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親権者の意思に反し未成年者に対し生命維持治療を行うための法的指針に関する研究

臨床医としては,親権者の治療拒否の意思に反して生命維持治療を強行することに対しては,たとえこの行為が刑法上正当行為として適法と評価されるとしても,少なからず躊躇を覚えるであろう。その理由としては,(1)医師と親との信頼関係(rapport)が破壊され,医療に支障をきたす,(2)たとえ新生児が救命されても,親がその存在を受容しなければ,結局は新生児の福祉が害されることになる,(3)日本にはドイツのように事前に裁判所から治療の許可を直接受けるような制度がなく,医師は,自らの判断において行動しなければならない,といった点があげられる。このようにみてくると,親による治療拒絶の問題を法的に解決することには,自ずから限界がある。したがって,これに代わりむしろ重要となるのは,障害新生児の権利擁護の視点に立ったうえで,生命維持治療の実施に向け親と医師などの当事者間において自律的なかたちで合意形成がなされること,およびそうした合意形成を促進するためのシステムを医療のなかに設けることであり,このようなシステムを担いうるものとして,「病院倫理委員会」を活用すべきである。この場合、病院倫理委員会は,医療行為の倫理性について審議することに加えて,コンサルテーションやソーシャルワークの機能に特化した小チームを倫理委員会の下部組織としておき,両親,担当の医師や看護婦などの当事者と面接し,当事者間の意見の調整や、必要に応じて関係の修復などもおこなうべきである。これにより,両親の心理的・福祉的ニーズの未充足や医療者との意見の対立など、生命維持治療を阻害する要因を把握し除去しうる。これらのプロセスを踏まえたうえで,病院倫理委員会は,両親をはじめとする当事者に対し助言・調停などの手段を積極的に講じるべきである。こうしたシステムの構築により,新生児の権利擁護の観点から生命維持治療の実施に向けた当事者間の合意形成が促進され、親による治療拒否の問題それ自体が解消されうる。たとえ親権者による治療拒否が児童虐待を構成する不当なものであっても、刑法上は、治療行為に関する同意原則のもとで患者の意思に反する「専断的治療行為」が違法とされるのであり、このことの延長線上において、患者本人が未成年者であるために必要な判断能力を具備していない場合には、その親権者に意思に反する治療行為も刑法上違法とされる可能性がある。そのため、医師が未成年者の救命に不可欠な生命維持治療をその親権者の拒絶意思に反して実施しようとする場合、法的にきわめて不安定な状態におかれることになる。そこで、判断能力を有しない未成年者については同意原則が妥当せず、したがって親権者の同意を得ない生命維持治療であっても刑法上は違法とはならない点について、ドイツの法状況を手がかりにしながら論証することに努めた。ドイツでは、刑法上は親権者の意思に反する生命維持治療が常に違法と解されている一方で、民事上は、生命維持治療に対して親権濫用的な拒絶がなされた場合について、後見裁判所がドイツ民法典1666条--親権者により「子の福祉」が危殆化されたときに後見裁判所が必要な措置をとるべきことを定める--に基づいて介入し親権者に代わりその許可を与えるケースが散見される。そこで、こうしたケースに関する後見裁判所の裁判例なども分析しながら、生命維持治療の拒絶が親権濫用的とされる法的・理論的根拠を明らかにしていくこととした。そして、この作業の成果を刑法の治療行為論のなかに取り込むことにより、民法上親権濫用的とされる治療拒絶が同時に刑法上も無効であり、よって当該拒絶意思に反する生命維持治療については刑法上専断的治療行為とはならず適法である、という点について理論づけを試みた。また、いかなる場合に生命維持治療の拒絶が親権濫用的となるのかという法的基準についても、ドイツ民法典1666条に関する解釈論や後見裁判所の判例を手がかりにして明らかにするよう努めた。

こうしたシステムの構築により,新生児の権利擁護の観点から生命維持治療の実施に向けた当事者間の合意形成が促進され、親による治療拒否の問題それ自体が解消されうる。
軟体動物由来のD-アミノ酸含有ペプチドfulicinおよびfulyalの生理、生化学的研究

1.Fulicinおよびfulyalの分解酵素食道下神経節膜画分にfulicinおよびfulyalを分解する活性を見いだした。この活性は二価金属を必要とし、特定の阻害剤により阻害されることからエンドペプチターゼ24.1.1様酵素によるものと思われる。2.Achatin-l,fulicin,fulyal,およびACEP-I前駆体遺伝子の発現を中枢神経節と心房で観察した。Achatin-l遺伝子は食道下神経節から検出され、心房からは検出されなかった。fulicin,fulyal遺伝子とACEP-I遺伝子は食道下神経節と心房から検出され、ACEP-I遺伝子は脳神経節からも検出された。In situ hybrizationによりachatin-l遺伝子は足神経節、fulicin,fulyal遺伝子は体壁神経節、ACEP-I遺伝子は脳神経節と足神経節に発現する細胞が観察された。以上の結果からachatin-lは足神経節のみで合成されるが、fulicin,fulyalとACEP-Iは中枢神経節と心房の両方で合成され、fulicin,fulyalとACEP-Iは心房性ホルモンとして働いている可能性が示唆された。3.Fulicinおよびfulyalの生殖器に対する役割Fulicinおよびfulyalは雄性生殖器(ペニス鞘)と同様に雌性生殖器(膣、卵管)にも収縮活性を示し、fulicin様物質を含む神経繊維が膣と卵管を広範に支配していた。質量分析により膣にfulicin,fulyalとfulicin遺伝子関連ペプチド(FGRP)七種を確認した。FGRPは収縮活性を示さず、fulyalの活性がfulicinの1/100程度であることから、fulicinがアフリカマイマイの雄性と雌性の生殖器の運動を制御する生理的は神経ペプチドであることが示唆された。1.アフリカマイマイにおけるフリシンおよびフリアルの合成神経細胞および効果器官のの特定アフリカマイマイ神経節由来のD-アミノ酸含有ペプチド、フリシンおよびフリアルの前駆体タンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。フリシンとフリアルは同じ遺伝子にあり、in situhybridization法によってフリシン前駆体遺伝子を発現している神経細胞を観察した。その結果、発現神経細胞は食道下神経節の体壁神経節のみに局在していることが明らかになった。また、Northernblottingによりフリシン遺伝子は、食道下神経節以外に心房でも発現していることが分かった。また、抗フリシン抗体を用いて心臓を免疫染色した結果、主に心房に免疫陽性を示す神経繊雑とバリコシティー構造が観察された。2.フリシンおよびフリアルの分解酵素フリシンおよびフリアルの分解、不活性化に関与していると思われる酵素を神経膜画分より抽出した。祖抽出物から換算して22倍の比活性を示すまで精製した。この酵素は、EDTAによって活性を失い、Znイオンによって再活性化された。また、酵素阻害剤のうちフォスフォールアミドンおよびチオルファンによって阻害されたがカブトブリルでは阻害されなかった。これらの結果からこの酵素は、哺乳類のエンドペプチダーゼ24.1.1様の酵素であることが示峻されたが、pH依存性および二価金属の種類について噛乳類酵素と異なっていることが示された。1.アフリカマイマイ神経ペブチドachatin-I、fulicin、fulyalおよびACEP-Iの発現部位の観察D-アミノ酸含有ペプチドachatin-Iと心房由来のペブチドACEP-Iの前駆体cDNAをクローニングした。

