hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二重ベータ崩壊実験用Ca同位体のレーザー濃縮

ニュートリノのマヨラナ粒子性の検証のためにCa-48を用いた二重ベータ崩壊がその低バックグラウンド性において有望と期待されている。しかしCa-48の天然存在比は0.2%以下と小さいため、その濃縮技術の開発が切望されている。本研究では濃縮比の高い同位体分離法として期待されるレーザー法に着目し、同位体を選択的にイオン化し回収する方式について、実験的にその性能を明らかにすべく研究を進めた。27年度は予備的な実験として半導体レーザーによる選択励起とそれに引き続くYAGレーザーの第2高調波による非共鳴的イオン化の実験を行い、同位体選択性は低いものの選択的なイオン化が確認された。28年度はイオン化用光源を波長可変色素レーザーに置き換え、同位体分離実験を以下の手順で実施した。(1)Ca原子ビームの発生:真空容器内でCaをヒータで加熱、蒸発させ、アパーチャによりコリメートし、原子ビームを形成した。(2)レーザー照射:選択励起用光源である波長423nm近傍で同調可能な半導体レーザー光とイオン化用色素レーザー光を、原子ビームに照射した。(3)同位体選択性の分析:レーザー照射により生成したCaイオンを飛行時間法を用いた質量分析法により同位体の分析を行った。その結果、次のことが判明した。(i)色素レーザー光強度がある程度強い場合、色素レーザー光のみである程度イオン化が起こる。次にCa-48に半導体レーザーを同調して照射すると、Ca-48イオン信号のみが増加し、実験条件では14倍の濃縮が確認された。(ii)色素レーザー光のみによるイオン化を抑えた条件で、半導体レーザー光を照射した場合、Ca-48イオン信号のみならず、他の同位体の信号も増大し、濃縮比が20倍程度に抑えられた。これは、2つのレーザーの協同作用が原因となっていて、より高い濃縮比を得るためには工夫が必要であることが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。ニュートリノのマヨラナ粒子性の検証のために、Ca-48を用いた二重ベータ崩壊実験がその低バックグラウンド性において有望と期待されている。しかしCa-48の天然同位体存在比は0.2%以下と小さいため、その濃縮技術の開発が切望されている。本研究では濃縮比の高い同位体分離法として期待されるレーザー法に着目し、同位体を選択的にイオン化し回収する方式について、実験的にその性能を明らかにすべく、研究を進めた。27年度は当初の計画通り、連続発振半導体レーザーによる選択励起とそれに引き続くパルス発振YAGレーザーの第2高調波によるイオン化を組み合わせた選択的光イオン化法について以下のように実験を進めた。(1)Ca原子ビームの発生:真空容器内でCaをヒータ加熱(550°C)し、Ca原子蒸気を発生させ、アパーチャによりコリメートし、鉛直方向に原子ビームを形成した。(2)レーザー照射:選択励起用光源である423nm近傍で同調可能な連続発振半導体レーザー光と、イオン化用YAGレーザー光を同軸上に重ね、真空容器内で原子ビームに直角に照射した。(3)同位体選択性の分析:レーザー照射により生成したCaイオンは電界によりレーザービームおよび原子ビームの両方に対して直角方向に偏向し、飛行時間法を用いて質量分析を行った。結果の概略は次のとおりである。[1]YAGレーザーのパワー密度(強度)を比較的小さく設定した場合、特定の同位体を2倍程度濃縮することができた。[2]YAGレーザーのパワー密度を変化させて行った実験から、[1]の照射条件ではイオン化効率が低いこと、パワー密度の増加とともに生成イオン量は増加するが同位体の選択性が低下することが観測された。以上のことから、YAGレーザーの第2高調波による非共鳴的イオン化を用いた場合、同位体の選択性とイオン化効率の両者を同時に高くすることは難しいと考えられる。当初の計画通り、Caの原子ビームを発生させ、これに選択励起用半導体レーザー光と、イオン化用YAGレーザーの第2高調波を照射する分離実験を試みた結果、同位体選択性とイオン化効率について大まかな評価することができた。

その結果、次のことが判明した。(i)色素レーザー光強度がある程度強い場合、色素レーザー光のみである程度イオン化が起こる。次にCa-48に半導体レーザーを同調して照射すると、Ca-48イオン信号のみが増加し、実験条件では14倍の濃縮が確認された。(ii)色素レーザー光のみによるイオン化を抑えた条件で、半導体レーザー光を照射した場合、Ca-48イオン信号のみならず、他の同位体の信号も増大し、濃縮比が20倍程度に抑えられた。これは、2つのレーザーの協同作用が原因となっていて、より高い濃縮比を得るためには工夫が必要であることが分かった。27年度は、423nm近傍の波長で同調可能な連続発振半導体レーザーとパルス発振YAGレーザーの第2高調波をそれぞれCa同位体選択励起用光源、およびイオン化用光源として用い、レーザーでイオン化されたCa原子の質量スペクトルを飛行時間法を用いて測定することにより、予備的な分離実験を行った。その結果、レーザー照射領域における標的同位体の高効率イオン化と同位体の高い選択性を同時に達成することは困難であることが示唆された。このことを踏まえ、今後、同位体選択性とイオン化効率の両方を改善するために、YAGレーザーの代わりに波長可変パルス色素レーザーを用いた共鳴的イオン化の方式を採用し、分離実験を試み性能を評価する。手法に関しては基本的に昨年と同様であるが、イオン化にどの波長を用いるかというところが性能に大きく影響すると考えられる。実施の手順は次のとおりである。(1)Ca原子ビームの発生:真空容器内でCaをヒータ加熱によりCa原子蒸気を発生させ、アパーチャによりコリメートし、鉛直方向に原子ビームを形成する。(2)レーザー照射:選択励起用半導体レーザー光と、イオン化用YAGレーザー光を同軸上に重ね、真空容器内で原子ビームに直角に照射する。選択励起段のCaの遷移確率が大きいため、数10mWの半導体レーザーは集光せずに照射する。一方、色素レーザー光はレンズで集光して照射する。(3)同位体選択性の分析:レーザー照射により生成したCaイオンは電界によりレーザービームおよび原子ビームの両方に対して直角方向に偏向し、質量分析を行う。過去の文献により適用可能な波長を選択し、それらの波長に色素レーザーを同調して分離実験を試みる。また、色素レーザーの波長を広範囲にわたり掃引し、Cano励起状態からのイオン化スペクトルの取得を試みる。これらより本方式の性能を評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
歯根膜神経再生時における血液神経関門の動態

