hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト抗体ライブラリを用いた網羅的配列解析によるガン細胞特異的ヒト抗体の創製研究

特異的なクローンを単離し、scFv-Fcフォーマットでの結合活性の確認を行うことに成功した。以上の結果は、抗体ファージライブラリからの特異抗体の単離・同定に、NGSを用いた網羅的配列解析手法が、極めて効率的で有用なことを示している。本研究では、達成することができなかった、細胞を標的としたパンニングについても、今後は、フローサイトメータを用いた新しい手法の導入により、本手法の有用性を示していきたい。本研究は、ヒト抗体ライブラリー技術に、次世代シークエンサーを使った網羅的配列解析技術(NGS法)を組み合わせることによる、より短期間で確実な特異的抗体の単離システムの構築を目的とした。成果として、肝ガン細胞、並びに食道がん細胞を標的としたルテラン並びに抗原Aの組み換え型タンパク質に対する抗体の単離をNGS法によって行い、特異的な複数の結合クローンの単離に成功した。この結果は、NGS法が通常のクローニング/結合スクリーニングに比べ、多数の結合クローンの同定において有用であることを示している。申請時の予定では、健常人由来抗体ライブラリからのS1T細胞特異的な抗体ファージの分離と網羅的配列解析についても実施を予定していたが、Hep-G2に対しする細胞パンニングにおいて、予想外に多くの結合クローンが得られたことから、本研究では、標的のガン細胞としては肝ガン細胞に絞ることにした。26年度の研究目標である、得られた抗体の特異性の確認は、十分に達成されたが、もう一つの細胞パンニングから得られた抗体クローンの抗原の同定には至っていないため、本年度の評価を、やや遅れているとした。タンパク質工学、免疫学平成27年度の予定としては、得られた抗体をタンパク質として発現させ、結合活性の再確認と共に、標的とする抗原を含めたエピトープ解析を行っていく予定である。即ち、以下の項目を推進する(2)得られた抗体タンパク質を用いて、Western blotting解析並びに、マススペクトル解析により、抗原を同定する。(3)得られた抗体タンパク質を用いて、肝ガン患者の組織切片の免疫染色を行い、特異的な免疫染色に使用できる抗体かどうかの評価を行う。以上の検討を通して、本方法が、ヒト抗体ライブラリからの癌細胞特異的抗体の単離において、特に、迅速かつ多様な抗体を同定する上で優れた方法であることを実証し、今後の抗体医薬開発に貢献する。申請時の予定では、(3)健常人由来抗体ライブラリからのS1T細胞特異的な抗体ファージの分離と網羅的配列解析についても実施を予定していたが、この項目については、健常人由来抗体ライブラリではなく、白血病患者由来抗体ライブラリを用いた、白血病細胞株(S1T細胞)に対する抗体の単離に一部変更した。ライブラリの遺伝子ソースなどの準備に手間取ったことから、本年度は、この項目についてはライブラリ構築までは行ったものの、解析の実施はできなかった。しかしながら、本年度の研究目標である、網羅的配列解析の有用性については、上記(1)と(2)によって、十分に達成できたことから、本年度の評価は、おおむね順調とした。平成26、27年度の予定としては、得られた抗体のHEP-G2細胞並びにS1T細胞への結合活性を確認するとともに、予定していた以下の臨床検体サンプルへの応用を検討していく。
ニホンナシ花芽分化期にFT転写が誘導されない要因の解明

ニホンナシの花芽分化期にFLOWERING LOCUST (FT)の発現が誘導されない要因について解明すべく花芽分化期におけるin situ hybridizationによりFT転写物を解析したが、センスプローブによるバックグランドが高く明確なシグナルが検出できなかった。FTタンパク質については抗FT抗体の特異性が低くく再確認の必要があるが、FTは花芽分化期を通して芽に存在している可能性が示唆された。他方、FTと拮抗するTERMINAL FLOWER1(TFL1)の発現は花芽分化に先立ち低下することから、FTは準備万端の状態にありTFL1の低下により花芽分化が始まると推察した。ニホンナシのFT遺伝子が、花芽分化期に明確な遺伝子の発現上昇が認められない原因について明らかにする。まず、FTの花芽分化中の発現解析を行い、これまで同様に花芽分化期にFTの堅調な発現上昇が認められないことを確認した。続いて、単離しているニホンナシ由来のFTとTFL1が機能を有するかについて、シロイヌナズナのft変異体とtfl1変異体に導入した。FTとTFL1の遺伝子導入により、それぞれft変異体は早咲き性を、tfl1変異体は遅咲き性を確認した。このことからニホンナシ由来のFTとTFL1が機能のある蛋白質をコードしていることが明らかとなった。さらに、ナシの花芽の分化前、中、後のin situ hybridizationを行った。経時的に芽をサンプリングして分化ステージを調査するとともに、パラフィンで包埋してin situ hybridizationに供した。その結果、アンチセンスFTプローブのシグナル強度が、センスFTプローブのシグナルよりも強く(バックグランドのシグナルが高い)、花芽分化の進行に伴う明確なFTシグナルが検出できなかった。また、TFL1については分化期間中を通してシグナルは極めて弱かった。特に、アンチセンスFTプローブでシグナルが高く出てしまう原因を探るため、FTの下流遺伝子(FTの発現誘導後に発現が高まる遺伝子)であるLFY遺伝子をコントロールとして、in situ hybridizationを行ったところ、センスLFYプローブのシグナルを綺麗に検出することができ、花芽分化が進むに従ってシグナル強度が期待通りに高くなった。そのため、実験系自体は悪くないことが判明した。今後は免疫組織化学法により、FTの蛋白質を検出して、その花芽分化中の変化を解析する。ニホンナシのFT遺伝子が、花芽分化期に明確な発現上昇しない原因について明らかにする。これまで、ナシの花芽分化前、中、後の時期の組織でin situ hybridizationを行い、FT遺伝子の存在様式を明らかにしようとしたが、バックグランドのシグナルが高く、花芽分化の進行に伴う明確なFT遺伝子のシグナルを検出することはできなかった。そこで、免疫組織化学法により、FTタンパク質を検出した。まず、抗FT抗体が正常に作用するかを確認するため、大腸菌でFT遺伝子を発現させてFTタンパク質とし、抗FT抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。強いシグナルバンドが約23Kdaのサイズで検出された。このサイズは、発現ベクターのHATタグのサイズと計算上のFTタンパク質のサイズを合計したサイズに一致したため、抗FT抗体は正常に働いていると考えた。続いて、花芽分化前、中、後の花芽からタンパク質を抽出しウエスタンブロット解析を行ったところ、サイズが約35KDaと、大きいサイズでシグナルが検出された。この大きくなった原因の一つとしてFTタンパク質に糖鎖が修飾している可能性を世界で初めて示した。また、ウエスタンブロット解析で、FTタンパク質は花芽分化の時期にかかわらず一定量存在していることを示した。この結果は免疫組織化学法の結果とも一致した。FTタンパク質の茎頂での存在箇所は、リンゴのMdFTで示されている箇所とも一致した。以上のように、ニホンナシでは、FTは花芽分化の時期にかかわらず一定量存在していること、そして、花芽分化前のTFL1遺伝子の発現低下によるFT/TFL1遺伝子(タンパク質)比の変化が重要で、この低下による相対的なFTの比率の上昇が花芽分化を誘起している可能性を示唆した。果樹園芸学平成25年度に予定してたFTの発現解析、シロイヌナズのft変異体による機能解析を行うとともに、in situ hybridizationを一応行うことができたため、「おおむね順調に進展している」と判断した。FTの遺伝子レベルでの検出は難しいことが分かった。シロイヌナズなどのモデル植物では、FTのmRNAではなく、蛋白質が茎頂組織で作用していることが知られているため、免疫組織化学法により、FTの蛋白質を検出して、その花芽分化中の変化を解析する。FTのin situ hybridizationが期待通りに検出することができなかった。そこで、蛋白質レベルの検出に未使用予算を投資することとしたため。免疫組織化学法を効果的に行うため、本法に対する技術と知識をを持った契約職員を雇用するとともに、専門の会社への分析委託を含めて検討する。
高眼圧症の視神経内グリア細胞に及ぼす影響

