hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発性胆汁性肝硬変における免免応答機序の解明と診断・治療法の確立

3.PBCに対する免疫療法を開発することを目的に、PBC患者末梢血より自己抗原特異的T細胞を誘導し、誘導された自己抗原特異的T細胞の機能を解析した。PBC患者末梢からCD8陽性で自己抗原であるPDC-E2抗原を特異的に認識する自己抗原特異的T細胞が誘導可能であった。自己抗原特異的CD8陽性T細胞は抗原特異的な細胞傷害性活性を示した。自己抗原が自己抗体と免疫複合体を形成し、特異的レセプターを介して樹状細胞に取り込まれる過程には、細胞質内のプロテアソームの作用が必要であることが証明された。原発性胆汁性肝硬変(PBC)の病態形成の中心と考えられる免疫応答機序を解明し、診断・治療法の確立を目的として研究を行った。PBCの胆管上皮細胞障害に関する標的抗原の全貌は未だ明らかではないが、胆管細胞に発現する自己抗原に対する自己免疫機序が想定されている。一方、胆管は解剖学的に腸管内微生物に暴露されやすい部位にあることから、胆管細胞には、炎症、自然免疫、獲得免疫などに関連して多様な免疫制御機構が発達してきた可能性がある。そこで本年度は、ミトコンドリア抗原エピトープ(PDC-E2 163-17)特異的T細胞クローンとヒト培養胆管上皮細胞(BEC)を用いて、(1)BECの抗原提示細胞(antigen presenting cell : APC)としての機能、(2)BECのAccessory Cell (AC)としての機能について検討した。BECでは、抑制性second signalを伝える補助分子(PD-L1、PD-L2)の発現やprostaglandin-E2(PG-E2)などの抗炎症性液性因子の分泌を介して、T細胞の活性化を抑制する多彩な免疫制御機構を有することが示された。一方、PBCには、長期間の経過観察でもほとんど進行しない予後良好な症例と、進行して肝不全に至る予後不良な症例とが混在するこが知られているが、両者を鑑別するために有用な血清マーカーは存在しない。PBCで陽性化する抗核膜孔蛋白抗体の対応抗原とされるgp210の測定系を確立した。抗gp210抗体はPBCに極めて特異的であった(特異性;100%と)。過去22年間の長期経過を観察したPBC患者71症例の血清を用いた検討で、抗gp210抗体は予後不良群で高率に陽性となり、PBCの長期予後を予測するための有用な血清マーカーであることを明らかにした。この結果は、別の集団の80症例の検体を用いた解析からも妥当性が確認された。抗gp210抗体を血清マーカーとして予後不良が予測される症例を対象とした新しい治療研究が可能になるものと思われる。原発性胆汁性肝硬変(PBC)の病態形成の中心と考えられる免疫応答機序を解明し,診断・治療法の確立を目的として研究を行った.PBCの胆管上皮細胞障害に関する標的抗原の全貌は未だ明らかではないが,胆管細胞に発現する自己抗原に対する自己免疫機序が想定されている.一方,胆管は解剖学的に腸管内微生物に暴露されやすい部位にあることから,胆管細胞には,炎症,自然免疫,獲得免疫などに関連して多様な免疫制御機構が発達してきた可能性がある.そこで本年度は,PBCにおけるToll-like Receptorの関与を検討した.TLR-4はPBC肝組織に発現し,PBCの進行とともに肝細胞の細胞質・膜発現がしていたが(Wang AP et al.;J Autoimminity),核内移行は少数例にしかみられなかった.Bezafibrate添加群でPPARαの発現は亢進し,細胞増殖効果,catalase発現亢進が観察された.
地球環境史と鉱床生成史の統合体系的研究

地球環境史と鉱床生成史の統合体系化を図る観点から、地質イベント解析を対象とする内外の各種共同調査研究プロジェクトに硫黄同位体地球化学研究協力者として積極的に参画し、分析情報の蓄積とその解析につとめ初期の目的を達成した。本研究の理論的基礎は著者が独自に展開してきた「金属鉱床生物有機源環境規制モデル:黒鉱-石油同源説(PUMOS理論)」及び「海洋無酸素事変(OAE)の硫黄同位体地球化学的判別理論」である。[生物大量絶滅期の環境復元]:地球史における主要な地質境界期(PC/C、F/F、G/L、P/T、C/T、K/T)から得られた硫黄同位体情報を解析し、これらの境界期の前後にはいずれも微量重金属元素の濃集を伴う種々の時間スケールのOAEが生起していたことを明らかにした。とくに古生代末大量絶滅期(P/T、G/L)には海水硫黄同位体比の顕著な負シフトが見られることから、これには特異なカタストロフィズム(天体衝突によるマントル硫黄の放出とそれに伴う水圏酸性化及び大気酸素レベルの低下)が起因している可能性があることを指摘した。[鉱床生成期の環境復元]:中・古生代及び新生代の主要な時間-層準規制型同生重金属鉱床(層状含銅硫化鉄キースラガー鉱床、層状マンガン鉱床、黒鉱型塊状鉱床)を含む堆積シーケンスから得られた硫黄同位体情報を解析し、これらの鉱床生成期には例外なく同調的又は前後して顕著なOAEが出現していたことを実証した。これは鉱床生成現象が海洋物質酸化還元サイクルの一環であることを強く証拠づける新たな知見である。[硫黄同位体層序学の新展開]:現世生物源炭酸塩の構造置換態硫酸(SSS)が海水溶存硫酸と等価な硫黄同位体比をもつことを実証し「炭酸塩SSS硫黄同位体層序学」の基礎を確立するとともに、同手法を古生代の石灰岩類に適用し海洋同位体進化高次変動曲線の復元におけるその有効性を検証した。1.炭酸塩構造置換態硫黄の同位体研究:現世海棲生物の炭酸塩殻中に存在する硫黄の同位体分布を詳細に検討した.その結果,構造置換態硫黄はアラゴナイトよりカルサイト中に顕著に濃縮するが,その同位体比は海水溶存硫酸の値とほぼ一致しているとの確証が得られた.この成果は炭酸塩が過去の海水硫黄同位体進化を復元する上でエバポライト硫酸塩にとって代わる重要な指標となることを裏付けている.2.大量絶滅期の硫黄同位体地球化学的研究:中国等の古生界を対象とする共同研究に参加し,硫黄同位体地球化学的解析を分担した.その結果,模式P/T境界において海洋硫酸態硫黄の同位体比が10%以上の突然かつ極端な負シフトを示す事実を見い出した.これは大規模隕石の衝突によるマントル硫黄の莫大量の放出を示唆しており,同期大量絶滅の成因論に新たな制約となるものである.3.黒鉱鉱床生成期の硫黄同位体地球化学的研究:東北日本グリンタフ地域の黒鉱層準泥質岩層を対象とする広域的な硫黄同位体地球化学的研究に着手した.今年度は北鹿地域の試錐岩芯試料の分析を行い,いわゆるM2泥岩層準の硫黄同位体分布を検討した.

