hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞増殖・鉄代謝に関連するDAP分子の機能解析

細胞での鉄輸送はDMT1に担われる。本研究では赤芽球モデルであるK562細胞株を用いDAPの発現変化を検討した。DAPにはPPIXと共通する受容体がアミノ酸配列から想定され、DAPとPPIXは相互作用を持つと考えて実験を行った。PPIX投与後のDAP, DMT1, TfR1, FTHの蛋白量とmRNA量の発現変化を調べた。PPIXはDAP, DMT1の蛋白量を減少させ、DMT1mRNAの低下はDMT1の転写因子であるC/EBPaの発現低下が原因と考えた。PPIXはFTH, DAP, DMT1の減少を誘導し、ライソソーム阻害剤とプロテアソーム阻害剤の併用はFTHの蛋白分解作用を最も阻害した。鉄は細胞機能の維持に必須な酵素反応を触媒する遷移金属であり、Divalent Metal Transporter 1 (DMT1)を含む小胞によるエンドサイトーシス機構により細胞内に取込まれる。DMT1を含む小胞が細胞質を移動する輸送機構には未解明な点が多く、ラット十二指腸cDNAライブラリを用いたyeast-two-hybrid systemにより、DMT1 Associated Protein (DAP)を同定した。DAPはエンドサイトーシスと関連するだけではなく、細胞増殖を調節する分子であった。腫瘍のパラフィン包埋組織でのDAPの発現検討は報告されていないため、申請者は、市販されているTissue MicroArray(TMA)標本の免疫染色を施行した。TMA標本の追加免疫染色により、多くの腫瘍組織でDAPは発現していることを確認した。tumorheterogeneityによる発現パターンの変化があることが否定できないため、今後は、倫理委員会での研究計画の承認後に、外科病理材料を用いてDAP免疫染色を行い、腫瘍組織での発現パターンの詳細な検討を行う予定である。DAPをknock outするゲノム編集用プラスミドやゴルジ装置や形質膜を可視化するプラスミドを購入し、培養細胞を用いた実験を行う準備を行った。また、DAPはPeripheral-typebenzodiazepinereceptor(PBR)と結合するモチーフ配列が見られるため、PBR抗体を購入しマウス胎児組織や中皮腫組織を用いて免疫染色を行った。PBRとDAPの局在パターンについて検討を行い、腫瘍組織における発現レベルの検討を行う準備を進めている。平成27年10月に追加内定を受け、研究課題に取組みを始めた。市販のヒトTissue-MicroArray(TMA)スライドの追加購入と免疫染色を行った。TMAでは多症例の検討が同時に出来るが、腫瘍組織での発現にばらつき(tumorheterogeneity)が存在する場合には、鑑別診断のマーカーとしての有用性は制限される。生検組織のような小検体ではTMAコアよりは小さいためTMA標本でも十分と考えられるが、tumorheterogeneityの有無の検討のため、切除材料を用いた検討を行う。また、市販TMA標本は腫瘍の組織型によっては、臨床病期別に作成されたTMA標本もあり、臨床病期との相関についても検討を行う。申請者は、アメリカ留学時にDAP分子の研究を開始した。DAP分子はPeripheral-type benzodiazepine receptor(PBR)と結合することが想定されている分子である。PBRはBenzodiazepine以外にもProtoporphyrin IX (PP IX)と結合することが知られている。PP IXは二価鉄と錯体を形成してヘム合成の基質となり、鉄代謝と関連する。申請者はアメリカ留学時にDAP分子とPP IXについて研究を行い、筆頭著者として論文投稿の原稿を作成しており、この研究成果を踏まえたDAP分子の機能解析の展開まで、進捗している。DMT1 Associated Protein (DAP)は、DMT1のC末端と相互作用を示すだけではなく、Peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR)とも相互作用を示すことが想定され、PBR-Associated Protein 7 (PAP7)とも呼ばれている。PBRは、ヘムの前駆体であるprotoporphyrin IX (PP IX)の輸送に関連していることが想定されている。そのため、赤芽球系細胞におけるヘム合成のモデル細胞株として汎用されているK562(赤白血病細胞株)を用いて研究を行った。PP IXをDMSOに溶解してK562を処理すると、濃度依存性に細胞内PP IXとヘム濃度の増加が見られた。この濃度増加は三層性であり、1時間で急激に増加し(一層目)、12時間後までは平衡状態であり(二層目)、24時間後には再増加が見られた(三層目)。PP IX処置によりDAPの発現が1時間後から低下し、24時間後には蛋白量の回復が見られた。PP IX投与により、DAP mRNAが12時間後には増加し、蛋白量の減少を回復するためにmRNAを誘導して蛋白量の回復を行っていると考えられた。DAPと異なりDMT1のmRNAは低下したままであり、異なる発現調節機構の存在が示唆された。造血細胞ではC/EBPalpha (C/EBPa)は顆粒球分化に伴って発現亢進し、赤芽球分化に伴って発現低下を示すことが知られている。PP IX処置による赤芽球分化誘導作用に伴い、K562細胞ではC/EBPaの発現は低下していた。C/EBPaはDMT1の転写亢進因子であり、C/EBPaの減少がDMT1mRNAの発現低下と関連することが考えられた。

DAPとDMT1は蛋白レベルでは相互作用を示すが、mRNAの発現調節機構は異なることを明らかにした。DAPとPP IXの関連について、学術論文として発表を行うことができた。DAPの細胞内分子機構を明らかにするため、作成してあるsh vectorを用いてシグナル伝達経路の解析を行う予定である。赤白血病細胞株を用いて研究を起こったが、遺伝子導入が容易な子宮頸がん細胞株(HeLa)、胎児腎臓細胞株(HEK293T)、不死化中皮細胞(MeT5A)、悪性中皮腫細胞株を用いて、knock downの実験を行う予定である。Divalent metaltransporter 1(DMT1)は二価金属の輸送に関わる分子であり、細胞の鉄代謝に重要な役割を果たす。申請者たちは、DMT1のC末端と相互作用を示すDMT1 Associated Proten(DAP)を同定した。DAPはperipheral-type benzodiazepine receptor(PBR)との相互作用が推定され、PBRはヘムの前駆体であるprotoporphyrin IX(PPIX)をミトコンドリア内に輸送するため、PBRを介してPPIXとDAPの相互作用が推定される。赤芽球モデル細胞株として汎用されいるK562を用いてPPIXとDAPの相互作用を検討した。PPIX処理により、DAP蛋白は減少し、何らかの相互作用の存在が示唆された。PPIXは細胞内鉄プール(Labile iron pool; LIP)から鉄の供給を受けてヘムとなり、フェリチン蛋白は分解される。PPIXにより誘発されるフェリチン蛋白の分解は、クロロキンとラクタシスチンの組合せが有効に分解を抑制できたが、DAP分子の分解阻害は明瞭ではなくDAP分子の分解機構の解析は今後の検討課題である。また、食事中の非ヘム鉄は十二指腸からDMT1を介して吸収され、十二指腸吸収上皮様の分化を示すCaco-2が実験モデルとして用いられている。この実験モデルを用い、ヘム鉄投与によりDMT1が管腔側から細胞質へ内在化されることを明らかにした。非ヘム鉄の投与では数十分でDMT1の内在化が誘導されるが、ヘム鉄ではDMT1の内在化は二時間後に観察された。ヘム鉄投与二時間後にはLIPは増加していた。ヘム鉄がヘムオキシゲナーゼにより分解されてLIPの鉄量を増加させ、適切な細胞内コンパートメントに鉄を配るためにDMT1の内在化が誘導されたと考えるが、分子機構の解析は今後の検討課題である。細胞での鉄輸送はDMT1に担われる。本研究では赤芽球モデルであるK562細胞株を用いDAPの発現変化を検討した。DAPにはPPIXと共通する受容体がアミノ酸配列から想定され、DAPとPPIXは相互作用を持つと考えて実験を行った。PPIX投与後のDAP, DMT1, TfR1, FTHの蛋白量とmRNA量の発現変化を調べた。PPIXはDAP, DMT1の蛋白量を減少させ、DMT1mRNAの低下はDMT1の転写因子であるC/EBPaの発現低下が原因と考えた。
糖尿病リスクファクターとしての歯周病原性細菌エキソペプチダーゼの解析

