hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中間径フィラメントと細胞間接着デスモソームの制御機構の解明

1.ケラチン8結合候補蛋白質として同定したトリコヒアリン及びプレクチンに相同性を有する新規蛋白質を同定し、トリコプレイン(Trichoplein)と命名した。ノザン法では、この遺伝子は種々の組織で発現していた。この蛋白質に対する抗体を作製したところ、ウエスタン上、分子量61kDa前後を示し、cDNAより推察されるものと合致した。作製した抗体を用いて免疫沈降を行い、内在性のトリコプレインとケラチン8・18が複合体を形成していることを確認した。また、細胞染色上、内在性のトリコプレインは、細胞内でケラチンとの共局在していた。さらに、免疫電顕でも、トリコプレインは、ケラチンフィラメント上に局在していることを認めた。2.p0071蛋白質は、デスモソームあるいはアドヘレンス・ジャンクションに局在していると報告されているarmadillo蛋白質であるが、私共は、上皮細胞の極性形成に関与しているLAPファミリー蛋白質に属するERBINがp0071と結合することを見出した。ERBINは、そのPDZドメインを介して、p0071のC末端に存在するPDZ結合配列と結合した。ERBINに対する抗体を作製し、細胞染色を行ったところ、ERBINは、主としてアドヘレンス・ジャンクション、一部デスモソームに局在し、p0071と共局在していた。また、細胞にRhoファミリー蛋白質のCdc42、Rac1、及びRhoAのドミナント・アクティブ体を強制発現するとERBINが細胞間接着部位に濃縮することを認めた。また、ERBINのホモローグであるDensin-180が、デルタ・カテニン及びN-カドヘリンと複合体を形成し、神経シナプスに局在していることを見出した。1.ケラチン8結合候補蛋白質として同定したトリコヒアリン及びプレクチンに相同性を有する新規蛋白質について検討した。two-hybridスクリーニングで得たクローンのcDNAをGenBankで検索し、この新規遺伝子の全長cDNAをPCR法にてクローニングした。免疫組織染色では、細胞内でゴルジ体近傍に存在しており、現在ケラチンとの共局在を検討しているところである。さらに、Densin-180結合蛋白質として、MAGUIN-1を同定し、MAGUIN-1を介して、Densin-180とPSD-95が複合体を形成しうることを認めた。ケラチン8結合候補蛋白質として同定したトリコヒアリン及びプレクチンに相同性を有する新規蛋白質について検討した。

two-hybridスクリーニングで得たクローンのcDNAをGenBankで検索したところ、BC004285、AK092736(FLJ35417)、及びAY007230(A novel tumor suppressor gene at 12q,TS12Q)として登録されている遺伝子に相当することが判明し、この新規遺伝子の全長cDNAをPCR法にてクローニングした。この分子はトリコヒアリン及びプレクチンと一部相同性を有することから、私共はこの分子をトリコプレイン(Trichoplein)と命名した。ノザン法では、この遺伝子は種々の組織で発現していた。この蛋白質に対する抗体を作製したところ、ウエスタン上、分子量61kDa前後を示し、cDNAより推察されるものと合致した。In vitro結合実験で、トリコプレインは、種々の中間径フィラメント蛋白質のうち、ケラチンとの結合が最も強いことがわかった。cDNAを細胞に強制発現すると、ケラチン8・18フィラメントと共局在することを認めた。作製した抗体を用いて免疫沈降を行い、内在性のトリコプレインとケラチン8・18が複合体を形成していることを確認した。また、細胞染色上、内在性のトリコプレインは、細胞内でケラチンとの共局在していた。さらに、免疫電顕でも、トリコプレインは、ケラチンフィラメント上に局在していることを認めた。今後、siRNAiでトリコプレインをノックダウンできることを確認し、その細胞を用いてトリコプレインの生理学的機能を検討する。
圧縮性流体・固体の熱連成現象に対する多相場解析手法の改良と実用問題への適用

本研究では,研究代表者らが提案した圧縮性流体と固体の熱連成計算手法について,例えば気体と金属のように物性値が大きく異なる場合や,固体が移動する場合に適用すべく改良を行った.提案した手法では,圧縮性流体と固体から構成される多相場を1つの流体と仮定し,計算セルに含まれる各相の体積割合に基づいて平均化された基礎方程式に対して低マッハ数の非等温流れを高速に計算可能な圧縮性流体解法を適用する.以上の提案手法について,流体と固体の基礎方程式を個別に解いて得られた既往の計算結果と比較して多相場の平均化手法の妥当性を確認した.また,回転する歯車状の固体周りの熱対流を計算して手法の適用性を確認した.初年度である2016年度は,研究代表者らがこれまでに開発を行ってきた圧縮性流体と固体の熱連成現象に対する多相場解析手法に改良を加え,圧縮性流体と固体の間で密度や比熱,熱伝導率などの物性値が異なる問題にも適用可能な手法を提案した.なお,流体は理想気体,固体は変形せず静止していると仮定する.本手法の特徴としては,混相流の分野で提案されている一流体モデルに基づき,圧縮性流体と固体から構成される多相場を1つの混合体としてモデル化する.したがって,本手法では相の境界形状に適合する計算格子を生成する必要がなく,複雑な形状の固体を含む場合にも単純な直交構造格子を用いて流体と固体の熱連成を計算することが可能である.また,本手法は流体の圧縮性を考慮するため,時間,空間的に温度や圧力が大きく変化し,非圧縮性流体として扱えない問題にも適用することが可能である.本年度は,特に混合体の運動量や熱伝導を計算する際に,固体の物性値を適切に考慮する手法を新たに提案した.これにより,例えば気体と金属のように,密度や比熱,熱伝導率などが大きく異なる場合にも本手法を適用することが可能となった.提案した手法は,例えば熱伝導性固体を含むキャビティ内の自然対流計算に適用され,相境界に適合する計算格子を用いた既往の計算結果と比較した.その結果,十分に細かい計算格子を設定することで,本手法による結果と既往の計算結果が概ねよく一致することを確認した.当初の計画通り,2016年度内に固体の物性値を適切に考慮した計算手法の構築,検証を行うことができたため,概ね順調に進展していると考えられる.ただし,手法の構築が完了したのが年度後半であったため,成果発表については本年度中に全てを行うことはできなかった.最終年度である2017年度は,前年度に構築した圧縮性流体と固体の熱連成計算手法について,固体が移動する問題へ応用すべく改良を行った.提案した計算手法では,計算セル内に含まれる各相の体積割合に基づいて平均化された基礎方程式に対し,低マッハ数の非等温流れを高速に計算可能な圧縮性流体解法を適用する.したがって,本手法では固体形状が複雑な場合や移動するような場合でも,流体の密度変化を考慮しつつ,単純な直交構造格子を用いて計算を行えるという特徴がある.本年度では特に,移動する固体周りの流れを妥当に計算するために,各相の運動量を平均化する計算段階について改良を行った.また,任意形状の移動固体を計算するために,固体を2次元計算の場合は三角形要素,3次元計算の場合は四面体要素の集合体として表現し,各計算セルをさらに細かく分割したサブセルがこの三角形あるいは四面体要素に含まれるかを判定して計算セルにおける各相の体積割合を算出する手法(四面体サブセル法)を導入した.改良した手法の適用性を確認するために,まずは矩形キャビティ内で回転する三角形固体周りの熱対流を計算した.この計算では,三角形固体の中心部と周囲の壁が,それぞれ一定温度で加熱,冷却される.以上の計算を行った結果,回転する三角形の頂点付近で熱対流が発達していく様子や,固体の物性値を変えた場合に流況や温度分布が変化すること,与えた温度差に応じた流体の密度変化を計算できることを確認した.また,放熱フィン付きの回転円筒を模擬した歯車状の回転固体周りの熱対流を計算し,任意形状の移動固体へ適用可能であることを確認した.本研究では,研究代表者らが提案した圧縮性流体と固体の熱連成計算手法について,例えば気体と金属のように物性値が大きく異なる場合や,固体が移動する場合に適用すべく改良を行った.提案した手法では,圧縮性流体と固体から構成される多相場を1つの流体と仮定し,計算セルに含まれる各相の体積割合に基づいて平均化された基礎方程式に対して低マッハ数の非等温流れを高速に計算可能な圧縮性流体解法を適用する.以上の提案手法について,流体と固体の基礎方程式を個別に解いて得られた既往の計算結果と比較して多相場の平均化手法の妥当性を確認した.また,回転する歯車状の固体周りの熱対流を計算して手法の適用性を確認した.最終年度である2017年度は,2016年度に構築した計算手法をさらに複雑な問題に適用し,既往の実験結果等と比較して手法の妥当性を確認する予定である.具体的には,発熱円柱群からの自然対流などを検討している.また,2016年度分も含め,研究成果を積極的に発表していく.数値流体力学計算手法の構築が完了したのが年度後半であり,学会発表や論文投稿などの成果発表を本年度中に全て行えなかったため.2016年度の成果を速やかにまとめて学会発表や論文投稿を行う予定であり,次年度使用額はこれに使用する.
制約論理プログラミングに基づく高機能グラフィックインタ-フェ-スの設計

