hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両連続相マイクロエマルションベースの高速・温度応答型インテリジェントゲルの創製

水/油/界面活性剤間の調整により、水・油相がミクロに混在した両連続相マイクロエマルション(BME)をテンプレートとし、水相のゲル化により、スポンジ状の3次元連続ミクロ多孔を有するハイドロゲルの作製を行ってきた。また、感温性のN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)モノマーを用いてBMEの水相に導入し、ゲル化を行うことで、感温性のBME-PolyNIPAMハイドロゲル(BME-PNIPAM gel)の作製を行ってきた。作製したゲルは、水と油の連続的なミクロ構造をテンプレートとした広い表面積を有しており、温度のスイッチングに応答して(PNIPAMの32°Cでの体積相転移点を利用)可逆的な膨潤収縮が可能であると同時に従来のPNIPAM gelに比べて速い温度応答性を示すことを明らかにした。また、水/油/界面活性剤が導くBMEの自己集合構造に限らず、その界面活性剤の分子構造自身が、溶液中で様々な自己集合構造(ラメラ,球状ベシクルおよびチューブ状など)が得られることがわかっている。もう一つの研究では、主にリン脂質系界面活性剤を用いてナノチューブ構造を構築し、それをテンプレートとして感温性NIPAMのゲル化を行った。結果、温度に応答してチューブの径を可逆的に変化できることを明らかにした。このような刺激応答性材料は薬物送達システムなどのバイオマテリアルへの応用に加えて、刺激応答性チューブなどの異方性をもった構造は、外場のスイッチングに応答したマイクロ流路への応用も期待されると考えられる。ソフトかつウェットなゲルの利用は内部に化学的な物質組成を包含可能であり、高い柔軟性、外部の環境に対して容易に物理的特性を変化可能である。本研究では、インテリジェント(スマート)マテリアルを指向した,外部刺激(温度)応答型の新規多孔ゲルの作製および、高速応答型のゲル膨潤/収縮挙動の評価を行うことを目的とした。水相にNaClaq,油相にトルエンを用いた3相系両連続相マイクロエマルション(BME)の溶液構造をテンプレートとして、水相側に加えた水溶性モノマー,N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)のレドックス系室温重合を行うことで、ミクロ水相をゲル骨格に、ミクロ油相部分を空隙とした多孔ゲルの作製を行った。乾燥後のゲルの内部構造を、走査型電子顕微鏡(SEM)で観察したところ、5-10μmの孔を有するPNIPAM-BME両連続多孔ゲルが生成していることを確認した。あらかじめ、室温でゲル化させたPNIPAM-BMEゲルをそれぞれ、45および60°Cに調整した水浴に浸潤させたところ、高温度で処理したものほど、ゲル内の多孔サイズが縮小した。PNIPAMの下限臨界溶液温度(LCST)、32°C以上の温度変化において、PNIPAMの相分離速度を制御することで、ゲルの多孔サイズを制御することに成功した。PNIPAM-BMEおよび比較としてBMEを用いて同条件で作製したPNIPAM均質ゲルを用いて、水中に浸透させた膨潤ゲルに対して加熱および冷却を繰り返し行い、サイクルにおける膨潤および収縮挙動の膨潤率および膨潤度の確認とおよび再現性を調査した。高温で膨潤させたゲルに対して室温冷却させた場合、BMEゲルで60%の膨潤度(1時間あたり)、均質ゲルの20%に対して高速応答性を示した。このことから、BMEゲルでは急速に、大量の溶媒を吸収・放出が可能であることを明らかにした。
懸濁液滴内スラリー重合によるマイクロカプセルの製造

懸濁液滴内in situ重合によるマイクロカプセル製造を、1.スチレン(St)-イソオクタン(i-Oct)-水系及び2.St-ジビニルベンゼン(架橋剤,DVB)-i-Oct-水系で行った。1.St-i-Oct-水系容積800mlのセパラブルフラスコ中、スクリュー型撹拌器を用い450-1400rpmで撹拌し、重合進進行に伴う液滴又はマイクロカプセル粒子の粒径分布の変化を検討した。その結果、本実験範囲で得られるマイクロカプセルの平均径は50-200umである事がわかった。液滴径に及ぼす一番重要な操作条件は撹拌速度である事がわかった。しかしながら、回転速度1400rpmでは、重合進行に伴い、10μm以下の微小液滴が多数生成し、1400rpmは実用上の最大撹拌速度である事を示唆した。分散相分率も液滴径を決定する重要な因子であるが、滴径の分散相分率依存性は低く、0.2乗程度であった。実際に、膜厚や膜の性状を決定するモノマー及び開始剤濃度は液滴径にほとんど影響を与えない事がわかった。2.St-DVB-i-Oct-水系1)50-200μm径マイクロカプセルの製造外壁膜の強化のために、架橋剤DVBを加え、上述とほぼ同様の実験を行った。その結果、粒子径分布に関しては架橋剤の影響はほとんど見受けられず、上述のSt-i-Oct-水系とほぼ同様の結果を得た。2)1-10μm径マイクロカプセルの製造ホモジナイザーを用いる事により、所定の大きさの液滴を予め調製し、重合は通常のセパラブルフラスコにて行った。界面活性剤を0.1wt%加える事により、重合進行に伴う液滴同志の合一はほぼ抑えられるので、本方法では、マイクロカプセル粒子径の制御はホモジナイザーの回転数と操作時間だけによる。高速度回転程、また長時間撹拌する程、粒子径は小さくなった。本方法により、平均径1-10μmのマイクロカプセルが得られる事がわかった。
Pulsed ELDOR detected NMRによるタンパク内分子の構造解析

