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カント『純粋理性批判』超越論的弁証論の研究

本研究は、イマヌエル・カント『純粋理性批判』(1781/87年)の「超越論的弁証論」に関する総合的研究である。弁証論に現われる3つの特殊形而上学(心理学・宇宙論・神学)に対するカントの批判的議論の哲学的内実を分析することで、観念論論駁、自由論、存在の根拠の問題などに関するカントの哲学的思索に迫ることができた。またこれによって、弁証論全体をつらぬくカントの理性批判あるいは仮象批判の方法論の一端を明らかにしえた。本研究は、カント『純粋理性批判』のなかの「超越論的弁証論」に関して、その三つの特殊形而上学のテーマ(心理学を批判する誤謬推理論、宇宙論を批判するアンチノミー論、神学を批判する理想論)の諸問題を解明するとともに、弁証論全体の方法論的本質を明らかにすることをめざしている。19年度は、前者の個別的なテーマの諸問題に関して、基礎的・準備的な研究をすすめた。とりわけ、「神の存在証明」を批判する「理想論」を箇所を、存在論的な観点から解読するとともに、そこにこめられたカントの仮象批判の戦略を解明する作業にあてられた。また「神の存在証明」をめぐっては、前批判期から『純粋理性批判』にいたる発展史的な研究も作業中である。なお、このテーマに関しては今後さらに研究を進めて、20年度中に研究論文として発表する予定である。アンチノミー論に関しては、その第三アンチノミーにおける「自由」の問題について、「理性と普遍性-カントにおける道徳の根拠をめぐって」(仮題、近刊予定)において倫理学的な観点から解明をこころみ、また「根拠」をめぐるカント哲学的思考様式に若干の見通しをつけたところである。訳と解題を発表した「ゲッティンゲン書評」は、『純粋理性批判』を「観念論」だと批判して、カントをして「第四誤謬推理」の全面改訂と「観念論論駁」の執筆へと駆り立てたものであり、誤謬推理論の研究の基礎資料となるものである。共著書に寄稿した「カントの空間論・序説-身体・開闢・感情」(『形と空間のなかの私』)なども足掛かりにして、今後、観念論の問題にさらに迫っていきたいと思っている。本研究は、誤謬推理論/アンチノミー論/理想論についての個別的な研究と、弁証論全体の方法論に関する研究とからなるが、20年度は、前年度からひきつづき個別的なテーマに関する研究が中心となった。理想論については、とくに宇宙論的証明に対する批判に焦点をあわせて解明を試み、「神の現存在の宇宙論的証明に対するカントの批判について」と題して口頭発表し、カント研究者諸氏からコメントを寄せてもらった。この発表は、カントの理想論、とりわけ宇宙論的証明批判のもつ弁証論的理性批判としての方法論的意義を明らかにしつつ、そこに託されたカントの新たな存在論構想への転回を展望したものである。この成果をさらに発展史的知見で充実させ、論文Fとして仕上げることが21年度の課題となる。アンチノミー論については、とくに第三の自由アンチノミーがテーマであったが、『岩波講座哲学06モラル/行為の哲学』所収の「理性と普遍性-カントにおける道徳の根拠をめぐって」において、自由アンチノミーについて、その行為論的な射程を示し、倫理的含意を解明することによって、その思想構造に関して一定の見通しを得たところである。誤謬推理論については、とくに第四誤謬推理(観念論批判)に関して、『人文学の生まれるところ』所収の「哲学-観念論とはなんだったのか?」において、カントの観念論と観念論批判の意味について、原理的な観点から論及を試みた。これに文献的な裏付けを与え、カント研究として結実させることが今後の課題である。20年度の研究では、弁証論の個別テーマに関して一定の解明が進められたが、なお発展史的な文献の裏付けなどに課題を残すところもあり、21年度の研究に期するものである。本研究は、カント『純粋理性批判』の超越論的弁証論に関して、心理学・宇宙論・神学の三つの形而上学批判の諸相を解明し、さらに弁証論をつらぬく理性批判の方法論的意義を明らかにしようとするものである。本年度は理想論(神学)に関する研究をとりまとめ、論文「神の現存在め宇宙論的証明に対するカントの批判について」として発表することができた。これはカントの宇宙論的証明批判を、第四アンチノミーなどとも関わる弁証論の文脈におきいれて理解し、弁証論的理性に対する批判として読み解くものである。このような批判をとおして存在論的なユートピアを解体し、分析論における新たな様相論へと展開していく批判哲学の軌跡を、描きだすことができた。カントの弁証論の方法論的意義に関しても、この研究によって一定の見通しを得たところである。

さらに、弁証論研究の射程を『実践理性批判』の弁証論にまでひろげ、実践理性における徳と幸福のアンチノミーを考察し、その成果をカント協会でのシンポジウムで「カントにおける幸福のパラドクス-幸福主義批判と最高善とのあいだ」と題して発表した(これは『日本カント研究』(近刊)に収録)。このような実践的な弁証論もまた、カントの弁証論を総合的に理解するためには欠かせない観点であろう。誤謬推理論における観念論の問題についても研究を進めているが、これは22年度からの科研費「近代哲学史のなかのカント理論哲学-対話的哲学史の試み」でも継続し、デカルト対カントという観点から研究をまとめる予定である。今後とも、弁証論研究を続行し、弁証論に関わるこれまでの拙論をとりまとめ、さらにはあらたに数本の論文を発表し、最終的には弁証論に関する単著として刊行する所存である。
ＥＭＭＰＲＩＮを標的とした頭頸部癌治療法の検討

