hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
船舶騒音が海棲哺乳類の生態に与える影響についての研究

日本列島南方において大型帆船により、石川県能登島周辺海域において小型帆船と小型動力船により、曳航した音響センサーを用いて、海棲哺乳類の船舶騒音に対する反応行動を調査した。前者では対象生物との遭遇率が不十分で有意なデータとならず計測システムの検証にとどまったが、後者ではミナミハンドウイルカの群れの反応を頻繁に計測、記録することができた。この解析の結果によると、イルカの反応には、低速かつ低プロペラ荷重度の動力船と帆走中の帆船では顕著な違いは確認されなかった。これより本調査の範囲では、船舶騒音がイルカに悪影響を与えるという事実は定量的に確認されなかった。北太平洋上において練習帆船上で、低周波数用および高周波数用の音響センサーを曳航し、機走時および帆走時の水中音を計測した。そこでは曳航索の力学解析よりおもりの適正配置を決め安定した曳航状態を実現した。また、水中計測音を船舶雑音と海棲哺乳類発生音に自動分離し、イルカの遊泳軌跡を表示する解析ソフトウエアを作成した。さらに計測された水中音と鯨類の鳴音レベルを比較することで、船上からの鯨類の探知可能距離を求め、その機走時帆走時の比較から計測プラットフォームとしての帆船の優位性を定量化した。能登島周辺海域において、遊泳中のミナミハンドウイルカの群れ付近を、高周波数用の音響センサーを曳航した船舶を航行させた。この船舶に対するイルカの反応行動をイルカのソナー音計測記録の三角測量により求めた。用いた船舶は、静穏な帆走中の小型帆船(セーリングクルーザー)と機走中の動力船の2種類とした。この解析の結果によると、イルカの反応には、帆船と動力船で顕著な違いは確認されなかった。これより、船舶騒音がイルカに顕著な悪影響を与えるという事実は本調査では確認されなかった。これは、観光産業としてのイルカ・ウオッチングの在り方についての科学的データのひとつとなりうるものであり、また海棲哺乳類と海運の共存を考える研究のひとつの端緒を拓くものといえよう。船舶海洋工学海棲哺乳類と船舶騒音を同時計測できる曳航式水中音響センサーシステムを構築し、北太平洋上の大型練習帆船上でその作動を確認できた。しかしながら、練習帆船の航海訓練の安全確保のため、海棲哺乳類との遭遇予想海域の通過時間が短く、海棲哺乳類との遭遇に至らず、その音響計測もできなかった。このため、方法論の研究にとどまり、実証データを取るに至らなかったため、現在までの達成度はやや遅れていると判断した。次年度は、より確実な海棲哺乳類との遭遇を図るため、イルカの定住している七尾湾を対象海域とし、大型帆船を小型帆船(大型ヨット)に変えたうえ、今年度の方法論を適用することとしたい。大型帆船による調査において海棲哺乳類との遭遇がなかったため、その音響データの解析に要する経費が未使用となった。次年度の小型帆船による調査では、海棲哺乳類との遭遇可能性が高いため、その解析に要する経費などに充当することを計画している。
メラネシアにおける民族紛争と地域住民に関する開発社会学的研究

本研究では、近年続発しているメラネシア地域の紛争に関し、とくに住民の生活との関連について、開発社会学および開発人類学的観点から分析を加えることを目的に置いた。その結果、以下の諸点が明らかになった。(1)ソロモン諸島における「民族紛争」の主要な背景は、ソロモン諸島における「近代化」のありようであり、中でもガダルカナル島民の「辺境化」であった。(2)ソロモン諸島においては、「避難民」の多くが、これまでの彼らの移住パターンの延長上に「避難」が行われたが、紛争の舞台になったガダルカナル島のどこにどういう経緯で生活を営んでいたかによって、その「避難」のありよう、また、生活戦略の立て直しのありようには相違がある。(3)ソロモン諸島においては、民族紛争が集団範疇(氏族および「○○島民」)の固定化の作用をもたらし、それが人びとの生活戦略にまで影響を及ぼしている。たとえばマライタ島では、自分たちのクランの土地に戻らなければならないという観念が芽生えはじめている。(4)ソロモン諸島においては民族紛争の経緯の中で、もともと紛争解決の手段として儀礼的な側面が強かった「コンペンセーシヨン」について、近代的貨幣要求の部分が肥大化し、また、政府によっても「早期解決」のための手段と化した。(5)そうした中でソロモン諸島では、民族紛争の反省から、職のない若者たちのの再教育の試みなど、社会的なコンフリクトを生む温床の低減への試みがいくつか登場している。(6)一方、表面的に民族紛争のない隣国ヴァヌアツにおいては、首都ポートヴィラの土地をめぐる民族集団間の葛藤と均衡が、「名乗り」の中に現れているという現象を見ることができる。本研究では、近年続発しているメラネシア地域の紛争に関し、その背景や、地域ごとの相違点、さらには住民の生活との関連などについて、開発社会学的観点から分析を加えることを目的においた。本年度の研究では、以下の諸点が明らかになった。(1)ソロモン諸島における民族紛争について、その背景や経緯について、これまで報道されたり調査されたりした以上の詳しい経緯--たとえばマライタ島では武装グループ登場の前にその準備の段階があったことなど--が、関係者の証言から明らかになった。(2)ソロモン諸島においては、民族紛争が集団範疇(クランおよび「○○島民」)の固定化の作用をもたらし、それが人びとの生活戦略にまで影響を及ぼしている。(3)ソロモン諸島においては民族紛争によって、もともと集団間の紛争の解決の手段として儀礼的な側面が強かった「コンベンセーション」が、単なる金のやりとりにすぎなくなり、そのことが社会的な不安定をもたらしている。(4)そうした中でソロモン諸島では、民族紛争の反省から、職のない若者たちのの再教育の試みなど、社会的なコンフリクトを生む温床の低減への試みがいくつか登場している。(5)一方、表面的に民族紛争のないバヌアツにおいてもその萌芽は存在しており、それは首都ポートヴィラの土地をめぐって民族集団間の葛藤である。この葛藤は、複雑な歴史的な経緯と現代的な問題がもつれ合う中で存在している。本研究では、近年続発しているメラネシア地域の紛争に関し、とくに住民の生活との関連について、開発杜会学および開発人類学的観点から分析を加えることを目的に置いた。(1)ソロモン諸島においては、紛争の舞台になったガダルカナル島のどこにどういう経緯で生活を営んでいたかによって、その被害の遭いかたに大きな相違があることが明らかになった。もっとも大きな被害に遭ったのは、ホニアラ郊外に土地を購入していた他島民(主にマライタ島民)である。マライタ島民は、ホニアラの町へのアクセスと村のサブシステンス経済の両方を得る戦略として土地購入をしていたが、この戦略は紛争によって挫折した。

