hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体膜分子Nogoによる病原性自己抗体産生の新たな制御機構の解明

このように小胞体膜分子Nogoは自己抗体産生に重要な役割を果たしていることを明らかにしている。昨年度の途中で自身の異動(所属研究機関の変更)があったため,研究の進行に遅れが生じている。マクロファージにおいて,小胞体膜分子Nogoによる核酸認識TLRのシグナル制御機構と新規会合分子GRAMD4を同定することに成功した。また,TLR7遺伝子をコードする領域の重複によりSLE様の症状を呈する自己免疫疾患モデルマウスBXSBにNogo欠損マウスを戻し交配したBXSB.Nogo欠損マウス解析から,Nogoが自己抗体産生に重要な役割を果たしていることが示唆された。しかし,B細胞の寛容維持機構における役割は依然明らかになっておらず,核酸認識TLRのシグナル制御機構,自己抗体の産生,およびクラススイッチにおけるNogoの役割を明らかにする。BXSB.Nogo欠損マウスを用い,病態ならびにB細胞の寛容破綻におけるNogoの位置付けを明らかにする。また,TLR7遺伝子をコードする領域の重複によりSLE様の症状を呈する自己免疫疾患モデルマウスBXSBにNogo欠損マウスを戻し交配したBXSB.Nogo欠損マウスが有意に減少した血中抗ds-DNA IgMおよびds-DNA IgG抗体価を有することを確認した。このようにNogoが自己抗体産生に重要な役割を果たしていることを明らかにしたが,B細胞の寛容維持機構における役割は依然明らかになっておらず,核酸認識TLRのシグナル制御機構,自己抗体の産生,およびクラススイッチにおけるNogoの役割を検討する。さらにBXSB.Nogo欠損マウスを用い,病態ならびにB細胞の寛容破綻におけるNogoの位置付けを明らかにする。年度途中で自身の異動(所属研究機関の変更)があったため,研究の進行に遅れが生じた。次年度以降の計画を進行させる。昨年度の途中で自身の異動(所属研究機関の変更)があったため,研究の進行に遅れが生じた。
新規NF-kB選択的阻害剤DHMEQによる急性膵炎の重症化および多臓器不全の抑制

セルレインによる急性膵炎モデルで、新規NF-kB選択的阻害剤DHMEQを用いて、重症化、多臓器不全の抑制効果について検討した。セルレイン膵炎を誘導することはできたが、DHMEQによる膵炎の抑制は血清学的にも、組織学的にも効果がなかった。そのため、多臓器不全モデルのセルレイン膵炎とLPSによる致死率モデルを検討したが、モデルの確立には至らなかった。また、膵炎の程度、多臓器障害の程度を血清、組織学的に評価したが、DHMEQによる抑制効果は認められなかった。急性膵炎の重症化と多臓器不全の機序とNF-κBとの関与を解明するため、新規NF-κB選択的阻害剤DHMEQを用いて、セルレイン(Cn)膵炎モデルで検討した。まず、C57BL6/Jマウスを用いてCn急性膵炎を作製した。コレシストキニンanalogであるCnを1時間おきに6回腹腔内投与(ip)することで急性膵炎が起きていることを確認した。DHMEQによる急性膵炎の抑制効果を検討するため、まずCn投与2時間前にマウスにDHMEQを12mg/kgの用量でipし(予防的投与群)、文献上言われている膵炎のピークであるCn初回投与12時間後に血清、組織学的検討を行ったが、血清のlipaseではcontrol群に比較し、やや低かったものの有意の抑制を認めず、amylaseは有意の抑制をみなかった。また、組織学的検討においても膵炎の程度(空砲化、壊死性変化、浮腫)はcontrol群と同程度であった。そこで、犠牲死の時間を変えて検討したが、いずれもcontrol群と比較して差がなかった。そこで、DHMEQ投与時間をCn最終投与後2時間に変更し(治療的投与群)血清、組織学的検討を行った。しかし、予防的投与群と同様に血清,組織とも膵炎の程度はcontrol群と同程度で膵炎を抑制することは出来なかった。さらに、全身への影響として肝機能、腎機能の指標としてGOT, GPT, LDH, BUN, Creを測定したがいずれも予防、治療的投与、測定時間に関わらずcontrolと同程度であった。そのため、今後は急性膵炎の重症化に続く多臓器不全モデルとしてCn投与後にLPSをipし致死率モデルを作製しDHMEQによる致死率の改善効果および血清、組織学的評価の検討を行う予定である。これまでの実験で、セルレイン(Cn)膵炎モデルでのDHMEQによる膵炎抑制効果は認められなかったことから、Cnよるマウス膵炎後にLPSを投与する致死モデルを作製し検討した。過剰のLPS腹腔内投与(ip)でも致死が得られなかったため、投与方法を静脈内投与(iv)へ変更した。しかし、確実な致死率が得られないため、マウスの種類をBALB/cへ変更した。その結果、安定した致死率(3mg/kgで致死率25%)が得られた。これにCnを投与する致死性急性膵炎モデル(Cn+LPS)による致死率を検討した。Cnを1時間おきに6回ipし、その2時間後にLPSをivした。DHMEQはCn投与終了時に12mg/kg ipした。しかし、Cn+LPSモデルではコントロールでも全例生存してしまう結果となった。これは、Cn、LPSの溶解に用いている生理食塩水(投与6回)による補液効果と考えられた。血清学的評価では、amylase, lipaseのピークはCn初回投与後9時間で、Cn膵炎より早めにピークが来ていたが、治療群とcontrol群問に逸脱量に相違はなかった。全身への影響として肝機能、腎機能(GOT, GPT, LDH, BUN, Cre)を評価したがいずれも測定時間に関わらずcontrolと同程度であった。また、組織学的評価において、肝細胞のbalooningなどの浮腫、炎症所見もcontrolとDHMEQ群で同程度であった。これらの結果は、DHMEQの投与時期を変更(予防的投与、治療的投与)しても変わらなかった。今回の実験モデルでは、DHMEQによるCn膵炎における膵炎の重症化を抑制することはできなかった。
超臨界二酸化炭素を用いた木材の新規アセチル化処理法の開発

