hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高速衝撃を受ける粉粒体のための粒子間力学モデルの構築

粉粒体モデルとして,四角形容器にランダム充填したプラスチック球の集合体を用い,その上表面の中心に,鋼球飛翔体(直径12.0mm)を衝突させ,その衝撃時の挙動を,2台の高速度ビデオカメラ(側面からと上方から)による撮影および三次元離散要素法によるシミュレーションにより,詳細に調べた.昨年に比べ,容器のサイズを8倍にし,容器の影響をできるだけ排除するようにした.また,プラスチックス球には約10万個のスチレン球(質量は三種類0.12g,0.25g,0.33g)を用い,球の質量の影響を調べた.粉粒体の高速衝撃を支配する因子を調べるために,飛翔体の衝突速度(125m/s)と衝突角度(0°65°)も変化させた.その結果,条件により飛翔体の挙動は,粉粒体の中に貫入したり,粉粒体に貫入しなかったりした(跳ね返るもしくは,貫入せずに,粉粒体の表面を沿うように進む).本実験の条件下では,Johnsonら(1976)の結果と異なり,飛翔体の挙動は飛翔体と粒子の密度比に加え,飛翔体と粒子の直径の比にも依存した.そこで,直径比を含むようにJohnsonらの実験式を改良した新しい式を提案した.また,飛翔体の衝突速度および衝突角度は,飛翔体の跳ね返り速度および粉粒体の飛散挙動に大きな影響を与えた.この現象が生じる要因を,離散要素法シミュレーションを用いて調べた.まず,昨年度に提案した粒子問の力学モデルのさらなる改良を行い,本年度の条件下でも力学モデルの妥当性を確認した.その力学モデルを用いて調べたところ,粉粒体中を伝わる接触力は400m/s程度で非常に遅いものの,その大きさおよび伝播方向が重要な役割を担っていることが分かった.解析対象として,四角形容器にランダム充填したナイロン球の集合体(粉粒体モデル)を用い,その上表面の中心に,鋼球飛翔体(直径6.3mm)を衝突させ,その衝撃挙動を,2台の高速度ビデオカメラによる二方向からの撮影および三次元離散要素法によるシミュレーションにより詳細に調べた.用いたナイロン球の集合体は,タイプ(I)直径6.35mmの球5000個と直径4.76mmの球5000個,タイプ(II)直径6.35mmの球8000個,タイプ(III)直径4.76mmの球19000個の三種類である.ランダム充填した粉粒体の高速衝撃現象を支配しているパラメータを調べるために,飛翔体の衝突速度(120m/s)および衝突角度(0°70°)を変化させた.その結果,飛翔体の挙動は,粉粒体の中に貫入,粉粒体に貫入しない(跳ね返るもしくは,貫入せずに,粉粒体の表面を沿うように進む)に大別でき,その挙動は主に飛翔体の衝突速度および衝突角度により変化することがわかった.また,飛翔体の衝突速度,衝突角度および大きさにより,飛翔体の跳ね返り速度や角度および粉粒体の飛散挙動も大きく変化した.このような現象が生じる原因を離散要素法シミュレーションより調べた.まず本実験結果を上手く再現できるように,粒子間の力学的モデルの改良を行った.個々の粒子について,高速衝突時の弾塑性挙動を再現できるように改良したところ,衝撃現象を上手く再現でき,粉粒体を伝播する接触力の大きさおよび伝ぱ方向が重要な役割を担っていることが分かった.粉粒体モデルとして,四角形容器にランダム充填したプラスチック球の集合体を用い,その上表面の中心に,鋼球飛翔体(直径12.0mm)を衝突させ,その衝撃時の挙動を,2台の高速度ビデオカメラ(側面からと上方から)による撮影および三次元離散要素法によるシミュレーションにより,詳細に調べた.昨年に比べ,容器のサイズを8倍にし,容器の影響をできるだけ排除するようにした.また,プラスチックス球には約10万個のスチレン球(質量は三種類0.12g,0.25g,0.33g)を用い,球の質量の影響を調べた.粉粒体の高速衝撃を支配する因子を調べるために,飛翔体の衝突速度(125m/s)と衝突角度(0°65°)も変化させた.その結果,条件により飛翔体の挙動は,粉粒体の中に貫入したり,粉粒体に貫入しなかったりした(跳ね返るもしくは,貫入せずに,粉粒体の表面を沿うように進む).本実験の条件下では,Johnsonら(1976)の結果と異なり,飛翔体の挙動は飛翔体と粒子の密度比に加え,飛翔体と粒子の直径の比にも依存した.そこで,直径比を含むようにJohnsonらの実験式を改良した新しい式を提案した.また,飛翔体の衝突速度および衝突角度は,飛翔体の跳ね返り速度および粉粒体の飛散挙動に大きな影響を与えた.この現象が生じる要因を,離散要素法シミュレーションを用いて調べた.まず,昨年度に提案した粒子問の力学モデルのさらなる改良を行い,本年度の条件下でも力学モデルの妥当性を確認した.その力学モデルを用いて調べたところ,粉粒体中を伝わる接触力は400m/s程度で非常に遅いものの,その大きさおよび伝播方向が重要な役割を担っていることが分かった.
ヒドロ虫類の生殖細胞系列分化における多様性に関する系統進化学的研究

