hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨吸収抑制薬が歯の発生・発達過程に及ぼす影響の解明

歯牙は胎児期から青年期にかけて形成される第一の消化器官であり、正常な咬合は全身成長に不可欠である。歯胚形成期の発達機構については解明が進む一方で、出生後から成長期を経て永久歯の咬合が完成するまでのメカニズムは不明な点が多い。破骨細胞抑制により骨吸収抑制作用を示す抗RANKL抗体やビスホスホネート製剤は、発達期の顎骨や歯牙萌出に対する作用機序や副作用が不明瞭なまま、小児の骨系統疾患への適用が開始されており、安全性に関する知見の充実が急務である。申請者らは、成長期、特に出生後から永久歯の萌出完了までの青年期における、歯胚および歯槽骨形成と顎骨骨代謝の連関を明らかにすることを目的として本研究を行っている。本年度は本研究の要となるモデル動物の作成に着手した。抗RANKL抗体およびビスホスホネート製剤を、乳児期である生後1週齢のマウスの腹腔皮下に投与し、通常条件下で飼育した。申請者らの先行研究により、生後1週齢に投与したビスホスホネート製剤が全身成長を妨げ、歯牙の萌出を遅延させることが、判明している。乳児期に対する骨吸収抑抑制薬の作用を細胞レベルで解析するため、投与1週間後の骨髄細胞を採取し、フローサイトメトリーを用いて免疫関連マーカーの発現を解析した。抗RANKL抗体投与群の骨髄細胞においてB220陽性細胞の減少が認められた。また、窒素含有ビスホスホネート製剤であるゾレドロン酸投与群では、CD11b陽性細胞の増加とCD19、CD22、B220陽性細胞の減少が認められた。免疫細胞の異常が歯牙萌出に影響を及ぼす可能性が考えられるため、現在顎骨の解析を開始している。前年度から継続して行っている実験を継続して行うことにより、本年度の計画はおおむね順調に進展している。本年度に作製した乳児期モデルを成体となる8週齢まで生育し、歯牙発達について解析する。破骨細胞および骨芽細胞の歯牙発達に対する作用を詳細に解析する他、歯の形態形成への関連が報告されている骨形成因子BMP、繊維芽細胞増殖因子FGF、腫瘍壊死因子TNF、エナメル質形成時のSHHなどの免疫染色を行う。また、生後1日齢で薬剤投与を行う新生児期モデルの作製に着手する。平成30年度は乳児期モデルを作成し、解析を行った。現在研究内容の一部を論文作成中であり、学会発表、英文校正費などは次年度以降に使用予定である。
外傷時におけるエネルギー基質としてのケトン体の研究

研究は、1,ケトン体輸液の作成2,侵襲を受けた実験動物に対するケトン体輸液の投与効果3,侵襲時の患者に対するケトン体輸液の投与効果についてすすめられた。1,ケトン体輸液については、3-ヒドロキシ酪酸製剤を用いた。当初、DL-3-ヒドロキシ酪酸ナトリウムいわゆるラセミ体を用いたが、非生理的なL-3-ヒドロキシ酪酸を含有するため、D-3-ヒドロキシ酪酸のみを含有する製剤を開発した。本年の実験は、新しく開発されたD-3-ヒドロキシ酪酸ナトリウム溶液(sodium D-3-hydroxybutyrate:以下3-OHB)を用いておこなった。また、熱傷モデルのラットを用いて、投与された3-OHBが侵襲時にもよく酸化され、末梢組織で利用されていることを、ラジオアイソトープを用いて証明した。この結果は、現在投稿中である。また、呼気中のトレーサーの排出量を検討するのみではなく、体内での分布に関しても検討中であり、研究をさらにすすめている。3,臨床研究としては、外傷例および、熱傷例に対する注入の結果については、すでに報告した。現在は、頭部外傷患者に対して、投与し、ケトン体が脳の嫌気的代謝を抑制しえるかどうか検討しており、研究が進行している。近年の救急医療の進歩により、重症多発外傷患者の救命率は著しく向上した。しかし一方では急性期の一時的な損傷部位の修復に成功したにもかかわらず、侵襲に伴うエネルギ-代謝の不均衡と蛋白異化の亢進のため、その後の感染や多臓器不全で死亡することが多くなった。われわれは外傷急性期にも利用できるエネルギ-基質として、組織浸透性の良好なケトン体の有用性に着目し検討をすすめてきたが、すでに外傷患者における経静脈的投与により蛋白異化の亢進が抑制できることを報告した。しかし外科的侵襲時に投与されたケトン体がエネルギ-基質として良好に酸化され、利用されているのかを明らかにした研究はこれまで行なわれていない。本年の研究では^<14>Cで標識したケトン体とグルコ-スを熱傷ラット、および正常ラットに投与し呼気^<14>CO_2への回収率を測定することにより、両エネルギ-基質の燃焼率を比較検討した。正常ラットにケトン体を投与した時の6時間後の呼気^<14>CO_2累積回収率累積は67.5±3.4%であるのに対し、グルコ-ス投与では48.3±4.9%であった。熱傷を作成したラットではグルコ-スの回収率は42.2±6.7%に低下したが、ケトン体を熱傷ラットに投与した時の回収率は67.9±7.2%と正常時とほとんど変化しなかった。本研究は熱傷急性期という外科的侵襲時にも、投与したケトン体がグルコ-スに比較し良好かつ速やかに燃焼していることを初めて明らかにしたものであり、この結果はケトン体のエネルギ-基質としての有用性を支持するものである。本年の研究の一部は第17回日本熱傷学会、The 51th Annual Meeting of The American Association for the Surgery of Traumaにて発表予定である。今後の研究課題としては、ケトン体を長時間投与した場合の燃焼率を含め、輸液製剤としての可能性を検討する。重症外傷患者の治療成績は近年著しく向上し、従来救命できなかった患者も救命できるようになった。しかし、一方では、急性期に見られるエネルギ-代謝の不均衡と蛋白異化亢進のため、一時的な損傷部位の修復に成功したにもかかわらず、その後の感染症や多臓器不全で死亡することとなった。われわれはケトン体が組織浸透性の良好な、きわめて利用しやすいエネルギ-基質であることに注目し、外傷患者における経静脈的投与の効果を検討し、蛋白異化の亢進に抑制的に作用する結果を得た。本研究の目的は投与されたケトン体の効果をさらに総合的に評価し、栄養投与の困難なこの時期のエネルギ-基質としての意義をあきらかにすることにある。平成2年度の研究により、ケトン体が熱傷急性期という侵襲時にも、非侵襲時と同様に良好に燃焼することが明らかとなった。本年度は昨年と同様熱傷ラットモデルを用い、ケトン体の投与前後での血中ケトン体、グルコ-ス、アミノ酸、3メチルヒスチジン等の変化につき検討した。その結果、熱傷ラットにヒドロキシ酪酸を投与した場合、その酸化過程の代謝産物であるアセト酢酸の濃度が熱傷を作成しないラットに比較し、上昇しないことが明らかとなった。その生理学的意義にかんしては現在検討中である。さらにケトン体を投与したときの尿中3メチルヒスチジンは、同様の熱傷モデルにグルコ-スを投与した場合より明らかに少なく、骨格筋における筋蛋白の崩壊が軽度であることを示唆するものである。外傷急性期にケトン体をエネルギ-基質として投与したのは、我々が初めてでありこの結果も侵襲下でのケトン体の代謝を明らかにする貴重なデ-タ-と考えられる。本結果は第92回日本外科会総会において発表予定である。

