申請者はミミズの体壁筋に着目した。これは心筋や平滑筋のような流体制御に適した膜環状構造を持ちながら骨格筋のように瞬発性・制御性が高く、また体表の剛毛と併せて蠕動運動も可能なきわめて高度な筋組織であり、本研究ではこれを用いた微小流路内での流体制御および物体輸送システムの創成を目的とした。当該年度は、前年度までに実証したミミズ体壁筋を用いたポンプの実績をベースに、これを流体を止める装置であるバルブに展開した。バルブはポンプと違い、確実に穴をふさぐ大きな変位に加えて持続的な収縮力が求められる。そこで、電気刺激を断続的に与え、持続的に収縮できるようにすることで、電動バルブを動作させることに成功した。さらに、化学刺激による持続的な収縮力を利用したバルブも実証し、これにより駆動源のみならず、刺激もすべて化学物質によるアクチュエータをはじめて実証した。今後の細胞バイオデバイス発展にとってきわめて意義深い結果である。当該年度は、実際にミミズの体壁筋を用いたポンプに引き続きバルブを実現することができ、まずは当初の計画を達成できたといえる。また、電気刺激のみならず化学刺激によるバルブ駆動も実証できたことから、本来のバイオアクチュエータである、化学物質オンリーでの駆動・制御ができることが証明され、順調に目的が達成できているといえる。
機能性有機分子の低次元π電子ナノネットワーク構造の生成と評価

・光増感型複合π電子系有機ナノ結晶の光物理化学過程と光物性の解明異なるπ電子系有機分子を光励起エネルギーのドナー(D)とアクセプター(A)として複合化した光増感型複合有機ナノ結晶を新たな分子ナノ集合系として生成し,そのDおよびA蛍光強度のDA混合比依存性(A/D=10^<-6>10^<-1>)を定量的に評価した。複合ナノ結晶におけるDA間およびAA間のForster半径を見積もり,Forster励起エネルギー移動(FRET)効率のA/D値依存性を与えるモデルをForster理論に基づいて独自に構築した。さらにそれらをForster理論に基づいて構築したモデルによって解析し,DA,AA間のFRET効率のDA混合比依存性を明らかにした。これにより蛍光強度比のA/D値依存性を1つのパラメーターのみで非常に良く再現することに成功した。その結果,この系では光合成系のような2桁以上におよび光吸収断面積の増大効果によってA分子の励起状態を限られたナノ空間に高密度に生成させることができ,それを利用することでAA間の励起子対消滅効率を制御できることを明らかにした。この結果から,光増感型複合有機ナノ結晶が高効率な単一光子発生源として振る舞う可能性を示唆された。・単一分子ナノ集合体の光子相互相関測定法の開発昨年度,独自に開発したレーザー走査顕微蛍光分光装置に,新たにHanbury-Brown-Twiss型光子相互相関計測システムを導入した。この装置では無偏光ビームスプリッターで1:1に分割した信号光子を2つの単一光子検出器でそれぞれ検出し,光子到達時間間隔のヒストグラムを時間相関単一光子計数法によって測定する。現在までに,連続光を励起光源とした光子相互相関測定に成功し,単一π電子系分子ナノ集合体の光子アンチバンチング挙動を調べることが可能となった。分子性材料として活発に研究が行われているπ電子系有機分子集合体の物性や機能の発現機構を段階的な分子自己集合(クラスターアプローチ)によって解明することは重要である。ところが、π電子系有機材料のほとんどは極めて高い融点を持った不揮発性固体であり、クラスターを効率よく生成する方法が確立されていない。本研究では、それらのクラスターを生成するための新たな方法を開発し、特に低次元π電子ナノネットワーク構造体を生成してその物性解明を行うことを目指している。本年度はその目的に向け、以下のことを行った。単一有機ナノ結晶の顕微発光分光と光安定性:基本的なπ電子系有機材料であるテトラセンやルブレンのナノ結晶を作製し、その単一ナノ結晶の発光スペクトルを測定した。励起子の非局在化に基づく長波長側へ大きくシフトした超放射発光が観測されたが、室温・大気中におけるナノ結晶の光安定性はきわめて悪く、特に小さいサイズについて測定を行うことが困難であった。そこで単一クラスター測定を可能にする一つの方策として形状の類似した異種π電子系有機分子と混合した複合ナノ結晶を作製し、その光安定性の評価をおこなった。その結果、光安定性を著しく向上させることに成功し、サイズの小さいナノ結晶まで単一粒子の発光スペクトルの測定が容易にできるようになった。単一有機分子の検出とその振動分光:単一クラスター計測のための顕微分光装置の性能の評価と向上を推進する一環として、表面増強ラマン散乱(SERS)効果が強い色素分子であるローダミン6G(R6G)の単一分子検出に取り組んだ。極微量のR6G分子を吸着させた銀ナノ粒子凝集体の一部にレーザー光を照射し、SERS信号のブリンキングやスペクトル拡散などの現象の観測に成功した。これにより本装置で単一分子(あるいは極めて少数個の分子)の検出とその振動分光が可能であることを確認された。
液相プラズマ法による新しい炭素系無機物質の合成プロセスの開発

本研究は液相プラズマという全く新規な反応系を創出し、新しい炭素系無機物質を一段階で直接合成するための手法を開発、確立することを目的とする。従来このような高エネルギー条件下での反応は選択性に乏しいという見解が一般的であったが、本研究はプラズマと液相との相互作用およびそれから誘起される溶液内反応を積極的に活用することで活性種の反応性の制御を実現するものである。液相プラズマ媒体として水溶液を用い、プラズマ励起により誘起される溶液中の有機成分の酸化分解反応を詳細に検討し、水分子の解離に由来するヒドロキシルラジカルが最も量要な活性種であることを明らかにした。また液相媒体をポリクロロメタンとして、プラズマ分解により生成する炭素質固体の分離精製を試みた。1.プラズマ生成条件下での液相内有機酸化反応の機構的解明(1)大気圧直流プラズマを用いてフェノール類の酸化分解反応を検討し、中間酸化生成物を精査した。(2)酸化活性種の生成速度をヨードメトリーにより定量的に明らかにした。(3)分解速度に対する反応制御因子の影響に基づく速度論的考察からヒドロキシルラジカルを主要な酸化種とする反応機構を推定した。(4)交流高電圧をプラズマ源として用いた場合にも同様の反応機構が成立することを確かめた。(5)プラズマ生成活性種の同定のため発光スペクトルの解析をおこなった。2.液相プラズマ反応からの活性種を利用する無機反応設計(1)ポリクロロメタンおよびポリクロロエチレンから高度不飽和結合を有するC1-C6のハロカーボンが生成することを見出した。(2)プラズマ発生電極上および溶液中に生成する炭素質固体の性状解明のため分離精製を試みた。(3)超炭素活性種としてラジカルとともにカルベン種の生成が示唆された。本研究は液相プラズマという全く新規な反応系を創出し、無機活性種に加えて有機分子由来の活性種をも最大限に活用することで新しい炭素系無機物質を一段階で直接合成するための手法を開発、確立することを目的とする。液相プラズマ媒体として水溶液を用い、プラズマによって誘起される液相内反応の基本的性格を明らかにすることを試みた。また液相媒体をパーハロカーボンとして、そこで生成する一次および二次的活性種の同定と反応性の解明を検討した。1.プラズマ生成条件下での液相系の物理化学的挙動の解明(1)大気圧直流プラズマを用いた場合の反応制御因子である電流および電圧に対するプラズマ雰囲気ガスの影響を詳細に検討し、液相内反応の主要活性種は溶媒分子由来であることを明らかにした。(2)交流高電圧をプラズマ源として用いた場合についても同様の解析を進めている。2.液相プラズマ反応からの活性種を利用する無機反応設計(1)四塩化炭素から高度不飽和結合を有するC1-C6のハロカーボンが生成することを見出した。(2)超活性炭素種としてラジカルとともにカルベンの形成が強く示唆された。

