hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜光受容体間基質の光応答に関する基礎的研究

3)視細胞変性モデル動物の網膜光受容体間基質の光応答についてレクチンを用いて組織化学的に検索した。2種類の遺伝性視細胞変性マウス(nr,pcd)網膜では,視細胞外節が中等度以上変性した時点で光応答が消失したのに対し,視細胞外節の全く形成されないrdsマウス網膜では,生後のいずれの時点においても光応答は検出されなかった。以上の結果から,光受容体間基質の光応答が発現するためには,正常視細胞外節の存在が必要であることが判明した。1.N-グリコシド結合型糖鎖末端にシアル酸を付加する酵素であるβガラクトシドα2-6シアリルトランスフェラーゼのcDNAを分離し、遺伝子工学の手法を用いプラスミッドDNAに組み込み、RNAポリメラーゼを用いてそのmRNAに相補的なRNAプローブを合成した。これを用い、ラット網膜のα2-6シアリルトランスフェラーゼのmRNAの発現状態についてin situ hybridization組織化学的に検索した。網膜光受容体間基質光応答が初めて観察される生後16日目に一致して、そのmRNAの発現が増加している像が検出された。過去のレクチン組織化学的研究結果と合わせて考察すると、N-グリコシド結合型糖鎖末端のシアル酸が、光受容体間基質の光応答の発現に重要な役割を果たしている可能性が高くなった。一方、暗順応に比べ明順応網膜視細胞でそのmRNAの発現が増加している像が同定されたことから、2相性光応答の後半部分、すなわち明順応網膜の内節周囲の光受容体間基質成分の分布が光で増加するのは、光に応答して新しくその合成が増加したためであることが判明した。2.ウシ光受容体間基質をシアル酸を含む分画と含まない分画とにわけ、それぞれの電気抵抗値を測定比較したところ、前者の方が低いことが判明した。一方、サル網膜視細胞側より電極を用いて、錐体が多く存在する黄斑部と、杆体が多く存在する周辺部の光受容体間基質の電気抵抗を明順応下に測定、比較したところ、後者の方が低値を示した。すなわち、光受容体間基質の電気抵抗は、シアル酸を含有する杆体視細胞周囲の方が、シアル酸をほとんど含有しない錐体周囲よりも低いことが間接的に証明された。これらの実験結果から、杆体視細胞周囲の光受容体間基質の電気抵抗は低く、杆体外節の過分極の変化は、光受容体間基質を介して隣接杆体外節へ伝達される可能性が示唆された。
小児外科領域における大脳・仙骨神経調節の有用性に関する基礎的並びに臨床的検討

神経調節とは、障害された中枢・仙骨神経に電気的刺激をあたえ機能回復を図る方法で、痛みを伴わない小児に適した方法として高頻度磁気刺激法に注目し、小児外科疾患における有用性を基礎的並びに臨床的に検討した。家兎を用いた基礎的研究で、刺激条件として15Hz5秒間刺激を1分毎に10回刺激する方法とした。検討例(鎖肛24例、ヒルシュスプルング病10例、慢性便秘10例)において有害事象の発生はなかった。鎖肛術後薬剤抵抗性の高度排便障害2例、膀胱機能障害1例において、高頻度磁気刺激は著効を奏し、新しい治療法として有用であることを明らかにした。膀胱や消化管は、臓器自体の有する神経調節機構が高次の中枢性神経調節をうけることで、各臓器に特徴的な複雑な機能を営んでいる。このような神経調節機構は、多くの小児外科疾患において先天的に障害されていたり手術操作などにより障害を受けることがある。内科的治療に抵抗性の場合が多い。小児外科では、食道閉鎖、胃食道逆流症、腹部術後胃排泄能低下症例、消化性潰瘍、化学療法や腹部照射後の麻痺性イレウス、CIIPS、MMIHS、long segmentヒルシュスプルング病、慢性便秘、直腸肛門奇形、ヒルシュスプルング病、CIIPS、MMIHS、骨盤部悪性腫瘍、二分脊椎、その他の膀胱直腸部手術(膀胱尿管逆流症、水腎水尿管症、膀胱前立腺悪性腫瘍)など多彩な神経障害の存在する症例を治療している。神経調節は神経に電気的刺激を加えることで機能改善を図るものであるが、電極を生体内に埋め込み刺激するような侵襲的な操作ではなく、体外より高頻度磁気刺激を行うことで小児に適した非侵襲的な神経刺激を行うものである。しかし、小児においては至適刺激条件や刺激部位に関しても不明な点が多く、動物実験を用いた基礎的な磁気刺激法に関する検討と、臨床的な応用により磁気刺激法を用いた神経調節の有用性を検討することを目的としている。平成19年度(研究の初年度)は、次の基礎的並びに臨床的研究成果をあげることができた。基礎的研究:家兎を用いた頭部高頻度磁気刺激における至適刺激条件の検討家兎5羽を用いて、頭部高頻度磁気刺激を行い、膀胱内圧、直腸内圧に最も影響を及ぼす刺激条件の設定を行った。8の字型コイルにて左右の運動野を高頻度刺激することにより、直腸内圧と膀胱内圧の一過性上昇をもたらすことができた。至適刺激条件の設定のために筋電図導出と解析システムの構築が必要で、現在、1秒間の高頻度刺激に対する各筋電図解析システムが構築でき、現在動物実験のための記録システムを構築している。平成20年度は更なる詳細な解析が可能となる。臨床的検討:仙骨神経高頻度刺激neuromodulationによる膀胱・直腸機能改善の検討太施設の倫理委員会にて仙骨高頻度磁気刺激よる神経調節が認められ、直腸肛門奇形術後過緊張型膀胱1例、重度慢性便秘症1例、失禁型慢性便秘1例に対して各1クールの仙骨高頻度磁気刺激を行った。当初予定していた15Hz5秒間高頻度刺激を1分毎に30分行う刺激条件では、コイルが発熱し15分程度しか刺激できなかった。この条件の刺激では有害事象は発生しなかった。刺激前後で臨床的に明瞭な改善は認められていないが、高頻度磁気刺激に対する筋電図解析を今後行うことにより、疲労現象などとの関連で、その有用性を検討する。また、数ケ月毎に繰り返し行うことも検討している。また、胃食道逆流症の解析のためのインピーダンスシステムを本年度末に構築することができ、現在インピーダンスシステム自体の解析妥当性を従来の24時間pHモニターと比較検討しており、次年度には磁気刺激に対する有用性を開始する予定である。平成20年度(研究の二年目)は、次の基礎的並びに臨床的研究成果をあげることができた。基礎的研究:家兎を用いた頭部並びに仙骨部高頻度磁気刺激における至適刺激条件の検討頭部磁気刺激に対する反応は明瞭には導出できず、現在刺激部位の検討を続けている。仙骨部刺激では、明瞭な外肛門括約筋筋電図導出が可能で、種々の電極を作成し、刺激条件と記録電極との関連を検索している。自作肛門管スティック型電極では、皿電極と異なり明瞭な筋電図が記録可能で、しかも頻回刺激に対して漸増反応が記録された。今年度は、針電極を用いて括約筋single fiberよりの活動電位記録を検討し、仙骨部刺激の更なる精度向上と頭部からの刺激導出も再検討する。また、針電極による平滑筋である内肛門括約筋からの筋電図導出も検討する。臨床的検討:仙骨神経高頻度刺激neuromodulationによる膀胱・直腸機能改善の検討

