hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポドサイトの転写因子Tcf21の機能解析を通じた慢性腎臓病の機序解明

我々は腎臓の発生をコントロールする蛋白Tcf21が、糖尿病性腎症や腎臓の繊維化に関与すると考えた。一方でTcf21のKOマウスは生まれた直後に死んでしまうので、大人になってからTcf21遺伝子を除去し、生存するポドサイト特異的Tcf21KO、あるいは腎間質でのTcf21KOを作製した。大人マウスでポドサイト特異的Tcf21 KOは尿蛋白を呈さなかったが、これに糖尿病を起すと、腎障害が進むことがわかり、Tcf21は糖尿病性腎症に保護的と思われた。また、間質特異的なTcf21KOは尿細管と集合管の著明な低形成を来たした。すなわち、Tcf21はポドサイトの保護や、腎間質の機能維持に重要と思われる。本年度はTcf21を全身においてテトラサイクリン誘導性にノックアウトするマウスを確立した。このマウスに高脂肪食を6週齢から8週間与えると、野生型と比較して糖負荷試験では差がないものの、インスリン負荷試験を行うと、インスリン負荷後の低血糖からの回復が遅延する事が分かった。一方でTcf21をテトラサイクリン誘導性に、腎ポドサイト特異的にノックアウトするマウスも確立した。このマウスを用い、出生後の様々な時期に遺伝子欠損を誘導して検討を行ったところ、生後3ー6週にて誘導してもマウスはほぼ正常であるが、出生直後にポドサイトからTcf21を欠損させると5ー6週零においてアルブミン尿を呈する事が分かり、Tcf21はポドサイトの発生に重要だが出生後はその必要性は低下する事が分かった。さらに、糖尿病との関連においては、培養ヒトポドサイトを高グルコースにより刺激するとTcf21の発現が12時間をピークとして2倍程度と弱いながらも増加する事が判明した。また、Tgf-bにより刺激すると、24時間後に3倍程度の発現増加を認めた。また、STZを用いた1型糖尿病モデルマウスの糸球体において、Tcf21の発現は糖尿病発症後5週まで増加するが、10週及び20週後には非糖尿病群の約30%に低下している事がわかった。今までのところ、全身においてTcf21を成熟個体において欠損するマウスを作製し表現型を観察したが、各臓器の重量に変化はなく、成熟個体は健康で顕著な表現型は見られなかった。一方、PodocinrtTA/TetOCre/Tcf21 floxedマウスを作製し、腎糸球体が分化した後にドキシサイクリンを用いてCreを誘導し、糸球体ポドサイト特異的にTcf21をKOした。出生後直後にTcf21を欠損させたところ、マウスはアルブミン尿の有意な増加を示し、組織学的には一部の糸球体で部分的な糸球体硬化と、メサンギウム領域の拡大を示していた。一方で、生後3週を経てからドキシサイクリンを用いてTcf21を欠損させても、尿蛋白は見られない事がわかり、Tcf21はポドサイトにおいては発生分化に重要であるが一度糸球体が生成されるとあまり重要ではないと推察された。さらに、これらのマウスにSTZを用いて6週齢から糖尿病を惹起したところ、preliminaryな結果では、糖尿病惹起後15-18週齢での解析で、Mutant群において尿蛋白が増悪する傾向が認められた。マウス屠殺時のデータでは糖尿病を有するポドサイト特異的Tcf21 KOマウスの腎は表面粗造で萎縮しており、現在組織学的検討を行っている。以上より、Tcf21は発生時に最も重要で、ポドサイトが成熟するとその重要性は減弱するが、疾患状態において再度、糸球体の構造と機能の維持に重要な役割を果たすと推察された。テトラサイクリン誘導性ポドサイト特異的Tcf21KOマウスの確立に成功した。現在糖尿病性腎症モデルを作製し経過観察中であるが、Tcf21 KOマウスにおいては尿蛋白の増悪傾向が認められ、今まで得られたデータに矛盾しない結果となっている。今後組織学的解析並びに遺伝子発現解析に進む予定である。我々は以前、Tcf21と呼ばれる転写因子がポドサイトの発生分化に必須であることを見いだした。Tcf21は成熟腎ではポドサイトと間質細胞に発現し、胎生期にはネフロン並びに間質の前駆細胞に認められる。Tcf21をネフロンの前駆細胞で欠損すると、ポドサイトの分化が著しく障害され、また、発生途中のポドサイトでTcf21を欠損する(Pod-KOマウス)と、一部のmutantマウスは大量の尿蛋白と糸球体硬化を呈するが、60%のマウスは尿蛋白を示さない。糖尿病性腎症におけるTcf21の役割を検索する目的で、Pod-KOマウスの非尿蛋白群を集め、ストレプトゾトシン(STZ)を用いて糖尿病を惹起したところ、数週後からマウスは次々と尿蛋白ならびに糸球体の硬化を来たし、Tcf21は糖尿病性腎症に対し保護的に働く可能性が示唆された。しかしながらこのマウスは胎生期に既にポドサイト傷害を来たしている可能性があったため、出生後3週以降の成熟したポドサイトにおいてTcf21を欠損したところ、マウスは24週齢まで明らかな表現型を呈さなかった。更に3週齢にてTcf21を欠損したマウスに6週齢以降に糖尿病を惹起すると、STZ投与後9-12週が経ってから遅発性の尿蛋白と糸球体の硬化をきたすことが分かった。

