hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リン脂質リモデリング酵素LPCAT1の構造機能解析

リン脂質は、細胞内環境を維持する細胞膜の形成、細胞内外の物質輸送、膜タンパク質の局在・活性制御に関与し、シグナル伝達のメディエーターとしての機能も担う。脂肪酸鎖リモデリング経路は、リン脂質のホメオスタシスにおいて極めて重要な役割を果たす。本研究では、リン脂質リモデリングに関わるアシル転移酵素の一つであるリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素LPCAT1のEF-handドメインの立体構造を明らかにし、そのカルシウム結合能と基質認識への影響に関する新規の知見を得た。生体内に存在する多種多様なリン脂質は、細胞内環境を維持する細胞膜の形成、細胞内外の物質輸送、膜タンパク質の局在・活性制御に関与し、シグナル伝達のメディエーターとしての機能も担っている。リン脂質脂肪酸鎖リモデリング経路で働くリゾリン脂質アシル転移酵素群は、これらリン脂質の多様性と恒常性の制御において重要な役割を担っている。本研究では、リン脂質脂肪酸鎖リモデリングの鍵となるアシル転移反応の分子機構の解明に向け、リゾホスファチジルコリンアシル転移酵素LPCAT1の構造機能解析に取り組んだ。1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシル転移酵素(AGPAT)ファミリーに属する小胞体膜上に局在するアシル転移酵素であるLPCAT1は、膜貫通領域、AGPATファミリーに共通する3つの配列モチーフを含む触媒ドメインに加えて、2つのEF-handカルシウム結合モチーフを持つ。H27年度は、それぞれの機能ドメインの結晶構造解析に取り組んだ。第一に、LPCAT1のEF-hand領域の結晶構造を2.4オングストローム分解能で決定し、カルシウム結合による構造変化や機能制御に関わる構造知見を得た。異なる基質に対してカルシウム非依存的なアシル転移活性とカルシウムによる阻害効果を示すが報告されており、これらの知見はLPCAT酵素群の基質特異性や活性機序を理解する上で重要である。また、LPCAT1と同じくAGPATファミリーに属するリゾリン脂質アシル転移酵素であるLPCAT2のEF-hand領域の結晶化にも成功し、X線回折データーを得た。今後、構造決定を行い、LPCAT1とLPCAT2のカルシウム結合能の比較を行う。さらに、LPCAT1の膜貫通領域を除いた領域の大量発現系、試料調製法を確立、結晶化を行い、微結晶を得ている。結晶化条件を最適化し、結晶構造決定を行う予定である。研究計画通り、LPCAT1のEF-hand領域の結晶構造解析は順調に終了し、バイオインフォーマティクス解析や生化学的解析から、本酵素のカルシウム結合に関する知見を得た。触媒ドメインのみのタンパク質試料は可溶性が低く、構造解析のターゲットとして不向きであることがわかったため、膜貫通領域を除いた領域の発現、精製へと方針を変更し、その結果、微結晶が得られている。まだ、結晶化条件の改善が必須であるが、概ね順調に進んでいるものと考える。基質認識および触媒機構を明らかにするために、NMR, X線小角散乱(SAXS)など、X線結晶解析以外の構造生物学、物理化学的な手法を利用し、さらに効率的に研究を進めていくことが可能である。近年、リン脂質脂肪酸鎖リモデリング経路で働くリゾリン脂質アシル転移酵素群が、これらリン脂質の多様性と恒常性の制御に関与していることがわかってきた。本研究では、リン脂質リモデリングに関わるアシル転移酵素のひとつとして同定されたリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素LPCAT1の構造機能解析を行った。LPCAT1は、膜貫通領域、1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシル転移酵素(AGPAT)ファミリーに共通する3つの配列モチーフを含む触媒ドメインに加えて、EF-handカルシウム結合モチーフを持つ。これまでに、LPCAT1の脂肪酸転移アシル化活性に関して、異なる基質に対してカルシウム非依存的なアシル転移活性とカルシウムによる阻害効果を示すが報告されている。そこで、第一に、EF-handドメインの結晶構造を2.4 A分解能で決定し、そのルシウム結合能を検証した。アミノ酸配列から予想された通り、このドメインには2つのEF-handモチーフが含まれていた。得られた結晶構造とNMR滴定実験の結果から、N末側のモチーフにはカルシウムが弱く配位することができるが、典型的なEF-handモチーフと比較するとそのカルシウム結合能は顕著に低いことが示された。また、C末端側のモチーフにはカルシウム結合能はみられなかった。すなわち、EF-handドメインのみではカルシウムに特異的な結合しないことが示唆された。しかし、触媒ドメインとの相互作用によりEF-handドメインへのカルシウム結合が促進される可能性がある。現在、触媒ドメインとEF-handドメインも含む領域の発現、精製を行い、構造機能解析を進めている。H27年度前半で、カルシウム結合モチーフである2つのEF-handを含む領域(アミノ酸325495)の精製、結晶化を行い、位相決定のためのセレノメチオニンを導入したタンパク質試料を調製した。セレンの異常分散効果を用いて初期位相を決定し、結晶構造を決定した。H27年度後半から本年度(H28年度)では、得られた結晶構造を元にこの領域のカルシウムおよび他の金属への結合特異性を等温滴定カロリメトリー測定およびNMR滴定法を用いて解析した。

また、LPCAT1と同じく1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシル転移酵素(AGPAT)ファミリーに属するリゾリン脂質アシル転移酵素であるLPCAT2のEF-hand領域についても大量発現、精製、結晶構造解析を行い、機能の比較を行った。これらの結果については、現在、成果発表のための論文を作成中であり、LPCAT1のカルシウム結合ドメインに関する構造機能解析は概ね予定通りに進んだ。一方、触媒ドメインの構造機能解析については、可溶性タンパク質として大腸菌内で大量に発現させることが難しく、触媒ドメインとEF-handドメインを含む領域の解析に計画を変更した。本領域は、膜貫通ドメインを欠いているものの、全長における構造機能相関を検証するに十分な領域であると考えた。現在、微結晶を得られており、条件の最適化を行っている。また、このタンパク質試料を用いて、基質との結合実験を行った。H28年度では、概ね予定した実験を終了することができた。本研究では、リン脂質リモデリングに関わるアシル転移酵素のひとつとして同定されたリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素LPCAT1の構造機能解析を行った。LPCAT1は、膜貫通領域、1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシル転移酵素(AGPAT)ファミリーに共通する3つの配列モチーフを含む触媒ドメインに加えて、EF-handカルシウム結合モチーフを持つ。昨年度までに、EF-handドメインの結晶構造を2.4 A分解能で決定し、そのカルシウム結合モードを明らかにしている。論文作成のため、これまでに得られたapo型、Mg結合型、Ca結合型のEF-handドメイン構造の比較、さらに既知のEF-hand motifとの比較、類似性の検証を行った。その結果、予測されたcEF-handモチーフに加えて、配列から予測できなかった2つの`hidden'EF-hand (hEF-hand)モチーフを有することがわかった。hEF-handは典型的なカルシウム結合ループ領域を持たず、cEF1のヘリックス配置やループ構造を安定化する役割を果たしている。このような特徴的なドメイン構造は、ミトコンドリアのカルシウム結合GTPaseであるMiroタンパク質のカルシウム結合ドメインにもみられる。Miroタンパク質との構造類似性から、LPCAT1のEF-handドメインが触媒ドメインと連動してその酵素活性に関与することが示唆される。前年度着手した触媒ドメインとEF-handドメインを含むLPCAT1の構造機能解析を継続して行った。膜貫通領域を欠失した触媒ドメインとEF-handドメインの両方を含む領域(N末端欠失LPCAT1)を大腸菌内で大量発現、精製した。基質であるパルミトイルCoAもしくはリゾリン脂質との複合体の結晶化スクリーニング実験を行った。ポリエチレングリコールを沈殿剤とする条件から微結晶を得たが、X線結晶構造解析に適した単結晶を得るにはいたっていない。リン脂質は、細胞内環境を維持する細胞膜の形成、細胞内外の物質輸送、膜タンパク質の局在・活性制御に関与し、シグナル伝達のメディエーターとしての機能も担う。脂肪酸鎖リモデリング経路は、リン脂質のホメオスタシスにおいて極めて重要な役割を果たす。
前十字靭帯のバイオメカニクス-線維束張力作用部位の3次元動態マッピング-

