hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発生初期過程における血管芽細胞分化メカニズムの解明

血管系は決まったタイムコースに従い、安定した形態を構築するが、関与する遺伝子群は十分に明らかになっていない。我々は、ETSrp遺伝子の発現を抑制したゼブラフィッシュ胚を用いて、遺伝子発現変動をマイクロアレイ法で解析し、結果1.5倍以上の発現上昇を示した165遺伝子の同定に成功した。32遺伝子に関しては詳細な発現パターンをZFINデータベース上で確認し、血管形成領域で特異的に発現している11遺伝子を同定した。ほか新たに68遺伝子を選定し発現パターンを確認し、新規の発現パターンを3遺伝子で得ることに成功した。上記の14遺伝子に対しては、今後遺伝子破壊体を作成し、血管形成との関連を解析していく。本研究課題では、ETSrp遺伝子の発現を抑制し血管芽細胞の分化を阻害した際に発現の変動を示した466遺伝子群の機能解析を行い、血管芽細胞が如何にして間葉系の細胞から分化していくのか、そのメカニズムの解明を目指している。そのために、in silico解析による候補遺伝子のスクリーニングを行い、まず遺伝子リストのうち、遺伝子のアノテーションの付いたもの(上昇:83遺伝子、下降:154遺伝子)に関して、ゼブラフィッシュ関連の総合データベースであるZFINを用い、これまでの発現パターンや関連文献を検索し血管系との関係が報告されているかを確認した。また研究室内のコンピューターにゼブラフィッシュやヒト、マウスの最新の遺伝子情報のデータベースを構築し、Local blastを利用して集約的に解析するシステムを構築した。これを用いて遺伝子のアノテーションが付いていないもの(上昇:108遺伝子、下降:121遺伝子)に関して、DNAプローブの基となったEST配列を取得してblast解析を行い、ヒトやマウス遺伝子からオーソログなものを探索した。以上のin silico解析を466遺伝子に対して行い、ヒトやマウスでのホモログ遺伝子が同定され、かつ血管系との関係が報告されていないものの選定作業を行い、一方で遺伝子の発現パターンが未報告の遺伝子に対しては、in situ hybridization法による解析を進めている。また形態学的評価法の確立に関しては、正常に発生の進行した胚の透過型電子顕微鏡(TEM)、KOH消化法による走査型電子顕微鏡(SEM)による観察を行い、血管芽細胞の正常発生過程での形態的な変化の解析を進めている。本研究課題では、血管芽細胞分化の上流に位置していると考えられるETSrp遺伝子の発現を抑制した際に発現の変動を示した遺伝子群を同定し、血管芽細胞が如何にして間葉系の細胞から分化していくのか、そのメカニズムの解明を目指した。まずマイクロアレイ法を用いて血管系が形成されるタイミングで血管芽細胞分化を阻害することで1.5倍以上発現が上昇し再現性(n=2)を示した191プローブを抽出した。次にゼブラフィッシュのRefseq databaseを用いてBlast解析し、165遺伝子のannotationを確定した。これらの遺伝子のうちZFINデータベースに詳細な発生過程での発現パターンの報告を認めた32遺伝子を同定し、そのうち血管形成領域との関連が想定された11遺伝子を抽出することに成功した。これらの遺伝子群は、1)頭部の血管形成領域の神経組織や間質に特異的に発現している遺伝子、2)脳動脈の形成領域で発現を示す遺伝子、3)脳静脈の形成領域に近接した神経組織で発現を示す遺伝子、4)伸展する血管が接触する脳幹-脊髄の腹側領域で特異的な発現を示す遺伝子、5)脊索で特異的な発現を示す遺伝子の5パターンに大きく分類することができた。一方詳細な発現パターンが得られなかった遺伝子群に対しては、種間の保存性なども考慮したうえで68遺伝子を抽出し、DIG標識のRNAプローブを合成しin situ hybridization法を行い、発現パターンを確認した。その結果、前腎管や体節での発現を認めた3遺伝子で新規の発現パターンを得ることに成功した。以上の結果を踏まえて、現在TALEN法、あるいはCRISPR/Cas9法を用いて、これらの14遺伝子のノックアウト系統の作製を進めており、血管芽細胞分化との関連の解析を行う予定である。これにより、新たな関連遺伝子の同定や分化メカニズムの解明へとつながっていくことが期待される。平成23年度には、in silico解析による候補遺伝子のスクリーニングを行った。まず遺伝子リストのうち、遺伝子のアノテーションの付いたもの(上昇:83遺伝子、下降:154遺伝子)に関して、ゼブラフィッシュ関連の総合データベースであるZFINを用い、これまでの発現パターンや関連文献を検索し血管系との関係が報告されているかを確認した。

これを用いて遺伝子のアノテーションが付いていないもの(上昇:108遺伝子、下降:121遺伝子)に関して、DNAプローブの基となったEST配列を取得してblast解析を行い、ヒトやマウス遺伝子からオーソログなものを探索した。以上のin silico解析を466遺伝子に対して行い、ヒトやマウスでのホモログ遺伝子が同定され、かつ血管系との関係が報告されていないものの選定作業を現在継続して進めている。形態学的評価法の確立に関しては、正常に発生の進行した胚の透過型電子顕微鏡(TEM)、KOH消化法による走査型電子顕微鏡(SEM)による観察を行い、血管芽細胞の正常発生過程での形態的な変化の解析を進めている。平成23年度に行ったin silico解析による候補遺伝子のスクリーニングに関しては、アノテーションの付いたものに関して、ZFINからこれまで報告のあるin situ hybridizationの発現パターンや関連文献からなるデータベースを構築した。このデータベースをもとに詳細な解析を進めて、脳血管芽細胞の初期分化過程に一致して発現を認める遺伝子を5つ同定することに成功し、現在これらの機能解析の準備を進めている。また研究室内のコンピューターにゼブラフィッシュやヒト、マウスの最新の遺伝子情報のデータベースを構築し、Local blastを利用して集約的に解析するシステムの構築も完了し、ゼブラフィッシュ、マウス、そしてヒトのrefseqデータベースからオーソログ遺伝子の有無の判定が行えるようになっている。これらのin silico解析は当初の予定よりやや時間がかかったが、順調に進行している。形態学的評価法に関しても、正常発生した胚の観察を進めており、血管芽細胞の正常発生過程での形態的な変化をとらえつつある。平成24年度には、in silico解析による候補遺伝子のスクリーニングを終了させ、いくつかの遺伝子に対して、in situ hybridization法による発現部位の解析を行った。その結果、新規に動脈形成領域で特異的に発現する遺伝子(Tag-274)の同定に成功した。この遺伝子に対しては、系統樹解析を行い、ヒト・マウスでの相同遺伝子も同定した。現在機能解析の準備を進めている。このデータベースをもとに現在詳細な解析を進めており、脳血管芽細胞の初期分化過程に一致して発現を認める遺伝子を複数同定することに成功した。また研究室内のコンピューターにゼブラフィッシュやヒト、マウスの最新の遺伝子情報のデータベースを構築し、Local blastを利用して集約的に解析するシステムの構築も完了し、ゼブラフィッシュ、マウス、そしてヒトのrefseqデータベースからオーソログ遺伝子の有無の判定を進めている。
細胞微小環境の協奏的制御による神経組織の再生

