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F1-ATPaseモーターの機能における揺らぎと水和

F1-ATPaseは, ATP一分子の加水分解・合成と内部のγサブユニットの回転を共役させる分子モーターである.我々はF1-ATPaseのトルクと釣り合う外部トルクの大きさを求め,その結果からATPの加水分解による自由エネルギー変化をほぼ100%の効率で回転のエネルギーに変換していることを示した.更に釣り合いから離れた条件での非平衡揺らぎの測定から,回転自由度へのエネルギーの散逸が非常に高効率で起こること,その性質が回転を駆動するポテンシャルの形と切り替えのタイミングで説明されることを見いだした.ATPはその加水分解に際して得られる自由エネルギーを通して生体内のエネルギー通貨とも言える役割を果たしている.ATPの加水分解の自由エネルギー変化は水中でおこるため反応前後の水との相互作用の変化の影響を強く受けており,蛋白質がATPを分解して機能する場合も蛋白質と水の相互作用が重要な影響を及ぼす.本研究ではF1-ATPによるATPの加水分解自由エネルギーと回転運動の化学力学変換のメカニズムの理解を出力を定量的に評価するための外部トルク印可システムを用いて,エネルギーの入出力関係を正確に見積るとともに種々のヌクレオチド結合の熱力学的パラメーターを求めて,さらに非水溶媒などを利用してとともに、水中でATPを加水分解して働く分子機械特有のダイナミクスに対する水和の効果を明らかにする.F1-ATPaseは, ATP一分子の加水分解・合成と内部のγサブユニットの回転を共役させる分子モーターである.我々はF1-ATPaseのトルクと釣り合う外部トルクの大きさを求め,その結果からATPの加水分解による自由エネルギー変化をほぼ100%の効率で回転のエネルギーに変換していることを示した.更に釣り合いから離れた条件での非平衡揺らぎの測定から,回転自由度へのエネルギーの散逸が非常に高効率で起こること,その性質が回転を駆動するポテンシャルの形と切り替えのタイミングで説明されることを見いだした.本研究は, F_1-ATPaseによるATPの加水分解自由工ネルギーと回転運動の化学力学変換のメカニズムの理解をめざして、基質,蛋白,生成物の水との相互作用(水和状態)に注目し,水中でAfPを加水分解して働く分子機械特有のダイナミクスを理解することを目的としている.平成20年度は,試料調製のための小型超遠心機を購入し,以下の実験を行って結果を得た.1)既存の温度調節可能な顕微鏡を用いてF_1-ATPaseの回転の温度依存性を確認し,今まで考慮されてこなかった反応の逆反応が低温でのステップのdwell time histogramに影響を与えていることが示唆された.2)F_1-ATPaseの回転の主要ステップは, IArp, ADPの結合脱離によって引き起こされていることが分かっている.この過程の理解を目指してADPの結合の熱力学的解析を,変異導入したトリプトファンの蛍光がADP結合によって減少することを利用してその温度依存性から行った.その結果,以前熱量測定から得られていた単離βサブユニットに比べ, △G^0は近いものの,負である△H^Oの絶対値が小さく,正の△s^0が大きいという結果が得られた.これは複合体でのサブユニット相互作用の影響を示唆するが,今後単離βサブユニットで蛍光測定から同様の実験を行うなどして更に研究を進める.3)水の溶媒としての働きを直接的に検証するためにDMSOによる影響を検討した.2mM ATP, 30%DMSOでステップらしきものが見えており,今後どのような過程にDMSOが影響しているかについて検討する予定である.その他,回転電場による揺らぎの解析からも興味深い結果が得られている.今年度の予定は,1.回転電場印可・温度調節可能な顕微鏡を稼働させるところまで持ってゆくこと,2.非水溶媒としてDMSOを30%加えた条件下でF_1-ATPaseの回転をさらに詳細に観察すること,3.βサブユニット単体とα_3β_3γ複合体について,ヌクレオチドの結合の温度依存性の解析から熱力学パラメーターを求めること,の3点であった.1.に関しては特注の部品が多かったため予定がかなり遅れ,2010年3月の時点で温度調節装置は試作品の検討中,回転電場装置は構成要素となる信号発生装置などの納品待ちの状態である.これは2010年度の早い時期に稼働状態に持ってゆく.2.に関してはDMSO存在下では見られる停止状態の位置はATP待ちの位置であることが確認され,さらにステップ回転を行っている間の角速度も低下する事が分かってきた.DMSOの溶媒の粘度に対する影響はあまり大きくないことが分かり,DMSOはステップの待ち時間とステップ自体に影響を与える事が明らかになりつつある.これも2010年度にさらに慎重な検討を重ねる予定である.3.に関してはMg存在下でATPとADPの結合は単離βサブユニットに対し,実質的に同じ熱力学パラメーターを示すこと,ややばらつきはあるが単離サブユニットに比べてα_3β_3γ複合体に対するMgADPの結合は明らかにエントロピー変化が大きくエンタルピー変化が小さいことがわかった.