靱帯張力を計測するために,6軸力センサのキャリブレーションにおいて,靱帯張力作用位置近辺で精度が高まるような方法に改良した.これにより,張力作用位置付近での荷重位置解析誤差を,10mm程度から1mm程度に減少させた.ロボットシステムにより複合荷重を膝関節に負荷し,その際の6軸力センサの出力を記録した.その後,大腿骨の前十字靭帯付着部近辺の形状を医用CTで計測し,先に求めた靭帯張力作用線と,CTによる靭帯付着部形状の交点を十字靭帯の張力作用点と判断した.その結果,屈曲位において脛骨に前方力が作用する際,前十字靱帯の前内側部に荷重作用位置があることが分かった.これは,別途行われた前十字靱帯張力分布の実験結果に一致するものであった.靱帯張力を計測するために,6軸力センサのキャリブレーションにおいて,靱帯張力作用位置近辺で精度が高まるような方法に改良した.これにより,張力作用位置付近での荷重位置解析誤差を,10mm程度から1mm程度に減少させた.ロボットシステムにより複合荷重を膝関節に負荷し,その際の6軸力センサの出力を記録した.その後,大腿骨の前十字靭帯付着部近辺の形状を医用CTで計測し,先に求めた靭帯張力作用線と,CTによる靭帯付着部形状の交点を十字靭帯の張力作用点と判断した.その結果,屈曲位において脛骨に前方力が作用する際,前十字靱帯の前内側部に荷重作用位置があることが分かった.これは,別途行われた前十字靱帯張力分布の実験結果に一致するものであった.我々はこれまでに,独自に開発したロボットシステムを用いて,正常膝関節および再建膝関節の3次元力学試験を行い,膝の挙動と前十字靭帯の機能について調べてきた.特に,正常膝に関しては,前十字靭帯を前内側線維束,中間線維束,後外側線維束に分けて機能を調べ,前方引き出し力作用時には,伸展位で後外側線維束が緊張し,屈曲するにつれて中間線維束が緊張すること,前内側線維束が全屈曲角度で比較的緊張を維持すること,などを明らかにした.この結果を参考にして,前十字靭帯の機能を別の観点から検討するために,本研究では研究代表者が発案した手法により,前十字靭帯内の張力作用位置を,線維を分離せずに同定することを目指している.平成20年度は,ロボットシステムに固定されている6軸力センサを用い,様々な荷重状態で前十字靭帯に生じた張力を解析し,張力作用線を求めた.実験後に膝関節のCT撮影を行い,前十字靭帯付着部の3次元形状を求めた,そして,張力作用線と付着部形状の交点を,靭帯張力作用点として求めた.その結果,膝に作用する荷重の種類や大きさによって,張力作用点が靭帯付着部内を移動することが分かった。しかし,荷重の種類によっては解析誤差が増大して,張力作用点が付着部内におさまらない場合があった.基本実験用のシステムを作り,誤差に関して,原因解明と低減手法の開発について検討する必要がある.本研究では,靭帯が付着した骨に伝わる6軸荷重を6軸力センサで計測し,これと等価な単一荷重を求めることで靭帯張力を求める方法を用いる.そこで,骨を剛体に見立て,骨に固定した6軸力センサの6軸荷重出力を,靭帯付着部近辺で高精度に計測するための,6軸力センサのキャリブレーション方法を開発した.骨の代わりにアルミ合金ブロックを用い,6軸力センサを固定した.実際の関節を用いた試験時において大腿骨の靭帯付着部に近い位置にあるアルミ合金上の複数の点をセンサ座標系(x-y-z)で表した.それらの位置にx,y,またはz方向の荷重を与え,その大きさを変化させながら,6軸力センサの出力を記録した.荷重を変化させたときの6軸力センサの出力差を基にクロスカップリング除去マトリックスを求め,マトリックスを計測プログラムに入力した.あらためてアルミ合金ブロックの任意位置に荷重を与え,6軸力センサの出力を記録した.この出力を,別途作成した荷重作用線解析プログラムに入力したところ,1mm程度の誤差で荷重作用位置が求められることを確認した.メーカーが提供する6軸力センサの座標系中心でのクロスカップリング除去マトリックスを用いる従来法に比べ,靭帯張力作用位置をより高精度に求めることが可能となった.新規購入した6軸力センサをロボットシステムに固定するためのクランプを作成した.上記の解析方法をプログラム化し,実験準備を進めた.整形外科疾患において,靭帯損傷や変形性関節症などの関節部における疾患の占める割合は高い.スポーツの興隆や高齢化,あるいは交通事故の増加がさらに拍車をかけている,これらの疾患の治療成績を向上させるためには,生体関節そのものの特性を可能な限り解明し,ついで臨床処置の良否について詳細な解析・評価を行って行く必要がある.本研究では膝靭帯の中で最も損傷頻度の高い前十字靭帯に着目し,独自に開発したロボットシステムと荷重作用線の解析手法を用いて,前十字靱帯張力作用位置を大腿骨付着部内で求めた以前に開発した6軸力センサのキャリブレーション手法を改良を加え,キャリブレーションを,センサの中心ではなく,靱帯張力作用位置近辺で行うことにした.これにより,張力作用位置付近での荷重位置解析誤差を,10mm程度から1mm程度に減少させた.ついで,ロボットシステムにより複合荷重を膝関節に負荷し,その際の6軸力センサの出力を記録した.その後,大腿骨の前十字靭帯付着部近辺の形状を医用CTで計測し,先に求めた靭帯張力作用線と,CTによる靭帯付着部形状の交点を十字靭帯の張力作用点と判断した.