ヒドロ虫類は、他の刺胞動物と異なり、生殖巣(生殖体)の形態が多様である。そこで、本研究では、このヒドロ虫類の生殖体の形態の多様化の要因について系統進化学的に解析した。その結果、これらの多様化は、刺胞動物の中で派生的と考えられるヒドロ虫類においてボディサイズが縮小したことにより、生殖巣の形成部位が胃腔側から体表側に移り、また、生殖細胞の起源や成長過程などにも違いが生じたためであることが示唆された。本研究は、多細胞動物の系統上根幹にあるヒドロ虫類(刺胞動物)について、生殖体の型や形成位置の異なる数種を材料に、生殖細胞分化様式における多様性を明らかにし、『多細胞動物の発生初期におこる生殖細胞系列分化が系統上いつ生じたのか』の問題の解決に寄与することを目的とする。平成22年度は、すでに組織学的な研究を行ったタマクラゲについて、生殖細胞の卵や精子の母細胞への分化マーカーとなる遺伝子のクローニングを試み、減数分裂の最初期に発現する蛋白質であるSpo11やDmc1の全長の配列を決定した。また、これらの発現時期を調べるために、発色にアルカリフォスファターゼをもちいたin situ hybridizationを行ったが、タマクラゲの生殖器官にアルカリフォスファターゼの発色基質と類似の色の色素の沈着があり、充分詳しい観察が困難であった。そこで、次年度には内在性の色素の影響を受けないと予測される蛍光標識したプローブを用いたin situ hybridization方法を試みる予定である。またこの蛍光プローブを用いた方法では、蛍光の種類(色)を変える事により、Spo11とDmc1の両方の局在を一度に観察できる可能性がある。一方、海産の単体性ヒドロ虫類ハタイヒドラについては、組織学に生殖細胞分化の過程を追跡した結果、卵原細胞は胴部の内胚葉に分布する間細胞から分化すること、さらに、卵原細胞の集団の中の1つが周囲の卵原細胞を捕食して巨大化し卵母細胞に成長することが示唆された。このことは、タマクラゲや同じく単体性のヒドラにおける生殖細胞の分化様式と異なる現象であり、ヒドロ虫類における生殖細胞分化の多様性の一端が明らかとなった。平成23年度は、タマウミヒドラの卵細胞形成過程を組織学的に追跡した。本種は、ポリプがすべて同形の群体性ヒドロ虫類であり、従来、生殖細胞は触手基部に形成される子嚢タイプの生殖体の内部で分化するとされていた。しかし、本研究において、卵母細胞はすでに生殖体外に存在し、それらが接した部分に生殖体が形成され、周囲の内胚葉とともにその中に入り、成長していくことが明らかとなった。この現象はこれまでに明らかにしたアミネウミヒドラなどの子嚢タイプの生殖体の形成過程と類似するものであり、子嚢タイプの生殖体形成には分類群を越えて共通する機構があることが示唆された。タマクラゲの生殖細胞分化に関しては、平成22年度に分子マーカーとしてクローニングした減数分裂初期に発現する遺伝子Spo11とDmc1を利用してホールマウントインシチュハイブリダイゼーションを試みたが、タマクラゲの自家色素の阻害により、これら遺伝子の発現を観察することは困難であった。そこで、自家色素を持たないエダアシクラゲにおいて抗体染色によりSpo11の発現を調べたところ、生殖細胞の検出に有効であることが明らかとなった。このことから、Spollは同様に自家色素をもたないミサキアミネウミヒドラやハタイヒドラ、タマウミヒドラなどに対しても減数分裂初期の生殖細胞を観察できる可能性が示唆された。本研究は、多細胞動物の系統上根幹にあるヒドロ虫類(刺胞動物)について、生殖体(子嚢またはクラゲ)の型や形成位置の異なる海産の数種を材料に、生殖細胞分化様式における多様性を明らかにすることを目的として行った。平成24年度は、これまでの研究を継続するとともに、最終年度として研究の取り纏めを行った。その結果、従来ヒドロ虫類の生殖細胞は外胚葉起源とされていたが、それが内胚葉起源である種の存在が明らかとなった。また、生殖細胞の成長に関しては、2タイプ確認された。1つは、淡水性ヒドラのように、分化した生殖細胞のうち1つが周囲の生殖細胞を捕食して成長するタイプであり、もう1つは分化したすべての生殖細胞が内胚葉から栄養を摂りながら成長するタイプであった。また、複数種において生殖細胞(あるいは、生殖細胞に分化する間細胞)が内胚葉細胞間を移動し外胚葉に接すること、それらの細胞が接した部位の体表側に生殖体が形成されること、生殖体の形成に伴って生殖細胞がその中に取り込まれることが判明した。

さらに、外胚葉に接触する生殖細胞の成長時期に違いがあり、それが生殖体の型と関連していることが明らかとなった。最近の分子系統学的な研究では、刺胞動物において花虫類が祖先的でヒドロ虫類は派生的とみなされている。また、生殖巣(生殖体)は、花虫類では胃腔側に、ヒドロ虫類では体表側に形成される。これらのことから、ヒドロ虫類では、ポリプのボディサイズの縮小によって生殖巣の形成部位が胃腔側から体表側に移り、また、生殖細胞の成長過程などに違いが生じ、結果として生殖体の型や位置に多様化が生じたと考えられた。今後は、花虫類も含めた刺胞動物において生殖細胞の起源となる細胞をさらに追及し、生殖細胞系列の分化様式が進化の過程でどのように多様化してきたのかを明らかにしたいと考えている。研究代表者が所属する国立科学博物館の研究部門移転による標本資料の移送作業並びに担当する企画展の実施などに伴い、本研究に充当できる時間が減少したために、生殖細胞分化の過程における遺伝子発現の検出などの実験に十分な時間を与えることができなかったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。タマクラゲについては自家蛍光色による抗体検出の阻害が著しいため、他のヒドロ虫類において生殖細胞分化過程追跡の研究を優先的に進める。具体的には、生殖体の型や形成位置が異なり、且つ、自家蛍光色のないヒドロ虫類数種において、Spo11やDmc1の発現が検出される細胞の場所を特定することで生殖細胞がどこで分化するか(減数分裂を開始するか)を明らかにし、生殖体の型や形成位置と生殖細胞分化の場所との関係を解析する。
骨格筋細胞膜裏打ちに関する形態学的・細胞生物学解析-インテグリン軸を中心として-

骨格筋では細胞内の細胞骨格と細胞外の基底膜をつなぐために、ジストロフィン-ジストログリカン軸およびインテグリン軸が存在する。成熟骨格筋においては、インテグリン軸の分子連関は全く分かっていない。我々は形態学的解析を行い、インテグリンとジストロフィンがコロイド金の二重免疫染色で2040nmと近接して存在すること、神経筋接合部では培養細胞接着班に局在する多くの蛋白とも共局在することを見いだした。そこで次に免疫沈降法によりインテグリンと相互作用する蛋白を検索するとともに、ジストロフィン-ジストログリカン軸の蛋白質に注目し、両軸の分子連関の可能性についても検討した。使用した抗インテグリン抗体は、ウサギにおいて作製し、成熟した骨格筋に発現するアイソフォームであるインテグリンβ1Dを特異的に認識する。ラットより骨格筋を採取し、細胞膜を含む粗マイクロソーム分画を得た。この分画の膜タンパクの可溶化はTritonX-100、SDS、デオキシコール酸を単独または組み合わせて用いた。免疫沈降は、抗インテグリンβ1D抗体または抗ジストロフィン抗体、抗ビンキュリン抗体で行い、ウェスタンブロット法でインテグリン、ビンキュリン、アクチン、ジストロフィン、ジストログリカンの検出を行った。インテグリンで免疫沈降を行った場合、アクチンを検出できたが、ジストロフィンやジストログリカンは検出できなかった。逆にジストロフィンで沈降した場合、アクチンを検出できたが、インテグリンは検出できなかった。次にビンキュリンで沈降した場合、ジストロフィンを検出することができたが、インテグリンを検出することはできなかった。以上の結果からはインテグリンに直接作用する分子は明らかではないが、ビンキュリンが他の細胞種でインテグリンと相互作用することから、インテグリン軸とジストロフィン-ジストログリカン軸がアクチンをとおして連関する可能性が示された。我々の研究の今までの研究成果(Hijikata et al.2003)および他の研究者のデータを総合すると、骨格筋インテグリン軸はビンキュリン、β-シネミン(デスマスリン)、ジストロブレビン間の分子連関を介してジストロフィン-ジストログリカン軸と関連をもつことが示唆されるが、今のところその直接の証拠はない。そこで今回インテグリン軸とジストロフィン-ジストログリカン軸間の分子連関の形態学的根拠を得ることを目的として研究をおこなった。方法は(1)共焦点レーザー顕微鏡によるインテグリンβIDとジストロフィンの二重染色の観察。(2)電顕による超微形態レベルの二重染色による検討をおこなった。(2)については(2)-1:クリオスタット切片に免疫染色を施した後,再包埋し、電顕観察する方法、および(2)-2:サポニンで処理したChemically skinned fiberでの免疫ラベルする方法で実施した。(2)-1の方法ではインテグリンβIDとジストロィンの、(2)-2ではインテグリンとα-ジストログリカンの二重染色をおこない、両者のラベルの位置関係を検討した。その結果(1)共焦点レーザー顕微鏡ではインテグリンβIDとジストロフィンの染色は互いに重なることが確認できた。電顕レペルの(2)-1では両者のラベルが近接して分布する像も数多く観察され、両者のラベル間の距離のヒストグラムを作製するとTriton処理しない場合で2030nmに、Triton処理した場合で3040nmにピークが認められた。(2)-2の方法では細胞膜をはさんでα-ジストログリカンとインテグリンのラベルが相対する像が観察された。

