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リグニンのシリンギル構造の分解に関与する多様なジオキシゲナーゼシステム

Sphingomonas paucimobilis SYK-6株は、リグニンの主要な代謝中間体であるシリンガ酸を唯一の炭素源・エネルギー源として生育する。SYK-6株のシリンガ酸代謝にはプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、3-O-メチルガリック酸3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子、およびガリック酸ジオキシゲナーゼ遺伝子(desB)を含む多様な芳香環開裂酵素系が関与する。現在までに、SYK-6株のシリンガ酸代謝系においてはdesBが主要な働きを担うこと、シリンガ酸代謝時にDesB活性が増大することが明らかにされている。本研究ではdesBの転写制御機構の解明を目的として、desBの転写活性化に関わる誘導物質の同定と転写制御遺伝子の単離を行った。desBの転写活性化に関わる誘導物質を同定するために、シリンガ酸代謝に関わる各遺伝子の遺伝子破壊株を用いてdesBプロモーター活性をβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)活性を指標に測定した結果、シリンガ酸が誘導物質であることが示唆された。desBの転写活性化に関わる転写制御遺伝子を単離することを目的として、desBプロモーターとレポーター遺伝子であるlacZを染色体に挿入した宿主にSYK-6株の遺伝子ライブラリーを導入して、desBプロモーター活性を増大させるクローンを選抜した。得られたクローンの塩基配列を解析した結果、機能未知の遺伝子とアミノ酸レベルで相同性を示すORF(orf1)が存在することが示された。この結果からorf1がdesBの転写活性化に関与する遺伝子であると推測されたが、orf1によるdesBの転写制御機構の詳細は明らかにされなかった。今後、orf1の遺伝子破壊やゲルシフト解析を用いた遺伝子および酵素レベルでの機能解析を行うことで、desBの転写制御機構の理解がより深まると考えられる。リグニンの主要な代謝中間体であるシリンガ酸は、Sphingomonas paucimobilis SYK-6株においてprotocatechuate 4,5-dioxygenase遺伝子(ligAB)、3-O-methylgallate dioxygenase遺伝子(desZ)、およびgallate dioxygenase遺伝子(desB)が関与する多様な芳香環開裂経路によって代謝されるが、主にガリック酸を経由する経路が重要であることを明らかにしてきた。本研究では、シリンガ酸代謝系の全体像を明らかにすることを目的として、シリンガ酸代謝に関わる3つのdioxygenase遺伝子の転写誘導性を評価した。SYK-6株のガリック酸分解にはdesBおよびligABが関与することが示されている。そこでシリンガ酸存在下または非存在下で生育させたSYK-6株のガリック酸分解活性を比較して、これら遺伝子のシリンガ酸存在下における誘導性を評価した。その結果、SYK-6株のガリック酸分解活性はシリンガ酸存在下において顕著に誘導されることが示され、desBおよびligABの転写はシリンガ酸存在下において活性化されることが示唆された。そこでdesBおよびligABのプロモーター活性をβ-galactosidase活性を指標に評価した。その結果、両遺伝子のプロモーター活性はシリンガ酸存在下において活性化されることが明らかとなった。一方、desZのプロモーター活性はシリンガ酸の存在に関わらず同等であったことから、desZは構成的に発現していることが示された。
近代法思想の形成過程における環境観の変動の意義に関する研究

平成10年度は、ルネッサンス期から近現代にかけての環境観をめぐるさまざまな資料を調査・収集するとともに、マーチャント、ミース、イリイチらを初めとするエコ・フェミニズムの基本的な文献を読解することによって、近代初期の〈環境への態度〉の変化が、人間観や世界観の根本的変動と連動して起こっていることを明らかにしようと努めた。平成11年度はこの作業をさらに推し進めた。第一に、17世紀イギリスにおける自然哲学の進歩に多大な寄与を果たしたベーコンの原典および二次文献の分析を行い、このエポック・メイキングな人物が、いかにして環境観の変動を推進したかを追究した。その結果、すくなくとも、彼がルネッサンス以降盛んになった〈女性としての自然〉というイメージを巧みに利用しつつ、科学技術による〈自然の支配〉を唱道して、人類の物質的福利の向上をめざそうとしていたことが明らかにされた。第二に、原子論的・機械論的自然哲学がまさに形成されつつあった17世紀中葉のイギリスにおいて、プロテスタンティズムという背景を共有するヴァーチュオーシ(科学的探求に深く係わった人々)によって、どのような自然論・環境論が展開されていたかを探求した。研究の結果、たとえばJ・グランヴィルは、ベーコンを忠実に踏襲して、自然科学の目的は自然を支配することによって人間生活を改善することだと考えていたこと、また王立協会の中心的メンバーだったボイルは、物質を〈生命なき〉諸粒子へと還元する一方、自然を人間にとって便利な生活品を供給する〈倉庫〉に格下げすることにより、環境へのはっきりした人間中心主義的・権力的態度を示していたことが、明らかになった。今年度は、ルネッサンス期から近現代にかけての環境観をめぐるさまざまな原典・二次文献を購入し、その渉猟に努めたが、その際、本科学研究費補助金によって購入したパーソナル・コンピュータは、国内外の情報の収集に多大な力を発揮した。17世紀を中心とする環境観の変動を、来年度に向けて個別具体的に探求するに先立ち、今年度はまず、マーチャント、ミース、イリイチらを初めとするエコ・フェミニズムの基本的な文献を読解することによって、近代初期の〈環境への態度〉の変化が、人間観や世界観の根本的変動と連動して起こっていることが明らかになった。すなわち、ルネッサンス期まで支配的であった有機的世界観にあっては、大地・地球がもろもろの存在に生命と運動を与える力をそなえている、言わば“養い育てる母"であるとみなされる一方、女性もまた、生命を生み出す存在としての尊敬をかちえていた。この有機的な枠組みにおいては、母-大地というイメージが自然の搾取・開発に対する一定の制約としてはたらいたけれども、この枠組みは17世紀を境として、自然を生命なき、不活性な粒子からなる、ある種の“機械"とみなす世界観にその座を明け渡すことになる。これは独り自然観の変化にとどまらず、社会も人体もまた、交換・除去が可能な多数の原子的部分(個人、臓器)から成り立っている、ある種の“機械"であるととらえる社会観・人間観の形成をも伴っていた。近代の市民社会が自由主義・個人主義を謳いあげる一方、環境との関係ではまさに〈自然の搾取・開発〉によって、その富を蓄積・拡大しえたのは、社会観・人間観のみならず、このような環境観の根本的変革をも必須の条件としていたのである。かかる自然観・社会観の変動が、具体的にいかなるプロセスをへて生じたのか、そして、それはまた18世紀の政治経済学の成立にいかなる意味をもたらすのかをいっそう詳細に追究することが、平成11年度の本研究の目的となる。
集積回路内臓型多重微小電極による脳多細胞活動同時記録解析システムの作成と応用

