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エイズと1980年代アメリカ演劇の研究

本研究の目的は、エイズ(後天性免疫不全症候群)という病が、1980年代以降のアメリカ演劇とどのようにかかわったのかを、3年間にわたる研究によって、明らかにすることにあった。最終年度に当たる平成10年度は、主として基礎資料の収集を継続して行なった。当該研究者は、平成10年8月まで、昨年度から引き続き、ニューヨーク大学大学院パフォーマンス研究科に客員研究員として滞在し、その期間、アメリカ現代演劇の代表的研究者である同大学院リチャード・シェクナー教授の指導の元、現地で収集可能な資料について、積極的な収集を行なった。その結果、出版されているエイズ及び1980年代以降のアメリカ演劇関係の書物のほか、インターネット等を利用しての雑誌・新聞記事、さらに、実際に80年代以降活躍している演劇人・演劇集団にまつわる資料(ビデオ・プログラム等)については、かなり満足できる量の資料を収集することができた。また、ニューヨーク市立図書館の舞台芸術分館及びニューヨーク大学大学院パフォーマンス研究科図書館において、資料収集およびビデオの視聴を行なうことができ、また、シェクナー教授に研究の成果についてのレヴューを受けることもできた。ほかにも、隣接分野の研究者と意見交換をおこなう場をもつ機会もあり、当該研究課題の持つ重要性を再認識するともに、演劇史関係の資料にとどまらず、より広い文化史的な視野から見て重要な資料を収集する必要性を痛感するにいたった。帰国後は、そうした視野からの資料収集を継続して進め、学会発表などのかたちで、当該研究の成果を積極的に発表した。本研究の目的は、エイズ(後天性免疫不全症候群)という病が、1980年代以降のアメリカ演劇とどのようにかかわったのかを、3年間にわたる研究によって、明らかにすることにある。初年度の平成8年度は、主として基礎資料の収集を行なった。その際、アメリカ現代演劇の代表的研究者であるニューヨーク大学のリチャード・シェクナ-教授と連絡を取り合い、資料収集の方法その他について随時指導をしていただいた。その結果、出版されているエイズ及び1980年代以降のアメリカ演劇関係の書物のほか、インターネット等を利用しての雑誌・新聞記事、さらに、実際に80年代以降活躍している演劇人・演劇集団にまつわる資料(ビデオ・プログラム等)を、まだ満足できる量とは言えないものの、相当収集することができた。また、当該研究年度内に、実際にニューヨークに滞在する機会を得たので、ニューヨーク市立図書館の舞台芸術分館及びニューヨーク大学大学院パフォーマンス研究科図書館において、資料収集およびビデオの視聴を行なうことができた。さらに、年度末には、再度ニューヨークに行き、シェクナ-教授に研究の成果についてレヴュ-を受ける予定である。現在、集まった資料の整理を行なっている段階であるが、次年度も引き続き、さらなる資料収集を行なうほか、今年度収集した資料に基づき、具体的な研究を効率的に進行させていく予定である。当該年度中、エイズと直接かかわる主題とは言えないが、80年代に先立つ「イメージの演劇」についての論考を雑誌「ユリイカ」に、また、ニューヨーク滞在中に集めた資料により、また別の論考を雑誌「テアトロ」に発表した。本研究の目的は,エイズ(後天性免疫不全症候群)という病が,1980年代以降のアメリカ演劇とどのようにかかわったのかを,3年間にわたる研究によって,明らかにすることにある。2年目に当たる平成9年度は,主として基礎資料の収集を継続して行なった。その際,アメリカ現代演劇の代表的研究者であるニューヨーク大学のリチャード・シェクナ-教授と連絡を取り合い,資料収集の方法その他について随時指導をしていただいた。その結果,出版されているエイズ及び1980年代以降のアメリカ演劇関係の書物のほか,インターネット等を利用しての雑誌・新聞記事,さらに,実際に80年代以降活躍している演劇人・演劇集団にまつわる資料(ビデオ・プログラム等)については,かなり満足できる量の資料を収集することができた。また,シェクナ-教授に研究の成果についてレビューを受けることもできた。ほかにも,隣接分野の研究者と意見交換を行う場を持つことができ,当該研究課題の持つ重要性を再認識するとともに,演劇史関係の資料にとどまらず,より広い文化史的な視野から見て重要な資料を収集する必要性を痛感するにいたった。現在,集まった資料の整理を行っているが,次の年度も引き続き,さらなる資料収集を行うほか,今年度収集した,資料に基づき,より具体的な研究を効率的に進行させていく予定である。

ほかにも、隣接分野の研究者と意見交換をおこなう場をもつ機会もあり、当該研究課題の持つ重要性を再認識するともに、演劇史関係の資料にとどまらず、より広い文化史的な視野から見て重要な資料を収集する必要性を痛感するにいたった。帰国後は、そうした視野からの資料収集を継続して進め、学会発表などのかたちで、当該研究の成果を積極的に発表した。
アデニンの新規作用としての中枢神経細胞死抑制効果

グリア細胞や神経細胞などが正常に機能するには、ADP・アデノシンなどのプリン塩基が重要な役割を果たしており、それらの多くが受容体を介している事が明らかになっている。当研究室では、高濃度アデニンの存在下でラット胎児小脳を初代培養すると、プルキンエ細胞の細胞死が抑制される事が明らかになった。そこで、初代培養系におけるプルキンエ細胞の細胞死にミクログリア細胞が関与しているか調べる為に、ミクログリア細胞の貪食阻害剤を加えプルキンエ細胞の細胞死への影響を調べた。その結果、初代培養系においてミクログリア細胞がプルキンエ細胞を貪食している事が明らかになった。また、初代培養系から単離したミクログリア細胞やマクロファージに分化させたU937細胞を各種塩基の存在下で培養する事により、アデニン特異的に細胞死を誘導している事も明らかになった。以上の結果から、アデニン添加によりミクログリア細胞の細胞死が誘導される事により、間接的にプルキンエ細胞の細胞死が抑制されるという仮説が成り立つ事が強く示唆された。続いて、アデニン誘導細胞死の詳細メカニズムを解析するために、アデニン添加による細胞周期の分布の変化を調べたところ、アデニンを添加する事によりS期の進行が遅延する事がわかった。今後の最重要課題は、このアデニン特異的結合タンパク質がアデニンによる神経細胞死の抑制機構に関わっていることを明らかにすることである。以上のように、アデニンによるプルキンエ細胞死の抑制機構を明らかにすることは、中枢神経系におけるプリン誘導体の新たな作用、およびその機構の解明につながることが期待され、神経細胞の細胞死抑制機構についてさらなる理解が得られる糸口がつかめるものと確信する。我々のグループは、ラット小脳初代培養系を用いて種々のプリン化合物の神経細胞死に及ぼす影響を解析し、新たにアデニンが小脳プルキンエ細胞の細胞死を抑制する効果を有することを見出した(j.Neurosci.Res., 74, 754-759, 2003)。本研究の当該年度では、このアデニンの新規作用の分子機構の解明を目指し、アデニンの神経細胞死抑制効果を担う可能性を有する一連の受容体の単離を試みた。イオンチャネル型受容体であるP2X受容体を除き、これ迄に発見されたプリン受容体は皆Gタンパク質共役型受容体(GPCR)であることから、アデニンの神経細胞死抑制効果を担う受容体もGPCRである可能性が想定される。そこで、神経細胞で発現している既知のプリン受容体GPCRで保存性の高い膜貫通領域の遺伝子配列を基にしてdegenerateプライマーを設計し、ラット小脳初代培養系においてアデニンの有無で発現に差異のあるGPCR遺伝子を同定することを目指した。その結果、作成したプリン受容性GPCR特異的degenerateプライマーは、クローニングした既知のラット由来プリン受容体遺伝子5種の全てをPCR増幅することができ、その実効性が示された。この特異的プライマーをラット小脳初代培養からのmRNAに用いた結果、推定増幅サイズの500bp付近に多くの増福DNAが検出されたが、増幅産物量の過多ゆえにアデニンの有無で発現に差異のあるバンドを目視で確認することはできなかった。今後は、発現に差異のあるdegenerate PCR産物を同定するため、TAクローニング法による増幅産物のDNA配列決定、あるいはサブトラクションPCR法を用いた発現差のある遺伝子の検出法などを駆使し、有意差遺伝子の同定作業を進める予定である。我々のグループは、ラット小脳初代培養系を用いて種々のプリン化合物の神経細胞死に及ぼす影響を解析し、新たにアデニンが小脳プルキンエ細胞の細胞死を抑制する効果を有することを見出した(J. Neurosci. Res., 74,754-759,2003)。

