hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急性肺傷害におけるリゾリン脂質の解析と同アシル基転移酵素遺伝子導入の効果

本研究は生体への抗原性の乏しいアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ARDS実験モデル肺に同酵素を遺伝子導入することで、ARDSにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、有効な薬物治療の乏しいARDSに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。今年度はリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素(LPCAT)およびコントロールとしてLacZ酵素を組み込んだAAVウイルスの作成を行った。AAVウイルスにはいくつかの血清型が存在するが、文献(Strobel B et al. Am J Respir Cell Mol Biology 53:291-302, 2015 )によると気道-肺胞系にもっとも遺伝子発現効率の高いものはAAV6.2とされている。しかしAAV6.2は市販されていないため、われわれはAAV6を鋳型にしてMutagenesisを誘導し、AAV6.2を作成し、DNAシークエンスにて正しく作成されていることを確認した。またIn vivo動物実験においてマウスやラットへ気管内投与し、肺組織において十分な遺伝子発現を得るためには大量のAAVウイルス作成が必要であり、この方法のプロトコールを作成した。平成28年度までにLacZおよびLPCAT-cDNAを組み込んだリコンビナントアデノ随伴ウイルス(AAV)の作成を終了した。さらに市販されていない気道-肺胞組織に高い遺伝子発現を示すとされているAAV6.2リコンビナントウイルスをわれわれ自身で作成した。In vitro実験に必要なラット肺胞II型上皮細胞を単離し、インサートウェル内での気相培養法を行い、肺胞II型上皮細胞の分化機能を維持した培養法を確立した。さらにIn vitro動物実験に必要な大量のウイルスを作成するためのプロトコールの開発にも成功した。以上のように平成28年度まで予定していた実験の大半をおおむね順調に終了した。急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は治療法の乏しい、いまだに死亡率の高い呼吸器疾患である。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスホリパーゼA2の作用によりリゾフォスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。これらリゾリン脂質は炎症をさらに増悪させると推測されるが、ARDSの病態生理における意義はかならずしも明らかにされてこなかった。リゾリン脂質アシル基転移酵素はリゾリン脂質に対しアシル基を転移し、元の安定なリン脂質に戻す作用がある。本研究は生体への抗原性の乏しく遺伝子導入に優れているとされるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、ARDS実験モデル肺に同酵素を遺伝子導入することで、ARDSにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、ARDSに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。肺細胞への親和性の高いとされる血清型AAV6.2を新たに作成した。A549細胞を用いてコントロールAAV6.2としてのLacZ酵素発現の確認を細胞染色の目視、およびフローサイトメーターによる定量解析を行った。同細胞へのリポポリサッカライド添加による細胞障害がリゾフォスファチジルコリンアシル
太陽風磁場構造の発展過程

本研究の目的は、太陽面磁場構造と太陽風磁場構造をつなぐ重要な手がかりである非平均的な太陽風磁場、とりわけ、太陽磁場の時間発展を反映すると考えられる「太陽風中の平面状磁場構造」について、1.太陽面上のどの磁場構造に対応付けられるかを、惑星間空間と太陽面の双方の観測から明らかにし、2.太陽面上に両端を持つ磁力線が惑星間空間に引き出され「平面状磁場構造」として観測される、というモデルを確かめることであったが、惑星間空間探査機「さきがけ」の磁場観測と太陽観測衛星「ようこう」軟X線望遠鏡観測を用いることによって、平面状磁場構造と光球面近傍の磁力線形状との対応付けに成功した。対応付けを容易にするため、太陽面の静穏であった1993年1-7月を解析期間とし、この期間中,「さきがけ」によって観測された3つの典型的な平面状磁場構造について、太陽風速データを用いて構造が太陽から放出された日時を求め、その発生源と思われる領域を「ようこう」X線画像を用いて調べた。その結果、平面状磁場構造の発生源は3つとも最近「ようこう」で発見された「活動域膨張」を示している領域に対応することがわかった。「活動域膨張」は、下部コロナで観測される、太陽面上の活動域からループ状の構造が惑星間空間に向かって放出される現象である。活動域の磁場は非常に強いため、惑星間空間まで引き出されることはないという考えがこれまでの主流であったが、本研究によって「活動域膨張」が惑星間空間まで引き出されることが示された。発生源とみられる活動域のうち少なくともひとつはフレアを伴っておらず、近傍にフレアがある場合でも小規模のものしか無いことから、平面状磁場構造の発生は、フレアによらず「活動域膨張」によることがわかる。
高信頼ソフトウェアを実現する強力なテストケース生成手法の開発

