hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗体提示ファージの1ビリオン直接蛍光検出を機軸とする高性能変異抗体の効率的創製

免疫測定法は病態検査に不可欠な手段だが、その性能は用いる抗体の親和力や特異性の制約を受ける。動物を免疫する従来法では目的の抗原結合能を持つ抗体分子種は必ずしも得られず、遺伝子操作による機能改変に期待がかかる。ランダム変異を導入した多様な抗体のライブラリーをファージ粒子上に提示し、標的抗原に結合するクローンを単離する「ファージ提示法」は、2018年ノーベル化学賞を受賞した分子進化の手法であるが、膨大な非特異的ファージから希少な目的ファージの選別に多大の労力と時間を要する。本研究ではこの状況の抜本的な改善方法として、蛍光標識した抗ファージ抗体を駆使して、標的抗原を捕捉し、ファージを直接検出することを試みた。既に共焦点レーザー顕微鏡下でファージ粒子の観察条件を決定し、抗体フラグメント(scFv)を提示したファージと標的抗原の反応を異なる蛍光色素で検出することで、これまで不明であった全ファージ中の抗体提示率も明らかにした。確立した観察条件からスライドガラス上の抗原特異的なファージの回収を想定していたが、顕微鏡の視野を手作業で探索する方法は現実的ではなく、機械による自動化が望まれた。そこで、最終年度では自作した抗ファージ抗体を応用する抗原特異的なscFv提示ファージのマイクロアレイ型スクリーニングを考案した。変異scFv遺伝子を導入した大腸菌ライブラリーをコロニー分離し、予め標的抗原(コルチゾール; CS)を固定化したマイクロウェル内で個別に培養し、CS特異的なscFv提示ファージを捕捉する。未反応のファージを洗浄除去し、発光タンパク質で標識した抗ファージscFvを加えて固相のファージを発光検出した。高いシグナルを示したウェルからファージを回収し、CS結合能を精査したところ、親和力(Ka)が向上した変異scFvを複数種得た。本法は従来の選択法に比較して短期間で効率のよいファージライブラリーのスクリーニング法であった。抗体は病態検査に不可欠の機能性分子であるが、免疫動物からは目的の結合能を持つ分子種は必ずしも得られず、遺伝子操作による機能改変に期待がかかる。ランダム変異を導入した多様な抗体をファージ粒子上に「提示」し、標的抗原に結合するクローンを単離するが、膨大な非特異的ファージからの選別に多大の労力と時間を要する。この状況の抜本的な改善が期待されている。申請者はマウスモノクローナル抗ファージ抗体をクローニングし、その可変部をリンカーで連結した一本鎖Fvフラグメント(scFv)を調製し、抗原特異的なscFv提示ファージの検出を試みた。抗ファージscFvのC末端に付加したタグ配列FLAGを認識する蛍光標識抗体を用いて共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行ったところ、繊維状ファージと推定されるサイズである約1μmの蛍光像が得られた。続いて、モデル抗原として用いた抗コルチゾール(CS) scFv提示ファージを同様に観察しscFvの蛍光検出を行ったところ、同様にファージ粒子と推定される蛍光像が観察された。続いて、本scFvの抗原であるCSのBSA結合体を反応させ抗原抗体複合体としてscFvの検出を試みた。申請者が調製したCS-BSA結合体をビオチン標識したのち、アビジンおよび申請者が自作した蛍光標識抗CS IgG抗体で染色した結果、scFvに由来すると推定される蛍光像が得られた。さらにscFvタンパク質に特異的なモノクローナル抗イディオタイプ抗体を調製して同様に標識し、scFv提示ファージの選択的な検出が可能となる最適条件を決定し、抗原特異的なファージを検出する。本研究では蛍光標識した抗ファージ抗体と抗scFv抗体を駆使して、1ビリオンの抗体提示ファージの可視化を試みることが平成28年度の計画であった。現在、抗ファージ抗体のクローニングおよびscFv化を成功させている。本scFvを用いた共焦点レーザー顕微鏡下でファージ粒子の最適観察条件を決定することにも成功しており、当初の研究計画通りに遂行されている。また、全ファージ中の抗体提示率の算出に関しても、ビオチン標識抗原および蛍光標識モノクローナル抗体(いずれも申請者が自作したもの)を組み合わせた実験により明らかになりつつある。抗体は病態検査に不可欠の機能性分子であるが、マウスなど免疫動物からは目的の結合能を持つ分子種は必ずしも得られず、遺伝子操作による機能改変に期待がかかる。ランダム変異を導入した多様な抗体をファージ粒子上に「提示」し、標的抗原に結合するクローンを単離するが、膨大な非特異的ファージライブラリーからの選別に多大の労力と時間を要する。申請者は抗ファージ抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)を用いて、抗コルチゾール(CS) scFv提示ファージを共焦点レーザー顕微鏡で観察したところファージ粒子と推定される蛍光像が観察された。続いて、申請者が調製したビオチン標識CS-BSA結合体と抗CS scFv提示ファージをアビジンを介して混合架橋させたのち、この複合体に申請者が自作した蛍光標識抗CS IgG抗体を加えて、抗ファージ抗体固定化チャンバーへ反応させて観察した結果、バックグラウンド蛍光に比してscFvに由来すると推定される蛍光像が得られている。また、これまで不明とされていた全ファージ中の抗体提示率の算出に関しても、本法により経験上推定されている提示率0.11%に近い値が得られている。

また、蛍光観察条件から得られた大腸菌の培養条件などを活用して抗ファージ抗体固定化マイクロウェルにファージライブラリーをクローニングしつつスクリーニングする新しいマイクロアレイ型のスクリーニング法も試みており、CSに対して親和力が向上したと推定されるクローンを獲得しており、選別操作の大幅な時間の短縮に成功している。これまでに本研究では蛍光標識した抗ファージ抗体を用いるscFv提示ファージの可視化に成功し、当初の研究計画通りに遂行されている。平成29年度計画では、確立した観察条件からスライドグラス上の抗原特異的ファージの回収をすることを想定していたが、顕微鏡の視野を手作業で探索する方法は現実的ではなく、機械によるオートメーション化が望まれる。そこで、次善の策として平成30年度計画で予定していたマイクロアレイ型のscFv提示ファージのスクリーニングに着手している。免疫測定法は病態検査に不可欠な手段だが、その性能は用いる抗体の親和力や特異性の制約を受ける。動物を免疫する従来法では目的の抗原結合能を持つ抗体分子種は必ずしも得られず、遺伝子操作による機能改変に期待がかかる。ランダム変異を導入した多様な抗体のライブラリーをファージ粒子上に提示し、標的抗原に結合するクローンを単離する「ファージ提示法」は、2018年ノーベル化学賞を受賞した分子進化の手法であるが、膨大な非特異的ファージから希少な目的ファージの選別に多大の労力と時間を要する。本研究ではこの状況の抜本的な改善方法として、蛍光標識した抗ファージ抗体を駆使して、標的抗原を捕捉し、ファージを直接検出することを試みた。既に共焦点レーザー顕微鏡下でファージ粒子の観察条件を決定し、抗体フラグメント(scFv)を提示したファージと標的抗原の反応を異なる蛍光色素で検出することで、これまで不明であった全ファージ中の抗体提示率も明らかにした。確立した観察条件からスライドガラス上の抗原特異的なファージの回収を想定していたが、顕微鏡の視野を手作業で探索する方法は現実的ではなく、機械による自動化が望まれた。そこで、最終年度では自作した抗ファージ抗体を応用する抗原特異的なscFv提示ファージのマイクロアレイ型スクリーニングを考案した。変異scFv遺伝子を導入した大腸菌ライブラリーをコロニー分離し、予め標的抗原(コルチゾール; CS)を固定化したマイクロウェル内で個別に培養し、CS特異的なscFv提示ファージを捕捉する。未反応のファージを洗浄除去し、発光タンパク質で標識した抗ファージscFvを加えて固相のファージを発光検出した。高いシグナルを示したウェルからファージを回収し、CS結合能を精査したところ、親和力(Ka)が向上した変異scFvを複数種得た。本法は従来の選択法に比較して短期間で効率のよいファージライブラリーのスクリーニング法であった。scFv提示ファージの提示率算出に関して、別のアプローチによるscFv検出を試みる。研究分担者によって調製されているscFvタンパク質に特異的なモノクローナル抗イディオタイプ抗体を蛍光標識して用いる。抗原抗体反応に基づく蛍光像とscFvとイディオタイプ抗体に基づく蛍光像が同時に得られれば提示率の算出はより確実なものになると期待される。以上の蛍光観察実験により、調製するscFv提示
アピカル面競合による上皮細胞の選別機構

