hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホルモン応答性なTopII依存的DNA切断修復異常による病態メカニズムの解明

本研究の目的は、次の2つである。1、トポイソメラーゼ2型酵素(Top2)がDNA切断端に共有結合したDNA二重鎖切断(DSB)修復の分子メカニズムを明らかにすること、2、エストロゲンによるTop2依存的なDSB形成と疾患とを結びつけることである。2018年度は、目的2の解明に注力した。MCF-7細胞を使い、TOP2beta, 53BP1, TOP2beta/53BP1/BRCA1, TDP2欠損細胞を作製した。エストロゲン処理によってできるDSB損傷修復をgH2AX fociを指標に調べた結果、1、エストロゲンによってできるDSBは、TOP2beta依存的であること、2、エストロゲンによってできるDSB修復には、BRCA1が必要であること、を明らかにした。BRCA1が欠損すると非常に強いエストロゲンのDNA毒性が観察された。エストロゲン受容体に対する拮抗阻害剤を使い、このDNA毒性がエストロゲン受容体依存的であルことを示した。アメリカ国立衛生研究所(NIH)のAndre Nussenzweig博士と共同研究を実施し、エストロゲン投与によるDNA毒性をBRCA1欠損マウスの乳腺組織で調べた。BRCA1欠損マウス乳腺では、エストロゲン投与によってエストロゲン受容体陽性細胞であるルミナール上皮細胞でgH2AX fociが観察された。BRCA1遺伝子は、遺伝性乳がん、卵巣がんの原因遺伝子である。BRCA1はすべての細胞に必須である相同組換えに機能する。相同組換えは、DSB修復経路の一つであり、すべての細胞に必須である。もしBRCA1欠損によって発症するがんの原因が、相同組換えの異常であれば、臓器特異性のないがんを発症するはずである。本研究の意義は、エストロゲンによるTOP2依存的なDSBの修復にBRCA1が重要な働きをしていることを発見した。このBRCA1の新機能が、BRCA1欠損による臓器特異的発がんを説明できると考えている。これらの研究成果を、米国科学アカデミー紀要に発表した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の2016年度研究計画に書かれたことをほぼ全て完了させ、次のことを明らかにした。1、トポイソメラーゼII型酵素がDNAを切断後、再結合できずにDNA-TopII複合体が細胞の中には非常に多く存在すること、2、二重鎖切断端に共有結合したDNA-TopII複合体の除去にMre11が必須であること3、DNA-TopII複合体の除去に関与することが知られているTdp2酵素を過剰発現することによってMre11欠失による増殖阻害を回避できることを明らかにし、解析結果をまとめて国際誌に発表した。また本年度は2017年度以降の研究計画の準備を行った。まず乳腺細胞であるMCF7, T47D細胞を使ったゲノム編集のプロトコールを確立した。このプロトコールを用いて、BRCA1欠損細胞MCF7, T47D細胞で樹立し、蛋白質が発現していないことを確認した。auxinデグロン法を用いた条件的ノックアウト細胞をTK6細胞で作製し、auxin添加依存的にBRCA1蛋白質が分解を受けることを確認した。本研究課題の研究計画の通り、2017年以降この細胞を使って、DNA-TopII複合体除去におけるBRCA1の機能とMre11との関係性を明らかにする。また2016年度には、申請者が所属する研究室と国立医薬品食品衛生研究所の本間正充部長の研究室が中心となりTK6コンソーシアムを設立し、ゲノム編集技術を利用して作製したDNA修復に関係したヒトTK6変異細胞、約40種類を一般に公開した(http://www.nihs.go.jp/dgm/index.html)。本研究課題の2016年度研究計画では、1,ヒトB細胞株(TK6)においてMre11とBRCA1等をゲノム編集(遺伝子破壊と点変異挿入)、2, Mre11又はBRCA1の欠損細胞において,DNA二重鎖切断端に共有結合したトポイソメラーゼII型酵素(TopII)の定量、3, Mre11欠損による細胞致死性をTDP2強制発現で抑制できるか否か解析することであった。この研究成果を発展させ、Mre11の上流分子とされるBRCA1の機能解析を開始し、今のところ滞りなく2017年度の研究計画を進行させている。特にBRCA1の機能解析には、乳腺細胞であるMCF7とT-47D細胞を用いてBRCA1遺伝子破壊細胞を樹立できた。

エストロゲン受容体に対する拮抗阻害剤を使い、このDNA毒性がエストロゲン受容体依存的であルことを示した。アメリカ国立衛生研究所(NIH)のAndre Nussenzweig博士と共同研究を実施し、エストロゲン投与によるDNA毒性をBRCA1欠損マウスの乳腺組織で調べた。BRCA1欠損マウス乳腺では、エストロゲン投与によってエストロゲン受容体陽性細胞であるルミナール上皮細胞でgH2AX fociが観察された。BRCA1遺伝子は、遺伝性乳がん、卵巣がんの原因遺伝子である。BRCA1はすべての細胞に必須である相同組換えに機能する。相同組換えは、DSB修復経路の一つであり、すべての細胞に必須である。もしBRCA1欠損によって発症するがんの原因が、相同組換えの異常であれば、臓器特異性のないがんを発症するはずである。本研究の意義は、エストロゲンによるTOP2依存的なDSBの修復にBRCA1が重要な働きをしていることを発見した。このBRCA1の新機能が、BRCA1欠損による臓器特異的発がんを説明できると考えている。これらの研究成果を、米国科学アカデミー紀要に発表した。ニワトリDT40細胞とヒトTK6細胞、乳腺細胞MCF7とT-47D細胞のBRCA1ノックアウト細胞を用いて、DNA-TopII複合体除去におけるBRCA1の機能を明らかにする。具体的には、1、TK6, MCF7とT-47D細胞を用いてBRCA1細胞においてDNA-TopII複合体が蓄積しているか、2,ヒトTK6細胞を用いて、Mre11BRCA1二重変異細胞を作製して2つの関係を明らかにする。今後、これらの細胞を用いて、次世代シークエンサーを用いた転写解析を考えているため、2017年度は転写解析を行うためのコンピューター技術(Perl, R言語)の習得を行う。また、DNA-TopII複合体除去に関わるBRCA1と相互作用する因子を同定することを目的として、3FLAGエピトープタグをBRCA1遺伝子座のスタートコドンにノックインした細胞を作製中である。3FLAG-BRCA1タンパク質を発現した細胞をエトポシド(DNA-TopII複合体を安定化する薬剤)暴露し、相互作用する因子を免疫沈降と質量分析を使って同定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
咀嚼システムにおける呼吸と咀嚼とのカプリングならびにスウイッチングの中枢神経機構

