hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
工芸の展開―金属工芸鋳金における真土型鋳造法の研究―

最終年度は、大型原型のブロンズ鋳物の制作方法の展開を実施した。平成29年7月、制作した中型原形の真土型に関する技法検討の結果、当初の予想に反し、中型原形の技法検討だけでは、真土込型の技法の全容を把握することができず、研究目的である真土込型鋳造法の多面的アーカイブ化を達成できないことがわかり、研究遂行上、大型原形の真土込型に関する技法検討が不可欠であることから、追加で大型原形の真土込型を制作する必要が生じた。大型原型の人物像を目的対象としてその分割方法、分割手段、その後の溶接による完成形までの工程を確認し実施した。対象の人物像は、等身の坐像で椅子に腰掛け手前で両手を合わせている形であるが、分割するにあたって、それぞれの鋳型の大きさ、重要な形態(顔や手等)の配置、鋳造品が歪まない位置どり等を考慮し分割した。また、それに伴った寄せ型も多種にわたった。特に浮いた状態の手の部分は、窓寄せの型を取り、中子を入れる工夫をして実施した。結果としては概ね良好な鋳造物を完成させることができた。特にそれぞれの分割された鋳造物を合わせて溶接する際には、それぞれの分割面がほとんどずれることもなく、溶接は順調に展開できた。ここでは分割の方法が適切であったこともあるが真土込型の歪みの少ない精度のある鋳物を確認できた。また、中子の取りにくい部分で肉厚が厚くなった部分でも、ブロンズの引けによる収縮はほとんど起きず、鋳型の吸収力の優れた点を確認できた。全体的に大型の原型に対した方が真土込型は適性があることを実感できた。ただし、技法的には難易度が高いことは変わらないため、熟練者の指導を仰いで実施したことや、大型の鋳型になればなるほど人的仕事量は大きくなり、困難な場面も多く、鋳造の大変さを改めて実感した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。27年度初年度は、基礎研究として東京藝術大学に保管されている資料や、他大学、外部機関から鋳造に関する文献を元に研究を展開した。また、国内で真土型鋳造の鋳型が発掘されて保存されているものの状況調査、現物調査を実施した。真土を用いて現在制作している鋳造所の調査も行ったが、現在は廃業しているところも多く、その廃業した鋳造所の内容を把握するための調査も行った。国外においては、中国の安陽の殷墟、西安の周原等において、保存されているそれぞれの時代の鋳型の現物調査を行った。また、青銅器の現物調査も同時に実施し鋳造法について考察した。真土型による実制作においては、前半は遅れがちであったが、後半に中型鋳型の多種展開や、蝋型も含めて平滑な鋳造物の制作を実施し、良好な結果が得られた。他に真土型ではないが、イタリアで行われていた石膏による型取り法の貴重な資料を収集し、今回の真土型型取りの技法との共通性を認識し、アーカイブの一部に加えた。真土型鋳造法による実制作の展開で、前半なかなか進展せず、後半に集中したが、本来の研究目的からは多少遅れが出た。28年度は、真土込型鋳造法の実制作を中心に展開した。対象は滋賀県栗東市の大宝神社の木造狛犬一対(12世紀後期の作、作者不詳、明治33年国指定重要文化財、京都国立博物館に寄託)。この狛犬は、造形的にも優れていることと、真土込型技法で制作することに関しては難易度が高いことから選択した。鋳物の原型は重文から直接取ることはできないが、大学所有の石膏原型を元に制作にあたった。重文指定前に模られた石膏像であるため劣化がひどく石膏像の再制作を実施した。この場面でのシリコンどり工程と石膏どりの工程も貴重な型取り法として記録した。真土込型鋳造法の実践としてこの狛犬を3体制作し記録した。一対は東京藝術大学美術学部の鋳金研究室で行い、大学で伝承されている内容と真土型鋳造法の第一人者の指導も得て実施した。後の一体は、真土込型鋳造法を現在も継承している関東地区の鋳造工房で実施した。大学での制作法と民間での制作法の相違点(鋳型の分割、寄せ型の考え方、中子の取り方等中心に)を把握しこれらの記録を元に系統立てたアーカイブ化を検討中である。海外の調査では、ネーパール・パタンでの鋳造工房の調査を実施した。基本的には真土型鋳造法であるが、蝋を原型とした真土型鋳造であり、その肌土の内容や真土への添加物の内容、原型の制作、鋳型の制作、鋳造法、仕上法の違い等日本の方法と類似点もあるが独特の展開があり、これも貴重な内容が取れ、多角的に鋳造法の記録ができた。困難ではあったが、真土込型鋳造法の実制作をほぼ完了でき、大きな収穫があった。今後、他の技法収集に徹することができる状態となった。

平成29年7月、制作した中型原形の真土型に関する技法検討の結果、当初の予想に反し、中型原形の技法検討だけでは、真土込型の技法の全容を把握することができず、研究目的である真土込型鋳造法の多面的アーカイブ化を達成できないことがわかり、研究遂行上、大型原形の真土込型に関する技法検討が不可欠であることから、追加で大型原形の真土込型を制作する必要が生じた。大型原型の人物像を目的対象としてその分割方法、分割手段、その後の溶接による完成形までの工程を確認し実施した。対象の人物像は、等身の坐像で椅子に腰掛け手前で両手を合わせている形であるが、分割するにあたって、それぞれの鋳型の大きさ、重要な形態(顔や手等)の配置、鋳造品が歪まない位置どり等を考慮し分割した。また、それに伴った寄せ型も多種にわたった。特に浮いた状態の手の部分は、窓寄せの型を取り、中子を入れる工夫をして実施した。結果としては概ね良好な鋳造物を完成させることができた。特にそれぞれの分割された鋳造物を合わせて溶接する際には、それぞれの分割面がほとんどずれることもなく、溶接は順調に展開できた。ここでは分割の方法が適切であったこともあるが真土込型の歪みの少ない精度のある鋳物を確認できた。また、中子の取りにくい部分で肉厚が厚くなった部分でも、ブロンズの引けによる収縮はほとんど起きず、鋳型の吸収力の優れた点を確認できた。全体的に大型の原型に対した方が真土込型は適性があることを実感できた。ただし、技法的には難易度が高いことは変わらないため、熟練者の指導を仰いで実施したことや、大型の鋳型になればなるほど人的仕事量は大きくなり、困難な場面も多く、鋳造の大変さを改めて実感した。多少遅れはあるものの、当初の計画通り28年度以降実施する。前年度までに実施した真土型鋳造法の不足内容を実施する。特に前年まで制作した大宝神社の木造狛犬一対の込型鋳造法における詳細内容を多角的に検証しまとめる。また、大宝神社の木造狛犬一対の鋳造成果物の仕上げ工程についても具体的に着色まで含めアーカイブ化していく。その他日本各地の鋳造法に着目し、その技法の収集と相違点を確認し記録していく。上記内容を受けて作家の制作の立場から安定した美術鋳物の真土型鋳造法を、以前の研究データに加えて系統的にまとめ再現性を重視しデータ化する。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
SkechPoint:INK技術に基づいた個人情報処理システム

