hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性疼痛下のモルヒネ反復投与によるオピオイド受容体情報伝達の変容と脱感作抑制現象

我々は慢性疼痛モデル動物を作成し、上記の現象を再現することに成功し、痛み刺激によるκオピオイド受容体(κ受容体)機構の活性化や、protein kinase C (PKC)などによる受容体リン酸化の減少が耐性形成抑制を誘導する可能性を示唆してきた。さらに、昨年度の報告においては、慢性疼痛下におけるmorphineの鎮痛効果に対する耐性形成抑制は、痛み刺激によるκ受容体機構の活性化が起こることによってcPKC活性が減弱し、μ受容体リン酸化の減少、すなわちmorphine耐性形成の抑制を導く可能性を示唆した。近年、細胞接着分子の一つであるNeural Cell Adhesion Molecules (NCAM)が、モルヒネμ受容体刺激によるPKCのリン酸化シグナル伝達機構の一部を共有し、さらに細胞レベルではNCAMの発現量低下とμオピオイド受容体の発現量低下が相関していることが報告されていることから、本年度は、新たな分子種としてNCAMに焦点を当てて検討した。NCAMに対するAS-ODNの処置によって、モルヒネの耐性形成は抑制された。さらに、モルヒネ耐性形成マウスの脳中脳部位におけるcPKCタンパク質の発現上昇もAS-ODNの処置によって薬物未処置の対照群レベルに回復した。さらに、モルヒネの耐性形成時には、NCAMタンパク質発現がモルヒネ投与後数時間で消失することが明らかになった。一方、慢性疼痛下のモルヒネ耐性不形成時には、NCAMタンパク質発現に変動はみられなかった。以上、慢性疼痛下におけるmorphineの鎮痛効果に対する耐性形成抑制には、NCAMの消失そのものに起因するのではなく、モルヒネ投与後にNCAMの急激な変動が起こらないことが、cPKC活性の上昇を抑制する機序において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
木曽三川下流低平農業地帯の水環境改善に対する集落排水施設の導入効果に関する研究

木曽三川の沖積作用により形成された豊かな濃尾平野における、都市部の無秩序な拡大を主因とする多くの問題の内、最も重要な水環境の悪化に対する農村側での取り組みとして期待される。農業集落排水施設の導入効果について研究を実施した。先ず、本施設の物理的な汚濁物質の負荷軽減作用だけでなく、農村居住民の地域環境改善への意欲を高め、ひいては周辺地域からの各種汚濁水の流入による農業用排水の水質悪化を防止する、広域対策の実施への方向性を追求した。対象地として、木曽三川下流域に分布する輪中群の中核的な位置を占める、高須輪中地区を中心として水環境の経時的変化に関する調査を継続し、今後さらなる改善への努力の傾注が必要であること確認した。同時に、高須輪中地区の最上流部に位置する平田町にて水路の水質調査を行い、現状の汚濁負荷の高さを実証すると共に、同町で計画・施工中の排水処理施設が早期に稼動を開始する以外に抜本的な対策がないこと、さらにそこへ至るまでの水質調査の継続が重要であることを認めた。農業集落排水施設の導入効果の検討に際し、処理機能に特徴を有する施設を対象に、機能と維持管理に関する調査を継続した。その結果、現在一般的に行われている運転管理のレベルでは、十分に設計処理機能が発揮できない状況が多く生起していることが分かった。また、これから着工ないしは供用開始が予定されている施設において、その処理能力の問題故に、将来間違いなく強化される排水基準とどう整合性を保つかということも、今後の重要な課題である。本低平地帯が排水の終着駅たる環境は以後も永劫に続くため、本排水施設の導入効果の高さと、その機能の維持管理の重要性とを強く認識した。木曽三川の沖積作用により形成された豊かな濃尾平野における、都市部の無秩序な拡大を主因とする多くの問題の内、最も重要な水環境の悪化に対する農村側での取り組みとして期待される、農業集落排水施設の導入効果について研究を開始した。先ず、木曽川下流地域における水質調査に関する公表資料の解析を行った結果、今回の検討対象地域内でもかなりの水質汚濁が確認された。従って、調査地区が下流地域全範囲に及べば、さらに多数の水質汚濁地域が確認されよう。しかし、現在水質関連のデータは意外に少なく、今回の検討においてもデータの収集にかなりの困難を生じた。よって、今後各地域における水質調査を補完的に行うと同時に、原因究明調査を行うことが必要である。さらに、汚濁地域の総合的な調査研究を行うことにより、水質汚濁の防止及び改善策を検討することも必要であろう。水環境改善策の一つとして期待される農業集落排水事業であるが、今回の検討ではその効果を明確にするまでには至らなかった。しかし、農村集落からの生活排水が明らかに汚濁源として関与していることが分かり、何らかの排水処理施設が必要であることは明かである。農業集落排水施設には、農村住民の自主的な水環境管理面などの波及効果が期待されているが、今後住民の意識調査を行うことにより水環境に関する関心を高めたり、集排事業に対する期待度を知ることも大切なことである。水環境の保全と管理は、地方行政機関と地域住民が一体となって初めて確立されるものであるが、問題となる河川流域全体の地域が事業に着手していく必要がある。以上の観点を踏まえ、次年度は所期の研究目的を達成するよう、さらに検討を深める予定である。木曽三川の沖積作用により形成された豊かな濃尾平野における、都市部の無秩序な拡大を主因とする多くの問題の内、最も重要な水環境の悪化に対する農村側での取り組みとして期待される、農業集落排水施設の導入効果について研究を継続した。

先ず、本施設の物理的な汚濁物質の負荷軽減作用だけでなく、農村居住民の地域環境改善への意欲を高め、ひいては周辺地域からの各種汚濁水の流入による農業用排水の水質悪化を防止する、広域対策の実施への方向性を追求した。対象地として、木曽三川下流域に分布する輪中群の中核的な位置を占める、高須輪中地区を中心として水環境の経時的変化に関する調査を継続し、今後さらなる改善への努力の傾注が必要であるを確認した。同時に、高須輪中地区の最上流部に位置する平田町にて水路の水質調査を行い、現状の汚濁負荷の高さを実証すると共に、同町で計画・施工中の排水処理施設が早期に稼動を開始する以外に抜本的な対策がないこと、さらにそこへ至るまでの水質調査の継続が重要であることを認めた。農業集落排水施設の導入効果の検討に際し、処理機能に特徴を有する全国の処理施設を対象に、機能と維持管理に関する調査を継続した。その結果、現在一般的に行われている運転管理のレベルでは、十分に設計処理機能が発揮できない状況が多く生起していることが分かった。また、これから着工ないしは供用開始が予定されている施設において、その処理能力の問題故に、将来間違いなく強化される排水基準とどう整合性を保つかということも今後の重要な課題である。本低平地帯が排水の終着駅たる環境は以後も永劫に続くため、本排水施設の導入効果の高さと、その機能の維持管理の重要性とを強く認識した。
アンギオテンシン変換酵素阻害薬を長期投与した高血圧自然発症ラットの血管反応性

