hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
銅輸送タンパク質キャディーを用いたチロシナーゼ反応機構の解明

チロシナーゼは、活性中心に2つの銅イオン(二核銅)を有する酸化酵素であり、チロシンを水酸化しドーパへと変換する反応と、ドーパを脱水素してドーパキノンへと変換する反応を触媒する。申請者は、チロシナーゼに特異的な銅輸送タンパク質(キャディーと命名)との複合体として、チロシナーゼの三次元構造を決定した。本構造中において、キャディーのTyr98残基が、チロシナーゼの基質結合部位に位置している。最近、キャディーのTyr98残基がチロシナーゼの触媒作用により、ドーパキノンへと変換されうることを発見した。本研究ではチロシナーゼ・キャディー複合体を利用し、二核銅含有酵素チロシナーゼの反応機構の解明を目指す。ラマンスペクトルを測定した結果、チロシナーゼをオキシ型に変換すると、初期段階でμ-η2:η2-ペルオキソ二核銅(II)が形成し、最終的にドーパセミキノン・Cu(II)複合体が生じることが明らかになった。さらに、X線結晶構造解析を用いた検討からは、チロシナーゼ・キャディー複合体の結晶中でオキシ型チロシナーゼを形成させると、Tyr98残基のオルト位に濃い電子密度が観測され、結晶中でもチロシナーゼ反応が進行していることが強く示唆された。また、オルト位に濃い電子密度が生じるのに先立って、2つの銅イオンのうちCuAと名付けた銅イオンが、Tyr98残基の水酸基の方に移動することが判明した。これまでの検討から、キャディーのTyr98残基に対するチロシナーゼの大まかな反応機構を提唱することができた。次の課題として、Tyr98残基に対するチロシナーゼの反応性を弱めることで、短寿命の反応中間体を捉えることを試みた。具体的には、キャディーのTyr98残基をフッ化チロシンに置換することに取り組んだ。現時点で、無細胞タンパク質合成システムを用いて、チロシナーゼ・キャディー複合体を取得することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。最近、キャディーのTyr98残基がチロシナーゼの触媒作用により翻訳後修飾を受け、ドーパキノンへと変換されうることを発見した。チロシナーゼが触媒する2つの反応のうち、モノオキシゲナーゼ反応は二核銅活性中心に分子状酸素が結合したオキシ型酵素が触媒する。今年度は、チロシン生合成遺伝子のひとつを欠損させたチロシン要求性大腸菌を作成し、チロシン残基の水酸基の酸素原子を18Oに置換したチロシナーゼ・キャディー複合体を調製した。通常のチロシナーゼ・キャディー複合体に加え、チロシン残基の水酸基を18Oに置換した複合体を用い、16O2もしくは18O2存在下でラマンスペクトルを測定した結果、チロシナーゼをオキシ型に変換すると、初期段階でμ-η2:η2-ペルオキソ二核銅(II)が形成し、最終的にドーパセミキノン・Cu(II)複合体が生じることが明らかになった。

また、オルト位に濃い電子密度が生じるのに先立って、2つの銅イオンのうちCuAと名付けた銅イオンが、Tyr98残基の水酸基の方に移動することが判明した。これまでの検討から、キャディーのTyr98残基に対するチロシナーゼの大まかな反応機構を提唱することができた。次の課題として、Tyr98残基に対するチロシナーゼの反応性を弱めることで、短寿命の反応中間体を捉えることを試みた。具体的には、キャディーのTyr98残基をフッ化チロシンに置換することに取り組んだ。現時点で、無細胞タンパク質合成システムを用いて、チロシナーゼ・キャディー複合体を取得することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ラマンスペクトルを測定するために必要な、同位体置換した試料を調製でき、生成する分子種を捉えるための準備を整えることができた。また、X線結晶構造解析からは、チロシナーゼの反応機構において、CuAが移動することが重要であるという知見を得ることができた。今年度も引き続きラマンおよびX線結晶構造解析を行い、短寿命の反応中間体を捉えることを目標とする。また、反応中間体の寿命を長くすることを検討する。具体的には、Tyr98残基に対するチロシナーゼの反応性を弱めることを目的として、本残基を、水酸基のオルト位にフッ素が結合したチロシン誘導体に置換することを目指す。チロシン要求性大腸菌にチロシナーゼ・キャディー複合体の発現プラスミドを導入し、フッ化チロシンを添加して培養すると、菌の発育が著しく阻害された。このため、無細胞タンパク質合成システムを用いる方法を検討する。さらに、ごく最近建設されたX線自由電子レーザー施設を利用することで、微結晶中における短寿命の中間体を捉えられる可能性がある。そこで、本施設の利用に先立ち、微結晶の作成や試薬の添加条件を検討する。
マダガスカル手話の記述的研究