現在、グラフィックインタ-フェ-スをソフトウェア工学的に容易に実現する方法としては、オブジェクト指向プログラミングがもっともよく使われている。それに対して本研究では、論理指向のアプロ-チを展開する。このアプロ-チは部品間の関係を制約としてとらえ、グラフィカルなレイアウトは論理的な仕様で記述するというものである。以下に、今年度の成果を述べる。(1)制約論理型言語Tritonの設計エルブラン領域を対象にした論理型言語を一般化した制約論理型言語Tritonを設計した。Tritonは線形方程式、線形不等式を扱うことができ、変数の領域は実数に拡張されている。これによりレイアウト問題における代数的制約を言語上で宣言的に記述することができた。そして、制約充足は言語処理系に任かせることができるため、部分的な変更を一貫して管理することが可能となった。TritonはProlog,ESP等の論理型言語処理系上で開発されており、移植性がよい。(2)制約指向グラフィックスの提案制約指向によるグラフィック構築法にはThingLabに見られるようなオブジェクト指向プログラミングに基づくアプロ-チがあるが、本研究では、制約論理プログラミングによるアプロ-チを展開した。ThingLabと比べると、オブジェクトの定義、属性・制約の継承が論理的に記述でき、セマンティックスも明らかになっている。また、デフォルトはNegation as failureの枠組によって、デフォルト制約として扱っている。
ニホンウズラのリンパ球機能およびMHC多型に関する研究

1.ニホンウズラのリンパ球抗原に関する研究(1)ニホンウズラの胸腺由来細胞(Thy細胞)を免疫原とするモノクローナル抗体(MoAb)を5種:QT-1QT-5、ならびにファブリシウス襄由来細胞(BF細胞)を免疫原とするMoAbを5種:QB-1QB-5、作成した。(2)免疫組織染色の結果、QT-1^+,-4^+および-5^+細胞はThy皮質にのみ存在した。QB-1^+,-2^+および-3^+細胞はBFの髄質に密集し、また脾臓(Sp)の動脈周囲リンパ球鞘の外周に存在した。(3)フローサイトメトリー法による解析の結果、QT-1^+,-4^+および-5^+細胞はThyにのみ存在した。QB-1^+,-2^+および-3^+細胞はBF細胞の約90%を占め、またThy細胞、Sp細胞および末梢血リンパ球(PBL)中にも存在した。QT-2^+,QB-4^+および-5^+細胞はThy細胞、BF細胞、Sp細胞、PBLおよび赤血球(RBC)に存在し、QT-3^+細胞は各種免疫臓器由来細胞に存在したが、RBCには認められなかった。2.ニホンウズラのMHCクラスI領域に関する研究(1)ニワトリのMHCクラスI抗原cDNA(BF10)をプローブに用いたニホンウズラゲノミックDNAのRFLP像には多型が観察された。(2)ニホンウズラの肝臓cDNAライブラリーからBF10およびBF10陽性クローン(QF41)をプローブに用いて9つの陽性クローン(QF41,63,76,95,103,111,113,128)を得た。これらのクローンは塩基配列に基づき、5つの遺伝子座に分類され、そのうち2つの遺伝子座には対立遺伝子が存在した。(3)PCR法を用いてQF41およびQF63のα1α2領域を増幅したところ、QF63の増幅産物(609bp)はα1とα2との間に181bpのイントロンを含んでいたが、QF41の増幅産物(434bp)はα1とα2の間にイントロンが認められなかった。(4)QF63の増幅産物は制限酵素BanIIおよびFcoT14I処理によるPCR-RFLPパターンの組合せにより9つの遺伝子型の存在が予測されたが、このうち5つの遺伝子型のみが観察された。1.研究代表者の渡邉らが見い出した、血清lgG値の遺伝的変異に基づくニホンウズラの2系統、即ち高lgG系統(A系統)および低lgG系統(B系統)の血清中のlgG濃度を抗lgG家兎血清を用いた単円免疫拡散(SRID)法により測定し、A系統とB系統とを確認し、現在両系統を維持している。2.末梢血リンパ球を密度

