hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘテロ高分子ゲル中に自発的に形成される構造の直接観察

平成10年度ヘテロ高分子ゲルの体積相転移挙動を実験的に測定した.特に,疎水相互作用と水素結合が競合することによって,ヘテロ高分子ゲルの体積相転移挙動が著しく変化する現象が見いだされた.これらの実験結果を理解するために,ヘテロ高分子ゲル中に形成される水素結合がゲルの体積相転移に及ぼす影響の理論的考察を行った.一般に,ゲルの高分子網目に水素結合等の二次的結合が形成されることによって,ゲルの網目構造が大きく変化する.ここでは,水素結合形成による高分子網目の基準状態の変化と高分子網目中の電荷の減少に着目し,平均場理論に基づいた理論を構築した.このようにして得もれたゲルの理論膨潤曲線は,実験的に観測されるゲルの膨潤挙動と定性的に一致することが明らかとなった.平成11年度ゲルが膨潤・収縮する際にパターンが形成されることが知られている.特に,ゲルの収縮過程において観察されるパターンは多様性に富むため,統一的な理解がなされていない.ここでは,収縮過程に観察されるパターンの形成過程をレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて観察した.この結果,パターン形成過程は溶媒の拡散,ゲル表面における膜状の収縮層の形成,相分離という三つの速い過程と,これに引き続いて起こる非常に遅い収縮過程からなることが明らかとなった.平成10年度ヘテロ高分子ゲルの体積相転移挙動を実験的に測定した.特に,疎水相互作用と水素結合が競合することによって,ヘテロ高分子ゲルの体積相転移挙動が著しく変化する現象が見いだされた.これらの実験結果を理解するために,ヘテロ高分子ゲル中に形成される水素結合がゲルの体積相転移に及ぼす影響の理論的考察を行った.一般に,ゲルの高分子網目に水素結合等の二次的結合が形成されることによって,ゲルの網目構造が大きく変化する.ここでは,水素結合形成による高分子網目の基準状態の変化と高分子網目中の電荷の減少に着目し,平均場理論に基づいた理論を構築した.このようにして得もれたゲルの理論膨潤曲線は,実験的に観測されるゲルの膨潤挙動と定性的に一致することが明らかとなった.平成11年度ゲルが膨潤・収縮する際にパターンが形成されることが知られている.特に,ゲルの収縮過程において観察されるパターンは多様性に富むため,統一的な理解がなされていない.ここでは,収縮過程に観察されるパターンの形成過程をレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて観察した.この結果,パターン形成過程は溶媒の拡散,ゲル表面における膜状の収縮層の形成,相分離という三つの速い過程と,これに引き続いて起こる非常に遅い収縮過程からなることが明らかとなった.【1】ゲル調製条件の探索ヘテロ高分子ゲルに構造を刷り込むため,疎水相互作用・静電的相互作用・水素結合の相互作用を有するモノマー種を選択し,その調製条件を決定した.低温かつ比較的高濃度のゲルに構造が刷り込まれていることを示唆する結果が得られた.このような条件下で効率良くゲルを調製するため,新しい光重合システムを開発した.また,この研究の過程において粒子径のそろった感熱性ゲルラテックスが調製できることも明かとなった.【2】レーザー走査共焦点顕微鏡システムの構築上の研究と並行してレーザー走査共焦点顕微鏡システムを構築した.装置はカ-ルツアイス社製倒立顕微鏡と横河電機製共焦点スキャナーユニットからなる.このシステムにおいては,レーザー光源としてアルゴンイオンレーザーを用いる.従って,効率良い測定を行うためには,ゲルを適当な蛍光試薬でラベルする必要がある.この点については,フルオレセインイソチオシアナ-トを用いることによって解決できることが明かとなった.【3】比較的大きなスケールに亘る構造の観察ゲルが収縮する際,ゲルに美しいパターンが形成されることがわかった.パターンを形成したゲル中における高分子網目の密度分布を明らかにするため,レーザー走査共焦点顕微鏡観察を行った.パターンが形成されているゲルでは,網目密度が局在化していることが明かとなった.また,パターンの形成過程において,高分子網目密度が時間と共に変化してゆく様子が観察できた.以後,この過程のダイナミクスを研究する予定である.ゲルが強く収縮する過程において,ゲルに美しいパターンが形成される.このようなパターン形成過程におけるゲルの高分子網目の動的挙動を,共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察した.まず,この過程を観察するためのゲルの調整条件を決定し,この後,ゲルを蛍光色素によりラベルした.得られたゲルの溶媒を貧溶媒に変え,ゲルを収縮させた.この過程において,ゲルに泡状のパターンが形成された.このパターンはゲルの協同拡散から予想される特性時間よりかなり早く形成されることが明らかとなった.さらに,このパターンはおよそ1週間後には消滅することから,ゲルに現れるパターンは過渡的な減少であることが明らかとなった.しかしながら,パターンが消滅した後においても,ゲル中における高分子網目の分布は局在している.このことは,パターン形成過程は,非常に速い過程と非常に遅い過程から成ることを示唆するものである.この点を明らかにする目的で,種々の条件下におけるゲルの収縮過程を動力学的に研究した.これらの結果から,ゲルにおけるパターン形成には,ゲルの収縮過程における非線型性が重要な寄与をしていることが推察された.
緑内障進行におけるＤＮＡ損傷応答の役割

