hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幼稚園への支援を通しての自発的発達障害支援整備の推進

本研究では、幼稚園において発達障害の疑われる子どもにかかわる保育者が持つ困難の諸特徴を明らかにした。これに基づき、幼稚園で自発的に気になる子どもへの支援や配慮を進めていけるためのガイド冊子「気になる子どもへの保育ヒント集要因を整理し、環境を見直し、具体的に対応する」を作成し、活用をすすめた。規模、保育形態の異なる3園の私立幼稚園による研究協力を受け合計21回訪問し、事例検討および保育コンサルテーションを通して述べ200以上の相談事例を収集した。いずれの園でも、発達障害が疑われ、保育上で配慮を要する幼児を一定数抱えており、保育者からの相談は、各幼稚園で日々取り組んでいる問題に直結したものであった。具体的には、以下のような成果を上げた。(1) 200を超す相談事例から、次年度に幼稚園が発達障害の疑われる子どもの支援を行うのに活用可能なガイド作成のための基礎データを収集することができた。今後事例を分類、分析し、一般化できる支援の方法を抽出する。(2)規模や体制の異なる複数の園での相談により、規模や保育体制の違いが、発達障害の疑われる子どもの生活環境としてどのような利点や効果を生むのか検討した。(3)保育者へのアンケート実施により、発達障害の疑われる子どもの実態およびそれぞれの保育者のレベルでの問題意識や保育上の配慮の現状について明らかにした。特に、保育者の経験年数によって、問題意識には差があり、保育への自信や保護者との関係に悩む姿が明らかになった。(4)継続的に相談を行うことにより、当該の子どもおよび子ども集団の継時的な変化や、子どもをとりまく関係機関の連携状況についても、把握することができた。(5)保育コンサルテーションについて、保育者による評価を実施したところ、保育者が日々の保育を振り返り、子どもの状態を捉えなおし、保育への自信を高め子どもを抱えられるのに一定の効果があったことが検証された。昨年度収集した幼稚園での相談事例のべ216ケースをデータベース化し、幼稚園が自発的に発達障害の疑われる子どもへの対応整備を進めていくための要件を分析した。その結果、年間カリキュラムに沿った集団ベースの保育環境を生かした、保育者の視点にたった保育者支援の必要性が明らかになった。明らかな障害の有無にかかわらず、気になる1人1人の子どもを幼稚園が抱え、効果的対応を実践するためのガイドブック「気になる子どもへの保育ヒント集要因を整理し、環境を見直し、具体的に対応する」を作成し、幼稚園や巡回相談事業などで活用を開始した。ガイドブック作成過程で以下の点が明らかになった。(1)アンケート調査結果から、保育者にとって気になる問題群を8項目に整理した(「行動や気持ちの落ち着かなさ」「不安・パニック・情緒的混乱」「子ども同士のトラブルと他害行動」「こだわりに見える行動」「思い通りにいかないと気がすまない」「コミュニケーションや会話の難しさ」「集団行動の苦手さ」「その他」)。(2)216ケースを8項目に分類し、さらに類似するケースから関連する発達的要因、環境因、子どもの素因を分析し40テーマを抽出した。(3)各テーマについて、問題が起こりやすい目安として、年齢、障害の診断の有無、年度内の時期などの特徴を明らかにし、ガイドブックを活用する際の手がかりとした。このガイドブック活用によって、以下の効果をあげることができる。(1)集団の中で子どもの抱える困難に気づき、周囲の環境も含めて観察して客観的に捉えることができる。(2)集団に対する保育活動の中での支援、および個別的働きかけによる支援、特定の仮説に基づいた技法を用いた支援を総合的に行うことができる。(3)保育者個人だけでなく、幼稚園の体制の中で子どもを抱えていくことが可能になり、保護者への支援や専門機関との連携の円滑化が図れる。
フ-リエ分光法による赤外円偏光二色性測定装置の開発と生体高分子の高次構造研究

昨年度試作したフ-リエ分光法による赤外円偏光二色性(FTーIRCD)測定装置の光学系ならびに電気系の改良・調整により、次のような仕様をもつFTーIRCD測定装置が完成した。測定波数領域:2、000-900cm^<ー1>最小検知感度:△A=10^<ー6>OD最高分解能:1cm^<ー1>ポリプチド鎖の局所的なコンホメ-ションの研究に振動円偏光二色性(VCD)法を応用するために、オリゴペプチドのVCDを測定し、コンホメ-ションとVCDの関係について検討した。モデル化合物として、NーacetylーLーalanineーN'ーmethylamide(AcーLーAlaーMA)、NーpivaloylーLーalanineーN'ーmethylamide(PivーLーAlaーMA)、AcーLーValーMA、AcーLーLeuーMA、AcーLーPheーMA、AcーLーProーMA、PivーLーProーMAを合成し、四塩化炭素、重水素化クロロホルム、ジメチルスルホキシドの有機溶媒中でのIRCDを測定した。AmideA吸収帯のVCDは、NーH基の水素結合の状態に非常に敏感であることがわかった。濃厚溶液中で分子間水素結合を形成している状態では、これら全てのペプチドにおいて会合状態に特有の高波数測から(-+)のVCDカップレット構造が観測された。AcーLーAlaーMA、AcーLーValーMA、AcーLーLeuーMA、AcーLーPheーMAは希薄溶液中で5員環の分子内水素結合を形成したC_5構造をとり、3400cm^<ー1>付近に高波数測から(+-)のVCDを示す。AcーLーProーMA、PivーLーProーMAは希薄溶液中で、7員環の分子内水素結合を形成したC_7構造をとり,3320ー3330cm^<ー1>に正のVCDバンドを示すことがわかった。βータ-ン構造をとるAcーLーProーMA、PivーLーProーMAのアミドA吸収帯は正のVCDバンドを示すことが明らかとなった。FTIR/CD測定用の光学系を製作し、既存のIRFー10赤外干渉計に組込んだ。その結果、波数2000ー800cm^<ー1>の領域のIRCDの測定が可能となった。分解能4cm^<ー1>,積算2000回(測定時...2時間)で△A×10^<ー6>の感度が得られた。実に測定時間の短縮とS/N比向上の為に,光学系・電気系の改良を進めている。ポリペプチド鎖の局所的なコンホメ-ションおよび不斉構造の研究にIRCD法を適用するために,モデル化合物についてのIRCDの測定と解析を進めている。