昨年度は、このアデニンの新規作用の分子機構の解明を目指し、アデニンの神経細胞死抑制効果を担う可能性を有する一連の受容体の単離を試みた。具体的には、degenerate PCRによるラット小脳初代培養系においてアデニンの有無で発現に差異のあるGタンパク質共役型受容体遺伝子を同定することを目指したが、発現に有意差のある遺伝子は認められなかった。そこで本研年度は、作業仮説を転換し、小脳プルキンエ細胞に細胞傷害性を及ぼす可能性のある細胞群に対するアデニン効果の検討を行った。候補細胞群としては、神経組織に由来するミクログリア細胞、血液に由来するマクロファージが考えられた。検証実験では、ラット脳から単離したミクログリア、単芽球性リンパ腫U937細胞から分化させたマクロファージ様細胞を始め、種々の培養細胞を用いて検討した。その結果、これらの細胞に対し、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルの4塩基中では、アデニンのみが強い細胞死誘導活性を有することが判明した。また、この細胞死は典型的なアポトーシスとは異なり、カスパーゼ非依存性の細胞死であることも明らかとなった。さらに、アデニンの保護作用が貪食細胞群の排除にあることの裏付けとして貪食阻害剤の小脳初代培養系への効果も検討し、アデニンと同様に小脳プルキンエ細胞の選択的生存効果が認められた。これらの結果は、初代培養系におけるプルキンエ細胞の選択的培養にアデニンが有効であることを示しているだけでなく、損傷を受けた神経組織の保護に貪食細胞による食作用の阻止が有用となる可能性を示している。
コメニウスにおけるPansophiaの理念に関する総合的研究

チェコ、ドイツ、ポーランドなどヨーロッパ各地の図書館で文献調査を行い、『世界図絵』の異版本や『開かれた言語の扉の苗床』1773年版、『前庭』1658年版、『広間』1661年版等を閲覧した。以上の現地調査及び研究者との交流、文献の分析を通して得られた知見を『コメニウス「世界図絵」の異版本』としてまとめ、2016年12月に追手門学院大学出版会から刊行した。『世界図絵』については、従来未解明の課題が幾つも残されてきたが、本書ではその中で特に次の課題について考察した。たとえば、1多言語版の意図と活用の方法、2チェコ語版の出版が遅れた理由、3短縮版が特にウィーンで多く出版された理由などである。2014年度の研究実績の概要は、以下の通りである。1学会誌に論文を発表した。教育史学会紀要『日本の教育史学』第57集に収録されている「大学における教養教育とコメニウスにおけるPansophiaの理念」で、科研費の研究課題と密接に関連する内容である。すなわち、日本の大学における教養教育のあり方について考察するために、教養の教育についての歴史的系譜をたどり、とりわけコメニウスのPansophiaの理念に焦点をあてて論じた。2学会の編集する刊行物に論文を執筆した。それは日本教育方法学会編『教育方法学ハンドブック』の「第III部第1章第2節外国における教育方法の思想史」である。その中で戦後日本の教育方法学研究における外国の教育方法思想史のレビューを行い、コメニウス、ペスタロッチ、ヘルバルト、デューイらの研究が重要な位置を占めてきたことを明らかにした。3国際学会で発表した。すなわち、2014年6月下旬にロンドン大学で開催された第36回国際教育史学会の大会での「コメニウスの教科書における戦争と平和」と題する発表である。国際平和の構想を提起し、その実現のために活動したコメニウスの教科書の中に意外にも「戦争」に関する詳しい説明が見られることについて考察したものである。4この他に所属大学の年報においても、コメニウスのPansophiaの理念に連なる博物館の展示についての考察や、日本の教育における平和教育と関連する道徳教育のあり方を問う論文を発表した。今年度も、海外への発信を引き続き重視した。2015年6月上旬にサンクトペテルブルグで行われたコメニウス研究国際学会に参加し、ロシア、ポーランド、ドイツ、チェコなどの研究者と研究討議を行った。9月上旬にはブダペストで開催された世界教育学会の大会に参加した。サンクトペテルブルグの参加者は約50人、ブダペストには約3000人が集まった。どちらも初めて参加したが、全体の参加人数にかかわりなく、分科会の参加者はそれぞれの主題の専門的研究者であり、大変有意義であった。また、国内の学会では8月にお茶の水女子大学で開催された日本教育学会のラウンドテーブル「コメニウス教育学の再評価ー『パンパイデイア』から学ぶ」の企画と司会をつとめた。さらに10月に岩手大学で開催された日本教育方法学会の課題研究「戦後戦後70年と平和教育ー戦後教育実践と教育方法学(1)」のコーディネーターとして、提案者の人選、提案内容の調整等を行い、大会当日には司会をつとめた。11月には京都産業大学むすびわざ館で行われた総合人間学会第7回関西談話会において「生涯にわたる教育の構想ーコメニウス『パンパイデイア』の翻訳出版によせて」というテーマで発表した。そしてこの発表原稿に加筆をして、「コメニウスの『パンパイデイア』における老年期の課題について」を『追手門学院大学教職課程年報』第24号に投稿し、掲載された。大学の紀要類に原稿を執筆した他、関西チェコ/スロバキア協会発行の『ブルタバ』107号に、「ヨーロッパにおけるコメニウスの足跡」と題する一文を寄稿した。以上のようにコメニウスの晩年の大作である『パンパイデイア』を重点にして研究をすすめた。『パンパイデイア』についての研究は、順調に進んでいるが、「パンソフィア」については、まだまだこれからである。これまでに引き続き、コメニウス(J.A.Comenius,15921670)のPansophia(汎知)の理念の内容を解明することを目的として研究を行った。そして、継続して取り組んできたコメニウスの『世界図絵』異版本の研究をまとめ、追手門学院大学出版会の助成を得て刊行した。『世界図絵』は、従来「世界最初の挿絵入り教科書」として知られてきたが、そればかりではなく、実は「世界最初のさわって動かせることのできる教材」でもあることを本書において明らかにした。このことについては2017年5月31日に放映のNHKテレビ番組「探検バクモン」でも模型を使用して一般の視聴者にもわかりやすく解説をしている。また、本書をまとめる過程でコメニウス研究の成果を確認しておく必要を感じたので、それを「コメニウス研究50年の到達点と今後の課題」としてまとめ、『追手門学院大学教職課程年報』に掲載した。そしてチェコにおけるコメニウスゆかりの土地を訪ねる活動について「チェコのコメニウス教育博物館」として整理し、『Musa博物館学芸員課程年報』に収録した。さらに、コメニウスのPansophiaの理念の研究とかかわって「教養教育」についての考察を行い、「教師教育と教養教育」としてまとめた。これは、日本教師教育学会編『教師教育研究ハンドブック』(学文社)に収録され、2017年9月に刊行される。

