hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リスク環境での状況認識共有化と安全制御のための多層インタフェース

本研究の目的は,動的環境での人間・コンピュータ協調を支援する新しいヒューマン・インタフェースの提案である.自動車や航空機をはじめとする交通移動体は,動的に変化する環境の中での的確な認知・判断・操作が不可欠であるが,十分な時間余裕が保証されていない状況でそれらを遅滞なく,かつ誤りなく行うことは容易ではない.そこで,認知・判断・操作に関わる人間の負担を軽減すべく,状況に応じて人と自動化システムの間での役割分担を動的に変化させる機能配分の設計が重要な課題となる.ここで導入される自動化システムは高い自律性と知能を有するものであるがゆえに,状況認識喪失,自動化システムへの過信,警戒心の欠如,オートメーション・サプライズなどの不都合が生じうることが知られている.本研究では,実世界での事例として,アダプティブ・クルーズ・コントロール(ACC)システムを取り上げ,ドライバの状況認識を支援する情報提示系,状況認識共有化を図ることによって過信やオートメーション・サプライを抑制する情報提示系,リスクに応じて自動化レベルを動的に変化させる安全制御系から構成される「多層インタフェース」を構築した.具体的には,高速域ACCシステムと低速域ACCシステムが混在する環境の中でのドライバのモード認識を支援する情報提示系,ACCシステムの減速機能限界に関わる情報提示系,コンピュータの制御意図をドライバに理解させ,ドライバとACCシステムとの間での状況認識共有を可能にするための情報提示系などを構築し,効果を認知工学的実験によって解析・評価した.さらに,ドライバに過信や警戒心欠如が生じた状況においてのシステム安全を確保するための権限委譲方策を提案し,離散事象シミュレーションによって有効性を解析・評価し,いわゆる「人間中心の自動化」の枠組みから外れるものの中に,安全確保の観点から有用なものがあることを証明した.本研究の目的は,動的環境での人間・コンピュータ協調を支援する新しいヒューマン・インタフェースの提案である.自動車や航空機をはじめとする交通移動体は,動的に変化する環境の中での的確な認知・判断・操作が不可欠であるが,十分な時間余裕が保証されていない状況でそれらを遅滞なく,かつ誤りなく行うことは容易ではない.そこで,認知・判断・操作に関わる人間の負担を軽減すべく,状況に応じて人と自動化システムの間での役割分担を動的に変化させる機能配分の設計が重要な課題となる.ここで導入される自動化システムは高い自律性と知能を有するものであるがゆえに,状況認識喪失,自動化システムへの過信,警戒心の欠如,オートメーション・サプライズなどの不都合が生じうることが知られている.本研究では,実世界での事例として,アダプティブ・クルーズ・コントロール(ACC)システムを取り上げ,ドライバの状況認識を支援する情報提示系,状況認識共有化を図ることによって過信やオートメーション・サプライを抑制する情報提示系,リスクに応じて自動化レベルを動的に変化させる安全制御系から構成される「多層インタフェース」を構築した.具体的には,高速域ACCシステムと低速域ACCシステムが混在する環境の中でのドライバのモード認識を支援する情報提示系,ACCシステムの減速機能限界に関わる情報提示系,コンピュータの制御意図をドライバに理解させ,ドライバとACCシステムとの間での状況認識共有を可能にするための情報提示系などを構築し,効果を認知工学的実験によって解析・評価した.さらに,ドライバに過信や警戒心欠如が生じた状況においてのシステム安全を確保するための権限委譲方策を提案し,離散事象シミュレーションによって有効性を解析・評価し,いわゆる「人間中心の自動化」の枠組みから外れるものの中に,安全確保の観点から有用なものがあることを証明した.状況認知・判断・決定に許される時間制約が異なれば,人間とコシピュータの協調形態も異なる.また制御対象の動特性によっても協調形態は異なり得る.まず,低速域アダプティブ・クルーズ・コントロール(ACC)システムによる自動走行中における先行車追従制御を想定するシミュレータを構築し,センサが先行車を見失ったときの制御方式によっては、ドライバのメンタルモデルが円滑に構築できないことを,認知実験的によって明らかにした.この結果は,自動化システムの意図を含めた状況認識支援インタフェースの重要性を示している.また,先行車減速時にはACCによって自車も自動的に減速するが,先行車急減速時にはACCでは対応できないことがある.そこでACCの機能限界を超えるときは警報を発するシミュレータならびにインタフェースを構築し,安全確保における有効性を実験的に評価するとともに,警報へのドライバの信頼と依存(あるいは過信)を種々のシナリオのもとで解析した.さらに,先行車追従が高速で行われる場合と低速で行われる場合が交互に現れる状況を模擬できるシミュレータを構築し,制御系の設計方式によってはモード誤認が発生し,オートメーション・サプライズに至る可能性があることを示した.自動車とは動特性がまったく異なるシステムの例として原子力プラントを取り上げ,認知タスクネットワークを構築し,状況認識過程を模擬するシミュレーションを行い,人間と機械の協調形態のあり方を自動化レベルの観点から考察した.また,異なる動特性をもつサブシステムから構成される仮想的プロセスを構築し,オペレータのワークロードを制御できるシミュレーション環境において,監視制御タスク実施中のオペレータ注視点を抽出し,サブシステムの動特性ならびにワークロードとの関連を解析した.状況認知・判断・決定に許される時間が十分ではない人間・コンピュータ協調系の例として,低速域アダプティブ・クルーズ・コントロール(ACC)システムによる先行車追従制御を取り上げ,リスク環境でのシステム監視制御にあたる複数の主体(人間,コンピュータ)間での状況認識共有化を図りつつ,状況に応じた自動化レベルを持つ安全制御に有用な多層インタフェースを構築した.

