hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路、ＴＧＦ‐β／Ｓｍａｄ経路を標的とした化合物の開発と創薬展開

膜結合部位はドデカノールに、2置換型ホスホラアミダイトを用いてリン酸基を導入して合成した。続いて、イノシトールリン酸部位に膜結合部位のリン酸ジエステル結合を介した導入を検討し、細胞膜結合部位としてドデカノールをもつイノシトールリン酸誘導体を得た。ピリジンを持つ金属結合化合物については、ケリダム酸の両カルボキシル基をアルデヒドとした後ににアジド導入、還元して4-アミノピリジン-2,6-ジカルボアルデヒドに導いた。これにシステアミン側鎖を導入した後に側鎖部位窒素にNps基を導入した化合物を得た。ピリジン4位のアミノ基に各種蛋白質認識部位を導入可能である。平成24年度の結果、PI3K/Akt経路およびTGF-β/Smad経路に作用しうる化合物に変換可能な中間体として有用な化合物を合成することができた。本研究計画の前半の根幹はイノシトールリン脂質のリン酸の各種位置異性体を自在に合成することである。従来myo-イノシトールから水酸基の保護と脱保護を繰り返して合成していたが、平成23年度の研究でDiels-Alder反応を基軸とした多用途合成中間体の合成に成功した。これにより本研究に必要な各種のイノシトールリン脂質誘導体を合成するための突破口を開くことができた。よっておおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の本研究の前半の成果は細胞膜に相互作用するイノシトールリン酸誘導体を得たことであり、これによりPI3K/Akt経路への作用が可能となった。平成24年度の本研究の後半の成果はピリジン4位に各種官能基を導入する手がかりとなるアミノ基をもった金属結合性化合物を得たことであり、これによりTGF-β/Smad経路の活性化と阻害への突破口を開くことができた。本研究で合成する化合物はイノシトール誘導体とピリジン配位子の2種類である。イノシトール誘導体については平成23年度にDiels-Alder反応を基軸とした合成法を開発したので、今後は合成したイノシトールリン酸にファルネシル基やジアシルグリセロール部分を連結させ、細胞膜上のAkt蛋白質と相互作用するように構造修飾を行う。ビリジン配位子については、ケリダム酸にシステアミン側鎖を導入することで合成する。得られた合成化合物について、Akt/PI3K経路、TGF-β/Smad経路への作用を検討する。イノシトール誘導体については平成24年度に細胞膜結合部位としてドデカノール部位をもったイノシトールリン酸を合成したので、今後は細胞膜相互作用部位としてファルネシル基やジアシルグリセロール部分をイノシトールリン酸連結させ、細胞膜上のAkt蛋白質とよりよく相互作用するように構造修飾を行う。ピリジン配位子については、ピリジンをもつ化合物に加えて2つのヒスチジンと2つのグリシンからなるペプチド性金属結合化合物合成し、TGF-β/Smad経路への作用を検討する。
キャビテーション噴流式表面改質装置の試作

1.キャビテーション噴流用ノズルを0.4mmから1.9mmまで大口径化したキャビテーション噴流式表面改質装置を試作した。2.試作した上記装置を用いて,PVDFセンサによりキャビテーション衝撃力を測定し,ノズル口径を約5倍にすると,衝撃力の発生頻度が増大するばかりでなく,最大衝撃力も5倍以上増大することが判明した。また試料水中の溶存酸素量と衝撃力の関係を計測した結果,溶存酸素量を減らすと衝撃力が増大することを明らかにした。3.試作した装置で種々の加工速度で表面改質した試験片の硬さと残留応力などを計測して最適加工速度を明らかにした。また硬い材料ほど圧縮残留応力を導入しやすいことを明らかにした。耐食性向上における最適加工時間については,キャビテーション噴流を噴射した時間と噴射後の材料表面の腐食電位の関係から,炭素鋼S45Cの耐食性の向上における最適加工速度を明らかにした。4.キャビテーション噴流を噴射中の被加工面の電位と作動流体のpHの関係から,プルベイ線図より,キャビテーション噴流式表面改質装置の最適作動流体を明らかにした。5.歯車や歯車を模したV溝付試験片の表面改質を行い,ショットピーニングに比べて,被加工面の粗さを増大することなく表面改質が可能であることを明らかにした。また金型等に用いられる硬い材料SKD61にもキャビテーション噴流により圧縮残留応力を導入できることを実証した。6.回転曲げ疲労試験により,試作した上記装置で表面改質した試験片の疲労強度が未処理の試験片に比べて増大し,本表面改質法により高強度化を行えることを実証した。また電気化学的計測により,本表面改質法により炭素鋼の耐食性を30%程度向上できる明らかにした。本研究は、キャビテーション噴流を用いた機械の構成部品の残留応力改善や耐食性向上の実用化を目指して、キャビテーション噴流式表面改質装置の試作、および最適加工条件の確立を目的とする。本年度は,表面改質におけるノズル口径の寸法効果解明のために以下の研究を実施した。1.キャビテーション噴流式表面改質装置の試作設備備品費に計上のプランジャーポンプを購入して,キャビテーション噴流を噴出するノズルを大口径化したキャビテーション噴流式表面改質装置を試作した。ノズル形状は,表面改質効果の再現性を良くするために,ノズルの口径ならびに流量係数を等しくすることが重要であることが判明し,したがってノズル形状はノズルスロート穴を精度よく空けたノズルプレートを挟み込む形状が最適であることが明らかになった。2.キャビテーション衝撃力における寸法効果の解明上記装置を使用して,研究代表者らが開発したPVDFフィルムを用いたキャビテーション衝撃力測定センサにより0.4mm1.9mmまでのノズル口径からのキャビテーション噴流の加工能力を測定した。その結果,ノズル口径を約5倍にすると,衝撃力の発生頻度が増大するばかりでなく,最大衝撃力も5倍以上増大することが判明した。また,設備備品費に計上の溶存酸素計を用いて,試料水中の溶存酸素量と衝撃カの関係を計測した結果,溶存酸素量を減らすと衝撃力が増大することを明らかにした。3.残留応力改善・耐食性向上における寸法効果の解明キャビテーション衝撃力を増大した上記装置により,金型等に用いられる硬い材料にもキャビテーション噴流により圧縮残留応力を導入できることを実証した。本研究は,キャビテーション噴流を用いた機械の構成部品の残留応力改善や耐食性向上の実用化を目指して,キャビテーション噴流式表面改質装置の試作,および最適加工条件の確立を目的とする。本年度は,表面改質における最適加工速度の解明と表面改質における最適作動流体の解明のために以下の研究を実施した。1.加工硬化量による最適加工速度の簡易評価

