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マウス胎仔皮膚再生とアクチン重合の関係

マウス胎生13日から17日のさまざまな発生段階のマウス胎仔に胎仔手術を施し共焦点顕微鏡を用いてactin cable形成の有無と、皮膚再生の関係を観察した。その結果、胎生13日に作成した創傷は、創が完全に閉鎖するまでactin cableの収縮で進行し、胎生14日に作成した創傷は、途中まではactin cableの収縮で創が収縮するが、途中から表皮のmigrationに切り替わり、胎生15日胎仔に作成した創傷は、ほぼ最初から表皮のmigrationで進行することが考えられた。ICRの妊娠13日から17日のマウスに対して、全身麻酔下に開腹術を行った。子宮、羊膜を切開後にマイクロサージャリー手術用の剪刀を用いて、各々の発生段階の胎仔側胸部に、長軸方向に沿った長さ約2mmの皮膚全層切開創を作成した。創作成後48時間の検体に関しては、創を同定するため、創作成後にピペットを用いて、PBSに溶いた蛍光色素0.1%DiI(Molecular Probe)を創部に投与した。さまざまな時間の後に創傷を作成したマウス胎仔を採取し、検体を実体蛍光顕微鏡を用いて、DiIを指標に創傷作成部を同定し、皮膚表面の形態を観察した。また、Actin cableは上皮化が終了する前の創傷治癒の過程で出現するので、創作成後6、24時間で観察した。検体を5nMのPhalloidin-Alexa488(Molecular probe)と核染色のための500倍希釈Hoechst溶液の混和液に、4°Cで24時間incubateした。その後実体蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて表皮内のactin cableの形成の有無を確認した。計画書通り、順調に遂行されている。本研究では、in uteroで皮膚が完全に再生する胎生13日の創傷部位と、それ以降の再生しなくなる創傷部位で、actin cableの形成の有無が直接関与しているか否かを検討した。さらにactin cableの形成に関わっている因子についても検討を行った。これまで、マウス胎生11.5日に作成された皮膚創傷では、創辺縁の表皮角化細胞内にactin cableの形成されることが報告されていたが、in uteroでactin cableの発現は未知であった。本研究では、これまで独自に開発した方法で胎生13日から17日までさまざまな発生段階のマウス胎仔に創傷を作成し、その変化を観察し創作成後6時間、24時間、ならびに上皮化が完了する48時間後に創を回収した。皮膚が再生する時期からしなくなる時期に切り替わるその前後でactin cableの形成の有無を確認したところ、胎生13日まではactin cableの形成が確認されたが、胎生14日では創傷治癒の途中からactin cableの形成が抑制されることを見出した。さらに胎生15日以降の創傷部では、最初からactin cableは形成されないことを見出した。さらに、actinの重合にはRac-1,cdc42、Rho,Wave-2, Profilin, ARP2,ARP3などが関連しているので、これらの発現を免疫染色で確認したところ、このうちいくつかのタンパク発現に差異が認められることを確認した。順調に研究が遂行されているので、計画書のとおり、研究を遂行する予定である。形成外科使用する試薬類が、初年度は予想よりも少ない量で研究が遂行できたため。次年度の試薬類の購入に充てる予定である。
公卿補任の基礎的研究-成立過程と書写状況の追求-

1.内閣文庫・尊経閣文庫・京都大学付属図書館・陽明文庫・神宮文庫・国立国会図書館において主要な公卿補任写本の書誌学的調査を行なった。その結果、内閣文庫所蔵公卿補任59冊本が尊経閣文庫所蔵三条西実隆書写本と同系統の写本であること、および他の多くの写本が冊立て・奥書等からみて、山科本系統の新写本であることが判明した。2.宮内庁書陵部において公卿補任60冊本の写本調査を行なった。その結果、同本が山科本を忠実に書写した善本であることが確認された。また、同本は新訂増補国史大系『公卿補任』の底本として用いられているが、刊本の若干の誤りにも気付いた。3.京都大学文学部博物館において勧修寺家旧蔵公卿補任4冊本の写本調査を行ない、うち1冊が他の3冊とは明らかに整合せず、別本としなければならないことが判明した。4.国立歴史民俗博物館所蔵東洋文庫旧蔵の広橋家本公卿補任8冊本を写真によって検討し、同本が山科本成立と密接にかかわる重要な写本であることが判明した。5.言継卿記・言経卿記を精査することによって、山科言継の書写の具体的な様子、祖本の借用状況、写本の保管・貸出状況などが明らかになった。6.東京大学史料編纂所において山科卿記紙背文書(騰写本)を調査し、山科言継が実際には大永7年(1527)2月以前に広橋兼秀らより公卿補任の写本を借り受けている事実が判明した。7.山科本成立以前の公家の日記として、建内記・師守記・実隆公記より公卿補任関係記事を収拾し、公卿補任書写・保管・貸借・利用状況の一端が明らかになった。本研究の目的は山科言継書写本成立に至るまでの公卿補任諸本の存在形態・成立過程を可能な限り追求・復原する点にある。本年度においては主として東京方面と関西方面の図書館・文庫所蔵の写本調査を実施し、次のような知見を得た。1)内閣文庫所蔵公卿補任59冊本は尊経閣文庫所蔵の三条西実隆書写本と同様の「公卿伝目録」を有し、さらに同本と同じく第一冊冊尾に「歴運記」を収めること、また内容的にも三条西本とほぼ同様であることなどから、三条西本の系統をひく写本であることは確実である。但し、一部に山科本の本奥書をも有することから、三条西本と山科本との取り合わせ本ということになる。2)内閣文庫所蔵公卿補任38冊本および京都大学付属図書館所蔵公卿補任43冊本は冊立て・奥書等からみて、いずれも山科本系統の新写本であることが判明した。3)京都大学文学部国史研究室所蔵勧修寺家旧蔵公卿補任4冊本のうちの1冊は「公卿補任第十□本院」の外題を有し、内容上後水尾天皇代の公卿補任であり、他の3冊とは冊立てにおいて明らかに整合せず、別本としなければならない。また、言継卿記を精査することによって、山科本成立に関する豊富な史料を収拾することができた。これによって、言継の書写事業開始は享禄2年(1529)2月、終了は永禄13年(1570)のことであることが知られたが、さらに東京大学史料編纂所所蔵の山科卿記紙背文書(騰写本)によって、実際には遅くとも大永7年(1527)3月以前には広橋兼秀らから公卿補任の写本を借り受けている事実も判明した。公卿補任開始のための準備期間がある程度存在したと見られる。

