hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
LAMP法によるヘルペスウイルス感染症のpoint of care test開発

LAMP法は、迅速な病原体核酸検出を行う有用な検査法であるが、高感度検出法のためのprimer選択が複雑など解決すべき問題も多い。この問題の解決のためRPA法とLAMP法の融合による解決(R-LAMP)を着想した。R-LAMPによるHHV-6 DNAの検出下限は、熱変性による検出限界とほぼ等しい10コピー/反応であり、プラスミド濃度と濁度の間にも良好な直線関係が示された。本法は、熱変性と比較するとコンタミネーションのリスクを減らすことができる一方、余分に試薬が必要など問題はのこる。今後、まだ臨床検体による検討を必要とする。次に、ポリメラーゼスパイラル反応(PSR)によるVZV DNAの検出を行った。この方法でも10コピー/反応を検出することができ、VZV LAMPよりも高感度であることが分かった。しかし、問題としてNTC(No template control)の濁度上昇が確認された。NTCの濁度上昇は、電気泳動結果からprimerダイマーによるものと確認された。この濁度の増加とDNA増幅とを区別するために、EprobeをPSRに利用することにした。Eprobeは、近年開発された等温増幅法にも利用可能なprobeである。EprobeによるPSRの感度も10コピー/反応であった。しかし、EprobeによるPSRを用いたVZV DNAの検出でもNTCの蛍光強度の増加が確認された。この原因は、primer同士のアニールによって生じる産物中にEprobeとのミスアニールする配列が生じる可能性があったことがOligoanalyzerによる解析で分かった。NTCとPSR産物の区別のため行った融解温度分析で、ピーク蛍光温度には、明らかな差があり両者を区別可能であることも分かった。本研究では、臨床検討のためさらなる研究が必要とされるものの、LAMP法の感度改善法、あらたな等温増幅法を構築した。我々は、loop-mediated isothermal amplification(LAMP)法を用い、ヒトヘルペスウイルス感染症迅速診断法開発を行ってきた。特にhuman herpesvirus 6(HHV-6)感染については現場での有用性を最優先に臨床検体からの直接ウイルスゲノム検出や、試薬乾燥化による検査工程の簡易化を実現した。LAMP法は、6つのprimerを必要とし、専用ソフトがあるが設計に難渋することがあり、標的領域において優れたprimerを選択できないこともある。本研究室でもHerpes simplex virus(HSV)やvaricella-zoster virus(VZV)では、他のヘルペスと交差反応性のない領域にprimer設定が困難、GCリッチな配列では目標とする標的遺伝子の増幅感度を得ることが出来なかった経験がある。この場合、感度を上昇する簡易な方法としてテンプレートの熱変性があるが、本法のDNA polymeraseが非耐熱性で使えないこと、操作が煩雑になるなどが問題であった。そこで本研究では、他の等温増幅法でDNA変性のために使われているhelicaseやrecombinaseをLAMP法に応用することで熱変性によらない感度上昇を目指すこととした。二つ目の問題は、遺伝子の定量的評価の問題である近年、LAMP法に利用可能なprobeとして報告されたDARQ probeを用いて、LAMP法による簡便な遺伝子定量的評価法を開発する。このように、本研究では現在のLAMP法が抱える未解決の二大問題を解決し、ヘルペスウイルス感染症に最適なpoint of caretest(PCT)としての臨床応用を目指す。本年度は、RPA反応とHHV-6 LAMP法を組み合わせ、これと我々が構築したHHV-6LAMP熱変性法(感度に優れる)と比較した。HHV-6熱変性法は、サンプルとLAMP mixtureを96度で30s加熱、氷中30s後、反応チューブにBst polymeraseを加えLAMP反応開始(63度60分)した。本法は、10コピ-/反応を検出できる。我々が、本研究で検討するのは、RPA反応で鍵となる試薬recombinase(RecA)、single stranded binding protein (SSB:T4 gene 32 protein)、adenosin 5'-Triphosphate(ATP)について原著論文(PLoS Biol 2003)を参考にLAMP mixtureに加え、熱変性をおこなわなくても十分なLAMP感度を得ることにある。サンプルは、標的領域をサブクローニング、コピー数を決定したplasmidを段階希釈して検出可能な最高希釈コピー数を感度とした。前述のRPA反応に必要な3つの試薬を加えてもLAMP反応が確認できたため、それらの濃度を可変(RecA:100ng、200ng SSB:500ng、900ng、ATPは75ng固定)してLAMP反応に与える影響について検討した。反応温度についてはLAMP反応での至適温度の63度である。LAMP反応のbuffer、primer、dNTPs、Bst polymeraseは、熱変性HHV-6LAMP法と同様である。SSBが900ngでは、LAMP反応が起きなかった。もっとも感度に優れた組み合わせはLAMP mixtureにRecA:100ngとSSB:500ngとした場合であり、その感度は反応あたり100コピー/反応と熱変性より低い感度であった。LAMP法は、簡易遺伝子増幅法として広く利用されるようになってきたが、primer設計は複雑で高感度検出系の構築には経験と時間を要する。我々は、熱変性工程によって検出感度が上昇することを報告したが、さらなる簡便化のためには熱変性工程以外の手法を検討する必要があった。

そこでLAMP法と他の等温増幅法(recombinase polymerase amplification(RPA)、Helicase dependent amplification(HDA))を組み合わせることで感度が上昇する可能性考えた。昨年度は、RPAに必須の3要素、Recombnase、SSB、ATPを添加しLAMP反応が起こることを確認した。次に前述の3要素をLAMP試薬に添加し、至適条件を設定した。しかし、熱変性LAMP法を上回る感度を得ることができなかった。その理由として、DNA合成酵素であるBst polymerase(LAMP法)、Recombnase(RPA法)それぞれの至適反応温度が異なることが考えられた。そこで、近年報告された他の等温核酸増幅法について検討することを計画した。これは、polymerase spinal reaction(PSA)法と呼ばれリング状基本構造から自己を鋳型として増幅が進行する方法である。LAMP同様に増幅産物の濁度判定も可能、LAMP反応と同一酵素で反応が進行、単純な増幅様式のため増幅基本単位も構築しやすくLAMP反応と組み合わせることが可能と予想した。本年度は、従来から感度改善の必要性が高かったVZVの核酸増幅を目的として、PSR法のprimerを設計、至適温度、Mg濃度などの至適条件を決定、遺伝子増幅感度を従来のLAMP法と比較した。さらに等温増幅で利用可能なE-probe(ダナフォームKK)とPSR法を組み合わせてDNA定量評価法の構築を目指す。水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ORF62領域にPSR primerを設計した。基礎検討としてPSR反応に必要な試薬のうちMg濃度(4mM、6mM、8mM、10mM)、トレハロース(0mM、80mM、100mM、120mM、200mM)の至適濃度について、同一テンプレートを用いて濁度が0.1に達する時間を基準に決定した。さらに至適反応温度(63度、65度、67度)についても決定した。PSR実施上のその他の反応条件は、以下の通りである。10x thermopol buffer, 0.8M betaine, 1.4mM dNTPs,8U Bst polymerase (total 20μl)。サンプル5μlは、LAMP法にてVZV DNA陽性が確認された帯状疱疹患者病変部ぬぐい液で、検体を10-210-4希釈して用いた。Mgの至適濃度は8mM(10-2:1302秒、10-3:1578秒、10-4:1839秒)だった。核酸やpolymeraseを保護,反応阻害物質を吸着するとされているトレハロースは、いずれの濃度でも反応効率に差はなかった。至適温度は、65度(10-2:1329秒、10-3:1554秒、10-4:1824秒)が最も優れていた。
核医学診断におけるがん病変の描出を改善する分割収集法の最適化に関する研究