4ないし32チャンネルの多点記録用金属用金属多重微小電極を設計し製作した。電極の芯材としては記録および通電性能に優れたエルジロイ合金を用い、これをエッチングし尖端部を形成してから低融点がガラスによりコ-ティングし、尖端電極を形成してからガラスの上に微細加工を行い、多重電極とそのリ-ド部を形成した。それらのパタ-ン形成のために、マイクロパタ-ニングの技法を応用した。微小な金属針の先端に多数の電極を作成するには、表面に均等な間隔でラセン状の配置をさせつつ、連続したパタ-ンを三次元的に形成する必要があった。真空蒸着法によってまずクロ-ムを、次に金を蒸着し、薄膜形成を行った。次いでネがしジストを塗布し、三次元的に正確なパタ-ンを描くための自動化された制御装置が必要であった。電極をXYZの三次元方向に微動させ、紫外線ビ-ム露光を行う装置を作成し、それらをマイクロコンピュ-タで制御するためのプログラムを開発した。20×20μmの電極を200μの距離で定間隔に装着し微細リ-ド線をコネクタ-部まで形成することができた。リ-ド線で導いた多重出力を一端マルチプレクサ-ICに入力して、任意の組合せで出力が取出せるようにした。その出力をリニアICで差動増幅し、次にアンプへ接続して増幅波形を観察した。一本の複合電極の異った点からの導出によって、10個以上の細胞の発射活動が同時に記録でき、その記録の分析から細胞の皮質内の深さを推定できた。以上はラットを用いた実験であるが、さらにサルを用い、全身麻酔下に頭蓋上に記録用シリンダ-を装着し、それに合せた電極ドライバ-を介して電極を刺入し、マイクロマニピュレ-タで微小操作しつつ任意の位置に電極を移動させた。あらかじめ訓練された運動を動物に行わせ、その運動遂行中に大脳運動野から細胞活動記録を行った。複数の細胞の発射活動相互の関係ならびに運動との関連を解析することができた。まず第一に、多重微小電極の設計を行い、432チャンネルの多点記録用電極のパターンを製作した。電極用素材としてはエルジロイ合金を芯材とし、これにガラスコーティングを行った。その表面に、電子ビーム露光法およびプラスマエッチング法を応用して、多重電極およびそのリード部のパターンを形成した。次に電極に接続するスイッチング回路と増幅回路をそれぞれマイクロ化し、電極基部に装着できるように設計し、その製作を行った。多重電極と回路部を、マイクロパターニング法で配線接続を行った。製作した複合電極の性能テストの結果、記録部の分極特性およびリード部・接続部の電気的絶縁性に問題点のあることが判明し、それぞれに改良を加えた結果、改善することができた。その試作品を使用して、まず予備実験としてラットを用い、記録性能テストを行った。ラット大脳の体性感覚野および運動野に多重電極を刺入して、多点記録法によって複数のニューロンから同時に活動電位の記録を行った。電位記録には一応成功したが、雑音混入の問題点が判明したので、その改善を行った。一方本実験を行う準備を開始した。まず実験用のサルを訓練するために必要なシステムを作成し、規定の行動および運動を行わせる学習過程を開始した。

今後は、多重電極によってサルの運動野から、運動遂行中のニューロン活動を複数個記録し、それらの解析を行うことになるが、そのために必要な実験プロセス制御システムを現在作成することを開始した。前年度で開発された手法に従い、まず多重電極を作成した。真空蒸着法で形成した金一クロム薄膜を微細加工することによって微小電極のマイクロパタ-ンを製作するために、三次元リソグラフィを自動的に行うシステムを作成し、コンピュ-タプログラムによって制御できるようにした。多重電極の電気的および機械的特性の改良を重ねて実用に耐えるに至るまで動作試験を行った。製作した多重電極は高等動物の脳に直接刺入可能な形態を有し、そこから複数の神経細胞活動が記録できるように設計されたものである。まずラットを用いて一連の予備実験を行った。動物はネンブタ-ル膜腔内注入麻酔下に開頭手術を行い、大脳皮質を露出して電極を刺入した。当初の試作品はS/N比が低く、ノイズ除去の必要があった等の改良が必要であったが、結局単-細胞の活動電位を記録できるに至った。多チャンネルの電極に配線されたリ-ド線を、いったんマルチブレクサ-IC(CMOS)に入力して任意の組合せを選択した出力が取り出せるようにした。その出力をリニアICでいったん差動増幅し、次にアンプへ接続し、ブラウン管オシスコ-プで皮形を観察した。一本の複合電極の異なった点からの導出により10個程度の細胞の発火活動が同時に記録でき、その記録の分析から細胞の皮質内の深さを推定することができた。次にサルを対象として実験を行った。全身麻酔下に頭蘆上に記録用シリンダ-を装着し、それに合わせた電極ドライバ-を介して電極を刺入し、油圧マイクロマニピュレ-タで微小操作しつつ、任意の位置に電極を移動させた。記録には無麻酔であらかじめ訓練された運動をサルに行わせ、その運動遂行中に大脳運動野から細胞活動記録を行った。皮質表層および深層の複数の細胞から発射活動を記録し、それら相互の活動の関係および運動出力との関連を解析した。
成長および加齢に伴う柔軟性の変化とその改善方法に関する研究

本研究では、「柔軟性」を関節可動域と定義し、以下の3点について検討を行った。すなわち、1)関節可動域の規定因子を筋腱特性の観点から明らかにすること、2)関節可動域およびその規定因子の性差および加齢変化を明らかにすること、3)関節可動域およびその規定因子の可塑性について検討すること、である。これらの目的のために、負荷を規定できる筋力計を開発し、筋腱複合体の伸長性を生体計測するシステムを構築した。このシステムを用いて、足関節底屈・背屈動作の可動域および下腿三頭筋・前脛骨筋筋腱複合体に着目して一連の研究を遂行した。その結果、以下のことが明らかになった。1)について、関節可動域は他動的及び能動的に評価する必要性があることが示され、それぞれの規定因子として、筋量、筋力、筋腱複合体の材質特性があげられた。2)について、関節可動域の性差(女性>男性)には、腱組織の伸長抵抗性が深く関係していること、ただし、その程度は成長や加齢によって変化することが示された。3)について、関節をまたぐ筋群の静的ストレッチングによって関節可動域が増加するが、これは主として腱組織の伸長性の増加によることが示された。また、安静臥床も同様の変化をもたらすことが明らかになった。さらに、筋量および筋力と筋形状、腱特性の関連性について、詳細な検討を行い、筋腱複合体の受動伸長時・力発揮時の変形と関節トルクとの関連性などに関する研究を通して、受動伸長や力発揮が筋腱複合体の特性を一過的に変化させること、変化の程度は筋によって異なることなどが明らかになり、柔軟性のトレーニングへの方向性が示された。本年度は、柔軟性を関節可動域と定義し、健常な被験者を対象に、関節可動域の規定因子について検討を行った。特製の筋力計を用い、モーターによって足関節を一定のトルクで背屈方向に回転したときの背屈角度を計測した。中高齢男女を被験者とした実験を通じて、以下の知見が行られた。1)同じトルクを付加しても、それによって受動的に生じる足背屈の角度は被験者によって異なり、足関節の「柔らかい」人や「堅い」人が存在した。2)男女とも、受動背屈角度と下腿後部の筋厚との間には有意な負の相関関系が望められ、背屈時に伸長される下腿後部の筋群が多いことによる伸長抵抗性が柔軟性と関系していた。3)受動背屈角度は高齢の被検者ほど小さくなる傾向であり、これは腓腹筋やアキレス腱の伸長性の違いと関係していた。4)等尺性最大足底屈トルク発揮のスピードは最大等尺性測定トルクと有意な正の、そして年齢との間に負の相関関係が認められた。これらの結果から、柔軟性を左右する因子として、筋量(多いほど柔軟性が低い)、筋力(大きいほど柔軟性が高い)、筋腱複合体の材質特性(堅いほど柔軟性が低い)があげられた。高齢者の場合は、筋萎縮によって受動伸長組織が減少するが、組織そのものの伸長性が低下することにより、受動背屈角度が減少することが示された。また、高齢者に顕著な筋力低下が自力で動かせる可動域の幅をさらに狭める可能性が示唆された。高齢者においては、しなやかな、すばやい動きのために筋力トレーニングが必要であることが明らかになった。そのほか、中学生男女を対象にした実験を同様に行い、成長が柔軟性に及ぼす影響について検討を進めている。本年度は、高齢者を対象に、関節可動域の性差およびその規定因子について検討を行った。被検者は事前に実験参加に同意した140名の健常な高齢者(65-83歳;女性86名、男性54名;平均年齢に男女差なし)であった。被験者は定期的な身体運動を実施していた。

