hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
他種との局所的な繁殖干渉が駆動する種分化プロセスの解明

さらに、同じ個体群の同種オスの鳴き声と同所的な他種オスの鳴き声をプレイバック実験によってメスに聴かせ、メスの鳴き声に対する選好性の定量化を試みた。その結果、瑞芳の1ペアで交尾まで観察できたほか、実験したすべての個体群のヤモリから多数の求愛の鳴き声が録音できた。録音した鳴き声データに関しては、現在解析を進めている最中である。昨年度の調査において、鳴き声が当初の予定より細かい遺伝的スケールに応じて変化しており、他種との相互作用を含めた自然選択の影響を検出するためには、遺伝的にごく近縁で系統学的制約を無視できる群間で比較することが必要であることが示唆された。さらに、共同研究者によるミナミヤモリの系統地理学的研究によって、ミナミヤモリは台湾島内で複数回分化し、各系統はほぼ側所的に分布を接していること、さらに分化した系統のそれぞれが南西諸島に海上分散し、南西諸島で異所的に分布していることが示唆された。以上を考え合わせると、台湾島内で分布を接している系統間で、南西諸島に分散する以前に、種認識形質の分化が生じた可能性が高い。これらのことから、計画を大きく変更せざるを得ない状況が生じたため、本年度は基盤情報としての種内の鳴き声の地理的変異の実態を明らかにすることを優先させた。その結果、プレイバック実験など後続の実験に遅れが生じているものの、遺伝的近縁性も考慮した比較に適した台湾の集団に拡張し実験を行うことで、総体としては科学的により価値高いデータを収集できている。ミナミヤモリの種内系統において同一クレードに属する個体群のうち、同属のオキナワヤモリと同所分布している伊是名島と久米島の個体群と、同属種から隔離されている伊江島と阿嘉島の個体群のそれぞれの鳴き声形質と、メスの鳴き声に対する選好性を調べた。その結果、伊是名島と久米島では、伊江島と阿嘉島に比べて、オキナワヤモリの鳴き声とより異なったパルス間間隔の短い方向に鳴き声が変化していることが示された。さらに、伊是名島のメスに伊是名島と伊江島のオスの平均的な鳴き声を聞かせたところ、よりパルス間間隔の短い自個体群の鳴き声を好んだ。一方で、伊江島のメスは、個体群間の鳴き声の違いに対して有意な選好性を示さなかった。加えて、伊是名島のメスに、自個体群のオスでありながら平均よりパルス間間隔の短い鳴き声と長い鳴き声を聞かせたところ、パルス間間隔の短い鳴き声を好んだ。これは、なんらかのコストや制約によってオスの鳴き声がメスの選好性に合わせて最適化されておらず、メスの選好性に対する繁殖形質置換が先行していることを示すものと解釈できる。また、他種との共存によって生じた繁殖形質置換が、同種の個体群間の生殖隔離を二次的に成立させるという仮説が支持された。一方で、伊江島のメスに自個体群の平均よりパルス間間隔の短い鳴き声と長い鳴き声を聞かせたところ、この違いに対して有意な選好性を示さなかった。これは、地理的隔離により交雑等の繁殖干渉のコストから解放された個体群では、鳴き声に対するメスの選好性の厳密さが緩むことを示唆する。これらを考え合わせると、二次接触以前の分散元で他種と分布を接していたかどうかが、二次接触後に出会った集団との相互作用の帰結(二次的に成立した生殖隔離を通じて種分化するか、選好性の緩みによって交雑し集団が融合するか)を決めている可能性がある。ミナミヤモリ種内の鳴き声の地理的変異の実態の概要が明らかになりつつあるため、そのデータに基づき後続の実験デザインを再考する。具体的には、同一クレードでかつ単独分布の島と同属のオキナワヤモリと同所的である島を比較し、繁殖干渉の実態やオスの鳴き声形質、メスの鳴き声に対する好みの定量化を試みる。
行動変容技法を活用したインターネットによる身体活動促進プログラムの有効性

本研究は、生活習慣改善の方法として、これまでその有効性が検証されている行動変容技法を活用し、インターネットを通した身体活動促進プログラムの開発及び効果検証を目的としていた。情報のセキュリティについては、パスワード管理し、暗号化技術を用いて、解読キーを第三者からもらう、というシステムを構築した。参加募集にあたっては市の広報を用いた。プログラムでは2ヶ月間で計6回の情報交換が行われた。おおよその手順は、(1)ホームページで参加受付-画面上で問診回答-(受付メール)、(2)第1回課題実施-(アドバイスメール)、(3)第2回課題実施-(アドバイスメール)、(4)第3回課題実施-(アドバイスメール)、(5)第4回-(アドバイスメール)、(6)画面上で最終問診回答、というものであった。ホームページの内容は、(1)健康づくり情報提供(参加目的・準備性などにより内容は異なる)、(2)スキルアップ課題(目標設定、行動契約、達成度評価、実践障害への対処、メリットの確認)、(3)歩数・運動消費カロリー記録-グラフ作成、(4)掲示板、(5)Q&A、(6)健康づくりリンク集、によって構成されていた。企業従業員41名を対象とした介入では、減量希望者で平均減量が-1.9kgという良好な効果が得られたが、地域住民を対象とした介入では、参加者数が11人と少なく、途中脱落者が6名いた。しかし、最後まで継続した参加者の運動実施頻度や運動実践への準備性には向上がみられた。地域住民に対するプログラムでは、ほとんどの参加者が女性であり、インターネットを使い始めたばかりで日常的に接続しているユーザーではなかった。このような層に対するプログラムとしては、1)コミュニケーション機能を最大限活用する、2)トークシステムを用い報酬が高頻度で生じるようにする、などの工夫により定期的なインターネットへのアクセスを促進する必要があると思われる。本研究は、生活習慣改善の方法として有効性が確かめられている行動変容技法を活用し、インターネット通した身体活動促進プログラムを開発して、その有効性を検討することを目的としていた。平成13年度は、過去に開発し試験的検討を行っているインターネットプログラムに大幅な修正を加え、新たに地域住民を対象として予備的検討を行った。まず、プログラムへの参加者を募集するため、平成13年9月1日付けのT市報上での広報を行った。その結果、4名の申し込みがあった(途中脱落1名)。その後、10月1日より教室を開始し、11月末まで、2ヶ月計6回のやりとりを行った。おおよその手順は以下の通りである。ホームページで受付-画面上で問診解答-(受付メール)-第1回課題実施-(アドバイスメール)-第2回-(アドバイスメール)-第3回-(アドバイスメール)-第4回-(アドバイスメール)-画面上で最終問診解答ホームページの内容は、(1)知識(参加目的・準備性などにより内容は異なる)、(2)スキルアップ課題(目標設定、行動契約、達成度評価、実践障害への対処、メリットの確認)、(3)歩数・運動消費カロリー記録-グラフ作成、(4)掲示板、(5)Q&A、(6)健康づくりリンク集、というものであった。配布した、一次元加速度センサーを指標として、プログラム参加による運動消費カロリーの変化をみてみると、1名の身体活動量は増加傾向にあり、2名には維持傾向がみられた。もう1名は開始から6週目まで増加傾向が見られたが、終了時には元に戻っていた。前後の問診から、運動への準備性は2名が関心期(関心はあるが運動してない)から実行期(週2回以上定期的に行っている)へと、1名は準備期(定期的ではないが時々やっている)から実行期へと変化し、1名は開始時より維持期で変わらなかった。参加者のプログラムに対する評価をみると、1)わかりやすさ(5点中平均3.5点)、2)内容量(平均2.5点)、3)記入量(平均2.8点)、4)テキスト有効性(平均3点)、5)アドバイス有効性(平均3.5点)、6)総合評価(10点中平均5.3点)となっていた。これらの予備的検討の結果、研究で用いたプログラムは身体活動量の向上に有効であることが示唆された。また、行動変容技法を活用したスキルアップ課題を、よりわかりやすくする必要があることが明らかになった。平成14年度は、問題点を改善した上で、当初の予定通り、参加者200名程度の大規模な介入研究を行う予定である。すでに関東・九州の企業4社にプログラム参加へのリクルート活動を行っている段階である。

