hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスグルタミナーゼ修飾が誘起する変性疾患関連タンパク質の分子構造変化の解明

アルツハイマー病などのヒト変性疾患には多くの蛋白質分子が関与するが、それらの分子は、トランスグルタミナーゼ修飾(TG)をはじめとする様々な生化学修飾を受けつつ複雑な分子過程を引き起こしている。その現象群に中で、本課題が主に注目したのは、アミロイド凝集性の分子群に関わるものであり、その凝集過程に対し、TG修飾やリン酸化等の病理的修飾が如何なる効果を及ぼすかを分子レベルで解明した。そのために、大きなアミロイド性分子の配列から凝集に必須な部分の断片を抜き出して、修飾・非修飾体の双方を人工合成し、構造や凝集物性を分子科学的手法で詳細に解析し、例えば以下のような点を明らかにした。1.ポリグルタミン領域を保持する分子群やアルツハイマー病関連のタウ分子由来ペプチドのアミロイド凝集は、TG修飾によって強く抑制された。そこでは複数の分子機構が働き、ペプチド鎖上への負電荷導入やポリアミン分子との架橋形成が原因であることが示された。2.タウ由来ペプチドの繊維状凝集は、リン酸化によって強く影響され、そのメカニズムは主に、リン酸基導入で生じる負電荷に由来することが明らかになった。その効果は、リン酸化の導入箇所周囲の電荷環境に応じて、凝集を促進したり抑制したりする。また、ごく微量のリン酸化された分子が混入することで、系全体の凝集性が極めて強く影響されることも明らかになった。以上の研究の過程で、生化学修飾効果の発現の仕方が、周囲の溶液環境に強く依存することが明らかとなった。そこで、アミロイド凝集過程に対する環境効果自体の知見を従来より深めるための研究も、一方で行った。さらに、生化学修飾を受ける疾患関連分子には膜蛋白質群も含まれることを考慮し、将来の展開の準備として、膜蛋白質の化学修飾現象を扱うための方法論を開発する研究も推進した。本年度は、アミロイド性凝集に対するトランスグルタミナーゼ(tTGase)修飾の効果を検討するために、アミロイド性モデルペプチド分子を用いた実験・シミュレーション系を構築し、引き続いて、その系を用いた凝集実験・分子動力学計算を実施した。ターゲットには、tTGase修飾の関与がよく知られているアルツハイマー病関連のタウタンパク質とハンチントン病関連のポリグルタミン分子を選んだ。1.タウの一次配列のごく一部分が、その凝集にとりわけ重要であることが、既にわかっている。我々は、この小ペプチド部分を人工合成し、さらに、そこに含まれるグルタミン残基をtTGase修飾し、凝集特性や構造特性の変化を解析した。また、他の化学修飾(リン酸化修飾など)の効果とも比較した。それによって、ペプチドの如何なる分子構造変化がアミロイド生成に対して寄与するかを解明しつつある。例えば、VQIVYKという配列のペプチド(PHF6と呼ばれる)を修飾した一連のモデルペプチド群の間の比較検討を行い、その成果の一部を論文発表した。また、同様の実験研究を、人工合成したポリグルタミン分子についても行い、このグルタミン側鎖のtTGase修飾が、ペプチドの凝集特性に強い影響を与えることを見出している。これについても、詳細にデータをそろえて近々に論文発表を行いたい。2.上述の実験結果を補完し分子論的解釈を行うため、モデルペプチド及びそのtTGase修飾体の会合過程をコンピュータ空間上で再現する試みを進めている。例えば、上述のPHF6分子を数個と水分子数千数万個を含む系について、全原子分子動力学計算を行っている。このシミュレーションには長時間の計算が求められるため、まだ研究半ばであるが、19年度も継続して計算・解析を行い、実験結果と総合して、tTGase修飾がアミロイド性凝集に与える影響を、詳細に解明したい。

昨年度に続き、トランスグルタミナーゼ(tTGase)修飾を含む様々なタンパク質修飾が、アミロイド性凝集に及ぼす効果を、アミロイド性ペプチド分子を用いた実験とX線結晶構造に基づいた計算機シミュレーションを併用し、詳細に検討した。ターゲットには、tTGase修飾や他の修飾の関与が知られている疾患関連の分子を複数用いたが、以下では主に、アルツハイマー病関連のタウについて詳述する。タウの一次配列の中で、凝集に重要な部分配列は既にわかっているので、対応するペプチド群を合成し、そこに含まれるグルタミン残基をtTGase修飾し、また、アルツハイマー病の発症に極めて重要なリン酸化修飾をTyrやSerに施し、ペプチドの凝集や構造の変化に及ぼす影響を解析し、それによって、疾患発症の背後にある生化学修飾の効果を解明した。まず、タウに導入されたリン酸基は、それが保持する負電荷と、導入場所周囲の他の電荷残基との静電的相互作用を介して、導入部位特異的に凝集を促進したり抑制したりすることが、明らかになった。この静電的な効果の発現は、tGase修飾にも該当すると考えられ、tGase修飾による負電荷増加に伴い、ペプチド間の静電的相互作用が変化して凝集特性を変えることが示された。これらの結果の詳しい解釈を行うため、タウペプチド及びその化学修飾体のアミロイド構造をコンピュータ空間上に再現し、そのエネルギー計算や分子動力学計算を行い、上述の静電的機構を原子構造レベルで解明した。以上の結果は、アルツハイマー病における生化学修飾の寄与の機構を明らかにしたものであり、この結果を統括した論文を、まもなく投稿する。タウ分子以外にも、ポリグルタミン分子やセルピン分子について、同様の合成ペプチドを用いた手法で、アミロイド性凝集に対するtTGase修飾及び他の生化学修飾の効果に示唆を与える知見を得た。
炭素及びシリコンからなるコアシェル構造を有したリチウムイオン電池負極材料の合成

