hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本近世における老人扶養・介護に関する実態的研究

「近世社会のなかの高齢者」はこの3年間に収集した資史料の分析と文献の整理を行いながら、研究史を振り返り問題点と課題をまとめたものであるが、あらためて近世社会の高齢者介護のありかたをみるうえでの視点に気がついた。これまで武家の日記からは、武士が親の看病や看取りにさいして「看病断」の制度を利用して自ら介護にあたる姿を確認していたが、日記は当主の目で当主自身の行為を中心に記録されている。当主の妻や母を始め他の家族員がそのさいどのように動き、役割を持っていたのかという、家族全体の動向を捉えた上で当主である男性の看病介護の中身を位置づける必要があり、これを通じてはじめて近世家族の高齢者介護のありかたの特質がみえてくることになる。また、庶民家族の扶養介護の問題では、個々の家族の経済状況が大きく影響するほかに、地域社会の扶助役割の役割が大きかったが、地域は直接的な介護負担を避けて金銭で負担を解決しようとする動きや、村を越えた広域地域で対応するなどの動向も確認できた。以上の点は期間内に個別論文としてまとめることはできなかったが、準備を進めている段階であり、近いうちに発表したいと考えている。
高速鉄道トンネル周辺での音環境改善を目指したアクティブ消音装置の開発

「リニア新幹線」や「700系新幹線」に見られるような列車の高速化や,二階建て新幹線のような車両の大型化に伴い,トンネル抗口において騒音が発生し,周辺の「音に対する環境」を悪化させている。一つは「トンネル微気圧波」であり,もう一つはリニア実験線で問題となった「連続的な低周波騒音」である。これらの騒音はトンネル坑口周辺での居住空間の音環境を悪化させ精神的な苦痛を与える。本研究では,列車の形状・速度,トンネル形状などの条件の違いに自動的に追従できる,アクティブな微気圧波・低周波騒音の消音技術を確立することを目指すものである。本研究の手法はトンネル内で正圧を用いて圧力波形を制御するという特徴を持ち,従来研究されてきたアクティブ消音手法の欠点(実現可能性・制御の安定性)が全くなく,しかも装置を非常に小型で安価にすることができる。平成16年度までに数値計算・模型実験により微気圧波の消音技術をほぼ確立した。平成17年度は,実際のトンネルへの応用条件を明らかにするとともに,トンネル坑口から放射される連続的な低周波騒音について,同じ手法を用いてアクティブ消音を試みた。微気圧波に比べ低周波音は連続的であり,その発生・制御には連続的にバルブを動作させる必要がある他,必要な空気量が膨大になる。低周波音を発生・制御できるようにサーボアクチュエータや駆動ソフトウェアを改良し,空気タンク容量を増加させた後,リニア実験線で観測された8Hz以下の低周波音を発生させることに成功した。位相を反転させた制御波を枝坑から発生・合成させることで,低周波騒音が技術的に消音可能であることを示した。高速列車がトンネルに突入するとトンネル内の空気を圧縮し圧縮進行波を生じる。圧縮進行波はトンネル内を音速で伝播するにつれ圧力勾配が切り立ち,トンネル出口に到達すると微気圧波騒音を発生させる。またトンネル内の器材坑(横穴)を列車が通過するときにできる圧力波が,トンネル坑口から放射されることで連続的な低周波騒音が発生する。これらの騒音はトンネル坑口周辺での居住空間の音環境を悪化させ住民に精神的な苦痛を与える。本研究ではこれらの騒音に対応可能なアクティブな消音装置の開発を目指している。これまでに,トンネル内で枝坑から正圧の制御波を発生させる本研究の消音手法は,ある程度の制御タイミングのずれや圧力不足があっても,消音制御の安定性が高いことを数値計算で明らかにし,トンネル模型を使った消音装置でその実証実験を行ってきた。平成16年度は,より実用化に近い研究に移行し,アクティブな微気圧波の消音システムの開発を目指した研究を行った。新幹線の先頭車両形状や突入速度,トンネル毎に異なる内部構造により,発生する圧縮進行波の先頭波形形状は一定ではない。そこで,発生した圧縮進行波の先頭波形に応じて,最適な制御波を発生させ微気圧波を消音することを目指し,任意の波形を持つ制御波を発生させるため2種類の手法を検討した。1つは制御波発生用サーボバルブ駆動曲線と発生した制御波圧力波形の間の伝達関数を実験により明らかにしてしまう手法である。もう1つは圧縮性流体理論から,タンク内圧力を大気圧の2倍以上の一定値に保つことで噴出する粒子速度をほぼ音速にチョークさせ,開口面積に比例した圧力を得る手法である。前者は,必要十分な精度で伝達関数を求めることができなかったが,後者については,良好な実験結果が得られ,タンク内圧力を十分高く設定すれば,効率よく開口面積に比例した制御波圧力が得られることを明らかにした。

一つは「トンネル微気圧波」であり,もう一つはリニア実験線で問題となった「連続的な低周波騒音」である。これらの騒音はトンネル坑口周辺での居住空間の音環境を悪化させ精神的な苦痛を与える。本研究では,列車の形状・速度,トンネル形状などの条件の違いに自動的に追従できる,アクティブな微気圧波・低周波騒音の消音技術を確立することを目指すものである。本研究の手法はトンネル内で正圧を用いて圧力波形を制御するという特徴を持ち,従来研究されてきたアクティブ消音手法の欠点(実現可能性・制御の安定性)が全くなく,しかも装置を非常に小型で安価にすることができる。前年度までに数値計算・模型実験により微気圧波の消音技術をほぼ確立し,実際のトンネルへの応用条件まで明らかにした。平成17年度はトンネル坑口から放射される連続的な低周波騒音について,同じ手法を用いてアクティブ消音を試みた。微気圧波に比べ低周波音は連続できであり,その発生・制御には連続的にバルブを動作させる必要がある他,必要な空気量が膨大になる。低周波音を発生・制御できるようにサーボアクチュエータや駆動ソフトウェアを改良し,空気タンク容量を増加させた後,リニア実験線で観測された8Hz以下の低周波音を発生させることに成功し,消音実験により本手法を用いて低周波騒音が技術的に消音可能であることを示した。
環境水中リン酸イオンの簡易な超高感度分析法の開発