一般に近傍核の観測には(パルス)ENDORという手法が用いられるが、ENDORには周波数特性、周波数限界など技術的問題が多い。実際ENDORでは1000MHz以上の大きさのNMR遷移を捉えることは技術的に困難である。実際に市販品のESR機では100MHz以下のNMR遷移が観測限界となっている。パルスELDOR法はパルスESR法の手法のなかでも手付かずの領域であった。当研究課題ではPulsed ELDORdetected NMR法を開発し、生物系への応用を目指すものであった。当初予想においてはこの手法を用いれば高感度化が実現し、それによって低濃度測定が強いられる生物系への測定に大きなメリットがあると考えられた。しかし、スペクトルの高分解能条件では必ずしも高感度化を謳うことは適切ではないことはわかった。さらに、実験を進める中でこの手法によれば非常に広い周波数範囲の測定がたやすくできることがわかった。実際1000MHzの範囲でのマンガン原子のNMR信号をたやすく観測することができた。もしこれを既存のENDOR法などで行おうとすれば数種類の高価なNMR用アンプと数種類の測定用プローブを試作測定しなければならないだろう。Pulsed ELDORdetected NMR法広い周波数特性は当初予想していなかったものの最大のメリットであるということができる。今後ますます発展が期待できる手法であることもわかった。方法を模索していく中、生物系への応用も初めての例として雑誌に受理されている。これらの結果によって当初研究計画の目標は果たせたものと考えられる。ESR(電子スピン共鳴)法は電子スピンを対象とした磁気共鳴法の一種で、原理的には核スピンを測定対象としているNMRと類似の技術である。感度はNMR法の2000倍程度もあり、ほぼ同時期に成立した技術である反面、ESR法の発展はこまで遅れてきたが、最近、新たな技術としてパルスESR法が大きく発展しているたとえはパルスESR法の技術の一つであるパルスELDOR法を用いれば長距難のラジカル間距離を高感度で測定することができる。ENDOR法は成立当初「X線結晶解析にまさるとも劣らない」と評された技術ではあるが、実際に測定、解析するには多くの障害がある。生物試料観測において最大の障害となっているのは感度の小ささである。当研究ではこれを克服するためにPulsed ELDOR(電子電子二重共鳴法)によってENDOR法をカバーする方法の確立を目的としている。本年度、外部パーソナルコンピューターから外部制御を行えるようにESR機のマイクロ波制御部分の改造や、ガウス波形パルスの製作などが完成しすでに実験可能な段階となっている。現在の段階ではおおむね期待した効果が得られている。更に、ELDOR-detected NMR法では当初はまったく予想していなかった高い高周波特性を示すことがわかった。これはまだ予備的な結果ではあるが、この手法の最大の利点と謳うことができる。その反面、当初の予想ほどの分解能が今のところ達成されていない。これらの結果を踏まえて次年度継続課題としたい。本年度、国際学会において同様な方向を目指している発表が著名な研究者によってなされた事実を知った。この手法はかなり広く普及する可能性を秘めており、国際的競争の面からも早急に結果を生かすべく研究を進行させる。
世阿弥の音曲論とその思想史的背景

本年度は、昨年度に引き続き世阿弥および禅竹の能楽論を中心とする研究を進めつつ、背景の部分にまで踏み込んだテクストの検討に着手した。まず世阿弥であるが、思想形成のプロセスを扱った昨年度の成果を踏まえ、今年度は彼の音曲論に対するより個別的・各論的検討を行った。その結果、彼の考える能という営み全体を根底から支える働きを音曲が担わされていたこと、そのことが彼の思考の随所に独特な形で現れていること、そしてそれが彼の能楽観・世界観の独自性を形成していることが、明らかとなった。こうした考え方は、彼の後継者である禅竹と共通する志向性を持ちつつ、能という営みをどこに収斂させるかという点について、深い部分で二人が見逃せない相違を持っていたことを示すものである。二人の能楽観は音曲をめぐって大きく近接し、またその近接ゆえに結果として鋭い対比を持つに至った(以上、『美学芸術学研究』24号・25号掲載論文)。また今年度は、世阿弥の能楽観の背景を探る試みとして、彼の創作した実作品の検討も行った。現行曲の多くが世阿弥の手になるものであるが、その思想史的な深みについてはまだ多くの検討の余地を残している。とりわけここでは、芸術的営みが主人公の生き様と密接な結びつきを持つもの(具体的には修羅能)を選び、そこに潜む芸術観・音楽観を掘り起こす作業を行った(『死生学研究』掲載論文)。さらに、より広く日本思想史一般の問題として本研究を位置づけるため、視野を広げて歌論の領域にも検討の手を伸ばした。取り上げるべき論題・論者は数多いが、試みの一つとして鴨長明について論じ、中世日本において芸術的営為が現在とは違う形で人間の生と切り離せない重要性を担っていた可能性を提示した。本研究は、能における「音楽」の役割・位置づけを、能楽論を思想史的に検討することによって解明しようとするものである。本年度は計画通り、能を思想的に語ったテクストとして最も重要な世阿弥および金春禅竹の能楽論を中心にして検討を進めた。まず世阿弥であるが、従来、稽古論や身体論といった領域に比べると注目されることが少なくまた価値的にも重要度がやや劣るものと見なされがちであった世阿弥の音曲論が、実は彼の思想形成のプロセスにおいて(特に、彼の思想の極点である「無」や「妙」との関わりにおいて)見逃すことのできない重要性を担っていたことが明らかになった(雑誌『美学』掲載論文)。次に禅竹であるが、禅竹の能楽論は時期的にも環境的にも世阿弥とごく近いところで生産されながらも、世阿弥とはかなり異なった精神史的背景をバックボーンにして成り立っている部分が大きいため、彼の音曲思想を読み取ることにも困難が存したが、「翁」なる宗教的一者をすべての上に置き猿楽者の生業・営為をそれとの関わりの内に捉えようとする禅竹の独特な能楽観を考慮に入れることにより、彼の中での音曲の重要性がいかなる意味を持っているのか、一応の見取り図を描くことができた。禅竹にとって音曲は、猿楽者が翁との合一を目指すという使命を果たすための欠かせない媒介であった。この点についての成果が現在成稿しつつある段階である。さらに、能楽論以外の文化的コンテクストをも視野に入れることも重要であるが、眼を向けるジャンルの選択が難しく、この方面についてはいまだ模索の段階にあると言わざるを得ない。歌論や楽書などのいわゆる芸術論テクストだけでなく、物語や説話・随想にも焦点を当てて、芸術論的言説の掘り起こし作業を行っている。
脳の形態画像解析と遺伝子多型解析による強迫性障害の病態、診断、治療研究

