hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複合体結晶の構造決定に基づく構造特異的ヌクレアーゼFEN1の機能・制御機構の研究

DNAの複製系において、岡崎フラグメントのRNAプライマーは最終的に副産物として鋳型鎖から引き剥がされ、FEN1によって構造特異的に切断除去される。また、FEN1の酵素活性は、DNAスライディングクランプであるPCNAと相互作用することによって、大幅に促進される。本研究では、既にヒト由来FEN1とPCNAとの複合体の結晶構造を決定したが、この構造には基質となるDNAが含まれていないため、FEN1によるDNAの認識機構や触媒機構を解明するまでには至らなかった。本研究では、これらの機構を解明することを目的として、本年度は、基質となるDNAを含めたFEN1-DNA複合体およびFEN1-PCNA-DNA複合体の結晶化条件の検索に努めた。一般的な経験則として、DNA-タンパク質複合体は、特定の塩基配列のDNAを用いて、PEGを沈殿剤としたときに結晶化に成功することが多い。本研究では、DNAとの複合体結晶を作製するために、新たに下記の3つの試料を準備して結晶化条件を検索した。第1に、触媒活性を失活する活性中心変異体や無駄な領域を省いた9種類のFEN1のコンストラクトを作製した。第2に、既に決定したFEN1-PCNA複合体の結晶構造を基にして、DNAを含めた立体構造モデルを作成した。そのモデルから、結晶化に適用できるDNAの長さを予測し、その予想に基づいて16種類の結晶化用のDNAを調整した。第3に、市販されている結晶化スクリーニングキットから、PEGを沈殿剤とする条件のみを抜粋して結晶化条件の検索に用いた。新たに調整した上記のFEN1とDNAの組み合わせを変えて結晶化条件を検索した結果、特定のDNAとFEN1のコンストラクトを組み合わせたFEN1-DNA複合体を用いたときのみ、幅広い条件で結晶が得られた。また、これらの結晶を用いて、放射光施設SPring-8で分解能5ÅのX線回折データの収集することに成功した。今後、FEN1-DNA複合体の最適な結晶化条件を検索して、高分解能のX線回折データを収集して、既に決定したヒトFEN1の立体構造をモデル分子とした分子置換法によって、複合体の結晶構造を決定する予定である。DNA複製のラギング鎖のRNAプライマーは、DNA複製の最終過程で副産物として鋳型鎖から引き剥がされ、FEN1によって構造特異的に切断除去される。本研究では、分解能2.9ÅでヒトFEN1とPCNAの複合体の結晶構造解析に成功し、FEN1の触媒ドメインとPCNA結合領域の間にヒンジ領域があることを同定した。このヒンジを軸として、PCNAに結合したFEN1の触媒ドメインの配向が規則正しく変化することによって、FEN1の酵素活性が促進されることを我々は提唱し、投稿論文にまとめた。本研究課題では、FEN1の触媒機構やPCNAによって活性が促進される機構を詳細に理解することを最終的な目標として、基質であるDNAを含めた、DNA-FEN1-PCNA複合体の結晶構造解析を推進している。現在までに、DNA-FEN1-PCNAの3分子が溶液中で安定に複合体を形成する条件やその組成比を絞り込み、3分子複合体の結晶を作製することに成功した。この結晶について、放射光施設SPring-8で低分解能ではあるが、X線回折データを収集することができた。立体構造を決定するためには、さらに高分解能の回折データを収集する必要がある。そこで、FEN1-PCNA複合体の立体構造や既に報告されている生化学的なデータを参照して、結晶化に適すると思われるFEN1のコンストラクトを作製すると同時に、DNAの塩基配列についても検証し直した。現在、これらの試料を用いて、再度、系統的に結晶化条件を検索しているところである。

新たに調整した上記のFEN1とDNAの組み合わせを変えて結晶化条件を検索した結果、特定のDNAとFEN1のコンストラクトを組み合わせたFEN1-DNA複合体を用いたときのみ、幅広い条件で結晶が得られた。また、これらの結晶を用いて、放射光施設SPring-8で分解能5ÅのX線回折データの収集することに成功した。今後、FEN1-DNA複合体の最適な結晶化条件を検索して、高分解能のX線回折データを収集して、既に決定したヒトFEN1の立体構造をモデル分子とした分子置換法によって、複合体の結晶構造を決定する予定である。
スマート端末による意識調査と数理解析手法を利用した次善道路料金設定法の開発

