hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好酸球顆粒蛋白質の細胞傷害活性の検証に関する研究

好酸球顆粒蛋白質は気管支喘息のようなアレルギー性疾患の病態に関与していることが示唆されている。しかし、アレルギー性疾患における好酸球顆粒蛋白質役割を解明するためには大量の好酸球顆粒蛋白質が必要であるが、現在のところ、好酸球顆粒蛋白質を大量に調製することは困難である。そこで、遺伝子組み替えにより好酸球顆粒蛋白質を得るための基礎検討として、我々は、ラットmajor basic protein(MBP)及びラットeosinophil cationic protein(ECP)のcDNAクローニングを行った。ラットMBP及びECPのcDNAクローニングの方法としてはRT-PCR法及びrapid amplification of cDNA ends法を用い、RT-PCRのtemplateとしてラットの骨髄細胞より調製したmRNAを用いた。ラットMBPのcDNAクローニングの結果から、ラットMBPのmRNAは推定分子量が25.2kDaであるpreproprotein(preproMBP)をコードしていることが明らかになった。PreproMBPはそれぞれ、signal peptide、酸性アミノ酸を多量に含むacidic peptide、強塩基性蛋白質である成熟MBPの3つの部分から構成される蛋白質であることが推定された。従って、ラットMBPもヒト及びモルモットと同様の構造を持っていることが明らかになった。ラットECPのcDNAクローニングの結果から、ラットECPの分子量は15.5kDaであり、等電点は9.85であると推定された。従って、ラットECPもラットMBPと同様に強塩基性の蛋白質であることが明らかになった。ラットECPとヒトのeosinophil ribonuclease(RNase)との相同性は51-54%であり、マウスのeosinophil-associated ribonucleaseとの相同性は65%であった。また、ラットECPのアミノ酸配列にはRNase活性の活性中心に相当するアミノ酸が保存されていたことからラットECPはRNase gene superfamilyに属する遺伝子産物であることが示唆された。我々はさらに、ラットの好酸球顆粒蛋白質が哺乳動物細胞や細菌に対して細胞傷害性を示すかどうかについて解析した。10^6個の好酸球より抽出した顆粒蛋白質はラット気道上皮細胞及びラット線維芽細胞に対して細胞傷害性を示さなかった。一方、3μg/mlのラットMBP及びラットECPは協力な殺菌活性を示した。従って、ラット好酸球顆粒蛋白質は細菌に対する傷害性が高いことが明らかになった。これらの結果から、気道に浸潤した好酸球は気道上皮細胞に対して組織傷害を示すことよりも、気道に侵入した細菌を駆除する働きをもっていると考えられる。今年度は研究代表者らが確立したラットの好酸球増多症モデルを活用してラットmajor basic protein(MBP)の精製行い、部分アミノ酸配列を明らかにした。さらに、得られた情報をもとに、MBPのcDNAクローニングを以下に述べる方法で行った。好酸球増多症を誘発させたラットの骨髄から骨髄細胞を採取し、AGPC法によりtotal RNAを調製し、RT-PCR法によってMBPのcDNAの部分塩基配列を決定した。その結果、約240bpのPCR産物が得られ、その塩基配列にはヒトおよびモルモットのMBPの対応する部分と高い相同性が認められた。これらの塩基配列をもとにプライマーを作製し、3′および5′RACE法によりラットMBP cDNAの全長の塩基配列を決定した。ラットMBPのcDNAは全長が867bpで5′noncoding regionが45bp、coding regionが684bp(signal peptide、proprotein、matureMBPの合計領域)、3′codingregionが125bp(poly A tailを含む)であった。ラットMBPは、ヒトMBPと65%の相同性があり、モルモットMBP(GMBP1)とは61%の相同性があることが明らかになった。ラットMBPのcDNAの解析の結果、ラットMBPもヒトおよびモルモットのMBPと同様にproprotein構造をもつことが示された。Proprotein部分はグルタミン酸が豊富であり、pI値は3.5と計算された。一方、ラットMBPのN末端側のmature protein部分は、分子量13.5kD、pI11.9であることが明らかになった。したがって、ラットMBPにおいてもproproteinがmature proteinの細胞傷害性を抑制していることが示された。現在、RT-PCR法によりラットMBPの全長のcDNAをもつプラスミドを作製し、recombinantMBPを作製するための準備を行っている。PreproMBPはそれぞれ、signal peptide、酸性アミノ酸を多量に含む

acidic peptide、強塩基性蛋白質である成熟MBPの3つの部分から構成される蛋白質であることが推定された。従って、ラットMBPもヒト及びモルモットと同様の構造を持っていることが明らかになった。ラットECPのcDNAクローニングの結果から、ラットECPの分子量は15.5kDaであり、等電点は9.85であると推定された。従って、ラットECPもラットMBPと同様に強塩基性の蛋白質であることが明らかになった。ラットECPとヒトのeosinophil ribonuclease(RNase)との相同性は51-54%であり、マウスのeosinophil-associated ribonucleaseとの相同性は65%であった。また、ラットECPのアミノ酸配列にはRNase活性の活性中心に相当するアミノ酸が保存されていたことからラットECPはRNase gene superfamilyに属する遺伝子産物であることが示唆された。我々はさらに、ラットの好酸球顆粒蛋白質が哺乳動物細胞や細菌に対して細胞傷害性を示すかどうかについて解析した。10^6個の好酸球より抽出した顆粒蛋白質はラット気道上皮細胞及びラット線維芽細胞に対して細胞傷害性を示さなかった。一方、3μg/mlのラットMBP及びラットECPは協力な殺菌活性を示した。従って、ラット好酸球顆粒蛋白質は細菌に対する傷害性が高いことが明らかになった。これらの結果から、気道に浸潤した好酸球は気道上皮細胞に対して組織傷害を示すことよりも、気道に侵入した細菌を駆除する働きをもっていると考えられる。今年度は研究代表者らが確立したラットの好酸球増多症モデルを活用してラットeosinophil cationic protein (ECP)の精製を行い、部分アミノ酸配列を明らかにした。得られた部分アミノ酸配列の情報を基にラットECPのcDNAクローニングを以下に述べる方法で行った。ラット好酸球の顆粒蛋白質から精製したECPの部分アミノ酸配列を基にdegenerate primerを作製し、Ascaris suum antigen extractで感作したラットの骨髄細胞から調製したmRNAをtemplateとしてRT-PCRを行った。その結果、190bpのPCR産物が得られ、その塩基配列を解析した結果、ヒトECPのcDNAに70%の相同性があった。次いで、このPCR産物の塩基配列を基に新たにプライマーを作製し、RACE法によってラットECPのcDNAの3'末端及び5'末端の塩基配列を決定した。cDNAクローニングの結果から、ラットECPのcDNAは465pbのcoding regionを含む719bpから成ることが明らかになった。また、cDNAの塩基配列から推定される
電位依存性KチャネルKCNXが有する細胞接着性の研究

