hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極域におけるオゾンの輸送機構の研究

昭和基地に於て1988年2月に開始された地上オゾン濃度連続観測データの解析を行い、冬(7月)に最高、夏(1月)に最低という顕著な季節変化を示すこと、この季節変化に重畳した数週間程度の不規則な変化が見られること、8月半後から9月の間のかけて濃度が数日にわたって極端に低下する現象が見られること、等の事実を見いだした。昭和基地におけるオゾン全量、鉛直分布の観測データ、TOMSによるオゾン全量水平分布のデータから1993年の南極オゾンホールは過去最大と言われた1992年と同様の最大規模であったことが確認された。ハレーベイ基地では100DU以下が観測されている。但し、ホール-極渦-の形が極端に歪んでいたため、極渦の周辺にある昭和基地では10月11日、一担はこれまでの最低値を更新し139DUを示したものの、変動が大きく、月平均値としては9月、10月も92年には及ばぬ値となった。南極昭和基地およびゲオルグフォスター基地での長年のオゾンゾンデ観測結果の詳しい解析を行い、極域成層圏の状態が時期により変化していることが分った。1966年から92年までの間の前半では成層圏上部で熱帯成層圏のQBO(準2年振動)に対応する2年振動力がよく発達し、後半は成層圏下部で2年振動が発達していた。1986年以降70hapa高度では、10月平均オゾン温度が高めの年はQBOは西風、オゾン濃度が低目の年QBOは東風であった。オゾン濃度の変化が、高度により、化学により支配されている部分、力学的影響を強く受けている部分、そして火山噴火等のエアロゾルの影響を強く受けている部分があることが明らかになった。大気大循環モデルによる解析から、パッシブトレーサーの輸送が調べられ、南極大陸上空では成層圏から対流圏への下向き輸送が起っているらしいことを示す結果が得られた。対流圏オゾンについては、地上オゾン観測データに見られる春季の急減現象を追跡した。南極に加え新しく始った北極域スバールバル、ニーオルスンの観測データからも、3月末から4月、5月にかけてオゾンの急減現象が見られ、南極、北極の相似性、太陽光との関連、が示唆された。本研究は、オゾンの変動をもたらす要因が様々ある中で、大気の運動による効果、即ち輸送過程を解明することを中心課題としている。3年目に当たる平成6年度は長年にわたって続けている南極昭和基地での、オゾン全量やオゾンゾンデによる鉛直分布の観測結果をもとに解析を行い、オゾン変動の様態を明らかにした。1980年代に入って顕著になった春季オゾンの減少は、90年代に入ってますます強まり、安定的に低いオゾン全量を続けている。オゾンの鉛直高度分布では、オゾンホールの強まった時期、中心的な高度の1419km、70150hPa域ではオゾンが完全に破壊されてしまうことが明らかになった。特に、90年代の特徴として、成層圏下部、100150hPa域のオゾン減少が顕著で、オゾンホール解消以降も低い値が続いている。この高度領域は、ほとんど全て力学的効果によって支配されているので、極渦の形態、その解消など、大気循環場の変化、輸送過程の変化が起っているものと考えられる。成層圏オゾン変動解明の一歩として、力学と化学過程を分離すべく、流線沿いに並んだ離れた地点でオゾンゾンデの同期観測を行った。これは、ドイツ、南アフリカ、インド、ロシアと日本との国際共同研究として行ったもので、各国の南極基地ノイマイヤー、サナエ、マイトリ、ノボラザレフスカヤ、昭和の各基地で、1993年9月初旬の10日間、オゾン全量およびオゾンゾンデの共同観測として実施した。観測値と気象客観解析データに基くバックワードトラジェクトリーの比較等から、極渦周辺域での変化の特徴が明らかにされた。多くは、成層圏上層だは低緯度から極渦中心方向への輸送が、下層では中心から北向への輸送があることが分り、オゾン量の変動が説明された。
水環境中におけるブラックカーボンの挙動と消長の解析

ブラックカーボン(BC)は、山火事や火山活動、化石燃料やバイオマスの不完全燃焼で発生する。大気中に排出されたBCは、湿式(降雨)や乾式の沈澱により地表に到達し、その一部は土壌に吸着し,一部が降雨時に土壌とともに流出すると考えられているが、その動態は明らかでない。そこで本研究では、水中でのBCと天然有機物(NOM)との相互関係や、流速、土壌の性質が、BCの地層中での挙動に及ぼす影響を調べた。実験方法として、疎水性のBCとして米国Cabot社製のBlackPearls2000を、負に帯電したBCとして、Aqua-Black001(東海カーボン製)を用いた。天然有機物(NOM)としてはIHSSから購入したSuwanee River NOM(SRNOM)を用い、それ以外に多糖類としてアルギン酸ソーダを利用した。土壌は、東京大学構内の地表から1.8mおよび4.4mの深さから摂採取した粘土質土壌をA-Iと、粘土性のローム層をA-IIと命名して使用した。土壌カラム実験は、0.4-1.0mmに篩い分けた土壌を、内径14mm、長さ88mmのガラスカラムに充填して行った。実験の結果、BCとSRNOMやアルギン酸ソーダを3日間接触させ平衡状態を保ったところ、これらの有機物はBCの水中での分散を促進することが示された。土壌カラムからの流出水中のBC濃度を連続的に測定したところ、有機物が付着したBCと同じ電位に帯電していた土壌A-IIの方が、土壌A-Iよりも遅く破過が始まり、なおかつ低いBC濃度であった。これは、土壌とBCの電気的な反発力よりも、BCの物理的な捕捉の方が大きく影響したためと考えられた。即ち、粒径が小さい土壌A-IIの方が、粒径が大きい士壌A-1よりもBCを捕捉しやすいと考えられた。本研究の結果から、土壌中、あるいは地下帯水層中でのBCの挙動は、土壌粒子の特徴、有機物の含有率、塩分濃度、あるいはこれらの変動などに影響を受けることが明らかにされた。特に、これまで土壌に吸着してほとんど移動しないと考えられていたBCが、有機物との反応により容易に水中に分散して移動することが明らかになった。本研究の目的は、(1)天然有機物(NOM)とコロイドがブラックカーボンの水環境中での挙動に及ぼす影響を評価すること、(2)地表水-地下水・土壌のダイナミックなサイクルの中で、ブラックカーボンの挙動と、それが水環境に及ぼす影響を把握することにある。そのため、今年度は天然土壌中でのブラックカーボンの移動が、天然有機物および多糖類の影響を受けるかどうかを調べるため、実験装置の製作と、いくつかの予備実験を行った。1.はじめに、内径30mmのガラス筒に石英砂を充填し、pHを5または7に調整し、NOM添加或いは無添加の条件で、ブラックカーボンの挙動を調べた。この結果は、2010年6月に国際フミン質と天然有機物に関する国隙会議(IHSS)に投稿した。2.次に、内径20mm、長さ150mmのガラス製クロマトカラムを製作し、新しく購入した土壌サンプル用のpH計とともに、ブラックカーボンを含む試水の通水実験装置を設置した。3.東京都内において天然土壌のコアサンプルを採取し、45°Cで3日間乾燥した。その後、ふるいにより0.4-1.0mmの画分と0.4mmの画分に分離した。その後、それぞれの土壌を湿潤状態で5-8cmの層高まで充填し、約1LのCaCl2溶液とKCl溶液を順番に通水することでイオン平衡を保ち調製を行った。4.その後、親水性のカーボンブラックであるAquablack-001(東海カーボン社製)をモデル物質として用いて通水実験を開始した。Aquablack-001は、親水性のブラックカーボンであり、水中に分散しやすいことから、様々な産業で用いられている。現在は、Aquablack-001を用いた実験結果を取得し、解析を行っている。粘土(pH7.60)またはローム(pH6.24)を充填したガラスカラムを用いて、親水性および疎水性のブラックカーボン粒子の土壌カラム中での挙動を調べた。流速0.036cm/sの定常流において、土壌カラム内に堆積したブラックカーボン粒子を測定し、1次沈殿式で近似した。このモデルは、土壌の乾燥重量当たり、一定で均一なブラックカーボン粒子の付着を仮定しており、実験データへの最少二乗法近似により、粘土粒子表面へのブラックカーボンの付着量と、付着速度係数をもとめた。これまでの研究で、水で飽和した砂層内の親水性ブラックカーボンの移動は、ブラックカーボンの表面に天然有機物が付着することにより変化することを報告しているが、粘土層やローム層内では天然有機物の付着は疎水性ブラックカーボンの移動を促進することはなかった。これは、おそらく天然有機物を付着したカーボンブラックのサイズ分布が0.241±0.062μmと大きかったためと考えられる。このことから、自然の地層中では疎水性のブラックカーボンの移動は限定的であることが考えられた。一方、親水性のブラックカーボンは粒径0.080-0.190μmであり、pH中性の条件で土層中で移動しやすかった。しかし、粘土層中とローム層中では親水性ブラックカーボンの移動が異なっており、その原因として、陽イオン交換容量(CEC)、土壌中のフミン質含有量、土壌の表面積、流量などによることが示された。