液相プラズマ媒体として水溶液を用い、プラズマ励起により誘起される溶液中の有機成分の酸化分解反応を詳細に検討し、水分子の解離に由来するヒドロキシルラジカルが最も重要な活性種であることを明らかにした。また液相媒体をポリクロロメタンとして、プラズマ分解により生成する炭素質固体の分離精製を試みた。1.プラズマ生成条件下での液相内有機酸化反応の機構的解明(1)大気圧直流プラズマを用いて種々のフェノール類の酸化分解反応を検討し、中間酸化生成物を精査した。また分解速度に対する反応制御因子の影響に基づく速度論的考察からヒドロキシルラジカルを主要な酸化種とする反応機構を推定した。(2)交流高電圧をプラズマ源として用いた場合についても同様の解析を進めた。2.液相プラズマ反応からの活性種を利用する無機反応設計(1)ポリクロロメタンおよびポリクロロエチレンから高度不飽和結合を有するC1-C6のハロカーボンが生成することを見出した。(2)プラズマ発生電極上および溶液中に生成する炭素質固体の性状解明のため分離精製を試みた。本研究は液相プラズマという全く新規な反応系を創出し、無機活性種に加えて有機分子由来の活性種をも最大限に活用することで新しい炭素系無機物質を一段階で直接合成するための手法を開発、確立することを目的とする。従来このような高エネルギー条件下での反応は選択性に乏しいという見解が一般的であったが、本研究はプラズマと液相との相互作用およびそれから誘起される溶液内反応を積極的に活用することで活性種の反応性の制御を実現するものである。(2)酸化活性種の生成速度をヨードメトリーにより定量的に明らかにした。(3)分解速度に対する反応制御因子の影響に基づく速度論的考察からヒドロキシルラジカルを主要な酸化種とする反応機構を推定した。(4)交流高電圧をプラズマ源として用いた場合にも本質的には同様の反応機構が成立することを確かめた。(5)プラズマ生成活性種の同定のため発光スペクトルの解析を行った。(2)プラズマ発生電極上および溶液中に生成する炭素質固体の性状解明のため分離生成を試みた。(3)超炭素活性種としてラジカルとともにカルベン種の生成が示唆された。
死亡者の飲酒後経過時間推定に関する法医学的研究

平成11年度から本年度にかけて、死体から採取される体液中に含まれるエタノール濃度を測定し、主として飲酒によるエタノールの吸収・分布・排泄が各体液へ時間的に不均衡に起こることに着目して、飲酒後もしくは飲酒終了後から死亡までの経過時間を推定することが可能かどうかについて検討した。体液中のエタノール濃度測定を行なった酩酊死亡85例について測定した各体液中のエタノール濃度の相関係数は次のようであった。心臓血・大腿静脈血=0.923、心臓血・尿=0.848、心臓血・脳脊髄液=0.926、心臓血・硝子体=0.796、大腿静脈血・尿=0.860、大腿静脈血・脳脊髄液=0.905、大腿静脈血・硝子体=0.905、尿・脳脊髄液=0.772、尿・硝子体=0.902、脳脊髄液・硝子体=0.872。飲酒から死亡までの時間が既知の剖検例においては、飲酒後経過時間の短いほど血液と硝子体との濃度比が小さく近い値を示した(但し、血中濃度>硝子体中濃度は0例)のに対して、経過時間の長いものでは大きくなる(血中濃度<硝子体および他)という、当初の予想通りの傾向が確認された。飲酒後経過時間推定は、1)エタノール濃度差の大きな体液同士の比率と、2)飲酒の時間的状況の明瞭な症例での飲酒後経過時間という2つのパラメーターの比較によって可能になるとの仮説に基づいている。本研究では、特に後者の情報収集について、統計学的に有意な所見を見出すには至るほど症例数が集まらなかったため、実用的な飲酒後経過時間を算出するための具体的なノモグラムを作成は出来なかったが、尚長期にわたる多数の症例収集を行なうことにより算出のための精度向上が期待できると考えられた。本研究の目的である死体における飲酒後経過時間推定のために,各飲酒後死亡例における血液(心臓血・大腿静脈血),尿,脳脊髄液および硝子体中のエタノール濃度パターン分析を実施している.平成12年2月末までに弘前大学分だけで24例の飲酒後死亡症例が集まり,研究分担者の所属機関から10数例の症例がストックされている.現在この作業は継続中であるが,統計学的分析にはさらに多くの症例が必要であると考えられる.また当初の予想どおり飲酒前後の時間的状況が特定できる症例は限られていることから,死亡前の飲酒状況に関する情報収集法についても随時検討を加えている.諸体液中の詳細なエタノール濃度パターン分析は,現時点ではこのように中途段階にとどまっているが,実際に収集した症例間で同パターンを比較してみたところ,脳脊髄液の測定値が硝子体のそれに近い場合が多いようであるため,今後ある程度症例数が蓄積できた段階で脳脊髄液と硝子体とにおけるエタノール濃度の相関性について,総合的な結論を得る前に検討しておくことも必要と考えている.これら2種類の体液は,尿よりも遺体から採取できる可能性が高く,また死後産生エタノールの影響も血液や尿と比較して低いと予想される.これら2種類の体液の相関関係は,当初の予想よりも飲酒後経過時間推定上重要な役割を果たす可能性が大きいのではないかと考えられるので,今後これらのデータを中心に分析を続けてゆくことにしている.平成11年度に引き続き,本研究の目的である死体における飲酒後経過時間推定のために,飲酒後死亡例における体液中のエタノール濃度分析を行っている.平成12年3月から平成13年2月末までに弘前大学分だけで取り扱った解剖例数は昨年度よりも多く全部で156例あり,うち体液アルコール検査を実施した例は100例であった.

