hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東南アジアの生物から単離されたペプチド神経毒の合成研究

1.新規イモ貝毒コノトキシンの合成とS-S架橋様式解明2.サソリ毒のS-S架橋様式と立体構造および活性との相関サソリHeterometrus fulvipesから単離されたhefutoxin-1は22残基のアミノ酸から成り、2本のヘリックスが2本のS-S結合により梯子状に架橋されたU字型の立体構造をもっている。折れ曲がり部分のアミノ酸を1残基および2残基欠損したアナローグを合成したところ、天然物と同じS-S架橋様式が保たれていることが明らかとなった。並行していくつかのアミノ酸置換アナローグを合成し、その作用を検討した。同族のサソリ(H.spinifer)から単離されたκ-KTx1.3はhefutoxin-1と配列相同性が高いにもかかわらずKチャネルに対する阻害作用を示さない。アミノ酸置換アナローグの合成により、後者の活性部位であるLys19の隣にある塩基性アミノ酸が、チャネルとの相互作用を妨害していることを明らかにした。1.新規イモ貝毒コノトキシンの合成とS-S架橋様式解明イモ貝(Conus marmoreus)から単離された新規ペプチド毒コノトキシンCMrII、CMrIII、CMrVの合成を行った。14残基のアミノ酸からなりC末端がアミド化されたCMrIIとCMrIIIの合成ではS-S架橋形成反応に高度希釈条件が必要であり、多大な労力を必要とした。一方、16残基のアミノ酸からなるCMrVの合成はスムーズに進行し、高収率で目的物を得た。得られた合成物はHPLCのco-injectionにより天然物と同一であることが確認された。CMrVを用いて部分還元とアルキル化、およびアミノ酸配列分析の組み合わせによるS-S架橋様式解明を試みた。その結果、3本の分子内S-S架橋の中でC3とC6の間に架橋があることが示された。続いてCysの保護基にAcm基とTrt基を使い分ける選択的2段階架橋法による合成物と天然物との比較を行い、C1-C5およびC2-C4の間にS-S架橋があることが示唆された。2.サソリ毒のS-S架橋様式と立体構造および活性との相関アジア産黒サソリ(Heterometrus fulvipes)から単離されたHefutoxin 1の活性増強を目指して活性部位Lys19の近傍にある酸性のGlu16とGlu20を中性のAlaに置換したアナローグを合成した。合成はスムーズに進行し、置換部位はS-S架橋形成に重要ではないことが明らかとなった。得られたアナローグはいずれもKv1.2チャネルに対しては天然物より高い阻害活性を示したが、Kv1.1チャネルに対しては活性が低下した。このことから、16位と20位のアミノ酸はチャネルの選択性に寄与していると考えられた。その他の6カ所の塩基性あるいは酸性アミノ酸残基をAlaに置換したところ、S-S架橋形成はいずれもスムーズに進行した。1.新規イモ貝毒コノトキシンの合成とS-S架橋様式解明イモ貝(Conus marmoreus)から単離された新規ペプチド毒コノトキシンCMrIIのS-S架橋様式解明を試みた。選択的2段階S-S架橋法による合成物と天然物をHPLCでのco-elutionにより比較して、C1-C4、C2-C5およびC3-C6の間にS-S架橋があることを示唆する結果を得た。続いて、ショクコウミナシ貝(Conus amadis)から単離された新規コノトキシンAmIVとAmIXの合成を試みた。AmIVは分子内にωコノトキシン型配置の6残基のCysを有し、C端にHyp残基を持つことが特徴である。AmIXは連続しない6残基のCysを有している。天然物の構造を確認するため、それぞれについてC端がアミドのものとフリーのものを合成したところAmIVはC端がフリーであること、AmIXはC端がアミド化されていることが明らかとなった。2.サソリ毒のS-S架橋様式と立体構造および活性との相関サソリ(Heterometrus fulvipes)から単離されたHefutoxin-1は22残基のアミノ酸から成り、2本のヘリックスが2本のS-S結合により梯子状に架橋されたU字型の立体構造をもっている。折れ曲がり部分のアミノ酸を1残基および2残基欠損したアナローグを合成したところ、S-S架橋形成はスムーズに進行し、酵素分解の結果、天然物と同じS-S架橋様式が保たれていることが明らかとなった。

同族のサソリ(H.spinifer)から単離されたκ-KTx1.3はHefutoxin-1と配列相同性が高いにもかかわらずKチャネルに対する阻害作用を示さない。後者の活性部位であるLys19の隣に前者では塩基性のLys20があることがその原因と予想し、Lys20を中性あるいは酸性のアミノ酸残基で置換したアナローグを合成したところ、阻害活性を示した。
高等植物における硝酸シグナルの伝達と応答の分子機構の解析

