hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オートファジーのストレス・情動系関与についての機能形態学的研究

オートファジーは細胞内タンパク質分解機構の一つで神経変性疾患などへの関与が知られているが、本研究ではストレス・情動系へのオートファジー関与をストレスモデル、遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることを目的とする。平成30年度はオートファジーの活性化をモニターするレポーター遺伝子が神経細胞特異的に発現するGFP-LC3-RFP-LC3ΔGマウスを3系統作製した。初代海馬培養神経細胞にラパマイシンを投与してオートファジーを起こさせて顕微鏡観察したが、コピー数が少ないためかGFPとRFPの発現がかなり弱く、蛍光でなかなか観察できなかった。またストレス負荷と脳内オートファジーの関連性を調べるためにフットショックによるモデルマウスの作製を行い脳組織で、抗GFP抗体と抗RFPを用いて免疫組織化学染色で脳内のオートファジー活性を調べたが、ともに発現が弱く、免疫組織化学染色によるオートファジー活性の正確な測定は困難であった。そのため新たに5系統(GFP-LC3-RFP)のトランスジェニックマウスを作製した。今年度はこの5系統をスクリーニングしてオートファジー活性化をモニターできるかを確認した後、ストレス・情動に関わる脳領域でオートファジーfluxによる活性化を組織・細胞レベルで解析する。うつ様行動における側坐核NPYニューロンの役割を解析するために、DREADDテクノロジーを用い側坐核NPYニューロンの活性化を行った。NPY-Creマウスの側坐核でAAVウイルスを用いhM3Dデザイナー受容体を発現させ、clozapine-N-oxideの腹腔内投与により側坐核NPYニューロンの活性化を行うと、その後、オープンフィールド試験で中心部滞在時間の増加傾向と、高架式十字迷路試験、オープンアームの滞在時間の増加傾向が見られた。昨年度神経特異的なオートファジー活性を測定するためのレポーターシステム(GFP-LC3-RFP-LC3ΔG)を発現したマウスを3系統作製し、実際にin vitro, in vivoでオートファジーを細胞レベルで可視化できるか、詳細な検討を行った。しかしながら、いずれの系統のマウスも遺伝子発現が弱く、解析に耐えられないと判断し、年度途中より新たにGFP-LC3-RFPマウス作成を開始し、年度終了時に5系統作製できた。2019年度はこのマウスを用いたストレスモデルのオートファジー解析を行う予定である。その間NPY-Creマウスを用いた情動モデルの検索も同時並行で行っている。1.新たに作製した5系統のGFP-LC3-RFPマウスに対して、脳内でのオートファジー活性を測定する。まず、レポーターシステムの確認のために海馬神経細胞初代培養系を作製し、オートファジー活性化剤であるラパマイシンを投与して緑色と赤色の比率が変化するのを可視化できるのかを確認する。一番強い緑色及び赤色を発現する系統を用いて次にマウス脳内にラパマイシンをインジェクションして局所にオートファジーの活性化が可視化できるかを、蛍光抗体を用いた組織化学法で確認する。さらにオートファジー阻害剤であるクロロロキンも脳内に注入し、神経細胞でオートファジーの抑制が起きるかを確かめる。2.GFP-LC3-RFPマウスを用いてストレスによる脳内オートファジー活性の変化を調べる。具体的には、拘束ストレス(8時間)やフットショックストレス(0.4mA, 4回)を受けたマウスを4%パラホルムアルデヒドで固定を行い、作製した脳切片の扁桃体、側坐核、海馬、視床下部等の神経でのオートファジー活性の変化を観察する。さらに、一過的なストレス以外にも社会敗北型ストレスモデルや慢性疼痛モデルも作製し同様の解析を行う。3.情動・摂食に関与する神経ペプチドNPYは生体のエネルギー状態に応じてオートファジーを起こすことが報告されている。我々はNPY特異的にCreを発現するマウスを飼育しており、NPY-CreマウスとGFP-LC3-RFPマウスを交配し、NPYニューロンを、DREADD法を用いて特異的に刺激した時にオートファジーが起こるかを脳内でモニターする。オートファジーは細胞内タンパク質分解機構の一つで神経変性疾患などへの関与が知られているが、本研究ではストレス・情動系へのオートファジー関与をストレスモデル、遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることを目的とし、平成29年度はストレス負荷と脳内オートファジーの関連性を調べるためにフットショックによるモデルマウスの作製を行った。ショックジェネレーターにより5秒間4回の電気ショックの負荷を行い、翌日恐怖条件付けを測定した。その後、マウスの灌流・固定を行い、抗LC3抗体を用いて免疫組織化学染色で脳内のオートファジー活性を調べた。しかし、免疫組織化学染色によるオートファジー活性の正確な測定は困難であった。そこで脳内オートファジー活性の測定のために新たなレポーターシステム(GFP-LC3-RFP-LC3ΔG)を導入したマウスを作製した。このマウスは神経特異的にGFP-LC3-RFP-LC3ΔGを発現しており、神経細胞内でのオートファジー活性をモニタリングできる。今後、このマウスを用いストレス負荷とオートファジー活性の関連性を調べる。NPY-Creマウスの側坐核でAAVウイルスを用いhM3Dデザイナー受容体を発現させ、clozapine-N-oxideの腹腔内投与により側坐核NPYニューロンの活性化を行った。その後、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、強制水泳試験、尾部懸垂試験を行った。