1.内閣文庫・尊経閣文庫・京都大学付属図書館・陽明文庫・神宮文庫・国立国会図書館において主要な公卿補任写本の諸誌学的調査を行った。その結果、内閣文庫所蔵公卿補任59冊本が尊経閣文庫所蔵三条西実隆書写本と同系統の写本であること、および他の多くの写本が冊立て・奥書等からみて、山科本系統の新写本であることが判明した。2.宮内庁書陵部において公卿補任60冊本の写本調査を行った。その結果、同本が山科本を忠実に書写した善本であることが確認された。また、同本は新訂増補国史大系『公卿補任』の底本として用いられているが、刊本の若干の誤りにも気付いた。3.京都大学文学部博物館において勧修寺家旧蔵公卿補任4冊本の写本調査を行い、うち1冊が他の3冊とは明らかに整合せず、別本としなければならないことが判明した。4.国立歴史民俗博物館所蔵東洋文庫旧蔵の広橋家本公卿補任8冊本を写真によって検討し、同本が山科本成立と密接にかかわる重要な写本であることが判明した。5.言継卿記・言経卿記を精査することによって、山科言継の書写の具体的な様子、祖本の借用状況、写本の保管・貸出状況などが明らかになった。東京大学史料編纂所において山科卿記紙背文書(騰写本)を調査し、山科言継が実際には大永7年(1527)2月以前に広橋兼秀らより公卿補任の写本を借り受けている事実が判明した。7.山科本成立以前の公家の日記として、建内記・師守記・実隆公記より公卿補任関係記事を収拾し、公卿補任書写・保管・貸出・利用状況の一端が明らかになった。
ハイブリッド配糖体を光増感剤とする分子シンクロシステムの光線力学療法への新展開

1.近年,レーザー治療法の一つである光線力学的療法(Photodynamic Therapy, PDT)はクリーンながん治療法として注目を浴びている。しかしながら,PDTに用いられている従来の光増感剤は暗所毒性,低い腫瘍集積性,低水溶性など多くの課題が残されている。本研究は,生体適合性ならびに生体内部位認識力にすぐれた糖分子を導入したPDT用光増感剤を開発し,ミクロな刺激に同調した生体構造中の分子や分子集合体をデバイスとする生理活性発現システムの抽出という,従来の単なる構造-物性相関という概念を超越した材料システムをPDT分野において構築することを目的としている。本年度はこれまでの糖連結ポルフィリンおよびクロリン誘導体に加えて糖連結フラーレンの合成,物理化学的特性,腫瘍細胞ターゲッテング能,およびPDT効果を精査検討した。2.ポルフィリンに高い細胞親和性をもたせ,PDTに応用することを目的として,Tetraphenylporphyrine (TPP)を基本骨格とした糖連結ポルフィリン誘導体およびフラーレン誘導体の合成を行った。糖分子として,グルコース・ガラクトース・マンノース,キシロースを選択した。これらの新規PDT用剤の酸素活性化能を評価した。3.新たに合成したハイブリッド配糖体について,生体分子とシンクロナイズした情報伝播システムとしての可能性を調べるため,培養がん細胞及びマウスに移植したがん細胞に対する細胞毒性を評価した。以上の結果、一部の化合物はPDT用剤として極めての有用であることが判明した。以上の知見をもとに、今後実用化への展開をめざしていきたい。1.初期ガンに有効な治療法の一つである光線力学的療法(Photodynamic Therapy,・PDT)が新しい治療法として期待されている。PhotofrinやFoscanが現在PDT用剤として使用されているが、混合物であったり、水溶性が低い、バイオターゲッティング能が低い、光励起に使用するレーザー光の組織透過性が低いため深在性ガンに対して効果が低いなどの様々な問題点がある。これらの問題点を踏まえて本研究では深在性ガンに適用可能な新規水溶性薬剤の開発として、ポルフィリンより長波長に吸収をもつクロリンならびにバクテリオクロリン骨格へ種々の糖質を導入し、糖質機能とのシンクロナイズを目指してPDT用高機能性光増感剤の開発を目的としている。本年度は、水溶性ポルフィリンならびにクロリン類を用いた腫瘍マウスに対する薬剤の生体内動態およびPDT効果について検討した。2.糖連結水溶性メタ置換ポルフィリン類ならびにクロリン類を、悪性黒色腫(B16F1)移植腫瘍モデルマウスへ投与し、種々の臓器における蛍光強度を経時的に測定することにより、連結する糖鎖と基本骨格の違いが光感受性物質の生体内動態に及ぼす影響を評価した。各臓器で薬剤濃度が最大になるまでに要する時間は糖連結水溶性ポルフィリン約12時間、糖連結クロリン類は約24時間以内で、FoscanやPhotofrinより迅速に集積した。レーザー照射によるPDT効果の検討において、水溶性D-グルコースクロリンにおいてFoscanと同様の抗腫瘍活性が得られた。
四肢の発生におけるWntシグナルの働きの解析

分泌タンパク質Wntファミリーは様々な器官形成の過程で発現し,重要な働きをしていると考えられているが,その働きについては十分理解されていない。そこで,本研究ではニワトリ四肢の発生系を用いて,Wntファミリーの働きの解析を行った。ニワトリ四肢で発現するWntファミリーの因子を同定し,その発現パターンを調べた。Wnt-3aが頂堤で,Wnt-4が関節形成領域で,Wnt-5aが頂堤と遠位の間充織で,Wnt-7aが背側外胚葉で,Wnt-11が背側と腹側の上皮に近接する間充織で,各々固有のパターンで発現していることを見出した。胚操作後の発現パターンを解析し,背側上皮からのシグナルがWnt-11の発現に必要であり,頂堤からのシグナルがWnt-5aの遠位間充織での発現に必要であることを明かにした。この結果から,Wntファミリーの因子は,上皮からのシグナルによって異なる発現調節を受けることが示された。また,遠位で発現するWnt-5aをレトロウイルスベクターを用いて肢芽全体で発現させると,主に軛脚部の軟骨分化が遅延した。この結果から,Wnt-5aは軟骨分化の調節を行うことで,近遠軸に沿ったパターン形成に関わることが示された。次いでWntシグナルの受容機構について解析するため,受容体をコードするFrizzledファミリーの遺伝子クローニングを行い,6種類のFrizzled遺伝子を得た。これらのFrizzledファミリーは,Wntファミリーと同じく肢芽において固有の発現パターンを示した。このうち新奇Frizzledとして同定したFrizzled-10は,Wnt-7a8の受容体として肢芽後部間充織でのSonic Hedgehogの発現維持に働くことを明かにした。
TiO_2表面の可視光励起キャリアーによる反応素過程のESR追跡