平成10年度に試作したキャビテーション噴流式表面改質装置において,任意の速度で試験片を加工できるように試験片ホルダを改良して,種々の加工速度で試験片を加工し,ロックウェル硬さ試験機を用いて,キャビテーション噴流にさらす時間と加工硬化量の関係から,加工硬化量が飽和する時間を最適加工速度として,種々の材料において表面改質における最適加工速度を簡易評価できることを明らかにした。2.残留応力改善における最適加工速度の解明上記装置を使用して,種々の速度およびキャビテーション噴流の噴射時間で加工した試験片の残留応力をX線回折装置により測定し,加工速度あるいは噴射時間と残留応力の関係から種々の材料の最適加工速度を明らかにした。また微小硬さと残留応力の関係を明らかにした。3.耐食性向上における最適加工速度の解明キャビテーション噴流を噴射した時間と噴射後の材料表面の腐食電位の関係から,炭素鋼S45Cの耐食性の向上における最適加工速度を明らかにした。4.表面改質における最適作動流体の解明キャビテーション噴流を噴射中の被加工面の電位と作動流体のpHの関係から,プルベイ線図より,キャビテーション噴流式表面改質装置の最適作動流体を明らかにした。本研究は,キャビテーション噴流を用いた機械部品の疲労強度向上や耐食性向上の実用化を目指して,キャビテーション噴流式表面改質装置の試作,および最適加工条件の確立を目的とする。最終年度である本年度は,表面改質層の非破壊評価と最適加工条件の確立のために以下の研究を実施した。1.X線による表面改質層の評価平成10年度に試作し,平成11年度に改良したキャビテーション噴流式表面改質装置により,種々の材料を種々の条件で加工し,被加工面の残留応力をX線回折式応力測定装置により計測し,表面改質をX線により定量的に非破壊評価できることを明らかにした。2.X線による評価と加工硬化の相関の解明上記装置を使用して,種々の条件で加工した試験片の残留応力と,マイクロビッカース硬さ試験機による硬さの計測の比較により,加工硬化量と残留応力の変化の相関を明らかにした。また硬い材料ほど圧縮残留応力を導入しやすいことを明らかにした。3.被加工面形状と表面改質効果機械部品の表面改質への実用化を踏まえ,歯車や歯車を模したV溝付試験片の表面改質を行い,ショットピーニングに比べて,被加工面の粗さを増大することなく表面改質が可能であることを明らかにした。また歯車の表面改質においては,歯幅方向にキャビテーション気泡が流れることにより,歯底を広範囲にピーニングできることを示した。4.高強度化・高耐食化の実証回転曲げ疲労試験により,本装置で表面改質した試験片の疲労強度が未処理の試験片に比べて増大し,本表面改質法により高強度化を行えることを実証した。なお材料によっては疲労限が50%も増大することが明らかになった。また電気化学的計測により,耐食性が30%程度向上することを明らかにした。
口蓋形成後の口蓋裂発生メカニズムについてーＭＥＯＸ２遺伝子に着目してー

マウス口蓋形成後の口蓋裂発生原因遺伝子と考えられるMEOX2遺伝子に着目し変異部位を明らかにすることを目的とする。日本人口蓋裂患者99名に対して血液サンプルからDNAを抽出し、MEOX2 (NM_005924 3exons)の遺伝子変異exon部とその前後のintron部の塩基配列をシーケンス解析した。MEOX2遺伝子のexon3部におけるアミノ酸変異を認めた。MEOX2遺伝子は、頭蓋および顔面の骨格異常との関係が示唆されており、発達した口蓋や、筋形成などに影響することが知られている。本研究より口蓋裂発生にMEOX2が関連し、口蓋突起癒合後の解離に影響を与えている可能性が示唆された。私達は、胎生期に口蓋突起が癒合し、口蓋が一旦形成された後に、癒合部が解離して口蓋裂が発症するという従来の概念とは異なる口蓋裂の発症機構を見出し、報告してきた。このような口蓋形成後の口蓋裂発生現象に着目し、マウスで同様の現象を惹起していると報告されているmesenchyme homeobox 2 (MEOX 2)遺伝子に関して、申請者らの保有するヒト口蓋裂患者の血液試料を用い、同遺伝子の変異を探索して、MEOX2遺伝子の変異と口蓋裂発症の因果関係を見出すことを目的とする。合計100例のサンプル採取が完了したため、それぞれのサンプルからDNA抽出を行った。MEOX2遺伝子におけるプライマーの設計も終了したため、MEOX2遺伝子の各exon近傍のintron部に設定した3組のプライマーセットを使用し、DNAシークエンスを行った。現在exon1において、repeat masterの存在により、解析が不十分となっており、追加解析を行う予定である。解析終了後、データの評価を行ない、学会発表、論文作成を行う予定である。本研究は、マウス口蓋形成後の口蓋裂発生原因遺伝子と考えられるMeox2遺伝子に着目し変異部位を明らかにすることを目的とする。ヒト染色体上では、7番染色体p22.1-p21.3にMEOX2は認められる。日本人口蓋裂患者99名に対してMEOX2の変異についてシーケンス解析を行った。ヒト口蓋裂患者の血液サンプルからDNAを抽出し、MEOX2 (NM_005924 3exons)の遺伝子変異exon部とその前後のintron部の塩基配列を解析した。【結果】MEOX2遺伝子のexon3部におけるアミノ酸変異を認めた。【考察】MEOX2遺伝子は、血管分化調節因子であり、関連したマウスタンパク質の突然変異は、頭蓋および顔面の骨格異常との関係が示唆されている遺伝子であるとともに発達した口蓋や、筋形成などに影響することが知られている。本研究の結果から口蓋裂発生にMEOX2が関連し、口蓋突起癒合後の解離に影響を与えている可能性が示唆された。私は、胎生期に口蓋突起が癒合し、口蓋が一旦形成された後に、癒合部が解離して口蓋裂が発症するという従来の概念とは異なる口蓋裂の発症機構を見出し、報告してきた。口唇口蓋裂患者血液試料の中から、口蓋裂患者20例を抽出し、DNA抽出を行った。一方、口蓋裂単独症例の新たな血液資料20例を集めることができた。血液資料60例が収集できたところでシークエンス解析を行う。ヒトMEOX2遺伝子は、ヒト7番染色体短腕部に75.46kbの長さを持つホメオボックス遺伝子で3つのexonからなる。ヒトMEOX2遺伝子の変異に関してNCBIのSNPデータベースにintron部の変異は1039の報告があるがexon部の変異の報告は無い。そこで、3つのexon各々の両端2027bpをプライマーとする。現在、プライマー設計を行っており、プライマーの配列が適正なものであるかどうかをPrimar 3等のソフトを用いて確認中である。口蓋裂単独症例の新たな血液資料を当初の予定より、20例多く、80例集めることができた。プライマーの設計が終了し、シークエンス解析を行うことができた。血液資料が順調に収集できているが、プライマーの設計がまだ終了していない。早急にプライマーの設計を行い、シークエンスを行うことが必要である。結果の解析および評価を行い、学会および論文にて発表予定である。