これはサブユニット相互作用の変化を反映していると考えられ,非常に興味深い.またMgGTP,MgGDPの単離βサブユニットに対する結合の熱力学パラメーターはMgATP,MgADPと比べてエントロピー変化だけが異なっておりプリン環と蛋白の相互作用には疎水相互作用が重要であることを示している.以上の結果は現在のところ全て学会発表止まりで,さらに慎重な検討を要するものであるが,興味深いものであると考えている.今年度は,2009年度にほぼ出来ていた回転電場印可・温度調節可能な顕微鏡について,部品の自作などによって低温観察時の結露を防ぐ仕組みを完成させ,実際にF1-ATPaseの回転を低温で観察して高濃度のATPでもステップが観察できることを確認した.更に実際の実験を行いながら使い勝手の改善を行う予定である.また,非水溶媒としてDMSOを30%加えた条件下でF1のステップ回転時の角速度の低下が既に観察されていたが,DMSOの溶媒の粘度に対する影響をレーザーピンセットで捕捉した粒子のブラウン運動や,F1に固定した回転プローブに対する揺動散逸関係を利用した解析から見積り,ステップ回転時に発生するトルクが減少していることが確認できた.更にストールトルクも減少していることが示されたが,定量的な解析はこれからである.ヌクレオチドの結合の温度依存性の解析については単離サブユニットとα_3β_3γ複合体に対する各種ヌクレオチドの結合のデータがほぼ出そろってきており,エントロピー変化とエンタルピー変化の違いなどが明らかになってきている.以上の結果は依然として全て学会発表止まりであるが,データを確実にして論文投稿にもってゆく予定である.2010年度の大きな成果としては,非平衡物理学の成果であるHarada-Sasa等式を利用したF1-ATPaseの回転に伴うエネルギーの散逸の見積がある(Toyabe et.al PRL2010).これは回転自由度でのエネルギーの散逸をATPの加水分解自由エネルギーや外部トルクを制御して測定したもので,その結果,F1-ATPaseは実験条件下でほぼ100%の効率でATPの加水分解自由工ネルギーを回転自由度を介して散逸させることが分かった.これは分子機械の理解のための大きな進歩であると考えている.本研究ではF_1-ATPaseによるATPの加水分解自由エネルギーと回転運動の化学力学変換のメカニズムの理解とともに、水中でATPを加水分解して働く分子機械特有のダイナミクスに対する水和の効果を理解することを目的として研究を進めてきた.所期の計画としては,1.温度と外部トルクの同時コントロールが可能な顕微鏡を用いた回転観察.2.γサブユニットが感じるポテンシャルの推定.3.DMSOの回転に対する影響についての実験.4.ヌクレオチドの熱力学的結合パラメータの決定.5.様々なヌクレオチドによる回転をα_3β_3γ複合体について解析.6.ストップトフローを用いた実験,等があったが,最も進んだのは2.の研究で回転のトラジェクトリから最尤推定を用いるという方法でポテンシャルの形だけでなく,ステップ回転をする時にポテンシャルが切り替わる位置の情報までもが得られ,今まで得られていた他の結果ときれいに整合するものとなったことにより,メカニズムの理解が一歩前進した.この件については投稿論文として発表することが出来た.その他4.に関しては着実にデータの蓄積がすすみ,近いうちに投稿論文にまとめられるものと考えており,5.の研究をその先の段階として進める準備が出来ている.3.については,DMSO存在下にストールトルクが変化するという予備的な結果が得られていたが,実験担当者の交代により,実験精度が維持出来ない状態で,残念ながら肯定的な結果も否定的な結果も出ていない.6.は予備的な結果が出たのみであるが今後の進展に悲観的な要素はないと考えている.
運動機能解析と組織病理解析の併用による消化管運動異常症の包括的病態解明

まず我々は、食道アカラシアにおけるわが国の疫学研究は十分ではないことから、日本における罹患率と期間有病率、食道がんとの合併率、治療動向を調査した。全国のアカラシア患者数は、200517年の大規模なレセプトデータベースを使用して推定した。また、登録されている診断コードより、食道アカラシアと食道がんを合併している患者を特定した。さらにアカラシアの治療介入について調べた。約549万人の集団のうち、385人が食道アカラシアと診断された。罹患率は10万人年当たり0.811.37と算出され(男女比はほぼ1、診断時平均年齢は43.3±14.4歳)、期間有病率は10万人当たり7.0であった。年齢層にわたって、罹患率および期間有病率に統計学的に有意な増加傾向があった(すべてp<0.0001)。アカラシアを有する4人の男性が食道がんを発症し、アカラシアを有する食道がんの罹患率は100人年当たり0.25と推定された。治療介入については、64.7%の患者に初回治療として食道拡張術が行われ、そのうち56.9%で再治療が必要となった。経口内視鏡的筋層切除術(POEM)で治療された患者の割合は年々増加し、2017年は41.1%であった。以上の調査から、食道アカラシアの罹患率および期間有病率は他の国と同程度であること、食道がんの発症リスクはアカラシア患者で一般人口と比較し相対的に高いことが示された。また、主に実施されている治療法は食道拡張術であるが、POEMによる治療の割合も年々増加していることがわかった。食道アカラシア以外の罹患率・有病率算出の妥当性の検討にやや時間を割いたが既に研究成果を報告することができている。消化管運動異常症における組織学的解析の予備実験も開始している。平成30年度までの研究内容を一層深めつつ、さらに食道アカラシア以外の消化管運動異常症の研究も進める。研究に遅延が生じ、免疫組織学的解析のための試薬等の購入はH31年度に行うこととしたため未使用額が生じた。
新しい微生物ポリエステルの分子構造と分離・認識機能との相関性

最近、筆者らは、水素細菌Alcaligenes eutrophusに与える餌の炭素源を工夫することによって、新しい共重合ポリエステルを発酵合成することに成功した。吉草酸と酪酸とから、3-ヒドロキシブチレート(3HB)と3-ヒドロキシバリレート(3HV)とのランダム共重合ポリエステル(1)を発酵合成できることを見いだした。また、4-ヒドロキン酪酸から、3HBと4-ヒドロキシブチレート(4HB)との新しい共重合ポリエステル(2)が発酵合成できることを明らかにした。これらの微生物ポリエステルは、共重合組成を変えることによって多様な物性を発現し、強い糸、しなやかで透明なフィルム、弾性に富むゴムなどさまざまな材料となることを示した。バイオポリエステルの最大の特性は、土の中や沼の底の微生物が分泌するPHB分解酵素によって分解される生物分解性にある。筆者らは、開発した共重合ポリエステルの生物分解性を調べるために、P(3HB)、P(3HB-co-4HB)、P(3HB-co-3HV)の3種のフィルム(厚さ70ミクロン)を、土の中(2025°C)に埋めてテストした。6週間後には、4HB共重合体のフィルムは完全に分解していた。3種のフィルムを活性汚泥の中に入れ、30°Cで分解のテストを行った。その結果、4HBユニットを含む共重合体は、2週間後に完全に分解することがわかった。微生物による分解の速度は、4HB共重合体>P(3HB)>3HV共重合体の序列で低下した。PHB分解菌のAlcaligenes faecalisから分解酵素を単離・精製し、分解酵素による微生物ポリエステルフィルムの分解実験を行った。酵素分解の速度は、4HB共重合体が最も速く、3HVユニットが増加するにつれて低下することを明らかにした。このように、生物(酵素)分解性は、物性と同様に、バイオポリエステルの分子構造や共重合組成によってコントロールできることを見いだした。
フライングディスクの姿勢を安定させる投てき動作の運動学

フライングディスクを利き手側から投げ出すフォアハンドスローは、ディスクスポーツでよく使用される重要な基本技術のひとつである一方、初心者ばかりでなく競技経験の長い選手でも不得意とする者が多く、改善に非常に長い時間が費やされている。特に初心者の場合、ディスクは空中でその姿勢が安定せずにバタバタと揺れながら飛行し、距離が伸びずに落下する。しかし、改善のための科学的研究は見当たらない。本研究の目的は、ディスクのフォアハンドスローの熟練者と未熟練者の10mスローに着目し、両群におけるディスク姿勢の角速度を生成する体幹部および投てき腕の各関節運動の特徴を明らかにすることである。
苛酷環境下にあるコンクリート工場製品の耐凍害性向上に関する研究