モデル化合物として,NーAcetylーLーalanine methylamide(AcーAlaーMA),NーPivalylーLーalanine methylamide(PivーAlaーMA),AcーValーMA,AcーLeuーMA,AcーProーMA,PivーProーMAを合成し,血塩化炭素,重水素化クロロホルム,ジメテルスルホキシドの有機溶媒中でのIRCDを測定した。AcーProーMA,PivーProーMAは,稀薄溶液中では7員環を形成する分子内水素結合したC_7構造をとる。この構造に対応して3320cm^<ー1>に正のVCDバンドが観測される。濃厚溶液中では、分子間水素結合により会合し,3300cm^<ー1>を中心に,高波数側から(-+)のカップレット構造を示す。ヌアミドI,II吸収帯についても,各々時微的なVCDパタ-ンが観測される。今後これらのVCDバンドとペプチド鎖の立体構造との関連を詳細に研究してゆく所存である。昨年度試作したフ-リエ分光法による赤外円偏光二色性(FT-IRCD)測定装置の光学系ならびに電気系の改良・調整により、次のような仕様をもつFT-IRCD測定装置が完成した。測定波数領域:2,000-900cm^<-1>最小検知感度:ΔA=10^<-6>OD最高分解能:1cm^<-1>AmideA吸収帯のVCDは、N-H基の水素結合の状態に非常に敏感であることがわかった。濃厚溶液中で分子間水素結合を形成している状態では、これら全てのペプチドにおいて会合状態に特有の高波数側から(-+)のVCDカップレット構造が観測された。Ac-L-Ala-MA、Ac-L-Val-MA、Ac-L-Leu-MA、Ac-L-Phe-MAは希薄溶液中で5員環の分子内水素結合を形成したC_5構造をとり、3400cm^<-1>付近に高波数側から(+-)のVCDを示す。Ac-L-Pro-MA、Piv-L-Pro-MAは希薄溶液中で、7員環の分子内水素結合を形成したC_7構造をとり、3320-3330cm^<-1>に正のVCDバンドを示すことがわかった。
自己資本比率規制が銀行業および日本経済に与える影響

3つ目は「公的資金注入のキャピタル・クランチ促進効果」である。これは平成20年度より引き続き取り組んできた研究であり(論文タイトルを変更。旧タイトルは「公的資金注入と銀行貸出--国際行と国内行の非対称性」)、平成21年度日本金融学会春季大会(2009年5月)にて報告した後、改訂を経て国内誌『金融経済研究』に投稿し、レフェリーコメントを頂き、再改訂・再投稿を行ったところである。「研究の目的」に記した「自己資本比率規制を多面的に研究する」という目標は達成できたと考えている。ANUでの滞在研究では想像以上の良い副産物を得られ、研究実施計画以上の結果を得られたと言える。1つ目の論文は平成19年度から継続して取り組んできた研究である。本研究は一定の成果が得られた為、現在、日本金融学会学会誌への投稿(理事推薦)手続きに入っている。尚、当研究成果は2009年3月に第41回内藤章記念賞を受賞した。2つ目の論文は昨夏に取り組み始めた研究である。10月12日に広島大学に於いて開かれた日本金融学会2008年度秋季大会にて、10月29日に慶應大学の金融ワークショップにて、2009年1月にThe Australian National Universityに於いて開かれたAsia Pacific Weel2009にて発表する機会を得た(その都度、論文タイトルは変更された)。多くのコメントを頂き、現在それを基により良い研究になるよう再度修正中である。【昨年提出の研究計画との対応】計画書で記しか「平成20年度内に2つの論文を書く」という目標は達成されたが、2つ目の論文は当初平成21年度に取り組む予定であった論文であり、計画とは異なる。当初予定していた論文はデータの制約等の問題があった為、取り組む順序を入れ替えた。平成2年度以降に挑戦していきたい。尚、2つ目の論文自体も当初の計画に比べると改善の余地がある。当初の計画に近づけるよう平成21年度に一層励みたいと思う。また、学術誌投稿の計画が達成できずにいるので速やかに投稿を行いたいと考えている。1つ目の論文はほぼ昨年提出の計画書通りに研究を行うことができた。投稿時期が当初の計画より若干遅くなってしまったが、計画以上の面白い研究成果が得られたと考えている。
前臨床サル移植モデルによる革新的膵島・腎移植法を用いた糖尿病性腎症根治療法の確立

サル同種間で、骨髄移植を同種膵島腎移植に併用した免疫寛容実験、およびドナー骨髄キメラとその免疫学的検討を行った。免疫寛容誘導療法に関するこれまでの成果として、第1世代では、45日間シクロスポリン(CyA)を基礎に、移植前T細胞除去のためCD3除去抗体を用いたところ、3例中2例は200日を越える移植腎生着を得たが、CyAによる膵島毒性とキメラ継続は一過性(移植後3週間以内に消失)という問題を呈した。そこで第2世代として、膵毒性軽減のため高濃度CyA投与を早期に減量し、またco-stimulatory blockade抗体とラパマイシンを主とした導入療法を用い、更にNKT細胞寛容も目指し移植前後にanti-GalCerを投与したところ、予期せぬグラフト損傷と感染等のため長期生着は得られなかったが、初めて移植後1か月以降のキメラ維持(末梢血T細胞6%、myeloid 5%、更に骨髄キメラ1.4%; Day 37)を確認し得た。しかし、本課題の最終目的は糖尿病性腎症、特に自己免疫疾患1型糖尿病を対象とするため自己免疫制御も必要となる。近年、小動物実験で、キメラ継続により自己免疫も制御しえる成果が報告され、本モデルの最終目的の達成にも高い割合での長期キメラ維持の必要性が示唆される。そこで平成30年度は、第3世代として、より多くの骨髄前駆細胞の移植が期待できるLeukapheresis法を確立し、免疫抑制はco-stimulatory blockade抗体と少量タクロリムスを用いた。本療法で5例のLeukapheresisを行い、臨床骨髄移植で骨髄生着に必要な2-6 x10^6/kgの4倍以上のCD34+細胞を回収しえた。うち2例で同種移植を行い、2例とも30%を超える末梢血キメラが6週間以上継続し、更に骨髄キメラもlymphoidで15%、myeloidで42%確認しえた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、streptozotocin(STZ) 80mg/kg静注によりインシュリン依存性糖尿病(IDDM)を誘導したサル3頭を用いて、我々の開発したcomposite Islet-Kidney移植(IK TX)とドナーhematopoietic stem cell(HSC)を併用した同種移植を行った。免疫抑制剤として、T細胞除去抗体をHSC移植前に投与し、シクロスポリン(CyA)を45日投与を行った。HCS移植後20-22日にIK移植を行った。ドナー細胞キメリズムは、IK移植時には1%以下と低値であったものの、移植されたIKグラフトは生着し、2例は200日を越える正常腎機能を呈した。一例は移植後2ヶ月時に腸捻転を生じ犠牲死とした。血糖に関しては、STZ投与により移植後のインシュリン投与を必要としたが、IK移植後その投与量は著しく減少した。2例に関しては、一例はCyA投与期間中に2U/day、その後1U/dayから無投与、もう一例はインシュリン投与不要であった。残りの一症例は、移植後高濃度CyAの膵島毒性と考えられる高血糖を1例において認め、IK移植後CyA投与期間に5U/dayのインシュリン投与を必要としたが、CyAの中止に伴いインシュリン投与量は漸減し、移植100日以降はほぼ1U/dayとなった。これらの結果は、免疫抑制中止後もIK機能の維持が示され、免疫寛容の誘導が可能であることを示したが、CyA投与期間中の高血糖に対する免疫抑制導入療法の考慮が必要であることが示唆された。平成28年度は、当初の実験計画に記載した内容について、研究実績の概要に記載したようにほぼ計画とおりに実験を遂行し、閣下を得ることができた、平成29年度以降も計画書に従い、円滑な県有を進めることが可能と考えられるため、おおむね順調に研究が進んでいると判断した。1.移植実験:我々の開発したcomposite Islet-Kidney移植(IK Tx)とドナーhematopoietic stem cell(HSC)を併用した同種移植の導入療法として、2例は、膵島毒性を軽減すべきCyAの投与量を高濃度から早期に減少させ、Anti-CD40抗体とラパマイシンを主とした導入療法を用いた。また、NKT細胞寛容も目指し、GalCerを移植前および移植後に投与し、HSCTxとして骨髄穿刺によるBM移植を用いた。CyA投与期間は移植後3Uほどのインシュリンを投与が必要であったが、血糖のコントロールは可能であった。しかし、一例はDay 46に予期せぬGraft損傷により、もう一例は術後尿管修復に起因する病態の変化によりDay 37で犠牲死とした。特筆すべき所見として、1例において、これまでに確認し得なかった骨髄キメラをDay 37の時点において6%認めた。2.サルPBMCとヒトPBMCにおけるiNKT cell subset解析:αGalCerを本実験のin vivo導入療法に用いる上で、サルとヒトの血中に含まれるiNKT cellの解析を行った。iNKT cellはCD3分子を発現し、αGalCerとCD1d複合体を認識する細胞の総称である。iNKT cellの同定にはanti-CD3抗体とαGalCer-loaded CD1d tetramer抗体を用いて、フローサイトメトリーにより解析を行った。

