hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経ペプタイドYの血管透過性作用における構造活性相関の解析

神経ペプタイドY(neuropeptide Y:NPY)は交感神経終末にノルエピネフリンと共存する神経伝達物質である。神経原性肺水腫の発生メカニズムの研究において、われわれは交感神経系の刺激が肺の血管透過性を亢進させることを示し、特にNPYがこれに強く関与することを示してきた。NPYの血管透過性作用の発現における細胞内情報伝達の解明の一環として、われわれはin vitroでラットの大動脈内皮細胞monolayerの実験系を用い、NPYの血管透過性作用における構造活性相関の解析を進めることとした。平成18年度より引き続き、平成19年度はdouble-chamber methodを用いて、上層チャンバーにラットの大動脈内皮細胞を培養しmonolayerを作成し、低酸素状態(酸素濃度1015%)での透過性亢進をFITC-labeled albuminを用いて測定した。また血管透過性に対するNPYの効果について検討してきた。一方でヒト大動脈内皮細胞を用いて同様の実験系を作成し血管透過性に対する吸入麻酔薬(セボフルラン、イソフルラン)野影響についても検討した。NPYは36アミノ酸からなるペプタイドで、これを17番目のアミノ酸(Met)の前後で切断し、それぞれのペプタイドの血管透過性に及ぼす影響を比較するため、分割した小さなペプタイド(3-8アミノ酸)を作成した。これらの分割ペプタイドによる血管透過性作用の変化を測定中である。このようにして、Y3受容体に特異的に結合し、血管透過性作用を示すアミノ酸配列を明らかにされるものと考える。これにより、将来的には内皮細胞に発現しているY3受容体を同定し、その化学的構造の解明および受容体後の細胞内情報伝達の解明の手掛かりとなると考える。神経ペプタイドY(neuropeptide Y : NPY)は交感神経終末にノルエピネフリンと共存する神経伝達物質である。平成18年度はラット大動脈内皮細胞を購入し培養増殖し、分割、凍結保存した。double-chamber methodを用いて、上層チャンバーにラットの大動脈内皮細胞を培養しmonolayerを作成し、透過性測定はFITC-labeled albuminを上層チャンバーに注入し、低酸素状態(酸素濃度1015%)で反応させた。このとき内皮細胞monolayerのある上層チャンバーにNPYなどを投与し、一定時間反応させた後、下層チャンバーからサンプリングし蛍光度測定をした。また現在は外注によりNPYを17番目のアミノ酸(Met)の前後で切断し、それぞれのペプタイドの血管透過性に及ぼす影響を比較するため、分割した小さなペプタイド(3-8アミノ酸)を作成した。これらのペプタイドによる血管透過性作用の変化を順次測定中である。このようにして、Y3受容体に特異的に結合し、血管透過性作用を示すアミノ酸配列が明らかにすることを目標とする。
高齢者との共生を目指した移動システムの研究

高齢者がいきいきと生活できるために、非高齢者と共生できる移動システムが重要となる。本研究では、H1011年の基盤研究で提案した超小型の自動車が、より実現の方向にむかうために解決すべき課題として挙げられた、運転操作系の改良と一般の自動車との混合交通における安全確保に関して注目した。ドライビングシミュレータによる検討と、実車(同等の市販車)を用いた試験により、問題解決を目指した。具体的に行った内容を以下にしめす。まず、運転を実験室で模擬し、統制のとれた環境下でデータを取得するため、動揺付加式ドライビングシミュレータを作成し、高齢者の運転特性を採取した。その後、高齢者の特性に基づく運転操作系を提案し、評価・検討を行った。その結果、操作を手に集中させる方式の優位性がしめされた。次に、ドライビングシミュレータによる検討から、高齢者によりよいという知見の得られた運転操作系を,超小型電気自動車に組み込み、実車での評価を行った。その結果、適切な操舵系ギヤ比の設定や、手だけで操作できる操作系の妥当性が確認された。また、市販の超小型電気自動車を地域(茨城県十王町)へ導入し、高齢者・非高齢者のモニタに長期間貸し出しを行った。このモニタ実験から、共生のための移動システムに関する知見を得た。超小型車は非高齢者からも好評で、車両が混在した低速交通の実現への課題が整理された。以上から、本研究で目指す共生移動システムの実現に向けた課題がほぼクリアされ、基盤技術として確立した。1)高齢者特性の追跡調査3年前に調査した秋田県鷹巣町の高齢者41人のデータに関して、追跡調査を行い、24人のヒアリング・実験、12人のアンケートデータを採取した。3年間のライフスタイルの変化はあまりないものの反応特性データには加齢の影響が顕著に出ており、意識にあまりなく身体特性劣化があることに注意が必要であることがわかった。さらに、住居地区とモビリティ、運転能力と身体特性の間の関係を考察し、モビリティ確保の必要性、自動車等移動手段の重要性、簡易自動車の操作インターフェイスへの必要要件などについて検討を行った。ここで得られた情報を、シミュレータにおける実験条件設定や支援技術開発、訓練プログラム構築につなげていく。2)シミュレータシステムの構築新規導入した6軸モーション装置を使ったドライビングシミュレータシステムの構築作業を行った。装置の搬入が10月であったので装置の基本動作試験、ソフトウエア開発環境の整備、などを装置関連作業として実施するとともに、モーション付きとなるため、画像、車両運動計算などのプログラムも全面的に見直しを行い、開発に着手した。また、装置の上物となる、運転操作系については、基本構想をまとめ、一部製作に着手した。以上のように、今年度はシステムとして動くところまでの到達で、次年度以降、装置を完全に完成させて、高齢者特性を調べる部分や訓練部分などの構築と被験者による実験を行っていく予定である。1)シミュレータシステムの作成操作系の変更を容易に行うことが可能であり,また高齢者が容易に乗り込めるようにリフト装置を配した6軸モーション装置によるドライビングシミュレータシステムを完成させた.これにより,高齢者を対象としたシミュレータによる車両操作実験が可能となった.2)高齢者向け自動車操作系インタフェースの検討白動車の運転における「認知」・「判断」・「操作」という一連の流れの中で,高齢化による「操作」能力の低下に対して有効であると考えられる操作系インタフェースの改良について,特に過去の取り組みが少ない操作系の形状面について注目し,比較検討を行った.まずは,高齢者の「操作」能力低下の要因を調査検討した.すると,関節可動域の減少,筋力低下が主な要因であるという知見が得られた.そこで,それらの能力低下要因を減少させることができると考えられる操作系として,操舵系は小舵角ハンドル,加減速系は左手スロットルスティック,およびハンドル附属式ブレーキレバーを提案,試作し,現状のオートマチック自動車の操作系との比較を行うために,上記のドライビングシミュレータシステムを用いて高齢者を対象とした操作系評価実験を行った.