本研究では、水中の極微量レベルのリン酸を測定する方法として、HPLCと組み合わせたオンライン固相抽出法の開発を行った。通常の高感度測定法より検出感度は著しく改善された(0.1μg PO_4/L)。本法では、モリブデンブルーと四級アンモニウムイオンのイオン会合体をDOSミニカラムで捕捉・濃縮し、CH_3CN/H_2Oの移動相で溶出させてuv/vis検出器で定量を行った。本法は、測定範囲が広く(0.1-200μg PO_4/L)、かつ塩分の影響を受けないことが特長である。環境水中のリンの挙動解明やリン除去技術開発において、リン酸イオンを超高感度で測定することが重要な課題となっている。本研究における課題のひとつは手分析で行える簡易な超高感度測定法の開発であり、その方法としてメンブレン抽出法の開発を行った。最適なイオン対形成試薬とその反応条件を明らかにするとともに、Siの妨害を抑制する条件についても明らかにした。その結果、目標を上回る検出限界(0.3μg-PO4/L)を達成することができた。本法は、通常の分光光度計のみで測定が可能であるが、現状の自動分析装置と同程度の検出限界であり、かつ、従来法により発色したモリブデンブルー溶液に本法を適用できることを明らかにした。もう一つの超高感度測定法としてオンライン固相抽出法の開発を行った。本法は、メンブレン抽出に代えてODSカラムでモリブデンブルーのイオン対を抽出濃縮する方法であり、測定の自動化が可能である。モリブデンブルー形成及びイオン対形成条件は、上記メンブレン抽出法に準じて行い、オンライン固相抽出条件の最適化を行った。試料供給量、送液速度、カラム抽出溶媒と供給速度、カラム再生条件等について検討を行った。また、海水中のリンの測定に及ぼす影響についても検討し、高濃度NaCl溶液においても測定を妨害しないことを明らかにした。検出限界は0.14μg-PO4/Lであり、ほぼ目標を達成した。また、ダイナミックレンジの上限は100μg-PO4/Lと極めて広い濃度範囲で適用可能であることが明らかとなった。現在、さらにオンライン固相抽出条件の検討を進めており、検出限界をさらに改善できる可能性が示されている。次年度は、検出限界のさらなる改善を行うとともに、環境試料について測定を行う。本研究における課題は簡易な超高感度測定法の開発であり、その方法としてオンライン固相抽出法の開発を行った。本法では、リン酸イオンからモリブデンブルーを生成し、モリブデンブルーと4級アンモニウムイオンとのイオン対をODSカラムで抽出濃縮する方法であり、測定の自動化が可能である。本法により、昨年度はリン酸イオンを0.14μg-PO_4/L100μg-PO_4/Lの範囲で定量できる条件を開発し、本年度はさらに高感度測定のための条件の開発を行った。高感度測定を可能とするためには、ブランク値の低減と安定化が課題である。そのための重要な課題は、ODSカラムのコンディショニング条件であり、未反応試薬の除去とカラムの再生方法について検討を行った。次いで、クロマトグラムのベースラインの安定化により検出感度を改善するため、イオン対の溶離条件について検討を行った。特に、カラム抽出溶媒の組成についてイソクラティックモードに加えてグラディエントモードについて最適化を行った。その結果、検出限界を0.06μg-PO_4/Lまで改善することができた。この検出限界は、既存のFIAによる自動分析装置で達成できる検出限界より高感度である。現在、報告されている検出限界は0.03μg-PO_4/Lであることから、次年度はさらに検出限界の改善法について検討を行う。また、河川水(渓流水等)や海水などの環境試料について測定を行い、本法の適用可能性について検討を行う。環境水中のリンの挙動解明やリン除去技術開発において、リン酸イオンを超高感度で測定することが重要である。本研究では、リン酸イオンから生成したモリブデンブルーに4級アンモニウムイオンを添加してイオン対を形成し、このイオン対をODSカラムで捕捉濃縮し、有機溶媒で脱着して紫外可視吸光度検出器で定量する方法を開発した。本法において、検出感度を向上させるためには、イオン対を含む溶液の供給量に加えて、ブランク値の低減と安定化が重要である。反応試薬条件、イオン対形成反応条件、ODSカラムによる捕捉とカラム洗浄条件、イオン角溶離条件の最適化を行った結果、検出限界として0.1μg-PO_4/Lを達成することができた。

この検出限界は、現在まで報告されている最高の検出限界に相当している。本法における定量範囲の上限は、200μg-PO_4/Lであり、測定のダイナミックレンジは極めて広いことが特長として指摘できる。既存のFIAによる自動分析装置によって海水中のリンを測定する場合、試料の塩分濃度が高いことによる屈折率の影響のため、専用の標準溶液を調整する必要がある。しかしながら、本法では3.5%のNaCl溶液においても、全く妨害が認められず、海水試料についても共通の検量線を使用できることが明らかとなり、多様な試料を同時に測定できることが示された。本研究において開発した高感度リン酸イオン測定法を用いて、河川上流部にあるダム湖の水質を測定した。これら試料のリン酸イオン濃度は1μg-PO_4/L付近で、FIAによる自動分析装置の定量限界値付近であったが、本法測定によって高い精度で測定することができた。
高効率なネットワーク資源配分を用いたスケーラブルなリアルタイムデータ配信方式

本研究では,マルチキャストに参加するエンドノードのリソース貢献度に応じたインセンティブを支払いながら,全体としても低遅延マルチキャスト木が自律的に構築されるようなインセンティブ配分法およびプロトコルを提案する.本年度はインセンティブを用いて,総遅延の小さくバランスの取れたマルチキャスト配信木を構築するためのアルゴリズムの検討を行なった.また,従来のデータ配信木構築方式に対してどの程度効果があるかを比較するため,それぞれシミュレータに実装し,負担したコストに対して具体的にどれだけのインセンティブを割り当てれば,最も効果的であるかについての検討を行なった.提案プロトコルでは,参加ノードの総数,各ノードが提供可能な次数(申告出次数),平均遅延などの情報を収集し理想とする低遅延マルチキャスト木モデルを計算する(この木を理想木と呼ぶ).この理想木と各ノードの申告出次数からノードの理想木における位置(理想位置)をソースノードからの遅延として各ノードに提示する.次に,ノードが理想位置に近づくほど,そのノードの獲得インセンティブが増加するようにインセンティブを設定することでノードを理想位置へと誘導する.また,申告出次数に対する実際の提供出次数に応じたインセンティブを配分することで,ノードが積極的に他ノードの接続を受け入れるごとを報償するとともに,空き次数が多いマルチキャスト木が構成されることを抑制する.この結果,低遅延の配信木を自律的に構築させることが可能となる.このプロトコルに対してシミュレーションによる性能評価を行った結果,提案手法により構築されるマルチキャスト木の最大遅延は,最適値に近い最大遅延を実現できる集中型のプロトコルとほぼ同程度に押さえられていることを確認した.本研究では,マルチキャストに参加するエンドノードのリソース貢献度に応じたインセンティブを支払いながら,全体としても低遅延マルチキャスト木が自律的に構築されるようなインセンティブ配分法およびプロトコルを提案する.本年度はインセンティブを用いて,総遅延の小さくバランスの取れたマルチキャスト配信木を構築するためのアルゴリズムの検討を行なった.また,従来のデータ配信木構築方式に対してどの程度効果があるかを比較するため,それぞれシミュレータに実装し,負担したコストに対して具体的にどれだけのインセンティブを割り当てれば,最も効果的であるかについての検討を行なった.提案プロトコルでは,参加ノードの総数,各ノードが提供可能な次数(申告出次数),平均遅延などの情報を収集し理想とする低遅延マルチキャスト木モデルを計算する(この木を理想木と呼ぶ).この理想木と各ノードの申告出次数からノードの理想木における位置(理想位置)をソースノードからの遅延として各ノードに提示する.次に,ノードが理想位置に近づくほど,そのノードの獲得インセンティブが増加するようにインセンティブを設定することでノードを理想位置へと誘導する.また,申告出次数に対する実際の提供出次数に応じたインセンティブを配分することで,ノードが積極的に他ノードの接続を受け入れるごとを報償するとともに,空き次数が多いマルチキャスト木が構成されることを抑制する.この結果,低遅延の配信木を自律的に構築させることが可能となる.このプロトコルに対してシミュレーションによる性能評価を行った結果,提案手法により構築されるマルチキャスト木の最大遅延は,最適値に近い最大遅延を実現できる集中型のプロトコルとほぼ同程度に押さえられていることを確認した.
超重力理論を用いたゲージ理論の非摂動論的解析