CECが大きな土壌中では、ブラックカーボンの移動が妨げられた。土壌中のフルポ酸はカーボンブラック粒子を分解し、粒径を0.010-0.10μmとして、土壌中の空隙に入りやすくするため、クロマトグラフィー効果によりカーボンブラックの流出が遅延した。これらのことから、粒径0.10-0.38μmの大きな粒子のほうが、粒径の小さな粒子よりも移動性が高いことが示された。ブラックカーボン(BC)は、山火事や火山活動、化石燃料やバイオマスの不完全燃焼で発生する。大気中に排出されたBCは、湿式(降雨)や乾式の沈澱により地表に到達し、その一部は土壌に吸着し,一部が降雨時に土壌とともに流出すると考えられているが、その動態は明らかでない。そこで本研究では、水中でのBCと天然有機物(NOM)との相互関係や、流速、土壌の性質が、BCの地層中での挙動に及ぼす影響を調べた。実験方法として、疎水性のBCとして米国Cabot社製のBlackPearls2000を、負に帯電したBCとして、Aqua-Black001(東海カーボン製)を用いた。天然有機物(NOM)としてはIHSSから購入したSuwanee River NOM(SRNOM)を用い、それ以外に多糖類としてアルギン酸ソーダを利用した。土壌は、東京大学構内の地表から1.8mおよび4.4mの深さから摂採取した粘土質土壌をA-Iと、粘土性のローム層をA-IIと命名して使用した。土壌カラム実験は、0.4-1.0mmに篩い分けた土壌を、内径14mm、長さ88mmのガラスカラムに充填して行った。実験の結果、BCとSRNOMやアルギン酸ソーダを3日間接触させ平衡状態を保ったところ、これらの有機物はBCの水中での分散を促進することが示された。土壌カラムからの流出水中のBC濃度を連続的に測定したところ、有機物が付着したBCと同じ電位に帯電していた土壌A-IIの方が、土壌A-Iよりも遅く破過が始まり、なおかつ低いBC濃度であった。これは、土壌とBCの電気的な反発力よりも、BCの物理的な捕捉の方が大きく影響したためと考えられた。即ち、粒径が小さい土壌A-IIの方が、粒径が大きい士壌A-1よりもBCを捕捉しやすいと考えられた。本研究の結果から、土壌中、あるいは地下帯水層中でのBCの挙動は、土壌粒子の特徴、有機物の含有率、塩分濃度、あるいはこれらの変動などに影響を受けることが明らかにされた。特に、これまで土壌に吸着してほとんど移動しないと考えられていたBCが、有機物との反応により容易に水中に分散して移動することが明らかになった。
下水汚泥コンポスト炭素のオオムギによる再固定の実験的証明

下水汚泥はコンポスト化され肥料として有効利用されている。コンポスト窒素の効果とともに、最近ではコンポストを施用した農地からの炭素吸収あるいは放出量にも関心が持たれている。本研究はδ^<13>C自然存在比を自然のトレーサーとして用い、コンポスト施用直後から2ヶ月間のコンポスト由来炭素および窒素をポット試験により追跡し、士壌-植物-大気間の循環を明らかにすることを目的とした。コンポスト長期連用土壌および化学肥料連用土壌に栽培したオオムギのδ^<13>C値は、土壌あるいはコンポストの値を反映せず、土壌のδ^<13>C値がコンポスト区<化学肥料区なのに対して播種後6および9週目のオオムギのδ^<13>C値はコンポスト区>化学肥料区であった。3週目のオオムギの値はコンポスト区<化学肥料区であったこと、また化学肥料連用土壌にコンポストを施肥した播種前(0週目)の土壌の値がコンポストの値を反映して小さくなったものの播種後3週目でその値は化学肥料連用土壌の値に戻ったことから、コンポストを粉砕して用いたことも影響して土壌中のコンポストは播種前後までに多くが分解したことが考えられた。また、今後検討が必要であるが、土壌中での下水汚泥コンポスト由来炭素の分解(無機化)が、例えば気温、土壌水分等に影響された事も考えられる。3連で実施した試験結果はコンポスト区と化学肥料区間で有意差が認められ、本研究の目的であるコンポスト炭素の土壌-植物-大気間の循環を明らかにし、生育初期のオオムギによる再固定を証明することはできなかった。一方オオムギのδ^<15>N値は、播種後3、6、9週間目のいずれも土壌あるいはコンポストの値を明らかに反映しており、生育のごく初期においてもコンポスト由来窒素が有効に吸収されていることが示唆された。また、その値も生長にともなって大きくなり、栽培期間中のオオムギは積極的にコンポスト由来窒素を利用し、生育したと考えられた。
転写リズムを生成する核内機能複合体の同定と生体リズム調整剤の開発

