hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異とグリオーマ幹細胞発生の関連性検証

低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子をTet-onシステムを用いてヒトiPS細胞に導入し、BRAF-V600E変異導入ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の樹立に成功した。BRAF-V600E変異はヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の増殖能を亢進させる作用を有し、それにはMAPK, PI3K, RAS pathway関連遺伝子発現が関与することが示唆された。ヒトiPS細胞およびヒトiPS細胞由来神経前駆細胞を応用した低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異の機能解析を行った報告は殆ど無く、当該領域における新規性のある萌芽的研究成果が得られたと結論づけられた。成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異を正常ヒト神経幹/前駆細胞で発現させてその機能を評価するため、正常ヒト神経幹/前駆細胞を作成する元になるヒトiPS細胞にTet-onシステムを用いた外来遺伝子誘導系を導入した。ヒトiPS細胞(409B2株)をSNLフィーダー細胞上で拡大培養した後、遺伝子導入用にフィーダーフリー培養システムへの馴化培養を実施した。フィーダーフリー化したセミコンフルエントのヒトiPS細胞409B2株に対して、Lipofectamine&reg; 3000試薬(Thermo Fisher Scientific社)を用い、TET3G vector(Clontech社)を遺伝子導入し、抗生剤G418を用いたセレクションにてTET3G導入株をセレクションした。次に、クローニングしたTET3G導入株に、Lipofectamine&reg; 3000試薬を用いてcontrol response plasmid (pTRE3G-Luc)を遺伝子導入し、Doxycycline添加/非添加の培養液に置換して24時間培養後、Luciferase活性を測定してTET3G導入株選定を実施した結果、候補クローン6株よりDoxycycline添加/非添加ウェルの発光量比が10倍以上あることが確認されたクローンが2株選択され、それらを拡大培養し凍結保存した。以上の結果から、Tet-onシステムを用いた外来遺伝子誘導が可能となるヒトiPS細胞株の樹立に成功したと判断される。正常ヒト神経幹/前駆細胞へ成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異を導入し、その機能を評価するための実験系の構築が初年度の目標であったが、Tet-onシステムで外来遺伝子の発現制御が可能なシステムを組み込んだヒトiPS細胞の樹立に成功した。このヒトiPS細胞を分化誘導させることで正常ヒト神経幹/前駆細胞を作成することが技術的に可能であり、正常ヒト神経幹/前駆細胞において成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異の機能を評価するためのプラットホームの構築は達成されたと判断する。具体的な遺伝子変異導入は現在進行中であり、全体の進捗としてはおおむね順調に進展していると判断する。低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異がヒトiPS細胞由来神経前駆細胞のエピジェネティクスに及ぼす影響を評価するため、遺伝子導入前段階のヒトiPS細胞由来神経前駆細胞のDNAメチル化状態を、マイクロアレイ(illumina社製)を用いて評価し、神経組織由来正常ヒト神経幹/前駆細胞のDNAメチル化状態との比較検討を実施した。遺伝子導入されたヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の造腫瘍能を評価するためのin vivo実験系の構築として、免疫不全マウス(NOGマウス)の線条体への定位的細胞移植手法と移植細胞数の検討を実施した。また、マウス脳組織内で移植されたヒト細胞を同定するため、ヒト細胞を選択的に認識する抗体(STEM121抗体、抗ヒト核抗体)を用いた免疫組織学的手法の有用性を評価した。2年目は、正常ヒト神経幹/前駆細胞へ成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー変異遺伝子を導入し、その機能をin vitroおよびin vivoで評価する計画としていた。細胞移植法等やその他の周辺in vivo評価技術の開発については先行して確立することができた。しかし、DNAメチル化解析等のin vitro解析により、Tet3Gを導入したヒトiPS細胞株409B2が今後の解析に不適な株であることが判明したために、細胞を選定し直して遺伝子導入株の再作製を行ったために、Tet-On 3G誘導発現系の構築は十分には実施されなかった。ただ既に遺伝子導入ヒトiPS細胞株の作製を終了して解析準備を整えることができている上、in vivo評価系の構築は終了していることから、総合的には当初の計画にやや遅れが見られる程度である。正常ヒト神経幹/前駆細胞において成人低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異の機能を評価するためのプラットホームの構築は概ね達成されたと判断され、研究進捗としては当初目標よりはやや遅れているが最終年度で十分に回復が可能なレベルにあると判断する。前年度にマイクロアレイ(illumina社製)を用いてDNAメチル化データを取得した遺伝子導入前段階のヒトiPS細胞由来神経前駆細胞と神経組織由来正常ヒト神経幹/前駆細胞に関して、さら詳細なデータの解析を行い、両細胞のDNAメチル化レベルで検討した。また、これら正常細胞と、グリオーマ幹細胞とのDNAメチル化データの比較検討を行い、正常神経幹/前駆細胞とグリオーマ幹細胞とのDNAメチル化レベルでの相違点を解析し、エピジェネティクスの観点からグリオーマ発生に関わる遺伝子群を解析した。BRAF-V600

E変異はヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の増殖能を亢進させる作用を有し、それにはMAPK, PI3K, RAS pathway関連遺伝子発現が関与することが示唆された。ヒトiPS細胞およびヒトiPS細胞由来神経前駆細胞を応用した低悪性度グリオーマ関連ドライバー遺伝子変異の機能解析を行った報告は殆ど無く、当該領域における新規性のある萌芽的研究成果が得られたと結論づけられた。研究開始時点では、樹立済正常ヒト神経幹/前駆細胞にエレクトロポレーション等を用いて外来遺伝子を導入する手法を計画し、その実施を試みたが、効率が十分でなく、別アプローチとしてヒト神経幹/前駆細胞作製の元になるヒトiPS細胞に先行してTet-onシステムを導入し、Tet-onシステム導入iPS細胞を神経分化誘導させることで遺伝子導入ヒト神経幹/前駆細胞を作成する手法に変更した。その結果、目的とする遺伝子導入ヒトiPS細胞の作成に成功し、結果的にはより汎用性の高い実験系を構築することができたと判断する。次年度以降は、このシステムを利用して、発生段階および領域特異性の異なるヒト神経幹/前駆細胞を作成し、そこに主に低悪性度グリオーマ発生との関連性が報告されている融合遺伝子を導入し、グリオーマ発生に及ぼす機能を解析していきたいと考える。最終年度は、今年度作製した低悪性度グリオーマ関連ドライバー変異遺伝子ベクターをヒトiPS細胞由来神経前駆細胞に導入して発現させ、in vitroにおける機能解析、NOGマウス脳内移植系を用いてin vivoでの腫瘍形成能を評価し、正常ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞からのグリオーマ発生に関わる機能を解析すると同時に、導入されたドライバー変異遺伝子がヒトiPS細胞由来神経前駆細胞のエピジェネティクスに及ぼす機能を解析していきたいと考える。脳神経外科学物品費において予定より支出が少なく済み、次年度使用額が生じた。物品費において予定より支出が少なく済み、次年度使用額が生じた。研究に必要な細胞培養関連、遺伝子解析関連、動物実験関連の資材等の消耗品購入のための物品費、遠方の連携研究者との共同研究を円滑に実施するため会議に関わる国内旅費、国際学会での情報収集・成果発表のための国際旅費、および論文作成に関わるその他経費を計上した。これらは研究を円滑に実施し、かつ研究成果を世界に発信するために必要なものと考え、妥当な範囲内のものと考える。
古生代末2段階大量絶滅の研究:G-L境界とP-T境界事件

