hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＧＭ－ＣＳＦの投与による新しい自閉症モデルの開発

我々のPET研究の結果から、自閉症では脳内ミクログリアの総量が2倍になり、そのため、元々ミクログリアの活性化が起こりやすい脳部位(小脳、脳幹、眼窩前頭野、前部帯状回)で活性化ミクログリアが2倍になっていることが示唆された(Suzuki et al., JAMAPsychiatry 2013)。したがって、胎生期に脳内に定着するミクログリアの総量を2倍にする処置により、新たな自閉症の動物モデルを作成できる可能性がある。しかし、胎生期にミクログリアの総量を2倍にすることは技術的に困難である。そこで、本研究では、新生仔にGM-CSFを投与してミクログリアの総量を増やし、行動と活性化ミクログリアを調べ、新たな自閉症モデルとしての可能性を探ることを目的とした。平成27年度は、新生仔期のGM-CSF投与が、脳内ミクログリア数の増加をもたらすか否かを脳病理学的に検討した。すなわち、新生仔ラットにGM-CSFを複数の用量(0-、1-、3-、および、10-μg/g体重、各群n=6)で腹腔内投与し、投与から1週間後に深麻酔下にパラホルムアルデヒド液で潅流固定し脳を取り出し、抗Iba-1免疫組織化学法に供した。その後、脳各部位(前頭前野、側坐核、海馬、視床、小脳等)におけるミクログリアの総数、および、休止型であるラミファイド型から活性化体であるアメボイド型までの各ミクログリアの状態を形態学的に評定し、それぞれの数を測定した。その結果、GM-CSFは用量依存性に総ミクログリア数と活性化ミクログリア数を増加させる傾向が認められた。今後は、今年度に得られた結果をふまえ例数を増やすとともに、自閉症を特徴づける行動異常との関係について調べる必要がある。
分子動力学シミュレーションを用いた電界共役流体の物性値の決定と流動理論の構築

電界共役流体(ECF)は電圧の印加によって活発に流動する機能性流体である.電界共役流体に分類される液体は数多く報告されているが,本研究ではデカン二酸ジブチル(DBD)に生じる流動を研究対象として流動理論の構築を目指した.これは,DBDは構造式が明らかな単一物質であるためである.これまでに,DBDに発生する流動を,Korteweg-Helmholtz式で計算される電気力を導入したナビエストークス方程式によってモデル化し,DBD流動を計算機中で再現した.また,支配方程式に現れるイオン移動度を分子動力学計算を用いて理論的に算出した.2018年度は,これらのモデルおよびイオン移動度を用いて,DBDの流動発生に有効な電極配置を計算機上で求めるとともに,実験によってその妥当性を検証した.すなわち,四角柱電極とスリット電極によって構成される電極対を用いてDBDに電圧を印加した際に,電極の配置が電極間に発生する流動に与える影響を計算機内で検証した.四角柱電極とスリット電極の間隔,およびスリットの間隔を電極の設計パラメータとしてDBDに発生する流動の流速をこれまでに構築した流動モデルを用いて推定した.この計算結果に基づいて,四角柱-スリット電極対を製作し,実験によってDBDに発生する流動を可視化した.この結果,四角柱とスリットの距離およびスリット間隔の適切な値を明らかにした.さらに,流動モデルを用いて電極間での流速分布求めることによって,電極形状が流動発生に与える影響を考察した.この結果,四角柱電極とスリット電極の間隔が広い時には渦の発生が抑制されるものの電界強度が低くなるため活発な流動は得られないと理解できた.また,スリット間隔が広くなると,スリットへの液体の流入量が増加するとともに,スリットへの流入抵抗が減少し,DBDの流動が活発化することが明らかとなった.電圧を印加すると流動する電界共役流体(ECF)として多くの液体が報告されているが,本研究ではデカン二酸ジブチル(DBD)に生じる流動を研究対象とした.これは,DBDは構造式が明らかな単一物質であるためである.はじめに,DBD中での電位分布を測定した.DBDに流動を発生させるには,液中に電極対を挿入して電圧を印加する必要があり,これに応じて,ECF中には電位分布が発生するが,従来のECF流動モデルでは電極間において線形あるいは非線形な電位分布を仮定していた.電圧を印加した際に微小なプローブを挿入して電位を測定する静電探針法を用いてDBD中の電位分布を明らかにすることによって電極間で線形の電位分布が発生していることを確認した.なお,電位分布を測定した実験系には,DBDを充填したチャンバ内に直径0.3 mmの線状電極を2本,中心軸を合わせて電極間隔2 mmで対向して配置した対向棒電極対を用いた.つぎに,DBD流動の支配方程式を決定した.上記で測定した電位分布に応じてDBD中での電位分布を線形モデルで計算し,DBD流動の支配方程式をKorteweg-Helmholtz式で計算される電気力を導入したナビエストークス方程式によってECF流動をモデル化し,DBD流動を計算機中で再現した.ただし,支配方程式に現れる電気的パラメータのひとつであるイオン移動度は実験的な計測には複雑な過程を必要とするため,本研究では分子動力学計算を用いて理論的に算出した.このために,イオン移動度の実験値が報告されている炭化水素を例に,分子動力学計算がイオン移動度の算出に有効であることを確認した.当初の計画では,平成28年度は電界共役流体(ECF)中における電界分布の計測と,ECF流動のモデル化を行う予定であった.つまり,ECFの物性値の理論的な決定は平成29年度に予定していたが,電界分布の計測と流動のモデル化が順調に進んだため,分子動力学計算を用いたECF物性値(イオン移動度)の理論的な算出を平成28年度に前倒して達成した.また,分子動力学計算によるイオン移動度の算出は,ECF流動の計算のみならず,炭化水素の物性値の計算にも活用できるため,イオン移動度の計算手法として独立した学術論文として発表した.このため,現在までの進捗状況を「当初の計画以上に進展している」と判断している.電圧を印加すると流動する電界共役流体(ECF)として多くの液体が報告されているが,本研究ではデカン二酸ジブチル(DBD)に生じる流動を研究対象としている.これは,DBDは構造式が明らかな単一物質であるためである.これまでに,DBDを充填したチャンバ内に直径0.3 mmの線状電極を2本,中心軸を合わせて電極間隔2 mmで対向して配置した対向棒電極対を用いて電極間の電位分布を測定した.この結果,DBD中での電位分布が電極間で線形に分布していることが明らかになった.また,上記で測定した電位分布に応じてDBD中での電位分布を線形モデルで計算し,DBD流動の支配方程式をKorteweg-Helmholtz式で計算される電気力を導入したナビエストークス方程式によってECF流動をモデル化し,DBD流動を計算機中で再現した.ここで,支配方程式に現れる電気的パラメータのひとつであるイオン移動度は実験的な計測が複雑であるため,分子動力学計算を用いて理論的に算出した.具体的にはイオン移動度の実験値が報告されている炭化水素を例に,分子動力学計算がイオン移動度の算出に有効であることを確認した後,DBDのイオン移動度を計算によって見積もった.