特別に製作した筋力計を用い、様々な設定トルクで他動的な足関節背屈を行ったときの設定トルクと他動関節角度変化の関係を求めるとともに、超音波装置を用いて、腓腹筋内側頭の遠位筋腱移行部の足背屈に伴う移動(腓腹筋筋腹伸長)と設定トルクの関係を求めた。次に、関節角度を変化させたときの筋腱複合体全長の変化を推定し、アキレス腱の伸長を推定した。上記に加えて、特別に作製した角度計を用いて、被検者自身が最大努力で背屈動作を行ったときの足関節角度(能動背屈角度)を計測した。設定トルクが増すにつれて受動足背屈が進行し、関節角度変化は男性よりも女性が大きかった。このときの筋腹の伸長率(安静時の推定筋腹長に対する増加率)は、女性が男性を上回っていた。一方、能動背屈角度には男女差はみられなかった。以上の結果は、足関節の受動背屈角度が伸長される組織(下腿三頭筋を中心とした足底屈筋群)の多寡に依存し、一方、能動背屈角度は背屈筋群の筋量や筋力の影響も受けることを示唆する。これは中高年者を対象とした申請者らの先行研究を支持する結果であるが、腱伸長率(安静時のアキレス腱長に対する増加率)に性差がみられないなど、高齢者に特有の傾向も認められた。この他、中学生男女および青年男女について同様の実験を実施し、現在結果を分析中である。また、静的ストレッチングおよび等尺性筋収縮が筋腱複合体の伸長性に及ぼす一過的効果に関する実験を現在進めているところである。本年度は、前年度までに明らかになった足関節柔軟性(可動域)の性差や加齢変化に関する横断的研究の知見を一歩進めて、個人内の柔軟性の可塑性に影響を及ぼす因子について検討を行った。静的ストレッチング、力発揮の連続、マッサージが足関節の可動域に及ぼす効果を検討するために、成人6名を対象として各試行の前後で足関節の背屈角度、下腿三頭筋の最大随意筋力、皮膚上の表面温および筋温、足関節のみで行う跳躍動作(反動無し/反動有り)を測定した。その結果、ストレッチングとマッサージにはいずれの指標にも有意な変化はみられなかったが、力発揮では跳躍動作のパフォーマンスとした力積が有意に増加した。このことから、ストレッチングや力発揮を行った際に、ウォームアップで用いる程度の負荷では、跳躍動作の向上よりパフォーマンスに対する効果はあるものの、関節可動域や最大筋力には有意な変化をもたらさないことが示された。また、成人男性6名を対象として20分間の足関節の他動背屈を行ない(静的ストレッチングを模した試行)、その前後で下腿三頭筋腱複合体の伸長、腓腹筋伸長、アキレス腱伸長を算出し、他動背屈の効果に筋伸長と腱伸長のどちらがより貢献するかについて検討した。20分間の足関節の他動背屈の前後で筋腱複合体伸長と腱伸長は有意に増加したが、筋伸長には有意な変化はみられず、ストレッチングの効果は筋腹よりも腱に表れやすいことが示された。これらの知見から、足関節可動域や身体運動のパフォーマンスのトレーナビリティには腱組織の伸長性の変化が大きな影響を及ぼすことが明らかになった。
高効率硝酸イオン還元電極の精密設計と実用化

