hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞の活性化、アポトーシスにおける低分子量G蛋白の役割に関する研究

破骨細胞は最終分化した増殖能のない細胞であり、一旦分化するとreceptor activator of NF-kBligand(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)などの生存因子が存在しないと速やかに細胞死に至る。破骨細胞の細胞死はアポトーシスによるものであることが報告されている。アポトーシスは「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、細胞への様々な刺激、あるいはストレスなどによって誘導され、DNAの断片化を特徴とする静かな細胞死である。近年破骨細胞の細胞死はアポトーシスによることが明らかになってきたが、このように骨代謝の要ともいえる破骨細胞がなぜアポトーシスに陥りやすいのか、またその分子メカニズムはいかなるものか、などについてはほとんど明らかになっていないのが現状である。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を有する骨粗鬆症治療薬であるが、その作用メカニズムとして破骨細胞のアポトーシス誘導が知られている。われわれはこれまでにsmall G proteinのひとつであるRasが破骨細胞の生存に重要であり、Rasの活性を抑制するdominant negative Ras遺伝子の導入によって破骨細胞は速やかにアポトーシスに陥り、Ras-ERK経路を活性化するconstitutively active MEK1の導入によってアポトーシスが強力に抑制されることを明らかにした。やはりsmall G proteinであるRhoファミリーに属するRac1はラメリポディアの形成などアクチン細胞骨格の制御に重要な働きをすると考えられているが、ある種の細胞ではアポトーシスシグナルに関与することが明らかになっている。われわれは破骨細胞のアポトーシスにおけるsmall G protein、なかでもRho,Rac,Cdc42といったRhoファミリーの役割を明らかにした。今年度はまず、主要なRhoファミリー低分子量Gタンパク質であるRhoA、Rac1、Cdc42のドミナントネガティブ型変異体(DN)のアデノウィルスを作製し、それぞれの低分子量Gタンパク質の破骨細胞の生存、活性における役割を検討した。先行研究の結果と同じく、RhoA、Rac1の活性を抑制すると、共存培養によって形成された破骨細胞の骨吸収窩形成は著明に減少したが、さらにRac1の機能抑制では破骨細胞の生存も抑制され、ウエスタンブロッティングでも切断型Caspase-3のが増加していた。アポトーシスの促進を示唆するこの効果はRac1^<DN>に特異的であった。そこで、さらにRac1が関わるシグナル伝達の経路に着目して実験を進めた。破骨細胞に対して最も強力な抗アポトーシス作用を持つM-CSFの投与は速やかにRac1を活性化した。また、M-CSFの添加により破骨細胞の生存は促進されたが、Rac1^<DN>の過剰発現により、この生存促進効果はほぼ完全に打ち消された。次にMEK1の選択的阻害剤であるPD98059、PI-3'キナーゼの阻害剤であるワートマニン、LY294002、PI-3'キナーゼの下流のmTORの阻害剤とされるラパマイシンを用いて実験を行った。恒常活性型Rac1は著明に破骨細胞生存を促進し、PD98059はこれを抑制する傾向はあったが、有意差はなかった。一方PI-3'キナーゼ阻害剤である、ワートマニンとLY294002は共に完全にこれを抑制した。ラパマイシンでも同様の傾向が見られた。以上の結果からRac1による破骨細胞の生存促進のシグナルにはMEK/ERKの経路よりもPI-3'キナーゼ/Aktの経路がより大きく関与することがわかった。昨年の研究でわれわれは低分子量G蛋白Rac1が破骨細胞においてマクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)の下流で働き、細胞のアポトーシスを抑制していることを明らかにした。

本年度はRac1の破骨細胞活性化あるいは不活化が破骨細胞の細胞骨格に与える影響を検討した。予想に反し、アクチンリングの形成は恒常活性型、抑制型のいずれでも明かな影響を受けていなかった。次に破骨細胞における動的な細胞骨格の変化を評価するため、微速度ビデオ顕微鏡撮影のをもちいて、M-CSF投与の前後で破骨細胞の形態を比較した。その結果、興味深いことにM-CSF投与後に生じる膜運動の活性化がRacDNを過剰発現させることによって明らかに抑制されていることがわかった。以上の結果より、あくまでM-CSFの添加という非生理的な状況ではあるが、Rac1が動的な細胞骨格の制御に関わることが示された。
マラリア迅速診断検査キット導入に伴う医療者の行動変容プロセス