DNA損傷応答とは、DNAの修復、細胞周期の制御、細胞死の誘導などの生体現象である。本研究では主に低酸素負荷により網膜神経節細胞死が起きる際、DNA損傷応答に関わるATM, NF-kB, 53BP1,ヒストンH4K20モノメチル化などの分子が細胞死を抑制していることを初代培養ラット網膜神経節細胞で確認した。さらに、ATM, 53BP1に関しては、マウスおよびラットの生体内でも確認した。低酸素負荷時に網膜神経節細胞死を抑制するプロスタグランジンF2α誘導体ラタノプロストはH4K20モノメチル化を促進することが分かった。今後、この特性を考慮した緑内障性視神経症治療薬の開発が期待される。本研究の目標は、緑内障でみられる網膜神経細胞(RGC)死におけるDNA損傷応答(DDR)の役割を解明していくことである。平成23年度には、DDRの中心的役割を果たすATM-53BP1が培養RGCにおいても細胞死と関連した動態を示すことを確認したことを受け、平成24年度には以下の内容が進展した。1.培養RGCにおけるATM-53BP1に依存した細胞死抑制経路の解明(1)前年度に明らかとなったRGCにおけるATMに依存した細胞死抑制経路をさらに詳細に検討するため、ATMの影響を受けるとされるHDAC4について調べた。HDAC4は核に局在すると細胞死促進方向に転写を制御するとされている。そこで、この現象が低酸素負荷時ならびにATMインヒビター添加時に培養RGCにおいても観察されるか否かを調べ、HDAC4が核に局在することを確認した。低酸素負荷によりATM-53BP1の経路が活性化することが分かった。(2)プロスタグランジンF2aアナログのラタノプロストは低酸素負荷時における培養RGCの細胞死を抑制する。そのメカニズムをDNA損傷応答と関連させて調べた。低酸素負荷時に減少する53BP1核内フォーカスがラタノプロスト添加時に再び増加することを確認した。(3)神経細胞死に抑制効果を発揮するとされるNF-kBの活性化について調べた。NF-kBの活性を調節するリン酸化部位として、p65のセリン468(不活性化)が知られている。ラタノプロストの添加によって、p65セリン468のリン酸化が抑制された。(4)ラタノプロストがGSK3bセリン9のリン酸化を促進するとGSK3b自体の活性が低下し、p65セリン468の抑制をすることが分かった。2.ATMノックアウトマウスの解析前年度に行ったATMの培養RGC保護作用をインビボで確認するために、ATMノックアウトマウスのRGC数の解析に着手した。前年度までにATMとDNA損傷部位に集積する53BP1が網膜神経節細胞(RGC)の生存に重要であることを確認した。平成25年度はこれらの上流に位置するヒストンH4K20のメチル化についての解析を行った。また、ラタノプロストによる神経保護作用機序についても明らかにした。1.ATMノックアウトマウスにおけるRGC数減少の有無の確認RGCに蛍光を発するThy-1-CFPマウスとATMノックアウトマウスを交配し、RGC数を計測した。生後4か月の野生型とノックアウトマウスとの間に差は見られなかった。Thy-1-CFP -ATMマウスは生後6か月前後で死亡するため、ATMノックアウトマウスで12か月以上生存したものを組織学的に観察し、網膜の変性を確認した。2.RGC-5における低酸素負荷時のヒストンH4リジン20のメチル化の変化53BP1の核内フォーカスの上流のH4K20のメチル化を調べた。低酸素負荷によりRGC-5のH4K20のモノメチル化(H4K20me1)は抑制されており、53BP1のフォーカス減少と細胞死増加との相関性が確認された。H4K20のモノメチル化は細胞周期と連動することがすでに報告されており、RGC-5に於いても低酸素負荷によりG1期からS期に移行する細胞が増加した。3.ラタノプロストのRGC保護作用とヒストンH4K20のメチル化の関連性低酸素負荷による細胞死を抑制するラタノプロストは低酸素により減少するH4K20me1を一部回復し、53BP1のフォーカス減少と細胞死増加も一部回復した。細胞死抑制効果はH4K20me1と相関している可能性が強く示唆された。本研究を通じて網膜神経節細胞死抑制にDNA損傷応答分子であるATM、53BP1、ヒストンH4K20モノメチル化が連動して機能し、低酸素負荷により抑制されたその機能がラタノプロストにより回復されることが明らかになった。

本研究の目的は、緑内障の主座である網膜神経節細胞において、いかなるDNA損傷応答が起こり、その細胞死に関与するのかを明らかにし、緑内障診断および治療における分子標的を同定することである。1.初代ラット培養網膜神経節細胞(以下培養神経節細胞と略す)に対して、DNA損傷応答蛋白の免疫染色を行い、評価可能なマーカーとしてγH2AXと53BP1を選択した。これらはDNA損傷時に損傷部位に集積し、増殖細胞、がん細胞では、核内フォーカスを形成することがすでに知られ、そのDNA損傷応答における重要性は確立されているが、培養神経節細胞においても核内フォーカスが確認できたことは、同様にDNA損傷応答が起きている有力な証拠を得たことになる。2.培養神経節細胞に4種類の模擬的緑内障負荷(グルタミン酸、低酸素、高圧、酸化ストレス)をかけ、上記2種類のマーカーでDNA損傷応答を評価したところ、低酸素負荷によって53BP1の核内フォーカス形成の有意な低下、グルタミン酸負荷によるγH2AXの核内フォーカスの増加が確認できた。3.8から10週齢のラットの右眼の視神経を圧迫し虚血状態を作成(視神経挫滅モデル)、左眼はシャム手術を行った。2日後に固定し、網膜神経節細胞における53BP1の核内フォーカス形成を観察したところ、53BP1の核内フォーカス形成は培養神経節細胞と同様に視神経挫滅眼で有意に減少していた。4.53BP1に関与する経路をさらに明確にするために、同じ実験系を用いて小脳失調性毛細血管拡張症原因遺伝子ATMの特異的インヒビターKU55933を添加した。この結果、低酸素負荷時の53BP1核内フォーカス減少と細胞死増加はATMに依存性であることが確認された。これらの結果より、網膜神経節細胞において、ATM-53BP1を介したDNA損傷応答経路がその細胞死に重要な役割を担うことが明らかとなった。1.培養RGCにおけるATM-53BP1に依存した細胞死抑制経路の解明(1)ATMに依存した細胞死抑制経路をさらに詳細に検討するため、ATMの影響を受けるとされるHDAC4について調べた。HDAC4は核に局在すると細胞死促進方向に転写を制御するとされているが、低酸素負荷時ならびにATMインヒビター添加時に培養RGCにおいて、HDAC4が核に局在することを確認し、低酸素負荷とATM機能抑制は同様の経路を介してRGC死を誘発することが分かった。(2)プロスタグランジンF2αアナログのラタノプロストは低酸素負荷時における培養RGCの細胞死を抑制することが知られている。そのメカニズムをDNA損傷応答と関連させて調べた。低酸素負荷時に減少する53BP1核内フォーカスがラタノプロスト添加時には再び増加することが確認できた。(3)神経細胞死に抑制効果を発揮するとされるNF-kBの活性化について調べた。NF-kBの活性を調節するリン酸化部位として、p65のセリン468(不活性化)が知られている。ラタノプロストがGSK3βセリン9のリン酸化を促進するとGSK3β自体の活性が低下し、p65セリン468の抑制をすることが分かった。(3)、(4)については今後DNA損傷応答(DDR)との直接的な接点をを求めていく予定である。2.ATMノックアウトマウスにおけるRGCの観察RGCに蛍光を発するCFP-Thy1トランスジェニックマウスとATMノックアウトマウスを交配した。
果実における内部組織発達メカニズムの解明

本研究では,果実内部組織の発達を制御するメカニズムの解明を目的とし,トマト果実のゼリー部分など特定の果実内部組織で重要な役割を果たすと考えられる遺伝子および代謝物の解析を行う.遺伝子の機能解析にはゲノム編集技術,代謝物の分布解析にはイメージング質量分析を中心に用いる.得られる成果は,トマトを含む多肉性果実の胎座組織の発達や,ゼリーへの分化メカニズム解明に学術的に貢献するとともに,園芸生産上問題となっているゼリー発達異常の発生メカニズムの解明や,ゼリーの量や成分の遺伝的改良技術の開発につながることが期待される.本研究では,果実内部組織の発達を制御するメカニズムの解明を目的とし,トマト果実のゼリー部分など特定の果実内部組織で重要な役割を果たすと考えられる遺伝子および代謝物の解析を行う.遺伝子の機能解析にはゲノム編集技術,代謝物の分布解析にはイメージング質量分析を中心に用いる.得られる成果は,トマトを含む多肉性果実の胎座組織の発達や,ゼリーへの分化メカニズム解明に学術的に貢献するとともに,園芸生産上問題となっているゼリー発達異常の発生メカニズムの解明や,ゼリーの量や成分の遺伝的改良技術の開発につながることが期待される.
動く薄膜領域上のナヴィエ・ストークス方程式の解析

