hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
境界領域模擬プラズマにおけるイオン温度の精密測定

核融合炉実現に向けた重要課題のひとつである境界領域プラズマ中の熱・粒子輸送制御に関わるイオン温度の精密測定を行った。境界領域プラズマを模擬可能な直線型定常プラズマ装置および大型タンデムミラー型プラズマ装置GAMMA10/PDXにおけるプローブを用いたイオン温度計測を行い、イオン温度の磁場異方性とその計測への影響を明らかにした。今後、本研究で整備したレーザー誘起蛍光計測システムをGAMMA10/PDX装置に適用し、プローブ法と併用しながら境界領域プラズマ中のイオン温度やその空間分布を詳細に計測し、高イオン温度プラズマによる非接触プラズマ形成過程の解明やその制御手法に関する研究等に展開する。磁場閉じ込め核融合プラズマの境界領域プラズマにおける熱の伝わり方やプラズマの動き方を的確に制御するためには、イオンの挙動、特にイオン温度を正確に把握することが重要である。本研究では、境界領域プラズマを模擬した直線型プラズマ発生装置を用いて、イオン温度を測定可能なプローブであるイオンセンシティブプローブ(ISP)とイオン速度分布関数を測定可能なレーザー誘起蛍光(LIF)法の同時計測を行い、イオン温度の精密測定を実現することを目的としている。本研究で用いるレーザー誘起蛍光計測は外部共振器型可変波長半導体レーザーを励起光としてプラズマ軸(磁力線方向)に平行あるいは垂直に入射させ、その入射に伴うプラズマイオンからの蛍光を入射光に対して垂直に配置した狭帯域干渉フィルタを取付けた光電子増倍管にて観測する。本年度は、波長可変ダイオードレーザーシステムを新たに導入し、既設の直線型プラズマ発生装置において、プラズマ軸に垂直入射配位のレーザー誘起蛍光計測システムの整備を行った。ISPに関してはプローブヘッドを作製し、径方向プローブ掃引装置に取付け、ISP電流-電圧特性のプラズマ径方向分布を計測し、磁化アルゴンプラズマ中のイオン温度の評価を行った。また、ISPに流入するイオンに関して、ISPの形状や電界の影響などについて議論した。なお、LIF計測に関しては、助成額に合わせて当初計画していた機器の仕様を修正した。そのため光学系の調整に時間を要したものの、次年度の系統的な実験を円滑に行えるシステムを構築することできた。磁場閉じ込め核融合プラズマの境界領域プラズマにおける熱・粒子輸送を制御するためには、イオンの挙動、特にイオン温度を正確に把握することが重要である。本研究では、境界領域プラズマを模擬したプラズマ発生装置を用いて、イオン温度の精密測定の実現を目的として、イオン温度を測定可能なプローブであるイオンセンシティブプローブ(ISP)による計測とイオン速度分布関数を測定可能なレーザー誘起蛍光(LIF)法の準備を行っている。これまでにLIF計測系の整備を進めるとともに、小型直線型装置ならびにミラー閉じ込めプラズマの開放端磁場配位を利用した境界領域模擬プラズマにおいて、ISPによるイオン温度計測を行い、イオン温度の磁場に対する異方性の評価に寄与する実験データを取得した。磁場閉じ込め核融合プラズマの境界領域(周辺・ダイバータ)プラズマにおける熱・粒子輸送を制御するためには、イオンの挙動、特にイオン温度を正確に把握することが重要である。本研究では、イオン温度の精密測定の実現を目的として、高いイオン温度を有する筑波大学のタンデムミラー型プラズマ装置GAMMA10/PDXの開放端磁場領域に設置されたダイバータ模擬実験モジュール(D-module)において、プローブを用いたイオン温度計測を行い、粒子輸送に大きな影響を与える磁場に対するイオン温度異方性の評価を行った。D-module内に磁場中のイオン温度測定に用いられるイオンセンシティブプローブ(ISP)を設置するとともに、GAMMA10プラズマのイオン温度が高いことを利用して、その上流側、下流側でISPと同じ磁力線上に設置された静電プローブのイオン飽和電流の解析によるイオン温度の評価を行った。また、イオン速度分布関数を測定可能なレーザー誘起蛍光(LIF)法のGAMMA10への適用の準備も進めた。ISPおよび静電プローブ計測の結果、得られたイオン温度には、各々のプローブで明確な差異が観測された。GAMMA10端部プラズマはその開放端磁場配位により、磁力線に平行および垂直方向のイオン温度が大きく異なることが知られている。そこで、プローブ計測位置の磁場配位において、磁気モーメント保存、エネルギー保存則を考慮したイオン温度の異方性の解析を行い、実験結果と詳細に比較したところ、ISPでは磁力線に垂直方向のイオン温度、静電プローブのイオン電流から評価したイオン温度は磁力線に平行方向成分を示していると考えるのが妥当であることが明らかとなった。これらの知見は境界領域プラズマの粒子輸送の理解に資するとともにイオン温度計測の精密化に寄与する重要な成果と言える。長野高専の直線型プラズマ装置におけるイオンセンシティブプローブ(ISP)によるイオン温度計測に加えて、核融合科学研究所の大型ヘリカル装置のダイバータプラズマや、筑波大学のミラープラズマ開放端磁場配位を活用した境界領域プラズマ模擬実験装置においてもISPデータを取得することができた。

これらの詳細な解析から、レーザー誘起蛍光法によるイオン温度評価と合わせて、イオン温度の異方性に関する知見などイオン温度計測の精密化に寄与する成果が期待できる。プラズマ理工学、核融合学、プラズマ計測平成27年度からの所属異動に伴い、筑波大学のミラープラズマ核融合実験装置GAMMA10/PDXを本研究の推進に活用する。本装置ではミラープラズマの開放端磁場配位を活用した境界領域模擬プラズマを生成可能であり、磁力線に平行および垂直方向のイオン温度が大きく異なることを利用して、イオン温度計測の精密化(特に異方性)に関わる研究を展開でき、これまで進めてきた本研究課題をより推進することができる。また、本研究課題で整備してきたレーザー誘起蛍光計測システムのGAMMA10への適用も進める。ISPプローブ計測は順調に行えたものの、LIF計測システムについては、助成額に合わせて当初導入を計画していたレーザー機器の仕様を修正して、波長可変レーザーの基本システムのみとし、光学系の調整は自前で行うこととした。そのため光学系構築に必要な物品の調達や調整に時間を要する結果となり、当初計画していたISPとLIFによるイオン温度同時計測は年度内での実施には至らなかった。年度末の段階でほぼ光学系の方の準備も整い、次年度の系統的な実験に向けたシステムは構築できているので、遅延分については平成26年度の計画と合わせて実施することで、計画に沿った研究を遂行可能である。次年度使用額は、消耗品経費として留保していたものであったが、当該年度内には支出不要であったため、助成金の有効利用のため、次年度に使用することとした。平成25年度に構築した径方向LIF計測システムとISPによるイオン温度同時計測により、ISP計測によるイオン温度の磁場に対する異方性の影響を詳細に解析し、温度の校正を行う。また、境界領域プラズマにおけるイオンの径方向輸送に関して議論を深めるため、系統的にプラズマの状態を変化させてイオン温度計測を行うとともに、軸方向LIF計測システムの整備を進め、二次元的な輸送の議論へと展開していく。研究成果は、21th PSI会議、核融合エネルギー連合講演会、電気学会、PLASMA2014等で発表し、議論する予定である。次年度経費と合わせて、消耗品経費等として使用予定である。H27年度より筑波大学に異動。次年度使用額は、消耗品経費(純ガス等)として留保していたものであったが、当該年度内には支出不要であったため、助成金の有効利用のため、次年度に使用することとした。次年度経費と合わせて、消耗品経費等(純ガス等)として使用予定である。
多周波合成開口レーダを用いたInSAR解析によるセンサ特性の評価

