hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトプロセスによる低結晶アパタイト透明体の構造設計と歯科材料としての機能評価

従来のアパタイト透明体の製造法であるハードな高温・高圧プロセスでは高結晶性かつ結晶粒の大きな透明体しか得られない。本研究課題では、ソフトプロセス(低温操作)によるナノ粒子集合化について詳細な検討を行うことで、生体骨ミネラルに近い低結晶性アパタイトナノ粒子からなる透明体の開発とその組成制御および構造制御に成功した。さらに、開発した低結晶性アパタイト透明体上での細胞挙動を観察し、歯科材料としての機能発現に係るナノ構造の影響を検討した。本研究課題は、新規な機能性歯科材料の創出を目指し、申請者が見出した「ソフトプロセス」により得られる低結晶性アパタイト透明体の構造制御と機能評価に関する検討を行うものである。このソフトプロセスとは、室温付近で作製した低結晶性アパタイトナノ粒子の水分散体を室温付近で乾燥させることでナノ粒子を集合化させる手法である。平成24年度においては、低結晶性アパタイト透明体の組成制御のために、陽イオン(マグネシウムイオン)あるいは陰イオン(炭酸イオン)といった共存イオン種を加えてアパタイトナノ粒子を作製した。アパタイトナノ粒子は硝酸カルシウムとリン酸水素二アンモニウムを用いた湿式法をベースとして作製した。作製したナノ粒子の粒子径および形態は走査型電子顕微鏡によって評価し、X線回折法によってその結晶構造を同定した。マグネシウムイオンあるいは炭酸イオンを添加した場合、得られるナノ粒子の結晶性が低下することを確認した。次に、作製したナノ粒子分散液を各条件で乾燥させることで、透明ナノ粒子集合体を作製した。マグネシウムイオンを加えた場合には透明性が低下し、一方、炭酸イオンを加えた場合には透明性が向上した。これは、得られたナノ粒子の粒子径および凝集状態が添加イオン種によって異なり、粒子径および凝集塊が小さい場合に透明性が向上することを見出した。ここで、透明体の電子顕微鏡観察から、得られた透明体には粒子間隙に由来するナノ気孔が存在することが明らかとなった。また、作製したアパタイト透明体をリン酸緩衝液中に浸漬した結果、透明体内部に存在するナノ気孔中に液体が浸潤することを見出した。以上のように、平成24年度の検討によって、透明体形成に最適な低結晶性アパタイトナノ粒子の作製条件およびソフトプロセスの処理条件を明らかとした。平成25年度においては、前年度までの検討によって得られた低結晶性アパタイト透明体の評価を行った。まず、水銀圧入法によりナノ多孔質構造を評価した結果、ナノ多孔質構造は集合化したナノ粒子の間隙に由来するものであり、原料として用いたナノ粒子の粒子径が小さいほど孔径が小さくなることが明らかとなった。さらに、組成制御のために加えた共存イオン種によってナノ粒子の分散性が異なり、ナノ粒子の表面電位が高い場合では孔径および気孔率が小さくなることが明らかとなった。これらの結果は、前年度までに評価を行ったナノ粒子集合体の透明性と相関したものであった。次に、作製したナノ粒子集合体の細胞試験を行った。この際、透明性の高いナノ粒子集合体を用いた場合では、播種した細胞を前処理することなく光学顕微鏡で直接観察することが可能であった。また、いくつかの細胞種を用いて評価を行った結果、骨芽細胞様細胞の低結晶性アパタイト透明体に対する初期接着性は市販培養シャーレと同程度に高いことが確認された。さらに、原料となるナノ粒子の粒子径が初期接着性および増殖性に与える影響について検討した結果、細胞種によって最適な原料粒子径があることを明らかとした。以上のように、平成25年度の検討によって、低結晶性アパタイト透明体の物理的性質と生物学的特性の関係を導き出し、歯科材料としての機能発現に係るナノ構造について知見を得ることができた。平成23年度においては、低結晶性アパタイト透明体の構造制御のために、まず、アパタイトナノ粒子の作製条件について検討を行った。アパタイトナノ粒子は硝酸カルシウムとリン酸水素二アンモニウムを用いた湿式法によって作製した。この際、湿式法の条件を変化させることで40300nmのナノ粒子の作製に成功した。この際、ナノ粒子が小さいほど透明性が高くなることを見出し、また、ナノ粒子濃度を高くすることで透明体の面積を大きくすることが可能であった。

ここで、透明体の電子顕微鏡観察から、得られた透明体には粒子間隙に由来するナノ気孔が存在することが明らかとなった。また、X線回折測定から、透明体は特定の配向性を持たないことが確認された。さらに、透明体の機械的特性を評価した結果、原料となるナノ粒子の粒子径が小さいほど強度が高くなることが明らかとなった。また、作製したアパタイト透明体をリン酸緩衝液中に浸漬した結果、透明体内部に存在するナノ気孔中に液体が浸潤することを見出した。以上のように、平成23年度の検討によって、透明体形成に最適な低結晶性アパタイトナノ粒子の作製条件およびソフトプロセスの処理条件を明らかとした。平成24年度の検討においては、透明体形成に最適なハイドロキシアパタイトナノ粒子の作製、および、透明体の形成条件を見出すことを目的とした。「9.研究実績の概要」に記載したように、当初の目的通り、湿式法およびソフトプロセスの諸条件を検討することで目的を達成したため、「(2)おおむね順調」と自己評価した。平成23年度の検討においては、透明体形成に最適なハイドロキシアパタイトナノ粒子の作製、および、透明体の形成条件を見出すことを目的とした。(1)低結晶性アパタイト透明体の構造制御:アパタイトナノ粒子の作製時に、陽イオンとして亜鉛イオン等あるいは陰イオンとしてフッ素イオン等を加えることで、得られるアパタイトの組成を制御する。作製したアパタイトナノ粒子用いて、平成2324年度の検討により最適化したソフトプロセスにより透明体を作製し、その構造および機械的特性を評価する。(2)生物学的特性評価:作製した各種アパタイト透明体上で細胞の初期接着性、および、細胞機能の発現(増殖、運動挙動、分化挙動)を評価する。ここで、対象とする細胞としては、アパタイトの認識性が高い骨芽細胞および間葉系細胞を主に扱う予定である。本研究で対象とする材料は透明であるため、染色することなく上記のような細胞挙動を経時的に観察することが可能である。得られた知見をもとに、透明体の物理的性質(アパタイトナノ粒子の粒径、表面荒さ、表面電位)と生物学的特性(細胞接着性、細胞増殖性、接着分子の発現、分化マーカーの発現)の関係を導き出し、細胞機能発現に係るナノ構造の一般法則について明らかにする。以上の結果をもとに、アパタイト透明体の構造制御を達成し、機能発現に係るナノ構造の一般法則を明らかとすることで、新規な機能性歯科材料の創出を目指す。(1)低結晶性アパタイト透明体の構造制御:アパタイトナノ粒子の作製時に、陽イオン(マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど)あるいは陰イオン(炭酸イオン、フッ素イオンなど)といった共存イオン種を加えることで、得られるアパタイトの組成を制御する。作製したアパタイトナノ粒子用いて、平成23年度の検討により最適化したソフトプロセスにより透明体を作製し、その構造および機械的特性を評価する。
ヌクレオチド除去修復によるアルキル化損傷ＤＮＡの修復開始段階の解析