本研究実施に際して、当初は免疫組織化学的手法を光顕及び電顕観察に用いて、高眼圧におけるグリア細胞を中心とした視神経乳頭部の組織学的変化を捉えるものであったが、各種組織の微細構造の変化を捉えるには従来の光顕及び電顕所見だけでは十分でないことが分かり、代って組織をより自然な状態で、三次元でより高い解析が可能な急速凍結、ディープエッチング法を用いて検討した。実験動物として当初はサルを用いたが、一連の実験を行うに経費が掛かりすぎるため、モルモットに変更した。モルモットの視神経乳頭部は、篩板後部まで有髄神経で篩板部から無髄神経になり眼球内へ移行していき、ヒトの視神経乳頭部と同じ組織形態を有しているため緑内障における視神経乳頭部の変化を捉えるには有用なモデルと思われた。今回の研究では急速凍結、ディープエッチング法という新しい手法により正常眼での視神経乳頭部の微細構造を捉えることが出来た。特に篩板を通過する視神経軸索の内部構造の観察には本法は大変優れ、神経軸索内の微小管、神経フィラメントなどの骨格蛋白が明瞭に描出されたばかりか、これらをつなぐクロスリンカーも同定することが出来た。更にグリア細胞内構造、篩板細胞外マトリックスの微細構造、及びこれらの微細構造と視神経軸索の形態学的関係も明かにすることが出来、手法の有用性が証明された。α-キモトリプシン、アルゴンレ-ザ-隅角線維柱帯光凝固などによる日本ザル高眼圧眼作成は非常に困難を極めたため、白色家兎眼に変更した。白色家兎眼後房内にα-キモトリプシンを注入し、高眼圧眼を作製し、その視神経内グリア細胞の変化を免疫組織化学的手法を用いて調べてみた。モノクロ-ナル抗人GFAP抗体は家兎視神経グリア細胞にも交叉性があり染色も良好で、コントロ-ルとの形態学的比較は容易であった。光顕的に篩板前後における神経線維の破壊、変性とともにグリア細胞の変化が明らかに認められた。そもそもグリア細胞は神経要素が阻害された場合、それを修復、充填する作用もあり障害部位でのグリア細胞の増殖も考えられる。そこで、同時にブロモデオキシウリジン(BRDu)を前もって静注しておき、増殖しているグリア細胞が取り込んだBRDuを、抗BRDu抗体を用いて染色してみた。しかし今回の実験で用いた高眼圧家兎眼ではその染色性は不良であり、これに対し以下のような推測がされる。用いた高眼圧家兎眼の眼圧に対して受けた障害が強すぎたためグリア細胞の障害も強く、その機能を発揮していなかったのではないか。又、高眼圧により視神経が障害される場合、グリア細胞が反応する時期があり、今回得られた組織の場合とは時間的にズレがあったことが考えられる。したがって、今後は更に視神経グリア細胞の形態的な変化と、活動性(増殖性)の変化を経時的にとらえる必要があることが示唆され、これを追求していくことにする。高眼圧下における視神経内グリア細胞の活動性に経時的な変化が捕らえられれば、緑内障による視神経障害の可逆性、不可逆性がつかめると考える。6匹の猿眼を使用して片眼に実験的高眼圧症をキモトリプシン後房内注入、及び線維柱帯光凝固で作製し、他眼にコントロ-ルとして視神経乳頭篩板前後の神経膠細胞の変化を経時的に神経膠細胞のマ-カ-であるGlial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)による免疫組織化学染色と細胞増殖の有無をブロモデオキシウリジン(Brdu)法で光学顕微鏡により観察し、視神経乳頭の緑内障性陥凹状態と神経膠細胞の変化を比較検討した。眼圧は経時的に空気眼圧計(PTG,Alcon社製,Fortworth,Texas,USA)で測定し常に実験眼が525mmHg高眼圧状態にあることを確認した。又、眼底検査により視神経乳頭に緑内障性陥凹が惹起されていることを確認した。

様々な病期の猿を屠殺前30分にブロモモデキシウリジン(Brdu)30mg/Kgを静注し、眼球を摘出し、ザンボニ液で固定後、型通りパラフィン切片作製し、脱パラ後3%過酸化水素水で内因性ペルオキシダ-ゼを阻止し、一次抗体(Antiーhuman GFAP mouse monoclonal antibody:1/100 SAB10)で1時間反応させ、更にPBSで洗浄後ペルオキセダ-ゼ標識二次抗体を(Antiーmouse IgG:1/100:BIOSYS COMPIEGNE)を1時間反応させた後、PBSで水洗しDABーH_2O_2溶液に浸し発色させた。コントロ-ル眼においてGFAP陽性部は視神経乳頭生理的陥凹部分で2ー3層にわたり観察され、主としてGFAP陽性細胞(神経膠細胞)は視神経線維束周囲、網膜中心動静脈周辺に観察されネットワ-ク状に互いに連なっていた。乳頭緑内障性陥凹が進行するに従いGFAP陽性細胞(神経膠細胞)の肥厚があり、視神経線維を包む神経膠細胞の走行、構造の乱れがみられ、BrdU陽性所見を示す神経膠細胞の増加がコントロ-ルに較べ明らかで、神経膠細胞の増殖が起こっていることが推定された。これらの結果は高眼圧により緑内障性乳頭陥凹が形成される際、神経膠細胞は神経線維が傷害され消滅していく過程でそれを補整、修復していくものと考えられる。今後、緑内障性乳頭陥凹の成因を究明する為にまず、(1)正常眼における細胞外マトリックスの分布、局在、(2)加令に伴う変化、(3)緑内障病期による局在、分布の変化等も検討されねばならない。眼圧上昇に伴う、視神経軸索輸送障害の機序と篩板への影響を検討するために、正常モルモットの視神経乳頭篩板部の微細構造をquickーfreeze,deepーetch,rotaryーshadow法にて解析した。1.篩板を通る視神経軸索の微細構造を明らかにした。軸索内にはmicrotubule(mt)やneurofilanent(nf)が主な骨格を成し、その間には無数のcrossーlinkerが認められ、軸索内小器管もこのIinkerによって結合されていた。高速軸索輸送を支えるこれらのcrossーlinkerは5つに分類され、篩板の前後で形態学的影響を受けるかどうかを知るため、篩板前後でのlinkerの長さを定量した。その結果、篩板の前後で差がないことが分かり、軸索内の微細構造は篩板によって影響されない事が示唆された。2.篩板を構成する各種成分の微細構造を明らかにした。特に神経膠細胞と篩板膠原線維との境界の基底膜と、篩板内マトリックスの微細構造が立体的に解明され、視神経軸索にかかる圧力が篩板膠原線維まで伝達される経路が理解された。
脳血管形成と細胞周期の協調的な制御メカニズムの解明

