hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己組織化ペプチドを用いるナノファイバーの構築と融合マテリアル展開

以下の課題について、研究を展開し、新規機能性の自己組織化ペプチド融合マテリアルの開発を行った。1.自己組織化ペプチドの設計とペプチドナノファイバーの構築:細胞機能性基を有しβシート構造をとり、自己集合化により幅20100nm、長さ数μmのナノファイバーを構築するペプチドをさらに設計・合成した。ペプチドナノファイバーの立体構造特性や構造制御方法を明らかにした。ペプチド配列に応じ、カルシウムイオンと融合し、ハイドロゲルを形成する分子制御達成し、細胞の機能を制御する設計を行った。2.ナノファイバーに特異的に結合するペプチドの進化分子工学法による獲得:平成23年度において、ファージディスプレイ法による進化分子工学手法で、ナノファイバーへ特異的に結合するペプチド群を獲得した。ペプチドライブラリ(約1x107乗種)を遺伝子的に構築し、その中からナノファイバーに特異的に結合するペプチドをバイオパニング選択により獲得する研究である。さらに獲得したペプチドファージをクローニングし、個々のペプチドを化学合成により調製した。獲得されたペプチドを用いて、特異的にナノファバーの表面構造を識別できる分子制御を行い、抗体結合の金ナノ粒子をナノ制御配置した。3.ナノファイバーを利用した人工細胞外マトリクス・融合マテリアル創成:カルシウムイオンとの融合化により、外部イオンと応答し、機能性を向上できる自己組織化ペプチドを構築し、ナノファイバーのネットワーク機能強化させ、細胞外マトリクスとして応用できるペプチドハイドロゲルを作成した。さらにペプチドナノファイバーに細胞機能制御配列を導入し、細胞の接着増殖や分化を制御できる人工細胞外マトリクスとして新規機能化した融合マテリアルの創成研究を創成した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、自己組織化ペプチドを用いてナノファイバー素材を構築する。自己組織化ペプチドの設計とペプチドナノファイバーの構築:βシート構造をとり、自己集合化により幅20100nm、長さ数μmのナノファイバーを構築するペプチドを種々設計・合成した。ペプチドナノファイバーの立体構造特性を赤外分光法や電子顕微鏡等を用いて明らかにした。ペプチド配列に応じた分子制御を達成した。ナノファイバーに特異的に結合するペプチドの進化分子工学法による獲得:ファージディスプレイ法による進化分子工学手法で、ナノファイバーへ特異的に結合するペプチド群を獲得した。ペプチドライブラリ(約1x10^7種)を遺伝子的に構築し、その中からナノファイバーに特異的に結合するペプチドをバイオパニング選択により獲得することに成功した。獲得したペプチドファージをクローニングし、個々のペプチドを化学合成により合成した。獲得されたペプチドを用いて、特異的にナノファイバーの表面構造を識別できる分子制御を行った。ナノファイバーの無機融合マテリアル化と機能化:獲得した特異的結合ペプチドとナノファイバーとの結合特性を分光法、ELISA法、電子顕微鏡等により、詳細に解析した。これらを用いて、金属ナノ粒子をナノ配置した融合マテリアルの創成に成功した。また抗体タンパク質をナノレベル配置する技術も獲得し、分子や細胞認識素子としての有用な材料として発展させる基礎研究を行った。当初の予定通りのペプチドナノファイバーの構築と分子制御に成功した。また、金ナノ粒子やタンパク質のナノ配置を施した融合マテリアルの構築に成功した。開発したペプチドナノファイバー素材を金属イオンとの融合マテリアルに展開させ、人工細胞外マトリクスとしての応用展開を推進する。
地域公共財の供給メカニズムと農業水利資本形成:南アジアにおける農民の維持管理行動

南アジア農業では灌漑施設への投資は「緑の革命」のみならず、換金作物を栽培するために不可欠である。本研究の目的は、灌漑用水路などの地域公共財の供給メカニズムを実証的に明らかにすることである。ネパール、バングラデシュ、比較分析のためにラオスを含め、現地農村調査を実施した。ネパールの二つの水利システムは農民の共同作業を促進する制度の形成条件の典型を示している。カトマンズ盆地にあるサリナディ灌漑区は農民管理組織が機能していない。彼らは収益性の高い夏馬鈴薯を乾季に灌漑栽培している。夏馬鈴薯の収量差は、上流下流間で統計的に有意な差を確認できなかった。この場合、夏馬鈴薯の栽培農家間で水配分を定めるルールをつくるインセンティヴは働きにくい。また灌漑溝の維持管理活動において上下流農家が共同する必要性はない。一方、ビシ・ノウビシェ水利組合では灌漑用水の利用ルールが定められている。この水利組合では各圃場への取水口に鍵をかけているため、農民が自分勝手に水を利用できない点がユニークである。上流ではコメ-夏イモ-夏イモの作付けが多く、下流では水不足のためにコメ-休閑-夏イモの作付けが多い。前者はより収益性が高い。すなわち、水資源が稀少である場合、水配分や水利施設の維持管理に関するルールがよく守られている。この理由として、ほぼ全農家が取水口の鍵の効用をあげていた。鍵の効果は、そればかりでなく組合員相互の信頼関係の構築にも寄与していた。ほぼ8割の農家は適度の水量を確保できており、6割の農家が適宜に水を利用できていた。現地調査の結果は、水利資本ストックの維持管理を担う水利組織の形成について、農民の経済的な誘因の違いが、維持管理行動に多様性を生んでいることを示した。本研究は,ネパールのカトマンズ盆地に位置するSankhu村の農家を対象として灌漑水の需要を明らかにした。調査対象農村の灌漑水の確保が容易である上流部では、「米-夏馬鈴薯-冬馬鈴薯」の年3作の作付体系が普及している。水路を維持管理し水を配分するためのフォーマルな水利組合は存在しない。農民の灌漑水需要が水利組合の形成に大きな影響を与えていると考えられる。そこで、本研究では、コンジョイント分析によって、夏馬鈴薯栽培のための灌漑水に対する農民の支払意志額を明らかにした。灌漑水需要に影響を及ぼす要因として、(1)灌漑の増加回数、(2)1回の灌漑水増加に対する料金水準、(3)夜間灌漑の有無、の3つを設定し選択実験を実施した。分析の結果、以下のことが明らかになった。灌漑水の支払意志額に影響を与える要因は,灌漑水の増加対象となる圃場の位置であった。灌漑システムの下流に位置する圃場を耕作する農民ほど高い支払意志を持っていることが明らかになった。また、耕作面積に占める灌漑困難な農地割合が高かったり、あるいは、馬鈴薯単収が低い圃場を耕作する農家ほど灌漑水に対する支払意志額が高かった。夏馬鈴薯のための灌漑回数を1回増加させることに対する支払意志額を算出した結果、灌漑面積1ロパニあたり514ルピーであった。これは、1回の灌漑増加により得られると予想される粗収益の79%を占める。また、夜間に灌漑しなくて済むのであれば、1ロパニあたり198ルピーの支払意志額をもつことも明らかになった。ラオスについては、Ban Vuen-Tonhen水利組合を調査した。