細胞競合は等価な細胞集団において特定の細胞が増殖と生存の優位性(Fitness)を獲得し、fitnessの劣る細胞は組織から排除されるとする考え方である.細胞競合は遺伝的に標識された二種類の細胞集団の増殖率を比較する事で検出されるため、増殖と成長が緩やかな組織で細胞競合が起こるのかについての知見はまだない。本研究では細胞増殖を伴わない細胞競合が起きるかを検討した。ショウジョウバエ胚発生後期(細胞分裂15-16回目)では外胚葉に細胞が密集し表面張力がプラス(押し合い)の状態で頂端面の拡大縮小を繰り返すゆらぎの状態にあり、体節間の溝や各種器官の原基を内部に陥入させる原動力となっている。ライブイメージングにより外胚葉の細胞が一定の頻度で個別に頂端面積を減少させ、その一部の細胞が基部側に脱離することを見いだした。この脱離運動の容態に関して以下の知見を得た。1)細胞脱離はミオシン集積や核の凝集を伴わず、細胞死による脱離とは様相が異なる。2)神経分化においても脱離が起こる事が知られているがstage11の細胞脱離は神経細胞の大幅な減少を招くAc/Sc遺伝子の欠損変異体においても見られる。3)頂端面はsubapical(SA)とその基部側に位置する接着結合部位(AJ)に分かれるが脱離に際してはAJマーカー(Par6, p120CTN)が維持されるのに対しSA分子(Crumbs, aPKC)は減少することを見いだした。4)Crumbsの遺伝子量を1/2にした個体では細胞脱離の頻度が上昇する。これらの結果から頂端面のSA分子量はゆらぎ状態にあり、それらが閾値を下回ると頂端面を維持できず脱離すると考えられた。これらの結果はSA面の極性分子がFitnessの指標となり、その消失が脱離というかたちで細胞排除につながると解釈出来る。28年度が最終年度であるため、記入しない。細胞競合は等価な細胞からなる集団において特定の細胞集団が他の細胞集団に対して細胞増殖と細胞生存の優位性(fitness)を獲得し、fitnessの劣る細胞が組織から積極的に排除されるとする考え方である.ショウジョウバエの成虫原基や哺乳動物組織で細胞競合の存在が確認され、がん細胞の選択的増殖などの現象を説明するパラダイムとされている.しかし実験上の制約から細胞競合が遺伝的に同質な正常細胞間においても起きるのか、排除される細胞はどうやって選別されるのかについての知見は乏しい.我々は胚のライブ観察を通じて、形態形成運動を行っている発生中の胚の外胚葉は盛んにアピカル面の拡張と収縮を繰り返していること、および一部の細胞はアピカル細胞面を完全に失って上皮面から基底部側に脱離する、事を見出した.この脱離の様相を明らかにするために各種の細胞極性マーカーを用いてライブ観察を行ったところ細胞アピカル面マーカーの消失を伴うことが判明した。しかしミオシン蓄積を伴う細胞の積極的な排除は起こっていなかった。また細胞の脱離だけではなく基底部側から新たな上皮細胞が挿入される現象を見出した。細胞競合の考え方によるとこの現象は細胞のfitnessの喪失、もしくは獲得の結果によると考えられた。これらの条件では細胞死の徴候は見られなかった。また外部からの栄養供給がない胚の細胞では細胞の成長は起こらないのでこれらの表現型は成長中の組織で見られる細胞競合とは異なるものであると考えられた。ライブ観察による上皮細胞のダイナミックな形態変化が平面上だけではなく頂端部-基底部方向に向けても盛んに起きていることを見出したことは新規の発見である。また細胞の脱離において頂端部マーカーの消失が伴うことの発見は細胞脱離に細胞極性の変化が伴う可能性を示している。細胞の脱離だけではなく挿入が起きているという知見は予想外の発見で、興味深い。しかしその生物学的意義を追求する実験を組むことが新たに必要となった。

4)Crumbsの遺伝子量を1/2にした個体では細胞脱離の頻度が上昇する。これらの結果から頂端面のSA分子量はゆらぎ状態にあり、それらが閾値を下回ると頂端面を維持できず脱離すると考えられた。これらの結果はSA面の極性分子がFitnessの指標となり、その消失が脱離というかたちで細胞排除につながると解釈出来る。細胞の脱離における頂端部マーカーの消失の機能的意義を追求するために一部の細胞で頂端部マーカー発現量、活性を変化させるモザイク実験を計画している。細胞の脱離がfitness低下の結果であるとすると、fitnessがさらに低下する条件では細胞脱離の頻度が増すことが予想される.そこでそのような表現型を来す変異体を探索するためにタイムラプス画像データを解析し、細胞脱離の頻度、分布に変化が見られるかを検討する.まず我々が保有しているEGF受容体シグナル、細胞周期の変異体のタイムラプス画像を再解析する.また細胞死関連の変異体、細胞極性遺伝子(Crb, aPKCなど)、細胞競合で知られているJNK経路などの変異体における細胞脱離パターンの変動を検討する.細胞脱離パターンに異常の見られた変異体を元にfitnessを規定する遺伝子経路の解析を行う.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
赤痢菌のタイプIII分泌装置から分泌される核移行蛋白質,IpaH,に関する研究

