hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アブレータを用いた耐熱シールドの淀み点下流域に生じる著しい空力加熱現象の解明

過去2年間に開発を進めてきた、突入軌道に沿った空力加熱およびアブレータの熱応答解析統合コードを適用して、Stardustサンプルリターンカプセルの突入シミュレーションを行い、米国の解析結果との比較を通して、コードの検証とアブレーションガスによる早期乱流遷移の効果を調べた。乱流遷移させない場合は米国の解析例と良く一致したが、乱流遷移させると下流域の加熱率が著しく上昇する結果を得た。次に、この統合コードを用いて、パイオニア・ビーナス金星探査計画で大気圏に突入した4機のカプセルの突入シミュレーンョンを行い、飛行データとの比較を行った。4つのカプセル全ての場合において、下流側で計測されたアブレータ内部温度は淀み点側の内部温度を著しく上回ったことが飛行データに示されているが、本解析は飛行データと同様の結果を与えた。飛行データとの定量的な比較でも概ね良好な一致を得た。以上の結果から、淀み点下流域に見られた著しい空力加熱現象は、アブレーションガスによる境界層の早期乱流遷移と境界層内の渦粘性の増大によって生じることが示された。また、アブレーションガスがもともと乱流状態にあると仮定する乱流モデルを用いることによって、飛行データを定量的に説明できることが初めて示された。以上の統合コードでは、スペクトル依存性を詳細に考慮した輻射加熱解析コードを用いて輻射加熱量を求めたが、流体との連成は考慮されていない。木星大気圏に突入したガリレオ突入カプセルの飛行データは、パイオニア・ビーナスと同様に下流域で著しい空力加熱が生じたことを示しているが、この解析を行うには輻射と流体の連成を解かなければならない。これまでに、スペクトル依存性を考慮した輻射流体の並列計算コードの開発が進んでおり、アブレータ熱応答解析コードと組み合わせることによって、ガリレオ突入カプセルの解析が早期に実現できるところまで来た。物体表面からの噴出ガスによる境界層遷移促進を調べるために行われた風洞試験データの再現を最初に試みた。噴出ガスが乱流であると仮定するパークのモデルを、Van Driestの減衰関数に基づいて既存の乱流モデルに組込んだところ、淀み点の加熱量について噴出ガスによる加熱量増加を定量的に再現した(文献1)。この手法を既存の熱化学非平衡コードに組込み、金星大気に突入したパイオニア・ビーナス探査衛星の飛行データ再現を試みた。突入軌道に沿って空力加熱量解析とアブレータの無応答解析を疎結合させ、衛星表面での温度、噴出量、噴出気体の組成の同定を行い、首尾一貫した境界条件を反復的に与えた。得られた結果より、飛行データで見られた下流域の強い加熱が再現され、温度の上昇量も定量的に比較的良い一致を得た(文献2)。一方、衛星下流域の加熱量を増加させる要因として、アブレータから飛び出した炭素片が衝撃層内で発光する可能性がある。これを調べるには強い輻射流れ場の密結合解析を行う必要がある。このような流れ場に対して、従来の完全陰解法は比較的安定であるが、著しい記憶容量と長大な計算時間を必要とする。このため、熱流束の陽的な取扱いを試み輻射流れ場の密結合解析の実用化を試みた。著しく強い輻射流れ場に対して、流れ場の支配方程式を陰的に解き輻射場を陽的に解いても、安定かつ極めて効率的に解けることが示された(文献3)。一方、アブレータから噴出した炭素化合物は衝撃層内で非平衡輻射を起こす。このため、非平衡熱化学CFDコードに輻射解析コードを組込みFIREIIの飛行データ再現を試みた。

計算では非平衡輻射の特徴をよく再現したが、輻射熱流束についてほ飛行データを大幅に下回った。炭素片からの輻射を模擬するために主流にCNを混入させて輻射加熱量の変化を調べたところ、波長の短い領域で飛行データの輻射加熱量を再現した(文献4)。初年度に開発されたパイオニアビーナス金星探査機大気圏突入時の空力加熱解析コードを高度化して、宇宙科学研究所が計画しているMUSES-C探査機が地球大気圏に突入する時のアブレータ応答を含めた空力加熱現象を解析した。特に本年度は、炭素化合物を含む空気の化学種に対する熱化学非平衡反応パッケージを解析コードに組み込んだ。さらに、流れ場の計算結果からマルチバンド法で輻射熱流束を高精度に求めるパッケージを解析コードに組み込んだ。ただし、流れ場と輻射場は結合されていない。以上の改良を施した解析コードを用いて、宇宙科学研究所で計画されているMUSES-C探査機の突入軌道に沿った空力加熱を算出してアブレータの熱応答を求めたところ、淀み点では既存の推定値に極めて近い履歴を得た。また淀み点下流域ではアブレーション生成ガスによる境界層の乱流遷移が起こり、下流域の壁面加熱率が著しく増大した。このため、下流域の壁面温度は淀み点とほとんど変わらない値まで上昇した。一方、超軌道速度で突入する場合など輻射加熱が支配的な場合に、正確な壁面加熱率を求めるには、輻射と流体の密結合解析が不可欠である。前年度に簡易輻射モデルを用いて輻射流れ場の収束解を求める計算手法を提案したが、本年度は簡易モデルを詳細なマルチバンドモデルに変更して計算精度を高めた。また、マルチバンドモデルを用いる際に著しく増大する計算負荷を低減して、実用的な計算時間で収束解を得るために、並列計算機上にコードを移植した。ORIGIN2000並列計算機の128CPUを用いて計算したところ、20GFLOPSの実行計算速度を達成した。以上より、輻射が卓越した2次元軸対称密結合流れ場の収束解を容易かつ高精度に求める計算手法が確立された。今後、MUSES-Cの解析コードに輻射流れ場の密結合計算機能を与え、統合アブレータ解析コードとしての実用化を進める。過去2年間に開発を進めてきた、突入軌道に沿った空力加熱およびアブレータの熱応答解析統合コードを適用して、Stardustサンプルリターンカプセルの突入シミュレーションを行い、米国の解析結果との比較を通して、コードの検証とアブレーションガスによる早期乱流遷移の効果を調べた。乱流遷移させない場合は米国の解析例とよく一致したが、乱流遷移させると下流域の加熱率が著しく上昇する結果を得た。次に、この統合コードを用いて、パイオニア・ヴィーナス金星探査計画で大気圏に突入した4機のカプセルの突入シミュレーションを行い、飛行データとの比較を行った。4つのカプセル全ての場合において、下流側で計測されたアブレータ内部温度は淀み点側の内部温度を著しく上回ったことが飛行データに示されているが、本解析は飛行データと同様の結果を与えた。飛行データとの定量的な比較でも概ね良好な一致を得た。以上の結果から、淀み点下流域に見られた著しい空力加熱現象は、アブレーションガスによる境界層の早期乱流遷移と境界層内の渦粘性の増大によって生じることが示された。
マラリア原虫抗原変異機構の解析とBCG菌を利用したマラリアワクチン開発

