hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒスタミンＨ４受容体遮断薬の掻痒における作用点の解明と新たな治療戦略

アトピー性皮膚炎をはじめとする、痒み症状を伴う慢性皮膚疾患では、長期間にわたる外用ステロイド療法は必要不可欠となる。一方、申請者は、ステロイド外用剤を反復塗布すること自体が、痒みの原因となり得ることを報告してきた。ヒスタミンの4番目の受容体を阻害するH4受容体拮抗薬は、ステロイド外用薬の抗炎症作用を高め、且つ、ステロイドが引き起す痒みを改善することを本研究により明らかにした。H4受容体拮抗薬は、長期ステロイド外用療法をより安全に実施する上で有効な治療薬となり得ると考えられた。H4Rの急性掻痒、慢性掻痒および長期外用ステロイド剤の反復塗布に起因する掻痒症に対するH4Rアンタゴニスト(H4RA)の作用点の解明を目的とし、H25年度は以下の研究成果を得た。1.サブスタンスP (SP)誘発急性掻痒モデルに対するH4RAの抑制機序の解明を目指し、H4RA (JNJ7777120)の皮内投与の検討より、H4RAの作用点が皮膚局所にあることが示唆された。更に、ヒト不死化ケラチノサイト株HaCaT細胞を用いた検討から、SP掻痒に対するJNJ7777120の作用点はケラチノサイトのNO産生抑制以外にある可能性が考えられた。SP掻痒マウスの起痒部位におけるマイクロダイアリシス法を用いた検討により、SP掻痒においてNOの関与の可能性は低いと考えられた。2.ステロイド掻痒モデルの皮膚病変部におけるヒスタミン受容体mRNA発現量を検討し、正常マウスに比べ皮膚炎マウスの病変部位では他のヒスタミン受容体と異なりH4RmRNA発現が有意に亢進している知見を得た。更に、dexamethasone塗布によりH1RおよびH2R mRNAは有意に減少したが、H4R mRNAは減少しなかった。これより、dexamethasoneを長期塗布した皮膚においては、相対的にH4R数が増加している可能性が考えられた。そこで、掻痒増悪におけるケラチノサイト由来NO産生とH4Rの関与を明らかにすることを目的に、HaCaT細胞培養系を用い検討した。IFN-γ刺激したHaCaT細胞はdexamethasone添加によりNO産生の亢進を示した。この時、iNOS mRNAおよびH4R mRNA発現はいずれも亢進していた。更に、NO産生はJNJ7777120添加により有意に低下したことから、H4RがケラチノサイトのNO産生において、重要な役割を果たしている可能性が示唆された。本研究は、H4受容体の急性掻痒、慢性掻痒および長期外用ステロイド剤の反復塗布に起因する掻痒症に対するH4受容体アンタゴニストの作用を分子レベルで解析することにより、未だ解明されていないH4受容体の掻痒における作用点の解明を目的としている。研究計画に基づき、以下の点について研究成果を得た。1.サブスタンスP掻痒におけるLTB4の関与を明らかにするため、LTB4産生を特異的に阻害するLTA4 hydrolase inhibitorを用いて検討した。サブスタンスP処置によりマウス投与部位の皮膚内LTB4産生および掻破行動が亢進した。一方、LTA4 hydrolase inhibitorを事前に処置したマウスでは、サブスタンスPによるLTB4産生は抑制されたが、サブスタンスPが誘発した掻破行動に変化は見られなかった。以上の結果から、本サブスタンスP掻痒モデルにおけるLTB4の関与は小さい可能性が考えられた。さらに、マスト細胞欠損マウスと野生型マウスを用い、サブスタンスP処置による起痒部位の皮膚内LTB4産生量および掻破行動を検討した。サブスタンスPはマスト細胞欠損マウスにおいて掻痒反応を惹起したが、LTB4産生量には影響しなかった。これより、LTB4の産生細胞としてマスト細胞が考えられること、またサブスタンスP掻痒においてはLTB4以外の因子の関与が大きい事が考えられた。2.ステロイド長期塗布誘発掻痒モデルにおけるH4受容体の関与を検討するに先立ち、掻痒への関与が考えられるマスト細胞由来掻痒抑制因子であるPGD2産生について検討した。その結果、ステロイド塗布が誘発する掻痒は、マスト細胞由来PGD2産生の抑制に起因する可能性が考えられた。長期外用ステロイド剤の反復塗布に起因する掻痒症に対し、H4受容体拮抗薬を用いた新たな治療戦略の提案を目的とし、H26年度は以下の研究成果を得た。ステロイド外用薬はアトピー性皮膚炎をはじめとする慢性掻痒性皮膚疾患の第一選択薬として頻用されるが、長期塗布に伴い適用部位に副作用として様々な毒性をもたらす。我々はこれまで、実験的慢性皮膚炎マウスに対しmediumクラスのステロイド剤であるデキサメタゾン(DEX)が、長期塗布により掻痒症状を増悪させることを報告してきた。H26年度の検討では、マウスDEX長期塗布誘発掻痒モデルに対するH4受容体拮抗薬の有用性を掻痒誘発予防の観点から検討した。