今年度は静止した2次元閉曲面に退化する3次元薄膜領域上のナヴィエ・ストークス(NS)方程式について、膜の厚さゼロ極限に関する特異極限問題の研究を行い閉曲面上の極限方程式を導出した。また本研究の極限方程式と先行研究で導出された極限方程式の比較を行った。1.特異極限問題の研究:3次元空間内に与えられた2次元閉曲面(極限曲面)に対し、極限曲面上の十分小さな関数のグラフとして表される2つの閉曲面の間の領域として定義される薄膜領域上で「流体が領域の内外に出入りせず、境界上で摩擦力を受けながら滑る」という(ナヴィエの)滑り境界条件を課したNS方程式を考える。ただし境界条件としては摩擦力のない完全滑り境界条件も含む。このとき、薄膜方程式の解に対して膜の厚さ方向への積分平均を考え、膜の厚さゼロの極限で解の積分平均が極限曲面上の適切な関数空間内で収束し、極限関数が極限方程式の唯一の解であることを示すことによって極限曲面上の極限方程式を数学的に厳密に導出した。さらに、薄膜領域の膜の厚さが一定で薄膜NS方程式に摩擦力のない完全滑り境界条件を課す場合、本研究で導出した極限方程式は曲面上のNS方程式となることを示した。曲面上のNS方程式を薄膜極限により数学的に厳密に導出したのは本研究が最初の結果である。2.先行研究で導出された極限方程式との比較:Temam-Ziane (1997)は2次元単位球面に退化する薄い球殻上で「流体が領域の内外に出入りせず、速度場の回転が境界上で法線方向に平行である」というホッジ境界条件の下でNS方程式を考え単位球面上の極限方程式を導出した。本研究ではこの極限方程式と本研究で完全滑り境界条件の下で導出した極限方程式を比較し、その構造に大きな変化が現れることやその違いが薄膜NS方程式に課す境界条件の違いと薄膜領域の境界の曲率がゼロでないことに起因することを発見した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は2次元の動く閉曲面に退化する3次元薄膜領域上の非圧縮ナヴィエ・ストークス方程式について、薄膜領域が閉曲面に退化する際の退化曲面上の特異極限方程式(以下、極限方程式と呼ぶ)の導出とその考察を行った。1.極限方程式の導出:幅一定の動く薄膜領域上でナヴィエ境界条件(領域の内外で流体の出入りがなく、領域の境界と流体との間に摩擦力が働かないという条件)を課したナヴィエ・ストークス方程式を考え、膜の厚さがゼロに近づき領域が曲面に退化する際の極限方程式を形式的な計算により導出した。極限方程式導出に関しては変数変換により薄膜領域の幅を固定してパラメータに関する特異性を持つ方程式を考察することが一般的であるが、本研究で扱う退化集合は動く曲面であるため変数変換の方法は計算が著しく複雑になる。そこで今回は薄膜領域上の方程式を退化曲面からの距離関数で展開し、その主要部を決定することで極限方程式を導出した。同じ方法で薄膜領域上の流体に対するエネルギー保存則から退化曲面上の流体に対するエネルギー保存則を導出した。この方法は形式的ではあるが計算が容易であり、退化集合が複雑な形状を持つ薄膜領域上の様々な方程式に応用可能であると予想される。2.極限方程式に対する考察:薄膜領域上の流体に対する非圧縮条件の特異極限は退化曲面上の流体に対する非圧縮条件となる。また極限方程式における運動量保存則は通常のナヴィエ・ストークス方程式と同じく「慣性項+圧力勾配=粘性項」という形で表現されるが、粘性項はラプラス作用素以外にガウス曲率のような曲面の形状を表す項を持つことが分かった。さらに極限方程式に対応するエネルギー保存則において退化曲面の運動が流体の運動エネルギー変化に寄与することも判明した。上記考察により極限方程式で表される動く曲面上の流体の運動に対する曲面の形状および運動の影響を明らかにすることができた。本年度の研究目標は動く曲面に退化する薄膜領域上のナヴィエ・ストークス方程式に対して退化曲面上の特異極限方程式を形式的な手法および厳密な数学理論により導出することであった。結果として数学理論による導出には至らなかったが、形式的な手法により簡潔にかつ物理的解釈の行いやすい形で特異極限方程式および対応するエネルギー方程式を導出することができた。特に、特異極限方程式に対する考察を通じて薄膜領域上の流体運動の特異極限として表される動く曲面上の非圧縮粘性流体の運動に対する退化曲面の形状および運動の影響を明らかにすることができたため、本年度の研究に順調な進展があったと判断した。本年度は3次元の静止した薄膜領域上のナヴィエ・ストークス方程式について、薄膜領域が2次元の閉曲面に退化する際の特異極限問題に対する考察を行い、その過程で得られた知見を基に薄膜領域上の方程式の強解(一意性が成り立つクラスの正則な解)の時間大域存在の証明とその時空間ノルムの精密な評価を行った。1.特異極限問題に対する考察:与えられた閉曲面上の十分小さな関数のグラフとして表されるような2つの閉曲面を考え、その間の領域を薄膜領域としてナヴィエ・ストークス方程式を考える。ただし境界条件としては領域の内外で流体の出入りがなく、境界上で流体が摩擦力を受けながら滑っているという(ナヴィエの)滑り境界条件を課す。