その結果,硫化物硫黄の同位体分布が局部堆積盆の酸化還元環境を反映しており,黒鉱探査の有効な指標となることが示された.古生代末カタストローフの復元提案:中国メイシャンP/T境界の共同プロジェクトにおいて硫黄同位体地球化学的解析を分担し、大規模な天体衝突による著量のマントル硫黄の放出、それに伴う水圏の酸性化、及び大気酸素レベルの低下が、地球史上最大規模の古生代末生物大量絶滅の原因である、とする学説を世界に共同発信した。尚、同学説を検証すべくブルガリア等他地域のP/T境界セクションを対象とした共同研究を継続中である。初期古生代石灰岩の硫黄同位体地球化学的研究:韓国の初期古生代(カンブリア紀-オルドビス紀)石灰岩試料を対象に、構造置換態硫酸および硫化物の分離分析を行い、同時代には顕著に重い硫黄同位体を濃縮した酸欠成層海洋が卓越していたことを指摘した。また、同国の中生代-新生代花崗岩鉱床区の硫黄同位体的性質との比較研究を行い、同花崗岩鉱床区の重金属熱水鉱化作用の成立にはこれらの基盤石灰岩が硫黄レザバーとして関与していた可能性を指摘した。この観点からの研究をさらに中国大陸に広げて継続中である。黒鉱鉱床成因論の再検討:東北日本グリンタフ地域に分布する泥質岩の硫黄同位体地球化学的システマテイクスを行い、黒鉱鉱床の成因に関する「有機源環境規制モデル」の合理性を指摘するとともに、同モデルを指導原理とする新たな黒鉱探査戦略を提案した。中国南部の古生代末大量絶滅境界を対象とした共同プロジェクトに参画し、硫黄同位体研究を分担した。その結果、P/T境界(251Ma)におけるカタストロフィズム(天体衝突による著量のマントル硫黄の放出、それに伴う水圏酸性化及び大気酸素レベルの低下)を示唆する同位体情報を得るとともに(2001国際誌に報告済)、今回新たに,その下位のG/L境界(258Ma)において、全く同様のイベントを示唆する同位体情報を得た。これは世界最初の知見である(国際誌投稿準備中)。また、韓国及び中国の中生代マグマ熱水性鉱床を対象とした共同プロジェクトに参画し、鉱床地域の基盤を構成する古生代(カンブローオルドビス紀、石炭紀-デボン紀)の石灰岩試料を対象として、SSS(構造置換態硫酸)及び硫化物硫黄の分離分析を分担した。その結果、これらの基盤石灰岩のSSSがエバポライト研究から知られている同時代の古海水硫酸と同様に顕著に重い同位体を濃縮しており、硫黄の地球化学レザバーとして同地域のマグマ熱水性鉱床の形成に大きく関与したことを明らかにした(国際誌発表)。古生代末大量絶滅期の環境復元に関する共同プロジェクトを継続し、中国及びハンガリーのP/T境界セクションの硫黄同立体地球化学的比較研究を行った。その結果、両セクションのP/T境界から炭酸塩構造置換態硫酸の同位体比の顕著な負シフトを共通に検出するとともに、硫化物の見かけ同位体分別度の変動から長期にわたる無酸素環境の継続と一時的富酸素化エピソードを復元した。下位のG/L境界においても同様の同位体変動様式を見出した。これらは、既に公表提起した古生代末カタストロフィズム説(天体衝突による著量のマントル硫黄の放出とそれによる水圏酸性化及び大気酸素レベルの低下)を補強する成果である。また、本邦太平洋岸で採取した現世生物(珊瑚・二枚貝・ウニ)を対象に炭酸塩構造置換態硫酸の濃度と同位体比の分布を検討し、生物源炭酸塩中の微量構造置換態硫酸が海水と等価な同位体的性質を有していることを実証するとともに、石炭紀バシュキリアンの珊瑚質石灰岩中の硫酸態汲び硫化物態硫黄の分離同立体分析を行い、同時代の古海水硫酸同位体比及び富酸素的埋没堆積盆水系の復元に成功した。これらは硫黄同位体層序学及び硫黄同位体古環境解析学の有効性を保証する基礎的情報である。
高校生の認知行動療法によるレジリエンスを高める感情統制教育プログラムの開発と検証