末梢神経の軸索変性の急性期には、一時的に血液神経関門が開くことが知られているが、歯根膜ルフィニ神経における血液神経関門を介した分子の供給機構および調節機構については全く不明である。そこで歯根膜ルフィニ神経の再生過程において、血管内皮細胞の動態について検索した。下歯槽神経切断7日後、実験側の歯根膜切歯側領域に血管内皮細胞が伸長し、周囲に遊走シュワン細胞が観察された。14日後には対照群と同様の局在を示した。歯根膜ルフィニ神経終末の再生過程において、神経切断後7日後の歯根膜に血管が一時的に出現し、この血管を足場にしてシュワン細胞が遊走し神経終末の再生に重要な役割を果たす可能性が示唆された。下歯槽神経再生過程の機能血管の動態を観察することを目的として、本年度は、対照群(下歯槽神経非切断群)とする正常ラットに対しトマトレクチンによる標識を行い、歯根膜および三叉神経節の機能血管について検索を行った。8週齢の雄性成熟ラットに、機能血管を標識するトマトレクチン(Lycopersicon esculentum Lectin;Vector社)文献Am J physiol renal phisiol. F721-733; 300, 2011) 1.25mg/kg, (1mg/ml)を外頚静脈より静脈内投与し、5分後に4%パラホルムアルデヒドによる灌流固定を行った。下顎骨および三叉神経節を取り出し、一晩浸漬固定を行い、下顎骨はEDTAにより脱灰後、凍結切片を作成した。凍結切片に対して、機能している血管と機能していない毛細血管の有無およびその分布について検索することを目的に、閉鎖端や新生端等の機能していない血管にも発現する内皮細胞のマーカーであるRECA-1の免疫染色を行った。さらに、抗ASIC3抗体および各種神経栄養因子抗BDNF抗体、神経線維のマーカーとしてPGP9.5タンパク、シュワン細胞のマーカーとしてS-100タンパクを用い免疫蛍光多重染色を行い、共存関係を明らかにするため蛍光顕微鏡にて観察を行った。歯根膜ルフィニ神経終末の再生過程において、終末シュワン細胞が重要な役割を果たすこと、各種神経栄養因子が時期依存的に働くことを明らかにしてきた。一方、末梢神経の軸索変性の急性期には、一時的に血液神経関門が開くことが知られているが、歯根膜ルフィニ神経における、血液神経関門を介した分子の供給機構および調節機構については、全く不明であった。そこで歯根膜ルフィニ神経の再生における血管内皮細胞および血管周皮細胞の動態について検索を行うこととした。実験動物として、これまでの我々の研究により研究データが蓄積されているラットを用いた。(1)下歯槽神経非切断群(対照群)における機能血管の標識。(2)三叉神経節に対する免疫細胞化学。(3)歯根膜神経の再生時における血管内皮細胞および血管周皮細胞の変化と各神経栄養因子の発現様式について検討。(4)下歯槽神経傷害による三叉神経節における機能血管の検討を行った。対照群の歯根膜において、樹枝状に分岐した歯根膜ルフィニ神経終末、楕円形の終末シュワン細胞、血管内皮細胞は主に歯根膜の歯槽骨側に限局した。一方、下歯槽神経切断7日後の歯根膜では、ルフィニ神経終末はほぼ消失しているが神経線維のわずかな再生を認めた。歯根膜の歯槽骨側に限局していた血管内皮細胞は、歯根膜の切歯側領域にも出現し、その周囲に紡錘形のシュワン細胞の遊走が見られた。下歯槽神経切断14日後には、ルフィニ神経終末は形態的な再生の過程にあり、血管とシュワン細胞はほぼ対照群と同様の分布を示した。これらのことから、歯根膜ルフィニ神経終末の再生過程において、ルフィニ神経終末の再生に先行して、歯根膜の切歯側へ一過性に血管が誘導され、この血管を足掛かりとしてシュワン細胞が遊走しシュワン細胞索を形成し、ルフィニ神経終末の再生の足場を作る可能性が示唆された。トマトレクチンの静脈内投与を行ったが、歯根膜内の血管内皮細胞への標識が弱いため。27年度が最終年度であるため、記入しない。矯正歯根膜神経の再生時における血管内皮細胞および血管周皮細胞の変化と各神経栄養因子の発現様式について検討する。1.下歯槽神経傷害には、下歯槽神経切断モデルを用い、トマトレクチンにより機能血管を標識し、歯根膜神経再生中の機能血管の動態を多重免疫染色にて検索する。

各種内皮細胞のマーカーとしてCD31、RECA-1、また周皮細胞のマーカーとしてα-SMA、Desminを、神経線維およびシュワン細胞のマーカーとしてそれぞれPGP9.5タンパク、S-100タンパクを用いる。また、血管増殖因子VEGFの発現変化について検索する。2.神経再生中の遊走内皮細胞およびシュワン細胞の動態と神経栄養因子の関連性の検討を行う。各種抗体を用いて、免疫組織化学およびin situ hybridizationを行う。3.下歯槽神経傷害による三叉神経節における機能血管の検討として、三叉神経節における、血管の変化と神経およびグリア細胞について検討する。4.下歯槽神経再生中の歯根膜における、内皮細胞様遊走細胞および遊走シュワン細胞のASIC3および神経栄養因子のmRNA量の測定を行う。下歯槽神経損傷後、経日的に試料を採取し、未固定未脱灰切片を作成し、S-100タンパクおよびASIC3の免疫染色に供する。この標本からレーザーマイクロダイセクション装置を用いてS-100タンパク陽性終末シュワン細胞、またASIC3陽性の血管内皮細胞様細胞を採取する。採取した試料からtotal RNAを抽出し、Real time PCR装置にて各種神経栄養因子の発現量の変化を明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ポータブル心臓灌流装置を用いた心停止ドナーからの心臓移植の臨床応用

心臓移植は、重症心不全に対する最終的な治療として世界的にその重要性が唱えられており、近年、移植医療のさらなる発展が見られている。一方、現在、日本での最大の問題点はドナー不足であり、移植待機中に亡くなられる患者が少なくない。そこで、本研究ではドナー候補でありながら、心機能の点から心移植を断念する例(主として心停止ドナー)を想定した動物モデルに対して、体外循環を用いた調節再灌流を行うことにより心蘇生を行い、移植に適するまでに心機能が回復することを実験的に証明することを目的に研究を進めていく。一方、現在、日本での最大の問題点はドナー不足であり、移植待機中に亡くなられる患者や海外渡航による移植が後を断たない。心移植のドナープールを増やすために、現在、心停止後ドナー心の活用が世界中で模索されているが臨床応用はまだ散発しているのみであり、その問題としてマージナルドナーである心停止ドナーの心臓が移植に耐えうるか判断が困難であることがあげられる。心停止後ドナー心の移植用グラフトとしての有効性を証明するには、移植前に体外で心機能を評価する必要があり、負荷非依存性の心機能測定法の確立が必要である。我々は、以前よりブタ心停止後ドナーモデルを作成し、その心機能評価に取り組んでおり、これまでの研究の中で、体外での心機能を評価する方法について種々の検討を行ってきた。本年度の検討では、まず心停止ドナーの問題の一つである心筋細胞の過伸展に注目した。心筋細胞に伸展負荷刺激を加えた際に発現する遺伝子としてc-fos mRNAが知られている。c-fosは、伸展負荷後5分と非常に早くから発現を認め、その発現レベルは伸展の強度に依存していることから心室容量負荷の程度を定量化する指標となる。この研究の結果として、心停止後ドナー心では左室心筋に対して右室心筋は7倍以上のc-fos発現が認められた。すなわち、虚血心停止時には左室と比較して右室に対しより大きな容量負荷がかかっていることが示された。当初の目的である、ポータブル還流装置を用いた心臓の蘇生、還流は可能となり、また心機能低下の原因とされる心筋の過伸展について示唆されている。今後は、ポータブル還流装置で心機能評価を行うことで、移植に耐えうるかどうかの判断が可能となるか検討する予定である。前述のとおりすでにポータブル還流装置による心臓の還流は可能となっており、今後の研究を円滑に行えると考えている。今後は、ポータブル還流装置を用いて、移植前の心機能評価が可能であるか検討を行う予定である。ポータブル還流装置では、生体と違い心臓に対する前負荷および後負荷がなく、装置内でいかに生体内の環境を作成するかが重要となる。これらは人工心肺に使用する血液ポンプや人工肺および貯血槽を組み合わせて行くが、心臓生理に関する知識を必要とする。最終的には、ポータブル還流装置内で評価した心臓を、実際に移植して再度心機能を測定することにより、ポータブル装置内での心機能評価の信頼性を探ることができ、ひいては臨床応用可能かどうかの判断となる。

