hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マラリア感染による調節性リンパ球の誘導に対するIL-18の生理的意義の解析

しかしながら、最近の研究からIL-18は単独では、T細胞、NK細胞、マスト細胞に作用してIL-4,IL-10,IL-13等の抗炎症作用を持つサイトカインの産生を誘導するユニークなサイトカインである事が明らかになってきた(Kashiwamura S.,et al.,J.Immunothera.,2002)。この様な経緯からIL-18が炎症の制御という観点においても重要な役割をはたしていると考えその作用を解析した。その結果、炎症性疾患である子宮内膜症患者の腹水中でIL-18が高値を示す事が明らかとなった(Oku H.,et al.,Hum.Reprod.,2004)。この疾患では炎症部位に浸潤したリンパ球がIL-18を産生し、周囲の非免疫系の間質細胞がIL-18の受容体を発現している事、同時にこれらの細胞がCox-2遺伝子を発現している事が明らかとなった。この結果はIL-18が種々の細胞に作用してプロスタグランデインE2を産生誘導し、TNFαなどの炎症性サイトカインを抑制している可能性を示唆するものと考えられた。また、IL-18にはその単独の作用として、癌細胞の転移抑制効果を示す事が我々の研究で示されており(Okamoto T.,et al.,J.Interferon Cytokine Res.,2004)、この結果はIL-18が感染、炎症、癌細胞の拒絶といった様々な状態での個体の抵抗性獲得機構にとって重要な因子であることを示唆するものと考えられた。炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン18は感染・炎症の初期から終息に至る全ての段階で重要な役割を担っている可能性が示唆されている。我々はマウスのマラリア感染モデルでIL-18の欠損が宿主の抵抗性を著しく阻害することを明らかにした(Shin R.P., Kashiwamura S., et al., J.Immunol., 2002)。また最近の研究からIL-18は単独ではT細胞、NK細胞、マスト細胞などに作用してIL-4、IL-10、IL-13などのTh2タイプ、もしくは抗炎症性のサイトカイン産生を誘導することが明らかとなってきた(Kashiwamura S.,et al., J.Immunothera., 2002)。このことからIL-18が炎症の制御においても重要な役割を担うものと考え、その作用を解析した。その結果、炎症性疾患である子宮内膜症患者腹水中でIL-18が産生され、非免疫系の間質細胞でのCox-2遺伝子の発現上昇とPGE2の産生を誘導することが明らかとなった(Oku H., Tsuji Y., Kashiwamura S., et al., Hum.Reprod., 2004)。さらに、本年度の研究において、IL-18が単独でNOの産生を誘導し、急性膵炎モデルマウスにおける病態を改善しうることが明らかとなった(Ueno N., Kashiwamura S., et al., Shock, 2005)。この結果は、IL-18が産生誘導するCox-2が同じくIL-18の作用で産生されたNOの付加によって活性化され、その結果産生されたPGE2がTNF-αの産生を抑制した可能性が示唆され、感染症やリュウマチなどの自己免疫疾患においても病態の進行をIL-18が抑制している可能性があるものと考えられた(Okamura H., Kashiwamura S., et al., Nippon Rinsho, 2005)。
生体内マイケル付加反応を介して作用発現する天然由来成分の探索と機能解明

本研究課題において昨年度までに,マウス腹腔マクロファージを用いたリポ多糖刺激によるNO産生抑制活性を一次スクリーニングとし,アーユル・ヴェーダやユナニー医学において炎症性疾患の治療に用いられている没薬から,myrrhanol Aをはじめ数種の含有テルペノイド成分にNO産生抑制活性が認められた.また,これら候補化合物のiNOSに及ぼす影響を検討したところ,myrrhanol Aは,iNOSに対する酵素阻害活性は殆ど認められず,iNOSの発現を抑制することが判明した.同様にエジプト地域に自生するヒガンバナ科植物のCrinum yemenseの球根部から3種の新規ヒガンバナアルカロイドyemenin A-Cを単離・構造決定するとともに,yemenin Aをはじめ数種の含有アルカロイド成分がiNOS発現抑制活性に起因するNO産生抑制活性を有することを見いだすなど,新しいタイプの天然由来化合物(低分子リガンド)にα-methylene-γ-butyrolactone構造を有するセスキテルペノイド類であるconstunolideやdehydrocostus lactoneなどと共通する作用メカニズムを見いだした.今年度はこれまでに得られた結果をふまえ,タイ料理のトムヤンクンなどに香辛料として用いられるAlpinia galangaから得られたフェニルプロパノイド成分の1'S-1'-acetoxychavicol acetateを低分子リガンドとして,NOの過剰産生に至るシグナル伝達機構に関与するタンパクあるいは遺伝子の発現に及ぼす影響を解明した.また,日本民間薬のヒュウガトウキからクマリン類やアセチレン化合物を,さらには漢薬良姜からジアリルヘプタノド類を新たなタイプの低分子リガンドとして見いだすなど,今年度の当初計画をほぼ達成した.これまでに,α-methylene-γ-butyrolactone構造を有するキク科植物由来セスキテルペンであるconstunolideやdehydrocostus lactoneなどがシステインやメルカプトエタノールなどに対し立体選択的マイケル型付加反応を起こることを明らかにしており,またconstunolideやdehydrocostus lactoneなどに認められた誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現抑制活性が,システインやメルカプトエタノールなどの付加体では活性が減弱することを見いだしている.これらの知見から,constunolideやdehydrocostus lactoneなどがタンパクのシステイン残基などと結合することによって,ターゲットタンパクの機能を消活しているものと推察し,同様の作用メカニズムを有する低分子リガンドを探索することを目的とする.今年度は,マウス腹腔マクロファージを用いたリポ多糖刺激によるNO産生抑制活性を一次スクリーニングとし,各種炎症性疾患の治療や改善に用いられる世界各地の薬用植物から活性成分を探索した.その結果,スリランカやインド地域の伝統医学であるアーユル・ヴェーダやユナニー医学において炎症性疾患の治療に用いられている没薬から,5種のpolypodane型新規トリテルペンmyrrhanol A, Bおよびmyrrhanone A, A acetateおよびBなど計6種の新規化合物を単離・構造決定するとともに,myrrhanol Aをはじめ数種の含有テルペノイド成分にNO産生抑制活性が認められた.さらに,iNOSに及ぼす影響を検討したところ,myrrhanol Aは,iNOSに対する酵素阻害活性は殆ど認められず,iNOSの発現を抑制することが判明した.同様にエジプト地域に自生するヒガンバナ科植物のCrinum yemenseの球根部から3種の新規ヒガンバナアルカロイドyemenin A-Cを単離・構造決定するとともに,yemenin Aをはじめ数種の含有アルカロイド成分がiNOS発現抑制活性に起因するNO産生抑制活性を有することを見いだすなど,新しいタイプの天然由来化合物(低分子リガンド)にconstunolideやdehydrocostus lactoneなどと共通する作用メカニズムを見いだすなど,平成16年度の当初計画をほぼ達成したものと考える.本研究課題において昨年度までに,マウス腹腔マクロファージを用いたリポ多糖刺激によるNO産生抑制活性を一次スクリーニングとし,アーユル・ヴェーダやユナニー医学において炎症性疾患の治療に用いられている没薬から,myrrhanol Aをはじめ数種の含有テルペノイド成分にNO産生抑制活性が認められた.また,これら候補化合物のiNOSに及ぼす影響を検討したところ,myrrhanol Aは,iNOSに対する酵素阻害活性は殆ど認められず,iNOSの発現を抑制することが判明した.同様にエジプト地域に自生するヒガンバナ科植物のCrinum yemenseの球根部から3種の新規ヒガンバナアルカロイドyemenin A-Cを単離・構造決定するとともに,yemenin Aをはじめ数種の含有アルカロイド成分がiNOS発現抑制活性に起因するNO産生抑制活性を有することを見いだすなど,新しいタイプの天然由来化合物(低分子リガンド)にα-methylene-γ-butyrolactone構造を有するセスキテルペノイド類であるconstunolideやdehydrocostus lactoneなどと共通する作用メカニズムを見いだした.今年度はこれまでに得られた結果をふまえ,タイ料理のトムヤンクンなどに香辛料として用いられるAlpinia galangaから得られたフェニルプロパノイド成分の1'S-1'-acetoxychavicol acetateを低分子リガンドとして,NOの過剰産生に至るシグナル伝達機構に関与するタンパクあるいは遺伝子の発現に及ぼす影響を解明した.また,日本民間薬のヒュウガトウキからクマリン類やアセチレン化合物を,さらには漢薬良姜からジアリルヘプタノド類を新たなタイプの低分子リガンドとして見いだすなど,今年度の当初計画をほぼ達成した.
転写制御が生み出す分子振動メカニズムの解析