具体的には,ACCシステムのセンサが先行車を見失ったときの2種類の制御方策の各々に対して低速域ACCシステムと高速域ACCシステムの間での走行モードの移行を実行するアルゴリズムならびにコンピュータのモード制御を提示するインタフェースを開発し,ドライビング・シミュレータを用いた認知実験により,先行車と自車とのさまざまな相対関係を表す数十種類のシナリオのもとでの被験者(ドライバ)の認知・判断・行動パタンの抽出ならびに心的負荷の同定,状況認識支援が必要となる状況の同定と機能限界警報の生成アルゴリズムの策定,コンピュータの安全制御への過信が発生しうる状況の抽出などを行った.さらに,コンピュータの制御意図がシステム状態表示に自然な形で組み込まれ,ドライバとACCシステムとの間での状況認識共有を可能にするインタフェースを考案・設計・構築するとともに,コンピュータへの過信が生じた潜在危険状況において,たとえシステム故障やシステム機能限界事象が発生してもドライバの安全を確保するための自動化レベルの同定と,状況適応的自動化レベル調整機構の有効性を検証する離散事象シミュレーションを実施した.状況認知・判断・決定に許される時間が十分ではない人間・コンピュータ協調系の例として,低速域アダプティブ・クルーズ・コントロール(ACC)システムによる先行車追従制御を取り上げ,リスク環境でのシステム監視制御にあたる複数の主体(人間,コンピュータ)間での状況認識共有化を図りつつ,状況に応じた自動化レベルを持つ安全制御に有用な多層インタフェースを構築した.具体的には,低速域ACCシステムを利用しての走行中を想定し,先行車と自車とのさまざまな相対関係を表す数十種類のシナリオのもとでの被験者(ドライバ)の認知・判断・行動パタンの抽出ならびに心的負荷の同定,状況認識支援が必要となる状況の同定を行った上でACCシステムの減速機能限界を提示する警報インタフェースを構築し,ドライバが警報をいかに利用するか,欠報によってその利用方策がいかに変化するかを解析した.また,コンピュータの制御意図がシステム状態表示に自然な形で組み込まれ,ドライバとACCシステムとの間での状況認識共有を可能にするために,追従対象として捕捉した先行車の有無のみを表示するインタフェース及びACCのセンサ検知範囲を表示するインタフェースを低速域ACCの動作理解を支援する情報として構築し,その効果を認知工学的実験によって解析・評価した.さらに多層インタフェースとして,ドライバのリスク認知が欠如した状況においての緊急時安全を確保するための権限委譲方策を数種類提案し,離散事象シミュレーションによってそれらの有効性を解析・評価し,いわゆる「人間中心の自動化」の枠組みから外れるものの中に,安全確保の観点から有用なものがあることを証明した.
外場により制御されるナノ磁石

磁石と呼ばれる化合物は構造的に二種類に大別され,2次元・3次元構造を持ち転位温度以下で長距離磁気秩序相を示すバルク磁石に対し,1次元ないし孤立した分子構造を有する磁石をナノ磁石と総称する.ナノ磁石が磁石として振る舞うメカニズムは,分子内に形成された双極小ポテンシャルによってスピン反転が妨げられることに起因し,分子構造の設計により磁気特性の制御が可能なことが大きな特徴である.ナノ磁石構築には,容易軸型の磁気異方性を有する金属イオンを強磁性的ないしフェリ磁性的に連結することが一般的な構築手法であるが,筆者は磁化容易面型の金属イオンを構造制御しながら連結することにより,これまでにないタイプのナノ磁石(単一次元鎖磁石)の構築に成功してきた.この系はその分子構造により磁気構造が規制されるため,外場に応答した構造的な変化と磁気挙動の変化が連動するという特徴を有する.構造変化の要因として,結晶溶媒の可逆な吸脱着に着目して研究を遂行した.錯体を形成する有機配位子部分に種々の置換基を導入した錯体を合成し,それぞれについて溶媒の吸脱着と磁気特性の変化について詳細を検討した結果,本系がこのような外場の変化に対して種々の応答を示すこと,例えば磁気特性が強化される系,ほとんど影響を受けない系,あるいはナノ磁石と常磁性の間を往復する系などを見出した.バルク磁石系ではこのような可逆な磁気挙動の変化を示す系は知られていたが,ナノ磁石系では初めての例である.本研究においては,磁化容易面が交互に90°ずつ振れ配向することにより形成された磁化容易軸を有する新規Fe(II)-Fe(III)混合原子価単一次元鎖磁石において,圧力や結晶溶媒の吸脱着などの外的容易による磁気挙動の制御を目的とする,本年度は溶媒の吸脱着による磁性の制御を目指し,類似の磁気構造を有する誘導体の合成と構造の解明,及び種々の条件下における磁気挙動の変化の解明を行った.具体的には,本単一次元鎖磁石系を構成する有機配位子Hbpcaにおいてアルキル基やクロロ基などの側鎖の導入を試み,結晶中における一次元鎖配列の制御を試みた.その結果,置換基をメチル,t-ブチル,フェニル基へと変化させることにより,磁気挙動の溶媒吸脱着依存性に違いが生じた.メチル基を導入したものにおいては,結晶溶媒が減圧乾燥下においても保持されるため,磁気挙動は常に一定であった.一方,t-ブチル基を導入したものにおいては,溶媒の格納される細孔が大きくなり,溶媒の吸脱着に伴う構造変化,磁性変化は可逆性が乏しいものとなった.また,フェニル基を導入したものにおいては,鎖間におけるフェニル基同士のπ-πスタックが生じており,溶媒の吸脱着により構造的には結晶相とアモルファス相を,磁性的にはフェリ磁性的な相と反強磁性相を可逆的に行き来することを見出した.以上により,本系においては結晶溶媒の吸脱着による構造変化・磁性変化を,有機配位子Hbpcaへの置換基導入により制御することに成功した.磁石と呼ばれる化合物は構造的に二種類に大別され,2次元・3次元構造を持ち転位温度以下で長距離磁気秩序相を示すバルク磁石に対し,1次元ないし孤立した分子構造を有する磁石をナノ磁石と総称する.ナノ磁石が磁石として振る舞うメカニズムは,分子内に形成された双極小ポテンシャルによってスピン反転が妨げられることに起因し,分子構造の設計により磁気特性の制御が可能なことが大きな特徴である.ナノ磁石構築には,容易軸型の磁気異方性を有する金属イオンを強磁性的ないしフェリ磁性的に連結することが一般的な構築手法であるが,筆者は磁化容易面型の金属イオンを構造制御しながら連結することにより,これまでにないタイプのナノ磁石(単一次元鎖磁石)の構築に成功してきた.この系はその分子構造により磁気構造が規制されるため,外場に応答した構造的な変化と磁気挙動の変化が連動するという特徴を有する.構造変化の要因として,結晶溶媒の可逆な吸脱着に着目して研究を遂行した.錯体を形成する有機配位子部分に種々の置換基を導入した錯体を合成し,それぞれについて溶媒の吸脱着と磁気特性の変化について詳細を検討した結果,本系がこのような外場の変化に対して種々の応答を示すこと,例えば磁気特性が強化される系,ほとんど影響を受けない系,あるいはナノ磁石と常磁性の間を往復する系などを見出した.バルク磁石系ではこのような可逆な磁気挙動の変化を示す系は知られていたが,ナノ磁石系では初めての例である.
長繊維強化高分子複合材料の精密プレス成形法の研究