以上の他には「いじめ問題とどう向き合ってきたか」について日本教育方法学会紀要『教育方法学研究』に執筆した他、関西チェコ/スロバキア協会主催の会合で「コメニウスと歩くチェコとスロヴァキア」と題して講演した。年度当初は、ロシアおよびチェコで行われる国際学会に参加する予定であったが、いずれも授業期間中の開催であったので、出席を控えた。それに代えてチェコとポーランドに出張し、研究者と面談したり、文献調査を行ったりした。また、コメニウスにゆかりのある場所の中で、これまで訪ねることのできていなかった土地を訪問し、当時の状況を推察した。とりわけ有益であったのは、ポーランドのレシュノにおける調査である。今回の調査では、コメニウスが当時滞在していた場所を確認することができた他、コメニウス名称の学校が2つ存在し、現在もコメニウスの業績を称賛していることがよく理解できた。これまでに引き続き、コメニウス(J.A.Comenius,15921670)のPansophia(汎知)の理念の内容を解明することを目的として研究を行った。昨年追手門学院大学出版会から刊行した『コメニウス「世界図絵」の異版本」』において残された課題について考察するために、ポーランドおよびチェコに出張して調査した。そしてコメニウスの思想について理解を深めるためには、彼の生涯と活動についての考察に向かうことがどうしても必要であることを改めて認識した。なぜなら彼の思想の展開は、彼の置かれた状況と密接な関連が認められるからである。コメニウスは広くヨーロッパで活躍した人であり、6つの国の博物館で展示が見られる珍しい人である。科研費の助成を得てそれらの国を訪ねた活動について「ヨーロッパのコメニウス関係博物館」として整理し、『Musa博物館学芸員課程年報第32号』に収録した。さらに、コメニウスのPansophiaの理念の研究とかかわって「教養教育」についての考察を行った。1「教師教育と教養教育」としてまとめた内容を、日本教師教育学会編『教師教育研究ハンドブック』(学文社)に収録した。2総合人間学会関西談話会において「大学における教養教育の必要性と可能性」と題する報告を行った。3日本教育方法学会紀要『教育方法学研究』第43巻に、山崎奈々絵著『教員養成改革と「教養教育」』(六花出版)に関する書評を執筆した。以上の他「子どもの貧困」を中心にした課題研究のまとめを『教育方法学研究』に執筆した。また、日本教育学会第76回大会(桜美林大学)のラウンドテーブル「コメニウスにおける『汎知学の光』の考察」のコーディネイトを行った。チェコ、ドイツ、ポーランドなどヨーロッパ各地の図書館で文献調査を行い、『世界図絵』の異版本や『開かれた言語の扉の苗床』1773年版、『前庭』1658年版、『広間』1661年版等を閲覧した。以上の現地調査及び研究者との交流、文献の分析を通して得られた知見を『コメニウス「世界図絵」の異版本』としてまとめ、2016年12月に追手門学院大学出版会から刊行した。『世界図絵』については、従来未解明の課題が幾つも残されてきたが、本書ではその中で特に次の課題について考察した。たとえば、1多言語版の意図と活用の方法、2チェコ語版の出版が遅れた理由、3短縮版が特にウィーンで多く出版された理由などである。4年間の研究の初年度にあたる2014年度の研究実施計画は、次の通りである。
低酸素性虚血性脳障害におけるHeme Oxygenase-1の役割に関する研究

平成8年度は、新生児期のラットに対する低酸素性虚血負荷がラット脳内におけるHO-1蛋白の発現に及ぼす影響を、主として免疫組織法によって検討した。平成9年度には、Western Blotting法及びNorthern Blotting法を用い、半定量的解析を行った。1,HO-1蛋白の発現時期、発現部位に関する検討生後7日目の新生仔ラットを用いて新生児仮死モデル(Rice's model)を作成し、HO-1蛋白の発現について検討した。負荷後、経時的にラット脳を摘出し、hematoxylin-eosin染色、抗HO-1抗体とABC法を用いた免疫染色を行った。さらに、抗HO-1抗体によるWestern blottingを行ない、発現量を比較した。(結果)(1)免疫染色:HIEラットでは低酵素終了後3時間後より結紮側の大脳皮質、外包およびCA1領域を中心とする海馬においてHO-1陽性細胞が増加した。(2)Westernblotting:HIEラットでは低酵素12時間後で最も強く発現したが、低酸素終了後24時間後には対照の発現レベルまで低下していた。また、部位別に発現量を検討したところ結紮側の海馬を含む部分に多く認められた。2,HO-1蛋白遺伝子の発現に関する検討in situ hybridizationによってHO-1蛋白遺伝子の発現を検討したところ、負荷6時間後から発現が認められた。さらに、ラット脳より部位別にRNAを抽出しNorthern Blotting法を用いて発現量を比較したところ、蛋白の発現部位と同じく、結紮側の海馬を含む部分に最も発現が多かった。平成8年度は、新生児期のラットに対する低酸素性虚血負荷がラット脳内におけるHO-1蛋白の発現に及ぼす影響を主として免疫組織法によって検討した。1、HO-1蛋白の発現時期、発現部位に関する検討生後7日目の新生仔ラット68匹を用いて新生児仮死モデル(Rice's model)を作成し、負荷を行わなかった同日齢の新生仔ラット38匹を対照とした。負荷後、経時的にタット大脳を摘出し、抗ラットHO-1抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、負荷群の頚動脈結索側にのみHO-1蛋白の発現が認められた。大脳皮質部、海馬CA1領域における染色性が最も強く、白質部にもびまん性の発現が認められる個体も存在した。HO-1蛋白の発現は負荷後12時間頃より認められ、負荷後36時間後に最も顕著に認められた。2,HO-1蛋白遺伝子の発現に関する検討in situ hybridizationによってHO-1蛋白遺伝子の発現部位を検討した。HO-1蛋白の発現時期よりも早期(負荷6時間後)から発現が認められた。今後、症例数を増やして発現部位、細胞の種類をより明確にするとともに、定量的な手法を用いて時間の経過に伴う発現量の推移について検討する予定である。虚血後に生じる細胞死には様々な分子機構が関与している。今後の研究を通じてこれらの機構における新生児と成人の差を明らかにし、新生児仮死の新たな治療法を見い出したい。平成9年度は、新生児ラットに対する低酸素性虚血負荷がラット脳内におけるHO-1蛋白及びその遺伝子発現に及ぼす影響をWestern Blotting法、Northern Blotting法を用いて半定量的に解析した。1.HO-1蛋白の発現時期、発現部位に関する検討生後7日目の新生仔ラットを用いて新生児仮死モデル(Rice's model)を作成し、対照群としては同日齢の幼若ラットを用いた。負荷後、経時的にラット大脳を摘出し、抗HO-1抗体によるWestern blottingを行なった。Western blottingにより得られたバンドをコンピューター画面上に取り込んで半定量解析を行なった。(結果)ラット脳におけるHO-1蛋白の発現量は、低酸素負荷終了後徐々に増加し、12時間後に最も強く発現した。しかし、低酸素負荷より24時間後には対照の発現レべルにまで低下した。