以上の結果から抗体の分子サイズ、一次抗体と二次抗体を使っていることなどを考慮にいれるとインテグリン軸とジストロフィン-ジストグリカン軸の少なくとも一部のものは相互に分子連関を持っているとしても矛盾しないことが結論づけられた。骨格筋では細胞内の細胞骨格と細胞外の基底膜をつなぐために、ジストロブィン-ジストログリカン軸およびインテグリン軸が存在する。成熟骨格筋においては、インテグリン軸の分子関連は全く分かっていない。我々はこれまでに電子顕微鏡による形態学的解析を行い、インテグリンとジストロフィンが近接して存在することを見いだした。本研究の目的は、インテグリンと細胞骨格との関連を明らかにすることである。免疫沈降法によりインテグリンと相互作用する蛋白を検索するとともに、ジストロフィン-ジストログリカン軸の蛋白質に注目し、両軸の分子関連の可能性についても検討した。使用した抗インテグリン抗体は、ウサギにおいて作製し、成熟した骨格筋に発現するアイソフォームであるインテグリンβ1Dを特異的に認識する。ラットより骨格筋を採取し、細胞膜を含む粗マイクロソーム分画を得た。この分画の膜タンパクの可溶化はTritonX-100、SDS、デオキシコール酸を単独または組み合わせて用いた。免疫沈降は、抗インテグリンβ1D抗体または抗ジストロフィン抗体、抗ビンキュリン抗体で行い、ウェスタンブロット法でインテグリン、ビンキュリン、アクチン、ジストロフィン、ジストログリカンの検出を行った。インテグリンで免疫沈降を行った場合、アクチンを検出できたが、ジストロフィンやジストログリカンは検出できなかった。逆にジストロフィンで沈降した場合、アクチンを検出できたが、インテグリンは検出できなかった。次にビンキュリンで沈降した場合、ジストロフィンを検出することができたが、インテグリンを検出することはできなかった。以上の結果からはインテグリンに直接作用する分子は明らかではないが、ビンキュリンが他の細胞種でインテグリンと相互作用することから、インテグリン軸とジストロフィン-ジストログリカン軸がアクチンをとおして連関する可能性が示された。
放射線耐性は膜の状態によって規定されるか？-臨床的治療耐性細胞によるアプローチ-

本研究ではがん細胞の放射線抵抗性メカニズムを解析するため、放射線に抵抗性の細胞(CRR細胞)と感受性の細胞(ρ0細胞)における細胞膜の酸化状態・過酸化水素の取込み・細胞膜構成タンパク質の発現・突然変異を指標にストレス応答機構解析を行っている。ヒト子宮頚部がんHeLa及びヒト舌がんSAS細胞由来のρ0細胞およびその親株細胞を使用した。現在までに次の1)から3)の結果が得られている。1)各細胞における脂質の過酸化の検討:ρ0細胞において、細胞膜における代表的な脂質の過酸化物マーカーを検出するHNE抗体を用いて過酸化水素処理後の脂質の過酸化についての検討を行った。HNE量は親株細胞と比較してρ0細胞で上昇していた。またCRR細胞においては、親株細胞のHNE量が上昇する処理後2時間までに増加は認められなかった。2)安定同位元素を用いた細胞内への過酸化水素取り込みの追跡:細胞内過酸化水素量の変化が細胞外に添加した過酸化水素由来であることを検証するために、安定同位元素を用いた取り込み実験を行った。ρ0細胞では、親株細胞と比較して取り込み量の増加が認められた。またCRR細胞では、HeLa細胞では親株細胞と同様の取り込み量であった。SAS細胞では親株細胞より取り込み量の増加が認められなかった。3)細胞膜構成要素の発現解析と突然変異の解析:水チャネルであり過酸化水素を透過させるとの報告があるアクアポリン(AQP)1, 3, 8, 9について、その遺伝子発現量を比較した。その結果、ρ0細胞では親株細胞と比較して遺伝子発現量の増加が認められ、CRR細胞では逆に減少が認められた。現在までの進捗状況は以下の通りである。1)各細胞における脂質の過酸化の検討、2)安定同位元素を用いた細胞内への過酸化水素取り込みの追跡、3)細胞膜構成要素の発現解析と突然変異の解析を行った。1)については、HNE量は親株細胞と比較してρ0細胞で上昇していた。2)については、ρ0細胞では、親株細胞と比較して取り込み量の増加が認められた。3)については、ρ0細胞では親株細胞と比較して遺伝子発現量の増加が認められ、CRR細胞では逆に減少が認められた。今後、2年間の研究期間において、下記の3項目を行う予定である。1)リポソーム膜を用いた脂質の密度・酸化度合いと過酸化水素取り込み量の検討:リポソーム膜の構成成分を変化させて過酸化水素の取り込み量を調べ、過酸化水素の細胞内への取り込みが細胞密度や膜の過酸化状態に依存しているのかを検証する。2)過酸化水素処理後の細胞内活性酸素量の検証:過酸化水素を添加後の各活性酸素種の発生量をジヒドロエチジウム、mitoSOX、HPFを用いて検出する。3)細胞膜構成要素の発現解析と突然変異の解析:アクアポリンのタンパク質量発現の解析、突然変異の解析を行い、発現変化もしくは突然変異が見られた遺伝子について、過剰発現もしくは発現抑制を行い感受性の変化を検討する。発現ベクターを用いた過剰発現実験について、コンストラクトが予定通り作製できない可能性がある。この場合、CUSABIO社から発売されている膜貫通タンパク発現ベクター(アクアポリンもラインナップされている)を購入し、細胞への導入を行う。