強迫性障害患者(OCD)95名と健常者93名に対して、各種遺伝子多型(5HTT-LPR、5HTT-VNTR、DAT-VNTR、D4-120、D4-48)の、患者ー健常2群間比較解析において有意差は認められなかった。OCD群40名、健常群40名の遺伝子多型と脳画像体積との間での交互作用の解析では、いずれの遺伝子型においても有意な所見は見出せなかった。5-HTTLPRに関して、疾患と右の前頭極の体積との関連性が示唆された。OCD群48名、健常対照者48名に対して、HTR2A遺伝子とCOMT遺伝子においてメチル化定量解析を行った。COMT遺伝子においてOCD患者群で有意に多くのメチル化が観察された。強迫性障害患者(OCD)95名(男性37名、女性58名、平均年齢35.3歳(SD=11.0))、健常者93名(男性36名、女性57名、平均年齢35.5歳(SD=10.8))に対して、セロトニントランスポーター遺伝子多型2種類(5HTT-LPRと5HTT-VNTR)、ドーパミントランスポーター遺伝子多型(DAT-VNTR)および、ドーパミン受容体D4遺伝子多型2種類(D4-120,D4-48)に関して遺伝子型を同定した。それぞれの遺伝子型、アリルの患者-健常二群間比較解析において有意差は認められなかった。OCD群40名(男性20名、女性20名、平均年齢34.8歳(SD=12.1))、健常群40名(男性14名、女性26名、平均年齢39.7歳(SD=13.0))に対して、MRI脳画像による構造解析と遺伝子解析を行った。二群間比較において、患者群で、左中央後頭回、右海馬、右海馬傍回、左外側後頭側頭回、左右後帯状回で体積減少、左中心前回において体積増大が認められた。また、5HTT-LPRの遺伝子型(L/S)を決定し、さらに、Lアレル塩基配列内の一塩基多型(A/G)を同定した。LAアレルを持つ遺伝子型をL型とし、持たない群をS型として2群に分類し、χ二乗検定を行ったところ、S型とL型においてOCD患者群と健常対照群の分布に有意な差を認めた。さらに疾患の有無と候補遺伝子多型の関連を調べるため、脳形態画像をエンドフェノタイプとした分散分析による解析を行った。L型の患者群で右海馬、右海馬傍回、右上前頭回の体積減少を認めた。OCD群48名、健常群48名に対して、セロトニントランスポーター遺伝子のexon1を含むCpG islandおよび5 ́側上流の5HTT-LPR多型を含む領域の範囲から、4つのターゲット領域を設定して、その領域におけるDNAメチル化の状態について解析を実施している。強迫性障害患者(OCD)95名(男性37名、女性58名、平均年齢35.3歳(SD=11.0))、健常対照者93名(男性36名、女性57名、平均年齢35.5歳(SD=10.8))に対して、セロトニントランスポーター遺伝子多型2種類(5HTT-LPRと5HTTin2VNTR)、ドーパミントランスポーター遺伝子多型(DAT-VNTR)および、ドーパミン受容体D4遺伝子多型2種類(D4-120、D4-48)の遺伝子多型を同定した。それぞれの遺伝子型、アリルの患者-健常2群間比較解析において有意差は認められなかった。OCD群40名(男性20名、女性20名、平均年齢34.8歳(SD=12.1))、健常対照者群40名(男性14名、女性26名、平均年齢39.7歳(SD=13.0))に対して、MRI脳画像による構造解析と遺伝子解析を行った。2群間比較において、患者群で、左中央後頭回、右海馬、右海馬傍回、左外側後頭側頭回、左右後帯状回で体積減少、左中心前回において体積増大が認められた。LAアレルを持つ遺伝子型をL型とし、持たない群をS型として2群に分類し、χ二乗検定を行ったところ、S型とL型においてOCD患者群と健常対照者群の分布に有意な差を認めた。L型の患者群で右の前頭極の有意な体積減少を認めた。また、OCD群48名、健常対照者48名に対して、HTR2A遺伝子とCOMT遺伝子においてOCDとの関連が指摘されている部位に関してのメチル化定量解析を行った。現在、結果について解析中である。強迫性障害患者(OCD)95名(男性37名、女性58名、平均年齢35.3歳(SD=11.0))、健常対照者93名(男性36名、女性57名、平均年齢35.5歳(SD=10.8))に対して、セロトニントランスポーター遺伝子多型(5HTT-LPR、5HTT-VNTR)、ドーパミントランスポーター遺伝子多型(DAT-VNTR)、ドーパミン受容体D4遺伝子多型(D4-120、D4-48)に関して遺伝子型を同定したが、それぞれの遺伝子型、アリルの患者ー健常

2群間比較解析において有意差は認められなかった。OCD群40名、健常群40名のMRI脳画像による構造解析と遺伝子解析を行った。MRI脳画像による体積の患者-健常二群間比較では、患者群で、右海馬傍回で体積減少、左中心前回で体積増大を認めた。遺伝子多型と脳画像による体積との間での交互作用を解析したところ、いずれの遺伝子型においても統計学的に有意な所見は見出せなかったものの、5-HTTLPRに関して、健常対照者に比べてOCD患者において右の前頭極の体積との関連性が示唆された。さらに、OCD群48名、健常対照者48名に対して、HTR2A遺伝子とCOMT遺伝子においてOCDとの関連が指摘されている部位に関してのメチル化定量解析を行った。COMT遺伝子においてOCD患者群で健常対照者に比較して有意に多くメチル化が観察された。今回の我々の研究によって遺伝子と脳構造の関連性やメチル化定量解析の結果からOCDの生物学的基盤の解明の一助になったものと考えられる。強迫性障害患者(OCD)95名と健常者93名に対して、各種遺伝子多型(5HTT-LPR、5HTT-VNTR、DAT-VNTR、D4-120、D4-48)の、患者ー健常2群間比較解析において有意差は認められなかった。OCD群40名、健常群40名の遺伝子多型と脳画像体積との間での交互作用の解析では、いずれの遺伝子型においても有意な所見は見出せなかった。5-HTTLPRに関して、疾患と右の前頭極の体積との関連性が示唆された。OCD群48名、健常対照者48名に対して、HTR2A遺伝子とCOMT遺伝子においてメチル化定量解析を行った。COMT遺伝子においてOCD患者群で有意に多くのメチル化が観察された。計画に挙げていた脳画像と遺伝子の比較解析を行うことが出来ており、一定の成果を得ることに成功した。メチル化解析については解析作業を進めていく必要がある。分子細胞神経科学これまで本邦のOCD研究にはなかった画像所見と遺伝子多型の関連性について調べており、病態解明の一助となったと思われる。5種類の遺伝子多型と脳画像所見との関連について引き続き解析を進めていく。メチル化解析についても結果の考察を深めていきたい。統計学的信頼性を高めていくために、サンプル数を増やしていく必要がある。またメチル化解析においてはシーケノム株式会社に委託し、結果の解析を残すのみとなっている。新たに5HT2A,COMTの遺伝子多型の解析実験を行う必要があり、再度、神経画像との関連解析を行う予定であるが、当該年度はまだ施行できなかったため。これまで本邦のOCD研究にはなかった画像所見と遺伝子多型の関連性ついて調べており、病態解明の一助となったと思われる。現在メチル化解析を実施しているが、さらにSSRIや非定型抗精神病薬に対する反応性、症状亜型、神経心理所見と遺伝子多型の関連を調べていく。臨床症状や治療反応性の指標となる生物学的マーカーの同定が出来れば、治療に直結した研究成果となる。当該年度で行ったメチル化解析はいまだ途中段階である。次年度で更なる実験と解析が必要となる。また、当該年度では研究結果についての学会発表や論文作成に関しての費用が少なかった。次年度は解析結果を踏まえて、学会発表や論文作成に基づく費用の執行を必要とする。メチル化解析のための実験と結果の解析や学会発表や論文作成に対して使用する予定としている。
3次元画像解析とプロジェクションマッピングを用いた乳房再建手術支援システムの開発