当初の目的である、ポータブル還流装置を用いた心臓の蘇生、還流は可能となり、また心機能低下の原因とされる心筋の過伸展について示唆されている。今後は、ポータブル還流装置で心機能評価を行うことで、移植に耐えうるかどうかの判断が可能となるか検討する予定である。前述のとおりすでにポータブル還流装置による心臓の還流は可能となっており、今後の研究を円滑に行えると考えている。今後は、ポータブル還流装置を用いて、移植前の心機能評価が可能であるか検討を行う予定である。ポータブル還流装置では、生体と違い心臓に対する前負荷および後負荷がなく、装置内でいかに生体内の環境を作成するかが重要となる。これらは人工心肺に使用する血液ポンプや人工肺および貯血槽を組み合わせて行くが、心臓生理に関する知識を必要とする。最終的には、ポータブル還流装置内で評価した心臓を、実際に移植して再度心機能を測定することにより、ポータブル装置内での心機能評価の信頼性を探ることができ、ひいては臨床応用可能かどうかの判断となる。
Wiskott-Aldrich症候群の分子病態の解明とType2-WASの提唱

原発性免疫不全症であるWiskott-Aldrich症候群(WAS)の原因遺伝子は主に細胞骨格系を司るWASPであり、WAS患者でWASP蛋白質発現量と臨床的予後が相関することは報告されているが、T細胞におけるWASP蛋白質分解の分子機序は不明であり、本疾患の分子病態を理解する上で重要である。本研究代表者は、前年度の研究実績報告に加えて、WIPノックアウトマウスT細胞においてWASP蛋白質が不安定で蛋白質発現量が低下していること、T細胞受容体シグナル伝達系におけるWASP蛋白質分解が蛋白分解酵素calpainおよびubiquitin-proteasome系によって制御されること、WIPノックアウトマウス及びWAS患者T細胞を用いた実験結果から、WIPはWASP蛋白質の安定化に不可欠であることを発見した。臨床的にWAS患者に認められるWASPミスセンス変異の大部分がWIP結合領域に集中している分子基盤として、このWIPによるWASP蛋白質安定化の機構がこれらのWAS患者の分子病態の理解に重要であり、機能的にも細胞骨格系の制御に重要であることを証明した。更に、患者T細胞を用いて、calpainおよびubiquitin-proteasome系阻害剤や既に臨床応用がなされているproteasome阻害剤により、WASP蛋白質発現量が上昇することを発見した。これらの成果はPNASに共筆頭者として論文が受理された。また、上記の研究成果およびWASPとWIPノックアウトマウスの表現形の類似性から、常染色体遺伝性Type2-WASとしてのWIP欠損症のスクリーニングを施行した。これまで可能性のある症例検体を国内より入手し、WIP蛋白質発現および遺伝子変異の検索を行ったが、WIP遺伝子異常は認めなかった。世界的にもまだ報告がなく、今後も検索症例数を増やし、研究を継続する。Wiskott-Aldrich症候群(WAS)の原因遺伝子はWASPであり、患者でWASP蛋白質発現は低下しているが、WASP蛋白質分解の機序は不明である。本研究代表者は、WASP-Interacting Protein (WIP)ノックアウトマウス(-/-)T細胞においてWASP蛋白質発現が対照の10%以下に低下し、WAS患者のWASPミスセンス変異の90%以上がWIP結合領域に集中していることを発見した。本年度の研究により、1)WIP-/-におけるWASP蛋白質の発現低下を、当研究室で作製した抗WASPモノクローナル抗体によるフローサイトメトリー法により確認した。2)T細胞株へのWIP蛋白質の誘導発現系により、WASP蛋白質発現の増加を確認した。3)T細胞受容体シグナル伝達系におけるWASP分解の分子機構として、蛋白分解酵素Calpain及びUbiquitin-proteasome系特にCbl-bの関与をin vitro、in vivoの実験系にて明らかにした。4)T細胞受容体刺激後のWASP-WIP複合体の解離がWASP分解のtriggerになっていることを発見した。5)Calpain、proteasomeの特異的阻害剤によりWASP分解は阻害され、細胞骨格系において機能的な効果を発揮することを、アクチン重合化を指標として検討した。6)WIP結合領域にWASP変異をもつWAS患者検体を用いて、上記特異的阻害剤がWASP蛋白質発現を回復させ、アクチン重合化を機能的に回復させることを見出した。これらより、WIPによるWASP蛋白質の安定化の機構が大多数のWAS患者の分子病態の理解に不可欠であることを示した。この成果は、Immunityに投稿済であり、現在再投稿準備中である。現在、常染色体遺伝性Type2-WASとしてのWIP欠損症のスクリーニングが進行中である。原発性免疫不全症であるWiskott-Aldrich症候群(WAS)の原因遺伝子は主に細胞骨格系を司るWASPであり、WAS患者でWASP蛋白質発現は低下し、その発現量と臨床的予後が相関することは報告されているが、WASP蛋白質分解の分子機序は不明であり、本疾患の分子病態を理解する上で重要である。本研究代表者は、前年度の研究実績報告に加えて、T細胞受容体シグナル伝達系におけるWASP蛋白質分解が蛋白分解酵素calpainおよびubiquitin-proteasome系によって制御されること、WIPノックアウトマウス及びWAS患者T細胞を用いた実験結果から、WIPはWASP蛋白質の安定化に不可欠であることを発見した。これらの追加実験を加えることでさらに詳細な研究成果を得、この成果は再投稿済である。今後もWASP蛋白質活性化と分解を繋ぐ分子機序の研究を継続する予定である。現在、上記の研究成果および、WASPとWIPノックアウトマウスの表現形の類似性から、常染色体遺伝性Type2-WASとしてのWIP欠損症のスクリーニングが国内検体を中心に進行中である。これまで可能性のある症例より4検体を入手し、WIP蛋白質発現および遺伝子変異を検索中である。WIP欠損症のスクリーニングと病態解析の遂行には、ハーバード大学医学部小児科学・ボストン小児病院免疫学部門Raif S. Geha研究室との共同研究を継続している。

