hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性腎疾患におけるインテグリンの病態生理学的役割の解明とその制御による治療への応用

各種腎疾患において生じる細胞外基質のリモデリングによりインテグリンを介した細胞内シグナルや遺伝子発現の変化が、病態の進展にどのような影響を与えるのか検討した。その結果、各種腎疾患においてみられるβ1 integrinの発現亢進が、ICAM-1やco-stimulatory factorであるCD80の発現を介し、炎症細胞浸潤やリンパ球の活性化を引き起こし腎疾患の進展に影響を与えていることを明らかにした。インテグリンは細胞表面に存在するa鎖とb鎖からなる受容体で,細胞を他の細胞と,あるいは細胞と細胞外基質とを物理的に結合させる働きを持ち,炎症細胞の局所への浸潤や細胞構築の維持に重要な役割を果たしている。我々は各種腎疾患において生じる細胞外基質のリモデリングによりインテグリンを介した細胞内シグナルや遺伝子発現の変化が,病態の進展にどのような影響を与えるのか検討した。培養ヒトメサンギウム細胞で各種細胞接着分子の発現をFACScanで検討したところ,静止期のメサンギウム細胞においてα2,3,4,5,β1integrins,CD44,CD80の恒常的な発現を認めた。α6,v,β3integrins,ICAM-1,Fasはわずかに発現していたが,α1,β2integrins,VCAM-1,CD40,CD40L,CD86は発現していなかった。β1integrin特異刺激抗体(mAb13)によりβ1integrinの活性化を行なうとこれらの細胞接着分子のうちICAM-1とCD80のみ発現が亢進した。MHCclassIやICAM-1,VCAM-1などの刺激ではICAM-1などの発現に影響を与えなかった。以上より,各種腎疾患においてみられるβ1integr出の発現亢進は,ICAM-1やco-stimUlatory factorであるCD80の発現を介し,炎症細胞浸潤やリンパ球の活性化を引き起こし腎疾患の進展に影響を与えている可能性が示唆された。インテグリンは細胞表面に存在するa鎖とb鎖からなる受容体で、細胞を他の細胞と、あるいは細胞と細胞外基質とを物理的に結合させる働きを持ち、炎症細胞の局所への浸潤や細胞構築の維持に重要な役割を果たしている。我々は各種腎疾患において生じる細胞外基質のリモデリングによりインテグリンを介した細胞内シグナルや遺伝子発現の変化が、病態の進展にどのような影響を与えるのか検討した。培養ヒトメサンギウム細胞で各種細胞接着分子の発現をFACScanで検討したところ、静止期のメサンギウム細胞においてα2、3、4、5、β1 integrins、CD44、CD80の恒常的な発現を認めた。α6、v、β3 integrins、ICAM-1、Fasはわずかに発現していたが、α1、β2 integrins、VCAM-1、CD40、CD40L、CD86は発現していなかった。β1 integrin特異刺激抗体(mAb13)によりβ1 integrinの活性化を行なうとこれらの細胞接着分子のうちICAM-1とCD80のみ発現が亢進した。MHC class IやICAM-1、VCAM-1などの刺激ではICAM-1などの発現に影響を与えなかった。以上より、各種腎疾患においてみられるβ1 integrinの発現亢進は、ICAM-1やco-stimulatory factorであるCD80の発現を介し、炎症細胞浸潤やリンパ球の活性化を引き起こし腎疾患の進展に影響を与えている可能性が示唆されたインテグリンは細胞表面に存在するα鎖とβ鎖からなる受容体で、細胞を他の細胞と、あるいは細胞と細胞外基質とを物理的に結合させる働きを持ち、炎症細胞の局所への浸潤や細胞構築の維持に重要な役割を果たしている。以上より、各種腎疾患においてみられるβ1 integrinの発現亢進は、ICAM-1やco-stimulatory factorであるCD80の発現を介し、炎症細胞浸潤やリンパ球の活性化を引き起こし腎疾患の進展に影響を与えている可能性が示唆された
デフォーマブル筋骨格モデルのカスタムメイド化技術の開発及びその妥当性の検証

筋骨格モデルは、運動中の人体にかかる負荷を推定できるため、人間工学的デザインの設計や、リハビリ・スポーツ分野における運動負荷の解析などでよく用いられている。しかし、解析対象となる個人を忠実に再現した筋骨格モデルは未だ存在せず、個人にあわせたカスタムメイドな設計・診断・治療を行うことができない状況が続いている。本研究では、昨年度までに、個人のMRI画像から抽出した筋・骨の形状を、筋のボリュームや変形まで表現できるデフォーマブル筋骨格モデルに適用することにより、個人を反映したカスタムメイド筋骨格モデルを作成する技術の開発を行ってきた。これまで肩周辺部を対象として技術開発を行ってきたが、今後様々な応用を促進するためには、全身のカスタムメイドモデルを作成する必要がある。MRIの撮影範囲の制限により一度に両腕を含む全身を撮影することはできないため、本年度は全身を7回程度で分割して撮影し、それらをソフトウェアで結合するプロトコルの確立を行った。また、筋同士の干渉シミュレーションの安定化・高速化に有効な筋膜の形状は、MRI画像から抽出することが困難であったため、MRI画像から得られた筋形状に基づいて筋膜形状を自動生成する技術の開発も行った。これらの成果技術を用いることによって、MRI画像に基づいて全身のカスタムメイド筋骨格モデルを作成することが可能となり、今後、健康・スポーツ分野における様々な革新的サービスの創出が起こることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。従来の筋骨格モデルでは、筋のボリュームが無視され、肩などの複雑な関節では正確な筋走行を再現できないという大きな問題を抱えていた。この問題を根本的に解決するため、筋肉のボリュームと干渉による変形を考慮したデフォーマブル筋骨格モデルの開発を行ってきた。しかし、現時点のデフォーマブル筋骨格モデルは標準体型モデルに過ぎず、整形外科、スポーツ、リハビリなどのバイオメカニクス関連分野に応用するには、各個人のモデル(カスタムメイドモデル)を作成する技術が必要である。本研究では、被験者の体表面形状を用いてカスタムメイドモデルを作成する技術の開発を行う。本年度は、被験者の体表面形状をモーションキャプチャーで計測するためのプロトコルの整備を行った。まず、体表面形状を高精度に計測するための計測方法について検討した。被験者の前腕部に150個もの大量の極小マーカー(直径3mm)を約15mm間隔で表面全体を覆うように貼付し、各マーカーの3次元位置をモーションキャプチャーで撮影した。6台のカメラだけでは密に配置された極小マーカーを識別することは困難であったが、12台程度のカメラを適切に配置することでほぼすべてのマーカーの記録に成功し、高精度なポリゴンモデルを得ることができた。次に、最適なマーカー数を検討するため、得られた高精度モデルのマーカー数を減らしたモデルをコンピュータ上で作成し、マーカー数がモデル精度に与える影響について検討を行った。高精度モデルは約150点(13(スライス数)×12(1スライスあたりの円周点数))から構成されるが、スライス数としては約6スライス、円周点数としては約6点よりも小さくなると急激に高精度モデルからの誤差が増加することがわかった。この解析で得られたマーカー数を用いることで、効率良くかつ正確に表面形状を計測することができると考えられる。本年度は、被験者の体表面形状をモーションキャプチャーで計測するためのプロトコルの整備を行うことが目的であった。このために必要な1「計測技術」と2「解析技術」の開発を行ったことから、おおむね順調に進展していると言える。1計測技術:当初、高精度モデルの取得のために、施設に既存の6台のカメラ(Raptor-12カメラ)を用いて計測を行った。これらのカメラは1,250万画素もの高解像度を有するものの、密に配置された大量のマーカーを個別に識別することはできなかった。私はこれを解像度の問題ではなく、カメラ台数不足であることを見極め、中程度の解像度のカメラ(Kestrel、220万画素)をできるだけ多く(6台)追加配備することによって計測を成功させた。2解析技術:マーカー数がモデル精度に与える影響を解析するために、高精度モデルからマーカーの数を減らしたモデルをコンピュータ上で作成し、高精度モデルとの体積誤差を計算する必要があった。2つのポリゴンモデルの体積誤差を計算する際に、各ボクセルが2つのモデルに含まれるか否かの判定を行うが、ボクセルサイズが小さい場合、その判定には膨大な計算量が必要になる。GPUを用いた並列計算手法を用いてこの問題の解決を行うなど、体表面形状を定量的に扱うための解析技術の開発も十分進展したと言える。本研究では、筋肉のボリュームと干渉による変形を考慮したデフォーマブル筋骨格モデルを発展させて、個人に合わせたカスタムメイドモデルを作成する技術の開発を行っている。被験者の筋骨格形状を取得する方法としては、MRI等を利用して内部形状まで含めて取得する方法と、3Dスキャナやモーションキャプチャーで体表面形状のみを取得する方法がある。本研究では、体表面形状だけからカスタムメイドモデルを作成することをまず目標に取り組んでいる。昨年度は、体表面形状をモーションキャプチャーで計測するためのプロトコルの整備を行い、本年度は、その体表面形状にデフォーマブルモデルをフィットさせるための準備を行った。フィットさせるためには対象とする部位のすべての筋をモデル化して身体内部を埋め尽くすことが必要である。