ハマダラカによって媒介されるマラリアは年間2億7000万人が感染し200万人が死亡するという最も大きな被害を人類に及ぼしている原虫感染症である。クロロキン、DDTなどの特効薬や殺虫剤により一時は撲滅が可能かに見えたマラリアは、薬剤耐性マラリア原虫株や殺虫剤に耐性の媒介蚊の出現によりその治療と制圧は現在困難な状況に陥っている。一方、マラリア原虫の細胞より十分な量の蛋白質を精製する事が極めて難しいため、マラリア原虫に関する生化学的な解析にも乏しい。さらに、マラリア原虫のcDNAは大腸菌において一般にうまく発現せず、レコンビナント蛋白質として調製することも容易ではないことも解析を遅らせている。マラリアワクチンの開発は人類の夢の一つであるが、マラリア感染に対する宿主(ヒト)の免疫応答が理解されていないことに加えて、マラリア原虫はその主要抗原のアミノ酸配列を高頻度で変換するための機構を複数有していると考えられる。マラリアワクチンの開発をめざす本研究課題においては、まず、ワクチン候補抗原蛋白質を安定して供給できるシステムの構築を行なった。抗原遺伝子は以下で述べるSERAであるが、本抗原遺伝子はマラリヤ原虫株のなかでもよく保存されていると考えられているが、このSERA遺伝子の抗原変異の頻度について解析をすすめた。(1)熱帯熱マラリア原虫の培養細胞に対して増殖阻害的に働くマウスのモノクローナル抗体を用いて単離したSERA(Serine Repeat Antigen,113kD)は、赤血球期マラリアのトロフォゾイト、シャイゾント期に大量に発現される蛋白質であり、感染赤血球が壊裂する直前に、47kD、50kD、18kDの三つの断片となる。このSERA抗原はマラリアワクチンの候補抗原として重要と考えられているが、一方、SERA遺伝子のcDNAを大腸菌の発現ベクターに組み込んでも、レコンビナント蛋白質の発現は容易ではなかった。我々は、極端にAT含量の高いマラリア遺伝子とGC含量が高い大腸菌の間におけるコドン使用頻度の違いがレコンビナント蛋白質の発現量を低下させていると考え、熱帯熱マラリアのコドン使用頻度を大腸菌型に変えた、これら三つの断片をコードする人工合成遺伝子を構築し、大腸菌において3種類のSERA蛋白質を大量に発現させた。精製した後、マウス及びラットを免疫し、得られた抗血清を用いてマラリア原虫の培養細胞の増殖に与える影響を調べた結果、SERA蛋白質のN-末端17-382アミノ酸残基の領域(SE47′蛋白質)がマラリア原虫の増殖に対して阻害効果をもつ抗体を誘導することが明かとなった(Sugiyama et al.,in the press)。(2)フイールドからの単離株とラボ株合計10種についてSERA遺伝子の塩基配列を決定したところ、SERA抗原の中央部やC-末端領域は極めて保存されていたが、上記(1)の実験でマラリア原虫の増殖に対して阻害効果をもつ抗体を誘導することが明かとなったN-末端領域にはアミノ酸配列の変化が見いだされた。熱帯熱マラリア原虫のMSP-1抗原遺伝子は田辺らによってその抗原変異機構の解析がすすめられているが、本研究において解析を行なった10株についてはすでにMSP-1抗原遺伝子の解析が終了しており、SERAとMSP-1遺伝子の平機構について比較検討を行なっている。現在までのところ、SERA遺伝子はかなり良く保存された抗原であり、重要な機能を担うことが示唆されるが、防御抗体を誘導するN-末端領域については株によって若干の変異を伴っていることが明かとなった(Morimatsu,Horii etal.,in preparation)。(3)SE47′蛋白質による防御抗体の誘導は、抗血清中の全ELISA価とは独立にアジュバントや蛋白質の形状等、免疫を行なう条件によって大きく左右された。このことはSE47′蛋白質の特定の領域が防御抗体の誘導に関連しており、その領域に対する免疫応答が免疫の条件に依存することを示唆する。そこで、エピトープ解析による防御抗体を誘導する領域の同定を行なうため、15アミノ酸残基よりなる合成オリゴペプチドを多数調製し、SE47′蛋白の全領域をカバーするこれらのペプチドに対してマラリア原虫細胞の増殖阻害能力のある血清と増殖阻害を示さない血清を用いてELISAを行なった。その結果、168-182アミノ酸残基の領域が防御抗体産生に強く関わっていることを示す結果を得た。一方、マラリア原虫細胞に対して増殖阻害的に働くマウスモノクローナルIgM抗体を用いたところ52-66アミノ酸残基領域にエピトープが含まれることが示された。これらの結果は、SERA蛋白質中には防御抗体に対応する複数のエピトープが存在することを示唆する(Pang,Horii et al.,in preparation)。(4)以上の結果より本研究課題において作成した人工SERA遺伝子によるレコンビンナント蛋白質の発現システムはマラリアワクチン実現にむけて十分な可能性があると考えられる。一方、BCG菌の発現ベクターにこの人工合成遺伝子を組み込むことは、研究計画の年限内に終了することが難しい現状であるが、実用化マラリアワクチンとして極めて大きな可能性があるため継続して研究を行ってゆく。