BALB/c系雌性マウスの両耳介に2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene (TNCB)を週3回反復塗布し慢性皮膚炎を誘発した。TNCB塗布開始2週間後より7週間、DEXを両耳介へ連日塗布すると共に、H4受容体拮抗薬(JNJ28307474)あるいはH1受容体拮抗薬(Fexofenadine)をそれぞれ20 mg/kgおよび30 mg/kgの用量で1日2回連日経口投与した。掻痒は掻破回数を、皮膚炎症状は耳介腫脹を指標に評価した。また、耳介組織中の掻痒および炎症関連因子mRNA発現量を測定した。DEXは皮膚炎マウスの耳介腫脹を顕著に抑制したが、皮膚炎に伴い亢進した掻破回数の上昇は抑制せず、さらに増悪させた。JNJ28307474はDEXが誘発した掻破回数の増悪を強く抑制し、DEXによる耳介腫脹抑制作用を更に亢進した。一方、Fexofenadineは掻破回数、耳介腫脹いずれにおいても明らかな作用を示さなかった。以上の結果より、H4受容体拮抗薬は長期外用ステロイド療法に伴う掻痒の増悪を予防し、抗炎症作用を増強する有効な治療薬となり得ると考えられた。薬理学1.SP誘発急性掻痒モデルに対するH4RAの抑制機序の解明を目指し、本年度はJNJ7777120をSPと共に皮内投与し、掻破回数が有意に減少する事を明らかにした。これよりJNJ7777120の作用点が皮膚にあることが示唆された。SPの掻痒惹起機序の一つとしてケラチノサイトのNO産生亢進が報告されている為、ヒト不死化ケラチノサイト株HaCaT細胞のSP刺激に対するNO産生について検討した。その結果、SP刺激でHaCaT細胞のNO産生は誘導されないことから、SP掻痒におけるNOの関与は小さく、JNJ7777120の作用点はNO産生抑制以外にある可能性が考えられた。更に、SP刺激に伴うNO産生をin vivo系で検討すべく、マイクロダイアリシス法により、SP皮内処置後のNO産生量を測定したところ、処置前後でNO産生量に変化が見られず、SP掻痒におけるNO関与の可能性は低いと考えられた。2.ステロイド誘発掻痒における検討を実施し、正常マウスに比べ皮膚炎マウスの病変部位ではH4R mRNA発現が有意に亢進してる事を見出した。更に、dexamethasone塗布によりH1RおよびH2R mRNAが有意に減少したのに対し、H4R mRNAは減少しなかったことから、dexamethasoneを長期塗布した皮膚においては、相対的にH4R数が亢進している可能性が示唆された。そこで掻痒増悪におけるケラチノサイト由来NO産生とH4Rの役割を明らかにする為、HaCaT細胞を用い詳細を検討した。IFN-γ刺激したHaCaT細胞はdexamethasone添加によりNO産生の亢進を示し、同時にiNOS mRNAおよびH4R mRNA発現いずれも亢進していた。一方、JNJ7777120はNO産生を有意に抑制したことから、ケラチノサイトのNO産生においてH4Rが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。1.サブスタンスP急性掻痒における皮膚内LTB4産生の関与について、LTB4産生を特異的に阻害するLTA4hydrolase inhibitorのJNJ26993135を用いて検討した。
希土類元素含有セラミックスによるフレキシブルナノ発光素子の創製

フレキシブルプラスチック基板上へナノパターン化したアップコンバージョン発光層を作製するために、毛細管マイクロモールド法を用いてフレキシブルプラスチック基板上へポリカチオン修飾型フッ化イットリウムナノ粒子で形成させたアップコンバージョン発光層を作製した。シリコーンモールドのパターンサイズとナノ粒子分散液の濃度を調節することでアップコンバージョン発光層の幅を最小50 nmへ低減することに成功した。本研究の手法は、フレキシブルフォトニクス分野の非投影方式のアップコンバージョン透明ディスプレイを作製する基幹技術として発展することが期待できる。フレキシブルプラスチック基板上に最小50nmのライン幅を有するポリカチオン修飾型希土類元素含有ナノ粒子によるアップコンバージョン発光層のパターンを作製することができた。初年度と同様にシリコーンモールドを用いた毛細管マイクロモールド法を利用してフレキシブルプラスチック基板上へナノサイズに微細化したアップコンバージョン発光層を作製することを検討していた。当初用いた酸化イットリアナノ粒子は水中での分散安定性が乏しいために、シリコーンモールド中へ分散液を注入後に毛細管の入り口付近で沈降するために、5μmより直径が小さい毛細管内へアップコンバージョン発光層を作製することが難しかった。そこで水中で分散安定性の良いポリカチオン修飾型NaYF4ナノ粒子を新たに合成し、毛細管マイクロモールド法を用いてフレキシブルプラスチック基板上へアップコンバージョン発光層のパターンを作製することを試みた。シリコーンモールドの毛細管サイズとポリカチオン修飾型NaYF4ナノ粒子分散液の濃度を調節することでアップコンバージョン発光層の幅を最小50nmから5000nmまで制御することができた。ポリカチオン修飾型NaYF4ナノ粒子膜の粒子密度も制御できた。フレキシブルプラスチック基板上へアップコンバージョン発光層を作製する本手法は、フレキシブルフォトニクス分野の非投影方式のアップコンバージョン透明ディスプレイを作製する基幹技術として発展することが期待できる。これまでに作製することが困難であった希土類元素含有(RE)セラミックスを用いたフレキシブルナノ発光素子の創製を行うことが本研究の目的である。REナノ粒子を用いた「焼成が必要ない(CF)ソフトリソグラフィー法」を確立することで、低コストでナノ発光素子を作製することが可能となる。発光強度の経時劣化が少ないREセラミックスを用いることで、従来の有機発光素子に比べて長寿命かつ水溶液中でバイオイメージングも行うことができるフレキシブルナノ発光素子を作製することが期待できる。具体的な研究計画は次の通りである。(1)粒子径の異なるREナノ粒子を合成し、(2)二種類のCFソフトリソグラフィー法を検討する。(3)近接場光学顕微鏡を用いて、ナノ領域におけるアップコンバージョン発光を評価する。(1)REナノ粒子の合成に関する実績:従来の均一沈殿法で粒子径100 nmのREナノ粒子の合成を行った。アップコンバージョン発光と近赤外の蛍光発光が観察できたことから、このREナノ粒子は蛍光ナノ粒子として機能することがわかった。今回新しく酵素沈殿法で粒子径40 nmのREナノ粒子の合成に成功した。このREナノ粒子も上記と同様に蛍光微粒子として機能した。この2種類のREナノ粒子は水とメタノール各々の分散液を作製することができ、溶液法でREナノ粒子膜の製膜が可能であることがわかった。(2)2種類のソフトリソグラフィー法に関する実績:ソフトリソグラフィー法の中の1つである毛細管リソグラフィー法を用いて、REナノ粒子膜をプラスチック基板上へ作製することができた。用いたゴム状スタンプモールドのパターンサイズとREナノ粒子分散液の濃度を変えることで、REナノ粒子膜のパターンサイズやREナノ粒子膜中のナノ粒子密度を制御することができた。CFソフトリソグラフィー法を用いて、ナノサイズのRE-発光薄膜をプラスチック基板上へ作製する方法を確立して、従来の有機発光素子よりも長寿命なフレキシブル発光素子を創製する。具体的には下記の4点に焦点を絞って研究を推進する計画であった。(1)従来のRE-ナノ粒子径(300ナノメートル)より小さいRE-ナノ粒子(最小40ナノメートル)を合成する。(2) RE-ナノ粒子膜のパターンサイズを従来の20マイクロメートルから最小100ナノメートルにする。(3) RE-分散溶液とモールドのみでパターニングが可能な2種類の手法を検討する。(4)近接場光学顕微鏡を用いて、アップコンバージョン発光のナノ観察を行う。研究実績の概要で示した通り、(1)のREナノ粒子の合成は計画通り進行している。