これまで我々はPorphyromonas gingivalis等歯周病細菌の4ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)の構造と機能を明らかにしてきた。本プロジェクトでは2型糖尿病の増悪化に歯周病菌DPPが関わるという仮説の元に、歯周病菌DPPの宿主への役割を明らかにする。歯周病細菌DPP4が2型糖尿病の病態増悪化に関与する可能性が考えられた。マウス耐糖試験において、細菌性DPP4の前投与が活性型インクレチン濃度を低下させ、その結果、血糖値を上昇させることが明らかとなった。さらに歯周病細菌DPPの切断できないN末修飾ペプチドを選択的に分解するオリゴペプチダーゼのクローニングに成功した。我々は2011年および2014年に歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisにおいて細胞外ペプチドを分解してジペプチドを産生する新規のジペプチジルペプチダーゼ(DPP)およびDPP5を発見した。その結果本菌が従来のDPP4、DPP7と合わせ、4種類の基質特異性を異にするDPPがペリプラズムに存在し、効率的に細胞外ポリペプチドをそのN末端から順次切り出してゆけることが判明した。これらの成果を2015年に総説として報告した(Nemoto and Ohara-Nemoto,雑誌論文2)。ところで、ヒトの血しょうタンパク質のN末端は多くの場合アセチル化などで修飾されているが、上記DPPはN末修飾ペプチドを基質とすることはできない。そこで我々はN末修飾ペプチドを分解しうる活性を持つ候補を探索して、遺伝子PGN_1349がN末修飾よりジペプチチドやトリペプチドを遊離することのできるアシルペプチジルオリゴペプチダーゼ(AOP)と命名したペプチダーゼをコードすることを見出した(Nemoto et al.,雑誌論文1)。我々はさらに本菌がジペプチドを菌体内に本当に効率よく取り込まれているのか、もしそうであるならばその仕組みを明らかにしたいと考えて各種アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、およびオリゴペプチドの取り込み実験を行った。その結果アロマブルーの還元で見る細胞内代謝の上昇は細胞外にジペプチドを加えた時に顕著に上昇することからジペプチドを選択的取り込みが確認できた(小早川ら、学会発表3)。本菌にはアミノ酸およびオリゴペプチドトランスポーターとして3つの遺伝子が存在するが、それぞれの遺伝子破壊株を作成してどの遺伝子がジペプチド取り込みを担当するかを決定しつつある(根本優子ら、2016年8月歯科基礎医学会発表)。当初計画の新規エキソペプチダーゼの検索に関しては、新たに新規ペプチダーゼを同定してAOPと命名した(Nemoto et al.,雑誌論文1)。またジペプチドがアミノ酸やトリペプチドよりも優先的に取り込まれることを示すことができ、さらにこの取り込み過程に関与する遺伝子についても3つの遺伝子に絞り込み、かつ、各遺伝子破壊株の作成にも成功しているので、このジペプチド取り込み担当アミノ酸トランスポーターについても決着しつつある(小早川ら、学会発表3)。さらにマウスへの耐糖試験におよぼすP. gingivalisリコンビナントDPP4の影響を定量する実験も開始しており、予備的な結果を得ている。今後は少なてin vitroではインクレチン分解活性を持つDPP5、DPP7も含めて検討して行く予定である。これら3点を鑑み当初の計画以上に進展していると判断した。2 P. gingivlias以外の歯周病原性細菌におけるエキソペプチダーゼの同定歯周病の発症にはPrevotera intermediaやTrpoema intermediaなどのグラム陰性菌も関与する。そこでこれらの菌におけるエキソペプチダーゼの発現を検討した、P. intermediaにおいてArg特異的アミノペプチダーゼが発現していることを突き止めた。さらにこの遺伝子をPCRクローニングして活性型分子の発現にも成功した(T. Sarwarら、未発表)。3歯周病と2型糖尿病をリンクするエキソペプチダーゼの可能性ヒトジペプチジルププチダーゼDPP4は、膵臓でのインシュリン分泌誘導能のあるインクレチン類(GLP-1とGIP)のN末のジペプチドを遊離して不活化させる。そのためヒトDPP4阻害剤は非常に有効な2型糖尿病の治療薬となっている。そこで我々はP. gingivalis、Prev. intermedia、T. fortsythiaよりDPP4を発現精製して性質を検討した。その結果、合成基質やインクレチン類に対してヒトと細菌のDPP4が同様の分解活性を有することを確認した。さらにマウスにおける耐糖試験によって、細菌DPP4の静注が、高血糖値の正常値への回復時間を遅らせることを見いだした(Ohara-Nemotoら論文投稿中)概要に述べた項目1-3のうち、項目1については、2016中に新規のエキソペプチダーゼを同定して論文を上梓することができた。さらに我々は、DPP7とDPP11について、一部の菌で性質のやや異なるサブタイプが存在することを見出している(根本ら日本細菌学会発表2017年3月)。項目2は当初予定していなかった望外の成果である。現在クローニングした分子の性質の決定を進めている。項目3は本課題のメインテーマであるが、すでに現在論文(Ohara-Nemoro et al., under submission)を投稿、レビューアーの返事があり、その指示に元づいて4月に再投稿した。もうすぐアクセプトされると期待している。さらにこの結果を元に研究を発展させて当初予定の結果を出して行きたい。Porphyromonas gingivalis等の歯周病関連菌のエキソペプチダーゼ群について詳細に検討した。