本研究では、リチウムイオン電池負極用炭素の可逆容量、不可逆容量、サイクル特性などの電気化学的特性向上を目的に、1000°C以下で熱処理された低結晶性炭素をコア材料として用い、CVD法を利用して、高結晶性熱分解炭素、ならびにシリコンをシェル材料として多層被覆した新規負極材料の合成について検討した結果、初期容量1150 mAh/gと現在の負極材料である黒鉛の理論容量より高い値を持つことを見出した。また、初期クーロン効率は黒鉛と同程度であり、良好なサイクル特性を有していることを明らかにした。本年度は、前年度に引き続き、(1)コア用材料の検討として、「高容量低結晶性炭素の合成条件の解明」、および(2)シェル材料の検討として、「熱分解炭素ならびにシリコンコーティング条件と表面構造および電気化学的特性との関係の解明」について検討した。(1)については、前年度のセルロース繊維炭素化物での結果を受け、木質炭素化物(杉)をコア用材料として選定し、炭素化温度の違い、及び熱分解炭素コーティングによる影響について、構造解析と電気化学的特性評価を行い考察した。また、低結晶性炭素ではないが、比較材料として既存負極である黒鉛粒子についても検討した。作製した木質炭素化物および熱分解炭素コーティング試料について、XRDパターンおよびBET比表面積を解析した結果、熱分解炭素膜は、木質炭素化物よりも結晶性は高いが、黒鉛粒子よりは結晶性は低いことを見出し、また、いずれのコア炭素を用いても、ナノメータースケールで非常に緻密な熱分解炭素が析出したことを明らかにした。電気化学的特性評価より、セルロース繊維炭素化物同様、木質炭素化物を用いても黒鉛の理論容量(372mAh/g)より高い容量を示すこと、容量は炭素化温度が低いほど高くなることを明らかにした。また、コーティングにより、いずれのコア炭素を用いても不可逆容量が減少することを見出した。(2)については、本年度は主にシリコンコーティング条件について検討した。セルロース繊維炭素化物をコア炭素に用いて、四塩化ケイ素ー水素ガス系から8001000°CでCVD処理を行うことで、数十nm厚の薄膜状で結晶性のシリコンが析出することを見出した。20wt%のシリコンを析出させた試料について充放電測定を行った結果、コア炭素の容量(450-500 mAh/g)を超える950 mAh/gの容量が得られることを明らかにした。本年度は、8001000°Cの低温で炭素化を行ったセルロース粉末へパルスCVI法を用いて基質炭素上へ熱分解炭素コーティングを行い、炭素化温度の違い、及び熱分解炭素コーティングによる影響について、構造解析と電気化学的特性評価を行い考察した。用いた炭素化セルロース粉末のSEM画像とTEM画像を解析した結果、SEMよりセルロース粉末は大きさにバラつきがあり、熱分解炭素コーティングを行っても凝集していないこと、またTEMより膜厚は10-20μm程度で、熱分解炭素は層状に析出していることを明らかにした。次に、各温度で炭素化したセルロース粉末についてパルスCVI処理前後の試料のXRDパターンを測定し、未処理のものは炭素化温度に関係なく一般的な難黒鉛化性炭素と見られる回折ピークが観測され非常にブロードな002と01のピークが現れること、そして熱分解炭素を析出させることで、002ピークが高角度側へシフトしd002値が減少することを見出した。これは、基質の炭素化セルロースよりも結晶性の高い熱分解炭素が析出したためだと推定した。電気化学的特性評価として、1000°Cで炭素化したセルロース粉末の熱分解炭素コーティング前後での初期充放電曲線を解析し、熱分解炭素を析出させることにより、不可逆容量が減少することを明らかにした。これは、熱分解炭素を析出させることで活性なエッジ面や表面あるいは末端の官能基と電解液との接触を妨げ、不可逆容量の原因となる電解液の分解等を抑制したためだと推察している。また、コーティングにより、不可逆容量の低減に加え、可逆容量の増加がみられた。これは、表面でのLiの導入・脱離速度が向上したためだと考察した。また800900°Cで得られた試料においても、不可逆容量の低減がみられ、処理温度の低下とともに可逆容量が増加することを明らかにした。本研究では、リチウムイオン電池負極用炭素の可逆容量、不可逆容量、サイクル特性、安全性などの電気化学的特性向上を目的に、1000°C前後以下で熱処理された低結晶性炭素をコア材料として用い、独自の手法である圧力を変動させるパルスCVD/CVI法を利用して、高結晶性熱分解炭素、ならびにシリコンをシェル材料として多層被覆した新規炭素の合成について検討した。

コア用材料の検討については、前年度までに、セルロース繊維、木材を用いて、800°Cから1000°Cで炭素化することで、黒鉛の理論容量(372mAh/g)より高い容量を示すことなどを明らかにした。また、シェル材料の検討に関し、熱分解炭素をコーティングすることで、いずれのコア炭素を用いても不可逆容量が減少することを見出した。又、数十nm厚の薄膜状で結晶性のシリコンを20wt%析出させた試料について充放電測定を行った結果、コア炭素の容量(380-500 mAh/g)を超える950 mAh/gの容量が得られることを明らかにした。本年度は、これまでに得られた炭素およびシリコンコーティング条件に関する知見をもとに、シリコンと熱分解炭素を複合化したシェルの被覆を試みた。セルロース繊維炭素化物をコア材料として、まず、シリコン薄膜のみをコーティングしたところ、初期容量は、前述の通り950 mAh/gであったが、クーロン効率が66%と低く、充放電サイクルによる著しい容量低下が見られた。シリコンコーティングの後、さらに熱分解炭素膜を7wt%析出させたところ、初期容量1150 mAh/gを示し、初期クーロン効率は84%と向上した。また、サイクル特性の改善も見られた。以上、本研究により、シリコン膜で大容量化を、熱分解炭素膜で電解液分解の抑制による高効率・サイクル特性向上の機能の複合化が可能であることを明らかにした。電気化学、無機材料合成本年度の目的は,【1】コア用材料の検討として、前年度のセルロース繊維炭素化物に引き続き、その他の高容量低結晶性炭素の合成条件の解明、および【2】シェル材料の検討として、熱分解炭素ならびにシリコンコーティング条件と構造および電気化学的特性との関係の解明についてであった。【1】については、前年度、セルロースで良好な結果が得られたことを受け、セルロースとリグニンを主成分とする木質炭素化物を選定し、系統的に炭素化条件を吟味し、黒鉛を超える容量(372 mAh/g)以上が得られる条件について検討した。その結果、杉を、700から1000°Cで、アルゴン雰囲気中、4時間炭素化することで、372 mAh/g以上の容量が得られることを見出した。特に800°Cで炭素化した木質炭素化物は、コーティング処理を行えば522 mAh/gと大きな容量が得られた。このように、セルロース繊維に加えて、木材でも黒鉛を超える高容量炭素の合成条件を見出すことができ、充分な研究の進展が得られたと考えられる。【2】について、本年度は主にシリコンの析出条件について検討を進めた。その結果、四塩化ケイ素ー水素ガス系から8001000°CでCVD反応を行わせることで、20wt%の析出量で数十nm厚の薄膜状で結晶性のシリコンが析出することを見出した。本試料について充放電測定を行った結果、コア炭素の容量(450-500 mAh/g)を超える950 mAh/gの容量が得られることを明らかにし充分な研究の進展が得られた。熱分解炭素コーティングに関しては、前年度のプロパンガス系からの析出に加え、ベンゼン系など他のガス系からの析出を試みる予定であったが、シリコンの析出を主に検討したため、前年度と同程度の知見が再現よく得られることを確認した段階である。本年度の計画では,【1】コア用材料の検討として、「高容量低結晶性炭素の合成条件の解明」、および【2】シェル材料の検討として、「熱分解炭素ならびにシリコンコーティング条件と表面構造および電気化学的特性との関係の解明」について検討する予定であった。
大規模生態群集に見られる多様性のパターンとその創出機構