EMMPRIN/CD147による腫瘍形成機序の検討の結果、S100A9タンパク質とEMMPRIN/CD147との相互作用が頭頸部癌細胞の遊走能を誘導することを確認した。また、EGFRおよびEMMPRINいずれの阻害によっても細胞増殖、遊走能の抑制効果がみられたが、同時阻害により、それらの効果は増強することが確認され、EMMPRIN/CD147の阻害によりEGFR標的治療効果が増強されることが示唆された。また臨床検体における検討では、Stage I,IIの舌癌において、浸潤最深部の癌胞巣におけるEMMPRIN/CD147の発現が潜在的頸部リンパ節転移を予測する独立した因子となる可能性が示された。CD147/EMMPRINの頭頸部癌における機能解明のため、EMMPRINのリガンドとして注目されるサイクロフィリンAが頭頸部癌細胞に対して及ぼす影響の検討がなされた。この結果サイクロフィリンAはEMMPRINとの相互作用により頭頸部癌細胞の浸潤能や薬剤耐性を亢進することが明らかとなった。またEMMPRINを標的とした頭頸部癌治療の有効性とより効率的な戦略を検討するため、これまで明らかとしてきたEMMPRINの腫瘍促進能に加え、頭頸部癌細胞における他の癌促進因子との関連性を検討した。この結果、EMMPRINは頭頸部癌において近年主要な標的分子として注目されるEpidermal Growth Factor Recepter(EGFR)によってその発現が導かれるのみでなく、EGFRによって誘導されるMMP産生および細胞浸潤能を媒介することが明らかとなった。また、EMMPRINの阻害は、頭頸部癌細胞の細胞増殖能および細胞遊走能を抑制し、さらにこれらの抗腫瘍効果はEGFRとの同時阻害により増強されることが分かった。またEMMPRINの頭頸部癌におけるより臨床的な役割を検討するため、舌癌の頸部リンパ節転移と原発腫瘍におけるEMMPRINの発現の相関が検討された。この結果、臨床的にリンパ節転移なしと判断された舌癌症例の潜在的頸部リンパ節転移に、原発腫瘍におけるEMMPRINの発現が関与する可能性が示唆された。頭頸部癌におけるEMMPRINの機能解析を目的に、まず頭頸部扁平上皮癌細胞株におけるEMMPRINの腫瘍形成に対する機序の解明を試みた。最初に、EMMPRINを介した腫瘍形成能の促進の引き金となる因子の同定のため、頭頸部癌細胞にEMMPRINのリガンドのひとつであるサイクロフィリンAを作用させた。この結果、サイクロフィリンAは頭頸部扁平上皮癌細胞の増殖能に加え、MMP-9産生の促進および頭頸部癌に対する重要な治療薬であるシスプラチンへの耐性を引き起こすことが明らかとなった。またサイクロフィリンAは細胞浸潤も誘導するが、この細胞浸潤能の増加はEMMPRINの阻害により消失した。この結果はEMMPRINとサイクロフィリンAの相互作用が腫瘍形成能に重要な働きを持っていることを示すものであった。次に、EMMPRINと他の癌促進因子との関わりを検討した。近年頭頸部癌においてもEGFRを標的とした分子標的薬が使用されているが、これまでEMMPRINとEGFRの相互関係は明らかとなっていない。このため実験ではEGFRとEMMPRINの関係について検討を行った。この結果、EGFR刺激はEMMPRINの発現を誘導し、この誘導されたEMMPRINがEGFRによって導かれる頭頸部癌細胞のMMPの産生および細胞浸潤を媒介してることが示された。さらに、EMMPRIN阻害による抗腫瘍効果を検討した。siRNAまたはEMMPRIN機能阻害抗体によりEMMPRINを阻害した結果、頭頸部癌細胞の分化能および遊走能が抑制され、EMMPRINが頭頸部癌治療の新たな標的となりうる可能性が示された。またこれらの抗腫瘍効果はEGFRとの同時阻害により増強されることが認められ、今後の頭頸部癌治療への応用が期待される結果となった。頭頸部癌進展に対する炎症反応を介したCD147/EMMPRINの関与を検討するため、炎症に関与し、かつCD147/EMMPRINの特異的リガンドとして報告されたS100A9とCD147/EMMPRINの相互作用について検討した。この結果、S100A9による刺激により頭頸部癌細胞の増殖能と浸潤能が亢進することが確認されたが、この浸潤能の亢進はCD147/EMMPRIN阻害剤により消失した。この結果から、S100A9とCD147/EMMPRINの相互作用が頭頸部癌進展に寄与し、CD147/EMMPRINが炎症環境下における頭頸部癌進展に関与することが示唆された。

また、頭頸部癌転移に対するCD147/EMMPRINの関与を検討する目的で、早期舌癌の臨床検体を用い、原発腫瘍におけるCD147/EMMPRINと頸部リンパ節転移に関する検討を行った。この結果、原発腫瘍におけるCD147/EMMPRINの発現と頸部リンパ節転移に相関性が示された一方、CD147/EMMPRINの発現と腫瘍細胞の分化型や脈管浸潤、リンパ管浸潤、神経周囲浸潤などとは有意な相関を示さず、CD147/EMMPRINが早期舌癌の頸部リンパ節転移の独立した予測因子となる可能性が示唆された。さらに、頭頸部癌細胞におけるCD147/EMMPRINを介した細胞内シグナル伝達の解明を目的に、頭頸部癌細胞におけるCD147/EMMPRINをノックダウンし、主要なシグナル伝達因子の変化を検討した。この結果、RAS/MAPKカスケードの関与が示唆された。医歯薬学これまでに頭頸部癌細胞におけるEMMPRINのcyclophilin Aを介した新たな腫瘍促進機序の解明が行われた。また頭頸部癌におけるEMMPRINとEGFRとの関連を解明し、これに基付きEMMPRINを標的とした効率的な頭頸部癌抑制効果の検討がなされた。さらに臨床検体におけるEMMPRINの発現と予後との検討が行われ、頭頸部癌における予後不良因子としてのEMMPRINの可能性が示唆されている。サイクロフィリンAによるEMMPRINの活性化による細胞増殖、MMP産生、薬剤耐性など腫瘍形成に関わる諸現象への検討などが行われ、頭頸部癌におけるサイクロフィリンAとEMMPRINの相互関係が明らかとなった。また、EMMPRIN阻害による抗腫瘍効果が検討され、EMMPRIN阻害による増殖、遊走、MMP産生など抗腫瘍効果の確認がなされた。このほか、主要な腫瘍促進因子であるEGFRとの相互関係も検討され、今後の頭頸部治療に対する可能性が示されている。近年、慢性炎症としての肥満と癌の関連が指摘されるなど、癌と炎症反応との関連が注目され、その機序の解明が進んでいる。このことからEMMPRINが頭頸部癌において果たす炎症反応への役割を検討することは、EMMPRINを標的とした新たな治療戦略につながる可能性が期待される。今後はEMMPRINを介した細胞内シグナル伝達の解明と同時に、炎症関連因子などとの相互関係を解明し、EMMPRINを標的とした頭頸部癌治療の可能性を検討したい。EMMPRINを介した細胞内シグナル伝達についての検討を行い、頭頸部癌細胞内でのEMMPRINの作用機序の詳細な解明を試みる。またこの結果に応じ、EMMPRINを標的とした際の効率的な抗腫瘍効果獲得の検討を行う。さらに動物モデルにおけるEMMPRINの腫瘍形成に対する効果を検討する。これに加え、臨床検体におけるEMMPRINの発現を検討しその臨床的意義を調査する。この結果と基礎的検討の結果を踏まえ、EMMPRINを治療標的とする効果を検討する。EMMPRINに関連する細胞内シグナル伝達の解明を行い、この結果をもとに頭頸部癌抑制に対するEMMPRINの阻害効果の検討を行う計画であったが、EMMPRINとEGFRとの関連が明らかとなったため、これらの分子の阻害効果の検討が先行された。このため、当該年度内に細胞内シグナル伝達の解明に必要とされる各種抗体、試薬の購入がなされなかったため。
カテコ-ルアミン関連酵素DNAプロ-ブによる遺伝性精神神経疾患の遺伝子解析