(2)と(3)のREナノ粒子膜のパターンサイズに関して、毛細管リソグラフィー法を用いて従来の20マイクロメートルから5マイクロメートルまでサイズダウンをすることができた。さらに、REナノ粒子膜中のナノ粒子密度を制御することに成功した。(4)のREナノ粒子膜のアップコンバージョン発光に関して、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスケールのアップコンバージョン発光観察と近赤外光の蛍光観察をすることで、REナノ粒子膜がプラスチック基板上で発光膜として機能することを明らかにできた。以上の結果から、当初の研究計画に沿って研究が進行している。今後は、REナノ粒子膜のパターンサイズを前年度の5マイクロメートルから当初の目標である100ナノメートルへサイズダウンをすることを目標とする。ナノサイズのREナノ粒子膜を作製できる実験条件を確立したのちに、近接場光学顕微鏡を用いてREナノ粒子膜のアップコンバージョン発光と近赤外光の蛍光発光のナノ観察を進める予定である。パターン化したREナノ粒子膜の観察に必要な光学顕微鏡(オリンパス製・約100万円)を購入予定である。前年度の研究成果を国内・国外の会議で報告するための旅費で約30万円を使用予定である。残りの予算は消耗品の購入や論文投稿費に使う予定である。
ゲノムの安定な維持に関わる制御機構

出芽酵母二倍体細胞におけるヘテロなマーカー遺伝子の喪失(LOH)を指標に、有糸分裂中に生じる多様なゲノム変化(染色体喪失、交叉・転座・欠失等の染色体再編、点突然変異)を分子レベルで解析する系を用いて、内因性のDNA傷害を解消してゲノムを安定に維持する機構について研究を行っている。これ迄に、ゲノムの安定な維持には相同組換えや複製後修復を中心とした修復機構が関与すること、また、この相同組換えによる修復は複数のステップでゲノムの変化を抑える様に制御されることを明らかにした。本研究では制御の中でも、特に相同組換えと複製後修復を使い分ける機構を理解することを目標に、SRS2遺伝子を中心に解析した。相同組換えと複製後修復の使い分けや、その他の作用点・機能について検討するために、srs2単独欠損、及び、複製後修復遺伝子(RAD18)や相同組換え遺伝子(RAD51・RAD52)との二重欠損によって誘発されるゲノム変化を上記の実験系を用いて包括的に解析した。srs2rad18二重欠損株では各単独欠損の場合に比べて染色体再編が相乗的に上昇したことから、SRS2は相同組換えを抑制しているが、その作用は複製後修復と相同組換えとの間の相互作用とは独立していることが示唆された。さらに、srs2欠損下では、染色体再編の種類の分布に変化が生じて相対的に遺伝子変換が低下することや、相同組換えによって引き起こされる染色体喪失が誘発されること等、SRS2が相同組換え自体にも関わっていることが示された。rad51欠損にsrs2欠損を加えても、ゲノム変化のパターンはrad51単独欠損の場合と同様であったことから、SRS2はRAD51と同じ経路で作用していると考えられたが、一方、rad52欠損との二重欠損株では染色体喪失が相乗的に増加したことより、rad52欠損下で顕在化する様な新たなSRS2の作用が示唆された。申請者は、有糸分裂中の出芽酵母二倍体細胞におけるヘテロなマーカー遺伝子の喪失(LOH)を指標に、多様なゲノム変化(染色体喪失、交叉・転座・欠失などの染色体再編、点突然変異)を分子レベルで解析する系を用いて、内因性のDNA損傷やDNA複製障害を解消してゲノムを安定に維持する機構について解析を進めている。これ迄に、染色体の安定な維持には相同組換えや複製後修復を中心としたゲノム維持機構が関与していること、また、この相同組換えによる機構は複数のステップでゲノムの変化を抑える様に制御されていることを明らかにしてきた。本研究の目標は、これらの制御機構の分子メカニズムを理解することである。本年度はこれらの中でも特に相同組換え機構と複製後修復機構を使い分ける機構に焦点を絞り、SRS2遺伝子の作用を中心に解析を行った。相同組換えと複製後修復の使い分けにおけるSRS2の関与や、その作用点・機能について検証するために、srs2単独欠損、及び、SRS2と複製後修復遺伝子(RAD18)や相同組換え遺伝子(RAD51・RAD52)との二重欠損によって誘発されるゲノム変化を上記の実験系を用いて包括的に解析した。srs2rad18二重欠損株ではそれぞれの単独欠損の場合に比べて染色体再編が相乗的に上昇したことから、SRS2は相同組換えを抑制しているが、その作用は複製後修復と相同組換えとの間の相互作用とは独立していることが示唆された。

さらに、srs2欠損下では、染色体再編の種類の分布に変化が生じて相対的に遺伝子変換が低下することや、相同組換えによって引き起こされる染色体喪失が誘発されること等、SRS2が相同組換え自体にも関わっていることが示された。また、rad51欠損にsrs2欠損を加えても、ゲノム変化のパターンはrad51単独欠損の場合と同様であったことから、SRS2は基本的にRAD51と同じ経路で作用していることが分かった。以上の結果より、SRS2はRAD51が作用している複数の過程で拮抗的に働いて相同組換えを制御しているとの仮説を立て、検証を進めている。出芽酵母二倍体細胞におけるヘテロなマーカー遺伝子の喪失(LOH)を指標に、有糸分裂中に生じる多様なゲノム変化(染色体喪失、交叉・転座・欠失等の染色体再編、点突然変異)を分子レベルで解析する系を用いて、内因性のDNA傷害を解消してゲノムを安定に維持する機構について研究を行っている。これ迄に、ゲノムの安定な維持には相同組換えや複製後修復を中心とした修復機構が関与すること、また、この相同組換えによる修復は複数のステップでゲノムの変化を抑える様に制御されることを明らかにしてきた。本研究では制御の中でも、特に相同組換えと複製後修復を使い分ける機構を理解することを目標に、SRS2遺伝子の作用について解析を行ってきた。昨年度のsrs2単独欠損株におけるゲノム変化の解析よりSRS2は相同組換え自体にも関与することが示唆されていたが、本年度はこの点に関して相同組換え遺伝子(RAD51・RAD52)との関係について解析を進めた。rad51欠損にsrs2欠損を加えても、ゲノム変化のパターンはrad51単独欠損の場合と同様であったことから、SRS2はRAD51と同じ経路で作用していると考えられたが、一方、rad52欠損との二重欠損株では染色体喪失が相乗的に増加したことより、rad52欠損下で顕在化する様な新たなSRS2の作用が示唆された。この株については、(1)rad51欠損を加えて三重欠損にしてもゲノム変化に効果は認められないこと、(2)rad18欠損を加えで複製後修復を不活化した場合にはさらに染色体喪失が増加すること、(3)rad52単独欠損の場合と同様のFACSパターンを示すことが分かった。以上の結果より、rad52欠損下で顕在化するSRS2の作用は、複製後修復やチェックポイントに関わるものではなく、相同組換えにおけるRAD51・RAD52とは独立した働きであると考えられる。
小分子化合物を用いた再生歯胚構築の為の細胞分化誘導法の開発