平成30年度は、第一に平成29年度に引き続き、高校生が認知する激しい怒りを感じている友人へのサポート行動に対する困難の様相について質的帰納的に明らかにした。その結果【対象者の理解】【落ち着かせること】【声掛けすること】【的確なアドバイスをすること】【サポートの受け入れ】【受容的な対応をすること】【自己のコントロール】の7つのカテゴリが抽出された。第二に生徒が幸福を感受する日常的なイベントと精神的な健康との関連について明らかにした。その結果、生徒が幸福を感受する日常的なイベントは、ポジティブ気分とともに人生に対する満足度を高めることが示唆された。第三に怒り場面における友人によるサポート行動と精神的健康への影響について検討した結果、怒り場面における友人によるサポート行動は、ストレス認知を低減し、精神的健康を高めることが示唆された。以上のことからプログラム開発に向け、ピアサポート行動の促進やストレス対処行動を促す上で以上の内容について配慮する必要性が示唆された。感情統制教育プログラム開発では、2校100名の生徒に対し、プレテストを実施したが毎週1回×4回の実施は困難であり、3か月間で4回の実施となり教育内容の定着が十分に図れなかった。介入効果では、開始前レジリエンスの高い生徒のみストレス低減効果が得られるという結果となった。次年度はこれらの結果を踏まえ、1各回の最初と最後にリラクゼーション呼吸法(マインドフルネス演習)を取り入れること2感情統制が困難な場面でのロールプレイにあたり、映像を入れ臨場感を出すこと3感情統制困難時、援助希求行動を促すため、困難を感じた時の援助の求め方と友人が困難な状況にある時、援助に繋げられるような関わり方について追加することとした。また、高校現場の実状に合わせ、全3回で構成するものとした。修正プログラムによるプレテストを予定通り終えることができた。また、プログラム開発にあたり、スクールカウンセラー、養護教諭、精神科を専門とする専門職と多角的にプログラム内容について検討でき、ブラッシュアップができている。以上のことから「おおむね順調に進展している」と評価した。修正プログラムによる介入効果を量的、質的に評価し、得られた知見を学会発表および論文化し公開する。介入は、2週間ごとに50分×3回の介入を実施する。実施内容としては、毎回の授業の最初と最後にリラクゼーション呼吸法(マインドフルネス演習)を盛り込み、1回目:心理教育(ストレスと上手につきあおう)、2回目:感情統制(怒りの感情と上手につきあおう)、3回目:レジリエンス向上(しなやかなこころを育てよう)を予定している。アウトカムは気分、レジリエンス、怒りに対する対処行動、対人ストレス、精神的健康とし、計5回[(実施前(T0)、実施4週間目(T1)、終了時(T2)、終了1ヶ月後(T3)、終了3ヶ月後(T4))]を予定している。本研究は、高校生の暴力行動予防をねらいとし、ストレングスベースの認知行動療法によるレジリエンスを高めるための感情統制教育プログラムの開発と検証を目的とする。29年度は、第一に、高校3年間を通してレジリエンスの怒りに対する対処行動や精神的健康への影響、集団及び個人の変化について3波によるパネル調査を実施した。その結果、レジリエンス、怒りに対する対処行動における「状況分析」「逃避」、精神的健康は、個人差が認められなかった。また、「暴力行動」「援護要請」では1年次にこれらの対処行動を行わなかった者ほど増加量が大きくなることが明らかとなった。このことから「暴力行動」については、早期に予防的介入を行うことの必要性が示唆された。第二に、生徒に対し怒りに伴う感情統制が困難な場面に対する認知、生徒が幸福を感受する日常的なイベント、生徒同士による怒りを喚起する場面でのサポートの現状について質的帰納的に検討した。さらにサポートは尺度化した。その結果、感情統制が困難な場面に対する認知では、適応的思考として〈解決思考〉〈自己制御思考〉、非適応的思考として〈自己否定的思考〉〈絶望的思考〉などを行っていることが明らかとなった。怒りを喚起する場面における友人によるサポート行動では、「行動的サポート」「鎮静的サポート」「見守り的サポート」の3因子が抽出され、「思春期の怒り場面における友人によるサポート行動尺度」を開発した。幸福を感受するイベントでは、幅広いインパクトのあるイベントが抽出され、「しっかりと寝た」といったインパクトの弱いイベントも幸福を感受する重要なイベントであることが推察された。第三に感情統制プログラムの開発に向けたプレテストの実施により、生徒の反応から認知的技法よりも行動的技法をより多く用いることや、調査結果および教育現場の実情を踏まえ、1年次後期以降早い段階で実施することが検討された。3年間のレジリエンスおよび怒りに対する対処行動、精神的健康について3波によるパネル調査を実施し、構造方程式モデリングを用いたマルチレベル分析により、これらの変化について集団および個人の変化を明らかにしたこと、また次年度に予定していた生徒の怒りに関する状況把握を500名程度の高校生を対象に記述調査を実施し明らかにしたこと、怒り場面における友人によるサポート行動については質的帰納的研究の成果により質問紙調査を行い、尺度化したことが挙げられる。また、新たに幸福を感受する日常的なイベントを明らかにしたことにより、レジリエンスの促進に加え、精神的健康の維持・向上に向けた支援方法開発に資する知見を得ることができている。さらに「感情統制教育プログラム開発」に向け、翌年以降予定されていたプレテストの実施を繰り上げて追加実施できていることから、より高校生の現状に即したプログラム開発が期待される。

以上のことから「おおむね順調に進展している」と評価した。平成30年度は、第一に平成29年度に引き続き、高校生が認知する激しい怒りを感じている友人へのサポート行動に対する困難の様相について質的帰納的に明らかにした。その結果【対象者の理解】【落ち着かせること】【声掛けすること】【的確なアドバイスをすること】【サポートの受け入れ】【受容的な対応をすること】【自己のコントロール】の7つのカテゴリが抽出された。第二に生徒が幸福を感受する日常的なイベントと精神的な健康との関連について明らかにした。その結果、生徒が幸福を感受する日常的なイベントは、ポジティブ気分とともに人生に対する満足度を高めることが示唆された。第三に怒り場面における友人によるサポート行動と精神的健康への影響について検討した結果、怒り場面における友人によるサポート行動は、ストレス認知を低減し、精神的健康を高めることが示唆された。以上のことからプログラム開発に向け、ピアサポート行動の促進やストレス対処行動を促す上で以上の内容について配慮する必要性が示唆された。感情統制教育プログラム開発では、2校100名の生徒に対し、プレテストを実施したが毎週1回×4回の実施は困難であり、3か月間で4回の実施となり教育内容の定着が十分に図れなかった。介入効果では、開始前レジリエンスの高い生徒のみストレス低減効果が得られるという結果となった。次年度はこれらの結果を踏まえ、1各回の最初と最後にリラクゼーション呼吸法(マインドフルネス演習)を取り入れること2感情統制が困難な場面でのロールプレイにあたり、映像を入れ臨場感を出すこと3感情統制困難時、援助希求行動を促すため、困難を感じた時の援助の求め方と友人が困難な状況にある時、援助に繋げられるような関わり方について追加することとした。また、高校現場の実状に合わせ、全3回で構成するものとした。修正プログラムによるプレテストを予定通り終えることができた。また、プログラム開発にあたり、スクールカウンセラー、養護教諭、精神科を専門とする専門職と多角的にプログラム内容について検討でき、ブラッシュアップができている。平成30年度は、怒り場面における友人によるサポート行動と怒りに対する対処行動や精神的健康との関連、生徒が幸福を感受する日常的なイベントを尺度化し、精神的健康との関連について明らかにする。また、プログラム開発に向け、平成29年度の研究成果及び先行研究を基に介入時期を2年生後期から前期に変更し、行動的技法をより多く取り入れたプログラム試案を作成し、プレテストを実施する。更に研究成果公表に向けた学会発表と論文作成を進める。なお、平成29年度実施予定であった教員を対象とした教師側からみた生徒の怒りに対する対処行動および教師が感じるサポート困難感などのサポートの現状については、当初10名程度の教師への面接調査を実施する予定であったが実施しない予定である。
病態の組織破壊・修復を制御する細胞外プロテオグリカンの代謝と分解産物の新規機能

細胞外マトリックス(ECM)型プロテオグリカンのバーシカン(Vcan)は各種病態の組織破壊後の修復の際に一過性に高発現し、間質細胞の挙動を制御してECMの再構築に重要な役割を果たす。VcanはADAMTS群の蛋白質分解酵素群によって特異的に分解されその分解産物バーシカインは新たな生理機能を有することが明らかとなりつつある。本研究の目的は、ADAMTS群抵抗性Vcanを発現する遺伝子ノックインマウス(V1R系)を作出し、同マウスに各種病態を作出して、その解析を通じて病態局所の間質Vcanとバーシカインの生体内機能を明らかにすることである。皮膚創傷治癒実験:V1Rのホモ接合体(R/R)と野生型と比較したところ、R/Rでは創傷作出後Day 2, Day5で治癒の促進が認められたが、7日目では治癒の程度に有意差はなかった。組織学的にDay2, Day 5ではR/Rにおいて表皮の遊走の亢進、創底部と周囲の肉芽形成の促進が観察された。免疫染色では、Vcanの蓄積、Smooth Muscle Actin陽性筋線維芽細胞の増加が確認された。このことは、創傷治癒早期に細胞外マトリックスに局在するVcanがADAMTS群の蛋白質分解酵素によって一定の分解を受けること、創傷治癒後期では主として他の酵素がVcanの代謝を司ることを示している。細胞培養系にて検討したところ、R/Rの皮膚線維芽細胞ではSmad2/3が核に局在している細胞が増加していた。このことは蓄積したVcanがTGFbetaシグナルを亢進させることを示唆している。本研究は論文投稿の準備中である。DSS腸炎実験:デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を用いて腸炎を作出して炎症の程度を比較したところ、R/Rでは炎症の軽減と江印象細胞浸潤の低下が観察された。現在、R/Rにおける炎症軽減のメカニズムを検討中である。研究はおおむね順調にしており、創傷治癒研究に関しては論文投稿準備中である。研究はおおむね順調に進んでいる。さらなる病態モデルを試みると同時に、モデルレスキュー実験などを組み合わせて研究をさらに充実させる予定である。
格子QCD数値計算によるバリオン励起状態の研究