スギ心材試片を超臨界二酸化炭素雰囲気中でアセチル化処理し、従来法でアセチル化した試片との性能比較を行った。試片1本当たりの薬剤使用量は従来法より少ないにもかかわらず、質量増加率は1時間の短時間処理で1620%の高い値を示した。15%以上の質量増加率を得るために必要な処理時間が液相法で4時間、気相法で8時間であることと比較すると、アセチル化反応が速やかに進行していることがわかる。また処理時間を延ばすことで質量増加率はさらに増加し、24時間処理で2428%にまで達した。処理試片を水中に沈め、減圧しながら1週間浸漬させたのち、試片寸法を測定して膨潤率を求め、抗膨潤能(ASE)を算出した結果、超臨界二酸化炭素中での処理では1時間でASEは約6076%に達した。液相法では1時間の処理でASEが5256%、気相法で613%であったのと比較すると、短時間で高い寸法安定性が得られていることがわかる。さらに15時間以上の処理ではASEは80%を超え、無触媒反応としては非常に高い値が得られた。強度測定の結果、超臨界二酸化炭素雰囲気中でのアセチル化処理試片は曲げヤング率(MOE)、曲げ強さ(MOR)ともに未処理試片と同程度の値を示した。また、従来法と比較しても試片強度はほぼ同じで、高圧下の超臨界二酸化炭素沖でアセチル化処理を行っても、強度には大きな影響を及ぼさないことが示された。軟X線による木口面の密度測定において、液相法では試片中央部より周辺部の方が密度増加が大きかったのに対し、超臨界二酸化炭素を用いたアセチル化処理では試片の中央部も周辺部もほぼ同程度に増加していたことから、アセチル化反応が試片全体で均一に進行しているものと推測された。アセチル化処理は、木材の水分に対する寸法安定性や防腐・防蟻性を高め、湿度変動時に生じる木材の強度的性質やレオロジー的性質の変動も抑制する、非常に有効な木材改質法である。しかし、長時間処理であることや大量の薬剤を使用することなどの問題点も抱えている。本課題では、液体並の高密度ながら気体並の浸透・拡散力を持つ超臨界二酸化酸素を化学反応場とした木材のアセチル化処理法を検討した。実際にはあらかじめアルベン抽出処理(96h)及び熱水抽出処理(8h)したスギ心材試片を用いた。試片寸法は抗膨潤能(ASE)測定用が5mm(L)×20mm(R)×20mm(T)、強度測定用が100mm(L)×6mm(R)×6mm(T)であった。無水酢酸0.35mol/lを耐圧容器内に注入し、さらに全乾状態の試片2個を無水酢酸と直接接触しないように容器に入れ、密閉した。10分間減圧したのちに二酸化炭素を充填させ、温度と圧力を120または130°C/1012MPaに調整した。目的の温度・圧力に達した時点で実験開始とし、124時間アセチル化処理を行った。処理後、試片の重量増加率を求めたところ、1時間でも1620%の重量増加率が得られた。処理時間を延ばすことで重量増加率はさらに増加し、24時間処理で2428%に達した。処理試片を水中に沈め、減圧しながら1週間浸漬させたのち、試片寸法を測定して膨潤率を求め、ASEを算出した結果、1時間でASEは約6076%に達し、短時間で高い寸法安定性が得られた。全乾状態の処理試片を二点支持中央集中加重方式によって繊維方向の応力-ひずみ図を作成し、曲げヤング率(MOE)および曲げ強さ(MOR)を測定した結果、未処理試片のMOEが5.97.8GPa、MORが7798MPaであったのに対し、アセチル化処理試片はMOEが6.07.9GPa、MORが7290MPaとなり、両者はほぼ同じ値を示した。このことから、超臨界二酸化炭素によるアセチル処理が木材強度を低下させるようなことはないと推測された。

強度測定の結果、超臨界二酸化炭素雰囲気中でのアセチル化処理試片は曲げヤング率(MOE)、曲げ強さ(MOR)ともに未処理試片と同程度の値を示した。また、従来法と比較しても試片強度はほぼ同じで、高圧下の超臨界二酸化炭素沖でアセチル化処理を行っても、強度には大きな影響を及ぼさないことが示された。軟X線による木口面の密度測定において、液相法では試片中央部より周辺部の方が密度増加が大きかったのに対し、超臨界二酸化炭素を用いたアセチル化処理では試片の中央部も周辺部もほぼ同程度に増加していたことから、アセチル化反応が試片全体で均一に進行しているものと推測された。
トランストランスレーション反応の分子メカニズムの解明

トランストランスレーションは、翻訳が中断したmRNAからtmRNAへとリボソームが翻訳を切替えることで二つの分断された情報から一本のキメラペプチドを作り出す、変則的翻訳である。この反応を行うtmRNAは、tRNA様の構造を持つtRNAドメインとタグペプチドをコードするmRNAドメインの二つのドメインから成る。これまでの研究によりタグペプチドのコード領域のすぐ上流に翻訳再開のシグナルの存在が明らかになってきたが、それが何によって、またどのようにして認識されることで翻訳再開位置の決定が行われるのかという問題はいまだ解決されていない。本研究では、リボソームの小サブユニットのAサイトに結合することが知られているアミノグリコシド系抗生物質のtmRNAおよびトランストランスレーションに対する影響を調べた。まず融解温度の変化の測定により、パロモマイシンはtmRNAに2分子結合することを明らかにした。さらに化学修飾により、それぞれのパロモマイシン結合部位を特定した。2分子の結合のうちtRNAドメインへの結合はアミノアシル化に影響を与え、さらにはSmpBのtmRNAへの結合を阻害した。一方、パロモマイシンはトランストランスレーションの開始位置を-1だけシフトさせることを明らかにした。なお、アミノグリコシド系抗生物質が翻訳をシフトさせるという現象はこれまでに報告されていないものであった。そしてリボソームに変異を導入することで、このシフトはパロモマイシンがtmRNAに結合することに起因するのではなく、リボソームのAサイトに結合することに起因することを明らかにした。さらに様々なアミノグリコシドの効果を調べた結果、ハイグロマイシンだけはシフトを誘導しないことから、トランストランスレーションのシフトはリボソームの小サブユニットのAサイトのA1492A1493のフリップアウトが原因であると結論づけることができた。トランストランスレーションは、翻訳が立ち往生したmRNAからtmRNAへとリボソームが翻訳を切替えることで二つの切り離された情報から一本のキメラペプチドを作り出す、変則的翻訳反応である。tmRNAは、tRNA様の構造を持つ部分(tRNAドメイン)と4つのシュードノットに囲まれたタグペプチドをコードする領域(mRNAドメイン)の二つのドメインから成る363塩基のRNAである。本研究では、翻訳再開位置がどのように決定され、リボソーム上でRNAの切替えがどのように行われているかという分子メカニズムに焦点を当てて研究を行い、まずタグペプチドをコードする領域の3-5塩基上流の配列が翻訳再開位置の決定に重要な役割を果たしていることを明らかにした。この上流配列に施したある変異はトランストランスレーション活性を低下させ、またある変異はtmRNAの翻訳のフレームをシフトさせた。一方、mRNAドメインから一見遠く離れたtRNAドメインにおいて、たった一塩基の変異でトランストランスレーション活性を失わせるものがあることを発見した。そして、この塩基はtmRNA結合蛋白質として知られるSmpBの認識部位であることを明らかにした。さらにこのタンパク質はトランストランスレーションにおける複数のステップ(tmRNAの安定化、tmRNAのアミノアシル化の活性化、tmRNAのリボソームへの結合)で重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究では、リボソームの小サブユニットのAサイトに結合することが知られているアミノ