現在、マウスの作製および行動解析は継続中である。さらに、NPY-Creマウスの側坐核でヒトHB-EGFを発現させ、ジフテリア毒素の投与により側坐核NPYニューロンを特異的に破壊したマウスを作製した。これらマウスの行動解析も行っている。神経特異的なオートファジー活性を測定するためのレポーターシステム(GFP-LC3-RFP-LC3ΔG)を発現したマウスの作製に時間がかかったが、29年度内に終了し、30年度はこのマウスを用いたストレスモデルのオートファジー解析を行う予定である。その間NPY-Creマウスを用いた情動モデルの検索も同時並行で行っている。オートファジーは細胞内タンパク質分解機構の一つで神経変性疾患などへの関与が知られているが、本研究ではストレス・情動系へのオートファジー関与をストレスモデル、遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることを目的とする。平成30年度はオートファジーの活性化をモニターするレポーター遺伝子が神経細胞特異的に発現するGFP-LC3-RFP-LC3ΔGマウスを3系統作製した。初代海馬培養神経細胞にラパマイシンを投与してオートファジーを起こさせて顕微鏡観察したが、コピー数が少ないためかGFPとRFPの発現がかなり弱く、蛍光でなかなか観察できなかった。またストレス負荷と脳内オートファジーの関連性を調べるためにフットショックによるモデルマウスの作製を行い脳組織で、抗GFP抗体と抗RFPを用いて免疫組織化学染色で脳内のオートファジー活性を調べたが、ともに発現が弱く、免疫組織化学染色によるオートファジー活性の正確な測定は困難であった。そのため新たに5系統(GFP-LC3-RFP)のトランスジェニックマウスを作製した。今年度はこの5系統をスクリーニングしてオートファジー活性化をモニターできるかを確認した後、ストレス・情動に関わる脳領域でオートファジーfluxによる活性化を組織・細胞レベルで解析する。うつ様行動における側坐核NPYニューロンの役割を解析するために、DREADDテクノロジーを用い側坐核NPYニューロンの活性化を行った。NPY-Creマウスの側坐核でAAVウイルスを用いhM3Dデザイナー受容体を発現させ、clozapine-N-oxideの腹腔内投与により側坐核NPYニューロンの活性化を行うと、その後、オープンフィールド試験で中心部滞在時間の増加傾向と、高架式十字迷路試験、オープンアームの滞在時間の増加傾向が見られた。昨年度神経特異的なオートファジー活性を測定するためのレポーターシステム(GFP-LC3-RFP-LC3ΔG)を発現したマウスを3系統作製し、実際にin vitro, in vivoでオートファジーを細胞レベルで可視化できるか、詳細な検討を行った。しかしながら、いずれの系統のマウスも遺伝子発現が弱く、解析に耐えられないと判断し、年度途中より新たにGFP-LC3-RFPマウス作成を開始し、年度終了時に5系統作製できた。2019年度はこのマウスを用いたストレスモデルのオートファジー解析を行う予定である。
サプライチェーンにおけるパフォーマンスのトレード・オフ克服のメカニズム

本研究では、製造業がサプライチェーンにおけるパフォーマンスのトレード・オフを克服するメカニズムを探った。日本の製造業者2千社へのアンケート調査およびその内の8社へのインタビュー調査のデータにもとづいて、オペレーションの能力が高い企業には、「機能横断的なプロセス改善能力」と呼ぶ組織能力が備わっていることを明らかにした。さらに、サプライチェーン・マネジメント(SCM)の先進企業である株式会社リコーのグローバル在庫可視化システムに関する事例研究を行い、パフォーマンス測定システムの構築・運用を成功に導く要因について議論した。平成24年度は、当年度初めに提出した「研究実施状況報告書」で説明した通り、研究目的に掲げた3つのテーマ、(1)サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係の詳細なモデル化、(2)競争力のパフォーマンスに見られるトレード・オフを克服する動態的なパターンの整理、(3)競争力を累加的に強化する現象の検証の内、動態的な研究である(2)と(3)をテーマから外し、静態的な研究である(1)に注力した。(1)のモデル化については、平成23年度に実施した5つの業務プロセス(製造フロー管理、需要管理、注文充足、顧客サービス管理、顧客関係管理)に加えて、サプライヤー関係管理と製品開発の2つを追加した。モデルの構築過程では、文献調査とインタビュー調査を実施した。文献調査については、SCMに関する企業事例が豊富に掲載されている『月刊ロジスティクス・ビジネス』を中心に、生産管理やロジスティクス管理の主要なジャーナルと関連図書を加えて行った。インタビュー調査については、これまで中心的に行ってきた花王を含めて、モデルの外的妥当性を確保するために、自動車、精密機械、一般機械、電気機械、化学、医薬品、食品、飲料といった様々な業界の実務家や有識者へのインタビュー調査を計15回行った。並行して、構築したモデルを踏まえて、企業へのアンケート調査を行うための質問票を作成し、実務家へのプレテストを7回実施した。プレテストで実務家からもらったコメントを踏まえて、質問票を改良し、来年度に実施するアンケートの実査への準備を行った。なお、平成24年7月にオランダ・アムステルダムで開催されたP&OM World Conferenceに参加し、学会発表と情報収集を行った。平成25年度は、当年度初めに提出した「研究実施状況報告書」で説明した通り、平成24年度に構築したモデル(サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係を示すモデル)について、平成25年5月に企業へのアンケート調査を実施した。対象は、日本の製造業者2千社であり、105社から回答を得た。有効回答数は94社であった。これらのデータを使って、統計分析(検証的因子分析、共分散構造分析など)を行うとともに、分析結果の理解を深めるために、アンケート回答企業の内、9社へのフォローアップのインタビュー調査を行った。結果、オペレーションの競争力が高い企業は、「機能横断的なプロセス改善能力」と呼ぶ組織能力を備えていることを明らかにした。この結論に至る過程で、モデルの外的妥当性の確保や結論の理論的・実務的示唆を議論するために、さまざまな業界の企業5社へのインタビュー調査、SCM先進企業である花王のマネジャー1名、SCM研究者1名との議論を行った。加えて、SCM先進企業であるリコーがグローバルに在庫を可視化するシステムを構築して、効率性と応答性のパフォーマンスを向上させている事例を調査した。同社SCM部門のマネジャーへの計4回のインタビューにもとづいて、パフォーマンス測定システムをいかにして構築・運用すればよいのかを明らかにした。なお、平成25年6月にアイルランド・ダブリンで開催された20th EurOMA Conferenceに参加し、学会発表と情報収集を行った。11月には、東京大学ものづくり経営研究センターにて開催された第106回ものづくり経営研究コンソーシアム定例会議分科会において、上記のアンケート調査およびフォローアップ・インタビュー調査にもとづいた研究成果を報告した。平成23年度は、サプライチェーンにおけるパフォーマンスのトレード・オフを克服するメカニズムに関するモデルを作成する上で、研究実施計画書の通り、主に文献調査を行い、インタビュー調査を補助的に行った。文献調査については、SCMに関する企業事例が豊富に掲載されている『月刊ロジスティクス・ビジネス』(約10年間分)を中心に、生産管理やロジスティクス管理の主要なジャーナルと関連図書を加えて行った。また、インタビュー調査については、「15年以上にわたってサプライチェーンの業務プロセスの変革を継続しており、パフォーマンスを漸進的に向上させている企業」として、日用品業界大手の花王株式会社の協力を得ることができた。同社へのインタビューは計5回実施した。対象部門は、ロジスティクス部門、生産部門、情報システム部門である。Lambertらが提唱している業務プロセスの区分を使って、主に製造フロー管理、需要管理、注文充足、顧客サービス管理、顧客関係管理の5つの業務プロセスを中心にインタビューを行った。文献調査とインタビュー調査を踏まえて、暫定的なモデルを作成した。具体的には、各プロセスの能力を測定する指標を開発しているところである。