屈曲位において脛骨に前方力が作用する際,前十字靱帯の前内側部に荷重作用位置があることが分かった.これは,別途行われた前十字靱帯張力分布の実験結果に一致するものであった.前十字靱帯の再建術において,前十字靱帯を一本の線維として代替する従来再建法の場合,少なくとも屈曲位においては前内側部付着部に大腿骨骨孔を作孔するべきであることが示唆された.また,前十字靱帯を二本の線維として再建する2束再建法において,屈曲位での再建膝の特性を向上させるためには,前内側グラフトを強固に再建することが重要であることが分かった
立体構造を高度に制御した反応性高分子の合成とクリック反応による配列制御

Cu(I)触媒存在下で高効率・高選択的に進行するアルキンとアジドの反応(クリック反応)を高分子の側鎖修飾反応に適用し,立体構造の高度に制御された高分子誘導体を得た。ポリマーに導入されるユニットの配列は用いる添加アミンによってブロック的あるいはランダム的に制御できた.この添加アミンの効果は,末端アジド化ポリマーを用いるグラフト化反応,アジドおよびアルキン基を有するブロックコポリマー間の反応による分岐ポリマーの合成,二官能性アジドを用いる架橋反応においても顕著にみられ,クリック反応による高分子反応の制御の新しい手法となることを明らかにした.Cu(I)触媒存在下で高効率・高選択的に進行するアルキンとアジドの反応(クリック反応)を高分子の側鎖修飾反応に適用し,立体構造の高度に制御された高分子誘導体を得た。ポリマーに導入されるユニットの配列は用いる添加アミンによってブロック的あるいはランダム的に制御できた.この添加アミンの効果は,末端アジド化ポリマーを用いるグラフト化反応,アジドおよびアルキン基を有するブロックコポリマー間の反応による分岐ポリマーの合成,二官能性アジドを用いる架橋反応においても顕著にみられ,クリック反応による高分子反応の制御の新しい手法となることを明らかにした.(1)メタクリル酸プロパルギル(PgMA)ならびにそのアルキン水素を保護した3-トリメチルシリルプロパルギルエステル(TMSPgMA)を合成し,LiOSiMe_3を助剤とする開始剤系を用いてアニオン重合を行い,高度にイソタクチックで,分子量分布の制御された反応性ポリマーを合成した.(2)ベンジルアジド、安息香酸アジド、アントラセン-9-メチルアジド,1-アジドアダマンタンなど種々のアジド化合物と(1)で得たポリマーとのクリック反応をCu(I)触媒存在下で行い、定量的修飾反応を達成し、立体規則性の制御された高分子誘導体を得た。(3)上記反応の過程で、部分修飾反応を試みたところ、Cu触媒とともに用いる添加アミンの種類によって、導入される側鎖の配列に違いのあることを見出した。すなわち、配位性の強いトリアミンでは反応がランダムに進行するのに対して、配位力の弱いモノアミンを用いた場合には、ポリマー側鎖に生成したトリアゾール基がCu触媒の活性化を促すため、隣接基の反応が促進されてブロック的連鎖が生成することを明らかにし、触媒系の選択による連鎖制御を可能にした。(4) PgMAとTMSPgMAの共重合を行い,ランダム共重合体ならびにブロック共重合体を合成し、これらを用いて、PgMA単位の第一段クリック反応,TMSPgMA単位の脱保護後の第二段クリック反応で2種のアジド化合物を導入し、原料共重合体の組成連鎖を反映した連鎖の制御された立体規則性機能性ポリマーを合成する手法を確立した。1.メタクリル酸プロパルギルのアルキン水素を保護した3-トリメチルシリルプロパルギルエステル(TMSPgMA)のアニオン重合で合成した高度にイソタクチックなポリマーを用い、Cu触媒によるアジドとのclick反応における添加アミンによる生成連鎖の違いを明らかにするため、トリアジン基を含む初期反応生成(共重合体)のNMRによる連鎖解析を行った。配位力の弱いモノアミンを用いた系では、反応初期からトリアジン基を含む連鎖が生成することを明らかした。2.側鎖にアジド基を有する立体規則性ポリマーの合成を目指し、アジド基に誘導可能なメタクリル酸グリシジル(GMA)の立体規則性ポリマーを合成し、NaN3の付加・開環反応を利用してアジド基を側基に有するポリマーを得た。3. ATRP法を経て合成した末端にアジド基を有するポリスチレン(PS)を合成し、主鎖の立体規則性の制御されたポリ(PgMA)を用いて,立体規則性グラフトポリマーの合成を試みた。低分子アジド之反応で見られたアミンの添加効果がこの場合も観測され、多座配位アミンではグラフト化反応がランダムに起こるため、先に導入されたPSグラフトの立体障害によってグラフト化率が20-30%程度に留まるのに対して、モノアミンでは反応がブロック的に起るため、最高でグラフト化率90%を越える高密度グラフトポリマーの合成が可能であった。1.前年度はメタクリル酸グリシジル(GMA)の立体規則性ポリマーを合成し,その開環反応で側鎖にアジド基を有する立体規則性ポリマーを得たが,配位性エポキシ基の影響で立体制御が十分でなかった。本年度は,アジド化が可能なハロゲン化アルキル基を有するモノマー,メタクリル酸2-クロロエチルの立体特異性重合を試み,Me_3SiOLi存在下の重合でmm含量98%,嵩高いアルミニウム化合物存在下の重合でrr含量97%の立体規則性の高いポリマーの合成に成功し,それぞれの高分子反応で定量的にアジド化ポリマーを得た。2.アルキンブロック,アジドブロックをそれぞれ有する立体規則性ブロック共重合体を合成し,ブロック間でのクリック反応によって立体規則性分岐ポリマーを合成した.また,相手ブロックにイソタクチックPMMAとシンジオタクチックPMMAのように選択的相互作用の期待できるブロックを選び,ステレオコンプレックス形成溶媒中での反応を行ったが,反応をやや阻害する効果が見られた.3.グラフト鎖の立体制御を目指して、末端にアジド基を有するシンジオタクチックPMMAを合成し、立体規則性ポリメタクリル酸プロパルギルとの反応で、主鎖・側鎖とも立体制御されたグラフトポリマーの合成を試みた.分子量5000を越える末端アジド化

PMMAの反応が十分に進行せず,グラフト鎖導入率は低度に留まった.4.xylylene diazideなどの二官能性アジドとポリメタクリル酸プロパルギルのクリック反応に及ぼす添加アミンの効果を検討したところ,モノアミン存在下では比較的低濃度でも分子間反応による多量体生成がみられた.一方,配位性の強いトリアミン存在下では分子内反応が優先し,凝縮した一分子架橋体が生成した.初年度で見出した添加アミンの違いによる反応経路の制御が架橋反応にも及ぶことが明らかになった.
ヒンジ領域のひずみ蓄積がRC曲げ破壊部材の変形性能に与える影響