一方、マラリア原虫の細胞より十分な量の蛋白質を精製する事が極めて難しいため、マラリア原虫に関する生化学的な解析にも乏しい。さらに、マラリア原虫のcDNAは大腸菌において一般にうまく発現せず、レコンビナント蛋白質として調製することも容易ではないことも解析を遅らせている。マラリアワクチンの開発は人類の夢の一つであるが、マラリア感染に対する宿主(ヒト)の免疫応答が理解されていないことに加えて、マラリア原虫はその主要抗原のアミノ酸配列を高頻度で変換するための機構を複数有していると考えられる。マラリアワクチンの開発をめざす本研究課題においては、まず、ワクチン候補抗原蛋白質を安定して供給できるシステムの構築を行なった。抗原遺伝子は以下で述べるSERAであるが、本抗原遺伝子はマラリヤ原虫株のなかでもよく保存されていると考えられているが、このSERA遺伝子の抗原変異の頻度について解析をすすめた。(1)熱帯熱マラリア原虫の培養細胞に対して増殖阻害的に働くマウスのモノクローナル抗体を用いて単離したSERA(Serine Repeat Antigen,113kD)は、赤血球期マラリアのトロフォゾイト、シャイゾント期に大量に発現される蛋白質であり、感染赤血球が壊裂する直前に、47kD、50kD、18kDの三つの断片となる。このSERA抗原はマラリアワクチンの候補抗原として重要と考えられているが、一方、SERA遺伝子のcDNAを大腸菌の発現ベクターに組み込んでも、レコンビナント蛋白質の発現は容易ではなかった。我々は、極端にAT含量の高いマラリア遺伝子とGC含量が高い大腸菌の間におけるコドン使用頻度の違いがレコンビナント蛋白質の発現量を低下させていると考え、熱帯熱マラリアのコドン使用頻度を大腸菌型に変えた、これら三つの断片をコードする人工合成遺伝子を構築し、大腸菌において3種類のSERA蛋白質を大量に発現させた。精製した後、マウス及びラットを免疫し、得られた抗血清を用いてマラリア原虫の培養細胞の増殖に与える影響を調べた結果、SERA蛋白質のN-末端17-382アミノ酸残基の領域(SE47′蛋白質)がマラリア原虫の増殖に対して阻害効果をもつ抗体を誘導することが明かとなった(Sugiyama et al.,in the press)。(2)フイールドからの単離株とラボ株合計10種についてSERA遺伝子の塩基配列を決定したところ、SERA抗原の中央部やC-末端領域は極めて保存されていたが、上記(1)の実験でマラリア原虫の増殖に対して阻害効果をもつ抗体を誘導することが明かとなったN-末端領域にはアミノ酸配列の変化が見いだされた。熱帯熱マラリア原虫のMSP-1抗原遺伝子は田辺らによってその抗原変異機構の解析がすすめられているが、本研究において解析を行なった10株についてはすでにMSP-1抗原遺伝子の解析が終了しており、SERAとMSP-1遺伝子の平機構について比較検討を行なっている。現在までのところ、SERA遺伝子はかなり良く保存された抗原であり、重要な機能を担うことが示唆されるが、防御抗体を誘導するN-末端領域については株によって若干の変異を伴っていることが明かとなった(Morimatsu,Horii etal.,
核内転写因子PPARαを介した2次性アミロイド-シスの制御に関する研究

1)マウスAAアミロイドモデルにおいてフェノフィブラートは脾臓アミロイド沈着及び経血清アミロイドA(SAA)濃度を有意に抑制した。2)フェノフィブリン酸は肝細胞HepG2におけるサイトカイン刺激によるSAA産生を抑制した。3)フェノフィブリン酸はマクロファージ系細胞RAW264における炎症刺激によるIL-1β,IL-6産生を抑制した。4)RT-PCRによりマクロファージにおけるPPARαの発現は認めなかった。更にSAAやIL-1β,IL-6などの蛋白の遺伝子上にはPPAR結合領域(PPRE)の存在は確認できなかった。5)肝細胞からのSAA産生あるいはマクロファージからのサイトカイン産生時にnuclear factor κB(NF-κB)活性が上昇し、フィブリン酸の添加によりNF-κB活性が抑制された。6)ラットアジュバント関節炎モデルに対しフェノフィブラートの投与を行ったが、明らかな抑制効果を認めなかった。また、ヒトRA滑膜細胞中にPPARαの発現を認めなかった。(総括)フェノフィブラートはマウスアミロイドモデルにおいて血中SAA上昇を抑制し、組織アミロイド沈着を強力に抑制することが確認された。さらに、in vitroではSAAのみでなくIL-1βやIL-6をも抑制し、その作用機序はPPARα活性化に伴うNF-κBの抑制などのシグナル伝達の関与が推測された。1)マウスAAアミロイドモデルに対し、フィブラートの経口投与(75, 150, 300mg/kg/day)を3週間行った。結果。投与群では脾臓アミロイド沈着が濃度依存的に有意に抑制され(300mg/kg投与群では非投与群に対し80%以上の抑制)、さらに経過中の血清アミロイドA(SAA)もほぼ平行して抑制されていた。さらに、血清中のIL-6及び大腿骨骨髄中のIL-1β,IL-6濃度をELISAにて測定した。血清中IL-6は、投与薬剤の濃度が高いほど抑制される傾向にあった。骨髄中IL1βがフィブラート投与群では非投与群に比べ抑制されていたが、濃度による差は明らかではなかった。2)肝細胞HepG2においてIL-1β,IL-6刺激によるSAA産生に対するフェノフィブリン酸(フェノフィブラート活性代謝物)の影響をみたところ、フィブリン酸100-300μMでSAA産生が有意に抑制されることが確認された。3)マクロファージ系細胞RAW264においてlipopolysaccharide刺激で産生されるIL-1β,IL-6に対するフェノフィブリン酸の影響をみたところ、フェノフィブリン酸は100-250μMでいずれのサイトカイン産生も抑制したが、特にIL-1βに対する抑制効果が強かった。(総括)フェノフィブラートはマウスモデルにおいて血中SAAを抑制し、組織アミロイド沈着を強力に抑制することが確認された。さらに、SAAのみでなくIL-1βやIL-6をも抑制することから、広く抗炎症に関わる可能性があった。これらの結果に対するPPARαの関与を明らかにすることを次年度の課題とする。前年度にフェノフィブラート(あるいはフェノフィブリン酸)が1)マウスにおけるAAアミロイドーシスを抑制したこと2)培養細胞において肝細胞からの血清アミロイドA(以下SAA)蛋白の産生、あるいは単球系細胞からのIL-1,IL-6などの炎症性サイトカインの産生を抑制したことを報告した。フィブラートは核内転写因子peroxisome proliferator activated α(以下PPARα)のactivatorであることから、本年度は上記結果におけるPPARαの関与を明らかにすること、更にフィブラートの他の炎症性疾患への応用の可能性を考え、関節炎における抑制効果を確認することを課題とした。結果1)肝細胞及びマクロファージのおけるPPARαの発現をRT-PCR法で確認したところ、肝細胞では多く発現していたが、マクロファージにおける発現は認めなかった。更にSAAやIL-

1,IL-6など遺伝子上にはPPAR結合領域(PPRE)が存在しないことより、フィブラートのSAAあるいは炎症性サイトカイン抑制機序にはPPARα-PPREの直接のシグナルではなく、何らかの別の細胞内伝達経路が存在することが示唆された。2)in vitroにおいて炎症性サイトカインによる肝細胞刺激、あるいはlipopolysaccharideによるマクロファージ刺激ではNF-kB活性が著明に上昇するが、フィブリン酸の添加によりこのNF-kB活性を抑制することをゲルシフトアッセイにて明らかにした。3)ラットアジュバント関節炎モデルに対しフェノフィブラートの投与を行ったが、明らかな抑制効果を認めなかった。また、ヒトRA滑膜細胞中にPPARαの発現を認めなかった。
リチウム同位体含有シンチレーターによる未知中性重粒子探索とそのスピン結合行列要素