本研究では,Pd,Pt,Rhについて硝酸イオンの吸着状態と硝酸イオン還元活性との関係,スズを修飾した貴金属電極の還元活性向上の理由について考察した.赤外分光法による測定結果から,貴金属電極による硝酸イオン還元の活性種は,単座型に吸着した硝酸イオンであると考えられる.単座型硝酸イオンでは硝酸イオンの酸素に対してプロトン付加が起こりやすいため, N-Oの結合解離を誘起することによって還元が起こるものと考えられる.スズ修飾電極では,活性の増大はスズが硝酸イオンの酸素と相互作用することによってN-Oの結合解離が促進されることに起因するものと考えられる.本研究では,種々の疾病の原因となる飲料水中の硝酸イオンを電気化学的に還元して無害化する電極を設計するために,電気化学的測定と連動した表面増強赤外分光法によって,貴金属およびそれらのスズ修飾電極での硝酸イオンの吸着状態,電位による吸着量の変化,特にスズが誘起する還元されやすい吸着状態はどのようなものであるかを分析,解明し,これらの知見を基に新たな機能性電極を設計することを目的としている.さらに,より実用性の高い膜電極を用いたシステムへ応用を図ることについても考慮している.平成24年度は前年度に引き続き,主として,電気化学的測定と連動した表面増強赤外吸収スペクトルの測定から,パラジウム,白金,およびスズ修飾パラジウム電極のN-O結合解裂能力と白金の水素化能力の兼備を期待したパラジウムー白金合金電極について,これらの電極およびこれらをスズで修飾した電極を用いて硝酸イオンの吸着状態に関する知見を得た.パラジウムー白金電極では,1種類のバンドのみが観測され,bidentate型に吸着した硝酸イオンのN=0伸縮振動によるバンドであると帰属された.また,電極のパラジウムの組成の増大に伴って,bidentate型に吸着した硝酸イオンのバンドが高波数側へ移動することが観測された.パラジウムー白金合金電極では,PdPd,PdPt,PtPtの3つの吸着硝酸イオンが予想されるが,観測れたバンドはこれら3種類の平均であると考えられる.観測されたバンドが,bidentate型吸着硝酸イオンのN=0伸縮振動によるバンドである所から,パラジウムの割合の増大に伴って,N上の正電荷が増大し,N=0の結合が強くなったものと考えられる.即ちパラジウムの割合の増大によって硝酸イオンは,より還元されやすい状態になっていることが明らかになった.これは電気化学的測定による結果と一致している.本研究では,種々の疾病の原因となる飲料水中の硝酸イオンを電気化学的に還元して無害化する電極の設計のために,電気化学的測定と連動した表面増強赤外分光法によって,貴金属およびスズ修飾貴金属電極での硝酸イオンの吸着状態,スズが誘起する還元されやすい吸着状態はどのようなものであるかを分析,解明し,これらの知見を基に新たな機能性電極を設計することを目的としている.本年度は,研究の総括として,これまでのPd,Pt,Rh,およびそれらの合金について硝酸イオンの吸着状態と硝酸イオン還元活性との関係,これら貴金属にスズを修飾した場合の還元活性向上の理由について考察した.表面増強赤外分光法による測定では,Pd-Pt,Pt電極では,1種類のバンドが観測され,二座型に吸着した硝酸イオンのN=0伸縮振動によるバンドであると帰属された.また,Rh電極では,二座型に吸着した硝酸イオンの他に単座型に吸着した硝酸イオンも観測された.二座型吸着硝酸イオンのN=0伸縮振動位置から,二座型吸着硝酸イオンの還元されやすさの順序は,Pd>Pt>Rhであると予想されるが,これらの貴金属電極の硝酸イオン還元活性の順序は,Rh>Pt>Pdであることが報告されている.この結果から,貴金属電極による硝酸イオン還元の活性種は,二座型ではなく単座型に吸着した硝酸イオンであると考えられる.単座型硝酸イオンでは他の吸着様式と比べて電極との相互作用は小さいが,硝酸イオンの酸素に対してプロトン付加が起こりやすいため,プロトン付加によってN-Oの結合解離を誘起することによって還元が進行するものと考えられる.スズ修飾電極では,吸着硝酸イオンの還元されやすさの順序は, Pd>Pt>Rhであるが,活性の増大はスズが硝酸イオンの酸素と相互作用することによってN-Oの結合解離が促進されることに起因するものと考えられる.本研究では,Pd,Pt,Rhについて硝酸イオンの吸着状態と硝酸イオン還元活性との関係,スズを修飾した貴金属電極の還元活性向上の理由について考察した.赤外分光法による測定結果から,貴金属電極による硝酸イオン還元の活性種は,単座型に吸着した硝酸イオンであると考えられる.単座型硝酸イオンでは硝酸イオンの酸素に対してプロトン付加が起こりやすいため, N-Oの結合解離を誘起することによって還元が起こるものと考えられる.スズ修飾電極では,活性の増大はスズが硝酸イオンの酸素と相互作用することによってN-Oの結合解離が促進されることに起因するものと考えられる.本研究では,種々の疾病の原因となる飲料水中の硝酸イオンを電気化学的に還元して無害化する電極を設計するために,電気化学的測定と連動した表面増強赤外分光法によって,貴金属電極(白金,パラジウム,ロジウム,イリジウム,ルテニウム)およびそれらのスズ修飾電極での硝酸イオンの吸着状態,電位による吸着量の変化,特にスズが誘起する還元されやすい吸着状態はどのようなものであるかを分析,解明し,これらの知見を基に新たな機能性電極を設計することを目的としている.さらに,より実用性の高い膜電極を用いたシステムへ応用を図ることについても考慮している.

平成23年度は主として,電気化学的測定と連動した表面増強赤外吸収スペクトルの測定から,貴金属電極(パラジウム,白金,ロジウム)およびそれらのスズ修飾電極を用いて硝酸イオンの吸着状態に関する知見を得た.また,硝酸イオン還元触媒として有効な銅修飾パラジウム,スズ修飾パラジウム電極のN-O結合解裂能力と白金の水素化能力の兼備を期待したパラジウムー白金の合金についても研究対象とした.既に報告したように白金ではbidentate型に吸着した硝酸イオンのバンドが現れるが,パラジウムでは明確なバンドは出現しなかった.平面型の構造をとる硝酸イオンはパラジウム表面と平行に吸着していることが予想される.また,パラジウムー白金の合金では,白金と同様にbidentate型の硝酸イオンのバンドが現れ,パラジウム/白金比の増大に伴ってバンド位置は高波数側に移動することがわかった.また,これらの電極ではスズを修飾してもバンド位置の変化は小さいことがわかった.ロジウム電極では,硝酸イオンの添加によってbidentate型に吸着した硝酸イオンのバンドの他にunidentate型に吸着した硝酸イオン,硝酸イオンの還元生成物であるNOと考えられるバンドも出現した.パラジウムー白金電極を用いて,その組成を連続的に変化させることによって,bidentate型吸着硝酸イオンの場合,N上の正電荷の増大が,電極表面に吸着した硝酸イオンの還元されやすい状態と符合していることが明らかになった.スズの修飾によって硝酸イオン還元活性が増大することについても,スズの正電荷がN上の正電荷の増大に寄与していることが予想される.これついては,白金電極を用いてスズ被覆率を変化させた場合の一連の赤外吸収スペクトルの測定によって明らかにしつつある.このように,赤外分光法から見た還元されやすい状態にある硝酸イオンについては明らかにすることができた.これらの研究結果について,3件の学会発表を行った.現在,パラジウムー白金の合金電極,ロジウム電極の結果をまとめて,学会誌への投稿論文を執筆中である.平成23年度の主な目標は,電気化学的測定と連動した表面増強赤外吸収スペクトルの測定から,貴金属電極およびそれらのスズ修飾電極を用いて硝酸イオンの吸着状態に関する知見を得ることである.これまでの知見から,スズ修飾パラジウムおよびスズ修飾白金電極では硝酸イオン還元に対して高い活性を示すが,スズ修飾ロジウム電極では活性は低いことがすでに明らかにされている.これらの結果に基づいて,パラジウム,白金,パラジウムー白金の合金,ロジウムおよびそれらのスズ修飾電極を用いた赤外吸収スペクトルの測定から,当初の予想通り貴金属電極表面に吸着した硝酸イオンは,貴金属の種類によって吸着様式に違いがあることがわかった.また,スズ修飾および銅修飾パラジウム電極では,硝酸イオンの還元によるNOのバンドが観測された.これらの電極については,硝酸イオンに加えて,亜硝酸,NOを用いて,吸着状態の検討を行った.これらの研究結果について,5件の学会発表(国内の学会:4件,国際学会:1件)を行った.
長鎖脂肪酸による前立腺癌進展の機序解明－パルミチン酸とＭＩＣ－１の関連－

