hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接着付着界面の複合劣化特性と補修補強後部材の性能予測

コンクリート構造物補強法における接着界面付着特性に関し,FRP接着工法の付着特性は18か月の浸潤後において多少低下するものから向上するものまであり,増厚工法の付着特性は60度までの温度上昇とともに低下するが,温度が低下すると多少回復する.これらの結果に基づき,付着特性推定式を提案した.補強後の性能向上技術として,ポリウレア層挿入FRP接着工法の解析技術,増厚工法用アンカー筋補強効果推定モデル,ひび割れ樹脂注入による疲労耐力向上推定モデルを提示した.凍害を含む複合劣化に関し,疲労との複合作用下のコンクリート損傷推定モデル,塩害との複合作用下の凍害促進推定モデル,凍害損傷の分布測定法を提示した.(1)FRP接着工法の耐久性試験に関しては,国内外の企業による実務に適用されている6つのシステムの浸潤環境の影響を15ヶ月間の期間にわたり比較試験をし,接着・含浸樹脂は引張強度が少し低下するものがあること,せん断付着強度は,システムによって多少低下するものの,樹脂の引張強度とは密接な相関はなかった.せん断剥離破壊モードは,コンクリートの凝集破壊から,付着界面剥離破壊へと変わった.(2)セメント系増厚工法の耐久性試験に関しては,国内企業(2社)により実務に適用されている複数のシステムの温度の影響を1ヶ月間にわたり試験を行った結果,高温(60度)の影響は,1日で見られ,セメント系材料(PCM)の強度及び付着強度は顕著に低下する.試験時の温度を常温に下げると強度は回復する.破壊モードは付着界面剥離破壊からPCMの凝集破壊へと変わった.(3)FRP接着工法の剥離耐力向上技術開発に関しては,ポリウレア層を設けた炭素繊維シートとコンクリート間の付着特性に関する検討を行った.試験温度が60度以下であれば付着強度の低下が起こらないことを実験的に明らかにするとともに,実用的な有限要素解析用の付着モデルを構築した.(4)セメント系増厚工法の剥離耐力向上技術開発に関しては,下面増厚端部に設置するアンカー筋の長さおよび位置を変数として実験を行い,アンカーによる補強効果を確かめた.実験によって,増厚端部補強筋の引張力によって生じる割裂破壊面の局部曲げ応力の一部をアンカー筋が受け持つことが示された.(5)凍害と荷重による複合劣化に関しては,凍結融解繰り返し作用下のコンクリートの変形挙動のモデルを構築し,実験結果を推測できることを示した.また,荷重作用を合わせて受ける場合の変形や強度推定モデルの構築中である.(1)FRP接着工法の耐久性試験に関しては,6つのシステムの浸潤環境の影響を18ヶ月にわたり比較試験をし,接着・含浸樹脂の引張強度,FRPとコンクリートとの界面でのせん断付着強度とせん断剥離モードは6ヶ月後の性状から大きく変化しないこと,現場で繊維に樹脂含浸し接着するシステムよりFRP成形材を樹脂で接着するシステムの方が強度低下抑制という点で勝ることを示し,湿潤環境の影響を考慮した付着応力-すべりモデルを提案した.(2)セメント系増厚工法の耐久性試験に関しては,1システムへの温度の影響(1ヶ月間60,40度に暴露)を要素試験とはり試験を通して確認し,2014年度までに実施した他の2システムの結果にも適用できる付着界面剥離強度推定式,この式に基づいた増厚補強したはりの剥離耐力推定法を提案した.合わせてひび割れ幅推定法も提示した.(3)FRP接着工法の剥離耐力向上技術開発に関しては,ポリウレア層を挿入し炭素繊維シートを巻き付けまたは貼り付けた場合のはりのせん断破壊試験において,ポリウレア層がない試験体に比べせん断補強効率が向上すること,ポリウレア樹脂を挿入し繊維シートにより曲げ補強したはりの曲げ破壊試験において,コンクリート強度が小さいと付着割裂破壊が発生するため付着耐力の向上を期待できないことを実験的に明らかにした.(4)セメント系増厚工法の剥離破壊およびかぶり割裂破壊に関しては,アンカー筋配置の補強効果による耐力の推定モデルを構築した.また,接着工法およびセメント系増厚工法と併用されることが多いひび割れ補修に関しては,ひび割れを跨ぐ鉄筋の疲労寿命の増大に対する推定モデルを構築した.(5)凍害と荷重による複合劣化に関しては,凍結温度下のコンクリートの強度推定モデルと,凍害と疲労荷重の複合作用下のコンクリートの変形挙動のモデルを構築し,実験結果を推測できることを示した.(1)接着工法と増厚工法の耐久性に関しては,時間依存性荷重(持続、疲労荷重)との複合劣化試験を除いて,予定とおり進捗しており,研究の成果も論文や国際会議などで公表(公表決定のものも含む)している.(2)FRP接着工法の剥離耐力向上技術に関しては,解析的な検討を行うための実験事実を蓄積することができた.現在は,解析的検討を含めた形で,研究成果を広く公表する準備を進めている.(3)接着工法およびセメント系増厚工法と併用されることが多いひび割れ補修による被補強構造部材の疲労特性に関しては,研究の成果を国内の論文に公表している.(4)コンクリートの複合劣化の推定モデルに関しても,予定とおり進捗しており,研究の成果を論文や国際会議において公表(公表決定のものも含む)している.(1)FRP接着工法の耐久性試験に関しては,浸潤環境による付着強度の劣化程度に影響を与える,コンクリートの表面粗度の影響を定量化するための実験を実施し,粗度が大きいほどせん断付着強度(平均付着強度と局部付着強度)が大きくなることが明らかになった.(2)セメント系増厚工法の耐久性試験に関しては,PCM増厚工法に対して,せん断付着強度を明らかにする実験を行った.せん断