DNAのアルキル化で生じる損傷塩基やAPサイトは細胞死や突然変異の原因となるが、通常、塩基除去修復(BER)で修復される。本研究では、分裂酵母のヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、遺伝学的および生化学的に解析した。NER因子のRhp7pとRhp41pがAPサイトの修復に関与していた。さらに、rhp7とrph16が異なったDNA損傷により誘導された。従って、NERはUV損傷ばかりでなく、APサイトなど小さな傷をBERと協調して効率よく除去することができる。ヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、分裂酵母を用いて遺伝学的および生化学的に解析した。通常、MMSによるアルキル化損傷は塩基除去修復(BER)により修復される。ゲノム全体を対象としたNER(GG-NER)の初期過程に働く遺伝子rph7とrhp41のBER酵素とのMMS損傷修復におけるエピスタシス解析により、Rph7pはAPサイトをRhp41pはアルキル化塩基とAPサイトを認識してNER過程に導いていることが判明した。両因子ともにBERで生じるも3'ブロックには作用しなかった。Rhp41p/Rhp23p(ヒトのXPC/HR23ホモログ)複合体の結合特性を解析するために、大腸菌で同複合体を共発現させる系を作成した。Rhp7pとRph16pは複合体をつくり、その遺伝子は互いに逆向きに隣接している。これらの遺伝子のDNA損傷による発現誘導を調べたところ、UV損傷のみならずMMSによっても誘導された。現在、誘導に関わるプロモーター領域を欠失解析により検索している。出芽酵母のRhp7p/Rph16pホモログはUV損傷に誘導されるヒストンH3のアセチル化をともなうクロマチンリモデリングに関わる。分裂酵母のUVやMMS損傷に誘発される全ゲノムのH3アセチル化(K9/K14)をウエスタンブロッティングで検出した。種々の損傷・修復条件で比較したが、変化はみられなかったので、分析方法の改善を試みている。NERエンドヌクレアーゼのRhp16p/Swi10p(ヒトのXPF/ERCC1)はMMS損傷のBER過程で生じる3'ブロックにも作用することが遺伝学的に判明した。これを生化学的に証明するために、大腸菌で同複合体を共発現させる系を作成した。昨年に引き続き、ヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、分裂酵母を用いて遺伝学的および生化学的に解析した。ゲノム全体を対象としたNERの初期過程に働くrph7とrhp41について、塩基除去修復(BER)でAPサイトに働くnth1とのエピスタシス解析を、脱アミノ剤で種々の変異体を処理して行った。脱アミノ剤はシトシンをウラシルに変換し、さらにウラシルDNAグリコシラーゼによりAPサイトになる。それぞれの単独欠損株よりも、nth1/rph7およびnth1/rhp41欠損株は脱アミノ剤に対して感受性になった。したがって、Rhp7pとRhp41pはDNAグリコシラーゼによって生じたAPサイトを認識してNERに導いていることが判明した。さらに、NERエンドヌクレアーゼRad13pはRad2p(ヒトのFEN1ホモログ)とUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。Rhp7p/Rph16p複合体の遺伝子は互いに逆向きに隣接している。これらのプロモーターをレポーターアッセイで測定した。rph16プロモーターはレポーターアッセイでUV誘導性のみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導された。種々のDNA損傷に対する誘導性は、Rhp16pがUV損傷以外の修復にも関わっていることを示唆する。rph7プロモーターはこれまでの所、UV誘導性を観察できていない。NERにかかわるヘテロ二量体のRhp41p/Rhp23p(XPC/HR23)とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10p(XPF/ERCC1)を大腸菌で共発現させる系を作製したが、両者ともかなりのタンパク質が不溶性で、現在、培養や抽出方法を検討している。DNAのアルキル化で生じる3-メチルアデニン(3-mA)やその脱塩基部位のAPサイトは、細胞死や突然変異の原因となる。分裂酵母のヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、遺伝学的および生化学的に解析した。ゲノム全体を対象としたNER(GG-NER)の初期過程に働くrph7とrhp41(ヒトのXPC)の塩基除去修復(BER)遺伝子とのMMS損傷修復における遺伝的相互作用の解析により、rph7はAPサイトをrhp41はアルキル化塩基とAPサイトを認識してNER過程に導いていることが判明した。また、NERエンドヌクレアーゼrad13(XPG)はrad2(FEN1)とUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。DNA損傷誘発ヒストンH3のアセチル化、アセチル化酵素阻害剤の修復への影響、クロマチンリモデリング複合体成分ada2の遺伝的作用を調べたが、NER因子のクロマチンリモデリングへの関与を見いだせなかった。分裂酵母の定常期における細胞寿命(経時寿命)が、NER因子のrhp41やrhp14(XPA)欠損株で短縮することがわかった。この結果は、代謝で生じた活性酸素などによるDNA損傷の認識にrhp41が関与していることを示唆する。rhp7とrph16遺伝子は互いに逆向きに隣接している。

これらのプロモーターをレポーターアッセイで測定し、rph16プロモーターはUV誘導性のみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導することを見出した。本研究で得られた結果はNERが3-mAやAPサイトのような小さなDNA損傷の修復にBERと協調的に作用していることを示し、NERの生物学的意義やNER欠損の病態の理解に役立つものと考える。DNAのアルキル化で生じる損傷塩基やAPサイトは細胞死や突然変異の原因となるが、通常、塩基除去修復(BER)で修復される。本研究では、分裂酵母のヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、遺伝学的および生化学的に解析した。NER因子のRhp7pとRhp41pがAPサイトの修復に関与していた。さらに、rhp7とrph16が異なったDNA損傷により誘導された。従って、NERはUV損傷ばかりでなく、APサイトなど小さな傷をBERと協調して効率よく除去することができる。平成26年度は、遺伝学的な解析とDNA損傷応答の解析は予測通りの進行具合で実施することができた。すなわち、Rph7pとRhp41pがBERの初発酵素であるDNAグリコシラーゼの作用で生じたAPサイトを認識してNER過程に導いていることを明らかにすることができた。また、NERエンドヌクレアーゼRad13pとRad2pがUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。さらに、rph16とrph7プロモーターのレポーターアッセイ系を構築し、rph16プロモーターがUVのみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導されることを示した。これにより、DNA損傷に応答するエレメントの同定に発展させることができる。しかし、生化学的解析では苦戦している。Rhp41p/Rhp23p複合体とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10pを大腸菌で共発現させる系では、両者ともかなりのタンパク質が不溶性となり、これら因子の精製に手間取っている。分子遺伝学平成27年度は最終年度であり、当初の方針通りに研究を進める。まず、これまでに完了していない遺伝学的解析を行う。さらに大腸菌で発現させたNER因子の精製・機能解析などの生化学的解析行う予定である。最後に、研究の成果を英語論文にまとめたい。平成25年度は、遺伝学的な解析は予測通りの進行具合で実施することができ、Rph7pはAPサイトをRhp41pはアルキル化塩基とAPサイトを認識してNER過程に導いていることを明らかにすることができた。また、これらを生化学的に証明するための発現プラスミドの作製(Rhp41p/Rhp23p複合体とRhp16p/Swi10p複合体)も行うことができ、平成26年度に精製や機能解析を行う予定である。ヒストンH3のアセチル化をともなうクロマチンリモデリングに関わる実験については、年度を前倒して実験を行ったが、実験方法上の問題も見つけることができたので、平成26年度に再実験する。このように、平成25年度はおおむね実験を進めることができた。予算の9割以上を使用したが、今年度は出張回数が1回であったり、既存の試薬類を使うことができたので、約30万円の繰越金ができた。
抗DNA抗体の病因論的解析(モノクローナル抗体を用いた研究)