初年度は、舌の呼吸リズム活動と咀嚼リズム活動とのカプリングの中枢ニュ-ロン機構を、ペントバルビタ-ル麻酔下のネコで解析し、延髄網様体の呼吸ニュ-ロンの中には、呼吸リズム活動を示す舌下神経運動ニュ-ロンに投射するpremotor neuronが存在することを見いだした。これらのニュ-ロンの中には、1)舌下神経核および横隔神経核両者の刺激に対して逆行性スパイク応答を示し、2)それぞれの神経梓に限局注入した異種の蛍光色素で二重標識され、3)自発性スパイクによる舌下神経および横隔神経の発射活動の加算平均により両者に単シナプスの潜時で増大が認められうものがあった。この結果は、同一の延髄網様体呼吸ニュ-ロンの軸索が2本に分岐して、舌下神経ならびに横隔神経両者の運動ニュ-ロンに直接興奮性シナプス結合していることを示すものであり、これらのニュ-ロンは舌の呼吸活動と咀嚼活動とのカプリングに関与していると結論した。嚥下に一致して呼吸運動は停止し、舌の呼吸リズム活動から嚥下の活動パタンにスウィッチングする。第2年度には、呼吸から嚥下への舌の機能のスウィッチングに関する延髄網様体の呼吸ニュ-ロンの投割を解析する目的で、迷走神経を両側切断したクロラロ-ス麻酔下の非動化ネコで、舌下神経運動ニュ-ロンに投射し、呼吸リズム活動を示すpremotor neuronの単一二ュ-ロン活動を延髄網様体から記録した。舌下神運動ニュ-ロンにのみ投射する呼息性ニュ-ロンは、上喉頭神経の電気刺激によって誘発される嚥下に一致して群発活動を示すが、舌下神経と横隔神経両者の運動ニュ-ロンに投射する吸息性ニュ-ロンの発射活動は、嚥下に一致して停止することが明らかになった。この結果から,舌下神経運動ニュ-ロンに投射する延髄網様体の興奮性premotor neuronに見られるこれらの活動変化は、呼吸から嚥下への舌機能のスウィッチングに関与すると結論した。本年度は、舌の呼吸リズム活動と咀嚼リズム活動とのカプリングの中枢神経機構について、同一のpremotor neuronの軸索が2本に分岐して、横隔神経運動ニュ-ロンおよび舌下神経運動ニュ-ロンの両方に直接投射して興奮性シナプス結合しているか否かを、ケタミン麻酔下のネコを用いて形態学的・生理学的手法で解析し、以下の結果を得た。1)横隔神経核に蛍光色素Nuclear yellow、舌下神経核に蛍光色素Fast blueを限局性に注入した結果、それぞれの色素で逆行性に標識されたニュ-ロンが孤束核の腹外側部、疑核の背内側部およびKF核周囲に見いだされ、これらのニュ-ロンの中には両色素により二重標識されたニュ-ロンが存在した。2)頸髄の横隔神経運動ニュ-ロンプ-ルに刺入した金属微小電極による限局性刺激に対して逆行性スパイク応答を示す橋・延髄網様体の呼吸ニュ-ロンのなかには舌下神経核の刺激に対しても逆行性に興奮するものがあった。

3)呼吸ニュ-ロンの単一ニュ-ロン活動を導出し、その自発性スパイクをtriggerとして、舌下神経および横隔神経の発射活動を平均加算した結果、それぞれの神経発射活動に単シナプス性の潜時で増大を示すものとともに、同一の呼吸ニュ-ロンからこれら両神経活動に単シナプス性に増大を引き起こすものが見いだされた。以上の事から、延髄網様体の呼吸ニュ-ロンの中には呼吸リズム活動を示す舌下神経運動ニュ-ロンに投射する興奮性premotor neuronが存在し、その一部は軸索を分岐して横隔神経運動ニュ-ロンにも投射していると、結論した。これらのニュ-ロンは舌の呼吸リズム活動と咀嚼リズム活動とのカプリングに関与していると想定される。昨年度は、舌の呼吸リズム活動と咀嚼リズム活動とのカプリングの中枢神経機構について、ペントバルビタ-ル麻酔下のネコを用いて形態学的・生理学的手法により解析し、延髄網様体の呼吸ニュ-ロンの中には呼吸リズム活動を示す舌下神経運動ニュ-ロンに投射する興奮性premotor neuronが存在し、その一部は軸索を分岐して横隔神経運動ニュ-ロンにも投射することが明らかになった。この結果から、舌下神経運動ニュ-ロンおよび横隔神経運動ニュ-ロンの両者に直接投射するするこれらのpremotor neuronは、舌の呼吸リズム活動と咀嚼リズム活動とのカプリングに関与していると結論した。嚥下に一致して、呼吸運動は停止し、舌の活動は呼吸リズム活動から嚥下の活動パタンにスウイッチングする。本年度は、呼吸から嚥下への舌の、機能のスウイッチングに関する上記の延髄網様体の呼吸ニュ-ロンの役割を検索した。迷走神経を両側切断したクロラロ-ス麻酔下の非動化ネコで舌下神経運動ニュ-ロンに投射し、呼吸リズム活動を示すpremotor neuronの単一ニュ-ロン活動を延髄網様体から微小電極で記録し、その活動が上喉頭神経の電気刺激によって誘発された嚥下に一致して、どのような変化を示すかを解析した。その結果、舌下神経運動ニュ-ロンにのみ投射する吸息性ニュ-ロンは上喉頭神経刺激による嚥下に一致して群発活動を示すが、舌下神経運動ニュ-ロンと横隔神経運動ニュ-ロンとの両者に投射する吸息性ニュ-ロンの発射活動は嚥下に一致して停止することが、明らかになった。この結果から、舌下神経運動ニュ-ロンに対射する延髄網様体の興奮性premotor neuronに見られるこれらの活動の変化は、呼吸から嚥下への舌下神経運動ニュ-ロンの機能のスウイッチングに関与していると結論した。
正則言語による論理関数の計算量解析

組み合わせ論理回路の基本的な計算量尺度である「段数」と5次対称群の上で動作する非一様決定性有限オートマトン(以下,NUDFAと略す)の基本的な計算量尺度である「長さ」とが密接な関係にあることが示されて以来,様々な群やモノイドの上で動作するNUDFAと組み合わせ論理回路のクラスとの関係が調べられている.また更に,NUDFAが有限オートマトンを一般化した計算モデルであることから,幾つかの組み合わせ論理回路のクラスの計算構造が正則言語によって表現され分析され得ることが知られている.このことは,代数的オートマトン理論における既知の結果が論理回路のクラスを分析するための道具になり得ることを示唆している.しかしながら,NUDFAに関わる研究が始まってまだ10年程度しか経過していんこともあり,多くの素朴な疑問が未解決のまま残されている状況にある.本研究では,まず,あらゆる論理関数を計算できるという意味で万能な群やモノイドの構造について考察した.この結果,非ベキ零群を埋蔵した任意のモノイドMに対して,Mの上で動作するNUDFAが任意の論理関数を計算できることを示した.次に,任意の論理関数fに対して,fを計算する5次対称群ので動作するNUDFAの長さがfを表す最も短い論理式の長さの二乗程度であることが知られているが,この関係が任意の非可解群に関して成立することを示した.組み合わせ論理回路の基本的な計算量尺度である「段数」と5次対称群の上で動作する非一様決定性有限オートマトン(以下,NUDFAと略す)の基本的な計算量尺度である「長さ」とが密接な関係にあることが示されて以来,様々な群やモノイドの上で動作するNUDFAと組み合わせ論理回路のクラスとの関係が調べられている.また更に,NUDFAが有限オートマトンを一般化した計算モデルであることから,幾つかの組み合わせ論理回路のクラスの計算構造が正則言語によって表現され分析され得ることが知られている.このことは,代数的オートマトン理論における既知の結果が論理回路のクラスを分析するための道具になり得ることを示唆している.しかしながら,NUDFAに関わる研究が始まってまだ10年程度しか経過していんこともあり,多くの素朴な疑問が未解決のまま残されている状況にある.本研究では,まず,あらゆる論理関数を計算できるという意味で万能な群やモノイドの構造について考察した.この結果,非ベキ零群を埋蔵した任意のモノイドMに対して,Mの上で動作するNUDFAが任意の論理関数を計算できることを示した.次に,任意の論理関数fに対して,fを計算する5次対称群ので動作するNUDFAの長さがfを表す最も短い論理式の長さの二乗程度であることが知られているが,この関係が任意の非可解群に関して成立することを示した.
植物の茎頂における細胞層状構造の分化・維持に関わる転写制御因子の解析

