hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋環境の変動による底生有孔虫群集の変化に関する研究

申請者らは有明海,八代海,鹿児島湾,名瀬湾の海底から柱状試料を採取し,その中に含まれる底生有孔虫・浮遊性有孔虫の同定および群集解析,軟体動物・マクロベントスの同定と群集解析および堆積学的分析(粒度分析,砂粒分析,ソフトX線撮影など)を行なっている。とくに鹿児島湾では,湾奥部北東に位置する海山の水深80m付近周辺域から熱水に特有なハオリムシが発見された。この海域には多くの火山性海底噴気が存在しており,この発見は世界で最も浅い記録になる。ハオリムシのコロニーの周辺から採泥し,その中の底生有孔虫を現在調べている。また,この海域の水深200m凹地にも多くの火山性海底噴気が点在し酸性水塊が発生している。新たに柱状試料を採取し,酸性水塊の消長と底生有孔虫との関係を調べ,水深200m凹地では少なくとも大正時代以前から酸性水塊は存在し,水深140mの海底付近へは1960年頃を境に酸性水塊の影響が及んだことが明らかになった。一方、名瀬湾から得られた柱状試料では,泥からサンゴ片を多く含む砂礫に漸移している。下位の泥層は,含まれる底生有孔虫や炭質物から内湾の泥と考えられ,底生有孔虫の中ではAmmonia beccariiのtepida typeが卓越することから内湾度が高かったと思われる。ウルム氷期以降の,海水準がまだ低い時期の堆積物の可能性がある。上位の砂礫層は,その大半がbioclasticsからなることより高エネルギー下の堆積物と考えられ,海水準の上昇,水温の上昇によって現在に近い環境下で堆積したと推定される。これらの試料について,^<14>C法による年代測定を依頼しており間もなく結果が明らかになる予定である。他の海域の試料についても早急に底生有孔虫やその他のベントスの群集解析を行ない,報文を完成させる予定である。
大腸鋸歯状病変における内視鏡的・分子生物学的診断ツールの開発

色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する第二相試験を行い「黄色粘液付着」が鋸歯状腺腫(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)診断における有用な内視鏡的鑑別所見となった.一方,分子生物的解析では,左側病変に比べ右側大腸の鋸歯状病変でCpG island methylator phenotype陽性大腸癌の前駆病変である可能性を明らかにした.さらに,右側大腸のSSA/Pと過形成性ポリープについてDNAメチル化アレイ解析を行い,腫瘍発生過程に関与しうる新規候補遺伝子群を抽出した.H24年度に行った後向きコホート研究結果をもとに「色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する第二相試験」を多施設共同試験として6月より開始した.鋸歯状ポリープ120例を目標に症例をリクルートしており,現在約60例の登録がある.これにより鋸歯状腺腫に特徴的内視鏡所見を探索することをエンドポイントとしている.本研究について説明・同意がえられた大腸ポリープ患者のうち,内視鏡的に鋸歯状病変を疑い,かつ6mm以上病変から内視鏡下生検により組織サンプル採取を行った114病変86症例について臨床病理学的所見及び分子生物学的所見と内視鏡所見との関連について解析している.現時点での解析結果について述べる.大腸鋸歯状病変には,組織学的に過形成性ポリープ,鋸歯状腺腫に分けられが,その内視鏡的鑑別はしばしば困難である.類似の内視鏡所見を示す大腸鋸歯状ポリープにおける分子生物学的検討では,BRAF変異の頻度については有意な差は認められなかったが,CIMPについては右側大腸病変で有意に高率であった.今回の結果から右側大腸の鋸歯状病変は左側病変に比べCIMP陽性大腸癌の前癌病変である可能性が考えられた.さらに,25年度末から鋸歯状ポリープのうち鋸歯状腺腫(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)と過形成性ポリープ(hyperplastic polyp, HP)についてアレイ解析も開始した.これまでの研究結果からHP,特にMVHPからSSA/Pへ進展する可能性があり,この進展にかかわる新規遺伝子異常を調査するのが目的である.なお,これら分子生物学的解析については当大学のゲノムに関する倫理委員会の承認をえて解析を進めている.本研究について説明・同意がえられた大腸ポリープ患者のうち,内視鏡的に鋸歯状病変を疑い,かつ6mm以上病変から内視鏡下生検により組織サンプル採取を行った.現在,当大学の倫理委員会の承認をえて症例集積ならびに組織サンプル採取を開始している.現在,60症例の組織サンプル採取が終了している.臨床データ集積であるが,内視鏡所見については,一般的所見に加えて色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見も含めてデータ集積を行う.後向きコホート研究において鋸歯状ポリープの特徴的内視鏡所見の解析を行った.特徴的内視鏡所見を拾い上げることができた.1)H25年6月より開始した「大腸鋸歯状病変における内視鏡所見と臨床病理学的特徴に関する前向き多施設共同試験」であるが鋸歯状ポリープ120例の目標症例数の登録が終了し,現在内視鏡切除標本に対する病理所見の中央診断レビューが進行中ある.病理診断レビューが終了次第最終解析に入る予定である.本試験は,鋸歯状腺腫に特徴的内視鏡所見を探索することをエンドポイントとしている.2)本研究について説明・同意がえられた大腸ポリープ患者のうち,内視鏡的に鋸歯状病変を疑い,かつ6mm以上病変から内視鏡下生検により組織サンプル採取を行った114病変86症例について臨床病理学的所見及び分子生物学的所見と内視鏡所見との関連について解析を行い,解析結果を国際学会で公表しH26年8月に論文にて最終解析結果を報告した(Endoscopy International Open 2014;02:E171).解析結果から,内視鏡的に工藤分類II型腺口形態を示す大腸鋸歯状病変では右側と左側大腸病変において異なる分子生物学的特徴を有し,右側大腸のMVHPからSSA/Pを介しCIMP陽性大腸癌へと発育・進展する可能性が推定された.さらに,25年度末から鋸歯状ポリープのうち鋸歯状腺腫(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)と過形成性ポリープ(hyperplastic polyp, HP)についてDNAメチル化に関するアレイ解析も開始した.これまでの研究結果からHP,特にMicroveiscular HP (MVHP)からSSA/Pへ進展する可能性があり,この進展にかかわる新規遺伝子異常を調査するのが目的である.今回SSA/PとMVHPを各3病変抽出しMCAMを行い,SSA/Pに発現の強い候補遺伝子をリストした.H27年度は鋸歯状病変サンプルを用いてvalidation studyを行い,有意な遺伝子について機能解析を進めていく予定である.なお,これら分子生物学的解析については当大学のゲノムに関する倫理委員会の承認をえて解析を進めている.1)H25年6月より開始した「色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する第二相試験」多施設共同試験であるが鋸歯状ポリープ150例151病変をもって登録終了となった.現在、病理医2名による病理中央判定を行っている。