今年度、臨地研究としては、2008年8月8日から、9月6日までマダガスカル国マハザンガ市及び、首都アンタナナリブ市に滞在しました。マハザンガ市では、4年に1回開催される、マダガスカル全国ろう者大会に参加し、マダガスカル各地から集まったろう者達と交流を深めました。また、マダガスカル全国ろう者協会の支援国であるノルウェーからのろう者とも交流を持ちました。マダガスカル手話は、1960年にアンツィラベに最初のろう学校が設立されたときに、ノルウェーから多数の教師が赴き、そのせいでノルウェー手話の手話単語を多く受け入れているようです。これは、今後の研究課題になります。アンタナナリブでは、ミティアろう学校のラウベリナ・エバ先生から聞き取り調査を行ないました。マダガスカル手話は、管見の及ぶ限り、他の言語学者によっては研究されていません。ろう者自身の語彙集編算は、マダガスカル全国ろう者協会を中心に進められています。以上のことから、マダガスカル手話の文法、語彙、テクスト・談話収集などのすべての領域において、言語学的訓練を受けた人間によるさらなる研究が俟たれており、本研究は、その一端を担っています。なお、最終年度において、予算を大幅に消化せずに終わってしまいましたが、特に2008年度後半、2008年10月辺りから、2009年4月辺りまで、持病の鬱が重篤化し、物品を注文するなどの事務処理が、全くできない状況に陥ってしまったことによります。予算を大幅に使わなかったこと、および持病の鬱が重篤化したことで、本研究最終時期の研究および、今後の研究に少しく影響があったことは否めませんが、本研究の全体的な達成度については、発表論文などを、持病の鬱の重篤化以前に提出していたこともあり、おおむね順調であったと考えます。本研究の初年度、平成18年度には、マダガスカルの首都アンタナナリブに8月頭から1ヶ月滞在し、アカニニ・マレニナろう学校、マダガスカル全国ろう者協会を訪問したり、またネイティブ手話話者から現地調査を実施した。マダガスカル手話に関しては、これまで、現地のろう者による、語彙集の編纂、また多地域方言語彙集の編纂などは行われてきているが、文法研究はほとんど行われていない。研究代表者は、まず、語順に関心を持ってデータを集めてきた。語順とは、まず、主語(S)、目的語(O)、動詞(V)の順番、即ち基本語順であり、また文中の様々な要素の順番である。マダガスカル手話に、影響を与えている可能性のある、音声・文字マダガスカル語の基本語順は、VOSあるいはVSOであり、そのほかに、SVO、OVSが可能である。マダガスカル手話では、OSV、SOV、SVO、OVSが可能であり、音声・文字マダガスカル語とは、半分しか重ならないことがわかった。マダガスカル手話は、音声・文字マダガスカル語から影響を受けているとしても、それは全般的なものではなく、部分的、選択的なものであることがわかった。その他の文中要素の順番に関しては、主要部(head)が従属部(dependent)に先行することが多い音声・文字マダガスカル語に対し、マダガスカル手話では、主要部が従属部に先行する場合も、後行する場合も見られることがわかった。このようなゆれが、生来のマダガスカル手話文法の持つ特徴なのか、音声・文字マダガスカル語からの干渉の強弱によってもたらされるのかは、今後の調査・研究を待たねばならない。本研究の第2年度、半成19年度には、マダガスカルの首都アンタナナリブおよび、地方都市マハザンガに8月頭より1ケ月滞在し、アカニニ・マレニナろう学校を訪問したり、またろうのネイティブ手話話者から現地調査を実施した。平成18年度には、マダガスカル手話の語順は、OSV、SOV、SVO、OVSが可能であり、VOS、VSO、SVO、OVSが可能である音声・書記マダガスカル語とは、50%としかかさならず、音声・書記マダガスカル語からの、マダガスカル手話への影響は、あるとしても、全般的なものではなく、部分的選択的なものであることがわかっていた。平成18年度には、1対1の面接による、文例の収集が主であったが、平成19年度には、1人語りや、会話の収録にも成功した。そこでは、S、O、Vの全てがそろっている文は、ほとんどなく、SVO語順の文が、2、3見られるに過ぎなかった。これは、面接・質問による調査と、自由な発話による調査で、文体(スタイル)が変わることを示し、今後の査において、留意しなければ行けない点である。また、会話時に、話者と聞き手の発話が、かなりオーバーラプすることも見られた。これは、音声言語に於いて見られるよりも甚だしいものであり、談話分析の観点からの分析が必要になるかもしれない。

マダガスカル手話は、管見の及ぶ限り、他の言語学者によっては研究されていません。ろう者自身の語彙集編算は、マダガスカル全国ろう者協会を中心に進められています。以上のことから、マダガスカル手話の文法、語彙、テクスト・談話収集などのすべての領域において、言語学的訓練を受けた人間によるさらなる研究が俟たれており、本研究は、その一端を担っています。なお、最終年度において、予算を大幅に消化せずに終わってしまいましたが、特に2008年度後半、2008年10月辺りから、2009年4月辺りまで、持病の鬱が重篤化し、物品を注文するなどの事務処理が、全くできない状況に陥ってしまったことによります。予算を大幅に使わなかったこと、および持病の鬱が重篤化したことで、本研究最終時期の研究および、今後の研究に少しく影響があったことは否めませんが、本研究の全体的な達成度については、発表論文などを、持病の鬱の重篤化以前に提出していたこともあり、おおむね順調であったと考えます。
ディジタルホログラフィによる高性能３次元空間粒子計測法の研究

本研究では,ディジタルホログラフィ粒子計測法の精度向上を図るため,3つの改善手法を開発した.ディジタルホログラフィは,3次元空間の対象物情報をディジタル画像に干渉縞として記録し,その画像をPC上で波動光学解析して対象物情報を得る光学手法である.対象物体は,燃料噴霧や大気中粒子状物質のように約1-100ミクロン径の微小な粒子,液滴,気泡である.主に対象物の大きさと3次元空間位置の計測精度を3つの後処理法で改善しており,その性能を実験及び数値解析で評価した.その結果,各改善手法は測定誤差抑制と測定結果の信頼性向上に効果があり,さらに,水噴霧計測に応用することで,多相流計測における実用性を示した.超高速燃料噴霧の液滴径・数密度などの空間分布情報計測や,材料変形と周囲流体の連成運動の3次元同時計測は従来の流体計測法では困難であり,簡便で高性能な計測法の開発が望まれている.そのような計測を実現するための一つの有用な技術にディジタルホログラフィが挙げられる.これは撮像カメラとパーソナルコンピュータを組み合わせ,従来のホログラフィをディジタル化したもので,微小粒子など計測対象物の3次元空間分布状態を干渉縞パターンとしてディジタル画像に記録し,その画像を波動光学に基づき解析すると,粒径・数密度・移動速度など様々な計測対象物の量が同時計測できるという特長を持つ.本研究課題では,単眼で3次元空間に高密度分布する数マイクロ数十マイクロメートルの微小粒子・液滴群に関する様々な量を時系列同時計測できるディジタルホログラフィ粒子計測システムの高性能化を目的としている.このシステムの高性能化は,「記録現象の高速化」「計測情報の高精度化」によって達成し,実用レベルの単眼3次元空間粒子計測システムを実現するとともに,この粒子計測システムの高い計測性能を実証実験により検証する.先ず,「高精度化への対応」として,数値像再生処理の改善を図った.数値像再生処理は,カメラにより一旦記録された観測ホログラム(干渉縞パターン)から元の微小粒子群の空間分布を3次元的に再現する処理で,如何に元の分布状態に近い空間分布を再現できるかがそこに記録された粒子群の計測精度に影響する.平成26年度はデコンボリューション法と仮想粒子法によって,より現実に近い数値再生像空間の再現と粒子計測結果の信頼性の向上をそれぞれ図った.次に,「高速現象への対応」として,超短時間照明が可能なレーザー光源によるチルト式位相シフト法の観測光学系を構成し,平成27年度以降の高速現象に対応できる実証試験装置を準備した.超高速燃料噴霧の液滴径・数密度などの空間分布情報計測や,材料変形と周囲流体の連成運動の3次元同時計測は従来の流体計測法では困難であり,簡便で高性能な計測法の開発が望まれている.そのような計測を実現するための一つの有用な技術にディジタルホログラフィが挙げられる.これは撮像カメラとパーソナルコンピュータを組み合わせ,従来のホログラフィをディジタル化したもので,微小粒子など計測対象物の3次元空間分布状態を干渉縞パターンとしてディジタル画像に記録し,その画像を波動光学に基づき解析すると,粒径・数密度・移動速度など様々な計測対象物の量が同時計測できるという特長を持つ.本研究課題では,単眼で3次元空間に高密度分布する数マイクロ数十マイクロメートルの微小粒子・液滴群に関する様々な量を時系列同時計測できるディジタルホログラフィ粒子計測システムの高性能化を目的としている.このシステムの高性能化は,「記録現象の高速化」「計測情報の高精度化」によって達成し,実用レベルの単眼3次元空間粒子計測システムを実現するとともに,この粒子計測システムの高い計測性能を実証実験により検証する.先ず,「高精度化への対応」として,粒子計測結果の信頼性改善方法の開発と噴霧計測における実証研究を推進した.ディジタルホログラフィにおける数値像再生では,測定対象の粒子像が再生像空間にその影として生じるが,干渉性の高いレーザー光を用いるためスペックルノイズが発生し,これを粒子像と誤解することで計測精度を低下させてきた.平成27年度は一旦検出した粒子情報を元に再度再生像を構成して粒子像とスペックルノイズを見分ける方法を開発し,粒子計測結果の信頼性の向上を図った.次に,「高速現象への対応」として,超短時間照明が可能なレーザー光源による観測光学系を利用して,実際の水噴霧を計測し,その実用性を実証的に検証した.「高精度化への対応」は平成26年度に提案・性能評価した2つの粒子測定精度改善手法をさらに発展させ,より信頼性の高い計測結果を得るために,検出粒子固有の回折パターンを利用した回折像指標を新たに導入し,誤検出排除する後処理手法を提案した.この計測手法の性能を数値シミュレーションで評価したところ,粒子像特定のための閾値の影響を受けず,信頼性の高い計測結果が得られ,粒径10,20,30ミクロンの3つの異径粒子が混在する計測において,誤差率はそれぞれ3.0,2.5,2.0%であることが示された.また,基礎実験では標準粒子を用いた誤差評価を行い,公称粒径10,20,30ミクロンの3つのピークを持つ粒径分布に対して,計測結果は与えられた粒径分布とよく一致しており,標準粒子の公称値の平均値との誤差率はそれぞれ11.2,6.2,4.3%であることを確認した.