交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。生体リズムの形成維持を担う時計センターは、脳内視床下部に存在する視交叉上核(SCN)にある。SCNに発現する遺伝子群を網羅的に捕らえるため、高純度のSCN抽出RNA溶液を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。ここで得られた候補分子群の発現を確定する目的で、SCN組織切片を用いてさらにin situ hybridizationを行った。また、転写リズムの生成に関わる核内機能複合体の同定を目指し、時計発振ループの中枢因子PER2に結合する蛋白質(PER-binding protein,ここではPAPと呼ぶ)を検索した。PER2-PAP複合体を精製するため、Flagタグ付きのPER2蛋白質を発現する細胞株を作出した。PER2蛋白質が転写抑制因子として機能する特定の時間帯(血清刺激後8-14時間後)を狙って細胞を回収し、核抽出液に含まれるmPER2蛋白質複合体を抗Flag抗体カラムを用いてアフィニティー精製した。この複合体をグリセロールグラジエント法を用いてサイズ分画した後、アクリルアミドゲルに展開した。銀染色によって検出したタンパク質を質量分析解析に供し、PAPの候補となる新規分子を同定することに成功した。この分子の特性を知るため、組み換え蛋白質を調製し、これを抗原として使用することによりPAPを特異的に認識するための抗体を得た。SCNに発現するGPCR分子群を網羅的に捕らえるため、DNAマイクロアレイ法を用いてSCNに発現する候補GPCRをリストアップした。これに先立ち、高純度のSCN抽出RNAを調製した。具体的には、脳内の微小神経核であるSCNを精度よく摘出するため、SCNを含む脳のマイクロ切片を調製し、その後すぐに顕微鏡下においてSCN部分だけを特殊ニードルを用いてパンチアウト回収した。またさらに、転写リズムの生成に関わる核内機能複合体の同定を目指し、時計発振ループの中枢因子PER2に結合する蛋白質(PER-binding protein, PAP)を検索した。PER2複合体を精製するため、Flagタグ付きのPER2蛋白質を発現する細胞株を作出した。具体的には、Tet-OFFシステムによって発現誘導されるTet-Off-Flag-mPer2をNIH3T3細胞に異所的に導入した。これにより、培地中に含まれるドキシサイクリンの有無によってFlag-PER2の発現を自在にコントロールすることが可能となった。PER2蛋白質が転写抑制因子として機能する特定の時間帯(血清刺激後8-14時間)を狙って細胞を回収し、核抽出液に含まれるmPER2蛋白質複合体を抗Flag抗体カラムを用いてアフィニティー精製した。さらに、この複合体をグリセロールグラジエント法を用いてサイズ分画した後、アクリルアミドゲルに展開した。銀染色によって検出したタンパク質をMS/MS解析に供し、PAP分子の候補となる複数の蛋白質を質量分析解析によって同定することに成功した。
神経個性を決める潜在的クロマチン変化の意義とその制御機構の解明

私たちの脳をはじめとする神経系は、様々な個性を持つ神経細胞から構成されています。本研究者は、線虫C. elegansにおいて、神経細胞の個性を決定づけるクロマチン変化が、その個性確立のずっと前に行われることを明らかにしてきました。しかしながら、「なぜそのタイミングでクロマチン変化を起こす必要があるのか」について、その理由はわかっていません。本研究では、そうしたクロマチン変化のタイミングと不可逆性に着目することで、部分的に行われるクロマチン変化と全体的なゲノムの高次構造とを繋ぐ分子基盤を明らかにします。
リーマン多様体の収束・崩壊理論の新展開

境界つきリーマン多様体で、断面曲率が下に、境界の第2基本形式が一様に有界であるような無限列のグロモフ・ハウスドルフ収束や崩壊について研究し、特にその極限空間の幾何学をほぼ決定することができた(Z.Zhang氏との共同研究)。これは昨年度までに得ていた内半径崩壊する場合の結果の拡張を与えるものである。極限空間の特異点集合の次元の可能性も決定した。境界つき多様体のダブルの単体的体積がノンゼロであるが崩壊に対する障害となることを証明した。ここでは直径に関するバウンドも不要で、多様体の断面曲率ではなくリッチ曲率の下からのバウンドのみで十分であることも判明した。また「無限小の意味でのアレクサンドロフ空間」なる概念を自然に着想するに至った。極限空間の構造を完結させるために、今後は極限空間が「無限小の意味でアレクサンドロフ空間」になることを証明したい。来年度に論文を完成させる予定である。・CAT(1)空間の局所構造について、昨年度までの永野幸一氏との共同研究を発展させて、次が判明した(塩谷隆氏も交えた共同研究):12次元CAT(1)空間が局所的には有限個のCAT(1)リプシッツ円板の貼り合わせとして表現される2特異点集合はこれらのリプシッツ円板の交わりから得られる局所有限なリプシッツ曲線であること3これらの特異リプシッツ曲線は局所有限なturn(測地的曲率に相当)をもつ4逆にこれらにより2次元CAT(1)空間が特徴づけられる52次元CAT(1)空間がホモトピー型が同じ多面体構造をもつ2次元CAT(1)空間により近似される.ガウス・ボンネ定理も考察した。・崩壊する境界をもつ3次元アレクサンドロフ空間の位相を決定した(三石史人氏とも共同研究)。この過程で、1次元以下の空間に崩壊する境界つき3次元アレクサンドロフ空間は、実際には非負曲率をもつことが判明した。現在までの研究で、境界つきリーマン多様体の極限空間の構造がほとんど解明できた。また2次元CAT(1)空間については、局所構造の決定、多面体構造をもつCAT(1)空間による近似とホモトピー同値の構成を成し遂げることができた。崩壊する境界をもつ3次元アレクサンドロフ空間の位相も完全に決定することができた。・境界つきリーマン多様体の極限空間の構造を完結させるために、極限空間が「無限小の意味でアレクサンドロフ空間」になることを証明したい。・2次元CAT(1)空間に対してガウス・ボンネ定理を確立して、2次元CAT(1)空間の一連の結果を論文にまとめる予定である。・崩壊する境界つき3次元アレクサンドロフ空間の位相の決定に関して論文を仕上げる。・崩壊する閉多様体を代数的トポロジーの言葉で特徴づけたい。・アレクサンドロフ空間の極集合という特異点集合と全空間との関係を明確にする。・2次元CAT

(1)空間に対してガウス・ボンネ定理を確立して、2次元CAT(1)空間の一連の結果を論文にまとめる予定である。・崩壊する境界つき3次元アレクサンドロフ空間の位相の決定に関して論文を仕上げる。・崩壊する閉多様体を代数的トポロジーの言葉で特徴づけたい。・アレクサンドロフ空間の極集合という特異点集合と全空間との関係を明確にする。
転移好発性固形腫瘍の分化誘導療法に関する基礎的ならびに臨床的研究