本研究では、鋸歯状腺腫の診断に有用な内視鏡所見を探索することをプライマリーエンドポイントとして進めている.平成28年度には最終解析結果を報告できる予定である2)内視鏡的に鋸歯状病変を疑い,かつ6mm以上病変から内視鏡下生検により組織サンプル採取を行った114病変86症例について臨床病理学的所見及び分子生物学的所見と内視鏡所見との関連について解析し,右側大腸の鋸歯状病変は左側病変に比べCpG island methylator phenotype (CIMP)陽性大腸癌の前癌病変である可能性が考えられた(Endosc Int Open 2014).この結果から,鋸歯状ポリープのうち右側大腸の鋸歯状腺腫(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)と過形成性ポリープ(hyperplastic polyp, HP)についてアレイ解析も開始した.これまでの研究結果からHP,特にMicrovesicular HP (MVHP)からSSA/Pへ進展する可能性があり,この進展にかかわる新規遺伝子異常を調査するのが目的である.現在,当大学のゲノムに関する倫理委員会の承認をえて解析を進めている.いくつかの新規候補遺伝子を抽出しており,現在機能解析を行っている.現時点での進行状況としてはほぼ予定通りと思われる.色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する前向き第二相試験において症例集積が予定より少し遅れたが,予定症例数の登録は終了した.鋸歯状ポリープの発癌過程に関与する新規候補遺伝子の機能解析についても進めていきたい.1)H25年6月より開始した「色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する第二相試験」多施設共同試験であるが、今年度病理医2名による病理中央判定が終了し鋸歯状ポリープ150例151病変をもって登録終了となった.現在、病理医2名による病理中央判定が終了し最終解析結果として「黄色粘液付着」が鋸歯状腺腫診断における有用な内視鏡的鑑別所見となった.本研究の解析結果は,第25回欧州消化器病関連学会週間(UEGW)での発表を予定している.また,現在論文作成も最終段階である.色素内視鏡併用下で腺口形態所見及びNarrow Band Imagingによる微細血管所見による鋸歯状ポリープ診断に関する第二相試験を行い「黄色粘液付着」が鋸歯状腺腫(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)診断における有用な内視鏡的鑑別所見となった.一方,分子生物的解析では,左側病変に比べ右側大腸の鋸歯状病変でCpG island methylator phenotype陽性大腸癌の前駆病変である可能性を明らかにした.さらに,右側大腸のSSA/Pと過形成性ポリープについてDNAメチル化アレイ解析を行い,腫瘍発生過程に関与しうる新規候補遺伝子群を抽出した.現時点での進行状況としてはほぼ予定通りと思われる.
廃用性筋萎縮予防のための適切な運動負荷量の検討

可及的に廃用性筋萎縮を予防するため、早期から運動療法が実施されるが、脆弱な筋にストレスを加えると微小な外傷が生じる危険性がある。これを回避し、かつ萎縮をできるだけ避けるような運動負荷の方法について実験材料としてラットヒラメ筋を用いて検討した。これらに対して後肢懸垂を行った。その結果、後肢は無荷重となり、また後肢の筋群の活動は約70%減弱した。後肢懸垂中に筋萎縮を予防する目的で、等張性、等尺性筋収縮、および後肢の荷重運動を行った。組織学的検索により筋繊維の横断面積および外傷にともなう組織の変性を評価するためモノクローナル抗体(EDI)によるマクロファージの染色、さらにプロテアーゼ活性の変化を測定した。そして神経・筋接合部の形態的変化も観察した。結果、横断面積は荷重運動が一番小さく、等張性、等尺性筋収縮運動の順であった。マクロファージの出現の頻度は、荷重運動や等尺性筋収縮運動では散見される程度であったが、等張性運動では著明に多く見られる筋があった。Ca^<++>依存性中性プロテアーゼとそのインヒビターの活性は等張性収縮運動で最も高く、次いで荷重運動、等尺性筋収縮運動の順であった。リソソーム酵素であるカテプシン類の活性もほぼ同様の変化であった。神経・筋接合部の神経下装置の退行性変性の程度は、荷重運動が最も著しく、等張性、等尺性筋収縮運動の順であった。これらの結果より、等尺性筋収縮運動が筋萎縮は比較的少なく、組織の崩壊の程度も小さく、また神経・筋接合部の退行性変性も僅かであることより、予防の運動として最適であると思われる。神経難病、脳卒中、あるいは高齢などによる寝たきり患者に併発する廃用性筋萎縮の予防や改善を目的に、後肢懸垂ラットを用いて、運動療法の効果について検索した。本年度は特に老齢ラットに、老年性の筋萎縮、さらにこれに後肢懸垂による廃用性の萎縮が加わった場合の、トレッドミル走行による運動効果について、ヒラメ筋を材料に検討した。ミオシンATPase染色による筋細胞径の計測結果より、4週間の運動後、老年性の筋萎縮は予防が可能であった。しかし、廃用が加わると筋細胞径は縮小したままであり、萎縮の予防は不可能であった。アクリジン・オレンジ染色によるRNAの増減を検討すると、運動を行った場合は細胞質内の筋鞘下には橙色の蛍光を発する部分が存在した陽性細胞が多く見られ、対照群に比べややRNAの増加が認められた。すなわち萎縮筋では運動が引き金となり、アクチンやミオシンの合成能が若干亢進することが示唆された。ヘマトキシリン・エオジン染色による形態学的検索の結果、筋は単に萎縮するのみならず中心核、塩基好性細胞、群性萎縮、あるいは小角化細胞などの筋原性および神経原性の変化を示していた。一方、運動を行っているとこれらの変化は減少していた。筋細胞の変性と関連し、神経・筋接合部にも種々の変性像が認められた。その頻度は、運動を実施しているとやや減少する傾向にあった。すなわち、加齢や廃用による萎縮筋に対するトレッドミル走行による運動は、萎縮の進行を緩解させることが可能であるが、予防は困難であることが示唆された。廃用性筋萎縮予防のための運動負荷量を検討するため、本年度は萎縮筋および予防のために運動負荷を加えたマウスヒラメ筋の神経・筋接合部(NMJ)の超微形態がどのような変化を示すのか、定量的、定性的に検索した。マウス18匹を三群に分け、6匹を対照群に残りの12匹を実験群とした。実験群には後肢の懸垂を行った。

その結果、後肢は無荷重となり、また後肢筋群の筋活動は対照群に比し、1/31/4に減弱した。実験群の内の一群(6匹)は筋萎縮の予防を目的とした運動負荷を小動物用トレッドミルを用いて加え、筋萎縮の予防を計った。定量的検索は、筋線維をタイプIとタイプIIに識別し、各々の線維を支配するNMJの神経軸索に面する一次シナプス間隙長と神経下裂隙長を乗じた領域を計測した。定性的検索は、NMJ自身や神経下装置の変性、神経原性変化など種々の退行性変性の頻度を比較した。廃用性萎縮筋のNMJは、タイプI線維およびタイプII線維ともに対象群のそれに比べ平均すると約50%膨大していた。トレッドミル走行による運動負荷を加えると、タイプI線維のNMJは対照群のそれと変わらなかったが、タイプII線維のNMJは約40%膨大していた。実験群では退行性変性を主体とした種々の形態的異常が観察された。この異常は、運動負荷を加えた場合より、廃用性萎縮筋の方が高頻度であった。また実験群のタイプI線維よりタイプII線維のほうが頻度が大であった。この結果より、NMJの形態の保持には神経栄養効果が重要であり、筋活動の多寡にともない、代謝が変化していることが示唆された。
膜タンパク質膜挿入における糖脂質MPIaseのシャペロン様・酵素様活性機構の解明