腸内細菌Bacteroides属に発現するジペプチジルペプチダーゼ11(DPP11)では、歯周病菌とは異なり、Asp特異的で、Gluをほとんど認識しなかった。さらに通常の菌には2種類しか存在しないS46ファミリー(DPP7, DPP11)以外に、Bacteriodes属細菌には、機能未知の第3のS46メンバー遺伝子が存在していた。歯周病原細菌の4種類のDPP(DPP4, DPP5, DPP7, DPP11)についてリコンビナント技術を用いてすべてをクローニング及び発現し、各々のペプチダーゼ活性測定に成功したが、実は、いまだに完全にDPP7特異的で高活性のDPP7の基質は得られていない。そこで基質のN末とN末から2番目(P1位置)のアミノ酸の特異性に関して再検討し、最適なDPP7基質Phe-Met-MCAを創生した。本基質は従来の基質よりも20倍高親和性で、かつP1部位特異性をほぼ同じくするDPP5よりも20倍も特異的だった。この新規DPP7基質を用いて、歯周病細菌や口腔組織のすべてのDPP活性を同時に測定することが初めて可能となった。これまで我々はPorphyromonas gingivalis等歯周病細菌の4ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)の構造と機能を明らかにしてきた。本プロジェクトでは2型糖尿病の増悪化に歯周病菌DPPが関わるという仮説の元に、歯周病菌DPPの宿主への役割を明らかにする。歯周病細菌DPP4が2型糖尿病の病態増悪化に関与する可能性が考えられた。マウス耐糖試験において、細菌性DPP4の前投与が活性型インクレチン濃度を低下させ、その結果、血糖値を上昇させることが明らかとなった。さらに歯周病細菌DPPの切断できないN末修飾ペプチドを選択的に分解するオリゴペプチダーゼのクローニングに成功した。今後も同様に以下の3つの柱を並行して進めて行く。すなわち、(1)歯周病原性細菌における新規エキソペプチダーゼ同定、(2)本菌におけるジペプチドの重要性の確定と、ジペプチド取り込み担当遺伝子の同定、(3)本菌のDPPが歯周病と2型糖尿病悪性化における役割の解明である。(1)と(2)についてはこれまでの方法でさらに検討して行く。(3)についてはこれまでの予備実験により細菌性DPP4にヒトDPP4同様に、インクレチン分解活性と、それによる耐糖試験時の血糖値上昇をみいだしているので、さらに他のDPP、特にDPP5とDPP7に同様の活性がないかどうかを検討する。項目1-3についてさらに検討を進める。特に、項目2においては、Prev. intemedia菌の発現する新規アミノペプチダーゼを同定することができたが、それ以外にも未知のDPPあるいはオリゴペプチダーゼが発現することを見出している。この遺伝子についても検討を進める。項目3においては、歯周病原性DPP4が2型糖尿病の悪性化に働く可能性を提示することができた。今後は歯周病患者において、細菌性DPP4が実際にそのベクトルに働いているのかどうかを決定する。
カンドルおよび離散的対称空間の構造理論の構築

(1)本研究計画の総まとめの意味も込めて、2018年11月に「カンドルと対称空間」と題した研究集会を大阪市立大学に於いて開催した。この研究集会には、カンドル・対称空間・組み合わせ論といった様々な方面の専門家による講演があり、多くの情報交換と交流を行うことができた。(2)前年までに引き続き、カンドルおよび対称空間内の「極大対称可換」な部分集合についての研究を行った。ここでカンドル内の部分集合が対称可換であるとは、その部分集合内の任意の二点において、それらの点に付随する点対称(二項演算で言うと右作用)が可換となることである。対称可換な部分集合は、対蹠集合の一般化になっており、興味深い対象であると考えている。本年の研究により、有向実グラスマン多様体内の極大対称可換部分集合については、ほとんどの場合に決定することができた。特に、多くの場合には等長的合同の下での一意性が成り立つが、例外的に一意性が成り立たない場合も存在することが分かった。この結果をまとめた論文を現在執筆中である。また、半分次元の部分空間の成す有向実グラスマン多様体の場合には、極大対称可換部分集合についても未解明の部分が多いの。その場合についても、研究を継続中である。(3) 10月に「広島幾何学研究集会2018」を広島大学に於いて、また12月には「合宿セミナー2018 in福山」を広島県福山市に於いて開催し、本研究費からも旅費の援助等を行った。(1)カンドルに関して,今年度中に2編の論文が出版された。1つは巡回型カンドルの全体像を記述したものであり,もう1つは平坦な連結有限カンドルの分類を与えたものである。平坦カンドルに関する結果は,その後の研究の基礎となっているものである。(2)上記のもの以外に,対称空間やその部分多様体に関連するものについても,今年度中に3編の論文と1編の総説が出版された。(3)平坦な非連結等質有限カンドルについての研究を行い,頂点推移的なグラフを用いた構成方法を与えた。構成された平坦カンドルは,その特別な例として,有向実グラスマン多様体内の有限部分カンドルとして実現されるものを含んでいる。(4)カンドル内の部分集合に対して「極大可換」という概念を定義し,いくつかのカンドルに対して極大可換な部分集合を決定した。カンドルの可換という性質は,これまでに研究してきた平坦よりもさらに強い条件となっている。この研究は現在も継続中である。(5) 2016年10月に「広島幾何学研究集会2016」を,また11月に「合宿セミナー2016in山口」を開催した。本研究費からは,講演者および参加者の旅費等の援助を行った。平坦有限カンドルについては,完全な分類には至っていないものの,連結なものの分類を行い,等質かつ非連結なものを大量に構成するなどの成果が上がっている。また,カンドル内の極大可換な部分集合という新しい概念を定式化し,その研究も進行中である。これらのことから,おおむね順調に進展していると考える。(1)平坦なカンドルについて,連結な場合には非常に限られたものしかないことが分かっている。一方で非連結な場合には,等質性を仮定したとしても,多くの例が存在する。実際,我々は昨年度までに,頂点推移的なグラフから平坦な非連結等質カンドルを構成することができることを示している。今年度は,その内容を整理し,論文としてまとめた。論文はほぼ完成しており,近日中に投稿予定である。(2)上記の研究で得られた平坦カンドルの一部は,有向実グラスマン内の部分集合として実現される。今年度は,そのような部分カンドルの特徴付けに関する研究を行った。現時点では完全な特徴付けが得られている訳ではないが,「対称可換」という性質と強く関わることが分かって来た。(3)コンパクト対称空間内の「対称可換」な部分集合の研究を行った。今年度は,その一般的な性質を明らかにし,特に具体例として古典型リー群の場合を調べ,その中の対称可換部分集合をほぼ決定することができた。この結果は,論文としてまとめる予定である。(4)今年度は10月に「広島幾何学研究集会2017」を,また12月に「合宿セミナー2017in大久野島」を開催した。(5)今年度2月には組み合わせ論の研究集会に招待して頂き,そこでカンドルの研究について講演する機会を得た。以前から組み合わせ論の研究者との繋がりはあったが,それを強化することができた。また,今後の研究の指針についても多くの知見を得ることができた。これまでは対称空間論を応用してカンドルを調べるという方向の研究を主に行ってきたが,逆にカンドルの研究から「対称可換」というアイデアを得ることができ,対称空間の研究に新しい問題を持ち込むことができた。このことは,当初の計画の予定通りではないが,想定以上に面白い方向に進展していると考えている。