全身性エリテマトーデス(SLE)患者血清中には多彩な自己抗体が出現する。これらの自己抗体の特異性を詳細に解析することは、難治な本病の病態を解析する上で最も重要な課題である。なかでも抗DNA抗体は、本症の予後を左右する腎症や血管炎の形成に関与する重要な自己抗体を考えられている。しかし、患者血清中には様々な自己抗体が含まれているため、詳細な特異性の解析には困難がつきまとう。その様な難点をモノクローナル抗体作製のテクノロジーが解決してくれた。本研究者は、SLEのモデルマウスの脾細胞を用いたB細胞融合により数十種類のモノクローナル抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立し、その特異性を解析してきた。この研究を通して得られた最も重要な新知見のひとつは、抗DNA抗体が多様な抗原に対して交差反応性を有するということであり、この様な特性は、抗DNA抗体の産生が、当該抗原DNAの存在なしにも、他の多種の自己抗原の刺激により、自己抗体を恒常的に産生しうることを示唆している。本研究者は、モノクローナル抗DNA抗体を用いた抗体の特異性の解析により当該研究期間に以下の点を明らかにし、それらの一部はすでに論文として報告した。【○!1】モノクローナル抗ss/dsDNA抗体は、DNAのみならずRNA、プロテオグリカン、リン脂質(特にカルジオリピン)、免疫グロブリン等に対して多様な交差反応性を有する。【○!2】モノクローナル抗ss/dsDNA抗体の大部分は補体第一成分であるC1qに反応性を有し、これは従来からSLE患者血清中に認められてきたC1q-precipitinと同一の特異性と考えられた。【○!3】モノクローナル抗ss/dsDNA抗体は、株化(腫瘍化)リンパ球や活性化リンパ球に対して反応性を有し、いわゆる抗リンパ球抗体活性を有する。本研究者は,全身性エリテマトーデス(SLE)のモデルマウスから,多数の抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立し,これまでにそれらの特異性につき解明してきたが,今年度は以下の点を明らかにした.1.カルジオリピンに対する交差反応性:モノクローナル抗DNA抗体のなかで,一本鎖DNA(ssDNA)と二本鎖DNA(dsDNA)の両方に交差反応性を有する抗体(抗ss/dsDNA抗体)のうちの25%は,リン脂質のカルジオリピンと交差反応性を有していた.この反応は, DNAの"骨格構造"とカルジオリピンの分子構造の類似性に由来すると考えられた.モノクローナル抗ss/dsDNA抗体の大部分は,補体第一成分であるC_1gに対して反応性を有していた.この反応は,抗体をF(ub)_2にすることにより消失したことから, SLE患者血清中にしばしば認められるC_1g-preapitinと同一の特異性と考えられた.3.リンパ球抗体としての活性:モノクローナル抗ss/dsDNA抗体の大部分は,リンパ球に対する反応性を有していた.特にFACSを用いた解析から,本抗体は,活性化T細胞や腫瘍化T細胞に対して特異的に反応することが明らかとなった.また,これらの細胞を用いたWestern-blottingにより,対応抗〓の性状も明らかになりつつある.本研究者は、全身性エリテマトーデス(SLE)のモデルマウスから多数の抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立し、これまでにそれらの特異性につき解析してきた。

前年度は主として本自己抗体のカルジオリピンに対する交差反応性ならびに補体第一成分(C1q)に対する反応性につき検討してきたが、本年度はモノクローナル抗DNA抗体がリンパ球抗体としての活性を有していることを明らかにし、その特異性を解析し、以下の新知見を得た。(1)モノクローナル抗DNA抗体のなかでも一本鎖DNA(ssDNA)と二本鎖DNA(dsDNA)の両DNAに対して交差反応性を有する抗体(抗ss/dsDNA抗体)のみが、マウスT細胞株であるEL-4、BW5/47ならびにマウスB細胞株であるに対して反応することをFACSを用いて明らかにした。しかし、これらの抗体はマウス形質細胞株であるP3u1に対し2は反応しなかった。(2)モノクローナル抗DNA抗体のうちssDNAにのみ反応性を有する抗体(抗ssDNA抗体)には、この様な抗リンパ球抗体活性を認めなかった。(3)この様な反応性は単に株化したリンパ球に対してのみならず、mitogenで芽球化した末梢リンパ球に対しても認められた。しかし抗ss/dsDNA抗体は静止リンパ球に対しては反応しなかった。(4)抗ss/dsDNA抗体のリンパ球に対する反応性は、DNAにより用量依存的に消失することから、抗原-抗体反応による結合と考えられた。またリンパ球をあらかじめDNaseで前処理しておいても、この反応は全く変化せず、抗ss/dsDNA抗体のリンパ球上の対応抗原は、リンパ球上のDNAではなく、リンパ球由来の膜抗原構造と考えられた。
気候変動による流域水環境の変化が汽水域の生物生息環境に及ぼす影響評価に関する研究