本研究の目的は、小動物の転移好発性の悪性固形腫瘍に対し、腫瘍殺滅を主体とする副作用を伴う従来の治療法に代わり、腫瘍自体の悪性度を人為的にコントロールする分化誘導療法が治療法となりうるか否かを追及することにある.第一に、このような腫瘍に対する従来の治療成績をまとめ、総説としてその一部を発表したが、これは日本におけるデータがほとんどなかったためであり、その結果、諸外国で報告されている成績とほぼ同様であることが明らかとなった.同時に、これらの腫瘍から細胞株の樹立を試み、すでに骨肉種、肥満細胞種、乳腺癌など、多くの腫瘍細胞を樹立した(骨肉種-既発表および掲載予定、肥満細胞種-投稿準備中、乳腺癌-投稿準備中).これらはいずれももともとの組織と高い相同性を有しており、今後この分野の研究だけでなく、腫瘍研究に広く用いられるものと考えられる.最も初期に樹立した犬の骨肉腫細胞に対し、ビタミンD3、TGF-β、BMP-2といった生理活性物質を用いてin vitroでの分化誘導を試みた.その結果、これらの物質は程度の差はあるものの、骨芽細胞の指標となるALP活性、オステオカルシン濃度、PTH応答性cyclic-AMP濃度、I型コラーゲンなどをいずれも増加させた.また、電顕所見等から、これらの物質による分化誘導はアポトーシスを介して生じることが示唆された.一方、より分化した細胞ほど抗ガン剤、放射線に感受性を示すが、これらの物質によって分化誘導された細胞はいずれもこれらの治療法に対する感受性を増加させた.これらの結果は、きわめて悪性度が高い骨肉腫がin vitroではあるが、これらの生理活性物質によって分化が亢進する可能性を示唆しており、今回の研究ではできなかったが、in vivoの系、あるいは実際の症例を用いて検討する価値があると考えられた.現在、新たに2種の骨肉腫細胞を用いて、最近注目されているレチノール系薬物による分化誘導を検討しており、すでに良好な結果が得られ、今春に学会発表予定である.転移好発性固形悪性腫瘍に対する治療成績に関しては、すでに口腔、鼻腔の悪性腫瘍、肥満細胞腫、猫の乳癌等について調査を終了し、その一部は総説として報告するとともに、他の専門誌への投稿を準備中である。これらの結果はいずれも従来の報告とほぼ同様であるが、鼻腔腫瘍では従来の臨床病期分類が必ずしも適切とはいえず、CTスキャン等を用いた新しい分類法がより臨床的病期を適切に表すことが明かとなった。また鼻腔腫瘍に対する治療法に関しては、化学療法はかならずしも効果的とはいえず、むしろ放射線治療の成績が良好であった。一方、猫の乳癌ならびに犬の悪性黒色腫に関して細胞株の樹立に成功し、現在これらについても投稿準備中である。これらはいずれもヌードマウスの皮下移植によって肺その他へ転移することが確認されており、今後本研究の重要な材料となることが期待されている。分化誘導療法の可能性に関しては主として骨肉腫瘍細胞株を用いてin vitroの実験を行った。ビタミンD_3、TGF-β_1、BMP-2をクローン化した4つの骨肉腫培養細胞株に添加したところ、骨細胞の指標であるALP活性、オステオカルシン産生量、I型コラーゲン産生量等はさまざまな程度の上昇を示し、中でもBMP-2が最も強い作用を示した。また組織学的にもこれらの物質によって分化程度が誘導されており、さらに電顕所見からアポトーシスの発現も確認された。これらのデータは骨肉腫においてもこれらの薬物等による分化誘導の可能性を示唆するものであり、今後さらに詳細な検討を加える価値のある成績と考えられた。本研究の目的は、小動物の転移好発性の悪性固形腫瘍に対し、腫瘍殺滅を主体とする副作用を伴う従来の治療法に代わり、腫瘍自体の悪性度を人為的にコントロールする分化誘導療法が治療法となりうるか否かを追及することにある.第一に、このような腫瘍に対する従来の治療成績をまとめ、総説としてその一部を発表したが、これは日本におけるデータがほとんどなかったためであり、その結果、諸外国で報告されている成績とほぼ同様であることが明らかとなった.同時に、これらの腫瘍から細胞株の樹立を試み、すでに骨肉種、肥満細胞種、乳腺癌など、多くの腫瘍細胞を樹立した(骨肉種-既発表および掲載予定、肥満細胞種-投稿準備中、乳腺癌-投稿準備中).これらはいずれももともとの組織と高い相同性を有しており、今後この分野の研究だけでなく、腫瘍研究に広く用いられるものと考えられる.最も初期に樹立した犬の骨肉腫細胞に対し、ビタミンD3、TGF-β、BMP-2といった生理活性物質を用いてin vitroでの分化誘導を試みた.その結果、これらの物質は程度の差はあるものの、骨芽細胞の指標となるALP活性、オステオカルシン濃度、PTH応答性cyclic-AMP濃度、I型コラーゲンなどをいずれも増加させた.また、電顕所見等から、これらの物質による分化誘導はアポトーシスを介して生じることが示唆された.一方、より分化した細胞ほど抗ガン剤、放射線に感受性を示すが、これらの物質によって分化誘導された細胞はいずれもこれらの治療法に対する感受性を増加させた.これらの結果は、きわめて悪性度が高い骨肉腫がin vitroではあるが、これらの生理活性物質によって分化が亢進する可能性を示唆しており、今回の研究ではできなかったが、in vivoの系、あるいは実際の症例を用いて検討する価値があると考えられた.