シロイヌナズナの茎頂L1層における遺伝子発現制御には、HD-GL2ファミリーに属するホメオドメインを持った転写因子ML1,PDF2が関わる。本研究では、植物の茎頂において表皮細胞を分化するL1層が、胚発生の過程でどのように確立し、維持されているかを明らかにするため、シロイヌナズナゲノムに16遺伝子存在するHD-GL2ファミリーに注目し、その包括的な機能解析をすすめた。1)以前にpdf2-1 ml1-1二重変異が表皮分化欠損を示すことに加えて、胚致死になる個体が分離することを確認していたが、ホメオドメインのコード領域にT-DNAが挿入されたml1-2アリルを用いた場合には、pdf2-1 ml1-2二重変異のすべてが胚致死となり、これらの遺伝子が胚発生において必須であることを確認した。2)表皮欠損を示すpdf2-1 ml1-1変異の芽生えを用いてcDNAマイクロアレイ解析を行なったところ、膨大な数の遺伝子に野生型芽生えとの発現の相違が認められたが、表皮に形成されるクチクラやワックス合成に関わると予想される脂質の合成や代謝関連の遺伝子発現の低下が目立った。ML1,PDF2はL1層で発現するこれらの遺伝子のプロモーター領域に存在するL1ボックスへの結合を介して、それらの発現を正に制御し、表皮分化をもたらすことが示唆された。3)一方、HDG1HDG12と名付けたHD-GL2ファミリーの各遺伝子については、T-DNA挿入変異株のアリルを追加して解析をすすめたところ、hdg11-1にトライコームの分枝増加の表現型を見つけた。さらに、最も相同性の高い遺伝子HDG12のT-DNA挿入変異hdg12-2の分枝には異常が見られなかったが、bdg11-1 hdg12-2二重変異では分枝増加が強調されたことから、これらの遺伝子はトライコームの分枝調節に関わると予想された。植物の茎頂では細胞が層状構造をしており、最外層(L1層)は各器官の表皮へ分化する。これまでの研究で、シロイヌナズナの茎頂L1層に特異的な遺伝子発現に関与する遺伝子上流のシス配列としてL1ボックスを同定し、ホメオドメインを持つ転写因子PDF2,ATML1がL1ボックスに結合すること、これらをコードする遺伝子の二重突然変異株は表皮細胞分化に欠損がみられることを明らかにしていた。本研究では、植物の器官形成、形作りにおける表皮分化欠損の影響という視点から、pdf2 atml1二重変異株の解析をさらに進めたところ、形態異常は、球状胚期のL1層細胞にすでに認められ、しばしばこの段階で胚発生が停止してしまうことから、胚発生における表皮細胞分化の重要性が示唆された。発芽した場合は、完全暗黒下で生育した黄化芽生えにおいて、胚軸の伸長阻害と肥大、表皮細胞の形態異常が観察されたが、それに加えて皮層の細胞の縦方向への伸長阻害や横方向への肥大、中心柱維管束の増加が見られ、表皮分化と内側の細胞層の分化が独立でないことが示唆された。他方、PDF2,ATML1を含むHD-GL2遺伝子群の全16遺伝子のうち、HDG1・HDG12と名付けた未解析のメンバーについて、HDG4以外の遺伝子のT-DNA挿入変異株を単離した。これまでに得られた変異株は、いずれも顕著な形態異常を示さず、遺伝子間の機能の重複が示唆された。PDF2,ATML1に最も近縁のHDG2,HDG3については、それらのT-DNA挿入変異株の間で二重変異株の作成をすすめ、pdf2 hdg3変異に、子葉の枚数や形態の異常、低頻度ながら子葉表皮からの不定芽形成が観察された。また、atml1 hdg3変異では、子葉が下偏成長を示したことから、HDG3がPDF2やATML1と協調して子葉の分化に関わると予想された。

さらに、最も相同性の高い遺伝子HDG12のT-DNA挿入変異hdg12-2の分枝には異常が見られなかったが、bdg11-1 hdg12-2二重変異では分枝増加が強調されたことから、これらの遺伝子はトライコームの分枝調節に関わると予想された。
植物集団の分布変遷における種子散布形質・自家和合性の適応的意義

