hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真核生物におけるDーアミノ酸バイオシステムの機能と制御

本研究では、Saccharomyces cerevisiaeのD-セリンデヒドラターゼおよび、細胞性粘菌、Dictyostelium discoidiumのセリンラセマーゼの反応機構について検討し、前者についてはその亜鉛の役割、後者については二塩基機構による反応機序を明らかにした。また哺乳動物におけるD-アスパラギン酸の生理機能を明らかにすることを目的に、アスパラギン酸ラセマーゼの可能性が指摘されているマウスのGOT1L1遺伝子のクローニングと同タンパク質の取得を試みた。一方D-アミノ酸と発生の関係を明らかにするため、単細胞から多細胞へと生活環を変化させる細胞性粘菌、Dictyostellium discoidiumをとりあげ、同菌においてD-セリン分解にかかわるD-セリンデヒドラターゼの遺伝子破壊を行った。その結果、多細胞期の変異型粘菌体内にD-セリンが蓄積するとともに、胞子形成にかかわる細胞分化に関して異常が起こる事が認められた。本研究ではさらに、生体内D-セリンを分解するためのツールを構築する目的で、酵母のD-セリンデヒドラターゼのポリエチレングリコール修飾を行い、免疫原性が低減した酵素を得る事に成功した。平成22年度は、(1)D-アミノ酸のバイオマーカーへの応用に関する研究、(2)D-アミノ酸代謝関連酵素の酵素学的研究、(3)D-Serと発生の関連に関する研究の3点を行った。(1)では、まずD-セリンデヒドラターゼとピルビン酸オキシダーゼを用いたD-Serの酵素定量法の確立を目標とし、D-Serから生成したピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼと反応させ、その際生じる過酸化水素をペルオキシダーゼと共役させ蛍光的に検出することにより、1μMオーダーでのD-Ser定量を可能にした。難病の筋萎縮性側索硬化症(ALS)では、脳脊椎でのD-Ser濃度の上昇が上告されている。そこでこの定量法を用いて、ALSモデルマウスにおける病態の進行とD-Ser濃度の挙動を解析した。本年度の研究において脳脊髄液中のD-Serの定量は可能となった。(2)では細胞性粘菌由来の酵素を用いて、D-Serの生合成に働く真核細胞型セリンラセマーゼの反応機構、特に金属よる酵素の活性化や、基質のα-水素の授受に関わる触媒基について検討した。この結果、同酵素がMgとNaの両方で活性化を受けること、また両金属の結合部位が共通であることを明らかにした。また同酵素が補酵素ピリドキサルリン酸近傍にあるリジン残基とセリン残基を、Serの2位水素授受の触媒基として用いることを明らかにした。(3)では、D-セリンデヒドラターゼをカイコに投与して、カイコ体内のD-Ser濃度を低下させ、変態への影響を検討したが、明確な結果は得られなかった。また酵素にポリエチレングリコール修飾を行い、これによってマウスに対する免疫源性が低下することや酵素の体内保持時間が延長されることを明らかにした。本年度当初に計画した下記の5項目について、それぞれ研究結果を記す。1)真核細胞型セリンラセマーゼおよび真核細胞型D-セリンデヒドラターゼの構造機能相関の解明。細胞性粘菌由来セリンラセマーゼと出芽酵母由来のD-セリンデヒドラターゼについてX線結晶構造解析を進めた。また、後者については、部位特的変異やD-セリン2位水素の引き抜き反応の動力学解析などからZn依存性酵素であることが明らかとなった。2)哺乳動物アスパラギン酸ラセマーゼの酵素学的研究。ヒトおよびマウスのアスパラギン酸ラセマーゼの大量調製を計った。E.coliを宿主とし、それぞれの遺伝子を発現させた場合には、タンパク質はinclusion bodyを形成した。そのため、昆虫培養細胞を用いた発現系を構築した。3)PEG修飾D-セリンデヒドラターゼによる体内D-セリン濃度の制御。免疫原性の低下や血中保持時間の増加が認められたPEG修飾D-セリンデヒドラターゼをALSモデルマウスの脊椎に継続的に投与し、D-Ser濃度を低下によって、ALSの進行が押さえられるかどうかを検討した。しかしマウス体内のカプセルに埋め込んだ酵素の活性が低下し、脳脊椎液中のD-Ser濃度の減少は得られなかった。4)D-セリン酸およびD-アスパラギン酸酵素定量法の病態解析への展開。当研究室で開発したD-セリン酵素定量法を用いて、尿中D-セリンの測定キットを構築した。

またD-アスパラギン酸オキシダーゼとオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ用いたD-アスパラギン酸の高感度酵素定量法を確立した。5)細胞性粘菌の生活環に対するD-セリンの影響単細胞と多細胞の両生活環をもつ細胞分化研究のモデル生物、D.discideumのD-セリンデヒドラターゼ遺伝子の破壊株を構築した。破壊株では菌体内でのD-セリン蓄積とともに、柄と胞子への細胞分化の阻害が認められた。1)真核細胞型セリンラセマーゼおよび真核細胞型D-セリンデヒドラターゼの構造機能相関の解明。細胞性粘菌のセリンラセマーゼ反応がピリドキサルリン酸(PLP)結合リジン残基と、PLPを挟んで反対側に存在するセリン残基による2塩基機構で進行する事を明らかにした。またD-セリンデヒドラターゼのPLPのピリジン環窒素に結合するチロシン残基の部位特異的変異から、同酵素反応においてはPLPが電子溜めとして機能していない可能性を明らかにした。2)哺乳動物アスパラギン酸ラセマーゼ(GOT1L1)に関する研究。アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子をノックアウトしたマウスの各臓器のD-アスパラギン酸濃度の測定から、GOT1L1がアスパラギン酸ラセマーゼとは異なる可能性を明らかにした。。3) PEG修飾D-セリンデヒドラターゼによる体内D-セリン濃度の制御。免疫原性の低下や血中保持時間の増加が認められたPEG修飾D-セリンデヒドラターゼの腹腔内投与によって、海馬におけるD-セリン濃度が有意に減少することを明らかにした。4) D-セリン酸およびD-アスパラギン酸酵素定量法の病態解析への展開。当研究室で開発したDーセリン酵素定量法を用いて構築した尿中Dーセリンの測定キットが上市されるに至った。本キットによって、ヒト尿中D-セリン濃度の組織的な定量を行い、D-セリン濃度とL-セリン濃度、およびD-セリン濃度とクレアチニン濃度比がほぼ一定であることなどを見出した。5)細胞性粘菌の生活環に対するD-セリンの影響単細胞と多細胞の両生活環をもつ細胞分化研究のモデル生物、D. discideumのセリンラセマーゼ遺伝子のノックアウトに成功した。年初に計画した5つの研究課題についてはすべて着手し着実に進行させた。うち2課題については所期の目的を達成した。また2件の新奇な発見を得た。24年度が最終年度であるため、記入しない。1)本年度の研究によって得た研究ツールであるD-セリンおよびD-アスパラギン酸の酵素定量法を用いて、生体物質中の両D-アミノ酸の解析を行い、これらが疾患等のバイオマーカーとなる可能性を検討する。2)D-セリンデヒドラターゼはピリドキサル酵素としては初めてのZn依存性酵素である。本酵素の反応機構について、ピリドキサルリン酸の電子溜め機能の観点から解析を行う。3)D-セリンが発生のシグナルとして機能する可能性については以前から指摘されていたが、分子レベルでの確証は得られていなかった。今回得られた細胞性粘菌のD-セリンデヒドラターゼ遺伝子破壊株は、これを立証する良いモデルとなる可能性がある。
体幹部定位照射においてコンボルーション法による線量計算の精度を高める手法の開発