AdS/CFT対応は、反ド・ジッター(AdS)時空上の超弦理論や超重力理論と1次元低い時空上で定義された共形場理論(CFT)との等価性を示すものであり、場の理論の非摂動論的性質を解析するための新たな方法として注目されている。当初のAdS/CFT対応では、共形対称性と高い超対称性をもった理論が主に扱われていたが、現実的なゲージ理論に適用するためには、より低い対称性を持つ場合を考える必要がある。本研究では、低い対称性を持った理論に対するAdS/CFT対応について考えるために、摂動による対称性の破れについて調べた。具体的には、IIB型超弦理論からトーラス・コンパクト化によって得られる6次元の最大の超対称性をもった超重力理論を使った。この6次元の理論は、3次元AdS時空と3次元球面の直積の形の解を持ち、その解はN=(4,4)超共形対称性をもった2次元のCFTに対応する。この解にベクトル場の摂動を付け加え、N=(4,4)超共形対称性がどのように破れるかについて、CFT側と超重力理論側の両方でくわしく調べた。CFT側では、この摂動は共形ウェイトが(2,2)または(1,1)の演算子に対応する。CFT側と超重力理論側の両方で、N=(4,4)超共形対称性が、(2,2)演算子の場合はN=(4,2)ポアンカレ超対称性に、(1,1)演算子の場合はN=(4,0)超共形対称性に破れることを示した。CFT側と超重力理論側の結果の一致は、AdS/CFT対応の仮説が正しいことを示す新しい証拠とみなすこともできる。その後、有限温度や有限粒子密度の場合のゲージ理論の相構造を、対応する超重力理論の解を用いて解析する研究を行い、現在も継続中である。本年度の研究では、低い対称性を持った理論に対するAdS/CFT対応について考えるために、摂動による対称性の破れについて調べた。この解にベクトル場の摂動を付け加えた新しい解が、すでに知られていた。この摂動によって、N=(4,4)超共形対称性がどのように破れるかについて、CFT側と超重力理論側の両方でくわしく調べた。CFT側では、この摂動は、共形ウェイトが(2,2)または(1,1)の演算子に対応することがわかる。これらの演算子と超Virasoro

代数の生成子との交換関係を計算することによって、N=(4,4)超共形対称性が、(2,2)演算子の場合はN=(4,2)ポアンカレ超対称性に、(1,1)演算子の場合はN=(4,0)超共形対称性に破れることを示した。超重力理論側では、フェルミオン場の超対称性変換を調べることにより、CFT側とまったく同じ対称性の破れが得られることを示した。CFT側と超重力理論側の結果の一致は、AdS/CFT対応の仮説が正しいことを示す新しい証拠とみなすこともできる。これらの結果は、現在投稿準備中の論文で発表する予定である。AdS/CFT対応は、反ド・ジッター(AdS)時空上の超弦理論や超重力理論と1次元低い時空上で定義された共形場理論(CFT)との等価性を示すものであり、場の理論の非摂動論的性質を解析するための新たな方法として注目されている。当初のAdS/CFT対応では、共形対称性と高い超対称性をもった理論が主に扱われていたが、現実的なゲージ理論に適用するためには、より低い対称性を持つ場合を考える必要がある。昨年度から引き続いて行った研究では、低い対称性を持った理論に対するAdS/CFT対応について考えるために、摂動による対称性の破れについて調べた。具体的には、IIB型超弦理論からトーラス・コンパクト化によって得られる6次元の最大の超対称性をもった超重力理論を使った。この6次元の理論は、3次元AdS時空と3次元球面の直積の形の解を持ち、その解はN=(4,4)超共形対称性をもった2次元のCFTに対応する。この解にベクトル場の摂動を付け加え、N=(4,4)超共形対称性がどのように破れるかについて、CFT側と超重力理論側の両方でくわしく調べた。CFT側では、この摂動は共形ウェイトが(2,2)または(1,1)の演算子に対応する。CFT側と超重力理論側の両方で、N=(4,4)超共形対称性が、(2,2)演算子の場合はN=(4,2)ポアンカレ超対称性に、(1,1)演算子の場合はN=(4,0)超共形対称性に破れることを示した。その後、有限温度や有限粒子密度の場合のゲージ理論の相構造を、対応する超重力理論の解を用いて解析する研究を行い、現在も継続中である。
高温超伝導体原子層デバイスの創製とその応用

グラファイト(黒鉛)は炭素原子が作る蜂の巣格子が積み重なった構造をとり、その一原子層をグラフェンと呼ぶ。グラフェンのように層状の結晶構造を持つ物質は、3次元的な物質では見られない物性を示すことから注目されている。そのような層状物質の中でも、極めて高い温度で超伝導(電気抵抗がゼロになる現象)を示す高温超伝導体について、ナノスケールのデバイスを作製し、原子層薄膜の電気伝導特性を測定する。さらに、超伝導と電子の磁気的な性質を組み合わせることで、新たな磁気センサの開発や、超伝導の起源に迫ることを目指す。
波長チャネルと非線形相互変調効果を用いた半導体マイクロリング光信号処理回路の研究

本研究では,マイクロリング共振器に半導体光増幅器(SOA)を導入して,SOA中での信号光自身の自己位相変調(SPM)や入力信号光と制御光間の相互利得変調(XGM)および相互位相変調(XPM)を共振器によって増強して光-光高速変調に利用し,高速光パルス信号のリミッタなどの波形整形,インバータや2入力信号のXORなどの基本演算を,波長チャネルを用いて可能にする半導体マイクロリング光信号処理回路の実現を目的として,研究を開始した。実際にフォトマスクの作製や結晶成長用混合ガスなどの消耗品の購入を行い研究を進めつつあったが,その途中で,基盤研究(S)の追加採択が決まったため,本研究を廃止することにした。
湖沼で蓄積する難分解性溶存有機物の動態とトリハロメタン生成能の評価