4年間の研究期間において、南中国四川省北部、九州高千穂地域、およびクロアチア、ベレビット山地での野外調査および国内での室内分析を行った。その成果として、以下の事が明らかになった。1)G-L境界での1回目の絶滅が起きる直前に海水中の炭素同位体比が異常に高くなる期間が500万年間以上続くことを世界で初めて発見し、調査地にちなんでKamuraevent(上村事件)と命名した。当時の海洋における生物基礎生産量の増大およびそれに伴う大気中の二酸化炭素の大量消費が起きたことが記録されており、温室効果の低下によるグローバルな寒冷化がおきたと推定される。2)当時の赤道域の浅海で繁栄した、大型フズリナやサンゴに加え、特殊な巨大二枚貝化石(Alatoconchidae)群集の消長・絶滅パタンを解明した。いずれもペルム紀中期末におきたグローバル寒冷化によって絶滅したが、その原因は、3者が共通にもっていた適応戦略である光合成共生系の崩壊であったと考察される。3)Sr同位体比の経年変化を分析し、過去5.5億年間での最低値がペルム紀中期末に起きた事を明らかにした。その後、値が急上昇することから、この時に超大陸パンゲアの最初期分裂が開始したこと、すなわちG-L境界事件が超大陸分裂に関係していたことを示した。4)P-T境界での2回目の絶滅時に頻繁に珪長質火山活動がおきたことを南中国で示し、その鉱物学的特性からマントルプルーム起源のマグマ活動であったことを示した。これらの新データは、研究代表者がかねてから考察してきた「プルームの冬」仮説を一部実証した。以上の成果は、いくつかの世界初の発見や指摘を含んでおり、すでに31編の学術論文(査読付き国際誌28編及び書籍3冊)として公表された。また2006-2007年度には海外で開かれた国際会議・学会において、3度のキーノート講演を含む6回の口頭発表を行った。設備備品として日本電子社製の走査型電子顕微鏡、オックスフォード社製のX線マイクロアナライザー、および日本電子社製のカーボンコーターを2004年8月に購入し(備品費)、東京大学大学院総合文化研究科の磯崎研究室に設置した。すでに調整・補正作業を終え、既に採取してあるP-T境界前後の各種岩石試料の微量元素組成の分析を開始した(消耗品費)。また、つくば市の産業技術総合研究所の川幡研究室との共同研究で、日本国内および中国南部から採取した石灰岩試料について、炭素同位体比の測定を行った(消耗品費)。その結果、P-T境界およびG-L境界において明瞭な同位体シフトが認められた。とくに日本の検討セクションからの報告は、失われた過去の超海洋中央部からのデータとしては世界で初めてのものであり、重要である。これらの成果の一部を、2004年10月に、アメリカ合衆国コロラド州デンバー市で開かれたアメリカ地質学会において発表した(海外旅費)。また、それらの成果を数編の学術論文にまとめ、投稿した。別記リストに示すように、一部はすでに公表されたが、まだ印刷中あるいは査読中のものも含まれる。さらに今後の研究方針について議論するため2005年3月にハワイ大学およびカリフォルニア大学サンディエゴ校において打ち合わせを行った(海外旅費)。同3月後半には、追加岩石試料の採取のため、和歌山県北部御坊北方地域および中国四川省北部朝天地域にて野外調査を行った(国内旅費・海外旅費)。その際、中国側共同研究者の姚建新博士と、これまでの成果のとりまとめと今後の方針について相談した。

古生代末、G-L境界およびP-T境界での2段階絶滅事件を記録している宮崎県高千穂町での地質調査を2回行った。その時に採取した試料および前年度までに中国から採取してきた様々な岩石試料の微小領域化学分析を行った。またつくば市の産業技術総合研究所と協力して、同様の連続試料について炭素同位体比の詳細測定を行った。この分析用の粉末試料作成のために臨時職員を雇用した。その結果、南中国および日本から採集した連続岩石試料から極めて重要な結果が得られた。とくに最初の大量絶滅(G-L境界)事件の直前に、当時の海洋生物の基礎生産が増大し、結果としてグローバルな寒冷化をひきおこしたことを示す炭素同位体比シグナルを見い出したことは世界で初めてであった。さらに古生代二枚貝としては最大のサイズ(殻長50cm以上)を持つAlatoconchidaeを高千穂町において新たに発見し、当時の特異な環境条件および光合成藻類との共生関係を示す証拠を得た。これらの研究成果の一部を、アメリカ・カナダ地質学会(カナダ、カルガリー市、8月)、アメリカ地球物理学連合(米国サンフランシスコ市、12月)、トリアス系国際シンポジウム(中国巣湖市、5月)、日本地質学会(京都市、9月)、日本古生物学会(京都市、2月)において口頭発表した。また別記の論文として公表した。さらに米国内務省地質調査所(ワシントン市、8月)およびカリフォルニア工科大学(パサデナ市、2月)において共同研究の打ち合わせを行い、これまでの成果の整理と来年度以降の研究方針について議論した。古生代末G-L境界での絶滅事件を記録した石灰岩が分布する、宮崎県高千穂町および岐阜県大垣市での地質調査を各々2回、さらに中国四川省およびクロアチア/スロベニアにおける野外調査を各々1回ずつ行なった。その際に採取した試料および、前年度までに採取した様々な岩石試料の微小領域化学分析を行なった。また、つくば市の産業技術総合研究所と協力して、同様の連続試料について炭素同位体比の詳細測定を行った。南中国および日本から採取した連続岩石試料について炭素同位体比を測定した結果、G-L境界事件の直前に当時の海洋生物の基礎生産が増大し、その結果グローバルな寒冷化(上村事件と命名)が起きたことを世界で初めて明らかにした。さらに前年度高千穂町から発見した古生代最大の二枚貝Alatoconchidae(殻長50cm以上)を新たにクロアチアでも確認し、ペルム紀に繁栄したそれらの巨大二枚貝が、世界で同時にG-L境界直前の上村寒冷化事件で絶滅したことを解明した。これらの研究成果の一部を、欧州地球物理学連合(オーストリア、ウィーン市)、アメリカ地質学会(米国、フィラデルフィア市、10月)、アメリカ地球物理学連合(サンフランシスコ市、12月)、第2回万国古生物学会議(中国、北京市、6月)、日本惑星科学連合学会(幕張市、5月)、日本地質学会(高知市、9月)において口頭発表した。また、別記の論文として公表した。さらに米国ハーバード大学およびマサチューセッツ工科大学において講演、および共同研究の打合わせを行った(ケンブリッジ市、11月)。平成19年度には,南中国四川省北部,九州高千穂地域,およびクロアチア,ベレビト山地での野外調査および国内での室内分析を行った。
顕微鏡視野内におけるSV40複製反応の直接観察法を用いた分子動態の解明