我々は、小型魚類のゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いて、初期の脳血管系がいかにして構築され、その後どのようにして椎骨動脈系と統合されるか、その全過程を明らかにすることに成功した。そして血管内皮細胞の核で特異的に蛍光を発する遺伝子組み換え体の観察から、初期に頭部灌流血液の静脈路として機能するPHBC(primordial hindbrain channel)から後脳実質を貫き脳底動脈へとループしてつながるCtA(central artery)が萌出する直前に、PHBCを構成する内皮細胞の数が劇的に増加する現象を捉えることに成功した。このことは血管系がその後の血管新生に先んじて内皮細胞の細胞分裂を進行させている、すなわち血管系の形態形成と細胞周期が協調的に制御されていることを示している。そこで本研究課題では、細胞周期を可視化するFucciを血管内皮細胞で特異的に発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作成し、得られた胚をタイムラプス・イメージングすることで、脳血管形成過程における細胞周期変化の全容を詳細に解析する。また血管新生因子として最重要な役割を果たしているvascular endothelial growth factor(vegf)遺伝子やその上流に位置すると想定されているsonichedgehog(shh)遺伝子に着目し、heat shock protein(hsp)プロモーター下流につなげ、Infrared Laser-Evoked Gene Operator(IR-LEGO)を用いた熱応答により発現が誘導できる組み換え体を作成する。局所的な熱応答により時間・空間的に制御した異所的な遺伝子発現を血管周囲の神経組織や脊索で誘導することで、その後の細胞周期への影響を評価する。平成30年度には、作成した系統を用いてライトシート顕微鏡によるタイムラプス観察を行った。しかしながら細胞分裂期に発現を認めるはずのGemininに連結した緑色蛍光を十分に観察することができなかった。また29年度に樹立した方法では、同時に3系統を組み合わせたトリプル・トランスジェニック胚を使用する必要があり、すべてのレポーター遺伝子を十分発現している胚の取得がうまくいかない場合があった。これらの問題点を解決するために、より効率的に血管系でレポーター遺伝子を発現させ容易にライン化できる強力かつ長さの短いプロモーターの作成を試みた。すなわちこれまで使用してきたflk1(kdrl)のプロモーターの発現調節に関係しない領域を削り5kbpまで短くしたコンストラクトを作成した。kdrl_shortP:EGFPを1細胞期の受精卵にインジェクションしたところ非常に高効率でトランジェントでのEGFPの発現が確認できた。またF0世代のスクリーニングでも20-30%の高確率でfounderが得られた。またレポーター遺伝子も、自己開裂型の2Aペプチド配列を利用して、mCherry-zCdt1-P2A-mVenus-zGemininのコンストラクトを作成した。平成30年度に、これらを組み合わせたコンストラクトの作成は終了しており、今後ライン化を行い、早急にイメージングによる解析を進めていく。一方、熱反応でvegfaやshha遺伝子の誘導可能な系統の作成では、平成30年度に、hsp:EGFPCAAX-P2A-mCherryCAAX(control)、hsp:EGFPCAAX-P2A-vegfaa、hsp:EGFPCAAX-P2A-shhaの3系統のfounderを得ることに成功した。令和元年度には、まずは平成30年度に作成したkdrl_shortP: mCherry-zCdt1-P2A-mVenus-zGemininのライン化を行う。完成したラインでは、1系統で血管内皮特異的にFucci2分子を同時に発現させることが可能となり、また15体節期からの観察が可能となる。これを用いて、15体節期から始まる脳血管の脈管形成過程とその後の血管新生過程での細胞周期との関連性を解析する。さらに受精後1.5日目からのPHBCを中心としたタイムラプス・イメージングも行い、血管形成過程と細胞周期との関連性を詳細に解析する。これらのイメージングはライトシート顕微鏡を用いて行うが、われわれはすでにライトシート顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ胚のタイムラプス・イメージングに関しては、十分な経験を積んでおり、イメージング開始から48時間程度の連続した観察が可能であることも確認してある。また令和元年度には、熱反応で遺伝子誘導可能な遺伝子組み換えゼブラフィッシュを用いた細胞周期へのvegfa遺伝子やshha遺伝子の影響評価も合わせて行う。血管内皮で特異的にFucciを発現する系統とのダブル・トランスジェニック胚を用いることで、血管内皮のFucciをイメージングしながら、同時にIR-LEGO顕微鏡を用いて時間空間的に制御したvegfa遺伝子やshha遺伝子を発現誘導し、その後の細胞周期の変化をリアルタイムでイメージングにより評価する。