マダガスカル共和国のマラリア治療基準では,迅速診断検査結果に基づき抗マラリア薬を処方することになっているが,1次医療では必ずしも遵守されていない.医療従事者を対象とした質的研究から、彼らは患者個人の利益を優先する傾向があり,それが社会全体の利益となる治療基準と対立しているためと考えられた.従来の抗マラリア薬を容易に供給できる環境も、治療基準を尊重しない傾向を助長している.治療基準はこういった医療従事者の特質を考慮して策定する必要があるマダガスカル共和国のマラリア治療基準では,迅速診断検査結果に基づき抗マラリア薬を処方することになっているが,1次医療では必ずしも遵守されていない.医療従事者を対象とした質的研究から、彼らは患者個人の利益を優先する傾向があり,それが社会全体の利益となる治療基準と対立しているためと考えられた.従来の抗マラリア薬を容易に供給できる環境も、治療基準を尊重しない傾向を助長している.治療基準はこういった医療従事者の特質を考慮して策定する必要がある本研究の目的は、マダガスカル共和国において2005年から導入されたマラリア迅速診断キット導入(RDT)に関して、医療者の認識、態度、行動がどう変わったのか、そのプロセスを聞き取り調査と診療記録から明らかにすることである。初年度では、すでに実施した予備調査結果の分析と、新たな調査地域での調査許可取得と予備調査の実施を目指した。当初予定した内容のうち、2008年にトゥリアーラで行った予備調査の分析を完了し、高マラリア流行地域であるマジュンガでの予備調査を実施した。しかし、低マラリア流行地域であるトゥリアーラでは、治安の悪化により調査が十分に行えず、アンタナナリヴに調査地を変更し予備調査を行った。1)トゥリアーラ郡で行った予備調査の分析の結果、政府のマラリア治療指針を遵守する者(すべての発熱患者にRDTを使用する、RDT結果が陰性の場合には抗マラリア薬を使用しない)は少なく、主任処方者(医師または診療所長)であることが,適正なRDT使用に関連していた.また,RDT結果遵守には主任処方者であることおよび監督者の訪問による監視頻度が高いことが関連していた(Rakotonandrasana et al.,2011).今後予定している聞き取り調査で用いる質問項目の決定に際して有益な成果が得られた。2)マジュンガでは、I郡、II郡での調査許可を取得した。マジュンガI郡のすべての診療所を訪問し医療従事者を対象とした予備的な聞き取り調査および医療記録収集を行った。3)アンタナナリヴでは、中心地より半径15キロ以内にある診療所で抗マラリア薬処方に携わっている医療従事者すべてを対象者とした。行政区域では4つの郡にまたがっていたが、それぞれの郡保健局より調査許可を得ることができた。今後、対象診療所をすべて訪問し医療従事者より聞き取り調査を行う予定である。本研究の目的は、マダガスカル共和国において2005年から導入されたマラリア迅速診断キット導入(RDT)に関して、医療者の認識、態度、行動がどう変わったのか、そのプロセスを聞き取り調査と診療記録から明らかにすることである。23年度は、前年度に行った予備調査の結果をふまえて、アンタナナリヴ市街より半径15キロ以内にある診療所で抗マラリア薬処方に携わっている医療従事者すべてを対象者として聞き取り調査、診療記録調査を行った。インタビューの総数は201例であった。また、低マラリア流行地域であるトゥリアーラでは、治安の悪化により調査が十分に行えない状態が続いたため本年度も追加調査を施行できなかった。また、前年度までに収集したデータに基づき、低マラリア流行地域(トゥリアーラ)と高マラリア流行地域(マジュンガ)における医療従事者の処方行動を比較した。その結果、高マラリア流行地域の医療従事者の方が、政府のマラリア治療指針を遵守(RDT結果が陰性の場合には抗マラリア薬を使用しない)する傾向があった。高マラリア流行地域では、検査結果陽性を経験することが多いため、検査結果を信頼するperceptionが強化されるのではないかと考えられた。RDT結果遵守には主監督者の訪問による監視頻度が高いことは、両地域に共通していた。これらの結果については、日本寄生虫学会で報告を行った。質的研究については、昨年度までに収集、分析したデータを基にカテゴリーに修正を加える作業を継続中である。マダガスカルの医療政策では、マラリア迅速診断検査陽性の場合にのみ抗マラリア薬であるアルミシニン系合剤を処方することが定められている。しかし、医療現場では、検査結果が陰性にもかかわらず、抗マラリア薬が処方されることが多いことが従来の研究からわかっており、その原因を明らかにすることが求められている。本年度は、マダガスカル各地で一次医療施設に勤務し抗マラリア薬の処方を担当する医療従事者(医師、看護師)を対象とした処方行動データを収集した。また、オープンエンドの質問による聞き取り調査資料に基づき質的研究を行った。その結果、なぜ迅速診断検査が陰性でも抗マラリア薬を処方するのかという問に対しては、(1)医療従事者にとって最も大切なのは医療政策に従うことではなく患者を助けることであるため、(2)患者にとって最善の治療方針を理解しているのは政策立案者ではなく医療従事者であるため、(3)これまでの医療従事者としての経験から発熱患者には抗マラリア薬が有効であるためという回答が抽出された。

また、迅速診断検査陰性時にどのように抗マラリア薬を使用するのかという問には、(1)ガイドラインに記載のないアルテミシニン系合剤を処方する、(2)アルテミシニン系合剤以外の従来の抗マラリア薬を処方する、(3)他のガイドラインを参照にして処方することがわかった。さらに、(1)マラリア以外の発熱要因が考えられない患者、(2)治療内容と経過からマラリアが疑われる患者には、迅速診断検査で陰性にもかかわらず抗マラリア薬を処方する傾向があった。医療従事者は、患者個人の利益を優先する傾向があり、そのことが社会全体の利益となる「マラリア迅速診断検査陽性の場合にのみ抗マラリア薬を処方すること」との対立を生み出していると考えられた。ガイドラインはこういった医療従事者の特質を考慮に入れて策定する必要がある。低マラリア流行地域であるトゥリアーラでの追加調査はできなかったものの、代替地であるアンタナナリヴにてデータ収集を十分行うことができた。しかし、高マラリア流行地域であるマジュンガでは、そもそも医療従事者の数が少ないために、十分なデータ収集ができなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。低マラリア流行地域と高マラリア流行地域の医療従事者の処方行動の違いについては、予備的な結果が得られたが、実証のためにはマジュンガ以外の高マラリア流行地域にてデータを収集する必要がある。また、本研究の柱である質的研究について重点的に分析を進めていく。
ニューロン状導電性高分子の合成とその機能素子としての特性の研究

1.ニューロン状導電性高分子を電解重合法を用いて重合した。重合中、重合条件を変えることで成長パターンの種類を変えることが出来ることが分かった。成長パターンの制御が可能となった。2.2個のニューロン状導電性高分子の接続ができた。両者をある程度まで成長させた後、電位差を設けることによりこのことが可能となった。3.第3電極を設けてパス部のドープ、脱ドープを行い導電率の制御を行った。導電率の変化は印加したパルスの極性、幅、高さと回数に依存した。パス部の重みはパルスに依存することになり学習効果あるいはメモリー効果を付加できることが分かった。4.新しい素子としてのニューラルネットワークの実験のために8個のニューロン状導電性高分子でネットワークを作った。ネットワークに電圧を印加している時、パスの重みをかえることによりネットワークの状態が変化し、出力変化が起きることを示した。1つのパルス入力に対して出力が変化するのでなく内部状態に依存した出力が出るという新しい性質が見いだされた。これを用いた新しい素子が作成可能であるこが示唆される。5.パターンのマルチフラクタルとウエーブレット解析を行い成長過程の複雑さを数量的に示した。マルチフラクタルを求めることにより大域的な情報を得ることが出き、さりにウエーブレット解析により2次元成長の各場所でのフラクタル性を図示することが出来た。成長パターンの時間的変化とともにその2次元マップの推移を求めることが出き、各点での成長度や複雑さを定量的に求められた。平成7年度の研究計画の項目は、(1)ニューロン型成長パターンの重合、(2)2個のパターンの接続、(3)接続部のド-ピング制御とネットワーク化、(4)学習効果の確認、(5)ネットワーク間の導電率制御、(6)パターンの解析手法の確立、である。これらの項目に対して、これまでに得られた知見は以下のとおりである。1.導電性高分子の成長パターンを制御することにより、ニューロン状の導電性高分子を重合することができた。この導電性高分子を同一セル内で2個以上合成し、枝部の接続が可能であることを確認した。2.2個のニューロン状の導電性高分子を接続し、枝部のドーパントイオンを第3電極を用いて出入りさせることにより、接続枝部に重みづけをすること、あるいは学習効果を持たせることができるようになった。3.ドーパント量は第3電極に印加する電圧の極性、印加時間(パルス幅)、大きさで制御可能であることを確認できた。4.フラクタルパターンの成長過程を写真撮影し、イメージスキャナでパターンデータを取り込むことにより、鮮明な画像データが得られるようになった。また、形状のフラクタル解析を行うためのプログラムも開発し、フラクタル次元を算出できるようになった。平成8年度の研究成果で特に次の項目で大きな見知が得られた。:(1)同一セル内で他のニューロン型導電性高分子を接続し、電圧パルス等を重畳して接続部のパスの重みを変化させ学習効果持たせること、(2)マルチフラクタル性を中心にしてパターン解析を行うこと1.3個以上のニューロン型導電性高分子の接続ができることを示した。8個のニューロン型導電性高分子をニューラルネットワークを考慮した形のネットワークを作製した。これにより任意の形のネットワークが作製可能であることが示された。ネットワークの1部を脱ドープさせること、また他のパス部を脱ドープさせることにより、ネットワークの重みを変化させ、3つの出力層の電流値を変えることができた。これにより、パルスと1:1対応した出力でなく内部のネットワークの状態に応じた出力を出すことができた。これは学習効果が単に1つのパス上で行われるのではなくパターン全体で行わせることができることを示していることが分かった。2.成長パターンのマルチフラクタルを求めるだけでは、パターンの解析は十分ではないことがわかった。