(2)ソロモン諸島においては、民族紛争が集団範疇(とくにクラン)の固定化の作用をもたらし、それが人々の生活戦略にまで影響を及ぼしている。たとえばマライタ島では、自分たちのクランの土地に移住しようという志向が強まっており、そのことが、人々の生活に不安定さをもたらしている。(3)そうした中、ソロモン諸島では、民族紛争の反省から、職のない若者たちの再教育の試みなど、社会的なコンフリクトを生む温床の低減への試みがいくつか登場している。(4)一方、表面的に民族紛争のないバヌアツにおいても、その萌芽は存在しており、それはポートヴィラの土地をめぐる民族集団間の葛藤であるが、この葛藤は、複雑な歴史的経緯と現代的な問題がもつれ合う中で存在している。
拡張π共役ケイ素化合物の革新的合成法開拓

ケイ素からなるπ電子系化合物であるジシレン(ケイ素ーケイ素二重結合化合物)の二重結合ケイ素上のシリル置換基を選択的かつ温和な条件で種々の官能基に変換可能な汎用性の高い方法を開発した。この方法の特色は従来用いられている強い還元条件を用いずに、塩基を作用させることで達成している点である。この方法を用ることで、多環芳香族置換基やヘテロ元素置換基を導入したジシレンを簡便に合成することができ、さらにこの方法で合成した拡張π共役ケイ素化合物であるテトラシラ-1,3-ジエンのさらなる官能基化にも成功した。平成27年度は安定ジシレンを用いたケイ素ーケイ素二重結合伸長反応の開拓を目的として以下の点を重点的に行った。(i)安定ジシレンの置換基変換種々の置換基及び合成条件を検討した結果、安定ジシレンのケイ素ーケイ素二重結合上の置換基を還元的に脱離させてケイ素ーケイ素二重結合とシリルアニオンをあわせもつジシレニドを安定化合物として得ることに成功した。さらに合成したジシレニドに対して種々の求電子剤を反応させることで新規安定ジシレンを合成した。これらの反応は二重結合ケイ素上に異なる種類の置換基を持つジシレンでも同様に適応できることを見出し、適切な安定ジシレンを用いれば、一般性の高い反応であることが推定された。これらにより本研究の基盤となる反応を確立した。(ii)安定テトラシラブタジエンの合成(i)で得られたジシレニドの酸化的カップリングにより、共役ジシレンであるテトラシラブタジエンを新規に合成した。X線結晶構造解析の結果、合成したテトラシラブタジエンの2つのケイ素ーケイ素二重結合同士は、ほぼ共平面内にあり、これまでに合成されたテトラシラブタジエンの中で最も二重結合同士の二面角が小さく、ケイ素ーケイ素二重結合同士が有効に相互作用可能な構造を持っていた。紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、孤立したケイ素ーケイ素結合をもつ化合物の吸収極大に比べて著しく長波長シフトした吸収帯が観測され、ケイ素ーケイ素二重結合同士の有効な共役が確かめられた。(i)安定ジシレンの置換基変換安定ジシレンからジシレニドを安定化合物として合成し、種々の求電子剤を反応させることで新規安定ジシレンを合成することに成功した。さらにこれらの反応が異なる種類のジシレンに適応可能であり、ある程度一般性があることを見出せたことから、当初の想定以上に研究は進んでいると考えている。(ii)安定テトラシラブタジエンの合成(i)で得られたジシレニドの酸化的カップリングにより安定テトラシラブタジエンの合成およびその詳細な分子構造解析に成功しており、順調に研究は進んでいる。平成28年度は前年度明らかにしたケイ素ーケイ素二重結合伸長反応の展開を目的として以下の点を重点的に行った。(i)鎖状拡張π共役ケイ素化合物の合成前年度検討した安定ジシレンとは異なる置換基をもつ安定ジシレンに対しても、同一野反応条件を適応することで対応するテトラシラブタジエンが生成することを明らかにし、前年度見出したケイ素ーケイ素二重結合伸長反応の一般性を明らかにした。更に生成したテトラシラブタジエンに対して同様な伸長反応を適応してみたところ、極低温では対応するテトラシラブタジエニドが生成することを見出した。これは分子内に2つのケイ素ーケイ素二重結合とシリルアニオンを併せ持つ化合物として初めての化合物である。また、この反応を進行させるためには、溶媒および添加剤の選択が重要であることも突き止めた。関連して2つのケイ素ーケイ素二重結合がSiMe2鎖で連結された1,4-ペンタシラジエンの合成にも成功し、ケイ素ーケイ素二重結合間のホモ共役も明らかにした。(ii)環状拡張π共役ケイ素化合物の合成代表的な環状6π電子系化合物であるシクロペンタジエニドのケイ素類縁体の合成を検討した。その結果、シクロペンタジエニドの構造異性体のケイ素類縁体が生成することを見出した。X線結晶構造解析および核磁気共鳴スペクトルから、生成した化合物が、ホモ共役により安定化され大きく分極した構造をもつことを明らかにした。更に求電子剤との反応の位置選択性および生成物の構造からも、分極した構造をもつことが支持された。また、熱反応により三環式構造をもつクラスターアニオンに構造変化することも見出した。今年度、これまでに開発したケイ素ーケイ素二重結合伸長反応が様々なジシレンに対して適応可能であることを明らかにし、この反応の一般性を明らかにすることができたことから、本研究課題の基盤を確立できたと考えている。また、この反応を活用して、新たな拡張π共役ケイ素化合物への展開も進められており、おおむね順調に研究が進行していると考えている。本研究で開発した安定ジシレンから安定ジシレニド(ジシレンのアニオン)への変換反応を用いて合成したテトラシラ-1,3-ジエンの熱および光反応でそれぞれ異なる立体配置を持つシクロテトラシレンを与えることを見出した。すなわち熱反応では逆旋的に閉環した生成物を与えるのに対して、光反応では同旋的に閉環した生成生物を与えることを見出した。1,3-ブタジエンやシクロブテンの間の電子環状反応は実験的理論的に

