hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内T細胞環境要因としてのNotchリガンドの役割

胸腺内T細胞分化を支持するNotchシグナルの分子機構解析造血未分化細胞の胸腺への移行に始まるT細胞分化には、胸腺環境を担う上皮細胞を介したNotchシグナルの発動が必須であるが、その分子的詳細は明らかではない。これまで、未分化T細胞におけるNotchシグナルの解析には、Notchリガンド(NotchL):Dll1あるいはDll4を強制発現させたOP9細胞等の単層培養系が用いられてきた。しかし、これまでの我々の解析から、上記単層培養系にて調製された未分化T細胞は、胸腺内ではT細胞へ分化できないことが明らかとなり、単層培養系と本来の胸腺環境との間には、少なからず差異があることが示唆された。そこで我々は、Notchシグナルを付与しないT細胞分化環境として、Dll4欠失胸腺を用い、未分化T細胞への様々な遺伝子導入により、Notchシグナルを代替しうるシグナルについて調べた。Dll4非存在下に胸腺未分化T細胞(DN112画分)を胸腺器官培養にて分化誘導を行うと、ほとんどT細胞は分化しなかった。これは、TCR6鎖およびpTαの遺伝子導入を行っても改善しなかった。また、Notch下流にて機能することが示唆されるc-mycおよび活性化Aktの共発現によっても正常T細胞分化は再現できず、異常増殖が観察されるのみであった。これに対し、DN3画分のDP細胞への分化については、c-mycの恒常的発現によって、Dll4由来シグナルの欠失による分化停滞を限定的ながら回復させることが見出された。これらのことから、T細胞分化および正常細胞増殖の担保には、制御されたNotchシグナルの発動が重要であり、その本態としてc-mycが関与することが推察された。T細胞分化支持におけるDll4/Dll1の機能的差異T細胞分化決定に重要なDll4の機能を詳細に理解するため、胸腺上皮細胞にてDll4遺伝子が欠失するFoxN1-Cre、Dll4-floxedマウスを、Cre依存的にDll4あるいはDll1を強制発現するTgマウスと交配し、内在性Dll4欠失によるT細胞分化障害の回復を試みた。Dll4の強制発現により、胸腺上皮細胞上にDll4が再発現し、T細胞分化支持能の回復を認めた。一方、Dll1の強制発現によっては、T細胞分化支持能は回復しなかった。しかし、胸腺内でのB細胞分化を抑制したこと、内在性Dll4存在下に誘導されたDll1がT細胞分化を遅延させることから、Dll1はDll4とは異なるNotchシグナルを誘導していることが考えられた。このことは、未分化造血細胞に発現するNotch1がDll4と選択的に協働することを予想させ、Notch2/Dll1の優位性を示す脾臓偏縁域B細胞分化との対比から、Notchシグナル発動の分子基盤を探るうえできわめて興味深い。また、Dll1/4の機能的差異をin vitroにて検討可能な実験系を得るため、新たにマウス胎仔胸腺由来間葉系細胞株を樹立し、さらにDll発現細胞を作製した。その結果、Dll4導入細胞では、きわめて高いT細胞分化誘導能を発揮したが、Dll1導入細胞では、得られるT細胞数およびその分化ステージ、いずれについても、著しく低い分化能を示すのみであった。現在、同細胞を用い、種々のDll1/4キメラ分子を発現させ、両分子間の機能的差異を、両分子の構造的差異との比較から理解すべく、実験を継続している。
大環状ポリオキサゾール二量体化合物を用いたDNA四重鎖の可逆的認識とその検出

グアニンが豊富なDNA配列は、一価のカチオン(Na+,K+など)存在下でG-quadruplex(G4)と呼ばれる特殊な高次構造を形成する。G4は、グアニン同士がG-quartetと呼ばれる平面構造を形成し、さらにそれらがπ-π相互作用により積み重なることで安定化されている。代表的なG4形成配列にはヒトのテロメアに含まれるTTAGGGの繰り返し配列がある。テロメア配列におけるG4の形成はテロメア伸長酵素であるテロメラーゼの阻害、およびテロメア維持機構を担うテロメア結合タンパクの解離により、癌細胞をアポトーシスへと導くことが知られている。G4の生体内における形成の有無およびG4の生物学的機能を調査するためのツールとして、in vitroにおいてG4に強力かつ選択的に結合するG4リガンドが求められている。