サルPBMCとヒトPBMC中に含まれるiNKT cellは非常に少数であり、サルPBMC中には0.3%、ヒトPBMC中には1.6%のiNKT cellが同定された。次にこれらiNKT cellのサブセット解析を行った。サルiNKT cellは45.9%がCD4 single positiveの集団であり、35.7%がCD8 single positiveの集団であった。平成29年度は、研究実績の概要に記載したようにほぼ計画とおりに実験を遂行し、結果を得ることができた。平成30年度も計画書に従い、円滑な研究を進めることが可能と考えられるため、おおむね順調に研究が進んでいると判断した。サル同種間で、骨髄移植を同種膵島腎移植に併用した免疫寛容実験、およびドナー骨髄キメラとその免疫学的検討を行った。免疫寛容誘導療法に関するこれまでの成果として、第1世代では、45日間シクロスポリン(CyA)を基礎に、移植前T細胞除去のためCD3除去抗体を用いたところ、3例中2例は200日を越える移植腎生着を得たが、CyAによる膵島毒性とキメラ継続は一過性(移植後3週間以内に消失)という問題を呈した。そこで第2世代として、膵毒性軽減のため高濃度CyA投与を早期に減量し、またco-stimulatory blockade抗体とラパマイシンを主とした導入療法を用い、更にNKT細胞寛容も目指し移植前後にanti-GalCerを投与したところ、予期せぬグラフト損傷と感染等のため長期生着は得られなかったが、初めて移植後1か月以降のキメラ維持(末梢血T細胞6%、myeloid 5%、更に骨髄キメラ1.4%; Day 37)を確認し得た。しかし、本課題の最終目的は糖尿病性腎症、特に自己免疫疾患1型糖尿病を対象とするため自己免疫制御も必要となる。近年、小動物実験で、キメラ継続により自己免疫も制御しえる成果が報告され、本モデルの最終目的の達成にも高い割合での長期キメラ維持の必要性が示唆される。そこで平成30年度は、第3世代として、より多くの骨髄前駆細胞の移植が期待できるLeukapheresis法を確立し、免疫抑制はco-stimulatory blockade抗体と少量タクロリムスを用いた。本療法で5例のLeukapheresisを行い、臨床骨髄移植で骨髄生着に必要な2-6 x10^6/kgの4倍以上のCD34+細胞を回収しえた。うち2例で同種移植を行い、2例とも30%を超える末梢血キメラが6週間以上継続し、更に骨髄キメラもlymphoidで15%、myeloidで42%確認しえた。平成28年度は計画書に従い順調に研究が推進している。H29年度も当初の研究計画に従い研究を進めていく方針である。平成29年度は計画書に従い順調に研究が推進している。平成30年度も当初の研究計画に従い研究を進めていく方針である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
種々の溶媒に含まれる微量揮発性物質の活量に関する研究

化学工業や最近のバイオインダストリーでは分離・精製技術が重要であり、相平衡関係の基礎データとして液相の非理想性を表現する活量(活量係数)が必須となる。しかしながら、実測データの蓄積も不十分であり、また工学的に有用な推算法も少ないのが現状である。そこで本研究では、迅速かつ正確な測定を可能にするガス・ストリッピング法による無限希釈活量係数の測定装置を製作し、炭化水素溶媒中の揮発性物質(アルコール、エーテルなど)の測定を系統的に行った。まず、ガス・ストリッピング法による無限希釈活量係数の測定装置を製作した(福地)。装置は、水恒温槽部、サンプリング部、濃度分析部から構成される。現有の冷凍機付き恒温水相で測定温度2080°Cに±0.03°Cで制御されたディリューター中の溶質(揮発成分)がヘリウムガスで溶媒からストリッピングされ、現有の空気恒温槽中のサンプル管を備えた六方切り換えコックを経て、本研究の設備備品として購入したガスクロマトグラフ(ジ-エルサイエンス(株)GC-380TDD)で濃度の時間変化が分析され、無限希釈活量係数を決定できる。本装置を用いて、無限希釈活量係数データの豊富なヘキサン+ヘキサデカン系の測定を2080°Cで行い、文献値と比較することで、本実験方法を検証した。次に、炭化水素溶媒(オクタン、ノナン、テトラデカン、ヘキサデカン)中の溶質(メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル)の無限希釈活量係数を2080°Cの範囲内で測定した(福地)。今後は、溶質としてケトンや水の測定も計画中である。さらに、集積したデータに立脚し、工学的に有用な無限希釈活量係数推算法であるASOG式を適用し、良好な結果を得た。さらに、極性物質にも十分適用できるグループ寄与法を新たに検討している(荒井)。
CRISPR/Cas9を用いたin vivoゲノム編集による遺伝子治療法の開発