ipaH9.8欠損変異株の病原性を、マウス肺炎惹起能を利用して野生株と比較するとipaH9.8欠損変異株では野生株に比べて炎症が著しく激化していた。そこでyeast two-hybrid法を利用して、IpaH9.8の標的宿主因子をスクリーニングした結果、splicing factor, U2AF35と結合することがわかった。U2AF35はマウスのIgM pre-mRNAのalternative splicing反応に必須であることが既に知られており、IpaH9.8のIgM遺伝子splicingへの影響を調べると、その反応はIpaH9.8の濃度依存的に阻害された。これらの知見から、赤痢菌から分泌された.IpaH9.8は宿主細胞の核内でU2AF35と結合し、U2AF35の機能を何らかの機序で抑制し、スプライシング異常を引き起こす結果、炎症反応に関わる因子の発現を抑制し、抗炎症作用を引き起こしていることが示唆された。そこで、RNAiの手法を用いてU2AF35発現をノックダウンしたHeLa細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行ったところ、非常に多くの遺伝子の発現が抑制されていたが、発現が抑制されていた遺伝子の中から、特に炎症に関わる遺伝子群を抽出したところ、炎症部位への好中球の遊走に重要な役割を果たすことが知られているケモカインである、IL-8やRANTES、さらにIL-1βやGM-CSFなどのサイトカインの発現が有意に抑制されていた。さらに、変異株と野生株で感染実験を行ったHeLa細胞およびマウスからRNAおよび肺ホモジネートをそれぞれ抽出し、IL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの発現量をRT-PCRおよびELISAで調べたところ、変異株と比べて、野生株感染細胞およびマウスにおいてIL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの有意な発現抑制が観察された。最後に、変異株感染マウスの肺における好中球の遊走量と定着菌数を調べたところ、野生株感染マウスに比べて、有意な好中球の遊走と菌数の減少がみられた。以上の結果から、赤痢菌が分泌するIpaH9.8は、タイプIII分泌装置によって宿主細胞内に打ち込まれた後、核内に移動し、宿主細胞のスプライシング反応を阻害し、免疫応答、特に好中球の遊走、に関わるケモカインやサイトカインの発現を抑制することで抗炎症作用を引き起こし、赤痢菌が宿主の免疫反応から逃れ、上皮細胞内で増殖し易くなるようにしていることが考えられる。ipaH9.8欠損変異株の病原性を、マウス肺炎惹起能を利用して野生株と比較すると、ipaH9.8欠損変異株では野生株に比べて炎症が著しく激化していた。また、実際に蛋白質同士で結合することをin vitroでのpull down assaylにより確認した。最近kravchenkoらは、ikki遺伝子をノックアウトした細胞ではNF-κBの活性化経路は正常であるものの、NF-κBによる転写制御をうけるC/EBPδの活性化が起こらなくなり、その結果、活性型C/EBPδにより転写活性化されるIL-6,TNFα,IL-1β遺伝子の発現量が抑制されることを報告した。HEK293T細胞にIpaH9.8発現プラスミドとNF-κB-luciferaseあるいはIL-6-luciferaseレポータープラスミドをそれぞれco-transfectionしたところNF-κBの転写量は変わらなかったが、IL-6の転写量はIpaH9.8過剰発現により有意に抑制された。さらにアデノウイルスベクターによりIpaH9.8をHeLa細胞へ過剰発現させると、ikki遺伝子の発現量も有意に抑制された。RNAi法によりU2AF35発現をノックダウンし、RT-PCRおよびウエスタンブロット法によりikki遺伝子の発現量を調べたところ、ikki遺伝子の発現量は有意に抑制された。またRNAiによるU2AF35ノックダウンにより、C/EBPδの活性化が有意に抑制され、活性型C/EBPδにより転写活性化されるIL-6,RANTES,IL-1β遺伝子の発現量も著しく抑制された。したがって、赤痢菌から分泌されたIpaH9.8が宿主細胞の核内でU2AF35と結合し、U2AF35の機能を何らかの機序で抑制し、ikki遺伝子のスプライシング異常を引き起こす結果、一連のサイトカインの産生が抑制される可能性が考えられる。

これらの知見から、赤痢菌から分泌された.IpaH9.8は宿主細胞の核内でU2AF35と結合し、U2AF35の機能を何らかの機序で抑制し、スプライシング異常を引き起こす結果、炎症反応に関わる因子の発現を抑制し、抗炎症作用を引き起こしていることが示唆された。そこで、RNAiの手法を用いてU2AF35発現をノックダウンしたHeLa細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行ったところ、非常に多くの遺伝子の発現が抑制されていたが、発現が抑制されていた遺伝子の中から、特に炎症に関わる遺伝子群を抽出したところ、炎症部位への好中球の遊走に重要な役割を果たすことが知られているケモカインである、IL-8やRANTES、さらにIL-1βやGM-CSFなどのサイトカインの発現が有意に抑制されていた。さらに、変異株と野生株で感染実験を行ったHeLa細胞およびマウスからRNAおよび肺ホモジネートをそれぞれ抽出し、IL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの発現量をRT-PCRおよびELISAで調べたところ、変異株と比べて、野生株感染細胞およびマウスにおいてIL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの有意な発現抑制が観察された。最後に、変異株感染マウスの肺における好中球の遊走量と定着菌数を調べたところ、野生株感染マウスに比べて、有意な好中球の遊走と菌数の減少がみられた。以上の結果から、赤痢菌が分泌するIpaH9.8は、タイプIII分泌装置によって宿主細胞内に打ち込まれた後、核内に移動し、宿主細胞のスプライシング反応を阻害し、免疫応答、特に好中球の遊走、に関わるケモカインやサイトカインの発現を抑制することで抗炎症作用を引き起こし、赤痢菌が宿主の免疫反応から逃れ、上皮細胞内で増殖し易くなるようにしていることが考えられる。
ペプチド鎖間にＳＳ結合を有するインスリンの効率的なフォールディング手法の開発

