hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨格筋を中心とする臓器間ネットワークによる老化調節機構解明と画期的抗加齢療法開発

mAktDKOマウスが骨格筋量を含む表現型を呈する分子メカニズムとして、Aktの下流でFoxOの経路が制御しているのか、mTORC1の経路が関与しているのかを引き続き検討するため、骨格筋特異的Akt1/2 FoxO1/4欠損マウス(m4KOマウス)と、同Akt1/2 TSC2欠損マウス(m3KOマウス)の解析を進めた。mAktDKOマウスで認めた骨格筋量減少、運動機能低下、骨量減少、全身のインスリン抵抗性などの表現型のうち、前三者はm4KOマウスでは対照マウスと同等にまで回復したが、m4KOマウス全身のインスリン感受性は、半分程度の回復にとどまった。これは骨格筋量が回復した一方で、インスリン依存性糖取り込みが障害されたままである可能性が想定された。更に全身の老化を考える上で個体寿命を追跡しているが、m4KOマウスでは明らかな寿命短縮を認めず、またmAktDKOマウスで好発した衰弱死も殆ど見られていない。一方m3KOマウスではm4KOマウスと異なり、骨格筋量減少を引き続き認めたが、筋力は部分的に、持久力はほぼ完全に回復していた。また骨量減少を引き続き認めたことから、m4KOマウスとm3KOマウスの比較からも、本研究で探索している骨格筋から分泌される骨芽細胞活性化因子は、mTORC1でなくFoxOの下流にあるものと考えられた。また高脂肪食負荷mAktDKOマウスはサルコペニア肥満のモデルと期待されるが、負荷40週時点で解析したところ、普通食下と同様に骨格筋量減少、運動機能低下、全身のインスリン抵抗性、骨量減少の表現型を認めた。加えて精巣周囲脂肪重量の増加を認め、骨格筋と脂肪組織間の相互作用の存在が示唆された。mAkt/TSC2 KOマウスを樹立し、その表現型を解析することで、mAkt KOマウスやmAkt/Foxo KOマウスの表現型との比較が可能となった。これにより、骨格筋におけるAktの下流分子としては、主にFoxOが重要であることが確かめられ、またサルコペニアと骨粗鬆症との間を関連づける分泌因子も、FoxOの下流にある可能性が強まった。一方で、mAkt KOマウスの様々な表現型のうち、一部についてはmTORC1経路の関与も示唆された。更にmAktDKOマウスに高脂肪食負荷を行なうことで、骨格筋と脂肪組織間の相互作用の存在が示唆され、サルコペニア肥満の病態解明に関しても新たな知見を得た。mAktDKOマウスを用いてサルコペニアの病態について、これまで得られた知見を基に、骨格筋を中心とした臓器間ネットワークを、主に分泌因子が担うとの仮説に立ち、更なる解析を進める。特に絞り込みを行なった重要なmyokine候補について、実際にヒトの検体を用いて、臨床情報との照らし合わせを行なう。各々の候補分子に関して、必要であれば測定系を開発し、その上で特にサルコペニアや、サルコペニアに合併した骨粗鬆症との関連を検討し、良い相関を示すものの絞り込みを更に進める。この過程で有望と思われたものについては、モデルマウスや培養細胞系に立ち返り、リコンビナント蛋白の投与ないし添加実験などにより、その分子機序を検証する。またmyokineの受け手側において、活性化または抑制を受けるような重要な経路が同定されれば、その欠損モデルを作製することでより詳細な分子メカニズムを明らかにすることもできると期待される。またAktの下流の鍵分子として、骨格筋や骨の老化に関しては、転写因子FoxO1/4が重要であることが示されつつあるが、個体レベルでの老化についてはまだ明らかでない。そこでmAkt/FoxO KOマウスを長期間飼育・追跡し、その生存期間の観察と死因の解析を継続する。このように骨格筋におけるFoxO活性を阻害することが、サルコペニアやその合併症の抑制に重要であり、創薬の対象となることが期待される。そこで本学のケミカルライブラリーイニシアチブのライブラリーを用いたスクリーニングを行ない、既知のFoxO阻害薬とも比較しながら、その有効性、並びに安全性について、培養細胞系、加齢野生型マウス、及びモデルマウスにおける評価を行なう。以上により、サルコペニアの更なる病態解明と共に、サルコペニアの早期診断バイオマーカーや、治療薬の創薬シーズとなることを目指して、残る期間で研究を推進していく方針である。我々が作成したmAktDKOマウスでは、8週目以降で体重・骨格筋量・骨量が野生型マウスに比して低下していた。また、32週目以降からインスリン負荷試験にインスリン感受性の低下が明らかとなり、週齢を追う毎に悪化した。野生型・mAktDKOマウスにおいて、各時点での骨格筋の網羅的発現解析を行ったところ、mAktDKOマウスミトコンドリア機能や生合成に関与する遺伝子およびオートファジー関連遺伝子の発現低下が起きており、また骨格筋の老化を示唆する遺伝子変化が起きていた。Aktのシグナルを伝達する主要な経路として転写因子FoxOを介するものと、mTOR complex 1(mTORC1)を介する経路があると考えられる。これらの経路が、加齢によるサルコペニア形成にどのように関与しているのかを検討するために、mAktDKOマウスと、FoxO1, FoxO3およびFoxO4を骨格筋特異的に欠失したmFoxOTKOマウスを交配して、サルコペニアの表現型がどのように変化するかを検討を開始した。