電子顕微鏡レベルで観察しても、変異マウスにおいてはポドサイトの足突起の癒合や平定化が認められた。即ちTcf21はポドサイトの発生分化に必須であり、成熟した糸球体では定常状態では必須ではないが、糖尿病性腎症を含む疾患状態において腎保護的に働いていると考えられる。我々は腎臓の発生をコントロールする蛋白Tcf21が、糖尿病性腎症や腎臓の繊維化に関与すると考えた。一方でTcf21のKOマウスは生まれた直後に死んでしまうので、大人になってからTcf21遺伝子を除去し、生存するポドサイト特異的Tcf21KO、あるいは腎間質でのTcf21KOを作製した。大人マウスでポドサイト特異的Tcf21 KOは尿蛋白を呈さなかったが、これに糖尿病を起すと、腎障害が進むことがわかり、Tcf21は糖尿病性腎症に保護的と思われた。また、間質特異的なTcf21KOは尿細管と集合管の著明な低形成を来たした。すなわち、Tcf21はポドサイトの保護や、腎間質の機能維持に重要と思われる。2種類の4重変異を有するTcf21KOマウス(テトラサイクリン誘導性全身性及びポドサイト特異的KOマウス)を確立でき、また既に予測されているTcf21のポドサイトにおける重要性の他、インスリン感受性への関与を見出す事ができたため。今後は分子生物学的な機序解明のため、ポドサイト培養系を用いてChIPアッセイを行ないダイレクトなターゲット分子の探索をおこなう。また、培養ポドサイトにCRISPRシステムを用いてTcf21のノックアウトを行ない、細胞の表現型の観察(形態、遊走、アポトーシスの評価)を行う。糖尿病性腎症ヒト不死化ポドサイトにてTcf21をretoro virusにより過剰発現させ、細胞の形態、actin fiberの分布、遊走、接着、増殖などの細胞機能が修飾されるか検討する。また、ポドサイト特異的TCf21KOマウスをimmortomouseと交配し、Tcf21 KOポドサイトを単離し培養系を確立し、in vitroの実験に供する。ヒト培養ポドサイトを用い、Tcf21のDNAへの結合をChIP-Seq法で網羅的に比較解析し、その標的遺伝子を同定する。今のところTcf21に対しては良い抗体が存在しないため、Flag tagを持つTcf21を安定的に過剰発現させたポドサイト細胞株を用い、anti-flagM2抗体を用いてChIP assayを行う。また、このTcf21-Flagを発現する細胞を用い、IP-mass specによりTcf21の結合因子を同定する。加えて、野生型およびテトラサイクリン誘導性ポドサイト特異的Tcf21KO (PiTcf21KO)マウス(6週齢)にStreptozotocin (50mg/kg x5日間)を腹腔内注射し糖尿病を誘導する。野生型、iTcf21KO、野生型糖尿病、iTcf21KO糖尿病の4群をモニターし尿蛋白、血糖、体重を測定する。糖尿病惹起後18週後にマウスをsacrificeし、腎障害の進行を組織学的に比較検討し、ポドサイト傷害ならびに糸球体の構造変化を評価する。このような研究により、糖尿病性腎症の研究に新たな発見を加える事ができると期待される。
加速度脈波による過労警告システムの開発

作業中の脈波の連続した計測を容易にするため耳朶から脈波を記録した。安静時2分間の記録では、安定した波形が記録された(記録装置は(株)ユメディカ製を使用した)。耳朶脈波の波形から、原波形を数学的に2回微分した加速度脈波を記録した。耳朶の加速度脈波は、指尖加速度脈波と同様にa,b,c,d,e波が確認されたが、指尖加速度脈波の波形とはやや異なっていた。耳朶および指尖の加速度脈波のそれぞれの指数b/a,c/a,d/a,e/aには、相関が認められるものもあった。作業時の耳朶からの記録では、頭部の動きがない場合は安定した波形が記録されたが、頭部や体動により波形が変化した。現在の耳朶への取り付け装置は、試験段階にあり形状が大きく、被検者への違和感も多い。このように耳朶からの記録装置の改良が必要であるものの、指先加速度脈波との比較では、波形指数に相関がみられたため、これまでの指先加速度脈波の研究成果が利用できる可能性がある。香りの疲労回復効果を検討するため男性参加者(30歳から60歳)に対する香りの印象評価をおこなった実験では、ラベンダー、柑橘系、ミント類、ジャスミン、クローブなどの香りをかがせて印象評価(7段階SD法、視覚アナログ尺度: VAS)と心電図RR間隔を記録した。好き嫌いの評価では柑橘、ミント類が好まれる結果が得られた。疲労感、ストレス感のVASによる評価では、柑橘、ミント類が小さかった。心電図RR間隔の心拍変動周波数解析により交感神経の評価尺度である低周波成分と高周波成分の比率をみると、ラベンダーで高く、ミント類、ジャスミンで低くなる傾向がみられた。この結果から男性に対する作業時の疲労減弱を図るため、ミント類の使用が有用である可能性が考えられた。疲労感や倦怠感は主観的な形容語でありその客観的な評価方法は皆無である。本研究は、(1)主観的な疲労感・倦怠感を客観的な数値で表現し、過労状態に至る前に警告を発生するアルゴリズムを構築し産業衛生に応用すること、ならびに(2)芳香療法に使用される精油による疲労回復や、疲労を減弱する効果を検証することである。(1)については、非観血的で計測が容易な加速度脈波から疲労感の指標を得ることに主眼をおいた。試験参加者に精神負荷作業をさせて作業中の加速度脈波、脳波を計測した。作業開始前後での加速度脈波の各指数、脳波の各周波数帯域のパワー値、および加速度脈波、脳波の時系列データを使用してカオス学的手法による自己相関関数、相関次元、リアプノフ指数等の変化を観察した。その結果、加速度脈波の指数に統計学的な有意差を認めた。また高次脳機能が疲労によりどのように変化するかを捕捉するため、注意力や弁別能力を試験するソフトを製作して精神負荷作業の前後で変化をみたが統計学的有意差は認めなかった。次年度では警告アルゴリズム構築のための追試、高次脳機能計測ソフトの改良が必要である。(2)では、日本アロマテラピー協会の推奨する芳香療法に使用される精油のうち、化学成分の大きく異なる精油を選択して参加者に対して官能試験を試行し、比較的多数の参加者に好感される精油を選別した。20代30代の健常な男女を対象にした試験では、柑橘系の精油は、他の精油に比較して多数の参加者に好まれる頻度が高かった。次年度においては他の年代層に対する試験を行い、大多数の参加者に嫌悪されない精油を使用して疲労減弱効果を検証する。心電図

RR間隔の心拍変動周波数解析により交感神経の評価尺度である低周波成分と高周波成分の比率をみると、ラベンダーで高く、ミント類、ジャスミンで低くなる傾向がみられた。この結果から男性に対する作業時の疲労減弱を図るため、ミント類の使用が有用である可能性が考えられた。
セルロースナノファイバー強化型義歯用材料の開発と義歯への実用化に向けた検討