本研究では、核医学診断におけるがん病変の描出を改善する分割収集法の最適化を目指した。FDG-PET検査における直腸がんを対象とした分割収集法は、従来の連続収集法と比較して分割収集法の方が画質および病変描出能が有意に優れ、臨床的有用性が示唆された。また、胸部動態ファントムを用いて、胸部FDG-PET検査における呼吸運動の影響を受ける肺結節性病変の新しい定量的補正法を導いた。本研究で提案した定量値補正法は、部分容積効果と呼吸運動による肺結節性病変のカウント数の減少を許容範囲の誤差範囲以内で補正することが可能となった。がんの画像診断において、生体機能の評価が可能な核医学検査の有用性が増しているが、信号雑音比の高い良質の核医学画像データを収集するには、分単位の収集時間が必要であり、体動の影響を排除する工夫が求められる。この問題に対処するため、我々は、FDG-PET画像の分割収集法に関する検討を進めてきた。本研究の目的は、核医学検査における分割収集法による画質向上の理由を理論的に解明し、さらに従来法の連続収集法と比較しながら、がん病変の診断に至適な画質の画像を得ることが可能な分割収集法の臨床的有用性を確立し、病期診断成績の改善を図ることである。これまでの研究成果から、FDG-PET検査における静止体を対象とした分割収集画像では、従来法の画像と比較して画質改善効果があり、臨床的な有用性も期待できる。しかし、その画質改善効果の起因となる理論が解明されていないため、基礎実験を中心に画質改善の理論的根拠を検証する。さらに、臨床的有用性を確立するため、実際のがん病変の診断に対して分割収集法を適応し、病変の描出能の有意な改善を確認し、病期診断成績が向上することを証明する。今年度は、核医学検査における分割収集法による画質向上の理論的な解明を進めるとともに、FDG-PET検査におけるがん病変の描出能に対する分割収集法の臨床的有用性について検討した。FDG-PET検査における静止体を対象とした分割収集法では、従来の連続収集画像と比較して得られる画像の画質改善効果があり、臨床的な有用性が期待できる。このため、実際の臨床症例のがん病変の診断に対して分割収集法を適応し、病変の描出能が分割収集法により改善するか否かを検討した。核医学検査における分割収集法による画質向上の理由を理論的に解明し、さらに従来法の連続収集法と比較しながら、がん病変の診断に至適な画質の画像を得ることが可能な分割収集法の臨床的有用性を確立し、病期診断成績の改善を図ることを目的として研究を実施した。前年度までの研究成果から、FDG-PET検査における静止体を対象とした分割収集画像では、従来法の画像と比較して画質改善効果があり、臨床的な有用性も期待できるが、その画質改善効果の起因となる理論が解明されていないため、基礎実験を中心に画質改善の理論的根拠を検証した。具体的に、今年度は、低酸素PETトレーサを用いたPET検査における肺がん病変の描出能に対する分割収集法の臨床的有用性の確立を目指した。先ず、放射線治療の効果は組織内酸素分圧に依存するため、腫瘍の低酸素状態を把握することは重要である。このため、最近、低酸素PET検査が注目されているが、低酸素PETトレーサを用いたPET検査では、低酸素領域とバックグランドの集積比がFDG-PET検査と比較して低いことが知られている。このため、低酸素PET検査において、がん低酸素領域の描出能を分割収集法により改善させて、臨床的有用性を増強させることを目指した。併せて、肺がん病変では呼吸運動による影響を受けるため、各種補正を施すことにより病変描出能および定量性の向上を目指して検討し、新たな定量値補正法を導いた。本研究では、核医学検査における分割収集法による画質向上の理由を解明し、従来法と比較しながら、がん病変の診断に至適な画質の画像を得ることが可能な分割収集法の臨床的有用性を確立することを目指し、病期診断成績の改善を図ることを目的として研究を実施した。前年度までに、今後臨床応用が期待される低酸素PETトレーサを用いたPET検査において低酸素領域の描出能が分割収集法により実際に改善するか検討することを目的し、呼吸運動の影響を受ける肺がん病変に対する各種補正法を開発し、病変描出能および定量性の向上を目指したが、研究環境の変化により満足のいく研究成果が得られなかった。このため、当該年度に実施予定であった、低酸素PETトレーサを用いたPET検査におけるがん病変の描出能に対する分割収集法の臨床的有用性の確立については、低酸素PETトレーサを用いたPET検査において、実際のがん病変の描出能が分割収集法により改善するか否かを検討し、臨床的有用性の確立を目指したが、十分な研究成果を得ることはできなかった。本研究課題は、補助事業期間を当初3年と予定していたが、前年度および当該年度におけるエフォートが、交付申請書に記載した予定と比べて少なかったため、当初計画に遅延が生じたと考える。職場の異動に伴い、交付申請書作成時の研究環境と現在の研究環境に大きな変化が生じ、前年度および当該年度におけるエフォートが、当初計画時と比べて少なかったためと考える。本研究では、核医学検査における分割収集法による画質向上の理由を理論的に解明し、がん病変の診断に至適な画質の画像を得ることが可能な分割収集法の臨床的有用性を確立することを目的として研究を実施した。