1.未知中性重粒子探索に利用可能なシンチレーター検出器からのデジタル波形情報を用いる粒子識別法の開発・デジタルオッシロスコープを用いた、シンチレータ検出器からのオンライン波形データ取得法の開発。・未知中性重粒子探索に比較的有利なCaF_2シンチレーターでのβ/γ線とα線の粒子識別法の開発。・フラシュADCを利用して得られる波形の時系列情報を利用したシンチレーター素材中のウラン、トリウム系列の含有率の精密測定とその同定法の開発。具体的にはウラン系列の半減期164/μsecを持つ連続した2.ヨウ化リチウム検出器を用いた極低バックグラウンド未知中性重粒子検出器・リチウム同位体のうち^6Liのみを含むものと^7Liのみを含むヨウ化リチウムヨウカリチウム検出器のプロトタイプの作成とその検出器テスト。・ヨウ化リチウムシンチレーターのシンチレーター光の減衰時間に粒子依存性があることが報告されていたが、この粒子依存性は現在までのテストでは再現できず、その原因については究明中である。・中性未知重粒子探索のバックグラウンド源となる中性子バックグラウンドとそのエネルギー分布を^6Li含有検出器を用いて評価する方法を開発し、地上でのテストと神岡地下実験室での予備テストを行なった。
マルチメディア時代のバウハウスとメディアリテラシー教育の研究

1.マルチメディアによってもたらされる芸術の変容について、その表現形式の問題として情報の統合ということを焦点化し、歴史的なバウハウス運動の理念的成果としての様々な統合論と比較考察を行った。特に、マルチメディアによる作品において顕著となっている美術と音楽との統合については、バウハウスの重要な理念の一つである「諸芸術の統合」として認識できた。さらにバウハウスの歴史上での美術と音楽の密接な関係についても再考した。また、もう一つの重要な理念である「芸術と技術の統合」については、マルチメディア作品のあり方自体を示しているものであり、今日の新しい「バウハウス」として教育・研究機関が誕生してきていることと関連づけた。そのような新しい状況のなかで、マルチメディアによる表現の教育的な可能性を探ることの重要性を確認した。2.美術におけるメディアリテラシー教育の重要性を指摘するとともに、マルチメディアによる表現を教材化する基礎としての実践研究を行った。まず、メディア批判の能力を育成するためのメディアリテラシーを土台にしながらも、美術において「メディアの特性を理解して自分の意図を効果的に表現できる総合的な能力の獲得」を位置づけた。さらに、マルチメディアによる表現によってもたらされる新たな課題として、「時間軸と運動を包含する動画(アニメーション)」、「映像と音声の同期」、「インタラクティブな作品のあり方」、「仮想現実(ヴァーチャル・リアリティ)の問題」を想定して、教育養成課程での教育実践に取り入れた。そこでは,動きのあるCGアニメーション制作、「自然との関わり」を考慮した制作プロセスの提案、プロモーション・ビデオ制作、コマーシャル制作などの実践成果を得た。ドイツの芸術造形学校であり、芸術・デザイン運動でもあった「バウハウス」の歴史的な理念としての「総合芸術」と「芸術と技術の統合」を今日的な視座において再考することによって、「マルチメディア時代」の芸術のあり方と「美術教育」の可能性を検証した。まず第一に、「エレクトロニック・バウハウス」という概念による芸術と電子テクノロジーの統合としての表現形式について、歴史的なバウハウスの理念との整合性を考察した。ここでは、マルチメディア・アーティストという表現者の立場と、バウハウス教育の研究家の立場での認識の相違について、双方の論述を比較検討し、マルチメディアによる表現のさらなる発展の可能性を探るとともに、個としての人間を全体的に教育していこうとする「全人教育」理念の重要性を再認識することとなった。次に、「美術」という教科における「メディアリテラシー教育」の可能性を実践研究として実施し、教員養成課程での教材開発を試みた。ここでは、ビデオカメラ、ビデオ編集機、コンピュータ等映像機器を活用した映像表現としての「ビデオクリップ」の制作や、簡単なCGアニメーション、Webデザインの教材化を実験的に実践した。この作業によって、マルチメディアの特性の理解から新たな表現が生じる可能性を検証するとともに、教育媒体として活用するための基礎的な考察を行った。
薬物性歯肉肥厚の治療

Tenidapがnifedipine感受性歯肉由来線維芽細胞の発育を抑制することをすでに報告している。本研究ではヒト歯肉由来線維芽細胞を用いてTenidapと類似の作用を有する薬物の検索を行い, diclofenac Na, indomethacin, mefenamic acidなどが細胞膜を通したCa^<2+>の流入の抑制,細胞内pH([pH]i)の低下などを引き起こすことを認めた。これらの薬物を用い,ラットおよびイヌにおけるnifedipine歯肉肥厚に対する抑制効果(治療効果)を検討した。Tenidap(軟膏中濃度100μg/ml)はラットおよびイヌ歯肉盲嚢内局所投与においてnifejipine投与によって生じる歯肉肥厚で,有意な仮性ポケットの深さの軽減,上皮厚さの菲薄化を示し,肉眼的にも歯肉肥厚の軽減が認められた。Diclofenac Na(軟膏中濃度100μg/ml)も同様にnifedipine歯肉肥厚の軽減を示した。これらのことは,循環器系疾患でカルシウム拮抗薬の投与を持続しなければならない患者で歯肉肥厚を発症する場合にも,同時にtenidapまたはdiclofenac Naの局所投与を併用することにより過剰な歯肉肥厚形成を抑制できることを示唆している。インフォームドコンセントを得た患者の口腔外科的処置または生検時に得られた歯肉から,すでに報告された方法(Fujii et al.,1994,1995)を用いて組織培養によりoutgrowthした線維芽細胞を得,実験に供した。実験には継代歯肉線維芽細胞(58代)を用いた。また以下の実験を行うために,細胞内イオンアナライザー(CAF-110,JASCO)を購入した。(1)細胞内カルシウムの動態に対する各種薬物の影響:tenidapと同じ種類の作用を示すと考えられる各種合成抗炎症薬の細胞内カルシウム動態に対する影響をすでに報告した方法(Fujii et al.,1994,1995)を用いて検討した。その結果,tenidap,indomethacin,mefenamic acidがthapsigarginによってひき起こされるカルシウム流入を抑制することが明らかになった(第72回日本薬理学会年会,1999)。(2)細胞内pH(pHi)変化に対する各種薬物の影響:pHi変化が細胞増殖と密接な関係を有すると考えられたので,各種薬物によるpHiについて検討した。pHi変化はBCECF-AM(3μM)/HEPES bufferを細胞内にloadし,常法により測定した。その結果,tenidap,histamine,diclofenac Naなどが一過性のpHiの低下をひき起こすことが認められた(第18回日本歯科薬物療法学会,1999;77^<th> General Session of IADR,1999)。(3)実験的歯肉肥厚に対する薬物療法:上述のtenidapと類似の作用を示す薬物を用いて,薬物を局所的に投与し,実験的歯肉肥厚に対する薬物の効果を,前実験として検討した。その結果,tenidapはnifedipineによってひき起こされた歯肉肥厚を抑制する傾向が認められた。本研究ではヒト歯肉由来線維芽細胞を用いてTenidapと類似の作用を有する薬物の検索を行い,diclofenac Na,indomethacin,mefenamic acidなどが細胞膜を通したCa^<2+>の流入の抑制,細胞内pH([pH]i)の低下などを引き起こすことを認めた。