体幹部定位照射において、コンボルーション法による線量計算の精度を高める手法の開発に向けて、次のような研究を行った。・10個程度のエネルギービンでもって、水などの低原子番号媒体から鉛などの高原子番号媒体に適用するX線スペクトルを再構築し、スペクトルが軸外距離と共にどのような特性でもって変化するかを、6種類のX線発生装置について調べた。その結果、発生装置ごとに、又同じ発生装置でも加速電圧が変わるつど、一般にその特性が変わることが分かった。この事実は、スペクトルの軸外距離に関する内外挿する手法は一律には決まらないことを意味する。・微分線量法に基づいて、エネルギービンごとの一次及び散乱線量カーネルをモンテカルロ法により作成した。その結果、特に一次線量カーネルは、従来のそれと比較して光子作用点付近において比較的小さな値を示すことが分かった。この事実は、微分線量法に基づいて得られた一次線量カーネルは、ジョウ及びMLC照射野周辺当たりの線量の計算精度を高めることにつながる。・水ファントム照射において、エネルギービンごとに得られた一次及び散乱線量カーネルをそれぞれの代表光子エネルギーの一次水衝突カーマに作用させて重畳計算した線量は、実測値と比較して±1%以内に収まることが分かった。つまり、エネルギービンごとのカーネル及び一次光子強度を用いることにより、カーネル及びビーム線質硬化現象を考慮する必要がなくなることが知られた。・空中X線強度の計算に関しては、X線ターゲット面及び平坦化フイルタ面において、それぞれ誤差関数を適用する方法を開発した。オープンジョウ照射野においては、ジョウコリメータを介しての視野に誤差関数を適用し、MLC照射野においては、リーフ出力差分法を新たに導入して、ジョウ及び各MLCリーフを介しての視野に誤差関数を適用する。これにより、精度の高い計算が可能になることが分かった。マルチリーフコリメータ(MLC)を用いた定位照射におけるコンボルーション法の計算精度を高めるために行った理論的及び実験的研究を以下に述べる。1.ライナックX線装置からのX線スペクトルを軸外距離の関数として、効果的に「エネルギーフルエンス」及び「光子フルエンス」で表す方法を確立した。2.X線ターゲット及び平坦化フイルターにおける線源強度分布を、それぞれガウス関数で表すことに成功した。これにより、ジョウ照射野における空中出力係数を「線源軸外線量比(OCR)」及び「軸外コリメータ散乱係数(Sc)」の積で表す計算ソフトを作成した。ここで、「線源軸外線量比(OCR)」は、無限照射野を想定した場合の空中一次線強度分布を表す。「軸外コリメータ散乱係数(Sc)」は、無限照射野にジョウ照射野を設定した場合の空中一次線強度分布の変化を表す。3.MLC使用時の場合は、さらにMLCによって遮蔽される部分に新案の「リーフ照射野出力差分法(leaf-field output subtraction method)」を適用させ、さらに軸外距離の関数であるX線スペクトルを考慮して、MLC照射野内外での入射X線強度を算出する計算ソフトを開発した。特に、MLC微細構造におけるX線漏洩の程度を計算に反映させることに成功した。4.モンテカルロ法を用いて、半無限厚の水ファントムを想定して得られる「一次線量拡散分布」及び「散乱線量拡散分布」のカーネルを作成する手順を開発した。これらのカーネルを用いることにより、特に小照射野での線量計算がより正確になることをモンテカルロ法により確認した。

5.入射X線スペクトルの各エネルギービンの代表エネルギーごとのカーネル及び一次X線強度を用いることにより、媒体中における一次X線強度及びカーネルに関して、線質変化を考慮することなしに高精度線量計算が可能となるコンボルーション法を確立した。体幹部定位照射において、コンボルーション法による線量計算の精度を高める手法の開発に向けて、次のような研究を行った。・10個程度のエネルギービンでもって、水などの低原子番号媒体から鉛などの高原子番号媒体に適用するX線スペクトルを再構築し、スペクトルが軸外距離と共にどのような特性でもって変化するかを、6種類のX線発生装置について調べた。その結果、発生装置ごとに、又同じ発生装置でも加速電圧が変わるっど、一般にその特性が変わることが分かった。この事実は、スペクトルの軸外距離に関する内外挿する手法は一律には決まらないことを意味する。・微分線量法に基づいて、エネルギービンごとの一次及び散乱線量カーネルをモンテカルロ法により作成した。その結果、特に一次線量カーネルは、従来のそれと比較して光子作用点付近において比較的小さな値を示すことが分かった。この事実は、微分線量法に基づいて得られた一次線量カーネルは、ジョウ及びMLC照射野周辺当たりの線量の計算精度を高めることにつながる。・水ファントム照射において、エネルギービンごとに得られた一次及び散乱線量カーネルをそれぞれの代表光子エネルギーの一次水衝突カーマに作用させて重畳計算した線量は、実測値と比較して±1%以内に収まることが分かった。つまり、エネルギービンごとのカーネル及び一次光子強度を用いることにより、カーネル及びビーム線質硬化現象を考慮する必要がなくなることが知られた。・空中X線強度の計算に関しては、X線ターゲット面及び平坦化フイルタ面において、それぞれ誤差関数を適用する方法を開発した。オープンジョウ照射野においては、ジョウコリメータを介しての視野に誤差関数を適用し、MLC照射野においては、リーフ出力差分法を新たに導入して、ジョウ及び各MLCリーフを介しての視野に誤差関数を適用する。これにより、精度の高い計算が可能になることが分かった。
エクソソームで運ばれるmicroRNAは歯周病における歯槽骨破壊に関与するか？

