hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軸索ガイダンス分子の長期記憶形成における役割

長期記憶の形成には新規の遺伝子発現やタンパク質合成が必須であることが明らかになっているが,どのような分子により制御されているかについては未だに明らかではない.分泌型軸索ガイダンス分子セマフォリン3A(Sema3A)が記憶形成の分子基盤であるAMPA型受容体をシナプスへ移行し短期記憶の成立に必要であることを明らかにした.従って,Sema3Aの長期記憶の形成,AMPARsの新規合成を制御するかを検証する.Sema3Aが長期記憶形成に関与する場合,この機構の障害による精神疾患や記憶障害の病態解明や創薬のターゲットとなることが期待される.本年度は,Sema3AがAMPARsの新規合成への関与を明らかにするため初代海馬分散培養細胞21日目にSema3Aを添加した24時間後にAMPARsの発現量をウエスタンブロッティング法により定量した。その結果、Sema3AによりAMPARsのサブユニットであるGluA1の発現量が他のGluA2/3/4サブユニットと比較して増加することが明らかになった。この結果はSema3AがGluA1の新規合成に関与することが示唆された。また、長期記憶時に関与するシグナル経路を同サンプルにて解析を行い新たな知見を得ることができた。さらには実際にSema3AにてAMPARsが新規タンパク合成される動態をイメージングで解析するために新規合成タンパクをラベル化する技術を立ち上げつつある。in vitroでSema3AがAMPARsの新規合成に関与する知見が得られたため。今後は個体レベルでの解析を進めていく。2019年度当初の計画通り進めていく予定である。個体レベルでの長期記憶形成時のSema3Aの動態解析ならびにSema3Aによるin vitroでのシナプスにおける局所的なAMPARs新規タンパク合成について新規合成タンパクを標識化する技術を用いイメージングや免疫化学染色にて明らかにしていく。長期記憶の形成には新規の遺伝子発現やタンパク質合成が必須であることが明らかになっているが,どのような分子により制御されているかについては未だに明らかではない.分泌型軸索ガイダンス分子セマフォリン3A(Sema3A)が記憶形成の分子基盤であるAMPA型受容体をシナプスへ移行し短期記憶の成立に必要であることを明らかにした.従って,Sema3Aの長期記憶の形成,AMPARsの新規合成を制御するかを検証する.Sema3Aが長期記憶形成に関与する場合,この機構の障害による精神疾患や記憶障害の病態解明や創薬のターゲットとなることが期待される.本年度は,まず長期記憶形成時における分泌領域を特定する上で,Sema3Aが記憶形成時にどの領域より分泌されるかをSema3Aの分泌を可視化する事が可能な変異マウスを用い免疫組織化学染色法により検証した.海馬学習依存的な受動的回避行動試験実施後,4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定し,ビブラトームにて脳切片を作成し海馬領域にてプレシナプスマーカー,ポストシナプスマーカーと分泌Sema3Aを共染色した.その結果,分泌Sema3Aはプレシナプスマーカーと共局在している事が明らかになった.以前より,in vitroの系でSema3Aは有芯小胞に内包されている事が報告されている.この結果は,記憶が形成される際に有芯小胞を介してプレシナプスより分泌されることが示唆された.Sema3Aの分泌を可視化する事が可能な変異マウスを用いて,長期記憶形成時の分泌領域を特定する上で,まず記憶形成時における分泌領域を明らかにする事ができた.一方で,長期記憶形成時におけるSema3A機能阻害抗体を用いた機能評価を行えておらず,さらなる検証が必要なため.長期記憶の形成には新規の遺伝子発現やタンパク質合成が必須であることが明らかになっているが,どのような分子により制御されているかについては未だに明らかではない.分泌型軸索ガイダンス分子セマフォリン3A(Sema3A)が記憶形成の分子基盤であるAMPA型受容体をシナプスへ移行し短期記憶の成立に必要であることを明らかにした.従って,Sema3Aの長期記憶の形成,AMPARsの新規合成を制御するかを検証する.Sema3Aが長期記憶形成に関与する場合,この機構の障害による精神疾患や記憶障害の病態解明や創薬のターゲットとなることが期待される.本年度は,Sema3AがAMPARsの新規合成への関与を明らかにするため初代海馬分散培養細胞21日目にSema3Aを添加した24時間後にAMPARsの発現量をウエスタンブロッティング法により定量した。平成30年度は当初の計画通り進めていく予定である.Sema3AがAMPARsの新規合成に関与しているかを明らかにするため、初代海馬分散培養15日目にSema3Aとタンパク質合成阻害剤であるアニソマイシンを添加する。60分後に細胞を固定し、細胞表面のGluA1の発現量を免疫化学細胞染色にて解析する。

またSema3A機能阻害抗体を用い長期記憶形成時における機能評価を行う.2019年度当初の計画通り進めていく予定である。個体レベルでの長期記憶形成時のSema3Aの動態解析ならびにSema3Aによるin vitroでのシナプスにおける局所的なAMPARs新規タンパク合成について新規合成タンパクを標識化する技術を用いイメージングや免疫化学染色にて明らかにしていく。現在得られている予備的な結果より,当初の予想より解析対象が多くなる可能性が考えられた.動物の凍結胚からの個体の作成や抗体の作成,動物脳内へのインジェクションに使用する機器など必要になる.そのため,平成29年度の未使用残額をこれらに充てるため繰越申請を行う.現在得られている予備的な結果より,当初の予想より解析対象が多くなる可能性が考えられた.動物の凍結胚からの個体の作成や抗体の作成、新規合成タンパクのラベル化技術の立ち上げるため,2018年度の未使用残額をこれらに充てるため繰越申請を行う.
水酸化ポリ塩化ビフェニルのプロテインジスルフィドイソメラーゼへの作用解析