このような薄膜領域上の方程式について、弱形式(試験関数を含む積分等式)に対する極限操作を行うことで薄膜領域が閉曲面に退化する際の極限方程式の導出を試みた。その結果、極限方程式の構造について知見を得ることはできたが、極限操作による積分等式の収束には薄膜領域上の方程式の正則な解に対する時空間ノルムの評価が必要であることが分かり、現時点では数学的に厳密な極限方程式導出に必要な理論が不足していることが分かった。2.強解の時間大域存在の証明と時空間ノルムの評価:上記の特異極限問題に対する考察を基に同じ薄膜領域上で滑り境界条件を課したナヴィエ・ストークス方程式の解析を行い、薄膜の厚さが十分小さいときに非常に大きな初期値と外力に対して強解が時間大域的に存在することを証明し、薄膜の厚さを用いて強解の精密な時空間ノルムの評価を行った。証明の鍵となるのは方程式の粘性項と慣性項の内積の積分の評価であるが、退化曲面の法線方向への積分平均を取って3次元ベクトル場をほぼ2次元の平均場とその残余項に分解して各々を評価することにより積分に対する良い評価を得ることができた。本年度の研究目標は薄膜領域が閉曲面に退化する際のナヴィエ・ストークス方程式の極限方程式を数学的に厳密に導出することであった。しかし、導出の過程で必要な理論が不足していることが判明し、その理論構築に多大な時間を費やしたために本年度中の厳密な極限方程式導出には至らなかった。また、薄膜領域が静止している状況でも方程式の解析が困難であったため、動く薄膜領域上の方程式については考察を行うことができなかった。本年度は様々な解析を行って今後有用となる理論を構築することはできたが、上記の状況を鑑みて研究は少々遅れていると判断した。今年度は静止した2次元閉曲面に退化する3次元薄膜領域上のナヴィエ・ストークス(NS)方程式について、膜の厚さゼロ極限に関する特異極限問題の研究を行い閉曲面上の極限方程式を導出した。また本研究の極限方程式と先行研究で導出された極限方程式の比較を行った。1.特異極限問題の研究:3次元空間内に与えられた2次元閉曲面(極限曲面)に対し、極限曲面上の十分小さな関数のグラフとして表される2つの閉曲面の間の領域として定義される薄膜領域上で「流体が領域の内外に出入りせず、境界上で摩擦力を受けながら滑る」という(ナヴィエの)滑り境界条件を課したNS方程式を考える。ただし境界条件としては摩擦力のない完全滑り境界条件も含む。このとき、薄膜方程式の解に対して膜の厚さ方向への積分平均を考え、膜の厚さゼロの極限で解の積分平均が極限曲面上の適切な関数空間内で収束し、極限関数が極限方程式の唯一の解であることを示すことによって極限曲面上の極限方程式を数学的に厳密に導出した。さらに、薄膜領域の膜の厚さが一定で薄膜NS方程式に摩擦力のない完全滑り境界条件を課す場合、本研究で導出した極限方程式は曲面上のNS方程式となることを示した。曲面上のNS方程式を薄膜極限により数学的に厳密に導出したのは本研究が最初の結果である。2.先行研究で導出された極限方程式との比較:Temam-Ziane (1997)は2次元単位球面に退化する薄い球殻上で「流体が領域の内外に出入りせず、速度場の回転が境界上で法線方向に平行である」というホッジ境界条件の下でNS方程式を考え単位球面上の極限方程式を導出した。
抗腫瘍抗体結合型光増感剤を用いた光線力学治療

光線力学治療は光増感剤を癌患者に投与し、光増感剤が取り込まれた腫瘍組織に光照射を行うことにより、腫瘍を殺傷させる方法である。現在、光線力学治療用の光増感剤としてポルフィリン誘導体であるフォトフリンが用いられている。しかし、フォトフリンは腫瘍選択性が低いという欠点がある。そこで本研究では腫瘍選択性をもった光増感剤の開発を目的とし、抗体結合型のクロリンe6(Ce6)を調製した。昨年度までに抗体一分子当たり約11個のCe6が結合した抗体結合型Ce6を調製し、高い腫瘍選択性と癌細胞殺傷力を確認した。さらに、Ce6結合数の異なる抗体結合型Ce6を調製し、結合数が抗体結合型Ce6の腫瘍細胞認識能に与える影響を調べた結果、抗体に結合したCe6の結合数が多くなるほど腫瘍細胞認識能が低下することが分かった。本年度では昨年度までの抗体結合型Ce6調製の技術を基に様々な結合体を調製し、それらの効果を調べた。抗腫瘍抗体に結合する光増感剤としてフタロシアニンを用いたところ、腫瘍選択性の高い抗体結合型フタロシアニンの調製に成功した。このことから、本研究で得られたコンジュゲート技術は様々な光増感剤に応用可能であることが分かる。さらにキャリアーとしてポリ-L-リジンを用いたポリ-L-リジン結合型Ce6を調製し、その効果を測定した。Lその結果、ポリ-L-リジン結合型Ce6はCe6と比較して細胞蓄積量が高く、細胞内で主に核に集積し、高い癌細胞殺傷力があることが明らかとなった。これは光増感剤を細胞の核に集積できた初めての例となった。以上のことより本研究で創成された蛋白質と機能性低分子のコンジュゲート技術は高い汎用性と有用性があることが明らかとなった。光線力学治療は光増感剤を癌患者に投与し、光増感剤が取り込まれた腫瘍組織に光照射を行うことにより、腫瘍を壊死させる方法である。しかし、フォトフリンは腫瘍選択性が低いこと、組織透過性の良い長波長領域の光の吸光係数が小さく、深部の腫瘍の治療には適さないという欠点がある。そのためフォトフィリンを用いた光線力学治療は治療効果が低く、副作用である光線過敏症を起こしやすいといった問題があった。そこで本研究では光増感活性が高く、腫瘍選択性をもった抗体結合型光増感剤の開発を目的とし、抗体結合型のクロリンe6(Ce6)を調製した。Ce6は水溶液中で単量体として存在するため、高い光増感活性が期待される。抗体一分子当たり約11個のCe6が結合した抗体結合型Ce6を調製した。また、抗体結合型Ce6はCe6と比較して飛躍的に高い取り込み量を示した。これは抗腫瘍抗体が腫瘍細胞を認識したために高い取り込み量を示したためと考えられた。細胞内での局在部位を調べた結果、Ce6は細胞膜に蓄積したのに対し、抗体結合型Ce6は細胞内に蓄積していた。抗体結合型Ce6の光増感作用を調べた結果、抗体に結合したCe6は結合していないCe6と比較して、一重項酸素の生成量は低いことが分かった。しかし、光照射による光毒性を調べたところ、抗体結合型Ce6はCe6と比較して高い光毒性を示した。これは抗体結合型Ce6が効果的に細胞に蓄積したためと考えられる。昨年度では抗体一分子当たり約11個のCe6が結合した抗体結合型Ce6を調製し、高い腫瘍選択性を確認した。本年度ではCe6結合数の異なる抗体結合型Ce6を調製し、結合数が抗体結合型Ce6の腫瘍細胞認識能および光増感作用に与える影響を調べた。腫瘍細胞認識能を調べた結果、抗体に結合したCe6の結合数が多くなるほど腫瘍細胞認識能が低下することが分かった。さらに、細胞へのCe6取り込み量に対する殺細胞効果を調べたところ、結合数が最も低い抗体結合型Ce6が良好な殺細胞効果を示した。以上の結果から、結合数が低い抗体結合型Ce6ほど腫瘍細胞を認識した後、効果的に取り込まれ、殺細胞効果が高いことが分かった。

そこで本研究では腫瘍選択性をもった光増感剤の開発を目的とし、抗体結合型のクロリンe6(Ce6)を調製した。昨年度までに抗体一分子当たり約11個のCe6が結合した抗体結合型Ce6を調製し、高い腫瘍選択性と癌細胞殺傷力を確認した。さらに、Ce6結合数の異なる抗体結合型Ce6を調製し、結合数が抗体結合型Ce6の腫瘍細胞認識能に与える影響を調べた結果、抗体に結合したCe6の結合数が多くなるほど腫瘍細胞認識能が低下することが分かった。本年度では昨年度までの抗体結合型Ce6調製の技術を基に様々な結合体を調製し、それらの効果を調べた。抗腫瘍抗体に結合する光増感剤としてフタロシアニンを用いたところ、腫瘍選択性の高い抗体結合型フタロシアニンの調製に成功した。このことから、本研究で得られたコンジュゲート技術は様々な光増感剤に応用可能であることが分かる。さらにキャリアーとしてポリ-L-リジンを用いたポリ-L-リジン結合型Ce6を調製し、その効果を測定した。Lその結果、ポリ-L-リジン結合型Ce6はCe6と比較して細胞蓄積量が高く、細胞内で主に核に集積し、高い癌細胞殺傷力があることが明らかとなった。これは光増感剤を細胞の核に集積できた初めての例となった。以上のことより本研究で創成された蛋白質と機能性低分子のコンジュゲート技術は高い汎用性と有用性があることが明らかとなった。
東アジアにおける「冊封・朝貢」の終焉とその記憶の形成過程

