hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大規模高速地すべりの発生・運動予測法の開発

2)阪神大震災で発生した仁川地すべりの繰り返し載荷リングせん断試験を実施した結果、地震力により土が破壊すると土粒子構造の破壊、粒子破砕により、せん断面付近のみで液状化が起こり(「すべり面液状化」)急激にせん断強度が低下することにより高速地すべりが発生することがわかった。3)東京において長崎県・雲仙眉山地すべりの高速運動について討議を行い、資料収集を行った。4)9月にカナダ、英国、ニュージーランド、米国、イタリアの共同研究者が京都大学に集まり、約2週間の集中討論により、実用的な地すべり発生・運動予測法をまとめるための出版予定等を立てることが出来た。5)佐々、福岡は10月に大規模地すべりの発生が懸念されている中国西安市・華清池地すべりの現地調査および観測計器の設置を行った。また、観測結果の資料を収集し、現地観測所と共同で解析を行い、西安地質学院で同地すべりの予知予測についての検討会を開き討論を行った。6)佐々・福岡は徳島県善徳地すべり地と長崎県・北松地すべり地帯において現地踏査と資料収集を行った。7)日浦は大規模高速地すべりの発生が懸念されている中国西安市・華清池地すべりを現地観測所と共同で調査し、観測結果について合同で検討した。平成8年度1)福岡は6月にノルウェー理工大学等を訪問し、ノルウェー西海岸の大規模岩盤地すべりの現地調査を行った。ノルウェーではフィヨルド沿いに岩盤地すべりが発生しており、崩壊した岩盤がフィヨルドに落ち津波を引き起こすために、直下だけでなく広範囲に被害が及んでいるが、これら岩盤地すべりの資料等を収集した。2)佐々、福岡は平成8年12月の長野県小谷村の土石流災害現場を調査し、上流で発生した地すべり土塊が渓床堆積物の上に落ち非排水載荷したために流動化し土石流が発生したと考え、現場付近の沢で土石流発生地点と同種の土試料を採取し持ち帰った。京都大学においてリングせん断試験機により非排水載荷試験を行ったところ、すべり面液状化が発生しせん断強度が急激に減少して高速せん断が開始することを見出し、小谷村土石流が発生する過程を実験的に証明することが出来た。さらに高速せん断する過程で、「すべり面液状化」から「液状化」に移行しているらしいこともわかった。3)本科学研究費補助金による研究成果について佐々は米国地質調査所で開かれた国際地質科学ユニオンの会議において、福岡は中国・驪山地すべり防止観測所において発表を行った。1)平成6年7月24日から8月7日の間に、佐々が委員長として進めているユネスコと地すべり関連の3国際学会合同の高速地すべり運動予測委員会(WG/RLM)を京都大学で開催し、大規模高速地すべり運動予測法について共同研究を実施した。カナダ側の共同研究者はカナダ政府の「Pacific 2000 fund」の経費で来日し、本科学研究費よりProf.T.Davies(New Zealand),Prof.J.N.Hutchinson(英国)の2名の招聘旅費を負担した。この他にDr.R.K.Bhandari(国連人間居住センター顧問)、中国科学院成都山地災害及び環境研究所の李天地教授(中国)他が参加した。この期間に京都大学防災研究所において日本の共同研究者とともに高速地すべり発生・運動予測法についての各分野、各地域での研究のレビューと議論を行うとともに8月1-3日には9名で大規模な高速地すべりが懸念されている長崎県雲仙七面山の合同調査を実施した。また、この研究会の特別セッションの資料として中国西安市華清池での地すべり予測の共同研究の結果をA4版251頁(一部カラー)にまとめて出版した。
自己免疫性肝炎診断のための抗ヒトP450自己抗体測定法の開発に関する研究

抗肝腎ミクロソーム抗体1(LKM1)の抗原であるチトクロームP-450IID6のより特異的で高感度な自己抗体測定法の開発において平成9年度に引き続き、Radioligand assayによる測定法の開発も試みた。プラスミドに組み込んだヒトトトクロームP-450IID6を大量に調整し、T7ファージのRNAポリメラーゼと網状赤血球抽出液からの蛋白翻訳系をつかって細胞胞下で^<35>S-メチオニンでラベルを入れたチトクロームP-450IID6を合成する。これを検体と液相で反応させ、できた抗原抗体複合体を分離し、放射活性で測定する方法である。この方法は得られる蛋白量の少ないのが欠点であるが、高次構造を保ちうることと得られる蛋白のほとんどすべてがP-450IID6由来でありるため非特異反応が少ないことが期待される。この方法で自己免疫性肝炎(AIHスコアが10以上)28例、B型慢性肝炎25例、C型慢性肝炎24例、他の全身性自己免疫疾患(慢性関節リウマチ、SLE、MCTD、SSc)27例、健常者50例について血清中の抗P450自己抗体を測定した。強陽性例の値を内部標準としたインデックスで値を表現することとし、健常群の測定値からカットオフ値を2.3と設定した。このとき自己免疫性肝炎中の15例が陽性(2例強陽性、13例弱陽性)であった。測定値はAIHスコアとは相関がなかった。他にC肝の5例(強陽性2、弱陽性3)、B肝-弱陽性3、全身性自己免疫疾患で弱陽性8であった。弱陽性例では考えられなかった。しかしながら、健常者の測定値とは明らかに分布が異なっており、この非特異反応がいかなる意味を持つのかについて今後の検討を要すると考えられた。抗肝腎ミクロソーム抗体1(LKM1)の抗原であるチトクロームP-450 IID6のより特異的で高感度な自己抗体測定法の開発により、典型的症候をあらわさないため診断されない軽症例の診断に役立つか、臨床的意義を評価することを目的として研究を始めた。まず、ヒトレコンビナントチトクロームP-450 IID6を抗原としたELISAによる自己抗体測定系の設定を試みた。ELISAの構成を通常の抗原固相に2次抗体を用いる方法、抗原サンドイッチによる方法を試みたが、非特異結合によるバックグラウンドがあまり低くならず、また蛍光抗体法で陽性の検体が陽性にでないことがあり、抗原固相による蛋白の高次構造の変化のためと考えられた。このため、当初の予定を変更して、より高次構造を保ちうる方法としてRadioligand assayを試みることにした。プラスミドに組み込んだヒトチトクロームP-450 IID6を大量に調整し、T7ファージのRNAポリメラーゼと網状赤血球抽出液からの蛋白翻訳系をつかって無細胞下で^<35>S-メチオニンでラベルを入れたチトクロームP-450 IID6を合成する。この方法は得られる蛋白量の少ないのが欠点であるが、高次構造を保ちうることと得られる蛋白のほとんどすべてがP-450 IID6由来でありるため非特異反応が少ないことが期待される。現在はこの方法で測定系を構成して、試験的に少数検体を測定できる段階にあるが、蛍光抗体法で陽性の検体が確実に陽性にでるばかりでなく、ANA、抗平滑筋抗体陽性でI型の自己免疫細肝炎に分類される患者検体の一部でP-450 IID6抗体が陽性にでており今後さらに検討する予定である。
複数機水中グライダーの同時展開による海洋環境モニタリングに関する研究