個人情報処理システムに手書き文字認識の機能の追加およびユーザインタフェースの向上を図るために,次の2つの研究を行った.1.手書き文字入力枠の最適値個人情報処理システムでは,手書きによるnote-taking及びテキスト入力を考慮に入れたうえ,手書き文字認識機能を追加する際に,特に枠あり文字認識の場合は,文字認識率が高く,ユーザが心地よく入力できる文字枠の最適な寸法について研究を行った.具体的には文字の種類(英数字とかな漢字まじり)と文字枠の形状(正方形と長方形)という2つの側面から着手し手書き文字入力枠の最適値を実験的に求めた.その結果,英数字の最適値が1.09 ×1.661.44 ×1.44 cm,ひらがな・カタカナおよびかな漢字まじりの最適値が1.44 ×1.44 cmであることを明らかにした.これらの結果は手書き文字入力枠(認識用と非認識用の両者)の設計に役立つ.画面上のオブジェクトを迅速かつ正確に選択できるペン操作技法Zoom Selectorを開発した.この操作技法では,まず,ペン先が画面上のオブジェクトに接近するとき,ある程度の大きさの半透明の円("ズームエリア"と呼ぶ)が表示される.次に,そのズームエリアにカバーされたオブジェクト群をズームエリアに拡大表示され,そのオブジェクト群はペン先の中心にパイのような形で並ばれる("ズームパイ"と呼ぶ).このように,ペンでズームパイ上のオブジェクトを迅速かつ正確に選択できる.上記の操作技法を実証するための評価実験を行った結果,Zoom Selectorは既存の技法より特に小さなオブジェクトの選択に有効であることを明らかにした.個人情報処理システムの特性を研究調査するために,ペンを持つ携帯情報端末を用いたターゲットポインティングと手書き文字入力実験を行った.まず,掌サイズのディスプレイ上の両入力デバイスでのターゲットポインティングを比較する実験を行った.実験1では,ターゲットサイズの実用限界を知るため,様々なサイズのターゲットを用いてポインティング課題を行った.この結果,ターゲットとなるセルのサイズが2mmから4mmのときにはペンのエラー率はカーソルキーよりも高いが,5mmのときには両者の差が見られなくなることが分かった.実験2では,ターゲットのサイズを5mmに固定し,ターゲット数を変化させてポインティング課題を行った.この結果,カーソルキーでターゲットまでの移動セル数が3以上のとき、カーソルキーよりもペンの方がターゲットを速くポイントできることが分かった.つぎに,ペンの長さがポインティング・パフォーマンスに及ぼす影響を調べた.実験ではこの長さ(7cm)のペンとそれより長いペン(16cm)を用いたターゲットポインティングの速さと精度の違いを定量的に評価した.また,人差し指によるポインティングも併せて検討した.実験では,16cmペンは7cmペンより高いパフォーマンスを示し,人差し指によるポインティングは,十分な精度で小さなターゲットをポイントできないことが示された.また,携帯情報端末における手書き文字入力枠の最適値を求めるために手書き文字入力を実施した.入力パフォーマンス,人間の生理パラメータを用いた疲労度及び主観的評価の3方向から検討した.なお,本研究では最適値を使用者の疲労を最小限に抑え,入力効率の優れた枠サイズと定義した.実験の結果,英数字の枠サイズの最適値が1.44×1.44cm付近であることを明らかにした.新しいペン入力ならびに従来のGUIベースのアプリケーションのサポートにペンインタラクションサービスを提供するために,context-aware infrastructureを開発した.このinfrastructureはアプリケーションに適応したコンテンツを提供している.具体的にはジェスチャ認識技術,連続手書きおよび基本的なストローク(インク)に対する操作技術などを提供している.ジェスチャ認識においては,インフォーマルなnote-takingと上下文関係に基づいたジェスチャの認識方式も提案しており,この方式はインクとインクの間の空間関係を把握した柔軟なジェスチャ認識技術を開発した.このinfrastructureをベースにして開発したSketchPointは,ペンによるノートやメモ取り(note-taking)の機能,手書きスライド製作の機能とインフォーマルなプレゼンテーション機能を持っている.主な特徴は次の2つである.第一,SketchPointはnote-takingで自由手書きされたインク群を有機的に階層構造に統合した機能を持っている.第二,SketchPointはnote-takingとインフォーマルなプレゼンテーションの両者の間の架け橋とした機能も設けている.SketchPointに対してインフォーマルな評価ではすでに使用者から有益なコメントと建設的な意見を頂いた.今後はlab testingおよびfiled studyなどの評価手法を用いてシステムを評価していく.個人情報処理システムに手書き文字認識の機能の追加およびユーザインタフェースの向上を図るために,次の2つの研究を行った.1.手書き文字入力枠の最適値個人情報処理システムでは,手書きによるnote-taking及びテキスト入力を考慮に入れたうえ,手書き文字認識機能を追加する際に,特に枠あり文字認識の場合は,文字認識率が高く,ユーザが心地よく入力できる文字枠の最適な寸法について研究を行った.具体的には文字の種類(英数字とかな漢字まじり)と文字枠の形状(正方形と長方形)という2つの側面から着手し手書き文字入力枠の最適値を実験的に求めた.その結果,英数字の最適値が1.09 ×1.661.44 ×1.44 cm,ひらがな・カタカナおよびかな漢字まじりの最適値が1.44 ×1.44 cmであることを明らかにした.

これらの結果は手書き文字入力枠(認識用と非認識用の両者)の設計に役立つ.画面上のオブジェクトを迅速かつ正確に選択できるペン操作技法Zoom Selectorを開発した.この操作技法では,まず,ペン先が画面上のオブジェクトに接近するとき,ある程度の大きさの半透明の円("ズームエリア"と呼ぶ)が表示される.次に,そのズームエリアにカバーされたオブジェクト群をズームエリアに拡大表示され,そのオブジェクト群はペン先の中心にパイのような形で並ばれる("ズームパイ"と呼ぶ).このように,ペンでズームパイ上のオブジェクトを迅速かつ正確に選択できる.上記の操作技法を実証するための評価実験を行った結果,Zoom Selectorは既存の技法より特に小さなオブジェクトの選択に有効であることを明らかにした.
高性能制振材料による極限防振技術の開発