この組合員の中には水利費を支払わない農家が存在しているため、この要因の解明に努めた。個々の農家の水利費の支払能力を求めた結果、少なくとも経済的には支払能力はあることが明らかとなった。ネパールを中心に農民灌漑組織の設立経緯と水利施設の維持管理について農村調査を実施した。調査対象は、ネパールのカブレ地域のライヤレ・バカレルディヒ・コミュニティ水利組合とネパール・ビシ・ノウビシェ水利組合である。前者は農家戸数400戸、受益面積は90haである。この水利組合の設立は、1995年に水源に近い上流部に農地をもつ農家約6戸によって水路の建設に着手したことが契機となっていた。この水利組合は新たに水源を開発したのではなく、既存の水利組合との交渉の末、既存水利組合の水路の末端からさらに水路を延長したものであった。その後、ネパールのDIO(地方灌漑事務所)からの援助を得てアクアダクト、スーパーパッセージなどの水利施設が建設し現在の水利組合が発足した。水路の長さは約8kmで、受益地は下流部に位置する。一方、後者のネパール・ビシ・ノウビシェの水利施設は国会議員主導の下で建設された。農家戸数250戸、受益面積150haである。この水利組合の水源は受益地から約7km離れた地点の上流部に位置している。新たに水源を開発している。水利施設はDIOの援助で建設され、2003年に農民に移管された。こうした両水利組合の歴史的経緯をふまえた上で、水利費の負担、水配分および水路の維持管理のルールついて調査した。両水利組合とも(1)水利用、(2)水利費、(3)水路の維持管理、に関して明確なルール形成されていた。さらに、水利費は作付作物によって異なっていた点が注目される。水利施設の維持管理に関しても、農民同士の協力関係が維持されていた。灌漑の効果は、ネパール・ビシ・ノウビシェ水利組合において顕著であり「米-小麦」から「米-馬鈴薯」へと作付体系が変化したことが明らかになった。一方、ライヤレ・バカレルディヒ・コミュニティ水利組合においては、水路建設以前に比較して多少の効果は認められるものの、上流部と比較すればその効果は小さかった。ネパールカトマンズ近郊の農業水利組合について調査を実施した。カトマンズ盆地内サリナディ灌漑区について、夏馬鈴薯栽培における上下流間での単収格差の有無と農民の灌漑行動を明らかにすることを第一の目的とした。約100筆の圃場をランダムサンプリングし馬鈴薯の単収を調査した。馬鈴薯栽培において、上流下流間で有意な収量格差は確認されなかった。むしろ、疫病に由来する単収変動が大きかった。灌漑システムの上流部と下流部との単収格差の不在は、上流と下流で同等の灌漑水を確保できている可能性を示唆している。その場合、夏馬鈴薯の栽培農家間で水配分の見直すインセンティヴは働きにくいし、水配分と定めるルールも必要とされないことになる。水配分という視点からの農民の組織化のインセンティヴは働きにくいと考えられた。第二にネパール・ビシ・ノウビシェ水利組合について、農家の灌漑水利用の実態と灌漑水の効果を調査した。この水利組合では各圃場への取水口に鍵をかけているため、農民が自分勝手に水を利用できない点がユニークである。上流から下流にかけて約60戸の調査対象農家を抽出した。ほぼ8割の農家は適度の水量を確保できており、6割の農家が適宜に水を利用できていた。
糸状菌をホストとした高効率生物合成システムの構築

ジャガイモ夏疫病菌よりクローニングした新規ポリケタイド合成酵素(PKS)遺伝子pksNについて発現系を構築し、アルタナピロンと命名した新規ポリケタイド化合物の生産を確認した。本化合物はデカケタイド鎖に8つのメチル基が位置特異的に導入された化合物であり、その生成を単独のPKSが触媒することが明らかになった。また、ジャガイモ夏疫病菌自身では、本化合物の生産は認められず、糸状菌発現系を用いることで初めて生産、同定されたものと考えられる。PKSの反応制御機構の解明にむけて、ナフトピロン合成酵素WAについて、種々の変異体を発現させることにより、新たな機能ドメインとして、これまで単にチオエステラーゼとして考えられていたC-末部分がポリケトメチレン鎖の閉環・芳香化に関与するClaisen cyclaseとして機能していることを明らかにした。病原糸状菌Aspergillusfumigatusのメラニン生合成に関わると推定されたalb1、ayg1遺伝子の共発現により、alb1遺伝子がヘプタケタイド合成酵素遺伝子であり、その発現により生産されるナフトピロンがayg1遺伝子にコードされる酵素Ayg1pにより加水分解的に側鎖切断を受け、テトラヒドロキシナフタレンへと変換される新しい生合成経路を同定した。また、この発現系を利用して、Ayg1pの精製、特性化を行った。植物由来のトリテルペン閉環酵素について、糸状菌での発現系を構築し、発現を検討したが、発現は確認できなかった。その原因として、植物と糸状菌での使用コドンの違いや、転写後のmRNAの安定性やプロセシングの差などが考えられ、今後の課題である。麹菌Aspergillusoryzaeをホストとして、α-アミラーゼプロモーター下流に生合成酵素遺伝子を組み込み、その発現による化合物生産を検討した。糸状菌をホストとした高効率生物合成システムの構築を目的に以下の項目について検討した。麹菌Aspergillusoryzaeをホストとして、α-アミラーゼプロモーター下流に糸状菌芳香族ポリケタイド合成酵素遺伝子を組み込み、その発現、化合物生産を検討した。その例として、病原糸状菌Aspergillusfumigatusのメラニン生合成に関わると推定されたalb1、ayg1遺伝子の共発現により、alb1遺伝子がヘプタケタイド合成酵素遺伝子であり、その発現により生産されるナフトピロンがayg1遺伝子にコードされる酵素により加水分解的に側鎖切断を受け、テトラヒドロキシナフタレンへと変換される新しい生合成経路を同定した。これは基本炭素骨格構築における二次的な変換反応の新規な例であるとともに、物質生産におけるその応用が期待される。糸状菌におけるポリケタイド化合物生産の鍵酵素であるポリケタイド合成酵素の反応制御機構の解明にむけて、ナフトピロン合成酵素WAについて、種々の変異体を発現させることにより、新たな機能ドメインとして、これまで単にチオエステラーゼとして考えられていたC-末部分がポリケトメチレン鎖の閉環・芳香化に関与するClaisen cyclaseとして機能していることを明らかにした。還元型ポリケタイドの発現と生産に向けて、ジャガイモ夏疫病菌より、還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子を含む生合成遺伝子クラスターをクローニングし、現在、その機能同定を進めている。また、テルペノイド類の基本骨格形成を検討するため、植物由来のトリテルペン閉環酵素について、糸状菌での発現系を構築し、発現を検討した。現在のところ、残念ながら、発現を確認するには至っていないが、より強力なプロモーターなどを利用することを検討する予定である。