マウスの未分節中胚葉においてHes7遺伝子の発現は、Hes7タンパクが自身のプロモーターに結合し、その転写を抑制することで、増減(オシレーション)すると考えられている。数理シミュレーションによって、Hes7が転写され、Hes7タンパクが自身のプロモーターを抑制するまでに要する時間時間遅れ)が、安定的なオシレーションを生み出すと予測されているが、実験的な証明はまだない。本研究では、転写調節によつて引き起こされるオシレーションの分子機構の解析を行い、オシレーションを利用して形成される体節形成のメカニズムを解明することを目的とする。時間遅れがオシレーションの周期に影響するのかを調べるために、コンピューターシミュレーションによって、転写に要する時間を変化させ、オシレーションへの影響を調べた。その結果、転写時間が長くなると、オシレーションは安定的に起こるが、その周期が長くなるという予測が得られた。そこで、この予測を実験的に検証するために、Hes7タンパクの性質は変化させずに、転写に要する時間だけを変化させるノックインマウスを作製している。具体的には、Heg7遺伝子の3' UTRに大きなイントロン(5kb, 10kb, 20kb)を挿入することで、シミュレーションの状況をマウス個体で再現できると予測している。現在までに、変異アリルを持つES細胞の樹立に成功し、そのキメラマウスが得られている。今後、ノックインマウスにおける体節形成の変化を解析し、転写時間のオシレーションへの影響を実験的に検証する。このオシレーションを生み出すためには、Hes7が転写され、Hes7タンパクが自身のプロモーターを抑制するまでに要する時間(時間遅れ)を考慮しなければならないことが数理シミュレーションによって予測されているが、実験的な証明はまだない。そこで本研究では、転写調節によって引き起こされる分子発現のオシレーションに焦点を絞り、体節形成の周期性がいかに制御されているかを解明することを目的とする。まず、時間遅れがオシレーションの周期に影響するのかを調べるために、コンピューターシミユレーションで、転写に要する時間を変化させ、オシレーション周期への影響を調べた。その結果、転写時間が長くなると、オシレーション周期が長くなるという予測が得られた。そこで、この予測を実験的に検証するために、ノックインマウスの作製を行っている。現在、Hes7の3'-UTRに変異loxP配列を導入したES細胞を樹立し、変異loxP配列を両端にもつイントロン(5kb,10kb,20kb)をCreリコンビナーゼにより挿入することを試みている。イントロンが組み込まれたESが取れたら、マウスへ戻し、ノックインマウスの作製を開始したいと考えている。
基底核における可塑性の実験形態学的研究

学習、記憶は形態学的に捉えられるものか疑問の点が多い。一方、傷害を受けた脳に可塑的な変化が起こり、神経連絡の再構築が見られることは多くの実験例が示している。運動に関する学習の一つのモデルとして、あまり幼若でない仔ネコ(350-800g)の脳に種々の傷害を与えた後の線維連絡の状態を光顕、電顕的に検討した。1.大脳皮質6野を吸引除去し、1-12ケ月後に4野の前肢領域に放射性アミノ酸を注入しオートラジオグラムを作成した。尾状核頭を観察対象とし、6野からの終止域に4野からの投射線維が新たに側枝を出すなどして終末領域に再構築が起こることを期待したが、明かに断定できる結果は得られなかった。2.前例と同様の仔ネコの尾状核頭中央部から内側部にかけてを電気的に破壊し、術後数ケ月-1年の後に尾状核頭外側部に放射性アミノ酸を注入しオートラジオグラムを作成した。線条体淡蒼球間に存在する内外の局在投射に変化は見られなかった。3.尾状核一脚内核一視床投射回路においてシナプスのレベルで可塑性を検討した。(1)脚内核の軸索終末をシナプス小胞の形状、シナプス後膜の分化を指標に4型に分類した。【I】型は尾状核由来、【II】型は視床下核あるいはそれ以下の脳幹由来と視床への投射ニューロンの軸索側枝の終末の混合型、【III】型は起始の不明なもの、【IV】型は視床下核あるいはそれ以下に由来するものであった。(2)第2の実験と同じ手術操作をしたネコで電顕観察を行い定量化をはかった。この結果内側尾状核投射線維終末消失後に外側部から新たな軸索発芽は見られず、また核内の軸索側枝の終末の増加もはっきりとは結論できなかった。これらの実験の結果から生後1ケ月以上経たネコでは基底核を中心とする系の中で、局在性を変化するような投射の再構築は、少くとも光顕的には起こらないと結論できた。
新しい混合原子価二核錯体の合成とその分子スイッチへの応用