今年度は、NREに結合するとして単離したNBPタンパク質のin vivoでの解析を行った。まず、一過的発現系を用いたアッセイにより、NBPはNREに特異的に結合して転写を活性化する能力を持つことを示した。次に転写活性化能を強化したNBPを過剰発現する形質転換体を作出して硝酸誘導性遺伝子の発現を調べたところ、それらの発現レベルが上昇していた。これらのことから、NBPが植物体においてNREに結合して硝酸誘導性遺伝子の転写活性化を行うことが示された。次に、NBPの機能欠損の影響を調べるために、キメラリプレッサー型NBPを構築した。その形質転換体では生長が強く抑制され、硝酸応答性遺伝子の発現量が低下しており、窒素飢餓の際に誘導される遺伝子の発現が上昇していた。以上から、NBPの機能を抑制することで硝酸応答が抑制された結果、窒素飢餓状態になり、生長に影響が出たと考えられた。また、キメラリプレッサー型NBPによって発現が抑制される遺伝子にはアンモニア同化に関わる主要な酵素の遺伝子も含まれており、硝酸シグナルが窒素同化全体を制御していることが示唆された。最後に、硝酸シグナルを受ける領域の決定を行った。NBPのN末端側の機能未知領域をバクテリアのDNA結合タンパク質LexAに融合させた合成転写因子を作成し、これを構成的に発現する形質転換体を作出した。この形質転換体において、硝酸存在下でのみ転写活性化が見られたことから、N末端側の機能未知領域が硝酸応答を制御していることが明らかとなった。以上のことから、NBPが硝酸により転写後修飾を受けて活性化され硝酸誘導性遺伝子の発現を引き起こす因子であること、その機能は植物の生長に重要であることが示された。硝酸応答性を示す亜硝酸還元酵素遺伝子のレポーターラインを用いて、恒常的硝酸応答変異体のスクリーニングを行なった。一次選抜では、硝酸を与えないで育てた状態で、高いレポーター活性を示すもの、つまり、硝酸がない状態でも硝酸があるかのように振る舞う変異体を選抜した。異なる八つのバッチ由来のM2種子を用い、合計13233個体をスクリーニングし、150個体の候補株を得た。M3種子が得られた26系統については二次選抜を行った。その結果、18系統では、硝酸がない状態・ある状態ともに、野生型よりもレポーター活性が高くなっており、硝酸応答が亢進した変異体候補を得ることができた。本年度はまた、亜硝酸還元酵素遺伝子プロモーター上に、硝酸応答を担うシス配列を同定した。まず、亜硝酸還元酵素遺伝子プロモーターの欠失解析を行ない、硝酸応答に必要な領域を翻訳開始点から-189から-334の領域に狭めた。その後、塩基配列の相同性検索を行い、高等植物種の亜硝酸還元酵素遺伝子プロモーター上の保存された回文配列を見出した。この配列(NRE)を4コピーつないだものを最小プロモーター:GUS上流に配置したコンストラクト(4xNRE-min-GUS)を構築してシロイヌナズナの形質転換体を作成した。GUSアセイと定量RT-PCR解析を行い、4xNRE-min-GUSが硝酸応答を示すことを明らかにした。また、NREに変異を入れた場合には、亜硝酸還元酵素遺伝子のプロモーターの硝酸応答が著しく減衰することを示した。以上のことから、この保存配列が硝酸応答を担うシス配列であることが明らかとなった。これは、硝酸応答を担うシス配列の同定に成功した実質的に最初の研究である。昨年度単離した構成的硝酸応答変異体について解析を進めたところ、これらは硝酸を過剰に蓄積する変異体であり、応答機構に異常があるわけではないという結果を得た。そこで、突然変異体の解析は中止し、以降は順調に進んでいるシロイヌナズナの亜硝酸還元酵素遺伝子プロモーターに見出した硝酸応答配列(NRE)の解析とNREに結合する転写因子の同定に集中することとした。シロイヌナズナの亜硝酸還元酵素遺伝子プロモーターのNREに類似した配列が他の高等植物種の亜硝酸還元酵素遺伝子のプロモーターにも存在することから、これらの配列がNREとしての機能を持つかどうか検討を行った。ホウレンソウ、マメ、セイヨウシラカンバ、トウモロコシのNRE類似配列を4コピー、最小プロモーターとGUS遺伝子の前に配置したレポーター遺伝子を構築してシロイヌナズナの形質転換を行った。形質転換シロイヌナズナを用いて硝酸応答を調べたところ、調べた限り、すべてのNRE類似配列由来のレポーターで硝酸応答が見られた。このことから、これらの保存された配列がNREとして機能しうることが示され、高等植物間で硝酸応答機構が共通のものであることが示唆された。さらに、NRE配列に結合する転写因子を同定することを目的として、酵母ワンハイブリッドスクリーニングを行った。その結果、同一の遺伝子ファミリーに属する遺伝子のクローンを複数得ることに成功し、これらをNBP (NRE-binding protein)と命名した。NBPはNREには結合するが硝酸応答を担うことができない変異型NREには結合しないことがゲル移動度シフト法によって確認されたことから、NBPがNREによる硝酸誘導的遺伝子発現を担う転写因子であることが強く示唆された。

次に転写活性化能を強化したNBPを過剰発現する形質転換体を作出して硝酸誘導性遺伝子の発現を調べたところ、それらの発現レベルが上昇していた。これらのことから、NBPが植物体においてNREに結合して硝酸誘導性遺伝子の転写活性化を行うことが示された。次に、NBPの機能欠損の影響を調べるために、キメラリプレッサー型NBPを構築した。その形質転換体では生長が強く抑制され、硝酸応答性遺伝子の発現量が低下しており、窒素飢餓の際に誘導される遺伝子の発現が上昇していた。以上から、NBPの機能を抑制することで硝酸応答が抑制された結果、窒素飢餓状態になり、生長に影響が出たと考えられた。また、キメラリプレッサー型NBPによって発現が抑制される遺伝子にはアンモニア同化に関わる主要な酵素の遺伝子も含まれており、硝酸シグナルが窒素同化全体を制御していることが示唆された。最後に、硝酸シグナルを受ける領域の決定を行った。NBPのN末端側の機能未知領域をバクテリアのDNA結合タンパク質LexAに融合させた合成転写因子を作成し、これを構成的に発現する形質転換体を作出した。この形質転換体において、硝酸存在下でのみ転写活性化が見られたことから、N末端側の機能未知領域が硝酸応答を制御していることが明らかとなった。以上のことから、NBPが硝酸により転写後修飾を受けて活性化され硝酸誘導性遺伝子の発現を引き起こす因子であること、その機能は植物の生長に重要であることが示された。
(11)C-choline PETによる食道癌放射線治療の効果判定

I.[^<11>C]ヨウ化メチル自動合成装置の交換可能なトレイ部分だけを改造し、[^<11>C]メチルトリフレートによるループ標識合成を可能とした。これによる[^<11>C]ラクロプライドと[^<11>C]3NMPBの自動合成法を確立した。II.ネズミ脳で虚血のアセチルコリン代謝に及ぼす効果を、組織切片上の[^<11>C]choline標識率で定量し、acetyl-L-camitine投与が虚血後脳機能障害を改善する可能性を証明した。III.食道がん患者で放射線治療直後にFDG-PETを行って食道局所のトレーサ集積率を計測し、その後のがん局所再発の有無との相関をみた。その結果、1)トレーサ注入後60分に食道がんへの高い集積が確認された2)放射線治療後には腫瘍縮小効果に相関した集積率の低下がみられた3)再発例は無再発例にくらべて集積率の平均値は有意に高く、治療直後のトレーサ集積率で予後推定が可能と考えられたが、両者を厳密に区別する閾値の設定は困難であった。その主たる原因として放射線治療による炎症反応組織へのトレーサ集積による高い偽陽性が考えられた4)腫瘍と炎症への集積を鑑別するためにトレーサ注入後45分と90分の2時点で集積率を計測し、2測定値間の増減と再発の有無を対比検討した。集積率の増加は再発例に多かったが偽陽性が16%にみられた。減少した例で再発はみられなかった。本法によってもPETによる予測と臨床経過とでは乖離がみられた。(11)C-cholineの臨床応用に対する倫理委員会の許諾が未だ得られなかったため、本期間中は1)試薬合成法の改善、2)動物実験による基礎的研究、また、3)FDGによるPETで臨床研究を継続して行った。1)ではSep-Pac[11C]メチレーション法に基づいた11C-choline自動合成法を開発し、臨床応用に耐え得る高い収量率(88%)を達成した。また、[11C]メチルトリフレートを既存の装置に換置してループ標識合成を可能とした。2)ではネズミ脳で虚血のアセチルコリン代謝に及ぼす効果を[11C]choline標識率で定量し、acetyl-L-carnitine投与が虚血後脳機能障害を改善する可能性を証明した。3)では根治的放射線治療を施行した食道進行癌患者で放射線治療終了後3週間以内にFDG-PETを施行した。試薬注射後45分と90分で癌病巣のSUVを計測し、2測定値間の増減とその後の臨床経過を対比検討した。isotope注入45分から90分後にSUVが増加した6症例中5例では早期に再発し、減少した場合には6ヵ月以上の腫瘍制御が得られた。SUV増加がみられても再発しなかった1例では、PET施行時の粘膜炎が他の症例とくらべて高度にみられた。本研究は、放射線性食道炎によるトレーサの集積と腫瘍への集積とを鑑別する方法として考案したものであったが、偽陽性が16%にみられた。FDGをトレーサとしている場合の限界と思われ、新たな腫瘍トレーサによる検討が必要と考えられる。食道扁平上皮がんに対する放射線治療直後の効果判定は二次治療の適応を決定する上で重要である。食道がんが局所に残存しているかどうかを推定する方法としてPETの有用性を検討した。根治的放射線治療または化学放射線療法終了後2週間以内に、トレーサ(18-FFDG)注入後60分に食道主病巣の補正uptake率の最大値(SUVmax)を定量した。I.未治療9例のSUVmaxは平均9.4±4.3と著明に高く本トレーサの集積が確認された。