勾配遠心法により分離し、メンヨウ、ウサギおよびニワトリ赤血球とのロゼット形成反応、細胞膜表面lgG(slgG)の検索および電子顕微鏡による形態観察、更に、これら末梢血リンパ球とファブリシウス嚢由来(B)細胞および胸腺由来(T)細胞との抗原性を比較したところ以下の成績を得た。(1)末梢血リンパ球は、比重差および形態により3型に大別されるが、その中で、比重が最も軽い細胞(I型)は、ウサギ赤血球とのみロゼットを形成し、slgGを有さず、形態および抗原性からT細胞と判断された。(2)中間の比重を示した細胞(II型)は、メンヨウ赤血球免疫後にのみその赤血球とロゼットを形成し、slgGを有し、形態および抗原性からB細胞であることが示唆された。(3)最も比重の重い細胞(III型)は、ニワトリ赤血球とのみロゼットを形成し、slgGを欠き、I型細胞とはサブクラスの異なるT細胞とも考えられた。3.末梢血リンパ球のうちウサギ赤血球に対するロゼット形成細胞(RaRFC)および非形成細胞(NRaRFC)、並びにTおよびB細胞をそれぞれ家兎に免疫し、得られた抗血清を相互吸着し抗原性を比較した。(1)抗RaRFCはT細胞と、抗NRaRFCはB細胞と最も強く反応した。(2)抗TはT細胞とのみ、抗BはB細胞およびlgGとのみ反応した。4.TおよびB細胞に対するモノクローナル抗体の一部は、赤血球、T,Bリンパ球の何れにも反応した。また、ニワトリのMHC class I抗体およびcDNAプローブ(譲渡)とニホンウズラの試料とが交差反応を示すことが明らかにされた。1)ニホンウズラの胸腺由来細胞(Thy細胞)およびファブリシウス嚢由来細胞(BF細胞)を免疫源とするモノクローナル抗体(MoAb)をそれぞれ5種、計10種類作製した。これらは、Thy細胞或はBF細胞にそれぞれ特異的なMoAbが各3種、計6種、また、Thy細胞およびBF細胞に共通のMoAbが4種であった。現在、認識する抗原の免疫臓器、細胞における分布、並びに抗原の生理化学的性状を検討中である。2)酸エステラーゼ染色および酸フォスファターゼ染色によりリンパ球の細胞質に顆粒が観察された。また、Thy細胞とBF細胞との間で、顆粒の数および分布に差異が認められ、併せてリンパ球の成熟との関連が示唆された。3)末梢血リンパ球の各種マイトージェンによる幼若化反応の培養条件を検討し、各マイトージェンの濃度並びに培養適温を明かにした。4)高lgG系統(A系統)と低lgG系統(B系統)との間で、メンヨウ赤血球(SRBC)、ブルセラ死菌(BA)およびサルモネラ細胞壁由来多糖類(LPS)に対する抗体価および抗体のlgクラスの経時的推移と比較検討したところ、A系統のlgG産性能はB系統より高く、逆にA系統のlgM産性能はB系統より低い傾向が認められた。5)A、B両系統間で赤白血球共通抗原型のLyシステムの表現型頻度および遺伝子頻度を比較したところ、両系共に、Ly 1型固体は認められず、Ly 2およびLy 3の、いずれかのホモあるいはヘテロ個体であった。またLy 2およびLy 3の頻度に明確な差異は認められなかった。6)A、B両系統間でニワトリのMHC classIのcDAN(F10)をプローブとしてECL法によりゲノムDNAのサザン解析による制限酵素断片長多型(RFLP)像を比較したところ、PvuII処理したRFLP像において、B系統にはA系統に観察されない7.9kbのバンドが特異的に観察された。1.ニホンウズラのリンパ球抗原に関する研究(1)ニホンウズラの胸腺由来細胞(Thy細胞)を免疫原とするモノクローナル抗体(MoAb)を5種:QT-1QT-5、ならびにファブリシウス嚢由来細胞(BF細胞)を免疫原とするMoAbを5種:QB-1QB-5、作成した。(2)免疫組織染色の結果、QT-1^+,-4^+および-5^+細胞はThy皮質にのみ存在した。
心筋炎、拡張型心筋症におけるHMG-CoA阻害薬、スタチンの有用性について

心不全は現在なお死亡率の高い疾患群であり、その治療の進歩が望まれている。近年、心不全の原因の一つに、心筋の炎症が関与していることが注目されてきている。本研究の目的は、心筋炎後心不全、拡張型心筋症のよい実験モデルである自己免疫性心筋炎ラットを用いて、HMG-CoA阻害薬、スタチンの有用性、およびそのメカニズムを明らかにすることであった。既報のごとく心筋ミオシンを感作し、ルイスラットに自己免疫性心筋炎を誘導した。心筋炎ラットは感作後約2週で炎症極期となり、4週で炎症巣は治癒、あるいは瘢痕に置き換わり慢性期に入る。心筋炎感作後4週目からスタチンをラットに投与し(高濃度群、低濃度群の2群を作成)、心不全進展に対するその効果を、以下の項目について検討した(n=7)。死亡率、心臓エコー検査の各種パラメーター、心臓カテーテル検査の各種パラメーター、心臓重量、心臓の各種免疫組織染色、血中各種サイトカイン濃度。一回目の群では、上記のいくつかの結果において、スタチンが心筋炎後心不全の進展抑制に効果があるデータを得た。その後、nを増やし、結果をより確実なものにするための実験を行ったが、初回に得られた結果と異なる結果であった。結果が不安定であり、その原因として、薬の投与方法(経口的投与)を考えた。そこで、現在ラットの体内にポンプを植え込み、経静脈的投与に方法を切り替え、実験を継続している。本研究と関連する研究として、別紙の論文をこの2年間に報告させていただいた。本研究の目的は、心筋炎後心木全、拡張型心筋症のよい実験モデルである自己免疫性心筋炎ラットを用いて、HMG-CoA阻害薬、スタチンの有用性、およびそのメカニズムを明らかにすることである。初年度は自己免疫性心筋炎ラットを用いてスタチンの心筋炎、心筋炎後心不全に対する効果を検討すること、2年目は初年度に得られた結果をもとに、そのメカニズムをin vivo, in vitro両面から検討することが当初の予定であった。上記のいくつかの結果において、スタチンが心筋炎後心不全の進展抑制に効果があるデータを得ている。今後、動物数を増やし、結果を確認し、そのメカニズムについて検討を加えていく予定である。
根尖病巣に対する挑戦的再生療法の確立