この研究集会には、カンドル・対称空間・組み合わせ論といった様々な方面の専門家による講演があり、多くの情報交換と交流を行うことができた。(2)前年までに引き続き、カンドルおよび対称空間内の「極大対称可換」な部分集合についての研究を行った。ここでカンドル内の部分集合が対称可換であるとは、その部分集合内の任意の二点において、それらの点に付随する点対称(二項演算で言うと右作用)が可換となることである。対称可換な部分集合は、対蹠集合の一般化になっており、興味深い対象であると考えている。本年の研究により、有向実グラスマン多様体内の極大対称可換部分集合については、ほとんどの場合に決定することができた。特に、多くの場合には等長的合同の下での一意性が成り立つが、例外的に一意性が成り立たない場合も存在することが分かった。この結果をまとめた論文を現在執筆中である。また、半分次元の部分空間の成す有向実グラスマン多様体の場合には、極大対称可換部分集合についても未解明の部分が多いの。その場合についても、研究を継続中である。(3) 10月に「広島幾何学研究集会2018」を広島大学に於いて、また12月には「合宿セミナー2018 in福山」を広島県福山市に於いて開催し、本研究費からも旅費の援助等を行った。平坦カンドルについては,等質かつ非連結なものを構成した結果をまとめ,論文を執筆する。また,カンドル内の極大可換な部分集合についての研究を推進する。特に,その一般的な性質を明らかにし,いくつかのコンパクト対称空間内の極大可換な部分集合を決定する予定である。カンドルの構造理論の構築に向けた研究と同時に,そこから登場した対称空間論の新しい問題にも取り組む。特に,対称可換な部分集合の研究を通して,「対称空間をもっともよく近似する有限部分集合は何か」という問題に取り組みたい。予定されていた海外出張の日程が変更になり,帰国日が年度をまたいでしまったため,その分の旅費が次年度の会計扱いとなってしまった。そのため,おおむね計画通りに執行することができたが,一部の次年度使用額が生じた。上記の出張旅費は,すでに次年度の会計に入っているため,繰り越し分はその費用に充てる。
巡礼記・参詣記についての文献学的研究─院政期の南都・熊野・高野を中心に

本研究課題による研究成果は、殊に南都圏の縁起・巡礼記に関連したもの、熊野参詣およびその周縁(紀州地域)の巡礼・参詣資料に関連したもの、軍記物語・私撰国史などの縁起・巡礼記資料と密接な関わりを持つ資料群についての検討、の三点におよそ概括できる。それ以上に、本研究課題の推進したことによって、和歌山県地域における各寺社との連携体制を拡充できたことが何よりの成果と言える。本年度の研究活動は、当初の研究計画にそくし、南都圏の巡礼記および高野山・熊野についての巡礼記・参詣記に関する基礎資料の閲覧と、その分析にあたったと概括しうる。前者の南都圏の巡礼記については、『南都巡礼記』注釈のための原稿執筆はもとより、これに関連した資料の閲覧および書誌調査を行った。その成果は、「〈コラム〉紀行・巡礼」(小峯和明編『日本文学史古代・中世編』ミネルヴァ書房,2013.3)および、「巡礼記と縁起集ー寺院空間の「歴史学」」(徳田和夫編『中世の寺社縁起と参詣』竹林舎,2013.5刊行予定)において公表される。後者の高野山・熊野に関連する研究活動についてもやはり、基礎的文献の収集・分析にあたったほか、重要資料の閲覧・基礎的調査に従事した。現段階では、その成果を明確なかたちで明らかにすることはかなわないが、その一部については、「『平家物語』の鱸ー「贄」を食ふ平清盛」(鈴木健一編『鳥獣虫魚の文学史ー日本古典の自然観4魚の巻』三弥井書店,2012.7)において、熊野圏に関する平清盛関連言説についての分析・検討を行った。なお、平成25年度以降の研究活動の進展に照らして、和歌山県および大阪府南部地域における寺社との連絡を密にすることが可能な状況となりえ、それに基づく寺院経蔵悉皆調査についての展望も開くことができた。その過程において、平成25年度12月刊行予定の企画として、『アジア遊学』から「寺社圏論のパースペクティヴ(仮題)」なる企画を共編にて刊行することが内定している。2013年度の研究活動は、当初の研究計画にそくし、南都圏の巡礼記および高野山・熊野についての巡礼記・参詣記に関する基礎資料の閲覧と、その分析にあたったと概括しうる。前者の南都圏の巡礼記については、『南都巡礼記』注釈のための原稿執筆はもとより、これに関連した資料の閲覧および書誌調査に基づき、大橋直義「巡礼記と縁起集ー寺院空間の「歴史学」」(徳田和夫編『中世の寺社縁起と参詣』竹林舎、2013年5月)、大橋直義・藤巻和宏・高橋悠介(共編著)『中世寺社の空間・テクスト・技芸ー「寺社圏」のパースペクティヴ』(勉誠出版、2014年4月刊行予定)としてその成果を活字化することができた。後者の課題については、現段階で活字化に至ってはいないが、大橋直義「巡礼・参詣と文献学ー平維盛の粉河寺巡礼を中心に」(紀州研・第三回学内研究交流会、2013年5月)、説話文学会例会シンポジウム「〈根来寺〉の輪郭ー空間・資料・人」コーディネーターおよびエクスカーション・展観コーディネーター(和歌山大学、2013年12月)、大橋直義「熊野詣のはなしー参詣記と物語を読みとく」(講演・岸和田サテライト浪切サロン、2014年1月)等の口頭発表(講演)、あるいはシンポジウムコーディネイトとして、一部、結実している。当初の研究計画にそくして言うならば、現段階において、おおむね順調に進展しているとしてよい。勤務校周辺には、多くの研究資源が存在することもその理由だが、殊に和歌山県内における各寺社において、充分な協力を得られる見通しが立ったことが極めて大きな理由である。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後とも、当初の研究計画に沿って研究を遂行してゆく予定である。殊に、本年において得られた、各寺社との信頼関係をより強固なものにしてゆくため、定期的に調査におもむき、その成果を随時公表してゆくことに主眼を置きたい。
単細胞増殖系における一年生少染色体植物の遺伝子型および染色体型の伝達性の研究