昨年度よりの継続検討で、直腸肛門奇形術後過緊張型膀胱1例、重度慢性便秘症3例、失禁型慢性便秘3例に対して仙骨部高頻度磁気刺激を行った。過緊張型膀胱例にはこの2年間で2回刺激を行い、顕著な膀胱機能改善を観ている。有害事象の発生は昨年同様なかった。他の症例では、顕著な効果は認められていない。本年度は、仙骨部手術の術後にルーチンとして行う予定である。また、胃食道逆流症の解析のためのインピーダンスシステムを初年度に構築することができ、本年度は30例に施行でき、non-acid refluxの検出に有用であった。また、このうち12例はインピーダンスと従来の24時間pHモニターを同時測定し、食後の逆流評価に用いるための検討を進めている。頭部磁気刺激に対する反応は、動物実験で至適条件が不明のためまだ開始していない。直腸肛門内圧測定においては、仙骨磁気刺激に対する肛門反応を同時に測定し、23例において施行し、反応のパターンで仙骨機能評価が可能であった。平成21年度(研究の三年目)は、過去2年間の基礎的並びに臨床的研究成果をもとに次の成果を挙げることができた。基礎的研究:家兎をにおける実験では、仙骨高頻度磁気刺激により外肛門括約筋筋電図を良好に導出できる刺激条件を設定し、スティック型電極だけでなく針型電極両者による反応の違いを検討したが、再現性という点では全体から筋電図を導出するスティック型が優れていた。針型電極によるsingle fiber実験でも、頭部高頻度磁気刺激に対する反応は家兎では導出困難で、更なる検討には大動物による検討が必要と考えられた。臨床的検討:仙骨神経高頻度刺激neuromodulationによる膀胱・直腸機能改善の検討鎖肛術後過緊張型膀胱1例は、昨年度の検討でも更なる改善が得られ学会で報告した。また、仙骨磯能障害が考えられる重度慢性便秘、失禁型慢性便秘に対して継続して刺激を行い長期的経過が観察できてきたが、有害事象の発生は現在まで皆無である。また、顕著な改善ではないが施行前後で腹満の改善や排便時間の減少など多くの改善点が得られることが判明し、昨年度より仙骨部手術の術後にルーチンとして施行し、本年度にその効果を評価する予定である。直腸肛門内圧測定においては、仙骨磁気刺激に対する肛門反応を継続して施行している。現在の問題点としては、ヒトにおける適切な刺激条件の設定が困難で、昨年度より種々の方法を検討しているが、刺激回数が少なくても効果のある症例が存在し興味深い。中枢神経機能障害が関与すると考えられる胃食道逆流症において、新しい検査法としてインピーダンスシステムを導入し、従来法である24時間pH測定と同時測定を施行しその有用性を検討してきたが、持続して発生しているNon-acid refluxについては検知できないことが判明し、そのプログラムの改善を業者と検討している。逆流症における頭部刺激に適応に関しては、検討中である。平成22年度(4年間研究計画の最終年)は、過去3年間の基礎的並びに臨床的研究成果をもとに研究実績をまとめ、国際学会や国際誌での研究成果の発表を行った。基礎的研究:家兎における実験では、家兎用スティック型電極を作成し、仙骨刺激に対する外肛門括約筋反応の再現性のある導出を可能とし、頭部高頻度磁気刺激による反応を検討したが、頭部高頻度磁気刺激に対する反応は家兎では導出困難であった。臨床的検討:仙骨神経高頻度刺激
定量的層別マッピングによる機能性資材の抗口腔バイオフィルム作用の評価に関する研究

表面改質型酸反応性無機ガラス(S-PRG)フィラーは、ガラスコアの表層にグラスアイオノマー相を形成させたもので、種々の無機イオンを徐放する特性を有している。S-PRGフィラー配合歯磨剤の濾過液を口腔バイオフィルムに作用させると、齲蝕予防に有利なフッ化物停滞性の向上が認められたため、フィラーから徐放される二価の陽イオンであるストロンチウムに注目し、フッ化物停滞性の要因を検討したが、ストロンチウム単独の作用ではなく他のイオンとの相互作用の結果であることが示唆された。バイオフィルムに対する機能性という観点では、オーラルケア製品を利用した間欠的であっても高濃度での応用は望ましい方法かもしれない。表面改質型酸反応性無機ガラス(S-PRG)フィラー配合歯磨剤から放出されるフッ化物が、他の無機イオン(Al、BおよびSr)と同時に口腔バイオフィルムに作用した場合のフッ化物停滞性に与える影響を、depth-specific analysisの手法で評価した。被験者20名(18-34歳)の左右上顎臼歯部に、in situバイオフィルム堆積装置を取り付け、装置内のエナメル質片上に口腔バイオフィルムを堆積させた。3日後、装置を取り外し、Al (344.9 ppm)、B (460.5 ppm)、Sr (931.1 ppm)およびF (202.0 ppm)を含む、S-PRGフィラー配合歯磨剤スラリーの濾過液に1分間浸漬した。直ちに口腔内に戻し、30分後に装置を回収した。バイオフィルム試料は凍結乾燥後、包埋し、表層、中層、内層の層別試料分画(厚さ300μm)に分離した。表面から順に厚さ2μm×2片と4μm×4片の切片に分け、所定の厚さになるまで繰り返した。F (195.0 ppm)を添加したS-PRGフィラー未配合歯磨剤の濾過液で処理したものを対照群とした。4μmの切片から抽出されたフッ化物と他の無機イオンは、それぞれイオン電極法とICP発光分光分析法で定量した。分析結果は、染色した2μmの切片を用いて推定したバイオマス量で補正した。表層におけるAl、B、SrおよびFの平均取込比(S-PRG群/対照群)は、それぞれ3.48、2.34、3.64および3.64であった。両群とも、作用したフッ化物濃度はほぼ同じであったにも関わらず、S-PRGフィラー濾過液で処理したバイオフィルム表層のフッ化物濃度は、対照群よりも有意に高かった(t-test、p<0.001)。これらの結果から、S-PRGフィラー配合歯磨剤は口腔バイオフィルムのフッ化物停滞性を促進することが示唆された。口腔バイオフィルムをdepth-specific analysisの手法で評価するための層別採取法は、研究計画調書で示したように、これまでの研究方法を応用することができた。また、本研究に至るまえの検討で、ICP発光分光分析法を使った分析で、ストロンチウムが、バイオフィルムの内部まで浸透することが予想されていた。このような背景から、順調に経過したと考えられる。