多種群集モデルの解析を行い,多様性のパターンが様々な群集パラメータにどのように依存するかを調べた。その結果,種内競争と種間競争の強さの比,種間相互作用行列の対称度,ひとつの種が係わる他の種の数(種間相互作用行列の疎性),種間相互作用における相利と競争の比などのパラメータが群集の多様性のパターンを決定する重要な役割を果たすことを見出した。特に,疎な種間相互作用行列に対して,「全種共存解」や「複数のピークをもつ種個体数分布」を新たに発見した。研究機関中,査読付き論文4本を発表し,8件の国際会議発表(うち2件招待講演,2件シンポジウムチェア)を行った。さらに今年度中に2本の査読付き論文を発表予定。熱帯雨林や珊瑚礁などの,多種からなる大規模生態群集において普遍的に観測される種個体数分布および種数面積関係などの「多様性(種の豊富さ)のパターン」が生み出されるメカニズムの解明は,理学的にも環境保全などの応用上も重要な課題である.これに対し,多種群集の数理モデルを構築し,近年発展してきた統計物理学や集団遺伝学における理論的手法を用いた解析を行い,多様性のパターンがさまざまな群集パラメータにどのように依存するかを調べることが本研究の目的である.当該年度においては,現実に観測される多様性のパターンを示す多種群集の数理モデルとして種間相互作用が時間的に変動する適応的・進化的な群集モデルの振舞いを統計力学的な方法を用いて理論的に調べ,種間相互作用の時間変動が確かに群集の安定性や多様性に寄与することを見出した.これは従来シミュレーションによって得られていた描像を厳密な数学的解析によって証明した最初の結果である.さらに,中立性を破る「格子ほぼ中立モデル」の振舞いをGPUを用いた超並列シミュレーションによって解析した結果,ある条件下では中立性を仮定しなくても完全な中立モデルと同じ種の豊富さのパターンや多様性を示すこと判明し,それらが種子や幼体が分散する距離に依存して変化することなどを新たに見出した.これらの結果により,本研究課題の目的である多様性のパターンの創出機構として,種間相互作用の適応的・進化的変動や種の分散距離の影響などを理論的に示すことができた.これらの結果について,1件の国際会議招待講演,2件の国内国際ワークショップ招待講演,1件の国際会議口頭発表,3件の国内学会口頭発表を行い,査読付き国際論文誌に1件論文を発表した.熱帯雨林や珊瑚礁などの,多種からなる大規模生態群集において普遍的に観測される種個体数分布および種数面積関係などの「多様性(種の豊富さ)のパターン」が生み出されるメカニズムの解明は,理学的にも環境保全などの応用上も重要な課題である.これに対し,多種群集の数理モデルを構築し,近年発展してきた統計物理学や集団遺伝学における理論的手法を用いた解析を行い,多様性のパターンがさまざまな群集パラメータにどのように依存するかを調べることが本研究の目的である.当該年度においては,現実に観測される多様性のパターンを示す多種群集の数理モデルとして種間相互作用が時間的に変動する適応的・進化的な群集モデルの振舞いを統計力学的な方法を用いて理論的に調べ,種間相互作用の時間変動が確かに群集の安定性や多様性に寄与することを見出した.これは従来シミュレーションによって得られていた描像を厳密な数学的解析によって証明した最初の結果である.さらに,中立性を破る「格子ほぼ中立モデル」の振舞いをGPUシミュレーションによって解析した結果,ある条件下では中立性を仮定しなくても完全な中立モデルと同じ種の豊富さのパターンや多様性を示すことが判明し,それらが種子や幼体が分散する距離に依存して変化することなどを新たに見出した.これらの結果により,本研究課題の目的である多様性のパターンの創出機構として,種間相互作用の適応的・進化的変動や種の分散距離の影響などを理論的に示すことができた.これらの結果について,2件の国際会議招待講演,1件の国際会議口頭発表,5件の国際会議ポスター発表,4件の国内学会口頭発表を行い,査読付き国際論文誌に2件論文を発表した.熱帯雨林や珊瑚礁などの,多種からなる大規模生態群集において普遍的に観測される種個体数分布および種数面積関係などの「多様性(種の豊富さ)のパターン」が生み出されるメカニズムの解明は,理学的にも環境保全などの応用上も重要な課題である.これに対し,多種群集の数理モデルを構築し,近年発展してきた統計物理学や集団遺伝学における理論的手法を用いた解析を行い,多様性のパターンがさまざまな群集パラメータにどのように依存するかを調べることが本研究の目的である.当該年度においては,現実に観測される多様性のパターンを示す多種群集の数理モデルとして種間相互作用が時間的に変動する適応的・進化的な群集モデルの振舞いを統計力学的な方法を用いて理論的に調べ,種間相互作用の時間変動が確かに群集の安定性や多様性に寄与することを見出した.さらに,中立性を破る「格子ほぼ中立モデル」の振舞いをGPUを用いた超並列シミュレーションによって解析した結果,ある条件下では中立性を仮定しなくても完全な中立モデルと同じ種の豊富さのパターンや多様性を示すことがわかり,それらが種子や幼体が分散する距離に依存して変化することなどを新たに見出した.さらに隔離されていた生態系が交流を持つときの安定条件などの研究も行った.これらの結果により,本研究課題の目的である多様性のパターンの創出機構として,種間相互作用の適応的・進化的変動や種の分散距離の影響などを理論的に示すことができた.