本研究の成果は,第一にゲーミフィケーションと移動軌跡情報法を導入したスマホ型交通行動変容プログラムの開発である.調査参加者の歩数のランキングを配信することで,より効果的な行動変容を促すもので,三回の調査を実施して効果を検証した.第二の成果は,スマホ型調査で得られる膨大なGPS軌跡情報のカーネル密度推定を応用した簡便な分析法の開発である.データの時空間の三次元視覚化や回遊行動の広がりを定量的に評価する指標を新たに提示した.第三の成果は,トリップ・チェイン型利用者均衡配分の簡易な長期予測手法の提案である.2時点の熊本都市圏パーソントリップ調査のデータを利用して,モデルの限界と有用性を確認した.本研究の目的は,(1)スマートフォン(以下,スマホ)のアプリ等の機能を活用した道路料金政策に対する人の行動変化を予測する方法の開発と,(2)その方法と交通ネットワーク均衡モデルを統合した道路料金の適切な設定法の構築にある.本年度は,まずスマホ・アプリによる交通調査手法の国内外の動向の整理を行った.また,世界各国の諸都市における道路混雑課金政策の最新の動向についても整理した.次に,スマホ・アプリに開発に関して,研究代表者が構築済みの交通調査アプリの改良と同時に,ゲーミフィケーションを利用した交通行動変容アプリを開発した.後者は,調査参加者の歩数を計測して,調査参加者に結果のランキング情報を配信し,交通手段の変更などの行動変容を促するものである.大学生を対象にプレ調査を実施し,想定した効果を確認している.このアプリは,料金を含めた交通行動環境に対する人の意識把握にも有効と考えられる.交通ネットワーク均衡モデルについては,研究代表者が開発済みのトリップ・チェイン型のモデルを長期予測に応用する手法を提案し,熊本都市圏の実データをもとにその手法の妥当性の検討を行っている.この方法は,コードン課金,エリア課金などの次善混雑課金について,課金対象地域や課金レベルを長期的に変化させる動的料金設定問題に対しての,実用的な方法論につながるものと考えられる.この他,有料道路の多頻度利用時の割引制度を評価可能なモデルの検討などを実施している.本年度は,スマートフォン型交通・意識調査(スマホ型交通調査)について,その参加者数を増加させる方法,既存のスマホ型調査の解析,紙面調査との比較,新規調査の実施などを実施した.スマホ型交通調査は,既存の紙面調査と比較して,謝礼を準備することで,若年層の参加が多いこと,友人連れの参加が多いことなどの特性を把握した.また,謝礼が無かった場合に調査に参加しない層の存在を確認した.平成27年8月に開催された熊本市江津湖花火大会来場者の行動についてスマホ型調査を実施し,軌跡データの把握,およびスマホ型調査から取得できるセンサーデータから来場者の意識を推定する方法などの検討を行っている.来街交通手段別,消費金額別の分析なども進めた.さらにゲーミフィケーションの概念を利用することで,交通行動の変容を促すスマホ型アプリの開発・改良も進めている.競争心の高い人には,ランキング型の情報発信が有効であることなどの知見を得ている.各種調査の実施,分析を進めることができているため.ゲーミフィケーションの概念を利用することで,交通行動の変容を促すスマホ型アプリの改良を継続し、その有効性を検証する調査を2014年12月、2015年6-7月に続いて、2016年12月に実施した。本年度は、実際の行動変容をGPSにより記録できる改良を実施した。対象者の具体的な行動変容の客観データを可視化し、それと事後調査での主観的な回答の差などを明らかにしている。また、スマホ型回遊調査データについて、GPSデータの時空間の三次元視覚化に加えて、カーネル密度推定法を応用した三次元の体積値で、空間的な回遊行動の多さを定量的に評価する指標を新たに提示した。これらの分析方法を2013年11-12月に実施した熊本都心部回遊調査データに適用した。さらに2015年8月にアフガニスタン国カブール市においてスマホ型交通調査を実施し、紙面による調査との結果比較分析などを行った。また、2016年1月にスマホ型調査による熊本大学構内回遊調査を実施し、屋内滞在時と屋外滞在時の測位誤差の比較などについての知見を得た。次善混雑課金の分析法については、これまでの筆者の研究内容について、社会的余剰の相対改善(Relative Gain)という指標で政策評価結果を再構成して、体系的に整理した論文を公表した。なお、平成28年4月に発生した熊本地震の復旧・復興支援活動を優先したため、本研究の最終年度の進捗は限定的なものとなったが、前年度までに取り組んだ内容を含めて研究成果が多数公表されている。本研究の成果は,第一にゲーミフィケーションと移動軌跡情報法を導入したスマホ型交通行動変容プログラムの開発である.調査参加者の歩数のランキングを配信することで,より効果的な行動変容を促すもので,三回の調査を実施して効果を検証した.第二の成果は,スマホ型調査で得られる膨大なGPS軌跡情報のカーネル密度推定を応用した簡便な分析法の開発である.データの時空間の三次元視覚化や回遊行動の広がりを定量的に評価する指標を新たに提示した.第三の成果は,トリップ・チェイン型利用者均衡配分の簡易な長期予測手法の提案である.2時点の熊本都市圏パーソントリップ調査のデータを利用して,モデルの限界と有用性を確認した.

スマホ・アプリの構築・改良および交通ネットワーク均衡モデルの拡張などを進めることができているため.調査の分析などを順次進めたい.土木計画学スマホ・アプリによる道路料金に対する意識調査については,回答に応じて設問を変化させる等にアプリを改良したのち,アプリを公開し調査などを実施していく予定である.当初予定していた研究補助員の人件費等について,別途の研究費で一部補助をうけることが可能となったため.当初予定していた研究補佐員の雇用について,今年度については別の事務補佐員の支援を一部受けることができたため.調査の実施などに有効に活用したい.次年度以降は,研究補佐員を雇用し,研究の本格的な支援を受ける予定である.
網膜色素上皮細胞の放出する細胞外微粒子による網膜下炎症環境の破綻

加齢黄斑変性(AMD)の先制医療につながる独創的医療の基盤技術開発と言う目的を一部達成した。網膜下組織の恒常性維持には、網膜色素上皮細胞(RPE)やマクロファージ(Mps)が担う自然炎症系が重要な役割を果たす。『RPEの細胞機能変性によるRPEとMps系との情報ネットワークの破綻』をAMD早期病態の本質と捉え、補体活性化抑制因子産生やMpsからの炎症増悪因子TNFaの産生抑制が酸化的変性RPEにおいて破綻していることやRPEの遊離する細胞外微粒子(extracelluar vesicles:EVs)が本破綻に関係することを解明し、萎縮型AMDに係る新しい分子標的を明確化した。本提案課題では、加齢黄斑変性(AMD)の慢性組織炎症病態を、『RPEの細胞機能変性によるRPEとMps系との情報ネットワークの破綻』と捉え、「細胞外微粒子によりMpsやRPEが貪食能の低い細胞に変性変換され、結果、恒常性維持に係る貪食処理が進まず、ドル-ゼン形成に至るとする新しい回路の存在を検証し、萎縮型AMDに係る新しい分子標的を明確化し、創薬基盤技術として新分野の開拓に資する。初年度27年度においては、1評価すべき貪食能の低下を確認する系をマウスの新鮮Mps細胞、初代RPE細胞系において確立し、続いて、2如何なる変性処理により貪食能が低下するかの陽性対照系を作成し、3引き続き、Mps・RPEの共培養系でどのような相乗作用がみられるかを検定し、MCP-1, IL-6, IL-8, PEDF、VEGFの産生が共培養で著明に増強されること、これに対し、TNFの産生は逆に抑制されることを確認できた。何れも新しい知見で投稿準備中、国際学会発表の段階まで進んだ。以上のことは、マウスMps細胞株であるRAW264とマウス初代RPEを用いた共培養系でも確認された。RPEの機能の1つに、補体活性化による組織損傷の抑制があるが、本機能がMps共培養により変化するかPCR法で検定した。共培養でクラステリン(Clus)は発現が増加し、補体系活性化抑制因子CD59とCFHは減少した。一方、補体系活性化因子CFH, CFHの発現は、逆に、共に高進した。この結果は、Mpsとの共培養によりRPE機能に病態増悪方向への変化が起こっていることを示す。本共培養系で培養上清に特異的に発現する細胞外微粒子に含まれるmiRNAの解析を繰り返したが現在の処、miR-6968-5p,miR-3473e,miR-326-5p,miR-3473aが候補となっているが最終確定には至っていない。1評価すべき貪食能の低下を確認する系をマウスの新鮮Mps細胞、初代RPE細胞系において確立し、共培養上清のRPEへの添加でRPEの貪食能が有意に低下することが確認できた点は研究仮説の正当性をを裏付ける。2しかし、培養上清中の分子種で本貪食能低下に係る本体は未だ明確には出来ていない。次年度の課題である。3Mps・RPEの共培養系において炎症増悪回路に係る因子の産生増強が認められ、血管新生、抑制因子双方の産生が増強されること、TNFの産生は逆に抑制されること、一方、補体活性化因子の産生は増強され、補体活性化抑制因子の産生はClusを除き発現抑制されるとの知見はAMD病態の解釈に極めて重要な発見であり、Mpsとの相互作用により炎症増悪と補体系活性化抑制機構の破綻が同時に起こることを示す。MpsがMCP-1などのケモカインにより脈絡膜下に侵襲することでRPE機能の病態抑制効果が破綻するという変性が起こっていることが明確となった。今後、本破綻を担う分子種の同定と標的分子の解明により新しい創薬標的並びに診断手段が提供できる可能性が高まったと言える。後眼部組織の恒常性破綻が加齢黄斑変性(AMD)の病態を規定する。組織の恒常性維持とともに、危険感知機能を担うマクロファージ(Mps)の機能変化は加齢黄斑変性・ぶどう膜炎など眼炎症の遷延化など広範囲の疾患動態を左右する。28年度は臨床への活用を意識し抗線維化療法としての低分子化合物OBP801の実用化への開発研究に注力するとともに、Mpsと網膜色素上皮(RPE)の相互作用について、その分子実態をサイトカイン・細胞外微粒子(Evs)の分泌、機能修飾におけるパラクライン作用の視点より進めた。Mps亜集団の活性化に係り、AMD病態と直に対応する補体系の活性化抑制経路の破綻とAMD病態の対応に係る炎症経路の増悪に関する研究についてはMpsとRPEの共培養系において細胞外微粒子Exosomeの産生が著明に増強されるという全く新しい知見を28年度に発見した。新規医薬品候補物質の有用性の実験的POC確立としては、TNF-α,TGF-β何れもHDAC回路を直接・間接に修飾し、上皮間葉移行(EMT)高進、細胞外マトリックス(ECM)産生増大回路を高進することで相加的にRPEの線維化を促進することが判明した。レーザー照射による脈絡膜新生血管(CNV)誘導モデル実験でOBP801はCNV形成を抑制し、αSMA陽性の線維化形成も抑制された。