基質タンパク質Pf3の膜挿入状態の決定タンパク質の膜挿入因子である糖脂質のMPIaseや膜挿入抑制因子であるジアシルグリセロール(DAG)が基質タンパク質の膜挿入に与える影響を観測するため、固体NMRの手法の一つであるPISEMA法を用いて、基質タンパク質のモデルであるPf3の膜への挿入角度の解析を試みた。そのために、まずPf3のhelix2を含む部分構造を部位特異的に15N安定同位体標識したペプチドを固相合成法により合成した。これをバイセルに挿入した試料を調製し、このペプチドの膜挿入状態をPISEMAスペクトルにより解析した。その結果、スペクトルはペプチドのへリックス部分と脂質膜のなす角度に依存したPISEMAスペクトル特有のホイール状の特長的な相関ピークのパターンを示した。実験スペクトルをシミュレーション結果によりフィッティングした結果、Pf3部分構造は膜に対して約70度の角度で挿入していることがわかった。次に、抑制因子であるDAG存在下でPf3部分構造の膜挿入角度を解析したところ、DAG存在下では挿入が大幅に阻害され、Pf3部分構造の一部のみが膜表面近くに挿入していることがわかった。さらに、活性に影響を与える膜中の電荷がPf3部分構造の膜挿入状態に与える影響を検討したところ、Pf3部分構造の膜への配向角度は膜を構成する脂質に依存しないものの、DAGによる蛋白質膜挿入抑制は負電荷をもつDMPGの存在により増強されることを明らかにした。始めは、尿素にPf3部分構造を溶かして膜外から膜挿入することに成功していたが、この膜挿入方法を再現しようとしても再現できなくなってしまったため、バイセルの構成膜脂質であるDHPCでペプチドを包んで膜挿入する方法に切り替えることにした。この点以外は問題なく研究が進んでいる。MPIase,基質タンパク質、膜の間に働く以下の各種相互作用について解析する。MPIase-基質タンパク質Pf3の膜への挿入、結合状態を決定するために、これまでにPISEMAスペクトルを用いてPf3の部分構造で行ってきた解析を全長Pf3に対して行い、膜への配向角度を決定する。さらにMPIase、DAG存在下における配向角度の変化を解析する。MPIase-膜DAGやMPIaseが脂質膜の運動性に与える影響を解析する。既に膜脂質頭部やMPIase自身の運動性、膜の形態変化、脂質のアシル鎖の配向度合い、膜脂質のパッキング、DAGのflip-flop速度等を解析し、MPIaseが膜脂質の様々な運動性のパラメーターに影響を与えていることを明らかにしているが、さらに合成類縁体を用いた解析を行い、MPIaseの官能基が脂質の運動性に与える影響が活性とどう関係するかを突き止める。MPIase-MPIase一般に糖鎖の相互作用は弱いために、糖鎖が集まってクラスターを形成していることが知られている。MPIaseの糖鎖を蛍光標識しておき、平面膜の顕微鏡観測を行うことで、会合状態を検証する。

既に膜脂質頭部やMPIase自身の運動性、膜の形態変化、脂質のアシル鎖の配向度合い、膜脂質のパッキング、DAGのflip-flop速度等を解析し、MPIaseが膜脂質の様々な運動性のパラメーターに影響を与えていることを明らかにしているが、さらに合成類縁体を用いた解析を行い、MPIaseの官能基が脂質の運動性に与える影響が活性とどう関係するかを突き止める。MPIase-MPIase一般に糖鎖の相互作用は弱いために、糖鎖が集まってクラスターを形成していることが知られている。MPIaseの糖鎖を蛍光標識しておき、平面膜の顕微鏡観測を行うことで、会合状態を検証する。
ダブルウォールカーボンナノチューブを用いた透明伝導膜の開発

高純度の2層カーボンナノチューブ(Double Wall Carbon Nanotube,DWNT)を用い、高電気及び高光学的透過率であるDWNT透明導電膜の合成である。その成果を以下のようにまとめた。(1)DNA、NMPなど様々な界面活性剤を添加し超音波処理と超遠心処理で得られた孤立DWNT分散液が得られた。そしてPL及びUV吸収分析を通してDWNTの分散状態が孤立したことを確認した。(2)外部チューブに選択的な修飾とin-situ polymerization方法で得られたDWNT/高分子透明膜は強くて、高い伝導特性と共に透明であることを証明した。(3)CNTの表面欠陥によるDNA水溶液の分散状態を確認した。(4)DWNT分散液をポリウレタンに添加し、透明で高伝道・高熱伝導・高強度を示すポリウレタン膜に成功した。(5)製膜DWNT透明膜は500回で透明度は85%以上で、180Ω/sq以上の電気伝導性を示すことを確認した。これは、innerとouterチューブには、金属チューブが約55%程度存在することをFast Fourier Transform image processingを通して確認した。性能的には、充分にタッチパネルに応用できる数値であってITO代替物としてOLED及びLCDへの応用も視野に入っている。本研究の目的は高純度2層カーボンナノチューブ(DWCNTs)を用い、高電気及び高光学的透過率であるDWNT透明導電膜の合成である。しかし、本来のDWCNTsが持っている優れた性質を生かには分散技術の確立と光学物性の確認が重要である。界面活性剤及びDNAを用いて孤立したDWCNT分散液を得て、その分散液の光学特性を評価した。(1)DWCNT分散技術の確立と光学特性評価:様々な界面活性剤を添加し超音波処理と超遠心処理で得られた孤立DWNT分散液が得られた。そしてフォトルミネッセンス及びUV吸収分析を通してDWCNTの分散状態が孤立したことを確認した。SWCNTに比べて、DWCNTは内外層の相互作用による優れた分散能力を見せるし、内部チューブからは安定かつ高い蛍光を証明した。(2)DNAによる分散手法の確立:DNAを用いてDWCNTの単体状態までの分散化を行った。DNAは、一般的に使われる界面活性剤である分散剤、SDBSと比較して、DWCNTに対して優れた分散能力を有していた。また、ssDNAは、dsDNAより高い分散能を示した。特にナノチューブ分散溶液のpHを低下させることで大きな直径(1nm以上)をもつチューブが選択的に凝集することを見いだした。この現象を利用し、pH変化と遠心の組み合わせにより簡単に分離できる直径による選択的な分離が可能であることを明らかにした。(3)DWCNT/高分子透明膜の合成:外部チューブに選択的な修飾とin-situ polymerization方法で得られたDWCN/高分子透明膜は強くて、高い伝導特性と共に透明であることを証明した。本研究の目的は、高純度の2層カーボンナノチューブ(Double Wall Carbon Nanotube, DWNT)を用い、高電気及び高光学的透過率であるDWNT透明導電膜の合成である。詳細には、DWNTとDNAの相互作用の解明と、DWNT分散溶液から透明薄膜を製造し、その性能を評価した結果を以下のようにまとめた。1)DNAを用いたDWNTの分散法の確立および相互作用の解明:single stranded DNAを用いてDWNTの単体状態までの孤立・分散に成功し、そのDWNTとDNAの相互作用を光学的に分析した。DNAのWrappingにより孤立かつ分散されたDWNT溶液からは、DNAからのチャジー移動によるouterチューブの光学シグナルがクエンチングすることに対してinnerチューブからは強いPLを確認した。2)CNTの表面欠陥によるDNA水溶液の分散状態:DNA溶液内でのAs-grownチューブと高温で熱処理したチューブの分散状態について光学装置を用いて比較検討を行った。結晶性の低いチューブの分散性は高結晶性チューブより二倍以上優れていた。その原因として、ナノチューブ表面に存在する欠陥がDNAと高い結合性を示すことを理論的に証明した。3)DWNT