本年度は、糸状菌をホストとした高効率生物合成システムを用いた新規化合物生産系の構築に重点を置き、単独の発現のみで化合物生産が可能な糸状菌タイプI型ポリケタイド合成酵素(PKS)の新規遺伝子クローニングとその発現、生産化合物の同定を進めた。まず、ジャガイモ夏疫病菌よりクローニングした新規PKS遺伝子pksNについて麹菌をホストとした発現系を構築し、アルタナピロンと命名した新規ポリケタイド化合物の生産を確認し、化学的に同定した。本化合物はデカケタイド鎖に8つのメチル基が位置特異的に導入された化合物であり、その生成を単独のPKSが触媒することなど極めて興味深いものである。また、ジャガイモ夏疫病菌自身では、本化合物の生産は認められず、糸状菌発現系を用いることで初めて生産、同定されたものと考えられる。現在、pksNを含む遺伝子クラスターの機能についても検討するため、クラスター中に含まれるoxidaseやP-450各遺伝子との共発現を試みている。糸状菌においては、pksNのように新規機能をもつ様々なPKS遺伝子の存在が推定され、その発現による新規化合物の生産が期待される。そこで、各種糸状菌のゲノムDNAを鋳型にPKS遺伝子断片のPCRによる増幅、全長遺伝子のクローニングとその発現系の構築を進めた。また、糸状菌発現系が糸状菌二次代謝酵素の発現にも極めて有効であることをAspergillus fumigatusの新規酵素Ayglpの発現、精製・特性化により、実証した。テルペノイド化合物の生物合成系の構築を目的に植物由来のトリテルペン合成酵素の糸状菌での発現を更に検討したが、発現は確認できなかった。その原因として、植物と糸状菌での使用コドンの違いや、転写後のmRNAの安定性やプロセシングの差などが考えられる。
アトピー性疾患モデル動物の作製

アトピー性疾患は現代病として大きな社会問題にもなっている。アトピー素因の一つとして、抗原特異的なIgE産生の亢進があり、アトピー性疾患の患者の血中IgEa度は正常人の数千倍にもなり得る。アトピー性疾患と同様な症状を誘発し、その発症のメカニズムを生体内で再現したモデル動物を作製することを目的として、抗原特異的IgEトランスジェニックマウス(Tgマウス)を作製した。アトピー性皮膚炎の主要アレルゲンとして重要な卵白アルブミン(OVA)、ダニ抗原(Derf II)、及びこれまでのアレルギー研究でしばしば抗原として用いられてきたトリニトロフェニル(TNP)に特異的なIgE遺伝子(H鎖・L鎖)を導入遺伝子としてそれぞれ構築した。等モルのH鎖及びL鎖に対応する導入遺伝子断片をBALB/c受精卵前核へマイクロインジェクションし、Tgマウスを作製した。これまでに抗TNP-IgE導入遺伝子陽性マウスを3系統得た。いずれの系統においても正常マウスと比較して100-500倍の血中IgE濃度を示した。また、発現しているlgEのほとんどがTNPに特異的なものであった。このTgマウスの耳介にTNP基を持つ塩化ビクリルを塗布したところ、塗布後1時間をピークとして皮膚の肥厚が認められた。一方、Tgマウスに抗原(TNP-BSA)を静脈注射した結果、体温の著しい低下及び血管透過性の亢進が認められ、全身性アナフィラキシーを誘発することが可能であることが示された。すなわち、このアレルゲン特異的IgE-Tgマウスにおいて、その生体内で典型的なI型(アトピー性)アレルギー反応を再現することが可能であった。抗原による事前の感作無しに、ただ1回の抗原曝露のみで確実に抗原特異的なアレルギー反応を誘発することが可能であり、非常に有用なアトピー性疾患モデル動物となるものである。アトピー性反応は、マスト細胞に発現しているIgEレセプターに結合しているIgE分子を外来多価抗原(アレルゲン)が架橋することによって開始されるが、その発症機序を解明し、新しい治療法を開発するにあたって、モデル動物の樹立が必須と考えられる。アトピー性皮膚炎の主要アレルゲンとして重要な卵白アルブミン(OVA)・ダニ抗原(Derf II)及び、これまでのアレルギー研究においてしばしば抗原として用いられてきたトリニトロフェニル(TNP)に特異的なIgEを強制発現させたトランスジェニックマウスを作製することを目的とし、導入遺伝子を作製した。すでに作製されているマウス抗OVA IgG産生ハイブリドーマ、抗Derf II IgG産生ハイブリドーマ及び抗TNP IgE産生ハイブリドーマよりRNAを調製し、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域における相同性の高い部分に対応する混合プライマーを用いてRT-PCRを行い、発現している免疫グロブリン可変領域のcDNAをそれぞれ単離した。得られたcDNAは各ハイブリドーマにおいて重鎖・軽鎖ともにただ1種類であり、それらはいずれも機能的に再構成していた。これらをプローブとして、各ハイブリドーマのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、再構成した重鎖及び軽鎖の可変領域を含む遺伝子断片を単離、クローニングした。一方、BAL B/cマウスのゲノムDNAライブラリーあるいは生殖細胞型免疫グロブリン遺伝子クローンより定常領域(Cε、Cκ)及び免疫グロブリンの発現に必要なエレメント(プロモーター、イントロンエンハンサー、3'エンハンサー)をそれぞれ単離した。これらを連結することによって、抗OVA IgE、抗Derf II IgE及び抗TNP IgE強制発現のための導入遺伝子(重鎖・軽鎖)をそれぞれ構築した。
高エネルギー,ギャップ混晶半導体の成長と物性

研究の目的......プラズマCVD,クロライドVPEのような安価で安全な成長方法による高エネルギー・ギャップ混晶半導体、AlAsN,AlGaAs、の成長の可能性を明らかにする。前者はGaAs,GaInAsP、等の化合物半導体の保護膜,絶縁膜として有望であり、AlGaAsのクロライドVPEが可能になれば、レーザ・ダイオードの生産方法に大幅な変革をもたらす可能性がある。実験......本年度はまずAl【(CH_3)_3】...TMA...と【NH_3】を使ったAlNのプラズマCVD,TMAとAs【Cl_3】,あるいはAl【(CH_3)_2】ClとAs【Cl_3】を用いたAlAsのクロライドVPEを試みた。実験結果AlNのプラズマCVD......TMAと【NH_3】を別々のパスから反応室に導くことにより、AlNのプラズマCVDが可能であることをめて明らかにした。成長速度はTMAの供給量によって支配され、【NH_3】/TMA比が大きくなるほど膜質が良くなる。スパッタリングオーシェによる組成分布ではAl,N,の他に常に数%の酸素が検出されたが、これは測定機中の残留酸素による可能性がある。赤外吸收によるピークは650【cm^(-1)】、紫外吸收によるバンドギャップは4.8eV、X線回折パターンでは特定のピークは観測されなかった。AlAsのクロライドVPE......TMA又はAl【(CH_3)_2】ClとAs【Cl_3】をHeをキャリアガスとして高温領域(750°C)に送り、(AlCl+Al【Cl_3】)を作る。成長領域(ここも750°C)では【H_2】を導入することによりAlを折出させる。As【Cl_3】からのAsがあるため、GaAs基板上にAlAsが成長することを明らかにした。Alと石英反応管との反応を防ぐため、Cのコートをすること、As【Cl_3】/TMAの比を最適(0.64)にすることがキーポイントであった。最高成長速度は3μm/hr、今後界面の急峻性等について明らかにすることが必要である。
植民地における衛生をめぐる近代性と現地社会―２０世紀前半の香港を例としてー