実験は,操作負担はトラッキング課題と音の聞き分け課題による二重課題法を用いて評価し、操作性能はダブルレーンチェンジ時の成功率によって評価した.被験者は普通免許を所持する高齢者2名,および若年者2名を対象とした.その結果,現状の操作系と比較して新しく提案した操作系,特に小舵角ハンドルとハンドル附属式ブレーキレバーを組み合わせた操作系の高齢者に対する有効性が示された.以上により,現状の操作系に対して新しい操作系を適用することによって,高齢若の運転能力を的確に補助することができることを示すことができた.高齢者がいきいきと生活できるために、非高齢者と共生できる移動システムが重要となる。本研究では、H1011年の基盤研究で提案した超小型の自動車が、より実現の方向にむかうために解決すべき課題として挙げられた、運転操作系の改良と、一般の自動車との混合交通における安全確保に関して注目した。ドライビングシミュレータによる検討と、実車(同等の市販車)を用いた試験により、問題解決を目指した。具体的に行った内容を以下にしめす。まず、運転を実験室で模擬し、統制のとれた環境下でデータを取得するため、動揺付加式ドライビングシミュレータを作成し、高齢者の運転特性を採取した。その後、高齢者の特性に基づく運転操作系を提案し、評価・検討を行った。その結果、操作を手に集中させる方式の優位性がしめされた。次に、ドライビングシミュレータによる検討から、高齢者によりよいという知見の得られた運転操作系を,超小型電気自動車に組み込み、実車での評価を行った。その結果、適切な操舵系ギヤ比の設定や、手だけで操作できる操作系の妥当性が確認された。また、市販の超小型電気自動車を地域(茨城県十王町)へ導入し、高齢者・非高齢者のモニタに長期間貸し出しを行った。このモニタ実験から、共生のための移動システムに関する知見を得た。超小型車は非高齢者からも好評で、車両が混在した低速交通の実現への課題が整理された。以上から、本研究で目指す共生移動システムの実現に向けた課題がほぼクリアされ、基盤技術として確立した。
細動脈レベルにおける腎循環調節機序-糸球体輸入・輸出細動脈における酵素活性の相違-

腎臓には、他の臓器と異なり、2つの抵抗血管がある。糸球体をはさんで輸入細動脈と輸出細動脈が直列につながり、両細動脈の収縮・拡張により腎血流量と糸球体濾過量が調節されている。本研究では、腎循環の調節因子であるアンジオテンシンII(AngII)と抗利尿ホルモン(アルギニン・バゾプレシン:AVP)に注目し、AngIIやAVPの腎血管に対する作用および血管内皮由来拡張因子(EDRF/NO)によるこれらペプチドの作用修飾について、in vitro、in vivoの両実験系で検討した。2)in vivoの実験:AVPを麻酔イヌの腎動脈内に注入すると、一過性の腎血流量の低下に続いて、注入開始35分で安定した腎血流量の低下が観察された。V_1受容体遮断薬処置下では、逆に、腎血流量は増加、即ち腎血管抵抗(RVR)が低下した。このRVRの低下は、V_2受容体遮断薬により消失した。EDRF/NO合成阻害時では、V_2受容体を介する腎血管の拡張が消失した。しかし、L-arginineによりその拡張作用は再出現した。L-NNA処置下では、AngIIの腎血管収縮作用は著明に増強された。しかし、L-NNAは、レニン分泌に影響を与えなかった。以上、AngII、AVPは、EDRF/NOにより腎血管に対する作用が大きく修飾される。特に、AVPは、腎血管収縮、拡張の両作用を持つ。拡張作用は、V_2受容体を介するものでEDRF/NOによることが解かった。しかし、AngIIのEDRF/NO合成・遊離促進は、直接作用によるかどうかは不明で今後の研究課題である。糸球体をはさんで輸入細動脈と輸出細動脈が直列につながり、両細動脈の収縮・拡張により腎血流量と糸球体〓過量が調節されている。本研究では、腎循環の調節血管である細動脈の特性を明らかにするため、血管内皮由来拡張因子(EDRF)の役割についてin vitro,in vivoの両系で検討を行った。1)in vitro実験:ウサギ腎臓から単離した輸入細動脈の収縮・拡張を以下の条件下で観察した。EDRF/NO合成阻害剤であるLーnitroーarginine(LーNNA)の添加は、輸入細動脈の内径を約20%減少させた。この収縮は、EDRF/NOの基質であるLーarginine添加により完全に抑制された。アンジオテンシンII(AII)は、腎血流量を強く低下させるが、輸入細動脈に対しては、全く収縮作用を示さない。しかし、LーNNA処置下の輸入細動脈では、AIIは強い収縮作用を発揮した。以上の結果は、細動脈レベルでもEDRF/NOは細動脈の緊張度に影響を与えること、そしてAIIはEDRF/NOの強い遊離刺激作用を持つことを示している。2)in vivo実験:腎血流量の自動性調節は、輸入細動脈により行われる。そこで、腎潅流圧の変化がEDRF/NOの遊離に影響を与えるかについて、以下の検討を行った。ペントバルビタ-ル麻酔イヌの腎動脈にLーNNAを持続注入すると、腎血流量は約20%低下し、尿量も減少した。これらは、無刺激状態でもEDRF/NOの遊離があり、腎機能にも影響を与えていることも示すものである。LーNNA注入下では、腎血流量の自動性調節は、部分的ではあるが障害された。しかし、Lーarginineにより自動性調節の回復が認められた。以上、腎動脈圧の低下により、EDRF/NOの遊離亢進があり、この増加が輸入細動脈の腎潅流圧依存性拡張をきたす。腎血流量の自動性調節機序の1つとして、EDRF/NOの関与が想定された。