更なる口蓋裂患者からの血液資料採取を進めていくことが重要である。口蓋裂単独症例は、年数とともに診察回数が減少することから、定期診察時に、血液採取を徹底することが重要と考える。また、シークエンス解析のため、プライマーが適正であるかどうかを吟味しておく必要がある。exon近傍のintronに変異が起こった場合、スプライシングが阻害される。こうした変異も検出するためダイレクトシークエンスのためのプライマーはintron内に設計する。そこで既に報告されている変異部を避けるために前もって変異の位置を確認する。intron部は変異が蓄積するため、報告されていない変異も多数存在すると考えられ、設計したプライマーでPCR反応が行えるか、条件検討もあわせて行う。研究結果の解析及び、研究成果の発表として、国内外の関連学会(日本口腔外科学会、日本口蓋裂学会、国際口唇口蓋裂学会)等において演題発表ならびに論文投稿を行う。
フランス語における構文型体系の統辞・語彙的基礎研究

本研究の主目標は構文型毎の下位クラスの分析・分類と頻度数の確定である。ル・モンド紙の社説を基本資料として文単位で3000例ほどのデータベースを作成し詳細に分類した結果、次の様な概観が得られた。頻度の観点から圧倒的重要性が認められるのは、他動詞構文の1240例であり、42%を越えている。中でも名詞を直接目的とする553例だけでも全体の18%を越えている。前置詞aやdeによる間接目的を取る他動詞の構文(N-V-N-a-N/Vinf,N-V-N-de-N/Vinf ; N :名詞、V :動詞、Vinf :不定詞)も各々、92例、45例で注目に値する。間接目的のみを取る構文は246例であるが、前置詞はやはりaとdeが多い。代名動詞構文は185例で、これに態としての価値を認めるかどうかが一つ問題となるが、能動他動詞構文、受動構文との詳細な比較が必要である。自動詞構文は90例であるが、この中には直接目的の省かれたものも含まれる。受動構文は201例で上の代名動詞構文の185例とほぼ拮抗しているのは興味深い。属詞構文(etreは除く)は104例で、その中で属詞が不定詞のものが36例で目立つ。etreの構文は次の非人称を除いても415例もあり、14%を越えている。etreの全出現数は493例(助動詞は除く)で16.7%である(因みにavoirは106例で3.6%である)。非人称構文はilのものが184例、ceのもの(分裂文)が69例で、etreが147例で非人称全体の58%を占めている。非人称の中には人称構文が平行して存在している点も注目すべきである。主辞機能なしの動詞連辞核のものは我々の資料では無視してもよいほどである。非動詞文は211例であるが、その内社説の表題の199日分を除いても92例である。これは自動詞用法の90例と比較してももっと注目されてよい。今年度の研究概要としては、多くの実例による構文型の分析、分類上の諸問題の検討・整理であるといえる。1.構文型としては、(1)動詞要素を含まないもの(2)含むもの。(2)の中に(2-1)主辞機能を含まないもの(2-2)含むもの。(2-2)の中に(2-2-1)非人称主辞を持つもの(2-2-2)人称主辞を持つもの。(2-2-2)の中に、大きく分けて、a.直接目的機能を持つもの、b.直接目的、間接目的機能を持つもの、c.直接目的、直接目的属詞機能を持つもの、d.受動態のもの、e.代名動詞構文のもの、f.間接目的機能を持つもの、g.述辞が自動詞で目的機能を持たないもの、h.述部が「動詞+属詞」のもの、等がある。

このような構文型の下位分類を量的に更に充実させる必要がある。2.分類上の問題点の一つは、間接目的機能と分類基準には、ならない状況補語との区別である。これは構文の他動性の問題、特有・非特有機能の区別の問題でもある。3.上の2.とも関連して今後の重要な課題は、各構文型の下位クラスを代表する個別の動詞の、実例に即した、構文と語彙・意味要素との関係の分析である。この為には対象となる動詞毎に用例分類を充実させねばならない。4.もう一つの重要課題は、上の(2-2-2)a.h.の8つのグループが相互にどういう関係にあるかを明らかにすることである。例えば、d(受動態)はa,b,c(直接目的を持つ能動態)との関係が密接であるし、e(代名動詞構文)とa,b,c,dとの相互関係も重要である。また、(2-2-1)(非人称構文)とg(自動詞構文)との関係も無視出来ない。このような構文間の関係を上述の3.の個別の語彙項目との関連で明らかにすることが重要である。平成7年度の主目標は、構文型毎の典型的動詞の構文分析である。非動詞文については典型的な核の選定は困難で、無主辞文については核は極めて限られている(例えば、VoilaPierre.のようなもの)。非人称文については、pleurerのような非人称でのみ用いられる動詞よりも、resterやarriverのように、人称、非人称両方に頻繁に使われるものの分析が重要で、この場合、人称、非人称の選択の問題が出てきて、これは文単位を越える文脈の分析を必要とする。しかし、非人称構文全体の一体性を支えているものが何であるのかも明らかにされねばならない。フランス語の構文型の中心はやはり人称構文である。直接目的機能を取る動詞は多く、prendre等は典型であるが、直接目的と関接目的(例えば、与格機能)を取るもの(例えば、donner)、直接目的と属詞を取るもの(例えば、trouver)、使役構文のようなもの(例えば、faire,laisser)等がある。これらの他動詞構文と直接に関係があるのは、受動態と代名動詞の構文である。直接、間接の両目的機能を取る構文で問題となるのは、間接目的の認定であるが、特に頻度の高い前置詞deが付いたもの(例えば、fournir la population de vetements chauds)についてはそうである。代名動詞構文については下位の構文分析が、受動態についてはその成立の基本条件(例えば、時制)が問題になる。間接目的のみを取る構文(例えば、pierre parle de Marie.)では、やはり間接目的の認定が問題になる。直接、間接目的を取らない自動詞構文の他構文との関係は単純ではない(例えば、Pierre baisse le niveau...Le niveau baisse)。属詞動詞の典型はetreとdevenirであるが、これらの取る属詞機能の違いの分析が必要である。以上のように大きな構文型毎の典型的なものの概要は把握されたが、その各々の詳細な分析はまだ不十分である。1996年度の主目標は構文型毎の下位クラスの分析・分類と頻度数の確定である。ル・モンド紙の社説を基本資料として文単位で3000例ほどのデータベースを作成し詳細に分類した結果、次の様な概観が得られた。頻度の観点から圧倒的重要性が認められるのは、他動詞構文の1258例あり、41%を越えている。中でも名詞を直接目的とする553例だけでも全体の18%を越えている。前置詞aやdeによる間接目的を取る他動詞の構文(N-V-N-a-N/Vinf,N-V-N-de-N/Vinf;N:名詞、V:動詞、Vinf:不定詞)も各々、92例、45例で注目に値する。間接目的のみを取る構文は242例であるが、前置詞はやはりaとdcが多い。代名動詞構文は205例で、これに態としての価値を認めるかどうかが一つの問題となるが、能動他動詞構文、受動構文との詳細な比較が必要である。受動構文は200例で上の代名動詞構文の205例とほぼ拮抗しているのは興味深い。
無機硫黄化合物の酵素化学の確立とその応用