苛酷環境下におけるコンクリートの耐久性を向上させる事はコンクリートの研究者にとって至上命題となっている。寒冷地における歩車道ブロックは凍結融解の作用や凍結防止剤の散布により表面剥離や崩壊などの被害が急増している。ここでは、コンクリート製品の一つである歩車道ブロックを対象として、コンクリートの耐久性を向上させる要因を明らかにすることを研究目的として、申請計画書に基づいて各種実験・研究を行った。3年間に亘って研究を行った結果をまとめると次のようなことがいえる。(1)コンクリート工場製品に透水型枠工法が適用できるかどうかについて検討した。試作した透水型枠と透水性シートを組み合わせることでコンクリートの表層部を強化でき、品質の良いコンクリートを製作できることがわかった。(2)透水型枠工法によって製作した歩車道ブロックの表面は透水性シートを使用した事により綺麗さが格段に向上した。また、水セメント比の低下や表層部の緻密化によってコンクリート表層部が強化され、凍害に対する劣化が抑制されることを明らかにした。(3)塩化物の浸入によるスケーリング抵抗性も透水型枠工法を用いることで向上し、歩車道ブロックの上面・側面ともにスケーリング量は大きく減少することを明らかにした。(4)コンクリート工場製品にかかわらず、コンクリート構造物の高耐久性、高機能性を考慮した時には透水型枠工法が有効な工法の一つである事を明らかにした。以上のように、凍害や塩害などを受けやすい苛酷な環境下にあるコンクリートはその表層部を強化してやることで劣化を抑え、かつ耐久性を向上させる事ができる事を明らかにした。また、透水型枠工法はコンクリート工場製品やコンクリート構造物などの表層部を強化できる有効な手法の一つであることも明らかにした。【平成14年度の研究実績の概要】1.コンクリート製品を製作する工場の実態調査コンクリート製品を製造している工場の協力を得て、製品を製造する際の材料・配合・養生方法などについて調査を行った。同工場におけるコンクリートを用いて,圧縮強度、引張強度、曲げ強度の基本的な強度を測定した。また、表層強度については現有の引抜き試験装置を用いて測定を行い,実験の基本的なデータを収集した。2.コンクリートの凍結融解試験と塩化物浸入による表面剥離に関する実験材齢の違いによるコンクリートについて、現有の凍結融解試験装置を用い、ASTM C-666 B法に準じて凍結融解試験を行った。現有の試験機器を用い、表層強度の変化、質量変化率、相対動弾性係数などからコンクリートの凍結融解抵抗性について明らかにした。表面剥離に関する実験は,12月から2月までの冬季間を利用して,降雪の中で曝露実験を行い,表面剥離について考察した。3.コンクリート表層部の強化方法コンクリート表層部の強化は透水性シートを用いた透水型枠工法によって行った。透水性シートを用いたコンクリートの表層部は余剰水が排出されて水セメント比が低下することにより,表層強度は1.52.0倍程度に増加した。これらの結果を,コンクリート工場で製造される歩車道境界ブロックに適用するために,歩車道ブロック型枠に透水性シートを装着できる型枠の試作を行った。型枠の試作にはかなりの時間を要したため,試作型枠での実験は継続中である。表層部が強化されたコンクリート製品の耐久性に関する研究とコンクリート製品工場の生産ライン上の試作型枠を通じて,次年度予定されている耐凍害生の向上要因を見出す研究の体制は十分に整っている。また,凍結融解抵抗性に大きな影響を及ぼす空気量については,シート面から内部方向へ変化する空気泡を実体顕微鏡で測定している。上記の研究成果の一部を既往の実験との関連でまとめ,研究論文として発表した。【平成15年度の研究実績の概要】1.歩車道ブロック用透水型枠によるコンクリート表層部の強化

コンクリート表層部の強化は透水性シートを用いた透水型枠工法によって行った。コンクリート製品工場で製造される歩車道ブロックに適用するために,歩車道ブロックA型枠を対象として,透水性シートを装着できる型枠の試作を行った。型枠には改良すべき点が幾つかあり、試作型枠での実験は継続中である。透水型枠工法で強化されたコンクリート製品の表層部の強度は大きく改善され、深さ7mmにおける表層強度は約1.3倍増加することが判った。また、切断した歩車道ブロックから小径コアを抜き取り圧縮強度を測定した結果、透水性シートを使用した面に近い箇所の強度増力が確認された。これらの試験に関しては実験の水準と要因を変化させながら継続していく予定である。2.コンクリートの凍結融解試験と塩化物浸入による表面剥離に関する実験透水型枠工法によって製作した歩車道ブロックコンクリートを10×10×40cmにカットし、現有の凍結融解試験装置を用いASTM C-666 B法に準じた凍結融解試験を行った。また、1日1サイクルでの塩化物(3%のNaCl溶棟)の存在下における凍結融解試験も行った。現有の試験機器を用い表層強度の変化、質量変化率、相対動弾性係数、表面剥離量などからコンクリートの凍結融解抵抗性を明らかにすべく(実験を継続中である。いずれも透水性シートを使用した歩車道ブロックの表層性状が大きく改善されており、透水型枠工法の有効性が確認できた。上記の研究成果の一部を既往の実験との関連でまとめ,研究論文として発表した。平成16年度は研究計画書に基づいて、主として下記の内容で実験研究を行った。「塩化物浸入による歩車道ブロックのスケーリング抵抗性」ASTMの試験方法に準拠した1日1サイクルでの塩化物(3%のNaCl溶液)の存在下における凍結融解試験を行い、表面剥離量を測定した。凍害と塩害の複合劣化に対する耐久性についての検討を行った結果、次のようなことがいえる。1)透水型枠工法によって作製した歩車道ブロックをカットし、上部断面と側面を対象としてスケーリング抵抗性の試験を行ったが、透水性シートを用いたブロックの上面・側面ともにスケーリング量が大きく減少し、抵抗性は格段に向上することがわかった。2)スケーリング抵抗性の向上は打設時における底面(歩車道ブロックの上面)の方が大きい。3)側面では振動締固め方法などの条件によってスケーリング抵抗性の向上は異なる傾向を示す。4)リニアトラバース法によって空気泡を測定した結果、振動締固めの条件によって空気量の分布に違いが見られたことから、振動締め固め方法がブリーディング水や空気泡の挙動におよぼす影響についての実験を行う必要があるといえる。以上のことから、透水型枠工法によって作製した歩車道ブロックのスケーリング抵抗性は大きく改善されることを明らかにした。
重症気管支喘息患者の気道におけるCCケモカインの発現とステロイド抵抗性