詳細な研究があるが、ケイ素化合物においても軌道対称性が保存された電子環状が反応が進行することを実験的に突き止めた。ケイ素ーケイ素二重結合の1,2位にジシレニドに変換可能な置換基が導入されたジシレンに対して段階的に新たな官能基を導入することに成功した。特にボリル基の導入では、途中で生成する生成する一置換体を単離することなく一容器内で段階的に2つボリル基を導入することができ、この反応の有用性を確かめることができた。関連して電子供与基であるアミノ基および電子求引基であるボリル基が同時にケイ素ーケイ素二重結合上に導入されたジシレンを合成することに成功し、電子供与基と電子求引基とケイ素ーケイ素二重結合とが有効に相互作用し共役が拡張されていることを紫外可視吸収スペクトルと単結晶X線結晶構造解析から明らかにした。さらにこのジシレンは一気圧の水素分子と速やかに反応し、ジシレンに対して2分子の水素分子が付加した生成物を与えることを見出した。そして理論計算により、この反応がケイ素ーケイ素二重結合とホウ素上の空の軌道が水素分子を活性化していることを突き止めた。本研究によりケイ素ーケイ素二重結合種の骨格および官能基の多様性を向上させる新たな方法論の開発に成功し、ケイ素からなる拡張π電子系創出の新たな基盤を構築することができた。ケイ素からなるπ電子系化合物であるジシレン(ケイ素ーケイ素二重結合化合物)の二重結合ケイ素上のシリル置換基を選択的かつ温和な条件で種々の官能基に変換可能な汎用性の高い方法を開発した。この方法の特色は従来用いられている強い還元条件を用いずに、塩基を作用させることで達成している点である。この方法を用ることで、多環芳香族置換基やヘテロ元素置換基を導入したジシレンを簡便に合成することができ、さらにこの方法で合成した拡張π共役ケイ素化合物であるテトラシラ-1,3-ジエンのさらなる官能基化にも成功した。(i)安定ジシレンの置換基変換今年度見出した反応の一般性を明らかにするために、種々の安定ジシレンからジシレニドの合成とその酸化的カップリングによるテトラシラブタジエンの合成を検討し、高収率でテトラシラブタジエンを得るための反応の最適化を進め、鎖状拡張π共役ケイ素化合物の合成に向け基礎をかためる。(ii)安定テトラシラブタジエンの合成今年度得られた安定テトラシラブタジエンの更なる官能基変換を検討し、鎖状拡張π共役ケイ素化合物の合成に向けた分子設計の精査を進める。(i)鎖状拡張π共役ケイ素化合物の合成これまでに合成した種々の鎖状テトラシラブタジエンの反応性を明らかにするとともに、更にテトラシラブタジエニドの生成条件の精査、ならびに、その酸化カップリング反応の精査を進めて、より共役の拡張したπ共役ケイ素化合物の合成の検討を進める。(ii)環状拡張π共役ケイ素化合物の合成今年度明らかにしたシクロペンタジエニドの構造異性体のケイ素類縁体の生成機構を理論計算を用いて明らかにする。さらにこれまでに開発してきた共役系の拡張方法を活用して種々の環状拡張π共役ケイ素化合物の合成を進める。有機元素化学重点項目の一つである安定ジシレンの置換基変換反応では、多種類のジシレンを用いた反応を検討する必要があると考えていたが、予想よりも早い時期に目的とする反応の確立に成功し、構造解析や物性の解明に集中したため、消耗品を中心として物品費に関する支出が低く抑えられた。昨年度明らかにした新しい合成法の基盤を確かなものにするために、今年度は主に研究推進に重点おいた。
Investigation of key nuclear reactions in the astrophysical rp-process

シリコンストリップ検出器とデュアルゲインASICプリアンプを組み合わせた高精度粒子追跡システムの開発と構築が完了しました。追跡システムは完全に装備されており、天体物理的プロセスに関連する重イオンの陽子分解反応の測定に使用する準備ができています。SAMURAI分光計のインフラストラクチャーと標準検出器を新しく設計されたシリコントラッカーと共に使用した詳細な実験計画が徹底的に開発され、2018年6月に公式に予定されていた実験を実行するための実験準備が開始されました。RIBFにおける機械時間委員会は、2019年の春まで暫定的に78Krビームの使用を延期することを決定した。
自然発症骨粗鬆症モデル動物の確立とその応用

加齡-生殖腺機能低下にともない尿中カルシウム濃度が約6倍と著しく増加するWistarの亜系統雌ラットを見いだした。1.ソフテックスで撮影したX線写真で加齡にともなう明らかな骨の実質の減少、大腿骨の乾燥重量の低下やカルシウム含有量の有意な減少が見られた。2.また尾椎骨でも乾燥重量や力学的骨強度の有意な低下が見られた。これらの変化から本系統の雌ラットは臨床的には老齢者ないしは閉経後に見られる骨粗鬆症や骨軟化症のモデル動物になると考えられた。3.カルシウム代謝に関与する内分泌系であるカルシトニン濃度は加齡ラットで有意な変化は認められなかった。副甲状腺ホルモンについては測定法を検討中であり、カルシウム代謝変化の機構については今後さらに検討が必要である。4.本系統では特に雄で腎臓機能の加齡変化が著明であるが、カルシウム代謝変化に関しては雌の変化の方が大きく、明らかな雌雄差が見られた。5.これまでこの系統はコンベンショナルな条件で飼育してきたが、カルシウム代謝変化と飼育条件との関連を明らかにするため、SPF化し12代目に至った。SPF化により平均寿命が延長したが、加齡にともなうカルシウム代謝異常は同様に見られ、カルシウム代謝異常がコンベンショナルという飼育条件によるものでないことが示された。6.カルシウム代謝に関連する腎臓の機能にドパミン受容体が関与していることが明かになってきた。そこで末梢におけるドパミン受容体の分布を明らかにするため凍結切片を用いた受容体解析法を新しく開発し、遺伝子工学により中枢神経系で明らかにされてきたドパミン受容体サブタイプの末梢における分布をまず肺循環で明らかにし報告した。7.一方加齡にともなう別の骨疾患であるリウマチについてもコラーゲン関節炎マウスを作成しその発症機構と病態制御に関する検討をおこなった。
地理・歴史・人からとらえる沖縄の慰霊碑