本研究は、損傷した神経組織の再生するための生体内微小環境を模倣したナノマトリクスを開発することを目的としている。脳の細胞外マトリクスの構成成分の一つであるコンドロイチン硫酸にコレステリル基とメタクリロイル基を導入する手法を確立し、新規ナノゲルの開発に成功した。得られたナノゲルをビルディングブロックとしてタンパク質とエキソソームを複合化したナノマトリクスを開発した。神経変性疾患や脊髄損傷の治療を目的として、神経幹細胞移植による中枢神経系の再生が試みられているが、神経幹細胞のみを損傷部位に移植するだけでは、脳脊髄液の循環による移植細胞の分散やニューロン分化率の低さから、効果的な神経組織の再生は望めない。生体内において細胞の機能は、細胞間の相互作用や細胞周辺に存在する細胞外マトリクス、さらには細胞増殖因子やサイトカインによって厳密に制御されているためである。本研究は、神経幹細胞の機能を制御可能な人工細胞微小環境として、エキソソームと疎水化グリコサミノグリカン(GAG)ナノゲルを複合化したナノマトリクスの開発を行うことを目的としている。本研究で提案するエキソソームを組込んだナノマトリクスは、疎水化ナノゲルに内包した増殖因子によるシグナル伝達に加え、エキソソームにより遺伝子発現をコントロールすることで細胞機能を制御するものである。今年度は、基盤材料となる疎水化GAGナノゲルの合成とキャラクタリゼーションを行った。具体的には、まず、末端にイソシアネート基あるいはアミノ基を有するコレステロール誘導体を合成し、縮合反応によりGAG側鎖の水酸基あるいはカルボキシル基への導入を試みた。NMR測定の結果から、アミノ基を有するコレステロール誘導体を用いた方が効率的に導入可能なことが明らかとなった。次に、種々の置換率を有する疎水化GAGを合成し、動的光散乱測定により粒子径を算出した。直径数百ナノメートルの微粒子が形成されていることが確認され、疎水化GAGナノゲルの作製に成功した。続いて、疎水化GAGナノゲルを集積化するために、さらに重合性基の導入を試みたが、反応中におけるゲル化が観察され、現在条件検討を進めている。本研究では、神経幹細胞の増殖・分化などの細胞機能を制御するための人工細胞外マトリクスを構築することを目的としている。本年度はまず、昨年度に達成できなかった疎水化グリコサミノグリカン(疎水化GAG)ナノゲルに対する重合性基の導入条件の検討を行い、酸性ムコ多糖を主成分とする疎水化GAGナノゲルにメタクリロイル基を導入することに成功した。また、得られた重合性疎水化GAGナノゲルの動的光散乱測定から直径約100nmの微粒子を形成していることを明らかにした。さらに、重合性疎水化GAGナノゲルとチオール末端ポリエチレングリコール(PEGSH)を任意の割合で混合することによりナノゲルを集積化することに成功した。一方で、重合性基を有する疎水化GAGナノゲルの合成が順調に進まない可能性も想定し、中性多糖ナノゲルから構成される人工細胞外マトリクスの作製にも着手した。中性多糖ナノゲル集積マトリクスに関しては、in vitroにおいて幹細胞との相互作用について解析し、細胞形態や増殖、分化に影響を与えることを見出した。疎水化GAGナノゲルのキャラクタリゼーションとして、タンパク質との相互作用について検討を行った。その結果、疎水化GAGナノゲルはタンパク質と複合体を形成することが明らかとなった。疎水化GAGナノゲル集積マトリクスとエキソソームとの複合化について検討した。エキソソームは疎水化GAGナノゲル集積マトリクス内に安定に保持されることを見出した。ナノゲル、タンパク質、エキソソームが集積・複合化した人工細胞外マトリクスの構築に成功し、これらが協奏的に作用することで細胞機能を制御できる可能性が示唆された。平成26年12月1日に所属機関を異動したため、申請時点とは研究環境が大きく異なることとなった。現所属機関でも、研究計画を十分に遂行できる環境であるが、その準備に相応の時間を要したため、予定よりやや遅れている状況である。再生医工学昨年度中に研究環境は概ね整備されており、平成27年度はやや遅れている研究パートの疎水化GAGへの重合性基の導入を早急に進める。これまでは、反応性の高いアクリロイル基の導入を試みていたが、メタクリロル基などの官能基に変更することで合成中のゲル化の問題は解決可能だと考えている。動物実験の環境も整っており、ナノマトリクスが得られ次第、in vitroおよびin vivo試験に移行していく。所属機関の異動に伴う事務手続きにより、科研費の執行が数ヶ月ストップし、必要物品が購入できなかったため。多糖原料・合成試薬など昨年度不足した試薬を購入する。また、異動に伴い新たに購入する必要がでてきた、エバポレーターなどの少額備品の購入に使用する。今年度の助成金は申請書通り使用する。
エキスパート的意思決定過程のフィードバック型ニューラルネットワークモデルの設計