本研究では,(1)マルチエージェントモデルの構築, (2)グライダー型群知能海中ロボットの構築,(3)群知能海中ロボットシステムの実証,の3点について検討を行った。水中グライダーのハードウェアと制御ソフトウェアの整備を行い,水槽試験および実海域試験によって潜航性能を明らかにした。複数機の水中グライダーの運用を支援するための自律型洋上ビークルを開発した。海中音響観測システムを設計・開発して,実海域試験で海棲哺乳類の生態行動をモニタリングできることを明らかにするとともに,船舶のスクリューなどの雑音を低減する手法を提案した。本研究の最終目標は,約千機の自律型水中グライダーが非同期的なコミュニケーションを図りながら観測海域の相互補間を行うことによって長期間・広範囲に亘る3次元多点同時観測を可能とする「グライダー型群知能海中ロボットシステム」を構築し,全地球規模での海洋環境生態系のモニタリングを実現することである。本研究では,主翼独立制御型水中グライダーSOARERとソーラー水中グライダーTonai60を用いて,「群知能海中ロボットシステム」の実現に向けた制御アルゴリズムの確立と具体的な運用手法の検討を行う。初年度は,Tonai60のハードウェアと制御ソフトウェアの整備に努めた。制御アルゴリズムの検証のため,神戸大学海事科学部附属練習船「深江丸」の協力を得て,徳島沖で潜航試験を行った(7月)。無線LANの通信機材の改良と浮力部材の設計・製作を行い,九州大学応用力学研究所の深海機器力学実験水槽での水槽試験(9月)を実施し,グライディング性能を調べた。さらに,鹿児島大学水産学部附属練習船「南星丸」の協力を得て,鹿児島湾での実海域試験(12月)を行った。SSBL位置検出装置によって得られた海中での挙動を詳しく解析した結果,水槽試験での映像の解析によるグライディング性能(潜航角度や速度)と良く一致していることが明らかとなった。また,GPSと3軸デジタルコンパスを内蔵した4ch海中音響観測システムを設計・開発して,和歌山県太地町立くじらの博物館での運用試験と米国・アラスカ州・プリンスウィリアム湾での実海域試験を行い,シャチの鳴音から音源方向を精度良く推定できることを示した。本システムの最大潜航深度は400mなので,自律型水中グライダーに搭載することで鯨類など海棲哺乳類の生態系をモニタリングすることが可能になる。さらに,複数機の水中グライダーの運用を援助するための自律型洋上ステーションの概念設計を行った。2年目は,複数機の水中グライダーの運用を援助するための自律型ソーラー洋上ビークルの設計・製作と試験航行を行った。遠隔操縦モードと自律型航行モードでの運用が可能で,現在,自律制御の改良を進めているところである。また,広範囲における長期間の運用を実現するために,自然エネルギーを最大限活用する推進方式として,海洋における密度躍層を形成する密度差を利用した密度差エンジンの水中グライダーを考案,検討して予備実験を試みた。さらに,複数機の水中グライダーの運用事例を想定して,海中音響観測システム(GPSと3軸デジタルコンパスを内蔵した4ch海中音響観測システム4ch-UPAMSと2ch海中音響観測システム2ch-UPAMS)を組み合わせて,和歌山県・太地町の森浦湾内の生け簀(8月;マダライルカ)および東京都・小笠原諸島海域(9月;マッコウクジラ)で,鯨類の海中での行動を推定し生態を明らかにするための実験を行った。その結果,海中での3次元的な運動を推定することが可能であることを明らかにするとともに,船舶のスクリューなどの雑音を軽減する手法を提案した。交付申請時の研究計画では,以下の項目を行うことになっていた。(1)マルチエージェントモデルの構築〔制御アルゴリズムの構築と検証〕:本研究では,将来的には約千機もの自律型水中グライダーで構成される群知能海中ロボットシステムの運用を目指していることから,非同期的なコミュニケーション手段として「黒板モデル」の実現を目指す。(2)グライダー型群知能海中ロボットの構築〔ハードウェアの整備〕:主翼独立制御型水中グライダーSOARERとソーラー水中グライダーTonai60に搭載されている制御用ハードウェアは異なるため,自律協調制御のためのハードウェアの整備が不可欠である。また,今回新しく導入するSSBL位置検出装置を用いた海中ロボットの位置の同定および制御機構へのフィードバックについて検討を始める。当初は,母船または水槽の曳航台車での運用から始め,自律型洋上ステーションへの装備を検討する。この計画に対して,2年目は,複数機の水中グライダーを組み合わせて「群知能海中ロボットシステム」を実現するために,自律型ソーラー洋上ビークルを設計・製作して,平水中での航行試験を繰り返している。この機体では,水中グライダーと同様に無線LANによる遠隔操縦を行うこともでき,複数機の水中グライダーの運用をより具体的にシミュレーションすることが可能となった。また,最大潜航深度1,500mのSSBL位置検出装置を導入したことによって,主翼独立制御型水中グライダーSOARERの位置や挙動,潜航性能を正しく推定,理解することができるようになり,今後の潜航試験に大いに役立てられるようになった。以上より,当初の計画に対してほぼ順調に進展していると判断することができる。