斐伊川・網走川の両流域とも窒素・リン負荷発生量において農業由来のものが.他の発生源と比べて大きな割合を占めると把握された.また地球温暖化シナリオをもとに両流域における水文量の変化や負荷量の流出量・流出パターンの変化を月ごとに予測した結果.斐伊川流域と比べると網走川流域の方が.気温上昇による蒸発散量の増加や降雪水量の減少等の程度が大きいと推定された.加えて.温暖化シナリオによる宍道湖塩分濃度予測結果から.降水量が30%増加した場合.ヤマトシジミの生産量に影響を及ぼす可能性が示唆された.斐伊川・網走川の両流域とも窒素・リン負荷発生量において農業由来のものが.他の発生源と比べて大きな割合を占めると把握された.また地球温暖化シナリオをもとに両流域における水文量の変化や負荷量の流出量・流出パターンの変化を月ごとに予測した結果.斐伊川流域と比べると網走川流域の方が.気温上昇による蒸発散量の増加や降雪水量の減少等の程度が大きいと推定された.加えて.温暖化シナリオによる宍道湖塩分濃度予測結果から.降水量が30%増加した場合.ヤマトシジミの生産量に影響を及ぼす可能性が示唆された.本研究は,地球温暖化による気候システムの急激な変化が流域圏に及ぼす影響を予測し,汽水域の生物多様性や生態系サービスに及ぼす影響を評価することを目的に研究を進めている.平成20年度はSoil and Water Assessment Tool(SWAT)モデルを斐伊川流域圏および網走川流域圏へ適応した.斐伊川流域圏については, 1985年2007年までの23年間をモデル化対象期間とし河川流況の再現を行った.さらに,栄養塩のキャリアと考えられる浮遊物質量(SS)に着目し,その挙動を1988年2007年までの20年間再現した.網走川流域圏に関しては, SWATモデルを適用するためのデータ整備を最初に行う必要があったので, GISデータ(土地利用,土壌,標高),気象データ(降水量,気温,風速,湿度,日射量)および現地データ(営農活動情報:栽培作物・栽培期間・施肥量・施肥時期・灌漑に関する情報,水量・水質)を聞き取り調査等から入手しモデルに入力した.そして斐伊川流域圏と同様に,河川流況およびSS負荷量の挙動を2001年2007までの7年間において再現した.また,地球温暖化シナリオをもとに両流域圏における水文量の変化(流量・流出パターン,蒸発散量,降雪水量)やSS負荷量の流出量・流出パターンの変化を月ごとに予測した.この結果をもとに斐伊川流域圏では,斐伊川下流に位置する宍道湖の月別塩分濃度変動を予測し,宍道湖の特産品であるヤマトシジミへの影響を文献調査により考察した.その結果,降水量が30%増加した場合, 8月に最大37%塩分濃度が減少すると予測され,年平均で最大24%減少すると予測された.この変動幅はヤマトシジミの成貝については殆ど影響無いと推定されたが,ヤマトシジミの産卵時期および卵の塩分変動耐性を考えると,受精する卵が減少する可能性があると考えられ,ヤマトシジミの生産量に影響を及ぼす可能性が示唆された.本研究は,地球温暖化による気候システムの急激な変化が流域圏に及ぼす影響を予測し汽水域の生物多様性や生態系サービスに及ぼす影響を評価することを目的に研究を進めた.平成21年度は特に網走川流域調査を重点的に行った.対象流域である北海道網走川は,流域面積約1100km^2,河川長約120kmの一級河川である.流域土地利用の約80%が森林,農地が約19%である.下流部に位置する網走湖は面積約33km^2の汽水湖であり,内水面漁場として地域の経済を支えている.ヤマトシジミが特産で国内の約4%(道内最大)を占めている.本研究では,Soil and Water Assessment Tool(SWAT)モデルを網走川流域に適応し,流域圏の水文循環過程を再現するとともに,主に面源と呼ばれる農地に起因した窒素およびリンの季節変動傾向を再現した.モデル解析に先立ち,流域圏の人間(営農)活動を把握するため,網走川流域圏に位置する網走市,女満別町,美幌町,津別町において現地踏査および聞き取り調査を行い,現地の営農活動や施肥量・時期を把握した.そしてその情報をモデルへのインプットデータとして活用した.月別に施肥量など流域圏での窒素およびリンの発生負荷量を算出した結果,雪解け後の営農活動が一斉に開始される4月および5月と秋まき小麦等の準備・施肥時期である9月において多くの負荷量(年間発生負荷量の50%程度)が発生していることが把握された.また近年の集中豪雨化や気温上昇および将来的な気候変動が流域圏水環境に与える影響を予測した結果,島根県斐伊川流域と比べると,気温上昇による蒸発散量の増加や降雪等水量の減少等の程度が大きいと推定された.特に蒸発散量は3月に,降雪等水量は4月と11月に,顕著にその傾向が伺えた.さらに網走川流域圏は農地の中でも畑地の占める割合が高く,降雨強度の変化による土壌流亡とそれに起因した栄養塩の流出量増加が,島根県斐伊川流域と比べて大きいことが推定された.
生物個体群動態の離散時間モデルにおける数学的構造の合理性に関する研究

本研究では,生物個体群動態(生物の総個体数や密度などの時間変動の様相)に関して,理論的研究に用いられてきた非線形差分方程式系による離散時間モデルの構造(関数形etc.)の生物現象の構造との論理的な整合性について体系的に数理的な考察を行った。歴史的に有名な非線形常微分方程式系による連続時間モデルLotka-Volterra型餌-捕食者系モデルに対する離散時間モデルを構成し,その解の特性と元の連続時間モデルとの数学的な比較を行い,新しく開発した方法で導出した離散時間モデルが時間の差分(時間ステップ)の大きさに対して,相当に高いロバストネスで,元の連続時間モデルのもつ定常解の特性を定性的に保持する性質を有することを数学的に示し,論文として発表するとともに,国際研究集会などで発表した。歴史的に数理生態学の数理モデルとしては,微分方程式を用いた連続時間モデルが主流であるが,差分方程式をもちいた離散時間モデルでは,数理モデリングにおいて,実際の生態現象における事象の時系列(生活史,捕食や寄生の時期など)を陽に組み込める利点がある一方,離散時間モデルの解の特性の解析には,数学的な困難も多い。しかし,本研究で開発された手法により,連続時間モデルと離散時間モデルの間の関連性についての数理的な議論が可能であり,その結果,特に,離散時間モデルの新しい一つの構成手順についての提案が得られた。本年度は,さらに,その手順を応用し,農業における「誘導多発生(resurgence)」現象(害虫防除に農薬を使用した結果,逆説的に害虫密度が増大する現象)に関する新しい離散時間モデルを構成し,解析した。誘導多発生現象は,農薬による派生現象としての天敵減少や害虫の生理的変性,あるいは,薬剤耐性の顕在化を原因として議論されてきたが,本研究の理論的結果として,その害虫が属する生態系に内在する種間関係のみで誘導多発生現象が生起しうることが示され,観測されてきた誘導多発生にもこの生態学的要因によって生起したものも少なくないのではないかという示唆が得られた。成果は関連する研究集会で発表しつつ,論文としても発表準備を進めている。成果は関連する研究集会で発表しつつ,論文としても発表した。一方,個体群動態における観測データが例外なく離散的な時系列として得られるという観点から,昨今,数理モデル研究が盛んに議論されるようになっている感染症の伝染ダイナミクスについても,離散時間モデルの構築に関する課題は多様である。本研究の延長として,やはり,従来,非線形常微分方程式系による連続時間モデルを用いて議論されてきた伝染病ダイナミクスモデルに関しても,離散時間モデルのモデリング研究を開始している。
先天性中枢性低換気症候群の病態について:PHOX2B変異とハプロタイプ

