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自然科学とエゾテーリウムの「あわい」で―フェヒナーからフロイト、ベルクソンへ

研究期間全体を通じて本研究は、フェヒナー思想における自然哲学の自然科学的基盤を詳らかにし、その賦霊論・彼岸論の拠って立つ基盤が、フェヒナーが創始した「精神物理学」という新しい学問にあることを明確にした(平成24年度)。さらにフェヒナー晩年の、万物には魂が宿っており、それらは神の精神に包括されているという、汎神論的な「光明観」と称される世界観を浮き彫りにし(平成25年度)、最後にフェヒナーの後代への、甚大ではあるがこれまで余り注目されてこなかった影響関係を、フロイトにおいてトレースすることができた。もっともフロイトの場合のそれは、フェヒナーの汎神論を継承したわけではなく、あくまで夢に関する心理学的な理論に限定されてはいたのであるが。研究計画に挙げたフェヒナーのベルクソンへの影響については、ノートを取るにとどまり、十分に論じることはできなかった。しかしこれについては、研究計画書にすでに記載していたように、ベルクソンとドイツ語圏の「生の哲学」の関係として別途取り上げる問題圏の中で、フェヒナーを参照するという位置づけで、再考する予定である。独語・独文学フェヒナー晩年の著作の分析に、予想を超える長い時間を要したため。また、副部局長に選出されたことによる学内管理運営業務の多忙化、ならびに学会支部長に選出されたことによる学外の学会運営業務の多忙化も、研究の遅れの一因である。資料収集とフェヒナーのテクストの分析、論述に関しては「おおむね順調」であるが、フェヒナーに至る一元論的思想の系譜については、参照しようと考えていたRudolf Eislerの著作『一元論の歴史』(Geschichte des Monismus)の記述があまり参考にならず(思想家、哲学者のテクストからの引用が多いが、書誌情報がなく、学問的に原典までたどることができないという問題がある)、この課題への取り組みの開始がやや遅れている。手持ちの資料分析を急ぎ、フロイト、ベルクソンとフェヒナーの関係を洗い出す。その際、フロイトに関しては、先行研究の枠を超える機軸を発見できるかどうかが鍵となる。ベルクソンについては、その思想に詳しい(理系の)研究者が近くにいるので、議論をしながら刺激を受けることができると思われる。上記「現在までの達成度」に記した課題である、一元論的思想の系譜学については、Eisler以外の文献を参照し、フェヒナーへ至る思想史的つながりをトレースする。また平成25年度は、本課題の申請書ならびに研究計画書に記したとおり、ウイーンで調査収集した文献資料に基づき、フェヒナーのフロイトへの影響を分析する。中心になるのはフロイトの無意識の理論であるが、具体的には『夢判断』(1900年)が対象になる。また「心的エネルギー」「快不快の原則」「恒常性の法則」といったフロイトのメタ心理学的概念の構築においてフェヒナーが果たした役割についても、分析を行う。研究旅費に関しては、先方(立教大学)から支給されたため、使用する必要が生じなかった。また、手持ちの資料の分析、およびコピーなどでの資料収集が多かったため、新規に書籍を購入する必要が、見込額よりも小額で済んだ。翌年度分と合わせた研究費は、フロイト、ベルクソンならびに「生の哲学」関係の書籍購入を中心に、有効に使用したい。特に「生の哲学」関係書籍は未購入のものが多く、内訳として物品費の使用率が高くなると予想できる。研究費は主として、国内国外の図書・資料・文献の購入および収集費として使用する予定である。また国内の学会における成果発表のための旅費、ならびに、掲載料が必要な場合の論文掲載費に使用する予定である。
理科教育における自己調整学習の成立過程に関する研究

本研究では、理科教育における自己調整学習の成立過程に関して、表象機能を中心とした認知的側面から、その実態の解明を志向した。加えて、そこでの検討結果から、子どもの自律的な理科学習を促進するための教授論的視点の導出を図った。結果として、子どもは様々なレベルの表象を相互作用的に機能させる中で知識の構造化を促進させることが明らかとなった。その際、メタ認知的活動の活性化によって、子どもの自律的な知識構成が具現化した。また、自己調整学習は、対話を基調とした協同学習を通じて、メタ認知的機能を活性化させるための足場づくりを提供することによって一層促進されることが明らかとなった。本研究では、子どもの科学概念の構築過程を表象の観点から考察することを通じて、今後の理科教育において強力に要請される「自己調整学習の成立」に向けた機能的な教授ストラティジーを開発することを主な目的とした。平成22年度は、子どもの科学概念構築と表象との関連性についての知見を深化させ、その上で、これまでの研究成果を踏まえ、Zimmerman,J.らの自己調整学習に関わる諸理論を援用して理科教育における自己調整学習の成立要因の抽出および教授論的展開の視点の導出を志向した。結果として、まず子どもの科学概念の構築過程に関しては、活動・映像・記号といった複数の形式、レベルの表象が複合的に機能していることを明らかにした。この科学概念構築と表象との関連性については、「表象ネットワークモデル」として、その様態をモデル化することに成功した。また、子どもは科学概念構築過程において、こうした複数の表象を的確に操作することが要求されるが、これまでその内実は不明瞭であった。この点について本研究では、Kozma,R.らの理論を援用して表象の操作上の因子として5つのレベルを同定し、具体的な理科授業を通じてその様態について分析を施した。さらに、これらの研究結果を踏まえ、子どもが自律的に表象を操作し、科学概念を構築していく学習を成立させるための因子についてZimmerman,J.自己調整理論を基盤に抽出し、具体的な教授論的展開の視点を導出した。自己調整学習の成立に向けては、子どもはメタ認知機能をハブ機能として、様々な表象を時宜に適して操作していくことによって自律的な科学概念構築が具現化される可能性があることが明らかとなった。本研究では、子どもの科学概念の構築過程を表象の観点から考察することを通じて、今後の理科教育において強力に要請される「自己調整学習の成立」に向けた機能的な教授論的視点を導出することを主な目的とした。平成23年度では、Nelson,T.O.らのメタ認知理論およびWinn6,P.H,の提起する自己調整学習モデルを基調として協同学習を加味した教授論的視点を構想した。その上で、中学校理科の植物のからだのつくりと働きの単元を事例に自己調整学習の成立過程を分析し、かつ教授論的視点の有用性を検証した。この際、自己調整学習の成立と連動して達成される科学概念形成の内実について表象機能の側面から分析することで、理科教育における自己調整学習の成立過程の認知的側面からの精査を志向した。結果として、自己調整学習は課題の明確化、学習目標の設定、方策および方略の設定といった過程をメタ認知的モニタリングとコントロールをハブ機能として成立していることが明らかとなった。その際、自己調整学習は、対話を基調とした協同学習を通じて、メタ認知的機能を活性化させるための足場づくりの提供によって一層促進されることが明らかとなった。また、協同的な学習過程を通じ、子どもが自らの認知過程を相対化するというメタ認知的機能を高めることによって、科学概念構築を具現化することが表象ネットワークの精緻化から明らかとなった。この際、教授過程において、子ども自身に学習全体を振り返えらせ、知識の精緻化を実感させる場面では、電子黒板の利用は有効であった。
低下した義歯の吸着を回復させるための唾液分泌機能亢進因子の検索