歯の再生は、歯科領域においては極めて重要な研究課題である。我々はiPS細胞等を用いて、歯の再生の中でも一番困難と考えられていたエナメル芽細胞の人為的な分化誘導に成功した。しかしながら、これらの手法は細胞や様々な蛋白分子を用いた手法であり、臨床に応用する為には異種由来成分不含環境での培養、分化誘導技術の開発が必要である。そこで本研究では、エナメル芽細胞の分化に必須の分子である神経成長因子NT-4と同様の作用を示す小分子化合物を用い、エナメル芽細胞分化の為の新たな培養条件の探索や、再生歯胚構築の為の基礎知見を創出すること目的とする。歯の発生に重要な分子であるNT-4の生物作用を模倣する小分子化合物LM22A-4と、TrkB受容体シグナルの阻害剤の歯原性上皮細胞に対する作用を検討した。歯原性上皮細胞株に、LM22A-4を刺激し、遺伝子発現変化を指標とし、エナメル芽細胞分化誘導能を検討した結果、エナメル芽細胞分化マーカー遺伝子の発現亢進を確認した。次に、生体に近い条件でのエナメル芽細胞分化能を評価する為、マウス胎仔の歯胚を用いた器官培養系を利用した。同小分子化合物を器官培養液に添加すると、歯胚においてもエナメル芽細胞分化マーカー遺伝子の発現が亢進した。以上の結果より、我々が用いた小分子化合物は歯原性細胞に対してエナメル芽細胞分化誘導能を有することが明らかとなった。さらに小分子化合物がエナメル芽細胞分化を誘導する分子機構を解明する為、シグナル活性化の探索を行ったところ、ERK1/2の活性化を引き起こした。今後、本小分子化合物の詳細な分子機構を解明し、歯の再生の基盤研究として発展させていきたい。唾液腺などの腺組織、毛根や腎臓など上皮ー間葉相互作用で発生が展開される臓器の再生研究に対しても、波及的に有益な情報を発信することが可能になると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。
高分子製膜乾燥過程の解析

高分子溶液を流延し熱風により加熱乾燥しフイルムに成型する工程の解析はこれまで行われてなく、従来、経験的にのみ装置の設計や操作条件の設定がなされてきた。本研究ではこの工程につき工業装置での長さ方向の乾燥条件の変化を時間変化に置き換え、同等の乾燥履歴を与えるBatch式のフイルム乾燥実験装置を製作し、工業装置の乾燥条件を再現し、フイルムの乾燥挙動を実験的に検討すると共にフイルムの吸脱着実験から得られる濃度依存相互拡散係数を用い、フイルム乾燥工程をシミュレ-トする計算プログラムを作成し、次の二つの系につき検討した。1、ポリ塩化ビニ-ルーテトラヒドロフラン系Batch式実験装置による乾燥挙動を熱風温度一定の場合及び工業装置で考えられる熱風温度の相当時間分布を与えた場合の両者につき測定した。また、フイルム吸脱着実験より得られた活量ー濃度の平衡関係及び相互拡散係数の温度および濃度についての実験式をシミュレ-ションプログラムに適用し計算した。両者の結果はほぼ一致した。熱風温度が高い場合の発泡現象についてはなお検討中である。2、ポリイミドージメチルアセトアミド系ポリイミドポリマ-としてカブトン及びユ-ピレックスSにつき、乾燥過程でのイミド化反応を促進する触媒を入れた場合と入れない場合(熱イミド化のみ)の乾燥速度への影響を検討した。触媒の有無による差は明確に出なかったが、同一溶媒を用いた場合のポリマ-の差は明確に現れ、カブトンの方が速い乾燥速度を示した。また、熱機械試験機によるヤング率の測定結果は触媒の有無で明確な差は見られず、カブトンの方が低い値を示した。その他、ナイロンペレットの乾燥挙動、及び、拡散係数の濃度依存性がべき乗型の関数で表される場合の簡便な算出法を得た。(1).Batch式フイルム乾燥実験装置の製作:高分子フイルム乾燥実験装置を製作した。熱風発生機より熱風を乾燥測定室に送り試料皿に入れた高分子溶液を平行流あるいはimpinging流により乾燥する。試料皿は電子天秤に直結され、フイルムの乾燥に伴う重量変化を精密に測定できる。熱風は温度制御系により常温300°Cの間でプログラムコントロ-ルされ製造装置内のフイルム移動方向の乾燥温度の変化をシミュレ-トできる。熱風風速は110m/sの間で変えられる。乾燥時のフイルムの温度変化は極細の熱電対を試料皿に取付けることにより熱風温度の時間変化と共に記録される。乾燥時のフイルムの表面状態や発泡の有無を外部より詳細に観察できる。(2).フイルム乾燥実験:ポリイミドジメチルアセトアマイド系溶液により(1)の装置で乾燥実験を行い、熱風温度100°Cおよび120°Cでフイルムの溶媒含有率および温度の時間変化を測定し乾燥速度が精密に算出できることを確認した。乾燥過程後半のレギュラ-レジ-ムにつき乾燥速度より相互拡散係数を濃度と温度の関数として算出した。この系の拡散係数は溶媒含有率のべき乘の形で変化する。ポリ塩化ビニ-ルテトラヒドロフラン系についても乾燥実験を行った。この系で熱風温度を溶媒の沸点より高い80°Cにするとフイルム表面に直径1数cmの気泡を発生し実際の製造装置で問題となっている発泡現象が確認された。今後、フイルム乾燥シミュレ-ションプログラムによる解析と並行しフイルム乾燥過程での発泡現象と乾燥條件の関係を検討する。(3).活量と拡散係数の測定:現有フイルム吸脱着実験装置によりPVA水系他につき活量と拡散係数の測定を行い実験式を得た。(4).フイルム乾燥シミュレ