本研究では,ソフトウェア開発におけるテスト工程の効率化を目的として,ペアワイズ法に基づいた不具合検出能力の高い,強力なテストケースの設計手法の研究・開発を行った.まず,昨年度から研究を行ってきた,テストケース実行のためのオーバヘッドを考慮したテスト生成法を完成させると共に,その定量的評価を行った.ここで実行のためのオーバヘッドとは,新しいテストケース実行の際に生じるコストのことである.例えば,プリンタや複写機のテストでは,テストケースの実行の際に,用紙トレイや印刷対象の大きさなどを設定することが必要だが,そのためのコストをモデル化したものと考えることができる.提案した生成法は2種類ある.一つは,グリーディー法と呼ばれる良いテストケースを一つずつ求めていく手法の拡張である.もう一つは,既存手法で得られたテストケースの集合に対し,実行のオーバヘッドが少なくなるよう,それらをスケジュールするという手法である.実験の結果,後者の手法の方が,オーバヘッドの少ないテストを比較的安定して生成することが分かった.更に,これまでの研究成果を総括する意味で,本課題にて実施した研究を含む,ペアワイズ法に関連した研究の体系化を行った.この結果はサーベイ論文の形で,電子情報通信学会論文誌において発表した.具体的には,約60の関連研究を精査し,それらをテストケースの生成法に基づいて分類した.また,実用の助けになるように,これまで知られている実際のシステムへの適用結果に関しても概説し,適用上の陥穽についても議論した.本研究では,高信頼ソフトウェアの実現に必要不可欠な,テスト工程の改善を目的として,ソフトウェア中の不具合の検出能力の高い,強力なテストケース生成手法の開発を行っている.より具体的には,組合せテスト(combinatorial testing.ペアワイズ法,全ペア法とも呼ばれる)に注目し,(1)テストケース作成手法とツールの開発,及び,(2)実ソフトウェアへの適用による有効性の検証,を行う.(1)に関しては,これまでの理論的成果は強い仮定を前提としていることが多く,現実的な場面で適用することが困難であった.そこで,テスト工程で生じ得る様々な制約に対処できるように研究を発展させ,実際のシステムに適用可能な手法,及び,ツールの開発を行う.(2)に関しては,(1)で開発したツールを用いて,現実のシステムへの適用を実施し,実際に検出されたフォールト数とコードカバレッジに基づく有効性の定量的な評価を行う.これらの目標を達成するため,本年度は(1)の課題に注力し,これまでに得られている理論的なテスト生成技術に基づき,実際のテスト工程に適用可能なテスト生成ツールを開発した.このツールは,Java言語で記述されたプログラムをテストの対象としており,組み合わせテストの実施を,半自動的に行うことができる.具体的には,Java言語によるソフトウェア開発で広く用いられている統合開発環境Eclipseでの実行を想定し,Eclipseの装備する標準的なテストフレームワークであるJUnit上で動作するテスト用のプログラムを,テスト対象の最低限の情報から自動的に生成することができる.従来のJUnitの利用法では,テストケースの記述は手動で行う必要があったのに対し,提案法ではこのようは煩雑な処理を自動化することができるため,組み合わせテストによる検出能力の向上だけでなく,生産性の改善にも有効である.本研究では,ソフトウェア開発におけるテスト工程の効率化を目的とし,ソフトウェア中の不具合を検出する能力の高い,強力なテストケースの設計手法の開発を行う.具体的には,組合せテスト(combinatorial testing.ペアワイズ法,全ペア法とも呼ばれる)に注目し,1.テストケース作成手法とツールの開発,及び,2.実ソフトウェアへの適用による有効性の検証を行う.1.に関しては,従来の理論的成果が仮定している非現実的な条件の緩和を行うことで,実際のソフトウェア開発に適用可能な理論を築き,それに基づいたテストケース設計ツールの開発を行う.2.に関しては,1.で開発したツールを用いて,現実のシステムへの適用を実施し,有効性の定量的な評価を行う.これらの目標を達成するため,本年度は具体的に以下の研究を行った.まず,1.の課題に関しては,これまで考慮されていなかったテストケース実行のためのオーバヘッドを考慮した問題の定式化に着手した.これは,例えばプリンタや複写機のテストを想定した場合,テストケースの実行の際に,用紙トレイや印刷対象の大きさなどを設定するためのコストをモデル化したものである.直感的には,連続するテストケースでこのような設定の変更ができるだけ生じないようにテストケースを順序付けるのと同時に,組合せテストの条件も満足するテストを設計することを,最適化問題として表現したものと言う事ができる.2.に関しては,実際のソフトウェア開発の現場での利用が可能なように,スプレッドシート上でテストケースの設計・操作を行う方法の開発を行った.本研究では,ソフトウェア開発におけるテスト工程の効率化を目的として,ペアワイズ法に基づいた不具合検出能力の高い,強力なテストケースの設計手法の研究・開発を行った.まず,昨年度から研究を行ってきた,テストケース実行のためのオーバヘッドを考慮したテスト生成法を完成させると共に,その定量的評価を行った.ここで実行のためのオーバヘッドとは,新しいテストケース実行の際に生じるコストのことである.例えば,プリンタや複写機のテストでは,テストケースの実行の際に,用紙トレイや印刷対象の大きさなどを設定することが必要だが,そのためのコストをモデル化したものと考えることができる.提案した生成法は2種類ある.一つは,グリーディー法と呼ばれる良いテストケースを一つずつ求めていく手法の拡張である.

もう一つは,既存手法で得られたテストケースの集合に対し,実行のオーバヘッドが少なくなるよう,それらをスケジュールするという手法である.実験の結果,後者の手法の方が,オーバヘッドの少ないテストを比較的安定して生成することが分かった.更に,これまでの研究成果を総括する意味で,本課題にて実施した研究を含む,ペアワイズ法に関連した研究の体系化を行った.この結果はサーベイ論文の形で,電子情報通信学会論文誌において発表した.具体的には,約60の関連研究を精査し,それらをテストケースの生成法に基づいて分類した.また,実用の助けになるように,これまで知られている実際のシステムへの適用結果に関しても概説し,適用上の陥穽についても議論した.
モーター蛋白質によって駆動されるサルコメア様マイクロアクチュエータの開発