二酸化チタン(TiO_2)ナノ粒子表面での可視光誘起電子移動反応に関するESR研究を行った.部分的に還元した系では,表面に生成したO_2-とTi^3+との間で可視光誘起電子移動反応が可逆的に起こることを明らかにした.また,光増感色素のモデル化合物として1-ナフトールを吸着させたスラリー系では,可視光照射により捕捉電子(Ti^3+)が生成し,特異的な光応答を示すことを見いだした.さらに,増感剤分子間距離や分散剤共吸着の光電変換特性に及ぼす影響を明らかにした.二酸化チタン(TiO_2)ナノ粒子表面での可視光誘起電子移動反応に関するESR研究を行った.部分的に還元した系では,表面に生成したO_2-とTi^3+との間で可視光誘起電子移動反応が可逆的に起こることを明らかにした.また,光増感色素のモデル化合物として1-ナフトールを吸着させたスラリー系では,可視光照射により捕捉電子(Ti^3+)が生成し,特異的な光応答を示すことを見いだした.さらに,増感剤分子間距離や分散剤共吸着の光電変換特性に及ぼす影響を明らかにした.初年度は,二酸化チタン(TiO_2)への可視光照射で起こる電荷移動過程を調査するためのモデル系として、部分的に還元したTiO_2ナノ粒子に酸素を吸着させた系について、試料調製条件を系統的に変えてin-situ ESR観測を行った。研究成果を以下にまとめる。(1)部分的に還元したTiO_2ナノ粒子に酸素を吸着させて調製した試料の77K ESRスペクトルは、表面O_2^-およびTi^<3+>に特徴的な線形からなる。両ラジカル種のESRパラメータはTiO_2の結晶型によって異なり、特にO_2^-のg_z値は、結晶型および生成サイトの違いに依存して大きく異なることがわかった。(2) 77Kで可視光(λ=500nm800nm)を照射すると、TiO_2表面に生成したO_2^-とTi^<3+>のESR信号強度カミ増加することを見出した。また、室温暗所では照射前と同一のスペクトル線形となり、この光応答は繰り返し起こることがわかった。この光応答を詳しく調べた結果、特定のg_z値を有するO_2^-だけが光活性を示し、そのg値は結晶型に依存して異なっていた。また、この光応答は、程度の差はあるものの、調べたすべてのTiO_2ナノ粒子(ルチル、アナタース、P-25)で観測できた。中でも、ルチル型において最も顕著であった。(3)ルチル型TiO_2ナノ粒子では、g_z=2.023,2.020の2種類のO_2^-が生成し、g_z=2.023のO_2^-は可視光照射には全く応答せず、g_z=2.020のO_2^-が光応答を示した。ESRスペクトルの積分値から、ルチル型において可視光照射で増加するO_2^-とTi^<3+>のスピン量の比は1:1であることがわかった。(4)光応答が顕著に起こる試料の調製条件を最適化した結果、TiO_2粉末を300°C大気下で1時間加熱処理し、500°Cで脱気した後、水素を200Torr導入し1時間保持後、室温で残留ガスを脱気し封管することが最も適当であることがわかった。光増感色素のモデル化合物として1-ナフトールを用いたTiO_2スラリー系では、550nm以下の波長領域に新しい光吸収帯が現れた。この吸収帯は、吸着ナフトールと表面Ti^<4+>との強い相互作用で生成した電荷移動錯体によるもので、ESRスペクトルは照射光波長および光強度に依存して変化した(77K)。結果を以下にまとめる。2.可視光(400nm-500nm)と赤外光(>600nm)の同時照射を行うと、可視光単独照射の場合に比べてNaph^.と表面Ti^<3+>の生成量が増加した。また、可視光照射後の両化学種が生成している系に、赤外光を照射すると、Naph^.と表面Ti^<3+>が共に増加した。この光応答は、可視光照射によりナフトールはNaph^.となるが、同時に一部はTi^<4+>と弱く相互作用する準安定種に転移すると仮定すれば説明可能である。すなわち、この準安定種が、赤外光により、Naph^.と表面Ti^<3+>に転換すると考えられる。以上の観測結果は、さらに詳細な検討を行う必要はあるが、本来近赤外領域に吸収を示さない増感剤を使って、近赤外領域の光を光電変換に利用できる可能性を示唆するものであり、極めて興味深い。また、TEMPOを色素骨格に導入した常磁性色素を新規に合成し、色素吸着溶液の濃度やコール酸添加効果の色素分子間距離および色素増感太陽電池の光電変換特性に及ぼす影響を調べた。その結果、コール酸共吸着系では色素の凝集は分子レベルで完全に抑えられ、色素分子間距離が1.15nm以下では、分子間エネルギー移動による電荷再結合が優先的に起こり、電子注入効率が低下することを明らかにした。

1-ナフトールを吸着したTiO_2スラリー系のESRスペクトルの可視光応答を詳しく調べるため、ESK光応答の照射光依存性および拡散反射UV-Vis-NIRスペクトルの測定、TiO_2の前処理の影響の調査を行った。結果を以下にまとめる。1.TiO_2表面に吸着した1-ナフトールに由来する常磁性種として、昨年報告したNaph^.(I)(捕捉ホール)に加えて別の種類が生成していることが分かった(Naph^.(II))。Naph^.(II)のg値はNaph^.(I)と等しい(g=2.000)が、線形は全く異なり、線幅約0.7mTの1本線からなる。Naph^.(II)は赤色外光照射により、Naph^.(I)に非可逆的に転換することが示唆された。2.Ti^<3+>の可視光応答性は、TiO_2の前処理条件に大きく依存することが分かった。3種類の異なる条件(未処理、大気下またはO_2雰囲気化で300°C1時間加熱処理)で比較した結果、大気下で熱処型を行った系でTi^<3+>の光応答性は最も高く、未処理の系が最も低かった。また、本系への可視光照射で生成したTi^<3+>には近赤外光に対する応答性が異なる成分が2つ以上含まれていることが示唆された。3.ナフトール系に加えて、1-および2-ナフトエ酸を吸着させたTiO_2のスラリー系においても、分子自身が可視光吸収特性を有する2-アントラセンカルボン酸の系と同様に、可視光照射によりTiO_2中にTi^<3+>が生成し、可視光応答を示すことをESR法で確認した。本研究では、可視光領域に光吸収帯を有しない比較的小さいπ共役系分子(アンカー:-OHまたは-COOH)をTiO_2に吸着させると、光増感作用を示すことをESR法により明らかにした。本系は、TiO_2中での捕捉電子の光応答と拡散挙動を調査可能なモデル系として、また、電荷移動錯体の光電変換特性を示す単純な系として大変興味深い。
進行活性化EGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する集学的治療に関する基礎的検討