我々は昨年度までにG4認識部位を二点持つG4リガンドとして大環状ヘキサオキサゾール二量体を報告している。今年度は、生体内において形成されるG4を強力に安定化することを目的として長鎖テロメアDNAとの相互作用解析を行った。具体的には、G4を一つ形成する24残基、二つ形成する48残基、三つ形成する72残基、四つ形成する96残基のDNAについてそのG4結合能を評価することとした。合成した各種化合物とテロメアDNAとの相互作用をCDスペクトル解析、電気泳動実験によりそれぞれ解析を行った結果、この新規6OTD二量体は、長鎖テロメアG4と相互作用し、分子内で連続的にハイブリッド型のG4構造を形成していることが明らかとなった。さらにCD融解実験を行った結果、長鎖テロメアG4をに対して極めて強力に結合することを明らかとした。6OTD二量体を用いたテロメアG4に結合するタンパクの同定へと展開し、G4結合タンパク質の精製・同定法を確立する。生体内において形成されるG4を強力に安定化することを目的として長鎖テロメアDNAとの相互作用解析を行うことができたため。具体的には、G4を一つ形成する24残基、二つ形成する48残基、三つ形成する72残基、四つ形成する96残基のDNAについてそのG4結合能を評価した6OTD二量体が長鎖テロメアG4をに対して極めて強力に結合することが明らかになったので、今後6OTD二量体を用いたテロメアG4に結合するタンパクの同定へと展開し、G4結合タンパク質の精製・同定法を確立する。グアニンが豊富なDNA配列は、一価のカチオン(Na^+,K^+など)存在下でグアニン四重鎖(G4)と呼ばれる特殊な高次構造を形成する。G4は、グアニン四つからなる平面構造を形成し、さらにそれらがπ-π相互作用により積み重なることで安定化されている。今年度は、G4安定化能の更なる向上を目的として、リンカー部位をアルキル鎖からエチレングリコール鎖へ、二量体同士の結合部位をアミドからリン酸受容体である二級アミンとした新規6OTD二量体を合成し、そのG4結合能を評価することとした。合成した各種化合物とテロメアDNAとの相互作用をCD、ESI-MASS、FRET融解実験によりそれぞれ解析を行った。その結果、いずれの二量体化合物もテロメアG4と1:1の結合比で相互作用することがわかった。また、これらのG4に対する安定化能は、これまでのアルキルリンカーを用いた場合よりも向上し、対応する単量体よりも強力にG4を安定化することを見いだした。今後は6OTD二量体の誘導体を用い「G4形成配列との不可逆な複合体(不可逆型G4)の形成」を検討する。これによりゲルビーズ上でのG4構造の安定化を計る。

具体的には、G4を一つ形成する24残基、二つ形成する48残基、三つ形成する72残基、四つ形成する96残基のDNAについてそのG4結合能を評価することとした。合成した各種化合物とテロメアDNAとの相互作用をCDスペクトル解析、電気泳動実験によりそれぞれ解析を行った結果、この新規6OTD二量体は、長鎖テロメアG4と相互作用し、分子内で連続的にハイブリッド型のG4構造を形成していることが明らかとなった。さらにCD融解実験を行った結果、長鎖テロメアG4をに対して極めて強力に結合することを明らかとした。6OTD二量体を用いたテロメアG4に結合するタンパクの同定へと展開し、G4結合タンパク質の精製・同定法を確立する。生体内において形成されるG4を強力に安定化することを目的として長鎖テロメアDNAとの相互作用解析を行うことができたため。具体的には、G4を一つ形成する24残基、二つ形成する48残基、三つ形成する72残基、四つ形成する96残基のDNAについてそのG4結合能を評価した6OTD二量体が長鎖テロメアG4をに対して極めて強力に結合することが明らかになったので、今後6OTD二量体を用いたテロメアG4に結合するタンパクの同定へと展開し、G4結合タンパク質の精製・同定法を確立する。
新規性分化・生殖機能異常責任遺伝子MAMLD1変異による疾患成立機序の解明