放射線治療後19例のSUVmaxの平均値は4.0±1.5で未治療例にくらべて有意に低い値であった。II.治療転帰から症例を1年以内に局所再発をきたした再発群11例と1年以上局所無再発が確認された制御群8例に分け、SUVmaxの平均値を比較したところ、再発群は4.9±1.3、制御群は2.7±0.5で制御群で有意に低値であった。この結果からSUVmaxが4以上または4以下で局所再発の予測が可能と考えられたが、SUVmaxが3以下であっても早期に再発する症例がみられたためさらに詳しい検討を行った。III.T3または4の高度進行がん13例でトレーサ注入後45分と90分の2回emission scanを行い、6.5mm間隔の14断面でSUVを定量し、食道縦方向の位置を横軸に45分後と90分後のSUVmaxをプロットした。各プロットを測定時間別に結び、主病巣中心8cm幅のSUVmaxプロフィールを作図した。45分から90分へのプロフィールの変化は以下の3つに分類された。a)90分後に口側、尾側でSUVmaxは低下し、中央では逆に上昇b)両線が平行c)各ポイントで両群に大差なく線が複雑に交差。a型の症例8例中7例は再発群、b型の1例は制御群、c型の4例では再発群2例、制御群2例であった。以上からSUVmaxの2次元的な経時的変化をみることにより、局所制御率が予想される場合があると考えられた。
腟菌叢とメタボローム: クラミジア卵管線維化機構とPID診断バイオマーカーの探索

クラミジア(Chlamydia trachomatis)は、国内外を問わず、主要な性感染症の原因菌である。エネルギーATPを感染細胞に依存するので偏性細胞内寄生性という特徴を持つ。この菌は、性行為を介して腟頸管細胞に感染するが、感染者の大部分は無症候性である。さらに無治療(1年以上)の感染者の約半数は、感染が卵管へと上向性に拡大すると共にPIDを発症し、その20%程度は、線維化により卵管は閉塞し不妊となる。国ごとに罹患率は異なるが、世界的に見るとクラミジア感染者数は、5%程度と推定される。一方、国内の健康女性へのクラミジアの感染率は2.4%程度であるが、特に30歳以下の罹患率が、11.3%と極めて高い。札幌市内の妊婦検診に訪れた280名(平均年齢28.3歳)を対象とした私達の研究でも、感染率は14.3%であった。年間あたりの妊婦数は100万人程度なので(厚生労働省「出生に関する統計」、2010)、クラミジア感染率を10%とすると、本邦におけるクラミジア感染に伴うPID発症者数は、毎年5万人にも達する。その一方で、クラミジアの腟への感染を規定する因子は良く分かっていない。そこで本研究では腟粘膜面でのクラミジア感染を促進する因子を明らかにすることほ目的として、クラミジア感染を助長する腟内因子の探索を行い、クラミジア感染者ではIFNγの作用を減弱させクラミジアの生存を助長する腸管由来のインドールが有意に高値を示すことを発見した。またクラミジア感染細胞のアポトーシス誘導を容易にトレースするためのDEVE配列挿入環状ルシフェラーゼを恒常的に発現する細胞でのカスパーゼ3の活性化測定法の確立し、クラミジアの細胞内増殖後期にカスパーゼ3の活性化を介してアポトーシス誘導が促進されることを突き止めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本邦における健康女性の子宮頸管部へのクラミジア(Chlamydia trachomatis)の感染率は、性的行動が活発な20歳台に限ってみると約10%と極めて高い。多くのケースは無症候性であり、無治療患者の約半数で、卵管へと上向性に感染は拡大し、骨盤内炎症性疾患(PID)を発症する。さらに20%程度で線維化に伴い卵管は閉塞し不妊となる。そこで本研究では、これまでの基盤研究を踏まえ、クラミジア感染に伴う不妊を未然に防ぐことを最終目的とし、クラミジア感染時に線維化を促進する菌側・宿主側因子と腟・尿・唾液からのPID診断バイオマーカーの探索を行うこととした。初年度(平成28年度)は、臨床材料(腟スワブ)からクラミジアの検出を行うと共に腟症の程度をNugent Scoreにて評価した。さらに菌叢解析も実施した。その結果、273検体を精査した結果、21検体でクラミジアが陽性であった。そのscoreと検体中の乳酸菌数との関連性について検討した結果、スコアの上昇と共に乳酸菌数は有意に減少したので、算定されたスコアの妥当性が確認できた。そこでNugent Scoreに沿って3グループに分け、クラミジアの検出頻度との関連性を検討した。しかしながらクラミジアの感染頻度と腟症との関連性は見出せなかった。一方、48検体について菌叢解析を行った。その結果、腟症がほとんど認められなかった検体において、クラミジア陽性検体にて、有意に腸内細菌科のOTU数が増加していることを見つけた。この結果は、腟症が認められない健常者において、肛門経由で膣内にインドール産生性の腸内細菌科が混入することで、クラミジアの生存性が高まることで、感染頻度を押し上げている可能性を示唆している。また線維化を加速する低酸素条件下でのクラミジアの培養系の構築がほぼ完了した。当初の予定通り、腟検体の菌叢解析を行い、クラミジア感染頻度を押し上げると考えられる要因候補を見つけだすことができ、組織の線維化を助長する低酸素状態でのクラミジアの感染・培養系の構築がほぼ完了した。よって「おおむね順調に進展している」とした。そこで本研究では、これまでの基盤研究を踏まえ、クラミジア感染に伴う不妊を未然に防ぐことを最終目的とし、クラミジア感染時に線維化を促進する菌側・宿主側因子と腟・尿・唾液からのPID診断バイオマーカーの探索を行ってきた。本年度は、昨年度の成果を踏まえ行った研究を通して、以下の成果を得た。1.膣スワブ検体の収集:検体総数が626検体に達した。各検体のクラミジアの感染の有無、膣症の程度(Nugent Score)、乳酸菌数(リアルタイムPCR)を決定した。2.低酸素条件下でのクラミジア感染細胞の繊維化に関わる遺伝子の発現変化の網羅的な検討: RT2 Profiler PCRを用いて検討した結果、低酸素環境下(2%O2)では、クラミジア感染に伴い、3つの繊維化