また、低酸素負荷12時間後に摘出した脳を用いて部位別に発現量を検討したところ、結紮側の海馬を多く含む部分に最も発現が多かった。2.HO-1蛋白遺伝子の発現に関する検討Shibaharaらの報告に基づき、RT-PCR法を用いてラットHO-1cDNAを作成した。in situ hybridizationによってHO-1蛋白遺伝子の発現を検討したところ、負荷6時間後から発現が認められた。さらに、ラット脳より部位別にRNAを抽出してNorthern Blottingを行ない、コンピューターによる半定量解析によって発現量を比較したところ、蛋白の発現部位と同じく結紮側の海馬を含む部分に最も発現が多く認められた。
乱流秩序渦構造による乱流混合の理解と制御

十分に発達した乱流中には秩序だった管状の渦構造が自己相似な階層構造をなして存在する。すなわち、半径が乱流のコルモゴロフ長程度の微細な秩序渦から、半径が積分長程度の大規模渦構造までさまざまなスケールの秩序渦が、重なりあって存在している。この秩序構造の多重スケール性こそが、乱流の強い混合や拡散の起源であることを明らかとした。すなわち、各階層の秩序渦構造のそれぞれが乱流に移流される物質塊を引き伸ばし折り畳み、したがって物質の混合が各スケールで同時に進行するために、全体として極めて強い混合が生み出されるのである。同様に乱流による強い拡散の起源も、この秩序渦の階層構造のはたらきとして説明することができる。興味深いことに乱流には物質を拡散するはたらきと同時に物質を凝集するはたらきもある。たとえば乱流からストークス抵抗のみを受けて移流される微小な重い粒子群は乱流中でクラスタを形成する。これらのクラスタは従来は最小スケールの秩序渦によるものであると理解されてきたが、我々の研究によれば、こららのクラスタもまた自己相似な階層構造をもつ秩序渦による効果として説明され、またその証拠としてクラスタが自己相似な性質をもつことを示した。さらに、これまで主に数値シミュレーションによって得られた以上の知見が現実の装置内での混合・輸送現象にも適用可能であることを示すために、歳差運動をする球体を用いた乱流混合の室内実験装置を提案した。今後は、これまでに開発してきた乱流混合のシミュレーションと、この新しい装置を用いた室内実験とを併用して、本研究課題でこれまでに得られた乱流混合や輸送現象に関する知見をさらに発展させていく。分子拡散と比して桁違いに効率のよい乱流による混合の物理機構を、乱流中に普遍的に存在することが知られる秩序渦構造に注目することによって明らかにし、さらにその制御の指針を得ることを目的として研究を遂行した。研究手段としては、乱流場の運動とそれに移流される流体粒子の集合の運動とを同時に直接数値シミュレーションによって数値的に求め、得られた結果の詳細な理論、数値および可視化解析をおこなった。その結果、本年度は以下の結果を得た。(1)統計的に自己相似的な乱流場において初期に近傍に存在した流体粒子対の運動は、乱流中に自己相似的に存在する秩序渦構造による捕獲と放出によるものと理解することができる。この簡単な描像に基づいて粒子対間隔の確率密度関数が従う方程式を導出すると、これがよく知られたリチャードソンの拡散方程式の一般形を与えることが示された。また、導出された方程式の解析解が数値シミュレーション結果をよく再現することを示した。(2)流体粒子の運動の軌跡(流跡線)は流れ場が定常であれば流線に一致することに注目することにより、乱流中の流線のトポロジーと粒子拡散との間に成り立つ関係を見出した。このことは乱流混合や拡散を考える上で秩序渦構造だけでなく、それに付随する流線構造を考えることの重要性を示唆する。(3)初期に直線や平面を構成する流体粒子の集合(流体線、流体面)は、一様乱流中で時間の指数関数でその全長や全面積が増大する。この指数関数的伸長は乱流中の最小スケールの秩序構造渦によるものとして説明するこができるが、実はその伸長率は最小構造渦だけでは決定されないことを示した。これはより大きな渦による畳み込みの効果が無視できないためであることを明らかにした。以上の結果は、流体力学の専門誌上に公表するとともに、IUTAMシンポジウム、第10回欧州乱流会議などの国際会議において発表を行った。(1)乱流による強い混合の起源を探るために、一様等方乱流の大規模数値シミュレーションを実行した。このシミュレーションでは、流体面(常に同一の流体粒子の集合よりなる面であり、この定義より流体の二つの部分の境界面を表す)の追跡を行い、この面の伸長率により混合を定量化する。その結果、乱流中には自己相似な階層構造をなす秩序渦が安定に存在しており、これらの各階層で流体面の伸長(したがって流体の二つの部分の乱流による混合)が同時に進行するために、全体として強い流体面の伸長(したがって強い乱流混合)が生み出されることが明らかとなった。(2)乱流中の慣性粒子の挙動を大規模数値シミュレーションにより詳細に調べた。ここで慣性粒子とは背景の流体とは異なる密度をもつ微小な粒子のことである。重たい慣性粒子は一様乱流中であっても非一様な空間分布をすることが知られる。われわれはこの慣性粒子の非一様分布も乱流中に安定に存在する自己相似な階層構造をもつ秩序渦の影響として説明できることを示した。すなわち重たい粒子は遠心力効果により秩序渦より掃き出されるが、秩序渦が自己相似かつ非一様に存在するために慣性粒子の空間分布も自己相似かつ非一様となる。また2次元一様乱流中での慣性粒子の空間分布は、流れ場の加速度が0となる点の空間分布と極めてよく一致することも示された。以上の結果は流体力学の専門誌に投稿するとともに、日本流体力学会年会、日本物理学会年次大会、第4回乱流およびせん断流現象についての国際会議等で口頭発表を行った。