これまでの研究成果から、18F-FDG-PET検査における静止体を対象とした分割収集画像では、従来法の連続収集法による画像と比較して画質改善効果があり臨床的な有用性も期待できる。しかし、その画質改善効果の起因となる理論が解明されていないため、基礎実験を中心に画質改善の理論的根拠を検証した。さらに、分割収集法における臨床的有用性を確立するため、実際のがん病変の診断に対して分割収集法を適応し、病変の描出能の有意な改善を確認し、SPECT検査などの単光子放出核種を利用した核医学検査を対象とした研究も展開する予定であった。また、補助事業期間は平成25年度平成27年度の3年間を予定していたが、補助事業期間中に研究実施環境が変化し、本研究課題に対するエフォートが交付申請書に記載した予定と比較して大幅に少ない状況となった。このため、補助事業期間延長承認申請を経て平成25年度平成28年度の4年間で研究を遂行した。しかしながら、本研究課題で予定していた、低酸素PETトレーサを用いたPET検査におけるがん病変の描出能に対する分割収集法の臨床的有用性の確立、およびSPECT検査を含む単光子放出核種を対象とした核医学検査における分割収集法の確立に至るまでの十分な研究成果を得ることはできなかった。本研究では、核医学診断におけるがん病変の描出を改善する分割収集法の最適化を目指した。FDG-PET検査における直腸がんを対象とした分割収集法は、従来の連続収集法と比較して分割収集法の方が画質および病変描出能が有意に優れ、臨床的有用性が示唆された。また、胸部動態ファントムを用いて、胸部FDG-PET検査における呼吸運動の影響を受ける肺結節性病変の新しい定量的補正法を導いた。本研究で提案した定量値補正法は、部分容積効果と呼吸運動による肺結節性病変のカウント数の減少を許容範囲の誤差範囲以内で補正することが可能となった。職場の異動に伴い研究環境に変化が生じたため、交付申請書に記載した研究目的の達成度については、やや遅れていると考えている。このため、次年度は研究に費やす環境を整備し研究目的達成へ向け精進したい。研究補助事業期間を1年延長し、早急に研究環境を整備し、研究課題の目的達成に向けて邁進したい。医歯薬学今後は、PET検査のみならず、SPECT検査を含む単光子放出核種を対象とした核医学検査における分割収集法の確立を目指す。FDG-PET検査におけるがん病変の描出能に対する分割収集法の臨床的有用性について検討するため、実際の直腸癌症例を対象として分割収集法の検討を行った。分割収集FDG-PET検査による分割収集画像では、従来の連続収集画像と比較して病変の描出能や画質が有意に向上し、良好な画質の画像が得られることが示された。このため、本研究により、分割収集FDG-PET検査は、直腸癌所属リンパ節の転移状態の診断成績の改善を図り、病期診断の成績が向上する可能性が示唆された。職場の異動に伴い、交付申請書作成時の研究環境と現在の研究環境に大きな変化が生じ、前年度および当該年度におけるエフォートが、当初計画時と比べて少なかったためと考える。このため、当該年度に予定していた研究結果の取り纏めおよび成果発表の遂行ができなかったことが原因である。研究結果の取り纏めおよび成果発表の遂行に使用する予定である。
新規ウイルスベクター構築に向けた遺伝子間相互作用の解析

本研究は、BmNPV遺伝子発現ベクターの改良を目的として、BmNPVの多角体タンパク質(Polh)高発現に関わる遺伝子間相互作用の解明を目指したものである。本研究では、arif-1(bm12)とpif-2(bm13)間に存在する、Polh発現に大きな影響を与える補完的(補償的)な相互作用に関して興味深い結果を得た。まず、両者に転写制御関係は認められず、また、何らかの機能が予想される共通構造は見出せなかった。そこで、arif-1とpif-2の両遺伝子同時ノックアウト(ダブルKO)ウイルスの表現型に関して詳細に解析した結果、両ウイルス間にウイルスDNA複製阻害は認められないこと、そして、2次感染に必要なウイルス(BV)を産生する機能に問題が生じていることが示唆された。さらに、ウイルス遺伝子を対象としたトランスクリプトーム解析を行った結果、両遺伝子をダブルKOした場合には、必須遺伝子に分類されるlef-2とbm67の発現が強く阻害されることが判明した。lef-2とbm67は、全てのバキュロウイルスで保存されているコア遺伝子であり、それらの単独KOウイルスでは、二次感染能が喪失(あるいは極端に低下)することが知られている。これらの結果から、ダブルKOウイルスでは、lef-2やbm67の発現が抑制された結果、BV産生やGFP発現の大幅な低下が観察されたと推定した。そこで、発現低下が安定して観察されたlef-2に着目して、この仮説を検証するためのレスキュー実験を行った。その結果、lef-2を1コピー導入することで、ダブルKOで大きく低下したウイルスの増殖能(Polh発現能)が、野生型と同等まで回復することが判明した。以上の結果から、非必須遺伝子であるarif-1とpif-2は、少なくとも必須遺伝子であるlef-2の十分な発現を実現するための制御において補償的に機能していると結論づけた。28年度が最終年度であるため、記入しない。バキュロウイルスは感染した宿主細胞核内に大量の多角体タンパク質(Polh)を産生する。この特徴を利用したバキュロウイルス発現ベクターが広く用いられているが、そのなかでもカイコ個体とBmNPVを用いた発現系は、真核細胞では最も効率の良いタンパク質発現系として知られている。Polhの高発現にはウイルス遺伝子間の複雑な相互作用が関係していると考えられるが、詳細は不明である。したがって、今後更に有用なBmNPVベクター系を開発するためには、ウイルスの増殖過程に組み込まれたPolhの高発現に関わる遺伝子間相互作用の解明が不可欠であると考えた。そこでBmNPVのPolh高発現に関わる非必須遺伝子間の相互作用の解明を目指し、本年度は遺伝子間相互作用のモデル構築とその検証、bm32bm38間におけるウイルス増殖のロバストネス構造の解明、について主に進めてきた。作製した組換えウイルスは全てPolh遺伝子を緑色蛍光遺伝子(GFP)に置き換え、Polh発現の指標として用いている。BmNPV感染細胞のRNAseqから予測されたウイルス遺伝子間ネットワークの検証を行うため、過剰発現によりPolh発現の亢進が予測される5遺伝子を選定し、GAL4-UASシステムによりそれら5遺伝子を過剰発現するウイルスを作製した。さらに、bm32bm38の7つの非必須遺伝子のうち、どの遺伝子の組み合わせがウイルス増殖に致命的な影響を及ぼすのかを調査するため、この7遺伝子を含む領域において様々な組み合わせのノックアウトウイルスを12種作製した。作製したウイルスの中には感染拡大がおこらないものやPolh発現量が極端に減少するものが存在し、特定の非必須遺伝子の組み合わせがPolh発現やウイルス増殖に大きな影響を及ぼすことが示唆された。本研究ではBmNPV遺伝子発現ベクターの改良を目的として、BmNPVの多角体タンパク質(Polh)高発現に関わる遺伝子間相互作用の解明を目指している。特にBmNPVの非必須遺伝子間の相互作用の解明を目指し、1遺伝子間相互作用のモデル構築とその検証、2arif-1(bm12)とpif-2(bm13)間に存在する補完的な相互作用の詳細解明、3bm32bm38におけるウイルス増殖のロバストネス構造の解明、の3つのアプローチで研究を行うこととし、まずは、12に焦点を当てて研究を進めている。1については、昨年度はRNAseqから予測されたPolh発現に関わるウイルス遺伝子間ネットワークモデルに基づき、Polh発現に影響を与えると推定された遺伝子をGAL4-UASシステムを用いて過剰発現する組換えウイルスを5種類得た。今年度はそれらのウイルスをBmN細胞にトランスフェクションし、それぞれの遺伝子の転写量とPolh遺伝子プロモーターの制御下に置いたGFPの発現量(蛍光強度)を調査した。その結果、過剰発現により多角体遺伝子の発現に明瞭な影響を与えない遺伝子と、過剰発現が多角体遺伝子の発現上昇あるいは現象に影響を及ぼす遺伝子が明らかになった。2については、昨年度arif-1とpif-2がお互いの転写に影響を与えている可能性を考え解析を行ったが、両者に転写制御関係は認められなかった。そこで今年度は2遺伝子産物の1次構造(アミノ酸配列)の比較を行い、arif1とpif2のアミノ酸配列の中間部分に類似領域が存在することを発見た。この類似領域と両遺伝子間の機能的補完性について調査するため、その部位にアミノ酸変異を導入した組換えウイルスを作製した。本年度は、ウイルス遺伝子間ネットワークモデルに基づき、昨年度に作製した組換えウイルスを用いてウイルス遺伝子の人為操作によるPolh発現量のコントロールを試みた。作製した組換えウイルスの解析から特定の遺伝子の過剰発現が多角体