-ションプラグラム:実際のフイルム乾燥装置の解析を可能とするプログラムを発泡現象を含み完成した。高分子の溶液を流延し熱風により加熱乾燥しフィルムに成型する工程は電子絶緑材料、写真フィルム、各種包製材料の製造に広く用いられるがこの工程の解析はこれまで行われておらず経験的にのみ装置の設計や操作条件の設定がなされて来た。本研究ではフィルム乾燥成型過程につき工業装置での長さ方向の乾燥条件の変化を時間変化に置き換え同厚の乾燥履歴を与えるBaich式のフィルム乾燥実験装置を製作し工業装置の乾燥条件を再現してフィルムの乾燥挙動を実験的に検討すると共にフィルムの吸脱着実験から得られる濃度依存相互拡散係数を開いてフィルム乾燥過程をシミュレ-トする計算プログラムを作成し次下の検討を行った。1.ポリ塩化ビニ-ルテトラヒドロフラン系フィルム。フィルムの吸脱着実験より平衛デ-タとして活量フィルム内溶媒濃度の関係を測定すると共に吸脱着速度より相互拡散係数を広い温度、濃度範囲につき求め実験式の形に表しシミュレ-ションプログラムを完成した。Batcli式フィルム乾燥実験による乾燥挙動は熱風濃度一定の場合および工業装置で考えられる熱風温度分布をプログラム制御による熱風温度の時間変化で与えた場合の両者につきシミュレ-ション計算と良く対応する結果を得てこの系ではほヾ初期の目的を達成した。2.ポリイミドジメチルアセトアミド系フィルム.この系ではフィルム乾燥過程でイミド化反応が起りこの乾燥挙動への影響が興味深い。ポリイミドとしてカプトンおよびユ-ピレックスSの両者につきイミド化反応促進触媒を加えた場合と加えない場合の両者につきBatch式乾燥装置で比較検討した。カプトンの乾燥速度は同じ溶媒を用いたにも拘らずユ-ピレックスよりもはるかに大で触媒の有無よりポリマ-分子構造の影響大なることが確認された。その他トリアセテ-ト系,フィルム品質と乾燥条件の関係など検討中。
構造分離政策が市場に与える影響の計量分析

本年度は、引き続き文献サーベイを行うとともに、構造分離政策が市場に与える影響に関連する分析として、EU加盟各国の鉄道事業を中心とした構造分離政策の決定要因について、OECDによって取りまとめられているETCRデータを用いたパイロットテストに取り組む計画であった。このような計画に従い、本研究では構造改革や規制政策と鉄道需要との相互連関について同時方程式モデルを構築し、1990年から2013年の24年間にわたるOECD加盟30カ国のデータを用いたモデル推定を行っている。推定結果より、旅客および貨物輸送市場における鉄道シェアと構造改革や規制政策との相互連関として、(1)鉄道シェアについて、旅客輸送では構造改革や規制緩和がプラスの影響を与えているが、貨物輸送ではマイナスの影響を与えていること、(2)国の債務は公的所有および上下一体にマイナスの影響を与えているが、参入規制および市場構造には影響が見られないこと、(3)旅客輸送および貨物輸送ともに、「全体としての規制の程度(overall regulation)」、参入規制、市場構造は鉄道シェアにマイナスの影響を与えていること、(4)1人あたりGDPの増加は、鉄道シェアに対して最も大きなマイナスの影響を与えていること、(5)国の人口が鉄道シェアに与える影響はマイナスまたはゼロであり、都市部の人口が鉄道シェアに与える影響は市場構造モデルにおいてのみプラスの影響を与えている、といった5点が明らかとなった。平成31年度は、引き続き論文掲載のための取り組みを進めるとともに、最終的な計量モデルの推定に向けたデータ収集・整理およびモデル構築に取り組む予定である。本年度は構造分離政策に関する先行研究の整理を行う計画であった。交通・公益事業を対象とした実証分析を行なっている先行研究のうち、電力産業を中心に文献サーベイを行なった結果、今回調査した範囲において、構造分離が市場に与える要因を分析する際、被説明変数として取り扱われているのは、主として価格、パフォーマンス、GDP成長であることが明らかとなった。これらの文献サーベイの結果を含めた電力産業の構造分離に関する計量分析を研究分担者および研究協力者とともに論文として取りまとめた。また、当該研究課題において主要な分析対象である鉄道事業の構造分離政策に関するデータの収集・整理を行なった。各産業の構造分離政策については、OECDによって取りまとめられたETCR(Indicators of regulation in energy, transport and communications)データがあげられるが、構造分離のみならず、その他の経済的規制も含めた規制政策について、鉄道および関連する運輸産業である航空およびバス・トラック輸送についてもあわせてデータの収集・整理を行なっている。さらに、鉄道に関するデータとして、これまでに我々が行なった分析においても用いてきたUICによる統計データについて、データのアップデートおよび補完を行なうとともに、新たなデータとしてOECD StatisticsやEurostatのデータを追加し、H30年度に実施する計画であるパイロットテストのための準備を行なっている。平成29年度の研究実施計画では構造分離政策に関する文献サーベイを行う予定であったため、その計画の通りに作業を進めている。平成30年度は、引き続き文献サーベイを行うとともに、構造分離政策が市場に与える影響に関連する分析として、EU加盟各国の鉄道事業を中心とした構造分離政策の決定要因について、OECDによって取りまとめられているETCRデータを用いたパイロットテスト行う予定である。購入予定としていたUIC Statistics(各年度約8万円)について、UICの事情により2012年度版以降のものが発売されていないため。今後、発売されるごとに適宜購入する計画である。
心筋症の病因・病態に関する分子生物学的研究

心肥大形成前期の心筋症ハムスター(Bio14.6)を用い、交感神経刺激や運動負荷の影響を、心筋における癌遺伝子(c-fos)の発現を指標として検討した。ノルエピネフリン(NE)による心筋_α受容体刺激により培養心筋細胞およびin vivoにおいて心臓のc-fos発現誘導を認めた。NE投与30分後のc-fos mRNAの発現はBio14.6で増強していた。この結果は、Bio14.6ではα_1受容体を介する核内へのシグナル伝達系が活性化されていることを示唆している。正常ハムスターとBio14.6の心筋α_1受容体mRNA発現量は両者間で明らかな差は認められなかった。Bio14.6ではα_1受容体と共役するG蛋白の増加を認めたという報告があり、この成績は今回の結果と矛盾しない。すなわち、Bio14.6では心筋α_1受容体刺激によるシグナルが、おそらくはG蛋白を介して過剰に伝達され、核内immediate early response geneであるc-fosの発現が促進し、心筋症の病態が悪化すると考えられ、血中NE濃度の上昇は環境因子としての心筋症増悪要因の一つであろう。少量のNE前投与により運動負荷の影響を調べたところ、正常ハムスターではc-fosの発現誘導はみられなかったが、Bio14.6では明らかな発現がみられ、心筋症の病態進展が助長されるものと考えられる。本邦の家族性肥大型心筋症(HCM)家系においても、白人HCM家系で認められた14番染色体上心筋β-MHC遺伝子変異(606Val→Metのミスセンス変異)が存在することが明らかとなった。この変異はアミノ酸の電荷変化を伴わず、予後がよいと報告されているもので、本症例の家系内にも突然死の症例はなく、明らかな病的所見を示す家族構成員もいなかった。本邦においても同一の変異が発見され、人種を超えた変異の存在のみでなく、臨床像の相似性も確認された。また、今回新たに発見された第3エクソンの第10コドンGGGの欠失はグリシンの欠失で、1個のアミノ酸欠失は白人のHCM家系でも報告はなく、本邦において初めて発見された変異である。β-MHCの遺伝子解析はHCM患者の発症前診断を可能にするが、現時点では心肥大を予防しうる有効な治療法は確立されておらず、疾患の発症予防に繋がる研究が急務である。正常および心筋症ハムスタ-(Biol4.6)にノルエピネフリン(NE)を投与し、in vivo心筋における核内癌遺伝子cーfos mRNAの発現レベルの推移を比較検討した。その結果、Biol4.6心筋において、早期からcーfos発現の一過性増強を認めた。このcーfos発現はα_1遮断薬で90%、β遮断薬で30%抑制された。また、cーfos発現を増強しない少量のNEを投与しトレッドミル運動負荷を行ったところ、Biol4.6心筋においてのみcーfos発現を認めた。