これらのことは,循環器系疾患でカルシウム拮抗薬の投与を持続しなければならない患者で歯肉肥厚を発症する場合にも,同時にtenidapまたはdiclofenac Naの局所投与を併用することにより過剰な歯肉肥厚形成を抑制できることを示唆している。
分布限界における植物個体群のダイナミクス

本研究では、シュロソウ科の多年生草本オオバナノエンレイソウを対象として、分布限界の生成に寄与しうる適応度成分の特定を試みた。緯度勾配に沿った多数の個体群で生育密度や適応度成分の地理的変異を調べたところ、中緯度(石狩地方)で最も生育密度が高く、低緯度や高緯度に向かうにつれて生育密度が低くなる傾向が見られた。また、分布南限の個体群では種子生産量が少なく、種子重量が小さいことが、幼植物の低い加入率に寄与している可能性が示唆された。生物種の分布域の決定要因を理解することは、生態学の中心的課題であるとともに、気候変動が及ぼす影響を評価する上でも重要である。本研究では、東北地方を分布南限とする多年生草本オオバナノエンレイソウを対象として、分布域の決定要因を明らかにすることを目指す。本年度は、分布南限から緯度勾配に沿った15の個体群(岩手県×3,秋田県×1,青森県×3,北海道×8)において、生育密度や個体群サイズ、ならびに複数の適応度成分を測定し、緯度およびオオバナノエンレイソウの生育期間である47月の平均気温との間に見られる関係について調べた。その結果、生育密度と個体群サイズは中緯度(分布域の中心)で最大となり、分布限界に近づくにつれて小さくなった。個体サイズは、低緯度(分布南限)の個体群ほど小さく、花数も少なかった。シカによる果実の被食圧が高い個体群を除けば、種子生産量は低緯度の個体群ほど少なかった。幼植物の加入率(幼植物が占める割合)は中緯度で最大となり、低緯度もしくは高緯度になるにつれて低くなった。また、生育期間の平均気温は、生育密度や個体群サイズと有意な関係を示したが、上記の適応度成分との間に相関関係は見られなかった。以上の結果から、分布南限の個体群では、分布域の中心に比べて個体サイズが小さい、種子生産量が少ない、幼植物の加入率が低い傾向が見られ、これらの適応度成分が分布南限の生成に寄与している可能性が示唆された。さらに多くの個体群や適応度成分を比較することで、これらの結果についてさらに検証を行う予定である。オオバナノエンレイソウを対象として行った昨年度の調査では、中緯度(石狩地方)で最も生育密度が高く、分布南限(秋田、岩手)で最も低いこと、複数の適応度成分が緯度勾配に沿った地理的変異を示すことが明らかとなった。しかし、特定の個体群だけが異なる挙動を示す場合もあり、さらに多くの個体群を対象とした調査が必要だと考えられた。そこで本年度は、昨年度よりも多くの個体群を用いて、緯度勾配に沿った適応度成分のパターンの再検討を行った。その結果、分布南限に近い低緯度の個体群ほど、個体サイズが小さくなる傾向が見られた。また、大型動物による被食圧が高かった個体群を除くと、低緯度の個体群ほど種子生産量が少なかった。幼植物の加入率と種子重量は中緯度で最大となり、低緯度もしくは高緯度になるにつれて小さくなった。さらに、分布域の中心と南限の5個体群においてマイクロサテライト遺伝子座を用いた遺伝解析を行ったところ、分布域の南限では遺伝的多様性が低いこと、近交弱勢が小さい傾向があることが分かった。この結果に関しては、さらに多くの個体群や遺伝子座を用いて検証を行う予定である。おおむね順調に進んでいるが、当初の計画と比べて遺伝解析がやや遅れている。昨年度までの調査で、オオバナノエンレイソウの分布南限の個体群では幼植物が顕著に少なく、個体の新規加入率が低い傾向があることが推測された。分布域の中心(石狩地方)と南限(秋田県、岩手県)にある各3ヶ所ずつの個体群を対象としてデモグラフィーを観察するため、2013年5月に50個の方形区をつくり、方形区内に生育する個体(約3,000個体)をすべて金属製のタグで標識した。標識された個体を毎年5月に追跡したところ、分布南限の方が個体の加入率が低いこと、また個体の生存率が低い傾向にあることが明らかとなった。個体群動態に関しては、今後さらに詳しい分析を行う予定である。また、個体の新規加入が制限される要因を明らかにするため、前述した個体群において、2012年7月に種子を播種することで実験個体群を設けた。小面積の方形区を多数設置し、半数の方形区では他の植物種を定期的に除去し、発芽率や発芽後の生存率を2016年まで観察した。その結果、どの方形区においても、実生がほとんど定着しなかった。先行研究では、移植先の局所的な環境条件によって結果が左右される傾向があることも明らかになっており、このようなアプローチで個体群間のデモグラフィーを比較することは難しい、あるいは、かなり多くの方形区を用意する必要があると考えられる。同様に、分布域外(宮城県)に設けた方形区においても、実生がほとんど定着しなかった。今後は、交配実験や生態ニッチモデルなどを用いて、分布域の決定要因について包括的に理解するための研究を継続して行う予定である。

また、分布南限の個体群では種子生産量が少なく、種子重量が小さいことが、幼植物の低い加入率に寄与している可能性が示唆された。おおむね順調に進んでいるが、当初の計画と比べて遺伝解析がやや遅れている。当初の計画にしたがって野外調査や遺伝解析を行い、すべての結果に基づいて分布域の決定要因について総合的に考察する。植物生態学当初の計画にしたがって、今後はデモグラフィーの観察や実験個体群を用いた調査を行う予定である。遺伝解析が遅れているため、試薬類を購入するための予算を中心として一部を次年度使用することとなった。遺伝解析が遅れているため、試薬類を購入するための予算を中心として一部を次年度使用とすることとなった。遺伝解析用の試薬類の購入に充てる予定である。
撃力による液体ジェットの制御と高粘度液滴を用いた革新的インクジェット技術の開発