これまでの研究で以下のような知見が得られた。●中心となるM2052合金の力学特性に関して、振動時の塑性変形または応力による劣化等で、非常に大きな経時変化が見られた。●真空環境への適合を調べるために、脱ガス試験を行った。表面処理の異なる材料に対して室温から250度および450度での昇温脱離測定を行った結果、複合電界研磨を行った材料のほうが良好な性質を示した。脱ガスのほとんどは水素、水、窒素、炭酸ガスで脱ガス量は0.003Pam/s程度(代表的なステンレス材料の値の約10倍)であるが、真空環境で使用される量を考えるとほとんど問題ないことがわかった。●M2052制振材料を使用した防振装置の試作を行った。試作に際しては、減衰能の低下を招く塑性変形を防ぐため、ばね材料に用いた部分を硬くしたものを作成した。その装置は、基本共振の周波数が約10Hz、Qが30程度であったが、広い帯域で理論どおりの防振性能が得られた。さらに性能を改善すべく、基本共振周波数の低いものを作成したが、さまざまな副共振が現れて、期待通りの性能は得られなかった。以上の実験結果から、M2052の特性を生かすには、一段あたりの防振比を稼ぐよりも、固めの防振装置を多段につなぐほうがよいとの結論を得た。ばね以外の部分もM2052で作成した防振装置を作成した。通常の金属製で見られる防振比が0dBになるような共振は見えず、良好な特性を示した。●このような高周波数(1kHz)での良好な制振性能を利用し、能動防振システムを試作した。これは、被防振部をM2052で作り、さらにM2052のワイヤーで懸架して防振台を作り、その上にレーザー干渉計型加速度計を設置して、負帰還制御で振動を抑えるものである。試作機では、2-50Hzの周波数帯域で20-40dBの防振比の改善が見られた。●材料の非線形性に注目し、その力学応答を精密に測定した。新しいセンサーを開発し、3桁にわたる振幅で測定が可能になり、大振幅での異常な振る舞いから、線形の領域まで測定ができた。線形領域でのQは30くらいで、大振幅で測定すると10くらいになる。同様の傾向は、自由減衰でも見えたが、揺らぎが大きく線形の領域まで測定することができなかった。今回、初めて正しく測定することができた。本年度の研究では、以下のような知見が得られた。まず、中心となるM2052合金の力学特性に関して、いくつかの形状のばね材料を試作し、実験を行った。その結果を対数減衰率を用いて評価すると、文献値では最高0.72が得られているのに対して、どの測定も大体0.15程度とかなり小さな減衰量となっていた。

この違いは、成分や処理の問題よりは、振動時の塑性変形による劣化であろうと判断された。しかし、すでに報告されているように減衰量が振幅依存が再確認され、計測時の条件に大きく依存することも判明した。詳しい解析で、対数減衰率はほぼ振幅に比例するということがわかった。さらに、減衰量だけでなく弾性率にも大きな振幅依存性があることが見出された。ただ、通常の金属の対数弾性率は0.001程度のものが多く、この値と比較すれば、条件をかなり悪くしても、高い制振性能を持つ材料であるといえることがわかった。次に、真空環境への適合を調べるために、脱ガス試験を行った。このM2052合金の主成分はマンガンで、超高真空環境での使用に関しての問題点があるかもしれないので、表面処理の異なる材料に対して室温から250度および450度での昇温脱離測定を行った。結果、複合電界研磨を行った材料のほうが、一般の表面処理の材料に比べて良好な性質を示した。さらに、脱ガスのほとんどは水素、水、窒素、炭酸ガスであった。脱ガス量は0.003Pam/s程度で、代表的なステンレス材料の値の約10倍であるが、真空環境で使用される量を考えるとほとんど問題ないことがわかった。また、実際に真空装置の部品として加工されたベローズの特性の評価を行ったところ、ステンレス製品と比べて、振動の減衰時間が早いモードとあまり変わらないモードが存在することがわかった。このような現象の原因はまだ不明である。昨年度の研究に基づき、M2052制振材料を使用した防振装置の試作を行った。試作に際しては、減衰能の低下を招く塑性変形を防ぐため、ばね材料に用いた部分を硬くしたものを作成した。その装置は、基本共振の周波数が約10Hz、Qが30程度であったが、広い帯域で理論どおりの防振性能が得られた。さらに性能を改善すべく、基本共振周波数の低いものを作成したが、さまざまな副共振が現れて、期待通りの性能は得られなかった。以上の実験結果から、M2052の特性を生かすには、一段あたりの防振比を稼ぐよりも、固めの防振装置を多段につなぐほうがよいとの結論を得た。ばね以外の部分もM2052で作成した防振装置を作成した。通常の金属製で見られる防振比がOdBになるような共振は見えず、良好な特性を示した。ただ、測定を行う際に、M2052ばねに応力がかかった状態にしておくと、減衰能が劣化する現象が見られたが、原因は不明である。このような高周波数(1kHz)での良好な制振性能を利用し、能動防振システムを試作した。これは、被防振部をM2052で作り、さらにM2052のワイヤーで懸架して防振台を作り、その上にレーザー干渉計型加速度計を設置して、負帰還制御で振動を抑えるものである。試作機では、2-50Hzの周波数帯域で20-40dBの防振比の改善が見られた。また、材料の非線形性に注目し、その力学応答を精密に測定した。減衰能の測定は、自由減衰振動を測定する場合が多いが、時間的に変動するので精密な測定が難しい。そこで、正弦的な力を加えて、その周波数を掃引して応答関数求めた。得られた結果から振動振幅が大きくなると異常な振る舞いをするが、ある振幅以下では線形の応答をしていることがわかった。このQは30くらいで、大振幅で測定すると10くらいになる。同様の傾向は、自由減衰でも見えたが、揺らぎが大きく線形の領域まで測定することができなかった。今回、初めて正しく測定することができた。
骨髄腫病態におけるSLAMF3の機能解明と新規分子標的治療法の開発