付着強度は,温度を上げると低下し,コンクリートの表面粗度を大きくすると増加する.温度を上げると荷重-滑り関係がより延性的になる場合があった.コンクリートとPCMの強度と表面粗度に基づくせん断付着強度推定式を提示した.(3)FRP接着工法の剥離耐力向上技術開発に関しては,ポリウレア層を挿入し,炭素繊維シートを下面に貼り付けたRCはりの破壊挙動を再現できる解析法を開発した。この解析法を用い,低温下でのポリウレア樹脂のヤング係数およびせん断弾性係数の増加および樹脂の大変形領域での大きな非線形特性がシートとコンクリート界面の付着特性に影響を及ぼし,破壊形式が変化することを示した。(4)セメント系増厚工法の剥離破壊及びかぶり割裂破壊を防止するためのアンカー耐力に関する実験から,前年度に構築した耐力推定モデルに組み入れた。接着工法及びセメント系増厚工法と併用されるひび割れ補修に関しては,補修後のひび割れ面の伝達機構を実験的に調べ,せん断方向と直交方向の剛性に対するひび割れ幅及び拘束力の影響を示した。(5)凍害と荷重による複合劣化に関しては,コンクリート中のNaClが与える影響を明示するための実験を実施し,NaClが水分の移動に与える影響,コンクリートの剛性や強度に与える影響,凍害機構に与える影響を示すとともに,影響が出る理由を明らかにした.また,凍害の損傷度合いの内部分布を推定する方法を提示した.コンクリート構造物補強法における接着界面付着特性に関し,FRP接着工法の付着特性は18か月の浸潤後において多少低下するものから向上するものまであり,増厚工法の付着特性は60度までの温度上昇とともに低下するが,温度が低下すると多少回復する.これらの結果に基づき,付着特性推定式を提案した.補強後の性能向上技術として,ポリウレア層挿入FRP接着工法の解析技術,増厚工法用アンカー筋補強効果推定モデル,ひび割れ樹脂注入による疲労耐力向上推定モデルを提示した.凍害を含む複合劣化に関し,疲労との複合作用下のコンクリート損傷推定モデル,塩害との複合作用下の凍害促進推定モデル,凍害損傷の分布測定法を提示した.(1)接着工法と増厚工法の耐久性に関しては,予定とおり進捗しており,研究の成果も論文や国際会議などで公表している(公表決定のものを含む).(2)接着工法と増厚工法の剥離耐力向上技術に関しては,予定とおり進捗しており,研究の成果も国内外の会議で公表している.(3)複合劣化の推定モデルに関しても,予定とおり進捗しており,研究の成果を論文や国際会議において公表している.(1)FRP接着工法の荷重条件と湿潤・温度環境条件との複合劣化条件下の長期耐久性試験として,凍結融解作用と疲労作用下の接着付着界面の実験的解明を実施する.PCM増厚工法の荷重条件と温度条件との複合劣化条件下の長期耐久性試験として,接着付着特性の高温下の疲労荷重下の接着付着疲労特性を実験的に解明する.接着付着界面とその周辺の変化の様子の観察をミクロレベルの測定から特性変化の解明を行なう.(2)FRP接着工法の剥離耐力向上技術開発として,要素実験に基づき開発した付着構成モデルを導入した剛体バネモデル解析を通じて,柔軟層の有無,温度,鉄筋の付着の程度,FRP補強材の剛性がFRPシート補強部材の破壊形式に及ぼす影響を明らかにするとともに,合理的な耐力評価法を開発する.
放射線による抗腫瘍免疫誘導の解明と、その増強に関する基礎的・臨床的研究

放射線治療による腫瘍免疫の誘導・活性化について基礎・トランスレーショナル的に検討し、1)食道癌患者において、化学放射線治療により腫瘍特異的免疫が活性化すること、2)この放射線による免疫の活性化には、照射後に腫瘍細胞から放出されるストレスタンパク質・HMGB1が関与していると推測されること、3)温熱化学放射線療法により、腫瘍のHLA class I発現が増強すること、4)マウスモデルにて、抗CTLA4抗体の併用にて局所治療効果が増強すること、等を報告した。術前温熱化学放射線療法が施行された直腸がん患者において、温熱化学放射線療法前・後の腫瘍組織のMHC Class I発現の変化について検討したところ、温熱化学放射線療法により、腫瘍組織のMHC Class Iの発現が有意増強することが認められた。予後(生存率、局所制御率、遠隔転移率)との相関は認められなかったが、腫瘍組織のMHC Class I発現が増強することは、温熱化学放射線療法により腫瘍のT細胞性免疫への寛容を初期化する可能性を示したものであり、免疫療法との併用療法が相乗的な効果をもたらす可能性を示唆している。(現在、論文投稿中)。また、脳腫瘍(神経膠芽腫)でも、放射線治療前の腫瘍組織を用いてMHC Class I発現と予後に関して検討を行ったが、予後との相関は明らかではなかった。現在、腫瘍内のHMGB1発現・Tリンパ球浸潤・ミクログリア(樹状細胞)浸潤の程度と予後との相関について検討中である。マウスモデルでは、EL4リンパ腫モデル、ルイス肺癌モデルにて、放射線(X線)照射後に全身性の腫瘍特異的な抗腫瘍免疫の活性化を明らかにし、かつ、放射線の局所効果が生体の免疫能によって大きく変わることを免疫を修飾する抗体(抗CD8抗体、抗CTLA4抗体)の併用により明らかにし、英文国際誌に掲載予定となっている。また、放射線(X線、および、炭素イオン線)照射後のHMGB1発現について、複数の腫瘍細胞を用いて検討中である。化学放射線療法が施行された食道がん患者のうち、HLAがA2もしくはA24の患者のみ、臨床検体(血液)を採取して研究を行い、そのうち約40%の患者において、癌精巣抗原特異的細胞障害性Tリンパ球が治療中治療後に有意に増加することを確認した。現在、その他の臓器のがん患者においても、抗原特異的細胞障害性Tリンパ球が増加するか検討中である。また、術前化学放射線療法が施行された食道がん患者において、臨床検体(腫瘍組織;術前および手術時のもの)を用いて研究を行い、化学放射線療法にて有意にHMGB1の増加が認められ、また、予後と有意に相関することが認められた。また、放射線治療前後のMHC Class I発現の変化については、直腸がん患者などにて実験を終え、現在解析中である。これらの成果は、放射線治療によって抗原特異的な抗腫瘍免疫が活性化されたことを証明したものであり、放射線治療と免疫療法の併用療法の可能性を示唆するものである。前年度に引き続き、放射線による抗腫瘍免疫誘導についてin vivo、in vitroにて検討を行った。放射線照射後の、腫瘍細胞(5種類)からのHMGB1放出について、X線・炭素イオン線(重粒子線)を用い継時的に比較検討したところ、X線・炭素イオン線とも線量依存性・経時的に放出が増加した。また、炭素イオン線の効果は、腫瘍細胞腫により違いはあるものの、細胞生残率から求められたRBE(23)で補正すると、X線とほぼ同等であった(ここまでJournal of Radiation Research誌に掲載予定)。同様に、in vivo実験にて、腫瘍細胞からのHMGB1の放出、腫瘍細胞におけるHLA class I発現の変化、についてて実験中である。なお、前年度の報告書で研究結果を報告した「術前温熱化学放射線療法が施行された直腸がん患者における、治療前後の腫瘍細胞のHLA class I発現の変化」、及び、「マウスモデルにおける、放射線治療による全身性抗腫瘍免疫誘導と局所効果への寄与」について、それぞれ、PLoS 0ne誌(IF=3.534)に掲載された。放射線腫瘍学研究は、当初の計画に沿って、ほぼ予定通りに実行されており、成果の一部については、英文国際誌に掲載が予定されている。また、その他の成果も、論文投稿の段階まで進んでいる。研究は、当初の計画に沿って、ほぼ予定通りに実行され、成果報告の段階まで進んでいる。研究実施計画に従い、臨床検体(血液、腫瘍組織)を用いた研究を継続する。また、同様に研究計画に従い、マウスモデルで放射線治療(X線に加え重粒子線も追加)による抗腫瘍免疫の活性化とその修飾について検討する。また、同様に研究計画に従い、マウスモデルで放射線治療による抗腫瘍免疫の活性化とその修飾について検討する。研究実施計画に従い、試薬、抗体、および、マウスの購入に使用する。また、研究成果発表のための旅費にも使用する。
歯根膜およびセメント質に特異的に発現する遺伝子のクローニング

レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステムは、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からRNAの抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その正確に分離・採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考えられる。当初予定していた、パラフィン切片から抽出したRNAは損傷が大きく、今回用いるマイクロアレイによる遺伝子配列の解析には適さないことがわかってきたため、RNAを凍結切片から抽出する方法に変更したが、周知のように硬組織の非脱灰凍結切片の作製が想像以上に困難であった。この問題をクリアするために試行錯誤した結果、特殊なブレードとフィルムおよびUV照射を使った方法により、LCMに応用できる非脱灰凍結切片の作製が可能となった。これまでに、これらの非脱灰凍結切片からは、18Sおよび28Sのピークが明瞭な良質のRNAが採取できることがバイオアナライザーを用いた解析により明らかとなった。現在microarrayの過程にあるが、採取した細胞から抽出したRNAを、増幅しPCR解析を行った結果、GAPDH、オステオカルシン、1型コラーゲン、ボーンシアロプロテイン、BMP-2などの発現を示す明瞭なバンドが確認され、この方法の信頼性が確認された。本研究の目的は、(1)歯根膜細胞およびセメント芽細胞に特異的な遺伝子を同定(クローニング)し(2)それを各細胞のマーカーとして細胞株を樹立し(3)その株化細胞を用いて機能解析を行うことにある。それを達成するためには、まず第一にマーカー遺伝子の同定が必須である。そのために、歯根膜細胞およびセメント芽細胞よりRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイ法によって、おのおのの組織に特異的な遺伝子を検索する。本研究において、我々はレーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクション法により、歯根膜細胞、セメント芽細胞を含む組織切片から、RNAを抽出した。この方法は、顕微鏡観察下において単一の細胞集団だけから選択的に遺伝子を抽出できる画期的なシステムであり、現在考えられる方法の中で最も確実な方法である。現在までに、パラフィン切片から抽出したRNAは損傷が大きく、今回用いるマイクロアレイによる遺伝子配列の解析には適さないことがわかってきた。そこで、RNAを凍結切片から抽出する方法に変更したが、周知のように硬組織の非脱灰凍結切片の作製が想像以上に困難であった。この問題をクリアするために試行錯誤した結果、特殊なブレードとフィルムを使った方法により、非脱灰凍結切片の作製が可能となり、そして現在もよりよい切片の作製方法を検討中である。これまでに、いくつかの非脱灰凍結切片からは、18Sおよび28Sのピークが明瞭な良質のRNAが採取できることがバイオアナライザーを用いた解析により明らかとなっており、次のステップへ向け大きく前進した。上記の方法によってクローニングされうる組織特異的な遺伝子は、細胞株を樹立する際に非常に有用なマーカーとなる。また、その遺伝子は、歯根膜組織およびセメント質の再生に影響する因子であることも予想されるため、その機能解析の結果は臨床的にも非常に意義がある。現在までの検討で、脱灰パラフィン包埋切片では、その処理過程においてRNAの崩壊が激しくマイクロアレイなどの遺伝子配列の検索には適していないことが明らかになった。したがって、非脱灰凍結切片の作成が必要となったが、骨と歯牙を含む組織においては、これが困難極まるものであった。申請者は、特殊なタングステンナイフとクライオフィルムを併用することによりレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが可能な非脱灰凍結切片を作成することに成功した。その過程においては、フィルムの種類また、接着剤とそれぞれの試薬の処理時間の検討に多くの時間がかかった。さらに、セメント芽細胞と歯根膜細胞とでは、レーザービームの至適強度に差があることもわかった。そしてそれらの組織から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、さらに、そのサンプルを用いたRT-PCR解析においても明瞭なGAPDHのバンドが確認され、RNAのクウォリティの高さを示唆する結果が得られた。上記の検討により、セメント質および歯根膜組織から遺伝子配列の解析が可能なRNA抽出法が確立され、各組織に特異的なマーカーの検索と機能解析の準備が全て整った。現段階では、マイクロアレイ解析を行うには抽出されたRNAの量が少ないため、RNA増幅キットを用いて、その量を増加させている過程にあり、間もなくマイクロアレイ解析に移行する予定である。当初予定していた、パラフィン切片から抽出したRNAは損傷が大きく、今回用いるマイクロアレイによる遺伝子配列の解析には適さないことがわかってきたため、RNAを凍結切片から抽出する方法に変更したが、周知のように硬組織の非脱灰

凍結切片の作製が想像以上に困難であった。この問題をクリアするために試行錯誤した結果、特殊なブレードとフィルムおよびUV照射を使った方法により、LCMに応用できる非脱灰凍結切片の作製が可能となった。これまでに、これらの非脱灰凍結切片からは、18Sおよび28Sのピークが明瞭な良質のRNAが採取できることがバイオアナライザーを用いた解析により明らかとなった。現在microarrayの過程にあるが、採取した細胞から抽出したRNAを、増幅しPCR解析を行った結果、GAPDH、オステオカルシン、1型コラーゲン、ボーンシアロプロテイン、BMP-2などの発現を示す明瞭なバンドが確認され、この方法の信頼性が確認された。
膵臓癌細胞由来オルガノイドモデルを用いた放射線化学療法耐性の機序解明