既にクローニングされているfulicinおよびfulyalの前駆体を含めてアフリカマイマイの中枢神経における発現をin situ hybridizationによって観察した。その結果、achatin-I遺伝子は食道下神経節の足神経節に、fulicinおよびfulyal遣伝子は、体壁神経節に、さらにACEP-遺伝子は、脳神経節と足神経節に発現していることが分かった。これらのペプチドは全て心臓に興奮的に働き、心房からも単離されたが、achatin-Iを除く3種のペブチドは、RT-PCRおよびsouthen blottingにより心房でも発現していることが分かった。その結果、それら3種のペブチドは心房性のホルモンとして働いている可能性が示された。2.Fulicinおよびfulyalの生理的役割Fulicinおよびfulyalが、雄性生殖器(ペニス鞘)に加えて雌性生殖器(膣、卵管)の収縮を引き起こした。抗fulicin抗体を用いた免疫染色でfulicin様物質を含む神経繊維が膣と卵管を広範に支配していること、また、fulicinおよびfulyalに加えてfulicin遣伝子関連ペプチド八種の内、一種を除く七種、合計九種のペプチドを膣の抽出物中にMSとMS/MSを用いて確認した。八種のfulicin遺伝子関連ペブチドは、膣と卵管に収縮効果を示さず、Fulyalの収縮活性は、fulicinの1/100程度の強さであったため、fulicinが、アフリカマイマイの雄と雌の両方の生殖器の運動を制御する生理的な神経ペプチドとして働いていることが示唆された。
プリオン仮説は本当か?:宿主自然免疫機構から探る真の病原体

本研究では、宿主の自然免疫機構に着目し、プリオン感染との関係について検討した。結果として転写因子IRF3がプリオン感染に重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究により、自然免疫機構をターゲットにしたプリオン病の予防・治療薬の開発が進むと考えられる。プリオン病はヒトを含む各種動物に見られる空砲変性及びグリオーシスなどの脳内病理変化を伴う難治性の中枢神経変性疾患である。これまで病原体(プリオン)は、正常型プリオン蛋白質(PrP)の構造変換によって作られる異常型プリオン蛋白質と推測されているが確定はしていない(プリオン仮説)。プリオン感染と自然免疫シグナルカスケードとの関連性を明らかにするために、本年度では以下の検討を行った。プリオン持続感染細胞と非感染細胞との間における自然免疫関連因子発現の差異についてリアルタイムPCR法を用いてプリオン持続感染細胞に特徴的な自然免疫関連因子の探索を行った結果、ウイルス由来のdsRNAに対し働くMyD88非依存のシグナルカスケードの代表的な因子であるRIG-I、TLR3、IRF3その下流の因子IFNbetaなどに有意な発現減少が確認された。さらにプリオン持続感染・非感染細胞ライセートのiTRAQラベルによるLC/MSMSの解析によりTLR4の発現の差違が確認された。これらの結果は、プリオン感染が自然免疫機構に何らかの関与を示しているものであり、特に、MyD88非依存シグナルカスケードの因子がターゲットとなっていると示唆される。さらに、プリオン持続感染細胞へのIRF3の強制発現により、異常型プリオン蛋白質の発現抑制が見られ、一方IRF3siRNAを用いた検討により、異常型プリオン蛋白質の発現増加も確認された。これらの結果より、MyD88非依存シグナルカスケードの因子の中でもIRF3が重要な役割を担っていると考えられる。今日まで否定的であった「プリオン感染ではIFN systemは惹起されない」定説に異を唱えるものであり。プリオン感染に異常型プリオン蛋白以外の未知のウイルスなどの他の因子がプリオン感染に影響を及ぼしている可能性を提起するものである。今後、このシグナルカスケードとプリオン感染との因果関係を明らかにすることにより、この系を賦活化させる化合物などを探索し、実用化に向けた治療薬および予防薬の開発を目指す。プリオン病はヒトを含む各種動物に見られる空砲変性を特徴とした脳内病理変化を伴う難治性中枢神経変性疾患である。これまで病原体(プリオン)は、正常型プリオン蛋白質(PrP^c)の構造変換によって作られる異常型プリオン蛋白質(PrP^<Sc>)とされているが、感染経路などの詳細なメカニズムは不明な点が多い。本研究では自然免疫シグナルカスケードに着目し,プリオン感染との因果関係を明らかにすることを目的とした。H22年度では、プリオン持続感染細胞においてウイルス由来のdsRNAに対し働くMyD88非依存シグナルカスケードの代表的な因子であるRIG-1、TLR3、,IRF3その下流の因子IFNbetaなどに有意な発現減少が確認された。またIRF3は、プリオン持続感染細胞におけるPrP^<Sc>の発現を制御することも明らかにしたことから、MyD88非依存シグナルカスケードがプリオン感染に重要であることを提起した。本年度では、「プリオンの"感染"と宿主の防御機構」に着目し、以下の研究を行った。まず、IRF3ノックアウトIRF3^<-/->)マウスを用いて、in vivoプリオン感染実験を行った。異なる3種のプリオン株、22L(スクレイピー由来)、Fk-1(GSS由来)、mBSE(BSE由来)のプリオン感染においてIRF3^<-/->マウスは野生型に比べ有意に早期の病態発症が確認され、22L株感染後25週のIRF3^<-/->マウスの脳における空胞変性、グリオーシスの程度は、野生型に比べ重度であった。さらにプリオン病発症マウスの脳乳剤を非感染細胞に添加し、PrP^<Sc>の発現について検討するin vitroプリオン感染実験において、IRF3恒常的過剰発現細胞群は、コントロール群に比べプリオン感染に対し抵抗性であった。これらの結果より、MyD88非依存シグナルカスケードの中でもIRF3がプリオン感染の初期に重要な役割を担っていると考えられる。今後、IRF3を介したシグナルカスケード因子によるプリオン感染防御機構のより詳細なメカニズムを明らかにすることにより、実用化に向けた治療薬および予防薬開発の研究分野が発展すると考えている。
多様体上のベクトル束の研究