本研究では、「近代性」が香港の中国人社会に及ぼした影響について取り組む。これによって、衛生問題をめぐる香港の中国人社会の実態を明らかにする。本研究の意義は以下の二点にある。まず、本研究の分析視角によって明らかとなった香港の事例は、、近代性そのものを批判的に検討する視点を提供することができる。そして、香港を含めた公衆衛生に関する歴史的事例を知ることは、私たちが今後、国家・社会・個人の関係性をどう構築していくのかを考える一助となる。
動物の関節疾患に伴う関節構造破壊に対するグリコサミノグリカンの構造安定効果

ヒトおよび動物の変形性関節症の症状改善薬として関節内投与ヒアルロン酸(HA)および多硫酸化ペントサン(PPS)が使用されている。外因性HAは、培養滑膜線維芽細胞および軟骨細胞において長鎖の内因性HAの産生を促進させる効果が示された。また、PPSは培養軟骨細胞内においてp38およびERKのリン酸化を抑制することでその下流のNK-kBの核内移行およびMMPの産生を制御することが示唆された。これらのメカニズムが、HAおよびPPSの臨床的な軟骨保護作用の発現の説明の一部になる可能性がある。(1)多硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)および多硫酸ペントサン(PPS)の臨床学的効果判定:関節疾患発症犬60頭を抽出し、あらかじめ策定した投与プロトコールにしたがってPSGAGあるいはPPSを投与し、これら物質の臨床学的な効果についてデータを集積した。それにより、破行の軽減、関節腫脹の減少、併用薬剤の下減量等の臨床的な症状改善効果の発現様式を分析した。(2)供試培養細胞(滑膜細胞および軟骨細胞)の採取、培養および凍結保存:健康な馬、関節疾患発症馬のそれぞれ非病態および罹患関節、さらに犬の罹患関節および非病態関節から滑膜および軟骨を採取した。これらの組織から細胞を分離・凍結保存し、in vitro培養細胞の試験に供する準備を実施した。具体的には、軟骨および滑膜のphenotypeの持続性を評価し、実験に供する最適な状態を確認した。(3)RT-PCR法を用いた滑膜細胞および軟骨細胞内のシグナル伝達系の確認:馬および犬に関する遺伝子情報から、JNK、ERK、p38、およびMMP-3とそれに関連したそれぞれのセンスおよびアンチセンスプライマーをヒトおよびマウスJNKのcDNA塩基配列の相同性の高い部分を参考に設計し、RT-PCRを最適化した。また、定量的な評価を可能とするrealtime-PCRについてもそれぞれの条件を最適化した。また、細胞内における生理活性を評価するためにNK-kBの核内以降形態を分析するため、蛍光抗体法における分析を可能にした。さらに、細胞活性が活性化した結果、細胞内で生成される酵素および生理活性物質の発現を評価するために、PSGAGやPPSに干渉されないPCR法の最適化を行った。完成した測定系を用いて、それぞれの細胞におけるPSGAGとPPSの炎症反応経路に対する効果の評価を開始し、得られた成果の一部を国際学会(3^<rd> World Vbterinary Orthopaedic Congress)にて公表した。(1)グリコサミノグリカンの培養軟骨細胞の細胞生物学的活性に対する効果:軟骨細胞に対する多硫酸ペントサンナトリウムの効果を検討するために、その細胞活性に対する影響をMTT法を用いて検討した。また、細胞の形態学的変化も同時に観察した。その結果、軟骨細胞代謝の亢進と同時に炎症性サイトカインによって誘導される軟骨細胞障害性を保護することが確認された。(2)グリコサミノグリカンの軟骨細胞の分子生物学的活性に対する効果:前年度の研究において馬および犬に関する遺伝子情報から、JNK、ERK、p38、およびMMP-3とそれに関連したそれぞれのセンスおよびアンチセンスプライマーをヒトおよびマウスJNKのcDNA塩基配列の相同性の高い部分を参考に設計し、RT-PCRを最適化した。その後、定量的な評価を可能とするrealtime-PCRについてもそれぞれの条件を最適化した。これらの検索システムを使用して、培養軟骨細胞に炎症性サイトカインであるIL-1βおよびTNF-αを作用させて炎症反応を惹起させ、培養軟骨細胞における古典的MAP-Kの介した細胞反応の活性化およびその結果として産生される産物であるMMP-3およびADAMTS-4および5の産生を評価した。分析された細胞反応が安定的に再現される環境を最適化した後、細胞の炎症応答に関連したグリコサミノグリカンの反応性を分析した。その結果、グリコサミノグリカンの一つであるポリ硫酸ペントサンは、p38およびJNKに干渉してNF-κBの核内移行を抑制し、その後の細胞の炎症応答を低下させることが明らかとなった。本研究では、グリコサミノグリカン投与が関節疾患を発症した関節における構造の保護にどのように関連しているかを検討した。まず、生体における関節疾患症状の変化を調べるために、以下の検討を行った。関節疾患を自然発症した症例犬60頭を抽出し、あらかじめ策定した投与プロトコールにしたがって多硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)あるいは多硫酸ペントサン(PPS)を投与し、これら物質の臨床学的な効果発現様式を検討した。

その結果、これらの物質の経口投与には、跛行の軽減、関節腫脹の減少、併用薬剤の下減量等の臨床的な症状改善効果の発現がみられた。次に、動物(馬および犬)の罹患関節および非病態関節から滑膜および軟骨を採取し、これらの組織から細胞を分離供した。軟骨細胞および滑膜細胞のphenotypeの持続性を評価し、実験に供する最適な状態を確認した。その後、以下の実験に供した。馬および犬に関する遺伝子情報から、JNK、ERK、p38、およびMMP-3とそれに関連したそれぞれのセンスおよびアンチセンスプライマーをヒトおよびマウスJNKのcDNA塩基配列の相同性の高い部分を参考に設計し、RT-PCRを最適化した。また、定量的な評価を可能とするrealtime-PCRについてもそれぞれの条件を最適化した。また、細胞内における生理活性を評価するためにNK-kBの核内以降形態を分析するため、蛍光抗体法における分析を可能にした。さらに、細胞活性が活性化した結果、細胞内で生成される酵素および生理活性物質の発現を評価するために、PSGAGやPPSに干渉されないPCR法の最適化を行った。完成した測定系を用いて、それぞれの細胞におけるPSGAGとPPSの炎症反応経路に対する効果を評価し、PPSの細胞内での抗炎症作用機序が明らかにされた。当初の計画通り、研究が進み、また、同時に比較的理にかなった結果が出ている。成果の公表についても順調に進み、国際学会での公表や国際雑誌での公表なども予定通り実施されている。今後は、得られた成果をより確実なエビデンスとすることが必要とされ、その意味でも計画されている細胞由来動物の違いによる結果の変動や細胞ソースの条件の違いが結果に与える影響等を詳細に検討し、より確実なエビデンスを用いて、目的とする事象を説明できるようにする努力が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で検討しているグリコサミノグリカンは、身体の構造物質であるプロテオグリカンと類似構造を有している。これら物質の補填が、損傷により破壊された身体構造の修復材料になると信じられ、いろんな経路を通じて身体に投与されてきた。身体構造の一部に類似しているこれら物質に対する細胞レベルでの生体の反応は、仮説として想定していたよりも大きな反応として確認された。この反応メカニズムについて、分子生物学的に検討しているが、より身体的な事象、具体的には免疫系等全身反応系に与える影響を考慮した反応メカニズムの解明が必要であると痛感している。本研究で明らかにできることと、さらに次の研究計画に向けた施策として、よりin vivoに近い検討の必要がある。
種々のレジスタントスターチの機能特性