最終年度の2018年度は現地調査、公開検討会、報告書作成の3つの大きな作業をおこなった。現地調査は、科研メンバー全員(研究協力者含む)が参加して、6月23日の慰霊の日前後に実施することができた。とりわけ糸満市域の慰霊祭、また京都の塔の位置する宜野湾市嘉数区の慰霊祭についての調査をおこなった。こうした成果については現地調査報告書『糸満市』のなかにまとめた。これまで毎年、科研メンバー全体による検討会を実施してきたが、2018年度は6月24日に那覇市立壺屋焼物博物館にて第4回検討会を実施した。今回は、昨年度に引き続き、公開検討会と位置付け、研究メンバーだけの閉じた議論ではなく、関心のある研究者にも科研の途中成果を公開し、意見をもらう機会とした。検討会では、研究メンバー3名によって、宗教者の動向について、地域の葬制について、慰霊空間に用いられる材(モノ)について、といった多様な側面からの報告がなされ、それに関する活発な議論がなされた。また、最終年度であり、これまでの調査成果をまとめる作業をおこなった。研究代表者・分担者・協力者がそれぞれ1編以上の研究論文を仕上げ、それらを取りまとめた報告書『沖縄の宗教・葬送儀礼・戦没者慰霊』を作成した。戦没者慰霊の地域差はもちろん、葬送儀礼との比較のなかで慰霊を検討する視角や、慰霊と宗教との関わりについての視角など、「地理・歴史・人からとらえる沖縄の慰霊碑」という科研タイトルに示されるような、多角的な研究成果をまとめることができた。平成28年度は1戦没者慰霊碑に関する基礎調査の遂行、2慰霊史の通時的理解、3慰霊史の共時的理解の3点について、研究を進めた。科研メンバーの複数名で実施した調査や研究会は次の通りである。6月23日の慰霊の日を含む前後5日間に、科研メンバーのうち、上杉・川瀬・藤本・奥谷・伊集・井口が沖縄で研究会と現地調査を実施し、各研究分担テーマに従って1・2・3に関する調査をおこなった。11月12日には京都府立大学で、すべての科研メンバー(研究協力者含む)による第2回の研究会を実施し(学部生・院生も参加)、浜井と奥谷が個人調査の途中経過について発表をおこない、また6月の現地調査の成果についての報告をすることで、科研の進捗状況や今後の方針についての共有をはかった。科研メンバーの個人で行った調査として、研究代表者の上杉は9月12-14日には座間味村、3月15日には八重瀬町にあるすべての慰霊碑に関して3に関する現地調査をおこなった。また、1に関して、研究協力者の井口、および研究補助者(学部生)の手を借りながら、新聞資料その他の資料調査を実施し、浜井・藤本・奥谷についても、それぞれ沖縄で2・3に関する個人調査を実施した。なお、その際は研究協力者で沖縄在住の伊集・井口の協力を得た。平成28年度の調査成果の一部をまとめたものとして、『八重瀬町』(京都府立大学文学部歴史学科文化遺産学コース、2017)を刊行し、上杉・川瀬・藤本・奥谷が執筆した。また、浜井は人文地理学会地理思想研究部会で調査成果を報告した。応募当初に記した研究計画に沿って、1・2・3それぞれ、調査をすることができた。また、京都市内(京都府立大学)での研究会も、計画通り実施でき、情報の共有を図ることができた。平成29年度は、沖縄本島南部・中部を中心として慰霊碑、慰霊祭の調査をおこなった。沖縄本島南部は沖縄県内でも慰霊碑の集中度が特に高い地域であり、これまでも調査を行ってきた。ただし、南風原町域については十分な知見を得られていなかったため、6月に実施した科研メンバーでの現地調査の中で南風原町域の現地調査をおこなった。すると、2000年代以降、南風原町域の慰霊碑は建て替えや改修といった事業がなされており、慰霊碑は「生きた」存在となっていることが分かった。こうした点は現地調査報告書の中で、上杉が報告した。京都の塔が建立されている沖縄本島中部、宜野湾市嘉数区を対象に、沖縄の地区住民と沖縄県外の遺族団体とのかかわりについて、また訪問者の状況などについて、調査をおこなった。その成果については現地調査報告書の中で研究協力者の奥谷がまとめた。また、外交と慰霊という視点において、浜井が論文を発表した。平成29年度は、6月21日に沖縄県立芸術大学附属研究所にて第3回研究会を実施した。これは公開研究会としたが、21名もの参加者を得た。科研メンバー(代表者・分担者・協力者)のうち5名(上杉・浜井・藤本・井口・伊集)が科研の中間報告をおこない、沖縄県内の研究者をはじめとする関心のある方から貴重な意見を受けることができた。沖縄県内での公開研究会は当初、平成30年度に予定していたが、研究の進展を鑑みて平成29年度に前倒しで実施した。結果として、開かれた場での議論を通じてさらなる進展のための方向性を得ることができたため、研究計画の一部変更は良い方向に作用したといえる。当初は平成30年度に予定していた沖縄県下での公開研究会について、研究の進展状況を鑑み、前倒しして実施することにした。この計画変更は、プラスの方向での変更であり、科研に参加している研究者の個別の研究が予想以上に進展していることを物語っている。

一方で、沖縄県内の慰霊碑の全体像を把握する作業は、着実に進めてはいるものの、想定通りに進展しているとは言えない状況である。これまで地域の中だけで知られており、研究分野には紹介されていなかった慰霊碑も見つかっており、こうした埋もれた慰霊碑をどのように把握するか、平成30年度に改めて検討することにしたい。こうした状況を総合的に判断すれば、おおむね順調だ、ということになるだろう。最終年度の2018年度は現地調査、公開検討会、報告書作成の3つの大きな作業をおこなった。現地調査は、科研メンバー全員(研究協力者含む)が参加して、6月23日の慰霊の日前後に実施することができた。とりわけ糸満市域の慰霊祭、また京都の塔の位置する宜野湾市嘉数区の慰霊祭についての調査をおこなった。こうした成果については現地調査報告書『糸満市』のなかにまとめた。これまで毎年、科研メンバー全体による検討会を実施してきたが、2018年度は6月24日に那覇市立壺屋焼物博物館にて第4回検討会を実施した。今回は、昨年度に引き続き、公開検討会と位置付け、研究メンバーだけの閉じた議論ではなく、関心のある研究者にも科研の途中成果を公開し、意見をもらう機会とした。検討会では、研究メンバー3名によって、宗教者の動向について、地域の葬制について、慰霊空間に用いられる材(モノ)について、といった多様な側面からの報告がなされ、それに関する活発な議論がなされた。また、最終年度であり、これまでの調査成果をまとめる作業をおこなった。研究代表者・分担者・協力者がそれぞれ1編以上の研究論文を仕上げ、それらを取りまとめた報告書『沖縄の宗教・葬送儀礼・戦没者慰霊』を作成した。戦没者慰霊の地域差はもちろん、葬送儀礼との比較のなかで慰霊を検討する視角や、慰霊と宗教との関わりについての視角など、「地理・歴史・人からとらえる沖縄の慰霊碑」という科研タイトルに示されるような、多角的な研究成果をまとめることができた。平成28年11月の研究会の折に出された「沖縄の研究者との意見交換も重要」という意見を重視し、平成30年度に予定していた沖縄でのオープンな研究会を平成29年度に前倒しで実施することにしたい。なお、6月の現地調査時の1日を研究会に充当することで、効率化を図る。平成30年度は本科研の最終年度に当たるため、まとめの1年となる。平成30年度は、現地調査を引き続き実施する一方で、6月に第4回研究会を実施し、これまでの成果を最終確認し、異なる研究分野間を横断するような視点を共有しつつ、慰霊を空間・時間・人といった多様な側面から考えることにする。研究成果については、年度末にとりまとめ、調査報告書として公表する予定である。資料(マイクロフィルム)の電子化作業費が、想定された予算よりも低い金額で収まったため、2,348円の未消化分が生じた。アルバイトを雇い、データ入力作業をしてもらっているが、予定よりも回数が少なくなったこと、また旅費(特に航空券)の変動もあり、若干の未使用額が生じた。未使用額分については、旅費もしくは人件費・謝金で使用することにしている。未使用額は少額であり、その執行による、研究計画の大きな変更は必要ない。本研究においては現地調査が重要となるため、沖縄への調査旅費が重きを占める。調査時にはレンタカーを利用して県内を効率よく調査する予定である。その他、資料の複写や関連する先行研究論文等の調査のための出張旅費、および複写費等を見込んでいる。また、資料のとりまとめの補助として、アルバイトを雇用する予定である。
極長鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症日本人症例の病因解析