当初、DL-3-ヒドロキシ酪酸ナトリウムいわゆるラセミ体を用いたが、非生理的なL-3-ヒドロキシ酪酸を含有するため、D-3-ヒドロキシ酪酸のみを含有する製剤を開発した。本年の実験は、新しく開発されたD-3-ヒドロキシ酪酸ナトリウム溶液(sodium D-3-hydroxybutyrate:以下3-OHB)を用いておこなった。また、熱傷モデルのラットを用いて、投与された3-OHBが侵襲時にもよく酸化され、末梢組織で利用されていることを、ラジオアイソトープを用いて証明した。この結果は、現在投稿中である。また、呼気中のトレーサーの排出量を検討するのみではなく、体内での分布に関しても検討中であり、研究をさらにすすめている。3,臨床研究としては、外傷例および、熱傷例に対する注入の結果については、すでに報告した。現在は、頭部外傷患者に対して、投与し、ケトン体が脳の嫌気的代謝を抑制しえるかどうか検討しており、研究が進行している。
発生・再生におけるRNA動態

本研究では、全能性・多能性をもつ幹細胞や生殖細胞の制御にRNAがどのように関わっているのかを明らかにすることを目標としている。特に、幹細胞や生殖細胞の細胞質に、なぜ巨大なRNA-タンパク質複合体があるのか、その必然性と生物学的な意味について明らかにすることを目標とした。近年の研究は、それらの巨大RNA-タンパク質複合体が翻訳制御に関与している可能性と、核内のクロマチン構造を制御している可能性の2つを示唆している。共同研究者である中村らは、ショウジョウバエを使って生殖細胞における翻訳制御の重要性を遺伝学的・生化学的に示すことに成功した。一方、プラナリアにおいては、幹細胞で発現しているRNA結合タンパク質について網羅的に調べたところ、細胞質に存在するものと核内に分布するものの両方があり、それらをRNAi法で機能解析したところ、他の遺伝子の発現に影響を与えるものや、幹細胞そのものが消失するものが得られた。これらの結果は、幹細胞の制御にRNAが多岐にわたってダイナミックに関わっていることを示唆しており、今後は生化学的なアプローチを組み入れて解析していくことが必要であることが明らかとなった。プラナリアの高い再生能は未分化な幹細胞である新生細胞により支えられている。新生細胞中には、クロマトイド小体とよばれる構造物が電子顕微鏡下で観察される。クロマトイド小体の機能のひとつとして、細胞分化に必要な因子をコードするmRNAを核から細胞質へと移送し、翻訳制御を行う場であることが推測されている。そこで、転写後制御に関与するさまざまなRNA結合タンパク質がクロマトイド小体に含まれていると予想し、ESTプロジェクトにより得られたRNA結合タンパク質をコードする遺伝子について発現解析を行った。そのうちのひとつである1352HH遺伝子はATP依存性DEADbox型RNA helicaseをコードし、酵母、ハエ、脊椎動物で保存されたRCK/p54/Me31Bfamilyに属していた。このmRNAは、脳の一部の分化した神経細胞と、間充織の未分化な新生細胞で発現していた。この遺伝子がコードするタンパク質を特異的に認識する抗体を作製し、タンパク質の分布を調べたところ、mRNAの分布と一致し、脳の神経細胞と間充織の新生細胞で発現していた。この抗体を用い、電子顕微鏡レベルでの抗体染色により、新生細胞中でのタンパク質の分布を調べたところ、クロマトイド小体に局在していることを明らかにした。1352HH相同遺伝子は、他の動物種で翻訳のマスキングに関わることが知られているため、クロマトイド小体の機能のひとつとして、mRNAを蓄積し、翻訳の調節を行う場であることが予想される。また、有性化個体においては、このタンパク質は生殖細胞中でも発現していた。プラナリアにおいては、クロマトイド小体を持つ未分化な新生細胞だけでなく、神経細胞や生殖細胞中でもRNAの転写後制御が重要であることが示唆される。プラナリアRCK/p54/Me31Bfamilyタンパク質が、幹細胞中のクロマトイド小体と呼ばれるmRNP complexの構成分子のひとつであることを示した。また、脳の分化した神経細胞内においても、電子密度の高い、クロマトイド小体様の構造物が観察されることを明らかにし、このタンパク質がこの構造物に局在することを示し、RCK/P54/Me31Bfamilyタンパク質が神経系においても翻訳制御に関与していることを示唆した。また、ショウジョウバエにおいては、細胞質内輸送途上のosk mRNAと複合体を形成している新規タンパク質として,翻訳開始因子eIF4EとCupと呼ばれるタンパク質を同定し、それらの機能解析を進めた。その結果、CupはeIF4Eと直接結合することでeIF4E-eIF4G相互作用を阻害し、osk mRNAの翻訳抑制因子として機能していることを示した。さらに、Cupはosk mRNAの3'UTRに結合するRNA結合タンパク質Brunoとも会合することを明らかにした。このBrunoは,osk mRNAの翻訳抑制因子として機能することが知られていたが,どの様にしてosk mRNAの翻訳を抑制しているのかについては全くわかっていなかった。今回の研究結果は、CupがBrunoとeIF4Eの結合を仲介し,5'末端と3'UTRを相互作用させることで,osk mRNAの翻訳抑制を実現している事を予想させる。このようなモデルは、種間を越えて保存された翻訳制御メカニズムの1つであると考えられた。