このようにBiol4.6心筋ではα_1受容体情報伝達系の活性化が示唆された。しかし、Biol4.6心筋α_1受容体のmRNAレベルは、正常ハムスタ-と差異はなく、有意な増加は認められなかった。ヒト肥大型心筋症と類似の病像を呈する心筋症ハムスタ-における以上の実験結果は、肥大型心筋症の病因・病態を解明する上で、また臨床的に心筋症患者に対する薬物治療および運動量の決定に際し参考とすべき知見である。一方、肥大型心筋症の多発家系における異常心筋ミオシン重鎖遺伝子の検索については、16の多発家系を含む約40名の肥大型心筋症患者の末梢血リンパ球からDNAを調整し、収集保存した。このうち、家族歴の濃厚な患者を中心に既報のプロ-ブと同一のものを用い解析を行ったが、これまでのところβ型ミオシン重鎖遺伝子エクソン13内の点突然変異は認められていない。現在、プロモ-タ-領域を含むミオシン重鎖遺伝子内の他の部位の変異につき検索中である。本邦における家族集積性を示す肥大型心筋症(家族性肥大型心筋症:FHC)患者を中心に、心筋ミオシン重鎖遺伝子の構造を解析した。サザンブロット法による検討では異常は検出されず、大きな欠失や融合遺伝子のような構造変化は認められなかった。次に、44名のHC患者(含22家系29名)を対象に、既にFHCにおいて原因遺伝子として報告されているいくつかのβ型ミオシン重鎖遺伝子異常「β型ミオシン重鎖遺伝子の点変異」を標的として解析したが、既報の異常は検出されなかった。Seidmanらは25のFHC家系を調べ、約半数の12家系のHC患者に14番染色体上のβ型ミオシン重鎖遺伝子の異常を確認し、点変異としては5つのエクソンにおける合計7種類を報告して、アミノ酸置換による電荷の変化と生命予後との関連性を示唆した。これらの変異のうちには異なる家系で同一のものも確認されており、変異部位はミオシン重鎖遺伝子の頭部、および頭部と尾部の接合部に集中してはいるが、必ずしも全て同一のアミノ酸置換ではない。一方、イタリアのFHC家系では16番、北米の家系では2番の染色体上に原因遺伝子の存在する可能性が報告されている。本邦におけるFHCでは心尖部肥大型の頻度が高く、日本人と白人とでは異なるFHCの祖先に由来していて、原因遺伝子を既報の点変異およびエクソン以外に、さらにはミオシン重鎖遺伝子以外に求めるべきかも知れない。最近、点変異を効率よく検出するために、PCR法により増幅した各エクソンを用い、SSCP(一本鎖DNA構造多型)法、およびミスマッチハイブリッドDNAの電気泳動における易動度が異なる現象を応用し、増幅したDNA断片中の点変異の有無の検出を試みている。さらにこれらの方法を用い、β型ミオシン重鎖遺伝子の点変異が報告されている以外の他のエクソンについても解析を開始した。一方、日本人FHC家系における連鎖解析により、その原因遺伝子が第18番染色体のプレアルブミン遺伝子と連鎖していることが示唆されている。本症では複数の遺伝子異常による病因が混在している可能性も考えられるため、これまでに収集した患者のDNAについてもプレアルブミンをプローブとして連鎖解析を行う予定である。本邦の家族性肥大型心筋症(HCM)家系においても、白人家系で報告されているのと同じ心筋β-MHC遺伝子変異が存在するとの前提のもとにその有無の検索を行い、さらに新たな遺伝子異常の検出を試みた。その結果、本邦のHCM患者においても、白人HCM家系で認められた14番染色体上の心筋β-MHC遺伝子の変異が存在することが明らかとなった。
ポストゲノム時代の家畜生産現場における遺伝子情報の活用に関する研究