これらの結果について,1件の国際会議招待講演,1件の国内国際ワークショップ招待講演,1件の国内学会口頭発表を行い,査読付き国際論文誌に2件論文を発表した.熱帯雨林や珊瑚礁などの,多種からなる大規模生態群集において普遍的に観測される種個体数分布および種数面積関係などの「多様性(種の豊富さ)のパターン」が生み出されるメカニズムの解明は,理学的にも環境保全などの応用上も重要な課題である。これに対し,多種群集の数理モデルを構築し,近年発達してきた統計物理学や集団遺伝学における理論的手法を用いた解析を行い,多様性のパターンがさまざまな群集パラメータにどのように依存するかを調べることが本研究の目的である。当該年度においては,現実に観測される多様性のパターンを示す多種群集の数理モデルとして,種間相互作用が疎(スパース)で,ひとつの種が係わる他の種の数が全体の種数に比べて無視できるほど少ない場合を解析した。その結果,これまで調べてきた種間相互作用が密の場合では非現実的なパラメータ領域でしか実現されなかった「全種共存解」が,種間相互作用が疎の場合には現実的なパラメータ領域で存在することを発見した。さらに,これまで理論的には予測されてこなかった,複数のピークをもつ種個体数分布が理論的に予測されることを見出した。この結果により,本研究課題の目的である多様性のパターンの創出機構として,種間相互作用のスパース性が決定的な役割を果たすことを理論的に示すことができた。これらの結果は査読付き国際論文誌に投稿済みであり,今年度中に掲載予定である。さらに,これらの結果に関連して,1件の国際シンポジウム招待講演,3件の国際会議口頭発表,5件の国内学会発表を行った。多種群集モデルの解析を行い,多様性のパターンが様々な群集パラメータにどのように依存するかを調べた。その結果,種内競争と種間競争の強さの比,種間相互作用行列の対称度,ひとつの種が係わる他の種の数(種間相互作用行列の疎性),種間相互作用における相利と競争の比などのパラメータが群集の多様性のパターンを決定する重要な役割を果たすことを見出した。特に,疎な種間相互作用行列に対して,「全種共存解」や「複数のピークをもつ種個体数分布」を新たに発見した。研究機関中,査読付き論文4本を発表し,8件の国際会議発表(うち2件招待講演,2件シンポジウムチェア)を行った。さらに今年度中に2本の査読付き論文を発表予定。研究自体は予定通り進捗していると考える.一方,研究会や学会に出席して研究成果を発表するための出張は予定通り行ったが招待講演が多く,旅費を科研費から支出する機会が予定より少なかった.また,2014年度は学内業務のための出張が予想以上に多く,専門的知識や研究連絡のための出張を予定通り行うことができなかった.そのため旅費支出が50万円ほど予定を下回り,人件費謝金についても支出がなく,合計60万円の未使用額が生じたため,27年度に繰り越すこととなった.27年度は国内外学会への参加をより積極的に行う予定.本年度得られた結果であるところの,相互作用が時間変動する多種群集モデルの統計力学的解析に関する論文を執筆・発表する.さらに,英国の共同研究者と集中的に議論する機会を作り,多種群集の数理モデルの統計力学的解析を進め,より現実的な適応的・進化的な多種群集モデルを数学的に厳密に解析する手法を構築し,多様性のパターンと群集パラメータとの関係を明らかにする.
真に実用可能な、卵巣癌の薬剤感受性予測バイオマーカーの確立

卵巣癌においてどの症例にどの薬物療法が有用であるかを示すバイオマーカーを確立し、治療個別化を行うことが、予後改善のためには喫緊の課題である。我々は卵巣癌高異軽度漿液性癌が、遺伝子発現プロファイルにより予後の異なる4つのサブグループにわかれ、この分類方法が卵巣癌標準治療であるTC(タキサンとプラチナ)療法のそれぞれ薬剤の感受性に関連することを見出し、遺伝子発現プロファイルと相関する病理組織細分類を提唱し、背景にある腫瘍微小環境の特性を明らかにした。これらは化学療法選択の個別化治療を実践するうえで予測バイオマーカーとなりうる。1)卵巣漿液性腺癌において、BMPシグナルが癌細胞の増殖を促進させており、有望な治療標的であることを明らかにした。2)卵巣癌ではT細胞の腫瘍内浸潤は、局所のIFN-γ濃度の上昇を来たし、それが癌細胞におけるPD-L1発現を亢進させ、腫瘍免疫抑制と癌の進展をもたらすことを明らかにした。3)卵巣明細胞腺癌のエクソームシークエンシングを行った。4)JGOG3016試験に登録された卵巣漿液性腺癌のHE標本の収集を開始した。5)アノイキス抵抗性に関わる新規因子を探索するためにshRNAライブラリーを用いた機能ゲノミクススクリーニングを行った。卵巣癌の組織型は多様でありそれぞれ異なる性質を示す。卵巣癌の中で、卵巣明細胞腺癌は本邦で頻度が高く、化学療法抵抗性で、卵巣の子宮内膜症性嚢胞という酸化ストレス環境下で発生するという特色がある。我々は、卵巣明細胞腺癌で高発現しているHNF1βが、癌細胞の糖取り込み亢進と酸化ストレス耐性、さらに化学療法抵抗性に関与していることを示した。このことから、卵巣明細胞癌において、HNF1βやその下流遺伝子を標的とする治療法が有用である可能性がある。卵巣癌の中で最も予後不良の組織型である卵巣高異型度漿液性腺癌は4つの遺伝子発現サブタイプに分けられることがThe Cancer Genome Atlas (TCGA)プロジェクトにより報告された。我々はそれぞれの遺伝子発現サブタイプと相関する病理組織細分類を樹立した。そしてこれらの病理組織細分類は化学療法感受性と関連することを見出した。また、これまで我々は、PD-L1/PD-1シグナルによる抗腫瘍免疫の抑制が、卵巣癌の進展をは、卵巣癌の進展を促進させることを示してきた。今回我々は、卵巣癌細胞におけるPD-L1発現の亢進は、特に腹膜播種巣において、T細胞由来のIFNgによりもたらされることを示した。また、抗がん剤投与によって、卵巣癌細胞におけるNF-kBシグナル経路が活性化し、それがPD-L1発現を亢進させることを見出した。このことから、抗がん剤と抗PD-1抗体の併用療法が卵巣癌において有望な治療戦略であると考えられる。卵巣癌のバイオマーカーおよび分子標的薬の研究において、多くの成果をあげて、多数の論文で発表することができた。これまで卵巣癌高異軽度漿液性癌が、遺伝子発現プロファイルにより予後の異なる4つの分類されることがすでに報告されているが、我々はこの分類方法が卵巣癌標準治療であるTC(タキサンとプラチナ)療法のそれぞれ薬剤の感受性に関連すること、およびその遺伝子発現サブタイプと相関する病理組織細分類を報告してきた。本研究では、卵巣癌の個別化医療を実践するために、卵巣癌を層別化し、それぞれの病態に応じた腫瘍微小環境を反映するシグナルと腫瘍免疫との関係性を明らかにし、個別化治療の根拠となる生物学的因子を複数同定した。これらは既知のみならず新規の薬物療法の感受性を予測するバイオマーカーになりうることを示した。2)卵巣癌明細胞癌のエキソームシークエンス解析により、染色体17番長腕の増幅が、再発に寄与する領域であることを同定し、プラチナ耐性に関与していることを発見した。3)卵巣癌におけるVEGF発現が、Myeloid-derived suppressor cells(MDSC)を誘導することで免疫を抑制することを報告した。VEGF signatureが卵巣高異軽度漿液性癌の遺伝子発現サブタイプのImmunoreactivesubtypeにおいて低発現であることを示した。当初の予定通り、卵巣明細胞腺癌に対するエクソームシークエンシングが終了した。また、卵巣癌に対する新規分子標的を見いだした。さらに、腫瘍免疫と腫瘍進展の関連についても新たな知見を得た。機能ゲノミクススクリーニングにより、アノイキスに関連する新たな因子を見いだした。今後もこれまでと同様に研究を進めていく。高異型度漿液性腺癌の病理組織細分類とタキサン感受性の関連については、我々はJGOG3016-A1試験を行っており、JGOG3016試験に登録した症例を集積しつつある。現在のところ、症例集積は150例を超えており、集積終了予定時期である平成28年9月末には250例に到達する見込みである。