唾液は唾液腺から分泌される。唾液と義歯の関係については、唾液は義歯と口腔粘膜の間に一層の膜として存在し、陰圧状態を保つことで義歯の吸着を維持している。唾液は義歯の吸着に役立つだけでなく、様々な生理作用があるため口腔内環境を健康に保つために重要な役割を果たしている。高齢者の唾液分泌量は減少することが知られており、唾液腺の唾液分泌能低下は義歯の吸着にとって大きな問題となる。本研究の目的は、分泌機能が低下した唾液腺に対して分泌機能を亢進させる因子を同定することで、低下した唾液腺の機能を回復させ唾液量を増やし義歯の吸着向上を目指すことである。大唾液腺は左右に一対ずつ存在するが、一方の唾液腺が傷害され分泌能が低下すると反対側の唾液腺が分泌量を増加させ機能を代償する。この現象に注目し、現在までにマウスの片側唾液腺に傷害を加えた傷害側、非傷害側の唾液腺の遺伝子発現変化をマイクロアレイで解析している。コントロールとしては、片側に偽手術を施した唾液腺の非傷害側の唾液腺を使用した。本年度は、傷害側と非傷害側の唾液腺間の遺伝子発現を解析ソフトを用いて解析し、分泌機能亢進因子候補の決定を行った。主成分分析とクラスタリングの結果より、傷害側はコントロールと比較すると、明らかに成分の変化が認められるが、非傷害側の唾液腺では成分に大きな変化は見られなかった。傷害側でコントロールと比較して2倍以上発現量が増加した遺伝子は4,821遺伝子、非傷害側では1,040遺伝子であった。その中で共通遺伝子は473遺伝子であった。今回は、傷害側で遺伝子発現量が増加したものの中で、細胞分化や増殖因子としての働きがあるFgF2とBMP2を唾液腺分泌機能亢進因子の候補として更に研究を進めることとする。本研究の研究計画として1傷害側ー非傷害側唾液腺間の遺伝子発現変化の検討および分泌機能亢進因子の候補決定2傷害側耳下腺からのシグナル因子の同定、非傷害側でのレセプターの検索3細胞におけるシグナル因子活性の検討(in vitro)4マウス唾液腺における候補タンパク質の作用の検討(in vivo)がある。平成30年度はマイクロアレイの結果を解析し、各唾液腺の性状の確認や分泌機能亢進因子の候補の決定を行った。初年度に1が終了していることから、計画の1/4が既に終了しいるのでおおむね順調に進展していると判断した。引き続き研究計画調書通りに研究を進める予定である。1.傷害側耳下腺からのシグナル因子の同定、非傷害側でのレセプターの検索。各耳下腺からRNA抽出用、液体窒素凍結用、10%ホルマリンPBS固定用のサンプルを用意する。傷害側で目的遺伝子(リガンド)、非傷害側で目的遺伝子に対応するレセプターの遺伝子発現をリアルタイムPCRで定量解析する。続いて、タンパク質レベルでの発現をイムノブロットで確認する。リガンドおよびレセプターの局在を調べるために切片を作製し免疫染色を施す。リガンドが血流に乗っていることを確認するために、血液を採取しELISA法で確認する。2.細胞におけるシグナル因子活性の検討。野生型マウスの耳下腺を摘出し細胞単離処理を行い、腺房細胞の培養を行う。腺房細胞に候補に挙がったタンパク質を作用させ、そのタンパク質がどのようなシグナルとなるのかを検討する。この実験で作用させるタンパク質が市販されていない場合は、分泌タンパク質である可能性が高いことからタンパク質を菌体外に高分泌可能なブレビバチラス分泌発現システムを用いてタンパク質の発現系構築を行う。3.マウス唾液腺における候補タンパク質の作用の検討。野生型マウスで片側唾液腺傷害マウスと偽手術マウス(コントロール)を作製する。唾液腺傷害マウスに深麻酔科下で頬切開を施し萎縮した耳下腺を露出させ候補タンパク質を注入する。傷害マウスに候補タンパク質を作用させたマウス、傷害マウス、コントロールマウスに唾液分泌を促進するピロカルピンを腹腔内投与し、唾液分泌量の比較を行う。また各マウスから耳下腺を摘出し、アミラーゼ活性を調べることにより唾液腺の機能についての検索も行う。

主成分分析とクラスタリングの結果より、傷害側はコントロールと比較すると、明らかに成分の変化が認められるが、非傷害側の唾液腺では成分に大きな変化は見られなかった。傷害側でコントロールと比較して2倍以上発現量が増加した遺伝子は4,821遺伝子、非傷害側では1,040遺伝子であった。その中で共通遺伝子は473遺伝子であった。今回は、傷害側で遺伝子発現量が増加したものの中で、細胞分化や増殖因子としての働きがあるFgF2とBMP2を唾液腺分泌機能亢進因子の候補として更に研究を進めることとする。本研究の研究計画として1傷害側ー非傷害側唾液腺間の遺伝子発現変化の検討および分泌機能亢進因子の候補決定2傷害側耳下腺からのシグナル因子の同定、非傷害側でのレセプターの検索3細胞におけるシグナル因子活性の検討(in vitro)4マウス唾液腺における候補タンパク質の作用の検討(in vivo)がある。平成30年度はマイクロアレイの結果を解析し、各唾液腺の性状の確認や分泌機能亢進因子の候補の決定を行った。初年度に1が終了していることから、計画の1/4が既に終了しいるのでおおむね順調に進展していると判断した。引き続き研究計画調書通りに研究を進める予定である。1.傷害側耳下腺からのシグナル因子の同定、非傷害側でのレセプターの検索。各耳下腺からRNA抽出用、液体窒素凍結用、10%ホルマリンPBS固定用のサンプルを用意する。傷害側で目的遺伝子(リガンド)、非傷害側で目的遺伝子に対応するレセプターの遺伝子発現をリアルタイムPCRで定量解析する。続いて、タンパク質レベルでの発現をイムノブロットで確認する。リガンドおよびレセプターの局在を調べるために切片を作製し免疫染色を施す。リガンドが血流に乗っていることを確認するために、血液を採取しELISA法で確認する。2.細胞におけるシグナル因子活性の検討。野生型マウスの耳下腺を摘出し細胞単離処理を行い、腺房細胞の培養を行う。腺房細胞に候補に挙がったタンパク質を作用させ、そのタンパク質がどのようなシグナルとなるのかを検討する。この実験で作用させるタンパク質が市販されていない場合は、分泌タンパク質である可能性が高いことからタンパク質を菌体外に高分泌可能なブレビバチラス分泌発現システムを用いてタンパク質の発現系構築を行う。3.マウス唾液腺における候補タンパク質の作用の検討。野生型マウスで片側唾液腺傷害マウスと偽手術マウス(コントロール)を作製する。唾液腺傷害マウスに深麻酔科下で頬切開を施し萎縮した耳下腺を露出させ候補タンパク質を注入する。傷害マウスに候補タンパク質を作用させたマウス、傷害マウス、コントロールマウスに唾液分泌を促進するピロカルピンを腹腔内投与し、唾液分泌量の比較を行う。また各マウスから耳下腺を摘出し、アミラーゼ活性を調べることにより唾液腺の機能についての検索も行う。次年度使用額が生じた理由は、ピペットチップやチューブなどの消耗品代である。本年度は、保管してあった消耗品を使用したため、次年度使用額が生じた。次年度の使用計画は、前年度と変更はなくチューブなどの消耗品代金として使用する。
成熟胸腺における上皮前駆細胞とそのニッチの解析