生体内に存在する天然の分子機械であるキネシンやミオシンといったモーター蛋白質を用いて,マイクロマシン及びLab-on-a-Chipデバイスの駆動に利用を目指した研究が行われている.本研究では,モーター蛋白質と細胞骨格を,微細加工技術によって作製した足場に結合させ,マイクロアクチュエータの開発を試みた.このために,足場となる円柱形微粒子を作製し,蛋白質を結合させた.また,このアクチュエータの設計を支援するシミュレーションを作成した.モーター蛋白質によって駆動されるサルコメア様マイクロアクチュエータを開発するために,以下の研究を行った.1.微小管やキネシンの足場となる円柱形微粒子の作製.フォトリソグラフィー法により,直径約10 μm,高さ約10 μmの円柱を一度に250,000個程度作製できるようにした.円柱を作製するための材料はフォトレジストSU-8を用いた.このSU-8円柱をλ-DNAを用いて配列させるために,円柱の上面にのみ金薄膜をつけようとした.このために,SU-8円柱の表面全面に金をスパッタした.さらに犠牲層となるOFPRを金薄膜の上にスピンコートした.その後,SU-8円柱上部を除いて露光・現像した後,金のエッチングを行った.しかし,SU-8円柱の全面で金薄膜がエッチングされてしまい,上面にも金薄膜が残らなかった.この原因は,SU-8の上部にOFPRがコートされていなかったためと考えた.2.λ-DNAの可視化.円柱微粒子を配列させるために使用するλ-DNAをYOYO-1で染色し,可視化した.3.設計用のシミュレーションの妥当性の検証.昨年度は,シミュレーションの主要部分を作成できたが,シミュレーションの妥当性を検証のための実験結果との比較では定量的な一致は得られなかった.そこで,実験条件の詳細についても再現してシミュレーションを行った結果,実験との良好な一致が得られた.これにより本シミュレーションの妥当性が示された.また,実験結果についての新たな知見が得られた.生体内に存在する天然の分子機械であるキネシンやミオシンといったモーター蛋白質を用いて,マイクロマシン及びLab-on-a-Chipデバイスの駆動に利用を目指した研究が行われている.本研究では,モーター蛋白質と細胞骨格を,微細加工技術によって作製した足場に結合させ,マイクロアクチュエータの開発を試みた.このために,足場となる円柱形微粒子を作製し,蛋白質を結合させた.また,このアクチュエータの設計を支援するシミュレーションを作成した.モーター蛋白質によって駆動されるサルコメア様マイクロアクチュエータを開発するために、以下の研究を行った.1.微小管やキネシンの足場となる円柱形微粒子の作製.円柱形微粒子は、フォトリソグラフィー法を用いて、SU-8で作製した.シリコン基板上に、犠牲層となるLORをスピンコートし、その上にSU-8の円柱を作製した.犠牲層を除去することで、円柱形微粒子を作製した.2.SU-8表面への蛋白質の結合.EDCとNHSを用いて、SU-8表面に蛋白質を固定した.今回は、IgGを用いて、IgGのSU-8表面への結合を確認した.蛋白質がSU-8表面に結合したかどうかの確認には、蛍光標識したIgG抗体を加え、SU-8表面に蛍光が観察されるかどうかで確認した.確認の結果、IgG抗体からの蛍光を確認することができ、IgGのSU-8表面への結合が確認された.3.設計を支援するコンピュータシミュレーションの開発.微小管を弾性棒として扱い、キネシンなどの微小管結合蛋白質や微細加工壁との相互作用を考慮したシミュレーションを開発している.作成したコンピュータシミュレーションの妥当性を評価するために、微小管が微細加工基板上をキネシンによって駆動される際の運動を、実験結果と比較した.シミュレーション結果は、実験と類似の傾向を見せたが、定量的な一致は見せなかった.4.構造最適化プログラムの作成.円柱形微粒子の構造最適化に向けて、遺伝的アルゴリズムのプログラムを作成した.この手法の妥当性を検討するために、これまでに開発した微小管滑り運動を制御するトラック設計シミュレーションを用いて、最適化を行った.この結果、構造探索について、良好な結果を得た.モーター蛋白質によって駆動されるサルコメア様マイクロアクチュエータを開発するために,以下の研究を行った.1.モーター蛋白質や細胞骨格の足場となる円柱形微粒子の作製.フォトリソグラフィー法により作製した円柱形微粒子の上面や側面に特異的に蛋白質や核酸を結合させるために,円柱形の上面のみに金薄膜をつけようと試みた.このために,以下のプロセスを試みた.スピンコートしたSU-8上に,OFPRをスピンコートする.この2層になったフォトレジストを露光する.露光後,OFPRのみを現像してから,金をスパッタする.その後,OFPRとSU-8の露光されていない部分を除去してよう試みた.この実験を行った結果,意図した通りにはならず,OFPRが現像されなかった.この原因は,OFPRをスピンコートした際に,OFPRの溶剤によりSU-8が溶出して混合し,混合したSU-8が露光部分で混合したためではないかと考えた.2.設計用シミュレーション方法の拡張.昨年度までに開発したキネシン・微小管についてのシミュレーションについて詳細な解析を行った.またこのシミュレーションをアクチン・ミオシンにも適用できるようにした.

このためにシミュレーションにミオシンのATP加水分解反応を加えた.シミュレーション方法の妥当性を調べるために,これまでに報告されている実験結果と比較した.この結果,シミュレーションと実験との間に良好な一致が見られ,シミュレーション方法の妥当性が示された.応用物理微細加工による円柱形微粒子の作製が遅れている.作製方法の検討と改善を何度も行い,当初計画した方法よりも大幅に単純化することが出来たが,まだ完成には至っていない.また、シミュレーション方法の妥当性を検証するに時間を要した.妥当性の検証のために,実験の詳細な条件を考慮して比較・検討を行うことに時間を要した.しかし,実験結果についての新たな解釈の提示などの知見が得られた.長期海外出張のため、微細加工などの実験研究はやや遅れ気味となってしまった.しかし、帰国後は遅れを取り戻すように努力し、円柱形微粒子の作製や、円柱形微粒子表面への蛋白質の結合方法について積極的に研究を行った.これにより、遅れを取り戻しつつある.一方、シミュレーションについては、計画よりも早く進展している.シミュレーションの基本的な部分である、微小管やモーター蛋白質の取り扱いや、微小管と微細加工構造物との相互作用などの部分はほぼ完成した.現在、シミュレーション結果の妥当性を確認中である.円柱形微粒子の作製および配列について重点的に研究を行う.当初予定していたプロセスよりも,微細加工のプロセスを大幅に単純化することが出来た.これにより,蛋白質や核酸を配置する足場となる円柱形微粒子作製の効率が向上し,作製における歩留りをおさえることができるものと考える.今後もプロセスのさらなる効率化を図る.また,シミュレーション方法の妥当性が確認出来たので,アクチュエータの設計に積極的に利用する.特に,最適化プログラムと本シミュレーションを組み合わせることによって,実験研究を支援する.当初の研究計画に沿って研究を推進する.ただし、今年度完了することが出来なかった蛋白質の円柱形微粒子各面への結合方法と、DNAの円柱形微粒子への結合方法について重点的に研究を行う.これにより、当初の研究計画からの遅れを取り戻す予定である.また開発中のシミュレーションの手法を再検討し、定量的な予測が行えるように改善する.その後、良好な結果を得ている構造最適化プログラムと組み合わせて、マイクロアクチュエータの設計に積極的に利用する.これにより実験研究の効率化を図る.研究費は,消耗品と旅費として使用する.消耗品としては,シリコンウェーハーなどの微細加工に使用する消耗品と,蛋白質などの生化学試薬を購入する.旅費としては,微細加工を行うための名古屋大学への出張や,研究打ち合わせ及び学会発表のための出張旅費を計上する.金額としては,今年度の繰越金と、当初次年度配分額を合わせた金額を使用する見込みである.これは、今年度に実施できなかった実験項目を次年度に繰り越して行うためである.
可積分系の離散的方法を基盤とした非線形波動解析のための計算アルゴリズムの開発