腎循環の調節因子の1つである抗利尿ホルモン(アルギニン・バゾプレシン:AVP)に注目し、AVPの腎血管に対する作用および血管内皮由来拡張因子(EDRF/NO)によるAVP作用の修飾についてin vitro、in vivoの両系で検討した。2)in vivoの実験:AVPを麻酔イヌの腎動脈内に注入すると、腎血管低抗(RVR)が上昇した。V_1受容体遮断薬前処置下では、逆に、RVRの低下が観察された。これらの変化は、V_2受容体遮断薬により消失した。以上の刺激は、腎血管床には、V_1・V_2両受容体が存在し、V_1受容体刺激により収縮、V_2受容体刺激により拡張する。EDRF/NO合成阻害時では、V_2受容体を介する腎血管の拡張が消失した。しかし、L-arginineによりその拡張作用が出現した。したがって、V_2受容体を介するAVPの腎血管拡張作用は、EDRF/NOを介するものと考えられる。以上、AVPは、腎血管収縮・拡張の両作用を持つ。拡張作用は、V_2受容体を介するもので、EDRF/NOによることが解かった。しかし、in vitroの実験系で、輸入細動脈にV_2受容体が存在するかどうかは不明で、次年度には明確にする。腎循環の主要な調節因子であるアンジオテンシンII(AngII)に注目し、AngIIの腎血管に対する作用および血管内皮由来拡張因子(EDRF/NO)によるAngII作用の修飾について、in vitro、in vivoの両実験系で検討した。2)in vivoの実験:EDRF/NO合成阻害薬を腎動脈内に投与すると、AngIIの腎血管収縮作用が著明に増強された。しかし、AngII受容体拮抗薬処置下でも、L-NNAの腎血管収縮作用は対照時と変化なかった。また、L-NNAは、腎からのレニン分泌には影響を与えなかった。以上、AngIIの腎血管への作用はEDRF/NOにより修飾を受ける。しかし、AngIIが直接EDRF/NOの合成・遊離を促進するかどうかについての解析は行っていない。L-NNAの腎血管収縮作用は、レニン分泌亢進の結果によるという報告に対しては、明確に否定できる。
多座配位子を用いた不安定有機ビスマス化合物および遷移状態の安定化の研究

1)ヘキサフルオロクミルアルコールリガンドを有する6配位ビスマス化合物の合成と環化反応5員環を有する5配位ビスマス化合物(1)にリチウム試剤(2)を反応させて、化合物(3)を合成した。得られた化合物3のX線構造解析による構造決定・NMRによる動的過程の追跡を行なった結果、固体状態および溶液状態ともに、図示した6配位構造をとっていることが明らかになった。また、6配位アルコール(4)は、室温で放置すると炭化水素脱離を伴う環化反応を起こすことがわかったので、べンゼン環のパラ位の置換基を変えた系を合成し、環化反応の選択性を調べた。その結果、炭化水素の脱離傾向は、p-MeOC6H4:p-CF3C6H4:p-CH3C6H4=3.5:2:1となり、強電子供与体と電子求引体が共に良い脱離基になるという興味深い結果が得られた。この結果は、以前我々が報告したアンチモンアート錯体のプロトン化反応における脱離傾向とよく対応しており、両反応とも6配位hypervalentアルコールを経由すると考えられる。2)分子内配位子を有するビスマス(III)化合物の合成とビスマス原子上での立体反転機構の解明5員環リガンドを有する3配位ビスマス化合物(5)を合成し、メトキシ基またはジメチルアミノ基を分子内配位子とするリチウム試剤と反応させて、10-Bi-4化合物(6)を得た。これらの化合物のビスマス原子上での立体反転エネルギーを、NMRにより追跡し、溶媒効果を調べた結果、反転が求核試剤の存在下で顕著に加速されることがわかった。このことは、反転がedge反転機構で進行していることを示唆している。
北インド・ムスリム社会における諸集団の序列化と「係譜」創出の関係をめぐる研究

本研究の目的は、階層社会としての北インド・ムスリム社会の社会構造を明らかにすることである。そのため、平成11年度は、平成78年度の現地調査期間中に収集した1次資料と2次資料の整理・分析を行い、その成果を『人文学報』83号に、「北インド・ムスリム社会のザート=ビラーダリー・システム:ムスリム諸集団の序列化と差異化に関する一考察」として発表した。これは、北インド・ムスリム社会の社会構造が同ヒンドゥー社会と非常によく似た階層構造をもつ反面、社会を構成する諸集団の序列は、イスラーム的なイディオム(「系譜」概念など)によって決定されているということを明らかにするものであった。しかしながら、この研究を進める中で、今日の北インド・ムスリム社会の社会構造およびカースト的集団の序列のあり方を十全に理解するためには、その歴史的側面についての考察が絶対的に不可欠であることが判明した。この理由として、国内外のヒンドゥー社会研究者が、ヒンドゥー社会におけるカースト的集団の形成・序列が、イギリスのインド支配の要のひとつであった「インド帝国人口センサス(「国勢調査」)」と深く結びついていたという指摘をあげることができる。これは、ムスリム社会のカースト的集団の研究にも適用できる。そこで、平成12年度は英領インド期の文献・資料を収集して分析を試みた。具体的には、19世紀後半から20世紀前半にかけて実施されたセンサスや民族誌などの植民地資料(マイクロフィッシュ)を国内大学図書館から取り寄せ、アルバイトを雇って紙焼作業を行い、ファイル化すると同時に、連合王国の大英図書館にも直接赴き、関連資料を収集した。こうして収集された資料の分析は現在進行中である。分析の結果としての研究成果の一部は、平成13年度中に2つの論文として発表する予定である。本研究の目的は、階層社会としての北インド・ムスリム社会の社会構造のあり方を明らかにすることにある。そのため、ウッタル・プラデーシュ州西部に位置するムスリムが多数派の小都市の事例に基づいて、現地社会を構成するムスリム諸集団の対外的・対内的な関係を、様々な角度から詳細に記述し分析することが必要となる。この視点からの現地調査は、平成78年度の約2年におよぶ北インド滞在中に実施済みである。その間に収集した1次資料(参与観察・聞き書き・質問票による調査結果、写真、録音テープなど)と2次資史料(地図、小冊子、統計資料、基礎文献、関連文献、学術論文など)を整理・分析することが、平成11年度の研究の主軸となった。具体的には、まずそうした資史料を整理するために、アルバイトを雇ってデータベース化を試みた。同時に、現地語(ウルドゥー語)文献の一部を翻訳する作業にも取り組んだ。さらに、資史料を分析し、理論的枠組を構築するために、南アジア・ムスリム社会関連図書および人類学関連図書を参照した。その結果、同じ北インド・ムスリム社会の社会構造を対象とした研究でありながら、異なる結論に至る事例報告が存在することも明らかとなった。こうした差異は、北インド・ムスリム社会の歴史的変化や地域的偏差に由来するだけでなく、研究者のスタンスの取り方にも関わっている。これに関する研究成果は、『人文学報』83号に、「北インド・ムスリム社会のザート=ビラーダリー・システム:ムスリム諸集団の序列化と差異化に関する一考察」として発表した。』本研究の目的は、階層社会としての北インド・ムスリム社会の社会構造を明らかにすることである。
日本、韓国、フィリピンの企業バスケットボール部の運営とその経済効果に関する研究