本研究では胸腺上皮前駆細胞とその胸腺内分布領域を特定するために、生後マウス胸腺における増殖性の上皮細胞の特徴とその分布領域について解析した。生後マウス胸腺には皮質および髄質上皮前駆細胞が存在し、それらの維持にはFoxn1転写調節因子が関わることが示唆された。また、増殖性の上皮細胞は成獣マウス胸腺では主に髄質領域に分布するが新生仔期までは皮質および髄質領域の両方に分布することから皮質および髄質上皮前駆細胞が異なる領域で発生することが示唆された。本研究は、成獣マウス胸腺においてFoxn1転写調節因子の発現を指標として胸腺上皮幹細胞もしくは前駆細胞を同定し、さらにそれらの幹細胞や前駆細胞の維持および分化を支えるニッチの特徴を明らかにすることを目的としている。平成20年度は、成獣マウス胸腺におけるFoxn1陽性細胞の特徴づけおよびKi67の発現を指標とした増殖細胞との関連について検討した。免疫組織学的検討およびCytospin標本を用いた検討より、Foxn1陽性細胞は胸腺皮質上皮細胞および髄質上皮細胞のいずれにも含まれことが示された。一方、成熟胸腺の上皮細胞のうちKi67陽性細胞のほとんどはFoxn1陽性細胞群に含まれることがCytospin標本を用いた解析およびFlowcytometryによる解析から明らかとなった。また、定量的PCRによる遺伝子発現解析により、Foxn1陽性細胞群では陰性細胞群に比べて胸腺形成に関与する転写因子発現が高い傾向が示された。現在、Foxn1陽性細胞群と陰性群について、胎仔胸腺間葉系細胞と共培養後ヌードマウス腎被膜下へ移植することにより各々の細胞群の分化・増殖活性を検討している。また、Foxn1陽性Ki67陽性細胞の多くが髄質上皮細胞マーカーであるUEA-1を発現し、さらに組織学的検討により髄質領域に分布することが解った。これらのことより、成熟胸腺において胸腺上皮幹細胞もしくは前駆細胞はFoxn1陽性細胞分画に含まれ、それらは主に髄質領域に存在する可能性が示唆された。今後、これらのマーカー発現をもとに胸腺上皮幹細胞および前駆細胞の濃縮を試みるとともに、それらの細胞の局在する髄質内微小環境の特徴付けを行う予定である。平成21年度は、フローサイトメトリーによる生後マウス胸腺上皮細胞の解析を行い、Foxn1陽性でKi67陽性の増殖している上皮細胞は、皮質または髄質上皮細胞マーカー分子を発現していることが示された。このことより、生後マウス胸腺では皮質および髄質上皮前駆細胞が存在することが示唆された。また、Foxn1の発現量の異なる胸腺上皮細胞分画における遺伝子発現解析を行い、Foxn1強陽性細胞群と弱陽性群間で機能分子の発現に違いがあることが分かった。このことより、Foxn1の発現量が機能の異なる胸腺上皮細胞群を弁別する指標となることが示唆された。また、BrdU標識法による増殖細胞の組織学的解析を行い、BrdU取込3週間後でも少数のFoxn1陽性BrdU陽性細胞が検出されたことから、Foxn1陽性細胞の中に細胞分裂速度の極めて遅いものが存在することが明らかとなった。これらの細胞は胸腺上皮幹細胞であると考えられ、さらに、それらは主に髄質領域に分布することが明らかとなった。今後、これらの細胞の分布領域を胸腺上皮幹細胞ニッチの候補とし、構成細胞の特異性や分化・増殖因子等の発現を検討することにより場の特徴付けを行う予定である。T細胞分化の場である胸腺は長く再生しない器官とされていたが、近年、定常状態における胸腺においても上皮細胞の増殖が報告され、胸腺上皮幹細胞・前駆細胞の存在が示唆されている。本研究では胸腺上皮前駆細胞とその分化能、および胸腺上皮前駆細胞の胸腺内分布領域と維持および分化・増殖調節の機序を明らかにすることを目的とし、生後マウス胸腺における増殖性の細胞の特徴とその分布領域について、胸腺上皮細胞の発生と初期分化に必須の働きを持つFoxn1転写因子のプロモーター下流でEGFPを発現するマウスを用い解析を行った。生後マウスにおけるKi67陽性の増殖している上皮細胞の多くがFoxn1を発現すること、それらの細胞には皮質もしくは髄質上皮細胞マーカーを発現するものが含まれることが明らかとなり、生後マウス胸腺には皮質および髄質上皮前駆細胞が存在すること、さらにそれらの維持にはFoxn1が関わっていることが示唆された。また、Foxn1陽性Ki67陽性細胞もしくはBrdU取り込み

細胞は、生後マウス胸腺では主に髄質領域に認められること、さらにその中にはBrdU標識3週間後もBrdUを検出できる極めて細胞周期の長い細胞が含まれることが明らかとなり、生後マウス胸腺では髄質領域に上皮前駆細胞が存在することが示唆された。一方、胎仔および新生仔マウス胸腺ではFoxn1陽性Ki67陽性またはBrdU取り込み細胞は髄質領域だけでなく被膜下領域にも見られることから、皮質および髄質上皮前駆細胞はそれぞれ胸腺内の異なる領域に発生することが示唆された。
代数曲線の整数論