すなわち、半径が乱流のコルモゴロフ長程度の微細な秩序渦から、半径が積分長程度の大規模渦構造までさまざまなスケールの秩序渦が、重なりあって存在している。この秩序構造の多重スケール性こそが、乱流の強い混合や拡散の起源であることを明らかとした。すなわち、各階層の秩序渦構造のそれぞれが乱流に移流される物質塊を引き伸ばし折り畳み、したがって物質の混合が各スケールで同時に進行するために、全体として極めて強い混合が生み出されるのである。同様に乱流による強い拡散の起源も、この秩序渦の階層構造のはたらきとして説明することができる。興味深いことに乱流には物質を拡散するはたらきと同時に物質を凝集するはたらきもある。たとえば乱流からストークス抵抗のみを受けて移流される微小な重い粒子群は乱流中でクラスタを形成する。これらのクラスタは従来は最小スケールの秩序渦によるものであると理解されてきたが、我々の研究によれば、こららのクラスタもまた自己相似な階層構造をもつ秩序渦による効果として説明され、またその証拠としてクラスタが自己相似な性質をもつことを示した。さらに、これまで主に数値シミュレーションによって得られた以上の知見が現実の装置内での混合・輸送現象にも適用可能であることを示すために、歳差運動をする球体を用いた乱流混合の室内実験装置を提案した。今後は、これまでに開発してきた乱流混合のシミュレーションと、この新しい装置を用いた室内実験とを併用して、本研究課題でこれまでに得られた乱流混合や輸送現象に関する知見をさらに発展させていく。
頭頸部癌におけるマイクロRNAの働き

肝細胞増殖因子(HGF)は様々な細胞に分化・増殖・浸潤等を促す多機能因子であるが、どのように異なった機能を発現調節されているか不明である。本研究で、頭頸部扁平上皮癌細胞株HSC3においてHGF刺激により、いくつかのmicroRNA発現が変化することをみつけた。さらにHGF刺激により発現低下したmiR-200cとmiR-27bが各々、ZEB1/E-cadherinの発現変化を介して上皮間質移行に重要な役割を担い、ST14/matriptaseによるHGF自己活性を行っていることを同定した。これらによりHGFはmicroRNAの発現変化を通して癌の浸潤や増殖に関与していることを示唆した。我々の研究目的は、頭頸部扁平上皮癌におけるmicroRNAの機能発現の解明である。そこでまず、我々は、頭頸部扁平上皮癌における重要な因子の一つである肝細胞増殖因子HGF刺激前後のmicroRNA発現変化の有無をマイクロアレイを用いて検討した。その結果、刺激前後で有意に変動するmicroRNAをいくつか同定し、リアルタイムPCRにより再現性を検討した。その結果、downregulationするmiR-200cとmiR-27bが同定できた。これらのmicroRNAの標的遺伝子を、データベースや報告論文をもとに調査しmiR-200cはEMT (epithlial-mesenchymal transition)に重要なZEB1/2を、miR-27bはHGF活性化酵素の一つであるMatriptaseが標的遺伝子の一つとして挙げられた。そこで、リアルタイムPCRを用いて刺激前後で各々のmicoRNAの標的遺伝子の発現が連動して変化するかを検討した。その結果、miR-200cとmiR-27bと各々の標的遺伝子であるZEB1、Matriptaseは時間依存性に有意に変動し、downregurationされたmicroRNAとは逆に、upregulationすることが分かった。この結果は、タンパクレベルでも同様な結果が得られた。これらより、HGF機能の1つであるEMTが起こる機序に、miR-200cが関与し、HGF刺激は、miR-27b発現低下を介しMatriptase発現を増加させ、HGF自身を活性化している可能性が考えられた。以上より、HGFはmicroRNAを介して頭頸部扁平上皮癌の機能発現を担っており、また逆にmicroRNAの制御にHGFが関与していることが示唆され、今後の頭頸部扁平上皮癌とmicroRNAの研究において重要な手がかりが得られた。これらのmicroRNAの標的遺伝子を、データベースや報告論文をもとに調査しmiR-200cはEMT(epithlial-mesenchymal transition)に重要なZEB1/2を、miR-27bはHGF活性化酵素の一つであるMatriptaseが標的遺伝子の一つとして挙げられた。さらに、変動したmicroRNAをトランスフェクションし強制発現をさせると、HGF刺激によるタンパク発現変化は打ち消され、さらに、invasionassayにおいてもmicroRNAを強制発現させるとHGF刺激しても有意に浸潤が低下することがわかった。
アモルファス合金ナノワイヤーを用いた3次元触媒開発