このうち体液中より有意濃度のアルコールが検出されたものが24例あり,他機関ならびに前年度と併せて60数例の事例が収集出来ている.平成12年度分(平成12年3月から平成13年2月末まで)だけでみた各体液間におけるアルコール濃度の相関係数は,心臓血:大腿静脈血=0.89,心臓血:尿=0.75,心臓血:脳脊髄液=0.93,心臓血:硝子体=0.87,大腿静脈血:尿=0.90,大腿静脈血:脳脊髄液=0.92,大腿静脈血:硝子体=0.96,尿:脳脊髄液=0.92,尿:硝子体=0.96,脳脊髄液:硝子体=0.93であり,従来の報告どおり大腿静脈血と硝子体のアルコール濃度の相関性が高いことは示されている.これまで比較されることが少なかった血液以外どうしの相関性については,特に脳脊髄液と尿および脳脊髄液と硝子体において予想外に強いことが示されている.しかし,個々の症例について比較すると,尿中アルコール濃度/脳脊髄液中アルコール濃度は最低0.36から最高2.78,また硝子体中アルコール濃度比/脳脊髄液中アルコール濃度比が最低0.60から最高1.41で,前者の方がばらつくことから,昨年度に予想したもの以上に,尿と脳脊髄液とのアルコール分布に飲酒後から死亡までの時間的要素が大きく寄与していることが伺われた.次年度は,主としてこのように諸体液の濃度にばらつきの大きな症例の収集を目指し,飲酒後経過時間によるアルコール分布のパターン化を試みることとしたい.平成11年度,12年度に引き続き,本研究の目的である死体における飲酒後経過時間推定のために,飲酒後死亡例における体液中のエタノール濃度分析を行っている.平成13年3月から平成14年2月末までに弘前大学分だけで取り扱った解剖例数は全部で152例あり,うち過半数について体液アルコール検査を実施した.このうち体液中から有意濃度のアルコールが検出されたものが17例あり,他機関ならびにこれまでと併せて約80例の事例が収集出来ている.平成13年度分(平成13年3月から平成14年2月末まで)だけでみた各体液間におけるアルコール濃度の相関係数は,心臓血:大腿静脈血=0.94,心臓血:尿=0.17,心臓血:脳脊髄液=0.96,心臓血:硝子体=0.87,大腿静脈血:尿=0.25,大腿静脈血:脳脊髄液=0.94,大腿静脈血:硝子体=0.93,尿:脳脊髄液=0.02,尿:硝子体=0.14,脳脊髄液:硝子体=0.88であり,従来の報告どおり大腿静脈血と硝子体のアルコール濃度の相関性が高いことは示されている.これまで比較されることが少なかった血液以外どうしの相関性については,時間の影響を受けやすい尿との関係においてばらつきが大きいようである.昨年度の予想にした時間的要素以外の条件でも尿と他の体液とのアルコール分布パターンに大きな変動を生じる可能性があることが伺われた.次年度は,引き続き諸体液の濃度にばらつきの大きな症例の収集を目指し,飲酒後経過時間によるアルコール分布のパターン化を本研究と総括したい.平成11年度から本年度にかけて、死体から採取される体液中に含まれるエタノール濃度を測定し、主として飲酒によるエタノールの吸収・分布・排泄が各体液へ時間的に不均衡に起こることに着目して、飲酒後もしくは飲酒終了後から死亡までの経過時間を推定することが可能かどうかについて検討した。体液中のエタノール濃度測定を行なった酩酊死亡85例について測定した各体液中のエタノール濃度の相関係数は次のようであった。心臓血・大腿静脈血=0.923、心蔵血・尿=0.848、心臓血・脳脊髄液=0.926、心臓血・硝子体=0.796、大腿静脈血・尿=0.860、大腿静脈血・脳脊髄液=0.905、大腿静脈血・硝子体=0.905、尿・脳脊髄液=0.772、尿・硝子体=0.902、脳脊髄液・硝子体=0.872。
マイクロRNAによる心筋リプログラミングと分子基盤の解明