さらに、mAktDKOマウスと、mTOR活性を抑制しているTSC2を骨格筋特異的に欠失するmTSC2KOマウスを交配して、mTORの活性化を促すとサルコペニアの表現型がどのように変化するかの検討を開始した。27年度に予定していたmAktDKOマウス骨格筋における表現型の原因解析は、ほぼ計画通り進行しており、現在その責任シグナル伝達経路を解析中である。Akt下流のFoxO経路とmTORC1経路の種々の表現型に対する影響の解析については、dominant negative FoxOトランスジェニックマウスとの掛け合わせではFoxO下流のシグナルの十分な抑制が起きていないと考えられたため、FoxOの3つのアイソフォームを全てノックアウトするための交配が必要であったが、これに予想より時間を要しており、ようやく動物が得られつつある。TSC2ノックアウトの交配においても予定よりやや時間を要していたが、実験に供する動物が得られつつある。mAktDKOマウスの骨格筋量低下の分子メカニズムとして、Akt下流のFoxOの経路が制御しているのか、mTORC1の経路が関与しているのかを検討するため、mAktDKOマウスにFoxOの骨格筋における主要なアイソフォームであるFoxO1とFoxO4のfloxマウスを交配して、骨格筋特異的Akt1/2, FoxO1/4ノックアウトマウスm4KOマウスを作成した。また、mAktDKOマウスにTSC2のfloxマウスを交配し、m3KOマウスを作成している。興味深いことにm4KOマウスは、骨格筋量や運動機能が回復していた。骨量や老化については検討中である。m3KOマウスについては、現在解析中である。mAktDKOマウスは通常食飼育下で寿命が10%程度短縮していたが、死因は衰弱死でありがんの増加はなかった。興味深いことにmAktDKOマウスに高脂肪食を負荷すると野生型とのインスリン感受性に関する際はなくなり、マウスでは骨格斤量低下よりも肥満そのものがインスリン感受性に大きく貢献していることが分かった。また、寿命についても差がなくなり、両群とも癌死が増加していた。mAktDKOマウスにおける骨量の低下につては、骨格筋から分泌される骨芽細胞活性化因子を想定して、野生型およびmAktDKOマウスの骨格筋の網羅的発現解析から、いくつかの候補を得て培養骨細胞への添加による検討を行っている。平成28-29年度に計画していたAkt下流のシグナルの検討のうち、FoxO経路について、m4KOマウスの骨格筋量回復という成果を得ており、またmTORC1の関与についてはm3KOマウスが既に作成済みであり29年度に解析可能な状態である。さらに、肥満の影響についても代謝・寿命の両面で解析がなされている。さらに、骨量調節因子についても絞り込みが進んでおり、概ね計画通りに進行している。mAktDKOマウスが骨格筋量を含む表現型を呈する分子メカニズムとして、Aktの下流でFoxOの経路が制御しているのか、mTORC1の経路が関与しているのかを引き続き検討するため、骨格筋特異的Akt1/2 FoxO1/4欠損マウス(m4KOマウス)と、同Akt1/2 TSC2欠損マウス(m3KOマウス)を作製した。m4KOマウスでは、骨格筋量や運動機能の回復を認めたが、加えて速筋線維、ミトコンドリア、解糖系、オートファジー、老化マーカー関連といった、mAktDKOマウスで見られた遺伝子発現変化が、ほぼ全て消失していた。
美しい都市景観形成に配慮する家庭ゴミ集積所の在り方―ＱＯＬ向上に資する基礎研究―

本研究は,日常生活に不可欠な家庭ゴミ集積所に求められる景観的・計画的配慮を,戸建住宅地および分譲マンションに注目し考察した。文献,アンケート,聞取り,現地観察の各調査を行った。結果,家庭ゴミ集積所は主に余剰地に配置されており,地形や敷地形状を考慮した計画や街区公園等との連携が必要。利用者や管理者は使い易さに加え美しさも求めており,集積容器には素材や形状,可搬性に改善が必要。景観行政は景観的配慮を,ごみ担当行政は収集作業の安全と容易さを各々優先し,両者のバランスが必要。住宅地および建物の設計者には,計画時の要配慮事項に含めることが必要。特に分譲マンションでは容積率算定対象からの除外が望まれる。本年は北海道内にある郊外戸建住宅地から、造成年、地形、収集方法の相違、建物形態規制の有無等に着目し、7市1町で調査対象の郊外戸建住宅地を選定した。うち1市で諸事情から住民意識調査の断念を要請され、6市1町で調査を実施し以下の成果が得られた。(1)8市町の行政担当部局聞取り調査から、町内会・自治会による自主管理が前提、民地内設置の原則、分別によるごみ減量効果の頭打ち、分別実施前から住まう住民と分別実施後に育った住民の使用実態の相違、ごみの種類や重量/容量による汚損状況の違い、収集事業者による実態に即した柔軟な対応、多様な苦情の具体的内容等、家庭ごみ収集の実状を整理するうえで貴重な情報が得られた。(2)6市1町の郊外戸建住宅地で計1,395通のアンケートを訪問配布し、1,004通を郵送回収した(受取人払、回収率71.9%)。箱型集積容器は、獣害や風害に遭いにくく評価が高いがデザインの改善が望まれている。未使用時に撤収する仮設型集積容器は、手間がかかるが未使用時に景観を阻害しない点が評価された。建物形態に統一感が見られるほど住宅地景観との調和が意識される一方、対象地の違いに依らず、住宅地開発時の設置位置考慮、容器デザインの洗練、利用者マナー向上等が重要と認識していることを明らかにした。(3)実態調査は、アンケート対象地域内の家庭ごみ集積所全465ヵ所、計566器の集積容器を対象とした。設置位置、置き方、容量、素材、備品の有無等をデータ化し整理分析した。ごみ種別に応じた複数設置、街路構成と道路幅員による配置位置の制約、公共地(歩道や河川敷、公園脇等)依存等が確認でき、住宅地開発時に家庭ごみ集積所も併せて考慮する必要性を明らかにした。(4)以上の調査を通じて使用方法(ソフト)を想定した住宅地構成(ハード)が欠かせないこと、さらに今後の研究課題が整理される等、大きな成果が得られた。H26年度は分譲マンション(以下MS)の家庭ごみ集積所に注目した。観察調査では,MS分布状況を確認のうえ,公共交通の駅周辺,景観との調和が求められる風致地区に着目し札幌市中央区内7地区を選定した。アンケート調査は,MS管理関係の団体に加盟する道内のMS管理組合を対象とした(回収/配布:215通/500通,回収率43%)。聞取り調査は,札幌市の家庭ごみ担当と都市景観担当部局,MS開発事業者と設計技術者に実施した。以下に成果の要点を整理する。(1)現状:観察した172箇所の家庭ごみ集積所のうち,既製品設置が51.8%,ごみを置く場所の施工が23.3%で計画段階の配慮の乏しさが確認できた。(2)管理者の考える望ましいあり方:清潔感66.7%,ごみが直接見えない52.6%,外壁等と調和24.9%が上位3項目となった。40.0%が街並み景観との調和を「必要」とした。(3)計画段階の配慮の変化:10年程前までは接道部分に既製品の置き場所を確保する程度であった。近年,本州の開発事業者が建物と仕上げを合わせたり建物に組込む方法を採り入れ,道内事業者の追従が見られる。目的はMS品位の向上であり,計画段階の配慮に繋がっている。(4)計画上の懸念:建物に組込むと容積率算定に含まれ住戸面積の縮小に繋がる。購入想定階層が一般的な場合は既製品を設置,ハイクラスの場合は品位重視で組込む傾向にある。組込む場合は臭気流入や出入口付近での液垂れに対策が必要となる。(5)景観行政との関係:札幌市には景観計画('08年適用)があり,一定程度以上の建物は届出と協議・指導の対象となる。適用後6年経過し事業者にも家庭ごみ集積所の景観的配慮が浸透しつつある。(6)上記から,設計段階の配慮事項に望ましいあり方を反映させる,共用廊下等に倣い家庭ごみ集積所の容積算定除外を検討する,などの必要性が整理でき大きな成果が得られた。H27年度は,H25年度に取り組んだ戸建住宅地を対象とする調査研究,およびH26年度に取り組んだ分譲マンションを対象とする調査研究の成果をまとめることと,必要に応じた補足の情報収集に取り組んだ。