そこで本年度は、肩を対象とし、三角筋や大胸筋などのアウターマッスルだけでなく、棘上筋や棘下筋などのインナーマッスルも含めた計33筋のモデル化を行った。また、これほど多くの筋が存在する場合、筋同士または筋と骨の干渉を検知して適切に回避することが必要である。多数のポリゴン間の干渉チェックには多大な計算負荷がかかるという問題があるが、本研究ではGPU並列計算プログラミングを用いることで計算時間を軽減し、この問題を解決した。こうして出来上がった肩のデフォーマブル筋骨格モデルは、人体運動のシミュレーション、運動負荷解析、アニメーション等の用途に利用できる汎用性の高い基盤技術として認められ、民間企業に技術移転されるなどの社会展開も始まっている。本年度は、体表面形状にデフォーマブルモデルをフィットさせるために必要な準備として、1肩の全筋肉のモデル化と2干渉計算プログラミングを行ったことから、おおむね順調に進展していると言える。また、今後必要となる3MRIの情報収集も始めたことから、次年度も順調に進展することが期待できる。1肩の全筋肉のモデル化:各筋肉と骨のサンプル形状は、BodyParts3D(Copyrightc 2008ライフサイエンス統合データベースセンターlicensed by CC表示ー継承2.1日本)を基に作成した。このサンプルでは、骨と筋の位置関係の整合性はある程度取られているが、いくつかの筋肉の起始・停止部分において筋のポリゴンが骨に埋まってしまっている場合があった。これは干渉計算の不安定性につながる可能性があるため、埋まっている点を骨の外に配置しなおすという念入りな修正作業も行った。2干渉の検知と回避:干渉計算の実装に際しては、GPUによる速度向上を重視して単精度の浮動小数点演算を用いてきた。しかし、薄い筋が多数重なりあう部位(上腕骨の大結節稜や小結節稜)においては、姿勢によっては計算が発散してしまう問題も発生した。今後は、倍精度浮動小数点演算を用いるなどしてこの問題を解決していく。3MRIの情報収集:1.5テスラMRIでは筋腹の厚い部分については十分に個々の筋を識別可能であるが、腱部分や薄い筋肉を識別することが困難であることがわかってきた。現在3テスラMRIを利用できる環境整備を進めている。筋骨格モデルは、運動中の人体にかかる負荷を推定できるため、人間工学的デザインの設計や、リハビリ・スポーツ分野における動作フォームの解析などでよく用いられている。近年、私は筋のボリュームや変形まで表現できるデフォーマブル筋骨格モデルを開発したが、そこで用いられている人体の形状は平均的なテンプレート形状に過ぎず、解析対象の人物の形状とは必ずしも一致しないという問題がある。本年度では、個人のMRI画像から抽出した筋・骨の形状をデフォーマブル筋骨格モデルに適用することにより、個人を反映したカスタムメイド筋骨格モデルを作成する技術を開発した。なお、実験データの管理では、個人情報・プライバシーに配慮し、各被験者にIDを割り当て、データファイル内およびファイル名に氏名が含まれないよう工夫した。
超弦理論にもとづく素粒子の統一理論の現象論的研究