1)については、HNE量は親株細胞と比較してρ0細胞で上昇していた。またCRR細胞においては、親株細胞のHNE量が上昇する処理後2時間までに増加は認められなかった。2)については、ρ0細胞では、親株細胞と比較して取り込み量の増加が認められた。またCRR細胞では、HeLa細胞では親株細胞と同様の取り込み量であった。SAS細胞では親株細胞より取り込み量の増加が認められなかった。3)については、ρ0細胞では親株細胞と比較して遺伝子発現量の増加が認められ、CRR細胞では逆に減少が認められた。今後、2年間の研究期間において、下記の3項目を行う予定である。1)リポソーム膜を用いた脂質の密度・酸化度合いと過酸化水素取り込み量の検討:リポソーム膜の構成成分を変化させて過酸化水素の取り込み量を調べ、過酸化水素の細胞内への取り込みが細胞密度や膜の過酸化状態に依存しているのかを検証する。2)過酸化水素処理後の細胞内活性酸素量の検証:過酸化水素を添加後の各活性酸素種の発生量をジヒドロエチジウム、mitoSOX、HPFを用いて検出する。3)細胞膜構成要素の発現解析と突然変異の解析:アクアポリンのタンパク質量発現の解析、突然変異の解析を行い、発現変化もしくは突然変異が見られた遺伝子について、過剰発現もしくは発現抑制を行い感受性の変化を検討する。発現ベクターを用いた過剰発現実験について、コンストラクトが予定通り作製できない可能性がある。この場合、CUSABIO社から発売されている膜貫通タンパク発現ベクター(アクアポリンもラインナップされている)を購入し、細胞への導入を行う。
有酸素的運動により発現しう酸素毒性に関する研究

細胞膜リン脂質のヒドロペルオキシ体(LOOH)の分別定量法を確立するために、まずリン脂質のうちフォスファチジルコリン(PC)に焦点を絞り、その過酸化物の分析条件を検討した。PCは、順相シリカ・カラム(YMC社)を用いてメタノ-ルーアセトニトリル系を溶媒とすることにより他のリン脂質との分離が可能であった。またPCのLOOH体の標準物質を作製するために、234nmの吸収でジエンの生成をモニタ-して種々の過酸化反応誘発剤をPC標品に作用させてみた結果、3.5%butyl hydroperoxide,1mM FeSO_4,1mM ascorbic acidの存在下に37°Cでincubateすることにより、効率良く過酸化を起こさせうることがわかった。一方、電気化学検出器(EICOM社、ECDー100)でグラシ-カ-ボン電極を用いて、-300mVの設定電位でLOOH体由来の還元電流を検出したところ、PCのLOOH体ピ-クの検出限界は1nmole程度であり、感度を上げるための何らかの工夫が必要となった。また、ヒト赤血球膜脂質をBlighーDyer法で抽出し、上記の分析系に注入してみたところ、PCに先行する大きなピ-クに重なって明瞭な検出ができないことがわかり、抽出物の精製の必要性が示された。またこれらの実験とは別に、ヒト好中球の活性酸素産生能の新たな測定系確立を試みた。細胞内カルシウム測定システム(日本分光、CAMー220)にブル-・フィルタ-を装着し、DCFHーDAを細胞内の発光物質とすることにより、polyーlysineでプレパラ-トに接着させた状態(より生体内での反応に近い状態)の好中球で測定することが可能となった。予備的に実施した計測では、好中球を浮遊させた状態で刺激する場合と異なり、接着状態での好中球ではPMA刺激による活性酸素産生がほとんど無くなり、逆にConーA刺激による活性酸素産生が著明に亢進することを認めた。
Probing the heterogenous structures in buried interfaces by synchrotron X-ray reflection tomography

本研究は、シンクロトロン放射光の平行性の高い微小X線ビームを用い、高い空間分解能の3次元表面界面イメージングを目指している。研究室内で製作する試料まわりの部品類をビームラインに備わっている機器と有効に組み合わせて活用するつもりで準備していたが、実験室系X線源による事前テストでも十分な結果を得ることができなかったため、次のステップになかなか進めることができず、結果として放射光による高分解能データを取得するに至っていない。事前テストでは、放射光の平行配置とは異なり、ファンビーム配置(垂直方向)としたが、水平方向の角度発散を十分に抑えきれず、試料に対する視射角を変化させた時の表面、界面でのコントラストを十分出せなかったことが問題であると後になってわかった。簡単な原理のように見えるが、部品はどの1つをとっても細心の注意を払う必要がある。研究所の任期中の最後の放射光実験の機会に間に合わせることができなかったのは残念であるが、高分解能イメージングに必要な諸条件、特に機器、部品のそれぞれの細かな条件を詳しく明らかにすることができた。
鉄鋼冷間圧延用炭化物系多合金白鋳鉄の開発研究

鉄鋼冷間圧延用炭化物系多合金白鋳鉄の開発を目的に,最適成分の検討を行い,その成分を有する鋳鉄について,凝固組織と凝固条件の関係,変態特性,熱処理特性,摩耗特性の検討を行った。最適成分としてはC量:11.5%,Cr:5%,Mo:5%以上,V量:1%以上が推奨される。この成分を有する合金には,MC,M2C共晶炭化物が912%含まれる。凝固組織は冷却速度に依存して変化し、デンドライト二次アーム間隔や炭化物の大きさは,冷却速度の関数として表され,冷却速度が増大するほど小さくなる。変態挙動を調査した結果,パーライト変態、ベイナイト変態及びマルテンサイト変態が認められ,パーライト及びベイナイト変態領域は長時間側にある。このため焼入れ性は良い。しかし,Mf点が認められないことから,焼入れ状態ではマルテンサイトと残留オーステナイトが共存する。焼入れ焼戻し特性を調査した結果,焼入れ後の焼戻しでは,高合金を含有する工具鋼や,高炭素を含有する多合金系白鋳鉄と同様に二次硬化特性を示し,約800Kでの焼戻しで最高硬さ(850HV)を示す。この硬さは冷間加工用ロール材に必要な硬さ(800HV)を上回っている。スガ式アブレッシブ摩耗試験により,耐摩耗性を評価した結果,耐摩耗性は,高炭素を有する多合金系白鋳鉄よりも幾分劣ると考えられる。低炭素多合金系白鋳鉄の合金設計と材質調査1合金元素量と炭化物の種類炭素量が11.7mass%でCrを5mass%一定として,Mo、V量を変化させて、炭化物の種類及び形態を調査した。晶出する炭化物はMC、M2C及びM7C3であり、合金元素量により、晶出炭化物の種類が変化した。冷間圧延用ロール材としては、晶出炭化物としてMC及びM2Cが好まれ、M7C3の晶出はなるべく抑えたい。MC及びM2C炭化物が同時に得られる成分範囲は1%Cの場合、>2%V、>2%Mo、1.25%Cの場合、13.5%V、>3%Mo、1.5%Cの場合、13.5%V、>4%Mo、1.7%Cの場合、2%Vでは>5%Mo、3%Vでは>4%Moとなる。なお、それぞれの炭化物の形態に大きな変化は認められなかった。2凝固組織と凝固条件の関係炭化物を基地中に微細に分散させるには、凝固組織を微細にすることが重要である。そこで、0.941.6%C-5%Cr-5%Mo-3%Vの3種の合金について凝固組織及び炭化物の形状に及ぼす凝固条件(冷却速度V : K/s)の影響を調査した。結果は以下のとおり。D_d(デンドライト2次アーム間隔:μm)=(38-4・%C)V^<-(0.44-0.035・%C)>低炭素多合金系白鋳鉄の連続冷却変態挙動,熱処理特性及び耐摩耗性の調査1.連続冷却変態挙動:C量が0.51.5%,Cr及びMo量が各5%,V量が13%の合金について,連続冷却変態(CCT)挙動を調査した。いずれの合金もベイナイト及びマルテンサイト変態は認められたが,パーライト変態は本実験の範囲(冷却速度:0.02K/ss)では,0.5%C-2%V材,1%C-3%V材,1.5%C-1%V,1.5%C-2%V材にのみ認められた。ただし,パーライト変態が起こる臨界冷却速度は0.02K/s0.1K/sの範囲にあり,パーライト変態する領域はからに長時間側にある。ベイナイト変態はいずれの合金でも450600Kの範囲で起こり,マルテンサイト変態の開始点(Ms点)は350610Kの範囲にある。