義歯床の破折防止を目的として、義歯床の機械的性質を向上させるためにグラスファイバーなどの繊維性補強材を埋入し、義歯床を繊維強化型複合材料にする研究がなされてきた。近年、産業界において高強度の植物性ナノマテリアルであるセルロースナノファイバーが,合成樹脂材料の繊維性補強材として期待されている。歯科領域においては、義歯床用レジンの機械的強度を増加させる研究が進められているが、セルロースナノファイバーを繊維性補強材として用い義歯床用レジンの強度向上を示した研究はほとんどみられない。平成30年度の目的は、セルロースナノファイバー強化型複合材料を用いた義歯への実用化に向けた義歯の製作方法について検討することである。平成29年度ではセルロースナノファイバー含有の義歯床用射出成形型熱可塑性樹脂をサンプルとして作製した。本実験は、ISO20795-1に基づいた義歯床用レジン用の試料を作製し、曲げ試験を行い評価した。実験の結果、セルロースナノファイバー含有アクリルレジンと非含有アクリルレジンと比較したところ、セルロースナノファイバーによって曲げ強さが有意に向上したものはなかった。平成30年度ではセルロースナノファイバー含有の熱可塑性アクリル樹脂複合体から、従来型の射出成形型義歯床用レジンに配合し、曲げ試験を行い評価した。セルロースナノファイバー非含有レジンと比較したところ、5,10,15,23wt%でセルロースナノファイバー含有量が増えるにつれて曲げ強度および曲げ弾性係数が有意に向上したことがわかった。射出条件は従来型射出成形型義歯床用レジンと同様に設定したためセルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体においても義歯床の製作が可能であると考えられる。しかしながら、高湿潤環境で繰り返し衝撃荷重が負荷される口腔内環境での長期的変化については今後の検討課題となる。平成30年度ではセルロースナノファイバー非含有レジンと比較したところ、5,10,15,23wt%でセルロースナノファイバー含有量が増えるにつれて曲げ強度および曲げ弾性係数が有意に向上したことがわかった。射出条件は従来型射出成形型義歯床用レジンと同様にしたためセルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体においても、射出条件では熱分解は起きず、セルロースナノファイバーが凝集することなく分散し義歯床の製作が可能であると考えられる。しかしながら、高湿潤環境で繰り返し衝撃荷重が負荷される口腔内環境での長期的変化および義歯の審美性や研磨性などについては今後の検討課題となる。セルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体の色調についてはリグニン未含有のセルロースナノファイバーを用いることで改善が期待できる。また、高湿潤環境での長期的変化については熱サイクル負荷試験や長期水中浸漬試験などを行い機械的強度の変化を検討する。また粉液重合型が歯科用では頻用されるため、セルロースナノファイバーをモノマー溶液中に溶解させることで、常温重合レジンや加熱重合レジンなどに配合し義歯床用レジンの製作を検討する。平成29年度の目的は、セルロースナノファイバー強化型複合材料の機械的性質向上のための最適条件を明らかにすることである。義歯用材料の機械的性質の向上のため、過去に様々な研究が行われてきたが、義歯の破損は臨床において頻繁に見られる。従来の技術として、義歯床に金属補強線やガラス繊維などの補強用材料を添加して義歯を製作することは行われてきたが、未だ十分な機械的強度を有する義歯用材料が得られていない。そこで注目したのがセルロースナノファイバーである。セルロースナノファイバーの特徴として、1高強度(鋼鉄の5倍以上)、2高弾性率(鋼鉄の2/3)、3軽量(ガラス繊維の2/3の密度)、4低熱膨張性(ガラス繊維の1/50の線熱膨張係数)、5大きな比表面積(250m2/g以上)などを有する。その特徴のため、軽くて補強効果の高い複合材料の製作が可能となる。また複合材料として用いても透明で着色も可能な材料である。そこで、高強度のセルロースナノファイバーを義歯用材料の補強用繊維として用いれば、強くて軽い義歯用材料を開発することができると考えた。また、セルロースナノファイバーは植物由来なので、低コストで環境負荷が少ない材料として利用できる点が独創的である。平成29年度にはセルロースナノファイバー含有の義歯床用射出成形型熱可塑性樹脂をサンプルとして作製した。セルロースナノファイバーは、水存在下で機械的解裁法によりパルプなどから作製するため、水分分散液または含水状態にあるのが一般的である。これらをいったん乾燥させるとセルロース分子間の強い水素結合によって凝固・凝集が起こり、セルロースナノファイバーの樹脂強化能など優れた特性が活かせなくなる。ポリメチルメタクリレートにセルロースナノファイバーを少量含有させて射出成形型熱可塑性樹脂を曲げ試験したが、まだレジン中に均一に分散できていないことと、セルロースナノファイバーが200°Cを超えると熱劣化が始まることからセルロースナノファイバーの補強性が十分に発揮できなかったことが考えられる。平成30年度ではこれに対する対策案を加えて検討し,進行遅れを取り戻す予定としている。

近年、産業界において高強度の植物性ナノマテリアルであるセルロースナノファイバーが,合成樹脂材料の繊維性補強材として期待されている。歯科領域においては、義歯床用レジンの機械的強度を増加させる研究が進められているが、セルロースナノファイバーを繊維性補強材として用い義歯床用レジンの強度向上を示した研究はほとんどみられない。平成30年度の目的は、セルロースナノファイバー強化型複合材料を用いた義歯への実用化に向けた義歯の製作方法について検討することである。平成29年度ではセルロースナノファイバー含有の義歯床用射出成形型熱可塑性樹脂をサンプルとして作製した。本実験は、ISO20795-1に基づいた義歯床用レジン用の試料を作製し、曲げ試験を行い評価した。実験の結果、セルロースナノファイバー含有アクリルレジンと非含有アクリルレジンと比較したところ、セルロースナノファイバーによって曲げ強さが有意に向上したものはなかった。平成30年度ではセルロースナノファイバー含有の熱可塑性アクリル樹脂複合体から、従来型の射出成形型義歯床用レジンに配合し、曲げ試験を行い評価した。セルロースナノファイバー非含有レジンと比較したところ、5,10,15,23wt%でセルロースナノファイバー含有量が増えるにつれて曲げ強度および曲げ弾性係数が有意に向上したことがわかった。射出条件は従来型射出成形型義歯床用レジンと同様に設定したためセルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体においても義歯床の製作が可能であると考えられる。しかしながら、高湿潤環境で繰り返し衝撃荷重が負荷される口腔内環境での長期的変化については今後の検討課題となる。平成30年度ではセルロースナノファイバー非含有レジンと比較したところ、5,10,15,23wt%でセルロースナノファイバー含有量が増えるにつれて曲げ強度および曲げ弾性係数が有意に向上したことがわかった。射出条件は従来型射出成形型義歯床用レジンと同様にしたためセルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体においても、射出条件では熱分解は起きず、セルロースナノファイバーが凝集することなく分散し義歯床の製作が可能であると考えられる。しかしながら、高湿潤環境で繰り返し衝撃荷重が負荷される口腔内環境での長期的変化および義歯の審美性や研磨性などについては今後の検討課題となる。セルロースナノファイバーは親水性の物質のため疎水性のレジンとは混合しにくく、均一に分散させづらい。現在多くの化学変性を試み、段々と補強性に優れた化学構造が明らかになって来た。セルロースがもつ反応基を疎水性に置換する化学変性をセルロースナノファイバーに反応させ、疎水性のレジンへの分散性を向上させることで、セルロースナノファイバー複合材料の強度向上が考えられる。また、その化学変性方法についても、対策案を検討している。セルロースナノファイバー含有アクリル樹脂複合体の色調についてはリグニン未含有のセルロースナノファイバーを用いることで改善が期待できる。
ＲＡＦ１遺伝子変異におけるヌーナン症候群発症メカニズムの解明