本研究は、硫黄を好んで食べる硫黄酸化細菌の「硫黄を消化(代謝)する酵素」を研究することで、その細菌が硫黄を代謝する仕組みを解明する。この理解は「無機硫黄化合物の酵素化学」という硫黄の化学として新たな研究分野を開拓することにつながる。これにより得られる知見は、石油の脱硫に伴い生じた大量の脱硫硫黄の生物的処理への応用が期待できる。我々は既に複数の硫黄酸化細菌から新規な硫黄代謝酵素を発見した。この内、テトラチオン酸ハイドロラーゼは酸性の硫黄酸化微生物にだけ確認されたユニークな酵素であり、この遺伝子の同定・組換え発現・結晶化に成功した。X線結晶構造解析により、その新規な反応メカニズムの一部を解明した。無機硫黄化合物の酵素化学の研究のために、硫黄酸化細菌の一種Acidithiobacillus ferrooxidans由来のテトラチオン酸ハイドロラーゼ(Af-Tth)を対象とした。本酵素は、還元型無機硫黄化合物のテトラチオン酸(S4O62-)の加水分解反応を触媒する極めてユニークな酵素である。従って、その反応機構の解明は「硫黄の化学」として極めて興味深い。微生物の還元型無機硫黄化合物代謝については主に2種類の代謝系が存在し、これに関係する酵素についても数種類以上が結晶解析レベルでそれらの反応機構が解明されてきた。その結果より、これらの酵素のほとんど全てが活性中心にシステイン残基を有し、このチオール基が基質である無機硫黄化合物と反応することで酵素活性を持つことが解明されている。つまり無機硫黄化合物を基質とする酵素においてシステイン残基は、その触媒活性に必要不可欠であると考えられている。一方、Af-Tthの遺伝子から推定されるアミノ酸配列は、499アミノ酸に対してシステインは唯一であった(C301)。従って、このシステイン残基の役割を調べるために、部位特異的変異酵素(C301A)を作成し酵素活性やサブユニットの会合などを野生型酵素と比較した。この結果、Af-Tth C301Aは野生型酵素と活性やサブユニットの会合において、ほぼ同様の結果を示した。このことはAf-Tthが他の硫黄代謝関連酵素とは異なり、システイン残基がその反応の触媒として関与しない新規な反応機構を有している可能性を強く示唆した。現在、Af-Tthの結晶化に成功しており、これのX-線結晶構造解析を推進している。本酵素の立体構造を決定し、活性中心と反応機構を解明することで新規な無機硫黄化合物の酵素反応への知見が得られる。同時に「硫黄の化学」として教科書の新たな1ページを形成することも期待できる。平成27年度は、結晶化に成功した鉄硫黄酸化細菌の硫黄代謝酵素の一種、テトラチオン酸ハイドロラーゼ(Af-Tth)の結晶構造解析に焦点を絞って研究を推進した。セレノメチオニン置換した本酵素結晶を作成し、大型放射光施設SPring-8のビームラインを使用し、SAD/MAD法によって位相を決定した。またNative結晶の回折像データも2.15Aの分解能で得ることができた。これらデータの解析を行い、本酵素の構造を決定することに成功した。また本酵素の結晶はP3_2の空間群であることが分かった。この結果を構造分類データベースのSCOPで検索したところ、本酵素の構造はClass: All beta proteins, Fold: 8-bladed beta-propellerに分類された。さらに基質であるテトラチオン酸溶液に浸漬した結晶にX-線照射して2.25Aの分解能を持つ回折像データを得た。得られたデータを解析した結果、Native結晶データでは観察されなかった新たな分子の電子雲が確認でき、これが基質のテトラチオン酸であると推定され、本酵素の活性中心をつきとめることができた。しかしながら今回得られたの回折像には明瞭な反射の他に微弱な反射が確認され、活性中心のアミノ酸残基と基質の電子雲が明瞭ではなく、基質分子を電子雲に正しく配置することはできなかった。今後は引き続き同様の解析を進めることで、より分解能の高いデータを得ることで、本酵素の反応メカニズムの解明を目指す。Af-Tth結晶から位相を決定し、X-線回折像データ解析より本酵素の立体構造の決定に成功した。また基質溶液に本酵素結晶を浸漬する手法により酵素基質複合体を形成した結晶の回折像データを得られたのは、大きな収穫であった。これにより、酵素の立体構造において基質結合部位を決定することができるだけでなく、そこに関わるアミノ酸残基を特定することが可能となるため、最終目的である本酵素の反応メカニズムの解明に向けて大きく前進した。当該研究では既に、A. ferrooxidansの4THase遺伝子(Af-tth)を世界で初めて同定し、これを大腸菌で組換え発現させて得た封入体から酸性refolding処理により活性型酵素を獲得する新規な手法を開発した。これにより組換え型Af-Tthの大量取得が可能となり、高度に精製することで結晶化にも成功した。本研究において作成したAf-Tth結晶をSPring-8のビームラインでX-線照射実験を行い、結晶構造データを回収した。しかし本酵素は新規な構造を有するため、分子置換法による構造決定ができなかった。そこでセレノメチオニン置換したAf-Tth結晶を作成し、同様にX-線照射によるデータを回収した。このデータを解析し位相を決定後、本酵素の空間群(P32)格子定数(a=b=94.7, c=234.3)など結晶学的性質を解明した。