本年度は主に2つの実績をあげている。1つ目が、昨年度に行っていたがん研有明病院でのマネキンを用いた事前検討の実施に基づいて行った、男性ボランティアに模擬乳房を装着して行った予備実験である。マネキンだけでは、頭部、上肢、臀部から下が切断されたモデルになっており、実際の腕の位置や臀部の位置による体幹の形状変化が捉えられないという問題があった。実際にヒトの体幹は腕の位置や臀部の座位角度で大きく形状や位置が変化し、マネキンだけでは実際に則したモデルとしては不十分であった。さらに体動の問題や呼吸性変動など、より動的な変化に対して、どのように効果的にプロジェクター画像を追随する形で投影するかなど、さらなるデータ採取と、それをもとにしたソフトウエアのバージョンアップ、プロジェクターを用いた投影上の工夫に対する知見が得られた。二つ目に共同研究者である荒船のチームと合同で2018年に様々な学会において、本研究の開発中のソフトウエアと運用に関する発表を行い、学会上からのフィードバックを得た。具体的には形成外科領域、工学領域にて合わせて6演台の報告を行い、そのうち1演題はThe14th Korean-Japan Congress of Plastic and Reconstrtuctive Surgeryという国際学会での発表であった。さらにこれを発展させ、1本の和文論文として成果を報告した。さらに、荒船チームの院生である柳沼が生体医工学シンポジウムにてベストリサーチアワードを受賞するという形で、我々の研究成果が生体医工学の分野にて一定の評価を受けるという形に至った。現在、マネキンを用いた事前検討で3次元画像データ取得のノウハウが蓄積されている。さらに男性ボランティアに模擬乳房を装着して、体動や呼吸変動がある中での、3次元データの採取を行う際の術前、術中、術後相同性、再現性を得るためのレジストレーション用ボディマーカーの選定と妥当性の検討も済んでいる。さらに3次元データを一定のlayer(layer1layer n)に切り出した2次元平面上で比較対象点をID1, ID2, ID3,...とマーキングし、その移動距離n1,n2,n3,...を計測し、視覚的に捉えやすいようにカラーマッピング化、可視化させるための自動化ソフトウエアもバージョンバップが行われている。またこの差分画像を実空間のプロジェクタ投影座標視点から見た映像に変形させ、乳房表面位置へ投影するシステムも既に開発済みであり、実際の男性ボランティアにおいて体動や呼吸変動がある中での投影画像の追随などより実臨床に近い形での事前検討も終えている。ハードウエアの準備、ソフトウエアの開発としては臨床実験に進める状態にある。次の段階として臨床での実地データの採取、それによるフィードバックを行い、さらなるシステムの改善を進める段階にある。しかしながら、前回と同様第1段階のSRBを通過し、IRBの修正後申請を行なっている状況であり、このIRB申請で複数の修正再申請が重なっており、倫理委員会を通じた実臨床での実地が行えていない状況である。よって「やや遅れている」という判断となった。昨年に引き続き、今後の研究の推進方策としては、第1に倫理審査(IRB)の承認を目指している。倫理審査にて承認を得ることで、実際に臨床研究を開始することが可能となり、現在準備しているハードウエア構成のチェックが可能となり、またバージョンアップを終えたソフトウエアの運用、実際上の問題点と改善点が明らかとなる。臨床症例での蓄積を得ることで、ソフトウエアの完成形を目指す。当院の倫理委員会の審査の通過のために、当院の臨床研究開発センター企画品質管理部門の助言を得ながら、対応を行っているところである。本年度は主に3つの成果をあげている。1つは院内倫理委員会の部分的な通過である。現在、本研究課題である「3次元画像解析とプロジェクションマッピングを用いた乳房再建手術支援システムの開発」に対する院内倫理委員会への申請作業を行なっている。当院はSRB (Scientific Review Board)とIRB (Institutional Review Board)の2階建て審査となっており、前者が科学的手法に関する妥当性の評価、後者が倫理面に関する妥当性の評価を行なっており、独立した審査が行なわれている。現在SRBの審査を通過し、IRBにおける指摘事項を修正し、再審査中となっている。3次元画像解析のための基本的なハードウエア、また開発中のソフトウエアも基本となるものは完成しているため、SRBを通過し、IRB審査に進めていることは、今後の臨床における実際の運用につながるものであり、その意義が高いと考えている。2つ目が、実際に臨床の現場で運用が可能であるか検討する事前実験の実施である。こちらは、既に実際に臨床研究を行なう"がん研有明病院"の手術室においてマネキンを用いた事前実験として検討を行なっている。この事前検討により、実際に行なう際の運用上の流れと問題点、また開発中のソフトウエアの実行可能性と問題点が明らかとなり、さらに必要となるハードウエアも明らかとなった。事前検討を行なうことで、IRB通過後にスムーズに臨床研究に進むことが可能となり意義が高いと考えている。最後に共同研究者である荒船のチームが20172018年の様々な学会において、本研究の開発中のソフトウエアについて発表を行い、座長および出席者より発展性や問題点の指摘を受けている。第三者の視点で評価を受けることで、より客観的なシステムの開発に繋がり、重要なステップであったと考えている。「おおむね順調に進捗している」現在、マネキンを用いた事前検討で3次元画像データ取得のノウハウが蓄積されている。