この値をDBD流動の支配方程式に導入することによって,流動計算において実験的なパラメータ同定の必要性をなくした.具体的には,分子動力学法を用いて算出したDBDのイオン移動度を支配方程式に導入して四角柱-スリット電極間に発生するDBDの流動を数値計算した結果と,同条件での流動の可視化実験の結果を定量的に比較し,電圧印加直後からの過渡現象を含めて両者が定量的に一致することを示した.当初の計画では,平成28年度は電界共役流体(ECF)中における電界分布の計測と,ECF流動のモデル化を行い,平成29年度にECFの物性値の理論的な決定を行った後,平成30年度に計算機内でのECF流動の定量的再現を行うことを計画していた.しかし,電界分布の計測と流動のモデル化,および分子動力学法を用いたECFの物性値の理論的は決定が順調に進んだため,計算機内でのECF流動の再現が平成29年度に前倒しで達成された.このため,現在までの進捗状況を「当初の計画以上に進展している」と判断している.電界共役流体(ECF)は電圧の印加によって活発に流動する機能性流体である.電界共役流体に分類される液体は数多く報告されているが,本研究ではデカン二酸ジブチル(DBD)に生じる流動を研究対象として流動理論の構築を目指した.これは,DBDは構造式が明らかな単一物質であるためである.これまでに,DBDに発生する流動を,Korteweg-Helmholtz式で計算される電気力を導入したナビエストークス方程式によってモデル化し,DBD流動を計算機中で再現した.また,支配方程式に現れるイオン移動度を分子動力学計算を用いて理論的に算出した.2018年度は,これらのモデルおよびイオン移動度を用いて,DBDの流動発生に有効な電極配置を計算機上で求めるとともに,実験によってその妥当性を検証した.すなわち,四角柱電極とスリット電極によって構成される電極対を用いてDBDに電圧を印加した際に,電極の配置が電極間に発生する流動に与える影響を計算機内で検証した.四角柱電極とスリット電極の間隔,およびスリットの間隔を電極の設計パラメータとしてDBDに発生する流動の流速をこれまでに構築した流動モデルを用いて推定した.この計算結果に基づいて,四角柱-スリット電極対を製作し,実験によってDBDに発生する流動を可視化した.この結果,四角柱とスリットの距離およびスリット間隔の適切な値を明らかにした.さらに,流動モデルを用いて電極間での流速分布求めることによって,電極形状が流動発生に与える影響を考察した.この結果,四角柱電極とスリット電極の間隔が広い時には渦の発生が抑制されるものの電界強度が低くなるため活発な流動は得られないと理解できた.また,スリット間隔が広くなると,スリットへの液体の流入量が増加するとともに,スリットへの流入抵抗が減少し,DBDの流動が活発化することが明らかとなった.当初計画よりも順調に研究が推移しているため,今後の研究を以下のように計画している.構築した流動モデルの妥当性を検証する.はじめに,電界共役流体(ECF)に発生する流動を可視化し,実際に現れる流速分布を測定する.これまでに構築したECFの流動モデルの妥当性を検証するには,実際に観察されるECF流動との比較が不可欠である.
高精度流体制御による血小板産生のオンチップモニタリング

輸血用の血小板を人工的に作製することを目的として,現在,iPS細胞から巨核球を作製し,巨核球から血小板を産生する研究が行われている.しかし,人工的な血小板産生では1巨核球当たりの血小板産生数が少なく,1巨核球あたりの血小板産生数を向上させる必要がある.血小板産生数と乱流エネルギーは相関関係があることが報告されているが,詳細に解明されていない.そこで本研究では,安定な環境かつ顕微鏡上で観察可能という利点を持つマイクロ流体チップ中で,巨核球に2軸の速度変動を印加することで高い乱流エネルギーが発生できる血小板産生モニタリングシステムの構築を行う.輸血用の血小板を人工的に作製することを目的として,現在,iPS細胞から巨核球を作製し,巨核球から血小板を産生する研究が行われている.しかし,人工的な血小板産生では1巨核球当たりの血小板産生数が少なく,1巨核球あたりの血小板産生数を向上させる必要がある.血小板産生数と乱流エネルギーは相関関係があることが報告されているが,詳細に解明されていない.そこで本研究では,安定な環境かつ顕微鏡上で観察可能という利点を持つマイクロ流体チップ中で,巨核球に2軸の速度変動を印加することで高い乱流エネルギーが発生できる血小板産生モニタリングシステムの構築を行う.
結晶表面のメゾスコピック構造形成の基礎に関する理論的研究