フタバガキ科Shorea属は種子散布形質が多様であり、属内でも種子に翼があり風散布に適応している種と、翼がなく重力散布に依存している種がある。これらの散布形質は過去の集団の履歴にどのような影響を与えていたかを検討するために、Shorea属のなかから種子散布形質の異なる近縁種2種Shorea laxa(羽根なし)、S.faguetiana(羽根あり)を選定した。マレーシア・ランビルの集団で各種15-20個体ずつ、核遺伝子座7座を用いて塩基配列を決定した。このデータからハプロタイプネットワークや中立性の検定(Tajima's D)などの集団遺伝学的な解析をおこなった。結果、ハプロタイプネットワークは星型、TajimaのDは負になり、最近の集団の拡大を示唆する結果であった。また、集団の拡大スピードをコアレセント解析によって推定した。結果、7座中5座では両種間で拡大速度に有意な差は見られず、1座でS.laxaよりS.faguetianaが有意に大きく、また1座では逆の結果であった。これらの結果からは「種子に翼のない種は翼のある種よりも集団の拡大スピードが遅い」という仮説を検証するにはいたらなかった。矛盾した結果を解消するために、7座すべてを考慮したモデルを考える必要があることが分かり、今後の課題である。また8月にブルネイでS.faguetianaとS.laxaのサンプリングを行った。これらのサンプルを用いて、今後さらに種としてのサイズの分布拡大について検討したい。今年度はまず、マレーシアサラワク州の研究者と研究計画をつめ、材料のサンプリングを行った。熱帯林では樹木密度が低いために、個体をみつけるのは大変で、サンプリング採取は大変困難を極めたが、サラワク州の1集団でShorea beccarianaを10個体以上,S.faguetianaを3個体以上採取することができた。これで、手持ちのサンプルはS.beccariana,S.faguetianaでサラワク州で2集団以上、S.laxaで一集団の解析集団となった。しかし、これではまだ不足であるので、今後はさらなる地点でのサンプリング、マレーシア・サバ州でのサンプリングも行いたい。7月末から、チューリッヒ大学に滞在し、遺伝解析を行った。まず、花粉一粒を分離し、PCRを行う方法を確立した。また、一粒花粉がもつDNA量が大変少ないため、全ゲノム増幅を行うことも成功した。次に、モデル生物であるArabidopsisで既にわかっている中立遺伝子、機能遺伝子の計40遺伝子座を用いてPCR増幅を行った結果、20遺伝子座以上で増幅が確認された。そのうち10遺伝子座で多型を確認し、現在はCAPSマーカーを作成している。これらのマーカーのほか、既に他樹種で開発されているSSRマーカーを用いて解析を行う。このマーカーを用いて連鎖地図の作成、系統地理の解析を行う。また、10月にチューリッヒの国際シンポジウムでフタバガキ科の種子・花粉散布の意義についての発表、3月は日本生態学会で種子・花粉散布の距離について新たな手法を用いた解析を行い、学会発表を行った。他の研究者に意見を交換することができ、大変有意義であった。対象としている種は、種子散布形質の異なるShorea属2種Shorea laxa(種子に翼無し)、S.faguetiana(翼あり)である。昨年度にPCR増幅と多型を確認した核遺伝子座7座の塩基配列を、各種20個体程度決定した。2倍体で他殖が優占するこれらの植物は、ヘテロ接合であることが多く、ダイレクトシークエンスではハプロタイプが分離できない。そこで、SNPのある箇所に特異的なシークエンスプライマーを設計して、ハプロタイプを分離する方法を開発・最適化して、これらのハプロタイプの決定に成功した。決定された塩基多型情報をもとに、集団遺伝学的な解析をおこなった。塩基多様度は、遺伝子座間で異なったが他の木本種と同程度であった。ハプロタイプネットワークや中立性の検定(Tajima's D)などからは、他のShorea属でも報告されているような最近の集団の拡大が示唆された。また集団の拡大速度についてもそれぞれの種で推定を行った。その結果、遺伝子座間で多少の誤差はあるものの、どちらの種においても拡大傾向があること、また拡大のスピードはS.faguetianaがS.laxaよりも大きいという結果であった。これは、「種子散布の大きな種が小さな種よりも集団の拡大速度が大きい」という当初の仮説に矛盾しない結果であった。この結果の一部は、日本生態学会で発表し、他の研究者と意見交換ができて大変有意義であった。また、2月にはマレーシア・サバ州でS.laxa,S.beccarianaのサンプリングを行った。今後、この集団を加えて、集団構造を考慮した解析を付け加える予定である。

結果、ハプロタイプネットワークは星型、TajimaのDは負になり、最近の集団の拡大を示唆する結果であった。また、集団の拡大スピードをコアレセント解析によって推定した。結果、7座中5座では両種間で拡大速度に有意な差は見られず、1座でS.laxaよりS.faguetianaが有意に大きく、また1座では逆の結果であった。これらの結果からは「種子に翼のない種は翼のある種よりも集団の拡大スピードが遅い」という仮説を検証するにはいたらなかった。矛盾した結果を解消するために、7座すべてを考慮したモデルを考える必要があることが分かり、今後の課題である。また8月にブルネイでS.faguetianaとS.laxaのサンプリングを行った。これらのサンプルを用いて、今後さらに種としてのサイズの分布拡大について検討したい。
脳静脈虚血における内因性神経幹細胞応用の基盤研究

脳静脈虚血は、比較的軽度かつ長時間持続する虚血を特徴とする故、虚血巣や周辺組織にはその際に様々な修飾が加えられている可能性がある。本研究はこの特異な脳静脈虚血の病態解明と治療法の開発を目的とし、具体的には、動物実験モデルを利用して内因性神経幹細胞の発現動態を明らかにすることで今後の同分野の研究基盤を確立する事として研究を計画した。本年度は,確実な蛍光免疫染色手法を獲得するため,脳静脈虚血ラットモデル作成と並行してラット中大脳動脈閉塞モデルを新たに作成し,両方で染色反応が得られる免疫染色プロトコールを作成した.ラット中大脳動脈閉塞モデルにおける新生神経細胞の発現を示した先行研究の報告があるので、両モデルの切片において新生神経細胞が確認出来る蛍光免疫染色のプロトコールを作成した。脳静脈虚血ラットモデル(3日連続BrdUを腹腔内投与したのち、5週間後に脳を摘出して作成した脳切片)の蛍光免疫染色では、当初ホルマリン固定切片での評価を行っていたが、どうしても発光が乏しく評価に耐えられなかったので、抗体反応・発色のより良いプロトコール作成のためにホルマリン固定から、摘出時の脳を4%PFAに固定して凍結した検体凍結切片を用いた染色へ変更するなど手を加えて,免疫染色に関するプロトコールを作成した.結果,ラット脳静脈虚血モデルにおける脳皮質領域の梗塞巣周辺に、BrdU・NeuN共陽性の新生神経細胞を示唆する細胞が確認することができた.手技が複雑な脳静脈虚血ラットモデル作成については初年度・次年度より手技が安定したが,本年度は確実な蛍光免疫染色プロトコールを作成することを目的としその評価のために比較実験用としてMCAOラットモデルを新たに作成した.こちらの手技獲得に時間を要した.手技獲得後に、研究プロトコールに従い当初ホルマリン固定標本を用いて蛍光免疫染色を行ったが,評価に耐えられるほどの蛍光免疫発色が得られず,研究を重ねて凍結切片標本を用いることで発色が得られるようになった.このプロトコール変更に至るまでにも時間を要した.モデル作成手技の安定化,評価可能な蛍光免疫染色のプロトコール作成ができたので,研究期間を1年延長することで研究を重ねて,最終年度は新生細胞および成熟神経細胞の細胞数カウント・発生分布の評価を行っていく。手技が複雑な動物モデルである静脈梗塞モデルの作成から研究を実施した。以下の手順でWisterラット(200-250g:オス)の脳静脈虚血モデルを作成した。包水クロラール腹腔内投与麻酔のもと、静脈ラインを確保し、腹臥位としてStereotactic frameに頭部を固定する。左頭頂部をhigh speed drillにて開頭(8x16mm)することで、半透明の硬膜下に脳皮質と脳表静脈を透見する。Rose Bengaldyeを静脈内投与し、fiberoptic illuminationを用いて2本の隣接する脳表静脈を光凝固法で閉塞させる。HE染色による脳静脈梗塞巣の完成を確認したが、手技の煩雑さにより安定した静脈巣作成が得られなかったため、モデル作成手技を見直し、本年度に予定した全てのラットで脳静脈閉塞手技のみを行った。腹腔内薬剤投与の手技については、今回は生食で代用した。初年度研究計画に従って手技後5週目に灌流固定を行い、脳組織を病理学的に検討し、梗塞部位での大脳白質の神経細胞脱落を認め、梗塞の作成を確認した。複雑な病態の解明のためには、手技が煩雑な動物モデルである脳静脈虚血モデルを使用する必要があるが、作成には経験の蓄積が必要で、モデル作成の安定を得る為に時間を要したため、初年度に計画した、免疫染色による評価まで到達する事が出来なかった。本年度も、継続して安定した静脈梗塞モデルの作成を実現するべく、実験を継続した。また、実験の本題である免疫染色については、抗体の賦活条件や至適条件を検討し、プロトコールを作成した。