本研究の最終目標は,約千機の自律型水中グライダーが非同期的なコミュニケーションを図りながら観測海域の相互補間を行うことによって長期間・広範囲に亘る3次元多点同時観測を可能とする「グライダー型群知能海中ロボットシステム」を構築し,全地球規模での海洋環境生態系のモニタリングを実現することである。本研究では,主翼独立制御型水中グライダーSOARERとソーラー水中グライダーTonai60を用いて,「群知能海中ロボットシステム」の実現に向けた制御アルゴリズムの確立と具体的な運用手法の検討を行う。最終年度は,複数機の水中グライダーの運用を援助するための自律型ソーラー洋上ビークルの制御系の改良と試験航行を行った。遠隔操縦モードと自律型航行モードでの運用が可能で,今後,自律制御の高度知能化のための改良を進めていく。また,複数機の水中グライダーの運用事例を想定して,海中音響観測システム(GPSと3軸デジタルコンパスを内蔵した4ch海中音響観測システム4ch-UPAMSと2ch海中音響観測システム2ch-UPAMS)を組み合わせて,鯨類の海中での生態行動を推定するための手法の検討を行った。米国・アラスカ州プリンスウィリアム湾およびノルウェー・トロムソ沖におけるシャチやザトウクジラの生態を調査し,高速旅客船と海棲哺乳類との衝突事故の軽減に向けた検討を行った。北海道・羅臼沖での調査結果から宇宙機(人工衛星)による海洋環境データと水産資源データを組み合わせて,海棲哺乳類の生態を推定評価する手法の妥当性,有効性を確認した。本研究では,(1)マルチエージェントモデルの構築, (2)グライダー型群知能海中ロボットの構築,(3)群知能海中ロボットシステムの実証,の3点について検討を行った。水中グライダーのハードウェアと制御ソフトウェアの整備を行い,水槽試験および実海域試験によって潜航性能を明らかにした。複数機の水中グライダーの運用を支援するための自律型洋上ビークルを開発した。海中音響観測システムを設計・開発して,実海域試験で海棲哺乳類の生態行動をモニタリングできることを明らかにするとともに,船舶のスクリューなどの雑音を低減する手法を提案した。交付申請時の研究計画では,以下の項目を行うことになっていた。(1)マルチエージェントモデルの構築〔制御アルゴリズムの構築と検証〕:本研究では,将来的には約千機もの自律型水中グライダーで構成される群知能海中ロボットシステムの運用を目指していることから,非同期的なコミュニケーション手段として「黒板モデル」の実現を目指す。(2)グライダー型群知能海中ロボットの構築〔ハードウェアの整備〕:主翼独立制御型水中グライダーSOARERとソーラー
外来看護における高齢者虐待徴候発見と対応のためのプロトコール開発

2019年度は、今まで行ってきた外来看護師及びエキスパートナースへのインタビュー調査、医療ソーシャルワーカー、退院調整看護師、地域包括支援センター職員へのインタビュー調査、訪問看護ステーション看護師へのインタビュー結果と先行研究をもとに、病院外来看護師の為の高齢者虐待徴候発見・対応プロトコールを作成した。高齢者虐待疑いのサインをキャッチした後、病院内だけでなく、院外の地域の支援ネットワークにつなげ、どう働きかけていくかがわからないことが、外来看護師の課題であった為、連携をとる先の専門職が外来看護師に何を求めているかがわかるように提示した。その原案を現場の外来看護師にみてもらい、さらに研究協力者にも助言をもらい、このプロトコールを完成させた。病院の外来看護師が、病院内外への調整・相談・通報へ対応する方法の大枠を示すことができたので、今後の外来看護師の高齢者虐待疑い事例に遭遇時の対応能力向上に役立つ1つのツールとなると考える。「外来看護師のための高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」の作成をすることを目的に、初年度は研究者が平成25年度と平成26年度に行った高齢者虐待に関する病院外来看護師との相談・調整についての他職種へのインタビュー調査の結果整理とプロトコールに必要な要素の抽出及び、まだ行っていない訪問看護ステーション看護師へのインタビュー調査の準備を行った。1)今までの外来看護師や他職種へのインタビュー調査の整理とプロトコールに必要な要素の抽出:外来看護師においては、虐待のリスク度が高く家族関係が複雑な事例に関して短時間でのタイムリーな対応の調整に苦慮しており、さらに院外のリソースの存在を知っている人もいれば知らない人もいるため、院内・外の連携していく可能性のある所を虐待のパターンに合わせていろいろとプロトコールで示す必要性がでてきた。また、院内の外来看護師の中でも救急部門担当看護師は医療ソーシャルワーカーや退院調整看護師との連携がとれていたが、それ以外の外来看護師や病棟看護師とは十分とはいかない所があったため、その連携が十分とはいっていない看護師が迷わないようなつくりにしてく必要性がでてき。加えて、今の所、病院と地域包括支援センター職員との連携はごく少数だが、病院外来看護師との「顔の見える関係作り」を望んでいるため、プロトコールを使用していくのに、地域の関係者の顔あわせや関係作りも必要なことが抽出された。2)訪問看護師へのインタビュー調査の準備:高齢者虐待が疑われる外来患者を地域に返す時に、病院外来看護師が連携を重要と捉えている訪問看護ステーション看護師に、どのようなポイントを病院外来看護師が伝え相談すれば、虐待疑い高齢者をスムーズに調整できるかを明らかにするためにインタビュー調査をするため、研究計画の倫理審査を受審し、訪問看護ステーションとの調整を行った。本来ならば、平成27年度中に訪問看護ステーションの看護師へのインタビュー調査が終わる予定で、研究計画を本学の倫理審査委員会を通し準備をすすめていたが、当初承諾を得ていたステーションの事情で調査ができなくなってしまい、新たな所に打診し承諾を得ることまではできたが、年度内に直接の調査まで至れなかった。平成28年度は、高齢者虐待が疑われる外来患者を地域に返す時に、病院外来看護師が連携を重要と捉えている訪問看護師にインタビュー調査を行った。そして「外来看護における高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」の作成に必要な要素の抽出を行った。1)今回のインタビュー調査の概要訪問看護師と外来・病棟看護師との現在の連携の実際と訪問看護師が病院からの継続看護に求めることを明らかにすることを目的に、2016年8月10月に機縁法により2訪問看護ステーション看護師7名に、個別に約30分の半構成的面接調査を行った。参加者は臨床看護歴平均19.7年であった。虐待疑い事例は皆遭遇していたが、病棟看護師長から相談を受けた1ケース以外は、外来看護師から直接連絡や相談をうけた人はいなかった。一方、訪問看護師から病院への連絡や相談は5ケースあった。外来看護師や主治医に、家族が付き添えず1人での外来受診がある可能性の情報提供や、受診できず薬が不足する事の相談、入院時に病棟看護師や師長に虐待疑い状況の情報提供などがあった。連携室の看護師に、本人・家族の思いを代弁して伝えていた。病院との継続看護の為に訪問看護師が欲しい情報は、キーパーソンの有無・理解度、家族との関係性であり、カルテの家族情報の更新を求めていた。加えて、虐待につながると予測できる事は、些細なことでも発信することを望んでいた。本研究では外来看護師から訪問看護師への連絡・相談は確認できなかった。病院看護師と訪問看護師との連携を図るには、病院看護師が患者の在宅生活や家族背景に関心を持って、院内で得た情報を訪問看護師に伝え、情報を更新すること、いつもと違う気づきを伝える発信力が必要である。プロトコール開発では、上記の対応方法を反映・精選することが今後の課題にあがった。本来ならば、「外来看護師の為の高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」の作成・修正までが終わっている予定であったが、平成27年度からの進捗状況の影響で計画より遅れている。平成28年度は、訪問看護師へのインタビュー調査をまとめた所までは終了したが、上記プロトコールの作成中で完成には至らなかった。1)78割が在宅で行われているオランダの認知症ケアの視察