【目的】アンギオテンシン変換酵素阻害薬(ACEI)長期投与による血管反応性の改善効果とその機序についてSHRを用いて検討した.【方法】19週齢の雄性SHRにcaptopril 100mg/kg/day、AT_1受容体拮抗薬:losartan 10mg/kg/dayをそれぞれ飲水に加え与え群、BK_2受容体拮抗薬であるHOE140 500mug/kg/day(osmotic mini pump)+captopril 100mg/kg/dayを与えた群、薬物非投与のcontrol群の4群で検討した。7週間の飼育後に大動脈と上腸間膜動脈を摘出し、serotonin(5-HT),KClに対する収縮反応とacethycoline(ACh)とsodiumnitropursside(SNP)に対する弛緩反応を等尺性張力の変化で評価した。【結果および総括】7週目での血圧値はcaptopril群138±7,DUP群144±6,captopril+HOE 140群146±18(mmHg)でcontrol群の178±6に比し,有意に低下していたが、薬物投与の3群間では有意差はみられなかった.1)Captoprilは,上腸間膜動脈,大動脈の両血管においてKCl,5-HTに対する収縮反応とAChに対する内皮依存性弛緩反応を改善させた.2)Losartanは,上腸間膜動脈においてKCl,5-HTに対する収縮反応とAChに対する弛緩反応を改善させたが,大動脈では有意な変化は認められなかった.また,上腸間膜動脈でみられた改善効果はCaptoprilのそれに比し小であった.3)HOE 140は,上腸間膜動脈においてAChに対する弛緩反応を減弱させた.4)SNPに対する内皮非依存性の弛緩反応は薬物投与の各群で差はなかった.【結論】captopril,losartanともにSHRでみられた異常血管反応性を改善させたが,その効果はCaptoprilの方が大であり,とくに内皮依存性弛緩反応の改善にはACEIのもつbradykinin濃度増加の関与が示唆された.【目的】アンギオテンシン変換酵素阻害薬(ACEI)長期投与による血管反応性の改善効果とその機序についてSHRを用いて検討した.【方法】19週齢の雄性SHRにcaptopril 100mg/kg/day、AT_1受容体拮抗薬:losartan 10mg/kg/dayをそれぞれ飲水に加え与え群、BK_2受容体拮抗薬であるHOE140 500mug/kg/day(osmotic mini pump)+captopril 100mg/kg/dayを与えた群、薬物非投与のcontrol群の4群で検討した。【結果および総括】7週目での血圧値はcaptopril群138±7,DUP群144±6,captopril+HOE 140群146±18(mmHg)でcontrol群の178±6に比し,有意に低下していたが、薬物投与の3群間では有意差はみられなかった.1)Captoprilは,上腸間膜動脈,大動脈の両血管においてKCl,5-HTに対する収縮反応とAChに対する内皮依存性弛緩反応を改善させた.2)Losartanは,上腸間膜動脈においてKCl,5-HTに対する収縮反応とAChに対する弛緩反応を改善させたが,大動脈では有意な変化は認められなかった.また,上腸間膜動脈でみられた改善効果はCaptoprilのそれに比し小であった.3)HOE 140は,上腸間膜動脈においてAChに対する弛緩反応を減弱させた.4)SNPに対する内皮非依存性の弛緩反応は薬物投与の各群で差はなかった.【結論】captopril,losartanともにSHRでみられた異常血管反応性を改善させたが,その効果はCaptoprilの方が大であり,とくに内皮依存性弛緩反応の改善にはACEIのもつbradykinin濃度増加の関与が示唆された.
HTLV-I抗体陽性者の長期追跡

日本には九州、沖縄を中心にキャリアが約120万人存在し、その一部が数十年の長い潜伏期間を経てATL、HTLV-I関連ミエロパシー(HAM/TSP)、ぶどう膜炎などを発症する。抗体陽性者を長期間追跡することで感染から発症に至る間の生体内での変化と、それに係わる内外の因子を解析することができる。HTLV-I関連疾患の臨床像、疫学的特徴を検討する。各バイオマーカーとHTLV-Iプロウイルス量との関係を解析し、HTLV-I関連疾患発症のリスクグループを特定する。また献血時に抗体陽性者に通知が開始され、通知後に起こる様々な社会医学的問題についても研究班として対応していくことが期待されており、これまでの基礎的データを役立てていく。本研究は、キャリアの追跡を基本とし、HTLV-I感染症の自然史の詳細な解明を目的とする。これらは治療、予防への道を開くものである。HTLV-I、成人T細胞白血病(ATL)多発地域の研究者は各々追跡対象地域を設定し、HTLV-I抗体陽性者(キャリア)の生体内で起こる経時的変化、リスク因子、リスクグループを明らかにしている。今年度は下記のプロジェクトが進行した。抗体陽性者の長期追跡によりキャリアからのATL発症率、HTLV-Iの年間陽転率、HTLV-I関連疾患の全貌が明らかになりつつある。HTLV-I感染が世界で最も濃厚である地域で進められている各班員の研究は疫学から臨床まで広範囲であり、高い水準が維持されている。2.第9次ATL全国実態調査4.ATLの発症、進展とp16遺伝子のメチル化7.HAMにおけるHTLV-Iプロウイルス量の長期追跡10.緑茶ポリフェノールによるATL予防介入の基礎研究HTLV-Iキャリアの生体内で起こる経時的変化、リスク因子、リスクグループを明らかにするため、多発地域の研究者は各々追跡対象地域を設定している。キャリアからの成人T細胞白血病(ATL)発症率、HTLV-Iの年間陽転率、新しいHTLV-I関連疾患が明らかになりつつある。毎年地域への情報還元を目的として各班員のフィールドで公開シンポジウムを開催している。今年度の研究実績は以下のとおりである。1)HTLV-Iキャリア13年間のフォローアップ:ATL発症者の発症前ウイルスマーカー2)長崎県におけるATLの罹患変動3)HTLV-Iキャリアのフォローアップ4)HTLV-Iの組み込み部位5)感染細胞のサイトカイン構成的過剰産生に対する眼房水中の抑制因子とその抑制機構6)対馬成人検診におけるHTLV-Iとシェ-グレン症候群に関する検討7)HTLV-Iと膝関節疾患VIII.同種骨髄移植を施行したATL8)ATL細胞.HTLV-I細胞株における模型.分泌型Fsa(CD95)isoforms9)HTLV-Iによる膜融合機構の解析XI.HLA-A^*26とB^*4002/6のHTLV-ITaxアンカーモチーフの欠如はATL発症リスクと関連するHTLV-I、成人T細胞白血病(ATL)多発地域の研究者は各々追跡対象地域を設定し、HTLV-I抗体陽性者(キャリア)の生体内で起こる経時的変化、リスク因子、リスクグループを明らかにした。この十年の抗体陽性者の追跡によりキャリアからのATL発症率、HTLV-Iの年間陽転率、新しいHTLV-I関連疾患が明らかになりつつある。2)長崎県離島におけるキャリアの長期追跡4) ATLの発症、進展とp16遺伝子のメチル化の関連5) 1、HTLV-Iぶとう膜炎(HU)におけるウイルス量とHTLV-I感染細胞のサイトカイン構成的過剰産生に対する眼房水中の抑制因子とその抑制2、HTLV-Iの潜伏感染におけるLTRのCpGメチル化の意義8)岩手県内のHTLV-I抗体陽性者9) ATLにおけるFas Isoformと病態11)緑茶ポリフェノール成分はHTLV-I感染細胞のアポトーシス誘導とpX遺伝子発現を抑制する日本には九州、沖縄を中心にキャリアが約120万人存在し、その一部が数十年の長い潜伏期間を経てATL、HTLV-I関連ミエロパシー(HAM/TSP)、ぶどう膜炎などを発症する。