ホームページの内容は、(1)健康づくり情報提供(参加目的・準備性などにより内容は異なる)、(2)スキルアップ課題(目標設定、行動契約、達成度評価、実践障害への対処、メリットの確認)、(3)歩数・運動消費カロリー記録-グラフ作成、(4)掲示板、(5)Q&A、(6)健康づくりリンク集、によって構成されていた。企業従業員41名を対象とした介入では、減量希望者で平均減量が-1.9kgという良好な効果が得られたが、地域住民を対象とした介入では、参加者数が11人と少なく、途中脱落者が6名いた。しかし、最後まで継続した参加者の運動実施頻度や運動実践への準備性には向上がみられた。地域住民に対するプログラムでは、ほとんどの参加者が女性であり、インターネットを使い始めたばかりで日常的に接続しているユーザーではなかった。このような層に対するプログラムとしては、1)コミュニケーション機能を最大限活用する、2)トークシステムを用い報酬が高頻度で生じるようにする、などの工夫により定期的なインターネットへのアクセスを促進する必要があると思われる。
着床面における子宮内膜細胞局所的細胞死の合目的副次効果の解明

ヒト胚が着床の局面で子宮内膜上皮バリアを通過する際に、子宮内膜上皮細胞が細胞死に陥ることで胚の陥入ルートとも表現出来るバリアの欠損が現出することが報告されている。本研究では、「子宮内膜上皮細胞の細胞死をトリガーとした、それ以後の着床にとって合目的な細胞動態の機構を証明する」ことを目標とし、細胞死によって破壊された子宮内膜上皮細胞の内容物がヒト着床の機能制御に関与しているか否かの検討を行った。細胞死に限らず子宮内膜上皮細胞の細胞体破壊による内容物漏出がヒト着床に影響を及ぼす可能性も念頭に、ソニケーションによる物理的破壊とFas抗体コートビーズを用いた細胞死誘導による細胞体破壊の両者をサンプルとして、in vitroでのヒト着床モデルによる種々細胞機能解析を実施した。その結果、物理的破壊による細胞体内容物の添加によってはin vitroヒト着床は有意差のある影響を示さなかった。その一方で、Fas抗体を用いた細胞死誘導による細胞体破壊内容物の添加では着床能にわずかながら促進的働きを示すことが明らかになった。ヒト着床の最初の段階である胚と子宮内膜上皮細胞のアクセスによって子宮内膜上皮細胞層の細胞死が引き起こされるが、その後の子宮内膜上皮細胞内容物によるヒト着床への影響を想定した場合、すでに開始された接着を促進するよりも、細胞死と同時に開始されより有効に胚の侵入陥入をアシストすると考えられる子宮内膜上皮細胞層の胚回避的な遠心的運動に寄与するほうが合目的である。その仮説の下、さきの細胞死誘導による子宮内膜上皮細胞内容物の子宮内膜上皮細胞自身の細胞運動機能への関与を検討したところ一定の時間においてアクセル様のアシストを及ぼしうる知見を得た。生殖医療で最大の障壁となっているのが機序に不明な点の多い着床である。子宮内膜上皮細胞層が着床点において細胞死に陥り胚の通過ルートを形成することが知られているが、胚を回避する遠心性の子宮内膜上皮細胞運動よりも効率が悪い細胞死機序を選択していることには、胚の通過ルート形成以外の生理学的意義も持つためと想像している。すなわち、細胞死をトリガーとした、それ以後の着床にとって合目的な細胞動態の機構解明を本研究の目的としている。平成28年度は、「細胞死による破綻子宮内膜上皮細胞成分の回収および同成分による子宮内膜上皮細胞への影響の解析」を目標とし、子宮内膜上皮細胞モデルIshikawaに対して細胞死を誘導する方法の確立および、細胞死誘導後のIshikawa細胞内容の回収法の確立を目指した。子宮内膜上皮細胞死を誘導する方法の確立において、細胞死を惹起するFas-FasLシグナルを利用するためのanti-Fas Abcoatedpolystylene beadsの作出を行った。既報のものは径3.0 μmの微小パーティクルであったが、本研究においては胚からの細胞死シグナルが子宮内膜上皮細胞に対して引き起こす減少を検討することを目的としているため、ビーズ径を胚サイズの100.0μmとした。サイズ径の違いのためか、anti-Fas抗体でのコーティングに難航し、FasR刺激性および阻害性の両抗体でのコーティング完成までに時を要した。細胞死由来子宮内膜細胞内容の回収法においては、conditioned medium回収、スクレイパーによる機械的回収は速やかに実施できたが、ソニケーターによる超音波破砕の条件設定にも手間取った。以上の理由から、当初平成28年度内に遂行予定であった、細胞死由来子宮内膜細胞内容による、子宮内膜上皮細胞の細胞運動、細胞増殖の機能解析が実施できていないため、進捗を「遅れている」とした体外受精の不成功原因の70%以上は着床ステップのロスによる。排卵誘発、受精技術の向上に着床技術の向上が伴わない最大の要因は着床研究の物理的・倫理的な制限にある。ヒトと完全一致するわけではない齧歯類での研究からある程度の類推が成立するにしても、ヒトの着床は齧歯類や霊長類以外の哺乳動物とは一線を画す部分が少なくないため、ヒト着床メカニズムの解明には遠く及ばず上記のような臨床結果を示している。ヒト着床研究はもっぱらin vitroによる着床アッセイに依存しているが、わずかに得られている知見では、胚が子宮内膜上皮バリアを通過する際に、子宮内膜上皮細胞が細胞死に陥ることで胚の陥入ルートとも表現出来るバリアの欠損が現出することが報告されている。ただし、細胞死による胚陥入ルート形成は物理的な空隙形成によって完結するとは考えにくい。胚陥入後のsequentialな「着床」プロセスに空隙形成以外の第二の意義があると想定している。そのひとつの候補案として、細胞死による子宮内膜上皮細胞体の破壊そのものが次に続く着床における生理現象のトリガーとなっているという仮説を立てている。平成29年度までにin vitro着床アッセイにおいて胚モデル添加によって、確かに子宮内膜上皮細胞層に細胞死が起こっていること(ただし、既報のように胚モデル直下に限るわけではない)、抗Fas抗体でコートしたビーズを添加して細胞死を誘導することで、胚モデルを添加することなく子宮内膜上皮細胞層の細胞死を惹起出来ること、引き続きその状況で添加した胚モデルの進展に加速的な効果を及ぼすことを明らかにした。