特定の器官の細胞を三次元的に培養した立体組織であるオルガノイドの作成が多く報告されている。生検組織から三次元的培養後オルガノイドを作成し、同オルガノイドを用い薬剤感受性試験を行うことで、個別化治療に寄与させることが本研究のメインテーマであった。当初の対象癌細胞であった膵臓癌検体は、治療前検体は内視鏡下穿刺でしか採取できないことや、手術後検体では術前化学放射線療法による修飾が加わっている可能性高く、生検検体が比較的入手しやすい食道扁平上皮癌細胞(ESCC)を用いてオルガノイド作成を試みた。培養方法としては、未治療の進行食道扁平上皮癌患者において内視鏡下に腫瘍部より組織を採取し,酵素処理などにて腫瘍を細断化後マトリゲルと包埋し、EGF、Noggin、Rspondinなど各種増殖因子を入れた培養液とともに培養することで、世界初のオルガノイド作成を成功させる事が出来た。形成できたオルガノイドは症例によって異なる性質を示し、化学療法耐性性についても実臨床での奏功度と、オルガノイドの奏功度が一致していたことを報告することが出来た(Kijima T et al, Three-Dimensional Organoids Reveal Therapy Resistance of Esophageal and Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2018Sep 14;7(1):73-91)。膵臓癌検体採取は、最近では超音波内視鏡下生検でも得ることが可能であるが、確実な採取には摘出標本からの採取が必要となる。しかし、膵臓癌手術は術前にて化学療法もしくは化学放射線療法といった前治療が加わり、がん細胞内において様々な修飾が加わっている可能性が高い為、まずは比較的検体採取容易な食道扁平上皮癌(Esophagus Squamous Cell Carcinoma: ESCC)のオルガノイド培養が可能かどうかを実験した。方法として、1未治療の進行食道扁平上皮癌患者において上部食道内視鏡下に、腫瘍部より組織を生検鉗子にて採取後、1時間以内に酵素処理などにて腫瘍を細断化2マトリゲルと包埋し24 wellプレートを使用し、EGF (Epidermal Growth factor)、Noggin、R-spondinなど各種増殖因子を入れた培養液とともに培養310-12日後にできたオルガノイドの個数、形態、大きさを顕微鏡下にて評価し、さらに免疫染色による増殖能の評価を行うという手順とした。ここまでの結果として、9例中6例(67%)にて食道扁平上皮癌からオルガノイドを形成することができた。HE染色にてオルガノイドを形態学的に分類し比較検討すると、低分化の扁平上皮癌に類似したオルガノイドでは免疫染色にて高い増殖能を示した。また、食道扁平上皮癌の細胞株でも同様の実験を行うと、低分化のSCCに類似した構造のオルガノイドを形成した。これらより、食道扁平上皮癌からのオルガノイド培養は短期間にて培養可能である可能性が示された。比較的検体採取が容易な進行食道癌細胞のオルガノイド培養が可能であることが、これまでの研究で分かった。しかしながら、当初予定していた膵臓癌オルガノイド培養は、前治療を受けている場合が多くを占めているため、検体採取に難渋しており、この点で研究がやや遅れている。特定の器官の細胞を三次元的に培養した立体組織であるオルガノイドの作成が多く報告されているが、膵臓癌の検体採取は比較的難しい。そのため、まずは検体採取が比較的安易な食道扁平上皮癌(ESCC)にてオルガノイド培養が可能かを検討し、培養手技を確立することとした.方法としては、未治療の進行食道扁平上皮癌患者において内視鏡下に腫瘍部より組織を採取し,酵素処理などにて腫瘍を細断化する.マトリゲルと包埋し24wellプレートを使用,EGF, Noggin, R-spondinなど各種増殖因子を入れた培養液とともに培養する.10-12日後にできたオルガノイドの個数,形態,大きさを顕微鏡下にて評価し,さらに免疫染色による増殖能の評価を行った.その結果、9例中6例(67%)にてESCCからオルガノイドを形成することができた.HE染色にてオルガノイドを形態学的に分類し比較検討すると,低分化のSCCに類似したオルガノイドでは免疫染色にて高い増殖能を示した.また,ESCCの細胞株でも同様の実験を行うと,低分化のSCCに類似した構造のオルガノイドを形成した.これらの結果から、ESCCからのオルガノイド培養は短期間にて培養可能であり,またより生体内に近い環境にて培養できるとされている.今後オルガノイドの研究が進むことで,薬剤感受性試験を含めた個別化治療へつながっていく可能性が期待される.これまでの結果で、食道癌生検組織からのオルガノイド培養は高い確率でかのうであることがわかった。しかしながら膵臓癌検体採取は、技術的な問題が大きく関与し安易でないため研究に遅れが生じている特定の器官の細胞を三次元的に培養した立体組織であるオルガノイドの作成が多く報告されている。

当初の対象癌細胞であった膵臓癌検体は、治療前検体は内視鏡下穿刺でしか採取できないことや、手術後検体では術前化学放射線療法による修飾が加わっている可能性高く、生検検体が比較的入手しやすい食道扁平上皮癌細胞(ESCC)を用いてオルガノイド作成を試みた。培養方法としては、未治療の進行食道扁平上皮癌患者において内視鏡下に腫瘍部より組織を採取し,酵素処理などにて腫瘍を細断化後マトリゲルと包埋し、EGF、Noggin、Rspondinなど各種増殖因子を入れた培養液とともに培養することで、世界初のオルガノイド作成を成功させる事が出来た。形成できたオルガノイドは症例によって異なる性質を示し、化学療法耐性性についても実臨床での奏功度と、オルガノイドの奏功度が一致していたことを報告することが出来た(Kijima T et al, Three-Dimensional Organoids Reveal Therapy Resistance of Esophageal and Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2018Sep 14;7(1):73-91)。食道癌細胞のオルガノイド培養を進め、オルガノイド培養細胞の特徴を解明していく。膵臓癌細胞オルガノイド培養は、まずは細胞株レベルでの培養を試みてみる。まずは、検体採取が安易である上部消化管関連悪性腫瘍(特に食道癌)でのオルガノイド培養をすすめ、検体数を増やすことで培養細胞の特徴を更に解析していく
In vitro口腔発がん可視化モデルを用いた浸潤様式・転移機序の解析