昨年度の結果を踏まえ、レジスタントスターチ(RS)を添加したうどんを作成し、茹でた後に凍結乾燥させたものをマウスに与え、加工したRSの機能性を検討した。高脂肪餌にうどんをRS含量が1%となるよう添加し、マウスに13週間摂取させた。RS添加うどんはRS非添加うどんと比較して、耐糖能異常を抑制し、糞中IgA量を有意に増加させた。また、盲腸内の短鎖脂肪酸を調べたところ、RS添加うどんではプロピオン酸が有意に増加していた。続いて、パンケーキを用いて未加工、加工のRSの機能性をマウスを用いて比較検討した(未加工のRSを生RS、加工したRSを加工RSとする)。高脂肪餌によるマウス肥満モデルにおいて(それぞれ飼料中のRS含量は2%)、生RSと加工RS共通に見られた効果として、動脈硬化惹起性コレステロールであるnon-HDLコレステロールの低下と絶食時遊離脂肪酸の低下、盲腸内pHの低下、糞中IgAの上昇であった。一方、生RS群では盲腸内容物中のプロピオン酸と酪酸含量がコントロール群と比較して有意に増加していたが加工RSでは増加していなかった。また、加工RS群のみで非絶食時の遊離脂肪酸がコントロール群と生RS群より有意に低かった。遊離脂肪酸濃度は脂肪組織におけるホルモン感受性リパーゼ(HSL)の活性と関係しており、HSL活性はインスリンにより負の制御を受ける。よって、インスリンが分泌されている非絶食状態において加工RS群で遊離脂肪酸濃度が低いことは脂肪組織でのインスリン抵抗性に関係している可能性がある。ただし、インスリン抵抗性試験に関して有意差は見られなかった。うどんとパンケーキでは盲腸内の短鎖脂肪酸に差が見られた。パンケーキはうどんと異なり作製時に卵を添加していることから、タンパク質が一定量存在時にRSを加熱加工すると、RSは腸内細菌により資化できなくなる可能性があると推察される。前年度(2017年度)には様々なレジスタントスターチ(RS)を用いて麺やパンケーキを作り、官能評価試験および加熱加工後のRS残存量の結果から、うどんにはアミロファイバーを、パンケーキにはアミロジェルを適したRSとして選抜した。また、一般的にドリンク類等に非加熱で利用される難消化性デキストリンなどの水溶性難消化性グルカンに関して、マウスを用いた4週間の短期試験を実施し、脂質代謝や腸管免疫系に与える影響など新たな知見を得た。2018年度はこれら前年度の結果を踏まえて、RSを添加した「うどん」および「パンケーキ」を用いて調理加工後のRSの機能性について、高脂肪餌誘導型マウス肥満モデル(13週間飼育の長期摂取試験)を用いて生活習慣病や腸管免疫に対する影響について検討した。さらにパンケーキを用いた実験では実験群に生デンプン状態のRSを添加した実験群を設け、生デンプン状態のRSと加熱加工したRSの機能性の比較を行った。これら「うどん」および「パンケーキ」の実験から、調理加工したRSの糖代謝や腸管免疫に対する新たな知見を得、生デンプン状態のRSと調理加工したRSでは機能性に違いがあることを確認した。また、水溶性難消化性グルカンの機能性比較として、試験期間を6週間に伸ばしてマウスを用いて機能性を比較し、効果が強かった1種類については、さらに試験期間を9週間に延長するとともに、分子量による分画を行ったサンプルを投与することによって機能成分の同定を現在実施している。以上のことから、本研究は申請時の研究計画にそって、順調に進められていると考えられることから「おおむね順調に進展している」とした。本研究は加熱加工して利用されるレジスタントスターチ(RS)とドリンク類等に非加熱で利用される難消化性デキストリンなどの水溶性難消化性グルカンに関して、様々なサンプルの機能性を比較検討して各サンプルの機能特性を明らかにするものである。RSに関する研究は、申請時に計画した実験はおおむね2018年度までに終了したが、2018年度に実施した動物実験のデータの詳細については十分な確認と考察ができていないため、学会発表や論文発表に向けてデータの検討を引き続き実施する。論文のためのデータが不足していた場合は必要に応じて追加実験を実施する。また、水溶性難消化性グルカンの実験については、これまでに複数の難消化性グルカンサンプルに加え、フラクトオリゴ糖やポリデキストロースといった水溶性難消化性糖質をサンプルとして動物実験に供し、盲腸での資化性や脂質吸収抑制作用、腸管免疫への影響などを検討してきた。今年度は、本研究で新たな知見が得られた難消化性グルカンサンプルについて、腸管IgA分泌能を中心に作用メカニズムおよび機能成分について検討を行う。また、2018年にCell誌においてフラクトオリゴ糖など大腸内で資化性が高い難消化性糖質の肝臓がん誘発性が報告されたことから(Cell, 175, 679-694, 2018)、RSと水溶性難消化性グルカンの実験結果に関して、ASTやALTといった肝臓毒性の指標を中心に、毒性についても注意して実験データを考察する。本年度の計画は複数のサンプルから加熱加工調理に適したレジスタントスターチ(RS)サンプルを選抜することと、RSの種類による機能性比較を行うことである。RSサンプルとして水溶性サンプルを4種類、不溶性サンプルを6種類用いて実験を行った。・水溶性サンプルの機能評価:4種類の水溶性サンプルまたはコーンスターチを通常食および高脂肪食に5%添加し、マウスに4週間摂取させることで機能性を評価した。