我々はこれまでに心筋リプログラミング遺伝子を導入することで直接心筋作製可能であることを示してきた。しかしリプログラミングの分子機構は不明であり、また転写因子のみによる心筋の誘導効率は十分でないなどの課題もある。我々は本研究で心筋マイクロRNAであるmiR-133が心筋リプログラミングをマウスおよびヒト細胞で促進すること、さらにその分子メカニズムとしてmiR-133がSnai1を直接抑制して線維芽細胞の形質を抑制し心筋誘導することを見出した。本研究は世界で初めて心筋リプログラミングの分子基盤の一端を明らかにした論文である。1.心筋特異的に発現するマイクロRNAの網羅的解析心筋リプログラミングを促進するマイクロRNAを見出すため、まずその候補因子として心筋特異的に発現するマイクロRNAを同定した。方法としては自ら開発した心筋細胞と線維芽細胞のFACSによる細胞選別法を用いて(Ieda et al, Dev Cell, 2009)、心筋特異的マイクロRNAの発現をマイクロアレイ法で解析。実験の結果、既知のmiR-1,miR-133に加えて複数の新規心筋特異的マイクロRNAを見出した。2.心筋直接リプログラミングを促進するマイクロRNAの同定新規のものも含めた複数の心筋特異的マイクロRNAの中から心筋リプログラミングを促進するマイクロRNAを同定する。スクリーニング方法としてはαMHC-GFPマウスの心臓線維芽細胞にGata4/Mef2c/Tbx5の3因子を導入する際に、同時にマイクロRNA機能を増強するマイクロRNA mimic (miR)を導入して心筋誘導効果をαMHC-GFP、cardiac troponin T (cTnT)の心筋マーカーでFACSにより定量的に解析する。これまでの実験でmiRの遺伝子導入効率が90%以上であること、心筋リプログラミングを促進する心筋特異的マイクロRNA (miR-133)を同定することに成功した。今後さらにスクリーニングを続け、さらに心筋誘導を改善するマイクロRNAがないか検討する。またマイクロRNAのみで心筋リプログラミングが可能かも検討する。心筋リプログラミングを促進する可能性のある新規マイクロRNAを予想外に同定し、さらに過剰発現実験などによるマイクロRNAの性質を調べる追加実験の必要が生じたため。3.マイクロRNAにより誘導される心筋様細胞の経時的変化マイクロRNAによる心筋リプログラミング促進効果の分子基盤を明らかにするため、経時的に誘導心筋細胞の遺伝子発現や生理機能を解析した。方法としてはaMHC GFPマウスを用いて、このマウス線維芽細胞にGata4, Mef2c, Tbx5 (GMT)あるいはGMT/miR-Xを導入して誘導心筋細胞の遺伝子発現変化をqRT-PCRで、心筋特異的蛋白の発現や横紋構造をFACSや免疫染色で確認した。生理機能は自発的に細胞内カルシウム濃度変化を有する細胞数や自律拍動する細胞数の変化を解析した。これまでの実験で、1qRT-PCRでmiR-Xによる心筋遺伝子の上昇や線維芽細胞遺伝子の発現低下が認められること、2免疫染色ではmiR-Xにより横紋構造を有する心筋様細胞の数が著増すること、3生理機能として自律拍動する細胞数はGMT群と比較して7倍に増加し、さらに細胞拍動までの期間も短縮できることを見出した。4.マイクロRNAによる心筋リプログラミングの分子基盤解明(1)マイクロRNAによる心筋リプログラミング促進制御機構マイクロRNAによる心筋リプログラミングの制御機構を解明するため、miR-X導入により発現が変化する遺伝子を網羅的に解析した。方法としてはGata4, Mef2c, Tbx5 (GMT)あるいはGMT/miR-Xを線維芽細胞に導入して経時的に誘導心筋細胞をFACSで回収して全遺伝子発現をマイクロアレイ法で解析した。その結果、上昇した遺伝子は心筋特異的遺伝子が有意であること、逆に低下した遺伝子は線維芽細胞特異的遺伝子が有意であることを確認した。心筋リプログラミングを促進するマイクロRNAを同定する検討を行った。その結果、心筋リプログラミングを促進するmiR-Xを同定でき、当初のマイルストーンは達成した。一方、miR-X以外にも複数の新規マイクロRNAを同定することができたため、これら新規マイクロRNAの機能、心筋リプログラミングの分子メカニズム解析を追加で行う必要が出た。新規のものも含めた複数の心筋特異的マイクロRNAの中から心筋リプログラミングを促進するマイクロRNAを同定した。スクリーニング方法としてはMHCーGFPマウスの心臓線維芽細胞にGata4/Mef2c/Tbx5の3因子を導入する際に、同時にマイクロRNA機能を増強するマイクロRNA mimic (miR)を導入して心筋誘導効果をαMHC-GFP、cardiac troponin T (cTnT)の心筋マーカーでFACSにより定量的に解析した。これまでの実験でmiRの遺伝子導入効率が90%以上であること、心筋リプログラミングを促進する新規心筋特異的マイクロRNA (miR-X)を同定することに成功した。次にマイクロRNAによる心筋リプログラミングの制御機構を解明するため、miR-X導入により発現が変化する遺伝子を網羅的に解析した。方法としてはGata4, Mef2c, Tbx5 (GMT)あるいはGMT/miR-XをMHCーGFPマウスの線維芽細胞に導入して経時的に誘導心筋細胞をFACSで回収して全遺伝子発現をマイクロアレイ法で解析した。変化した遺伝子群の特徴をGO term解析、Pathway解析、Scatter plot解析などにより検討して、miR-Xによりどのような性質をもった遺伝子群が上昇するか、または低下するかを明らかにした。

その結果、miR-Xにより100以上の遺伝子が上昇し、300以上の遺伝子が低下することを見出した。さらにはScatter plot解析の結果、上昇した遺伝子は心筋特異的遺伝子が有意であること、逆に低下した遺伝子は線維芽細胞特異的遺伝子が有意であることを確認した。当初の予定通りに新規のものも含めた複数の心筋特異的マイクロRNAの中から心筋リプログラミングを促進するマイクロRNAを同定することができた。またマイクロRNAによる心筋リプログラミング促進制御機構やそのターゲット遺伝子を解明し、心筋リプログラミングの分子基盤解明をすることができた。マイクロRNAはシードシークエンスと配列が一致する遺伝子の3-UTR領域に直接結合して、遺伝子の発現を抑制して機能する。そこで心筋リプログラミングの分子基盤を解明するため、miR-Xの作用を説明できるターゲット遺伝子を同定した。方法としてはmiR-X導入により発現が低下する遺伝子をマイクロアレイ法で探索して、候補遺伝子をTargetScanなどのBioinformaticsで絞り込んだ。最終的に候補遺伝子の発現抑制をルシフェラーゼアッセイ、遺伝子発現や蛋白発現の低下をqRT-PCRやWestern blotなどで確認する。これまでの実験でmiR-Xの新規ターゲットとなる標的遺伝子Yを同定することに成功した。遺伝子YはEpithelial-Mesenchymal Transition(EMT)のマスター遺伝子として知られており、miR-XによるYの発現抑制により線維芽細胞の表現型が消失することを説明できる。さらに遺伝子Yの過剰発現によりmiR-Xによる心筋誘導効果が抑制されることも確認しており、miR-XによるYの抑制と線維芽細胞の表現型消失が心筋リプログラミング促進の分子基盤の一つであることが示唆された。さらに上記マウス研究で同定したmiR-Xを自ら同定したヒト心筋リプログラミング因子(GMTMM)と一緒にヒト線維芽細胞に導入して、ヒト心筋誘導効果を解析した。具体的にはこれまでの研究で得た知見や材料を利用して、qRT-PCR、免疫染色、FACS、マイクロアレイや生理機能的検査(Caイメージ、細胞拍動、パッチクランプ)でヒト心筋誘導が確認できた。我々はこれまでに心筋リプログラミング遺伝子を導入することで直接心筋作製可能であることを示してきた。しかしリプログラミングの分子機構は不明であり、また転写因子のみによる心筋の誘導効率は十分でないなどの課題もある。我々は本研究で心筋マイクロRNAであるmiR-133が心筋リプログラミングをマウスおよびヒト細胞で促進すること、さらにその分子メカニズムとしてmiR-133がSnai1を直接抑制して線維芽細胞の形質を抑制し心筋誘導することを見出した。本研究は世界で初めて心筋リプログラミングの分子基盤の一端を明らかにした論文である。
重症虚血肢に対するハイブリッド治療-センダイウイルス遺伝子治療と細胞移植療法-