本研究は、根尖病巣の大きさに合う粘膜穴を介して歯槽骨に穴を開けて、根周囲の清掃、消毒後、三次元ゲルを充填することで、歯根周囲の再生を促し、歯を保存するというものであった。1年目は、本研究の仮説を裏付けるために、実際東京歯科大学付属病院での外科的切除根尖病巣摘出標本を分析し、口腔検査学会雑誌に投稿した。同時に、犬に窩洞を形成し、実験に着手した。2年目には、実験的に形成された窩洞を感染させ、洗浄液の分析、歯髄細胞を含むコラーゲンゲルを充填し、検討した。しかし、歯周組織の再生は一部でのみ見られたものの、全周にわたるものではなかった。本研究は、根尖病巣の大きさに合う粘膜穴を介して歯槽骨に穴を開け、病巣に到達させ、そこから根の周囲を清掃、消毒し、同部には再生を促す三次元ゲルを充填することで、歯根周囲組織の再生をうながし、歯牙を保存するという新しい挑戦である。この方法は、従来のように根管治療では不可能な場合に行われている歯根端手術や抜歯と異なり、歯は歯、根尖病巣は根尖治療という2つの治療概念で歯の保存をより確実にするものである。その結果、歯は歯内療法により無菌化がなされ、根尖部は、根尖療法により無菌化再生を促すという、歯内療法的治療概念を離れた歯牙保存療法を確立するチャレンジ性がある。従来、保存学は便宜的に、修復学、歯内療法学および歯周療法学と3つに分かれていたが、実際には根尖病巣に対する治療法はこの3つの学問の中では理解しにくい分野であった。歯内療法学が、根管治療と称し、歯内から根尖部にできた病巣を治療してきたが、病巣自体が根尖の広範囲に形成されていることが多く、主根管を治療経路とする歯内療法ではその限りがあり、また、細菌などが原因であるにも関わらず、抗菌薬を貼付することなく、化学薬剤を中心に治療してきた点にも大きな医学的原因療法に齟齬が生じていることは否めない。本研究では、根尖治療学を導入することで、歯管内を清掃、消毒、根充填する歯内療法学と合わせて、歯牙を保存する提案である。すなわち、歯内は歯内の完全治療を、そして根尖治療学では、根尖の病巣を治療、再生させることで、従来の歯内療法された歯牙の保存率を確実に高めるものである。その結果、再根管治療も抜歯の率も軽減することができる。ひいては、医療費の削減にもつながり歯科医療を歯科医学に基づくものとさせるために重要な研究となる。平成26年度は、根尖病巣1590例を分析することと、実験方法の確立に時間を費やした。仮説を証明する為の研究として、1590例の根尖病巣の病態解析を行い、根管充填材や根管治療薬と考えられる異物が223例(14.0%)、標本内に細菌や真菌などの微生物塊が観察されたものは172例(10.8%)、セメント質や象牙質、感染性硬組織を認めたものは202例(12.7%)で、あった。免疫組織学的に、細菌感染がある症例では高いディフェンシンの発現がみられ、硬組織片や異物が存在する症例ではマクロファージ由来のCD68陽性細胞が顕著にみられた。Ki67陽性細胞は、微生物塊群で基底細胞、棘細胞に陽性を示した。P53陽性細胞も、微生物塊群で基底細胞および棘細胞に陽性を示した。また、歯根嚢胞の裏装上皮は高い細胞増殖能と腫瘍原性潜在能を持つことが示唆された。このことから、本実験の必要性が証明された。ビーグル犬を用いた実験では、窩洞の形成、病巣作製、歯髄細胞を含むゲル充填を行ったが、一部にセメント質および歯根膜の再生をみたものの、全体的なものではなかった。また、充填するゲルの実験として、Concentrated growthfactor(CGF)は白血球・血小板由来の成長因子を含む完全自己血由来のフィブリン生体材料の一つで、骨再生への応用が期待されている。実験として、フィブリンを有するCGFとplatelet-poor plasma gel(PPP gel)をラット血液から生成し、ラット骨髄細胞を各試料上に播種し、無血清培地を用いて培養した。In vivoでは、ラット頭蓋骨に直径3。8mmの骨欠損を作製し、CGFを移植した。CGFのフィブリンおよび可溶性因子はin vitroにおいてラット骨髄細胞の初期伸展、増殖、骨芽細胞分化を促進し、in vivoにおいてラット頭蓋骨欠損の骨治癒を促進する。今後、本実験へのゲルの応用を試みる段階に入った。

平成26年度は、本研究の仮説の根拠を裏付けるために、病理組織学的に歯根嚢胞・歯根肉芽腫と診断された症例における感染的要因の関与の占める割合を、臨床統計学的に検討感染を除去することが根尖病巣治療に重要なことが示され、本研究を行う意義づけとなった。一方で動物実験を開始するに当たり、ビーグル成犬を用い、歯牙抜髄後、根尖部に病原菌を混合感染させ、根尖病巣を作った。この確認のため組織標本を作製し、根尖病巣の形成を確認できた。しかし、26年度中に実験を進めるには至らなかった。臨床検査病理学平成26年度に根尖病巣を作ることができたので、病巣の歯牙直上に生検トレパンを用いて、粘膜穴を開け、ついで生検トレパンと同直径のラウンドバーにて病巣に穿通孔を開ける。この穿通孔は同直径のチタン円盤で封鎖する。根管から注入した洗浄液が穿通孔より流出することを確認し、1日おきに洗浄を繰り返す。洗浄液を毎回回収し、細菌検査を行い確認する。細菌の激減を確認後、三次元培養歯髄を含むゲル作製注入し、形態学的に再生を確認し、本研究が臨床的にも応用可能な、トランスレーショナルリサーチに発展させていく。。
加齢性病態を再現する孤発性アルツハイマー病モデルマウスの開発と解析