●固定化DNA形態制御技術のDNAポリメラーゼ動態解析への応用本研究では、これまでに開発した技術のうち、(1)疎水性ガラス基板へのDNA分子の片端固定、(2)直流電場によるDNAの形態制御、また(3)酵素活性を保持できる酵素分子の蛍光標識法を真核細胞のDNAポリメラーゼβの動態解析に応用した。DNAポリメラーゼβの蛍光標識では、DNAと複合体を形成した状態で酵素表面のアミノ基に蛍光物質を結合させることによって、酵素活性を保持したまま標識産物を回収することに成功した。蛍光標識DNAポリメラーゼβの比活性が標識前のDNAポリメラーゼに比べて増大したことは、標識過程においてDNA結合活性を有しているDNAポリメラーゼのみが選択的に回収できていることを示唆している。また、標識産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、標識前のDNAポリメラーゼβと比較してバンドがシフトアップしたことからDNAポリメラーゼβに蛍光物質が共有結合していることが示された。顕微鏡視野内においてガラス基板に静電的に伸張固定した2本鎖DNAにdNTPとマグネシウムイオンが存在しない条件で蛍光標識DNAポリメラーゼβを作用させたところ、DNA上に結合する様子がみられ、またDNA鎖に沿って直線的にスライディング運動する様子も観察された。次に特定の位置にニックを挿入した2本鎖DNAを用いたところ、DNAポリメラーゼβはニック部分に優先して結合した。また、疎水性ガラス表面に片端固定したあと直流電場によって伸張させたDNAに相互作用するDNAポリメラーゼβの挙動を観測することを試みた。DNaseIによってランダムにニックやギャップを入れたDNAを用いた場合にDNAポリメラーゼβは電界中で伸張するDNAに結合し、20V/cmの直流電界中で遊離することなくDNAに結合した状態を保持した。本研究により開発された疎水性ガラス基板へのDNAの固定化法は、ガラス表面へのDNA分子の非特異的吸着を抑制できるために顕微鏡下でのDNA-酵素間相互作用の解析に有用であると考えられる。また、直流電場によるDNAの形態制御およびDNA結合性酵素の蛍光標識法は、DNAに相互作用する様々なタンパク質(酵素)の動態解析に大きく寄与するものと期待される。
結晶の格子歪み制御によるMg2Siの熱電特性向上

Mg2Si薄膜の熱電特性に及ぼす歪の効果を調べた。種々の基板上に作製した膜では、0.2%の引っ張り歪から0.4%の圧縮歪を膜に印加することに成功した。しかし得られた膜の熱電特性には大きな違いは認められなかった。一方、Mg-Si膜には原子サイズの異なるCaを添加することを試みた。500°Cで熱処理したMg-Ca-Si膜は、Si過剰組成ではn型の特性を示したが、それ以外の広い組成ではp型を示した。また熱電特性には大きな組成依存性があることも明らかになった。一方、Mg2SiにCaを置換した組成範囲では特性の向上は認められなかった。申請者は熱電材料として大きな期待を集めているMg2Siについて、熱電特性の評価が可能なエピタキシャル膜を絶縁体である(001)Al2O3基板上へ作製することに世界で初めて成功した。得られたMg2Siエピタキシャル膜は、約0.2%の格子歪みを有しており、p型伝導を示した。Mg2Siの研究は、格子歪みが無い焼結体や単結晶で行われており、n型伝導を示すことが広く知られている。エピタキシャル膜において、n型伝導ではなくp型伝導を示した結果は、格子歪みがMg2Siの伝導特性を支配する最も重要な支配因子である可能性を示している。本研究は、種々の結晶格子歪みを有したエピタキシャルMg2Si膜を作製し、格子歪みの熱電特性に及ぼす影響を明らかにする。得られた知見を基に、格子歪み制御による特性の向上方法を検討することで、Mg2Siの熱電特性を飛躍的に向上させることを目的としている。種々の方位のMgO, SrTiO3やSiC単結晶基板上にMg2Siのエピタキシャル薄膜を作製可能であることを明らかにした。得られた膜の基板との方位関係を明らかにするとともに、結晶構造解析をおこなった。その結果、種々の歪を有したMg2Si膜の作製に成功しており、電気特性および熱電測定も異なっていることが明らかになった。申請者は熱電材料として大きな期待を集めているMg2Siについて、熱電特性の評価が可能なエピタキシャル膜を、絶縁体である(001)Al2O3基板上へ作製することに世界で初めて成功した。得られたMg2Siエピタキシャル膜は、約0.2%の格子歪みを有しており、これまでほとんど報告されていないp型伝導を示した。エピタキシャル膜においてn型伝導ではなくp型伝導を示した結果は、格子歪みがMg2Siの伝導特性を支配する最も重要な支配因子である可能性を示している。本研究は、種々の結晶格子歪みを有したMg2Si膜を作製し、格子歪みの熱電特性に及ぼす影響を明らかにする。熱膨張率がMg2Siより大きいCaF2と、小さいAl2O3基板上に(111)配向膜を作製し、面内の面間隔の異なる膜の作製に成功した。しかし得られた膜の特性はほぼ同じで、今回印加した範囲の歪みでは特性に大きな影響を与えないことが明らかになり、p型特性の発現している理由は格子歪みでない可能性が示された。なお、p型伝導特性の発現の起源となりうる酸素の混入についてもSIMSによる検討を行ったが、酸素の量と伝導型にも大きな相関が認められなかった。さらにMg2Siに大きな格子歪みを誘起することを目指して、Mg-Si-Caの3元系に拡張した研究を行った。その結果、広い組成範囲でp型伝導が得られることが明らかになった。種々の基板上に歪量の異なるエピタキシャル膜の作製に成功しており、次年度に膜の歪と熱電特性を系統的に研究するための試料作りができた。無機薄膜今後は主に、種々の組成のMg2Siエピタキシャル膜の作製と評価に取り組む。1)エピタキシャル膜作製:従来Mg2Siに添加することで高い熱電特性が得られることが報告されている、p型のAgやn型のSn等での置換をまず行う。特に特性が低くMg2Siの実用化の大きな問題になっているp型に関しては、クラーク数が1桁で毒性が無いものの、これまでに十分な評価がされていないCaを試みる。組成の制御は、Mgディスク上に種々のチップを置いて行う。2)膜評価:得られた試料の評価は、初年度と同様の方法で評価を行う予定である。