SLAMF3は、免疫グロブリン様ドメインを分子内に有するI型膜貫通糖タンパク質であり、他の細胞上に発現する同じ分子をリガンドとして認識するself-antigenである。SLAMF3は、主に、T細胞・NK細胞・B細胞に発現しており、更に、多発性骨髄腫の骨髄腫細胞(腫瘍細胞)においても高発現している。新たな骨髄腫細胞同定抗原としてSLAMF3の有用性を検討するため、骨髄腫患者の骨髄腫細胞においてSLAMF3と骨髄腫同定抗原CD138の発現を詳細に解析した。その結果、骨髄腫同定抗原CD138は病態進行に伴い発現が低下している症例が存在していたが、SLAMF3の発現は病勢進行に関わらず不変であった。しかしながら、骨髄腫細胞におけるSLAMF3の機能は十分には解明されていない。本研究では、骨髄腫細胞におけるSLAMF3の機能の解析し、新規治療薬の標的として検討を行った。更に、近年、様々な免疫関連分子の可溶型が腫瘍患者の血清中に検出されおり、その濃度が病態進行や予後に関連すると報告されている。そこで、骨髄腫患者の血清中の可溶型SLAMF3の濃度をELISA法にて測定した。前年度と今年度の結果から、in vitroとin vivoの解析においてSLAMF3が、アダプター蛋白質GRB2とSHP2を介したERKシグナルの活性化を誘導し、骨髄腫細胞の増悪(細胞増殖能の亢進と薬剤抵抗性)を強く誘導していることを明らかにした。SLAMF3は骨髄腫の病勢とは関わらず、骨髄腫細胞に高発現しているこことから、免疫治療を含む骨髄腫治療の新たな標的となると推察された。一方、骨髄腫患者における血清可溶型SLAMF3の濃度が、病勢進行を反映しており、可溶型SLAMF3が予後指標として有用であることを本研究で明らかにした。以上のことを纏めて、国内学会と国際学会で発表し、現在は論文を作成し、投稿中である。平成30年度では、以下の結果を得た。In vivo解析では、SLAMF3陰性骨髄腫細胞を用いて作成したSLAMF3安定型発現細胞と細胞内ドメイン欠失SLAMF3(ΔSLAMF3)発現細胞を免疫不全マウスNOGに移植した。SLAMF3細胞移植NOGマウスはΔSLAMF3細胞移植NOGマウスと比較し、有意に腫瘤の大きくなるスピードが速く、生存期間が短かった。続いて、SLAMF3細胞とΔSLAMF3細胞の間で遺伝子発現の違いを詳細に調べるために、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。Gene set enrichment analysis (GSEA)で解析を行った結果、SLAMF3細胞には、ERKシグナルに関連する遺伝子群が多く同定され、且つ、骨髄腫細胞の増悪化に関連する遺伝子群も亢進していた。更に、SLAMF3を発現している骨髄腫細胞を抗SLAMF3抗体で処理すると細胞増殖能は有意に低下し、薬剤感受性が増加した。つまり、骨髄腫細胞間のSLAMF3ーSLAMF3の相互作用が、骨髄腫の増悪化に関与していることを明らかにした。次に、骨髄腫患者の血清中の可溶型SLAMF3濃度をELISA法にて検討した。正常コントロールと比較し、骨髄腫患者では可溶型SLAMF3濃度が有意に増加しており、且つ、骨髄腫の病態進行とともに亢進していた。更に、可溶型SLAMF3高値群の患者は、低値群の患者と比較し、有意に病勢が亢進しており、無増悪生存期間も短かった。可溶型SLAMF3は、骨髄腫細胞の培養上清中、SLAMF3発現骨髄腫細胞を移植したNOGマウスの血清中にも検出された。この可溶型SLAMF3は、骨髄腫細胞が産生するMMP-9により切断されたSLAMF3の細胞外ドメイン部分であった。以上より、SLAMF3は骨髄腫の増悪化に関与する分子であり、その可溶型SLAMF3は骨髄腫の病勢を反映する指標になることを明らかにした。SLAMF3の細胞内ドメインのチロシンベーススイッチモチーフにはSNP rs509749が存在する。SLAMF3のSNP rs509749のAアレルは、全身性エリトマトーデス(SLE, systemic lupus erythematosus)においてリスクアレルであることが報告されている。しかしながら、骨髄腫患者においてはSLAMF3のSNP rs509749においての報告はない。そこで、骨髄腫患者と健常者において、SLAMF3のSNPアレルの頻度を検討し、更に、アレルの違いで予後に違いがあるのか検討する。また、SLAMF3のアレルの違いによって、骨髄腫の細胞増殖能や薬剤感受性に与える影響を解析する。骨髄腫におけるSLAMF3のSNP rs509749に関して纏めて、論文で発表する。そこで申請者は、新たな骨髄腫細胞同定抗原としてSLAMF3の有用性を検討した。骨髄腫同定抗原CD138は病態進行に伴い発現が低下している症例が存在するが、SLAMF3の発現は病勢進行に関わらず不変であった。

以上のことから、SLAMF3は新たな骨髄腫細胞同定抗原としての可能性を示した。しかしながら、骨髄腫におけるSLAMF3の機能は明らかではない。本研究では、骨髄腫細胞におけるSLAMF3の機能の解析し、新規治療薬の標的として検討を行っている。更に、骨髄腫患者の血清中において可溶性SLAMF3濃度をELISA法にて測定したところ、骨髄腫の病勢進行とともに可溶性SLAMF3濃度が亢進していた。本研究では更に、可溶性SLAMF3の産生機序、更に、予後指標として有用か検討を行っている。平成29年度は、骨髄腫細胞におけるSLAMF3分子機能についてin vitroにて解析を行い以下の結果を得た。骨髄腫細胞株においてSLAMF3は高発現していることから、骨髄腫細胞のSLAMF3発現をノックダウンすると、細胞増殖能が抑制され、骨髄腫治療薬に対して感受性が増加した。一方、SLAMF3陰性骨髄腫細胞を用いて、SLAMF3安定発現骨髄腫細胞を作製した。SLAMF3発現骨髄腫細胞は、細胞内ドメイン欠失SLAMF3 (ΔSLAMF3)発現細胞と比較し、細胞増殖能が亢進し、薬剤抵抗性を示した。更に、SLAMF3の細胞内シグナル伝達にはアダプター蛋白SHP2とGRB2との相互作用が重要であり、SHP2阻害薬処理やSHP2/GRB2発現ノックダウン骨髄腫細胞ではSLAMF3ノックダウン細胞と同様の特徴を有していた。更に、SLAMF3ノックダウン細胞、ΔSLAMF3細胞、SHP2阻害薬処理した細胞では、コントロールと比較し、ERKシグナルが低下し、cyclin DとBCL2遺伝子が有意に低下していた。以上のことから、SLAMF3分子は、アダプター蛋白質GRB2、SHP2の相互作用を介して、ERKシグナルを伝達し、細胞周期関連遺伝子と抗アポトーシス遺伝子の発現を誘導し、骨髄腫細胞の増悪化に関与することを明らかにした。SLAMF3は、免疫グロブリン様ドメインを分子内に有するI型膜貫通糖タンパク質であり、他の細胞上に発現する同じ分子をリガンドとして認識するself-antigenである。SLAMF3は、主に、T細胞・NK細胞・B細胞に発現しており、更に、多発性骨髄腫の骨髄腫細胞(腫瘍細胞)においても高発現している。新たな骨髄腫細胞同定抗原としてSLAMF3の有用性を検討するため、骨髄腫患者の骨髄腫細胞においてSLAMF3と骨髄腫同定抗原CD138の発現を詳細に解析した。その結果、骨髄腫同定抗原CD138は病態進行に伴い発現が低下している症例が存在していたが、SLAMF3の発現は病勢進行に関わらず不変であった。しかしながら、骨髄腫細胞におけるSLAMF3の機能は十分には解明されていない。本研究では、骨髄腫細胞におけるSLAMF3の機能の解析し、新規治療薬の標的として検討を行った。更に、近年、様々な免疫関連分子の可溶型が腫瘍患者の血清中に検出されおり、その濃度が病態進行や予後に関連すると報告されている。そこで、骨髄腫患者の血清中の可溶型SLAMF3の濃度をELISA法にて測定した。
脳内在性多機能神経毒によってもたらされるパーキンソニズム発症機構の解明