本院外来通院中の79名の安定期喘息患者につき、末梢血好酸球数、総IgEレベル、血漿エオタキシン濃度、血漿IL-5濃度を測定した。一方、ステロイド治療によるエオタキシン濃度を含む血中マーカーの変化を検討するため、症状増悪によりステロイド治療を要する非安定期の喘息患者22名につき、ステロイド投与前後の血中マーカーの変化を観察した。安定期の喘息患者の血中マーカーの検討では、GINAステップ4の患者では、血漿エオタキシン濃度は軽、中等症の患者に比べ高い傾向を示したが、総IgEレベル、末梢血好酸球数、血漿IL-5濃度と重症度の関連は明らかでなかった。一方、非安定期の喘息患者のステロイド投与前後の血中マーカーは、末梢血好酸球数と血漿IL-5濃度が治療後に低下傾向を示したのに対し、血漿エオタキシン濃度は不変であった。この結果、血漿エオタキシン濃度はステロイド抵抗性であり、ベースラインの重症度と疾患活動性の両者との関連が示唆された。近年エオタキシン産生誘導因子としてbradykininが注目されるようになった。気道におけるbra-dykininがエオタキシン産生を介して喘息の重症化に関与する可能性を考え、喘息患者53例、対照健常者8例の呼気濃縮液を採取し、bradykinin濃度をELISA法で測定した。呼気濃縮液中bradykinin濃度は測定可能であったが、喘息群と対照群で平均値に有意差を認めなかった。一方、重症喘息患者における気道のリモデリングの進行に線維芽細胞が重要な役割を果たすと考えられている。そこでヒト胎児線維芽細胞HFL-1を用い、近年エオタキシン産生誘導因子として認識されるようになったbradykinin, TGF-β1, oncostatin-Mなどの影響を検討した。いずれの因子も単独ではHFL-1のエオタシン産生に大きな影響を与えなかった。TNF-αはエオタキシン産生を著明に増加させたが、TGF-β1またはoncostatin-Mの同時投与により産生は軽度減少した。TNF-αによるエオタシン産生はdexamethasoneにより著明に抑制されたが、TGF-β1の追加によりさらに減少した。本院外来通院中の気管支喘息患者を重症度別に分類するため、約100名の安定期の喘息患者につき、治療内容の推移、肺機能検査所見を調査するとともに、末梢血好酸球数、総IgEレベル、血漿eotaxin-1濃度、血漿IL-5濃度を測定した。一方、ステロイド治療によるeotaxin-1濃度を含む血中マーカーの変化を検討するため、症状増悪によりステロイド治療を要する非安定期の喘息患者15名につき、経口ステロイド投与前、投与1週間後の血中マーカーの変化を観察した。安定期の喘息患者の血中マーカーの検討では、GINAステップ4の患者では、血漿eotaxin-1濃度は軽、中等症の患者に比べ高い傾向を示したが、総IgEレベル、末梢血好酸球数、血漿IL-5濃度と重症度の関連は明らかでなかった。一方、非安定期の喘息患者のステロイド投与前後の血中マーカーは、末梢血好酸球数と血漿IL-5濃度が治療後に低下傾向を示したのに対し、血漿eotaxin-1濃度は不変であった。

この結果、血漿eotaxin-1濃度はステロイド抵抗性であり、ベースラインの重症度と相関している可能性が示唆された。誘発喀痰については、各重症度に分類される安定期の喘息患者について採取を開始し、現在約20例のサンプルを集積した。In vitroの実験については、気道上皮細胞としてprimary culture, A549、単球系細胞として、U937, MonoMac 6においてeotaxin-1, MCP-4の発現をNorthern blotならびにELISA法で検出を試みた。A549、U937において、eotaxin-1, MCP-4のmRNAがTNFα刺激により誘導され、dexamethasone投与により抑制された。しかしながら、eotaxin-1, MCP-4の蛋白レベルは低く、ステロイドの長期投与や各種薬剤のケモカインレベルヘの影響をみるには、これらのcell lineではmRNAレベルでの検討が必要と考えられた。近年エオタキシン産生誘導因子としてbradykininが注目されるようになった。気道におけるbradykininがエオタキシン産生を介して喘息の重症化に関与する可能性を考え、喘息患者53例、対照健常者8例の呼気濃縮液を採取し、bradykinin濃度をELISA法で測定した。呼気濃縮液中bradykinin濃度は測定可能であったが、喘息群と対照群で平均値に有意差を認めなかった。喘息患者におけるbradykinin濃度は個人差が大きく、何らかのphenotypeとの関連が示唆された。他の因子として、LTC4も検出可能であったがエオタキシンは検出されなかった。一方、bradykininの起源として肺胞マクロファージの重要性が示唆されつつある。単球系cell lineであるMono Mac 6を種々の因子で刺激し、培養上清においてbradykinin濃度を測定した。非刺激でもbradykininは検出され、IFN-γにより産生は亢進していた。重症喘息患者における気道のリモデリングの進行に線維芽細胞が重要な役割を果たすと考えられているが、線維芽細胞はエオタキシンを多く産生する細胞型として知られている。そこでヒト胎児線維芽細胞HFL-1を用い、近年エオタキシン産生誘導に関与する因子として認識されるようになったbradykinin, TGF-β,oncostatin-Mなどの影響を検討した。いずれの因子も単独ではHFL-1のエオタキシン産生に大きな影響を与えなかったが、TGF-βとoncostatin-Mの同時投与によりエオタキシン産生は増加した。一方、TNF-αはエオタキシン産生を著明に増加させたが、この効果はdexamethasoneにより減弱し、TGF-βの追加投与によりさらに低下した。重症喘息患者の気道においてはTGF-β産生は亢進していると考えられ、TGF-β存在下においてもエオタキシン産生は持続し、ステロイド投与の影響を受けにくいと推察される。このメカニズムとしてoncostatin-M、TGF-β、ステロイドの相互作用の存在が示唆された。
ホスト-ゲスト相互作用を利用した特異的反応制御システムの構築