1)日本の実験グループ(LEPS collaboration)によって発見された正のストレンジネス(S=+1)を持つエキゾッチクなバリオン、"ペンタクォーク"状態Θ(1540)に関する格子QCDを用いた研究を世界に先駆けて行った。未だ、実験的に確定していないペンタクォークの量子数(スピン、パリティ、アイソスピン)に関して、格子QCD数値実験を用いてその量子数を予言した。また、負のチャーム(C=-1)を持つエキゾチックなバリオンΘcの存在に関しても数値実験して、その質量が多くの現象論模型で予測されている程軽くはなく、むしろ核子・D中間子の崩壊閾値よりもはるかに重いことから、Θ(1540)のように寿命の長い共鳴状態ではなく、かなり寿命の短い共鳴状態の可能性が高いことを報告した。2)格子QCD数値実験において、核子励起状態、Δ粒子励起状態(スピン1/2および3/2、正負パリティ状態)について詳細に有限体積効果の研究を行った。基底状態に比べ、励起状態に対する有限体積効果は無視できないくらい大きく、また、Δ粒子の有限体積効果は核子のそれとは逆に働くことが判明した。その原因が核子-Δ粒子の質量差における超微細構造相互作用の有限体積効果に起因している可能性を指摘した。3)高エネルギー研究機構の4H(K-,N)反応実験(KEK-PS E471)で発見された、ストレンジネスをもったトライバリオンの構造に関する理論的解釈として、フレーバーSU(3)対称性を用いた群論による議論を用いて、9つのクォークで構成されるノナクォーク状態の可能性を提唱した。1)核子と全く同じ量子数を持つ動径励起状態(ローパー共鳴)N(1440)ような場合は、ハドロンの虚時間2点相関関数の虚時間遠方での漸近的振る舞いからハドロンの質量を求めるという従来からの方法では難しい。そこで最近、発展著しい最大エントロピー法を用いて、格子QCD数値計算によってもたらされたハドロンの虚時間2点相関関数から直接ハドロンのスペクトル関数を導出することを試みた。スペクトル関数は、ハドロンの基底状態のみならず動径励起状態の性質について多くの情報を得ることができる。得られたスペクトル関数の解析により、ローパー共鳴はクォーク3体の状態が支配的であることが判明した。また有限体積効果についても調べ、ローパー共鳴が基底状態(核子)よりも有限体積効果に非常に敏感であり、かなり広がりを持った状態であることを指摘した。2)一昨年秋に日本の実験グループ(LEPS collaboration)によって発見された正のストレンジネス(S=+1)を持つエキゾチックなバリオン、"ペンタクォーク"状態Θ(1540)に関する格子QCDを用いた研究を世界に先駆けて行った。
C型肝炎ウイルスの複製効率と薬剤感受性を規定するウイルス遺伝子領域の解析

本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)のレプリコンシステムを用い、HCVのRNA複製効率とインターフェロン(IFN)などの薬剤に対する感受性を規定するウィルスゲノムの領域を明らかにすることである。分子進化学的解析、レプリコンの手法やHCVのウィルス培養系を組み合わせることにより、ウィルスRNAの複製効率やウイルス複製の薬剤感受性に関与するウイルスゲノムの領域の同定を試みた。複製効率の異なるレプリコンの遺伝子配列の比較による責任領域の推定:これまでの解析からHCV株のなかにレプリコンとして複製可能なJFH-1とJFH-2株の遺伝子配列を他の慢性肝炎患者由来株と比較すると、NS5Aの領域で最も変異が強いことがわかった。この領域はIFNの感受性に関係することが報告されているが、複製効率との関連は不明である。JFH-1株と他のウイルス株とのキメラウイルスを作製して、ウイルス複製、ウィルス粒子形成分泌などに重要なウイルス遺伝子領域を同定した。ウイルス複製に重要な領域は5'非翻訳領域、NS3ヘリカーゼ領域、NS5bのRNAポリメラーゼ領域であった。さらにこの領域の他にウィルス粒子形成分泌に重要な領域が存在することが明らかとなった。臨床的には遺伝子型1bと2aでは明らかにIFNなどの治療に対する反応性が異なることが知られているが、その違いのメカニズムは全く不明である。IFNをレプリコン細胞に添加することによりウイルス複製を容量依存性に抑制することが可能であった。また、これまでリバビリンの作用機序はその変異誘導によると考えられていた。しかし、リバビリンをレプリコン細胞に添加するとウィルス複製は抑制されるが変異の誘導は観察されなかった。従って、リバビリンが直接ウイルス複製を抑制していることが示唆された。最近HCVに対する新たな抗ウイルス剤としてサイクロスポリンAが注目されており、またRNAポリメラーゼの阻害薬なども実用化されつつある。これまで遺伝子型1bのレプリコンに対してサイクロスポリンが効率よく複製を阻害することが報告されている。今回、遺伝子型2aのレプリコンに対してもサイクロスポリンが有効であることが明らかとなった。しかし、その作用機序は遺伝子型により異なることも示唆された。本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)のレプリコンシステムを用い、HCVのRNA複製効率とインターフェロン(IFN)などの薬剤に対する感受性を規定するウイルスゲノムの領域を明らかにすることである。より効率の良いウイルス培養系の開発や、新たな抗ウイルス治療法の開発の可能性を探る。平成16年度は分子進化学的解析とレプリコンの手法を組み合わせることにより、ウイルスRNAの複製効率やウイルス複製の薬剤感受性に関与するウイルスゲノムの領域の同定を試みた。キメラレプリコンおよび点変異導入ウイルスによるHCVの複製に関与する領域の同定:レプリコンとして複製効率の良いJFH1株と複製しないHCJ6株の各遺伝子領域を入れ替えたキメラウイルスを作製して、HCVの複製効率に関与する遺伝子領域を同定した。