正負繰り返し載荷時には逆方向載荷を行う度に単調載荷時の抵抗機構が一時的消滅と再形成を繰り返している。但し、ここで言う抵抗機構の消滅とは抵抗機構が単調載荷時のものとは異なるものに変化したことを意味しており、抵抗機構自体がなくなることではない。正負繰り返し載荷時に耐力を維持するためには、次の2つの条件を満足する必要がある。(1)一時的に消滅した単調載荷時抵抗機構が再び形成されること、(2)再形成された単調載荷時抵抗機構が作用荷重に対して破壊しないこと。既往の強度的な破壊モードが(2)の条件を満足しないために発生するものであるのに対し、正負繰り返し履歴破壊は(1)の条件を満足しないために発生する。この破壊メカニズムは、形成された抵抗機構が作用荷重によって破壊する強度破壊型の破壊メカニズムとは異なったものである。一時的消滅後の抵抗機構の再形成は常に完全に行われるのではなく、多少の誤差を伴って行われ、再形成される抵抗機構は徐々にもとの、単調載荷時抵抗機構とは異なったものとなってくる。再形成過程における誤差分であると考えられるヒンジ領域歪み蓄積の発生が繰り返し載荷実験から観察された。RC部材の耐力低下が、繰り返しの度に蓄積されたヒンジ領域歪み蓄積(誤差分)が非常に大きくなり、単調載荷時抵抗機構の再形成が不能となり引き起こされたと考えられる。曲げ破壊を起こすRC部材は、単調載荷時には靱性に富む場合でも、曲げ降伏後の繰り返し載荷を受けることにより、著しく変形能力が低下することが知られている。著者らは、曲げ降伏後の繰り返し載荷によりせん断変形成分を徐々に増加し破壊に至る梁部材の耐力低下挙動を考察することにより、従来の強度破壊型のメカニズム(せん断破壊)とは異なる、繰り返し載荷時に特有の破壊モードが存在することを主張してきた。この破壊モードは、曲げ降伏後の繰り返し載荷によりヒンジ領域に横方向歪みが徐々に蓄積し、これが原因で引き起こされるものであることが実験より推察されている。本研究では、この横方向歪の蓄積挙動が引き起こされるメカニズムを解明する目的でRC梁部材の繰り返し載荷実験および、これと平行する形で、ヒンジ領域をシンプルな形にモデル化した歪み蓄積挙動解析を行った。この結果、次の成果が得られた。・固体内に左右の剛性のアンバランスが存在すると、繰り返しにより横方向歪み蓄積が発生する。・横方向歪みの蓄積は1サイクル目がもっとも大きく、それ以降小さくなり、一定値に収束する。・横方向歪みの増加により固体に剛性低下が生じると仮定すると、この剛性低下の急激さの違いによって、歪み蓄積が収束する場合と発散する場合の2通りが起こる。・発散条件は強度を含まない形で剛性低下の度合いを表す係数を用いて定式化する事が可能である。・解析から得られた収束発散挙動はRC梁部材のヒンジ領域における横方向歪みの増加挙動と定性的に一致する点が多い。

再形成過程における誤差分であると考えられるヒンジ領域歪み蓄積の発生が繰り返し載荷実験から観察された。RC部材の耐力低下が、繰り返しの度に蓄積されたヒンジ領域歪み蓄積(誤差分)が非常に大きくなり、単調載荷時抵抗機構の再形成が不能となり引き起こされたと考えられる。
ADF/チオレドキシンによる食品低アレルゲン化法の開発と食物アレルギー治療

本研究により以下の研究成果を得た。1.卵に主要アレルゲンであるオボムコイド、オボアルブミンをリコンビナントヒトADF/オチレドキシン(TRX)で処理することにより、加熱調理や蛋白分解消化酵素に対する反応性が亢進し、IgE抗体との結合性が減少し、低アレルゲン化されることを明らかにした。この低アレルゲン化法により作成された低アレルゲン化卵を経口投与することにより、卵アレルギー患者にアレルギー症状を引き起こすことなく経口免疫寛容を誘導して卵アレルギーが早期に治療できる可能性を示唆した。2.経皮的卵白アルブミン感作によりマウスに抗原特異的IgE抗体産生とアトピー性皮膚炎を惹起した。このマウスへの抗原の経口投与は抗体産生とリンパ節T細胞のIL-4、IFN-γの産生を抗原特異的に抑制し、皮膚炎に対し、表皮の肥厚、肥満細胞数や真皮内の好酸球数を抑制し、真皮の肥厚、皮下組織領域の好酸球数は抑制しなかった。これらの成果は低アレルゲン化食品を用いた経口免疫寛容誘導による食物アレルギーの関与したアトピー性皮膚炎の治療に関して重要な示唆を与えた。これらの研究成果により、ADF/チオレドキシンによる食品低アレルゲン化が可能であり、この低アレルゲン化食品を用いた経口減感作による食物アレルギーの早期治療の可能性を示唆すると共に、ADF/チオレドキシンの制御による生体のレドックス調節によるアレルギー疾患治療の可能性を示唆した。乳幼児期に多く見られる食物アレルギーは有効な治療法に乏しく、患者は原因食物を除去せざるを得ず、低アレルゲン化食品の開発は極めて重要である。また、低アレルゲン化食物抗原により患者に免疫寛容を誘導して食物アレルギーを治療しうる可能性が示唆される。小児期の食物アレルギーとして最も頻度の高い卵アレルギーでは、患者全員にオボアルブミン(OA)に対する、また75%にオボムコイド(OM)に対するIgEが存在した。我々がATL由来因子(ADF)としてクローニングしたヒトチオレドキシン(TRX)は分子量12kDの酸化還元酵素で、その活性部位にあるふたつのシステイン基の間でジスルフィド結合を作る酸化型は、NADPHとNADPH-TRX reductaseによりジチオールの還元型となり、標的蛋白のジスルフィド結合を還元する。OAやOMのアレルゲン性の維持には分子内のジスルフィド結合が重要な役割を果たしていることから、TRXの還元作用を利用してOAおよびOMの分子内ジスルフィド結合を還元することにより、抗原性が低下するかどうかを検討した。まず、遺伝子工学的手法を用いて、ヒトTRXと酵母TRXの大量生産を可能にした。このリコンビナントTRXを用いて試験管内でOAとOMを処理すると、消化酵素であるペプシンやトリプシンで容易に消化された。さらに、チオレドキシンと消化酵素で処理されたOAとOMは特異IgEとの結合性が著しく低下し、低アレルゲン化されたことが示された。低アレルゲン化抗原によりヘルパーT細胞のサイトカイン産生が変化するかどうか、体内の抗原提示細胞内においてもTRXにより抗原分子の還元処理が行われるかどうかの検討が今後の課題である。食物アレルギー患者のQOLの改善と治療法の開発を目的として、我々が遺伝子を同定したレドックス制御蛋白として細胞内外のレドックス環境の維持に深く関与しているADF/チオレドキシン(TRX)による食品低アレルゲン化と食物アレルギーの新しい治療法の可能性を検討し、以下の結果を得た。(1)乳幼児期の食物アレルギーで最も頻度の高い卵アレルギーの主要アレルゲンであるオボムコイド(OM)およびオボアルブミン(OVA)は、チオレドキシン処理により消化酵素により分解されやすくなり、かつ、加熱処理に対して感受性が高まることにより、低アレルゲン化されることが明らかになった。