昨年度は作製した膜の結晶構造解析に多くの時間がかかり、当初予定したより作製した膜の数が少なく、膜作製に為の費用をすべて使用しなかった。結晶構造の評価方法は確立したので、膜の作製から評価を系統的に行い、当初の目的を達成する。
汚濁湖沼水の生物膜処理におけるカビ臭生成微生物のエコテクノロジ-を活用した制御

汚濁湖沼水のエコテクノロジ-を活用した方法として、生物膜法の一種である接触酸化を法を用いて生物処理する方法が注目されている。本法は反応槽内に充填されたハニコム状、ひも状、板状の接触材上に形成された生物膜により浄化することを特徴としている。生物膜には細菌、菌類、原生動物、袋形動物などが生息しており、これらの混合微生物群が有機物の分解・除去に貢献している。とくに懸濁状の澡類の除去・分解には捕食者としての微小動物の役割が大きいものと考えられる。そこで、汚濁湖沼水中に出現する藍藻類、糸状性のカビ臭生成原因生物であるPhoromidium tenue等の藻類を有用微小動物として、これらの糸状藻類を摂食するのに適したやな器という細胞小器官を有するTrithigmostomaーcuoullulusーおよび細菌に着目して、効率的分解・除去を目指した検討を行っていた。その結果、カビ臭生成糸状澡類のP・tenueーはT・cucullulusにより摂食速度1030μm・s^<-1>程度、最大比増殖速度1.61d^<-1>、また最大個体数1200N・ml^<-1>で捕食、分解され好的食物源となること、T・cucullulusの存在はTON、2ーMIB、クロロフィルa量、濁度、TOC、DOCなどの除去効率を高める上で大きな効果を有すること、2ーMIBの分解は、T・cucullulusの食胞内で観察されるpH4以上で非常に高く、また、高温であるほど、酸との接触時間が長いほど分解能が高まることなどが明かとなった。これらより、糸状藻類を摂食する微小動物等を汚濁湖沼水の生物処理法の接触酸化反応槽内に大量に定着させることができれば、カビ臭物質の分解をエコテクノロジ-的に達成できることを明らかにできた。本研究は、(1)汚濁湖沼水を処理している生物膜法の施設からカビ臭を分解する細菌、菌類、原生動物および微小後生動物の分離培養を行い、最適培養条件を明らかにすること、(2)汚濁湖沼水よりカビ臭を産生する微生物の分離培養を行い、2ーMIB、ジオスミン等のカビ臭産生能の違いを明らかにすること、(3)分離培養に成功したカビ臭産生微生物とカブ臭分解微生物との二者培養を行い、カビ臭分離能の高い微生物の種類を明らかにすると同時に、それらの種のカビ臭産生微生物に対するカビ臭分解微生物の選択的特異性を明らかにすること、および(4)カビ臭産生微生物の懸濁液を基質とし、回分培養槽において各種の組み合せによるカビ臭分解微生物を培養し、最大のカビ臭分解能の達成可能な種の組み合せの条件を明らかにすることなどを目的としているが、本年度は、カビ臭生成糸状藻類を捕食する原生動物Trithigmostoma cucullulusに着目し、T・cucullulusの消化機構、特に食胞のpH領域を明らかにし、かつpHと2ーMIBの分解との関係を明らかにするための研究を主として行った。得られた成果は以下に示す通りである。(1)T.cucullulusの食胞内pHは、酸性側で3、アルカリ側で8程度の範囲で変化することが、コンゴ-レットとニュ-トラルレッドを用いた生体染色法でわかった。(2)2ーMIBの酸による分解能は、pH4以下で非常に高く、pH5を越えると分解能が著しく低下すること、及び2ーMIBの酸による分解能は高温であるほど、また酸との接触時間が長いほど高まることが、SE30をカラム充填剤として用いたガスクロマト解析により明かとなった。

(3)T.cucullulusはカビ臭生成糸状藻類Phormiduim tenueを捕食した後、強酸側の食胞内において2ーMIBを分解していることがわかった。(4)カビ臭物質を分解する細菌および微小動物を数種類の分離、培養、保存法について明らかにできた。汚濁湖沼水のエコテクノロジ-を活用した方法として、生物膜法の一種である接触酸化法を用いて生物処理する方法が注目されている。本法は反応槽内に充填されたハニコム状、ひも状、板状の接触材上に形成された生物膜により浄化することを特徴としている。生物膜には細菌、菌類、原生動物、袋形動物などが生息しており、これらの混合微生物群が有機物の分解・除去に貢献している。とくに懸濁状の藻類の除去・分解には捕食者としての微小動物の役割が大きいものと考えられる。そこで、汚濁湖沼水中に出現する藍藻類、糸状性のカビ臭生成原因生物であるPhormidium tenue等の藻類を有用微小動物として、これらの糸状藻類を摂食するのに適したやな器という細胞小器官を有するTrithigmostoma cucullulusおよび細菌に着目して、効率的分解・除去を目指した検討を行った。その結果、カビ臭生成糸状藻類のP.tenueはT.cucullulusにより摂食速度1030μm・s^<ー1>程度、最大比増殖速度1.61d^<ー1>、また最大個体数1200N・m^<ー1>で捕食、分解され好的食物源となること、T.cucullulusの存在はTON、2ーMIB、クロロフィルa量、濁度、TOC、DOCなどの除去効率を高める上で大きな効果を有すること、2ーMIBの分解は、T.cucullulusの食胞内で観察されるpH4以下で非常に高く、また、高温であるほど、酸との接触時間が長いほど分解能が高まることなどが明かとなった。これらより、糸状藻類を摂食する微小動物等を汚濁湖沼水の生物処理法の接触酸化反応槽内に大量に定着させることができれば、カビ臭物質の分解をエコテクノロジ-的に達成できることを明らかにできた。
吃音の言語訓練の自然性向上のためのコンピュータを用いた支援