代数曲線の整数論は, 1930年代に,代数関数体の研究として数論の現代的史流のもとで,重要な側面をなしてきた.代数曲線とは,元々代数幾何学の対象としてRiemann以来,複素関数論の事物としてもまた深い研究があった.この研究課題は,多方面から追求しかつ総合しようという目的のもとで計画されたものであった.代数関数体は,その曲線の関数の全体を代数的集合的にみたものである. '20年代から'30年代にかけてのいわゆる「抽象代数」とよばれる代数学の学風のところで,代数曲線を考えたものである.代数曲線とは,その名の通り幾何学的なもので一般には最初は複素数の範囲で考えられてきたものである.代数曲線を,整数論の中で研究するのは,定義体を有限体にする場合が特に重要である.すなわち,有限体を係数とする方程式で定義される代数曲線である.19世紀後半, DedekindとWeberが着目して以来,代数的数体と代数曲線は多くの類似点をもつものとして平行的に議論されてきており,現在でもDedekind環の理論として統一的に整備されている.類体論という理論は,この類似性による結果である.定義体が有限体のとき,類似性が更に深まるが,このときゼータ関数の類似物を考えるのが, '20年代のアルティン以来考えられてきた.リーマンの予想の類似も当然,研究された.本来の整数論,つまり代数体の整数論も,計算機での大型実験を行うことにより本研究で行われた.そのほか,調和解析,複素多様体の幾何学,エルゴード理論,微分幾何学,ポテンシャル論との関わりで研究が各分担者で進められた.全国の他の大学の研究者との間での,研究上の問題点での討論,資料の収集等で非常に多くの利点があった.代数曲線の整数論は, 1930年代に,代数関数体の研究として数論の現代的史流のもとで,重要な側面をなしてきた.代数曲線とは,元々代数幾何学の対象としてRiemann以来,複素関数論の事物としてもまた深い研究があった.この研究課題は,多方面から追求しかつ総合しようという目的のもとで計画されたものであった.代数関数体は,その曲線の関数の全体を代数的集合的にみたものである. '20年代から'30年代にかけてのいわゆる「抽象代数」とよばれる代数学の学風のところで,代数曲線を考えたものである.代数曲線とは,その名の通り幾何学的なもので一般には最初は複素数の範囲で考えられてきたものである.代数曲線を,整数論の中で研究するのは,定義体を有限体にする場合が特に重要である.すなわち,有限体を係数とする方程式で定義される代数曲線である.19世紀後半, DedekindとWeberが着目して以来,代数的数体と代数曲線は多くの類似点をもつものとして平行的に議論されてきており,現在でもDedekind環の理論として統一的に整備されている.類体論という理論は,この類似性による結果である.定義体が有限体のとき,類似性が更に深まるが,このときゼータ関数の類似物を考えるのが, '20年代のアルティン以来考えられてきた.リーマンの予想の類似も当然,研究された.本来の整数論,つまり代数体の整数論も,計算機での大型実験を行うことにより本研究で行われた.そのほか,調和解析,複素多様体の幾何学,エルゴード理論,微分幾何学,ポテンシャル論との関わりで研究が各分担者で進められた.全国の他の大学の研究者との間での,研究上の問題点での討論,資料の収集等で非常に多くの利点があった.
ウエアラブルな床反力センサおよびモーションセンサを用いた下肢の運動解析技術の開発

歩行リハビリテーションの研究においては,運動中の患者の関節に働く力などを定量的に把握することは非常に有用な情報となっている.しかし,現在,広く用いられている設置式の計測法では,場所や歩数に大きい制限があることや高価であることから,限られた条件での研究には使用されているものの,幅広い条件での測定や日常のリハビリテーションに使用するには至っていない.本研究では,場所および歩数の制限がなくコンパクトな計測方法として,被験者が着用可能なセンサと信号処理を用いて関節モーメントなどを推定するシステムを開発することを目的として.そのためのキー技術であるウエアラブルな6軸の床反力センサおよびウエアラブルなモーションセンサの開発を行った.6軸の床反力センサとしては,パラレル型6軸のロードセルを開発し,それと3軸のロードセルおよびジャイロセンサを履物に内蔵したシステムを開発した.ジャイロセシサにより運動座標系と静止座標系の間の角度を計測し,運動座標系での床反力を静止座標系に変換した.運動センサとしては,加速度計とジャイロセンサを組み合わせたウエアラブルな運動センサシステムを開発し,床反力センサ,運動センサを用いて歩行実験を行い,カメラを用いた3次元動作解析装置と据え置き型の床反力計を用いる従来法による計測結果との比較検討を行った.床反力,運動ともに提案する手法と従来法の結果とはよく一致した.さらに,その結果を用いて下肢の関節モーメントを推定する方法を開発し,従来法と比較のための実験を行った結果,提案する方法の結果は,従来法とよく一致した.したがって,提案する方法を使用することにより,従来法の欠点であった計測場所や歩数の制限のない状態で,関節モーメントを推定することが可能となった.歩行リハビリテーションの研究においては,運動中の患者の関節に働く力などを定量的に把握することは非常に有用な情報となっている.しかし,現在,広く用いられている設置式の計測法では,場所や歩数に大きい制限があることや高価であることから,限られた条件での研究には使用されているものの,幅広い条件での測定や日常のリハビリテーションに使用するには至っていない.本研究では,場所および歩数の制限がなくコンパクトな計測方法として,被験者が着用可能なセンサと信号処理を用いて関節モーメントなどを推定するシステムを開発することを目的として.そのためのキー技術であるウエアラブルな6軸の床反力センサおよびウエアラブルなモーションセンサの開発を行った.6軸の床反力センサとしては,パラレル型6軸のロードセルを開発し,それと3軸のロードセルおよびジャイロセンサを履物に内蔵したシステムを開発した.ジャイロセシサにより運動座標系と静止座標系の間の角度を計測し,運動座標系での床反力を静止座標系に変換した.運動センサとしては,加速度計とジャイロセンサを組み合わせたウエアラブルな運動センサシステムを開発し,床反力センサ,運動センサを用いて歩行実験を行い,カメラを用いた3次元動作解析装置と据え置き型の床反力計を用いる従来法による計測結果との比較検討を行った.床反力,運動ともに提案する手法と従来法の結果とはよく一致した.さらに,その結果を用いて下肢の関節モーメントを推定する方法を開発し,従来法と比較のための実験を行った結果,提案する方法の結果は,従来法とよく一致した.したがって,提案する方法を使用することにより,従来法の欠点であった計測場所や歩数の制限のない状態で,関節モーメントを推定することが可能となった.歩行リハビリテーションに関する研究を進める場合に,リハビリテーションを行っている患者の筋活動状況や関節モーメントを定量的に把握することは最も重要な項目の一つである.また,リハビリテーションの現場でそれらの情報が得られれば,効率的にリハビリテーションを進められるようになることが期待できる.しかし,現在,広く用いられている方法では,場所や歩数に大きい制限があること,計測の準備にかなり時間を要すること,また高価であることなどの問題があることから,日常のリハビリテーションに使用することは困難な状況である.そこで,本研究では,場所および歩数の制限がなく,コンパクトで容易に計測できる方法として,被験者が着用可能(ウエアラブルな)センサと信号処理を用いて関節モーメント・筋張力を推定するシステムを開発することを目的として,研究を進めている.ウエアラブルなセンサシステムは,大きく床反力センサと運動解析センサに分かれるが,今年度は,床反力センサの第一歩として,履物に内蔵可能な3方向の床反力センサとして,従来型の直列型のセンサではなくパラレル型のセンサを試作し,その性能を確認した.今後,コンパクト化などの課題はあるものの,3方向の床反力が精度よく計測できることを確認した.また,ウエアラブルな運動センサとして,加速度計とジャイロセンサからなるシステムを試作し,それを,床反力センサの近傍に配置して,足の運動の解析を行った.今後精度の向上などの課題は残ったが,試作したセンサにより運動解析を行うことが可能であることが確認できた.歩行リハビリテーションの研究においては,歩行中の患者の関節に働く力などを定量的に把握することが非常に有用な情報となっている.日常のリハビリテーションの現場でもそれらの情報が得られれば,非常に効率的にリハビリテーションを進めることが期待できる.しかし,現在,広く用いられている設置式の計測法では,場所や歩数に大きい制限があることや高価であることから,研究ではよく用いられているものの日常のリハビリテーションに使用するには至っていない.