そこで本研究課題では、細胞周期を可視化するFucciを血管内皮細胞で特異的に発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作成し、得られた胚をタイムラプス・イメージングすることで、脳血管形成過程における細胞周期変化の全容を詳細に解析する。また血管新生因子として最重要な役割を果たしているvascular endothelial growth factor(vegf)遺伝子に着目し、heat shock protein(hsp)プロモーター下流につなげ、Infrared Laser-Evoked Gene Operator(IR-LEGO)を用いた熱応答により発現が誘導できる組み換え体を作成する。局所的な熱応答により時間・空間的に制御した異所的な遺伝子発現を血管周囲の神経組織や脊索で誘導することで、その後の細胞周期への影響を評価する。平成29年度には、まず血管系で特異的にFucciを発現する遺伝子組み換え体の作成を行った。DNAコンストラクトとしては、血管系で特異的に発現を誘導するflk1遺伝子のプロモーターを用いてFucciを直接発現させるもの(flk1:Fucci)と、Gal4-UASの系によるもの(UAS:Fucci)の2種類を作成し、1細胞期の受精卵へインジェクションを行った。その結果、直接Fucciを発現誘導する系では、founderが得られなかったが、Gal4-UAS系を用いる系では、founderを得ることに成功した。そして既に作成してあったflk1:GFF(Gal4の改変体)の系統と新たに作成したUAS:Fucciの系統を交配することで、血管特異的にFucciを発現する系統を作成することに成功した。さらにこの系統の胚をライトシート顕微鏡で観察し、細胞分裂期の血管内皮細胞で緑色蛍光が、またそれ以外の細胞周期の血管内皮細胞で赤色蛍光が発現されていることを確認した。これらの発現は、発生が進行する過程で一部の細胞では切り替わっており、Fucciが機能して血管系での細胞周期が可視化されていることが確認できた。一方、熱反応で遺伝子誘導可能なDNAコンストラクトの作成では、hspの発現制御領域下流に、膜移行シグナルを付加したEGFP(EGFPCAAX)とP2A配列を介して各血管新生関連因子(vegf、shh、mCherryCAAX(control用))のcDNA配列をつなげたコンストラクト(hsp:EGFPCAAX-P2A-血管新生関連遺伝子)の作成を行った。シークエンスによる確認も済んでおり、30年度にはインジェクションを進めていきラインの確立を目指す。我々は、小型魚類のゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いて、初期の脳血管系がいかにして構築され、その後どのようにして椎骨動脈系と統合されるか、その全過程を明らかにすることに成功した。
ニューラルネットワークモデルを用いた大学入試動向の解析と予測

近年、大学入試においては、面接や小論文を入試科目として加えたり、推薦入学制度や帰国子女特別選抜の導入などにより多様化が進められている。また、18才人口の減少などによる志願者数や進学率の大きな変動も予想される。実際に、平成10年度センター試験出願者数は前年度より若干減少し、大学進学者が今後減少していくような徴候が見られるようになった。このため、志願者数や進学率を含む大学入試の動向を予測することは、大学入試センターのみならず、各大学にとっても非常に重要な問題である。本研究では、各大学の試験科目や制度、併願状況、および受験倍率などのパラメータをニューラルネットワークモデルによりモデル化し、今後の動向の予測を行う。本研究で構築するニューラルネットワークモデルを用いたモデルによって、より正確に大学入試の動向を捉えることが可能となる。そして、将来的な変化がより正確に予測できるため、将来目指すべき入試制度を模索するための重要な手段の一つとなるものと考える。平成11年度には、平成10年度の研究成果を実際のデータに適用した。まず、本研究において使用するデータの作成を行った。次に、各大学を受験難易度、地域などのプロフィールによって分類し、それぞれのプロフィール毎にニューラルネットワークモデルを当てはめた。これにより、プロフィール毎の特色についての解析も行った。また、この際全データに当てはめた場合との比較検討も行った。そして、モデル構築後、妥当性を検討するためにシミュレーション実験を行うとともに、パラメータの推定値そのものの違いからそれぞれの大学の特色に関しての検討も行った。平成10年度は、一般的なニューラルネットワークモデルにおける初期値とパラメータ推定の方法に関する研究を行った。特に、推定方法に関しては、比較的収束が速く、1次微分の係数さえ計算が可能であれば適用できるガウス・ニュートン法をニューラルネットワークモデルに応用することを考えた。この方法の場合、計算の途中で逆行列を求めることが必要となるが、本研究で取り扱うデータは各大学の試験科目や制度、併願状況、および受験倍率などパラメータが非常に多い。このため、逆行列を計算するためのアルゴリズムにも注意が必要となる。そこで、様々な逆行列計算、パラメータ推定のためのプログラムを作成し、多くのシミュレーション実験を行った。
レニン分泌細胞の機能に関する生理,生化学的研究

ラット腎皮質初代培養細胞を用いてレニン遊離におよぼすアドレナリンα-作動薬並びにCa-作動薬の影響について検討した。体重約80gのWistar系雄性ラットの両腎を、灌流,洗滌した後、その腎皮質を細切した。次いで0.25%トリプシン液を用いて細胞を分散させ、遠心、洗滌操作を繰り返した。得られた腎皮質細胞がトリパンブルー排除試験陰性であることを確認した後、これをPercall密度勾配上に重層し、遠心分離後、レニン活性の最も高い分画を分取した。本分画を10%牛胎児血清を含むRPM11640培地に加え、48時間5%【CO_2】下培養した後、実験に供した。分取した細胞のレニン活性は、約50ng angiotensin【I】/hr/【10^4】cellsであった。これらの細胞を培養した場合、培養3日目まで、レニン活性は顕著に増大したが、以後は徐々に低下した。培養48時間後の細胞懸濁液に【10^(-8)】【10^(-4)】MのノルエピネフリンあるいはBay K8644を添加すると、メジウム中へのレニン遊離は薬物濃度の増加に応じて減少した。このレニン遊離減少作用は、Ca拮抗薬及びカルモデュリン阻害薬の添加により消失した。上記の作用は、実験材料として腎皮質切片を用いた場合にも認められた。従来より、単離灌流腎や腎皮質切片を用いて、レニン遊離と細胞内Ca濃度の間に負の相関性があることが提案されてきた。レニン分秘細胞を豊富に含む腎皮質初代培養系を用いた本実験結果は、上の仮説を強く支持するものである。なお、細胞内遊離Ca濃度の測定については、現在検討中である。
付加環化活性を有する有機遷移金属分子の創製

Diels-Alder反応に代表される[4+2]付加環化を選択的に進行させるには、ジエノフィルに電子吸引性置換基が必要であり、一般的なアルキンを基質とした場合には、苛酷な反応条件を必要とするため、位置選択性が悪いことに加え、脱水素による芳香族化をさけられなかった。本研究では、1,4-ビス(ジフェニルホスフィノ)ブタンとシクロオクタジエンを配位子としてもつロジウム(I)カチオン錯体が、イソプレンをはじめとする共役ジエンと1-ヘプチンなど通常の末端アルキンとの[4+2]付加環化のきわめて効率的な触媒となり、温和な条件下にほぼ完全な位置選択性で、1,4-ジアルキル置換-1,3-シクロヘキサジエン誘導体を合成できることを明らかにした。このロジウム(I)カチオン活性種は、さらに1,6-ヘプタジイン誘導体とノルボルネンとの[2+2+2]付加環化によるビシクロ環化反応に対しても、有効な触媒作用を示すことも発見した。さらにロジウムの4核カルボニルクラスター錯体が、ホモプロパルギルアミン、一酸化炭素、ならびにアルキルシラン、相互間の三成分一段連結反応の良好な触媒となり、塩基存在下に、対応するα-(シリルメチレン)-γ-ラクタム骨格を一段階で構築できることを見いだした。例えば、o-エチニルアニリンからは、オキシインドール環が形成できた。典型的なルテニウム(0)錯体である、Ru(1,5-シクロオクタジエン)(1,3,5-シクロオクタトリエン)における両者の8員環配位子が、2分子のプロピオール酸エステルと、[6+2]ならびに[2+2+2]二重付加環化し、新規なビシクロメタラサイクル・ルテニウム(II)錯体が生成すること、ならびにこのビシクロメタラサイクル錯体が、加熱により容易に炭素-水素結合活性化と再結合をおこし、対称構造をもつ新たなルテニウム・ビス(π-アリル)錯体に異性化することを発見し、その異性化機構を明らかにした。
含飛散性アスベスト排ガスのマイクロ波プラズマ化による無害化処理