15年度は主に以下のような研究を行った。(1)まず従来型の意思決定のニューラルネットワークモデルについて、前述の協和モデルを含め、並列制約充足モデル、リスクティキングモデル等すべてにわたって、十分な検討を行う。そのためには、文献による検索だけではなく、海外を含めた各研究者との直接の情報交換を行った。(2)(1)での検討をふまえて、基礎となるフィードフォワード型のニューラルネットワークをコンピュータ上に構成し、シミュレーションを行ってその特性を十分研究した。(3)(2)で構成したシステムに、さらに、フィードバック機構を組み込んでシミュレーションを行い、その特性を研究した。(4)(3)で構成したシステムにおいてフィードバック機構の種類や構造を様々に変化させ、モデルの機能の拡張を行った。(5)当該ニューラルネットワークが想定している、フィードバック的心理処理を含む意思決定過程に相当する心理学実験を構成し、実際の人間の被験者で実験を行った。(6)(5)で用いた心理学実験と同じ実験材料、同じ実験方法を前提として、(4)のモデルでコンピュータシミュレーションを行い、(5)で行った人間での実験結果と比較検討した。(7)(6)の結果の考察をつうじて、モデルがより人間の意思決定における思考方法に近づくように改良した。さらに、16年度は15年度の成果に基づき以下のような研究を行った。(1)15年度の結果を踏まえて、単なる意思決定のモデルではなく、エキスパートにおける意思決定過程のモデルとして利用可能な形にモデルを発展改良した。(2)当該ニューラルネットワークが想定している、エキスパートにおけるフィードバック的心理処理を含む意思決定過程、に相当する心理学実験を構成し、実際エキスパートの被験者で実験を行った。(3)(2)で用いた心理学実験と同じ実験材料、同じ実験方法を前提として、(1)のモデルでコンピュータシミュレーションを行い、(2)で行った人間での実験結果と比較検討した。(4)(3)の結果の考察をつうじて、モデルがよりエキスパートの意思決定における思考方法に近づくように改良し、教育工学的応用の可能性を考察した。1.まず従来型の意思決定のニューラルネットワークモデルについて、前述の協和モデルを含め、制約充足モデル、リスクティキングモデル等すべてにわたって、十分な検討を行った。また、そのために、文献による検索だけではなく、海外を含めた各研究者との直接の情報交換を行った。2.1での検討をふまえて、基礎となるフィードフォワード型のニューラルネットワークをコンピュータ上に構成し、シミュレーションを行ってその特性を十分検討した。3.2で構成したシステムに、さらに、フィードバック機構を組み込んでシミュレーションを行い、その特性を研究した。4.3で構成したシステムにおいてフィードバック機構の種類や構造を様々に変化させ、モデルの機能の拡張を行った。5.当該ニューラルネットワークが想定している、フィードバック的心理処理を含む意思決定過程に相当する心理学実験を構成し、実際の人間の被験者で実験を行った。6.5で用いた心理学実験と同じ実験材料、同じ実験方法を前提として、4のモデルでコンピュータシミュレーションを行い、5で行った人間での実験結果と比較検討した。7.6の結果の考察をつうじて、モデルがより人間の意思決定における思考方法に近づくように改良することができた。

(3)(2)で用いた心理学実験と同じ実験材料、同じ実験方法を前提として、(1)のモデルでコンピュータシミュレーションを行い、(2)で行った人間での実験結果と比較検討した。(4)(3)の結果の考察をつうじて、モデルがよりエキスパートの意思決定における思考方法に近づくように改良し、教育工学的応用の可能性を考察した。
リソソーム蛋白LAPTM5によるTCR発現レベルの制御機構の解明

細胞表面上のT細胞抗原レセプター(TCR)の発現制御は、T細胞の活性化のみならず、過剰な活性化による自己応答性の抑制にも極めて重要である。抗原刺激後、細胞表面のTCRの発現量は細胞内への取り込みや分解などの経路を経て巧みに調節されているが、そのメカニズムは未だ不明な点が多い。我々は、リソソーム蛋白LAPTM5が、TCRの分解を介してT細胞の過剰活性化を抑制していることを明らかにした。本研究により、TCRを制御する新しい調節メカニズムを明らかにした。平成20年度の研究計画に基づき、以下の点を明らかにした。T細胞の活性化におけるLAPTM5の役割について、1、LAPTM5はT細胞抗原受容体(TCR)の発現を制御していることを明らかにした。2、LAPTM5欠損T細胞が、野生型T細胞と比較して、抗原刺激に対し過剰に応答することをin vitroの解析で示した。3、LAPTM5欠損マウスにおいて遅延型アレルギー反応が亢進することを明らかにした。4、LAPTM5はT細胞上のTCRの発現量を、TCR複合体の構成因子であるTCRC鎖と物理的に相互作用し、その蛋白分解を促進することで調節していることを明らかにした。5、このTCR制御機構には、LAPTM5のPYモチーフおよびユビキチン結合領域が重要であることを示した(以上は、immunity 29, 33-43, 2008に掲載)。また、6、既知のTCR発現制御分子、Cb1およびSLAPとの機能的相互関係を明らかにするため、それぞれの分子との二重欠損マウスを樹立した。7、T細胞におけるLAPTM5の機能をより明確にするために、T細胞特異的に発現するLAPTM5トランスジェニックマウスを作製した。LAPTM5がT細胞表面のTCR発現量を調節し、T細胞の過剰活性化を抑制してアレルギー反応や自己免疫反応を抑える機能を持つことが判明したことから、LAPTM5の欠損により自己免疫疾患が誘発される可能性が考えられる。そこで次年度においては、LAPTM5欠損マウスの長期飼育下における自己免疫疾患の自然誘発の観察を行う。LAPTM5欠損マウスにおける自己免疫疾患の発症の有無を検討することにより、自己免疫疾患発症のメカニズムの解明に大きく貢献でき、さらに自己免疫疾患の新たな治療法開発につながることが期待される。平成20年度の研究成果より、LAPTM5がT細胞表面のTCR発現量を調節し、T細胞の過剰活性化を抑制してアレルギー反応を抑えることが判明したことから、LAPTM5の欠損により自己免疫疾患が誘発される可能性が考えられた。そこで平成21年度においては、LAPTM5欠損マウスの長期飼育下における自己免疫疾患の自然誘発を観察した。その結果、劇的な自己免疫疾患の症状は観察されないものの、LAPTM5欠損マウスでは血中のIgM量、抗dsDNA IgMおよびIgG抗体が有意に上昇していた。またLAPTM5欠損マウスでは腎糸球体において自己抗体の沈着も観察された。以上のことから、SPF環境下で自己免疫疾患が自然発症するほどの強い制御破綻はないものの、LAPTM5が自己免疫疾患に関わる可能性を示唆し、誘導実験系を用いてより明瞭な結論が出せると確信する。また、TCR制御因子であるユビキチンリガーゼCbl-bとの機能的相互作用を検討するため、LAPTM5とCbl-bの二重欠損マウスを作製し解析したところ、二重欠損T細胞における抗原刺激後のTCR量がそれぞれの野生型および単独欠損マウスと比較して顕著に上昇していた。しかしながら、長期飼育した二重欠損マウスでは明らかな自己免疫疾患の症状は示さず、各単独欠損マウスと同程度の血中IgM量ならびに抗dsDNAの出現に留まった。以上の結果より、二重欠損による相乗効果が見られなかったことから、LAPTM5およびCbl-bがTCRの同じ調節経路で働く可能性が示唆される。今後、LAPTM5とCbl-bがどのように協調的にTCRの発現量を調節しているのか、これまでに知られていない新しいメカニズム解明につながる点で極めて意義深い。
ＧＬＰ－１の薬理活性を利用した新しい周術期血糖管理法の検討