重症虚血肢(CLI)に対するセンダイウイルス遺伝子治療と自己骨髄細胞移植(末梢血単核球細胞移植療法)のハイブリッド治療の基礎的研究としてCLIマウスでのシロスタゾールの血管新生効果を検討したところシロスタゾールには血管新生効果があり、その効果はNOを介した経路によって機能していることが推測された。今後はさらにVEGF、HGF等をはじめとした分子物質の発現に関して検討し、重症虚血肢に対するセンダイウイルスを用いたハイブリッド治療の臨床応用へ進展させることが引き続きの課題である。本年度は、重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いた遺伝子治療と自己骨髄細胞移植あるいは末梢血単核球細胞移植療法のハイブリッド治療の完成を目指すための基礎研究としてマウス重症虚血肢モデルにおけるシロスタゾールを用いた血管新生効果の検討を行った。【方法】マウス野生型を用いて左大腿動脈およびその分枝を結紮して虚血モデルを作成しシロスタゾール投与群(Cil群)と通常飼料投与群(Ctr群)で血管新生の程度を比較・検討した。その評価にはレーザードップラーを用いた。またNO合成酵素阻害剤であるNG-nitro-L-arginine methyl esterを連日、腹腔内投与した群においてもCil群、Ctr群に分けて同様の比較・検討を行なった。【結果】Cil群ではCtr群と比較して術後3日目、7日目では血流に有意差を認めなかったが14日目ではCil群では有意に血流の改善が認められ、シロスタゾールが血管新生を促進させる方向に働いていることが推測された。また、NO合成酵素阻害剤であるNG-nitro-L-arginine methyl esterを連日20mg/kg腹腔内投与した群では、Cil群、Ctr群共に血管新生は抑制された。このことから、シロスタゾールには血管新生効果があり、この効果はNOを介した経路によって機能していることが推測された。【今後の課題】シロスタゾールの血管新生効果にNOが関与していることに関しての組織学的な検討や追加実験が必要と考えられ、次年度は標本の筋肉組織サンプルからのeNOSやVEGF、HGF等をはじめとした分子物質の発現に関して検討し、重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いたハイブリット治療の臨床応用へ進展させることが引き続きの課題である。シロスタゾールには血管新生効果があり、この作用はNOを介した経路によって機能していることが前年度の研究結果より推測された。本年度は重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いた遺伝子治療と自己骨髄細胞移植あるいは末梢血単核球細胞移植療法のハイブリッド治療の完成を目指すための基礎研究としてマウス重症虚血肢モデルにおけるシロスタゾールの血管新生効果の更なる検討を行った。【方法】マウス野生型を用いて左大腿動脈およびその分枝を結紮して虚血モデルを作成しシロスタゾール投与群(Cil群)と通常飼料投与群(Ctr群)で術後5日目虚血肢筋肉サンプルを採取して蛋白の電気泳動および免疫染色であるWestern blottingを行い、eNOS、リン酸化eNOS、α-Tublinの発現を比較検討した。【結果】Cil群ではCtr群と比較し、α-Tublin、TOTALのeNOSでは2群間に差を認めなかったが、Ser1177のリン酸化eNOSはシロスタゾール群で増加していることが判明した。以上よりシロスタゾール投与により、術後5日目の時点で、蛋白量とeNOSの総量には変化がみられず、eNOSの活性化が増加することが解った。【今後の課題】本年度における標本の筋肉組織サンプルからの研究によりシロスタゾールの血管新生効果にNOが関与していることが判明したが来年度はさらにVEGF、HGF等をはじめとした分子物質の発現に関して検討し、重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いたハイブリット治療の臨床応用へ進展させることが引き続きの課題である。本年度は重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いた遺伝子治療と自己骨髄細胞移植あるいは末梢血単核球細胞移植療法のハイブリッド治療の完成を目指すための基礎研究としてマウス重症虚血肢モデルにおけるメトプォルミンの血管新生効果の検討を行った。【方法】マウス野生型を用いて左大腿動脈およびその分枝を結紮して虚血モデルを作成しメトプォルミン投与群(high dose群(MtH群)、low dose群(MtL群))と通常飼料投与群(Ctr群)で術後3, 7, 14, 21, 28日目にレーザドプラ血流計による下肢血流の評価を行った。【結果】レーザードプラ血流計による解析では虚血肢/健肢の平均値は術後3日目でMtH群0.04、MtL群0.14、Ctr群0.14、7日目でMth群0.07、MtL群0.43、Ctr群0.24、であった。以上よりMtL群ではCtr群と比較して虚血状態が改善したと考えられるが、MtH群では改善を認めなかった。【今後の課題】

今までの標本の筋肉組織サンプルからの研究によりシロスタゾールの血管新生効果にNOが関与していることが判明し、またlow doseメトプェルミンの虚血改善作用効果が示唆された。さらにVEGF、HGF等をはじめとした分子物質の発現に関して検討し、重症虚血肢に対するセンダイウィルスを用いたハイブリット治療の臨床応用へ進展させることが今後の引き続きの課題である。
Ｋｖ１．３移入線維芽細胞による不全心筋の活動電位再生と逆リモデリング誘導の研究

心不全における心筋リモデリングでは、一過性外向きカリウムチャンネル(Ito)発現低下による活動電位の延長を来し、さらに細胞内カルシウム過負荷による心筋傷害を引き起こして心不全を悪化する。本研究では、活動電位を正常化して心筋の逆リモデリングを誘導することを目的とした。過去の研究で十分なIto発現の誘導ができなかったため、今回の研究では、Kv1.3+Kir2.1を移入した線維芽細胞を心筋に移植する方法を採った。線維芽細胞は心筋と電気的に結合し活動電位を正常化してカルシウム過負荷を防止する。本研究では、線維芽細胞でKir2.1の移入が安定せず、目標の線維芽細胞を完成できない段階で研究期間が終了した。ラット心筋組織に移植するための線維芽細胞ラインを作成しイオンチャネルの発現状態を確認中である。レトロウイルスベクターシステムとしてはpDON-5Neoを使用し、Kv1.3とKir2.1を移入用のベクターを作成した。移植用の線維芽細胞株は、移植後の生着率を考慮し、2種類用意した。一つはマウス線維芽細胞株(NIH-3T3)であり、もう一方はラット線維芽細胞株(NRK)である。心不全モデル動物への移植ステップにおいていずれを用いるかは、生着率と電気生理学的変化の程度によって決定する予定である。NIH-3T3とNRKに対するチャネルの発現は、RT-PCRおよびWestern blottingによりすでに確認したが、Kv1.3の発現量が少ない可能性があり、再現性をチェックしている。細胞内局在の確認のために、免疫染色を準備中である。Kv1.3移入線維芽細胞の移植については、正常Lewisラットをペントバルビタール麻酔下に左側側開胸し、露出した左心室表面に26G針で注入する。なお、Kv1.3移入細胞の移植による心不全や不整脈の治療効果を検証するためのモデルとしては、当初自己免疫性心筋炎ラットモデル(Lewisラット)を想定していたが、急性期の死亡率が高くなることを懸念し、イソプロテレノール短期・間欠的投与による心不全モデルに変更した。本モデルは、既報により、電気的リモデリングが主体で、構造的変化の少ない心不全が誘発されることが示されている。これまでに心不全、心筋線維化の発現とともに、局所の酸化ストレス増大(HEL染色)を確認し、また心筋活動電位の延長、不応期の延長を確認している。心筋へのKv1.3移入線維芽細胞の心不全および不整脈の治療効果は、移植部心筋の電気生理学的特性変化、不整脈誘発性、組織学的変化、ならびに心臓超音波による心機能評価等で検証する。ラット心筋組織に移植するための線維芽細胞ラインを作成しイオンチャネルの発現状態を確認した。レトロウイルスベクターシステムとしてはpDON-5Neoを使用し、Kv1.3とKir2.1を移入するためのベクターを作成した。移植用の線維芽細胞株は、移植後の生着率を考慮し、2種類のオプションを用意した。心不全モデル動物への移植ステップにおいていずれの細胞株を用いるかは、生着率と電気生理学的変化の程度によって決定する。NIH-3T3とNRKに対するチャネルの発現は、RT-PCRおよびWestern blottingによりすでに確認したが、Kv1.3の発現量が極端に少なく、原因は今年度中には明らかに出来なかった。Kir2.1については、免疫染色によって細胞膜への分布を確認できた。Kv1.3移入線維芽細胞の移植については、正常Lewisラットをペントバルビタール麻酔下に左側側開胸し、露出した左心室表面に26G針で注入する方法を用いる。なお、Kv1.3移入細胞の移植による心不全や不整脈の治療効果を検証するためのモデルとしては、当初自己免疫性心筋炎ラットモデル(Lewisラット)を想定していたが、急性期に重度の心不全を来すために死亡率が高くなることを懸念し、イソプロテレノール短期・間欠的投与による心不全モデルに変更した。これまでに心不全、心筋線維化の発現とともに、局所の酸化ストレス増大(HEL染色)を確認し、また心筋活動電位の延長、不応期の延長を確認した。心筋へのKv1.3移入線維芽細胞の心不全および不整脈の治療効果は、今後の研究において移植部心筋の電気生理学的特性変化、不整脈誘発性、組織学的変化、ならびに心臓超音波による心機能評価等で検証する。ラット心筋組織に移植するための線維芽細胞ラインを作成中である。レトロウイルスベクターシステム(pDON-5Neo)を使用し、Kv1.3とKir2.1を移入するためのベクターを作成した。移植用の線維芽