可積分系の研究において見出された離散数理構造を積極的に用いて複雑な波動現象解明のための革新的な計算手法を開発することを目標として研究を行なった。具体的には、(1)離散可積分系研究で見出された手法を基盤とした高精度で高速な構造保存型差分スキームの開発およびその数理的性質の研究、(2) 2次元波動パターンのある時刻における情報からそのパターンを生成する厳密解を構成し波動パターンの時間発展を予測する計算アルゴリズムの開発に取り組んだ。(1)においては離散可積分系の手法とともに離散微分幾何学の手法を積極的に用いて、申請者らが提案した自己適合移動格子スキームの研究、開発を中心に行なった。いくつかの物理現象の数理モデルに対して自己適合移動格子スキームの構築と精度検証を行なった。また、離散微分幾何学的アプローチを用いて離散空間曲線の運動から渦糸の運動を記述する複素WKI方程式の自己適合移動格子スキームの構築に取り組んだ。この結果については現在論文を執筆中であり国際査読論文誌に投稿予定である。(2)においては、2次元可積分系理論を基盤としてコード図、ネットワーク図、三角形分割などの組み合わせ論や計算幾何学の手法を積極的に用いて2次元非線形波動方程式の分類問題に取り組んだ。特に、DKP(結合型KP)方程式、Davey-Stewartson方程式のソリトンが作るパターンの分類手法の開発に取り組み、ネットワーク図、コード図の拡張にたどり着いた。またこれまで困難であったBKP方程式のソリトンパターンの研究についても前進があった。現在、これらの成果をまとめて論文を執筆中で国際査読論文誌に投稿予定である。物理学において現れるいくつかの数理モデルについて自己適合移動格子スキームの構築を行いそれらの数値計算精度を詳しく検証し、自己適合移動格子スキームが信頼できる数値計算法であることが確認できた。また,自己適合移動格子スキームの幾何学的構築の方法についての研究も大きく前進した。2次元波動パターンの研究については、DKP方程式とDavey-Stwartson方程式のソリトンパターンの分類問題に対する解析手法として、ネットワーク図、コード図の拡張にたどり着くことができた。7月(台湾)と3月(アメリカ)の国際会議でこれらの成果を発表したところ好評であった。以上のことから、「おおむね順調に進展している」と判断した。自己適合移動格子スキームの適用範囲をさらに広げるため、様々なタイプの非線形偏微分方程式に対して自己適合移動格子スキームの構築を行い、自己適合移動格子スキームの数値計算において扱える範囲を広げ計算精度の検証を行うことで、実用的な数値計算法として確立することを目指す。また、離散微分幾何学とのつながりをさらに深く追求することで離散微分幾何的アプローチの数値計算への応用について研究していく予定である。2次元ソリトンパターンの問題については、本研究課題に取り組んでいく中で拡張されたネットワーク図などの新たな道具や組合せ論的手法を使ってこれまで解析が困難であったDKP方程式やBKP方程式のソリトンパターンの分類問題および逆問題の解析に取り組んでいく予定である。

また、離散微分幾何学とのつながりをさらに深く追求することで離散微分幾何的アプローチの数値計算への応用について研究していく予定である。2次元ソリトンパターンの問題については、本研究課題に取り組んでいく中で拡張されたネットワーク図などの新たな道具や組合せ論的手法を使ってこれまで解析が困難であったDKP方程式やBKP方程式のソリトンパターンの分類問題および逆問題の解析に取り組んでいく予定である。当初、参加を予定していた学会、研究会に学内業務のため参加できなくなった、招聘を予定していた共同研究者が来れなくなった、必要な消耗品は大学の研究費で購入することができたなどのため次年度使用額が生じた。次年度使用額は国際会議や学会での研究成果発表のための旅費や共同研究者の招聘旅費等に使用する予定である。
核多角体病ウイルス分離株の比較による殺虫スピード決定機構の解明

本研究は、殺虫スピードの異なる核多角体病ウイルス(NPV)を比較し、殺虫スピードを決定する要因の解明を行った。その結果、殺虫スピードが遅いウイルスでは、ウイルスの増殖速度が遅く、さらに昆虫の呼吸を司る器官である気管の周囲の細胞での感染が遅れることが分かった。また、当初、ウイルスの形態からNPVであると考えて特性解明を行った宮崎県からの分離株が、実は、NPVではなく顆粒病ウイルス(GV)であり、GVの形態異常変異株であることが明らかになった。本研究課題は、殺虫スピードの異なる核多角体病ウイルス(NPV)をチャノコカクモンハマキ幼虫に接種し、その病理学的性状を比較し、殺虫スピードを決定する要因を明らかにすることを目的としている。具体的には、チャノコカクモンハマキNPV(AdhoNPV)つくば株、Autographa californica MNPV(AcMNPV)、AdhoNPV宮崎株、Adoxophyes oranaNPV(AdorNPV)オランダ株等を比較対象として用いる。供試するウイルスを増殖しウイルス包埋体を精製して、チャノコカクモンハマキ幼虫に接種して殺虫スピードを調査した。その結果、ウイルス感染致死時間は、AcMNPV、AdorNPVオランダ株、AdhoNPVつくば株および宮崎株の順で長かった。また、オランダ株のDNAについて制限酵素断片長を解析した結果、2種以上の遺伝子型が混在しており、さらにin vivo isolationを行った結果、致死スピードの速い遺伝子型と遅い遺伝子型があることがわかった。一方、ウイルスの遺伝子型により致死スピードが異なることから、チャノコカクモンハマキ野外個体群から新たな遺伝子型の探索を試みた。H18年に京都府ではチャノコカクモンハマキが大発生したため幼虫を採集し採集個体からウイルス病の探索を試みたが、8月に採集した個体群からはNPV罹病虫は見つからなかった。致死スピードのもっとも遅いAdhoNPV宮崎株について、その同定を行った。電子頗微鏡による観察とウイルスDNAおよび包埋体タンパク質の解析を行った結果、このウイルスは、NPVよりも顆粒病ウイルスに近い性質を持っていることがわかった。また、チャノコカクモンハマキの初代培養細胞の樹立を行った。平成19年度も引き続きチャノコカクモンハマキの初代培養細胞の樹立を試みたがウイルス感染可能な増殖力の高い樹立細胞系は得らなかった。そこで、アメリカで組み換えバキュロウイルスについての研究経験を持つvan Beek博士を招聘し培養細胞を用いずにin vivoで組み換えウイルスを作製する法について検討した。また、宮崎県で分離されたウイルス株についてさらに詳細に検討した結果、リンゴコカクモンハマキから分離された顆粒病ウイルス(GV)と極めて近縁であるが包埋体の形状がNPVに似たウイルスであることがわかった。本研究の主題とは直接関係がないが、このような新しいGVの変異株を調査することにより包埋体の形状に関連する遺伝子についての情報が得られるため引き続き調査を行う。平成19年にも京都府でチャノコカクモンハマキの野外個体群においてウイルス病の探索を試みたが、8月に採集した個体群からはNPV罹病虫は見つからなかった。本研究課題は、核多角体病ウイルスの殺虫スピードを決定する要因を解明することを目的としている。イギリスから分離されたリンゴコカクモンハマキNPV(AdorNPV)は、つくばで分離されたチャノコカクモンハマキNPV(AdhoNPV)よりも殺虫スピードが速く、さらにそのゲノム構成はAdhoNPVに極めて近縁であった。また、AdorNPVのゲノムをAdhoNPVと比較すると、Ecdysteroid UDP-glucosyltransferase(EGT)の遺伝子の機能ドメインが欠損が見らることが、別の研究グループにより報告された。殺虫スピードとegt遺伝子との関連を調べるためには、組み換えウイルスを作製して検証することが必要であるので、前年度に引き続きin vivoで組み換えウイルスを作製する法について検討した。まず、幼虫にDNAを注射接種することにより感染するかどうか調査した結果、核酸導入試薬を用いることによりAdhoNPVのDNAを4齢のチャノコカクモンハマキに注射して感染虫を得ることに成功した。また、宮崎県で分離されたウイルス株については、全ゲノム塩基配列の決定を行った。その結果、99,504塩基の宮崎株全長の解読に成功した。宮崎株は、119個の推定ORFを持ち、このすべての推定ORFが、リンゴコカクモンハマキ顆粒病ウイルス(AdorGV)のホモログであった。宮崎株は、AdorGVに較べて包埋体の形状が著しく異なっている。宮崎株とAdorGVの推定ORFのアミノ酸配列の一致度を比較すると、119個中60個の推定ORFが100%一致し、さらに、112個のORFが95%以上一致した。