3次元データの採取を行う際に、術前、術中、術後相同性、再現性を得るためのレジストレーション用ボディマーカーの選定とマネキンを用いた妥当性の検討も済んでいる。また3次元データを一定のlayer(layer1layer n)に切り出した2次元平面上で比較対象点をID1, ID2, ID3,...とマーキングし、その移動距離n1,n2,n3,...を計測し、視覚的に捉えやすいようにカラーマッピング化、可視化させるための自動化ソフトウエアは既に開発済みである。実際に"乳房あり/乳房切除"を模したマネキンを用いて3次元画像を取得し、これが実際に開発したソフトウエアにてカラーマッピングし、可視化可能なところまで事前実験が済んでいる。またこの差分画像を実空間のプロジェクタ投影座標視点から見た映像に変形させ、乳房表面位置へ投影するシステムも既に開発済みであり、マネキンを用いたプロジェクションマッピングの実行可能性まで事前実験済みである。ハードウエアの準備、ソフトウエアの開発としては臨床実験に進める状態にある。次の段階として臨床での実地データの採取、それによるフィードバックを行い、さらなるシステムの改善を進める段階にある。しかしながら、当院の倫理審査はSRBおよびIRBの2階建てとなっており、また審査終了までに6-10ヶ月程度の時間を要し、現在IRBにて再審査中というステップにて実験の進捗にいくらかの遅れが出ている。しかしながら第1段階のSRBを通過し、IRBの修正後申請を行なっている状況のため、全体として「おおむね順調に進捗している」という判断とした。本年度は主に2つの実績をあげている。1つ目が、昨年度に行っていたがん研有明病院でのマネキンを用いた事前検討の実施に基づいて行った、男性ボランティアに模擬乳房を装着して行った予備実験である。マネキンだけでは、頭部、上肢、臀部から下が切断されたモデルになっており、実際の腕の位置や臀部の位置による体幹の形状変化が捉えられないという問題があった。実際にヒトの体幹は腕の位置や臀部の座位角度で大きく形状や位置が変化し、マネキンだけでは実際に則したモデルとしては不十分であった。さらに体動の問題や呼吸性変動など、より動的な変化に対して、どのように効果的にプロジェクター画像を追随する形で投影するかなど、さらなるデータ採取と、それをもとにしたソフトウエアのバージョンアップ、プロジェクターを用いた投影上の工夫に対する知見が得られた。二つ目に共同研究者である荒船のチームと合同で2018年に様々な学会において、本研究の開発中のソフトウエアと運用に関する発表を行い、学会上からのフィードバックを得た。具体的には形成外科領域、工学領域にて合わせて6演台の報告を行い、そのうち1演題はThe14th Korean-Japan Congress of Plastic and Reconstrtuctive Surgeryという国際学会での発表であった。さらにこれを発展させ、1本の和文論文として成果を報告した。
遷移金属触媒による脂肪族アルコールへの直截的官能基導入法の開発

脂肪族アルコールの直截的官能基化の検討を行った。RuHCl(CO)(PPh3)3触媒存在下、種々のカルボニル化合物とアルコールとの反応によりα位アルキル化が効率よく進行した。本反応は水素移動反応によるアルコールからアルデヒドの生成、アルドール縮合と続く水素移動反応により進行しているものと思われる。これらの反応においては窒素系配位子の添加が有効であった。また、RuHCl(CO)(PPh3)3は保護されたホモアリルアルコール類の選択的異性化反応にも有効であった。ホモアリルカーボネートとマロン酸エステルとの反応ではオレフィン異性化とアリル位アルキル化が連続的に進行した。アルコール類は入手容易な炭素原料であり、有機合成において重要な出発基質である。本研究では、遷移金属触媒によるアルコールのアルデヒドへの水素移動型反応を活用した炭素ー炭素結合形成反応の開発を行なった。アセトアミドとアルコール類との反応を検討したところ、RuHCl(CO)(PPh3)3触媒存在下、塩基としてカリウムtert-ブトキシドを用いた場合にアセトアミド類のα位アルキルが良好に進行することを明らかとした。種々配位子の検討を行ったところ、本反応では窒素系配位子が有効であることを見いだした。配位子としてビピリジルを用いるとベンジルアルコール類との反応が良好に進行した。一方、非ベンジル型のアルコールとの反応は緩慢であった。しかしながら、窒素系三座配位子であるピラゾリルピリジルピロールを添加することでベンジルアルコール類のみならず非ベンジル型アルコールでも反応が良好に進行することを見いだした。さらに、アルコールを用いたα位アルキル化反応をアセトニトリルに適用したところ、RuHCl(CO)(PPh3)3触媒を用いて良好に反応が進行することを見いだした。種々用いる塩基の検討を行なったところ、本反応では塩基としてリン酸カリウムの添加が有効であることが明らかとなった。一方、窒素系配位子の添加効果はなく本反応においてはアセトニトリルが配位子として作用していることが示唆された。また、RuHCl(CO)(PPh3)3が水素移動反応に関与していることも明らかとした。さらに、予備的な実験によりRuHCl(CO)(PPh3)3ベンジルアルコール類と芳香族ボロン酸との反応により、低収率ながらアルコールのα位に芳香族置換基が導入された生成物が得られることを見いだしている。しかしながら、脂肪族アルコールの炭素上に直接官能基を導入することは困難であるため、酸化反応やハロゲン化等により、より反応性の高い化合物に変換し官能基を導入する手法が一般的である。本研究では、遷移金属触媒によるアルコールの水素移動型反応を活用することで、脂肪族アルコールの直截的な官能基化反応を開発することを目的とする。平成24年度は主にアルコールのα位官能基化について検討した。近年アルコールを用いた、ケトンのアルキル化反応が有用な炭素ー炭素結合形成反応として広く研究されている。申請者はRuHCl(CO)(PPh3)3触媒を用いたケトンのα位アルキル化について検討を行った。本触媒系では弱塩基であるCsCO3を用いることが可能であるが、ベンジル型アルコールでは反応が良好に進行するものの、単純脂肪族アルコールでは反応が非効率であるという問題点を有していた。本反応の一般性拡張のため、配位子の再検討を行なった。その結果、窒素系2座配位子である1,10-phenanthrolineを添加することで単純脂肪族アルコールを用いても良好に反応が進行することを見いだした。さらに、これまでに報告例が限定されている単純なアセトアミド類のα位アルキル化について検討を行った。本反応においては窒素系3座配位子の添加が有効であることを明らかとしている。本研究では、遷移金属触媒によるアルコール類の触媒的変換反応の開発を行なった。RuHCl(CO)(PPh3)3触媒存在下、1位にフェニル基を有するホモアリルアルコールを反応させるとオレフィンが異性化しブチロフェノンが高い収率で得られた。一方、シロキシ基で保護したホモアリルアルコールを反応させると1つだけ二重結合が異性化したアリルシリルエーテルが高い選択性、収率で得られることを見いだした。この異性化反応では1位の置換基の立体的影響が大きく置換基が小さくなるにつれビニルエーテルの生成が多くなることが明らかとなった。さらに、1位にフェニル基を有するホもホモアリルアセテート、ホモアリルカーボネートをもちいて検討したところいずれも二重結合の異性化は1つだけ進行し、アリルアセテート、アリルカーボネートが高収率で得られた。