細胞株は、移植後の生着率を考慮し、2種類用意した。一つはマウス線維芽細胞株(NIH-3T3)であり、もう一方はラット線維芽細胞株(NRK)である。実験後半においていずれの細胞株を用いるかは、生着率と電気生理学的変化の程度によって決定する予定である。NIH-3T3とNRKに対するチャネルの発現は、RT-PCRおよびWestern blottingによりすでに確認した。細胞内局在は、現在免疫染色によって確認中である。Kv1.3移入線維芽細胞の移植については、正常Lewisラットをペントバルビタール麻酔下に左側側開胸し、露出した左心室表面に26G針で注入する方法を用いる。なお、Kv1.3移入細胞の移植による心不全や不整脈の治療効果を検証するためのモデルとしては、当初自己免疫性心筋炎ラットモデル(Lewisラット)を想定していたが、急性期に重度の心不全を来すために死亡率が高くなることを懸念し、イソプロテレノール短期・間欠的投与による心不全モデルに変更して採用する予定である。本モデルは、既報により、電気的リモデリングが主体で、構造的変化の少ない心不全が誘発されることが示されている。心筋へのKv1.3移入線維芽細胞の心不全および不整脈の治療効果は、移植部心筋の電気生理学的特性変化、不整脈誘発性、組織学的変化、ならびに心臓超音波による心機能評価等で検証する。移植用の線維芽細胞の設計およびラインの作成は概ね順調であるが、イオンチャネル発現量に問題があり、設計を見直す必要が出る可能性もある。移植対象とするラットモデルを変更する方針を採用したことから、マクロ的な評価、手術手技の確認等、具体的な手順に遅れが生じている。移植用の線維芽細胞の設計およびラインの作成は概ね順調であるが、移植対象とするラットモデルを変更する方針を採用したことから、マクロ的な評価、手術手技の確認等、具体的な手順に若干の遅れが生じている。移植のためのKv1.3+Kir2.1移入線維芽細胞株におけるイオンチャネル発現を確認するとともに、これを1正常ラットへ移植し、移植の方法と電気生理学的効果を検証する、2心不全モデルへ移植し治療効果を確認するステップを各々予定している。それぞれに計画年度3年目を充当する予定である。移植のためのKv1.3+Kir2.1移入線維芽細胞株は順調に作成されているので、これを(1)正常ラットへ移植し、移植の方法を検証する、(2)心不全モデルへ移植し治療効果を確認するステップを各々予定している。それぞれに計画年度2年目、3年目を充当することで、概ね計画通りの進行が期待できる。概ね当初の計画通りである。細胞株ラインの維持、チャネル発現確認のための試薬・抗体の購入、移植先となるラットの購入と飼育、などの費用へ使用することを予定している。
正常圧水頭症における非侵襲的治療の検討

神経疾患における歩行障害の病態機序解明を目的とし、正常圧水頭症での歩行障害ときわめて類似した病態を呈する血管性パーキンソニズムに着目した。この病態では足がすくんで出せない状態、すなわちすくみ足もみられる。すくみ足は正常圧水頭症でもみられ、転倒頻度の増加を来し生活レベルの低下に直結する。白質病変を来した患者では、血管性パーキンソニズムを呈することが多い。頭部MRIでの拡散強調画像の拡散性の定量評価を行い得られたデータと、肝要な臨床症状のひとつであるすくみ足との関連について解析し、論文を作成した。全脳でのFA, MD, AD, RDはすべてFOGQと有意に相関した。局所的には、FOGQとFAでは運動前野直下の左上縦束、右脳梁、左大脳脚において負の相関を認め、一方FOGQとMDでは左放線冠と右脳梁において、またFOGQとAD, RDでは左放線冠において正の相関を認めた。これらのことからすくみ足には神経回路を構成する種々の部位が多因子的にかかわることが証明された。この研究は、歩行やそれに随伴するすくみ足についての病態解明を行ったものであり、極めて重要な知見が得られた。東北大学医学研究科から京都大学医学部に所属が変更となったために、予定していた動作解析実験などが東北大学で継続できないこととなり研究の計画変更を余儀なくされた。ただし、現所属は環境としてすぐれている面も多く、こちらでの環境を生かしてさらに研究を進めていく所存である。東北大学医学研究科から京都大学医学部に所属が変更となった。そのために、予定していた動作解析の実験などが東北大学で継続できないこととなり研究の計画変更を余儀なくされた。ただし、後述するように現所属は環境としてすぐれている面も多く、こちらでの環境を生かしてさらに研究を進めていく所存である。所属変更のため若干の遅れはやむを得ないが、新たな環境を生かして更なる研究の飛躍に邁進する所存である。東北大学から京都大学に異動となった。そのため、主たる研究として正常圧水頭症患者の募集については、京都大学関連病院と連携して行うこととする。反復経頭蓋刺激を含む電気生理学的検査、および手技については現所属が専門のため、より施行しやすくなった。また、神経イメージングに関しても前所属と同様実施しやすい環境にある。反復経頭蓋磁気刺激の解析ソフトウェア購入、経頭蓋直流刺激装置購入、関連病院にて汎用で使用するための患者記録用カメラおよびビデオ購入、解析に必要なMATLAB含めたソフトウェアのライセンス購入および更新。成果の国内、海外発表のための旅費、被験者の謝金、等に使用する予定である。次年度使用額は、当初所属の東北大学にて計画していたトレッドミル購入を次年度に延期し、異動先の京都大学にて執行予定とすることによって生じたものであり、延期したトレッドミル購入に必要な経費として、平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。
カイコを利用したヒト病原性RNAウイルス感染モデルの開発