本研究ではCRISPR/Cas9システムを介した遺伝子ノックアウトを、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた脳内への高効率な遺伝子導入により実施することにより、脊髄小脳失調症1型の新規遺伝子治療法の開発を目指した。化膿連鎖球菌由来のSpCas9や黄色ブドウ球菌由来のSaCas9を検討したが、疾患モデルマウスにおいて治療効果を確認することはできなかった。現在、この原因がCas9の低発現や遺伝子ノックアウトの効率の低さにあると考え、種々の効率化を目指しさらなる検討を重ねている。【In vivoノックアウトの検証】生きたマウスの脳内でアデノ随伴ウイルス(AAV)を介した、遺伝子のノックアウトが可能であるかを検証するために、プルキンエ細胞特異的にGFPを発現したトランスジェニックマウスを対象としたGFPのノックアウト実験を実施した。Cas9のみを発現するAAVを投与した場合、GFPの蛍光が失われることはなかったが、GFP遺伝子をターゲットとしたガイドRNA(gRNA)をCas9と同時に発現した場合のみ、GFPの蛍光が消失したプルキンエ細胞が多数観察された。以上のことから、AAVを用いたIn vivoノックアウトが実施可能であることが示唆された。【SCA1モデルマウスを対象としたIn vivoノックアウト】脊髄小脳失調症1型(SCA1)のモデルマウスであるB05を治療対象とした研究に移行した。まず、SCA1の原因遺伝子であるATXN1をノックアウトするための適切なgRNA配列をHEK293Tを用いて同定した。同定したgRNA配列をCas9と同時に発現するAAVを作成し、B05に投与後、Rotarodによって、経時的に運動失調の進行を計測した。現在までのところ、治療効果は確認できていないが、引き続き観察を続ける予定である。【関連する研究発表】関連する研究として、薬剤を用いた脊髄小脳失調症1型の治療研究(Iizuka et al)、AAVを用いたマーモセットへの遺伝子導入法に関する研究(Matsuzaki et al.)、「経頭蓋直流電気刺激法(tDCS)」のメカニズムに関する共同研究(Monai et al.)について、国際誌への論文発表を行った。当初計画では、1年目はAAVの作成とガイドRNAの最適化を行う予定だった。この計画に従い、Tetシステムを介した二重感染法を用いたAAVの作成を実施し、早期に完了した。具体的には「SpCas9」と「gRNA+tTA or rtTA」をそれぞれ発現させるAAVを作成した。また、gRNAの最適化も同時並行で行い。5種類のgRNAの中から最適と思われる2種類を同定した。ここまでの段階で、1年目の計画が終了したため、2年目の計画であったSCA1モデルマウスを用いたIn vivoノックアウトへと研究を進めている。このため、「当初の計画以上に進展している」とした。【脊髄小脳失調症モデルマウスを対象としたIn vivoノックアウト】申請当初から予定していた計画通り、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(SpCas9)とAtaxin-1に対するgRNAを搭載したアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を、脊髄小脳失調症1型のモデルマウスに対して、In vivoノックアウトによる治療を実践した。AAV投与後、運動失調の改善がみられるかどうか、Rotarod試験により経過を追跡したが、改善は全くみられなかった。さらに、AAV投与マウスにおいて、gRNAのターゲットとなる領域のゲノム配列を解析したところ、全く編集が起こっていないことが確認された。この原因として、SpCas9は遺伝子サイズが大きく、AAVのパッケージング限界に極めて近いサイズであったために、十分な遺伝子発現が得られていないためではないかと考えた。実際にSpCas9にタグとして付加されているFlagによる免疫染色でも明確な発現は確認できなかった。そこで、本研究計画の申請後に報告された、遺伝子サイズの小さい、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のCas9(SaCas9)(Ran et al., 2015)を用いる事とした。SaCa9用のgRNAを設計し直し、Ataxin-1をノックアウトするのに最適な配列を選択した。このgRNAをSaCas9を含むAAVに搭載し、脊髄小脳失調症1型のモデルマウスに対する治療効果を検討中である。【関連する研究発表】本研究と関連する研究として、AAVを用いた研究を国際誌に1報報告した。また、関連性は薄いが、AAVを用いた研究や国際共同研究による論文を併せて4報報告した。初年度は当初の計画以上に進展していると考えていたが、SpCas9によるIn vivoノックアウトがうまくいっていないことが発覚し、研究計画の変更を余儀なくされた。しかしながら、本研究計画の申請後に報告されたSaCas9を用いた検討に速やかに移行しており、現在、治療効果の検証中である。このため、「おおむね順調に進展している。」と判断した。CRISPR/Cas9を用いたin vivoゲノム編集を介した遺伝子治療法を実践するために、脊髄小脳失調症1型(SCA1)のモデルマウスであるB05を対象とした治療実験を行った。まず、当初の計画通り、化膿連鎖球菌由来のSpCas9を用いて実施し、治療効果をRotarodによって追跡した。しかしながら、治療効果は確認できなかった。SpCas9は遺伝子サイズが大きく、プロモーターとSpCas9のみで、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターのパッケージング限界に極めて近いサイズとなってしまう。

このため、発現を安定化させるためのWPRE配列等を付加できない事から、SpCas9の発現量が極めて低いことが予想された。実際、免疫染色でSpCas9の発現を確認したところ、ほぼ発現がみられない事が明らかとなった。このため、近年報告された遺伝子サイズの小さい黄色ブドウ球菌由来のSaCas9を使用した治療実験を実施することとした。SaCas9はSpCas9とPAM配列が異なるため、最適なgRNAの再選定を行い、再度AAVベクターを作成した。これを用いてB05を対象としたin vivoノックアウトによる遺伝子治療を試みたが、治療効果が認められなかった。また、治療を試みたマウスからゲノムDNAを抽出し、ゲノムシークエンスを実施したが、期待された領域に対するゲノム編集は確認できなかった。現在、トリプルCRISPR法(Sunagawa et al., 2016)などの導入により、ゲノム編集効率を上げる事などを検討中である。本研究そのもに対する成果は現状では得られていないが、一方で、29年度の研究期間中にAAVを用いた関連研究計6報を国際誌に報告した。本研究ではCRISPR/Cas9システムを介した遺伝子ノックアウトを、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた脳内への高効率な遺伝子導入により実施することにより、脊髄小脳失調症1型の新規遺伝子治療法の開発を目指した。化膿連鎖球菌由来のSpCas9や黄色ブドウ球菌由来のSaCas9を検討したが、疾患モデルマウスにおいて治療効果を確認することはできなかった。現在、この原因がCas9の低発現や遺伝子ノックアウトの効率の低さにあると考え、種々の効率化を目指しさらなる検討を重ねている。引き続き行動実験によりSCA1モデルマウスの運動失調の進行を観察する。観察後、免疫組織染色やDNA配列解析によるノックアウトの確認などを行う。これがうまくいった場合、In vivoノックインに関しても同様に検討する予定である。引き続きIn vivoノックアウトによる脊髄小脳失調症1型モデルマウスにおける治療効果を検証していく。また、実際にゲノムの編集が起きているかをゲノムシークエンスにより解析する。神経科学計画的に使用していたが、\47,397が次年度使用となった。旅費への支出額が予定よりも少なかったために、残額が生じた。当初の予定より消耗品の購入頻度が高くなかったため。本金額は、次年度における消耗品の購入に充てる予定である。最終年度は初年度に買った消耗品の枯渇が予想され、当該年度で購入しなかった分の消耗品分を次年度の早い段階で購入する必要が出てくると思われる。このため、特に大きな使用計画の変更をしなくとも、計画通りの研究費の使用が可能である。
fMRIを用いた脳循環動態異常疾患評価