HTLV-I感染が世界で最も濃厚である地域で進められている各班員の研究は疫学から臨床まで広範囲であり、高い水準が維持されている。2.第9次ATL全国実態調査4.ATLの発症、進展とp16遺伝子のメチル化7.HAMにおけるHTLV-Iプロウイルス量の長期追跡10.緑茶ポリフェノールによるATL予防介入の基礎研究
コーパス分析に基づく辞書の位相情報の精緻化

本研究は,その重要性にも関わらず,従来の国語辞典において記述が不十分だった位相情報を取り上げる。はじめに,国語辞典・英語辞典に注記されている位相情報を調査した。次に,位相情報のうち,「古風な語」に着目し,各種国語辞典の記述の比較調査,『現代日本語書き言葉均衡コーパス』における使用実態の調査と用例分類,辞書記述方法の作成を行った。また,日本語学習者や,母語話者である大学生が作文において誤りやすい位相情報の調査・分析を行った。話し言葉的な語がレポート類の作成時に誤って用いてしまう例を抽出した。そして,誤用を訂正する情報がコーパス分析から得られる実例を示した。(1)日本語教育におけるアカデミック・ライティング指導において文体差の指導が必要となる語の分析を行った。日本語学習者にとって必要度の高い文体的特徴を持つ語を,日本語教育の修士コースの学生4人がアカデミックな文章として書いた合計64の文書から抽出した。例えば,「A.そんなに/それほど,B.どれくらい/どの程度,C.一番/最も,D.すごく/非常に」の4組(前者がいわゆる話し言葉的で修正対象となった語,後者が書き言葉的な修正候補語となった語)についてその使用実態を『現代日本語書き言葉均衡コーパス』(BCCWJ)を硬[白書,教科書,広報紙,新聞],中[書籍],軟[雑誌,Webデータ]の3つに区分して調べた(中納言1.0.2を使用)。その結果,A,Bは,軟らかい文体で話し言葉的な語(そんなに、どれくらい)が多く使われ,一方C,Dは,特に硬い文体で話し言葉的な語(一番、すごく)がほとんど使われていない,という特徴を捉えることができた。いずれも使用実態からその文体差が明確に捉えられることがわかった。また。今回の調査で、書き言葉コーパスであるにも関わらず,いわゆる話し言葉的な語が,硬,中,軟のいずれの文体の文章にも使用され,その割合もあまり低いものではないという点が確認できた。それらの成果をまとめ,次のとおりポスター発表を行った。木田真理・柏野和佳子「書き言葉均衡コーパスを活用した文体的特徴を持つ語の分析と記述の試みーアカデミック・ライティング指導を例にー」『日本語教育国際研究大会名古屋2012予稿集第1分冊(ポスター発表)』p.217.(2012年8月18日)(2)現行の国語辞典で扱われている「古風」という位相情報の調査分析とコーパスを活用した辞書記述の改善案を作成した。その成果をまとめ,論文誌に投稿中である。『岩波国語辞典』に「古語的」と注記がついている15語と,「古風」と注記がついている145語を調査対象語に選定し,現行の国語辞典5種の記述を調査した。そして,『現代日本語書き言葉均衡コーパス』に収録される図書館サブコーパスの使用頻度調査と用例分析とを行った。「古風な語」の使用を,(1)古典の引用,(2)古い文体,(3)時代・歴史小説,(4)現代文脈,に4分類する辞書記述方法を提案し,実際に記述を行った。その結果,文体的特徴や用例を辞書に記述することは,作文や日本語学習などのさまざまな用途に対する情報量を増やし,その利用価値を高めることを明らかにした。その成果を論文誌に投稿中である。また,アカデミック・ライティング指導において文体差の指導が必要となる語の分析を最終年度にさらに進めた。丸山を中心に,「台湾人日本語学習者の誤用調査」「母語話者である大学生のレポートの語彙調査」「書き言葉と話し言葉の助詞の分布の分析」を行った。ここから,例えば「得た」とすべきところを「もらった」とするような誤りや,「だいぶ,たくさん,たまに,結構,案外」などのくだけた副詞をレポートで多用するなどの問題点を抽出した。さらに,木田・柏野は,大学院の修士課程で学ぶ留学生が授業における課題やレポートとして書いた文章から,文体差の指導が必要なものを抽出し,文体差の修正を要する語の代表例を『現代日本語書き言葉均衡コーパス』で分析した。それにより,コーパスの分析結果が示す使用実態は,日本語教師にとっても,学習者にとっても文体差の修正が必要とされる度合いの手がかりとなる有益な情報であることを明らかにした。その成果を『第5回コーパス日本語学ワークショップ』(国立国語研究所,2014年3月7日)で口頭発表した。(1)各種国語辞典・類語辞典に注記されている位相情報に関する先行研究を調査し,また,最新の位相情報についても調査した。(2)次の英和辞典・英英辞典を対象に,位相情報の付与状況を比較分析した。[ロングマン英和辞典/桐原書店(2007)※収録:約10万語,ロングマン