超弦理論は、高次元の統一理論を記述するものとして期待されている。近年、超対称統一模型の諸問題をこうした高次元理論のアプローチから解決しようとする試みが様々なされ、注目されている。柳田とその共同研究者は、大統一理論の困難であるヒッグス3重項と2重項の分離の問題を自然に説明できるなどの好ましい性質を持っているセミシンプル統一模型が、高次元のタイプIIB超重力理論をオービフォールドにコンパクト化した理論に埋め込まれ、模型の持つ諸性質が、この枠組みで自然に理解できることを示した。また、オービフォールドの性質を用いて大統一群を破る統一模型について、6次元の理論から出発した場合に超対称統一理論の持つ好ましい性質が保たれることを議論した。さらに、クォークやレプトンの世代数や性質について、その起源を高次元の理論に求めることが出来るという推測をあたえた。その他、ニュートリノ振動を説明する模型の研究、レプトン数の破れと宇宙のバリオン数生成に関する研究、宇宙の暗黒エネルギーを説明する模型の構築などについて研究をすすめた。山口とその共同研究者は、余剰次元を用いて、大統一模型の諸問題、すなわちヒッグス3重項と2重項の分離の問題や、陽子崩壊の抑制などを説明する新しい機構を提唱した。また、TeVスケールの余剰次元模型について、現在の実験からの制限や、将来のLHC実験などでどのような信号が選られうるかについて、研究した。その他に、超対称模型における超対称性の破れの伝搬の機構とその現象論的帰結などについて研究をした。これらの成果は、論文あるいはプレプリントとして公表している。超弦理論の強結合領域の研究の発展は、弦理論のもつ構造の豊かさを明らかにしてきた。超弦理論の示唆する素粒子の統一模型の研究も、こうした発展を受けて従来の枠をこえた可能性を模索しはじめている。こうした状況の中で、超弦理論の最近の発展を動機とし、この新たなパラダイムに基づく統一理論の現象論的研究を進めるのが、本研究の目的である。本年度は、当初の計画にほぼ従って主にヘテロ型M-理論にもとづいた研究を行なった。これまでの成果のうち特筆すべきものとして(1)M理論に現れるアクシオンの宇宙論的な影響、特に宇宙の密度揺らぎに対する影響に関して、詳細な検討を行ない、将来の観測で検証ざれ得ることを示した(2)M理論の示唆する超対称粒子の質量スペクトルに関して、弱結合の弦理論の場合と比較検討し、その現象論、および宇宙論的な特徴を考察した、ということがある。また、弦理論は一般に、デラトンやモジュライと呼ばれるスカラー場の存在を予言するが、これに関し、(1)デラトン場の安定化に対するR対称性に基づく新しい提案を行なった(2)モジュライ場の崩壊によるグラヴィテーノの過剰生成の可能性について議論した。さらに、I型超弦理論においては、弦の典型的なスケールがITeVぐらいになる可能性が許されるが、この場合の現象論的な帰結に関する研究を始め、これまでにWボソンのカルザークラインモードがフェルミ結合定数に与える影響などに関して議論をした。これらの成果は論文、あるいはプレプリントとして公表している。非摂動論的な超弦理論の研究の発展は、弦理論のもつ構造の豊かさを明らかにし、超弦理論の示唆する素粒子の統一模型の研究に対しても大きな影響を与えている。こうした状況の中で、超弦理論の最近の発展を動機とし、こうした新たなパラダイムに基づく統一理論の現象論的研究を進めるのが、本研究の目的である。本年度の研究のなかで特筆すべきものとして、(1)I型などの超弦理論においては、弦の典型的なスケールが1TeVぐらいになりうるが、そうした場合の現象論的研究。とくに、標準模型のゲージボソンのカルザ・クラインモードのLHC実験における可能な信号としてどのようなものがあるか、どのぐらいの質量スケールまで実験的に到達できるか。また「大きな余次元」のシナリオにおいて中間スケール(例、アクシオンのスケール)をいかにして作るか、その現象論的宇宙論的制約等について議論した。

(2)統一理論におけるフェルミオン質量の説明。フレーバー対称性と現実的なフェルミオン質量行列に関する研究。(3)R-パリティの破れた超対称理論におけるニュートリノ質量の生成の機構に関する研究。最近のニュートリノ振動を示唆する諸々の実験結果との比較検討(4)インフラトンの崩壊時におけるレプトン数の生成の機構の提唱。(5)超高エネルギー宇宙線の実験から示唆される非常に重い暗黒物質の研究、などがあげられる。これらの成果は論文、あるいはプレプリントとして公表している。超弦理論の最近の発展によれば、我々の世界が10次元的空間内の4次元のBrane上にある可能性がある。このBrane Worldシナリオは、超対称性を破る場がわれわれのBrane以外の空間的に離れた他のBrane上にあると思われる。これは、超対称理論におけるフレーバー問題を見事に解決するため興味深い考えだと思われる。平成12年度では、我々は上記の超対称性の破れを我々のBrane上の場に伝えるメカニズムを提案した。またBrane Worldシナリオでは、部分的にN=2超対称性が存在している場合がありえる。我々はこのN=2超対称性が自然にN=1超重力理論で見つかっているhybridインフレーションモデルを生み出すことを発見した。また、現在は、Brane Worldシナリオに基づいた素粒子の統一理論を作っている。この理論によれば、大統一理論の困難の一つであるdoublet-tripletのヒッグスの質量の問題が見事に解決できる。さらにこの理論は、D3-D7 BraneをもつIIBタイプの超弦理論に拡張される。超弦理論は、高次元の統一理論を記述するものの候補として期待されている。近年、超対称統一模型の諸問題をこうした高次元理論のアプローチから解決しようという試みがなされ、注目されている。柳田は、大統一理論の困難であるヒッグス3重項と2重項の分離の問題を自然に説明できるなど好ましい性質を持つセミ・シンプル統一模型が、高次元のタイプIIB超重力理論をオービフォールドにコンパクト化した理論にうめこまれ、模型の持つ特徴がこの枠組みで自然に説明できることを示した。また、クォークやレプトンのもつべきR対称性が高次元理論から如何に出るかということについて考察を進めた。さらに、オービフォールドの性質を使って大統一群を破る統一模型について、6次元の理論から出発した場合に超対称統一理論の持つ様々な良い性質を保つことを議論した。山口は、高次元理論においてソリトン的な背景場の近傍にカイラルフェルミオンが局在化できるという現象を用いて、大統一模型の諸問題、即ちヒッグス3重項と2重項の分離や、陽子崩壊の抑制等を説明する新しい機構を提唱した。また、超大統一理論の古典的な予言の一つであるボトムクォークとタウレプトンの質量比に関して、現在の実験の制限を加味した詳細な研究を行い、大統一スケールで大きな補正効果がないとうまく行かないことを示した。この結果は、大統一理論における模型構築に対する強い制限になると期待される。これらの成果は、論文あるいはプレプリントとして公表している。
新規生物発光プローブの開発と生体分子の可視化計測