本研究では、多様体上のベクトル束の1:代数幾何学的研究、2:代数解析学的研究、3:整数論的研究を行いベクトル束に関する以下の研究実績を得た。1:に於いては、(1)射影空間P^n(n【greater than or equal】4)上の階数2のベクトル束が線束に分解する為の必要十分条件を得、ベクトル束の線束への分解問題に関する重要な諸予想への新しい方針を見い出した。(2)C^3のNon-projective Moishezon compact化(X,Y)を、境界因子Yのnef性により、決定した。更に、Non-Stein多様体S上のC^1-bundleのStein性とS上のある階数2のベクトル束の自明性との同値性を示した。(3)第一チャーン類に関するある条件の下、楕円ファイバー構造をもつ曲面上のベクトル束のモジュライ空間の有利性を示すと共にアーベル曲面上のベクトル束のモジュライ空間のピカ-ル群やアルバネ-ゼ写像を決定した。2:に於いては、(1)半単純リー代数最高ウエイト加群のなかでも、特にコンパクトエルミート対称空間に関するものを研究した。さらに対応する量子群の最高ウエイト加群を研究し興味深い結果を得た。(2)一般型旗多様体上で、D-加群の立場から、ラドン変換の定義を与え、これらの諸性質を調べた。今後、ベクトル束の理論が本質的に効く可能性のある知見を得た。(3)一般化された超幾何関数に関する双対性を、twisted cohomology群の交点理論と外積構造を利用して、得た。3:に於いては、(1)4型領域上の正則尖点形式に付随するL-関数を、その部分Fourier展開係数を利用して積分表示し、ある条件の下で、L-関数の解析接続、関数等式を得た。これは、2次のSiegel尖点形式に関するKohnen-Skoruppaの結果の一般化である。(2)正標数局所体のp-進ガロア表現の圏はエタールなフロベニウス付きの微分加群の圏と圏同値になり,特に,惰性群が有限表面を経由するものは過収束な対象と対応することを示した。(3)複素多様体におけるRiemann-Hilbert対応の類似に当たる、p-進Hodge理論の層化及び相対化を研究した。(2)C^3のNon-projective Moishezon compact化(X, Y)を、境界因子Yのnef性により、決定した。

(3)第一チャーン類に関するある条件の下、楕円ファイバー構造をもつ曲面上のベクトル束のモジュライ空間の有理性を示すと共にアーベル曲面上のベクトル束のモジュライ空間のピカ-ル群やアルバネ-ゼ写像を決定した。2:に於いては、(1)半単純リー代数の最高ウエイト加群のなかでも、特にコンパクトエルミート対象空間に関するものを研究した。さらに対応する量子群の最高ウエイト加群を研究し興味深い結果を得た。(2)一般型旗多様体上で、D-加群の立場から、ラドン変換の定義を与え、これらの諸性質を調べた。今後、ベクトル束の理論が本質的に効く可能性のある知見を得た。(3)一般化された超幾何関数に関する双対性を、twisted cohomology群の交点理論と外積構造を利用して、得た。3:に於いては、(1)4型領域上の正則尖点形式に付随するL-関数を、その部分Fourier展開係数を利用して積分表示し、ある条件の下で、L-関数の解析接続、関数等式を得た。これは、2次のSiegel尖点形式に関するKohnen-Skoruppaの結果の一般化である。(2)正標数局所体のρ-進ガロア表現の圈はエタールなフロベニウス付きの微分加群の圈と圈同値になり,特に,惰性群が有限表現を経由するものは過収束な対象と対応することを示した。(3)複素多様体におけるRiemann-Hilbert対応の類似に当たる、ρ-進Hodge理論の層化及び相対化を研究した。
エネルギー環境リテラシー育成のカリキュラム開発研究