われわれはヒト正常舌ケラチノサイトにHPV陽性,陰性に場合分けした上で口腔扁平上皮がんとの関連が示唆されているがん遺伝子を導入することにより, in vitroで口腔多段階がんを忠実に再現したモデルを世界で初めて樹立した。<研究の目的>口腔がんにおける発がんの責任遺伝子を明らかにするため、ヒト正常口腔粘膜上皮細胞に腫瘍原性をもたらす遺伝子(発現)異常の組み合わせをHPV陽性、陰性の場合に分けて同定する。口腔がんの悪性度と遺伝子(発現)異常の組み合わせの間の相関を明らかにし、それらの遺伝子異常を標的とした治療法の各悪性度における妥当性を検討する。<研究実施計画>過去の臨床検体での解析から口腔がんにおける様々ながん関連遺伝子の変異、増幅等が明らかにされており、p53,Rb遺伝子の変異は50%程度、erbB1,erbB2遺伝子はそれぞれ60%,20%程度、c-myc遺伝子は50%程度遺伝子増幅、変異していることが報告されている(Perez, B., et al. J Clin Pathol59,445-53,2006)。Hras、Kras遺伝子は欧米諸国や日本では5%程度と低頻度であるが、噛みタバコの習慣のあるインドなどの南アジアでは40%程度の口腔がんで遺伝子変異が報告されている(Sathyan, K.M., etal. Mod Pathol20,1141-8,2007)。これらの報告を参考にしてヒト正常口腔粘膜上皮細胞にHPV16 E6E7を導入、もしくはcdk4,cyclin D1,hTERTを導入することにより不死化した。これらの細胞に口腔扁平上皮がんとの関連が示唆されている前述のがん遺伝子(erbB1もしくはHras,とcMyc)やドミナントネガティブp53をレトロウイルスを用いて遺伝子導入することにより、人為的に形質転換させることに成功した。すなわち、HPV陽性ならびに陰性の口腔扁平上皮がんのin vitro多段階発がんモデルを確立した。これらのモデルはヒト口腔扁平上皮がんで見つかる異常とがん化・がん形質の維持における意義を明らかにする上で重要な役割を果たすと考えられた。今後、口腔発がんにおけるトリガーポイントを明らかし、転移関連遺伝子・抗がん剤耐性遺伝子など、新たな分子標的候補を検索する研究をすすめていく。<研究実施計画>ヒト正常口腔粘膜上皮細胞にHPV16 E6E7を導入、もしくはcdk4,cyclin D1,hTERTを導入することにより不死化した。これらの細胞に口腔扁平上皮がんとの関連が示唆されているがん遺伝子(erbB1もしくはHras,とcMyc)やドミナントネガティブp53をレトロウイルスを用いて遺伝子導入することにより、人為的に形質転換させることに成功した。これらのモデルはヒト口腔扁平上皮がんで見つかる異常とがん化・がん形質の維持における意義を明らかにする上で重要な役割を果たすと考えられる。口腔がんの浸潤先端部・転移巣で特異的に発現の変化する遺伝子・蛋白質群を検索し、HPV陽性モデルと陰性モデルの場合分けをした上で、悪性度に関わる遺伝子異常とその組み合わせを明らかにした。Poly HEMAでコートした、培養プレートを用いて足場非依存性に増殖した細胞を経時的に回収し(免疫染色法、ウエスタンブロット法)、腫瘍形成初期の増殖に重要な遺伝子の同定を目指したが、まだ結果が得られていない。今後も口腔がんのがん関連遺伝子異常、さらには転移関連遺伝子異常の解析に取り組む。口腔がんにおける責任遺伝子の一つにErbB1ということが示唆されてきており、抗がん剤耐性との関連などさらなる解析を進める。
脳のpH変化の機能的意義と分子メカニズムの解明

統合失調症やうつ病など様々な神経精神疾患の病態モデルマウス、モデルラットの脳pHの測定、および組織pH変化の主な要因のひとつと考えられているラクテートの濃度測定について、データの蓄積を行った。これらのモデル動物には、遺伝子改変動物や各種の実験的操作を施した動物などが含まれ、自身で作成したものと共同研究者から譲渡いただいたものが含まれる。脳pHおよびラクテート濃度が増加、あるいは減少しているモデル動物が複数種類見つかってきている。また、この脳pHおよびラクテート濃度の変化の行動レベルでの機能的意義の推定を試みている。これまでに脳pHおよびラクテートの測定に用いたモデル動物の系統について各種行動テストのデータを収集し、それらの行動テストのデータから計算論的に脳pHあるいはラクテート濃度の予測モデルが構築できるかどうか検討している。プレリミナリーな結果であるが、脳内ラクテート濃度と各種の行動指標との関係性について示唆的なデータが得られてきている。さらに、脳pHおよびラクテート濃度の変化のコアとなる脳領域の推定を試みている。上述した、脳pHおよびラクテート濃度の変化が再現性よく検出できる実験的操作について、海馬や扁桃体、線条体などの各脳領域を分けてDNAマイクロアレイ解析を行っているデータを公的データベースより取得し、バイオインフォマティクス解析を行った。その結果、ラクテート増減の要因のひとつと考えられる神経活動のマーカー分子や、ラクテートの代謝に関わる分子の発現が特定の脳領域で生じていることが示唆された。脳pHの操作方法について、pHおよびラクテート濃度の変化を再現性よく誘導できる実験的操作を特定できつつあるなど、おおむね順調に進展している。脳pH変化の当該モデルにおいて、神経活動マーカー分子やラクテート合成酵素分子のタンパク質レベルでの発現変化が生じている脳領域を絞り込むなどして、脳のどの領域・回路が脳pH変容と関連しているのか推定する。上述の通り、pHやラクテート変化を示すモデルマウスの探索、およびin silico解析を中心に行い、抗体等の分子発現解析用の試薬の購入頻度が低かったため。免疫組織染色などによりpH、ラクテートの変化に伴う詳細な分子発現解析を次年度に行う。
ケ-ブル布設船の運動制御に関する研究