当該年度は本課題の最終年度であり,これまでに研究成果を挙げてきた撃力による液体ジェットの応用へ向けた研究の実施と,研究成果発表に力点を置いた.具体的には,医療機器・生体印刷用途に向けたマイクロジェット研究,および高粘度液体吐出機構開発に関する研究を進めた.まず,マイクロ液体ジェットを用いて,ゼラチンゲル(生体模擬材料)および動物皮膚へ対するマイクロ液体ジェットの衝突・浸透過程の実験的解析を行った.ゼラチンゲルを用いた実験では模擬材料に対する液体浸透過程について,動物皮膚に対する実験では皮膚内部に浸透するに要する条件について,それぞれ知見を得た.上記の結果は,医療機器・生体印刷等,幅広い応用へ向けた基礎的な知見となり得るものと期待される.上記の知見は,査読付き英文学術誌(Journal of Visualization)に論文として発表した.また,高粘度液体を吐出するための機構開発のため,撃力により生じるキャビテーション制御手法の実験的検討を行った.液体中に通常生じるキャビテーション(例:Pan & Kiyama, et al., PNAS, 2017)は制御が非常に困難であるのに対し,予め気泡を含有するゲルを系内部に配置することで,その制御を試みた.その結果,ゲルに予め含有される気泡が圧力変動に伴って膨張・収縮することに伴い,通常のキャビテーション気泡と類似の効果が認められ,ジェット射出能が向上した.これは,高粘度液体の吐出機構開発に資するものだと期待される.上記の知見は,査読付き学術雑誌に論文として発表した(前嶋,木山ら,日本画像学会誌,2019).平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度において,主として,低粘性流体中におけるキャビテーション気泡発生メカニズムの解明,に取り組んだ.これは,撃力によって生じる液体ジェットの運動について,液中における気泡挙動が顕著な影響を与えることが示唆されているためである.この気泡発生について理解を深めることは,撃力によるジェットの制御には不可欠な要素である.当該年度は特に,キャビテーション発生条件の解明,キャビテーション発生がジェットに与える影響,について取り組んだ.まず,キャビテーションの発生条件の解明に取り組んだ.これまで,キャビテーション発生条件としては,流れ場の平均速度の自乗を分母に持つ無次元数である,キャビテーション数が知られていた.しかし,従来のキャビテーション数は,本研究が対象とするような,液体急加速(撃力付与)時の気泡発生条件には適用できないと考えられる.そこで本研究では,撃力付与の瞬間における運動量変化に注目し,新たな指標(無次元数)を提案した.次に,キャビテーション発生がジェットに与える影響について取り組んだ.先述の通り,キャビテーションが発生する場合,液体ジェットの速度が,気泡が発生しない場合と比して最大2倍程度増速することが報告されている.しかし,これまでの研究は高速度撮影結果から考察を与えたものだけであり,実際の圧力変動を実験的に計測した例はなかった.本研究では,そのメカニズム理解のための第一歩として,液中に生じる圧力波をハイドロフォンプローブによって定点計測するとともに,液中での気泡挙動を高速度カメラで捉えることで,両者の関係の解明を試みた.その結果,キャビテーション気泡の発生により,液中圧力場が負圧から急激に回復する様子をはじめて計測した.当該年度には,低粘性流体中におけるキャビテーション気泡発生メカニズムの解明,に取り組んだ.そのなかでも特に,キャビテーション発生条件の解明,キャビテーション発生がジェットに与える影響,について取り組んだ.まず,キャビテーション発生条件の解明であるが,高速度撮影を用いて,撃力付与の瞬間における液体容器の運動と,その結果として生じるキャビテーション気泡の運動を捉えることによって,新規に提案した(撃力付与時に適用可能な)理論的なキャビテーション発生条件との比較が可能になった.実験結果は,新規に提案した理論に対し,幅広い実験条件で良好な一致を示した.このことは,撃力付与時におけるキャビテーション発生の傾向を適切に表現できるようになったことを示す.本成果は,査読付き国際学術誌に投稿中である.次に,キャビテーション発生がジェットに与える影響についてであるが,高速度撮影と水中圧力計測とを組み合わせることによって,キャビテーション挙動が圧力場に与える影響を議論することが可能になった.この実験によって得られた結果は,おおむね,高速度撮影結果のみから推測された結果と整合するものであった.また,個々の気泡の挙動と圧力場との関係が調べられるようになったことは,大きな前進であった.これにより,個々の気泡としてのふるまいと,気泡群としてのふるまいとが液中圧力場,さらにはジェットに与える影響を議論できるようになったことは重要な点である.以上の進展を踏まえた結果は,今後査読付き国際学術誌に投稿する予定である.以上より,研究は概ね予定通りの進展を見せている.平成29年度は,微小液滴生成とその制御に取り組むことを計画していた.この目的に照らして,まず,マイクロ流路を用いた液体ジェット生成,に取り組んだ.特に,液体ジェットの速度に注目して実験的に調査した.研究を実施するなかで,液体中に生じるキャビテーション気泡がジェットの運動に顕著な影響を与えることが示唆された.そのため,ジェット制御に向けて,キャビテーション制御手法の検討は不可欠であると考え,メゾスケール実験系を用いたキャビテーション気泡の制御性に関する検討を加えて行った.

マイクロ流路を用いた実験では,液体にパルスレーザーを照射し,局所的に加熱・気化させることで周囲流体に撃力を付与する手法を用いた.低粘度の液体ジェットでは投入エネルギー量によってジェット速度は記述されると考えられたが,液体中にキャビテーションが発生する場合はジェット速度が最大2倍程度変化した.一方,高粘度のジェットでは,その速度は低粘度ジェットと比して明らかに低下した.またジェットの径も太くなり,水の100倍程度の粘度を有するジェットでは,その先端から液滴を生成することが困難になることが実験的に明らかになった.キャビテーションに関しては,昨年度より進めていたキャビテーション発生条件について,それを普遍的に記述する無次元数を定式化した.加えて,流路内部にごく微小な気泡(マイクロ・ナノサイズ気泡)を導入し,擬似的なキャビテーション発生源とすることを構想し,実験を実施した.その結果,導入した気泡が急拡大することで,液体ジェット速度にキャビテーション発生時と同様の変化が生じることがわかった.この結果は,微小気泡導入によるキャビテーション発生制御の可能性を示唆するものである.平成29年度は,当初計画に沿って微小液滴生成装置の構築とジェット・液滴の制御に取り組んだ.具体的には,マイクロチャネルを利用してマイクロジェット挙動の実験的解析を行った.その結果,マイクロ流路内に微小なキャビテーション気泡が生じることにより,液体ジェットの制御性が著しく低下することを実験的に明らかにした(Hayasaka, Kiyama, et al., Microfluidics and Nanofluidics, 2017).このキャビテーション発生条件については,メゾスケールの実験を行うことで定式化を進めている(Pan, Kiyama, et al., Proceedings of National Academy of Science, 2017).また,流路内に微小な気泡を疑似的なキャビテーション発生源として導入することにより,キャビテーション発生及び液体ジェット速度を制御するための指針を得た(Yukisada, Kiyama, et al., Langmuir, 2018).加えて,高い粘度のジェット・液滴について検討を進めた.水の100倍程度の粘度を有する液体に関しては,増粘により液体ジェット先端からマイクロ液滴を分離・形成することが困難になるとの結果を得た.また先述のキャビテーションの効果としては,液体ジェットの速度ばかりでなく,その飛翔時の形状に対しても大きな影響を与えることが実験的に明らかになった.以上のことから,当初想定した課題に対して,概ね順調に研究が進展していると考えられる.加えて,当初想定していなかった,キャビテーションがジェット形状に与える影響なども明らかになっており,今後の研究進展に対する有望な示唆が得られた.当該年度は本課題の最終年度であり,これまでに研究成果を挙げてきた撃力による液体ジェットの応用へ向けた研究の実施と,研究成果発表に力点を置いた.具体的には,医療機器・生体印刷用途に向けたマイクロジェット研究,および高粘度液体吐出機構開発に関する研究を進めた.
長期集団宿泊活動(自然教室)が児童の心身に及ぼす効果に関する研究