グリコシド系抗生物質のtmRNAおよびトランストランスレーションに対する影響を調べた。まず融解温度の変化の測定により、パロモマイシンはtmRNAに2分子結合することを明らかにした。さらに化学修飾により、それぞれのパロモマイシン結合部位を特定した。2分子の結合のうちtRNAドメインへの結合はアミノアシル化に影響を与え、さらにはSmpBのtmRNAへの結合を阻害した。一方、パロモマイシンはトランストランスレーションの開始位置を-1だけシフトさせることを明らかにした。なお、アミノグリコシド系抗生物質が翻訳をシフトさせるという現象はこれまでに報告されていないものであった。そしてリボソームに変異を導入することで、このシフトはパロモマイシンがtmRNAに結合することに起因するのではなく、リボソームのAサイトに結合することに起因することを明らかにした。さらに様々なアミノグリコシドの効果を調べた結果、トランストランスレーションのシフトを起こしうる最小構造を明らかにした。最終的に、トランストランスレーションのシフトはリボソームの小サブユニットのAサイトの構造変化が原因であることを結論づけることができた。トランストランスレーションは、翻訳が中断したmRNAからtmRNAへとリボソームが翻訳を切替えることで二つの分断された情報から一本のキメラペプチドを作り出す、変則的翻訳である。この反応を行うtmRNAは、tRNA様の構造を持つtRNAドメインとタグペプチドをコードするmRNAドメインの二つのドメインから成る。これまでの研究によりタグペプチドのコード領域のすぐ上流に翻訳再開のシグナルの存在が明らかになってきたが、それが何によって、またどのようにして認識されることで翻訳再開位置の決定が行われるのかという問題はいまだ解決されていない。本研究では、リボソームの小サブユニットのAサイトに結合することが知られているアミノグリコシド系抗生物質のtmRNAおよびトランストランスレーションに対する影響を調べた。
消化器癌における腫瘍拒絶抗原(MAGE-1)遺伝子の発現

平成6年度は次の2つのサブテーマについて検討する予定であったが、いずれの項目においても以下の如き新しい知見が得られつつある。(1)MAGE-1遺伝子の特異的検索法の開発1994年になってMAGE遺伝子群は12以上の遺伝子から構成されていることが発表され、そのうちMAGE-1-12遺伝子については詳細な遺伝子配列が明らかとなった。報告に従いRosenbergらによるRT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法とT.BoonらによるRT-PCRを比較検討した。PCR産物のシークエンスの結果Rosenberg法よりもBoon法の方が優れていることを明らかにした。(2)消化器系癌におけるMAGE遺伝子の発現検索94年度は胃癌、食堂癌、大腸癌におけるMAGE遺伝子群の発現を検討した。その結果1)臨床胃癌組織でのMAGE-1,2,3遺伝子発現は28/68(41%),21/68(31%),26/68(38%)であり,食堂癌組織では26/42(62%),18/42(43%),24/42(57%)に,大腸癌組織では13/59(22%),12/59(20%),11/59(19%)に認められた。2)切除標本非癌粘膜ではMAGE遺伝子発現は認められなかった。3)細胞株でのMAGE-1,2,3遺伝子発現は胃癌ではそれぞれ6/9(67%),5/9(56%),6/9(67%)であり、食堂癌では5/12(42%),4/12(33%),4/12(33%)であった。以上、1)胃癌及び食堂癌におけるMAGE-1,3遺伝子発現は高率であった。2)MAGE遺伝子発現は非癌健常粘膜では認められず、MAGE抗原は腫瘍特異的抗原となりうる可能性が示唆された。2)日本人におけるHLA-A2抗原の陽性率は約40%であることから,食堂癌の25%,胃癌の15%にMAGE-3/HLA-A2を介した自己腫瘍特異的免疫療法の可能性が示唆された。これらの結果を2編の論文にまとめ、すでに報告した。平成7年度はこれらの知見をもとに予定したサブテーマである「薬剤によるMAGE遺伝子発現の増強」に関する検討に着手している。
内耳前庭有毛細胞のギャップ結合を介した平衡感覚機能障害発症の病態メカニズム解明

【目的】平衡感覚障害は加齢に伴い発症し、日常生活動作に著しい悪影響を及ぼすことから"生活の質"の低下が懸念され、超高齢化社会を迎えた我が国において、非常に重要視されるべき疾患である。平衡感覚は、内耳の有毛細胞により受容され、その機能維持にギャップ結合が作り出す膜迷路内のイオンバランスが重要とされるが、詳細は不明である。本研究は、ギャップ結合阻害による平衡感覚への影響について解析した。【方法】4週齢ddY雄性マウスの内耳内にギャップ結合阻害剤カルベノキソロン(CBX)を局所投与した。処置1日後および7日後に聴性脳幹反応を指標に聴力を測定した。また、尾懸垂試験および水泳試験により平衡感覚機能について解析した。また、処置1日後に平衡感覚受容器細胞である前庭有毛細胞の障害をファロイジン染色法により検出した。さらに、処置1日後および7日後における前庭組織の形態学的変化についてヘマトキシリン染色により観察した。【結果】対照群では少なくとも処置7日後まで聴力変動はなかった。一方、CBX処置群では、処置1日後より7日後まで聴力悪化がみられた。また、尾懸垂試験では、CBX処置群において処置1日後以降で著しい異常な回転行動が観察された。しかしながら、ファロイジン染色の結果、CBX処置1日後の前庭有毛細胞数および形態に変化は認められなかったが、処置7日後において前庭有毛細胞の形態異常が観察された。また、ヘマトキシリン染色において、CBX処置1日後および7日後における蝸牛および前庭組織の形態に著変は認められなかった。【考察】これらのことから、ギャップ結合は前庭感覚の機能発現に必須であることが示唆され、内耳ギャップ結合の破綻は著明な平衡感覚障害を引き起こすことが明らかとなった。また、本動物が平衡感覚障害のモデルとして有用であると考えられる。ギャップ結合阻害薬であるカルベノキソロン(CBX)の内耳内投与により、平衡感覚に異常がみられ、平衡感覚機能障害モデルマウスの作成に成功した。予定通り、平衡感覚機能におけるギャップ結合の役割について解析を進められている。平衡感覚機能障害モデル動物でみられる平衡感覚機能の異常と前庭ギャップ結合の機能障害との関わりを明らかにする。また、前庭ギャップ結合の破綻と有毛細胞の機能維持について解析する。さらに、同モデル動物の個体機能と前庭有毛細胞に対する薬物(神経栄養因子、抗酸化剤、カルパイン阻害剤)の影響を解析し、障害された有毛細胞の機能を予防・回復・維持させる薬物を探索する。
小児期における高比重リポ蛋白(HDL)の構造と機能に関する研究(小児期からの成人病予防に関する研究)