我々は、高脂肪食、高パルミチン酸食摂取前立腺がんXenograftマウスでは、Macrophage inhibitory cytokine 1(MIC-1)分子の発現が亢進し、前立腺がんの増殖と浸潤を促進することを明らかにした。また、高脂肪食下前立腺がん進展には脂肪酸産生酵素であるFASNの発現変化が重要である可能性が示唆された。また、細胞内のパルミチン酸産生酵素であるFatty acid synthase (FASN)が、高脂肪食摂取LNCaP xenograftマウスのXenograftには高発現、血清中には低発現していることを見つけ出した。また、Xenograftを用いた免疫染色では高脂肪食群でP-AKT, P-ERKが高発現、P-AMPKが低発現していた。前立腺癌LNCaP, C4-2細胞は、AKT, ERK抑制剤であるLY294002、U0126処理すると細胞内のFASNの発現の低下と細胞培養液中のFASN発現の増加を認めた。また、LY294002とU0126処理により前立腺がん細胞内のAMPKの活性化が亢進し、さらにAMPK活性剤であるAICAR処理によって前立腺がん細胞内のFASN、SREBP-1蛋白の発現低下と細胞外のFASN発現亢進を認めた。一方、FASNsiRNAとFASN抑制剤Cerulenin処理により、前立腺がん細胞の増殖能が低下するが、パルミチン酸添加により改善が見られた。面白いことに、FASN抑制によって、前立腺癌細胞のP-AKT, P-ERKの抑制とP-AMPKの亢進を認めた。これは、前立腺癌細胞で、FASN発現とP-AKT, P-ERKとP-AMPKシグナルには重要なフィードバック存在している可能性を示唆している。前立腺癌組織では、FASN発現はGleason scoreと病理学的ステージと関連していて、さらにホルモン除却療法と化学療法によって発現が低下していることを認めた。このようにFASNは、高脂肪食、肥満などによる前立腺癌進展に重要な役割をしている可能性がある。我々は、初めて長鎖脂肪酸パルミチン(PA)刺激で前立腺癌細胞LNCaP, PC-3、DU145でのMIC-1の遺伝子発現の亢進を確認し、さらにPA刺激でPC-3, DU145細胞内と細胞培養液中のMIC-1の産生が亢進することを確認した。LNCaPxenograft解析では、高脂肪食(HFD)摂取群では低脂肪食群(LFD)より癌の大きさ((2569.9 ±151.1 vs 2010.3 ±120.7 mm3, p = 0.025)、癌組織中の脂肪酸量(172.2 ±43.9 vs 119.6 ±17.8 nMol/mg, p < 0.001)、血清中のMIC-1濃度(24155.2 ±4281.6 vs 18343.8 ±7019.9 pg/mL, p = 0.012)は有意に高く、さらに血清MIC-1は癌の大きさと相関していた(r = 0.642, p = 0.022)。マウス血清を用いた細胞増殖アッセイでは、HFD群はコントロール群より有意にLNCaP, C4-2細胞の増殖と浸潤を促進し、リコンビナントMIC-1(rMIC-1)も同様に前立腺癌細胞の増殖と浸潤を促進した。さらに、HFD血清、rMIC-1によってERKシグナルが活性化されることを確認している。健常者54人と前立腺癌患者168人の血清MIC-1を比較では、前立腺癌患者血清MIC-1は健常者に比べて有意に高く(1154.2 ±889.9 vs 784.0 ±299.6 pg/mL, p = 0.002)、前立腺癌患者血清MIC-1は、Gleason score (GS)が高くなるにつれて有意に高く(p < 0.01)、患者の肥満度と関連している可能性が示唆された(p = 0.087)。以上の結果より、MIC-1は高脂肪食や肥満による前立腺癌進展に関与している可能性が示唆された。脂肪酸産生酵素FASNは、細胞内の余分なエネルギーを脂肪酸(最初産物はパルミチン酸)、さらに脂質に転換させる酵素である。今回我々は免疫染色、ウェスタンブロット、ELISA法などを用いて、高脂肪食摂取LNCaP Xenograftマウス群では低脂肪食摂取群に比較して、がん組織にはFASN, PI3K, ERKの発現の亢進とAMPK発現の低下、血清中のFASNの低下(3344.6 ±1005.8 vs 6666.4 ±3685.8 pg/mL, p = 0.026)を確認した。またLNCaP, C4-2細胞を用いて、このような細胞内外のFASN発現の変化は、増殖シグナルであるPI3KとMAPKシグナル、エネルギー関連シグナルであるAMPKの活性化に制御されていることを確認した。またヒト前立腺がんがん組織でのFASN

発現レベルがGleason Scoreと相関していて、さらにホルムン、化学療法の反応性分子であることも確認した。このように、高脂肪食下脂肪酸産生酵素FASNの発現変化はPI3K, ERK, AMPKシグナルによって制御され、前立腺がんの進展を促進する可能性が示唆された。泌尿器系癌初めに、我々は高脂肪、高パルミチン酸食摂取前立腺癌担癌マウスの解析を通じてMIC-1が高脂肪食、肥満などによる前立腺癌進展の重要なファクター分子であることを突き止めた(Huang M, etal, Endocr Relat Cancer. 2013)。今までの研究で以下のことを明らかにした。1.長鎖脂肪酸パルミチンは前立腺癌細胞のMIC-1の発現と産生を促進した。2.高脂肪食摂取LNCaP Xenograftでは、癌組織、血清中のMIC-1の発現は有意に亢進し、ERKシグナルを亢進させ、前立腺癌の増殖と浸潤を促進していた。我々は、今まで前立腺癌担癌マウスを用いた高脂肪食付加実験を通じて、PI3K, MAPKなど増殖シグナルが亢進していることを明らかにした。最近の研究によると、PI3K反応分子であるphosphatidylinositolsの脂肪酸成分がその機能に重要な役割を及ぼす可能性が指摘されているがその詳細は不明な点が多い。今後は、質量分析法で高脂肪食摂取によりであるphosphatidylinositolsの変化とそのメカニズムを研究する。私達はこれまで、MIC-1がパルミチン酸によって発現、産生が亢進し、前立腺癌細胞の増殖と浸潤を促進する可能性があることを明らかにした。今後はさらにパルミチン酸による前立腺癌進展がMIC-1依存性に起こっているかを動物モデルで検証し、またその機序に関与する下流シグナルの同定を行う。これらの結果から前立腺癌との関連が確認されたら、動物モデルを用いてこれらの再確認とまた経路阻害薬で癌増殖、進展抑制が可能かどうか検討する。さらに高脂肪食によって、パルミチン酸関連酵素であるFASN発現の変化が生じる可能性と意義について研究する。パルミチン酸によるMIC-1発現と産生の役割と意義に加えて、パルミチン酸関連酵素であるFASNの発現の変化と役割についても検討を行った。高脂肪食によってMIC-1の他にFASNの発現の変化が前立腺癌の進展に重要である可能性があるため、その可能性についても予備実験を行った。次年度には以下のように研究を行う。1.前立腺癌動物モデルの作成と高脂肪、高パルミチン酸食による進展のメカニズムの解析2.前立腺癌患者全摘サンプルを用いてMIC-1の機能解析3.高脂肪食による前立腺癌細胞におけるパルミチン酸関連酵素FASNの発現の変化とその役割の検討
固着した古文書類の簡便な展開法の研究 -凍結真空乾燥法を利用して-