(1)RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群9症例(生後2か月16歳)の詳細な臨床症状を収集し、9症例中4例が就学前に死亡、就学している5症例中4例が支援学級に通っているなど、長期的な自然歴を明らかにした。(2)先天異常症候群が疑われる患者を診断に導く遺伝学的検査の実施体制を構築した。具体的にはマイクロアレイ染色体検査を導入した。また、マイクロアレイ染色体検査から得られた結果によって患者家族にもたらされる心理社会的影響について文献的レビューを実施し、マイクロアレイ染色体検査実施前後の遺伝カウンセリングの在り方を明らかにした。分子生物学的観点と臨床的観点からヌーナン症候群の発症メカニズムを明らかにすることを目的として、本年度は以下の研究を施行した。1.臨床症状からヌーナン症候群関連疾患が疑われる患者の検体を全国から収集した。収集した検体の遺伝子解析を施行した。現時点ではRAF1遺伝子に変異を認めるヌーナン症候群は18症例だった。2.RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群の臨床症状の詳細な検討を実施するために、文献検索を施行した。その上で、主治医からの臨床情報収集を開始した。3.遺伝子解析方法としてRAF1遺伝子直接シークエンス法に加えて、マイクロアレイ染色体検査法を導入した。対象検体の遺伝子解析中にマイクロアレイ染色体検査で他の先天異常症候群(Pallister-Killian症候群)であることが判明した症例を経験した。ヌーナン症候群を始めとする先天異常症候群の鑑別を施行する際にはマイクロアレイ染色体検査が有用であることを経験し、本研究対象疾患であるヌーナン症候群の検体を効率よく収集するためにも、マイクロアレイ染色体検査での他の先天異常症候群の除外が必要であることが明らかとなった。4.ヌーナン症候群やヌーナン症候群関連疾患の遺伝子解析や自然歴収集を施行していく中で、遺伝カウンセリングの必要性が出現した。そのため、遺伝カウンセリング体制の構築に向けての準備を開始した。1.臨床症状からヌーナン症候群またはヌーナン症候群関連疾患が疑われる患者の検体を全国から収集した。2.収集した検体の遺伝子解析を施行した。18症例でRAF1遺伝子に変異を認めるヌーナン症候群であることが確定した。臨床症状からはヌーナン症候群関連疾患が疑われた症例の中に、当初予定していた直接シークエンス法では遺伝子変異が認められず、遺伝子解析法にマイクロアレイ染色体検査法を加えることによって、他の先天奇形症候群(Pallister-Killian症候群など)であることが確定した症例を認めた。3.RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群患者では肥大型心筋症を高率に合併することの関連を明らかにするためにRAF1遺伝子機能解析を施行した。具体的には、ヌーナン症候群で認められるRAF1遺伝子変異はS257L変異が最多であり、この変異のタンパク発現プラスミドを作成し、心筋細胞株にRAF1変異遺伝子を導入した。野生型と変異型遺伝子導入細胞でのRAF1タンパク発現状態を比較検討した。4.平成25年度の研究実施計画に記載した、RAF1遺伝子変異陽性ヌーナ症候群の臨床症状の詳細な検討を実施するための準備をした。具体的には、RAF1遺伝子変異型と表現型との相関を明らかにするために必要な肥大型心筋症以外の臨床症状項目を列挙するために文献検索を施行した。分子生物学的観点と臨床的観点からヌーナン症候群の発症メカニズムを明らかにすることを目的として、本年度は以下の内容で研究を進めた。1.臨床症状からヌーナン症候群関連疾患が疑われる患者の検体を全国から収集し、遺伝学的解析を継続的に施行した。2.RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群の臨床症状の詳細検討を実施するために、主治医への質問紙による調査を施行した。9症例のRAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群の詳細な自然歴を収集することができた。3.RAF1遺伝子直接シークエンス法に加えて、マイクロアレイ染色体検査法を遺伝学的解析方法として導入した所、ヌーナン症候群以外の先天異常症候群(Pallister-Killian症候群や染色体微細欠失症候群など)であることが確定した症例を経験した。解像度高く染色体全体を網羅的に検索できるマイクロアレイ染色体検査の導入により、染色体異常症を除外した検体収集が可能となった。4.ヌーナン症候群をはじめとする先天異常症候群に関して、診断につなげられる分子遺伝学的検査の活用法を検討した。5.本研究の遺伝子解析でRAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群であることが判明した患者の中に、遺伝子変異が片親から伝播している症例がいた。また、遺伝学的解析方法としてマイクロアレイ染色体検査法を導入したことにより、ヌーナン症候群ではない別の先天異常症候群であることが判明した症例がいた。遺伝学的検査により、ヌーナン症候群をはじめとする先天異常症候群の患者もしくはその家族が予想していなかった結果が出された際の遺伝カウンセリングをどの様にすれば良いのか、文献的系統レビューにて検討した。分子生物学的観点と臨床的観点からヌーナン症候群の発症メカニズムを明らかにすることを目的として、最終年度は以下の内容で研究を進めた。1.9症例(生後2か月16歳)のRAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群の詳細な臨床症状を収集し、自然歴をまとめた。9症例中4症例が就学前に死亡、就学している5例中4例が支援学級に通っているなど、長期的な自然歴が明らかとなった。得られた結果は英語学会雑誌へ投稿準備中である。