新生神経細胞の発現を確認するべく、8週齢のwisterラットを用いて脳静脈虚血ラットモデルを作成し、3日連続BrdUを腹腔内投与したのち、5週間後に脳を摘出して切片を作成した。HE染色で梗塞巣を観察するとともに新生細胞と成熟神経細胞の確認のため、免疫学的染色での検討を加えている。脳静脈虚血ラットモデルの作成は非常に難しく、また1日に作成できる数(3-4匹)が限られる。脳静脈の閉塞手技については安定しているが、側副血行路による虚血回避が生じ、梗塞(神経細胞の脱落)が得られない検体が含まれる。これについては、閉塞する静脈の選択や範囲を工夫したり、手技効率を上げて1日に作成できる検体の数を増やす努力をしている。免疫染色については、抗体の賦活条件や至適条件を検討し、プロトコールを作成したが、新生細胞と成熟神経細胞の染色は得られたものの、やや発光が弱い印象のため、脳の固定方法や保存条件について再検討を実施中である。脳静脈虚血は、比較的軽度かつ長時間持続する虚血を特徴とする故、虚血巣や周辺組織にはその際に様々な修飾が加えられている可能性がある。本研究はこの特異な脳静脈虚血の病態解明と治療法の開発を目的とし、具体的には、動物実験モデルを利用して内因性神経幹細胞の発現動態を明らかにすることで今後の同分野の研究基盤を確立する事として研究を計画した。本年度は,確実な蛍光免疫染色手法を獲得するため,脳静脈虚血ラットモデル作成と並行してラット中大脳動脈閉塞モデルを新たに作成し,両方で染色反応が得られる免疫染色プロトコールを作成した.ラット中大脳動脈閉塞モデルにおける新生神経細胞の発現を示した先行研究の報告があるので、両モデルの切片において新生神経細胞が確認出来る蛍光免疫染色のプロトコールを作成した。脳静脈虚血ラットモデル(3日連続BrdUを腹腔内投与したのち、5週間後に脳を摘出して作成した脳切片)の蛍光免疫染色では、当初ホルマリン固定切片での評価を行っていたが、どうしても発光が乏しく評価に耐えられなかったので、抗体反応・発色のより良いプロトコール作成のためにホルマリン固定から、摘出時の脳を4%PFAに固定して凍結した検体凍結切片を用いた染色へ変更するなど手を加えて,免疫染色に関するプロトコールを作成した.結果,ラット脳静脈虚血モデルにおける脳皮質領域の梗塞巣周辺に、BrdU・NeuN共陽性の新生神経細胞を示唆する細胞が確認することができた.手技が複雑な脳静脈虚血ラットモデル作成については初年度・次年度より手技が安定したが,本年度は確実な蛍光免疫染色プロトコールを作成することを目的としその評価のために比較実験用としてMCAOラットモデルを新たに作成した.こちらの手技獲得に時間を要した.手技獲得後に、研究プロトコールに従い当初ホルマリン固定標本を用いて蛍光免疫染色を行ったが,評価に耐えられるほどの蛍光免疫発色が得られず,研究を重ねて凍結切片標本を用いることで発色が得られるようになった.このプロトコール変更に至るまでにも時間を要した.予想外の結果となった訳ではないため、研究の方向性の変更は不要である。よって、当初予定していた神経幹細胞発現の確認は次年度に行う。脳静脈虚血ラットモデルは引き続き作成を継続する。免疫染色については、脳摘出時の脳を4%PFAに固定して凍結した検体と新鮮凍結した検体で比較検討し、発光がよりよい方を採用する。安定してラットモデルと免疫染色が得られた際には新生細胞および成熟神経細胞の細胞数や発生分布を検討していく。モデル作成
三次元位相コントラストシネMRIを用いた血流動態解析による弁置換術後評価法の開発

三次元位相コントラストシネ法で得られる大動脈弁前後の血流速経時的三次元画像を基に、高精度血流動態解析ソフトの制作と改良を行った。また、MRI撮影条件の最適化を確立。さらに、大動脈弁置換術後症例を模擬したMRI対応型ファントムの開発、改良も進めた。東京女子医科大学倫理委員会からの承認も取得。約70名の大動脈弁置換術後の症例から本研究への参加承諾を得て、MRI検査を実施。MRI検査から得られたデータに対して、高精度血流動態解析ソフトを用いた解析を開始。心臓超音波検査から得られるデータと比較することで、同ソフトの臨床評価ならびに有用性を検討。そのうえで、今後の臨床応用への発展の可能性を示した。人工弁における圧較差は、弁周囲で生じる乱流によるエネルギーの損失が本質であり、定量的に解析する必用がある。これまでのMRI対応型血流計測用心臓動態ファントムの開発経験と流体解析ソフトの開発経験を駆使すれば、臨床応用が可能となる。個々の症例において、大動脈弁置換術後に生ずる乱流の状態を、定量的ならびに可視的に評価することにより、より質の高い手術法を確立する。今年度はまず、研究分担者・協力者全員に計画の全体像の概要を説明し、基本構想をまとめた。その後、弁輪部狭窄およびAVR後症例の血流動態評価における、臨床的重要性を明確にし、解決すべき問題点を本研究参加者全員で臨床的立場とMRIの技術的立場より検討した。次いで、その問題点を解決すべく、三次元位相コントラストシネ法にて得られる、数人の健常ボランティアにおける大動脈弁前後の血流速経時的三次元画像データを基に、高精度血流動態解析ソフトの制作とMRI撮像条件の最適化を行っている。さらにAVR例を模擬したMRI対応型ファントム(人工弁の着脱も可能)の開発を同時に行っており、ファントム実験を通じて、随時同ソフトの性能評価や改良を進めていき、乱流に起因する真のエネルギー損失の定量的評価法も確立しつつある。MRI検査自体は非侵襲的であるが研究参加者に可及的に不利益が生じないような対策を講じている。現在、東京女子医科大学倫理委員会の承認を申請中である。AVR術後患者数は今年度も着実に症例数を増やした。そのため、倫理委員会の承認を得られ次第、高精度血流動態解析ソフトの臨床評価を開始し、有用性を検討する。臨床応用としてAVR術後患者に対してのMRI検査とデータ解析を行う。人工弁における圧較差は、弁周囲に生じる乱流によるエネルギー損失が本質であり、定量的に解析する必要がある。個々の症例において、大動脈弁置換術後に生じる乱流の状態を定量的ならびに可視的に評価することにより、より質の高い手術法を確立する。今年度は、昨年度に引き続き、三次元位相コントラストシネ法で得られる大動脈弁前後の血流速経時的三次元画像を基に、高精度血流動態解析ソフトの制作と改良を行い、また、MRI撮影条件の最適化を確立した。これまでに大動脈弁置換術を実施した患者へ十分なインフォームド・コンセントを行い、本研究およびMRI検査への参加協力を依頼した。MRI検査自体は非侵襲的であるが、研究参加者に対し不利益が生じないような対策を十分に講じている。約70名の大動脈弁置換術後の症例から、本研究への参加承諾を得られ、MRI検査を実施することが出来た。これらのMRI検査で得られたデータに対して、高精度血流動態解析ソフトを用いた解析を開始した。心臓超音波検査から得られるデータと比較することで、同ソフトの臨床評価ならびに有用性を検討する。そのうえで、今後、臨床応用への発展の可能性を示す。心臓血管外科学高精度血流動態解析ソフトの制作およびMRI対応型ファントム(人工弁の着脱も可能)の開発に時間を要している。また、東京女子医科大学倫理委員会の承認をまだ得られていない。ソフト開発の効率化を図るために、必要に応じて、シーメンス本社に協力を要請するか、ソフト開発業者に下請けを依頼する。また、ファントム開発に時間がかかる場合、十分倫理的に配慮しつつ、臨床応用を前倒しにすることも考慮する。引き続き、AVR術後患者数は着実に症例数を増やしていく。高精度血流動態解析ソフトの制作およびMRI対応型ファントム(人工弁の着脱も可能)の開発に時間を要している。高精度血流動態解析ソフトの制作およびMRI対応型ファントムの開発費用に使用予定。
受傷後急性期の打撲傷を証拠化する試み～虐待の早期発見を目指す取り組み～