親植物と同じ遺伝子型を保持したままで植物を長期間保存するために液体窒素を用いる方法が有効であるが、種子の保存を除いて一般的に利用されるには至っていない。そこで、Tanaka & Ikeda(1983)によって開発されたクロ-ン増殖体である苗条原基を利用することによって、凍結保存をより簡単にすることが可能となった(Taniguchi et al.1988)。本研究においてはこの方法を更に広範な植物に適用していくことによって、遺伝子銀行としてのシステム化を促進していき、更に、苗条原基を単細胞レベルまで落としていくことによって本当の意味でのクロ-ン、すなわち、単細胞由来の遺伝子型として保存し、その伝達過程の人為的制御法を見いだすことを目的とした。苗条原基を利用した遺伝子資源のシステム化を進めるうえで広範囲の遺伝子資源に適用できる必要があり、この観点からなるべく多くの植物で苗条原基の作出を試みた。供試した89種中、66種で苗条原基が作出された。これらのうちキク科植物を中心に、凍結保存法を9種類の苗条原基に実施し、9種類すべてにおいて高い生存率を得た。単細胞の凍結保存に関しては、クレピスの懸濁細胞を誘導し、これより苗条原基を経て植物体に再生するクロ-ン増殖系の作出に成功した。この懸濁細胞を凍結保存に利用した。ここで凍結保存の大きな問題点として、生存判定を如何に早くするかが、凍結保存のシステム化にとって重要であり、従来より利用されているFDA染色法により細胞の生存を確認するとともに、新たに、酵素抗体法を用いて細胞分裂活性を測定する方法を開発した。これらの方法を利用して、凍結保存条件の検討を行い、懸濁細胞における凍結保存法の確立を行った。また遺伝子型及び染色体型の伝達に関しては、単細胞レベルでは確認するまでには行かなかったが、組織レベルでは、7種類について安定に伝達されていることが確かめられた。今後、更に単細胞増殖系について凍結保存を実施していくが、基本的には、苗条原基組織について凍結保存のシステム化を完成させてゆき、それでは補い切れない部分について他の培養細胞系の凍結保存を実施していきたい。現在,ハプロパップスについて凍結保存法が完成し,少染色体植物について凍結保存実験を進めている.凍結保存法は以下のとおりである.継代培養中の苗条原基を5%DMSOで3日間前培養し,プログラムフリーザーにて-40°Cまで, -0.5°C/分の冷却速度で予備凍結を行い,直ちに液体窒素中に凍結保存する.回復は凍結保存苗条原基を37°Cの温湯中にて急速融解し,元の培養にもどす.新しく回復してきた苗条原基は,親植物と同一の染色体型を維持していた.しかし,生存率は約30%と低いため,生存率を高める実験を進めている.問題点としては融解後培養液で直接洗っているためDMSOをうまく除くことができない点に原因していることが考えられる.そこで10%DMSOを7%,5%,3%,0%と各10分毎に濃度を下げて行き,DMSOを徐々に除去して行く方法を実施中である.さらに,単細胞化することによって凍害防御剤の浸透が効果的に行われることが伴っているので,苗条原基の単細胞化を試みた.ハプロパップスにおいては既に苗条原基由来のほとんど単細胞よりなる懸濁細胞から再び苗条原基へもどす系が確立された(Tanaka et al.1985).今回,さらにクレピスのカルス由来のほとんど単細胞よりなる懸濁細胞からの苗条原基誘導の系が確立された.この細胞増殖系を用いて凍結保存実験が可能となったので,苗条原基組織において実施された方法をもとに,前培養条件,冷却速度,凍害防御剤の種類と濃度(DMSO,Lープロリン,グルコース,グリセリン及びその組合せ),融解後の凍害防御剤の除去条件について検討して行き,最適条件を求める予定である.親植物と同じ遺伝子型を保持したままで植物を長期間保存するために液体窒素を用いる方法が有効であるが、種子の保存を除いて一般的に利用されるには至っていない。

ここで凍結保存の大きな問題点として、生存判定を如何に早くするかが、凍結保存のシステム化にとって重要であり、従来より利用されているFDA染色法により細胞の生存を確認するとともに、新たに、酵素抗体法を用いて細胞分裂活性を測定する方法を開発した。これらの方法を利用して、凍結保存条件の検討を行い、懸濁細胞における凍結保存法の確立を行った。また遺伝子型及び染色体型の伝達に関しては、単細胞レベルでは確認するまでには行かなかったが、組織レベルでは、7種類について安定に伝達されていることが確かめられた。今後、更に単細胞増殖系について凍結保存を実施していくが、基本的には、苗条原基組織について凍結保存のシステム化を完成させてゆき、それでは補い切れない部分について他の培養細胞系の凍結保存を実施していきたい。ハプロパップスの苗条原基を用いて、前年度に報告した凍結保存法を更に改良した。この方法を少染色体植物(5種類)、キク科植物(4種類)の苗条原基へ実施し、好結果を得ている。改良された凍結保存法は以下のとおりである。継代培養中の苗条原基集塊を約2mmの小塊に分割し、0.5Mソルビトール添加培地中で2日間前培養し、O°Cの恒温槽中で凍害防御剤DMSOを添加していき最終的に0.5Mソルビトール+10%DMSO濃度とした。1.5時間後に、プログラムフリーザーに移して、-40°Cまで-0.5°C/分の冷却速度で予備凍結を行い、直ちに液体窒素中に保存する。融解は凍結保存苗条原基を37°Cの恒温槽中に入れ急速融解し、触害防御剤を段階的に加えて希釈し、最終的にもとの培地にもどす。回復培養に移して新しく回復してきた苗条原基は、親植物と同一の染色体型を維持しており、親植物と同一の植物体に分化した。現在、4カ月間凍結保存している苗条原基について再生が確かめられている。生存率に関しては前年度に報告した約30%から約90%に向上して、この点に関しては一応の目処がたった。本年度はこの苗条原基の凍結保存の生存率を高めることに重点を置いていたので、単細胞の凍結保存に関してはまだ十分な結果が得られていない。単細胞増殖系の凍結保存は苗条原基集塊の場合と同一の方法で行い、FDA蛍光染色によって生存活性を見た。観察した細胞のうち約10%の活性が確認されている。さらに率を高めていくことが必要で、これに加えて増殖、苗条原基への回復、植物体への再分化についても確かめていくことが今後の問題として残されている。親植物と同じ遺伝子型を保持したままで植物を長期間保存するために液体窒素を用いる方法が有効であるが、種子の保存を除いて一般的に利用されるには至っていない。そこで、Tanaka & Ikeda(1983)によって開発されたクロ-ン増殖体である苗条原基を利用することによって、凍結保存をより簡単にすることが可能となった(Taniguchi et al.1988)。本研究においては、苗条原基を単細胞レベルまで落としていくことによって本当の意味でのクロ-ン、すなわち、単細胞由来の遺伝子型として保存し、その伝達過程の人為的制御法を見いだすことを目的とした。単細胞の凍結保存に関しては、クレピスの懸濁細胞を誘導し、これより苗条原基を経て植物体に再生するクロ-ン増殖系の作出に成功した。この懸濁細胞を凍結保存に利用した。
単一量子状態選別三重項酸素分子ビームによる表面反応スピン・立体効果の解明