混合原子価錯体の分子素子への応用を目指して、ビスー2,2'ー(2ーピリジル)ー6,6'ージベンズイミダゾール(BiPBzIH_2)で架橋された一連のRuおよびOs二核錯体〔(bpy)_2M(BiPBzImH_2)M'(bpy又はphen)_2〕^<4+>(I)(M,M'=Ru,Os;bpy=2,2'ービピリジン;phen=1,10ーフェナントロリン)を新規に合成し、その性質を検討したところ、下記のようないくつかの興味ある結果を見い出した。(1)錯体Iは、アセトニトリルー緩衝溶液(1:1V/V中)で架橋部分のイミノ基による2段の酸解離平衡を示す。電気化学的測定から得られた酸化過程は、プロトン移動が電子移動とカップリングした見かけ上一段の二電子過程として観測され、電位ーpH図から、混合原子価M(II)ーM'(III)およびM(III)ーM(III)状態のpKa値が得られた、プロトン移動に電子移動をカップリングさせた安定な二核錯体としては、これがはじめての例であり、生体系での酸化還元反応との関連で興味深い。(2)BiPBzImH_2で架橋された混合原子価二核錯体では架橋部分のBiPBzImH_2がプロトン化された状態では1300nm(ε<100)に非常に弱い原子価間遷移(ITband)しか観測されないが、脱プロトン化がおこると、1670nm(ε【approximately equal】2000)にかなり強いITbandが観測されるようになる。すなわち、架橋配位子部分のプロトン平衡により、金属間の相互作用が変えられることを意味しており、プロトン平衡を利用した分子スイッチの可能性を示唆する結果を得た。(3)錯体Iを分子集合体として固体表面上に固定化し、素子への応用を試みた。錯体Iは陽イオン性であることを利用し、グラッシーカーボン電極上に展開した陽イオン交換膜であるナフィオンに集積することができた。この修飾電極は、錯体Iの性質をほとんど保持しており、溶液のpHに対して酸化電位も変化する。このことは、固定化した錯体内での金属間相互作用も変化することを意味しており、pH応答スイッチング素子への応用が期待できる。
ERKを中心とする増殖シグナル蛋白質の構造・機能・発現・伝達異常と癌化

代表者らはERK2蛋白質遺伝子のCDドメイン中のコドン322のグルタミン酸残基がリジンに変わった点突然変異(E322K)をヒト細胞で始めてしかも口腔癌細胞株(HSC6)で見出した。本研究ではこの変異の結果ERK2蛋白質の生化学的、物理学的、生物学的性質がどのように変わったか、またこのような変異の頻度を口腔癌で解析し、ERKのCDドメインの変異と細胞の癌化との関連を明らかにする事を目的に研究を進めた。結論として、(1)HSC6細胞株ではCDドメインのアミノ酸荷電の変化を伴うE322K変異蛋白質は脱リン酸化酵素との結合ができずその結果ERK2が恒常的に活性化されている事、(2)癌化能の1つの指標である軟寒天中でのコロニー形成能が増強されている事(3)PC12細胞で野生型に比べ神経様突起形成能が若干弱い事(4)E322Kに相当するショウジョウバエのERK遺伝子変異を作製し、それを導入したtransgenic flyについての分化を調べたところ、強くはないが複眼の分化異常を誘導する事(5)口腔癌88症例でERK2のCDドメインのアミノ酸荷電の変化を伴う変異は見当たらなかったが3例の遺伝子多型が見つかった。従って、E322K変異は弱いながらも細胞の癌化,分化異常に寄与するが、癌細胞での変異はあっても率は低い事が判明した。この他リン酸化型ERK 2結合蛋白質として同定したSNT-2がEGFからERKに伝達されるシグナルをEGF受容体のレベルでfeedbackloop様式で抑制していることが示唆された。その他口腔癌細胞株でのNaf1lの"異常"発現が観察され、Naf1はG2/M期停止細胞におけるアポトーシス誘導阻止に働いている仮説と矛盾しない結果が得られた。さらに新たに2つのERK2結合蛋白質が見つかった。口腔癌細胞株HSC6で見つけたERK2のCDドメイン中のアミノ酸chargeの変化を伴う突然変異遺伝子の生物学的、生化学的変化とERK蛋白質の上・下流蛋白質の解析を行い以下の結果を得た。1)口腔癌(本邦とインドの口腔扁平上皮癌の計50例以上)についてERK2のCDドメインの変異をPCR増幅DNAのSSCPあるいは塩基配列決定法で変異を検索したがHSC6のみで変異頻度は低かった。2)ショウジョウバエのトランスポゾンベクターで変異遺伝子を導入発現させhomozygousになった個体を作成したがseven maker変異のような複眼の顕著な形態異常は見出せなかったが。微細構造の差等についての解析を進めている(京都繊維工芸大学・山口教授との共同研究)。まだ結果は得られていないが細胞癌化能についての解析をすすめた。3)in vitro ERKキナーゼ活性をHSC6と正常型ERKを発現するHaKaTの血清飢餓細胞と通常培養細胞で比較した。通常培養細胞では差は見られなかったが飢餓細胞で活性に2倍の差が検出され酵素レベルで活性化していた。4)変異ERKの上流下流蛋白質との相互作用:上流のMEKによるリン酸化異常は検出されなかったが、下流のMKP-1により野生型ERKは脱リン酸化されたが変異型は脱リン酸化されず変異型がMKP-1と結合できずこれがERK2の恒常的活性化の要因である可能性が示された。5)ERKの野生型と変異型の融合蛋白質を発現させ結合蛋白質の相違を解析できる系を確立した。6)ERK

2結合蛋白Naf1はM期で過リン酸化され、G1期に入ると分解された。またG2/MとG1で細胞周期を止めるTSA処理または許容温度で培養したp53(A138V)発現Saos-2細胞にsiNaf1を導入するとアポトーシスが誘導された。またNaf1は変異型ERKと結合しやすい予備的結果を得た。7)SNT-2はERK2と186-252アミノ酸領域で結合しMEKより上流でERK活性化を阻害し、SNT-1とは異なる作用点をもつことが明らかとなった。8)口腔扁平上皮癌細胞株7株についてAKTの恒常的リン酸化とetoposide等の抗癌剤感受性に大きな相関は見い出せなかった。細胞増殖シグナル蛋白質ERK2の癌細胞における変異(E322K)と結合蛋白質を中心に前年度に引き続き解析した。(1)口腔扁平上皮癌腫瘍組織におけるERK2蛋白質を電気泳動移動度の違いを指標にした方法で変異の有無を解析した。前年度の結果と同様ERK2の変異は見いだせなかった。したがって変異率は低いものと考えられる。(2)ERKで保存されているCDドメインの321番目のD(アスパラギン酸)のアミノ酸荷電を変えたNまたはKアミノ酸はの変異蛋白はE322Kと同様SDS-PAGEで移動度の速い蛋白質として検出されたがとキナーゼドメインの250K変異蛋白質は正常型に近く、CDドメインのアミノ酸荷電の変化が物理的性質を変える性質をもつことが判明した。322K変異では、脱リン酸化酵素(MKP)との結合はpull-down法で抑制されていた。また活性化に重要なTEYリン酸化のうちYの脱リン酸化がおきにくくこれらがERKの恒常的活性化の原因と考えられた。(3)GST-結合正常型と変異型ERKと血清飢餓と飢餓+EGF刺激で得られた癌細胞株抽出物を用いて結合蛋白質をTOF-MASSにて解析した。正常型ERKではホモダイマーができるが変異株ではできにくい事を示唆する結果が得られた。ERK2と結合する蛋白質としてyeast two hybrid法で得た2つの蛋白質についてヒト細胞で結合を確認した(4)SNT-2の293-311アミノ酸領域およびNaf1のc-末端アミノ酸領域に対する抗体を作成した。SNT-2は細胞増殖、トランスフォーメーションの両者に対して抑制的であった。また、SNT-2がEGFR, ERKと3者の複合体を作り、EGFからERKへのシグナルを抑制したが、ERK2との結合に必須領域237-252を欠いた変異株(新たに作成)では抑制効果が減弱していた。なお2カ所のsiRNAを作成したがknock-downの効果は検出できなかった。NEFとリン酸化型Naf1との結合、ERK2との結合領域、低リン酸化型Naf1と変異型ERKとの結合について解析を試みた。なお抗Naf1抗体で口腔癌細胞株での発現を解析し、truncated型Naf1と細胞株間での発現量の違いを検出した。
様々な数の近似論におけるマルコフスペクトルの研究