NS3のヘリカーゼ領域とNS5B領域が複製効率に大きく影響することが判明した。また、遺伝子配列の比較で変異の多かったNS5A領域は複製効率には影響しなかった。IFNとリバビリンの抗ウイルス効果の評価:臨床的には遺伝子型1bと2aでは明らかにIFNなどの治療に対する反応性が異なることが知られているが、その違いのメカニズムは全く不明である。IFNをレプリコン細胞に添加することによりウイルス複製を容量依存性に抑制することが可能であった。また、これまでリバビリンの作用機序はその変異誘導によると考えられていた。しかし、リバビリンをレプリコン細胞に添加するとウイルス複製は抑制されるが変異の誘導は観察されなかった。従って、リバビリンが直接ウイルス複製を抑制していることが示唆された。本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)のレプリコンシステムを用い、HCVのRNA複製効率とインターフェロン(IFN)などの薬剤に対する感受性を規定するウイルスゲノムの領域を明らかにすることである。より効率の良いウイルス培養系の開発や、新たな抗ウイルス治療法の開発の可能性を探る。平成17年度は我々が開発したHCVのウイルス培養系を用いて、ウイルス粒子形成分泌、ウイルスRNAの複製効率やウイルス複製の薬剤感受性に関与するウイルスゲノムの領域の同定を試みた。キメラウイルスを用いたウイルス複製や粒子形成分泌の責任領域の推定:JFH-1株と他のウイルス株とのキメラウイルスを作製して、ウイルス複製、ウイルス粒子形成分泌などに重要なウイルス遺伝子領域を同定した。ウイルス複製に重要な領域は5'非翻訳領域、NS3ヘリカーゼ領域、NS5bのRNAポリメラーゼ領域であった。さらにこの領域の他にウイルス粒子形成分泌に重要な領域が存在することが明らかとなった。サイクロスポリンのHCV複製に対する有効性の検討最近HCVに対する新たな抗ウイルス剤としてサイクロスポリンAが注目されており、またRNAポリメラーゼの阻害薬なども実用化されつつある。これまで遺伝子型1bのレプリコンに対してサイクロスポリンが効率よく複製を阻害することが報告されている。今回、遺伝子型2aのレプリコンに対してもサイクロスポリンが有効であることが明らかとなった。しかし、その作用機序は遺伝子型により異なることも示唆された。
担子菌を用いる毒性芳香族化合物の分解とそのバイオレメディエーションへの応用

1.白色腐朽菌及びリグニン分解酵素による毒性芳香族化合物の分解まず、ポリマーの合成原料であり、内分泌攪乱作用を持つビスフェノールA(BPA)の分解作用を担子菌中で検索し、食用担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)に強力な活性を検出した。ついで、この菌の培養液から精製したグニン分解酵素、マンガンペルキシダーゼ(MnP)を用いてBPAを分解したところ、その約30%が分解され、1電子酸化によると考えられる分解産物を同定した。さらに、4-クロロレゾルシノール(4-CR)の分解能を検索し、P. ostreatusなどのPleurotus属やその他の白色腐朽菌にも高い分解能を認めた。また、P. ostreatusのMnPにより、2.4-ジクロロフェノールが塩素の発生を伴いながら酸化され、キノンを生成することを認めた。2.白色腐朽菌によるダイオキシンの分解ダイオキシン分解能を有する担子菌MZ-340株およびその粗酵素標品を用いてダイオキシンの分解を試み、2塩素置換から8塩素置換のすべてのダイオキシンが減少することを認め、この作用が蛋白質のトラッピング現象によることを明らかにした。さらに、汚染土壌からトルエン抽出により得たダイオキシン含有抽出液をガラスビーズに吸着させて、2週間本菌を培養したところ、35%のダイオキシンの減少を確認した。また、その抽出液をシリカゲルカラムに吸着後、本菌で処理したところ80%の減少を認めた。また、土壌を塩酸処理することにより、土壌成分が変化し、ダイオキシンの分解の促進が認められた。さらに、未処理土壌を固相系で長期処理したところ、360日の室内放置により約35%のダイオキシンの減少がみられた。以上のように、化学的な処理を全く必要とせず、ただ単に白色腐朽菌を混合することで、土壌中のダイオキシン類を分解処理できる可能性が示され、広範囲の汚染土壌の分解浄化処理技術としての可能性が示唆された。1.ビスフェノールAなど毒性化合物の分解リグニン分解性を有する食用担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)は内分泌攪乱作用をもつビスフェノールA(BPA)を液体培養条件下で2週間で約80%を分解した。次いで、本菌の液体培養条件において生産されるマンガンペルオキシダーゼ(MnP)がBPAを分解することを見出し、主要な分解産物の構造を明らかにした。このことからBPAの分解がラジカル酸化反応によることを推定した。さらに、塩素化フェノールもP.ostreatus及びMnPにより酸化されることを明らかにした。2.ダイオキシンの分解高活性ダイオキシン分解菌MZ-340株を種々の培養条件下で液体培養を行い、粗酵素液を調製した。その粗酵素液とダイオキシン類の標準品を作用させたところ2塩素置換から8塩素置換のすべてのダイオキシン類が減少することを明らかにした。さらに、この現象を詳細に検討したところ、粗酵素液中のタンパク質によるトラッピング現象であることを明らかにした。次いで、本菌の培養条件を詳細に検討し、ダイオキシントラッピング物質を多量に産生する条件を見い出した。さらに、ダイオキシントラッピング物質を土壌および飛灰に作用させ、ダイオキシン類が水層に移行することを明らかにした。これにより、菌体外物質による土壌および飛灰中ダイオキシン類の処理が可能であることを示した。本年度では、白色腐朽菌MZ-340株を用いてダイオキシン汚染土壌の浄化を試みた。

まず、土壌からダイオキシン類を抽出し、その土壌抽出液をビーズに添加し、菌処理したところ減少が認められた。さらに土壌抽出液をシリカゲルで処理したところ、減少率は約80%と大きく上昇した。また、土壌の塩酸処理により、処理後の強熱減量、即ち有機成分の減少が見られるとともに、前処理することにより、白色腐朽菌によるダイオキシンの分解が認められた。土壌は一般に種々の粘土鉱物や長石等の造岩鉱物、さらに腐植と呼ばれる有機物から構成され、通常これらが凝集した塊として存在している。塩酸処理による土壌成分の変化により、白色腐朽菌がダイオキシン分解に効果的に作用しているものと予想した。また、平成12年度に作成した試験体(プラスチック製ケース)を室内で360日間静置した結果、ダイオキシン類実測濃度で35.1%減少、TEQ濃度で33.7%の減少を確認した。即ち、化学的な処理を全く必要とせず、ただ単に白色腐朽菌を混合することで、土壌中のダイオキシン類を分解処理できる可能性が示され、広範囲の汚染土壌の分解浄化処理技術としての可能性が示唆された。一方、各種の担子菌による液体静置培養条件での4-クロロレゾルシノール(4-CR)の分解を試み、Pleurotus ostreatus、P.Pulmonaris、C.consors、C.hirsutus、P.sajor-caju、Daedaleopsistricolor、Ganoderma lucidumなどに高い分解活性を認めた。さらに、同菌をグルコース-ペプトン培地で培養し、その培養液から部分精製したマンガンペルオキシダーゼによる2,4-ジクロロフェノールの分解試み、24時間の反応により基質の分解とキノンの生成を認めた。また、塩素イオンの発生は分解された基質の約50%であった。
遺伝子治療のモデルとしての単離心筋細胞への遺伝子導入、機能測定システムの開発