パターン全体の情報が得られるけれども場所の情報が明確に得られないために成長過程の各場所での変化を定量的に把握できないためである。そこでそのウエーブレット解析を導入し、この値から各点でのフラクタル性を求め、各場所での複雑さの変化を2次元的に図示することを試みたで。これにより成長過程の複雑さの変化が数量的に示せるようになった。
ヨーロッパ周辺地域の社会と民族に関する史的研究

本研究はバルカン諸国および旧ソ連の西部国境地域の諸共和国(バルト3国、ウクライナ、ベラル-シ、モルドヴァ)、換言すると、ヨーロッパ周辺地域がかかえる最大の問題の一つである民族・少数民族間題を、それぞれの伝統社会の歴史的な考察を通じて、比較検討することを目的としている。この目的のために、平成7年度はバルカンおよび東欧諸国、旧ソ連の西部諸共和国の伝統社会が持つ共通面と、それぞれの特性の比較研究を行った。平成8年度はそれぞれの伝統社会から生じる民族・少数民族門題の比較検討と現状の把握に重点を置いた。本年度は、これまでの研究をまとめ上げることを課題としていた。当初考えていた文献が入手できないなどの理由により、研究は思うように進んでいないのが現状である。しかし、この地域の社会と民族を比較研究するなかで、あらためて「国民国家」や国境が所与のものではないことが見えつつある。90年代に入り、ソ連やユ-ゴスラヴィアやチエコスロヴァキアなどの連邦国家が相次いで解体してしまったが、もう一度連邦制について考えてみる必要性も感じている。これらの問題については、「研究成果報告書」で明らかにしたいと考えている。本年度の研究実施計画はバルカンおよび東欧諸国、旧ソ連・西部国境地域の諸共和国の伝統社会がもつ共通面と、それぞれの社会の特性の比較・検討であった。そのため、バルカンおよび東欧諸国、旧ソ連・西部国境地域の諸共和国の歴史と社会に関する内外の文献や史料の収集を行うとともに、研究分担者の報告と共同討議の研究会を二回開催した。柴が「バルカン地域概念の変遷とバルカン社会の特性」について、中井が「『新東欧』という地域概念とウクライナ・ポーランド社会の特性」について、安岡が「ロシア地域概念の再考」についてそれぞれ報告した。まだ、本年度に注文した文献や史料が納入される前であったため、これまでの研究を整理することに力点が置かれた。今後は納入したマイクロフィルムを駆使することが課題とされよう。しかし、こうした状況のなかでも柴および中井がそれぞれ、当該研究に関連する成果を2点ずつ発表している。十分な成果とはいえないが、研究初年度としては許容されるものと思われる。初年度に行ったバルカンおよび東欧諸国、旧ソ連の西部諸共和国の近代史と伝統社会の比較に基づき、本年度の研究目的はそれぞれの地域がかかえる民族・少数民族問題の比較・検討と現状の把握であった。そのため、分担者の報告と共同討議の研究会を公開で二回開催した。柴が「バルカンの民族問題と現状」について、中井が「ウクライナ、ベラル-シにおける民族関係」について、安岡が「ロシアの民族問題と現状」について、それぞれ報告を行い意見交換した。いまのところ、納入した文献やマイクロフィルムの史料を駆使するにはいたってはいない。しかし、本年度に文献の整理が行われたため、それぞれがこれまでの研究蓄積に加え、広い視野に立って周辺地域のかかえる民族問題や民族関係を比較しながら、さらに研究を深めていく環境が整ったことは特筆すべきことであろう。こうした現状の中でも、当該研究に関連する成果を柴が3点、中井が2点、安岡が1点発表している。十分な成果とは言えないが、共同研究をするなかで見えてきた視点を取り入れて研究は着実に進んでいる。
材料表面精密制御によるフジツボ接着メカニズムの解明と抗付着材料の開発