(α,β)が3次の実数の組でその体が非総実でありかつ擬Jacobi-Perrcmアルゴリズムの周期点あるとする。擬Jacobi-Perronアルゴリズムによる中間近似分数が最良近似であることが、伊藤俊次氏(金沢大)および古門麻貴氏(横浜国大)との共同研究で解明することができた。すなわち主結果は以下の通りである。主定理(α,β)が擬Jacobi-Perronアルゴリズムの周期点であり、かつQ(α)が非総実であるとする。さらに周期部分に関するある条件(省略)を満足するとする。腔周期とする。アルゴリズムから定まる近似分数(P_n/q_n,r_n/q_n)は、必ずしも最良近似を与えるとは限らない。しかし、このときあるa_1,a_2,...,a_jおよびm_1,m_2,...m_jが存在して{a_1q_<kn+m_1>+a_2q_<kn+m_2>+...+a_jq_<kn+m_j>}(n=1,2,...)は、最良近似を与える。すなわち、Q_n=a_1q_<kn+m_1>+a_2q_<kn+m_2>+...+a_jq_<kn+m_j>とおき、P_n,R_nをQ_nα,Q_nβに最も近い整数点とする。√<Q_n>(Q_nα-P_n,Q_nβ-R_n)はn→∞のときの集積点は楕円になり、しかも√<Q>(Qα-P,Qβ-R)Q→∞の集積点の中の原点にもっとも近い楕円を与える。本来の研究目標であったマルコフ・ラグランジェスプクトラムの同時近似における展開にまでは至らなかったが、その基礎的部分をなすと思われる高次近似アルゴリズムの一つである擬Jacobi-Perronを有る程度解明することができた。またそれは、同時に、高次元近似アルゴリズムが、連分数展開と異なる様相を示すことも浮き彫りになってきたと思われる。非斉次近似アルゴリズムについて新アルゴリズムを見いだし、それが近似論的に良い性質を持つことを解明することができた。腔周期とする。今年度は3次の数に関する同時近似問題の探求を行った。擬ヤコービペロンアルゴリズムで周期的である数の組に関して、総実でない場合に、その近似度と擬ヤコービペロンアルゴリズムの関係の確立を目指した。すなわちもっとも良い近時を与える整数格子点が擬ヤコービペロンアルゴリズムから与えられるかどうかである。もしこのことが成立すれば、数の近似問題のマルコフスペクトラムが連分数を通して研究されるように、同時近似問題のマルコフスペクトラムも擬ヤコービペロンアルゴリズムを通して調べることが可能になると思われる。周期1の場合は今までの研究から、それが成立することが分かっている。また計算機実験から、そのことを肯定する結果を得ることができた。しかしながら証明にはいたらなかった。この問題を3次元空間のある平面とその付近に関する数の幾何の問題に還元することはできた。この方向で研究を進める予定である。

また総実である場合も計算機実験を進め、興味深い現象を見出した。この解明は次年度以降の課題としたい。また、次年度以降の研究予定であった非斉次近似問題の探求も前倒しして実施した。マルコフスペクトラムを考える上で、基盤となる非斉次近アルゴリズムの探求を行った。現在一般的に使われている非斉次近アルゴリズムでは、不十分な点があるので、その改良を行った。その改良されたアルゴリズムはいくつかの良い性質を持つことが分かった。このアルゴリズムを用いてマルコフスペクトラムの探求を行っていく予定である。今年度は3次の数の2元同時近似の問題の特にその体が非総実である場合の理論の完成を目指した。擬Jacobi-Perronアルゴリズムとの関連はほぼ解明できた。すなわちある例外を除けば、その最良の同時近似は,擬Jacobi-Perronアルゴリズムから得られるいわゆる中間近似数で与えられるということである。この結果は,当初予想していたこと、すなわち擬Jacobi-Perronアルゴリズムの主近似で最良の同時近似が得られるのではという見通しとは多少異なった結果である。しかしながら,簡単な場合ですら擬Jacobi-Perronアルゴリズムが最良近似を与えるかどうか知られていなかった現状からすると大きな前進であると思われる。本来の目標であるマルコフスペクトラムの探求であるが,通常の数の近似問題の場合,最良近似の程度とその連分展開とは明快な関係があり,それを用いてマルコフスペクトラムの分析が進められる。同様にして、擬Jacobi-Perronアルゴリズムと同時近似の程度の関係を求め,それを利用してマルコフスペクトラムの研究を進める予定であった。しかしながら上記で述べたように擬Jacobi-Perronアルゴリズムと同時近似との基本的な関係が明らかになったのであるが,同時近似の程度と擬Jacobi-Perronアルゴリズムとの関係までは,まだギャップがありさらに研究中である。非斉次近似問題の方であるが,その間題を探求する道具として期待されるアルゴリズムの基礎理論を論文にまとめ,現在投稿中である。今年度は前年度までに達成し得なかった3次の数の2元同時近似の問題の特にその体が非総実である場合の理論の完成を目指した。擬Jacobi-Perronアルゴリズムとその中間近似分数との関連を前年度までにに解明し得たのであるが、証明にある組み合わせ論的な前提を置いていたのだが、その前提部分にあいまいさがあり、結果的に証明にギャップが残っていることが判明した。すなわち同時近似問題とある平面上のタイル貼りと、深い関係があり、ある種の置きかえ操作を無限回繰り返すことにより全平面のタイルが生成されることが、証明に決定的に重要である。しかしながら、どのような場合に平面が生成されかが、明確に記述されていなかった。Jacobi-Perronアルゴリズムについては、伊藤俊次氏等による結果があり、擬Jacobi-Perronアルゴリズムについても伊藤俊次氏等によるノート(未刊行)があるが、残念ながら整理されていない部分があり、そのまま結果を適用することはできなっかった。今年度は、伊藤俊次氏等による結果を踏まえて、この部分の明確な記述化を行うことに成功し、最終的に証明を完成することができた。これらの結果は、現在論文として、執筆中である。また、同時近似の程度と擬Jacobi-Perronアルゴリズムとの関係は、いまだ未解決であった。非斉次近似問題の方であるが、非斉次近似問題を探求する道具として我々が解明したアルゴリズムに関する基礎理論の論文は平成16年度に受理され平成17年度中に出版予定である。
トコトリエノ-ル類の脂質代謝調節機能