霞ケ浦湖水,流入河川水、流域の溶存有機物(DOM)発生源水(森林渓流水、畑地浸透水、田面流出水、下水処理水,生活雑排水,し尿処理水等をDOM分画手法(生分解試験+フミン物質の分離に基づく樹脂分画)に供し,サンプルDOMおよび難分解性DOMをフミン物質,疎水性中性物質,親水性酸,塩基物質,親水性中性物質の5つに分画した。引き続いて,ろ過サンプル,フミン物質,親水性画分(HlF:親水性酸+塩基+親水性中性物質)のトリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。霞ヶ浦湖水、河川水および流域水サンプルでは、有機酸画分(フミン物質と親水性酸)が優占していた。湖水では親水性酸が特に優占し、河川水ではフミン物質と親水性酸が同程度存在した。DOM濃度の低い森林渓流水や畑地浸透水ではフミン物質が圧倒的に優占していた。下水処理水、生活雑排水、藻類培養後培地、田面流出水では親水性酸の存在比がフミン物質よりも大きかった。難分解性DOMとしては、湖水では親水性酸、河川水ではフミン物質が代表的であることが明らかとなった。藍藻類由来の難分解性DOMとしてフミン物質の存在は無視できると示唆された。湖水においてはフミン物質とHiFのTHMFPに有意な差はなかった。湖水中の存在濃度を考慮すると、湖水ではフミン物質ではなくHiFのほうが主要なトリハロメタン前駆物質であることが明らかとなった。生分解プロセスのTHMFP(μmol THM mgC^<-1>)に及ぼす影響を評価したところ、湖水DOMやフミン物質のTHMFPは生分解により少し上昇したが、HiFのTHMFPは生分解によりかなり増大した。流入河川水および様々な流域水サンプルにおいて、し尿処理水を例外として、生分解プロセスにより、フミン物質のTHMFPはあまり変化しないが、DOMおよびHiFのTHMFPが顕著に増大した。したがって、河川水や流域水サンプルにおいて、DOMのTHMFPは、生分解によって、THMFPの高い難分解性HiFが生成あるいは残ぞする事により著しく増大すると示唆された。長期間生分解試験の実験条件を確立した。湖水,河川水および溶存有機物(DOM)発生源水中のDOMの溶存有機炭素(DOC)濃度はほとんど全てのケースで約60日間の20°C,暗所,約60rpm振とうで安定化した。サンプルをより確実に難分解性化するために,100日間の生分解試験後に残存するものを難分解性DOMと定義した。霞ヶ浦湖水(5地点),DOM発生源水(流入河川水,下水初沈水,下水処理水,生活雑排水,し尿処理水,田面流入水・流出水,森林渓流水,藻類培養後ろ液(藍藻,緑藻,珪藻)やヨシ・ガマの繁茂する池の水をDOM分画手法(生分解試験+フミン物質の分離に基づく樹脂分画)に供し,サンプルDOMをフミン物質,疎水性中性物質,親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画した。

引き続いて,ろ過サンプル(DOM)フミン物質(AHS),親水性画分(HiF:親水性酸+塩基+親水性中性物質)のトリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。実際の存在濃度を考慮するために測定値に溶存有機物濃度を乗じたμmoleTHM・L^<-1>としてTHMFPを評価した。河川水ではAHSとHiFのTHMFPはほぼ等しいかったが,湖水ではHiFのTHMFPがAHSの約2倍の値を示した。以上の結果より,河川水では既報のようにAHSも代表的なTHM前駆物質と言えるが,湖水ではHiFがAHSよりも重要なTHM前駆物質であると結論される。下水処理場関係サンプルについても興味深い結果が得られた。下水初沈水(沈殿処理後の下水)と処理水のTHMFPを比較したところ,下水処理水のほうが下水初沈水よりもTHMFPが高い結果となった(初沈水:0.45μmole・L^<-1>,STPE:0.68μmole・L^<-1>)。すわなち,下水処理場は下水を処理することでトリハロメタンに関するリスクを増大させていると言える。霞ケ浦湖水(5地点),DOM発生源水(流入河川水,下水初沈水,下水処理水,生活雑排水,し尿処理水,田面流入水・流出水,森林渓流水,藻類培養後ろ液(藍藻,緑藻,珪藻)やヨシ・ガマの繁茂する池の水をDOM分画手法(生分解試験+フミン物質の分離に基づく樹脂分画)に供し,サンプルDOMをフミン物質,疎水性中性物質,親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画した。引き続いて,ろ過サンプル(DOM),フミン物質(AHS),親水性画分(HiF:親水性酸+塩基+親水性中性物質)のトリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。サイズ排除クロマトグラフィにより,湖水中のDOM, AHSおよびHiFの分子量分布を測定した。湖水DOM, AHSおよびHiFは全て分子量分布の狭い,比較的低分子の有機物の集合体であることが示唆された。DOM, AHS, HiFの平均分子量は各々780, 960, 610g mol^<-1>であった。疎水性有機酸であるフミン物質は親水性DOMよりも高い分子量を持つことがわかった。霞ヶ浦湖水,溶存有機物(DOM)発生源水(河川水,下水初沈水,下水処理水,生活雑排水,し尿処理水等をDOM分画手法(生分解試験+フミン物質の分離に基づく樹脂分画)に供し,サンプルDOMをフミン物質,疎水性中性物質,親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画した。引き続いて,ろ過サンプル(DOM)、フミン物質(AHS),親水性画分(HiF:親水性酸+塩基+親水性中性物質)のトリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。生分解プロセスのTHMFP(μmolTHMmgC^<-1>)に及ぼす影響を評価した。湖水DOMおよびフミン物質のTHMFPは生分解前後で少し(約4%)上昇した。一方、親水性画分のTHMFPは生分解によりかなり増大した(約14%)。霞ヶ浦に流入する河川水では、湖水とは異なり、生分解前後でフミン物質のTHMFPは少し減少し、DOMおよび親水性画分、特に親水性画分のTHMFPが顕著に増大した。また、下水初沈水や生活雑排水等の生分解性の高いサンプルでは生分解前後でTHMFPが極端に異なった。下水初沈水および生活雑排水のTHMFPは生分解によりDOMで各々9倍、10倍増大し、親水性画分では各々16倍、5倍増大した。両サンプルともフミン物質のTHMFPは約8%減少した。一方、既に生分解処理を既に受けている下水処理水のTHMFPは、生分解によって、DOMで30%上昇、フミン物質で8%減少、親水性画分で40%増大した。
膜結合型増殖因子の機能制御機構