発話の障害の一種である吃音の言語訓練では流暢性形成訓練が広く用いられている。流暢形成訓練に含まれる柔らかい声立て(軟起声)の自動判定には従来は立ち上がりにかかる時間が用いられるため、時間をかけた発声が練習される可能性があった。本研究では、立ち上がりにかかる時間によらない音響特徴量から自動判別する手法を開発し、高い判別率を得た。さらに、軟起声の評価を視覚的にフィードバックする言語訓練システムを作成し、それを使って長期的な訓練を行うことによって、軟起声の指示をしない普段の発声でも軟起声を達成することができた。さらに、その発声のさいの構音速度もゆっくりになることを回避できた。吃音は、音や語の一部の繰り返し・引き伸ばし、発話が開始や継続ができなくなる阻止といった中核症状のある言語障害である。言語訓練で一般的に用いられている流暢性形成は発話速度をゆっくりに調整することや、軟起声とよばれる立ち上がりが柔らかな楽な発声などを習得するであるが、訓練施設で行う治療者と対面での練習以外に、自宅でも日常的に練習を行うことが欠かせない。しかし、練習者自身が発声が適切かどうかを判断することは困難であると考えれる。そのため、訓練音声の自動評価やモデル音声の提示が有効であると考えられる。本研究では、吃音の言語治療である流暢性形成法の自宅練習を行いやすくするために、とくに軟起声の発声に着目し、練習者ができているかどうかを自動評価し、訓練するシステムを開発することを目指す。平成26年度では、訓練音声が軟起声かどうかを音響的特徴量から自動判別する手法を開発した。従来は軟起声の音声波形の振幅が緩やかに増加することを利用して声立ての立ち上がりにかかる時間が評価基準として用いられてきたが、ここでは硬起声に比べ軟起声の発声時には倍音成分が相対的に小さいことに着目し、基本倍音と第2、第3倍音の振幅比と、周期性の強さを使って判別することを提案した。それによって言語聴覚士の軟起声、硬起声が良好に判別できることを示した。さらに、治療者ではない非吃音者、吃音者の通常発声、および軟起声を想定した発声を収集し、各音響的特徴量の分布が提案する言語聴覚士の発声をもとにした判別手法が有効であることを示した。また、発話練習のモデル音声として自然な音声合成が有効と考えられるため、さまざまな速さや強調の音声の韻律的特徴を分析し、音声合成につながる知見を得た。発話の流暢性の障害である吃音では、言語訓練として流暢性形成法が用いられ、その効果は実証されているが、流暢性を向上させて日常場面に汎化し効果を継続するには、自宅等での毎日の練習が必要であるが、正しく発話できているかの自己判断は難しい。また、練習した発話パターンは、不自然さのために日常での使用が妨げられることがある。そこで、本研究では、流暢性形成法で指導される、柔らかい声立て(軟起声)に焦点を当て、(1)コンピュータを使った自動評価法を開発する。(2)自動評価の結果をフィードバックしながら練習させることによって、自然性の高い発話パターンが獲得できる練習ソフトウェアを作成し、その効果を評価する。本年度は、自動評価方法をフィードバックするシステムを開発し、その短期的、長期的な効果の検証をした。短期的効果の検証は、吃音者9名、非吃音者6名で実施した。長期的な訓練の検証は吃音者1名について実施し、2名について現在実施中である。前年度開発した軟起声の自動評価方法から、その結果をフィードバックするシステムを開発し、その短期的訓練効果を検証を実施できた。また、自動評価システムをタブレットPCなどに搭載し、長期的な効果の検証を行っているが、練習前後での吃音の軽減への有効性を調べるためにはまだ実施人数が十分とはいえない。言語障害の一種である吃音は、音や語の一部の繰り返し・引き伸ばしと、発話の開始や継続ができなくなる阻止(難発)とを中核症状とし、その他の非流暢も伴う。進展(悪化)に伴い発話困難のため社会参加に影響が及ぶ場合もある。吃音の言語訓練では流暢性形成訓練が広く用いられている。流暢形成訓練に含まれる柔らかい声立て(軟起声)の自動判定には従来は立ち上がりにかかる時間が用いられるため、1音目を不自然に伸ばした発話パターンが練習され、日常で使いにくい印象を与える恐れがある。そこで本研究では、立ち上がりにかかる時間によらない音響特徴量から自動判別する手法を開発した。具体的には、声帯が開いた状態からの起声を軟起声と定義し、発声開始時の音声波形の周期性に関わる特徴量を利用する。臨床経験のある言語聴覚士の軟起声・硬起声を学習データとして用いて高い判別率を得た。また、吃音者および非吃音者に軟起声を教示して発声を比較し、吃音者のほうが有意に軟起声を意図した発声において硬起声で発声した者が多いことを示した。さらに、軟起声の評価を視覚的にフィードバックする言語訓練システムを作成した。それを使って吃音者に長期的な訓練を行った。本システムの使用前の1か月(言語訓練実施中、ベースライン)の後、1か月間は言語訓練と並行して提案システムを使用した練習を行った。