本年度は、当研究のベースとなっているN末端選択的化学修飾法を用いたIgG型蛍光プローブの作製法に関して英国王立化学協会・速報誌に論文発表を行った(代表者ら、Chem. Commun. 54, 12734, 2018)。大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いたアルキン導入ルシフェラーゼの発現を試みた。まず、プロパルギル基を直交性官能基として有するBoc保護非天然アミノ酸に対してクロロアセトニトリルを反応させ、カルボキシル基の活性化を行った。さらに、ジヌクレオチドpdCpAと反応させ、脱Boc化反応によりアミノアシル化pcCpAを合成した。別に調製した古細菌由来tRNA(CUA)断片3種類とアミノアシル化pdCpAを酵素化学的にライゲーションすることにより、アミノアシル化tRNAの作製を行った。GFPuv5を発現レポーターとしてアンバーサプレッサー法により、無細胞タンパク質合成系における非天然アミノ酸の導入効率を検討した。いずれの古細菌由来tRNAを用いてもプロパルギル-リシンをタンパク質に導入することが出来ることが分かったが、導入効率には2倍程度の差違があった。次に、Gaussia由来ルシフェラーゼのN末端、あるいはC末端にそれぞれプロパルギル-リシンを導入することを試み、ウェスタンブロット解析及び発光測定により発現を確認した。予め調製しておいた"糖鎖アジド基導入・N末端蛍光標識IgG抗体"に対してクリック反応によるルシフェラーゼ標識を試み、発光測定を行ったがルシフェラーゼ由来の発光を観察することはできなかった。SDS-PAGEによる分子量サイズの確認を行った結果、重鎖の分子量が変化しておらず、クリック反応が機能していないことが判明した。His-tagが配位子(THPTA)と競合するという報告があり、別の精製用タグを使った系を検討したい。本研究の目的は、生物発光プローブを設計・合成する一般的手法を確立することで、様々な生体分子を可視化・計測することである。個々のリガンドに対する受容体タンパク質を機能拡張することでBRETプローブの作製を行う従来の手法とは異なり、高い構造的相同性を有する抗体を母骨格として、汎用性の高いBRETプローブの基本設計・開発を行うのが本研究の特色である。つまり、抗体型のBRETプローブを用いることで、これまでプローブが存在しなかった多種多様な抗原分子の発光計測が可能になることが期待される本年度は抗オステオカルシン一本鎖抗体のN末端側にルシフェラーゼ・SNAP-tagを融合した人工タンパク質を無細胞タンパク質合成系で調製し、SNAP-ligandを介してアクセプターとなる蛍光色素(TAMRA, Rhodamine Red)を導入した新規BRETプローブの開発を行った。ルシフェリンを添加して発光測定を行ったところ、ドナー・アクセプター双方の発光ピークが観察されBRETが生じている事が確認された。また、抗原であるBGP-C7ペプチドの濃度に依存して僅かにBRET効率が変化したことから、フェルスター距離に変化が生じていると推定された。アクセプターである蛍光色素を直接励起してスペクトル測定したところ、抗原濃度に依存して蛍光強度が変化したことから蛍光消光解消も生じていることが明らかとなった。また、BRETはルシフェラーゼ近傍の蛍光色素に対してのみ生じるため、遊離の蛍光色素が混在した夾雑系においても発光測定が可能であることを見出した。この他、ルシフェラーゼ2種類、セレンテラジン3種類、抗酸化剤の有無に関して検討を行い、安定に発光測定可能な条件を選定した。新規BRETプローブのプロトタイプとしてルシフェラーゼ・SNAP-tag融合型scFvの合成、及び発光スペクトル測定によるモデル抗原(生体分子)のレシオ検出に成功したため。本年度はIgG型のBRETプローブを作製するための検討を行った。まず、申請者らが開発したN末端選択的化学修飾法を用いてTAMRA標識IgGを作製した。抗原が存在しない条件下ではTAMRAがIgG内のトリプトファン残基との接触により蛍光消光を受けるが、抗原が結合することにより抗体の構造変化が生じ、トリプトファンとTAMRAとの接触が解消され蛍光が回復する(代表者ら、投稿準備中)。このN末端TAMRA標識IgGをさらに位置選択的に標識することを試みた。具体的には、Qasbaらの抗体糖鎖への酵素化学的な直交性官能基導入法を利用した。まずモデル系としてアジドを直交性官能基として有するガラクトースを糖鎖末端へと導入した後、アルキン誘導体化したRhodamine Greenをヒュスゲン環化付加反応によりコンジュゲートした。電気泳動後にゲル蛍光イメージングで標識を確認したところ、重鎖・軽鎖はそれぞれTAMRAで標識されている一方、Rhodamine Greenは糖鎖が存在する重鎖にのみ標識されていた。また、PNGase F処理によりRhodamine Greenが糖鎖に対して位置選択的に付加したことを確認した。二重蛍光標識IgG抗体のドナー(Rhodamine Green)を490 nmで励起したところ、ドナー・アクセプター双方の発光ピークが観察されFRETが生じている事が確認された。抗原を添加したところ、アクセプター(TAMRA)の蛍光強度は抗原濃度依存的に増大する一方、ドナーの蛍光スペクトルは変化しなかった。市販のIgGのN末端アミノ基及びN-結合型糖鎖をそれぞれ位置選択的に(二重)標識する技術を確立した。これにより、予定外の成果としてIgG型のFRETプローブを創製するに至った。一方で、Pyrrolysyl-tRNA

合成酵素・アンバーサプレッサーtRNAを用いたアルキン導入ルシフェラーゼの大腸菌発現系の構築を試みたが、現状では非天然アミノ酸の導入が確認できていない。このため、IgGに対してコンジュゲートすべきルシフェラーゼの準備ができておらず、IgG型のBRETプローブ作製に至っていない。これらを総合的に勘案し、(3)の評価とした。本年度は、当研究のベースとなっているN末端選択的化学修飾法を用いたIgG型蛍光プローブの作製法に関して英国王立化学協会・速報誌に論文発表を行った(代表者ら、Chem. Commun. 54, 12734, 2018)。大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いたアルキン導入ルシフェラーゼの発現を試みた。まず、プロパルギル基を直交性官能基として有するBoc保護非天然アミノ酸に対してクロロアセトニトリルを反応させ、カルボキシル基の活性化を行った。さらに、ジヌクレオチドpdCpAと反応させ、脱Boc化反応によりアミノアシル化pcCpAを合成した。別に調製した古細菌由来tRNA(CUA)断片3種類とアミノアシル化pdCpAを酵素化学的にライゲーションすることにより、アミノアシル化tRNAの作製を行った。GFPuv5を発現レポーターとしてアンバーサプレッサー法により、無細胞タンパク質合成系における非天然アミノ酸の導入効率を検討した。いずれの古細菌由来tRNAを用いてもプロパルギル-リシンをタンパク質に導入することが出来ることが分かったが、導入効率には2倍程度の差違があった。次に、Gaussia由来ルシフェラーゼのN末端、あるいはC末端にそれぞれプロパルギル-リシンを導入することを試み、ウェスタンブロット解析及び発光測定により発現を確認した。予め調製しておいた"糖鎖アジド基導入・N末端蛍光標識IgG抗体"に対してクリック反応によるルシフェラーゼ標識を試み、発光測定を行ったがルシフェラーゼ由来の発光を観察することはできなかった。SDS-PAGEによる分子量サイズの確認を行った結果、重鎖の分子量が変化しておらず、クリック反応が機能していないことが判明した。His-tagが配位子(THPTA)と競合するという報告があり、別の精製用タグを使った系を検討したい。現状ではBRET効率が相当低いため、scFv型BRETプローブの設計(特に蛍光色素の種類、蛍光アミノ酸やバイオ直交性反応などタンパク質タグを使わない蛍光基の導入法)に関して更なる可能性を検討していく。また、発光測定する生体分子のレパートリーを広げる。BRET変化の良好なscFv型BRETプローブが完成し次第、培養細胞を用いたイメージングを試みる。さらに、IgG抗体の位置選択的蛍光標識・タンパク質(ルシフェラーゼ)ライゲーションによる新規BRETプローブ作製についても検討を行っていく。収量が低いことが見込まれるが、大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いたアルキン導入ルシフェラーゼの発現を試みる。発現が成功した後は、N末端蛍光標識IgGに対してクリック反応を行い、位置選択的に蛍光色素・ルシフェラーゼが導入されたBRETプローブの合成を行う。
濃縮血小板フィブリンと脂肪由来幹細胞分泌タンパクを用いた骨再生