一方、試験歯磨剤から抽出されるフッ化物以外の無機イオンのうち、ホウ酸とアルミニウムについても、そのときのストロンチウムの場合と同様に、試料から抽出後、蒸留水で希釈し、ICP発光分光分析法で定量してきた。しかし、分析装置の部品交換により、溶液の吸引量が変わったことから、希釈方法を蒸留水から1N過塩素酸に変更し、希釈液の違いによる検出値への影響を検討したところ、ストロンチウムの測定結果には影響がなかったものの、ホウ酸とアルミニウムの検出値に影響することが明らかになった。そのため、この違いが最終的な結果にも影響するかどうか確認するため、抽出作業や希釈作業を検討する必要が出てきた。この検討に時間を要する場合には、今後の研究の進展に影響が出る可能性がある。表面改質型酸反応性無機ガラス(S-PRG)フィラーにはAl、B、FおよびSrを徐放する性質があり、このフィラーを配合した歯磨剤濾過液は口腔バイオフィルムのF停滞性を促進させる。このF停滞性の促進は2価の陽イオンであるSrによるという仮説の検証を行った。被験者18名の上顎両側臼歯部にin situバイオフィルム堆積装置を取り付け、エナメル質スラブにバイオフィルムを3日間堆積させた。その間、装置を、朝夕2回、S-PRGフィラー配合歯磨剤スラリーの濾過液(Al;340.5,B;447.7,F;181.0,Sr;985:ppm)に1分間浸漬した。最終浸漬から30分後に装置を回収し、凍結乾燥後、包埋試料を作製した。フィラー未配合歯磨剤濾過液にFとSrおよびFのみを添加した溶液で浸漬処理したものを陽性(PC群)および陰性対照(NC群)とした。バイオフィルム表面から切片(2μmおよび4μm)を交互に採取し、表層、中層および内層の層別試料分画(厚さ300μm)に分離した。酢酸緩衝液(pH5.2)を用いて4μm切片から無機イオンを抽出後、Fはイオン電極法、他のイオンはICP発光分光分析法で定量した。結果は、染色した

2μm切片の面積と切片の厚さから推定したバイオマス量で補正後、ANOVAと多重比較で統計的検討を行った。S-PRG群のF濃度は、PC群およびNC群より表層と中層で有意に増加した。しかし、全層を通じてPC群とNC群の間に有意差が認められなかったことから、S-PRGフィラーによるバイオフィルムのF停滞性の促進は、Sr単体の作用によるものでないことが明らかとなった。一方、S-PRG群とPC群は、全層でNC群より有意にSr濃度が上昇したが、S-PRG群で表層のSr濃度がPC群より高くなったことから、S-PRGフィラーにはSrの停滞性も亢進させる作用のあることが示唆された。S-PRGフィラー配合歯磨剤濾過液、フッ化物とストロンチウムおよびフッ化物のみ濃度調整したS-PRGフィラー非配合歯磨剤濾過液を、それぞれ反復曝露させた3種類のバイオフィルム内の無機イオンの分布の比較から、フッ化物停滞性の促進はストロンチウムの働きによるという仮説の検証を行った。その結果、ストロンチウム単独でのフッ化物停滞性の促進が確認されなかったことから、その停滞性は他のイオンとの相互作用によって起きる可能性が示唆された。同時に、フッ化物とストロンチウムを濃度調整したS-PRGフィラー非配合歯磨剤濾過液の反復曝露で、ホウ酸とアルミニウムの曝露がないにも関わらず、バイオフィル中のホウ酸とアルミニウム濃度の上昇がみられた。しかし、分析試料中のホウ酸とアルミニウムの濃度が低いことから、安定した結果を得ることが難しく、その結果に関してICP測定の微量な数値の変動がおよぼす影響を否定できなかった。表面改質型酸反応性無機ガラス(S-PRG)フィラーは、FやSrに加え、B、Al、SiおよびNaのイオンを徐放する性質を持つ。このS-PRGフィラーを配合した歯磨剤の口腔バイオフィルムへの機能性を明らかにする目的で、被験者の口腔内に留置した口腔バイオフィルム堆積装置上に形成されたin vivoバイオフィルムに、その歯磨剤濾過液を作用させ、depth-specific analysisの手法を用いて、Al、B、FおよびSrのバイオフィルム内分布の解析を行った。その結果、1回の浸漬処理でも、FとSrはバイオフィルムの内部まで容易に浸透し、この歯磨剤濾過液を3日間作用させたin vivoバイオフィルムを用いた分析から、この濾過液にはバイオフィルムのF停滞性を高める作用のあることが明らかとなった。2価の陽イオンであるCaやMgがバイオフィルム内のFの停滞性を高めることから、この濾過液中のSrの役割に注目し、フッ化物停滞性の要因の検討したところ、S-PRGフィラー配合歯磨剤に含まれるF停滞性の促進は、Sr単独の作用ではなく、他のイオンとの相互作用の可能性が示唆された。しかし、AlとBに関しては、ICPを用いた定量の際の微量な数値の変動による影響が否定できなかった。S-PRGフィラーを添加した歯科材料上に堆積したバイオフィルムは、内部から放出されたミネラルに絶えず曝されるため、より高濃度のミネラルの存在が期待され、安定したICPによる測定が可能と考えられた。そこで、最終年度では、S-PRGフィラーを配合した複合レジン上に堆積した口腔バイオフィルムを用いた同様の分析により、Al、B、F、SiおよびSrの分布を解析した。その結果、Fが同じ資源から放出される他のミネラルイオンと同時に作用すると、バイオフィルム内のFの挙動が影響を受ける可能性のあることが示唆された。表面改質型酸反応性無機ガラス(S-PRG)フィラーは、ガラスコアの表層にグラスアイオノマー相を形成させたもので、種々の無機イオンを徐放する特性を有している。S-
表面電離によるアルカリ金属の選択的脱離と捕集

汚染土壌から放射性Csを効率的に除染する方法として、電界中で土壌を加熱する手法について検討した。塩化セシウム(CsCl)を電界強度670 V/m以上で加熱すると、融点より200°C低い温度でCs+イオンが脱離することを見出した。また粘土鉱物にCsを吸着させた試料について電界中で加熱すると、Csだけが選択的にCs+として脱離することがわかった。460°Cで2時間加熱した後の残渣を定量分析した結果、加熱前に比べて、Csの含有量は約13%減少した。以上の結果から、電界中で加熱することによって、粘土鉱物からCsの一部を低温でCs+イオンとして選択的に脱離させることができることを明らかにした。本研究は、表面電離現象を利用してCs化合物およびCsを吸着させた粘土鉱物からCsを正イオンとして選択的に脱離させることに挑戦し、これにより福島第一原子力発電所の事故により粘土鉱物などに吸着した放射性Csを効率的かつ選択的に脱離させる方法の開発を目指して実施している。初年度である平成28年度は、Csの脱離装置の設計・製作を行うとともに、塩化セシウム(CsCl)を試料とし、表面電離現象およびそのメカニズムについて詳細に検討した。