KCNH3は哺乳動物の脳に豊富に存在する電位依存性カリウムチャネルである。近年、KCNH3ノックアウトマウスが報告され、このチャネルが、生体内で極めて重要なはたらきをしていることが示唆された。(Miyake et al., 2009, J.Neurosci, Zhan et al., 2010, Nature Neurosci)。今年度、私はこのチャネルの特徴的な構造に興味を持って、研究を行った。その構造的特徴とは5番目と6番目のヘリックスの間の非常に長い(80残基)細胞外ループ(Poreループ)である。共同研究者の溝口教授らによれば、KCNH3はこのPoreループを介して、細胞を接着させる機能を有する(論文未発表)。また、私は、これまでの研究で、このPoreループに存在する糖鎖修飾がKCNH3のチャネルの機能と細胞表面への輸送を制御していることを明らかにした(Noma et al., 2009, JBC)。このように、PoreループはKCNH3の機能の発揮に必須の非常に重要な部位である。このPoreループの機能の分子機構に迫るために、同僚とともに構造解析を試みた。一般に膜タンパク質の構造解析は非常に困難であることから、KCNH3のPoreループのみの構造を解析することが得策であると考えた。具体的には、PoreループをGSTに融合させ、大腸菌で発現させ、精製を行った。マススペクトロメトリーにより、得られたタンパク質が全長の目的タンパク質であることを確認した。また、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、精製タンパク質が単分散であることを確認した。さらに、円二色性偏光を用いた実験から、一部がαヘリックス構造を有していることが示唆された。これらの結果は、精製タンパク質が結晶化に適していることを示している。現在は結晶化のスクリーニングを行っている。これまでの研究では、Kv12.2の三箇所の糖鎖修飾の内、少なくとも一箇所が細胞表面への輸送に必須であることを明らかにしていた。そこで、今年度は糖鎖修飾がKv12.2のチャネル機能に与える影響について検討した。方法として、Kv12.2を発現させたCHO細胞を、生きた状態で糖鎖切断酵素(PNGaseF)処理し、その前後での様々なチャネル特性の相違を調べた。その結果、糖鎖を切断することによって、Kv12.2の電位依存的な活性化の指標となる活性化カーブが脱分極側に30mV程度シフトすることが明らかになった。この変化は、非常に大きいものであり、糖鎖がない状態では、チャネルが開きにくくなることを意味している。しかしながら、このように糖鎖を持たないチャネルは、本来機能を発揮する場である細胞表面には輸送されないことが分かっているので、生体内では利用されていないと考えられた。この問題について調べるために、マウスの臓器から調整した粗膜画分の試料について、糖鎖切断処理後に免疫フロットを行った。その結果、生体内のKv12.2タンパク質は脳、特に大脳と嗅球に特異的に発現しており、そのほとんどが糖鎖修飾されていることが明らかになった。以上のことから、糖鎖修飾は、Kv12.2の適切な細胞表面への輸送と、適切な電位依存的な活性化の両方に重要な役割を果たし、生体内では糖鎖修飾されたKv12.2だけが利用されている可能性が高いことが明らかになった。以上の成果を、論文にまとめ、The Journal of Biological Chemistry誌に投稿、受理された。
携帯用パノラマX線撮影装置の開発に向けての基礎的研究

携帯用パノラマX線撮影装置の開発を朝日レントゲン工業株式会社に依頼し、設計を進めた。当社より市販されている軽量な携帯用X線撮影装置(KX-60)を改良し、連続撮影に耐えられ、より鮮明な画像がえられるように管電圧70kVの高周波インバータ-方式による軽量X線発生装置を新たに開発した。従来のパノラマX線撮影装置の管球の回転軸は垂直方向であるが、遺体撮影の場合、どうしても仰臥位となるため回転軸を水平方向とした。遺体を載せる台は市販の折畳み式ストレッチャーを用い、頭部固定台を後付けし、本体に接続できるようにした。頭部の位置付けは、犬歯・正中・フランクフルト平面・下顎底部の4方向へのビームを目安に本体装置をハンドルで位置調整する。フィルムは通常のパノラマ撮影に使われている15×30cmを用い、平面カセッテに装着する方式とした。本体総重量は約130kgでストレッチャーと共にワゴン車に収納でき大人3人で運搬可能であった。生体及びファントーム(樹脂に包埋した頭蓋骨)をX線パノラマ撮影した結果、撮影時間は12秒で個人識別に十分なX線画像が得られた。この世界初の本装置完成により、迅速な検案作業とより正確な個人識別が期待される。また、将来的には身障者や寝たきり老人の在宅歯科診療への応用も可能である。今後、さらに小型軽量化を図り、鮮明な画像がえられるよう開発を進めていく方針である。
Cyp3a遺伝子発現の性特異性を調節するホルモンの役割