カテコ-ルアミン系神経伝達物質(ド-パミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)のヒトの生合成酵素のDNAプロ-ブを用いて、遺伝性精神・神経疾患の発症の分子機構の解明を目指している。これまでに、クロ-ニングしたヒト・チロシン水酸化酵素(hTH)、ヒト・ド-パミンβー水酸化酵素(hDBH)、ヒト・フェニルエタノ-ルアミンNーメチル基転移酵素(hPNMT)のDNAプロ-ブを用いて、遺伝子異常の解明とモデル動物及び分子診断法の確立を試みる。平成2年度にヒト・ド-パ脱炭酸酵素(hDDC)のcDNAをクロ-ニングすることに成功し、4種のカテコ-ルアミン生合成酵素全てのDNAプロ-ブをそろえた。(1)hDDCcDNAは、全長1932塩基で、480アミノ酸からなる分子量53.891のタンパク質を規定していた。予想される補酵素ピリドキサルりん酸の結合部位周辺のアミノ酸配列は、ヒト、ブタ、ハエで完全に一致していた。(2)hTHmRNAの多型性を動物について調べた。齧歯目及び食中目では、1型THに対応するmRNAしか検出されなかった。霊長目からは1型及び2型THに反応するmRNAが検出された。(3)hTH遺伝子をC57BL/6マウス受精卵に注入したトランスジェニックスマウス(tg)マウスを作製した。導入遺伝子mRNAは副腎と脳に特異的に発現していた。副腎は対照の5倍、脳は50倍、in situハイブリダイゼ-ションによる解析で中脳黒質と腹側被蓋野に強く発現し、脳の各部位でのTHタンパク量および酵素活性は対照の35倍の増加し、免疫組識化学法の結果も同様であり、この結果hTHの遺伝子発現及びカテコ-ルアミン量について未知の調節機構が働いていることが示唆された。(4)2種類のhDBHcDNA(DBHー1、DBHー3)をサル腎臓COS細胞にトランスフェクトして活性のあるhDBHタンパク質を得ることに成功した。(5)hDDCcDNAをCOS細胞にトランスフェクトションした。発現された酵素の分子量は50kDaであった。本研究は、カテコ-ルアミン系神経伝達物質(ド-パミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)のヒトの生合成酵素のDNAプロ-ブを用いて、遺伝性精神・神経疾患の発症の分子機構の解明を目指している。これまでに、クロ-ニングしたヒト・チロシン水酸化酵素(hTH)、ヒト・ド-パミンβー水酸化酵素、ヒト・フェニルエタノ-ルアミンNーメチル基転移酵素のDNAプロ-ブを用いて、トランスジェニックスマウスによるパ-キンソン病やそううつ病のモデル動物の確立を試みる。我々は、ヒト・ド-パ脱炭酸酵素(hDDC)のcDNAをクロ-ニングすることに成功し、4種のカテコ-ルアミン生合成酵素全てのDNAプロ-ブをそろえることができた。hDDCをヒト褐色細胞腫から均一し、精製酵素をリジルエンドペプチダ-ゼで加水分解して、生じるペプチドフラグメントのアミノ酸配列を気相式アミノ酸シ-クエンサ-により決定した。得られたアミノ酸配列の一つの相補的な38塩基長のDNAを合成し、プロ-ブとし、6x10^5のヒト褐色細胞腫cDNAライブラリ-をスクリ-ニングすることにより、hDDCの全アミノ酸配列を規定している領域を含む完全長cDNAクロ-ンを単離した。単離されたcDNAは、全長1932塩基で、480アミノ酸からなる分子量53.891のタンパク質を規定していた。予想される補酵素ピリドキサルりん酸の結合部位周辺のアミノ酸配列(ーAsnーPheーAsnーProーHisーLysーTrpー)は、ヒト・ブタ・ハエで完全に一致していた。この部位のアミノ酸配列が、基質特異性の決定あるいは本酵素の活性発現に重要な役割を担っていることを意味する。また、hTHを導入したトランスジェニックマウスの作製にも成功しており,現在hTHの発現量の発現部位等について検討中である。家族性パ-キンソン病におけるhTHをプロ-ブとして用いた制限酵素断片長多型性の研究では、米国の患者において制限酵素断片の変化を見つけたので、家系分析を行なうための試料を採集中である。

霊長目からは1型及び2型THに反応するmRNAが検出された。(3)hTH遺伝子をC57BL/6マウス受精卵に注入したトランスジェニックスマウス(tg)マウスを作製した。導入遺伝子mRNAは副腎と脳に特異的に発現していた。副腎は対照の5倍、脳は50倍、in situハイブリダイゼ-ションによる解析で中脳黒質と腹側被蓋野に強く発現し、脳の各部位でのTHタンパク量および酵素活性は対照の35倍の増加し、免疫組識化学法の結果も同様であり、この結果hTHの遺伝子発現及びカテコ-ルアミン量について未知の調節機構が働いていることが示唆された。(4)2種類のhDBHcDNA(DBHー1、DBHー3)をサル腎臓COS細胞にトランスフェクトして活性のあるhDBHタンパク質を得ることに成功した。(5)hDDCcDNAをCOS細胞にトランスフェクトションした。発現された酵素の分子量は50kDaであった。カテコ-ルアミン系神経伝達物質(ド-パミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)のヒトの生合成酵素のDNAプロ-ブを用いて、遺伝性精神・神経疾患の発症の分子機構の解明を目指している。これまでに、クロ-ニングしたヒト・チロシン水酸化酵素(hTH)、ヒト・ド-パミンβー水酸化酵素(h DBH)、ヒト・ド-パ脱炭酸酵素(hDDC)、ヒト・フェニルエタノ-ルアミンNーメチル基転移酵素(h PNMT)、のcDNAプロ-ブを用いて、遺伝子異常の解明とモデル動物及び分子診断法の確立を試みる。(1)hTH遺伝子をC57BL/6マウス受精卵に注入したトランスジェニックス(tg)マウスを作製した。導入THのmRNA発現量は副腎では対照の5倍、脳では50倍であった。in situハイブリダイゼ-ションによる解析では導入遺伝子は中脳黒質と腹側被蓋野に強く発現していた。脳の各部位でのTHタンパク量および酵素活性は対照の35倍の増加で、免疫組織化学法の結果も同じ傾向を示した。またカテコ-ルアミン量は対照に比べ有為な差はなかった。このtgマウスではhTHの遺伝子発現及びカテコ-ルアミン量について未知の調節機構が働いていることが示唆された。(2)2種類のhDBHcDNA(DBHー1、DBHー3)は、6塩基異なり304番目のアミノ酸がDBHー1のではアラニン、DBHー3ではセリンとなり、サル腎臓COS細胞にトランスフェクトして、活性のあるhDBHタンパク質を得ることに成功した。(3)hDDCcDNAをCOS細胞にトランスフェクションした。この酵素はLーDOPA、Lー5HTPおよびLーthreoーDOPSを脱炭酸した。LーDOPAに対する至適pHは6.5であったがLー5HTPに対してはより広範囲なpH領域で活性を示した。LーDOPA、Lー5HTPのいずれを基質とした場合もPLPの添加により活性は大きく上昇した。
日本産ゾウムシ上科甲虫のモノグラフ作成とデータベース構築