現在、新たに2種の骨肉腫細胞を用いて、最近注目されているレチノール系薬物による分化誘導を検討しており、すでに良好な結果が得られ、今春に学会発表予定である.本年度は前年度も用いたクローン化骨肉腫細胞株である4種のPOS細胞を用い,これらにビタミンD_3,、TGF-β_1,BMP-2の3種の生理活性物質をin vitroで作用させ、その後の各細胞の増殖能の変化,および抗腫瘍剤ならびに放射線に対する感受性の変化を検討した。その結果,各細胞はこれらの生理活性物質の処理により培養2日目から増殖速度は有意な低下を示した。また,抗腫瘍剤に対する感受性は必ずしも各細胞,あるいは抗腫瘍剤によって一様な反応は得られなかったが,ほぼ臨床的薬用量のレベルでも有意な感受性の増加を示したものが多かった。中でもシスプラチン,5-FU,シタラビンに対する感受性はいずれの細胞も各生理活性物質によって増加した。放射線感受性は各生理活性物質の処置により増加を示す細胞が多かったが、類骨産生細胞クローンであるPOS53Dは著しい効果が得られなかった。一方,腫瘍の転移能の指標となる細胞の運動能ならびに浸潤能についてみると,各生理物質による処置はいずれの細胞に関してもこれらを有意に低下させることが示された。以上の結果から,各生理活性物質は少なくともin vitroにおいては骨肉腫細胞の分化を亢進させ,悪性度を低下させる可能性が示唆された。本研究の目的は、小動物の転移好発性の悪性固形腫瘍に対し、腫瘍殺滅を主体とする副作用を伴う従来の治療法に代わり、腫瘍自体の悪性度を人為的にコントロールする分化誘導療法が治療法となりうるか否かを追求することにある.第一に、このような腫瘍に対する従来の治療成績をまとめ、総説としてその一部を発表したが、これは日本におけるデータがほとんどなかったためであり、その結果、諸外国で報告されている成績とほぼ同様であることが明らかとなった.同時に、これらの腫瘍から細胞株の樹立を試み、すでに骨肉腫、肥満細胞腫、乳腺癌など、多くの腫瘍細胞を樹立した(骨肉腫-既発表および掲載予定、肥満細胞腫-投稿準備中、乳腺癌-投稿準備中).これらはいずれももともとの組織と高い相同性を有しており、今後この分野の研究だけでなく、腫瘍研究に広く用いられるものと考えられる.最も初期に樹立した犬の骨肉腫細胞に対し、ビタミンD3、TGF-β、BMP-2といった生理活性物質を用いてin vitroでの分化誘導を試みた.その結果、これらの物質は程度の差はあるものの、骨芽細胞の指標となるALP活性、オスチオカルシン濃度、FTH応答性cyclic-AMP濃度、I型コラーゲンなどをいずれも増加させた.また、電顕所見等から、これらの物質による分化誘導はアボトーシスを介して生じることが示唆された.一方、より分化した細胞ほど抗ガン剤、放射線に感受性を示すが、これらの物質によって分化誘導された細胞はいずれもこれらの治療法に対する感受性を増加させた.これらの結果は、きわめて悪性度が高い骨肉腫がin vitroではあるが、これらの生理活性物質によって分化が亢進する可能性を示唆しており、今回の研究ではできなかったが、in vivoの系、あるいは実際の症例を用いて検討する価値があると考えられた.現在、新たに2種の骨肉腫細胞を用いて、最近注目されているレチノール系薬物による分化誘導を検討しており、すでに良好な結果が得られ、今春に学会発表予定である.
ＲＡＳＡＬ１の腸管自然発癌及び炎症発癌における役割の解明

RASAL1ノックアウトマウスを作製した。これまで約1年半の経過観察中にホモマウスの腸管、胃、肝臓などに腫瘍発生は見られていない。またその一方で大腸腫瘍自然発生モデルAPCノックアウトマウスとの交配を行い、その腫瘍発生の影響を解析中である。今までのところマウスの生存率に相違がみられてはいない。現在ではさらに炎症性発がんへの影響を検討するために、AOM/DSS投与を行い、引き続き表現型について検討している。マウスRasal1遺伝子エクソン11ー13をloxP配列で挟み込んだRasal1コンディショナルノックアウトマウス(Rasal1 flox)を理化学研究所発生再生科学総合センターと共同開発により作製した。全身でCreリコンビナーゼを発現するCAG-Cre/+マウスとの交配により、得られたホモノックアウトマウス(Rasal1-/-)はメンデルの法則に従い得られ、胎生致死ではないことが明らかとなった。Rasal1-/-マウスとRasal1+/-マウスは特に成長障害や明らかな外見上の異常は見られていない。またRasal1+/-マウス同士の交配により得られた胎仔からRasal1-/-及びRasal1+/+ (WT)の線維芽細胞(MEF)を樹立した。樹立したMEFにおけるRasシグナル及びPI3Kシグナルの活性化を検討したが、Rasal1-/-とRasal1+/+との間で明らかな差は認めなかった。次にRasal1ノックアウトマウスにおける腫瘍発生について検討したが、現在までのところ自然発生腫瘍は見られず、大腸腫瘍自然発生マウスモデルApcヘテロノックアウトマウスとRasal1ノックアウトマウスとの交配や大腸炎症発癌マウスモデルであるAOM/DSS投与、肝発癌マウスモデルであるDEN投与をRasal1ノックアウトマウスに対して施行し、検討している。1年の結果観察期間中にRasal1ホモノックアウトマウスの腸管、胃、肝臓に腫瘍発生は見られていない。また、Apcヘテロノックアウトマウスとの交配やAOM/DSS投与モデル、DEN投与モデルでRasal1-/-マウスとRasal1+/+マウスの間の表現型の差を解析中である。今後もマウスの匹数を増やして検討していく予定である。まず、このマウスを全身でCreリコンビナーゼを発現するCAG-Cre/+マウスと交配することにより、全身でのRasal1ノックアウトマウスを作製した。Rasal1floxマウスとCAG-Cre/+マウスとの交配により、まずヘテロノックアウトマウス(Rasal1+/-)を作製し、その後さらにRasal1+/-マウス同士の交配により、ホモノックアウトマウス(Rasal1-/-)を作製した。Rasal1-/-マウスはメンデルの法則に従い、1/4の確率で得られ、胎生致死ではないことが明らかとなった。Rasal1-/-マウスとRasal1+/-マウスは今までのところ6か月令までの観察で特に成長障害や明らかな外見上の異常は見られていない。またRasal1+/-マウス同士の交配により得られた胎仔からRasal1-/-及びRasal1+/-の線維芽細胞(MEF)を樹立した。樹立したMEFにおけるRasシグナル及びPI3Kシグナルの活性化を検討したが、今のところRasal1-/-とRasal1+/-との間で明らかな差は認めていない。マウスRasal1遺伝子エクソン11-13をLoxP配列で挟み込んだRasal1コンディショナルノックアウトマウス(Rasal1 flox)を理化学研究所発生再生科学総合センターと共同開発により作製した。全身でCreリコンビナーゼを発現するCAG-Creマウスとの交配により、得られたホモノックアウトマウス(Rasal1-/-)はメンデルの法則に従い得られ、胎生致死ではないことが明らかとなった。またRasal1+/-マウス同士の交配により得られた胎仔からRasal1-/-及びRasal1+/+(WT)の線維芽細胞(MEF)を樹立した。樹立したMEFにおけるRasシグナル及びPI3Kシグナルの活性化を検討したが、Rasal1-/-とRasal1+/+との間で顕著な差は認めなかった。次にRasal1ノックアウトマウスにおける腫瘍発生について検討したが、約1年半の観察期間中にRasal1ホモノックアウトマウスの腸管、胃、肝臓に腫瘍発生は見られていない。