新規病態診断技術の開発としては、炎症増幅回路に係るTNF-α産生は、生理的条件下ではRPEにより抑制されること、MDAなど酸化ストレスのある病理学的条件下では、本作用は消滅することを確認した。RPEによる補体抑制因子の産生はMpsとの細胞間相互作用により抑制される、逆に、RPEによる補体活性化因子の産生はMpsとの相互作用で増強されることも確認できた。また、本共培養系でCD63陽性のExosomeの産生が著明に増強されることも確認できた。加齢黄斑変性(AMD)の先制医療につながる独創的医療の基盤技術開発と言う目的を一部達成した。網膜下組織の恒常性維持には、網膜色素上皮細胞(RPE)やマクロファージ(Mps)が担う自然炎症系が重要な役割を果たす。『RPEの細胞機能変性によるRPEとMps系との情報ネットワークの破綻』をAMD早期病態の本質と捉え、補体活性化抑制因子産生やMpsからの炎症増悪因子TNFaの産生抑制が酸化的変性RPEにおいて破綻していることやRPEの遊離する細胞外微粒子(extracelluar vesicles:EVs)が本破綻に関係することを解明し、萎縮型AMDに係る新しい分子標的を明確化した。計画書に従い予定通りに進める。特にMpsとRPEの相互作用によりRPE巣局所の炎症増悪と補体系活性化抑制機構の破綻機構を担う細胞変性誘導因子の同定と同因子の標的分子の解明に傾注する。1変性RPE細胞内miR並びに分泌型miRの網羅的検索は27年度に終了しており今後は,エキソゾームの分泌量と細胞変性の関係ならびに分泌されるエキソゾームの種類の同定を実施する。共同研究者のがんセンター研究所落谷先生と連携しExoscreenを用いる。2巣での着手しているRPE変性因子oxLDL, TGFβ/TNFαにより分泌型miR産生機能がどう変化するか最終結論を出す。3機能的に重要なmiRを決定するために、RT-PCRにより発現の再現性を確認後、標準miRを購入し、トランスフェクション法により機能再構築を行うと共に、抗当該miRによりmiR機能を抑制することで確認する。4POS貪食能力の変化との対応:既に確立しているPOS貪食系で実施する。必要に応じMFG-E8, ITGB5、MERKなどPSの直接、間接の受容体発現の変化を解析する。29年度になると思うが、米国輸入AMD患者眼球検体において特定miR,エキソゾームの分布の検定、特に、補体抑制因子CD46, CD55, CD59,クラステリン陽性エキソゾームの局在検定を実施する。免疫学研究が順調に進展し、予想よりも少ない金額で進展したこと、次年度に分子種の決定など本格的の研究展開に備えて消耗品代を繰り越した。消耗品;エキソゾーム単離精製試薬90万,miR機能検定用mimics, antagonist約70万,細胞培養用試薬約50万,貪食能検定用培養器、試薬約50万,旅費(がんセンター研究所で実験)約20万
心室動脈整合関係からみたレジスタンストレーニングの至適運動負荷条件の探究