当初の研究計画通り,日常生活で転倒するなどして受傷した急性期の打撲傷などについて,経時的に赤外線サーモグラフィーカメラで撮影するデータの蓄積を行った.今年度は新たに球技中に捻挫したケースなど,いわゆる直接的な打撲による受傷でない場合でも赤外線サーモグラフィーカメラにより皮膚温に変化が生じることが明らかになった.通常,軽度の打撲傷では皮膚温の変化は殆どないが,表皮に僅かな表皮剥脱(擦過傷)を伴う場合は皮膚温の上昇として観察でき,これは表皮のバリアが崩壊することにより局所的な炎症が生じるためと考えられた.しかし,中等度以上の打撲傷では,表皮剥脱(擦過傷)を伴わなくても皮膚温の上昇として観察でき,捻挫のような高度な軟部組織損傷を伴う場合は周囲の健常皮膚との温度差が45度にも及ぶことが判明した.この原因として,表皮のバリアが崩壊せずとも軟部組織損傷のみでも高度な炎症が生じているものと考えられ,この炎症は疼痛として1週間,熱感・腫脹として10日間に亘り継続した.なお,この捻挫のケースでは,受傷直後から疼痛の訴えはあるものの,受傷からしばらくは外表面には皮膚変色などを伴わず,赤外線サーモグラフィーカメラによる画像が唯一の重症度を示す物的証拠であった.本研究を子ども虐待の損傷検査などに実務応用するにあたり,オーバーダイアグノーシス(過剰な診断)が問題になる.既に判明している予防接種などの注射や虫刺傷などでも皮膚温は上昇することが知られており,打撲傷以外のケースについてもデータの蓄積を行った.本研究の難点は,不慮の事故によって打撲傷が生じるのを待たなければならない問題がある.当初からこの問題は予想されたため,研究期間を長めに設定して,ケースの集積を続けている.もっとも,実績の概要でも紹介したように,本研究ではオーバーダイアグノーシス(過剰な診断)を防ぐために,打撲傷以外に皮膚温が上昇する様々な条件についてもデータを取っており,成果を上げている.なお,本年度は予期していない出来事として,赤外線サーモグラフィーカメラの故障があった.撮影の途中で赤外線サーモグラフィーカメラがフリーズしてしまい,せっかくの打撲傷のデータが保存できないという事態に陥り,また業者に修理に出している間は研究を休止せざるを得なかった.データを解析するにあたり,ややデータが不足しているため,暫くは新規データの蓄積を継続する.打撲傷はもちろんのこと,その他の皮膚温の上昇を伴うケースも積極的に赤外線サーモグラフィーカメラによる測定を行う.同時に,今まで蓄積したデータについては赤外線サーモグラフィーカメラ専用のソフト(FLIR Tools)を用いて数的情報として解析する.研究成果については既に国内・海外でも発表しており,子ども虐待を証拠化する実務に応用する目標を達成する.打撲傷を受傷した際に,生体反応として受傷部位に局所的な発熱が生じることはしばしば経験される.肉眼的な変化として証拠化しにくい受傷後早期の打撲傷を赤外線サーモグラフィーカメラ(FLIR T440)を用いて観察し,証拠化することを試みた.健常小児が転倒するなどして打撲傷を負った場合に,赤外線サーモグラフィーカメラで観察するとともに,必要に応じて従来からの特殊波長光線による観察を追加した.赤外線サーモグラフィーカメラのカメラ温度レンジは-20120度とし,画像モードは通常の赤外線カメラモード(熱画像のみ)に加えてMSX(Multi Spectral Dynamic Imaging)モードでも撮影して比較した.MSXモードは,撮影と同時に得られる可視画像で対象のエッジを強調した熱画像で,打撲傷に相当する部分の温度をより明確に表す点で優れているとみられたが,受傷後早期の打撲傷は可視画像では明瞭に映らない場合が多く,必ずしもMSXの方が優れているとは言えなかった.また,熱画像は設定する表示温度幅により色調が決まるため,レベルスパン調整が重要である.当初は自動調整モードにより画面に映る範囲内において最大温度と最小温度でレベルスパンを自動調整して撮影を行っていたが,フォーカスを合わせることが可能な範囲となると皮膚の接写は困難で,ある程度離れた撮影をするとレベルスパンが拡がって発熱の弱い軽微な打撲傷は明瞭な色調差として示されないことが判明した.そこで,現在は手動調整モード,即ち予め皮膚温として予想される温度範囲を固定し,その範囲内で色調を調整する方法で観察を試みている.この場合,設定された温度範囲外の情報は全くなくなるが,受傷後早期の打撲傷からの発熱を安定して捉えることは可能であると考えられ,研究を進めている.本研究のサンプルは健常小児が転倒するなどして打撲傷を負った場合にのみ発生するため,サンプル数が乏しいことは計画段階から予期されていた.また,小児が打撲傷を負っても,その申告が遅れるなどタイミングを逃すと,既に受傷後早期の打撲傷の状態を過ぎていて赤外線サーモグラフィカメラによる温度変化として捉えられない場合が多々みられた.赤外線サーモグラフィーカメラの条件設定にもやや時間を要した.サンプルが少ないこともあって,イメージモード,レベルスパン調整など,適切な条件で撮影するために試行錯誤した.受傷後早期の打撲傷は一般に証拠化が困難である.