著者等のグループはテトラヒドロイソキノリン(TIQ)類の神経毒が極めて多彩な機能を有していることを明らかにしつつある。本研究の第一の目的は、上記化合物を含めて現在までに著者らが見出しているパーキンソン病発症物質候補を用いて神経毒の機能解明を行うことである。本年度の研究から、上記化合物の毒性発現を修飾する因子として、P糖蛋白などのトランスポーターの寄与を検討したところ、TIQ類は基質として認識され、P糖蛋白によって脳内から排泄されることを明らかとした。更にP糖蛋白を阻害してあるマウスにTIQ類を投与したところ、行動薬理学的に明らかにパーキンソニズム発症が促進された。次にTIQ類を投与する事によってP糖蛋白遺伝子に変動が起こるか否かの検討を行った。この結果、投与量や投与期間によって異なるが、ある程度まではP糖蛋白遺伝子の発現上昇がおこり補償的に働くが、それ以上の処置では減少する事が示唆された。このことからP糖蛋白の発現制御にはTIQ類が深く関わっていると思われる。これらの事をまとめるとヒトにおいてP糖蛋白の機能不全はパーキンソン病の増悪因子となり得ることが示唆された。今年度の研究により1位に長鎖アルキル基が置換しているTIQ類は極めて強いミトコンドリア呼吸鎖阻害活性を有していることが明らかとなった。またTIQ類で処理した神経細胞のミトコンドリア関連遺伝子発現について検討したところ、complex Iとcomplex II関連の遺伝子が減少していた。従ってTIQ類は呼吸鎖阻害と関連遺伝子発現減少という2種類の抑制が認められた。このことは神経細胞死に至らしめる機構として重要であると考えている。次に上記化合物の毒性発現を修飾する因子として、P糖蛋白などのトランスポーターの寄与を検討したところ、TIQ類は基質として認識され、P糖蛋白によって脳内から排泄されることを明らかとした。このことからヒトにおいてP糖蛋白の機能不全はパーキンソン病の増悪因子となり得ることが示唆された。
小離島の「互助」を活かした高齢者ケアの創出を推進する看護実践モデルの提案

本研究の目的は、行政・専門職が提案する公助・共助の活動ではなく、住民のやりたいこと・できることを活かした互助の活動を専門職が支援することで、高齢者ケアを創出し、地域の課題解決に資することである。つまり行政・専門職は、住民が活動に参加する支援ではなく、住民が主体となる活動を支援する必要があると考える。公助・共助の医療・介護サービスが脆弱な小離島は、都市地域と異なり、互助を活かした介護予防と生活支援の強化が必要である。そのため小離島の互助を活かした高齢者ケアの創出を試み、地域の医療・介護の課題解決に互助を活用する看護実践モデルの提案が重要である。
染色体末端ドメインの機能・構造維持メカニズム

真核生物の線状染色体末端のテロメアに隣接して、サブテロメアというドメインが存在する。近年、テロメアに関する知見は急激に蓄積したが、サブテロメアの機能や制御のメカニズムについては、DNA配列が完全に決定されていない、長大な重複配列があるなど解析上の困難から、不明な点がまだ多く残されている。そこで本研究では、我々が最近作製した分裂酵母のサブテロメア共通配列(SH)完全欠損株(SD5株)を利用し、サブテロメア機能の具体的な制御メカニズムを明らかにすることを目的としている。興味深いことに、SD5株では、サブテロメアヘテロクロマチンがSH隣接領域(Knob領域)に侵入しており、その領域の遺伝子発現が著しく抑制されていたことから、SH領域はヘテロクロマチンをKnob領域まで広がらせないために必要であることがわかった。また、Knob領域の一部(約25 kb)をSD5株において削除したところ、ヘテロクロマチンがKnob領域からさらに内側に侵入することはなかったことから、Knob領域の端(セントロメア側)には、ヘテロクロマチンの広がりをブロックする仕組みがある可能性が示唆された。そのバウンダリーのクロマチン構造を解析したところ、ヌクレオソーム構造が欠落していることが明らかになった。その構造を生み出すメカニズムを探るため、ゲノムにランダムに変異を導入し、サブテロメアの外側に挿入したマーカー遺伝子の発現がヘテロクロマチンの侵入により抑制される変異株を取得した。ヘテロクロマチンのバウンダリーがヌクレオソームの欠落により制御されているかもしれないという驚くべき現象を見出し、そのメカニズムを探るべく、変異株の取得に成功した。これまでに取得できたバウンダリー異常株の変異部位を同定し、その遺伝子の機能解析を行う。複数の変異株が取得できているため、それらの機能相関を調べる。
幹細胞から分化する異なる表現型のマスト細胞のイオンチャネルとその制御メカニズム

マウス(Balb/c)の脛骨および大腿骨より採取した骨髄細胞をpokeweed mitogenで刺激したマウス脾細胞培養上清(PWM-SCM)存在下で4週間以上培養し分化させたマスト細胞(bone marrow-derived mast cells;BMMC)の膜電流をパッチクランプ法を用いて測定した。その結果、BMMCが粘膜型マスト細胞の生化学的性質を持つことからの予測に反して、電気生理学的には不均一な集団であったことは今後BMMCの分化を研究していくうえで重要な発見である。私達は室温で記録されたチャネルの種類によってBMMCを試験的に次の4タイプに分類した。Type 1:殆どチャネル活性が見られないもの(40%)。Type2:内向き整流性Kチャネルが優位に存在するもの(14%)。Type3:外向き整流性C1チャネルが優位に存在するもの(24%)。Type4:内向き・外向き両方向の電流が見られるもの(22%)(Kuno et al.,印刷中)。非選択的陽イオン透過性チャネルや大きなコンダクタンスの陰イオン透過性チャネルも時に観察された。また、記録用chamberの温度を37度まで上昇させたり細胞内Ca濃度を上昇させると、Type1のBMMCでも外向き電流が活性化されることが明らかになるなど、多様なチャネル活性はBMMCの細胞内代謝条件を反映していることが示唆された(1995年3月、第72回生理学会大会で発表予定)。現在、実験条件や様々な物質のチャネル活性に対する影響や、培養液にチャネルブロッカーを添加したりイオン組成を変えた場合のBMMCの出現・増殖・結合組織型への分化に対する影響を検討している。今後、BMMCの個々のチャネル活性が分化過程でどのように発現・制御されているのかを細胞の機能との関連のなかで追求していきたい。マウス(Balb/c)の頸骨および大腿骨より骨髄細胞を採取し、pokeweed mitogen刺激後のマウス脾臓細胞培養上清(PWM-SCM)存在下で長期培養すると、2-4週間後にアルシアンブルーに染色されたマスト細胞(bone marrow-derived mast cells,以下BMMCと略す)が得られた。これらのBMMCにパッチクランプ法を適用しホールセル電流を測定すると、約1/3の細胞では殆ど電流が見られなかったが、14%で内向き整流性電流、24%で外向き整流性電流、22%で内向きおよび外向きの電流が記録された。内向き整流性電流は、1mMBaでブロックされ、逆転電位が細胞外K濃度に依存するため、K電流であると結論された。次に、外向き整流性電流は、C1チャネルブロッカーのDIDSでブロックされること、細胞外液のC1を不透過性のisethionateで置換すると著明に減少すること、内外のC1濃度比を下げていくと逆転電位が+側にシフトすることなどから、主にC1電流によると推測された。この他、内向きおよび外向きの電流を通過する約30pSおよび150-280pSのコンダクタンスの単一チャネル電流がホールセルクランプ下で観察された。BMMCの静止膜電位は、殆ど電流の見られなかった細胞では0mVに近く、多少とも内向き整流性電流が見られた場合は、入力抵抗が減少するほど過分極側に移動し、外液K濃度を増加させるほど脱分極した。一方、高K液中でK電流の逆転電位を0mVにした場合でも膜電位は-400mVであったため、内向き整流性Kチャネルのみならず外向き整流性C1チャネル活性もBMMCの膜電位調節に寄与すると考えられた。