レジスタンストレーニングは心臓リハビリテーションにおける主要な運動療法プログラムの1つであるが,中等症以上の心疾患では安全性や有効性の高いレジスタンストレーニングの方法が確立されていない.本研究では,レジスタンストレーニングの血行力学的特性の詳細を明らかにし,トレーニング効果を最大限に維持しつつ,心負荷が最小限となる安全なレジスタンストレーニングの運動負荷条件を見いだすことを目的とした.本研究により,後負荷を上昇させやすい運動であるIHGであっても,反復性に行われる運動負荷条件下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,心室動脈整合関係を悪化させにくい可能性が示唆された.本研究は,可能な限り心負荷を抑えつつ,筋力増強効果が得られるレジスタンストレーニングの運動負荷条件を見いだすことを目的とするものである.研究初年度は,(1)心室動脈整合関係(Ees/Ea),実効動脈エラスタンス(Ea),収縮期末エラスタンス(Ees)の非侵襲的な評価法の確立,(2)レジスタンス運動におけるの運動負荷条件を選択的操作による心室-動脈整合関係(Ees/Ea)の変化の追跡を行った.はじめに,先行研究に準じて,心収縮期時間と動脈圧に基づくEes/Eaの非侵襲的な計測システムを作成し,本システムにて算出した心収縮期時間,頸動脈圧,および別途超音波法によって計測した左室容積の解析からEes/Ea,Ees,Eaの非侵襲的評価が可能となった.このシステムを用いて,健常男性13名を対象に,運動仕事量(筋出力と運動時間の積)を一定とした運動負荷条件下において,等尺性ハンドグリップ運動(IHG)の抵抗荷重および運動様式がEes/Ea,Ees,Eaへ及ぼす影響を観察した.その結果,抵抗荷重(15%MVC,30%MVC)が及ぼす影響の検討では,抵抗荷重によるEes/Ea,Ees,Eaの相違は明らかではなかった.一方,運動様式(持続性IHG,反復性IHG)が及ぼす影響の検討では,運動様式よるEesの相違を認めなかったものの,反復性IHGは持続性IHGよりもEaの上昇とEes/Eaの低下が緩徐であることが示された.IHGは後負荷を上昇させやすい運動であるが,反復性に行われる運動負荷条件下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,Ees/Eaを低下させにくい可能性が示唆された.本研究は,可能な限り心負荷を抑えつつ,筋力増強効果が得られるレジスタンストレーニングの運動負荷条件を見いだすことを目的とするものである.研究初年度は,(1)心室動脈整合関係(Ees/Ea),実効動脈エラスタンス(Ea),収縮期末エラスタンス(Ees)の非侵襲的な評価法の確立,(2)レジスタンス運動におけるの運動負荷条件を選択的操作による心室-動脈整合関係(Ees/Ea)の変化の追跡を行った.はじめに,先行研究に準じて,心収縮期時間と頸動脈圧に基づくEes/Eaの非侵襲的な計測システムを作成し,本システムにて算出した心収縮期時間,頸動脈圧,および別途超音波法によって計測した左室容積の解析からEes/Ea,Ees,Eaの非侵襲的評価が可能となった.初年度には,後負荷を上昇させやすいと考えられる等尺性ハンドグリップ運動であっても,反復性に行われる運動負荷条件下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,心室動脈整合関係を悪化させにくい可能性を見いだした.続く平成26年度では,Ees/Eaのより安定した計測を目指し,心収縮期時間と頸動脈圧に基づくEes/Eaの非侵襲的な計測システムを新たに構築した.このシステムを用いて,抵抗荷重を40%MVCに設定のうえ,等尺性ハンドグリップ運動の運動様式(持続性,反復性)がEes/Ea,Ees,Eaへ及ぼす影響を観察した.その結果,初年度と同様に,高い抵抗荷重においても等尺性ハンドグリップ運動では反復性に行われた場合にEaの上昇とEes/Eaの低下が緩徐となることが示された.本研究は,可能な限り心負荷を抑えつつ,筋力増強効果が得られるレジスタンストレーニングの運動負荷条件を見いだすことを目的とするものである.研究初年度は,(1)心室動脈整合関係(Ees/Ea),実効動脈エラスタンス(Ea),収縮期末エラスタンス(Ees)の非侵襲的な評価法の確立,(2)レジスタンス運動におけるの運動負荷条件を様々に設定し,心室-動脈整合関係(Ees/Ea)の変化を観察した.非侵襲的な評価を行うため,先行研究に準じて,心収縮期時間,頸動脈圧,および別途超音波法によって計測した左室容積の解析から,Ees/Ea,Ees,Eaの非侵襲的な計測システムを作成した.等尺性ハンドグリップ運動(IHG)を15%MVC,30%MVCで実施し,本システムにて解析した結果,反復性に行われる運動負荷条件(反復性IHG)下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,心室動脈整合関係を悪化させにくい可能性を見いだした.平成26年度では,より高い抵抗荷重(40%MVC)にて,IHGの運動様式(持続性IHG,反復性IHG)がEes/Ea,Ees,Eaへ及ぼす影響を観察した.これらの検討結果から,高い抵抗荷重下でのIHGにおいて,反復性に行われる運動負荷条件下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,心室動脈整合関係を悪化させにくいことが示唆された.

Ees/Eaの変化に関係する生理学的因子を検討するために,平成27年度にはEes/Eaの変化における筋代謝受容器反射の影響を検討した.持続性IHG,反復性IHGを40%MVCの抵抗荷重にて施行し,運動後阻血(PEMI)によって筋代謝受容器反射の活性化の程度を両条件間で比較した.その結果,反復性IHGでは持続性IHGと比較してPEMI中の血圧,Eaは低く,また,Ees/Eaは高値で推移した.以上より,心室動脈整合関係の変化には筋代謝受容器反射が関与すると考えられた.レジスタンストレーニングは心臓リハビリテーションにおける主要な運動療法プログラムの1つであるが,中等症以上の心疾患では安全性や有効性の高いレジスタンストレーニングの方法が確立されていない.本研究では,レジスタンストレーニングの血行力学的特性の詳細を明らかにし,トレーニング効果を最大限に維持しつつ,心負荷が最小限となる安全なレジスタンストレーニングの運動負荷条件を見いだすことを目的とした.本研究により,後負荷を上昇させやすい運動であるIHGであっても,反復性に行われる運動負荷条件下であれば,後負荷の上昇が緩徐であり,心室動脈整合関係を悪化させにくい可能性が示唆された.左室容積の計測に必要な超音波装置の購入手続に時間を要し研究の開始時期が大幅に遅延したこと,計測システムの構築に時間を費やしたこと,研究室の改修による研究時期に遅延が生じ,研究期間の遅れを回収できなかった.総合領域研究実施に関わる今後の方向性として,1.より高い抵抗荷重下における,後負荷の上昇や心室動脈整合関係の悪化を抑制するための至適運動負荷条件の検討,2.心室動脈整合関係の悪化に関与する生理的背景因子の検証,3.至適運動負荷条件下でのレジスタンストレーニングによる心血管計および筋骨格系への影響の検討,の3点を行っていく.計測に必要な超音波装置の購入手続に時間を要し研究の開始時期が大幅に遅延したこと,計測システムの構築に時間を費やしたことで,研究計画の全体が遅延したため.研究初年度に,計測に必要な超音波装置の購入手続に時間を要し,研究の開始時期に大幅な遅延が生じたこと.また,既存の実験施設の改築にともない,実験遂行の中断を余儀なくされた.以上の状況による遅れを回収することができず,使用額に繰り越し分が生じた.研究実施に関わる今後の方向性として,1.大量のデータを効率的に分析するために,コンピュータに取り込んだ心音図,心電図,動脈圧波形から算出される心収縮期時間の自動演算化と精度の向上,2.高い抵抗荷重下において,Eaの上昇やEes/Eaの低下を抑制するための至適運動負荷条件の検討,3.至適運動負荷条件下でのレジスタンストレーニングによる心血管計および筋骨格系への絵今日の検討,の3点を行っていく.未使用額については,被検者への謝金(160,000円)および論文投稿に係る諸経費(300,000円)に充当する予定である.
脂質代謝を制御する核内受容体のリガンド変換酵素の単離と解析