より自然の状態に近いHDLである、アポAl含有リポ蛋白(AlLp)のマクロファ-ジ泡沫細胞(動脈硬化発症モデル)に対する影響を検討した。アポAl含有リポ蛋白は更に抗体カラムを用いてアポAlのみから成るLpAlとAl及びアポA2から成るLpAl/A2とに細分画した。超遠心分離したHDLを用いた研究ではHDL_3のみが泡沫細胞からのコレステロ-ル引き抜き作用を示し、HDL_2にはその作用が見られないとされている。また、培養液中に放出されたコレステロ-ル(C)はすべて遊離コレステロ-ル(FC)と報告されていた。私達は本研究でLpAl及びLpAl/A2共に泡沫細胞からCを減少させ得る事を明らかにしち。また培養液中のコレステロ-ルの検討ではLpAl在存下では39%,LpAl/A2存在下では10%がエステル型(CE)であった。超遠心分離HDLではこれまでの報告と同様、CEは存在しなかった。さらにLCAT活性を抑制すると、LpAlのC引き抜き作用は消失したが、LpAl/A2の作用は影響を受けなかった。また、HDL_2及びHDL_3よりLpAl及びLpAl/A2を分離したところ、HDL_2粒子の70%がLpAlであり、逆にHDL_3粒子70%がLpAl/A2である事が判明した。この事実は超遠心分離中にHDLからFCをエステル化するLCATが失われる事を示しており、HDL_2にC引き抜き作用がないのは、LpAlから遠心操作中にLCATが失われた為と考えられた。このように従来の方法で分離されたHDLは生体内でのHDLと構造及び機能の両面で異なっており、今後HDLの機能の研究には超遠心法に代え、抗体カラムを用いてHDLを自然の状態で分離すべきであろう。これまでHDLの機能に関する報告は、HDL_3のみに注目している為、本来のHDLの持つ機能を過少評価していると思われた。以上の事を平成3年度の研究で明らかにした。マクロファ-ジを用いた泡沫細胞の作製法、泡沫細胞を使ったコレステロ-ル逆転送の分析法を確立し、アポAーI含有リポ蛋白(AーILp)の影響を検討した。アポAーI含有リポ蛋白は更に抗体カラムを用いてアポAーIのみから成るLpAーIとアポAーI及びアポAーIIから成るLp AーI/AーIIとに細分画した。これまでの超遠心分離したHDLを用いた研究では泡沫細胞からのコレステロ-ル引き抜き作用は主にコレステロ-ルエステル(CB)減少作用であり、細胞内のフリ-コレステロ-ル(FC)はむしろやや増加する傾向にあった。また、培養液中のコレステロ-ルは全てFCと報告されていた。私達は本研究でLpAーI及びLpAーI/AーII共に泡沫細胞からCEを減少させ得る事、更にLpAーIはFC減少作用も有する事を明らかにした。結果として泡沫細胞からの総コレステロ-ル引き抜き作用はLpAーIのみで観察された。

また培養液中のコレステロ-ルの検討ではLpAーI存在下では40%,LpAーI/AーII存在下では17%がエステル型であった。この事実は超遠心分離中にHDLからFCをエステル化する酵素lecithin:cholesterol acyltransferase(LCAT)が失われる事を示しており、また、我々のリポ蛋白間の機能の違いはLCAT活性の差による事を示唆している。このように従来の方法で分離されたHDLは生体内でのHDLと構造及び機能の両面で異なっているため、今後HDLの機能の研究には超遠心法に代え、抗体カラムを用いてHDLを自然の状態で分離すべきであろう。以上の結果より、泡沫細胞からのコレステロ-ル引き抜き作用が、2つの独立した機構成ること(HDLレセプタ-を介したCE減少機構及びLCAT活性を介したFC減少機構)を平成2年度の研究で明らかにした。より自然の状態に近いHDLである、アポA1含有リポ蛋白(A1Lp)のマクロファ-ジ泡沫細胞(動脈硬化発症モデル)に対する影響を検討した。アポA1含有リポ蛋白は更に抗体カラムを用いてアポA1のみから成るLpA1とA1及びアポA2から成るLpA1/A2とに細分画した。超遠心分離したHDLを用いた研究ではHDL_3のみが泡沫細胞からのコレステロ-ル引き抜き作用を示し、HDL_2にはその作用が見られないとされている。また、培養液中に放出されたコレステロ-ル(C)はすべて遊離コレステロ-ル(FC)と報告されていた。私達は本研究でLpA1及びLpA1/A2共に泡沫細胞からCを減少させ得る事を明らかにした。また培養液中のコレステロ-ルの検討ではLpA1存在下では39%,LpA1/A2存在下では10%がエステル型(CE)であった。超遠心分離HDLではこれまでの報告と同様、CEは存在しなかった。さらにLCAT活性を抑制すると、LpA1のC引き抜き作用は消失したが、LpA1/A2の作用は影響を受けなかった。また、HDL_2及びHDL_3よりLpA1及びLpA1/A2を分離したところ、HDL_2粒子の70%がLpA1であり、逆にHDL_3粒子70%がLpA1/A2である事が判明した。この事実は超遠心分離中にHDLからFCをエステル化するLCATが失われる事を示しており、HDL_2にC引き抜き作用がないのは、LpA1から遠心操作中にLCATが失われた為と考えられた。このように従来の方法で分離されたHDLは生体内でのHDLと構造及び機能の両面で異なっており、今後HDLの機能の研究には超遠心法に代え、抗体カラムを用いてHDLを自然の状態で分離すべきであろう。これまでのHDLの機能に関する報告は、HDL_3のみに注目している為、本来のHDLの持つ機能を過少評価していると思われた。以上の事を平成3年度の研究で明らかにした。
液体ヘリウム3のヘリウム4の溶解度の研究