一方では大腸腫瘍自然発生モデルApcヘテロノックアウトマウスとRasal1ノックアウトマウスとの交配を行い、表現型への影響を検討している。現在までのところ約半年間の経過観察中でマウスの生存率には相違が見られていない。さらには大腸炎症発癌マウスモデルであるAOM/DSS投与、肝発癌マウスモデルであるDEN投与をRasal1ノックアウトマウスに対して施行し、表現型の違いについて検討している。引き続き今後もマウスの匹数及び観察期間を延長して検討を続けていく予定である。大腸がんRasal1ノックアウトマウス作製、マウス胎生線維芽細胞の作製、腸管腫瘍自然発生マウスモデルであるApcヘテロノックアウトマウスとの交配、AOM/DSS,DENの投与などはやや産仔の数が予定より少ない点を除けばほぼ計画通りに進んでいる。十分な個体がそろった時点でRasal1欠損のマウス腸管及び肝臓の腫瘍発生に及ぼす影響を明らかにする。理化学研究所発生再生科学総合センターと共同開発によるRasal1floxマウスが完成し、全身でCreを発現するCAG-Cre/+マウスとの交配により、Rasal1の全身でのヘテロノックアウトマウス(Rasal1+/-マウス)及びホモノックアウトマウス(Rasal1-/-マウス)も順調に作製することができた。マウスの交配も順調に進んでおり、今後種々の発癌性薬剤の投与や腫瘍自然発生マウスモデルとの交配によるRasal1ノックアウトの腫瘍形成への影響の解析を進める準備が整いつつある。腸管腫瘍自然発生マウスモデルであるApcヘテロノックアウトマウスとの交配、AOM/DSS,DENの投与などほぼ計画通りに進んでおり、Rasal1欠損のマウス腸管及び肝臓の腫瘍発生に及ぼす影響が明らかになりつつある。今後はマウスの匹数を増やし、観察期間を延長することにより、Rasal1の腫瘍発生における役割を解明していく。腸管に腺腫を多発し、一部が癌化することが知られており、adenoma-carcinoma sequenceの理想的なマウスモデルの一つと考えられているApcヘテロノックアウトマウス(Apc+/-)をRasal1ノックアウトマウスと交配することにより、Rasal1がこのような発癌経路を経る大腸腫瘍の発生あるいは進展に関与するかを明らかにする。具体的にはApc+/-マウスとRasal1-/-マウスを交配し、Apc+/-; Rasal1-/-及びApc+/-; Rasal1+/-というマウスを得て、生じる腫瘍の数、腫瘍径、組織学的悪性度などをApc+/-マウスと比較する。さらに上記のような免疫染色及び遺伝子変異検索により、Rasal1欠損がApc+/-マウスの腫瘍に及ぼす影響のメカニズムを明らかにする。古典的なadenoma-carcinoma sequenceと異なる大腸発癌機序のひとつに炎症性腸疾患による慢性炎症に起因する発癌がある。この発癌機序へのRASAL1の関与を明らかにするため、代表的なな大腸炎症発癌マウスモデルであるAOM/DSS誘発大腸癌モデルをRasal1ノックアウトマウスに適用する。
フアジイ測度を用いた効用理論とその政策策定のための利用に関する研究

本研究は、主として次の3点において行なわれた。1.ファジイ測度を用いたファジイ効用理論の研究。(1)従来の意志決定分析にけるける数値的効用理論では確立測度が用いられてきたが、ファジイ意思決定分析におけるファジイ効用関数の構築に際しては、その一般化としてのフアジイ測度が用いらればければならない。そのための方法として、確率的な効用関数の導出における確率的な「くじ」実験をの代わりに、その一般化としてのファジイ「くじ」実験を用いて、ファジイ効用関数の導出を行う方法を提示した。(2)集団的な意思決定環境において、効用関数の導出を可能性分布の評価の基礎上で行うことを提案し、これによって集団的なファジイ効果関数を構築しうることを示した。2.協力ファジイケ-ムの研究。ファジイ効用理論を政策的に利用しうる代表的な分野の一つとしてのファジイ・ゲームの実際的な解法についてのいくつかのモデルを示し、その応用への途を明らかにした。(1)ゲームをパラメトリックプログラミングの形式で解く方法を示し、これがファジイゲームを解くことに帰着することを明らかにし、国際的な葛藤解決のための有効な提携の形成を求める問題に応用した。(2)ファジイ提携の上で定義されたn-人協力ファジイゲームにおける集約された余剰に基づく解くとしの仁の定義とその性質についての研究をおこなった。またファジイ目標と結合されたファジイ双行列ゲームの形で定式化した場合のゲームの均衡解の性質についての研究も行った。3.コンピュータ支援意思決定分析のための対話型ソフトウエアの開発。オブジェクト指向型ブログラミング言語C^<++>を用い、知的意志決定支援システム(IDSS)の環境の下での運用を想定し、またGUIの機能を駆使して、確率評価にもとずく期待効用値の計算をを含む、意思決定分析支援のための対話型のソフトウエアIDSSを開発した。I.本研究の目的は、従来の意志決定分析がその基礎とする確率測度に代えて、より一般的なファジイ測度の基礎上で新たにファジイ意志決定分析を論理的に構成し、かつその政策的な適用のための方法を構築することである。II.本年度の研究は、主として次の3点において行なわれた。1.ファジイ測度を用いたファジイ効用理論の研究(MCDM国際会議で発表)一般の数値的効用理論においては、確率測度による「くじ」法が用いられているが、ファジイ効用理論では「ファジイくじ」の概念が用いられることを示した。また、そのための基礎研究として、確率測度との対比においてその一般化としてのファジイ測度の特性についての研究をおこなった。2.協力ファジイゲームの研究(MCDM国際会議で発表、および論文発表)(1)ファジイ提携の上で定義されたn-人協力ファジイゲームにおける最小コア、すなはち最大余剰を最小にする解とそれに関連する解、および集約された余剰に基づく解としての仁定義とその性質についての研究をおこなった。(2)ファジイ協力ゲームをファジイ特性関数の構築の上に定式化し、パラメトリックプログラミングの形式で最適解としての仁をもとめる方法を提案するとともに、国際提携ゲームの構築問題へに適用を試みた。3.コンピュータ支援意思決定のためのソフトウエア開発(進行中)

われわれは既に多目的意思決定支援のためのコンピュータプログラムとして、MAPを開発しているが、このプログラムには不確実性下の意思決定問題に固有の確率評価などの要素が含まれていないので、この弱点を補うために、確率評価を含む意思決定分析のためのソフトウエア開発を行った。この研究は、ファジイ意思決定分析のためのソフトウエアの開発のための前段階として必要なものである。本研究は、主として次の3点において行なわれた。1.ファジイ測度を用いたファジイ効用理論の研究。(1)従来の意志決定分析における数値的効用理論では確率測度が用いられてきたが、ファジイ意思決定分析におけるファジイ効用関数の構築に際しては、その一般化としてのファジイ測度が用いられなければならない。そのための方法として、確率的な効用関数の導出における確率的な「くじ」実験の代わりに、その一般化としてのファジイ「くじ」実験を用いて、ファジイ効用関数の導出を行う方法を提示した。(2)集団的な意思決定環境において、効用関数の導出を可能性分布の評価の基礎上で行うことを提案し、これによって集団的なファジイ効用関数を構築しうることを示した。2.協力ファジイゲームの研究。ファジイ効用理論を政策的に利用しうる代表的な分野の一つとしてのファジイ・ゲームの実際的な解法についてのいくつかのモデルを示し、その応用への途を明らかにした。(1)ゲームをパラメトリックプログラミングの形式で解く方法を示し、これがファジイゲームを解くことに帰着することを明らかにし、国際的な葛藤解決のための有効な提携の形成を求める問題に応用した。(2)ファジイ提携の上で定義されたn-人協力ファジイゲームにおける集約された余剰に基づく解としての仁の定義とその性質についての研究をおこなった。またファジイ目標と結合されたファジイ双行列ゲームの形で定式化した場合のゲームの均衡解の性質についての研究も行った。3.コンピュータ支援意思決定分析のための対話型ソフトウエアの開発。オブジェクト指向型プログラミング言語C^<++>を用い、知的意志決定支援システム(IDSS)の環境の下での運用を想定し、またGUIの機能を駆使して、確率評価にもとづく期待効用値の計算をを含む、意思決定分析支援のための対話型のソフトウエアIDASSを開発した。
XおよびY染色体連鎖遺伝子群が関与する多因子性・致死性疾患の遺伝解析