皮膚変色などの肉眼的変化が乏しいケースでは,患者が「痛みがある」,「熱を持っている」等と訴えても,客観的に証明することは難しい.本研究では,損傷受傷後に生体の炎症反応として生じる局所的な熱感を客観的に捉えて証拠化することを試みた.被験者が転倒するなどして損傷を負った場合に,赤外線サーモグラフィーカメラ(FLIR T440)を用いて損傷を観察・撮影し,同時に可視光線下でも撮影した.赤外線サーモグラフィーカメラの温度レンジはー20120°Cとし,画像モードはカメラモードに加えてMSXモードでも撮影して損傷検出のしやすさを比較した.熱画像は設定する表示温度幅により色調が決まるため,自動調整モード(画面に表示される範囲で最大温度と最低温度でレベルスパンを自動調整して表示)と手動調整モード(予め皮膚温として予想される温度範囲を固定しその範囲内で色調を表示)の両者で検討した.個体差,身体部位の差,更に室温などの環境条件の影響を除外するために,損傷部だけでなく非損傷部も写し込んで検討した.受傷後早期の損傷のうち,受傷後1日以内であれば皮膚の温度差として観察できたケースは,打撲傷で13例中8例(62%),打撲擦過傷なども含めると16例中11例(69%)であった.また,色分布の表示方法としては,自動調整モード,手動調整モードは,それぞれ証拠化する目的により利点・欠点があるため,両方のモードでの撮影が推奨された.なお,同検査は予想以上に鋭敏で,日常生活における皮膚温の変化に大きく影響を受けていることが判明した.今後は受傷後早期の打撲傷の証拠化のみならず,日常生活における様々な皮膚温が変化する状況・病態について検討を深める必要がある.平成29年度は適切な撮影条件を探りながらも,実際の症例により多くの知見が得られた.受傷後早期の損傷のうち,受傷後1日以内であれば皮膚の温度差として観察できたケースは,打撲傷で13例中8例(62%),打撲擦過傷なども含めると16例中11例(69%)であった.皮膚の温度差として観察できない打撲傷は,ごく軽症であったり,被験者が「皮膚の奥の方(皮下深層)が痛い」と訴えるものであった.撮影条件についての検討では,MSXモードは可視画像で対象のエッジを強調した熱画像でコントラストが明瞭になるが,やや滲んだような画像になるため,肉眼的に不明瞭な打撲傷には効果が乏しかった.色分布の表示方法としては,自動調整モードはスケールの全ての色分布を使用するためカラフルで温度差の検出に優れているが経時変化はわかりにくいのに対し,手動調整モードは温度差の検出には劣るが,経時的な変化を捉えるのに優れていることが判明した.当初の研究計画通り,日常生活で転倒するなどして受傷した急性期の打撲傷などについて,経時的に赤外線サーモグラフィーカメラで撮影するデータの蓄積を行った.今年度は新たに球技中に捻挫したケースなど,いわゆる直接的な打撲による受傷でない場合でも赤外線サーモグラフィーカメラにより皮膚温に変化が生じることが明らかになった.通常,軽度の打撲傷では皮膚温の変化は殆どないが,表皮に僅かな表皮剥脱(擦過傷)を伴う場合は皮膚温の上昇として観察でき,これは表皮のバリアが崩壊することにより局所的な炎症が生じるためと考えられた.しかし,中等度以上の打撲傷では,表皮剥脱(擦過傷)を伴わなくても皮膚温の上昇として観察でき,捻挫のような高度な軟部組織損傷を伴う場合は周囲の健常皮膚との温度差が45度にも及ぶことが判明した.この原因として,表皮のバリアが崩壊せずとも軟部組織損傷のみでも高度な炎症が生じているものと考えられ,この炎症は疼痛として1週間,熱感・腫脹として10日間に亘り継続した.なお,この捻挫のケースでは,受傷直後から疼痛の訴えはあるものの,受傷からしばらくは外表面には皮膚変色などを伴わず,赤外線サーモグラフィーカメラによる画像が唯一の重症度を示す物的証拠であった.
メラノソームの細胞間輸送システムの解明

メラノソーム輸送に関わることが判明しているsmall G蛋白ファミリーであるRab3a,Rab8,Rab27aの細胞内動態をTRP-1(tyrosinase-relatedprotein-1)に対する抗体(TA99)で蛍光染色する事により観察、評価した。メラニンの輸送系にどの分子が最も重要であるかに重点を置いて色素細胞および母斑細胞にて観察したところ、メラニン産生の盛んな細胞にて、いずれの細胞においてもRab27aの発現の著明増加、樹状突起の延長を認めた。これまでの研究成果を含め、同様の方法で増殖維持に必要な因子を明らかにし、色素産生細胞特有の細胞内小器官において生成されたメラニンが周囲角化細胞へ輸送される際の関連分子種の研究を進める。さらに効率良く進めるために、ヒト正常色素細胞および角化細胞のco-culture系を用い、色素細胞およびメラノソームを蛍光標識することにより、ヒトの色素細胞一角化細胞の相互作用をよりin vivoに近い状態にて観察、検討し、色素細胞内の物質の角化細胞へ移行させる因子、条件を解析している。得られた新知見を用いることで、今後は皮膚発癌予防および皮膚病の遺伝子治療への応用を試みたい。例えば、色素産生細胞から周囲角化細胞に必要な分子のみを効率よく散布することで、紫外線による角化細胞のDNA損傷を防御して、日光暴露による紫外線発癌をより効果的に予防する、あるいは、遺伝子異常を相補するような遺伝子や物質を異常角化細胞の特定部位に輸送させることで治療するなど、病因論に基づいて応用する。そのためにも、腫瘍細胞の増殖因子、各種抗癌薬と細胞内や細胞間輸送への関連を臨床症例にて検討すべく、様々な腫瘍の関連因子についての情報を蓄積、解析中である。メラノソーム輸送に関わることが判明しているsmall G蛋白ファミリーのRab3a,Rab8,Rab27aをlipofectionにて強発現させ、メラノソームの局在はメラノソームに豊富に存在するTRP-1(tyrosinase-related protein-1)に対する抗体(TA99)で蛍光染色する事により評価することで、ケラチノサイトへの輸送系にどの分子が最も重要であるかを明らかにすることを試みた。まず、ヒトメラノサイトにおいてRab3a、Rab8a、Rab27a分子の発現動向を、メラノソームの輸送能が低いと考えられているヒト母斑細胞との比較で検討したところ、突起の形成と延長、およびメラノソームの輸送については共焦点顕微鏡にて各種抗体の局在を蛍光発色法にて検出し、母斑細胞よりもメラノサイトのほうがαMSH刺激後早期から樹状突起の伸長、および突起先端でのRab3a、Rab8a、Rab27a蛋白の存在が認められた。さらに、αMSH刺激による発現量の変化をWestern blottingおよびRT-PCR法にて確認し、メラノサイトではRab3a、Rab8a、Rab27aの蛋白とtyrosinaseの発現亢進がみられたのに対し、母斑細胞では発現が低下する結果となった。それらの差がαMSHレセプターの一つであるmelanocortin-1receptor(MC-1R)の機能の異常による可能性を考え、用いた母斑細胞およびメラノサイトの塩基配列を確認したが、機能異常を起こす変異はなかった。結果については下記学会にて報告した。第19回日本色素細胞学会年次学術大会(2005.12.3-4)メラノソーム輸送に関わることが判明しているsmall G蛋白ファミリーのRab3a, Rab8,Rab27aをlipofectionにて強発現させ、同時に蛍光染色する事により評価することで、ケラチノサイトへの輸送系にどの分子が最も重要であるかを明らかにすることを試みたところ、母斑細胞よりもメラノサイトのほうがαMSH刺激後早期から樹状突起の伸長、および突起先端でのRab3a、Rab8a、Rab27a蛋白の存在が認められた。今後は、得られた研究成果について、皮膚発癌予防および皮膚病の遺伝子治療への応用を試みたい。例えば、メラノサイトから周囲ケラチノサイトへ必要な分子を効率よく散布することにより、紫外線によるケラチノサイトのDNA損傷を防御して、日光暴露による紫外線発癌をより効果的に予防する、あるいは、遺伝子異常を相補するような遺伝子や物質を異常ケラチノサイトの特定部位に輸送させることで治療するなど病因論に基づいて応用することが可能ではないかと考えている。加えて、メラノソームのみならず、平滑筋細胞や皮膚腫瘍についても各種ストレスに対する細胞内輸送、細胞増殖の変化を観察し、その生理学、生化学的機序を考察し、その結果について学会報告を行った。以上の結果について下記学会にて発表した。張力刺激が発症要因と考えられた乳房部皮膚平滑筋腫第105回日本皮膚科学会総会学術大会(2006年6月2-4日)ヒトメラノサイトと母斑細胞におけるMSH刺激によるRabファミリーの発現とメラノソーム輸送の相違について日本研究皮膚科学会第31回年次学術大会(2006年5月31日-6月2日)メラノソーム輸送に関わることが判明しているsmall G蛋白ファミリーであるRab3a,Rab8,Rab27aの細胞内動態をTRP-1(tyrosinase-relatedprotein-1)に対する抗体(TA99)で蛍光染色する事により観察、評価した。