本研究は脂質過酸化に起因する諸疾病の予防・改善のために、トコフェロ-ルに代る天然物質としてトコトリエノ-ル(T3)の脂質代謝調節機能に関する基礎知見を得ることを目的としたものである。1.トコトリエノ-ルの吸収性:パ-ム油の精製工程で調製されたT3標品(αー,γーおよびδーT3をそれぞれ18,25および10%含み,残りのほとんどはαートコフェロ-ル,Toc)を胆汁酸塩ミセルとしてリンパ瘻を施したラットに経口投与し、リンパへの吸収効率を測定した結果、3種のT3は24時間に1520%吸収され、この値はTocの1.52倍であった。この成績はT3は経口的にも効果が期待できることを示唆している。2.トコトリエノ-ルの脂質代謝への影響:上記のT3標品を精製パ-ム油食に含まれる量(約3mg/飼料100g)の5および20倍量含むコレステロ-ル添加飼料をラットに4週間与えた。血清コレステロ-ル濃度に対しT3は大きな影響を示さなかったが、HDLーコレステロ-ル濃度はT3添加量に応じて高くなった。組織リン脂質中のアラキドン酸の割合は高濃度のT3食でも変化しなかったが、血小板によるトロンボキサンA_2および動脈壁によるプロスタサイクリンの産生は低下傾向を示した。しかし、この両エイコサノイドの比率はほとんど変らなかったので、T3はエイコサノイドの過剰産生を抑制し脂質代謝を改善する目的に沿うものと考えられた。3.トコトリエノ-ルの降圧作用:自然発症高血圧ラット(SHR)の血圧上昇に及ぼすT3標品の効果を食餌レベル0.2%で調べたところ、T3標品はTocと同様の降圧効果を示した。血小板凝集に対しては影響はなかったが、正常動物の場合とは対照的に、T3は動脈壁によるプロスタサイクリン産生を増加させる傾向にあった。以上の結果は、T3にはトコフェロ-ルとは異なる特異的な生理機能があることを指摘している。個々のT3成分についての検討が待たれる。
全能性幹細胞における受容体型チロシンキナーゼtieの発現

申請者らは、受容体型チロシンキナーゼtieのmRNAが骨髄造血幹細胞に発現され、分化にともないその発現が消失することをこれまでに報告した。本研究においては我々は、ヒトおよびマウスtieに対するモノクローナル抗体を作成し、血液細胞におけるtie蛋白の発現を詳細に検討した。tieはヒト骨髄有核細胞のCD34陽性幹細胞分画の42%に発現し、しかも最も未分化な幹細胞とされているCD34^+CD38^-細胞の81%に発現が確認された。またin vitroのアッセイでも、CD34^+tie^+細胞のほうがCD34^+tie^-よりコロニー形成能がよく、LTC-IC(long-term culture initiating cells)も多く含んでいた。マウスでもヒトとほぼ同様の所見を得た。以上の所見は、tieが血液幹細胞でも最も未分化な細胞に発現し、幹細胞の増殖や自己複製に関与する可能性を示している。今後はtieの造血幹細胞における機能解析を行なう予定である。また他のグループの報告のようにtieが血管内皮細胞に発現していることも確認した。血液細胞と血管内皮細胞は同じ中胚葉由来の細胞系列であり、それぞれの細胞系列に分岐する以前に共通の母細胞が存在すると考えられている。tieはこれら両方の細胞系列の共通母細胞にも発現されるものと想定され、我々が作成したモノクローナル抗体を用いて、yolk sacでの共通母細胞の同定、およびEmbryonic stem cellを用いての共通母細胞の同定を行ない得るものと考えている。
in vivoイメージングを用いたPKR阻害剤の肝細胞癌増殖抑制効果の解明

本研究では、肝癌細胞株Huh7を用いて、既存のprotein kinase R (PKR)阻害剤がin vitroにおいて用量依存性に細胞増殖抑制作用をもつことを確認した。次にPKRの腫瘍増殖抑制効果をin vivoで確認するために、肝細胞癌株Huh7をヌードマウスに皮下移植し、PKR阻害剤を投与により腫瘍の増殖が抑制されるかどうかを検討した。PKR阻害剤の連日腹腔内投与により腫瘍の増殖が有意に抑制され、さらにその効果には用量依存性がみられた。また、PKRはHCV感染細胞に、エピジェネティックな変化をもたらし、複数の肝細胞癌内遺伝子のメチル化を変化させることを見出した。これまでにC型肝炎ウイルス(HCV)関連肝細胞癌においてProtein kinase R (PKR)がErk1/2, JNK1などMAPKの活性化により、c-Fosおよびc-Junを活性化し、それに伴う細胞増殖促進作用を示すことを報告してきた。PKRの腫瘍増殖抑制効果をin vivoで確認するために肝細胞癌株Huh7をヌードマウスに皮下移植したモデルを作成し、既存のPKR阻害剤を投与し、腫瘍の増殖が抑制されるかどうかを検討した。PKR阻害剤の連日腹腔内投与によりコントロールに比べて明らかに腫瘍の増殖が抑制され、さらにその効果には用量依存性がみられた。阻害剤の連日投与1ヶ月後に移植した皮下腫瘍から組織を回収し、PKR,リン酸化PKRのウエスタンブロット解析、リン酸化PKRの免疫組織染色を行い、コントロールとの比較を行った。PKRの阻害剤によるリン酸化PKRの阻害作用には個体差、部位差が強く既存の阻害剤ではPKRシグナルの阻害が十分ではないと考えられた。さらにPKRで活性化されるJNK1が肝細胞癌におけるDNAメチル化に関与しているという報告があることからPKRが肝細胞癌のDNAメチル化に関与するかについて検討した。HCV複製肝癌細胞株においてPKRノックダウンによりDNAメチル化酵素(DNMT1, 3a, 3b)の発現がRNAレベル、さらにタンパク質レベルで抑制されることを明らかにした。それにより複数の肝細胞癌内遺伝子のメチル化に変化がみられた。特に癌促進遺伝子であるP-REX1の発現はPKR阻害により抑制され、その抑制はDNMT阻害剤である5-Aza-dCによりキャンセルされることが明らかとなった。またそれらPKRによるDNMT発現変化はHCV感染のない肝癌細胞株では見られず、HCVとの何らかの相互作用を介している可能性が示唆された。今年度はPKR阻害剤によりin vivoでの肝細胞癌増殖抑制効果を明らかにした。さらに予定通り、阻害剤投与終了後の皮下腫瘍からタンパク質を回収し、ウエスタンブロット解析でPKRの活性を示すリン酸化PKRの発現をコントロールと比較した。リン酸化PKRの抑制は見られているものの部位差が強く効果は一定でなかった。そのためよりPKR阻害作用の強い新規化合物を検索していく予定である。またPKRの肝細胞癌における役割としてPKRの肝癌細胞内遺伝子のメチル化に及ぼす影響について解析した。同内容については国際学会にて成果を発表し、現在論文化に向けて準備を行っている。研究代表者らはこれまでにC型肝炎ウイルス(HCV)関連肝細胞癌においてProtein kinase R (PKR)がMAPKの活性化により、c-Fosおよびc-Junを活性化し、それに伴う細胞増殖促進作用を示すことを報告してきた。本研究ではまず、肝癌細胞株Huh7を用いて、既存のPKR阻害剤がin vitroにおいて用量依存性に細胞増殖抑制作用をもつことを細胞増殖アッセイにより確認した。阻害剤投与後に、移植した皮下腫瘍から組織を回収し、PKR,リン酸化PKRのウエスタンブロット解析、リン酸化PKRの免疫組織染色を行い、コントロールとの比較を行った。そこで申請者らはPKRシグナルの新たな作用標的を同定する必要があると考え、Huh7細胞にPKR阻害剤を加えることで変化するタンパク質を質量分析の手法で網羅的に解析した。それによりPKR阻害剤による低下するタンパク質を複数同定した。また、PKRはHCV感染細胞に、DNAメチル化酵素(DNMT1, 3a, 3b)の発現変化を介してエピジェネティックな変化をもたらし、複数の肝細胞癌内遺伝子のメチル化を変化させることを見出した。それらの中には細胞内代謝のキー分子であるFOXO3を含め、代謝酵素も含まれており、PKRが非アルコール性脂肪肝炎(NASH)を背景とする肝細胞癌に対しても影響を与えている可能性が示唆された。