Ms点は,同一V量であればC量の増加とともに低下し,同一C量であれば,V量の増加とともに上昇する。2.熱処理特性:同上組成の合金について,焼入れ焼戻し挙動を調査した。いずれの場合も,焼戻し温度が800K程度で,硬さが上昇する二次硬化を示す。焼戻し後の硬さはオーステナイト化温度が高い方が高いが,1.5%C-1%V合金及び1.5%C-2%V合金では焼戻し後でも残留オーステナイト量が多く存在するために低くなる。オーステナイト化温度に関わらず,焼入れ状態での残留オーステナイト量が約30%の状態から焼戻すと,最高硬さ850HVが得られる。また,最高硬さが得られるように合金設計するには,オーステナイト化温度を1373Kで行う場合には,炭素バランスが0.16,1273Kオーステナイト化の場合,0.48になるようにすればよい。3.耐摩耗性:Fe-1%C-5%Cr-5%Mo-12%V合金について,スガ式摩耗試験を実施し,耐アブレシブ摩耗性を健闘した。最高硬さが得られる熱処理を施すと,耐摩耗性は向上する。耐摩耗性を炭素量の高い多合金白鋳鉄と比較すると,本軽合金はわずかに劣る。
銅基酸化物超伝導体と共存する不純物との熱力学

本研究は、実用化が期待される銅を含む酸化物高温超伝導体についてその作製時の不純物混入を制御するために熱力学的データが不可欠と考え、その収集に当たるものである。Ca-Cu-O系について大気中の平衡状態図、減圧酸素雰囲気下での相平衡関係を焼鈍試料により調査し完成させた。さらに、ジルコニア固体電解質を用いて3相平衡試料の平衡酸素分圧測定を系統的に行った。その結果より化合物の標準生成自由エネルギーを算出し実験範囲外での酸素分圧下でいかなる平衡関係が達成されるかについて予測を行った。Ag-Cu-O系は、酸化物超伝導体を実用化するに当たり必要な銀シース材の問題を解決するために状態図を研究した。熱分析、化学分析、組織観察、熱重量変化の測定を総合して検討したところ、従来予測されていた状態図とは異なる共晶反応、偏晶反応を見出し、その温度、組成、酸素分圧を明らかにした。Agの融点以下で生じる共晶反応は酸化物超伝導体と銀とが反応して粒界で部分溶融する事実に対応する。また高温での不変反応は酸化物超伝導体の材料リサイクルの指針となる。Bi-Sr-Ca-O系ついても大気中での相平衡関係を明らかにし、現在CaF_2を用いた固体電解質カルシウムセンサーを構築している。これは、多元素系固相間の不変反応の安定した超電力測定値からカルシウムの化学ポテンシャルを正確に測定するものである。
N-mycによる組織間相互作用と器官形成の制御

N-myc突然変異体マウスは11日胚に達するといくつかの器官の形成に欠陥を表しはじめ、11、5日をすぎるとほとんどが死んでしまう。それ以降の過程においてN-myc発現がどのように関与しているか、また組織間の相互作用のどの部分がN-mycに依存しているかを明らかにする目的で、次の方法を用いた解析を行なった。1、N-myc欠損胚の器官のin vitroの培養。特に、肢芽と肺に注目して研究を行なった。11、5日以前のN-myc欠損胚から単離した肢芽と肺を器官培養して正常胚と比較した結果、N-mycの欠損によって肢芽の先端部(指など)の形成不全、肺の気管支の分岐の抑制がおきることが明らかになった。2、N-myc欠損(double knock-out)ES細胞と正常胚盤胞との間のキメラマウスの作製。キメラ胚のほとんどは発生の異常を伴いながらも妊娠期間を全うしまた出生したものの一部は成体にまで成長した。どの時期の胚・個体をとってみてもES細胞は常に5010%の寄与率を示した。このことからまず、N-myc遺伝子の活性は、細胞の自己増殖能には関与していないことが明らかになった。これらキメラ個体の器官形成を調べると、肢芽と肺の間で著しい違いがみられた。肢芽の発生はESの寄与率にかかわらず正常であったが、肺の発生は、ESの寄与率の増加とともに著しく抑制された肢芽と肺の相違に代表されるように、N-myc遺伝子活性の組織構築への関与の仕方は、器官・組織ごとに異なると考えられる。
低出力レーザーのイオンチャネルへの作用による鎮痛作用機序の解明

低出力レーザー照射(0.006-9J)により、記録した62%の細胞で脱分極を、17%で過分極を認めた。脱分極変化量は0.006-0.036Jの照射では仕事量依存的に増加、それより大きな仕事量では逆に低下し、0.05-9Jでは14mVの一定値であった。静止膜電位の脱分極からの回復は小仕事量群では53%に、大仕事量群では27%に認められ、回復例では脱分極の再現性が認められた。膜電位を-50mVに固定し、レーザー照射(0.016J)すると内向き電流の増加(最大値-230pA)が認められた。この内向き電流は50mM TEAで変化せず、2μM TTXで完全に阻害された。膜電位を-80mVに固定し、脱分極刺激をしたときのレーザー照射(0.012J)によるNa^+電流の電流-電圧関係への影響を検討した。照射後4分において-40から+50mVの範囲の脱分極刺激により照射前と比較して、175%から350%の増大を認めた。照射後6分には、ほぼ照射前のレベルまで回復した。現在、レーザー照射によるNa^+channelの開閉機構に対する作用を詳細に検討する予定である。
概均質空間の構造の研究とその応用