近年、microRNAはエクソソームと呼ばれる細胞が分泌するナノ粒子の中に存在して、レシピエント細胞に対して機能するということが判ってきた。本研究では、これまで炎症性サイトカインやLPSを中心に議論されていた歯周病の病態を、エクソソームという全く新しい視点から解明することを目的とする。炎症性サイトカインのTNF-αが、歯周病における免疫反応で重要なマクロファージへ作用すると、エクソソームの分泌が促進されて、その中のmicroRNA発現プロファイルが変化した。また、歯根膜線維芽細胞は、豊富にsmall RNAを含むエクソソームを分泌した。平成26年度は、マクロファージに着目し、炎症性サイトカインがマクロファージへ作用した時に放出されるエクソソームを含む細胞外小胞について解析した。ヒト単球様細胞株THP-1を200nM PMAで3日間処理し、マクロファージ様細胞を誘導した。その後、炎症性サイトカインTNF-a存在下および非存在下で培養し、それぞれの培養上清から細胞外小胞を回収した。1.まず、ヒトマクロファージ様細胞から得られた細胞外小胞の粒子数と大きさの分布をTNF-a刺激の前後で計測した。TNF-a刺激前の粒子径の平均値は133nm、モード値117nm、刺激72時間後の平均値は136nm、モード値117nmであった。粒子数は刺激前で2.99 x 108個/mL、刺激72時間後4.07 x 108個/mLであった。このことから、ヒトマクロファージ様細胞が分泌する細胞外小胞は、TNF-a刺激によって増加するが、粒子径はほとんど変化しないことが、示唆された。2. TNF-a刺激の前後で細胞外小胞内のRNAを回収し、microRNAの発現をマイクロアレイ法で網羅的に解析した。TNF-a刺激前の細胞外小胞内では、調べた1,222種類のmicroRNAのうち、53種類の発現が確認された。特に、miR-1246, miR-574-5p, miR-4281がこの順に多く発現していた。一方、TNF-a刺激72時間後の細胞外小胞内では、発現量の多い上位10種類程度のmicroRNAのプロファイルには、大きな変化はなかった。しかし、それ以下の発現順位のプロファイルは大きく変化していた。このことから、TNF-aによって、ヒトマクロファージ様細胞が分泌する細胞外小胞内のmicroRNA発現プロファイルは、多量に発現しているものを除き、大きく変化する可能性が示唆された。平成27年度は、炎症性サイトカインTNF-alphaがマクロファージへ作用した時に放出されるエクソソームを含む細胞外小胞について、前年度の結果を更に詳細に解析した。その後炎症性サイトカインTNF-alpha存在下および非存在下で培養し、それぞれの培養上清から細胞外小胞を回収した。前年度は、細胞外小胞内で発現量の多い上位10種類程度のmicroRNAのプロファイルには、TNF-alpha刺激による大きな変化はなかったことを報告した。その一方で、それ以下の順位のmicroRNAでは、有意に変動したmicroRNAが多数あった。解析した1,222種類のうち100種類のmicroRNAについて、TNF-alpha刺激で2倍以上発現が変動した。特に、miR-146a (miR-146a-5p), miR-378 (miR-378a-3p), let-7b (let-7b-5p), miR-16 (miR-16-5p), miR-21 (miR-21-5p),およびmiR-670 (miR-670-5p)については、TNF-alpha刺激で有意に発現が上昇した。以上、前年度の結果と考え合わせると、TNF-alphaはヒトマクロファージの細胞外小胞の分泌を促進させて、細胞外小胞内のmicroRNA発現プロファイルを変化させることが示唆された。当初の研究計画では、マクロファージと口腔上皮細胞から得られたエクソソームを用いて実験する予定であった。マクロファージに関しては順調に実験できたが、口腔上皮細胞からのエクソソームが回収できなかった。このことが原因で時間を要した。平成28年度は、まず初代ヒト口腔上皮細胞が、エクソソームを分泌するかどうかについて検討した。口腔上皮細胞から得られた培養上清中における細胞外小胞の粒子数と粒子径の分布をNanoSightによって計測した。粒子径のMode値は108.3nm、粒子数は5.3 x 108個/mLであった。次に初代ヒト歯根膜線維芽細胞について同様な解析を行った。歯根膜線維芽細胞では、粒子径のMode値は108.9nm、粒子数は5.6 x 109個/mLであった。これより、ヒト口腔上皮細胞はエクソソームを分泌するが、その量は少なく、歯根膜線維芽細胞の1/10程度である可能性が示唆された。そこで、ヒト口腔上皮細胞では、かなり大量に細胞培養する必要があり、予算等の都合もあるので、口腔上皮細胞ではなくて、歯根膜線維芽細胞から分泌されるエクソソーム内のsmall RNAについて解析した。歯根膜線維芽細胞を培養し、得られた培養上清をExoQuick-TCで処理した。