成果は以下のとおりである。まず、CsClを加熱したときのCsの脱離について検討した。CsClを真空中で等速昇温し、中性Csの脱離強度の温度依存性(昇温脱離スペクトル)を測定したところ、摂氏400度付近から脱離が始まり、650度付近にピークが認められた。このピーク温度は、CsClの融点(645度)に近いことから、CsClの融解、蒸発によるもとと考えられる。一方、Cs+イオンの脱離はほとんど認められなかった。次に摂氏460度において、CsClを入れたルツボに正電位をかけCs+イオンの脱離強度を測定したところ、ルツボ電位が+50 VくらいからCs+イオンの脱離が観測され、+300 V付近で脱離強度が飽和した。このことから、ルツボに正電位を印加することにより表面電離の割合が増加することが明らかとなった。また、ルツボに+100 V以上の電位をかけた場合、脱離するCs+イオンと中性Csの比(Cs+/Cs)は摂氏410度付近で最大となった。これはCsCl粒子の表面が融解することにより、表面の仕事関数が見かけ上大きくなり、表面電離によりCs+イオンとして脱離する割合が減少するためと考えられる。以上の結果から、試料に正電位を印加して加熱することにより、CsClの融点より240度低い410度という低温でCsをCs+として脱離させることができることを明らかにした。当初計画では、初年度の平成28年度において下記の2点を実施する計画であった。1)Cs脱離装置の設計・製作2)Csの標準試料(CsClなど)について脱離に関する基礎データの取得。1)に関しては、既存の真空加熱装置を改造し、試料電位の印加や試料温度測定ができるようにした。この真空加熱装置と四重極質量分析計を既存の真空容器に取り付け、CsClを加熱した時に脱離する中性Cs及びCs+イオン(質量数:133)が測定できることを確認した。以上のことから、Cs脱離装置の設計・製作は計画通り達成することができた。2)に関しては、CsClを試料とし、真空加熱による中性CsおよびCs+イオンの脱離について検討するとともに、試料に正電位を印加することにより表面電離の割合が増加し、Cs+イオンの強度が増大することを見出した。また、ルツボに+100 V以上の電位をかけた場合、脱離するCs+イオンと中性Csの比(Cs+/Cs)は摂氏410度付近で最大となることを見出し、そのメカニズムを明らかにした。以上の結果から、試料に正電位を印加することにより、410度という比較的低温でCsをCs+として脱離させることができることを明らかにした。以上、1)、2)の進展状況を勘案し、本研究は当初計画どおり、おおむね順調に進展していると判断した。福島第一原子力発電所の事故により、土壌中などに吸着した放射性Csの効率的な除染方法の開発が急務である。汚染土壌を加熱してCsを脱離させる除染方法は、廃棄物の発生量が少ない反面、1000°C以上の高温が必要と言われており、エネルギーコストを考えると、より低温でCsを脱離させる技術の開発が必要である。本研究は、Csのイオン化エネルギーが3.9 eVと全元素中最小であるという特異性に着目し、電界中で土壌を加熱することにより、CsをCs+イオンとして選択的に脱離させる手法について検討した。まず、標準試料として塩化セシウム(CsCl)の脱離挙動について調べた。ルツボに+100 V(電界強度は670 V/m)以上の電圧を印加し加熱すると、380°C付近から表面電離現象によりCs+の脱離が観測され、脱離するCs+イオンと中性Csの比は415°Cで最大となった。イオンと中性の脱離強度比の温度依存性を理論的に解析した結果、415°CにおけるCs+脱離強度の極大は、表面の仕事関数変化によることがわかった。

また脱離したCsを定量分析した結果、Cs+イオンの脱離収率は中性Csの約10倍であることがわかった。以上の結果から、CsClを電界中で加熱すると、CsClの融点(645°C)より200°C以上低い温度でCs+が脱離することを明らかにした。次に、実際の福島県産粘土鉱物にCsを吸着させた試料について検討を行った。通常の加熱では、800°Cまでセシウムは全く脱離しない。一方、ルツボに+100 Vを印加して加熱すると、Csだけが選択的にCs+として脱離した。そこで、460°Cで2時間加熱した後の残渣を定量分析した結果、加熱前に比べて、Csの含有量は約13%減少した。以上の結果から、電界中で加熱することによって、粘土鉱物からCsの一部をCs+イオンとして選択的に脱離させることができることを明らかにした。汚染土壌から放射性Csを効率的に除染する方法として、電界中で土壌を加熱する手法について検討した。塩化セシウム(CsCl)を電界強度670 V/m以上で加熱すると、融点より200°C低い温度でCs+イオンが脱離することを見出した。また粘土鉱物にCsを吸着させた試料について電界中で加熱すると、Csだけが選択的にCs+として脱離することがわかった。460°Cで2時間加熱した後の残渣を定量分析した結果、加熱前に比べて、Csの含有量は約13%減少した。以上の結果から、電界中で加熱することによって、粘土鉱物からCsの一部を低温でCs+イオンとして選択的に脱離させることができることを明らかにした。平成29年度も当初計画に沿って以下の研究を進める。1Csを吸着させた粘土鉱物の表面電離に関する検討:福島県に多い代表的な粘土鉱物であるバーミキュライト(福島県小野町から採取)にCsを吸着させた試料について、前年度と同様の表面電離に関する実験を行う。具体的には、まず試料を真空中で等速昇温し中性CsとCs+の脱離強度を測定する。次に、試料に正電位を印加した時の中性CsとCs+の脱離強度を種々の温度において測定する。これにより、表面電離現象を利用して粘土鉱物からCsをCs+イオンとして脱離させるための最適条件を見出す。2脱離したCsの定量:上記の実験において、脱離したCsの量を測定する。具体的には、加熱装置上方にCs捕集用の金属板を置き、種々の条件において金属板表面に堆積したCsの量を、X線光電子分光法、蛍光X線分析法により定量する。これにより、できるだけ低温でCsを多く脱離させることができる条件について検討する。以上の結果から、表面電離現象を利用した粘土鉱物からのCsの選択的脱離と捕集に関する最適条件を見出し、これにより提案した手法の有用性を実験的に実証したい。表面化学本実験の一部は、茨城県つくば市にある高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設(KEK-PF)で行うことを計画していて、そのための旅費(茨城県東海村ーつくば市、福島県福島市ーつくば市)を計上していた。この旅費に関しては、KEK-PFの放射光共同利用実験を申請し、それが認められたのでKEK-PFから支給される共同利用実験旅費を充てた。以上の理由により、次年度使用額が生じた。平成29年度は、1) Csを吸着させた粘土鉱物の表面電離に関する検討、および2)脱離したCsの定量分析および状態分析に関する実験を行う。予算は主にこれらの実験を行うための真空容器の部品(ガスケット、フランジなど)の購入、加熱装置の整備、および吸着実験用セシウム化合物試料の購入に充てる。また旅費は、実験に係る旅費(福島県いわき市ー茨城県東海村)および学会(日本放射光学会など)における成果発表のための出張旅費に充てる。