本研究ではホスト分子として環状糖鎖分子であるシクロデキストリン(CD)や複雑な分子を極めて厳密に認識することができるモノクローナル抗体を用いて新規超分子触媒を構築した。先に我々はCDとラクトン・ラクチドを無溶媒で反応させることで、助触媒を用いることなく開環重合を行うことに成功した。今回、さらに高活性な重合触媒を開発することを目的にCDの二級水酸基にエステル基を導入したところ、無置換のCDでは見られない重合活性を示した。β-CDの修飾位置やエステル・アミド結合の違いにより重合活性が異なることがわかった。さらに多数のCDを表面に有する球状分子を合成し、CD球状体表面からのエステルの重合を試みた。金コロイドにチオール化β-CDを添加した後にヨウ素酸化により金コロイドを除去することによってジスルフィド結合を介して多数のβ-CDが連結した球状分子を合成した。このβ-CD球状分子にδ-valerolactone(δ-VL)を添加・加熱し、CD球状体表面からのエステル重合を試みた。その結果、転化率55%でδ-VLの開環重合反応が進行した。^1H NMRの積分強度比より、β-CD球状分子1分子に対して、15ユニットのpoly(δ-VL)が存在していることが分かった。原子間力顕微鏡(タッピングモードAFM)で球状分子を観測したところ、重合前は高さが1.0nmであったのに対し、重合後は152.0nmへと増加していることがわかった。β-CD球状分子の表面でポリマー鎖を成長させることに成功した。CD球状体表面で生成したポリマー鎖にα-CDが包接することによりロタキサン構造体が形成され、エステル重合反応がさらに進むことを見いだした。本研究は超分子科学におけるホストとゲストの関係を利用した新規超分子触媒を構築することを目的として優れたホスト分子である環状糖鎖分子「シクロデキストリン(CD)」と複雑な分子を極めて厳密に認識することができる生体高分子「抗体」を用いて協奏的に触媒機能を発現させる。本年度は主にCDを用いて水が無い条件下における環状ラクトンの重合反応を検討した。CDとラクトンを混合し、100°Cに加熱したところ、助触媒や溶媒を必要とせず重合が進行し、ポリエステルが得られた。その際、ポリマーの収率はCDの空孔の大きさとモノマーめ構造に依存していることがわかった。小さいサイズのラクトンは小さい空孔をもつCDによって、大きいサイズのラクトンは大きい空孔をもつCDによって、高い収率でポリエステルを与える傾向にあることを見いだした。つまりCDとラクトンの包接錯体形成が重合反応において重要であることを示唆しており、本システムは基質選択的な触媒となることがわかった。得られたポリエステルは末端にCDがひとつ結合した構造であった。当初、生長反応ではぐポリマー鎖末端のヒドロキシル基が求核攻撃を行うと推定されたが、ポリマー鎖末端のヒドロキシル基をベンジル基で保護したモデル化合物も重合活性を示した。この結果はポリマー鎖末端のヒドロキシル基は重合反応に寄与せず、CDによるラクトンの重合反応は生長反応がポリマー鎖に結合したCDによって行われていることを示すものである。CDを用いた重合反応では、ポリマー鎖末端のCDによる反応場の提供が重要であることが明らかとなった。
ＤＮＡメチル化に制御される遺伝子探索による微小変化型ネフローゼ症候群の病因解明

微小変化型ネフローゼ症候群は小児の主要な腎疾患の一つであるが、その病因は未だ解明されていない。本研究は蛋白尿惹起液性因子を産生すると考えられる末梢血免疫担当細胞をターゲットとして、ヘルパーT(Th)細胞とB細胞を分離し、疾患の活動期、寛解期及びコントロール群間で異なるエピジェネティック修飾を受ける遺伝子と、そのエピジェネティック修飾により発現の制御を受ける遺伝子を探索することで、疾患発症の素因や蛋白尿惹起液性因子、またはその産生に関わる因子を解明すること目的とし研究を行った。患者再発時、寛解時、および健常コントロールの末梢血から採取・分離したTh細胞とB細胞からゲノムDNAと総RNAを抽出し、インフィニウムアッセイ法によるDNAメチル化アレイとDNA発現アレイを行い、ナイーヴTh細胞でゲノムワイドにDNAメチル化と発現の解析を行った。患者は男児10名、女児10名、健常コントロールは年齢をマッチさせた男児5名、女児5名で解析を行った。DNAメチル化は再発、寛解、コントロールの3群間で病勢に一致して10%以上の変化が認められた遺伝子を抽出し、T Cell Receptorを介したc-srkのチロシンキナーゼ活性やT細胞活性化における共刺激シグナルに関わる遺伝子が検出された。遺伝子発現解析では細胞性免疫、細胞分化、細胞増殖のネットワークに関連する遺伝子の発現変化が検出された。今後は他のTh細胞とB細胞でも解析を進め、各群間でメチル化の変化と発現の変化が相関する遺伝子を探索する。検出された遺伝子はDNAメチル化により発現が制御される疾患関連候補遺伝子としてバイオインフォマティクスを用いて総合的に解析するとともにsiRNAによるノックダウンや発現解析、サイトカイン定量などにより機能を推定し、病因関連遺伝子の同定を目指す。
パソコン版GLAPSの開発

1.GLAPSをパソコンに移植し、動作することを確認した。2.GLAPSのマニュアルを作成した。3.利用者アンケートにより、利用者ごとにGLAPSの使い方には大きな差があることが確認された。4.GLAPSおよびそれに関連するFORTRAN処理系の出すエラーメッセージのうち、分かりにくいものをピックアップして解説した。5.GLAPSが走るパソコン環境をどうしたらいいか、事例を紹介した。6.GLAPS用のデータ形式チェックプログラムを作成した。7.多くの学生と共同でGLAPSを利用してデータ分析を行なう場合の事例を紹介した。8.GLAPSの応用プログラムの例について、いくつか例を示した9.グラフ作成プログラムOBIの考え方と使用法を示した。10.GLAPSによるデータ処理と有意差検定プログラムの関係について考察した。11.パソコン利用が「方言」と「言語行動・社会言語学」分野でどのように行われているかを、サーベイした。以上のような内容により、GLAPSがパソコンで動作し、言語研究者に使われるように条件を整備することができた。1.研究会の開催札幌で、研究打ち合わせ会を1回開催し、それぞれの人のGLAPS利用上の諸問題やさまざまなノウハウを話し合った。その結果、それぞれの分担者ごとにGLAPSの利用方法が異なり、それぞれの利用方法にしたがって各自のノウハウが蓄積されていることがわかった。2.方言データ分析各分担者が、GLAPSを用いて方言データの分析を行なった。一部には、学生に使わせたりして、GLAPSがどのように動くか、実地に試すことができた。3.ソフトの開発GLAPSに関連して、一部のソフトを開発した。データを入力する部分と、GLAPS出力を加工する部分であるが、データ入力部分では、入力されたデータ形式のチェックを行なうプログラムなどがある。また、出力加工部分では、グラフの自動作成プログラムなどを作成した。4.GLAPSマニュアルの印刷GLAPSのマニュアルを印刷した。130ページほどのもので、パソコン版GLAPSの導入(インストール)から出力を得るまでの一通りが解説されている。1.研究会の開催東京と山口で、研究打ち合わせ会を各1回開催し、それぞれの人のGLAPS利用上の諸問題やさまざまなノウハウを話し合った。多数の初心者学生にGLAPSを使わせたりして、GLAPSの普及のノウハウなどが話し合われた。データを入力する部分と、GLAPS出力を加工する部分である。データ入力部分では、既存のデータベースソフトを活用するアイディアや各種文書とデータの総合的な管理のありかたなどが検討された。また、出力加工部分では、有意差検定のためのプログラムなどを作成した。1.研究会の開催新潟で、研究打ち合わせ会を1回開催し、それぞれの人のGLAPS利用上の諸問題やさまざまなノウハウを話し合った。この打合せの結果、GLAPSのエラーメッセージの問題などが指摘され、報告書に書くべき内容も固まってきた。3.報告書の執筆今までの3年間に話し合われてきた内容を基に、報告書を執筆した。GLAPSのエラーメッセージについて、GLAPSをとりまくパソコン環境の現状について、私のGLAPSの使い方、データチェックプログラムdcheckの考え方と使用法、学生諸君との共同のデータ分析のしかた、GLAPSの応用プログラムについて、グラフ作成プログラムOBIの考え方と使用法、GLAPSによるデータ処理と有意差検定、などが記述されている。
乳歯歯髄細胞由来iPS細胞からのLEF-1陽性幹細胞の単離