最新鋭の合成開口レーダの位相誤差の評価手法の構築を目的に、本年度は主に「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」を実施した。「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」では、まずTerraSAR-X、及びALOS-2 PALSAR-2において、観測モードや撮影方向によらず基線長が長いほど、DEMの誤差が小さい傾向があることを確認した上で、テストサイトを茨城県つくば市とし、道路、駐車場、公園等の不動点におけるDEMの誤差を用いて、位相ノイズを定量的に明らかにした。また災害時を想定し、本結果を差分干渉処理による微小変位量推定に当てはめた場合の誤差を明らかにした。次にTerraSAR-Xとその併用機であるTanDEM-Xを用いてシングルパスインターフェロメトリ(同一軌道にある衛星より同時に取得したデータによる干渉解析)によるDEMを用いて、位相ノイズの推定を行なった。さらに、前年度実施したリピートパスインターフェロメトリ(異なる時期に取得したデータによる干渉解析)の結果とシングルパスインターフェロメトリの結果を比較することにより、大気の位相ノイズに与える影響や地表面の時間変化の影響を定量的に明らかにした。本研究では、異なる手法(シングルパスインターフェロメトリとリピートパスインターフェロメトリ)により得られたDEMの誤差に着目し、大気の影響や地表面の時間変化の影響を評価する手法を構築した点で意義がある。平成30年度は、予定していた「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」において、当初予定していた周波数の差異や対象物による位相誤差の違いを評価するとともに、大気の影響や地表面の時間変化の影響を評価することができた。平成30年度までに、研究の主となるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価を実施した。今年度はCバンドのSentinel-1について、同様に評価を行うことで、L、C、Xバンドの特性を明らかにすることができる。これらを踏まえ、現在の主要な衛星搭載合成開口レーダのInSAR解析によるセンサ特性についてまとめる予定である最新鋭の合成開口レーダの位相誤差の評価手法の構築を目的に、本年度は「データの収集と評価」、「コヒーレンスマップの生成と土地被覆毎の特性解析」、及び「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」の一部を実施した。「データの収集と評価」では、テストサイトを茨城県つくば市とし、TanDEM-X DEM(12mメッシュ)、及びPRISM DEM(5mメッシュ)を収集するとともに、その土地被覆毎の特性や高さ精度を明らかにした。特にTanDEM-X DEMはシングルパスインターフェロメトリによる取得されたデータであり、対象物の時間変化や大気の影響を受けないため、高精度が期待されていたが、仕様を上回る精度であることを確認した。「コヒーレンスマップの生成と土地被覆毎の特性解析」では、XバンドのTerraSAR-XとLバンドのPALSAR-2において、土地被覆(人工構造物、自然対象物)と撮影条件(基線長、撮影間隔等)により相関値がどのように変化するのかを明らかにした。「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」では、XバンドのTerraSAR-X、及びLバンドのPALSAR-2において、DEMの特性解析を実施するとともに、位相ノイズの評価を行なった。本研究では、昨今のTerraSAR-X、及びALOS-2ともに衛星の軌道精度が向上していることで、本手法によるDEMの精度を用いた位相ノイズの推定が効果的に行えるようになっていることを示した点で意義がある。平成29年度は、予定していた「データの収集と評価」、及び「コヒーレンスマップの生成と土地被覆の特性解析」に加え、次年度に実施を予定していた「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」の一部を実施することができた。

平成30年度は、予定していた「異なる撮影条件によるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価」において、当初予定していた周波数の差異や対象物による位相誤差の違いを評価するとともに、大気の影響や地表面の時間変化の影響を評価することができた。平成29年度はXバンドとLバンドの解析を中心に実施した。平成30年度は、これまで実施したTerraSAR-X/TanDEM-Xのリピートパスインターフェロメトリによる位相誤差の推定だけではなく、シングルパスインターフェロメトリによる位相誤差の推定を行う。更にそれらを比較することで、大気の影響や地表面の時間変化の影響を評価する予定である。平成30年度までに、研究の主となるDEMの特性解析とセンサのラジオメトリック特性の評価を実施した。今年度はCバンドのSentinel-1について、同様に評価を行うことで、L、C、Xバンドの特性を明らかにすることができる。これらを踏まえ、現在の主要な衛星搭載合成開口レーダのInSAR解析によるセンサ特性についてまとめる予定である当初予定していた海外出張旅費に別の予算を割り当てたため、繰越が発生した。これらは、平成30年度の国内外の学会発表のための旅費や参加費に割り当てる予定である。国際学会参加費において、国内の国際学会に発表したため、旅費が想定より安かった。2019度の学会発表旅費等で割り当てる予定である。
可逆性不死化培養心筋細胞を用いたペースメーカー細胞の再生