概均質空間の応用について,それぞれの役割分担により研究を行なった。その結果,まず概均質空間が正則(regular)であることの,満足できる定義を得た。その上で、正則な概均質空間の相対不変式のみたす、偏微分方程式系,ならびにその降空間の構造を研究した。この偏微分方程式系は、特に空間が対数的な場合、従来知られていない、著しい対称性をもつことが明らかとなった。その場合,相対不変式の零点集合の、特異性を表現する「指数」が,{α;α:指数}={2ーα;α:指数}という性質をもつことがわかる。このことの系として,既的概均質ベクトル空間の、指数の和に関するトレ-ス公式が証明される。概均質空間のZeta函数については、相対不変式の中積の和として、定義の糸にはできたが,その和をとるべき不連続構造の設定について、代数的側面から種々研究を行なった。まだ決定的結果に至っていない。相対不変式の不変量b(S)の決定については、上記の指数で処理できる場合は終了し,その他、幾何学的な不変性から発生する微分方程式をもつ場合に、具体的決定作業が行なわれた。特に,概均質ベクトル空間の局所化として生ずる概均質空間について,有効な結果を得た。概均質空間の相対不変式の特量性を層化することについての,幾何学的研究もあわせ行なわれ、対数的層化が有効であること、対数的層化では、孤立点の連続体が発生する場合に、それをまとめて一つのものとみなす手法についても、研究し、部分的な成果をおさめた。
網羅的ゲノム解析に基づく性分化疾患の発症機序の解明

「研究の目的」性分化疾患(DSD: Disorders of sex development)は、出生時の外性器異常、思春期発来異常および不妊の原因など多彩な臨床症状を招く病態である。本症は、単一遺伝子疾患および多因子疾患として発症する。本研究の目的は、DSD症例の検体を用いて網羅的遺伝子解析を行うことにより、DSD疾患発症に関与する遺伝子を同定、ヒトの性分化機構を明らかにすることである。「研究成果」MAP3K1遺伝子機能亢進変異は、精巣形成不全による46,XY DSDの発症原因として報告され、これまで15種類の塩基置換が発症遺伝子変異として登録されている。しかし、これら塩基置換の機能解析はほとんどされておらず、数種類の塩基置換のみが1つのグループにより機能解析されているのみである。研究代表者は、46,XY DSD患者のMAP3K1遺伝子の変異スクリーニングを行い、すでに兄弟例よりナンセンス随伴性スプライス変更を呈するMAP3K1遺伝子の塩基置換を同定していた。最終年度はさらに、3例からヘテロ接合性のミスセンス変異を同定した。現在、MAP3K1発現ベクターの作成が終了し、HEK293細胞およびNT2/D1細胞に導入を行って機能解析を進めている。この成果は、科学論文雑誌に発表する予定である。研究代表者は上記の研究の他に、ARの機能を反映するバイオマーカーの同定、NR5A1遺伝子変異の同定された46,XX精巣性DSDの臨床像、胎児発達遅延を伴う46,XY性分化疾患患者におけるMIRAGE症候群の同定についての論文報告にも参加した。[本研究の目的]性分化疾患(DSD: Disorders of sex development)は、出生時の外性器異常、思春期発来異常および不妊の原因など多彩な臨床症状を招く病態である。本研究の目的は、DSD患者を対象とした網羅的ゲノム解析による既知および新規DSD発症原因の発見と機能解明である。[研究成果]46,XX精巣性/卵精巣性DSDは、非常に稀な疾患であり、その原因の9割がY染色体上の性決定遺伝子SRYが転座することで発症する。しかし、残り1割の患者における発症原因はほとんど分かっていなかった。われわれは、血縁関係のない46,XX精巣性/卵精巣性DSD患者2例から、NR5A1遺伝子のp.R92W変異を同定し、この遺伝子変異が疾患発症に関与した可能性を論文として発表した。この成果は、掲載雑誌(Human mutation)の表紙に採用され、小児遺伝学会の優秀演題に選ばれた。さらにわれわれは、マウスではこのp.R92W変異が性分化異常を引き起こさないことを確認し、この成果を論文として発表した。そのほか、46, XY DSDの双児における新規NR5A1の遺伝子変異および思春期早発症患者における新規機能獲得型PROKR2変異を論文として発表した。また、尿道下裂患者では、無精子症原因領域のコピー数異常がないことを確認し、その成果を論文化した。[本研究の重要性]DSD患者は、出生後の外性器異常により発見されることが多く、社会的性の決定や治療方針を決める上で、ゲノム解析による早期診断が期待されている。本研究は、従来法よりも早期に既知原因遺伝子変異を同定できる点で患者の遺伝子診断に貢献している。また、新規DSD原因変異を同定し、その発症機構を解明することでヒト性分化の分子基盤の理解に貢献している。5つの研究成果を論文として発表できたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。本年度は、下記の研究成果を得た。これらは、性分化疾患(DSD)の発症機構の解明と疾患スペクトラムの理解に繋がる成果であった。1)既報の遺伝子変異が認められなかった46,XY性分化疾患患者119例を対象にして、GATA4遺伝子の変異スクリーニングに取り組んだ。同定した2つの遺伝子置換について機能解析から、4症例に同定されたp.P407Qは疾患感受性多型であり、1例に同定されたp.R265Cは疾患発症へ影響のない塩基置換である可能性を見出した。重要な点として、心疾患の伴わない46,XY DSD患者において、GATA4変異による疾患発症は稀であることが判明した。2)NR5A1遺伝子のp.R92W変異は、46,XX精巣性/卵精巣性DSDを引き起こす初めての単一遺伝子変異として、われわれが昨年度に論文報告したものである。本年度は、この変異を持つ1家系の詳しい臨床情報をまとめ、表現形型の多様性を示した。3)PROKR2遺伝子は、思春期遅発症の発症責任遺伝子として知られている。われわれは、思春期早発症患者においてPROKR2遺伝子にヘテロ接合性の機能亢進型変異を世界で初めて同定した。この変異タンパクは、単独ではシグナル伝達能の喪失が認められたものの、野生型タンパクとの共発現下ではシグナル伝達の亢進が認められた。よって、この変異は野生型と2量体を形成することで機能亢進を示すことが示唆された。4).MAP3K1遺伝子変異は、機能亢進変異によって46,XY DSDを起こすことが報告されている。われわれは、停留精巣とマイクロペニスを有する兄弟例より、MAP3K1遺伝子に同一のヘテロ接合性の塩基置換を同定した。