「外来看護における高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」作成において、特に認知症がある高齢者の介護にかかわる家族支援、虐待の予防及び対応が重要となってくるが、その示唆を得るために、認知症ケアの先進国であるオランダのマネジメントやサポートをしている組織・機関の視察に平成29年9月17日23日の期間でいった。視察した場所は、アムステルダムの在宅ケア組織Buurtzorg ,認知症居住村De Hogeweyk ,介護サポート機関Markant ,在宅ケア組織Madeliefje Thuiszorgの4か所である。De Hogeweykの高齢者虐待予防としては、コーチとよばれる人が抜き打ちでラウンドし、実際におきていないかみたり、認知症ケアのトレーニングをしているとのことであった。施設が広いので、常に虐待の抑止をしていっていることがわかった。またMarkantにおいては、高齢者虐待については、マントルケアの負担が重すぎて、ネグレクトや暴力につながってしまうケースはあるが、それは介護者の負担の範囲を超えているからで、わざとやっているわけではないとのことだった。だから、介護負担の3分チェック(介護者の負担が許容範囲かをみるために、カードにすべてやっていることを書き出してもらいチェックする)が大切である。許容範囲を超えていることを自覚してもらうことが大事であるとのことだった。さらにオランダにおいては、高齢者虐待を告発するホットラインがあり、また日常のテレビやCMでも高齢者虐待予防のことが流れているとのことであった。今後、上記の視察の学びをプロトコール作成に際して反映させていく予定である。本来ならば、「外来看護における高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」の作成・修正まで終わる予定であったが、平成27年度からの進捗状況の遅れに加えて、平成29年度は半年間介護のため、当研究への時間を思うようにとることができず、プロトコールを完成させることができなかった。2019年度は、今まで行ってきた外来看護師及びエキスパートナースへのインタビュー調査、医療ソーシャルワーカー、退院調整看護師、地域包括支援センター職員へのインタビュー調査、訪問看護ステーション看護師へのインタビュー結果と先行研究をもとに、病院外来看護師の為の高齢者虐待徴候発見・対応プロトコールを作成した。高齢者虐待疑いのサインをキャッチした後、病院内だけでなく、院外の地域の支援ネットワークにつなげ、どう働きかけていくかがわからないことが、外来看護師の課題であった為、連携をとる先の専門職が外来看護師に何を求めているかがわかるように提示した。その原案を現場の外来看護師にみてもらい、さらに研究協力者にも助言をもらい、このプロトコールを完成させた。病院の外来看護師が、病院内外への調整・相談・通報へ対応する方法の大枠を示すことができたので、今後の外来看護師の高齢者虐待疑い事例に遭遇時の対応能力向上に役立つ1つのツールとなると考える。訪問看護ステーションの看護師へのインタビュー調査は、フィールドを確保できたため、平成28年度早々にとりかかり、調査結果をまとめる。また上記の結果も反映させた「外来看護師の為の高齢者虐待徴候発見・対応プロトコール」の原案を作成し、連携研究者や老年看護のエキスパートナースなどの協力を得ながら、プロトコールを精選させていく。平成29年度は、早期にプロトコールの原案を作成し、エキスパートパネルを行い、連携研究者や老年看護のエキスパートなどの意見をもらって修正する。
内分泌かく乱物質による精子形成不全と協調するタンパク質DJ-1-男性抗不妊薬,不妊マーカーの可能性-

1.体細胞での機能DJ-1結合タンパク質として、アンドロゲン受容体(AR)の転写制御因子であるPIASxα、タンパク質のSUMO-1修飾に関与するUbc9,Daxx,HIPK1、p53結合タンパク質p53BP3、新規タンパク質DJBPを同定した.まず、DJ-1はARの負の制御因子であるPIASxαと結合・吸収することでARを活性化するARの正の制御因子であることが明らかとなった。PIASには複数のファミリータンパク質があり、DJ-1は負の活性を有するPIAS3,PIASyとも結合するが、その相互関係は不明である。更に、PIASxαはHepG2などの細胞では逆にARを活性化するが、DJ-1は活性化されたARには作用しない.また、DJ-1はPIASxαと同様にARの負の制御因子であるDJBPも結合・吸収しARを活性化したことより,DJ-1は抑制化型ARの救助因子として機能した.また、DJ-1の機能にはSUMO-1修飾が必要であった.更に,ARの機能発揮には核内ドット状構造への局在が必須と考えらているが,AR機能低下を引きおこす内分泌かく乱物質投与の種類によってはARのこの局在が変動するものと変動しないものがある.これらのいずれにおいてもDJ-1は局在を核,細胞質と変動することから,ARが機能発揮するためには,DJ-1との核内ドット状構造への共局在が必須であることが明らかとなった.2.精子での機能DJ-1は精子頭部に局在する.in vitroでの人工授精実験で,AR機能低下を引きおこす内分泌かく乱物質投与マウスでは受精能が低下し,坑DJ-1血清は正常マウス受精能を抑制した.更に,X線結晶構造解析の結果,DJ-1はプロテアーゼIとの酷似が認められ,事実DJ-1は弱いながらプロテアーゼ活性が存在した.この事より,DJ-1は卵への結合後,プロテアーゼ活性により卵に侵入に関与すると考えられた.1.体細胞での機能DJ-1結合タンパク質として、アンドロゲン受容体(AR)の転写制御因子であるPIASxα、タンパク質のSUMO-1修飾に関与するUbc9,Daxx,HIPK1、p53結合タンパク質p53BP3、新規タンパク質DJBPを同定した.まず、DJ-1はARの負の制御因子であるPIASxαと結合・吸収することでARを活性化するARの正の制御因子であることが明らかとなった。更に、PIASxαはHepG2などの細胞では逆にARを活性化するが、DJ-1は活性化されたARには作用しない.また、DJ-1はPIASxαと同様にARの負の制御因子であるDJBPも結合・吸収しARを活性化したことより,DJ-1は抑制化型ARの救助因子として機能した.また、DJ-1の機能にはSUMO-1修飾が必要であった.更に,ARの機能発揮には核内ドット状構造への局在が必須と考えらているが,AR機能低下を引きおこす内分泌かく乱物質投与の種類によってはARのこの局在が変動するものと変動しないものがある.これらのいずれにおいてもDJ-1は局在を核,細胞質と変動することから,ARが機能発揮するためには,DJ-1との核内ドット状構造への共局在が必須であることが明らかとなった.2.精子での機能DJ-1は精子頭部に局在する.in vitroでの人工授精実験で,AR機能低下を引きおこす内分泌かく乱物質投与マウスでは受精能が低下し,坑DJ-1血清は正常マウス受精能を抑制した.更に,X線結晶構造解析の結果,DJ-1はプロテアーゼIとの酷似が認められ,事実DJ-1は弱いながらプロテアーゼ活性が存在した.この事より,DJ-1は卵への結合後,プロテアーゼ活性により卵に侵入に関与すると考えられた.
フェノールの酸化とワインの品質-フェノールの酸化が赤ワインの変色,混濁形成,機能性に及ぼす影響-