1.カイコを利用したインフルエンザウイルス感染モデルの開発本研究ではインフルエンザウイルスのカイコ感染モデル開発の実現可能性について検討した。ウイルスの宿主特異性の問題を克服するために、インフルエンザウイルスの糖タンパク質を汎親和性の水泡性口内炎ウイルスの糖タンパク質(VSV-G)に置換した改変型ウイルスを用いた。本ウイルスをカイコ培養細胞へ接種した結果、ウイルスゲノムに組込まれたgfp遺伝子に由来するmRNAおよびタンパク質の経時的な増加が観察されたことから、カイコ細胞へ改変型インフルエンザウイルスが接着・侵入し、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現が起こることが示された。さらに、カイコ幼虫へ本ウイルスを接種した結果、その体内からgfp mRNAが検出されたことから、改変型インフルエンザウイルスのカイコ体内での感染が示唆された。インフルエンザウイルスの感染モデルとして無脊椎動物の利用を初めて提案したのは本研究が初めてである。なお本研究は、東大・医科研の河岡義裕教授、野田岳志特任助教との共同研究として行った。2.レオウイルスのカイコ感染モデルの確立による抗ウイルス薬評価系の開発レオウイルスのカイコ感染モデルを開発するため、同科に属する細胞質多角体病ウイルス(CPV)を利用してカイコ幼虫個体でのin vivo感染系を確立した。通常CPVのカイコに対する致死性は低いが、本研究では九大・院農・遺伝子資源開発研究センターに保存されているカイコ(80系統)からCPV感染死を起こす系統を見いだし、治療候補化合物の効果を個体の生死に基づいて評価する方法を確立した。今後は、CPVのin vivo感染系と昨年度に確立したin vitro感染系とを組み合わせて抗ウイルス物質を探索することによってレオウイルス感染症治療化合物が発見されることが期待される。1.カイコのRNAウイルスを用いた抗ウイルス薬の評価系の確立病原性RNAウイルスのカイコ感染モデルと抗ウイルス薬の評価系を確立するために、まずカイコに感染するRNAウイルスである細胞質多角体病ウイルス(CPV、レオウイルス科)を用いて、カイコ培養細胞と個体両方を用いた感染系の確立と、抗ウイルス薬の評価を行った。カイコ培養細胞へのCPV感染時に見られる細胞質での多角体形成を指標に、既存の抗RNAウイルス薬の抗CPV効果を検討した結果、リバビリン、ミコフェノール酸、チゾキサニドが多角体形成率を低下させるとわかった。次に、CPVをカイコへ接種し、腸管における多角体形成量を指標に、先述の化合物の抗ウイルス効果を検討した。その結果、リバビリン(C型肝炎ウイルスの治療に適用)は多角体形成を抑える傾向を示したが、チゾキサニド(臨床上は使われない、体内動態に問題がある)は抗ウイルス効果を示さなかった。カイコ個体のCPV感染系においてヒトでの適用と同様に抗ウイルス薬の治療効果が評価できたことから、カイコのCPV感染系はウイルス感染症治療候補化合物の検索に有用であると期待できる。2.カイコ感染モデルにおける治療候補化合物の体内動態と治療効果との関連性体内動態は治療候補化合物の検索時に考慮すべき問題だが、カイコにおける薬物の体内動態については研究があまり進んでいない。そこで、所属研究室で確立されていた黄色ブドウ球菌感染モデルを用いて、抗菌化合物の体内動態と治療効果との関連性を検討した。黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を示した13種の化合物のうち、治療効果を発揮したものはリファンピシンのみであり、その他の化合物は、カイコに対する毒性や体内動態の問題によって治療効果が低下したと考えられた。したがって、カイコ感染モデルを利用した治療候補化合物検索は、毒性や体内動態の問題によって治療効果が低下する化合物の排除に有効であると考えられる。
銭謙益の『列朝詩集小伝』に関する実証的研究

銭謙益『列朝詩集小伝』は、明代の詩人を研究するための基本的な伝記資料であり、後世の明文学史観に大きな影響を与えた。しかし、銭謙益が書いた詩人の伝記には多くの解決すべき問題点がある。『列朝詩集小伝』には、典拠未詳の逸話や意図的な改変が含まれているのである。本研究は、主に銭謙益による『列朝詩集小伝』の詩人の伝記および文学批評に関するいくつかの問題をとりあげて分析したものである。この研究成果は『『列朝詩集小傳』研究』として2018年1月に公開する。銭謙益の『列朝詩集小伝』(以下『小伝』)は、明詩研究の基本文献であり、後世の明文学史観に大きな影響を与えたことで知られている。しかし、詩人の逸話に典拠未詳のものが含まれていること、また銭謙益による意図的な伝記改変があるなど、多くの問題がある。本研究は、明の代表的詩人50名について、銭謙益が『小伝』編纂の際に依拠した原資料を索出し、原資料と『小伝』の内容を比較検討することで『小伝』の誤謬を正そうとするものである。『小伝』の依拠資料は、詩人の墓誌銘や行状、詩集の序文から詩話や筆記、あるいは小説や野史の類にまで及んでいるが、資料名や逸話の出処は記されていない。そのためこの研究を一人で行うことは難しく、本研究では研究グループを組織し、定期的に「『列朝詩集小伝』講読会」を開催して検討することとした。具体的にはグループ内であらかじめ担当する明代詩人を決めておき、担当者は詩人の「小伝」の訓読や注の外に、「小伝」が依拠したと思われる原資料を索出し、「小伝」に改変または潤色が疑われる箇所がないか、ある場合はどのような改変なのかについて調査した結果を研究会でレジュメ報告し、その後でグループ内で改変の意図やその影響を検討する形をとった。26年度に開催した研究会は11回、とりあげたのは袁宏道、徐渭、王慎中、鍾惺、譚元春(論譚元春詩を含む)、袁宗道など、公安派や竟陵派を中心とする詩人である。検討の結果、『小伝』には同時代人による竟陵派批判の語が複数引用されているが、その中には本来竟陵派批判として書かれたものではないにもかかわらず、原資料の文章を恣意的に改変したものが含まれていること、そこには明末に、呉の詩壇から竟陵派を駆逐し、呉の詩風を再興させようと願った銭謙益の強い意図があったことが明らかになった。本研究は、明の代表的詩人50名について、銭謙益が『列朝詩集小伝』(以下、『小伝』)編纂の際に依拠した原資料を索出し、原資料と『小伝』の内容を比較検討することで『小伝』の誤謬を正そうとするものである。『小伝』が依拠した資料は、詩人の墓誌銘や行状、詩集の序文から詩話や筆記、あるいは小説や野史の類にまで及んでいるが、依拠した資料名や逸話の出処は記されていない。そのため、まずは『小伝』が依拠した原資料を調査索出し、『小伝』の内容と比較検討して、改変や潤色の有無を考察した。27年度は前年度同様、研究グループによる「『列朝詩集小伝』講読会」を定期的に開催して解読を進めた。研究会では担当者が詩人の『小伝』の訓読や注の外に、『小伝』が依拠したと思われる原資料や、「小伝」に改変または潤色が疑われる箇所について調査した結果を研究会でレジュメ報告し、その後に出席者全員で改変の意図やその影響を検討する形をとった。27年度に開催した研究会は14回、とりあげたのは袁中道、謝在杭、程嘉燧、羅洪先、李卓吾、唐寅、劉基(甲前集と甲集一の2篇)の7篇と、加えて「列朝詩集序」1篇の解読も行った。特に上記の詩人のうち袁中道、程嘉燧、李卓吾は銭謙益の文学評価に影響を与えた人物でもあり、これらの小伝と「列朝詩集序」の解読によって、『列朝詩集』の編纂過程の一端を明らかにすることができた。銭謙益の遺民詩に対する評価を検討した結果、彼が早くから遺民詩になみなみならぬ関心を抱いており、それが『列朝詩集』「甲集」の直前に「甲集前編」を置いて明のみならず、かつて元に仕えていた詩人の詩を載録した動機であったこと、また、銭謙益が劉基の元朝時代の伝を「甲集前編」に入明後の伝を「甲集」の卷首に置いた背景には、明朝と清朝の両朝に仕えることになった銭謙益自らの事情を反映したものであった点も明らかになった。計画どおり、27年度は研究会を14回、月に1度以上の頻度で開催し、『列朝詩集小伝』について解読を進めた。27年度に取り上げた詩人の『小伝』はいずれも長篇で引用が多く、依拠資料の調査に時間を要したことから、とりあげた小伝は8篇と序文1篇と分量には多くないが、すでにこれまでに予定の50篇中29篇が完成している。