軟起声の指示をしない普段の発声は提案システムの導入前には硬起声に分類されていたが、訓練期間終了後は軟起声に近づいていた。さらに、その発声のさいの構音速度もゆっくりになることを回避できた。発話の障害の一種である吃音の言語訓練では流暢性形成訓練が広く用いられている。流暢形成訓練に含まれる柔らかい声立て(軟起声)の自動判定には従来は立ち上がりにかかる時間が用いられるため、時間をかけた発声が練習される可能性があった。本研究では、立ち上がりにかかる時間によらない音響特徴量から自動判別する手法を開発し、高い判別率を得た。さらに、軟起声の評価を視覚的にフィードバックする言語訓練システムを作成し、それを使って長期的な訓練を行うことによって、軟起声の指示をしない普段の発声でも軟起声を達成することができた。軟起声の自動判別手法についてはその有効性を示すことができた。提案する軟起声の自動判定手法に基づく訓練のさいの自動判別結果の提示方法について、また母音以外発声についても対応する判別手法について研究を進めている。また、短期的な訓練効果について予備的な検討を行っている。今後は長期訓練の実施人数を増し、前年度に引き続き軟起声の自動評価システムの長期的な訓練効果の検証を行う。音声信号処理軟起声についてその自動判別手法を開発した。今後は、自動判別結果を視覚的にフィードバックすることにより発話者の言語訓練を行うシステムを開発する。被験者事件により自動判別結果の効果的な提示方法を検討する。さらに、吃音者を被験者とし、その訓練システムによる訓練効果を検証する予定である。また、軟起声では通常発声に比べ音量が小さくなることが考えられるため、練習発声の音量を視覚的にフィードバックすることによる訓練効果も検討する。開発した自動評価システムによる言語訓練の長期効果の検証では、まだ実施人数が少ないためである。言語訓練で使用するPCの購入を予定していたが、研究協力者が少ないためまだ必要となっていない。これまで、軟起声の自動判定の手法を開発し、その訓練効果について予備的検討を行ってきた。訓練効果を調べる際は被験者に貸し出すための複数台のパーソナルコンピュータが必要となるが、現段階では貸し出し実験を行っていないため、来年以降にパーソナルコンピュータを購入する予定である。今年度は自動評価システムによる言語訓練の長期効果の検証のためと言語訓練の実施結果を解析するためにPCを購入予定である。また、検証結果の国際会議発表ののための参加費等や、論文投稿のための投稿料と英文校閲のために使用する予定である。言語訓練システムを搭載したパーソナルコンピュータの貸し出しによる長期訓練の効果の検証を行うため、パーソナルコンピュータおよび録音用マイクを購入する。また、評価実験のため、被験者謝金を支出する。研究成果発表として日本音響学会、日本音声言語医学会での発表、雑誌論文への投稿を予定しているため、研究発表費用が必要になる。
生殖障害に関与する性分化遺伝子の解析と初期胚発生過程における分子細胞生物学的解明

1)配偶子形成障害モデルc-kitmutantマウスにおける生殖能障害の解明:遺伝子変異によって胚発生後の胎生期における成長過程から精巣機能が影響を及ぼされる動物の生殖機能を分析した。Spermatogoniaの分化に関与する受容体型チロシンキナーゼレセプターc-kitのmutantマウスを用いて11週齢マウスWBB6F1(wild type)+/+,78個のアミノ酸の欠落があるhetero W/+,アミノ酸の点突然変異をもつhetero W^v/+,機能喪失性,突然変異遺伝子を2個持つW/W^vを使用した。各マウスより精巣細胞を分離し,抗マウスc-kit抗体(CD117)と反応させ,flow cytometryでc-kit陽性細胞率を解析した。また,精巣組織の組織学的検討,c-kit遺伝子発現についても検討した。この結果,W/W^vにおいて精巣重量の減少,精巣組織におけるspermatogenesisの著しい障害,免疫組織化学におけるc-kit発現の抑制RT-PCRによるc-kit mRNA発現の障害が確認された。2)外因性配偶子形成障害モデルマウス作製とその障害機構の解明:外因性の影響因子による配偶子形成障害モデルマウスを作製するために8週齢より12週間の少量doxorubicinの連続投与を行い,生殖能障害のメカニズムとその障害抑制の可能性について検討した。精巣重量はdoxorubicin投与により減少し,組織学的にはspermatogonia以降における減数分裂障害が認められた。免疫組織化学におけるc-kit発現の減少およびRT-PCR法によるc-kit mRNA発現の減少が証明され,c-kit遺伝子発現の抑制による分化障害機構が示唆された。Apoptosisの検討では,meiosisの早期過程におけるapoptosisの増加が認められ,同時にtelomerase活性を検出すると活性の増強が検出された。従って,toxic agentによる配偶子形成障害は,telomerase活性が増強し,障害機構に対抗して反応するが,結果としてapoptosisが生じ,c-kit mRNA発現の障害を介してmeitosisの抑制を生じることが示唆された。生殖障害に関して,特に造精機能障害を伴う重症男性不妊を主徴とする生殖障害の原因としてのこれらのメカニズム及び遺伝子発現状況とその意義について解明することを目的とした。Doxorubicin (DXR)の低容量,長期投与による配偶子形成抑制モデルマウスを作製した。0.15mg/kgのDXRを2回/週を5週間腹腔内投与し,精巣重量抑制,maturation arrestの組織像を呈する実験モデル動物を作製して分析に供した。これに対して以下の病態分析を行った。(1)Spermatogoniaの分化に関与する受容体型チロシンキナーゼレセプターc-kitについて抗マウスc-kit抗体(CD117)を用いた,免疫組織化学的によりc-kit陽性細胞の発現を解析した。また,その各々について精巣からgerm cellを抽出し,RT-PCR法によってmRNA発現の有無と相違を比較検討し,生殖能分析を行った。その結果,精巣重壁の60%減少に伴いc-kit及びc-kit mRNA発現の著しい減少を証明した。(2)テロメラーゼ活性を数値化可能で定量性に優れた,Non-RIであるFluorescence-based TRAP法(F-TRAP法)を川いて,マウス精巣細胞のテロメラーゼ活性の定量を行い,この方法の有効性や問題点を検討した。テロメラーゼ活性は長期投与マウスではすでに減少し,細胞死プログラミングの終末像を呈した。(3)組織内におけるアポトーシス細胞の検出のためterminal deoxynucleotidyltransferase (TdT)を用いて,断片化したDNA末端を組織化学的に検出するTUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)法での分析を行った。DXR投与によりアポトーシス細胞の増加を示した。次に,配偶子形成障害モデルに対して,障害を抑制または解除することを日的として,障害メカニズムの制御に作用する薬剤の投与をDXRと同時投与するモデル動物を作製し,同様の病態解析実験に供した。DXRを同様に投与しつつ同時に予備飼育時より15週間TJ41(補中益気湯)1,2,4g/kg,TJ7(八味地黄丸)1,2,4g/kg,GTE(green tea extract)0.2,0.5g/kgを各々経口投与した。さらにDXRは投与せずにTJ41 2g/kg,TJ7 2g/kg,GTE 0.5g/kgを各々単独投与して比較検討し,総計130匹(精巣260個)の検体を分析した。(1)c-Kit及びc-kit mRNA発現はともにDXRによる発現低下を抑制していた。その効果は精巣重量の減少と同様の推移を示したが,とくにTJ41 2g/kg以上において発現低下を全面的に抑制した。(2)テロメラーゼ活性はDXR単独群より高い活性を示した。(3)アポトーシス細胞の数的比較から減少を示した。これらの結果からmaturationarrestの病態像を示すモデル及びその抑制実験においてテロメラーゼ活性の亢進とその後の低下,アポトーシスの亢進が生じ,精子形成の分化過程においてもc-kit mRNA発現の減少を介して障害が発生することを示した。
限られたアミノ酸のみから原始タンパク質が構築できるか？