プラナリアの高い再生能を支える幹細胞は、その細胞質中にクロマトイド小体と呼ばれる巨大RNA/タンパク質複合体を保持しているが、その機能については謎が多い。本研究では、クロマトイド小体の構成成分を明らかにし、RNAi法によってその機能を推察することを行なっている。今までに、ESTプロジェクトからRNA結合タンパク質関連遺伝子としてリストアップされた112遺伝子について、発現解析によって幹細胞で発現する遺伝子を絞り込み、多数の幹細胞で発現するRNA結合タンパク質遺伝子を同定した。そのうちMe31B遺伝子については、そのタンパク質に対する抗体作成と免疫電顕を行い、Me31Bタンパク質がクロマトイド小体に局在することを確認をした。しかし、ESTで同定した遺伝子については、RNA干渉法で機能阻害実験を行っても顕著な表現型は得られなかった。一方、セルソーターを用いて精製した幹細胞分画に特異的に発現する遺伝子をクローン化し、その中からRNA結合ドメインをもつ遺伝子に着目した。そのようにしてクローン化されたpiwiファミリー遺伝子をRNAi法で機能阻害すると幹細胞システムが破壊されてプラナリアの再生が起きなくなることを見出した。これらの結果はpiwiファミリー遺伝子が全能性幹細胞の維持に不可欠であることを示唆した。また、ショウジョウバエの生殖細胞について、RNA/タンパク質複合体である極顆粒が必要であるとともに、この極顆粒をもつ生殖細胞の維持にはlipid phosphate phosphataseが不可欠であることを証明することに成功した。本研究では、発生や再生現象に見られる転写後のRNAの翻訳調節について、その生物学的意義を明らかにするとともに、その調節メカニズムとRNAの情報ネットワークを分子レベルで明らかにすることを目的としている。今までに翻訳調節が活発に行われていると考えられている1.生殖細胞、2.幹細胞、3.神経細胞の3つの細胞システムに関与しているRNA翻訳調節因子を明らかにすること、遺伝学的解析およびRNAi法によって各因子の機能を明らかにすることを行っている。本年度においてプラナリアRNA結合たんぱく質musashiのホモログについて、その発現細胞と機能解析を行った。脊椎動物では、神経細胞のみならず幹細胞全般にmusashi遺伝子が発現していることが示されているが、プラナリアから3つのmusashiのホモログを単離することに成功したが、いずれも神経細胞で発現していた。また、個々の遺伝子あるいは3遺伝子とも破壊したRNAi個体を作成したにもかかわらず顕著な表現型は得られなかった。生殖細胞については今年度においては、ホヤを用いた生殖細胞系列の発生についてRNA結合タンパク質遺伝子の発現をもとにして生殖細胞系列の発生と再生について詳細に記述した。本研究では、発生や再生現象に見られる転写後のRNAの翻訳調節について、その生物学的意義を明らかにするとともに、その調節メカニズムとRNAの情報ネッワークを分子レベルで明らかにすることを目的としている。翻訳調節が活発に行われていると考えられている幹細胞と生殖細胞を中心に解析をおこなっている。
熱帯における生物蓄積性人工化学物質の分布と挙動並びにその地球規模での広がり

有機塩素系の生物蓄積性人工化学物質は大気を媒体として地球規模で広がり、最終的には海洋がそのたまり場になる。ところが熱帯における化学物質利用の拡大にともない、地球汚染の分布状況はかなり変化しつつあると言われている。高温・多雨の自然条件下における化学物質の使用は、温帯や寒帯と違う環境での移動・集積・拡散が予想される。したがつて地球規模の環境汚染を包括的に理解するには、新しい発生源つまり低緯度地域における化学物質の動態とそこを起点とした長距離輸送の態様を明らかにする必要がある。そこで本研究では、有機塩素化合物(PCB,DDT,BHCなど)による熱帯アジアの汚染について調査し、地球汚染のソ-スとしての熱帯域の役割を明らかにするとともに、南北西部太平洋およびインド洋の調査も伴せて行ない、この種の物質のゆくえについて考えた。その結果、インド、タイ、ベトナム、台湾、ソロモン、パプアニュ-ギニアなど熱帯地域の環境試料(大気、河川水、海水、底質、農耕地土壌、食品、生物)から検出される有機塩素化合物は、DDTやBHCなど農薬による汚染が相対的に進んでおり、工業用材料として利用されたPCBの残留はそれほど顕在化していない。しかし都市周辺では、PCBによる局所的な汚染が認められ、熱帯地域への利用の拡大が示唆された。温帯地域と比べると、一般に熱帯の汚染は大気ですすんでおり、水や底質、魚介類の残留濃度はむしろ低い。南インドのベラ川河口域で行なった環境調査の実測値を数値モデルに代入し、集水域における農薬BHCの物質収支を計算したところ、河川へ流出し河口へ到達した量は散布量の1%弱で、残余の大半は水田つまり使用の場から直接大気へ揮散したものと推定された。このことを裏付けるため、南インドの水田でBHCの散布試験を行なったところ、散布後2週間で95%のBHCが大気へ揮散し、水、土壌、稲への残在量はきわめて少ないことが判明した。このように熱帯で使用された化学物質は、速やかに大気に移行する。したがって、沿岸海洋へ与える影響は小さいが、地球規模の汚染に大きな負荷をもたらすことになると結論された。そこで外洋の調査を行なったところ、この種の有機塩素化合物は全ての調査海域から検出されたが、その汚染レベルには海域および物質によって違いが認められた。大気試料の場合、いづれの有機塩素化合物も南半球に比ベ北半球で高濃度分布がみられ、この種の物質の汚染源が依然として北半球におることを確認できた。しかしながら汚染分布の細部に注目すると、DDTはベンガル湾や南シナ海など熱帯・亜熱帯海域に高濃度分布が存在するのに対し、クロルデン化合物やPCBは北半球内での濃度差が相対的に小さくなっており、こうした化合物の使用が中緯度の先進工学国から低緯度の第三世界へ広がりつつあることを支持している。ところで表層海水の濃度分布はかならずしも大気中の分布パタ-ンと一致しなかった。例えばBHCの場合、大きな汚染源が存在しないと思われる北緯40゚以北の寒帯域で高い濃度分布がみられ、顕著な極域汚染の進行が観察された。一方DDTでは、インド・中国周辺海域で高濃度分布がみられた。また、外洋環境におけるこの種の物質の動態を理解するために、同一地点で採集した大気・海水試料の実測値から各有機塩素化合物のフラックスを計算した。その結果BHCはベンガル湾、南シナ海、東シナ海といった汚染源周辺で高い値を示し、大気から海水への活発な移行が観察されたが、ここから遠距離にある北太平洋中緯度域、東部インド洋、南氷洋では低い値が認められた。ところが北部北太平洋、アラスカ湾、ベ-リング海、チュクチ海などは汚染源から遠く離れているにもかかわらず大きな平衡のずれを示し、多量のBHCが海洋に流入していることがわかった。これとは対象的にDDTはベンガル湾、南シナ海など限られた海域で高い値を示した。こうした結果はヘンリ-定数の高い物質ほど汚染源から移動拡散しやすいこと、また北極周辺海域が生物蓄積物質のたまり場になっていることを示している。つまり熱帯から放出された物貭は一様に広がるのではなく、特定の海域に集中的に集積するものと結論される。