EGFR遺伝子変異の発現がPD-L1を誘導し,EGFR遺伝子変異陽性肺癌でEGFR阻害薬によりPD-L1発現が減少することが示唆されているが,我々の樹立したExon19欠失Egfr遺伝子改変マウスで肺腺癌組織にPD-L1の発現は免疫染色では認められなかったが,フローサトメトリーでは弱陽性であった。岡山大学病院で2004年2008年に切除された25症例の肺腺癌組織によるヒト検体の検討では,EGFR遺伝子変異陽性症例中9/12 (75%),EGFR遺伝子変異陰性症例中4/13 (31%)でPD-L1陽性であった。EGFR遺伝子変異陽性とPD-L1発現に有意な関連が示唆された(P=0.047)。1)EGFR遺伝子改変マウス(欠失型)における肺のPD-L1発現状況を免疫染色で検討した。肺腫瘍にPD-L1の発現が認められており、抗PD-L1抗体±ゲフィチニブをEGFR遺伝子改変マウスに投与して、ゲフィチニブ単剤との生存期間を比較検討中である。また,EGFR遺伝子改変マウス(欠失型)を10匹ずつ体重で層別化し6群に分け,A群無治療;B群10週齢よりゲフィチニブ5 mg/kg連日経口投与;B群10週齢よりゲフィチニブ50 mg/kg連日経口投与;D群10週齢よりエベロリムス(mTOR阻害薬)5 mg/kg連日経口投与;E群10週齢よりバンデタニブ25mg/kg連日経口投与;F群10週齢よリアファチニブ5 mg/kg連日経口投与;G群10週齢よりドセタキセル15 mg/kg腹腔内投与を行いながら,CTを4週毎に撮影し,各薬剤の最大効果発現時期を同定中である。また,腫瘍死まで観察中である。3)手術検体でのヒトにおけるPD-L1発現について検討中である。岡山大学呼吸器外科で2004年2008年に肺癌手術を行った101例の手術検体を用いて免疫染色でPD-L1の発現状況を調べている。現在のところ、約60例の免疫染色を行った。PD-L1発現状況と再発までの期間や、EGFR遺伝子変異やK-RAS変異などの遺伝子変異との関連を検討中である。1)EGFR経路の活性化とPD-L1の活性化による免疫抑制,気管支上皮細胞でのEGFR遺伝子変異の発現がPD-L1を誘導し、EGFR遺伝子陽性肺癌でEGFR阻害薬によりPD-L1発現が減少することが示唆されている。Exon19欠失EGFR遺伝子改変マウスでの肺腺癌組織におけるPD-L1発現を免疫染色で検討した。方法:検体は8週齢のマウスExon19欠失EGFR遺伝子改変マウスでの肺腺癌組織を用いた。ポジティブコントロールとしてマウスPD-L1が高発現しているGVHDマウスモデルの皮膚を使用した。結果:EGFR遺伝子改変マウスでの肺癌組織では抗体で阻止実験のできるレベルのマウスPD-L1の発現は残念ながら認められなかった。2)岡山大学病院で2004年2008年に切除された肺腺癌組織を使用して、PD-L1発現を免疫染色で調べた。EGFR遺伝子変異はPNA LNA PCR-Clamp法で測定した。結果:検体数は25例で全て肺腺癌症例であった。年齢中央値は64歳(範囲4783歳)、男性4例、女性21例であった。術後病期はI期22例、II期2例、III期1例であった。PD-L1陽性症例が全体で13/25 (52%)であり、EGFR遺伝子変異陽性例は12/25 (48%)であった。EGFR遺伝子変異陽性症例中9/12 (75%)がPD-L1陽性であり、EGFR遺伝子変異陰性症例中4/13 (31%)でPD-L1陽性であった。結論:肺腺癌切除症例においてEGFR遺伝子変異陽性とPD-L1発現に相関関連が示唆された(P=0.047, Fisher's exact test).現在,マウスモデルでの結果とヒト検体でのdiscrepancyを科学的に証明できていない。呼吸器内科学(胸部腫瘍学)昨年は医局・実験室の耐震化工事があり,移転作業のために実験が大幅に制約されたが,この4月に耐震化工事も終わり,それ以後順調に実験は進行されている。薬剤を投与した遺伝子改変マウスの生存期間を観察中であり,何らかの結論は確実に得られると考えている。ヒト検体でも染色はほぼ完了しており,臨床背景との関連を調査するのみである。

昨年は医局・実験室の耐震化工事があり,移転作業のために実験が大幅に制約されたため,消耗品の購入を大幅に控えていた。今年7月に耐震化工事も終わり,通常の実験活動も終わり,予定通り実験遂行可能と考えている。
アデノシンデアミナーゼ欠損重症複合免疫不全症の遺伝子分析と遺伝子治療の研究

アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損重症複合免疫不全症(SCID)の本邦症例のADA遺伝子解析を進めて来た。骨髄移植を受けたあと免疫不全症状が消失して生存している症例につき遺伝子解析を実施した。繊維芽細胞から調製したADAcDNAをPCRで増幅したあと、プラスミドベクターに挿入してクローニングした。2クローンの塩基配列を分析したところ、エキソン7の塩基646がGからAへ変異した点突然変異が発見された。これはADA216アミノ酸がグリシンからアルギニンへ変異することを意味する。この点突然変異によってADAcDNAに制限酵素BstXI切断部位が生じた。得られたADAcDNAクローンはすべてBstXIで切断された。しかし、繊維芽細胞ADA遺伝子からPCRで点突然変異部位を含むDNA断片を増幅してBstXI処理したところ、半分は切断されたが、残りは切断されなかった。対立遺伝子の一方は前記点突然変異を持つことを明らかにした。他の対立遺伝子の異常の解析を進めている。今年度および前年度に報告した症例はADAの酵素活性部位のあるエキソン7に異常があり、病気の重症度を反映している。遺伝子治療の手段として、遺伝子相同組み替え法を検討して来たが、組み替え効率が極めて低いために本法の研究を一時保留した。これに代わり、adeno-associated virusベクターの開発を進めて来た。本ベクターはレトロウイルスベクターと異なって分裂期でない細胞にも遺伝子移入が可能なので、造血多能性幹細胞も対象となり、有効性が期待されている。
シナプス前末端内Ca^<2+>動態の高速イメージング:放出と短期可塑性機構の解明