1)ゾウムシ上科のモノグラフ九州大学農学部昆虫学講座所蔵の日本および東南アジア産ゾウムシ標本を分類順に配列整理し直して,モノグラフ執筆の準備を進めている.現在までにクチカクシゾウ亜科,カレキゾウ亜科,アナアキゾウ亜科の520種21,000点の整理を終了した.これと平行してクチカクシゾウ亜科のモノグラフ原稿を執筆中で,既知種102種が165種に増加する.また,この亜科の分類体系の再検討を目的として詳細な比較解剖を行っており,現在までに12属が終了した.原稿は本年8月までに仕上げ,日本昆虫学会発行の「The Insects of Japan」シリーズに公表の予定である.2)データベース構築1.タイプ標本に関する調査.日本から記載されたタイプ標本類の調査は,今までにロンドンとパリの自然史博物館で行っており,今回北海道大学と国立科学博物館所蔵のタイプ標本類116種を調べたので,ホロタイプの指定と登録を準備中である.2.文献類の収集.アジア産のゾウムシ類に関係する文献目録の作成と収集を継続しており,分類関係の収集はほぼ完了した.1)ゾウムシ上科のモノグラフ九州大学農学部昆虫学講座所蔵の日本および東南アジア産ゾウムシ標本を分類順に配列整理し直して,モノグラフ執筆の準備を進めている.現在までにクチカクシゾウ亜科,カレキゾウ亜科,アナアキゾウ亜科の520種21,000点の整理を終了した.これと平行してクチカクシゾウ亜科のモノグラフ原稿を執筆中で,既知種102種が165種に増加する.また,この亜科の分類体系の再検討を目的として詳細な比較解剖を行っており,現在までに12属が終了した.原稿は本年8月までに仕上げ,日本昆虫学会発行の「The Insects of Japan」シリーズに公表の予定である.2)データベース構築1.タイプ標本に関する調査.日本から記載されたタイプ標本類の調査は,今までにロンドンとパリの自然史博物館で行っており,今回北海道大学と国立科学博物館所蔵のタイプ標本類116種を調べたので,ホロタイプの指定と登録を準備中である.2.文献類の収集.アジア産のゾウムシ類に関係する文献目録の作成と収集を継続しており,分類関係の収集はほぼ完了した.
歯髄のプラスミンによるＣＯＸ－２産生シグナルとＰＫＣの活性化

本研究の目的は、plasminによるCOX-2産生シグナルにおけるPKCの関与について解明することにある。結果としてplasminによるCOX-2産生は、細胞内カルシウムプールからのカルシウムイオンの放出と細胞外からの流入により構成されることが推察された。また、COX-2産生にはPKCシグナルが関与することが示唆された。申請者はこれまでに、ヒト歯髄培養細胞においてPlasminがProtease activated receptor-1を介してCOX-2の産生を促進することを報告し、炎症反応を惹起することを示してきた。またそれには細胞内カルシウムイオン濃度([Ca2+]i)の上昇と、シグナル伝達過程においてcalcineurinが関与することまで明らかにした。[Ca2+]iは細胞外からのチャネルを介したCa2+の流入もしくは細胞質内カルシウムストアからの放出のバランスにより調節されており、シグナル伝達に関与するCa2+の由来を同定することはPlasminによる炎症誘発システムの解明に有用であると考えられる。そこで本研究では[Ca2+]i動態を細胞外からの流入・小胞体からの放出を分けて検討し、それによるCOX-2タンパク質産生量の変化を検索した。またカルシウムシグナルに深く関与するProtein Kinase C (PKC)の関与についても検討を行った。その結果、細胞外Ca2+非存在下においてもPlasminは[Ca2+]iの上昇を引き起こすが有意に減少し、さらにCOX-2タンパク質発現を抑制した。これは、PlasminによるCOX-2タンパク質発現には主に細胞外からの流入によるCa2+が関与することを意味すると同時に、細胞質内ストアからのCa2+放出メカニズムも存在することが示唆された。細胞外Ca2+非存在下でCa2+小胞体Ca2+-ATPase阻害剤であるThapsigarginは、Plasminによる[Ca2+]iの上昇を抑制した。このことからも、小胞体からの放出されるメカニズムがあると考えられた。PKC阻害剤であるRo31-8220は、PlasminによるCOX-2タンパク質発現を有意に抑制し、PKCシグナルの関与も示唆された。[Ca2+]iの上昇は、細胞質内小胞体カルシウムプールからの放出と、細胞外からチャネルを介した流入がある。プラスミン刺激時の細胞外Ca2+を除去した状態、およびThapsigargin (小胞体膜上のCa2+-ATPase阻害剤)作用時における[Ca2+]i動態、COX-2 mRNA発現量の変化を検索した。PARsシグナルだけでなく、後述するPKCにおいても[Ca2+]iは重要な役割を果たすため、いずれの場合においてもCa2+の由来を明確にする必要があると考えられた。結果として、細胞外カルシウムを除去した状態では、[Ca2+]iの上昇は抑制され、その下流のCOX-2 mRNA発現量の上昇も抑制された。これは、プラスミンによる[Ca2+]iの上昇とそのシグナル伝達は、細胞外カルシウムの流入によるものと考えられた。Ca2+/Cnにより脱リン酸化されたNFATは核内DNAに結合した後、分解されずに再度リン酸化され、細胞質内に移行する(shutlling)という特徴がある。これまでに核内、細胞質内でタンパク質画分を分け、ウェスタンブロット法によりプラスミン作用後のNFAT存在位置の変化を確認した。また、NFATc1 transfactorchemiluminescent kitにてDNA結合能は確認済みであるが、さらに詳細な検討の為ゲルシフトアッセイを行う予定としていた。感度の問題等で思うような結果が得られないが、NFATc1 transfactorchemiluminescent kitにて回数を重ね、有意差を数値化する予定である。PKC活性化剤、阻害剤によるNFAT挙動およびCOX-2、PGE2産生量の変化の検索PKCはジアシルグリセロールやCa2+などにより活性化され細胞増殖、遺伝子発現、受容体制御、アポトーシスなど広範な生理機能を担うことが知られている。また、これまでにPKC活性化剤であるphorbol myristate acetate (PMA)がTNF-aによるuPAの分泌を相乗的に促進することを確認し、炎症反応とPKCシグナルには密接な関係があると考えている。現在プラスミンによって[Ca2+]iが上昇することは分かっており、PKCシグナルの一部も活性化されている可能性が高いと想像できる。さらにPKCがNFATを活性化する報告も多く、10種以上の存在が確認されているPKCのisoformが複雑に関与している可能性があり興味深い。よって今回プラスミンのCa2+/Cn/NFATシグナルに与えるPKC活性化の影響を、相乗効果に焦点を絞り検討する細胞培養後、結果はウェスタンブロット法、ELISA法で求める研究が多く、その為の消耗品に研究費の多くを費やす。すなわち各種試薬、抗体、測定キット等に使用する。保存治療系歯学における研究の為、国内では歯科保存学会(2回)、研究発表を予定しており、学会会場までの旅費を必要とする。
小中学校における一貫性・継続性を考慮した情報活用カリキュラムの基礎研究