長繊維強化高分子複合材料(以下長繊維FRTPと略称する)の精密プレス成形では、プレス成形中の材料の流動挙動が成形品精度、強度・異方性の支配要因であることに着目し、本研究では、試作および市販長繊維FRTP(Xシート)について、基本的な短形板の平面歪圧縮および円板の圧縮成形を行った場合の強化材繊維の配向・分離におよぼす材料、成形条件の影響を検討した。さらに繊維配向角分布・含有率分布の測定法について検討し、精密プレス成形に関する基本的知見を与えた。1.繊維配向角分布の表示式と測定法成形品の繊維は、互いに絡み合い複雑な構造を有し、その配向角分布の表示および測定法はまだ確立されていない。まず表示式に関しては、スタインの配向関数を修正した山田の式が長繊維強化材のみならず短繊維射出成形品の場合にも適用し得ることがわかった。測定法に関しては、(1)繊維を個々に識別できる場合、交点計数法により、(2)識別できない場合、成形品のX線写真から得られる繊維影濃度の勾配を利用することによって測定する新しい方法を考案した。本法による配向角分布は強さの異方性と強い相関があり、その有用性を明らかにした。2.繊維含有率分布の非破壊測定法成形品のX線写真から繊維含有率分布を、含有量標準サンプルを参照して、測定する方法を確立した。本法は従来の燃焼法に代わる簡便精密な方法と考えている。3.繊維含有率分布これまで成形に伴う繊維の分離は、母相と繊維の固液混相流として扱えば、良く予測できることを一次元流れに関して示してきた。これを円板の圧縮成形における二次元流れに拡張し、その妥当性を明らかにした。
機能性多糖ナノスフェアの設計とゲルバイオ材料としての応用

様々な合成高分子や生体高分子からなるヒドロゲルは、その力学特性や高い含水率だけでなく様々な薬物を吸収、放出し得ることから、バイオ・医療への応用が活発に研究されている。その中でも生分解性を有するハイドロゲルは医療応用において、ゲル特有の物理的、機能的特性だけでなく体内での残留の問題点を解決でき、薬物徐放材料や再生医療用足場材料としての応用が期待されている。生分解性の生体高分子は多糖やポリペプチド、核酸などが挙げられるが、動物由来の高分子は病原の混入や均質性などの問題がある。一方、生分解性合成高分子の代表的なものとしてポリ乳酸やポリアセタールなどがあり、側鎖に種々の官能基を導入することで分解速度を制御することが出来る。しかしながら、これらの合成高分子は親水性が低いため、そのゲルの含水性は低く、ヒドロゲルとして応用するには親水性ポリマーとの共重合などの工夫が必要であり、工業生産における安定性や生体内使用時の用途選択性などに課題がある。そこで本研究では、新規球状多糖である3Dグルカンの種々の機能化を行い、ドラッグデリバリーシステム(DDS)における新規ナノキャリアの開発を行った。種々のサイズを有する単分散の3Dグルカン(直径10nm, 20nm, 30nm, 40nm)に長鎖アルキル基を導入した疎水化3Dグルカンあるいは、スペルミンなどの多価アミンを3Dグルカンに導入したカチオン性3Dグルカンが、細胞内デリバリーシステムとして、有用であることを明らかにした。さらに、3Dグルカンをビルディングブロックとした新規3Dグルカン集積ゲルを設計し、その機能評価を行った。反応性3Dグルカンを光重合して得られるヒドロゲルは、アミラーゼ酵素で分解するとともに内包したタンパク質を放出しえる新規酵素応答性ゲルであることが明らかになり、DDSや再生医療材料として期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。両親媒性高分子は、水中でその疎水基が疎水性相互作用により会合し自己組織化することで粒子を形成する。近年、ナノサイズの高分子ゲルが医療、バイオテクノロジーなど様々な分野から注目されており、申請者の所属する研究室では、疎水化した多糖が水中において自己組織的に会合し、粒径20-30 nmのヒドロゲル(ナノゲル)を形成することを見いだした。中でも、コレステロール置換プルラン(CHPナノゲル)は、タンパク質や薬物の内包・放出が可能であるため、ドラッグキャリアとして研究が展開されている。この機能を利用し、抗がん剤治療への応用が期待されているsiRNA(small interfering RNA)を目的の腫瘍に届ける核酸デリバリーを目指す。申請者はナノゲルのサイズ制御および、新たな機能化ナノゲルの作成を目指し、球状多糖であるグルカンデンドリマー(GD、多糖ナノスフェア)を多糖骨格として新規ナノゲルの実現を目標に研究を行っている。GDはデンプンの分解物に三種類の酵素を加えて合成された、α-1,4;α-1,6-グルカンである。この多糖は、特徴として内部に20単糖程度の環状構造とα-1,6結合による分岐を10%程度持つことで高密度かつ水溶性の高い多糖である。この多糖はグルカンを糖骨格にしていることから、生分解性も高い。また酵素の反応条件を制御することにより、分子量の異なるGDの合成が可能である。そこで申請者は、新規多糖のGDにコレステリル基や長鎖アルキル基であるドデシル基などの疎水性基や正電荷を有するスペルミンなどのカチオン性基を修飾した誘導体を合成し、血管新生因子を切断するsiRNAとの複合体をガン細胞に添加することで血管新生因子を抑制し、担癌マウスに局所投与することで有意な抗腫瘍効果が得られた。特徴的な多分岐構造と高い水溶性を持つ新規「多糖ナノスフェア」であるグルカンデンドリマー(GD)に着目した。GDにコレステリル基(CHGD)や長鎖アルキル基(C12GD)などの疎水性基を修飾するだけでなく、スペルミンなどの正電荷をもつ機能性基(GD-spe)を修飾することで細胞導入効率の高い機能化多糖ナノスフェアを調製した。合成物は水中で安定な微粒子を形成し、スペルミンを導入したものは正電荷を有しており、DDSや再生医療への応用を目指した核酸デリバリーキャリアとしての機能を評価した。本実験では目的のmRNAを切断しタンパク質の発現を抑制する(RNA干渉)small interfering RNA (siRNA)を、従来用いられてきた低分子の化学合成薬剤に替わる次世代の薬剤としてがん治療に用いた。カチオン性GDと血管新生因子であるVEGFをターゲットとしたsiRNAとの複合体をマウス腎ガン細胞(Renca細胞)に添加すると、目的のmRNAの減少が見られ、さらに市販薬として広く用いられている核酸導入試薬であるlipofectamineよりも優れていることが確認された。次に担癌モデルマウスに局所投与したところ、キャリア単体やネガティブコントロールとの複合体を担癌マウスに局所投与した群では腫瘍の増大を抑制できなかったが、siVEGFとカチオン性GD複合体を投与した群で、抗腫瘍効果が見られた。これらの結果から、機能性基を修飾したグルカンデンドリマーは核酸薬剤を細胞内に送達するキャリアとして機能することが明らかとなり、核酸医療への応用が期待される。