現代英英辞典(5訂版)/桐原書店(2008)※収録:約23万語,ロングマン現代アメリカ英語辞典(2訂版)/ピアソンエデュケーション(2008)※収録:約18万語,コリンズコウビルド英英辞典(改訂新版)/桐原書店(1995)※収録:約7万5千語,ケンブリッジ英英辞典(3版)※収録:約17万語。](3)次の英和辞典で用いられている位相情報の比較調査を行った。[ロングマン英和辞典/桐原書店(2007)※収録:約10万語,ウィズダム英和辞典(2版)/三省堂(2007)※収録:約9万語,ユースプログレッシブ英和辞典/小学館(2004)※収録:約8万5千](4)中村明『日本語語感の辞典』(岩波書店,2010年)の位相情報の調査,分析を行った。「時間性」の「古い」語,約1400語を抽出した。また,『現代日本語書き言葉均衡コーパス』(国立国語研究所),『青空文庫』(http://www.aozora.gr.jp/),『太陽コーパス』(国立国語研究所)の頻度調査に着手した。(5)日本語学習者の作文を分析し,日本語学習者が誤りやすい位相情報をもつ語を抽出した。そして,それらの語のコーパス分析に着手した。当初の計画通り,国語辞典における位相情報(古風)のつく語が,現行の国語辞典でどう扱われているかを調査し,実際の使用実態をコーパスで分析し,新たな辞書記述の方法を提案し,その成果を論文誌へ投稿できた。また,教育におけるアカデミックライティングにおける位相情報の活用に着目し,日本語学習者が誤りやすい位相情報をもつ語の調査分析を行い,その成果のポスター発表を行えた。このように,応用研究についても進めることができた。文章語か口語か,硬い語か俗語か,といった位相情報のコーパス分析については,進捗が遅れている。初年度に,各種国語辞典・類語辞典に注記されている最新の位相情報を明らかにすることを目的にしていた。それら調査に加え,位相情報の記載が充実している英英辞典や英和辞典を調査分析に加えたこと,及び,豊富な位相情報が記載された,中村明『日本語語感の辞典』を調査分析に加えたことにより,現在までにどのような位相情報が辞書情報として記載されてきたかを十分に明らかにすることができた。また,新たに,日本語学習者が誤りやすい位相情報をもつ語を抽出し,それらの語のコーパス分析にも着手することができた。古風な語に着目して成果をまとめ,投稿中である論文を論文誌に掲載する。また,分析が遅れている,「文章語か口語か」「硬い語か俗語か」といった位相情報のコーパス分析を行う。そして,日本語学習者が誤りやすい位相情報をもつ語の調査分析についても,さらに進めて,成果をまとめる。「古い語」と位相情報がつくような語のコーパスにおける使用実態の調査分析を引き続き行う。さらに,調査対象語に,文章語か口語か,硬い語か俗語か,といった位相情報をもつ語を加え,広くコーパス分析を行う。日本語学習者が誤りやすい位相情報をもつ語のコーパス分析結果については,2012年8月に開催される「日本語教育国際研究大会」(名古屋)にて成果発表を行う。そのほかの学会発表も積極的に行っていく。調査分析を補助する非常勤職員の雇用継続を予定している。
近赤外光で弾性が制御可能なゲルを用いる細胞運動の時空間解析

本研究では、近赤外光により弾性が変化する新奇なゲルを開発し、細胞培養基板に応用することを目指した。基材に用いるためのゲルとして、任意の弾性に制御したポリアクリルアミドゲルを作製し、ゲル表面に細胞接着性を付与することで、実際に細胞が接着できる様子を確認した。また、架橋点となる希土類含有セラミックス発光ナノ粒子を合成し、ナノ粒子表面にポリエチレングリコール/ポリアクリル酸共重合体を固定することに成功した。今後、これらの材料を組み合わせることで、近赤外光応答性弾性基板を作製し、細胞運動の挙動を解明する研究への利用が期待される。細胞が自らの居場所を変化させる細胞移動現象において、細胞外マトリクス(ECM)の力学的特性が細胞の移動挙動に影響を及ぼすことが指摘されている。本研究では、近赤外(NIR)光により弾性が変化する新奇なゲルを開発し、このゲルを細胞培養基板に用いて、ゲルの弾性が細胞の運動性に及ぼす影響を時空間的に解析し、ECMの弾性が細胞移動現象に与える影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、NIR光応答性ゲルを用いた細胞移動観察に向けて、まず弾性が異なるアクリルアミド-ビスアクリルアミド共重合体ゲル(アクリルアミドゲル)の作製およびそのゲル上での細胞培養、細胞移動の観察を行うことで、研究の基盤技術を確立した。まず弾性が異なるアクリルアミドゲルをカバーガラス上に作製し、このゲル表面にpoly-D-lysine (PDL)を修飾することで、基板表面にアミノ基を有し、高い細胞付着性を持つ表面を作製した。さらにPDL修飾ゲル表面上に、ポリエチレングリコール(PEG)鎖末端に光分解基を有するポリマーを修飾し、UV光照射を行うことで、細胞パターンを作製した。この際、フォトマスクのパターンを変えることによって、様々な形状の細胞パターンを、弾性の異なるゲル上に作ることに成功した。ストライプ状の一次細胞パターンに二次UV光照射を行った際には、弾性の高いゲル上ほど細胞の移動が速くなることが明らかになった。さらに円形の一次細胞パターンに二次UV光照射を行った際には、ゲルの弾性の違いによって、通常のガラス上とは全く異なる特異な細胞移動の挙動を確認することができた。これらの結果から、足場の弾性が細胞移動現象に与える影響について、重要な知見を得ることができた。細胞移動とは、細胞が自らの居場所を変化させる現象であり、細胞外マトリクス(ECM)の力学的特性が細胞の移動挙動に大きく影響することが知られている。本研究は近赤外(NIR)光により弾性が変化する細胞培養ゲル基板を開発し、ゲルの弾性が細胞の運動性に及ぼす影響を時空間的に解析し、ECMの弾性が細胞移動現象に与える影響を明らかにすることを目的としている。本年度はまず、NIR光応答性ゲルを用いた細胞移動観察のために、アクリルアミド-ビスアクリルアミド共重合体ゲル(アクリルアミドゲル)を作製し、このゲル上で細胞培養、細胞移動の観察を行った。弾性が異なるアクリルアミドゲルをカバーガラス上に作製し、このゲル表面にpoly-D-lysine (PDL)を修飾することで、基板表面にアミノ基を有し、高い細胞付着性を持つ表面を作製した。ゲルの弾性率は、蛍光ビーズを取り込ませたゲル上にステンレス球を静置した前後における蛍光ビーズの焦点位置の変化を、共焦点蛍光顕微鏡によって観察することで求めた。この結果、作製したゲルの弾性率は、ほぼ狙い通りの値であることが確認できた。またゲル表面の接着性を、蛍光標識フィブロネクチンの接着の様子を蛍光顕微鏡で観察することで確認した。さらにこのゲル基板上においてイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来MDCK細胞を培養し、一細胞レベルでその移動の様子をタイムラプス観察することに成功した。またNIR光応答性ゲルの架橋点となるセラミックス発光ナノ粒子(UCNP)の合成を行い、平均粒径60nmの希土類イオンドープNaYF4ナノ粒子を合成することに成功した。今後このUCNPをゲルのネットワーク構造の架橋点に用いることで、NIR光応答性を有する細胞培養ゲル基板の構築と、足場の弾性が細胞の移動に与える影響に関する重要な知見を得ることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオマテリアル26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた近赤外(NIR)光により弾性が変化するゲルの開発の前段階として、まず弾性が異なるアクリルアミドゲルの作製およびそのゲル上での細胞培養、細胞移動の観察を行った。この際に、ゲル上にポリエチレングリコール(PEG)鎖末端に光分解基を有するポリマーを修飾し、UV光照射を行うことで、弾性が異なるゲル上に種々の形状の細胞パターンを作製することに成功した。ゲル上に様々な形状の細胞パターンを作製することは、既往研究例では難しく、本研究の成果は細胞パターニング技術において重要な進捗であると考えている。