そこで,本研究では,場所および歩数の制限がなく,コンパクトで容易に計測できる方法として,被験者が着用可能な(ウエアラブルな)センサと信号処理を用いて関節モーメント・筋張力を推定するシステムを開発することを目的として,研究を進めている.ウエアラブルなセンサシステムは,大きく床反力センサと運動解析センサに分かれる.床反力センサに関しては,昨年度に試作した履物に内蔵可能な3方向の床反力センサを用いて歩行実験を行い,従来法と比較した結果,せん断方向の床反力は静止座標と運動座標の間の座標変換が重要であること,および,座標変換を行わなければ両者は大きく異なるが座標変換を行えば両者はよく一致すること,などを明らかにした.また,柔軟な床反力センサについては,初期モデルの試作を行った.運動センサについては,昨年度試作したジャイロセンサによる計測システムを用いて歩行実験を行い,まず,長時間使用する場合の累積誤差に関する問題点を抽出した.その結果を元に,歩行運動であるという仮定を置き,歩行状態を4つのフェーズを推定しながら信号処理を行ない累積誤差を抑える方法を提案した.運動センサを下肢に装着して歩行実験を行い,カメラを用いた従来法と比較した結果,誤差の累積の問題は解決し,安定した結果が得られることがわかった.歩行リハビリテーションの研究においては,運動中の患者の関節に働く力などを定量的に把握することは非常に有用な情報となっている,しかし,現在,広く用いられている設置式の計測法では,場所や歩数に大きい制限があることや高価であることから,研究でかつ限られた条件では使用されているものの,幅広い条件での測定や日常のリハビリテーションに使用するには至っていない。本研究では,場所および歩数の制限がなく,コンパクトな計測方法として,被験者が着用可能なセンサと信号処理を用いて関節モーメントなどを推定するシステムを開発することを目的として研究を進めてきた。今年度は,既に試作した6軸ロードセルと市販の3軸のロードセルを組み合わせたカセンサとジャイロセンサを内蔵した床反力推定システムならびに下肢の取り付けた加速度計とジャイロセンサを組み合わせた運動センサシステムを用いて歩行実験を行い,カメラを用いた3次元動作解析装置と据え置き型の床反力計を用いる従来法による計測結果との比較検討を行った。床反力,下肢の運動ともに提案する手法と従来法による結果とはよく一致した。さらに,その結果を用いて下肢の関節モーメントを推定する方法を開発し,従来法と比較のための実験を行った結果,提案する方法による推定結果は,従来法による結果と非常によく一致した。したがって,提案する方法を使用することにより,従来法の欠点であった計測場所や歩数の制限がなくなることから,例えば,階段昇降などの厳しい条件での計測や日常のリハビリテーションにおいて関節モーメントを推定すること,あるいは,リハビリテーション支援機器やスポーツトレーニング機器へ組み込み使用者の関節モーメントをリアルタイムで推定しながら機器を制御することへの展開が可能になると考えられる。
微動を用いた地盤モデル自動作成システムの構築

将来の地震災害に備える上で,地域の地震危険度解析と建設地点での地震動予測の高精度化が必要である.そのためには,簡便に測定のできる微動を用いた地盤モデルの精度の向上が最も有用である.微動は種々の波動から成り立っているため,地盤モデル作成においては多くの情報を総合的に利用する必要がある.本研究においては,単点測定で得られる水平・上下スペクトル比とアレー測定から得られる位相速度の両者に対して逆解析を行い,最適な地盤モデルをシステマティックに探索する手法の開発を目的とした.地震計を1台加えた7点の微動アレー観測結果に振動数-波数法を適用する体制を整え,東京都の東品川および横浜市の港北地区で観測を行った.また,2004年10月23日に発生した新潟県中越地震で大きな被害を蒙った小千谷市のK-NET観測点付近ならびに最大加速度を記録した十日町市のK-NET観測点付近においても微動アレー観測を行なった。それらの観測に並行して逆解析アルゴリズムの検討を行い,複数のターゲットを同時に扱う観点から,当初候補としていた遺伝的アルゴリズムをNeighbourhoodアルゴリズムに変更して逆解析手法を開発し,数値実験により水平・上下スペクトル比と位相速度の同時逆解析が可能であることを確認した.また,高次モードを含む表面波速度を安定かつ高速に計算するために,一般化TRマトリックス法に基づいた表面波速度計算手法を開発した.以上の準備の下に,4地点の観測による水平・上下スペクトル比と位相速度の同時逆解析を実施した.その結果,浅い地盤で精度の高い情報を含む位相速度と,深い地盤の情報を含みうる水平・上下スペクトル比を組み合わせることによって,都市部の観測で現実的なアレー半径100m程度以下の観測により,深さ数十m程度の範囲の地盤モデルの改善が示された。研究代表者が7台所有する地震計と同一の地震計1台を購入し,それらの同時測定結果の検討により,他の地震計と同等の性能を有することを確認した.一般化TRマトリックス法による表面波モード探索アルゴリズムを改良し,安定かつ高速に分散曲線および水平/上下(H/V)スペクトル比を求められるようになった.また,各モードの地表微動への寄与を表すメディアムレスポンスの計算を可能とし,振動数に関するそれらの成分比の変動がきわめて著しいことを示した.2004年8月の世界地震工学会議に出席し,ヨーロッパにおける微動を用いた地盤構造同定に関する大規模な共同研究(セサミプロジェクト)の情報を収集した.公開されている微動分析プログラムを入手し微動測定結果に適用したところ,研究代表者が用いている計算手法と同等の性能を有することを確認した.また,同プロジェクトで言及されている逆解析アルゴリズムであるNeighborhoodアルゴリズムのプログラム化を行い,シミュレーション結果について表面波分散曲線とH/Vスペクトルの同時逆解析が有効であることを確認し,日本建築学会関東支部研究発表会で発表した.2004年10月に発生した新潟県中越地震の被害調査を行い,震度6強が観測されたK-net小千谷観測点,JMA小千谷観測点,K-net十日町観測点近傍で予備的に微動測定を行った.そこで得られたH/Vスペクトルピーク振動数はPS検層結果で説明できそうであり,各K-net観測点は小学校および中学校であるため敷地上の制約も小さいことから,これらの観測点が2005年度の微動アレー測定侯補地として相応しいことがわかった.将来の地震災害に備える上で,地域の地震危険度解析と建設地点での地震動予測の高精度化が必要である.そのためには,簡便に測定のできる微動を用いた地盤モデルの精度の向上が最も有用である.微動は種々の波動から成り立っているため,地盤モデル作成においては多くの情報を総合的に利用する必要がある.