ビスフェノールAの母体への曝露が、胎児・乳幼児の脳神経系発達に悪影響を及ぼすことが示唆されている。代表者はこれまでに、ビスフェノールAの結合タンパク質としてプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を同定し、ビスフェノールAがPDIに結合することにより、タンパク質のリフォールディング活性、及び甲状腺ホルモン(T3)結合活性が阻害される事を明らかにしてきた。一方、ポリ塩化ビフェニル(PCB)が甲状腺ホルモンの働きを撹乱し、脳神経系形成に悪影響を及ぼすことが以前より示唆されているが、最近、PCBはヒトの体内で代謝されて水酸化PCBを生じる事が報告された。昨年度は、4'-hydroxy-2,3,3',4,5-pentachlorobiphenyl (OH-PenCB)と4-hydroxy-2,3,3',5,5',6-hexachlorobiphenyl (OH-HexCB)を用いた検討により、水酸化PCBがPDIのT3結合を阻害することを明らかにしたが、本年度はPDIのイソメラーゼ活性及びシャペロン活性への影響を検討した。PDIは2カ所の活性中心を有し、基質タンパク質の酸化・還元反応と異性化反応を行う活性中心は異なる事から、PDIによる還元型RNaseの酸化反応、およびスクランブル型RNaseの異性化反応における水酸化PCBの影響を検討したところ、酸化反応はOH-PenCBによって阻害されたが、異性化反応はPCB,水酸化PCBのいずれによっても阻害されなかった。この事から、水酸化PCBはPDIの基質タンパク質の酸化・還元に特異的に作用することが明らかとなった。次に、PDIのシャペロン活性への作用を検討したところ、OH-HexCBにのみ阻害が見られた。以上のことから、水酸化PCBによるタンパク質フォールディングの形成異常を引き起こすことが示唆された。ビスフェノールA(BPA)の母体への曝露が、胎児・乳幼児の脳神経系発達に悪影響を及ぼすことが示唆されている。我々はこれまでに、脳神経細胞においてBPAの特異的結合タンパク質を単離・精製し、このタンパク質が甲状腺ホルモン(T_3)の結合タンパク質であるプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)であることを明らかにした。さらに我々は、BPAがPDIに結合することにより、タンパク質のリフォールディング活性、及びT_3結合活性が阻害される事を明らかにしてきた。一方、近年、ポリ塩化ビフェニル(PCB)の代謝物である水酸化PCBが、胎児・乳幼児期の発達過程に重要である甲状腺ホルモンの働きを撹乱し、脳神経系形成に悪影響を及ぼすことが示唆されている。水酸化PCBは核内甲状腺ホルモン受容体を介して、甲状腺ホルモン作用を模倣することが明らかにされているが、PDIに対する作用は明らかにされていない。そこで本研究では、PDIを介した水酸化PCBの作用を明らかにするため、2種類の水酸化PCB異性体(4'OH-2,3,3',4,5-pentachlorobiphenyl、40H-2,3,3',5,5',6-hexachlorobiphenyl)を用いてPDIへの作用を検討した。PDIに対する[^<125>I]T_3の結合阻害試験を行った結果、PCBでは阻害性がみられなかったが、水酸化PCBでは用量依存的な阻害性がみられた。T_3応答性の成長ホルモン産生を示すGH3細胞を用いて検討を行ったととろ、PCB、水酸化PCBともに、成長ホルモン産生への影響は認められなかった。また、水酸化PCBではT_3同様にイソメラーゼ活性の阻害がみられたが、PCBでは影響がみられなかった。これらの事から、PCBが水酸化されることによって、よりT_3に対して構造類似性を有する事によりPDIの機能阻害性をする事が示唆される。
階層型無線センサーネットワークの研究

ワイヤレスセンサーネットワークは,外部環境に温度,湿度,雨量などの情報の他,地震や地殻変動さらには人の動きなど様々な情報をあるエリアにおいて検出し,それらの情報を収集するうえで今後大きく期待されている分野である。従来,ネットワーク構成法において種々の提案があるが,主にネットワーク全体の電力消費を小さくし,ライフタイムを大きくする研究が主体であった。本研究では,無線の周波数を有効利用し,かつシステムの信頼性を伸ばすことを主眼として階層型ネットワーク構成の提案を行い,実際の計測とともにコンピュータによるモデル化を行い有効性を明らかにした。階層型の構成法として,センサーノードにZigBeeを用い,上位のノードに王EEE802.11b/gのネットワークを適用し,かつ両者の周波数を共用する方式の提案を行い,両者が非同期の環境において周波数を共用するためのトラヒック制御を行った。その結果,非同期においても,同一の周波数を共用できることを明らかにした。次に,階層型の上位ノードとしてのクラスターの形成方法として,従来のLeach方式を改良してクラスター内に分布するセンサーノード数の分散を低減させる方式を提案し,コンピュータのモデル化によりその有効性を明らかにした。また,ネットワーク障害や災害などによりネットワークホールが発生することを予想して,これらの障害において情報転送に支障がなく,迅速に復旧する手法を提案し,コンピュータによるモデル化を行い,その有効性を明らかにした。以上の検討により提案した階層型無線センサーネットワークが今後の実システムへの適用においても十分有効かつ効果のある方式として確立した。無線リソースの効率的利用から、階層型無線センサネットワークを同一帯域で構成することを検討した。すなわち、アプリケーションネットワーク,中継ネットワークおよびセンサネットワークの異なる通信方式およびトラフィックを同一帯域に混在させるネットワーク構成について検討した。アプリケーションネットワークと中継ネットワークとしてIEEE802.11の無線LANを、また、センサネットワークとしてIEEE802.15.4を共に2.4GHz帯で用いる実証実験用の階層型無線センサネットワークを構築した。現行の仕様で両者を用いる場合に、干渉と衝突の問題から生じる通信品質の劣化を実験で示し、十分な品質と複数のネットワークを構成するチャネル帯域を得ることができないことを明らかにした。同時に、現行仕様における通信品質の劣化要因を明らかにした。実験より明らかになった劣化要因をVisualSLAMによるシミュレーションでモデル化し、通信品質の劣化を回避する方法について検討した。アプリケーションネットワークおよび中継ネットワークのノードに用いる無線LANについて、通信方式にIEEE802.11gを用いて、トラフィックを制限する制御を行うこと、さらにアクセス制御を変更することにより通信品質を改善できることをシミュレーションの結果から明らかにした。また、トラフィック制御においては、アプリケーション別のネットワークパフォーマンスを解析し、実験環境で実際に改善されることを示した。さらに、提案する方法は、IEEE802.11の無線LANとIEEE802.15.4の無線センサを同じチャネルで用いるため、複数のネットワークを2.4GHz帯に構成できる。汎用性の高いISM帯の通信装置を用いた階層型無線センサネットワークについて、無線帯域の効率的な利用を可能とする基本的なネットワーク構成方法とネットワークノードの制御方法を示した。これまでに、センサーノードとクラスターヘッドで周波数を共用する方法を提案した。具体的には、トラヒック制御を行い、衝突を軽減する方法を提案し、その基本的な特性を明らかにした。今年度は、まず、IEEE802.11b/g(無線LAN)とIEEE802.15.4(Zigbee)の干渉特性に関して、測定ツールChariotを用い、スループットを評価した。干渉によるスループットの劣化が、ZigbeeのACKの伝送時間が長いことを実測によって明らかにした。それを軽減する方法として、無線LANのDIFSの時間を短縮するアルゴリズムを提案し、コンピュータでモデル化し、その効果を明らかにした。次に、クラスターの形成方法について検討を進めた。簡易に均等なクラスタを生成するタイムベースなクラスタ形成アルゴリズムを提案した。データが意味あるものとして存在するためにはデータ収集日、間が非常に重要である。そしてそのデータ収集時間はクラスタ内のノード数に依存する。クラスタ内のノード数を決定するのはクラスタ数とその配置である。