小学校や中学校にパーソナルコンピュータ等の情報機器の導入が進み,情報教育の実施環境が整いつつある。しかし,小・中ともほぼ同時といってよい時期にパソコン導入が利用がはじまっているため,そこで行われている情報教育の内容や方法が,同じような内容やレベルで実施されているのが現状である。このままでは,小学校で学習したことがらを中学校でも繰り返すことになりかねない。したがって,小学校から中学校,さらに高校までを視野に入れた,継続性・一貫性のある情報教育のカリキュラムを策定するための基礎研究として,指導要領や教科書などの資料から各教科の内容に含まれている情報活用に関連する内容や学習活動など学習項目の調査分析し,とくに小中学校の理科と中学校数学について,その学習内容と情報活用に関連する項目を検討分析して,関連表を作成した。中学校数学では,いくつかの領域について関連表を作るとともに,これまで開発してきた学習用ソフトを整理し,学習内容や活用場面との対応を明確にした。さらにそれらにもとづいて,10の実践研究授業を実施した。小学校理科では,物理領域,化学領域,生物領域,地学領域および4領域に係わる学習内容で,「情報の収集・選択」「情報の分析・整理・理解」「情報の判断・創造」「情報の伝達」の4つの情報活用のどの部分が扱えるかを関連表としてまとめた。中学校理科においても,第一分野と第二分野で同様の関連表を作成した。また,小学校理科においても,情報活用能力のうち,とくに情報の創造と伝達に主眼をおいてネットワークによって情報交流をする実践研究授業を実施した。また,既存教科の枠をはなれ,小学校低学年における情報活用にかかわる活動の可能性を検討するために,10時間の授業カリキュラムを設計して実践授業も実施した。今回の研究では,小学校から中学校までの全学年を見通す情報活用カリキュラム案の作成までにはいたらなかったが,理科と数学について,学習内容と情報活用の関連を明らかにすることができた。平成6年度は,これまでの教育ソフト・データ約400件を収録したCD-ROM教材集の内容を見直し,文字情報,図形情報それぞれに関する情報活用技能の項目,表計算による数値情報処理やデータベースを用いた情報の収集・判断・作成などについて,学習可能な学年段階を調査分析ができるように再構成した。さらに,これにもとづき,次年度は,調査用のCD-WOディスクを作製して、小中学校10校程度で調査を実施し,情報活用技能の系統案を作成する予定である。さらに,指導要領や教科書などの資料から各教科,特に理科と算数数学教育の内容に含まれている情報活用に関連する内容や学習活動など,学習項目を調査分析を実施し,中学校数学の全分野については,学習項目と情報活用の方法の関連および使用するソフト例と授業での使用法を記述した一覧表をした。次年度には,小学校算数学習系統表を作成し,中学校数学との関連を分析するとともに,作成したCD-WOを用いた試行的教育実勢による調査の結果を用いて,一貫性・継続性のある情報活用カリキュラムの試案を構成する予定である。したがって,小学校から中学校,さらに高校なでを視野に入れた,継続性・一貫性のある情報教育のカリキュラムを策定するための基礎研究として,指導要領や教科書などの資料から各教科の内容に含まれている情報活用に関連する内容や学習活動など学習項目の調査分析し,とくに小中学校の理科と中学校数学について,その学習内容と情報活用に関連する項目を検討分析して,関連表を作成した。

中学校数学では,いくつかの領域について関連表を作るとともに,これまで開発してきた学習用ソフトを整理し,学習内容や活用場面との対応を明確にした。さらにそれらにもとづいて,10の実践研究授業を実施した。小学校理科では,物理領域,化学領域,生物領域,地学領域および4領域に係わる学習内容で,「情報の収集・選択」「情報の分析・整理・理解」「情報の判断・創造」「情報の伝達」の4つの情報活用のどの部分が扱えるかを関連表としてまとめた。中学校理科においても,第一分野と第二分野で同様の関連表を作成した。また,小学校理科においても,情報活用能力のうち,とくに情報の創造と伝達に主眼をおいてネットワークによって情報交流をする実践研究授業を実施した。また,既存教科の枠をはなれ,小学校低学年における情報活用にかかわる活動の可能性を検討するために,10時間の授業カリキュラムを設計して実践授業も実施した。今回の研究では,小学校から中学校までの全学年を見通す情報活用カリキュラム案の作成までにはいたらなかったが,理科と数学について,学習内容と情報活用の関連を明らかにすることができた。
無秩序系有機無機光散乱媒質への分光性機能付加に関する研究

透明なシリコーンゴムに、その透明性を失わないようなナノ粒子の分散を実現することで、ある波長(色)でだけ光が透明に党利図けることができる特殊な材料を実現する研究を行う。この材料に、屈折率が近いマイクロサイズの粒子を混合すると、特定の波長(色)で透明になる物のそれ以外では磨りガラスの様に不透明になる、これまでにない材料が実現できる。この材料は接着剤や充填剤、塗布剤、ポッティング剤となりうるため、光を利用した分析やディスプレイなどの光の応用に広く応用できる新しい仕組みを実現できる。
アルゴリズムアニメーション用ウィジェットセットの設計に関する研究

本研究では、まず、既に提案されているアルゴリズムアニメーションシステムを調査し、それに基づいてアルゴリズムアニメーション用ウィジェットセットの設計を行った。次に、その設計に基づきXウィンドウ上でウィジェットセットのプロトラタイプを完成させた。完成させたシステムはグラフ問題に対するもので、最短経路問題と極大木問題に対するアルゴリズムを例に有効性を確認した。当初の予定通り節点と枝の属性を変えるだけでアルゴリズムの振舞いを理解することができた。さらに、本研究の目的であるアニメーションプログラミングの簡略化についても、元のプログラムに本研究で用意したウィジェットの関数を数行追加するだけで簡単に視覚化が可能であることがわかった。現在のシステムでも、描画スピードの変更やステップ単位での実行、およびアニメーションの逆回しなどが実行可能であるが、今後このプロトタイプをさらに高機能なシステムに発展させていきたい。具体的には、現在既にグラフの自動描画ルーチンが組み込まれているが、ユーザにとっては好ましい描画を実現するとは限らない。そこで、複数の自動描画ルーチンを組み込むことで、ユーザの好みにあった描画を可能にしたいと考える。また、グラフ問題に対してはほぼ成功したと考えているが、他の問題分野にも拡張していきたい。次の問題分野としては、幾何学問題を考えている。現在、ソースコードの見直しを行った後、フリーソフトウェアとしての配布も検討中である。なお、電子情報通信学会への論文投稿を準備中である。
小児プロテインC欠乏症の発症時期に関する包括的リスク評価