「高速現象への対応」は,前年度に超短時間照明が可能なレーザー光源を導入し,これを高速噴霧現象の観測に利用するため,同期信号系統を整備すると共に,実際の水噴霧の計測に適用した.噴霧の高速現象をフリーズさせるため,レーザー照明時間を250nsとし,ファンクションジェネレータの信号駆動により,噴霧タイミングからの経過時間によって測定結果を整理した.そして,噴霧圧力を10MPaとした条件下で得た結果をバックライト観測による噴霧の巨視的構造と比較しながら,その信頼性を確認した.噴霧液滴は噴射ノズル直下で密集しており,時間経過に伴い液滴径ピークは小さくなるとともに,その液滴が幅方向に広がる傾向が計測できることを示した.また,噴霧圧力を変化させ,液滴数,粒径,空間分布の変化を確認し,噴霧圧力を大きくすると噴霧液滴は微細で数密度が高くなり,噴霧現象の一般的な傾向とよく一致する計測結果が得られた.最終年度である平成28年度は,ディジタルホログラフィ粒子計測システムの性能実証研究を完了させることによって,次の研究ステップへの基礎を固めることを優先した.粒子計測システムの「高精度化への対応」として,多波長レーザー照明と3板式カラーカメラを利用した多波長ディジタルホログラフィによって粒子計測の精度向上を図った.測定精度改善のための計測原理の理論的展開を踏まえ,異なる波長によるホログラムパターンを,奥行き位置の異なる単波長照明ホログラムと見なし,差分法及び加算法と呼ぶ2つの粒子計測処理法を提案した.数値シミュレーションによる性能改善評価を行い,単波長による計測及び位相シフトによる計測との比較を行ったところ,誤検出数及びRMS誤差は良好に低減できることを示した.これらの結果は2つの国内学会講演会で研究発表した.実証研究では,本研究計画開始までに既に所有していたHe-Neレーザー(633nm)と固体レーザー(波長532nm)に加え,本研究課題で購入した固体レーザー(波長488nm)によって3波長によるカラーレーザー照明と,昨年度末に導入したプログレッシブ3板式カラーカメラによる多波長ホログラム観測装置を構築した.基本性能試験として,1mm厚の薄い水槽中を自由落下する標準粒子の運動を2波長照明でホログラフィ計測するとともに,同様の観測対象について数値シミュレーションで計測精度を評価しており,いずれも単波長照明の場合に比べ高精度に粒子運動計測可能なことを示している.この研究成果については,国内で開催予定の国際シンポジウムに原稿を提出済であり,査読の結果に応じて研究発表の見込みであり,関連学会の学術雑誌への投稿を計画している.なお,開発手法の実用性を実証するため,応用計測として流体ー構造体連成同時計測を計画していたが,実験実施中のため,今後の継続課題としていく予定である.本研究では,ディジタルホログラフィ粒子計測法の精度向上を図るため,3つの改善手法を開発した.ディジタルホログラフィは,3次元空間の対象物情報をディジタル画像に干渉縞として記録し,その画像をPC上で波動光学解析して対象物情報を得る光学手法である.対象物体は,燃料噴霧や大気中粒子状物質のように約1-100ミクロン径の微小な粒子,液滴,気泡である.主に対象物の大きさと3次元空間位置の計測精度を3つの後処理法で改善しており,その性能を実験及び数値解析で評価した.その結果,各改善手法は測定誤差抑制と測定結果の信頼性向上に効果があり,さらに,水噴霧計測に応用することで,多相流計測における実用性を示した.「高精度化への対応」は順調に進行し,2つの改善手法について以下のような結果を得ている.
フェムトセカンドレーザーを用いた無縫合角膜移植の開発