メラニンの輸送系にどの分子が最も重要であるかに重点を置いて色素細胞および母斑細胞にて観察したところ、メラニン産生の盛んな細胞にて、いずれの細胞においてもRab27aの発現の著明増加、樹状突起の延長を認めた。これまでの研究成果を含め、同様の方法で増殖維持に必要な因子を明らかにし、色素産生細胞特有の細胞内小器官において生成されたメラニンが周囲角化細胞へ輸送される際の関連分子種の研究を進める。さらに効率良く進めるために、ヒト正常色素細胞および角化細胞のco-culture系を用い、色素細胞およびメラノソームを蛍光標識することにより、ヒトの色素細胞一角化細胞の相互作用をよりin vivoに近い状態にて観察、検討し、色素細胞内の物質の角化細胞へ移行させる因子、条件を解析している。得られた新知見を用いることで、今後は皮膚発癌予防および皮膚病の遺伝子治療への応用を試みたい。例えば、色素産生細胞から周囲角化細胞に必要な分子のみを効率よく散布することで、紫外線による角化細胞のDNA損傷を防御して、日光暴露による紫外線発癌をより効果的に予防する、あるいは、遺伝子異常を相補するような遺伝子や物質を異常角化細胞の特定部位に輸送させることで治療するなど、病因論に基づいて応用する。そのためにも、腫瘍細胞の増殖因子、各種抗癌薬と細胞内や細胞間輸送への関連を臨床症例にて検討すべく、様々な腫瘍の関連因子についての情報を蓄積、解析中である。
文化の習得と継承に関する人類学的研究-北東アフリカにおける伝統的知識体系と近代化

本調査研究の目的は、北東アフリカにおける多様な生業形態を持つ諸社会を対象に人類学的調査を行い、それぞれの社会で長年培われてきた知識体系が習得・継承されてゆく文化装置を浮き彫りにするとともに、そのような装置が近代化の中で遭遇する諸問題を明らかにすることによって、今日の人類が直面する普遍的課題に学術的立場から貢献しようとするものである。上記の目的に基づいて、各研究分担者および研究協力者は、相互に関連した個別テーマのもとに、平成7年度以来エチオピアとスーダンにおいて調査を行ってきた。3年間の研究期間のうち前半期は、現地における観察・聞き取りによって伝統的な文化の継承装置を浮き彫りにすることを目的とする調査を行い、後半期は、そのような文化の継承装置に対する近代化の影響を検討することをめざすとともに、そうした文化の持続および変化が、異なる社会の間でどのように共通・相違点がみられるのかを比較・検討する作業を行った。平成9年度は、前年度までの現地調査を補足するとともに、各研究者が調査の成果を土台として、論文・口頭発表を行い、諸社会が抱える問題の普遍性・個別性を検討した。その結果、近代化への対応は個別社会によって異なっており、その要因として、それぞれの社会が持つ文化継承装置がいわば外部の影響に対するパラメータとして働くことが見いだされた。これらの成果は、今年度わが国で開催された国際エチオピア学会をはじめとする関連学会で発表され、同時に本調査研究の報告書が本年度に発行された。本研究は、伝統的な教育・学校教育・文化的アイデンティティという研究上の視点を共有する共同研究によって、文化の継承装置と近代化との関係を明らかにしていく一つのモデルを提示する研究としての見通しをつけ、調査研究の目的は達成されたと考えられる。本学術研究の目的は、北東アフリカにおける多様な生業形態を持ついくつかの社会を対象に人類学的調査を行い、それぞれの社会において長年培われてきた知識体系が習得、継承されゆく文化装置を浮き彫りにするとともに、そのような装置が近代化の中で遭遇する諸問題を明らかにすることによって、今日の人類が直面する普遍的課題に学術的立場から貢献しようとするものである。この目的に基づいて、各研究分担者および研究協力者は、相互に関連した個別テーマのもとに、エチオピアとスーダンにおいて調査を実施した。福井勝義は、エチオピア西南部のスルマ系農牧民ボディ社会における家畜、モロコシと人間関係をめぐる文化の習得、子供の遊びにみる自然観の習得について調査を行った。栗本英世は、エチオピア西部において、ナイル系アニュワ社会における混合経済にみられる生業技術の習得と継承、年齢組織などの調査を行った。重田眞義は、オモ系根栽農耕民アリ社会における植物、人間関係に関わる知識の習得と継承、および口頭伝承にみる価値観の継承について調査を行った。宮脇幸生は、クシ系農耕民アルボレ社会における生態的知識と農牧技術の習得、通過儀礼にみられる社会化などの調査を行った。佐藤廉也は、スルマ系農耕民マジャンギルにおける焼畑に関する伝統的知識体系および学校教育・キリスト教化のそれらに及ぼす影響について調査した。縄田浩志は、スーダンのベジャ社会の家畜認識における知識の習得過程に関する調査を行った。今年度は、伝統的な知識体系の習得と子供の社会化を調査することによって、生業をとりまく知識の習得とそれぞれの民族固有のアイデンティティの形成過程を明らかにすることに重点をおいた。その結果、学校教育をはじめとする近代化のインパクトの分析に重点をうつしてゆく次年度以降の調査の土台となる資料の蓄積が達成されたと考えられる。本調査研究の目的は、北東アフリカの多様な生業形態をもつ社会で培われてきた知識体系が、習得・継承されていく文化装置を浮き彫りにすると同時に、その装置が近代化の中で遭遇する諸問題を明らかにしていくことにある。