モデルを作成する過程で、モデルの質的向上を図るための研究者との議論(1回)、モデルの外的妥当性を確保するための他社へのインタビュー調査や実務家との議論(3回)を実施した。平成24年1月に香港で開催されたThe Third POMS-HK International Conferenceに参加して、学会発表と情報収集を行った。計画変更後の中心的な研究テーマである、(1)サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係の詳細なモデル化について、モデル化を終え、来年度はモデルの実証に移る。平成24年度の初めに立てた研究計画からの遅れはなく、順調に進んでいる。研究目的に掲げた3つのテーマ、(1)サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係の詳細なモデル化、(2)競争力のパフォーマンスに見られるトレード・オフを克服する動態的なパターンの整理、(3)競争力を累加的に強化する現象の検証のうち、平成23年度は当初の計画通り、(1)のモデル化に取り組んだ。年度末の段階で、モデル化は製造フロー管理、需要管理、注文充足、顧客サービス管理、顧客関係管理の5つの業務プロセスで進んでおり、サプライヤー関係管理と製品開発の2つの業務プロセスを残している。モデルの作成が遅れ気味なのは、東日本大震災の影響で、先進企業への協力の打診やインタビューの実施が遅れたことによるものである。平成24年度に構築したモデル(サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係を示すモデル)について、平成25年5月(予定)に企業へのアンケート調査を実施する。対象は、日本の製造業者2ー3千社を予定しており、100ー200社の回収を見込んでいる。回収後、データの統計分析を行うが、分析結果の理解を深めるために、アンケート回答企業数社へのフォローアップのインタビュー調査を行う予定である。加えて、モデルの外的妥当性を確保するために、さまざまな業界へのインタビュー調査を今後も継続する。今後は、研究目的に掲げた3つのテーマ、(1)サプライチェーン・マネジメントに関する各種のアクション・プログラムが基盤能力、競争力、財務のパフォーマンスに結びつく静態的な因果関係の詳細なモデル化、(2)競争力のパフォーマンスに見られるトレード・オフを克服する動態的なパターンの整理、(3)競争力を累加的に強化する現象の検証について、静態的な研究である(1)のモデル化に実証を追加し、一方で動態的な研究である(2)と(3)をテーマから外すように研究計画を変更したい。
放射線分割照射による小腸腺窩細胞の増殖反応に関する基礎研究

小腸腺窩における分割照射中の再増殖能と増殖動態の機序を解明することを本研究の目的とする。増殖の機序はポテンシアル倍加時間(Tpot)の短縮または細胞喪失因子の減少によるとされている。本年度は分割照射中における小腸腺窩の標識指数(Ll)、S期の長さとTpotについて検討した。【材料と方法】C3H/Heマウスに一回線量2Gyを照射した。照射期間は1、3、5、7日間で、一日一回と二回照射群に分けた。最後の照射終了一日後にブロムデオキシウリジン(BrdUrd)と3H-チミジン(3H-dThd)を一定間隔で投与し屠殺した。摘出した空腸の同一切片から、免疫組織化学とオートラジオグラフィーによりおのおので標識した細胞核を可視化した。腺窩列におけるBrdUrdと[3H]dThdそれぞれの単標識と二重標識を数え、標識指数(L1)、S期の長さとTpotを計算で求めた。一腺窩当りの細胞も数えた。【結果】L1は、一日一回照射群と二回照射群で有意差はなく、照射期間により大きくなり、照射5日目でほぼ最大になった。S期の長さは、実験を通して不変であった。Tpotは、一日一回照射と二回照射群で差はなく、照射期間に伴って短縮した。照射5日目で最短になり以後変わらなかった。一方、腺窩の細胞数は照射五日まで増加し、以後変わらないのは同様であったが、一日二回照射群では一日一回照射群に比し細胞数が有意に多かった。【考察とまとめ】腺窩において分割照射中に再増殖が起きており、Tpotの短縮が関与している。しかし、腺窩内の細胞数は、一日二回と一回照射群では明らかに差があり、Tpotの短縮だけでは説明がつかない。このことから、Tpotの短縮以外に増殖に関わる細胞喪失因子の減少について今後検討を進めるべきであると考える。
携帯電話機と人体の電磁相互作用に関する研究

本研究の目的は人体の影響を含めた携帯電話機用のアンテナの設計を確立することと、携帯電話機が人体に与える影響を明らかにして安全基準の一指針を与えることである。ここで、実用型携帯電話機のモデルとして、方形の誘電体カバー付き金属筐体にモノポールアンテナが設置されているモデルを考える。人体のモデルには、周波数を1.5GHz帯と考えると頭と金属筐体を握る手だけを考えれば良い。解析手法について時間領域の差分法(FDTD法)を用いた。電波が人体にどのくらい吸収されるかについての最も基本な因子は人体の比吸収率SAR(Specific Absorption Rate)である。SARは人体の導伝率σと誘電率ε_rに依存するものである。人体の皮膚部分はσとε_rが低い、頭の内部のσとε_rが大きいので本研究では人体の頭は1cmの外層皮膚と半径8cmの内部部分で構成した。ここで二つ組のσとε_rの値を与えて(外層:σ_1=0.055S/m,ε_<r1>=5.6;σ'_1=0.12S/m,ε'_<r1>=5.6,頭の内部:σ'_2=1.09S/m,ε'_<r2>=35;σ_2=1.4S/m,ε_<r2>=46)計算を行った。頭部に吸収された電力はそれぞれ入力電力の40%と50%であることが分かった。一般的に、小電力の携帯電話機のアンテナの出力は最大1wで、この場合に人体の頭中に吸収される電力は0.40.5wになることが分かった。
概念の深い理解を目指す科学教育カリキュラム開発のための小中高大協働研究

本研究は、小中高大理科教員の協働研究組織(Professional Learning Community)を生かし、教科と学校種を超えた教員主体のカリキュラム開発がどうしたら可能になるか、組織的継続的に授業研究や授業実践検討を行い、深い概念理解を目指すカリキュラム開発の実践研究を行うものである。日本の学校教育においては、学習指導要領によって学習内容が決められてきているが、学校現場主体のカリキュラムマネジメントの必要性も指摘されている。教科や学校種を超えた協働研究組織、児童生徒の科学的概念形成プロセスや幅広いカリキュラム編成理論を踏まえた実践研究を継続し、カリキュラム開発を目指す。
アルコールの中毒作用に対して非酸化代謝過程のおよぼす影響