本研究はペプチド鎖間ジスルフィド(SS)架橋法によって天然型インスリの簡便且つ効率的な酸化的フォールディング手法を確立することを目的としている。平成25年度は交付申請書に記載した「研究の目的」に従い、(1)インスリンA鎖およびB鎖を用いたペプチド鎖間SS架橋法によるフォールディング収率の向上を目指した反応条件の検討、(2)インスリンに対して最適化した反応条件の二本鎖ペプチドホルモン、リラキシンへの適用を主要課題として設定し、研究を行った。(1)の研究課題は交付申請書「研究実施計画」に従って実験を行い、天然型インスリンを高収率で得る為、フォールディング反応の条件検討を行った。フォールディング収率だけでなく反応過程における中間体の生成量に基づいて、温度、pH、添加剤などの条件を緻密に検討し、最適化を行った。結果として、はじめにインスリンA鎖の分子内SS結合を一部架橋し、次に還元型のインスリンB鎖を添加することで分子間SS架橋反応が効果的に促され、良好な収率で天然型のインスリンが得られた。さらに低温、弱塩基性条件下で収率の向上が見られた。また、添加剤として複数のヒドロキシ基を有する水溶性添加剤を適当量加えることで収率をさらに改善することができた。添加剤の作用機序については現在検証中である。現在インスリンのフォールディング収率は3540%を達成している。続いて課題(2)では、インスリンで最適化した反応条件と同様のものをリラキシンにも応用した。結果的に天然型リラキシンをフォールディング収率4570%で得ることができ、過去の報告と比較して格段にフォールディング効率を向上させた。本反応は、添加剤およびpH条件等に工夫を凝らしているが、基本的にインスリンあるいはリラキシンのA鎖とB鎖をモル比1:1で混合しただけであり、従来法と比較して格段に短い反応ステップでフォールディングを達成した。インスリンやリラキシンは医薬品としての需要が高いため、本手法はこれら医薬用ペプチドホルモンの安価な市場供給に貢献できると期待できる。リラキシンのフォールディング手法に関しては2014年2月に特許を出願済みである。現在、これらの結果に関する論文をまとめている。(抄録なし)本研究はペプチド鎖間ジスルフィド(SS)架橋法によって天然型インスリの簡便且つ効率的な酸化的フォールディング手法を確立することを目的としている。平成24年度は交付申請書に記載した「研究の目的」に従い、(1)インスリンの構成ペプチドであるA鎖およびB鎖の分子内SS形成反応挙動の解明と生成SS中間体の構造特性の解析、(2)インスリンA鎖およびB鎖を用いたペプチド鎖間SS架橋法によるフォールディングの条件検討を主要課題として設定し研究を行った。(1)の研究課題は「研究実施計画」に従って実験を行った。SS結合が開裂された還元型のA鎖およびB鎖に、独自に開発した強力なSS形成試薬(DHS^<ox>)を添加しSS結合形成反応を開始した。反応速度論解析を行うことで適用pH条件におけるA鎖およびB鎖のSS形成挙動を詳細に把握することに成功した。特に重要な知見は、弱塩基性条件下におけるインスリンB鎖の分子内SS形成速度は還元型B鎖の構造化によって著しく低下するということある。これはB鎖の分子内SS形成反応を塩基性条件下において速度論的に阻害することで、A鎖-B鎖間SS架橋を優先的に促せることを暗示する重要な結果である。先に示した有益な結果に基づき、続いて課題(2)の天然型インスリンを得る為のペプチド鎖間SS架橋法によるフォールディング反応の条件検討を行った。温度、pH、添加剤などを変化させながら、フォールディング収率、SS中間体の生成量に基づいて条件の最適化を行った。現在のところ、フォールディング収率は37%を達成している。本反応は、添加剤およびpH条件に工夫を凝らしているが、基本的にインスリンA鎖とB鎖をモル比1:1で混合しただけであり、従来法と比較すると非常に簡便な方法である。A鎖とB鎖の直接的なカップリング法によって天然型インスリンをこれほどの収率で得たという前例はなく、この実験結果はすでに高い評価に値するものと考えられる。

現在インスリンのフォールディング収率は3540%を達成している。続いて課題(2)では、インスリンで最適化した反応条件と同様のものをリラキシンにも応用した。結果的に天然型リラキシンをフォールディング収率4570%で得ることができ、過去の報告と比較して格段にフォールディング効率を向上させた。本反応は、添加剤およびpH条件等に工夫を凝らしているが、基本的にインスリンあるいはリラキシンのA鎖とB鎖をモル比1:1で混合しただけであり、従来法と比較して格段に短い反応ステップでフォールディングを達成した。インスリンやリラキシンは医薬品としての需要が高いため、本手法はこれら医薬用ペプチドホルモンの安価な市場供給に貢献できると期待できる。リラキシンのフォールディング手法に関しては2014年2月に特許を出願済みである。現在、これらの結果に関する論文をまとめている。これまで当研究室で確立してきた酸化的フォールディング機構解析に関する研究技術をうまく適応でき、分子内SS形成挙動に関する研究が滞りなく進んだ為。また、このときの研究結果が鎖間SS架橋法によるインスリンの酸化的フォールディングの戦略を練る上での鍵となり順調に研究が進行している為。反応における小分子添加剤の選択と濃度をさらに検討することで更なるフォールディング収率の向上が見込まれており、条件の最適化を優先して行っていく予定である。さらに、確立したフォールディング条件をインスリンと構造的に酷似したペプチドホルモン、リラキシンにも応用し、本手法の汎用性を示す予定である。良好な収率結果が得られ次第、学術論文へ投稿する。さらに、マイクロリアクターを用いたマイクロスケール反応場におけるフォールディング反応を計画してる。現行のフォールディング手法はインスリンA鎖およびB鎖の効率的な鎖間SS架橋法に最大の独創性をもつ。このような分子間反応はより小さな反応場を利用し、分子間接触頻度を上げることでより効率よく反応が進行するものと考えられる。このような実験を実際に行う為、本年度4月よりマイクロリアクター内における有機合成研究を行っているイギリス、カーディフ大学のThomas Wirth教授の研究室に滞在し、その研究ノウハウを学ぶと共に、実際にフォールディング反応への応用を行う予定である。(抄録なし)
中世浄土宗寺院における学問形成についての基礎的研究

平成14年より平成17年にかけ、2ヶ月に1度(2日間)のペースで、浄土宗名越派の中心寺院であった如来寺(福島県いわき市平山崎字矢ノ目)の蔵書調査を行った。全1500点余の書肆カードを取り終えた後、見直し作業を兼ねてパソコンへのデータ打ち込みを行い、800点の処理を終えた。また、名越派の本山であった専称寺(いわき市平山崎字梅福)の蔵書調査も併せて行った。本報告書には、如来寺蔵書調査・研究の成果として目録抄を掲載した。平成15年より平成17年にかけ、年に1度(3日間)のペースで、京都における浄土宗名越派の中心寺院であった檀王法林寺(京都市左京区三条)の蔵書調査を行った。檀王法林寺の蔵書調査の成果を踏まえ、「袋中の本箱」(『説話文学研究』37,説話文学会,平成15年6月)を提出した(本報告書に転載)。平成14年より平成17年にかけ、2ヶ月に1度(2日間)のペースで、真言宗智山派の寺院、宝聚院(いわき市西小川)、圓通寺(同遠野町上遠野)に所蔵される、浄土宗関係資料の蔵書調査を行った。研究成果として、「圓通寺蔵書目録」(『むろまち』10号,室町の会,平成18年3月)を提出した(本報告書に転載)。本研究の成果を踏まえ、平成17年5月、中世文学会創立50周年記念シンポジウムにおいて、第一部会資料学のパネラーをつとめ、「地域寺院と資料学」の題で発表を行った(本報告書に転載)。また、,平成17年11月、中世文学会秋季大会においてもシンポジウムのパネラーをつとめ、「日本(ヤマト)からのアプローチ-中世における琉球文学の可能性-」の題で発表を行った(本報告書に転載)。浄土宗名越派の中心的寺院であった如来寺(いわき市平山崎字矢ノ目)の聖教調査を4・6・8・10・12・2月の6回、計14日間行った。如来寺の聖教は2度にわたる水害を受けたために、約3000冊の本が入り交じり、未整理のまま収められていた。書誌カードをもとに外題・内題・柱題・尾題をパソコンに打ち込んでソートをかけ、蔵本の整理を行った結果、聖教全体の点数が、約1300点であることが判明した。次に書誌カードの見直し作業に入り、蔵書の3割の見直しを終えた。書誌カードの見直し作業の終了まで、あと1年半ほどかかる見通しである。書誌カードの見直しが終わり次第、パソコンへのデータ入力をおこなう予定でいる。室町時代後期以降、名越派の本山であった専称寺の聖教予備調査は8月におこなった。現在、専称寺に残されている聖教が江戸時代以降の版本が中心であることを確認した。如来寺蔵書の整理・書誌カード見直し作業、専称寺蔵書の予備調査と平行して、戦国期の学侶である良定(袋中)の著作物の確認作業に入った。名越派の聖教を把握していく上で、良定の著したおびただしい作品群の解析が必要と考えられるからである。良定の著作物の確認作業は、如来寺と同様に多数の聖教を蔵する檀王法林寺(京都市左京区三条)の聖教調査に入るための準備作業でもある。なぜなら、檀王法林寺は、良定が中興し、多くの著作物を収めた寺院だからである。