自然教室(「自然教室推進事業」)は児童生徒に1週間(5泊6日)程度の集団宿泊活動をさせ、体験学習を通して心身の調和的発達を図ることをねらいとしている。本研究の目的は、自然教室が児童の身体・心理面にどのような影響を及ぼしているかを実証的に解明し、さらに健康教育領域における認識形成や学習能力を高める上でどのように位置づけることができるかを検討することにある。自然教室に参加した児童の学校生活時と自然教室期間中における身体、心理状況等を明らかにするため計3回の調査を行った。その結果、学校生活時に比べて自然教室期間中に疲労自覚症状の訴え率が低率を示したのをはじめとして、セルフ・ヘルス・チェックの回答率の変化、空腹感の訴え率の増加や生活満足度が高まるなど自然教室が児童の身体面に有効な影響を及ぼしたと判断できるデータを得た。また、セルフ・エフィカシィーの変化から自然教室の体験が児童の心理面においても効果を及ぼしていたことも認めた。以上のことから自然教室の宿泊日数の妥当性や教育効果が推察できた。さらに、自然教室期間中の身体状態が学校生活時の状態と違うことや自己能力の修正が行われたことなどに注目した学習指導システムを構想できた。本研究の目的は、1週間(5泊6日)程度の集団宿泊活動「自然教室推進事業(自然教室)」が児童の身体・心理面にどのような影響を及ぼし、どのような効果をもたらしているかを実証的に解明し、期間の妥当性や教育効果について一定の見解を示すことにある。また、健康教育領域における認識形成や学習能力を高める上でどのように位置づくかを検討し、自然教室をより有効に機能させる指導システムを開発しようとするものである。93年度はA市J小学校の児童を対象に平常の学校生活時(自然教室前後・各1週間)と自然教室期間中(5泊6日)における身体状況、食生活、生活満足度等について調査を実施した。その結果、平常学校生活時に比べて自然教室期間中に疲労自覚症状30項目の訴え率が低率を示し、特に、「ねむけとだるさを主とする一般的な身体症状」や「注意集中の困難を主とする精神症状」項目に顕著な低率を認めた。さらに、空腹感の訴え率の増加や生活満足度が高まる等、自然教室が児童の心身面に有効な影響を及ぼしたと推察できるデータが得られた。したがって、94年度は児童の心身における動態をより一層把握するために継続調査を実施するとともに、自然教室期間中に認められた身体状況の変化に着目して、一層有効な健康学習にするための指導システムを提起することが課題である。本研究の目的は、自然教室が(1)児童の身体・心理面にどのような影響を及ぼしているかを実証的に解明し、さらに(2)健康教育領域における認識形成や学習能力を高める上でどのように位置づけることができるかを検討し、体験学習をより有効に機能させる指導システムを開発することにある。昨年度の調査において児童の自然教室期間中と平常学校生活との身体状況(疲労、食生活、生活満足感等)に差異が認められたので、本年度も引き続き身体状況(セルフ・ヘルス・チェック、フリッカー値の測定等)について調査するとともに、児童のセルフエフィカシィー等に着目して、自然教室の直前、直後、1カ月後に調査を実施した。その結果、セルフ・ヘルス・チェック項目において平常学校生活時に比べ自然教室期間中に「良好」と回答する児童の割合が有意に増加した。また、セルフエフィカシィーでは因子得点群ごとに自然教室前後の変化をみたところ自己効力感が低いレベルの児童ほど効力感が向上し、逆に高いレベルの児童では低下を認めた。以上のことから、自然教室の宿泊日数の妥当性や教育的な効果が推察できた。また、児童の身体・心理面に有効な影響を及ぼしていることに注目し、平常学校生活時と自然教室時の生活の違いに気づくような健康教育の指導システムを構想できた。特に、自然教室の生活体験に関連づけた事前事後の指導には可能予期(ある結果を生ずる行動を行えるという確信)と結果予期(ある行動がある結果を導くという推測)を重視する学習理論の導入が有効であることが予測できた。
Ctf18-RFC/Polε複合体による新生DNAでのPCNAの協調的配置機構