細胞膜結合型増殖因子の代表例としてproHB-EGFを用いて、細胞膜表面での切断(shedding)後に産生されるC-末端フラグメント(CTF)の機能を解析した。その結果、(1)CTFはエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、小胞輸送の逆経路を経て核膜内膜に局在する、(2)複数の転写抑制因子と相互作用し、細胞増殖に必須の遺伝子発現を制御する、(3)いくつかの癌腫でCTFシグナルが恒常的に入っていることを明らかとした。膜型増殖因子proHB-EGFは細胞膜表面でsheddingを受け、カルボキシ末端断片(HB-EGF-CTF)を産生する。HB-EGF-CTFは速やかに核に移行し転写抑制因子PLZFと結合し、これを核外にくみ出す反応を惹起する。この基本的な実験結果を基に以下の5項目につき研究を推進した。1:膜型増殖因子HB-EGF-CTFシグナルの独立操作系の開発内在性フーリンによるHB-EGF-CTF産生用プラスミドを構築し、発現したところ、薬剤によるshedding誘導なしにHB-EGF-CTFが産生し、ER/核膜への移行を確認した。現在、本EIB-EGF-CTFによるPLZFの機能解除を解析している。(論文作成中)2:標的リプレッサーのプロファイリングPLZFならびにBcl6のHB-EGF-CTF結合領域の解析からコンセンサス配列を予測し、これを基に各種遺伝子データーベースから隠れマルコフモデルを用いて検索を実施し、ヒトとマウス転写抑制因子をコードする遺伝子をそれぞれ479個、446個同定した(論文作成中)。PLZF5-8/HB-EGF-C複合体形成阻害剤のスクリーニングは、まず複合体測定システムを確立し、6000種の低分子化合物より行った。その結果、3化合物を同定し、その1化合物が細胞増殖抑制効果を示すことを観察した。HB-EGF-CTFシグナルの標的リプレッサーとしてPLZFを同定したが、その他のリプレッサーがHB-EGF-CTFシグナルの標的になりうるのかどうかを検討するために、PLZFの属するBTB/POZ-ZnFファミリーで一次構造上最も類似しているBcl-6について検討を加えた。その結果、まず免疫沈降法ならびにGST-pull downによりBcl-6がHB-EGF-CTFと結合することが確認できた。次に、Bcl-6が細胞周期制御因子の一つcyclin D2の遺伝子発現抑制をしていることが報告されていることから、cyclin D2 promoter-Luciferaseをレポーター遺伝子として用いてBcl-6によるcyclin D2遺伝子の発現抑制をHB-EGF-CTFが解除するかどうかを検討した。Bcl-6結合部位に変異を入れたミュータントcyclin D2 promoter-Luciferaseをコントロールとしてヒト繊維芽肉腫細胞株HT1080細胞でLuciferaseアッセイを行った。まず内在性Bcl-6の転写抑制活性がBcl-6特異的siRNAによる遺伝子ノックダウンにより有意に阻害されることを確認した。このアッセイシステムに野生型proHB-EGF、shedding抵抗性ミュータントproHB-EGF、細胞内ドメイン欠損ミュータントproHB-EGFΔcの各遺伝子を導入し,TPA処理によりsheddingを誘導した。その結果、野生型を導入した細胞でのみBcl-6による転写抑制が解除された。以上の結果からHB-EGF-CTFがBcl-6による転写抑制を解除することができると結論づけた。また、細胞にshedding刺激が加わると、これにより産生されるHB-EGF-CTFとsheddingされずに細胞膜に残るunshed proHB-EGFは共に、エンドサイトーシスにより細胞内に取込まれることを明らかにした。さらに、これらは、低分子量G蛋白質のRab5とRab11による小胞輸送機能により、リサイクリングエンドゾームを経由して,ゴルジ装置、ERに運ばれることを明らかにした。また、ERに局在化したHB-EGF-CTFとunshed proHB-EGFは核膜内膜に局在化できることを免疫電子顕微鏡観察により明らかにした。これらの糸課より、細胞膜蛋白質力叉レトログレート小胞輸送により核膜内膜に局在しうることを世界に先駆けて証明した。HB-EGFは細胞膜に発現するI型膜蛋白質であり、その細胞外領域は増殖因子活性を有する。細胞に様々な刺激が加わると、膜型HB-EGFはsheddingを受けHB-EGF-CTFを産生する。HB-EGF-CTFと同時に、sheddingされずに細胞膜に残るunshed proHB-EGFは、共にエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、核膜内膜に局在変化することをこれまでに明らかにしてきた。また、核膜内膜において転写リプレッサーと結合し、これらの機能を制御することを報告してきた。

本年度では、HB-EGF-CTFの標的リプレッサーの一つであるBCL-6が、HB-EGF-CTFとの結合により、その蛋白質の不安定性が増し、蛋白質分解によってその機能が負に制御されることを示した。一方、HB-EGF-CTFの標的リプレッサーのスクリーニングから、さらに4つの標的リプレッサーを同定した。これら4種共に、構造的な特徴を共有し、N-末端側にKRABドメインを持ち、G-末端側にC2H2Znフィンガードメインを持つKRAB-ZNフィンガーファミリーに属する転写リプレッサーであることが明らかとなった。また、これら4種共に、これまでに報告の無い因子であることから、KRAB-1, KRAB-2, KRAB-3, KRAB-4とそれぞれ命名した。それぞれのリコンビナント蛋白質を作成し、HB-EGF-CIFとの結合をin vivo実験において確認した。さらに、細胞内局在を検討した結果、4種共に核内局在を示した。KRAB-1, KRAB-2, KRAB-3, KRAB-4のそれぞれに機能については現在解析を進めているところである。HB-EGFは細胞膜に発現するI型膜蛋白質であり、その細胞外領域は増殖因子活性を有する。細胞に様々な刺激が加わると、膜型HB-EGFはsheddingを受けHB-EGF-CTFを産生する。HB-EGF-CTFと同時に、sheddingされずに細胞膜に残るunshed proHB-EGFは、共にエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、核膜内膜に局在変化することをこれまでに明らかにしてきた。また、核膜内膜において転写リプレッサーと結合し、これらの機能を制御することを報告してきた。本年度では、まず、HB-EGF-CTFの標的リプレッサーとして新規に同定したZF50の機能解析を行った。ZF50は血管内皮細胞に比較的特異性を持って発現していることから、血管内皮細胞において何らかの機能を果たしていることが予測される。そこで、siRNAによるZF50 mRNAノックダウンを施した血管内皮細胞の特性を解析した。その結果、興味深いことに、血管内皮細胞増殖因子VEGFに対する細胞増殖能にはほとんど変化はないが、マトリゲル上で誘導されるネットワーク形成が、顕著に抑制されることが明らかとなった。このことから、ZF50は血管新生に関与する因子であることが予測されたことから、ノックアウトマウスを作製し、個体発生過程、並びに病態誘導における血管新生を解析した。ZF50-/-は予想とは大きく異なり、見かけ上は野生型とほとんど変化なく成長する。また、胎生期10.5日胚マウスの血管形成にも大きな以上は認められなかった。しかし、新生仔の網膜血管形成を経時的に観察すると、14日目までの網膜血管のネットワーク形成に大きな遅延が認められた。現在その分子メカニズムの詳細を解析しているところである。
マルチブロック共重合体のループ含率とレオロジー挙動の関連の解明