TRX処理により低アレルゲン化された卵アレルゲンを経口摂取することにより、アレルギー反応を起こすことなく卵に対する経口免疫寛容が誘導され、卵アレルギーの早期治療法可能性が示唆された。(2)上記の可能性を検討するために、OVAの経皮感作によるOVAアレルギーマウスモデルを作製し、このモデルではOVAの経口投与によりOVAに対する免疫寛容が誘導されることを明らかにした。この系を用いて、TRX処理OVAを経口投与することにより、TRX未処理のOVAと同様にOVAに対する免疫寛容が誘導できるかどうかの検討を準備した。(3)TRXはケモカイン様の白血球遊走活性を認めることを明らかにすると同時に、マウスの実験において、TRXの静脈内投与のより循環血液中のTRX濃度を高くすると、LPS刺激などによる局所への白血球の血管外漏出を抑制することを明らかにし、TRXは生体内で免疫担当細胞の活性化や遊走を制御することを示唆した。以上の結果より、TRXは食物の低アレルゲン化に有用であるばかりではなく、食物アレルギー患者のアレルギー体質改善を目指した新しい治療法の開発に有用である可能性が示唆された。本研究により、以下の研究成果を得た。1.卵低アレルゲン化法の開発:卵の主要アレルゲンであるオボムコイド(OM)およびオボアルブミン(OVA)をチオレドキシン(TRX)で処理することにより、加熱調理や蛋白分解消化酵素に対する感受性が亢進し、未処理の抗原に比してIgE抗体との結合性が1/100以下に減少する事を示し、卵の低アレルゲン化法を明らかにした。この低アレルゲン化卵の経口投与により、卵アレルギー患者に免疫寛容を誘導して、その早期治癒を導くことが出来る可能性を示唆した。2.卵白感作皮膚炎モデルの作成とその経口免疫寛容に関する研究:卵白アルブミン経皮感作による特異的IgE抗体産生や感作部位のアレルギー性皮膚炎惹起モデルマウスを作成し、このマウスへの卵白アルブミン経口投与が投与抗原特異的に特異抗体産生を抑制し、リンパ節のT細胞の抗原特異的IL-4,IFN-γの産生も抑制する事を示した。これらの成果は低アレルゲン化食品による経口免疫寛容誘導による食物アレルギーやアトピー性皮膚炎治療の可能性とその実験モデルを示すものであった。3.ADF/チオレドキシンのレドックス制御作用によるアレルギー制御に関する研究:TRXはcaspase3の酵素活性維持を介してアポトーシスシグナル伝達に関与すること、Ref-1と協調して転写因子p53の活性化に関与すること、白血球の血管外漏出抑制作用を有すること、GeranylgeranylacetoneがTRXの発現と分泌を促進することを明らかにした。さらに、TRXの内因性活性阻害蛋白Thioredoxin-binding protein 2/Vitamin D3-upregulated protein-1(TBP-2/VDUP-1)を同定した。以上の研究成果は、TRXによる食物低アレルゲン化の可能性を示し、また、TRXやその制御による食物アレルギーの新しい治療法の開発の可能性を示すものであった。
シリコンの陽極酸化時における多孔質構造のナノからマクロへの自発的変化

本研究では,p型シリコンウエハを用いることにより,セルフスタンディングの多孔質シリコン層を作成した.このとき,ウエハの抵抗値と電解の電流密度をパラメータとした.これまでの研究から,高抵抗のp型シリコンウエハを陽極酸化すると,ナノ多孔質の柱状構造が生成することを確認している.この場合には,多孔質層中に多孔質化していない領域が柱状に存在し,その部分は機械的強度の向上に寄与し,セルフスタンディング膜の生成に有利であると考えられる.しかしながら,このような予想に反して,高抵抗のp型シリコンウエハを用いると,セルフスタンディングの多孔質層を得ることができなかった.一方,低抵抗のp型シリコンウエハを用いると,ウエハ全体(500μm)を均一に多孔質化することができ,シリコンウエハをフレームとするセルフスタンディングの多孔質層を得ることができた.電流密度がある限度をこえると,気泡による応力で,多孔質シリコン層を破壊してしまう.集電体としてウエハの裏面につける金属は重要である.例えば,銅は陽分極の条件によらず自発的に多孔質層に析出した.陽極酸化された領域の形状測定の結果,多孔質層の表の面は溶解しておらず,凹または凸な面になりうることがわかった。試料の裏面のプロファイルは表の面と同じ方向に湾曲しており,残留応力の存在を示していた.ここで作成したような,比較的厚い多孔質層については,孔に残留している溶液を揮発させるのに数日を要することが重量変化測定,真空中での圧力測定により示唆された.シリコンウエハの陽極酸化により生成する多孔質シリコン層の構造に対するウエハの抵抗および電解電流密度の効果を調べた。作成条件により2種類の多孔質構造が現れた。ひとつは均一なナノ多孔質構造であり、他はナノ多孔質体がシリコン壁により仕切られたマクロ構造である。後者においては多孔質層形成過程においても構造が変化し、均一なナノ多孔質相生成からマクロ孔にナノ多孔質相が充填された構造の生成へと変化する。本研究では、この変化が起こる条件を明確にした。多孔質層の形態は実験条件の微妙な変化に大きく影響される。電流密度が低い場合とウエハの抵抗が高い場合、マクロ孔生成へと変化しやすい。ただし、この変化によって溶解の価数も多孔度も影響されない。ナノ多孔質相が充填されたマクロ孔構造の成因について考察し、シリコン表面から垂直方向への多孔質層成長速度と横方向への成長速度が異なり、後者においては隣り合う成長サイトの存在によって空間的に制限を受けるために充填マクロ構造が現れるというモデルを提案した。これまでに報告されているシリコンマクロ孔では、多孔質相の充填が見られない構造が多い。陽極酸化時にフッ酸溶液が用いられるが、フッ酸濃度が低い時にはナノ多孔質シリコンが溶解することを見出した。また、DMSOなどの有機溶媒中でも同様な溶解が起こることが知られている。これまでに種々のマクロ孔生成モデルが提案されているが、われわれは本研究の結果から、マクロ孔生成について、ナノ多孔質相充填マクロ構造が形成され、その充填体が化学溶解することにより、シリコン中にマクロ孔構造が現れるという新しい考えを提案した。このような形態の変化を利用すると、多様な表面構造の基板を作成することができる。これらの構造は結晶面が現れていることとサイズ分布が小さいことが特徴となっている。試料の裏面のプロファイルは表の面と同じ方向に湾曲しており,残留応力の存在を示していた.ここで作成したような,比較的厚い多孔質層については,孔に残留している溶液を揮発させるのに数日を要することが重量変化測定,真空中での圧力測定により示唆された.
システム生物学的手法を用いた癌幹細胞の新規分子標的の同定