新しい糖尿病治療薬であるグルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)関連薬剤は,低血糖を生じることなく優れた血糖降下作用が期待できる。本研究課題では,麻酔薬とGLP-1の相互作用について検討し,以下の研究成果を得た。1)イソフルランの吸入は, GLP-1の基礎分泌量を減少させた。2)デクスメデトミジンは,インスリン分泌を濃度依存性に抑制した。3) GLP-1はインスリンの分泌を増強したが,この効果にはイソフルランは影響を与えなかった。4) GLP-1はイソフルランによって生じた膵臓β細胞の過分極作用を拮抗した。5)プロポフォールは培養L細胞からのGLP-1の放出を抑制した。本年度は,各種麻酔薬(イソフルラン,プロポフォール,デクスメデトミジン)がインスリン分泌および内因性GLP-1分泌に及ぼす作用を検討し,これらの研究成果について学会発表を行った。1.膵頭灌流試験:正常雌性ラットから摘出した膵頭を用いた灌流試験において,イソフルラン(0.5 mM; 1MAC相当)は高血糖誘発性インスリン分泌(GIS)を抑制した。一方,プロポフォールは10 μMという高い濃度においてもGISに影響を与えなかった。デクスメデトミジンは,臨床使用濃度では有意な影響はなかったが,より高濃度(10 μM以上)ではGISを抑制した。2. in vivo GLP-1濃度測定試験:各種麻酔薬がGLP-1分泌に及ぼす影響をラットを用いたin vivo実験系で検討した。それぞれの麻酔薬の麻酔深度は,ラットの正向反射が消失する最小投与量で行った。その結果,イソフルランおよびプロポフォールは,同程度にGLP-1の血中濃度(5-10 pM)を低下させた。一方,デクスメデトミジンはGLP-1濃度に影響を及ぼさなかった。3. in vitroGLP-1分泌試験:イソフルランおよびプロポフォールのGLP-1分泌抑制作用の機序を解明するために,ヒト腸管NCI-H716細胞からのGLP-1分泌に対する影響を検討した。NCI-H716細胞の細胞外グルコール濃度を増加すると,濃度依存性にGLP-1の分泌量が増加し,この反応をイソフルラン(0.5 mM)とプロポフォールは(10 μM)は抑制した。以上の成果から,麻酔薬のインスリン分泌および内因性GLP-1分泌に及ぼす作用は,麻酔薬の種類によって異なることが示された。今後,これらが臨床上どのような意義があるか検討をする必要がると考えられる。本研究課題の主要な目的は,麻酔・鎮静薬がGLP-1の分泌動態および薬理活性に与える影響とその機序を明らかとすることである。特に,平成24年度では,内因性GLP-1の分泌動態に及ぼす各種麻酔・鎮静薬(イソフルラン,プロポフォール,デクスメデトミジン)の影響をin vivoモデルを用いて検討した。まず,無麻酔のラットに対して,グルコース(150mg)の経口負荷が内因性GLP-1を10pM前後の基礎分泌量から20-30pMまで増加することを明らかとした。このモデルを用いて,各種薬物の影響を検討した。イソフルランについては, 1.0MAC相当の濃度の吸入(自発呼吸)によりグルコース負荷による内因性GLP-1分泌増加が有意に抑制された。イソフルランのGLP-1分泌抑制の程度は,イソフルランの耐糖能異常と相関していたことから,イソフルランによる内因性GLP-1分泌抑制作用は,イソフルラン麻酔時のインスリン分泌抑制作用の機序の一つと考えられる。一方,起立反射が抑制される最小量のプロポフォールおよびデクスメデトミジンは,グルコース負荷による内因性GLP-1分泌増加に影響を与えなかった。プロポフォールやデクスメデトミジンのインスリン分泌能に及ぼす影響についての報告はこれまでにないが,今回の結果からは,これらの薬剤は,イソフランと異なりGLP-1を介するインスリン分泌に影響を与えないものと推測される。以上のin vivo研究に加えて,膵島灌流試験の予備研究を行った。その結果,外因性GLP-1の投与による一過性のインスリン分泌増加を引き起こす作用を再現することができた。今後,膵島灌流試験においてもin vivo研究と同様な傾向がみとめられるかどうかの検討を行い,来年度以降の詳細な機序や各種麻酔薬間の相互作用の検討につなげたいと考えている。グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)関連薬剤は,低血糖の危険性が少ない糖尿病薬であり,周術期血糖管理にも有効である可能性がある。