最も一致度の低かったのは、odv-e25(55%), ORF109(67%), 38.7kd(84%)などであった。これらのORFについても、in vivo組み換えウイルス作製により、どの遺伝子の変異が包埋体の形状異常に関与するのか明らかにすることができる。
心筋細胞系列の決定機構の解明

本研究は、発生の初期段階から心筋細胞に特異的に発現している転写因子Nkx2.5のプロモーター領域を解析し、Nkx2.5の上流因子を同定することにより、心筋細胞系列を決定する機構を解明することを目的としている。われわれはNkx2.5の上流60kbをBACライブラリーより分離し、約70種類のレポーターコンストラクトを作製した。培養心筋細胞を用いたin vitroの系でそれらのコンストラクトの活性を調べたところ、6箇所レポーター活性の強い領域を見いだした。これらは心臓線維芽細胞やCOS細胞ではまったく活性がなく、in vitroの系では心筋細胞特異性があると考えられた。この6種類のDNAフラグメントをLacZレポーターコンストラクトに組み込み、トランスジェニックマウスを作製して、in vivoでの活性を調べた。その結果、3種類のDNAフラグメントがin vivoでも心筋細胞でプロモーター活性を示した。中でも特に上流5,2kb6,4kbのフラグメントはcardiac crescentからstraight heart tubeの時期に心筋細胞に強い活性を認めた。この部位のDNA配列を調べたところ、tandemに並ぶSmad結合部位を認め、その部分を取り除くと、in vitroでのレポーター活性は有意に低下した。これはBMPなどのSmadを介するシグナルがNkx2.5の初期発現に必須であり、心筋細胞系列の決定機構に関与していることを示唆する結果であった。これをin vivoの系で確認することを現在実施中である。さらに、Smad結合部位以外に強い活性を示す部位が1箇所あり、DNA配列を調べたところ、既知のコンセンサス配列が含まれていなかったので、いくつかのベイトを作製し、心筋細胞系列決定に関わる新規分子同定に向けて、yeast one-hybrid法にて未知の結合蛋白を検索中である。本研究は心臓特異的転写因子Nkx2.5のプロモーター領域を同定することにより、Nkx2.5の上流にあると考えられている心筋細胞系列を決定する因子を単離することを目的としている。そこでこれら6種類のレポーターコンストラクトでトランスジェニックマウスを作製し、in vivoでの活性を調べた。6種類のうち、1種類は心臓以外での発現を認め、3種類はあまり活性がなくin vitroでの結果を反映しなかったが、2種類ではin vivoでも心筋に明らかな活性を認めた。現在、この2つのラインで、発生の各段階でのレポーター遺伝子の発現を調べているところである。今後、再びin vitroの系で、これら2種類のコンストラクトにいろいろな変異を導入してレポーター活性の変化を調べ、重要な領域を同定する。その変異によってin vivoでも活性が失われるかトランスジェニックマウスを用いて調べたのち、その部位が既知のコンセンサス配列であれば、その部位にコンセンサス配列に対応する転写因子が本当に結合するかEMSA法などを用いて検討する。その部位が未知の配列であれば、その配列をベイトとしたyeast one-hybrid法にて未知の転写因子を見つけていく方針である。まず、我々はNkx2.5の上流60kbのゲノムDNAをBACライブラリーより分離し、約70種類のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。

これらのレポーター活性をラット培養心筋細胞を用いて調べ、活性が有意に高い領域を6箇所同定した。この6種類のDNAフラグメントをLacZレポーターコンストラクトに組み込み、トランスジェニックマウスを作製して、in vivoでの活性を調べた。その結果、3種類のDNAフラグメントがin vivoでも心筋細胞でプロモーター活性を示した。中でも特に上流5,2kb6,4kbのフラグメントはcardiac crescentからstraight heart tubeの時期に心筋細胞に強い活性を認めた。この部位のDNA配列を調べたところ、tandemに並ぶSmad結合部位を認め、その部分を取り除くと、in vitroでのレポーター活性は有意に低下した。これはBMPなどのSmadを介するシグナルがNkx2.5の初期発現に必須であり、心筋細胞系列の決定機構に関与していることを示唆する結果であった。現在、Smad結合部位を取り除いたコンストラクトでトランスジェニックマウスを作製し、in vivoにおいても活性が低下または消失することを確認中である。さらに、このフラグメント(上流5,2kb6.4kb)に種々のdeletionを入れて、詳細にレポーター活性をin vitroの系で調べたところ、Smad結合部位以外に強い活性を示す部位が1箇所あり、DNA配列を調べたところ、既知のコンセンサス配列が含まれいなかったので、現在、in vivoの系でこのレポーター活性を確認するとともに、いくつかのベイトを作製し、心筋細胞系列決定に関わる新規分子同定に向けて、yeast one-hybrid法にて未知の結合蛋白を検索中である。
オブジェクト指向開発におけるプロジェクト管理のための支援環境