基礎・応用の両面において重要な酸素分子は、不対電子に由来する電子スピンを持ち、直線分子という球でない形を持つ。我々は、六極磁子による磁場選別法により、スピン状態と回転状態の双方を良く定義できる酸素分子ビームを開発し、表面反応の分子軸方位依存性の検出に成功した。直接解離によるSi(100)表面酸化では分子軸が表面平行に近い場合にのみ反応が起こることを明らかにした。また、Al(111)表面酸化でも顕著な立体効果を検出し、長年論争が続いた反応動的過程を解明した。本計画では、単一スピン・回転状態を選別した三重項酸素分子ビームを開発し、酸素分子/表面相互作用の量子状態依存性を明らかにすることを目的としている。平成22年度は、本研究に必要な速度可変単一量子状態選別三重項酸素分子ビーム源の開発を行った。以下にその内容をまとめる。1.焦点可変永久磁石型六極磁子システムの開発状態選別分子線の速度は六極磁子の焦点距離により決定される。電磁石型六極磁子を用いれば速度調整を行うことができるが、装置の大型化と重量化が避けられない。そこで本計画では、長さ可変の永久磁石型六極磁子を開発し、真空外からの操作により速度を数点変化できるシステムを開発する方針を採用している。新ビーム源設計の予備実験として、直線上に並べた永久磁石型六極磁子ユニット5個の2ユニットを真空外から直進導入機構により抜き差しできる機構を試作した。そして六極磁子の有効長と組み合わせを変えることにより、分子線の速度を4通り変化出来ることをStern-Gerlach実験により示した。本予備実験結果を基に、運動エネルギー0.1-1eVの範囲で10段階程度、速度調整できるビーム源を設計、製作した。2.加熱可能な酸素分子ノズルの試作酸素/He混合比を変えることにより運動エネルギー0.3eV程度の超音速酸素分子ビームを得ることができるが、より高速のビームを得るにはノズル加熱が必要になる。そこでノズル径20-50μmで700°C程度まで加熱可能なノズルを試作した。酸素分子は自然科学のあらゆる分野において最も基礎的かつ重要な分子の一つであり、酸素分子と表面の相互作用は、触媒反応、腐食、ゲート絶縁膜形成等と深く関わる点、極めて重要である。本年度は、運動エネルギー可変(0.1-0.4eV)単一量子状態選別酸素ビーム源と既存の超高真空容器を組み合わせた表面計測装置の試作、およびこれを用いた予備的な酸化反応実験を行った。測定技術に関しては、六極磁子による収束効果のため、ビーム生成に用いる混合ガス中の酸素分圧が低い場合でも、電離真空計を用いた全圧法で表面反応計測を行える点を見いだした。本手法および試作した表面反応計測装置を最も代表的かつ半導体産業で重要な酸化反応であるシリコン(100)表面酸化反応に適用し、非常に明瞭な立体効果を示し、かつ信号対雑音比の大変良い実験データを得ることができた。そして吸着確率の並進エネルギーおよび温度依存性の解析により、前駆体にトラップされる過程には立体効果がないこと、直接過程では分子軸が表面平行に近い分子のみが解離吸着に寄与していることを明らかにした。これにより単一回転状態選別酸素ビームと磁場制御を用いた酸化反応立体効果の新規計測手法を確立することができた。学会発表、誌上発表、プレス発表を行い、2012/4/27の日刊工業新聞に成果が紹介された。また本年度後半にはSi実験の経験を踏まえ、表面反応計測用新チャンバーを設計製作した。本計画の最終年度である本年度は、昨年度末に納入された試料作製および分析用超高真空装置の立ち上げ、および本システムを用いた状態選別酸素分子線による酸化反応立体異方性測定を行った。作製した超高真空装置は、試料作製室、分析室およびロードロック室から構成される。作製室には既存のAES分析用可動式円筒鏡面分析器、LEED光学系、スパッタイオン銃、電子衝撃蒸着源および膜厚計を設置し、2000°C加熱可能な試料ホルダーを製作・設置した。これにより表面組成・構造分析、加熱清浄化、薄膜作製を可能にした。また分析室ではKing-Wells法による付着確率計測、阻止電位分析器によるスピン偏極準安定脱励起分光測定が実施できるようにし、性能確認も行った。両チャンバーの到達真空は10-11Torr台である。次に、本装置を用いてアルミニウム表面酸化、微傾斜シリコン表面酸化における反応立体効果を観測した。アルミニウム表面酸化は表面酸化の最も基本的な例として過去に詳しい研究があるが、反応機構は良く理解されていない。並進エネルギーが低い条件下では、分子軸を表面垂直にして反応するabstraction機構が主プロセスとする機構が近年広く支持されている。

我々は本装置を用いて吸着確率の分子軸方位依存性測定を行い、低速では表面平行な分子が主に反応することを証明した。また表面垂直な分子の解離活性化障壁は平行分子より0.1eV程度高いことを示し、低速でabstractionが主とする反応機構が不適切であることを明示した(H24年秋物理学会)。また微傾斜Si(100)表面を用いた酸化実験を行い、酸化速度が分子軸とSiダイマーの方位角にも依存することを明らかにした(H25年春物理学会)。下記(1),(2)の点においては、本計画は予想以上に順調に進んでいるが、(3)の点では少し遅れている。(1)既存の容器を用いた予備実験段階で、酸化反応に大変クリヤーな量子状態依存性を示すことができ、本手法が原理的に正しいことを証明できた。これにより本計画全体の見通しが大変に良くなった。(2)四重極質量分析計による表面反応量子状態依存性計測は難しいと考えていたが、電離真空計法の利用により低コストでこの問題を解決できた。(3)昨年度製作した0.1-1eV程度のエネルギー領域で速度可変な酸素ビーム源のテストが現時点では進んでいない。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である今年度、以下の3点について重点的に研究を進める予定である。(1)運動エネルギー効果の検証:Si表面への酸素吸着確率は分子軸が表面平行と垂直で異なることを見いだしたが、0.1-0.4eVのエネルギー範囲で両配置の差は運動エネルギーに殆ど依存していない。今年度製作する高速状態選別ビームにより、垂直配置における活性化障壁の値を見い出す。(2)面内効果の観測:表面が一次元的である場合、酸素分子軸が表面x方向とy方向でも反応性が異なると期待されるので、本技術によりその検証に取り組む。(3)スピン効果の検証:本ビームでは分子スピンの向きを指定できるので、強磁性体表面を用い、表面反応におけるスピン相関の有無を検証する。
考古学資料に基づく「寒冷化」現象把握のための基礎的研究