本研究課題では,麻酔・鎮静薬がGLP-1の分泌動態および薬理活性に与える影響とその機序を検討し,以下の研究成果を得た。1)内因性GLP-1の分泌は, 1MAC相当のイソフルラン麻酔で抑制される。このことは,イソフルラン麻酔中のインスリン分泌抑制効果の原因の一つである可能性が示唆される。2)イソフルラン(0.5 mM)は培養小腸L細胞の血糖依存性GLP-1分泌反応を抑制する。一方,静脈麻酔薬であるプロポフォールは,影響を与えなかった。3)ラット膵臓から酵素法を用いて,ランゲルハンス島を単離し,膵頭灌流試験を行った。イソフルランは,高血糖により誘発されるインスリン分泌を有意に抑制させた。一方, GLP-1は濃度依存性に高血糖により誘発したインスリン分泌反応を増強した。このGLP-1のインスリン分泌増強効果にイソフルランは有意な影響を与えなかった。この結果は,外因性GLP-1 (10 nM)の薬理効果は,全身麻酔中に抑制されない可能性を示唆している。つまり,外因性GLP-1は,周術期の血糖調節薬としての有効性が推測できる。4)ラットの膵臓から膵臓β細胞を単離し,パッチクランプ法のwhole-cell current-clampモードで膜電位を記録した。高血糖では膜電位が脱分極側に変化するが,外因性GLP-1 (10 nM)のBath投与によりその効果が有意に増強した。イソフルラン(0.5 mM)は,高血糖による膵臓β細胞の脱分極反応を抑制するが, GLP-1存在下ではその効果は棄却される。一方,外因性GLP-1による膵臓β細胞の脱分極反応はイソフルランにより影響を受けなかった。周術期管理学本研究課題の現在までの到達度は概ね計画通りに進行していると考えられる。特に, in vivoでの実験成果がNCI-H716細胞を用いたin vitroでの実験系でも再現できた。このことにより,イソフルランとプロポフォールがGLP-1の分泌を抑制する機序に関して,それぞれ異なるイオンチャネルを介する作用であることが明らかとなった。来年度は,これらの相互作用を明らかにすることにより,麻酔中のGLP-1分泌の抑制を予防する方法を検討していきたい。また,内因性GLP-1分泌に対する麻酔薬の影響に関しては,ほぼ予定どおり全ての麻酔薬での検討を終えることができ,成果の一部は学会で発表した。一方,外因性GLP-1によるインスリン分泌に対する各種麻酔薬の影響に関しては,ラットにおけるGLP-1投与の指摘投与量の設定に予定よりも時間がかかった。ただし,インスリン濃度に僅かに影響する少量投与量と,明らかな分泌亢進がみられる高投与量を決定することができた。当初の予定では,今年度中に外因性GLP-1投与試験を開始する予定であったが,次年度からのスタートとなった。このため本実験に使用するGLP-1および実験動物購入のための研究費が未使用となり来年度に持ち越しとなった。これまでの研究計画はおおむね順調に進展していると考えられる。ただし,今回は,イソフルラン,プロポフォール,およびデクスメデトミジンについて検討したが,他の麻酔薬(セボフルラン,エトミデート,チアミラール)についてはまだ研究を行えていない。セボフルランについては実験用気化器を用意できており予備実験も終えていることから期間内に実験を行えると考えられる。
細胞膜におけるタンパク質集合の制御機構

本研究では、細胞膜におけるタンパク質集合の制御機構を解明することを目的として、脂質膜の構造と流動性に与えるタンパク質の影響を調べた。diphenylhexatriene(DPH)の蛍光異方性を利用した研究により、アミロイドβペプチドは脂質膜の流動性を低下させることが示されていた。しかし、DPHは脂質膜からペプチド、タンパク質に移行するため、DPH蛍光異方性は脂質膜の流動性に対するタンパク質の影響を調べる目的には不適切であることがわかった。そこで、本研究では、脂質膜の構造や物理的性質を調べるための新規手法を開発した。細胞がシグナル伝達を行う際には、受容体や細胞内の膜アンカー型シグナル伝達分子が膜内の局所に集合し、伝達の効率を高めていると考えられている。一方で、アミロイドβペプチド(Aβ)の病原型構造への転移の際にも、タンパク質の細胞膜局所に集合する性質が関与している。従って、細胞の本来の生理機能に影響を与えることなく、膜内におけるタンパク質の集合を阻止できれば、様々な病気の予防や治療が可能になると期待される。本課題では、細胞膜の内在性レセプターを標的としてタンパク質が集合するという従来の考え方とは異なる、脂質膜そのものが流動性やパッキングの高低差を利用してタンパク質集積の場を生み出すという新しいアイディアに立脚し、膜タンパク質集合のOn-Offスイッチ機構を解明することを目的とする研究を遂行中である。現在、脂質膜の流動性を見積もる方法として、1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH)の蛍光異方性が汎用されている。過去に行われた多くの研究により、細胞膜やリポソームにAβを添加すると、膜中のDPHの蛍光異方性が増大することが報告されている。これを根拠として、Aβは脂質膜の流動性を低下させる作用を持つと考えられている。しかし、本研究課題を遂行する過程で、DPHを含む脂質膜にAβを添加すると、DPHが脂質膜から脱離して、会合状態にあるAβペプチドと結合する場合があることが見出された。DPHの動きはAβのオリゴマーや線維に結合することにより強く制限されると考えられるため、DPH蛍光異方性は、脂質膜の流動性を正しく反映しない可能性がある。平成25年度には、DPH蛍光異方性の利用について厳密な再検証を行い、Aβ共存下では膜流動性の計測手段として不適切であることを明らかにした。また、顕微ラマン分光法を用いて細胞膜局所の流動性を計測するための新規手法を開発した。アミロイドβペプチドの病原型構造への転移やウイルスの感染・出芽には、タンパク質の細胞膜局所に集合する性質が関与している。従って、シグナル伝達など細胞の本来の生理機能に影響を与えることなく、膜内におけるタンパク質の集合を阻止できれば、様々な病気の予防や治療が可能になると期待される。24年度は、脂質分子のパッキング状態がタンパク質の脂質膜に対する親和性に与える影響を調べた。細胞膜には、周囲の膜とは組成や物理的性質の異なるミクロドメインが点在し、プリオン病やアルツハイマー病など神経変性疾患の発症と密接に関わっていると考えられているが、本研究により、プリオンタンパク質の中央部疎水領域とアミロイドβペプチドは、両者に共通する特徴として、構成脂質が密にパッキングするラメラゲル相膜に対して高い親和性を持つことが明らかになった。さらに、膜の相の違いは、親和性のみならず、ペプチドの二次構造にも影響する可能性も示された。これまでに得られた結果から、ペプチドの病原型構造への転移メカニズムを解明するには、糖鎖や電荷など膜表面の化学組成・性質のみならず、脂質分子のパッキング状態がペプチドと膜の相互作用に与える影響も考慮に入れる必要があることが示された。また、タンパク質が脂質膜の流動性に与える影響を調べるための主な手段であるDPH等プローブ分子の蛍光異方性の利用について再検証を行なった。その結果、本法の利用にはプローブの結合部位の検討が必要であることがわかった。アミロイドβペプチド(Aβ)の病原型構造への転移やウイルスの感染・出芽の際、特定のタンパク質の細胞膜局所に集合する性質が関与していると考えられる。本課題では、細胞膜の内在性レセプターを標的としてタンパク質が集合するという従来の考え方とは異なる、脂質膜そのものが流動性やパッキングの高低差を利用してタンパク質集積の場を生み出すという新しいアイディアに立脚し、膜タンパク質集合のOn-Offスイッチ機構を解明することを目的とする研究を行った。脂質膜の流動性を見積もる方法として、1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH)の蛍光異方性が汎用されている。