深層循環の数値モデル実験による基本的力学の研究

暖かい海水で満たされている南,北両半球にまたがる海洋が,南半球の南端域で冷たい水を形成することによって,どのように冷やされるかを調べることにより,深層循環の基本的力学の理解を図った.深層循環を水平対流として考えることにより,形成される冷たい水がそれ自身の力学によってどのように深層湧昇を形成するかを理解しようとするものである.海面では全海洋一様に暖めた.太平洋を対象としたモデルであり,以下のような知見が得られた.1.海洋の冷却は,形成域から冷水がポテンシャル渦度を保存しつつケルビン波形の密度流となってもたらされることから,赤道域及び東岸域の深層部から始まる.この東岸域の冷水は,ロスビー波型の密度流として内部領域に極向き流を形成しながら西に進み,西岸に達して,北半球には北向きの西岸境界流を形成する.このようにして赤道を横切る境界流が形成され,効率よく北半球が冷やされるようになる.北半球の北半分に反時計回りの循環が,東岸,北岸に沿って進ケルビン波の公課によって形成される.2.残りの海洋は内部領域及び沿岸での湧昇によって深層からより浅い層へと冷却されていく.3.上記過程において,冷たい水がまわりの暖かい水と混合することによって温度躍層が深層域まで広がる傾向がある.これにより,深層にも顕著な鉛直構造が存在するようになり,求まった水平循環パターンは最深層部のみがストメルのものとなる.4.赤道域の冷え方はそれ以外の海域と異なり,赤道に沿った東西流に"ZIGGY"構造が見られるように,鉛直高次モードの運動が卓越する.5.循環の強さは,等温面に直交する意味での鉛直拡散の効果に大きく存在しており,この効果が大きい程循環が活発になる.暖かい海水で満たされている南,北両半球にまたがる海洋が,南半球の南端域で冷たい水を形成することによって,どのように冷やされるかを調べることにより,深層循環の基本的力学の理解を図った.深層循環を水平対流として考えることにより,形成される冷たい水がそれ自身の力学によってどのように深層湧昇を形成するかを理解しようとするものである.海面では全海洋一様に暖めた.太平洋を対象としたモデルであり,以下のような知見が得られた.1.海洋の冷却は,形成域から冷水がポテンシャル渦度を保存しつつケルビン波形の密度流となってもたらされることから,赤道域及び東岸域の深層部から始まる.この東岸域の冷水は,ロスビー波型の密度流として内部領域に極向き流を形成しながら西に進み,西岸に達して,北半球には北向きの西岸境界流を形成する.このようにして赤道を横切る境界流が形成され,効率よく北半球が冷やされるようになる.北半球の北半分に反時計回りの循環が,東岸,北岸に沿って進ケルビン波の公課によって形成される.2.残りの海洋は内部領域及び沿岸での湧昇によって深層からより浅い層へと冷却されていく.3.上記過程において,冷たい水がまわりの暖かい水と混合することによって温度躍層が深層域まで広がる傾向がある.これにより,深層にも顕著な鉛直構造が存在するようになり,求まった水平循環パターンは最深層部のみがストメルのものとなる.4.赤道域の冷え方はそれ以外の海域と異なり,赤道に沿った東西流に"ZIGGY"構造が見られるように,鉛直高次モードの運動が卓越する.5.循環の強さは,等温面に直交する意味での鉛直拡散の効果に大きく存在しており,この効果が大きい程循環が活発になる.
去勢抵抗性前立腺癌における神経内分泌癌への進展機序と薬剤選択マーカーの開発

本年度は3Dオルガノイド作成と並行して前立腺癌におけるYAPの関連を検討した。細胞株でのYAPの発現と臨床検体での免疫染色でのYAPの発現を検討した。引き続き前立腺癌全摘出標本より3Dオルガノイドの作成を行ったが、臨床検体からの提供数の問題と安定した継代とオルガノイドバンクとしての構築にはまだハードルが存在するため、今後は研究分担者とも協力し、新たな手法を用いて引き続き安定した継代技術の確立と機能解析を進めていく予定である。また、根治的前立腺全摘術(開腹術、またはロボット手術)を施行した133名の患者標本を用いて免疫染色を行った。結果ではYAPとリンパ管浸潤(p=0.0124)、ARHGAP29とD'Amicoリスク分類、cT stage、術前Gleason score、全摘標本Gleason scoreとの間に有意差を認めた(p=0.0129, 0.0080, 0.0011, 0.0058)。予後との関連については、YAPとARHGAP29のいずれも生化学的無再発生存率(biochemical PFS)との間に有意差を認めた(P=0.0422, 0.0123)。細胞株を用いた解析ではYAPの下流のARHGAP29の発現がPC3で優位に発現亢進、LNCaPで有意に発現低下しており、これら細胞株を用いてYAP、ARHGAP29の前立腺癌における機能解析を行った。PC3にてARHGAP29をノックダウンすると細胞増殖が有意に抑制され、浸潤能も低下し、YAPのリン酸化が促進された。逆にLNCaPにARHGAP29を強制発現すると細胞増殖が促進され、浸潤能も有意に増強された。またPC3においてARHGAP29のノックダウンにてCofilinのリン酸化が上昇し、前立腺癌においてYAP-ARHGAP29-Cofilin経路を介した悪性形質の獲得の機序が解明された。本年度は3Dオルガノイド作成を主研究課題として行った。まずは山口大学人医学系研究等審査委員会にて「三次元培養技術を用いた尿路悪性腫瘍における進展と薬剤耐性獲得機序の解析に関する研究:承認番号H28-112」審査と承認を得たのち、前立腺癌全摘出標本より3Dオルガノイドの作成を行った。共同獣医学部からの指導も受けつつ、ほぼすべての症例から初代3Dオルガノイド培養の確立が可能となった。今後は安定した継代技術の確立と機能解析を進めていく予定である。また、並行して前立腺癌におけるYAPの関連を検討した。YAPはHippo signal伝達系の主要な転写因子であり、Hippo signal活性化することでYAP/TAZは細胞質に留まり、細胞増殖が抑制されるが、YAP/TAZの核移行すると細胞増殖が誘導され、癌の発生・進展に寄与することが報告されている。