ここからTotal RNAを抽出した。得られたRNAをAgilent 2100 Bioanalyzerで解析したところ、20 - 1,000 ntの範囲のRNAが多かった。特に20 - 200 ntが豊富に存在した。更に、このRNAを用いてsmall RNA-Seqを行った。ライブラリー構築後、次世代シーケンサーIllumina HiSeq 2500を使用し、Pair-End法100塩基読み取りにより、塩基配列データを取得した。その結果、歯根膜線維芽細胞由来のエクソソームには、33 ntのisomiR-X1、32 ntのisomiR-X2、そしてmiR-Yがこの順に多く存在した。以上より、ヒト歯根膜線維芽細胞は口腔上皮細胞よりも豊富にsmall RNAを含むエクソソームを分泌する可能性が示唆された。近年、microRNAはエクソソームと呼ばれる細胞が分泌するナノ粒子の中に存在して、レシピエント細胞に対して機能するということが判ってきた。本研究では、これまで炎症性サイトカインやLPSを中心に議論されていた歯周病の病態を、エクソソームという全く新しい視点から解明することを目的とする。炎症性サイトカインのTNF-αが、歯周病における免疫反応で重要なマクロファージへ作用すると、エクソソームの分泌が促進されて、その中のmicroRNA発現プロファイルが変化した。また、歯根膜線維芽細胞は、豊富にsmall RNAを含むエクソソームを分泌した。ヒトマクロファージの実験に、予定よりも時間がかかってしまった。平成28年度は培養細胞で得られた研究結果をもとに動物実験する予定であったが、予定を変更して「口腔上皮細胞からエクソソームが分泌されるかどうか培養細胞で再検討」し、口腔上皮細胞がエクソソームを分泌しない場合は、歯根膜細胞などの他の細胞で実験する予定である。細胞生物学本研究分野は新しい分野のため、至適な実験条件等を確立するのに時間が必要だった。平成27年度は、これまでのノウハウが蓄積されてきたので、早く結果が出せるようにしたい。次年度使用額として18661円生じたが、不必要な物品を年度内に無理に購入せずに、次年度に有効活用するため敢えて残した。今年度の予算使用率は99%以上であり、予定通り予算を使用した。当初の研究計画に比べて、やや遅れがあったために、次年度使用額が生じた。しかし、平成27年5月14日現在、その遅れは取り戻し、繰り越した研究費も近日中に全額使用済となる。上記予算は、次年度の試薬購入に充てる予定である。平成27年5月14日現在、研究計画の遅れは取り戻し、繰り越した研究費も近日中に全額使用済となる。
人細膜色素上皮細胞の細胞骨格蛋白の同定

アクチンについてはロ-ダミン標識のphalloidinを用いて調べた.アクチンはニワトリの網膜色素上皮細胞で報告されているのと同様,細胞の側壁に分布するcircumferential microfilament bundlesと微絨毛に存在するparacrystaline bundlesとして分布していた.中間型フィラメントとしてはビメンチンをウエスタンブロッティング方法で確認し,細胞内にメッシュ状に分布することをつきとめた.ケラチンは同定されなかった.チューブリンは細胞質内にわずかに存在していた.網膜色素上皮細胞は人においてもケラチンを有さない特異な上皮細胞であることがわかった.アクチンについてはロ-ダミン標識のphalloidinを用いて調べた.アクチンはニワトリの網膜色素上皮細胞で報告されているのと同様,細胞の側壁に分布するcircumferential microfilament bundlesと微絨毛に存在するparacrystaline bundlesとして分布していた.中間型フィラメントとしてはビメンチンをウエスタンブロッティング方法で確認し,細胞内にメッシュ状に分布することをつきとめた.ケラチンは同定されなかった.チューブリンは細胞質内にわずかに存在していた.網膜色素上皮細胞は人においてもケラチンを有さない特異な上皮細胞であることがわかった.
Vlasovシミュレーションで迫るニュートリノの宇宙大規模構造形成への力学的影響

2018年度には、様々な質量を持つニュートリノが宇宙大規模構造形成に及ぼす力学的影響を調べる数値シミュレーションを実施した。それぞれのニュートリノ質量について、複数のシミュレーション領域サイズで数値シミュレーションを行うことで、分解能の収束性を確認しつつ広いダイナミックレンジにわたってニュートリノの力学的影響を調査することを可能にした。宇宙大規模構造の密度揺らぎのパワースペクトルのニュートリノ質量依存性を調べ、ニュートリノによる密度揺らぎの減衰が線形領域では摂動理論の予言と一致することを確認する一方、非線形領域では摂動理論から有意にずれることを確認した。また、ダークマターハローの質量関数のニュートリノ質量依存性を調べニュートリノ質量が大きいほどダークマターハローの数密度が下がることを確認した。さらに、過去の質量を持つニュートリノの存在かでの球対称崩壊モデルをもとにした質量関数の理論モデルと比較し、この理論モデルと我々の数値シミュレーションの結果が良く一致することを見出した。更に、ダークマターとニュートリノの密度揺らぎの相互相関関数をダークマターとニュートリノの相対速度依存性を含む形で調べることで、我々の数値シミュレーションではダークマターの高密度領域の下流側にニュートリノの高密度領域が形成されていることを発見し、これは理論的なモデルで予言されたneutrino wakeと良く一致することがわかった。多くの計算機資源を獲得することが出来たおかげで、複数のシミュレーション領域サイズと複数のニュートリノ質量について、当初の計画通りに宇宙大規模構造の数値シミュレーションの実施を達成することができた。得られたデータの解析については本研究課題の直接経費で購入したストレージを用いて効率的に実行することができ、シミュレーションデータからこれまでにない新しい知見を得ることが出来た。今後の研究方針は、一つはこれまでの研究よりも軽いニュートリノを考えたときに、それが宇宙大規模構造形成に及ぼす影響を調べることである。このようなニュートリノでは質量固有状態ごとに質量が異なっており、ニュートリノを質量ごとに少なくとも2種類の成分として扱う必要がある。そのような数値シミュレーションを行うことによって、素粒子実験では明らかになっていないニュートリノの質量階層の違いによる宇宙大規模構造形成に対する力学的影響を調べることが可能になる。二つ目はダークマターハローの分布と内部構造に対するニュートリノの力学的影響をより空間分解能を上げた数値シミュレーションによって調べることである。これまでの数値シミュレーションよりもダークマターの数値シミュレーションの空間分解能を向上させ、これまでよりも非線形領域におけるニュートリノの力学的影響を研究する。
実験的Peters'奇形の組織化学的研究