急性アルコール中毒死の剖検例においてエタノールの非酸化物である脂肪酸エチルエステル(FAEE)の高濃度の諸臓器分布が報告されて以来、FAEEは酸化的酵素活性の低い臓器においての障害発生原因として注目されてきた。しかしながら、FAEEの分解によって生じるfreeの脂肪酸に細胞毒性があることや酸化的代謝によって生じるアセトアルデヒトを含めた酸化的ストレスを考慮すると、FAEEはむしろ高濃度のエタノールによる酸化ストレスに対する防御機構として生じる可能性がある。そこでこの研究では、Wistar系雄ラットを用いて、ALDH多型とエタノール代謝動態の関係を調べ、それらのFAEE産生に及ぼす影響を検討した。エタノール代謝動態解析では、in vivoにおいて1g/kgを静脈投与した。投与後経時的に血中のエタノール濃度ならびに酢酸濃度を測定し、得られたエタノール濃度曲線ならびに酢酸濃度曲線を解析した結果、エタノール浪度曲線において差は認めないものの、酢酸濃度曲線については2型に分類された。さらに、肝ALDH多型分析を行ったところ、mitochondrial ALDHにおいて多型(2型)が認められ、先の酢酸濃度曲線の2型とそれぞれ一致した。このmitochondrial ALDH多型が血中酢酸濃度に影響を及ぼしたことから、Wistar系ラットのFAEE産生に対して血中酢酸濃度ならびにALDH多型の及ぼす影響は無視できないことが示唆された。現在ALDH遺伝子の変異点を検索中であり、遺伝子多型診断によって2群に分けFAEE産生との関係を検討している。
飛翔体と地上ロボットの群制御を用いた多次元情報収集システムの開発

小型の飛翔体や地上移動型ロボットを用いた情報収集をより高機能にすることを目的として多数の機体を連携させる群制御の研究を行った。自然界における鳥や魚の群運動を参考にして、接近、反発、平行移動の3つの制御を組み合わせた群制御モデルを作成し、これを用いて地上移動型ロボットや各種飛翔体を用いた群制御を試みた。その結果、これらのハードウェア上で3つの制御の全て、あるいは一部が正しく機能することを確認し、飛行船と地上移動ロボットという異種の機体間での連携制御にも成功した。また、魚群行動を分析して個体の成長段階に応じた群形成パラメータの変化を確認し、群移動時のエネルギ消費を低減できる個体配置を明らかにした。平成23年度は(1)群制御アルゴリズムの開発、(2)群制御ハードウェアの開発の2点について下記の通り取り組み成果を得た。(1)群制御アルゴリズムの開発:編隊飛行中の飛翔体群の編隊形状を変化させるために、新たに形状制御用の制御モデルを設計し、従来モデルに組み込んだ。その結果、形状変形時に多発していた群の分裂を減少させることに成功し、目標形状にある程度安定に収束させることに成功した。また、要素間の性能差が存在する時の群制御の特性を明らかにするため、一部の機体が他の機体を誘導するモデルを作成し、誘導機体の比率の違いが誘導の成功率に与える影響を分析した。その結果、誘導の成功率に強い影響を持つパラメータが明らかになった。また、群制御アルゴリズムの参考データを取得するため、魚群運動の3次元解析システムを構築し、成長段階が異なる個体からなる魚群がいかにして群を安定に維持できるかを分析する実験を開始した。(2)群制御ハードウェアの開発:飛翔体と地上移動型ロボット群の連携を実現させるため、飛行船ロボットに気圧高度センサを搭載し、地上移動ロボット群に高度データを送信する実験系を構築した。その結果、飛行船ロボットの高度変化に応じて地上ロボット群の運動を制御することが可能になり、飛行船の上昇と下降に伴って、地上ロボットが集合と分散を切り替える実験に成功した。また、小型飛翔体の群制御に使用する機体の空力性能を分析するための風洞実験を行ったほか、飛翔体に搭載する群制御用の制御ボードに搭載されている加速度センサやGPSの精度検証実験を行い、加速度センサが電気的なノイズの影響を受けやすく、微小な加速度ではS/N比が十分ではないこと、およびGPSセンサが衛星情報を取得するまでに予想以上に時間がかかること等を明らかにした。また、飛翔体群制御用に使用する固定翼型機体を選定し購入した。本研究のテーマは(1)群制御用ソフトウェアの開発と(2)群制御用ハードウェアの開発に別れており、それぞれについて以下のような成果が得られた。(1-a)航空機向け群制御用プログラムの開発:本年度は固定翼機とマルチコプター型の回転翼機を対象とした群制御用のプログラム開発を行い、機体間の適正距離の維持と機体方位の整列化を実現する制御プログラムを開発した。開発後は実機上で地上試験を行い、距離や方位に応じて適切な操舵が行われることを確認した。また、複数機体の飛行経路の設定や、複数機体から送信される位置や角度の情報を一元管理できる地上システムを開発した。(1-b)生物の群運動における個体間の情報伝達の分析:マサバ幼魚の群を用いた実験により、特定の個体に与えた刺激が他個体に伝播する仕組みを明らかにした。また、群遊泳中の個体の移動コストが単体での移動コストよりも減少することを確認し、群遊泳のエネルギー的利点を定量的に示した。(2-a)固定翼型、回転翼型の航空機を用いた群制御システムの開発:固定翼型の群制御システムの開発では、市販のラジコン飛行機に自動制御用のマイコンと機体間通信に必要な通信装置を搭載し、GPSの位置情報と磁気方位センサの方位情報を機体間で共有しあう制御システムを実現した。また、回転翼型の航空機では群制御用のマルチコプターを開発し、超音波センサや方位センサを用いた機体間の距離制御や方位制御を実現した。(2-b)飛翔体と地上移動型群ロボットの連携制御の改良:25年度は地上ロボットの改良を行い、走行部には全方向移動機構を採用し、超音波センサを8機搭載して検知範囲を拡大した。また、駆動部制御基板と超音波センサ制御基板の2種類を使用して負荷の分散を行った。超音波センサ制御基板はユニバーサル基板を使用し、CPUはH8/3052Fを使用した。実験の結果、複数ロボットによる群制御に成功した。