近年のヒトゲノムプロジェクトに代表されるゲノミックスの飛躍的な進歩と発展に伴い、一すべての哺乳類のDNAシークエンスの類似性が明らかになり、ヒトやマウスで開発された先端技術が家畜にも応用され、その結果、家畜に関する遺伝性疾患遺伝子や経済形質に関与する遺伝子(QTL)の位置と効果が解明されつつある。本年度は以下の3つの研究を行った。その第1は、ゲノムワイドでの高密度なマーカーを用いて家畜の遺伝的能力を評価する方法の有用性をマウスのデータを用いて検討した。マウスの体長と総コレステロールの2形質を対象に、QTL解析データを基にして有意なSNPを10個選び、それらの相加的効果および優性効果を推定し、その効果を基にしてマーカースコアを作成した。その結果、表現型のみの情報を用いたときの体長と総コレステロールに関する遺伝分散は、表現型とマーカースコアの情報を両方取り込んだときの遺伝分散はそれぞれ0.020、0.042であり、表現型のみの情報を用いたときの半分程度であることを示した。現在、同様の方法を黒毛和種集団に適用すべく、枝肉重量に関与すると考えられる遺伝子マーカーを5個選び、タイピングを行っている。第2は、ゲノム育種価に加え、親の予測育種価、後代の表現型情報が利用できる場合を想定し、ゲノミック評価における育種価の正確度を検討した。その結果、ゲノム育種価の正確度が低いときは、ゲノム育種価、親の予測育種価に加え、後代の表現型情報を取り入れることで、さらなる育種価の正確度の上昇が見込まれることが示唆された。第3は、サンプル個体群のSNPマーカーにおけるヘテロ接合度過剰から集団の有効な大きさを区間推定する方法を開発した。コンピュータ・シミュレーションの結果は、開発した方法はNeについてわずかに幅の広い信頼区間1を与えるが、実用上きわめて有効性が高いことを示唆するものであった。近年のヒトゲノムプロジェクトに代表されるゲノミックスの飛躍的な進歩と発展に伴い、すべての哺乳類のDNAシークエンスの類似性が明らかになり、ヒトやマウスで開発された先端技術が家畜にも応用され、その結果、家畜に関する遺伝性疾患遺伝子や経済形質に関与する遺伝子(QTL)の位置と効果が解明されつつある。このような遺伝子の位置、機能さらにその効果の大きさに関する情報を整理し、個別の遺伝子情報の育種現場や生産現場での活用を図ることは極めて重要な研究課題と言える。本年度は、3つの理論研究に着手した。その第一は、種畜の遺伝子の後代への拡散を計算し、その種畜の価値を評価することができる従来のGene Flow法を改良することにより、集団内での遺伝子型別の発現量を計算できるようにした。さらに、本方法を利用して、牛の脂肪交雑に関与する2対立の劣性遺伝子を想定し、劣性ホモ型の種雄牛、ヘテロ型の種雄牛を用いた場合、それぞれの種雄牛によってもたらされる利益の検討を行った。第二は、分子マーカーにおけるアリル共有度からの集団の有効な大きさの推定個体間の分子共祖係数から集団の有効な大きさを推定する方法を開発した。コンピュータシミュレーションにより、開発した方法は下方向に偏った推定値を与えるが、信頼区間は既存の方法よりもはるかに小さく抑えることが明らかになった。第三は、効果の大きなQTL(メジャージーン)を含む多数の遺伝子座によって影響を受けている形質が、長期間にわたり選抜を受けた場合の遺伝子頻度の変化について、すべてのQTLは相加的であると仮定した無限集団有限遺伝子座モデルを用いて検討した。その結果、長期間選抜を受けている形質では、メジャージーンの多くは固定されている可能性が高いと考えられた。第1の研究では、病気の遺伝子の遺伝様式および集団での遺伝子頻度を考慮して、病気の遺伝子を持つ個体を選抜することによって生じる経済的な損失を推定する方法論を確立した。さらに、この方法論をクローディン16欠損症、バンド3欠損症といった実際に家畜で起こっている病気に適用し、これらの病気を持つ個体を選抜してしまうことで生じる損失を算出した。第2の研究では、世代重複および交配様式を考慮して遺伝子型情報を用いた選抜を最適化する方法を開発した。本研究の研究成果は国内の学会で発表し、海外の論文に掲載された。第3の研究では、単一世代のサンプルにおけるマイクロサテライトやSNPなどの分子マーカーから、集団の有効な大きさを推定するための新たな方法を開発した。開発した方法は、サンプル個体間の分子共祖係数を親世代ベースに変換した値を用いるものである。この方法を、サンプル集団のヘテロ接合度の過剰に基づく既存の方法とコンピュータシミュレーションによって比較した。新規の方法は、下方向に偏った推定値を与える傾向があるが、既存の方法よりも、はるかに狭い信頼区間を与えることが明らかになった。

近年のヒトゲノムプロジェクトに代表されるゲノミックスの飛躍的な進歩と発展に伴い、一すべての哺乳類のDNAシークエンスの類似性が明らかになり、ヒトやマウスで開発された先端技術が家畜にも応用され、その結果、家畜に関する遺伝性疾患遺伝子や経済形質に関与する遺伝子(QTL)の位置と効果が解明されつつある。本年度は以下の3つの研究を行った。その第1は、ゲノムワイドでの高密度なマーカーを用いて家畜の遺伝的能力を評価する方法の有用性をマウスのデータを用いて検討した。マウスの体長と総コレステロールの2形質を対象に、QTL解析データを基にして有意なSNPを10個選び、それらの相加的効果および優性効果を推定し、その効果を基にしてマーカースコアを作成した。その結果、表現型のみの情報を用いたときの体長と総コレステロールに関する遺伝分散は、表現型とマーカースコアの情報を両方取り込んだときの遺伝分散はそれぞれ0.020、0.042であり、表現型のみの情報を用いたときの半分程度であることを示した。現在、同様の方法を黒毛和種集団に適用すべく、枝肉重量に関与すると考えられる遺伝子マーカーを5個選び、タイピングを行っている。第2は、ゲノム育種価に加え、親の予測育種価、後代の表現型情報が利用できる場合を想定し、ゲノミック評価における育種価の正確度を検討した。その結果、ゲノム育種価の正確度が低いときは、ゲノム育種価、親の予測育種価に加え、後代の表現型情報を取り入れることで、さらなる育種価の正確度の上昇が見込まれることが示唆された。第3は、サンプル個体群のSNPマーカーにおけるヘテロ接合度過剰から集団の有効な大きさを区間推定する方法を開発した。コンピュータ・シミュレーションの結果は、開発した方法はNeについてわずかに幅の広い信頼区間1を与えるが、実用上きわめて有効性が高いことを示唆するものであった。
ノイズ刺激の追加による認知成績向上と適応的メンタルセット形成に関する研究

本研究では,ノイズを追加したときに却って認知成績が向上するという,一見直感とは矛盾する現象を追求した。まず,ノイズを追加すると標的同定率が向上するという結果と,逆に低下するという結果を追試によって確認した。さらに,その条件分析をすることで,ノイズ刺激追加が標的同定成績を向上もしくは低下させる要因の特定を行った。実験事態では,注意の瞬き現象を利用して,第2標的の検出率が低下しているときにノイズ刺激を追加して呈示した。間接的に類似した条件を含む先行研究の比較に基づき,ノイズ刺激追加効果の出方を左右している要因を特定した。ノイズ刺激数を操作したところ,ノイズ刺激を単独は毎フレームに複数呈示することは標的同定成績に大きな影響を与えないことがわかった。ノイズ呈位置を操作したところ,ノイズ刺激周辺に呈示したときに標的同定成績に大きな影響があった。標的位置予測が最も大きく関与していた.標的位置が予測可能の場合,注意を焦点化することによってノイズを適切に抑制できることがノイズ追加による促進効果に関与していた。標的位置が予測不可能なときは,ノイズ追加による効果はなく,常に同定成績は悪化していた。最適な効果を生じるノイズ刺激の種類と強度を調べたところ,動的な刺激であること,かつパターンをもつ刺激であることが促進効果の生起に重要であることがわかった。これらの結果は,促進効果が確率的共振に起因している可能性を示唆していた。本年度の実験では,一見矛盾する従来の研究結果である,ノイズを追加すると標的同定率が向上するという結果と,逆に低下するという結果を追試によって確認した.さらに,その条件分析をすることで,ノイズ刺激追加が標的同定成績を向上もしくは低下させる要因の特定を行った.実験事態では,注意の瞬き現象を利用して,第2標的の検出率が低下しているときにノイズ刺激を追加して呈示した.間接的に類似した条件を含む先行研究の比較に基づき,ノイズ刺激追加効果の出方を左右している要因を特定した.ノイズ刺激数を操作したところ,ノイズ刺激を単独は毎フレームに複数呈示することは標的同定成績に大きな影響を与えないことがわかった.ノイズ呈位置を操作したところ,ノイズ刺激周辺に呈示したときに標的同定成績に大きな影響があった.標的位置予測が最も大きく関与していた.標的位置が予測可能の場合,注意を焦点化することによってノイズを適切に抑制できることがノイズ追加による促進効果に関与していた.標的位置が予測不可能なときは,ノイズ追加による効果はなく,常に同定成績は悪化していた.最適な効果を生じるノイズ刺激の種類と強度を調べたところ,動的な刺激であること,かつパターンをもつ刺激であることが促進効果の生起に重要であることがわかった.これらの結果は,促進効果が確率的共振に起因している可能性を示唆していた.本年度の結果は行動指標を用いてノイズによる成績の向上が起こる条件を特定した最初の知見という意味で重要な発見といえる.I.ノイズ先行呈示によるメンタルセット変調を生む条件の特定昨年度の成果から,先行呈示する試行数は80試行以上は必要であることがわかったので,本研究では120-200の先行試行を呈示し,それが後の試行に及ぼす効果を観察した.(1)抽象的学習方略の性質の検討ある刺激属性に対する鋭敏化が起こっていたのか,あるいは抽象的な刺激vs.妨害刺激の関係を学習していたのかを特定した,学習セッションでの刺激とテストセッションでの刺激を重複しないように設定した実験の結果,この刺激セットでもテストセッションへの学習の転移が生じていた.従って,抽象的な刺激vs.妨害刺激の関係を学習していたことがわかった.II.ノイズ先行呈示効果の持続時間と転移可能性の検討(1)で見られた学習効果の持続時間を調べる.抽象的な学習法略は,神経心理学症例での保続に相当するような,比較的短時間での知覚セットの状態が書き換えられないことを反映するのか,あるいは環境特異的な学習なのかを区別するために,学習効果の持続時間を調べた.上述(1)のテストセッションは学習直後に実施するため,それが保続によるものなのか,環境特異的な学習なのかが区別できない.