戸建住宅地に関しては,まとめとなる論文を日本建築学会計画系論文集へ投稿し,2016年4月発刊(戸建住宅地における家庭ごみ集積所の実態と利用者の評価美しく住みよい戸建住宅地を実現するための基礎研究日本建築学会計画系論文集第81巻第722号pp1019-1028)に掲載された。また,まとめの中で今後の課題に整理した「造成時から家庭ゴミ集積所用地を確保」した住宅地を2箇所探し出すことができ,更なる研究の足がかりを得られた。同時に,複数の民間事業者が独自の視点で開発した新たなデザインのゴミ集積容器を3器確認し,札幌市内の清掃事務所において熱心に家庭ゴミ集積所の在り方改善に取り組んでこられた方との意見交換から現場の様子を伺うことができた。分譲マンションに関しては,まとめとなる論文の投稿を鋭意執筆中である。日本マンション学会北海道支部において研究成果を紹介する機会を頂戴できた。その場において,研究では気づけなかった個別の問題(ゴミ集積所の扉を閉じる際に出る音への苦情,中が見えないと不法投棄される懸念,積雪・降雨時の動線確保等)を伺うことができた。また,マンション設計技術者からは,建設時期や立地の違いから生じるゴミ集積所の配置が特徴的なマンションの図面を複数提供いただいた。戸建住宅地と分譲マンションとのそれぞれについて,研究成果を論文として公表したり関係者に紹介したりできたことが最終年度の大きな成果と考える。それに留まらず,研究のステップアップにつながる複数のヒントや資料を収集できた意味は大きい。さらに精緻な調査研究に取組み,適切な方法での成果公表を通じてQOL向上への寄与を目指す。本研究は,日常生活に不可欠な家庭ゴミ集積所に求められる景観的・計画的配慮を,戸建住宅地および分譲マンションに注目し考察した。文献,アンケート,聞取り,現地観察の各調査を行った。結果,家庭ゴミ集積所は主に余剰地に配置されており,地形や敷地形状を考慮した計画や街区公園等との連携が必要。利用者や管理者は使い易さに加え美しさも求めており,集積容器には素材や形状,可搬性に改善が必要。景観行政は景観的配慮を,ごみ担当行政は収集作業の安全と容易さを各々優先し,両者のバランスが必要。住宅地および建物の設計者には,計画時の要配慮事項に含めることが必要。特に分譲マンションでは容積率算定対象からの除外が望まれる。当初計画に沿って,分譲マンションの分布状況や地域特性を考慮した上で調査対象地区を適正に選定し,家庭ごみ集積所の観察調査を172箇所で実施し,管理状況アンケート調査には215の管理組合から回答を得た。聞取り調査は,行政の家庭ごみ収集の担当部局と景観の担当部局,民間のマンション開発事業者と設計技術者に実施した。観察調査では,現在の分譲マンションに見られる家庭ごみ集積所について,バリエーションをおよそ網羅してそれぞれの特徴を分類整理することができた。アンケート調査では,日頃から家庭ごみ集積所の管理に携わるマンション管理員の実感・考え・意見をくみ上げられた。加えて,使用中の家庭ごみ集積所の形状と設置位置を確認する問いを用意したことから,観察調査で収集整理した家庭ごみ集積所の様子と照合して,管理の内容や状況を踏まえた考察ができた。聞取り調査からは,「収集」と「景観」との両面について行政からなされる指導および協議内容を整理できたとともに,開発事業者・設計技術者の考え方や対応の実態,さらに入居後の居住者から寄せられたクレームなどの反応も伺うことができた。一方,集合住宅には分譲マンションのほか賃貸マンションもあるが,賃貸マンションは研究対象から除外した。その理由として,家庭ごみ集積所の管理状況に関する正確な把握と確認の困難さ,居住者の匿名性が高くマナーのみが主な論点となる懸念が挙げられ,計画的な配慮を導き出すに足る調査結果は見込みにくいと判断したためである。
企業による農業参入の今日的課題の解明

本研究では,企業の農業参入の今日的課題の解明を図った。国際比較の観点からは,企業の農業参入は必ずしも農地取得を伴わないこと,企業経営はプロ農業経営者により支えられるべきことを明らかにした。また,我が国における企業の農業参入は,(1)当該品目の希少性,(2)調達できないときの損失,(3)調達先多様化のメリット,(4)全社的な収益向上,(5)自社遊休資源の有効活用の5つの論理から説明できることを示した。国内外における企業の農業参入について,従来注目されていなかった新たな論点を析出すベく,研究を進めた。国内では,農業参入を行う業種として食品製造業の原料調達など「動脈」視点での参入が専ら注目されているのに対し,食品リサイクルという「静脈」視点で廃棄物処理業者等の参入が増加する可能性を示すとともに,当該業種による農地取得には処分場用途もあり,農地の適正利用の確保が課題となることを指摘した。また,食品関連業種においても,従来は農地を取得する方式での農業参入が専ら注目されてきたが,農商工連携など農地取得に限定されない形での農業参入についても調査研究を進めている。国外では,米国における企業の農業参入規制の動向および農地取得にこだわらない農業参入方式として生産契約の活用による参入実態について現地調査を行った。米国中西部では農地取得に州レベルでの規制が存在し、企業の農業参入の抑止策となっているが,農地取得ではなく生産契約形態での参入も進行している。生産契約は専ら畜産分野で活用が進み, 90年代後半には耕種分野での普及も予測されていた。2008年夏に行った調査では,実際には耕種における生産契約の普及は進んでいないことが明らかになった。また,種子生産において普及している生産契約の契約実態について分析を行い,種子生産では適作地が限られることもあり,生産者が著しく不利になるような契約内容とはなっていないことを明らかにした。国内外における企業の農業参入について,従来注目されていなかった新たな論点を析出すべく,研究を進めた。国内では,農業参入を行う業種としてあまり注目されていない食品卸売業における農業参入事例に着目した。卸売企業による農業参入は,売れ残りリスクや販売価格リスクといった農産物の販売にかかるリスクを回避し,高付加価値販売を実現できるという点で,農業参入に際し一定の優位性を持っているが,生産については必ずしも優位性を持っているわけではないことを示した。その内実は,確保した農地の条件が悪いといった制度的・社会的要因によるものもあれば,栽培に関する技術的要因によるものもあるため,これらの課題を円滑に解決しつつ,その優位性をいかに発揮していくかが食品卸売業による農業参入成否の鍵となると考えられる。また,食品関連業種に限らず,従来は農地を取得する方式での農業参入が専ら注目されてきたが,農商工連携など農地取得に限定されない形での農業参入についても調査研究を進めている。国外では,英国における企業の農業参入をめぐる状況について調査分析を行った。英国では「企業の農業参入」は一部の野菜・果樹などの集約的部門に限られているが,その一方で,農業経営・農場運営を地権者から受託し,専門のファームマネジャーを擁して大規模経営を行う請負会社が存在している。そこで,このような請負会社について事例分析を行い,その特徴や存立条件などを整理した。研究最終年度にあたる本年度は,これまでの研究成果のとりまとめと補足調査を中心に,(1)企業の農業参入をめぐる政策に対する提言,(2)既存の農業経営による企業的な発展可能性に関する理論的基礎の提供,を行うことを目的として,国内の農業参入事例の分析及び英国における企業と農業の関連に関する実態調査を実施した。その研究成果は,企業の農業参入の論理と課題として整理した。すなわち,企業の農業参入は,(1)当該品目の希少性(自分たちが作らなければ手に入らない恐れ),(2)調達できないときの損失(食品工場の稼働率の低下など),(3)調達先多様化のメリット(外部の取引先に対する予防線),(4)全社的な収益向上(ブランドイメージの向上や新たなビジネス獲得),(5)自社遊休資源の有効活用(機械・労働力や堆肥など)の5つの論理から説明できること、また,課題としては,本業が別にある企業にとっての農業は「副業」としての位置づけにとどまるケースが多いことから,企業の農業参入によって生産過程に革新が見られるわけではなく,結果として地域農業の活性化というよりも地域農業(および日本の農業)が持つ「生産の効率化が難しい」という問題点を浮き彫りにするものであることを明らかにした。また,今後の展望として,農地取得による生産進出というよりも,既存の農業法人への出資や,提携・契約等による参入が増えていくことが予想されること,その際に,特に出資についてはROEの低さが問題となることを示した。
気質から見た双極性障害の病態進展と治療反応性の予測