さらにこれらの弾性が異なるゲルにおいて、形状の異なる細胞パターンに二次UV光を照射したところ、それぞれの条件において、特異的な細胞移動挙動を示すことを見出した。これらの細胞移動挙動は、通常のガラス上においては見られない挙動であり、細胞移動の研究において、重要な知見を得たと考えている。以上を考え合わせると,当初の予定に対しておおむね順調に進んでいると言える。NIR光応答性ゲルに用いるために、ツリウム、イッテルビウムドープ型NaYF4粒子(UCNP)を合成する。さらにこの表面に光解離性の2-ニトロベンジル基を有する架橋剤とアジド末端ポリエチレングリコールのclick chemistryを用いて、アミノ基を表層に有する光応答性表面を有するUCNPを作製する。その後、NIR光応答性UCNPの表層に蛍光分子や抗癌剤を導入し、粒子表面における光応答的な結合の解離、および薬物リリースへの展開を目指す。さらにポリアクリルアミドゲルに、このNIR光応答性UCNPを架橋剤の一部として用いることで、NIR光応答性ゲルを作製する。このゲル表面にpoly-D-lysineをコーティングすることで、基板表面にアミノ基を有し、高い細胞付着性を持つ表面を作製する。その後、ゲル上で細胞培養を行い、NIR光照射により弾性を変化させながら、足場の弾性の違いが細胞の運動性や細胞接着にどのような影響を与え、細胞移動の変化につながっているかを明らかにする。
加齢黄斑変性による線維瘢痕化の病態および治療研究

加齢黄斑変性(AMD)は、視力予後が不良の難治性疾患で、失明原因の上位を占める疾患群であり、高齢化社会が進行中の我が国をはじめとした先進国において、成人の失明や視力低下の主因となっている。近年VEGFを標的とした薬剤が開発され臨床応用されているが、根治的な治療法ではなく、継続的な治療が必要である。AMD増悪期に見られるCNVに伴う出血や滲出性変化は、網脈絡膜組織を障害し、障害された組織はやがて線維化・瘢痕化を起こす瘢痕期と呼ばれる病態へと移行していく。一旦黄斑が線維瘢痕化すると抗VEGF療法も適応とならず、現時点では視力を改善させる有効な治療法がない。そのため増悪期に対するVEGF以外の分子を標的とする治療法の開発、さらには瘢痕期への移行を防ぐ治療法の開発は臨症上重要な課題である。制御性T細胞のCNV形成への影響を検討するために、C57/BL6マウスを用いたレーザーCNVモデルマウスを作成し、フローサイトメトリーを用いて炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち制御性T細胞の割合を検討した。現在は、マウス網膜下瘢痕形性モデルを用いて制御性T細胞の瘢痕形成への影響について検討を開始したところである。線維瘢痕化症例の臨床的特徴の検討を行うため、治療開始後3ヶ月後、12ヶ月後、24ヶ月後における線維化、および萎縮の発症率を検討し、線維化における治療前の臨床所見、視力、中心窩網膜厚、CNVの臨床的タイプ、年齢、QOL,罹患期間、網膜病変領域等の患者背景因子により層別解析を行うために、データベースを構築を行った。現在治療開始24ヶ月までのデータを入力終了し、データ検討に移行している。現在データ解析中である。マウスを用いた脈絡膜新生血管(CNV)モデル作成においては確立、安定している。フローサイトメトリーを用いての検討を行った。マウス腹腔内マクロファージを用いた網膜下線維化モデル作成は安定してモデルを作成できるようになっている。現在、制御性T細胞の瘢痕形性への影響について検討を開始したところである。また、臨床的データを用いた検討では、治療開始24ヶ月後までのデータベースを作成した。現在、データ解析を行っている。マウスを用いたCNVモデルでは、炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち、制御性T細胞の割合をフローサイトメトリー(FACS)で検討を行った。続いて制御性T細胞のCNVへの影響を確認するため、in vitroでnaive T細胞から分化させた制御性T細胞をレーザー照射後に眼内へ移入した際のCNVの形成について比較検討中である。網膜下線維化モデルへの影響は現在、準備開始したところである。臨床データは、データベースを用いて統計解析中である。制御性T細胞のCNV形成への影響を検討するために、C57/BL6マウスを用いたレーザーCNVモデルマウスを作成し、眼球摘出を行った。現在このサンプルのフローサイトメトリーを用いて炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち制御性T細胞の割合を検討中である。線維瘢痕化症例の臨床的特徴の検討を行うため、治療開始後3ヶ月後、12ヶ月後、24ヶ月後における線維化、および萎縮の発症率を検討し、線維化における治療前の臨床所見、視力、中心窩網膜厚、CNVの臨床的タイプ、年齢、QOL,罹患期間、網膜病変領域等の患者背景因子により層別解析を行うために、現在データベースを構築中である。現在治療開始24ヶ月までのデータを入力中である。構築次第、データ検討に移行する。マウスを用いた脈絡膜新生血管(CNV)モデル作成においては確立し、安定してきている。現在、フローサイトメトリーを用いて検討中である。臨床的データを用いた検討では、治療開始24ヶ月後までのデータベースを現在作成中である。概ね入力が完了しつつあり、完了次第、データ解析に移れる予定である。

AMD増悪期に見られるCNVに伴う出血や滲出性変化は、網脈絡膜組織を障害し、障害された組織はやがて線維化・瘢痕化を起こす瘢痕期と呼ばれる病態へと移行していく。一旦黄斑が線維瘢痕化すると抗VEGF療法も適応とならず、現時点では視力を改善させる有効な治療法がない。そのため増悪期に対するVEGF以外の分子を標的とする治療法の開発、さらには瘢痕期への移行を防ぐ治療法の開発は臨症上重要な課題である。制御性T細胞のCNV形成への影響を検討するために、C57/BL6マウスを用いたレーザーCNVモデルマウスを作成し、フローサイトメトリーを用いて炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち制御性T細胞の割合を検討した。現在は、マウス網膜下瘢痕形性モデルを用いて制御性T細胞の瘢痕形成への影響について検討を開始したところである。線維瘢痕化症例の臨床的特徴の検討を行うため、治療開始後3ヶ月後、12ヶ月後、24ヶ月後における線維化、および萎縮の発症率を検討し、線維化における治療前の臨床所見、視力、中心窩網膜厚、CNVの臨床的タイプ、年齢、QOL,罹患期間、網膜病変領域等の患者背景因子により層別解析を行うために、データベースを構築を行った。現在治療開始24ヶ月までのデータを入力終了し、データ検討に移行している。現在データ解析中である。マウスを用いた脈絡膜新生血管(CNV)モデル作成においては確立、安定している。フローサイトメトリーを用いての検討を行った。マウス腹腔内マクロファージを用いた網膜下線維化モデル作成は安定してモデルを作成できるようになっている。現在、制御性T細胞の瘢痕形性への影響について検討を開始したところである。また、臨床的データを用いた検討では、治療開始24ヶ月後までのデータベースを作成した。現在、データ解析を行っている。マウスを用いたCNVモデルでは、炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち、制御性T細胞の割合をフローサイトメトリー(FACS)で検討中であり、続いて制御性T細胞のCNVへの影響を確認するため、in vitroでT細胞から分化させた制御性T細胞をレーザー照射後に眼内へ移入した際のCNVの形成について比較検討する予定である。臨床データは、データベースを用いて統計解析に移る予定である。マウスを用いたCNVモデルでは、炎症励起後眼内に浸潤してきたT細胞のうち、制御性T細胞の割合をフローサイトメトリー(FACS)で検討を行った。続いて制御性T細胞のCNVへの影響を確認するため、in vitroでnaive T細胞から分化させた制御性T細胞をレーザー照射後に眼内へ移入した際のCNVの形成について比較検討中である。網膜下線維化モデルへの影響は現在、準備開始したところである。臨床データは、データベースを用いて統計解析中である。予定していたより試薬使用量が少なかったため、次年度に繰り越すこととした。in vivo実験を開始および追加するため、実験動物やその処置にかかる費用、組織の染色を行うための試薬を購入する予定があるため
遺伝的アルゴリズムを用いた移動通信用コンフォーマル非周期アレーアンテナの研究