海を隔てた地域間における次世代の通信方式として、大容量通信が可能で経済性にも優れた海底光ケ-ブル通信方式が主役として登場し、ケ-ブルや中継器の布設工事においてもますます厳しい条件が課せられることとなり、その一つとして布設同時埋設方式がある。このような布設工事においては、埋設機は布設ル-ト上を正確かつ滑らかに曳航されなければならず、この為ケ-ブル船はより精度の高い針路保持が要求され、また布設作業の能率向上およびケ-ブル船乗組員の労力軽減の為にも操船システムの自動化が望まれる。そこで本研究では、風や潮流などの外乱下において、布設同時埋設作業中のケ-ブル船の針路安定性に影響を及ぼすと考えられる種々のパラメ-タの中で、海底の状況、水深および索長の影響を明らかにすると共に、針路保持性能設計の観点からケ-ブル船の操縦運動特性について検討を加え、さらに操船量として舵の他にバウスラスタ・スタンスラスタを考慮し、最適レギュレ-タ制御系を適用した結果、以下のような結論を得た。1.ケ-ブル布設船の針路保持に際しては船幅を初め水深や海底の土質、さらには埋設機の曳航索の長さも重要なパラメ-タとして考慮する必要がある。2.特に埋設機曳航角はケ-ブル船の針路保持に関して有効かつ実用的な制御パラメ-タである。3.この曳航角と回頭角を主な制御パラメ-タとして考慮した最適レギュレ-タ-制御系はケ-ブル船の針路保持制御に有効であった。従ってケ-ブル布設作業の精度向上を目指すケ-ブル布設船の操船システムの自動化に際し、本手法は一助になるものと思われる。海底ケーブル通信方式においては、現在光ケーブルが主役の座を占めようとしているが、この光ケーブルは衝撃に弱いことが欠点であり、また設定された航路に精度よく布設されることが要求される。従って布設時のケーブル船の運動を制御することが重要な課題となる。本研究はこのケーブル布設船の性能として重要な浅海部のケーブル布設埋設時の針路保持に関して、まず潮流や風等の外乱れがない状態において、水深や海底の状況等が布設船の針路安定性にどのような影響を及ぼすかについて検討した。検討方法としては、ケーブル布設船が海底に沿って埋設機を曵航しながら航行している時の運動方程式を定式化し、さらにこの方程式を基に導いた針路安定判別の為の特性方程式を用いて水深、海底土質、索長、船の主要目が針路安定性に及ぼす影響などを検討した。計算対象船型は船長105mのケーブル布設船である。また海底土質として軟泥、締った砂地、固い粘土質の3状態を考慮した。以上のデータおよび条件下におけるケープル布設時の船体運動シミュレーション計算より次のような知見が得られた。ケーブル布設船の針路安定性は、海底が軟泥の場合には水深が深い程、また索長は長い程向上するが、海底が固くなるに従いその安定領域は減少してくる。一般に水深が浅くなり針路不安定の場合には索長を短くし、軟かい場合には索長を長くすることも有効な手段の一つと考えられる。さらに船幅が増加すれば針路安定性が悪化する傾向もみられた。このようにケーブル布設船の針路保持に関しては水深や海底土質、埋設機の曵航索の長さが最も重要なパラメータとして考える必要がある。次年度は以上の結果を基磯として、風や潮流等の外乱を考慮し、さらにこの外乱下におけるケーブル布設船の針路保持の為の制御法について検討を加える計画である。

海を隔てた地域間における次世代の通信方式として、大容量通信が可能で経済性にも優れた海底光ケ-ブル通信方式が主役として登場し、ケ-ブル布設作業においてもより厳しい条件が課せられることとなり、その一つとして布設同時埋設作業がある。このような布設工事においては、埋設機は予め決められた布設ル-ト上を正確かつ滑らかに曳航されなければならず、この為ケ-ブル布設船はより精度の高い針路保持が要求され、また布設作業の能率向上およびケ-ブル船乗組員の労力軽減の為にも操船システムの自動化が望まれる。そこで本研究では、前年度に明らかにしたケ-ブル船ー索系の挙動に及ぼす風や潮流等の外乱や海底土質及び水深等の影響をふまえ、ケ-ブル布設船の針路保持に関して最適レギュレ-タ制御系を適用し、シミュレ-ション計算によりこの制御系がケ-ブル布設埋設時の操船システムとして適したものであるかどうか検討した結果、1.最適レギュレ-タ制御系はケ-ブル船の針路保持に有効であった。2.また最適レギュレ-タ制御系の適用に際しては評価関数に含まれる重み行列の決定が重要となるが、回頭角と曳航角を主なパラメ-タとして考慮すれば、有効かつ実用的な制御が可能になると考えられる。3.さらに制御系に及ぼす海底土質や潮流の影響を検討した結果、海底土質が軟らかくなるに従い、船速が大きくなり外乱の影響を受けにくい為、針路保持に関する制御は容易となる。4.一方、流速が1ktの潮流中におけるケ-ブル船の針路保持制御は、実際上、十分なものであった。したがってケ-ブル布設作業の精度向上を目指すケ-ブル布設船の操船システムの自動化に際し、本手法は一助になるものと思われる。
不確実状況下での選択行動に関する異文化比較研究

3年間の異文化比較研究により、以下の成果が得られた。(1)日本、タイ、マダガスカルにおいて、遅延により報酬が価値が割り引かれる程度(時間割引率)が測定された。その結果、時間割引の程度は、報酬量が大きくなるほど小さくなること、タイおよびマダガスカルでは金銭報酬の割引率が日本よりも大きいこと、および、タイと日本で金銭報酬と食料報酬(お米)を比較した場合、日本では金銭報酬より食料報酬の方が割引率が大きくなるのに対し、タイでは食料報酬より金銭報酬の方が割引率が大きくなること等が示された。次に、(2)報酬を他者と共有することにより報酬の価値が割り引かれる程度(共有割引率)を研究するための手法が開発され、日米の学生を被験者として分析された。その結果、共有する相手が家族や親戚である場合には割引率が小さくなること、日本の被験者はアメリカの被験者よりも大きな割引率を示すこと等が示された。また、(3)不確実状況下での選択行動に関する研究が日本とインドネシアにおいて行われ、どちらの国の被験者においても確実性効果(選択肢間の確率の比を一定にしたまま確率の値を減少させると選択肢間の選好が変化する現象)が見られること、インドネシアの被験者の方がリスクの少ない選択肢をより多く選択すること等が示された。さらに、(4)配偶者選択や子供数の選択などのより現実な選択行動に影響を及ぼす要因を解明するための探索的な研究が行われ、「親としての自我」を規定する指標の開発等の成果が得られた。加えて、(5)海外の研究者を招き、上記の研究成果と問題点を検討するための研究会が行われ、今後これらの研究を発展させてゆくための詳細な方法が整理された。本年度は、不確実状況下での選択行動を規定する報酬の時間割引に着目し、この現象を規定する異文化比較要因を解明するための以下のプロジェクトに着手した。(1)時間割引率を調査するための質問紙の仏語版を開発し、それをマダガスカルにおいて実施した。同様の質問紙の英語版を開発し、それをタイにおいて実施した。また、これを用いてタンザニアでの調査の準備も行った。以上の調査から発展途上国では先進諸国とは異なった時間割引が見られることが解明された。(3)時間割引研究の権威であるグリーン教授を招聘し、日本心理学会第62回大会において不確実状況下での異文化比較研究に関するシンポジウムを開催した。また、これまでに収集したデータの比較検討を行う研究会を開催した。その結果、この手法が異文化比較研究にとってとても有用であることが示された。(4)不確実状況下での確率判断の異文化比較研究をインドネシアと日本において行うために、インドネシア調査の現地調整を行った。(5)時間割引と社会的共有の関係に関する日米の異文化比較研究を行うための打ち合わせを行った。本年度は、様々な報酬に関して、その主観的価値の時間経過に伴う割合(時間割引)と、分配に伴う割引(分配割引)に着目し、以下のプロジェクトに着手した。(1)時間割引率調査を英国において実施するために、英国より経済心理学者の第一人者であるLea博士を招聘し、日本心理学会第63回大会において不確実状況下での異文化比較研究に関するシンポジウムおよび研究会を開催した。その結果、発展途上国では先進諸国とは全く異なった時間割引曲線が得られる等の成果が得られ、それに基づいて国内外でさらなるデータを収集するための打ち合わせが行われた。(2)その一環として、不確実状況下での異文化比較研究をインドネシアと日本において行うために、インドネシアよりこの分野の専門家(Hastjarjo博士)を招聘し、今後の調査の打ち合わせおよびインドネシアに特有の社会事情、および宗教事情についての研究会、および、インドネシアにおいて不確実状況下での選択行動を研究するための打ち合わせが行われた。