2.ヌーナン症候群をはじめとする先天異常症候群が疑われる患者の診断につなげるための遺伝学的検査を実施できる体制を構築した。具体的には、マイクロアレイ染色体検査を導入する一端を担った。その結果、ヌーナン症候群類縁疾患が疑われる患者が染色体微細欠失症候群やテトラソミーモザイク疾患と確定診断がつけられた症例を認めた。3.ヌーナン症候群をはじめとする先天異常症候群の患者が、診断を目的にマイクロアレイ染色体検査を実施した場合、得られる結果は4種類に分類される。数的変化を1)認めなかった場合、2)認めた場合で1病的変化、2臨床的意義不明の変化(VUS: Variants of uncertain significance)、3偶発的所見(IFs:Incidental Findings)の4種類である。各々の結果が患者と家族・その患者を担当している医療者にもたらす心理社会的影響について文献的レビューを実施した。その結果、マイクロアレイ染色体検査を含む網羅的遺伝学的検査実施前後の遺伝カウンセリングの在り方を明らかにすることができた。(1)RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群9症例(生後2か月16歳)の詳細な臨床症状を収集し、9症例中4例が就学前に死亡、就学している5症例中4例が支援学級に通っているなど、長期的な自然歴を明らかにした。(2)先天異常症候群が疑われる患者を診断に導く遺伝学的検査の実施体制を構築した。具体的にはマイクロアレイ染色体検査を導入した。また、マイクロアレイ染色体検査から得られた結果によって患者家族にもたらされる心理社会的影響について文献的レビューを実施し、マイクロアレイ染色体検査実施前後の遺伝カウンセリングの在り方を明らかにした。当初の計画では、分子生物学的観点と臨床的観点からヌーナン症候群の発症メカニズムの一端を明らかにすることを目的としていたが、途中年度から臨床的観点からの検討に重点を置くことに変更している。変更に伴ない遺伝カウンセリング体制作りが必要となった。臨床的観点からの検討では、データ収集が完了しているが発表できる段階にまでは至っていない。遺伝カウンセリング体制作りに向けての文献的系統レビューは完了しているが、体制が構築できる段階にまでは至っていない。そのため、研究期間を1年間延長する方針となり、科学研究費助成事業補助事業期間延長が2015年3月20日に承認された。臨床遺伝学臨床的観点からの検討で収集したデータを取りまとめ、学会や論文で発表する。遺伝カウンセリング体制作りに向けて施行した文献的系統レビューに関して学会や論文で発表しつつ、ヌーナン症候群をはじめとする先天異常症候群に対して遺伝子解析により診断された時の遺伝カウンセリング体制作りを進めていく。本年度は、RAF1遺伝子変異陽性ヌーナン症候群の臨床症状を詳細に検討し、臨床的観点からヌーナン症候群の発症メカニズムを明らかにすることを中心的に施行した。
電気防食の大気腐食への適用に関する基礎研究

種々の塗装を施した炭素鋼板を短冊状(幅50mm、長さ1m)に切り、この長手方向の一方の端にアノードを取り付け、さらにアノードから所定の距離の所に人工欠陥としてドリル穴をあけた。これに所定の量の海塩を与えた後アノード-炭素鋼間に種々の電圧を負荷し、このときの電流を測定しつつ欠陥部の電極電位の測定を行った。こうして、相対湿度,海塩付着量,塗料の親水性,付加電圧の大きさ,欠陥位置などが欠陥部の電位や流入電流に及ぼす影響を調べることにより,大気腐食へのカソード防食の有効性の検討を行なった.その結果、塗料に親水性のものを用い,塗料膜面上の海塩付着量が多く、湿度が高いほど電極電位が卑化し、本防食法が有効であることが確かめられた。このように、腐食性の高い-海塩付着量が多く、湿度湿度が高い-環境ほど防食効果が発揮されることは、本防食法の大きな利点であるといえる。本試片について1次元モデルの等価回路を考えて,測定結果を解析することにより,アノード持ち上げ部抵抗、塗膜上水膜抵抗、分極抵抗、あるいは欠陥部流入電流などが相対湿度の関数として得られ,所定の条件における電極電位の推定および防食設計が可能となった.これにより,以下の知見をえた:1)塗装面の欠陥が1つしかないという良好な塗装状態であるならば,かなりの距離(35m)まで防食電流が到達可能である。2)塗装面の欠陥が2つ存在する場合,どちらも防食することは困難であるが,アノード近傍の防食は可能である.その際には欠陥配置を考えた防食設計が必要である.3)アノードへの付加電圧の大部分がアノード持ち上げ部で消費されており,この部分の抵抗値をいかに小さくするかが,今後の課題である.種々の塗装を施した炭素鋼板を短冊状(幅50mm、長さ1m)に切り、この長手方向の一方の端にアノードを取り付け、さらにアノードから所定の距離の所に人工欠陥としてドリル穴をあけた。2)塗装面の欠陥が2つ存在する場合,どちらも防食することは困難であるが,アノード近傍の防食は可能である.その際には欠陥配置を考えた防食設計が必要である.3)アノードへの付加電圧の大部分がアノード持ち上げ部で消費されており,この部分の抵抗値をいかに小さくするかが,今後の課題である.近年、腐食が進行するのは降雨時あるいは結露時など水膜が存在する場合であることから、この水膜を通して電流を流すことで大気腐食にも電気防食を適用できる可能性が示され、種々の方法が提案されている。本研究の目的は、本手法の防食能におよぼす種々の因子の影響について調べ、これを実用化させることである。本年度は、種々の塗料による塗装を施した鋼板に人工欠陥を与え、これに防食電流を流しつつ欠陥部の電位を測定し、これらにおよぼす塗装膜の吸湿性やぬれ性、アノード持ち上げ材、電源電圧あるいは海塩付着の有無などの影響について調べた。絶縁体アノード持ち上げ材(5mm厚のPMMA板)、電源電圧15V、という条件で測定を行ったところ、非親水性塗料を塗った試片では降雨時にのみ電位が卑化したのに対して、親水性塗料を塗った試片では結露時にも電位が卑化した。以下では試片を降雨の直接当たらない屋外に設置し、結露時での防食効果におよぼす各因子の影響について調べた。つぎに、アノード持ち上げ材を導電性のもの(5mm厚の飽和KCl含有寒天)にしたところ、非親水性塗料を塗った試片においても結露時の電位卑化が見られた。また、電源電圧を10Vまで下げたところ、いずれの条件下でも電位卑化がおこらなかった。以上のように、親水性塗料および導電性アノード持ち上げ材を採用して適正な電源電圧(現在のところ15V)を与えることによって、本防食法を大気腐食にも適用できる見通しが得られた。塗装面に海塩を付着させると電位はさらに卑化した。したがって、従来腐食環境が厳しいとされる海洋性環境において、本防食法が有効に働く可能性がある。