ホモアリルカーボネートの反応をマロン酸エステル、塩基存在下行なったところ、二重結合の異性化とアリル位アルキル化反応が連続的に進行し、置換アルケンが良好な収率で得られることを見いだした。また、ベンジルアルコールとベンジルトリメチルシランとの反応をRuHCl(CO)(PPh3)3触媒存在下に行なうと、シリル基の酸素原子上への移動が起こりベンジルシリルエーテルが得られることを見いだした。さらに、ベンジルアルコールとオルトニトロフェノールとの反応では低収率ながらベンズオキサゾールが得られている。ベンジルアルコールとニトロ基との間で水素移動反応により、ベンズアルデヒドとオルトアミノフェノールが生成し、環化反応が進行したものと考えている。また、2ーフェニルベンジルアルコールを用いた反応検討で低収率でフルオレノンが得られることが分かった。詳細な検討の結果、ロジウム触媒存在下、2ーフェニル安息香酸を反応させると高収率でフルオレノン誘導体が得られることを見いだした。化学本研究では安価で入手容易な炭素原料であるアルコールを用い、遷移金属触媒によるアルコールのアルデヒドへの水素移動型反応を活用することで新たな炭素ー炭素結合形成反応を開発することを目的としている。これまで、RuHCl(CO)(PPh3)3触媒を用い、配位子、塩基を的確に選択することでケトン、アセトアミド、アセトニトリルのα位アルキル化反応の開発に成功した。これらの反応では、水素移動型反応により生成したアルデヒドとカルボニル化合物とのアルドール縮合が鍵過程として含まれる。一方、アルコールのα位への芳香族置換基の導入はこれまでほとんど未発達であるが、RuHCl(CO)(PPh3)3触媒によりベンジルアルコール類と芳香族ボロン酸との反応によりα位への芳香族置換基の導入が可能であるという有望な結果を得ることができた。次年度では、アルコールのβ位およびγ位への官能基導入法の開発に力点を移す計画であるが、本年度に得られた研究の達成度は十分に満足のいくレベルであり、次年度に向けて本研究は順調に推移して行くものと考えている。本年度はアルコールα位の官能基化について充填的に検討を行なった。その結果、ルテニウムヒドリド錯体触媒による、アルコールを用いたケトンのα位アルキル化が良好に進行することを見いだしている。平成24年度の検討により、窒素系配位子を添加することでベンジル型アルコールのみならず、単純脂肪族アルコールとの反応も良好に進行することを見いだしている。さらに、単純アセトアミド類のα位アルキル化も良好に進行することを見いだしている。一方、アルコールβ位、γ位の官能基化についてもすでに検討を始めており、平成25年度に本格的な検討を行なう準備は整っている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているものといえる。アルコールのα位での官能基化に続き、水素移動型反応により生成するアルデヒドの酸性プロトンを活用し、アルコールβ位への官能基化導入法の開拓に重点をおく。各種求電子試薬や有機金属試薬との反応を検討する。また、アルデヒドを配位性官能基として活用し、アルデヒドβ位の炭素ー水素結合を活性化することで、アルコールγ位の官能基化する反応の新規触媒系を精査するものとしたい。。
のう胞形成前立腺癌異種移植モデルを用いた前立腺癌分泌蛋白質の発現・機能解析

免疫不全マウスにヒト前立腺癌組織を移植して新規患者由来異種移植片、KUCaP3を作成した。KUCaP3はアンドロゲン受容体とPSAを発現し、アンドロゲン依存性増殖および嚢胞形成の特徴を有する。LC/MS法でこの嚢胞液のタンパク質発現解析を行い、23のヒト由来タンパク質を同定した。その内発現の高かったNiemann-Pick disease, type C2(NPC2)について発現・機能解析を行った。前立腺癌臨床組織の免疫染色で、正常腺管に比べ、癌細胞でその発現低下を認めた。NPC2を発現抑制した細胞株を作成し、3D培養を行うと、腺管形成が阻害された。NPC2は前立腺腺管形成に関わると思われた。免疫不全マウスの皮下で、嚢胞を形成する前立腺癌臨床検体由来Xenograftモデル、KUCaP-3の嚢胞内容液および血清を質量分析にて網羅タンパク質解析を行った結果、Niemann-Pick病typeC2の原因遺伝子であるNPC2が高度に発現していた。前年の報告のように、細胞株を用いた実験で、この蛋白の発現は悪性度と負の相関を示すことがわかった。さらに臨床検体での発現解析で、前立腺の腺管構造とも負の相関を示していた。腺管構造を形成しうる細胞株であるRWPE-1を用いて、このNPC2をknockdownしたクローンを作成し、三次元培養を行うと、knockdownしたクローンの腺管形成は抑制された。これらを踏まえ、NPC2が前立腺の腺管構造に関わるタンパクとしてさらに解析を進めている。またほかの候補として、悪性度と正の相関を示すタンパク質を選定し、前立腺癌の新規バイオマーカー足り得るものを探索している。免疫不全マウスの皮下でのう胞を形成する前立腺癌xenograft、KUCaP-3ののう胞内溶液およびKUCaP-3を移植したマウスの血清を質量分析にて網羅的蛋白質解析をした結果、Niemann Pick病typeC2に関係するNPC2の発現をのう胞および血清で確認した。NPC2は前立腺正常細胞株RWPE1では発現が高いもののLNCaPでは発現が低下傾向であり、さらに悪性度の高いPC3やDU145ではよりその発現低下を確認した。ヒト前立腺癌組織でのNPC2の免疫染色を用いた発現解析ではGleason3のような腺管構築をなす癌では発現が高く、Gleason4のように腺管構築の乱れがある癌ではその発現が低下する傾向であった。そこでRWPE-1を用いてNPC2の発現をretrovirusで発現低下させて変異細胞株を作成し、親株とともに3次元培養をすると、NPC2低発現細胞株では腺管を形成する割合が低下していた。以上から、NPC2は前立腺癌の腺管構築の維持に必要なタンパク質でGleason gradeの高い高悪性度癌ではその発現が低下する傾向にあった。進行性前立腺癌において去勢抵抗性療法が標準治療であるが、ほぼ全例、平均2年の奏功期間ののち、去勢治療に抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)となる。CRPCに対しては、抗がん剤治療も限られており、CRPCの伸展機序の解明に伴う新規標準治療の開発が急務となっている。我々は嚢胞を形成する患者癌組織由来Xenograft、KUCaP-3を新規に樹立した。KUCaP-3は臨床癌と同様に、アンドロゲン受容体を発現し、多量のPSAを発現している。本Xenograftモデルを用い、去勢抵抗性を獲得する前後で嚢胞液内のヒト由来の分泌蛋白質を網羅的に質量分析で解析した。その結果、Niemann-Pick病typeC2の原因遺伝子であるNPC2が高度に発現していた。またこの蛋白の発現は悪性度と負の相関を示すことがわかった。腺管構造を形成しうる細胞株であるRWPE-1を用いて、このNPC2をノックダウンしたクローンを作成し、三次元培養を行うと、ノックダウンしたクローンの腺管形成は抑制された。これらを踏まえ、NPC2が前立腺の腺管構造に関わる蛋白としてさらに解析を進めている。また他の候補として、悪性度と正の相関を示す蛋白を選定し、前立腺癌の新規治療標的及びバイオマーカーの足り得るものを探索している。前立腺癌NPC2以外の候補について、質量分析で得られたデータからの絞り込みに時間がかかっているため。免疫不全マウスの皮下でのう胞を形成する前立腺癌xenograft、KUCaP-3ののう胞内溶液からこれまで前立腺癌ではその分泌の知られていなかったあらたなタンパク質NPC2の機能解析を施行した。現在、網羅的蛋白発現解析の結果得られた別のタンパク質の発現・機能解析中である。上記のようにNPC2以外の候補タンパクの選定を進める。