〔目的〕【^3He】と【^4He】の混合液は、低温で【^4He】濃厚相と【^3He】濃厚相とに相分離し、【^4He】濃厚相には【^3He】は絶対零度においても6.4%迄溶け得る。一方【^3He】濃厚相については、【^4He】の溶解度が極めて小さい為、100mK以下の測定は非常に難かしく、理論的予測も近似的なものにすぎない。我々は、界面熱伝達の測定より液体【^3He】に【^4He】は100mK以下で従来予測されているものよりも相当多量に溶け、その温度変化も高温側から外挿されるものとは異なっているであろうとの推論に達し、溶解度の定量的測定を行なった。〔測定方法〕ある既知濃度の【^4He】を含む液体【^3He】を測定セルに詰め、希釈冷凍機混合室に熱接触させる。セルの温度を下げていくと、ある温度で混合液は相分離し、【^4He】のフィルムがセルの壁に析出する。液体【^3He】と【^4He】の誘電率は1.5%違うので、【^4He】フィルムがセル内のキャパシターの極板上に析出したことによる容量の変化を、共振回路の周波数変化として検出した。【^4He】のフィルムフローを抑制する為、測定セルのすぐ近くに弁を設けた。〔測定結果〕8種類のモル濃度の【^4He】を含む液体【^3He】についてその相分離温度を測定した。その結果、1.24%のものでは276mK、1620ppmでは147mK、156ppmでは89mK、76ppmでは72mK、48ppmでは65mKで相分離が検出された。一方、2ppm、24ppmでは、25mK迄相分離は見られず、46ppmでは、わずかに相分離の兆候が見られたが、温度を決定することは不可能であった。セルの壁に【^4He】原子が2原子層固体状になって吸着しているとして、セルの表面積よりその【^4He】量を見積ると、セル中の液体【^3He】に溶けている【^4He】のうち11ppmが吸着に与っていることになる。これらの量を考慮しても、液体【^3He】への【^4He】の溶解度は、サーム等の予測値より、100mK以下では、かなり大きいことがわかった。
生体内におけるCpGのがん細胞に対するアジュバント効果の検討

【平成22年度】(1)悪性黒色腫株のB16melanoma(以下、B16)を購入し、培養にて増殖させ保存した。(2)抗腫瘍薬である5-FUをマウスに投与し、7日目前後でnadirといわれる骨髄抑制が起こることを確認した。(3)免疫賦活剤でアジュバンド効果のあるCpGをマウスに投与して、炎症性サイトカインが生産されることを確認した。【平成23年度】(1)B16を野生型マウスに皮下注射し、生着することを確認した。(2)末梢血液中に8%程度常在するGr-1陽性CD11b陽性細胞(myeloid derived suplessive cells=MDSC)が、5-FU投与後の好中球減少症、所謂nadirである7日前後では4%以下に減少していた。5-FUの抗腫瘍効果を維持しつつ、nadirを補償する目的で、5-FUを投与する前にCpGを投与した。その結果、MDSCはnadirでも20%程度にまで増加していた。平成22年度はがん細胞腫の入手と増殖、生体内でのアジュバントの薬剤効果判定、抗腫瘍剤の効果判定を行った。初めに、マウスに投与する二種類のがん細胞腫を入手した。一つはB16 melanoma(マウス悪性黒色腫細胞株)で研究資源バンクより購入した。もう一つはSCCVII(マウス扁平上皮癌細胞株)で、放射線医学研究所ゲノム診断研究グループより分与頂いた。それぞれのがん細胞腫を培養液中で増殖させた。増殖方法はそれぞれのプロトコールに従って行った。約50匹投与分のストックを作成し、凍結保存状態にある。マウスへの投与、生着についてはまだ確認できていない。また、抗腫瘍アジュバントとして使用する予定であるCpGを、SIGMA社より購入しマウスに投与した。その結果、未投与群と比較して投与群では、投与後3日目に全個体において脾腫がみられ、血清中からはIL-6、TNF-aがELISAにて検出されていた。以上から、CpG投与による生体内での賦活効果を確認することができた。さらに、抗腫瘍剤である5-FUをマウスに単独投与し、その効果判定を行った。投与後7日目の全個体において、大腿骨のHE染色、末梢血の血算値を検討したところ著明な骨髄細胞の減少を認めた。すなわち、組織像では細胞数の著しい減少がみられ、血算では白血球と血小板の減少がみられた。赤血球系統は減少していなかった。また、投与後14日目にはHE染色と血算において、骨髄細胞の増殖、回復が確認された。以上から、5-FU投与による骨髄抑制が誘導されていることが確認できた。投与後14日目には、骨髄抑制から回復してくる細胞群について、Flow Cytometryで確認した。その結果、遠隔転移部で多く観察されるmyeloid系CD11 b+Gr-1+細胞腫が、骨髄中で著明に増加しているのが観察された。(2)抗腫瘍薬である5-FUをマウスに投与し、7日目前後でnadirといわれる骨髄抑制が起こることを末梢血液中の血算値と大腿骨骨髄像をHE染色で確認した。(3)免疫賦活剤でアジュバンド効果のあるLPS、CpGをマウスに投与して炎症性サイトカインが、血液中に生産されることをELISA法にて確認した。以上から、担腫瘍モデルマウスの確立と抗悪性腫瘍薬およびアジュバンドの効果を確認することができた。その結果、末梢血液中に3%程度常在するGr-1陽性CD11b陽性細胞が、腫瘍の成長に伴って増殖してくることをフローサイトメトリーにて確認した。この細胞種はMDSC(myeloidderivedsuplessivecells)として知られているもので、悪性腫瘍の中心部に存在していることや転移に関連しているものとされている。また、MDSCの全てがCD45.2を発現していて、腫瘍由来ではなく宿主由来のものであることがわかった。