温帯地域と比べると、一般に熱帯の汚染は大気ですすんでおり、水や底質、魚介類の残留濃度はむしろ低い。南インドのベラ川河口域で行なった環境調査の実測値を数値モデルに代入し、集水域における農薬BHCの物質収支を計算したところ、河川へ流出し河口へ到達した量は散布量の1%弱で、残余の大半は水田つまり使用の場から直接大気へ揮散したものと推定された。このことを裏付けるため、南インドの水田でBHCの散布試験を行なったところ、散布後2週間で95%のBHCが大気へ揮散し、水、土壌、稲への残在量はきわめて少ないことが判明した。このように熱帯で使用された化学物質は、速やかに大気に移行する。したがって、沿岸海洋へ与える影響は小さいが、地球規模の汚染に大きな負荷をもたらすことになると結論された。そこで外洋の調査を行なったところ、この種の有機塩素化合物は全ての調査海域から検出されたが、その汚染レベルには海域および物質によって違いが認められた。大気試料の場合、いづれの有機塩素化合物も南半球に比ベ北半球で高濃度分布がみられ、この種の物質の汚染源が依然として北半球におることを確認できた。しかしながら汚染分布の細部に注目すると、DDTはベンガル湾や南シナ海など熱帯・亜熱帯海域に高濃度分布が存在するのに対し、クロルデン化合物やPCBは北半球内での濃度差が相対的に小さくなっており、こうした化合物の使用が中緯度の先進工学国から低緯度の第三世界へ広がりつつあることを支持している。ところで表層海水の濃度分布はかならずしも大気中の分布パタ-ンと一致しなかった。例えばBHCの場合、大きな汚染源が存在しないと思われる北緯40゚以北の寒帯域で高い濃度分布がみられ、顕著な極域汚染の進行が観察された。一方DDTでは、インド・中国周辺海域で高濃度分布がみられた。また、外洋環境におけるこの種の物質の動態を理解するために、同一地点で採集した大気・海水試料の実測値から各有機塩素化合物のフラックスを計算した。その結果BHCはベンガル湾、南シナ海、東シナ海といった汚染源周辺で高い値を示し、大気から海水への活発な移行が観察されたが、ここから遠距離にある北太平洋中緯度域、東部インド洋、南氷洋では低い値が認められた。ところが北部北太平洋、アラスカ湾、ベ-リング海、チュクチ海などは汚染源から遠く離れているにもかかわらず大きな平衡のずれを示し、多量のBHCが海洋に流入していることがわかった。これとは対象的にDDTはベンガル湾、南シナ海など限られた海域で高い値を示した。こうした結果はヘンリ-定数の高い物質ほど汚染源から移動拡散しやすいこと、また北極周辺海域が生物蓄積物質のたまり場になっていることを示している。つまり熱帯から放出された物貭は一様に広がるのではなく、特定の海域に集中的に集積するものと結論される。
不動産登記の電算処理と司法書士制度(登記原因証書による登記制度の再構成にむけて)

本研究では、不動産登記制度の電算化をうけて、登記簿記載の項目と登記に際して司法書士によって作成され提出される書面としての登記原因証書の記載事項の検討した。もっとも、研究の期間が短いこともあり、主に各書面における日付の意味を中心に分析した。まず、不動産登記簿には、登記の受け付けの日付登記原因の日付登記された当該の日付が記載されているが、各々の日付が法務省当局にとっての日付で、その元となった資料の明示がないこともあり、当該日付の意味については曖昧な状態であることが明らかになった。また、登記申請との関係では、特に登記原因の日付が、登記原因証書作成の日付ではなく、不動産業者が関わった手付け交付時に取り交わすことの多い売買契約の日付であったり、代金支払いの日であったり、とまちまちであることが明らかとなった。一見明白であるように思われていた不動産公示における各々の日付が、取引に応じて種々であることが理解できたが、情報のソースを明らかにしない限り、情報それ自体の意味は明確ではないということが、これまで不動産登記簿には欠落していたといえる。この点で、これら情報のソースを明らかにすることは、登記の申請に携わっている司法書士の重要な責務として今後検討が深められるのではと考えている。また、登記の記載の日付が対抗要件具備の日付であることはつとに言われてきたところであるが、登記の受け付けの日付が、そもそもは売買証書と考えられていた登記原因証書の確定日付の日付付記を意味していたとことも知ることができた。この点については、特に民法施行法の立法過程を含め、現在論文を作成中であり、登記原因証書の意味を考えるに付いても参考となると考えている。
感性フィーチャに基づく意匠設計支援および形状情報に基づく工学的評価システムの開発

企画・コンセプト設計のプロセスにおいて,簡便にそして迅速に三次元ソリッドモデルを構築するためのシステムおよび意匠設計における創造活動を支援するシステムが望まれており,本研究では,これらの要求に応えるために,「感性フィーチャに基づく意匠設計支援および形状情報に基づく工学的評価システム」の試作開発を行うことを目的として遂行された。本研究は,平成12年度と平成13年度の2ヶ年に渡って実施され,以下に示す研究実績が得られた。(1)三次元デジタルモデル簡易・迅速構築システムの開発スケッチ,バーチャルクレイモデル,ラフ実モデル,断面輪郭制御構築簡易モデルから3次元デジタルモデルを簡易にかつ迅速に構築する三次元デジタルモデル簡易・迅速構築システムの開発を行った。(2)感性フィーチャの抽出とフィーチャに基づく美形状化システムの開発意匠製品形状を分析し,全体形状,部分形状,キャラクタライン,ハイライトのフィーチャ(特徴)を抽出するとともに,抽出されたフィーチャに基づき形状を修正・変更するシステムの開発を行った。(3)意匠形状を工学的に評価する形状情報の抽出と評価システムの開発意匠形状を工学的に評価するため,微視的形状情報として形状基本量を,また,巨視的形状情報として形状統計量を独自に提案し,それらに基づいて形状を評価するアルゴリズムを開発し,コンピュータにシステムとして実装した。(4)システムの統合と評価3つのサブシステムを統合して目的とするシステムを構築し,評価実験を行った。また,2カ年の研究のまとめを行った。本研究は,平成12年度と平成13年度の2ヶ年に渡って実施され,「感性フィーチャに基づく意匠設計支援および形状情報に基づく工学的評価システム」を開発することを目的としている。同システムは,3つのサブシステムから構成されており,平成12年度ではそれらのサブシステムの開発にあたり,以下に示す研究実績が得られた。(1)三次元デジタルモデル簡易・迅速構築サブシステムの開発スケッチ,バーチャルクレイモデル,ラフ実モデル,断面輪郭制御構築簡易モデルから3次元デジタルモデルを簡易にかつ迅速に構築する三次元デジタルモデル簡易・迅速構築サブシステムの開発を行った。(2)感性フィーチャの抽出とフィーチャに基づく美形状化アルゴリズムの開発・実装意匠製品形状を分析し,全体形状,部分形状,キャラクタライン,ハイライトのフィーチャ(特徴)を抽出する。それぞれのフィーチャに基づき形状を修正・変更するモジュールの開発を行った。(3)意匠形状を工学的に評価する形状情報の抽出と評価アルゴリズムの開発・実装意匠形状を工学的に評価するため,微視的形状情報として形状基本量を,また,巨視的形状情報として形状統計量を独自に提案し,それらに基づいて形状を評価するアルゴリズムを開発し,コンピュータに実装した。本研究は,平成12年度と平成13年度の2ヶ年に渡って計画された。企画・コンセプト設計のプロセスにおいて,簡便にそして迅速に三次元ソリッドモデルを構築するためのシステムおよび意匠設計における創造活動を支援するシステムが望まれており,本研究では,これらの要求に応えるために,「感性フィーチャに基づく意匠設計支援および形状情報に基づく工学的評価システム」の試作開発を行うことを目的としている。同目的を達成するため,次の3つのサブシステムを構築した。(1)三次元デジタルモデル簡易・迅速構築サブシステム(2)感性フィーチャに基づくエージェント型美形状化支援サブシステム(3)形状情報に基づく設計形状の工学的評価支援サブシステム平成13年度における研究開発は以下のとおりである。(1)感性フィーチャに基づくエージェント型美形状化システムの開発(担当:青山,池田)○前年度に開発されたフィーチャに基づく美形状化モジュールを統合し,美形状化サブシステムを構築した。(2)形状情報に基づく意匠形状評価システムの開発(担当:松岡,池田)○前年度開発された評価モジュールを統合し,意匠形状評価サブシステムを構築した。(3)システムの統合と評価(担当:青山,松岡,池田)○3つのサブシステムを統合して目的とするシステムを構築し,評価実験を行った。○2カ年の研究のまとめを行った。
π性電子供与体の環境場における光電子移動反応の制御