本研究では,オブジェクト指向に基づくソフトウェア開発における,プロジェクト管理のための支援環境の設計と構築を目的としている.支援環境の機能としては,1.計画支援:開発すべきソフトウェアの機能量(例えば,ファンクションポイント)の計測やそれに基づく開発工数や開発期間の見積もりを行う.2.進捗管理支援:開発プロセスから収集されたプロセス/プロダクトに関するデータに基づいて,品質,コストも含めた進捗状況の把握を行う.3.開発支援:様々なメトリクス計測ツールによる支援(集中的にレビューを行うべき複雑な部分の指摘,変更のための改善案の提示等)あるいは,エラーデータ収集分析ツールを用いたエラーに関する分析結果の開発者へのフィードバック支援を行う.計画支援に関しては,UML設計仕様書からのファンクションポイント計測について実施した.提案手法により,専門家が手作業で数えたファンクションポイント値と近い値を算出できることを確認した.進捗管理支援については,複雑度メトリクスを用いて,プログラム中のモジュールに対するエラー発生予測手法について検討した.計測ドメイン毎に,エラー発生の予測式を構築することで,予測制度が向上した.最後に,開発支援については,地方自治体向けソフトウェアに対するアプリケーションフレームワーク導入を目的として,フレームワーク導入における効果を定量的に評価した.結果として,フレームワーク導入により開発工数の削減が可能であることを確認した.実施した内容を統合することで,一つのオブジェクト指向開発プロジェクトのための支援環境の構築が可能になると考えられる.本研究では、オブジェクト指向に基づくソフトウェア開発における、プロジェクト管理のための支援環境の設計と構築を目的としている。支援環境の機能としては、(1)計画支援:開発すべきソフトウェアの機能量(例えば、ファンクションポイント)の計測やそれに基づく開発工数や開発期間の見積もりを行う。(2)進捗管理支援:開発プロセスから収集されたプロセス/プロダクトに関するデータに基づいて、品質、コストも含めた進捗状況の把握を行う。(3)開発支援:様々なメトリクス計測ツールによる支援(集中的にレビューを行うべき複雑な部分の指摘、変更のための改善案の提示等)あるいはエラーデータ収集分析ツールを用いたエラーに関する分析結果の開発者へのフィードバック支援を行う。本年度は、主に、計画支援と開発支援に関する研究を行った。先ず、計画支援に関しては、近年活発に用いられつつあるJavaプログラムからのファンクションポイント計測についての研究を行った。ファンクションポイントを用いた見積りにおいては、過去に開発されたプログラムからのファンクションポイント値の計測が必要であり、そのための自動化を行った。開発支援に関してはC++プログラムを対象としてChidamberらのメトリクスの一つであるクラスの内部複雑さを評価するためのメトリクスの詳細化を行った。詳細化によって、よりクラスの内部複雑度を正確に評価でき、より重点的にテストやレビューを行うクラスの特定が可能となった。本研究では,オブジェクト指向に基づくソフトウェア開発における,プロジェクト管理のための支援環境の設計と構築を目的としている.支援環境の機能としては,1.計画支援:開発すべきソフトウェアの機能量(例えば,ファンクションポイント)の計測やそれに基づく開発工数や開発期間の見積もりを行う.2.進捗管理支援:開発プロセスから収集されたプロセス/プロダクトに関するデータに基づいて,品質,コストも含めた進捗状況の把握を行う.3.開発支援:様々なメトリクス計測ツールによる支援(集中的にレビューを行うべき複雑な部分の指摘,変更のための改善案の提示等)あるいは,エラーデータ収集分析ツールを用いたエラーに関する分析結果の開発者へのフィードバック支援を行う.計画支援に関しては,UML設計仕様書からのファンクションポイント計測について実施した.提案手法により,専門家が手作業で数えたファンクションポイント値と近い値を算出できることを確認した.進捗管理支援については,複雑度メトリクスを用いて,プログラム中のモジュールに対するエラー発生予測手法について検討した.計測ドメイン毎に,エラー発生の予測式を構築することで,予測制度が向上した.最後に,開発支援については,地方自治体向けソフトウェアに対するアプリケーションフレームワーク導入を目的として,フレームワーク導入における効果を定量的に評価した.結果として,フレームワーク導入により開発工数の削減が可能であることを確認した.実施した内容を統合することで,一つのオブジェクト指向開発プロジェクトのための支援環境の構築が可能になると考えられる.
骨格筋が分泌する自然免疫分子による筋萎縮抑制効果の解明と食品成分による制御

骨格筋の分化・融合が正常に行われることは、発生時に重要であることに加え、筋障害時における骨格筋の再生や運動時の筋増強にも関与する。筋分化の過程において、自然免疫系分子の関与が予想されているが、その全貌は明らかではない。そこで本研究では、自然免疫系の分泌分子が骨格筋に及ぼす影響に着目し、これを明らかにすることを目的とした。これまでに分泌分子が骨格筋より分泌され、分化時の筋細胞の表面に結合することを確認しており、筋分化に何らかの形で関与する可能性は十分に考えられるため、今後は更なる詳細な解析、機能解明を目指す。
筋小胞体Ca^<2+>-ATPase蛋白のドメイン間相互作用

カエル骨格筋より分離した筋小胞体へのリガンド(Ca^<2+>及び非分離性ATPアナログβ, γ-メチレンアデノシン3リン酸AMPOPCP)の結合を解析したところ両リガンドの結合は独立ではなく,相互作用があることが判った.即ちCa^<2+>不在下でのAMPOPCP結合は均質な独立の結合部位に結合することで説明されるのに対し, Ca^<2+>が存在するとAMPOPCP結合の親和性が増加し,しかも, negative cooperativityを示す. Ca結合も同様にAMPOPCPの共存により影響を受ける.これらの現象は筋小胞体のCa^<2+>-ATPase反応の根幹に係わるものであり,上記所見にもとづけば,今迄の疑問点が氷解する.同一分子内のドメイン間の相互作用により活性が調節されていることが示唆されるので,トリプシンで限定分解することにより相互作用がどのように変化するかを調べて,ドメイン間相互作用による全体の機能調節機序を明らかにしようと試みた.しかし筋小胞体膜をトリプシン分解した場合, ATPase蛋白フラグメントと膜小胞の低分子量の成分との識別が困難であり,表面活性剤を用いて精製したCa^<2+>-ATPase蛋白でのドメイン間相互作用は未処理小胞のものとは異るなど多くの困難に遭遇した.一方,家兎骨格筋筋小胞体とカエル骨格筋筋小胞体の性質の差異を比較検討していくうちに後者はE・Ca・ATPであるのに対し,前者はそのほかにE・Ca_2・ATPが存在し,このものがEP・Ca_2に転換されるという考えが多く信じられている.しかしATP分解量に対するCa量の量比は1-2と異った値が報告されている.E・Ca・ATPでもEP・Caに転換されうるのではないかと考え,実験条件(ATPの濃度,そのほかの様々の基質,温度など)を変えて量比を測定した.低ATP濃度,カルバミルりん酸では量比が2であるが,高ATP濃度,低温などでは1となることを示した.これはドメイン間相互作用による機能調節機序のもう一つの面である.カエル骨格筋より分離した筋小胞体へのリガンド(Ca^<2+>及び非分離性ATPアナログβ, γ-メチレンアデノシン3リン酸AMPOPCP)の結合を解析したところ両リガンドの結合は独立ではなく,相互作用があることが判った.即ちCa^<2+>不在下でのAMPOPCP結合は均質な独立の結合部位に結合することで説明されるのに対し, Ca^<2+>が存在するとAMPOPCP結合の親和性が増加し,しかも, negative cooperativityを示す. Ca結合も同様にAMPOPCPの共存により影響を受ける.これらの現象は筋小胞体のCa^<2+>-ATPase反応の根幹に係わるものであり,上記所見にもとづけば,今迄の疑問点が氷解する.同一分子内のドメイン間の相互作用により活性が調節されていることが示唆されるので,トリプシンで限定分解することにより相互作用がどのように変化するかを調べて,ドメイン間相互作用による全体の機能調節機序を明らかにしようと試みた.しかし筋小胞体膜をトリプシン分解した場合, ATPase蛋白フラグメントと膜小胞の低分子量の成分との識別が困難であり,表面活性剤を用いて精製したCa^<2+>-ATPase蛋白でのドメイン間相互作用は未処理小胞のものとは異るなど多くの困難に遭遇した.一方,家兎骨格筋筋小胞体とカエル骨格筋筋小胞体の性質の差異を比較検討していくうちに後者はE・Ca・ATPであるのに対し,前者はそのほかにE・Ca_2・ATPが存在し,このものがEP・Ca_2に転換されるという考えが多く信じられている.しかしATP分解量に対するCa量の量比は1-2と異った値が報告されている.E・Ca・ATPでもEP・Caに転換されうるのではないかと考え,実験条件(ATPの濃度,そのほかの様々の基質,温度など)を変えて量比を測定した.低ATP濃度,カルバミルりん酸では量比が2であるが,高ATP濃度,低温などでは1となることを示した.これはドメイン間相互作用による機能調節機序のもう一つの面である.
近代イギリスにおける動物福祉の歴史的生成－実践・制度・理念の総合的研究