本研究では、ガスアトマイズ法を用いてアモルファス合金ナノワイヤーを長尺化、微細化、均一化するため、生成物であるワイヤーおよび粉体の形状や直径の分布に溶湯温度が及ぼす影響を調べた。線径と粒径は対数正規分布に従い、高温ではメディアン径が減少することを見出した。この対数正規分布は微細化の過程を反映しており、生成物のサイズ分布の評価基準とすることで、形成機構を明らかにすることが可能になった。さらに、これらの温度効果は、オーネゾルゲ数と呼ばれる無次元数によって類別できることが分かり、ナノワイヤーが主要生成物となるための温度条件の最適化に成功した。本研究は、ガスアトマイズ法を用いた一括大量生産技術を基盤に、触媒能をもつPt基ならびにPd基アモルファス合金から長尺なナノワイヤーを作製し、表面のナノ結晶化・ナノポーラス(多孔質)化を有機的に組み合わせ、この新規素材であるアモルファス合金ナノワイヤーの高い耐久性と機械的強度を活用した3次元構造・無担持電極を開発するための知見を得ることを目的とする。本年度は、ガスアトマイズ法を用いたアモルファス合金ワイヤーの設計指針の確立に向けて、ガラス形成能が高いPd-Cu-Ni-P合金のナノワイヤー化から着手し、ワイヤーの形成と直径分布に温度が及ぼす影響を調べた。ワイヤーが形成され得るのは、溶湯の粘性が高く、液糸から液滴への分裂前に固化する場合だと考えられるが、アモルファス合金の粘性は温度に大きく依存する。そこで、異なる温度でPd-Cu-Ni-P母合金をアトマイズし、生成したワイヤーおよび粉体は、XRD、SEM-EDSを用いて構造解析、組成分析を行った。次に、各温度でのSEM像からワイヤー径と粒径の頻度分布を求め、統計分布関数をフィッティングすることで、サイズ分布を比較した。その結果、融点よりも十分に高い温度では粉体が主要生成物であり、温度が低くなるにつれてワイヤーの割合が増加し、融点以下ではワイヤー形成が主となることが分かった。また、ワイヤー径と粒径は対数正規分布に従い、高温ではメディアン径が減少することを見出した。これらの温度効果は、オーネゾルゲ数と呼ばれる無次元数で類別でき、ワイヤーのナノ化にとって重要な知見である。さらに、このナノワイヤーは触媒機能が活性なPdから構成されるアモルファス合金であることから、燃料電池や水素生成ための高耐久性触媒材料の開発に繋がるという意義がある。本研究は、新規素材であるアモルファス合金ナノワイヤーの高い耐久性と機械的強度を活用した3次元構造・無担持電極を開発するための知見を得ることを目的とする。本年度は、平成26年度に取り組んだアモルファス合金の中で、いち早くナノワイヤーの作製に成功したPd基アモルファス合金を優先させ、ワイヤー構造のより一層の長尺化、微細化、均一化を図るための研究を継続した。昨年度に取り組んだ温度依存性に加えて、ガスの種類や圧力をはじめとした曵糸速度に直結するアトマイズのパラメータを最適化する中で、生成されるワイヤーおよび粒子の直径分布が対数正規分布に従うことを再確認した。対数正規分布は微細化の過程を反映しており、これら生成物のサイズの評価基準とすることで、ガスアトマイズ法の生成条件を確立することができた。現在、こうして実現した量産可能なアモルファス合金ワイヤーの微細度・直径分布、ワイヤーと粒子の分級および各々のサイズによる分級、溶媒への分散安定化の改善を進めている。上記の手法により作製したアモルファス合金ワイヤーについて、当初予想していなかった再生医療の分野への研究展開があったので、波及効果として報告する。細胞培養の足場となる親水性ゲルシートに、サブミクロンのPd基アモルファス合金ワイヤーを組み合わせたところ、導電性や機械強度が増大することが観測された。この結果に関する論文は、学術誌の表紙にも採用されており、その重要性が評価されたと考える。今後、ナノスケールの分散性ワイヤーを活用できれば、アレイ化による配向制御が可能となって、導電性や強度がさらに高まり、再生医療の発展に資するハイブリッド材料の実現が期待される。現在までに、温度を主要パラメータとして様々なアトマイズ条件を検討しており、アモルファス合金のナノワイヤー作製において必要となるノウハウを蓄積できたため。また、Pd基アモルファス合金ワイヤーについては、研究計画で述べた電気化学測定による活性表面積(ECSA)の評価やDSCによる熱特性評価・熱処理も推進することができたため。表面物理/ナノサイエンス平成26年度に取り組んだアモルファス合金の中で、いち早くナノワイヤーの作製に成功したPd基アモルファス合金を優先させ、研究を継続する。

今後、ワイヤー構造のより一層の長尺化、微細化、均一化のため、温度依存性に加えて、ガスの種類や圧力をはじめとした曵糸速度に直結するパラメータを最適化しアトマイズ工程を確立した上で、ナノ結晶化とナノポーラス化の制御、それらが比表面積、耐久性、触媒活性に及ぼす影響の評価を進めていく計画である。また、本研究の進展を図るため、国内学会や国際会議における調査・発表を積極的に行いたいと考えている。
新生児脳障害の胎児・新生児治療法の開発

新生児低酸素虚血性脳障害(HI)モデルラットを用いてHIの患側、健側および低体温療法後の患側、健側の脳組織からAGPG法を用いてRNAを回収し、炎症性サイトカイン関連遺伝子群、成長因子関連遺伝子群、接着因子関連遺伝子群、アポトーシス関連遺伝子群などの各種遺伝子群について網羅的にreal time PCR法を用いて発現遺伝子量の差異について解析した。その結果、有意差を認められたものがinterleukin (IL)-18とICAM-1であった。さらに検討を進めたところ、IL-18が、最もHI脳症の患側、健側における脳組織における遺伝子発現量に有意な差異が確認された。IL-18の発現量の差異について検討し、新生児HI脳障害モデルラットの患側脳組織においてIL-18の発現が蛋白レベルおよびmRNAレベルで増強していることが確認され、低体温療法による治療によって患側におけるIL-18発現量が、蛋白レベルおよびmRNAレベルにおいて健側における発現レベルと同程度になるまで発現量の改善が認められ、新生児HI脳症における治療法の標的因子となりうる可能性が明らかとなった。この知見よりIL-18をターゲットに遺伝子治療の可能性が示された。さらに、新生児脳における放射線障害もモデルマウスにおいてもIL-18が重要な因子であった。また、新生児HI脳障害における高二酸化炭素状態が及ぼす影響を長期的に検討したところ軽度の高二酸化炭素状態が、神経学的予後を長期的に予後改善する可能性が示され、高二酸化炭素状態の新生児HI脳障害治療への応用の可能性が明らかとなった。これら炎症性の反応を制御するために用いられるステロイドホルモンによる影響について検討を進め、ステロイド療法による脳重量の減少、脳内の神経幹細胞減少が確認され、ステロイド療法の神経発達に及ぼす負の作用が示された。モデルはヒト正期産児の脳と成熟度が一致するとされている、生後7日のラットを用いて行い、ハロセンで麻酔下に片側の総頚動脈を結紮した上で8%低酸素負荷を1時間加えて低酸素虚血脳障害モデルを作製した。このモデルについて神経保護作用を有するサイトカインであるinterleukin-10の発現に関して解析を行った。再灌流後6h,12h,24h,2d,3d,7d,14dに脳組織を摘出,内因性IL-10の発現をRT-PCRにより評価した。その結果、RT-PCRではIL-10mRNAの発現の差異を確認することができなかった。現在さらに脳組織から蛋白を抽出し、IL-10蛋白の発現について解析中である。また外因性IL-10の投与による脳保護効果についての検討を進行している。さらに実験モデルのラットにおいて低酸素虚血性脳症の患側、健側および低体温療法後の患側、健側の脳組織からAGPC法を用いてmRNAを回収し、cDNAマイクロアレイを用いた解析を進行中である。さらに胎児期、新生児期のステロイド療法の脳、神経発達に及ぼす悪影響が指摘されており、動物実験モデルを用いて解明するために以下の検討を行った。ステロイド治療による胎児脳の神経細胞再生について神経幹細胞をbromodeoxyuridine(BrdU)を用いて標識し、ステロイド投与による神経幹細胞の動態を解析したところ、ステロイド投与に伴う脳内の神経幹細胞の減少が確認され、ステロイド治療の脳、神経発達に及ぼす悪影響の要因が明らかとなり、これらの知見を現在投稿中である。平成16年度に引き続き低酸素虚血性障害モデルラットを用いて低酸素虚血性脳症の患側、健側および低体温療法後の患側、健側の脳組織からAGPG法を用いてRNAを回収し、炎症性サイトカイン関連遺伝子群、成長因子関連遺伝子群、接着因子関連遺伝子群、アポトーシス関連遺伝子群などの各種遺伝子群について網羅的にreal time PCR法を用いて発現遺伝子量の差異について解析した。その結果IL-18、VEGF、ICAM-