高速共焦点顕微鏡によるCa^<2+>ドメインの可視化カエル神経筋シナプス前末端において2ミリ秒の時間分解能での高速のCa^<2+>イメージングに成功し、電位依存性Ca^<2+>チャネルから流入したCa^<2+>により形成される空間的にヘテロなCa^<2+>濃度分布(Ca^<2+>ドメイン)を可視化した。Ca^<2+>ドメインは神経刺激後515ミリ秒の時間に存在し、25ミリ秒程度たつとほぼ一様になることが判った。シナプス前末端内Ca^<2+>除去へのミトコンドリアの寄与ミトコンドリア内Ca^<2+>をRhod2で測定した。連続刺激中は前末端内Ca^<2+>濃度上昇がプラトーに達したあたりからミトコンドリア内Ca^<2+>が上昇し始め、刺激終了後は前末端内Ca^<2+>は速やかに減少したのに対して、ミトコンドリア内Ca^<2+>は非常にゆっくりとしか減少しなかった。クロナゼパムでミトコンドリアからのCa^<2+>放出を抑制すると、100Hz30100回刺激終了後の末端内Ca^<2+>の減衰が速くなることからも、取り込まれたCa^<2+>が連続刺激終了後にミトコンドリアからゆっくりと放出されることが示された。前末端内残存Ca^<2+>と短期可塑性(促通)との関係BAPTAが少量でも負荷されると速い促通が抑制され負荷量が増えるとほとんど消失した。この時には遅い促通も減少した。EGTAは速い促通への抑制効果がBAPTAに比べて非常に弱く、多量に負荷しても速い即通は残った。しかし、遅い促通はよく抑制した。BAPTAを負荷すると、速いCa^<2+>減衰は消失し、減衰時定数12秒ほどの成分のみになった。EGTAを負荷した時には大きさは小さくなるものの速いCa^<2+>減衰成分が残り、後は減衰時定数が34秒の非常に小さな成分になった。速い促通は古典的残存Ca^<2+>で説明可能であるが、遅い促通は、残存Ca^<2+>を間接的に反映する遅いキネティクスを持った機構である。1.高速共焦点顕微鏡によるCa^<2+>ドメインの可視化カエル神経筋シナプス前末端において2ミリ秒の時間分解能での高速のCa^<2+>イメージングに成功し、電位依存性Ca^<2+>チャネルから流入したCa^<2+>により形成される空間的にヘテロなCa^<2+>濃度分布(Ca^<2+>ドメイン)を可視化した。2.前末端内残存Ca^<2+>と短期可塑性(促通)との関係Ca

^<2+>キレート剤であるBAPTAやEGTAを前末端に負荷した時の短期可塑性の変化を電気生理学的に、また、その同じシナプス末端内Ca^<2+>動態の変化を測光装置により測定した。結果は以下の様になった。BAPTAが少量でも負荷されると速い促通が抑制され負荷量が増えるとほとんど消失した。そして多量に負荷されると遅い促通も減少した。これに対して、EGTAは速い促通への抑制効果がBAPTAに比べて非常に弱く、多量に負荷しても速い促通は残った。しかし、遅い促通はよく抑制した。100Hz10回刺激後の末端内Ca^<2+>濃度の減衰は、3つの指数関数(減衰時定数40ミリ秒程度、150200ミリ秒、700800ミリ秒)の和プラス定数でよく近似された。これに、BAPTAを負荷すると、速いCa^<2+>減衰は消失し、ほぼ減衰時定数12秒程の成分のみになった。また、EGTAを負荷した時には大きさは小さくなるものの速いCa^<2+>減衰成分が残り、あとは減衰時定数が34秒の非常に小さな成分になった。これらの結果から、速い促通は古典的残存Ca^<2+>で説明可能であるが、遅い促通の機構は、残存Ca^<2+>をリアルタイムでモニターする高親和性Ca^<2+>センサーではなく、残存Ca^<2+>を間接的に反映するような遅いキネティクスを持ったものであると考えられる。1.高速共焦点顕微鏡によるCa^<2+>ドメインの可視化カエル神経筋シナプス前末端において2ミリ秒の時間分解能での高速のCa^<2+>イメージングに成功し、電位依存性Ca^<2+>チャネルから流入したCa^<2+>により形成される空間的にヘテロなCa^<2+>濃度分布(Ca^<2+>ドメイン)を可視化した。Ca^<2+>ドメインは神経刺激後515ミリ秒の時間に存在し、25ミリ秒程度たつとほぼ一様になることが判った。2.シナプス前末端内Ca^<2+>除去のミトコンドリアの寄与我々はカエル神経筋シナプス前末端内のCa^<2+>動態解析から、前末端内に速くて大容量のCa^<2+>除去機構が存在することを明らかにしてきたが、この機構がミトコンドリアへのCa^<2+>取り込みであることを以下のように実験的に示した。ミトコンドリア内のCa^<2+>濃度変化をRhod2で測定したところ、連続刺激中で前末端内のCa^<2+>濃度上昇がプラトーに達したあたりからミトコンドリア内のCa^<2+>濃度が上昇し始め、連続刺激終了後は前末端内Ca^<2+>濃度は速やかに減少したのに対して、ミトコンドリア内Ca^<2+>濃度は非常にゆっくりとしか減少してゆかなかった。ミトコンドリアからのCa^<2+>放出をクロナゼパムを用いて抑制すると、100Hz30100回刺激終了後の末端内Ca^<2+>濃度の減衰が速くなることからも、取り込まれたCa^<2+>が連続刺激終了後にミトコンドリアからゆっくり放出されることが示された。3.前末端内におけるCICRの短期可塑性(増進・増強)への寄与
リン酸基結合タグ分子を利用したリン酸化プロテオーム解析技術の開発