また、PKRはHCV感染細胞に、エピジェネティックな変化をもたらし、複数の肝細胞癌内遺伝子のメチル化を変化させることを見出した。来年度はPKR発現そのものが腫瘍の増殖にin vivoで作用するか否かを明らかにするためshPKR発現レンチウイルスを用いてPKR持続knockdown細胞株を作成する。作成した細胞株をマウスに皮下移植し腫瘍の増殖が抑制されるかどうか明らかにしたい。そのうえで企業との共同研究などにより化合物ライブラリーを入手し、PKRシグナルの抑制効果の強い新規PKR阻害剤を検索したい。そのため学内の共同研究により、ハイスルプットなスクリーニングが可能な実験系を立ち上げることを計画している。また当初の計画に示したPKR下流の遺伝子のプロモーターを組み込んだレポーターを作成し、in vivoイメージングによるPKRシグナルの腫瘍増殖に対する重要性を検討する実験も引き続き学内の共同研究により進めていきたい。今年度に施行予定であったshPKR発現レンチウイルスを用いたPKR持続knockdown細胞株の作成を次年度に行うこととしたため。今年度はPKRと肝細胞癌のDNAメチル化に関する実験結果をまとめることを優先した。shPKR発現レンチウイルスを用いたPKR持続knockdown細胞株の作成や、PKRの下流の遺伝子のプロモーターを組み込んだレポータープラスミドの作成などに使用したい。
ゼオライト細孔内金属酸化物クラスタ触媒の調製および低温酸化反応への応用

Cu-YおよびPd-Yゼオライト結晶中の触媒活性種を動力学的手法および各種のスペクトル分析によって研究し,その化学構造と触媒作働状熊における作用機構を解明した。ゼオライト格子内の活性種は,予備焼成,水素環元および酸素酸化の連続した3段階から成るR-OX_U処理によって生成し,Cu-YおよびPd-YおよびPd-Yゼオライトにおける活性種生成過程を昇温還元法(TPR)によって追跡した。その結果,活性種生成量は,R-O処理中の各段階の処理条件に著しく依存し,これらの条件によって活性種の表面濃度を制御できることが判明した。TPRスペクトルから求めた活性種の表面濃度の増加に従って,低温領域における一酸化炭素の酸化反応に対するR-O処理ゼオライトの触媒活性は直線的に増大したが,その活性化エネルギーは実質的に一定値が得られた。これらの事実から,R-O処理によって生成した活性種が一酸化炭素の酸化反応における触媒中心として機能し,その化学的性質は表面濃度に依存せず均一であると結論づけた。R-O処理活性化前後のCu-YおよびPd-YゼオライトのEXAFSスペクトルの詳細な解析結果から,これらの活性種はイオンの状熊にあるのではなく,それぞれ,CuOおよびPdOの酸化物であることが解明できた。また,得られた中心原子の配位数から,これらの酸化物の粒子径は4-6Aであり,数個の金属原子から成る酸化物クラスタであると結論した。触媒作動状熊において,さらに,これらの金属酸化物クラスタは,一酸化炭素によって金属状熊に還元され,酸素によって酸化物に再酸化される,いわゆるレドックスサイクル機構に従って,触媒中心としての機能を果すことが解明できた。本研究は、申請当初の計画通り、順調に進行している。以下、本年度遂行した研究内容と成果について、具体的に、順を追い略述する。(1)申請時以前に、銅・ゼオライトにおいてすでに確認されていた、還元ー酸化処理による活性化を、パラジウム・ゼオライトに適用した結果、細孔内に活性種の生成が認められたので、その成果を直ちに、J.Mat.Sci.に投稿し、採用され、本年度印刷される。(2)上記パラジウム・ゼオライト細孔内の活性種の生成過程とその構造が銅・ゼオライト内のそれと著しく異なっていたので、それらの差異についてEXAFSスペクトルを詳細に比較検討した結果を、国際分析科学会議(IUPAC)において報告し、また、論文として、Anal.Sci.に採用され、本年度印刷される。(3)次いで、パラジウム・ゼオライト内の活性種生成過程と生成条件について詳細に検討し、そのメカニズムを解明し、これらの成果をプラハで行なわれた国際ゼオライト会議において報告し、また、論文として当該国際会議のProceedingsに採用され、本年度印刷される。(4)上記パラジウム・ゼオライト細孔内に生成した活性種の触媒能について広範囲に恒って試験した結果、酸化反応におけるより、むしろ、還元反応において顕著な触媒活性が認められたので、現在、窒素酸化物の還元除去触媒としての有効性を検討しているところである。これらの結果は、化学会春季年会および国際ゼオライト会議において発表し、適当な学会誌に投稿する予定である。本研究は、申請当初の計画通り順調に進行し、一応目的は達成されたものと考える。Y型合成ゼオライトを銅イオンおよびパラジウムイオンで交換した触媒に関して、還元一酸化処理により、触媒活性中心の生成を、各種物理化学的方法により確認し、さらに、その活性種がCuOおよびPdOのような酸化物のリラスタであることを解明した。これらの成果は国内外のいくつかの学術誌に発表した。このように、当初の目的が達成されたとの判断の上に立って、本年度の後半以降は、申請計画以外の新たな計画に基ずき、上記活性化ゼオライトの実用触媒としての可能性を検討する実験を開始した。