背景:心筋細胞はほとんど分裂能を持たないため、培養心筋細胞を増やして長期に渡って維持し、その後ペースメーカー機能の付加など種々の操作を加えたり、移植に用いることは今まで不可能であった。目的:移植可能な安全かつ大量の心筋細胞をえる。更にラットの心筋梗塞モデルに移植する。方法:可逆性不死化システムを備えたレトロウィルスベクターSSR#69を用いて新生児ラット培養心筋細胞に不死化遺伝子を導入した。このシステムでは不死化遺伝子であるSimian virus 40 largeT抗原(SV40T)によって細胞を不死化して増やした後にCreリコンビナーゼ発現アデノウィルスベクター(AxCANCre)を用いてSV40T遺伝子を除去し安全な心筋株にもどすことができる。更に心筋梗塞ラットに移植した。結果:SSR#69のより新生児ラット培養心筋細胞には心筋細胞の核にSV40Tが発現するようになり、現在までに142回細胞の分裂を認めている。この細胞はCreリコンビナーゼにより速やかにSV40Tが取り除かれ増殖を停止した。DNAマイクロアレイにて増殖中の細胞と、増殖停止細胞を比べたところ興味深い事に増殖停止細胞においてペースメーカー電流であるHyperpolarization-activated Cyclicnucleotide-gated potassium channel 4(HCN4)遺伝子の発現が増加していた。更に心筋梗塞ラットの心臓に移植したところGFP陽性細胞として心筋組織に定着し、心機能の改善を認めた。1)背景:心筋細胞はほとんど分裂能を持たないため、培養心筋細胞を増やして長期に渡って維持し、その後ペースメーカー機能の付加など種々の操作を加えたり、移植に用いることは今まで不可能であった。目的:そこでまず移植可能な安全かつ大量の心筋細胞をえることを目的とした。方法:可逆性不死化システムを備えたレトロウィルスベクターSSR#69を用いて、新生児ラット培養心筋細胞に不死化遺伝子を導入した。このシステムでは不死化遺伝子であるSimian virus 40 largeT抗原(SV40T)によって細胞を不死化して増やした後に、Creリコンビナーゼ発現アデノウィルスベクター(AxCANCre)を用いて、SV40T遺伝子を除去し安全な心筋株にもどすことができる。結語:SSR#69による可逆性不死化心筋細胞株の作製に成功した(Circ J.2005)2)ペースメーカー電流をつくるHCN遺伝子が固有心筋に発現しているかどうかをみたところ、発現していた。(J Biol Chem.2004)背景:心筋細胞はほとんど分裂能を持たないため、培養心筋細胞を増やして長期に渡って維持し、その後ペースメーカー機能の付加など種々の操作を加えたり、移植に用いることは今まで不可能であった。
地域環境を生かした小学校防災教育の開発

現行の小学校学習指導要領における防災教育関連記述は、社会、理科、生活および特別活動にみられる。理科の第5学年での「流水の働き」と「天気の変化」、第6学年での「土地のつくり変化」の単元で防災科学の視点からの学習が可能といえる。阪神・淡路大震災以降の平成10年度版の学習指導要領から単元目標に「災害」という記載がされており、教科書での扱われ方も防災を意識したものとなってきていた。「流水の働き」に関する先行実践研究は多く、それらの研究を大別すると、実地体験を重視したもの、流水実験器に関するもの、動画コンテンツを利用したものの3つに集約される。それらの中で防災の視点をカリキュラム上に位置づけものは少なかった。「流水の働き」の単元では、いかに身近な河川と教室内での流水実験に結びつくかが、防災を考える上で重要な要素となってくる。本研究では、地域の移り変わりを今と昔の写真を比較することを単元導入とし、流水実験器もプランターの底を用い、砂をイ砂:川砂=9:1の割合で混ぜたものを利用することで簡易的に流水の三作用を確認することができた。さらに、地域を流れる河川を観察し、理科で学習した内容と防災の視点を踏まえた診断マップを個々に作成した。近年、住宅地内を流れる河川は、ほとんどが護岸工事されているが、逆にその効果について考えるとともに、流域の形成や流れの速さから堤堰の役割を考えることができ、理科学習の中で事象を科学的に考えることで、地域に目を向けた防災教育が有効であることに一定の成果を得た。「土地のつくりと変化」につながる実践では、ペットボトルを用いた液状化実験、ココアと小麦を用いた断層実験、津波発生装置を用いた津波実験の3つを行い、それぞれ地域の特徴を資料として提示(ワークシート、各実験で実験編と資料編を作成)することで、防災の視点から地域を類推することが可能であった。
繊毛形成に必須な多サブユニット複合体IFT-Bコアの結晶構造解析

繊毛内輸送を司るIFT(intraflagellar transport)装置は、6サブユニットのIFT-A複合体(760 kDa)と16サブユニットのIFT-B複合体(1,000 kDa)、8サブユニットのBBSome(490 kDa)から構成される。IFT-B複合体はキネシン2と結合することで繊毛内の軸糸微小管に沿った順行輸送を担う。IFT-B複合体は10サブユニットのコア複合体と6サブユニットのペリフェラル複合体から成り立っている。IFT-Bコア複合体は530kDaのタンパク質複合体であるが、それぞれ5サブユニットから成るコア1とコア2に大きく分割される。本年度はヒトのIFT-B複合体コア1について結晶化のために構造の均一化を目指して、大腸菌共発現系の改良を行った。IFT-B複合体コア1はIFT22、IFT25、IFT27、IFT74、IFT81の5サブユニットから構成される。二次構造予測に基づきIFT74サブユニットとIFT81サブユニットについてN末端およびC末端のフレキシブルと予想される領域を段階的に削除した変異体を作成した。SUMOタグを利用した多サブユニット共発現系にIFT-B複合体コア1の変異体を導入して発現量を比較した。その結果IFT74-81複合体、IFT22-74-81複合体について発現量の高いコンストラクトを得ることに成功し、大腸菌で共発現、精製し結晶化スクリーニングを行った。発現が極めて困難であったIFT-B複合体コア1ついて共発現領域を最適化し、結晶化に必要な量のサンプルを調製することが出来た。IFT-B複合体コア2はIFT46、IFT52、IFT56、IFT70、IFT88の5サブユニットから構成される。IFT-Bコア複合体2について結晶構造解析のために最適な発現領域を探索し、共発現系の改良を行う。本年度購入しなかった物品があるため繰越金が生じたが、翌年度は必要になるため翌年度分として請求した助成金と合わせて購入する。
酵母オートファゴソーム形成機構の解明