フォスタグ技術を世界標準のリン酸化プロテオーム解析技術にすることを目的として,(1)蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したリン酸化ペプチドのフォスファターゼ反応の解析システム,(2)リン酸化タンパク質のフォスタグ電気泳動システム,(3)リン酸化生体分子の分離カラムシステムなどを開発した.本研究で開発した新しいリン酸化合物解析法は,今後のリン酸化プロテオーム研究を劇的に促進するものであると確信している.フォスタグ技術を世界標準のリン酸化プロテオーム解析技術にすることを目的として,(1)蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したリン酸化ペプチドのフォスファターゼ反応の解析システム,(2)リン酸化タンパク質のフォスタグ電気泳動システム,(3)リン酸化生体分子の分離カラムシステムなどを開発した.本研究で開発した新しいリン酸化合物解析法は,今後のリン酸化プロテオーム研究を劇的に促進するものであると確信している.フォスタグ技術を世界標準のリン酸化プロテオーム解析技術にすることを目的として,1)フォスタググのリン酸基結合能と生体分子(酵素や抗体)の特異的機能を組み合わせた分析法,2)フォスタグ技術を組み込んだハイスループットなリン酸化生体分子の検出法(ペプチドアレイやキャピラリーゲル電気泳動法),3)リン酸化タンパク質のプロファイリングを目的とした新しい二次元電気泳動法,4)質量分析前処理用の耐圧性リン酸アフィニティー担体,5)フォスタグとリン酸基の結合により誘導される蛍光共鳴エネルギー移動を利用したリン酸化反応の分析法の開発を3年度計画で行います。本年度は,フォスタグ分子を生体高分子や人工高分子ビーズをアミド結合により結合させた新しい高分子を合成しました。それらの中でも人工高分子担体であるトヨパールに結合したフォスタグ誘導体は,液体クロマトグラフィー用の有機ポリマービーズとして優れた性質を持っていることを明らかにしました。また,ポリアクリルアミド電気泳動ゲル用に開発したアクリルアミド基を有するフォスタグは,電気泳動用ゲルの共重合単体として使用可能であり,新しい二次元電気泳動法へ応用できることを見いだしました。それら新しい二次元電気泳動は,汎用されているUrea PAGEや等電点電気泳動とフォスタグ電気泳動の組み合わせにより,リン酸化タンパク質の詳細な解析を可能にしました。さらに,フォスタグ電気泳動法は,リン酸化タンパク質の分離分析以外にも,遺伝子変異の検出(核酸分子の分離分析)にも適用可能であることを発見しました。このような新しい知見を踏まえ,来年度は特に光化学分析法へのフォスタグ技術の利用について検討を進めたいと思います。フォスタグ技術を世界標準のリン酸化プロテオーム解析技術にすることを目的として,1)フォスタグのリン酸基結合能と生体分子の特異的な分子認識機能を組み合わせた分析法,2)フォスタグ技術を組み込んだハイスループットなリン酸化生体分子の検出法(ペプチドアレイやキャピラリーゲル電気泳動法),3)リン酸化タンパク質のプロファイリングを目的とした新しい二次元電気泳動法,4)質量分析前処理用の耐圧性リン酸アフィニティーゲル担体,5)フォスタグとリン酸基の結合により誘導される蛍光共鳴エネルギー移動を利用したリン酸化反応の分析法の開発を3年度計画で行います。本年度は,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したリン酸化ペプチドのフォスフターゼ反応をリアルタイムで解析するシステムを開発しました。蛍光分子の組み合わせを検討した結果,基質となるリン酸化ペプチドにフルオレッセインを結合した分子と,アミノクマリンを結合したフォスタグの組み合わせの場合に最も有効なFRET現象が起きることが明らかになりました。それらの蛍光分子の組み合わせに,フォスファターゼを作用させると,リアルタイムにFRET効率の減少を観察することができました。今後,この蛍光分析システムを,キナーゼ反応の解析に利用することを検討していく予定です。また,フォスタグ電気泳動法は,リン酸化タンパク質の分離分析以外にも,複数の遺伝子変異の同時検出(核酸分子の分離分析)にも適用可能であることを発見しました。このような新しい知見を踏まえ,来年度は特にハイスループットなキナーゼ反応の解析システム(キャピラリー電気泳動法)について検討を進めたいと思います。フォスタグ技術を世界標準のリン酸化プロテオーム解析技術にすることを目的として,1)フォスタグのリン酸基結合能と生体分子の特異的な分子認識機能を組み合わせた分析法,2)フォスタグ技術を組み込んだハイスループットなリン酸化生体分子の検出法,3)リン酸化タンパク質のプロファイリングを目的とした新しい二次元電気泳動法,4)質量分析前処理用の耐圧性リン酸アフィニティーゲル担体,5)フォスタグとリン酸基の結合により誘導される蛍光共鳴エネルギー移動を利用したリン酸化反応の分析法の開発を3年度計画で行った。本年度は,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したリン酸化ペプチドのキナーゼ反応を解析するシステムを開発した。蛍光分子の組み合わせを検討した結果,基質となるリン酸化ペプチドにフルオレッセインを結合した分子と,アミノクマリンを結合したフォスタグの組み合わせの場合,キナーゼ反応に不可欠なATP存在下でも有効なFRET現象が起きることが明らかになった。それらの蛍光分子の組み合わせに,キナーゼを作用させると,FRET効率の増加を観察することができた。今後,この蛍光分析システムを,様々なキナーゼ反応の解析に利用することを検討していく予定である。また,フォスタグ電気泳動法は,リン酸化タンパク質の分離分析以外にも,ダメージを受けた生体試料内の遺伝子変異の同時検出にも適用可能であることを見いだした。

さらに,長期間保存可能なフォスタグゲルの開発にも成功した.本研究で開発した新しいリン酸化合物解析法は,今後のリン酸化プロテオーム研究を劇的に促進するものであると確信している。
新規カーボン多孔質材料の創製とキャラクタリゼーション

黒鉛にルビジウムやセシウムなどのアルカリ金属を反応させると、水素や窒素のような分子が収容される穴が無数にできるようになる。本研究では分子を吸収するときに分子とこの化合物の相互作用が分子の種類及びアルカリ金属の種類によってどのように異なるかを明らかにした。また、この化合物は空気中では不安定で分解してしまうが、ブタジエンを反応させて表面をポリブタジエンで被覆することで安定性が向上することを見出した。グラファイト(膨張化グラファイトシート、Grafoi1)をホストとして金属セシウムをインターカレーションし、セシウム濃度の異なる4種類の層間化合物(CsC24、CsC20、CsC16、CsC12)を合成した。これらの化合物の194Kでのエチレン吸収アイソサームを決定したところ、エチレン吸収量はCsC24で最も大きく(1モルのCsC24あたり約1.9モルのエチレンが吸収された)、セシウム濃度の増加と共に減少し、CsC20では1.5モル、CsC16で1モル、CsC12で0.6モルのエチレンが吸収されることが明らかにされた。これはCs濃度増加に対してナノスペース容積が単調に減少するためであると考えられた。このようにして得られた三元系化合物を室温で約2ヶ月間保持してエチレンのオリゴメリゼーションを促進させた後、水中に投入したところCs(C2H4)1.9C24以外の三元系化合物は水に浮いた相と沈んだ相に分かれたが、Cs(C2H4)1.9C24はすべてが完全に浮いた。またこれらの溶液中のCs濃度を分析した結果、Cs(C2H4)1.9C24の場合には溶液中のCs濃度は他のものと比べてきわめて低く、逆に浮遊物中には高濃度のCsが存在していることが確認された。以上のことからCsC24においてオリゴマー反応が最も効率的に進行していること及びオリゴマーネットワークが発達することによってセシウムと水との反応を著しく阻害しているものと考えられた。CsC24と分子との相互作用を明らかにするためにCsC24の分子吸収に伴う電気抵抗率を決定した。1モルのCsC24あたりエチレン吸収量が1モルまではほとんど抵抗率に変化がみられず、エチレンがナノスペースに容易に吸収されると考えられたが、1モルを越えた付近から急激な抵抗率増加が観測され、エチレンとの相互作用が吸収量によって大きく異なることが見出された。グラファイトの層間に新規ナノスペースを創製することを目的として、まずはセシウムやルビジウムをインターカレーションした化合物(CsC24、RbC24)を調製し、そのナノスペースにエチレン、ブタジエンを吸収させた。得られた三元系化合物を室温で放置してエチレンやブタジエンを層間内で重合させた後、酸素や水蒸気などで処理してアルカリ金属だけを選択的に除去して、最終的にナノスペースを有するグラファイト-オリゴマー複合体とすることが目標である。エチレンを吸収・重合させた三元系化合物(CsC24(C2H4)x)を酸素と反応させた場合、生成物は77Kで水素を吸収せず、分子吸収に有効なナノスペースの生成はみられなかった。同様にして水蒸気や液体アンモニアとの反応を実施したが、結果的には酸素処理と同様にナノスペース生成は確認できなかった。より反応性の大きい臭素で処理するとCsは完全に除去できることが確認された。しかしこの場合には臭素が生成物中に残留してしまい、目的とするグラファイト-オリゴマー複合体は得られなかった。ブタジエンをRbC24に接触・吸収させて三元系化合物を合成した。室温では表面にブタジエン重合物と思われる高分子物質が析出してしまうことから、-21°Cで吸収させたところ試料の端面にのみインターカレーションした。この三元系化合物は空気中で非常に安定で、端面の層間内で生成したブタジエン重合物が酸素や水蒸気との反応を阻止しているものと考えられた。電気抵抗率はRbC24の値とほとんど同じで、軽量高導電材料や熱電材料としての利用が考えられる。以上の結果からナノスペースを有するグラファイト-オリゴマー複合体の創製には至っていないが空気中で安定な黒鉛層間化合物を開発する方法が見出された。RbC24を合成し合成過程の電気伝導率変化を決定した。室温電気伝導率はグラファイトに比べておよそ20倍となった。この試料表面をポリブタジエン被覆した場合に電気伝導率はまったく変化せず、表面のみをポリブタジエンが覆っていることが推定された。ポリブタジエンで被覆していないRbC24試料をそのまま空気中に放置した場合の電気伝導率は空気と接触するや否や急激に低下して1日放置後には放置前に比べて約20%まで低下した。