本研究は、近代イギリスの動物福祉に関する報告者のこれまでの研究成果に立脚し、動物福祉の歴史的変容を総合的に捉える視座の構築を目指すものである。そのために、新たな史料群の発見・分析を通じて、動物福祉の実践、理念、制度という3つの視角からこの研究課題にアプローチする。3年目(最終年度)にあたる2018年度は、補完的な史資料調査を行いつつ、本研究の総括を進めた。その過程で、本研究のテーマであるイギリスの動物福祉、およびサブテーマのひとつであるロンドン動物園についての講演の機会を得たため、本研究の成果を社会に還元するためのアウトリーチ活動にも取り組むことができた。さらに、ドイツの学術出版社De Gruyterより刊行予定のHandbook for Historical AnimalStudiesに「動物園の歴史」についての章を寄稿する依頼をうけて、リサーチ対象を拡大したため、イギリス以外の地域にも視野を広げることができた。それにより、ヨーロッパ内外との比較の視点からイギリスの動物福祉の特性について歴史的理解を深めることができた。前年度から取り組んできたヨーロッパとの比較の視点から日本の動物園史に取り組んだ論文、Flying Penguins in Japan's Northernmost Zooに関しては、編者の指摘を受けて推敲を進め、年度内に校了となった。2019年5月に刊行予定である。以上のように、本年度は研究成果のとりまとめ、アウトリーチ、および派生的展開の追求について大きな進展があった。研究プロジェクト終了後に執筆予定の単著に向けて、十分な準備ができたと考える。本研究は、近代イギリスの動物福祉に関する報告者のこれまでの研究成果を基盤とし、その歴史的変容を総合的に捉える視座を構築することを目的とする。新たな史料群の発見・分析を通じて、動物福祉の実践、理念、制度という3つの視角からこの研究課題にアプローチする。初年度にあたる2016年度は、19世紀イギリスの動物福祉に関する構造的変化を、歴史的アクターの視点から捉え直すという試みを中心に、研究を進めた。具体的には、進化論者チャールズ・ダーウィンによる『人間と動物の感情表現』(1872年)に着目し、感情を科学的に解明するにあたり、それが当時の人々の動物観にあたえた影響と、とりわけ動物実験の是非をめぐる動物生体解剖論争との関係において、明らかにしようと試みた。その成果の一部を、「観察ーダーウィンとゾウの涙」(伊東剛史、後藤はる美編『痛みと感情のイギリス史』所収)として発表した。また、派生的な研究成果として次の2点がもたらされた。ひとつは、動物学の制度化と専門分科に関するものである。これは自然、動物、生命を理解するにあたり科学の影響力が増大したヴィクトリア期イギリス社会を総体的に考察するうえで、重要となる研究テーマである。これに関して、化学史学会において研究報告を行った。ふたつめの派生的な成果は、イギリスとの比較の観点から日本における動物観の歴史的変容を考えるものである。これに関しては、カナダで開催された国際ワークショップ、およびアメリカで開催されたアメリカ歴史学協会年次大会において、旭山動物園を題材とし英語圏の動物園史との比較の観点から研究報告を行った。今後、その成果をまとめ、国際共著論集に寄稿する予定である。初年度の目的は、科学者チャールズ・ダーウィンの視点から、19世紀イギリスにおける動物福祉の構造的変化を捉えるというものだったが、それがひとつの研究成果としてかたちになり、充実した初年度になったと考えている。本研究計画は、初年度にフォーカスした19世紀後半から世紀末までを中心とし、その前後を含めて1世紀余を対象としている。そのなかでの動物をめぐる制度と理念、あるいは動物福祉の実態の長期的変容を考察するうえで、ひとつの観測点を築くことができた。2年度以降の研究を展開させるうえで一助となるだろう。2年目にあたる2017年度は、当初の計画どおり研究を進めるとともに、前年に得られた成果に対する諸方面からのフィードバックを活かし、本研究プロジェクトの広がりと意義を確認した。具体的には、昨年度末に公刊した共編著『痛みと感情のイギリス史』の3回の合評会を通じ、今後の研究の方向性について重要な示唆が得られた。そのひとつは、イギリスの動物福祉の歴史の大きな転換点となる、1876年の動物虐待防止法(動物実験規制法)の成立過程およびその社会的影響を、関係者の書簡等の新史料から再検討したものである。研究全体の成果は、本プロジェクト終了後に公刊予定の学術書(単著)として発表する予定であり、今年度は全体の構想を練り、一部原稿の執筆を開始した。以上が今年度の主要な研究成果である。関連する派生的な成果としては、19世紀イギリスにおける動物学会の発展と動物学の制度化との関連を議論した1論文「19世紀のロンドン動物学会からみた動物学の制度化」、2生命科学以外の自然科学の制度化をグローバル視点から考察する試論「犬吠埼灯台から考える「科学のリロケーション」」、および3現代日本の「人と動物の関係史」を旭山動物園を事例に、英米との比較の視点から議論した3'Flying Penguins in Japan's Northernmost Zoo'が得られた。