原発性免疫不全症であるWiskott-Aldrich症候群(WAS)の原因遺伝子は主に細胞骨格系を司るWASPであり、WAS患者でWASP蛋白質発現量と臨床的予後が相関することは報告されているが、T細胞におけるWASP蛋白質分解の分子機序は不明であり、本疾患の分子病態を理解する上で重要である。本研究代表者は、前年度の研究実績報告に加えて、WIPノックアウトマウスT細胞においてWASP蛋白質が不安定で蛋白質発現量が低下していること、T細胞受容体シグナル伝達系におけるWASP蛋白質分解が蛋白分解酵素calpainおよびubiquitin-proteasome系によって制御されること、WIPノックアウトマウス及びWAS患者T細胞を用いた実験結果から、WIPはWASP蛋白質の安定化に不可欠であることを発見した。臨床的にWAS患者に認められるWASPミスセンス変異の大部分がWIP結合領域に集中している分子基盤として、このWIPによるWASP蛋白質安定化の機構がこれらのWAS患者の分子病態の理解に重要であり、機能的にも細胞骨格系の制御に重要であることを証明した。更に、患者T細胞を用いて、calpainおよびubiquitin-proteasome系阻害剤や既に臨床応用がなされているproteasome阻害剤により、WASP蛋白質発現量が上昇することを発見した。これらの成果はPNASに共筆頭者として論文が受理された。また、上記の研究成果およびWASPとWIPノックアウトマウスの表現形の類似性から、常染色体遺伝性Type2-WASとしてのWIP欠損症のスクリーニングを施行した。これまで可能性のある症例検体を国内より入手し、WIP蛋白質発現および遺伝子変異の検索を行ったが、WIP遺伝子異常は認めなかった。世界的にもまだ報告がなく、今後も検索症例数を増やし、研究を継続する。
B型肝炎におけるBane粒子構成ポリペプチドに関連した抗原抗体系の臨床的意義

HBVの芯を構成するcore粒子は、HBV DNAのC遺伝子の遺伝情報に基づき発現される183残基のアミノ酸からなるcore蛋白が約300個集合して形成される。core蛋白には、粒子形成した際表面に出てくるc抗原決定基と、粒子内部にかくれてしまうe抗原決定基があるが、その他にC末端34個のアミノ酸からなるペプチド部分にはHBinner core抗原と呼ばれる抗原基が存在することが明らかになった。そしてHBV感染者の血清中にはHBic抗原に対する抗体が検出される例があることが分った。HBic抗体はHBe抗体陽性の無症候性キャリアに高頻度、高力価に検出された。蛍光抗体法でHBic抗原の局在を検討すると、活動性の強いB型慢性肝疾患例で、HBC抗原、HBe抗原とほぼ同一の状態で検出された。近年HBVのC遺伝子の発現では、各種の病態に関連してpreーC領域の遺伝子の発現が注目されている。本研究者らも、HBe抗原からHBe抗体へのseroconvertion例、reactivation例、HBe抗体陽性でありながらHBV DNAが高値を示すB型慢性肝炎例、B型劇症肝炎例につき、preーC領域の塩基配列を検索した。その結果、HBe抗原のseroconvertion現象はHBV野生株からpreーC変異株への置換と、野生株の増殖する肝細胞の免疫学的排除であることが明らかになるとともに、HBe抗体陽性の活動性慢性肝炎やB型劇症肝炎ではpreーC変異株が増殖していることから、一部のpreーC変異株には強い肝炎惹起能があるものと考えられた。尚、これらのpreーC変異株ではpreーC領域の83番目の塩基がGーtoーA点変異を来たし、28番目のcodonがstop codonとなる変異が大部分を占めていた。B型肝炎ウイルは直径42nmの球型粒子で、core粒子と外殻部分から構成される。外殻部分にはpreS-1、preS-2、S抗原が存在し、core粒子構成ペプチドにはHBc抗原、HBe抗原、HBic抗原が存在する。HBキャリア43例の肝組織について、各種モノクロ-ナル抗体を用いて上記の抗原の組織局在を検討し、病態との関連を考察した。その結果、肝組織内のpreS-1抗原、preS-2抗原はS抗原と一致して染色されること、HBc抗原、HBe抗原、HBic抗原も一致して検出され、それらの症例ではS関連抗原の陽性率が高いこと、HBe抗原陽性例、GPT高値例、CAHではD関連抗原、c関連抗原の染色率が有意に高率であることが明かなった。この事実はHBVの遺伝子産物の発現が系統的に行われていることを示しており、HBVの増殖の盛んな宿主では、一たんこれらの抗原に対する免疫応答が始まれば、強い組織障害が生ずる可能性を孕むものと考えられた。次に宿主の免疫応答の一部を解明する目的で、B型劇症肝炎患者のpreS-1、preS-2抗原に対する液性抗体に関して他施設との共同研究を行った。11例のB型劇症肝炎患者はIgM型、IgA型のpreS-1抗体、preS-2抗体の高力価を示し、特にIgA型のpreS-1抗体、preS-2抗体は非劇症化例に比し有意な高値であった。したもIgA型抗体はポリマ-型が主体であり,劇症肝炎では液性抗体反応の亢進状態にあるものと考えられた。IgA抗体が特に高値を示す理由に関しては不明な点が多いが、肝胆道系を介したIgAの代謝の障害が一部関連しているものと推測される。Dane粒子に関連した研究は最近HBVのpreーC領域に集中しており、本研究者らもpreーC領域の発現に焦点をあてた臨床的研究を行った。