神経細胞特異的に細胞内輸送機能を低下させることで、脳の老年性(加齢性)変化を再現する孤発性アルツハイマー病モデルマウスの開発を目的とし、Tet-onシステムを用い軸索輸送モーター蛋白であるdynein特異的shRNAを神経細胞特異的に発現するマウス作成を目指した。細胞実験系ではdyneinのノックダウンに成功したが、作成したマウスの脳内でdyneinのノックダウンは確認されず、認知機能の低下も無かった。このマウスではshRNA発現量が不十分と考えられ、今後、より強力なプロモーターを用いることで、新たなアルツハイマー病モデルマウスの開発に取り組みたい。アルツハイマー病の約9割は孤発性タイプであり、遺伝子の変異によらず老化とともに発症することが大きな特徴である。これまでの研究成果により、老化に伴う細胞内輸送機能の障害がアルツハイマー病の原因因子と考えられているβアミロイド蛋白(Aβ)の蓄積を引き起こすことが明らかとなった。そこで本研究では、神経細胞特異的に細胞内輸送機能を低下させることで、脳の老年性(加齢性)変化を再現する孤発性アルツハイマー病モデルマウスの作出を目的とする。初年度である平成25年度は、神経細胞特異的にrtTA(逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子)を発現するトランスジェニックマウスを導入するとともに、軸索輸送モーター蛋白であるdyneinに対するshRNAを発現する遺伝子コンストラクトと、テトラサイクリン応答性に目的因子を発現させる遺伝子コンストラクトの作成を行った(松田、高橋)。作成したshRNA発現遺伝子コンストラクトをマウス由来神経系セルラインであるNeuro2a細胞に導入したところ、dyneinの有意なノックダウンとともに、Aβやその前駆体であるアミロイド前駆体蛋白(APP)の細胞内蓄積が確認された(木村)。このことから、今回作成したshRNA配列は効果的にマウスのdyneinをノックダウンさせることが可能である。一方、テトラサイクリン応答性に目的因子(この場合はdyneinに対するshRNA)を発現させる遺伝子コンストラクトをNeuro2a細胞に導入したところ、テトラサイクリン存在下において有意なdyneinのノックダウンを確認することができた(高橋、木村)。これらの結果から、テトラサイクリン刺激によって細胞内輸送を障害することが技術的に可能であることが証明され、この技術を応用すれば細胞内輸送障害モデルマウスの開発に繋がる可能性が示唆された。加齢に伴うエンドサイトーシス障害が、アルツハイマー病の原因蛋白質と考えられているアミロイドβ(Aβ)の蓄積のみならず、シナプス障害などの神経伝達機能障害の要因となることから、エンドサイトーシス障害が引き起こす神経細胞の機能低下を忠実に再現できる新たなアルツハイマー病モデルマウスの開発を目的とする。Tet-onシステムによりテトラサイクリン刺激応答性に軸索輸送モーター蛋白であるdynein特異的shRNAを発現する遺伝子コンストラクトについて、25年度に作成したコンストラクトは細胞実験においてテトラサイクリン非存在下においても若干の目的因子発現が確認された。そこで26年度は、テトラサイクリン非存在下でのshRNAの発現が厳密に抑制される系とするためにテトラサイクリン調節性転写サイレンサー(tTS)を共発現する遺伝子コンストラクト(tTS-tetO-hU6-dynein shRNA)を作成し、マウス受精卵に顕微注入しトランスジェニックマウスを作出し、ファウンダーマウスが4匹得られ交配により次世代への遺伝子伝達を確認し4ラインを系統化した。本マウスと、すでに導入した神経細胞特異的CaMKIIαプロモーター制御下にrtTAを発現するマウス(CaMK2a-rtTA Tgマウス)との交配により、目的のダブルトランスジェニックマウスの作成を開始した。作出したダブルトランスジェニックマウスに、ドキシサイクリンを継続投与することで、神経細胞特異的にdyneinの発現が抑制され、エンドサイトーシス障害による神経伝達機能低下が引きおこされ、認知機能低下を示す新規のアルツハイマー病モデルマウスとなることが期待される。神経細胞特異的に細胞内輸送機能を低下させることで、脳の老年性(加齢性)変化を再現する孤発性アルツハイマー病モデルマウスの作出を目的とした。Tet-onシステムによりテトラサイクリン刺激応答性に軸索輸送モーター蛋白であるdynein特異的shRNAを神経細胞特異的に発現するマウスの作成として、tTS-tetO-hU6-dynein shRNA Tg(トランスジェニック)マウス4ラインと、CaMK2a-rtTATgマウスとの交配を行い、目的のダブルTgマウス3ラインを得た。これらのマウスに4週間ドキシサイクリンを継続投与し、神経細胞特異的にdyneinの発現が抑制され、エンドサイトーシス障害による神経伝達機能低下が引きおこされ、アルツハイマー病モデルマウスとなるかどうかを検討した。Y迷路を用いた行動学的解析の結果、残念ながら新規作成マウスではいずれのラインにおいても明確な認知機能低下が確認されなかった。各マウスを安楽殺解剖して海馬組織を取り出し、蛋白質を抽出してwestern blot法による検索を行ったところ、いずれのラインにおいても明確なdyneinの発現抑制効果が確認されなかった。昨年度までの成果により、今回のマウス作成に用いた遺伝子コンストラクトは全て、in vitro実験系においては有意なdyneinのノックダウンが認められている。このことから、今回作成したマウスの脳内でdyneinのノックダウンが確認されなかったのは、発現させたshRNA

配列に問題があるというよりもむしろ、十分なshRNA発現量が得られなかったことに起因すると考えられる。今後は、より強力に下流の遺伝子を発現させるプロモーターを用いた改良型遺伝子コンストラクトを作成し、新たなアルツハイマー病モデルマウスの開発に取り組みたい。神経細胞特異的に細胞内輸送機能を低下させることで、脳の老年性(加齢性)変化を再現する孤発性アルツハイマー病モデルマウスの開発を目的とし、Tet-onシステムを用い軸索輸送モーター蛋白であるdynein特異的shRNAを神経細胞特異的に発現するマウス作成を目指した。細胞実験系ではdyneinのノックダウンに成功したが、作成したマウスの脳内でdyneinのノックダウンは確認されず、認知機能の低下も無かった。このマウスではshRNA発現量が不十分と考えられ、今後、より強力なプロモーターを用いることで、新たなアルツハイマー病モデルマウスの開発に取り組みたい。トランスジーン・コンストラクトの改良を行い、shRNAの発現が厳密に制御される系を構築し、新規トランスジェニックマウスを複数系統作成し、目的とするダブルトランスジェニックマウスの作成を開始することが出来、ほぼ当初の計画通りに達成できている。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験動物学目的のダブルトランスジェニックマウスを複数系統、樹立し、皮膚組織や胎仔を用いて線維芽細胞の初代培養を行い遺伝子発現、蛋白発現などを確認し、最適なマウス系統を選抜する。作出した新規アルツハイマー病モデルマウスにドキシサイクリンを継続投与し、Y迷路試験や水迷路試験等の行動学的検索法を用いて認知機能を評価するとともに、脳組織の生化学的病理学的検索を行い、神経細胞の変性やエンドサイトーシス障害の有無、Aβの蓄積量等を検索して、アルツハイマー病の加齢性病態が再現されていることを詳細に解析する。ほぼ当初の計画通りに達成できている。次年度(平成26年度)は作成した遺伝子コンストラクトを受精卵に導入し、実際に産仔を得ることを目標とする。今回作成したテトラサイクリン応答性遺伝子コンストラクトは、テトラサイクリン非存在下においても若干の目的因子発現が確認された。そこで、テトラサイクリン非存在下ではテトラサイクリン応答因子の発現を抑制する新たな遺伝子コンストラクトを作成し、両者を同時に遺伝子導入することでより厳密に遺伝子発現をコントロールする方法を検討している。本研究において、新規アルツハイマー病モデルマウスを作成するため、25年度に神経細胞特異的にrtTA(逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子)を発現するトランスジェニックマウスを導入済みであり、このマウスを計画的に増産するため、体外受精を行う予定で、体外受精用培地等を年度末に購入予定であったが、業者による納入が年度内に間に合わなかった。従って、培地等の購入費として予定していた額が次年度使用額として生じた。
Lp (a)の急性相反応物質としての役割及び血管内皮・平滑筋細胞への作用について