サブアレー16個からなる非周期アレーアンテナの最適設計法について検討した。非周期アレーの要求条件として、実用化を念頭におき次の5項目を考えた。(1)非周期アレーアンテナの大きさの限界を周期アレーアンテナの大きさの75%増とする。(2)サブアレーの一つの対角線方向のサイドローブ特性はITU-Rの勧告580の技術基準を満たす。(3)この方向以外のサイドローブについての制約は無いものとする。(4)各サブアレー間の電気的カップリングは無視できる。(5)実際のハードウエアを製作するときに必要な寸法誤差はサブアレーの大きさを12ビットで量子化した時の最小ディジット程度とする。上記5項目の要求条件を満たす非周期アレーアンテナの最適配置を求めるための初期値を乱数で求めるアルゴリズムを考案した。このプログラムは第1番目のサブアレーを非周期アレーアンテナの中心に置き、乱数を使って求めた2番目のサブアレーが第一番目と重ならない場合を正解として第2番目のサブアレーを配置する。順次サブアレーの数を増やし、最終的には16個全部のサブアレーを乱数を使って配置した。正解を得られるまでの計算時間はデスクトップ型パソコンでは数分であるが、ノートパソコンではほとんど正解は得られなかった。この乱数で求めた初期値より出発し最急降下法を使って最適値を求めることを試みた。この手法により設計した非周期アレーアンテナは、周期配置のアレーアンテナと比べ約6dBのサイドローブ特性の改善が得られた。そこで、初期値と得られた最適値を2進コード化し、各コードの間に存在する遺伝的関係を調べた。これらの結果は論文としてIEEEの国際会議で発表した。先ず、非周期アレーアンテナの設計法として従来から使われている最急降下法による最適化の限界について検討した。4×4の放射素子(合計16個)を平面上に巧みに配置することにより、指定の方向のサイドローブパターンを最適化する問題を例にして、最急降下法による最適化を行った結果、最適化の計算結果が、初期条件に大きく依存するとともに、わずかな初期条件の違いにより、解が全く異なってしまい、真の最適解を求めることが困難なことが分かった。そこで、放射素子の位置座標を1と0の2進数の組み合わせで表し、この2進数をコードとして使い、各コードに対応した放射パターンを求めるプログラムを作成した。一旦コード化された位置座標は、1と0を入れ替えることにより、任意の位置を指定することができるので、この性質を使って、遺伝的アルゴリズムによりコードの入れ替えのルールと放射パターンの関係を調べた。コードの入れ替えのルールとして、MSD5ディジットを固定し、残りの5ディジットを、放射パターンが優れているコードと置き換える方法を試みた。この計算は単純な作業の繰り返しであるため、コンピュータに関心のある学生にコンピュータの操作を依頼した。計算の初期値としては、0と1をランダムに発生させ、10ビットを使って、放射素子一個の位置座標とした。16個の位置座標が互いに重なり合わない場合だけを計算の対象とした。これまでに得られているデータのうち、もっとも優れている放射パターンでは、最急降下法による最適化により得られている放射パターンより約2dB優れている。この結果を、非周期アレーの設計例に関する論文として、IEEE国際会議に投稿した。サフアレー16個からなる非周期アレーアンテナの最適設計法について検討した。(2)サブアレーの一つの対角線方向のサイドローブ

特性はITU-Rの勧告580の技術基準を満たす。(3)この方向以外のサイドローブについての制約は無いものとする。(4)各サブアレー間の電気的カップリングは無視できる(5)実際のハードウエアを製作するときに必要な寸法誤差はサブアレーの大きさを12ビットで量子化した時の最小ディジット程度とする。上記5項目の要求条件を満たす非周期アレーアンテナの最適配置を求めるための初期値を乱数で求めるアルゴリズムを考案した。このプログラムは第1番目のサブアレーを非周期アレーアンテナの中心に置き、乱数を使って求めた2番目のサブアレーが第一番目と重ならない場合を正解として第2番目のサブアレーを配置する。順次サブアレーの数を増やし、最終的には16個全部のサブアレーを乱数を使って配置した。正解が得られるまでの計算時間はデスクトップ型パソコンでは数分であるか、ノートパソコンではほとんど正解は得られなかった。この乱数で求めた初期値より出発し最急降下法を使って最適値を求めることを試みた。この手法により設計した非周期アレーアンテナは周期配置のアレーアンテナと比べ約6dBのサイドローブ特性の改善が得られた。そこで、初期値と得られた最適値を2進コード化し、各コードの間に存在する遺伝的関係を調べた。この結果は論文としてIEEEの国際会議で発表した。
微小重力プラズマ中浮上帯電微粒子の精密操作法