1.マウスCyp3a41遺伝子5'-隣接領域を用いたレポーター遺伝子アッセイ昨年プロモーター活性が認められた-844bまでについてさらに解析した。その結果、C/EBP推定結合配列を含む-844-670領域が転写促進的に、CREB、AP1推定結合配列を含む-670-163領域が抑制的に働く事が明らかになった。しかし、その領域においては成長ホルモン(GH)、グルココルチコイド依存的調節が観察されず、調節領域は他の部位にあることが推測された。2.マウスCyp3a41遺伝子5'-隣接領域の単離NCBI核酸配列データーベース中のマウスCyp3a41遺伝子と思われる配列を基にプライマーを設計し、昨年度解析した-3.6kbまでよりさらに上流域の単離を試みた。マウス染色体DNAを鋳型として-11kb上流まで単離したが、基にした配列と完全に一致しないDNA断片しか増幅されなかった。これは、染色体中にCyp3a41と極めて相同性の高い配列が多数存在するためと推測された。最近、Cyp3a41に極めて高い相同性を有する遺伝子として、Cyp3a41A,Cyp3a44A,Cyp3a44Bという遺伝子の存在の可能性が示され、それらがCyp3a41遺伝子単離の障害になっていると考えられた。そこで、Cyp3a41遺伝子断片を有すると推測されるBACクローンを入手し、そのDNAからの増幅を行い、-11kb上流まで単離することが出来た。3.マウス初代培養肝細胞におけるCyp3a41遺伝子のホルモンによる発現調節マウス肝細胞初代培養系のレポーターアッセイ受容細胞としての評価を前年度に引き続き実施した。昨年度検討した合成グルココルチコイド(デキサメタゾン)に加え、天然型グルココルチコイドであるハイドロコルチゾン、コルチコステロンについて検討した結果、それらによっても濃度依存的な誘導、GHとの協調作用、抗グルココルチコイド(RU486)による阻害が観察された。グルココルチコイド単独作用と同様に、GHとグルココルチコイドによる協調的発現誘導においても、プレグナンX受容体ではなく、グルココルチコイド受容体(GR)が作用に関与していることが示された。誘導の経時変化及びタンパク質合成阻害剤を用いた検討より、グルココルチコイドによるCYP3A41mRNA発現誘導には、短寿命のタンパク質因子の新規合成が必要であることが示された。以上より、マウス肝細胞初代培養系においても、Cyp3a41遺伝子が生理的機構を反映した転写調節を受けている可能性が示され、レポーター遺伝子アッセイの受容細胞として有望であることが明らかとなった。1.マウスCyp3a41遺伝子5'隣接領域の単離DDBJの遺伝子データベースよりマウスCYP3A41 cDNAと完全に一致する遺伝子配列(contig NW 017337)を見出し、それを基にプライマーを設計し、C57BL/6Nマウスの染色体DNAを鋳型とし遺伝子断片を単離した。増幅できたDNA断片は5'上流3,669塩基を含む全長3,871塩基の断片であった。2.マウス初代培養肝細胞におけるCyp3a41遺伝子のホルモンによる発現調節レポーターアッセイにおける受容細胞として使用可能か否か検討する目的で、マウス初代培養肝細胞におけるホルモンによるCyp3a41遺伝子の発現調節について解析した。その結果、マウス個体において観察される成長ホルモン(GH)、グルココルチコイドによる協調的調節が初代培養肝細胞においても観察された。即ち、(1)GHの添加によって発現が増加した。(2)デキサメタゾン(合成グルココルチコイド)によっても発現が増加した。(3)両ホルモンを同時に添加すると、相乗的に発現が増加した。(4)抗グルココルチコイド(RU-486)を用いることにより、Cyp3a41遺伝子の調節が、他の遺伝子、例えばヒトCYP3A4遺伝子やマウスCyp3a11遺伝子の様にPXR(Pregnane X Receptor)を介したものではなく、グルココルチコイド受容体の介在によるものである事が明らかになった。以上より、マウス初代培養肝細胞が解析に使用可能であることが示された。3.マウスCyp3a41遺伝子5'隣接領域を用いたin vitroレポーター遺伝子アッセイ1で単離した遺伝子断片(-3669+61あるいはその一部)をpGL3 basic vectorに挿入し、レポータープラスミドを作製した。その結果、-844塩基までを含むコンストラクトでは遺伝子の転写が観察され、さらに上流域を含むと転写が抑制されるという結果となった。-844塩基までにはC/EBP,AP1,CREB, STATなど他のCYP遺伝子の肝における発現への関与が指摘されている転写因子の推定結合配列が存在するため、Cyp3a41遺伝子においてもそれら因子による調節の可能性が考えられた。しかし、これまでの検討においてGH、グルココルチコイド依存的遺伝子転写が観察されず、次年度の課題となった。

しかし、その領域においては成長ホルモン(GH)、グルココルチコイド依存的調節が観察されず、調節領域は他の部位にあることが推測された。2.マウスCyp3a41遺伝子5'-隣接領域の単離NCBI核酸配列データーベース中のマウスCyp3a41遺伝子と思われる配列を基にプライマーを設計し、昨年度解析した-3.6kbまでよりさらに上流域の単離を試みた。マウス染色体DNAを鋳型として-11kb上流まで単離したが、基にした配列と完全に一致しないDNA断片しか増幅されなかった。これは、染色体中にCyp3a41と極めて相同性の高い配列が多数存在するためと推測された。最近、Cyp3a41に極めて高い相同性を有する遺伝子として、Cyp3a41A,Cyp3a44A,Cyp3a44Bという遺伝子の存在の可能性が示され、それらがCyp3a41遺伝子単離の障害になっていると考えられた。そこで、Cyp3a41遺伝子断片を有すると推測されるBACクローンを入手し、そのDNAからの増幅を行い、-11kb上流まで単離することが出来た。3.マウス初代培養肝細胞におけるCyp3a41遺伝子のホルモンによる発現調節マウス肝細胞初代培養系のレポーターアッセイ受容細胞としての評価を前年度に引き続き実施した。昨年度検討した合成グルココルチコイド(デキサメタゾン)に加え、天然型グルココルチコイドであるハイドロコルチゾン、コルチコステロンについて検討した結果、それらによっても濃度依存的な誘導、GHとの協調作用、抗グルココルチコイド(RU486)による阻害が観察された。グルココルチコイド単独作用と同様に、GHとグルココルチコイドによる協調的発現誘導においても、プレグナンX受容体ではなく、グルココルチコイド受容体(GR)が作用に関与していることが示された。誘導の経時変化及びタンパク質合成阻害剤を用いた検討より、グルココルチコイドによるCYP3A41mRNA発現誘導には、短寿命のタンパク質因子の新規合成が必要であることが示された。以上より、マウス肝細胞初代培養系においても、Cyp3a41遺伝子が生理的機構を反映した転写調節を受けている可能性が示され、レポーター遺伝子アッセイの受容細胞として有望であることが明らかとなった。
数論的等式・漸近式と特殊函数