透明膜の性能評価:孤立したDWNT分散溶液からナノディッパーを用いて製造した膜は500回で透明度は80%以上で、電気伝導性は1.7KΩ/sqまで出ることを確認した。本研究では、DWNTとDNAの相互作用がSWNTとは違うことを証明し、CNTの表面に存在する欠陥の量がDNAとの相好作用に強く影響することを理論計算と実験で確認した。DWNT透明膜はSWNTより高い性能を見せており、最適化することによってITO代替物として高い可能性を示している。本研究の結果は、CNTのITO代替物以外にもバイオセンサとエネルギーデバイスなどの応用探索に役に立つことである。本研究の目的は、高純度の2層カーボンナノチューブ(Double Wall Carbon Nanotube,DWNT)を用い、高電気及び高光学的透過率であるDWNT透明導電膜の合成である。詳細には、高純度の2層カーボンナノチューブ製造と共にDWNT分散溶液から透明薄膜を製造し、その性能を評価した結果を以下のようにまとめた。(1)N-メチル-2-ピロリドンを用いたDWNTの分散法の確立:N-メチル-2-ピロリドンへの添加、及び超音波と遠心処理を行い、上澄み(70%)を採取し、光学分析を通して強い光学シグナルからチューブは単体状態までの孤立・分散状態であることを確認した。(2)DWNT入りのポリウレタン高分子成膜:そのDWNT分散液をポリウレタンに添加し、透明で高伝道・高熱伝導・高強度を示すポリウレタン膜に成功した。更に、孤立かつ分散されたDWNTのinnerチューブからは強い光学特性からチューブは高分子内に孤立分散状態であることが確認された。これは透明導電膜以外にも医療機器など様々な分野で応用可能性をもっている。(3)製膜DWNT透明膜の性能評価:N-メチル-2-ピロリドン及びsingle stranded DNAの溶液にDWNTを添加及び超音波と遠心処理を行い、得られた溶液に対して、nano-dipperを用いてPETフィルム上に製造した膜は500回で透明度は85%以上で、180Ω/sq以上の電気伝導性を示すことを確認した。これは、innerとouterチューブには、金属チューブが約55%程度存在することをFast Fourier Transformimage processingを通して確認した。性能的には、充分にタッチパネルに応用できる数値であってITO代替物としてOLED及びLCDへの応用も視野に入っている。
薬剤耐性胃癌細胞株の樹立とそのタンパクプロファイル

癌細胞の薬剤耐性のメカニズムを解明することは癌化学療法において重要である。根治手術後の補助化学療法の進歩に伴い、手術単独の治療よりも長期無再発・長期生存例が得られるようになってきた。一方、術後補助化学療法にも関わらず30-40%の再発が見られる。本研究では癌細胞がどのようにして薬剤耐性を獲得するのかの分子生物学的機構を明らかにするために胃癌細胞株に薬剤を添加し耐性細胞株として樹立した。この耐性株をCDDP下での反応を比較するとDNA傷害に関わる経路の反応が破たんしていた。このことは耐性株では細胞がストレスに暴露された場合、アポトーシスや細胞周期の停止などの適切な状態に進むことができず増殖が停止しないことを示している。固形がんに対する化学療法は、術前・術後の補助療法として治癒率の向上に貢献するようになったほか、切除不能高度進行癌・再発癌の生存期間の延長をもたらすようになった。一方で、薬剤療法抵抗性腫瘍や毒性発現による治療継続困難例も多数存在する。そのうち薬剤抵抗性の獲得はがん化学療法において大きな障害となっている。従って薬剤に抵抗性を示す細胞を解析することは、薬剤耐性の獲得メカニズムを解明するため非常に有用であると考えられる。本研究では胃癌の化学療法に最も広く使われている抗癌剤の一つであるシスプラチン(CDDP)と、ヒト胃癌細胞株であるMKN45を用いてシスプラチン抵抗性胃癌細胞集団を単離し、細胞がCDDP抵抗性を獲得した時にどのような違ったタンパク分子反応を引き起こすか検討する。今までに単離された7つのCDDP耐性細胞集団から、最も大きな差を示した集団に対して再びCDDPと接触させウェスタンブロットを行った。CDDP暴露後24時間ではp53タンパクとp21タンパクは薬剤濃度の増加に応じて発現が増強した。一方、耐性集団ではp53タンパクは16μMを中心に発現の変動がみられ、p21タンパクは薬剤濃度の増加に伴って発現が減弱した。これらのことから、これらの時間と薬剤濃度でより詳細な蛋白レベルでの検討を行うことで、親株と薬剤耐性集団の蛋白反応の違いを見ることが可能となった。今後は親株および耐性集団に対して詳細なインターバルでサンプルの回収を行い、蛋白定量解析に優れた技術であるRPA(逆相蛋白ライセートマイクロアレイ)を用いて検討を行う。薬剤存在下で生存しうる細胞集団をpropagateし、最終的に「薬剤耐性細胞集団由来細胞」として確立した細胞株の多くがその耐性を喪失していることが判明した。例外的に耐性を獲得したままのものでも、複数の薬剤に対する耐性を伴っていることが多く、単一薬剤の耐性機構を分子レベルで検討するモデルとしては最も適したものであるかは疑問が残る。これらの結果を踏まえて、我々は新たに薬剤耐性細胞集団のコロニーから直接タンパク分子プロファイルを行うことを試みている。コロニー単離までの方法は交付申請書に述べたものと同様であるが、細胞株および薬剤の種類を複数として行っている点が異なる。接触させる薬剤は対数スケールの濃度勾配とし、それぞれの薬剤濃度で生存しえた2050個のコロニーの細胞集団(直径0.5-1mm)を採取し、10μlの細胞ライセートを調製する。このライセートを用いて従来法に改良を加えたプロトコルで1コロニー1ドットのRPAを作製する。用いる一次抗体は、薬剤耐性と癌幹細胞の関連から現有する表面マーカーパネル、および細胞周期・アポトーシス・細胞骨格関連のパネルを用いる。現在まで胃癌細胞株MKN45をシスプラチンに接触させて採取したシスプラチン耐性細胞集団について検討を進めているが、シスプラチンの濃度依存性に発現が上昇する癌幹細胞マーカーがあることを示唆する結果が得られた。来年度はタンパク分子プロファイルおよび機能解析を行う予定である。一方、術後補助化学療法にも関わらず30-40%の再発が見られることも事実であり、そのような化学療法の効果が見られなかった症例への対応が急務である。本研究では癌細胞がどのようにして薬剤耐性を獲得するのかの分子生物学的機構を明らかにするために胃癌細胞株MKN45にCDDPを添加し、薬剤存在下で生存しえたコロニー由来の細胞を増殖させ耐性細胞株として樹立した。この耐性株を親株とともに再びCDDP下での反応を比較するとDNA傷害に関わる経路の反応が破たんしていることが判明した。耐性株では高度の細胞ストレスに暴露された場合、アポトーシスや細胞周期の停止などの適切な状態に進むことができず増殖が停止しないことになる。
Ｌｙ４９Ｑ介在性免疫応答とシャペロン介在性オートファジーとの時空間的クロストーク