しかし、25年度までの本研究遂行過程で、DPHは脂質膜から会合状態にあるAβペプチドへ移行する性質を持つことが明らかとなった。従って、細胞膜やリポソームにAβを添加するとDPHの蛍光異方性が増大することを根拠として、Aβは脂質膜の流動性を低下させる作用を持つとした従来の解釈は再検証される必要がある。また、脂質膜の流動性や硬さを計測するためには、DPH蛍光異方性に代わる新たな手法も必要となる。そこで、26年度は以下の研究を行った。(1)脂質膜に結合させたアゾベンゼン誘導体の共鳴ラマン散乱を利用して脂質膜の秩序性を計測する新規手法を開発した。見出された共鳴ラマンプローブと顕微ラマン分光装置を組み合わせると、単一細胞中の径1μm程度の限られた領域の膜秩序性を計測することも可能である。(2)コレステロールが脂質膜中において会合する性質は膜タンパク質の集合・離散の制御に重要な意味を持つと考えられている。蛍光性のコレステロール誘導体であるdehydroergosterol(DHE)を用いて膜中における存在状態の解析が試みられた例はあるが、会合したDHEは自己消光により蛍光を発さなくなるという問題があった。本研究では、DHEの円偏光二色性を用いて会合状態の解析が可能であることを明らかにした。構造生物学当初の計画では、主にタンパク質による脂質膜流動性の制御メカニズムの解明を25年度に行う予定であった。しかし、これまで多くの研究者により脂質膜流動性の計測手段として利用されていたDPH蛍光異方性測定が本研究の目的には適さない可能性が出てきたため、以下のように計画を一部変更した。得られた成果は、本研究が関連する研究領域の進展に極めて重要である。このため、本研究は順調に進展していると判断した。(1)タンパク質が脂質膜の流動性に与える影響をDPH蛍光異方性を利用して調べると、蛍光プローブの膜からペプチドへの移行により誤った情報が得られる可能性がある。このことは本研究遂行上の妨げになるだけでなく、他の多数の研究者により報告されていた類似する研究の結果の解釈にも影響を及ぼす。このため、25年度には、DPH蛍光異方性の利用について厳密な再検証を行うことを最優先とした。この検討の結果、DPH蛍光異方性を用いることができる限界を明確に示すことができた。(2)DPH蛍光異方性は、本研究で実施するタンパク質が脂質膜の流動性に与える影響を調べる方法として適さないことが明らかになったため、これに代わる他の方法の開発を行った。この結果、顕微ラマン分光法と共鳴ラマンプローブを用いることで、脂質膜内局所における流動性を、高い空間分解能で計測することが可能となった。この新規手法は、リポソームだけでなく、細胞膜の流動性の解析にも用いることができるため、26年度に行う生細胞のin situ構造解析に利用される予定である。当初の24年度の研究計画では、タンパク質のアミノ酸配列と(1)タンパク質-脂質間の親和性、および(2)脂質膜の流動性との関係を明らかにことを目標としていた。以下、項目ごとに現在の達成度を述べる。(1)アミロイドβペプチド(Aβ)はガングリオシドなど負電荷を持つ酸性脂質に高い親和性を持つ。
乳幼児呼吸器感染症の病原体網羅的検出法の構築および脳症、脳炎との関連解析

呼吸器感染症の病原体は多く報告されている。本研究では、特にウイルス感染症に焦点を当て、multiplex real-time PCR法を用いた18の呼吸器ウイルス検出系を構築し、乳幼児呼吸器感染症検体を用いて、1年間を通した病原体検出、流行解析をおこなった。その結果、(1)呼吸器ウイルス感染症のうち、約45%は、2種以上の複数ウイルス陽性例であること、(2)複数ウイルス陽性例は、特に春季に高い割合を示すことを明らかにした。従来、単一病原体に起因すると考えられていた呼吸器感染症において、複数の病原体共存例が多いことが示唆され、今後、共存の意義の解析が必要であると考えられた。呼吸器感染症の病原体は、200種以上存在することが報告されている。原因病原体を迅速かつ正確に検出、同定することは、有効な治療法決定、感染症拡大予防のみならず病原体の詳細な流行解析が可能となることから治療、予防、流行解析の観点から重要である。本年度、我々は、呼吸器感染症病原体のうち、特にウイルス感染症に焦点を当て、近年、発見されたばかりのヒトボカウイルス(HBoV)、ヒトコロナウイルス(HKU1,NL63,229E)を含む18種のRNAウイルス、DNAウイルスを検出可能なmultiplex real-time PCR法を用いた検出法を構築した。臨床検体を用いて検討した結果、対象とするすべてのウイルスが検出可能であった。また、RSウイルスについては、サブグループA、B、ヒトパラインフルエンザウイルスについては1-4型の型別が可能であった。本年度は、検出したウイルスの中で、特に国内における流行像が不明であったHBoVを中心に解析を実施した。その結果、HBoVは春季を中心とした流行であること、HBoV陽性検体のうち約半数は他の呼吸器ウイルスとの共検出であること、定量解析の結果から単独検出検体中のウイルス量は、共検出検体と比較して有意に高いことが示された。乳幼児を主な対象とした調査では、HBoV陽性者の年齢分布は、3歳未満が全陽性者の95%を占め、特に6ヶ月-2歳において高い検出率を示した。一方、構築したmultiplex real-time PCR法を用いた結果、国内における検出が未報告であるヒトコロナウイルスHKU1を呼吸器感染症患者由来5検体から初めて検出した。現在、分子疫学的手法を用いて陽性株の遺伝学的解析を進めている。呼吸器感染症の原因病原体を迅速かつ正確に検出、同定することは、有効な治療法の選択、感染症拡大予防、流行解析の観点から重要である。昨年度構築した18種ウイルスに対するmultiplex real-time PCR法に加え、本年度は同手法を用いた細菌6種(百日咳菌、肺炎球菌、レジオネラ属菌、A群溶血性連鎖球菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌b型、マイコプラズマ)の検出系を構築し、レジオネラ属菌を除くすべての細菌について、臨床検体からの検出を確認した。ウイルスについては、2009年10月2010年9月の1年間に採取された呼吸器感染症由来428検体のうち362検体(84.6%)から597のウイルスを検出した[1種ウイルス陽性(55.2%)、2種以上のウイルス陽性(44.8%)]。複数ウイルス陽性例は、4、5月の春季を中心に高い割合を示したことから、春季の風邪様症状は、遷延化および症状が複雑化する可能性が示唆された。ライノウイルス、ヒトボカウイルスは、他の呼吸器ウイルスとの共検出率が高いことから、共検出が臨床症状に与える影響の解析が必要と考えられた。本研究では、国内における知見が少ないライノウイルスの遺伝グループCについて流行期を解析し、主に冬季を中心とした流行であること、遺伝グループAとは異なる流行期であることを示した。また、多項目の呼吸器感染症病原体検出を継続的に実施することで、2010年夏を中心に起こったエンテロウイルス68型の流行を国内で初めて報告するとともに検出株のゲノム配列の解読、解析結果を報告した。調査した不明熱、熱性けいれん由来検体からも呼吸器ウイルスが検出され、症状との関連が示唆された。一方、脳炎・脳症由来検体については、髄液からの呼吸器ウイルス検出は稀であるが、呼吸器由来検体からは検出が散見されるため、その関連について継続した調査が必要であると考えられた。
妊娠,輸血,移植における血小板不適合の臨床的意義の検討