(3)これまでは、異文化比較研究を本格的に行うために、研究者が空間的に移動してデータを収集してきた。しかし、この方法では、限られた地域の限られたデータしか収集できないことが分かってきた。そこで、ホームページ上でJAVAを用いた調査実験プログラムを運用し、世界各地でいつでも同一のデータを大量に収集することのできるシステムを開発するプロジェクトが開始された。その開発と運用試験のために、英国よりLea教授を招聘して、試験運用のテストを行った。その結果、このシステムは異文化比較研究を飛躍的に進歩させる可能性を持っていることが示された。(4)小型の液晶プロジェクタを利用して、様々な大学において多くの学生に調査項目を見せることにより、日本国内において一度に大量のデータをとるシステムが開発された。3年間の異文化比較研究により、以下の成果が得られた。(1)日本、タイ、マダガスカルにおいて、遅延により報酬が価値が割り引かれる程度(時間割引率)が測定された。その結果、時間割引の程度は、報酬量が大きくなるほど小さくなること、タイおよびマダガスカルでは金銭報酬の割引率が日本よりも大きいこと、および、タイと日本で金銭報酬と食料報酬(お米)を比較した場合、日本では金銭報酬より食料報酬の方が割引率が大きくなるのに対し、タイでは食料報酬より金銭報酬の方が割引率が大きくなること等が示された。次に、(2)報酬を他者と共有することにより報酬の価値が割り引かれる程度(共有割引率)を研究するための手法が開発され、日米の学生を被験者として分析された。その結果、共有する相手が家族や親戚である場合には割引率が小さくなること、日本の被験者はアメリカの被験者よりも大きな割引率を示すこと等が示された。また、(3)不確実状況下での選択行動に関する研究が日本とインドネシアにおいて行われ、どちらの国の被験者においても確実性効果(選択肢間の確率の比を一定にしたまま確率の値を減少させると選択肢間の選好が変化する現象)が見られること、インドネシアの被験者の方がリスクの少ない選択肢をより多く選択すること等が示された。さらに、(4)配偶者選択や子供数の選択などのより現実な選択行動に影響を及ぼす要因を解明するための探索的な研究が行われ、「親としての自我」を規定する指標の開発等の成果が得られた。加えて、(5)海外の研究者を招き、上記の研究成果と問題点を検討するための研究会が行われ、今後これらの研究を発展させてゆくための詳細な方法が整理された。
レーザー共鳴イオン化を用いたキセノンからのラドン除去

キセノン(Xe)は、暗黒物質探索、二重ベータ崩壊探索等の稀事象探索に広く用いられる重要な元素であり、バックグラウンドとなる不純物をを如何に抑えられるかがキーポイントになる。キセノン中に含まれる放射性希ガス不純物の中で、アルゴン(39Ar)及びクリプトン(85Kr)は蒸留により容易に除去できる。しかし、ラドン(222Rn)は検出器の構成物質からキセノン中へ定常的に放出されるため、長時間にわたり連続的にラドンを除去する手法を開発する必要があった。そこで、本研究ではレーザーを用いた共鳴イオン化技術に着目し、ラドンのみを選択的にイオン化して除去する斬新な手法を導入し、原理検証に成功した。昨年度、レーザー装置のある日本原子力開発機構にラドンソースを持ち込めないことが判明したので、ラドン濃度の高い神岡坑内の空気を冷却活性炭に濃縮し、そこからラドンを脱離させる装置の開発を行った。そして、まずは原理検証のため効率は劣るものの、より簡単な2光子励起を利用してイオン化を試みた。結果は空気由来の水和物によるバックグラウンドに埋もれ、ラドンの質量数222の位置にピークは見られなかったが、基本的な測定系の構築は完了できた。そこで、キセノン中のラドンの代わりに、同じく希ガスの組み合わせで、不純物としてKrを含むアルゴンでの実験に切り替えた。1kVの電場を加えた電極プレート間に、10 ppm Kr含有の大気圧Arを流しながら212.6 nm(5 ns pulse)を集光し、Krを(2γ+γ)共鳴イオン化させたところ、電極に陽イオンによるシグナルを確認できた。つまりレーザーによって共鳴イオンされたKrの収集に成功した。一方、昨年度開発に成功した1光子励起によるラドン共鳴イオン化のための145.2nmの高出力VUV光を生成するパルスレーザーのさらなる安定化に取り組んだ。具体的にはレーザーへの入力光を安定させるため、共振器なしでの光パラメトリック発生(OPG)光学系の開発に取り組み、BBO結晶4つに半導体レーザーを反射なしの一方通行で照射させることにより、212.6nmの非常に安定なVUV光を作り出すことに成功した。本研究によって、共鳴イオン化によって原理的に希ガス不純物を取り除けることを示し、安定に長時間ラドンの共鳴イオン化を実現できる環境を整えた。キセノン(Xe)ガスにレーザーを照射し、不純物ラドン(Rn)のみを選択的にイオン化し、除去する手法を確立するのが本研究の目的であるが、200nm以下の真空紫外(VUV)光が必要であるため、共鳴イオン化を高効率に行うための高出力かつ狭線幅のVUV光を安定に生成するパルスレーザーの開発が最初の課題である。今年度は必要な波長の光源開発を行った。Xeのイオン化には、s軌道経由の178.6nmを使用するスキームと、d軌道経由の145.2nmを使用するスキームが考えられる。まずは、クリプトン(Kr)ガスセルを用いた共鳴四波混合による178.6nmの発生を試験し、生成方法、検出方法を技術的に確立すると同時に4μJ/pulseの強度を確認した。さて、共鳴励起先としてd軌道を使用した方が共鳴イオン化段数が少なくて済むため、イオン化断面積が二桁以上高くなるので、望ましい。まず、145.2nmの光を178.6nmと同様の手法によって発生させた。ところが、Krの屈折率からは位相のミスマッチがおこり、Krガスセル中で発生した光が減衰してしまうことが確認された。Krの圧力を0.3atmまで下げることによって、145.2nm自体の発生は確認できたが、強度は不十分なものであった。そこで、Krのガスセルに屈折率の小さいXeを混ぜることで位相整合を行い、VUV光の出力を向上させる手法を試みた。KrとXeの混合比を変えながら出力の最適化を行い、結果Xe/Kr 0.073と調整したときに、7μJ/pulseの145.2nmの光出力を確認できた。当初の計画では、178.6nmの光源を実現した段階で、レーザー設備がある、原子力研究開発機構大洗研究センター(原研)のラドン線源を持ち込んで、ラドンの共鳴イオン化の実験を行う予定であった。しかし、原研内へ外部から新たに非密封放射線源を持ち込むことが法令上非常に難しく、200Bqのラジウム線源1個ですら、地域住民への説明会を開かねばならない等、すぐには実現できないことが判明した。したがって、当面、ラドンの共鳴イオン化自体を行わず、その分、レーザー光源開発に専念することにした。