飛散性アスベストを含む排ガスを、大気圧下でマイクロ波放電によりプラズマ化し、その高温・高反応活性を利用してアスベストを無害化する技術について、実際に飛散性アスベストやアスベスト模擬物質を用いて実験を行った。その結果、形状変化や組成変化が観察され、この処理法の有効性を示した。また、アスベスト処理システムを例に挙げ、ここから排出される含アスベスト排ガスの処理に、この処理装置を組み込む実用的な配置を提案した。この研究では、飛散性アスベストを含む排ガスを、迅速で安全にそして確実に無害化するため、排ガスを大気圧下でマイクロ波放電によりプラズマ化し、その高温・高反応活性を利用して、アスベストを溶融・熱分解・ガラス化することで形状変化および構造変化を起こさせ、無害化する技術を開発するものである。今年度は、大気圧マイクロ波空気プラズマの特性と固体粒子への熱収支挙動の解析と、アスベスト疑似固体で主な組成がアルミナとシリカであるセラミックウールを用いた処理実験を行った。後者では、投入電力、キャリアガス流量、空気流量、サンプル質量流量などを変化させて実験を行った。解析法は、回収したセラミックス繊維をSEMで100200個程度撮影し、画像解析ソフトを用いて各粒子の投影面積、投影周長を測定した後、粒子形状指標である投影面積円相当形と円形度を計算する。そして処理効率を表すものとして、ある円形度以上の粒子の投影面積の総和を求め、処理前の値との比を球状化率と定義し、各実験操作条件に対する球状化率の変化を調べた。その結果、融点の低いセラミックウールでは投入エネルギーの増加と共に球状化率が上昇したが、融点の高いセラミックウールは大きな変化が見られなかった。また、ガスの流量が増加すると球状化率が低下した。プラズマの温度を仮定し、セラミックウールが融点まで達し、その後全て融解するまでの伝熱現象を簡単にモデル化し得られた伝熱パラメータと実験で得られた球状化率との相関を取ったところ、一つの傾向にまとまることが示唆され、その傾向から本方法によりアスベストは十分に処理できると推測された。今年度は、純アスベストとアスベスト含有廃棄物を実際に大気圧マイクロ波空気プラズマに導入し、その処理の状態を調べた。用いたアスベストはクリソタイル、アモサイト、クロシドライドである。分析は、粒子形態を電子顕微鏡で、含有の有無を位相差顕微鏡とX線回折で行った。その結果、どの純アスベストも形状が変化し、球状等に溶融固化することがわかった。また、位相差顕微鏡やX線回折結果から、アスベストの含有が大幅に減少し、また後者からは新たなピークも観測され、アスベストが構造変化を起こしていることが明らかとなった。また、含有物でも球状等の溶融固化が確認され、位相差顕微鏡写真からはアスベストは検出されなかった。さらに、含有物の平均アスペクト比を処理前後で比較し、その結果、危険とされるアスペクト比3以上のものが大幅に減少することも明らかとなった。なお、実験では処理する粒子の定量導入が課題となることも示された。一方、プラズマの数値解析も開始し、旋回流が円管中心部の圧力を減少させ、そのためプラズマが安定化することが示唆された。得られた結果から本方法により飛散性アスベストは処理が可能であると推測された。この研究は、飛散性アスベストを含む排ガスを、迅速で安全にそして確実に無害化するため、排ガスを大気圧下でマイクロ波放電によりプラズマ化し、その高温・高反応活性を利用して、アスベストを溶融・熱分解・ガラス化することで形状変化および構造変化を起こさせ、無害化する技術を開発するものである。これまでの2年間に得られた結果から、この方法により飛散性アスベストは処理が可能であると推測されており、最終年度にあたる21年度は、アスベスト疑似固体であるセラミック繊維やステンレス繊維を、これまで行ってきたアスベスト等の処理と同一の条件で実験を行い、その形状変化や組成変化を調べると共に、これまで得られている各種純アスベストやアスベスト混合物の処理結果と共に総括した。実験の結果、セラミック繊維やステンレス繊維はその融点や初期形状により溶融状態が異なった。そして全ての試料について、プラズマからの熱による昇温と溶融を示す指標を定義し、その指標と、危険とされるアスペクト比が3以上のものの繊維の減少率(針状消失率)の相関を取ったところ、物質にかかわらず比較的良い相関が得られた。そして、この相関から、針状消失率がほぼ1となるための指標を知ることができ、円柱形の純アスベストを想定すると、直径が10μm以下のものであれば、本方法で針状を消失することができると推測され、本処理法の有効性が示された。

また、ロータリーキルン型アスベスト処理システムを例に挙げ、ここから排出される含アスベスト排ガスの処理に、このマイクロ波処理装置を組み込む実用的な配置を提案し、本研究の総括とした。
広域行政圏単位の土地利用変化の分析とその予測モデルの構築