双極性障害患者のうち、循環気質高得点群は低得点群と発症年齢はほぼ一緒だが、年間あたりの抑うつエピソードが有意に多く、年間あたりの総気分エピソード数も有意に多かった。またn-back testをタスクとしてfMRIを撮像すると、0-back testにおいて脳幹部中脳付近に有意なクラスターを認めた。このクラスターは、循環気質高得点群の方が循環気質低得点群よりも、罹病期間が長くなるほど賦活の程度が小さくなるという交互作用を有した。0-back testにおけるこの交互作用は、循環気質の患者は双極性障害の罹病期間が長くなるほど中脳・縫線核のセロトニン機能が低下する病態を呈する可能性を示唆する。この研究においては、気質の神経基盤と推定される部位からどのように脳機能が変化して双極性障害に至るのか、発症した後に再発が繰り返される患者ではどのように脳機能が変化していくのか、などを検討することが主たる目的である。昨年度1年間で、fMRIに関してはうつ病患者5名(男性3名、女性2名)平均年齢43.4歳と双極性障害患者13名(男性11名、女性2名)平均年齢41.8歳を完了した。N-backtestの成績を気分障害の疾患別に調べたところ、0 back testでは双極性障害、うつ病、健常者の間に有意差なく、1 back testや2 back testでは双極性障害とうつ病よりも健常者の方が有意に成績が良かった。最も難易度の高い3 back testでは、双極性障害がもっとも成績が悪く、うつ病、健常者の順に成績は良くなり、双極性障害とうつ病、うつ病と健常者の間に有意差を認めた。これらの所見は、N-back testで評価しうる認知機能に関して疾患別に差異があり、双極性障害<うつ病<健常者であることを示唆している。最近、台湾での研究(Chen MH, 2015)で、55歳以上のうつ病1946名、双極性障害345名、年齢や性をマッチさせた健常者2291名を追跡したところ、認知症の罹患率は、双極性障害>うつ病>健常者の順であったという報告があり、認知機能で見ると我々の所見と一致して、双極性障害<うつ病<健常者であった。今後症例数を増やすとともに、画像的に脳のどの部位がN-back testと相関しているか、それが経時的にどのように変化していくかを検討していきたい。この研究の目的は、健常者の気質のみの脳画像と、双極性障害初発の患者の脳画像、さらに再発を繰り返した患者の脳画像を比較することで、どのように気質や気分を司る神経基盤の変化があるのかを脳画像を用いて縦断的に多角的に推定していくことである。同一患者をフォローするのは時間的に困難なので、健常者群、発症後間もない群、再発群をそれぞれ横断的に検査し、それらの所見を縦断的に組み立てる。おそらく、双極性障害に関する従来の画像研究は、気質による所見と双極性障害による所見を整理せずに、すべて双極性障害による所見とみなしていた可能性が高く、画像研究をさらに精緻なものにする意義もある。また今までは、疾患の種類、疾患の経過、疾患の病像などによって、気分安定薬の選択などを行ってきたが、疾患の背景にある気質にも注目して治療の使い分けが出来るように検討する。中間解析として、双極性障害患者15名(双極I型障害6名、II型障害9名)を対象に、n-back testをタスクとしてfMRIを撮像した画像データを解析した。平均年齢は42.8歳、男性11名、女性4名、平均エピソード回数は7.5回、そのうちうつ病エピソードは4.7回、軽躁病エピソードは1.8回、躁病エピソードは1.0回であった。平均罹病期間は14.6年で、検査時のハミルトン抑うつ状態評価尺度平均得点は6.8点、ヤング躁状態評価尺度平均得点は1.1点とほぼ正常気分であった。n-backtestの平均正答率は、0 back 74.5%, 1 back 62.7%, 2 back 45.2%, 3 back 43.0%と難易度が上がるにつれて正答率は低下した。n-back task(0,1,2,3)の正答率を従属変数とし、年齢・性別・双極性障害のタイプ(BPIor BPII)、エピソード回数、罹病期間、質問紙(HDS-R, YMRS, BDI)を独立変数として重回帰分析(ステップワイズ法)を行ったところ、0 backや1 backでは性別が正答率を有意に予測し、2 backや3 backでは罹病期間が正答率を有意に予測した。さらに、n-back testをタスクとして賦活される脳部位と年齢、性、罹病期間、エピソード回数の相関を重回帰分析により検討すると、0 backや1 backでは相関のあるクラスターはなく、2 backや3 backで右小脳と左下部頭頂葉が有意な相関を示した。今回の解析の対象にはしなかったが、健常者やうつ病の被験者も着実に収集できており、最終的に、健常者、うつ病、双極性障害の3群間の比較を行える状況である。