種々の塗装を施した炭素鋼板を短冊状(幅50mm、長さ1m)に切り、この長手方向の一方の端にアノードを取り付け、さらにアノードから所定の距離の所に人工欠陥としてドリル穴をあけた。これに所定の量の海塩を与えた後アノード-炭素鋼間に種々の電圧を負荷し、このときの電流を測定しつつ欠陥部の電極電位の測定を行った。こうして、相対湿度,海塩付着量,塗料の親水性,付加電圧の大きさ,欠陥位置などが欠陥部の電位や流入電流に及ぼす影響を調べることにより,大気腐食へのカソード防食の有効性の検討を行った.その結果、塗料に親水性のものを用い,塗装膜面上の海塩付着量が多く、湿度が高いほど電極電位が卑化し、本防食法が有効であることが確かめられた。このように、腐食性の高い-海塩付着量が多く、湿度湿度が高い-環境ほど防食効果が発揮されることは、本防食法の大きな利点であるといえる。本試片について1次元モデルの等価回路を考えて,測定結果を解析することにより,アノード持ち上げ部抵抗、塗膜上水膜抵抗、分極抵抗、あるいは欠陥部流入電流などが相対湿度の関数として得られ,所定の条件における電極電位の推定および防食設計が可能となった.これにより、以下の知見をえた:1)塗装面の欠陥が1つしかないという良好な塗装状態であるならば,かなりの距離(35m)まで防食電流が到達可能である。2)塗装面の欠陥が2つ存在する場合,どちらも防食することは困難であるが,アノード近傍の防食は可能である.その際には欠陥配置を考えた防食設計が必要である.3)アノードへの付加電圧の大部分がアノード持ち上げ部で消費されており,この部分の抵抗値をいかに小さくするかが,今後の課題である.
精神的ストレスによる疾病リスクに対するローズマリー成分の効果

我々は、精神的ストレスによる疾病リスクに対するローズマリー成分の効果を明らかにすることを目的とし、拘束によりストレス状態にしたマウスに対するカルノシン酸(CA)及びローズマリー葉抽出物(RLE)の効果を調べた。その結果、一定時間の拘束処置によって引き起こされた血清IL-6及びコルチコステロンの増大が、CA摂取により軽減されることがみられた。また拘束処置による小腸の杯細胞数の減少と肝臓脂質含量の変動が、RLE摂取により改善されることがみられた。以上より、CAが抗ストレス効果を有することが示唆された。精神的ストレスによる疾病リスクに対して、CAが有効な軽減効果を示す可能性が考えられた。本年度は、精神的なストレスとして拘束ストレスを負荷したマウスの腸内環境及び血中成分に対して、ローズマリー成分のカルノシン酸摂取が与える影響を明らかにすることを目的とした。Balb/cマウスに精神的ストレスとして5日間の拘束ストレスを与えたところ、ストレス負荷により体重増加の有意な減少が確認された。このストレス負荷マウスにおいて、ノーマル群では検出されなかった腸内のClostridium cluster XIが増大しており、この増大がカルノシン酸摂取により抑制されることが明らかになった。また、ストレス負荷マウスで増大した血中炎症性サイトカインがカルノシン酸摂取により抑制される傾向がみられた。成果は学会発表のみであるが、カルノシン酸摂取による傾向を確認することができ、次年度の研究に結びつく結果を得る事ができたため。神経細胞保護作用と脳機能改善作用を示すローズマリー成分カルノシン酸について、抗ストレス効果を検証するために、平成27年度には拘束ストレス負荷マウスの腸内細菌叢や炎症性サイトカインに対する影響を明らかにした。本年度は、さらに詳細な影響を明らかにするために、ストレス強度を高めた状態での拘束ストレス負荷マウスの腸内環境、血清・肝臓因子に対するカルノシン酸摂取の影響を検討した。なお、拘束ストレスは精神的ストレスを与えることを目的として負荷した。方法としては、Balb/c雄マウス(5週齢)をノーマル群、拘束ストレスを負荷したコントロール群、カルノシン酸を摂取させ拘束ストレスを負荷したカルノシン酸群の3群に分け、30日間飼育した。カルノシン酸群には50 μMカルノシン酸水溶液を飲水として自由摂取させた。7日間一日5時間の拘束ストレスを与えた後、解剖し、血液・肝臓成分の分析、組織化学的評価、腸内細菌叢の解析、小腸・大腸での遺伝子発現の分析を行った。その結果、ストレスホルモンの一種である血清コルチコステロン濃度について、ノーマル群と比較し、ストレスを負荷したコントロール群での有意な上昇が確認され、カルノシン酸群ではこの上昇が抑制された。またストレス負荷によるコントロール群での腸内細菌叢の変動が、カルノシン酸群では改善していた。さらに、小腸の組織化学的評価から、コントロール群にて確認された杯細胞の減少が、カルノシン酸群では改善していた。これらより、カルノシン酸摂取が拘束ストレス負荷マウスに対して、好ましい影響を与える可能性が示唆された。一方、脂質代謝への影響についても検討を加えた。拘束ストレス負荷マウスに対するローズマリー成分カルノシン酸摂取の影響について、著しくはないものの一定の効果を与えることを明らかにすることができた。一方で、マウスの拘束時間の延長がストレス強度を高めるとは単純には言えない面もあり、拘束ストレス負荷による実験モデルの再検討も行う必要がある。ストレス社会といわれる現代、健康を維持するためには、様々な疾病の発症や進行リスクとなるストレスへの対応が求められている。本研究は、ローズマリーに含まれる機能性成分であるカルノシン酸を対象として、ストレスによる疾病リスクに対する改善効果を明らかにすることを目的としている。平成27・28年度の検討により、一定時間拘束し、ストレス状態としたbalb/c雄マウスにおいて、カルノシン酸摂取により血清炎症性サイトカイン濃度、血清コルチコステロン濃度の変動に対する改善効果がみられた。さらに腸内細菌叢の変化、小腸の杯細胞数の減少といったストレス状態における腸内環境の変動に対しても、カルノシン酸摂取による改善傾向がみられた。ローズマリーにはカルノシン酸の他にも、カルノソール、ロスマリン酸といった抗酸化成分や特有の香り成分が含まれている。そこで、平成29年度は、ローズマリー成分の複合的な効果を明らかにすることを目的とし、ローズマリー抽出物を調製し、ストレス状態のマウスへの効果を検討した。その結果、連続5日間一定時間拘束することによりストレス状態としたbalb/c雄マウスにおいて、ローズマリー葉エタノール抽出物の摂取により、ストレスの指標となる糞排泄量増大の抑制傾向、小腸の杯細胞数減少への改善効果がみられた。さらに、これは肝臓脂質含量の結果とも連動していた。以上より、カルノシン酸は単体、及び他の成分との混合物であるローズマリー抽出物において、拘束ストレス負荷マウスの腸内環境に対して好ましい影響を与えることが示唆された。カルノシン酸が抗ストレス効果を示す成分として有効に機能する可能性が考えられた。