さらには去勢抵抗性となったKUCaP-3を用いることで、去勢抵抗性獲得に関わるタンパク質の候補も得られている。当研究室はアンドロゲン依存性前立腺癌細胞株LNCaPから去勢抵抗性のクローンをすでに作成しており、これを用いてその候補の選定とvalidationを進めていく。去勢抵抗性を獲得したKUCaP-3ののう胞液の網羅的蛋白質発現解析の結果得られた、去勢抵抗性癌のバイオマーカ候補であったSPARCに関しては、ごく最近別の研究グループがその機能解析を報告した。そのため我々は、先の網羅的解析の結果得られた別の候補分子につき去勢抵抗性変異に関わる機能解析を推進する方針である。NPC2については、結果の確認のため同様の表現型に関わる3D培養を何度か行う予定である。また去勢抵抗性変異に関わる別の候補分子についても、上記と同様の実験計画に基づき、候補蛋白の絞り込みを行い、その妥当性を評価する。さらにin vivoでの確認のため、その遺伝子を過剰発現あるいは発現抑制をした細胞株を移植したxenograftを作成し、去勢により増殖がどのように変化するかを確認する。
日本語音声における韻律的特徴の実態とその教育に関する総合的研究ー外国人を対象とする日本語教育における音声教育の方策に関する研究ー

今年度の研究は評価研究、対照研究、生成・知覚研究、教育研究グル-プに分かれて進めてきた。それぞれ研究グル-プの成果は以下のとおりである。1.評価研究:英語、韓国語、中国語を母語とする学習者の日本語の発話の「外国語なまり」についての聴取実験を実施した。日本語教師、学生の評価結果をみると、日本語教師のほうが評価が厳しく、母語別評価結果として、単語レベルでは、英語話者のアクセント、韓国語話者の単音、中国語話者の単音、アクセント、文レベルでは、母語を問わず、複合語アクセント、文末イントネ-ション、リズム、ポ-ズなどが問題点として指摘された。また、別の聴取実験の結果では、外国人学習者の日本語に対し、東京方言話者、大阪方言話者とで、文のどの部分が際立って聞こえるかについて異なった判定をすることが分かった。2.対照研究:日本語の疑問文の文末上昇調、名詞列挙文の韻律のピッチ曲線の分析を進めるとともに、韓国語、スペイン語、モンゴル語、トルコ語話者の疑問文の文末ピッチパタン、インドネシア語、トルコ語話者の名詞列挙文のピッチパタンについて、それぞれの母語との対照研究の結果をまとめ、日本人とベトナム語話者の日本語の単語の発話中のピッチパタンの対照研究の結果をまとめた。外国人日本語話者の日本語の韻律には、内容と程度に差はあるが、学習者の母語の干渉があり、日本語の韻律の習得上、問題となっていることが明らかになった。3.知覚・生成研究:東京語における疑問詞疑問文と単純疑問文のイントネ-ションパタンの差異は、分節音が欠如した状況で、両者の聞分けのキュ-になることを、聴取実験によって確認した。熊本、福井の無アクセント方言においても、イントネ-ションパタンは文の統語構造を示す働きを持つことが確認された。また、熊本方言においてはさまざまなタイプのイントネ-ションが存在し、同一の文にいくつかのタイプが使用されることが判明した。4.教育研究:シンポジウム「日本語音声の韻律的特徴と日本語教育」を開催し、日本語教育現場での日本語音声教育の現状についての討論を行なった。日本でも海外でも、音声教育は未だ軽視されがちであるが、学習者の音声言語習得の意欲は高く、学習者は現状に不満をもっていることが分かった。
筋細胞の適応を決定する運動後のカルシウムイオンダイナミクスの重要性