良定の著作の確認作業の成果の一端を4月27日、説話文学会例会において「袋中の本箱」の題で発表し、その後、さらに確認作業を続けた結果、良定が名越派の五重相伝を作り上げた人物であることの確証を得た。その成果は、論文「袋中の本箱」として『説話文学研究』38号に掲載予定である、(入稿済み)。浄土宗名越派の中心的寺院であった如来寺(いわき市平山崎字矢ノ目)の聖教調査は、4・5・6・8・10・12・2月の7回、計19日間行った。15年度は、書誌カードの見直し作業を行い、全体(約1300点)の9割の見直しを終えた。16年度には再度の見直し作業を兼ねて、パソコンへのデータ入力を行う予定でいる。室町時代後期以降、名越派の本山であった専称寺の聖教予備調査は8月に行った。専称寺に残されている聖教の内、如来寺聖教と重複する典籍の確認作業を行った。専称寺に残される真言宗の行法書との関係を明らかにするため、いわき市内の真言宗寺院である宝聚院(いわき市西小川)の調査を、9・11月に4日間行った。檀王法林寺の調査は、10月に3日間行った。如来寺蔵『三語集』(戦国期末成立。説草集)の編者である、如来寺十三世良要(良定の伯父)関係の典籍調査を行い、『果号事』、『果号切紙』、『鎮西義一紙相伝』、『浄土鈔相伝法軌詮議式定事』の四点の書誌データと写真の取り込み作業を行った。良要については、ほとんど資料か残されていないため、貴重なデータとなる。また、良定の著作『枕中書』の書誌データ取りを行った。なお、『三語集』については注釈作業に入っており、15年度は、全九十九話のうち二十三話に、語釈、ロ語訳、解説などを施した。如来寺蔵書の書誌カード見直し作業、専称寺蔵書の予備調査、檀王法林寺の聖教調査と平行して行った、戦国期の学侶良定(袋中)の著作物の確認作業は、名越派の五重相伝を軸に、「袋中の本箱」として『説話文学研究』38号に掲載された。浄土宗名越派の中心的寺院であった如来寺(いわき市平山崎字矢ノ目)の聖教調査は、4・6・8・10・12・2月の5回、計19日間行った。8月の調査で書誌カードの見直し作業を完了した。10月の調査以降、再度の見直し作業を兼ねて、パソコンへのデータ入力を行い、全体の3割の作業を終えた。専称寺に残される真言宗の行法書との関係を明らかにするため、いわき市内の真言宗寺院である宝聚院(いわき市西小川)の調査を、5・7・9・11・3月の5回、計10日間行った。調査の過程で、宝聚院の聖教中に、浄土宗名越・白旗両派の相伝許可状『五重相伝』『布薩戒血脈』を発見し、書誌調査などを行った。檀王法林寺の調査は、9月に2日間行った。説草集)の編者、如来寺十三世良要(良定の伯父)の甥であり弟子でもある良定(袋中)関係の典籍調査を行い、『枕中書』の書誌調査と画像データの収集作業を行った。名越派内における書物の伝播の状況を窺うため、良要、良定の著書内における共通の言説の確認作業を行った。成果の一部は、17年度中世文学会50周年シンポジウム(5月28日)において、「地域寺院と資料学」と題し発表することが決まっている。なお、『三語集』の注釈作業については、16年度は、全九十九話のうち二十話(15年度と併せて四十三話)に、語釈、口語訳、解説などを施した。如来寺蔵の聖教調査は、2005年6月25、26日、8月37日、10月15、16日、12月17、18日に行った。聖教の全点数の半分、七百五十点の書誌カードの見直しと、パソコンへのデータ打ち込みを完了した。研究成果報告書(冊子体)に、調査完了時点での所蔵目録を掲載する予定である。また、同地域の真言宗寺院である宝聚院(いわき市西小川)に所蔵される、浄土宗関係資料の調査を、7月2、3日、9月18、19日、11月12、13日に行った。
膜結合型細胞増殖因子HB-EGFの細胞膜上での発現を調節すタンパク質の解析

HB-EGFはEGFファミリーに属する膜結合型細胞増殖因子であるが、一方でその膜結合型フォームはジフテリア毒素(DT)のリセプター(DTR)となっている。我々は、DTの側からこのタンパク質の解析を進めてきており、これまでに次のことを明らかにしている。(a)DTRにはDRAP27と命名した膜タンパク質がアソシエートしていること、(b)DRAP27のcDNAクローニングを行い、(c)細胞膜を4回貫通する膜タンパク質で、血小板等で見つかっているCD9抗原のホモローグであること、(d)DRAP27は細胞表面のDTR数を著しく上昇させること、等である。本研究の目的は、膜結合型細胞増殖因子としてのHB-EGFの作用にDRAP27がどのような生理的役割を果たしているかを解析することであり、以下に述べる結果を得た。DRAP27は、それ自体はDTに結合性を持たないが、DTR/HB-EGFとコンプレックスを形成し、細胞表面のDTR量を10-20倍上昇させる。はじめに、DRAP27は、細胞表面での膜結合型HB-EGF分子数を実際に増やしているのか、タンパク量自体は変えていないがDTRとして働く機能的なHB-EGFの量を増やしているのかを検討した。その結果、DRAP27は細胞表面のDTR/HB-EGF分子数そのものを増やすのではなく、むしろDTR/HB-EGF分子とアソシエートすることで機能的なDTRの形成を助けていることが明らかになった。次に、膜結合型細胞増殖因子としてのHB-EGFの作用についてDRAP27が同様な効果を持っているかどうかを調べた。その結果、HB-EGFは膜結合型の状態で隣接した細胞に細胞増殖作用を示し得ること、DRAP27はこの作用を著しく増強することが示された。このことは、膜結合型細胞増殖因子の作用機構を理解する上で極めて重要な事実であると考えられる。これについては、今後のさらなる解析を行う予定である。
大腸菌genetic networkの解明