評価項目は食物繊維様作用(糞重量および糞中総脂質の量により評価)、腸内での資化性(盲腸内容物の量、pH、短鎖脂肪酸量により評価)、腸管免疫(糞中IgA量により評価)の3項目とした。食物繊維用作用は通常食ではほとんど無く、高脂肪飼料では3サンプルにおいて強く確認された。また、糞量の増加や高脂肪食での糞中総脂質量の増加が見られるサンプルは糞のIgAも誘導していることが明らかになり、非消化性グルカンが腸管免疫を刺激していると考えられた。盲腸内容物はすべてのサンプルで増加していたが、短鎖脂肪酸、pHへの影響があったサンプルは2サンプルであり、通常食と高脂肪食でも差があった。・不溶性サンプルの評価:不溶性サンプルは加熱調理が必要であるため、サンプルを20%含むパンケーキを焼成し評価を行った。加熱加工によるRS含量の変化を検討したところ、酸処理や湿熱処理がなされていないハイアミロースコーンスターチなどはパンケーキ中ではRS含量が20%程度に減少してしまった。一方、酸処理や湿熱処理を行ったRSは加熱調理しても80%程度RS含量を維持していた。さらに、官能評価を実施したところ、各サンプルは硬さやもちもち感などの食感に影響を与えており、硬さについてはレオメーターとの相関性が得られた。以上の結果から来年度以降の試験には湿熱処理を行ったハイアミロースコーンスターチに絞って研究を実施することとした。本年度の計画では難消化性デキストリンなどの水溶性難消化性グルカンを含む10種類程度のレジスタントスターチ(RS)をサンプルとして調理加工に適したサンプルの選抜と一部サンプルの機能性比較である。RSサンプルとして水溶性サンプルを4種類、不溶性サンプル6種類を複数の企業から提供していただき、これらについて計画書にそって研究を実施した。いずれの実験においてもコントロールとしてコーンスターチを用いた。水溶性サンプルに関しては市販のRSアッセイキットでは測定できないことから、4週間のマウスでの試験を行い食物繊維用作用、腸内での資化性、腸管免疫への影響を評価することで最適なサンプルを選抜することとした。4種類のサンプルの中で1種類が3項目すべてにおいて有効であり、血液生化学値にもマイナスな影響を与えなかったことから来年度以降のサンプルとして選抜することが出来た。不溶性サンプルに関しては加熱調理を行いRS残量と美味しさの観点から選抜を行った。加熱調理として再現性の高い調理法であるパンケーキとパスタを作製したが、パスタでは多くのサンプルで茹で時にデンプンが溶出してしまったため、パンケーキに絞り実験を行った。RS残量に関しては酸や湿熱処理がなされていないRSおよび1種類の架橋デンプン(4型RS)は加熱調理後にRSが8割程度減少してしまった。一方、酸や湿熱処理がされているRSは減少が2割程度にとどまった。美味しさの評価は官能評価とレオメーターを用いた分析を行うことによって実施した。RSの含量と美味しさにはほとんど相関は無く、硬さが大きく変化したサンプルは1種類であった。これらの評価から湿熱処理を行ったハイアミロースコーンスターチを選抜することが出来た。以上の結果から2種類のRSが選抜でき、複数の水溶性RSの機能性比較が行われたため、平成29年度は予定通り実験を実施することが出来たと考える。
小型類人猿における「音楽」知覚・認知の生物学的基盤

本研究は、霊長類を対象に、聴覚的な知覚・認知特性をヒトとの比較を通じて明らかにすることを目的とした。特に、感覚性強化法といった、訓練を要しない行動学的な実験方法での検討をこころみた。サルの体の場所を指標として、飼育室の左右のどちらかに定位すると刺激が提示される、聴覚的な強制選択選好法を用いて検討した結果、サルは自発的に協和音と不協和音刺激を区別していると考えられたが、その音源に対する選好性は特には認められなかった。本研究は、聴覚音声系のコミュニケーションに特化した小型類人猿を対象に、聴覚的な知覚・認知特性をヒトとの比較を通じて明らかにすることを目的としている。研究の全体では、飼育個体を対象とした行動実験を予定しているが、本年度は研究所の実験室が耐震補強改修工事のため実験は当初の通り思うように進まなかった。したがって、基本的には実験するための装置の作成を行った。また、予備的にニホンザルとキャンベルズモンキーという旧世界ザルにおいて、協和音不協和音に対する選好性を強制選択選好法を用いて検討した。実験の結果旧世界ザルにおいては協和音に対する選好性は認められなかった。テナガザル類を対象とした実験であるが、他の旧世界ザルの情報も不可欠なためニホンザルとキャンベルズモンキーという旧世界ザルにおいて、協和音不協和音に対する選好性を検討した。方法は、サルの体の場所を指標として、飼育室の左右のどちらかに定位すると刺激が提示される、聴覚的な強制選択選好法を用いて検討した。実験の結果旧世界ザルにおいては協和音に対する選好性は認められず、選好性はほぼ位置偏向となった。しかし、音源提示されると何らかの影響が行動に与えていることも同時に確認された。結果として、サルは自発的に協和音と不協和音刺激を区別していると考えられたが、その音源に対する選好性は特には認められなかった。現在論文を執筆中である。また、テナガザルの音声収集のための海外調査もおこない、近縁他種のサンプリングをおこなった。具体的にはアジルテナガザルの亜種である、スマトラ産の2亜種とマレー半島産の1亜種である。またシロテテナガザルという、アジルテナガザルにとって近縁な他種の音声刺激も収集できた。これを利用して実験することを計画している。テナガザル類を対象とした実験であるが、研究環境の問題、また、他の旧世界ザルの情報も不可欠なため、ニホンザルとキャンベルズモンキーという旧世界ザルにおいて、協和音不協和音に対する選好性を検討した。まず、ベースライン条件として、白色雑音で過剰な騒音レベルの聴覚刺激と、通常起こりえる騒音レベルの対刺激を用いて、選好反応を調べた。その結果、過剰なレベルでの白色雑音環境を避けるような反応が現れ、実験パラダイムの有用性が確認された。次に、協和音に対する反応を調べた。実験の結果、旧世界ザルにおいては協和音に対する選好性は認められず、選好性はほぼ位置偏向となった。さらに、種特異的な音声と未知のサルの音声を対刺激として検討を重ねた。特に大きな差は得られなかった。また、他の条件に関しても検討を重ねて現在論文として結果をまとめている。ニホンザルにおける実験も遂行し、同種他個体の時の音声に音源定位の方法が異なることを見出し、共同研究として論文を刊行した。テナガザルに関しても現在同様の実験をすすめ現在解析を行っている。刺激収集の仮定で行った、行動観察において、未成熟個体が歌を獲得する過程の重要な証拠も得られ、現在論文としてまとめている。
1970・80年代香港における台湾文学の受容：文学の翻案行為に注目して

本研究は、1970・80年代香港における台湾文学の受容について分析することで、香港意識の生成期にあった市民感情の重層性を明らかにせんとするものである。香港における台湾文学の受容については、台湾文学の戯曲化や映画化、すなわち文学の翻案(アダプテーション)という視座から分析する。本研究を通して、香港文化と台湾文化との間にいかなる連動性があるか、また文学を翻案することと国民意識を形成することの間にいかなる関係性があるかを考察し、中国語圏現代文学の受容研究、並びに翻案研究の発展に貢献したい。
魚類特有の器官「ヒレ」を活用した細胞内寄生細菌に対する細胞性免疫機構の解明