2)新生児血小板減少性紫斑病の研究:これまでの研究で、本邦でYuk^a型不適合20症例、Yuk^b型不適合3症例、Bak^a型不適合5症例、Br^a不適合1症例を我々は確認した。このうち、Yuk^b型不適合の1症例とBak^a型の2症例で新生児に血小板減少による脳内出血が認められている。我々は現在、全国の病院でprospective studyを開始している。新生児血小板減少性紫斑病の疾患概念が広く認識されてきているので急速に、症例が蓄積されると推定している。3)輸血患者での血小板抗体についての研究:輸血患者の血小板抗体スクリーニングを実施し、輸血患者では抗Sib^a抗体と抗Br^a抗体が多いことを明らかにした。4)血小板抗体の同定検査に関する研究:血小板抗体スクリーニングで検出された抗体の特異性は、血小板抗体の同定検査パネルがなければ分析出来ない。我々は世界で初めてルーチン検査として使用可能なパネルを完成した。稀な血液型パネルを確保するには血小板パネルの長期保存が必須であった。我々は今回の研究で、血小板をマイクロタイタ-プレートに固相し、保存液として5%サッカローズ溶液を加え-40°C以下で凍結すれば、膜の凍結障害もなく半永久的に血小板抗原パネルを保存出来ることを見いだした。現在、諸外国でこの方法が試みられ、一定の評価をえてきている。1.血小板型については現在、HPA(Human Platelet Antigen)として1-5型が公認されている。最近新しい血小板型が続々と欧米で報告されているが、フィンランドでR.Kekomakiらにより新生児血小板減少性柴斑病で発見されたTu^a型はフィンランド人では0.7%しか陽性者がいないが、本邦ではその約10倍の7%に陽性者がいることを見い出した。このことはフィンランド人(フィン族)は元来、アジア系と言われていることと関連していると思われる。本邦でTu^a型が7%も存在することは、本邦でもTu^a型が新生児血小板減少性柴斑病および血小板輸血不応答に関与している可能性が推定された。2.血小板抗体の特異性解明には血小板抗体同定用パネルの確立が必須であったが、今年度の研究でHPAの1-5とNak^a型、上記のTu^a型を含む12パネルが完成した。今後、赤血球抗体の同定検査と同程度の簡便性で血小板抗体の同定が世界で初めて可能になった。マイクロプレートへの血小板の固相にグルタール液を用い、血小板膜の活性化を防止しえたこと、および凍害防止剤としてサッカローズを用いることにより、膜に損傷をきたすことなく固相血小板を凍結保持できるようになったことが同定用血小板12パネルの完成に役立った。3.輸血暦のある患者3,600人の血清について、血小板抗体をスクリーニング検査し以下の知見を得た。抗HPA2b抗体が10例(0,25%),抗HPA3a抗体が2例(0,05%)抗HPA4b抗体が3例(0,05%),抗HPA5b抗体が6例(0,15%)このことから輸血を受けた患者では約0,5%に血小板抗体が産生されており、赤血球の温式抗体なみの検出頻度であることが、世界で初めて明らかとなった。4.今後は妊娠での血小板抗体産生ことに新生児血小板減少性柴斑病との関係を明らかにする予定である。1)血小板型について研究:フィンランドで新生児血小板型不適合症例で発見された新しい血小板型Tu^aが本邦で薬5%(15/314)で陽性者が存在することを確認した。確認の方法として血清学的には我々の開発MPHA法を用いた。血小板型のDNAタイピングにはRPLPを用いた。血清学的ならびにDNAタイピングの結果は完全に一致した。

他のヨーロッパ人ではTu^a型の陽性者は殆どいないのにフィンランド人はフィン族でアジア系なので日本人と共通性があると推定された。我々は、つい最近、日本人の分娩経験婦人の献血者に抗Tu^a抗体を検出した。本邦でも約5%もTu^a型の陽性者が存在することから、新生児血小板減少性紫斑病に関与している可能性が示唆された。2)新生児血小板減少性紫斑病についての研究:本疾患の原因抗体として抗Bak^a抗体はしばしば経験されて来たが、これまで検出出来なかった低力価の抗Bak^a抗体でも重篤な新生児血小板減少性紫斑病が生じることを世界で初めて明らかにした。血小板は活性化を防いで、分離、固相し軽度に固定すれば低力価の抗Bak^a抗体が検出出来るようになった。その後の2症例でも低力価の本抗体による新生児血小板減少性紫斑病を経験している。他の血小板型と異なり、Bak^a型は血小板にしか表現されていないので、血小板の減少性が著しくなり、症状も重篤になると推定される。3)血小板抗体スクリーニング法の開発に関する研究:血小板輸血の需要は急激に増加している。しかし、繰り返し血小板輸血を実施すると、抗体(抗HLA抗体と抗血小板抗体)が患者に産生され、それ以後の血小板輸血が無効となる。したがって、血小板抗体のスクリーニング法の開発は重要である。我々の開発した血小板膜よりの抽出抗原を用いる方法は大変すぐれ、殆どの抗体を検出しえることが明確になった。
KSHV免疫回避膜タンパク質MIRによる標的認識機構の分子基盤解明