2つのマウス近交系統、♀DDDおよび♂DH-Dh/+間のF1♂Dh/+マウスは、生後まもなく成長障害を示し死亡する。死因は直腸膀胱瘻による排泄不全である。F1♀Dh/+は発症しない。また、♀DH-Dh/+および♂DDD間のF1♂Dh/+マウスも発症しない。本疾患は、1番染色体Dh遺伝子座、X染色体Grdhq1座、およびY染色体遺伝子座の独立した3遺伝子座における特異的アレルの組み合わせにより生じる多因子性遺伝疾患である。本研究の目的は、これら3遺伝子座、特にXおよびY染色体座の原因遺伝子を同定することである。X染色体Grdhq1座領域に存在する候補遺伝子Mid1などについて、DDD系統での変異を検索したが、原因変異は同定できなかった。Y染色体座については、昨年までの結果を継続・追加し、様々な近交系由来のYをDHの背景に戻し交配したYコンソミック系統(現在ほぼ戻し交配の2030世代程度)を作出した。♀DDDとの交配結果、本症を発症するYと発症しないYの2種類のY染色体が実験用マウスに共存していることを証明した。Yコンソミック系統間の比較において、精巣の重量に差があることを示す予備結果を得たため、本年度は上記のYコンソミック系統間の精巣重量を比較し、徹底した証明を行った(継続中)。♂DH-Y-+/+コンソミック間には精巣重量の差は認められなかったが、♂DH-Y-Dh/+コンソミック間には有意な精巣重量差が認められた。この結果は、DhがY染色体遺伝子と相互作用することを示している。精巣重量の重さ・軽さと上記の致死疾患発症の有無との間には、Yの種類に関して、明確な相関は認められなかった。従って、Dhは複数のY染色体遺伝子と相互作用している可能性が示唆された。Y染色体遺伝子多型の解析は今後も継続する予定である。また、新規に確立した数系統のYコンソミック系統についても上述のとおり、致死性、および精巣重量の点に関する研究を進める。前年度までの結果から、Grdhq1座はX染色体遠位部、擬似常染色体領域(PAR)近傍に存在することが明らかとなっており、本年度は、当該領域に存在する候補遺伝子の幾つかについて、DDD系統での変異を検索したが、原因と考えられる変異は同定できなかった。

Y染色体座については、昨年までの結果を継続・追加し、様々な近交系由来のYをDHの背景に戻し交配したYコンソミック系統(現在ほぼ戻し交配の20世代程度)を作出した。♀DDDとの交配結果、A/J,AKR/J,CF1,DBA/2J,DDD,SJL/J,SWR/J,TIRANO/Ei,C57BL/6J,BALB/c,DH由来のYは本症を発症させるが、RF/J,CAST/Ei,C3H/HeJ由来のYでは発症しなかった。すなわち、Y染色体座に関しては、本症を発症するYと発症しないYの2種類のY染色体が実験用マウスに共存していることが確認された。これら近交系の系統発生的な類縁関係と本疾患発症との間に明確なパラレルは認められなかった。Yコンソミック系統間の比較において、精巣の重量に差があることを示す予備結果を得た。本年度は上記のYコンソミック系統間の精巣重量を比較し、徹底した証明を行う。精巣重量を支配する遺伝子はかなり限定されると思われるので、精巣重量の軽重と疾患発症の有無の間に相関が認められれば本疾患を発症させるYと発症させないYの原遺伝子変異が同定可能であると考えられる。2つのマウス近交系統、♀DDDおよび♂DH-Dh/+間のF1♂Dh/+マウスは、生後まもなく成長障害を示し死亡する。死因は直腸膀胱瘻による排泄不全である。F1♀Dh/+は発症しない。また、♀DH-Dh/+および♂DDD間のF1♂DH/+マウスも発症しない。本疾患は、1番染色体Dh遺伝子座、X染色体Grdhq1座、およびY染色体遺伝子座の独立した3遺伝子座における特異的アレルの組み合わせにより生じる多因子性遺伝疾患である。本研究の目的は、これら3遺伝子座、特にXおよびY染色体座の原因遺伝子を同定することである。本年度は、X染色体Grdhq1座領域に存在する候補遺伝子Mid1などについて、DDD系統での変異を検索したが、原因変異は同定できなかった。Y染色体座については、昨年までの結果を継続・追加し、様々な近交系由来のYをDHの背景に戻し交配したYコンソミック系統(現在ほぼ戻し交配の2030世代程度)を作出した。♀DDDとの交配結果、本症を発症するYと発症しないYの2種類のY染色体が実験用マウスに共存していることを証明した。昨年度、Yコンソミック系統間の比較において、精巣の重量に差があることを示す予備結果を得たため、本年度は上記のYコンソミック系統間の精巣重量を比較し、徹底した証明を行った(継続中)。♂DH-Y-+/+コンソミック間には精巣重量の差は認められなかったが、♂DH-Y-Dh/+コンソミック間には有意な精巣重量差が認められた。この結果は、DhがY染色体遺伝子と相互作用することを示している。精巣重量の重さ・軽さと上記の致死疾患発症の有無との間には、Yの種類に関して、明確な相関は認められなかった。従って、Dhは複数のY染色体遺伝子と相互作用している可能性が示唆された。
HIV-1,gag蛋白依存性に活性化される宿主トポイソメラーゼIのはたらき