発揚気質高得点群は低得点群と比較して、発症年齢が遅い傾向があるが、年間あたり気分エピソード数に有意差はなかった。さらに、fMRIでn-back task施行中の脳賦活部位に関して、循環気質得点の高低の主効果、罹病期間の主効果、循環気質得点の高低と罹病期間の交互作用について、年齢と性別を共変量としてモデルに採用したところ、1-back, 2-backでは有意なクラスターを認めなかったが、3-back testにおいて循環気質得点の高低の主効果として左小脳と右下頭頂小葉に有意なクラスターを認めた。また、0-back testにおいて脳幹部中脳付近に有意なクラスターを認めた。このクラスターは、循環気質高得点群の方が循環気質低得点群よりも、罹病期間が長くなるほど賦活の程度が小さくなるという交互作用を有した。中脳付近には、セロトニン神経細胞が密集する縫線核が存在し、セロトニンが双極性障害の病態生理とかかわっている可能性が大きいことや、先述したように循環気質高得点群は年間あたりの抑うつエピソードが有意に多いことを考慮すると、0-back testにおけるこの交互作用は、循環気質の患者は、双極性障害の罹病期間が長くなるほど中脳・縫線核のセロトニン機能が低下する病態を呈する可能性を示唆する(投稿準備中)。双極性障害患者のうち、循環気質高得点群は低得点群と発症年齢はほぼ一緒だが、年間あたりの抑うつエピソードが有意に多く、年間あたりの総気分エピソード数も有意に多かった。またn-back testをタスクとしてfMRIを撮像すると、0-back testにおいて脳幹部中脳付近に有意なクラスターを認めた。0-back testにおけるこの交互作用は、循環気質の患者は双極性障害の罹病期間が長くなるほど中脳・縫線核のセロトニン機能が低下する病態を呈する可能性を示唆する。積極的に被験者のエントリーを行なっていく。病棟や外来の患者さんにも、今まで以上に声掛けをしていく。積極的に被験者のエントリーを行っていく。学会発表なども行う。双極性障害、うつ病、メンタルヘルス予定していた学会発表を行なわずに、旅費が30万円分浮いたため。被験者のエントリーが予定数より少々少なかったため予定した学会発表を行わず、旅費を使用しなかったため当該年度の症例予定数に満たなかった分も、次年度症例を集める予定であるため、その経費として使用する。また、学会発表も積極的に行なう。当該年度まで症例予定数に満たなかった分も、次年度症例を集める予定であるため、その経費として使用する。また、学会発表も積極的に行う。
材質制御成形の逆行シミュレーション

本研究は、解析シミュレーションによるひずみの評価、プラスティシンによるモデル試験、および、ステンレス鋼の実物試験を中心に研究を進め、下記の成果を得た。1.本研究に適用可能な汎用構造解析プログラムを調査し、複数のプログラムを選定し、各々の特長を比較検討した。2.上記プログラムから1つを選定し、単純な形状について、大変形問題に対する適用性を、(1)剛塑性,(2)弾一完全塑性条件で確認した。3.前年度選定した解析プログラムにより、材料特性に分布を持つ場合を検討し、材料特性の温度依存性についてモデル試験に対応する結果を得た。4.逆行シミュレーションのためのひずみ評価法として、プラスティシンの内部のひずみを、赤外CCDカメラにを使い温度分布を計測することにより自動計測する手法を案出した。この方法によって、加工度の評価が容易に可能となった。5.ステンレス鋼(SUS304H,SUS304L)の円柱据込み試験によって、加工温度、加工度と材料組織の関係を検討し、ひずみ分布と硬度分布の対応付を行った。6.上記試験によって、加工温度と加工度とからひずみ分布を解析シミュレーションにより推定し、予め用意した加工パス-組織データベースで最終材料組織を予測することが可能であることを示した。7.加工パス-組織のマッピングのための試験方法、あるいは、測定項目等に関して検討し、今後の研究の方向を提案した。
植物における中枢時計の探索

本研究は植物における生物時計の組織特異的な機能を明らかにするための第一歩として、組織特異的に時計機能を阻害した系統の作出および時計遺伝子のプロモーター活性を組織特異的に測定するための系の開発を目指した。茎頂・表皮・葉肉・維管束・根および自身のプロモーターやCaMV35Sプロモーターを使い組織/器官特異的に時計機能を阻害した24系統の作出に成功した。また、スプリットルシフェラーゼを応用することで、組織特異的な発光リズムの振動が測定された。本研究は植物における主要時計の探索と生物時計の機能の組織特異的な解析を行うことで、主要時計を始めとする生物時計を器官/組織レベルで理解し、動物との比較から生命の基本システムとしての時計の理解を目指すものであった。具体的には組織特異的プロモーターを用いて、生物時計機能を組織特異的に阻害した系統の作出を行った。研究計画時に比べて、作出する形質転換体の種類を倍増させたため、研究にやや遅れが見られたものの、葉肉(CAB3,LhcB)、維管束(SUC2,Sultr1:3,Serat2:1)、表皮(CER6,AtML1)、茎頂(UFO,WUS)、根(At3g12580)、内生プロモーター(TOC1,CCA1)、過剰発現(35S)と13種類のプロモーターについて、それぞれToc1-GFPとCCA1-GFPを発現する形質転換体の作出が終了した。これら形質転換体はT1世代において花成時期や葉の面積、胚軸等さまざまな生理応答に対して表現型が見られ、植物の生物時計が広範な生理応答に関わっていることが改めて確認されるとともに、それらの生理応答を制御している生物時計機能には組織特異的な機能分担が存在することが示唆された。本年度は計画より遅れていた組織特異的に生物時計機能を阻害した系統(全24種)についての作出およびホモ化の大半が終了した。全ての系統についてのホモ化が完了していないものの、すでにホモ化されている系統の解析から、花成の促進に関しては篩管束箭部における生物時計機能が重要であることが示唆された。このことは既に報告されている花成ホルモンであるFTの発現部位が維管束篩部であることと一致するものであり、花成制御における篩管束の生物時計の重要性が改めて示された。得られた系統の中には葉の大きさや胚軸伸長などに野生型と異なる表現型を示すものが見られており、これらについても順次解析を進めている。こうした結果から、植物にも生物時計の組織特異的な機能分担が存在していることが示され、今後の細胞や組織レベルでの解析の重要性が示唆された。
全身性微振動刺激のがん骨転移の成立・進展に対する予防効果の実験的検証