本研究においては,単点測定で得られる水平・上下スペクトル比とアレー測定から得られる位相速度の両者に対して逆解析を行い,最適な地盤モデルをシステマティックに探索する手法の開発を目的とした.地震計を1台加えた7点の微動アレー観測結果に振動数-波数法を適用する体制を整え,東京都の天王洲および横浜市の港北地区で観測を行った.また,2004年10月23日に発生した新潟県中越地震で大きな被害を蒙った小千谷市のK-NET観測点付近ならびに最大加速度を記録した十日町市のK-NET観測点付近においても微動アレー観測を行なった.それらの観測に並行して逆解析アルゴリズムの検討を行い,複数のターゲットを同時に扱う観点から,当初候補としていた遺伝的アルゴリズムをNeighbourhoodアルゴリズムに変更して逆解析手法を開発し,数値実験により水平・上下スペクトル比と位相速度の同時逆解析が可能であることを確認した.また,高次モードを含む表面波速度を安定かつ高速に計算するために,TRマトリックス法に基づいた表面波速度計算手法を開発した.以上の準備の下に,4地点の観測による水平・上下スペクトル比と位相速度の同時逆解析を実施した.その結果,当初の予想通り浅い地盤で精度の高い情報を含む位相速度と,深い地盤の情報を含みうる水平・上下スペクトル比を組み合わせることによって,都市部の観測で現実的なアレー半径100m程度以下の観測により,深さ数十m程度の範囲の地盤モデルの改善が示された.
起立体性低下における前庭系の関与

今回の研究により明らかになった起立時の血圧調節について以下にまとめる。1.起立により体軸に対する重力の方向が変化することにより,身体の長軸方向の静水圧差が増加する。2.下半身への血液シフトより,静脈還流量と心拍出量が減少し,血圧が低下する。3.この血圧低下は,圧受容器で感知され,negative feedback調節機構である圧受容器反射を介して血圧が維持されると考えられていた。4.しかし,圧受容器反射だけでなく,前庭-血圧反射も重要な役割を担う。姿勢変化に伴う重力方向の変化が前庭系で感知され,前庭-血圧反射を介した血圧上昇が起こる。この反射は,血液シフトによる血圧低下とは無関係に,重力方向の変化のみにより誘起され,次に起こるであろう血圧低下を補正するように働く。すなわち,negative feedforward的調節機構である。5.以上,起立時の血圧は,血液シフトによる血圧低下と前庭-血圧反射および圧受容器反射による血圧上昇の総和として表すことができる。正常な状態では,その総和として起立時でも血圧は低下することなしに,維持される。ところが,前庭系は非常に可塑性が強く,日々のphasicな前庭系への入力が減少すると,可塑性が起こり前庭-血圧反射の可塑性が起こり,前庭-血圧反射の調節力が低下し,この反射を介する昇圧が起こらなくなり,起立性低血圧が発生する。この様な状態は,日常の活動が低下した高齢者でみられる。また,宇宙の微小重力環境では前庭系への入力がほとんどなくなることから,同様の前庭-血圧反射の調節力低下が起きると考えられ,宇宙飛行後の起立性低血圧の原因のひとつを考えられる。この様な状態を予防・治療する方法として微弱な電流による前庭系の電気刺激を提案した。研究期間全体のworking hypothesis“1Gと異なる重力環境下では,前庭-血圧反射の可塑性が起こり,起立性低血圧を引き起こす"を証明するため,本年度は以下の研究を行った。・2Gの環境で誕生・生育した10週齢のラットの前庭-血圧反射を測定して,通常の1G環境下で誕生・生育したラットのそれと比較した。・GVSにより前庭-血圧反射を遮断して,起立時における前庭-血圧反射の役割をヒトにおいて調べた。これらの研究により,以下の点が明らかになった。・2G環境で育ったラットは,前庭-血圧反射の調節力が低下し,重力変化に伴う血圧応答が小さくなる。また,前庭系を介する協調運動も阻害される。・前庭-血圧反射の変化は,1G環境で1週間飼育することにより元に戻るが,協調運動阻害は,1G環境に戻しても回復しない。・GVSにより前庭-血圧反射を非侵襲的・可逆的に阻害することができる。・ヒトの起立時の血圧調節に前庭-血圧反射が重要な役割を果たしている。日常の活動が低下している高齢者では,前庭-血圧反射が働かず,起立時に血圧が低下する。研究期間全体のworking hypothesis"1Gと異なる重力環境下では,前庭-血圧反射の可塑性が起こり,起立性低血圧を引き起こす"を証明するため,本年度は以下の研究を行った。・3G環境下飼育により引き起こされる前庭-血圧反射の可塑性が,前庭を電気刺激することにより代償できるかどうかを調べた。3Gでラットを2週間飼育すると,前庭-血圧反射の調節力は,23±1mmHgから12±1mmHgに低下するが,3G環境下飼育中に前庭電気刺激することにより20±1mmHgに回復した。従って,異なる重力環境により引き起こされる前庭-血圧反射の調節力低下は,前庭電気刺激により回復することが分かった。

・3G環境下でラットを飼育2週間飼育し,行動量,摂食量,体重,脳内Fos発現量を調べた。3G環境下では立ち上がり行動はほぼ0になり,水平方向の運動も20%程度に抑制された。また,摂食量と体重増加も有意に抑制された。これらの抑制は,前庭系を破壊することにより改善することから,前庭系を介して引き起こされたことが分かった。また,3G負荷により,前庭神経核,孤束核,最後野,第3脳室室傍核にFosが発現するが,これらの発現も前庭破壊により有意に抑制された。以上の結果から,過重力負荷では行動量が減少し,日常の活動に伴うphasicな前庭系への入力が減少し,use-dependentな可塑性が引き起こされる。この可塑性は,前庭電気刺激により予防されることが証明され,宇宙での微小重力環境下でも同様な現象が起こる可能性があり,宇宙から帰還後の起立耐性低下の予防として,前庭電気刺激の有用性が示唆された。過重力環境では,前庭系は定常的に大きな入力に曝されることになる。また,過重力環境では体重が重力倍になり,活動が減少する。従って,過重力環境で起こる前庭系の可塑性の原因として,以下の2つを考える必要がある。1)定常的に大きな入力に曝されることにより,受容器レベルでdownregulationが起こる;2)体動に伴うphasicな前庭系への入力が減少し,use-dependent deteriorationが起こる。後者の可能性を調べるため,1G環境下で体動を制限して飼育することにより,過重力環境下と同じ様な前庭-血圧反射の可塑性が起こるかどうかを調べた。頭部に3軸の加速度センサーを装着して頭部の動き、即さ前庭系へのphasicな入力を測定すると,3Gの過重力環境下ではphasicな力が1G環境下の13%(過重力1日目)まで減少し,過重力14日目でも25%に減少した。また,立ち上がり回数も1G環境下での400500回/日から,ほぼ0にまで減少した。この状態を模擬するため,屋根を低くして立ち上がりができないような環境で2週間ラットを飼育し(Roof群),前庭-血圧反射を比較した。前庭-血圧反射は,前一後,左-右の直線加速(2G)に対する昇圧応答の大きさで評価した。1口G群では,前方加速により27±1mmHg,後方加速により18±1mmHg,左方加速により25±1mmHg,右方加速により24±1mmHgの昇圧応答が見られた。これらの昇圧応答はRoof群および3口G群では有意に抑制された。一方,前庭系を介さない昇圧応答(air-jet)は3群間で差はなかった。以上の結果より以下の3点が明らかになった。1)過重力環境下では,日常の立ち上がり回数が抑制され,前庭へのPhasicな入力が減少する。2)過重力環境で2週間飼育することにより,前庭一血圧反射の調節力が低下する。3)屋根を低くした環境で立ち上がりを抑制して2週間飼育すると,過重力環境でみられたと同様の前庭一血圧反射の調節力低下が引き起こされる。
スギ心材色発現に関与する化学成分とその化学変換による材色調節