1.ワインの混濁形成に影響を与えるブドウのタンパク質に関する実験試料用ブドウとしてカベルネ・ソーピニヨン,マスカット・ベリーA.甲州,シャルドネ,リースリング,セミヨンの6品種を用いて,果汁,果皮,種子中の遊離アミノ酸,ペプチド,タンパク質量,及びそれらのアミノ酸組成を調べた。果汁では遊離アミノ酸量はブドウ品種によって異なり,精度が19ブリックスの時では4002230mg/Lの範囲にあった。可溶性タンパク質は100331mg/Lの範囲にあり,セミヨン種が最も多く含んでいた。種子では遊離アミノ酸濃度が1mg/g以下と低く,タンパク質濃度は3050mg/gであった。果皮でも遊離アミノ酸はほとんど検出されず,タンパク質は15mg/gの濃度にあった。赤ワイン用品種であるカベルネ・ソーピニヨンやマスカット・ベリーAは,タンパク質濃度が低く,果汁やワインからのタンパク質の調製が困難であり,電気泳動での分離も不十分であった。一方,セミヨン種ブドウにタンパク質が多いことが明らかになった。そこで,ワインタンパク質はセミヨン種の果汁,フリーランワイン及び赤ワインの製法と同じ方法で試醸した醸しワインから調製した。これらに含まれるタンパク質を硫安塩析法及びSuperdex75HRカラムを用いたHPLCにより分離した。HPLCの溶出液を分取した結果,果汁とフリーランワインでは純度90%程度のタンパク質画分が得られたが,醸しワインでは55%程度の糖が含まれていた。これらのタンパク質画分を電気泳動で分離し,試料間の違いを調べた。果汁とフリーランワイン間では類似していたが,醸しワインは他と異なっていた。これらのタンパク質試料を用いて,混濁形成実験を行った。タンパク質画分の水溶液に種子フェノール画分を混合し,12時間反応後,遠心分離により混濁を形成したタンパク質を除去した。上清をHPLCで分離し,混濁形成前後のタンパク質の違いを比較した。その結果,タンパク質の種類により混濁形成に対する感受性に違いがあることが明らかになった。2.ブドウポリフェノールオキシダーゼの精製実験タンパク質に結合するフェノール化合物を酸化するポリフェノールオキシダーゼをSephadexG-100等のカラムクロマトグラフィーを用いて精製し,それらの酵素化学的性質を調べた。ブドウポリフェノールオキシダーゼの分子量は約40kDaで,至適pHは6.3であった。ワインの混濁形成に影響を与えるブドウのタンパク質に関する実験を行った。試料用ブドウとしてカベルネ・ソーピニヨン,マスカット・ベリーA,甲州,シャルドネ,リースリング,セミヨンの6品種を用いて,ブドウ成熟の各期にサンプリングしたブドウ果粒を果汁,果皮,種子に分け,それぞれの組織中の遊離アミノ酸,ペプチド,タンパク質量,及びそれらのアミノ酸組成を調べた。果汁では遊離アミノ酸量はブドウ品種によって異なり,糖度が19ブリックスの時では4002230mg/Lの範囲にあった。可溶性タンパク質は100500mg/Lの範囲にあり,セミヨン種が最も多く含んでいた。種子では遊離アミノ酸濃度が1mg/g以下と低く,タンパク質濃度は2040mg/gであった。

果皮でも遊離アミノ酸はほとんど検出されず,タンパク質は15mg/gの濃度にあった。以上のことからワインの窒素化合物供給源として,果汁や酵母の代謝物/自己消化物以外に,果皮や種子が考えられた。ワイン醸造において抽出されうる各成分の最大量を組織別に分類すると,遊離アミノ酸は主として果汁由来であるが,タンパク質は果皮由来の物が多いことが明らかになった。モデル溶液にカベルネ・ソーピニヨン及びマスカット・ベリーA種の種子及び果皮を浸漬し,溶出される成分を検討したところ,ワインと同じ条件ではアミノ酸は種子から20mg/L,果皮から73mg/L溶出し,タンパク質は双方から5mg/L程度が溶出した。また,種子の場合モデル溶液のpH,温度,及びエタノール濃度が高いほど多くの窒素化合物が抽出され,果皮では温度とエタノール濃度が高いほど抽出率が増加した。1.ブドウポリフェノールオキシダーゼの精製実験タンパク質に結合するフェノール化合物を酸化するポリフェノールオキシダーゼをSephadex G-100等のカラムクロマトグラフィーを用いて精製し,それらの酵素化学的性質を調べた。ブドウポリフェノールオキシダーゼの分子量は約40kDaで,至適pHは6.3であった。2.ブドウ及びワインタンパク質の混濁形成に関する実験前年度の実験から,セミヨン種ブドウにタンパク質が多いことが明らかになったので,セミヨン種のブドウ果実から果汁,フリーランワイン及び醸しワインを調製した。これらに含まれるタンパク質を硫安塩析法及びSuperdex 75 HRカラムを用いたHPLCにより分離した。HPLCの溶出液を分取した結果,果汁とフリーランワインでは純度90%程度のタンパク質画分が得られたが,醸しワインでは55%程度の糖が含まれていた。これらのタンパク質画分を電気泳動で分離し,試料間の違いを調べた。果汁とフリーランワイン間では類似していたが,醸しワインは他と異なっていた。これらのタンパク質試料を用いて,混濁形成実験を行った。タンパク質画分の水溶液にセミヨンブドウの種子から50%エタノール抽出により調製したフェノール画分を混合し,12時間反応後,遠心分離により混濁を形成したタンパク質を除去した。上清をHPLCで分離し,混濁形成前後のタンパク質の違いを比較した。その結果,タンパク質の種類により混濁形成に対する感受性に違いがあることが明らかになった。
液晶フォトニクス材料-新しい原理に基づく光記録