網羅的に遺伝的ネットワークを解明することを目的に、2重欠失株作製の系の開発と解析の評価を行った.2重欠失の為の既存の欠失株ライブラリーにさらにもう1種類の欠失株ライブラリーの構築、単一欠失の接合による2重化のツールの開発、2重化のhighthroughput化、解析システムのそれぞれの開発を行った.新規欠失株ライブラリーには、20ntのbarcodeを挿入し、創薬等のhighthroughputスクリーニングへの道も開いた.網羅的に遺伝的ネットワークを解明することを目的に、2重欠失株作製の系の開発と解析の評価を行った.2重欠失の為の既存の欠失株ライブラリーにさらにもう1種類の欠失株ライブラリーの構築、単一欠失の接合による2重化のツールの開発、2重化のhighthroughput化、解析システムのそれぞれの開発を行った.新規欠失株ライブラリーには、20ntのbarcodeを挿入し、創薬等のhighthroughputスクリーニングへの道も開いた.本年度は、1、必須遺伝子欠失導入用ベクター開発、2、、アーカイブクローンから必須遺伝子解析ベクターへの遺伝子断片の組み換え、3、必須遺伝子の供給下でのWanner法による遺伝子欠失の導入、4、必須遺伝子欠失株における生育に関するIPTG濃度依存性の解析、5、ORFクローンのGateway化およびGateway entryライブラリーの構築、6、特定の配列を付加したバーコード方式の欠失株ライブラリー作製、7、接合による遺伝子欠失の移動の系の開発、そして8、合成致死遺伝子同定システムの自動化を目標に研究開発を進めてきた。上記目標を一通りすべて当初の目標とおり達成することができ、特に開発項目の6、においては、特定の配列を付加(bar code)のみならず、対象とする遺伝子の開始コドンにGFPを融合するように設計を変更し、対象遺伝子の細胞内の発現を、本来のプロモーターおよび翻訳シグナルを用いた、しかも単一細胞で測定可能にすることができた。これにより、今後はsingle cell levelで、しかもin vivoにおいて発現解析が可能になった。本欠失株は本年度に一通りの候補株取得を終了し、あとはbar codeの読み取りを含めた、ゲノム構造の確認作業を残すのみとなっている。さらに、既存の欠失株と新規の欠失株を接合を用いて欠失の2重化も効率よく行うことが可能となった。この成果により、ロバスト性、代謝経路の冗長性など、細胞内ネットワーク解明に大きな一歩を踏み出すことができたと言える。1.必須遺伝子機能ネットワークA)欠失導入用ベクター開発野生型と温度感受性型Fplasmid由来発現調節低コピーベクターの開発を終了した。B)必須遺伝子ORFクローンと欠失株ライブラリー開発。必須遺伝子クローンライブラリーを構築した。その存在下で必須遺伝子領域の欠失株を取得した。約200遺伝子については欠失できたが、?遺伝子は欠失ができなかった。取得したものの解析を進めている。2.リソース拡張Entry cloneライブラリー用ベクターの構築と約200遺伝子についてライブラリー構築を行った。Destination vectorによる、GST融合と酵母two hybrid cloneの構築で評価を行い、良好な結果が得られた。全ORFへ拡張している。B)新規単一遺伝子欠失株ライブラリー構築対象遺伝子の開始コドンとGFPとの融合、バーコード配列の導入、Chloramphenicol耐性遺伝子導入の特徴を持たせた新規単一遺伝子欠失株ライブラリーの構築を行った。現在、3000遺伝子についてライブラリーとして確立した。残る約1000の遺伝子群は、平成20年度第一四半期での作製終了を予定している。A)接合による遺伝子欠失の移動の系の開発染色体の任意の位置でHfrを作製する系を開発した。これにより、2-B)の新規遺伝子欠失株をHfr化し、Km^R欠失株ライブラリーとの間で、接合による2重欠失株作製の系を確立した。ロボットシステムを用いて、寒天プレート上でhigh throughput接合の系を開発した。一日当たり10遺伝子以上の欠失を全4000遺伝子欠失株ライブラリーと組合わせることを可能にした。1)2重欠失株構築方法の確立とシステマティックな解析方法の確立既に開発済みの一遺伝子欠失株ライブラリーに加え、新規にCm耐性、分子バーコードを持たせた一遺伝子欠失株ライブラリーの開発を終えた。この2種類のライブラリーの欠失を、接合を用いて2重欠失株を作製する系の開発を行った。接合の為に、宿主株をHfr株にするために、接合に必須な断片を持ったプラスミドを構築、その断片を宿主染色体に組込む事で、効率的にHfr株にする系の開発を終えた。この系を利用し、プレートあたり、1536株という高密度で接合を行い、high throughputに2重欠失株を作製する自動システムを、Biomek FXという自動分注ロボット装置を改良して構築を行った。2)コロニーサイズによる定量的な遺伝的ネットワーク解析方法の確立上記(1)の解析システムから生成される、プレートあたり1536株のコロニーを、その大きさを自動的に定量する系の開発を行った。現在は、透過光による自動スキャンの系を開発し、経時的に測定可能な装置を開発し、定量を行っている。3)GFP融合株ライブラリーの完成と融合株による細胞内動態の定量解析及び細胞内局在性の解析方法の確立解糖系、TCA回路、ペントースリン酸回路など、中心代謝系に関与する遺伝子群のGFP融合株の作製を行い、蛍光顕微鏡による局在性解析及びフローサイトメーターによる定量解析を可能にし、解析を進めている。4)上記1,2,3の解析結果を合わせた相関解析方法の確立上記の解析を総合的に活用し、すでに2009年度にNature Methodに公開している。

5)4より得られた解析結果を元に、分子バーコードを利用した表現型parallel assay方法の確立(1)で開発を行った分子バーコードを持つ欠失株の混合培養液中の、各遺伝子欠失株のpopulationの変動を、新世代シーケンサーによるバーコード領域の配列解析による頻度分布により解析可能にした。
胃がんにおけるＰＰ２Ａ阻害因子ＳＥＴの機能解明