一般にB型肝炎では、HBe抗原陽性期にはHBVの増殖が盛んで、肝病変の活動性も強いが、HBe抗原のseroconversionとともに、ウイルス増殖、肝病変の活動性は鎮静化し、HBe抗体の出現とともに肝病変は非活動化することが知られている。しかし少数例ではあるが、HBe抗体陽性でありながら活発なウイルス増殖を示し、極めて活動的な肝病変を示す一群のB型慢性肝炎が経験される。本研究者らはHBe抗体陽性でありながら、HBe抗原陽性例に匹敵するHBVウイルス量を示すB型慢性活動肝炎の3例を選別し、Dane粒子を回収し、preーC領域を含むDNA断片を調整した上で、preーC領域の塩基配列を決定した。その結果、3症例より合計10クロ-ンを得たが、それらのクロ-ンでは共通してpreーC領域の83番目の塩基が“A"となっており、HBV野生株の“G"から点変異が起っていることが確認された。そのためpreーC領域の28番目のアミノ酸はstop codonとなり、HBe抗原の合成、分泌が阻害されるものと考えられた。すなわち、HBe抗体陽性でありながら、活発なウイルス増殖を示し、活動的な肝病変を示すB型肝炎では、preーC領域に変異があり、HBe抗原を分泌できないHBV変異株が活発な増殖をしていることが判明した。この事実は各種の発現実験やHepadnaウイルスを用いた感染実験からも合理的であること考えらるが、何故一部のHBe抗体陽性例のみに活発なウイルス増殖がみられ、しかも極めて活動的な肝病変がみられるのか今後の課題である。本研究者らは、前年度までに、Dane粒子の内部に存在するcore粒子を構成するcore蛋白のC末端にはHBinner core抗原活性が存在し、それに対する抗体がHBe抗体陽性の無症候性キャリアの血清中に高頻度、高力価に存在すること報告した。その間HBVに関する基礎的な発現実験の結果、core蛋白のN末端、ないしは更に上流の遺伝子にコ-ドされるpreーC領域の発現産物がB型肝炎の病態に密接に関連することが明らかにされてきた。そこで本研究者らもHBV感染症としては最もdrasticな経過を示すB型劇症肝炎につき、HBV DNAのpreーC領域を検討した。その結果6例のB型劇症肝炎から合計88クロ-ンのHBV株が得られたが、それらは全てpreーC領域の83番目の塩基がGーtoーAの点変異を示し、28番目のコドンがstop codonとなったpreーC領域変異株であった。対照とした通常経過を示すB型急性肝炎6例からは合計121クロ-ンが得られたが、HBe抗原、HBe抗体に関係なく、全てのクロ-ンはHBe抗原を分泌できる野生株であった。本研究者らは既に、HBe抗体陽性でありながら、HBVが活発な増殖を示す活動性の強いB型慢性肝炎の一群でも、preーC変異株が活発な増殖を示す事実を報告したが、一部のpreーC変異株は特に肝病変の惹起能が強いものと推測される。一般にHBe抗原からHBe抗体にseroconversionしたHBVキャリアでは、ウイルスの増殖が極端に弱まり、肝病変も鎮静化するのに、何故一部のHBe抗体陽性者では活発なウイルス増殖が続き、一部のpreーC変異株が強い肝病変を引き起こすのか今後に残された課題である。
γ-セクレターゼ制御Deltaシグナルの末梢CD4T細胞分化に おける役割

様々な培養条件下で末梢のCD4 T細胞を培養する際にNotch, Deltaシグナルを加えることでその分化への影響を検討した。Th1, Th2, Treg等への分化への顕著な影響はいずれの培養でも見られなかったが、わずかではあるがニュートラルコンディションでNotchシグナルがTh17分化を促進する傾向が見られた。Th17コンディションではこの傾向はみられず、NotchシグナルはTGF-βやIL-6で誘導するTh17とは異なる経路で分化を誘導する可能性が考えられた。Notch/Deltaは両方向性シグナルであり、免疫学分野においてNotchシグナルの研究は数多くあるが、Deltaシグナルの研究は少ない。そこで、末梢CD4T細胞の分化の際にDeltaシグナルがどのように関わるかをNotchシグナルの役割と並べて検討するのが本研究の目的である。初めに末梢CD4T細胞においてNotch (Notch1-4)およびNotchリガンド(Delta1-like protein (D11) 1, 3, 4, Jaggedl, 2)を発現しているかどうかを脾細胞由来CD4T細胞で検討した。その結果、NotchにおいてはNotch1の発現が強く認められ、Notch2および3はやや弱いが発現が認められた。Notch4については発現が認められなかった。リガンドの発現においてはDll1とJagged2の発現は認められたが、他のリンガンドの発現は検出できなかった。またこれらの細胞を抗CD3抗体と抗CD28抗体で刺激した際にはこれらの分子の発現に大きな変化は認められなかった(刺激後2日目まで検討)。これらの結果から、末梢CD4T細胞はNotch1,2,3およびDll1, Jagged2のシグナルを受ける可能性が示された。末梢CD4T細胞を抗CD3と抗CD28で刺激(プライミング)する際にNotchもしくはDeltaを発現したCOS7細胞を共存させることでDeltaシグナルおよびNotchシグナルをT細胞に与え、一週間培養後に細胞を回収し、サイトカイン発現を調べることでどのようなヘルパーT(Th)細胞に分化したかを調べた。まず、細胞内サイトカインを染色することで検討したが、IFNγ, IL-4, IL-10, IL-17の発現にはNotchシグナル、Deltaシグナルを与えた細胞群とコントロールの細胞群の間に差異はなかった。また、Th分化の指標となるマスター遺伝子の発現についても検討したが、大きな差は認められなかった。現在までの結果で大きな差は認められていないが、今後はプライミングを複数回行なうことでの検討や、ある特定のTh細胞分化を誘導する条件下でのNotch/Deltaシグナルの役割について検討を重ねていく予定である。Notch/Deltaは両方向性シグナルであるが、免疫学分野においてNotchシグナルの研究は数多くあるが、Deltaシグナルの研究は少ない。22年度までに末梢CD4T細胞を抗CD3と抗CD28のビーズで刺激(プライミング)する際にNotchもしくはDeltaを発現したCOS7細胞を共存させることでDeltaシグナルおよびNotchシグナルをT細胞に与え、どのようなヘルパーT(Th)細胞に分化したかを調べるために、細胞内サイトカイン染色やTh分化の指標となるマスター遺伝子の発現をRT-PCRにより検討したが、大きな差は認められなかった。23年度は、このプライミングが一度だけでは完全なTh細胞への分極化が見られないということで、同様の刺激を頻回行なうことで、さらに検討を進めた。しかしながら、抗CD3と抗CD28のビーズ(ミルテニ社)のプロトコール通りの刺激(1回目と同じ)を2回目に行なったところ、刺激が入らないようで、細胞が十分活性化・増殖しなかった。何度か同様に試みたものの、うまく刺激が入らないようだったので、頻回刺激できる条件を検討することにした。ファクターとしては一回目から二回目までのインターバル期間の長さ、増殖に必須であるIL-2の添加する濃度、細胞の濃度やビーズの濃度(比率)などを主に検討した。結果として、IL-2の濃度を少し下げることで2回目以降の刺激が入り、増殖することが分かった。インターバルについては1週間から10日程度で調べたが、10日経過すると細胞がかなり死に始めるため、7-8日程度が良いと判断した。上記条件にすれば、細胞濃度やビーズ濃度はプロトコール通りで刺激できた。以上より、今後はIL-2の濃度を下げた状態で行なうことにした。Notch/Deltaは両方向性シグナルをもつが、免疫分野においてDeltaシグナルの解析は皆無である一方、Notchシグナルの役割についてもはっきりしない部分が多い。本研究では末梢CD4 T細胞の分化に於けるNotchシグナルおよびDeltaシグナルが両方向性シグナルとしてどのような影響を及ぼすかについて、特にDeltaシグナルに着目して検討した。