平成24年度は(1)群制御アルゴリズムの開発、(2)群制御ハードウェアの開発、(3)多次元情報表示システムの開発、の3点に取り組む予定であったが、(3)の多次元情報表示システムの開発については、表示の対象となる画像データ、温度、湿度等のデータの取得に必要なセンサ類の導入が遅れて機体への搭載まで至らなかったため、来年度に行うこととし、(1)、(2)の項目について研究を行い以下のような成果を得た。(1)群制御アルゴリズムの開発重点課題として取り組んでいる編隊飛行中の飛翔体群の編隊形状の制御において、形状の変更中に起きる分裂や脱落を防ぐために機体間の相互作用モデルを変更し、機体の移動方向の変動を抑えるための改善を加えた。その結果、70%程度あった分裂の発生率を10%程度にまで抑えることに成功した。また、外乱モデル(Drydenモデル)を導入することによって外乱時の編隊飛行の安定性を評価し、安定性を高めるために有効なパラメータを同定することができた。さらに、魚群を構成する個体のエネルギー消費を分析し、先頭個体よりも後続個体の方が少ないエネルギー消費で移動できること、及びエネルギー消費を最小にすることができる最適な個体の位置が存在することを定量的に証明し、群制御が持つエネルギーコストの低減効果を明らかにした。(2)群制御ハードウェアの開発自律飛行による群制御を実現するために飛行制御ボードを入手し、搭載センサの精度検証を行い良好な結果を得ることができた。また、機体間の相互作用の一つである機体の向きを揃える制御(平行制御)を実現するために、方位センサの情報を通信装置を用いてロボット間で交換し、互いの向きを揃える制御に成功した。また、飛翔体と連携する地上ロボットについては、新たに全方位移動機能を搭載したロボットを導入し、超音波センサを搭載して複数ロボット間の相互作用制御を実現した。群制御アルゴリズムの開発において、形状制御や誘導制御に関して一定の成果や知見が得られたこと、また、群制御ハードウェアの開発において、地上ロボットと飛行船の連携行動に成功し、制御ボードの精度検証を行ったこと、さらに、魚群運動の3次元解析システムを構築し、実験を開始したことなどから研究は順調に進展していると判断できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。群制御アルゴリズム研究については、群の分裂や脱落の問題に対して機体間の相互作用モデルを改良し、機体間の距離に応じて相互作用を連続的に変化させることによって、機体運動の急激な変動を抑えて運動を安定化することに成功した。その結果、従来モデルで発生していた群の分裂や脱落を大幅に削減することに成功した。また、再現性の高い外乱モデルであるDrydenモデルをシミュレータに組み込んで、安定性に影響を持つパラメータを分析した結果、同時に相互作用できる機体数(Nb,max)が大きいほど、外乱下における群形状の変動や移動方向のばらつきが抑えられ、高い安定性を維持できることを確認した。Nb,maxを増加させることの有効性は過去の外乱モデルでも指摘されていたが、より再現性の高いDrydenモデルでも同様な結果を確認できたことは、Nb,maxが持つ群制御の安定性向上の効果をより確実に示す成果だと言える。また、魚群の運動解析を行って、群の先頭個体よりも後方個体の方が運動時のエネルギー消費量が小さいこと、及び後方個体の中で前方個体の斜め後ろに位置する個体が最もエネルギー消費が小さいことを確認することができた。
siRNA法による全メタロチオネイン分子種発現抑制細胞の作成

ヒト体内に蓄積したカドミウムの大部分は生体防御蛋白質メタロチオネインと結合することによってその毒性発現が抑えられている。ヒトのメタロチオネインには10種以上の構造的に類似する分子種が存在するが、このように多くの分子種が存在する意義は全く分かっていない。この疑問を解くためには、全てのメタロチオネイン分子種を欠損したヒト由来細胞が研究材料として必須である。そこで、本研究では全てのメタロチオネイン分子種の発現が抑制されたヒト培養細胞をsiRNA法を用いて樹立すると共に、本細胞に、siRNAによって認識されないように工夫を凝らしたメタロチオネイン分子種の遺伝子を一つずつ発現させて、それぞれの分子種の機能の比較を可能とすることを目指した。全メタロチオネイン分子種に共通して存在する複数の塩基配列部分をそれぞれ含む種々のsiRNA発現プラスミドを構築し、それらを個々にヒト由来培養細胞に導入し、リアルタイムPCR法によって全メタロチオネイン分子種の発現程度をそれぞれ調べることによって、最も効率良く全てのメタロチオネイン分子種の発現を抑制するsiRNAを選択した。このsiRNA発現プラスミドを用いることによって、恒常的にsiRNAを発現する細胞株を得ることに成功した。この細胞が保持するメタロチオネイン分子種の発現は全て、有意に減少していることが確認され、また、本細胞はカドミウムに対して高い感受性を示した。この細胞中にメタロチオネインIまたはIIを単独で発現させることにも成功し、メタロチオネイン各分子種の作用検討に利用可能な細胞株を樹立することができた。
コンドロイチン硫酸の腸管への作用による生体防御機構の解明

本研究では市販のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカン標品(サンスター社のヒアルコPG)からプロテオグリカン画分を分画し、これをマウスに経口投与した後、小腸に到達したときのプロテオグリカンの構造の変化について検討した。この標品にはプロテオグリカンの他にコラーゲン、ヒアルロン酸等の不純物が含まれていることから,初めにこれらを可能な限り除去するためにDEAE-Sephacelによるイオン交換クロマトグラフィ及びSepharose CL-2Bによるゲル濾過クロマトグラフィを行った。その結果,カルバゾール硫酸法によるウロン酸量を指標として分子量の異なる3つのプロテオグリカン画分(分子量の大きいものからPG1,PG2,およびPG3)を得た。このうちPG2はプロテオグリカンそのものであり,量的にもっとも多く回収された。これに対してPG1は,PG2と除去しきれなかったヒアルロン酸とが凝集体を作ったもの,また分子量の小さいPG3はPG2の部分分解物と考えられ,いずれもPG2に比較し回収量は少なかった。そこで以後の実験にはPG2画分を用いた。このPG2画分を10 mg/mlの水溶液としたものをマウスに経口投与した後、小腸内容物を回収した。これを7 M尿素/50 mMトリス塩酸緩衝液(pH 7.5,プロテアーゼ阻害剤を含む)により抽出し,可溶画分を得た。この可溶画分に含まれるプロテオグリカン消化産物をDEAE-Sephacelにより回収し,Sepharose CL-4Bによるゲル濾過で分子量変化を検討した。その結果、小腸におけるプロテオグリカンは低分子化しており、そのサイズはアクチナーゼで消化したプロテオグリカンと等しいことから,タンパク質部分がほぼ完全に消化されたことが示唆された。また,プロテオグリカンの糖鎖長や硫酸基の結合位置には変化が認められないことも示唆されたが,さらなる検討が必要である。今年度は市販プロテオグリカン標品からプロテオグリカンをマウスに投与するに十分な量を精製することを目標の第一にあげた。次に,これを実際にマウスに投与し,小腸内容物からプロテオグリカン消化産物を回収して,投与前のプロテオグリカンと構造を比較することにより,経口投与されたプロテオグリカンの消化の実態を明らかにすることが二つ目の目標であった。まず,プロテオグリカン標品をそれぞれ大型カラムを用いたイオン交換クロマトおよびゲルろ過クロマトをそれぞれ4回ずつ行い,市販プロテオグリカン標品に含まれているコラーゲンなどの不純物を除去すると同時に,以降の実験に十分な量のプロテオグリカンを調製した。これをマウスに投与して1時間後にほぼ小腸に達していることを,胃,小腸,盲腸および大腸の内容物の電気泳動による分析で確認した。その後,マウスに投与後の小腸内容物の回収を繰り返し,その可溶画分からイオン交換樹脂により酸性物質を回収し分析した結果,小腸におけるプロテオグリカンはタンパク質部分がほぼ完全に消化されたが,その糖鎖長や糖鎖の硫酸基の結合位置には変化がないことが示唆された。以上より,今年度計画はほど順調に進展したと判断した。プロテオグリカンを経口摂取してもプロテオグリカンの糖鎖(コンドロイチン硫酸)の構造が変わらないとすれば,コンドロイチン硫酸そのものが腸管から吸収される可能性は極めて低いものと推測される。プロテオグリカンの経口投与が生体に影響を与えるとすれば,コンドロイチンが腸管に直接作用し何らかの生物活性を発現している可能性がある。そこで今後の研究は,プロテオグリカン消化産物の構造解析と並行して,コンドロイチン硫酸の腸管上皮細胞への直接的な影響を,培養細胞を用いて検討する計画である。