がんの骨転移に対する全身性微振動刺激(WBV)の治療効果について検討した。がん細胞を乳腺移植したマウスを3群に分け、各々に0 Hz(無負荷)、45 Hz、90 HzのWBV(加速度振幅0.3g)を、1日20分、週5日で与えた。3週間後、脛骨近位骨幹部を放射光CTで計測し、3次元骨構造解析を行った。無負荷群に比べ、90 HzのWBVを与えた群では皮質骨体積、海綿骨体積分率ともに有意に高値を示し、血中オステオカルシンも上昇した。一方、45 HzのWBVはほとんど効果を示さなかった。WBVによる骨形成促進ががんによる骨破壊を遅延させていると推測され、その効果は振動数依存的であることが示唆された。近年,がん療法の進歩によって患者の生命予後が延長される一方で,QOLを著しく損なうがん骨転移のリスク管理も強く求められるようになっている.本研究の目的は,骨吸収抑制作用が報告されている全身性微振動(whole body vibration: WBV)のがん骨転移の成立に対する予防効果を,マウス実験によって検証することである.初年度は適切なマウス骨転移モデルの作製を試みた.易骨転移性を示す乳がん細胞(4T1)をマウス(BALB/c, ♀, 8週齢)の乳腺あるいは左心室に移植し,移殖部位と移殖数によるマウス病状,生存期間への影響を調べた.これまでのマウスWBV負荷実験においてその骨への作用が3週間ほどで認められたことから,生存期間の目処を>3週間とし,また,WBVの効果検証を困難とする重度な骨破壊進展とならない移殖条件を探索した.文献調査により,移殖部,移殖がん細胞数は以下の組合わせて行った(いずれもn=5).この結果,左心腔内移植については,いずれの移殖数でも23週間で死亡し,胸腔内、肺、心血管周囲、胸膜に腫瘍が確認された.20,000 cells移殖では体重減少も認められた.一方,乳腺移植については,1,000,000 cells移殖で一匹のみ2週後に死亡が見られたが,体重減少は認められず,立毛やうずくまりも確認されなかった.移殖3週後の腫瘍転移は4T1細胞の好転移部位である肺,骨に確認された.本結果より,WBV実験に利用されるマウス4T1骨転移モデルとして,乳腺移殖,移殖数200,0001,000,000 cellsとすることが適切と考えられた.次年度の本実験へ向けて,重要なマウスがん骨転移モデルの作製の目処が立った.実験計画では,骨転移の好発環境である骨吸収促進部位を有す骨粗鬆症マウスの利用を考えたが,高い易骨転移性を示す4T1細胞の利用により,シンプルな系での骨転移モデル作製が可能となった.また,振動負荷装置については既に設置済みであり,与える振動条件についても検討済みである.本骨転移モデルに対するWBV負荷実験は既に開始したところである.全身性微振動(whole body vibration: WBV)のがん骨転移の成立に対する予防効果を検証するため,マウス骨転移モデルを用いた実験を行った.<動物実験>前年度に作製を試み,がん骨転移の観察に適当と判断した乳がん細胞(4T1,5x10^5 cells)を乳腺に移植したマウス(BALB/c, ♀, 8週齢)を利用し,4T1細胞移殖の翌日より,20分/日,5日/週で3週間のWBV負荷実験を行った.マウスはWBV群(3群)と非WBV群(振動ケージに入れるが,振動は与えない)に分け(各群10匹),WBV群には加速度振幅0.3g,周波数15Hz,45Hz,あるいは90Hzの負荷を与えた.<放射光CT>3週後に摘出した脛骨試料は固定後,SPring-8放射光施設において単色CT計測をおこなった(分解能2.74μm).現在まで画像再構成,ファントム計測に基づく骨ミネラル情報の抽出,形態解析のための画像処理は完了し,骨転移はあるが骨構造は概ね維持されたていることが確認されている.現在,形態解析に取り組んでいるところである.<生化学分析>WBV終了後に採血し,血清から骨形成マーカー(オステオカルシン),骨吸収マーカー(酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ)をELISAにて測定した.骨形成マーカーには有意差は無かったが,45HzのWBVで高値を示した.一方,骨吸収マーカーは15Hz,90Hzで有意に高値であった.これらのことから,WBVの骨代謝への効果が周波数に依存し,効果の望める特定の周波数レンジの存在が示唆された.画像処理用に準備した高パフォーマンスPCが不調となり,その回復の間,汎用PCを使用せざるを得ず,大量画像データを処理するのに予想外の時間が費やされたため.現在,この問題は解決されている.乳がん骨転移に対する全身性微振動(whole body vibration: WBV)の抑制効果を,マウス骨転移モデルを用いて実験的に検証した.<動物実験>データの信頼性を増強するため,乳がん細胞(4T1,5x10^5 cells)を乳腺に移植したマウス(BALB/c, ♀, 8週齢)を用いた実験を引き続き行った.

マウスはWBV群(3群)と非WBV群(振動ケージに入れるが,振動は与えない)に分け(各群10匹),4T1細胞を移殖した翌日から,20分/日,5日/週の頻度でWBV刺激を3週間与えた.WBVの振動様式は加速度振幅0.3g,周波数15Hz,45Hz,あるいは90Hzとした.さらに,週齢を合わせた健常マウスとの比較評価も行った.<計測> 3週後に摘出した脛骨試料は固定後,SPring-8放射光施設において単色CT計測をおこなった(分解能2.74μm).骨・骨髄の体積,海綿骨体積率,骨梁幅,骨梁結合数,皮質骨空隙率,骨ミネラルを解析した.また,WBV実験後に採血し,血清から骨形成マーカー(オステオカルシン),骨吸収マーカー(酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ)をELISAにて測定した.<結果>非WBV群に比べ,15および90HzのWBV群の皮質骨体積,骨梁体積率は有意に高値を示し,有意差はなかったが結合数,結合密度も高値を示した.ただし,WBVによる骨転移抑制の効果は健常骨の骨形態を維持するものではなかった.一方,45HzのWBV群ではほとんど効果が見られなかった。骨形成マーカーは90HzのWBV群で非WBV群より高値を示したが,15HzのWBV群では差は認められなかった.がん骨転移に対するWBVの作用は,周波数依存性であることが窺われた.がんの骨転移に対する全身性微振動刺激(WBV)の治療効果について検討した。がん細胞を乳腺移植したマウスを3群に分け、各々に0 Hz(無負荷)、45 Hz、90 HzのWBV(加速度振幅0.3g)を、1日20分、週5日で与えた。3週間後、脛骨近位骨幹部を放射光CTで計測し、3次元骨構造解析を行った。無負荷群に比べ、90 HzのWBVを与えた群では皮質骨体積、海綿骨体積分率ともに有意に高値を示し、血中オステオカルシンも上昇した。一方、45 HzのWBVはほとんど効果を示さなかった。WBVによる骨形成促進ががんによる骨破壊を遅延させていると推測され、その効果は振動数依存的であることが示唆された。がん骨転移成立に対するWBVの抑制効果について,骨量および骨内微細構造のSPring-8放射光CTに基づいて評価する.<組織標本観察> WBVの条件を加速度振幅0.3g,周波数を15Hz,45Hz,あるいは90Hzとして,負荷実験を行う.WBVは4T1細胞移殖の翌日より開始し,20分/日,5日/週で負荷する.マウスはWBV群(3群)と非WBV群(振動ケージに入れるが,振動は与えない)に分け,各群10匹,計40匹を使用する.3週後に試料を摘出し,放射光CTによって骨微細構造を高精度で抽出,加えて線吸収係数から骨ミネラル密度を計測し,骨転移成立へのWBVの作用について検討する.<生化学分析>WBV負荷期間の最終日に尾静脈より採血し,血清を得る.骨代謝および腫瘍血管新生の生化学的指標エンザイム・イムノアッセイ(EIA,ELISA)により測定する.放射光CT画像に基づく乳がん移植マウス脛骨のマイクロ形態解析を進めるとともに,同骨組織の研磨試料を作製し,第2高調波発生光を利用したコラーゲンの無染色イメージング,および顕微ラマン分光法による化学成分解析(ミネラル,コラーゲン,成熟性)を行い,骨組織上の骨成分分布マップを作成する.以上の多角的な計測・解析により,WBVの乳がん骨転移における作用を検証する.生体医工学3月に納品となり(代表者),支払いが完了していないものと,消耗品の購入予算(研究分担者)における残余で,納品時の割引によるものである.既に使用済みであるが,3月使用分について一部支払いが完了していないため.本未使用額は,H28年度助成金の使用計画の消耗品(動物実験)に充てる.4月に支払い完了予定である.
堆積物のキノン分析による過去の微生物群集変動の復元