細胞内カルシウムイオン濃度は非常に低い濃度で維持されており,その変化によって細胞内の様々な細胞応答が制御されている.その一つとして,骨格筋ではタンパク質合成を活性化することが知られている.これまでに細胞外からの流入により伸張性収縮(ECC)では細胞内カルシウムイオンの増加をともなうことを報告した.しかしながら,ECCによって増加した細胞内カルシウムイオンおよびタンパク質合成経路の活性化の関連性は不明である.そこで本研究は,ECC後の損傷再生過程の安静状態の筋における筋線維のカルシウムダイナミクス(空間・時間的な濃度変化),およびタンパク質合成因子の活性化が見られるという仮説を検証した.Wistar系雄性ラットの前脛骨筋(TA)に電気刺激によるECCを負荷し,麻酔下において生体内環境を維持したまま1,3,7日後のTAを露出させ,細胞内カルシウムイオン蛍光指示薬(Fura-2)を負荷し,細胞内カルシウムイオンダイナミクスを数時間観察した.その後,筋を摘出しウエスタンブロッティングによりmTOR系の定量を行った.ECC後,細胞内カルシウムイオン濃度が高くその変動も大きい1日後ではmTOR,p70S6K,S6,eIF4Gのリン酸化の亢進が見られた.また,細胞内カルシウムイオン濃度が低く変動も小さい3日後ではmTOR,eIF4E,eIF4Gのリン酸化,細胞内カルシウムイオン濃度が再度上昇し変動は小さい7日後ではmTORとeIF4Eのリン酸化が亢進した.これらの変化にAktのリン酸化は伴わなかった.以上の結果から,ECC後の損傷再生過程において筋細胞内細胞内カルシウムイオンダイナミクスが見られ,また,mTOR系の一部活性化を介したタンパク質合成の亢進が示唆された.平成30年度は,ラットを用いて伸張性筋収縮が誘発する筋損傷モデルを作成し,in vivo観察モデル(Sonobe et al.2008, Eshima et al.2013を改良)によるカルシウムイオンダイナミクスを評価した.その結果,運動誘発性筋損傷後のカルシウムイオンダイナミクスの動態特性の特性を確認するとともに,同じプロトコールを用いてタンパク質合成経路との対応関係を明らかにした.1-3日後はp70S6KならびにS6,3-7日後においてmTORおよびeIF4Gのリン酸化が亢進していることが示された.さらに,これらの特性がカルシウムイオンダイナミクスによって直接的に制御されているのかについて確認する必要性がある.平成31年度は,運動後のカルシウムイオンダイナミクスの役割を明らかにするために,筋小胞体やミトコンドリアの薬理的阻害によって, 1.カルシウムイオンダイナミクス, 2.タンパク合成経路のシグナルがどのように変化するのかについて解明を進める.実験モデルとして, 1) in vitroコントロール,2) in vivoコントロール,3 )in vivo筋収縮負荷(エキセントリック:ECC負荷)において,薬理阻害の有無のモデルをそれぞれ設定する.筋収縮負荷後,数日間(1,3,7日後)のフェーズにおいて,カルシウムイオンダイナミクス,ならびにタンパク合成経路のシグナルを検証する.また,筋収縮負荷に加えて,カルシウムイオン動態に影響する温熱負荷による検証をすすめる.これは,筋損傷を回復の経過におけるカルシウムイオンの役割を解明するためである.筋収縮負荷後の温熱負荷後,In vivoモデルによってCa2+ダイナミクスを評価する(負荷直後数日後の経過時点)するとともに,観察後,筋を摘出し,タンパク質合成(AKT, mTOR, S6K)ならびに分解(カルパイン,アポトーシス,AMPK)に関与するタンパク質のリン酸化をWestern blot法により評価する予定である.骨格筋の収縮ー弛緩サイクルはカルシウムイオンダイナミクス(細胞質中の空間的・時間的な濃度変化の連続)によって制御される.本研究は,「筋収縮に関与しない持続的なカルシウムイオンダイナミクスが運動後に起きており,この現象が骨格筋の肥大(タンパク質合成)や損傷(タンパク質分解)を制御している」という仮説を立てた.この仮説を検証するために,蛍光顕微鏡および2光子レーザー顕微鏡を導入し,独自に開発したin vivo(生体内)バイオイメージング技法と組み合わせることで,カルシウムイオンダイナミクスと骨格筋適応(筋肥大・損傷)の関連性を検討した.平成28年度は,Wistar系雄性ラットの前脛骨筋(TA)に電気刺激による伸張性筋収縮(ECC)を負荷し,麻酔下において1日7日後のTAを生体内環境を維持した状態でカルシウムイオン蛍光指示薬(Fura-2)を負荷し,カルシウムイオンダイナミクスを数時間観察した.その結果,ECC後から数日(1日- 7日間)経過しているにもかかわらず,筋細胞内カルシウムイオンの分布は筋線維毎に異なり,また,筋線維内でもカルシウムイオンのばらつきが観察された.さらに,麻酔下の安静状態において,カルシウムイオンの上昇と減少が連続的に起こっているカルシウムダイナミクスを観察した.一方,ECC無負荷のTAにおいて,このような現象は認められなかった.以上の結果から,ECC後は数日間にかけて筋細胞内カルシウムダイナミクスが起こることが明らかにされた.これはタンパク質分解などのシグナル機構として作用する可能性が考えられる.本研究の大きな特色はカルシウムイオンの評価法である.我々が独自に開発を進めてきたin vivoモデル(Sonobe et al. 2008, 2010, Eshima et al. 2013, 2015)を基盤として,2光子レーザー顕微鏡を導入することにより空間・時間分解能の改善を試みた.現在までの所,呼吸や拍動によるノイズ処理の問題から,観察法を確立するには至っていない.しかしながら,従来からの蛍光顕微鏡によるin vivoモデルを用いることによって,研究目的である筋損傷モデルにおけるカルシウムイオンのダイナミクス現象を捉えることには成功している.

今後は,2光子レーザー顕微鏡の導入によって,空間・時間分解能の改善によるこの現象の詳細な検討に結びつけたいと考えている.骨格筋の収縮ー弛緩サイクルはカルシウムイオンダイナミクス(細胞質中の空間的・時間的な濃度変化の連続)によって制御される.本研究は,「筋収縮に関与しない持続的なカルシウムイオンダイナミクスが運動後に起きており,この現象が骨格筋の肥大(タンパク質合成)や損傷(タンパク質分解)を制御している」という仮説の検証を目的としたものである.この仮説を検証するために,蛍光顕微鏡および2光子レーザー顕微鏡を導入し,独自に開発したin vivo(生体内)バイオイメージング技法と組み合わせることで,カルシウムイオンダイナミクスと骨格筋適応(筋肥大・損傷)の関連性を検討した.平成29年度は,昨年度までに得られた運動誘発性筋損傷後のカルシウムイオンダイナミクスの動態特性とタンパク質合成経路との対応関係を明らかにすることを試みた.カルシウムイオンダイナミクスは筋損傷が誘発された24時間後にかけて,細胞質内の高い蓄積レベルと周期的な変動を認めた.3日後には,一時的にカルシウムイオン濃度の低下が認められたが,7日後には再び濃度は上昇に転じた.同じプロトコールでタンパク質合成経路を生化学的に検証した.その結果,1-3日後はp70S6KならびにS6,3ー7日後においてmTORおよびeIF4Gのリン酸化が亢進していることが示された.現在,カルシウムイオンダイナミクスとタンパク質合成経路シグナルについての対応関係を調べている.平成29年度は,ラットを用いて伸張性筋収縮が誘発する筋損傷モデルを作成し,筋損傷の特徴を組織化学的に検証した.その結果,カルシウムイメージングの対象領域となる筋表層部の筋損傷像を確認し,モデルの妥当性を確認した.次に,in vivo観察モデル(Sonobe et al.2008, Eshima et al.2013を改良)によるカルシウムイオンダイナミクスの評価において,蛍光顕微鏡による分析を進めた.予定された2光子レーザー顕微鏡による評価は、呼吸等による振動ノイズをキャンセルできなかったことから,観察方法の再検討を進めている.昨年度までに得られた運動誘発性筋損傷後のカルシウムイオンダイナミクスの動態特性の再現性を確認するとともに,同じプロトコールを用いてタンパク質合成経路との対応関係を明らかにした.その結果,1-3日後はp70S6KならびにS6,3ー7日後においてmTORおよびeIF4Gのリン酸化が亢進していることが示された.これらの特性が,カルシウムイオンダイナミクスによって,直接的に制御されているのかについて確認することを予定している.これは,今年度の実験計画で予定されていた研究の一部を含んでいることから,研究の進展がやや遅れていると判断した.細胞内カルシウムイオン濃度は非常に低い濃度で維持されており,その変化によって細胞内の様々な細胞応答が制御されている.