当初の具体的目標を要約すると,(1)ステップダイナミクスを調べるための格子モデルの構築,(2)短距離での弾性相互作用と自己組織的島構造の解明,(3)連続体モデルの導出,ということであった.1.(1)と(3)に関して,Si(111)のように一様な構造を持つ表面でのモデルを,微斜面での表面構造がテラスごとに交代するSi(001)微斜面や,ステップをはさんで2相が共存する構造相転移温度近傍でのSi(111)微斜面などに拡張し,その格子モデルを構成した.格子モデルでのモンテカルロシミュレーションや,これから導かれる連続体モデルの研究によって,これらの系での結晶成長中ならびに外場による吸着原子のドリフトのある系でのステップの蛇行やバンチングの現象を統一的に説明した.この中で表面のステップパターンの決定にステップ間の斥力相互作用が非常に重要であることが明らかになった.またいくつかの予言も行ったので今後の実験的検証が期待される.2.比較的単純な表面での島状構造の緩和を理論的に研究し,Si(111)での実験と比較しよい一致を見た.また前進するステップの蛇行不安定性についても実験とのよい対応が得られた.3.(2)の弾性相互作用を調べるために,結晶格子における原子間の結合エネルギー,原子間の力,原子変位に対する弾性力を取り入れた格子モデルを考案した.2次元格子モデルで,グリーン関数法と数値計算を活用し,近距離,中距離でのステップ間相互作用を求め,単純な連続体弾性論の適用限界と問題点を明らかにした.また,このモデルを使ってヘテロエピタキシャル系の吸着物結晶の形状によるエネルギーの違いを計算し,隣接原子間の力と格子不整合度の関数として薄膜の成長様式を理論的に予想した.微斜面上のステップのパターン形成の問題,弾性相互作用における離散格子の効果,ファセット上の島の緩和過程について研究し,以下の知見が得られた.1.透過性ステップからなる微斜面では吸着原子のステップ上段に向かうドリフトに対しバンチングに対する不安定化が起こる.モンテカルロシミュレーションで束大きさの時間に対する成長指数を調べると,1/2から拡散長の増大とともに1にまで増大することがわかった.非透過性ステップからなる微斜面の成長中には,ステップカイネティクスの非対称性によってはステップバンチングが発生しうる.長波長の不安定化が起きる条件を求め,さらにシミュレーションによって束の成長則が,時間の1/2乗になることを示した.2.ステップの下段側から原子を取り込んで結晶が成長していくときにステップの蛇行が起きうる.数マイクロメーター以上の巨大なテラス上での実験が可能となり,1本のステップの蛇行の実験い,理論との良い一致を見た.3.連続弾性理論のエネルギー密度の表式を離散化した2次元格子模型や近接原子をバネでつないだ2次元格子模型で吸着原子やステップ間の弾性相互作用を調べた.その結果,単純な弾性理論はステップなど表面が平坦でない場合には相互作用の強さの評価を全く誤ること,相互作用ポテンシャルのベキについても弾性理論が正しいとみなせる距離が場合によって2桁も異なることが判明した.4.ステップ運動の解析から3次元島の平らな界面への緩和やファセットの出現過程などを議論した.鉛の微結晶での平衡状態への緩和の実験と良い一致が得られ,実験からのステップパラメタの決定に有効であることがわかった.また,シリコン(111)面上の島崩壊の実験との比較の結果,連続体ステップ・モデルによる記述がナノメーターの範囲まで有効であり,相互作用強度やカイネティクスの情報が得られることがわかった.当初の具体的目標を要約すると,(1)ステップダイナミクスを調べるための格子モデルの構築,(2)短距離での弾性相互作用と自己組織的島構造の解明,(3)連続体モデルの導出,ということであった.1.(1)と(3)に関して,Si(111)のように一様な構造を持つ表面でのモデルを,微斜面での表面構造がテラスごとに交代するSi(001)微斜面や,ステップをはさんで2相が共存する構造相転移温度近傍でのSi(111)微斜面などに拡張し,その格子モデルを構成した.格子モデルでのモンテカルロシミュレーションや,これから導かれる連続体モデルの研究によって,これらの系での結晶成長中ならびに外場による吸着原子のドリフトのある系でのステップの蛇行やバンチングの現象を統一的に説明した.この中で表面のステップパターンの決定にステップ間の斥力相互作用が非常に重要であることが明らかになった.またいくつかの予言も行ったので今後の実験的検証が期待される.2.比較的単純な表面での島状構造の緩和を理論的に研究し,Si(111)での実験と比較しよい一致を見た.また前進するステップの蛇行不安定性についても実験とのよい対応が得られた.3.(2)の弾性相互作用を調べるために,結晶格子における原子間の結合エネルギー,原子間の力,原子変位に対する弾性力を取り入れた格子モデルを考案した.2次元格子モデルで,グリーン関数法と数値計算を活用し,近距離,中距離でのステップ間相互作用を求め,単純な連続体弾性論の適用限界と問題点を明らかにした.また,このモデルを使ってヘテロエピタキシャル系の吸着物結晶の形状によるエネルギーの違いを計算し,隣接原子間の力と格子不整合度の関数として薄膜の成長様式を理論的に予想した.微斜面上のステップのパターン形成の問題,とくに拡散の異方性交替や2相共存表面でのステップのバンチングと蛇行の問題およびヘテロエピタキシャル系での弾性相互作用による島形成の機構を研究し,以下のような知見を得た.

1.シリコン(001)微斜面のように拡散の異方性がテラスごとに交替する系では,外場による吸着原子のドリフトによって外場の向きによらずにステップ対の形成が起きるが,ステップ間斥力の効果によって今まで知られていなかったタイプのステップの位相をそろえた蛇行が起きることを理論的ならびにモンテカルロシミュレーションによって確認した.2.シリコンの(111)微斜面で7×7構造から1×1構造への転移点の近傍ではステップを境に2相が共存する.このとき2相の拡散係数の違いによって,蒸発が弱い場合には位相をそろえたステップの蛇行が起きることを示した.これは最近の実験で見られた蛇行パターンを説明する.3.高温のシリコンの(111)微斜面のような標準的な表面では外場による吸着原子のドリフトが位相のそろった蛇行パターンを生み出すこと,そのパターンがMBE成長について導かれた非線形発展方程式と同一の方程式によって記述できることを示した.4.ヘテロエピタキシャル系の吸着物質の最低エネルギーの表面形態が弾性相互作用によってウルフの平衡形からどのように変わるかを2次元格子モデルのシミュレーションによって調べた.これによって連続弾性論のさまざまな疑わしい近似なしに基底状態を決めることができ,自発応力,格子不整合などによる成長様式の変化を推測することができた.微斜面上のステップのパターン形成の問題,とくに拡散の異方性交替や2相共存表面でのステップのバンチングと蛇行の問題,およびヘテロエピタキシャル系での弾性相互作用による島形成の機構を研究し,以下のような知見を得た。1.シリコンの(111)微斜面で7x7構造から1x1構造への転移点の近傍ではステップを境に2相が共存する.このとき成長中に位相をそろえたステップの蛇行が起きることを実験的に見出した.この現象を2相の拡散係数と平衡原子密度の違いによって理論的に説明し,モンテカルロ・シミュレーションによって蛇行パターンの特徴を調べた。2.シリコンの(001)微斜面のようにテラスとステップの構造が1段ごとに交替する系では,外場による吸着原子のドリフトによって外場の向きによらずにステップ対の形成が起きることが知られている.1次元ステップモデルをつかって,拡散の異方性の交替,ステップのカイネティク係数の交替がどのような条件でバンチングを起こすかを調べた.3.高温のシリコンの(111)微斜面のような標準的な表面では外場による吸着原子のドリフトが位相のそろった周期的な蛇行パターンを生み出すこと,そのパターンがMBE成長について導かれた非線形発展方程式と同一の方程式によって記述できることを示した.4.ヘテロエピタキシャル系の吸着物質の最低エネルギーの表面形態が格子不整合と結晶表面の自発応力によってどのように変わるかを2次元格子モデルの数値計算によって調べた.その結果をもとに薄膜の成長様式を理論的に予想し,今まで知られていない成長様式がありうることを見出した.微斜面上のステップのパターン形成の問題,とくに拡散の異方性交替や2相共存表面でのステップのバンチングと蛇行の問題,およびヘテロエピタキシャル系での弾性相互作用による島形成の機構を研究し,以下のような知見を得た.また結晶化におけるカイラル対称性の破れの問題も研究した.
血管平滑筋の伸展刺激誘発性収縮における張力とミオシンリン酸化との乖離