虫損や汚損により固着した古文書類の展開は、これまで技術や時間、経費の問題で困難であった。この展開法を簡便にするために、我々は出土木製品の保存処理に応用されている凍結真空乾燥法の利用を考えた。しかし、国内において自由に使うことのできる凍結真空乾燥機が少ないために、簡便な方法を確立することを試みた。その結果、家庭用冷蔵庫での凍結、手に入れやすい実験用具での真空乾燥でもって実施できることがわかった。ただ、水漬けによる染料などの流失や、展開での紙葉破片の散逸などのリスクを考えたうえでの利用が求められる。また、研究過程で、固着文書と呼ばれている文書類の実態が判明した。一つは固着しているが故に整理調査をされないまま放置されている現状であり、一つは若干の文書修復的な処置をすれば簡単に展開できる固着文書類が数多くあるという実態である。さらに、水の利用が前提になる凍結真空乾燥法では、紙の強度が著しく低下することもわかった。今後、文化財や歴史資料として求められる紙の強度についての研究の必要性があるといえよう。今年度、研究者等が試料収集を兼ねた実態調査を実施した結果、古文書に関する収集・整理・調査・研究・保存は飛躍的に進展している一方で、固着文書は収集整理の段階でその範疇から外れることが多く、収集できたものも固着しているがゆえに研究対象にはならず燻蒸処置のみ施し保管されている現状が明らかになった。また、調査を欲した文書であっても、その紙葉の展開にかかる費用が大きくなること、担当者自身が展開するにもそのための技術や知識が浅く、史料保存のためにそのままにしてあることが明らかになった。本研究のために提供されあるいは情報を得た固着文書の中には、本研究の対象、すなわち凍結させ真空乾燥によって展開する必要がある板状の文書や劣化が極度に進んだ文書ではなく、虫食いによる孔がホック状になり展開しづらいだけの文書も一定数あった。それらは、ヘラ状の道具を使えば担当者が簡単に展開できるもので、本研究の発端ではあるが史料を扱う機関や個人の固着文書の現状認識が明らかになった意味は大きいといえる。同時に、史料研究のためにもこのような現状を伝え広める必要性を痛感する。和紙を凍結させることは再度水を通すことであり、そのために和紙の強度劣化が問題となる。引っ張り試験機を用い強度変化を認識したところ、水を通すことで、おおむね半分以下に強度が下がることがわかった。そこで、和紙を始めとして様々な紙について、水分率や乾燥方法の違いによる強度試験計画を立てることにした。凍結真空乾燥で以て展開できた固着文書の紙質や強度に問題がない状況を明らかにしていきたい。本研究の主務である凍結真空乾燥法を利用した固着文書の展開は、元興寺文化財研究所保存科学センターに設置してある大型真空凍結乾燥機やデシケーターなどを使った簡便な方法での実施等を提供された試料をもとに臨床的に試験をした。前年度からの課題でもあった実施試料の選択は、歴史学や表装技術などの専門家からも教示をいただき、一定の指針を見出すことができた。それは、(1)水漬けによる原試料の破壊の恐れがないもの(2)展開により紙葉破片などが散逸しないもの(3)固着をそのままにしておくと廃棄されてしまうものなどの基準である。一方、紙の強度変化の課題については、紙が水に濡れることによって強度変化をさせることは知られているが、和紙の種類や方向による強度変化の定量的データは少ないことがわかった。そこで、水の影響による強度変化を確認するとともに、強度の回復の可能性も探った。試験方法は小型引張り圧縮試験機を使い、JISによる紙及び板紙の引張り強ざ試験方法(P8113)・紙及び板紙の湿潤引張り強さ試験方法(P8135)に準じて試験を行った。結果を見ると、繊維方向による強度は、雁皮紙・新聞紙・堵紙の順で確認でき、特に雁皮紙に顕著に見られた。紙を水に晒した後の凍結真空乾燥・自然乾燥の引張り強さは、それぞれ低下している。自然乾燥中に加圧処置を取ると引張り強さはかなりの程度まで戻る。乾燥後の加圧処置での回復度が微増であることからして、水に濡れた紙の加圧処置の意味は大きいと言える。

凍結真空乾燥での加圧処置は、乾燥中も乾燥後も効果はなかった。文書修復での加圧の重要性はあらためて確認できたが、固着文書の展開における凍結真空乾燥では、水が媒介として必要でありその結果紙力の回復が望めない以上、前述した同法の利用基準は重要である。また今後、文化財や歴史資料として求められる紙の強度を探り、定量的なデータの提示が急務になった。
アテトーゼ型脳性麻痺を対象とした歯突起骨の成因に関する研究

歯突起骨は重篤な脊髄損傷に発展する危険をはらむ骨奇形であるが、その成因については未だ意見の一致をみていない。沖縄県内9施設に入所または通園しているアテトーゼ型脳性麻痺患74人(男39名、女35名で、撮影時年齢3歳56歳)の頚椎レントゲン像を撮影し検討した。1)歯突起骨を2人に認めた。2)後弓低形成(側面レ線像で環椎後弓の断面が、その前方の前弓と後弓をつなぐ部分の頭尾径と同じかより小さい)は13人にみられた。3)開口位レ線像での環軸関節の骨棘は15人が有していた。4)環軸椎亜脱臼(正常の歯突起を想定して前屈位のAtlanto-dentalintervalが13歳以上で3mm以上または12歳以下で5mm以上)は13歳以上の63人中26人にみられたが12歳以下ではいなかった。5)Lawrence分類による椎間板変性(Grade Iは変性のない像との区別が難しいのでGrade IIIVを有意とした)はC2/3で6人、C3/4で16人、C4/5で21人、C5/6で29人、C6/7で18人にみられた。6)3.5mm以上の椎体辷りは前屈時においてC2/3とC3/4で各3人、C4/5とC5/6で各1人にみられ、後屈時にはなかった。7)C5レベルでの固有脊椎管前後径の狭窄(20歳以上で12mm以下が狭窄)は成人54人中1人のみであった。8)最小の有効脊椎管前後径の狭窄(前項と同じ)は5人で、C4/5が1人、、C5/6が4人であった。つぎに何らかの症状を有していたため手術を行った歯突起骨患者10人でレントゲン像の検討を行った。歯突起骨手術患者10人のうち、ダウン症2人、アテトーゼ型脳性麻痺21人を除く7人の中で、環椎後弓の低形成を明らかに認めたのは2人で、明らかに認めなかったのは3人であった。なお、ダウン症は2人とも低形成であり、アテトーゼ型脳性麻痺の1人は判定不能であった。歯突起骨の発生率の比較は困難で、後弓低形成の率はアテトーゼ型脳性麻痺(13/74で18%)の方が他の歯突起骨例(2/7で29%)よりかえって低かった。環軸椎亜脱臼、椎間板変性、椎体辷りなどの結果から、アテトーゼ運動による頚椎へのストレスは大きいと考えられた。