平成28年度の時点で参考論文の3μmサイズのビーズよりも大きいサイズのビーズ(胚サイズを意図したサイズアップ)への抗Fas抗体コーティング効率が劣り、条件設定に苦慮した。超音波破砕装置を用いた機械的子宮内膜上皮細胞体破壊を意図して条件設定を繰り返していたが、結局満足出来る条件を見いだすことができず時間を要した(方針を変更して、機械的な子宮内膜上皮細胞体破壊は超音波破砕装置からスクレイパーによる用手的な破壊に変更した)。本研究の根幹にあたる細胞死による子宮内膜上皮細胞体破壊によって漏出する子宮内膜上皮細胞内容(UDP glucoseを中心とした因子)が着床にとって合理的かつ肯定的に効果を及ぼすという仮説内容に対して、解析ツールとしての子宮内膜上皮細胞内容のサンプリングに成功したため、停滞していた研究進行は改善すると想定している。ヒト胚が着床の局面で子宮内膜上皮バリアを通過する際に、子宮内膜上皮細胞が細胞死に陥ることで胚の陥入ルートとも表現出来るバリアの欠損が現出することが報告されている。本研究では、「子宮内膜上皮細胞の細胞死をトリガーとした、それ以後の着床にとって合目的な細胞動態の機構を証明する」ことを目標とし、細胞死によって破壊された子宮内膜上皮細胞の内容物がヒト着床の機能制御に関与しているか否かの検討を行った。細胞死に限らず子宮内膜上皮細胞の細胞体破壊による内容物漏出がヒト着床に影響を及ぼす可能性も念頭に、ソニケーションによる物理的破壊とFas抗体コートビーズを用いた細胞死誘導による細胞体破壊の両者をサンプルとして、in vitroでのヒト着床モデルによる種々細胞機能解析を実施した。その結果、物理的破壊による細胞体内容物の添加によってはin vitroヒト着床は有意差のある影響を示さなかった。その一方で、Fas抗体を用いた細胞死誘導による細胞体破壊内容物の添加では着床能にわずかながら促進的働きを示すことが明らかになった。ヒト着床の最初の段階である胚と子宮内膜上皮細胞のアクセスによって子宮内膜上皮細胞層の細胞死が引き起こされるが、その後の子宮内膜上皮細胞内容物によるヒト着床への影響を想定した場合、すでに開始された接着を促進するよりも、細胞死と同時に開始されより有効に胚の侵入陥入をアシストすると考えられる子宮内膜上皮細胞層の胚回避的な遠心的運動に寄与するほうが合目的である。その仮説の下、さきの細胞死誘導による子宮内膜上皮細胞内容物の子宮内膜上皮細胞自身の細胞運動機能への関与を検討したところ一定の時間においてアクセル様のアシストを及ぼしうる知見を得た。細胞死由来子宮内膜細胞内容の回収に目処がたったため、平成29年度は、前年度に実施できなかった、子宮内膜状細胞の細胞運動、細胞増殖の機能解析をはじめに行うこととしている。前年度の遅れを取り戻すために、平成29年度は「細胞死による破綻子宮内膜上皮細胞成分による子宮内膜間質細胞への影響の解析」を目的として、細胞外基質を分解するMMPsの産生解析を行ったのちに、子宮内膜間質細胞への細胞死由来子宮内膜上皮細胞内容による細胞運動、細胞増殖機能への影響を検討する予定であったが、子宮内膜間質細胞への同解析を前倒しし、子宮内膜状細胞の細胞運動、細胞増殖機能への影響検討と同時に実施することを予定している。抗Fas抗体コートビーズによる人為的細胞死の条件に加えて、機械的な子宮内膜
核内レセプター変異疾患に対する治療薬の分子設計と合成

本研究では、核内レセプター変異疾患に対する薬物の分子設計と合成をおこなう。特に、ビタミンD受容体機構異常症(特定疾患)の治療薬の開発を目的とする。つまり、異常レセプターに結合する救済型リガンドを設計することである。さらに、ここでの方法論を、他のレセプター異常症治療薬の開発に応用する。リガンドの設計は、レセプタータンパクの3次元構造に基づきコンピュータモデリングにより行う。天然型の活性ビタミンD_3では3つの水酸基がレセプターと2つずつ合計6つの水素結合を形成している。変異型ビタミンDレセプター(VDR)は、274のアルギニンがロイシンに変異しているので天然型の活性型ビタミンD_3の1位の水酸基と水素結合を作れず、親和性が低く。遺伝的くる病が起きる。そこで昨年度までに、2位に水酸基をもつアルキル基(アンカー部)を導入し、142のトレオニンと水素結合を形成し、レセプターとの結合を強める分子の設計を行い、合成を行った。実際、変異レセプターとの結合能を調べたところ、天然体リガンドより数倍増強した。また、セコステロイド骨格を持たない、ノンセコ型リガンドを設計し、合成を行った。変異レセプターを用いて、転写活性を調べたところ、天然体リガンド(活性型ビタミンD3)より高い活性を示した。最近、癌の分子標的薬等のタンパク質の変異(DNAの変異)によって引き起こされる様々な疾病に対する薬物の開発が注目されている。これらの薬物の開発が可能となったのは、ゲノムの解析、タンパク質の構造化学、コンピュータによるモデリング技術、精密有機合成等の進歩に基づくものである。核内レセプターの変異によって起こる疾病があり、これらの疾病は遺伝子の変異によって起きるもので、難病とされているものが多い。当研究者は、これらの疾病に対する薬物開発に興味を持った。これは遺伝的に起こる疾病に対する化学的なアプローチと考えられる。つまり、異常レセプターに結合する救済型ビタミンDを設計することである。そこで、2位に、水酸基をもつアルキル基(アンカー部)を導入し、142のトレオニンと水素結合を形成し、レセプターとの結合を強める分子の設計を行い、合成を行った。変異型ビタミンDレセプター(VDR)は、274のアルギニンがロイシンに変異しているので天然型の活性型ビタミンD_3の1位の水酸基と水素結合を作れず、親和性が低く、遺伝的くる病が起きる。