また,プロテオグリカンの糖鎖長や硫酸基の結合位置には変化が認められないことも示唆されたが,さらなる検討が必要である。今年度は市販プロテオグリカン標品からプロテオグリカンをマウスに投与するに十分な量を精製することを目標の第一にあげた。次に,これを実際にマウスに投与し,小腸内容物からプロテオグリカン消化産物を回収して,投与前のプロテオグリカンと構造を比較することにより,経口投与されたプロテオグリカンの消化の実態を明らかにすることが二つ目の目標であった。まず,プロテオグリカン標品をそれぞれ大型カラムを用いたイオン交換クロマトおよびゲルろ過クロマトをそれぞれ4回ずつ行い,市販プロテオグリカン標品に含まれているコラーゲンなどの不純物を除去すると同時に,以降の実験に十分な量のプロテオグリカンを調製した。これをマウスに投与して1時間後にほぼ小腸に達していることを,胃,小腸,盲腸および大腸の内容物の電気泳動による分析で確認した。その後,マウスに投与後の小腸内容物の回収を繰り返し,その可溶画分からイオン交換樹脂により酸性物質を回収し分析した結果,小腸におけるプロテオグリカンはタンパク質部分がほぼ完全に消化されたが,その糖鎖長や糖鎖の硫酸基の結合位置には変化がないことが示唆された。以上より,今年度計画はほど順調に進展したと判断した。プロテオグリカンを経口摂取してもプロテオグリカンの糖鎖(コンドロイチン硫酸)の構造が変わらないとすれば,コンドロイチン硫酸そのものが腸管から吸収される可能性は極めて低いものと推測される。プロテオグリカンの経口投与が生体に影響を与えるとすれば,コンドロイチンが腸管に直接作用し何らかの生物活性を発現している可能性がある。そこで今後の研究は,プロテオグリカン消化産物の構造解析と並行して,コンドロイチン硫酸の腸管上皮細胞への直接的な影響を,培養細胞を用いて検討する計画である。
生理的・心理学的指標を用いたうつ病への集団認知行動療法における有効性の検討

本研究は、看護師が中心となって実施するうつ病への集団CBTのプログラムを作成・実施し、その効果を生理学的及び心理学的指標を用いて検証することを目的とした。平成24年10月27年12月の期間で、主治医から紹介された被験者に1クール6セッションの集団CBTを計5回実施し22名のデータを得た。心理学的指標では、BDIーII、QIDS-Jの得点が有意に低下し、うつ傾向が軽減し、SF-36v2では、社会的機能に改善が見られた。自尊心尺度も有意に増加した。生理学的指標としてのNIRSの結果は現在解析中である。この研究により、看護師が実施する集団CBTにおけるうつ病患者への有効性が示唆された。2012年10月2013年1月に、M大学医学部附属病院精神科外来、または入院中の患者の中で、主治医からの説明で同意が得られた、気分障害と診断された50代女性、30代女性、30代男性の3名を対象に、全6回のセッションを構造化したプログラムを作成し実施した。プログラム開始前後にSF-36v2、BDI-II、QIDS-J、自尊心尺度(SE)、近赤外線スペクトロスコピィ(以下NIRS)を実施した。NIRSは安静1分、鏡映追跡課題1分、安静1分の計3分間実施した。セッション毎にBDI-II、QIDS-Jを実施した。NIRSについては課題遂行時の右前頭葉・左前頭葉の酸素化ヘモグロビン(oxy-Hb)の変化が示す波形の積分値、波形の重心値、課題開始5秒間の波形の上昇率(初期賦活)の3つのパラメータの値について検討し、今回は積分値についてCBT前後で対応のあるt検定で有意差を求めた。その他質問紙に関してはセッション前後の得点を比較した。全被験者がCBT実施前後の比較で、BDI-II、QIDS-J、SF-36v2、SEの全質問紙において得点の改善がみられた。NIRSの積分値のCBT実施前後の比較では、1名を除き、右前頭葉・左前頭葉の積分値が有意に増加し、課題遂行時の前頭葉活動の活性化が見られた。うつ病患者は一般に健常者と比較し、課題中の積分値が小さいことが明らかになっており、集団CBTを実施したことにより、より健常な脳活動を示すようになったことが示唆された。心理的側面においては、有意に改善したものはSF-36v2のみであったが、BDI-II、QIDS-J、SEも有意ではないが改善がみられたことから、集団CBT実施によって自覚的な健康度も回復することが示唆された。今回は対象者が3名と少なく、結果を一般化することは困難であり、今後例数を増やすことで、集団CBTの効果をさらに検証していく必要がある。本研究は、「生理的・心理学的指標を用いたうつ病への集団認知行動療法における有効性の検討」をテーマに、看護師中心となって行ううつ病に対する集団認知行動療法の効果を明らかにする研究である。平成26年度は、研究協力病院である宮崎大学医学部附属病院精神科外来と医療法人如月会若草病院にて、24名の集団認知行動療法のセッションを5クール実施した。1クールは6回のセッションで構成されている。対象の選定基準に従い、2病院の医師を通じてリクルートを依頼した。被験者は16名(男性11名、女性6名)であったが、そのうち、男性3名、女性3名のドロップアウト事例があり、最終的なデータ取集数は現在10例である。本研究は、医師と連携して看護師が中心となって実施するうつ病への集団認知行動療法(Cognitive Behavioral Therapu:以下CBT)のプログラムを作成・実施し、プログラムの効果について、生理学的指標及び心理学的指標を用いて検証することを目的とした。本研究を行うことにより、現在2%程度にとどまっているCBTの実施率が向上し、それにより、うつ病治療の選択肢が増え、うつ病の再発率の改善や自殺率の低下が期待できる。本研究のプログラムは、先行研究のうつ病を対象とした集団CBTプログラムを参考に作成した。生理学的指標としては、NIRS(近赤外線スぺクトロスコピー)を用いた。心理学的指標として、BDI-II、QIDS-J,SF-36v2、自尊心尺度を用いた。平成24年10月平成27年12月の期間で、主治医から紹介された被験者に1クール6セッションの集団CBTを実施し、計22名のデータを収集した。そのうち、平成27年度は、4クールで15名の被験者を対象に実施した(1名ドロップアウト)。心理学的尺度では、BDI-II,QIDS-Jの得点が有意に低くなり、うつ傾向が軽減した。SF-36v2では、社会的機能に改善が見られた。自尊心尺度も有意に増加していた。NIRSの結果については、現在解析中である。