イヌ脳底動脈において伸展刺激による張力発生とミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化との関係について検討した。テトラエチルアンモニウム(5mM)存在下、緩徐伸展刺激を1mm/secで初期長の1.5倍に15分間与えると、収縮を伴わずにミオシン軽鎖(MLC)の複数のリン酸化体(少なくとも1,2および3リン酸化体)が増加し、張力とMLCのリン酸化との間に乖離が認められた。また、緩徐伸展はプロテインキナーゼC(PKC)αおよびδの細胞質から膜フラクションへのトランスロケーションを惹起した。MLCのリン酸化はカルシウム拮抗薬のニカルジピンおよびミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬のML-9またはプロテインキナーゼC(PKC)阻害薬のカルホスチンCにより薬物未処置の血管におけるリン酸化の約50%に抑制された。Rhoキナーゼ阻害薬のY-27632はMLCのリン酸化をほぼ完全に抑制した。一方、PKCδの特異的阻害薬ロトレリン(5μM)はMLCのリン酸化に影響を与えなかった。PKCαのトランスロケーションはカルホスチンCのみにより抑制されたが、PKCδのトランスロケーションはカルホスチンC、ロトレリンおよびY-27632により抑制された。更に、フォスファターゼ阻害薬のオカダ酸(OA)により80mM KClによる収縮は抑制されたが、MLCのリン酸化量は高いレベルが維持されていた。また、OAによる電気泳動パターンは伸展時のものと類似していた。以上の結果より、伸展刺激による張力発生とMLCのリン酸化との乖離にRhoを介するミオシンフォスファターゼの抑制およびPKCδ以外のPKCが関与する可能性が示唆された。イヌ脳底動脈において伸展刺激による張力発生とミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化との埀離について検討した。雌雄雑犬(体重10-18kg)の脳底動脈より作製したリング標本に機械刺激装置により伸展を加え、発生した張力を等尺性に記録した。また、MLCのリン酸化は等電点電気泳動法/イムノブロッティング法により測定した。テトラエチルアンモニウム(5mM)存在下、伸展刺激により張力と細胞内Ca^<2+>濃度は一過性に上昇したが、伸展15分後にはほぼ静止状態まで減少した。一方、伸展刺激によりMLCのリン酸化量は増加するが、伸展15分後でもなおこの高レベルを維持しており、張力とMLCのリン酸化との間に埀離が認められた。伸展時、電気泳動により非リン酸化および1、2、3リン酸化MLCの4本のバンドが認められた。伸展刺激による張力発生と伸展1分後のMLCのリン酸化の増加は、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬のML-9(100mM)前処置により完全に抑制されたが、伸展15分後のMLCのリン酸化量は薬物未処置のときの約50%にまで増加した。また、伸展刺激による張力発生直後にML-9を作用させると伸展15分後のMLCのリン酸化量は伸展1分後のものよりもやや増加する傾向が認められた。伸展15分後のMLCのリン酸化は低分子量G蛋白質Rhoの阻害薬C3により抑制された。更に、フォスファターゼ阻害薬のオカダ酸(OA)により80mM KCIによる収縮は抑制されたが、MLCのリン酸化量は高いレベルが維持されていた。以上の結果より、伸展刺激による張力発生とMLCのリン酸化との埀離にRhoを介するミオシンフォスファターゼの抑制が関与する可能性が示唆された。

イヌ脳底動脈において伸展刺激による張力発生とミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化との関係について検討した。雌雄雑犬(体重10-18kg)の脳底動脈より作製したリング標本に機械刺激装置により伸展を加え、発生張力を記録した。また、MLCのリン酸化は等電点電気泳動法/イムノブロッティング法により測定した。テトラエチルアンモニウム(5mM)存在下、伸展刺激により張力は一過性に上昇したが、伸展15分後には静止状態まで減少した。一方、伸展刺激によりMLCのリン酸化量は増加するが、伸展15分後でもなおこの高レベルを維持しており、張力とMLCのリン酸化との間に乖離が認められた。電気泳動により伸展1分後では非リン酸化および1リン酸化MLCの2本のバンドが、また、伸展15分後では非リン酸化および1、2、3リン酸化MLCの4本のバンドが認められた。伸展刺激による収縮と伸展1分後のMLCのリン酸化の増加は、カルシウム拮抗薬のニカルジピン(100nM)およびミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬のML-9(100μM)前処置により完全に抑制されたが、伸展15分後のMLCのリン酸化量は薬物未処置のときの約50%にまで増加した。伸展15分後のMLCのリン酸化は低分子量G蛋白質Rhoの阻害薬C3(10μg/ml)およびRhoキナーゼ阻害薬のY27632(1μM)により、また、プロテインキナーゼC(PKC)阻害薬のカルホスチンC(1μM)により抑制された。更に、フォスファターゼ阻害薬のオカダ酸(OA)により80mMKClによる収縮は抑制されたが、MLCのリン酸化量は高いレベルが維持されており、また、OAによる電気泳動パターンは伸展15分後のものと類似していた。以上の結果より、伸展刺激による張力発生とMLCのリン酸化との乖離にRhoを介するミオシンフォスファターゼの抑制およびPKCが関与する可能性が示唆された。テトラエチルアンモニウム(5mM)存在下、緩徐伸展刺激を1mm/secで初期長の1.5倍に15分間与えると、収縮を伴わずにミオシン軽鎖(MLC)の複数のリン酸化体(少なくとも1,2および3リン酸化体)が増加し、張力とMLCのリン酸化との間に乖離が認められた。また、緩徐伸展はプロテインキナーゼC(PKC)αおよびδの細胞質から膜フラクションへのトランスロケーションを惹起した。MLCのリン酸化はカルシウム拮抗薬のニカルジピンおよびミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬のML-9またはプロテインキナーゼC(PKC)阻害薬のカルホスチンCにより薬物未処置の血管におけるリン酸化の約50%に抑制された。Rhoキナーゼ阻害薬のY-27632はMLCのリン酸化をほぼ完全に抑制した。一方、PKCδの特異的阻害薬ロトレリン(5μM)はMLCのリン酸化に影響を与えなかった。PKCαのトランスロケーションはカルホスチンCのみにより抑制されたが、PKCδのトランスロケーションはカルホスチンC、ロトレリンおよびY-27632により抑制された。更に、フォスファターゼ阻害薬のオカダ酸(OA)により80mM KClによる収縮は抑制されたが、MLCのリン酸化量は高いレベルが維持されていた。また、OAによる電気泳動パターンは伸展時のものと類似していた。以上の結果より、伸展刺激による張力発生とMLCのリン酸化との乖離にRhoを介するミオシンフォスファターゼの抑制およびPKCδ以外のPKCが関与する可能性が示唆された。
誘導型ユビキチンリガーゼSSBによるEphrin受容体の機能制御