LEACHのようなクラスタリングベースのルーティングプロトコルは、どれも確率に従ってクラスタヘッドが生起してクラスタを形成する。当然クラスタ数を保証していない。提案したクラスタ形成アルゴリズムでは、生起確率を生起時間に変換することでクラスタ数を保証する方式である。さらに生起したクラスタヘッドの履歴を利用して生起時間を決めることにより、クラスタヘッドを分散して配置することを可能とした。具体的には、クラス数を保証することと、クラスタのばらつきを抑える2つのことを効率的に行う方法を提案した。コンピュータによるシミュレーション実験で、提案手法により、従来提案されているLEAHに比較し、分散のバラツキを低減させる効果を明らかにした。センサノード(SN)は第一に故障時の交換の難しさ、第二に空間面及びコスト面の制約から小型化が必要であり、当然エネルギーの制約が厳しい。そこで低電力消費なネットワークアーキテクチャが必要である。階層構造は省電力を可能にするだけでなく、データ収集時間、ノードの管理の点においても利点がある。今回階層型ルーティングのクラスタ形成アルゴリズムを提案し、その特性を明らかにした。提案したクラスタ形成アルゴリズムでは、生起確率を生起時間に変換することでクラスタヘッド数を保証した。さらに生起したCHの履歴を利用して生起時間を決めることでCHを分散して配置することを可能にした。クラスタリングを行う階層型ネットワークを採用することにより、クラスタヘッド(CH)間での通信が可能となり、各SN間での通信を行うよりホップ数を少なくし、送信データの信頼性、低消費電力化等の向上が得られる。しかし、CHがダウンしてしまうと新たなCHが生起するまでそのクラスタは役割を果たさなくなるため、クラスタリングを行わない方が良い結果を得ることができる。そのため、ノードの故障率の高い、すなわち危険度の高いエリアにおいては各SN間で通信を行う事とした。故障率を考慮に入れたルーティングを行うことで、より信頼性の高いネットワークを構築することを可能とした。
並列処理によるプルトニウム溶液超臨界時の放出エネルギーのシミュレーション

プルトニウム溶液体系の超臨界時の過渡状態を正確にシュミュレートする場合には以下の3つの物理現象を正確にかつ高速に扱う必要がある。すなわち、1.中性子連鎖反応による核分裂連鎖反応の空間分布(核反応モデル)2.核分裂の発熱による溶液の膨張、対流、蒸発の発生(熱流動モデル)3.核分裂による放射化分解ガスのマイクロバブルの発生及び消滅(放射化ガスモデル)である。本研究では、3台の計算機で上記の物理現象を別々に並行してシュミレーションを行いながら互いにフィードバックをかけることで、全体の事象のシミュレーションを正確かつ高速に行う方法の確立を目指している。本年度は、3台の計算機による並列処理システムの検討及び核反応モデルのシミュレーションのための物理モデルのコード化(計算プログラム化)を行った。並列処理システムの検討では、本シミュレーションを行うのに適した計算機の検討及び数値解析能力のテストを行った。また、核反応モデルのコード化では、2次元の空間依存過渡解析コードを独自に開発した。本コードは、中性子束の空間分布計算に中性子拡散理論を用い、動特性計算には改良準静的近似解法を用いている。なお、シミュレーションに必要な各種パラメーターの計算には既存のコードであるSRAC95及びJENDL-3.2核データライブラリーを用いている。更に、日本原子力研究所の燃料サイクル安全工学研究施設(NUCEF)と情報の交換をおこない、NUCEFの過渡臨界実験装置(TRACY)行われている溶液燃料の過渡臨界実験の結果と今回開発したコードによる解析結果の比較検討を行った。以上の本年度の研究の結果、並列処理による本シミュレーションの方法の確立について一定の見通しを得ることができた。
多職種による包括的アプローチ法を土台とした転倒予防プログラムの開発