極長鎖アシルCoA脱水素酵素(VLCAD)欠損症は、ミトコンドリアβ酸化スパイラルの第一反応を触媒し、長鎖脂肪酸に基質特性を持つ酵素の異常により生じる脂肪酸β酸化異常症の一つである。この疾患は、小児重症型、小児軽症型、そして骨格筋型の3つの臨床病型に分類される。本研究では、日本人のVLCAD欠損患者5症例に関して蛋白質・遺伝子レベルでの解析を行った。臨床病型は骨格筋型3例、小児軽症型1例、そして小児重症型1例であった。イムノブロットでは骨格筋型では薄いバンドを認めたが、小児重症型および軽症型ではバンドを認めなかった。遺伝子レベルでは骨格筋型の3例にそれぞれA416T/R450H、K264E/M437V、そしてA416T/1798del A変異を、小児軽症型では、P89S/IVS16-delAA変異を、そして小児重症型ではE130del/K382Q変異を同定した。小児重症型の変異は2つのアリールともnull変異であった。他の5つのミスセンス変異についての発現実験では、温度感受性を有する残存VLCAD活性を認めた。残存活性はK264E>P89S>A416T>R450H>M437Vの順であり、培養温度30°Cの方が、37°Cより残存活性が増加しており、各々の変異の残存活性の違いに関しても明確に区できた。null変異は残存活性を持たなかった。これらの結果は、null変異の臨床病型は小児重症型になり、点変異、またはフレームシフト変異は小児軽症型ないしは骨格筋型になり得ることを示している。温度感受性を利用した培養細胞を用いた発現実験を行うことによって、遺伝子変異と臨床病型との相関関係をより明確にできることが示された。本研究を通じて、日本人VLCAD欠損症は骨格筋型が欧米に比べて多い傾向があること、遺伝子型と臨床病型とが相関する可能性が高いことが明らかになった。この疾患は、小児重症型、小児軽症型、そして筋型の3つの臨床病型に分類される。臨床病型は筋型3例、小児軽症型1例、そして小児重症型1例であった。イムノブロットでは筋型では薄いバンドを認めたが、小児重症型および軽症型ではバンドを認めなかった。遺伝子レベルでは筋型の3例にそれぞれA416T/R450H、K264E/M437V、そしてA416T/1798delA変異を、小児軽症型では、P89S/IVS16-delAA変異を、そして小児重症型ではE130del/K382Q変異を同定した。残存活性はK264E>P89S>A416T>R450H>M437Vの順であった。これらの結果は、null変異の臨床病型は小児重症型になり、点変異、またはフレームシフト変異は小児軽症型ないしは筋型になり得ることを示している。本研究の結論として、温度感受性を利用した発現実験を行えば、臨床病型と遺伝子型との相関関係を明らかに出来る可能性が示唆された。

温度感受性を利用した培養細胞を用いた発現実験を行うことによって、遺伝子変異と臨床病型との相関関係をより明確にできることが示された。本研究を通じて、日本人VLCAD欠損症は骨格筋型が欧米に比べて多い傾向があること、遺伝子型と臨床病型とが相関する可能性が高いことが明らかになった。
細胞感接着による細胞増殖・分化の制御:ES細胞を用いた実験的アプローチ

(1)モエシン遺伝子のノックアウトラディキシンは、きわめてよく似たエズリン、モエシンとともに、ERMファミリーを形成することが明らかとなった。我々は、それぞれのcDNAを得ることに成功していたので、これらの遺伝子を順次ノックアウトしていくことを始めた。まず、遺伝子がX染色体上にのっていることが分かったモエシンから始め、ノックアウト細胞を3クローン得た。また、ラディキシンのシングルノックアウト細胞も得られつつある。(2)カテニン遺伝子のダブルノックアウトカドヘリン結合蛋白質であるαカテニン。βカテニン両方のcDNA単離しているので、ともにノックアウトを始め、すでにシングルノックアウトに成功した。ダブルノックアウトを目指して、努力を続けている。(3)220kD蛋白質(ZO-1)遺伝子のノックアウトカドヘリンと局在する200kD蛋白質のcDNAが得られ、すでに、シングルノックアウトに成功した。これも、ダブルノックアウトを、目指して努力を続けている。また。必要に応じて、ノックアウトマウスの作製もはじめている。また。
雌性雌雄異株であるノマアザミの雌株維持機構の解明

雌性雌雄異株であるノマアザミC.chikushienseのメス株の維持機構の解明をめざして,本研究では以下のような調査観察がなされ,解析が進行中である.a)食害状況の把握:両性株とメス株のそれぞれで,昆虫による食害の程度を把握し,異性型間にどのような差があるかを明らかにするため,鹿児島県野間岳の自然集団の約300株の頭花を開花期結実期(9月下旬から12月下旬)に採集した.その結果,開花1週間前ほどの頭花に数多くのゾウムシ類の幼虫の生息が確認され,またそれら幼虫の食害によって頭花は致命的なダメ-ジを受けることを確認した.b)食害昆虫の解析:この研究以前のデータでは,メス株頭花にはあまり虫害がみられなかった.そこで今回の研究では,この虫害における性差が昆虫の産卵時の選択によるのか(両性株を選択的に産卵),昆虫成長時の死亡率の差による(メス株による幼虫の成長阻害)のか明らかにしようと試みた.しかし今回の本格的な調査では,虫害における明瞭な性差は検出されず,作業仮説自体の検証には至らなかった.またメス株の進化的維持機構において重要と予想していた両性株だけが備えている花粉を中心に採餌する昆虫類については,その可能性のある昆虫は採集したものの明瞭な花粉採餌を残念ながら確認できなかった.ノマアザミの両性株には強い自家不和合性が生じており,近交弱勢の不利さは両性株にはない.したがって現在のメス株の進化的維持機構は,雄性器官省略によって得られたコストを他の生態的特性へ配分することによって構築されている可能性が高い.したがってメス株の維持機構の解明のためには,今後は虫害における性差ばかりでなく,生活史全般にわたる生長解析などによって性差の検出を試みなければならないであろう.雌性雌雄異株であるノマアザミC.chikushienseのメス株の維持機構の解明をめざして,本研究では以下のような調査観察がなされ,解析が進行中である.a)食害状況の把握:両性株とメス株のそれぞれで,昆虫による食害の程度を把握し,異性型間にどのような差があるかを明らかにするため,鹿児島県野間岳の自然集団の約300株の頭花を開花期結実期(9月下旬から12月下旬)に採集した.その結果,開花1週間前ほどの頭花に数多くのゾウムシ類の幼虫の生息が確認され,またそれら幼虫の食害によって頭花は致命的なダメ-ジを受けることを確認した.b)食害昆虫の解析:この研究以前のデータでは,メス株頭花にはあまり虫害がみられなかった.そこで今回の研究では,この虫害における性差が昆虫の産卵時の選択によるのか(両性株を選択的に産卵),昆虫成長時の死亡率の差による(メス株による幼虫の成長阻害)のか明らかにしようと試みた.しかし今回の本格的な調査では,虫害における明瞭な性差は検出されず,作業仮説自体の検証には至らなかった.またメス株の進化的維持機構において重要と予想していた両性株だけが備えている花粉を中心に採餌する昆虫類については,その可能性のある昆虫は採集したものの明瞭な花粉採餌を残念ながら確認できなかった.ノマアザミの両性株には強い自家不和合性が生じており,近交弱勢の不利さは両性株にはない.したがって現在のメス株の進化的維持機構は,雄性器官省略によって得られたコストを他の生態的特性へ配分することによって構築されている可能性が高い.したがってメス株の維持機構の解明のためには,今後は虫害における性差ばかりでなく,生活史全般にわたる生長解析などによって性差の検出を試みなければならないであろう.
脂質メディエーターを介する皮膚線維化機構の解析とその臨床応用