平成12年度の実績報告書に述べたように、この3年間の研究(むしろこれまでの研究生活)を通じて最大の成果は、平成l2年12月23日に、名古屋大学谷川好男助教授と京都大学数理解析研究所研究員吉元昌己氏と共同で、ゼータ関数に対する、モジュラー関係式を貫くルートの存在-モジュラー関係式原理-を発見したことであります。平成13年度は、この原理を個々のゼータ関数へ実際に適用し、ガンマ因子が一個の、ヘッケの関数等式をみたす種々のゼータ関数(とくに、多重フルウィッツゼータ関数、エプシュタインゼータ関数、保型形式に対応するL-関数)の整数点および有理点におけるラマヌジャン公式を求めることに成功致しました(裏面の業績[3],[4])。この原理の発見に至ったのは、ゼータ函数値の急速収束級数表示を改良しようという試みにおいてであり、[1]では、それが「フルウィッツ・ゼータ函数を係数にもつベキ級数を、フルウィッツ・ゼータ函数の導函数を含む有限和で表す」という「和公式」から従うことを示しております。昨年出版された、Choi-Srivaslavaの著書『Series associated with the zeta and related functions」Kluwer Academic Publishers,2001の第4章にある公式は、ほとんどすべて、論文[1]の公式の系であります。また、これと平行して、[2]では、マイエ行列式を構造的に解析レ、こクランゼン型のマイエ行列式と合わせることによって、デデキントゼータ関数の正の整数点における特殊値が表示できることが示されました。[6]では、約数問題の進展を行いました。また、現在、中国科学院教授C.-H.Jia氏とともに、日中セミナーの報告集(裏面の図書)を編集しております平成12年度の実績報告書に述べたように、この3年間の研究(むしろこれまでの研究生活)を通じて最大の成果は、平成l2年12月23日に、名古屋大学谷川好男助教授と京都大学数理解析研究所研究員吉元昌己氏と共同で、ゼータ関数に対する、モジュラー関係式を貫くルートの存在-モジュラー関係式原理-を発見したことであります。また、現在、中国科学院教授C.-H.Jia氏とともに、日中セミナーの報告集(裏面の図書)を編集しております高木函数,リーマン函数,ワイエルシュトラス函数等のギャップ・フーリエ級数で与えられた,カオスを生成する函数に対し,それに附随する生成ディリクレー級数を考察し,それらのオイラー積分解を得ることができた.それにより,ファーレイ分数値による,リーマン予想との同値命題を求めることに成功した.離散力学系の観点からいえば,本研究成果は,その無限和であり,いわばアトラクターの部分に当たる.これは,指導下の院生吉元との共著として,Publ.Math.(Debrecen)に掲載予定である.力学系により関連の深い有限和の部分は,指導下の院生吉元が論文にまとめているところである.ファーレイ分数を含むベキ和についても広範な結果が得られ,論文として投稿した.ゼータ・レギュラリゼーションについては,定値2次形式のラプラシアンの行列式すなわち,クロネッカーの第1極限公式と,その加法指標付きの場合の第2極限公式を融合することに成功し,指導下の院生熊谷,吉元がそれぞれ論文にまとめて投稿した.また,以前に得たフルウィッツ・ゼータ函数を含む非常に一般の和公式の応用として,ゼータ-,L-函数の急収束級数表示を得た.これは,熊谷,吉元との共著で,The Ramanujan J.に掲載予定である.以後の進展の方向は無限にあるが,取敢えず,多変数のバーンズの多重ガンマ函数の研究を進める予定である.本年度の最大の成果は,平成12年12月23日に名大谷川好男,京大吉元昌己ととも得た,ゼータ函数に関するスシュムナー原理であります.

これは,従来,ゼータ函数に対して,函数等式がもっとも基本的であると考えられ,その線に沿って考察がおこなわれてきたのを,ボホナーにしたがって,函数等式に同値なモジュラー関係式を基本におくことにより,モジュラー関係式から,保型形式(の変換公式)がえられ,したがって,函数等式をみたすゼータ函数から保型形式をつくりだすことができ,逆に,保型形式(の変換公式)から,モジュラー関係式,したがって,函数等式をみたすゼータ函数が偉られるという,へッケ理論の画期的な拡張の部分もあります.これにより,保型形式の理論と解析数論の境界がなくなって,おおきな一つの枠組みで考えることができるようになりました.さらに,この原理により,不完全ガンマ函数係数級数表示を経由して,臨界領域でなりたつ唯一の公式である,リーマンジーゲル公式に至ることができます.この原理により,ゼータ函数の理論に革命が起こることは確実であります.その一部は,国際会議の報告集に掲載予定の論文で述べております.今後5年間に渡り,毎年10編程度の画期的な論文を著すことにより,西洋に先んじられていた,数学の最先端を,日本から発信できるものと確信しております.さらに,フルウィッツ・ゼータ函数を含む非常に一般の和公式の応用として,ゼーター,L-函数の急収束級数表示を得ることに成功致しました.ファーレイ分数を含むベキ和についても広範な結果が得られ,日本数学会の学会誌に掲載されました.平成12年度の実績報告書に述べたように、この3年間の研究(むしろこれまでの研究生活)を通じて最大の成果は、平成12年12月23日に、名古屋大学谷川好男助教授と京都大学数理解析研究所研究員吉元昌己氏と共同で、ゼータ関数に対する、モジュラー関係式を貫くルートの存在-モジュラー関係式原理-を発見したことであります。平成13年度は、この原理を個々のゼータ関数へ実際に適用し、ガンマ因子が一個の、ヘッケの関数等式をみたす種々のゼータ関数(とくに、多重フルウィッツゼータ関数、エプシュタインゼータ関数、保型形式に対応するL-関数)の整数点および有理点におけるラマヌジャン公式を求めることに成功致しました(裏面の業績[3],[4])。この原理の発見に至ったのは、ゼータ函数値の急速収束級数表示を改良しようという試みにおいてであり、[1]では、それが「フルウィッツ・ゼータ函数を係数にもつベキ級数を、フルウィッツ・ゼータ函数の導函数を含む有限和で表す」という「和公式」から従うことを示しております。昨年出版された、Choi-Srivastavaの著書「Series associated with the zeta and related functions」Kiuwer Academic Publishers,2001の第4章にある公式はほとんどすべて、論文[1]の公式の系であります。また、これと平行して、[2]では、マイエ行列式を構造的に解析し、こクランゼン型のマイエ行列式と合わせることによって、デデキントゼータ関数の正の整数点における特殊値が表示できることが示されました。[6]では、約数問題の進展を行いました。また、現在、中国科学院教授C.-H.Jia氏とともに、日中セミナーの報告集(裏面の図書)を編集しております。
肺の線維化と気腫化における誘導型NO合成酵素遺伝子発現の意義とNOの役割