ブタジエン(B)とスチレン(S)を成分とする(BSB)_p型マルチブロック共重合体(p=1-3)をS-選択性のフタル酸ジブチルに溶解した系に対し、構造とレオロジー挙動を調べた。平衡状態では沈殿BドメインをSブロックが連結した網目構造に由来する静的弾性が観察されたが、流動下では、流動面をまたぐブリッジ型Sブロックがループ型になるために弾性が消失することが見いだされた。さらに、ブリッジ型Sブロックの再生が流動停止後の弾性回復の律速過程となること、この弾性回復時間は、ブリッジ再生に必要な過渡的なSIB混合の熱力学的バリアのみならず、ブロック鎖同士の絡み合いにも強く影響されることを明らかにした。スチレン(S)とイソプレン(I)を成分とする(SIS)_p型マルチブロック共重合体(p=1-5)をI-選択性のテトラデカンに溶解した系に対して、誘電測定を行った。共重合体の特定のIブロックだけに双極子反転を導入し、このIブロックの誘電応答を選択的に検出することで、平衡状態におけるループ含率φ_<loop>を各1ブロックに対して決定した。その結果、共重合体鎖の中央のIブロックの方が端部のIブロックより小さなφ_<loop>を持つこと、また、全ブロック数の増加に伴いφ_<loop>は微増した後に漸近値(*60%)に至ることを明らかにした。さらに、共重合体中のブリッジ型Iブロックの高い延伸性(最大伸長比=30)は、共存しているループ型Iブロックが延伸下で示す浸透圧効果に由来することも明らかとなった。共重合体ダイナミクスの基礎的理解のために、星形ホモポリイソプレン系に対して粘弾性および誘電測定を行い、束縛解放機構がこの系の緩和を支配することを明らかにした。さらに、屈曲性鎖の基礎モデルであるバネービード・モデルの理論解析から、一定応力下のクリープ過程では鎖の全セグメントが配向相関を示すことなどを明らかにした。本研究ではスチレン(S)とブタジエン(B)を構成ブロックとするBSジブロック、BSBトリブロック、BSBSBペンタブロック、BSBSBSBヘプタブロック共重合体をアニオン重合法で合成し、その構造と非線形レオロジー挙動を調べることで、ブロック形態が系の力学特性に与える効果を検討した。Sブロックのみを溶解するフタル酸ジブチル(DBP)中で、これらの共重合体のBブロックは球状のミクロドメインを形成し、BSジブロック共重合体のSブロックはBドメインにグラフトされたテール型のコンホメーションを、また、それ以外のマルチブロック共重合体のSブロックは隣接Bドメインをつなぐブリッジ型および同一Bドメインにアンカーされたループ型のコンホメーションをとる。定常流動によって、これらの系の弾性は著しく低下したが、小角中性子散乱測定から、この弾性低下は、流動によるBドメイン配列の乱れに由来することがわかった。さらに、流動停止後の弾性の回復挙動を調べたところ、BSジブロック系ではドメイン配列の乱れが大きいほど弾性回復も遅いという容易に予想される結果が得られたが、その他のマルチブロック系は、弾性回復に要する時間がドメイン配列の乱れの程度に依存しないという特異な挙動を示した。この挙動から、流動によってループ型に転化したSブロックがブリッジ型へと回復する過程が系の弾性回復を支配すること、さらに、このコンホメーション変化の律速過程がB、S両ブロックの過渡的混合過程であることが推察された。

また、トリブロック、ペンタブロック、ヘプタブロック系の順に弾性回復時間が約10倍づつ増加するという興味ある結果が得られたが、この結果から、B、S両ブロックの過渡的混合の自由エネルギーが熱エネルギーと同程度(〓2.5kJ/mol)であることが推定された。マルチ・ブロック共重合体系のレオロジー特性は、内部ブロックのコンホメーション(ループ型もしくはブリッジ型)に強く影響される。本研究では、スチレン(S)とブタジエン(B)を成分とするBSBトリブロック、BSBSBペンタブロック、BSBSBSBヘプタブロック共重合体を、Sブロックに対する選択性溶媒であるフタル酸ジブチル(DBP)に溶解した系に対して、流動下、および、流動停止の構造とレオロジー挙動を調べた。平衡時の系では、沈殿Bドメインを可溶化Sブロックが連結した体心立方格子型の網目構造が形成され、この網目に由来する静的弾性が観察された。この系に流動を印加すると、流動速度がB/S濃度揺らぎの周波数に近い時に網目構造がもっとも強く破壊され、流動面をまたぐブリッジ型Sブロックがループ型に転化することによって、静的弾性が消失することが明らかとなった。さらに、流動停止後の弾性回復に要する時間は、網目構造の破壊の程度に依存しないという特異な挙動が観察された。この挙動から、流動によってループ型に転化したブリッジ型Sブロックの再生が弾性回復の律速過程であると考えられた。さらに、この考えに基づき、BSB、BSBSB、BSBSBSB系の弾性回復時間の差を解析した所、この時間は、ブリッジ型Sブロックの再生のために必要な過渡的なS/B混合の熱力学的バリアのみならず、ブロック鎖同士の絡み合いにも強く影響されていることがわかった。このような絡み合い緩和の基礎的理解のために、モデルホモポリマー系に対してレオロジー測定と誘電緩和測定を行い、束縛解放機構が緩和に大きな寄与をもつことを明らかにした。さらに、現在の絡み合いモデルの基礎骨格をなすバネ-ビード・モデルの精密解析も行い、クリープ過程では、応力を一定に保つように、鎖の全セグメントが配向相関を示すことなどを明らかにした。
DNAの構造変化とそれに及ぼす宿主因子に関する分子生物学的基礎研究

ウシパピローマウィルスシャトルベクターを用いて,動物細胞及び原核細胞における遺伝相同組換えを調べる実験系を確立した。まず第1には,1型ウシパピローマウィルスゲノムを含むシャトルベクター上に,SV40由来の約850bpのDNAをネオマイシン耐性遺伝子を挟んで同方向反復配列(pDR),又は逆向き反復配列(pIR)になるように配置した。これらをマウスC127細胞に導入し,約一カ月後に染色体外に存在するDNAを解析したところ,pDRでは約30-50%の高い頻度で相同反復配列間での交叉によりプラスミドの一部欠失が認められた。16クローンにつき制限酵素によるマッピングを行ったところすべて同一パターンを示した。このうち5クローンにつき塩基配列を決定したところ相同組換えが正確に起こっていたが,例外として1クローンにおいて塩基対のみの置換が認められた。一方,PIRの場合,染色体外にはpIRが主に検出され組換え体は極小量しか検出できなかった。即ち動物細胞において反復配列の方向性が組換え体形成に著しい影響をもたらすことがわかった。第2に,ウシパピローマウィルスシャトルベクター上に,欠損部位が異なる2個のネオマイシン耐性遺伝子を挿入し,相同組換えが起こると正常遺伝子を発現するように構築した。これを遺伝子組換え経路の異なる大腸菌に導入したところ,RecBC経路,RecE経路,RecF経路において各々異なった組換え体を検出した。各々について組換えのモデルを提出することができた。マウス白血病ウィルス(MLV)のgag蛋白であるp30蛋白を持続発現する細胞株を樹立するため,MLVのgagとプロテアーゼ遺伝子を含む部分を,β-アクチンプロモーターを有する発現ベクターに組み込みマウスの細胞に導入したところ,約85Kbの蛋白が検出されたもののgag蛋白の前駆体となるp65蛋白やp30へのプロセシングは認められなかった。
有機合成化学的手法によるホヤ精子活性化・誘引物質の作用機構解明