変異陽性患者の臨床解析を行い、MAMLD1が胎児期の外性器形成のみならず、思春期の男性ホルモン産生と精子形成に関与する可能性を見出した。また、ホルモン産生細胞を用いたin vitro実験から、Mamld1がCyp17a1の転写制御を介してテストステロン産生を修飾することを明らかとした。SF1-MAMLD1-CYP17A1系は、精巣でのテストステロン産生調節に重要な機能を果たしていると推測される。(2)RNA干渉の手法を用いた一過性発現抑制実験により、MAMLD1が、増殖速度増加とステロイド産生酵素活性の発現量増加を介して、ホルモン産生腫瘍細胞におけるテストステロン産生とエストロゲン産生の調節に関与する可能性を見いだした。(3)外性器異常症患者において、新規MAMLD1変異を同定し、機能解析を開始した。また、卵巣機能不全患者において、ミスセンス変異を同定し、MAMLD1が胎児性分化決定期の男性ホルモン産生のみならず、成人女性における卵巣機能にも関与する可能性を見出した。本研究の目的は、MAMLD1変異陽性患者の臨床像の解析とMAMLD1の細胞内機能の解明により、本遺伝子変異による性分化異常・生殖機能障害の疾患成立機序を明らかとすることである。平成21年度は、以下の進展が見られた。1.MAMLD1変異陽性患者の臨床像の解析:200例以上の男児外性器異常症患者を対象として、MAMLD1変異スクリーニングを行なった。その結果、3つのナンセンス変異、1つのスプライスアクセプター変異、1つのミスセンス変異が同定された。さらに3つのナンセンス変異がnonsense mediated mRNA decayの機序により生体内において早期に分解され、スプライスアクセプター変異とミスセンス変異が安定型mRNAを形成することが見出された。この知見に基づき、スプライスアクセプター変異とミスセンス変異の機能解析を開始した。さらに、患者の臨床像の解析から、MAMLD1変異が、出生時の外性器異常のみならず経時的精巣機能低下を招く可能性が見出された。2.MAMLD1細胞内機能の解明:マウスLeydig腫瘍細胞を用いて、siRNAによるMamld1一過性発現抑制を行ない、MAMLD1の細胞内機能を検討した。その結果、Mamld1のノックダウンが、CYP17a1発現量の減少とandrostenedioneとtestosteroneを含む複数のステロイド代謝産物の産生低下を招くことが見出された。以上の成績は、Mamld1/MAMLD1が精巣におけるステロイド合成酵素の転写活性化を介して、男性ホルモン産生に関与する可能性を示唆する。本研究の目的は、われわれが同定した新規性分化・生殖機能異常責任遺伝子MAMLD1の生体内機能を解明することである。平成22年度には下記の成果が得られた。1.新規変異陽性患者の同定:欧米人性分化疾患患者において新規MAMLD1機能低下変異を同定し、MAMLD1異常が人種を越えた性分化疾患の原因遺伝子であることを明確にした。また、MAMLD1変異陽性患者の中核症状は尿道下裂と停留精巣であり、明らかな遺伝子型-表現型相関は認められないことを明らかとした。2.変異陽性患者の臨床像の解明:無機能型変異陽性患者を対象とした出生時から思春期までの経時的臨床解析によって、MAMLD1機能低下が、出生時の外性器異常のみならす、思春期の男性ホルモン産生障害を招く可能性を見出した。さらに、変異陽性患者において高頻度に精巣内微細石灰化が認められることを明らかとし、MAMLD1が精子形成障害および不妊症の発症にも関与する可能性を見出した。3.MAMLD1細胞内機能の解明:ステロイド産生機能を有するマウスLeydig腫瘍細胞(MLTC1)を用いて、siRNAによるMamld1一過性発現抑制を行い、MAMLD1/Mamld1がステロイド産生に及ぼす効果を検討した。マイクロアレイ解析、ウエスタンブロッティングおよび定量PCRを用いた発現解析の結果、Mamld1がCyp17a1のmRNA発現制御を介してテストステロン産生を修飾することが明らかとなった。なお、われわれは過去にMAMLD1がSF1による制御を受ける可能性を見出している。これらの成績は、精巣でのテストステロン産生調節におけるSF1-MAMLD1-CYP17A1系の関与を示唆する。
細胞膜ミクロドメインやオルガネラ間における糖輸送体動態の分子細胞形態学的解析