研究代表者は、正常水晶体胞分離および臨床的にPeters'奇形に相当する水晶体胞分離不全成立機序を、その鍵となる物質を検索する目的で検討した。胎生期のJcl:ICRマウスを用い、正常水晶体胞分離過程と実験奇形学的に発生させた水晶体胞分離不全の成立過程を組織学的および組織科学的に検討した。水晶体胞分離過程で角膜上皮基底膜および同基底膜と水晶体胞との間質にはコンドロイチン硫酸A/CとBが存在し、水晶体胞分離後には角膜上皮基底膜にヘパラン硫酸が出現した。水晶体茎および水晶体嚢にはコンドロイチン硫酸A/Cが存在したがヘパラン硫酸は存在しなかった。この結果、水晶体胞分離にはコンドロイチン硫酸異性体の細胞接着阻害作用とヘパラン硫酸の神経堤細胞遊走や細胞接着促進作用が、複雑に相互作用していると考えられた。また、水晶体胞分離不全では角膜上皮基底膜および同基底膜と水晶体胞との間の間質にはコンドロイチン硫酸A/CとB、水晶体茎および水晶体嚢にはコンドロイチン硫酸A/Cが存在した。また、これらの構造にはヘパラン硫酸がなく、正常水晶体胞分離前のグリコサミノグリカン分子種の分布様式と同様であったが、眼杯内板のコンドロイチン硫酸A/Cは正常と比べて著しく少なかった。以上より、水晶体胞分離不全の成立に眼杯内板の異常が関与していると考えられた。
ゾーンプレート原器描画装置の開発

ゾーンプレート(ZP)の製作に短波長レーザを用いた描画装置の開発研究を行った。ZPは中心部ではその格子線の幅は太く,周辺部に行くにつれて細くなる。申請者の提案した方法は,ZP中心部ではレーザビームの焦点を外し,周辺部に向かうにつれて焦点を合わせることにより線幅を制御することにある。これまでの方式は重ね書きによるものであるが,本法は,格子線の中心部分まで一気にビームの位置を移動させることができる。当初,レンズの移動にピエゾの撓みを利用する方式をとったが,移動量の再現性が乏しいことと,広範囲の移動量を実現することが困難なことが判明した。この間の実験期間が長期に渡ってしまった。そこで,今回はピエゾの駆動機構を諦めて,小型のアクチュエータを購入して,これを平行バネ機構による精密移動ステージ(自作)に取り付け,その移動量をフィードバックしながら高精度にレンズの移動量を調整する方法に変更した。この装置を使用して,デフォーカス量とレーザーパワー,描画される格子線の幅,基板回転速度との関係の理論を立てて,実験で確かめた。また,この装置によって描かれたゾーンプレートを用いて,天体望遠鏡の主鏡の測定を行った。これまでの方法と比較して,デューティ比が一定に保たれた格子が描けるようになり,描画時間が1/2程度に短縮された。
遺伝因子解析に基づく日本人妊娠糖尿病の病態解明

現在まで日本人妊娠糖尿病(GDM)感受性遺伝子の網羅的検討はなされていない。今回我々は既知の糖代謝異常関連候補遺伝子の多型情報を取得し、日本人GDM感受性遺伝子を抽出した。対象は、妊娠中期に75g経口糖負荷試験を受けGDMの有無を判定した妊婦である(GDM:n=171、正常型:n=128)である。母体末梢血から抽出したDNAを用いた既知2型糖尿病もしくはGDM関連遺伝子(36遺伝子:45 SNP)とGDM発症との関連解析により、GDMではインスリン感受性関連1遺伝子、インスリン分泌関連2遺伝子のリスクアレルを有することが判明した。本研究により日本人GDM感受性候補遺伝因子の存在が示唆された。目的:本年度の目的は日本人妊娠糖尿病(GDM)関連遺伝子候補の抽出である。方法:母体年齢をマッチさせた妊娠糖尿病(GDM)193例と正常耐糖能(NGT)328例を対象とした。なお、臨床情報は診療録を参照した。分娩後に母体末梢血からDNAを抽出し、Sequenom社のMassARRAYシステムを用いて既知の2型糖尿病関連遺伝子(77遺伝子:SNP 142箇所)の遺伝子型を解析した。MassARRAYシステムはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(Matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight mass spectrometry: MALDI-TOFMS)を使用しており、高い特異性と質量数の差に基づき正確なアレルの同定が可能であることを特徴としている。MassARRAYシステムにて得られた遺伝子型をもとにcase/control関連解析およびlogistic回帰分析を行い、GDMと有意な相関を示す遺伝子を抽出した。結果:74遺伝子のSNP 125箇所について遺伝子型を決定できた。GDM群とNGT群とを比較すると、11遺伝子のSNP 12箇所に有意差を認め、オッズ比は1.41-2.15であった.4遺伝子がインスリン分泌に関与し,7遺伝子がインスリン感受性に関与すると考えられる遺伝子であった.また,5遺伝子はこれまで未報告のGDM関連遺伝子であった。考察:今回我々は、日本人GDM群とNGT群でGDM発症において有意差を認める遺伝子を抽出した。既知のインスリン分泌および感受性関連遺伝子に加え、現在までGDM発症との関連が報告されていない候補遺伝子を同定することができた。以上より、SNP解析が日本人女性におけるGDM発症の病態解明につながる可能性が示唆された。目的:臨床情報をもとに、妊娠糖尿病(GDM)群および正常耐糖能(NGT)群を層別化し、GDM関連候補遺伝因子抽出を行う。方法:臨床情報を診療録にて確認し、妊娠中後期のGDMスクリーニングが陽性となり、経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)をうけた妊婦299名を対象とした(GDM :171例、NGT 128例)。また、既報をもとに、日本人におけるminor allele frequency>30%を満たす2型糖尿病もしくはGDM関連遺伝子(36遺伝子:SNP 45箇所)を抽出した。平成26年度同様に母体末梢血から抽出したDNAを用い、Sequenom社のMassARRAYシステムにて対象例における36遺伝子(SNP 45箇所)遺伝子型を解析した。結果: GDM群とNGT群における母体年齢、BMI、OGTT施行週数は同等であった。GDM群とNGT群とを比較すると、3遺伝子に有意差を認めた(インスリン分泌関連:2遺伝子、インスリン抵抗性関連: 1遺伝子)。なお、インスリン分泌関連の1遺伝子はこれまで未報告のGDM関連遺伝子であった。考察:今回,対象集団の母体背景の均一化をはかり、GDM発症において有意差を認める遺伝子を抽出した。前年同様に現在までGDM発症との関連が報告されていない候補遺伝子を同定することができ、SNP解析が日本人女性におけるGDM発症の病態解明につながる可能性が示唆された。GDM群とNGT群の母体背景均一化により、適切な候補遺伝因子の抽出を行った。しかしながら、当初予定していた臨床的リスク因子抽出には症例数が不十分であり、最終年度における検討課題とした。[考察]本研究では日本人GDM発症にAIPOQ、CDKN2A/2BおよびSSR1-RREB1が関与している可能性が示された。今回抽出されたCDKN2A/2BおよびSSR1-RREB1はともにインスリン分泌関連遺伝子である。本研究により、インスリン分泌不全がGDM発症に深く関与することが遺伝学的にも示唆された。臨床情報の詳細解析により、GDM群はその診断時期や重症度により当初の予想以上に不均一な集団であることが判明した。