開発したアプローチ法の概要は,転倒予防プログラムの活用方法の教授、ならびに職種の対等性やチーム医療における目標の共有、各職種のアプローチ方法の独自性や職種役割に関する教育の共有についてであった。結果,「転倒予防に関する知識が増えた」「転倒リスクをより具体的に判断できるようになった」「転倒予防方法をより適切に実践できるようになった」「転倒予防を通してスタッフと意識の共有ができた」等で介入群と対照群に有意差があり,本アプローチ法の使用は有効と示唆された。本研究の目的は、「多職種による転倒予防の包括的アプローチ法」を開発し、それをすでに考案した転倒予防プログラムに組み込み、予防効果の高いプログラムに改定し臨床で活用してもらうことである。今年度は、多職種による包括的アプローチ法を開発するための情報として、それぞれの専門性を発揮できるための連携に必要なこと、促進・障壁要因を明らかにした。研究デザインは2段階により行った。第1段階では、療法士を対象にフォーカスグループインタビュー法(FGI法)(Vaughn、2006)による面接調査を行い、「連携を促進するために必要なこと、促進する上で課題となっていること」など、転倒予防に関する意識を明らかにした。第2段階では、無記名の調査用紙を用い看護師や療法士を対象に、転倒予防に関する自作の質問、ならびに日本語版Attitude towards health care teams(IPW尺度)、日本語版Rathus Assertive Scheduleによりチーム医療に関する意識調査をした。自作の調査内容は第1段階で得られた療法士の調査結果、同様にFGI法により得られた看護師の意識調査結果(加藤他、2009)、チーム医療に関する先行研究、研究者による検討を基に作成した。共に新潟大学医学倫理審査委員会の承認を得て、それを遵守し研究を遂行した。結果、第1段階では連携の促進には「回復期にある患者を支援するチーム員としての意識をもつこと」が柱としてあり、障壁は「職種による垣根意識をもつこと」であり、根底には<看護目標とリハゴールにズレがある>ことが明らかとなった。第2段階では、統計的分析により障壁要因は「スタッフの一員と思っていない認識がある」「相手が忙しそうにしている」「検討会で自分の意見を批判される可能性を考える」があり、促進要因は「話やすい職場の雰囲気」などかおることが明らかになった。今年度は前年度の研究成果および文献レビューにより得たエビデンスを統合してアプローチ法を開発し、その効果や運用性について質的記述的に検証した。対象は看護師・理学療法士・作業療法士であり、方法は各1名を1つのチームとし、生活動作障害のある脳卒中患者についてそれぞれの立場からシミュレーションでアプローチし、その結果ならびにその後のインタビュー結果をもとに修正したアプローチ法を再編したチームに再度実施した。意義は、各職種が協働的連携のもと効果的効率的に介入でき、さらに職種間の意識障壁を打破し、スタッフの業務負担を増加させることがないためアドピアランスの点でも運用性が高く、結果、持続的に実践できる転倒予防効果の高い包括的アプローチ法の開発に貢献できるための基盤検証が実現する。包括的アプローチ法は(1)教育の共有を含む連携のためのブレインストーミング(チーム医療の効果性・効率性などを実践レベルで共有する)、(2)患者アセスメントから続く看護目標・リハビリテーションゴール、ならびに看護ケアとリハビリテーションプログラムのプロセス性を踏まえた共有、(3)転倒予防の包括的アプローチに向けた専門性の統合と役割の明確化、(4)連携の組織的支援から成った。1回目は<他職種の転倒予防判断プロセスの共有>が多職種連携効果として3職種共通にみられた。しかし、<看護師が療法士の記録から進行しているアプローチを理解するには専門性が高<活用困難>であり、運用性の点で問題があることが分かった。一方、理学療法士と作業療法士は看護過程法を理解することにより<記録から看護師との転倒予防連携方法の示唆が得られる>結果があった。そのため、看護師が療法士の記録から情報を得ることを削除し、看護記録が連携の仲介に使用できることをアプローチ法に盛り込み2回目を実施した。結果、教育の共有をさらに強化すると効果と運用性が向上する示唆が得られた。今年度は、前年度に試作し検証したプログラムを修正し、かつ活用できるよう冊子体として教材開発し、多職種による転倒予防の包括的アプローチ法を基盤とした転倒予防プログラムを完成させ、その効果や運用性を検証した。プログラムは1)職員教育、2)転倒予防に関した施設の課題を明確化し、解決策を立案、3)個人の転倒リスクを見極め、リスクに応じた介入計画を立案・実施、4)組織的に転倒予防に関する助言の提供や検討、5)転倒発生時は包括的に原因を明らかにし、介入計画を修正するから成った。

転倒予防教育は「転倒予防の知識・技術提供」に加え、「教育の共有(各職種のアプローチの方向性・役割、職種の対等性)」と「チーム医療の効率化・効果性を実践レベルで共有」の講義、および様々な事例を用い実践的かつ参加型で転倒予防アプローチ技術を共有する方略をとった。対象は介護老人保健施設の看護職、介護職、セラピストで、介入は3ヶ月間、介入群(1病棟・23名)と対照群(2病棟・36名)を設けた。アウトカムは職員の転倒予防およびそのチーム医療に関する意識変化であり、無記名の調査によりデータを得た。本研究は金沢大学医学倫理審査委員会の承認を得て遵守し実施した。結果、「転倒予防に関する知識が増えた」「転倒リスクをより具体的に判断できるようになった」「転倒予防方法をより的確に判断できるようになった」「転倒予防方法をより適切に実践できるようになった」「スタッフとのコミュニケーションが増えた」「転倒予防に関する発言が増えた」「転倒予防を通してスタッフと意識の共有ができた」で、介入群と対照群に有意差がみられた。事例を用いた参加型共有では全ての対象者が転倒予防に活用できると答えた。以上のことから、本包括的アプローチ法を土台としたプログラムは、職員の転倒予防におけるチーム医療の促進ならびに知識・技術向上に効果があり、運用面においても使用可能と示唆された。
歯周病原性細菌のプロテアーゼに対するモノクロナール抗体を利用した迅速診断法の開発

Porphyromonas gingivalisの産生するトリプシン様酵素の1つであるPase-Cに対するモノクローナル抗体(mAb-PC)を作製した。BApNA及びカゼインを基質としたPase-Cの酵素活性に対する中和試験を行った結果、mAb-PCは活性中心から離れた部分でPase-Cと結合し、Pase-Cの酵素活性を阻害することが分かった。本抗体は、P.gingivalisの産生する他のトリプシン様酵素(Pase-B,Pase-S)とは反応しないことがウェスタンブロッティングの結果から明らかとなった。また、ドットブロッティングにより他の歯周病原性細菌との反応性を調べた結果、Bacteroides forsythusやTreponema denticolaの様なトリプシン様酵素産生菌とも反応しないことが確認できた。歯周炎患者よりペ-パ-ポイントを用いて採取した歯肉溝滲出液中のPase-C、P.gingivalis量をmAb-PC及びP.gingivalisに対するポリクローナル抗体を用いたELISA法により調べた。その結果、50検体のPase-C検出量とP.gingivalis検出量の間に有意な相関は認められなかった。しかし、プロービング時に出血(BOP)を認めなかったサンプル(-)だけで解析したところ、両者の間に有意な相関が認められた。そこで、BOPの程度でサンプルを群分けし、各々のPase-C検出量、P.gingivalis菌量を調べた。その結果、Pase-C量はBOPの程度が進むに従い増加する傾向が認められたが、P.gingivalisの菌量には群間にそのような傾向を認めなかった。BOPはある程度炎症の活動度を反映するものと考えられることから、mAb-PCを用いて歯肉溝滲出液中のPase-C量を測定する方法が、歯周炎の診断・予後の予測に利用できる可能性が示唆された。BHIbrothを用いて大量培養を行ったPorphyromonas gingivalis381株の培養上清からアセトン分画により粗酵素を抽出し、得られた粗酵素をゲル濾過、Octhlthioglucosideによる可溶化後、アルギニン-セファローズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより抗原として用いるPase-Cを分離・精製した。次いで、凍結保存中のモノクロナール抗体(MAb-PC)を産生するハイブリドーマ(TLE2-1)を融解し、トリパンブルー染色を行ったところ死滅していたので、他のクローン(TLE2-2,TLE2-9)を用い、無血清培地(RPMI1640)で培養した培養液からモノクロナール抗体(MAb-PC)を回収した。抗体産生はTLE2-2が最も強く、したがって、現在このクローンが産生する抗体とTLE2-1クローンより回収して保存中の残余抗体との免疫学的性質の異同について、鋭意検討中である。予定のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマが死滅したため研究の進展がやや遅れているが、この間を利用してTLE2-1より得た保存抗体の諸性質を調べるとともに、本年度購入したDELFIAReserchプレートリーダーを用いて、モノクロナール抗体を一次抗体としたPase-Cの高感度検出測定法の検出限界などの条件設定を精製酵素抗原を用いて検討している。前年度、Porphyromonas gingivalis 381株の産生するトリプシン様酵素のなかで、最も病原性が強いと考えられるPase-Cに対するモノクロナール抗体(MAb-PC)を産生するハイブリドーマ(TLE2-1)をクローニングしたが、この株が死滅したため、新たに、TLE2-2株をクローニングした。