遺伝子の発現にポジティブあるいはネガティブに影響を与える遺伝子が明らかとなってきたことから、本ネットワークの遺伝子相互作用に関する詳細な解析とネットワークの人為操作の実現に一歩前進したと言える。また、arif-1(bm12)とpif-2(bm13)間に存在する補完的な相互作用の解明に関しては、arif1とpif2間に転写段階での相互制御関係が認められなかったことから、両者によるロバストネスの構造を理解するためには両遺伝子産物の機能解析が必要となった。その様な状況下、両産物の1次構造解析においてアミノ酸配列に類似構造を見いだし、その構造の機能的意義を解析するための組換えウイルスを完成させた。本研究は、BmNPV遺伝子発現ベクターの改良を目的として、BmNPVの多角体タンパク質(Polh)高発現に関わる遺伝子間相互作用の解明を目指したものである。本研究では、arif-1(bm12)とpif-2(bm13)間に存在する、Polh発現に大きな影響を与える補完的(補償的)な相互作用に関して興味深い結果を得た。まず、両者に転写制御関係は認められず、また、何らかの機能が予想される共通構造は見出せなかった。そこで、arif-1とpif-2の両遺伝子同時ノックアウト(ダブルKO)ウイルスの表現型に関して詳細に解析した結果、両ウイルス間にウイルスDNA複製阻害は認められないこと、そして、2次感染に必要なウイルス(BV)を産生する機能に問題が生じていることが示唆された。さらに、ウイルス遺伝子を対象としたトランスクリプトーム解析を行った結果、両遺伝子をダブルKOした場合には、必須遺伝子に分類されるlef-2とbm67の発現が強く阻害されることが判明した。lef-2とbm67は、全てのバキュロウイルスで保存されているコア遺伝子であり、それらの単独KOウイルスでは、二次感染能が喪失(あるいは極端に低下)することが知られている。これらの結果から、ダブルKOウイルスでは、lef-2やbm67の発現が抑制された結果、BV産生やGFP発現の大幅な低下が観察されたと推定した。そこで、発現低下が安定して観察されたlef-2に着目して、この仮説を検証するためのレスキュー実験を行った。その結果、lef-2を1コピー導入することで、ダブルKOで大きく低下したウイルスの増殖能(Polh発現能)が、野生型と同等まで回復することが判明した。以上の結果から、非必須遺伝子であるarif-1とpif-2は、少なくとも必須遺伝子であるlef-2の十分な発現を実現するための制御において補償的に機能していると結論づけた。RNAseqから推測されたネットワーク検証のために必要な組換えウイルス(GAL4-UASを利用した遺伝子過剰発現ウイルス)の作製が完了し、その解析結果が得られてきている。さらに非必須遺伝子の組み合わせた遺伝子欠損ウイルスを新たに十数種作製し、それらについても解析が進んでいることから、順調に進展していると言える。
民主主義のディスコースと表象:文化人類学的研究

2ヶ年にわたる本研究プロジェクト実施の結果,以下の諸点について予定の進捗をみた。1.本年度は,とくに政治家,知識人による民主主義をめぐる言説のあり方について,文献資料収集と研究討議(本学で3回,東京で2回)を行った。2.日本を含むアジア・太平洋諸社会のうち,スリ・ランカ,フィリピン,ハワイ,マレーシア,シンガポール等の諸社会で,民主主義がどのように捉えられ,理解されているのか,民主主義の言説のあり方についての基礎資料の収集が円滑に行われた。こうした資料はこれまで集中的に検討の対象となったことは殆どなく,今後の研究展開に資すると期待している。3.民主主義の問題はこれまで政治学の専門領域として研究されてきたが,今日情報化とグローバル化のなかで,民主主義が文化・社会環境を異にする非西欧社会にどう根付くかが大きな論議を呼んでいる。その点本研究が着目した,文化的側面からの検討は,民主主義が文化の境界を越えて,間文化的なシステムとして拡がりゆくための,諸条件および個別文化との関わりについて,より総合的な視点を構築する手がかりを得た。4.もとより民主主義の本格的な研究は超領域的に行う必要がる。本研究プロジェクトの実施によって国内・外の他分野の研究者との協力体制が緒に着いたことも成果のひとつである。5.蓄積された研究資料のさらなる分析と検討については現在進行中であり,国外の研究協力者の参加も得て,1998年6月に「アジアにおける文化と民主主義」シンポジウム(於札幌)を計画中である。平成8年度の研究では、民主主義のディスコースと表象について、以下の3点を中心とした。1)日本を含めたアジア諸社会において、またアジアと西欧のあいだで、民主主義がどう語られ、表象されているか、その代表的な言説(政策、政治家の演説テクスト、知識人の意見、学術研究、マス・メディアの表現など)について文献資料調査を行った。文化と民主主義をめぐる言説、たとえばある特定の文明・文化は民主主義実現の阻害要因となるとする説(S.ハンチントン)、あるいは西欧流の民主主義はアジアの伝統に馴染まぬとする説(リ-・クワン・ユ-)など、文化と民主主義をめぐる言説にとくに注目し、国内の大学、研究機関において、内外の文献資料調査を行い、おおよその基礎資料を整備した。映像、文芸作品等に表象される民主主義については、研究の端緒をつけたが、第二年度さらに継続する。2)当該社会における、民主主義に関連する自由、人権、公正、平等などの諸概念についての文献資料調査に着手した。この点に関してはさらに第二年度継続する。3)民主主義の概念についての内外の識者との集中的インタヴューに関しては、さまざまな機会を利用して実施しており、国内の研究者および日本を訪れたアジアの知識人を対象として約15人から意見を聴取した。以上の研究を遂行するにあたり、国会図書館、東京大学東洋文化研究所等で文献資料調査を行い、またその機会を利用して識者との集中的インタヴュー調査を実施した。また札幌では、地元研究者(他学部、他分野)との研究会を随時開くとともに(5回)、諸分野の専門家を招請し、年度のまとめを行っている。文献資料の整理、コンピュータ入力、および研究成果の蓄積については調査補助者を雇用し、所期の目的を達成している。2ヵ年にわたる本研究プロジェクト実施の結果、以下の諸点について予定の進捗をみた。1.本年度は、とくに政治家、知識人による民主主義をめぐる言説のあり方について、文献資料収集と研究討議(本学で3回、東京で2回)を行った。2.日本を含むアジア・太平洋諸社会のうち、スリ・ランカ、フィリピン、ハワイ、マレーシア、シンガポール等の諸社会で、民主主義がどのように捉えられ、理解されているのか、民主主義の言説のあり方についての基礎資料の収集が円滑に行われた。こうした資料はこれまで集中的に検討の対象となったことは殆どなく、今後の研究展開に資すると期待している。