各自分担した研究テーマに対して下記実績を得た。1.国土数値情報の1/10細分区画土地利用データを用いて、香川県における1987年から1997年の宅地化の構造を説明するモデルを二項ロジットモデルで構築した。説明変数としては、地形、地質、期首の人口、期首の土地利用に関する指標を用いて研究を進めた結果、宅地化はこれらの指標により比較的良い精度で推計可能であること、また期首の土地利用が重要な要因となっていることが明らかとなった。2.マルチレベル・モデリング・アプローチによって、単層モデルよりも少数の指標から精度のより高いモデルを構築できるだけでなく、単層モデルでは捨象された地域特性を汲み上げることに成功した。農協のリーダーシップ、労働市場の展開水準、農業投資の水準、農村コミュニティの紐帯の強さなどの地域的要因が上位レベルから農地分布を規定している点が明らかになった。3.台湾南部における灌漑プロジェクト地域を対象にして、リモートセンシングデータを用いた画像解析を行い、土地利用変化を定量的に捉えるとともに、その変化をもたらした要因を明らかにした。さらに、これらの計測結果と要因分析に基づいて農地利用の変化を、農業内での土地利用変化と他用途への転用の二つに分けて捉え、それぞれに関するに関するダイナミック・システム・モデルの構築を試みた。4.広域行政圏単位の土地利用変化分析結果を集大成した。最後に、以上の今年度成果を含めてこれまでの3年間の研究成果を最終報告書としてとりまとめた。平成12年度研究実施計画に沿って研究を進め、以下の成果が得られた。1.広域圏単位の土地利用データベースを構築し、土地利用状況と地域構造の分析に基づいて広域行政圏の類型化を行った。今後、この類型化に基づいて、広域行政圏単位の土地利用変化モデリングを進めていく。2.わが国の3大都市圏で整備されている細密数値情報を用いて、ゾーニングと土地利用変化の関係等、詳細な土地利用変化分析を行うと共に、土地利用変化モデリングのための基本的枠組み整理を行った。3.土地利用、自然的条件、農業センサス等の統計データを市町村単位に編集して全国データベースを構築し、このデータベースを用いて全国の農地分布の要因分析を行った。分析では、市町村レベルと県レベルの2段階の階層的な要因構造を仮定し、マルチレベルモデルを適用した。市町村レベルの要因では、自然的条件、農業経営指標、都市化指標がそれぞれ農地分布を決定する有意な要因と認められたが、そのような要因の作用力は、県レベルの特性(地方労働市場の展開度、農業投資水準、農協の組織力)に依存していることが確認された。4.農地利用がどのような要因によって変化し、その変化がどのようなメカニズムによって生じているかを明らかにするため、農地の農業外への利用転換(たとえば農地の工業用地への転換)と農地の農業内での利用転換(たとえば水田から畑への転換)の二つに分け、利用転換のメカニズムをシステムダイナミックス・モデルによってモデル化した。5.土地利用変化と社会・経済条件の関係をみるために、市町村間通勤行列および市町村別業種別従業者数(1960、1975、1990年)に関するデータベース整備を進めた。具体的事例として香川県の土地利用を重点的に分析することとし、今年度はとくに香川県の土地利用上重要な要素となる溜池データの整備を重点的に行った。土地利用データベースについては、前年度に引き続き、広域行政圏単位の土地利用データ整備を進めたほか、香川県の土地利用モデルの構築を目的として土地利用(100mメッシュ)、地形(標高・傾斜50mメッシュ)、地質(ポリゴン)、人口(1kmメッシュ)、農業集落カード(ポイント)等をGISデータベースとして整備し、三次元空間解析による地域の自然立地条件把握に資するシステムを開発した。土地利用変化分析については、市町村県の2階層データに対してマルチレベルモデルを適用し、市町村別の農地面積率の変化量(1975-90)を目的変数にとって、農地動態のドライビング・フォースを明らかにした。前年度に実施した農地分布モデルの場合と比較すると,自然立地条件および経営指標(営農類型)の係数の符号が逆転しており,その作用が大きく異なっている点を明らかにした。

また、大都市圏周辺域の土地利用変化については、10mメッシュの細密数値情報データを利用して3大都市圏の土地利用変化の特徴を抽出するなど、詳細な土地利用変化分析を行った。土地利用変化予測モデリングについては、中国無錫市周辺地域を対象にして、リモートセンシングデータを用いた画像解析により土地利用変化を定量的に捉えるとともに、その変化をもたらした要因を明らかにした。さらに、これらの計測結果と要因分析に基づいて土地利用変化に関するダイナミック・システム・モデルの構築を試みた。また、新しい試みとして、細密数値情報を利用した生態学的モデルによる土地利用変化予測モデルの適用性について検討を加えた。まず、今年度は、各自分担した研究テーマに対して下記実績を得た。1.国土数値情報の1/10細分区画土地利用データを用いて、香川県における1987年から1997年の宅地化の構造を説明するモデルを二項ロジットモデルで構築した。説明変数としては、地形、地質、期首の人口、期首の土地利用に関する指標を用いて研究を進めた結果、宅地化はこれらの指標により比較的良い精度で推計可能であること、また期首の土地利用が重要な要因となっていることが明らかとなった。2.マルチレベル・モデリング・アプローチによって、単層モデルよりも少数の指標から精度のより高いモデルを構築できるだけでなく、単層モデルでは捨象された地域特性を汲み上げることに成功した。農協のリーダーシップ、労働市場の展開水準、農業投資の水準、農村コミュニティの紐帯の強さなどの地域的要因が上位レベルから農地分布を規定している点が明らかになった。3.台湾南部における灌概プロジェクト地域を対象にして、リモートセンシングデータを用いた画像解析を行い、土地利用変化を定量的に捉えるとともに、その変化をもたらした要因を明らかにした。さらに、これらの計測結果と要因分析に基づいて農地利用の変化を、農業内での土地利用変化と他用途への転用の二つに分けて捉え、それぞれに関するに関するダイナミック・システム・モデルの構築を試みた。4.広域行政圏単位の土地利用変化分析結果を集大成した。ついで、以上の今年度成果を含めてこれまでの3年間の研究成果を最終報告書としてとりまとめた。
薬物代謝型シトクロムP-450の変異遺伝子と疾患

本研究の目的は、シトクロムP-450の変異遺伝子と疾患との関連を種々のシトクロムP-450サブファミリーについて調べ、シトクロムP-450がどのような疾患と関連しているのかを知ることにより、シトクロムP-450の生体機能を理解することにある。昨年度までにシトクロムP-450IIDサブファミリーの変異遺伝子とパーキンソン病や肝臓疾患との関係を明らかにしてきた。当年度は、神経疾患や肝臓病の原因になることが考えられる薬物代謝型シトクロムP-450IICサブファミリーと疾患との関連を解析することを試みた。まずシトクロムP-450IIC18遺伝子のDNA多型をPCR法と制限酵素で検索し、遺伝子の5 ́側上流のDdeIサイトが多型的であることがわかった。このサイトの遺伝子型およびシトクロムP-450IID6遺伝子の多型的なHhaIサイトの遺伝子型を72人の肝臓病患者、64人のパーキンソン病患者および56人の健常者について調べた結果、パーキンソン病や肝臓病患者にはコントロールの健常者に比べて両方の遺伝子についてのヘテロ接合体が6倍以上多くみられた。この差は5%レベルで有意であった。これらのことより、シトクロムP-450IIC18変異遺伝子がシトクロムP-450IID6変異遺伝子と共にパーキンソン病や肝臓病の発症過程になんらかの関与をしている可能性が示唆された。今後、シトクロムP-450間の相互作用や種々の疫病発症のメカニズムをモデル動物等を用いて解析することが望まれる。
筋分化誘導型オリゴDNAによる筋萎縮の予防・治療の基盤研究