また、YAPは組織の3次元構築や硬度を制御する因子としても機能しており、メカノトランスダクションの重要分子と言われており、臨床的に硬結を有する前立腺癌でも重要な役割を果たしていることが推測される。そこで、本年は基礎的研究として、細胞株でのYAPの発現と臨床検体での免疫染色でのYAPの発現を検討した。細胞株ではAR非依存性のPC3、DU145細胞にてAR依存性のLNCaP、22RV1細胞より優位にYAPの発現亢進を認めた。またハイリスク前立腺全摘標本にて81例を対象にYAP、リン酸化YAP、YAPの下流分子であるARHGAP18の発現を免疫組織化学染色にて検討した。単変量解析にてYAPはPSA値グリソンスコア、皮膜外浸潤の有無と有意な相関を認め、ARHGAP18は直腸診での硬結の有無と有意な相関を認めた。症例数が少なくYAP発現の有無における無再発生存率ではp=0.1393であったが、高発現群は予後不良の傾向が認められた。ヒトでの検体を用いるため、まずIRB承認を得なければならなかったことと、症例集積が思うように進まない点。また3Dオルガノイド作成、継代の技術的な課題があったため。山口大学人医学系研究等審査委員会にて「三次元培養技術を用いた尿路悪性腫瘍における進展と薬剤耐性獲得機序の解析に関する研究:承認番号H28-112」の審査と承認を得たのち、前立腺癌全摘出標本より3Dオルガノイドの作成を行った。摘出標本より初代3Dオルガノイド培養の確立が可能であった。また3Dオルガノイド凍結切片を作成し、免疫染色を施行したところ、症例によってYAP、ARの発現が見られる症例があった。しかし、臨床検体からの提供数の問題と安定した継代とオルガノイドバンクとしての構築にはまだハードルが存在するため、今後は安定した継代技術の確立と機能解析を進めていく予定である。

また、PC3において培養環境の差により、すなわち2Dと3D培養にてYAPの発現に差異が見られ、やはり従来の2D環境下での細胞実験系においては3次元構築を基本とする生体内での癌の分子制御機構は十分に再現できていないことが立証され、3Dオルガノイドを用いた分子細胞機構の研究がより実臨床での診断、治療の応用に有用である可能性が示唆された。次にハイリスク前立腺全摘標本にて108例を対象にYAP、リン酸化YAP、YAPの下流分子であるARHGAP18の発現を免疫組織化学染色にて検討した。多変量解析にてYAPはリンパ管侵襲と相関を認めた(p=0.0440)。またさらにPSA非再発生存率ではYAPとARHGAP18で高発現群が有意に予後不良であり、多変量解析でARHGAP18は唯一の独立した予後予測因子であった(p=0.0062)。前立腺癌において全世界中で原発巣(限局癌)よりの前立腺癌オルガノイド樹立を競っているが、当科においてもいまだ安定した培養技術の確立に至っておらず、細胞バンク化に至っていないため、それを用いた安定した細胞解析や薬剤感受性試験に至っていないため。細胞株を用いた2D、スフェロイド培養を用いて代用し研究を進めているところである。本年度は3Dオルガノイド作成と並行して前立腺癌におけるYAPの関連を検討した。細胞株でのYAPの発現と臨床検体での免疫染色でのYAPの発現を検討した。引き続き前立腺癌全摘出標本より3Dオルガノイドの作成を行ったが、臨床検体からの提供数の問題と安定した継代とオルガノイドバンクとしての構築にはまだハードルが存在するため、今後は研究分担者とも協力し、新たな手法を用いて引き続き安定した継代技術の確立と機能解析を進めていく予定である。また、根治的前立腺全摘術(開腹術、またはロボット手術)を施行した133名の患者標本を用いて免疫染色を行った。結果ではYAPとリンパ管浸潤(p=0.0124)、ARHGAP29とD'Amicoリスク分類、cT stage、術前Gleason score、全摘標本Gleason scoreとの間に有意差を認めた(p=0.0129, 0.0080, 0.0011, 0.0058)。予後との関連については、YAPとARHGAP29のいずれも生化学的無再発生存率(biochemical PFS)との間に有意差を認めた(P=0.0422, 0.0123)。細胞株を用いた解析ではYAPの下流のARHGAP29の発現がPC3で優位に発現亢進、LNCaPで有意に発現低下しており、これら細胞株を用いてYAP、ARHGAP29の前立腺癌における機能解析を行った。PC3にてARHGAP29をノックダウンすると細胞増殖が有意に抑制され、浸潤能も低下し、YAPのリン酸化が促進された。逆にLNCaPにARHGAP29を強制発現すると細胞増殖が促進され、浸潤能も有意に増強された。またPC3においてARHGAP29のノックダウンにてCofilinのリン酸化が上昇し、前立腺癌においてYAP-ARHGAP29-Cofilin経路を介した悪性形質の獲得の機序が解明された。山口大学共同獣医学部とのオルガノイド安定樹立、継代についての技術協力が得られたため、引き続きヒトからの前立腺癌組織採取と3Dオルガノイド樹立を進めるとともに、去勢環境、薬剤投与での細動の遺伝子発現、増殖、浸潤への影響を遺伝発現、タンパク質発現の両面から検討する。また、オルガノイド樹立の基礎的確認としてマウス皮下移植腫瘍作成を行い、採取した元の前立腺癌組織とマウス皮下移植腫瘍の組織学的相同性の検討を確認し、オルガノイド樹立確実性を担保する。そのうえで2次元培養細胞との去勢環境、薬物投与環境での遺伝子発現変化を対比して、新規メカニズムの解明を進める。ターゲット分子の同定ができた時点で実際のヒト末梢血採血からのcell free
膵がん免疫微小環境における血管内皮細胞の役割と機能制御