炎症担当細胞にてサイトカイン産生等を制御する抑制性レセプターLy49Qと、細胞内ホメオスタシス維持を担うタンパク質分解系オートファジーとの関連を明らかにするため、Ly49Qノックアウトマウス由来の自然免疫系細胞や細胞株RAW264.7におけるLy49Q発現の陽性・陰性株を用いて解析した。オートファジー関連カテプシンの成熟型解析や炎症性刺激物に対するサイトカイン産生プロファイルの解析、分解小胞の細胞内局在解析等から、Ly49Qはオートファジー抑制や分解系オルガネラの輸送制御にも関わることが示唆された。本研究では、炎症担当細胞において組織浸潤やサイトカイン産生を制御する抑制性レセプターLy49Qと、細胞内ホメオスタシス維持を担うタンパク質分解系であるオートファジーとの相互作用を明らかにすることで、炎症応答におけるオートファジーの役割を理解することを目的とした。Ly49Q有無におけるオートファジー関連タンパク質の発現量を解析した結果、定常状態においてLy49Q陰性マクロファージでは陽性マクロファージに比してLAMP-2A発現量が高く、LAMP-2Aの発現量はオートファジー活性と相関することから、Ly49Q陰性マクロファージではオートファジー活性が亢進している可能性が示唆された。さらに、オートファジー関連カテプシン(カテプシンD等)に関しても、Ly49Q陰性マクロファージにおいて、成熟型の量が増大する傾向が見られ、Ly49Q欠損によりオートファジー活性が上昇することが示唆された。また、活性酸素産生に関わる酵素群の発現量の違いを解析し、さらに、炎症性刺激物であるCpGオリゴヌクレオチド等に対する炎症性・抗炎症性サイトカインの産生プロファイルは、Ly49Qの有無で異なるだけでなく、当該刺激物と、エンドソーム、ライソソーム、オートファジー小胞それぞれとの共局在kineticsやLAMP輸送も影響を受けることを示唆する結果を得た。LPS刺激に対しても、Ly49Q陰性マクロファージでは、炎症性サイトカイン産生能の低下(IL-6、MCP-1、TNF-α)やシグナル分子p38やErk等のLPS刺激後のリン酸化の早期減弱を認めている。したがって、Ly49Q欠損を起因としてオルガネラの輸送制御や恒常性維持機構が障害されるとともに、オートファジーの異常な高活性化が誘導され、その結果TLR4シグナリングが障害されることが示唆された。炎症担当細胞において組織浸潤やサイトカイン産生を制御する抑制性レセプターLy49Qが、細胞内ホメオスタシス維持を担うタンパク質分解系であるシャペロン介在性オートファジーを時空間的に制御する機構を明らかにするために、当グループが独自に作出したLy49Qノックアウトマウス由来のマクロファージ、樹状細胞に加え、マウスマクロファージ株RAW264.7におけるLy49Q発現の陽性株、陰性株を用い、Ly49Q有無によりシャペロン介在性オートファジー及びライソソームの性状がどのような影響を受けるかの解明に取り組んだ。シャペロン介在性オートファジー関連カテプシン(カテプシンD等)に関しては、Ly49Q陰性マクロファージにおいて、成熟型の量が増大する傾向が見られ、Ly49Q欠損によりシャペロン介在性オートファジー活性が上昇することが示唆された。また、活性酸素産生に関わる酵素群の発現量の違いを解析し、さらに、炎症性刺激物であるCpGオリゴヌクレオチド等に対する炎症性・抗炎症性サイトカインの産生プロファイルは、Ly49Qの有無で異なるだけでなく、当該刺激物と、エンドソーム、ライソソーム、オートファジー小胞それぞれとの共局在kineticsやLAMP輸送も影響を受けることが示唆され、Ly49Qはオルガネラ輸送制御にも重要な役割を果たすと考えられる。また、ライソソームやオートファジー小胞内酵素活性に影響するpHは、Ly49Qの有無により炎症性刺激前後でどのように変動するかを明らかにするため、異なる蛍光インディケーターの取り込みとフローサイトメーター解析とを組み合わせ、蛍光強度からpHを求める系を確立した。Ly49Qとシャペロン介在性オートファジーとの関連において、炎症性刺激後におけるオートファジー関連タンパク質群の輸送や酵素活性の相違等を明らかにできた。ライソソームやオートファジー小胞の内部環境を反映する小胞内pHについても測定できる系を確立できたため、Ly49Q有無における炎症性刺激前後のpH変動をモニタリングしながら、TLR下流のMAPKファミリー分子の活性化やサイトカイン産生プロファイルの解析へと展開できる。引き続き、Ly49Q陽性及び陰性の免疫担当細胞を用い、今後は、炎症性刺激有無におけるサイトカイン産生、MAPKファミリー分子活性化、シャペロン介在性オートファジー活性との関連について、生化学的解析を中心に展開する。該当なし
大脳新皮質の基本構築をシナプス結合則から読み解く