今年度はSAAFのより効率的な合成法を確立し、さらに4位にビオチンを導入したビオチン化SAAFの合成に成功した。前年度の実験よりSAAFの硫酸基を1つでも除去すると活性が大きく低下するという知見が得られたので、今回4位ヒドロキシル基をビオチン導入部位として選んだ。実際のプローブ合成に先立ち、まずSAAF合成中間体のより効率的な合成を行った。以前のSAAF合成法では35位の立体制御に問題が残されていたが、高ジアステレオ選択的反応を組み合わせることによって解決した。すなわち、ケノデオキシコール酸から誘導した4,5-不飽和-3-アルコール体の二重結合の転移を伴った還元、得られた3,4-を二重結合のエポキシ化、続くエポキシドのアキシャル開裂反応により、SAAF骨格を有する中間体3-ヒドロキシ-4-アセトキシ-7-ベンジルオキシメチルエーテル体(1)を選択的に高収率で得ることに成功した。これによりSAAFの分子プローブ化に必要な中間体を供給するだけでなく、SAAF自体も100mgというスケールでの合成に成功した。次にビオチン化SAAFの合成を行った。まず1から側鎖の導入、保護基の変換を経て鍵中間体である3,26-TBSエーテル-4-ヒドロキシ-7-ベンジルオキシメチルエーテル体(2)を合成した。4位ヒドロキシル基に対しCbz-β-アラニンを縮合させてリンカーを導入し、TBS基の脱保護、硫酸化後、水素添加により7位とリンカーのアミノ基の脱保護を同時に行った。最後にアミノ基をビオチニルスクシンイミドと縮合させることで目的とする4位ビオチン化SAAFの合成に成功した。今年度はSAAFの推定構造から可能性のある2種類のジアステレオマーを共通の中間体より合成し、それらを天然物と比較することでSAAFの全立体配置を決定した。すなわち、ケノデオキシコール酸を出発原料とし、5段階で3ケト4エノール体へと変換後、シリカゲル共存下で水素化シアノホウ素ナトリウムによる還元を行うことで望む4位と5位の立体をもつジオール体をジアステレオマーとの混合物として得た。次に環状硫酸エステルへと変換し、その後3位で選択的に開環させることでSAAFの推定構造におけるステロイド部分の立体構造を構築した。さらに3段階を経てアルデヒド体へと変換し、これに対して、それぞれ対応する立体化学を有する側鎖をWittig反応により導入し、さらにベンゾエートの除去、硫酸化、イオン交換、接触還元を行い、最終的にSAAFの可能性のある2種類のジアステレオマー25R体と25S体を合成した。これらの^1H NMRを天然物と比較した結果、25R体では26位のプロトンおよび25位メチル基のシグナルがやや高磁場シフトしているのに対し、25S体ではこれらのシグナルも完全に一致した。その結果、天然物は25S体であると決定することができ、SAAFの全立体配置を決定するとともにその化学合成を達成した。また、合成したSAAFは約3.7nMで精子活性化活性を示し、10nM以下で精子走化性活性を示したことから、SAAF本体が単一でこの両活性を担っていることを証明することができた。興味深いことに25位に関するジアステレオマーである25R体もSAAFと同程度の活性を保持していた。前年度にSAAFの構造を決定したので、今年度はSAAFに存在する硫酸基が1つ外れた26位脱硫酸体および3位脱硫酸体、さらに2つとも硫酸基が外れた3,26位脱硫酸体を合成し、それぞれについて活性試験を行い硫酸基がどの程度活性に影響しているかを調べることにした。これにより、SAAFの分子プローブ化を行ううえでその修飾部位に関する知見が得られると考えた。これら3種の脱硫酸体はSAAFの合成中間体である3位ベンゾエート、4位、7位ベンジルオキシメチルエーテル体(1)から導くことにした。すなわち、26位脱硫酸体はまず、中間体(1)の側差を保護してからベンゾエートを除去し、硫酸化、イオン交換、接触還元を経て合成した。次に3位脱硫酸体は、まず1に対して側鎖の硫酸化を行い、イオン交換後、ベンゾエートを加水分解により除去し、最後に接触還元を行い合成した。残る3,26位脱硫酸体は、1のベンゾエートを除去し、接触還元を行い合成した。これら3種類のSAAF脱硫酸体について、ユウレイボヤ精子活性試験を行った。まず、精子活性化活性について、SAAFはこの条件下、10nMで精子活性化活性を示したのに対し、26位脱硫酸体は10μMで活性を示した。また3位脱硫酸体も同程度の活性を保持しており、これらはSAAFよりも1000倍程活性は低下していたが、依然、精子活性化活性を有していた。一方、硫酸基が2つとも外れた3位26位脱硫酸体については、活性は全く示さなかった。続いて精子誘引活性について、SAAFは30nMで精子誘引活性を示したのに対し、26位脱硫酸体および3位脱硫酸体は両者とも3μMで活性を示した。その結果、精子誘引活性についてもSAAFより活性が100倍程低下するものの、依然活性を有していることがわかった。一方、3,26位脱硫酸体については、活性は全く示さなかった。

前年度の実験よりSAAFの硫酸基を1つでも除去すると活性が大きく低下するという知見が得られたので、今回4位ヒドロキシル基をビオチン導入部位として選んだ。実際のプローブ合成に先立ち、まずSAAF合成中間体のより効率的な合成を行った。以前のSAAF合成法では35位の立体制御に問題が残されていたが、高ジアステレオ選択的反応を組み合わせることによって解決した。すなわち、ケノデオキシコール酸から誘導した4,5-不飽和-3-アルコール体の二重結合の転移を伴った還元、得られた3,4-を二重結合のエポキシ化、続くエポキシドのアキシャル開裂反応により、SAAF骨格を有する中間体3-ヒドロキシ-4-アセトキシ-7-ベンジルオキシメチルエーテル体(1)を選択的に高収率で得ることに成功した。これによりSAAFの分子プローブ化に必要な中間体を供給するだけでなく、SAAF自体も100mgというスケールでの合成に成功した。次にビオチン化SAAFの合成を行った。まず1から側鎖の導入、保護基の変換を経て鍵中間体である3,26-TBSエーテル-4-ヒドロキシ-7-ベンジルオキシメチルエーテル体(2)を合成した。4位ヒドロキシル基に対しCbz-β-アラニンを縮合させてリンカーを導入し、TBS基の脱保護、硫酸化後、水素添加により7位とリンカーのアミノ基の脱保護を同時に行った。最後にアミノ基をビオチニルスクシンイミドと縮合させることで目的とする4位ビオチン化SAAFの合成に成功した。
免疫・炎症応答が惹起する肝局所DICとそれを介した劇症肝炎の解析