同様にNGT群についてもその臨床像の詳細検討が必要である。そのため、当初予定していた臨床的リスク因子抽出には症例数が不十分であり、次年度以降の検討課題とした。他施設とも連携し、症例収集を試みる。周産期医学臨床情報をもとに、GDM群およびNGT群を層別化し、対象集団の母体背景の均一化を試みる。解析に必要な症例数を再度見積もり、他施設とも連携した症例収集を行う。母体背景をマッチングさせたGDM群およびNGT群において再度SNP解析を行う。当初の予定を修正し、既存検体をもとに再解析を行ったため、繰越し金が生じた。当初の予定よりも解析対象症例が少なくなったこと、海外における学会発表に際しての費用が少なくなったため、繰越し金が生じた。最終年度における解析試薬・学会発表などにあてる予定である。解析試薬などに充当する予定である。
物理化学に基づく球状蛋白質の動態解析

本研究の目標は、蛋白質のフォールディングエネルギー地形を、実験の立場から定量的に記述し、蛋白質が天然状態へたどり着く機構を理解することである。スタフィロコッカル・ヌクレアーゼについて、蛍光共鳴エネルギー移動と超高速混合法とを組み合わせ、反応初期に非一様な構造形成が起こることを見いだした。これは初期中間体形成が特異的な相互作用に起因することを示唆する。アポミオグロビンについて、フォールディング反応初期に蓄積する中間体が平衡条件下において蓄積する中間体と同じ速度過程で形成することを見いだした。この結果は、これらの中間体が同一の分子種であることを示唆する。本研究の目標は、球状蛋白質のフォールディングエネルギー地形を、実験の立場から定量的に記述し、蛋白質が特異的な天然立体構造を獲得する仕組みを理解することである。この目標を達成するために、蛋白質フォールディングに伴う自由エネルギー変化を種々の構造パラメータによって記述することによって、フォールディングのエネルギー地形を自由エネルギーと構造アンサンブルとの関係として描く。これまでに、蛍光共鳴エネルギー移動と各種速度論的手法とを組み合わせることによって、モデル蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)の構造形成が、非一様に起こること、即ち、この蛋白質の二つのドメインのうち、β-バレルドメインはフォールディング反応初期中間体において天然様構造を獲得する一方、もう一つのα-ヘリカルドメインの天然構造は、反応の律速段階において獲得されることが示唆された。この成果は、国際雑誌Protein Scienceに出版した。平成25年度は、もうひとつのモデル蛋白質ウマアポミオグロビン(hapoMb)について、幾つかの異なる条件下で蓄積する平衡論的中間体の特徴を、速度論的なふるまいを比較することによって調べた。これまでの研究において、速度論の立場からhapoMbの尿素存在下で蓄積する平衡論的中間体とフォールディング中間体とが同一であることを明らかにした。酸変性についても同様の検討を行った。穏和な酸変性条件(pH 4)において蓄積する平衡論的中間体についても、天然状態に至る過程で蓄積するフォールディング中間体との同一性が、速度論の立場から示唆された。この結果は、マッコウクジラapoMbに関して水素重水素交換NMR法を用いて得られた二つの中間体の構造的な類似と整合する。さらに、各種の塩存在下の酸変性条件下で蓄積する中間体についても、同様の検討を行っている。平成24年度は、モデル蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)について、二つのドメインのそれぞれにドナー・アクセプターを持つ変異体一種類と、β-バレルドメイン内にドナー・アクセプターを持つ変異体二種類とを作成した。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)と連続フロー法およびストップト・フロー法を組み合わせることによって、これらの変異体のフォールディング/アンフォールディング反応に伴うエネルギー移動効率を、様々な尿素濃度において反応開始後約30マイクロ秒から10秒に至るまで観測した。フォールディング反応開始後100マイクロ秒程度で蓄積する初期中間体において、β-バレルドメイン内のドナー・アクセプター間距離はほぼ天然の値に近づいたが、二つのドメイン間にまたがるドナー・アクセプター間距離が天然の値になったのは、反応の律速段階においてであった。この結果は、SNaseの二つのドメイン(β-バレルドメインとα-ヘリカルドメイン)のうち、β-バレルドメインはフォールディングの極めて初期に天然様構造を獲得する一方、α-ヘリカルドメインは、フォールディングの律速段階においてはじめてβ-バレルドメインに付加することにより、天然構造を形成することを示しており、SNaseの構造形成の非一様性を示唆する。平成24年度には、蛍光共鳴エネルギー移動と各種速度論的手法とを組み合わせることによって、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)の構造形成が、非一様に起こることが示唆された。平成25年度は、もうひとつのモデル蛋白質ウマアポミオグロビン(hapoMb)について、幾つかの条件下で蓄積する平衡論的中間体の特徴を、速度論的なふるまいを比較することによって調べた。これまでの研究において、速度論の立場からhapoMbの尿素存在下で蓄積する平衡論的中間体とフォールディング中間体とについて、それらの形成過程が同一であることを明らかにした。これらの成果は、現在論文投稿中である。平成26年度は、hapoMbについて、塩条件下、pH2において蓄積する中間体(salt-induced中間体)とpH4において蓄積する中間体(pH 4中間体)の構造形成機構を比較した。これらの中間体は、分光学的には類似の構造をもつことが示唆されている。フォールディング初期過程においては、これらの中間体は共通の速度論的なふるまいを示した。一方、フォールディング後期過程においては、pH 4中間体は、salt-induced中間体には認められない反応中間体を蓄積することが明らかになった。