英、仏、米国、オーストラリアでのエネルギー環境教育調査により独立教科はないが、ESDとして積極的に取り組んでいた。日本国内のエネルギー環境教育実践校のデータベース研究により意思決定の教育実践は少なかった。理工学系、教科教育等の多様な研究分担者等によりエネルギー環境リテラシー育成のカリキュラム構築の基本的枠組が、次の2点の合意形成を得た。エネルギー環境リテラシー育成のカリキュラムフレームワークの目標と内容の二次元マトリックスと重層構造図である。本年度の目的は三つあり、第一はこれまでに企業や大学及び小中学校で開発作成されているエネルギー環境教育教材、実践事例のデーターベース化に向けた基本的なフレームワークは、常葉学園大学を中心に京都教育大学、東邦大学、静岡大学とも連携して基本的に構築でき、それ基づくデーターベース作業を進めている。第二の目的の海外調査は当初のドイツは環境教育の先進国であるが、エネルギー教育に重点化した対象にコンタクト出来なかったので、エネルギー資源国のオーストラリアと原子力発電での先進国のフランスを調査対象とした。オーストラリアはクィースランド大学、同工科大学とクィースランド州の実証植林の調査の結果、エネルギー環境教育に関した単独の教科は無いが、初等及び前期中等教育では科学の教科の四つの基本概念の一つがエネルギーとなって位置づけられている。また、Sustainable Scienceの分野が進展中であった。他方、フランスはEUの中心としてフランス原子力委員会、核科学技術国立研究所が大学以上のレベルでのヨーロッパ核教育ネットワークを展開している。ADEME(環境エネルギー管理庁)では学校教育向けのエネルギー環境教育に関する様々な教材を作成し、全国レベルの教員対象の大会を開催し、学校教員を支援している。フランス電力会社は具体的な教材開発よりもネットを通じた広報活動をしていた。複数の科学博物館ではエネルギーに焦点化したフロアーや、気候温暖化の事例を展示して、エネルギー環境教育に高い関心を寄せていた。従って、日本における大学、学校でのエネルギー環境教育の取り組みは現時点では世界的にもユニークな事例と言える。これらと相互関連させた第3の目的であるエネルギー環境教育リテラシーに対する基本理念は日本エネルギー環境教育学会の昨夏の全国大会のシンポジュムや同学会誌でも展開しており、さらに2回の集中討議等により理工系、教育系、さらには理科、社会科、家庭科、技術の各教科教育からも意見を交換し、基本的に認識は共有しつつある。本年度の研究目的は3点あり、第一は海外調査として、英国には畑中、八田が訪問調査したのはロンドン大学環境教育専門のDillon教授とロンドン郊外の2つの中等学校、それに代替エネルギーセンター(CAT)である。それによりイングランドでは2020年までに全学校をサステイナブル学校にすることを目指しており、八テーマの中の「エネルギーと水」、「移動と交通」が関連した内容であること、特に上記中等学校の一つはエコスクールとして積極的にエネルギー環境教育に取り組んでいた。ナショナルカリキュラムでも持続可能性の観点からエネルギー環境教育は幾つかの教科で教えられていることが判明した。CATは1973年創立で現在は科学館を兼ね、90名のスタッフより成り、環境大学院も開設し、修士、博士課程を有する代替エネルギー研究組織としては欧州最大の組織であることが判明した。米国は長洲がアイオワ州のアイオワ大学の科学教育のYager教授の紹介により北アイオワ大学のエネルギー環境教育センターの訪問調査により、アイオワ州の現職教育の一環として実施しており、その教育内容は日本の教育実践とほぼ同じであることが判明した。第二は国内のエネルギー教育実践校小、中学校127校を対象に教材データベース化を行ない、実践内容を分析した。その結果電気を中心に、各種エネルギーに関する内容が殆どで、現実のエネルギー環境に関した問題やイシューズに対する意思決定などの高次思考の指導は技術科で一部なされているのみであった。第三の目的として、以上の国内・外の研究を踏まえ、エネルギー環境教育リテラシーの概念規定と構成に関して分担者間のコミュニケーションに基づき、その基本的枠組みを確定できた。これらによりエネルギー環境教育カリキュラム開発の基本的枠組みを確定化できた。エネルギー環境リテラシー育成のカリキュラムを開発するために、フレームワーク(枠組み)を以下の方策により検討作成した。本研究領域が多岐且つ多様な分野を含む事から、各科教育、理学系、工学系の様々な分野領域の分担者や協力者が数回討議し、共通用語の理解を図り、具体的な枠組みの作成を行なった。先ず、英国と豪(ナショナルカリキュラム等におけるエネルギー環境教育の位置づけ)仏(フォーマルおよびインフォーマル教育におけるエネルギー環境教育の位置づけ)、米(ナショナルスタンダードにおけるエネルギー環境教育の位置づけ)での海外調査研究、次に日本における研究のレビューのデータベースの結果、カリキュラムの枠組みを二次元とし、横軸は自然、社会、人文科学に工学、農学、生活科学等の従来の学問研究分野とマルチ/インターディシプリンの四領域とし、縦軸は興味関心・気付き、知識・理解、技能(基礎と操作的スキル)、思考・判断・表現・高次思考、意志決定・価値付け・態度の5分野とした。例えば、自然科学分野に対応する知識・概念はエネルギー関連概念、自然の持続可能性など、工学、農学、生活科学分野ではエネルギー効率、エネルギーの減量、プロダクト、廃棄物、リスク、不確実性、調和、マネジメント、循環型社会システム等。

社会科学、人文科学ではエネルギー環境政策・法律、世代間公平、社会資本、コスト、外部介在の内部化などが挙げられる。高次思考では何れの分野にも関わるものとして総合的判断施行、LCAなど。思考決定にはトレードオフ、思考決定マトトリック、見通しの輪などが挙げられる。これらの二次元の教育内容を一覧出来るチャートを作成した。以上のようにして開発作成したエネルギー環境リテラシー育成のカリキュラムフレームワークを基礎に、学校教育における具体的な教育内容を各教科教育、理学系、工学系各分野より展開し、一部の教科分野では実際に学校教育において実践展開した。
タリウムによる生態汚染の現状解明

タリウムは生体微量元素の中でも毒性が高く、さらに近年のハイテク産業などに伴い、工業的な需要が急増している。しかし、実際の生態毒性や体内動態に加え、地球環境中、なかでも生物圏における分布や挙動など、未解明な部分が多い元素といえる。本研究は、環境化学的に無視できない超微量元素であるタリウムによる生態汚染および環境動態の把握を目的とした。つまり、底質や粉じんといった環境試料に加え実際の野生生物体内における濃度を、マイクロウエーブ分解-誘導結合プラズマイオン源質量分析法にて測定し、解析を試みた。本年度は、前年に確立した分析法を用い、環境試料の拡大・充実に重点を置き、研究を遂行した。その結果、バイカルアザラシやオットセイなど、淡水および海棲の哺乳類においてもタリウムは検出され、その汚染が地球規模で拡大している可能性が明らかとなった。アジア地域で急速な発展を遂げるタイ・バンコク沖の柱状堆積物の分析は過去約50年の汚染経緯を示していると考えられ、解析の結果、経済活動が活発化した1980年代にタリウム濃度は僅かながら上昇し、その後、最近(1997年のバーツ暴落後と考えられる)になって濃度が減少する傾向が認められた。同じく、インドシナ半島における分布を、水系の高次捕食者であるライギョを用いてモニターした結果、タリウムはカンボジアで、タイやベトナムよりも高濃度が認められた。カンボジアでは首都プノンペンよりも観光地シェム・リアップとトンレ・サップ湖で高値が示された。また、ベトナムのメコンデルタでは、体内のタリウム濃度が雨期に高くなり、乾季に低くなる季節変動を示した。さらに、ベトナムではホーチミン市の運河で、極めて高レベルが検出され、アジアの都市における汚染が示唆された。また、東南アジアの沿岸棲海産魚を分析した結果、タリウムは肝臓に高レベルで蓄積し、筋肉の濃度は肥満度と共に上昇した。また、藻類を嗜好する種で高濃度になる傾向が認められた。最後に、東京都内の鉄道沿線の粉じんの濃度は低く、前年の「日本の都市部で低い」推測を支持する結果も認められた。微量元素の中でも毒性の高いタリウムは、近年、ハイテク産業の急激な発展に伴い工業的な需要が増大している。しかし、その詳細な生体毒性や体内挙動はもとより、環境中での分布・動態や生態系への影響など、いまだ未解明な点が多い元素でもある。本研究は、このような、環境化学的に無視できない新たな超微量元素による環境汚染の把握を目的としている。これまで、本研究室に蓄積された各種環境試料中の濃度を、マイクロウエーブ分解-誘導結合プラズマイオン源質量分析法にて測定した。NISTの標準物質(No.1577b)を用い、分析の精度および確度を検討した。その結果、繰り返し分析から良好な再現性が得られた。また、既報の分析値ともよく一致した。生態系における分布を確認するため、世界の幾つかの水域(日本沿岸・深海や黒海など)から収集された魚類43種および、野生鳥類9種(ロシア共和国及び日本産)の筋肉、肝臓および腎臓における蓄積を比較生物学的アプローチにて解析した。その結果、大量変死を起こした栃木県産ムクドリの体内から極めて高濃度のタリウムを検出した。また、東京都内の主要幹線道路18地点で約一年間、道路脇粉じんを採取し、アジアを代表する都市環境における汚染の実態把握を行った。その結果、東京都内においてタリウムは都心から都下にかけて減少する地理分布が認められたが、上野など都内の中心部において経時的な濃度上昇が確認された。これらの成果は、強毒性元素であるタリウムが人為活動を通じて生物圏へ放出され、さらに生態系で進行する異常に寄与している可能性を示唆するものと結論付けられた。来年度は更なる試料多様性の充実を行い、より包括的な生態系での分布を明らかにすると共に、他元素との相互関係など生化学的なアプローチも含め、タリウムの生体影響評価に迫る方針である。