さらに、B16を生着させた状態で、5-FUを投与して末梢血中のMDSCを観察したところ、好中球減少症としてのnadirである7日前後では1%以下に減少していることが確認された。5-FUの抗腫瘍効果を維持しつつ、nadirを補償する目的で、B16が生着した状態で5-FUを投与する前にCpGを投与した。その結果、MDSCはnadirでも平常時の2倍程度にまで増加していることが確認された。このことは、5-FUの副作用であるnadirがCpG投与によって抑えられていることを示唆するものである。以上から、交付頂いた2年間で悪性腫瘍モデルマウスを確立し、使用する薬剤が生体で作用することを確認することができた。
中国の環境政策・環境訴訟における公衆参加と環境保護組織に関する研究

5月に研究分担者、連携研究者が一堂に会した打ち合わせ会議兼研究会を開催し、研究課題の進捗状況について意見交換しすり合わせを行った。研究会では火力発電所における地域連携政策評価について、ゲストスピーカーから報告してもらった。近年の反スパイ法の制定により、外国人の中国国内における環境調査については以前にもまして困難になっていることを再確認し、今後は現地研究者との連携による慎重な調査を進めることとした。前年度に引き続き、台湾の環境政策と公衆参加についての現地調査を行ったほか、12月にベトナム・ハノイに出張し廃棄物・リサイクルや中国資本による開発案件の環境アセスメントの実態把握を中心に環境政策の調査を行った。急速な経済発展の下で、環境法政策の整備途上であることを確認した。3月に、イリノイ大学アーバナシャンペイン校の研究者を招聘して米国の環境政策における住民意見、メディアの役割について報告してもらい、意見交換した。米国の環境NGOは1700万人の会員がいるが、一般の人はNGOのホームページを読んでも内容を必ずしも理解できていないこと、NGOは寄付を受けることを重要な目的として情報公開していること、時間、能力、知識がないと必要な情報を入手することは困難なことなどを報告してもらった。また、龍谷大学受託研究員・王莎(西安建築科技大学講師)から、中国陝西省漢中地区の農業景観と発展政策をテーマに報告してもらい、景観保全のための政府、農民の取組みについて興味深い知見を得た。外国人の現地調査に対する中国政府の厳格な管理のため、現地でのインタビュー等において困難さが増しているものの、研究者との意見交換等には大きな支障はなく最終年度に向け概ね順調に研究は進められている。環境政策における公衆参加と環境保護組織の動向、環境公益訴訟の実態について把握するため引き続き現地に赴き、研究者のほか主要な環境NGOにインタビューし本研究課題のとりまとめを行う。年度後半に総括ワークショップを企画する。2015年から施行された改正環境保護法を受け、環境影響評価制度などの政策運用面での公衆参加と環境保護組織の現状を把握し、その役割・機能を総合的、学際的に解明することを目的に調査研究をおこなった。8月に研究代表者、研究分担者、連携研究者が一堂に会した研究打ち合わせをおこない、調査地域、内容を調整した。7月、3月に北京大学の汪勁教授、王社坤副教授と面会し、環境公益訴訟の現状と課題、改正環境保護法、改正大気汚染防治法の施行状況について調査した。この結果、汚染設備の押収、生産停止命令などの行政強制の強化、日罰制の厳格な執行など罰則の強化を確認できた。また、12月に山東大学の張式軍教授らを京都に招聘して「中国の環境政策、環境訴訟における公衆参加に関するワークショップ」を開催し、意見交換した。環境NGOの関係では、北京市、成都市、雲南省、河北省などの団体にインタビューし、活動の現状と課題について把握した。関連政府部門を見つけないと新規登録できないこと、活動資金の不足などの課題があるものの、環境NGOが集まる会議は定期的に開かれているようであり、NGO相互の情報交換は比較的スムーズにおこなわれている。一方で、地方政府の情報公開は環境影響報告書の公開などを除ききわめて限定的である。とりわけ、境外非政府組織管理法の制定に見られるように、外国組織や個人による調査、活動に対する政府の警戒感は根強い。このほか、中国の環境政策を周辺国と比較する視点から、モンゴル国に出張し関係機関の研究者と意見交換した。研究代表者、研究分担者は、それぞれ中国側研究者、関係団体とのネットワークを活用して現地調査、関係者へのインタビューをほぼ順調におこなっている。一方で、3月に雲南省環境保護庁へのインタビュー申し入れが直前に断られたこと、中国人研究者の招聘においても厳格な手続きがおこなわれており招聘できなかった研究者がいるなど、外国人の関与に対する警戒感が強く調査研究において若干ながら支障が生じている。4月に分担者、連携研究者が一堂に会した打ち合わせ会議を開催した。5月に韓国の環境政策に関する研究会、9月にベトナムの環境政策に関する研究会を開催し、招聘したゲストスピーカーからの報告を受け、各国の公衆参加と環境保護組織に関する特徴と課題について意見交換し、中国との比較分析を行った。また、9月に台湾に出張し環境法研究者、弁護士、環境NGO関係者にインタビューし環境政策における公衆参加の現状を把握した。3月に西安、成都に出張、研究者、環境NGOと環境活動の現状と課題を確認した。11月、慶應義塾大学湘南藤沢キャンパスで開催された日本現代中国学会全国大会において、企画分科会「環境政策における市民参加とガバナンス」を主宰、政府主導か市民主導か、ガバナンスの改善にはいずれが優先されるへきかという点を中心に討議した。当初、12月に上海市の大学において台湾の研究者を招聘して国際ワークショップを開催する予定であったが、直前にあった米国大統領の発言など国際情勢の変化により急きょ開催を中止、延期した。再度調整を行い、2017年11月4-5日、山東大学において同大学法学院との共催で「環境政策に関する国際ワークショップ」を開催した。日本側6人、中国側14人の研究者が参加、報告した。これにより習近平政権下の環境法政策の進展(厳罰化、情報公開など)と環境公益訴訟における検察官起訴案件の増加という特徴など、最新の知見を獲得した。研究成果については、日本と中国の研究者の執筆を得て英文図書を出版した。当初予定していた公衆参加と環境保護組織に関する現地調査の困難性は増しているが、中国側研究者の協力によりほぼ順調に推移している。