核内ステロイドレセプターの一つであるPPAR(パーオキシソーム増殖剤応答レセプター)α、γ、δは脂質代謝、脂肪細胞分化誘導、血管内皮での泡沫細胞形成等の多彩かつ特異的な生理作用を司っている。PPARはリガンド誘導性転写制御因子として働き、リガンドのシグナルに応じて標的遺伝子の発現を転写レベルで調節する。この際、PPARはRXR(レチノイドXレセプター)とヘテロダイマーを形成し、PPAR、RXR各々のリガンド依存的に転写共役因子群を獲得し、基本転写装置と共に転写を開始する。このようなPPAR機能発現には、リガンドの結合が必須であるが、内因性PPARリガンドは複数存在することが知られている。そのためPPARによる多様な生理作用は、多様なリガンド各々固有の作用が担うと予想されている。その分子メカニズムとして、様々なPPARリガンドが転写共役因子群を選択的に使い分けることで、リガンド固有の作用をもたらしている可能性が考えられる。また、一般に既知核内レセプターリガンドの生合成はリガンド産生酵素により厳密に制御されているため、PPARリガンド産生酵素には未同定酵素の存在が考えられる。そこで、本研究ではPPARリガンド群の特異的生理作用をもたらす分子メカニズムの解明を目指し、I.リガンドによる選択的なPPARgと転写共役因子の相互作用、II.PPAR(a,g)リガンドの同定を目指した新規リガンド産生酵素の検索、の2点を検討した。本研究室では、核内受容体およびそのリガンドの前駆体を用いて、リガンドを前駆体から活性体へと変換する酵素を単離するための新規の酵母および哺乳類細胞での発現クローニング系を開発した。このスクリーニング系では、細胞内に核内レセプターとその標的配列をもつレポータープラスミドおよび発現ライブラリーを導入し、リガンドの前駆体存在下での標的配列からの転写量を測定する。もし細胞内にリガンドの前駆体を活性体に変換する酵素の遺伝子が導入されれば、活性型リガンドが産生され、核内レセプターに結合することによって標的配列からの転写が起こる。これら転写が活性化した細胞よりプラスミドを回収することにより変換酵素のcDNAを取得する。本研究では、このスクリーニング系を用いてPPAR δについて活性型リガンドおよびその変換酵素遺伝子を単離、同定することを目指す。その準備段階として平成10年度は以下の実験を行った。1、PPAR α,γ,δの転写活性化領域の解析を行った。多くの核内レセプターは、リガンドの結合するE/F領域にリガンド依存的な転写活性化能(AF-2)を持つ。一方、PPARがリガンド依存的な転写活性化能を発揮するためには、E/F領域と共にD領域が必要であった。したがって、PPARは他の核内レセプターとは異なった転写共役因子により活性が制御されている可能性が考えられる。3、さまざまなリガンドに対するPPARの転写活性化能を測定し、PPAR α,γ,δのリガンド特異性が低いことを示した。これは、PPARのリガンド結合ポケットが他の核内レセプターよりも1つ余分なa-helixを持つことに起因すると考えられた。4、8S-リポキシゲナーゼ遺伝子を取得した。アラキドン酸存在下でこの遺伝子を培養細胞に発現させたところ、PPAR α,γ,δの転写活性化が認められた。平成11年度は、上記結果を踏まえ、PPARの新規リガンドおよびその変換酵素の取得を試みる。核内ステロイドレセプターの一つであるPPAR(パーオキシソーム増殖剤応答レセプター)α,γ,δは脂質代謝、脂肪細胞分化誘導、血管内皮での泡沫細胞形成等の多彩かつ特異的な生理作用を司っている。

この際、PPARはRXR(レチノイドXレセプター)とヘテロダイマーを形成し、PPAR、RXR各々のリガンド依存的に転写共役因子群を獲得し、基本転写装置と共に転写を開始する。このようなPPAR機能発現には、リガンドの結合が必須であるが、内因性PPARリガンドは複数存在することが知られている。そのためPPARによる多様な生理作用は、多様なリガンド各々固有の作用が担うと予想されている。その分子メカニズムとして、様々なPPARリガンドが転写共役因子群を選択的に使い分けることで、リガンド固有の作用をもたらしている可能性が考えられる。また、一般に既知核内レセプターリガンドの生合成はリガンド産生酵素により厳密に制御されているため、PPARリガンド産生酵素には未同定酵素の存在が考えられる。そこで、本研究ではPPARリガンド群の特異的生理作用をもたらす分子メカニズムの解明を目指し、I.リガンドによる選択的なPPARgと転写共役因子の相互作用、II.PPAR(a,g)リガンドの同定を目指した新規リガンド産生酵素の検索、の2点を検討した。
読み書きの習得に影響する認知要因と環境要因に関する縦断研究

本研究では、読み書き到達度に影響する認知能力と環境要因について明らかにすることを目的とした。今年度は、幼児期から追跡している小学校2-4年生を対象に縦断研究5年目の調査を行い、通常学級に在籍する199名の児童とその保護者のデータを収集した。並行して昨年までに収集したデータの分析を行った。小学校1年生から2年生にかけての音読速度の変化を予測する要因について検討したところ、幼児期の読書活動頻度がひらがな単語と文章課題の有意な予測変数であった。読書活動を通して文字列知識の学習が進み、単語をまとまりとして読むorthographic(正字法的)な処理の発達が促進される可能性が示された。また、幼児期の認知能力と環境要因および読み書き成績から2年生の読み書き到達度を予測する分析を行った。カタカナ単語と無意味語の音読成績を予測する明らかな変数は認められなかった。一方、自動化能力(RAN課題)と音韻認識(単語逆唱課題)、および読書活動頻度がカタカナ単語の書取成績を有意に予測した。また、漢字単語の音読には語彙力が、漢字単語の書取にはひらがな書取成績が関わっており、過去の横断研究の結果を支持する結果であった。全体として認知能力の貢献度が高く、文字種、モダリティ、正確性または流暢性という違いにより、読書活動という環境要因の関与の程度が異なることが明らかとなった。なお、幼児期の家庭での文字指導頻度は、1年生、2年生時のいずれの読み書き成績とも有意な関連が認められなかったことから、早期からの文字指導は必ずしも有効ではないことが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究1:典型発達児における読み書き到達度に影響する認知能力と環境要因、およびそれら双方の相互関係について明らかにすることを目的としている。平成26年度は、縦断研究4年目の調査を行った。幼児期から追跡している小学校1-3年生の典型発達児とその保護者を対象に、夏休み期間中の7日間にわたり調査を行った。研究補助者とともに児童のデータ収集を行い、221名のデータを収集した。児童が課題を行っている間、保護者には質問紙に回答してもらった。調査終了後、データ入力、確認を行い、データ分析の前準備を行っているところである。調査と並行して、昨年までのデータを再分析し直した。その結果、小学1年生のひらがな音読においては、自動化能力に加えて、幼児期の本への接触頻度が高いほど、単語や文章の音読速度が速くなる傾向が明らかとなった。本への接触は、単語をまとまりとして読む音読方略の発達に貢献している可能性が示された。さらに、小学1年生のひらがな書取においては、音韻認識に加えて、幼児期の本への接触頻度が、無意味語の書取成績を有意に予測した。ひらがな音読の熟達度を反映していると考えられる速読成績を独立変数に含めても同様の結果が得られ、速読成績は書取成績を予測しなかった。したがって、文字に接する機会が多いほど、文字表象の発達が促される可能性が示唆された。現在、再解析を行った結果を国内外の学術雑誌に投稿するため、論文執筆中である。研究2:発達性読み書き障害児数名を対象とし、認知課題成績が同程度に低い場合に、読み書き到達度の分散に関わる環境要因を保護者に対する質問紙調査から明らかにすることを目的としている。平成26年度は、来年度本格的に調査を行えるよう、準備を行った。典型発達児を対象とした調査にて使用している質問紙を土台として、質問項目を選定しているところである。また、調査対象者候補を何名か挙げ検討している。年に一度行っている追跡調査を予定通り実施し、小学1年生から3年生までの児童約220名のデータを収集できた。昨年までのデータについて、確認、再解析を行い、現在論文を執筆中である。