実験用家兎においてフェムトセカンドレーザーを用いた無縫合角膜移植の開発を行った。水疱性角膜症モデルならびにドナー角膜に対し、ジグザグ型、トップハット型、マッシュルーム型の角膜切開を行った結果、いずれの組織にも炎症細胞の浸潤を認めず、本レーザーにより侵襲の少ないレシピエント角膜の切開ならびにドナー角膜の作製が可能であった。作製したドナー角膜は、従来の全層角膜移植と同等もしくは少ない縫合数で移植することが可能であった。スクリュー型の切開法が確立されれば無縫合角膜移植の実現につながると考えられた。本年度は、ヒト臨床で行われている角膜切開様式(ジグザグ型、トップハット型、マッシュルーム型)について家兎角膜において同様の切開を行うことができるかを検討した。結果、いずれの切開方法についても可能であることを確認した。次に、フェムトセカンドレーザーを用いて家兎角膜を切開した場合の炎症反応について組織学的な検討を行った。本レーザーを用いた角膜移植では、免疫反応を可能な限り抑制するために、レーザーによる角膜切開で惹起される炎症は最小限であるのが望ましいと考える。我々は、ヒト臨床と同条件でフェムトセカンドレーザーによって切開した家兎角膜において組織学的に炎症の有無を検討した。検討には、HE染色ならびに、CD4、CD8、CD11bの発現を免疫染色を用いた。結果、切開部位において、明らかな細胞浸潤を認めず、またCD4、CD8、CD11bの発現を認めなかった。つまり、ヒト臨床と同条件で家兎角膜を切開した場合に、炎症反応が生じないことが確認できた。続いて、透明家兎角膜においてはヒト臨床と同程度のエネルギーならびに照射間隔において角膜切開が可能であるが、一方、角膜移植では、角膜内皮が傷害された水疱性角膜症角膜に対し、レーザーを照射する必要がある。そこで水疱性角膜症モデルにおいて安定した角膜切開を行える条件について検討した。結果、水疱性角膜症眼において、透明角膜切開時と同様の切開効率を維持するためのエネルギーおよび照射間隔の最適な条件を見出した。加えて、本年度はフェムトセカンドレーザーIntraLaceFSにおけるスクリュー型角膜切開のプログラム構築について、共同研究者であるAMO社と継続して進めた。スクリュー型切開におけるネジ山の高さ、フランク角度などについて、条件検討を進めた。その一方で市販品である本レーザーに対し、基幹システムへの新規プログラムの組み込前年度から継続して行った。エネルギー、照射密度、照射時間を最適化することにより、家兎角膜においてヒトと同様の平滑な角膜切開(ジグザグ型、トップハット型、マッシュルーム型)を得ることができた。フェムトセカンドレーザーを用いて切開した正常家兎角膜では、ドナー角膜片、レシピエント角膜ともに検眼鏡的観察において明らかな角膜混濁等の所見は認めず、透明性は保持されていた。また、水疱性角膜症モデル家兎角膜においても、レーザー施行により明らかな検眼鏡的な変化は認めなかった。また、HE染色による組織学的検討においても正常眼では細胞浸潤を認めず、水疱性角膜症眼ではレーザー施行前と比較して同等であった。加えてCD3, CD4, CD8, CD11b, CD20, F4/80, Macrophage, αSMAの免疫染色を施行したところ、正常角膜においてはいずれのマーカーの発現も認めず、水疱性角膜症眼でも施行前と差はなかった。本研究ではヒト角膜と比較して高エネルギーの条件でフェムトセカンドレーザーによる家兎角膜の切開を行ったが、本レーザーが惹起する炎症がないことが確認された。スクリュー型の角膜切開におけるネジ山の高さやフランク角度といった条件の検討を行った。現在はプログラムを組み込む検討を行っている段階である。本年度は従来の切開方法(ジグザグ型、トップハット型、マッシュルーム型)を行い、最低限の縫合でモデル角膜への移植を行った。術後、いずれの方法においても術後に角膜厚が薄くなり、治療効果が確認された。また、術後の炎症反応についてもHE染色ならびにCD3, CD4, CD8, CD11b, CD20, F4/80, Macrophage, αSMAの免疫染色にて確認した結果、ブレードを用いてマニュアルで切開した通常の角膜移植と同等であることがわかった。角膜内皮障害により角膜混濁をきたし視力が著明に低下した症例には全層角膜移植手術がおこなわれる。しかし、ドナー角膜とホスト角膜の縫合が必要なため、術後の不正乱視による視機能低下や感染症の発生といった危険性がある。本研究では、近年臨床にも用いられ始めたフェムトセカンドレーザーを用いて、角膜をスクリュー型に切開する無縫合の全層角膜移植の開発を目的とする。具体的には、スクリュー型切開による角膜移植を家兎・水疱性角膜症モデルに施行し、組織学的検討ならびに角膜形状解析、角膜厚測定を行う。

これにより創傷治癒や免疫反応を組織学的に検討するとともに治療効果に関する知見を得る。。本年度は、まずフェムトセカンドレーザーIntraLaceFSにおけるスクリュー型角膜切開のプログラム構築を行った。プログラミングにあたっては、共同研究者であるAMO社の開発部と協力した。スクリュー型については、これまでの知見よりフランク角30度、ネジ山高1mmが妥当であると考えその構築を進めているが、本機器は既に市販品であり、変更したプログラムの組み込みには機器の根幹システムの変更を要するため、来年度にかけて継続して進めていく。また、家兎における水疱性角膜症モデル作製を行った。具体的には、正常家兎の内皮細胞をデスメ膜ごとで剥離する方法と冷凍凝固を用いて経角膜的に角膜内皮細胞を障害する方法を行った。上記処置を施した家兎は角膜厚が8001000μmと正常家兎角膜厚約300μmと比較して肥厚し、角膜は混濁しており、水疱性角膜症のモデルの作製に成功した。加えて、作製したモデルに対し組織学的検討を行ったところ、角膜実質の肥厚および層構造配列の乱れおよび炎症細胞の浸潤を認め、水疱性角膜症と矛盾しない結果であった。本年度は、フェムトセカンドレーザーIntraLaceFSにおけるスクリュー型角膜切開のプログラム構築と同時並行で、ヒト臨床で行われているジグザグ型、トップハット型、マッシュルーム型といった種々の角膜切開方法について、家兎角膜においてもフェムトセカンドレーザーを用いて施行可能であることが確認できた。23年24年度の研究計画に沿った内容であり、予定通りに研究が進展していることを示している。加えて、本年度はフェムトセカンドレーザーを用いて角膜移植を行った場合の炎症反応について組織学的な検討を行い、レーザーによる角膜切開では惹起される炎症は最小限であることを確認した。これはフェムトセカンドレーザーを用いた角膜移植を安定して施行するにあたり、非常に重要な知見であり、本研究の遂行に大きく役立つ。加えて、角膜内皮が傷害された水疱性角膜症における、フェムトセカンドレーザーの照射条件検討についても最適化することができた。これにより、安定しホストならびにドナー角膜の切開、移植が可能となり、安定した移植成績が得られると考える。加えて、本年度はフェムトセカンドレーザーIntraLaceFSにおけるスクリュー型角膜切開のプログラム構築については、継続してAMO社と協力して進めており、スクリュー型切開におけるネジ山の高さ、フランク角度などの条件について、プロトタイプのプログラムの構築ができたことから、計画はおおむね順調に進展していると考える。本プログラムを市販品である本レーザーの基幹システムへの組み込みを継続して進めている。本年度の計画であるフェムトセカンドレーザーIntraLaceFSにおけるスクリュー型角膜切開のプログラム構築については、専門的な知識を有する共同研究者であるAMO社の開発部と協力して行い、スクリュー型切開におけるネジ山の高さ、フランク角度などの条件について、プロトタイプのプログラムの構築ができたことから、計画はおおむね順調に進展していると考える。また、本年度は正常家兎の内皮細胞をデスメ膜ごとで剥離する方法と冷凍凝固を用いて
有用物質蓄積機構の解析と制御