さらに基質のテトラチオン酸や生成物のチオ硫酸溶液に浸漬した結晶のX-線照射データを解析することで本酵素の反応機構の解明を目指した。その一方で、酵素タンパク質の一次配列の比較から反応機構の解明にも取組んだ。システイン残基は、そのチオール基が基質の硫黄原子と反応することから、無機硫黄化合物を基質としたほとんどの酵素の活性中心に関わっている。そこでAf-Tthの一次配列を調べたところ、システイン残基は全499アミノ酸中で唯一(C301)存在した。これを部位特異的変異導入でアラニン置換した変異酵素(Af-Tth C310A)を作成し、その活性や分子量の測定、結晶構造解析を行い野生型酵素と比較した。その結果、この変異酵素は野生型とほとんど変化がなく、C301は本酵素において重要な働きをなさないことが明らかとなった。このことは同時に、Af-Tthが他の硫黄代謝関連酵素で見られるシステイン依存性の反応機構とは全く異なる反応メカニズムを持つ可能性が示唆された。本研究は、硫黄を好んで食べる硫黄酸化細菌の「硫黄を消化(代謝)する酵素」を研究することで、その細菌が硫黄を代謝する仕組みを解明する。この理解は「無機硫黄化合物の酵素化学」という硫黄の化学として新たな研究分野を開拓することにつながる。これにより得られる知見は、石油の脱硫に伴い生じた大量の脱硫硫黄の生物的処理への応用が期待できる。我々は既に複数の硫黄酸化細菌から新規な硫黄代謝酵素を発見した。この内、テトラチオン酸ハイドロラーゼは酸性の硫黄酸化微生物にだけ確認されたユニークな酵素であり、この遺伝子の同定・組換え発現・結晶化に成功した。X線結晶構造解析により、その新規な反応メカニズムの一部を解明した。新規な無機硫黄化合物代謝酵素であるAf-Tthの結晶化とX-線回折像の獲得に成功したことは大きな収穫であった。また、新規構造であるため分子置換法による構造決定ができなかったが、セレノメチオニン置換酵素を作成し、これも同様に結晶化に成功したことから、異常散乱法による位相と構造決定が可能となった。現在はデータの解析により構造決定を推進している。この間、システイン残基の活性への役割を調べる実験としてC301A変異酵素の作成と解析を行ったが、変異が活性などに影響を与えず、本酵素はシステイン残基に依存しない新規な反応機構を有している可能性が強く示唆された。概要でも述べたが、Af-Tth結晶を基質溶液に浸漬することで酵素基質複合体の結晶を得ることができた。これにX-線を照射し、回折像データを得る。高い分可能を得るためには良質な結晶を得ることが必要となるので、酵素の精製度を高めることや結晶化条件を微調整する。また、良質な結晶データが得られる可能性が高めるためには、回数をこなすことも必要である。このため、大量に結晶を作成するなどして、良質な結晶の生成する確立を高めていく。基質と活性中心のアミノ酸残基の立体配置を決定し、反応メカニズムの推定を目標とする。またその反応の正当性を部位特異的変異酵素を作成することで実証する。
地域バイオマスを活用した食料産業クラスター事業を評価する会計システムの研究

2018年度は、2017年度に引き続き、2016年度の「研究実施計画」をもとに、食料産業クラスターの事業評価を支援する会計システムの実践的適用可能性に関して、以下の2つの研究・調査を実施した。まず1つ目は、現在、企業や自治体などでも注目されている持続可能な開発目標(Sustainable Development Goals:SDGs)を考慮に入れ、その会計システムを組み込んだマネジメントシステムモデルを検討した。その内容は、2017年度までに検討した、バランス・スコアカードと戦略マップの概念や手法に基づくフードバレーとかちを対象とした会計システムを、SDG CompassやSDG Industry Matrixの内容を参考にしながら、気候変動対策のためのマネジメントシステムモデルを概念的に提示した。次に、2つ目は、1つ目に述べたマネジメントシステムモデルの実用可能性の検証についてである。ここでは、都内の大学などで開催された研究会や、青森県での地域活性のための打ち合わせにおいて、このモデルの概要を報告し、そこで出された意見などをもとに、同モデルの実用可能性だけではなく、地域の健康保持・増進を目指したヘルスバレー事業、小水力など再生可能エネルギーを活用した地域経済促進事業、地域循環共生圏を目指した廃棄物事業など、地域のサステナビリティ経営のためのモデルの拡張可能性についても明らかにすることができた。今年度に実施した以上の研究・調査成果の一部は、2017年度にマイクロソフト(Microsoft)のエクセル(Excel)で構築したシステムモデルに反映し、また、学会報告においても公表されている。今年度は、研究実施計画に基づいて、次の3点に関する取組みを行った。まず、オランダのヘルダーランド州におけるバイオマス政策・事業と農政・農業の現状分析については、事業のコア組織となっているワーゲニンゲン大学、同大学リサーチセンター、フードバレー財団で展開されている食料産業クラスター(フードバレー)に関する報告書や関連資料を収集し、データ化して整理した。また、日本に関しても、バイオマスとフードバレーの取組みを支援している農林水産省と環境省や、食品需給研究センター、十勝地方(帯広市)、栃木県、富士宮市においてフードバレーに関する報告書や関連資料を収集し、データ化して整理した。これらのうち、栃木県と富士宮市では、フードバレー関係者に対してヒアリング調査も行った。こうしたデータ整理や調査に基づいて、3地域のフードバレーの実施形態の違いを明らかにし、また、この事業の課題についても検討した。次に、バイオマスを活用した食料産業クラスターの概念モデルの構築については、先述のデータ整理や調査結果以外に、経営学、農学、バイオマスに関する著書・論文を用いて、バイオマスを食料産業クラスター事業のエネルギーなどに活かす事業モデルや、食料産業クラスターから排出されるバイオマスを地域内外で活かす事業モデルなど、地域の持続的成長が見込めるさまざまな事業モデルを検討した。そして最後に、この概念モデルを持続可能な事業モデルとして具体化させるために利用可能な会計モデルの検討については、経営学、会計学に関する著書・論文を用いて、バイオマスおよび食料産業クラスターのマネジメントモデルと、会計システムに関するモデル化の方向性を検討した。以上の研究成果の一部については、研究論文や招待講演の資料作成に使用した。なお、研究論文は2015年12月に公表されている。今年度は、オランダや日本の食料産業クラスター(フードバレー)に関する報告書や関連資料に基づいて、バイオマスやクラスターの取組内容を整理するとともに、地域の持続的成長が実現可能と考えられる事業モデルや、その事業を支援する会計システムのモデル化の方向性を検討することができた。しかし、オランダ政府の経済・農業・技術革新省や環境省で公表されている報告書や関連資料については、まだ十分に整理できていない。また、上記の事業モデルについても、バイオマスを活かした食料産業クラスターモデルとして具体化させるまでには至っていない。以上から、「(2)おおむね順調に進展している」と評価した。今年度は、研究実施計画に基づいて、以下の3点に関する研究・調査の取組みを行った。まず1つ目は、十勝地域で展開されているフードバレーとかちのコーディネーター組織である帯広市の事業担当者に対して数回ヒアリング調査を行い、この調査結果と同市提供の関連資料、そして、帯広市図書館で収集した新聞記事に基づいて、フードバレーとかちのコア事業となっている十勝型フードシステムの構築とバイオマス事業との融合による統合事業モデルに関する現状と課題について整理した。2つ目は、主に国連のSDGs資料と、サステナビリティ戦略、サステナビリティ・サプライチェーン、産業クラスター、マネジメント・コントロール、バランス・スコアカードの著書と論文の考察を通じて、先述の統合事業モデルに基づく想定シナリオとそれを評価する会計モデルを検討した。ここでは、事業関係者(特に、コーディネーター組織でもある帯広市)が、このシナリオの評価に有用と考えられる評価項目および評価データと、これらを用いて新たな事業化を論理的に検討することができる会計モデル(地域レベルのバランス・スコアカードモデル)とともに、このモデルに基づいて、評価マップおよび意思決定カードを用いたシステム化の方向性を明らかにした。そして最後に、3つ目は、バイオマス産業都市に選定され、十勝地域など他のフードバレーの取組みを参考にして事業展開し始めた新潟市のニューフードバレーの事業担当者に対してヒアリング調査を行い、この調査結果と同市提供の関連資料から、先述のシナリオや会計モデルの同市への応用可能性を明らかにした。以上の研究・調査の取組成果の一部は、今年度国内で刊行された研究論文とディスカッション・ペーパー、そして、海外の学会報告にも利用されている。今年度は、平成27年度での研究成果を参考にしながら、十勝の地域特性を考慮に入れた新たな事業展開のための想定シナリオと、同シナリオの評価や検討を支援する会計モデル、そして、これらの他地域への応用可能性について検討することができた。