先天性中枢性低換気症候群の約90%の症例では,PHOX2B遺伝子の5-13個のアラニン鎖の伸長変異を有しており,残りの10%はその他の変異である.私達は,伸長変異は父由来であり,精子形成時における姉妹染色分体交換によることを報告した.今回の研究では,これらの更なる確認と,7アラニン伸長変異とrs17884724 : A>C多型との関係を明らかにし,主な伸長機構は精子形成時における姉妹染色分体交換であることを確認した.また,アラニン伸長変異の約90%はde novoの変異であると考えられてきたが,最近,親からの遺伝が25%を占めるとの報告があり,今回の研究で同様な結果を確認した.遺伝子診断は確定診断.合併症の管理および遺伝カウンセリングに非常に有用であることを報告した.先天性中枢性低換気症候群の約90%の症例では,PHOX2B遺伝子の5-13個のアラニン鎖の伸長変異を有しており,残りの10%はその他の変異である.私達は,伸長変異は父由来であり,精子形成時における姉妹染色分体交換によることを報告した.今回の研究では,これらの更なる確認と,7アラニン伸長変異とrs17884724 : A>C多型との関係を明らかにし,主な伸長機構は精子形成時における姉妹染色分体交換であることを確認した.また,アラニン伸長変異の約90%はde novoの変異であると考えられてきたが,最近,親からの遺伝が25%を占めるとの報告があり,今回の研究で同様な結果を確認した.遺伝子診断は確定診断.合併症の管理および遺伝カウンセリングに非常に有用であることを報告した.先天性中枢性低換気症候群の約90%の症例では,PHOX2B遺伝子の5-13個のアラニン鎖の伸長変異を有しており,10%の症例はミスセンス変異,ナンセンス変異,フレームシフト変異などを有している.また,アラニン伸長変異の95%はde novoの変異であり,5%は親からの遺伝による.私達は,de novoのアラニン伸長変異の由来および伸長機構について研究し,2007年,このde novoの変異はinformativeな6家系において父由来であること,さらに伸長機構についてはinformativeな4家系において不等姉妹染色分体交換による事を明らかにした.今回の研究では,さらにそれぞれ3家系において,父由来であることと,不等姉妹染色分体交換による事を確認した.また,7個のアラニン伸長変異では,rs17884724:A>Cの多型を有する頻度が非常に高く,この多型有することで,不等姉妹染色分体交換を想定した配列の並びでは,ミスマッチ配列が少なくなり,このことも伸長機構は不等姉妹染色分体交換によることを裏付けているものと考える.父由来であるが,父の年齢効果は認められなかった.臨床的には,国内の多くの症例の遺伝子診断を行い,約50例のPHOX2B遺伝子変異を検出し,臨床的にも貢献してきたと考えている.家系分析では,モザイクや遅発性の中枢性低換気症候群に罹患している親からの遺伝も明らかにして,遺伝カウンセリングにも有用な情報を提供している.25PARMでは,13例中9例は新生児期に,4例は乳児期以降に発症していた.新生児期に発症した4例では,生後数か月以降は呼吸管理を受けず,2例は感染症罹患時に再び呼吸管理を受けていた.巨大結腸症の合併は認めなかった.家族検索では,LO-CHSの症例や呼吸器症状を認めない家族も検出され,症状の多様性および不完全浸透が確認された.26以上のPARMおよび一塩基挿入変異では,全て新生児期に発症し,睡眠時に(症例によっては覚醒時も)継続的な呼吸管理を要し,巨大結腸症および慢性の便秘など自律神経系の異常が高頻度に認められた.43家系44例の両親を検索し,40例はde novoの変異であり,4例(2例は兄弟)は変異のモザイクやLO-CHSに罹患した親からの遺伝であった.家族を含めた遺伝子解析は,確定診断に基づいた診療を可能とし,罹患家族と保因者の検出および遺伝カウンセリングに有用である.先天性中枢性低換気症候群の約90%の症例では,PHOX2B遺伝子の5-13個のアラニン鎖の伸長変異を有しており,10%の症例はミスセンス変異,ナンセンス変異,フレームシフト変異などを有している.また,アラニン伸長変異の95%はdenovoの変異であり,5%は親からの遺伝によると考えられてきた.私達は,denovoのアラニン伸長変異の由来および伸長機構について研究し,2007年,このdenovoの変異はinformativeな6家系において父由来であること,さらに伸長機構についてはinformativeな4家系において不等姉妹染色分体交換による事を明らかにした.今回の研究では,さらにそれぞれ3家系において,父由来であることと,不等姉妹染色分体交換による事を確認した.また,7個のアラニン伸長変異では,rs17884724 : A>Cの多型を有する頻度が非常に高い事を確認した.この多型有することで,不等姉妹染色分体交換を想定した配列の並びでは,ミスマッチ配列が少なくなり,このことも伸長機構は不等姉妹染色分体交換によることを裏付けているものと考える.国内の多くの症例の遺伝子診断を行い,約50例のPHOX2B遺伝子変異を検出し,臨床的にも貢献してきたと考えている.伸長変異の5%は親からの遺伝によると考えられてきたが,モザイクや遅発性の中枢性低換気症候群に罹患している親からの遺伝によるものが25%も存在する事を明らかにした.
ヒト好中球の活性酸素産生顆粒の細胞内動態を制御するシグナル伝達機構の解析