子実や塊茎などの貯蔵器官の肥大や貯蔵物質の質的改善のために同化産物の貯蔵器官への効率的転流や代謝に関する生理生化学的研究が必要とされる.物質の輸送において重要な膜透過についてシャジクモの液胞膜でのアミノ酸輸送がH+勾配を利用して行なわれることを明らかにし,また細胞間輸送は原形質流動と原形質連絡を通じての受動的拡散によって行なわれることがRb+を用いて明らかにされた.原形質流動は低温処理で停止し,原形質連絡の輸送は細胞間の膨圧差で阻害されることも示された.膜透過により選択的に篩管内へ取り込まれる物質の組成はかなり安定であるが栄養条件や品種によってアスパラギンやグルタミンの相対比に変動がみられること,光照射により光呼吸関連アミノ酸の増加やスクロースの増加がみられることが示され,またシンクの生長や物質貯蔵に及ぼすグルタミンやメチオニンの影響も明らかにされた.イネ子実におけるデンプンの集積過程について究明され,アミロプラストの単離及びADPグルコースピロフォスフォリラーゼの精製が行なわれた.イネ子実でのタンパク質蓄積についてはプロラミンのcDNA構造が明らかにされ,シグナルペプチドの解明がなされ, in Vitroタンパク合成系でイネプロラミンがトウモロコシタンパク顆粒に蓄積することを示した.サツマイモ根茎貯蔵タンパク,スポラミンのcDNAをタバコや酵母に導入し,スポラミン前駆体のプロセシングと液胞への蓄積過程について明らかにした.ヒマ種子の脂質転移タンパクのアミノ酸配列,このタンパクの三種類のイソタンパクの存在,このタンパクの未熟型から成熟型へのプロセシング等が解明された.イネおよびダイズでのタンパク蓄積と栄養供給および光条件との関連が検討され,イネ胚乳タンパクでは高窒素処理によりグルテリンの割合が若干上昇すること,ダイズ子実への炭素の転流は一日で終了し,貯蔵成分への分配に時間のかかることが示された.子実や塊茎などの貯蔵器官の肥大や貯蔵物質の質的改善のために同化産物の貯蔵器官への効率的転流や代謝に関する生理生化学的研究が必要とされる.物質の輸送において重要な膜透過についてシャジクモの液胞膜でのアミノ酸輸送がH+勾配を利用して行なわれることを明らかにし,また細胞間輸送は原形質流動と原形質連絡を通じての受動的拡散によって行なわれることがRb+を用いて明らかにされた.原形質流動は低温処理で停止し,原形質連絡の輸送は細胞間の膨圧差で阻害されることも示された.膜透過により選択的に篩管内へ取り込まれる物質の組成はかなり安定であるが栄養条件や品種によってアスパラギンやグルタミンの相対比に変動がみられること,光照射により光呼吸関連アミノ酸の増加やスクロースの増加がみられることが示され,またシンクの生長や物質貯蔵に及ぼすグルタミンやメチオニンの影響も明らかにされた.イネ子実におけるデンプンの集積過程について究明され,アミロプラストの単離及びADPグルコースピロフォスフォリラーゼの精製が行なわれた.イネ子実でのタンパク質蓄積についてはプロラミンのcDNA構造が明らかにされ,シグナルペプチドの解明がなされ, in Vitroタンパク合成系でイネプロラミンがトウモロコシタンパク顆粒に蓄積することを示した.サツマイモ根茎貯蔵タンパク,スポラミンのcDNAをタバコや酵母に導入し,スポラミン前駆体のプロセシングと液胞への蓄積過程について明らかにした.ヒマ種子の脂質転移タンパクのアミノ酸配列,このタンパクの三種類のイソタンパクの存在,このタンパクの未熟型から成熟型へのプロセシング等が解明された.イネおよびダイズでのタンパク蓄積と栄養供給および光条件との関連が検討され,イネ胚乳タンパクでは高窒素処理によりグルテリンの割合が若干上昇すること,ダイズ子実への炭素の転流は一日で終了し,貯蔵成分への分配に時間のかかることが示された.
イネの窒素レベルに応答した転写因子ＤＲＥＢによる光合成の制御に関する研究