1、フィリピンのPBA、韓国のKBLはプロ組織である。しかしながら、いずれの国のクラブもその経営形態は、クラブの運営経費をオーナー会社に頼る、いわば「企業サポートクラブ」であるといえる。2、PBAチームのオーナー会社は、バスケットボールを企業の宣伝の手段と認識しており、クラブ維持経費を企業の総宣伝経費との比較でとらえ、バスケットボールは国民に対して会社の健康なイメージを与える格安で絶好の宣伝手段であるとしている。3、KBLはオーナー会社の宣伝と社員の帰属意識向上のためという2つの目的を立てている。4、日本のバスケットボール選手は、社員選手、嘱託社員選手、プロ契約選手の3種類にわけられる。社員選手はスポーツ中心の生活であるが、その給与体系や福利厚生は社員のそれが適応される。嘱託杜員にも福利厚生や住居費などが社員に準じて与えられる。選手は怪我や引退のリスク回避を、チームを保有する企業の「スポーツ活動の支援は企業の社会的責任である」また「社内のクラブ活動は厚生事業の一環であり、プロ選手の保有はその基本理念になじまない」という基本姿勢が、日本独特の「企業選手」を作り上げている。5、選手の給与は、JBLは400万から1,500万円、KBLは3,600万ウオンから20,000万ウオン、PBAは300,000ペソから2,000,000ペソで(韓国、フィリピンはサラリーキャップ制度導入)、またいずれの国も遠征手当て、試合手当て、勝利手当てなどを支給している。それらを合計すると、日本の社員選手においても他の同年齢の社員よりは高い報酬を得ているといえる。6、報酬は高いものの、ほとんどの選手が選手を辞めた後の生活設計に悩みを持っている。7、いずれの国も、外国人選手の試合参加は2名以内という制限を設けている。さらにPBAとKBLは外国人選手に対して身長に制限を設けている。そのうえKBLでは、各試合の第2クオーターを外国人の参加1名と制限し、自国選手に参加の機会を増やしている。8、バスケットボール部を持つことにより企業にとって経済的効果については、先に述べたようにその経営基盤がかなり異なるために、3国間の比較はできなかったが、少なくとも韓国、フィリピンでは企業クラブは大いなる宣伝効果が期待できると考えている。バスケットボール部運営の実態調査のため、韓国KBL(7月25日8月1日)、フィリピンPBL(9月8日12日)のリーグを訪問し、コミッショナーはじめ2,3のチーム経営責任者、数名の選手等と面談した。KBL、PBLはともにプロのリーグであるが、韓国はウェーバー方式によるドラフト制度や年俸のキャップ制(1チームの総年俸が決められている)をとっている。さらに外国人選手採用にはアメリカでKBL主催の選考会をおこない、その参加選手の中から各チームが必要選手をドラフトするという方式を採用しており、利益共同体として非常に強い結束を持っていることがわかった。一方のPBLは選手契約の期間や健康診断などの共通の規約があるものの、外国人選手も含めて、給料などの契約内容はクラブに一任されている。またテレビ放映料や入場料の分配方法もそれぞれの国で異なっている。アマチュアである日本では、クラブは親会社の福利厚生の一部と位置付けられており、選手の給料は、契約選手を除き、所属会社社員の俸給規定に従って支払われている。

外国人を含めて選手の採用はクラブの独自のルートで行なわれている。本年度は上記の基本的資料収集にくわえて、各国選手個人の収入・支出に対するアンケート調査を実施した。フィリピンについてはすでに回収し、分析を始めている。韓国、日本については回収中である。各国のバスケットボールを内から(3カ国において、チームの経営や財政管理者、リーグの財政担当者等にインタビューし、選手にはインタビューやアンケートを実施した)、あるいは外から(実際の試合を見物し試合運営の方法や観客の反応を観察した)実証的研究を進め、運営と経済効果について比較検討を行った。1、フィリピン・バスケットボール連盟(以下PBA)、韓国・バスケットボールリーグ(以下KBL)は全選手がプロ契約をしている、いわゆる「プロ」である。しかしながら、いずれの国のクラブもその経営形態は、アメリカNBAのように独立採算をしておらず、クラブ経費をオーナー会社に頼る「企業内クラブ」であるといえる。PBA、KBLは選手のサラリーに「サラリー・キャップ制」をとっている。2、日本のクラブはアマチュア(所属会社の社員と言う意味)を前提としているが、実際は年限を限った"プロ契約"をしている選手が存在する。3、PBAは企業の宣伝の手段と認識されているので、企業の総宣伝経費との比較でその存在意義が語られることが多い。KBLはオーナー会社の宣伝と社員の帰属意識向上のためと考えられている。4、日本のオーナー企業においては、スポーツ活動の支援は企業の社会的責任であるとの理解の元、社内のクラブ活動を厚生事業の一環として取り扱っている。5、いずれの国も外国人選手の試合参加に人数の制限を設けている。そのほとんどがアメリカ国籍の選手であるが、給与は1シーズン2000万円ほどで、国による差はあまり無い。(世界的な共通価格があると考えられる)6、PBAは、フィリピン系アメリカ人を「内国人」として、無制限に受け入れている。2002年末から3年にかけて、FilAmと呼ばれている彼らの中にフィリピン系でない選手のいることがわかり問題となっている。7、KBLは各チームのコーチやスカウトが揃ってアメリカに出向き「スカウティング・セッション」を開いている。アメリカの選手に2,3日の「トライアウト」への参加を呼びかけ、そこで下位チームから希望の選手を獲得する「ドラフト会議」がもたれる。ここで雇用される選手の給料や待遇は、KBLで決められている。8、日本においての外国籍選手の獲得は各チーム独自に行っており、その額や条件はまちまちである。9、経済効果の数量化については、16年3月現在、検討中である。
ナノファイバー及びマイクロ電極を用いた神経系疾患薬剤の評価法