虚血下における安静時fMRI信号の相対的時間差を算出することにより、全脳灌流時間の計測が出来ることを示した。また信号遅延が急性期梗塞域に見られることから、計測対象が非神経活動由来である事を確認し、虚血患者にて神経障害の有無に関わらず、同法にて灌流時間マッピングが可能であることを示した。平行して脳脊髄液減少症患者における、自発的神経活動および認知機能異常の変化を髄液漏出の治療前後にて縦断的に評価し、認知機能変化と関連する自発性神経活動の変化を同定した。1) fMRIによる脳血行動態異常評価:脳血行動態異常がfMRI信号に与える影響評価を、これまでの研究に引き続き試行した。タスクありMRIにて見られた低灌流下でのBOLD信号遅延を、安静時fMRIを用いて脳血液循環障害のある患者において全脳で評価した。呼吸・心拍に由来する生理的ノイズ成分と考えられている安静時fMRIの全脳平均信号変動を基準とし、各ボクセルの信号変動との相関が最も高くなる時間差をボクセル毎に算出し、安静時fMRI信号遅延時間マップを得た。異常還流域はGd造影灌流画像における相対的ピーク到達時間遅延域と定義し自動抽出した。これと安静時fMRI信号遅延マップの空間的相似性及び両者の量的相似性を評価し、高い相似性および有意な相関があることを示した。また信号遅延が急性期脳梗塞巣でも見られることから、同計測の対象が非神経活動由来であることを示した。安静時fMRI遅延時間解析の安定性評価のため、全10分の撮影を2分し同様の解析を前半/後半についても行い結果を比較し、同計測法の高い安定性も確認した。以上より安静時fMRI信号遅延評価により潅流異常域の範囲と重症度が非侵襲的に評価可能なことを示した。結果は学会(ISMRM 2013, JSMRM 2013)および学術誌(Radiology 2014;270(2):548-55)にて報告した。2)脳脊髄液循環動態異常患者の神経活動異常評価:低髄圧症候群/脳脊髄液減少症患者でのfMRIおよび認知機能評価を術前後にて試行している。術前データの取得は終了しており、認知機能評価の成績と併せて解析を進めている。これまでの研究で、低灌流/慢性虚血下では、神経活動/酸素代謝が正常であっても、血行動態異常を反映してこの重度に応じたBOLD反応遅延・延長が起こることを示している(Amemiya et al. Neuroimage 2013)。今回、安静時fMRIにおいて、心拍・呼吸に付随する生理的ノイズ成分と考えられている全脳平均信号変動を基準とした各ボクセルの位相差を算出することから信号遅延時間評価を試みた。低灌流(慢性虚血及び急性期梗塞)患者群において、Gd造影灌流画像における相対的ピーク時間遅延域と定義し、異常灌流域を自動抽出した。これと、上述のfMRI全脳遅延時間マッピングによる信号遅延域との間に高い空間的相似性、有意な量的相関があり、灌流異常域の同定と重症度評価が非侵襲的に可能なことを示した。また信号遅延が急性期梗塞域に見られることから、計測対象が非神経活動由来である事を示した。結果は学会(核磁気共鳴学会2013、大会長賞)および論文(Amemiya et al. Radiology 2014)にて発表した。平行して脳脊髄液減少症患者における、自発的神経活動および認知機能異常の変化を髄液漏出の治療前後にて、working memory課題および安静時fMRIによるlocalおよびnetwork levelでの神経活動計測を行い縦断的に評価した。術前の認知機能低下とtask-positive network nodesにおけるALFF(amplitude of low frequency fluctuations)の相関は術後、認知機能の回復にともなって減弱、正常化しており、脳脊髄液減少下における機械的圧排/浮力低下に伴う前頭葉底部での異常神経放電が、可逆性認知機能障害を起こしている可能性が考えられた。結果は学会(核磁気共鳴学会2014)にて発表した。本研究では安静時fMRIにおいて、全脳平均信号変動を基準とした各ボクセル信号の遅延時間をマップすることにより、全脳灌流時間の計測が出来ることを示した。また信号遅延が急性期梗塞域に見られることから、計測対象が非神経活動由来である事を示した(JSMRM 2013、大会長賞、Amemiya etal. Radiology 2014)。一方で健常者においては、全脳性のfMRI信号の伝播が血液灌流の時差とは別に存在すること、この伝播性信号がtask-positive networkとdefault-mode-networkの相互作用の基盤となる神経活動を見ている可能性があることを報告した(JSMRM 2015, Amemiya et al. Neuroimage 2016)。平行して脳脊髄液減少症患者における、自発的神経活動および認知機能異常の変化を髄液漏出の治療前後にて、working memory課題および安静時fMRIによるlocal/ network levelでの神経活動計測を行い縦断的に評価した。

術前の認知機能低下とtask-positive network nodesにおけるALFF(amplitude of low frequency fluctuations)の相関は術後、認知機能の回復にともなって減弱、正常化しており、脳脊髄液減少下における機械的圧排/浮力低下に伴う前頭葉底部での異常神経放電が、可逆性認知機能障害を起こしている可能性が考えられた(JSMRM 2014, Amemiya et al. Cephalalgia 2016)。虚血下における安静時fMRI信号の相対的時間差を算出することにより、全脳灌流時間の計測が出来ることを示した。また信号遅延が急性期梗塞域に見られることから、計測対象が非神経活動由来である事を確認し、虚血患者にて神経障害の有無に関わらず、同法にて灌流時間マッピングが可能であることを示した。平行して脳脊髄液減少症患者における、自発的神経活動および認知機能異常の変化を髄液漏出の治療前後にて縦断的に評価し、認知機能変化と関連する自発性神経活動の変化を同定した。計画に沿って研究データ取得、解析を施行し、結果を基にして得られた研究成果を国内学会にて発表した(日本磁気共鳴医学会大会)。今後未発表の内容につき、国際学会および投稿中の論文にて発表を行う予定である。放射線医学国際学会および投稿中の論文にて研究成果の発表を行う予定である。研究計画書に沿ってデータ収集と解析を行っている。1) fMRIによる脳血行動態異常評価:安静時fMRI時間差解析により、個人レベルでGd造影還流画像のtime-to-peak mapと空間的、量的に同等の情報が得られることが確認できた。これは当初の予想よりよい結果であり、健常者とのオーバーラップの大きい(個人差の大きい)amplitude等による指標を用いた実験は不要となった。2)脳脊髄液循環動態異常患者の神経活動異常評価:計画通り、脳脊髄液減少症、低髄圧症候群術前患者15名のデータ収集を終えている。ここまでのデータ解析で、認知機能指標と相関する成分の同定に至っており、今後さらに解析を進める予定である。論文の受理、発刊が遅延しているため、成果発表のために参加できる国際学会の日程が遅延したため1)fMRIによる脳血行動態異常評価:血行動態異常下・脳梗塞患者の結果から、今回の実験方法で計測される安静時fMRIでの信号位相差が血行動態により生じることが示されている。本結果をさらに発展させるために、同様に健常者で確認される位相差が脳循環動態の部位による差異により説明可能かを検討するための準備実験をはじめることを検討している。2)脳脊髄液循環動態異常患者の神経活動異常評価については、今後も計画通りに進める。論文掲載費用、学会参加に関わる経費学会参加の旅程変更および、掲載誌からのカラー画像料請求が遅延しているため繰越する。学会参加、論文掲載カラー画像料、その他余裕があれば未購入のままになっている機材の購入に当てる予定である。
抗酸化物としての羅布麻の探索