よりin vivoに近い三次元培養系においても、細胞層中のハイドロキシプロリン量、培養液中の1型コラーゲン量は、いずれもMEA添加により低下していた。以上より、in vivoにおけるMEAの抗線維化作用を明らかになった。次に、in vivoにおけるMEAの抗線維化作用について検討した。はじめに予備実験としてICRマウスの背部に、0.1,1,10%MEA溶液を4週間連日塗布したところ、肉眼的、組織学的に明らかな皮膚障害は見られなかった。ブレオマイシン含有ポリ乳酸マイクロスフェーアーによる皮膚線維化モデルマウスを用いて、MEA(N-methylethanolamine)のin vivoにおける効果を検討した。皮膚線維化モデルマウスにMEA軟膏を3週間外用したところ、コントロールに比べて線維化した真皮の厚さは有意に減少した。また、I型コラーゲンおよびCTGFのmRNA発現はコントロールと比較して有意に減少し、MMP-13のmRNA発現は有意に増加していた。以上より、phospholipase D阻害剤であるMEAの外用が皮膚線維性疾患の改善に有用である可能性が示唆された。1.MEAによるヒト皮膚線維芽細胞におけるI型コラーゲンおよびMMP-1発現制御機構について正常ヒト皮膚線維芽細胞にMEAを添加し、I型コラーゲン及びMMP-1の発現に与える影響について検討したところ、MEAは濃度依存性にI型コラーゲンmRNAおよび蛋白の発現を抑制し、MMP-1mRNAおよび蛋白の発現を亢進することが明らかになった。次に、MEAがいかなるシグナル伝達経路を介してこれらの遺伝子の発現を制御しているかを知るために、各種シグナル伝達経路のリン酸化抗体を用いた検討を行なったところ、MEAはERK, JNKのリン酸化を亢進し、p38MAPK, Aktのリン酸化を抑制すること、SMAD2およびSMAD3のリン酸化には影響を与えないことが明らかになった。更にこれらのシグナル伝達経路の阻害剤を用いた検討の結果、MEAによるMMP-1発現亢進作用はMEK/ERKおよびJNKを介していること、更にp38MAPKおよびP13KのMMP-1発現抑制作用を抑制することにより、MMP-1の発現を増強していることが明らかになった。またMEAによる1型コラーゲン遺伝子発現の抑制にはMEK/ERKが関与していることが明らかになった。2.MEAのアスコルビン酸2リン酸添加三次元培養線維芽細胞中のコラーゲン量の変化についてよりin vivoに近い三次元培養系においても単層培養系同様の抗線維化作用を示すかどうか検討する目的で、細胞層中のハイドロキシプロリン量、培養液中の1型コラーゲン量を測定したところ、ハイドロキシプロジン量、1型コラーゲン量は、いずれもMEA添加により低下していた。3.MEAの表皮細胞及び線維芽細胞の増殖に与える影響についてMEAは線維芽細胞の増殖に対しては用量依存的に促進的に働き、表皮細胞の増殖に対してはやや抑制的に働くことが明らかになった。4.マウス皮膚へのMEA塗布実験ICRマウスの背部に、0.1,1,10%MEA溶液を4週間連日塗布した。いずれの濃度においても、肉眼的、組織学的に明らかな皮膚障害は見られなかった。正常ヒト皮膚線維芽細胞において,N-methylethanolamine (MEA:phospholipase D阻害剤)は,濃度依存性にI型コラーゲンmRNAおよび蛋白の発現とCTGFmRNAの発現を抑制し,MMP-1mRNAおよび蛋白の発現を亢進した。これらのMEAの作用はTGF-βシグナル伝達経路とは独立した経路によるものであることを示し,I型コラーゲン遺伝子発現の抑制はMEK/ERKを介したものであること,MMP-1遺伝子発現の亢進にはMEK/ERKおよびJNKによる正の制御,p38MAPKによる負の制御が関与していることを明らかにした。よりin vivOに近い三次元培養系においても,細胞層中のハイドロキシプロリン量,培養液中の1型コラーゲン量は,いずれもMEA添加により低下していた。以上より,in vivoにおけるMEAの抗線維化作用を明らかになった。次に,in vivoにおけるMEAの抗線維化作用について検討した。

はじめに予備実験としてICRマウスの背部に,0.1,1,10%MEA溶液を4週間連日塗布したところ,肉眼的,組織学的に明らかな皮膚障害は見られなかった。ブレオマイシン含有ポリ乳酸マイクロスフェアーによる皮膚線維化モデルマウスを用いて,MEA(N-methyletlianolamine)のin vivoにおける効果を検討した。皮膚線維化モデルマウスにMEA軟膏を3週間外用したところ,コントロールに比べて線維化した真皮の厚さは有意に減少した。また,I型コラーゲンおよびCTGFのmRNA発現はコントロールと比較して有意に減少し,MMP-13のmRNA発現は有意に増加していた。以上より,phosphohpase D阻害剤であるMEAの外用が皮膚線維性疾患の改善に有用である可能性が示唆された。
双極性障害モデル動物確立のための遺伝子改変動物における行動学的・生理学的検討