未分化であり自己増殖能力を有した幹細胞は、さまざまな組織への分化能を有している。幹細胞の中でも、間葉系幹細胞(MSCs)は、各種幹細胞特異的マーカーによって他の細胞とは区別され、再生医療分野において多くの疾患に対する臨床応用が期待されている。歯髄幹細胞はその性質がMSCsに類似し、歯科疾患に対する再生医療やその他全身疾患で応用が期待されている。LEF-1は、生物の発生に重要なwnt/β-cateninシグナルにおける転写因子であり、β-cateninを介してwnt標的遺伝子の転写に関わることがわかっている。また、iPS細胞を含めた幹細胞における未分化の維持・増殖に関与することも報告されている。LEF-1は歯の発生の初期の段階で関わることから、歯髄幹細胞を含めた未分化な歯系細胞においてマーカーとなるのではと考え、本研究においてプロモーターとして採用することとした。これまでの研究では、乳歯歯髄細胞へpiggyBacトランスポゾンベクターを用いLEF-1プロモーターを配したプラスミド(pTA-LEN)の遺伝子導入実験を行ってきた。本研究では同様のプラスミド(pTA-LEN)をiPS細胞へ導入し、LEF-1陽性乳歯歯髄細胞由来iPS細胞の単離を目的としている。フィーダー細胞上にて培養した乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へ遺伝子導入後、薬剤選択の段階でフィーダー細胞ごとiPS細胞が剥がれてしまい、多くのiPS細胞が死滅する現象が続いた。そこでフィーダーフリーでの培養に切り替え、遺伝子導入から薬剤選択を安定して行えるよう培養条件を変更することとした。しかし、これまでフィーダー上で培養していた乳歯歯髄細胞由来iPS細胞をフィーダーフリーでの培養に切り替えたが、未分化の維持を安定させることが困難であり、今後はiPS細胞の培養方法のさらなる検討を行う予定である。近年、乳歯を用いた再生医療が着目されており、申請者はこれまでの研究より、幹細胞の増殖や未分化の維持に関与するWntシグナルの転写因子の1つであるlymphoidenhancer-bindingfactor-1(LEF-1)に着目し、乳歯歯歯髄細胞(HDDPCs)より転写因子を標的としてLEF-1陽性幹細胞の単離を行ってきた。HDDPCsへLEF-1プロモーターを配したプラスミドの遺伝子導入実験を行ってきたが、遺伝子導入効率が悪く、十分な結果が得られていなかった。そのため、哺乳類細胞への遺伝子導入効率が高いとされるpiggyBacトランスポゾンベクターを用い同実験を修正したところ、遺伝子導入効率が高くなり、薬剤耐性を持ったLEF-1陽性乳歯歯髄細胞の単離が可能となった。乳歯歯髄細胞よりLEF-1プロモーターを用いてLEF-1陽性細胞の単離が可能となったことから、本研究ではHDDPCs由来iPS細胞を用いた実験を計画した。HDDPCs由来iPS細胞から遺伝子工学的手法を用いて「LEF-1陽性幹細胞」を単離・濃縮し、その性状を解析することを目的とした。LEF-1プロモーターを配したプラスミド(pTA-LENプラスミド)を構築し、iPS細胞に最適な条件を検討した上で、HDDPCs由来iPS細胞へLEF-1プロモーターを配したプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入後のLEF-1陽性細胞をG418にて薬剤選択を行ったところフィーダー細胞ごとiPS細胞が剥がれてしまう現象が認められたため、薬剤選択の条件の検討を行っている。薬剤選択の際にiPS細胞がフィーダー細胞ごと剥がれてしまう現象が認められたことは、遺伝子導入後に使用する培養液の影響が関係している可能性が考えられる。

今後は、再度HDDPCs由来iPS細胞へLEF-1プロモーターを配したpTA-LENプラスミドを遺伝子導入し、LEF-1陽性細胞を単離できないか実験を行う予定である。その際、薬剤選択の際のG418の濃度および培養液の再検討を予定している。また、実験がうまくいかない場合は、フィーダーフリー培養への切り替えも検討している。
直鎖状ポリユビキチン鎖による細胞死抑制メカニズムの解析