本年度は昨年度に引き続き、研究目的の肺の急性傷害と修復過程でのiNOS遺伝子発現の関与、iNOS誘導が気腫化と線維化の規定因子となるか、肺のiNOS発現誘導と肺胞マクロファージのNO産生との相関、線維化関連サイトカインの遺伝子発現への影響、iNOS遺伝子発現に対する各種抗炎症剤、抗生剤、抗酸化剤の効果、について検討した。マウスにプレオマイシン(BLM)を腹腔内少量間歇投与することによりヒト肺線維症類似の肺線維化が生じた。この線維化はniacin(NA)やnicotinamide(ND)により抑制された。BLM投与により肺胞マクロファージでのiNOS遺伝子発現は軽度誘導されたが、線維化関連サイトカインtransforming growthfactor β、platelet-derived growthfactorの肺組織における発現は線維化群、線維化抑制群、対照群間で明らかな差を認めなかった。またNAやNDによる線維化抑制は急性期の炎症抑制に基づくものではなかった。一方、培養ラット肺胞マクロファージを用いてlipopolysaccharideとinterferon・γにより誘導されるiNOS遺伝子発現とNO産生をそれぞれノザンプロット法とポーラログラフィ法で検討したところ、ステロイドホルモンや非ステロイド消炎剤、マクロライド系抗生剤はいNOS遺伝子発現とこれに基づくNO産生を有意に抑制したが、セフエム系抗生剤、ペニシリン系抗生剤、ニューキノロン系抗菌剤、抗酸化剤に抑制効果は認められなかった。これらを考慮すると、炎症による肺の急性傷害の成立に肺胞マクロファージでのiNOS遺伝子発現とそれによるNO産生が寄与している可能性はあるが、iNOS発現自体が線維化関連サイトカインの発現などを通じて肺の線維化を規定する可能性は低いと考えられた。またマクロライド系抗生剤や抗炎症薬がiNOS発現を抑制することにより線維化や気腫化につながる肺の傷害を防ぐ可能性が示唆された。本年度は、研究目的の、1肺の急性傷害と修復過程での誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)遺伝子の関与を明確にする、2iNOSの制御が気腫化と線維化の規定因子となりうるかを検討する.に対応して、ブレオマイシン(BLM)による肺傷害、肺線維化モデル動物の作成と検討、肺砲マクロファージ(MΦ)におけるiNOS遺伝子発現の制御についての検討を行った。
レチノイドによるサイトカイン受容体発現調節を介した癌細胞サイトカイン感受性の制御

肝癌ではレチノイドの核内受容体(RXRα)がRas-Raf1/Erk系によるリン酸化を受け、転写機能を喪失しており、正常なレチノイドの細胞増殖抑制作用が阻害されているこを明らかにしてきた。一方、教室で開発した合成レチノイド(ビタミンA誘導体)は肝細胞癌にアポトーシス(細胞死)を誘導し、肝(前)癌細胞クローンを硬変肝から消去することで、肝発癌を抑制する。この合成レチノイドはRXRαのン酸化を抑制し、その機能を回復させる働きを有することが明らかにした。本研究では、機能回復したRXRαの下流にあり細胞増殖の抑制・アポトーシスの誘導を行う実行遺伝子群として、インターフェロン(IFN)受容体やIFNの細胞内情報伝達蛋白であるSTAT1を同定した。肝癌細胞において合成レチノイドは細胞表面のIFN受容体の発現を誘導し、その下流にあるSTAT1の蛋白合成も亢進させ、癌細胞のIFNに対する感受性を高めさせた。その結果、IFN耐性であった肝癌細胞に感受性を獲得させ、レチノイド+IFNによる相乗的なアポトーシス誘導を導いた。この研究成果は、レチノイドによる癌の化学予防と免疫予防を橋渡しし、将来的な両者の併用による発癌予防(免疫化学予防)の先鞭を付けるものである。また、現在まで多く、の研究者が取り組んでいるにもかかわらず、肝癌には特異的な遺伝子異常が見られていない肝発癌を、蛋白レベルでの異常による「核内受容体病」であると捉え、その機能回復が発癌予防につながるという独創的な病態機序の解明に繋がる成績である。我々はレチノイドによる肝発癌抑制をテーマとして研究を進めてきた。その結果1996年に非環式レチノイドが根治療法後の二次肝癌の発生を有意に抑制できることを、1999年には肝癌の発生を抑制するのみならず患者の生命予後をも改善することを発表し得た。その作用機序をさらに明らかにするため、分化誘導とアポトーシス誘導機序の検討を進めている。本年度の重要な成績は、以下の通りである。1)この非環式レチノイドは、単一の核内受容体にリガンドとして結合するのではなく、かなり広範囲の核内受容体と結合することが明らかとなった。この核内受容体は細胞特異性があり、そのレチノイドとの反応性にも細胞により違いが認められた。これは分化誘導やアポトーシス誘導機序を考える上でも、今後の薬剤デザイン上も重要と考えられた。2)関連する核内受容体のひとつであるレチノイドXレセプターの特定部位(260番目のセリン残基)のリン酸化の状態や、代謝の速度に差があることが明らかになり、これが肝細胞の癌化と強く結びついている可能性が示唆された。3)非環式レチノイドとインターフェロン(IFN)-βを加えることにより相乗的にアポトーシスの誘導を高めることが出来る。この時、非環式レチノイドによりIFN受容体の膜表面への表出、細胞内シグナルであるSTAT1の量ならびにその活性、さらに下流にある2,5AS活性を上昇させることを認めた。これらの知見は、肝癌細胞内で変化を来した核内受容体分子を標的として、そのリガンドである非環式レチノイドを用いることにより、アポトーシスからすり抜けた癌細胞を再度分化させてアポトーシスに導くという、大きな発癌予防の戦略を支持するものとして極めて重要と考えられる。肝癌細胞は一般にサイトカインによるアポトーシス誘導に抵抗性であり、宿主の生体反応や薬剤による癌細胞の排除を阻害し、癌細胞の生体内での生存を継続させている。一方、この点を解決することが出来れば、効率の高い癌治療(癌細胞排除)の開発が期待できる。