当該年度では、まず一部の残基がD-アミノ酸となった場合の[GADV]-タンパク質の立体構造について、MDシミュレーションによって推定した。D-アミノ酸の出現確率が50%の場合に加え、確率が25%、12.5%の場合についても計算を行った。これらの検討の結果、D-アミノ酸の含まれる割合が高くなればなるほどアミノ酸鎖が二次構造を形成する頻度が下がる傾向にあることが示された。この結果は、「アミノ酸がラセミ体で存在する環境」と「アミノ酸の一方の光学異性体が多い環境」では後者のほうが何らかの構造をもったタンパク質を構築しやすいことを示唆しており、この立体構造形成能の違いが一種の淘汰圧として働いて、生体におけるホモキラリティの起源となった可能性が考えられる。また、タンパク質中におけるアミノ酸の立体反転機構について、量子化学計算を用いて明らかにした。どのような環境下でアミノ酸の立体反転が起こるのか、その立体障壁はどのくらいかを量子化学計算によって求めた。その結果、水分子やリン酸イオンなどが立体反転の触媒となり得ることや、反転することがよく知られているアスパラギン酸のみならずグルタミン酸も反転する可能性があることなどが示唆された。さらに[GADV]-タンパク質以外にも、バリンの代わりにセリン(S)を含めた[GADS]-ペプチドの立体構造についてもMDシミュレーションを用いた解析を行っている。疎水性残基が多いペプチドほど二次構造をとる傾向が高いことは事前に想定できたため、溶媒接触可能表面積や極性表面積を用いて、水溶性と立体構造とのバランスを評価した。これらについてはおおむね加えた残基の性質に応じて立体構造形成能や表面積が増加・減少する傾向にあった。また、既知タンパク質(酵素)の一部のアミノ酸を変異させる研究も行っており、おおむね実験的に得られた酵素活性を再現する結果が得られた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、限られたアミノ酸のみを含むアミノ酸鎖をコンピュータ上でランダムに作成し、分子シミュレーションによってその立体構造を推定した。アミノ酸セットとしてはグリシン・アラニン・アスパラギン酸・バリンのGADVセットと、GADVのバリンをセリンに置き換えたGADSセットを用いた。これらのアミノ酸は原始地球環境下で非酵素的に合成可能であったと考えられており、地球上での生命の起源に関与するアミノ酸であると考えられている。シミュレーションの結果、GADVのみを含むアミノ酸鎖では二次構造を形成する能力がある程度確保できることが示された。GADSでは二次構造形成能は低いものの、水溶性を保ったまま何らかの立体構造を構築することが可能であることが示唆された。これらの結果は、限られたアミノ酸のみでもタンパク質として機能する高分子鎖が構築可能であることを示している。また、これらのアミノ酸鎖のアミノ酸残基をランダムにD-体に置き換えたペプチドについても作成したが、D-体を含有する鎖では二次構造形成能が著しく低下することが分かった。これらの計算に先立って、分子シミュレーションが短いアミノ酸鎖の立体構造予測に使用できるかどうかのベンチマークテストについても行った。これまでに実験的に立体構造が解明されている小さいタンパク質に対して分子シミュレーションを行い、実験構造を再現できるかどうかについて評価を行った。その結果、20残基程度のタンパク質であれば少なくとも二次構造形成については再現できることが示された。従って本研究で用いた手法の妥当性が指示されたことになる。本年度においては、アミノ酸を限定した場合の高分子鎖において二次構造がどれだけ形成されうるかを推定した。さらに限定アミノ酸セットを変えたときの二次構造形成能や水溶性の変化についても見積もり、原始タンパク質を構成する要素についての推測を行った。また、現在タンパク質を構成するアミノ酸のみならず、現存するタンパク質では構成要素と見なされていないD-アミノ酸についても鎖に含む場合を検討し、それらが生体の構成要素から除外された理由について考察した。これらの計算に際して、用いた手法の妥当性についても評価しており、研究結果の信頼性を確保するための操作も行っている。そのため研究はおおむね順調に進展していると考えられる。

疎水性残基が多いペプチドほど二次構造をとる傾向が高いことは事前に想定できたため、溶媒接触可能表面積や極性表面積を用いて、水溶性と立体構造とのバランスを評価した。これらについてはおおむね加えた残基の性質に応じて立体構造形成能や表面積が増加・減少する傾向にあった。また、既知タンパク質(酵素)の一部のアミノ酸を変異させる研究も行っており、おおむね実験的に得られた酵素活性を再現する結果が得られた。今後の研究については、まず本年度の成果をふまえてさらに拡張していく予定である。限定アミノ酸セットについて、これまでに検討していないセット(例えばグルタミン酸を加えたセットなど)についても計算し、二次構造形成能を向上させるような組み合わせを探索する。また現在存在するタンパク質の用いていないアミノ酸についての検討も進め、現在の約20種類のアミノ酸がタンパク質形成に果たす役割について推定する。また、これまでに行ってきたランダムにアミノ酸をつないだタンパク質の計算に加え、現存するタンパク質を元にアミノ酸を減らして作成した人工タンパク質のシミュレーションも行う。このようなタンパク質は複数報告されているが、これらに対してシミュレーションを行うことでタンパク質としての立体構造および機能を確保するために必要な相互作用ネットワークを見出す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
初期神経発生におけるSOX因子の転写調節ネットワークの小型魚類を利用した解析