山口県内の重症心身障がい児・者におけるプロテインC(PC)欠乏症の有病率を明らかにするため,山口大学医学部附属病院を含む県内関連病院12施設および,重症心身障がい児・者施設3施設に通院・もしくは入所している大島分類14に相当する患児・患者を対象とした血栓症関連の調査を行なっている.血栓症を疑う病歴や家族歴の確認,定期検査時に血液凝固系検査を追加し,遺伝子検査の対象をスクリーニングした.これまでに山口大学医学部附属病院を含む2施設40人のスクリーニングを行った.このうち, 34人中15人で下肢の深部静脈血栓症を認めた.またD-dimerの上昇を認めたのは2例のみであった.PC活性<75%は6例,プロテインS(PS)活性<60%は2例, 40例の平均PC/PS比は1.5であった.遺伝性血栓症の疑いがあり,同意の得られた4人に遺伝子検査を施行したがPROC, PROS遺伝子の変異は認められなかった.引き続き各施設の対象患児・患者のエントリーを進め,目標の100例を目指す.PC欠乏症の血栓症発症に関連する内的・外的因子を明らかにするため,すでに遺伝子検査でPC欠乏症と診断されている患児,およびdisease controlとして新生児・小児期に血栓症を発症し,かつ遺伝子検査でPROCの異常を認めなかった患児を前方視的に観察を行なっている.当院を含む2施設において, PC欠乏の患児を1例(PC活性を出生時よりフォロー),新生児脳梗塞3例をエントリーした.これまで4例全例で新規血栓症の発症はなかった.新生児脳血管障害の患児を含めた小児の神経救急疾患におけるAmplitude-integrated EEGの有効性について学会発表した.各施設におけるIRBの進捗が遅延している.また,重症心身障害児・者の定期の血液検査に凝固能の精査を追加するため,血液検査をするタイミングが年に1, 2回しかない場合に検査が遅延する例がみられる.各施設のIRB申請が終了後,重症心身障害児・者のエントリーを行い,目標の100例を目指す.これまでも複合ヘテロPC欠乏症において,新生児期の他, AYA世代での発症の報告は散見されている.当該男子において,思春期に入りPC活性が低下してきた機序について生活習慣,性ホルモンなどの検査を追加し関連を調べる.山口県内の重症心身障がい児・者におけるプロテインC(PC)欠乏症の有病率を明らかにするため,山口大学医学部附属病院を含む県内関連病院12施設および,重症心身障がい児・者施設3施設に通院・もしくは入所している大島分類14に相当する患児・患者を対象とした血栓症関連の調査を行なっている.血栓症を疑う病歴や家族歴の確認,定期検査時に血液凝固系検査を追加し,遺伝子検査の対象をスクリーニングした.これまでに山口大学医学部附属病院を含む2施設40人のスクリーニングを行った.このうち, 34人中15人で下肢の深部静脈血栓症を認めた.またD-dimerの上昇を認めたのは2例のみであった.PC活性<75%は6例,プロテインS(PS)活性<60%は2例, 40例の平均PC/PS比は1.5であった.遺伝性血栓症の疑いがあり,同意の得られた4人に遺伝子検査を施行したがPROC, PROS遺伝子の変異は認められなかった.引き続き各施設の対象患児・患者のエントリーを進め,目標の100例を目指す.PC欠乏症の血栓症発症に関連する内的・外的因子を明らかにするため,すでに遺伝子検査でPC欠乏症と診断されている患児,およびdisease controlとして新生児・小児期に血栓症を発症し,かつ遺伝子検査でPROCの異常を認めなかった患児を前方視的に観察を行なっている.当院を含む2施設において, PC欠乏の患児を1例(PC活性を出生時よりフォロー),新生児脳梗塞3例をエントリーした.これまで4例全例で新規血栓症の発症はなかった.新生児脳血管障害の患児を含めた小児の神経救急疾患におけるAmplitude-integrated EEGの有効性について学会発表した.各施設におけるIRBの進捗が遅延している.また,重症心身障害児・者の定期の血液検査に凝固能の精査を追加するため,血液検査をするタイミングが年に1, 2回しかない場合に検査が遅延する例がみられる.各施設のIRB申請が終了後,重症心身障害児・者のエントリーを行い,目標の100例を目指す.これまでも複合ヘテロPC欠乏症において,新生児期の他, AYA世代での発症の報告は散見されている.当該男子において,思春期に入りPC活性が低下してきた機序について生活習慣,性ホルモンなどの検査を追加し関連を調べる.
癌関連線維芽細胞（CAF）を標的とした胆道癌の新規治療法の開発

ヒト胆管癌はサンプル採取法の検証が難しかったため、胃癌からのCAF分離に取り組んだ。胃癌腫瘍組織より細胞を分離培養し、継代の後αSMA染色でMyofibroblastであることを確認した。胃癌症例より分離したCAF細胞において6例中3例にてCXCL12の高発現を認めた。CXCL12高発現CAFとCXCR4発現胃癌細胞OACM5.1Cを共培養すると、癌細胞の浸潤能が有意に亢進し、CXCR4 antagonistであるAMD3100を投与すると、その作用は抑制された。まず癌細胞株と共培養モデルを行うヒト腫瘍組織内Myofibrolastの分離に取り組んだ。ヒト胆管癌は症例が少なく、サンプル採取法の検証が難しかったため、胃癌からのCAF分離に取り組んだ。Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を用いて胃癌腫瘍組織より細胞を分離培養し、継代の後αSMA染色でMyofibroblastであることを確認した。細胞を増やした後凍結し、各種実験用にストックした。これまで胃癌(特に胃接合部癌)組織におけるCXCL12の発現を免疫組織学的に確認し、Myofibloblastが発現している症例を約50%に認めたため、分離したCAF細胞においてもこの発現を確認したところ、6例中3例にてCXCL12の高発現を認めた。CXCL12の受容体であるCXCR4を介した癌細胞-CAF相互作用が存在するかを確認した。ヒト腫瘍組織からCAFを分離する手法を確立した。胆管癌症例が少ないため、胃癌における相互作用の解析を進めているが、方法論は胆管癌にも用いる事ができるため、症例の蓄積を行い同様の解析を行っていく。共培養モデルはこれまで我々は複数の報告を行ってきたが、3次元での培養に取り組む必要がある。Collagen gelの作成に時間を要しており、組成の検証が必要。動物舎の改築工事のため、ヒトサンプル・細胞実験を優先的に行っている。今研究では、胆管癌において豊富な間質に存在するCAFをターゲットとした治療、すなわちCAFを活性化させる因子Hedgehog siganlingをターゲットとした治療(SMO, GLI antagonist)の有効性、またそのメカニズムについて解析を行うことを目的とする。ヒト胃接合部癌組織におけるCXCL12の免疫組織学的評価を行ったところ、間質の特に線維芽細胞にCXCL12の発現を認めた。間質におけるCXCL12の発現と臨床病理学的因子との関連性を調べると、CXCL12の高発現はリンパ節転移陽性率・リンパ管浸潤と関連し、さらに根治切除後の5年生存率が有意に不良であった。研究対象を胆管癌としていたものの、症例数の問題から、CAFと癌細胞の相互作用解析を胃癌に変更し引き続きその詳細なメカニズム解析、CAFを標的とした治療への応用を目指す。胃癌細胞ーCAFで確認された相互作用のより詳細なメカニズムを明らかにするため、胃癌細胞におけるCXCR4以下の細胞内シグナルを調べる。また、ヒト胃癌組織におけるCXCL12の臨床的発現意義も調べる。腫瘍免疫学比較的安価にて消耗品が購入でき、また、研究進捗の関係上、予定していた出張を行わなかったため。研究対象を胆管癌としていたものの、症例数の問題から、CAFと癌細胞の相互作用解析を胃癌に変更し、引き続き研究を行う。その変更に際し消耗品費が今年度よりかかることが予想される。また、データ管理、及び資料作成のための事務補佐員人件費、研究成果発表・情報収集のための旅費に研究費を充てたいと考えている。
大腸発がんの新規細胞モデルを用いた発がん分子機構解明と治療標的同定の統合的研究