しかし、会計モデルの評価データを用いた現状対シナリオ、またはシナリオ対シナリオの評価や検討ができていないことや、想定シナリオを用いた事業担当者との打ち合わせが十分にできていないことから、より一層実効性の高いモデル構築までは検討できていない。以上から、「(2)おおむね順調に進展している」と評価した。今年度は、「研究実施計画」とともに、昨年度の「今後の研究の推進方策等」に示された内容に基づいて、主に2点の研究・調査を行った。まず1つ目は、昨年度十分に実施できなかった想定シナリオに関する事業担当者との打ち合わせや、同シナリオの評価や検討に関する研究であるが、今年度は、バランス・スコアカードと戦略マップの概念と手法を用いて、十勝地域のフードバレー事業である「フードバレーとかち」の推進プランや戦略プランに基づくシナリオ評価モデルとその評価方法を概念的に提示した。しかし、このモデルを実践的に適用可能なものにしていくための事業担当者との打ち合わせや、評価対象事業を選定するための現地調査は、まだ十分には実施できていない。2つ目は、上述した想定シナリオの評価モデルを、マイクロソフト(Microsoft)のソフトウェア(エクセル(Excel)、アクセス(Access)、ビジオ(Visio)など)を用いてシステム化していく取組みについては、今年度は、エクセルを用いたシステムモデルを構築できた。しかし、このシステムモデルに、「フードバレーとかち」の事業に関係するデータを持たせ、この事業をより良い方向に展開していくためのシミュレーション評価としての利用方法や、事業関係者との意見交換に基づき、その仕様のカスタマイズまでは十分に検討できていない。今年度に実施した以上の研究・調査成果の一部は、国内の研究論文(大学紀要)や学会報告でも公表されている。今年度は、「研究実施計画」と、昨年度の「今後の研究の推進方策等」の内容に基づいて、研究・調査を有効的に進めていく予定であった。しかし、本学部の執行部に就き、その業務(学内あるいは学部内の委員会業務や入試業務など)を優先的に行わなければならなかったことから、昨年度に実施すべき事業担当者との想定シナリオの作成や、シナリオ評価手法の実践適用可能性の検討が十分にできなかった。また、これに加えて、今年度実施すべきシナリオ評価手法に基づくシステム構築と、それを用いた評価対象事業のシミュレーション技法や事業担当者との意見交換によるシステムのカスタマイズ作業もできなかった。以上から、今年度は、「(3)やや遅れている」と評価した。2018年度は、2017年度に引き続き、2016年度の「研究実施計画」をもとに、食料産業クラスターの事業評価を支援する会計システムの実践的適用可能性に関して、以下の2つの研究・調査を実施した。
がん患者の家族におけるグループ療法の効果検討

がん患者の家族のグループ療法について、予備的な研究を行った。患者の家族は、患者や家族自身の不安は、背景や個人差があると感じており、構造化しないグループにとまどいを持つことが示唆された。医療スタッフと乳がん患者とその配偶者で行ったグループでは、医学的知識を得る機会となっただけでなく、夫妻だけでは話合いにくい患者や家族の気持ちが表出可能となり、患者と家族のコミュニケーションを深める手段となることが示唆された。がん患者の家族は、患者が告知を受けた後に身体的にも精神的にも負荷を抱え、QOLが低下していることが多い。しかしがん患者の家族を対象として研究や心理社会的介入の有効性を示す研究はほとんど行われていない。家族への心理社会的介入の有効性を検討するためにグループ療法を行った。まず、主な備品であるボイスレコーダー、データの保存、解析を行うための環境を整備した。参加者募集の案内を作成し、主治医、看護師、患者、家族に対して家族のためのグループ療法を説明し、実際の参加者を募集とした。今回は予備的検討として、患者と家族の両者、医療スタッフが参加するグループ療法により問題点を明らかにすることとした。参加の希望者に対しては、グループ療法の研究の主旨および内容を説明して、文書により同意を習得した。グループ療法は研究代表者と研究協力者により構造化された形で行った。グループ内でのディスカッションを行い、精神力動的な介入を行った。グループでのディスカッションにより、患者と家族がよりがんや医療に関しての情報を求めていることが明らかになった一方で、医療スタッフもどこまで情報を開示して問題がないのか不安を抱えていることが明らかになった。グループが深まり凝集性が高まるにつれて、次第に率直な意見が交わされるようになり、がん患者と家族の間のコミュニケーションの仕方に不安があること、お互いどのように接したらよいのか分からず自身がもてないこと、また今後の病状の進行への不安が開示された。問題点についてはグループ内で率直に議論することによってワークスルーが成され、グループ療法の有効性が示唆される結果となった。がん患者およびその家族は、がんの告知を受けた後に、身体的にも精神的にも大きな負担がかかりQOLが低下することが多い。しかしがん患者の家族を対象として研究や心理社会的介入の有効性や必要性を示す研究は日本ではほとんど行われていない。このため、家族への心理社会的介入の有効性を検討するためにグループ療法およびその予備的検討を行った。参加者募集の案内を作成し病院の外来での掲示、患者図書室などで配布を行った。グループの講義で提供する情報の収集、データの保存解析、環境の整備を引き続き行った。通院中および入院中のがん患者およびその家族に対して主治医および看護師とともにグループ療法を説明して参加者を募集した。予備的研究として、グループ療法の対象となるがん患者の家族に対して、グループ療法の案内を行い参加の希望の有無を確認し、可能な場合にはその理由を面接により調査することとした。参加希望者がグループ療法の人数に達せず、グループ開催には至らなかったが、面接による聞き取り調査から、グループ療法に対して様々なニーズや印象があることが明らかになった。背景の異なる見知らぬ参加者とグループに参加する不安や、参加することで利益が得られるのか不確かであること、参加者に対して貢献可能であるのか自信がないといった意見が認められた。治療についての知識を得るために前半の講義については参加してみたいと希望しても、後半の患者家族同士でのグループセッションに対しては抵抗感があるとの意見が多かった。家族ががんに罹患していることを他者には知られたくないといった意見が認められ、親戚や友人などに隠している家族ほどグループ参加に抵抗を感じる傾向が認められた。がん患者の家族へのグループとしては構造化されないグループよりは、まずは知識の提供などを主体とした構造化されたプログラムの方が参加しやすい可能性が示唆された。
生活習慣病の発症に関わる食生活と遺伝要因の相互作用に関する研究