糖輸送体GLUT4はインスリン刺激により細胞内プールから細胞膜へと移行し細胞膜の糖輸送活性をあげることにより、血糖値の調節に重要な役割をはたしている。まず、3T3-L1培養脂肪細胞における糖輸送体GLUT4の分布を、蛍光抗体法により解析した。インスリン刺激によって細胞膜へと移行するGLUT4は細胞内に貯蔵されているもののごく一部であり、形態学的解析での障害となった。一方、腎臓の集合管主細胞に発現している水チャネル蛋白の一つであるアクアポリン2は、バソプレシン刺激により細胞内プールから細胞膜へと移行し細胞膜の水透過性をあげていて、細胞内プールから細胞膜へと移行する膜蛋白の良いモデルとなる。そこで、アクアポリン2の細胞膜や細胞内コンパートメント、オルガネラにおける存在様式、特にラフトを中心とする膜ミクロドメインとの関係について検討を加えた。アクアポリン2はトライトンX100不溶性分画にありラフトに存在するのが示唆された。フォルスコリン刺激によりアクアポリン2は細胞膜へと移行し、カベオリン1と共局在した。フォルスコリンを洗い流すとアクアポリン2はエンドサイトシスによりEEA1陽性の初期エンドソームと思われる細胞内小胞へと移行した。これらのトラフィッキングは膜ミクロドメインを乱す様々な薬剤により大きく影響され、アクアポリン2の細胞膜へのトランスロケーションやエンドサイトシスにおいて、膜のミクロドメイン構造が重要であると考えられた。3T3-L1培養脂肪細胞における糖輸送体GLUT4の分布を、蛍光抗体法により解析した。試料の観察は、共焦点レーザー顕微鏡法や凍結準超薄切片の冷却CCDカメラ観察によりおこなった。小胞体マーカー(カルレティキュリン、カルネキシン)、ゴルジ装置マーカー(ゴルジ58kD)、トランスゴルジネットワーク(TGN)マーカー(TGN38)、初期エンドソームマーカー(EEA1)、リソソーム/後期エンドソームマーカー(カテプシンD,LgP,LIMP)等のオルガネラマーカーと、GLUT4との多重染色をおこなった。体止時とインスリン刺激時に、GLUT4がゴルジ装置、TGNに多量に分布すること、また初期エンドソームには分布するが、リソソームには無いことなどを、個々の細胞について示した。また小胞移送に大きな役割を果たすVAMPについても検討中である。さらに、これらの蛍光抗体標識と並行して、3T3-L1脂肪細胞に、蛍光標識トランスフェリン、蛍光標識デキストランを投与し、GLUT4の分布パターンとの比較を多重標識法によりおこなった。その結果、GLUT4は後期エンドソームにはほとんど入らないのが判明した。細胞内でGLUTU4を含有する個々の小胞が酸性かどうかは、DAMPを蓄積した小胞との二重染色を用いて検索し、GLUT4が酸性のコンパートメントにもあるのを示した。GLUT4の細胞表面への露出に関しては、細胞膜非透過性ビオチン化試薬を用いて細胞表面のビオチン化も試みている。しかしながらインスリン刺激によって細胞膜へと移行するGLUT4は細胞内に貯蔵されているもののごく一部であり、形態学的解析にあたって大きな障害になっている。一方、腎臓の集合管主細胞に発現している水チャネル蛋白の一つであるアクアポリン2は、バソプレシン刺激により細胞内プールから細胞膜へと移行し細胞膜の水透過性をあげている。このようにアクアポリン2は細胞内プールから細胞膜へと移行する膜蛋白の良いモデルとなる。そこで、アクアポリン2の細胞膜や細胞内コンパートメントにおける存在様式、特にラフトを中心とする膜ミクロドメインとの関係について検討を加えた。カベオリン1との免疫染色ではほとんど共局在しなかったが、フォルスコリン刺激により共存が観察された。

D-PDMPでグルコシルセラミド合成を阻害し、ラフトの成分を枯渇させると、フォルスコリン刺激による細胞内アクアポリン2の細胞膜への移行が阻害された。同様に、メチル-ベータ-シクロデキストリン処理により細胞膜からコレステロールを除去したり、ナイスタチンによりコレステロールミクロドメインを壊すと、アクアポリン2の細胞膜への移行が阻止された。一方でクロロプロマジン処理ではアクアポリン2の細胞膜への移行には影響がみられなかった。以上の結果は、アクアポリン2の細胞膜へのトランスロケーションにおいて膜のミクロドメイン構造が重要であることを示している。糖輸送体分子GLUT4は細胞内貯蔵プールと細胞膜との間を移行して細胞表面における糖輸送活性を調整している。今回はこのGLUT4と類似の挙動をとる水チャネル分子であるアクアポリン2に着目し、細胞膜ミクロドメインとの関連について検討した。材料には、アクアポリン2を発現した上皮細胞であるMDCK-AQP2細胞を用いた。フォルスコリンにより細胞内cAMPを上げると、細胞内にあるアクアポリン2貯蔵小胞は頂部細胞膜に融合(エクソサイトシス)し、アクアポリン2が細胞膜に出現して細胞の水透過性が上昇する。