(1)炭化水素による窒素酸化物除去。この反応は従来酸素共存下で行なわれているが、活性化PdYゼオライトを用いたところ、酸素不在下でも、NOを殆ど完全にN_2に還元されることが見出されたので、現在、反応条件の影響について系統的に検討している。(2)メタンの低温酸化反応による合成ガスの製造。活性化ゼオライトCuYおよびPdYを用いて、希薄酸素中でメタンの酸化反応を検討したところ、合成ガスが低温で高収率で得られたので、現在、速度論的にその反応機構を検討している。反省点;分析装置の作製(ケミルミ)故障(マススペクトル)等のトラブルにより、予想以上の時間を浪費し、研究の進行が遅れている。
新しい時代に適した人と土との循環システムの構築

生活排水を高度処理できる実証装置を松江市、久留米市、枚方市の各モデル家庭に設置した。この実証装置は多段土壌層法を応用したもので、黒ボク土壌やマサ土に金属鉄粒とジュートペレットを1525%添加して脱NとP活性を強化しながら、ゼオライト層と積層させることによって汚水の浸透能も改良されている。生活排水(BOD 100,FN50,F1010ppm程度)を1ton/5m^2/日程度の処理速度で浄化して、BOD 10ppm25下,FN 15ppm以下,FP1ppm以下の処理水を得ることが可能である。気温,生活排水の質によって浄化能が変化するが、適切な負荷量と通気を行うことによって浄化程度を管理することができる。目詰まりは交互使用方式によって対応する。これまでの実証試験によって以下のようなことが明らかになった。(1)生活排水の負句は日変動が極めて大きいが、多段土壌層法による浄化装置はその負宇変動に十分対応できる。(2)通気が十分に行えばBOD浄化能は処理水で微ppm以下という性能を達成できる。しかし逆にFNとFPの液化能は装置内に浄化土壌層が好気手になりすぎるため、低下する。BOD,FN,FPを最も良く浄化できる適切な通気条件が存在する。(3)目詰まりは約1ケ年の使用で発生するが、13ケ月の体止時間によって回復する可逆的なものであることがわかった。以上のような実証試験をふまえ、本多段土壌層法を用いた生活排水処理装置が各種の野園施設に設備置し、性質を調査した。三瓶国立公園内のフィールドミュージアム内に設置された装置は夏期に集中する使用実態にもかかわらず、BOD,FN,FP浄化能ともすぐれた実積をあげている。次年度以降には農村集落排水の高度処理装置、高速道路パーキングエリア内の生活排水の高度処理装置としての実証を行うことが決定している。
トルコ北部における緑化システムの開発に関する研究

トルコは過去数千年にわたる過放牧や無計画な燃料採取によって国土の大半が裸地化し、土砂崩壊が多発すると同時に土壊流亡による生物生産性の著しい衰退が進行している。このため国土の緑化が最も重要な国家的課題となっている。本研究はトルコ共和国カラデニーズ工科大学林学部と共同で同国の現状にもとづいた実践的な緑化システムの開発を行うことを目的としたものであり、取り組むにあたり、研究代表者らは1992年に現地を2回訪問してトルコ政府森林省との研究協力を取り付け、さらに1996年には岡山大学農学部とトルコ国カラデニーズ工科大学林学部との間に学術交流協定を締結した。これらの準備段階を経て、平成11年平成13年度に科学研究費補助を得て、遂行した研究成果は以下のとおりである。1.トルコと日本の植生の相違点を比較し、気候が類似する黒海沿岸の低山地帯では近似することが明らかになった。(2,3章)2.トルコ国有林の民営化推進による森林保護政策について検討をおこない、生産性の向上と自主管理意識の高揚により盗伐防止の可能性が示唆された。(4,5章)3.導入可能な樹種の生理特性を比較検討した(6章)4.導入樹種の違いが進入種の定着に及ぼす影響を検討して、法面の早期緑化に用いる牧草類の画一的播種には問題点があることを明らかにすると同時に伐倒処理した樹幹を等高線方向にならべる処理が養分流亡を防ぎ有効な緑化手法となることを実証した。(7、8、9章)5.当該地域の緑化に最適な種を上記の成果より検討した結果、竹類導入が好ましいと思われた。(10章)以上の成果をとりまとめ、成果報告書を作成した。研究代表者および分担者の佐藤豊信(農学部・教授)、嶋一徹(自然科学研究科・助手)の3名は1999年7月にトルコ北東部黒海沿岸地域を訪れ、カラデニーズ工科大学林学部教授ゼキ・ヤヒョウル氏の協力のもと、同地域の典型的な森林に固定調査区を設け、植生調査ならびに土地利用形態に関する聞き込み調査を実施した。調査区は黒海に面したトラブゾン市カラデニーズ工科大学林学部演習林のほか、スメラ保護区およびリゼ市近郊の3地点であり、いずれも過放牧と盗伐による荒廃が目立つ林分である。保護区での優占樹種は、標高に応じて変化しており、黒海沿岸から5700m付近ではハンノキ、ブナ類の広葉樹が優占していた。これら地域では特産品のチャイ畑の無計画な拡大によって国有林の減少が著しいことが判明した。さらに標高700m1500m付近の保護林ではトウヒ類を中心とする針葉樹が優占しているが、国有林の大部分は盗伐と地域農民たちの放牧地拡大により急峻な斜面での荒廃地化が顕著であった。これら荒廃斜面では早急に緑化施工を行う必要性が認められた。帰国後、現地での野外データ取りまとめを行うと同時に、スポット衛星データによる地形情報の解析をおこなった。さらに、これら調査結果をもとに、わが国における最新の荒廃地縁化手法を取り入れ、今後の施行方針を検討すべく、カラデニーズ工科大学林学部教授ゼヒ・ヤヒョウル氏を岡山大学へ招聘し、研究2年目以降の綿密な試験計画について議論を行った。研究代表者らは2000年9月にトルコ北東部黒海沿岸地域を訪れ、カラデニーズ工科大学林学部教授ゼキ・ヤヒョウル氏、ヴァル・ムスタファ氏の協力のもと、昨年に引き続き同地域の典型的な荒廃林に設けた固定調査区での植生調査ならびに土地利用形態に関する聞き込み調査を実施した。