我々は肝癌細胞において、サイトカインとしてはインターフェロンをモデルとし、肝癌細胞に分化誘導効果を発揮するレチノイドを修飾薬剤として用いることにより、肝癌細胞のインターフェロン感受性を制御できるか否かを検討し、期待できる結果を得た。5種類の肝癌細胞を検討したが、何れもインターフェロンによってアポトーシスは誘導されなかった。レチノイドの単独処理でもアポトーシス誘導には56日を要した。ところが両者を併用することにより、2日間の培養で高度にアポトーシスが惹起された両化合物の前後関係を検討したところ、レチノイドによる前処理が不可欠であった。すなわちレチノイドは肝癌細胞にインターフェロン感受性を誘導した。その機序は(1)レチノイドによるインターフェロン受容体mRNA発現の増強、(2)インターフェロン受容体蛋白の細胞表面への表出、(3)インターフェロン受容体を起点とする細胞内情報伝達経路の賦活(STAT1経路の増強)、(4)下流の標的遺伝子(アポトーシス惹起能を有するOAS、等>の誘導、であった。以上、レチノイドが細胞表面へのサイトカイン受容体表出調節を介して、癌細胞のサイトカイン感受性を制御する機構を、肝癌細胞をモデル細胞・インターフェロンをモデル分子として解明した。今年度は、機能回復したRXRαの下流にあり細胞増殖の抑制・アポトーシスの誘導を行う実行遺伝子群として、インターフェロン受容体やインターフェロンの細胞内情報伝達蛋白であるSTAT1を同定した。肝癌細胞において非環式レチノイドは細胞表面のインターフェロン受容体の発現を誘導すると同時に、その下流にあるSTAT1の蛋白合成も亢進させ、癌細胞のインターフェロンに対する感受性を高めさせた。その結果、インターフェロン耐性であった肝癌細胞に感受性を獲得させ、非環式レチノイド+インターフェロンによる相乗的なOAS活性の誘導やアポトーシス誘導を導いた。この研究成果は、レチノイドによる癌の化学予防(chemoprevention)と免疫予防(immunoprevention)を橋渡しし、将来的な両者の併用による発癌予防(免疫化学予防:immnono-chemoprevention)の先鞭を付けるものである。加えて科学的には、現在まで多くの研究者が取り組んでいるにもかかわらず、肝癌には特異的な遺伝子異常が見られていない肝発癌を、蛋白レベルでの異常による「核内受容体病」であると捉え、その機能回復が発癌予防につながるという独創的な病態機序の解明に繋がる成績である。
無限次元多様体と帰納極限のトポロジー

本研究期間中、LF多様体の理論、すなわちLF空間と呼ばれる局所凸線形位相空間をモデルとした多様体の理論の構築を目指して、関連する諸問題を研究し多くの成果が上げたが、LF多様体の特徴付けに関してはBanakhとRepovsに先を越されてしまった。また、無限次元トポロジーの若手研究者育成のために、単体複体のトポロジー、次元論、ANR理論を学ぶための大学院生用教科書であり、研究者にとっても有用な参考文献になる書籍を完成させることができた。この書籍「Geometric Aspects of General Topology」の出版がシュプリンガー社により受理された。本研究の主な目的は,フレッシェ空間(完備距離付け可能局所凸線形位相空間)の単調増加列の帰納的極限である局所凸線形位相空間として定義されるLF空間をモデルとする多様体の位相構造を研究することである.まず,本研究課題の申請書で述べたWhitney位相を持つ同相写像群に関する論文とLF空間の開集合に関する単体分割定理を示した論文が,それぞれTopology Proc.とCanad.J.Math.に掲載予定だが,出版に先立ち電子出版された.さらに,位相群への連続写像がなすWhitney位相を持つ群に関する論文が掲載されたTopologyAppl.は本年度中に出版された.本研究において重要である距離位相を持つ単体複体に関しては,細分が距離位相を保存するためには,頂点集合が疎であることが必要十分であることを示すことができ,論文はCanad.Math.Bull.に掲載が決まり出版に先立ち電子出版された.Hendersonは単体複体の細分に関するWhiteheadの定理が距離位相に関しても成立することを1975年に示したが,彼の証明には局所有限次元の条件が必要であった,昨年度末に,研究代表者は無条件で有効な証明を与えることができ,この論文はJ.Math.Soc.Japanに掲載が決まった.さらに,一様収束位相を持つ数直線上の一様同相写像群に関する論文がTopology Appl.に出版された.さらに,幾何的トポロジーにおいて,非常に重要な例であるTaylorのCE写像の構成と証明の間違いを発見し正しい証明を与えることができたが,その論文はGlasnik Mat.に掲載されることになった.さらに,本年度中,連携研究者も多くの様々な成果を上げることができた.本研究の主な目的は,フレッシェ空間(完備距離付け可能局所凸線形位相空間)の単調増加列の帰納的極限である局所凸線形位相空間として定義されるLF空間をモデルとするLF多様体の位相構造を研究することである.可分ヒルベルト空間l_2の有限座標以外は0となる点全体からなる部分線形位相空間l_2^fは,典型的な可分LF空間であるユークリッド空間の帰納極限R∞の異なる位相付けと見なせる.両者は,可算無限充満複体の弱位相を持つ多面体と距離位相を持つ多面体と同じ同相写像で同相となっている.同様に,l_2^f(τ)を稠密度がτ>N_0である非可分ヒルベルト空間l_2(τ)の有限座標以外は0となる点全体からなる部分線形位相空間とすると,頂点の濃度がτの無限充満複体の距離位相を持つ多面体と同相であることが分かったので,どんな線形位相空間が(ホワイトヘッド)弱位相を持つ多面体と同相なのか興味深い問題である.有限次元部分線形空間に関する弱位相をl_2^f(τ)に入れても線形位相空間にはならないが,Rの箱積の部分空間としての位相(箱位相)をl_2^f(τ)に入れるならば局所凸線形位相空間になる.単体複体の多面体における箱位相に相当する位相は弱位相と距離位相の中間にあたり,多面体はこの位相によって距離空間に対するANEになることが分かったが,単体複体の位相としては非常に悪い性質を持つ位相であることも判明した.実際,重心細分はこの位相を保存しないし,この位相に関して連続とならない単体写像も存在する.この結果は,論文にまとめられ学術雑誌に投稿され審査中である.その他,これまでの出版予定であった論文が年度中に出版された.本研究の主な目的は、フレッシェ空間(完備距離付け可能局所凸線形位相空間)の単調増加列の帰納的極限であるLF空間をモデルとするLF多様体の理論の構築を目指すと共に、無限次元多様体の応用を図ることである。昨年度、LF多様体の位相構造を研究に有用であろうと期待される箱位相を持つ単体複体を研究したが、非常に悪い性質を持つことが判明した。今年度は、新たな手法を求め試行錯誤を行ったが良い進展が見られなかった。無限次元多様体の応用に関しては,関数空間に関して成果を上げることが出来た。無限個の点を含む