以上の結果から、BMMCは電気生理学的性質の異なるsubpopulationから構成されることが明らかになり、表現型の異なるマスト細胞のチャネル発現の多様性に関与すると考えられた。本年は、前年度に得た結果をさらに発展させ、マウス(Balb/c)骨髄幹細胞をpokeweed mitogenで刺激したマウス脾細胞培養上清(PWM-SCM)存在下で4週間以上培養し分化させたマスト細胞(bone marrow-derived mast cells;BMMC)が電気生理学的には不均一な集団であることを明らかにし、室温で記録されたチャネルの種類によってBMMCを試験的に次の4タイプに分けた。Type1:殆どチャネル活性がみられないもの(40%)。Type2:内向き整流性Kチャネルが優位に存在するもの(14%)。Type3:外向き整流性Clチャネルが優位に存在するもの(24%)。:Type4:内向き・外向き両方向の電流が見られるもの(22%)。電流固定下で膜電位を測定すると内向き整流性Kチャネル、外向き整流性Clチャネルの開口にともなって膜電位は過分極側に変異したが、静止膜電位はK、Clイオンの平衡電位よりかなり+側にあることが多く、チャネル開口がなんらかの因子で抑制されているか、これらのチャネル以外の膜電位規定因子が存在する可能性が考えられる(Kuno et al.,印刷中)。更に、記録用Chamberの温度を37度まで上昇させると、Type1のBMMCでも外向き電流が可逆的に活性化されることが明らかになり、チャネル活性の制御に細胞内代謝機構などが密接に関与していることが示唆された(1995年3月、第72回生理学会大会で発表予定)。現在、引き続いて実験条件や様々な物質のチャネル活性に対する影響を検討しており、今後、BMMCの多様なチャネル活性が何を反映しているのか、また表現型を変えていく過程でチャネル活性がどのように変化していくのかを細胞の機能との関連のなかで追求していきたいと考えている。
羊膜類における頭蓋冠相同性理論の再構築

哺乳類が哺乳類型爬虫類の一群から起源した過程で,哺乳類型爬虫類において40個ほどの骨が構成していた頭蓋は哺乳類で28個の構成骨に減少した.これら10数個の骨は哺乳類に至る系統で完全に喪失したと考えられてきた.しかし,失われたと従来考えられてきた骨のいくつかは実は哺乳類でも保持されている可能性が出てきた.そこで,これらの骨は胎子期には存在しており,それらが発生の進行の過程で癒合が進むことで見かけ上の骨数が哺乳類で減ったかに見えるようになったという作業仮説を立て,その検証を行った.その結果,胎児期には祖先的爬虫類様の頭部形態がかなりの程度みられることを確認した.哺乳類が哺乳類型爬虫類の一群から起源した過程で,哺乳類型爬虫類において40個ほどの骨が構成していた頭蓋は哺乳類で28個の構成骨に減少した.これら10数個の骨は哺乳類に至る系統で完全に喪失したと考えられてきた.しかし,失われたと従来考えられてきた骨のいくつかは実は哺乳類でも保持されている可能性が出てきた.そこで,これらの骨は胎子期には存在しており,それらが発生の進行の過程で癒合が進むことで見かけ上の骨数が哺乳類で減ったかに見えるようになったという作業仮説を立て,本年度からその検証を行った.共同研究先である理化学研究所において,羊膜類脊椎動物(マウス・ニワトリ)を材料として,実験発生学的手法を用いて頭蓋冠における骨,軟骨,筋肉,脳,末梢神経,各形態パーツ相互の相対的位置関係を組織染色によって記載し,Amiraアプリケーションによってそれらの三次元的再構築を行った.また,頭蓋骨の縫合に形成・促進に関連する遺伝子(Frfbr2, Ihh, Pthc1,Tgfr2)の発現パターンを分析するため,in situ hibridizationによる実験を進めた.遺伝子のクローニング,プローブの作製も進行し,来年度からのDIG標識実験への目処が立った.また,オーストラリアおよびシンガポールにて現地自然史博物館に収蔵されている哺乳類の胎子標本の観察を行い,胎子期における頭蓋骨形成の種間変異の分析を進め,スペインではバレンシア大学にて共同研究者とともに頭蓋骨の各骨パーツの発生と癒合の数理的パターンの分析をした.前年度に蛍光顕微鏡機器を導入したため胚発生における遺伝子発現の観察が可能になった.また,本年度はミクロトームをようやく導入することができ,所属部局での効率的な組織切片づくりが可能になった.理化学研究所にてPtch1,Ihh,Tgfbr2,Fgfbr2,Dlx5,dhand遺伝子のプローブ作成を行った.また妊娠マウスよりE11.5E17.5ステージの胎子を各種採材し,先述のプローブを用いてホールマウントおよび連続切片でのin situハイブリダイゼーション法による染色を進めた.また連続切片を川本法による回収を行い,その後ヘマトキシリン=エオシン染色によって神経,軟骨,骨,筋肉等の染色を行った.Amiraソフトウェアを用いて頭蓋冠における骨,軟骨,筋肉,脳,末梢神経,血管の発生過程,各形態パーツの三次元的位置関係をコンピュータ内で再構築した.また,人体発生の研究を本学教育学部と京都大学医学研究科と進め,人体における頭骨の骨化・成長・縫合の過程の三次元的な把握を開始した.人体発生も視野に入ってきたことで,哺乳類全体における頭骨発生の統合的理解にさらに近づいたと期待される.さらに,北海道等で野外捕獲を継続し,小動物胎子の収集につとめた.in situハイブリダイゼーションなどの実験発生学的解析は順調に進んでいる.また研究補助員の雇用によって三次元再構築や解析の進行も効率的に進んでいる.本年度は本格的に哺乳類の胎子の組織切片作成と比較観察をすすめることが出来た.理化学研究所の協力をうけPtch1, TGfbr2, Fgfr2, Dlx5, Ihh遺伝子のプローブを用いてマウス胎子に対してin situハイブリダイゼーション染色を行った.また,東京大学総合研究博物館では齧歯類および偶蹄類,コウモリ類の胎子に対し,抗αチューブリン抗体,MF20個体,2H3抗体,2H8抗体を用いた免疫組織化学染色,アザン染色を行った.連続切片は川本迅速法を用いて高精細な切片の回収と作成を行った.これらをコンピュータ上でAmiraソフトによって三次元再構築を行い,胚形態の発生過程の観察および種間比較による発生進化の解析を行った.また,東京大学教育学研究科および京都大学医学研究科と共同し,ヒトの胎子標本のCT分析を進め,頭骨発生の三次元パターンの数理的解析を行った.まだ本研究課題の統括的論文は完成していないが,予察的論文を複数報告するに至っており,順調に進展していると判断できる.哺乳類が哺乳類型爬虫類の一群から起源した過程で,哺乳類型爬虫類において40個ほどの骨が構成していた頭蓋は哺乳類で28個の構成骨に減少した.これら10数個の骨は哺乳類に至る系統で完全に喪失したと考えられてきた.しかし,失われたと従来考えられてきた骨のいくつかは実は哺乳類でも保持されている可能性が出てきた.そこで,これらの骨は胎子期には存在しており,それらが発生の進行の過程で癒合が進むことで見かけ上の骨数が哺乳類で減ったかに見えるようになったという作業仮説を立て,その検証を行ってきた.共同研究先である理化学研究所において,羊膜類脊椎動物(マウス・ニワトリ)を材料として,実験発生学的手法を用いて頭蓋冠における骨,軟骨,筋肉,脳,末梢神経,各形態パーツ相互の相対的位置関係を組織染色によって記載し,Amiraアプリケーションによってそれらの三次元的再構築を行った.