両株の産生する抗体の異同について免疫学的、生物学的性質を調べたがほぼ同一であった。そこで、まず本株をマウスの腹腔内に移植して大量の抗体を産生させた。本抗体とP.gingivalisとの反応性が、プロテアーゼ活性を持つ他の歯周病原菌(Prevotella intermedia,Actinobacillus actinomycetemcomitans,Bacteroides forsythus,Treponema denticola)との反応性に比べて、かなり強くでることをELISA法で確認し、現在は歯周疾患患者の歯肉浸出液(GCF)を抗原として本抗体との反応性を検討中である。但し、GCF中の抗原の吸着を考慮すると、使用するプレートの材質を吸着のよいものにする必要があり、この際、当初予定していたデルフィア(ユーロビウム標識抗体)を用いるとブランク値が高くなり、測定値の信頼性に疑問がある。従って、現在はELISA法を用いてGCF中のPase-Cが定量的に検出できる条件について検討中である。プロテアーゼ(Pase-C)に対するモノクローナル抗体(mAb-PC)を用いて歯肉溝滲出液(GCF)中のPase-C量をELISA法によって測定するために、GCFの採取方法及びELISA用プレートの検討を行った。その結果、サンプル採取には操作性の点からペ-パ-ポイントを、ELISA用プレートはサンプルの吸着が良く、ブランク値が高くなりすぎないという点から住友ベ-クライト社のHプレートを用いることとした。当初の計画では、GCF中のPase-C量と同時にペリオチェックを用いてサンプルのトリプシン様酵素活性を測定する予定であったが、サンプルを原液のままELISA法に用いる必要性が生じたことから酵素活性は測定できなかった。従って、最終的に採取した50検体についてPase-C量、Porphyromonas gingivalis量を、それぞれmAb-PC、P.gingivalisに対するポリクローナル抗体を用いて測定し、同時に調べたプロービング深さ、プロービング時の出血(BOP)と合わせて解析した。その結果、Pase-C検出量とP.gingivalis検出量の間に有意な相関は認められなかった。しかし、BOPが-のサンプルだけで解析したところ、両者の間に有意な相関が認められた。そこで、BOPの程度でサンプルを群分けし、各々のPase-C検出量、P.gingivalis検出量を調べた。その結果、Pase-C量はBOPの程度が進むに従い増加する傾向が認められたが、P.gingivalisの菌量には群間にそのような傾向を認めなかった。BOPはある程度炎症の活動度を反映するものと考えられることから、mAb-PCを用いて歯肉溝滲出液中のPase-C量を測定する方法が、歯周炎の診断・予後の予測に利用できる可能性が示唆された。
バルク金属ガラス表面の超微細加工法の確立

金属ガラス材料の破壊試験後の破壊表面には、波状の「Vein Pattern」が出現することが1970年代から知られていた。本研究では、バルク金属ガラスの圧縮試験後の破壊表面に対して走査電子顕微鏡を用いて詳細な観測を行い、ナノワイヤーや、ナノチューブなどのナノ構造体が生成されていることを見出した。ナノワイヤーやナノチューブなどのナノ構造は、ナノデバイス・システムを構築するための不可欠な基本的構造要素であるため、これら金属ガラスでできたナノ構造の発見は、高強度、低ヤング率、耐摩耗性、耐食性など金属ガラス材料の優れた機械的特性を有する工業的価値のあるナノ構造群を創製できる可能性を示しており、今後、このナノワイヤーの作製、ならびに特性評価が可能となれば、ナノデバイスの基幹材料としての応用は計り知れない。またこれらナノ構造の生成メカニズムは、高温の過冷却領域における金属ガラスに特有な超塑性特性に起因している。本解析では,Zr_<50>Cu_<40>Al_<10>金属ガラスナノワイヤーに対してアモルファス状態が保持されているかどうか検証するため、透過電子顕微鏡を用い観測を行った。試料は破壊面に生成されたナノワイヤーを収束イオンビームを用いて加工を施し、その厚さが0.1マイクロメートルになるまで加工した。ナノワイヤー断面のTEM像はほぼ円形を示し、ナノワイヤーに対する回折像はアモルファス構造を示すディフューズなパターンが得られた。(1)金属ガラス材料表面の平坦化方法の体系化AFMを用いて固体表面上の原子・ナノ構造を観測するためには、その表面を原子・ナノレベルで平坦化しなければならない。そこで本年度は、(a)ダイヤモンド電着ワイヤー切断機などを使った金属ガラス材料の切出し、(b)バフ研磨、ダイヤモンドペースト研磨による鏡面仕上げ、また(C)イオンミリングによって金属ガラス表面が原子レベルにおいて平坦で、かつ不純物の影響を受けない表面処理を行うことが可能であることを明らかにした。(2)加熱による結晶化構造のナノレベルにおける観測平坦化を施した表面において、金属ガラスのマイクロ組織構造、ナノ構造、ならびに稠密無秩序充填構造などの構造的特徴の観測を実行した。また、試料温度をガラス転移点近傍まで加熱することによって、ナノ準結晶生成に拘わる構造的変化を捉え、これらの構造生成の知見を得ることに成功した(Applied Physics Letters印刷中)。(3)剪断破壊後の破断面におけるナノワイヤー、ナノチューブ構造の観測破壊試験後の金属ガラス破断面では、ヴェインパターンと呼ばれる特殊な構造が30年以前から研究されてきたが、今回、我々の走査プローブ顕微鏡ならびに走査電子顕微鏡を用いた詳細な観測において、これらの破断面では、金属ガラスの粘性に特有なナノ構造が出現することを見出した(論文投稿準備中)。
核内足場クロマチン構造を介したncRNA, IPWの作動機序の解明