本研究は工学系と生物系研究者の異分野連携によって海洋付着生物であるフジツボの付着メカニズム解明を通して抗付着材料を開発することを目的としており、平成30年度は下記の項目について研究を行った。1)表面官能基効果の評価:これまでの研究においてフジツボの付着期幼生であるキプリス幼生は親水性末端(OH基)で修飾した基板表面には著しく付着しづらいことが明らかとなっていた。そこで付着防止材料を開発するための指針としてどの程度のOH基割合が付着防止に必要かを調査した。その結果、概ねOH基の割合が8割を超えるときに付着防止効果が現れ、6割以下だとキプリス幼生は付着する傾向を示した。しかしOH基の割合が4割のときにも付着阻害効果が生じているようで、これまでに報告されていた材料表面の表面自由エネルギーだけでは説明できない結果が得られた。2)キプリス幼生の認識サイズ評価:キプリス幼生はどの程度のサイズでOH基があると付着を嫌がるのかを調査し、材料開発の指針を得るとともにキプリス幼生が認識する大きさを解明することを目的とし、SAMのマイクロスケールパターン化基板の作製と解析を行った。SAMのマイクロスケールパターン化にはフォトマスクを利用した紫外オゾン処理によって、パターンが形成したかの確認には水分散微粒子を塗布することで、実際にパターン化できていることを確認した。3)微細構造効果の評価:耐候性を有するフッ素樹脂や、柔軟かつ耐久性を有する加硫ゴムの表面微細加工に成功し、さらにキプリス幼生を用いた毒性試験によって、材料に毒性がないことを確認した。4)抗付着材料の開発:北海道苫小牧市沿岸に5月から9月まで各種サンプルを浸漬した結果、室内実験でも良好な付着防止効果を示した架橋ポリビニルアルコール基板はフィールドでも3ヶ月間程度はきれいな表面を保っていることが確認された。上述の通り、本研究で進める研究項目1)4)について申請時のスケジュール通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると考えられる。特に1)表面官能基効果の評価においては、これまでに報告されていた材料表面の表面自由エネルギーだけでは説明できない結果が得られており、我々はキプリス幼生が付着時に分泌し、付着誘引作用もあるタンパク質(フットプリント)が基板表面に残りにくいときにキプリス幼生は付着を嫌がるのではないかと考え、今後はフットプリントの観察や、基板からの剥離し易さも測定し、抗付着効果のメカニズム解明も目指すことにした。さらに急遽試験的にフィールド実験を行えた架橋ポリビニルアルコール基板は良好な付着防止効果を示していたことから、抗付着材料の開発に向けて順調に成果が得られていると考えられる。その他、SAMのマイクロパターニングとその可視化(SAMがパターン化しているかどうかの確認)、様々な材料で微細構造を作製するための実験系の構築も平成30年度には完成しており、次年度も順調に研究を進められると考えている。平成30年度は各々の実験の下準備的な要素が強かったが、おおむねそれらの研究も終わったことから、次年度以降は加速度的に研究を進められると考えている。特に上述の付着誘引作用があるフットプリントの剥離性については、平成30年度末に水晶振動子マイクロバランス装置を研究室で再稼働させることに成功し、実際に試験できる状態にある。またSAMのマイクロパターニングにも成功していることから、キプリス幼生の認識サイズ効果だけでなく、電子顕微鏡観察と併せることで、どのような官能基表面だとフットプリントが残存しやすいのかなど、その残存状況を直接観察することもでき、付着防止効果のメカニズム解明が期待される。研究項目3, 4)については、平成30年度のフィールド実験で効果を示した架橋ポリビニルアルコールや、すでに外壁塗装などで耐久性が証明されている架橋性フッ素樹脂、タイヤに代表される加硫ゴム表面などに熱インプリント法などを利用することで微細加工できることを確認しており、さらにその熱インプリントの際に使用する鋳型の作製についても自研究室でかなりの部分を進められる状況を構築したため、詳細に微細構造とキプリス幼生の付着性を議論できるようになった。これら微細構造と付着性に関する研究成果を2019年内にある程度まとめ、2020年の2月に苫小牧沿岸などにサンプルを沈め、実際にその効果を調査する予定である。さらに、流体抵抗低減などを含む微細構造に由来する機能についても評価を行い、付着防止効果だけでなく、複数の機能を有し環境に優しい材料の開発も目指す。このように、基板表面の化学組成や微細構造を精密に制御することで付着防止効果のメカニズム解明や付着防止に必要な要素を抽出し、実際にフィールドに浸漬することで実用可能な付着防止材料の開発を同時に進めていく予定である。2)キプリス幼生の認識サイズ

評価:キプリス幼生はどの程度のサイズでOH基があると付着を嫌がるのかを調査し、材料開発の指針を得るとともにキプリス幼生が認識する大きさを解明することを目的とし、SAMのマイクロスケールパターン化基板の作製と解析を行った。SAMのマイクロスケールパターン化にはフォトマスクを利用した紫外オゾン処理によって、パターンが形成したかの確認には水分散微粒子を塗布することで、実際にパターン化できていることを確認した。3)微細構造効果の評価:耐候性を有するフッ素樹脂や、柔軟かつ耐久性を有する加硫ゴムの表面微細加工に成功し、さらにキプリス幼生を用いた毒性試験によって、材料に毒性がないことを確認した。4)抗付着材料の開発:北海道苫小牧市沿岸に5月から9月まで各種サンプルを浸漬した結果、室内実験でも良好な付着防止効果を示した架橋ポリビニルアルコール基板はフィールドでも3ヶ月間程度はきれいな表面を保っていることが確認された。上述の通り、本研究で進める研究項目1)4)について申請時のスケジュール通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると考えられる。特に1)表面官能基効果の評価においては、これまでに報告されていた材料表面の表面自由エネルギーだけでは説明できない結果が得られており、我々はキプリス幼生が付着時に分泌し、付着誘引作用もあるタンパク質(フットプリント)が基板表面に残りにくいときにキプリス幼生は付着を嫌がるのではないかと考え、今後はフットプリントの観察や、基板からの剥離し易さも測定し、抗付着効果のメカニズム解明も目指すことにした。さらに急遽試験的にフィールド実験を行えた架橋ポリビニルアルコール基板は良好な付着防止効果を示していたことから、抗付着材料の開発に向けて順調に成果が得られていると考えられる。その他、SAMのマイクロパターニングとその可視化(SAMがパターン化しているかどうかの確認)、様々な材料で微細構造を作製するための実験系の構築も平成30年度には完成しており、次年度も順調に研究を進められると考えている。平成30年度は各々の実験の下準備的な要素が強かったが、おおむねそれらの研究も終わったことから、次年度以降は加速度的に研究を進められると考えている。特に上述の付着誘引作用があるフットプリントの剥離性については、平成30年度末に水晶振動子マイクロバランス装置を研究室で再稼働させることに成功し、実際に試験できる状態にある。またSAMのマイクロパターニングにも成功していることから、キプリス幼生の認識サイズ効果だけでなく、電子顕微鏡観察と併せることで、どのような官能基表面だとフットプリントが残存しやすいのかなど、その残存状況を直接観察することもでき、付着防止効果のメカニズム解明が期待される。研究項目3, 4)については、平成30年度のフィールド実験で効果を示した架橋ポリビニルアルコールや、すでに外壁塗装などで耐久性が証明されている架橋性フッ素樹脂、タイヤに代表される加硫ゴム表面などに熱インプリント法などを利用することで微細加工できることを確認しており、さらにその熱インプリントの際に使用する鋳型の作製についても自研究室でかなりの部分を進められる状況を構築したため、詳細に微細構造とキプリス幼生の付着性を議論できるようになった。
頭頸部悪性腫瘍の細胞特性に関する研究