3.民主主義の問題はこれまで政治学の専門領域として研究されてきたが、今日情報化とグローバル化のなかで、民主主義が文化・社会環境を異にする非西欧社会にどう根付くかが大きな論議を呼んでいる。その点本研究が着目した、文化的側面からの検討は、民主主義が文化の境界を越えて、間文化的なシステムとして拡がりゆくための、諸条件および個別文化との関わりについて、より総合的な視点を構築する手がかりを得た。4.もとより民主主義の本格的な研究は超領域的に行う必要がある。本研究プロジェクトの実施によって国内・外の他分野の研究者との協力体制が緒に着いたことも成果のひとつである。5.蓄積された研究資料のさらなる分析と検討については現在進行中であり、国外の研究協力者の参加も得て、1998年6月に「アジアにおける文化と民主主義」シンポジウム(於札幌)を計画中である。
腫瘍に対する免疫監視機構におけるDNAM-1の機能の解明

DNAM-1(CD226)は、細胞傷害性T細胞およびNK細胞などのキラーリンパ球に強く発現しており、腫瘍細胞などに発現するリガンド(CD155およびCD112)を認識して接着し腫瘍細胞に細胞傷害を誘導する。本研究では、腫瘍に対する免疫監視機構におけるDNAM-1の機能を明らかにするため、DNAM-1遺伝子欠損マウスを用いて腫瘍モデルを検討した。その結果、メチルコラントレン25μgを皮下に接種するとDNAM-1遺伝子欠損マウスでは腫瘍の発生率が亢進し、生存率が低下することを見出した。このことから、キラーリンパ球に発現するDNAM-1は、腫瘍発生に対する免疫監視機構において重要な役割を有することを明らかにした。【目的】DNAM-1は細胞傷害性T細胞およびNK細胞に強く発現しており、腫瘍細胞などに発現するリガンド(CD155またはCD112)を認識して接着し、腫瘍細胞に細胞傷害を誘導する。本研究では腫瘍に対する免疫監視におけるDNAM-1の機能を明らかにするため、DNAM-1欠損マウスを用いて解析した。【方法・結果】化学癌誘発剤(メチルコラントレン: MCA)による腫瘍の発生に対する免疫監視機構におけるDNAM-1の機能について検討した。MCA25μgを皮下に接種すると、DNAM-1欠損マウスでは腫瘍の発生率が野生型マウスと比較して有意に亢進し、生存率が低下することを明らかにした。【研究意義】DNAM-1は腫瘍の発生に対する免疫監視機構において重要な役割を有することが示された。【研究目的】DNAM4-1は、細胞傷害生T細胞およびNK細胞などのキラーリンパ球に強く発現しており、腫瘍細胞などに発現するリガンド(CD155またはCD112)を認識して接着し、腫瘍細胞に細胞傷害を誘導する。本研究では、腫瘍に対する免疫監視におけるDNAM-1の機能を明らかにするため、DNAM-1遺伝子欠損マウスを用いて腫瘍モデルを検討した。【方法・結果】野生型およびDNAM-1遺伝子欠損マウスにメチルコラントレンを接種してメ1ラノLマを誘導し、腫瘍発生に対する免疫監視機構におけるDNAM-1の機能について検討した。その結果、メチルコラントレン25μgを皮下に接種するDNAM-1遺伝子欠損マウスでは腫瘍の発生率が充進し、生存率が低下することを見出した。また、DMBAを400g皮膚に塗布することでパピローマを誘導した結果、DNAM-1遺伝子欠損マウスでは生存率が低下することを見出した。メチルコラントレンで誘導した腫瘍組織におけるDNAM-1リガンドの発現をリアルタイムPCRで定量したところ、DNAM-1遺伝子欠損マウス由来の腫瘍において有意に発現が充進していた。このことは、DNAM-1は腫瘍化することで発現が元進するDNAM-1リガンドを認識して腫瘍排除に働くことを示唆している。【研究意義】キラーリンパ球に発現するDNAM-1は、腫瘍発生に対する免疫監視機構において重要な役割を有することを示した。
腫瘍組織の低酸素状態をTc-99m標識化合物によって評価する方法の開発

本研究は、Tc-99m標識化合物、Tc-99m-HL-91がTc(テクネチウム)の特殊な酸化/還元状態を反映して、低酸素の状況では安定性が高く、集積性が高い事を利用して、組織内部の酸化還元の状態をTc-99m-HL-9の集積状態から測定することを目的としたものである。実験はヒトの腫瘍(胃癌、大腸癌、肺癌、類上皮癌)を植えたマウスについて行い:(1)Tc-99m-HL-91を投与後、組織切片を用いてTc-99mの組織内分布をオートラジオグラフィにて検討し、さらに切片をHE染色により、生存の部分と壊死の部分とを判別した結果、集積と組織の低酸素状況とが一致する(生存部分と壊死部分との境界領域に非常に強いTc-99m-HL-91の集積を認める)ことを確認した。(2)腫瘍に酸素分圧プローブを挿入して酸素分圧を測定した結果、腫瘍内の酸素分布とTc-99m-HL-91のそれとの間に有意な相関を認めた。以上の結果から、Tc-99m-HL-91を用いたイメージングは腫瘍の低酸素を非侵襲的に評価できる方法として有望であることが示された。
幼児・児童の感情言及と関係調整プロセス：他者理解への道筋を探る