心理学的指標では、BDIーII、QIDS-Jの得点が有意に低下し、うつ傾向が軽減し、SF-36v2では、社会的機能に改善が見られた。自尊心尺度も有意に増加した。生理学的指標としてのNIRSの結果は現在解析中である。この研究により、看護師が実施する集団CBTにおけるうつ病患者への有効性が示唆された。平成26年度は、研究協力病院である、宮崎大学医学部附属病院精神科外来と医療法人如月会若草病院にて、24名の集団認知行動療法のセッションを5クール実施した。1クールは6回のセッションで構成されている。被験者は16名(男性11名、女性6名)であったが、そのうち、男性3名、女性3名のドロップアウト事例があり、最終的なデータ取集数は現在10例である。研究当初の被験者数が20名であり、ドロップアウトの6事例があるため、データ獲得数が目標よりも遅れている状況である。精神看護学平成27年度は、目標の被験者数(20例)に向けて、セッションを数回実施したい。並行して、研究成果の論文化を行っていく予定である。M大学附属病院で、2クールのセッションを実施し、3名から研究データを得ることができた。当初予定より、物品費用について、使用しなかったため、当初予定より使用額が少なくなったため。M大学附属病院だけでは、対象者の例数を総定数まで設定することが困難なため、今後、協力体制の取れる附属病院以外の精神科病院での実施を予定している。科研費による研究の最終年度として、研究成果を国内外に発信するために、論文化による費用に充てる予定である。当初予定より、物品費用について、他の研究者との共同購入により当初予定より使用額が少なくなったため。物品費用の大きな項目であったNIRSと分析ツールは購入できたが、ソフトを使用するためのPCが必要となったため、その購入費用に充当する予定である。
パーキンソン病発症メカニズムにおけるリソソーム病の新たな病態関与の探索

パーキンソン病は脳内ドパミン不足により進行性の運動障害を起こす神経変性疾患である。根本治療や疾患修飾療法の開発のため病態解明が喫緊の課題である。本研究では、3家系の常染色体優性遺伝性パーキンソン病患者にリソソーム病関連遺伝子の新規遺伝子変異を発見したことに基づき、患者iPS細胞や遺伝子変異導入マウスを用い脂質組成変化やリソソーム酵素活性の変化に着目した研究を行う。家族性パーキンソン病の新規原因遺伝子変異における、リソソーム機能障害に関連した酵素活性低下や脂質変化を捉えることで病態解明を目指し創薬を目指した治療ターゲットを探索する。
非生殖細胞である分化多能性幹細胞における異所性の減数分裂と胎生致死との関連

生殖細胞は減数分裂を開始する際にPRC1.6複合体の機能を破綻させる必要があるが、その分子メカニズムの解明と人工的なPRC1.6複合体の機能の抑制が異所性の減数分裂を惹起を引き起こすかについて解析した。その結果、PRC1.6複合体の機能を破綻させることが想定される生殖細胞特異的Mgaバリアントの同定及びMaxノックアウト雄始原生殖細胞での減数分裂遺伝子発現上昇の結果を得た。減数分裂は、精子及び卵子という通常の体細胞が持つ染色体の数を半分にするための細胞分裂である。そして、この減数分裂は、減数分裂を経て作られた精子と卵子が合体して受精卵を作る際に、その受精卵における染色体の数を通常の体細胞と同じ数に保つためのものであり、生殖細胞にとっては極めて重要な生物学的現象であり、かつ、生殖細胞に特異的現象である。但し、研究代表者は、平成27年度までに、生殖細胞ではないES細胞において、専らc-MYC転写因子のパートナー因子として認知されているMAXタンパク質をコードする遺伝子をホモでノックアウトするとES細胞が減数分裂前期の中のpachytene期の直前もしくは初期段階までの変化を示すことを見出した。そして、その、思いもよらぬ発見を軸に本研究課題を始めたが、今までの期間に、その現象の背景にある分子基盤の解明を試み、MAX遺伝子ノックアウトによりみられるES細胞の減数分裂様の変化は、MAXタンパク質をサブユニットの一つとして持つ非典型的PRC1複合体(PRC1.6)の機能破綻の結果を反映していることを明らかにした。なお、MAX遺伝子ノックアウトマウスは、胚の着床後、即、細胞の増殖がほぼ完全にストップし、そのため、胎生致死のフェノタイプを呈するが、その報告がなされた2000年においては、もちろん、Max遺伝子が減数分裂に対する抑制因子であるという概念はなく、それ故、MAXノックアウトマウスが呈するすべてのフェノタイプはMyc活性との関連で結論されている。それ故、私は、改めてMAXノックアウトマウスについて機能解析を行い、ES細胞に相当する細胞である内部細胞塊細胞での異所性の減数分裂がこのマウスが呈する胎生致死のフェノタイプに関わっている可能性について検討する。現在までに、マウスMaxノックアウトES細胞が異所性に減数分裂様の変化を示すという現象を規定している分子メカニズムに関しては、MAXタンパク質をサブユニットの一つとして含むPRC1.6複合体の機能の消失による結果であるということを証明することができた。なお、PRC1.6複合体は、MAXやPCGF6など、計12個のタンパク質により構成される複合体であるが、ES細胞におけるMAX遺伝子ノックアウトが引き起こす効果の大きさは、PCGF6などの他のどのサブユニットをコードする遺伝子のノックアウトが引き起こす効果よりも大きいことがわかった。かつ、その理由は、1つには、MAXがPRC1.6複合体に対してDNA結合能を付与している因子であることが関係しているが、それに加え、MAXがMYC転写因子が機能する上で必須な因子であるため、Max遺伝子のノックアウトは体細胞分裂のための主要因子であるMYCの機能消失を誘導し、そのことが、間接的に減数分裂の効率を高めるからであることを明らかにした。かつ、これらのin vitro実験を行うのと並行して、マウス個体におけるMAXタンパク質の減数分裂における役割を明らかにすべく米国からMaxコンディショナルノックアウトマウスを取り寄せるなど、マウスを用いた解析を行うための準備を整えた。細胞増殖に深く関わることが知られているMYCタンパク質は、がん遺伝子産物の一つであり、そのMYCは、Cyclin D遺伝子などの細胞増殖に関わる遺伝子からの転写を正に制御する転写因子として、生物学的な機能を発揮していることが知られている。但し、MYCタンパク質は、単独では転写因子として機能することができず、その為にはMAXタンパク質との相互作用を必要とする。従って、MAXは、MYCに対するパートナー因子として専ら認知されている。実際、MAXがMYCと相互作用する因子としてクローニングされたという歴史的な背景もこのMAXに対する認識に大いに関係している。但し、私たちを含むいくつかのグループは、最近、MAXタンパク質が、6種類存在する、転写を強力に抑制する複合体であるPRC1複合体の中で最も非典型的複合体と称されるPRC1.6複合体の中のサブユニットの一つであり、このPRC1.6複合体による転写抑制は、Sycp3遺伝子等、減数分裂関連遺伝子にかなり特異的に作用していることを証明している。すなわち、生殖細胞は、減数分裂を開始するためにPRC1.6複合体による減数分裂関連遺伝子に対する発現抑制を解いている。このような背景を踏まえ、私は、マウス個体でも、MAXタンパク質を含むPRC1.6複合体の機能の抑制の解除が、生殖細胞における減数分裂の時期を決定しているかという点について解析した。その結果、本来、減数分裂を起こさない雄の始原生殖細胞におけるMax遺伝子の破壊に伴ったPRC1.6複合体の機能の抑制が、減数分裂関連遺伝子の発現の上昇を引き起こすことを明らかにすることができた。