私たちは機能未知のSSB4(SPSB4)結合タンパク質として、細胞膜受容体EphB2を同定した。EphB2は細胞の種類に依存してガン遺伝子あるいはガン抑制遺伝子として機能することが知られている。私たちはSPSB4がEphB2の細胞内領域を分解誘導することを示した。次にephrin B2(リガンド)を発現する細胞と、EphB2受容体を発現する細胞を混ぜて共培養する系を用いて細胞間反発運動を解析した。その結果、SPSB4ノックダウンにより細胞間反発運動の亢進がみられ、SPSB4はEphB2刺激を介したシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。SOCSボックスタンパク質としてCIS/SOCSファミリーが知られている。それらはサイトカインシグナル伝達を抑制し、過剰な免疫反応が起きないようにしている。一方でSOCSボックスをもつSSBファミリー(SSB-1, 2, 3, 4)はその機能が分かっていない。われわれはSSBファミリーの新規結合分子として細胞膜受容体Ephを同定した。Ephは細胞の種類によりガン遺伝子あるいはガン抑制遺伝子として機能していることが知られており、SSBによるEphの制御がどのような生理的役割を担っているのかを明らかにすることを目的としている。本年度は1過剰発現系あるいはノックダウンによりSSBのタンパク質量を制御し、Ephの安定性をシクロヘキシミドチェイス実験などにより評価する2in vivoやin vitroにおいてユビキチン化反応をおこない、SSB依存的なEphのポリユビキチン化を確認することなどを目的とした。Ephの細胞内ドメインとSSBをHEK293T細胞に発現させ、Ephのユビキチン化を比較検討した結果、SSB依存的なEphのユビキチン化を確認することができた。また、Ephの細胞内ドメインがプロテアソーム阻害剤依存的に蓄積することも確認した。さらに、内在性のSSBのノックダウンによりEphの細胞内ドメインが安定化することを確認した。内在性のEphと過剰発現したSSBとの結合が確認できたので、EphはSSBによってユビキチン修飾依存的に分解制御されていることが示唆される。一方でSSBの過剰発現によるEphの発現量の変化はみられなかった。このことは内在性のSSBで必要十分である可能性を示唆している。過去の報告から予想されたSSBのユビキチンリガーゼとしての機能を確認でき、新規に同定した基質候補であるEphとの結合や、ユビキチン化などを示すことができているため。昨年度より引き続いて以下の結果を確認した。1SSB依存的なEphの細胞内ドメインのユビキチン化を確認することができた。2Ephの細胞内ドメインがプロテアソーム阻害剤依存的に蓄積することも確認した。3内在性SSBのノックダウンによりEphの細胞内ドメインが安定化することを確認した。4SSBノックダウンによりリガンドを発現する細胞株との反発が強くなることを見出した。他の研究との兼ね合いで進捗がやや遅れたが現在投稿準備中である。他の研究結果を国際雑誌に投稿し、掲載されるまでに予想以上の追加実験を要求されたため、本申請課題の解析が遅れたため。一方、SOCSボックスタンパク質であるSPSB4の機能はよく分っていなかった。私たちはSPSB4結合タンパク質として、細胞膜受容体EphB2を同定した。EphB2は細胞の種類に依存してガン遺伝子あるいはガン抑制遺伝子として機能することが知られており、SPSB4とEphB2の結合がどのような生理的役割を担っているのかを明らかにすることを目的とした。他のグループが既にEphB2受容体はephrinB2(リガンド)刺激により細胞膜内で切断されることを示しており私たちも確認することができた。この細胞内ドメインはプロテアソーム依存的に分解され、プロテアソーム阻害剤の添加により安定化した。したがって、EphB2はephrinB2刺激により細胞外ドメインと細胞内ドメインに分離する。私たちはSPSB4がEphB2細胞内ドメインをポリユビキチン化しプロテアソーム依存的タンパク質分解に導くことを示した。また、SPSB4ノックダウンはEphB2細胞内ドメインを安定化した。次にephrinB2(リガンド)を発現する細胞と、EphB2受容体を発現する細胞を混ぜて共培養する系を用いて細胞間反発運動を解析した。EphB2発現細胞はephrinB2発現細胞と接触するとEphB2を介したシグナル伝達が起こり、ephrinB2発現細胞から逃げるように動く細胞間反発運動が起こる。SPSB4ノックダウンEphB2発現細胞はコントロール細胞と比較して細胞間反発運動の亢進がみられ、SPSB4はEphB2刺激を介したシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。

私たちは機能未知のSSB4(SPSB4)結合タンパク質として、細胞膜受容体EphB2を同定した。EphB2は細胞の種類に依存してガン遺伝子あるいはガン抑制遺伝子として機能することが知られている。私たちはSPSB4がEphB2の細胞内領域を分解誘導することを示した。次にephrin B2(リガンド)を発現する細胞と、EphB2受容体を発現する細胞を混ぜて共培養する系を用いて細胞間反発運動を解析した。その結果、SPSB4ノックダウンにより細胞間反発運動の亢進がみられ、SPSB4はEphB2刺激を介したシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。当初の予測、研究計画に即したデータをおおむね得ることができているので、今後も申請した研究計画に沿って実験を行う。すなわち、SSBによるEphの発現制御が細胞間シグナル伝達に及ぼす影響を過去の報告に従い明らかにする事を目的とする。1SSBが生理的なリガンドEphrin刺激により発現誘導されるかを検討する。2過去の報告に従い、大腸がん細胞株Colo201の内在性SSBをノックダウンし、細胞の増殖速度、ガン細胞の浸潤能などを比較評価する。現在投稿準備中である。タンパク質翻訳後修飾試験管内ユビキチン化反応を行う予定であったが、まだ実施できていない。今後大腸菌発現用のプラスミドを構築し、各タンパク質を大量精製し行う予定であるため。また、ユビキチンリガーゼ複合体は昆虫細胞を用いて大量精製する予定である。細胞遊走能の評価ができていないので、キットを購入し評価する予定である。他の申請課題の掲載のため、要求された追加実験に時間がかかり本申請課題の進捗が遅れたため。タンパク質を大量精製するための試薬、培地、キットの購入に充てる。論文掲載料や、追加実験のための消耗品費に使用する。
新機構微粒化方式による溶融素材の粉体化に関する基礎的研究