真核細胞が栄養飢餓環境に適応するために、自己の構成成分を分解する現象は自食作用と呼ばれる。自食作用は、オートファゴソーム(以下AP)の形成とAPの細胞内分解コンパートメントであるリソソーム/液胞との融合、それに続く分解という一連の過程を取ることが知られ、単細胞真核生物から高等動植物に至るまで広く保存されている細胞応答機構である。単細胞真核生物である出芽酵母にも自食作用が見いだされており、自食作用に必須な遺伝子群ATGの解析が進められている。これまでAtgタンパク質の局在解析は、細胞にプラスミドを持たせた系で進められてきた。新規に導入したGreen Fluorescent Protein(以下GFP)タギング法は、出芽酵母ゲノム中の標的部位に直接GFPの配列を挿入する方法で、酵母生細胞内で生理的条件下でのタンパク質の局在解析を進める上で有効な手法である。そこで本年度は、この手法を用いて可能な限りのAtgタンパク質にGFPタグを付け、それら融合タンパク質の局在を確認した。さらに、出芽酵母の利点を生かし、それぞれの株に対し網羅的にATG遺伝子の破壊を行う系を開発し、遺伝子破壊を実行に移した。遺伝子破壊株内でのGFP融合Atgタンパク質の局在変化を遺伝学的に解析した結果は、今まで知られていなかったAtgタンパク質間の相互作用を明らかにすると共に、機能未知であったAtgタンパク質の機能を明らかにする上でも有用な情報を我々にもたらしつつある。自食作用は、細胞質がオートファゴソームに取り込まれ、細胞内分解コンパートメントに輸送されるシステムであり、単細胞真核生物である出芽酵母から高等動植物にまで普遍的に見られる現象である。自食作用は基本的に非選択的な輸送システムであるが、出芽酵母においては、いくつかの液胞加水分解酵素がオートファゴソームに選択的に取り込まれ、細胞内分解コンパートメントである液胞へ輸送されることが知られている。アミノペプチダーゼI(以下API)はそのような液胞タンパク質のひとつであり、私は前年度までに緑色蛍光タンパク質を融合したAPIを作成し、APIの細胞内局在と動態を光学顕微鏡を用いて明らかにしてきた。本年度もAPIの可視化解析を進め、APIがオートファゴソームに取り込まれるまでに、これまで知られていたよりも多くの段階を踏むことを明らかにした。APIがCvt complexと呼ばれる大きな集合体を形成するためにはアミノ末端の20アミノ酸残基が重要であること、Cvt complexの形成とオートファゴソームの形成は全く独立して進行する現象であること、そして、Cvt complexがオートファゴソームにターゲティングされるためにはCvt9,Cvt19タンパク質が必須であることなどである。現在、オートファゴソームにより選択的に輸送される別のタンパク質、α-マンノシダーゼの輸送機構の解析を進めている。APIの輸送機構の解析とあわせ、オートファゴソームによる選択的輸送の基本的な機構をさらに明らかにしていきたい。
再生医療用網膜組織の機能を担保した冷却保存方法の開発

細胞移植において、最終製品の細胞を手術現場まで輸送することは不可欠であり保存方法の改良ならびにその評価法の確立が強く求められている。本研究課題では、蛍光異方性という光学技術を利活用した評価手法確立と不凍タンパク質というユニークな素材に網膜組織の保存技術の課題解決に取り組んだ。蛍光異方性については、蛍光物質による検量線作成は滞りなく完了したが、特定のタンパク質がラベルされたiPS細胞由来神経網膜組織を用いて評価を試みたが、蛍光タンパク質の発現量を反映する蛍光異方性の検出結果を得ることができなかった。課題になったのは立体構造を有する神経網膜特有の「厚み」の問題と浮遊状態であるために水分(光散乱)を極小化することが困難であった。また、不凍タンパク質を用いた細胞生存率の向上に関しては、冷蔵環境下においてIII型AFP添加により細胞生存率の向上が確認された。今後、生原基の課題(リコンビナント化)やGMP化を検討することで臨床応用の可能性は考えられる。他方、「他家iPS細胞由来RPE細胞懸濁液移植に関する臨床研究」においてRPE細胞懸濁液を輸送する課題があり、生原基の課題から素材採用は早急には難しかった反面、温度などの保存条件の環境検証は前段の素材開発より得たノウハウを生かして臨床研究における保存条件確定に至った。また、科学的エビデンスとしては冷却しすぎることによる細胞毒性も顕著に確認され(Kitahata et al., Sci Rep., 2019)、振動に関する検証は輸送資材を一定レベルで準備することで配慮は限定的で十分であることを見出した(Hori et al., JTERM, 2019)。本研究の目的は、再生医療の臨床応用とその普及・標準化に向けて重要な課題となる「細胞保存技術」のソリューション開発である。臨床用途の特定細胞加工物を保存する際には、生存率だけでなく細胞機能が担保されている事が非常に重要である。一方で、細胞機能を非接触かつ非侵襲的に定量する技術はほとんど存在しない。そのため、保存前後の細胞機能を定量する技術を通して、保存技術のPOCを取得する基盤技術の開発を試みる。本年の成果として、【1蛍光異方性を用いた新規機能解析系】蛍光異方性による細胞内温度変化のモニタリングを目指して、様々な温度下における蛍光タンパク質(GFP)懸濁液の蛍光異方性を蛍光プレートリーダーを用いて評価し、その定量性を確認した。しかしながら、3次元網膜など細胞内に発現する蛍光タンパク質では強度や定量性に課題があることもわかり現在その解決に向けて検討を進めている。【2不凍タンパク質を用いた冷却保存法】RPE細胞、RPEシートあるいは3次元網膜について、いくつかの温度に暴露した際の細胞生存率や細胞状態の変化を検証した。細胞種あるいは形状によって影響が観察される温度帯に違いがある事がわかってきた。一方、不凍タンパク質については当初溶解度の課題があったが、精製方法の改良等を進める事で溶解度を一定以上に引き上げる事に成功している。次年度は、蛍光異方性の応用に向けた検証と低温時の細胞状況の詳細検討を進めていく予定である。進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断している。【1蛍光異方性を用いた新規機能解析系】蛍光タンパク質の温度依存的な蛍光異方性については定量的なデータが得られている一方で、細胞(特に3次元網膜など立体構造を有するもの)については線形データが得られにくい状況になった。解析プログラムを改良する事で解決可能なのかなどいくつか検証を進めている。当初計画では、細胞温度変化検出は次年度の課題のため、現状は順調な進行と判断している。【2不凍タンパク質を用いた冷却保存方法】再生医療用網膜組織(RPE細胞、RPEシート、3次元網膜)について、低温暴露時の細胞状態の変化を検出した結果、細胞種あるいは構造によって違いがある事がわかってきた。責任遺伝子の探索は完了していないもののいくつか候補は挙げられている。また、当初予期していなかった不凍タンパク質の溶解度の問題については精製方法の改変等を通して解決した為次年度予定している保護効果の検証準備は整っている。臨床研究等に資する細胞製剤を製造する上で、細胞機能を担保した保存技術の開発は不可欠である。現状臨床用細胞では細胞ラベル等の修飾を施すことは容易ではないが、基盤技術開発ではその制限が少ないため本研究では細胞機能をモニタリングする技術として、蛍光タンパク質の蛍光異方性に着目した。細胞機能あるいは純度を規定するタンパク質にマーカータンパク質をノックインした細胞を用いてPOC取得に取り組んだ。蛍光タンパク質溶液では検量線を描くことができたが、細胞内タンパク質の発現量では蛍光タンパク質の量的問題と立体網膜の形状、厚みの問題から線形関係を定量するに至っていない。検出系の改良を主軸に課題解決を図っている。また、不凍タンパク質を用いた細胞保存技術については、昨年度課題になった不凍タンパク質の溶解度の問題を解決し、NIH3T3等の細胞株を用いて冷蔵環境下における不凍タンパク質の細胞保護効果について検証した。その結果、Control群(無処理)やBSA添加群と比較してIII型AFP添加群において顕著に細胞生存室の維持が観察された。今後、RPEやRPEシート等の再生医療等製品などで検証を重ね、細胞生存率のみならず細胞機能(蛍光異方性だけでなく分泌タンパク質の定量や貪食能等も)にも焦点を当てて評価を継続したい。他方、「他家iPS細胞由来RPE細胞懸濁液移植に関する臨床研究」において製造施設と医療施設間を輸送することが求められたため、本課題に関連して細胞保存条件の検証を行った。