この研究により、パクリタキセル投与量の多いdose-dense TC療法が、タキサン感受性を示すと予想されるMesenchymal Transitionタイプで有用か否かを検証することができる。28年度が最終年度であるため、記入しない。婦人科腫瘍1)卵巣明細胞腺癌のエクソームシークエンシングデータを用いて、遺伝子変異とコピー数異常の統合解析を行う。2)JGOG3016試験に登録されたデータを用いて、特に「Mesenchymal subtype」において、タキサン投与量の多いdose-dense TC療法が有効であるか否かを明らかにする。3)化学療法の投与と癌細胞のPD-L1発現、腫瘍免疫との関わりについて明らかにする。4)機能ゲノミクススクリーニングで明らかにしたアノイキス関連因子について、卵巣癌における生物学的、臨床的意義を明らかにする。
脳神経系における硫化水素の二次メッセンジャー8-メルカプト-cGMPに関する研究

硫化水素関連物質として、システインのSH基にイオウが過剰に付加したシステインパーサルファイドを同定し、生体内に多量に存在することを明らかにし、反応性の高さから「活性イオウ分子」と命名した。活性イオウ分子は、高い抗酸化活性とレドックスシグナル調節活性を有し、レドックスシグナルの二次メッセンジャーである8-ニトロ-cGMPを8-メルカプト-cGMPへと変換する。8-メルカプト-cGMPが脳や培養神経細胞で生成されることを質量分析法、免疫染色法で明らかにした。また、環境中親電子毒物であるメチル水銀による活性イオウ分子/レドックスシグナル調節機構の破綻による新奇の毒性発現メカニズムを解明した。近年、硫化水素およびその関連物質が様々な神経機能に関与することが明らかとなってきたが、そのシグナル制御機構は未だ不明な点が多い。我々は、NO/ROSシグナル分子である8-ニトロ-cGMPが硫化水素およびその関連物質によってそのレベルが制御され、新規二次メッセンジャーとして8-メルカプト-cGMP(8-SH-cGMP)に変換されることを発見した。本研究では、脳神経系における8-SH-cGMPの産生機構、およびその生理・病理作用を解明することを目的とした。平成25年度は、脳神経系における8-SH-cGMPの産生を解析するために、LC-MS/MSによる安定同位体希釈法で、ラットの各臓器(農を含む)、グリオーマ細胞、神経モデル細胞であるPC12細胞、初代培養神経細胞で産生される8-SH-cGMPの定量を行った。RNA干渉法を用いた実験から、8-SH-cGMPの産生には、システインの代謝系酵素であるcystathionine β-synthaseが関与していることを明らかにした。さらに、8-SH-cGMP特異的抗体の作製を試み、ポリクローナル抗体野作成に成功した。硫化水素が「第三のガス状メディエーター」として注目され、脳神経系においても様々な生理・病理機能が報告されてきた。しかしながらその産生機構、作用機構の詳細に関しては不明であった。我々は、一酸化窒素/活性酸素シグナルの二次メッセンジャーとして、8-二トロ-cGMPを世界に先駆けて発見し、神経機能を含め様々な生理・病理機能を発揮することを報告してきた。また、8-二トロ-cGMPは硫化水素関連物質と反応し、8-メルカプト-cGMPに変換されることを発見した。本研究では脳神経系における8-メルカプト-cGMPの産生機構、およびその生理病理作用を解明することを目的とした。平成26年度は、生体内で機能する硫化水素関連物質として、システインのSH基にイオウが過剰に付加したシステインパー(ポリ)サルファイドが生体内に多量に存在することを示した。これらのパーサルファイドを含む化合物は活性イオウ分子種と命名された。また、生体において硫化水素はほとんど産生されず、活性イオウ分子種が生体内で主に機能していることを報告した。活性イオウ分子種は、8-二トロ-cGMPと反応し、効率よく8-メルカプト-cGMPに変換されることを明らかにし、8-メルカプト-cGMPが活性イオウ分子種の二次メッセンジャーである可能性を示した。また、機能解析として、ラット小脳初代培養神経細胞を用い、メチル水銀毒性試験を行ったところ、メチル水銀処理によって、活性イオウ分子種の減少に伴い、8-二トロ-cGMPから8-メルカプト-cGMPの変換が抑制されることを見出し、メチル水銀毒性の新たな毒性発現機構を提示した。しかしながらその産生機構、作用機構に関しては不明であった。我々は、一酸化窒素/活性酸素シグナルの二次メッセンジャーとして8-ニトロ-cGMPを世界に先駆けて発見し、神経機能を含め様々な生理・病理機能を発現することを報告してきた。また、8-ニトロ-cGMPは硫化水素関連物質として反応し、8-メルカプト-cGMPに変換されることを発見した。本研究では脳神経系における8-メルカプト-cGMPの産生機構およびその生理病理作用の解明を目的とした。平成26年度までに、生体内で機能する硫化水素関連物質として、システインのSH基にイオウが過剰に付加したシステインパーサルファイドが多量に存在することを明らかにしている。過剰に付加した硫黄は反応せいが高いため「活性イオウ分子」と命名した。平成27年度は、活性イオウ分子の生理・病理機能を解明するため、メチル水銀毒性の調節機構の解析を行った。メチル水銀を神経細胞に処理すると、活性酸素の産生増大とそれに伴うレドックスシグナルの活性化(二次メッセンジャーである8-ニトロ-cGMPの増加)、細胞死シグナルの活性化が認められた。一方、活性イオウ分子種は枯渇し、それに伴い8-メルカプト-cGMPも減少していた。神経細胞を外因性活性イオウ分子種で前処理すると、メチル水銀毒性が軽減されたことから、活性イオウ分子がメチル水銀毒性に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析装置を用いた、多重反応モニタリング法、安定同位体希釈法を組み合わせることにより、マウス脳内で8-メルカプト-cGMPが産生していることを明らかにした。