研究成果マイクロアレイの解析結果からCDXを選択した。膵がん組織凍結切片をCDX抗体で免疫染色した結果、膵がん組織内の内皮細胞が陽性を示した。一方非腫瘍部の内皮細胞は陰性であった。凍結切片で用いたCDX抗体はホルマリン・パラフィン切片では陰性であるため、CDXを認識する他社CDXポリクローナ抗体を使用し、膵がん119症例の免疫染色を行った。膵がん腫瘍領域内において、CDX陽性内皮細胞細胞の多い群、少数群に分類し予後検定を行った。膵がん領域内CDX陽性多数群では優位に予後良好であった(p=0.002)。CDX陽性内皮細胞の分布は膵がん領域の辺縁部に多い傾向が認められた。次に膵がん組織の内皮細胞がどのようにしてDCXを発現するかを検討した。臍帯内皮細胞(HUVEC)を低酸素状態で24時間培養した細胞と通常培養状態で細胞のCDXの発現を解析した結果、低酸素状態で培養されたHUVECは通常状態で培養された内皮細胞に比してCDX抗原発現が1.3倍亢進していた。また、CDX分子の発現が膵がん組織の免疫微小環境に影響を及ぼしている可能性が考えられ、活性型のリンパ球マーカーCD69、分化マーカーHLADR及び細胞増殖因子マーカーKi67, CD4との各組み合わせによる二重染色を行い検討した。膵がん腫瘍組織内でCDX陽性細胞の多い群では内皮細胞周辺領域に活性型リンパ球が優位差をもって確認されたp=0.024。また、CTLA-4の発現とCDX発現を比較したところ、CTLA-4の発現はCDX陽性とは負に相関していた。CTLA-4の発現は過剰な免疫活性化を抑制することが知られ、CDXの発現亢進のデータを裏付けるものであった。これらの結果から、膵がん免疫微小環境の中でCDX陽性内皮細胞の発現は膵がん微小環境の局所で免疫反応を促している可能性が示唆された。この事は今回の研究テーマであるがん免疫微小環境の不均質の事象に帰結するものである。がんの免疫微小環境はがんの生物学にとって重要な役割を持つ。免疫微小環境の特性はがん組織への免疫細胞浸潤に反映され、免疫細胞の間質浸潤には血管機能の重要性が示唆されている。本研究では膵がん免疫微小環境における血管内皮細胞の役割と機能制御の理解を目指して、がん組織内の血管内皮細胞と免疫細胞浸潤との関係ならびにその機序を明らかにすることを目的にする。ヒト膵がん組織解析を出発点として、免疫細胞浸潤に関わる血管内皮細胞に発現する遺伝子・分子を同定し、その機能解析を進める。in vitro実験系、in vivo実験系、その遺伝子を血管内皮細胞に発現するトランスジェニックマウス作成と化学発がん系等を用いて、がん免疫微小環境形成における役割や機序について解析を進める。その分子の臨床病理学的な意義も検討する。初年度は、膵がん組織の免疫細胞浸潤と血管型や腫瘍内の位置との関係性を解析し、本研究ターゲットとすべき血管内皮細胞を明らかにする。膵がんおよび慢性膵炎組織内の血管内皮細胞について、網羅的遺伝子発現解析を実施する。がんの重要な生物学的特性は、がん細胞、がん間質、または両者の相互作用によって規定される。がん間質を構成する一員として免疫担当細胞があり、それによるがん微小環境に与える影響は大きく、このがん免疫微少環境が形成される分子機構を理解し、それをコントロールすることが出来れば、新たながん治療に繋がるものと確信される。1.膵がん組織および慢性膵炎組織において、免疫細胞浸潤に関わる血管内皮細胞に発現する遺伝子(分子)の同定と解析については膵がん組織あるいは慢性膵炎組織から単離した血管内皮細胞の網羅的遺伝子発現解析に関する進捗状況については現在外科切除された新鮮膵腫瘍組織・非腫瘍組織170検体を集めた。検体は術後直ぐに細切細断し酵素処理を行い、遊離した細胞を先ずCD45抗体付きマグネットビーズで前処理し、マクロファージを除いた後、CD31抗体付マグネットビーズにて血管内皮細胞を単離しマイクロアレイ解析までマイナス80度で保存した。また、検体の純度を確認するために検体処理後スメアーを作成し、CD31抗体を用い免役染色を行い純度の確認を行った。回収した内皮細胞検体のうち、非腫瘍6例と、膵腫瘍10例から全RNAを抽出、Rib-SPIA増幅法(NuGEN Technologies)により増幅後、マイクロアレイSurePrint G3, Agilentを用いマイクロアレイ実施した。また、膵がん微小環境及び膵がん組織に浸潤する免疫細胞分布の定量的検討については現在準備中である。免疫微小環境の特性がんの免疫微小環境はがんの生物学にとって重要な役割を持っている。免疫微小環境の特性はがん組織への免疫細胞浸潤に大きく反映され、がん患者の予後に関わりがある因子として報告がある。また、免疫細胞の間質浸潤には血管内皮機能の重要性が報告されている。腫瘍血管は正常血管と比較して病理組織学的に異なり,未熟であったり、腫瘍内血管同士の接着が正常に比べて疎であり、血管の透過性が亢進しているとの報告がなされている。また、がん微小環境内にある血管内皮細胞は染色体の異常、発現異常、血管基底膜異常などの報告が有り極めて重要な細胞である。

本研究では特に悪性度が高く予後の悪い膵臓がん組織における免疫微小環境内の血管内皮細胞の役割と機能制御の両面から理解を深め、膵がん組織内の血管内皮細胞と免疫細胞浸潤との関係とその機序を明らかにすることを目的とする。外科的に切除されたヒト膵がん組織解析を出発点として、免疫細胞浸潤に関わる血管内皮細胞に発現する遺伝子を網羅的解析により遺伝子及び分子を同定し、その機能解析を進める。in vitro実験系、in vivo実験系、その遺伝子群を血管内皮細胞に発現するトランスジェニックマウス作成と化学発がん系等を用いて、膵がん免疫微小環境形成における内皮細胞の役割や機序について解析を進める。また、その分子群の臨床病理学的な意義も免疫組織化学等の手法を用いて検討する。初年度は、膵がん組織の免疫細胞浸潤と血管型や腫瘍内の位置との関係性を解析し、本研究ターゲットとすべき血管内皮細胞を明らかにする。膵がんおよび慢性膵炎組織内の血管内皮細胞について、網羅的遺伝子発現解析を実施する。がんの重要な生物学的特性は、がん細胞、がん間質細胞、または両者の相互作用によって規定される。がん間質を構成する一員として免疫担当細胞があり、それによるがん微小環境に与える影響は大きく、このがん免疫微少環境が形成される分子機構を理解し、それをコントロールすることが出来れば、新たながん治療に繋がるものと確信される。1.進捗状況については膵がん組織および非腫瘍膵組織において、免疫細胞浸潤に関わる血管内皮細胞に発現する遺伝子(分子)の同定と解析については膵がん組織あるいは非腫瘍膵組織をコラゲナーゼ、リベレース酵素処理を行い、遊離した細胞を先ずCD45抗体付きマグネットビーズで前処理し、マクロファージ等を除いた後、CD31抗体付マグネットビーズにて血管内皮細胞を単離した。単離した検体は現在までに170例である。検体はマイクロアレイ解析までマイナス80度で保存した。また、検体の純度を確認するために検体処理後スメアーを作成し、CD31抗体を用い免役染色を行い内皮細胞の純度を確認した。回収した内皮細胞検体の中で内皮細胞の純度が高い非腫瘍膵6例と、膵腫瘍10例から全RNAを抽出、Rib-SPIA増幅法(NuGEN Technologies)により増幅後、マイクロアレイSurePrint G3, Agilentを用いマイクロアレイ実施した。2.膵がん微小環境及び膵がん組織に浸潤する免疫担当細胞分布の定量的検討については現在準備中である。研究成果マイクロアレイの解析結果からCDXを選択した。膵がん組織凍結切片をCDX抗体で免疫染色した結果、膵がん組織内の内皮細胞が陽性を示した。一方非腫瘍部の内皮細胞は陰性であった。凍結切片で用いたCDX抗体はホルマリン・パラフィン切片では陰性であるため、CDXを認識する他社CDXポリクローナ抗体を使用し、膵がん119症例の免疫染色を行った。膵がん腫瘍領域内において、CDX陽性内皮細胞細胞の多い群、少数群に分類し予後検定を行った。膵がん領域内CDX陽性多数群では優位に予後良好であった(p=0.002)。CDX陽性内皮細胞の分布は膵がん領域の辺縁部に多い傾向が認められた。次に膵がん組織の内皮細胞がどのようにしてDCXを発現するかを検討した。