現在までに、県内9施設に入所または通園している74人(3歳56歳)のアテト-ゼ型脳性麻痺患者(男39名、女35名)の頚椎レントゲン像を撮影し得た。1)歯突起骨を2人に、2)後弓低形成(側面レ線像において、環椎後弓の断面に見える部分が斜角にみえる部分と同じかより小さい)を13人に、3)開口位レ線像で環軸関節骨棘を15人に認めた。4)環軸椎亜脱臼(前屈位のAtlanto-dental intervalが13歳以上で3mm以上または12歳以下で5mm以上)は13歳以上の26人にみられた。5)椎間板変性(Lawrence分類のGrade IIIV)はC5/6で29人に、C4/5で21人に、C6/7で18人に、C3/4で16人に、またC2/3で6人にみられた。6)椎体辷り(3.5mm以上)は前屈のみでみられC2/3とC3/4で各3人、C4/5とC5/6で各1人であった。20歳以上の成人54人で、7)固有脊椎管前後径の狭小(12mm以下)は1人に、8)有効脊椎管前後径の狭小(12mm以下)は5人に(C5/6が4人、C4/5が1人)であった。歯突起骨について、骨癒合がまだ終了していない可能性がある10歳以下の8名を除く66人で考えると、その発生率は2/66で3%となる。この数値が大きいか否かを検討するには、正常人やアテト-ゼ以外の型の脳性麻痺患者の検討を行う必要がある。後弓低形成および固有脊椎管前後径狭小は、歯突起骨と同様に骨発達過程で生じる異常と思われるので、今後はこれらの項目の合併例を分析していきたい。環軸椎関節の骨棘、環軸椎亜脱臼、椎間板変性度、や最小脊椎管前後径狭小化などは、アテト-ゼ運動および加齢によると思われる退行性変化と考えられる。これらの数値の解釈には、アテト-ゼ運動の定量的評価やアテト-ゼ以外の型の脳性麻痺患者の検討が必要であろう。歯突起骨は重篤な脊髄損傷に発展する危険をはらむ骨奇形である。その成因については未だ意見の一致をみず、生下時にすでに歯突起骨になる素因があるとする説と、生後に何らかの外傷が作用して罹患するとする説とがある。沖縄県内9施設に入所または通園しているアテトーゼ型脳性麻痺患者74人(男39名、女35名で、撮影時年齢3歳56歳)の頚椎レントゲン像を撮影し、また何らかの症状を有していたため手術を行った歯突起骨患者10人も参考として、レントゲン像の検討を行った。調査項目は、1)歯突起骨、2)後弓低形成(側面レ線像において、環椎後弓の断面に見える部分が斜角にみえる部分と同じかより小さい)、3)開口位レ線像での環軸関節の骨棘、4)環軸椎亜脱臼(前屈位のAtlanto-dental intervalが13歳以上で3mm以上または12歳以下で5mm以上)、5)Lawrence分類によるC2/3C6/7レベル椎間板の変性度(Grade Iは変性のない像との区別が難しいのでGrade IIIVを有意とした)、6)前屈あるいは後屈時の3.5mm以上の椎体辷り、7)C5レベルでの固有脊椎管前後径(20歳以上で12mm以下が狭窄)、8)最小の有効脊椎管前後径(前項と同じ)とそのレベル、などであった。1)歯突起骨を2人に、2)後弓低形成を13人に、3)環軸関節骨棘を15人に認めた。4)環軸椎亜脱臼は13歳以上の63人中の26人にみられたが12歳以下ではいなかった。5)椎間板変性は、C5/6で29人に、C4/5で21人に、C6/7で18人に、C3/4で16人に、またC2/3で6人にみられた。6)辷りは前屈のみでみられ人数は、C2/3とC3/4で各3人、C4/5とC5/6で各1人であった。7)成人54人で固有脊椎管前後径の狭小は1人のみであった。8)有効脊椎管前後径の狭小は5人で、そのレベルはC5/6が4人、C4/5が1人であった。歯突起骨手術患者10人のうち、ダウン症2人、アテトーゼ型脳性麻痺21人を除く7人の中で、環椎後弓の低形成を明らかに認めたのは2人で、明らかに認めなかったのは3人であった。なお、ダウン症は2人とも低形成であり、アテトーゼ型脳性麻痺の1人は判定不能であった。
細胞周期標識・放射線感受性小頭症遺伝子欠損マウスを用いた関連分子の動態・機能解析

発生期脳特異的にAspm遺伝子を欠損するマウスを作製し、胎仔脳の形成、生後の脳成熟に及ぼすAspmの機能を解析した。胎生中・後期で、胎仔脳の脳室帯における細胞周期M期、S期細胞数は、Aspm欠損マウス、Aspm野生型で有意差がなかった。EdUパルスアッセイ法では、Aspm欠損マウスにおいて、EdU標識細胞総数が有意に減少しており、胎齢14.5日以降における新生神経細胞数減少によるものと考えられた。脳成熟期におけるMRI(拡散テンソル画像)から算出されたFA値は、Aspm欠損マウスの大脳皮質・白質で有意に低下し、組織学的に神経突起の性状(神経突起の縦横比率)の変動によるものと推測された。1.条件的Aspm欠損マウスの作製胎齢8.5日、9.5日において、母マウスにタモキシフェン(以下、TAM)を8mg(総量)経口投与し、胎仔脳においてAspmノックダウンを惹起した。TAM投与後の胎仔死亡率は39%(47/122)であったが、生存した胎仔のうちgenotype:CreERT2(+)+flox/floxの胎仔脳においてAspm mRNAの有意な発現低下(RT-PCR)、Aspm蛋白発現低下(免疫染色)を確認した。当該胎仔脳を用いて、12.5日14.5日まで終脳の形成を解析した。増殖・分裂に及ぼす影響を解析するために、EdU投与(10 mg/kg)1時間後の脳室層、脳室下層におけるEdU陽性細胞、分裂中期の細胞に関して、その分布・細胞数を計測した。CreERT2(+)+flox/flox(ホモAspm発現欠損)、CreERT2(-)(Aspm正常発現コントロール)、ならびにCreERT2(+)+flox/+(ヘテロAspm発現欠損)の3群間で比較検討中である。EdU陽性細胞の分布、細胞数に有意差はみられず、S期におけるDNA合成に影響はないが、分裂中期細胞の細胞分布・数に差異がみられ、今後さらに検討を続ける予定である。生後3-4週、ならびに生後10-12週において、同一個体でMRI画像(T2強調、拡散テンソル画像)を取得し、大脳皮質、海馬、脳室容積、神経回路の経時的な変化を解析している。Aspm欠損マウス(-/-)のメスでは、WT(+/+)に比較し、進行性の脳室拡大がみられるとともに、拡散テンソル画像でFA(fractional anisotrophy)値の差異がみられ、画像解析後(13-15週)に脳の組織学的解析を加え、その組織学的確証を解析中である。1.中枢神経特異的Aspm欠損マウス(NesCre- Aspmflox)の脳形成の解析:胎生期に、EdU投与+48時間後にBrdU投与(胎齢12.5日/胎齢14.5日、胎齢14.5日/胎齢16.5日)することで、胎齢の異なった時期にS期の細胞をラベル後、胎仔脳を解析した。Aspm欠損マウスでは、細胞周期の遅延、対称性・非対称性分裂の異常により、胎齢の時期に応じて、細胞増殖・分化、細胞遊走に変動が生じることが明らかになってきた(データ集積中)。3.生後の脳発達過程におけるAspmの機能解析MRIを用いた脳のin vivo時空間的変化:全身型Aspm欠損、Aspm野生型、雌雄の4群で、生後3週、10週において、MRI (T2強調画像: T2W、拡散テンソル画像: DTI)を施行した。Aspm欠損では、Aspm野生型に比して、雌雄ともに、生後3週、10週において、脳容積が有意に小さく、脳室容量は有意に大きかった。FA値は、生後3週、10週において、Aspm欠損では、大脳白質、外包、内包、海馬采で、有意な低下をみた。DTIで得られたFA値の有意差を組織学的に検証するために、Bodian染色、髄鞘染色による組織計測学的解析を施行中である。条件的Aspm欠損マウス(Fucci-Nes-CreERT2- Aspmflox)の脳形成の解析では、タモキシフェン投与条件の設定に難渋し、良好なAspm発現抑制が誘導できなかった。そのため、平成27年度上半期から、中枢神経特異的Aspm欠損マウス(NesCre- Aspmflox)の脳形成解析に研究計画を変更した。また、条件的Aspm欠損マウスでは、継代とともに、Fucciのライヴ蛍光が低下しており、新規のFucciマウス(R26Fucci2aR: G1期をmVenus、S/G2/M期をmCherryでラベル)との交配を開始し、年度終盤になって新規マウスの作製に至った。一方で、全身型Aspm欠損マウスを用いた画像解析は順調に進んだ。以上の問題が発生したため、研究の遂行が遅れている。1.脳特異的Aspm欠損マウス(Aspm KO)を用いた脳形成過程の解析1)皮質サイズ:大脳皮質厚は、胎齢16.5日でAspm KOに有意な減少がみられた。層形成のマーカー(Tbr1、Ctip2、Satb2)によって構成を検証したところ深層ほど層厚が減少していた。2)細胞増殖・細胞周期:細胞周期におけるM期(リン酸化ヒストン)およびS期(BrdU投与1時間後の分布)の変化について解析した。