超高齢社会では健康寿命の延伸が喫緊の課題である。特に、加齢や代謝疾患に伴う筋萎縮は、運動機能の低下を惹起する。しかし、骨格筋の恒常性維持に必須な筋芽細胞の分化能は加齢により減弱するため、筋芽細胞に作用し、その機能を活性化する分子の開発と実用化が求められている。我々は、筋分化を強力に誘導する分子として、乳酸菌ゲノム配列に由来するオリゴDNA「myoDN」の同定に成功した。本研究では、myoDNの筋分化誘導能を活用し、加齢性筋肉減弱症(サルコペニア)の予防法や、糖尿病等の代謝疾患で併発する筋萎縮の治療法の開発を目指す。本研究により、myoDNが機能性食品や医薬品として応用されることが期待される。
代数解析的手法の代数幾何の研究における応用

研究目的に掲げた精密化されたサイクル写像の単射性に関しては特筆すべき成果を挙げる事は出来なかったので、研究の対象をチャウ・キュネット分解に関するミューレの予想に変更し、これをコホモロジーのレベルが1以下の場合に証明し、更に特異点が0次元で像が1次元であるような多様体の間の写像の場合に拡張した。超平面配置のb-函数については、マルグランジュの定理の拡張をエノー、シェヒトマン、フィーベックらによる吉本予想の解決と組み合わせる事により、その比較的簡単な計算法を得た。これにより例えば次元が3で次数が8以下の超平面配置のb-函数は手で計算できる。超平面配置の乗数イデアルに関しては、跳躍係数が組み合わせ不変量であるというムスタタの予想を証明した。超曲面の乗数イデアルに関しては、ディムカ、メゾノーブ、トレリ氏らと共に、これが非特性超平面切断への制限ど可視である事を示し、スペクトラムに関する結果を導いた。交叉コホモロジーにおける代数サイクル類に関する花村氏との議論を発展する事により、交叉コホモロジーとコホモロジーのウェイト・フィルトレーションとの関係を一般の体の上で証明し、ウェーバー氏の結果を拡張した。ディムカ氏と共に、通常2重点を持った超曲面の局所コホモロジーのホッジ・フィルトレーションと極位数フィルトレーションとが一般には異なる事を示し、更にこれに関連したヴォツラフの予想を特異点の数が比較的少ない場合に証明した。2006年6月のヨーロッパ訪問に於いては、パリ南大学のイリュジー氏やエッセン大学のエノー氏と交叉コホモロジーに対するレフシェッツ公式についての議論を交わすことにより東北大学の花村氏の理論との関連が浮かび上がり、4人による共同論文に結びついた。2006年8月のシアトルでのアメリカ数学会の夏期学校では花村氏との議論を行うことにより、その理論をさらに進めることができた。これはレフシェッツ公式の局所項をデ・ヨング氏のオールタレイション上のサイクルの交叉理論を使うことにより書き表そうというものであるが、オールタレイションのコホモロジーと元の多様体の交叉コホモロジーとの関係はかなり複雑で、局所項を簡単な形で表すのは容易ではない。シアトルの夏期学校ではその他にミシガン大学のムスタタ氏やジョンホプキンス大学のブドゥール氏との議論を行い、超平面配置の跳躍係数が組み合わせ不変量であるというムスタタ氏の予想の解決に結びつけることができた。これはブドゥール氏の理論を使うことにより、ステンブリンク氏の意味のスペクトラムが組み合わせ不変量であることを示せばよいが、帰納法を使って実際に証明するのにはかなりの技術的困難を伴う。6月のヨーロッパ訪問に於いてはその他にニース大学のディムカ氏やメゾノーブ氏と非特性超平面切断に於けるスペクトラムの振舞についての議論を行い、それがホッジ加群の理論から自然に導かれることがわかった。これはその後ニース大学のトレリ氏を加えて4人による共著の論文に到った。2006年6月の5日から11日までバンクーバーに於けるモチーフと周期に関する研究集会に出席してチャウ・キュネット分解に関する研究発表を行い、またミューレ達と代数サイクルに関する議論を交わす機会を得た。これはコホモロジーのレベルが1以下の場合にチャウ・キュネット分解に関するミューレの予想の証明を与えるものであるが、最近特異点が0次元で像が1次元であるような多様体の間の写像の場合に拡張する事が出来た。2006年6月の17日から25日までイタリアのサン・セルボロ島に於けるホッジ理論の研究集会に招待され、超曲面のコホモロジーのホッジ・フィルトレーションに関するグリフィス理論の一般化に関するディムカ氏との共同研究の発表を行った。これは非孤立特異点を持った超曲面のブリースコルン加群を使うことにより一般化を行うものであるが、類似の理論を超平面配置のb-函数の計算に応用する事が出来、非常に有用である。

実際、これとエノー、シェヒトマン、フィーベックらによる青本予想の解決とを組み合わせる事により、次元が3で次数が8以下の場合には、計算機を使ってもなかなか計算できない超平面配置のb-函数を比較的簡単に手で計算する事が出来る。2006年10月の4日から12日までフランスのオルセイのイリュジー氏やニースのディムカ氏を訪問し、交叉コホモロジーに対するレフシェッツ公式やグリフィス理論の一般化についての議論を交わしたりすることが出来た。後者については最近、特異点が通常2重点ばかりからなる場合にベルリン大学のヴォツラフ氏による予想が提出され、これを特異点の個数が比較的少ない場合には解くことが出来たが、一般にはまだ未解決である。
新規真空プロセスによる有機高分子光電変換素子の研究開発

16年度から継続して研究している「真空スプレー法」に関する技術を、高分子のナノ界面構造制御技術として、さらに研究を発展させた。真空スプレー法は溶液中にポリマーと機能性色素を溶解し、真空中に溶液を噴霧することで残存溶媒の少ない色素分散薄膜を形成する技術である。今年度は溶液中のポリマーに対する機能性色素濃度を変化させながら真空中に溶媒を噴霧する技術を発案し、従来の溶媒を用いたポリマー製膜法(スピンコート法・キャスト法・ディッピング法など)では形成困難であった多層膜や濃度傾斜構造膜を真空スプレー法で形成できた。また、最新の透過電子顕微鏡技術(STEM/HAADF:高角散乱暗視野/走査型透過電子顕微鏡)を用いることで、上述の構造を効果的に評価できることを見出した。さらに、キャスト法で形成した薄膜と比較して、高濃度色素分散薄膜が形成できる、ポリマー薄膜中の色素の凝集体サイズが非常に小さい膜を形成できるという優位点を確認した。9月には国際会議「International Symposium on Polymers for Advanced Technologies 2005」(ハンガリー、ブダペスト)および「2005年光化学討論会」(福岡)にて発表を行った。真空スプレー法でポリマー型光電変換素子を形成し、評価した。また、組成・構造を詳細に分析した結果を膜形成法にフィードバックさせ、光電変換素子性能の向上を行った。
細胞接着因子様の細胞外ドメインを持つ新規レセプター型チロシキナーゼの機能