1、Gro、MCP-1遺伝子に関して低酸素虚血性脳症の患側、健側における脳組織における遺伝子発現量に有意な差異が確認された。さらに低体温療法による治療によって患側における遺伝子発現量が、健側における発現レベルと同程度になるまでこれら遺伝子群の発現量の改善が認められ、新生児低酸素虚血性脳症における治療法の標的因子となりうる可能性が示唆された。この知見をもとに蛋白レベルでの発現の差異ならびにこれら蛋白ならびに阻害剤を用いた遺伝子治療、蛋白レベルでの治療法について検討を行っている。また、長期的予後改善効果についてもStaircase testとABRを用いて解析中である。また、胎児新生児医療において広く用いられているステロイド療法についてラットモデルを用いて解析し、ステロイド療法による脳重量の減少、脳内の神経幹細胞減少が確認され、その作用にはdose依存性が認められ、ステロイド療法の神経発達に及ぼすネガティブな作用が明らかとなった(現在論文投稿中)。新生児低酸素虚血性脳障害モデルラットを用いて低酸素虚血性脳症の患側、健側および低体温療法後の患側、健側の脳組織からAGPG法を用いてRNAを回収し、炎症性サイトカイン関連遺伝子群、成長因子関連遺伝子群、接着因子関連遺伝子群、アポトーシス関連遺伝子群などの各種遺伝子群について網羅的にreal time PCR法を用いて発現遺伝子量の差異について解析した結果IL-18が、最も低酸素虚血性脳症の患側、健側における脳組織における遺伝子発現量に有意な差異が確認された。そこでIL-18の発現量の差異について検討したところ新生児低酸素虚血性脳障害モデルラットの患側脳組織においてIL-18の発現が蛋白レベルおよびmRNAレベルで増強していることが確認され、低体温療法による治療によって患側におけるIL-18発現量が、蛋白レベルおよびmRNAレベルにおいて健側における発現レベルと同程度になるまで発現量の改善が認められ、新生児低酸素虚血性脳症における治療法の標的因子となりうる可能性が明らかとなった。この知見をもとに遺伝子治療の可能性を検討中である。さらに、新生児低酸素虚血性脳障害におけるhypercapniaの及ぼす影響を長期的に検討したところ軽度のhypercapniaが、神経学的予後を長期的に予後改善することが明らかとなり、hypercapniaの新生児低酸素虚血性脳障害治療への応用の可能性が明らかとなった(Am J Obstet Gynecol,2006 in press)。さらに、胎児新生児医療において広く用いられているステロイド療法についてラットモデルを用いて解析し、ステロイド療法による脳重量の減少、脳内の神経幹細胞減少が確認され、ステロイド療法の神経発達に及ぼす負の作用を明らかとした(Am J Obstet Gynecol 2006,194,231-8)。
相同組換えによるゲノム安定化を介した発がんの防御

DNAの交換反応である相同組換えは体細胞分裂期にはゲノムの傷を修復する事でゲノムの安定化に寄与している。相同組換えの破綻はゲノムの不安定化を引き起こし、発癌の原因になる。真核生物における分子メカニズムを理解するため、細胞内での組換え反応を、出芽酵母をモデル系として解析する系を構築している。細胞内で部位特異的に組換えを誘発し、その部位をGFPで可視化する事で、その部位に結合する組換え蛋白質の挙動(集合、解離反応)を捉える事に成功した。その結果、従来の生化学的解析とは異なる組換えの分子メカニズムを示唆する結果を得る事が出来た。その中で蛋白質の解離反応がDNAの変換反応に共役している事、組換えに中心的な役割を果たすRad52蛋白質が組換え反応に3つの異なる過程に関わることを示唆する結果を得た。特に、組換えの中心的な反応である相同鎖検索、交換反応はRad51単独でなく、Rad51-Rad52複合体によって行われると推測された。このような知見は真核生物の組換えの分子メカニズムを知る上で大きく貢献した。また、同様な系を用いて、DNA損傷チェックポイント因子の局在も解析した所、組換えに関わる蛋白質と同一の挙動をとる事も分かった。このように核内での組換えに関わる蛋白質の動きを解析する系は有用であり、減数分裂期組換え、あるいは高等真核生物の組換えを解析する上でも有効であると考えられる。
遺伝性・炎症性角化症に対するカンナビノイド作動薬による治療の確立

カンナビノイド、バニロイド作動薬による表皮角化細胞におけるSERCA2発現亢進の効果はそれぞれCB2、TRPV3・4受容体を介した直接の作用であることを明らかにした。遺伝性および炎症性角化症の代表としてのダリエー病、尋常性乾癬のモデルマウスを用いた外用効果の確認においても、カンナビノイドは特に顆粒層の形成も回復せしめる病理学的な効果をもたらした。その効果はバニロイドによる効果とは病理学的に異なる効果であった。カンナビノイド作動薬は外用薬として、新規の角化症治療薬となりうることを示せたと考えた。我々はカンナビノイドとバニロイド作動薬が、表皮角化細胞に対し各々直接SERCA2遺伝子の発現を亢進し、特にカンナビノイドはダリエー病モデルの移植皮膚に対して顆粒層の回復までももたらす治療効果があることをより詳細な移植モデル、3次元モデル構築等を用いて病理学的に明らかにした。患者皮膚からの培養細胞に対しsiRNA法により各受容体の発現を抑制した状態での薬剤の効果や、選択的な阻害薬を使用することで、2つの作動薬は表皮角化細胞に発現する各々CB2, TRPV3/4受容体を介して独立した機序でSERCA2の亢進をもたらすことを明らかにし、より選択的な薬剤の選択を可能とした。温熱感受性受容体によるSERCA2蛋白の発現の変化は、ダリエー病が脂漏部位に夏期に悪化することを考えると病態論的にも興味深い。さらにカンナビノイド作動薬においては、SERCA2の発現亢進により細胞内カルシウム濃度を安定化し、角化の亢進を平穏化する効果のみならず、角化細胞の細胞増殖の抑制効果も有すことを新たに確認した。そこで異常角化の亢進と基底細胞の増殖亢進を病態とする尋常性乾癬に対する効果を期待すべく、そのモデル動物として入手が可能であるスタンフォード大学で作製されたK14-Raf/Tamマウスを、その作成者である高知大学皮膚科の樽谷准教授より供与頂きその効果を確認した。カンナビノイド作動薬を1-2週の間、連日外用することで、コントロールである溶媒のDMSOに比較して、著明に過角化や炎症細胞浸潤の抑制効果があることを病理学的に確認できた。患者皮膚からの培養細胞に対しsiRNA法により各受容体の発現を抑制した状態での薬剤の効果や、選択的な阻害薬を使用することで、2つの作動薬は表皮角化細胞に発現する各々CB2,TRPV3/4受容体を介して独立した機序でSERCA2の亢進をもたらすことを明らかにし、より選択的な薬剤の選択を可能とした。我々はダリエー病の原因遺伝子であるSERCA2遺伝子の表皮角化細胞での発現を亢進する薬剤として、幅広いスクリーニングの結果、カンナビノイドとバニロイド作動薬が、表皮角化細胞に存在する各々の受容体を特異的に介しSERCA2遺伝子の発現を亢進することを見いだした。さらにカンナビノイドはダリエー病モデルに外用することで顆粒層の回復までももたらす治療効果があることを、より詳細な移植モデル、3次元モデル構築等を用いて病理学的に明らかにした。患者皮膚からの培養細胞に対しsiRNAにより受容体の発現を抑制した状態での薬剤の効果や、選択的な阻害薬を使用することで、2つの作動薬は表皮角化細胞に発現する各々CB2,TRPV3/4受容体を介して独立した機序でSERCA2の亢進をもたらすことを明らかにし、より選択的な薬剤の選択を可能とした。