現在までに10,000種類にも及ぶノンコーディングな転写産物が同定されているが,これらの分子群が遺伝子の数だけでは説明できないヒトのもつ多様性や複雑さを生み出すための巧妙な遺伝子発現制御を担っている可能性が示唆されている。ノンコーディングな転写産物の中でもmiRNAやpiRNAなどのsmall RNAはこれまでの精力的な研究によりその作用機序が詳細に明らかにされているのに対し,200nt以上の長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)と呼ばれる分子群の作用機序については,未だ不明な点が数多く存在する。最近の研究から核マトリクス(MAR)結合タンパク質,SATB1やhnRNP U/SAF-Aを介したlncRNAの作用機序が提唱され,lncRNAの局所的な染色体領域へ作用には何らかの足場構造(核マトリクス)なるものが関与している可能性が強く示唆された。我々は,15q11-q13領域のゲノムインプリンティングの発現制御機構を解析する中で,インプリンティングセンターから転写されるncRNA,SNORD116HGが周囲の脱凝集したクロマチンを足場に,ICから1Mb離れたMAGEL2, NDN遺伝子領域の核内配置の制御に関わっていることを明らかにしてきた。非常に興味深いことに, Satb1欠損細胞株において,15q11-q13領域のクロマチン脱凝集はコンパクトになり,且つMAGEL2, NDN遺伝子の発現も低下した。つまり,ncRNA,SNORD116HGはSatb1により作り出された脱凝集したクロマチンを足場に遠位のMAGEL2, NDN遺伝子領域作用している可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。近年,X染色体の不活性化機構に重要なXistやゲノムインプリンティング制御に重要なLIT1, Airなどに代表されるノンコーディングRNA(ncRNA)が,染色体ドメインレベルに遺伝子発現を制御していることが明らかとなっている。これまでの研究から,それらの作用機序は多岐にわたり,XistのようにcisにX染色体上に局在し,染色体全体を不活性化に導くものもあれば,LIT1のようにある特定の局所な染色体領域にG9aなどのヒストンメチル化酵素複合体をリクルートするものまで様々である。最近の生化学的解析から,PRC2複合体などのncRNAと会合するタンパク質の実態は徐々に明らかにされつつあるが,ncRNAが如何に特定の局所な染色体領域にのみ作用するかについては未だ明らかにされていない。申請者は,これまでの実験からncRNAの局所的な染色体領域へ作用には何らかの足場構造なるものが関与している可能性を考えている。そこで,本研究ではncRNA, IPWが遠位の染色体領域に作用するのに必要な足場クロマチンの構築機構と,それに作用するncRNA, IPWの配列を申請者独自のヒト染色体工学技術と昨今のゲノム編集技術CRISPR/Cas9システム,及びshRNAライブラリースクリーニングを駆使して明らかにしたいと考えた。当該年度は,足場クロマチンとなる15q11-q13領域のクロマチン脱凝集を規定する分子をshRNAライブラリーのスクリーニングによって同定することを試みた。また,約4,500bpに及ぶncRNA, IPW配列のどこに機能ドメイン(作動エレメント)が存在するのかを明らかにするため,CRISPR/Cas9システムを用いて様々な欠失タイプのIPWを作製し,MAGEL2, NDN遺伝子発現やその核内配置を指標に,IPWの作動エレメントの同定を試みた。予定していたshRNAライブラリーのスクリーニングによる15q11-q13領域のクロマチン脱凝集を規定する分子を同定と,CRISPR/Cas9システムを用いたIPW配列の作動エレメントの同定実験は順調に進んでいる。平成28年度に,作成した改変染色体を用いてMAGEL2, NDN遺伝子発現やその核内配置を指標に,IPWの作用機序を明らかにする。

平成28年度は,引き続き生化学的アプローチとゲノム編集技術を駆使して,クロマチン脱凝集を規定する分子とncRNA, IPWとの作用機序を明らかにする。平成27年度に同定したクロマチン脱凝集を規定する分子の機能解析を行う。具体的には,既知のRNA結合タンパク質でない場合,リコンビナントタンパク質を作製し,生化学的解析よりRNAと相互作用する機能ドメインを同定する。さらに,RNA結合能に対する一般則を見出すため,RNA-IP解析により,結合するncRNA(機能性RNA)を網羅的に同定する。また,15q11-q13領域の発現制御に関わる既知の分子,MeCP2, TopIIα,β,SATB1との相互作用をIPにより生化学的に解析するとともに,平成27年度に作製したそれらのノックアウト細胞株を用いて,ncRNA,IPWが足場クロマチンを介して遠位の染色体領域に作用する分子基盤を明らかにする。また,平成27年度に作成した様々なIPW欠失ヒトiPS細胞にて,14番染色体上のDLK1-Dio3領域への作用にも異常をきたすか明らかにする。さらに,東京大学に設置されている超解像度顕微鏡を用いた脱凝集したクロマチンとncRNA, IPWの会合挙動の解析する。具体的には,ncRNA, IPWの5'末端および3'末端配列をプローブにし,3D-SIM(3D structured illumination)技法を用いた超解像度イメージングシステムにて,足場クロマチン(作動装置)とIPWの作動エレメントとの相互作用を解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
小児アレルギー及び感染症における末梢血単核球の高親和性IgE受容体の解析