ヒト多能性幹細胞は神経疾患の創薬スクリーニング分野で注目されている。しかし、現状では、多能性幹細胞から得られた神経細胞にダメージを与えずに、リアルタイムに薬剤応答を評価する方法はない。本研究では、申請者らはパターン化したナノファイバーを用いて、神経細胞用チップを作製し、そのチップ上で神経細胞を分化誘導しながらマルチチャネル電極で機能評価システムを開発した。このチップにより、神経ネットワークを構成しながら、リアルタイムに神経ネットワークの電生理信号を検出することができた。最終的には薬剤スクリーニングによる神経変性疾患に対する新規薬剤の同定に応用する。神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など)は治療薬がなく、新規薬剤の開発が急務となっている。また、ヒト多能性幹細胞(ES/iPS細胞)は神経細胞の創薬スクリーニング分野で注目されている。現状では、多能性幹細胞から神経細胞への分化効率が(90%)大幅に改善されたが、得られた神経細胞の機能性を評価するために酵素処理し、もう一度蒔き直すことになる。なぜなら、神経軸索が損傷している可能性がある。分化誘導された神経細胞にダメージを与えずに、リアルタイムに薬剤応答を評価する方法がない。本研究では、申請者らが作製したパターン化したナノファイバーとマルチチャネル電極を組み合わせた複合システムを開発する。この複合システムにより、神経ネットワークを構成しながら、リアルタイムに神経ネットワークの電生理信号を検出することができる。すなわち「神経ネットワーク電極」による新規薬効評価を行う。最終的には薬剤スクリーニングによる神経変性疾患に対する新規薬剤の同定を目的とする。。しかし、現状では、現在、多能性幹細胞から神経細胞への分化効率が(90%)大幅に改善されたが、得られた神経細胞の機能性を評価するために酵素処理し、もう一度蒔き直すことになる。この従来の方法は神経軸索が損傷している可能性がある。このことから、同じ基板上で、神経細胞へ分化誘導しながら、リアルタイムに神経細胞電生理機能を評価するシステムが必要である。マルチチャンネルマイクロ電極システムは、心筋、神経細胞の電気生理学的研究用ツールとして使われている。現状では、多能性幹細胞から分化した神経細胞の電位信号を検出することは困難である。これは、低分化効率、細胞と金属電極との低接着性、電気信号の低検出などが原因と考えられる。本研究では、申請者らが作製したパターン化したナノファイバーとマルチチャネル電極を組み合わせた複合システムを開発した。この複合システムにより、神経ネットワークを構成しながら、リアルタイムに神経ネットワークの電生理信号を検出することができた。将来に薬剤スクリーニングによる神経変性疾患に対する新規薬剤の同定を期待される。本研究の目的は、一方向配向性ナノファイバーを用いて、ヒトES/iPS細胞正常/疾患モデルから神経細胞に効率的に分化誘導し、パターン化したナノファイバーをマルチチャンネルマイクロ電極に取り入れて作った「神経ネットワーク電極」システムを用いた新規薬剤評価系を開発することである。今年度の目標は、一方向配向性ナノファイバーを用いたヒトES/iPS細胞の高効率神経細胞分化誘導法の開発である。予想とは違って、以前の研究成果により、マウス神経細胞をパターン化させる研究を行った時、見つけたナノファイバーの材質を用いて、ヒトiPS細胞由来した神経細胞を培養すると、細胞の接着能が低下したことが明らかとなった。細胞の接着能を向上させるために、コーティング剤使用の検討もしたが、あんまり効果が見られなかった。ヒトiPS細胞由来した神経細胞に適合性があるナノファイバーを開発するために、昨年度、ナノファイバーの最適化を行った。具体的に、ナノファイバーの材料、物理的な特性、パターン化可能性について検討してきた。主にナノファイバーの材料について、分解性がない、安定性が高い高分子材料に絞って実験を試みた。その結果、あるポリマー材料が適切であることを判明した。現在、その材料を用いて、ヒトiPS細胞由来した神経細胞に合うナノファイバーを作製条件を検討中。ナノファイバーの材料を検討する部分は当時の計画により、やや遅れていたが、本研究テーマを加速するために、ナノファイバーの作製条件を検討しながら、ヒトiPS細胞由来した神経細胞の分化誘導に関する検討も同時進行中である。マイクロエンジン二ング今年度の目標は「神経ネットワーク電極」システムを用いた神経細胞薬剤応答評価法の開発である。前半期では、昨年度の研究成果によって、見つけたナノファイバー材料を用いて、ナノファイバーの作製条件を見出し、ナノファイバーの物理および化学的な評価(例え:ナノファイバーのサイズ、厚み、密度、配合性、弾力性など)を行う。そして、標準化したナノファイバーを多電極デバイス上に転写、パターン化させる条件検討を行う。本研究テーマを加速するために、以上の項目を検討しながら、ヒトiPS細胞

由来した神経細胞の分化誘導法も条件検討して、均一な神経細胞の誘導させる方法を再現させる。後半期では、直接ナノファイバーをパターン化した多電極デバイスの上で、神経細胞を分化誘導しながら、神経細胞の電生理学機能を測定する予定である。順調で進めば、そのまま薬剤投入して、神経細胞の電生理学機能の変化を調べる予定である。実験の進展具合は予定より若干遅れているため、実際に使用した助成金は計画より少ない。来年度予定より加速した計画を立てた。計画通りに助成金を使用する予定。
初期胚における染色体異常発生メカニズムの解明

本研究では、分割停止を起こした受精卵や廃棄予定の受精卵を用いて染色体解析を行い、生殖細胞系列で発生する染色体異常の傾向を調べ、配偶子形成過程や初期胚で発生する染色体異常の種類、染色体異常が受精卵の分割にどのような影響を及ぼすか明らかにすることを目的として実施している。胚盤胞期に胎児を形成するICMと胎盤を形成するTEとの染色体比較解析の結果、ICMとTEでは約半数で核型が異なる結果が得られ、不一致の原因は受精後の初期胚に発生した染色体異常で、TEに蓄積する傾向にあることがわかった。さらに詳細な解析を行うと、受精前の配偶子形成過程で染色体異常が発生した胚は、受精後の初期胚にも染色体異常を起こしやすい傾向にあることがわかった。これらのデータを論文に作成している。受精卵のような微量な細胞から染色体解析を実施する際に、欠失や重複などの微細な構造異常やモザイク異常などを最も感度や解像度良く検出する手法を探索した。方法は全ゲノム増幅して次世代シーケンサーで浅く全ゲノムシーケンスし、バイオフォマティクス解析で染色体コピー数を決定するが、全ゲノム増幅などのサンプル調整やシーケンス法を工夫し、比較解析した。その結果、30%程のモザイク異常からの検出が可能となり、5Mb程の欠失や重複などのコピー異常を検出可能であることが分かった。また、これまで解析した染色体解析のデータから、どの染色体にどのような種類の染色体異常が発生したか、生殖細胞系列で発生する染色体異常の傾向についてまとめている。これまでに、胚盤胞期における胎児を形成するICMと胎盤を形成するTEとの染色体比較解析については、論文に必要なデータを揃え、現在は論文を作成している。また受精卵の染色体解析について、微細な構造異常を最も感度良く検出する手法を探索するため、種々の方法で比較解析実験を行った。これまで解析を行ったデータについて、染色体異常の傾向をまとめている。今年度は最終年度ということもあり、集大成として昨年度中に完成させる事ができなかった、胚盤胞期における胎児を形成するICMと胎盤を形成するTEとの染色体比較解析の論文、さらには受精卵の染色体解析に最適な手法を探索するため、種々の手法を用いて比較解析を行った実験について論文にまとめる。また分割停止胚の染色体解析のデータから、どの染色体にどのような種類の染色体異常が発生したか、生殖細胞系列で発生する染色体異常の傾向についてまとめる。本研究では、受精後の初期胚で発生する染色体異常について、分割停止を起こした受精卵、もしくは廃棄予定の受精卵の染色体解析を行い、染色体異常の発生頻度と母体年齢との相関関係、配偶子形成過程や初期胚で発生する染色体異常の種類、染色体異常が受精卵の分割にどのような影響を及ぼすか明らかにすることを目的とした。2017年度は、分割停止を起こした受精卵、もしくは廃棄予定の受精卵の染色体解析を数多く行い、その中で胚盤胞期における胎児を形成するICM(Inner Cell Mass)と胎盤を形成するTE (Trophectoderm)との染色体比較解析のデータがまとまったため、「Discordant cytogenetic findings between ICM and TE in human blastocysts」という演題名で日本人類遺伝学会で発表した。これまでのデータでは、ICMとTEでは約半数で核型が異なる結果が得られ、不一致の検体を詳細に解析すると、それらは受精後の初期胚に発生した染色体異常で胚盤胞期にはモザイク型の染色体異常として存在し、TEに蓄積する傾向があることがわかった。これはICMでは胚盤胞の段階で既に染色体異常を持つ細胞はアポトーシスや細胞周期の停止などにより、染色体異常を持つ細胞が淘汰される傾向にあると考えられる。この研究内容について論文を執筆しており、今年度中に投稿予定である。また分割停止を起こした受精卵の染色体解析をすると、多くの受精卵で複数の染色体に異常が見られることが分かった。現在、このデータをまとめ、分割を停止させる要因となる染色体異常、およびその領域に含まれる原因遺伝子を探索している。