抗CD3+抗CD28抗体によるT細胞刺激時に安定的にDeltaシグナル、Notchシグナルを付加するため、HEK293細胞を親株にNotchおよびDelta発現HEK293細胞株を樹立し、実験に用いた。培養にサイトカインを含まないニュートラルな条件ではNotchおよびDeltaシグナルを付加しても大きな差異は見られなかったため、様々なTh細胞誘導条件にNotch, Deltaシグナルを付加して検討を行った。まずTh1およびTh2誘導の培養条件ではNotch, Deltaシグナルを付加しても大きな差異は見られなかった。また、制御性T細胞を誘導する培養条件においても、そのマスター遺伝子であるFoxp3の発現割合に差異は見られなかった。他方、Th17を誘導する条件においてはDeltaシグナルを付加した場合に僅かではあるが、IL-17産生細胞が増加し、逆にNotchシグナルの場合は低下する傾向にあった。制御性T細胞とTh17細胞を誘導する培養条件ではTGFβを添加するが、DeltaシグナルはTGFβシグナル経路の最終段階で働く転写因子Smadの転写活性を増強させることから、Th17においてもTGFβ/Smadシグナルを修飾している可能性が考えられる。Th17分化はSmadに非依存的であるという報告もあるため、Notch/DeltaによるTh17分化メカニズムがSmadに依存するかどうかなどの詳細を今後検討したい。当初考えていた頻回刺激の実験において、2回目以降の刺激が充分に入らなかったために、その条件検討を行なうのに時間がかかってしまい、やや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に続き、頻回刺激の実験を行なうとともに、ある特定のThを誘導するサイトカインを加えた状態で刺激する際にNotch/Delta刺激を加えることでの影響を調べる。特にTGF-βを必要とするTregおよびTh17分化において、転写因子SMADを介するTGF-βシグナルをDeltaシグナルが修飾することが神経細胞分化で分かっていることより、この点に重点をおいて検討したい。この際にも、サイトカインの条件や抗CD3と抗CD28抗体刺激の条件がポイントになり、細かな条件検討が必要かもしれないので、その点も考慮しながら実験を進めていきたい。
金属ドープ金属内包フラーレン：双方向電荷移動超分子

金属内包リチウムイオン内包フラーレン(Li+@C60)は、市販されている新たな内包フラーレンであり、その電子的特性、構造、応用の可能性に近年,注目があつまっている。このLiイオン内包フラーレンに続いて研究の目標となるのは、中性のLi@C60である。なぜなら、フラーレンケージ内に中性のLi原子が存在するという状態は、「超水素原子」を作り出すことを意味するからである。しかしながら、報告された中性のLi@C60の作製方法は、効率的ではなく、時間がかかる。我々は容易に入手出来る還元剤であるデカメチルフェロセンを用いることで化学的に還元するという、簡便で、信頼性の高い、効率的な、中性のLi@C60の合成方法を開発した。この方法で作製した固体試料について、X線回折、ラマンおよびEPRを用いて研究を行った。化学還元で作製したLi@C60は、EPR不活性なダイマー化した(Li@C60)2の割合が少なく、ラジカルモノマー種(Li+@C60(-))の割合が多いことを発見した。新しい合成方法を発見したのみならず、Li+@C60とLi@C60を統合した金属内包フラーレンの特異な一群を理解する上で重要な特性に関する知見を得た。この研究で成し遂げた結果は、機能性分子材料、特に分子性炭素材料を基にした拡張π電子系を研究する材料化学者らの研究にも直結するものであった。超伝導体は、電気抵抗が0で、電気をエネルギー損失なく運ぶことが出来る。ゼロ抵抗に変わる温度をより高くするための新たな材料の開発は、材料科学が現在挑戦している最前線の課題の一つである。C60超伝導体は、高い超伝導転移温度を示し、また、極めて高い磁場にも耐え、過去30年間に渡り、材料研究の先頭の一角を担ってきた。しかしながら、近年、C60超伝導体の性能は頭打ちになっていたのも事実であり、代表者らは、従来のC60超伝導体の性能を越えることに挑戦している。高い対称性をもった金属イオンを内包した超原子的炭素骨格という未開拓のものを対象に、骨格の外から中へと、中から外への双方向の電子ドーピングによる電子制御という前例のないメカニズムを用いて、この目標を達成することを目指している。この種の系はこれまでに存在しないので、実に挑戦的な課題であり、もしも達成することが出来れば、素晴しい性能を発揮することが期待される。現在、母物質たる中性のリチウム内包C60フラーレンのバルク試料を合成し、その特性を調べるという最初のマイルストーンを達成した。これは、本研究課題の最終目標に向けて、着実に進んでいるということの証左である。電気化学合成により、Li+@C60カチオンから1電子還元してLi+@C60-ラジカルアニオンを、3電子還元してLi+@C603-アニオンを作り出す。最終的にアルカリ金属との化合物を作る際には、電解質およびそれ由来のカチオンは不要なので、これらを除去する方法を検討する。また、KHなどアルカリ金属化合物とこの段階で反応させて、K2[Li@C60]を直接生成することも検討する。Li@C60にKやRbをドープし、C60ケージの内部と外部にそれぞれ異なるアルカリ金属原子が存在する全く新しい物質の作製を試みる。合成方法については、通常のAxC60の合成に用いられるアルカリ金属とC60をガラス管に封入し、加熱して反応させる固相法に加えて、申請者らが開発・発展させた有機溶媒中で反応させる液相法を併用し、最適な合成条件を探る。作製したアルカリ金属ドープLi@C60 (AxLi@C60)について、粉末X線回折や磁性測定など、基本的な物性評価を行うとともに、生成物中のアルカリ金属の量を調べ、仕込み組成に対して実際の組成がどのようになっているのかを検討する。得られた良質の結晶性試料について、放射光を用いた精密粉末X線回折を行い、その結晶構造を解明する。また、構造解析と元素分析等を組み合わせることで、実際の組成がどのようになっているのかを確認する。磁化率測定、EPR、NMR、ラマン分光や赤外分光といった基本的な物性測定により、AxC60で観測された金属-絶縁体転移や超伝導転移ならびにヤーンテラー歪みといった現象がAx[Li@C60]でも起こるのかどうかを調べる。これにより、最適な組成のAx[Li@C60]を合成し、フラーレン超伝導体の持つ分子性固体中最高のTc = 38 Kを越える新規分子性超伝導体の実現を目指す。