関連遺伝子(CTGF、SERPIN1、JUN)の発現が低下することを見つけた。3.膣検体の菌叢解析と培養:昨年度の検討結果として、48検体について菌叢解析を行い膣症が認められなかった検体において、クラミジア陽性検体にて、有意に腸内細菌科細菌のOTU数が増加していたが、膣検体からの腸内細菌科細菌は培養できなかった。4.インドール検出系の確立:肛門経由で膣内に腸管で腸内細菌科細菌によって産生されたインドールそのものが混入することでクラミジアの生存性が高まると考えられたので、膣検体中のインドール量を測定するための検出系を確立した。以下の3つの成果が新たに得られたので、「おおむね順調に進展している」とした。1.低酸素条件下(2%O2)でのクラミジア感染細胞の繊維化に関わる遺伝子の発現変化の網羅的な検討した結果、クラミジア感染に伴い、3つの繊維化関連遺伝子(CTGF、SERPIN1、JUN)の発現が低下することを見つけた。2.昨年度の検討結果として、48検体について菌叢解析を行い膣症が認められなかった検体において、クラミジア陽性検体にて、有意に腸内細菌科細菌のOTU数が増加していたが、膣検体からの腸内細菌科細菌は培養できなかった。すなわちクラミジア感染者は、肛門経由で腸内細菌科細菌の強いフローがあることを見つけた。3.膣検体中のインドール量を測定するための検出系を確立した。クラミジア(Chlamydia trachomatis)は、国内外を問わず、主要な性感染症の原因菌である。エネルギーATPを感染細胞に依存するので偏性細胞内寄生性という特徴を持つ。この菌は、性行為を介して腟頸管細胞に感染するが、感染者の大部分は無症候性である。さらに無治療(1年以上)の感染者の約半数は、感染が卵管へと上向性に拡大すると共にPIDを発症し、その20%程度は、線維化により卵管は閉塞し不妊となる。国ごとに罹患率は異なるが、世界的に見るとクラミジア感染者数は、5%程度と推定される。一方、国内の健康女性へのクラミジアの感染率は2.4%程度であるが、特に30歳以下の罹患率が、11.3%と極めて高い。札幌市内の妊婦検診に訪れた280名(平均年齢28.3歳)を対象とした私達の研究でも、感染率は14.3%であった。年間あたりの妊婦数は100万人程度なので(厚生労働省「出生に関する統計」、2010)、クラミジア感染率を10%とすると、本邦におけるクラミジア感染に伴うPID発症者数は、毎年5万人にも達する。その一方で、クラミジアの腟への感染を規定する因子は良く分かっていない。そこで本研究では腟粘膜面でのクラミジア感染を促進する因子を明らかにすることほ目的として、クラミジア感染を助長する腟内因子の探索を行い、クラミジア感染者ではIFNγの作用を減弱させクラミジアの生存を助長する腸管由来のインドールが有意に高値を示すことを発見した。またクラミジア感染細胞のアポトーシス誘導を容易にトレースするためのDEVE配列挿入環状ルシフェラーゼを恒常的に発現する細胞でのカスパーゼ3の活性化測定法の確立し、クラミジアの細胞内増殖後期にカスパーゼ3の活性化を介してアポトーシス誘導が促進されることを突き止めた。今後は以下の点についてさらに精査していきたい。1.菌叢解析の結果を踏まえ、実際に腟検体より腸内細菌化細菌を分離同定する。2.低酸素状態でのクラミジアの生存に関わる菌側・宿主側因子を網羅的な解析にて絞り込む3.低酸素状態でのクラミジア感染細胞の動きをGFP発現クラミジアを用いて精査する
発声想像時の脳波を用いたサイレントスピーチインタフェース

本年度は,ブレイン・コンピュータ・インタフェースの基礎研究に関して,これまでの同期型から非同期型への拡張について,昨年度に引き続き取り組んできた.具体的には,脳波からあるメッセージをデコーディングするにあたり,従来の同期型では外部から同期信号をユーザに定時する必要があった.この非同期型では,同期信号を必要としないことが最大の特色であり,昨年来研究してきた結果は,IEEE Transactions on Biomedical Engineering誌に掲載された.また,この結果をベースとして,博士論文を執筆した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,発声想像時の脳波をデコーディングすることにより,四肢の運動を必要としないインタフェース(サイレントスピーチインタフェース)の構築を目的としている.その前段階として,今年度は,脳波を利用したインタフェースのイニシアチブである脳マシンインタフェース(BMI)に関する研究に注力した.まず,BMIと,その類似インタフェースである視線追跡インタフェースについて性能を比較,検討した.その研究結果をまとめた論文を平成28年度中に,Journal of Neural Engineering (2015 Impact Factor = 3.493)に投稿し,年度内に再録が決定した.また,BMIの持つ問題点の1つにキャリブレーションに時間がかかるということが挙げられる.その解決策として,一部のキャリブレーションデータを効率的に変換する手法を提案した.提案手法は信号の周波数スペクトルに着目し,シンプルな信号処理を用いてキャリブレーションデータを変換する.提案手法を用いることによりキャリブレーション時間を大幅に削減しつつ,一定の性能を保つことが可能となった.この研究成果をまとめた論文は,国際会議IEEE ICASSP 2017に採択された.本研究の目的とする,脳波を用いたサイレントスピーチインタフェース(SSI)構築の前段階として,脳マシンインタフェース(BMI)に関する研究に注力した.まとめた研究成果を論文誌Journal of Neural Engineeringに投稿し,また,国際会議IEEE EMBC 2016にて発表した.同時に,同会議において,SSIや発声想像に関する先行研究および研究動向を調査した.それらを参考に,発声想像時の脳活動を測定するための実験パラダイムをデザインした.デザインした実験パラダイムに基づき,発声想像時の脳波を計測・記録するための脳波測定システムを作成した.さらに,発声想像時に脳の聴覚野が活性化することに着目し,音声傾聴時のfMRIデータセットを収集した.fMRIの測定は,順天堂大学脳神経外科の菅野准教授の協力を得て実施した.以上のことから,現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると言える.本研究は,発声想像時の脳波をデコーディングすることにより,四肢の運動を必要としないインタフェース(サイレントスピーチインタフェース)の構築を目的としている.その前段階として,単純な刺激を与えた際の脳波を利用し,非同期性のインタフェースを開発した.具体的には,異なる位相と周波数で点滅する視覚的な刺激を利用し,それに対する脳応答をコマンド入力に利用した.さらに,過去に提案した脳応答識別手法を応用することでユーザのアイドル状態の識別が可能となった.提案した非同期脳コンピュータインタフェースは,先行研究と比較して有意に高い精度を達成した.この研究成果をまとめた論文を平成29年度中に,IEEE Transactions on Biomedical Engineering (Impact Factor 2016 = 3.577)に投稿し,年度内に再録が決定した.また,発声想像という複雑な問題を単純化するため,音,とくにリズムを想像した際の脳波を測定,解析した.視覚的な刺激によりリズム想像のタイミングを被験者に呈示し,3種類のリズムをそれぞれ想像させた.脳波を解析した結果,正準相関分析を利用することでチャンスレベルを超えるリズムの識別率を達成した.これにより,聴覚的な刺激を用いずリズムを想像した場合でも,想像したリズムが周期的な脳応答として観測できることがわかった.この研究成果をまとめた論文をFrontiers in Human Neuroscience (Impact Factor 2016 = 3.634)に投稿し,年度内に採録された.本研究の目的とする脳波を用いたサイレントスピーチインタフェース(SSI)構築の前段階として,脳マシンインタフェース(BMI)に関する研究に注力した.まとめた研究成果を論文誌IEEE Transactions on Biomedical Engineeringに投稿した.また,国際会議IEEE EMBC 2017にて関連研究成果を発表すると同時に,同会議において,SSIや発声想像に関する先行研究および研究動向を調査した.それらを参考に,発声想像時の脳応答を頭蓋内脳波として計測するためのシステムを,順天堂大学医学部と連携して構築を開始した.てんかん患者の方の頭蓋内に埋め込んだ電極を用いることで貴重な頭蓋内脳波を計測することができる.このシステムは,昨年度に構築した頭皮上脳波の測定システムを発展させたものである.以上のことから,現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると言える.本年度は,ブレイン・コンピュータ・インタフェースの基礎研究に関して,これまでの同期型から非同期型への拡張について,昨年度に引き続き取り組んできた.具体的には,脳波からあるメッセージをデコーディングするにあたり,従来の同期型では外部から同期信号をユーザに定時する必要があった.