液晶は結晶同様光学的異方性をもち,かつ液体のように流動性をもつためディスプレイ材料として広く使われている。現在の主流はネマチック液晶の電界駆動であるが,数ミリ秒の応答が限界であるため記録・スイッチング・演算など多方面への応用が制限されている。本研究ではフォトクロミック化合物の光化学反応がピコ秒ナノ秒という高速で起こることに着目し,フォトクロミック部位を組み込んだネマチック液晶を合成して,新しい原理に基づく光記録について検討した。アゾベンゼン誘導体のなかにはネマチック液晶相を発現するものがあることを見出した。これらアゾベンゼン液晶では,アゾベンゼン部位は液晶形成団(メソゲン)としての役割と,光応答部位としての役割の二つを担っている。アゾベンゼンには二つの異方体があり,棒状のトランス体ではある温度範囲でネマチック液晶相を発現するが,光照射後に生成する屈曲形のシス体ではどんな温度においても液晶相は発現しないことが明らかになった。すなわち,アゾベンゼン液晶に光を照射してトランス-シス光異性化を起こすと,シス体が生成すると同時にネマチック液晶は消滅することがわかった。水銀灯の366nmの輝線をアゾベンゼン液晶薄膜(厚さ100nm)に照射すると,トランス-シス光異性体に伴ないネマチック相一等方相の相転移が誘起され,光照射を止めると,熱的にシス-トランス逆異性化が起こりネマチック相が復活することを見出した。このネマチック相一等方相光相転移は1000回も繰り返し起こすことができた。光応答性をレーザーパルス(355nm,10ナノ秒半値幅)を照射して検討した結果,低分子アゾベンゼン液晶・高分子アゾベンゼン液晶いずれの試料においても,200マイクロ秒という従来のネマチック液晶応答と比較して10倍以上高速応答することを見出した。光記録について検討した結果,高分子アゾベンゼン液晶のガラス転移温度以上で画像を定着すると半年以上全く変わらずに定着画像が保存でき,ガラス転移温度以上に昇温すると画像が消去できることがわかった。
リンパ性上皮認識単クローン抗体によるBALTomaの解析

慢性気道感染症および膠原病肺患者からの開胸肺生検組織を対象として、1)ヘマトキシリン-エオジン染色によるBALTの過形成の出現と程度3)同部位におけるTヘルパー1(TH1)およびTヘルパー2(TH2)の分布の検討を行い以下の結果を得た。慢性気道感染症にみられるBALT過形成と膠原病肺のそれとは、解剖学的には基本構築に差は認められなかった。濾胞性Bリンパ腫の転座の解析を通じて発見された遺伝子、bcl-2(アポトーシスを抑制し、細胞寿命を延長させる)の発現も、疾患間の差は明らかでなく、濾胞の周囲に強く発現していた。インターロイキン4陽性細胞は予想に反し,BALT過形成組織内では非常に粗な分布を呈していた。一方、インターフェロンγ陽性細胞はより密な存在を示し、これらBALT過形成部位では、TH1によるTH2の抑制がかかっていることが推定された。BALTの過形成は、局所免疫機構として重要であるとともに、一方ではその過形成のため気道の狭窄をきたすという二面性を有していた。BALT過形成組織内でも同様な相反性が観察され、一方では過形成発達の機構と他方では液性免疫機構の抑制が認められた。これらの所見が、病期とどのような関連をもっているか、今後の検討課題である。
腫瘍指向性ホウ素クラスター修飾コウジ酸を用いたホウ素中性子捕捉療法の有用性

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、腫瘍選択的粒子線治療であり、浸潤性発育を特徴とする外科的治癒切除が不能な腫瘍に対する治療効果が期待される。本研究では、種々の癌細胞に対し親和性のあるコウジ酸をBSHに導入したKA-BSHを作成し、脳腫瘍モデルラットを用いてKA-BSHのBNCT用新規ホウ素化合物としての評価を行った。KA-BSHは腫瘍へのホウ素集積が低値であるにもかかわらず、BNCTにおいてMSTの有意な延長を認めた。BPAとは細胞内分布の異なるKA-BSHを併用することでさらなる治療効果の向上が期待されると考えられる。ホウ素中性子捕捉療法(boron neutron capture therapy; BNCT)は、極めて殺細胞効果の高いα粒子を用いて生物学的に腫瘍細胞を選択的に治療し得るため、正常組織に浸潤性に発育する悪性脳腫瘍の克服が期待されている。BNCTの治療効果はホウ素化合物の種類・投与方法などにも大きく左右される。現在までに臨床試験に用いられてきたホウ素化合物(BSH, BPA)では、ある程度の治療効果が示されたが未だ不十分と言わざるを得ない。BNCTはホウ素化合物の改良にこそ大きな伸びしろと魅力があり、本研究では腫瘍選択的粒子線治療であるBNCTのさらなる治療成績向上を目指し、腫瘍指向性新規ホウ素キャリアーとして開発した“ホウ素クラスター修飾コウジ酸(KA-BSH)"の有用性に関し検討し、臨床応用への可能性を探る。国内研究協力者である切畑光統教授(大阪府立大学・生命環境科学)とともに、BNCT用新規ホウ素化合物として数種の腫瘍指向性新規ホウ素化合物(コウジ酸-BSHおよびその類縁)を作成した。これらの薬剤を用いて悪性神経膠腫培養細胞に対し、in vitroでの集積について確認・スクリーニングを実施し、KA-BSHを用いて腫瘍細胞への集積特性(停留時間、暴露濃度・時間の変化による薬剤細胞集積)について確認した。またBNCTでの治療効果は、集積薬剤の絶対量のみならず細胞内・外の局在にも左右されるため、抗BSH抗体(切畑ら、大阪府立大学)による免疫染色を用いてその局在を検討し、新規化合物での優れた細胞内集積が期待できた。また脳腫瘍モデルラットを用い、KA-BSHを中心とした候補薬剤の全身投与を実施し、薬剤分布を検討したが、静脈内投与での脳腫瘍への移行は不十分であり、当初計画通りCEDによる投薬が望ましいと考えられている。本薬剤はBNCTにさらなる治療成績向上をもたらす可能性が高いと判断し、脳腫瘍モデルでの指摘投与条件を決定後、中性子照射実験による生存期間延長効果を確認していく。BNCTの治療効果はホウ素化合物の種類・投与方法および化合物の分布特性などによって大きく左右される。現在までに臨床試験に用いられてきたホウ素化合物(BSH, BPA)では、ある程度の治療効果が示されたが十分とは言えない。中性子源が原子炉から加速器へと移行し、次世代のBNCTではホウ素化合物の改良こそ大きな伸びしろと魅力といえる。本研究では、腫瘍指向性新規ホウ素キャリアーとして開発した“ホウ素クラスター修飾コウジ酸(KA-BSH)"の有用性に関し検討し、臨床応用への可能性を探る。国内研究協力者らとともに、BNCT用新規ホウ素化合物として数種の腫瘍指向性新規ホウ素化合物(コウジ酸-BSHおよびその類縁)を作成した。これらの薬剤を用いて悪性神経膠腫の培養細胞に対し、in vitroでの集積について確認・スクリーニングを実施し、KA-BSHを用いて腫瘍細胞への集積特性について確認した。またBNCTでの治療効果は、集積薬剤の絶対量のみならず細胞内・外の局在にも左右されるため、抗BSH抗体による免疫染色を用いてその局在を検討し、新規化合物での優れた細胞内集積が確認できている。また脳腫瘍モデルラットを用い、KA-BSHを中心とした候補薬剤の全身投与を実施し、薬剤分布を検討したところ、静脈内投与での脳腫瘍への集積絶対量はやや不十分であるが、正常脳に対する集積比は良好であった。また、当初計画通りCEDによる投薬では、腫瘍への非常に高い集積が認められた。本薬剤は悪性神経膠腫にたいするBNCTの治療成績向上をもたらす可能性が高いと判断し、本研究で示した至適投与条件での中性子照射実験による生存期間延長効果を確認する。安定した生存期間を示すF98グリオーマ移植担脳腫瘍モデルラットを用い、新規ホウ素化合物の投与後生体内分布を測定した。本モデル動物に対して、静脈内全身投与(iv)および局所投薬手法であるCEDを用い、コウジ酸-BSH(KA-BSH)および関連候補ホウ素薬剤を投与した後に経時的な組織内ホウ素濃度を測定した。組織内ホウ素濃度はICP-AESを用いて腫瘍および腫瘍側脳、対側脳など組織別に行った。これらの実験によりKA-BSHのivおよびCED投与時の薬物動態を測定し、至適投与条件の絞り込みを行った。またこれらの化合物において、ivおよびCEDにより新規化合物投与後脳を摘出し、正常脳における化合物の分布を確認した。研究用中性子源の稼働休止状態が続き、動物モデルに対する中性子照射実験は28年度に実施予定とし、これに対する準備、条件設定は完了した。