硫化水素関連物質として、システインのSH基にイオウが過剰に付加したシステインパーサルファイドを同定し、生体内に多量に存在することを明らかにし、反応性の高さから「活性イオウ分子」と命名した。活性イオウ分子は、高い抗酸化活性とレドックスシグナル調節活性を有し、レドックスシグナルの二次メッセンジャーである8-ニトロ-cGMPを8-メルカプト-cGMPへと変換する。8-メルカプト-cGMPが脳や培養神経細胞で生成されることを質量分析法、免疫染色法で明らかにした。また、環境中親電子毒物であるメチル水銀による活性イオウ分子/レドックスシグナル調節機構の破綻による新奇の毒性発現メカニズムを解明した。平成26年度以降「脳神経系における8-メルカプト-cGMPの産生」、「8-メルカプトcGMPの生理・病理作用」を研究する予定であった。「脳神経系における8-メルカプト-cGMPの産生」に関しては、脳や培養神経細胞で、LC-MS/MSを用いた定量的検出法、抗体を用いた蛍光免疫染色法で検出に成功し、また、活性イオウ分子による産生機構を明らかにした。「8-メルカプトcGMPの生理・病理作用」に関しては、初代培養神経細胞を用い、メチル水銀毒性試験を行い、メチル水銀毒性への8-メルカプトcGMPの関与を示唆する結果を得ている。神経化学「8-メルカプト-cGMPの産生」に関しては、脳や培養神経細胞で、LC-MS/MSを用いた定量的検出法、抗体を用いた蛍光免疫染色法で検出をする。病理機能との関連、また、活性イオウ分子種との関連についても解析する。「生理・病理作用」に関しても、引き続き初代培養神経細胞を用い、メチル水銀毒性試験を行いう。平成25年度に作作製した膜透過性8-メルカプト-cGMPを用い、詳細な検討を進めていく。平成25年度は、「8-SH-cGMP検出方法の確立」、「膜透過性8-SH-cGMPの調製」を中心に研旧を行う予定であった。8-SH-cGMP検出方法に関しては、LC-MS/MSによる安定同位体希釈法の確立、8-SH-cGMP特異的抗体の作製する計画であったが、いずれも達成できた。膜透過性8-SH-cGMPに関しては、8-SH-2'-O-butyryl-cGMPの合成に成功し、実際に細胞膜を通過して、細胞内に移行することをLC-MS/MS、蛍光免疫染色法で確認した。8-SH-cGMP検出に関しては、引き続きLC-MS/MSを用いた解析を行う。8-SH-cGMP特異的抗体に関しては、ELISA詩捨身を構築し簡易定量法の確立、免疫染色法の確立を目指すとともに、安定的に抗体の供給を可能にするため、モノクローナル抗体の作製も並行して行う。機能解析に関しては、25年度に作製した8-SH-2'-O-butyryl-cGMPを用いて、神経伝達物質の放出、神経細胞死などを解析していく。
哺乳類のMATE型有機カチオントランスポーターの構造と機能

hMATE1の輸送特性を詳細に解析することが可能な精製・再構成系を構築し、輸送活性を測定した。MATEの典型的な基質であるtotraethyiammonium(TEA)の輸送活性を測定した結果、hMATE1がH+勾配を駆動力とする能動輸送だけでなくH+勾配を必要としない促進拡散も行うことを明らかにした。さらにH+勾配の無い条件においてhMATE1がpH依存性を示すこと、アルカリ側pHにおいて基質に対する親和性が上昇することを明らかにした。この結果はpHの高い細胞質側で基質を捕らえ、pHの低い尿細管側で基質を放出するMATEにとって非常に合理的なメカニズムである。一価のTEAと二価のparaquatの輸送に対する膜電位の影響を謂べることで一価、二価の区別無くカチオンがプロトンと一対一で交換輸送されることを明らかにした。この結果からhMATE1は輸送基質に対する柔軟な識とプロトンとの強固な共役という性質を持つことを明らかにした。精製・再構成系を用いて新たなhMATE1の阻害剤を見いだした。この系はMATEと相互作用を起こす物質をスクリーニングするのに適している。Compound AはMATE特異的な阻害剤であり、非常に低濃度でhMATE1による輸送活性を阻害することができる。この阻害剤はHATEのin vivoにおける輸送のプローブとして使用可能であり、MATEの役割を明らかにしていくうえで有用である。さらにこれらの阻害剤の阻害メカニズムを明らかにするために様々な濃度の阻害剤存在下kineticな解析を行った。compound Aは非競合阻害剤であり、compound Bは競合的阻害剤であることを明らかにした。続いて、HEK293細胞からのTEAの排出をcompound Aが阻害することを示した。この実験はHEK293細胞発現系を用いていったんhMATE1を介して細胞内へと取り込ませたTEAを細胞外pHを6.0に変えることで放出せ、細胞内に残ったTEAの量を測定するというものである。Compound AはhMATE1によるTEAの取り込み、放出を両方阻害するため、hMATE1に結合することで、輸送に伴う構造変化を阻害するものと予想される。hMATE2、2Kも同様に精製、再構成し有機カチオンとH+を交換輸送する性質を持つことを示した。また基質特異性もhMATE1と類似していることを明らかにした。hMATE1、2、2Kの全ての精製、再構成系を構築したことで腎臓における有機カチオン系薬物排出研究の分子基盤を確立できた。(1)マウスのtype-III型MATEトランスポーターの機能解析マウスのtype-III型MATEトランスポーターであるmMATE2の機能解析を行うためにHEK293細胞に発現させ代表的な有機カチオンであるtetraethylammonium(TEA)の輸送活性を測定した。その結果、mMATE2も他のMATE familyのトランスポーターと同様にプロトンと有機カチオンとの交換輸送体であることを明らかにした。続いてその生理的機能を明らかにするために局在を調べた。その結果、精巣のライディッヒ細胞にmMATE2が存在することを明らかにした。これらの結果からmMATE2は精巣特異的な有機カチオントランスポーターであリ、ライディッヒ細胞においてステロイドホルモンの分泌に関与している可能性を示唆した。(2)マウスのMATE1トランスポーターのバリアントの同定マウスのゲノムデータベース上から見つかってきたMATE1のバリアント(MATE1b)の機能解析を行った。このバリアントはカルボキシル末端が30アミノ酸ほどMATE1より長いという特徴を持っていた。その輸送活性及び腎臓での局在を調べたところ、mMATE1と同様に腎臓に発現しており有機カチオン排出輸送体として機能していることを明らかにした。その長い疎水的なカルボキシル末端がタンパク間相互作用に関わっているのではないかと考え研究している。(3)ヒトMATE1の基質認識部位の同定ヒトMATE1(hMATE1)の基質認識部位を同定するために膜貫通領域に存在する4つのグルタミン酸残基をそれぞれアラニンあるいはアスパラギン酸に置換した変異体を作成し、TEAや1-methylphenyl-4-pyridinium(MPP)、cimetidineといったMATEの代表的な基質の輸送を速度論的に解析した。その結果4つのアミノ酸残基のうち3つが基質認識に関与していること、基質ごとに関わるグルタミン酸残基が異なることを明らかにした。この成果は薬物間相互作用等の臨床上の問題を考える上で有用な情報である。