また、これまで解析した染色体解析のデータから、どの染色体にどのような種類の染色体異常が発生したか、生殖細胞系列で発生する染色体異常の傾向についてまとめている。これまでに、胚盤胞期における胎児を形成するICMと胎盤を形成するTEとの染色体比較解析については、論文に必要なデータを揃え、現在は論文を作成している。また受精卵の染色体解析について、微細な構造異常を最も感度良く検出する手法を探索するため、種々の方法で比較解析実験を行った。これまで解析を行ったデータについて、染色体異常の傾向をまとめている。今年度は、昨年度に引き続き、分割停止を起こした受精卵、もしくは廃棄予定の受精卵の染色体解析を行う。昨年度に学会発表した「Discordant cytogenetic findings betweenICM and TE in human blastocysts」について、論文投稿する。また分割停止した受精卵の染色体解析について、詳細に解析しデータをまとめる。またデータをまとめるためには、大量の染色体解析のデータが必要になるため、サンプル調製法やシーケンス法など本研究の目的に沿った最適な方法を開発する。今年度は最終年度ということもあり、集大成として昨年度中に完成させる事ができなかった、胚盤胞期における胎児を形成するICMと胎盤を形成するTEとの染色体比較解析の論文、さらには受精卵の染色体解析に最適な手法を探索するため、種々の手法を用いて比較解析を行った実験について論文にまとめる。また分割停止胚の染色体解析のデータから、どの染色体にどのような種類の染色体異常が発生したか、生殖細胞系列で発生する染色体異常の傾向についてまとめる。(理由)人件費に計上した予算が浮いたため。(使用計画)差引額については、主に試薬消耗品として使用する。(使用計画)差引額については、試薬消耗品として使用する。
トスポウイルスの変異・適応に媒介虫が果たす役割

アイリス黄斑ウイルス(IYSV)には種のボーダーラインに位置する、オランダ(NL)型株とブラジル(BR)型株が存在する。平成30年度は、IYSV分離株によるウイルス獲得能の違いと各ゲノムの増殖傾向を明らかにするため、孵化直後のアザミウマ1齢幼虫に、まずいずれかのIYSV遺伝子型感染キノア葉を、その後異なる型の感染キノア葉をそれぞれ24時間ずつ摂食させウイルスを獲得させた。ウイルス獲得直後の2齢幼虫1個体ずつからRNAを抽出し、平成29年度に開発したリアルタイムRT-PCRを用いたジェノタイピング法で各ゲノムの遺伝子型を解析した。その結果、NL型からBR型を獲得した試験では、ウイルスは検出されなかった。一方で、BR型からNL型の順にウイルスを獲得させた個体においてSRNAは4.7%、MRNAは3.8%、LRNAは0.93%の個体でNL型のみが検出された。この結果から、分離株によって獲得能に違いがあること、1齢幼虫より2齢幼虫のほうが高いウイルス獲得能を持つこと、虫体内に取り込まれたIYSVの各ゲノムは速やかに増殖するものの各ゲノム間での初期の違いがあり、SRNA, MRNA, LRNAの順に増殖していることが示唆された。平成29年度の研究成果について平成31年度日本植物病理学会大会において、演題名「アイリス黄斑ウイルス系統の混合感染によって組み換えウイルスが発生する可能性」として口頭発表した。実験に使用するウイルスの媒介虫による媒介効率が著しく低下したため、正確なデータを取ることが難しくなった。今後当初計画の試験を遂行するためには、媒介効率の高いウイルス株の再選抜が必要であり、それに想像以上の時間を費やした。今回、補助事業期間を延長して、再選抜したウイルス株と来春新たに入手したウイルス株で実験を再開し、正確なデータの取得を進める。1.アザミウマのウイルス獲得、媒介時における利己的なウイルス選択と虫体内変異の可能性媒介個体数が統計的に有意な数が得られていないため、試験を繰り返して、論文発表に向けた仕上げの実験と論文の投稿準備を進める。2.ゲノム相同組み換え変異株の媒介能欠失の原因解明組換え植物を利用して着せ替え粒子感染植物を使用した獲得・媒介実験を進めていく。加えて、in vitro系での実験を進め、ウイルス構成タンパク間での相互作用が成熟粒子の形成に大きく影響していることを明らかにする。1.アザミウマのウイルス獲得、媒介時における利己的なウイルス選択と虫体内変異の可能性オランダ(NL)型のCbAls株とブラジル(BR)型の大館株が単独感染したChenopodium quinoa葉上で2つのネギアザミウマ個体群(新潟個体群、秋田個体群)のふ化1齢幼虫に24時間ずつ順序を変えてウイルスを獲得させた。まず、いずれを効率的に獲得しているかを明らかにするため、供試アザミウマ中に存在するウイルスをImmunocapture(IC)- RT-PCR-RFLP法により同定した。その結果、新潟個体群でBR型、NL型の順で獲得させた場合と秋田個体群でNL型、BR型個体群の順で獲得させた場合では、極めて低い保毒率となった。一方で、新潟個体群でNL型、BR型の順で獲得させた場合は、BR型の保毒率が、NL型の保毒率よりも2倍近く高かった。秋田個体群でNL型、BR型の順で獲得させた場合は、BR型の獲得は認められなかった。上記試験では、SRNAとMRNAの遺伝子型が異なっているパターンや両方の遺伝子型が検出される場合も認められ、SRNAとMRNAが相同組み換えしたキメラ個体が発生する可能性が考えられた。しかしながら、インパチェンスへの媒介試験で感染したウイルスのなかにキメラは認められず、いずれの遺伝子型のみが媒介される結果となった。2.ゲノム相同組み換え変異株の媒介能欠失の原因解明オランダ(NL)型のCbAls株とブラジル(BR)型の大館株のヌクレオキャプシドタンパク遺伝子をRT-PCRで増幅後、35Sプロモーター直下に連結した発現ベクターを構築した。構築した遺伝子については、現在、ベンサミアーナタバコに加え、タバコ(品種:White Burley)に形質転換し、再分化個体の育成を進めている。試験開始当初、研究室保有のウイルス株をChenopodium quinoaに接種し、病原性の確認を行ったところ、いくつかの株で病原性の失活、低下が起こっており、さらにアザミウマによる媒介効率が低下した株も存在した。そのため平成29年度以降の様々なウイルス株を用いた試験を順調に進めるために、平成28年度は、保存株の病原性、媒介効率の復帰と新たなウイルス株の入手と病原性の評価等研究体制の構築を併せて行った。また、平成29年度以降の実験に使用する組換え植物ついても、植物への遺伝子導入は終了しているが、実験に使用する種子はまだ得られていない。以上のことから、現在までの進捗状況の区分としては、やや遅れていると判断した。しかしながら、媒介虫体内では、2種類の遺伝子型がキメラで存在できるが、キメラ個体の媒介が認められないという、平成28年度の研究成果として予想された結果がほぼ得られている。したがって、平成29年度にこの結果を様々な実験系で検証することで、今後は計画通りに研究が進むものと考えている。1.アザミウマのウイルス獲得、媒介時における利己的なウイルス選択と虫体内変異の可能性オランダ(NL)型株とブラジル(BR)型株、2つの遺伝子型間でのゲノム相同組み換えを生じたIYSVが発生する可能性を研究するための