本科研は、所期の計画に従って、主に以下のような事例研究を提示した。第一に、冊封や朝貢に代表される中国の諸王朝と周辺諸国との関係は19世紀末に終焉するが、その過程で、清と周縁諸国との冊封・朝貢関係が言わば近代的国家関係を利用しつつ再編されたことに関する事例研究を示すことができた。第二に、20世紀に入り、中国が19世紀以前の周辺諸国との関係を、ナショナリズムの動向や日本との戦争、その時々の外交政策などとも関連させながら、伝統的な周辺との関係として記憶化してきたことが事例研究で示された。グローバル化と台頭する中国という二つの大きな変容要因に直面している東アジアの国際政治、国際関係を考えるで、東アシアに歴史的に内在したとされている伝統的国際秩序が、その存在の有無をふくめて注目され、重要な課題となっている。本研究では、冊封・朝貢などという語とともに用いられる中国を中心とする伝統的な国際秩序なるものが、存在の有無への問いも含めて、それが果たしてどのようなもので、どのように意識化されてきたのかということを、19世紀の後半から20世紀後半に至る長期的なスパンで解明することが、本科研の目的である。初年度は、研究代表者と研究分担者がおこなってきた、『中国近代外交の胎動』(岡本隆司、川島真編、東京大学出版会、2009年4月)の刊行へ向けての原稿の修正が中心的な活動となった。本書には、清と朝鮮の関係を扱った岡本の論考、また清の対外体制・思想の転換を扱った茂木論文、そして総理衙門から外務部への転換を扱った川島論文など、本科研の申請書の第一フェイズに掲げた課題に直接的にかかわる課題が含まれていた。日常的に会合や電子メイルで調整をおこない、本書は09年4月に無事刊行されることとなった。また、第一フェーズにかかわる研究として岡本は『世界のなかの日清韓関係史一交隣と属国、自主と独立一』(講談社選書メチエ420、2008年8月、全204頁)を刊行した。また、川島は「近代中国のアジア観と日本一『伝統的』対外関係との関連で」(高原明生ほか編『越境』<現代アジア研究1>(慶應義塾大学出版会、2008年、415-441頁)など、申請書の第二フェイズに即した課題に対応した成果を数点公刊した。だが、論文集の出版に集中したため旨ワークショップは延期されており、2009年度に台北で開催予定である。本研究では、冊封・朝貢などという語とともに用いられる中国を中心とする伝統的な国際秩序なるものが、存在の有無への問いも含めて、それが果たしてどのようなもので、どのように意識化されてきたのかということを、19世紀の後半から20世紀後半に至る長期的なスパンで解明することを目的とする。本共同研究で明らかにしようとしているのは、東アジアにおいて、(1)伝統とされる{冊封・朝貢+互市}がどのように終焉したのか(あるいはしなかったのか)、(2)過去のものとなったこうした対外関係の枠組み、秩序がどのように記憶され、教育などを通じて制度化されたのか、(3)そういった制度化された記憶に基づく自己/対外認識が具体的にどのように現代外交、現代東アジアの国際政治に影響を与えているか、という三点である。これに対して、科研の最終年度の本年には、2011年3月に中国近代外交史研究会を開催し、川島と岡本の近著および本科研の協力者たる五百旗頭薫の近著の書評会を開催し、また清や日本の近代的な対外関係形成過程に関する報告会も実施し、多くの参加者を得て活発な議論がおこなわれた。また、それぞれのメンバーが、たとえば川島真「近現代中国における国境の記憶-「本来の中国の領域」をめぐる」(『境界研究』、1号、2010年、1-17頁)や、岡本隆司「朝貢と互市と會典」(『京都府立大学学術報告(人文)』第62号、2010年12月、17-47頁)などの研究成果を公刊した。
ジルコノセン錯体を用いる新規有機合成反応の開発および利用に関する研究

有機ジルコノセンクロリド錯体の有機合成における反応試薬としての認知度は低く、精密有機合成にはあまり活用されてこなかった。しかしながら、我々の研究も含めて、ジルコノセン錯体を用いる数多くの特色ある反応が見出されてきており、その有用性が認識されつつある。本報告書の内容はアシルジルコノセン錯体、アルケニルジルコノセン錯体を炭素求核剤とする遷移金属触媒存在下での炭素-炭素結合形成反応について検討したものである。1.アシルジルコノセンクロリド錯体をアシルアニオン供与体として用いる合成反応。イミンへの付加反応によるα-アミノケトン体の生成がYb触媒あるいはブレンステッド酸により触媒されること、またアルデヒド、アミンおよびアシルジルコノセンクロリド錯体の三成分を混合するのみでα-アミノケトン体が得られることを明らかにした。さらにPd触媒存在下でのω-不飽和α,β-エノンとアシルジルコノセンクロリド錯体との反応による立体選択的ビシクロ[3.3.0]オクタン誘導体の生成に関する知見を基に、ω-アレニルα,β-エノン体につき同様に反応を行いexo-アルケニルビシクロノ[3.3.0]オクタン誘導体の合成を明らかにした。2.アルケニルジルコノセンクロリド錯体を用いる共役付加反応。アルケニルジルコノセンクロリド錯体のアルケニルアニオン供与体としての効率の良いイミン、アルデヒド誘導体への付加反応がRh触媒によってもたらされることを明らかにし、さらにα,β-エノン、エステル、およびアミド類へのアルケニルジルコノセンクロリド錯体の共役付加にも優れた触媒となることを明らかにした。共役付加反応の展開として、中間体エノレートアニオンのカルボニル官能基による分子内補足を行い立体選択的環状化合物の合成を行った。求核的アシル化剤としてのアシルジルコノセン錯体が芳香族イミン誘導体に対しYb(OTf)3-TMSOTfを触媒として用いると、効率よく反応しα-アミノケトン誘導体を収率よく与えることを見いだした。さらに、同様な反応がルイス酸としてのYb(OTf)3-TMSOTf触媒を用いなくてもブレンスッテド酸を触媒とする反応でも進行することを見いだし、最終的には反応系中に一当量の水を添加するのみでも反応が進行すると言う興味ある知見を見いだした。以上の結果は、水で容易に加水分解されるアシルジルコノセン錯体の性質を考えると非常に特徴的な結果と考えられる。また、これらの知見を基にアルデヒド、アミンの混合物溶液にアシルジルコノセン錯体を直接加えると、やはりα-アミノケトン体が効率よく得られることが判明した。これらの事実は、一般に不安定なイミン化合物を単離し反応を行う必要がなく、直接、三成分(アルデヒド、アミン、アシルジルコノセン錯体)を撹拌することによるα-アミノケトン体の合成法を示しており、今後のアシルジルコノセン錯体の高い実用的試薬としての可能性を示している。また、α,β-不飽和アシルジルコノセン錯体はPd(0)触媒の存在下α,β-ynone誘導体との反応では官能基化されたシクロペンテノン誘導体を一段階で与えることを明らかにした。シクロペンテノン誘導体は各種生理活性物質の合成のための有用な合成中間体となることより今後の展開が期待される。一方、α,β-不飽和アシルジルコノセン錯体はケトンのα,β-ジアニオンの前駆体となることを高次シアノクプラートとの反応から見い出しているが、そのα,β-ジアニオン中間体のスペクトルの確認には今のところ成功はしていない。