双極性障害モデルマウス確立のため作製された脳内mtDNA変異蓄積マウスにおける細胞内Ca^<2+>制御機能を調べた。前年度までに海馬スライス標本を用いてアゴニスト刺激によるIP_3産生を介したCa^<2+>動態を記録した。その結果、mtDNA変異蓄積マウスでは野生型マウスに比べCa^<2+>上昇がおこりにくい傾向があった。mtDNA変異蓄積のオルガネラレベルへの影響を直接的に探索するため、以下の実験系を確立した。mtDNA変異蓄積マウス前脳をホモジナイズし、ショ糖密度勾配法によりミトコンドリア分画を単離した。ミクロセル内にて既知濃度のCa^<2+>液を加え、ミトコンドリアによるCa^<2+>とりこみ能を観察した。ミトコンドリアは膜内外のプロトン濃度勾配を使って駆動するCa^<2+>ユニポーターにより、内膜側へCa^<2+>をとりこむことが知られている。また、そのときの膜電位差の消失に伴ってmPTP開口が引き起こされる。Ca^<2+>とりこみ速度、およびCa^<2+>液のくりかえし投与後に引き起こされるmPTP開口までの必要量を閾値量として測定した。その結果、ミトコンドリアDNAにコードされる蛋白質(Complex I)を含む一連の電子伝達系を動かす基質であるグルタミン酸を用いた場合にはmtDNA変異蓄積マウスで取り込み速度の亢進が観察された。一方、核遺伝子にコードされる蛋白質のみから構成されるComplex IIの基質となるコハク酸を用いて測定したところ、取り込み速度、およびmPTP開口の閾値は野生型と同様であった。なお、膜電位感受性色素JC-1で染色した結果からは変異マウスにおける膜電位低下は認められず、組織標本での活性染色像からも、特にComplex I活性低下は認められなかった。これらのことからmtDNA変異を起因とした神経細胞のCa^<2+>代謝変化は各ミトコンドリアにおけるCa^<2+>とりこみ能亢進によると示唆された。双極性障害モデルマウス確立のため、ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異が脳内特異的に蓄積するトランスジェニックマウスにおける行動学的検討を行なった。オープンフィールドテストを用いた数分間にわたる行動量観察に加え、輪回し行動テストで長期間の行動量変動を観察した。これらのマウスは行動量低下を示し、さらに野生型マウスでは観察されない行動リズム変化を示した。また、このマウスにおけるシナプス伝達、および細胞内Ca^<2+>制御機能を解明することを目的とし、5-8週令のマウス海馬スライス標本を作製し、細胞内Ca^<2+>イメージングと電気生理学的記録を同時に行なう系を確立した。ホールセルパッチクランプ法によりパッチ電極から直接、細胞体に電気的な脱分極パルスを加え、逆行性に活動電位を生じさせることで、細胞内Ca^<2+>上昇を引き起こした。Ca^<2+>感受性色素をパッチ電極から導入し、細胞体だけでなく、樹状突起におけるCa^<2+>動態も同時に記録した。海馬CA1錐体細胞で長期シナプス可塑性を引き起こすことが知られている発火頻度で連続的に活動電位を生じさせたところ、mtDNA変異蓄積マウスでは野生型に比べ、Ca^<2+>反応に違いがあった。また、小胞体、ミトコンドリアの相互作用を観察するため、アゴニスト刺激によるIP_3産生を介したCa^<2+>動態をイメージングする技術を習得した。G蛋白質結合型受容体アゴニスト潅流下に30Hz・20発の活動電位を生じさせると、野生型では1.脱分極による電位依存性Ca^<2+>チャネルからのCa^<2+>流入、2.アゴニスト刺激によるIP_3産生、の相乗効果により、小胞体からの強いCa^<2+>放出を観察できた。mtDNA変異蓄積マウスではこのCa^<2+>放出量が異なる傾向にあった。これらの結果からmtDNA変異蓄積マウスにおいてmtDNA変異を起因とした神経細胞のCa^<2+>代謝変化が示唆された。

その結果、ミトコンドリアDNAにコードされる蛋白質(Complex I)を含む一連の電子伝達系を動かす基質であるグルタミン酸を用いた場合にはmtDNA変異蓄積マウスで取り込み速度の亢進が観察された。一方、核遺伝子にコードされる蛋白質のみから構成されるComplex IIの基質となるコハク酸を用いて測定したところ、取り込み速度、およびmPTP開口の閾値は野生型と同様であった。なお、膜電位感受性色素JC-1で染色した結果からは変異マウスにおける膜電位低下は認められず、組織標本での活性染色像からも、特にComplex I活性低下は認められなかった。これらのことからmtDNA変異を起因とした神経細胞のCa^<2+>代謝変化は各ミトコンドリアにおけるCa^<2+>とりこみ能亢進によると示唆された。
糖蛋白質糖鎖の癌性変化を応用した癌診断法並びに治療法開発の為の基礎的研究

1.ヒト臓器から精製したγ-グルタミルトランスペプチダーゼの糖鎖の解析-先に報告したラット肝臓のγ-グルタミリトランスペプチダーゼの糖鎖の癌性変化を応用した肝癌診断法開発の一環としてヒト諸臓器の同酵素の糖鎖構造の全体像を明らかにする研究を進めた。本年度に解明の終った腎の酵素は個体間で糖鎖構造に差が認められず、X抗原構造を側鎖に持つbisected2,3本鎖複合型を有していた。この構造的特徴はマウス腎のものに酷似しているが、4本鎖やN-アセチルラクトサミン繰り返し構造がない点で後者と異っている。2.癌に異所性に産出されるhcGの糖鎖-HCG,特にそのサブユニットは絨毛癌ばかりでなく様々な癌で異所性に産生されることで注目されている。これら異所性ホルモンの糖鎖構造の解明は我々が現在進めている糖鎖を利用した絨毛癌診断法の開発にとり重要であるばかりでなく、これら非胎盤性heG産生腫瘍の診断法の開発につながる課題でもあるので、アデノカルチノーマ患者および未分化癌患者各1例の尿からhcGα-サブユニットを精製し、その糖鎖を調べた。その結果、共に絨毛癌のhcGには検出されたことの無いシアル酸を含む4本鎖や硫酸残基を持ったアスパラギン結合糖鎖が検出された。3.癌胎児性抗原(CEA)の糖鎖構造-昨年度の研究で我々はCEAがManα1→6(Manα1→3)Manβ1→4GlcNAcβ1→4(IFucα1→6)GlcNAcを母核に持つ極めて複雑な複合型糖鎖を持つことを明らかにした。今年度は更にアグリコン特異性のせまい様々なエキソグリコシダーゼによる消化を組み合わせてその構造の全貌を解明することに成功した。すなわち全糖鎖のおよそ38%はFucα1→2Galβ1→4GlcNAcおよびFucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcを側鎖に持つものであり、30%はGalβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcを側鎖に持つ24本鎖、13%はN-アセチルラクトサミンおよびその繰り返し構造を側鎖に持つ24本鎖であった。
細胞内微細構造インプロセス計測型マイクロ引張試験機の開発と評価