コンパクト距離空間X上の実数値連続関数のなす空間はバナッハ空間でヒルベルト・キューブの擬内部と同相であるので、ヒルベルト・キューブと同相なコンパクト化を持つことが分かるが、それが自然なものとして得られるかが問題となる。以前、上原との共同研究により関数をそのグラフと同一視することにより、関数空間をXと数直線のエンド・コンパクト化の直積空間の冪空間に埋め込み、そこでの閉包がその様なコンパクト化であることを示した。その後、小賀坂との共同研究によりXがコンパクトでない場合にも結果を拡張することが出来、今年度はさらに数直線をより一般の1次元局所コンパクトARの場合に拡張することに成功した。研究代表者が無限次元トポロジーの研究を目指す院生のために作成し年々加筆・改良を重ねてきたレクチャーノートを出版すべくシュプリンガーに投稿していたが、前半部分をGeometric Aspects of General Topologyという1冊の著書として編集し直すことによって、出版が決まり現在印刷中である。これも大きな成果の一つであるが、今年度は出版のためにかなりの時間と労力を費やした。また、これまで出版予定であった論文が今年度中に出版され、連携研究者も多くの様々な成果を上げることができた。LF多様体に対しても,無限次元多様体に関する基本定理が成立することが予想されるが,それらの証明には新たな技法や手法が必要であり,試行錯誤が続いている.1年目の進展に比べれば,2年目の進展は鈍ったものとなった.若手研究者の育成にも力を入れており,これまでの教材であったLecture Notesの改訂と出版を計画しており,そのために多くの時間を取られたことも理由の1つである.24年度が最終年度であるため、記入しない。上に述べたようにLecture Notesの改訂と出版の計画のために,2年目の進展はやや鈍りはしたが,Banakhたちによる研究においてヒントが見出されており,さらに関連する単体複体に関する研究も進んでいるので,引き続き同じ計画で研究を行っていく.予算の使い方に関してはLecture Notesの出版計画のために,外国人研究者招聘の費用を英文校正の費用に割り振り,出版を優先する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
有機半導体／無機透明ナノ多孔性電極から成る新規有機薄膜太陽電池の開発

無機ナノ材料をグラフェンシート120層分程度の炭素ナノ薄膜で均一にコートする「炭素ナノ被覆」を用いれば、コアとなる無機ナノ材料の美しい構造を保ったまま、その表面に炭素ならではの性質(導電性、疎水性、耐食性)を付与できる。しかも、炭素層は極めて薄いため光を透過する。本研究においては、アルミニウム陽極酸化被膜(Anodic Aluminum Oxide: AAO)を炭素ナノ被覆することで配列ナノ細孔をもつ透明導電膜を調製し、その細孔内部に有機半導体を充填した、新規太陽電池を作製することを主たる目的とし、研究開発を行った。その結果、1つの分子内部でp-n接合が実現している、フラーレンを包接したポルフィリン二量体を炭素被覆AAOの1次元ナノ細孔内部にほぼ90%以上の割合で充填することに成功した。また、炭素ナノ被覆は様々なナノ材料と組み合わせることができるため、新規融合マテリアルの調製にも挑戦した。一例としては、導電性の補助と構造変化抑制を目的にSiナノ粒子を均一に炭素ナノ被覆し、性能向上を検討した。Siを限界まで体積膨張させずに充放電を繰り返したところ、炭素は導電パスを保ったまま均一にSi骨格と融合してシワ状のナノ構造を形成し、極めて高いレート特性およびサイクル特性を示すことを見出した。調製した材料は、5.0 A/gの大電流密度においても1500 mAh/gの高容量を示し、100サイクルの間、全く容量の低下がみられなかった。その他にも、領域内で多くの共同研究を行った。具体的には、シリカナノ粒子の炭素ナノ被覆による新規構造色の発現、新規人工骨足場材料の開発、炭素ナノ被覆による電池電極材料の開発、イオン液体を原料とする新規多孔性グラフェン材料の開発などを行い、多くのシーズおよび成果を得ることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。高効率な新規有機薄膜太陽電池の開発を目指し、H23年度は規則性ナノ細孔をもつ透明導電膜の調製を行った。まず、Al板を酸性電解液中で陽極酸化することで、Al陽極酸化皮膜(AAO)を調製した。AAOは多孔性皮膜であり、膜面に対して垂直に配向したシリンダー状のナノ細孔を有する。細孔長は膜面にほぼ等しく、0.1100μm程度の範囲で自在に制御できる。また、細孔径も15200nm程度の範囲で制御可能である。AAOの主成分は酸化アルミニウムであるため、透明であるが導電性は無い。そこで、化学蒸着法(CVD)によってAAOの細孔内部を含む全表面を厚さ2nm程度の炭素ナノ薄膜で均一に被覆した。調製した炭素ナノ被覆AAOは規則性ナノ細孔をもち、かつ透明性と導電性を有していることを確認した。このように、金属基板上に多孔性透明導電膜(炭素ナノ被覆AAO)を堆積させたタイプは片側が光を透過するので太陽電池へ利用できるが、多孔性透明導電膜を透明基板上に作製できれば、デバイスとして透明な太陽電池を設計できる。そこで、石英基板上にAl層をスパッタし、これをAAOとした後にCVDによって炭素ナノ被覆することで、基板も光を透過する多孔性電極の調製も実施した。H24年度は、導電率と透過率の更なる向上を検討する。我々が過去に開発したヘテロ原子ドープCVDにより、NやBを炭素ナノ薄膜へドープしその影響を調べる。さらに、垂直配向ナノ細孔内部へ有機半導体を導入し、有機薄膜太陽電池を作製し、その性能評価を行う予定である。

H23年度までに多孔性無機透明導電膜作製技術を確立した。また、太陽電池の評価システムおよび評価法もセットアップが完了している。あとは、多孔性無機透明導電膜にp型およびn型有機半導体を導入すれば、太陽電池を構築でき、かつその評価を実施することができる。H24年度の早い段階で評価を実施し、その結果を材料合成にフィードバックし、更ならる性能の向上に取り組む。24年度が最終年度であるため、記入しない。H23年度までに多孔性無機透明導電膜の構造最適化は完了しているので、H24年度にはここにn型およびp型有機半導体を導入し、太陽電池を構築する。まず、もっとも単純なセルとして、バルクヘテロタイプのpn混合層を単に充填し、透明導電膜が多孔性であることの利点を明らかにする。さらにその後、p-nナノ積層タイプの有機薄膜太陽電池を作製し、高性能化を図る。
植物病原菌の宿主特異的毒素耐性を利用した病害抵抗性植物の細胞工学的創成