そこで,翌日テスト群,1週間後テスト群の2群を設け,学習効果がどれだけ遅延をおいても維持されるかを調べた.環境特異的な学習であれば,両群で効果の維持が認められると予測された.実験の結果はこの仮説を支持し,保続ではなく,本研究で得られたのは環境特異的な学習効果であることがわかった.知覚的構えは,われわれの意識の制御下にあるとこれまでは信じられてきた.自分が何を探そうとしているかは,はっきりと自覚でき,自分の意志で探す対象を設定できると思われていた.しかし,本年度の研究では,自分がどのような知覚的構えで認知行動を行っているかの設定は自らの意識では知り得ない場合があることを古くて新しい方法を用いて調べた.実験参加者は何も教示を受けず,キーボードとヘッドフォンのみを与えられた.そして文字が呈示されたとき,それに対応するキーを押すというオペラント反応に対して報酬〔クリック音)を与えられた.徐々にこのキー推し行動のシェイビングを行い,参加者は灰色の文字系列中に1つだけ呈示される赤色の文字を答えるという行動をするようになった.このとき,参加者は赤色の文字を探すという特徴探索モードをとっているのか,あるいは一つだけ色の異なるものを探すという異変検出モードをとっているのか?統制された条件下で妨害刺激を指標にした複数の実験を行った結果,観察者は大半が特徴探索モードをとっていたと内観報告していたが,行動成績は異変検出モードをとっていたことがわかった.さらに,意識的に探索モードを答えた後,さらに探索試行を続けても,行動成績からみた探索モードは変化せず,乖離し続けていた.この結果は,知覚的構えの選択は完全には意識的制御下にはなく,外発的要因によって規定されることを示唆している
サーモセンシングタンパク質の立体構造解析と医療への応用

放線菌Streptomyces albusが産生するRheAはリプレッサータンパク質であり,熱を感知してその構造を可逆的に変化させるサーモセンシング機能を有する。本研究では,RheAのサーモセンシング機能を構造生物学的に明らかにするとともに,その機能を医療に役立つ分子スイッチの開発へ応用することを目的としている。昨年度,C末端ヒスチジンタグ付きRheAとその特異的なオペレーターDNAとの複合体の結晶化に成功し,複合体結晶のX線回折実験を行ったが,構造解析に十分な回折強度データは得られなかった。そこで,天然型RheAの大腸菌における発現を行い,各種クロマトグラフィーの手法を用いることにより,その精製系を確立することができた。本年度は,天然型RheAを大量に取得後,その結晶化を行った。シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったが,数百種を超える結晶化条件を検討したにもかかわらず,結晶は生成しなかった。天然型RheAとオペレーターDNAとの複合体の結晶化も試みたが,結晶は生成しなかった。天然型RheAの精製は困難であり,かつ,結晶も生成しない。そこで,精製の容易なヒスチジンタグ付きRheAへ回帰することにした。ただし,C末端ヒスチジンタグ付きRheAとオペレーターDNAとの複合体の結晶化に成功しているが,その結晶は良質のX線回折データを与えない。RheAのC末端領域はDNA結合部位と考えられることから,C末端ヒスチジンタグが良質結晶の生成を妨げている可能性がある。したがって,N末端ヒスチジンタグ付きRheAを用いることにした。現在,N末端ヒスチジンタグ付きRheAの発現系を構築している。放線菌Streptomyces albusが産生するRheAは,熱を感知して可逆的にその構造が変化するサーモセンシング機能を有するリプレッサータンパク質である。本研究では,RheAのサーモセンシング機能を構造生物学的に明らかにするとともに,その機能を医療における分子スイッチに応用することを目的としている。本年度は,RheAタンパク質の立体構造をX線結晶構造解析するため,RheAの大量発現,精製,結晶化,およびX線回折実験を行った。RheAは大腸菌の宿主・ベクター系を利用して大量発現させた。次に、そのタンパク質の精製をニッケルアフィニティーカラムを用いて行った。これにより,ヒスチジンタグ付きの精製RheAを大量に取得できた。シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化を行った結果,RheAの結晶を得ることはできなかったが,RheAとオペレーターDNA(21mer)との複合体結晶を得ることに成功した。しかしながら,銅Kα線をX線源としてX線回折実験を行った結果,得られた複合体結晶は構造解析に十分な回折強度データを与えるものではないことが判明した。この原因として,RheAに付加したヒスチジンタグの影響が考えられたことから,次に,天然型RheA(native RheA)の発現系の構築および精製系の確立を試みた。本年度は,種々のカラムを駆使することにより,native RheAの精製系を確立できた。次年度は,精製native RheAの結晶化ならびにX線結晶構造解析を行うとともに,その知見を分子スイッチの開発へ応用することを目指す。また,他の放線菌にRheA様のリプレッサータンパク質が存在するか否かも調査する。