本研究課題で得られた結果を列記する。1.ラット血漿から超遠心法で分離した低比重リポ蛋白(LDL)に,酸化剤のCu^<2+>を加え,その酸化能をチオバルビツール酸反応物質を指標に検討した結果,あらかじめ羅布麻エキスを経口投与したLDLでは,酸化を著しく抑制する知見が得られた。また血中の遊離コレステロール,LDL-コレステロール,血漿,肝組織中のマロンジアルデヒドレベルの低下も認められ,羅布麻エキスに抗動脈硬化作用が示唆された。2.粥状動脈硬化病変への酸化LDLの機能を細胞を用い検討した。内皮細胞にLDLとCu^<2+>を添加して培養した場合,培地中へのチオバルビツール酸反応物質,総LDHの放出が増加して,細胞生存率の低下が観察された。しかし羅布麻エキス添加群ではこれらパラメータがいずれも改善し,またマクロファージを用いた系でもチオバルビツール酸反応物質,コレステロールエステル,コレステロールエステル/遊離コレステロール比がいずれも無添加群より有意に低下し,形態学的な変化も酸化LDLのとり込みに伴う泡沫化の形成を抑制する知見が得られた。このことから,羅布麻は酸化LDLが関与する動脈硬化の進展過程を抑制することが明らかとなった。3.老化における酸化防御機構における影響を老化促進マウス(SAM)を用い検討し,SAMで認められた酸化的ストレス状態を羅布麻エキスが緩和していた。酸化LDLはコレステロールエステルの細胞内での蓄積をもたらすのみならず,さまざまな炎症性変化をひき起こし,粥状動脈硬化発生の初期には,細胞内に大量のエステル化コレステロールを蓄積した泡沫細胞の血管内皮下での局在的な集蔟がみられるのが特徴とされ,このような泡沫細胞の起源は,血中の単球由来のマクロファージ及び血管平滑筋細胞であるといわれるが,特にその極めて初期の病変では,その大部分がマクロファージ由来であるとされている。本実験においてもマクロファージとLDL,Cu^<2+>を同時に培養した場合,LDLの酸化変性とともにエステルコレステロールが蓄積した泡沫化したマクロファージが蛍光顕微鏡下で多数観察された。しかし羅布麻エキスを添加した群では,これら所見がいずれも軽減し,特にエステルコレステロールの蓄積の程度がnativeLDL存在下の場合と匹敵するレベルにまで低下していた。また内皮細胞にLDLとCu^<2+>を添加して培養した場合,培地中へのTBARS,総LDHの放出が増加,細胞生存率の低下が観察されたが,羅布麻エキス添加群ではこれらパラメータがいずれも改善し,羅布麻エキスの抗動脈硬化作用を細胞レベルで明らかにした。Steinbergらは粥状硬化の形成において酸化LDLは,(1)血液単球に対して走化性を有し,血管壁へ単球を引き込むとともに,一旦動脈内膜へ侵入してマクロファージ化すると,その遊走を抑制して血液中へもどるのを阻止する,(2)scavenger受容体を介してマクロファージにとり込まれ,これを泡沫化する,(3)強い細胞障害性を有し,内皮障害を来して病変を進行させることを挙げ,酸化LDLが粥状動脈硬化の発症から進展巣の形成に至る広汎な段階に関わっている可能性が示されている。本実験において,羅布麻エキスが酸化LDLによってもたらされたマクロファージの泡沫細胞化と内皮細胞障害性に対し抑制作用を有することが示され,さらに走化性,遊走能などの検討も必要であるが,先に報告した高コレステロール投与ラットを用いた経口投与実験,無細胞系における酸化LDLの生成抑制作用から鑑み,羅布麻エキス自身が粥状硬化進展の予防に有用である可能性が推測された。血漿中には酸化を受けやすいリポ蛋白が存在し,さらに金属イオン,酸素濃度も高く,低比重リポ蛋白(LDL)の酸化による変性はアテローム性動脈硬化の発症の原因ともなっている。一方,フリーラジカルや活性酸素種の攻撃に対して,生体は種々の防御システムを有しているが,血漿中にもラジカルの生成の抑制,ラジカルの捕捉,さらには傷害による修復,再生機能などを備え持っている。

また必要に応じて抗酸化物を発生させ,必要な場へ送るという適応機能も持ち合わせていることが明らかにされているが,その能力は細胞内と比較して弱いことが指摘されている。このことからラジカルの生成を抑制する抗酸化物の開発が注目されている。すでに羅布麻葉が他の抗酸化物とは異なって,抗酸化活性とともに高LDL血症改善作用を有し,LDLの酸化に影響を及ぼしていることが示唆されたが,本年度はその活性成分をフリーラジカルを指標に検討し,羅布麻葉エキスにhyperoside,isoquercitrin,chlorogenic acid等を含有していることをMCI-gel CHP-20P,Sephadex LH-20カラムクロマトグラフィー等を駆使し,明らかにした。
形状記憶合金を用いた人工括約筋の開発