(1)光不斉アミノ化反応:電子受容体の存在下で芳香族オレフィン類に光照射して発生させたカチオンラジカルにアンモニアやアミンを求核付加させる光アミノ化反応において、ベンゼンなどのπ-ドナーを添加すると反応効率が著しく増大することを見い出している。これはカチオンラジカルがπ-ドナーとπ-錯体を形成するためだと考えられる。そこで、本研究では、キラル置換基を持ったπ-ドナーとして(-)-または(+)ーメンチルアリールメチルエーテル(3)を用いアネトール(1)のアンモニアによる光アミノ化反応を行い、その不斉誘導の可能性を検討した。その結果、アミノ化生成物(2)の旋光度は反応温度によって変化し、温度の逆数と旋光度の値が直線関係にあることが分かった。また、π-ドナーの電子供与性が増加するに従い旋光度の絶対値が大きくなり、HPLCの測定から、最高でおよそ15%のeeであった。また、π-ドナーのキラル部をメントールからカンファーなどに変えて種々の芳香族オレフィン類の不斉アミノ化反応について検討を行った。(2)疎水的環境場での電子移動反応:DNA光修復酵素(PRE)のモデル化が生体内酸化還元補酵素フラビンを光増感剤に用いて研究されているが、生体系の反応条件に近い中性条件下水溶液中でのモデル化反応には成功していない。本研究では、中性条件下水溶液中で、ピリミジンシクロブタンダイマー(4)のテトラアシルリボフラビン(FL)-光増感単量化反応をドデシル硫酸ナトリウムやヘキサデシル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤を臨界ミセル濃度以上添加した条件で行い、単量化反応が効率良く起こることを見出した。この反応はミセル中で4から^3FL^*への電子移動反応によって4のカチオンラジカルが生成することで開裂が起こっていると思われる。単量化の限界量子収率は最大で0.86と求められ、単量化は効率良く起こっていることが分かった。
多発性てんかん焦点モデルの基礎的研究

難治性てんかんの中でも、両側の大脳半球にてんかん焦点が見とめられる多発性てんかん焦点の症例は、抗てんかん薬による治療に抵抗し難治化することが多く、またてんかんの外科治療も、適応外となることが知られている。本研究では、猫およびラットの両側大脳皮質にてんかん焦点を作成し、多焦点てんかんの機序を検討し、また、外科治療の可能性についの研究を行った。実験Iでは、両側大脳感覚・運動領野にカイニン酸皮質内注入によりてんかん焦点を持つ慢性ネコ多焦点モデルを作成し、脳梁離断術の基礎的研究を行った。両側感覚運動領野にそれぞれ独立したてんかん焦点を作成したところ、発作波および発作も左右同期して初発するようになった。しかし、脳梁離断直後から、発作波は左右非同期して出現するようになり、脳梁は左右の脳皮質てんかん焦点のスパイク波の同期化に重要な働きを持っていることを明らかにした。実験IIでは、一側大脳感覚・運動領野にてんかん焦点を持つ慢性ラット焦点てんかんモデルに脳梁離断術を行ない、その後autoradiography法にて糖代謝の変化を検討た。脳梁離断直後から、コントロール群に比べて発作が軽くなったことより、脳梁は左右の脳皮質てんかん焦点の伝播に重要な働きを持っていることを明らかにした。実験IIIでは、ラットの両側大脳皮質にカイニン酸注入により多焦点モデルで、脳梁離断術後の脳波と糖代謝の変化を検討した。脳梁離断術後も、両側の独立した発作が残存したことから、脳梁離断術の限界を明らかにした。この研究は、臨床においても、両側大脳半球に異なった発作焦点を持つ多焦点の症例では、脳梁離断術後は左右の発作波の同期化のみが改善されることを示している。しかも各半球に独立した発作は残存することが示された。以上の結果を踏まえて、脳梁離断術の手術適応は、慎重に決定されなければならないことを明らかにした。両側大脳感覚・運動領野にてんかん焦点を持つ慢性ネコ多焦点モデルに脳梁離断術を行ない、てんかんの外科的治療に関する基礎的研究を行った。成ネコ6匹を用い、Nembutal麻酔下に定位脳手術を行い、両側感覚運動領野の皮質内にそれぞれ双極電極とカニューラを刺入した。術後1週間経過した、安静覚醒時に両側カニューラ内に注入針を挿入し、カイニン酸を10μgづつ注入した。発作波が両側感覚運動領に認められ、両側皮質焦点が十分に成熟した注入後2時間目に、Nembutal軽麻酔を行い、手術用顕微鏡下に脳梁離断術を行った。離断術前後の脳波を観察し、カイニン酸注入後24時間目に10%ホルマリン液で脳を潅流固定後に前額断のスライスにして、HE染色にて鏡検した。<結果>すべてのネコに、両側性にそれぞれ独立した皮質焦点発作が誘発された。発作波は始めは左右ばらばらに出現する傾向が認められたが、発作重積状態になった2時間後には、殆ど左右同期して、発作波が出現するようになった。脳梁離断術直後から、発作波はそれぞれ独立して出現するようになり、左右同期しないようになった。病理組織では、全脳梁が離断されていることを確認した。<考察および結論>両側感覚運動領野にそれぞれ独立したてんかん焦点を作成したところ、発作波および発作も左右同期して初発するようになった。しかし、脳梁離断直後から、発作波が左右非同期して出現するようになったことより、脳梁は左右の脳皮質てんかん焦点の同期化に重要な働きを持っていることが明らかになった。