カベオラは細胞膜ミクロドメインの一種である。カベオラの主要蛋白質の一つであるカベオリン1を蛍光抗体法で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。フォルスコリン刺激によりアクアポリン2は頂部細胞膜マーカーのGP135類似のパターンを呈し細胞膜へ移行した。この時カベオリン1とアクアポリン2はよく共局在した。フォルスコリンを洗い流すとアクアポリン2はエンドサイトシスによりEEA1陽性の初期エンドソームと思われる細胞内小胞へと移行した。この時カベオリン1とEEA1、あるいはカベオリン1とアクアポリン2の共局在が認められた。カベオリン1-GFPを発現させてから同様に細胞膜内への回収過程をみても、細胞内小胞でカベオリン1-GFPとアクアポリン2の共局在がみられた。さらに頂部ラフトマーカーのGPI-GFPを発現させた細胞では、フォルスコリン刺激後の洗滌時にEEA1陽性小胞がみられた。以上の結果は、アクアポリン2の細胞内への回収過程においてカベオラを介するエンドサイトシスが関与するのを示唆している。
土地・住宅ストックの利活用による資産デフレからの回復システムの解明

本研究では、第一に、中古住宅ストックの活用の現状を分析し、マンションの建替え準備のための生涯運営計画書と建替え・改修判断指針および建替え費用の評価方法を提案した。さらに、建替え促進のためにリバース・モーゲージを活用することを提言した。第二に、住宅ストックの利活用のためには、住宅を適正に評価することが重要であるが、住宅市場での配分がパレート最適となるべく、ヘドニック価格関数で住宅を評価することを提言した。また、分析誤差を取り除いてヘドニック価格関数を用いた評価を実際に行う方法を提案した。第三に、資産流動化型の不動産の証券化は不動産の有効利用を促進させ、資源配分の効率化に寄与することを経済モデルで明らかにした。さらに、証券化を不良債権処理の政策手段として適用した場合、財務指標の改善が必ずしも達成されないことを示した。第四に、新築住宅と中古住宅に対する課税の実態を、実効限界税率の計測を通して定量的に検討し、中古住宅市場の.活性化に向けた税制を提言した。第五に、オフィスビルを居住施設に転用するためには、住環境の評価が重要であることを示した。第六に、わが国の公営住宅に関して、都道府県間で福祉競争が起こっている可能性を明らかにし、公営住宅を利活用するためには、リンダールメカニズムを模した調整補助金の交付といった一定の国の関与が必要であることを示した。第七に、都市ストックの再生の海外事例を参考にして、環境共生型の都市再生政策について、その成功要因を解明した。第八に、ITを活用して住宅の市場情報を公開し、住宅の流通を促進する方法を探った。1990年代のわが国の資産型不況に対して、スウェーデンで採用された資産ベースの不況対策が有効だったことを示した。さらに、資産をべ一スとした福祉政策を提案し、この政策を採用する理由と背景を示し、具体例として児童信託基金を挙げた。深刻な不況に苦しむ日本経済の当面の最大の課題である資産デフレからどのように回復するかの手法を解明することは緊急の課題である。土地・住宅ストックを活用することで、資産デフレから回復し、かつ、福祉や環境の問題を解決するための諸提案を行うことが本研究の目的である。初年度は、第一に、老朽化マンションの建替えの課題を探るために東京都心部(赤坂、青山周辺地区)における築後30年以上のマンションの登記簿調査を行った。収集したデータに基づき、海外で収集した資料との比較検討を行った。第二に、中古住宅の評価法の研究のため、『週刊住宅情報』の物件のデータを入力し、住宅のヘドニック価格関数を計測した。また、中古住宅の評価法としてヘドニック価格関数を利用した評価法を提案し、このために、理論モデルを構築した。第三に、オフィスビルの居住施設へのコンバージョンについては、既存の建築ストックを地域のニーズに適合するように変更することの社会的意義をとらえることが重要である。このため、住宅需要者のニーズ分析、オフィス市場の都市管理からの考察、住環境と不動産価値からの考察を行った。第四に、主要先進国の住宅税制について、制度的特徴を比較した。また、わが国の不動産所得に対する課税のあり方について、租税思想史的視点から考察した。第五に、資産流動化型の不動産証券が不動産の流動化を促進させることの経済政策的効果を整理した。また、開発型証券化の成功の要件やそのマクロ経済に与える影響を分析した。第六に、不動産をベースとした福祉政策について提言を行う準備として、西欧の資料を収集した。第七に、都市再生の政策と評価について、英国政府の報告書を中心にメタ分析を行い、評価のシステムと手法の分類と類型化を行った。