今年度は、セコステロイド骨格を持たない、ノンセコ型リガンドを設計し、合成を行った。変異レセプターを用いて、転写活性を調べたところ、天然体リガンド(活性型ビタミンD3)より高い活性を示した。
Cytotoxic tRNase,コリシンDの研究

我々は,蛋白合成を阻害すると言われてきたコリシンDを大腸菌に作用させると,その菌体由来のRNA画分に低分子RNAが出現することを発見した.これを精製して配列決定すると,Argに対するmajorなtRNAがアンチコドンループで切断された5'側,および3'側断片であった.コリシンD処理大腸菌のRNA画分のアミノ酸受容活性を調べると,Argに対する活性のみが大きく損なわれていた.そこで,各種tRNAの3'側部分に相補的なDNAプローブを用意し,コリシンD処理菌のRNA画分をノザン解析すると,Argのmajor tRNAだけでなくminorなtRNAを含め計4種のアルギニンtRNAが特異的に切断されていた.さらに大腸菌の全tRNA画分に対してコリシンDを作用させ,同様にノザン解析すると,mojorなtRNA(ICGアンチコドン)とminorなtRNA(CCG)が切断されていた.さらにハイブリダイゼーションを利用してtRNA(ICG),tRNA(U*CU),tRNA(CCU)を精製し,コリシンDを作用させると,いずれもアンチコドンループ内の38/39位間が切断されており,コリシンDがin vivoでもin vitroでも4種のアルギニンtRNAを切断することを明らかにした.コリシンDのC末端付近の1箇所のHis変異で,殺菌活性とtRNA切断活性が同時に失われることを見出し,tRNA切断が殺菌活性の原因であることを明らかにした.これは我々がさきに見出したコリシンE5に続く第2のtRNAを標的とするトキシンである.しかし両者は分子レベルでの共通点が何もなく,進化と機能が興味深い.我々は,蛋白合成を阻害すると言われてきたコリシンDを大腸菌に作用させると,その菌体由来のRNA画分に低分子RNAが出現することを発見した.これを精製して配列決定すると,Argに対するmajorなtRNAがアンチコドンループで切断された5'側,および3'側断片であった.コリシンD処理大腸菌のRNA画分のアミノ酸受容活性を調べると,Argに対する活性のみが大きく損なわれていた.そこで,各種tRNAの3'側部分に相補的なDNAプローブを用意し,コリシンD処理菌のRNA画分をノザン解析すると,Argのmajor tRNAだけでなくminorなtRNAを含め計4種のアルギニンtRNAが特異的に切断されていた.さらに大腸菌の全tRNA画分に対してコリシンDを作用させ,同様にノザン解析すると,mojorなtRNA(ICGアンチコドン)とminorなtRNA(CCG)が切断されていた.さらにハイブリダイゼーションを利用してtRNA(ICG),tRNA(U*CU),tRNA(CCU)を精製し,コリシンDを作用させると,いずれもアンチコドンループ内の38/39位間が切断されており,コリシンDがin vivoでもin vitroでも4種のアルギニンtRNAを切断することを明らかにした.コリシンDのC末端付近の1箇所のHis変異で,殺菌活性とtRNA切断活性が同時に失われることを見出し,tRNA切断が殺菌活性の原因であることを明らかにした.これは我々がさきに見出したコリシンE5に続く第2のtRNAを標的とするトキシンである.しかし両者は分子レベルでの共通点が何もなく,進化と機能が興味深い.
アイトラッキングを用いた聾学校熟練教員と若手教員の授業中の視線行動に関する研究

ろう学校の熟練のろう教員ときこえる若手の教員(聴教員)の授業中の視線行動をアイトラッキング装置を用いて分析した。対象教員は7名だった(ろう教員2名、聴教員5名)。注視時間についてはろう教員と聴教員には有意な差が認められなかった。視線移動速度については、ろう教員の方が聴教員より有意に速いことがわかった。視線の動きの視覚化・数値化を行うアイトラッキング装置の活用は、ろう学校教員の専門的技量を高める方策の一つとなる得る可能性が期待できた。公立聾学校を研究協力校として依頼し、同校の熟練ろう教員2名の授業を分析した。熟練ろう教員にはウェラブルカメラを装着してもらうとともに、教室後方に設置したデジタルビデオカメラで同時に記録した。この授業ビデオをろう教員の研修会で、若手・中堅ろう教員により評価をしてもらった。視線やうなづき、表情、手話、指さしなどについての気づきが多く得られ、熟練ろう教員の専門技量の明らかになった。視線についての特徴をさらに検討するため、同校小学部及び中学部の複数の教員(11名)にアイトラッキング装置を装着してもらっての授業を記録し解析を行った。11名中4名の眼球の検出ができなかったり、データが記録できなかったため、7名の記録データで解析を行った。その結果、聴覚に障がいのない教員(聴教員)に比較してろう教員は、視線の動きが速く、かつ長く一箇所に留まらない傾向があることが判明した。平成29年3月末に、実験協力教員を交えて、解析結果についての説明とディスカッションを実施した。視線の動きが速いことや注視時間が短いことがろう学校教員として絶対的に必要な望ましい技量ではなく、手話を使用しているなど、子どもたちの実態に合った教育方法を行う中で、結果的に視線速度が速くなったり、注視時間が短くなるのではないかとの意見が得られた。授業開始前の短時間でできるアイトラッキング装置の校正方法の改良に時間を要した。また、授業場面での記録データから視線行動を分析をするために解析ソフトを用いるが、1人の解析に膨大な時間を要した。解析方法の検討ならび解析ソフトの改良をメーカーと協議していることも要因である。さらに、アイトラッキング装置を装着したときの眼球データがとれないケースがあり、実験協力校や授業者の日時の調整に時間が要したため。近年の聾学校は熟練教員の退職と若手教員の赴任が多く、聴覚的な情報や視覚的な情報に配慮した授業の専門的技能が継承されにくくなっている。各聾学校においては、新しく赴任した教員に対しての研修が取り組まれ、聴覚ならびに視覚的な情報伝達方法の重要性について語られることが必ず行われている。講義形式の研修だけなく、実際の授業を参観する研修を行う中で、教材の提示方法やわかりやすい話し方、さらには手話の講習など、実際を見て学ぶ機会を設けている。しかし、聴覚障がい教育に熟練した教師(以下、熟練教員)と新転任教員などの若手教員の授業力の差は歴然とあり、その原因のひとつに、「つい声だけで話してしまう」という音声を中心とした説明による視覚的な提示方法技術の未熟さがあるといわれている。そこで、本研究は聴覚特別支援学校(聾学校)において、アイトラッキング測定装置を用いて、授業者の授業中の視線行動を分析し、熟練の聴覚障がい教員(ろう教員)と若手教員(聞こえる教員、聴教員)の視線行動にどのような違いがあるかを明らかにすることを目的とした。公立Aろう学校の小学部と中学部の教員にアイトラッキング測定装置を装着して通常どおりに授業を行ってもらい、眼球運動に関するデータを解析した。眼球データに占める100ms以上と130ms以上のデータ数の割合と視線移動速度(deg/sec)について検討した結果、ろう教員と聴教員の平均値間では有意な差は認められなかったが、聴教員に比較してろう教員は視線が長く停留しにくい傾向があった。視線の移動速度については、ろう教員の視線移動速度の平均値は聴教員の平均値よりも有意に高いことが判明した。解析ソフトの改良を検討し、これまでのデータの再分析を行う。熟練教員や若手教員、聾教員や聴教員の比較、ならび技量の向上状態の把握のためにデータを増やしていく。解析ソフトの改良状況と、実験協力校との調整によってデータを増やすことがどこまで可能かが課題である。メーカーとの協議とともに実験協力校との調整を積極的に行っていきたいと考えている。特別支援教育助成金の関係で申請時の製品が購入できなかったため、申請時との異なるメーカーの製品を活用している。詳細な解析を行うためにプログラムの改良が必要なことが判明した。改良のための経費が必要となり、現在メーカーにプログラムの改良を検討してもらっている。次年度にそのプログラムを用いた解析を検討しているため、その費用を確保した。解析プログラム約300,000円500,000円。ろう教育科学会発表(3人、仙台、3日間)300,000円。
メカニカル医工学技術を駆使した３次元軟骨組織作製法の開発