これまでの研究によってHIV-1ウイルスの構造蛋白であるgag蛋白がtopoisomerase Iを活性化することを明らかにした。本研究においてはこのgag蛋白による宿主topoisomerase Iの活性化がウイルス複製のどの段階で関わっているかを明らかにすることを目的とした。具体的には以下の方法を取った。1。HIV-1の部分的なゲノムをT7 polymeraseによって産出するプラスミドを構築後、in vitroでRNAを転写しテンプレイトを準備する。2。1。を用いたin vitro逆転写系を準備する。3。2。のin vitro逆転写系において組み替えgag蛋白、topoisomerase I等のもたらす影響を調べる。その結果、両端にLTRを有し中央部gag-pol-envを除去した1本鎖HIV-1 RNAをテンプレートととし、標識したプライマー、市販精製RTを用いた逆転写反応において、GST-p15で活性化されたtopo Iを添加すると、濃度依存的にcDNA生成量が増加した。一方、このcDNA合成量はtopo I阻害剤であるカンプトテシンによって濃度依存的に減少した。本研究ではウイルスgag蛋白と宿主topoIの相互作用について、さらに理解を深めるためにHIV-1 RNAゲノムのin vitro複製モデル系を構築し、活性化topo Iの作用を検討した。その結果topo Iは逆転写効率をウイルスgag蛋白との関連により上昇させることが明らかになり、レトロウイルスの複製に一般化することができる可能性のある機構があきらかとなった。1。2。1。3。2。
光発芽レタス種子のジベレリン生合成酵素遺伝子発現に対する赤色光の効果

植物ホルモン・ジベレリン(GA)はレタス種子の光発芽誘導に重要な役割を担っていると考えられている.レタス種子においては赤色光による発芽誘導時に活性型GAであるGA_1の内生量が増加することが示されており,本研究ではどの生合成段階が赤色光処理により促進されるかを調べることを目的とする.昨年度は,GA生合成の後期段階を触媒する2種の可溶性酵素,GA 20-酸化酵素,3β-水酸化酵素をコードするcDNAをレタス種子より2種ずつクローニングした(Ls20ox1,Ls20ox2,Ls3h1,Ls3h2).本年度はまず,その他のアイソザイム遺伝子をクローニングするために,いくつかの種類の縮重プライマーや種子以外の起源のcDNAを鋳型として用いて探索を行った.その結果,各々の酵素について3種目のアイソザイムをコードするcDNAがクローニングでき,それぞれLs20ox3,Ls3h3と名付けた.また,GA生合成経路の中でも初期段階を触媒するコパリル二リン酸合成酵素とent-カウレン合成酵素をコードするcDNAもレタス種子より1種ずつクローニングし,それぞれLsCPS1,LsKS1と名付けた.ゲノミックサザン分析により上記8種の遺伝子は1コピーであると判断され,これら8種のcDNAをプローブとして,発芽光条件と非発芽光条件で培養したレタス種子を用いてノーザン分析を行った.その結果,初期段階を触媒するLsCPS1とLsKS1の遺伝子発現は光処理の影響を受けず,後期段階を触媒する酸化酵素の中でもLs20ox3,Ls3h2,Ls3h3の遺伝子発現は検出限界以下で,Ls20ox1とLs20ox2遺伝子は吸水のみで発現し,赤色光処理により発現量は増加しなかったが,Ls3h1遺伝子については吸水に加えて赤色光を処理することにより発現は誘導されることが示された.以上より,この活性型GAを合成する最終段階の酵素遺伝子の発現がフィトクロムにより制御されると考えられた.植物ホルモンの一つであるジベレリン(GA)はレタス種子の光発芽誘導に重要な役割を担っていると考えられている.すなわち,レタス種子においては赤色光による発芽誘導時に活性型GAであるGA_1の内生量が増加することが示されており,本研究ではどの生合成段階が赤色光処理により促進されるかを追求するために,まずGA生合成の後期段階を触媒する2つの可溶性酵素,GA 20-酸化酵素(GA_<53>→GA_<44>→GA_<19>→GA_<20>),GA 3β-水酸化酵素(GA_<20>→GA_1)のcDNAをレタス種子よりクローニングすることにした.他の植物でクローニングされている当該酵素の推定アミノ酸配列の間で相同性の高い部分を基にして設計したデジェネレートプライマーを用いて,レタス種子より調製したcDNAを鋳型としてPCRを行った.その結果,2つの酵素についてともに2種類ずつのPCR断片が得られた.その塩基配列より推定されるアミノ酸配列についてBLASTによるホモロジー検索を行ったところ,ともに他の植物の当該酵素と高い相同性を示したので,これらの断片がレタス種子のGA 20-酸化酵素,GA 3β-水酸化酵素遺伝子から増幅されたものだと考えられた.これらの断片の塩基配列を基にして全長のcDNAの塩基配列を5′RACE(Rapid Amplification of cDNA End),3′RACEにより決定した.その結果,383個,369個のアミノ酸をコードするレタスGA 20-酸化酵素遺伝子,Ls20ox1,Ls20ox2と,363個,362個のアミノ酸をコードするレタスGA 3β-水酸化酵素遺伝子,Ls3hl,Ls3h2がクローニングされた.それらのコード領域を発現ベクターpMAL-c2に組込み,マルトース結合タンパク質との融合タンパク質として活性検定を行った結果,Ls20oxはGA_<53>→GA_<44>→GA_<19>→GA_<20>,Ls3hはGA_<20>→GA_1の変換段階を触媒することが示され,全てのクローンが当該酵素をコードしていることが明らかになった.植物ホルモン・ジベレリン(GA)はレタス種子の光発芽誘導に重要な役割を担っていると考えられている.レタス種子においては赤色光による発芽誘導時に活性型GAであるGA_1の内生量が増加することが示されており,本研究ではどの生合成段階が赤色光処理により促進されるかを調べることを目的とする.昨年度は,GA生合成の後期段階を触媒する2種の可溶性酵素,GA 20-酸化酵素,3β-水酸化酵素をコードするcDNAをレタス種子より2種ずつクローニングした(Ls20ox1,Ls20ox2,Ls3h1,Ls3h2).本年度はまず,その他のアイソザイム遺伝子をクローニングするために,いくつかの種類の縮重プライマーや種子以外の起源のcDNAを鋳型として用いて探索を行った.その結果,各々の酵素について3種目のアイソザイムをコードするcDNAがクローニングでき,それぞれLs20ox3,Ls3h3と名付けた.また,GA生合成経路の中でも初期段階を触媒するコパリル二リン酸合成酵素とent-カウレン合成酵素をコードするcDNAもレタス種子より1種ずつクローニングし,それぞれLsCPS1,LsKS1と名付けた.

ゲノミックサザン分析により上記8種の遺伝子は1コピーであると判断され,これら8種のcDNAをプローブとして,発芽光条件と非発芽光条件で培養したレタス種子を用いてノーザン分析を行った.その結果,初期段階を触媒するLsCPS1とLsKS1の遺伝子発現は光処理の影響を受けず,後期段階を触媒する酸化酵素の中でもLs20ox3,Ls3h2,Ls3h3の遺伝子発現は検出限界以下で,Ls20ox1とLs20ox2遺伝子は吸水のみで発現し,赤色光処理により発現量は増加しなかったが,Ls3h1遺伝子については吸水に加えて赤色光を処理することにより発現は誘導されることが示された.以上より,この活性型GAを合成する最終段階の酵素遺伝子の発現がフィトクロムにより制御されると考えられた.