in vitro機能解析より、この塩基置換がエクソン内でスプライス変更を引き起こし、これによりタンパクが機能亢進を示すことが判明した。上記の研究成果により、英文科学雑誌に4報の論文として発表ができたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。「研究の目的」性分化疾患(DSD: Disorders of sex development)は、出生時の外性器異常、思春期発来異常および不妊の原因など多彩な臨床症状を招く病態である。本症は、単一遺伝子疾患および多因子疾患として発症する。本研究の目的は、DSD症例の検体を用いて網羅的遺伝子解析を行うことにより、DSD疾患発症に関与する遺伝子を同定、ヒトの性分化機構を明らかにすることである。「研究成果」MAP3K1遺伝子機能亢進変異は、精巣形成不全による46,XY DSDの発症原因として報告され、これまで15種類の塩基置換が発症遺伝子変異として登録されている。しかし、これら塩基置換の機能解析はほとんどされておらず、数種類の塩基置換のみが1つのグループにより機能解析されているのみである。研究代表者は、46,XY DSD患者のMAP3K1遺伝子の変異スクリーニングを行い、すでに兄弟例よりナンセンス随伴性スプライス変更を呈するMAP3K1遺伝子の塩基置換を同定していた。最終年度はさらに、3例からヘテロ接合性のミスセンス変異を同定した。現在、MAP3K1発現ベクターの作成が終了し、HEK293細胞およびNT2/D1細胞に導入を行って機能解析を進めている。この成果は、科学論文雑誌に発表する予定である。研究代表者は上記の研究の他に、ARの機能を反映するバイオマーカーの同定、NR5A1遺伝子変異の同定された46,XX精巣性DSDの臨床像、胎児発達遅延を伴う46,XY性分化疾患患者におけるMIRAGE症候群の同定についての論文報告にも参加した。今後も研究成果を論文として発表できるように、実験とともに執筆活動にも力を入れたい。DSDの原因となる可能性のある新規変異を同定した際は、どうしても病原性の検証に時間がかかってしまう。効率的に検証し、論文化する方法を模索中である。研究成果を論文として発表できるように、執筆活動に力を入れる。同時に、新しい成果を得るためのデータ解析や実験にも時間をかける。試薬に使用期限があるため、実験の進み具合に応じて、次年度に購入したほうが妥当だと判断した消耗品があった。試薬に使用期限があるため、次年度に購入したほうが妥当だと判断した消耗品があったために次年度使用額が生じた。今年度も消耗品のセール時期を考慮に入れて、計画的に助成金を使用する予定である。前年度と同様に、実験の進み具合や消耗品のセール時期を考慮に入れて、無駄なく効率的に使用する予定である。
Candida albicansによるアナフィラキシー様急性炎症の惹起-細胞壁マンナンによるレクチン経路を介する補体活性化の可能性-

報告者らはこれまでに、i)歯周病関連細菌のLPS,口腔レンサ球菌ならびにCandida albicansより調製した細胞壁画分を、細菌細胞壁ペプチドグリカンの要構造に当たる合成ムラミルジペプチド(MDP)を前投与したマウスに静脈注射すると、アナフィラキシー様ショック反応を惹起すること、ii)LPSによるショック反応の背景には血小板の末梢血から肺等への急激な移行と、臓器での凝集・崩壊、それに続発する急性の組織破壊が起こっており、MDPはこのような血小板反応を増強すること、iii)さらに、一連の反応の成立には、補体が必須であることを明らかにしてきた。本研究の当初の計画では、マンナンを主要構成多糖とするC.albicansの細胞壁がmannose-binding lectin(MBL)と結合して、所謂レクチン経路を介する補体活性化を起こす結果、血小板崩壊に続発するアナフィラキシー様反応が起こるとの作業仮説の実証を目指していた。しかし、研究の途上で、マンノースホモポリマー(MHP)を保有するKlebsiella O3(KO3)のLPSに極めて強力なショック誘導作用を認めたので、先ず、MHP保有LPSを供試する実験を実施した。即ち、横地高志教授(愛知医大)より、KO3の他、E.coli O8とO9(いずれもMHPよりなるO多糖を保有)さらに、O8およびO9合成酵素をコードする遺伝子をE.coli K12(O多糖欠くR変異株)に導入して得た遺伝子組替えLPSの分与を受けて、MHP保有LPSが例外無く強力なショック反応と血小板反応を惹起すること、さらに、松下操博士(福島医大)の協力を得て、MHP保有LPSはヒトMBLと結合して、血清中のC4を捉えて、補体系を活性化することを証明した。
劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎に認められる膵特異的自己抗体の意義と臨床応用

劇症1型糖尿病においてAmylaseα-2A(AMY)に対する自己抗体が産生され、これを高感度・高特異的に検出して、本疾患の迅速診断を試みてきた。今回合成ペプチドを作成し、これらを抗原とするELISA系を構築し、さらにAMYをマウスに免疫しその病因を検討した。その結果、AMYのC端側よりに相当する部位のペプチド7を用いた時に、本症をより高感度・高特異的に検出できることが判明した。また、AMY免疫マウスではリンパ球浸潤を伴う膵炎が惹起された。申請者らは膵アミラーゼ抗体は劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎に共通した膵特異的自己抗体であることをみいだしたが、今回本自己抗体測定のための高感度測定系を樹立し、両疾患の早期診断・臨床経過における有用性を検討する目的にて、以前開発したELISA測定系の改良を試み、更に両疾患の患者血清の収集とリストの作成に努めた。ELSAの改良は、1プレートの選定、2バックグランド低減のためのcoating buffer,blocking buffer、washing bufferの検討、3抗原の量および純度に関する3項目を中心に行った。その結果、プレートに関しては、現在の高結合タイプが陽性/陰性の識別能が高く、バックグランド低減のためには、0.1M carbonate bufferが優れ、blockingには1% BSAが最適であることが判明した。またwashing bufferは現行の0.05% Twen20を含むTris bufferで良好であった。最も結果を左右したのは、抗原であるヒトリコンビナントアミラーゼA2の溶解性に関するものであった。この抗原は大腸菌内でinclusionbody中に蓄積され、その溶出に6M Ureaを用いるが、これを透析にて除去する過程にて不溶化しやすく、また、長時間の操作で分解されることも判明した。現在、精製抗原は-80°Cで保存し、使用直前に溶解・coatingを行っている。一方、これらの改良にも関わらず、低力価抗体の検出はELISA readerの性能に限界があり、装置の更新の必要があり、患者血清のデータはこれを待って行わざる得ないと判断された。申請者らは膵アミラーゼ抗体は劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎に共通した膵特異的自己抗体であることをみいだし、本自己抗体測定のための高感度測定系を樹立すべく、以前開発したELISA測定系の改良を試みてきたが、ELISA readerの更新により、低力価抗体の測定も可能になった。劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎は共に膵外分泌・内分泌の障害を来す共通性を有するが、後者は高IgG4血症を示すことが特徴である。そこで、高感度アミラーゼ抗体検出用ELISAにて膵アミラーゼIgG4抗体の検出を試み、劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎の鑑別が可能か否かを検討した。膵アミラーゼリコンビナント抗原をプレートにcoatingし、患者血清を一次抗体、peroxidase-conjugated anti-humam IgG4を二次抗体として自己抗体の検出を行った。その結果、自己免疫性膵炎患者12例中10例にてIgG4型アミラーゼ抗体が検出されたが、劇症1型糖尿病10例では一例も検出されなかった。一方、自己免疫性膵炎を治療後には、8例中6例にてIgG4型アミラーゼ抗体が陰性化していた。これらの結果は、自己免疫性膵炎ではIgG4型アミラーゼ抗体が産生されるが、劇症1型糖尿病では非IgG4型であること、さらに、これらの相違に基づき両者の鑑別が可能であることを示す。また、劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎における膵アミラーゼ抗体産生機序には相違があり、両疾患の成因の解明に重要であると考えられた。本年度はAMY測定のためのELISAにつき、より高感度・高特異性にすべく、種々検討を行ったが、E.coli中で作成するリコンビナント抗原は易変性かつ難溶性であり、非特異的結合を低下させることには限界があった。そこで、対象抗原一次構造に基づき、24アミノ酸からなる7種類の合成ペプチドを作成し、各々を用いてELISAを行ったところ、ペプチドNo.7を用いた際、バックグラウンドが極めて低く、リコンビナント抗原を用いた場合と同様の陽性結果が得られることが判明した。今後、ペプチドNo.7を標準として用いて普及をはかる予定である。一方、リコンビナントAMYをマウスに免疫した際の膵の変化を観察したが、リンパ球浸潤を伴う自己免疫性膵炎様の変化を再現し得た。今後、耐糖能の変化、インスリン分泌能の変化を検討するが、AMY抗体が膵炎を惹起するモデルを確立できたことより、劇症1型糖尿病や自己免疫性膵炎の病因とAMY自己抗体の関連につき、より詳細に検討可能となるものと考えられた。
「個性」創発に至る次世代継承エピゲノム修飾とその脳内表現