生物由来原料基準等の背景から不凍タンパク質は採用できなかったが、温度に関する検証は先行して検証し、輸送温度や細胞形態等に関する課題を克服した輸送技術を確立し臨床研究で採用するに至った。本課題ではさらなる技術開発を通して、冷却保存を用いて安定した長期的細胞保存技術の開発を進める。【蛍光異方性と細胞機能評価】蛍光異方性と細胞機能を関連づけるために、細胞機能あるいは純度を規定するタンパク質にマーカータンパク質をノックインした細胞を用いてPOC取得に取り組んだ。蛍光タンパク質溶液では検量線を描くことができたが、細胞内タンパク質の発現量では蛍光タンパク質の量的問題と立体網膜の形状、厚みの問題から線形関係を定量するに至っていない。検出系の改良を主軸に課題解決を図っている。【不凍タンパク質の細胞保護効果】不凍タンパク質を用いた検証については、これまで溶解性の課題を不凍タンパク質の純化・精製工程の改良と見直しを通して、克服することに成功した。そして、冷蔵環境下における不凍タンパク質の保護効果について細胞を用いた評価に至っている。NIH3T3等の細胞株を用いて冷蔵環境下における不凍タンパク質の細胞保護効果について検証した。その結果、Control群(無処理)やBSA添加群と比較してIII型AFP添加群において顕著に細胞生存率の維持が観察された。今年度は細胞種を再生医療等製品であるRPEやRPEシート等を用いて評価を継続させる。そして細胞生存のみならず細胞機能について言及できるようにデータを積み重ねる予定である。細胞移植において、最終製品の細胞を手術現場まで輸送することは不可欠であり保存方法の改良ならびにその評価法の確立が強く求められている。本研究課題では、蛍光異方性という光学技術を利活用した評価手法確立と不凍タンパク質というユニークな素材に網膜組織の保存技術の課題解決に取り組んだ。蛍光異方性については、蛍光物質による検量線作成は滞りなく完了したが、特定のタンパク質がラベルされたiPS細胞由来神経網膜組織を用いて評価を試みたが、蛍光タンパク質の発現量を反映する蛍光異方性の検出結果を得ることができなかった。課題になったのは立体構造を有する神経網膜特有の「厚み」の問題と浮遊状態であるために水分(光散乱)を極小化することが困難であった。また、不凍タンパク質を用いた細胞生存率の向上に関しては、冷蔵環境下においてIII型AFP添加により細胞生存率の向上が確認された。今後、生原基の課題(リコンビナント化)やGMP化を検討することで臨床応用の可能性は考えられる。他方、「他家iPS細胞由来RPE細胞懸濁液移植に関する臨床研究」においてRPE細胞懸濁液を輸送する課題があり、生原基の課題から素材採用は早急には難しかった反面、温度などの保存条件の環境検証は前段の素材開発より得たノウハウを生かして臨床研究における保存条件確定に至った。
小児期における高比重リポ蛋白代謝酵素の発達生理と小児成人病における変動の意義

本年度はコレステリ-ルエステル転送蛋白(CETP)活性の測定をアイソトープ法で行うための基礎的検討から開始した。小児の血液サンプルを測定するためには、微量検体で測定を行う必要があることが判明し、ベックマン社製Airfugeを用いて175μlの血清からリポ蛋白を除去後に透析して測定に供した。サンプル量は20μl/tubeであり、^<14>C標識HDL_3は20μl/tube(コレステリ-ルエステルとして6.8μg)、標識コレステリ-ルエステルの受容体であるd<1.063のリポ蛋白は40μl/tubeという少量で測定ができたので、経費の節約にもなった。持続携帯腹膜透析療法を受けている末期腎不全患児においては、著明な高脂血症とCETP活性の亢進が認められた。従来成人の血液透析患者ではCETP活性が低下しているか、インヒビターの存在のために生体内における活性が低下していると報告されているのとは異なる所見であった。CETP活性とHDL-CまたはHDL-C細分画の間には有意な相関関係は認められず、むしろ高脂血症との相関が注目された。すなわち特にLDL-CやTGの高値である症例ほどCETP活性も高く、CETPの高活性は動脈硬化促進的に作用している事を示唆する所見であった。一方、脂肪組織はCETPを多く含んでいることが判明しているが、当研究室の成績では現在までのところ、肥満児ではCETP活性の有意な変動は認められていない。また、健常成人と内分泌・代謝・栄養障害を認めない小児において、血清中のCETP活性には有意差が認められず、HDL-Cに明らかな年齢差・性差が認められることとは対照的な成績であった。年齢によるCETP活性の変動を明らかにするためには、今後より多数例での詳細な検討が必要であると思われた。インスリン依存型糖尿病患児においては、HDL_2-Cの高値が認められており、CETP活性が変動している可能性が高いので、今後サマーキャンプにおいて血液を採取して活性を測定する予定である。
うつ病モデルマウスの巣作りはなぜ遅延するのか？－中枢モノアミン系の関与