様々な合成高分子や生体高分子からなるヒドロゲルは、その力学特性や高い含水率だけでなく様々な薬物を吸収、放出し得ることから、バイオ・医療への応用が活発に研究されている。その中でも生分解性を有するハイドロゲルは医療応用において、ゲル特有の物理的、機能的特性だけでなく体内での残留の問題点を解決でき、薬物徐放材料や再生医療用足場材料としての応用が期待されている。生分解性の生体高分子は多糖やポリペプチド、核酸などが挙げられるが、動物由来の高分子は病原の混入や均質性などの問題がある。一方、生分解性合成高分子の代表的なものとしてポリ乳酸やポリアセタールなどがあり、側鎖に種々の官能基を導入することで分解速度を制御することが出来る。しかしながら、これらの合成高分子は親水性が低いため、そのゲルの含水性は低く、ヒドロゲルとして応用するには親水性ポリマーとの共重合などの工夫が必要であり、工業生産における安定性や生体内使用時の用途選択性などに課題がある。そこで本研究では、新規球状多糖である3Dグルカンの種々の機能化を行い、ドラッグデリバリーシステム(DDS)における新規ナノキャリアの開発を行った。種々のサイズを有する単分散の3Dグルカン(直径10nm, 20nm, 30nm, 40nm)に長鎖アルキル基を導入した疎水化3Dグルカンあるいは、スペルミンなどの多価アミンを3Dグルカンに導入したカチオン性3Dグルカンが、細胞内デリバリーシステムとして、有用であることを明らかにした。さらに、3Dグルカンをビルディングブロックとした新規3Dグルカン集積ゲルを設計し、その機能評価を行った。反応性3Dグルカンを光重合して得られるヒドロゲルは、アミラーゼ酵素で分解するとともに内包したタンパク質を放出しえる新規酵素応答性ゲルであることが明らかになり、DDSや再生医療材料として期待される。本研究の臨床応用を目指すにあたり、siRNAの局所投与による抗ガン治療ではガンの種類によって治療が困難となるため、静脈投与による治療が必要であると考えられる。本研究で用いているグルカンデンドリマーを担癌マウスに静脈投与して腫瘍に蓄積させることを検討しているところである。今後、成果をまとめて報告する予定である。BALB/Cマウスの様々な部位にガンを作製し、ガンの部位によってキャリアの蓄積量に違いがあるかを検討し、グルカンデンドリマーを用いた最適な治療効果を検討する。その知見を基にsiRNAとの複合体を担癌マウスに静脈投与して抗腫瘍効果を観察し、昨年度に行った局所投与による治療実験との差異を検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Piwiの機能解析を通じたショウジョウバエレトロトランスポゾン発現抑制機構の解明

レトロトランスポゾンは多くの生物種のゲノムに散在する転移因子であり、ホストの遺伝情報に重大な損傷をもたらすことが知られている。従って、レトロトランスポゾンの発現抑制機構の解明は重要な課題であり、これまでに多くの研究グループがその解明に挑み、多種の因子の関与が報告されている。これらの因子の多くは、生殖巣特異的な25塩基程度の小分子RNAである、piRNA(Piwi-interacting RNA)の生合成に関与する細胞質局在因子である。細胞質内におけるpiRNA生合成機構の解明が進む一方で、核内におけるレトロトランスポゾン発現抑制の解明は、ほとんど手つかずと言って良い状況にある。その要因の一つとして、Piwiと供に、核内でレトロトランスポゾン発現抑制を担っていると推察される、パートナー蛋白質の同定が未だなされていないことがあげられる。そこで、新たな核内レトロトランスポゾン抑制因子の同定を目的とし、RNAiをベースとした遺伝子スクリーニングを行った。約100遺伝子を対象に試みた結果、既知の因子を含む11種の因子がレトロトランスポゾンの発現抑制因子として検出された。これら11種の因子の細胞内局在を検討したところ、CG3893(DmGTSF1)が核特異的に局在する蛋白質であることが判明した。ショウジョウバエDmGTSF1欠失個体を用いた解析より、DmGTSF1は卵巣特異的なレトロトランスポゾン発現抑制因子でPiwiと直接的に相互作用することが示された。またDmGTSF1によるレトロトランスポゾンの発現抑制は、Piwiと同様に、ヘテロクロマチン形成を介した転写制御であることが判明した。以上の解析結果を論文にまとめ報告した。DmGTSF1の機能解析は、不妊の病態形成機構の解明、ひいては新たな治療法の開発へと繋がる可能性を持っている。レトロトランスポゾンは多くの生物種のゲノムに散在する転移因子であり、コピー&ペースト方式による転移が、ホストの遺伝情報に重大な損傷をもたらすことが知られている。そのため、細胞内にはレトロトランスポゾンの発現を特異的に抑制する機構が備わっていると考えられる。近年の生化学的、遺伝学的解析により、レトロトランスポゾンの発現抑制が細胞の核内で行われていることと、Argonauteファミリータンパク質であるPiwiが、その抑制機構の中核を担うことが明らかとされてきた。しかしながら、その詳細な分子機構は未だ不明である。その要因の一つとして、Piwiと供に核内で働くパートナー因子の同定がなされていないことが挙げられる。我々は、ショウジョウバエ生殖組織の体細胞由来培養細胞株(OSC)を用い、RNAiをベースとした遺伝子スクリーニング法を行うことにより、核特異的に局在するタンパク質CG3893が、レトロトランスポゾンの発現抑制に必須の因子であることを見出し、さらに生化学的解析を行うことにより、核内でPiwiと直接的に相互作用することを明らかにした。CG3893は機能未知のタンパク質であるが、クロマチン免疫沈降法による解析から、CG3893はPiwiと同様に、ヘテロクロマチン形成を介した転写制御によりレトロトランスポゾンの発現を抑制していることが判明した。以上の解析結果から、CG3893をDmGTSF1と命名し、Piwiの新たな核内パートナー因子として、論文にまとめ報告した。Piwi及びDmGTSF1の機能的欠失が不妊の症状を誘引することが判明しているため、本研究成果は不妊の病態形成機構の解明、ひいては新たな治療法の開発へと繋がる可能性を持っている。ショウジョウバエにおいて、DmGTSF

1はPiwiと直接的に相互作用する、核内パートナー因子であり、レトロトランスポゾンの発現抑制に必須の因子であることを報告した。さらに、DmGTSF1によるレトロトランスポゾンの発現抑制機構は、ヘテロクロマチン形成を介した転写制御であることも明らかにした。これらの研究成果は、本研究における、レトロトランスポゾン抑制機構の解明という目的に対し、新たな知見を加えるものとなったと考えるため、おおむね順調に進展していると評価した。しかしながら、DmGTSF1の機能は、未だ不明であることから、さらなる解析が必要となる。DmGTSF1は機能未知のタンパク質であるが、RNA結合に関与すると考えられているZincfingerドメインを持っており、その変異体はレトロトランスポゾンの発現を抑制できない事が明らかになっている。従って、DmGTSF1に対する結合RNAの同定は、DmGTSF1の機能を探る上で有用な情報となり得ると期待される。そこで、効率よく結合RNAを得るため、まずはDmGTSF1に対するモノクローナル抗体の作製を行う。作製された抗体を用いて、結合RNAを同定する実験手法であるhigh-throughput RNA sequencing of cross-linked immunoprecipitation (HITS-CLIP)を行うことで配列の決定を目指す。
Cre-loxP系を応用した哺乳動物胚における新しい細胞系譜解析法の開発