本研究では、効率的な骨再生を目的として、自己血液由来濃縮血小板フィブリンゲル(CGF)と脂肪由来幹細胞分泌蛋白(ADSCsーCM)を用いた新しい治療法の検討を行った。CGFは、培養実験において血管の伸長する効果が確認された。生体内では移植後4周以内で分解し、その際、マクロファージ、新生血管を誘導して、再生環境の構築に関与できることが分かった。一方、機械的強度としては延性に優れ、様々な場面で臨床応用が可能であると思われた。ADSCs-CMは、成長因子であるPDGF-AA、VEGF、HGF、TGF-β1が含まれており、特に血管新生に関連するVEGFの他、HGF、TGF-β1が多いことが分かった。本研究はCGFと脂肪組織幹細胞分泌蛋白質を混合して骨再生を行う研究であるが、CGFの生体内分解挙動について不明な点が多いため、単体での使用での生体内変化を確認するため、ウサギを用いた実験を行っている。ウサギ耳静脈から血液を採取し、専用の遠心分離器にてCGFを作製した。CGFは臨床での使用方法に合わせて、そのままの状態のものと圧接したものを準備した。対照群として移植のための切開のみを行った群を用いた。いずれも背部皮下に移植した。移植後、1、2、4週後に過剰麻酔にて屠殺し、病理組織標本を作製して観察を行った。CGFは、そのまま、圧接したものいずれもおよそ4週までには分解、吸収された。分解時、辺縁より細胞を含む樹枝状の血管様組織の侵入がみられた。CGF分解過程では、初期から4週まで炎症性細胞の浸潤も軽度で、異物反応などはみられなかった。分解後に瘢痕組織を残さないなどきわめて良好な結果が得られた。免疫組織化学的手法にて、血管、白血球、幹細胞の誘導等についての検討を行っている。免疫組織化学染色からCGF周囲に血管の増生が確認された。またマクロファージ系の細胞も周囲ないしCGF内に認められた。文献などでは報告のある幹細胞については確認できなかった。またCGFを用いた血管増生の培養実験についての分析も行っている。CGFにより培養中の血管内皮細胞の管腔形成、伸長が確認された。対照群としてVEGFを混入したものを用いており、ほぼ同様の結果を得た。CGFが含有する蛋白質の溶出により血管を伸長したと思われ、血管増生効果があると考えられた。成分や生体内挙動が未知の材料を使用するため、動物実験前にそれらの成分を確認する必要があると考え優先したため。平成28年度では、CGFの臨床応用の可能性を検討するため、特に移植時の固定や移植部での安定を確認するためCGFの工学的評価を行った。心停止直後のウサギの心臓より血液を80ml採取した。専用遠心機(Medifuge)を用いてCGFを作製した。作製したCGFは、一部はそのまま、一部は一定の厚さになるように調整、作製したアクリル板による圧接器に、ガーゼ8枚(4枚×2)で挟んで圧接し、膜状にした。直ちに11mm×13mmの長方形(直方体)大きさにトリミングし、内側3mmにナイロン製縫合糸をかけてループを作った。引張試験器を用いて5N下で縫合糸を左右から引っ張り、引張強度、延性について検討を行った。対照群として既存のコラーゲン系人工被膜を用いた。結果、既存の人工被膜が約2Nであるのに対し、膜状CGFは0.4N程度であった。しかし延性が大きく、人工被膜が2%であったのに対し、CGFは、200%で、優れた延性をもつ材料として臨書応用が可能であると思われた。またウサギを用いた移植実験を行った。ウサギ耳静脈より採取した静脈血を専用遠心機にかけCGFを作製した。ウサギ頭蓋にトレフィンバーを用いて約5mmの脳硬膜を開放する円形の頭蓋骨欠損を作製した。この骨欠損部に作製したCGFについて対照群としてそのままのもの、実験群として脂肪由来幹細胞分泌タンパク溶液を注入したCGFを填入した。初期反応を確認するため移植後、2週で過剰麻酔にて屠殺してマイクロX線CT撮影を行い、その後脱灰して組織標本を作製した。実験後2週では欠損部に明らかな新生骨形成は確認されなかった。組織学的には血管の誘導がみられ、CGFによる血管誘導効果が確認された。骨新生については、骨新生は確認できなかったが、細胞の骨芽細胞分化の方向を確認するために、免疫組織化学的染色による細胞の評価やもう少し長期的な観察が必要であると思われた。

当初は培養実験を行う予定であったが、研究室の移転等によりクリーンベンチが使用できず、予定の実験を行うことができなかった。使用する材料の成分が把握できたため、実際にその効果を視点として動物実験モデルでの検討に入る予定である。口腔外科学平成27年度では、脂肪由来幹細胞分泌蛋白の成分分析を行い、CGFとの複合材料として、培養細胞を使った実験を行うと同時に、骨形成動物実験モデルにて効果について検討を行う予定である。成分分析を優先して行ったため、動物実験での経費を使用しなかったため。研究設備の移設があり、一部の実験が計画通り行うことができなかったため、確実に行うことのできる次年度にその予算を繰り越した。本年度で動物実験を行うため、平成27年度で行う実験に使用する。平成26年度で行うべき、培養系の実験と今回用いる材料の成分分析に使用する。
河床形状及び深浅測量のための超音波を用いた計測装置と高精度位置計測システムの開発