頭頚部悪性腫瘍の臨床的腫瘍特性は腫瘍細胞の細胞特性、すなわち組織学的悪性度と高い関連を持ち、なおかつ患者の予後を大きく左右すると考えられている。腫瘍細胞の細胞特性の指標として、細胞の増殖能としての腫瘍増殖因子(epidermal growth factor recepterなど)、増殖抑制能としての腫瘍抑制因子(p53 proteinなど)が挙げられ、それらの因子が腫瘍細胞の増殖活性をコントロールすると言われている。これらの因子の腫瘍細胞における発現様式を明らかにし、腫瘍細胞の客観的な悪性度の評価を確立する事を本研究の目的とした。山口大学医学部附属病院耳鼻咽喉科において治療を行った上咽頭悪性腫瘍患者の保存パラフィンブロックから、パラフィン切片を作成した。HE染色により腫瘍細胞の分化度、局所浸潤傾向、脈管浸潤の有無などの病理組織学的悪性度を明らかにした。病理組織学的な細胞分化度とEGF-R、p53 proteinの染色性との間には有意の相関はなかった。腫瘍の進展度、予後とp53 proteinの染色性の間に有意の相関を認めた。以上より頭頸部悪性腫瘍の細胞特性としての腫瘍増殖因子、腫瘍抑制因子が腫瘍の進展や予後に関連を持つことがあきらかになった。またこれらの因子を用いて客観的な悪性度を評価することが可能と考えられた。
極低温電子顕微鏡によるべん毛タイプIII蛋白質輸送装置の構造解析

本研究は、サルモネラ菌のべん毛を研究材料として、べん毛蛋白質輸送装置の立体構造および蛋白質間相互作用を捉えることによって、輸送過程における輸送装置のダイナミクスと効率的な輸送のメカニズムを解明することを目的としている。本年度は、サルモネラ菌のミニセルを作成し、機能状態のべん毛基部体の立体構造解析を行うことで、細胞内での輸送装置の構造を明らかにした。前年度までの研究結果から、FliH/FliI複合体がCリング縁の内側に結合することを明らかにしたが、細胞内で機能中の輸送装置の構造が明らかにされていないため、どのような構造変化を経て輸送過程が進行していくのか、その詳細な輸送メカニズムの解明には至っていない。そこで、細胞内の輸送装置の構造を明らかにするため、べん毛基部体を菌体から単離精製することなく、細胞膜に埋まった状態のまま、低温電子線トモグラフィーによって構造解析を行った。電子線は加速電圧300kVでも厚さ1μmのサルモネラ菌を透過しづらく、そのため菌体内の立体構造を可視化することが難しい。そこで、細胞分裂を促進させるFtsZ蛋白質を大量発現させることで、サルモネラ菌の運動能や機能を失うことなく、直径約0.4μmの球形ミニセルの作成に成功した。また、電子線トモグラフィーによって得られた基部体の平均像と単離精製した基部体の単粒子像解析による立体像を比較することで、輸送装置に対応する密度分布を同定した。輸送装置は2つのリング構造を形成し、6種類の膜蛋白質で構成されている輸送ゲートと合わせて、3つの部分構造で構成されていることが明らかとなった。今後は、各部分構造の構成蛋白質やドメインを同定し、輸送装置の詳細な構造、機能解析を行うことで輸送メカニズムの解明を目指す。当初の計画では、サルモネラ菌から単離精製したべん毛基部体に、別に大腸菌で大量発現し精製したサルモネラ菌の輸送装置構成蛋白質を加えることで、試験管内でべん毛蛋白質輸送装置の再構成を試みる予定であったが、結合が弱く再構成は困難であった。そこで、サルモネラ菌ミニセルの低温電子線トモグラフィーを用いることで、今まで不可能であった細胞内での輸送装置の立体構造が明らかになった。この手法では機能状態の輸送装置の構造を明らかにすることができ、より詳細な輸送メカニズムの解明が期待される。細胞内のべん毛基部体では、輸送装置は2つのリング構造を形成し、6種類の膜蛋白質で構成される輸送ゲートと合わせて、3つの部分構造を持つことが明らかとなった。しかしながら、各部分構造がどの蛋白質やドメインで構成されているのか、その詳細は不明である。そこで、輸送装置の各構成蛋白質を欠損させたサルモネラ菌ミニセルを作成し、低温電子線トモグラフィーにより基部体の立体像を数多く得て、その平均化を行うことで分解能を上げ、各構造の構成蛋白質を同定する計画である。すでにX線結晶構造解析等で明らかとなっている蛋白質の構造を基部体の平均像に当てはめることができれば、より詳細な輸送メカニズムの解明が期待される。サルモネラ菌のべん毛を研究材料として、蛋白質輸送過程における輸送装置の立体構造および蛋白質間の相互作用を捉えることによって、輸送装置のダイナミックスと効率的なべん毛蛋白質の輸送メカニズムを解明することを目的として研究を行った。輸送過程初期段階では、輸送装置の一部であるFliH/FliI複合体が基部体Cリング上を絶えず結合解離を繰り返すことで、輸送過程が進行していくことが提唱されている。本年度は、基部体とFliH/FliI複合体を別々に単離精製し、輸送過程の初期段階を再現するために、両者を混合し再構成する条件の検討を行った。構造解析には、位相差電子顕微鏡を用いて行った。FliH/FliI複合体を精製し、混ぜ合わせることで輸送過程初期段階のFliH/FliI複合体の観察に成功したが、その効率は極めて低かった。そこで架橋剤で固定された試料を密度勾配遠心法によって分離することができるGraFix法を用いて、FliHとCリング構成蛋白質の一つであるFliNとの相互作用の安定化を行い、試料が存在する画分を濃縮することで、基部体Cリング上に結合したFliH/FliI複合体の電子顕微鏡像を効率良く撮影することに成功した。架橋化したFliH/FliI複合体はCリング上、様々な部位に結合し、数や方向もばらつきがあったため、不均一な試料でも構造解析が行える電子線トモグラフィーと、極低温電子顕微鏡を組み合わせることで、より機能状態に近い状態での立体構造解析を行った。構造解析の結果、FliH/FliI複合体がCリングの縁もしくは内側に結合していることが明らかになった。輸送過程初期段階の構造情報が明らかになったことで、今後の輸送装置の構造解析や構造変化の予測が容易となり、輸送メカニズム解明の足がかりとなることが期待される。本研究は、サルモネラ菌のべん毛を研究材料として、蛋白質輸送過程における輸送装置の立体構造および蛋白質間の相互作用を捉えることによって、輸送装置のダイナミックスと効率的なべん毛蛋白質の輸送メカニズムを解明することを目的としている。本年度は、Cリング上でのFliH/FliI複合体の結合部位を、生化学的手法および極低温電子顕微鏡による構造解析を用いて特定した。