本研究で新しく開発した時間平均駆動法によって、プラズマ中の微粒子は1対の微細電極間の中央部に集められ、以下の特性をもつことが明かになった。1.一対の微細電極の片方をOFFすると、微粒子はON電極の近傍に集束し、その周りで球状のクーロン結晶を形成する。ON電極をOFFすることにより、クーロン結晶の崩壊過程が明らかにされた。2.微細電極を同時のON・OFFすることによる対称駆動力が、プエアズマ空間への微粒子雲の閉じ込めに重要であることが分かった。入射する微粒子の数を1つずつ増やしていくことにより、微粒子クラスターの形成過程が明らかになった。これらの構造は理論的な予測と良い一致を示した。微粒子数が多いとき、印加する電圧によって球状から楕円状に形状を制御できる。3.微小重力実験の解析結果から、時間平均駆動法によって形成された微粒子雲はボイドを含まず、ほぼプラズマ中央に補足されることが分かった。微粒子数が少ない時、シェル状の微粒子雲が形成された。微粒子数が多いとき、中央部の結晶構造を取り囲むシェル状構造が観測された。4.時間平均駆動法のシミュレーションコードが開発され、微粒子構造の特性が理論的に解析できるようになった。これにより、微小重力下で3次元球対称の微粒子結晶を形成するための評価が可能となる。本新方式により、微粒子を1つ1つ操作し、クーロンクラスターやクーロン結晶形成の精密な制御が可能であることが示された。微小重力環境における微粒子挙動の制御を行うために、重力成分の無い水平方向の挙動について詳細に調べた。実験では浮上電極の両側に1対の小型電極を設置し、正のパルス電圧を交互に印加した。負に帯電した微粒子は片方の小型電極が正のとき、この電極に向かう力を受ける。微粒子が動き始めると同時にこの小型電極の電圧をOFFし、もう片方の電極に正の電圧を印加すると、今度はそちらの電極に向かう力を受ける。この電圧印加を繰り返し行うと、微粒子は時間平均した力を受け、最終的には2つの電極を結ぶ直線の中央に収束する。実験によって以下のことが明らかになった。1、繰り返し周波数が低い場合(20Hz以下)、微粒子はジグザグ運動を行いながら小型電極間の中間点に集まる。最終的には微粒子集団は小型電極間で一定の振幅でを往復運動する。振幅は印加電圧の大きさに依存する。2、繰り返し周波数が大きい場合(100Hz以上)、微粒子は滑らかに小型電極間中央に集まる。往復振動は観測されない。印加電圧が小さい場合はほぼ球状の微粒子雲を形成する。印加電圧を大きくすると楕円状微粒子雲となることが分かった。いずれの場合も微粒子雲の中にボイドの形成は無い。3、これらの挙動について実験測定結果を元に理論的な検討を行った。小型電極近傍のプラズマ中の電位分布、並びにこれに起因する静電力の空間分布が微粒子構造決定に重要であることが明らかになった。
加齢黄斑変性の危険因子の解明と予防に関する大規模ゲノム疫学研

日本人における滲出性酒AMDの遺伝的背景を明らかにするため、ゲノムワイドに関連を調べた結果、8番染色体短腕上のrs13278062および4番染色体長腕のrs1713985の2っの趣Pに有意差を認めた。今回の研究により、8翻染色体上のTNFRSF10A-LOC389641繊云子および4翻染色体上のREST-C4orf14-POLR2BIGEBP7遺伝子は滲出性ANDこ対する新たな疾患感受性遺伝子として考えられる。研究成果の概要日本人における滲出性酒AMDの遺伝的背景を明らかにするため、ゲノムワイドに関連を調べた結果、8番染色体短腕上のrs13278062および4番染色体長腕のrs1713985の2っの趣Pに有意差を認めた。研究成果の概要高齢者の黄斑に生じる加齢黄斑変性age-related macular degeneration(AMD)は、高齢化社会が進行中の我が国をはじめとした先進国において、成人の失明や視力低下の主因となっているが、現在AMDに対する根本的な治療はなく、その病因解明は社会的急務である。その発症には、遺伝的素因(体質)や環境因子など様々な因子が関与していると考えられている。本研究はAMDのゲノムワイド疫学研究によってAMDの遺伝的危険因子を同定しその病因を解明することを目的とする。AMD罹患者および久山町健診受診者の健常者から採取した血液よりDNAを抽出し、加齢黄斑変性の発症および進展に影響を及ぼすSNPを体系的、網羅的なゲノムワイドアプローチにより解析する。平成21年度の研究実施計画は患者群、対照群のサンプルの収集であり、計画通り実施できた。具体的には、患者群は九州大学病院を受診され、文書による同意が得られた成人でAMD患者970名の血液サンプルを収集した。対照群は文書による同意が得られた久山町住民のうち、久山町眼科健診を受診したAMD非罹患者4656名の血液サンプルを収集した。個人情報保護には細心の注意を払い、各サンプルは記号化し匿名化をおこなった。生活歴、家族歴に関する調査をAMD患者に対し問診表を用いて行い、対照群は既に行われている久山町健診での生活習慣調査結果を利用して生活歴、家族歴を調査した。解析のため、各サンプルの臨床所見(視力、眼圧、視野、眼底所見、蛍光眼底造影、網膜断層像、病変の大きさ、臨床病型、活動性など)、年齢、性別、治療歴、治療の転帰、合併症、生活歴、家族歴などを含んだリレーショナル型データーベースを作成した。高齢者の黄斑に生じる加齢黄斑変性age-related macular degeneration(AMD)は、高齢化社会が進行中の我が国をはじめとした先進国において、成人の失明や視力低下の主因となっているが、現在AMDに対する根本的な治療はなく、その病因解明は社会的急務である。平成22年度の研究実施計画は患者群、対照群のサンプルの収集であり、計画通り実施できた。解析のため、各サンプルの臨床所見(視力、眼圧、視野、眼底所見、蛍光眼底造影、網膜断層像、病変の大きさ、臨床病型、活動性など)、年齢、性別、治療歴、治療の転帰、合併症、生活歴、家族歴などを含んだリレーショナル型データーベースを作成し、SNP解析を実施した。高齢者の黄斑に生じる加齢黄斑変性agerelated macular degeneration (AMD)は、高齢化社会が進行中の我が国をはじめとした先進国において、成人の失明や視力低下の主因となっているが、現在AMDに対する根本的な治療はなく、その病因解明は社会的急務である。AND罹患者および久山町健診受診者の健常者から採取した血液よりDNAを抽出し、加齢黄斑変性の発症および進展に影響を及ぼすSNPを体系的、網羅的なゲノムワイドアプローチにより解析する。平成23年度の研究実施計画は加齢黄斑変性の遺伝子多型の解析であり、計画通り実施できた。

具体的には、本遺伝子解析研究用の採血に同意された方に対し、従来報告のある既知の候補遺伝子(CHF,HTRA-1,APOE,ELOVL4,FBLN5,C2,BFなど)によるアプローチと体系的なゲノムワイドアプローチによるSNP解析を行った。血液より抽出したDNAは、理化学研究所にてSNP解析を行った。提供先機関は理化学研究所・ゲノム医科学研究センター基盤技術開発グループ多型解析技術開発チームである。また、SNPの解析者への情報は、匿名化IDのみを供与し、個人識別情報を含めない。患者群と対照群に対するゲノムワイド関連解析において約50万か所の一塩基多型(SNPs)を比較し、AMDの新しい関連遺伝子を探索した。本研究は既知の候補遺伝子によるアプローチと体系的なゲノムワイドアプローチによりSNP解析行うものであり、解析の結果、AMDのの発症あるいは進行に関与する複数の候補遺伝子が同定された。さらに同定された遺伝子の再現性を確認するため、Replicationとして新たに集団を設定して、遺伝子の関連解析を行った。
脳腫瘍幹細胞におけるMIFの機能解析