本研究では、ブリ類において細胞性免疫を担う細胞を識別するための抗体を作製した。はじめに、ブリ白血球由来cDNAより細胞性免疫を担う細胞であるヘルパーT細胞およびキラーT細胞にそれぞれ特異的に発現するCD4およびCD8分子に対する遺伝子を単離した結果、CD4分子のホモログとしてCD4-1およびCD4-2、CD8分子のアイソフォームとしてCD8αおよびCD8βの計4遺伝子の単離に成功した。なお、本研究で単離した遺伝子は、これまでブリにおいて未報告の分子であった。次に、抗体作製に使用する免疫原を作製するため、CD4およびCD8分子を安定的に発現する細胞の作製を行った。単離した遺伝子をマウス由来細胞にそれぞれ一過的に強制発現させた結果、全ての遺伝子が膜タンパク質として翻訳されることを確認した。強制発現させた細胞は継代培養し、安定発現株の作製に用いた。このうち、安定細胞株の樹立に成功したのはCD4-1、CD4-2、CD8βの3分子であった。作製した安定細胞のうちCD4-1もしくはCD8β発現細胞をマウスに免疫し、定法に従い各分子に対するモノクローナル抗体の作製を行った。ブリ末梢血白血球を用いて抗体を産生するハイブリドーマの単クローン化を行った結果、生きたブリ白血球を認識する抗体の作製に成功した。現在、作製した抗体がCD4-1もしくはCD8βを正確に認識するかについて確認を行っている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
鞭毛の自励振動の基礎となるダイニン滑り活性切り替え機構の解明

真核生物の鞭毛の振動運動は,軸糸内のダイニンが引き起こす協調的な微小管滑り運動によって生じる.これまでの研究から,滑り運動の制御には鞭毛の屈曲によるダイニン活性制御が重要であることが示唆されてきたが,その制御機構の詳細は明らかになっていない.本研究の昨年までの成果により,屈曲によって軸糸内のダイニン活性部位が中心小管の両側で切り替わることが済りの切り替えの実態であることが明らかになった.また,最近の研究からADPがダイニンの非加水分解ヌクレオチド結合部位に結合することによってダイニン活性を制御することが示唆されている.そこで本年度の研究では,ADPが屈曲による滑りの切り替え制御に関与しているかどうかを検討した.除膜してエラスターゼ処理をしたウニ精子鞭毛軸糸を用いて,異なるADP濃度条件下で軸糸の屈曲による滑りの切り替えを誘導する実験系を構築した.すなわち,低pH,apyase存在下または高濃度Ca^<2+>,hexokinase存在下でcaged ADPの光分解またはADPを加えることによってADP濃度を増加させる手法を用いて,屈曲による滑りの切り替えに対するADPの効果を調べた.その結果,どちらの条件下でもADP濃度を増加させると屈曲によって滑りの切り替えが誘導される割合が増加した.この結果は,屈曲による滑りの切り替えにはADPの存在が重要であることを示唆する.これまでの知見と合わせると,屈曲によってダイニンへのADPの結合が起こりやすくなる,というような仕組みによって滑りの切り替えが誘導される可能性が考えられる.屈曲によって軸糸内のダイニンの活性部位が中心小管の両側で切り替わることを証明した平成18年度の成果を,平成19年9月に弘前大学で開催された日本動物学会第78回大会で発表した.真核生物の鞭毛運動における微小管滑り運動の制御には,鞭毛の屈曲自体が関与することが示唆されてきたが,その制御機構はまだ明らかになっていない.本研究ではウニ精子鞭毛を用いて,軸糸の滑り方向の切り替えと屈曲方向との関係を調べた.除膜した精子をローダミン染色し,エラスターゼ処理をした後に蛍光顕微鏡下でcaged ATPのUV分解によって少量のATPを与え,数回に分けて滑り運動を誘導した.光学顕微鏡レベルで屈曲の方向と軸糸の構造の対応がつけられるという,以前に開発した実験系と微小ガラス針を用いて鞭毛を曲げる系を組み合わせて,滑りの逆転を引き起こす屈曲の方向を調べた.その結果,頭部付近に屈曲のある鞭毛と,墓部を切断した鞭毛では滑りの逆転を誘導する屈曲の方向が異なることが分かった.この結果から,軸糸の滑りの切り替えには屈曲方向とダイニン・微小管相互作用の組み合わせが重要であることが示唆された.以上の結果を平成17年11月に神戸で開催された国際ワークショップ「ダイニン2005」で発表した。また,屈曲により滑り方向が逆転した軸糸の滑り速度は,屈曲前の速度よりも減少することが示唆された.これは中心小管を介したCa^<2+>によるダイニン活性の抑制を反映している可能性がある.高濃度Ca^<2+>条件下では9+2構造の7番側のダイニンが活性化し,3番側のダイニンが不活性化することがこれまでの研究で示されている.ダイニンの活性部位が7番側から3番側に切り替わることによって滑りの逆転が引き起とされる場合には,Ca^<2+>濃度によって滑り速度が変化することが予想される.したがって現在,異なるCa^<2+>濃度条件下で屈曲による滑りの逆転を誘導し,滑り速度を解析している.真核生物の鞭毛の振動運動は,ダイニンによる微小管滑り運動が時間的・空間的に制御されることによって生じる.ウニ精子鞭毛の両方向の屈曲形成には,中心小管の両側(7番と3番)の滑りが重要であり,その切り替え制御に鞭毛の屈曲自体が関与することが示唆されているが,実験的な証明はなされていない.これまでの成果に基づくと,除膜してエラスターゼ処理をしたウニ精子鞭毛では,高濃度Ca^<2+>存在下で7番側のダイニンによって2本の束に別れるように滑った軸糸に屈曲を与えた場合,滑り方向の逆転が誘導される.この滑りの切り替えには(1)7番側のダイニンの出す力の向きが逆転する,(2)ダイニンの活性部位が3番側に切り替わる,という二つの仕組みのどちらか一方が関与する可能性と,両方が同時または時間差で関与する可能性がある.平成18年度には,これらの二つの可能性の検討を試みた.(1)について検討するために,細い束と太い束上にそれぞれ露出した7番と3番側のダイニンに重合微小管を作用させて,微小管をガラス微小針で曲げた時に滑り方向が逆転するかどうかを調べたが,逆転した例は観察できなかった.しかし,この実験系を用いて(2)を証明できる可能性に気づき,この系を発展させて以下の結果を得た.細い束,太い束上の重合微小管の滑りの極性は共に一定で,太い束上の微小管の滑り速度は細い束上の速度よりも有意に小さかった.また,軸糸を曲げて滑りの切り替えを誘導した場合,屈曲後の逆方向の滑り速度は順方向の速度よりも有意に小さかった.したがって,屈曲によりダイニン活性部位が7番側から3番側に切り替わったことが示され,屈曲による滑りの切り替えに(2)の仕組みが含まれることが証明された.