1.スギ心材の色調の変異に関与する化学成分の構造について知見を得るために、メタノールに溶出されてくる心材着色成分を、メチル化またはエチル化して過マンガン酸塩酸化し、その分解生成物のメチルエステルをGLCで分析した結果、次のようなことが明らかになった。(1)心材着色成分を構成する部分構造として、pーヒドロキシフェニル基、3,4ージヒドロキシフェニル基、グアヤシル基、3,4ージメトキシフェニル基、3ーメトキシー4,5ージヒドロキシフェニル基および6位縮合型のグアヤシル基など6種のベンゼン核構造が確認された。(2)3ーメトキシー4,5ージヒドロキシフェニル基は、赤心に比べて、黒心に多く含まれており、心材色の変異に密接に関与しているものと思われる。また、このようなトリオキシ型のフェニル基をもつフェノール成分は珍らしく、スギ材からはこれまで見出されていなかった。(3)黒心の着色成分のメトキシル基含有量は、赤心に比べて高かった。メトキシル基もまた、心材色の変異に関与していると推定される。2.スギ黒心を直接アセチル化してから、抽出物を分離し、3ーメトキシー4,5ージヒドロキシフェニル基をもつ低分子のフェノール成分の検索を行った。その結果、アガサレジノールとセキリンCのアセチル誘導体を単離し、同定した。トリオキシ型フェノールの可能性がある物質を、TLCで検出したが、単離するまでには至らなかった。3.スギ黒心木粉に、種々の化学処理を施し、材色の改良を試みた。その結果、溶媒にジクロロメタン:メタノール(1:1)を用いたオゾン処理が、材色改良に最も効果があることが分った。また、ジアゾメタンによるメチル化処理は、黒心に対して、著しい脱色効果をしめした。1.スギ材の中から,典型的な赤心(赤褐色の心材)と黒心(暗褐色の心材)を採取し,メタノール抽出した.抽出物を溶媒分画により,ポリフェノール画分とテルペノイド画分に分離した.2.赤心と黒心のポリフェノール画分の色調を比較すると,その差が明確であり,心材の色調に寄与している化学成分が,この画分に存在することが明らかとなった.3.ポリフェノール画分をメチル化後,過マンガン酸カリ酸化し,得られた生成物をジアゾメタンでメチル化して,ガスクロマトグラフを用いて分析した.その結果,生成物としてP-メトキシ安息香酸メチル, 3, 4-ジメトキシ安息香酸メチルおよび3, 4, 5-トリメトキシ安息香酸メチルが確認されたが,赤心と黒心とではその生成比が異なり,黒心にはトリメトキシ安息酸メチルが特に多いことがわかった.したがって,黒心の形成に寄与する着色物質は,トリオキシフェニル基を有するポリフェノール類であると推定された.4.スギ心材の中には,スギレジノール,ヒドロキシスギレジノール,セキリンCなどのノルリグナン類が存在することが,すでに報告されているが,トリオキシフェニル基をもつポリフェノール類の報告はない.したがって,スギ黒心の中に,トリオキシフェニル基をもつノルリグナンなどのフェノール成分が存在するか否か,確認するための実験を実施する予定である.5.赤心と黒心のテルペノイド画分の色調は,その差が僅かであった.しかしながら,両者をガスクロマトグラフで分析すると,モノテルペノイドの構成成分に明確な相違がみられた.これらは,直接材の色調に関与していないが,何らかの関連性があるものと思われる.昨年度スギ

黒心と赤心との間には、ポリフェノール成分に相違が見られ、とくにトリオキシフェニル基をもつフェノール成分が黒心に多いことを見出した。今回、新たにポリフェノール画分をエチル化したのち、過マンガン酸カリ酸化し、その分解生成物のメチルエステルをGC-MS分析した結果、3,4ジエトキシ-5-メトキシ安息香酸メチルの存在を確認することができた。したがって、黒心には3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル基をもつポリフェノールが多く存在することがわかった。これまでスギ心材から、スギレジノール、ヒドロキシスギレジノール、アガサレジノール、セキリンCなどのノクリグナン類が単離されているが、3,4-ジヒドロキシ-5.-トメキシフェニル基をもつフェノール成分は、単離されていない。しがって、黒心のポリフェノール画分を注意深くアセチル化し、トリオキシフェニル基をもつフェノール成分の単離を試みた。その結果、アガサレジノールとセキリンCのアセチル誘導体を単離した。また、TLC上でトリオキシフェニル基をもつポリフェノールと推定される成分を検出できたが、量的に少ないため、まだ単離・同定するまでに至っていない。スギ黒色心材に、オゾン処理、過酸化水素処理、亜塩素酸ナトリウム処理、亜ニチオン酸ナトリウム処理、ロンガリット処理、メチル化処理、アセチル化処理などを施し、材色の改良を試みた。その結果、オゾン処理では使用する溶媒によって脱色効果が異なり、メタノール:二塩化メチレン(1:1)を用いた場合が、最も脱色効果があった。また、ジアゾメタンによるメチル化も高い脱色効果を示した。しかしながら、黒色を赤色へ一挙に変換できる処理法は、見出されなかった。したがって、黒色心材を脱色したあと、赤色への着色化を行なうプロセスを考える必要がある。
抗体提示型ウイルスベクターを用いた平行線維・登上線維選択的遺伝子導入法の確立