本研究の主目的は、日常的な社会的場面での幼児・児童の自他感情言及とそれに伴う関係調整のプロセスの検討を通じ、同時期の他者理解の発達プロセスを探ることである。今年度は、特に、以下の点について検討を進めた。1幼児を対象とした検討幼稚園での観察・プロトコル化を進めるとともに、親密な仲間間にみられる感情言及の対人機能の発達プロセスについて検討した。2コホートの幼稚園児の3年間の縦断的データに基づき、ポジティブな感情語(「おもしろい」・「楽しい」)の機能及び、それらが関係構築にどのように寄与しているかという点に着目し、分析を行った。その結果、それらの感情言及の機能の発達プロセスには発達的共通性がみられ、幼稚園期を通じて、彼らの関係構築に有意義な役割を果たしていることが窺えた。他方で、同機能には、グループに応じた固有性もみられた(発達心理学研究、2019、第30巻1号、pp.44-56)。本結果は、社会的文脈における幼児期の感情言及を通じてみられる感情コンピテンスの発達や、「心の理論」の個人差に関わる示唆につながる重要な成果といえる。このほか、ある子どもの〈意図的ではないとみられる行動〉が原因で生じた(原因がわかりにくい)葛藤状況において、4歳クラス児が前期から後期にかけ、話題の転換や、軽口などを挟みながら解決していく様相を捉え(日本教育心理学会第60回総会、2018)、それをふまえる中で、園の仲間遊びにおいて、幼児がいかに遊戯的にネガティブ感情語に言及するかについて、さらに検討を進めた(日本発達心理学会第30回大会、2019)。2児童を対象とした検討高学年(6年)学級の話し合い活動の観察データについて、担任教員への確認を行いながら、プロトコル化を含む基礎データの作成を完了した。現在葛藤調整等に関わる予備分析を行っており、次年度にかけて焦点的な検討を行っていく予定である。今年度は昨年度から引き続き、日常場面での感情言及と関係調整に関わるデータを得るための、園・学校での観察とそのプロトコル化、およびそれらの分析を軸に検討を進めた。現段階までの研究成果のうち、本研究課題と大きく関わる、社会的文脈における親密な仲間間の感情言及(「おもしろい」・「楽しい」)がもつ対人機能についての研究成果が公刊された(発達心理学研究、2019、第30巻1号、pp.44-56)。同研究は、今後の本研究の展開に繋がる重要な基盤となるといえる。また、2018年5月2019年3月にかけての学会発表(日本保育学会第71回大会、日本教育心理学会第60回総会、日本発達心理学会第30回大会)では、有意義な研究交流が可能となり、遊びの中で引き起こされるポジティブ情動や、それに関わる言及が関係調整に果たす役割等について議論を深め、新たな分析の視点を得ることができた。次年度にかけて、これらをもとに分析や論文作成を進めていく予定である。小学校での観察データについては、担任教員からの助言も逐次得ながら、プロトコル化とフィールドノートの照合を進め、ほぼ完了することができた。それをもとに現在、どのような葛藤調整が行われているかを含め、予備分析を行っている。さらに、次年度の低学年の観察に向け、現在学校との調整を行っているところである。また、これまでに得られた未分析の家庭観察のデータについても現在分析が進んでおり、今後研究報告を行っていく予定である。また、予備分析として、大学生を対象に小学生期(小学校後半46年生頃)の夕食時の家族の会話への参加者としての,家族メンバーの様態及び,話題等について尋ね、検討を行った。総じて、当初の研究目的に沿った研究の進行は概ね順調になされているといえる。今後は、幼稚園での観察について、足りないデータを補完すること等もふまえ、継続して行っていくとともに、プロトコル化が済んでいないデータについて、同作業を進めていく。さらに、これまでに蓄積された園での観察データも含めて、学会での討議等で得られた内容をふまえ、逐次論文としてまとめていく予定である。小学校のデータについては、プロトコル化が完了している高学年のデータについて、予備分析・本分析を行い、本研究課題に関わる検討を進めていく。また、観察については、今後は低学年を対象に進めていくことを予定している。さらに、現在分析中の家庭観察データ(三世代)も含め、得られた研究成果については、日本発達心理学会や、日本教育心理学会、等において逐次報告し、意見交換を積極的に行っていく予定である。こうしたことを通じて、園・学校・家庭場面での感情言及と関係調整に関する研究をより深め、幼児・学童期の社会的文脈における他者理解のプロセスについて明らかにしていきたいと考えている。本研究の主目的は、『幼児・児童期の他者理解』について、日常的な社会的場面での彼らの自他感情言及とそれに伴う関係調整のプロセスを通じて発達的な検討を行うことである。1幼児を対象とした検討本年度は、幼稚園での横断的・縦断的観察及び、そのプロトコル化、関連文献の収集や参照を行いながら、幼児のポジティブ・ネガティブ感情言及を伴うやりとりの様相について検討を進めた。本年度は特に、「心の理論」等の変化期にあたる、4歳クラス児に焦点をあて、(過去の仲間同士の経験もふまえた)