本研究では3年間に亙り細胞を引張った際の内部構造の変化を,張力変化と同時に顕微鏡下に明瞭に観察できる装置の開発を進めた.顕微鏡(BX50WI,オリンパス)下に細胞の両端を細胞接着剤(Cell-Tak)でコートしたガラスマイクロピペット(内径315μm)に吸引・固定し,一端のピペットを電動マニピュレータ(MMS-77,島津製作所)で引張った際の細胞の形状変化を詳細に計測できるようにした.また他端のピペットはカンチレバー型とし,細胞変形に伴う撓み量の変化を光学的に計測することで細胞に加わる力を求めた.画質向上のため正立顕微鏡下で水浸の対物レンズにより観察する系とした.顕微鏡の光軸方向の位置決めには鏡筒上下式のものを用いることで複雑な実験操作を可能ならしめた.Explant法で得た継代67代目の培養ウシ胸大動脈平滑筋細胞(BASM)および酵素法で得たラット胸大動脈平滑筋細胞(RASM)に関し,37°Cの生理的塩類溶液中で引張試験を行えることを確認した.引張速度を変えたBASMの試験結果より,ひずみ速度と細胞の弾性特性との間にはひずみ速度4%/sec以上の領域では有意な相関のあることが明らかとなった.ひずみ速度が0.24%/secの範囲で行ったBASMとRASMの弾性率(公称応力-ひずみ線図より算出)を比較したところ,BASMでは3kPa程度,RASMでは12kPa程度と4倍程度高いことを見いだした.細胞採取方法の違いにより,BASMは収縮タンパクの少ない合成型,RASMは収縮タンパクに富む収縮型のフェノタイプを示していると考えられる.細胞内の収縮タンパク量の違いがこのような弾性特性の違いをもたらした可能性が考えられた.本研究では3年間に亙り細胞を引張った際の内部構造の変化を,張力変化と同時に顕微鏡下に明瞭に観察できる装置の開発を進めた.顕微鏡(BX50WI,オリンパス)下に細胞の両端を細胞接着剤(Cell-Tak)でコートしたガラスマイクロピペット(内径315μm)に吸引・固定し,一端のピペットを電動マニピュレータ(MMS-77,島津製作所)で引張った際の細胞の形状変化を詳細に計測できるようにした.また他端のピペットはカンチレバー型とし,細胞変形に伴う撓み量の変化を光学的に計測することで細胞に加わる力を求めた.画質向上のため正立顕微鏡下で水浸の対物レンズにより観察する系とした.顕微鏡の光軸方向の位置決めには鏡筒上下式のものを用いることで複雑な実験操作を可能ならしめた.Explant法で得た継代67代目の培養ウシ胸大動脈平滑筋細胞(BASM)および酵素法で得たラット胸大動脈平滑筋細胞(RASM)に関し,37°Cの生理的塩類溶液中で引張試験を行えることを確認した.引張速度を変えたBASMの試験結果より,ひずみ速度と細胞の弾性特性との間にはひずみ速度4%/sec以上の領域では有意な相関のあることが明らかとなった.ひずみ速度が0.24%/secの範囲で行ったBASMとRASMの弾性率(公称応力-ひずみ線図より算出)を比較したところ,BASMでは3kPa程度,RASMでは12kPa程度と4倍程度高いことを見いだした.細胞採取方法の違いにより,BASMは収縮タンパクの少ない合成型,RASMは収縮タンパクに富む収縮型のフェノタイプを示していると考えられる.細胞内の収縮タンパク量の違いがこのような弾性特性の違いをもたらした可能性が考えられた.本研究では細胞内構造を細胞が生きたまま染色し,変形を加えた際あるいは能動的に収縮・弛緩する際の内部構造の3次元的変化を,張力変化と同時にレーザ顕微鏡下に詳しく観察できる装置の開発を目指している.初年度である本年度は引張試験機本体の設計と試作,試料把持部の設計,ならびに対象と考えている血管中膜平滑筋細胞の単離方法の確立および染色方法の探索を行う一方,血管平滑筋の収縮特性を血管壁全体の立場から詳細に調べ,本装置で計測されるデータの比較対象となるデータの蓄積を行った.引張試験機本体の設計と試作に関しては,現有する顕微鏡との関係から装置の具体的緒元を決定し,調達した装置部品の基本性能を評価した.試料把持部に関しては,単離した細胞の操作方法を含め,把持方法の詳細を検討中である.また,血管平滑筋の単離に関しては,細切したウシ胸大動脈から遊走してくる中膜平滑筋細胞を集め,染色試験用の細胞を確保した他,ラット胸大動脈をコラゲナーゼならびにエラスターゼで処理し,平滑筋を単離する方法を確立した.しかし,現時点では血管壁内に存在すると予想される全平滑筋数のおおよそ10%程度しか回収されていないため,更なる条件の吟味が必要と考えている.

一方,血管壁全体を用いた平滑筋の収縮特性評価実験からは,平滑筋が生体内長の95%(無負荷状態からの伸び比1.42)付近で最大収縮応力200kPa程度を出すことが見積もられ,これより細胞一つあたりの発生張力はおおよそ20μNと予想された.次年度以降はこれらの結果をもとに引張試験機を完成し,装置の特性の評価および改善を進める予定である.本研究では細胞内構造を細胞が生きたまま染色し,変形を加えた際あるいは能動的に収縮・弛緩する際の内部構造の3次元的変化を,張力変化と同時にレーザ顕微鏡下に詳しく観察できる装置の開発を目指し3年間に亙る研究を進めている.中間年度である本年度は引張試験機本体の組立および評価,試料把持部の設計と試作,ならびに対象と考えている血管中膜平滑筋細胞の単離成績の向上を目指した方法の吟味,生きたままの細胞内微細構造を染色する手法の探索を行った.引張試験機本体の組立と評価に関しては,昨年度基本性能を評価した電動マイクロマニピュレータ等を共焦点正立型レーザ顕微鏡に組み込み,顕微鏡下に細胞をコンピュータ制御で操作できるようにした.また,細胞を酸素加された37°Cの保生液中で観察できるような小型の保温槽を開発した.試料把持部に関しては,マイクロピペットで細胞を保持し,そこに加わる力をマイクロマシンプロセスを応用したカンチレバー型ロードセルで計測することとし,現在,カンチレバーの製造工程の探索を進めているところである.また,血管平滑筋の単離に関しては,前年行ったラット胸大動脈をコラゲナーゼならびにエラスターゼで処理し,平滑筋を単離する方法の収率を向上させるべく,処理条件の吟味を進めている.細胞染色に関してはアクチンフィラメントの超生体染色を目指して染色手法の探索を行っている.次年度以降はこれらの結果をもとに引張試験機を完成し,装置の特性の評価および改善を進める予定である.本研究では3年間に亙り細胞を引張った際,あるいは能動的に収縮・弛緩する際の内部構造の変化を,張力変化と同時に顕微鏡下に詳しく観察できる装置の開発を進めた.研究の最終年度である本年度は,開発した各コンポーネントを組合せて引張試験装置を完成させ,細胞の引張試験を通じて装置の性能評価・改良を行った.共焦点レーザー顕微鏡下に細胞の両端を細胞接着剤(Cell-Tak)でコートしたガラスマイクロピペット(内径315μm)に吸引・固定し、一端のピペットを電動マニピュレータで引張った際の細胞の形状変化を詳細に計測できるようにした.また他端のピペットはカンチレバー型とし,細胞変形に伴う撓み量の変化を光学的に計測することで細胞に加わる力を求めた.画質向上のため正立顕微鏡下で水浸の対物レンズにより観察する系とした.顕微鏡の光軸方向の位置決めには鏡筒上下式のものを用いることで複雑な実験操作を可能ならしめた.Exprant法で得た継代67代目の培養ウシ胸大動脈平滑筋細胞(BASM)および酵素法で得たラット胸大動脈平滑筋細胞(RASM)に関し,37°Cの生理的塩類溶液中で引張試験を行えることを確認した.引張速度を変えたBASMの試験結果より,ひずみ速度と細胞の弾性特性との間にはひずみ速度4%/sec以上の領域では有意な相関のあることが明らかとなった.ひずみ速度が0.24%/secの範囲で行ったBASMとRASMの弾性率(公称応力-ひずみ線図より算出)を比較したところ,BASMでは3kPa程度,RASMでは12kPa程度と4倍程度高いことを見いだした.細胞採取方法の違いにより,BASMは収縮タンパクの少ない合成型,RASMは収縮タンパクに富む収縮型のフェノタイプを示していると考えられる.細胞内の収縮タンパク量の違いがこのような弾性特性の違いをもたらした可能性が考えられた.