Concanavalin A(Con A)をマウスに投与すると重症肝障害に至る。抗凝固剤のヘパリンを事前に投与しておくと、IFNγとTNFが正常に産生誘導されるにも関わらず肝障害に至ることから、凝固亢進の細胞・分子機序を検討した。その結果、IFNγとTNFに依存して、肝のマクロファージ(Mo)と肝類洞内皮細胞(SEC)が発現する凝固先導因子である組織因子(TF)の重要性を証明した。さらに、Con A肝炎抵抗性のRag2-/-マウスは、Con Aと共にIFNγとTNFを投与すると、TF依存性に劇症肝炎に陥ることが分かった。以上の結果から、IFNγ、TNF並びにCon Aシグナルによる、肝MoやSECでのTF発現誘導が、劇症肝炎の本体であることが判明した。当該研究は、局所性DICに起因する劇症型臓器不全の細胞・分子メカニズムを解明することを目的とする。既に報告しているように、T細胞レクチンであるConcanavalinAの静脈内投与により誘導される劇症肝炎は抗凝固剤の前投与で完全防御できることから、本モデルを用いて解析を行った。その結果、以下の点が判明した。(1)Con Aを投与した野生型マウスの肝臓の類洞壁には顕著なフィブリン沈着が観察され、凝固系のマーカーであるTATの血漿濃度の上昇も観られた(2)IFN^γTNF両遺伝子欠損マウスでは、肝のフィブリン沈着も血漿TAT値上昇も認められなかった。(3)凝固亢進の先導因子である組織因子(TF)と線溶阻止因子であるPAI-1の肝での発現を検討したところ、野生型マウスでは、Con A投与後、顕著な上昇が見られたが、IFN^γTNF両遺伝子欠損マウスでは全く認められなかった。(4)PAI-1欠損マウスにCon Aを投与すると、野生型マウスと遜色のない、凝固亢進と肝障害が観察された。(5)TFに対する中和抗体を投与すると、野生型マウスで観られた凝固亢進や肝障害は有意に抑制された。(6)野生型マウスに組換えIFN^γとTNFを投与するだけでは、凝固亢進も肝でのTF発現誘導も肝障害も誘導されなかった。以上の結果から、Con A肝障害は内因性のIFN^γとTNFに依存して誘導されるTFが必要であることが証明された。しかし、IFN^γとTNFだけでは、病的凝固亢進や結果としての肝障害を誘導するには不十分であることが判明した。それには、IFN^γとTNF信号に加えて、もう一つの信号経路の重要性が示唆された。T細胞マイトジェンであるConcanavalin A (Con A)をマウスに投与すると、マウスは劇症肝炎に陥る。既に、炎症性サイトカインであるIFNγとTNFがCon A肝炎に深く関わることが明らかにされているが、そのメカニズムは詳細には不明であった。一方、申請者らはCon A肝炎に血液凝固亢進が関わることを見出し、凝固阻害剤であるヘパリンを前もって投与しておくと劇症肝炎は回避されることを報告している。当該研究では、どのような細胞・分子メカニズムで凝固亢進に基づく劇症肝炎が誘導されるかを解析した。本年度はCon A投与により発現誘導される組織因子に着目し、以下の項目を明らかにした。(1)Con A投与により、血液凝固亢進の先導因子である組織因子が肝類洞構成細胞のいずれの細胞で発現誘導されるかを検討したところ、類洞内皮細胞とクッパー細胞を含む肝マクロファージの両者に強く発現が誘導されることが分かった。また、マクロファージ除去マウスを作製してCon Aを投与したところ、肝臓での組織因子の発現、肝臓のフィブリン沈着や肝逸脱酵素上昇のいずれもについて、優位な軽減が認められた。(2)IFNγのシグナルに必須のSTAT1がCon A投与による凝固亢進と劇症肝炎に必須であることを、STAT1欠損マウスを用いて明らかにした。(3)肝類洞内皮細胞と肝マクロラァージのいずれめ軸胞においても、IFNγ/STAT1信号が凝固亢進・劇症肝炎に必要であることを、野生型マウスとSTAT1欠損マウスのキメラマウスを用いて明らかにした。
リポソームを併用した前眼部への遺伝子導入・薬物送達法の評価法の開発

drug deliveryやgene transferの手段として超音波にmicro bubbleやbubble liposomeを併用することでより効率的に遺伝子や薬物の導入が可能になった。その効果を定量的に評価することを目的として研究を行った。既にin vitroで得られた至適条件とほぼ同様の超音波照射条件が薬物、遺伝子の細胞内の取り込みに適していることがわかった。また眼組織の超音波照射に最適なプローブの形状に関する知見を得た。これまで、角膜上皮細胞や前房内、網膜組織などの眼組織を対象として、低エネルギーの超音波照射とbubbleを利用することで薬物や遺伝子が細胞内に導入・送達されることを証明してきた。この知見をもとにして、drug deliveryおよび遺伝子導入後のcytokineや各種タンパクの定量ならびに評価を行い、下記の目標を達成する。(1)低エネルギーの超音波照射およびBubble liposomeを併用して、より効率的かつ安全に前眼部へのdrugdelivery・遺伝子導入を可能にする方法を確立する。(3)前眼部の難治性疾患への臨床応用の足がかりをつくる。上記目標を達成するため、薬物付加Bubble liposomeを培養ヒト角膜上皮細胞に添加した後に10-20秒、1W/cm^2を中心にした条件で超音波を照射した。その後、上清中のcytokine濃度を経時的に2,6,12,24時間後にcytometric bead arrayを用いて測定した。培養ヒト角膜上皮細胞での遺伝子導入の評価本方法は薬物遺伝子に置き換えて利用することも可能であるため、GFP plasmidを利用して、bubble liposomeとGFPplasmidを培養ヒト角膜上皮細胞に添加した後に10-20秒、1W/cm^2を中心にした条件で超音波を照射した。その後GFP遺伝子の導入効率を検討した。○in vivoでのbubble liposome併用超音波照射の評価昨年度にin vitroで培養角膜上皮細胞などの眼組織を対象として得られた知見をもとに、マウス眼球の前房内に薬物付加bubble liposome/遺伝子付加bubble liposomeを注射したあとに、10-20秒、1W/cm2を中心にした条件で超音波の照射をおこなった。一定時間後に摘出した眼球組織や前房水の微量サンプルから、cytokineの定量をおこなった。○超音波プローブの形状や発振方法、付加薬物および遺伝子の濃度と超音波発振の至適条件の決定昨年度および今年度のこれまでの研究結果を踏まえて、超音波の照射範囲、角度、duration、power、超音波プローブ先端の適切な大きさや形状など、眼球前眼部への超音波照射にとってもっとも適切な条件についての方向性を決定する知見を得ることができた。また、in vivoの前眼部組織における、遺伝子、各種薬物のもっとも効率的に導入できる適切な濃度についても同様に知見を得た。