また,頭蓋骨の縫合に形成・促進に関連する遺伝子(Frfbr2, Ihh, Pthc1,Tgfr2)の発現パターンを分析した.その結果,胎児期には祖先的爬虫類様の頭部形態がかなりの程度みられることを確認した.この結果をまとめ論文として発表する準備を進めている.哺乳類が哺乳類型爬虫類の一群から起源した過程で,哺乳類型爬虫類において40個ほどの骨が構成していた頭蓋は哺乳類で28個の構成骨に減少した.これら10数個の骨は哺乳類に至る系統で完全に喪失したと考えられてきた.しかし,失われたと従来考えられてきた骨のいくつかは実は哺乳類でも保持されている可能性が出てきた.そこで,これらの骨は胎子期には存在しており,それらが発生の進行の過程で癒合が進むことで見かけ上の骨数が哺乳類で減ったかに見えるようになったという作業仮説を立て,その検証を行った.その結果,胎児期には祖先的爬虫類様の頭部形態がかなりの程度みられることを確認した.研究補助者を雇用することで実験と解析が当初予定より進行が順調に進み,さらに新規に発売された蛍光顕微鏡および撮影機材を導入したことで,実験での観察が迅速化した.ミクロトームの導入によって所属部局内でマウスやその他の哺乳類の胎子標本を効率的に組織切片化することができるようになった.これまでは部局外での作業が多く必要であったが,これにより順調に研究が進められるようになったことは極めて大きい.現時点ではまだ大雑把にしか縫合閉鎖過程を追えていないが,次年度は特に頭骨の縫合癒合が急速に進行するE.15E17.5を集中的に採材し,引き続きin situハイブリダイゼーションによって縫合過程の詳細な観察を行う.また川本法による大量の組織切片作りが必要であり,研究補助員の投入によって効率的な作業進行に務める.まだマウス以外の哺乳類,特に非モデル生物の胎子標本の収集が十分でない.非モデル生物の胎子標本は,哺乳類全体での発生進化および頭骨の相同性解析のために必要となる.そのため,国外および国内で野外調査を継続し,胎子標本の収集に努める必要がある.入手した胎子標本は抗αチューブリン抗体,MF20個体,2H3抗体,2H8抗体を用いた免疫組織化学染色,アザン染色を行い,そののちコンピュータ上で三次元再構築を行う.マウスと非モデル生物種の胚形態の発生過程の種間比較を行い,頭骨の相同性を導出する.29年度が最終年度であるため、記入しない。進化形態学脳は胚頭部の中でも最も早期に形成される構造であり,シグナルセンターとして働く中脳-後脳境界をはじめ,頭部周辺の構造を誘導・規定するうえで重要な役割を担うことが知られる.特に頭蓋冠は脳と近接しており,各骨の形成・アイデンティティが脳の影響を強く受けている可能性がある.脳の各領域と将来骨格の発生する位置との関係を導出する.このとき,アリザリンレッドによる骨格発生の記載に加え,in situハイブリダイゼーションを行い,骨格の前駆組織に特異的なSox9, Aggrecanの発現を確認する.本年度の研究経過により,頭蓋骨の各骨パーツと神経の発生過程の把握の目処が付いたが,この過程で頭蓋骨の各骨,特に膜性骨パーツに対する血管系の位置関係の重要性が認識された.血管系の組織染色の技術導入を新たに進める予定である.購入予定にしていたワックスディスペンサーの納入が遅れ,次年度以降の納入となったため.基金であるため柔軟な予算執行を行った.29年度が最終年度であるため、記入しない。
植物におけるRNAサイレンシング誘起および抑制の分子機構の解明