東アジアにおける砂丘・砂堤・砂地の形成状況を把握することで、考古学的資料から寒冷化した時期の特定に努めた。地球が寒冷化すると沿岸部では海退がおこり、それに伴って砂丘や砂堤が形成される。一方内陸地帯では植物の生育力が低下し、砂漠や砂地が拡大する。沿岸部の砂丘遺跡では、温暖化して砂の供給が停止すると植物が繁茂してクロスナ層が形成される。このクロスナ層に含まれる考古遺物や遺構を分析することで、砂丘や砂堤が形成された時期を特定することが可能になる。西日本の沿岸地域での事例では、縄文時代早期と前期、前期と中期の境目、後期の後半の中頃、縄文時代と弥生時代の境目、弥生時代後期終末直前、古墳時代中期前半期にそれぞれ砂丘が形成されていたことが確認される。その中でも重要なのは、縄文時代と弥生時代を画する時期に寒冷乾燥化した現象が認められる。このことは広島県東広島市の黄幡1号遺構で検出された木材の年輪からも裏付けられる。すなわち紀元前750年をピークとする寒冷化現象は、オリエントや西ヨーロッパでも確認され、中国では軍都山の墓地の切り込み層位や、香港周辺地域の「間歇層」と対応し、西周末期の寒冷化に比定できる。北部九州ではこの時期に形成された砂丘の下部からは縄文時代晩期終末の黒川式土器が、砂丘の上層からは弥生時代初頭の夜臼1式土器が検出されることから、弥生時代の始まりは寒冷乾燥化した状況で成立したものであり、その時期はほぼ紀元前8世紀終わり頃と推定される。砂丘の形成は沿岸地帯に後背湿地を形成するが、この生態環境は弥生水稲耕作民に格好の生産場所を提供したのであったことが、砂丘出土の遺物により確認される。1.西日本の沿岸砂丘上に形成された縄文時代から古墳時代に属する遺跡の基本層序と伴出遺物、検出機構などを集成して、基本資料を作成した。2.南西諸島、鹿児島県、宮崎県、大分県、長崎県、愛媛県の沿岸地域の砂丘遺跡を踏査し、砂丘形成のしかたと考古学資料との相関関係を検討した。その結果砂丘遺跡では土器型式に不連続性が確認され、砂丘の上下に検出される土器型式の同定により、砂丘形成時期を特定することが可能なことが判明した。また韓国での砂丘遺跡の現地踏査をおこなったが、土器編年との対比は現在検討中である。3.島根県松江市古浦遺跡での小規模な発掘をおこない、砂丘の形成と考古学資料との直接対比を試み、層位的見地から、古墳時代中期には砂丘の利用がなかったことを確かめた。4.中国での砂丘形成と考古学資料の検討をおこない、気候寒冷化と砂丘の形成が一致することを把握し、その成果の一部を公表した(甲元眞之2005,2005、杉井2005)5.研究協力者の参加を得て研究会を開催し、山陰地域での砂丘形成と気候寒冷化が即応することを確かめた。ことに山陰地域では水月湖での年縞堆積物から復元された海進海退現象と一致することが明らかになった。以上の結果、縄文時代においては轟式土器と曾畑式土器の間、中期初頭、縄文晩期と弥生早期の間、弥生時代では後期後半と週末期の間、古墳時代では5世紀中頃と砂丘が形成されていることが確かめられた。これらの現象は中国でのそれと一致し、中国の暦年代との対比により、絶対年代を推定することを可能にするものである。韓国との対比は来年度に集中しておこなう予定である。
障害肝細胞から分泌されるヘパトソームはアルコール性肝炎の病態進行に寄与する

アルコール肝炎マウスモデルを使った実験により、アルコール摂取により障害を受けた肝細胞は小さな粒子を放出すること、さらにこの粒子は障害肝細胞の細胞成分を含有していることが分かった。この粒子の生物活性を調べるために、マウスの肝内マクロファージを分離し粒子を添加したところ、粒子はマクロファージに取り込まれ、さらにマクロファージが活性化(炎症に寄与)することが分かった。この結果は、障害肝細胞由来の粒子が「細胞間伝達物質」としてアルコール性肝障害の病態進行に寄与していることを意味している。将来的には、粒子成分を阻害することでマクロファージ活性を阻止する治療法の開発を行う予定である。アルコール性肝炎の病態進行には肝細胞・クッパー細胞・肝星細胞の細胞間コミュニケーションが重要な役割を担うがメカニズムの全容は不明である。またアルコール性肝炎の進行状況を判定できる非侵襲性バイオマーカーも確立されていない。近年我々は、非アルコール性肝炎において障害肝細胞から放出される細胞外小胞(ヘパトソーム)が標的細胞の活性化を介して病態進行に寄与することやバイオマーカーとして使用可能なことを明らかにした。そこで本申請では、アルコール性肝炎におけるヘパトソームが標的細胞の活性化を介して病態進行に寄与するメカニズムの解明を行い、アルコール性肝炎の新規治療標的の開発へとつなげる。将来的には、本研究のヘパトソームの成分同定の成果を、非侵襲性バイオマーカーの開発へと発展させることが可能である。本年度は、アルコール性肝炎マウスの血中細胞外小胞の数が上昇することを確認した。さらにアルコール性肝炎マウスから分離した障害肝細胞から放出されるヘパトソーム数は、コントロールマウスからのヘパトソームと比較して有意に多いことが明らかになった。引き続いて、タンパク質やmicroRNA等のヘパトソーム成分を同定した。これらの成分はアルコール性肝炎マウスの病態と連動していた。また予備実験の結果として、ヘパトソームが標的細胞を活性化することが分かった。これらの成果からヘパトソームがアルコール性肝炎の病態進行に寄与している可能性が示唆できた。研究計画書に基づき、アルコール性肝炎において障害肝細胞からヘパトソームが放出されることを明らかにできた。さらにヘパトソームの成分分析を行い、アルコール性肝炎に特異的な成分の同定ができた。近年我々は、非アルコール性肝炎において障害肝細胞から放出される細胞外小胞(ヘパトソーム)が標的細胞の活性化を介して病態進行に寄与することや、バイオマーカーとして使用可能なことを明らかにした。そこで本申請では、アルコール性肝炎におけるヘパトソームが標的細胞の活性化を介して病態進行に寄与するメカニズムの解明を行い、アルコール性肝炎の新規治療標的の開発につなげることを目的とした。成果として、アルコール性肝炎マウスにおいて、アルコール摂取により障害をうけた肝細胞が細胞外小胞を放出し血中を循環することで、血中細胞外小胞数が有意に上昇することを明らかにした。この肝細胞から放出されたヘパトソームの生物活性を調べる為に、肝内マクロファージを分離してヘパトソームを添加した。ヘパトソームは肝内マクロファージに効率良く取り込まれ、また肝内マクロファージ中の炎症関連遺伝子が上昇し、肝内マクロファージが活性化することが明らかになった。この結果はヘパトソームが肝内細胞間伝達物質として、アルコール性肝炎の病態進行に寄与していることを示している。ヘパトソームは障害肝細胞由来の細胞成分(microRNAやタンパク質)を含有していることが分かった。タンパク質成分については炎症に関与する候補は見つけられなかったが、microRNA成分においては、炎症に寄与する複数のmicroRNAが同定できた。現在肝内マクロファージの活性化に寄与する成分についての同定を進めており、将来的にはヘパトソーム成分を阻害することで、病態進行を阻止できる治療法の開発へとつなげていきたい。当初の研究計画書に基づいて研究を進める。具体的には、ヘパトソームを標識して標的細胞への導入や活性化を検討する。さらに同定できたヘパトーム成分の中から標的細胞の活性化に寄与する成分を特定する。特定できた成分の阻害剤をアルコール性肝炎マウスに投与することで治療効果についても検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。肝臓細胞生物学遺伝子デリバリー29年度が最終年度であるため、記入しない。
近世ドイツにおける学識者の「就職活動」に関する研究