胃癌は、未だに世界のがんによる死亡者数の第3位であり、新たな治療戦略が必要とされている。SETは、炎症反応の増強やがんの悪性化に重要な役割を果たす多機能タンパク質であり、重要ながん抑制因子であるタンパク質脱リン酸化酵素PP2Aの活性を阻害することでがんの悪性化に寄与する。実際に多くのがんでPP2Aの不活性化が認められており、一部のがんではSETの発現上昇と悪性度との相関が報告されている。しかし、胃癌におけるSETの発現や機能については明らかになっていない。そこで胃癌におけるSETの機能を解明することで、SETが胃癌に対する新規治療標的となりうるか検討することを目的に研究を行った。今年度の研究成果として、ヒト胃癌細胞株におけるSETの発現抑制は転写因子E2F1と、そのターゲット因子である幹細胞マーカーNANOGの発現を低下させた。このことから、SETはPP2A阻害を介してE2F1とNANOGの発現上昇を引き起こし胃癌細胞の幹細胞性を亢進させていると考えられる。また、SET標的薬であるOP449はE2F1の発現を減少させて抗がん効果を示したことから、胃癌に対する新規治療標的としてSETの有用性が期待される。また、SET標的薬OP449とキナーゼ阻害薬であるdasatinibの併用効果を胃癌細胞株で検討したところ、相加効果が認められた。さらに、HER2陽性の胃癌患者に適応されるHER2抗体trastuzumabに対して抵抗性を示す胃癌細胞株MKN7にも、OP449は抗がん効果を示した。これらの結果は、既存のキナーゼ阻害薬とホスファターゼ活性化薬の併用効果、薬剤耐性がんに対する抗がん効果を示すものであり、今後SET標的薬を初めとしたホスファターゼ活性化薬の臨床応用の可能性を強く後押しするものである。本研究の成果から、SETを標的とした抗がん戦略の新たな可能性が示された。29年度が最終年度であるため、記入しない。胃癌は、未だに世界のがんによる死亡者数の第3位であり、日本でも多くの罹患者数を維持している。しかし、効果的な治療薬は少なく、新たな治療戦略が必要とされている。SETは、炎症反応の増強やがんの悪性化に重要な役割を果たす多機能タンパク質である。がん促進因子としてのSETの機能は、重要ながん抑制因子であるタンパク質脱リン酸化酵素PP2Aの活性を阻害することで発揮される。そこで胃癌におけるSETの機能を解明することで、SETが胃癌に対する新規治療標的となりうるか検討することを目的に研究を行っている。これまでに、イヌ悪性黒色腫細胞に対してSET阻害が抗がん効果を示すこと、マウス胃癌モデルおよびヒトの胃癌臨床サンプルにおいてSET発現が上昇していることを明らかにしてきた。本研究ではさらに項目A:培養細胞を用いたSET発現による胃癌悪性化の分子機構解明、項目B:オルガノイドを用いたSETによる胃癌悪性化の分子機構解明、項目C:担がんマウスモデルを用いたSET阻害の抗がん効果検討の3つの視点から実験を行っている。今年度の研究成果として、項目Aでは、ヒト胃癌細胞株を用いた検討から転写因子E2F1を介した新たな胃癌悪性化メカニズムを明らかにした。また、項目Bでは、SETの過剰発現は、胃オルガノイドの幹細胞性を上昇させることが認められた。さらに項目Cでは、SETの阻害が担がんマウスモデルの腫瘍の成長を抑制することが明らかになった。今年度の研究結果から、SETが胃癌において重要な役割を果たしていることが示唆され、かつ新規治療標的として有用であると考えられる。項目Aにおける成果として、E2F1を介した新たな胃癌悪性化メカニズムを明らかにした。SETはPP2A活性を阻害することで様々な細胞内シグナルを活性化することが知られているが、胃癌細胞株においてSET発現を抑制すると、転写因子E2F1の標的遺伝子の発現が低下することが明らかになった。このメカニズムは過去に報告されていない新たな発見であり、今後の胃癌治療の発展に貢献できると考えられる。また、項目Bにおける成果としてSETの発現は胃オルガノイドの幹細胞性を上昇させることが認められた。今回,SETを過剰発現させたところ、形成されるオルガノイドの数が増加した。また、Real-time PCRにより幹細胞マーカーであるCD44のmRNAが上昇していたことからも、SETは胃癌の幹細胞性の維持に関与していると考えられる。さらに項目Cにおける成果として、SET阻害は免疫不全マウスに形成させた腫瘍の成長を抑制することを確認した。SET発現を安定的に抑制したヒト胃癌細胞株MKN45を免疫不全マウスの皮下に移植することで,担がんマウスモデルを作製した。腫瘍の成長を継時的に測定したところ、SET発現を抑制したMKN45では腫瘍の成長が顕著に抑制された。また、野生型のMKN45を移植したマウスに対してSET標的薬であるOP449を投与したところ、SET発現の抑制時と同様に有意な腫瘍成長の抑制が認められた。さらにOP449を投与したマウスの腫瘍部PP2A活性を測定したところ、活性の顕著な回復が見られた。

これらの結果は全てSETが胃癌に対する新規治療標的として有効であることを示す重要な知見であり、かつ次年度の研究計画に記載した事項につながる結果にもなっており、研究課題は概ね順調に進展していると言える。胃癌は、未だに世界のがんによる死亡者数の第3位であり、新たな治療戦略が必要とされている。SETは、炎症反応の増強やがんの悪性化に重要な役割を果たす多機能タンパク質であり、重要ながん抑制因子であるタンパク質脱リン酸化酵素PP2Aの活性を阻害することでがんの悪性化に寄与する。実際に多くのがんでPP2Aの不活性化が認められており、一部のがんではSETの発現上昇と悪性度との相関が報告されている。しかし、胃癌におけるSETの発現や機能については明らかになっていない。そこで胃癌におけるSETの機能を解明することで、SETが胃癌に対する新規治療標的となりうるか検討することを目的に研究を行った。今年度の研究成果として、ヒト胃癌細胞株におけるSETの発現抑制は転写因子E2F1と、そのターゲット因子である幹細胞マーカーNANOGの発現を低下させた。このことから、SETはPP2A阻害を介してE2F1とNANOGの発現上昇を引き起こし胃癌細胞の幹細胞性を亢進させていると考えられる。また、SET標的薬であるOP449はE2F1の発現を減少させて抗がん効果を示したことから、胃癌に対する新規治療標的としてSETの有用性が期待される。また、SET標的薬OP449とキナーゼ阻害薬であるdasatinibの併用効果を胃癌細胞株で検討したところ、相加効果が認められた。さらに、HER2陽性の胃癌患者に適応されるHER2抗体trastuzumabに対して抵抗性を示す胃癌細胞株MKN7にも、OP449は抗がん効果を示した。これらの結果は、既存のキナーゼ阻害薬とホスファターゼ活性化薬の併用効果、薬剤耐性がんに対する抗がん効果を示すものであり、今後SET標的薬を初めとしたホスファターゼ活性化薬の臨床応用の可能性を強く後押しするものである。本研究の成果から、SETを標的とした抗がん戦略の新たな可能性が示された。項目A:H28年度に引き続き、SETが胃癌悪性化を促進するシグナルの解明を行う。特に転写因子E2F1が胃癌細胞の幹細胞性を上昇させるメカニズムについて詳細な検討を行う。また、これまで明らかになっていないSETの発現を調節するメカニズムについても解析を行う。胃癌自然発症モデルマウスを用いた検討から、胃癌の発症以前に起こる炎症反応の亢進がSETのmRNAレベルを上昇させることが明らかになっている。そこで、炎症反応を介したシグナルに着目してSETの発現を調節するメカニズムを解析する。項目B:マウス胃オルガノイドにおけるSET発現上昇が引き起こすシグナル伝達の変化の解析を行う。SETを過剰発現させた胃オルガノイドにおいて幹細胞性の上昇が認められたことから、それが細胞内のどのようなシグナルを介しているのかをreal-time PCRおよびウェスタンブロット法を用いて解析する。項目C: SET標的薬OP449と、既存の抗がん剤との併用が胃癌成長に対する効果の解析を行う。今回、SETの阻害によりPP2Aを活性化させることが抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。
遺伝子導入免疫担当細胞を用いた新たな腫瘍免疫遺伝子治療の開発