堆積物中のイソプレノイドキノンとそれらの類似化合物に着目し,過去の微生物の生物生産や群集組成の年代変動を復元する研究法を開発・検討した。その結果、現世の海底堆積物中の遊離態成分や新第三紀および白亜紀の堆積岩中の高分子有機物(ケロジェン)に結合している成分として、イソプレノイドキノンに構造が類似するトコフェロールが有力な海生藻類バイオマーカー指標として応用できることを提案した。一方、限られた試料において、ケロジェン結合態フィロキノンがシアノバクテリアに由来し、その生産性の指標となることを提案した。また、芳香族キノンが、地衣類の生産性と海洋への移送・堆積量を復元するバイオマーカーに応用できる潜在性も指摘した。地質時代に埋積した堆積物中に含まれるイソプレノイドキノン(略してキノン)に着目し,キノン組成分析から過去の海洋および陸上土壌における全微生物の群集組成およびバイオマス,それらの年代変動を復元することを目的として,その分析法の開発と検討を行った。本研究は,微生物が駆動する長時間スケールの物質循環システムを解明するための情報を得ることにも踏み込む。検討された方法を,実際の連続的に得られた堆積層に対して応用し,年代変動を復元する段階まで進めることが目標である。平成20年度の研究成果は以下のとおりである。1.東北日本の新第三系の沖合堆積物層の珪質頁岩と中部日本の新第三系の沿岸堆積層の泥岩を使用して,堆積性高分子有機物(ジオポリマー)から結合態キノンを取り出す分析方法の開発・検討した。おもに化学分解法を用いた結合態キノン分析法の検討を進め, 3弗化ホウ素(BF3)/ジエチルエーテル錯体を用いたエーテル切断法を実用・レベルまで改善した。分解成分として得られたキノンの同定・定量には,すでに当研究室内に設置されているガスクロマトグラフ質量分析計(GC/MS)を使用した。その結果,数種類のキノンの派生物が検出され,数100万年前の堆積物にもキノンが残存することを確認した。2.中部日本の新第三系の沿岸堆積層について,キノン組成の年代変化を求める分析を行なった。その結果,ある限られた層準で,真核生物の葉緑体やシアノバクテリアがもつフィロキノンの派生物が比較的高濃度に検出されることがわかった。それが検出される地層の堆積環境などから判断し,フィロキノン濃度はシアノバクテリアの生産性(バイオマス)の指標になりうると提示した。3.平成21年3月(5月)から統合深海掘削計画(10DP)の赤道太平洋航海(Exp. 320)に参加し,深海掘削堆積物コアを採集する。このコアもキノン分析に用いる予定である。地質時代に埋積した堆積物中に含まれるイソプレノイドキノン(略してキノン)と関連化合物(ビタミン)に着目し,それらの組成分析から過去の海洋・陸上環境における全微生物の群集組成およびバイオマス,それらの年代変動を復元するために,分析法の開発と検討を行った。平成21年度の研究成果は以下のとおりである。1.平成21年3月5月に,統合深海掘削計画(IODP)の赤道太平洋航海(Expedition 320,PEAT)に有機地球化学者として参加し,深海掘削堆積物コアを採集した。2009年10月には始新世中新世の連続的なコア試料が当研究室に届けられ,汚染チェックのための分析を始めた。2.中部日本の新第三系の沿岸堆積層について,堆積性高分子有機物(ジオポリマー)から結合態キノンを取り出す分析方法の検討を継続して行った。3弗化ホウ素(BF3)/ジエチルエーテル錯体を用いたエーテル切断法に加えて,高温下の加水分解による切断も検討した。数種類のキノンに類似したビタミン化合物を同定した。3.キノンまたは類似したビタミン化合物の構造決定と,それらのジオポリマーへの取り込み反応を明らかにするために,キノンとビタミンの標準物質を用いて検討実験を行った。その結果,フィロキノン(ビタミンK)のジオポリマーへの結合形態について新しい知見を得た。4.植物化石を対象にキノン・ビタミン化合物の結合態成分の検出を試みた。その結果から生体から化石への続成過程におけるそれら化合物の変化を検討した。前年度まで分析してきた堆積物中のイソプレノイドキノンに加え,芳香族キノンとその類似化合物に着目し,それらの組成から過去の特定の微生物の生物生産と移送・堆積量の年代変動を復元するための分析法を検討した。

また,ケロジェン(ジオポリマー)に結合しているキノン化合物の切断処理やそれに伴う二次的な反応を検討するために,キノンとそれに類似するビタミンの既知標準物質を使った実験も行った。さらに,具体的に堆積層シーケンスに応用し,微生物の生産変動を推定した。平成22年度の研究成果は以下のとおりである。1.中部日本の新第三系の浅海域堆積層において,遊離態成分としてアントラキノンなどの芳香族キノンや、キサントンなどの芳香族ケトン・ピランを同定した。芳香族キノン・ピランは陸源物質の割合の高い層準で高濃度に検出される傾向があることがわかった。これらは地衣類におもに由来すると推定され,それらの陸域での生産と海洋への移送を示すバイオマーカーとなりうることを提案した。2.白亜紀新第三紀の数種類の堆積岩中のケロジェンから結合態キノンを取り出す分析方法の検討を継続して行った。3弗化ホウ素(BF3)/ジエチルエーテル錯体を用いたエーテル切断法ではキノンが稀にしか検出されないという結論に至った。しかし,トコフェロールなどのビタミンは多くの白亜紀など古代堆積物からも検出された。深海掘削堆積物試料でも同様の結果が得られた。今後,ケロジェン結合態分子研究において,キノンよりもビタミンに注目して調査するべきであると指摘する。3.キノンまたは類似したビタミンの標準物質を用いた検討実験の結果,フィロキノン(ビタミンK)やトコフェロールのBF3/ジエチルエーテル反応における二次反応生成物はほとんど生じないことを確認した。しかし,トコフェロールキノンは二次反応によって多くの分解物に生み,注意を要することを確認した。
モデルtRNAのアミノ酸との特異な相互作用の関する実験的研究