仲間同士の葛藤解決におけるやりとりや(日本保育学会大会、2017)、ある子どもの〈意図的ではないとみられる行動〉が原因で生じた(原因がわかりにくい)葛藤状況での関係調整(日本発達心理学会、2018)、さらに、遊びの中で4歳児が仲間同士でポジティブ感情を共有する様相(日本心理学会大会シンポジウム(「遊びとは?改めて問い直す」)、2017、指定討論者)について研究報告や討論を行った。それらの報告では、4歳クラス児が、ポジティブ・ネガティブ感情を共有し、葛藤調整や関係の調整に向けて感情言及を伴う多様なやりとりを行っている様相やその重要性について指摘した。現在は、これらをさらに展開して検討を進めている。2児童を対象とした検討本年度は、児童間の話し合い場面での感情言及を伴うやりとりについて検討を行うために、高学年(6年)学級の話し合い活動の観察データについて、プロトコル化を進めた。同時に、初期のデータの予備分析を行い、初期の児童間の自主的な話し合いにおける様相(進行そのものの難しさ)について、日本教育心理学会(2017)で報告した。今後プロトコル化がさらに進むことで、児童間の葛藤調整等を含む本課題のテーマについてより焦点的な検討を行うことができると考えられる。今年度は初年度ということもあり、国内外の資料収集を幅広く行うとともに、本研究の目的である、日常場面での幼児・児童の感情言及と関係調整に関わるデータを得るために、園・学校での観察とそのプロトコル化、およびそれらの予備分析を軸に検討を進めた。現段階までに得られた成果の一部は、論文報告(千葉大学教育学部紀要、第66巻1号、2017)や2017年5月2018年3月にかけての学会発表(日本保育学会第70回大会、日本心理学会第81回大会、日本教育心理学会第59回総会、日本発達心理学会第29回大会)を通じて発信することができた。学会での討議では、幼児間の遊びや児童間の話し合いの中での感情言及と関係調整に関わる今後の分析に向けた有意義な研究交流が可能となった。また、日本心理学会第81回大会では、公募シンポジウム(中野茂企画代表者、「遊びとは?」ー改めて問い直すー」)において指定討論者として討議を行う機会を得、遊びが引き起こすポジティブ情動等についてより幅広い視野から新たな視点を得ることができた。現在、そうした討議の内容もふまえながら、データの検討を進めている。なお、観察の施行についても、現在、順調に園での観察を続行中で、データが一定数蓄積されてきている。一方、小学校の観察データについては、プロトコル化を順次進め(現在7割程度完了、残りは続行中)ており、完了した段階で、より本課題の目的に焦点化した分析が可能となる予定である。また、これまでに得られた未分析の家庭観察のデータについても予備的な分析が進んでいる。これらについても今後研究報告を行っていく予定である。これらのことから、当初の研究目的に沿った研究の進行は概ね順調になされているといえる。本研究の主目的は、日常的な社会的場面での幼児・児童の自他感情言及とそれに伴う関係調整のプロセスの検討を通じ、同時期の他者理解の発達プロセスを探ることである。今年度は、特に、以下の点について検討を進めた。1幼児を対象とした検討幼稚園での観察・プロトコル化を進めるとともに、親密な仲間間にみられる感情言及の対人機能の発達プロセスについて検討した。
CO2取込機構を有するフェノール類環状オリゴマーを組み込んだ高性能分離膜の創成

膜素材の中で高分子膜は製膜性・生産性・経済性・高速透過性といった多くの利点をもちながらも、無機膜に比べ分離性が低い欠点をもつ。そこで、CO2ガスを捕捉する環状オリゴマーを組み込んだガス分離膜を見出し、この欠点を克服する。本研究では耐熱・耐水性に優れ、CO2取込構造をもつフェノール類の環状オリゴマーを用いた、膜厚50μm以下のガス分離薄膜を開発する。具体的には、i)フェノール類環状オリゴマーを高分子膜体中へ均一分散した高分子膜、ii)フェノール類環状オリゴマーをエチルエステル化等により化学修飾した分離膜、iii)化学修飾したフェノール類環状オリゴマー薄膜を炭化させた炭素膜、の3種類の分離膜を研究する。
ＲＮＡヘリケースＭＯＶ１０によるＮＦｋａｐｐａＢの負の制御の解析

MOV10は強発現によりNFκBを負に制御することを確認したが、発現を低下させることではNFkappaB活性に影響しないことが判明したため、他の候補分子であるCKIP-1の解析を開始した。CKIP-1はCARMA1と結合し、PKCthetaとCARMA1との相互作用を阻害することでPKCtheta-CBM-NF-κB signalingを抑制することが認められた。CKIP-1は、NFkappaB活性を定常状態に維持したり、不適切なシグナルによってT細胞が活性化することを防いだりすることで、適切なシグナル伝達のためのgatekeeperのような役割を果たしていると予想される。2CKIP-1の同定と機能解析:レンチウイルスライブラリーを用いたスクリーニングより、我々がすでに得ているNF-kappaBが恒常的に活性化している遺伝子変異導入細胞株においてNF-kappaBの活性が非活性化する遺伝子CKIP-1を昨年度同定した。本年度はこの遺伝子に対する機能解析を行った。CKIP-1分子はT細胞においてPMAやPKCthetaの刺激によるNF-kappaBの活性化を抑制していた。またこの分子はCARMA1と結合しており、その結果上流の分子であるPKCthetaとの結合と競合することが判明した。またCARMA1のCC domainとCKIP-1のPH domainが両者の結合に必要であり、CKIP-1のPH domain欠損分子はCARMA1と結合できずNF-kappaBの抑制効果もないこともわかった。この分子のNF-kappaBに対する役割は未だ報告されておらず、NF-kappaBの新規の抑制因子と考えられた。現在これらCKIP-1の解析結果をまとめ投稿中である。3新規NF-kappaB抑制因子の同定:上記CKIP-1以外にもレンチウイルスベクターライブラリーによるスクリーニングより同定された候補遺伝子があり、今後これらの分子の解析も進めていく予定である。MOV10に対してはNFkappaBの活性を抑える効果があることを確認するも、その機序に関しては残念ながら解明できませんでした。研究実施計画書でうまくいかなかった場合として、cDNAライブラリーを用いた実験によるスクリーニングの結果、新たにCKIP-1という分子が候補にあがり、この分子におけるNFkappaB抑制機序の研究を行った。CKIP-1はCARMA1と結合し、PKCthetaとCARMA1との相互作用を阻害することでPKCtheta-CBM-NF-kappaB signalingを抑制することが認められた。CKIP-1のPleckstrin homology (PH)domainが、CARMA1との結合においても、またNF-&#61547;B抑制効果においても必要であった。CKIP-1は、TNFalfaにより誘導されるNF-kappaB活性は抑制せず、CD3単独やPMA、PMA/CD28により誘導されるNF-kappaB活性を抑制する一方、CD3/CD28共刺激により誘導されるNF-kappaB活性を抑制しなかった。その機序としてCD3/CD28共刺激の際は、CKIP-1の細胞内局在が変化しCARMA1と結合できなくなり、NF-&#61547;B活性への抑制効果を示せないことが明らかとなった。CKIP-1は、NF-&#61547;B活性を定常状態に維持したり、不適切なシグナルによってT細胞が活性化することを防いだりすることで、適切なCD3/CD28シグナル伝達のためのgatekeeperのような役割を果たしていると予想された。以上の知見は第75回日本血液学会学術集会で報告したとともにPLOS One 2014Jan 17;9(1):e85762に論文が掲載された。(1)MOV10低発現細胞株の作成と検討;shRNA用レンチウイルスベクターにMOV10shRNAを組み込みウイルスを作成しJurkat T細胞株に感染させた。感染後限界希釈法により単一クローンとなったJurkat細胞のMOV10発現をウエスタンブロット(WB)法にて検出し、MOV10の発現が低下しているクローンを単離した。次に単離した細胞株におけるNFκBの活性化を検討した。MOV10の発現が正常のJurkat細胞と低発現細胞株をそれぞれCD3/28にて刺激しIκBαのリン酸化、発現量をWBにて比較したところ、両細胞間において刺激に対する反応に違いが認められなかった。κBプロモーター下で制御されたルシフェラーゼアッセイにおいても両細胞間でNFκBの活性化に違いが認められなかった。以上の結果よりMOV10はBcl10と結合するもののNFκBの制御にはかかわっていないことが分かりMOV10に関するこれ以上の実験は断念した。(2)レンチウイルスcDNAライブラリーによるスクリーニング;うまくいかなかった場合の対処として記載していた、レンチウイルスライブラリーを用いた計画を開始した。NFκBが常時活性化している遺伝子変異導入細胞株に対しレンチ