化学還元で作製したLi@C60は、EPR不活性なダイマー化した(Li@C60)2の割合が少なく、ラジカルモノマー種(Li+@C60(-))の割合が多いことを発見した。新しい合成方法を発見したのみならず、Li+@C60とLi@C60を統合した金属内包フラーレンの特異な一群を理解する上で重要な特性に関する知見を得た。この研究で成し遂げた結果は、機能性分子材料、特に分子性炭素材料を基にした拡張π電子系を研究する材料化学者らの研究にも直結するものであった。超伝導体は、電気抵抗が0で、電気をエネルギー損失なく運ぶことが出来る。ゼロ抵抗に変わる温度をより高くするための新たな材料の開発は、材料科学が現在挑戦している最前線の課題の一つである。C60超伝導体は、高い超伝導転移温度を示し、また、極めて高い磁場にも耐え、過去30年間に渡り、材料研究の先頭の一角を担ってきた。しかしながら、近年、C60超伝導体の性能は頭打ちになっていたのも事実であり、代表者らは、従来のC60超伝導体の性能を越えることに挑戦している。高い対称性をもった金属イオンを内包した超原子的炭素骨格という未開拓のものを対象に、骨格の外から中へと、中から外への双方向の電子ドーピングによる電子制御という前例のないメカニズムを用いて、この目標を達成することを目指している。この種の系はこれまでに存在しないので、実に挑戦的な課題であり、もしも達成することが出来れば、素晴しい性能を発揮することが期待される。現在、母物質たる中性のリチウム内包C60フラーレンのバルク試料を合成し、その特性を調べるという最初のマイルストーンを達成した。これは、本研究課題の最終目標に向けて、着実に進んでいるということの証左である。電気化学合成により、Li+@C60カチオンから1電子還元してLi+@C60-ラジカルアニオンを、3電子還元してLi+@C603-アニオンを作り出す。最終的にアルカリ金属との化合物を作る際には、電解質およびそれ由来のカチオンは不要なので、これらを除去する方法を検討する。また、KHなどアルカリ金属化合物とこの段階で反応させて、K2[Li@C60]を直接生成することも検討する。Li@C60にKやRbをドープし、C60ケージの内部と外部にそれぞれ異なるアルカリ金属原子が存在する全く新しい物質の作製を試みる。合成方法については、通常のAxC60の合成に用いられるアルカリ金属とC60をガラス管に封入し、加熱して反応させる固相法に加えて、申請者らが開発・発展させた有機溶媒中で反応させる液相法を併用し、最適な合成条件を探る。作製したアルカリ金属ドープLi@C60 (AxLi@C60)について、粉末X線回折や磁性測定など、基本的な物性評価を行うとともに、生成物中のアルカリ金属の量を調べ、仕込み組成に対して実際の組成がどのようになっているのかを検討する。得られた良質の結晶性試料について、放射光を用いた精密粉末X線回折を行い、その結晶構造を解明する。また、構造解析と元素分析等を組み合わせることで、実際の組成がどのようになっているのかを確認する。磁化率測定、EPR、NMR、ラマン分光や赤外分光といった基本的な物性測定により、AxC60で観測された金属-絶縁体転移や超伝導転移ならびにヤーンテラー歪みといった現象がAx[Li@C60]でも起こるのかどうかを調べる。これにより、最適な組成のAx[Li@C60]を合成し、フラーレン超伝導体の持つ分子性固体中最高のTc = 38 Kを越える新規分子性超伝導体の実現を目指す。
小児腹部手術周術期におけるグレリンの病態生理学的意義の検討と臨床応用に向けた研究

本研究では、小児の各腹部手術周術期の血中グレリン濃度の推移を検討した。具体的には小児の腹腔鏡下鼠径ヘルニア修復術、臍ヘルニア手術、良性腫瘍切除術、胃瘻造設術、噴門形成術、ヒルシュスプルング病根治術、先天性胆道拡張症根治術、胆道閉鎖症根治術、生体部分肝移植手術などである。小児外科疾患が成人と比較して稀な疾患が多いため、現在も症例を蓄積して解析をすすめている。以上の手術のうち、生体部分肝移植手術が目標数に達したため、胆道閉鎖症術後の生体部分肝移植手術患児を対象に解析を行った。その結果、小児生体部分肝移植手術において、術後血中グレリン濃度を大きく低下し、徐々に回復することが明らかとなった。また術後1日目の血中グレリン濃度は肝逸脱酵素や阻血時間と負の相関関係を認めた。基礎研究において、内因性のグレリンが肝臓の虚血再灌流モデルにおいて肝保護効果を認めるとの報告があることから、本検討においても移植肝の虚血再灌流傷害からの回復に内因性のグレリンが消費されて、術後に血中グレリン濃度が大きく低下した可能性が示唆された。虚血再灌流傷害は肝移植において大きな問題の一つであり、早期の移植肝不全の原因の10%を占めており、また急性・慢性拒絶反応の発症とも関連している。以上より、周術期にグレリンを補充することで虚血再灌流傷害等の移植肝への傷害を軽減させ、これらの合併症予防につながる可能性が示唆される結果が得られた。本結果は2018年に31st International Symposium on Pediatric Surgical Researchで発表し、Pesiatric Surgery Intrernational(2019 [Epub ahead of print])に掲載予定である。グレリンは胃から分泌される消化管ペプチドホルモンであり、摂食促進や消化管運動促進や抗炎症作用など多彩な生理活性を有する。成人外科領域では、周術期の血中グレリン濃度と手術侵襲との関連が報告されているが、小児を対象としたグレリンに関する研究報告は少なく、特に小児外科領域における周術期の血中グレリン濃度の変化に関する報告はない。本研究は小児外科疾患において、周術期の血中グレリン濃度が術後経口摂取再開までの期間や術後炎症所見と相関するとの仮説に基づき、手術を受ける患児を対象として周術期の血中グレリン濃度を測定し、術後回復との関連を検討する。本研究の成果は将来的に、手術侵襲からの早期回復を期待したグレリン投与試験への足掛かりとなることが期待できる。平成28年度は症例集積を主に行い、周術期の血液検体より血中グレリン濃度の測定を行った。疾患・術式別にその推移を検討し、さらに疾患・術式ごとに術後の胃排出機能、経口摂取回復、炎症マーカーの推移、術後合併症の有無等の臨床経過と周術期の血中グレリン濃度との関連性を検討した。上記の検討の結果、侵襲の大きな手術(生体部分肝移植等)において術後に血中グレリン濃度が大きく低下することが判明した。さらに、血中グレリン濃度の推移が手術侵襲、術後胃排出機能、経口摂取回復と相関する可能性が示唆された。今後さらに症例を蓄積し、血中グレリン濃度の推移とこれら臨床所見の関連性を明らかにし、術後に血中グレリン濃度の低下する術式に対して、予防的に合成グレリンの投与やグレリンを分泌促進するとされる六君子湯を投与することで、術後早期経口栄養摂取や手術侵襲による炎症反応の軽減効果を得られるかを検討する。予定通り症例の蓄積を行っているため。平成29年度は平成28年度に引き続き症例集積を継続し、周術期の血液検体より血中グレリン濃度の測定を行った。上記の検討の結果、すべての手術において血中グレリン濃度は術後に大きく低下するが、生体部分肝移植と噴門形成術において術後に血中グレリン濃度が大きく低下することが判明した。さらに肝移植において、術後早期の血中グレリン濃度が肝逸脱酵素と強い相関性を認め、術後血中グレリン濃度の低下と阻血時間との関連が示唆された。また血中グレリン濃度が大きく低下した症例は経口摂取の回復が遅延する傾向を認めた。今後さらに症例を蓄積し、血中グレリン濃度の推移とこれら臨床所見の関連性を明らかにし、術後に血中グレリン濃度の低下する術式に対して、予防的に合成グレリンを投与することで、術後経口摂取の早期回復や手術侵襲による炎症反応の軽減効果を得られるかを検討する。