我々の体は、歩行時の膝にかかる荷重など、常に機械的な刺激を受けている。これらの刺激は細胞機能の活性化に役立っていると考えられている。本研究では、機械刺激と細胞機能の関係を明らかにし、機械刺激の作用を利用するため、実験的に軟骨(肉腫)細胞を自己集合性ペプチドゲルと呼ばれるゲルの中で培養した後、引っ張り刺激を繰り返し与えた。その結果、細胞からのコラーゲンとその他のタンパク質の産生量が低くなることを確認した。本研究における軟骨細胞への機械刺激付与を実施する前段階として、細胞への伸展刺激を安定して加えるためのゲルの作成方法などについて検討を行った。従来、ゲル:細胞懸濁液=1:1の割合で混合したゲルを伸展チャンバーに挟み込み、8日間の静置培養の後に伸展を実施していた。しかし、伸展に対する細胞からのレスポンス(C2C12細胞のERKリン酸化促進によって確認)が安定せず、操作上のミスも多かったことから、伸展培養に移る際の手技(静置培養期間など)とWestern BlottingによるERKリン酸化促進の確認手技を中心に実験操作の見直しを行った。結果、伸展チャンバーを作製する際のもととなるチャンバーのメーカーの変更(ストレックス社製→メニコン社製)、静置培養(8日間)の実施場所の変更(伸展装置内→角型シャーレ内で培養した後、伸展の際に伸展装置に装着する)、さらに混合ゲルの作成方法の変更(ゲル:細胞懸濁液=3:2へ)を実施することで、安定した伸展刺激の伝達が可能となった。また、伸展チャンバーの親水化処理の徹底による細胞混合ゲルのゲルホルダーへの入り込みの向上とWestern Blottingその他ERKリン酸化促進の確認手技のマニュアル化が功を奏した。続いて、OUMS-272次元静置培養を行い、3次元培養の開始時播種密度の検討中である。また、正常ヒト膝関節軟骨についても市販の軟骨培養キットを用いての3次元培養について検討を開始する段階にある。まず、昨年度(研究初年度)の予備実験をもとに軟骨肉腫細胞(OUMS-27)を用いた三次元培養最適化を行った。OUMS-27はダブリングタイムが40時間以上と比較的長く、また、培地に添加した血清成分がゲルにトラップされて、最終的にELISAでのS/N比を低下させるという問題があった。そこで、従来のゲル内で細胞を増殖させた後に伸展を行う手法は取らず、初めから高濃度で(従来比約3倍1x10^7cells/ml)で細胞を播種し、24時間後に伸展実験を行った。また、血清は低濃度に抑え(DMEM+2%FCS)、伸展前の約15時間は血清フリーの培地に交換した。培養期間が短いため、1Hz程度の周期で伸展刺激を加えるとゲルが崩壊する問題が生じた。そのため、ゲル内で3次元培養したOUMS-27については、ゆっくりとした周期的伸展刺激(伸展速度=3sec/1%、伸展率=5 or 10%、伸展保持時間=5min)をかけ、II型コラーゲン、アグリカンの産生・遺伝子発現をELISAおよびRT-PCRで確認した。結果、無刺激コントロールに比べて両タンパク質の産生が抑制された。ELISAでは伸展3日後のタンパク量比較、RT-PCRでは伸展1日後のmRNA発現量比較で上記結果が確認された。従来、コラーゲン内で培養した軟骨細胞に周期的な圧縮刺激を加えるとII型コラーゲンとアグリカンの遺伝子発現抑制が起こることを確認していたが、今回、ゆっくりとした伸展刺激で類似のデータが得られた。また、ペプチドゲル内で静的に培養したOUMS-27からのII型コラーゲン、アグリカンの遺伝子発現量は2次元培養系と比較して高い傾向があることがわかった。これらの点について、スキャフォールドとしてのコラーゲンゲルとペプチドゲルの力学的強度の比較や伸展前の培養期間に起きるゲルの変形などを考慮した詳細検討が必要であると考えられる。メカノバイオロジー軟骨細胞の培養について、予定したデータを得るに至っていない。しかし、試験系・評価系の徹底した確認がなされ、今後の研究スピードアップが期待できる。試験計画に基づき、実験を進める。やや遅れている部分について、実験者のエフォートを増やし、26年度でのデータ収集完結と学会発表・論文発表によるデータの公表を目指す。
古代的世界観を記憶する景観の歴史地理学的研究