遺伝暗号は3つの塩基と1つのアミノ酸を対応づける。しかしその対応関係がどんな分子構造にもとづいて成立しているかについては何も判っていない。この起源をもとめて、我々はこれ迄に数塩基のオリゴヌクレオチドとアミノ酸の間の相互作用を実験的に求めてきた。ここでは更に進んでtRNAの構造を部分的に持つようなモデルtRNAを作成し、それとアミノ酸の間の相互作用を見る。そのためには現在のtRNAのどこが重要な部分であるかを決定する必要があり、これがtRNAアイデンテイテイの問題である。我々は大腸菌の20種のtRNAのどこがARSによって認識されているかを世界に先駆けて決定し、その大部分がアンチコドンと識別位塩基に集中していることを示した。ひきつづき、これらの部分を持っているtRNAを合成するのに最も適当な方法を調べた。クローン化、PCR法、直接T7RNAポリメレースをかける方法などをつぎつぎに試みた結果、大きなtRNAと違って、少々収率が悪くても、直接ポリメレースをかける方法が確実であることを認めた。その際のプライマーの取り方も、比較的一貫性のあるものを用いて良いことが判った。この結果に基づきいろいろな小RNAを作り、酵素的、無酵素的にアミノ酸やATPとの反応を調べたが、酵素的にはいわゆるミニヘリックスがほどほどの反応を示したに過ぎなかった。この結果はアミノ酸としてより活性のあるものを用いる必要を示しているものと思われ、現在この線で研究が進められている。モデルtRNAとしてどのようなものを作成するかを決めるため、大腸菌の20種のアミノ酸に相当する諸tRNAのミュ-タントをTクポリメレ-ス転写系を用いて用意した。アミノアシレ-ション活性をこれらミュ-タントについて調べると、アンチコドン,3′末端から4番目のいわゆる識別位塩基が、殆んどのtRNAについて共通に、アミノアシルtRNA合成酵素の認識位になっていることが判明した。ただし、tRNA^<Sen>,tRNA^<Len>,tRNA^<Ala>についてはアンチュド-が効かず,またtRNA^<Sen>,tRNA^<Thn>については識別位塩基が使われていなかった。この事実は,アンチコドンを識別位塩基の複合体が対応するアミノ酸を立体化学的に認識する事実があり,これが造伝暗号の分子給的基礎づけに関係するという我々の仮定と良く合致する。この点を確めるため,認識に効かなかったtRNA^<Thn>の識別位培基が酵母,仔牛といった高等生物にどのように働いているかを確かめる実験を進めている。一方、上記2部位以外の認識点も、glyでは5′末端から2番目の塩基対、valでは4番目(Alaは3番目のことが良く知られている)と解明されたので、いわゆるacceptor stem部分が原始の時期に活用されていた可能性が濃くなった。したがってacceptor stermからanti codon stemに続くヘアピン構造のモデルtRNAこそが、原始tRNAであると思われる。目下、クロ-ニング、を接ポリメレ-スをかける行き方、原始tRNAの長さに応じた合成法の違いといった諸点を中心に、大量にモデルtRNAを合成する方法を探っている。その確立が2年度の課題である。上記の結果は多くの出版物として発表されつつある。研究の目標を前年度にひきつづき、原始tRNA作成のための要素を決めるため、現在のtRNAの酵素による決定認識要素をいろいろなtRNAについて見出すこと、これによってヒントを受けた小RNAを作成しその酵素的ないし非酵素的アミノアシレーションを測定し、機能を見ることの二点にしぼった。まず前者については、大腸菌のすべての(20種の)tRNAを非修飾の形で作成し、その内GIu,Ile,Lysを除く17種のtRNAが対応する酵素のgood subatratesであるこてを確認した。これだけのlibvaryを持つ研究室は世界でも我々のものが唯一であり、tRNAのシステマティックな研究を統一的に行う道を開いたといえる。

実的その方向に研究は発展しつつあり、塩濃度のアミノアシレーションへの物質がtRNA毎に違う様子、CCA末端の塩基依存性が違う様子、第一塩基対が多くの場合G・Cであることの必要性、アレチコトンループの形の必要性の違いなどが次々に判明しつつある。認識部位がアンチコドン、73位のディクリマネータに集中していることは後に判明したので、アクセブターステムの認識部位とアミノ〓の大きさの関係といった他の部位の問題が今集中的に取り上げられており、特に種を通じて良く保存されている塩基に関しては殆んど潰し終った。種の進化に伴ったアイデンティティ変化も調ベつつある。こういった情報に基づいて、30-35塩基くらいのtRNAをクローン化ないしPCRで大量に製作する方法がいろいろと検討された。gly,Pro,Cnsなどではクローン化に成功したが、VAl,Hisなどでは成功しないといったものによる特徴がでつつある。来年度はクローン化の方法・条件を変えて〓才的な原始的tRNAの精製に挑みたい。遺伝暗号は3つの塩基と1つのアミノ酸間の対応関係を表している。この関係の分子論的基礎として、tRNAのアンチコドン3塩基と識別位塩基(3'末端より4番目の位置にあるアミノ酸のと化学的関係を暗示する塩基)の間の複合体が対応するアミノ酸を受容するポケットを形成し得ることが分子モデルによって示されている。RNAワールドの時代にはそう複雑な高分子は存在していないであろうから、tRNAに相当する分子の長さはもっと短かったものと思われる。そこで我々はこのモデルtRNAとして、tRNA各部分を削除した小tRNAをさまざまな方法で作成し、酵素ないし非酵素的反応性を調査した。これまでは主としてT7RNAポリメレース法を駆使して、モデルtRNA群を作成したが、今年度はRNA合成器を用いて直接RNAを合成する試薬が試験的に売り出されたので、これも試してみた(20mer程度の小tRNAは作れるとされた)。しかしその結果は満足できるものではなく、結局T7ポリメレース法に頼ることになった。数多く試された小tRNAの中では、アクセプターステムとアンチコドンアームをつなげたものが、いわゆるミニヘリックス(アクセプタステム+TpsiCアーム)に比べてやや反応性に欠ける形で酵素的反応が起こった。これからは非酵素的な反応に力点を移して研究を続ける予定である。