高次機能発現や各種精神疾患との深い関連が指摘されている皮質GABA細胞に注目し、大脳新皮質の基本構築を明らかにする。シナプス結合部位の違いは、神経細胞の活動性に多大な影響を与えることから、単一シナプスレベルで回路構造を解析することが、大脳新皮質の動作原理解明に必須である。また、理論解析を通じ、シナプス結合部位がネットワークの動作特性に与える影響を検証する。さらに、透明化技術の実践的応用開発も進め、次世代の形態解析法創成にも努める。平成30年度は以下の課題に取り組んだ。(1) M1において、各種GABA細胞からPV細胞への入力様式を検討した。皮質興奮性入力(VGluT1)・視床興奮性入力(VGluT2)・皮質抑制性入力(VGAT)入力様式についてはS1と同じ結果が得られ、領野を超えた一般原則だと考えられる。一方、各種GABA細胞からの入力様式を解析したところ、細胞体でも樹状突起でもPV発現細胞からの入力が多数を占め、S1のような部位指向性(Hioki et al., 2013; Hioki 2015)は認められなかった。すなわち、細胞種レベルで結合関係を眺めると、皮質構造は領野間で不均一であり、処理すべき情報に応じて結合様式が最適化されていると考えられる。(2)シナプス結合部位の密度と位置に注目し、同期特性の検証を行った。細胞体や樹状突起の形状も同期性に影響することが判明し、今後はPV細胞の形態を正確に計測する必要があることが分かった。(3)スライス標本を透明化するプロトコールを開発にした。膨張や収縮もなく、大幅な時間の短縮に成功している。また、電子顕微鏡観察に適した固定法・包埋法も確立し、今後は光学顕微鏡と電子顕微鏡をつなぐズームイン技術の確立を進めていく。特に大きな問題も生じず、順調に進んでいる。『構造無き機能は無い』という旗標を掲げ、大脳新皮質が高次機能を実現する仕組みの謎に、形態学的視点から挑む。近年、GABA細胞同士の結合解析が盛んに行われているが、どれも空間解像度が細胞体レベルに限定され、シナプス入力部位に関する解析は大きく後れを取っている。(1) M1におけるPV発現細胞へのシナプス入力について、これまでに得た知見をまとめていく。また、S1とM1において、PV発現細胞同士の相互結合を生理学的に検討する。分子生物学的見地からも、領野間の相違を検討する。さらに、SSOM発現細胞に対する各種シナプス様式の解析をS1において進めていく。(2) 2つのPV細胞を相互に結合させ(2体対称結合系)、同期パターンの解析を進めている。モデル化に必要な形態パラメタの追加取得を行う。(3)光顕と電顕の対応(LM-EM correlation)を効率的に行う目的で、対象となる構造物をマーキングする技術を開発する。平成28年度は以下の課題に取り組んだ。(1)第2/3層に分布する血管作動性腸管ペプチド(VIP)発現細胞に対する各種シナプス入力を第一次体性感覚野(S1)で解析した。VIP細胞への入力様式は傍細胞体コンパートメントと遠位樹状突起コンパートメントという2つの部位で大きく異なることが分かった。VIP細胞への興奮性入力はまず遠位樹状突起でマトスタチン(SOM)発現細胞により修飾され、活動電位発生は最終的にパルブアルブミン(PV)発現細胞により制御されるという二段構え構造になっていることが示唆された(Sohn et al., 2016)。また、PV発現細胞に対する入力様式を第一次運動野(M1)でも進めており、S1との類似性・相違性について検討を進めていく。(2) S1におけるPV発現細胞に対する入力様式について(Hioki et al., 2013)、共同研究者とモデル構築を進めている。また、各種形態パラメタをどう取得し、どう解析するかについて議論を重ねている。(3)透明化技術ScaleS法のプロトコール改変を進め、時間短縮に成功している。また、電子顕微鏡観察に適したサンプル調整法の開発を進めた。

シナプス結合部位の違いは、神経細胞の活動性に多大な影響を与えることから、単一シナプスレベルで回路構造を解析することが、大脳新皮質の動作原理解明に必須である。また、理論解析を通じ、シナプス結合部位がネットワークの動作特性に与える影響を検証する。さらに、透明化技術の実践的応用開発も進め、次世代の形態解析法創成にも努める。平成29年度は以下の課題に取り組んだ。(1)以前の研究にて、各種GABA細胞からPV細胞への入力様式をS1にて検討した。VIP細胞からの入力は細胞体を、PV・SOM細胞からの入力は樹状突起を好むことを明らかにした(Hioki et al., 2013; Hioki 2015)。すなわち、PV細胞は部位特異的なシナプス入力を受けていることを明らかにした。M1でも同様の解析を進めたところ、皮質興奮性入力(VGluT1)・視床興奮性入力(VGluT2)・皮質抑制性入力(VGAT)入力様式についてはS1と同じ結果が得られ、領野を超えた一般原則だと考えられる。一方、各種GABA細胞からの入力様式を解析したところ、細胞体でも樹状突起でもPV発現細胞からの入力が多数を占め、S1のような部位指向性は認められなかった。すなわち、細胞種レベルで結合関係を眺めると、皮質構造は領野間で不均一であり、処理すべき情報に応じて結合様式が最適化されていると考えられる。(2)取得したパラメタをもとに、S1におけるPV発現細胞の発火特性を検討した。抑制性シナプス入力部位によって、同期特性が大きく変わることを見出している。(3)スライス標本を透明化するプロトコールの開発を進め、大幅な時間の短縮に成功している。また、電子顕微鏡観察に適した固定法・包埋法の検討も進めた。特に大きな問題も生じず、順調に進んでいる。高次機能発現や各種精神疾患との深い関連が指摘されている皮質GABA細胞に注目し、大脳新皮質の基本構築を明らかにする。平成30年度は以下の課題に取り組んだ。(1) M1において、各種GABA細胞からPV細胞への入力様式を検討した。皮質興奮性入力(VGluT1)・視床興奮性入力(VGluT2)・皮質抑制性入力(VGAT)入力様式についてはS1と同じ結果が得られ、領野を超えた一般原則だと考えられる。一方、各種GABA細胞からの入力様式を解析したところ、細胞体でも樹状突起でもPV発現細胞からの入力が多数を占め、S1のような部位指向性(Hioki et al., 2013; Hioki 2015)は認められなかった。(2)シナプス結合部位の密度と位置に注目し、同期特性の検証を行った。
凝固能異常時のTAEにおけるNBCAの有用件についての研究

豚の出血(凝固能異常)モテル作成の確立と出血・凝固能異常に対する耐性評価などの目的に、先ずは準備実験を行った。豚の出血は腎臓・脾臓を開腹下に直接メスなどで切断・損傷させ、出血・凝固能異常の作成は瀉血とへパリン投与で行った。凝固能の評価は活性化凝固時間(ACT;Activated Clotting Time)で行った。豚はヒトよりも凝固能低下し難い印象であった。本実験では、豚出血モデルを正常凝固能群と高度凝固能異常群に分け、それぞれゼランスポンジ(GS)とN-Butyl Cyanoacrylate(NBCA)で腎臓・脾臓に径カテーテル的動脈塞栓術(TAE;Transcatheter Arterial Embolization)を行った。正常凝固能群のGS5出血・NBCA5出血では、全10出血で30分以内の再出血なく一次止血可能であった。これに対し高度凝固能異常群のGS5出血・NBCA5出血では、GS塞栓5出血のうち4出血(80%)が5会後の再出血、NBCA5出血のうち1出血(20%)が15分後の再出血を認めた。これら全20出血に対して、豚放血殺後に病理学的評価を行った。10頭20出血に対する評価では、高度凝固異常群で、GSに比較してNBCAがより確実な塞栓効果を得られることが示唆されるが、有意差評価のためにさらなる追加実験が必要と考えられる。今回、豚の出血・凝固能異常モデル作成法は確立されたと考えており、このモデルを使用して上記と同様の実験ないしは金属コイルなどの他塞栓物質を使用した実験を追加することで、臨床現場での大量出血・凝固能異常時のTAE戦略模索の一助となると考えている。
サル下側頭葉における無意識下での視覚情報処理様式の解明