延期したワークショップも順調に終了し、研究者や環境NGO関係者とのネットワークもさらに深化することができた。延期したワークショップについては若干内容を修正したものの、大きな障害もなく順調に開催できた。5月に研究分担者、連携研究者が一堂に会した打ち合わせ会議兼研究会を開催し、研究課題の進捗状況について意見交換しすり合わせを行った。研究会では火力発電所における地域連携政策評価について、ゲストスピーカーから報告してもらった。近年の反スパイ法の制定により、外国人の中国国内における環境調査については以前にもまして困難になっていることを再確認し、今後は現地研究者との連携による慎重な調査を進めることとした。前年度に引き続き、台湾の環境政策と公衆参加についての現地調査を行ったほか、12月にベトナム・ハノイに出張し廃棄物・リサイクルや中国資本による開発案件の環境アセスメントの実態把握を中心に環境政策の調査を行った。急速な経済発展の下で、環境法政策の整備途上であることを確認した。3月に、イリノイ大学アーバナシャンペイン校の研究者を招聘して米国の環境政策における住民意見、メディアの役割について報告してもらい、意見交換した。米国の環境NGOは1700万人の会員がいるが、一般の人はNGOのホームページを読んでも内容を必ずしも理解できていないこと、NGOは寄付を受けることを重要な目的として情報公開していること、時間、能力、知識がないと必要な情報を入手することは困難なことなどを報告してもらった。また、龍谷大学受託研究員・王莎(西安建築科技大学講師)から、中国陝西省漢中地区の農業景観と発展政策をテーマに報告してもらい、景観保全のための政府、農民の取組みについて興味深い知見を得た。外国人の現地調査に対する中国政府の厳格な管理のため、現地でのインタビュー等において困難さが増しているものの、研究者との意見交換等には大きな支障はなく最終年度に向け概ね順調に研究は進められている。引き続き、環境NGO、関連団体の調査を継続する。政策制度面の調査については、地方政府へのインタビューは困難が予想されるため、主に研究者や文献を通じた調査をおこなう。現地で研究者によるワークショップ、環境NGOによる座談会を企画するとともに、欧米の研究者との交流を企画し、現行の政治、社会制度における公衆参加と環境保護組織の機能の解明に努める。引き続き、中国での現地調査やインタビューを進めるとともに、他のアジア諸国(台湾、ベトナム等)との比較考察を進める。とりわけ環境公益訴訟、環境アセスメント、環境法政策の策定における環境NGO、住民の動向に留意する。環境政策における公衆参加と環境保護組織の動向、環境公益訴訟の実態について把握するため引き続き現地に赴き、研究者のほか主要な環境NGOにインタビューし本研究課題のとりまとめを行う。年度後半に総括ワークショップを企画する。
トンネル・地下鉄火災を対象とした多層ゾーン煙流動予測コンピューターモデルの展開

建築火災時を想定して開発を進めてきた多層ゾーン煙流動予測モデルを長大空間である地下鉄・トンネルの火災時にも適用できるように展開を行った。また模型トンネルを製作して火源、換気風、トンネル勾配の多数の条件に対して実験を行い、煙流動性状を調べた。実験結果との比較により、多層ゾーンモデルがトンネル火災時の煙流動予測のための実務的手法として有力なモデルとなり得ることを確認した。本研究は、建物火災を対象にして開発を進めてきた多層ゾーン煙流動予測モデルを、最終年度展開研究として地下街やトンネルなどへ利用可能なモデルとして新たに展開するものである。このため、今年度は建物対象の同モデルの実用化と、トンネル火災への適用検討の2つの作業を実施した。先ず、前者については、多層ゾーン煙流動予測モデルの理論・予測コードの取りまとめを行うとともに、ゾーンモデルへのデータ入力の簡易化および計算出力結果の把握の容易化のためのGUI(Graphic User Interface)システムの開発を行った。これにより、煙流動計算に必要な建物空間寸法、開口データなどが、モニター上のマウスクリックにより視覚的に入力可能となり、また予測結果として出力される煙層の温度や厚さの空間平面および断面上への図形表示が可能になった。更に、このGUIを用いて、地下街における煙流動のケーススタディーを行い、煙制御対策の効果を検討した。また、後者のトンネル空間への適用に関しては、京大防災研の構内に、大規模トンネル模型(幅1.8mx高さ1,8mx長さ27.6m)を制作し、トンネル空間が無風および勾配を有しない水平の条件下での煙流動の基本的性状を調べるために、メタノールを火源とした9条件の火災実験を行い、トンネル内天井流の温度分布性状を相似パラメタを用いて解析し、定常状態では温度が火源からの距離の1/3乗に反比例して降下することを明らかにした。また、建物内を対象とした多層ゾーン煙流動予測モデルの適用により、トンネル空間での煙性状がどの程度良好に予測できるかの検証ケーススタディーを行った。この結果、トンネルでは建物での煙流動予測計算のように静圧をパラメタとして計算するのでは不十分なであり、動圧の扱いに課題が残ることが明らかになった。本研究は、建物火災を対象にして開発を進めてきた多層ゾーン煙流動予測モデルを、地下街やトンネルなどへ利用可能なモデルとして新たに展開するものである。今年度は昨年度京都大学防災研究所の構内に製作した、大規模トンネル模型(幅1.8mx高さ1,8mx長さ27.6m)を用い、道路トンネルを想定した換気用ジェットファンのトンネル内煙流動への影響に関する実験を行った。予備実験として、先ずジェットファンの位置を変化させて、トンネル模型空間内の風速分布を測定し、この結果、ファンをトンネル出口近くに設置して空気を吸引する方式にするとトンネル空間内にほぼ一様な風速分布を得ることが出来るため、風速と煙流動の関係が明確にし易いことを確認した。煙流動実験においては、火源としてメタノールのプール火源を用い、径の異なる容器を用いることで発熱速度を17.5、33、55kWの3レベル段階に変化させ、火源の高さについては床上0mと0.6mの2ケース、およびトンネル内換気風速については無風、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25m/sの6段階を設定し、これらの全ての組み合わせについて計36条件の実験を行った。測定は、トンネル内9箇所に配置したツリー上に設置した計90点の熱電対による温度および4箇所に設置した計24点の風速計による風速の測定を着火3分前から15分間、1秒間間隔で行った。多層ゾーンモデルはトンネル内の気流の動圧が維持されていることを考慮して計算法を変更・修正し、このモデルによる予測を上記実験結果と比較し、概ね良好な一致をみた。一部一致の良くないケースは、換気風により火災プリュームが著しく吹き倒され、計算で設定したゾーンの範囲内で天井に衝突していない場合である。また、無風時トンネル内天井流の非定常伝播段階の煙層厚さと伝播速度について分析し、これらの予測式を規定する相似パラメタの関数として回帰的に求めた。一般に数kmに亘ることも少なくない長大なトンネルや地下鉄の火災時煙流動性状を予測し、有効な避難安全対策を計画ずるためには、様々な火災条件の下での煙流動性状を予測できる手法が必要であり、このため本研究ではCFDモデルに比較すれば計算時間が殆ど無視出来るほど速い従来の2層ゾーンモデルと同程度の計算速度で、かつ温度などの物理量の垂直分布が予測できる多層ゾーン煙流動予測モデルのトンネル空間への展開を図ってきた。このモデルにより、水平トンネル内の煙温度・流速分布については、火災性状予測のCFDモデルとして世界的に最も有名なFDS(Fire Dynamics Simulator)に劣らないレベルの予測が可能であることが確認されている。