本研究では、小児の各腹部手術周術期の血中グレリン濃度の推移を検討した。具体的には小児の腹腔鏡下鼠径ヘルニア修復術、臍ヘルニア手術、良性腫瘍切除術、胃瘻造設術、噴門形成術、ヒルシュスプルング病根治術、先天性胆道拡張症根治術、胆道閉鎖症根治術、生体部分肝移植手術などである。小児外科疾患が成人と比較して稀な疾患が多いため、現在も症例を蓄積して解析をすすめている。以上の手術のうち、生体部分肝移植手術が目標数に達したため、胆道閉鎖症術後の生体部分肝移植手術患児を対象に解析を行った。その結果、小児生体部分肝移植手術において、術後血中グレリン濃度を大きく低下し、徐々に回復することが明らかとなった。また術後1日目の血中グレリン濃度は肝逸脱酵素や阻血時間と負の相関関係を認めた。基礎研究において、内因性のグレリンが肝臓の虚血再灌流モデルにおいて肝保護効果を認めるとの報告があることから、本検討においても移植肝の虚血再灌流傷害からの回復に内因性のグレリンが消費されて、術後に血中グレリン濃度が大きく低下した可能性が示唆された。虚血再灌流傷害は肝移植において大きな問題の一つであり、早期の移植肝不全の原因の10%を占めており、また急性・慢性拒絶反応の発症とも関連している。以上より、周術期にグレリンを補充することで虚血再灌流傷害等の移植肝への傷害を軽減させ、これらの合併症予防につながる可能性が示唆される結果が得られた。本結果は2018年に31st International Symposium on Pediatric Surgical Researchで発表し、Pesiatric Surgery Intrernational(2019 [Epub ahead of print])に掲載予定である。予定通り症例の蓄積は行っているが、小児外科疾患の希少性のためさらに症例蓄積の継続が必要である。さらに症例数を増やして、血中グレリン濃度の推移と手術侵襲や術後経口摂取の回復に関連性について検討を行う。さらに症例数を増やして、血中グレリン濃度の推移と術後経口摂取の回復との関連性について検討を行う。前年度までにある程度の物品をそろえたため、次年度使用額が生じたと考えられる。(理由)次年度も引き続き症例蓄積を行う予定である。また解析結果を順次、学会報告や論文報告を行う。(使用計画)検体採取や血中グレリン濃度や炎症性サイトカインの測定に使用する。また研究成果の報告のため、学会発表や論文発表に使用する。血中グレリン濃度の測定をすすめ、また可能であれば炎症性サイトカインの測定も行う。またこれまでの成果について学会発表をすすめ、結果がまとまり次第論文化をすすめる計画である。
エクソン欠失変異エストロゲン受容体遺伝子発現に対するアンドロゲンの作用について

卵巣顆粒膜細胞がアンドロゲン濃度の違いにより、分化と退行の両極に変化し得ることを我々は明らかにしてきた。そこでこの機序を解明する目的にて、アンドロゲンの代謝産物であるエストロゲンについてその受容体の関与の可能性を検討した。エクソン欠失エストロゲン受容体(ERΔ)のうち転写調節活性に対してdominant positiveに作用すると報告されているエクソン5欠失受容体(ERΔ5)とdominant negativeに作用すると報告されているエクソン7欠失受容体(ERΔ7)の発現についてアンドロゲン濃度の違いが発現量にどのような影響を与えるかを定量的RT-PCR法によりmRNAレベルにて測定し検討した。ヒトIVF-ET実施症例より回収された顆粒膜細胞に10^<-9>10^<-5>Mのテストステロンを添加培養し72時間まで経時的にtotal RNAを抽出し目的遺伝子の発現量を検討した。その結果、まずテストステロン添加前の顆粒膜細胞では、ERΔ5, ERΔ7のER Wtに対する発現比率は同一症例においても卵胞ごとににかなり変動を認めた。未熟な卵胞ほどその発現比率が高い傾向にあり、卵胞によってはERΔの発現量がともにER Wtに対して逆転している症例も認められた。またテストステロンの添加により時間依存性、濃度依存性にER Wtの発現量が増加したのに対し、ERΔ5, ERΔ7の発現量は有為な変動を示さなかった。その結果両遺伝子の発現比率は時間、濃度依存性に低下傾向を示した。以上よりER WtとERΔの発現は異なった機序により調節されている可能性が示唆された。またER Wtの発現量の低い卵胞においてはERΔの発現量がその成熟度に応じて異なっていたことによりERΔはER Wtとはその役割がことなる可能性が示唆された。しかし、今回の検討ではアンドロゲン濃度のちがいによるER遺伝子の選択的スプライシングに対する影響には差がなかった。
マウス個体レベルでの分子シャペロンのDNA超ら旋構造調節に関する分子

研究代表者らは、大腸菌の細胞内のプラスミドDNAの超ら旋度が、ストレス刺激を受けると減少することを見いだし、DNAの超ら旋度の変化が熱ショックタンパクの誘導に寄与している、というこれまでには無かった新しい考え方を提唱している。さらに研究代表者らは、熱ショックタンパクDnaKの遺伝子欠損株では、熱ショック後のDNAの弛緩が回復しないこと、並びに、精製したDnaKタンパクが試験管内でのDNAジャイレースの反応産物の超ら旋度を上昇させることを示した。これらの結果は、ストレス刺激で誘導されたDNAの超ら旋構造を熱ショックタンパクが回復させる、という、分子シャペロンによるDNAの超ら旋構造の維持機構の存在を示唆するものである。本研究は、大腸菌で見いだされた、これらの事象の普遍性を、ヒトを含めたほ乳動物細胞で検証することを意図して立案されたものである。分子シャペロンの遺伝子ノックアウトマウスを作出し、ストレス刺激後の体細胞中のDNAの超ら旋度を測定することが、目下の目標である。現在、分子シャペロンのcDNAをプローブとしてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムクローンを得て、ターゲテイングベクターを作成することを目指している。本年度は、遺伝子ノックアウトマウスの作成に必要なES細胞培養室、並びにSPFマウス飼育室、マウス胚操作室の運営を軌道にのせることを第一の目標とした。現在、ES細胞がgerm lineに入り込んだマウスを得ることに成功しており、ノックアウトマウスの作成に必要な基本設備を整えることができたと判断している。