乳癌幹細胞スフェア培養の系で、HER2-NFkBパスウエイもしくはHER2-PI3Kパスウエイを阻害し、詳細な時系列をとってRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。得られた分子IGF2, AR, GDF15などが癌幹細胞維持に重要な役割を果たしていることを、乳癌臨床検体を用いて確かめた。HER2/ErbB2乳癌自然発症モデルMMTV-ErbB2マウスとFRS2betaノックアウトマウスを交配させたマウスを用いて解析を行い、FRS2betaによってErbBシグナルを効果的に減弱させることにより、癌幹細胞の自己複製能が維持させる仕組みを明らかにした。1)乳癌幹細胞システムを制御する鍵分子並びにパスウエイの同定乳癌幹細胞スフェア培養の系に、NFkBの特異的阻害剤DHMEQあるいはPI3 kinaseの特異的阻害剤LY294002を添加して、NFkBあるいはPI3 kinaseパスウエイを阻害し、この条件下で乳癌スフェアを形成させ、詳細な時系列をとってRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行い、網羅的にmRNA発現情報を取得した。NFkBパスウエイ阻害により、69個の鍵分子候補が得られた。さらにPI3 kinaseパスウエイ阻害により、約900個の鍵分子候補が得られた。これらの分子群をシグネチャーとして使って、乳癌の組織型、転移、再発ひいては予後との相関を解析している。さらに、in vitro乳癌幹細胞培養の系を用いて、スフェア形成能に与える影響をみたところ、自己複製能に重要な役割を果たしていることが示唆される分子が多く抽出されてきた。これらの分子の多くは新規分子標的候補である。2)乳癌幹細胞システムを制御する鍵分子の個体レベルにおける解析HER2乳癌自然発症モデルであMMTV-neuマウスとFRS2betaノックアウトマウスを交配させたマウスを用いて解析を行った。その結果、FRS2betaによってErbBシグナルを効果的に減弱させることにより、癌幹細胞の自己複製能が維持される機序が考えられた。さらなる解析により、FRS2betaは、乳癌幹細胞の細胞周期を抑制することにより、癌幹細胞性を維持することが示唆された。1)乳癌幹細胞システムを制御する鍵分子並びにパスウエイの同定乳癌幹細胞スフェア培養の系に、PI3 kinaseの特異的阻害剤LY294002を添加して、PI3 kinaseパスウエイを阻害し、この条件下で乳癌スフェアを形成させ、詳細な時系列をとってRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行い、網羅的にmRNA発現情報を取得した。PI3 kinaseパスウエイ阻害により、約900個の鍵分子候補が得られた。その中で、AREG, ARTN, IGF-1に注目して解析を行った。その結果、どの分子も癌細胞のスフェア形成能を上昇させることがわかった。2)乳癌幹細胞システムを制御する鍵分子の個体レベルにおける解析HER2乳癌自然発症モデルであるMMTV-neuマウスとFRS2betaノックアウトマウスを交配させたマウスを用いて解析を行った。FRS2betaノックアウトマウス由来の乳腺細胞は、野生型マウス由来の乳腺細胞に比較し、スフェア形成能が低いことが確認できた。1)乳癌幹細胞システムを制御する鍵分子の同定HRG-HER-NFkBシグネチャーならびにHRG-HER-PI3Kシグネチャーを鍵分子候補群として得た。GSEAやGOなどのパスウエイ解析も行った。様々なサイトカイン、ケモカイン、血管新生因子などのパラクライン、オートクライン因子によって、ニッチを制御するとともに、様々な細胞内因子を制御して癌幹細胞の未分化性が維持されていることが示唆された。乳癌臨床検体のスフェア培養の系を用いて、これら細胞外因子によるスフェア形成能が確認できた。また、いくつかの細胞内因子についても、ノックダウンによりスフェア形成が抑制されることから、癌幹細胞維持に重要な役割を果たしていることがわかった。2) HER2乳癌の自然発症モデルの鍵分子同定FRS2betaは、正常乳腺ではluminal細胞の前駆細胞に発現する一方、がん組織では癌幹細胞に発現していることがわかった。

FRS2betaが発現している細胞は、ERKの活性が比較的低く、そのために細胞の未分化性が保たれていることがわかった。3)当概領域メンバーとの共同研究を進め、鍵分子抽出を行う。医科歯科大学・土屋輝一郎講師との共同研究にて、DNAマイクロアレイ解析並びにGSEA解析などのパスウエイ解析を行い、鍵分子抽出に協力した。HRG-HER-NFkBシグネチャーならびにHRG-HER-PI3Kシグネチャーから、得られた候補分子、IGF2, AR, GDF15, MICAL3などについて、乳癌臨床検体のスフェア培養の系を用いて、癌幹細胞維持に重要な役割を果たしていることがわかった。分子機構を詳細に解析した結果、IGF2-ID1-IGF2サーキットの形成が、乳癌幹細胞の幹細胞性の維持に重要であることがわかった。ARは、EGFRのリガンドである。そこで、EGFRの代表的なリガンドであるEGFとスフィア形成能を比較した。その結果、ARのほうに、EGFよりも強いスフィア形成能が認められた。その分子機構を詳細に調べたところ、リガンド刺激に伴うEGFRの蛋白レベルのダウンレギュレーションが、EGF刺激ではおこるが、AR刺激ではほとんどおこらないことがわかった。蛋白質のダウンレギュレーションに重要な役割を果たすE3ユビキチンリガーゼCblが、EGF刺激によってEGFRとの結合が促進される一方、AR刺激によってはEGFRとの結合が促進されないことがわかった。CblとEGFRとの結合の違いによって、ARとEGFのスフィア形成能に違いが生じることが示唆された。FRS2betaは、正常乳腺ではluminal細胞の前駆細胞に発現する一方、がん組織では癌幹細胞に発現していることがわかった。その際に、ID3, Hes1の発現が上昇することがわかった。当概領域メンバーとの共同研究を進め、鍵分子抽出を行う。GDF15とMICAL3について、さらに解析を進めた。GDF15は、TGFbeta様リガンドであるが、Smad2/3ならびにSmad1/5/8ともに強い活性化を誘導しなかった。また、ERKやAktについても、チロシンキナーゼによって直接活性化をみる短時間刺激では変化がなかったが、48時間後に活性化が認められた。この長時間刺激後の活性化の分子機構を現在解析中である。MICAL3は、セマフォリン刺激の下流で活性化するmonoxygenase活性をもつ分子で、神経軸索の反発シグナルに関与することが知られているが、がん幹細胞性の維持については全く不明であった。詳細な解析により、MICAL3の下流でCRMP2が活性化し、分裂の際にNumbが不均等分配されることがわかってきた。領域メンバーとの共同研究により、DNAマイクロアレイならびにパスウエイ解析を引き続き進めた。26年度が最終年度であるため、記入しない。乳癌幹細胞維持の鍵分子候補が終了し、候補分子の評価が進み、癌幹細胞維持に重要な役割を果たすと考えられる分子が得られるにいたっている。FRS2betaが、癌幹細胞マーカーである可能性がでてきた。
ヌクレオイド構成タンパク質　ＨＵ　を手がかりとした核様体システムの解明