この非同期型では,同期信号を必要としないことが最大の特色であり,昨年来研究してきた結果は,IEEE Transactions on Biomedical Engineering誌に掲載された.また,この結果をベースとして,博士論文を執筆した.昨年度に設計した実験パラダイムに基づき,作成した脳波測定システムを用いて,発声想像時の脳活動解析のためのデータセットを作成する.被験者を15名ほど募り,東京農工大学研究倫理委員会の承認に基づいてインフォームドコンセントを得る.ここではまず,問題を単純化するため,母音などの単純な発声想像時の脳活動を記録する.記録したデータセットをもとに,多次元配列信号処理を用いたアプローチや,その他の周波数解析,パターン認識を用いて,発声想像時の脳活動の特徴を解析する.順天堂大学医学部と連携して頭蓋内脳波測定システムの構築,および,実験パラダイムの確率をはか.頭蓋内脳波の計測には,手術のため頭蓋内に電極を埋め込んだてんかん患者の方に協力してもらう予定である.被験者を15名ほど募り,東京農工大学研究倫理委員会および順天堂大学研究倫理委員会の承認に基づいてインフォームドコンセントを得る.最終年度初旬に実験データを取得し,中旬にデータを解析する予定である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
渡り鳥を介した抗生物質耐性菌の拡散メカニズム

危害微生物の越境移動に関する現状の把握は、健康・衛生上の観点から火急に行われるべき課題の一つである。シベリアや東南アジア、オセアニアに存在する種々の抗生物質耐性菌および耐性遺伝子が渡り鳥の腸内に濃縮され、渡り鳥とともに越境移動し、その生息環境に拡散していることが示唆されている。本研究では、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム手法と培養法を併用して、渡り鳥の糞に含まれる耐性菌の群集構造の経時的変化を調査する。同時に糞内容物についてメタバーコーディングを行うことで食性の経時的変化を調べ、日本滞在中の耐性菌群集構造と食性との関連を解析する。平成30年度は、冬季に大阪府北部に飛来したカモ科、夏季に北海道で繁殖し冬季に本州以南に飛来するカモメ科の渡り鳥を主な対象として、糞に含まれる細菌群集を解析した。以下の知見が得られた。1)ヒドリガモヒドリガモの腸内細菌の16S rRNA遺伝子のV4領域をPCR法で増幅し、次世代シーケンサーを用いて、網羅的に解析した。その結果、日本に飛来した12月から4月の間に、Clostridiaが減少し、Gammaproteobacteriaが増加した。また12月から4月の間に、コリスチン耐性の大腸菌や大腸菌群が経時的に減少した。これらのことよりコリスチン耐性菌が長距離移動していることが示唆された。2)カモメカモメの腸内細菌の16S rRNA遺伝子のV4領域をPCR法で増幅し、次世代シーケンサーを用いて、網羅的に解析した。その結果、綱レベルではGammaproteobacteriaが大部分を占め、主要な科としてはEnterobacteriaceaeが大部分を占めた。また、カモメの糞には半数以上で、コリスチン耐性大腸菌が存在し、10,000 CFU/g以上含まれる試料が多いことがわかった。当初の予定通り、1糞に含まれる細菌の現存量測定および群集構造解析、2糞に含まれる抗生物質耐性菌の現存量および種類の解析を行った。同種の鳥の個体間の違い、鳥の種間での違いについて知見を得ることができた。令和元年度以降の研究計画につながるノウハウを蓄積することができた。平成30年度に行ったフィールドでの結果をもとに、飛来する渡り鳥の腸内細菌の年度毎の違いや、地域間での違いについて研究を進める。11月3月にかけてカモ科、カモメ科を主な対象として糞を採取し、以下の検討を行う。1抗生物質耐性菌の現存量、種類、遺伝子型を解析する。2糞の内容物(食した餌)のミトコンドリアDNAのCOI遺伝子、葉緑体DNAのrbcL遺伝子を標的として、次世代シーケンサーを用いて、餌の種類の網羅的同定を行う。3糞に含まれる細菌群集の網羅的を行う。41で得られた特徴的な耐性菌について、接合伝達実験を行い、他の細菌への耐性遺伝子の伝達頻度を検討する。5得られたデータをもとに、渡り鳥の飛来にともなう細菌の移動量、細菌の属種について、鳥の種間での違い、同種の鳥の個体間での違い、同種の鳥の年度毎・地域間での違いについて検証する。GPSを用いた鳥の種類と飛行ルートなどの既知データと照合して、上記の研究結果を考察する。