イネにおいて、転写因子OsDREB1EおよびOsDREB1GによりRubisco小サブユニット遺伝子OsRBCS3のプロモーターが活性化された。この活性化にはOsRBCS3プロモーターに存在する二つのDRE因子が必要であった。また、OsDREB1EおよびOsDREB1GはOsRBCS3プロモーターのDRE因子と直接相互作用した。さらに、OsDREB1EおよびOsDREB1G遺伝子は窒素レベルの上昇にともなって発現レベルが高まったことから、OsDREB1EおよびOsDREB1Gは窒素レベルに応答してOsRBCS3遺伝子の転写を制御していることが明らかとなった。大腸菌で生産させたOsDREB1Gタンパク質を用いてOsRBCS3遺伝子のプロモーターとのゲルシフトアッセイを行ったところ、バンドのシフトが認められた。この結果は、OsDREB1GがOsRBCS3遺伝子のプロモーターに直接作用していることを示している。OsRBCS3遺伝子のプロモーターにはOsDREB1Gタンパク質が結合すると予想されるDRE因子(塩基配列5'-CCGAC-3')が二つ存在する。OsRBCS3遺伝子プロモーターの二つのDRE因子を5'-TTTTC-3'に置換するとOsDREB1Gタンパク質とのゲルシフトアッセイにおいてバンドのシフトが認められなくなった。しかし、一方のDRE因子のみを5'-TTTTC-3'に置換したOsRBCS3遺伝子のプロモーターではバンドのシフトが認められた。これらのことからOsDREB1Gタンパク質はOsRBCS3遺伝子のプロモーターに存在する二つのDRE因子のいずれにも結合することが示された。次に、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターに緑色蛍光タンパク質とOsDREB1GのcDNAを連結したプラスミドを作成し、パーティクルガンを用いてタマネギ燐葉の表皮細胞へ導入した。緑色蛍光は細胞核からのみ検出され、OsDREB1Gタンパク質は転写因子として働くために必要な核移行能力を持つことが示された。以上の結果より、OsDREB1GはOsRBCS3遺伝子のプロモーターに存在する二つのDRE因子に直接作用する転写因子であることが明らかとなった。ユビキチン遺伝子のプロモーターと転写因子OsDREBIGのcDNAとを連結したエフェクター遺伝子と、Rubisco遺伝子、OsRBCS3、あるいはSBPase遺伝子のプロモーターとルシフェラーゼのcDNAとを連結したレポーター遺伝子を作成した。OsRBCS3プロモーターを持ったレポーター遺伝子はエフェクター遺伝子とともにイネ葉身細胞へ導入するとルシフェラーゼ活性が高まったことから、転写因子OsDREBIGはOsRBCS3プロモーターの転写活性化因子であることが明らかとなった。一方、SBPase遺伝子のプロモーターを持ったレポーター遺伝子ではエフェクター遺伝子を同時に導入してもルシフェラーゼ活性の上昇は認められなかった。次に、OsRBCS3プロモーター中に存在するDRE因子(5'ーCCGACー3')を5'ーTTTTCー3'に置換したプロモーターとルシフェラーゼのcDNAを連結したレポーター遺伝子をエフェクター遺伝子とともにイネ葉身へ導入した。OsRBCS3プロモーター中に存在する2つのDRE因子の内、1つでも置換するとルシフェラーゼ活性の上昇は認められなくなったことから、転写因子OsDREBIGはOsRBCS3プロモーター中のDRE因子に作用して転写を活性化していることが明らかとなった。続いて、大腸菌で生産させたOsDREBIGタンパク質とOsRBCS3プロモーターとのゲルシフトアッセイを行ったところバンドのシフトが認められ、OsDREBIGが直接OsRBCS3遺伝子の転写を活性化していることが明らかとなった。さらに、NH4NO3濃度を低下させるとOsDREBIG及びOsRBCS3の発現レベルが低下した。以上の結果より、窒素レベルの低下に応答して転写因子OsDREBIGのレベルが低下することによりOsRBCS3遺伝子の発現レベルの低下が引き起こされることが示された。1.まず、トウモロコシのユビキチン遺伝子のプロモーターとOsDREB1EのcDNAを連結したエフェクタープラスミドを作成した。次に、OsRBCS3遺伝子のプロモーターとルシフェラーゼのcDNAを連結したレポータープラスミドを作成し、エフェクタープラスミドとともにイネの葉肉細胞へ導入した。エフェクタープラスミドの導入によりルシフェラーゼ活性が約4倍に増加した。このことから、OsDREB1EはOsRBCS3遺伝子プロモーターの転写活性化因子であることが示された。2.OsRBCS

3プロモーターに存在する二つのDRE因子(5'-CCGAC-3')の一つあるいは両方を5'-TTTTC-3'に置換したプロモーターとルシフェラーゼのcDNAを連結したレポータープラスミドを作成し、エフェクタープラスミドとともにイネの葉肉細胞へ導入した。DRE因子の片側あるいは両側を変異させるとOsRBCS3遺伝子プロモーターの転写はOsDREB1Eにより活性化されなくなった。このことから、OsDREB1EはOsRBCS3プロモーター中のDRE因子に作用して転写を活性化していることが示された。3.ゲルシフトアッセイにおいて、OsDREB1Eタンパク質はOsRBCS3プロモーターに結合したが、二つのDRE因子を5'-TTTTC-3'に置換するとOsRBCS3プロモーターに結合しなくなった。このことから、OsDREB1EはOsRBCS3遺伝子プロモーターのDRE因子に直接作用していることが示された。4.以上の結果より、OsDREB1EはOsRBCS3遺伝子プロモーターのDRE因子に直接作用して転写を活性化していることが明らかとなった。作物学OsDREB1GはOsRBCS3遺伝子のプロモーターに存在する二つのDRE因子の両方に結合して直接作用していることが示されたことから、本年度の研究目的はおおむね達成できた。しかし、抗OsDREB1G抗体を用いたイムノアッセイにおいて、OsDREB1Gタンパク質を十分に検出できず、窒素によるOsDREB1Gレベルの変化を明確に示すことができなかったため。転写因子OsDREB1GがRubisco遺伝子、OsRBCS3、の転写活性化因子であり、窒素レベルの低下に応答して転写因子OsDREBIGのレベルが低下することによりOsRBCS3遺伝子の発現レベルの低下が引き起こされることが示されたことから、本年度の研究目的はおおむね達成できた。しかし、SBPase遺伝子については予想に反して転写因子OsDREB1Gによる転写の活性化が認められなかったため。1.核タンパク質の抽出法を検討し、イムノアッセイによるOsDREB1Gの検出感度を高め、窒素レベルに応答したOsDREB1Gのレベルの変化を明らかにする。2.ユビキチン遺伝子のプロモーターとOsDREB1EのcDNAを連結したエフェクタープラスミドを作成する。次に、OsRBCS3プロモーターとルシフェラーゼのcDNAを連結したレポータープラスミドを作成し、エフェクタープラスミドとともにイネの葉身細胞へ導入する。この実験によりOsDREB1EがOsRBCS3遺伝子の転写活性化因子であることを明らかにする。3. OsRBCS3プロモーターに存在する二つのDRE因子(塩基配列5'-CCGAC-3')の一つあるいは両方を5'-TTTTC-3'に置換したプロモーターとルシフェラーゼのcDNAを連結したレポータープラスミドを作成し、エフェクタープラスミドとともにイネの葉身細胞へ導入する。置換プロモーターにおいてOsDREB1Eによる転写活性化が認められなくなれば、OsDREB1EはOsRBCS
遺伝性網膜変性におけるグルタミン酸の関与