温熱感受性受容体によるSERCA2蛋白の発現の変化は、ダリエー病が脂漏部位に夏期に悪化することを考えると病態論的にも興味深い。しかしダリエー病のみでは新薬の開発としては患者数が余りに限定されることが問題であり、カンナビノイド作動薬がSERCA2の発現亢進により細胞内カルシウム濃度を安定化し、過角化を抑制する効果のみならず、角化細胞の細胞増殖の抑制効果も確認した。そこで異常角化の亢進と基底細胞の増殖亢進を病態とする尋常性乾癬に対する効果を期待すべく、そのモデル動物として入手が可能であるスタンフォード大学で作製されたK14-Raf/Tamマウスを、高知大学皮膚科の樽谷准教授より供与頂きその効果を確認した。タモキシフェンで乾癬病態を誘導後にカンナビノイド作動薬を1-2週の間、連日外用することで、コントロールである溶媒のDMSOに比較して、著明に過角化や炎症細胞浸潤の抑制効果があることを病理学的に確認できた。今後は乾癬における免疫細胞の動向に与えるカンナビノイド作動薬の効果を確認することで、実用化に必要な情報を得られると考える。
終末糖化産物受容体阻害アプタマーの開発と心血管病、癌への応用

終末糖化産物を認識し病的シグナルを伝達する受容体(RAGE)の機能を阻害するDNAアプタマー(RAGEアプタマー)の糖尿病モデル動物や担癌動物に投与した。RAGEアプタマーは、ストレプトゾトシンで誘発した糖尿病ラットの腎症及び、ヒトメラノーマ細胞を移植したヌードマウスにおいて、いずれも抑制する効果を示した。さらに、RAGEアプタマーの投与を開始した時期は、腎症と腫瘍の病態が増悪してからであったにも関わらず、RAGEアプタマーが抑制効果を示したことは、将来の臨床応用に向けて重要な知見が得られたといえる。近年、糖尿病に伴う血管障害に終末糖化産物(Advanced Glycation End Products、以下AGE)の産生、蓄積の亢進が関わることが明らかになってきた。さらに、AGEが、AGEを認識する受容体(Receptor for AGE、以下RAGE)に結合することで、情報伝達系が活性化され、様々な臓器合併症をひきおこすことも知られてきた。本研究では、AGEを認識し、病的シグナルを伝達する細胞表面受容体RAGEに特異的に結合し、その作用を阻害するDNAアプタマーを開発し、糖尿病モデル動物や担癌動物に投与することにより、当該アプタマーの糖尿病性大小血管症、心血管リモデリング、癌への有効性を検証し、将来の臨床応用への可能性を模索することを目的とする。平成25年度、我々は、(1)RAGEの可変領域を含む可溶型RAGE蛋白発現ベクターを構築し、可溶型RAGE蛋白を大量に精製した。(2)既報のSELEX法により(Microvas Res 2007,74,65-69)、可溶型RAGE蛋白の可変領域に結合する高親和性のアプタマーを探索した。(3)ついで、候補アプタマーの中から、RAGE阻害機能を有するアプタマーを絞り込んでいった。具体的には、まず、固相化したAGEに対する可溶型RAGEの結合を阻害できるRAGEアプタマーの中から、高親和性のアプタマー(Kd=1nM)をELISA法で選択し、当該アプタマーがRAGEと結合することでAGE-RAGE相互作用をブロックすることをQCMにて確認した。さらに、当該アプタマーが、100 μg/mlのAGEにメサンギウム細胞を4時間暴露させた時に生じる酸化ストレス産生(DCFDA法で計測)と炎症性サイトカインや接着因子の遺伝子(RAGE, ICAM-1)発現の誘導(定量性RT-PCR法で計測)を完全に抑制することが見いだされた。ストレプトゾトシン糖尿病ラットに、前年度までに作成した修飾RAGEあるいはコントロールアプタマーを腹腔内に投与し、下記の項目について検討をおこなった。1.腎機能、腎重量、血圧などに及ぼす影響を検討する(1、3、5ヶ月目)。2.尿中微量アルブミン量、蛋白尿ならびに尿中ネフリン排泄や尿細管障害マーカー排泄に及ぼす影響を測定する(1、3、5ヶ月目)。3.微量アルブミン尿の出現やポドサイトの障害には、酸化ストレスの産生や炎症反応が関わることが知られている。そこで、酸化ストレスマーカーである8-OHdGの尿中排泄量や腎組織におけるVEGF、MCP-1の発現をELISA法やreal-time PCRならびにwestern blotを用いて検討する(1、3ヶ月目)。4.組織学的に糸球体硬化症や尿細管間質病変に及ぼすAGE-アプタマーの効果について検討する。合わせてポドサイトロスの程度や足突起の癒合についても形態学的な検討を加える(3、5ヶ月目)。本年度に於いては、終末糖化産物を認識し病的シグナルを伝達する受容体(RAGE)の機能を阻害するDNAアプタマー(RAGEアプタマー)の癌への有効性について検証をおこなった。ヌードマウスの皮下にヒトメラノーマ細胞であるG361細胞を100万個注入し、腫瘍異種移植片モデルを作製した。移植後、2週間経過した時点でRAGEアプタマー及びコントロールアプタマーの投与を開始した。アプタマーの投与は、浸透圧ポンプの腹腔内埋め込みにより持続的におこない、4週間後に腫瘍移植片を採取した。経時的な腫瘍体積の測定の結果、ポンプ投与後17日目から、RAGEアプタマー投与群における腫瘍体積はコントロールアプタマー投与群と比べて有意に低下していた。採取した腫瘍組織について免疫染色をおこなったところ、酸化ストレスマーカー(8-OHdG)、AGE、RAGE、腫瘍の増殖マーカー(PCNA)、p27、VEGF、血管内皮マーカー(CD31)、MCP-1、Mac-3等がいずれもRAGEアプタマー投与群で有意に低下していた。RAGEアプタマーはAGE-RAGE系の抑制により、組織内の酸化ストレス産生を阻害し、腫瘍内血管新生に加えてマクロファージの浸潤を低下させることで腫瘍増殖を抑制する効果を発揮することが示唆された。さらに、今回のRAGEアプタマー投与は、腫瘍移植後に腫瘍組織が目視で確認できる程度に成長してからであったにもかかわらず、腫瘍に対し抑制効果を示したことは、将来の臨床応用に向けて重要な知見が得られたといえる。