調査区は黒海に面したトラブゾン市カラデニーズ工科大学林学部演習林のほか、スメラ保護区およびリゼ市近郊の3地点であり、いずれも過放牧と盗伐による荒廃が目立つ林分である。これら荒廃林の植生調査の結果ならびに立地環境を検討した結果、同地域において過放牧ならびに過度の土地利用にともなう荒廃地における植栽には、同国における地域住民の換金性、利用便宜性および表土流亡効果を兼ねそなえたモウソウ竹が最適であろうという結論に達した。そこで、本年度の調査では、試験区の立地条件をさらに詳細に検討すべく土壌温度計、降雨観測計などの機材を設置して年間を通じての継続調査を開始した。これらの結果を踏まえ、荒廃林地におけるモウソウ竹の移植、保育管理の指針を立案し、あらたに実用的な緑化植栽工法について検討を開始した.そのため帰国後、現地での野外データ取りまとめを行うと同時に、これらをもとに、わが国における最新の荒廃地緑化手法を取り入れた緑化工法の立案および今後の施行方針を検討すべく、カラデニーズ工科大学理学部・教授トゥルカイ・トゥデシ氏と同大学林学部・助手ヴァル・ムスタファ氏を岡山大学へ招聘し、研究3年目に向けての綿密な試験計画について議論を行った。研究代表者および分担者の佐藤豊信(農学部・教授)、嶋一徹(農学部・助教授)の3名は2001年9月にトルコ北東部黒海沿岸地域を訪れ、現地研究協力者であるカラデニーズ工科大学林学部ヴァル・ムルタファ氏とともに同地域の植生・気候区分と森林荒廃との関連を広くグルジア国境付近まで視察した。その結果、これまで対象としてきたトラブゾン市を中心とする地域とは異なり,脊梁山脈の南斜面では植生が大きく異なるとともに、地域住民の土地利用形態にも大きな差異があることと、年間の降水パターンの違いから、新たな緑化施工法の立案が必須であることなどが判明した。さらに今回の現地訪問では、これまでの予備施工試験の成果を踏まえて、同地域に適していると思われる斜面緑化の工法を選別して、併設する試験林分において緑化工施工の実施を行った。さらに、その維持管理方法と今後の計測方法に関して、現地協力者と打ち合わせを行なった。また、2001年12月には現地研究協力者を岡山大学に招き、これまで収集した植生調査データおよび試験施工地での植栽木の生育状況に関して、今後のデータ取りまとめと報告書作成に関する打ち合わせを行なった。これと同時に、トルコ北東部における斜面緑化工法選択に関する試験を岡山大学農学部附属試験圃場内に設置した大型ライシメーターでも同時並行して行なっているが、この実験装置でのデータ解析および今後の計測に関しても、現地研究協力者と打ち合わせを行なった。
神経伝達物質セロトニンとGABAによる哺乳類精子受精能獲得の調節機構の解明

シリアンハムスターを用いた検討で、5HT2受容体の下流ではPLCを介したCaシグナルと可溶性アデニル酸シクラーゼを介したcAMPシグナルが働いており、5HT4受容体の下流では膜貫通型アデニル酸シクラーゼと可溶性アデニル酸シクラーゼの両方を介したcAMPシグナルが働いていた。どちらの受容体を介した調節経路でも共通してPKAの活性化を引き起こしていた。また5HT2受容体と5HT4受容体以外の5HT1受容体、5HT3受容体、5HT6受容体、5HT7受容体の関与について検討したところ、超活性化の惹起・促進にはこれらの受容体の関与は認められなかった。マウスを用いた検討では、セロトニンは5HT2受容体、5HT3受容体、5HT4受容体、5HT7受容体を介して精子超活性化を惹起・促進していた。5HT1受容体と5HT6受容体は関与していなかった。ハムスター精子ではセロトニンの濃度によって刺激される5HT受容体の種類が異なることが分かっているが、マウスでは濃度により刺激される受容体は明確には区別されていなかった。マウスでは体外受精を行う事が可能であるので、セロトニンで精子超活性化を惹起した時の体外受精への影響を調べた結果、セロトニンを添加して体外受精を行った方が受精率が高くなる結果がえられた。この事から、セロトニンは精子超活性化を惹起し、受精の成功を促進する作用があることが示唆された。ラットを用いた検討では、セロトニンにより5HT4受容体を介して精子超活性化を惹起・促進することが分かった。ハムスターでは計画の通り受容体の下流のシグナルの検討を行い、神経細胞で報告されている5HT2受容体と5HT4受容体の下流のシグナルと同様のシグナルの存在を確認することができた。マウスでは計画の通りセロトニンによる超活性化の惹起・促進の確認と関与する受容体の確認ができた。また予定より早くマウスでの体外受精を始めることができたので、セロトニン添加により体外受精の受精率が向上する事の確認ができた。これらマウスの成果については現在投稿中である(投稿先はReproduction)。ラットでは5HT4受容体を介して超活性化の惹起・促進が起こる事は確認できたが、その他の受容体の関与についてはまだ確認できていない。またGABAに作用については検討を進められていない。予定より早く研究が進んだ部分があるもののやや遅れている部分もあるため、全体としては概ね順調に進展していると判断している。ハムスターでの検討については5HT2受容体には3種類のサブタイプがあるため、どのサブタイプが関与するのか検討を行いたい。また5HT2受容体のアンタゴニストは抗ヒスタミン作用もあり、抗アレルギー剤として服用されていることから、アンタゴニストの個体投与により不妊を呈するのか検討を行いたい。マウスでの検討では、超活性化の惹起・促進に関与する各5HT受容体の下流のシグナルについて検討を行うと共に、受容体のアゴニストとアンタゴニストを添加した体外受精を行っていきたい。ラットでの検討では、セロトニンによる超活性化の惹起・促進に関与する受容体の特定を決定づけ、その下流のシグナルを検討していきたい。最後に、ハムスター、マウス、ラット精子超活性化に対するGABAの作用とその調節の仕組みついて検討を行い、マウスについてはさらにGABAを添加して体外受精を行っていきたい。

ラットでは5HT4受容体を介して超活性化の惹起・促進が起こる事は確認できたが、その他の受容体の関与についてはまだ確認できていない。またGABAに作用については検討を進められていない。予定より早く研究が進んだ部分があるもののやや遅れている部分もあるため、全体としては概ね順調に進展していると判断している。ハムスターでの検討については5HT2受容体には3種類のサブタイプがあるため、どのサブタイプが関与するのか検討を行いたい。また5HT2受容体のアンタゴニストは抗ヒスタミン作用もあり、抗アレルギー剤として服用されていることから、アンタゴニストの個体投与により不妊を呈するのか検討を行いたい。マウスでの検討では、超活性化の惹起・促進に関与する各5HT受容体の下流のシグナルについて検討を行うと共に、受容体のアゴニストとアンタゴニストを添加した体外受精を行っていきたい。ラットでの検討では、セロトニンによる超活性化の惹起・促進に関与する受容体の特定を決定づけ、その下流のシグナルを検討していきたい。最後に、ハムスター、マウス、ラット精子超活性化に対するGABAの作用とその調節の仕組みついて検討を行い、マウスについてはさらにGABAを添加して体外受精を行っていきたい。研究は概ね予定している通りに進行させていると考えています。したがって研究の進行の遅れにより次年度使用額が生じた訳ではなく、試薬等の購入においてキャンペーン等で予定より安く購入できたりしたことにより、4万円弱の次年度使用額が生じたと考えています。この4万円弱の次年度使用分については、得られた研究成果を第60回日本卵子学会学術集会(令和元年5月24日から5月26日、広島国際会議場において開催)において発表するので、そのための旅費として使用したいと考えています。演題番号O-95、発表演題名「セロトニンによるハムスター精子超活性化の調節機構」発表者:藤ノ木政勝、演題番号O-96、発表演題名「5HTによるマウス精子超活性化の調節機構」発表者:杉山由希子、藤ノ木政勝、柴原浩章。