前年度の研究結果から、FliH/FliI複合体がCリングの縁もしくは内側に結合していることが明らかとなったが、様々な部位に結合し、数や方向もばらつきがあったため、結合部位の特定には至らなかった。そこで、これまでの遺伝学的・生化学的研究により明らかとなっている、Cリング構成蛋白質FliNがFliH/FliI複合体とFliH-FliN相互作用を介して特異的に結合することに着目し、FliH-FliN蛋白質間相互作用に必須である113番目のバリン残基をSH基があるシステイン残基に置換した変異株を作成した。作成した変異株の基部体を単離精製し、SH基と特異的に反応するマレイミド基で修飾した金粒子を混ぜ合わせることで、結合部位の標識化に成功した。結合した金粒子は数にばらつきがあるものの、基部体Cリングの同一部位に見られたため、高分解能での構造解析が可能な単粒子像構造解析により構造解析を行った。その結果、Cリング縁の内側に金粒子が結合していることが明らかとなった。FliH/FliI複合体の結合部位が明らかになったことで、前年度に得られた電子線トモグラフィーのデータから、結合部位にあるFliH/FliI複合体だけを選別することができ、より詳細な解析を行うことができる。また、この部位以外に結合したFliH/FliI複合体は輸送過程の別の段階での構造を反映しており、今後の輸送装置の構造解析を行う上で重要な足がかりとなることが期待される。本研究は、サルモネラ菌のべん毛を研究材料として、べん毛蛋白質輸送装置の立体構造および蛋白質間相互作用を捉えることによって、輸送過程における輸送装置のダイナミクスと効率的な輸送のメカニズムを解明することを目的としている。本年度は、サルモネラ菌のミニセルを作成し、機能状態のべん毛基部体の立体構造解析を行うことで、細胞内での輸送装置の構造を明らかにした。前年度までの研究結果から、FliH/FliI複合体がCリング縁の内側に結合することを明らかにしたが、細胞内で機能中の輸送装置の構造が明らかにされていないため、どのような構造変化を経て輸送過程が進行していくのか、その詳細な輸送メカニズムの解明には至っていない。そこで、細胞内の輸送装置の構造を明らかにするため、べん毛基部体を菌体から単離精製することなく、細胞膜に埋まった状態のまま、低温電子線トモグラフィーによって構造解析を行った。電子線は加速電圧300kVでも厚さ1μmのサルモネラ菌を透過しづらく、そのため菌体内の立体構造を可視化することが難しい。そこで、細胞分裂を促進させるFtsZ蛋白質を大量発現させることで、サルモネラ菌の運動能や機能を失うことなく、直径約0.4μmの球形ミニセルの作成に成功した。また、電子線トモグラフィーによって得られた基部体の平均像と単離精製した基部体の単粒子像解析による立体像を比較することで、輸送装置に対応する密度分布を同定した。輸送装置は2つのリング構造を形成し、6種類の膜蛋白質で構成されている輸送ゲートと合わせて、3つの部分構造で構成されていることが明らかとなった。今後は、各部分構造の構成蛋白質やドメインを同定し、輸送装置の詳細な構造、機能解析を行うことで輸送メカニズムの解明を目指す。当初の計画では、サルモネラ菌から単離精製したべん毛基部体に、別に大腸菌で大量発現し精製したサルモネラ菌の輸送装置構成蛋白質を加えることで、試験管内でべん毛蛋白質輸送装置の再構成を試みる予定であったが、結合が弱く再構成は困難であった。
反復経頭蓋磁気刺激法の臨床応用への安全性の検討

経頭蓋磁気刺激を与えると、神経系の機能に変化を与えることが観察されるようになり、反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)が中枢神経疾患の治療に用いられようとしている。そこで、rTMSの安全でかつ有効な投与法の検討が、求められている。これまで副作用として痙攣や機能異常、脳波上の異常波の誘発などの指摘がある。これらの研究は世界的規模で行われており、国内、国外の治験の集積により、より有効でかつ安全な施行方法を追求する、反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)の臨床応用を検討する国際会議を開催した。本シンポジウムの目的はrTMSのヒトへの応用での安全性と効果であり、またそのメカニズムの解明である。シンポジウムでの結果をまとめると、rTMSでは大脳皮質の興奮と抑制をひきおこしている。rTMSで大脳の局所を刺激した時に、その反応は局所にとどまらず、経シナプス的に他部位に強い影響を及ぼす。また脳の再構築にはその闘値などの関与がある。最近低頻度rTMSが使われ始めているが、高頻度rTMSとその作用機構に質の差があることが示唆された。さらに、ヒトへの治療の応用にあたって、安全域の設定には慎重である必要があり、危険をよく知り、動物実験などの結果も重視する必要があると思われた。うつ病への応用にあたって、電気痙攣療法(ECT)を受けている患者さんにとっては、意識消失、痙攣、記憶障害などのETCの副作用を本法はさけれるため、rTMSの方がより安全であると思われる。刺激最適部位といわれる前前頭野の左右にbalance theoryが存在し大脳の左右への刺激の効果には差があると議論された。パーキンソン病(PD)へのrTMSの応用では、PDではうつ症状がよくなればQOLはかなり改善するといわれており、rTMSの抗うつ作用が改善に一定の役割をしていると考えられる。PDでの治療では刺激部位が運動野と前前頭野での差はあるのか、あるいは大脳への刺激が経シナプス的に基底核に影響を及ぼしているのかがさらに解明されれば、rTMSはさらに発展すると思われた。
血管新生制御因子Vasohibinに結合する蛋白質の同定と作用メカニズムの解明