本研究の目的は、場所に記憶された、様々な時代の人々の行為が、どのように現在に至るまでの景観に表出しているのかを、古代から現代までの様々な言説資料を使用して、人間と場所の無意識的で深遠な関係を明らかにすることである。平成30年度においては、東海道・東山道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集しデータベースを作成し、現地調査においては、資料収集、ドローンによる伝承と場所の関係を空撮することであった。これら作業において物品購入費および謝金を使用した。また現地調査においては旅費を使用した。そこでまずは古代の東海道沿いの古代の伝承として『田村の草子』を取りあげ、田村神社・鈴鹿峠・鈴鹿の関の資料調査および現地調査を行った。田村神社と鈴鹿の関においては、ドローンによる現地の空撮を行い、伝承と周辺地形の関係を把握した。つぎに古代東海道沿いの伝承として『常陸国風土記』を取りあげ、データベースを作成し、関連の文献も収集した。その上で、本風土記の神話伝承の言説、寺社、都市、自然環境との関係についての現地調査を行った。その際、ドローンでこれらの関係を映像化して確認した。東山道については言説資料として『玉藻の前』をとりあげ、那須野と白河の関において資料および現地調査を行った。また言説資料として『伊吹童子』をとりあげ伊吹山および不破の関との地理的位置の調査を行った。さらにこれら街道だけで『伊吹童子』との関連から『酒呑童子』との関連性から北陸道の最北に位置する新潟の弥彦山においても資料および現地調査を行った。弥彦山および古代の北陸道の位置関係については、ドローンの撮影も行った。山陽道に関しても「吉備津彦命」の伝承の資料および現地調査を行った。平成30年度の研究実施計画には、東海道・東山道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集し、現地調査を行う、とあり、特に東海道の『常陸国風土記』のデータベースを作成する予定になっているが、この作業はすでに完了している。またこれらデータを古代の交通路の地図に照合し、ネットワーク関係を探る点も完了している。『常陸国風土記』は、おおむね古代の交通路が中心地から当該地域に入る郡を中心に記述されており、明らかに古代交通路ネットワークとの関係が見られる。また常陸国の国府は筑波山と恋瀬川、さらに霞ヶ浦を通じて南東方向へ連続する関係が見られる。と同時に近世の水戸城下町においても同様の関係性が見いだせることが明らかとなった。これらの関係性はドローンでの空から映像化で、より明瞭に確認することが出来る点も終了している。このように古代の交通路が伝承、建造物、自然環境などの諸アクターを包含しながら、古代から近世への景観をネットワーク化していることが理解できる。また東山道に位置する中世の説話群、『伊吹童子』や『玉藻の前』においても古代の交通ネットワークが影響を与えていることが明らかとなった。山陽道の吉備津彦命の言説と鬼ノ城、吉備津彦神社についても上記と同様の作業を行った上で、現地調査を行う点も終了している。この研究においても、古代の交通路ネットワークと国境、関所などとの関係性が中世の新たな伝承を生んだ事例であるが、これらもやはり古代の衢の祭礼である道饗祭との関連性が指摘できるであろう。さらに現地調査の際、各県立図書館にて資料調査も実施し、現在把握していない言説の収集、あるいは神社等の資料調査も行った。最終的にはこれらを言説資料、地図史料、写真資料、映像資料をデータベース化も行っており、現在までの進捗状況はおおむね順調であると言える。令和1年度の研究実施計画は、西海道・北陸道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集し、現地調査を行う予定である。これらの研究計画を実施する際し、資料収集に関しては物品費、データベース作成については謝金、現地調査については旅費を使用する予定である。まずは古代の西海道に位置する『豊後国風土記』『肥前国風土記』のデータベースを作成する。データベースの作成には謝金を利用する予定である。その上で、データベースと古代の交通路の関係を地図化し、伝承と交通路のネットワーク関係を探る。ネットワーク関係を抽出した上で、神話伝承、あるいはその後の言説、寺社、都市、自然環境との関係仮説を立てた上で、現地調査を行い。ドローンでこれらの関係を映像化して確認する。また北陸道においては、近世城下町の民間伝承にも焦点を当てる。またその他の古代の交通路についても民間伝承や御伽草子等にも焦点を当て調査を行う予定である。さらに『播磨国風土記』に関しては、今年度も随時調査を続行する予定である。令和1年度は、西海道道・北陸道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集し、上記と同様の現地調査を行い、令和2年度は、南海道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集し、同様の現地調査を行う予定である。本研究の目的は、場所に記憶された、様々な時代の人々の行為が、どのように現在に至るまでの景観に表出しているのかを、古代から現代までの様々な言説資料(アニメや映画なども含む)を使用して、人間と場所の無意識的で深遠な関係を明らかにすることである。平成29年度においては、山陽道・山陰道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集しデータベースを作成し、現地調査においては、資料収集、ドローンによる伝承と場所の関係を空撮することであった。

これら作業において物品購入費および謝金を使用した。また現地調査においては旅費を使用した。そこでまずは古代の山陽道沿いの古代の伝承として『播磨国風土記』を取りあげ、データベースを作成し関連の文献も収集した。そのなか古代の山陽道にとって重要と思われる、姫路市太子町神尾山・佐比岡・意此川・古代太市駅の伝承に焦点を当て、現地調査を行い地図化した。また播磨国の重要な伊和大神の拠点である宍粟市伊和神社においては、ドローンによる現地の空撮を行い、伝承と周辺地形の関係を把握した。つぎに古代山陰道沿いの伝承として『出雲国風土記』を取りあげ、同様にデータベースを作成し、関連の文献も収集した。その上で、本風土記の神話伝承の言説、寺社、都市、自然環境との関係についての現地調査を行った。その際、ドローンでこれらの関係を映像化して確認した。さらに古代の本道だけでなく本道と本道を結ぶ連絡路にも焦点を当てた。本年度においては、山陽道と山陰道を結ぶ、播磨・因幡連絡路に注目し、鳥取市河原町の洗足山の口頭伝承を取りあげ、ドローンの撮影も行い、伝承で描かれた場所の関係を映像化した。また山陰道と山陽道を結ぶ広島県は三次市の近世の『稲生物怪録』にも焦点を当て、上記と同様の作業を行った上で、現地調査を行った。平成29年度の研究実施計画には、山陽道・山陰道を中心としたネットワーク上の都市、衢の言説を収集し、現地調査を行う、とあり、特に山陰道の『出雲国風土記』、山陽道の『播磨国風土記』のデータベースを作成する予定になっているが、この作業はすでに完了している。またこれらデータを古代の交通路の地図に照合し、ネットワーク関係を探る点も完了している。これら風土記は、おおむね古代の交通路が中心地から当該地域に入る郡を中心に記述されており、明らかに古代交通路ネットワークとの関係が見られる。また交通路と国府、郡衙、駅などを中心に伝承が配置されている点も確認出来る。これらの関係性はドローンでの空から映像化で、より明瞭に確認することが出来る点も終了している。このように古代の交通路が伝承、建造物、自然環境などの諸アクターを包含しながら、様々な古代からの景観をネットワーク化していることが理解できる。また山陰道と山陽道の伝路となっている広島県は三次市の『稲生物怪録』にも焦点を当て、上記と同様の作業を行った上で、現地調査を行う点も終了している。この研究においても、山陰と山陽を結ぶ交通の要所にある近世の城下町が、新たな伝承を生んだ事例であるが、これらはやはり古代の衢の祭礼である道饗祭との関連性が指摘できるであろう。この城下町における伝承と景観や宗教施設、あるいは城下町の防衛施設の関係も、古代の平安京の上記の関係と類似するものである点も指摘できることが分かった。さらに現地調査の際、各県立図書館にて資料調査も実施し、現在把握していない言説の収集、あるいは神社等の資料調査も行った。最終的にはこれらを言説資料、地図史料、写真資料、映像資料をデータベース化も行っており、現在までの進捗状況はおおむね順調であると言える。本研究の目的は、場所に記憶された、様々な時代の人々の行為が、どのように現在に至るまでの景観に表出しているのかを、古代から現代までの様々な言説資料を使用して、人間と場所の無意識的で深遠な関係を明らかにすることである。
細胞特異的高分子造影剤の設計による磁気共鳴画像診断の高解像度化