白血病におけるWT-1のように、近年いくつかの造血器腫瘍において免疫療法の標的として有望な腫瘍関連抗原が同定されつつある。今回われわれは未だ特異的な腫瘍抗原が同定されていない悪性リンパ腫に着目し、リンパ腫細胞に特異的な細胞障害性T細胞を樹立する研究を行なった。リンパ腫細胞における免疫グロブリンの相補結合領域(CDR)配列は個々の腫瘍における特異性が高く、リンパ腫細胞のみが持つ腫瘍特異抗原と考えられる。我々は数例の悪性リンパ腫症例より腫瘍組織を採取しCDRを含む配列を増幅レトロウイルスベクターへの組み込みの後に患者由来CD34陽性細胞へ遺伝子導入を行なった。種々の条件設定を行ないつつ、腫瘍特異抗原を発現する樹状細胞を誘導している。今後、患者T細胞との培養によって腫瘍特異CTLを樹立する計画である。リンパ球の抗腫瘍効果を期待して行われる細胞療法では、細胞障害を直接になうCD8陽性細胞障害性T細胞のみならず、樹状細胞(DC))による抗原提示が重要であると知られている。我々はウイルスベクターによる遺伝子導入法を用いてその過程を修飾し、より効果の高い遺伝子細胞免疫療法の開発を行っている。樹状細胞は強力な抗原提示能を持つことが知られるが、終末分化した細胞であるため、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に抵抗性である。今回我々はSCF、FL、TPO、IL-6存在下でEGFP遺伝子を導入したヒトCD34細胞を引き続きSCF、GM-CSF、TNF-αの存在下に培養することでEGFP発現細胞の40%程度をCD1a陽性DCとすることを可能とした。また、腫瘍関連抗原であるWT-1、TERTを効率よく血球細胞へ形質導入できるレトロウイルスベクター(GCsapWT-1、GCsapTERT)を作製した。現在、HLA-24陽性CD34陽性細胞から、WT-1陽性CD1aDCとTERT陽性CD1aDCを誘導し、当教室で作製されたHLA-A24拘束性WT-1ペプチド特異的CTLであるTAK-1およびNIM-1と共培養し、誘導DCが導入遺伝子をペプチドとしてMHC拘束性に提示することを検討中である。一方、遺伝子導入抗原提示細胞が生体内でも効率よく抗原提示をすることが可能であれば、持続的な抗腫瘍効果が期待できる。我々は遺伝子導入造血幹細胞に由来する抗原提示細胞が生体内でどのように分布し、遺伝子発現しているかを解析するため、EGFP遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した50個のマウス造血幹細胞を、同系マウスに骨髄移植した。各臓器での遺伝子導入細胞分布を検討したところ、移植後6ケ月を経過したマウス中でもEGFP陽性細胞は肺(7.6%)肝(3.1%)腸粘膜(1.9%)などに確認され、多くはMac-3抗原を持つ抗原提示細胞である組織マクロファージであった。
シクロオキシゲナーゼ2インヒビターによる口腔癌の化学予防に関する実験的研究

実験には6週齢F344ラット用い、4-NQOを30PPmの濃度で飲料水に混じて12週間投与し、その後、etodolacを150ppm、300ppmの濃度で16週間混餌投与した。発生した舌病変は、組織学的に上皮過形成、上皮異形成、乳頭腫、扁平上皮癌に分類した。その結果、扁平上皮癌の発生頻度は4-NQO単独群に比べ、etodolac投与群では有意に減少した。免疫組織化学的にCOX-2蛋白質は、上皮過形成と乳頭腫では基底細胞に陽性、上皮異形成および扁平上皮癌では基底細胞、異型細胞および癌細胞に陽性を示した。一方、RAGE蛋白質は、上皮過形成では顆粒細胞層に弱陽性、乳頭腫では弱から中等度陽性、上皮異形成および扁平上皮癌では異型細胞および癌細胞に陽性を示した。また、etodolacはCOX-2蛋白質の発現を減弱しなかったが、RAGE蛋白質の発現を減弱せしめた。そこで、RT-PCRを行いRAGEのmRNAの発現について分子生物学的に検討したところ、扁平上皮癌においてその発現が亢進していること、etodolac投与によりその発現が抑制されることが明らかとなった。以上より、4-NQOによるラット舌発癌過程において、COX-2とRAGE蛋白質が密接に関与すること、etodolacによる発癌抑制にRAGEのmRNA発現抑制が関与していることが示唆された。実験には6週齢F344ラット用い、4-NQOを30ppmの濃度で飲料水に混じて12週間投与し、その後、etodolacとnimesulideを150ppm、300ppmの濃度で16週間混餌投与した。その結果、扁平上皮癌の発生頻度は4-NQO単独群に比べ、etodolacおよびnimesulide投与群では有意に減少した。また、COX-2の選択的阻害剤はいずれもCOX-2蛋白質の発現を減弱しなかったが、RAGE蛋白質の発現を減弱せしめた。以上より、4-NQOによるラット舌発癌過程において、COX-2とRAGE蛋白質が密接に関与することが示唆された。実験には6週齢F344ラットを用い、4-NQOを30ppmの濃度で飲料水に混じて12週間投与し、その後、etodolacを150ppm、300ppmの濃度で16週間混餌投与した。

以上より、4-NQOによるラット舌発癌過程において、COX-2とRAGE蛋白質が密接に関与すること、etodolacよる発癌抑制にRAGEのmRNA発現抑制が関与していることが示唆された。
ニュートリノ質量とレプトンセクターにおけるCPの破れ

1、中性子星におけるニュートリノ交換多体ポテンシャルの有限性の証明ニュートリノ交換から生じる多体力は古くから知られ、R.FeynmanやJ.B.Hartleが重力の起源に関連して論じたが、最近、E.Fischbach(1996)が、この多体力は中性子星の自己エネルギーに矛盾を与え、これを回避するには、ニュートリノに数eVの質量が必要であると論じた。この議論に対して、K.Kiers等(1998)は数値計算により否定したが、数値計算は物理的意味が見え難いので、解析的な議論が望まれた。A.Abada(1998)等は、初めて3次元での解析的な議論を試みたが、その結論はCP不変性を破り数値的にも説得力に欠けた。我々は、CP不変性を正しく取り入れた定式化を行い、E.Fischbachの結論が誤りであり、中性子星の多体力の効果は有限で、ニュートリノ質量への制限はつかないことを初めて解析的に示した。(Prog.Theor.Phys.(Kyoto),Vol.100,1998,p1083。)2、ニュートリノ振動とCPの破れの解析的手法による分析ニュートリノ振動を数値計算によらず解析的計算で分析できる事がほぼ分かったので、これを用いて現在、太陽ニュートリ、大気ニュートリノ、原子炉ニュートリノ、加速器ニュートリノ、長基線ニュートリノ等を解析中である。