昨年度末に発表した研究成果に対して諸方面から大きなフィードバックが得られ、それをもとに、本プロジェクトの主要研究課題とその周辺課題の双方において、史資料調査を進め成果を得ることができた。動物福祉の歴史的変容を考察する際に重要な、1諸科学分野の制度化と、2動物園という同時代人の動物観に大きな影響を及ぼす制度/施設について、それらをイギリス史の文脈においてだけでなく、比較史やグローバル史の視点から検討することができたことは有意義だった。本プロジェクト最終年度の2018年度において、研究をさらに発展させる基盤を築くことができた。本研究は、近代イギリスの動物福祉に関する報告者のこれまでの研究成果に立脚し、動物福祉の歴史的変容を総合的に捉える視座の構築を目指すものである。そのために、新たな史料群の発見・分析を通じて、動物福祉の実践、理念、制度という3つの視角からこの研究課題にアプローチする。3年目(最終年度)にあたる2018年度は、補完的な史資料調査を行いつつ、本研究の総括を進めた。その過程で、本研究のテーマであるイギリスの動物福祉、およびサブテーマのひとつであるロンドン動物園についての講演の機会を得たため、本研究の成果を社会に還元するためのアウトリーチ活動にも取り組むことができた。さらに、ドイツの学術出版社De Gruyterより刊行予定のHandbook for Historical AnimalStudiesに「動物園の歴史」についての章を寄稿する依頼をうけて、リサーチ対象を拡大したため、イギリス以外の地域にも視野を広げることができた。それにより、ヨーロッパ内外との比較の視点からイギリスの動物福祉の特性について歴史的理解を深めることができた。前年度から取り組んできたヨーロッパとの比較の視点から日本の動物園史に取り組んだ論文、Flying Penguins in Japan's Northernmost Zooに関しては、編者の指摘を受けて推敲を進め、年度内に校了となった。2019年5月に刊行予定である。以上のように、本年度は研究成果のとりまとめ、アウトリーチ、および派生的展開の追求について大きな進展があった。研究プロジェクト終了後に執筆予定の単著に向けて、十分な準備ができたと考える。2年度目は、19世紀末から20世紀初頭の動物福祉に関する制度的変化と、その背景にある政治的、経済的要因、あるいはより広範な一般の人々の動物に対する理解や態度の変容を考察する。この時期は、初年度が対象とした19世紀後半から世紀末と比較して、研究が手薄い領域であり、史料上の新たな発見を目指すとともに、本研究課題が目的とする長期的変容を見据える総合的な視座の構築に寄与する、この時期の特徴を見極め、人と動物の関係史におけるその意義づけを行いたい。最終年度の2018年度は、19世紀から20世紀初頭のイギリスの動物福祉の変化を包括的に捉え、とりわけ、動物福祉の理念、実践、制度の相互関係に着目し、その相互関係の歴史的変容を解明することを目指す。当初の予測より消耗品(トナーなど)使用が少なかったため、11728円が次年度使用額となった。
平滑筋細胞膜内表面結合Caによる収縮調節機構の凍結切片-元素分析法による解析

平滑筋の形質膜内表面結合Caによる収縮調節機構を明らかにするために凍結切片-元素分析法によりムラサキイガイ前足糸牽引筋(ABRM)の細胞内Ca動態を観察した。静止時に凍結された縦断凍結切片の筋形質膜内表面と細胞中央の筋形質部とを点分析した結果、検出されたCa量は筋形質膜内表面では7.58mmol/kg dry wtであり、一方、筋形質部では1.56mmol/kg dry wtであった。外液のCaは凍結時除去されているので形質膜内表面の点分析によって検出されたCaは内表面に結合したCaによるものと考えられ、この結果は、より生体に近い状態での形質膜内表面Ca局在を明示するものと考えられる。形質膜内表面にそって連続的に点分析した時、必ずしもすべての分析点から有意な量のCaが検出されたわけではないが、この結果は、多分、形質膜に局在するCa結合タンパクの分布状態を反映したものと考えられる。この問題を明らかにするために、さらにCa結合タンパクと形質膜の微細構造を観察した。低角度回転蒸着レプリカの電顕観察はCa結合タンパクが長径22.1mm、短径17.5mmのずんぐりした楕円体であることを示した。一方、フリーズフラクチャーおよびエッチングレプリカの電顕観察により種々のサイズの形質膜粒状構造が確認されたが、それらの粒状構造のうち形質膜内表面でその一部を筋形質内に突出しているものが認められ、これらはCa結合タンパクである可能性が高いと考えられた。Caは、静止時に、おそらくCa結合タンパクの膜表面から突出した部分に結合しており、収縮時には結合タンパクが膜の電位変化に影響されそこから遊離されると考えられる。このことは収縮時のCa動態を詳細に検討する今後の研究によって明らかにしたい。平成7年度の目標は、平滑筋の収縮調節機構解明のため、イガイ前足糸牽引筋(ABRM)を用いて筋収縮をひきおこすactivator Caが形質膜内表面に局在することと筋収縮にともなう細胞内Ca分布変化を凍結切片-元素分析法により明らかにすることであった。Ca-free溶液中の静止状態で急速凍結されたABRMの凍結切片を-130°Cに冷却しながら電顕下で観察し、形質膜内表面、その近傍の筋形質部、細胞外に収束ビームをあてて、X線マイクロアナリシス(点分析)を行なった。細胞外分析で得られたX線スペクトルをバックグランドとして処理し、形質膜内表面と筋形質部から得られたX線スペクトルの3690eVのCa-Kαピーク強度をもとに定量計算されたCa量はそれぞれ2.35および0.42mmol/kg dry wtであった。この結果は、細胞化学法により示唆されていた形質膜内表面にCaが局することを生きている細胞に近い状態で直接的に示すものである。形質膜内表面に沿って連続的に点分析を行なうことにより二次元的な形質膜内表面Ca分布も確認された。この二次元的なCa分布をより直接的に示す方法としてエネルギーロス分光分析によるイメージマッピング法があり、ピロアンチモン酸法で固定したABRMの樹脂包埋切片で形質膜内表面Ca局在を示唆するイメージマップが得らた。しかし、エネルギーロス分光分析に必要とされる厚さ30nm程度の超々薄凍結切片の作製は容易でない。そこで、本年度設備備品で購入し部分的に改良したイオンコーターで通常の厚さ(70100nm)に薄切した切片をイオンエッチングで薄くする方法を開発し、樹脂包埋切片ではエッチングの時間に比例した切片切削が可能になった。