心不全に対する遺伝子治療のモデルとしての単離心筋細胞の機能測定システムを開発した。単一心筋細胞の張力測定については様々な方法が試みられてきたがいずれも細胞膜の障害、技術的困難さなどの問題があった。今回我々は新しく開発されたカーボンファイバーを応用することによって単収縮での発生張力を容易に測定することを可能とした。単離した心筋細胞の両端に固定用の固いファイバーと測定用の柔らかいファイバーを付着させ柔らかいファイバーの撓みを光ダイオードセンサーで検出することにより力を測定する。さらに柔らかいファーバーを接続したピエゾ素子の動きをセンサー出力をフィードバックすることで制御し細胞にかかる、前負荷、後負荷を自由にコントロールすることが可能となった。このシステムに細胞内カルシウム濃度測定系を組み合わせ細胞の張力、カルシウムトランジェントの同時測定も可能となった。後負荷をゼロから最大値(等尺性収縮)まで大きく変えカルシウムトランジェントを測定したところ従来報告されてきたものとは異なり明らかな負荷依存性を見い出した(論文投稿中)。現在心臓が収縮弛緩を繰り返す際に心室壁内で心筋細胞が経験する張力-長さ関係を再現することも可能となっている(working cell preparation)。心筋細胞への遺伝子導入に関してはGreen Fluorescent Protein (GFP)遺伝子を導入発現した単離心筋細胞の発生張力測定に成功した。変異ミオシン軽鎖の遺伝子はアデノウイルスへの組み込みが終わっている。本年度は主に機能測定システムの開発を行った。単離心筋細胞の張力を測定するためには細胞両端を固定し張力トランスデューサーにつなぐことが必須である。これまでにいくつかの方法が試みられてきたがいずれも高度の習熟を要する、細胞を障害するなどの欠点があった。我々は表面電荷を利用して細胞に付着するカーボンファイバーを改良しその付着力を向上することに成功したため容易にかつ障害を与えることなく細胞を固定することが可能となった。固いファイバーと柔らかいファイバーで両端を固定し収縮による柔らかいファーバーの撓みを検出することで張力を測定した。さらに柔らかいファイバーをピエゾ素子につなぎファイバーの変位をフィードバック信号としてピエゾを操作することによりファイバーの固さを自由に変え無負荷に近い条件での短縮から高い負荷条件下での等尺性収縮までが観察できるようになった。これは単一心筋細胞では初めての報告である。さらに負荷を連続的に変化させていったところ細胞が一回の収縮の間になす外的仕事も連続に変化し中等度の負荷で最大となった。これらは従来心筋片もしくは臓器としての心臓レベルで観察されてきたことであるが細胞レベルの性質を反映しているものであることが確認されたと同時にこのシステムの有用性を示すものと考えられる。次年度以降はさらに細胞内カルシウム濃度の同時測定を行えるようシステムを改良する。一方培養心筋細胞への遺伝子導入についてはアデノウイルスベクターを使って準備中である。

心筋細胞への遺伝子導入に関してはGreen Fluorescent Protein (GFP)遺伝子を導入発現した単離心筋細胞の発生張力測定に成功した。変異ミオシン軽鎖の遺伝子はアデノウイルスへの組み込みが終わっている。
抗精神病薬による脳内ドーパミンD2/3受容体を介した顕現性回路の制御機構の解明

本研究では、抗精神病薬であるリスペリドンあるいはパリペリドンを服薬中の統合失調症患者における脳内ドパミンD2/3受容体(D2/3R)占有率と、安静時機能的MRI(rs-fMRI)による顕現性回路(salience network, SN)内の脳領域を調べることで、D2/3R占有率に関係する脳領域を同定することを目的とした。独立成分分析により、rs-fMRIデータからSNが抽出された。抽出されたSNの構成領域である前頭皮質内側面、尾状核、前島皮質および視床の一部を関心領域とした灰白質容量とD2/3受容体占有率との関係を求めた。明らかにD2/3受容体占有率と相関のある脳領域は見いだせなかった。平成26年度は本研究を所属研究機関で行うための研究環境の整備を行った。具体的には研究課題名「抗精神病薬による脳内ドパミンD2/3受容体を介した顕現性回路の制御機構の解明」として東京慈恵会医科大学内の倫理委員会により承認された(# 7832)。また同研究は同大学附属病院内の臨床研究審査委員会により承認された。同時に同研究のUMINへの登録を行った(#000016622)。結果、臨床研究が開始となり現在被検者エントリーを開始している。さらに同大学放射線医学講座と共同で附属病院内設置のMRIで撮像シーケンスの調整を施行中であり、撮像費用などの支払い経路を確立した。平成27年度は健常被験者から撮像を開始し、MRデータ取得が問題なく行えることを確認後、患者のエントリーを開始、データを順次蓄積する予定である。平成27年度前半は、健常者からMRスキャンおよび心理実験を開始する予定であったが、統合失調症患者の異常顕現性を測定するSalience Attribution Test(Roiser, 2009)、脳内ドパミンの動態を反映しうるProbabilistic Learning Task(Pessiglione, 2006)のプログラムを含む実験系の確立に予想以上の時間を要した。当初から検討していたソフトウェアでの実験系での確立が困難であり、途中から商用ソフトウェアであるe-primeを用いた実験作成を行い、全体的な系を変更・確立した。被験者への実験報酬の支払い方法の変更を行い、27年10月29日に本学倫理委員会より変更許可がなされた。27年度末からは被験者のエントリーを開始している。実験報酬の支払いに関する研究計画書の変更、異常顕現性等にかかわる心理実験のプログラミングおよび確立に予想以上に時間を要したため研究計画が遅れている。平成28年度は、統合失調症の顕現性および妄想と関係する学習課題である、Salience Attribution Test(以下SAT、Roiser, et.al, 2009)のプログラムと妥当性検証と、MRIの撮像シーケンスおよび血液検体の遠心・保存に係る方法、血漿中リスペリドン/パリペリドンのLC/MS/MSを用いた薬物血中濃度測定施設の変更、被験者のエントリーおよび撮像、解析の前処理を行った。SATに関しては、平成27年度は心理実験作成ソフトウェアであるe-primeでのプログラムを行っていたが、先行研究のような反応時間が得られなかったため、ノッティンガム大学のJonathan W. Pierce開発のPythonライブラリであるPsychopyソフトウェアでも開発を行い、最終的にPsychopy版のSATを採用した。MRI特にEPIの撮像シーケンスについては、代表者の先行研究等から決定した。血液検体の処理に関しても、研究代表者の先行研究を参考に決定した。当初リスペリドン/パリペリドン血漿中濃度は外部業者に依頼予定であったが、測定価格がやや高価であるため東京慈恵会医科大学内のLC/MS/MSで測定を行う方向とした。平成29年度早々にリスペリドン/パリペリドンの原末を購入し、検体の測定を開始する予定である。上記の準備のため、被験者のエントリー開始が更に遅れたが、現時点での被験者エントリーは比較的堅調に進んでいる。平成28年度中に撮像が終了しなかったため、本研究の期間を平成29年度まで延長し、次年度も引き続き被験者の撮像を行う予定である。画像処理に関しては、Windows/Linuxワークステーションで画像データの処理を行っている。データ処理に関してはシェルスクリプトやバッチファイルのプログラムを行い、処理を効率化する系を作成している。被験者の撮像が終了せず、平成29年度も引き続き撮像を及び解析を行っているため。統合失調症患者を対象として、安静時機能的MRI(rs-fMRI)、静脈血採血によるリスペリドン・9-OHリスペリドンの血漿中濃度測定(ドパミンD2/3受容体占有率推定)精神尺度である陽性・陰性症状評価尺度(PANSS)、自記式心理検査である行動抑制系・行動賦活系尺度(BIS/BAS)日本語版、行動心理実験であるsalience attribution test(SAT)による異常顕現性の測定を行った。統合失調症患者9名のEcho Planner Imagingデータに対し、FMRIB Software Library(FSL)ソフトウェアバージョン5を用い、前処理ののちグループ独立成分分析(independent component analysis)を施行し、前頭皮質内側面、前島皮質および線条体を中心とした独立成分、すなわち各脳領域における顕現性回路の占める脳領域を確認した。