1特異性の高い抗グルタミン酸抗体を用いて、光顕で正常アダルトマウス網膜のグルタミン酸様免疫反応を見たところ、視細胞内節、外網状層、神経節細胞層にやや強い染色が認められ、双極細胞が大半を占める内顆粒層の外層、内網状層にも染色が見られた。1989年にRossらが生化学的に高速液体クロマトグラフィー法を用いて、各層ごとに薄切したアダルトラット網膜のアミノ酸量を調べた結果と、今回の結果はよく一致していた。次に対象を視細胞変性(rds)マウスとし、週齢ごとにrdsマウスと正常マウスとを比較すると、1週齢では両者の各層で差がないものの、2週齢では視細胞内節でグルタミン酸様免疫反応の増加が見られ、rdsマウスにおいて形態的な変性の始まる生後3週齢では視細胞内節、外網状層、内網状層で増加していた。9週齢では視細胞内節で増加、内網状層でもやや増加、外網状層で低下していた。2透過型電子顕微鏡を用いた、単位面積当たりのグルタミン酸様免疫反応の比較では、rdsマウスの視細胞内節において2週齢・3週齢・9週齢で有意な増加を認めた。外網状層では有意差は認められなかった。3免疫組織化学的に差の大きかった生後3週齢と9週齢のrdsマウスにおいて、微量アミノ酸分析を行った結果、生後3週齢・9週齢とも網膜全体の蛋白当たりのグルタミン酸濃度では正常マウスとの有意差は認められなかった。以上のことから、遺伝的視細胞変性ニワトリに続いて、視細胞変性(rds)マウスにおいても、変性がみられる前の生後2週齢から、視細胞に比較的限局したグルタミン酸の蓄積が生じていることが示された。
表面プラズモン共鳴観察によるアクティブマターのメカニズムの解明

本研究で検討するアクティブマターは,溶質の固体表面上の濃度分布により自走する,溶液とは非混和性の液滴である.着目しているアクティブマターのメカニズムは「液滴表面における溶質の吸着分布の不均一によるMarangoni効果によって液滴が運動する」と提案されているが詳細は不明である.本研究の目的は,アクティブマターを用いたマイクロ流体システムを開発するために,アクティブマターのメカニズムを解明することである.そのために,今年度は2事項に着目して検討した.1.液滴発生装置:固体表面上に液滴を生成する装置の開発を行った.特に,液滴が固体表面上に衝突する速度を制御可能とするために,気流によって液滴を加速して10m/s程度の速度で固体表面に衝突可能な液滴発生装置を開発した.液体送り速度と気体供試圧力とを制御することにより,液滴径と液滴速度とを制御することが可能であることを確認した.2.液滴挙動観察システムの構築:本研究で構築する表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築するための基本光学システムを構築した.表面プラズモンを発生させるためには,観察部底部から臨界屈折率以上で光を入射させ,光を基盤表面で全反射させ,液体側にエバネッセント波を染み出させる必要がある.そのためにガラスプリズム等の光学機器を用いて,光学系を構築した.更に購入した高速度カメラを用いて,液滴が基盤表面に接触する過程が観察可能であることを確認し,観測システムの空間分解能,および時間分解能を確認した.本年度は以下の2項目について検討を行った.1.液滴発生装置:液滴発生装置を構築することにより,液滴径と液滴速度とを制御させて観察部に液滴を生成することが可能となった.液滴が基盤上の液膜にどの程度の速度で衝突するかによって,液膜内の溶質分布が大きく変化し,アクティブマターの挙動が大きく変化するため,アクティブマターの挙動を解析するためには,液滴径と液滴速度とを制御させて観察部に液滴を生成することが必要不可欠である.本液滴発生装置を構築することにより,所定の要求が満たされることを確認した.2.液滴挙動観察システムの構築:表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築するための基本光学システムを構築した.観察部底部から臨界屈折率以上で光を入射させ,光を基盤表面で全反射させ,液体側にエバネッセント波を染み出させる光学システムを構築した.購入した高速度カメラを用いて,液滴が基盤表面に接触する過程の全反射観察が可能であることを確認した.観測システムの空間分解能,および時間分解能を確認し,観測システムとしては,所定の要求が満たされることを確認した.しかしながら,観察システムを構築するためには,全反射観測システムだけでは不完全であり,表面プラズモンを発生させるために,全反射光学システムの観察部に金薄膜を蒸着した基盤を設置する必要がある.表面プラズモンの発生を確認し,溶質濃度によって全反射光の屈折角がどの程度変化するかを確認し,溶質濃度と屈折角との関数を求めるまでを本年度の到達目標としていたが,本年度は光学システムの基本部分の構築に留まった.これまでに,構築された装置を用いて,本年度に引き続いてアクティブマターのメカニズムを検討する.1.表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムの構築:本年度までに構築された基本光学システムと改良し,表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築する.表面プラズモン共鳴の共鳴条件が,基板表面の状態に敏感に変化することを利用して,入射角を固定することで基板表面に吸着した溶質濃度分布を反射率の関数として光強度分布として定量化する.溶質吸着濃度と反射率との関係を求め相関関数を求め,固体表面における溶質吸着濃度分布を評価する.2.単一アクティブマター運動の解析:得られた表面プラズモン共鳴観察結果から,アクティブマター近傍の溶質吸着濃度分布の時間発展を可視化しアクティブマターの駆動力を評価する.アクティブマターの主要な駆動力は,接触線近傍での溶質濃度差であると考えられているが,様々な不均一性に起因するランダム運動を発現する.このランダム運動の発生原因を特定し定量的に評価する.そのために,溶質の基板表面上の吸着濃度分布の時間変化を詳細に計測し,アクティブマターの運動と溶質濃度分布の不均一性との関係を考察する.3.複数アクティブマターの秩序状態とメカニズムの解明:複数個のアクティブマターの運動による溶質吸着濃度分布の時間発展を観察し,アクティブマターの協同運動を定量的に評価し,メカニズムを解明する.アクティブマターの自己推進能を利用してマイクロ流体システムを構築するためには,アクティブマターが協同的に運動することが不可欠である.そのため,二つのアクティブマターの間に働く相互作用を,溶質吸着濃度分布の時間変化を元に考察する.本研究で検討するアクティブマターは,溶質の固体表面上の濃度分布により自走する,溶液とは非混和性の液滴である.着目しているアクティブマターのメカニズムは「液滴表面における溶質の吸着分布の不均一によるMarangoni効果によって液滴が運動する」と提案されているが詳細は不明である.本研究の目的は,アクティブマターを用いたマイクロ流体システムを開発するために,アクティブマターのメカニズムを解明することである.そのために,今年度は2事項に着目して検討した.1.液滴発生装置:固体表面上に液滴を生成する装置の開発を行った.