本課題の一つは、マウス胚の着床前後における細胞系譜の解析にある。着目したのは、8-cell胚。8-cell胚は未だ分化全能性を示し、決定は行われていないとされる。しかし、16-cell胚になると、胚の外側に面した割球は将来栄養外胚葉細胞(TE)に分化し、胚の内側に入った割球は将来の胚体になる内部細胞塊(ICM)へ分化すると言われている。その分岐は、8-cell胚割球が横に分裂するか、縦に分裂するかに依存する。前者では、全ての嬢細胞がTEになり、後者では一つ(外側に面した割球)がTE、もう一つ(内側に面した割球)はICMとなる。8-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターDNAを顕微注入し、翌日胚盤胞期をX-Galで染色すると、検討した胚全てが栄養外胚葉細胞の青染を示した。このことは、8-cell胚の割球の殆どは栄養外胚葉細胞への分化へ進む分裂の仕方、即ち、横方向への分裂をすると思われる。8-cell期では16-cell期へ分裂する間、横の分裂が最初に起こり、その後からICM細胞を作る縦の分裂が起こる可能性が示唆された。[序論]ホヤやウニや両生類等の動物胚における細胞系譜解析には、主に標識物質を細胞に注入する方法が用いられて来た。しかし、母体の中で胚が成長し、しかも胚の著しい成長を伴う哺乳動物胚では、発生と共に細胞に注入された標識物質が希釈されてしまうため、標識物質を細胞に注入する方法では支障があった。本実験では、Cre/loxP系がマウス胚細胞の細胞系譜解析に応用出来ないかどうかを検討した。[結果/展望]このような原理を踏まえ、pCETZ-17単独あるいはpCETZ-17+pCAG/NCreをマウス受精卵核に注入し、1日培養後、2-cell期に発光及びX-Galによる染色を施した。その結果、理論通りになり、Cre/loxP系がうまく働くことが判った。次いで、pCETZ-17を受精卵核に注入した後、1日目に両方の割球に発光を示す2-cell胚のみを回収し、その片側割球の核にpCAG/NCreを注入した。注入後、1日、2日と培養し、4-cell期、8-cell期における発光とlacZ活性を調べた。その結果、DNAを注入された細胞の子孫のみがlacZ活性を示し、胚の半分が青染された。同様の現象は、CETZ-17を導入されたtransgenicマウス由来の着床前胚にも見られ、Cre/loxP系がマウスのような哺乳動物胚の細胞系譜解析に頗る有効な系であることが示された。今後は、CETZ-17transgenic mouse由来の着床前胚に対し、特に、胚盤胞に着目し、その構成細胞にpCAG/NCreを注入し、注入された胚盤胞を仮親子宮に移植することにより、細胞の系譜をin vivoで追跡する予定。[序論]母体の中で胚が成長し、しかも胚の著しい成長を伴う哺乳動物胚は、下等生物に比し、細胞系譜の解析がこれまで困難であった。本実験は、その解析にCre/loxP系を応用し、哺乳動物胚における細胞系譜解析の可能性を検討することを目的としたものである。[結果/展望]2)CETZ-17Tg由来の着床前胚、例えば、2-cell胚あるいは8-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターpCAG/NCre(CreのN末に核移行シグナルを有する)DNAを顕微注入した。翌日、発生した4-cell to 8-cell胚あるいは胚盤胞をβ-galactosidaseの基質であるX-Gal存在下で染色すると一部の胚細胞は、青染された。これは、Creの発現でCETZ-17transgene内のloxPで挟まれたEGFP-CAT配列が除去され、その下流側にあったlacZ遺伝子がCAG promoterの影響で発現するようになったからと思われる。これにより、本系が細胞系譜解析に活用出来ることが判明した(Sato et al., Mol.Reprod.Develop.53,34-44,2000)。3)本課題の一つは、胚盤胞の構成細胞(栄養外胚葉と内部細胞塊)の核にpCAG/NCre DNAを顕微注入し、注入された胚盤胞を仮親子宮に移植することにより、細胞の系譜をin vivoで追跡することであった。しかし、いくつかの試行錯誤を繰り返したが、胚盤胞細胞にはなかなかDNAが入りにくく、注入後1日目の後期胚盤胞をX-Gal染色した結果、全てにおいてlacZ活性がnegativeであった。おそらく、胚盤胞細胞は分割期胚に較べ、細胞のサイズが小さく、それがために、核にDNAをうまく注入出来なかったためと思われる。今後は、DNA注入後、胚全体にelectroporationをかけ、DNAを胚盤胞細胞に効率的に導入することを計画している。

その分岐は、8-cell胚割球が横に分裂するか、縦に分裂するかに依存する。前者では、全ての嬢細胞がTEになり、後者では一つ(外側に面した割球)がTE、もう一つ(内側に面した割球)はICMとなる。8-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターDNAを顕微注入し、翌日胚盤胞期をX-Galで染色すると、検討した胚全てが栄養外胚葉細胞の青染を示した。このことは、8-cell胚の割球の殆どは栄養外胚葉細胞への分化へ進む分裂の仕方、即ち、横方向への分裂をすると思われる。8-cell期では16-cell期へ分裂する間、横の分裂が最初に起こり、その後からICM細胞を作る縦の分裂が起こる可能性が示唆された。
ナノ粒子による脳疾患治療への挑戦