本研究の目的は衛星測位システムGPSと安価な魚群探知機(超音波測深器)の融合化により簡便で,かつ安価な河床形状測定システムの構築することである。近年における衛星測位技術の発展は非常に目覚しいものがあり,本研究で開発予定であった地上ビーコン波を用いることによって精度向上を図る新しい高精度衛星測位システムは開発の段階で全く同じシステムを有するDGPSが開発・販売された。このような経緯より,本研究では新規性,独創性を優先し,衛星測位システムに関しては既存の高精度衛星測位システムDGPSを用い,本研究本来の目的である高精度衛星測位システムと超音波測深器の融合を主に実行した。まず,魚群探知機(超音波測深器)と衛星測位データをパソコンで取り込み一括処理の可能なソフトを開発した。このソフトの開発により現地観測での作業性は飛躍的に向上した(後述の観測結果のとおり)。この新しい測定システムの妥当性,有用性,使用性の検証及び観測データに基づいた実現象の解析を行った。現地観測は隅田川の下流部に位置する尾久橋付近,北海道東部に位置する網走川下流部の大湾曲部において行った。隅田川の観測では尾久橋の橋脚周りの河床形状を測定し,その全貌を明らかにすることができた。左岸・右岸の橋脚の1025m下流の間においては河床が1.5m程度洗掘されていることが捉えることができた。これは橋脚の後方に生じる縦渦により河床が洗掘されたためである。また,全体的に尾久橋付近における河床形状は右岸側に比べ左岸側が1.0m程度浅くなっていることがわかった。これは尾久橋の上流から下流にかけて流れ方向に対して左に湾曲している影響を受けているためである。このように本研究で開発した測定システムは橋脚周りにおける複雑な河床形状を捉えることができ,本システムの妥当性,有用性,使用性を確認することできた。本年度は、水中の浮遊物質、密度界面、底泥の厚さや硬度に関する超音波精密測定技術開発に向けた基礎的な現地実験を行った。現地実験では、市販の魚群探知機(周波数50kHz,107kHz,200kHz,400kHz)とADCP(ACCOUSTIC DOPPLER CURRENT PROFILER:周波数1200kHz,2400kHz)を使用した。実験場所には、研究代表者(山田)が、長年観測を行ってきた荒川、神田川、および北海道東部の網走川・網走湖を選定した。本研究で得られた主要な成果は以下のようである。河川感潮域および汽水湖における観測から、設定周波数を107kHzにすることにより塩水と淡水による密度成層の挙動を至短時間内に高精度で把握できることが明らかとなった。また、水中の浮遊物質の分布構造を把握するには、周波数を各種に設定することで,より最適な観測モードに調節できることが分かった。また,河床および湖底に堆積する泥の厚さ、硬度を評価し得る可能性についても示された。しかしながら、水中の挙動を高精度かつ軽易に把握するには、次のような問題点を克服する必要のあることがわかった。詳細な挙動を把握するには、大容量のデータを短時間に転送する必要があるため、データの転送速度や観測装置の小型化による記憶容量の縮小化には問題がある。また、観測時のセンサー部の移動速度(船の移動速度)によっては、センサー付近に形成される泡の影響により測定不可能になることがわかった。
がん治療における唾液分泌低下原因の探索を目指すアミラーゼ分泌モデル動物の作出

がん治療による唾液分泌低下は、様々な口腔内トラブルを誘発し、患者にとっては闘病意欲の低下や時に命の危険にも結びつくことから、がん看護において重大な問題となっている。本研究は、唾液分泌を蛍光タンパク質発現として容易に可視化・定量化できるVenus遺伝子導入マウス(遺伝子改変-蛍光唾液腺マウス)を作製し、唾液腺障害メカニズムの解明と唾液腺防護ケア開発を行うことを目的とした。今回の研究では、遺伝子改変マウスと唾液腺体外培養系の作製に成功した。今後は、作製したモデルマウスからの唾液腺細胞モデル培養系を構築し、唾液分泌防護剤や促進剤の検索と同定を行ってがん支持療法の開発に貢献していく。唾液分泌低下は、様々な口腔内トラブルを誘発し、患者にとっては闘病意欲の低下、時に命の危険に結びつくことから、がん看護において重要な課題のひとつとなっている。本研究では、唾液分泌低下の予防ケア開発を目標として、本研究で作成予定の「遺伝子改変-唾液分泌モデルマウス」からの唾液腺初代培養細胞の構築に挑戦している。この遺伝子改変マウスと構築した唾液腺初代培養細胞を、将来の個体・細胞レベルでの唾液腺障害メカニズムの解明に用いることで、治療による有害事象予防ケアの確立を目指している。本年度は、以下のことを実施した。1)遺伝子改変マウス作成に必要な改変遺伝子の作成と改良:改変遺伝子の作成を行って、アミラーゼプロモーターが機能することがわかっている培養細胞に導入し、作成した遺伝子が細胞内で計画通りに振舞うことを確認した。2)唾液腺初代培養細胞の単層化培養に必要な培地組成探索:妊娠13日目の胎児から顎下腺を摘出し、細胞を分離して、様々な因子の有無で培養を行い、増殖の様子を比較することによって、培地の基本的な組成を決定した。この結果、胎児顎下腺細胞は、無血清で単層化して培養が可能であることがわかった。顎下腺は以前から多くのグループが三次元培養には成功しているため、単層化培養の試みにおいても顎下腺からスタートしたが、今後は刺激によりアミラーゼを分泌する耳下腺でも顎下腺同様に単層化培養が可能か試行していく。マウス作成のための遺伝子作成と予備実験をほぼ終えている。また、遺伝子改変マウス作成後に唾液腺(顎下腺、耳下腺、舌下腺)の培養を行う予定だが、体外での初代培養細胞の増殖に必要な基礎培地の探索もスタートし、顎下腺の初代培養細胞の単層化培養に成功している。唾液分泌低下により、様々な口腔内トラブルが誘発され、患者にとっては闘病意欲の低下や時には命の危険にも結びつくことから、唾液分泌低下はがん治療において重要な課題のひとつとなっている。本研究では、唾液分泌低下の予防ケア開発を目標として、「遺伝子改変-唾液分泌モデルマウス」の作製とこのモデルマウスからの唾液腺初代培養細胞の構築に挑戦している。この遺伝子改変-唾液分泌モデルマウスと、構築した唾液腺初代培養細胞を、将来の個体・細胞レベルからの、がん治療による有害事象予防ケアの確立に用いることが本研究の目的である。本年度は、以下を実施した。1)アミラーゼ改変遺伝子のマウスへの導入:マウスへ改変遺伝子導入(Knock-in)を行い、産出された仔マウスの遺伝子型をPCR法によって確認したところ、2匹の仔マウスにアミラーゼ改変遺伝子がKnock-inがされていることがわかった。2)Knock-inマウス(遺伝子改変-唾液分泌モデルマウス)の解析:改変遺伝子はアミラーゼの一部とNanoLuc、Venusが融合したものである。実際に改変遺伝子がマウス個体で機能しているか調べるために、血中NanoLuc活性、flow cytometryによる耳下腺細胞のVenus蛍光を確認したところ、高い血中NanoLuc活性と、Venus蛍光を持つ細胞が多数確認された。これらのことにより本申請研究において、遺伝子改変-唾液分泌モデルマウスが完成したことがわかった。今後、このマウスを増殖させて、耳下腺からの初代培養確立に挑戦する。今後、遺伝子改変マウスを作成し、その解析を行う。また、唾液腺細胞の単層化培養に必要な基礎培地の最適化、細胞の生存率を高めた継代方法の改良に取り組む予定である。また、今後は顎下腺で得られた知見を利用して、耳下腺、舌下腺でも同様に初代培養細胞の単層化培養に取り組む。基礎看護学、細胞生物学必要な費用はほぼ使用した。残金はわずかであるため次年度の分と合わせて使用しようと考えたため。本年度の研究開始に必要な物品を4月中に購入予定である。
基質結合タンパク質と巨大分子特異的ＡＢＣインポーターとの複合体の構造と機能