真核生物ではPCNAがS期に染色体DNAに装着され、複製進行、染色体再構築を制御する。従来、複製時のPCNA装着は主要なローダーであるRFCによって高頻度でラギング鎖に装着されること明確であったが、リーディング鎖への能動的な装着のしくみは不明であった。我々はRFC類似複合体Ctf18-RFCがリーディング鎖DNAポリメラーゼPolεと複合体になってPCNAローダーとして機能することを示した。さらにこれを使ってPCNA装着とDNA合成様式の関係を解析した。その結果、この複合体では(Polε/PCNAによる安定な合成→合成の停止とPCNAの解離→Ctf18-RFCによるPCNAの装着→Polε/PCNAによるDNA合成の再開)というサイクルが行われ、安定で長いリーディング鎖が合成されることを示した。つまりリーディング鎖合成では、安定性が十分でないPolεによるDNA合成に対して、結合しているCtf18-RFCによって頻繁にPCNAが装着され安定にDNAが合成される。その結果、リーディング鎖DNAでもPCNAが能動的に装着されることになる。さらに、より完全な複製複合体を得るために複製型ヘリカーゼであるヒトCMG複合体を精製し、DNAポリメラーゼホロ複合体CMG/Polε/Ctf18-RFCの再構築を行った。これを使ってリーディング鎖合成過程でCMG/PolεによるDNA合成とPolε/Ctf18-RFCによるPCNA装着を介した合成再開反応の連係機構の解析を行った。またPCNA脱着を行うと言われているもう一つのRFC類似複合体、ヒトElg1-RFCを精製した。これを使いPCNA脱着反応の再構築を行い、精製タンパク質で脱着の再現が可能であることを示した。以上により複製時のPCNAの装着からその後の適時的なPCNAの脱着を連続的に解析することが可能となった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Ctf18-RFCがリーディング鎖DNAポリメラーゼPolεと複合体になった時に活性型PCNAローダーとして機能する。この複合体によるリーディング鎖側DNAへのPCNAの能動的装着により、2種類の新生DNA間の協調的な配置が行われることを予想した。そこでリーディング鎖型複製フォークの再構築などの生化学的アプローチ、出芽酵母、ヒト細胞によるタンパク質のゲノム動態解析を駆使してCtf18-RFCによる2種類の新生DNA間への協調的なPCNA装着を解析する。まず、Ctf18-RFCのPCNA装着活性の詳細な解析により、Ctf18-RFCがPolεと複合体を形成した時に、両者が協調的にプライマーDNA 3'末端に結合し、高効率のPCNA装着が発揮されることを示した。このことから、Polε/Ctf18-RFC複合体は、リーディング鎖DNAポリメラーゼの構成要素として機能することを提唱した。またPolε/Ctf18-RFCによるPCNA装着反応で足場になるPolεのDNA合成モードと装着活性が相互排他的になることを示した。このことからCtf18-RFCによるPCNA装着は、PolεのDNA合成に障害がある時に行なわれることを明らかにした。また、ヒト細胞でヘリカーゼ活性を有するCMG複合体の調製を可能にした。これを基にしてCMG/Polε/Ctf18-RFC型フォーク複合体の再構築を行ない、リーディング鎖型DNA合成過程でPCNAが装着される反応を検証可能となった。以上の生化学的な解析に加えて、ヒト細胞でPolεとCtf18-RFCの複合体形成、それによるPCNA装着の機能的な意義を解析するために、HeLa細胞で、CRISPR-Cas9を使ってゲノム編集でFLAGタグ付きヒトCHTF18とPolε結合性を持たないC末欠損変異型FLAG-CHTF18の発現細胞の作成を進めている。初期の達成目標として設定したPolεとCtf18-RFCとの相互作用の詳細についての解析を進め、両者の協調的なプライマー3'末端への集合とPCNA装着過程について新しい知見を得た。まずCtf18-RFCはPolεと複合体となった時にPCNA装着活性を有し、PolεがDNA合成を行なうリーディング鎖側で機能しているモデルが提示した。さらにCtf18-RFCによるPCNA装着は、PolεのDNA合成に障害がある時に行なわれることを明らかにした。これらは、Nucleic Acids Res.に投稿して受理された。出芽酵母でも同様のPolε/Ctf18-RFC複合体が機能していることを示した。さらにこの相互作用が、出芽酵母の染色体安定性に重要であることを示した。この結果は、Genes Cellsに投稿して受理された。出芽酵母の複製因子発現系を作成し、ヒト複製因子で示した特性を出芽酵母の因子で検証することが可能になった。また、活性を有するヒトCMG複合体の調製を可能になった。PCNAは真核生物の複製の進行から複製後染色体の構築まで必須のはたらきを持つ。PCNAをDNAに装着するローダー型複合体には必須のRFCに加えて必須でないCtf18-RFCとElg1-RFCが存在する。複製時のPCNA装着はRFCによって高頻度でラギング鎖に装着され、リーディング鎖へは能動的に装着されないと考えられてきた。Ctf18-RFCはリーディング鎖

DNAポリメラーゼPolεと複合体になってPCNAローダーとして機能する。この点に着目してこの複合体がリーディング鎖DNAへのPCNAの能動的装着を行うことを考えた。またElg1-RFCはPCNA脱着活性も過剰なPCNAの除去を行うと考えた。本研究ではこれらの機能に着目し、複製後の両新生DNA間の協調的なPCNA配置機構を明らかにすることを目的とする。まずCtf18-RFC/Polε複合体のPCNA装着活性、DNA合成様式を詳細に解析した。これよりこの複合体は安定したリーディング鎖合成を継続でき、リーディング鎖DNAへのPCNAの能動的装着できることを示すことができた。そこで複製時のPCNAの能動的装着を再現するために、複製フォークでヘリカーゼとして機能するヒトCMG複合体の発現系を作成し、活性型複合体が得られた。そこでこれを使ってDNAポリメラーゼホロ複合体CMG/Polε/Ctf18-RFCの再構築を行い、リーディング鎖合成過程でPCNAが装着される反応の再現を試みている。またヒトElg1-RFCのPCNA脱着反応の再構築を行い、その活性制御に関わる要素を解析し複製後DNAで適正なPCNAの配置が行われる機構の解析を進めている。昨年の成果であるCtf18-RFC/Polε複合体の活性の解析を発展させるため、CMGヘリカーゼの再構築を行い、活性型複合体を生成できた。しかし精製量がCMG/Ctf18-RFC/Polεホロ複合体の再構築には不十分であるため、発現、精製法の改善を行っている。これら再構築過程のローダー複合体とPolεを使い、PCNAアプタマーの解析を共同研究で行った。この過程で、使用したPCNAアプタマーがPCNA/Polε複合体に特異的に作用してそのDNA合成を強く阻害することを明らかにでき、その成果がNARに受理された。複製後DNAでの適正なPCNAの配置に重要な脱着機構に注目し、Elg1-RFCのPCNA脱着反応の再構築を行った。その結果、その脱着反応にはElg1-RFCに加えて細胞由来の付加的な因子が要求されることが示され、その解析を進めている真核生物ではPCNAがS期に染色体DNAに装着され、複製進行、染色体再構築を制御する。従来、複製時のPCNA装着は主要なローダーであるRFCによって高頻度でラギング鎖に装着されること明確であったが、リーディング鎖への能動的な装着のしくみは不明であった。我々はRFC類似複合体Ctf18-RFCがリーディング鎖DNAポリメラーゼPolεと複合体になってPCNAローダーとして機能することを示した。さらにこれを使ってPCNA装着とDNA合成様式の関係を解析した。その結果、この複合体では(Polε/PCNAによる安定な合成→合成の停止とPCNAの解離→Ctf18-RFCによるPCNAの装着→Polε/PCNAによるDNA合成の再開)というサイクルが行われ、安定で長いリーディング鎖が合成されることを示した。つまりリーディング鎖合成では、安定性が十分でないPolεによるDNA合成に対して、結合しているCtf18-RFCによって頻繁にPCNAが装着され安定にDNAが合成される。