同時に顕現性回路内脳領域内の灰白質体積を算出する目的で、各患者のT1強調画像をstatistical parametric mapping(SPM)ソフトウェアを用いて、分割化、Diffeomorphic Anatomical Registration using Exponentiated Lie Algebra(DARTEL)による位置合わせ、Montreal Neurological Institute(MNI)テンプレートへの標準化モジュレーションおよび平滑化を行った。リスペリドン・9-OHリスペリドンの血漿中濃度は14.8±7.5(平均±標準偏差)ng/mlであった。このリスペリドン血漿中濃度から推定した、リスペリドンによる脳内ドパミンD2/3受容体占有率は55.6±21.5(平均±標準偏差)%であった。SATによるaberrant salience値を算出した。グループICA解析による、前頭皮質内側面、前島皮質および線条体内の顕現性回路の占める代表的な脳領域内を関心領域とした灰白質の体積と推定された脳内ドパミンD2/3受容体占有率間の相関分析を行った。続いて同領域の灰白質の体積とaberrant salience値の相関分析を行い、リスペリドンによるドパミンD2/3受容体占有率・異常顕現性と機能的に最も相関する脳領域を探索した。本研究では、抗精神病薬であるリスペリドンあるいはパリペリドンを服薬中の統合失調症患者における脳内ドパミンD2/3受容体(D2/3R)占有率と、安静時機能的MRI(rs-fMRI)による顕現性回路(salience network, SN)内の脳領域を調べることで、D2/3R占有率に関係する脳領域を同定することを目的とした。独立成分分析により、rs-fMRIデータからSNが抽出された。抽出されたSNの構成領域である前頭皮質内側面、尾状核、前島皮質および視床の一部を関心領域とした灰白質容量とD2/3受容体占有率との関係を求めた。明らかにD2/3受容体占有率と相関のある脳領域は見いだせなかった。当初の研究計画では、平成26年度中に健常者の撮像を開始する予定であったが、審査書類の作成等、審査および関係部署の調整等に時間を要したため、結果的に健常者の撮像が平成27年度にずれこんだ。被験者のエントリーは開始しており、患者および健常者ともに早急にMRスキャンと心理実験を進めることにより、解析段階へ速やかに移行する。被験者のエントリーは比較的堅調に進んでいる。特に統合失調症患者に関しては、血漿中リスペリドン/9-OHリスペリドン濃度の測定が必要なため、なるべく早い段階での撮像終了を目指す。撮像に並行して脳画像解析を行い、年度内に結果を出すよう努力する。神経画像・神経薬理学平成27年度は早い段階で健常者の撮像を開始し、安定したMRデータ取得を確認後、患者群のエントリーを開始する予定である。心理実験系の確立に予想以上の時間がかかり、被験者のエントリーが遅れている。そのため、被験者のMR撮像等の費用を次年度へ持ち越す必要が生じている。被験者の研究エントリーに時間がかかり、東京慈恵医科大学に支払う予定の被験者の撮像費用および被験者への謝金支払いが平成29年度に持ち越しとなったため。また、血漿中リスペリドン/パリペリドン濃度の測定費用が平成29年度に持ち越しとなったため。平成26年度は研究環境の整備を行った。
東～南アジアの野蚕NPVの防除と利用に役立つ比較ゲノム解析