胎齢12.5日、胎齢14.5日、胎齢16.5日において、Aspm KOとAspm WTで脳室層におけるM期細胞数、S期細胞数に有意差がなく、皮質形成期における細胞増殖・細胞周期に関してAspm欠損の影響は少ないことが示唆された。3)神経新生・細胞遊走:EdUパルスアッセイ法を用いて、神経細胞新生、細胞遊走に関して解析した。EdU投与2日後(胎齢12.5日/胎齢14.5日、胎齢14.5日/胎齢16.5日)に解析を行った。胎齢12.5日/胎齢14.5日では、EdU標識細胞数、皮質板・中間帯における分布パターンに有意差はなかった。胎齢14.5日/胎齢16.5日では、EdU標識細胞総数が有意に減少しており、中間帯で顕著に減少しており、これらは未熟なニューロンマーカー(DCX、Tuj1)陽性であった。2. in vivo MRIによる脳の時空間的変化と組織学的検証:MRI(T2強調画像、拡散テンソル画像)を施行し、拡散テンソル画像から算出されたFA値は、生後3週齢、10週齢において、Aspm KOでは、Aspm WTに比し、大脳白質、外包、内包、海馬采で有意な低下をみた。同週齢において、脳組織のBodian染色、髄鞘染色を用いて細胞密度、神経突起の性状に関して組織計測学的解析を施行し、神経突起の走行(垂直方向・水平方向)、突起形状、束形成などの変化がFA値に影響を与えることが明らかになった。発生期脳特異的にAspm遺伝子を欠損するマウスを作製し、胎仔脳の形成、生後の脳成熟に及ぼすAspmの機能を解析した。胎生中・後期で、胎仔脳の脳室帯における細胞周期M期、S期細胞数は、Aspm欠損マウス、Aspm野生型で有意差がなかった。EdUパルスアッセイ法では、Aspm欠損マウスにおいて、EdU標識細胞総数が有意に減少しており、胎齢14.5日以降における新生神経細胞数減少によるものと考えられた。脳成熟期におけるMRI(拡散テンソル画像)から算出されたFA値は、Aspm欠損マウスの大脳皮質・白質で有意に低下し、組織学的に神経突起の性状(神経突起の縦横比率)の変動によるものと推測された。1.条件的Aspm欠損マウス(Fucci-Nes-CreERT2- Aspmflox)の脳形成の解析では、タモキシフェン(以下、TAM)投与条件の設定に難渋した。TAMの母仔に対する毒性が強く、胎仔脳におけるAspmのノックダウン誘導に至適な投与時期、投与量の設定に苦慮した。以上の問題が発生したため、研究の遂行が遅れている。1.条件的Aspm欠損マウス(Fucci-NesCreERT2- Aspmflox)を用いて、胎仔終脳壁の組織培養・タイムラプスを駆使し、一細胞レベルにおける細胞周期、対称性、非対称性分裂の動態に関して解析する。2. Aspm欠損マウスにおいて、MRI解析で得られたFA値の変動を組織学的に検証し、Aspmの機能が脳の発生・発達段階を追ってどのように変化するか、その成熟脳での帰結を明らかにする。3.成マウスを対象とした学習・行動解析:Aspm欠損成マウスを用いて、自動制御・24時間モニタリングとRFタグでの個体認識により、集団生活環境下での社会行動・空間認知機能解析を可能にするIntelliCageを用いた行動実験を行う。この一連の解析によって、完成した脳機能に及ぼすAspm欠損の影響を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。発生神経生物学、神経病理学タモキシフェン(以下、TAM)誘導型Aspm遺伝子破壊マウスの脳形成解析が順調に進まないため、中枢神経特異的Aspm欠損マウス(NesCre- Aspmflox)を用いて、Aspmの機能解析を並行して進める。EdU投与により、細胞増殖、細胞遊走、分化に着目した解析を行う。
閉鎖性水域の浄化容量

閉鎖性水域の浄化容量の実体を解析することを目的として、湖沼・河川生態系を物質循環の面からモデル化することを目指し、以下の研究結果を得た。本年度も前年に引き続き、河川については河道内、湖沼については沿岸域を対称として研究を行った。1.河川上流域にモデル地域を設定し、その地域での一年間の有機物収支を追跡し、以下の結果を得た。インプットとしては基礎生産による供給が100KgC,周辺の樹木等からの落葉・落枝が128KgC,その他が1730KgCであり、その他のうちの半分以上は溶存有機物の形で供給されていた。アウトプットとしては、水中の微生物群集の呼吸が77KgCで、これは基礎生産とリターによる有機物供給の34%に相当するものであった。河道内での有機物収支には底生動物群等の果す役割が大きく、河道内での有機物の無機化の18%を担っており、これが付着微生物群集の現存量を強く規定していることが分った。以上の結果をもとにして河道内での物質循環のモデル化を進め、今後、閉鎖性水域の浄化容量に果す河道内での物質収支の役割を検討する計画である。2.湖沼沿岸域については水生植物に付着する微生物群集の現存量、生産力および消失量についての季節的変動を実測し、その実体を明らかにした。同時に、併行して、沿岸域での自然浄化機能を数理モデルを用いて明らかにすることを試みた。研究対象としては沿岸域の主要な植生であるヨシ帯を採り上げた。ここでの浄化量とは、(無機化量+蓄積量)と定義している。扱うモデルはピストン・フロー・モデルとし、ヨシ帯内と沖合の湖水との交換が定量的に把握できるように配慮した。このモデルを用いて、ヨシ帯内の水の流れの速さと有機炭素および窒素の浄化量の関係を検討した。今後は対象物質として燐を加えると共に、沿岸域での物質循環モデルをさらに発展させると共に、閉鎖性水域としての湖沼全体のモデル化に取り組む計画である。