1. TtHUの相互作用因子との解析から、TtHUの機能解析を試みた。TtHUに対するpull-down assayの結果から同定されたRNA分解酵素の精製標品とTtHUの精製標品を用いてより詳細な相互作用解析を行った結果、TtHUといくつかのRNA分解酵素との相互作用を支持する結果を得ていた。ここでは、それらのRNA分解酵素の活性に対するHUの影響を調べ、RNAに対するHUの結合が、種々のRNA分解酵素の活性を阻害することがわかった。これまで、HUとRNA分解酵素との直接的な相互作用やその意義は示されていなかったので、この結果はHUの新規な機能の発見を示唆するものである。2. TtHU欠損株の表現型の観察から、TtHUの機能の同定を行うため、熱感受性TtHUを用いた系の作製を試みた。熱感受性TtHUの作製のため、16種類の一アミノ酸変異TtHUの発現プラスミドを構築し、精製を完了していた。ここでは、それらの熱安定性の測定を行い、各変異がHUの安定性に与える影響が分かり、熱感受性TtHUの作成に成功した。そこで、熱感受性TtHUをTtHB8細胞内に戻すプラスミドを構築し、TtHUに関する熱感受性TtHB8細胞の作製を試みた結果、細胞内のTtHUがDNAとの結合により安定化されていることがわかった。この結果は、HUの細胞内での新規な機能を示唆するものである。3. TtHUの溶液中での構造学的知見からの機能解析を行うために、NMRを用いた立体構造解析を試みた。現在、13C/15NラベルのされたTtHUを得る条件の検討を行っている。(抄録なし)1. TtHUとの相互作用因子の解析から、TtHUの機能解析を試みた。TtHUに対するpull-down assayの結果、いくつかのRNA結合タンパク質が同定されていた。ここでは、RNA分解酵素のひとつであるTTHAO252の精製標品とTtHUの精製標品を用いたfar-western assayとnative-PAGEを行った結果、TtHUとTTHAO252の相互作用を支持する結果を得た。これまで、HUとRNA分解酵素との直接的な相互作用は示されていなかったので、この結果は、HUの新規な機能の発見を示唆するものである。2. TtHU欠損株の表現型から、TtHUの機能の同定を行うため、熱感受性TtHUを用いた系の作製を試みた。2-(1).TtHU欠損株の表現型から、TtHUの機能の同定を行うため、熱感受性TtHUを用いた系の作製を試みた。ここでは、熱感受性TtHUの作製のため、16種類の一アミノ酸変異TtHUの発現プラスミドを構築し、精製を完了した。今後、それらの熱安定性を測定し、熱感受性TtHUの作製に繋げていく予定である。2-(2). TtHUの精製標品を用いて、示差走査型熱量計による熱安定性パラメータの測定を行った結果、TtHUが20°Cで低温変性することが示唆する結果を得た。多くのタンパク質は常温で低温変性することはないので、この結果は、タンパク質の熱安定性を研究する上で、HUが興味深い対象である事を提示するものである。1.TtHUとの相互作用因子の解析から、TtHUの機能解析を試みた。ここでは、TtHB8由来のRNA分解酵素の精製標品とTtHUの精製標品を用いたfar-western assayを行った結果、TtHUといくつかのRNA分解酵素との相互作用を支持する結果を得た。今後、それらのRNA分解酵素の活性に対して、HUの存在が与える影響を解析していく予定である。2.TtHU欠損株の表現型から、TtHUの機能の同定を行うため、熱感受性TtHUを用いた系の作製を試みた。現在、それらの熱安定性の測定を行い、変異がHUの安定性に与える影響が分って来たので、熱感受性TtHUをTtHB8細胞内に戻すプラスミドを構築中である。3.TtHUの溶液中での構造学的知見からの機能解析を行うために、NMRを用いた立体構造解析を試みた。現在、^<13>C/^<15>NラベルのされたTtHUを得る条件の検討を行っている。

2. TtHU欠損株の表現型の観察から、TtHUの機能の同定を行うため、熱感受性TtHUを用いた系の作製を試みた。熱感受性TtHUの作製のため、16種類の一アミノ酸変異TtHUの発現プラスミドを構築し、精製を完了していた。ここでは、それらの熱安定性の測定を行い、各変異がHUの安定性に与える影響が分かり、熱感受性TtHUの作成に成功した。そこで、熱感受性TtHUをTtHB8細胞内に戻すプラスミドを構築し、TtHUに関する熱感受性TtHB8細胞の作製を試みた結果、細胞内のTtHUがDNAとの結合により安定化されていることがわかった。この結果は、HUの細胞内での新規な機能を示唆するものである。3. TtHUの溶液中での構造学的知見からの機能解析を行うために、NMRを用いた立体構造解析を試みた。現在、13C/15NラベルのされたTtHUを得る条件の検討を行っている。一アミノ酸変異TtHUの熱安定性の測定結果から、熱感受性TtHUの作製を行う予定であったが、一アミノ酸変異TtHUの発現プラスミドの構築に手間取っているため。TtHUのX線結晶構造解析を行うために、結晶化を行ったが、上手く結晶ができなかったため。熱感受性TtHU発現TtHB8をつくるためのプラスミドの構築に想定より時間がかかっているため。NMRによる構造解析を行うために13C/15NラベルされたTtHUの精製条件の検討に時間がかかっているため。一アミノ酸変異TtHUの発現プラスミド構築をはやく終了し、熱安定性の測定を行う。その結果を元に熱感受性TtHU発現株を作製し、その表現型から、TtHUの機能解析を行う。TtHUの構造解析を行うために、結晶化を行う必要があるが、上手くいっていなかった。対応策として、よりTtHUの立体構造を一定に保つために、TtHUをDNAを結合させてから結晶化を試みたい。一アミノ酸変異TtHUの熱安定性の測定の再現性確認を行うと供に、熱感受性TtHU発現株作製プラスミドの構築を早く完了し、その表現型から、TtHUの機能解析を行う。13C/15NラベルされたTtHUの精製条件の検討は概ね完了したので、さっそくNMRによる構造解析に始めて行っていく。TtHUとRNA分解酵素との関係について、より定量的な解析を行う。(抄録なし)
アジア・ユーラシア大陸の地表面熱収支分布の解明

ISLSLP Initiative Iのデータセットを利用して,地表面熱収支の計算モデルを用いた計算を行った。得らえた結果からは,非常に現実に良く合っていると思われる熱収支項(特に潜熱フラックス)の分布が示された。しかし,実際に測定の行われている地点のデータを利用した検証も行ったところ,全体として潜熱フラックスが過大評価されていることが判明した。可能性のある原因として,モデルの中パラメタリゼーションが不適切であること,データそのものに一部不精確子値のあることなどが考えられた。来年度以後,上記の点をふまえ,モデルの改良,他のデータソースの利用の可能性を考慮していく予定である。
マウス精巣特異的ｌｎｃＲＮＡクラスターの新規メカニズムと生理機能解析