本研究は、政治史の文脈では権力に従属する道具的存在として理解されてきた近世ヨーロッパの学識者を、「学問の共和国」という同時代的かつ世俗権力に縛られない者としての共同体意識に即して、主体的に再解釈しより現実に即して理解することを目的とする。その為に、16世紀のライン地方およびニーダーラントが持つ「学問の共和国」上の特徴を分析し、学識者が現実の生活の中で取った行動の様式を、求職の交渉と実際の勤務という二段階に分けて解明する。これを通じて、君主権、寡頭制的権力の確立を支える「道具」としての学識者像、使い手として理解されてきた雇用者像の関係を見直し、再定位することを研究の目標とする。
頚動脈不安定プラ-クに対する光工学的診断方法の開発

頚動脈プラークの性状を、研究代表者らが独自に開発したウサギ動脈硬化モデルをもとに、光工学的手法を用いて分析検討した。光工学的手法として用いた方法は、自家蛍光計測による分析と拡散反射光計測による分析で、いずれの方法でも、対照群と疾患群とである特定波長のスペクトル強度に差がみられ、その結果を用いて画像化することができた。測定分析装置は小型で、細径の光ファイバーで測定可能であり、臨床応用への可能性が示唆された。本研究は、申請者らが開発した動物モデルを用いて、不安定プラークの脆弱性を多角的光工学的手法を用いて分析することにより、頸動脈狭窄症に対する治療戦略決定における重要な情報を与え、脳塞栓症の合併症を未然に予防することが目的である。本年度は、光計測システムを実際に運用してプラーク組織性状と計測結果の関連性について考察した。高コレステロール餌群(Cho群、約4週齢の雄性日本白色家兎をコレステロール餌1%にて13週間飼育)と対照群(通常の飼料群で飼育された雄性日本白色家兎,約16週齢)を作成し、安楽死させたウサギから直ちに大動脈を摘出、内腔面を以下の方法で測定した。実験1(時間分解自家蛍光スペクトル分析):Q-スイッチNd:YAGレーザーの第三高調波を励起光とし、血管内腔面に照射し発生した自家蛍光を分光システム(波長300750nm)で計測、蛍光強度、減衰時間を測定した。実験2(拡散反射光計測):光源にハロゲンランプを用いて、送受光一体型のプローブ先端を血管内腔面に接触させて組織を伝播した光を分光器(波長域900-1700nm)にて計測した。実験1では蛍光スペクトルのピーク波長付近である450nmにて、Cho群の方が蛍光強度が低かった。減衰時間はCho群の方がやや長かった。実験2では拡散反射光強度は、Cho群で高い傾向にあったが、拡散反射光のスペクトルは両群間で類似していた。以上から、実験1と2において対照群とCho群との間に差がみられ、新たな診断方法としての可能性が示唆された。2011年1月下旬に米国サンフランシスコ市で開催されたBiOS2011に参加し、本研究についてもポスター発表を行った。不安定プラーク診断を対象とした研究発表が散見され、最新の知見を得ることができた。1.目的本研究は、申請者らが開発した動物モデルを用いて、不安定プラークの脆弱性を多角的光工学的手法により分析し、頸動脈狭窄症に対する治療戦略決定における重要な情報を与え、脳塞栓症の合併症を未然に予防することが目的である。本年度も、ウサギモデルを作成して胸腹部大動脈を摘出し、血管内腔のプラークに対し光計測(「自家蛍光スペクトル分析」、「拡散反射光計測」)を行った。特に本年度では臨床応用を目指した画像化への可能性について検討した。2.方法高コレステロール含有餌食投与によってウサギ動脈硬化モデルを作製し、胸腹部大動脈を摘出した。展開した動脈の内膜面に対し以下の方法でプラーク性状について計測した。(1)自家蛍光計測:405nmの励起光を照射し、450-800nmまでの範囲においてマルチスペクトル蛍光イメージングを取得した。(2)拡散反射光計測:ハロゲンランプ光源により照射し、組織を伝播した光を分光測定(計測波長範囲は900-1700nm)した。以上計測結果より正常部位とプラーク部位のそれぞれの特徴を検討し、両者を鑑別できるように数値化し、画像化を行った。3.結果蛍光スペクトルにおいて、505nmは正常部位、615nmは動脈硬化部位に特徴的な蛍光ピークであることがわかり、両者の比を算出し、再画像化した。一方、拡散反射光計測結果から、脂質の吸収を示す1200nm付近の変曲点を中心に微係数を算出し、脂質含量を数値化し画像化した。以上いずれの方法においても、プラーク部位と正常部位とを明瞭にイメージングすることができた。臨床応用への可能性が示唆された。これまでプラーク標本に対する測定スペクトル分析のみであったが、本年度ではプラーク標本のプラーク性状を画像化することができた。これは臨床応用には欠かせない手法であり、その可能性を示したことは有意義な前進であった。なお、研究成果がまとまった時点が遅かったため、本年度の研究発表は来年度前半に持ち越しとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はプラークの画像化についてさらに研究を進めていく。

本年度は自家蛍光分析では505nm及び615nmの2波長比で画像化を行ったが、ピクセル毎の測定結果をより詳細に検討し、様々なパラメータを設定して画像化を試みる。さらに標本の組織学的検討を行い、測定結果との整合性について検証する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。