東南アジア諸国においてシルク生産に利用されるさまざまなヤママユガ科絹糸昆虫(野蚕)から核多角体病ウイルス(NPV)を分離し,それらの全ゲノムDNA配列を次世代シーケンサーにより比較解析した.その結果,各NPVを高感度かつ特異的に検出可能なマルチプレックスPCR診断技術の開発に成功し,優れた有用タンパク質生産特性を有するバキュロウイルスベクター系の構築ならびに野蚕NPVの遺伝的多様性および進化の考察に役立つ知見が得られた.1.野蚕NPVのサンプリングとゲノムDNA解析:協力研究者の清水とともにベトナム北部のソンラ省でエリサンNPVの発生調査を行い,ハノイ農業大学との共同研究協定を結び,NPVのサンプルを日本に持ち帰ることができた.また,インドについては,中央蚕糸局の協力を得て,アッサム州を中心に,ムガサン,エリサン,タサールサンの飼育現場を調査したが,NPVの発生は確認できなかった.25年度は,テンサンNPVのゲノムDNAの次世代シーケンサーによる解析を行い,サクサンNPVとの違いを明らかにした.2.野蚕NPV検出用PCR技術の開発:これまでの部分的ゲノム配列比較に次世代シーケンサーの配列解析結果を加味して,サクサンNPV,テンサンNPVおよびエリサンNPVを識別可能なマルチプレックスPCR用プライマーの設計に着手した.3.野蚕NPVのタンパク質生産特性:サクサンNPV,テンサンNPVおよびエリサンNPVの部分的ゲノム配列比較により,エリサンNPVがタンパク質生産量を高めるegt遺伝子を保持し,タンパク質の分解を促進するv-cathおよびchiA遺伝子を欠損していることが明らかになり,タンパク質生産に最も適していると判断された.1.野蚕NPVのサンプリングとゲノムDNA解:研究協力者(清水)経由で,カンボジアのエリサンNPVを入手した.また,研究協力者(梶浦)のテンサン飼育林(長野県)においてNPV発生現場の調査を行った.さらに,研究分担者の門野がインドの研究者からタサールサンのNPVサンプルを入手した.25年度に入手したベトナムのエリサンNPVのゲノムDNAを中国のエリサンNPVとともに次世代シーケンサーによる解析を行い,すでに解析済みのサクサンNPVおよびテンサンNPVと比較した結果,大きく2グループ(エリサンNPVグループとサクサン・テンサンNPVグループ)に大別されることが明らかとなった.また,各グループ内の変異も複数検出された.2.野蚕NPV検出用PCR技術の開発:上記の2グループを識別可能なゲノム領域と特異的なプライマーの選定と,グループ内の系統関係を識別可能な変異に対応したプライマーの選定を行い,これらの組み合わせによるマルチプレックスPCR技術の確立を試みた(継続中)3.野蚕NPVのタンパク質生産特性:サクサン培養細胞におけるベトナムのエリサンNPVの増殖性が良くないことが判明し,サクサンNPVにベトナムNPV由来の全長エクジステロイドUDP-グルコース転移酵素遺伝子を導入した組換えウイルスを作製した.このウイルスはサクサン培養細胞とエリサン幼虫と蛹で良好な増殖性を示し,脱皮抑制効果も認められた.1.野蚕NPVのサンプリングとゲノムDNA解析(1)現地調査とサンプリング:インドのクリキュラおよびタイのエリサンのNPVの発生状況の現地調査を行ったが,病気の発生は確認できなかった.一方,日本(長野)のテンサンNPV発生現場においてNPVに感染したシンジュサンをサンプリングできた.(2)ゲノムDNA解析:前年度に入手したカンボジアのエリサンおよびインドのタサールサンのウイルスDNAを次世代シーケンサーにより解読し,全ゲノム配列の再構築を実施した.その過程で,同一塩基が連続する部分や繰り返し配列においてエラーが見出されたため,これまでに解読したすべてのNPVのゲノム配列の見直し作業に着手した.2.野蚕NPV検出用PCR技術の開発(1)プライマーの設計とPCR条件の最適化:各種野蚕NPV分離株間で比較的大きな挿入欠失変異が見られるゲノム上の3領域を標的としたPCRプライマーを設計し,分離株を識別可能なマルチプレックスPCR法を確立した.(2)実証性検証:各種野蚕NPV分離株をエリサンに経口感染させ,継時的に体液を回収して上記のマルチプレックスPCRを実施した結果,病徴が現れる数日前には明瞭な分離株特有のバンドパターンを検出できたことから,実用性が確認された.3.野蚕NPVのタンパク質生産特性(1)昆虫培養細胞における感染・増殖性検定:エリサンおよびテンサンの培養細胞の樹立に至っていないため,タンパク質生産特性のサクサン由来AnPe細胞との比較は実施できなかった.インドネシアおよびタイにおいて野蚕NPVを入手できなかったが,そもそもこの地域において野蚕NPVの発生が報告されていないため,ある程度想定内の結果といえる.むしろ,国内でテンサン以外の野蚕としては,はじめてシンジュサンからNPVを分離できたことは想定外の貴重な成果であり,国内での野蚕NPVの分化について興味深い知見をもたらすことが期待される.また,次世代シーケンサーにより解読された配列データに含まれた使用機器特有のエラーを検出し,その修正が可能になったことにより,今後のゲノム解析の精度を上げるための有効な技術的進歩を達成できた.さらに, NPV分離株を識別可能なマルチプレックスPCR法を確立し,その実用性を計画通り達成できた.新たな野蚕培養細胞の樹立には至っていないが,通常培養細胞の樹立は数年の試行錯誤を経て達成されることから,想定内の状況といえる.1.野蚕NPVのサンプリングとゲノムDNA解析(1)現地調査とサンプリング:

インドネシアのクリキュラについては,現地研究者からウイルスの発生が確認できないとの連絡があり入手を断念した.インドの現地研究者からインド南部のタサールサンの病死体を入手したが,NPVは分離されなかった.研究期間終了直前の3月にタイの研究者の協力によりエリサンの病死体を入手したが,研究期間内にウイルス感染の確認作業を完了できなかったので,研究期間終了後も確認作業を継続実施する予定である.(2)ゲノムDNA解析:これまでに入手したサクサン(中国),エリサン(中国,ベトナム,カンボジア),テンサン(日本),シンジュサン(日本)およびタサールサン(インド)のNPV分離株(一部クローンを含む)の次世代シーケンサーによるゲノムDNA配列解析を完了後,繰り返し配列など確認が必要な部分配列を補正し,各分離株のコンセンサスゲノムを完成した.さらに,株内変異を検出するとともに近縁のNPVのゲノム配列と比較することにより,東南アジアに分布するヤママユガ科野蚕NPVのゲノム進化と多様化の過程を考察した.2.野蚕NPV検出用PCR技術の開発:開発技術を雑誌「昆虫と自然」にレポートとして公表した.3.野蚕NPVのタンパク質生産特性(1)昆虫培養細胞における感染・増殖性検定:サクサン培養細胞における各種NPV分離株のゲノムDNAをトランスフェクションし,ウイルスの増殖性を比較したところ,サクサンNPV,タサールサンNPVおよびエリサンNPV(中国)がほぼ同等な最も良好な増殖性を示し,テンサンNPVおよびシンジュサンNPVの増殖性はそれらよりもやや劣る傾向が認められた.一方,エリサンNPV(ベトナムおよびカンボジア)の増殖性は極めて低いことが判明し,宿主特異的増殖機構に関わる遺伝子の同定に役立つ可能性が示唆された.東南アジア諸国においてシルク生産に利用されるさまざまなヤママユガ科絹糸昆虫(野蚕)から核多角体病ウイルス(NPV)を分離し,それらの全ゲノムDNA配列を次世代シーケンサーにより比較解析した.その結果,各NPVを高感度かつ特異的に検出可能なマルチプレックスPCR診断技術の開発に成功し,優れた有用タンパク質生産特性を有するバキュロウイルスベクター系の構築ならびに野蚕NPVの遺伝的多様性および進化の考察に役立つ知見が得られた.目的としていたインドのタサールサンNPVの入手に成功し,それ以外にもカンボジアのエリサンNPVも入手することができた.インドネシアに関してはウイルス病発生の情報がないため,東南アジアの別の地域も含めて野蚕NPV発生の情報収集を行っている.さまざまなNPVのゲノム情報が順調に蓄積しており,ウイルスの識別診断が可能なPCR技術の確立に大いに役立っている.また,エリサンNPVから見つかった全長エクジステロイドUDP-グルコース転移酵素遺伝子により,野蚕幼虫におけるタンパク質生産量の向上を実現できる可能性が高まった.1.野蚕NPVのサンプリングとゲノムDNA解析(1)現地調査とサンプリング:27年度までに予定通り入手できなかった