アトピー性皮膚炎患者の末梢血単球における高親和性IgE受容体(FcεRI)の発現強度が、健常者に比し有意に高いことが報告されており、川崎病において末梢血単核球の活性化、血清中IgEの上昇が報告されている。これらの報告に基づき、FcεRI α-chain、β-chainの末梢血単核球におけるmRNAレベルでの発現を健常コントロール(平均4才5ヵ月)、気管支喘息患者(平均5才5ヵ月)、川崎病患者(急性期および回復期)(平均3才4ヵ月)において検討した。なお、川崎病患者はいずれも急性期の採決後に免疫グロブリン製剤(2g/kg)の投与を受けている。検討にあたっては健常者および患者の末梢血単核球を濃度勾配遠心法にて単離したのち、RNAを抽出してone-step RT-PCR法にて行った。得られたPCR産物を電気泳動法で検出し、内部標準(GAPDH)の発現量との比を用いて半定量的に解析した。1)気管支喘息患者において、FcεRI α-chainのmRNA発現は健常コントロールに比しほとんど差は認められなかった。また、総IgE値とFcεRI α-chainのmRNA発現の相関関係を検討した結果、相関係数r=0.28と相関関係は認められなかった。FcεRI β-chainについては健常コントロールおよび気管支喘息患者において発現は見られなかった。2)川崎病患者において、急性期の末梢血単核球におけるFcεRI α-chainのmRNA発現は健常コントロールと比し、差は認められなかった。しかし、回復期の末梢血単核球においては、その発現は健常コントロールと比し低下している傾向にあった(p=0.08)。FcεRI β-chainについては川崎病患者の急性期および回復期いずれにおいても発現は見られなかった。1)については気管支喘息患者ではアトピー性皮膚炎患者に比し、総IgE値は低い傾向にあるため発現の増強が見られなかった可能性が考えられた。2)については今後症例を増やしていくことで急性期と回復期の差が明らかにされる可能性が考えられた。高親和性IgE受容体(FcεRI)はIgEと特異的に結合し、肥満細胞、好塩基球の細胞表面に発現が認められる。健常人の末梢血単核球においてFcεRIは細胞表面に発現していない。ところがアレルギー疾患患者においてはその発現が増強されることが報告されているが、気管支喘息患者の末梢血単核球上の発現に関する報告はほとんどない。また、川崎病において末梢血単核球の活性化、血清中IgEの上昇が報告されているが、川崎病患児の末梢血単核球のFcεRIの発現についての検討は成されていない。そこで今回これらの疾患について検討を行った。気管支喘息患児においてCD14陽性細胞表面におけるFcεRI α-chainの発現についてはCD14陽性細胞数が少ない症例が多く、ばらつきが多いが若干発現が認められた。一方。CD4陽性細胞、CD8陽性細胞においては発現が認められた症例が多い傾向にあった。CD20陽性細胞についてはFcεRI α-chainの発現は認められなかった。川崎病患児においてはCD14陽性細胞、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞表面のFcεRI α-chainの発現については症例数が少ないため現時点での評価はできないが急性期には発現がやや増強している印象を受けた。各種呼吸器感染症に児においてはその感染の種類、感染原因、基礎疾患によるばらつきが大きく、評価困難であったが今後も症例を増やしていくことで何らかの傾向を見いだすことができるのではないかと考えている。現時点でこれらの疾患において、単球やリンパ球においてもFcεRI α-chainの発現が増強している可能性があり、今後はさらに症例数を増やして検討していくとともに、実際にmRNAレベルで発現が増強しているかをRT-PCR法を用いて検討していく。

しかし、回復期の末梢血単核球においては、その発現は健常コントロールと比し低下している傾向にあった(p=0.08)。FcεRI β-chainについては川崎病患者の急性期および回復期いずれにおいても発現は見られなかった。1)については気管支喘息患者ではアトピー性皮膚炎患者に比し、総IgE値は低い傾向にあるため発現の増強が見られなかった可能性が考えられた。2)については今後症例を増やしていくことで急性期と回復期の差が明らかにされる可能性が考えられた。
新しい脳水分測定法の開発と基礎的応用-水チャネルに着目した新脳浮腫治療法の開発-

麻酔・集中治療領域において脳浮腫は生命予後を左右する重大な病態であり、脳浮腫の抑制は治療戦略上重要である。脳浮腫は水分の脳への異常集積であり、研究上水分量の測定は不可欠である。古典的な方法では、脳全体の水分含有量しか測定できず、脳の部位による詳細な水分含有量測定は困難である。本研究では、カールフィッシャー法を用いて、局所の脳水分含有量を測定することができるようになった。本法は、古典的な方法とも相関性があり、損傷を起こした脳において、損傷の程度に応じた水分含有量を測定することができた。その精度の高さから、今後の研究への応用が期待できる。水が塩基とアルコールの存在下で,よう素,二酸化硫黄と定量的に反応することを測定原理とした新しい脳水分測定法を用い,ラットの脳水分を測定し,そのノウハウを蓄積し,安定した測定系を確立しっっある。文献的に報告されている約80%前後の水分量を,本測定法において計測でき,精度や再現性について問題なく測定できることが確認できた。本法の確立により,従来よりもより少量の検体,すなわち全大脳半球ではなく,脳表面の局所的な水分を20-30分程度の短時間で確実に計測できるようになった点が重要なポイントである。本法を応用し種々の実験モデルにおいて脳水分の測定を開始している。まず様々な薬物をラット腹腔内に投与しそれら薬剤の脳水分に与える影響を調べるために脳の水分を測定している。薬剤は,マニトールや高張食塩水などであるが,これらは実際の医療現場において脳浮腫治療に用いられたり,あるいは通常の輸液療法に用いられているものであり,臨床像に即した変化を観察することができた。同時に血液生化学データや血清浸透圧を調べたり,脳に発現している水チャンネルアクアポリン4の発現をウエスタンブロットで確認中である。また液体窒素を使用して,ラットの脳表面の凍結損傷モデルを作成し,脳の各部位の局所的な水分の差異を検討している。従来の水分測定ではでは障害側,非障害側としての水分の検討しか困難であったが,我々の方法では浮腫形成部付近,障害側遠位,反対側の障害部位と同部位などより局所的な水分測定が可能であり,実際それぞれ局所において段階的に水分が変化している結果を得ている。これら結果をふまえ,今後も測定を継続し,脳浮腫の機序とアクアポリン4の発現の関係,脳浮腫治療薬の効果等の研究を進める足がかりとしたい。水が塩基とアルコールの存在下で、よう素、二酸化硫黄と定量的に反応することを測定原理とした新しい脳水分測定法によってこれまで基礎的データを蓄積しほぼ測定系を確立した。その脳水分測定系を用いて、脳浮腫治療薬の投与がラット脳水分量に与える影響を測定しデータを蓄積した。実際の臨床現場で使用されている薬剤を様々な条件下で使用しその水分を測定した。一般的には脳の水分量は文献上約80%程度と報告されているが、我々の測定系での測定でもコントロールとして使用する薬剤非投与のラットにおいては、ほぼ同等の値であった。脳浮腫治療薬であるマンニトールや高張の塩化ナトリウム液投与ラットでも脳水分を測定したが、マンニトールで水分量が80%以下になる等、薬剤による影響を測定系にてとらえることができた。同時に血液ガスデータ、血清浸透圧、脳皮質の水チャネルアクアポリン4(以下AQP4)のウエスタンブロット法によるタンパク定量での発現の確認もおこなった。等張ナトリウム液に3%の塩化ナトリウムを加えたものと15%のマンニトールを加えたものをそれぞれ投与したラットで比較した実験ではAQP4の発現増加と我々の測定系で測定した脳の水分の減少の関連性をマンニトールを投与したラットの検体で見いだすことができた。マンニトールが臨床的に脳浮腫を軽減させる機序の1つとしてAQP4の発現が関与している可能性が示唆された。また障害を受けた脳(凍結損傷を加えた脳)・でも脳の水分、AQP4のウエスタンブロット法によるタンパク定量での発現の確認や免疫染色でのAQP4の確認も行ったがこれらはまだ結果が得られていない。今後もこれらの確認を行っていく予定である。脳浮腫治療薬を投与したラットにおいて、新しい水分測定法により脳水分を測定し、脳浮腫治療薬が実際に脳の水分軽減効果を発揮しているかを検討した。新しく確立した測定法を用いてラットに脳浮腫治療薬(マンニトール、高張食塩液)の持続投与を行い、脳の水分が時間依存的に効果的に軽減していくことを確認できた。その水分は文献的に脳の正常な水分含有量とされる80%から時間依存的に低下したことを確認した。