近年の臨床画像診断技術の進歩に伴い、次世代の磁気共鳴画像診断(MRI)用造影剤には、従来の疾患の早期検出機能に加え、検出した腫瘍の良性・悪性の判別など、形態診断・機能診断が強く求められるものと考えられる。そこで本研究では、従来の造影剤の体内分布に基づく画像描出法とは異なる、新しい概念に基づく造影剤を検討した。即ち、正常血管内や正常組織では画像信号を発現せず、腫瘍の生理的・病理的変化に応答して信号を発現するミクロ環境応答型MRI造影剤である。腫瘍組織の特徴としては、腫瘍の細胞外pHは正常組織のpHより低いことが報告されている。そこで、低pHに応答して画像信号を発現する造影剤を設計することが出来れば、癌のみの特異的描出が期待される。ガドリニウム(Gd)系MRI造影剤の造影原理は、Gdが水分子の縦緩和時間を短縮させることに基づく。そこで、ポリイオンコップレックス(PIC)型造影剤を設計し、Gd分子と水との相互作用をpH依存的に制御し、その画像シ信号のpH依存的on-off応答が可能となることを検証した。本研究では、アニオン性Gd錯体高分子とカチオン性高分子とを複合化したPICを調製し、in vitro試験による画像信号のpH応答性、及び、担癌マウスを用いてのin vivo MRI画像解析試験を行った。その結果、本PICは生食中でpH依存的造影活性の変化を示し、MRI画像解析により酸性pHでは輝度が上昇し、中性pHでは全く輝度の増強は示さなかった。更に、本PICを担癌マウスの正常部位及び腫瘍領域に局所投与したところ、正常筋肉部位では全く信号強度の増強効果は示さなかったのに対し、腫瘍領域において明確な輝度の上昇が認められた。従って、本PICは癌のみでその造影信号を発現する認識機能を持った造影剤であることが確認された。本研究の結果、我々が新しく提唱した画像描出概念の妥当性がPIC型造影剤により証明され、疾患部の存在診断能に加え機能診断能を持つ次世代の造影剤としての適応が期待される。既存のMRI造影剤は比較的高濃度に局在化する事が必要であるために、実用的な標的指向性造影剤は未だ存在しないのが現状である。そこで、本研究では単に既製の造影剤の標的化のみを行うのでなく、MRI造影剤の抜本的な造影機構から見直した新しい既念の造影剤の設計法を確立することを目的とした。一般に造影は、造影剤の濃度分布に応じて描かれる。たとえば、X線造影剤では、造影剤自体のX線吸収度が高いことが画像上の高輝度になる。既存のMRI造影剤もこの点では同様である。しかしながら、MRIでは造影剤それ自体は直接描出されず、造影剤が周囲の水分子のプロトン緩和時間(T1)を短縮することにより間接的に画像の輝度を上昇させたり低下させたりしている。そこで、造影剤と水分子との相互作用を造影剤のミクロ環境に応じて変化させることにより、造影剤の濃度分布だけでなく造影剤をとりまくミクロ環境を反映した画像描出する手法を検討した。MRI造影剤とpHに応答し親疎水性の変化する高分子材料との複合化を計った結果、pH変化追従して造影剤の水和状態を制御でき、水分子に対するT1短縮効果にpH応答性が付与できた。

とりわけ、高分子構造を最適化することで、造影剤の機能をpH応答的に完全にON-OFFできることがわかった。近年の臨床画像診断技術の進歩に伴い、次世代の磁気共鳴画像診断(MRI)用造影剤には、従来の疾患の早期検出機能に加え、検出した腫瘍の良性・悪性の判別など、形態診断・機能診断が強く求められるものと考えられる。そこで本研究では、従来の造影剤の体内分布に基づく画像描出法とは異なる、新しい概念に基づく造影剤を検討した。即ち、正常血管内や正常組織では画像信号を発現せず、腫瘍の生理的・病理的変化に応答して信号を発現するミクロ環境応答型MRI造影剤である。腫瘍組織の特徴としては、腫瘍の細胞外pHは正常組織のpHより低いことが報告されている。そこで、低pHに応答して画像信号を発現する造影剤を設計することが出来れば、癌のみの特異的描出が期待される。カドリニウム(Gd)系MRI造影剤の造影原理は、Gdが水分子の縦緩和時間を短縮させることに基づく。そこで、ポリイオンコップレックス(PIC)型造影剤を設計し、Gd分子と水との相互作用をpH依存的に制御し、その画像信号のpH依存的on-off応答が可能となることを検証した。本研究では、アニオン性Gd錯体高分子とカチオン性高分子とを複合化したPICを調製し、in vitro試験による画像信号のpH応答性、及び、担癌マウスを用いてのin vivo MRI画像解析試験を行った。その結果、本PICは生食中でpH依存的造影活性の変化を示し、MRI画像解析により酸性pHでは輝度が上昇し、中性pHでは全く輝度の増強は示さなかった。更に、本PICを担癌マウスの正常部位及び腫瘍領域に局所投与したところ、正常筋肉部位では全く信号強度の増強効果は示さなかったのに対し、腫瘍領域において明確な輝度の上昇が認められた。従って、本PICは癌のみでその造影信号を発現する認識機能を持った造影剤であることが確認された。本研究の結果、我々が新しく提唱した画像描出概念の妥当性がPIC型造影剤により証明され、疾患部の存在診断能に加え機能診断能を持つ次世代の造影剤としての適応が期待される。
90年代の日本と韓国における労働市場政策の変化-労働者派遣法の改正過程を中心に-