3次元培養下の野生型マウス腸管オルガノイドに対して、レンチウイルスで遺伝子導入を行うことで細胞レベルでも大腸多段階発がんが再現可能であることを以前報告した。そこで、本発がんモデルを利用して大腸発がんメカニズムの解明を目指した。具体的には、大腸がんで最も変異頻度が高いApcやKrasのコンディショナルマウス由来のオルガノイドを用い、Cre遺伝子を導入することで遺伝子変異を再現した上で、大腸がんで変異頻度が高い遺伝子のshRNAを導入して協調的に発がんを促進するか検討を行った。また、食事由来発癌物質などの環境要因との相互作用も検討に加え、段階的な発がん過程の進展が再現されることを確認した。マウス腸管のオルガノイド3次元培養とレンチウイルスによる効率の高い遺伝子導入を組み合わせる事で、大腸多段階発がん過程を再現する細胞レベルのモデルを確立して以前報告した。すなわち、大腸がんの大多数で変異を来すAPC遺伝子のshRNAを用いた発現抑制によりWnt経路の活性化を達成し、APC変異マウスと同等の腫瘍形成能の再現に成功した。一方、APC欠失に非依存的な発がん経路も大腸がんでは報告されていることから、Kras活性化を誘導した後に、APC以外のがん抑制遺伝子の発現を抑制することで発がんが誘導可能か検討を行なった。その結果、Kras活性化単独では腫瘍形成の誘導は見られなかったが、p16など複数の遺伝子に対するshRNAの導入により腫瘍の形成が観察された。ただし、APCの発現抑制をした時と比較して腫瘍径は小さく、また異なる組織像を呈していた。以上より、APCに依存的な発がん経路以外でも本モデルで再現可能であることを確認した。そこで、大腸がんで変異が高頻度で認められながら遺伝子改変マウスが作成されていないため、大腸発がんへの寄与が直接は証明されていない遺伝子2個(APC同様のWnt経路の抑制因子およびクロマチンリモデリング因子)についてshRNAを用いて発現抑制を行い、Krasの活性化やAPCの抑制などど組み合わせる事で発がんへの寄与を検討した。現在、ヌードマウス皮下への移植による腫瘍形成能の評価を行なっているが、Wnt経路の抑制因子のノックダウンはAPCのノックダウンと比較して造腫瘍能は有意に低い傾向を示しており、慎重に実験を繰り返している。一方、クロマチンリモデリング因子に関してはAPCの抑制依存的な発がん経路を促進することを見出しており、個体レベルでの解析に先駆けて発がん性を確認することんび成功している。前年度に引き続き、オルガノイドを用いた新規大腸がんモデルである「in vitro発がん再構成系」を用いて大腸発がん機構の解析を行った。APCのコンディショナルノックアウトマウスを新たに入手し、f/f個体由来の小腸オルガノイドに対してCre-recombinaseを導入することによりin vitroでAPCのtruncationノックアウトを行ったところ、ヌードマウス皮下に腫瘍形成が確認された。この結果はshRNAによる全長のノックダウンの時と同様であり、truncation変異の場合でも腸管微小環境に非依存的に発がん過程が再現可能であることが再確認された。APC変異マウスでは通常小腸に腫瘍が多発するが、大腸での腫瘍形成には炎症や他の変異などとの協調作用が必要とされ、APC変異が発がんに与えるインパクトは大腸において相対的に低いと考えられる。同様の結果がオルガノイドレベルでも確認されるか検証するために、大腸オルガノイドに対しても同様の手法を適用したところやはり腫瘍形成が見られたが、小腸と比較してAPCの不活性化よりもKras活性化の方に相対的に依存していることを見出した。さらに、オルガノイドを皮下に移植した際にSTAT3のリン酸化による活性化が誘導されることを見出した。通常、細胞ががん化したかどうかはヌードマウス皮下での腫瘍形成能で判断されるが、がん幹細胞で高頻度に見られるSTAT3の活性化が皮下組織で誘導されていることを明らかにし、皮下における炎症など間質と上皮の相互作用自体が発がん過程の一部を構成していることを明らかにした。以前導入したAPCのコンディショナルノックアウトマウスではタイピングでヘテロとホモが区別できないことが判明し、新たに別のマウスを導入したために研究の遅れが一時期見られたが、迅速な実験系である利点を生かして、結局当初の予定通り研究を進めることが出来ている。企業研究者との共同研究を予定していたが、担当者の海外赴任の時期と重なったためにその部分については研究開始が予定通りに進まなかった。遺伝子変異と環境要因の協調的な発がん促進作用に関しては分担研究者と連携しながら解析を進めており、順調に進展している。Apcのコンディショナルノックアウトマウス由来の小腸オルガノイドの培養を行い、レンチウイルスCreを導入することにより安定してヌードマウス皮下で腫瘍形成が誘導可能であることを確認した。ただし、腫瘍は径1cm程度のものが中心で、組織像では異形度が低く、腺管の破綻が顕著であった。ヒト大腸がんにおいて変異の頻度が高く、かつこれまで遺伝子改変マウスの作成により解析がなされていない数遺伝子について、Apcノックアウト後にshRNAを導入したところ、意外なことに、がんで不活性化している遺伝子にも関わらず、in vitroにおいてそのノックダウンが強い増殖抑制効果を示すものが多く認められた。このことは、正常細胞が多段階を経て癌化する過程で、蓄積する遺伝子変異が必ずしも直線的に発がんを誘導しているわけではないことを強く示唆しており、また遺伝子異常の組み合わせによる協調作用が重要な役割を果たしていることをあらためて示す結果と考えられた。