ホウ素中性子捕捉療法(boron neutron capture therapy; BNCT)は、極めて殺細胞効果の高いα粒子を用いて生物学的に腫瘍細胞を選択的に治療し得るため、正常組織に浸潤性に発育する悪性脳腫瘍の克服が期待されている。BNCTの治療効果はホウ素化合物の種類・投与方法および化合物の分布特性などによって大きく左右される。現在までに臨床試験に用いられてきたホウ素化合物(BSH, BPA)では、ある程度の治療効果が示されたが十分とは言えない。中性子源が原子炉から加速器へと移行し、次世代のBNCTではホウ素化合物の改良こそ大きな伸びしろと魅力といえる。そこで本研究では、腫瘍指向性新規ホウ素キャリアーとして開発した“ホウ素クラスター修飾コウジ酸(KA-BSH)"の有用性に関し検討した。BNCT用新規ホウ素化合物として数種の腫瘍指向性新規ホウ素化合物(コウジ酸-BSHおよびその類縁)を作成した。これらの薬剤を用いて悪性神経膠腫の培養細胞に対し、in vitroでの集積について確認・スクリーニングを実施し、KA-BSHを用いて腫瘍細胞への集積特性について確認した。またBNCTでの治療効果は、集積薬剤の絶対量のみならず細胞内・外の局在にも左右されるため、抗BSH抗体による免疫染色を用いてその局在を検討し、優れた細胞内集積が確認できた。脳腫瘍モデルラットにおいては、KA-BSHを中心とした候補薬剤の全身投与を実施し、薬剤分布を検討したところ、静脈内投与での脳腫瘍への集積絶対量はやや不十分であるが、正常脳に対する集積比は良好であった。また、CEDによる投薬では、腫瘍への非常に高い集積が認められた。原子炉の再開はなく、大規模な再検証が不可能であったが、先行させたパイロット研究の結果、本薬剤は悪性神経膠腫に対するBNCTの治療成績向上をもたらす可能性が高いと結論付けた。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、腫瘍選択的粒子線治療であり、浸潤性発育を特徴とする外科的治癒切除が不能な腫瘍に対する治療効果が期待される。本研究では、種々の癌細胞に対し親和性のあるコウジ酸をBSHに導入したKA-BSHを作成し、脳腫瘍モデルラットを用いてKA-BSHのBNCT用新規ホウ素化合物としての評価を行った。KA-BSHは腫瘍へのホウ素集積が低値であるにもかかわらず、BNCTにおいてMSTの有意な延長を認めた。BPAとは細胞内分布の異なるKA-BSHを併用することでさらなる治療効果の向上が期待されると考えられる。安定した生存期間を示すF98グリオーマ移植担脳腫瘍モデルラットを作成した。本モデル動物に対し、静脈内全身投与によりコウジ酸-BSH(KA-BSH)および関連候補ホウ素薬剤を投与した後、組織内ホウ素濃度を測定した。組織内ホウ素濃度はICP-AESを用いて腫瘍および腫瘍側脳、対側脳など組織別に行い、摘出組織に対するBSH特異的免疫染色(切畑ら、大阪府立大学)用標本を作製した。これらの実験によりKA-BSHのiv投与時の薬物動態の解明と至適投与条件の検討を加え、パイロッテ研究の結果から中性子照射に向けたプロトコールの選定・絞り込みを行っている。
心臓リモデリングにおける受容体作動性カチオンチャネルTRPC3の役割解析