本研究では、グリオーマおよび脳腫瘍幹細胞(BTSC)におけるMIFの機能解析を行った。グリオーマのMIF発現を阻害すると、細胞増殖が抑制され、この抑制効果はp53に依存することが明らかになった。その機序として、細胞内でMIFはp53と結合し、p53の腫瘍抑制機能を阻害していることが示唆された。さらにBTSCのMIF発現を阻害すると、細胞増殖抑制のみならず、in vivoでの抗腫瘍効果が認められた。以上の結果から、MIFがBTSCの治療標的となる可能性が示された。近年のがん研究の進展により、腫瘍幹細胞(brain cancer stem cell;BCSC)が、腫瘍の発生と維持に重要な役割を果たしていることがわかってきた。我々は、脳腫瘍より単離したBCSCに高発現する分子が、脳腫瘍根治における重要なかぎを握っているとの仮説に基づき、これらをターゲットとした分子標的療法の開発を目指している。すでに、我々は、macropharge migration inhibitory factor(MIF)がグリオーマおよびBCSCにおいて高発現していることを明らかにしており、本研究では、このMIFをターゲットとした脳腫瘍に対する分子標的療法の有効性の検討およびメカニズムの解析を行う。本年度は、グリオーマ患者組織から長期培養可能な複数のBCSC株の樹立に成功し、BCSCとしての性質(自己複製能、多分化能、腫瘍形成能)を有し、マウスへの移植においてglioblastomaに類似したphenotypeを示すことを確認した。さらに、定量PCR法を用いてMIFの発現を解析したところ、分離したBCSCに高発現していることを明らかにした。MIFは、炎症を促進するcytokineとして知られる一方、細胞増殖にかかわる分子として知られているが、BCSCにおいてMIFの発現をknockdownすることで、顕著な細胞増殖抑制効果を示すことを明らかにした。さらに、MIFの核内における機能とp53との相互関係を解析するため、glioma細胞から核タンパクを抽出し、免疫沈降法を施行することによりMIFがp53に結合していることを明らかにした。また、glioma細胞に対してsiRNAを用いてMIFをknockdownして、その核タンパクを用いてgel shift法を解析し、p53とMIFとの結合が増加することを確認した。今後はMIFをターゲットとした脳腫瘍に対する新たな分子標的療法の開発を目指して、in vivoでの脳腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討する予定である。近年のがん研究の進展により、腫瘍幹細胞(brain cancer stem cell;BCSC)が、腫瘍の発生と維持に重要な役割を果たじていることが明らかになってきた。我々は、脳腫瘍より単離したBCSCに高発現する分子が、脳腫瘍根治における重要な役割を担っているという仮説に基づき、これらをターゲットとした分子標的療法の開発を目指している。これまで我々は、macropharge migration inhibitory factor(MIF)がグリオーマおよびBCSCにおいて高発現していることを明らかにしており、本研究ではMIFを標的とした脳腫瘍に対する分子標的療法の開発およびメカニズムの解析を目的とする。本年度は、昨年度から引き続き、グリオーマ患者組織からBCSC株の分離・培養を行ない、長期培養可能な3種類のBCSC細胞株の樹立に成功し、神経幹細胞培養条件でのスフェア形成能、自己増殖能、多分化能を検証した。MIFは、炎症を促進するcytokineとして知られているが、グリオーマおよびBCSCにおける機能は解析されていない。そこで、siRNAおよびvirus vector用いてMIFの発現を特異的にknockdownすることによる抗腫瘍効果を検討した結果、invitroにおける細胞増殖抑制のみならず、invivo(脳腫瘍モデル)においても抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。以上、MIFは正常脳組織と比較して脳腫瘍において高発現し、MIFの発現をknockdownすることにより抗腫瘍効果を示すことから、MIFを標的とした脳腫瘍に対する分子標的治療の可能性が示された。
骨髄間葉系幹細胞を用いた血管柄付きハイブリッド人工骨の開発

骨髄間葉系幹細胞の足場となる人工骨は、通常の多孔体セラミックスでは気孔同士の連通が少ないために、血管束移植の媒体に適しておらず、全気孔連痛型ハイドロキシアパタイト(東芝セラミックス社製:NEO BONE)を用いることで、移植血管から人工骨全体に新生血管が生じることが判明した。NEO BONEを足場として骨髄間葉系幹細胞を培養し、これに血管束移植術をおこなうことで、血管柄付きハイブリッド人工骨の作製が可能であることが判明した。さらにこの血管柄付きハイブリッド人工骨を血管束移植2週後にシリコンラバーで包むことで血行不良部位での活性を調査した。対象群としてシリコンラバーで包んだ後に血管柄を結紮して血行を途絶させた群、コントロール群として培養細胞を含まない群を作製し統計学的検討を施行した。血管束移植4週後で、血管柄付き人工骨は、血行を有さない対象群およびコントロール群に比して骨形成能の指標となるアルカリフォスファターゼ活性およびオステオカルシン含量は有意に高値であった。組織学的にも、血管柄付き人工骨では気孔内に新生骨の形成を認め、新生骨は移植血管の周囲のみならず、シリコンラバーと接する辺縁にも存在しており、人工骨全体に血管新生が広がっていることも証明された。一方、対象群では気孔内には壊死組織しか認めず、血行不良部位では培養人工骨単独では活性を維持できないことが判明した。コントロール群では新生血管の広がりは認めるものの骨形成は一切認めず、血管柄付き人工骨にみられた新生骨は培養した骨髄間葉系幹細胞由来であることが判明した。本研究により、移植血管から人工骨全体に新生血管の誘導可能な全気孔連通型ハイドロキシアパタイトを足場として骨髄間葉系幹細胞を培養し、これに血管束移植を行うことで、血行不良部位でも骨形成能を維持できる血管柄付きハイブリッド人工骨が作製可能であることが判明した。血管柄付きハイブリッド人工骨を作製するにあたり、基盤となる人工骨は東芝セラミックス社製のNEO BONEを用いた。NEO BONEは多孔質ハイドロキシアパタイトであり、気孔間が連通しているのが最大の特徴である。そのため骨伝導能に優れていることと移植血管からの血管新生に適していると予想されたことが本実験にNEO BONEを用いた理由である。ラット骨髄間葉系幹細胞を直径6mm、高さ15mmの円柱体の人工骨上で培養し、骨芽細胞に分化させることでハイブリッド人工骨を作製した。このハイブリッド人工骨は、アルカリフォスファターゼ活性を測定することにより骨形成能を有していることを確認した。次にハイブリッド人工骨にラット伏在動静脈を移植し、二週間大腿部皮下で栄養した。二週後、大腿動脈を血管柄とする血管柄付きハイブリッド人工骨を、手術顕微鏡を用いて作製し、シリコンラバーで人工骨を包み周囲から隔離した状態でさらに二週間大腿部皮下で栄養した。血管柄を結紮したものを対象群とした。血管柄により栄養された人工骨では、骨芽細胞の分化マーカーとなるアルカリフォスファターゼ活性およびオステオカルシン含量は、対象群に比べて有意に高値を示していた。また組織学的にも、血管柄により栄養された人工骨では、移植血管から人工骨全体の血管新生がみられ、気孔内には新生骨が確認できた。一方、対象群では、移植血管は閉塞しており、気孔内には壊死組織しか認めなかった。これらの結果から人工骨と培養細胞を組み合わせたハイブリッド人工骨に血管束移植を行うことで、血行不良な場所にも移植可能な"血管柄付きハイブリッド人工骨"を作製できることが実験的に示唆された。