前周期遷移金属錯体、特に有機ジルコノセン錯体は有機合成における反応試薬としては一般に認知度が低く、精密有機合成にはあまり活用されてこなかった.しかし、近年我々の研究も含めて多数のジルコノセン錯体を用いる特色ある新規反応が開発されてきている。本研究はアシルジルコノセン錯体、アルケニルジルコノセン錯体を求核試薬とする遷移金属触媒存在下、炭素-炭素結合形成反応について検討を行ったものである。以下に平成14年度の研究成果を記述する.1,アシルジルコノセン錯体を用いるビシクロ環化合物の生成我々が以前に報告したα,β-不飽和ケトンへのアシルジルコノセン錯体の共役付加反応に関する反応機構に基づき、アシルジルコノセン錯体をPd-触媒存在下ω-位に不飽和結合を有するα,β-不飽和ケトン誘導体と反応させると、ビシクロ[3.3.0]オクタン誘導体が立体選択的に得られることを明らかにした。本反応にはα,β-不飽和ケトン官能基は必須であり、我々の作業仮説に基づく反応機構の正当性が証明された。さらに、種々ヘテロ原子を含むビシクロ[3.3.0]オクタン誘導体の合成にも成功し、その有用性を明らかにした。2,アルケニルジルコノセン錯体を用いるイミン誘導体への触媒的アルケニル化反応アルケニルジルコノセン錯体を用いるイミンへのGrignard型のアルケニル基の付加反応がRh(I)触媒を用い、非常に効率良く生起することを見いだした。反応性の非常に低いアルケニルジルコノセン錯体において本反応はイミンへの初めての触媒型の付加反応が可能であることを明らかにした。これまでに報告されてきている同型の付加反応は化学量論量の添加物を必要であったが、今回の発見によりアルケニルジルコノセン錯体を用いるイミンへのエナンチオ選択的な触媒反応の開発の可能性が示唆される。ジルコノセン錯体の有機合成試薬としての重要性、多様性をさらに認識させる反応結果を本年度に見い出すことが出来た。有機ジルコノセンクロリド錯体の有機合成における反応試薬としての認知度は低く、精密有機合成にはあまり活用されてこなかった。しかしながら、最近では我々の研究も含めて、ジルコノセン錯体を用いる数多くの特色ある反応が見出されてきており、その有用性が認識されつつある。本報告書の内容はアシルジルコノセン錯体、アルケニルジルコノセン錯体を炭素求核剤とする遷移金属触媒存在下での炭素-炭素結合形成反応について検討したものである。以下に平成15年度の研究成果を記述する。1.アシルジルコノセンクロリド錯体を用いるビシクロ環化合物の生成。Pd触媒存在下でのω-不飽和α,β-エノンとアシルジルコノセンクロリド錯体との反応による立体選択的ビシクロ[3.3.0]オクタン誘導体の生成に関する知見を基に、ω-アレニルα,β-エノン体につき同様に反応を行いexo-アルケニルビシクロ[3.3.0]オクタン誘導体の合成を行った。また、触媒としてニッケルを用いるとPd触媒反応で必須であったα,β-エノン官能基は必要でなく、環化反応を生起させうることを見出した。すなわち、ω-アルキニルアルデヒド、あるいはω-アルキニルオレフィンをNi-触媒存在下アシルジルコノセン錯体と反応させると効率よくアシル基が導入されたシクロペンテノール誘導体、あるいはビシクロ[3.1.0]ヘキサン誘導体を与えた。2.アルケニルジルコノセンロリド錯体を用いる共役付加反応。アルケニルジルコノセンロリド錯体のアルケニル
胎生期薬剤暴露による自閉症モデルラットにおける遺伝子発現異常

研究代表者らが作成した、5-HT神経系の初期発生異常を本態とする自閉症モデルラットは、疫学的に自閉症発症率を高めることが知られている催奇形性物質、サリドマイド(THAL)、またはバルプロ酸・ナトリウム(VPA)のいずれかを胎生9日のラットに暴露して得られる仔ラットである。今回の申請課題では、このモデルラットにおける以下の特徴を検索することができた。1.THAL投与による自閉症モデルラットと正常コントロールラットの暴露後の胎生期及び生後50日の海馬における、5-HTT mRNA発現定量の結果、薬剤暴露2日後のE11の5-HTT mRNA量は、正常コントロールと差を認めなかったのに対し、E13ではTHAL暴露群での有意な低下を認め、E15になると逆に、有意な上昇を認めた。また、生後50日のモデルラット海馬においては、THAL暴露群における5-HTT発現量がコントロールに比較して、有意に低下しているという結果が得られた。2.DNAマイクロアレイ法を用いてTHAL、VPA暴露によるモデルラットと、正常コントロールでの海馬における遺伝子発現比較を行った結果、その発現量がP20,30,40,50でそれぞれ増加、減少している遺伝子が多く発見された。特に、neurotransmitter遺伝子群では、ドパミンレセプターが、特にP20,30で発現が低下し、その後増加している傾向がVPA、THAL群共に見られる。以前の研究代表者らの検索でも、VPA, THAL群共に成体の脳内でのドパミン濃度上昇が認められており、本モデルラットにおける薬剤による遺伝子発現への影響は、モノアミン神経系に関しては共通であるという特徴が今回の実験からも裏づけされたといえる。これらの結果は、胎生早期にサリドマイド、またはバルプロ酸ナトリウムという催奇形因子に暴露されたラット胎児が共に自閉症類似のさまざまな症候を呈するに至る機転を解明する直接のカギとなる重要な発見であり、ヒト自閉症の病態解明、さらには診断・治療・予防への足がかりになると予測されるものである。研究代表者の成田奈緒子及び共同研究者の成田正明は、本年度の研究実施計画に基づき、5-HT神経初期発生に関わる遺伝子発現の変化のin vitro及びin vivoでの検索を行った。まず、セロトニン神経系の初期発生がバルプロ酸ナトリウム(VPA)の細胞外投与によって受ける影響について、マウス由来ES細胞から確立したセロトニン神経発生系を用いた実験を行った。その結果、これまでに確認されていたsonichedgehog(SHH)のみならず、serotonin transporter(5-HTT), Pet-1といったセロトニン神経系の初期発生に大きく関わることが知られている遺伝子群においても、VPAの細胞外添加によってES細胞由来のセロトニン神経発生系での発現の大きな低下が観察された。また、自閉症モデルラットの全胚抽出ホモゲナイズ検体を用いた検索においては、5-HTTの発現量の経時的変化をRT-PCR法を用いて解析した。その結果、バルプロ酸ナトリウム、あるいはサリドマイドを胎生9日に母体経由で暴露した群では、暴露後のE11に5-HTTの発現が大きく低下するが、その後E13,E15と逆に発現量がコントロールに比べて増加することが確認された。このことはすでに報告している本モデルラットにおけるセロトニン神経系の起始核である縫線核の形態の異常と関連付けられ、大変興味深い。