本研究の目標は、球状蛋白質のフォールディングエネルギー地形を、実験の立場から定量的に記述し、蛋白質が特異的な天然立体構造を獲得するしくみを理解することである。この目標を達成するために、蛋白質フォールディングに伴う自由エネルギー変化を種々の構造パラメータを用いて記述することによって、フォールディングのエネルギー地形を自由エネルギーと構造アンサンブルとの関係として描く。平成24年度には、蛍光共鳴エネルギー移動と各種速度論的手法とを組み合わせることによって、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)の構造形成が、非一様に起こることを示唆する結果を得た。この成果は、国際雑誌Protein Scienceに出版した。平成25年度は、もうひとつのモデル蛋白質ウマアポミオグロビン(hapoMb)について、いくつかの条件下で蓄積する平衡論的中間体の特徴を、速度論的なふるまいを比較することによって調べた。速度論の立場から、hapoMbの尿素存在下で蓄積する平衡論的中間体とフォールディング中間体とについて、それらの形成過程が同一であることを明らかにした。この成果は、国際雑誌PLOSONEに出版した。平成26-27年度は、hapoMbについて、酸および塩によるフォールディング・アンフォールディングについて調べた。これまで蛋白質の酸変性機構を説明するために独立に用いられてきたMonod-Wyman-Changeux(MWC)モデルとLinderstrom-Lang smeared charge(LL)モデルとの両方をマクロな系で再現するモデルを開発することを目指した。この成果の一部は、既に国際雑誌に投稿済みであり、修正中である。本研究の目標は、蛋白質のフォールディングエネルギー地形を、実験の立場から定量的に記述し、蛋白質が天然状態へたどり着く機構を理解することである。スタフィロコッカル・ヌクレアーゼについて、蛍光共鳴エネルギー移動と超高速混合法とを組み合わせ、反応初期に非一様な構造形成が起こることを見いだした。これは初期中間体形成が特異的な相互作用に起因することを示唆する。アポミオグロビンについて、フォールディング反応初期に蓄積する中間体が平衡条件下において蓄積する中間体と同じ速度過程で形成することを見いだした。この結果は、これらの中間体が同一の分子種であることを示唆する。平成24年度までに得られた成果を国際雑誌Protein Scienceに出版した。また、平成25年度までに得られた成果を、現在投稿中である。hapoMbについて、様々な条件で蓄積する中間体の形成機構を調べることは、中間体を安定化する環境の影響を明らかにする意味で、本研究の幅を広げるものである。
LIM結合蛋白Ldb1のヒトにおける遺伝子構造と機能及びヒト疾患との関連性の解析

Ldb1遺伝子の機能異常が婦人科悪性腫瘍の発生進展に関わる可能性について検討した。98年から99年にかけて発表されたヒトLdb1遺伝子のcDNA配列よりPCR用プライマーを設計し、様々な子宮体癌および卵巣癌細胞株についてbeta actineをinternal controlに用いたcomparative RT-PCR法を用いてそのmRNA発現量を詳細に検討した。子宮体癌細胞株においては、昨年の報告同様コントロールに用いた手術検体よりの正常子宮内膜におけるLdb-1遺伝子の発現量と差が認められなかった。卵巣癌細胞株においては、昨年度の研究でKuramochi,CAOV3の2株において発現量に差が認められたので、さらにSKOV2,OVCA-3,PAI,ES-2,JHOC5,SMOV-2,JHOC6の合計9株について検討した。その結果、common epithelial由来のKuramochi,CAOV3およびOVCA-3の3株ではコントロールである手術検体の正常卵巣組織に比較し、2.4倍から2.7倍のLdb-1遺伝子の過剰発現を確認した。しかしながらmalignant teratoma由来のPAI株では正常組織とほとんど変わらない発現量を示した。興味深いことにclear cell carcinoma由来のES-2,JHOC5,SMOV-2,JHOC6の4株ではそのすべてにおいて発現量の減弱(0.2-0.6倍)を認めた。これらの事実は卵巣癌の組織型によりLdb1遺伝子の発癌に対する寄与が異なることを示している。さらにclear cell carcinoma由来の細胞株では4株すべてにおいて発現量の減弱を示したことから、Ldb1遺伝子の発現量の減弱がこの腫瘍の臨床的表現型(抗ガン剤抵抗性、難治療性など)を特徴づけている可能性があることを示唆していると考えられた。昨年から本年にかけて研究者が試みていたヒトLdb1のcDNAおよびgenomic DNAの塩基配列の報告が異なる3つのグループから相次いで報告された。いずれも研究者がクローニングし報告したマウスにおける塩基配列と高いホモロジーを示しており、ヒトLdb1遺伝子と考えられる。そこでこれらの報告された遺伝子配列を利用して翌年度以降に解析予定であった癌細胞でのLdb1遺伝子の発現の解析を行った。検体には子宮体癌株(Ishikawa,Hec 1A、Hec1B,KLE,AN3CA)5株および卵巣癌細胞株(kuramochi,CAOV3)2株を用いた。正常対照として婦人科疾患での手術検体より患者の同意を得た後正常部分の子宮内膜および卵巣より組織を採取し用いた。細胞株および正常対照ともにISOGENにてtotal RNAを回収しこれを鋳型にしてSuperscriptを用いて逆転写を行いcDNAを作成した。sequence detaのマウスとのホモロジーからexon-intron boundaryを推測してexon8からexon9および、exon9からexon10にプライマーを設定しRT-PCRを行った。PCRの回数をプラトーに達する前に終了させbeta-actinを内部標準にしてLdb1のそれぞれの細胞株および正常組織での発現量を比較した。この結果、子宮体癌細胞株では正常に比較し発現量に大きな差は認めなかった。しかし卵巣癌細胞株において、検討した2株とも正常に比較し発現量の増強が認められた。よって今後卵巣癌細胞株を中心にcompetitive RT-PCRを用いてより正確な比較を行う予定である。遺伝子診断の可能性を前提に、患者組織を用いて同様の結果が得られるかも検討する。また、このような発現の増強が癌化の原因なのか結果なのかを遺伝子組み替え技術を用いて癌細胞株で検討する予定である。
MRIによるF-19 FDGの画像化の研究