本研究はアルツハイマー病、脳梗塞再灌流や脳出血等の脳疾患に対し、ナノ治療による効果的治療を行うため、様々な投与法とその送達効果に関して検討した。ナノ粒子は両親媒性の分子量1万程度の高分子の自己組織化により作成し、疎水性セグメント側鎖にニトロキシドラジカルを導入した(ラジカルナノ粒子、RNP)。pH=7以下で崩壊するナノ粒子とpHの変化にかかわらず崩壊しないナノ粒子を調製し(それぞれRNP^NおよびRNP^O)静脈投与、経口投与、経鼻投与に関して検討した。RNP^Oは静脈投与で1%程度脳内に送達された。集束超音波ビームを利用することにより送達率が一桁上がることが確認された。経口投与では血中に全く取り込まれることがないことが確認された。RNP^Nは静脈投与ではRNP^Oと同様の傾向であった。一方経口投与では5.7%血中に取り込まれ、その一部は脳に送達されることが確認された。これらの結果を基にアルツハイマー病モデルマウスにRNP^Nを経口投与したところ、4週間でほぼ完全に病態が回復する結果が得られた。平成22年度は材料設計と細胞および動物モデルの構築と評価を中心に検討を進めた。i)サイズの異なるナノ粒子の設計:自己組織型及び架橋型ナノ粒子を中心に検討を進めた。表層には生体適合性として知られるポリエチエレングリコール(PEG)を配し、合成条件を変えて30nmから1umまでの粒子を調製した。自己組織化型粒子には親-疎水性ブロック共重合体を利用する。リガンド導入能を有するアセタール-PEG-b-ポリ乳酸に加えて磁気共鳴イメージング(MRI)、電子スピン共鳴イメージング(ESRI)活性を有するアセタール-PEG-b-PCTEMPOを合成した。また、架橋型粒子には重合性基を有するアセタール-PEG-b-ポリ乳酸-メタクリロイルに加えてヘテロ2官能性PEGマクロモノマー(アセタール-PEG-メタクリロイル)を利用した乳化重合によるコア-シェル型ナノゲルを作製した。乳化重合ではクロロメチルスチレンのような疎水性モノマーの他、メタクリル酸ジエチルアミノエチルなど、pKaが7.0前後のモノマーも利用し、下記の実験に供した。ii)表面PEG鎖密度の異なるナノ粒子の設計:調製したナノ粒子の表層PEG密度は必ずしも充分にあがっているとは言い難い。そこでナノ粒子に対するPEG密度制御をメンシュトキン反応を利用してPEG密度向上を行い、PEG密度の異なる種々サンプルを調製した。iii)表面チャージの異なるナノ粒子の設計:アニオン性のホウ素クラスターを表層に廃し、表面電荷を制御した材料を設計した。iv)動物への投与:今年度は静脈および経口投与法によるナノ粒子の取り込み評価を行った。平成23年度は初年度の評価を基に次のように検討を行った。i)投与経路の異なる粒子薬物動態解析:静脈、動脈、経口、経鼻、経肺や頭頂後頭溝への直接投与など、さまざまな投与法によるナノ粒子の取り込み評価を行った。ICRマウスを中心に検討を進め、ラジオラベリング法(125I,RI)とともに電子スピン共鳴法(ESR)により経口投与では少なくとも1%程度の取り込みが確認された。特に経口投与によっても脳への取り込みが確認され、今後の脳疾患に対するナノ治療に期待される。ii)脳梗塞再灌流障害に対するナノ粒子取り込みに関する研究:脳梗塞再灌流障害は血液脳関門の損傷をきたすと報告されているものの、その真偽に関しては定かではないため、本研究ではカテーテルによる脳動脈閉そくに伴う虚血後、カテーテルを除去することにより再灌流を行った後、ナノ粒子を投与し、その取り込みに関して検討を行った。特に梗塞障害部位以外の取り込みを確認するため、蛍光ラベルナノ粒子を作成し、検討を行い、梗塞から離れているところでの粒子の存在を確認した。またESRによる取り込みも確認した。取り込み量は少なくとも1%以上に達し、効果的な取り込みが確認された。iii)収束超音波ビームによる血液脳関門透過に関する解析:集束超音波ビームによる血液脳関門透過研究を行い、透過量が10倍程度にあがることを確認した。収束超音波ビームはその強度により出血画餅発するため、その調整が重要であることを確認した。
CIDNP検出電子スピン共鳴法の開発および短寿命常磁性化学種の研究

本研究のもっとも直接的な目的は、反応中間体としての超短寿命ラジカル対を、遊離ラジカルとは区別して測定する方法として、新しくCIDNP検出ESR法を開発し、その方法を用いて化学反応の機構を解明することにあった。しかしこの目的に加えて、(a)CIDNPをより定量的に扱う方法を確立すること、(b)CIDNPとCIDEPの両面からの解析を可能とすることの2つの目的があった。以上、3つの目的のいずれについても大きな成果が得られた。以下にその要点を記す。1.CIDNPのenhancement factorの定量方法の確立測定管の改良、90°パルスの工夫等多くの改良と工夫を重ねて、enhancement factorを定量的に求める方法を確立した。2.過酸化ベンゾイルの光分解反応機構の解明および連続拡散モデルの検討。enhancement factorの温度依存性を定量し、連続拡散モデルの正しさを実験的に示した。3.光分解反応の前駆体のスピン状態の決定、およびジベンジルケトンの光分解反応への応用ケトンの開裂反応は一重項状態から起こるという、従来の定説をくつがえす重要な知見が得られた。4.CIDNPの磁場依存性を調べる方法の開発5.スピン相関CIDEP機構における新しい機構としての緩和モデルの提唱7.CIDNP検出ESRの開発8.Lバンド時間分解ESR法を用いた低磁場CIDEP法の開発本研究のもっとも直接的な目的は、反応中間体としての超短寿命ラジカル対を、遊離ラジカルとは区別して測定する方法として、新しくCIDNP検出ESR法を開発し、その方法を用いて化学反応の機構を解明することにあった。4.CIDNPの磁場依存性を調べる方法の開発5.スピン相関CIDEP機構における新しい機構としての緩和モデルの提唱7.CIDNP検出ESRの開発8.Lバンド時間分解ESR法を用いた低磁場CIDEP法の開発CIDNPを用いて,光化学反応の機構を解明することが可能となった.本年度の研究の主要な成果は次の通りである.1.カルボニル化合物によるキサンテンからの水素引き抜き反応キサントン(XO)ーキサンテン(XH_2)混合物を光照射し, CIDEPを測定すると,ラジカル対機構にもとづくE/A型に分極した. XHと・XOHラジカルが約0.2対1の割合で検出した.しかし,その複雑な超微細構のため,このCIDEPスペクトルからだけでは両ラジカルの正確なg値や反応を理解する上で重要な最終生成物を知ることはできない.そこでCIDNPを用いて更に反応を検討した.その結果,反応機構を完全に解明することができた.2.CIDNPのenhancement factorの決定CIDNPの定量的議論を行う場合,分極がどの位あるかという,いわゆるenhancement factorを正確に知る必要がある. CIDNP信号の時間発展を測定することによりこの因子を決定する方法を考え出した.その方法を,過酸化ベンゾイルの光分解でベンゼンを生ずる反応に適用した.その結果, enhancement factorとして39という値が得られた.更に,緩和時間の測定から,生成したのはベンゼンではなく,溶媒からの重水素と置換したモノ重水素置換体であることもわかった.3.CIDNP信号のフリップ角依存性熱分布状態にある系のNMR信号は,定常法とパルス法と同じ結果を与えるが, CIDNP信号では両者に差がある.原理的にはフリップ角がゼロの極限でのみ両者が一致する.この問題を実験的に確認することができた.また,フリップ角依存性を用いると,スペクトルの同定が上り確実になることもわかった.本年度はCIDNPの定量的な測定を軌道にのせること、および、本年度設置したESR用磁場を用いてCIDNP信号の磁場依存性を測定することの二点を主目的として努力してきた。この両方についてかなりの成果が得られ、ほぼ所期の目的は達せられたと考えられる。更にCIDEPとCIDNPを併用した研究も行い、ラジカル対を含む反応の機構について多くの知見が明らかとなった。以下主要項目の概要を述べる。1.CIDNPのenhancement factorの定量方法の開発従来、CIDNPの信号は、いわゆるKaptein則の見地から、信号が吸収、発光いずれとして観測されるかという定性的な知見を得るのみに用いられてきた。しかし、CIDNPの信号強度は、反応機構の詳細を如実に反映していることから、CIDNP信号を定量的に求めることは非常に重要なことである。本研究では、CIDNP信号の定量的な測定方法を開発することに成功した。