リポ蛋白(a) [Lp (a) ]が急性侵襲後に急性相反応による一過性の上昇を認めることは当教室から世界に先駆けて報告されたことであるが、多くの追試によって現在では広く認められてきている。しかし、この変動の意義については全く不明であったので、この点を明らかにする目的で本研究を行なった。創傷組織において抗アポ(a)抗体に反応するものの蓄積を認めることより、種々の由来及び段階の炎症組織を用いて、免疫組織化学的検討により、次のごとき結果を得た。炎症初期においては、フィブリノーゲンやプラスミノーゲンの染色性が強く、アポ(a)やアポBはごく僅かであったが、次の肉芽組織生成期に入ると、アポ(a)の染色性が著増し、且つ肉芽組織の表面に近い部分に層状形成を認めた。次いで組織再生が進むとこの抗アポ(a)反応性は減退し、上皮形成期になると、全く消失することが判明した。さらに、このアポ(a)染色部位とアポB染色部位とは一致することより、Lp (a)リポ蛋白として存在することが示唆された。また、小血管壁の染色像より、これが血液に由来することも明らかになった。次に、培養血管内皮細胞を用いて、Lp (a)が内皮細胞の遊走・増殖を濃度依存性及び時間依存性に促進させることを確認し、この機序としては、一部はbFGFのオートクライン作用を介するものであることを証明した。さらに、LDLやHDLについても同様に検討し、これらのリポ蛋白による血管内皮細胞の遊走・増殖促進活性の強弱を比較した。これらのデータより、損傷組織の修復機序に血清Lp (a)が関与し、とくに血管新生促進作用を有することが初めて明らかにされた。今後、アポ(a)イソ型の違いによるこの作用に及ぼす影響の相違についても検討することが必要と考えている。リポ蛋白(a)[Lp(a)]が急性侵襲後に反応し、急性相反応を示して一過性の上昇を認めることは当教室から最初に報告し、最近は多くの研究者による追試から世界的に認められるようになってきている。このように現象としては認められるものの、その意義に関しては現在のところ全く不明である。我々は創傷組織において抗アポ(a)抗体に反応するものを認め、今回は種々の由来及び段階の炎症組織において、免疫組織化学的検討を試みた。炎症初期においては、フィブリノーゲンやプラスミノーゲンの染色性が強く、アポ(a)やアポBはごく僅かであったが、次の時期、すなわち肉芽組織生成期に入ると、アポ(a)の染色性が著増し、且つ肉芽組織の表面に近い部分に層状形成を認める。さらに、このアポ(a)染色部位とアポB染色部位とは一致することより、Lp(a)リポ蛋白として存在することが示唆された。また、小血管壁の染色像より、これが血液に由来することも明らかとなった。このように損傷組織の修復機序に血清Lp(a)が何らかの役割を担っていることが推測された(Atherosclerosis、投稿中)。一方、上記のごとき組織修復の際に認められる血管新生機序に関連して、培養血管内皮細胞に対するLp(a)及びLDLとHDLの影響をin vitro実験系で検討しつつあり、若干のデータが得られているが、この結果については来年度の報告に譲る。

上記2点に関して、アポ(a)イソ型の違いによる影響の相違についても検討しつつあり、この点についても来年度には報告できるものと思う。リポ蛋白(a)〔Lp(a)〕が心筋梗塞や外科手術などの急性侵襲後に急性相反応による一過性の上昇を認めることは当教室から最初に報告されたことであるが、その後多くの追試によって現在では世界的に認められるようになってきている。しかし、この現象の意義に関しては全く不明であるので、この解明のために本研究は企画され、実施されたものである。昨年度は免疫組織化学的研究によって、創傷組織において抗アポ(a)抗体によって染色されるものの蓄積を認め、、且つフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、プロテオグリカン、PCNAなどとの関連性を検討し、さらに種々の創傷治癒過程の組織を用いた染色像から、Lp(a)が損傷組織の修復機序に関与することを報告した。本年度は上記の生理的機能に関する検討の延長として、培養血管内皮細胞を用いたin vitroの実験において、Lp(a)が内皮細胞の遊走及び増殖を濃度依存性及び時間依存性に促進させることを確認した。その機序としては、一部はbFGFのオートクライン作用を介するものであることを証明した。さらに、LDLとHDLもともに検討し、これらのリポ蛋白による血管内皮細胞の遊走・増殖促進活性の強弱を比較し、これらのリポ蛋白の促進作用の機序も同様に検討し、Lp(a)のそれと比較した。これらのデータよりLp(a)は血管新生促進作用を有することが明らかとなり、上記の損傷組織の修復機序への関与の裏付けとなるものである。なお、血管中膜平滑筋細胞に対するLp(a)の影響については、若干のデータは得られているが、現在なお検討中である。
介護職養成における看護職の関与のあり方と看護・介護労働の変容に関する日英比較研究