来年度の追跡調査や発達性読み書き障害児を対象とした調査の準備も始めており、概ね順調に研究が進展したと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究1:来年度も追跡調査を継続し、5年目の調査を行う。例年同様、典型発達児とその保護者を対象に、夏休み期間中の約8日間にわたりデータ収集を行う。小学校2-4年生約200名のデータが追加される予定である。前年までのデータと新たに追加されるデータについて統計解析を行い結果をまとめる。調査と並行して、前年までの研究成果を原著論文、学会等で発表する。研究2:発達性読み書き障害児やその疑いがある児童の保護者に対する質問紙調査を開始する。
ラット末梢神経再生における年齢依存性について

未熟な動物では、末梢神経が損傷されると神経細胞死が生じることが知られている。本実験では、神経細胞死が生じる未熟な時期に末梢神経に損傷を受けたラットの神経再生を長期間にわたって観察評価し、神経細胞死が機能回復にどのような影響を及ぼすかを検索した。雌Lewisラット107匹の後脛骨神経を用い、生後6日目に切断縫合した群(6日群)と生後22日目に切断縫合した群(22日群)を作製した。手術後2週目より48週目までの期間、Walking Track Analysis、電気生理学的評価、筋湿重量測定、病理組織学的評価を行った。Horseradish Peroxidase(HRP)による逆行性神経標識法を用いて、手術後1、3、14カ月で標識された脊髄神経細胞の定量を行った。右後脛骨神経はそれぞれの評価の対照群として用いた。Walking Track Analysisは22日群に比較して6日群において神経再生が不良であることを示した。神経伝導速度は、いずれの時点においても6日群が有意に低値を示した。筋湿重量も同様に6日群が有意に低かった。その傾向は手術後48週を経過しても同様であった。またHRPにより標識された脊髄神経細胞は6日群では、術後1カ月で656±59、3カ月で770±36、14カ月で748±27であったのに対し、22日群ではそれぞれ、1305±60、1315±31、1297±28といずれの時点でも有意に高値を示した。病理組織学的検索では両群間に有意な差はみられなかった。本実験の結果から、生後6日目に切断縫合した群は、生後22日目に切断縫合した群に比べて末梢神経の機能回復が明らかに不良であった。さらにその機能回復の差は、少なくとも生後14カ月までの間継続していた。HRPで標識された脊髄神経細胞数が、6日群と22日群を比較して6日群で有意に少なかったことから、生後6日目という未熟な発達段階における神経損傷がその中枢の神経細胞死を惹起し、末梢神経再生に長期にわたって悪影響を及ぼしていることが明らかになった。
高密度フォトンモード光記録システムのための有機光応答性材料の開発

フォトンモード光記録材料として期待されている有機フォトクロミック化合物の一つであるジアリールエテンにヘリセンを組み込んだ化合物を合成した。ヘリセンは旋光度が大きいことで知られている。光照射によって,光照射前は存在しなかったヘリセン骨格が生じることにより,旋光度の値が大きく変化することが期待される。なぜ大きい旋光度変化が有用であるかというと,光記録材料の記録の読み出しに,旋光度を用いることが可能であるからである。旋光度は,吸収帯にかからない光で,すなわちフォトクロミズムを誘起しない光で値を測定することができる。従って,記録の読み出しによって記録を破壊することなく読み出すことができる。まず合成反応を行った。Diels-Alder反応をキーステップとすることとし,いくつかの合成ルートを検討した。ジエンとしてビニルチオフェン,1-メトキシビニルチオフェン,2-メトキシビニルチオフェン,ジェノフィルとしてパラベンゾキノン,P-トルエンスルフィニルベンゾキノン,を用いて反応を試みた。その結果,最終的に,1-メトキシビニル基を持つチオフェンおよびメトキシメトキシエチル基を持つベンゾチオフェンをアリール基として持つジアリールエテンと,パラベンゾキノンのDiels-Alder反応を行うことで縮環した化合物を得ることができた。その後,この化合物のキノン部位のハイドロキノンへの還元,生じたフェノール性水酸基のエステル化,によって目的化合物を得た。この化合物は紫外光照射によって赤く着色した。今後,この化合物の光学分割を行い,光反応による旋光度変化を調べる。
薬剤投与実験可能な多発性嚢胞腎モデル動物の確立

常染色体優性遺伝性多発性嚢胞腎(ADPKD)はPKD1遺伝子あるいはPKD2遺伝子の異常を原因とする、最も頻度の高い遺伝性腎疾患である。今回私たちは、マウスならびにメダカを使用して薬剤投与実験可能なADPKDのモデル動物を作製することを研究の目標に定めた。はじめに、テロメラーゼ(テロメア伸長酵素)欠損マウスとPkd1ヘテロマウスとの交配し、テロメアが短縮したPkd1ヘテロマウスを作製した。テロメアが短縮するとゲノムの不安定により体細胞変異が起こり、Pkdノックアウトマウス・ヘテロ接合体においてヒト類似の多発性嚢胞腎ができることが予想されたためである。しかし、第6世代まで解析したところ、早期に嚢胞が形成される傾向が見られたが、モデルとなるような多発性嚢胞腎にはならなかった。次に、安価で簡便に飼育可能なモデル動物として小型魚類であるメダカを用い、Pkd2遺伝子欠失変異体を遺伝子導入したトランスジェニックメダカを作成した。EF-1α-Aプロモーターにより構成的に導入遺伝子を発現する系統ならびにTet-On/Off誘導系を用いてドキシサイクリンを投与することにより遺伝子発現を調節する系統も作成した。その結果、欠失変異体の発現量にもよるが、さまざまな程度の嚢胞形成が認められた。中でも10μg/mlの濃度のドキシサイクリンに曝露し続けたTet-On誘導系を用いたTet-On Pkd2△C-EGFP系統は,ホモ接合体にすると約4カ月後にヒト多発性嚢胞腎に類似した表現型が認められた。これらのことから、欠失変異体はドミナントネガティブ的に働き、正常のPkd2遺伝子の機能を阻害することが示唆された。今後は、この系統をさらに解析し、薬効評価を行う予定である。はじめに、テロメラーゼ欠損マウスとPkd1ヘテロマウスとの交配により、ゲノムを不安定にさせるPkd1ヘテロマウスを作成した。ヒトと同じように体細胞変異が起こり、Pkdノックアウトマウス・ヘテロ接合体においてヒト類似の多発性嚢胞腎ができることが予想されるためである。第3世代まで解析中であるが、世代を経るにつれてテロメアは短縮するはずであり、それに伴い嚢胞は多く形成される傾向が見られた。今後、第6世代まで継代し、解析を進めていく。次に、安価で簡便に飼育可能なモデル動物として小型魚類であるメダカを用い、Pkd2遺伝子欠失変異体を遺伝子導入したトランスジェニックメダカの作成を試みた。まず、ヒトPKD2遺伝子、マウスのPkd2遺伝子のシークエンスをもとに、フグならびにメダカゲノムデータベースを利用してメダカPkd2遺伝子をクローニングした。次に、N末端欠失変異体(エクソン1-4を欠失させる)、C末端欠失変異体(エクソン12-15を欠失させる)の2種類を作製し、それぞれ短縮させたクローンをメダカのEF1-α遺伝子(Elongation factor 1α)のプロモーターならびにGFPをタグとして付加した。受精卵での一過性遺伝子発現では、C末端欠失変異体を導入した場合において前腎に嚢胞が形成された。次に、C末端欠失変異体をもつトランスジェニックメダカの系統化を試みた。