本研究では、サルの下側頭葉に微小電極アレイを多数埋め込み(電極総数224本)、ニューロン活動を多チャンネル同時記録することにより、物体画像が意識的に知覚される時と無意識下に処理される時で、神経群の活動パターンがどのように視覚情報を符号化するのか解明することを目指した。さまざまな物体画像(100-250種類)を提示したところ、100チャンネル以上の電極から下側頭葉ニューロンの活動電位を記録することができ、神経活動には、どんな画像を見ているのか高い精度で判別できるだけの視覚情報が符号化されていることを明らかにした。さらに、意識的に顔認知している際の神経群の活動パターンを詳細に解析することができた。その結果、顔の頭部方位と個体識別に関する情報表現が同じ下側頭葉でも領域によって違うことが明らかになった。また、位相シフトという画像処理を使って、左眼画像を左方向、右眼画像を右方向に動かす特殊な両眼視野闘争刺激を生成し、両眼分離提示する実験系を構築した。同刺激を観察すると、左右の画像のうち、どちらか一方だけが意識的に知覚され、他方は抑制される。同刺激をサルが観察している間に生じる眼球運動を測定し、どちらの画像が意識的に見えているかを視運動性眼振とよばれる反射性の眼球運動パターンから判別できるかどうか検討した。最後に位相シフト操作による運動画像に対する、下側頭葉ニューロンの活動を記録したところ、ニューロンは、運動方向によらず、物体像に特異的に応答することが明らかになった。本研究では、サルの下側頭葉に微小多電極アレイを多数埋め込み(電極総数224本)、ニューロン活動を多チャンネル同時記録することで、神経群の活動パターンが意識的な物体画像知覚時に視覚情報をどのように符号化しているのか解明することを目指した。実験では、さまざまな物体画像(100ー250種類)を提示し、100チャンネル以上の電極から下側頭葉ニューロンの活動電位を記録することに成功し、神経活動の情報だけから、どんな画像を見ているのか、高い精度で判別できることを明らかにした。さらに神経群の活動パターンのうち、顔画像処理に関する応答を詳細に解析した。その結果、顔の方位と個体識別に関する情報表現が同じ下側頭葉でも領域によって異なることが明らかになった。また、quadrature motionという画像処理を使って、左眼画像を左方向、右眼画像を右方向に動かす特殊な両眼視野闘争刺激を生成し、ステレオ画像としてサルに提示する実験系を構築した。同刺激をサルが観察している間の眼球運動を測定し、どちらの画像が意識的に見えているかを視運動性眼振とよばれる反射性の眼球運動パターンから読み出せるか検討した。最後にquadrature motion刺激を提示している間、下側頭葉ニューロンの活動を記録したところ、運動方向によらず、物体像に特異的にニューロンが応答することが明らかになった。本研究では、サルの下側頭葉に微小多電極アレイを埋め込み、ニューロン活動を多チャンネル同時記録することで、神経群の活動パターンが意識の有無に依存してどのように変化するのか解明することを計画している。具体的には、両眼視野闘争刺激を観察中に、サルの眼球運動を計測し、その応答から、現在意識的に知覚している物体像を判定するパラダイムの検証を行う。その後、眼球運動を意識状態の指標として利用しながら、様々な視覚属性のうち、意識状態の変化によってどのような情報が下側頭葉のニューロンで表現されているのか解明するため、電気生理実験を行う予定である。本年度は、96本の電極からなるアレイを二つ、32本の電極からなるアレイを1つ、合計224本の微小電極をサルの下側頭葉に埋め込み、多数の神経活動を同時記録することに成功した。

さまざまな物体画像(100ー250種類)を提示したところ、100チャンネル以上の電極から下側頭葉ニューロンの活動電位を記録することができ、さらに神経群の活動パターンのうち、顔画像処理に関する応答を詳細に解析することができた。その結果、顔の方位と個体識別に関する情報表現が同じ下側頭葉でも領域によって違うことが明らかになった。また、quadrature motionという画像処理を使って、左眼画像を左方向、右眼画像を右方向に動かす特殊な両眼視野闘争刺激を生成し、ステレオ画像としてサルに提示する実験系を構築した。同刺激をサルが観察している間に生じる眼球運動を測定し、視覚体験の交代を視運動性眼振とよばれる反射性の眼球運動パターンから読み出せるかどうか検討した。最後にquadrature motion刺激を提示している間、下側頭葉ニューロンの活動を記録したところ、運動方向によらず、物体像に特異的にニューロンが応答することが明らかになった。研究計画書では、本年度中に(1)最大192チャンネルの埋め込み型微小多電極アレイをサルの下側頭葉に埋め込み、多数の神経活動を同時記録する(2)両眼視野闘争刺激観察中に生じる視覚体験の交代を視運動性眼振とよばれる反射性の眼球運動パターンから読みだすことを目標とした。本年度は、サルに224チャンネルの電極埋め込み手術を行い、100チャンネル以上の電極から神経活動の同時記録に成功するとともに、両眼視野闘争刺激観察中の眼球運動計測を行い、眼球運動パターンから視覚体験の反転が検出できるか検討を行うことができた。計画の第二段階として「無意識下の物体画像に対する神経情報表現の検討」を達成目標とする。両眼視野闘争中、意識的には見えなくなった画像に対し、ITニューロンは集団としてどの程度、情報表現を保持しているのかを検証する。両眼視野闘争刺激の画像が意識的に知覚されたときと、知覚されなかったときとで、どれほど神経活動の情報量に変化があるかを調べる。電極埋め込み手術に必要な試薬類などの消耗品支出にあてることを予定している。
金属イオンを含む過酸化水素水溶液による人工骨用チタンへの生体活性の付与