MAXの減数分裂抑制因子としての機能についての作用機序解明のための生化学的な解析はほぼやり終えたので、平成29年度は、マウスを用いたin vivo解析を中心に研究を遂行したいと考えている。既存のMaxコンディショナルノックアウトマウスに加え、既に、そのマウスからMaxノックアウトマウス(ヘテロ)を作製しているので、そのMaxヘテロノックアウトマウス同士の掛け合わせにより4分の1の確率で生ずるホモ欠失胚について、胎生致死のフェノタイプが顕著となる6日胚において異所性に減数分裂が惹起されているか否かについて免疫染色やRNA解析により検討する。また、Stra8ノックアウトマウスとの掛け合わせにより減数分裂が起こらないバックグラウンドを作った場合、Maxノックアウトマウスの着床直後における胎生致死というフェノタイプが緩和されるなどの変化がみられるかを検討する。幹細胞生物学ES細胞におけるMax遺伝子の欠失によって生ずる異所性の減数分裂様の変化に関して非典型的PRC1複合体(PRC1.6)の機能の破綻という直接的な原因の他にMycの機能不全も間接的には少なからず関係しているのではないかとう仮説が思いのほか容易に証明することができた。それ故、その分、研究試薬の購入に投入しなくてはならない費用を縮小できたことが、想定していた金額よりも実際の使用額が少なかった主な原因である。平成29年度は、Max遺伝子のホモ欠失が、ES細胞と同様に、初期胚のES細胞に相当する細胞である内部細胞塊細胞においても、異所性の減数分裂を引き起こすか否か、そして、その異所性の減数分裂が、実際に起こった場合、それは、Maxノックアウトマウスが呈する発生の極めて初期に起こる胎生致死のフェノタイプに関係しているか否かを明らかにするための研究が中心になるが、平成28年度の予算おいて繰り越された約23万円の研究費は、それらの解析の為の実験を、より洗練されたものにするため、当初予定していた免疫染色の為に購入する抗体の種類を増やすことに投入したいと考えている。
生物学的シグナル分子を担持した癌免疫療法用複合メソポーラスアジュバンド

本研究の目的は、「肝癌免疫補助治療用の新規癌ワクチンアジュバント材料を創製すること」である。本年度は、ガン抗原となる自己の死滅腫瘍と共存させることで、安全に且つ高い免疫活性化効果を示す新規アジュバント材料の調製を行い、in vitro及びin vivoでの免疫活性を評価した。昨年度確認したアジュバント材料の調製に重要なファクターを考慮し、シグナル物質の担体候補として301000nmの粒子径、210nmの孔径を有する種々のメソポーラスシリカを調製した。NIH3T3細胞を用いて安全性を確認したメソポーラスシリカに複合化するシグナル物質にはサイトカインではなく菌体抽出物を採用し、種々のアジュバント材料候補を得た。これらのアジュバント候補材料を添加した培養液中でマクロファージを培養し活性評価したところ、特定のアジュバント材料候補で刺激されたマクロファージはコントロール(無刺激)に比較して2.43.2倍の免疫応答指標サイトカインを産生し、マクロファージを明瞭に活性化しうるアジュバント材料が作製できた事が確認され、これをin vivo実験に用いた。アジュバント材料は、自己の死滅腫瘍組織片と共存するように腫瘍治療モデルマウスに注入し、腫瘍再発の有無を30日間観察した。コントロールの生理食塩水を注入した群では腫瘍が1/5匹で再発したが、アジュバント材料群では0/5匹だった。腫瘍の再発がないマウスに腫瘍細胞を播種すると、30日後に生理食塩水の群では2/4匹に腫瘍が形成されたのに対し、アジュバント材料の群では腫瘍形成が1/5匹に留まり、候補アジュバント材料がマウスのガン免疫獲得に好影響をもたらしたと考えられた。本年度は、マイクロウエーブ焼灼療法と併用することを前提とし、患部局所に投与可能で、さらに高い効果を有する肝癌免疫補助治療用の新規アジュバント材料を探索した。P123またはCTABをテンプレート化合物に用い、気孔径、粒子形状の異なるメソポーラス体を作製した。生物学的シグナル物質としてはインターロイキン-2(IL-2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、TNF-α、マグネシウム塩などを用いた。リンゲル液、クリニザルツB及びバイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液の混合し、37°C48時間25°C24時間程度の条件で保持し、キャリアーとシグナル物質の複合化を行った。合成物をX線回折、SEM、化学分析で評価したところ、メソポーラスシリカ・リン酸カルシウム複合体が生成していることを確認した。メソポーラス複合体表面を-NH2基や-SH基で表面修飾する必要はなかった。複合体の結晶相、表面構造、化学組成、シグナル物質担持量を検討するとともに、このようにして得られたメソポーラス複合体を細胞培養液に添加し、当該培養液中でNIH3T3細胞の培養を行い、細胞毒性を評価した。以上の工程を繰り返し、300μg/mLの粒子濃度でも細胞毒性が極めて低い、メソポーラス複合体を調製することができた。メソポーラス複合体のアジュバント活性を測定する準備として、THP-1細胞によるin vitroバイオアッセイ(培養プロトコール)の確認と、予備実験を進めた。