血管新生制御因子Vasohibin-2 (VASH2)及びsmall vasohibin binding protein (SVBP)に結合する新規蛋白を探索し、がん悪性化における機能解析を行った。その結果、がん細胞・血管内皮細胞・脳組織の抽出液から、細胞種特異的なVASH2及びSVBP結合性蛋白を単離・同定した。SVBPとの結合及びα-チューブリン脱チロシン化活性に重要なVASH2のアミノ酸残基を複数同定し、その変異体の一部はドミナントネガティブ作用を有することを明らかにした。また、がん細胞におけるVASH2の発現を阻害すると、がん関連線維芽細胞の活性化が抑制されることを新たに見出した。今年度はGST pull down法と質量分析により、血管新生制御因子Vasohibinファミリー(VASH1とVASH2)とsmall vasohibin binding protein (SVBP)に特異的に結合する蛋白群の同定を行った。大腸菌を用いてVASHの各機能ドメインと全長SVBPのGST融合蛋白を作製した。全長VASHのGST融合蛋白については、SVBPと共発現することによってVASH-SVBP複合体として安定的に調製することができた。また、ゲル濾過分画によって、VASHとSVBPが1対1の割合で複合体を形成することを新たに見出した。調製した各GST融合蛋白を内皮細胞・癌細胞・ES細胞・マウス脳組織の各細胞抽出液と反応して、GST pull down法によりVASHファミリーとSVBPに結合性を有する蛋白を分離した。SDS-PAGEによる分離後、銀染色によりバンドを検出し質量分析によって結合性蛋白を同定した。その結果、VASHファミリーについては約50種類、SVBPについては約10種類の結合性蛋白を新たに同定することができた。VASHファミリーに結合性を有する可能性のある蛋白には、膜蛋白、ヒートショックタンパク質、カルシウムイオン・cAMPシグナル制御因子、がん微小環境の制御に関わる因子に加え、細胞種・組織特異的な蛋白も確認された。同時に、VASH1とVASH2それぞれに対して特異的に結合する蛋白についても見出すことができた。また、Far-western blotting法によって、SVBPに結合するVASH2の構成ドメインと結合に必要とされるアミノ酸を新たに同定した。以上の結果は、これまで不明であったVASHファミリーの作用メカニズムを理解するために重要な成果であると考えられる。当該年度に計画していた実験を遂行し、VASHファミリーについては約50種類、SVBPについては約10種類の結合性蛋白を新たに同定することができた。これらの蛋白中には受容体やシグナル関連因子も含まれていることから、VASHファミリーの作用メカニズムを理解するために非常に重要なデータを得ることができたと考えられる。また、これまで非常に困難だった全長VASH蛋白の精製についても、SVBPとの共発現によってVASH-SVBP複合体として安定的に精製できることを見出すことができた。細胞外においてもVASHとSVBPが複合体を形成していることが知られており、精製VASH-SVBP複合体を用いた解析が可能となり、今後の研究に大きく役立つものと期待できる。また、Far-western blotting法によって、VASHとSVBPの結合に必要なVASHのドメインとアミノ酸も同定することに成功した。いずれも本研究の目的達成のための重要な成果であり、現在まで順調に進展していると自己評価した。バキュロウイルス発現系によるVasohibinファミリー(VASH1とVASH2)とsmall vasohibin binding protein (SVBP)の組換え蛋白の精製をおこなった。N末端側にGSTとPreScission Protease認識配列を付与した全長ヒトVASH或はSVBPをデザインし、PreScission Proteaseによる切断によってGSTを除去した組換え蛋白を精製した。バキュロウイルス発現系においても全長VASHの精製にはSVBPとの共発現が必要不可欠であり、VASH-SVBP複合体として安定的に調製できることがわかった。調製したVASH2-SVBP複合体を用いて培養細胞に対する影響を解析したところ、内皮細胞の遊走促進活性と癌細胞内におけるシグナル伝達経路の変化を確認した。CRISPR/CAS9によりヒト横紋筋肉腫細胞株RH30(VASH2高発現株)のVASH2欠損させたところ、親株と比して微小管の翻訳後修飾が大きく変化すること見出した。VASHのアミノ酸配列中にSVBPとの結合に必要とされる領域を新たに同定し、変異を導入することで細胞外分泌が抑制されることを確認した。胃癌発症モデルマウスを用いた解析から、VASH2欠損によって癌関連線維芽細胞の腫瘍間質への進展が顕著に抑制されるとともに、癌細胞の増殖や生存に関わるInterleukin-11とEpiregulinの発現が低下することを見出した。同様の発現変化はVASH2を欠損した家族性大腸癌モデルマウスにおいても確認された。以上の結果は、VASHファミリーの作用メカニズムを理解するために重要な成果である。現在、細胞の遊走活性・微小管の翻訳後修飾・癌関連線維芽細胞の進展に着目して、VASH結合性蛋白の機能解析を進めている。当該年度に計画していた実験を遂行し、VASH2による細胞の遊走活性・微小管の翻訳後修飾に対する影響を新たに見出すことができた。また、バキュロウイルス発現系によってVASH-SVBP複合体を安定的に精製することができるようになり、精製VASH-SVBP複合体を培養細胞に作用させる実験も行うことが可能となった。

癌発症モデルマウスを用いたin vivoの解析からは、癌関連線維芽細胞の進展に対する影響を新たに見出し、現在論文投稿の準備を進めている。これらの成果をもとに、VASHおよびSVBP結合性蛋白の機能解析を進めることが可能となり、今後の研究展開の大きなきっかけを掴むことができた。また新たにSVBPの結合に必要なVASHのドメインとアミノ酸も同定することに成功し、ドミナントネガティブ変異体及び阻害ペプチドの作製への応用が期待される。いずれも本研究の目的達成のための重要な成果であり、現在まで順調に進展していると自己評価した。今年度は、Vasohibin-2(VASH2)とsmall vasohibin binding protein (SVBP)の組換え蛋白をウサギに免疫して、新たに免疫沈降に利用可能な抗体の作製を試みた。精製した抗SVBP抗体は、免疫沈降に用いた場合、SVBPに結合しているVASHも共沈することから、共免疫沈降に適した抗体であった。共免疫沈降により結合性蛋白を分取して質量分析したところ、いずれも細胞骨格の動態を制御する既知の蛋白ファミリーであった。最近他のグループから、VASHファミリーがTransglutaminaseスーパーファミリーと一部相同性を有すること、チューブリン脱チロシン化酵素として機能することが報告された。VASH2の触媒活性中心と予想されるアミノ酸に変異を導入すると、脱チロシン化活性が失活することを確認した。VASH2を高発現するヒト横紋筋肉腫細胞RH30に同変異体を導入すると、細胞内のチューブリン脱チロシン化レベルが抑制されるため、ドミナントネガティブ作用を有することが示唆された。また、VASH2を発現する癌細胞の培養上清が癌関連線維芽細胞の活性化を誘導し、その活性はVASH2のノックダウンによって抑制されることを見出した。本研究では、三年間を通じて以下の研究成果を得ることができた。1VASH及びSVBPの新規結合性蛋白を同定した。2SVBPとの相互作用に必要とされるVASHのドメイン及びアミノ酸を同定した。3VASH2のチューブリン脱チロシン化活性に必須のアミノ酸を同定し、その変異体がドミナントネガティブ作用を有することを見出した。4癌細胞におけるVASH2の発現は癌関連線維芽細胞の活性化を誘導することを新たに見出した。以上の成果は、VASHファミリーの癌悪性化における役割とその作用機序の理解に重要であり、新規癌治療法への応用も期待できる。血管新生制御因子Vasohibin-2 (VASH2)及びsmall vasohibin binding protein (SVBP)に結合する新規蛋白を探索し、がん悪性化における機能解析を行った。
土壌圏のメタン生成・酸化機構解明のための安定同位体的手法と分子生物学的手法の活用