しかし、通常トンネルは最大で8%程度の勾配を持つ可能性があるので、本年度は、このような勾配を有するトンネルに対する多層ゾーン煙流動予測モデルの適用性を検証するための実験データを取得する目的で、勾配として9%および6%の条件において、火源および軸流換気風速の条件を変えた煙流動実験を行いデータを取得した。また、この実験の主な条件での測定結果と多層ゾーンモデルによる予測を比較した。この結果、多層ゾーンモデルは概ね良好に実験結果と一致する予測を与えることが確認されたが、一部予測制度的に改善する余地があることも分かった。さらに、この実験は、断面が約1.8m×1.8m、長さが約27mと、実大のトンネルに比較して小さい半実大模型トンネルであるので、実大での性状の予測精度確認の一助とするため、火源規模および模型規模と火災性状との関係についての相似則を検討した。一般に数kmに亘ることも少なくない長大なトンネルや地下鉄の火災時煙流動性状を予測し、有効な避難安全対策を計画ずるためには、様々な火災条件の下での煙流動性状を予測できる手法が必要であり、このため本研究ではCFDモデルに比較すれば計算時間が殆ど無視出来るほど速い従来の2層ゾーンモデルと同程度の計算速度で、かつ温度などの物理量の垂直分布が予測できる多層ゾーン煙流動予測モデルのトンネル空間への展開を図ってきた。このモデルにより、水平トンネル内の煙温度・流速分布については、火災性状予測のCFDモデルとして世界的に最も有名なFDS(Fire Dynamics Simulator)に劣らないレベルの予測が可能であることが確認されている。このモデルの予測機能を、一般に勾配を有するトンネル空間に対して確認するため、既に9%および6%勾配のトンネル煙流動実験を行っているが、更に3%勾配および9%の上り勾配と下り勾配を有する模型トンネルにおける実験を行い、多層ゾーンモデルの検証データを整備し、また予測値と実験測定結果との比較をおこなった。この結果を受けて、多少予測精度に改良の余地のある点についてモデルおよびプログラムを修正した。また、この多層ゾーンモデルを使用する場合には、モデルへの入力データおよび計算結果の出力が容易であるほど使用の便が良いのは当然であるので、入力および出力をグラフィック画面から行うことが出来るインターフェース(GUI)をVB(Visual Basic)を用いて構築した。これにより、煙流動結果についても数値による出力だけでなく、比較的簡単にビジュアルな表示が出来るようになり、煙流動性状が視覚的も把握出来るようになった。
リン酸化ペプチドの網羅的解析のための新技術開発

1)高純度リン酸化ペプチド精製技術の確立細胞全抽出液の消化物を用いてIMAC担体や金属の選定、バッファー条件や洗浄回数などの系統的な最適化を詳細に行い、リン酸化ペプチド精製の回収率・特異性を大幅に改善した。さらに、Ga-IMACとFe-IMACのリン酸化ペプチド精製の特異性の差を見出し、この特性を利用した、tandemIMAC法を構築することでより網羅性の高い精製技術を構築した。その結果、現在、わずか100ug程度のタンパク質消化物から700種類におよぶリン酸化ペプチドに成功した。さらに、大規模なリン酸化ペプチド解析のために、種々のイオン交換クロマトグラフィー等とIMACの組み合わせを検討し、10000種類以上のリン酸化ペプチドの同定が可能となるシステムを構築した。また、ILAC法やiTRAQ法などの安定同位体標識法による定量技術を用いることで、実際にリン酸化ペプチドを定量可能かどうかを検証し、2検体間の定量的比較(SILAC法)や多検体間の比較(iTRAQ法)による定量法を構築した。2)定量的リン酸化プロテオーム解析の応用上記、定量的なリン酸化ペプチドの大規模解析システムの構築を完了したため、細胞周期やシグナル伝達研究への応用を試みた。細胞周期の解析例としては、非同調細胞とM期同調細胞の比較を行い、3000種類以上のリン酸化ペプチド(約1500種類のタンパク質に相当)の定量を行い、多数のM期特異的なリン酸化を見出した。また、EGF刺激たよって引き起こされるリン酸化の大規模定量解析をiTRAQ法との併用によって遂行し、10000種類にリン酸化の経時変化をとらえることに成功した。これらの大規模データをもとに、各々の新規リン酸化タンパク質について詳細な解析を行うとともに、文献情報とのリンクやモチーフ解析などを行うことで、細胞周期やシグナル伝達における新たな知識発見が可能であることが示された。リン酸化ペプチドの精製技術の確立金属キレートカラム(IMAC : immobilized metal affinity chromatography)がリン酸化ペプチドの精製に汎用されているが、非リン酸化ペプチドの混入が大きな問題である。したがって、IMACによるリン酸化ペプチド精製法の詳細な最適化を行い、より特異的かつ菅便なリン酸化ペプチドの精製法を確立した。具体的には金属としてガリウム-IMACカラムを用いて、標準リン酸化タンパク質による予備的な最適化、さらに全細胞抽出液の消化物を用いた詳細な最適化を行った。その結果、一度のLC-MS/MS解析で400種類程度のリン酸化ペプチドの同定が可能となった。リン酸化ペプチドの同定技術の確立質量分析計におけるリン酸化ペプチドの解析はリン酸化ペプチドのイオン化効率の低さや特徴的な解列パターンから帰属が困難なことが多い。この問題点を解消するために、精製したリン酸化ペプチドを脱リン酸化処理後、質量分析計による測定を行う方法(PID : Post-IMAC dephosphorylation法)を考案した。実際に抗リン酸化チロシン抗体によって精製したチロシンリン酸化タンパク質を用いてPID法の予備的な実験を行い、確かに脱リン酸化処理によって効率よくリン酸化ペプチドの同定が可能であることが判明した。また、全細胞抽出液から精製したリン酸化ペプチドに対してもPID法を適用し、脱リン酸化によって同定信頼性の向上を認めた。