3分節のゲノムRNA (S, M, L)の遺伝子型を迅速に判別する方法として、リアルタイムRT-PCRを利用したジェノタイピング法を確立した。この方法を用いて、両遺伝子型を混合接種したChenopodium quinoa葉上で局部病斑における各ゲノムのジェノタイプを調べたところ、モザイク個体や組換え個体が確認された。しかしながら、再度単病斑分離を行うといずれかの遺伝子型の組み合わせにシフトした。この混合病斑をアザミウマに獲得させたところ、虫体内からはモザイク個体や組換え個体が確認されたが媒介はされなかった。以上の結果から、キノアとネギアザミウマ体内では組換えウイルスが存在すると考えられるが、媒介はされなかったため組換えウイルスの安定性は低く、組換えウイルスでは、副唾腺に侵入に必須である成熟粒子を形成できない可能性が考えられた。2.ゲノム相同組み換え変異株の媒介能欠失の原因解明オランダ(NL)型のCbAls株とブラジル(BR)型の大館株のヌクレオキャプシドタンパク遺伝子を導入したベンサミアーナタバコとタバコ(品種:White Burley)の作出を進めた。CbAls株については、種子を確保した。一方で大館株の導入植物は再分化個体後の生育が不良な状況で、再試験を行っている。発生圃場での観察から予想された組換えウイルスが発生しない理由として、成熟粒子の形成が大きく影響している可能性が様々な媒介試験で明らかとなった。オランダ型のヌクレオキャプシドタンパク遺伝子が導入された種子も確保されており、この植物を利用した、ウイルス構成タンパク間での相互作用や媒介試験を進める準備ができ、実験は順調に進んでいる。アイリス黄斑ウイルス(IYSV)には種のボーダーラインに位置する、オランダ(NL)型株とブラジル(BR)型株が存在する。平成30年度は、IYSV分離株によるウイルス獲得能の違いと各ゲノムの増殖傾向を明らかにするため、孵化直後のアザミウマ1齢幼虫に、まずいずれかのIYSV遺伝子型感染キノア葉を、その後異なる型の感染キノア葉をそれぞれ24時間ずつ摂食させウイルスを獲得させた。ウイルス獲得直後の2齢幼虫1個体ずつからRNAを抽出し、平成29年度に開発したリアルタイムRT-PCRを用いたジェノタイピング法で各ゲノムの遺伝子型を解析した。その結果、NL型からBR型を獲得した試験では、ウイルスは検出されなかった。一方で、BR型からNL型の順にウイルスを獲得させた個体においてSRNAは4.7%、MRNAは3.8%、LRNAは0.93%の個体でNL型のみが検出された。この結果から、分離株によって獲得能に違いがあること、1齢幼虫より2齢幼虫のほうが高いウイルス獲得能を持つこと、虫体内に取り込まれたIYSVの各ゲノムは速やかに増殖するものの各ゲノム間での初期の違いがあり、SRNA, MRNA, LRNAの順に増殖していることが示唆された。平成29年度の研究成果について平成31年度日本植物病理学会大会において、演題名「アイリス黄斑ウイルス系統の混合感染によって組み換えウイルスが発生する可能性」として口頭発表した。実験に使用するウイルスの媒介虫による媒介効率が著しく低下したため、正確なデータを取ることが難しくなった。
社会の夜型化傾向に着目した加齢黄斑変性発症の新たな分子基盤-動物モデルによる追究