形状記憶合金(SMA)を尿道括約筋として用いる場合、SMAの特性、括約筋装置としての形状、さらに用いるバイアススプリングにより全体として得られる力が異なる。そのため色々な組み合わせのものを作製し、それぞれの平熱時と加熱時の流量を測定した。その中で、臨床応用を考えた場合に基本的形状と考えられる装置を用いて実験を行なった。本括約筋装置は、二方向形状記憶効果を持つ4枚の形状記憶合金薄板(Ni-Ti合金、厚さ0.2mm)よりなり、各板は常温(室温)時に円弧形状、加熱すると平になるように記憶されている。バイアススプリングとしてゴム輪を用い、装置は最大の状態で15mmX25mmX18mmである。実験1では尿道モデルとして内径6mm、外径8mmのシリコンチューブを使用した。実験2では10kg前後の雑犬の尿道に装着して行った。各尿道には70-100cmH_2Oの一定圧を付加して流量を測定した。加熱方法は温水(実験1)および電熱線(実験2)を利用した。結果実験1:常温時には流れを完全に閉鎖できた。加熱時は46°Cで弁が開き始め、65°Cで完全に解放され最大流量24ml/secが得られた。加熱を中止した場合は自然放熱としたが、60°Cで閉鎖が始まり46°Cで完全に閉鎖した。実験2:常温時に犬尿道の流れを完全に閉鎖できた。加温はDC4.5Vの電圧を印加して行った。印加後100secで最大45°Cに達し、印加停止30sec後に35°Cになった(時間一温度特性)。30°Cで流れが急速に始まり最大1.8ml/secを維持した後、冷却後35-30°Cで流れが停止した(温度一流量特性)。印加30sec後に急速に最大流量1.8ml/secに達し、印加停止後30secで流量0となった(時間一流量特性)。印加後30secでは尿道負荷圧が100cmH_2Oから86まで低下し、印加停止後30secで100cmに回復した(時間一圧力特性)。今後さらに人体埋め込みを目的に、形状記憶合金の変態温度特性と装置の改良を検討したい。形状記憶合金(SMA)を尿道括約筋として用いる場合、形状記憶合金そのものの厚さと括約筋としての形状、さらにバイアススプリングとして用いる金属あるいはシリコンゴムの性質により、全体として得られる力が異なる。その中で、閉鎖特性と小型化が可能な点から人体に埋め込むには右図の形状のものが基本的形状と考え、多少工夫を加えながら実験を行なった。本装置は二方向形状記憶効果を持つ4枚の形状記憶合金薄板よりなり、各板は常温(室温)時に円弧形状(図b)、加熱すると平(図c)になるように記憶されている。バイアススプリングとしてゴム輪を巻いてある。尿道モデルは内径6mm、外径8mmのシリコンチューブを使用した。尿道には70cmH_2Oの一定圧を付加して流量を測定した。

加熱方法は温水および電熱線を利用した。実験結果:常温時の流量は0ml/secで流れを完全に閉鎖できた。加熱時は46°Cで開き始め、65°Cで完全に解放され最大流量24ml/secが得られた。加熱を中止した場合は自然放熱としたが、60°Cで閉鎖が始まり46°Cで完全に閉鎖した。人体に埋め込む場合は動作温度が問題となり、上記実験に用いた合金の変態温度では不都合である。しかし、合金の組成、熱処理、加工方法どよって形状記憶合金の変態温度を制御できるので、合金を人体埋め込みに適した温度に設定することは可能である。今後より小型化し、さらに体外から非接触で加熱できる高周波誘導加熱を検討する。形状記憶合金(SMA)を尿道括約筋として用いる場合、SMAの特性、括約筋装置としての形状、さらに用いるバイアススプリングにより全体として得られる力が異なる。そのため色々な組み合わせのものを作製し、それぞれの平熱時と加熱時の流量を測定した。その中で臨床応用を考えた場合に基本的形状と考えられる装置を用いて実験を行なった。本括約筋装置は、二方向形状記憶効果を持つ4枚の形状記憶合金薄板(Ni-Ti合金、厚さ0.2mm)よりなり、各板は常温(室温)時に円弧形状、加熱すると平になるように記憶されている。バイアススプリングとしてゴム輪を用い、装置は最大の状態で15mm×25mm×18mmである。実験1では尿道モデルとして内径6mm、外径8mmのシリコンチューブを使用した。実験2では10kg前後の雑犬の尿道に装着して行った。各尿道には70-100cmH_2Oの一定圧を付加して流量を測定した。加熱方法は温水(実験1)および電熱線(実験2)を利用した。結果実験1:常温時には流れを完全に閉鎖できた。加熱時は46°Cで弁が開き始め、65°Cで完全に解放され最大流量24ml/secが得られた。実験2:常温時に犬尿道の流れを完全に閉鎖できた。加温はDC4.5Vの電圧を印加して行った。印加後100secで最大45°Cに達し、印加停止30sec後に35°Cになった(時間-温度特性)。30°Cで流れが急速に始まり最大1.8ml/secを維持した後、冷却後35-30°Cで流れが停止した(温度-流量特性)。印加30sec後に急速に最大流量1.8ml/secに達し、印加停止後30secで流量0となった(時間-流量特性)。印加後30secでは尿道負荷圧が100cmH_2Oから86まで低下し、印加停止後30secで100cmに回復した(時間-圧力特性)。今後さらに人体埋め込みを目的に、形状記憶合金の変態温度特性と装置の改良を検討した。
細胞内情報伝達経路に作用する天然生物活性物質の探索とその応用

本研究は、ヒト培養細胞の細胞内情報伝達経路に作用点を持つ天然由来生物活性物質の発見、及びそれを探索分子として用いた情報伝達系の解析、から構成される。「ヒトT細胞におけるInterleukin-2遺伝子」及び「ヒト血管内皮細胞における血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子(Flt-1,KDR)」の発現を制御する情報伝達経路に対象を絞り、古来漢方において汎用されてきた生薬(約100種)についてスクリーニングを行った結果、いくつかの生薬エキスに上記の情報伝達を変調させる活性が見出された。そして、Interleukin-2遺伝子発現増強物質として、10年度に単離したOxyberberine(黄連)、Linoleic acid酸化物(厚朴)に加え、新たにEugenol(丁子)及びFalcarinol(前胡)を単離同定した。また、Flt-1遺伝子について、発現増強物質として「艾葉」からポリアセチレン化合物を単離し、発現抑制物質として「辛夷」からFarnesol誘導体を同定した。さらに、先に大黄よりIL-2遺伝子発現増強物質として単離されていたアントラキノン類の細胞内標的を同定するため、アフィニティカラムと二次元電気泳動を組み合わせた新しい解析法を開発した。そして、Glyoxalase Iをその標的の一つとして同定した。Glyoxalase Iは解糖系の副産物として生成するMethylglyoxalを、グルタチオンの存在下に解毒する酵素であるため、この阻害によって蓄積するMethylglyoxalがIL-2遺伝子発現に影響を及ぼすものと推測された。また、アントラキノンの直接の標的はグルタチオンである可能性もあるため、現在さらに詳しい検討を進めている。そして、Interleukin-2遺伝子発現増強物質として、「黄連」からOxyberberine、「厚朴」からLinoleic acidの酸化物を単離同定した。また、Flt-1遺伝子について、発現増強物質として「〓葉」からポリアセチレン化合物を単離し、発現抑制物質として「辛夷」からFarnesol誘導体を同定した。さらに、OxyberberineをヒトT細胞株Jurkat細胞に投与した際に、Interleukin-2と共に発現量が変動する遺伝子群をディファレンシャルディスプレイ法により解析し、いくつかの発現変動遺伝子の存在を確認した。そのうちの一つは、呼吸鎖において機能するcytochrome coxidase複合体の形成に必須なタンパクとして同定されているCOX15をコードする遺伝子であることが明らかになった。今後、ディファレンシャルディスプレイ法による情報伝達ネットワークの解析に加え、アフィニティラベル法を応用して標的となる細胞内情報伝達因子の同定を進めていく予定である。
平滑筋における自発活動発現の細胞内機序に関する生理学的研究