生活習慣病の発症に関わる遺伝要因と環境要因の相互作用について調べたところ、高血圧の発症には、ナトリウム・カリウムの摂取量とWNK1の遺伝子型の相互作用が重要であること、肥満の発症には脂質摂取量とPRDX3の遺伝子型の相互作用が重要であることが明らかとなった。また、糖尿病の発症には単独では効果が小さい複数のリスク遺伝子の積み重なりが重要であり、特に肥満というリスクをもたない群においては、リスク遺伝子の影響が強く現れることがわかった。活性酸素の体内での増加によって生じる酸化ストレスは、糖尿病、高血圧、動脈硬化、肥満、がんなどの生活習慣病の発症に影響を与えていると考えられる。しかしながら、同じような酸化ストレス状態にさらされたり、抗酸化作用を有する食品を摂取しても、その効果は個体によって異なることが多い。本年度は、活性酸素の生成や消去に関わる酵素の遺伝子の個体差が、生活習慣病の発症に影響を与えているかどうかについて分析した。さらに、活性酸素の増大に関与する脂質摂取量と遺伝子型の組み合わせが生活習慣病の発症に与える影響についても分析した。健康診断を受診した成人816名(平均年齢54.0±5.1歳)を対象として、活性酸素の生成や消去に関わる10種類の酵素の遺伝子(スーパーオキシドジムスターゼ(SOD2)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、カタラーゼ(CAT)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPX1)、チオレドキシン(TXN2)、ペルオキシレドキシン(PRDX3)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GSTP1、GSTT1、GSTM1、GSTM3))の多型と肥満、高血圧、糖尿病との関連を分析した。その結果、PRDX3遺伝子に存在する多型と肥満との間に関連が検出できた(P=0.0003)。次に、脂質摂取量と遺伝子型を組み合わせて分析したところ、この関連は、脂質摂取量過剰群(脂質%エネルギー≧25)でのみみられ(P=0.0016)、脂質摂取非過剰群(脂質%エネルギー<25)ではみられなかった。以上のことから、PRDX3の遺伝子型と脂質摂取量の組み合わせが肥満の発症に影響を与えていることが示唆された(投稿準備中)。WNK1は、腎尿細管におけるナトリウム再吸収やカリウムの排泄を調節しているセリンスレオニンキナーゼである。ラットに多量のカリウムを摂取させるとWNK1の働きを介して、ナトリウムの再吸収が減り、カリウムの排泄が促進され、このラットでは血圧が低下することが観察されている。本研究では、このWNK1遺伝子に注目して、WNK1遺伝子の個体差と血圧値の関連を日本人の健康な男性719人を対象として分析した。その結果、血圧値の決定に影響を与えるミスセンス変異(Met1808Ile)を検出した。さらに、ナトリウムおよびカリウムの摂取量とこの遺伝子型の組み合わせが、血圧値の決定に与える影響を分析するために、被験者を摂取したナトリウムとカリウムの比(Na/K比)の中央値で2群に分け、それぞれのグループにおける遺伝子型と血圧値の関連を調べた。Na/K比の高い群、すなわちナトリウム摂取量が多く、カリウム摂取量の少ないグループではMet型保有者の血圧は、Ile/Ile型のそれに比べて高かったが、Na/K比の低い群では、Met型保有者の血圧値とIle/Ile型のそれとの間に差はなかった。すなわち、Met型保有者の血圧値は、ナトリウムおよびカリウムの摂取量の影響を受けて変動しやすいことがわかった。従って、このMet型遺伝子は「食塩感受性遺伝子」のひとつである可能性が示唆された(論文投稿中)。全ゲノムを網羅的に解析することにより同定された17個の糖尿病リスク遺伝子と、肥満の有無、炭水化物や脂質の摂取量、運動習慣といった環境要因の組み合わせが糖尿病の発症に与える影響を分析した。被験者は、健康診断を受診し医師により糖尿病と診断された333人の男性と糖代謝正常の男性417人である。分析した糖尿病リスク遺伝子のうち、SLC30A8、CDKN2A/B、CDC123、KCNQ1の4つの遺伝子が本研究の被験者集団においても糖尿病のリスク遺伝子となっていることが確認できた。それぞれのリスク遺伝子単独の効果は、Odd比にして1.3から1.7とあまり大きくはなかったが、リスク遺伝子を併せ持つと、Odd比は3.6に上昇した。さらに、炭水化物摂取量の多いグループに限って分析すると、糖尿病のリスク遺伝子の保有数が増えるとOdd比は6.0に上昇した。また、肥満は糖尿病の最大のリスク因子であることが本研究でも確認できた。一方、肥満のあるグループでは、リスク遺伝子の保有数と糖尿病の間に関連は見られず、肥満のないグループでのみ、リスク遺伝子の保有数が糖尿病の強いリスク因子となることがわかった(Odd比7.6)。肥満がなくても、複数のリスク遺伝子を合わせ持つ人では、糖尿病発症のリスクが高くなるので注意が必要である。今後は、これらのリスク遺伝子保有数の違いが糖尿病の治療効果、食生活や生活習慣の改善効果の違いに影響を与えるのかどうかについても分析していく必要がある。
新しい基底膜浸潤モデルを用いた悪性腫瘍の転移の分子機構に関する研究