この事実は、臨床において、両側大脳半球に異なった発作焦点を持つ多焦点の症例には、脳梁離断術では左右の発作波の同期化のみが改善されることを示しており、離断後も、各半球に発作は残存することが考えられる。以上の結果を踏まえて、脳梁離断術の手術適応は、慎重に決定されなければならないことを明らかにした。一側大脳感覚・運動領野にてんかん焦点を持つ慢性ラット焦点てんかんモデルに脳梁離断術を行ない、その後autoradiography法にて糖代謝の変化を検討し、てんかんの外科的治療に関する基礎的研究を行った。Wistar系ラット14匹を用い、Nembutal麻酔下に定位脳手術を行い、一側感覚運動領野の皮質内にカニューラを刺入した。術後1週間経過してからハロセン麻酔下に、一側大腿動静脈にカニュレーションしてから腰部以下をギプス固定した。カニューラ内に注入針を挿入し、カイニン酸を5microgramを注入し焦点発作を誘発した。発作波が認められ、皮質焦点が十分に成熟した注入後2時間目に、Nembutal軽麻酔を行い、手術用顕微鏡下にコントロール群の7匹には開頭のみを、残りの7匹は開頭後に脳梁離断術を行った。術後2時間目に14C-deoxyglucoseを100mCi静注し、autoradiogramを作成した。<結果>すべてのラットに、発作重積が誘発された。離断グループは脳梁離断術直後から、発作が少し軽減され弱くなってきた。autoradiogramでは、全脳梁が離断されて、対側大脳皮質への発作が消失した。しかし、両側大脳基底核と視床には発作が残っていることを確認した。<考察および結論>一側感覚運動領野にてんかん焦点を作成した。脳梁離断直後から、コントロール群に比べて発作が軽くなったことより、脳梁は左右の脳皮質てんかん焦点の同期化に重要な働きを持っていることが明らかになった。しかし、脳の局所脳糖代謝では、皮質下諸核には両側性に発作が残存していることを明らかにした。この事実は、臨床においての脳梁離断術では左右皮質の発作波の同期化のみが改善されることを示しており、離断後も、各半球に発作は残存することが考えられる。以上の結果を踏まえて、平成12年度は、ラットの両側多焦点モデルで、脳梁離断術の代謝を検討し本研究を完成する予定である。難治性てんかんの中でも、両側の大脳半球にてんかん焦点が見とめられる多発性てんかん焦点の症例は、抗てんかん薬による治療に抵抗し難治化することが多く、またてんかんの外科治療も、適応外となることが知られている。本年度は、ラットの両側大脳皮質にてんかん焦点を作成し、多焦点てんかんの機序を検討し、また、外科治療の可能性についての研究を行った。実験には、Witar系ラットを用いた。Nembutal麻酔下に、両側大脳皮質感覚運動領野にカイニン酸注入用のカニューラを、定位的に刺入した。ビス電極を、両側運動野と頭頂葉の硬膜外の頭蓋骨に固定した。術後1週間目に、ハロセン麻酔下にカニューラに注入針を挿入し、2μgのカイニン酸溶液を両側に注入し、多発性てんかんを誘発した。カイニン酸注入後30分以内に、両側性の発作重積が誘発された。発作重積が誘発されてから1時間目に、脳梁離断を行った。4匹は脳波記録用に用い、残りの4匹は、脳梁離断後1時間目の、全身けいれん発作重積時に、14C-deoxyglucoseによるオートラジオグラフィーを行った。
中性物質廃出型反応を基盤とした環境調和型芳香族群の効率的合成法の開発

有機合成を用いてターゲット分子を構築する上で、廃棄物低減型の環境に優しいクリーンな方法論の開発が重要である。中性の廃棄物のみが副生するメリットとして、反応容器の劣化の抑制や、反応処理工程の簡略化などが挙げられる。我々は、安価な鉄塩や回収・再利用可能な不均一系遷移金属などを触媒として、水・メタノール・シラノール・水素などの中性物質排出型のクリーンな骨格構築法の開発を目指し、研究を推進した最終年度の実績として、まず水中で進行する不均一系銅炭素を触媒とした窒素ー酸素結合を伴う複素環化合物合成を開発し、それを基盤としたヘテロ原子導入反応などに展開した。水のみが副生するもしくは全く副生物を排出しないクリーンな反応である。また、次世代エネルギーである水素をアルコールや炭化水素から取り出す手法を開発すると共に、水素を活性化剤とした多様な反応に応用した。水素は引火性ガスで厳重な管理が必要であるため、水素の用事調製法として価値がある。その他、金属触媒を必要としない環境負荷低減型の反応開発へと展開することができた。研究全体を通して、水・メタノール・シラノール・水素などの中性物質を排出する数多くの反応を開発することができた。特に、医薬品原料の母核として重要な芳香環、ヘテロ環、重水素原子導入体など多様な新規骨格の合成に成功した。また、水素用事調製法は、次世代エネルギーである水素の製造法としても価値があり、薬学分野にとらわれず、多彩な分野に利用可能な方法論として構築することができた。有機合成において、地球環境に優しい方法論の開発は重要であり、反応の進行に伴い発生する廃出物が中性であることは、反応媒体(容器)の劣化を抑制するのみならず反応処理操作を簡略化(中和工程の除去など)できるため有用である。そこで、水・メタノール・シラノール・水素などの中性廃棄物を副生する芳香族群の触媒的創製ならびに変換法の開発に取り組んでいる。触媒として、安価な汎用ルイス酸である鉄触媒や、Pd/Cなどの回収・再利用可能な不均一系触媒を選択し、研究を推進した。また、アレーンのC-H活性化を基盤としたFriedel-Crafts反応やDiels-Alder反応などのアトムエコノミーに優れた方法論を主とした骨格変換法を検討した。これらは、環境負荷低減型の反応として有用であり、多様な芳香族群の構築ならびに官能基選択的変換を可能とする。芳香環を含む有機化合物の効率的合成や官能基選択的変換法の開発は、新たな医薬品や機能性材料を創製する上で重要である。一年目の計画で挙げていた、中性物資であるメタノールを排出する鉄触媒的フリーデルクラフツ反応を基軸とした骨格合成法に関して順調に成果を挙げることが出来ている。現在、この手法を応用することで、従来法では達成できない官能基選択的骨格変換法の実用化に展開している。また、鉄触媒を用いた新規反応を開発する上で、その原料合成の効率化も重要である。カルボニル化合物は求電性の高い反応種であるが、それらの官能基選択性の確立は困難である。現在、芳香族アルデヒド選択性を有する反応開発に従事している。また、不均一系触媒を用いた酸素酸化法は、水のみを廃出するグリーンな方法論である。芳香族アセタール選択的酸化反応を開発するとともに、現在新たな酸化反応へと応用している。更に、不均一系触媒的脱水素反応を基盤とした手法の開発と応用で成果を挙げることができた。申請書に記載した計画において、概ね順調に成果を挙げることが出来ている。それに加え、そこから得られた知見を元に新たな反応開発へと展開できている。「研究実績の概要」の欄で記載した芳香族アルデヒド選択的な反応は、シリルトリフラートとピリジンに由来する塩中間体の反応性を巧みにコントロールすることで獲得でき、申請計画に記載した求核種との反応に留まらず、様々な求核種への適応を検討し、予期していなかった収穫も得ることが出来ている。また、不均一系触媒を用いた酸素酸化では、芳香族アセタールをターゲットにした手法のみならず、ベンジルエーテルなどへの適用も可能した。不均一系触媒による脱水素反応を基盤とした芳香族化合物合成においても、順調に成果を挙げることができ、こらら3つの反応において、現在報文化の準備中である。また、特許申請の準備にも取りかかっている。脱水素反応で副生する水素を利用した還元反応や重水素標識化の開発にも至っている。また研究過程で、安定なリン酸エステルを用いた様々な有用な反応を開発しており、これらで得られた基質を利用して、上記方法論を活用した新規反応開発へと取り組んでいる。有機合成では、ターゲット分子をいかに効率よく合成するかが重要であり、更に廃棄物低減型方法論は環境に優しいクリーンな方法論として注目されている。反応の進行に伴い副生する廃棄物が中性であることは、反応容器の劣化を抑制できるだけでなく、反応処理工程の簡略化へと繋がる。我々は、水・メタノール・シラノール・水素などの中性物質排出型のクリーンな骨格構築法の開発を目指し、研究を推進している。触媒としては安価な鉄塩や回収・再利用可能な不均一系触媒などを駆使している。2年目の実績としてまず、不均一系パラジウム炭素を触媒として、酸素酸化を伴うベンジルアルキルエーテル類の炭素ー水素結合官能基化を基盤としたメタノールの挿入反応や、不飽和環状アルカン類の脱水素的芳香化反応を開発した。これらは、水や水素のみを排出するクリーンな手法として評価されている。