私共の先行研究では、単発の社会的敗北ストレスを暴露されたマウスで巣作り行動の遅延が見られた。巣作り行動は前頭前野や海馬が関与しており、これらの脳領域はうつ病発症とも深く関わる。このモデルの巣作り遅延は、5-HT2a受容体の拮抗薬で一部レスキューできることも明らかにした。以上により、社会的敗北ストレスモデルマウスの巣作り遅延に着目することで、モノアミン仮説とは異なるうつ病発症メカニズムを発見できる可能性があると考え、モデルマウスの巣作り遅延の原因を根本的に解明することを目指した。平成30年度は以下の点を明らかにした。1.ストレスを暴露されたマウスにおける巣作りの性差社会的敗北ストレスでは雌モデルを作出することが難しいため、雌モデルの作出が可能であるSubchronic Variable Stress(SVS)暴露法を用いて巣作り行動の性差への影響を調べた。結果としてストレス区の雄ではコントロール区と比較して増体重が有意に減少していたが、雌では有意な差が見られなかった。摂食量は雌雄ともにストレス区で有意に減少していた。巣作りは5段階のスコアにより評価されたが、コントロール区と比較して巣作りスコアは雌雄ともに有意な差はみられなかった。このSVS暴露法では増体重や摂食量に変化があったものの巣作りに性差があるとはいえなかった。2.巣作り遅延を引き起こす分子の解明および3次元解析システムを用いた行動評価a)急性社会的敗北ストレス暴露により変動する分子を網羅的に解析するためにストレス暴露後のマウス側坐核を採取し、リン酸化タンパク質アレイを行った。今後、データの解析を進めていく予定である。b)3次元深度カメラを用いた巣作り解析技術を利用して、急性社会的敗北ストレス後の巣作り行動、社会行動および活動量データを取得し、解析している。引き続き解析を続けていく。性差から巣作り遅延メカニズムを解明できないかと新たなストレスモデルを用いて実験を試みたが、雌雄ともに巣作りスコアに有意な差は見られなかった。そのため実験計画を再検討し、社会的敗北ストレスモデルを再度用いて生化学的および行動学的なアプローチから巣作り遅延メカニズムを解明する必要があると考えた。そのために以下の実験を行った。社会的敗北ストレスにより変動する分子を網羅的に解析するために側坐核を採取し、リン酸化タンパク質アレイを行った。前年度に実験手順を確立しており、H30年度は本実験を行う形となった。今後、データの解析を進める予定である。さらに、3次元深度カメラを用いた巣作り解析技術を利用して、急性社会的敗北ストレスが巣作り行動、社会行動および活動量におよぼす影響などを調べた。今後引き続き解析を続けていく。急性社会的敗北ストレスと巣作り行動を組み合わせたパラダイムを使用し、向精神薬のスクリーニングを継続していく。また平成29年度は、急性社会的敗北ストレスモデルマウスの側坐核などを採取し、リン酸化タンパク質の網羅的解析の予備実験を行い、実験プロトコルを確立した。この実験プロトコルをもとに平成30年度は、側坐核を採取し、本実験を行いデータを取得した。今後、このデータをもとに急性社会的敗北ストレスにより変動する脳内リン酸化シグナルを解析して、巣作り遅延に関与する分子を探索する。さらに平成30年度にc-Fosタンパク質発現のマッピングについて情報収集を行った。今後、これをもとに急性社会的敗北ストレスを暴露した後の脳を経時的にサンプリングし、c-Fosタンパク質発現のマッピングを行い、脳の活性化部位を明らかにする予定である。うつ病研究には社会的敗北ストレスモデルが広く使用されている。私共は、マウスに社会的敗北ストレスを暴露すると巣作り行動が遅延することを明らかにした。巣作りは体温調節や敵からの防御などに資する本能行動であり、前頭前野や海馬が関与している。これらの脳領域はうつ病発症にも関与している。平成29年度は以下の点を明らかにした。1.巣作り遅延をレスキューする向精神薬の探索a)ADHDの治療に広く使用されているMethylphenidate投与がモデルの巣作り遅延をレスキューするかを調べた結果、有意な有効性は認められなかった。b)同様にセロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬(SNRI)であるDuloxetineにも有効性は認められなかった。私共の先行研究では、セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)であるFluoxetine投与は巣作りを悪化させた。よって、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリンの再取り込み阻害では、モデルマウスの巣作り障害はレスキューされないことが明らかになった。平成30年度も同様に遅延をレスキューする薬剤のスクリーニングを継続する。2.巣作り遅延を引き起こす分子の探索社会的敗北ストレスにより変動する脳内リン酸化シグナルを解析して、巣作り遅延に関与する分子を探索している。平成29年度は、急性社会的敗北ストレスモデルマウスを作製し、前頭前野、側坐核、海馬などを採取し、予備的な解析を行い、実験プロトコルを確立した。平成30年度は確立したプロトコルをもとに本実験を行う。私共の先行研究では、5-HT2a受容体の拮抗薬の投与が急性社会的敗北ストレス

モデルマウスの巣作り遅延を部分的にレスキューすることを明らかにした。当初、5-HT2a受容体に焦点を当て、巣作り行動の研究を進めるつもりであったが、5-HT2a受容体の拮抗薬の作用は部分的な効果にとどまったため、計画を再検討し直した。そこで、平成29年度は抗うつ薬などの向精神薬の作用を検証した。研究代表者が確立した急性社会的敗北ストレスと巣作り行動を組み合わせた向精神薬スクリーニングパラダイムを活用し、平成29年度では2つの薬剤の影響を明らかにした。また、社会的敗北ストレスにより変動する脳内リン酸化シグナルを網羅的に解析するために、モデルマウスを作製し、脳サンプルを採取し、予備実験を行った。その結果、平成29年度には当該実験プロトコルを確立できた。平成30年度以降は急性社会的敗北ストレスにより変動する脳内リン酸化シグナルを網羅的に解析し、巣作り行動に関与するシグナルの探索を行う予定である。私共の先行研究では、単発の社会的敗北ストレスを暴露されたマウスで巣作り行動の遅延が見られた。巣作り行動は前頭前野や海馬が関与しており、これらの脳領域はうつ病発症とも深く関わる。このモデルの巣作り遅延は、5-HT2a受容体の拮抗薬で一部レスキューできることも明らかにした。以上により、社会的敗北ストレスモデルマウスの巣作り遅延に着目することで、モノアミン仮説とは異なるうつ病発症メカニズムを発見できる可能性があると考え、モデルマウスの巣作り遅延の原因を根本的に解明することを目指した。平成30年度は以下の点を明らかにした。1.ストレスを暴露されたマウスにおける巣作りの性差社会的敗北ストレスでは雌モデルを作出することが難しいため、雌モデルの作出が可能であるSubchronic Variable Stress(SVS)暴露法を用いて巣作り行動の性差への影響を調べた。結果としてストレス区の雄ではコントロール区と比較して増体重が有意に減少していたが、雌では有意な差が見られなかった。摂食量は雌雄ともにストレス区で有意に減少していた。巣作りは5段階のスコアにより評価されたが、コントロール区と比較して巣作りスコアは雌雄ともに有意な差はみられなかった。このSVS暴露法では増体重や摂食量に変化があったものの巣作りに性差があるとはいえなかった。2.巣作り遅延を引き起こす分子の解明および3次元解析システムを用いた行動評価a)急性社会的敗北ストレス暴露により変動する分子を網羅的に解析するためにストレス暴露後のマウス側坐核を採取し、リン酸化タンパク質アレイを行った。今後、データの解析を進めていく予定である。b)3次元深度カメラを用いた巣作り解析技術を利用して、急性社会的敗北ストレス後の巣作り行動、社会行動および活動量データを取得し、解析している。引き続き解析を続けていく。
高温域での応力下における構造用セラミックスのき裂治癒挙動に関する研究