特に,液滴が固体表面上に衝突する速度を制御可能とするために,気流によって液滴を加速して10m/s程度の速度で固体表面に衝突可能な液滴発生装置を開発した.液体送り速度と気体供試圧力とを制御することにより,液滴径と液滴速度とを制御することが可能であることを確認した.2.液滴挙動観察システムの構築:本研究で構築する表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築するための基本光学システムを構築した.表面プラズモンを発生させるためには,観察部底部から臨界屈折率以上で光を入射させ,光を基盤表面で全反射させ,液体側にエバネッセント波を染み出させる必要がある.そのためにガラスプリズム等の光学機器を用いて,光学系を構築した.更に購入した高速度カメラを用いて,液滴が基盤表面に接触する過程が観察可能であることを確認し,観測システムの空間分解能,および時間分解能を確認した.本年度は以下の2項目について検討を行った.1.液滴発生装置:液滴発生装置を構築することにより,液滴径と液滴速度とを制御させて観察部に液滴を生成することが可能となった.液滴が基盤上の液膜にどの程度の速度で衝突するかによって,液膜内の溶質分布が大きく変化し,アクティブマターの挙動が大きく変化するため,アクティブマターの挙動を解析するためには,液滴径と液滴速度とを制御させて観察部に液滴を生成することが必要不可欠である.本液滴発生装置を構築することにより,所定の要求が満たされることを確認した.2.液滴挙動観察システムの構築:表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築するための基本光学システムを構築した.観察部底部から臨界屈折率以上で光を入射させ,光を基盤表面で全反射させ,液体側にエバネッセント波を染み出させる光学システムを構築した.購入した高速度カメラを用いて,液滴が基盤表面に接触する過程の全反射観察が可能であることを確認した.観測システムの空間分解能,および時間分解能を確認し,観測システムとしては,所定の要求が満たされることを確認した.しかしながら,観察システムを構築するためには,全反射観測システムだけでは不完全であり,表面プラズモンを発生させるために,全反射光学システムの観察部に金薄膜を蒸着した基盤を設置する必要がある.表面プラズモンの発生を確認し,溶質濃度によって全反射光の屈折角がどの程度変化するかを確認し,溶質濃度と屈折角との関数を求めるまでを本年度の到達目標としていたが,本年度は光学システムの基本部分の構築に留まった.これまでに,構築された装置を用いて,本年度に引き続いてアクティブマターのメカニズムを検討する.1.表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムの構築:本年度までに構築された基本光学システムと改良し,表面プラズモン共鳴観察による濃度分布計測システムを構築する.表面プラズモン共鳴の共鳴条件が,基板表面の状態に敏感に変化することを利用して,入射角を固定することで基板表面に吸着した溶質濃度分布を反射率の関数として光強度分布として定量化する.溶質吸着濃度と反射率との関係を求め相関関数を求め,固体表面における溶質吸着濃度分布を評価する.2.単一アクティブマター運動の解析:得られた表面プラズモン共鳴観察結果から,アクティブマター近傍の溶質吸着濃度分布の時間発展を可視化しアクティブマターの駆動力を評価する.アクティブマターの主要な駆動力は,接触線近傍での溶質濃度差であると考えられているが,様々な不均一性に起因するランダム運動を発現する.
日本自動車産業における先端技術開発協業の実態調査

本研究では、日本自動車産業における「先端技術開発協業(R & D collaboration in an advanced technology development)」のマネジメントの実態について、各自動車メーカーごとの違い、各自動車部品特性の違いの二つに焦点を当てながら、定量的・定性的な分析を進めた。その結果、自動車メーカーでも部品メーカーでも、マネジメントのあり方に多かれ少なかれ深刻な課題を抱えており、依然として試行錯誤が続いていることが明らかになった。本年度は、まず第一に、1993年から2004年までに自動車メーカーが出願した全ての特許データと、同期間中に340社の一次部品サプライヤーが出願した特許数データ、及び自動車メーカー・部品サプライヤー間の部品レベルでの取引関係のデータ((株)アイアールシー発行の『主要自動車部品の生産流通調査』、84年版、87年版、90年版、93年版、96年版、99年版、02年版、05年版のデータを使用)に基づいて、日本自動車産業の先端技術開発協業の変容と現状について、社会的ネットワーク分析のツール等を用いて定量的な分析を行った。また、第二に、上記作業と並行しながら、自動車メーカー、及びその中核的サプライヤーへのインタビュー調査を行い、日本自動車産業における「先端技術開発協業」のマネジメントの実態と、各自動車メーカーごとの違い、及びその背景にあるロジックを探っていった。こうした成果は、基本的に、自動車メーカーやサプライヤーへのインタビュー調査を行う際に、マネージャ層に対してこれまでの研究・調査成果を報告する会を設けることで、調査への協力を引き出すための道具として役立てられた。また、成果の一部は、2009年8月28日に開催された、法政大学イノベーション・マネジメント研究センター主催のシンポジウム、『イノベーション・クラスターの創生政策とグローバル・リンケージ』の中で発表された。まだ調査・研究の途中ではあるが、来年度は暫定的な報告を行う論文を執筆し、ディスカッションペーパーや紀要にて発表する予定である。また、再来年度には、国内査読誌や海外査読誌への投稿を行いたいと考えている。本年度は、まず第一に、既に構築済みであった1993年から2004年までに自動車メーカーが出願した全ての特許データを網羅したデータベースに、1984年から1992年までと、2005年から2009年までのデータを追加し、整備を行った。また、自動車部品メーカーが出願した特許については、2000年から2004年までに150社の一次部品サプライヤーが出願した全ての特許データを網羅したデータベースを新たに構築した。また、第二に、こうした特許データベースをもとに、2000年代前半における日本自動車産業の先端技術開発協業の状況について、パテント・マップ分析と社会的ネットワーク分析の手法を組み合わせた定量的な分析を行った。第三に、上記作業と並行しながら、自動車メーカー、及びその中核的サプライヤーへのインタビュー調査を行い、日本自動車産業における先端技術開発協業のマネジメントの実態と、各自動車メーカーごとの違い、及びその背景にあるロジックを探っていった。まだ調査・研究の途中であり、やや混沌とした状況(最終的な着地点等が見通せない状況)にあるため、本年度は論文執筆や学会での報告は行わなかった。来年度は、少なくとも暫定的な報告を行う論文を執筆し、ディスカッションペーパーや学会等にて発表したいと考えている。本年度は、まず第一に、昨年度までに構築した1984年から2009年までに自動車メーカーが出願した全ての特許データを網羅した共同特許データベースに、共同特許出願先として名前の挙がった全ての自動車部品メーカー(延べ3386社)の19932005年の特許数データを追加し、整備を行った。