本研究では、粒径10μm程度の均一で微細な球状粉末を多量生産する簡便な方法を開発することを目的とし、気泡を混入させた泡状化溶融素材を二流体微粒化する方法、および溶融素材を薄膜状にして二流体微粒化する方法につて検討するため、物性が通常の液体と著しく異なるこれら物質の分裂機構や噴霧特性を疑似流体を用いて明らかにし、次いで上記の二方法の装置設計と試作および噴射予備実験を行い、実用の可能性と性能改善の方向を探ることを目標とした。1.溶融素材の疑似流体として溶融石油ピッチを用い、固定表面を流動する石油ピッチを高温気流により薄膜状に引き延ばして微粒化する方式を採用して、分裂機構や噴霧生成に及ぼす諸因子の影響について調べた。この結果、溶融ピッチは多くの場合おもに固体表面端部から繊維状に分裂してこれが微粒化する機構となり、おもに分裂時の液体温度の違いによる粘度変化が微粒化現象を支配する要因をなることが判明した。2.気泡混入流動を実現してこれを微粒化する方法について、数種類のノズルを設計試作し、疑似流体として水を用いて実験的に検討した。3.溶融素材のノズル内閉塞やノズルの摩耗を避ける構造上の工夫を考慮し、容器内に蓄えられた溶融素材を空気ノズルを用いて膜状微粒化する方法について検討した。水を用いた予備実験によると、膜厚の薄い平滑な液膜を高速気流で瞬時に微粒化する方法を採用すれば、平均粒径10μm以下の微細均一粒径粒子群の得られることが判明した。
GPGPUを用いた素粒子物理実験計算環境の構築

また、GPGPU対応した解析ソフトウェアを開発し現在のCPUだけでは処理しきれないデータ量の処理を実現する。世界最高エネルギー陽子陽子衝突型加速器LHCを用いた実験では世界規模の分散コンピューティングシステム、The Worldwide LHC Computing Grid (WLCG)を構築し膨大なデータを処理している。LHCを用いた実験の1つであるATLAS実験では常時30万から40万CPUコアを用いて実験データの処理やモンテカルロシミュレーションの生成を行っている。LHCでは2026年から衝突頻度を5倍にする計画があり取得されるデータ量も増えるが、現在の予算で見込めるコンピューティングシステムでは全てのデータを処理しきれないと見積もられている。そこで、本研究ではATLAS実験の計算環境としてGPGPUを導入しGPGPU用のソフトウェア開発を行うことで同規模の予算でも全てのデータを処理できる様に計算能力を向上させることが目的である。2018年度にはまずGPGPUを設置できる計算機筐体を購入しATLAS実験の計算環境を導入し動作確認を行った。東京大学では世界中にあるWLCGサイトのうちの1つを運営しており、また日本グループ向けに直接利用できるリソースの提供も行っている。この直接利用環境においてGPGPUを用いたシステムを構築した。ATLAS実験用のソフトウェアやデータが扱える環境の中で実際にGPGPUを用いたテストジョブを流しGPGPUが利用できる事を確認した。2018年度に導入したGPGPUはNVIDIA Quadro P4000であり、GPGPUの性能としては余り高いものではないがプログラムによっては実行時間をCPUの半分ほどの時間に短縮出来る事が確認できた。このGPGPUを使える環境をCPUのみを用いた環境と同じ状態で開発、テストを行える様構築し、ATLASの実験の日本グループに対して公開し利用を開始した。ATLAS実験では2026年のLHCのアップグレードによる衝突頻度の増加において、現在のコンピューティングシステムでは十分な処理が行えないと見積もられている。これに対処するためにソフトウェアの改善やコンピューティングシステム自体に新しいアイデアを導入することが研究されている。現在ATLAS実験では機械学習を用いた検出器データの再構成や物理解析などを多く行っているがGPGPUを使える環境は十分に整っておらずGPGPU用のソフトウェアの開発も進んでいない。東京大学のATLAS用のコンピューティングセンターにおいてもこれまでGPGPUを使える環境はなかった。これに対し、本研究により新たにNVIDIAのGPGPU、Quadro P4000を載せたGPGPU用抗体を導入した。コンピューティングセンター内に設置し、ATLAS実験用のソフトウェアの導入や環境構築を行った。環境設定には環境構築ツールPuppetを用い手順を確立した。GPU関連のツールに関してもCUDAなどの導入や環境設定の手順を確立した。日本グループが直接利用する環境のため、環境設定の手順を確立し実際にGPGPUを使える環境を整えた。この環境下でGPGPUを使うテストプログラムを実行し、GPGPUの利用を確認した。また同じプログラムの中でATLAS実験のソフトウェアやデータへのアクセスが出来る事を確認した。これまでに開発されたソフトウェアの中にTenrsorflowなどを用いた機械学習を使ったものがあるが、これらに関してはPythonのライブラリを変更するだけでGPGPUを利用することができ、実際に動作確認を行いQuadro P4000であっても現在利用中のCPU環境に比べ高速化出来る事が確認できた。2018年度の研究によりGPGPUを用いたATLAS実験用のソフトウェア環境を構築する手順を確立した。2019年度にはこの環境を使い、GPGPU用にソフトウェアの開発を行う。まずは機械学習を用いている物理解析用ソフトウェアにおいてGPGPUを使える様に変更しテストを行う。これらはGPGPUを使うライブラリがあれば比較的容易に行える。また、検出器情報の再構成を行うプログラムやシミュレーションプログラムに関してもGPGPU利用に向けた開発を行う。これらに関してはまず並列計算が可能な箇所を研究しGPGPU用のプログラムを開発する必要がある。実際に開発したプログラムをGPGPU環境で実行しパフォーマンスを測定しCPUと比較したコストパフォーマンスも測定する。また、ジョブ管理ツールHTCondorを用いてGPGPUを用いたバッチシステムの開発を行う。バッチシステムには商用クラウドを利用した計算機インスタンスを用い複数のインスタンスを利用しバッチ処理を行えるシステムにする。このシステムをWLCGのシステムに組み込み、ATLASのプロダクションシステムとしてのテストを行う。

2018年度に導入したGPGPUはNVIDIA Quadro P4000であり、GPGPUの性能としては余り高いものではないがプログラムによっては実行時間をCPUの半分ほどの時間に短縮出来る事が確認できた。このGPGPUを使える環境をCPUのみを用いた環境と同じ状態で開発、テストを行える様構築し、ATLASの実験の日本グループに対して公開し利用を開始した。ATLAS実験では2026年のLHCのアップグレードによる衝突頻度の増加において、現在のコンピューティングシステムでは十分な処理が行えないと見積もられている。これに対処するためにソフトウェアの改善やコンピューティングシステム自体に新しいアイデアを導入することが研究されている。現在ATLAS実験では機械学習を用いた検出器データの再構成や物理解析などを多く行っているがGPGPUを使える環境は十分に整っておらずGPGPU用のソフトウェアの開発も進んでいない。東京大学のATLAS用のコンピューティングセンターにおいてもこれまでGPGPUを使える環境はなかった。これに対し、本研究により新たにNVIDIAのGPGPU、Quadro P4000を載せたGPGPU用抗体を導入した。コンピューティングセンター内に設置し、ATLAS実験用のソフトウェアの導入や環境構築を行った。環境設定には環境構築ツールPuppetを用い手順を確立した。GPU関連のツールに関してもCUDAなどの導入や環境設定の手順を確立した。日本グループが直接利用する環境のため、環境設定の手順を確立し実際にGPGPUを使える環境を整えた。この環境下でGPGPUを使うテストプログラムを実行し、GPGPUの利用を確認した。また同じプログラムの中でATLAS実験のソフトウェアやデータへのアクセスが出来る事を確認した。これまでに開発されたソフトウェアの中にTenrsorflowなどを用いた機械学習を使ったものがあるが、これらに関してはPythonのライブラリを変更するだけでGPGPUを利用することができ、実際に動作確認を行いQuadro P4000であっても現在利用中のCPU環境に比べ高速化出来る事が確認できた。2018年度の研究によりGPGPUを用いたATLAS実験用のソフトウェア環境を構築する手順を確立した。2019年度にはこの環境を使い、GPGPU用にソフトウェアの開発を行う。
魚類の脳内で発現に雌雄差を示す神経ペプチド遺伝子の制御機構と生理的役割