本研究は、ゼブラフィッシュのモデル生物としての特徴を生かして、初期発生におけるグループB1 SOX因子の転写調節ネットワークを解析し、特に初期神経発生におけるグループB1 SOX因子の役割を解明することを目的に計画された。グループB1 Sox遺伝子は、神経誘導に伴って発現が開始されることから、初期発生、特に神経系の発生に重要であると考えられるが、loss of functionによる解析が充分には行われていないことから、本研究ではmorpholinoアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたノックダウンによるloss of function解析を体系的に行った。初期胚で働くsox2, 3, 19a, 19bについて、1遺伝子ずつをノックダウンした場合は、ほとんど胚発生に影響を与えなかった。3遺伝子までの同時ノックダウンでは、軽微な胚発生の異常が見られるだけであったが、4遺伝子を同時にノックダウンすると、初期発生のパターニングと中枢神経系の形成に著しい異常が見られた。この発生異常は、いずれかのmRNAを同時に導入することでかなり軽減されることから、各遺伝子の分子機能に大きな違いはなく、各遺伝子の個性は主に発現パターンの違いに由来すると考えられる。4遺伝子ノックダウン胚で、遺伝子発現にどのような変化が生じているかを、RT-PCR法、in situハイブリダイゼーション法などで調べたところ、背腹軸の決定に関わる遺伝子群、胚の収斂伸長運動に関わる遺伝子群の発現に変化が見られ、これらが胚の形態異常の原因であることが分かった。また、神経発生のごく初期の細胞分化に関わる遺伝子群が発現されないことが判明した。これは、グループB1 SOX因子が神経系の発生に必須の因子であることを示している。本研究は、小型魚類であるゼブラフィッシュのモデル生物としての特徴を生かして、初期発生におけるグループB1 SOX因子(SOX1/2/3/19)の転写調節ネットワークを解析し、特に初期神経発生におけるグループB1 SOX因子の役割を解明することを目的に実施する。グループB1 Sox遺伝子は、神経誘導に伴って発現が開始されることから、初期発生、特に神経系の発生に重要であると考えられるが、loss of function(機能欠損)による解析が充分には行われていないことから、本研究ではmorpholinoアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたノックダウンによるloss of function解析を体系的に行う。初期胚で働くsox2,3,19a,19bについて、一遺伝子ずつをノックダウンした場合は、ほとんど胚発生に影響を与えなかったが、4遺伝子を同時にノックダウンすると、中枢神経系の形成をはじめとして胚発生に著しい異常が見られた。一方、上記のいずれかのB1 soxをノックダウンすると、その遺伝子の発現がRNAレベルで上昇することが分かった。これには、タンパク質の発現レベルを保とうとするフィードバック制御が働いていると思われる。さらに興味深いことに、この時、直接ノックダウンを行っていない他のB1 soxの発現もRNAレベルで上昇していることが分かった。したがって、フィードバック制御のメカニズムは、B1 soxの活性の総和に対して働いていると考えられる。また、一遺伝子のノックダウンが胚発生に与える影響が少ないのは、他の遺伝子が通常以上に発現されることによるものと思われる。

グループB1 Sox遺伝子は、神経誘導に伴って発現が開始されることから、初期発生、特に神経系の発生に重要であると考えられるが、loss of function(機能欠損)による解析が充分には行われていないことから、本研究ではmorpholinoアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたノックダウンによるloss of function解析を体系的に行う。初期胚で働くsox2,3,19a,19bについて、1遺伝子ずつをノックダウンした場合は、ほとんど胚発生に影響を与えなかった。3遺伝子までの同時ノックダウンでは、軽微な胚発生の異常が見られるだけであったが、4遺伝子を同時にノックダウンすると、初期発生のパターニングと中枢神経系の形成に著しい異常が見られた。4遺伝子ノックダウン胚で、遺伝子発現にどのような変化が生じているかを、RT-PCR法、insituハイブリダイゼーション法などで調べたところ、背腹軸の決定に関わる遺伝子群、胚の収斂伸長運動に関わる遺伝子群の発現に変化が見られ、これらが胚の形態異常の原因であることが分かった。また、神経発生のごく初期の細胞分化に関わる遺伝子群が発現されないことが判明した。これは、グループB1 SOX因子が神経系の発生に必須の因子であることを示している。
フランス会社法とコーポレート・ガヴァナンス

わが国におけると同様にフランスにおいても、コーポレート・ガブァナンスに関わる会社法の改正が頻繁になされている。本研究では、それらの改正立法の内容を改正の経緯とそれに対する学説の対応も含めて検討し、その成果を公表してきた。それらの検討にもとづいてさらに、現在とくに最後の2004年の改正に関わる有価証券制度の変遷および展開と改正の意義についての研究をまとめるべく準備をすすめている。検討の対象としたのは以下の改正立法である。2003年度は主に、フランス会社法制の改正動向を検討し分析する作業を行なった。その研究成果の一端は、すでに、「海外金融法の動向/フランス」金融法研究19号(金融法学会、2003年6月)125-135頁として公表した。フランスでは近年法典化の作業が進められており、その一環として制定された「通貨金融法典(Code monetaire et financier)」をここではとり上げた。さらに、日仏法学23号に掲載予定の論稿として、「商法典-高法典の法律の部に関する2000年9月18日のオルドナンス第2000-912号」と「NRE-新たな経済の制御に関する2001年5月15日の法律第2001ー420号」という二つの立法紹介の原稿をすでに提出している。前者はやはり、法典化作業の一環としてあらためて制定された商法典を対象にして、その内容を紹介し、法典化の意義と問題点を検討したものである。後者は、金融法、競争法、会社法などの広範の経済法制に関わる改正立法を紹介し検討したものである。いわゆる「コーポレート・ガヴァナンス」の問題として議論されてきた内容も、そこでの会社法改正に反映されている。フランスではさらに、金融安全の2003年8月1日の法律第2003-706号によって、会社法その他の企業法制にとって重要な改正がなされている。今後とも立法動向の検討を進めるとともに、判例法の展開も対象に含めて研究を進めたい。わが国では会社法の改正が最近頻繁になされているが、フランスでも同様に会社の改正が頻繁になされている。本研究では、そのような最近のフランス会社法の改正動向を、それぞれの改正立法ごとに、改正の背景と改正の内容、さらには改正に対するその後の評価を相互に関連させて検討することを通じて、フランス会社法の立法動向、あるいは、フランスにおけるコーポレート・ガヴァナンスに関する法制度の動向を動態を明らかにすることを目的にして研究を進めた。本年度は、(1)商法典を改めて制定しそこに会社法規定も取り込んだ「商法典の法律の部に関する2000年9月18日のオルドナンス第2000-912号」、(2)会社法だけではなく競争法制、証券取引法制も対象にしているが、会社法に関しても株式会社の一層制の機構に執行と監督を分離させる可能性を導入するなどコーポレート・ガヴァナンスに直接に関わる内容をもつ「新たな経済の制御に関する2001年5月15日の法律第2001・420号」、(3)アメリカのエンロン事件等を契機にして資本市場に対する信頼回復を目的にして制定された「金融の安全性についての2003年8月1日の法律第2003-706号」、さらに、(4)株式会社が発行する有価証券制度の整備をはかった「商事会社が発行する有価証券の制度の改正を定める2004年6月24日のオルドナンス第2004-604号」に関して研究を進めあるいは研究成果を公表した。すなわち(1)ないし(3)に関しては、下記のように研究成果を公表しており、(4)に関しても現在、研究成果を公表するべく準備中である。