健康な成人女性の末梢血より好中球を単離し、protein kinase Cの賦活剤であるPMAで刺激、好中球細胞質内の顆粒に活性酸素を産生させ、この活性酸素を、酸化されると蛍光を発するH2DCFDAで標識した。各種の植物に含まれるpolyphenol、catechin、tocopherol (vitamin E)、の抗酸化剤をPBSで1mM, 10mM, 100mMの3段階の濃度で作用させ、抗酸化の程度を蛍光顕微鏡で形態学的に観察して評価するとともに、Flow cytometryを用いて、レーザーの励起光488nmを用いて、580nmの緑色の蛍光をgateG1で前方および側方蛍光強度を測定し、阻害度を生化学的定量的に測定した。その結果、polyphenol、catechin、tocopherolは濃度に比例して、抗酸化度は正の相関を示した。In vitroではなるが、その阻害度はpolyphenolが97.4%、tocopherolが43.0%、catechinが44.4%であった。このように、自然の中で日中太陽からの紫外線に曝されることから、これらの植物由来の化学物質は、自身を護る働きを持つものであるが、程度の差はあれ、ヒト好中球で産生される活性酸素に対して、強力な抗酸化作用を有することが明らかとなった。なお、本研究は本学のヒト研究倫理委員会の承認を得て実施された研究である。ヒト好中球は人体に侵入し、感染を引き起こす細菌を殺菌し、先ず第一に生体を防御に働く細胞である。好中球はその細胞質内に、中性染料に染まる特殊顆粒に似た長径0.2μm、短径0.1μmの顆粒を持ち、この顆粒の限界膜は,好中球で活性酸素の産生に関わる酵素、NADPHoxidaseの膜因子であるタンパクp22phox、gp91phoxを有する。一方細胞質内には、その細胞質因子であるタンパクp40phox、p47phox、p67phoxを持つ。好中球がprotein kinase CのアクチベータであるPMA、あるいは走化性オリゴペプドであるfMLPなどで刺激されるか、細菌を貪食するとこれら両因子は癒合し、NADPH oxidseとなり、活性酸素を産生し、この顆粒内に貯蔵される。細菌を貪食していない場合は、この顆粒は好中球の形質膜へ運ばれ、好中球外へ放出分泌される。それゆえ、我々はこの顆粒を分泌顆粒と呼んでいる。一方貪食した細菌がある場合は、この分泌顆粒は貪食胞へ移動し、その限界膜と癒合して食胞内へ活性酸素は放出され、細菌は殺菌されることを我々は明らかとした。今回の研究では栄養素であある、ワイン等に含まれるポリフェノール、お茶等に含まれるカテキン、ビタミンCであるアスコルビン酸、サポニン等が、如何に活性酸素の産生を阻害するかを検索した。健常ヒト末梢血よりヒストパークー・デキストラン沈殿法により、好中球を単離し、それぞれの栄養素を作用させて、産生された活性酸素をH_2DCFDAで蛍光発色させ、分光光度計、およびサイトフローメトリにて濃度を測定した。また、細胞内の蛍光発色している顆粒の分布を蛍光落写顕微鏡にて観察した。その結果、ポリフェノールを作用させた場合、活性酸素の産生は70%以上阻害され、ついでサポニン、カテキン、アスコルビン酸の順に阻害の程度が低下していた。また、それに比例して、蛍光発色した好中球内の顆粒の数が減少していた。今後、これらの阻害の割合を、サイトフローメトリでより詳細に分析していく予定である。ヒト好中球は人体に侵入した感染を惹起する細胞を貪食、殺菌する生態防御の第一線で働く細胞である。好中球は活性酸素を産生する酵素NADPHoxidaseの膜因子であるcytochrome B558(p22phox,gp91phox)をその限界膜に持つ顆粒を細胞質内に有する。

好中球をprotein kinase Cの賦活剤であるPMAで刺激すると、cytochrome Cは細胞質因子(p40phox、p47phox、p67phox)と共に、顆粒の限界膜上にNADPH oxidaseを形成し、活性酸素を産生する。この活性酸素により好中球はapoptosisを起こし、膿となると同時に、周囲に活性酸素を放出し、正常の細胞や組織を傷害する。今年度はphoriphenol、catechin、tocopherol(vitaminE)等の抗酸化効果について検索を進めた。方法は健康な成人女性よりインフォームドコンセントの後、静脈血を採取した(神戸女子大学ヒト研究倫理委員会承認H-19-2)。Dextran-Histopaque法により好中球を単離し、PMA刺激により活性酸素を産生させ、この活性酸素を酸化されると蛍光を発するH2DCFDAにて標識し、蛍光顕微鏡で観察、またFlow Cytometryにより活性酸素量を測定した。Polyphenolは活性酸素の産生を97.4%、catechinは36.5%、tocopherolでは61.4%の阻害効果を示すことがFlow cytometryにより明らかとなった。同じく蛍光顕微鏡観察により、蛍光を発する好中球内の顆粒は上記の程度に比例して減少していることが形態計測法により示された。
奈良朝中期政治史の研究

奈良時代中期、藤原式家は始祖宇合の薨去についで、長男の広嗣の諜反、そして誅殺によって政治的に低迷する時期を迎える。ところが、中期から、末期にかけて、恵美押勝の乱を契機として、藤原良継、白川を中心とする田麻呂・蔵下麻呂四兄弟の協力のもとに政治力を回復していく。その大きな手段が、光仁天皇の擁立と次代の桓武天皇の擁立であった。この両天皇の擁立によって、藤原式家は、天皇の信任のもとに大きく発展し、「藤原式家主導体制」ともいうべき時代を現出させていくが、この四兄弟の相次ぐ薨去によって、やがて衰退へと迎っていく。その衰退の中にかろうじて武家の政治力保持を支えたのは四兄弟の甥であった種継である。しかし、この種継の暗殺によって武家は奈良朝政治史の中に埋没していく。武家の衰退の現状に対して、桓武天皇は擁立してもらったという武家への遠慮という呪縛から解放され、天皇権力の擁立を目指して、平安朝という新しい時代の現出を迎えることになる。「長屋王木簡」「二条大路木簡」という新出史料に加えて、従来からの「続日本紀」「正倉院文書」をも駆使しながら、藤原四子体制下、中でも藤原宇合に注視した。いままでは藤原北家の祖房前が政治的には評価されてきたが、最近になっては武智麻呂をも重視する成果もみえてきているが、この二人の弟の宇合も政治的に重要な存在であると思われる。また、この宇合を始祖とする藤原武家の動向にも矚目した。藤原武家は、宇合の亡きあと一時は低迷するものの、奈良朝中期から末期にかけては他の藤原南・北家とは違った独自の政治的動向をとりつつ政治勢力を拡大していく。殊に宇合の孫である種継は、伯叔父である良継・百川らの光仁・桓武両天皇擁立の遺業を引きついで、政治権力を確立していく。若い時は、良継・百川の誘掖をえて、近衛員外少将・紀伊守・山背守という軍事・行政的枢職に補任して、反対派勢力の排除と武家勢力の確立に功績をあげ、良継・百川亡きあとは武家の中心官人として、その政治勢力の保持に尽力し、光仁・桓武朝に大きく活躍する。本年度は、奈良朝中期から末期の政治史について武家を中心に考察・解明した。奈良朝中期、藤原式家は始祖宇合の薨去についで、長男の広嗣の謀反、そして誅殺によって政治的に低迷する時期を迎える。ところが、中期から末期にかけて、恵美押勝の乱を契機として、藤原良継・巨川を中心とする田麻呂・蔵下麻呂四兄弟の協力のもとに政治力を回復していく。この両天皇を擁立した功績によって、藤原式家は、天皇の信任のもとに大きく発展し、「藤原式家主導体制」ともいうべき時代を現出させていくが、この四兄弟の相次ぐ薨去によって、やがて衰退へと迎っていく。その衰退の中にかろうじて式家の政治力を保持し支えたのは四兄弟の甥であった種継である。しかし、この種継の暗殺によって式家は奈良朝政治史の中に埋没していく。式家の衰退の現状に対して、桓武天皇は擁立してもらった式家への遠慮という呪縛から開放され、天皇権力の確立を目指して、平安朝という新しい時代の現出を迎えることになる。
成長板軟骨損傷後の治癒過程におけるガングリオシドによる内軟骨性骨化制御機構の解明