加齢黄斑変性は、視機能障害、そして失明にまで至る眼科疾患であり、長期間にわたる太陽光への曝露により引き起こされる可能性が指摘されている。近年、社会の夜型化傾向が進み、夜間に強い光を浴びる人が増加し、今後、この疾患の発症率が上昇する可能性が考えられる。ラットに対して明るい白色蛍光灯の光を照射すると、視機能が障害され、照射した光の量などによっては失明にまで至る。これを"ラット網膜光障害実験モデル"と呼ぶ。これを用いて、夜間に明るい光に曝されることが網膜にとってどれほど危険なのかを示し、さらに、そのBMAL1タンパク質を標的としたメカニズムを追究した。このようにして加齢黄斑変性のメカニズムに探ろうとした研究である。近年、日本を始めとする先進諸国を中心に、社会の夜型化傾向が加速しているため、本来の人間の昼型の生活リズムが崩れていると考えられる。さらに本来、光を浴びない時間帯である夜間に強い光を浴びるとともに、夜間にテレビやコンピュータなどで眼を酷使してしまう人が急増している。夜間における強い光曝露に対してゲノムレベルで順応できていないと考えられるヒトにおいて、崩された体内時計のリズムが網膜疾患とどのように関連するかについて検討することが重要である。ラットは夜間に強めの可視光線を照射することで、視細胞や網膜色素上皮細胞のアポトーシスを伴う網膜光傷害を生ずる。この網膜光傷害モデルを用いて、夜間の光照射が体内時計遺伝子の発現にどのように影響するかについて調べることで、黄斑変性症の発症メカニズムに迫ろうとしている。初年度の研究目的としては、どの体内時計制御に関与する遺伝子の発現が光照射により影響を受けるかについて解析し、トランスジェニック動物を作成するために使う遺伝子を決定することである。現在のところ、視細胞および網膜色素上皮細胞における特異的な変化を調べるために、免疫組織化学染色による検討を中心に行っている。抗体、抗血清の中には、免疫沈殿に用いることのできないものや抗体そのものの絶対量の少ない物もあるため、当研究室でのウサギを用いた抗血清の調製を行わなくてはならない可能性が浮上しており、その準備も同時に進めている。次年度は、導入する遺伝子を早急に最終決定し、遺伝子コンストラクト作成、トランスジェニックラット作成し、網膜に対する光の影響と体内時計との関係を探るためのモデル動物の確立を行う。我々は、網膜光障害における網膜の変性度の数値化法を確立させることができたので、これを利用して、網膜変性と体内時計との関連を検討した。この方法を用いることで、矢状面の眼球切片をヘマトキシリン-エオシンで染色した標本において、視細胞や網膜色素上皮細胞のアポトーシスによる変性が認められる領域を百分率で示すことができるようにした。まず、Wistar系ラットを24時間以上暗順応し、0時、6時、12時、18時より3時間、3000luxの白色光を照射し、4から7日後に病理組織切片を作製し、変性度を計測した。0時と6時からの光照射により、平均で約90%の網膜に変性が認められた一方、12時からは30.9%、18時からは49.2%の変性が認められた。Lewis系ラットでは、昼夜ともに、0-30%であり、耐性であったのに対して、WKY系ラットでは、昼夜の差がなく60-70%であり感受性を示した。このことから、同じ感受性を示すと考えていたWKY系統とWistar系統との間にも、体内時計が関与する網膜光障害発症機序において違いがあることが明らかとなった。そこで、光照射により視細胞や網膜色素上皮細胞において、時計遺伝子であるBmal1やCry2遺伝子の発現誘導が起こるかについて、免疫組織化学染色により検討した。光照射終了後9時間目において、錐体細胞の細胞体と思われる外顆粒層外側の細胞体を中心にWKY系統にてBMAL1陽性像が散見された一方、Lewis系統では数は少なかったが弱陽性細胞を確認できた。CRY2については発現誘導が認められなかった。このことから、網膜光障害における視細胞のアポトーシスにはBMAL1の発現誘導が関与する可能性が考えられた。また、我々が当初考えていたBMAL1-CLOCK-CRY2複合体形成によるアポトーシス抑制機構に関しては、この系には該当しないと現段階では考えている。
ヒト口腔扁平上皮癌における予後因子p27^<Kip1>発現と浸潤・転移抑制との関連性

今回、ヒト口腔扁平上皮癌においてp27^<Kip1>蛋白の発現は最も重要な予後因子となりうることを報告した(Anticancer Res 22:2985-2990,2002)が、p27^<Kip1>蛋白の高発現例は統計学的有意に頸部リンパ節転移を認めず、また治療後に局所再発を認めず、これが経過良好につながっていたため、in vitroにてこれを解析することを目的に、前年度に作製したヒトp27^<Kip1>cDNAをpcDNA3.1にセンスならびにアンチセンス・オリエントに組み込んだ発現ベクターを利用し、ヒト口腔扁平上皮癌細胞に導入して、浸潤・転移能に及ぼす影響につき検索し、以下の結果を得た。1)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、Boyden chamberを用いた細胞移動能測定法にて、細胞移動能を抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、細胞移動能を増強させること、2)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、in vitroにおけるアウトグロースアッセイにて、アウトグロースを抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、アウトグロース増強させること、3)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、癌転移関連遺伝子Tiam 1の発現を抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、Tiam 1の発現を増強させること、4)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、細胞接着因子E-カドヘリンの発現を増強し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、E-カドヘリンの発現を抑制させることを明らかにし、p27^<Kip1>蛋白発現は、ヒト口腔扁平上皮癌細胞において癌転移関連遺伝子Tiam 1や細胞接着因子E-カドヘリンを介して浸潤・転移抑制作用を発現している可能性が示唆され、これを報告した(Oncol Rep.,in press)。ヒトp27^<Kip1>cDNAをpcDNA3.1(Invitrogen)にセンスならびにアンチセンス・オリエントに組み込んだ発現ベクターを作製し、口腔扁平上皮癌細胞株B88細胞に導入し、p27^<Kip1>遺伝子発現を制御した。センストランスフェクタントではp27^<Kip1>蛋白は過剰発現しており、MTT法により細胞増殖抑制が見られ、この際転移関連遺伝子Tiam1(Tumor invasion and metastasis 1)の発現減弱ならびに細胞接着因子E-カドヘリン、N-カドヘリン、α5インテグリン、γ-カテニンの発現増強が見られ、さらにBoyden chamberを用いたMigration assayにてMigration(細胞移動)能は減弱した。またアンチセンストランスフェクタントではp27^<Kip1>蛋白は発現抑制され、MTT法により細胞増殖促進が見られ、この際Tiam1の発現増強ならびにE-カドヘリン、N-カドヘリン、α5インテグリン、γ-カテニンの発現減弱が見られ、Migration能は増強した。また細胞周期解析では、センストランスフェクタントでは、G1期停止とアポトーシスを示唆するsub-G1 peakが認められた。さらにin vivoにおいてもp27^<Kip1>過剰発現はB88細胞の増殖を抑制し、一方p27^<Kip1>発現抑制はB88細胞の増殖を促進し、ヌードマウス背部皮下ヘアンチセンストランスフェクタントを移植した場合には、著明な腫瘍の増大と癌細胞の筋層への浸潤が見られた。以上より、p27^<Kip1>蛋白はB88細胞において細胞周期をG1期に停止させ、アポトーシスを誘導し増殖抑制作用を発現するとともに、転移関連遺伝子Tiam1や細胞接着因子を介して浸潤・転移抑制作用を発現している可能性が示唆された。1)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、Boyden chamberを用いた細胞移動能測定法にて、細胞移動能を抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、細胞移動能を増強させること、2)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、in vitroにおけるアウトグロースアッセイにて、アウトグロースを抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、アウトグロース増強させること、3)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、癌転移関連遺伝子Tiam 1の発現を抑制し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、Tiam 1の発現を増強させること、4)p27^<Kip1>蛋白の過剰発現は、細胞接着因子E-カドヘリンの発現を増強し、逆にp27^<Kip1>蛋白の発現抑制は、E-カドヘリンの発現を抑制させることを明らかにし、p27^<Kip1>蛋白発現は、ヒト口腔扁平上皮癌細胞において癌転移

関連遺伝子Tiam 1や細胞接着因子E-カドヘリンを介して浸潤・転移抑制作用を発現している可能性が示唆され、これを報告した(Oncol Rep.,in press)。