本研究では、英国側調査として、まずは、NVQ養成の担当者と受講生、NVQから大学の看護師養成課程に進学する機会を得たNVQ経験のある学生を対象に、NVQ養成をどのように評価しているかについてのインタビュー調査を実施した。次に、NVQ養成担当者とHCA/NVQの双方を対象に、HCA/NVQの教育内容とシステム、教育の成果に対する評価、看護師とHCA/NVQとの協働の状況、業務項目ごとのHCA/NVQのCompetencyレベルの評価と将来的に期待するレベルについても尋ねた。一方、日本側調査では、介護職員の多数配置されている介護老人保健施設において、介護職員の教育研修ならびに業務について、看護職員と介護職員との双方に現状とあり方を尋ねるインタビュー調査と質問紙調査を実施した。日英双方における調査結果の比較から、英国においては、日本以上に(1)介護職員自身が教育担当者として自立していること、(2)看護職者の業務は薬剤管理やマネジメントが中心であるため、介護職は看護職との業務分担についてのジレンマが少ないこと、(3)ただし、それゆえに待遇面で不満が大きいことなどが確認された。他方、日本においては、英国と比べて、看護職との業務区分があいまいなままに、介護職の業務範囲が拡大し、かつ施設間格差も大きいこと、(2)介護職の養成制度が複雑で、教育研修が標準化されていないこと、(3)介護職員養成への看護職の関与が不十分であることなどが確認された。英国においては、2000年10月より看護補助者の上級資格(NVQ Level3)所持者の大学の看護婦養成コースへの入学が認可された。本研究(平成14年度)においてはこの実態把握のために、第一に、供給源であるNVQ養成サイドから、(1)NVQ(主としてLevel3)の養成コースの実態、(2)NVQ所持者の看護婦養成コースへの進学志望状況を、1)病院で実施されるNVQ養成コースと、2)民間教育機関における学卒者向けNVQ養成コースの2ヶ所での見学とヒアリングによって把握した。この結果、現在のNVQコース受講生は学力・経歴等非常に多彩であり、その進学可能性も個々人によって非常に幅があるが、多くのNVQが進学を希望していること、またその動機は、主として「より高い専門性の獲得」による「より根拠のあるケア提供ができる」「仕事に自身が持てる」「給与条件が良くなる」といった職務満足の追求によるものであることが判明した。また、NVQ養成は、実施機関が病院施設内・外部教育機関のいずれにおいても、国側の規定・「Care Standard Act」に基づき、方式や達成目標が厳密に定められ、非常に標準化された内容で実施されていた。第二に、看護学部を有する大学において、受け容れ側の看護婦養成コースでの教員、学生(NVQ資格を所持する看護学生)へのヒアリングを実施した。その結果、制度スタート時点の現在は、殆どのNVQ学生は意欲・動機付けの面で肯定的に評価され、これら学生のNVQ経験は、英国看護教育でもかなりの部分を占めるPlacement Study(臨地実習)において生かされ、臨床指導者側の評価も高いことが判明した。しかし一方、多様な年齢・社会人入学者を受け容れている英国の看護系大学においては、とりわけNVQ学生が特別視されることもなく、学生自身もごく自然に学生生活になじんでいた。14年度は、前年度に引き続き、英国における介護職員養成制度(NVS/SVQ)の変化について追跡し、介護職から看護職への移行教育志願者の動向について、関係者へのインタヴュー、資料収集を併せて継続して把握した。英国のNVQには制度発足当初から2種類のレベル(Level2/3)が設定されたが、現在、国のあらゆる職種に関する"技術査定委員会"が5年に1度のSkills Standardの見直し作業に入り、NVQのレベルについて、下位レベルであるLevel2の存続についての見直しや、NVQの業務範囲の拡大と明確化について検討を開始した。また、そこでは、今後さらに上位のLevel4を、看護職との役割区分の問題も含めて設けるのか否かという議論もいよいよ本格的に開始される。

一方、NVQ(Level3)の看護大学への進学者も制度開始2年目となる今年はますます増加し、2月の英国看護協会看護教育カンファレンスにおいては13年度より以上に14年度の今年は、NVQ経験のある看護系大学生の学習に関する研究/実践報告が増加した。英国側質問紙調査については、研究協力者のLes Storey氏および英国看護協会担当役員らとともに調査計画書、質問内容などを詳細に検討し10月には最終版の質問紙を完成させた。調査は、看護職指導者向け、NVQ向けの2種類を作成し、内容には、基本的属性、現在の職務と研修の実態、満足度などについて概要を尋ね、看護職と介護職の業務分担のあり方については、Les氏作成のCompetency概念に基づく詳細な質問項目を準備した。なお、今回は調査対象が主として国立病院(NHS)での調査となるため、質問紙完成後の当局の倫理審査に時間を要し、年度末ぎりぎりでの印刷・郵送となってしまったため、データの集計と報告書作成は来年度に行うこととする。最終年度にあたる15年度は、(1)14年度に実施した調査の集計・分析、(2)英国において現在進められている医療関連職種全体の業務範囲の見直し、(3)看護系大学におけるNVQ出身学生の実態について、の3点を中心に研究を進めた。(1)では、NVQおよびNVQ教育担当者を対象とした質問紙調査結果をとりまとめた。英国看護協会が主催する関連学会等に参加した各500名のNVQ/HCAと教育担当者に調査票を配布、返却は郵送法とし、それぞれ123名・44名から回答を得た。調査結果では、教育研修方法の多様性、受講生・教育担当者双方の評価と期待、今後の改善点などが明らかになった。NVQの現在の実践能力(competency)と将来的に望まれるレベルについて尋ねた結果では、NVQ教育担当者いずれの回答も傾向は似ており、特に日常生活援助に関する評価が高かった。(2)については、現在英国の「技術査定委員会」が実施している実践能力評価にもとづくSkills Standardの作成作業の一例として、経管栄養を受ける患者をめぐる各職種(RN.HCAおよびSpeech Therapist)の能力評価のための調査に同行し、その調査方法、内容について把握した。なお、これらが実際の業務範囲決定にどのように反映されるかについては調査継続中である。(3)では、看護系大学進学後のNVQ出身学生について、主として実習教育を中心に、現地でのヒアリングや見学を通じて把握した。NVQ出身学生は、「ケア対象者のholisticな理解」を、看護教育による新たなかつ重要な学びであると感じており、他方、実習指導者の評価では、NVQ、一般入学学生の間に特に目立った相違はみられなかった。以上については、成果報告書において、日本における介護職員教育・制度との比較において分析しとりまとめる。
ミオシン頭部の立体構造変化の研究

(1)ミオシン頭部の構造変化。回転シャドウイング法により電子顕微鏡で種々の条件下のミオシンを観察した結果、ミオシン頭部に2種類の形があり、条件によってその割合が変化することを見いだした。どの条件下でも、ミオシン頭部にはまっすぐなものと、頭部の中央部分で折れ曲がっているものとが観察された。この事は、単方向シャドウィング法(試料を回転させずに白金カ-ボンを一方向からのみ蒸着する方法。影の長さから、高さ方向の情報を知ることが出来る。)によっても確認された。折れ曲がりの位置は、ミオシン頭部のドメイン構造の環境にちょうど一致しており、電顕像からの3次元再構成像や結晶の電顕像とも一致している。ADPとバナジン酸、あるいはADP存在下では、折れ曲がったものが増加した。全ての条件下で、折れ曲がりの形状には変化がみられなかった。この知見を下に、ミオシン頭部は少なくとも2つの形状の平衝状態にあり、ATPやアクチンとの相互作用により平衝がずれるという考えを、作業仮説として提案している。(2)時間分解能クライオ電子顕微鏡法の開発。ケイニドATP等のケイジド化合物を、Nd・YAGレ-ザ-からの355nmのパルス光で照射することにより反応を開始し、急速凍結することにより反応を停止する事を基本原理としている。時間分解能を持たせる為に、落下中の試料の位置を光センサ-により検出し、一定時間後に(この時間は可変である)レ-ザ-光を発振させる。凍結時間は、熱電対の熱起電力の変化から決定する。これらの制御および情報処理は、A/D変換ボ-ドを装備したパ-ソナル・コンピュ-タ-で行っている。当方法により、アクチン・ミオシン系のATPとの相互作用による構造変化を、生のまま直接観察することが可能なった。
地域の水環境保全と利水との関連-とくに広域水道からの用水導入に伴う水環境の変化について-