本年度は、第一に、初年度に続き、中古住宅ストックの実態把握のため、東京都心部におけるマンションについて、アンケート調査を行った。第二に、ヘドニック価格関数による住宅の評価を提案した。すなわち、住宅の質と品質調整済み価格指標を説明変数とする住宅価格に関する回帰式を計測し、その理論値で住宅を評価し、その際に分析誤差を取り除く手法を構築した。さらに、住宅の評価について開示すべき情報を示した。第三に、コンバージョンの前提となる住宅市場における住宅ニーズの把握に関する分析を行った。アンケートデータをもとに、居住者の属性や価値観、住宅の仕様、居住者の満足度の関係を分析した。入居して一定時期を経ると満足度に関する逆転時期が存在し、コンバージョン住宅のターゲット層になりうることとなる。第四に、資産流動化型の不動産証券化のマクロ経済に与える影響について示した。また、資産デフレ脱却のために不動産市場を活性化させるには、証券化の普及だけでなく、税制の変更や土地利用規制との組みあわせが必要なことを示した。第五に、資産をベースとした経済政策によって生じる資産保有の不平等を是正するために、401(k)やESOPのような資産分配政策が必要であることを提示した。第六に、海外事例に基づき、個人・グループ間の合意を形成するための支援、補償制度事例について解析を行った。集積度、魅力度を形成するための効果的な交通システムのあり方とその社会的経済効果計測のプロトタイプモデルの構築を検討した。第七に、住宅資本ストック管理のルールとして、公営住宅についての福祉競争を回避するために中央政府からの補助を存続させることが必要であることを明らかにした。第九に、租税思想史的観点から資産保有課税の存在を考慮した所得税制改革の議論を概観し、それに基づきわが国の資本所得税のあり方を考察した。本研究では、中古住宅ストックの実態把握のため、東京都心部におけるマンションについて、アンケート調査を初年度から行っているが、本年度は、第一に、このアンケート調査を追加した。第二に、昨年度に本研究で提案したヘドニック価格関数による住宅の評価法を行えば、住宅市場における情報の不完全性が除去され、住宅市場における価格形成がパレート最適な配分と対応し、住宅投資の理論値からの乖離を削減できることを示した。第三に、住宅ストックをコンバージョンによって活用するためには、住宅需要のニーズと住宅の質や住環境が合致している必要があることから、住宅需要者のニーズを把握するための方法を探った。第四に、不動産の証券化についての分析の結果、証券化主体の財務指標(自己資本利益率と総資産利益率)に与える影響は、証券化主体の負債の利子率、証券の支払い金利、証券化対象の不動産の利回りなどに依存することを明らかにした。第五に、租税思想史の観点からわが国の資本所得税のあり方を考察し、所得税の補完税として帰属家賃に対する資産保有課税を検討すべきことを提案した。第六に、住宅の耐久性が都市衰退に与える影響を扱ったmortar and bricks modelを用いて、わが国のデータにより、当モデルの適応性を実証的に検証した。第七に、都市再生の海外事例に基づき、都市ストックの有効活用事例について、その成功要因を解析した。
生体内ラジカル反応解析のための機能性デンドリマーの開発とその応用

生体の生理的・病的現象に関係する生物ラジカルの生体内反応を解析するためのin vivo計測法の一つとして,電子スピン共鳴(ESR)法が注目されている。しかし,ESR法を適用するためには,体外から機能性スピンプローブ剤を投与して,その挙動を追跡する必要がある。一方,デンドリマーは,分岐が規則的に連続し規制された構造を有した三次元状巨大分子である。デンドリマーは,その中心や最外殻への官能基の導入が容易であることから様々な機能を付与することが可能であり,また世代が上昇するにつれて,内部が疎,末端が密の構造を有し,内部空孔に低分子化合物を保持できる。本研究では,スピンプローブ剤を内部に取り込ませたデンドリマーの合成を行い,その機能について基礎的知見を得ることが目的である。