同種の鳥の個体間の違い、鳥の種間での違いについて知見を得ることができた。令和元年度以降の研究計画につながるノウハウを蓄積することができた。平成30年度に行ったフィールドでの結果をもとに、飛来する渡り鳥の腸内細菌の年度毎の違いや、地域間での違いについて研究を進める。11月3月にかけてカモ科、カモメ科を主な対象として糞を採取し、以下の検討を行う。1抗生物質耐性菌の現存量、種類、遺伝子型を解析する。2糞の内容物(食した餌)のミトコンドリアDNAのCOI遺伝子、葉緑体DNAのrbcL遺伝子を標的として、次世代シーケンサーを用いて、餌の種類の網羅的同定を行う。3糞に含まれる細菌群集の網羅的を行う。41で得られた特徴的な耐性菌について、接合伝達実験を行い、他の細菌への耐性遺伝子の伝達頻度を検討する。5得られたデータをもとに、渡り鳥の飛来にともなう細菌の移動量、細菌の属種について、鳥の種間での違い、同種の鳥の個体間での違い、同種の鳥の年度毎・地域間での違いについて検証する。GPSを用いた鳥の種類と飛行ルートなどの既知データと照合して、上記の研究結果を考察する。H30年度は次世代シーケンス解析を効率的に進めることができ、その費用を他の予算でまかなうことができたため、当初予定より低価格となった。次年度は餌性の解析のため、次世代シーケンス解析の費用を増やして研究を進める。
フォトクロミック分子をペプチド主鎖骨格に導入した半人工蛋白質の構築と光制御

本年度は、蛋白質主鎖エンジニアリングを目的に掲げ、前年度確立したペプチド再結合法を用いて、非天然骨格をRNase Aループ領域に導入することに成功した。具体的に導入した非天然骨格としては、トリ及びテトラエチレングリコールとアゾベンゼンである。これらでループ領域を置換した半人工RNase Aは、天然型とほぼ同様のRNA切断活性や構造安定性を有することを示した。また、そこから獲得可能な機能として、トリ及びテトラエチレングリコール型ではプロテアーゼ耐性を向上させることが可能となった。これまで、天然の酵素活性を全く低下させることなく、プロテアーゼ耐性のみを向上させた例は報告されておらず、ここで示したアプローチは新たな蛋白質設計の指針になるものと期待できる。また、剛直且つ光応答特性を有するアゾベンゼンを導入した半人工RNase Aに関してもRNAループ領域の構造模倣体として許容されることが明らかとなった。このアゾベンゼン修飾半人工RNase Aに関して種々の分光学的測定を行った結果、トランス定常状態からシス定常状態へ異性化することでアゾベンゼン部位の局所的な構造変化がペプチド主鎖骨格を伝播し、RNase A高次構造を不安定化することが示された。また、この構造変化は酵素活性にも厳密に連動しており、異性化により活性を低下させることに成功した。これらの研究成果は、これまでにほとんど報告されておらず、蛋白質主鎖エンジニアリングという未踏の手法を提案することができたものと考えている。
PAF拮抗活性を有する海産ジテルペノイドPhomactinの合成研究

Phomactin類は、福井県沖で採集されたズワイガニの甲殻から分離された不完全菌Phoma sp.より単離構造決定されたジテルペノイドで強力なPAF拮抗作用を示す一連の化合物である。Phomactin類は、現在まで9種知られているが、とりわけPAF拮抗作用が強いPhomactin Dを標的化合物に選びその効果的合成法の開発を目的に本研究を行い以下の結果を得た。1.L-アスコルビン酸より合成したα,β-不飽和エステルとシクロヘキセノンとの連続Michael反応により立体選択的にビシクロ[2.2.2]オクタン誘導体を合成し、その位置選択的な炭素-炭素結合の切断反応を行い、Phomactin Dのシクロヘキサン部の立体化学の整った五置換シクロヘキサン誘導体を得ることに成功した。2.4-ペンチン-1-オールよりWittig反応等を行うことによりPhomactin Dの鎖状部分に相当するビニルヨ-ダイドを合成した。3.1で合成した五置換シクロヘキサン誘導体と2で合成したビニルヨ-ダイドを結合することにより分子内にスルホンとアリルクロリドを有する12員環環化前駆体の合成を行った。4.3で合成した環化前駆体にKHMDSを作用させることによりPhomactin Dの炭素骨格の整った重要合成中間体の合成に成功した。4で合成した重要合成中間体からPhomactin Dまでは、官能基の変換等の数工程を残すのみであり、現在それを検討中である。
転動球による車体の支持及び走行に関する基礎研究

3本の駆動ロ-ラを大きな球の上部同緯度に互いに120°に配置し接触させ、摩擦伝動により球を転動させ、かつ車体を支持するという構想を検証した。ベルトコンベア用のギヤ-ド・モ-タ内蔵ロ-ラ(周速度5m/s、直径28mm)3本とバスケット・ボ-ルを用いて駆動ユニットを製作し、同ユニットを揺動腕に取り付け定置とし、ピンポン球を多数敷詰めた上に置いたにボ-ルを乗せ板を動かすという実験装置を製作し検証実験を行った。得た成果は以下のようである。1.軌跡を、原点を通る直線で回帰し、その傾きでもって目標方向からのずれとし、回帰直線から軌跡までの距離の標準偏差でもって蛇行の大きさとして、直進性を評価した。その結果は視察による評点結果をよく定量的に表している。2.転動に方向性がある。すなわち、互いに120°に配置されているロ-ラの1つが転動方向と直角に他の2つが斜めになるので、ボ-ルが2つの斜めのロ-ラに巻き込まれるように転動するときは直進性が良いが摩擦伝動が不安定になる。3.ボ-ルの緯度が高くなるほど、目標方向からのずれが大きくなる。なお、蛇行の大きさにはあくまり影響しない。4.斜めになるロ-ラ周速度の転動方向成分と、直角になるロ-ラ接触点での速度すなわち同ロ-ラの周速度との比は幾何的に求められる。その比は、緯度が45°のとき1.35である。この比のところで蛇行はもっとも小さくなる。5.斜めになる各ロ-ラ接触状態の違いが生じたとき、目標方向からのずれが大きくなるが、接触状態の違いが交番するとき蛇行が大きくなる。ロ-ラの回転速度制御が必要である。6.駆動ユニット3基からなる走行装置を製作し、検証実験を行い、今後も計画を進めていく見通しを得た。転動球による車体の支持・推進システムを実現する1方法としての球転動システムの構成及び車体の支持・推進・かじ取りシステムの構想を実現するべく、転動ユニットの構造変数とパラメ-タを検証実験用ユニットを用いて試験・考察し、さらに球と土の相互作用のうち自由転動の場合について実験・考察した。その構想は、まず転動ユニットにおいては、球の上半球同緯度に配置した3個の駆動円筒の回転方向を組合わせることにより、球を任意の方向に転動せしめ、さらにユニット3基でもって車体を支持・推進し、各球の転動方向を組み合わせることにより車体のかじ取り・旋回をするものである。転動ユニットの構成変数として駆動円筒の被覆材料、球との接触位置(緯度)が、パラメ-タとして球の空気圧及び駆動円筒間の回転速度比がとった。観察により決定された良好な転動をなす変数の組合わせにおいて、各パラメ-タの組合わせについて転動の直進性を、軌跡の標準偏差でもって評価した結果、進行方向前方の駆動円筒より後方のふたつの回転速度を0.5%高くしたものがいずれの空気圧についても良好であることが明らかになった。自由転動する球と土の相互作用を、土壌槽を用いて軸付き中実ウレタン球に働く垂直・水平反力及び沈下量を計測することによって研究した。そして、締固め度と転動抵抗及び沈下量の関係が、垂直荷重と球のウレタン硬度(ウレタン硬度が70と40の2種類)をパラメ-タとして明らかにした。