その結果、高効率で共鳴イオン化が期待できる145.2nmの光源の実現の目途が立ち、今後のラドンの共鳴イオン化試験に期待が持てる状況である。今後は145.2nmの光の高出力化、狭線幅化、安定化が主要な開発項目である。高出力化については、位相整合の最適化をさらに進め、一桁程度の向上を目指す。共鳴励起に必要なVUV光密度はRnの吸収幅Δν[GHz]に反比例し10/Δν[μJ/cm2]程度である。吸収幅は主にRn原子の速度のばらつきによるドップラー幅およびパルスレーザー線幅で決まる。したがって、Xeのガス循環ラインシステムの流速の最適化およびパルスレーザーの線幅を狭線幅化が直接に有効である。後者に関しては、レザーパルス幅5nsに対するフーリエ限界の線幅(約90nm)を目指し、最終的にΔν1[GHz]を実現したい。波長の安定性については、波長変換に光パラメトリック発振(OPO)をもちいると波長がドリフトすることが分かっているため、共振器を組まない光学系を構成したうえで、上記の高出力化、狭線化を目指す。基本的には、VUV光源の開発に必要な物品の購入費として使用する。非線形結晶やガス系、真空系の配管部品や計測機器に充てる。また、線源として扱われないようなラドン源を用意することを考えている。具体的には神岡坑内のラドン濃度の高い空気を圧縮して乾燥、活性炭に吸着するための器具の購入を計画している。
子供はどのような肯定的証拠や否定的証拠から文法を学ぶのか

幼児の格助詞理解に関して三度の実験を行った。第一実験では、3歳児から6歳児を対象に動画を見ながら「誰がたたいたの」とか「誰をたたいたの」という文に関しての幼児の理解力を見た。その結果は、主格の格助詞に関しての正解率は年少児のグループでも9割に達したが、対格の格助詞に関しては2割程度であり、年長児でさえも7割程度にとどまるというものであった。この結果は昨年度の「言語入力がなくとも主格助詞の使用は易しい」また「対格の助詞に関しては複数の(肯定的・否定的)証拠が必要となる」という提案を言語理解の側面から支持するものと解釈できる。第二実験では主格「が」の意味・機能的な側面、すなわち新情報、焦点のマーカーといった機能を考慮し、刺激文に疑問詞の「誰」が含まれない文を使用した。「ライオンが押しました」とか「ライオンを押しました」のような刺激文と一致する画像を選ぶ動画選択法によって実験を行った結果、年少児でも対格の格助詞の正解率は40%位までのびた。これまでの実験において対格の助詞に関する理解力は低いのは、刺激文が文脈なしに使用されているのが原因ではないかと考え、第三実験では「ライオンをたたきました」の様な文に「山にかばがいました。すると...」というような文脈を示す文を与えてその影響を調べた。その結果、対格の格助詞「を」に関して文脈が与えられない場合は正解率が年少児で40%、年中児で60%程度にとどまっていたのが、文脈が与えられるとそれぞれ60%と80%付近まで上昇した。よって、幼児の格助詞理解力を判断するにあたっては、刺激文を単独で与えるよりも文脈の中で与えて判断する方が好ましいこと、また肯定的証拠、否定的証拠が格助詞の学習に与える影響においても新たに文脈という要素を考慮すべきではないかということが示唆されたと考えている。三歳一ヶ月から六歳一ヶ月までの幼児を対象とした二度の実験調査を行なった。最初の実験は、幼児に造語動詞を教えて、子供がその直後にどのような格助詞を造語動詞に対して使用するのかを調査する方法で行なわれた。格助詞に関する言語入力を全く行なわない条件での主語に関する正しい格助詞の使用率は68.6%であり、同じ条件での直接目的語に関する正しい格助詞の使用率は3.9%であった。これは、格助詞に関する言語入力がない状況では、幼稚園児は直接目的語に関しての正しい格助詞の使用が困難であること、また主格の格助詞使用に関しては、言語入力がなくてもその使用がある程度可能である事を示している。この後、肯定的証拠を与えてその影響を調べた。結果は、主語に関する正解率が70.6%で、直接目的語に関する正解率は3.9%というものであった。これによって言語入力を一度与えただけの肯定的証拠では格助詞の学習には影響・効果がないことがわかった。次の実験では肯定的証拠に変わり否定的証拠を与え、これが子供の直接目的語の格助詞使用にどのように影響を与えるのかを調査した。最初の実験と同じ手順で、子供に造語動詞を教えた後に否定的証拠を与え、格助詞の発話を促した。その結果、一度だけの否定的証拠であれば、肯定的証拠の場合と同じくその効果は見られないことがわかった。子供は自分の発話を否定され更に訂正されても直接目的語に対格の格助詞を使用することができず主格の格助詞を誤用し続け、その改善はされなかった。しかしながら、否定的証拠を与え続けると変化がみられた。平均して3.25回程度の否定的証拠で子供の発話に改善が見られたケースが38%観察された。これは逸話的に取り上げられてきた「否定的証拠は何度与えても効果を持たない例」に対して疑問を投げかける結果となった。

その結果、対格の格助詞「を」に関して文脈が与えられない場合は正解率が年少児で40%、年中児で60%程度にとどまっていたのが、文脈が与えられるとそれぞれ60%と80%付近まで上昇した。よって、幼児の格助詞理解力を判断するにあたっては、刺激文を単独で与えるよりも文脈の中で与えて判断する方が好ましいこと、また肯定的証拠、否定的証拠が格助詞の学習に与える影響においても新たに文脈という要素を考慮すべきではないかということが示唆されたと考えている。