慢性高血圧や虚血によって生じる心臓の形態変化(リモデリング)は心機能を低下させる原因として注目されている.我々は,ジアシルグリセロールで活性化されるTRPCチャネル(TRPC3/TRPC6)が圧負荷による心肥大を仲介することを明らかにした. TRPC6チャネルはThr69残基のリン酸化によりチャネル活性が抑制されることに着目し,ホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤や心房性ナトリウム利尿ペプチドがTRPC6の抑制を介して心肥大や血管収縮を抑制することを新たに見出した.特に血管平滑筋細胞においては, TRPC6がプロテインキナーゼA(PKA)やPDE3と複合体を形成することも明らかにした.さらに, TRPC3はCa2+流入依存的にPKCと相互作用し, NADPHオキシダーゼ依存的な活性酸素生成および心臓リモデリング(心肥大や線維化)の進行に寄与することも明らかにした.以上の結果は, TRPCチャネルシグナル複合体形成が心臓リモデリングにおいて重要な役割を果たすことを強く示唆している.慢性高血圧や虚血によって生じる心臓の形態変化(リモデリング)は心機能を低下させる原因として注目されている.我々は,ジアシルグリセロールで活性化されるTRPCチャネル(TRPC3/TRPC6)が圧負荷による心肥大を仲介することを明らかにした. TRPC6チャネルはThr69残基のリン酸化によりチャネル活性が抑制されることに着目し,ホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤や心房性ナトリウム利尿ペプチドがTRPC6の抑制を介して心肥大や血管収縮を抑制することを新たに見出した.特に血管平滑筋細胞においては, TRPC6がプロテインキナーゼA(PKA)やPDE3と複合体を形成することも明らかにした.さらに, TRPC3はCa2+流入依存的にPKCと相互作用し, NADPHオキシダーゼ依存的な活性酸素生成および心臓リモデリング(心肥大や線維化)の進行に寄与することも明らかにした.以上の結果は, TRPCチャネルシグナル複合体形成が心臓リモデリングにおいて重要な役割を果たすことを強く示唆している.細胞の膜電位に依存しない,神経液性因子によって制御される受容体作動性Ca^<2+>流入経路の増大が心血管病の発症・進展に関与することが個体レベルで明らかになってきている.本研究では,心血管リモデリング(筋肉細胞の肥大や線維化などの構造形態変化)におけるジアシルグリセロールなどの脂質によって活性化されるtransient receptor potential canonical (TRPC)チャネル(TRPC3/6)の細胞内シグナル伝達における役割を解析した.TRPCチャネル群は,カチオン透過性チャネルとしての機能だけでなく,様々なシグナル分子と機能的に結合するアンカー蛋白質としての機能も持つ.TRPC6チャネルにおいては,やホスホジエステラーゼと複合体を形成することによりcAMP-プロテインキナーゼA(PKA)やcGMP-PKG系の活性化に応じたTRPC6のリン酸化およびチャネル活性低下を効率よく行っていることを明らかにした(J.Biol.Chem., 2010).一方,TRPC3チャネルはPKCβと受容体刺激依存的に直接結合することで,TRPC3を介したCa2+流入依存的にPKCが活性化され,下流のMAPK経路を持続的に活性化させることも明らかにした(J.Cell Sci., 2010).さらに,拡張型心筋症モデルマウスの心臓では,TRPC3チャネルの発現量が顕著に増大しており,TRPC3チャネルの選択的阻害が心臓の酸化ストレスを抑制することで心不全を軽減させることを初めて明らかにした.以上の結果は,TRPC3チャネルが心不全治療薬の新しい標的分子となる可能性を強く示唆している.これまでの研究から,神経体液性因子により活性化される受容体作動性のCa^<2+>流入が心血管病関連遺伝子の発現誘導を制御することを個体レベルで明らかにしてきた.本研究では,心血管リモデリング(筋肉細胞の肥大や線維化などの構造形態変化)におけるジアシルグリセロールなどの脂質によって活性化されるtransient receptor potential canonical (TRPC)チャネル(TRPC3/6)の細胞内シグナル伝達における役割を解析した.TRPCチャネル群は,カチオン透過性チャネルとしての機能だけでなく,様々なシグナル分子と機能的に結合するアンカー蛋白質としての機能も持つ.TRPC6チャネルにおいては,やホスホジエステラーゼと複合体を形成することによりcAMP-プロテインキナーゼA(PKA)系の活性化に応じたTRPC6のリン酸化およびチャネル活性低下を効率よく行っていることを明らかにした(Afterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 2011).一方,TRPC3チャネルはNADPHオキシダーゼと相互作用することで,受容体刺激による活性酸素生成に寄与することも明らかにした.さらに,拡張型心筋症モデルマウスの心臓では,TRPC3チャネルの発現量が顕著に増大しており,TRPC3チャネルの選択的阻害が心臓の酸化ストレスや線維化を抑制することで心不全を軽減させることを初めて明らかにした(Biochem.Biophys.Res.Commun., 2011),以上の結果は,TRPC3チャネルが心不全治療薬の新しい標的分子となることを強く示唆している.
バイオフィルム形成における自己溶菌メカニズムの解明とその生物学的意義

細菌のバイオフィルム形成において、細胞外DNAが付着・接着因子として機能することが明らかとなっている。う蝕の主要原因細菌であり、古くからバイオフィルム研究の一つのモデル細菌として研究されてきたStreptococcus mutansにおいても細胞外DNAがバイオフィルムの形成や構造安定性に寄与することが報告されている。細胞外DNAが死細胞由来のゲノムDNAであることは想像に難しくないが、実際にDNAの放出過程を観察した例はない。本研究は、顕微鏡技術による生命現象のイメージングとその現象の根底にあるメカニズムを遺伝子レベルで明らかにすることを目的としている。今年度は、イメージング技術の確立を中心に研究を行った。増殖中に一部の細菌で起きる細胞死を一細胞レベルで検出するタイムラプスイメージング法を確立するため、培養条件および観察条件を検討した。生細胞と死細胞を識別するためには、蛍光顕微鏡観察が必要となるが、蛍光染色が細菌の増殖に与える影響を少なくするため、生細胞は蛍光染色せずに観察することを目指した。菌体を寒天培地上に接種し、培養後に観察したところ、細胞同士が重なり合い立体的なコロニーを形成したため、一細胞レベルでの解析は難しいと考えられた。そこで、マイクロチャンバーを用いて、増殖可能な空間を物理的に制限することで細胞同士が重なり合うことを防ぎ、平面的に増殖させることに成功した。また、培地に細胞膜非透過性の核酸蛍光標識試薬を添加して培養することにより、細胞死及び細胞外に放出される核酸の観察にも成功し、細菌の細胞死には,核酸を細胞外に放出するものと細胞形態を維持し核酸を放出しないものが存在することを明らかにした。本研究課題では、生命現象の可視化とメカニズム解析を目的としている。タイムラプスイメージングにより、細胞死及び細胞外DNA産生を観察することに成功し、細菌の細胞死には内容物を放出するものとしないものとが存在することが明らかとなった。こうした細胞死のバリエーションは、タイムラプスイメージングを行うことで初めて明らかとなったことである。イメージング技術を既存の定量的な解析と組み合わせることにより、生命現象をより詳細かつ正確に解析できると考えられる。また、これまでに細胞死に関与することが明らかとなっている遺伝子や細胞死に関与すると推定されている遺伝子の欠損株、プロモーターレポーター株を作製した。解析に必要な供試菌株及び手法の確立ができ、実際に解析を進めていく準備を整えることができた。平成30年度に作製した供試菌株を使用し、タイムラプスイメージングを行い、これまでに細胞死との関連が指摘されている遺伝子が実際に細胞死のどの過程にどのように関与しているのかを明らかにしていきたい。また、細胞死に関わる新規因子の探索を行うために、遺伝的に均一な集団内に見られる表現型の異なる細胞をセルソーターを用いてそれぞれ分取し、遺伝子発現の網羅的な解析を行いたいと考えている。

また、細胞死に関わる新規因子の探索を行うために、遺伝的に均一な集団内に見られる表現型の異なる細胞をセルソーターを用いてそれぞれ分取し、遺伝子発現の網羅的な解析を行いたいと考えている。