労働市場政策の変化は、両国の福祉制度に大きな影響を与えるため、福祉と雇用の相互関係性を考慮し、労働市場政策の変化を分析する必要がある。今年度の研究は、これを踏まえた上で、日韓両国の雇用保険についての比較研究を行った。つまり、雇用関係法の改正による雇用の流動性が進むことに対応し、雇用保障が充実すれば、労働市場の柔軟化を単なる自由化ではなく、フレクシキュリテキの実現ということができる。日韓の事例が、単なる自由化なのか、あるいはフクキシキュリティなのか明らかにするために、雇用保険改正を事例とし、検討を加えた。雇用保険は、雇用保障の中で、最もよく自由化に対応する政策と考えられるからである。ここで明らかになったのは、日本においては雇用保険改正が財政的負担軽減の観点からなされ、雇用保障としては手薄なものになってしまったのに対して、韓国では雇用保障の拡大・強化がなされたということである。こうした点から、日本において徹底的に自由主義化が進んだのに対して、韓国において限定的自由主義化が進んだといえよう。韓国の事例をフレクシキュリティというためには、ワークシェアリングやジェンダー平等など、異なる観点からの検討を行う必要があり、ここでは結論を留保したい。しかしながら、自由化と雇用保障という点に限ってみれば、日本よりも韓国の方がフレクシキュリティ戦略に近い変化を遂げていることは事実である。本研究の目的は、グローバル化と経済危機の中で、各国の政治・経済システムが収斂していると予想されているにもかかわらず、日本と韓国における労働市場政策の変化を明らかにすることである。この問題意識により、まず、1999年の日本における労働者派遣法改正と1998年の韓国における労働者派遣法の制定を比較した。この研究は、政策過程における労働組合の戦略によって、日本と韓国の労働市場の相違が生じたことを提示している。日本と韓国においては、労働組合や左派政党が弱いといわれている。そのため、権力資源論や党派性理論から分析した研究が少ないが、日韓の比較研究によって、その権力資源の重要性を明らかにした。本研究を、『法学論叢』に投稿し、平成21年中掲載される予定である。次に、労働者派遣法の改正以外にも、韓国においては、1996年の労働法改正、1998年の労働法改正、2006年の非正規労働法案制定が行われており、日本においても、1998年の労働基準法改正、1999年の労働者派遣法改正、2003年の労働基準法改正や労働者派遣法改正が行われた。それについて、文献調査やインタビュー調査を行っている。ここでは、労働組合の戦略よりも、政策過程の制度的要因に注目している。この問題意識により、まず、1999年の日本における労働者派遣法改正と1998年の韓国における労働者派遣法の制定を比較する。この研究は、政策過程における権力資源によって、日本と韓国の労働市場の相違が生じたことを提示している。また、日本と韓国においては、労働組合や左派政党が弱いといわれている。本研究を、『法学論叢』に掲載した。最後に、労働市場政策とともに福祉制度の変化がいかに行われているのか、またそれに福祉同盟がいかに影響を与えているのかを検討している。
シグナル伝達キナーゼによるリン酸化を介したFGヌクレオポリンの機能制御機構の解明

核膜孔複合体を構成する約30種のヌクレオポリンの内、約1/3はFGヌクレオポリンと呼ばれ、そのFG(フェニルアラニン-グリシン)リピート領域は典型的な天然変性タンパク質の機能を有している。以前よりヌクレオポリンが分裂期にリン酸化され、核膜孔複合体の解離を引き起こすことが知られていたが、近年のプロテオミクス技術の進展により、間期においても一部のヌクレオポリンがDNA損傷や酸化ストレス、ウイルス感染などによってリン酸化されることが明らかになってきた。本年度はまず、SPRやBeadHaloアッセイを行い、検討した6種類のFGヌクレオポリンのいずれもERK/MAPキナーゼによってリン酸化されると輸送運搬体の一つであるimportin-βとの相互作用が抑制されることを明らかにした。特にNup153のリン酸化によるimportinβとの結合能の変化を定量解析し、FGリピートの数とリン酸化部位の数によろて親和性が劇的に変化することを見出した。また細胞消化物からIMACによって精製したリン酸化ペプチドを安定同位体で化学標識した後、大規模に質量分析することによって120カ所以上のヌクレオポリンのリン酸化部位を定量した。その結果約40カ所のリン酸化が血清刺激によって2倍以上増加し、その中の約半分がERK経路に依存していることが判明した。さらにリン酸化型と非リン酸化型のNup153を固相化し、細胞抽出液からのプルダウン実験を行ったところ、リン酸化によって変化する様々な相互作用因子を同定することに成功した。この中には複数のimportin-βファミリータンパク質に加え、小胞輸送やDNA修復、ユビキチン系に関わるタンパク質などが含まれていた。近年FGヌクレオポリンが核-細胞質間輸送のみでなく、多彩な細胞機能に関与するとの報告がなされているため、その生理的意義を検討する予定である。核膜孔複合体と核輸送因子との相互作用を介した核-細胞質問の選択的分子輸送は,核膜を有する真核生物にとってほぼ全ての生命現象に関与する重要な細胞内プロセスの一つであるが、細胞内シグナル伝達によるこの輸送システムの制御機構は殆ど明らかにされていない。これまでに我々はリン酸化プロテオミクス的手法によって新規ERK/MAPキナーゼ基質として核膜孔複合体構成因子(ヌクレオポリン)の一つであるNup50を同定し、そのFG(フェニルアラニン-グリシン)リピートドメインがERKによってリン酸化されると核輸送因子であるimportin-βとの結合能が抑制されることを見出した。本年度はまず、in vitroキナーゼアッセイとPhos-tagウエスタンブロット法により、多数のFGおよび非FGヌクレオポリンがERK、p38、Cdk1/cyclin B、Chk2などの複数のキナーゼによってin vitroないしin vivoでリン酸化されることを明らかにした。そしてGSTプルダウンアッセイにより、Nup50だけでなく、Nup58、Nup62、Pom121、Nup153、Nup214などのFGヌクレオポリンがERKによってリン酸化されるとimportin-βとの結合能が全て抑制されることを見出した。さらにNup153のN末側のFGリピート領域のリン酸化によるimportin-βとの親和性の変化をプレートアッセイ法によって定量的に解析した。核膜孔における多数のFGヌクレオポリンのリン酸化を介して様々なシグナル伝達キナーゼが核-細胞質問輸送を制御している可能性が考えられる。