平成18年9月に開催された国際シンポジウム(松島),日本動物学会第77回大会(松江)において,軸糸の滑り速度の解析結果とこれまでの成果を合わせて発表した.真核生物の鞭毛の振動運動は,軸糸内のダイニンが引き起こす協調的な微小管滑り運動によって生じる.これまでの研究から,滑り運動の制御には鞭毛の屈曲によるダイニン活性制御が重要であることが示唆されてきたが,その制御機構の詳細は明らかになっていない.本研究の昨年までの成果により,屈曲によって軸糸内のダイニン活性部位が中心小管の両側で切り替わることが済りの切り替えの実態であることが明らかになった.また,最近の研究からADPがダイニンの非加水分解ヌクレオチド結合部位に結合することによってダイニン活性を制御することが示唆されている.そこで本年度の研究では,ADPが屈曲による滑りの切り替え制御に関与しているかどうかを検討した.除膜してエラスターゼ処理をしたウニ精子鞭毛軸糸を用いて,異なるADP濃度条件下で軸糸の屈曲による滑りの切り替えを誘導する実験系を構築した.すなわち,低pH,apyase存在下または高濃度Ca^<2+>,hexokinase存在下でcaged ADPの光分解またはADPを加えることによってADP濃度を増加させる手法を用いて,屈曲による滑りの切り替えに対するADPの効果を調べた.その結果,どちらの条件下でもADP濃度を増加させると屈曲によって滑りの切り替えが誘導される割合が増加した.この結果は,屈曲による滑りの切り替えにはADPの存在が重要であることを示唆する.これまでの知見と合わせると,屈曲によってダイニンへのADPの結合が起こりやすくなる,というような仕組みによって滑りの切り替えが誘導される可能性が考えられる.屈曲によって軸糸内のダイニンの活性部位が中心小管の両側で切り替わることを証明した平成18年度の成果を,平成19年9月に弘前大学で開催された日本動物学会第78回大会で発表した.
脳内神経ネットワーク見たモルヒネと吸入麻酔薬の作用機序に関する研究

線条体および海馬体神経細胞に対してwhole-cell patch clamp法によって吸入麻酔薬添加ごの静止膜電位と発火パターンの変化を観察し、可逆的な発火パターンの著明な乱れを認めた。これら神経細胞における情報伝達の乱れが、吸入麻酔薬のメカニズムである可能性が示唆された。吸入麻酔薬は,日常の麻酔臨床において臨床応用されているものの,その作用機序は未だ解明されていない.今回我々はPatch-clamp法を用いた神経細胞の静止膜電位変化およびそれぞれの神経細胞のもつ発火パンターンの変化様式により吸入麻酔薬が脳内神経伝達経路にあたえる影響を検討した.方法として,マウスに対して脳スライス標本を作成し,人工脳脊髄液(細胞外液)を還流しながら顕微鏡下に線条体の投射ニューロンであるMS (medium spiny)ニューロンに対してwhole-cell patch clampを行った.その後current clampモードによりその静止膜電位(RP)およびMSニューロンの発火を観察した。1015分間incubateしたのち人工脳脊髄液(細胞外液)に吸入麻酔薬(セボルフランおよびイソフルラン:2MAC)の添付を行い,経時的に発火パターンの変化を観察した.その結果,吸入麻酔薬(セボフルランおよびイソフルラン:2MAC)の添加15分後より発火パターンに変化が観察された.すなわち等間隔に発火していた様相に対して,吸入麻酔薬添付により変化が生じ,等間隔が損なわれ,バラバラに発火した.さらにGABA受容体の拮抗薬bicuculline(BMI):30μMの処理によってもこの『乱れ』は生じた.その後,吸入麻酔薬の添付を止めると,やはり1520分後には『乱れ』は消失し,吸入麻酔薬のもつ可逆性が示された.また、海馬のCA1細胞に対しても同様の実験を行い、可逆性のある発火乱れを認めた。このように吸入麻酔薬負荷によりMSニューロンに変化を与え,吸入麻酔薬の可逆性を呈することから,吸入麻酔薬の脳内神経伝達の影響が示唆された.加えて,BMI処理により変化ないことからGABA容体を介さない伝達経路に影響することも示唆された.私たちは意識形成に関与するGABA性抑制性インターニューロンが形成する脳内神経ネットワークの構成素因や機序などを明らかにしてきたが,今回吸入麻酔薬がこのネットワーク活動にどのような影響を与えるかについて検討した。方法として,マウス脳スライス標本を作成し,人工脳脊髄液を還流しながら顕微鏡下に線条体および海馬体神経細胞に対してwhole-cellpatch clampを行い,静止膜電位(RP)および細胞のもつ発火パターンをみた。その後,吸入麻酔薬の添加を行い,RPや発火パターンの変化を観察した。その結果,海馬CA1や歯状回における神経細胞のRPは約-80mVであった。そこへ吸入麻酔薬=セボフルランおよびイソフルランを還流させると,RPは変化ないものの,それぞれの細胞に特有の発火パターンは著明に変化した。また,発火する電位値も変化した。すなわち線条体細胞と同様に吸入麻酔薬の添加によりその均一さは失われ,『乱れ』が生じた。しかし,吸入麻酔薬中止により1020分の経過とともに『乱れ』はなくなり,元の発火パターンへと戻った。さらに,これら変化は海馬体の穎粒細胞や錐体細胞のみならず,介在細胞にまで観察された。このように,吸入麻酔薬は脳内における神経ネットワーク回路の情報伝達に変化(可逆性)を与えるものと思われた.この『乱れ』が吸入麻酔薬の作用機序そのものとは断定できないものの,皮質-線条体-視床-皮質というループ形成および海馬三シナプス性回路などに影響を与えることは十分に考えられる。これら神経細胞における情報伝達の『乱れ』は吸入麻酔薬メカニズムの解析に関連する可能性が示唆された。私たちは意識形成に関与するGABA性抑制性インターニューロンが形成する脳内神経ネットワークの構成素因や機序などを明らかにしてきたが,その研究成果をもとに吸入麻酔薬がこのネットワーク活動にどのような影響を与えるかについて検討した.マウス脳スライス標本を作成し,人工脳脊髄液を還流しながら顕微鏡下に線条体および海馬体神経細胞に対してwhole-cell patch clampを行い,静止膜電位(RP)および細胞のもつ発火パターンをみた.その後,吸入麻酔薬の添加を行い,RPや発火パターンの変化を観察した.海馬CA1や歯状回における神経細胞のRPは約-80mVであった.そこへ吸入麻酔薬:セボフルランおよびイソフルランを還流させると,RPは変化ないものの,それぞれの細胞に特有の発火パターンは著明に変化した.また,発火する電位値も変化した.すなわち線条体細胞と同様に吸入麻酔薬の添加によりその均一さは失われ,『乱れ』が生じた.しかし,吸入麻酔薬中止により1020分の経過とともに『乱れ』はなくなり,元の発火パターンへと戻った.さらに,これら変化は海馬体の顆粒細胞や錐体細胞のみならず,介在細胞にまで観察された.このように,吸入麻酔薬ば脳内における神経ネットワーク回路の情報伝達に変化(可逆性)を与えるものと思われた.

この『乱れ』が吸入麻酔薬の作用機序そのものとは断定できないものの,皮質-線条体-視床-皮質というループ形成および海馬三シナプス性回路などに影響を与えることは十分に考えられる.これら神経細胞における情報伝達の『乱れ』は吸入麻酔薬メカニズムの解析に関連する可能性が示唆された.