合成ハイドロキシアパタイトより作成した骨形成促進性骨セメントの実験

1.家兎20羽の頚骨骨幹部にアパタイトセメントを埋入し、1、3、6、12週で5羽ずつ屠殺し、骨幹部における3連続非脱灰薄切標本を作製した。トルイジンブルー染色を行い、組織学的観察及び骨形態計測専用システムを使用し、アパタイトセメント周囲長とそれに直接接する新生骨面の比(周長比)を調べた。3週以降の全ての標本でアパタイトセメント周囲にセメントに介在物なく接する新生骨を認めた。また、周長比は週数の多いもののほど大きかった。この結果より、アパタイトセメントの良好な骨親和性が認められた。今後、より多い週数での骨新生の評価をする予定である。2.ハイドロキシアパタイトを用いた高位脛骨骨切り術は本年度まで変形性膝関節症の9膝に実施された。これらの術後成績を調査したところ臨床症状における明らかな改善に加え、レントゲン評価においてもアパタイトブロックの破損、変形を認めず、femorotibial angleも良好な矯正角を保っている事が確認された。本年度以降さらに追跡調査を実施しその長期成績を追求する。また内固定除去に伴い術後約1年にて摘出された標本からトルイジンブルー染色を行った非脱灰標本を作成し、光学顕微鏡にてその組織像を観察したところ、異物反応を示す炎症細胞浸潤は認めず、アパタイトと脛骨の境界面において線維組織の介在のない骨組織との直接結合が確認されている。アパタイト内への骨細胞の良好なingrowthも確詔されたがその量的評価については今後さらに術後2、3年を経過した標本との比較検討が待たれる。1.骨折への使用に関する応用実験予備実験として、家兎30羽の脛骨にドリルにて2ヶ所の穴をあけ、ハイドロキシアパタイトセメントに石膏を混和したものを、骨髄腔に注入して、骨形成を観察した。全例においてハイドロキシアパタイトセメント周囲の骨形成は良好であり、石膏による骨新生の阻害は認めなかった。また橈骨遠位端骨折の臨床例5例において、骨欠損部にハイドロキシアパタイトブロックを挿入充填し、骨形成および術後経過を観察した。全例において、充填部でのハイドロキシアパタイトブロックの骨癒合は良好であり、骨折周囲の関節機能も良好に保たれ、良好な経過であった。2.良性骨腫瘍への使用良性骨腫瘍の臨床例3例に対して、病巣掻爬後にハイドロキシアパタイト細顆粒にフィブリン糊を混和したものを充填し、骨形成ならびに骨との親和性を観察した。全例において、充填部でのハイドロキシアパタイト周囲の骨形成は良好であり、腫瘍の再発を認めなかった。3.人工関節再置換への使用まず、予備的にハイドロキシアパタイト細顆粒をフィブリン糊と混和して人工関節と骨との境界面に注入し、経過を観察した。経過観察期間中、人工関節はゆるみがなく、良好な経過であった。4.関節形成術への使用変形性膝関節症の臨床例5例に対して、高位脛骨骨切り術をOpening Wedge法として骨切り部にハイドロキシアパタイトブロックを楔状に成型したものを挿入し、術後経過を観察した。全例において、挿入したハイドロキシアパタイトブロックは沈みこみもなく、早期の骨癒合を認め、良好な経過であった。今後、臨床応用について、実際の症例に用いて経過をみるとともに、実験ではフィブリン糊などの接着剤との混合を調節する。評価1平成8年度に行った予備実験である家兎30羽の脛骨採取に対し、非脱灰薄切標本を作製し、トルイジンブルー染色を行い組織学的観察を行った。アパタイトセメント周囲には良好な新生骨形成が見られた。アパタイトセメントと新生骨の間には介在物がなく、お互いに接触を認めた。

また、骨形態計測専用画像処理システムを用い、アパタイトセメント周囲全長に対する新生骨の接触面の周囲長(周長比)を調べ、新生骨の形成能を定量的に評価した。周長比は全例高値を示し、良好な新生骨形成を示した。今回の実験に際し、アパタイトセメントが血液と混和したことにより粘性が低下し、このため操作性低下を認めた。これを改善するためにゼラチンを混和したアパタイトセメントを作成し、同様に家兎20羽の脛骨に埋入し、骨親和性を評価する実験を行っているところである。評価2平成8年に行った変形性膝節症に対して、ハイドロキシアパタイト楔形を挿入して行った高位骨切り術後の症例について、内固定材料として用いた金属固定材料であるプレートを抜去する際、前回の手術で挿入したハイドロキシアパタイトブロックと周囲骨を一部摘出した。5症例中2症例にプレート抜去術を施行し、検体を採取し、現在包埋処理中である。包埋完成後、評価1と同様に非脱灰薄切標本を作製、組織学的検討を加える予定である。また残りの3例についてもプレート抜去術を行い、同様に評価する予定である。1.家兎20羽の頸骨骨幹部にアパタイトセメントを埋入し、1、3、6、12週で5羽ずつ屠殺し、骨幹部における3連続非脱灰薄切標本を作製した。トルイジンブルー染色を行い、組織学的観察及び骨形態計測専用システムを使用し、アパタイトセメント周囲長とそれに直接接する新生骨面の比(周長比)を調べた。3週以降の全ての標本でアパタイトセメント周囲にセメントに介在物なく接する新生骨を認めた。また、周長比は週数の多いもののほど大きかった。この結果より、アパタイトセメントの良好な骨親和性が認められた。今後、より多い週数での骨新生の評価をする予定である。2.ハイドロキシアパタイトを用いた高位脛骨骨切り術は本年度まで変形性膝関節症の9膝に実施された。これらの術後成績を調査したところ臨床症状における明らかな改善に加え、レントゲン評価においてもアパタイトブロックの破損、変形を認めず、femorotibial angleも良好な矯正角を保っている事が確認された。本年度以降さらに追跡調査を実施しその長期成績を追求する。また内固定除去に伴い術後約1年にて摘出された標本からトルイジンブルー染色を行った非脱灰標本を作成し、光学顕微鏡にてその組織像を観察したところ、異物反応を示す炎症細胞浸潤は認めず、アパタイトと脛骨の境界面において線維組織の介在のない骨組織との直接結合が確認されている。アパタイト内への骨細胞の良好なingrowthも確認されたがその量的評価については今後さらに術後2、3年を経過した標本との比較検討が待たれる。