研究実績の概要1マウス精巣ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:前年度までに同定した加齢精子によって変化するDNAメチル化領域(Differentially Methylated Regions, DMRs)について、特異的な転写因子結合部位との関連を指標に絞込を行い、候補転写因子Xを同定した。Xについて、市販の抗体を用いた免疫染色法およびウェスタン法によって発現を解析したが、いずれも矛盾のない結果を得ることができなかったので、技術支援班の協力により作成したCRISPR/Cas9によるTagノックインマウスを用いて解析したところ、免疫染色法によって精原細胞におけるXの発現が観察された。2ヒト精子ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:学内倫理委員会の審査を経て、所定の手続きにより共同研究先のクリニックより供与されたヒト精子を用いて、ウェスタンブロットによるヒストン修飾因子の定量を行った。加齢マウスにおいて増加が観察されたH3K79me3について、ヒト精子においても加齢による増加の傾向が観察された。3仔マウス個別脳内遺伝子発現様態解析および脳画像解析:前年度までに得た胎生14.5日目の雄胎仔脳のRNA-seqデータに加えて、胎生14.5日目の雌胎仔脳のRNA-seqデータ(若齢雄および加齢雄由来の仔)を取得した。1マウス精巣ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:モチーフ解析およびChIP-Atlas解析により、低メチル化領域の中に神経発生において重要な機能を有する興味深い転写抑制因子Xの結合配列が見つかり、さらにRNA-seqデータのGSEAからも同じ転写抑制因子がエンリッチすることがわかったことから、これら低メチル化領域の重要性や脳構築過程における遺伝子発現制御への関与を強く示している可能性がある。今後、XにTagを付加したノックインマウスの若齢雄および加齢雄において、加齢がXの発現に及ぼす影響を解析する予定である。2ヒト精子ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:所定の手続きにより得られたヒト精子を用いてウェスタンブロットによるヒストン修飾因子の定量を行った。加齢マウスにおいて増加が観察されたH3K79me3について、ヒト精子においても加齢による増加の傾向が観察されたが、定量性に課題が残った。追加配分によって購入した自動電気泳動・ウェスタン装置を使用し、より定量性のある解析を行う予定である。3仔マウス個別脳内遺伝子発現様態解析および脳画像解析:若齢父/加齢父および雄/雌の4群、それぞれ3個体について、遺伝子発現量と発現プロファイルの再解析を行っている。4仔マウス個別多種行動解析および脳生理機能解析:母子分離超音波発声の解析より、若齢雄由来の仔と加齢雄由来の仔マウスにおけるコール数の発達過程に有意差が観察された。生後6日目において加齢雄由来の仔マウス観察されたコール数の有意な減少は、コール数の発達過程の遅れによるものであることが示唆された。また、加齢雄由来の仔マウスのシラブル解析から、個体内での使用シラブル数は減少するが、個体間での使用シラブルの種類には大きなばらつきが観察され、若齢雄由来の仔マウスよりも「際立った」個性を示すことが示唆された。以上より、本研究テーマは順調に進捗しているといえる。1マウス精巣ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:加齢によりどのようにしてDMRsが生じるのかについて、および、精巣内精子形成過程におけるヒストン修飾分子の発現局在について解析を行う。2ヒト精子ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:共同研究先のクリニックより、さらにヒト精子検体の供与を得て、ウェスタンブロットによるヒストン修飾因子の定量を続け、加齢の影響について解析を進める。3仔マウス個別脳内遺伝子発現様態解析および脳画像解析:野生型雄マウスの加齢による仔マウスへの影響を解析するために、個体識別を行った仔マウスの脳構築について、神経活動マーカーc-Fosを用いた神経活動マッピングを行う。成体期への影響が残るかどうかに関しても各種分子マーカーを用いて組織学的検索を行う。また、若齢父/加齢父および雄/雌の4群、それぞれ3個体について、遺伝子発現量と発現プロファイルの再解析を進める。可能であれば、マウスを用いたMRI解析について条件検討を行う。4仔マウス個別多種行動解析および脳生理機能解析:雄マウスの加齢による仔マウスへの影響について、個体識別を行った仔マウスについて、各種行動スコアの相関性について解析する。また、超音波発声については、ソノグラム画像のdeep learning解析を行っている論文などを参考にしつつ詳細なシラブル解析を行う系を確立し、超音波発声の発達の様態についても解析を進める。1.マウス精巣ゲノム、エピゲノム、遺伝子発現解析:加齢により野生型(C57BL/6J)のマウス精子に生じるエピゲノム修飾変化について、ターゲットメチローム解析を行いて同定した16ヶ所の高メチル化領域と96ヶ所の低メチル化領域に関して、GOオントロジー解析を行った。これらの低メチル化領域には、神経発生や神経機能に関するGOタームがエンリッチしていた。また、モチーフ解析により、DMRsの中でも低メチル化領域に共通する配列として、興味深い転写抑制因子の結合配列が見つかった。クロマチン沈降塩基配列解析(ChIP-seq)データベースChIP-Atlasを用いて、上記DMRsと有意に相関する転写因子結合配列解析を行った結果、マウスES細胞由来神経幹細胞を用いたChIP-seqデータにおいて、同じ転写抑制因子の結合配列が浮かび上がった。