多くの点で工夫が必要であったが、特にa)CIDNP測定のために新たな測定試料管を考案したこと、およびb)正確な90°パルス系列を得るために特別の工夫を行ったことの2点が特に独創的なところである。新しく開発した方法を用いて、過酸化ベンゾイルおよびジベンジルケトンの光分解反応機構の詳細を知ることができた。2.CIDNPの磁場依存性従来のCIDNP測定は、NMRの固定磁場中で反応が行われていたため、磁場が極端に大きいという極限状態でのみ実験を行っていたことになる。本研究では、ESR用磁石を用いて、CIDNPの磁場依存性を求めるための特殊な実験装置を組み立て、データを得ることに成功した。この磁場依存性から、今まで求めることができなかったラジカル間の交換相互作用の大きさを見積ることができた。ほとんど大部分の溶液内光化学反応はラジカル対を経て起る。ラジカル対の寿命は、通常、10^<-9>から10^<-8>秒程度であるが、このような短い寿命のラジカル対をスペクトルの手段で観測することが望まれるが、通常の電子スペクトルやESRスペクトルではケ-ジ内再結合を起し得るラジカル対と、遊離したラジカルを区別することは事実上不可能である。このような状態から発展すべく、超短寿命のラジカル対を遊離ラジカルと区別して測定する方法としてCIDNP検出ESR法の開発を試みその測定に成功した。この方法をベンゾキノン水素引き抜き反応に適用して、ラジカル対の電子スピン共鳴スペクトルを得ることが出来た。このESRスペクトルは、ラジカル対から作られた生成物の核スピン分極が、ラジカル対におけるマイクロ波遷移によって変調されるという、Stimulated nuclear polarizationにもとづくものである。測定されたスペクトルには、その他中間体ラジカルの交差緩和にもとずくdynamic nuclear polarizationの寄与も含まれており、同時に遊離ラジカルのESRスペクトルも得られる。このstimulated nuclear polarizationとdynamic nuclear polarizationそれぞれの寄与を独立に求めることは可能であり、それぞれの寄与の割り合いが、マイクロ波のパワ-、水素供与体の濃度、反応物の濃度、励起光強度などによって変化することを実験的に見い出し、理論的な解釈を与えた。また、CIDNP検出ESRスペクトルのマイクロ波パワ-依存性より、stimulated nuclear polarizationによるスペクトルの線幅はラジカル対の寿命により決まり、またdynamic nuclear polarizationによるスペクトルの線幅はマイクロ波のパワ-によって決まることが明らかとなり、短いラジカル対の寿命を見積もることが出来た。
グルタミン中毒がんに特異的なアミノ酸輸送系を利用する新規ホウ素キャリアの開発

本研究では、がん細胞に強発現するアミノ酸トランスポーターを利用して10B原子を効率的に腫瘍に集積させるホウ素キャリアを開発し、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)の臨床適用の実現に資することを目指す。1)ホウ素クラスターをユニークな疎水性ファーマコフォアとして利用して、アミノ酸トランスポーター(ASCT2、LAT1)の輸送基質ミミックを開発する。2)腫瘍細胞取り込みスクリーニングを行い構造最適化する。3)担がんマウスモデルにおける体内動態解析により、構造最適化を行う。4)当該分子の効率的な合成法を確立する。5)in vitro及びin vivoにおける中性子増感効果を評価し、臨床適用へと導く。
ハイドロダイナミック遺伝子導入法による遺伝子治療ーイヌ血友病モデルでの検証ー

本研究は、ハイドロダイナミック遺伝子導入法を用いた、ヒトに対する遺伝子治療法の実現のため、遺伝子注入器の開発と、安全性、有効性の検証することを目的としている。昨年度からの本研究費による助成によって、以下の研究成果が得られた。1.大動物、特にイヌの肝臓、筋肉に対する適切な注入パラメーターの設定:昨年度より引き続き、血管造影手技によりイヌの各肝静脈、大腿静脈に遺伝子注入カテーテルを挿入し、設定した注入圧、量、速度などの各パラメーター下で、ルシフェラーゼ発現プラスミドを遺伝子導入し、その導入効率と安全性を検証した。この結果、イヌの下肢筋肉、肝臓に対する最適な遺伝子導入パラメーターが設定された。2.長期遺伝子発現効果の検証:上記のパラメーター下で、実験用雑種犬5頭に対し、ヒト凝固因子IX番発現プラスミド、ヒトアルファワンアンチトリブシン(hAAT)発現プラスミドをハイドロダイナミック法で遺伝子導入した。安全性の観点からは、注入時の一時的な肝逸脱酵素の上昇以外には、血液生化学的検証でも、安全性に問題を認めず、同一動物に対し、異なる遺伝子を導入しても、その成長にも問題を認めなかった。遺伝子導入効率の観点からは、ヒト凝固因子IX番欠乏血漿に対する凝固補完活性値は、導入前の4.6%から2週間で51.4%に上昇し、治療域レベルは10週にわたり維持され、血友病Bに対する治療効果が示唆された。hAAT導入では1週後には、ネフェロメトリー法による測定で、血清hAATが253μg/mlまで上昇し、効率的な遺伝子導入が確認された。3.注入システムの改良:昨年度に引き続き、理想的な肝実質内圧と時間曲線を再現するフィードバックシステムを組み込んだ電動モーター式の注入機を作製し、動物実験によりで有効性を検証している。以上の結果から、大動物においてハイドロダイナミック遺伝子導入法が安全、かつ効率的に応用が可能であることが示された。また、臨床診療で利用されている、血管造影手技と組み合わせることによって、より臨床応用に近づくことが示唆された。今後は、よりヒトに近いモデル動物として、霊長類での検証が必要不可欠であると考える。本研究の一部はピッツバーグ大学薬学部との連携研究として実施された。本研究は、ハイドロダイナミック遺伝子導入法による遺伝子治療法の開発のため、イヌを対象動物として、大動物における遺伝子導入効果及び安全性を検証することを目的としている。本年度に以下の研究成果が得られた。1.イヌの肝臓に対する適切な注入パラメーターの設定:血管造影手技によりイヌの各肝静脈に遺伝子注入カテーテルを挿入し、設定した注入圧、量、速度などの各パラメーター下で遺伝子導入を行い、発現効率、生理学的、血液生化学的、組織学的な検証を行った。これらの結果より、イヌの肝臓に対する、安全で効率的な遺伝子導入パラメーターが設定された。2.ハイドロダイナミック遺伝子導入法による、長期遺伝子発現効果:上記で設定されたパラメーター下で実験用雑種犬2頭に対し、ヒト凝固因子IX番発現プラスミドをハイドロダイナミック法で遺伝子導入した。ヒト凝固因子IX番欠乏血漿に対する凝固補完活性値は、導入前の4.6%から2週間で51.4%に上昇し、治療域レベルは10週にわたり維持され、血友病Bに対する治療効果が示唆された。血液生化学的検証では、肝逸脱酵素が対照群の約10倍まで一過性に上昇したが、1週以内に正常値へ復した。また生理学的検査では、呼吸、循環動態も安定していた。3.注入システムの改良:より安全に効率よく遺伝子を導入するため、理想的な肝実質内圧と時間曲線を再現するフィードバックシステムを組み込んだ電動モーター式の注入機を作製し、小動物で有効性を検証している。以上の結果から、血管造影手技と組み合わせることにより、大動物においてもハイドロダイナミック遺伝子導入法が安全に施行可能であること、さらにはその遺伝子治療効果が示唆された。現在、長期経過を観察中である。hAAT