新規のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ポリユビキチン鎖を特異的に生成するLUBACユビキチンリガーゼはTNF-alpha等によるNF-kappaBシグナル活性化に関与する。これまでに我々は、LUBACがNF-kappaB活性化非依存的にTNF-alpha下流で惹起される細胞死を顕著に抑制することを見いだした。本研究ではLUBACによる細胞死制御メカニズムを探索するために、LUBACを構成するサブユニットをノックアウトした細胞を作成し、様々なLUBACサブユニットの変異体を入れ戻し、細胞死制御に必須な領域を同定した。また質量分析でその領域に結合するタンパク質を探索した。TNF-alpha等のデスレセプターを介する刺激では、細胞の生存を促すNF-kappaBシグナル活性化に加え、細胞死を誘発する相反したシグナルが伝達される。これまでに新規タンパク質翻訳後修飾である直鎖状ポリユビキチン鎖を特異的に生成するLUBACユビキチンリガーゼは、TNF-alpha下流でのNF-kappaBシグナル活性化に関与することが明らかとなっているが、細胞死制御におけるLUBACの関与は不明であった。LUBACの直鎖状ポリユビキチン鎖形成能を欠損した細胞を、TNF-alphaとタンパク質翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドで処理したところ、野生型に比べ細胞死が顕著に起こること、また細胞死を惹起するタンパク質複合体の形成が顕著に亢進していることを見いだした。これらの結果はLUBACがNF-kappaB活性化非依存的に細胞死を惹起する複合体形成を抑制していることを示唆する。本研究ではLUBACの細胞死抑制機構を調べるために、LUBACを構成する全サブユニットを欠損した細胞をCRISPR/Cas9技術を用いて樹立した。LUBAC欠損細胞にレトロウイルス発現系を用いてLUBACの各種領域を欠損した変異体を入れ戻し、細胞死制御に必須なLUBACの領域を同定した。ユビキチンリガーゼは基質にユビキチン鎖を付加することで、タンパク質の機能を制御するので、同定した領域に結合するタンパク質がLUBACによる細胞死制御機構を解明する上で重要だと考え、質量分析法により結合タンパク質を探索中である。また、変異体入れ戻しの過程でLUBACの制御において新しい現象を発見したので、細胞死制御機構の解析に加えそちらも解析を行っていく。細胞死制御に必須のLUBACの領域を同定できた。また、LUBACの制御において新しい現象を見いだしたと共にLUBACによる抗細胞死を負に制御する新しい制御機構も見いだした。申請者の所属研究室では新規のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ポリユビキチン鎖を特異的に生成するLUBACユビキチンリガーゼを同定し、LUBACがTNF-alpha下流でのNF-kappaBシグナル活性化に関与することを見いだしてきた。申請者はさらに、NF-kappaB活性化非依存的にTNF-alpha下流で惹起される細胞死をLUBACが顕著に抑制することを見いだした。LUBACは活性中心を有するHOIP、アクセサリー分子であるHOIL-1L、SHARPINの三者複合体から成る。本研究ではLUBACによる細胞死抑制機構を調べるために、LUBACを構成する全サブユニットを欠損した細胞をCRISPR/Cas9技術を用いて樹立した。LUBAC欠損細胞にレトロウイルス発現系を用いてLUBACの各種領域を欠損した変異体を導入し、細胞死制御に必須なLUBACの領域を同定した。ユビキチンリガーゼは基質にユビキチン鎖を付加することで、タンパク質の機能を制御するので、同定した領域に結合するタンパク質がLUBACによる細胞死制御機構を解明する上で重要だと考えられる。そこで野生型LUBAC、細胞死を抑制出来ない変異型LUBACを発現する細胞からLUBACを精製し、質量分析法により結合タンパク質を探索した。現在、同定されたタンパク質の評価と共に、LUBACの精製方法、質量分析法の条件をさらに検討している。また、細胞死制御に必須なLUBACの領域を同定する過程で、LUBAC自身の安定性に関与する新規メカニズムを発見し、現在論文作成中である。それに加え、LUBACによる抗細胞死効果を制御するメカニズムも発見し解析中である。解析の過程で見いだした現象の論文化を急ぐと共に、同定したLUBACの領域に結合する細胞死制御タンパク質の同定を行う。分子生物学次年度は、同定したタンパク質の機能解析を精力的に行うのに加え、論文投稿の予算が必要となるため。同定したタンパク質を機能解析する上で必要な試薬(抗体やsiRNAやTNF等の細胞刺激因子)に加え、論文投稿の予算、研究成果を発表する為の学会費や旅費を計上する。
ナノギャップ電極を利用した熱ゆらぎ温度計の実証

ナノギャップ電極間における電気化学測定は,電気二重層がオーバーラップするような特殊な場の中での電気化学反応となるため,電気二重層の強い電界拘束環境に支配されると予想される。そこで,拡散係数に影響を与えるパラメーターである,水和半径や価数の異なる様々なイオンの拡散係数を電気インピーダンス測定を利用して測定した。その結果,測定したインピーダンスのナイキストプロットと,等価回路解析により,水和半径と拡散係数が反比例の関係あることを見出し,拡散係数と電流との相関はDebye-Huckel-Onsager equationで表せることを見出した。ナノギャップ電極間における電気化学測定は,電気二重層がオーバーラップするような特殊な場の中での電気化学反応となるため,電極間のレドックスサイクルで生じる電流量は,電気二重層の強い電界拘束環境下におけるイオンの拡散係数に支配されると予想される。拡散係数は電気インピーダンス測定における電流やワーブルグインピーダンスとして定量化出来るため,測定したインピーダンスのナイキストプロットと,等価回路解析により,水和半径と拡散係数が反比例の関係あることを見出し,拡散係数と電流との相関はDebye-Huckel-Onsager equationで表せることを見出した。実験面だけでなく,理論面での解析にも取り組み,有限要素法シミュレーションで流れ場,拡散,電気化学反応などを連成して解くことにより,ナノギャップ電極間における物理現象の定量的把握と,得られた実験データの理論解析を行った。その結果,定性的には実験値と良い一致を示すものの,定量的には誤差が大きい結果となった。これは,測定回路の誤差の要因とシミュレーションの精度の両方が反映されている結果と考えており,特に,高周波領域における電極と基板間の規制容量や配線ケーブルの特性インピーダンスの影響を考慮する必要がある結果となった。本年度はデバイスの作製と測定系の構築を行った。ナノ流路中にナノギャップ電極を組み込んだ評価用のナノ流体デバイスを構成し,ナノ電極間に超微少電流計を接続した測定系を組み上げた。ナノ流体デバイスの作製に当たっては,H20H22年度の基盤研究(C)で申請者が開発したナノ流路+ナノギャップ電極を元に作製した。本研究ではナノ加工に高度な半導体微細加工装置が必要となるため,申請者の現有装置だけでなく,かわさき新産業創造センター(KBIC)内の東大・東工大・早稲田大・慶応大の4大学で共同運営する最新のMEMS微細加工装置群を利用した。超微少電流計測に関しては,申請者現有の市販の電流計だけでなく,自作のオンチップ型電流計の設計と開発も進め,オンチップ化によるノイズの低減効果により,市販の装置と遜色無い高感度測定が可能であることを実証した。さらに,作製したデバイスによって,ナノ流路内に生じる電気二重層のイオン濃度依存性に関する測定にも成功した。熱ゆらぎによる増幅効果を得るに当たって,予備的に拡散係数の異なる溶媒,すなわち,水,イソプロピルアルコール,アセトニトリルなど,いくつかの溶媒を用いて電気二重層の広がりを測定した。溶媒だけでなく,溶質の違いに関しても検討し,1価のカチオンとしてリチウム,カリウム,ナトリウムイオンを,2価のカチオンとして,マグネシウムやカルシウム,さらに3価のイオンとしてアルミニウムイオンを用いた電気インピーダンス測定を行い,イオンの価数,および,イオン半径や水和半径が電界中の移動度に与える影響を計測し,実測した電気二重層の広がりが,従来の電気二重層理論と良く一致することを実証した。ただし,電気容量に関しては,理論式との解離が大きいため,その詳細な検証は次年度に持ち越すこととなった。H24年度は測定デバイス(ナノ流路+ナノ電極)の作製法の確立を目標としていた。実際は,測定デバイスだけでなく,オンチップ型の測定回路の試作と評価まで進み,かつ次年度に予定していたナノ流路特有の電気二重層構造の測定にも成功した。研究は順調に進んでいる。H25年度の研究で,熱ゆらぎによる電流変化の測定が実証されれば,当初計画の目標が達成される。具体的には,デバイス下部にヒーターを設置して電流変化の温度依存性を測定する。電流変化が少なく,十分な変化が無かった場合の対応として,電解液溶媒を水より低粘度のアセトニトリルに交換して評価する。アセトニトリルでは水に対して3倍近い拡散係数が得られるため,電流増加が期待できる。従って,最終的には温度依存性と共に,粘度依存性の測定も進める予定である。該当無し
樋門周辺堤体内のゆるみや空洞の生成・発達機構の解明と河川堤防危険度評価への応用