1.宿主特異的毒素の探索植物感染における特異性決定因子である宿主特異的毒素(HST)を生成する植物病原菌は約20例報告されているが、新たにアブラナ科植物黒すす病菌、キュウリ褐斑病菌、トマト褐色輪紋病菌、セイヨウナシbrown spot病菌が新規HSTを生成することを見い出し、それぞれAB、CCC、CCTおよびSV毒素と命名した。これらのHSTの構造決定を試みた結果、AB毒素はこれまでのHSTが低分子の二次代謝産物であるのとは異なり、35kDaの蛋白質であること、CCT毒素は分子量2,780の環状ペプチドであることが明らかとなった。2.植物の細胞培養と植物細胞からの宿主特異的毒素耐性細胞の選抜トマト褐色輪紋病は栽培品種に広く発生がみられ、抵抗性品種は見い出されていない。そこで、トマト品種の桃太郎を用いて、まず、細胞培養と培養細胞からの個体再生を検討した。その結果、緑色小斑カルスより効率よく植物個体が再生されることが明らかとなった。次に、トマト褐色輪紋病菌のCCT毒素を用いて緑色小斑カルスから毒素耐性カルスの選抜を行った。CCT毒素処理で褐変のみられないカルスを選抜し、植物体再生を試みたがすべて再生途中で生育が停止した。一方、トマトアルターナリア茎枯病菌のHST(AAL毒素)では、AAL毒素の不活化遺伝子(ESP1)が明らかとなっているので、ESP1保有バイナリーベクターを導入したAgrobacterium tumefaciensを作出し、アグロインフェクション法によるトマトの形質転換を試みた。一部にカルス形成は見られたものの形質転換植物体を得るまでには至らなかった。1.宿主特異的毒素の探索最近、新潟県でAlternaria属菌による西洋ナシ黒斑病の発生が報告されたが、これまで明かとなっている宿主特異的毒素(HST)生成菌はAlternaria属菌が多いので、本菌のHST生成有無について検討した。しかし、本菌の西洋ナシに対する病原性は弱くHST生成を確定するまでには至らなかった。2.宿主特異的毒素の単離と簡易抽出法の確立最近、HST生成が明かとなったトマト褐色輪紋病菌(Corynespora cassiicola)の培養ろ液よりHST(CCT毒素)の単離精製を試みた結果、分子量2,780の環状のペプチドであることが明かとなった。一方、ナシ黒斑病菌(A.alternata)のHST(AK毒素)やアブラナ科植物黒すす病菌(A.brassicicola)のHST(AB毒素)は、化学的に不安定な物質で複雑な単離操作の過程で容易に失活するが、胞子発芽液を用いることにより比較的簡易にHSTを単離精製することが可能となった。3.植物の細胞培養と植物培養細胞からの宿主特異的毒素耐性細胞の選抜トマト褐色輪紋病は栽培品種に広く発生がみられ、これまで抵抗性品種は育成されていない。そこで、培養細胞からのCCT毒素耐性細胞選抜による褐色輪紋病抵抗性トマト品種の作出を試みた。トマト品種の桃太郎を用いて、まず、細胞培養と培養細胞からの個体再生を検討した。その結果、胚軸より誘導されたカルスのなかで、緑色小斑カルスより効率よく植物個体が再生されることが明かとなった。次に、これらカルスにCCT毒素を処理すると、ほとんどのカルスは褐変枯死したが、褐変のみられないカルス数株が得られた。現在、これらのカルスからの植物個体再生実験を継続中である。1.宿主特異的毒素の探索最近、新潟県でAlternaria alternataによる西洋ナシ黒斑病が発生している。A.alternataには7種類の宿主

特異的毒素(HST)生成菌が知られているので、本菌のHST生成について検討した。その結果、本菌は西洋ナシ以外に斑点落葉病感受性のリンゴ品種にも強い病原性を示した。さらに、斑点落葉病菌のHST(AM毒素)生合成遺伝子の存在とAM毒素生成が認められ、本菌はリンゴ斑点落葉病菌であることが明らかとなった。2.宿主特異的毒素の単離と簡易抽出法の確立西洋ナシbrown spot病菌の培養ろ液よりHST(SV毒素)の単離を試みた。カラムクロマトグラフィー、TLC、HPLCにより2つの毒素(SV毒素IおよびIIと命名)が単離できた。これらの毒素は高い親水性を示す低分子物質で、構造中にアミノの存在が示唆された。3.植物の細胞培養と植物培養細胞からの宿主特異的毒素耐性細胞の選抜トマト褐色輪紋病は栽培品種に広く発生がみられ、抵抗性品種は育成されていない。そこで、昨年に引き続き本菌のHST(CCT毒素)を用いてカルス細胞からの毒素耐性細胞選抜による褐色輪紋病抵抗性トマト品種の作出を試みた。CCT毒素処理でも褐変のみられないカルスが得られたが、これらのカルスから植物体は再生しなかった。一方、トマトアルターナリア茎枯病菌のHST(AAL毒素)では、AAL毒素を解毒する代謝遺伝子が明らかとなっている。そこで、本遺伝子保有バイナリーベクターを導入したAgrobacterium tumefaciensを用いてトマトの形質転換による毒素耐性トマトの作出を試みたが、形質転換体を得るまでには至らなかった。1.宿主特異的毒素の探索トマト褐色輪紋病菌は宿主特異的毒素(CCT毒素)を生産し、トマトに病原性を示すが、キュウリにも病原性を示す菌株が存在した。一方、キュウリ褐斑病菌にもキュウリ以外にトマトに病原性を示す菌株が存在し、両菌ともにトマトに病原性を示す菌株はCCT毒素の生産がみられた。また、キュウリに病原性を示す菌株では、キュウリにのみ活性を示す宿主特異的毒素の存在が示唆された。2.宿主特異的毒素の単離と簡易抽出法の確立CCT毒素は、グルコースを含む20のアミノ酸からなる環状ペプチド(分子量2780.6)であることが明らかとなった。また、セイヨウナシbrown spot病菌の宿主特異的毒素(SV毒素)では効率の良い単離・精製法が確立できた。3.植物の細胞培養と植物細胞からの宿主特異的毒素耐性細胞の選抜トマト褐色輪紋病菌のCCT毒素を用いて品種"桃太郎"の緑色小斑カルスから毒素耐性カルスの選抜を行った。CCT毒素処理で褐変のみられないカルスを選抜し、植物体再生を試みたが、すべて再生途中で生育が停止した。一方、トマトアルターナリア茎枯病菌のHST(AAL毒素)では、AAL毒素の不活化遺伝子(ESP1)が明らかとなっているので、ESP1保有バイナリーベクターを導入したAgrobacterium tumefaciensを作出し、アグロインフェクション法によるトマトの形質転換を試みた。一部にカルス形成は見られたものの形質転換植物棒を得るまでには至らなかった。