ストレス負荷実験のモデルを再検討し、カルノシン酸を含むローズマリー成分を摂取した場合の効果について検討する予定である。小腸・大腸の遺伝子・たんぱく質発現、小腸・大腸・脳の組織科学的分析、肝臓・血清成分を中心にストレス負荷による変化がローズマリー成分摂取により改善されたかを分析することとする。血管新生関連因子についても分析を行う。今後は、拘束ストレス負荷による実験モデルを再検討した上で、カルノシン酸の効果のメカニズムを、組織化学的分析や遺伝子発現の解析により明らかにしていきたい。また、様々なローズマリー成分を含んでいるローズマリー抽出物を摂取した場合の影響についても、カルノシン酸単体の場合と比較し、検討したい。食生活学大学の基礎研究費の削減により、学会出張の予算を当初予定より多く使用することとなった。このため、前倒し使用の申請を行い、交付を受けた。しかし、試薬等をキャンペーン価格で購入できたことから予定より予算の執行が少なく、繰り越し金が生じた。前倒し申請を行っており、当初は平成29年度に使用する予定の予算であったため、計画どおり執行を行いたい。
異種臓器移植ドナーとしての遺伝子改変ブタ作出技術の開発

1)トランスジェニックブタ作出の基礎技術、すなわち卵成熟・体外受精・受精卵の体外発生、核移植、胚凍結、胚移植などの技術を確立した。特に体外で作出した脱出胚盤胞がフィーダー細胞に接着して増殖し、胚由来細胞のコロニーを形成することを明らかにした。作製した胚由来細胞は凍結保存している。また、ブタ体外成熟卵子から核を除く顕微操作法を確立した。3)ヒアルロン酸の体外生産ブタ胚の発生への影響は卵の成熟・受精における条件によりその影響が異なることを明らかにした。4)脱出胚盤胞から作成したブタ胚由来細胞は長期間体外で維持することが可能で、除核未受精卵への核移植により脱出胚盤胞期胚まで発生した。5)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を含むベクターを作成し、報告者が開発した胚由来細胞に導入し、導入細胞を選別する方法を開発した。GFP導入細胞は現在、凍結保存している。6)GFP発現胚由来細胞を除核成熟卵子に導入し、融合させ、活性化させる条件を明らかにした。現在、脱出胚盤胞期胚まで発生させることに成功している。1)異種臓器移植ドナーとしての遺伝子ノックアウトブタの開発戦略を構築した。すなわち、卵巣卵を体外成熟させ、除核未受精卵をつくる。また体外成熟卵を体外受精・体外発生させ、胚盤胞をつくり、そのような胚盤胞から胚性幹細胞をつくる。相同組み換えによりGalT遺伝子ノックアウトES細胞をつくり、これを除核未受精卵に移植する。このような再構築胚を体外で培養し、生存胚を仮親に移植し、糖鎖抗原をもたないブタをつくる。2)未成熟卵子の2030%を胚盤胞にまで発生させる体外成熟・体外受精・体外培養法を確立した。3)体外で作出した脱出胚盤胞がフィーダー細胞に接着して増殖し、胚由来細胞のコロニーを形成することを明らかにした。4)ブタ体外成熟卵子から核を除く顕微操作法を確立した。5)除核した成熟卵子に胚由来細胞を導入する方法を開発した。またそれらを電気的に融合させる条件を明らかにした。特に効率的に電気融合を誘起させる電気プローブを開発した。6)融合した再構築胚を発生させることに成功した。7)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を含むベクターを開発し、上記で開発した胚由来細胞に導入し、導入細胞を選別する方法を開発した。8) GFP発現胚由来細胞を除核成熟卵子に導入し、融合させ、活性化させる条件を明らかにした。現在、23細胞期まで発生させることに成功している。9) 8)で作製した分割卵を仮親に移植し、その後の発生について解析している。1)核移植用のレシピエント卵として使用可能な成熟卵を大量に調整する方法を開発した。2)未成熟卵子を体外成熟・体外受精・体外培養により脱出胚盤胞期胚まで発育させるため、ヒアルロン酸添加NCSU-23を基本とした培養液を開発した。3)体外で作出した脱出胚盤胞から作製した胚由来細胞は継代30回まで安定した形態を示し、遺伝子操作も可能であった。4)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を含むベクターを開発し、上記で開発した胚由来細胞に導入した。さらにGFP発現胚由来細胞を除核成熟卵子に導入し、効率的に融合させ、活性化させる条件を決定した。5)GFP発現再構築胚を脱出胚盤胞期胚に発生させる条件を決定した。6)5)でGFP発現再構築胚に発生能があることが明らかになったので再構築胚を仮親に移植した。7)移植する仮親を1回につき2頭用意した。性腺刺激ホルモンで発情排卵を誘起し、交配させ、受精卵をもつ個体に再構築胚を移植した。8)受精卵をもつ個体の卵管を潅流し、回収した受精卵35個と再構築胚を混合し、卵管に移植した。現在までに約1000個の再構築胚を20頭の仮親に移植し、胎子への発生を解析している。9)異種抗原産生酵素の遺伝子をノックアウトするベクターを開発した。10)9)で開発したベクターを用い、異種抗原産生酵素の遺伝子をノックアウトした胚由来細胞を作製中である。ES様細胞と核移植を用いる独自の戦略の下で(1)ES様

細胞に遺伝子(補体抑制蛋白質遺伝子など)を導入したり、標的遺伝子改変によりGa1T遺伝子などの遺伝子をノックアウトした細胞をつくり、これを除核未受精卵に移植する、このような再構築胚を(2)体外で培養し、(3)生存胚を仮親に移植するについて検討し次の成果を得た。(1)ブタ体外成熟卵子から核を除く顕微操作法を確立した。(2)除核した成熟卵子に胚由来細胞を導入する方法を開発した。またそれらを電気的に融合させる条件を明らかにした。特に効率的に電気融合を誘起させる電気プローブを開発した。(3)融合した再構築胚を発生させることに成功した。(4)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を含むベクターを開発し、上記で開発した胚由来細胞に導入し、導入細胞を選別する方法を開発した。GFP導入細胞は現在、凍結保存している。(5)GFP発現胚由来細胞を除核成熟卵子に導入し、融合させ、活性化させる条件を明らかにした。現在、脱出胚盤胞期胚まで発生させることに成功している。(6)作製した分割卵を仮親に移植し、その後の発生について次の2通りの方法で解析している。すなわち移植する仮親を1回につき2頭用意し、性腺刺激ホルモンで発情排卵を誘起し、交配させ、受精卵をもつ個体に再構築胚を移植した。また、受精卵をもつ個体の卵管を潅流し、回収した受精卵35個と再構築胚を混合し、卵管に移植した。現在までに約1000個の再構築胚を20頭の仮親に移植し、胎子への発生を解析している。(7)異種抗原産生酵素の遺伝子をノックアウトするベクターを開発した。
フェムト秒レーザ光造形法によるマイクロ熱加工用素子の開発