杭で剛支持された剛構造樋門の周辺堤防内には,ゆるみ領域や空洞の存在がしばしば確認されており,それらの分布や規模によっては堤防の安全性に重大な影響を及ぼすことになる。平成10年以降,樋門の設計は柔構造を基本としているが,今なお現存する樋門の多くは杭基礎を有する剛構造樋門であり,その周辺地盤にはゆるみ領域や空洞が伏在している可能性がある。近年頻発する豪雨に備え,樋門周辺地盤におけるゆるみ領域・空洞の有無の確認や対策の実施は急務となっている。本研究では,剛構造樋門の周辺に発生するゆるみ領域・空洞の生成・発達メカニズムを解明し,さらに,これらの影響を考慮した破堤危険度評価手法の提案を試みた。H27年度は,ゆるみ・空洞の生成・発達のメカニズムを明確にし,さらに,ゆるみ領域や空洞が河川堤防の浸透安全性に及ぼす影響を明確にするため,以下に示す模型実験を行った。1水位の繰返し変動を模擬した二次元繰返し浸透模型実験:樋門の横断面のみをモデル化した二次元模型実験装置を製作し,繰返し作用する浸透力による樋門周辺の土砂の吸出し過程を観察することにより,樋門下部空洞に起因するゆるみや空洞の発生過程について検討した。その結果,水位変動により樋門周辺地盤は空洞方向への浸透力を受けることで下部空洞に吸い出され,劣化領域が樋門側部から上部に向かって拡大することが分かった。2高水位における浸透流を模擬した三次元浸透模型実験:樋門を含む堤体の一部を再現した三次元繰返し浸透模型実験を行い,樋門底部への樋門側部土砂の吸い出しに加え,樋門底盤直下に形成される水みちの発達やそれに伴う土砂流失について観察した。その結果,樋門周辺地盤は排水時における浸透力によって下部空洞に吸い出され,これらの土砂はさらに樋門下部に形成された水みちに沿って堤内地側に流出することで,樋門周辺地盤の劣化が進行して行くことが分かった。さらに,初期空洞の幅によって樋門周辺堤防の劣化速度大きく異なるが,いずれのケースにおいても繰返し浸透を重ねるによって劣化が発生する可能性があるという結果が得られた。3ゆるみ領域・空洞を再現した堤防の浸透模型実験:樋門周辺地盤に様々な寸法を有するゆるみ領域を生成させた後,洪水時の高水頭差を作用させ,樋門周辺地盤の挙動を観察した。その結果,初期ゆるみ領域が広いほど,その後の高水頭の作用による被害が大きいことが分かった。特に,初期ゆるみが樋門より高い位置まで発生した場合は,その後続の一回目の洪水によって,空洞・ゆるみ領域が地表面近くまで急激に拡大し,堤防の安全性に大きい影響を及ぼす結果が得られた。以下の理由により,当初の計画以上に進展していると判断する。1研究の進捗状況について:申請時に予定していた,ゆるみ・空洞の生成・発達のメカニズムを解明するための二次元および三次元模型実験は予定どおり実施しており,十分なデータを収集できている。さらに,次年度予定していたゆるみ領域・空洞を再現した堤防の浸透模型実験も開始しており,ゆるみ領域や空洞が堤防の浸透安全性に及ぼす影響について確認できただけでなく,今後の実験の方向性も見出している。2研究成果の発進状況について:研究成果は直ちに査読付き論文,および地盤工学会学術講演会や土木学会年次大会の概要集に投稿できている。H28年度は,ゆるみ・空洞など劣化領域の生成・発達のメカニズムを明確にし,劣化領域を考慮した河川堤防の浸透安全性の評価方法を提案するため,以下に示す追加の模型実験と数値解析を行った。1水位の繰返し変動を模擬した二次元繰返し浸透模型実験では,樋門周辺地盤に発生する間隙水圧の変動の計測に成功し,既往の研究において目視の情報により推察した劣化領域の発生メカニズムに対し,土質・水理学的な根拠を得ることができた。具体的な成果として実験結果より,劣化領域は水位の繰返し変動によって次のように発生・進展していくことが分かった。給水時,地盤内に水が浸透するとともに空洞周辺が飽和状態となり,飽和した空洞周囲の土はサクションの消失によって不安定になり,一部の土粒子が水中に落下し,空洞が拡大される。排水時は,水位低下に伴って下向きに作用する浸透力によって,土粒子が下部空洞に向かって下方に移動し,下部空洞から排出される。また,空洞がある程度進展すると,空洞上部の地盤が不安定となり,ひび割れの発生や,徐々に崩落するなどの現象が見られた。2二次元繰返し浸透模型実験を対象とする数値解析では,水位の繰返し変動による間隙水圧や浸透力の変化をある程度再現することはできたものの,地盤中に発生する空気圧の評価や,地盤の不飽和浸透特性のモデル化など様々な課題も見られた。3ゆるみ領域・空洞を再現した堤防の浸透模型実験では,樋門周辺地盤に様々な寸法を有する劣化領域を生成させた後,洪水時の高水頭差を作用させ,樋門周辺地盤の挙動を観察した。その結果,初期ゆるみ領域が広いほど,その後の高水頭の作用による被害が大きく,特に初期ゆるみが樋門より高い位置まで進んだ場合は,その後続の一回目の洪水によって,空洞・ゆるみ領域が地表面近くまで急激に拡大し,堤防の安全性に大きい影響を及ぼすため,至急補修が必要であることが分かった。以下の理由により,概ね当初の計画どおりに進展していると判断する。