Doty社製コイルを用いた大容量5mlファントム撮像において、^<19>F画像が得られRat撮像の為の基礎パラメータ(共鳴周波数等)を確認できた。しかしながら、Ratの体内に静脈内投与した場合はでは^<19>F信号が得られず、Rat体全体でのスペクトル、膀胱付近のcoronal面の画像において共に得られなかった。コイルの感度不足もしくは体内での^<19>F濃度不足が原因と考えられた。そこで、被験物質のRat体内での拡散を防ぎ、高濃度で局所分布した状態での画像化を試みる為に、大容量皮下投与での撮像を行った。また、投与液を別途ファントムとしてRatの横に設置し同時に撮像を行った。その結果、^1H画像にて明確な皮下投与液の局所分布とファントムの画像が確認できたが、^<19>F画像ではファントムの画像が得られたのみで皮下投与された信号は得られなかった。そのため、コイル感度及び体内濃度以外の原因が考えられた。これまでのRatのMRI撮像にはイソフルランを用いた気化麻酔を使用したが、イソフルランには成分中にFが含まれており、たとえ低濃度であっても体内に吸収されたものがMRI信号へのノイズとし悪影響を与えることが考えられた。そこで、ウレタン麻酔下での皮下投与撮像を試みた。その結果、^1H画像にて得られた明確な皮下投与液の局所分布位置に対応した、^<19>F画像が得られた。これが今回初めて得られたRatin vivoでの5-FUの画像であったが積算時間14分では、わずかな信号であり、55分積算で明確に確認できた事を考慮すると、^<19>F画像を用いたRat in vivo評価系等への応用には、他の高感度化技術が必須であると考えられた。臨床用のMRIで実験を行った。1Hの実験結果を理論的に19Fに変換してFDG実験の感度を評価した。1Hの実験条件と結果を以下に示す。■Phantomは直径が約220mmの円筒■コイルはBody CoilのQD(Solenoid+saddle)■撮像条件は■S/Nを中心部の信号強度/周辺部の標準偏差の平均で求めると135.8となった。1H用の検出コイルを19F用に再調整する場合、共鳴周波数は1Hの約0.94倍と非常に近いので、コイルのQ値は事実上変わらない。したがって、となる。ここで、γは磁気回転比、Nは1画素中に含まれている19Fあるいは1Hの数である。γの値を入れ、Body Coilに水ファントムで行なった実験結果を代入すると、となる。Thickness:5mm、FOV:350mm、256×256マトリクスより1画素の体積は9.3mm^3であり、1画素中に含まれる水分子の数はNA×0.0093g/18g=3.1×10^<20>個となるので(ただし、NAはアボガドロ数)となる。よって、1Hの実験と同じ条件でS/N=1の19Fの画像を得るには、1画素中に2.6×10^<18>個の19Fが含まれていなくてはならない。現在PETの臨床で用いられているFDGの投与量は10mCiぐらいである。これを重さに換算すると、約1ngとなる。FDGの分子量が181なので、となる。以上の結果、FDGの濃度が6桁以上足りないことが判明した。

したがって、感度向上のために、NMR Force Microscopyの原理を用いた実験が必要であることがわかった。Doty社製コイルを用いた大容量5mlファントム撮像において、19F画像が得られRat撮像の為の基礎パラメータ(共鳴周波数等)を確認できた。しかしながら、Ratの体内に静脈内投与した場合はでは19F信号が得られず、Rat体全体でのスペクトル、膀胱付近のcoronal面の画像において共に得られなかった。コイルの感度不足もしくは体内での19F濃度不足が原因と考えられた。そこで、被験物質のRat体内での拡散を防ぎ、高濃度で局所分布した状態での画像化を試みる為に、大容量皮下投与での撮像を行った。また、投与液を別途ファントムとしてRatの横に設置し同時に撮像を行った。その結果、1H画像にて明確な皮下投与液の局所分布とファントムの画像が確認できたが、19F画像ではファントムの画像が得られたのみで皮下投与された信号は得られなかった。そのため、コイル感度及び体内濃度以外の原因が考えられた。これまでのRatのMRI撮像にはイソフルランを用いた気化麻酔を使用したが、イソフルランには成分中にFが含まれており、たとえ低濃度であっても体内に吸収されたものがMRI信号へのノイズとし悪影響を与えることが考えられた。そこで、ウレタン麻酔下での皮下投与撮像を試みた。その結果、1H画像にて得られた明確な皮下投与液の局所分布位置に対応した、19F画像が得られた。これが今回初めて得られたRat in vivoでの5-FUの画像であったが積算時間14分では、わずかな信号であり、55分積算で明確に確認できた事を考慮すると、19F画像を用いたRat in vivo評価系等への応用には、他の高感度化技術が必須であると考えられた。
ヒト上科の染色体進化に関する分子細胞遺伝学的研究

(1)ヒト第2染色体形成メカニズムを再検討する目的で、ヒト第2染色体ペイントDNAおよびα-サテライトDNAをプローブとして、ヒト、チンパンジー、およびゴリラの染色体に蛍光in situsハイブリダイゼーション(FISH)を行った。その結果、ペイントDNAは、従来の見解(ヒト第2染色体はチンパンジー第12・13染色体の末端融合によって形成された)を、確認した。α-サテライトDNAは、厳しい条件下で、ヒト第2染色体、チンパンジー第12染色体および小型メタセントリック(未同定)、およびゴリラ第11染色体のセントロメアに対してポジティブな反応を示した。今回のデータからでは、ヒト第2染色体の形成メカニズムに新しい知見を加える事はできなかったが、チンパンジーに、共通セントロメアを有する2対の染色体が存在する事は、その2対の染色体が共通の染色体から派生した可能性を示唆している。そこで、現在、染色体顕微切断法を用いて、チンパンジー第13染色体のセントロメアのDNA採取およびそれを用いてのFISHを行っている。また、チンパンジーの染色体分化の解明のための新戦略を検討中である。(2)シロテテナガザル、アジルテナガザル、ミューラーテナガザル、クロッステナガザル、およびワウワウテナガザルの染色体をC-バンド染色で観察したところ、従来発表されているパターンと異なるデータが得られた。腕内介在バンド、末端バンド、短腕全ヘテロクロマティン等を有する染色体が多く観察された。また、G-バンド染色で従来観察されていた第8染色体の逆位多型も、以前とは異なる状況で観察された。現在、染色体44本型テナガザル類の染色体分化のメカニズムを、今回観察した事実を基に、従来とは異なる方向から検討している。さらに、そのデータを基に、染色体変異ネットワークおよび核グラフ法を用いて数量的に解析中である。