精製・再構成系を用いて新たなhMATE1の阻害剤を見いだした。この系はMATEと相互作用を起こす物質をスクリーニングするのに適している。Compound AはMATE特異的な阻害剤であり、非常に低濃度でhMATE1による輸送活性を阻害することができる。この阻害剤はHATEのin vivoにおける輸送のプローブとして使用可能であり、MATEの役割を明らかにしていくうえで有用である。さらにこれらの阻害剤の阻害メカニズムを明らかにするために様々な濃度の阻害剤存在下kineticな解析を行った。compound Aは非競合阻害剤であり、compound Bは競合的阻害剤であることを明らかにした。続いて、HEK293細胞からのTEAの排出をcompound Aが阻害することを示した。この実験はHEK293細胞発現系を用いていったんhMATE1を介して細胞内へと取り込ませたTEAを細胞外pHを6.0に変えることで放出せ、細胞内に残ったTEAの量を測定するというものである。Compound AはhMATE1によるTEAの取り込み、放出を両方阻害するため、hMATE1に結合することで、輸送に伴う構造変化を阻害するものと予想される。hMATE2、2Kも同様に精製、再構成し有機カチオンとH+を交換輸送する性質を持つことを示した。また基質特異性もhMATE1と類似していることを明らかにした。hMATE1、2、2Kの全ての精製、再構成系を構築したことで腎臓における有機カチオン系薬物排出研究の分子基盤を確立できた。
新規三日熱マラリア伝搬阻止ワクチン候補抗原の同定

新たな三日熱マラリア伝搬阻止ワクチン抗原を同定するため、本年度は生殖母体表面蛋白の遺伝子クローニングを行った。熱帯熱マラリア原虫生殖母体表面蛋白であるPfs48のアミノ酸配列を用いて三日熱マラリア原虫ゲノムシーケンスデータベースをBLAST検索した。その結果、アミノ酸配列でPfs48と比較的相同性の高い2つの短いDNA断片が得られた。この情報を基に、三日熱マラリア原虫実験室内株からPCRによりpvs48遺伝子の全長を増幅した。またpvs48の近傍を探索した結果、熱帯熱マラリア原虫で報告されたのと同様pvs48の約3kb上流にpvs47と思われる遺伝子が見出された。タイ国内のマラリア流行地において三日熱マラリア患者の同意を得た後採血し、分離精製した生殖母体からRNAを抽出した。また、同一患者血液から赤内型原虫を分離した後in vitro培養したオーキネートを作成し、それぞれからもRNAを抽出した。それらを用いてRT-PCRを行いpvs47の転写を確認した。その結果、Pvs47は生殖母体のステージにのみ転写されており、早期の有性生殖ステージ原虫に特異的と考えられた。またこのcDNAをクローン化した後塩基配列を解析した結果、pvs47の遺伝子はイントロンを含んでいないことが判明した。Pvs47の塩基配列から予想される433残基のアミノ酸配列の特徴としては、N末端にシグナル配列を持ち、C末端にはGPIアンカーと思われる短い疎水性領域が存在していた。またそれらの間には、システインに富む領域が存在し、Pfs47との構造比較から6個の保存的なシステインが存在する「6-Cys Domain」、2個の保存的なシステインが存在する「2-Cys Domain」、6個の保存的なシステインが存在する「6-Cys Domain」で構成されていた。これらの構造は、マラリア原虫に特異的な構造であった。
法運動についての基礎研究

本研究は、新しい社会運動と呼ばれる紛争において、紛争当事者の正当性の主張にはらまれる「実体志向」と「過程(プロセス)志向」との錯綜状況を明らかにすることを目的とした。そのために、宮崎市一ツ葉海岸リゾート開発反対運動と、福岡県宗像市及び同県上陽町の産廃処分場建設反対運動を調査した。その結果得られた成果は、以下の通りである。(1)宮崎市の事例は裁判に持ち込まれたが(政策形成型訴訟)、その具体的な弁論の内実は、ほとんど専門家証人への尋問・反対尋問である。これは、まさに訴訟にしなければ、住民の危惧と専門家の見解とを架橋する議論の過程(本来的意味でのアセスメント)が保障されていない現状を表している。住民側は、政策形成時に実現されなかったプロセスを裁判の場で実現するわけである。ただし、閉寒的な制度を打破する最後の拠り所として裁判が起こされたが、そのことにより運動自体は閉寒化した。(2)産廃処分場建設反対運動の場合、都市近郊であれば、その運動は「自省的」となりやすい。これは都市生活が産廃を多く生み出しているからであるが、その場合、運動は、産廃処分場の必要性を認めた上で、その決定過程を問題にしようとする(しかしここでも議論を主導する関心は、可能な限り建設反対という実体的なものである)。他方、山村では、都会のゴミを持ってくるなという実体的主張となる。(3)福岡県と宗像市は、産廃処分場建設にあったて、業者に住民の同意を得る過程を条例で制度化し指導している(宗像市は審議会も設けており、その審議会が計画廃止を勧告したため、業者は当該条例の違憲性を主張して裁判を起こした)。かかる事前手続を、住民は、実体的な視点(計画を阻止できるか否か)から、「有効な制度」/「単なる儀式」と判断する。ただし住民は、現行制度上、実体的な判断を主張しても無力なので、それを手続的問題に変換して主張する。(4)以上のように「実体志向」と「過程志向」は具体的紛争の当事者においては、非常に複雑な関係にある。その理論的整理は今後の課題である。
ダウン症マウスモデルの脳発達遅滞および記憶学習障害の分子基盤解明と炎症亢進