平成30年度に行った研究では、マウスPrss43/Tessp-3・Prss45間より転写される新規のlncRNAをlncRNA-3、Prss45・Prss46間より転写される2種類の新規lncRNAをlncRNA-4u、lncRNA-4dと仮名をつけ、解析を行った。はじめに、lncRNA-4u、lncRNA-4dを含むゲノム配列がエンハンサーとしての機能を持つことを明らかにした。この実験において、導入したDNA配列からlncRNA-4uが転写されていたことから、enhancer RNAとして機能する可能性が考えられた。lncRNA-3が遺伝子の転写制御に関与する可能性について解析を行うため、はじめにマウス精母細胞由来の培養細胞株を用いて、一過的な過剰発現実験を行った。結果として、lncRNA-3がtransに転写を制御する機能を持たないことが示唆された。ここで、lncRNA-3がcisに標的遺伝子の転写を制御する可能性を検証するため、lncRNA-3を含む合計5.4kbのゲノムDNA配列を得て、レポーター遺伝子の下流に挿入した。ここで、lncRNA-3の上流にTet-on発現誘導系に用いられるプロモーターを挿入することで、任意のタイミングでlncRNA-3の転写を誘導できるような改変プラスミドを作製した。この実験において、誘導時/非誘導時でレポーター遺伝子の活性を定量したところ、lncRNA-3誘導時において有意に高い活性が確認されたため、lncRNA-3がcisに転写を活性化することが示唆された。最後に、in vivoにおけるlncRNA-3の生理的機能を解析するため、lncRNA-3欠損マウスの作製を行い、6匹のF0マウスを得ることに成功した平成30年度は、マウス精巣特異的なlong noncoding RNAが複数並ぶ遺伝子座(lncRNAクラスター)が減数分裂においてどの様な機能を持つのか解析を行う研究の1年目であった。現在までに、1)lncRNA-3、lncRNA-4u、lncRNA-4dの転写領域や転写方向を明らかとし、2)lncRNA-4uとlncRNA-4dを含むゲノム領域がエンハンサーとして機能することを明らかにした。さらに加えて3)lncRNA-3が少なくともcisに標的遺伝子の転写活性化に寄与することを示したうえで、4)lncRNA-3ノックアウトマウスのF0世代を複数得ることに成功している。これらの成果は、いずれもこのlncRNAクラスターの生理機能解明に近づくものであり、当初提出した申請書の進行状況に大きな遅れは認められない。よって、期待通りに研究が進展したと言える。1)lncRNA-3の生理機能解析は、平成30年度に作製したノックアウトマウスを材料として扱う。ここでは、精子形成に何らかの影響が生じることを仮定し、精巣の組織学的観察と、また雄性生殖細胞のステージ別形態観察、産仔数の計測・比較、また雄性生殖細胞における精子形成関連遺伝子の発現レベルの網羅的解析を行う。ここでは、RNA-seq解析を行うことで、野生型とノックアウト個体で発現変動に有意な差が見られる遺伝子を探索する。この結果についてはqRT-PCRで追試を行う。2)マウス精母細胞由来の培養細胞株を利用し、lncRNA-3の過剰発現実験・ノックダウン実験を行う。このとき、1)の網羅的解析で発現変動を示した遺伝子について、過剰発現・ノックダウンによる発現変動を定量解析する。3)平成30年度の実験からlncRNA-4u及びlncRNA-4dを含む領域がエンハンサーとして機能することを明らかにしたため、in vivoでのターゲット領域の同定を試みる。ここでは、マウス雄性生殖細胞で3Cアッセイを行うことで相互作用領域(標的プロモーター)を探索する。加えて、in vitroのエンハンサーアッセイを行うことで、標的プロモーターにエンハンサーとして機能することを確認する。4)分子メカニズムの解析として、標識オリゴDNAを作製し、ChIRP法によってlncRNA-3のゲノム上結合領域の同定を試みる。ここでは、主に1)のRNA-seq解析によって得られた標的候補遺伝子のクロマチン領域との結合の検証を行う。

この実験において、誘導時/非誘導時でレポーター遺伝子の活性を定量したところ、lncRNA-3誘導時において有意に高い活性が確認されたため、lncRNA-3がcisに転写を活性化することが示唆された。最後に、in vivoにおけるlncRNA-3の生理的機能を解析するため、lncRNA-3欠損マウスの作製を行い、6匹のF0マウスを得ることに成功した平成30年度は、マウス精巣特異的なlong noncoding RNAが複数並ぶ遺伝子座(lncRNAクラスター)が減数分裂においてどの様な機能を持つのか解析を行う研究の1年目であった。現在までに、1)lncRNA-3、lncRNA-4u、lncRNA-4dの転写領域や転写方向を明らかとし、2)lncRNA-4uとlncRNA-4dを含むゲノム領域がエンハンサーとして機能することを明らかにした。さらに加えて3)lncRNA-3が少なくともcisに標的遺伝子の転写活性化に寄与することを示したうえで、4)lncRNA-3ノックアウトマウスのF0世代を複数得ることに成功している。これらの成果は、いずれもこのlncRNAクラスターの生理機能解明に近づくものであり、当初提出した申請書の進行状況に大きな遅れは認められない。よって、期待通りに研究が進展したと言える。1)lncRNA-3の生理機能解析は、平成30年度に作製したノックアウトマウスを材料として扱う。ここでは、精子形成に何らかの影響が生じることを仮定し、精巣の組織学的観察と、また雄性生殖細胞のステージ別形態観察、産仔数の計測・比較、また雄性生殖細胞における精子形成関連遺伝子の発現レベルの網羅的解析を行う。ここでは、RNA-seq解析を行うことで、野生型とノックアウト個体で発現変動に有意な差が見られる遺伝子を探索する。この結果についてはqRT-PCRで追試を行う。2)マウス精母細胞由来の培養細胞株を利用し、lncRNA-3の過剰発現実験・ノックダウン実験を行う。このとき、1)の網羅的解析で発現変動を示した遺伝子について、過剰発現・ノックダウンによる発現変動を定量解析する。3)平成30年度の実験からlncRNA-4u及びlncRNA-4dを含む領域がエンハンサーとして機能することを明らかにしたため、in vivoでのターゲット領域の同定を試みる。ここでは、マウス雄性生殖細胞で3Cアッセイを行うことで相互作用領域(標的プロモーター)を探索する。加えて、in vitroのエンハンサーアッセイを行うことで、標的プロモーターにエンハンサーとして機能することを確認する。4)分子メカニズムの解析として、標識オリゴDNAを作製し、ChIRP法によってlncRNA-3のゲノム上結合領域の同定を試みる。ここでは、主に1)のRNA-seq解析によって得られた標的候補遺伝子のクロマチン領域との結合の検証を行う。