平滑筋細胞の自動運動発現機序を研究する目的で、モルモット胃平滑筋を用い研究を開始したが、平滑筋細胞同士のギャップ結合を介する興奮伝達が非常に重要であることがわかってきたので、その研究も行った。ギャップ結合の研究はモルモット小腸壁に分布する小動脈血管を用いて研究した。モルモット胃体部平滑筋の自発活動は縦走筋、輪走筋、間質細胞で異なっていた。輪走筋のみの標本では、微小脱分極反応(数mV)が観られ、その頻度は脱分極により増加した。周期的に20-25mVの緩電位が現れ、これらはいずれもニフェジピンで抑制されなかったので電位依存性Caチャネルを介さないと考えた。緩電位は細胞内電極により通電して膜を脱分極させても誘発されたが、再現性ある反応を誘発させるには20秒以上の間隔が必要で、このことは緩電位を発生するイオンチャネルは非常に長い不応期をもっていることが推定された。また電気的に脱分極させると緩電位発生には非常に長い(約1秒)潜時がみられた。細胞内Caイオン濃度をBAPTAなどで低下させるとこれらの反応は非常に発生しにくく、またCPAなどで筋小胞体からCaイオンを枯渇させると緩電位は発生しなくなった。そこで、緩電位は膜の脱分極により未知の機構により筋小胞体から遊離されたCaイオンが膜の未知イオンチャネルを活性化し、発生すると考えた。膜の未知イオンチャネルについては、その後更に研究を継続している。18β-glycirrhetinic acid(GA)はギャップ結合を遮断するといわれているので、細動脈血管を用いてGAの効果を調べた。平滑筋細胞間はギャップ結合で電気的に連絡しているが、血管では平滑筋と内皮細胞との間にもギャップ結合があることが知られている。そこで実験は内皮細胞と平滑筋細胞の連絡について調べた。細動脈では内皮細胞の興奮は平滑筋に伝搬し、またその逆方向にも伝搬することがわかった。GAはこれらのギャップ結合を非選択的に遮断することが判明した。そこでGA処理により単離した内皮細胞あるいは平滑筋細胞を酵素処理をしなくても作成できることが判明した。GA処理した血管では内皮細胞依存性過分極反応は平滑筋でのみ消失した。この血管ではアセチルコリンで内皮細胞内Caイオンは増加し、平滑筋は過分極したが、GAの作用から、過分極因子(EDHF)を考えなくても膜反応を説明できることが解った。モルモット胃輸送平滑筋を摘出し、自発活動に伴う平滑筋細胞内カルシウム(Ca)イオン濃度をfura-2により測定した。胃幽門部平滑筋の自発活動は組織のサイズを200ミクロン程度にまで細分するまで観察でき、微小電極法により、平滑筋細胞からは律動的に発生する緩電位が記録できた。

緩電位はニフルミン酸(塩素イオン透過抑制薬)によっても変化せず、シクロピアゾン酸(細胞内Ca貯蔵部位へのCa摂取抑制薬)により停止し、カフェイン(小胞体Ca遊離薬)で停止したので、小胞体Caが自発活動発現には重要であることが推定できた。Fura-2による蛍光も細胞の自発活動に伴い律動的に変化し、ニフェジピン(Caチャネル抑制薬)で蛍光変化の振幅は減少したが、自発的蛍光変化は消失しなかった。蛍光と膜電位の同時測定により、膜電位変化が蛍光変化に先行して起こることがわかり、このことは自発活動は細胞内におけるCaがその契機になっているのではなく、膜電位変化がおこり、脱分極に伴いCa濃度の変化が起こることが明らかになった。しかし細胞外液からCaを除去すると自発活動は停止したので、自発活動発現にはCa流入が必須であり、それによって発動された脱分極がさらにCa流入や消胞体からのCa遊離を促進して細胞内Ca濃度を上昇させ、筋を収縮させると思われた。さらに、自発活動の契機となるCa供給の機構や、緩電位発現のイオン機序について解析を行う。平滑筋細胞の自動運動発現機序を研究する目的で、モルモット胃平滑筋を用いて研究を開始したが、平滑筋細胞同士のギャップ結合を介する興奮伝達が非常に重要であることがわかってきたので、その研究も行った。ギャップ結合の研究はモルモット小腸壁に分布する小動脈血管を用いて研究した。(1)胃平滑筋の自動運動モルモット胃体部平滑筋の自発活動は縦走筋、輪走筋、間質細胞で異なっていた。輪走筋のみの標本では、微小(数mV)の膜電位変化が観られ、その頻度は脱分極により増加した。周期的に膜の大きな(20-25mV)脱分極(緩電位)が現れ、これらはいずれもニフェジピンで抑制されなかったので電位依存性Caチャネルを介さないと考えた。緩電位は細胞内電極により通電し膜を脱分極させても誘発されたが、再現性ある反応を誘発させるには20秒以上の間隔が必要で、このことから緩電位を発生するイオンチャネルは非常に長い不応期をもっていることが推定された。また電気的に脱分極させると緩電位発生には非常に長い(約1秒)潜時がみられた。細胞内Caイオン濃度をBAPTAなどで低下させるとこれらの反応は非常に発生しにくく、またCPAなどで筋小胞体からCaイオンを枯渇させると緩電位は発生しなくなった。そこで、緩電位は膜の脱分極により未知の機構により筋小胞体から遊離されたCaイオンが膜の未知イオンチャネルを活性化し、発生すると考えた。膜の未知イオンチャネルについては、その後更に研究を継続している。(2)ギャップ結合18 β-glycirrhetinic acid(GA)はギャップ結合を遮断するといわれているので、細動脈血管を用いてGAの効果を調べた。平滑筋細胞間はギャップ結合で電気的に連絡しているが、血管では平滑筋と内皮細胞との間にもギャップ結合があることが知られている。そこで実験は内皮細胞と平滑筋細胞の連絡について調べた。細動脈では内皮細胞の興奮は平滑筋に伝搬し、またその逆方向にも伝搬することがわかった。GAはこれらのギャップ結合を非選択的に遮断することが判明した。そこで酵素処理をしなくても、GA処理により単離した内皮細胞あるいは平滑筋細胞を作成できることが判明した。GA処理した血管では内皮細胞依存性過分極反応は平滑筋でのみ消失した。この血管ではアセチルコリンで内皮細胞内Caイオンは増加し、平滑筋は過分極したが、GAの作用から、過分極因子(EDHF)を考えなくても膜反応を説明できることが解った。