本研究の最終目標は糖脂質が成長板軟骨損傷において果たす役割を明らかにすることである。成長板軟骨損傷は損傷軟骨の部分的な骨化により成長障害を来たし、若年者に大きな負担を与えるがその詳細な機序は明らかにされていない。初年度に我々はマウス脛骨近位部成長板に25-G針を外側から内側方向に貫通させることにより、簡便に再現性のある成長板軟骨損傷モデルを作製することに成功した。本モデルにおいて損傷を受けた脛骨は健側のコントロールと比較し短縮した。組織学的解析では損傷を受けた術後1週で損傷部位に骨髄由来と考えられた線維芽細胞様細胞が集積し、3週で骨端と骨幹は骨性に架橋され、5週で骨量構造を伴ったPhyseal barが形成されていた。損傷を受けたマウス成長板の増殖能を調査するために5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)を回収前に投与し術後1、3週で成長板におけるDAPI陽性細胞数に対するEdU陽性細胞数の比を算出すると、術後1週では損傷群と対照群で同程度であったが、術後3週では損傷群で有意に低下していた。本研究により、小児骨端線損傷による成長障害を予防するためには、骨性架橋形成後よりも受傷早期の介入が必要であることが示唆された。今後、本モデルを用いて糖脂質合成酵素が成長板軟骨損傷後の治癒過程において果たす役割を明らかにし、新たな治療ターゲットを網羅的に解析する予定である。初年度にマウス近位部成長板軟骨損傷モデルとその評価方法を確立した。我々が独自に開発したモデルを用いて、糖脂質合成酵素欠損マウスを用いて表現型を調査する予定である。研究計画に則り、糖脂質合成酵素欠損マウスを用いて成長板軟骨損傷の治癒過程において糖脂質の果たす役割を網羅的に解析する予定である。マウス成長板軟骨損傷モデル作製過程において、想定していたよりも研究費を要さなかったため、次年度に繰越が生じた。
心臓におけるin vivo 四次元代謝イメージング技術の開発と応用

マイクロダイアラシス法を用いて、冠動脈結紮モデルにおける心筋局所の代謝の時間的変化を正確に把握することを目指す。このマイクロダイアラシスの技術と同位体元素を用いた定量的代謝フラックスイメージング(代謝の空間的把握)技術を組み合わせることで、in vivo四次元代謝イメージング技術を確立する。そのうえで、このin vivo四次元代謝イメージング技術を用いて、水素の同位体である重水素(2H2)の代謝動態を追跡し、水素の虚血再灌流障害抵抗性に関するメカニズムの解明を目指す。
根圏環境制御による畑作物の最適栽培管理技術に関する研究

I.国内における研究実績イチゴの本質的な生理・生態条件を生かしつつ、作物生育中の根圏域の土壌水分および地中温度等を物理的に制御することにより、イチゴの光合成、生育作用および果実の品質等に最も適する根圏物理環境条件の検討を試みた。1986年より4年間に亘るイチゴの栽培試験結果より、根圏環境要素とイチゴの生育との関係をまとめてみると、土壌中の栄養分として標準的な施肥栽培をした場合、(1)土壌水分を乾燥状態に制御すると収穫個数は増加するが、土壌水分を湿潤側に制御させると、果実重量は増加する。(2)総収穫重量を増加させる最適の土壌水分は、30.0%前後の含水比を示す時である。(3)果実の糖度は、地中温度を高め(28°C程度まで)に維持すると同時に、土壌中の水分として35.0%前後の含水比に制御するのが、最適のようである。また、根圏温度環境が作物の生育にどのような影響を及ぼすかを明らかにするために、べたがけ資材を用いて作物の生育量と根圏温度環境や他の気象環境との関係を調べた。べたがけによる作物の生育には、べたがけ内の気温や地温の積算値の他に日射量が大きく関係していることが明らかとなった。さらに、定量的な実測結果ならびにシュミレ-ション結果をもとに、比較解析を行った結果、べたがけ資材の物理的特性が根圏温度環境に与える諸要因の関係を明らかにすることが出来た。一方、作物根圏の土壌微生物バイオマスを測定する場合、土壌の採取法が極めて困難なために、この測定はほとんど行われていなかったが、ステンレスメッシュを用いた根圏土壌採取器(リゾボックス)を新規に開発することにより、それらの測定が可能となった。これまでにトマトを用いてリゾボックスの効用について調査した結果、改良型リゾボックスは、指による根圏土壌の採取法に比べて1/5の時間(全操作時間56分)で採取できること、また、実験誤差は23%となって測定値の信頼性も高くなることが判明した。II.外国における研究業績カナダでは、根圏環境特性の物理的、科学的把握こそが生産の基本となるとの認識により、行政的立場から各州内の畑の栄養状況の診断を行っている。例えば、サスカッチュワン州では、同州立大学構内に土壌診断専門機関として州立研究所を設置し、多数の専任技術者、優れた分析機器を備えている。農家に対しては、個々の畑に最も適した施肥設計を行うことができるように、土壌試料の採取法などきめ細かく指導している。採取時期としては10月を、深さとしては60cmまでを4層に分けて採取することとしている。そのサンプルを研究所で分析し、硝酸態窒素、硫酸態窒素、可溶性塩類の各量を決定し、最適施肥を提示している。ただし、栽培形態が土地利用型で面積も広大であるという理由のため、根圏熱環境に関連した実地診断は未だ行われていない段階のようである。グレ-トプレリ-の北部寄りの地帯(米国・ミネソタ州近辺)では積雪が多くあり、その自然条件の消長は畑作の栽培期間を左右している。積雪の消滅時期に関する研究が行われており、特殊なかつ簡単な積雪・凍結評価の器具ー科学薬品を使用故を開発している。さらに、その周辺の気象環境を併せて測定しつつ、熱収支の計算から、作物根圏に強い影響を与える地中熱状況の事前評価を求める努力をしている。カナダアガシズ試験場との共同研究で実施したナスのマルチ栽培におけるマルチ(被覆)資材(厚さ0.06mm)の色の効果判定の実験は興味ある結果であった。作物の収量は緑色≧茶色≧黒色≧透明の順であった。これはマルチの影響が根圏温度環境の他に、地上部での反射光の光質にも及び、緑色面反射光は開化(花芽分化)を促進させるためと考えられた。一方、資材の価格は茶色>緑色>黒色>透明であって、投下金額と生長促進効果の間にはありまり相関は見られないようであった。