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、免疫回避を担う膜結合型E3ユビキチンリガーゼMIRを発現し、宿主細胞表面の免疫タンパク質を分解する。我々は以前、MIRが膜貫通領域と細胞外領域で基質を認識することを見出した。本研究では、MIRによる基質認識の分子基盤を解明するため、膜貫通領域と細胞外領域からなる組換えMIRを作製した。得られたMIRを人工脂質二重膜であるナノディスクに再構成し、溶液NMRによるHSQCを測定したが、シグナルが低く構造決定には至らなかった。MIRの分子安定性を改善するため、MIRの変異体解析を行い、MIRの細胞質尾部がMIR構造を安定化するために必須であることを明らかにした。平成27年度は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)の免疫回避分子であるMIR1の膜貫通領域とその近傍を含むポリペプチドを、膜骨格タンパク質MSP1D1によりリン脂質を束ねたナノディスクへと再構成し、溶液NMRによる1H-15N HSQCを測定した。しかしながら、得られたMIR1由来のシグナルは、DPCミセル中で得られたものと比較して非常に低い強度であった。本研究ではDPCミセル中において不安定なMIRタンパク質の安定性向上を目的としたナノディスクへの再構成を試みているが、一方で分子量が増大したことでシグナル強度が大幅に下がったと考えられた。サイズが小さいナノディスクを用いることで分子量の増大を抑えることができるため、通常よりも短いMSP1タンパク質を設計し、これを用いたナノディスクを作製した。その一方で、KSHV MIR2についても膜貫通領域とその近傍のポリペプチドを大腸菌を用いて大量発現させ、これをMIR1と同様の方法で精製することに成功した。界面活性剤ミセルではなくナノディスクを用いることによる分子量の増大は予想されていたものであり、今後は高磁場のNMRを用いてのTROSY等による測定に移る予定だが、ナノディスクを小さくすることが可能であれば今後の解析においてより好ましい結果が見込まれる。そこで当初の研究計画にはないナノディスクの小型化を行っており、進行はやや遅れている。平成28年度は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus: KSHV)の免疫回避を担うウイルス膜タンパク質であるMIR1の構造解析を目的とし、膜貫通ヘリックスとその近傍を含むhelix-hairpin-helix構造と推定されるポリペプチドについて、通常よりも小型化したナノディスクへのin vitro再構成を試みた。しかしながら、ポリペプチドの長さを短くした変異型の膜骨格タンパク質MSP1D1を作製し、常法に従ってナノディスクを構成してその粒子径を測定した結果、通常の長さのMSP1D1で作製したナノディスクと同様であったことから、小型ナノディスクの作製には何らかの工夫が必要であることが示唆された。一方、本実験と並行して行ったMIR1の変異体解析により、本実験でin vitro再構成を試みているMIRポリペプチド、すなわち2本の膜貫通ヘリックスとそれらをつなぐ短い細胞外ループのみでは、細胞膜において構造が不安定になることを示す結果を得た。通常の膜タンパク質では、膜貫通ヘリックスと細胞質領域、特に特定の構造をもたないと推定される細胞質領域の場合は、構造的に関連性がなくそれぞれ独立していると考えられており、実際に膜貫通ヘリックスのみでのin vitro再構成によるNMR立体構造解析の例がいくつも報告されているが、MIR1の場合は膜貫通ヘリックス(とそれらをつなぐ細胞外ループ)のみでは不適当であり、細胞質側の一部の領域も重要な役割を持っている可能性が見出された。溶液NMRによる立体構造解析のため、膜内再構成を実現するための最小限の長さのMIRコンストラクトを作製して研究を行ってきたが、H28年度に実施した研究の成果により、膜貫通ヘリックスよりも細胞質側の一部の領域が、膜貫通ヘリックスの構造安定へ寄与している可能性が見出された。これまでに実施してきたMIRのミセル再構成によるNMR解析や、ナノディスクへの再構成がうまくいかなかった原因は、この点にあるのではないかと考えられる。また、研究実施期間中に所属研究室主任の他機関への転出があり、機器の再整備など、研究実施体制の構築に時間を要した。前年度までの研究において、ミセルおよびナノディスク中での溶液NMR測定のために準備したカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスMIR1由来の組換えポリペプチド、すなわち2本の膜貫通領域とそれらをつなぐループ(ヘリックス-ヘアピン-ヘリックス)のみでは構造不安定となることが明らかになったことを受け、平成29年度はその詳細について検討した。その結果、それぞれの膜貫通領域の細胞質側について、十分な長さの領域を有することが、細胞膜上におけるMIR1およびMIR2の安定発現に必要であることが明らかになった。また、ユビキチン化活性を担う細胞質N末端のRINGドメインと、認識を担うヘリックス-ヘアピン-ヘリックス、さらに安定発現のために十分な長さのC末端側細胞質領域を確保し、それ以降の細胞質領域を欠損させた変異体においても、MIRのユビキチン化活性は保たれていなかった。これらのことから、活性の面においてもヘリックス-ヘアピン-ヘリックスのみでは不十分であることが示唆された。これら成果を受けて細胞質領域の特にC末端側の役割について詳細な検討を行い、MIR2はMIR1に比較してより細胞質C末端側の天然変性領域を、安定発現と活性保持に必要とすることが判明した。本研究はウイルスユビキチンリガーゼMIRによる宿主タンパク質の認識

機構を構造生物学的に解明するために始まり、その目的の達成には至らなかったが、構造を有しないと予測されているMIRの細胞質尾部が、細胞膜で区切られた膜貫通領域の安定性を制御するという新しい知見を得ることができた。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、免疫回避を担う膜結合型E3ユビキチンリガーゼMIRを発現し、宿主細胞表面の免疫タンパク質を分解する。我々は以前、MIRが膜貫通領域と細胞外領域で基質を認識することを見出した。本研究では、MIRによる基質認識の分子基盤を解明するため、膜貫通領域と細胞外領域からなる組換えMIRを作製した。得られたMIRを人工脂質二重膜であるナノディスクに再構成し、溶液NMRによるHSQCを測定したが、シグナルが低く構造決定には至らなかった。MIRの分子安定性を改善するため、MIRの変異体解析を行い、MIRの細胞質尾部がMIR構造を安定化するために必須であることを明らかにした。本研究で新たに作製した小型ナノディスクについて動的光散乱法により分子径を測定し、設計通り直径が小さくなっていることを確認する。次に、小型ナノディスクへMIR1ポリペプチドを再構成し、再びHSQCを測定してMIR1を再構成した小型ナノディスクの有効性の評価を行う。DPCミセルへの再構成に比較してシグナルが良好になれば、この新しいナノディスクにMIR2を再構成してNMRによる立体構造解析を行っていく。膜貫通ヘリックスの構造安定化に寄与する、膜貫通ヘリックス外の領域の特定と、その分子メカニズムを解明する。その結果を踏まえてNMR用のMIRコンストラクトを新たに設計・作製し、ミセルやナノディスクへのin vitro再構成と溶液NMRによる構造解析を遂行する。タンパク質科学H28年度中の研究成果を受けてその後の研究実施内容に変更が生じたため、小額ながら次年度使用額が発生した。研究実施内容の変更により、達成度が予定よりもやや遅れているため、次年度使用額と次年度交付分を合わせて次年度の研究実施のために使用する。