ウイルスベースのcDNAライブラリーを導入し、NFκBが非活性化するような遺伝子を検索した。(3)CKIP-1の同定と機能解析;スクリーニングの結果、NFκBを負に制御する遺伝子候補が見つかった。そこで候補遺伝子のsiRNAを作成し、Jurkat細胞に導入しNFκBの状態を検索したところ、数種類のsiRNAでNFκBの上昇が認められたためそのうちの一つであるCKIP-1に注目して研究を進めることとした。まずJurkat細胞株にCKIP-1を導入しCD3/28にて刺激したところ、CKIP-1によりNFκBの抑制が認められ負に制御している事が示唆された。MOV10の解析に関しては問題があり研究の進行が遅延していたが、CKIP-1の同定後は我々の保有する分子細胞学的実験技術により解析が進み、現在論文投稿中である。MOV10分子がNFκBの制御に関わっていないことが判明したため、年度途中よりレンチウイルスcDNAライブラリーを用いるスクリーニングを開始した。レンチウイルスcDNAライブラリーはあらかじめウイルスを作成し準備していたため、すぐにスクリーニングを開始することができた。恒常的にNFκBが活性化している細胞株に対し、NFκBが定常状態に戻ったクローンを単離し、組み込まれたcDNAの配列を読むことによりCKIP-1が同定できた。この間のスクリーニングが比較的順調に出来たため、結果的に時間のロスは最小限に抑えられ、同年度内にCKIP-1の解析を開始することができた。まずはCKIP-1に関する論文を掲載に向け指摘された追加実験をしていく予定である。CKIP-1に関しては、上流にあると推測されるAKTやCK2のリン酸化モチーフの点変異体を用いた研究、confocal microscopyによる細胞内分布の刺激による変化などを研究していく予定である。またNFkappaBの抑制因子候補の研究も分子細胞学的手法を用いて解析していく予定である。MOV10の検討をあきらめ、当初の研究計画を変更することとなったが、NFκBを負に制御する新規分子としてCKIP-1を同定することができたため、この分子の検討を進めていくこととする。既に過剰発現においてCKIP-1はNFκBを負に制御することが判明したため、次にCKIP-1 shRNAを作成しCKIP-1低発現Jurkat T細胞を作成し、T細胞受容体刺激後のNFκBの活性化を検討する。またCKIP-1がT細胞におけるNFκBの活性化のどの段階で働いているかを検討する。CKIP1とシグナリングコンポーネントの各段階の活性化変異体を共発現しNFκBの解析を行うことにより、CKIP-1がどの段階で働いているかを解析する。解析の結果、CKIP-1との結合パートナーが判明した場合、結合部位などの解析を共免疫沈降法を用いて検討することとする。
りん核磁気共鳴法による筋収縮蛋白質の反応中間体の立体構造の研究

ミオシンは筋肉の収縮タンパク質であり、そのATPア-ゼ活性は筋肉における化学エネルギ-の力学エネルギ-へのエネルギ-変換過程の主要な部分を占める。本研究では、ミオシンATPア-ゼ反応中間体における立体構造および相互作用について新しい知見を得るために、ミクロ環境および相互作用のよいプロ-ブである核磁気共鳴法(NMR)を用いて測定を行った。ウサギ骨格筋から単離精製したミオシンをキモトリプシン処理して得られたサブフラグメント1(S1)について、MgーATPア-ゼとCaーATPア-ゼの活性を測定して十分に生理活性のよい標品が得られることを確認した。そのようなS1を用いて、NMR試料管中でATPア-ゼ反応を行ったが、複合体の燐NMRシグナルは観測されなかった。おそらく、ATP加水分解反応が速く、NMR測定に必要なだけの寿命をもっていないことによると考えられる。引き続き、ATP加水分解反応が骨格筋ミオシンよりも遅いトリ筋胃ミオシンについて、S1の作成法から検討しており、ミオシンATPア-ゼ反応中間体シグナルそのものの観測は今後の課題である。また、ATPのアナログであるADPとS1との複合体形成を0^゚Cから25^゚Cまでの種々の温度で測定した。その結果、高温では複合体のシグナルが観測されるのに対し、温度を下げていくと複合体のシグナルは線幅が変わらずに強度のみが弱くなっていき、5^゚Cでは観測されないことが明かとなった。これは、S1ーADP複合体には高温型と低温型の2種類の立体構造があるとして説明される。また、高温型複合体では、ADPの燐酸のまわりの電子状態が比較的等方的に分布するのに対して、低温型複合体でてはS1のアミノ酸残基がADPの燐酸と強く相互作用するために燐酸のまわりの電子が異方性をもって分布していると考えられる。ミオシンは筋肉の収縮たんぱく質で、そのATPase活性は筋肉における化学エネルギ-の力学エネルギ-へのエネルギ-変換過程の主要な部分を占める。本研究では、ミオシンATPase反応中間体における立体構造および相互作用について新しい知見を得るために、ミクロの環境および相互作用のよいプロ-ブである核磁気共鳴法(NMR)を用いて測定を行った。これまでに、ウサギ骨格筋からミオシンを単離精製して、それをキモトリプシン処理してサブフラグメント1(S1)を得て、それらのMg-ATPaseとCa-ATPaseの活性を測定することによって十分に生理活性のよい標品が得られることを確認した。そのようなS1を用いて、ADPとの複合体形成を0°Cから25°Cまでの種々の温度において、燐NMRを用いて測定した。その結果高温では複合体のシグナルが観測されるのに対して、温度を下げていくと複合体のシグナルは線巾が変わらずに強度のみが弱くなっていき、5°Cでは観測されないことが明らかとなった。このことは、S1-ADP複合体には高温型と低温型の2種類の立体構造があるとして説明される。また、高温型複合体においては、ADPの燐酸のまわりの電子状態が比較的等方的に分布するのに対して、低温型複合体においてはS1のアミノ酸残基がADPの燐酸のまわりに異方性をもって強く相互作用して分布していると考えられる。また、以上の測定に併行して、ATPの非水解アナログであるAMP・PCPとS1との複合体形成について測定を行い、ATPを用いた速度論的測定の予備的研究に着手した。さらにニワトリ砂のうミオシンの精製についても着手した。