本研究で合成したデンドリマーは,内部にスピンプローブ剤を約1分子包含することが可能であり,また,末端を糖鎖で修飾しているため水溶性を付与することが可能となり,組織認識能を有することが期待された。そこで,スピンプローブ剤(Carboxy-PROXYL)包含デンドリマーを生体投与し,その投与挙動を観察した結果,スピンプローブ剤はデンドリマーに内包されたことにより体内寿命が約2倍延長したことを見出した。しかし,組織認識能の評価は,合成したデンドリマーが生体適合性が低かったため行うには至らなかった。より生体適合性の高いデンドリマーの合成を目的とし,脂肪族ポリエーテルデンドリマーの合成を試みたが,その性質については,今後の課題である。生体内ラジカル反応の機構解明を目指して,スピンプローブ剤を用いるin vivo ESR法の研究が行われている.これまではスピンプローブ剤にニトロキシルラジカルが多用されてきたが,臓器・組織への特異的集積性に乏しく生体内全体に広く拡散するために,目的部位のスピンクリアランス(酸化還元力)に関する情報が得にくい欠点があった.本研究では,内部にスピンプローブ剤を包含させたデンドリマ-がこの問題を解決する新規プローブ剤になりうると考え,TEMPOLラジカルを取り込ませたデンドリマ-を合成した.第五世代のポリ(プロビレンイミン)デンドリマ-とTEMPOLをジメチルスルホキシド中で攪拌し.この溶液にN-tBOC-L-フェニルアラニン,無水フタル酸を加えることによりTEMPOLを包含した水溶性デンドリマ-(Den-Phe-phth)を合成した.包含されたTEMPOLの分子数は1分子のデンドリマ-に対し0.8個であった.スピンプローブ剤としての性質を調べるため,TEMPOLを含んだデンドリマ-(Den-Phe-tBOC)のアスコルビン酸ナトリウムによる還元反応速度をX-バンドESR法により測定した.その結果,TEMPOL単独と比べて還元反応速度が3.8倍低下した.次に,Den-Phe-phthの水溶液をラット腹部に皮下投与した後,L-バンドESR法で投与部位のラジカル濃度の径時変化を調べたところ,4-カルボキシTEMPOの単独投与に比べてラジカルの濃度の減少が11倍遅いことが分かった.この結果は,このデンドリマ-が投与部位に止まり,その部位のみのの酸化還元的環境を反映したものと考えられる.現在,糖鎖を用いて末端を修飾したデンドリマ-を合成し,生体組織への特異的集積性を検討中である.昨年度は、4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル(1)のカプセル化を検討し、L-フェニルアラニンを修飾したポリ(プロピレンイミン)デンドリマー(2)にフタル酸を用いて末端封止することで、1を包含したデンドリマーを合成し、ラット皮下におけるラジカルの半減期が、単独の1と比較して約11倍増加したことを見出した。

しかしながら、これまで合成されてきたニトロキシルラジカルを包含したデンドリマーは、水への溶解性が乏しく、溶解性が溶液のpHに依存する性質を有し、生体適合性が低いという問題があった。そこで今年度は、末端封止剤として糖誘導体を用いることで、生体適合性と組織集積性を向上させたスピンプローブ剤としての機能を有するデンドリマーを合成することを目的とした。3-Carboxy-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン1-オキシル(3)を最大1分子包含したデンドリマーを合成した。ラット皮下におけるデンドリマー内部に取り込ませた3の半減期は、単独の3と比較して約2倍増加したことを見出した。さらに、次の目標として、スピンプローブ剤の組織集積性の向上を検討し、既に肝細胞に取り込まれ易いという知見が得られている、ガラクトース残基を有する末端封止剤を用いて3を取り込ませたデンドリマーの、in-vivoにおける動態を観察することを目的とした。しかしながら、測定中に実験動物が死亡し、デンドリマーの致死量は360mgであった。この量は、L-band ESR装置で検出できる最小投与量の約半分に当たることが分かった。次年度の方針として、より多くのスピンプローブ剤分子をデンドリマー内部に取り込ませる条件と、生体への安全性を向上するためデンドリマーの分子設計を再検討する。