等張溶液では脳水分減少は確認できず、時間経過を追っても脳水分は80%前後で、新しい脳水分測定法の精度に関して、再現性もあり誤差の少ない測定法であることを示すことができた。さらに高張液の中でもその効果の程度に薬剤問の差異が確認でき、マンニトールがもっとも効果的であった。さらに脳アストロサイトに主に発現している水チャネルアクアポリン4の発現が脳水分の変化に関与しているか検討するため、脳浮腫治療薬を投与したラット脳での蛋白発現をウエスタンブロット法で確認し、水チャネルの発現と脳浮腫治療薬による脳水分変化との関連を新しい水分測定法を用いて確認することができた。一方、障害を与えた脳では障害部位に脳浮腫が生じるが、今回ラット脳に凍結損傷を加え、その局所水分も新しい測定法で検討してみたが、局所的には90%近くにまで脳の水分が増加していることが判明した。
異方的超伝導に特有の新量子現象

電子の電荷・スピンの両方が超流動状態となる画期的な「スピン三重項の超伝導」を確証するため、超純粋(スーパークリーン)なルテニウム酸化物Sr2RuO4を用いて、超伝導電子対のスピン方向や運動、磁場中での現象などを研究した。また、Sr2RuO4の結晶中に常伝導金属が規則的に自然析出する共晶試料を用いた超伝導接合の実験や、奇周波数ペアリングの理論展開から、新奇な近接効果などの新量子現象を明らかにした。本研究の目的は、スピン三重項超伝導に特有の新量子現象の創成・確立を目指すことにある。今年度は第一の研究アプローチとして、スーパークリーン物質Sr2RuO4について、RuO2面に平行な磁場下で50mTという低磁場まで核四重極共鳴(NQR)を利用したスピン磁化率測定を進め、以前の成果と合わせて、三重項スピンは低磁場領域で磁場方向に向きを変えることを示唆する結果を得た。また、面平行磁場下で精密磁化測定を行い、上部臨界磁場の約2/3の磁場で二つの超伝導相の間の転移を強く示唆する異常を発見した。さらに、超低温走査トンネル顕微/分光装置を用いて、Sr2RuO4の局所電子状態密度観測を進め、超高真空中の試料劈開によって得た清浄表面はほとんどSrO面であることを明らかにし、特徴的な常伝導ギャップ構造を観測した。理論的にはSr2RuO4の酸素サイトでの2p電子間のオンサイト斥力の効果を吟味した結果、短距離の強磁性相関が誘起されてスピン三重項超伝導を安定化させることを示した。また、スピン軌道相互作用に起因する内部ジョセフソン振動がRuO2面に垂直なスピンゆらぎを増大させることで、観測されているNQRの異常緩和が説明できることを示した。第二のアプローチとして、超伝導体Sr2RuO4と強磁性スピン相関の強いメタ磁性金属Sr3Ru2O7との共晶の合成に成功し、一見Sr3Ru2O7に見える部分が実は低磁場ではバルク超伝導性を示すことを明らかにした。接合に関する理論では、不純物散乱効果が強い常伝導金属とスピン三重項超伝導体の接合の理論を構築した。すなわち常伝導金属側では、近接効果による超伝導成分の存在にもかかわらず、アンドレエフ共鳴状態による準粒子が共存し、ゼロエネルギーで状態密度にピークを持つという、スピン一重項d波の超伝導体にはみられない効果を予言した。さらにp波超伝導体-常伝導体-p波超伝導体接合では、共鳴状態のためにジョセフソン電流が非常に大きくなることを理論的に示した。スピン三重項超伝導状態を制御することで現れる、内部自由度の存在に特有の新量子現象を多角的・集中的に研究する目的に沿って研究を進めた。本研究の第一のアプローチ「超伝導秩序パラメターの制御による新量子現象の研究」に関しては、スーパークリーン物質Sr_2RuO_4のRuO_2面に垂直に弱い磁場をかけて、超伝導状態でのスピン磁化率の測定に始めて成功した。その結果、三重項クーパー対のスピンの方向が比較的低磁場で磁場方向に回転することを示唆する知見を得た。理論的にはRuサイトでの原子内スピン軌道相互作用の効果を摂動論的に評価し、この実験結果を説明できる結果を得た。またスタンフォード大学との共同研究によってSr_2RuO_4の超伝導状態で光学カー回転の観測に成功した。クーパー対の軌道モーメントによる時間反転対称性の破れたいわゆるカイラル状態の新たな観測手段となることを示した。第二のアプローチ「共晶接合系などでの新量子現象の研究」に関しては、Sr_2RuO_4と単一Ru金属片との界面に誘起される超伝導について、ゼロエネルギー束縛状態の観測に成功し、界面超伝導の出現とカイラル状態の出現が異なる温度磁場で起こることを見出した。さらに接合系に関しては、拡散伝導領域にある金属と超伝導体接合の超伝導近接効果に関する一般論を提案した。そして、Sr_2RuO_4のようなスピン三重項p波接合は奇周波数のペアとなって常伝導領域に侵入するという劇的な性質があることを予言した。一方、超低温走査トンネル顕微/分光装置を用いて、Sr_2RuO_4の局所電子状態密度観測を進めた結果、この物質の壁開表面特有の効果を詳しく把握できた。理論的に予言されているp波超伝導特有の近接効果を観測するために、面内方向でトンネル電流を検出する新たな試みに着手した。また本特定領域内の他の研究グループとの連携、特に「内部自由度を持つ原子気体の超流動性」および「超流動ヘリウム3の異方的秩序変数とその制御」の研究グループとの研究会を企画した。スピン三重項超伝導に関する第一のアプローチ「超伝導秩序パラメターの制御による新量子現象の研究」に関しては、Sr2Ru04の上部臨界磁場の精密測定を行い、その方位角依存性が温度によらず3次元ギンツブルグ・ランダウモデルでよく記述できることを示した。