ヘテロ接合体での解析では、中腎に嚢胞は散在するものも認められたが、ヒトADPKDに認められるような嚢胞形成は現在のところ認められていない。現在、ホモ接合体を作成、また欠失変異体発現増加を試みている。常染色体優性遺伝性多発性嚢胞腎(ADPKD)はPKD1遺伝子あるいはPKD2遺伝子の異常を原因とする、最も頻度の高い遺伝性腎疾患である。今回私たちは、マウスならびにメダカを使用して薬剤投与実験可能なADPKDのモデル動物を作製することを研究の目標に定めた。はじめに、テロメラーゼ(テロメア伸長酵素)欠損マウスとPkd1ヘテロマウスとの交配し、テロメアが短縮したPkd1ヘテロマウスを作製した。テロメアが短縮するとゲノムの不安定により体細胞変異が起こり、Pkdノックアウトマウス・ヘテロ接合体においてヒト類似の多発性嚢胞腎ができることが予想されたためである。しかし、第6世代まで解析したところ世代を経るにつれて嚢胞は多く形成される傾向が見られたが、モデルとなるような多発性嚢胞腎にはならなかった。次に、安価で簡便に飼育可能なモデル動物として小型魚類であるメダカを用い、Pkd2遺伝子欠失変異体を遺伝子導入したトランスジェニックメダカを作成した。EF-1α-Aプロモーターにより構成的に導入遺伝子を発現する系統ならびにTet-On/Off誘導系を用いてドキシサイクリンを投与することにより遺伝子発現を調節する系統も作成した。その結果、欠失変異体の発現量にもよるが、さまざまな程度の嚢胞形成が認められた。中でも10μg/mlの濃度のドキシサイクリンに曝露し続けたTet-On誘導系を用いたTet-OnPkd2ΔC-EGFP系統は,ホモ接合体にすると約4カ月後にヒト多発性嚢胞腎に類似した表現型が認められた。これらのことから、欠失変異体はドミナントネガティブ的に働き、正常のPkd2遺伝子の機能を阻害することが示唆された。今後は、この系統をさらに解析し、薬効評価を行う予定である。
課題探求を指向する実験学習の支援システムに関する研究

実験科目において、データ収集、データ処理をコンピュータで行うためのツールを実装した。このツールを基礎物理実験で利用し、記録された情報から、学生が一般的に陥りやすい誤りや見落とし、測定精度などの実験実施上の問題点を分析した。その結果、実験計画の不備が原因と思われる測定値の不足、測定方法の不備と思われる不自然なデータ、計算式の誤り、有効桁数の不適切な設定など、支援を必要とする項目が発見された。支援が必要な項目のそれぞれについて、支援を必要とする状態を、データ収集・処理ツールに記録された情報から検出するための条件を設定し、ツールに支援機能を実装した。支援内容は、不適切さの程度が高く実験を実施している最中に助言を与え修正をうながすものと、実験終了後に実験結果を考察するための材料とするものとに分類した。また、実験学習の進行にしたがって活動記録を学習者が整理しやすいユーザインタフェースを設計するとともに、学習の進行状態を支援システムが把握して、適切なタイミングで助言を与えることのできる機能を実現した。実験内容に関する考察を深めるには、実験条件を変更して追加実験を行うなど、新たな情報を必要とする場合がある。しかし、実験時間が限られており現実には困難である。そこで、過去に行われた学生実験結果をデータベースに蓄積し、実験条件をキーにして検索する機能を実現した。これを利用することで、学生は自分の結果と比較して、自分の実験の問題点の考察や、実験対象となっている物理現象に関する検討が可能となった。本研究は、一定の自由度がある課題を与え課題探求を指向した実験学習を行わせるときに、学習者に適切な助言を与えられる支援システムの実現を目指している。今年度は、実験学習のプロセスを分析し、支援項目とそれを与える条件を検討して、学習者の活動のモデル化と、支援のモデル化を中心に研究を行った。活動モデルは、実験学習を行う時に学習者が実行するプロセスのモデルであり、支援モデルは、活動状況を評価し、活動の方向付けを定義するモデルである。対象としている実験学習では、使用する器具は事前に準備されており、実験条件、観測パラメータ、分析項目、分析方法に自由度が与えられている。これらの項目に対して適切なタイミングで適切な助言を与えるためには、支援システムが学習者の活動状況を把握できなければならない。一方、支援システムの都合で学習者に余分な負担をかけることがあってはならない。そこで、学習者の活動モデルに基づき、観測した実験データを整理するためのツールと、学習者が行ったデータ間の演算関係が保存される分析ツールを設計し、学習者と支援システム双方の要求を満たす実験学習支援ツールを実現した。学習者への支援は、支援モデルに基づいて、学習者の活動状況に現れる問題点を検出して行う。支援ツールの有用性と問題点検出の基本性能を確認するために、支援ツールを本学の物理基礎実験で試験運用して学習者の活動履歴を収集した。収集した活動履歴を分析した結果、実験条件の設定過程やデータ分析過程での問題点が検出できることを確認した。大学学部での実験科目では、限られた時間内に所定の内容を実施するために、詳細な手引書が用意されており、学生は手引きに従って、手順どおり実験をこなすだけになってしまう場合が少なくない。本研究では、実験に一定の自由度を持たせ、目的に応じて学生に実験を計画させる部分を残し、不適切なところがあれば助言を与える支援システムの実現を目指している。助言を与えるには、測定項目、測定値、データ処理などについて支援システムが把握する必要がある。このために、観測したデータを整理するためのツールと、計算ツールを実装し、学生が実験を進めていくプロセスを支援システムが認識できる枠組みを準備した。これらのツールを利用した学生の記録を分析したところ、それぞれの学生の個別の記録だけを見て不適切と判断できる場合と、測定データのいくつかについて学生全体の分布との比較で判断しなければならない場合があることがわかり、それぞれについて助言を与える項目と条件を抽出した。さらにこれらの項目を、実験条件設定直後に助言を与えるべきもの、実験とデータ収集後に助言を与えて再実験を促すもの、実験結果考察の材料とするものとに分類した。