グラム陰性細菌において、多糖の輸送に関わるABCトランスポーターの構造機能相関を解析した。その結果、基質を結合した結合タンパク質がinward facing構造のABCトランスポーターに接触し、その後、ATPの結合に伴い、結合タンパク質がドメインを開くと共にABCトランスポーターもoutward facing構造に変化し、基質がABCトランスポーターに受け渡され、次いで、ATPの加水分解により基質が細胞質に輸送されることを示した。また、本ABCトランスポーターは、マルトース輸送ABCトランスポーターと類似しているが、トンネル構造など巨大分子を輸送する特徴的な構造を有することを明らかにした。多糖(アルギン酸)輸送に関わるABCインポーター(AlgM1-AlgM2/AlgS-AlgS)と基質(アルギン酸)結合タンパク質(AlgQ1或いはAlgQ2)との相互作用を、ABCインポーターを膜に埋め込んで再構成したプロテオリポソームを用いて解析した。具体的には、ABCインポーター、基質結合タンパク質、及び各種リガンド存在下でその輸送機能を、ATP加水分解活性を指標に調べた。アルギン酸非添加時の活性を100%とすると、種々のアルギン酸(構成単糖:マンヌロン酸Mとグルロン酸G)オリゴ糖の存在下で200-500%程度の活性上昇が確認された。多糖アルギン酸添加時にも、濃度依存的な活性上昇が見られた。AlgQ1或いはAlgQ2存在下で、M/G組成の異なるアルギン酸オリゴ糖並びに多糖アルギン酸がATP加水分解活性を促進することから、ABCインポーターと基質結合タンパク質は、ヘテロ多糖を認識し互いに相互作用することにより、基質を輸送することが示唆された。ABCインポーターのX線結晶構造解析を進めた。AlgQ2の存在下でABCインポーターを結晶化し、各種スクリーニングによる結晶化条件の至適化を行った。その結果、分解能3.3ÅのX線回折データを与える安定な複合体結晶が得られた。AlgQ2と大腸菌由来マルトーストランスポーターをサーチモデルとした分子置換法によりABCインポーター複合体(AlgQ2/AlgM1-AlgM2/AlgS-AlgS)の初期モデルを構築し、構造のを進めている。本結晶構造は、高分子基質(アルギシ酸)を取り込むABCインポーターの最初の例である。AlgM1-AlgM2は、ベリプラズムでアルギン酸オリゴ糖を捕捉したAlgQ2と閉じた構造で接触しているのに対し、細胞質側のAlgS-AlgSとの結合面では開いた形状を示すため、ABCインポーターは全体構造としてInward-facing構造をとっていることが分かった。グラム陰性細菌(Sphingomonas sp. A1)のペリプラズム局在基質結合タンパク質は、細胞外膜から内膜に基質(アルギン酸)を輸送する機能を有し、ABCインポーターと接触して基質を受け渡した後、ABCインポーターから遊離する。従って、基質結合タンパク質とABCインポーターは、過渡的複合体を形成する。しかし、本研究が対象とする多糖の様な高分子物質の輸送に関わるABCインポーターと基質結合タンパク質との過渡的複合体の高次構造は決定されていない。そこで、両者の相互作用に関わる構造要因と高分子物質輸送機構を解析した。ABCトランスポーターをリポソーム内に再構成した後、結晶を調製しX線結晶構造に供した。ABCトランスポーターにおいて、膜貫通タンパク質は、基質結合タンパク質側は閉じており、ATPase側は開いており、全体としてInward Facing構造をとっていることが分かった。つまり、基質を結合した結合タンパク質がInward Facing構造のインポーターに接触し、その後、ATPの結合に伴い、結合タンパク質がドメインを開くと共にインポーターもOutward Facing構造に変化し、基質がインポーターに受け渡され、次いで、ATPの加水分解により基質が細胞質に輸送されることを明らかにした。今回構造決定したABCインポーターは、全体構造としてはマルトーストランスポーターと類似しているが、局所的に異なる点が見られた。先ず、結合タンパク質の相互作用様式が異なること、また、最大の相違点として、アルギン酸インポーターで認められる基質結合トンネルはマルトーストランスポーターに存在しないことである。これは、アルギン酸インポーターが長鎖アルギン酸を基質とすることが要因と考えられる。今後、ATPが結合したOutward Facing型を示す構造モデルを構築し、高分子アルギン酸がどのように輸送されるかを明らかにしなければならない。アルギン酸はマンヌロン酸(M)とグルロン酸(G)から構成されるヘテロ多糖である。その分子内には、MのみからなるMブロック、GのみからなるGブロック、及び両者がランダムに結合したMGブロックが存在する。グラム陰性スフィンゴモナス属細菌A1株は、何れのM/G組成のアルギン酸も良好に資化する。そのため、アルギン酸の輸送と分解に関わるA1株の各タンパク質は、MとGの両方を認識できることが示唆された。本年度は、ペリプラズムに局在するアルギン酸結合タンパク質AlgQ1とAlgQ2について、MとGの認識機構を解析した。

種々のM/G組成のアルギン酸オリゴ糖に対するAlgQ1とAlgQ2の親和性は、構成糖比には影響されなかった。また、AlgQ1と種々のアルギン酸オリゴ糖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析により決定した結果、オリゴ糖のカルボキシル基は特定残基により特異的に認識されるのに対し、水酸基は柔軟に認識されることが分かった。以上のことから、アルギン酸結合タンパク質はMとGの両方と結合する構造特性を示すことが明らかになった。ABCインポーターのX線結晶構造解析を進めた。これまでに、AlgQ2の存在下でABCインポーターを結晶化し、ABCインポーター複合体(AlgQ2/AlgM1-AlgM2/AlgS-AlgS)の主鎖構造を明らかにしている。本年度は、各アミノ酸残基の配置を決定した。メチオニンの硫黄原子をセレンに置換した変異体結晶を用いて、異常分散によりセレンの位置を同定した。セレンを目印として、モデルを修正したところ、構造精密化が改善された。ABCインポーター(特に膜貫通ドメイン)の内部(基質通過部位)を調べたところ、荷電性残基が多く配置していることが分かった。このような荷電性アミノ酸残基の配置が、酸性糖であるアルギン酸の取り込みに重要であることが示唆された。本研究の目的は、巨大分子を細胞内に輸送する特異なABCインポーター(AlgM1-AlgH2/AlgS-AlgS)のX線結晶構造を決定することにある。現在、このABCインポーターと相互作用するペリプラズムのアルギン酸結合タンパク質AlgQ1またはAlgQ2との複合体(AlgQ2/AlgM1-AlgM2/AlgS-AlgS)の初期モデルを構築するまでに至っている。ただ、分解能3.3ÅのX線回折データに基づいており、更に分解率を上げることによって初期の目的を達成できると考えられる。分解率を上げる方法も幾つか検討し、有望な方法を見出すに至っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。グラム陰性スフィンゴモナス属細菌A1株は、M/G組成にかかわらず全てのアルギン酸を資化することができる。アルギン酸の輸送に関わる基質結合タンパク質の構造機能解析を進めることにより、基質に含まれるMとGの両方を認識できる機構を原子レベルで明らかにすることができた。構造決定困難な膜輸送体であるABCインポーターについて、基質結合タンパク質と結合させることにより可溶性を上昇させ、良質な結晶が得られた。また、セレノメチオニン誘導体を用いた結晶も調製することができた。両結晶から側鎖を識別するのに十分な分解能のX線回折データが得られ、ABCインポーターと基質結合タンパク質との複合体の構造を決定するに至った。また、得られた構造から、酸性多糖であるアルギン酸の認識に関与する荷電性候補残基を見出している。
イトラコナゾールによるヘッジホッグ伝達経路阻害と獲得免疫の解析