悪性腫瘍の転移を変成するためには,脈管内への播種,脈管内から標的臓器実質への侵入の二段階で内皮細胞下の基底膜を浸潤,貫通しなければならない。我々の開発による再構成基底膜(matrigel)を用いたin vitroinvasion assayを用い,基底膜浸潤の分子機構の解明を試みた。基底膜浸潤は大きくの基底膜への接着,(2)酵素的破壊,(3)実質方向への迷入,の3つのプロセスに分けられる。我々はまず,ヒト線維肉腫細胞では,最初の接着の段階で,基底膜内糖蛋白lamininの4つのアミノ酸配列部位(YIGSR,PDSGR,RGP,IKVAV)及びtypelv collagenに接着することを明らかにした。次に,腫瘍細胞のlamininとの接着が引金になり,typelv collagehaseが分泌され,基底膜が破壊されることを証明した。さらに,本来は転移のバリヤーである基底膜の構成成分(特にその中でlaminin)が,腫瘍細胞の接着,酵素の放出,運動性,増殖能といった転移に必要な形質を全く助長する例通をもつことを証明した。invitroinvasion aesayは,腫瘍細胞の基底膜浸潤のブロッカーの検出にも有用であった。CAMPアナログ,人工ペプチドYIGSRは,invasion assayで基底膜浸潤を抑制し,更に動物実験でも転移をブロックすることが明らかになった。我々の用いたinvasion assayは臨床材料の浸潤能移走にも使用可能であった。腫瘍の摘出標本あるいは生検材料から,primay cultviveを作製し,invasionassayにかけると,悪性腫瘍では,程度の差こそあれ全く浸潤能を示し,正常皮フ由来の線維芽細胞などは浸潤能を示さなかった。生命予後との相関などの判定には,更にデータの集積を要する。さらに,基底膜構成成分がintroで腫瘍細胞の増殖を促進する点にヒントをえて,腫瘍細胞を基底膜抽出物(matrigel)に浮遊させてヌードマウス皮下に移植すると,腫瘍のヌードマウス可移植率が促進されることを発見した。可移植率が低いことが問題となっているヌードマウスを用いた,ヒト腫瘍の実験の福音となると思う。ヒト線維肉腫細胞,ヒト骨肉腫細胞,ヒト前立腺癌細胞が強い基底膜浸潤能を有することをIn Vitro Invasion Assayで確認した。さらにヒト線維肉腫細胞HT1080cellについては,type IV collagenaseが浸潤に関与していること,浸潤能はcyclic AMPアナログで抑制されることを確認した。また,基底膜浸潤は1)腫瘍細胞の基底膜との接着,2)基底膜破壊、3)実質方向への迷入の3つのプロセスよりなるが,最初の接着の段階で基底膜内の糖蛋白であるlamininの4つのアミノ酸配列(YIGSR,PDSGR,RGD,IKVAV)が,HT1080 cellとの接着に関与していることを確認した。また,lamininだけでなく,基底膜の構築の軸となっているtypeIV collagen自身も、線維肉腫細胞HT1080cellとの接着に関与していることを確認した。

現在の問題点は,lamininの4つの細胞接着領域が,どのような役割をもっているのか,即ち,次のプロセスである基底膜破壊や,迷入へのスイッチになるのは4つのうちどの領域との接着か,4つの接着領域はたがいにどのように関わり合っているかという点である。また,浸潤に関与する蛋白分解酵素は,type IV collagenase単一でなく,Stromelysin等の酵素も関与しているのではないかと思われ,アイット-プでラベルした基質の破壊,substrate gelを用いた実験などから検索を進める予定である。悪性腫瘍の基底膜内浸潤は,1)腫瘍細胞の基底膜への接着,2)腫瘍細胞由来の酵素による基底膜の破壊,3)転移の標的臓器実質方向への迷入という3つのプロセスに分けられる。われわれは,平成2年度に,ヒト線維肉腫細胞においては,最初のプロセスである基底膜への接着の段階で,基底膜内の糖蛋白であるlamininの4つのアミノ酸配列部位(YIGSR,PDSGR,RGし,IKVAV)およびtype IV collagenに接着することを報告した。また,Modified solid phaseradioassayを用いることにより,腫瘍細胞由来のtype IV collagenaseによって基底膜が破壊されることを報告した。更に,平3年度は,本来,転移りバリヤ-である基底膜の構成々分が,腫瘍細胞の運動性,増殖を促進する側面を持っていることを証明した。これは,1)ヒト線維肉腫細胞,あるいはヒト骨肉腫細胞と再構成基底膜(matrigel),あるいはlamininに暴露させると,in vitroで細胞の増殖を促進させること,chemotaxis効果が見られること,2)再構成基底膜(matrigel)に腫瘍細胞を浮遊させた状態で,nude mouse皮下に移植すると,腫瘍細胞によるtumorigenecityが著明に促進されること,から証明された。以上の事実から,悪性腫瘍の基底膜浸潤は,腫瘍細胞側からの一方的な働きかけによるのではなく,腫瘍細胞と基底膜構成々分の相互反応によって成立するという可能性が示唆された。また,再構成基底膜(matrigel)により,transplantabilityが低い事が問題になっているヌ-ドマウスを用いた制癌剤感受性テスト等,ヌ-ドマウスを用いたヒト腫瘍の研究に,飛躍的な発展がもたらされるかも知れない。我々が1986年に開発した、再構成基底膜を用いたin vitro invasionassayは、今や世界で最もポピュラーな腫瘍細胞の浸潤能の測定法となっている。しかし、従来、このアツセイを用いた研究結果は、すべて樹立された細胞株に関するものであった。もしも、外科手術や生検でえられた腫瘍についてのアツセイが可能となれば、個患者での転移能の予測、生命的予後の判定因子として有力なアツセイ法となる可能性がある。我々は、外科手術や生検でえられた腫瘍のprimary cultureでこのinvasion assayが可能なことを発見した。骨肉腫、Ewing肉腫、悪性神経上皮腫では強い浸潤能を示し、脂肪肉腫では以上より多少弱いが、やはり浸潤能を示した。しかし、正常の皮フ組識よりえられた線維芽細能は浸潤能を全く示さなかった。