導入では1週後には、ネフェロメトリー法による測定で、血清hAATが253μg/mlまで上昇し、効率的な遺伝子導入が確認された。3.注入システムの改良:昨年度に引き続き、理想的な肝実質内圧と時間曲線を再現するフィードバックシステムを組み込んだ電動モーター式の注入機を作製し、動物実験によりで有効性を検証している。以上の結果から、大動物においてハイドロダイナミック遺伝子導入法が安全、かつ効率的に応用が可能であることが示された。また、臨床診療で利用されている、血管造影手技と組み合わせることによって、より臨床応用に近づくことが示唆された。今後は、よりヒトに近いモデル動物として、霊長類での検証が必要不可欠であると考える。本研究の一部はピッツバーグ大学薬学部との連携研究として実施された。
MKおよび血管拡張因子EETsを介した腎・血圧調節機構の解明と新規降圧療法の開発

本研究は『MKーEETs血圧調節機構の解明を通じて、腎・心血管疾患における組織保護を有する新規降圧療法を開発すること』が目的である。腎の血行動態を観察するための多光子共焦点レーザー顕微鏡A1R MP (Nikon)を用いた生体深部にいたる観察を目的としたシステムの確立を行い、腎臓皮質表層表面における計測精度の向上を計ることができた。更なる向上のため、他社製品(浜松ホトニクス)による検討も合わせて行い、今後もより深部位の血管容積や血流の測定を試みることが必要である。上述のリアルタイムの評価システムを利用した腎循環検証のため、Midkine欠損マウス(MKKO)と野生型マウスに対し、1)STZ誘発性I型糖尿病動物モデル、2)Renal ablationモデル、3)deoxycorticosterone acetate (DOCA)のペレットを埋め込み、1%の食塩水を投与するDOCA saltモデルの3つのモデルを作成した。前述2つのモデルは6ヶ月の経過観察とし、DOCA Saltモデルの検証を先行して行った。結果として、MKKOと野生型において腎機能と腎組織病理所見に著明な有意差を認めず、血圧の推移についても両者ともに高血圧を呈したものの有意な差を呈しなかった。Na排泄量や尿蛋白について、蓄尿下での評価を行なったが、上述と同様に有意差を認めなかった。そのため、DOCA Saltモデルにおけるepoxyeicosatrienoic acids(EETs)投与による腎血行動態や腎機能障害に対する実験を前述2つのモデルへ施行し、検証を継続することにした。さらに、腎・心血管病変に対する予後判定Biomarkerとして、Whole DHET/Creの測定がその候補となりうるか、という課題について、糖尿病性腎症、腎硬化症の症例を蓄積した。本研究では『MKーEETs血圧調節機構の解明を通じて、腎・心血管疾患における組織保護を有する新規降圧療法の開発』を目的として、まず腎の血行動態を観察するため多光子共焦点レーザー顕微鏡A1R MP (Nikon)を用いた生体深部にいたる観察を目的としたシステムの確立をおこなった。結果として、ローダミン染色したデキストラン(赤色)を尾静脈から静注して腎臓皮膜表面に直接端子を密着させ、可能な限りの血管容積や血流の測定を行なった。更に、皮膜及び腎実質の切開をおこなった上での計測をおこなったが、切開による影響は避けられず、さらに精度を増した端子の開発が待たれる結果となった。次に、上記システムを利用して、血管収縮作用をもつepoxyeicosatrienoic acids(EETs)阻害剤やアデノシン阻害剤を投与するとMK欠損型マウスで血管は収縮し、血圧の上昇とともに血流量の低下や血管径の収縮を認めた。血流速度は上昇していた。一方で、交感神経系評価のためニコチンアセチルコリン受容体阻害薬を投与したところ、MK欠損型マウスに投与すると血圧が下降し、血流量の増加を示した。NO経路はMK欠損型マウスで野生型と比較し、尿中・臓器のNO代謝産物において有意な差を認めず、レニン・アンギオテンシン・アルドステロンおよびプロスタグランディンI2に差を認めなかった。そのため血流についても、大きな変化を認めなかった。一部既報と合致しないところあり、今後の課題となると考えた。また、糖尿病性腎症におけるMKの微小循環系、特にPTCに対する影響を検討すべく湯澤らによりJASN誌に投稿されたカルモジュリン強発現マウスに抗MK抗体を使用した実験系をおこなったが、糖尿病性腎症における血液量や流速・血管系については理論的に合致した結果を得たが、抗体の効果については不十分であり、今後の検討課題となった。本研究では『MKーEETs血圧調節機構の解明を通じて、腎・心血管疾患における組織保護を有する新規降圧療法の開発』を目的とする。昨年度の検証を継続し、腎の血行動態を観察するための多光子共焦点レーザー顕微鏡A1R MP (Nikon)を用いた生体深部にいたる観察を目的としたシステムの確立をおこなったところ、腎臓皮質表層表面における計測精度の向上を計ることができた。更なる向上のため、他社製品(浜松ホトニクス)による検討も合わせて行い、今後もより深部位の血管容積や血流の測定を試みる。上述のリアルタイムの評価システムを利用した腎循環検証のため、Midkine欠損マウス(MKKO)と野生型マウスに対し、STZ誘発性I型糖尿病動物モデル、Renal ablationモデル、deoxycorticosterone acetate (DOCA)のペレットを埋め込み、1%の食塩水を投与するDOCA saltモデルの3つのモデルを作成した。さらに、腎・心血管病変に対する予後判定Biomarkerとして、Whole DHET/Creの測定がその候補となりうるか、という課題について、糖尿病性腎症、腎硬化症の症例を蓄積している。最終年度に測定を行う予定である。DOCA Saltモデルの検証が終了し、次年度に残り二つの検証を行う予定である。