さらに、ベトナムではホーチミン市の運河で、極めて高レベルが検出され、アジアの都市における汚染が示唆された。また、東南アジアの沿岸棲海産魚を分析した結果、タリウムは肝臓に高レベルで蓄積し、筋肉の濃度は肥満度と共に上昇した。また、藻類を嗜好する種で高濃度になる傾向が認められた。最後に、東京都内の鉄道沿線の粉じんの濃度は低く、前年の「日本の都市部で低い」推測を支持する結果も認められた。
ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルの構造生物学的研究

ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルであるTIM23複合体のメンテナンスを担い,ミトコンドリア内でのカルジオリピン(CL)合成の最初の反応を触媒するTam41の結晶構造解析について,前年度に引き続き,様々なコンストラクトの発現・精製を検討した。今年度は,大腸菌発現系を用いて不溶性画分からのリフォールディング条件を検討した結果,Kluyveromyces lactisおよびKluyveromyces marxianus由来のTam41について,n-Dodecyl-β-D-maltosideとアルギニンの存在下で効率良く巻き戻ることが分かった。両者はゲルろ過クロマトグラフィーにおいても良好な溶出ピークが得られており,その溶出位置から,Tam41は単量体ではなく多量体を形成していることが考えられる。今後,リフォールディングしたTam41が酵素活性(CDP-DAG合成活性)を持っているかを確認し,結晶化スクリーニングに供する予定である。また,前年度までに得られていたPgs1 (PGP合成酵素)やGep4 (PGPホスファターゼ)について,昨年度までに得られた微結晶について結晶化条件の最適化を試みたが,結晶が成長しないため,引き続き沈殿剤の濃度やpH,コンストラクトの長さや基質の有無による結晶化条件の最適化を行う予定である。また,ミトコンドリア外膜と小胞体膜を物理的に結合させるERMES複合体について,前年度までに得られていたMmm1欠損株の増殖阻害を回復させるマルチコピーサプレッサー遺伝子について論文を執筆し,FEBS Letters誌に発表した。さらに,ERMES複合体が小胞体からミトコンドリアへのホスファチジルセリンの輸送に直接的に関与していることを明らかにし,その成果をScientific Reports誌に発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルであるTIM23複合体のメンテナンスを担い,カルジオリピン(CL)の合成に関わっているTam41の結晶構造解析に向けて,大量調製法の構築を目指した.まず,様々な生物種(出芽酵母種,哺乳動物種)由来のTam41をクローニングし,全長およびプレ配列やフレキシブルと予測される領域を切除したコンストラクトを作製し,収量が期待される大腸菌発現系を用いて可溶性画分からの発現・精製を検討した.いずれのコンストラクトも発現が確認できないか,不溶性画分に発現していたため,不溶性画分に発現したコンストラクトについて,アルギニンを用いたリフォールディングおよび界面活性剤を用いた膜画分からの可溶化を検討したが,うまくいかなかった.現在出芽酵母のTam41についてバキュロウイルスーカイコ発現系を試している.現時点では発現は確認できていないが,今後,コンストラクトの長さや,注射するバクミドの量を変えるなど検討していく予定である.また,CL合成に関わる酵素群のうち,Tam41以外についても大量調製法の構築を目指した.Tam41の次の反応を担うPgs1(PGP合成酵素)については,大腸菌膜画分からの可溶化および精製に成功し,再現性のある微結晶を得られた.PGPホスファターゼであるGep4についても,大腸菌可溶性画分からの大量調製法の確立に成功し,微結晶を得ている.今後これらの結晶構造決定に向けて,沈殿剤の濃度やpH,コンストラクトの長さや基質の有無による結晶化条件の最適化を行う.ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルであるTIM23複合体のメンテナンスを担い,ミトコンドリア内でのカルジオリピン(CL)合成の最初の反応を触媒するTam41の結晶構造解析について,前年度に引き続き,様々なコンストラクトの発現・精製を検討したが,現在のところ可溶性画分として得られていない。今後は,Tam41にランダム変異を導入し,可溶性画分に行くTam41変異体をスクリーニングし,大腸菌発現系での大量発現系構築を目指す。また,Tam41の次の反応を担うPgs1 (PGP合成酵素)について,昨年度までに得られた微結晶について結晶化条件の最適化を試みた。微結晶については再現良く得られたが,結晶のサイズが成長しなかった。そこでフレキシブルな領域が結晶の成長を妨げている可能性があると考え,フレキシブルと予測される領域を切除したコンストラクトをいくつか作製し結晶化を試みたが,十分な大きさの結晶は現在のところ得られていない。PGPホスファターゼであるGep4の微結晶に関しても,結晶が成長しないため,引き続き沈殿剤の濃度やpH,コンストラクトの長さや基質の有無等による結晶化条件の最適化を行う必要がある。また新たに,ミトコンドリア外膜と小胞体膜を物理的に結合させるERMES複合体についての研究に着手した。ERMES複合体構成因子欠損株の増殖阻害を回復させるマルチコピーサプレッサー遺伝子として受入研究室で単離された4つの遺伝子について解析を行い,これらのマルチコピーサプレッサー遺伝子が, ERMES構成因子欠損株の増殖阻害やミトコンドリアの形態異常を回復させることなどを明らかにした。カルジオリピン合成に関わる酵素群(Tam41, Pgs1, Gep4)の構造決定に向けて,Pgs1, Gep4に関して再現性のある微結晶を得ることができた。