金属チタン試片を,5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液中で60°Cで24時間保持し、最適処理条件を決定した。さらに5mMPbCl_2を含む過酸化水素水溶液による処理も行い、表面の水和チタニア層の構造制御を行った。試片の表面構造をフーリエ変換反射分光法,X線回折,X線光電子分光法及び走査型電子顕微鏡観察により調べた。5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液処理では、チタン金属表面に水和チタニアゲル層が形成し、ゲル中にタンタル酸ゲルの痕跡が確認された。表面粗さは0.3μm(Ra値)以下の範囲では化学処理前後では変化していないことがわかった。一方、PbCl_2を含む過酸化水素水溶液処理では、金属チタン表面に炭酸鉛・酸化鉛が析出していることがわかった。これらの表面処理した試片をヒト体液とほぼ等しい無機イオン濃度,液温及びpHを有する擬似体液に種々の期間浸漬し,表面構造変化を薄膜X線回折,FT-IR反射分光分析,SEM観察により調べ、さらに擬似体液のイオン濃度変化を高周波誘導プラズマ(ICP)発光分光法により測定した結果、PbCl_2を含む過酸化水素水溶液処理では極めて短期間に擬似体液中でアパタイトを形成することに成功した。5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液処理したいくつかの試片について,ラット骨芽細胞様細胞を用いた細胞培養実験を行い,試片表面が骨芽細胞に与える影響を調べた。また、金属チタン及び実用性の高いチタン合金を素材として選択し、家兎の脛骨に試料を埋入しその結合強度をPush outテストで評価した結果、あきらかに化学処理による骨結合強度の増大が確認された。以上の結果を総括し,金属チタンへの生体活性に必要とされる表面構造が明らかになり、金属表面処理条件が確立した。金属チタン表面をTaCl_5,SnCl_2もしくはPbCl_4を含む過酸化水素水溶液で処理し,表面に水和チタニア層を形成させれば,チタン表面に擬似体液中でアパタイトを形成する。従って,この処理は金属チタン材料に骨組織と結合する生体活性を与える新規手法として期待される。本研究では,化学処理により形成されたどの様な微構造を有する水和チタニア層がアパタイトの形成を誘起するのか,また表面に形成された水和チタニアゲルを含む生体活性層に対して,骨組織に関与する細胞がどの様な挙動を示すかを基礎的に解明するとともに,本手法の実用化への可能性を探求することを目的とする。金属チタンの板状試片を,5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液中で60°Cで24時間保持した。得られた試片を蒸留水で洗浄した後室温で乾燥させた。表面処理した試片をヒト体液とほぼ等しい無機イオン濃度,液温及びpHを有する擬似体液に種々の期間浸漬し,その表面構造変化を薄膜X線回折,FT-IR反射分光分析,SEM観察により調べる。さらに擬似体液のイオン濃度変化を高周波誘導プラズマ(ICP)発光分光法により測定した。材料表面でラット骨芽細胞株細胞を用いた細胞培養実験を行い,試片表面が骨芽細胞に与える影響を調べた。一方,円柱状の金属チタン試片に同様の処理を施し,家兎脛骨に埋入し,一定期間経過後骨組織との結合強度をPush out試験により評価した。その結果,金属チタン表面のアパタイト形成には,タンタル酸水和ゲルの共存がきわめて有効なことが明らかとなった。試料表面での細胞増殖

能は本処理により低下するが,アルカリフォスファターゼ活性は向上した。さらに表面を本手法により化学処理した金属チタンは,未処理の金属チタンに比べ,8週以内により高い結合強度を示すことが明らかになった。本研究では,化学処理により形成されたどの様な微構造を有する水和チタニア層のアパタイト形成を誘起するのか,また表面に形成された水利チタニアゲルを含む生体活性層に対して骨組織に関与する細胞がとの様な挙動を示すか基礎的に解明するとともに,本手法の実用化への可能性を探求した。金属チタン試片を,5mMのTaCl_5を宮む過酸化水素水溶液中で60゚Cで24時間保持する処理に加え、TaCl_5と過酸化水素水の濃度及び処理温度と時間を変えて処理し,最適処理条件を検討した。試片の表面構造をフーリエ変換(FT-IR)反射分光法,X線光電子分光法(XPS)及び走査型電子顕微鏡(SEM)観察により調べ,処理条件が表面構造に及ぼす処理条件の影響を調べた。表面処理した試片をヒト体液とほぼ等しい無機イオン濃度,液温及びpHを有する擬似体液に種々の期間浸漬し,表面構造変化を薄膜X線回折,FT-IR反射分光分析,SEM観察により調べ、擬似体液のイオン濃度変化を高周波誘導プラズマ(ICP)発光分光法により測定し、アパタイト形成能(生体活性)の高い試料と低い試料の表面化学状態の違いを検討した結果、水利チタニアゲル中のチタノール基の形成だけではなく、水利チタニアゲル中に含まれるタンタル酸の量や過酸化水素の残量が重要な因子であることが示唆された。代表的な試片について,ラット骨芽糾胞株細胞を用いた細胞培養実験を行い,試片表面が骨芽糾胞に与える影響を調べた結果、本化学処理は既に京大グループが有効であると報告しているアルカリ処理と比べて、細胞増殖速度及びアルカリフォスファターゼ活性が高いことが示唆された。さらに家兎の脛骨に試料を埋入しその結合強度を精密万能試験機を用いたPush outテストで評価したところ、未処理の試料よりも高い接着強度が得られた。金属チタン試片を,5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液中で60°Cで24時間保持し、最適処理条件を決定した。さらに、5mMPbCl_2を含む過酸化水素水溶液による処理も行い、表面の水和チタニア層の構造制御を行った。試片の表面構造をフーリエ変換反射分光法,X線回折、X線光電子分光法及び走査型電子顕微鏡観察により調べた。5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液処理では、チタン金属表面に水和チタニアゲル層が形成し、ゲル中にタンタル酸ゲルの痕跡が確認された。表面粗さは0.3マイクロ(Ra値)以下の範囲では化学処理前後では変化していないことがわかった。一方、PbCl_2を含む過酸化水素水溶液処理では、金属チタン表面に炭酸鉛・水酸化鉛が析出しいることがわかった。これらの表面処理した試片をヒト体液とほぼ等しい無機イオン濃度,液温及びpHを有する擬似体液に種々の期間浸漬し,表面構造変化を薄膜X線回折,FT-IR反射分光分析,SEM観察により調べ、さらに擬似体液のイオン濃度変化を高周波誘導プラズマ(ICP)発光分光法により測定した結果、PbCl_2を含む過酸化水素水溶液処理では極めて短期間に擬似体液中でアパタイトを形成することに成功した。5mMのTaCl_5を含む過酸化水素水溶液処理したいくつかの試片について,ラット骨芽細胞株細胞を用いた細胞培養実験を行い,試片表面が骨芽細胞に与える影響を調べた。また、金属チタン及び実用性の高いチタン合金を素材として選択し、家兎の脛骨に試料を埋入しその結合強度をPush outテストで評価した結果、あきらかに化学処理による骨結合強度の増大が確認された。
mTOR経路活性化におけるErbBフィードバック制御解明によるがん悪性化克服

分子標的薬を用いたがん治療が行われているが、患者による感受性の違いや獲得耐性などが治療の障害となっている。がん分子標的治療の進展には、がん分子標的薬感受性や獲得耐性機構の分子的解明が必須である。本研究では、ErbBフィードバック制御とmTOR経路の相互作用性の解明から、より効率的ながん分子標的治療への進展を目的とする。