抗体提示型ウイルスベクターによって、マウス小脳の平行線維終末と登上線維終末特異的に遺伝子導入する方法の確立を目指して研究を実施した。この目的のために、シナプス小胞の小胞膜内腔側に結合するVGluT1抗体およびVGluT2抗体を新規に作成した。また、本抗体を結合させたレンチウイルスベクターをマウス小脳に投与したが、期待される感染結果は得られなかった。以上の結果から、当初の計画で予定していた研究をおおよそ遂行したものの、期待した遺伝子導入法の確立には至らなかった。今後、現在進行しているアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入法などを用い、本手法の確立を目指したい。【抗体提示型レンチウイルスベクターの最適化】この研究項目に対しては前年度までにある程度進捗しており、さらに液体クロマトグラフィーを用いた精製法を確立することが本年度の課題であった。これに関しては、陰イオンクロマトグラフィーカラムHiTrapQHPを使用することにより、精製可能であったため、容易に実現できた。具体的な方法は以下の通りである。「1HEK293細胞に4種類のプラスミドをco-transfection2翌日、IgG-FreeのFBSを含む培地に培地交換33日後に培地上清に出てくる抗体提示型ウイルスベクターを超遠心により回収4ウイルスベクターをPBSに懸濁5AKTA Primeに取り付けた、HiTrapQHPカラムにアプライ6NaClによるグラジエント溶出により、一本のピークとして、ウイルス画分を得た」【抗体の作成】抗体の作成に関しては、前年度に完了している。しかしながら、マウス小脳スライスに対して、作成した抗体を用いた免疫組織染色をしたところ、あまり良好な染色結果が得られなかった。このため、精製が必要であると思われるが、Affinity精製をするための適切なペプチド固定化カラムが販売しておらず、抗体の精製に関しては進捗がみられていない。未精製であっても、感染が成立する可能性はあるので、まずはこれで感染実験を行うこととした。【実際のマウスでの感染実験】本年度の後半からマウスへの感染実験を行う予定であったが、ウイルスベクターの投与までは行ったが、感染結果の確認までは現在までのところ至っていない。今後、検討していく予定である。1.抗体提示型レンチウイルスベクターの最適化通常のレンチウイルスベクターにおいて、エンベロープタンパク質として用いるVSV-Gのプラスミドを、ProteinAの抗体結合ドメインをエンベロープとして持つプラスミドに変え、抗体提示型レンチウイルスベクターの作成した。超遠心による培地上清からの回収後、PBSに懸濁して実際にマウスの小脳へ感染を行ったところ、抗体を結合させていない場合の非特異的な感染がほとんどなくなっていた。研究計画では、「E2タンパク質のウイルス表面に出ている部分を段階的に欠損させることにより、非特異的な感染性を除去する。」としていたが、これまで設備的な事情により実施不能だった超遠心による精製を加えることにより、非特異的な感染を十分に除去することができた。今後、24年度に購入した液体クロマトグラフィーを利用した精製を加えることにより、さらなる感染の効率化を目指す予定である。2.抗体の作成VGluT1とVGluT2のルーメン側の抗体を受託合成により行った。それぞれRGGHVVVQKAQFN (VGluT1)、RGGKVIKEKAKFN(VGluT2)をペプチド抗原とした。抗体価は順調に上昇し、予定通りの納期で抗体が完成した。作成した抗体を用いて、マウス小脳に対する免疫組織染色を行った。ポジティブコントロールとして、市販されている抗体(ルーメン側に結合する抗体ではないため、抗体を介した感染に用いることが不可能)との共局在性が期待したものとは、異なっていた。今後、抗原として用いたペプチドのアフィニティカラムを用いた精製を行い、本手法への適応を検討する。抗体提示型ウイルスベクターによる平行線維終末と登上線維終末特異的感染法の確立を目指して研究を実施した。26年度においては、抗体提示型ウイルスベクターに、初年度に作成したVGluT1とVGluT2の抗体をそれぞれ結合させ、マウス小脳の神経細胞に対する特異的な感染を試みた。しかしながら、いずれの場合も、期待したような特異的な感染は得られなかった。一方で、結合した抗体ごとに感染細胞種には若干の違いがあったために、抗体依存的な感染は一部で起こっていると思われる。例えば、下オリーブ核ニューロンへの感染が期待されるVGluT2を結合させたウイルスの場合、期待に反して、プルキンエ細胞への感染が増大していた。これらのことから、初年度に作成した抗体の特異性が不十分であることが、このような結果をもたらしたものと考えられる。

今後は、結合させる抗体の特異性を高めることや、異なる膜タンパク質をターゲットとした抗体を結合させたウイルスを検討する必要がある。このように結果として、本手法の確立には至らなかったが、26年度中にマウス小脳への遺伝子導入や遺伝子治療を志向した関連する研究において、共著の2報の学術論文を出版することができた。神経科学概要に示したとおり、抗体の精製・マウスでの感染実験において、研究の進捗が遅れている。理由としては、平行して研究を進めていた「ウイルスベクターによる脊髄小脳変性症の遺伝子治療の研究」の方が順調に進捗していたため、そちらエフォートの多くを費やしていた。特に、本年度は論文を提出し、その改訂の対応にも追われていたことも大きな理由である。しかし、本論文は受理され、国際誌に掲載済「Konno A et al., Mutant Ataxin-3 with an Abnormally Expanded Polyglutamine Chain Disrupts Dendritic Development and Metabotropic Glutamate Receptor Signaling in Mouse Cerebellar Purkinje Cells. The Cerebellum 2014 Feb;13(1):29-41.」である。液体クロマトグラフィーの納入が予定よりも遅くなり、抗体提示型ウイルスベクターの精製法を検討することができなかった。しかしながら、簡便な精製方法のみで、予想していたよりも非特異的な感染が低く抑えられたことから、非特異的な感染の除去に関しては順調に研究が進んでいる。また、抗体に関しては作成は完了したが、本手法に適応するための精製ができていない状況である。マウスへの感染実験を特に重点的に実施する。感染実験を行ったマウスに対しては、小脳スライスを作成し、免疫組織染色を行うことにより、特異的な遺伝子導入が起きているかどうかの確認を行う。一方で、平行して行っていたアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた研究が、多方面に進捗しつつあるので、AAVを用いた顆粒細胞特異的な遺伝子導入法も、場合に応じて検討していく予定である。液体クロマトグラフィーを用いたウイルスベクターの精製法を確立する。必要な物品は購入済であり、今後条件検討などを行っていく。具体的には、HiTrapQ HPもしくはHiPrepQ FFを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を予定している。平行してウイルスベクターへ結合させるVGLUT1およびVGluT2抗体の精製も行う。抗原として用いたそれぞれのペプチドによるアフィニティー精製を介して、それぞれに対して特異的に吸着する抗体のみを調製する。さらに精製した抗体を提示させたウイルスベクターを小脳へ感染させることにより、平行線維(顆粒細胞)あるいは登上線維(下オリーブ核ニューロン)への選択的な遺伝子導入を確認する。消耗品費の利用額の誤差の範囲と考えられる。主に消耗品と学会参加のための旅費に使用する。