また,ERMES構成因子欠損株のマルチコピーサプレッサー解析について,単離されたマルチコピーサプレッサー遺伝子が, ERMES構成因子欠損株の増殖阻害やミトコンドリア形態異常を回復させるを明らかにした。ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルであるTIM23複合体のメンテナンスを担い,ミトコンドリア内でのカルジオリピン(CL)合成の最初の反応を触媒するTam41の結晶構造解析について,前年度に引き続き,様々なコンストラクトの発現・精製を検討した。今年度は,大腸菌発現系を用いて不溶性画分からのリフォールディング条件を検討した結果,Kluyveromyces lactisおよびKluyveromyces marxianus由来のTam41について,n-Dodecyl-β-D-maltosideとアルギニンの存在下で効率良く巻き戻ることが分かった。両者はゲルろ過クロマトグラフィーにおいても良好な溶出ピークが得られており,その溶出位置から,Tam41は単量体ではなく多量体を形成していることが考えられる。今後,リフォールディングしたTam41が酵素活性(CDP-DAG合成活性)を持っているかを確認し,結晶化スクリーニングに供する予定である。また,前年度までに得られていたPgs1 (PGP合成酵素)やGep4 (PGPホスファターゼ)について,昨年度までに得られた微結晶について結晶化条件の最適化を試みたが,結晶が成長しないため,引き続き沈殿剤の濃度やpH,コンストラクトの長さや基質の有無による結晶化条件の最適化を行う予定である。また,ミトコンドリア外膜と小胞体膜を物理的に結合させるERMES複合体について,前年度までに得られていたMmm1欠損株の増殖阻害を回復させるマルチコピーサプレッサー遺伝子について論文を執筆し,FEBS Letters誌に発表した。さらに,ERMES複合体が小胞体からミトコンドリアへのホスファチジルセリンの輸送に直接的に関与していることを明らかにし,その成果をScientific Reports誌に発表した。カルジオリピンの合成に関わる酵素群の構造解析に向けて,ミトコンドリア内膜タンパク質であるTam41 (CDP-DAG酵素), Pgs1 (PGP合成酵素), Gep4 (PGPホスファターゼ)の3つの酵素をターゲットとして大量調製系の確立を目指した.Tam41は大腸菌発現系を用いた大量調製がうまくいかなかったため,バキュロウイルスーカイコ発現系を検討中である.Pgs1とGep4に関しては大腸菌発現系を用いた大量調製に成功し,さらに結晶化一次スクリーニングにおいて再現性のある微結晶を得ることができた.Tam41の調製に向けて,Tam41にランダム変異を導入し,可溶性画分に行くTam41変異体をスクリーニングし,大腸菌発現系での大量調製系構築を目指す。Pgs1とGep4はともに微結晶が得られるものの沈殿しやすいことから,安定性が低いと考えられるため,可溶化を促進することが知られるGB1ドメインやLipoylドメインを付加したコンストラクトを検討する。ERMES構成因子欠損株のマルチコピーサプレッサー解析については,サプレッサー遺伝子がERMES複合体のどのような機能を代替してERMES欠損株の増殖やミトコンドリア形態異常を回復させるのかを解析していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。今後は優先的に,微結晶が得られているPgs1とGep4について結晶化条件の最適化を行い,結晶構造決定を目指す.
東南アジア都市における非正規雇用の人口移動メカニズム研究

本研究の目的は、非正規雇用に着目し、東南アジア首都の人口移動メカニズムを解明することにある。雇用政策の分析およびインドネシアジャカルタ首都圏における戸別訪問調査の結果、2000年代後半以降、非正規雇用者(アウトソーシングを含む)の流入が増加していることが示された。また、2012年のアウトソーシング規制に関する法律は非正規雇用者の削減と結びついていないことが示唆された。東南アジア諸国の首都郊外では、多国籍企業の工場進出が相次ぎ、日々新しい労働力が供給され、日本をはじめ先進国に向けた工業製品の生産が行われている。しかしながら、分析枠組みとデータの制約から、先行研究は首都郊外への人口移動が起こるメカニズムを明らかにできていない。本研究では、インドネシア首都ジャカルタを事例に、2010年代よりインドネシアの労働問題の中心となっている非正規労働者に着目する。具体的には、国際的な今日体制の変化に関する議論をインドネシアの雇用政策と照らし合わせながら援用し、質問紙調査とライフヒストリー調査によって非正規雇用労働者が首都郊外に流入するメカニズムを描き出す。本年度は、非正規雇用に対する国際的形成過程の理論研究とインドネシアにおける非正規雇用形成過程の分析を行った。とりわけ国際的なアウトソーシングの発展とインドネシア国内での展開について概観した。本研究において、労働移住大臣規定2012年第19号「他社への一部業務の委託条件に関する規定」によるアウトシーシングの規制の影響はきわめて重要であり、この影響を踏まえた質問紙を作成し、個別訪問調査を行う必要がある。進捗状況が当初よりも遅れているという問題はあるが、質問紙の作成に関しては、インドネシア大学社会政治学部と協力しつつこの点を盛り込み調査の設計を行っている。また、調査許可に関しても、すでにインドネシア研究技術省の会議を通過しており、発行手続きに入っている。本年度はインドネシアにおける非正規雇用形成過程の資料研究を予定していた。その際、インドネシア大学の客員研究員として、図書館を利用する予定であった。しかし、手続きに遅延があったことと、1月にジャカルタで起きたテロの状況についてインドネシア側の研究協力者と見極めながらスケジュールを計画したことにより、今年度は資料収集のみで分析が終了しなかった。平成28年度のはじめには分析を終える予定である。また、調査票については、印刷まで終えることはできなかったものの、すでに細かいワーディングの調整段階に入っており、平成28年度はじめに印刷を行う予定である。本年度は、調査対象地を選定し、質問紙を用いた訪問調査を行った。具体的には西ジャワ州ブカシ県北チカラン郡において、対象となる村を選定し、村内の連合町内会にあたる地区単位のなかから3地区をさらに選定した上で、計632名の調査地区住民に対して戸別訪問調査を実施した。過去の調査で問題となったサンプリングについては、エリアサンプリングの手法を参考にすることにより、母集団を明確に努めた。また、訪問時間の調整、家々の配置状況の確認や質問紙の工夫など、先行研究を踏まえた事前準備により、非正規雇用者を抽出することが可能となった。その結果から、非正規雇用者の転職と地域移動の状況を、より正確に観測できるようになった。平成28年度には、質問紙を用いた戸別訪問調査の実施・分析を行う。現在は、8月に調査を行う予定で、インドネシア政府からの調査許可プロセスを進め、現地のプレジデント大学とも調整している。対象者のサンプリングは、調査許可を踏まえ、現地大学と協議する予定である。調査員の学生アルバイトも、すでにおおかた手配を済ませている。8月に戸別訪問調査を実施し、9月以降にデータのクリーニング、集計を行う。10月以降に分析を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。社会学28年度が最終年度であるため、記入しない。
自閉症スペクトラム障害の脳内ネットワークによる類型化および療育のオーダーメイド化