これに対してポリブタジエン被覆した試料では1日放置後でも元の値の80%に相当する電気伝導率を保っており、表面ポリブタジエン層が空気中安定化に大きく寄与していることが見出された。その後時間経過と共に電気伝導率は徐々に低下してゆく様子が観測されたが1ケ月放置後でも元の値の約50%を保つことが確認された。今後このゆっくりした分解をいかに抑制するかが実用材料への応用にとって重要である。空気中放置に伴う電気伝導率変化を構造変化との関連で明らかにすることを目的としてX線回折測定を行った。ポリブタジエン被覆していないRbC24の場合には空気と接触後非常に急激にステージ構造が失われ一日放置後ではランダムステージ構造によるピークのみが観測された。これに対してポリブタジエン被覆した場合には空気中放置に伴って徐々にステージ2構造に基づくピーク強度が低下しステージ3、ステージ4といった高ステージ構造に相当するピークとランダムステージ構造に対応するピークが出現し、時間と共にそれらの強度が増加した。このことから電気伝導率減少と構造変化との関連が明らかにされた。
高等教育における看護教育カリキュラムとその開発に関する研究

本研究における当該年度は、3年間の研究計画の中の最後の年であり、本研究のまとめに入る年度である。したがって、本研究の目的すなわち「今日の社会におけるヘルスニードの構造的変化に対応できる看護婦リーダー及び看護研究者を育成する基礎としての4年制大学におけるカリキュラム開発を図ることを目的とする。」を達成させるための最終段階である。具体的に述べると以下の通りである。1.平成3年度に作成した看護学士課程カリキュラム評価ガイドラインを用いて、現行4年制看護系大学11校のカリキュラムと関係諸資料を分析した。2.1.の結果をみて、現行の4年制看護系大学11校がもつ問題点を指摘し、新しい3つのタイプのカリキュラムモデルを作成し、それらを精製した。3.研究報告書を作成するために研究代表者および研究分担者がそれぞれ分担して報告書を作成しつつある。今日の社会におけるヘルスニ-ズの構造的変化に対応できる看護婦リ-ダ-及び看護婦研究者を育成する基礎としての4年制大学におけるカリキュラム開発を図ることを目的として本研究に取り組んだ。まず、各研究分担者が、次の資料や文献を各々に分担して収集・分析した。すなわち、わが国の看護系大学における教育の現状分析のための資料や分献、各大学における現行カリキュラム、看護教育カリキュラムに関する実態調査、看護教育のフィロソフィやカリキュラムモデルの枠組に関する文献、看護教育の歴史的背景に関する文献を収集し、分析した。さらに、諸外国特にアメリカ・イギリス・ドイツ・オ-ストリア・ニュ-ジ-ランドの看護系大学における教育の現状分析のための資料や文献、各大学における現行カリキュラム、看護教育カリキュラムに関する実態調査、看護教育のフィロソフイやカリキュラムモデルの枠組に関する文献、看護教育の歴史的背景に関する資料や文献も収集・分析した。次に、これらの文献や資料の分析をもとにして、わが国の看護教育における4年制カリキュラムモデルの枠組について、その基本案を作成した。すなわち、看護学の学士課程を卒業した学生に期待する特性を中心として、看護学部・学科の教育目的や目標を設定し、カリキュラムデザインを検討した上で、具体的な学科目とその概要を整理した。これらの経過は、日本看護系大学協議会から関係諸機関に提出された看護学部・学科の設置基準に関する要望書としてまとめられた。又、現行の4年制看護系大学のカリキュラムを分析する枠組を検討し、決定した。上記の作業と並行して、次年度実施予定の調査用紙の内容や理論的枠組に関する討議を行ない、調査対象者を決定した。今日の社会におけるヘルスニ-ドの構造的変化に対応できる看護婦リ-ダ-及び、看護研究者を育成する基礎としての4年生大学におけるカリキュラム開発を図ることを目的とし、さらに大学設置基準の大綱化に伴い大学の自己評価の基準の検討が必要になっている時でもあり、信頼度の高いカリキュラム評価基準の作成は重要であると考え、本研究に取り組んだ。平成2年度の内外の文献研究をもとに、カリキュラムモデル案は1つではなく3タイプ創案された。すなわち、健康状況を基本枠組みとしたケアモデル(仮称)、多変量的健康システム論を基本枠組みとした健康レベルモデル(仮称)、人間の発達段階を基本枠組みとした発達段階モデル(仮称)である。これらのモデルは、看護の概念に深く結びついていることでもあり、多くの時間をつかい、その構造化と精製を行った。そして、各々のモデルに対応したカリキュラムデザインを検討し、具体的学科目の概要を整理した。また、現行カリキュラムの分析方法としてカリキュラム評価基準を用いることになったため、米国NLNの「Criteria for The Evaluation of Baccalaureate and Higher Degree Program」を邦訳し、一部修正の上、看護系4年制大学6校の現行カリキュラムの評価を試行した。その結果、実際に利用するに際しての問題点がいくつか明らかになったため、評価項目の追加修正、表現の明確化などを中心に数回の修正を行った。次に、このカリキュラム評価基準案の妥当性の検討を、看護教育のエキスパ-ト・大学カリキュラム委員会などに依頼した。その結果を現在収集中である。
ヒドリド超イオン導電体の物質探索