そのため、Apcノックアウトオルガノイド由来皮下腫瘍を再び培養した後に遺伝子導入を行い、in vitroでの培養を短期間にした上でヌードマウスへの皮下移植を行い経過観察を行っている。また、Apc非依存的な大腸発がんを再現するためにKras活性化後に複数のshRNAを導入したところ、Apc-KOとは異なる組織像の腫瘍が得られた。したがって、本実験系はWnt依存的発がんに限らず一般的に応用可能でることが示唆された。さらに、大腸発がん物質としてしられるPhIPについて、従来マウスではリンパ腫を発症してしまい腸管発がん性の検証が困難だったが、オルガノイド実験系を用いることで、Apc不活性化後にのみ発がん促進効果がみられることを確認した。この結果は、種々の化学物質の発がん性がin vitroでも迅速に評価可能であることを示しており、有用なアッセイ系となると考えれらた。3次元培養下の野生型マウス腸管オルガノイドに対して、レンチウイルスで遺伝子導入を行うことで細胞レベルでも大腸多段階発がんが再現可能であることを以前報告した。そこで、本発がんモデルを利用して大腸発がんメカニズムの解明を目指した。具体的には、大腸がんで最も変異頻度が高いApcやKrasのコンディショナルマウス由来のオルガノイドを用い、Cre遺伝子を導入することで遺伝子変異を再現した上で、大腸がんで変異頻度が高い遺伝子のshRNAを導入して協調的に発がんを促進するか検討を行った。また、食事由来発癌物質などの環境要因との相互作用も検討に加え、段階的な発がん過程の進展が再現されることを確認した。本年度の途中で研究機関を異動したために、Kras変異マウスなどの一部の遺伝子改変マウスを用いた実験が一時期中断を余儀なくされて当初より進捗が遅れたが、本モデルの迅速性を生かして短期間で解析結果を出す事が可能になった。当初本モデルを開発した機関とは別の機関で異なる研究者が実験を行なっても同様の結果が出る事が確認された事から、実験系としてのrobustnessは明確に示されたと考えている。また、本モデルがAPC依存的な発がん経路に対してのみ有効なのではないかという当初の懸念に対しても明確に否定することができた。ただし、APC非依存的な発がん経路による発がん性はAPC依存的経路によるものと比較して顕著に弱く、臨床サンプルにおける両者の変異数が大きく異なる事と一致した結果と考えられ、本モデルの有用性を別の面からも証明したと考えられた。APC変異とKras変異のコンディショナルマウス由来のオルガノイドを用いることで、APC依存的またはKras依存的な発がん過程と環境要因との協調作用が包括的に解析可能となる。個体モデルでこれまで明らかにされているこうした協調作用のうち、in vitroの実験系でも再現可能なものに特に焦点をあて、本モデルの可能性をさらに追求していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学当初予定していた、APCflox/floxマウス
配位不飽和二核ニッケル錯体を鍵とする協奏触媒開発と汎用性触媒系の開拓

本研究では、2核ニッケル錯体触媒の触媒反応系中における金属種の協奏的役割を明らかにすると共に汎用性の高い触媒プロセスの創生を目指すことを最終的な目的とした。具体的には、(1)クロスカップリング反応の機構解明を行い、2核構造を有する中間体を捕捉した。また、(2)通常反応性の低いジアリールアミンを使った室温下でのハロゲン化アリールのアミノ化を実現した。(3)安定かつ活性の高い触媒前駆体の合成を達成した。平成22年度は、ニッケル2核錯体を触媒とするKumada-Corriu反応の触媒過程の機構解明を目標として研究を行った。NMR測定により低温での速度論解析を行い、素反応過程の一つについて活性化エネルギーを決定し、中間体の可能性を提案できた。非常に速いプロセスであることから、この素反応過程が触媒プロセスに含まれている可能性の高いことを明らかにした。すなわちこの触媒系は安定な2核ニッケル1価錯体から、酸化的付加により不安定なニッケル3価錯体の生成を経由するのではなく、準安定なニッケル2価錯体の会合体を形成することでスムーズな反応を可能にしており、2核錯体を経由することによる反応エネルギーの大きな安定化が示唆される。また、同時に汎用性触媒系開拓のため、ニッケル1価NHC/ホスフィン錯体の合成、構造決定を行い、それがGrignard試薬の存在下でホスフィンを遊離し、定量的に2核錯体へ変換されることを明らかにした。また、このニッケル1価錯体をKumada-Corriu反応の触媒として適用し、高い触媒活性を明らかにした。アリールハライドのアミン化反応においても良い触媒となり、特にこの触媒反応の活性に乏しいジアリールアミン類からトリアリールアミン類が容易に生成するプロセスを発見した。この反応は通常100°C以上の加熱が必要であるが、高い触媒活性のために条件・基質によっては室温付近でも反応が起こることを明らかにした。平成23年度は、22年度の研究成果を受け、以下に示す2つの研究方針について、さらに詳細な研究を進めることができた。すなわち、(1)ニッケル1価2核錯体を経由するKumada-Tamao-Corriuクロスカップリングにおける反応機構の解明、(2)汎用触媒系の開拓のためのニッケル1価錯体を用いた触媒系および触媒反応開発、である。(1)22年度は、ニッケル1価2核σ-アリール錯体とハロゲン化アリールとの反応における速度論解析を行い、酸化的付加や還元脱離ではなく、ハロゲン化アリールの配位が律速段階であることがわかった。さらに予備的なDFT計算の結果、2核構造を保ったままでハロゲン化アリールの酸化的付加、ニッケル2価2核錯体の生成、還元的脱離によるニッケル1価錯体の生成が予測される結果を得ることができた。この2核錯体からは、酸化的付加とトランスメタル化のどちらのプロセスも理論的に可能であるため、錯体とハロゲン化アリールとGrignard試薬との当量反応混合物から生成物であるビアリール類の構造を明らかにした。その結果、ハロゲン化アリールのハロゲンが臭素の場合、酸化的付加反応が優先し、より高速なプロセスが可能であること、塩素の場合、Grignard試薬とのトランスメタル化も併発し、反応速度はより遅くなることを明らかにした。今後は、XAFS測定による溶液中活性種の構造決定を検討したい。(2)22年度までに、ニッケル1価錯体を用いたハロゲン化アリールとジアリールアミン類との反応によるトリアリールアミンとの反応が進行することを見出していた。23年度は、この反応の最も効率的なプロセスおよびいくつかの基質検討を行った。その結果、トリフェニルポスフィンを加えてニッケル1価単核錯体を前駆体とする触媒系が最も効率よいことが分かった。おそらく2核錯体のみのプロセスでは、触媒の失活がある頻度で進行するものと考えている。また、通常高い反応温度を必要とするトリアリールアミン合成については、室温下という非常に穏やかな条件でのいくつかのアミン類の合成に成功した。本研究では、2核ニッケル錯体触媒の触媒反応系中における金属種の協奏的役割を明らかにすると共に汎用性の高い触媒プロセスの創生を目指して研究を行った。24年度の主な成果は以下のとおりである。12核ニッケル錯体を用いたKumadaカップリング反応の触媒反応中間体を追跡し、また量論反応過程で生成するビアリール類の同定を行い、反応経路の推定を行った。計算科学的手法によって一部の経路の妥当性を評価した。シンクロトロン放射光を使った反応中間種のX線分光を行った。22核ニッケル錯体を触媒として用いたハロゲン化アリールのBuchwald-Hardwig aminationが、通常反応しにくいジフェニルアミンを用いた場合にも穏やかな条件で進行することを明らかにした。室温でもゆっくりと反応が進行し、良い収率でトリアリールアミンが生成した。本反応は有機電子材料として有用な種々のトリアリールアミン合成法としての可能性があると考えている。