RNAサイレンシングは、植物がウイルスに対して示す主要な防御反応のひとつである。RNA-induced silencing complex(RISC)は、RNAサイレンシングにおいて中核的な役割を果たす複合体である。本研究で我々は、AGO1タンパク質が分子シャペロンHSP90およびそのコシャペロンであるCYP40の助けを借りて2本鎖small interfering RNAをとりこむ過程を経てRISCを形成することを明らかにした。RNAサイレンシングは、植物がウイルスに対して示す主要な防御反応のひとつであり、Argonauteタンパク質とsmallinterferingRNA(siRNA)を中核として形成されるRNA-induced silencing complex(RISC)により作動する。一方、ウイルスは、自身がコードするRNAサイレンシングサプレッサーの働きによりRNAサイレンシングを抑制し、増殖を遂げる。RNAサイレンシングの誘起とその抑制の分子機構の解析基盤を構築するため、本年度はRISC形成機構を解析した。脱液胞化したタバコBY-2プロトプラスト抽出液中でAGO1タンパク質を対応するmRNAの翻訳反応により合成し、そこに2'-O-メチル化した22ヌクレオチドの2本鎖(ds)siRNAを添加すると、そのうちの一方の鎖(ガイド鎖)を捕捉したAGO1タンパク質複合体が形成された。この複合体は、ガイド鎖と相補的な配列をもつRNAに特異的に結合し切断する活性、すなわちRISC活性を有していた。エンドヌクレアーゼ活性を失った変異AGO1タンパク質はds-siRNAを取り込んだが、1本鎖化できなかったことから、パッセンジャー鎖の除去はその切断を介して起きることが示唆された。さらに、熱ショックタンパク質HSP90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシンがRISC形成を阻害すること、ATPアナログ存在下でHSP90-AGO1-ds-siRNA複合体が蓄積することを見いだした。このことから、RISC形成に分子シャペロンであるHSP90が関与していることが示唆された。本研究では、RNAサイレンシングにおいて標的の認識にかかわるRISC(RNA-induced silencing complex)の形成機構、および、トマトモザイクウイルス130Kタンパク質によるRISC形成阻害機構を解明することを目的として研究を進めた。我々は、脱液胞化タバコBY-2プロトプラスト抽出液(BYL)中でAGO1 mRNAを翻訳し、2本鎖small interfering RNA(siRNA)を添加するとRISCが形成されることを明らかにしていた。本年度までに、この試験管内RISC形成反応において、新生AGO1タンパク質が、ATPをもったHSP90に結合した状態で2本鎖siRNAをとりこみ、HSP90によるATPの加水分解をきっかけに2本鎖siRNAを1本鎖化して、保持した1本鎖siRNAと相補的なRNAを切断する活性を獲得することを明らかにした。難加水分解性ATP類縁体であるATP-γSを添加すると、AGO1とHSP90が結合した状態の複合体が形成された。さらに、この複合体にいくつかのHSP90コシャペロンが含まれていることを見いだし、それらのうちの一つにRISC形成促進能があることを見いだした。また、BYLを用いた試験管内翻訳反応で合成した130Kタンパク質(RNAサイレンシングサプレッサー)を添加することにより、RISC形成が阻害されることを示唆する予備的な結果を得た。昨年度までに、脱液胞化タバコBY-2プロトプラスト抽出液(BYL)において、AGO1タンパク質は、ATPをもったHSP90が結合した状態で2本鎖siRNAをとりこみ、RSP90によるATPの加水分解をきっかけに2本鎖siRNAを1本鎖化して、保持した1本鎖siRNAと相補的なRNAを切断する活性を獲得することを見いだした。難加水分解性ATP類縁体であるATP-γSを添加すると、AGO1とHSP90が結合した状態の複合体が形成され、この複合体にいくつかのHSP90コシャペロンが含まれていることを見いだした。本年度は、これらコシャペロンのうちcyclophilin40(CYP40)にRISC形成促進能が、protein phosphatase5にRISC形成阻害能があることを明らかにした。さらに、CYP40阻害剤を用いた実験などから、CYP40はHSP90を介してAGO1に結合し、2本鎖siRNAのAGO1への結合を促進する可能性が示唆された。一方、完成したRISCにはHSP90とCYP40は結合していなかった。また、昨年度、BYLを用いた試験管内翻訳反応で合成したトマトモザイクウイルス130Kタンパク質(RNAサイレンシングサプレッサー)を添加することにより、RISC形成が阻害されることを示唆する予備的な結果を得た。これについては、130Kタンパク質によりRISC形成に必要なATPが急速に分解されていることが判明し、生体内でのRNAサイレンシング抑制機能との関連は明らかにできなかった。
アデノウイルスベクターによる悪性脳腫瘍遺伝子治療の研究

アデノウイルスベクターは高効率で遺伝子導入ができる方法の一つで、遺伝子治療の分野において研究のみならず臨床でも使用されるようになってきた。我々はこのアデノウイルスベクター用いて悪性脳腫瘍に対する遺伝子治療の試みを行ってきた。また一方で種々のsuicide genetherapyを試みた結果、cytosine deaminase(CD)遺伝子の導入と5-fluorocytosine(5-FC)の全身投与が最も有効であると考えられた。他臓器腫瘍でもこの組み合わせの有効性が多数報告されている。しかし今回の動物実験結果ではCD/5-FC療法は抗腫瘍効果は高かったものの、周囲正常脳に対する毒性が強く、これを軽減する目的で次の実験を行った。着目したのはuracil phosphoribosyltransferase(UPRT)で、本酵素は5-FUをFUMPへ変換する活性を持っており5-FCをさらに効率的にactive metaboliteに変換することが予想された。In vitro実験ではCDとUPRTの両遺伝子の導入で親細胞に比べ数千倍の5-FC感受性を示した。このdataをもとにラット脳腫瘍実験を行った結果、より少ないベクターの投与で十分な抗腫瘍効果を示し、周囲正常脳に対する毒性も軽減され、本方法の有効性が示唆された。なおこれらの詳細な結果は誌上掲載されている。平成10年度の研究経過および今後の計画について報告する。昨年度までに、CAGプロモーターを用いたアデノウイルスベクターの遺伝子導入の有効性と、この遺伝子導入法を用いた悪性脳腫瘍に対する5-fluorocytosine(5-FC)/cytosine deaminase(CD)遺伝子療法の有効性、問題点を検討してきた。今年度は、この遺伝子治療をより優れた方法とするために、CD遺伝子とUrtacil phosphoribosyltransferase(UPRT)遺伝子の2つを用いた薬剤感受性遺伝子治療を検討した。UPRT遺伝子を腫瘍細胞に導入すると、5-FUからFUMPの代謝が亢進し、より強力な抗腫瘍効果が発揮される。UPRT遺伝子を持ったアデノウイルスベクター(AdexCA-UPRT)を用い、9L細胞で検討した。まず、in vitroでCDとUPRT遺伝子を同時に腫瘍細胞に導入し、それら遺伝子が発現し十分作用していることが確認した。5-FCに対する感受性は、CDとUPRTの両方の遺伝子導入の場合、コントロールに比べ、約3000倍に増加し、またCD遺伝子単独導入よりも感受性の増加が認められた。また、このシステムに強いbystander effectがあることが認められた。in vivoでは、ラット9L脳腫瘍モデルを用いて、AdexCA-CD、AdexCA-UPRT及び5-FC投与を行い、長期生存の検討、ならびにMRIによる腫瘍サイズの計測を行い、治療群の長期生存と腫瘍の縮小が認められた。これらの結果より、悪性脳腫瘍に対し、5-FC/CD+UPRT遺伝子治療は非常に有用と考えられた。