また、申請内容であるアルコールの脱水素反応の開発を基盤とした他の官能基変換法や、中性アルカンの脱水素反応への応用ならびに還元反応への適用などでも研究テーマを拡充することができた。一方、芳香族アルデヒドを基質にしてシリルトリフラートとピリジン誘導体を作用させると、ピリジニウム塩が得られる。この塩に対して、ビニルシリルエーテルを求核種として作用させると、ベータ-シロキシアルデヒドが得られる。アルデヒドを基質としてビニルシリルエーテルを求核種とした向山アルドール反応は、生成物がアルデヒド体であるため過剰反応を抑制することが困難である。この副反応を抑制しつつ、新たな選択性を有する芳香族アルデヒド選択的骨格構築法を開発した。得られた生成物のシロキシ部を鉄触媒的に変換し、中性シラノールを脱離基とした新たな変換法としても応用展開した。その他にも、リン酸エステルや有機触媒を用いた方法論と組み合わせ、数多くの成果を上げることができた。申請書に記載した計画においては、概ね順調に成果を挙げることが出来た。更に、申請計画に留まることなく、得られた知見を元に臨機応変に対応し、数多くの成果へとつなげた。不均一系触媒を用いた水素のみが排出される脱水素反応は、アルコールや不飽和環状アルカンを基質とした酸化反応に適用し論文として公表するに至っている。触媒の再利用やスケールアップなども可能であり、環境負荷低減型の酸化反応として有用である。また、基質を複素環化合物へ適用させることで、別の骨格変換が起こることも見いだしつつある。基質適用拡大や、得られた知見を更に発展させることで、多くの新規反応の開発に繋がることが期待される。シリルトリフラートとピリジン誘導体による芳香族アルデヒド由来のピリジニウム塩を利用した新規反応開発に成功した。この塩や、様々な求核種導入へと適用した成績体は、ベンジルシリルエーテル構造を有する。すなわち、これら化合物は鉄触媒的に脱保護することなく多様な官能基へと変換可能と考えられる。様々な求核種と、その後の中性物質のシラノールを脱離基とする変換反応へ応用することで、ステップエコノミーに優れた方法論へと展開可能と考えられる。有機合成を用いてターゲット分子を構築する上で、廃棄物低減型の環境に優しいクリーンな方法論の開発が重要である。中性の廃棄物のみが副生するメリットとして、反応容器の劣化の抑制や、反応処理工程の簡略化などが挙げられる。我々は、安価な鉄塩や回収・再利用可能な不均一系遷移金属などを触媒として、水・メタノール・シラノール・水素などの中性物質排出型のクリーンな骨格構築法の開発を目指し、研究を推進した最終年度の実績として、まず水中で進行する不均一系銅炭素を触媒とした窒素ー酸素結合を伴う複素環化合物合成を開発し、それを基盤としたヘテロ原子導入反応などに展開した。水のみが副生するもしくは全く副生物を排出しないクリーンな反応である。また、次世代エネルギーである水素をアルコールや炭化水素から取り出す手法を開発すると共に、水素を活性化剤とした多様な反応に応用した。水素は引火性ガスで厳重な管理が必要であるため、水素の用事調製法として価値がある。その他、金属触媒を必要としない環境負荷低減型の反応開発へと展開することができた。
新規治療法を目指したオートファジー・カテプシンの糸球体硬化進展への関与の解明