さらに、共同研究者の田代は、脳機能発達に対する様々な化学物質の影響を評価できる独自のアレイを用いて本モデルラットの生後20,30,40,50日における海馬のcDNAを用いたDNAマイクロアレイを施行した。現在はここから得られた膨大なデータを解析中である。複数の遺伝子の発現の大きな変化がコントロールと比較して確認されており、今後これらの各遺伝子について詳細な検討をかけていく予定である。昨年度に引き続き、脳機能発達に対する様々な化学物質の影響を評価できる独自のアレイを用いて本モデルラットの生後20,30,40,50日における海馬のcDNAを用いたDNAマイクロアレイを施行した。ここから得られた膨大なデータを解析した結果、以下のような点につき明らかにすることができた。1.サリドマイド(THA)暴露群では、主にP20,P30に大きな差異が正常コントロール群に比して見られ、P40,50ではその差異が減少し、正常コントロールの値に近づく傾向が見られた。P20-30で特に発現が異なる遺伝子としては、伝達物質放出機構に関する遺伝子群の中のSNAP25、synaptophysin、synapsinI、neurogranin、そして細胞骨格に関わる遺伝子GAP43などであり、いずれも正常に比べ遅い時期まで発現量の上昇が見られた。ただし、P40以降には正常コントロールと同程度の発現が観察された。このことからTHA群においては、正常コントロールに比してシナプス形成の開始が遅延、あるいは遅くまで形成していることが予測された。2.バルプロ酸ナトリウム(VPA)暴露群では、THAのような生後比較的早期に発現が上昇することは観察されなかった。しかし、P40以降はむしろSNAREタンパク群遺伝子、synapsinI、Synaptotagmin、neurograninなどがほとんど正常コントロールに比べて発現の低下をみており、特にP30以降にシナプスが減少していく、あるいは正常のシナプス形成が起こっていないという可能性が予測された。これらのことより、自閉症モデルラットで胎生期に暴露するTHAとVPAではその薬理作用も催奇形性の機序も異なるものの、いずれも正常コントロールと明らかに異なる生後早期のシナプス形成機構がその本態の一部であることが示唆された。
急速凍結法適用による平滑筋薬理学の新らしい展開

平滑筋収縮・弛緩状態を出来るだけ生体内中における状態に近い姿で固定したいという目的は著者らが発見したK拘縮長時間下での固定は異常な細胞像を呈する(中心部の空洞化)発表の確認の為にも是非共必要なものであった。この様な目的でスタートした本研究は意外な発展をしてしまった。すなわち同様な現象は特に血管平滑筋で著しいことが、普通固定標本、急速凍結標本で確認された。特にモルモット血管平滑筋の急速凍結置換法の適用は全壁(60μm以上)の水晶無し固定成功という驚くべき結果(従来本法のように液体窒素を用いた方法では78μmが固定可能)が得られたが、以後この追試が成功せず、急速凍結固定は停帯している。しかし、ここで得た現象は血管平滑筋には長期収縮時に中心部空洞化を生じることから、【Ca^(2+)】存在時にアクチンを切断する因子の探索にとりかかった。この因子の精製はDNAseIアフィニティカラムを用いて行った。さらにHPLCゲル瀘過を用いて完成した。精製された蛋白質は84Kダルトンの蛋白質でアクチンを【Ca^(2+)】存在下に切断した。この効果はトロポミオシンの存在下でも現われた。黄変米毒の主成分クロルペプタイドは84K蛋白質の作用に拮抗した。84K蛋白質は生体内に存在する自然のアクチンフィラメント出現阻止因子であり、黄変米毒の効果は生体内にアクチンフィラメントを出現させることにより細胞内構築変化を惹きおこすことが原因かもしれない。アクチンの切断と再生について急速凍結で分子形態の変化が追求されつつある。このプロジェクトによって平滑筋、特に血管平滑筋の収縮時の異常構造の問題は解決した。さらに薬理学・毒物学へのひとつの未解決であった黄変米毒効果への足がかりもつきはじめた。急速凍結固定法の完全解決は残されたが、これはひきつづき実験していきたい。
炎症時におけるトランスロケータープロテイン遺伝子の転写調節機構に関する研究