脳内で発現に雌雄差を示す神経ペプチド遺伝子にコードされる神経ペプチドが魚類の成長や生殖行動などの経済形質の雌雄差に寄与しているのではないかとの考えのもと、行動や内分泌の制御に関わる脳領域である視索前野で発現に雌雄差を示す3つの神経ペプチドに着目し、それぞれの遺伝子の発現制御機構、作用機序、機能を明らかにすることを目的として研究を行った。まず、神経ペプチドの作用機序を明らかにするため、視索前野のニューロンの投射先を神経トレーサーを用いて解析したところ、雌雄差を示す神経ペプチド遺伝子発現ニューロンの多くは下垂体へ投射していることを明らかとなった。続いて、昨年度に作成した各種神経ペプチド受容体を発現するコンストラクトを用いて、受容体の細胞内のシグナル伝達経路をin vitroでの解析によって明らかにした。また、昨年度の解析において神経ペプチドの受容体も下垂体で発現することが明らかとなっており、これらのことから、視索前野で雌雄差を示す神経ペプチドは、下垂体において各種受容体を介して各種下垂体ホルモンの制御に関与していることが示唆された。そこで、下垂体で作用を明らかにするため、下垂体を神経ペプチドの存在下で培養したところ、複数の下垂体ホルモン遺伝子の発現に有意な変動がみられた。これらの解析の結果、内分泌系の雌雄差は、視索前野で発現に雌雄差を示す神経ペプチド遺伝子によって生じている可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。脳内で発現に雌雄差を示す神経ペプチド遺伝子にコードされる神経ペプチドが魚類の経済形質の雌雄差に寄与しているのではないかとの考えのもと、行動や内分泌の制御に関わる脳領域である視索前野で発現に雌雄差を示す3つの神経ペプチドに着目し、それぞれの遺伝子の発現制御機構、作用機序、機能を明らかにすることを目的として研究を進めている。まず、視索前野においてオスで高い発現を示す神経ペプチドの作用機序を明らかにするため、受容体のクローニングおよび、発現を解析し、受容体の発現部位を明らかにした。さらに、受容体の細胞内のシグナル伝達経路を培養細胞を用いたin vitroでの解析によって明らかにした。続いて、機能を解析するために変異体メダカを作出し、行動解析を行ったところ、オスで高い発現を示す神経ペプチドは、オス型の行動の制御に関わっていることが明らかとなった。上記とは別の性差を示す神経ペプチドについても同様に、受容体のクローニングおよび、受容体の発現を解析し、発現部位を明らかにした。さらに、各種受容体の細胞内のシグナル伝達系を解析するため、各種受容体を発現するコンストラクトを作製した。また、対象としていた神経ペプチド遺伝子のほかに同じく神経ペプチド遺伝子ITも視索前野で雌雄差を示し、性ステロイドであるアンドロゲンによる制御がみられることが先行研究により明らかとなった。そこで、ITについても、発現制御機構や作用機序、機能を解析することとした。その結果、ITのアンドロゲンによる制御は、キスぺプチン遺伝子の一つであるKISS2を介したものであり、視索前野のIT発現ニューロンは下垂体へ軸索を伸ばしていることを明らかにした。複数の神経ペプチド遺伝子を対象に解析を進めているため、遺伝子によって進行度合いが異なり、予定よりかなり早く機能を明らかにすることができた遺伝子もあれば、少し遅れている遺伝子もある。また、新たに解析対象に加えたITの解析も順調に進んでいるため、総合的にみると「おおむね順調に進展している。」といえる。解析が遅れている神経ペプチド遺伝子の解析を中心に行う。受容体のシグナル伝達経路を細胞培養系を用いて明らかにするとともに、組織学的手法を用いて視索前野で産生される神経ペプチドの作用機序を明らかにすること目指す。さらに、機能を明らかにするために変異体メダカを作出する。また、組織学的手法によって作用部位が下垂体であった場合は、下垂体ホルモン産生細胞での受容体遺伝子の発現を調べるとともに、下垂体培養系を用いて神経ペプチドが下垂体ホルモン分泌にどのような影響を与えるか解析する予定である。
ニッチペプチドによる新規造血幹細胞制御法の開発