また『小伝』の原資料索出のために、大学休業期間を利用して、海外では北京の国家図書館、北京大学図書館、国内では国立公文書館内閣文庫や国会図書館関西館での調査を行っており、資料蒐集はほぼ順調である。論文についてもこれまで本研究に関わる成果として3本の論文を公刊している。28年度も前年度にひきつづき、研究グループによる「『列朝詩集小伝』講読会」を定期的に開催して解読を進めた。28年度に開催した研究会は13回で、とりあげた詩人の小伝は、楊維楨(甲前集巻七)、高啓(甲集巻四)、楊士奇(乙集巻一)、高廷礼(乙集巻三)、王守仁(丙集巻四)、康海(丙集巻十一)、辺貢(丙集巻十一)、謝榛(丁集巻五)、唐時升(丁集巻十三之上)、婁堅(丁集巻十三之上)である。また、これまでの研究会で得られた知見をもとに、日本中国学会第68回大会(2016年10月8日、於奈良女子大学)のパネルディスカッションの部で、「詩人の伝記と批評はどのように形づくられるかー『列朝詩集小伝』を例にー」をテーマとする報告と公開討論会を開催した。野村鮎子(研究代表者)は「『小伝』の依拠資料からみた『列朝詩集』の性格」を報告し、『列朝詩集』の編纂者である銭謙益が呉の文学の継承者であることを自負し、それが『小伝』編纂時の資料の取捨選択にも表れていることを明らかにした。田口一郎(研究分担者)は「「謝榛小伝」からみる『列朝詩集』の性格」を報告し、文学史的には「後七子」の一人とされる謝榛伝をとりあげ、銭謙益による詩人評価が偏向していることを明らかにした。和泉ひとみ(研究協力者)は「『小伝』における李東陽及び湯顕祖の評価について」は、李東陽伝と湯顕祖伝を通じて『小伝』の伝記編纂の恣意性を明らかにした。松村昂(研究協力者)は「『小伝』における李卓吾の位置づけについて」を報告し、李卓吾小伝が「閏集」、つまり一般の詩人とは別の、「異人」として収録されていることの背景や銭謙益の李卓吾に対する微妙な対し方を指摘した。また、北京の国家図書館特蔵善本書室、大阪大学懐徳堂文庫、国立公文書館内閣文庫に赴き、『列朝詩集』および『列朝詩集小伝』が編纂された過程についての調査を進めた。計画どおり、28年度は研究会を13回、月に1回以上の頻度で開催し、『列朝詩集小伝』について共同で解読を進めた。これまでに研究会で取り上げた詩人の『小伝』は、科研費研究に採択される以前の研究会の成果を加えると、ほぼ目標である50篇に達している。そして、これらのうち、40篇については原稿の整理を一通り終えている。『小伝』が編纂された過程についての調査もほぼ順調に行われている。また、当初計画していたシンポジウムについては、日本中国学会第68回大会(2016年10月8日、於奈良女子大学)におけるパネルディスカッションという形に変更して開催した。29年度は研究期間最終年度に当たるため、以下の3つの項目について取り組んだ。(1)昨年度の日本中国学会第68回大会(於奈良女子大学)においておこなった研究代表者と研究分担者から成るパネルディスカッション「詩人の伝記と批評はどのように形づくられるかー『列朝詩集小伝』を例にー」について、日本中国学会がHP上で公開する研究集録への報告論文を作成した。(2)研究期間の研究成果を学術図書として公表するべく、『『列朝詩集小傳』研究』をまとめ、科学研究費助成事業(研究成果公開促進費)に応募した。その結果、30年度の補助事業に採択された。これは『列朝詩集小伝』の中から明代の代表的な詩人約40名を選び、こうした誤謬を考証糾正したものである。40篇それぞれは『小伝』の原文、それに一部現代語訳を含む訓読と注からなり、注には『小伝』の内容に対する著者の反証や訂補などを盛り込む形式に整えた。全体の巻頭に序説と凡例、巻末に列朝詩集関連年表と索引、あとがきを附す。とりあげる40名の小伝は、一錢謙益「歴朝詩集序」、二太祖高皇帝朱元璋、三劉基、四楊維楨、五高啓、六宋濂、七楊士奇、八高廷禮、九李東陽・附王元美「書西涯古樂府後」、一〇王守仁、一一沈周、一二祝允明、一三徐禎卿、一四唐寅、一五文徴明、一六李夢陽、一七康海、一八邊貢、一九何景明、二〇楊愼、二一王愼中、二二唐順之、二三羅洪