TSPOは、炎症時に誘導されることが知られているため、炎症の特に脳内炎症の指標として、研究が行われている。しかしその遺伝子発現誘導機構については、不明な部分が多い。そこで、炎症応答性転写調節領域を明らかにするために、マウスおよびヒトTSPO遺伝子の炎症応答性領域の探索を行った。実験の結果、マウスTSPO遺伝子の上流およそ1500bp、ヒトTSPO上流700bpにおいても、炎症応答性転写領域を見出すことはできなかった。以上の結果から、マウスおよびヒトTSPO遺伝子上流領域において、マウスでは1500bp、ヒトでは700bo上流領域には、炎症に応答する転写調節領域はない可能性が示唆された。ミトコンドリアに存在する18kDaのタンパク質、トランスローケータープロテイン(TSPO)/末梢型ベンゾジアゼピンレセプター(PBR)は、炎症時に誘導されることが知られている。そのため、炎症の、特に脳内炎症の指標として、多くの研究が行われている。しかしながら、現在までにTSPOタンパク質およびTSPO遺伝子の誘導機構については、その詳細が明らかにされていない。炎症誘発剤リポポリサッカライド(LPS)を用いて炎症を誘発する研究は広く行われているので、LPSを用いてラット神経膠腫細胞C6細胞を処理した後、ルシフェラーゼアッセイにより、TSPO遺伝子の転写に関わる領域を調べてきたけれども、少なくとも、マウスおよびラットTSPO遺伝子の上流500bp付近においては、炎症特異的な転写調節領域を見出すことができていなかった。今回、マウスの遺伝子に絞ってTSPO遺伝子における上流領域のクローニングを行い、ルシフェラーゼアッセイによって、この領域に炎症特異的な転写調節領域が存在するかの探索を行った。その結果、およそ1500bpまでの領域において調べてみたけれども、これらの領域においても、目的とする炎症に応答する転写調節領域を見出すにいたらなかった。今回行ったLPS処理によってきちんと炎症が誘発され、目的の遺伝子が発現誘導しているかの確認をお行ったところ、TSPO遺伝子のみならず、もうひとつの炎症マーカーであるシクロオキシゲナーゼ-2タンパク質が誘導されていることも確認できた。そのため、実験条件には問題がないことは確認できている。トランスローケータープロテイン(TSPO)は、炎症時に誘導されることが知られている。そのため、炎症の特に脳内炎症の指標として、多くの研究が行われている。しかしながらその遺伝子発現誘導機構については、不明な部分が多く残されている。前年度までの実験において、マウスおよびラットのおよそ500bp上流領域は、LPSによって引き起こされる炎症によるTSPO遺伝子の誘導メカニズムに関係しないことが示されたたことから、最終年度においては、さらに上流領域の探索、あるいはマウスやラットといったげっ歯類だけでなくヒトの遺伝子についても、炎症時のTSPO遺伝子発現誘導に関わる領域の探索を行った。まずマウス遺伝子の上流領域ついては、およそ1500bp上流までクローニングすることができた。そこで、この1500bpの領域をラットグリオーマC6細胞に導入し、リポポリサッカライド(LPS)処理を行い炎症を誘発し、転写活性能を調べることができるルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、マウスTSPO遺伝子の上流およそ1500bpには、炎症応答性の領域を見出すことは出来なかった。一方、ヒトTSPO遺伝子のプロモーター領域のクローニングも並行して行い、およそ700bp上流までの領域を得ることに成功した。マウスTSPO遺伝子同様に、ヒトTSPO上流領域に炎症応答性転写領域が含まれるかどうか調べるために、ルシフェラーゼアッセイを行った。ヒト遺伝子の場合、マウスとは異なり、ヒトグリオーマU87細胞を用いて、検討した。実験の結果、ヒトTSPO上流領域においても、マウス同様、炎症応答性転写領域を見出すことはできなかった。以上の結果から、マウスおよびヒトTSPO遺伝子上流領域において、マウスではおよそ1500bp、ヒトにおいてはおよそ700bo上流領域に、LPSで誘発される炎症に応答する転写調節領域はない可能性が示唆された。しかしながらその誘導機構については、詳細が明らかになっていない。そこでまずラット神経膠腫細胞C6細胞を炎症誘発剤リポポリサッカライド(LPS)処理を行い、TSPO遺伝子の発現誘導について検討を行った。1、3、6、12、24時間のLPS処理におけるTSPO遺伝子の発現をRT-PCRにより調べたところ、処理後3時間において顕著な誘導が認められた。その誘導は、24時間後まで継続していた。TSPO遺伝子が誘導される条件が整ったので、次にLPSによるTSPO遺伝子の発現誘導のメカニズムを明らかにする為に、マウス、ラットおよびヒトTSPO遺伝子のプロモーター領域のクローニングを試みた。マウスおよびラットTSPO

遺伝子プロモーターのおよそ500bp上流までクローニングが出来たので、ルシフェラーゼアッセイ用ベクターに組み込み、マウスおよびラットのTSPOプロモーターを用いたるしフェラーゼアッセイを、LPS処理したC6細胞を用いて行った。その結果、このマウスおよびラットの両TSPO遺伝子プロモーター領域において、LPS処理に応答したるしフェラーゼ活性の上昇は見いだせなかった。すなわち今回用いたマウスおよびラットのおよそ500bp上流領域には、LPSによって引き起こされる炎症によるTSPO遺伝子の誘導メカニズムに関係しないことが示された。TSPO遺伝子における炎症特異的転写調節領域の特定がまだできておらず、予定より大幅に遅れている。しかしながら、少なくともマウスの遺伝子において1500bp上流には存在しない可能性を示すことができたという点では、一歩前進していると言える。初年度にTSPO遺伝子プロモーター領域におけるの炎症応答性配列を同定することを目的としていたが、今回は、すくなくとも500bp上流においては、目的の応答配列が無いことしか示すことが出来なかった。またヒトのTSPO遺伝子プロモーターに関しては、500bp上流領域のクローニングも出来なかったので、種差における遺伝子発現システムについて検討が完全ではない。これまでTSPO遺伝子の上流領域を、転写開始点付近を調べるのみであった。ある遺伝子の転写活性化領域が、おおよそ1万bp上流に存在し、遺伝子の発現調節に関与することから、TSPOにおいても、かなり距離の離れた領域に、炎症特異的転写調節領域を有しているかもしれない。転写開始点からさかのぼって領域を探索するとともに、5000bp以上離れた領域からも転写調節領域の探索を行い、TSPO遺伝子のLPS処理によって誘導される際に、関与するシスエレメントおよび転写調節因子の同定を目指す。初年度の実験方針を参考に、次年度はプロモーター領域のクローニングをもっと上流から行う。少なくともTSPO遺伝子プロモーターの20003000bpのクローニングを行い、炎症応答配列の検討をおこなう。前年度においては、ラット、マウス、ヒトにまたがってクローニングを行っていたので、まずは、一つの応答配列を見いだすために動物種をマウスに絞り、より上流領域のクローニングを最大の目的とする。研究の進行が遅れたため、実験が先に進まず、そのため翌年への持ち越し金が発生した。次年度の実験形態の主なものは、細胞培養、クローニングおよびルシフェラーゼアッセイなどが挙げられる。そのため次年度における研究費の使用としては、主に試薬および消耗品の購入に充てる予定である。また初年度において発生した持ち越し金は、次年度において行う実験に必要となる試薬および細胞培養に必要なディスポーザブルのピペット、ディッシュなどの消耗品の購入に充てる予定である。初年度において、研究の進行が遅れたため、実験が先に進まず、そのため翌年への持ち越し金が発生した。
知のオープン化時代の大学・科学相関システムの再構築

今日の科学は「科学の危機」に直面し、大学政策は何かにつけて大学がダメだという議論に陥りがちである。しかし、大学問題の根本には脆弱な根拠に基づく大学改革・大学政策、大学と噛み合わない科学振興がある。そこで、(1)大学政策に関して政策立案と政策運営の妥当性を反省的に検証し、(2)政策立案に学問知がいかに関わってきたか、適時的確なデータや研究成果を提供してきたか、方法は適切であったかをレビューし、(3)科学の現実を踏まえた大学論、科学の揺籃たる大学を取り込んだ科学論を構想する。これらを踏まえ、(4)大学論、科学論、政策論の協働により、新しい大学像・科学像、大学・科学相関システムをリデザインする。大学・研究機関による知の独占、仮説検証の理系的研究手法、そして研究機関と科学の安定的関係が主流であった旧来の知の体系が、社会変動とともに崩れ、科学的知への信頼が揺らぎ、仮説検証ではなく、むしろデータから研究のナラティブを導出する文系的手法への転回、そして領域融合的な知の必要という新たな知のオープン化・科学的体系の変革の中で、研究機関としての大学のあり方を構想しようとする研究である。大学改革を含めて、新たな社会を構想するために必要な研究である。大学改革との関わりでは、知のオープン化という新しい事態に直面して、政策立案と運営の妥当性の反省的な検証及び大学の組織のあり方の検討から、新たな科学論を構想することが求められており、その基盤を整備するシステム構築が期待される。このような研究が展開されることで、科学の新たな基盤の形成が進められることが期待される。