本研究では,これまで我々が取り組んできた,電界放出およびそれに続くマイクロプラズマ生成による材料加工プロセス(マイクロ熱加工)の更なる高度化を目指して,高い構造形成自由度を有するフェムト秒レーザ光造形法を駆使することで,マイクロ熱加工用素子の開発を行った.以下に得られた知見を示す.1.フェムト秒レーザによるレジストパターニングフェムト秒レーザ誘起非線形光吸収とエッチングプロセスを複合化することで,従来の半導体プロセスでは困難であった,立体基板上への構造形成を実現した.2.カーボンナノチューブを先端部に位置選択合成した針状微細電極電界放出特性に優れたカーボンナノチューブを前面に合成した針状微細電極を用い,電極先端部の曲率,被加工試料とのギャップ長,印加電圧をパラメータとして変化させ,金薄膜に電界放出による直接加工を行った.曲率と印加電圧が大きいほど,また,ギャップ長が小さいほど,加工は容易であり,直径2μm程度の円形パターンを形成した.電極先端部1μm程度の領域のみナノチューブを合成した電極では電界放出によってサブミクロンオーダでの直接加工を実現した.3.アレイ型マイクロプラズマ源半導体プロセスによってSiウェハー中に作製したホローカソード型微細電極(直径30μm)をアレイ化し,大気圧アルゴン雰囲気下では安定なグロー放電を得た.微量の酸素を混ぜることで,マイクロプラズマによるレジスト材料のマスクレス加工を実現した.本研究では,これまで我々が取り組んできた,電界放出およびそれに続くマイクロプラズマ生成による材料加工プロセス(マイクロ熱加工)の更なる高度化を目指して,高い構造形成自由度を有するフェムト秒レーザ光造形法を駆使することで,マイクロ熱加工用素子の開発を行った.以下に得られた知見を示す.1.フェムト秒レーザによるレジストパターニングフェムト秒レーザ誘起非線形光吸収とエッチングプロセスを複合化することで,従来の半導体プロセスでは困難であった,立体基板上への構造形成を実現した.2.カーボンナノチューブを先端部に位置選択合成した針状微細電極電界放出特性に優れたカーボンナノチューブを前面に合成した針状微細電極を用い,電極先端部の曲率,被加工試料とのギャップ長,印加電圧をパラメータとして変化させ,金薄膜に電界放出による直接加工を行った.曲率と印加電圧が大きいほど,また,ギャップ長が小さいほど,加工は容易であり,直径2μm程度の円形パターンを形成した.電極先端部1μm程度の領域のみナノチューブを合成した電極では電界放出によってサブミクロンオーダでの直接加工を実現した.3.アレイ型マイクロプラズマ源半導体プロセスによってSiウェハー中に作製したホローカソード型微細電極(直径30μm)をアレイ化し,大気圧アルゴン雰囲気下では安定なグロー放電を得た.微量の酸素を混ぜることで,マイクロプラズマによるレジスト材料のマスクレス加工を実現した.我々は,これまでに針状微細電極先端からの電界放出およびそれに続くマイクロアークの生成による微細加工プロセス(マイクロ熱加工)に独自に取組んできた.本研究では,このマイクロ熱加工プロセスの高度化を目指し,高い電界放出,あるいは高密度プラズマ生成が期待できる微細電極素子の作製とその特性評価を行った.本研究で得られた知見を以下に示す.1.フェムト秒レーザリソグラフィーによる化学増幅型ネガ/ポジレジストのパターニング特性評価を行い,多光子吸収による内部露光を確認するとともに,レーザパルスのレジスト中でのフィラメンテーションを利用した高アスペクト比パターニング法を提案した.また,プラズマエッチングとの複合プロセスにより,絶縁材料であるSiO_2薄膜の立体的表面加工を実現した.2.カーボンナノチューブの針状微細電極先端部への位置選択合成電界放出特性に優れたカーボンナノチューブを針状微細電極先端部に合成し,その電界放出特性評価を行った.フェムト秒レーザをリソグラフィー露光源として用いることで,3次元形状である針状電極への触媒金属のパターニングを行った.その後,プラズマCVD法でカーボンナノチューブを成長させた.真空雰囲気下において,この微細電極をステンレス板に近づけて電流-電圧特性を評価したところ,優れた電界放出特性を示した.3.アレイ型マイクロプラズマ素子の作製半導体プロセスを用いて,Siウェハー中にマイクロプラズマ生成のためのキャビティアレイを作製した.カソードSiの異方性エッチングにより,逆ピラミッド構造を形成するとともに,ルーフ状のSiO_2絶縁層を作製し,最後にアノードとしてニッケル薄膜/Cuメッシュを形成した.大気圧下でのプラズマ生成を確認した.これらの成果は,学術雑誌や国内外の学会において発表した.本研究では,これまで我々が取り組んできた,電界放出およびそれに続くマイクロプラズマ生成を用いた材料加工プロセス(マイクロ熱加工)の更なる高度化を行った.本年度に得られた知見を以下に示す.1.カーボンナノチューブ先端部に合成した針状微細電極針状電極およびカーボンナノチューブを全面に合成した針状電極を用い,針状電極の曲率,被加工試料とのギャップ長,印加電圧をパラメータとして変化させ,金薄膜に電界放出によう直接加工を行った.曲率と印加電圧が大きいほど,また,ギャップ長が小さいほど,加工は容易であった.フェムト秒レーザ誘起非線形光吸収を利用した新規パターニング手法を用いて,針状電極先端1μm程度の領域にのみカーボンナノチューブを位置選択合成した電極では,サプミクロンオーダでの電界放出による直接加工が実現した.2.アレイ型微細電極の作製と評価

半導体プロセスによって作製したホローカソード型微細電極に関して,アルゴン,酸素雰囲気下での放電特性評価を行った.大気圧近傍での最適な電極間距離はおよそ30μmであった.アルゴン中では安定なグロー放電が得られたが,酸素中では不安定化し,しばしばアークへの移行が観察された.アルゴン/酸素混合ガス雰囲気下でマイクロプラズマを生成し,レジスト材料へのマスクレス加工を試み,直径30μmの直接加工を実現した.これらの研究成果は,プラズマ化学やレーザ精密微細加工に関する国際会議,応用物理学会,溶接学会などで発表を行った.