一方、作物根圏の土壌微生物バイオマスを測定する場合、土壌の採取法が極めて困難なために、この測定はほとんど行われていなかったが、ステンレスメッシュを用いた根圏土壌採取器(リゾボックス)を新規に開発することにより、それらの測定が可能となった。これまでにトマトを用いてリゾボックスの効用について調査した結果、改良型リゾボックスは、指による根圏土壌の採取法に比べて1/5の時間(全操作時間56分)で採取できること、また、実験誤差は23%となって測定値の信頼性も高くなることが判明した。II.外国における研究業績カナダでは、根圏環境特性の物理的、科学的把握こそが生産の基本となるとの認識により、行政的立場から各州内の畑の栄養状況の診断を行っている。例えば、サスカッチュワン州では、同州立大学構内に土壌診断専門機関として州立研究所を設置し、多数の専任技術者、優れた分析機器を備えている。農家に対しては、個々の畑に最も適した施肥設計を行うことができるように、土壌試料の採取法などきめ細かく指導している。採取時期としては10月を、深さとしては60cmまでを4層に分けて採取することとしている。そのサンプルを研究所で分析し、硝酸態窒素、硫酸態窒素、可溶性塩類の各量を決定し、最適施肥を提示している。ただし、栽培形態が土地利用型で面積も広大であるという理由のため、根圏熱環境に関連した実地診断は未だ行われていない段階のようである。グレ-トプレリ-の北部寄りの地帯(米国・ミネソタ州近辺)では積雪が多くあり、その自然条件の消長は畑作の栽培期間を左右している。積雪の消滅時期に関する研究が行われており、特殊なかつ簡単な積雪・凍結評価の器具ー科学薬品を使用故を開発している。さらに、その周辺の気象環境を併せて測定しつつ、熱収支の計算から、作物根圏に強い影響を与える地中熱状況の事前評価を求める努力をしている。カナダアガシズ試験場との共同研究で実施したナスのマルチ栽培におけるマルチ(被覆)資材(厚さ0.06mm)の色の効果判定の実験は興味ある結果であった。作物の収量は緑色≧茶色≧黒色≧透明の順であった。これはマルチの影響が根圏温度環境の他に、地上部での反射光の光質にも及び、緑色面反射光は開化(花芽分化)を促進させるためと考えられた。一方、資材の価格は茶色>緑色>黒色>透明であって、投下金額と生長促進効果の間にはありまり相関は見られないようであった。イチゴの収量と根圏環境に及ぼす地温調節に加えて,果実収穫前2週間の土壌水分条件を変化させたときのイチゴの収量への影響について調査した。収穫前2週間の水分設定は,湿潤(4043%),標準(3738%),乾操(3035%),の範囲に維持され,地温はマルチ区が対照区(無マルチ)より12^。C,電熱加温区は58^。C高く設定されていた。それらの結果、イチゴ収穫直前2週間の土壌水分をPF1.21.4(4043%)に調節したあと,水分を圃場容水量に,地温を20^。C前後に維持すれば,大粒で,糖度は比較的一定,週間の収量もほぼ一定した作業効率の良いイチゴの栽培が可能となった。カナダBC州でのピ-マンを供試作物とし,全期マルチ,前期マルチ,後期マルチ,全期マルチ+トンネル処理実験の結果,後期マルチを標準区とした収穫促進度合は前期マルチで23倍,全期マルタで37倍に上るものとなった。さらにビニルトンネル+全期マルチ栽培とした場合には実に1013倍に達した。
子宮内膜癌発生機序の分子生物学的研究

我々は内膜増殖症及び内膜癌の発生過程の違いを明かにする為に細胞周期調節因子にたいする抗体を用いて免疫染色を行った。婦人科手術摘出材料より子宮内膜病変部を採取し、新鮮凍結切片及びホルマリン固定パラフィン包埋切片を作成した。H.E.染色切片により組織学的に内膜癌の存在を確認するとともにサイクリンやcdc2ファミリーやRB,p53等のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行い、正常上皮細胞と内膜増殖症及び内膜癌の増殖制御の違いを検討した結果、増殖期内膜ではサイクリンD1,サイクリンB,cdc2、cdk2、cdk4が機能層腺上皮にまたサイクリンEは基底層腺上皮を中心に発現を認めた。またサイクリンD1,cdk4は間質細胞にも発現を認めた。分泌期においては主に間質細胞においてサイクリンD1,cdk4、cdc2の発現が観察されたが、腺上皮細胞においては発現は認められなかった。サイクリンEは増殖期に基底層腺上皮に、一方サイクリンD1,cdk4は増殖期では機能層腺上皮及び間質細胞に分泌期では間質細胞に発現しており、性周期および組織内部位でサイクリンに機能的な使い分けがなされていた。また内膜癌ではこれらの細胞周期調節因子の殆どに異常があり、その異常は内膜癌が悪性化するについて集積する傾向にあった。このように内膜癌では、性ステロイド受容体の発現異常とそれに伴う段階的な細胞周期調節因子の異常が癌の発生および増殖に重要な因子であると考えられた。これらの結果は今まで内膜癌の発生過程の考え方に新しい理解を加えるもので、この方向での研究は益々推し進めなければならなく、大変評価出来るものである。婦人科手術摘出材料より子宮内膜病変部を採取し、新鮮凍結切片及びホルマリン固定パラフィン包理切片を作成した。H.E.染色切片により組織学的に内膜癌の存在を認識するとともにサイクリンやcdc2ファミリーやRB,p53等のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行い、正常上皮細胞と内膜増殖症及び内膜癌の増殖制御の違いを検討した結果、増殖期内膜ではサイクリンD1,サイクリンB,cdc2、cdk2、cdk4が機能層腺上皮にまたサイクリンEは基底層腺上皮を中心に発言を認めた。これらの結果は今まで内膜癌の発生過程の考え方に新しい理解を与えるもので、この方向での研究は益々推し進めなければならなく、大変評価出来るものである。またこれらの結果が得られたので次年度の研究の基盤が出来たと考えられる。

H.E.染色切片により組織学的に内膜癌の存在を確認するとともにサイクリンやcdc2ファミリーやRB,p53等のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行い、正常上皮細胞と内膜増殖症及び内膜癌の増殖制御の違いを検討した結果、増殖期内膜ではサイクリンD1,サイクリンB,cdc2、cdk2、cdk4が機能層腺上皮にまたサイクリンEは基底層腺上皮を中心に発現を認めた。またサイクリンD1,cdk4は間質細胞にも発現を認めた。分泌期においては主に間質細胞においてサイクリンD1,cdk4、cdc2の発現が観察されたが、腺上皮細胞においては発現は認められなかった。サイクリンEは増殖期に基底層腺上皮に、一方サイクリンD1,cdk4は増殖期では機能層腺上皮及び間質細胞に分泌期では間質細胞に発現しており、性周期および組織内部位でサイクリンに機能的な使い分けがなされていた。また内膜癌ではこれらの細胞周期調節因子の殆どに異常があり、その異常は内膜癌が悪性化するについて集積する傾向にあった。このように内膜癌では、性ステロイド受容体の発現異常とそれに伴う段階的な細胞周期調節因子の異常が癌の発生および増殖に重要な因子であると考えられた。これらの結果は今まで内膜癌の発生過程の考え方に新しい理解を加えるもので、この方向での研究は益々推し進めなければならなく、大変評価出来るものである。