就学前児童2,937名を対象に疫学調査を行い、自閉スペクトラム症(ASD)疑い群は45名(2.0%)であり、精神疾患の家族歴があることをASDリスク因子として同定した。ASD群33名、定型発達(NT)群8名を対象に拡散テンソル画像を撮像し、異方性比率(FA値)を算出した。その結果、NT群に比しASD群のFA値が左中小脳脚領域で増加、視床-脳弓領域で減少していた。ASD群において自閉症スペクトラム指数(AQ)とFA値との相関を調べ、AQ下位項目スコアの「注意の切り替え」と視床脳弓領域のFA値と負の相関を認めた。また、稀なASDリスク候補遺伝子を複数罹患家系のエクソーム解析より同定した。自閉症スペクトラム障害(ASD)の有病率を明らかにするために、新潟県新潟市において平成24-26年度小学校入学予定児童2527名を対象にして、自閉症スクリーニング質問紙(ASQ)および胎生期・周産期異常、遺伝負因、生活環境因子などの情報をアンケートにて収集し、同意の得られた2388名(回収率94.5%)から回答を得た。解析の結果、ASQ総得点15点以上のASD疑い群は40名(1.7%)であった。さらに出産時の母親の高齢(45歳以上)と未熟児であることが児がASD疑い群となるリスク因子として同定された(それぞれ、p < 0.01、オッズ比4.87倍;P < 0.01、オッズ比3.63倍)。また、上記調査で明らかとなったASDの児童および新潟県内の発達専門外来に通院するASD罹患者を対象とし、脳磁図所見、1.5テスラMRI装置を用いた拡散テンソル画像所見および対象者のDNA遺伝子変異を包括的に解析し、以下の成果を得た。ASDの視線認知課題中の脳磁図所見において、ASD群および定型発達群それぞれ12名ずつで比較したところ、定型発達群では目線が逸れる刺激よりも目線が合う刺激で右上側頭溝後部領域が有意に大きく活動していたのに対して、ASD群ではこの活動の大きさの有意差が消失することを見出し、Neuropsychobiology誌に報告した。拡散テンソル画像所見においてのASD群と定型発達群で有意差のある部位は同定できなかった。小児自閉症評価尺度を用いて評価されたASD群の臨床的特徴とOXTR遺伝子およびトリプトファン水酸化酵素2(TPH2)遺伝子との関連を調べ、OXTR遺伝子の変異が「模倣」、TPH2遺伝子の変異が「身体の使い方」の下位項目のスコアに有意な影響を与えていたことを明らかにし、それぞれPsychiatry Res.誌、Psychiatry Clin Neurosci.誌に報告した。自閉症スペクトラム障害(ASD)の有病率を明らかにするために、新潟県新潟市において平成24-27年度小学校入学予定児童2,937名を対象にして、自閉症スクリーニング質問紙(ASQ)および胎生期・周産期異常、遺伝負因、生活環境因子などの情報をアンケートにて収集し、同意の得られた2776名(回収率94.5%)から回答を得た。解析の結果、ASQ総得点15点以上のASD疑い群は45名(2.0%)であった。さらにASQの点数と妊娠中の喫煙本数に正の相関を認めた(r=0.064, p= 0.001)。自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder; ASD)の有病率を明らかにするために、新潟県新潟市において平成24-27年度小学校入学予定児童2,937名を対象にして、スクリーニング調査を行い、ASQ総得点15点以上のASD疑い群は45名(2.0%)であり、精神疾患の家族歴があることがASDリスク因子として同定したが(p =0.016、オッズ比:3.55倍、95%信頼区間:1.25-9.01)、上記調査で明らかとなったASDの児童および新潟県内の発達専門外来に通院するASD罹患者を対象とし、分子遺伝研究を行い、以下の結果を得た。ゲノム中の全エクソンを網羅的に解析するエクソームシークエンスをASD複数罹患家系において行い、候補リスク変異としてCLN8 R24Hを同定した(Egawa et al., 2015 Plos one)。CLN8遺伝子の他の変異もASDの発症リスクに関係している可能性があるため、複数罹患家系症例とは別のASD患者256名についてCLN8のエクソンシークエンスを行い、さらに、4つ(F39L、R97H、T108M、N152S)の稀なミスセンス変異を候補リスク候補変異として同定した(Inoue et al., 2015 PLoS One)。「心の理論」能力の有無を、ヒトとサルで共通して施行できるように、言語的教示がなく視線計測で定量的に判別する「非言語的誤信念課題」および、「共同注視」同様に判別する「視線矢印課題」を課題中の脳活動が計測できるように調整した。ミリ秒単位の優れた時間解像度を有する脳磁図(MEG)計および非磁性体視線計測装置のセッティングについて、定型発達者の計測を開始している。ASDの疫学研究および分子遺伝研究は概ね予定通りに進展した。