水道広域化政策に促されて、(1)市町村水道の水道用水供給事業=広域水道への依存が強まるのと引き換えに各市町村在来の自己水源への依存度が低下しているのではないか、(2)それに伴い後者への環境監視が弱まって地域の水環境が悪化するのではないか、というのが本研究の問題意識である。上記(1)に関しては『水道統計』の分析によって、とくに1984年以降、水道用水供給事業の施設能力が急速かつ継続的に増大し、以後1991年度までに150の自治体が新たに広域水道に加入しているが、このなかの少なからぬものが従来の自己水源を全廃したり、著しく縮小していることが分かった。そのなかで、深井戸を除く自己水源からの取水量減少の目立つ市町村やその同一流域内の自治体(山形県天童市・村山市・寒河江市・大江町、茨城県東村、新潟県柿崎町、滋賀県水口町、滋賀県吉川町、島根県大田市・邑智町、愛媛県吉田町、佐賀県佐賀東部水道企業団の給水地域)を訪問して、上記(2)に関わる調査(水道当局や廃止水源の現地での住民からの聞き取り)を行った。その結果、概して言えば、広域水道からの用水導入は当核市町村の内発的要求によるよりも県当局の慫慂によるところが少ないこと、自己水源からの取水を減らしてもその停止に至らない限りは水質検査等の管理を行わねばならず、その点で環境悪化にブレーキがかかること、取水を停止した水源については管理を行わなくなっているので当局としては水質等の変化を把握していないが、付近の住民の間では「悪化」と認識されている場合がかなり多いこと、などが分かった。この経験に基づいて広域水道の用水を導入した682自治体を対象とするアンケート調査を行い、417自治体から回答を得て、上記の諸点を一般的なものとみなしうることを確認した。本年度の調査によって、近年、ゴルフ場や産業廃棄物最終処分場の増加に伴い、これらによる水環境の悪化をおそれ、水道水源保護条例を制定する市町村が増えていることが分かった。一方、『水道統計』などの資料による分析によっても、水道用水供給事業への依存を強め、それと引き替えに地域在来の自己水源を放棄する市町村が、最近、加速度的に増えている。このことは、上記と同様の原因による地域の水環境悪化のおそれがあっても、このような条例制定などによる環境保全努力を促迫する動機の微弱な市町村が、そういう努力をしている市町村よりも、はるかに急速に増えているのではないか、という推測を生ぜしめる。実際、本年度に訪れた広域水道導入市町村(山形県天童市、同県大江町、茨城県東村、滋賀県水口町)では、いずれも、かつての自己水源に関わる環境保全努力を全く行っていない。尤もこれらの市町村に限って言えば、放棄した自己水源に関して、それを水道水源として利用していた当時にも、特段の環境保全努力をしていたわけではないから、その放棄が水環境悪化の要因になったと断定することはできない。しかし、放棄以前は行っていた水質調査を放棄以後は行わなくなっているから、管理が弱まったことは事実である。また東村では上述の問題意識とは逆に、在来水源の著しい汚染が、広域水道導入の最大の理由となっていた。市町村水道が「近い水」=近在の自己水源に依存する限りその水源は真剣な環境保全努力の対象となるのに対して、市町村水道が水道用水供給事業=広域水道=「遠い水」への依存を強めるにつれて「近い水」に対する環境保全努力は弱まり、地域の水環境破壊が進むのではないか、というのが本研究の問題意識である。

水道統計のデータを整理してみると、水道用水供給事業の施設能力は、とくに1984年以降、急速かつ断続的に増大し、以後、全国で150の事業体(その殆どが市町村)が新たに広域水道に依存するようになっているが、このなかの少なからぬものが従来の自己水源を全廃したり、そこからの取水量を大幅に減らしていることが分かる(詳しくは森瀧「水需給と河川環境」『地理科学』49-3 1994年7月を参照のこと)。なぜ自己水源を放棄してまで広域水源に依存するのか。現地(本年度は山形県村山市・寒河江市、佐賀県諸富町・佐賀市、新潟県柿崎町、兵庫県吉川町)での聞き取りによれば、広域水道への加入は当該市町村の要求に基づくよりも、県当局の慫慂によるところが大きい。ゴルフ場や産業廃棄物処分場の増加による水環境の悪化の脅威に対応して水道水源保護条例を制定する市町村が増え、それを受けて国レベルでも1994年2月いわゆる水道水源2法が成立したが、市町村水道の自己水源がこのように放棄されていくなら、折角のこれらの条例や法律も、その汚染に対する抑止力を発揮しえないことになる。現に訪問した市町(いずれも広域水道への依存度が高い)では、このような条例制定の動きが全くみられなかった。放棄された自己水源について条例以外の方法による環境保全の努力も全く払われていない。ただ今のところ、自己水源として利用していた時期と比べて、そこの水質環境が実際に悪化したかどうかについては、明らかにしえなかった。1980年代半ば頃から、市町村水道の水道用水供給事業(広域水道)への依存が強まり、これと引換えに、各市町村在来の自己水源への依存度が低下し、それに伴って後者への環境監視が弱まって、地域の水環境が悪化するのでないかというのが、本研究のもともとの問題意識である。加えて昨年度(1994年度)はまれにみる渇水年となり、その地域的態様と広域水道との関係についても若干の検討を行なった。本年度は、研究の締め括りの意味もあって、全国の、多少とも水道用水供給事業に依存するすべての水道事業体(約700)を対象とするアンケート調査を実施した。400余の水道事業体から回答が寄せられた。その詳しい分析結果は報告書で述べるが、広域水道の用水を導入した契機・理由として、県庁等の推奨による、とした回答が多くみられたことが特徴的である。これは、少なからぬ市町村が広域水道に加入後、自己水源からの取水量を減らしていることの有力な説明となるであろう。次に注目されるのは、広域水道に加入後も利用している自己水源に関しては、これというほどの水質の変化がみられない、という回答が多かったことである。これは、取水量を減らした水源に関しても同様であった。このことは、取水量を減らしても、水道事業体としては、僅かにせよその水源を利用しているかぎり、水質検査等の管理を行なうことを義務付けられていることによるものであろう。完全に取水を停止した水源については、その後の水質の変化は不明、とする回答が多く、アンケートの結果だけによって、上記の仮説を立証することは困難である。しかし、廃止後の水源地点の河川環境が悪化する傾向のあることは、現地調査(本年度は愛媛県吉田町など)によってもほぼ明らかである。