本研究では,申請者らが開発した優れたき裂治癒能力を有する窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCを供試材として選択した.100μmの表面き裂を導入した後,試験片に繰り返し応力を負荷した状態で,8001200°Cの大気中において所定の時間熱処理を行った.熱処理後の試験片の室温曲げ強度を測定し,応力下におけるき裂治癒挙動を調査した.さらに,それぞれのき裂治癒温度においても,三点曲げ強度,静疲労強度特性および繰返し曲げ疲労強度特性を調査した.その結果,以下の点が明らかとなった.1.熱処理後の試験片の曲げ強度は平滑材の曲げ強度と同等の値まで強度が回復していた.100μmの表面き裂を導入した予き裂材の曲げ強度の7080%程度の一定および繰返し応力下においてもき裂を治癒することが出来た.応力下でき裂治癒を施した試験片の曲げ強度は,き裂治癒温度においても,熱処理を施した平滑材と同等な曲げ強度を有していた.さらに,ほとんどの試験片の破壊起点はき裂治癒部以外であり,き裂治癒部の強度は十分に高いことが分かった.2.それぞれの材料に関して,き裂治癒可能な限界条件を,Newman-Rajuの応力拡大係数評価式および残留応力による応力拡大係数を用いて評価した.3.一定応力下および繰返し応力下でき裂治癒を行った試験片の治癒温度における静疲労限度および繰返し疲労限度は,治癒材の曲げ強度の7080%程度の値であり,き裂治癒部の疲労限度は十分に高いことが明らかとなった.上記の結論より,本研究で用いた窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCは,温度,応力および環境の条件によっては,使用中に生じたき裂をその場で治癒する能力を有していると言える.本研究では,申請者らが開発した優れたき裂治癒能力を有する窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCを供試材として選択した.100μmの表面き裂を導入した後,試験片に繰り返し応力を負荷した状態で,8001200°Cの大気中において所定の時間熱処理を行った.熱処理後の試験片の室温曲げ強度を測定し,応力下におけるき裂治癒挙動を調査した.さらに,それぞれのき裂治癒温度においても,三点曲げ強度,静疲労強度特性および繰返し曲げ疲労強度特性を調査した.その結果,以下の点が明らかとなった.1.熱処理後の試験片の曲げ強度は平滑材の曲げ強度と同等の値まで強度が回復していた.100μmの表面き裂を導入した予き裂材の曲げ強度の7080%程度の一定および繰返し応力下においてもき裂を治癒することが出来た.応力下でき裂治癒を施した試験片の曲げ強度は,き裂治癒温度においても,熱処理を施した平滑材と同等な曲げ強度を有していた.さらに,ほとんどの試験片の破壊起点はき裂治癒部以外であり,き裂治癒部の強度は十分に高いことが分かった.2.それぞれの材料に関して,き裂治癒可能な限界条件を,Newman-Rajuの応力拡大係数評価式および残留応力による応力拡大係数を用いて評価した.3.一定応力下および繰返し応力下でき裂治癒を行った試験片の治癒温度における静疲労限度および繰返し疲労限度は,治癒材の曲げ強度の7080%程度の値であり,き裂治癒部の疲労限度は十分に高いことが明らかとなった.上記の結論より,本研究で用いた窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCは,温度,応力および環境の条件によっては,使用中に生じたき裂をその場で治癒する能力を有していると言える.本研究では,申請者らが開発した優れたき裂治癒能力を有する窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCを供試材として選択した.100μmの表面き裂を導入した後,試験片に一定応力を負荷した状態で,800°C1200°Cの大気中において所定の時間熱処理を行った.熱処理後の試験片の室温曲げ強度を測定し,応力下におけるき裂治癒の可否を調査した.さらに,それぞれのき裂治癒温度においても,三点曲げ強度,静疲労強度特性および繰返し曲げ疲労強度特性を調査した.その結果,以下の点が明らかとなった.1.熱処理後の試験片の曲げ強度は平滑材の曲げ強度と同等の値まで強度が回復していた.しかも,ほとんどの試験片の破断起点はき裂治癒部以外である.したがって,強度を半減させるほどの大きなき裂を,極めて厳しい応力下においても完全に自己治癒することができる.2.それぞれの材料に関して,き裂治癒可能な限界条件を,応力拡大係数を用いて評価した.3.一定応力下でき裂治癒を行った試験片の治癒温度における静疲労限度および繰返し疲労限度は治癒材の曲げ強度の7080%程度の値であり,き裂治癒部の疲労強度は十分に高いことが明らかとなった.上記の結論より,本研究で用いた窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCは,温度,応力および環境の条件によっては,使用中に生じたき裂をその場で治癒する能力を有していると言える.

本研究では,申請者らが開発した優れたき裂治癒能力を有する窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCを供試材として選択した.100μmの表面き裂を導入した後,試験片に繰り返し応力を負荷した状態で,8001200°Cの大気中において所定の時間熱処理を行った.熱処理後の試験片の室温曲げ強度を測定し,繰返し応力下におけるき裂治癒挙動を調査した.さらに,それぞれのき裂治癒温度においても,三点曲げ強度,静疲労強度特性および繰返し曲げ疲労強度特性を調査した.その結果,以下の点が明らかとなった.1.熱処理後の試験片の曲げ強度は平滑材の曲げ強度と同等の値まで強度が回復していた.繰返し応力下において,100μmの表面き裂を導入した予き裂材の曲げ強度の7080%程度の繰り返し応力下においてもき裂を治癒することが出来た.繰返し応力下でき裂治癒を施した試験片の曲げ強度は,き裂治癒温度においても,熱処理を施した平滑材と同等な曲げ強度を有していた.2.それぞれの材料に関して,き裂治癒可能な限界条件を,Newman-Rajuの応力拡大係数評価式および残留応力による応力拡大係数を用いて評価した.3.繰返し応力下でき裂治癒を行った試験片の治癒温度における繰返し疲労限度は治癒材の曲げ強度の7080%程度の値であり,き裂治癒部の疲労限度は十分に高いことが明らかとなった.上記の結論より,本研究で用いた窒化ケイ素/SiC,アルミナ/SiCおよびムライト/SiCは,温度,応力および環境の条件によっては,使用中に生じたき裂をその場で治癒する能力を有していると言える.
新たなプロテアーゼDINEによる神経細胞変性の防御メカニズムの解明

運動神経が損傷を受けた後、生存・再生する過程で発現する遺伝子群をスクリーニングした結果、我々は多くの興味深い遺伝子を得た。中でもDamage Induced Neuronal Endopeptidase(DINE)と名付けた分子は新たなメタロプロテアーゼであり、中枢神経系のさまざまな障害に応答し、損傷を受けた神経細胞で発現が誘導される。また、培養細胞に発現させると、Mn-SOD,やCu/Zn-SODなどの発現を促進させ、スパーオキサイドによる細胞死の防御に働くことが明らかになった。メタロプロテアーゼであるDINEは、その基質や機能に未だ不明の点が多い。本年度は、DINEの転写制御機構について特に研究の展開がみられた。DINE遺伝子の5'上流領域の解析を進めた結果、5'上流約3kbのなかには、神経細胞特異的発現にかかる領域が存在した。また、この領域を用いてLacZを発現するトランスジェニック動物を作成したところ、神経傷害に応答してLacZの発現が認められた。このことから、この領域には神経傷害特異的発現にかかるプロモーター領域も含まれることが明らかとなった。DINEプロモーターの下流にルシフェラーゼを結合したコンストラクトを用いて、後根神経節細胞やPC12細胞を用いてプロモーター活性を検討した。各種神経栄養因子による発現制御を検討した結果、LIFによる誘導が著しいことが明らかになった。また、gp130の中和抗体やSTAT3のドミナントネガティブ発現によりプロモーター活性を抑制できることから、LIF/LIFR/STAT3を介するシグナルがDINEの発現に重要であると考えられる。また、ラットの軸索損傷モデルにおいて、坐骨神経にLIFを投与することでDINEの発現が後根神経節で誘導されたことから、in vivoでもLIFはDINEの誘導因子であると考えられる。
肺癌のheterogeneiltyと増殖能に関する病理組織学的研究