水田からのメタン放出に関する観測結果を取りまとめた結果がAgriculture, Ecosystems and Environmentsにおいて、発行された。これは全国8県9地点の水田において行った水管理の変更とメタンフラックスの変化の関係について述べたものであり、東南アジアなど水田耕作地域での温室効果ガス削減に対する提言を行ううえで重要な資料になるものと考えられる。水試料中の溶存有機炭素の安定同位体比測定の簡便・迅速化を進めており、標準試料の分析をもとに分析精度の検証を進め、その進捗状況を国内および国際学会にて発表した。この手法を用いて、森林の地下水や土壌水、河川水中の溶存有機炭素の炭素安定同位体比の測定を進めている。次年度も継続して行う予定である。半島マレーシア熱帯雨林と国内の森林において共同研究として行った植物葉や、森林樹冠上からのメタンフラックスの観測結果を、国際誌に投稿し受理された。さらに、マレーシア・サラワク州の二次林および人工林のサイトで、次年度から調査を開始するための予備調査を行った。東南アジアでは、森林の人為的伐採による環境の変化が激しく、そういった変化が土壌の物理化学性の変化を通じて、温室効果ガス動態にどのように影響するのかについて研究する必要がある。また、元来の植生である天然林や泥炭林のサイトと人工林のサイトを比較することで、人為的な活動の環境への影響評価を試みたい。この予備調査をもとに、観測サイトの選定を進めた。全国8県9地点の水田圃場においてメタンフラックス観測を行い、日本の水稲栽培で慣行的に行われている中干や中干後の間断灌漑を延長・強化するなどの水管理の変更を行うことで、耕作期間中のメタン放出が慣行的栽培法と比較していかに変化するかについて検討した。観測の結果、中干延長や間断灌漑などの水管理の変更により、多くの地点で慣行水管理に比べて栽培期間中のメタン放出を低減できた。特に、前年の有機物残渣を鋤き込んだ地点や、東北地方などの慣行水管理の中干期間が比較的長い地点で顕著であった。水管理の変更による収量低下が15%以下、メタン放出削減が10%以上の条件を満たす事例を抽出した場合、水管理の変更により平均でメタン放出が69.5%(対慣行)に抑えられた。その際の収量低下は平均で3.8%であった。これらの知見は、日本のみならず水稲栽培を行う多くのアジア諸国における農業生態系からの温室効果ガス発生削減に貢献するものと考えられる。この成果は海外誌に投稿、受理された。さらに、マレーシア熱帯雨林で行ったメタン・亜酸化窒素・二酸化炭素の林床土壌におけるフラックスの時空間変動の観測結果を降水量や土壌水分の変動、土壌の物理性などに着目して解析を行い、国際誌に投稿中である。また、溶存有機炭素の安定同位体比測定の簡便・迅速化を進めており、標準試料の分析をもとに分析精度の検証を行っている。次年度には、自然環境中の試料分析が可能になると考えられ、森林内部の溶存有機炭素のみならず、湖沼などの各種生態系での炭素動態の解明につながる手法の開発となることが期待できる。
画像の重ね合わせを用いた深層学習による統合型外観検査システムに関する実証的研究

製造業における品質は熟練目視検査員によって支えられているが、外観検査の自動化等による効率化が産業界から強く求められている。近年、この外観検査においても人工知能技術が実用化され始めているが、依然として検査員の補助という役割に留まっている。これまで検査員の補助であった領域において、自動検査システムを“主たる検査"とするための理論検証を本研究の目的としている。人工知能技術のひとつである深層学習を用いて“主たる検査"と認められるレベルまで判定精度を向上させるために、これまでの深層学習での対応が難しかった複数の撮影画像を用いる本研究独自のアプローチと、複数の学習モデルを用いた新しい統合的検査システムを研究協力企業で運用し、その効果について実地検証する。研究初年度である平成30年度の研究では、複数枚画像による深層学習を利用した外観検査システムを構築し、その効果を検証した。外観目視検査では、複数の画像を撮影することが多い。光源(種類や形状、発光色など)、光源とワークと撮影機材の相対的位置、被写界深度などを変えた複数の撮影画像を用いて、各画像をRGBカラーモデルの層のひとつとして捉えるアプローチにより、3枚のグレースケール画像を1枚のRGB画像として利用した。複数の画像間の関係性を画素単位で学習することになるため、各画像を別物のように個別に学習して分類の判定を行うような従来のアプローチに比べ、判定精度の顕著な改善が見られた。また、大規模画像認識の競技会で好成績を残したモデルの利用による効果についても明らかにすることができた。しかし、欠点の種類によっては少ないサンプル数での訓練になったが、その場合の効果が限定的であることも明らかになった。平成30年度では、実際の製品に対してNeural Networkの深層学習アルゴリズムを活用して複数枚画像を用いた外観検査システムを構築することができた。またその効果も明らかにすることができた。欠点の大きさ等に起因する作業員の目視検査による不良品判定の難しさを考慮すると、構築した外観検査システムの判定精度の実験結果から、改善効果は高いものがあると判断できたため、現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると考える。サンプル数の少ない欠点に対するモデル精度の改良は必要であると考えられるが、実際の製造現場における不良品判定に対して深層学習アルゴリズムの適用が可能であることが示された。また、実験の過程で加工機別の加工面の特徴を外観検査システムにより明らかにすることができた。本来、加工機による加工面の違いやロットごとの加工面の違いは、解消しなければならない問題である。しかし、実際には経年劣化や、予防保全の不備などが原因となって、それまで発生しなかったさまざまな品質上の問題が生じることがある。この問題に対して、外観検査システムを用いることで、作業員であっても認識することができない問題を未然に表出させることが可能になることを示唆する知見も得られたと考えている。平成30年度に複数枚画像による外観検査システムの効果を検証した。判定精度の向上に加え、今後は複数の学習済みモデルを用いた外観検査システムの効果を検証し、研究協力企業の製造工場において実地検証する。実際の運用においては、判定結果を示すだけでなく、判定理由や確信度などを教示するような仕組みも必要であり、外観検査システムが広く利用される指針を示すことが求められている。サンプル数の少ない欠点に対する改良が進まない場合においては、そのサンプル数や欠点の種類、不良品の出現率が判定精度に与える影響を明らかにすることで、外観検査システムの運用における基準を明確にし、社会において自動化に必要な手続きを具体的かつ明確に示すことが可能になると考える。同時に、外観検査システムのみで運用するだけでなく、人との協働を前提としたシステム構築についてもその知見を得ることで、人工知能に対する社会の理解を深めることに寄与したいと考えている。