しかし、脳イメージング研究において研究協力機関である国立病院機構西新潟中央病院に設置されているMEG計と非磁性体注視点計測装置(Eye Link)を連動させるためのセッティングすることに時間を要したが、さらにH27年度にMEG本体の基盤交換が行われ、測定器のオペレーションシステムも変わったことにより、Eye Linkとの連動セッティングに微調整を必要とし、予想外に時間を要した。自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder; ASD)の有病率を明らかにするために、新潟県新潟市において平成24-27年度小学校入学予定児童2,937名を対象にして、スクリーニング調査を行い、ASQ総得点15点以上のASD疑い群は45名(2.0%)であり、精神疾患の家族歴があることがASDリスク因子として同定したが(p =0.016、オッズ比:3.55倍、95%信頼区間:1.25-9.01)、上記調査で明らかとなったASDの児童および新潟県内の発達専門外来に通院するASD罹患者のうち、同意を得られた27名に対して国立病院機構西新潟中央病院の1.5テスラMRI装置を用いて15軸の拡散テンソル画像(diffusion tensor image; DTI)を撮像し、神経線維の体積を計測した。同時に自閉性尺度であるAutism Spectrum Quotient (AQ)した。ASDに関連すると報告されている神経回路とAQ得点および研究者代表者が同定してきたASDリスク遺伝子の変異(CLN8 R24H(2015 PLoS One)、WDR90 V1125fsおよびEFCAB5 L1210fs(2015 Psychiatry R Res)など)との関連を解析した。結果、AQ得点およびASDリスク候補遺伝子変異との相関する神経回路が複数同定された(詳細は研究成果報告書を参照)。本研究のような生物学的データを元にASDを類型化しようとする試みは、現在存在しないASDバイオマーカーの確立に貢献するものである。就学前児童2,937名を対象に疫学調査を行い、自閉スペクトラム症(ASD)疑い群は45名(2.0%)であり、精神疾患の家族歴があることをASDリスク因子として同定した。ASD群33名、定型発達(NT)群8名を対象に拡散テンソル画像を撮像し、異方性比率(FA値)を算出した。その結果、NT群に比しASD群のFA値が左中小脳脚領域で増加、視床-脳弓領域で減少していた。ASD群において自閉症スペクトラム指数(AQ)とFA値との相関を調べ、AQ下位項目スコアの「注意の切り替え」と視床脳弓領域のFA値と負の相関を認めた。また、稀なASDリスク候補遺伝子を複数罹患家系のエクソーム解析より同定した。ASDの疫学研究および分子遺伝研究は概ね予定通りに進展した。しかし、平成26年度にMEG計が設置されている国立病院機構西新潟中央病院の改築基礎工事が行われ、MEGデータにノイズが混入するため脳機能画像研究を進めることが困難であった。脳イメージング研究において、H27年度にMEG本体の基盤交換が必要になったため、非磁性体注視点計測装置(Eye Link)との連動セッティングなど予定よりも時間を要したが、ASD群および定型発達群の研究協力者は確保できており、今年度中に予定対象者数のデータを収集することは可能である。精神医学現在は基礎工事も終了しMEG計測に支障がない状態となったため、脳機能画像データの収集を急ぎ、臨床的特徴との解析の結果と併せて、ASDの類型化を目指す。ASDの疫学研究および臨床的特徴との遺伝子多型との関連解析は概ね予定通りに進展した。しかし、遺伝子多型との関連を解析するために十分な数の脳画像データを収集できず、ASDの妥当な類型化には至らなかった。
酵素の局在化メカニズムの多様性：テトラヒメナとゾウリムシの明瞭な違い

生命活動における酵素の局在化は,その高度な生理機能の維持に重要な役割を果たしている.我々は,繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ(AK1)が,N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした.一方で,繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる.後者のAKは,N末のミリストイル化シグナル配列を欠く.しかし代わりに,C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた.つまり,両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高いのである.この研究においては,繊毛虫におけるAK酵素の局在化メカニズムの多様性を明らかにし,その生理機能との関連性を探る.今年度は,AK3の基質阻害のメカニズムを詳細に解析した.AK3は基質アルギニンの濃度が高くなると反応速度が極端に低下する現象,即ち基質阻害を示す.AKが属する酵素群においては,基質阻害を示すものはAK3が初めての報告である.そのメカニズムを解明するために,3種類のモデルをテストし,理論値と実測値の誤差が最も少ないモデルを見出した.誤差は,R2, AICc,及びSy.xによって評価した.その結果,酵素基質複合体ES(解離定数0.61 mM)に2個目の基質が結合するプロセスが存在し(SES複合体),その解離定数が0.34 mMとES複合体のものより低いことが基質阻害を引き起こす主因であることが判明した.また,ES複合体のみならず,SES複合体も前者の1/3程度の速度で生成物を生じることが分かった.また,その構造的要因として,S79,S80,V81のアミノ酸が関与していることが明らかになった.基質阻害は,20%程度の酵素で見られる現象であるが,今回の研究のように詳しい速度論的解析が行われた例は極めて少ない.高度な生理機能の維持には,酵素の局在化が重要な役割を果たしている場合がある.この局在化が妨げられると酵素は本来の行き場を失う.我々は,繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ(AK1)が,N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした.そして,繊毛運動においてAK1をキー酵素とする連続的なATP供給機構を提唱した.一方で,繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる.後者のAKは,N末のミリストイル化シグナル配列を欠く.しかし代わりに,C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた.つまり,両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高い.今回の研究ではParameciumのAKに焦点を当て,繊毛内の局在化メカニズムを明らかにしたい.この多様性の解明は生物学的に非常に興味深い.今年は,Paramecium tetraureliaの4種類のAK(AK1-4)の酵素特性の解明と,AK1とAK3が実際にプレニル化されているかどうかの解明を中心に研究を行った.1.P. tetraureliaの4種類のAK(AK1-4)の酵素特性の解明ゲノム上では4種類のAK遺伝子が存在するが,それらが実際に細胞内で発現しているかを確かめるために,細胞からmRNAを市販のキットを用いて単離し,その後cDNA化した.このcDNAプールから,AK1-4に特異的なプライマーを用いてcDNAの一部を,PCR増幅した.増幅産物をクローニングし配列を確認したところ,AK4以外は細胞内で発現していることが分かった.次に4種類のAK酵素を大腸菌内で発現させ,その酵素活性を測定した.生体内で発現しているAK1-4は十分な酵素活性をもっていたが,一方でAK4の酵素活性は極端に低く,AK4が偽遺伝子化しつつあることが示唆された.また, AK3が自身の基質であるアルギニンによって阻害を受ける典型的な「基質阻害」を示すことが判明した.現在,変異体作製を通してそのメカニズムの解明に着手している.2.P. tetraurelia AK1とAK3は実際にプレニル化されているか4種類のAKのうち,AK1とAK3はC末端側に明瞭なプレニル化シグナル配列を持つ.この配列は,C末端から4番目のシステインに疎水性プレニル基の一種,ファルネシル基またはゲラニルゲラニル基が結合することを示唆する.実際にゲラニルゲラニル基が結合していることを証明するために,先ず, AK3を無細胞タンパク質合成系(島津)を用いて合成した.この系にはプレニル化するために必要な酵素が含まれている.尚,大腸菌を用いた系では,原核生物がプレニル化酵素を欠くことから,リコンビナント酵素がプレニル化されることはない.合成されたAK3は,予めN末側に付加しておいたStrep Tagを用いて高純度に精製することができた.合成されたAK1とAK3はそれぞれトリプシンで消化し,マススペクトル分析を行った(外注).その結果,C末端のトリプシンペプチドがファルネシル基されていることが明らかとなった.高度な生理機能の維持には,酵素の局在化が重要な役割を果たしている場合がある.この局在化が妨げられると酵素は本来の行き場を失う.我々は,繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ(AK1)が,N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした.そして,繊毛運動においてAK1をキー酵素とする連続的なATP供給機構を提唱した.一方で,繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる.後者のAKは,N末のミリストイル化