本研究は、ポドサイト特異的なAtg7欠損(KO)マウス、カテプシンKOマウスを使うことで、蛋白分解系関連蛋白の機能解明と、最終的には糸球体硬化進展メカニズムの解明を目的としている。本年度は、最終年度としてカテプシン関連、オートファジー関連研究のまとめを中心に、ポドサイト障害と糸球体硬化への各関連蛋白の機能解明を目指したが、今回実験腎炎におけるポドサイト障害時のカテプシンLおよびそのインヒビターの関与について報告することができた。ラットネフローゼモデルとして知られるピューロマイシン腎症において、蛋白尿出現初期より多くのポドサイトにカテプシンLの発現亢進が確認でき、また糸球体硬化出現時期には、カテプシンLを含むシステインプロテアーゼのインヒビターであるシスタチンCの発現が、ポドサイト内の特に障害が強いことが予想される部位(カテプシンLの発現が低下している部位)で上昇していることを確認した。これはカテプシンLがポドサイト剥離から糸球体硬化に進展する機序に関与する可能性があると考えられた。また、アクチン関連蛋白であるsynaptopodin(synp)がポドサイトに特異的に発現し、その発現低下が糸球体硬化を来すことは知られているが、今回マウス糸球体硬化症モデルとして知られるアドリアマイシン腎症において、ポドサイトの細胞骨格である中間系フィラメントの関連蛋白として、Neurofilament heavy polypeptide (NEFH)がポドサイト障害時に発現亢進することを確認した。さらにはNEFHがsynpとポドサイト内で共局在し、ポドサイト障害時のsynpの発現低下を防ぐこと、それによりポドサイトの剥離を抑制することに関与している可能性を報告した。これにより、最終目標としての蛋白分解系関連蛋白の機能解明と、糸球体硬化進展メカニズムの解明に近づくことができたと考える。本研究は、ポドサイト特異的なAtg7欠損(KO)マウス、カテプシンKOマウスを利用することで、オートファジー・リソソーム経路による分解系関連蛋白と糸球体硬化進展メカニズムの関係解明を目的としている。本年度は、各KOマウスに対して自然経過観察やADR腎症を惹起させ組織障害を観察すること、野生型マウス培養ポドサイトへのアドリアマイシン(ADR)添加によるカテプシンやオートファジーの観察を予定していた。カテプシンについては、本年度はポドサイト特異的カテプシンD(CD)KOマウスの自然経過の観察により、5か月齢で蛋白尿を検出し、20-22か月齢で腎機能低下に陥ることを確認した。KOマウスにおいては、年を経るごとにポドサイトアポトーシスの増加を認め、これによる糸球体硬化、腎機能低下となることが分かった。電子顕微鏡による観察では、ポドサイト内に神経特異的CD欠損マウスと同様の所見である、多くのオスミウム好性顆粒が貯留しており、中にはオートファゴソームの貯留、エンドソームの貯留も認められ、さらにはこの顆粒の中にスリット膜蛋白であるポドシンの貯留が確認できた。これらのことから、リソソーム機能の低下がオートファジー機能低下や不要な蛋白の処理機能低下による貯留がスリット膜形成不全による蛋白尿やアポトーシスを来し、結果として腎機能低下につながることが考えられ、カテプシンDはポドサイト障害、回復には必須であることが分かり、これらについて論文化した。今後はCDとカテプシンL、オートファジーとの関連についても検討を進める予定である。オートファジーについては、本年度は野生型マウス培養ポドサイトへの薬剤投与による観察を行により、ADRの投与によるオートファジーの活性化を確認した。今後はオートファジー欠損時のポドサイトの変化について観察するためにAtg7欠損ポドサイトの作成、観察を進める予定である。27年度の研究により、カテプシンD欠損マウスの観察においてカテプシンDはポドサイト障害、回復には必須であることが分かり、これらについて論文化することができた。またオートファジーについては、Atg7欠損マウスの薬剤投与による観察と、オートファジー欠損時のポドサイトの変化について観察するためにAtg7欠損ポドサイトの作成、観察を進める予定である。オートファジーについては、in vivo,in vitroについても観察途中であるが、カテプシンDについての論文化ができたことにより、概ね順調な進展と判断した。本研究は、ポドサイト特異的なAtg7欠損(KO)マウス、カテプシンKOマウスを使うことで、オートファジー・リソソーム経路による分解系関連蛋白と糸球体硬化進展メカニズムの関係解明を目的としている。本年度はポドサイト障害時のオートファジーの役割について検討を進めるべく、Atg7欠損マウスへの薬剤投与の観察と、オートファジー欠損時のポドサイトの変化について観察のため、Atg7欠損ポドサイトの作成観察を行う予定であった。リソソーム分解に関連して、平静時スリット膜の裏打ち蛋白として存在するポドシンが糸球体硬化時に局在移動することと、これがエンドサイトーシス関連蛋白であるsorting nexin 9(SNX9)との結合により行われており、SNX9は糸球体硬化を来す疾患において有意に増加することを論文化することができた。エンドサイトーシス顆粒はリソソーム分解系に関連するため、次年度はカテプシン欠損マウスにおけるエンドサイトーシス関連蛋白の観察を元にカテプシン欠損時のエンドサイトーシスと糸球体硬化との関連の解明を目指し、論文化していく予定である。

オートファジー関連については、Atg7KOマウスへのアドリアマイシン(ADR)腎症惹起、リポポリサッカリド(LPS)腎症惹起により、KOマウスにおいて有意に蛋白尿が増悪することを確認しているが、その障害メカニズム解析のためAtg7KOマウスから採取したポドサイトを元にオートファジー欠損ポドサイトを作成することに成功し、この観察により大変興味深い結果がみられている。次年度は最終年度であり、この結果をまとめ論文化することを目標とする。28年度の研究により、リソソーム分解に関連して、平静時スリット膜の裏打ち蛋白として存在するポドシンが糸球体硬化時の局在移動と、これがエンドサイトーシス関連蛋白であるsorting nexin 9(SNX9)との結合により行われており、糸球体硬化時に増大することを論文化することができた。エンドサイトーシス顆粒はリソソーム分解系で分解されるため、カテプシン欠損によるポドサイト障害への影響の解明についても、糸球体硬化とカテプシン・オートファジーとの関連を観察するために有益と考えられた。また、オートファジー関連についても、ポドサイト障害メカニズム解析のためAtg7KOマウスから採取したポドサイトを元にオートファジー欠損ポドサイトを作成することに成功し、この観察により大変興味深い結果がみられている。カテプシンマウスを使っての検討は進行中であるが、28年度はエンドサイトーシスとリソソーム系、糸球体硬化との関連を示唆する結果を得ることができ、糸球体硬化進展メカニズム解明に新たな視点を得られたことから、課題はおおむね順調に進行していると判断した。本研究は、ポドサイト特異的なAtg7欠損(KO)マウス、カテプシンKOマウスを使うことで、分解系関連蛋白の機能解明と、最終的には糸球体硬化進展メカニズムの解明を目的としている。本年度は、オートファジー欠損培養ポドサイトの観察およびAtg7KOマウス観察結果についての検証とまとめを予定していたが、まとめるには十分でないと判断し次年度に繰り越して研究を継続することととした。しかしながら糸球体硬化抑制に関連して、下記蛋白の機能解析を報告することができた。腎臓の発達に関連した蛋白であるSal1について、ポドサイト特異的Sal1KOマウスに糸球体硬化モデルであるアドリアマイシン(ADR)腎症を惹起したところ、KOマウスにおける蛋白尿の有意な増加、糸球体硬化の有意な増悪を確認した。またKOマウスにおいてアクチン関連蛋白であるsynaptopodinの減少とポドサイトアポトーシスの増加を確認した。以上から、Sal1が糸球体障害時にアクチン骨格の再構成やアポトーシスの制御を行うことでポドサイトに保護的な役割を担うことを論文化できた。また、細胞骨格関連蛋白であるRac1について、ポドサイト特異的Rac1KOマウスにおけるADR腎症の観察により、KOマウスにおいて糸球体硬化が有意に増加し、糸球体障害時にポドサイトが代償的に肥大できないことを確認した。そのメカニズムの検証によりポドサイト形態の維持に、Rac1とmTORが必要であることが確認でき、この結果も論文化できた。さらに、特発性ネフローゼ症候群患者の腎生検組織RNA解析により、toll-like receptor 8と10がネフローゼ発症と再発に関連している可能性を学会報告した。