1994年、私達は脳に特異的に高発現する新規なレセプター型チロシンキナーゼ、"Sky",をヒトcDNAライブラリーよりクローニングした。Skyは細胞内ドメインにチロシンキナーゼ構造をもち、細胞外ドメインにイムノグロブリン様ドメインとフィブロネクチンタイプIIIドメインをもつ。これらの細胞外ドメイン構造は神経細胞接着因子(NCAMs)やプロテインチロシンフォスファターゼなどの細胞接着因子に共通にみられる構造で、Skyは神経系における細胞接着に関与する可能性が考えられる。本研究では、Skyの機能を明らかにするため、まずラットSkyのcDNAをクローニングし、これをプローブとして、in situ hybridizationによりSky mRNAの脳内発現分布を明らかにした。この結果、skyは海馬CA1領域、小脳顆粒細胞層、嗅球内顆粒層、帯状回、紐蓋、扁桃体、大脳皮質など神経細胞の密に存在する部位での高い発現が観測された。またSkyに対する特異抗体を用いて、Skyの自己リン酸化活性化及びSrcファミリーキナーゼとの会合について明らかにした。さらにSkyの機能を解明するためSkyのリガンドを検出する系を作成した。すなわち、Skyの細胞外ドメインとヒトIgGのFc領域の融合蛋白質を発現させ、これを用いた発現クローニング及び、アフィニティークロマトグラフィーによるリガンドの精製を現在進めている。
半導体レーザーを用いた一酸化炭素フラックス測定法の開発

主要な大気汚染物質である一酸化炭素の動態探査技術として、レーザー分光法と緩和渦集積法を組み合わせた一酸化炭素フラックス計測法の開発に挑戦した。一酸化炭素は、都市大気であってもせいぜい数百ppb程度しか存在しないため、その実時間検出には半導体レーザーを用いた超高感度吸収分光法を採用した。そして、従来は二酸化炭素フラックスの計測に用いられてきた微気象学的手法の一つである緩和渦集積法を一酸化炭素用に改良し、レーザーシステムと連結した。この新しい手法の性能検証のため、大阪府立大(大阪府堺市)の研究棟の屋上で、野外大気の試験観測を行った。大都市における一酸化炭素フラックスの変動特性を初めて捉えた。平成28年度はまず、レーザー分光法を用いた一酸化炭素分子の超高感度計測が可能と考えられる4.6ミクロン付近の複数の孤立振動回転線に注目し、分子分光データベースに収録されている分光パラメータを使って、吸収線の温度および圧力依存性をシミュレーション計算により評価した。圧力依存と温度依存を同時に評価するため、Voigt関数を用いた。これにより、一酸化炭素分子の計測として、100 Torr程度のセル圧力が適していることが明らかになった。これは、減圧することによって、吸収線の線幅が狭くなり、他分子からの干渉を受けにくくなるためである。またシミュレーション計算により、計測に与える温度ドリフトの影響を抑えるための、技術的な工夫、具体的には試料ガスの温調が必要であることが示唆された。これらを踏まえて、中赤外レーザー光を用いて、一酸化炭素分子の検出実験を実験室内にて行った。分光法としては、軸はずし型の超長光路吸収分光法を用いた。光学セルにガスを導入するためのガス導入系および真空系を製作した。平成28年度はまた、微気象学的なフラックス計測法の一つである緩和渦集積法の主要部を設計し、組み立てを行った。超音波風速計は研究代表者が所有しているものを使用しているが、ガスサンプリングラインおよび排気系は、独自に作成した。開発した緩和渦集積装置を、大阪府堺市にある大阪府立大学の建物屋上に設置し、二酸化炭素フラックスの計測を行い、渦相関法によるフラックスと比較した。その結果、開発した緩和渦集積装置が正しく動作していることを確認することができた。レーザー分光装置の開発ならびに緩和渦集積装置の開発ともに、おおむね当初の予定通りに開発を進めることができている。本年度はまず、前年度より開発を行ったレーザー分光システムの性能評価を行った。具体的には、検出感度の安定性を調べるために、標準ガスを一定流量で光学セルにフローさせ、一酸化炭素濃度の測定値の標準偏差を評価した。同時に、アラン分散解析により、シグナル積算の最適化時間を見積もった。標準ガスとして、圧縮空気ボンベを利用した。圧縮空気ボンベには、京都市内の大気が充填されており、数百ppb程度の一酸化炭素が含まれていた。本年度はさらに、レーザー分光法による一酸化炭素測定センサーと、緩和渦集積法によるフラックス測定システムとを連結し、一つの測定システムとして稼働させた。実際の野外大気で試験的な観測を実施するために、大阪府立大学(大阪府堺市)にある研究棟の屋上にシステムを設置した。屋上であるため、太陽光による極端な温度上昇や雨風を避ける工夫を施した。三次元超音波風速計からのシグナルにより鉛直上向きと鉛直下向きの風成分を分離し、鉛直上向きの際の大気と、鉛直下向きの際の大気を、それぞれ別個のアルミバッグに採取し、レーザー分光システムを用いてアルミバッグ内の一酸化炭素を測定した。緩和渦集積法の測定システムが問題なく動作していることは、事前に、二酸化炭素の緩和渦集積フラックスと渦相関法フラックスとを比較することにより、系統的エラーが生じていないことにより確認した。試験測定時における大気試料の採取口は、超音波風速計のセンサーヘッドに干渉しないぎりぎりの位置に設置した。アルミバッグへの大気採取時間は、30分とした。すなわち、30分平均でのフラックスを導出することができるため、実効的に一日のフラックスデータを48点得ることに成功した。試験観測の結果、観測地における一酸化炭素フラックスにはユニークな時間的変動パターンが見出された。当初の計画どおりに進めていく予定である。大気化学次年度のテスト観測で使用を予定しているガスサンプリングラインなどを予備的にテストしたところ、既存の観測設備の配管やサンプリングバッグ等に、著しい劣化が生じていることが判明した。この劣化は、気温の変動や紫外線によるものと予想される。そのため、劣化部分の補強や刷新が必要なため、28年度経費の一部を、29年度へ充当することにした。

なお、28年度は、双曲線簡易渦集法によるサンプリングシステムについて、過去に試作したサンプリングシステムを補修して使用することで、研究費の節約を図ったため、当初計画からの遅れ等は発生していない。29年度の観測では、無人の森林にサンプリングシステムを取り付ける必要があり、サンプリングシステムに劣化が生じている箇所の厳重な補修を行うべく、特に配管(ステンレス、DKチューブ、テフロンチューブ、コネクター)やサンプリングバッグ等の消耗品に使用する。