最近では細胞回転のうち、増殖期にある細胞を通常の標本で検索が可能になり、現在ではG_1,S,G_2,M期の広く認識する抗体Ki-67が最も信頼されている。そこで、当院肺癌グループで収集した肺癌切除手術例で、Ki-67抗体を用い、多彩性な組織像を示す腺癌で検討した。その結果、φ1cm前後の小型の腺癌では陽性細胞は少なく、2cmを越えると陽性癌細胞が増えるが、個々で部位による分布をみると、一般的に周辺部の乳頭状増殖を示す所に陽性細胞が多く、中心部が圧倒的に少ない。ここで興味深いことは、多くの腺癌では周辺部は乳頭状、言わば高分化巣で、中心部は線維化を伴い腫瘍細胞が小型の管状増殖を示す、言わば中分化巣である。さらに、胎児型高分化腺癌では、一番未熟とされるmorula様の所は、Ki-67抗原の発現はほとんど認められず、周辺の管状腺癌を示す、言わば気管支の方への分化を示す部分で陽性細胞が多い。つまり、分化度と増殖能とは関連しない可能性が示唆される点である。今後、さらに多数例での検討が望まれる。
大腸上皮におけるNotchシグナル機能と慢性大腸炎における上皮分化異常機構

本研究は当初の研究計画に示した項目につき、下記に示すごとく大きな研究成果が得られた。1)活性型Notch、bHLH因子HES-1およびMath1の標的遺伝子群の網羅的解析においては杯細胞表現系を有する大腸上皮由来細胞株にcleaved Notch1及びHES1遺伝子がテトラサイクリン刺激において発現誘導する系を確立し、cleaved Notch1を誘導発現させたmRNAを用いマイクロアレイにて変化のあった遺伝子の単離に成功した。そのうちバネート細胞で発現している遺伝子が単離され実際にNorthern blot,RT-PCR解析によりNotchの発現誘導に伴いその遺伝子の発現増加を確認した。本年度はさらに解析を進め、cleaved Notch1を誘導発現した短時間での遺伝子発現解析を行ったところさらに新規標的遺伝子の単離に成功した(未発表データ)。これは幹細胞領域に発現している遺伝子でありNotchシグナルと幹細胞形質維持機構を密接に示唆するものであり、さらなる解析を進めている。2)炎症性メディエーターによるNotchシグナル制御機構の解析においてはまずNotchシグナル活性化評価としてDNA結合部位であるRBPjkの結合配列を用いたレポーターアッセイを構築し、定量化に成功した。今後種々のサイトカイン、ケミカルメディエーター刺激によるNotchシグナルの影響と腸管上皮細胞表現系の変化を解析していく。3)Notchシグナルの人為的制御による大腸炎治療の可能性の検討においてはまず正常ヒト大腸組織においてcleaved Notch,HES1,Math1の発現部位を免疫染色法にて検討した。Notch,HES1は大腸粘膜の増殖帯にほぼ同一の部位に発現しているのに対し、Math1は絨毛の管腔側まで発現していることが明らかとなった。本年度はさらに潰瘍性大腸炎患者におけるcleaved Notch,HES1の発現を解析したところ正常人と比較しより管腔側まで発現が増加しており、腸管上皮分化障害と密接に関わる事を示唆した(未発表データ)。現在腸炎モデルマウスにおけるNotch阻害薬の効果を詳細に解析中である。そのうちパネート細胞で発現している遺伝子が単離され実際にNorthern blot, RT-PCR解析によりNotchの発現誘導に伴いその遺伝子の発現増加を確認した。これはNotchシグナルがパネート細胞分化との関連性を示唆するものでありさらなる解析を進めている。3)Notchシグナルの人為的制御による大腸炎治療の可能性の検討においてまず正常ヒト大腸組織においてcleaved Notch, HES1, Math1の発現部位を免疫染色法にて検討した。Notch, HES1は大腸粘膜の増殖帯にほぼ同一の部位に発現しているのに対し、Math1は絨毛の管腔側まで発現していることが明らかとなった。今後潰瘍性大腸炎などの慢性大腸炎における発現検討を行う予定である。本研究は当初の研究計画に示した項目につき、下記に示すごとぐ大きな研究成果が得られた。

1)活性型Notch、bHLH因子HES-1およびMath1の標的遺伝子群の網羅的解析においては杯細胞表現系を有する大腸上皮由来細胞株にcleaved Notch1及びHES1遺伝子がテトラサイクリン刺激において発現誘導する系を確立し、cleaved Notch1を誘導発現させたmRNAを用いマイクロアレイにて変化のあった遺伝子の単離に成功した。そのうちパネート細胞で発現している遺伝子が単離され実際にNorthern blot, RT-PCR解析によりNotchの発現誘導に伴いその遺伝子の発現増加を確認した。本年度はさらに解析を進め、cleaved Notch1を誘導発現した短時間での遺伝子発現解析を行ったところさらに新規標的遺伝子の単離に成功した(未発表データ)。これは幹細胞領域に発現している遺伝子でありNotchシグナルと幹細胞形質維持機構を密接に示唆するものであり、さらなる解析を進めている。2)炎症性メディエーターによるNotchシグナル制御機構の解析においてはまずNotchシグナル活性化評価としてDNA結合部位であるRBPjkの結合配列を用いたレポーターアッセイを構築し、定量化に成功した。今後種々のサイトカイン、ケミカルメディエーター刺激によるNotchシグナルの影響と腸管上皮細胞表現系の変化を解析していく。3)Notchシグナルの人為的制御による大腸炎治療の可能性の検討においてはまず正常ヒト大腸組織においてcleaved Notch, HES1,Math1,の発現部位を免疫染色法にて検討した。Notch, HES1は大腸粘膜の増殖帯にほぼ同一の部位に発現しているのに対し、Math1は絨毛の管腔側まで発現していることが明らかとなった。本年度はさらに潰瘍性大腸炎患者におけるcleaved Notch, HES1の発現を解析したところ正常人と比較しより管腔側まで発現が増加しており、腸管上皮分化障害と密接に関わる事を示唆した(未発表データ)。現在腸炎モデルマウスにおけるNotch阻害薬の効果を詳細に解析中である。