また、支援システムをさまざまな実験課題に適用できる汎用性を持たせるため、今後オーサリングシステムを実装する際の資料とすることを目的として、助言を与える項目の性質を分析して、実験系を記述する方程式から導かれるもの、方程式を解く際の近似方法から導かれるもの、物理量の測定方法との関係で導かれるものとに分類した。実験科目において、データ収集、データ処理をコンピュータで行うためのツールを実装した。このツールを基礎物理実験で利用し、記録された情報から、学生が一般的に陥りやすい誤りや見落とし、測定精度などの実験実施上の問題点を分析した。その結果、実験計画の不備が原因と思われる測定値の不足、測定方法の不備と思われる不自然なデータ、計算式の誤り、有効桁数の不適切な設定など、支援を必要とする項目が発見された。支援が必要な項目のそれぞれについて、支援を必要とする状態を、データ収集・処理ツールに記録された情報から検出するための条件を設定し、ツールに支援機能を実装した。支援内容は、不適切さの程度が高く実験を実施している最中に助言を与え修正をうながすものと、実験終了後に実験結果を考察するための材料とするものとに分類した。また、実験学習の進行にしたがって活動記録を学習者が整理しやすいユーザインタフェースを設計するとともに、学習の進行状態を支援システムが把握して、適切なタイミングで助言を与えることのできる機能を実現した。実験内容に関する考察を深めるには、実験条件を変更して追加実験を行うなど、新たな情報を必要とする場合がある。しかし、実験時間が限られており現実には困難である。そこで、過去に行われた学生実験結果をデータベースに蓄積し、実験条件をキーにして検索する機能を実現した。これを利用することで、学生は自分の結果と比較して、自分の実験の問題点の考察や、実験対象となっている物理現象に関する検討が可能となった。
ムカシシロアリ細胞内共生細菌ブラタバクテリウムの全ゲノム機能解析

ブラタバクテリウムゲノムの分離精製法を確立しそのゲノムサイズ(650kbp)を決定した。また分離したゲノムDNAの配列を解読し, 523kbpのドラフトコンティグを作成した。(1)オオゴキブリ脂肪体からのブラタバクテリウムゲノムの分離オオゴキブリより脂肪体を取り出し,等張液中で機械式ホモゲナイザーで摩砕後,ナイロンメッシュでろ過した。ろ過液を材料としてホスト細胞成分とブラタバクテリウム細胞のパーコール密度勾配遠心による分離条件を検討した。超遠心により形成したパーコールのオートグラジエント(連続密度勾配)上にサンプルを載せ分離を諮る方法と70%濃度のパーコール溶液の上に密度の低いパーコール溶液を重層する不連続法を比較したところ,後者の境界面にブラタバクテリウム細胞の集積を確認したが,前者ではブラタバクテリウム細胞は拡散し層を作ることはなかった。このため,不連続法を採用した。この方法で分離したブラタバクテリウム分画へのホストゲノムの混入をPCRにより調べたところかなりの混入が確認された。このため,この方法で分離したブラタバクテリウム細胞をアガロースで固定し,細胞壁破壊のための酵素処理と制限酵素処理をしたのちパルスフィールド電気泳動にかけた。結果,ブラタバクテリウムゲノムDNAを分離した。(2)ブラタバクテリウムゲノムDNAからのゲノミックDNAライブラリーの作製分離したブラタバクテリウムゲノムの量はライブラリーの構築には十分ではなかった。このため,Phi29DNAポリメラーゼを使ったゲノムDNAの無差別増幅法により数マイクログラムまでゲノムDNAを増幅し,タカラバイオにpUC118プラスミドを用いたライブラリーの作製とロッシュ社GS20型DNAシーケンサーを用いた非クローニング核酸配列解析を委託した。タカラバイオは,サンプルをエマルジョンPCRで再度増幅したのちその一部でpUC118ライブラリーを構築し,残りでGS20を用いた解析を行った。結果としてゲノムDNAの約90%を解読した。現在ギャップ部分を解読するためpUC118ライブラリーを用いたショットガン解析を行っている。1)オオゴキブリより分離したブラタバクテリウムゲノムをI-CeuI、BglI、KspI等の制限酵素で切断し、パルスフィールド電気泳動法によりゲノムサイズを測定した結果、680kbpであることを確認した。2)18年度にパルスフィールド電気泳動法によって分離したオオゴキブリ由来ブラタバクテリウムゲノムのGS20大規模解析を行った(一部18年度報告に掲載)。結果、680kbpと推定されるブラタバクテリウムのゲノムから1018本のコンティグを得た。コンティクの最大長は23、014bp、平均コンティグ長は5、733bp、800フロー以上からなるコンティグの平均長は9、812bpであった。4kbp以上のコンティグは56本でこれらのみで552,860bpとゲノムの81%をカバーしていた。これに加えてpUC118プラスミドを使って作成したフラタバクテリウムゲノムショットガンライブラリー12、000サンプルのワンパス解析をABI3700自動DNAシーケンサーを用いて行い、得られたデーターとGS20のコンティグとのマニュアルアッセンブリーを行った。結果としてコンティグ長は最大117kbpまで増加した。ゴキブリ類全般およびシロアリ類現存最下等種であるムカシシロアリ(Mastotermes darwiniensis)が脂肪体細胞内に宿す共生細菌ブラタバクテリウム(Blattabacterium cuenoti)は貧栄養環境におけるゴキブリ類の尿酸リサイクルを担い,また,シロアリ類は,これを失いながら原生生物・重共生細菌・古細菌類との共生関係を発達させゴキブリ類より進化放散したと考えられている。シロアリ類進化の鍵を握るムカシシロアリのブラタバクテリウムゲノム解読を目標として以下の実験を行った。ムカシシロアリは豪州クイーンズランド州および北部準州のみに生息し入手の機会が限られるため,シロアリ類と同様に食材性であるオオゴキブリ(Panesthia angustipennis spadica)を材料としてパーコール比重差遠心とパルスフィールド電気泳動法を用いた脂肪体からのブラタバクテリウム分離法を確立し,またゲノムサイズ(650kbp,GC含量32.1±7.6%)を確定した。得られたゲノムDNAをサンガー法およびロッシュ社454DNAシーケンサーを用いて解析し,520kbpに渡るドラフトコンティグの構築とアノテーションを行った。また,同じ方法を用いてムカシシロアリ脂肪体よりブラタバクテリウムゲノムが分離し,現在ゲノム解析を行っている。