転動抵抗は、土壌硬度6kg/cm^2以上での一般不整地における範囲では、硬度が増加しても顕著な増加がみられず、ほぼ一定とみなしうる。ウレタンの硬いものはほとんど剛体に近く、剛体平面上では柔らかいものより転動抵抗は小さいが、土壌上とくに上記硬度以下において大きくなった。球を転動させ車体を支持推進する構想の検証実験を、本補助費の交付を受けた年度を含め3年間にわたり行ってきた。その構想は、3本の駆動ロ-ラを大きな球の上部同緯度に互いに120°に配置し接触させ、摩擦伝動により球を転動させ、かつ車体を支持するというものである。「かじ取り装置から“積分要素"をなくすとすればどのような機構が考えられるか」という命題に対するひとつの解として本課題は位置付けられよう。1.ベルトコンベア用のギヤ-ド・モ-タ内蔵ロ-ラ(周速度5m/s、直径28mm)3本とバスケット・ボ-ルを用いて駆動ユニットを製作し、同ユニットを揺動腕に取り付け定置とし、ピンポン球を多数敷詰めた上に置いたボ-ルを乗せ板を動かすようにして、転動性を調べた。板の上にカ-ボン紙を張り付けた上に白紙を敷き、ボ-ルの圧痕を付け軌跡を記録した。2.軌跡を、原点を通る直線で回帰し、その傾きでもって目標方向からのずれとし、回帰直線から軌跡までの距離の標準偏差でもって蛇行の大きさとして、直進性を評価した。3.結果、1)転動方向とロ-ラの位置関係により、転動に方向性がある。2)ロ-ラの緯度は蛇行の大きさに影響せず緯度が高くなるほど目標方向からのずれが大きくなる。3)転動方向と斜めになるロ-ラの回転速度は、直角になるロ-ラのそれより高く設定され、緯度が45°のとき、その比は1.35である。この比のところで蛇行もっとも小さくなる。4.駆動ユニット3基からなる走行装置を製作し、室内の床、草の生えている不整地及びロ-タリ耕後約1か月の畑地において、走行を確認した。5.今後、走行装置による検証実験を2年計画で進めていく予定である。
LDA+U法によるf電子系化合物の電子構造の理論的研究

本研究の目的は、現行のFLAPW法の計算プログラムをLDA+U法に使える様に変更を加え、これを用いて一電子基歳状態において強いクーロン相互作用の効果が顕著に現れていると予想されているf電子化合物等の主に非磁性の四極子秩序状態や一重項基底状態にある系の電子構造を計算し、dHvA効果や光電子分光などの実験と詳細に比較することにより、クーロン相互作用の役割を明らかにすることにある。3年間の研究において、スピン軌道相互作用がある場合にもLDA+U法を用いる事ができる様にLDA+U法を一般化された形式に拡張し、さらに密度行列を自己無撞着に計算できるようにプログラムに変更を加えた。実際に一重項基底状態を出発点としてPr金属、SmB_6、UPd_3、PrRu_4P_<12>などで計算を行った。また、CeRu_2Si_2、UAl_3、YbB_<12>などでは、非磁性状態にもかかわらず、f電子の電荷分布が大きな異方性を持った状態が安定な解として存在することを示した。また、PrPb_3の反強四重極秩序状態の予備計算を行い、本研究で新しく開発したLDA+U法が四重極秩序状態を記述できる事を示した。本研究の目的は、現行のFLAPW法の計算プログラムをLDA_+U法に使える様に変更を加え、これを用いて一電子基底状態において強いクーロン相互作用の効果が顕著に現れていると予想されているf電子化合物等の主に非磁性の四極子秩序状態や一重項基底状態にある系の電子構造を計算し、dHvA効果や光電子分光などの実験と詳細に比較することにより、クーロン相互作用の役割を明らかにすることにある。本年度は高速大容量のワークステーションを購入し、FLAPW法の計算プログラムの移植及びLDA_+U法の予備計算を行った。一方でLDA_+U法の効果を吟味するためにLDAの範囲内で研究も並行して行った。具体的にはYCo2、YbPb3、YbSb2、Yb4As3、LaNi2A15、CeNi2A15、YbIn3、LuIn3、YIn3、LuB12等の一連の化合物の電子状態とフェルミ面を求め、実験と詳細に比較した。これらの研究の結果、直方晶の結晶構造を持つ化合物やf電子を閉殻として持つ化合物においては、LDAはかなりよく実験を再現することが明らかになった。これらの研究結果はすでに投稿あるいは出版されている。LDA_+U法を適用するプログラムについては、原子状態に対してスピン軌道相互作用の基底状態を用いた方法のプログラムを試作して、PrやSmなどの非磁性の基底状態を持つ原子に対して計算を実行した。ただし、これはUの効果が顕著に現れるように簡便化した方法であり、密度行列を用いる一般化された方法のプログラムは現在開発中である。現実の物質の基底状態は結晶場で分離しているため、この効果も加えた原子状態での計算を経て、固体へ適用する予定である。本研究の目的は、現行のFLAPW法の計算プログラムをLDA+U法に使える様に変更を加え、これを用いて一電子基底状態において強いクローン相互作用の効果が顕著に現れていると予想されているf電子化合物等の主に非磁性の四極子秩序状態や一重項基底状態にある系の電子構造を計算し、dHvA効果や光電子分光などの実験と詳細に比較することにより、クローン相互作用の役割を明らかにすることにある。本年度において、LDA+U法の中で密度行列を用いる一般化された方法をスピン軌道相互作用の強い状態へ適用出来るように拡張した。この時、非磁性状態においてもスピン密度行列を用い、かつ、スピンに対する非対角成分を考慮する必要がある事を示した。さらに、この方法を現行のFLAPWの計算プログラムに導入し、実際にSmB6とUPd3に対する電子構造計画を行い、どちらも非磁性局在f電子状態をよく記述出来る事を示した。ただし、現行の方法をUをパラメータとしており、また、密度行列に関して自己無撞着な計算にはなっていない。

今後、自己無道着な計算が出来るようにプログラムを改良し、Pr化合物などの一重項基底状態や、Ce化合物の四極子秩序状態の計算を行う予定である。本研究の目的は、現行のFLAPW法の計算プログラムをLDA+U法に使える様に変更を加え、これを用いて一電子基底状態において強いクーロン相互作用の効果が顕著に現れていると予想されているf電子化合物等の主に非磁性の四極子秩序状態や一重項基底状態にある系の電子構造を計算し、dHvA効果や光電子分光などの実験と詳細に比較することにより、クーロン相互作用の役割を明らかにすることにある。本年度は、前年度までに開発したスピン軌道相互作用がある場合に一般化されたLDA+U法を密度行列を自己無撞着に計算できるように拡張した。実際に一重項基底状態を出発点としてPrRu4P12などで計算を行った。また、CeRu2Si2、UA13、YbB12などでは、非磁性状態にもかかわらず、f電子の電荷分布が大きな異方性を持った状態が安定な解として存在することを示した。また、PrPb3の反強四重極秩序状態の予備計算を行い、本研究で新しく開発したLDA+U法が四重極秩序状態を記述できる事を示した。
法科大学院教育を射程とした分散協調型マルチメディア教育システムの開発