近年、基底細胞母斑症候群患者の生殖細胞のPTCH遺伝子の機能欠損変異があることが報告されたことをきっかけに、基底細胞癌の発症のメカニズムとしてヘッジホッグ伝達経路の活性化が関与していることが報告された。また進行例や多発例において、ヘッジホッグ、イトラコナゾールがヘッジホッグ伝達を阻害するという報告があり、実際一部の基底細胞癌に効果的であると報告された。今研究では、基底細胞癌に対する腫瘍免疫の機能においてイトラコナゾールがどのように働くか解明することを目指す。また、基底細胞母斑症候群患者における基底細胞癌へのイトラコナゾール内服療法が獲得免疫に果たす役割についても評価する。基底細胞癌を発症している基底細胞母斑症候群の患者に対しイトラコナゾールにて加療し、腫瘍径の評価、さらには腫瘍浸潤部位の免疫学的解析を行う。我々はまず、二光子顕微鏡を使用し、実際の基底細胞癌を含む皮膚腫瘍の切除検体の一部を用い未染色で観察を行った。切除後1時間から4時間以内の検体を使用し、基底細胞の他に正常皮膚や日光角化症、ボーエン病、乳房外パジェット病も含め観察し条件検討を行った。対物20倍レンズを使用し感圧した。日光角化症、ボーエン病を含む上皮内有棘細胞癌においては角層の肥厚と表皮角化さ脂肪の核の腫大や細胞の腫大が観察され、また密度の増加や配列の乱れと表皮の肥厚を確認することができた。乳房外パジェット病では、角層内では表皮から排出されたと思われるパジェット細胞の死細胞が角層内に観察された。基底細胞癌は、表在性の基底細胞癌では、有棘細胞癌の細胞と比較して小型の細胞が腫瘍胞巣を形成し、メラニン顆粒と思われる蛍光の強い物質が胞巣内に散在していることが観察された。また進行例や多発例において、ヘッジホッグ伝達経路阻害剤が有効であると報告され、それらは腫瘍細胞のみに作用するだけでなく獲得免疫を亢進することがわかっている。近年、イトラコナゾールがヘッジホッグ伝達を阻害するという報告があり、実際一部の基底細胞癌に効果的であると報告された。対物20倍レンズを使用し観察した。日光角化症、ボーエン病を含む上皮内有棘細胞癌においては角層の肥厚と表皮角化細胞の核の腫大や細胞の腫大が観察され、また密度の増加や配列の乱れと表皮の肥厚を確認することができた。基底細胞癌は、表在型の基底細胞癌では、有棘細胞癌の細胞と比較して小型の細胞が腫瘍胞巣を形成し、メラニン顆粒と思われる蛍光の強い物質が胞巣内に散在していることが観察された。二光子顕微鏡を使用し、実際の基底細胞癌を含む皮膚腫瘍の切除検体の一部を用い未染色で観察を行った。なお表皮で異常な大型細胞が胞巣状に増殖していた。個細胞レベルで有棘細胞癌との形態的な区別をすることが難しく、光学顕微鏡と同等の精度で疾患の区別する所見の観察には今後の検討を要する。二光子顕微鏡による未染色での観察は、表層から120μmよりも深部になると画像の観察精度が著しく低下するため、個々の細胞形態の観察が難しく、そのため表在型基底細胞癌以外の基底細胞癌の観察が難しかった。メラニン顆粒が豊富な基底細胞癌ではさらに観察が難しかった。また倫理委員会申請書の作成が遅れているため。現在、作成中である。

近年、基底細胞母斑症候群患者の生殖細胞のPTCH遺伝子の機能欠損変異があることが報告されたことをきっかけに、基底細胞癌の発症のメカニズムとしてヘッジホッグ伝達経路の活性化が関与していることが報告された。また進行例や多発例において、ヘッジホッグ、イトラコナゾールがヘッジホッグ伝達を阻害するという報告があり、実際一部の基底細胞癌に効果的であると報告された。今研究では、基底細胞癌に対する腫瘍免疫の機能においてイトラコナゾールがどのように働くか解明することを目指す。また、基底細胞母斑症候群患者における基底細胞癌へのイトラコナゾール内服療法が獲得免疫に果たす役割についても評価する。基底細胞癌を発症している基底細胞母斑症候群の患者に対しイトラコナゾールにて加療し、腫瘍径の評価、さらには腫瘍浸潤部位の免疫学的解析を行う。我々はまず、二光子顕微鏡を使用し、実際の基底細胞癌を含む皮膚腫瘍の切除検体の一部を用い未染色で観察を行った。切除後1時間から4時間以内の検体を使用し、基底細胞の他に正常皮膚や日光角化症、ボーエン病、乳房外パジェット病も含め観察し条件検討を行った。対物20倍レンズを使用し感圧した。日光角化症、ボーエン病を含む上皮内有棘細胞癌においては角層の肥厚と表皮角化さ脂肪の核の腫大や細胞の腫大が観察され、また密度の増加や配列の乱れと表皮の肥厚を確認することができた。乳房外パジェット病では、角層内では表皮から排出されたと思われるパジェット細胞の死細胞が角層内に観察された。基底細胞癌は、表在性の基底細胞癌では、有棘細胞癌の細胞と比較して小型の細胞が腫瘍胞巣を形成し、メラニン顆粒と思われる圭子の強い物質が胞巣内に散在していることが観察された。二光子顕微鏡での画像解析にあたり、より良質な画像データを取得するため、まずは正常皮膚で撮影を行い、適切な波長やレーザーパワーおよびHVなどの条件検討を行った。また基底細胞癌、日光角化症、ボーエン病、乳房外パジェット病などでも撮影を行い、条件検討の比較対象にした。現在検討中である。実際の基底細胞癌を含む皮膚腫瘍の切除検体の一部を用い未染色で観察をおこなった。切また倫理委員会申請書の作成が遅れているため。現在、作成中である。