申請者はマウス胎仔造血幹細胞ニッチである肝芽細胞から、新規生理活性ペプチドを同定した。それらペプチドは幹細胞の増殖を20%抑制する一方で、幹細胞分画を増加させる事から、stemness維持に関わっている事が示唆された。さらに、生理活性ペプチドを、ヒト造血幹細胞の増幅に応用するための培養法等の検討を行い、サイトカイン、ペプチドを添加した動物性成分不含培地で9日間培養する事で、CD34(+)CD38(-)細胞を55倍増幅させる事に成功した。これら造血幹細胞は、短・長期骨髄再構築能、コロニー形成能を保持していた。この事から、これらペプチドは、ヒト造血幹・前駆細胞の増幅に有効であると考えられた。造血幹細胞は、多分化能と未分化性を維持しつつ増殖する自己複製能を持つが、その未分化性を維持するためのシステムは未解明であり、幹細胞を自在に制御する方法は確立されていない。申請者は、造血幹細胞を制御するニッチ細胞から生理活性ペプチドを同定するノウハウを有しており、これまでに胎仔肝臓造血細胞ニッチより新規生理活性ペプチドKS-13を同定し、解析を行っている。本研究においてもこの手法を利用し、造血幹細胞の未分化性を維持する低分子生理活性ペプチドの同定、作用機序の解析、及びペプチドを応用した新規造血幹細胞制御法の開発を目的としている。平成26年度には、胎齢14.5日目のマウス胎仔肝臓より造血幹細胞ニッチであるDlk-1陽性CD45陰性Ter119陰性肝芽細胞を回収し、この細胞からペプチド試料を調整した。LC-MS/MS解析によりこのペプチド試料に含まれる5種類のペプチドが検出され、そのうち分子量2,000以下の新規低分子ペプチドが2種類得られた。さらに、これら低分子ペプチドを人工合成してマウス胎仔肝臓造血幹細胞(CD45陽性c-Kit陽性Sca-1陽性細胞)に対する添加培養を行ったところ、培養4日目にペプチド未添加群と比較して、ペプチド添加群で細胞の増殖が約20%抑制されていた。さらに、同様に培養した細胞の細胞表面マーカー解析では、ペプチド未添加群に比べてペプチド添加群で造血前駆細胞分画の割合が増加しており、これらのペプチドが造血幹細胞の分化に作用する活性を持つ可能性が示唆された。造血幹細胞は多分可能と未分化性を維持しつつ増殖する自己複製能をもつが、その未分化性を維持するためのシステムは未解明である。申請者は造血幹細胞を制御するニッチ細胞から生理活性ペプチドを同定する技術を確立していることから、本研究では造血幹細胞を制御する新規物質として、胎生期幹細胞ニッチである肝芽細胞より“低分子生理活性ペプチド"を同定し、未来の幹細胞制御法開発へ向けた新規シーズの開発を目的とした。すでに平成26年度に2種類の新規低分子ペプチドを同定しており、マウス胎仔肝臓造血幹細胞にペプチドを添加培養することにより細胞増殖が抑制される一方で、造血前駆細胞分画が増加することを明らかにした。平成27年度には、ヒトの細胞を用いたin vitro機能解析、ペプチドの作用機序解明、造血幹細胞制御法開発への応用可能性の検討を計画した。ヒトの細胞に対する新規ペプチドの作用を評価するため、ヒト臍帯血造血幹細胞を増加させる既知のペプチドを用いて培養条件の最適化を行った。将来的な橋渡し・臨床研究への発展を見据えて、当初使用を予定していた培地から、無血清かつ動物由来成分不含の培地へと変更し、細胞内へのペプチド取り込み、培養後の生細胞数、ヒトCD34陽性CD38陰性造血幹細胞分画の細胞数、コロニー形成能、遺伝子発現の評価を行い、培養条件の最適化を完了した。生理活性ペプチドを応用した将来的な橋渡し・臨床研究に関して、PMDAの再生医療審査担当者との面談を行った。面談において、ヒト造血幹細胞の培養培地については、当初予定していたStem Span SFEM(無血清増殖培地)からStem Span ACF(動物由来成分不含)への変更が推奨されたことから、培地を変更し、培養の最適化を行った。その結果、培地変更前の条件と同様にペプチドが細胞内に取り込まれることを確認し、培養9日後にはペプチド添加群においてヒトCD34陽性CD38陰性の造血幹細胞分画の細胞数が培養開始時の約55倍に増加すること、増幅した細胞がコロニー形成能を維持していることを確認した。以上の結果より、おおむね順調に進んでいると考えられる申請者らは平成26年度に2種類の新規低分子ペプチドを同定しており、マウス胎仔肝臓造血幹細胞にペプチドを添加培養することにより細胞増殖が抑制される一方で、造血前駆細胞分画が増加することを明らかにている。また平成27年度には、ヒトの細胞を用いたin vitro機能解析、ペプチドの作用機序解明、造血幹細胞制御法開発への応用可能性の検討を行った。平成28年度には低分子ペプチドの作用機序を明らかにするため、下流シグナルの解析を行った。

低分子ペプチドと相互作用・結合する因子を同定するため、ビオチン標識した低分子ペプチドを造血細胞へ取り込ませた後、細胞からタンパク質を抽出し、抗ビオチン抗体を用いて免疫沈降を行った。得られた免疫沈降物で得られた結合タンパク質をLC-MS/MSで解析した。その結果、ペプチド添加条件のみに存在する候補因子を10種類選出した。候補因子に関して、real-time PCR法による遺伝子発現のvalidationの結果、下流シグナル因子2種を発見した。ヒト造血幹細胞を用いて以上の検討により選出したシグナルの発現抑を行い、低分子ペプチドと共に培養して、増殖数とコロニー形成能を解析した。その結果、低分子ペプチド下流シグナルの発現を抑制することで、ペプチド添加による細胞増殖能力とコロニー形成能の低下がみられた。申請者はマウス胎仔造血幹細胞ニッチである肝芽細胞から、新規生理活性ペプチドを同定した。それらペプチドは幹細胞の増殖を20%抑制する一方で、幹細胞分画を増加させる事から、stemness維持に関わっている事が示唆された。さらに、生理活性ペプチドを、ヒト造血幹細胞の増幅に応用するための培養法等の検討を行い、サイトカイン、ペプチドを添加した動物性成分不含培地で9日間培養する事で、CD34(+)CD38(-)細胞を55倍増幅させる事に成功した。これら造血幹細胞は、短・長期骨髄再構築能、コロニー形成能を保持していた。この事から、これらペプチドは、ヒト造血幹・前駆細胞の増幅に有効であると考えられた。研究提案において、平成26年度には、胎仔肝臓における肝芽細胞(Dlk-1陽性CD45陰性Ter119陰性細胞)の回収及びペプチド試料調整、ペプチド試料からの新規低分子ペプチドの同定、人工ペプチドの合成及び造血幹細胞へのペプチド添加培養による生理活性の評価を計画した。これに従い、胎仔肝臓肝芽細胞(Dlk-1陽性CD45陰性Ter119陰性細胞)からペプチド試料を調整し、LC-MS/MS解析を行うことによって分子量2,000以下の新規低分子ペプチドを2種類同定した。さらに、これらのペプチドを人工合成して胎仔肝臓の造血幹細胞(CD45陽性c-Kit陽性Sca-1陽性)分画に対する添加培養を行い、ペプチド添加群で細胞の増殖が約20%抑制されること、フローサイトメトリー解析ではペプチド添加群で造血前駆細胞分画が増加すること、が明らかになった。したがって、上記のように平成26年度には当初の計画に沿って研究を推進し、成果を得ていることから、本研究はおおむね順調に進展している。1至適条件で培養したサンプルを使用して、マイクロアレイ解析、リン酸化アレイ解析などを行い、ペプチド添加により変動する標的遺伝子・シグナル伝達経路を探索する。また、マイクロアレイ解析において、コントロールと比較して顕著な遺伝子発現の増加/減少が認められた上位各10因子に関して、real-time PCR法による遺伝子発現のvalidationを行う。マイクロアレイ解析と一致する結果が確認できた遺伝子に関して、該当遺伝子のプロモーター領域にペプチドが結合するか検討するため、ビオチン標識した低分子ペプチドを造血細胞へ取り込ませた後、抗ビオチン抗体を用いてChIPアッセイを行う。