ダウン症(DS)の精神遅滞や脳発達遅滞の分子メカニズムの解明を目的として,本研究ではDSモデルマウス由来脳組織を用いて種々の分子の発現や蓄積量を網羅的に比較した。タンパク質や遺伝子の発現解析や神経伝達物質の定量解析により,DSモデルマウス胎仔脳における抑制性神経の新生異常を示唆するタンパク質発現量の変動および炎症亢進を示唆するmRNA発現量の変動,さらに成体脳でのドパミン・セロトニン代謝亢進の可能性について明らかとした。また,胎仔脳での炎症亢進の原因は炎症細胞の流入と考えられ,その原因遺伝子を同定できた。これらの知見は,DS脳発達遅滞や精神遅滞の基盤となっている可能性が期待される。ダウン症モデルであるTs1Cjeマウスは,胎児期において脳発達遅滞がみられ,かつ成体期において記憶学習障害がみられる。我々は,これらの異常表現型の関連分子を同定することを目的として,網羅的発現変動解析を行った。まず,Ts1Cjeマウスの胎生14.5日目におけるマイクロアレイ解析を行うことで,以下の成績を得た。1Ts1Cjeマウスの胎児脳で殆どのトリソミー領域遺伝子のmRNA発現量は野生型に比し,1.5倍の増加を示した。2非トリソミー遺伝子のmRNA発現変動もみられ,Ts1Cje胎児脳において炎症・免疫関連分子のmRNAの増加,および発達関連分子のmRNA発現減少がみられた。また,プロテオミクス解析を行うことで,Ts1Cje胎児脳において4つの発現増加および1つの発現減少がみられる合計5つのタンパク質を同定した。これらのタンパク質の発現変動はmRNAの発現変動を伴わないこともリアルタイムPCRにより明らかとした。また,同定したタンパク質は細胞増殖関連分子であったことから,Ts1Cjeマウス胎児脳における細胞増殖についてin vivo BrdUラベリング法により検討したところ,Ts1Cjeマウスの基底核原基における細胞増殖の増加を明らかとした。次に,Ts1Cje成体脳(3ヶ月齢)におけるタンパク質発現変動についてプロテオミクス解析にて検討した。海馬,小脳および線条体といった脳部位別に検討したが,2次元電気泳動解析においてTs1Cjeマウス成体脳で発現変動がみられるタンパク質を検出することはできなかった。Ts1Cjeマウスは,ヒト21番染色体と相同の領域を3倍体として有するダウン症モデルマウスであり,胎児期での脳発達遅滞や成体期での記憶学習障害を呈する。我々は,Ts1Cjeマウスの胎児脳で発現する転写産物をDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。その結果,炎症関連遺伝子の発現異常が見られることを見出し,定量RT-PCR法によってその変動を確認した。さらにその中の1つの分子についてはWestern blottingによっても確認し,タンパク質レベルでの変動が見られることを明らかにした。次いで,野生型およびTs1Cjeマウスの胎児脳での炎症関連細胞の分布をフローサイトメトリー解析により検討したところ,Ts1Cjeマウス胎児脳での炎症関連細胞の増加を見出した。このように,我々は新たなTs1Cjeマウスの異常表現型として胎児期での炎症異常を見出し,脳発達遅滞や記憶学習障害への関与が期待される。ダウン症モデルTs1Cjeマウスの胎仔脳において炎症関連遺伝子の発現増加を見出したことから,その原因候補遺伝子の検索,および炎症亢進の病態生理学的意義の解明を目指している。昨年から引き続きTs1Cje胎仔脳での炎症性細胞数の定量解析を行っており,いくつかの炎症関連細胞の数がTs1Cjeマウスおよび野生型マウス間で異なることを見出した。さらに,炎症関連遺伝子の発現増加の原因候補トリソミー遺伝子としてEts2を想定し,Ets2遺伝子のみが正常コピー数となったTs1Cje-Ets2+/+/-マウスを作出し,胎仔脳での炎症関連遺伝子の発現について検討したが,Ts1Cje-Ets2+/+/-マウスでも炎症関連遺伝子の発現上昇がみられたことから本遺伝子のトリソミーが原因では無いことが分かった。現在,他の遺伝子に焦点を当てて解析を行っている。また,成体3ヶ月齢野生型とTs1Cjeマウスの海馬で発現している転写産物をDNAチップを用いて比較し,異常発現遺伝子を同定できた。ダウン症モデルマウスの胎仔脳での炎症関連細胞の異常分布および炎症遺伝子発現亢進の原因候補トリソミー遺伝子の1つを解析完了させ,さらにTs1Cjeマウスの成体脳海馬で発現量が野生型に比し異常の転写産物をDNAアレイ解析によって同定できたことから。ダウン症(DS)モデルマウスであるTs1Cjeマウスの胎仔脳において発現するmRNA量をアイクロアレイを用いて野生型マウスと比較検討し,炎症細胞関連分子の発現異常を見出している。そこで,本年度はこの炎症細胞関連遺伝子群の発現変動の原因トリソミー遺伝子の同定を試みた。まず,原因遺伝子がコードされるトリソミー領域を限定するために,Ts1Cjeマウスのトリソミー領域よりも狭い範囲がトリソミーとなったTs1Rhrマウスの胎仔脳でも炎症細胞関連遺伝子群の発現について検討したところ,Ts1Cjeマウスと同様の発現異常が見られたことから,Ts1Rhrトリソミー領域に炎症関連遺伝子の発現異常の原因遺伝子が存在していることが明らかとなった。

さらに,原因遺伝子の候補として2つかの遺伝子に着目し,各ヘテロ欠損マウスとTs1Cjeマウスとの交配によって作出した標的遺伝子のみが正常コピー数となったDSマウスを作出した。そのうち,1つの着目遺伝子のみを正常コピー数としたTs1Cjeマウスにおいて炎症細胞関連分子の発現異常が改善されたことから,この着目遺伝子が本異常表現型の原因トリソミー遺伝子であることが明らかとなった。さらに,FACS解析により,Ts1Cjeマウスの胎仔脳での炎症細胞数の異常も捉えることに成功し,加えて,この炎症細胞数の異常も先ほど同定した原因遺伝子の3倍体化が原因であることを突き止めた。ダウン症(DS)の精神遅滞や脳発達遅滞の分子メカニズムの解明を目的として,本研究ではDSモデルマウス由来脳組織を用いて種々の分子の発現や蓄積量を網羅的に比較した。タンパク質や遺伝子の発現解析や神経伝達物質の定量解析により,DSモデルマウス胎仔脳における抑制性神経の新生異常を示唆するタンパク質発現量の変動および炎症亢進を示唆するmRNA発現量の変動,さらに成体脳でのドパミン・セロトニン代謝亢進の可能性について明らかとした。また,胎仔脳での炎症亢進の原因は炎症細胞の流入と考えられ,その原因遺伝子を同定できた。これらの知見は,DS脳発達遅滞や精神遅滞の基盤となっている可能性が期待される。Ts1Cjeの胎児脳で炎症の異常を明らかとし,さらに炎症性細胞の分布異常を見出したため。引き続きTs1Cjeマウス胎仔脳での炎症関連遺伝子増加の原因遺伝子の同定を行う。Ts1Cjeマウス胎仔脳での炎症性関連細胞の分布についても検討を行っていく。また,DNAチップにより解析したTs1Cjeマウスの胎仔期と成体期脳での発現異常が見られる転写産物の解析を行っていく。医歯薬学当初の計画した研究内容に従って,Ts1Cjeマウスの生後脳における炎症性細胞の分布を詳細に調べるとともに,脳を構成する細胞の分布・割合についても検討する。また,成体海馬のDNAマイクロアレイも行う予定である。当初の予定通りである。プロテオミクス解析の結果から発展させたTs1Cjeマウス胎児脳における細胞増殖の知見は当初予定していなかったが非常に興味深い知見がえられたと考えている。サンプルの輸送料が航空費を含むため見積もりより実際の費用が異なったため。本年度合わせて使用する。今後は,成体脳の解析においてプロテオミクス解析レベルでは発現変動が見られなかったことから,マイクロアレイ解析を行うことを予定している。海馬における転写産物量をTs1Cjeおよび野生型マウス間で比較検討することで,Ts1Cjeマウスの記憶学習障害関連分子に迫る。また,野生型およびTs1Cjeマウス胎児脳における炎症・免疫関連細胞の分布を免疫染色やフローサイトメトリー解析といった生化学的解析により明らかにすることで,Ts1Cjeマウス脳発達遅滞のメカニズム解明を目指す。特別な理由は無い。次年度の使用予定の試薬を購入する場合,残額では購入不可能であるため。物品費に加算して使用する。