酸水素化物を対象に物質探索を行い、新規ヒドリドイオン導電体Ba2ScHO3を発見した。X線回折と中性子回折による結晶構造解析から、Ba2SHO3は[ScO4]層(ペロブスカイト層)と[Ba2HO]層(岩塩層)が交互に積層したK2NiF4型構造をとることが明らかになった。[Ba2HO]層中のH-とO2-は不規則配列し、全ての岩塩層内のアニオン位置は等価となる。一方で、これまでに報告したK2NiF4型構造のLi系酸水素化物は、ヒドリドがペロブスカイト層内を優先的に占有する。この構成元素の組み合わせによって変化するアニオン配列は、ポーリングの静電電荷則(第二規則)で説明できることができ、価数変化の無い非遷移金属系の酸水素化物においては、1価のH-がより価数の低いカチオンの近傍を優先的に占有する傾向があることが明らかになった。この結果は、カチオンの組み合わせを調整することで酸水素化物中のH/O配列を制御可能であることを示しており、今後のH-導電性酸水素化物の物質設計に役立つ指針となるであろう。また、新学術領域内の共同研究から、岩塩層内のH-拡散の活性化エネルギーがO2-の拡散よりも低いこと、過剰のH-を格子間位置に導入されることでペロブスカイト層内での拡散よりも高導電化が期待できることが理論計算により示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規哺乳類Atgホモログを用いたオートファジー制御機構の解析

昨年度までの研究から、Atg13がオートファジー誘導に必須であり、ULK1、FIP200とともに約3-MDaの複合体を形成していることを見出している。本年度は、Atg13-ULK1-FIP200複合体のより詳細な解析を進めるため、Atg13の結合因子の探索を行い、その候補因子として機能未知の新規遺伝子FLJ11773(Atg101)を得た。そしてAtg101は過剰発現系において、Atg13と結合することを確認した。Atg101を解析するために必要となる抗Atg101抗体をGST-Atg101を抗原としてウサギに免疫した。得られた抗体を用いて、免疫沈降実験を行い、内在性Atg101とAtg13、ULK1、FIP200との結合を検討した。その結果、Atg101は、栄養状態に依存せずにULK1、FIP200と結合していることが明らかとなった。さらに、superose6カラムを使用したゲル濾過クロマトグラフィー実験を行ったところ、Atg101はULK1-Atg13-FIP20複合体とともに、約3MDaという非常に大きな複合体を形成すること、加えて、Atg101の溶出画分がULK1、FIP200不在のAtg13溶出画分とも完全に一致したことから、Atg101がAtg13を介して、Atg13-ULK1-FIP200からなる3-MDa複合体に結合していることが示された。最後に、GFP-Atg101を用いて、Atg101の細胞内局在を観察したところ、GFP-Atg101が飢餓時に出現する隔離膜に局在することが明らかとなった。Atg13、ULK1、FIP200も隔離膜局在を示すことから、Atg101は、Atg13-ULK1-FIP200と結合し、オートファジー誘導に関与すると考えられる。本研究では、哺乳類動物細胞におけるオートファジー制御機能を解明するために、オートファジー制御の上流に位置すると考えられる哺乳類Atg13に注目し、機能解析を行っている。哺乳類Atg13のを解析するために必要となる抗Atg13抗体をHis-Atg13を抗原としてウサギに免疫し、得られた抗血清をGST-Atg13を用いて精製した。得られた精製抗体を用いて、ウェスタンブロット法を行い、哺乳類Atg13の検出バンドが、飢餓時にシフトダウンすることを見出した。ホスファターゼ処理によってAtg13のバンドがシフトダウンすることから、哺乳類Atg13は栄養状態が良好な時にはリン酸化されており、飢餓時には脱リン酸化されることが示された。さらに、作成した抗体を用いて免疫沈降実験を行い、内在性Atg13とULK1、FIP200との結合を検討した。その結果、哺乳類Atg13は、栄養状態に依存せずにULK1、FIP200と結合していることが明らかとなった。さらに、superose6カラムを使用したゲル濾過クロマトグラフィー実験を行ったところ、ULK1-Atg13-FIP20複合体は、約3MDaという非常に大きな複合体として細胞内に存在していることが明らかとなった。そして、この複合体構成因子のいずれかが欠けても、この巨大複合体は形成されず、オートファジー誘導能も欠損することも明らかとなった。また、GFP-Atg13を用いて、哺乳類Atg13の細胞内局在を観察したところ、GFP-Atg13が飢餓時に出現する隔離膜に局在することが明らかとなった。このため、この巨大複合体は、オートファジー誘導の初期段階に出現する隔離膜に局在し、オートファジー誘導に重要な役割を果たしていると考えられる。
光学活性βーシリルリンイリドの創製と不斉アルケニル化反応

βーシリルリンイリドはリン及びケイ素原子上の置換基を適当にデザインすることにより、アルデヒドとの反応において、シリル基が1,4ー転位したアルケニル化生成物を選択的にあたえる。この反応を不斉合成に応用する目的で、不斉源として光学活性フェロセニルホスフィンを用いて反応を検討した。光学活性βーシリルリンイリドla、及びlbはそれぞれ反応する光学活性N,N-dimethyl-1-[2-(diphenylphosphino)ferrocenyl]ethylamine(PPFA)のメチルホスホニウム塩とiodomethylmethyldiphenylsilaneから合成した。THF中n-BuLiで発生したイリドを-78°Cでアルデヒドと反応させると、アリルシランを生成することなくビニル化生成物を与え、さらにPPFAが回収できた。反応系にルイス酸(Et_2AlOEt)を添加すると収率が向上する。不斉収率に関しては、laを用いた場合benzaldehydeとの反応では770%eeであるが、脂肪族アルデヒドでは低い。一方、lbを用いると3-phenylpropanalとの反応でも85%eeの不斉収率が達成できた。Benzaldehydeとの反応で(S,R)-laからSー体、(S,S)-lbからRー体が得られたことより、この反応の不斉誘起はフェロセニル基側鎖の中心性不斉よりむしろフェロセニル基の面性不斉に基因することがわかる。今後リンイリドをさらにデザインすることにより、より高い不斉誘起が期待できる。