司法制度改革の一環として論議されてきた、法曹養成制度改革の一つの柱である法学教育について、2001年6月12日に司法制度改革審議会の意見書が政府に提出され、2004年から法科大学院を開設する運びとなった。こうした、従来にない教育目的を実現するためには、教育内容のみならず教育方法の革新も必須である。その点の配慮に欠くため、わが国の高等教育史における画期的な構想である法科大学院の理念を制約することがあってはならないのである。本研究は、そうした問題意識から着手したものである。実績は以下のとおり。1米国法学教育とマルチメディア教育技術2.法科大学院のための教育システム2.1法科大学院教育に求められる教育システム2.2教授補助システム2.2.1遠隔授業システム2.2.2授業拡張システム2.3自習システム2.3.1授業補助的な自習システム司法制度改革の一環として論議されてきた、法曹養成制度改革の一つの柱である法学教育について、2001年6月12日に司法制度改革審議会の意見書が政府に提出され、2004年から法科大学院を開設する運びとなった。実績は以下のとおり。1米国法学教育とマルチメディア教育技術2.法科大学院のための教育システム2.1法科大学院教育に求められる教育システム2.2教授補助システム2.2.1遠隔授業システム2.2.2授業拡張システム2.3自習システム2.3.1授業補助的な自習システム
大腸癌発癌pathwayから検証した大腸癌前癌病変の非侵襲的血清診断法の確立

本研究に関してはすでに発癌過程にて特異的に発現し、さらに血清中に分泌するものを複数個同定している。それらに関しても他施設で集めた血清を用いて検証実験を開始している。選択したmiRNAsの中で、miR-1290は大腸癌患者において血清中で発現が有意に高くなり、早期診断の可能性を示唆したほか、予後予測を可能とする予後マーカーとしても有用であること、また組織におけるmiR-1290発現が、癌進展機序に深く関与することを報告した。さらに他のmiRNAsに関しても、血清中と血清エキソソーム中におけるmiRNA発現レベルを同一患者血清で評価し、miRNA特異的に血清ならびに血清エキソソーム分画において発現変化が起こり、いずれも大腸腺腫検出において有用な早期診断マーカーとなり得ることを報告した。本研究に付随して早期診断のみならず、遠隔転移進展を診断できるmiR-203を同定し、さらにこのmiRNAは血中濃度を測定すると遠隔転移診断のみならず、サルコペニアを診断可能となることを明らかにしたほか、さらにmiR-203は骨格筋細胞をSurvivinを介してアポトーシスに誘導することを報告した。またさらに血清中エキソソーム分画に存在するmiRNAs発現を網羅的に解析するうえで、癌細胞より特異的に分泌されるエキソソームに着目し、大腸癌細胞ならびに正常上皮細胞より分泌されたエキソソームの抽出をおこない、網羅的蛋白プロファイリングを施行した。その結果、80を超える蛋白を癌細胞より分泌されたエキソソーム特異的に発現上昇を示すことが確認され、これらのなかで6つの蛋白が、パブリックデータベースを用いた解析においても大腸癌組織特異的に発現増加を示すことが判明した。しかしながら、エキソーム表出蛋白を標的とした測定法をELISA法の変法でこころみたが、その蛋白量が極めて少ないことからその測定系には相当量の血清がないと検出限界以下となることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究は1複数の大腸癌発癌過程(前癌病変から癌病変)特異的microRNAsを網羅的解析し、分泌されたそれらのmicroRNAsが血清で検出できるか否かを検証することで、あらゆる癌発生過程を踏まえた散発性大腸癌の血清早期診断マーカーを同定すること。2多施設共同研究にて集積中の内視鏡施行前の患者血清を用いた前向き検証試験を行い、同定したmicroRNAsの診断マーカーとしての精度検定を行うこと。3施設、手技、試薬に影響を受ける血清microRNAsの相対的定量法は実用化の上には障害であり、これに代わる絶対的定量法(コピー数)を確立し、血清中microRNAsの基準値を作成することにある。現在のところ、Adenoma carcinoma sequenceの発癌過程で、血清microRNAsの網羅的解析を行い、複数のmicroRNAsが大腸腺腫患者、大腸癌患者の血清で発現が高値のものを同定してきている。さらに、他施設共同研究により、前向きに2000症例を超える血清を集積し終えたところである。本研究は1大腸癌発癌過程(前癌病変から癌病変)にて特異的に発現するmicroRNAsを網羅的に解析し、分泌されたそれらのmicroRNAsが血清で検出できるか否かを検証することで、この癌発生過程を踏まえた散発性大腸癌の血清早期診断マーカーを同定することである。2他施設共同研究にて集積終了した内視鏡施行前の患者血清を用いた前向き検証試験を行い、同定したmicroRNAsの診断マーカーとしての制度検定を行うことである。1に関しては、すでに発癌過程にて特異的に発現し、さらに血清中に分泌するものを複数個同定している。それらに関して他施設で集めた血清を用いて、検証実験を開始している。選択したmicroRNAsの中で、前癌病変である大腸腺腫患者においても血清中で発現が有意に高くなっており、早期診断の可能性を示唆した結果となっており、現在論文投稿中である。さらに他のmicroRNAに関しては今まで報告されていないものであり、組織中での発現、その患者の血清での発現、さらにそのmicroRNAの機能解析に関しても現在試行中である。今後は、血清中のエクソソームに包埋されているmicroRNAsの発現を網羅的に解析する予定であるが、癌特異的に分泌されるエクソソームに着目するために、上皮特異的膜蛋白ならびに大腸癌特異的膜蛋白の同定後、それらを用いてエクソソームを分離し、大腸癌特異的エクソソーム並びにそれに包埋されている大腸癌由来の遺伝子情報を用いたliquid biopsyの確立を目指す。現在のところ大腸癌発癌過程において組織中、並びに血清中で発現が変化するmicroRNAsを網羅的に解析し、複数のmicroRNAsを集積した2000症例の血清を用いて検証実験している。すでに複数の既知のmicroRNAsが前癌病変である大腸腺腫患者の血清診断マーカーとして証明でき、論文作成している。さらに未知のmicroRNAに関しては正常、腺腫、癌組織中での発現、そしてその患者の血清での発現、さらにそのmicroRNAの機能解析に関しても現在試行中である。本研究は1大腸癌発癌過程(前癌病変から癌病変)にて特異的に発現するmicroRNAを網羅的に解析し、分泌されたそれらのmiRNAsが血清で検出できるか否かを検証することで、この癌発生過程を踏まえた散発性大腸癌の血清早期診断マーカーを同定することである。