昨年度に引き続き,デンドリマーの興味深い性質に着目し、新規スピンプローブ剤の開発のための基礎的知見を得るため,スピンプローブ剤を内部に取り込ませたデンドリマーの合成と機能についての検討を行った。デンドリマーは,分岐が規則的に連続し規制された構造を有した三次元状巨大分子である。デンドリマーは,その中心や最外殻への官能基の導入が容易であることから様々な機能を付与することが可能であり,また世代が上昇するにつれて内部が疎,末端が密の構造を有し,内部空孔に低分子化合物を保持できることが報告されている。デンドリマーは以上の性質より,医療材料をはじめとする様々な分野への応用が期待されている。本年度の研究で合成されたデンドリマーは,内部にスピンプローブ剤を約1分子包含することが可能となり,また,末端を糖鎖で修飾しているため水溶性を付与することが可能となり,組織認識能を有することが期待された。そこで,スピンプローブ剤包含デンドリマーを生体投与し,その投与挙動を観察した結果、スピンプローブ剤はデンドリマーに内包されたことにより体内寿命が約2倍延長したことを見出した。しかし,組織認識能の評価は,合成したデンドリマーが生体適合性が低かったため行うには至らなかった。より生体適合性の高いデンドリマーの合成を目的とし,脂肪族ポリエーテルデンドリマーの合成を試みたが,その性質については,今後の課題である。
人工的運動視差により誘起される新しい立体知覚とその3次元表示への応用に関する研究

本研究では、人工的に生成した運動視差によって表示対象を数十m数百mの遠方に観察者に知覚させ、かつ知覚される奥行きを制御できる従来にはない新しい3次元表示技術を提案し、実際に走行する自動車を用いた主観評価実験により提案技術の実現性を確認するとともに、本技術を将来カーナビゲーションへ応用する際に光学系を車載装置として実用的なサイズで実現できることなどを示し、その実用性についても実証した。主観評価で使用する実験システムを構築するとともに、3次元CG技術により動画のテストパターンの生成法を確立して、予想される奥行き知覚について基本確認を行った。1,実験システム構築:小型液晶ディスプレイ上に表示したパターンをレンズ系とハーフミラーを用いて、被験者の前面の風景に重畳して観察可能に被験者に提示できる光学系、ならびに光学シースルー型のヘッドマウントディスプレイにテストパターンを視差画像として前面の風景に重畳して被験者に観察可能に提示できる光学系を製作した。2.基本原理の確認:上記実験システムを用いて、被験者の移動速度、パターンサイズの時間的変化率、パターンの像位置をパラメータとした主観評価実験を実施した。実験の結果、まず、テストパターンを運動視差が支配的となる10m以上の固定位置に表示し、パターンの知覚位置がそのサイズの時間的変化率と被験者の移動速度に依存すること、すなわち人工的運動視差により制御できることを確認した。また、両眼視差が支配的と言われている10以下の距離にテストパターンを表示しても、人工的運動視差によりパターンの知覚位置を制御できることもわかった。これは予想外の結果であるが、光学系を小型化する上で好都合の結果である。人工的運動視差により誘起される新しい立体知覚について、昨年度製作した実験システムを用いて以下の項目を明らかにした。1.奥行き知覚を生じさせる各要因の支配的範囲:模擬する奥行きが70mから200mの範囲で調べた結果、この範囲においては運動視差による奥行き知覚が支配的であることを確認した。しかし、知覚される奥行きの運動視差依存度は計算値より小さくなることがわかった。これは、運動視差以外の要因も奥行き知覚に影響を与えていることを示す結果であり、その要因として心理的要因である網膜像の大きさを取り上げ、表示パターンのサイズをパラメータとしてその影響を評価した。この結果、パタンサイズによっても奥行き知覚が変化することが明らかになった。以上の結果より、運動視差に加えてパタンサイズを模擬する奥行きに応じて変化させることによって、より精度の高い奥行き知覚が可能であることがわかった。2.心理的要因による影響の明確化:運動視差は観察者が運動中に生じる知覚現象であるが、ナビゲーションへの応用においては運動が停止した場合でも、運動中に得た奥行き知覚が持続されることが望まれる。実験によりこの持続性について調べた結果、数十秒間は保持可能であることがわかった。また、提示パターンとして、単純なパターンだけでなく日常的に馴染みがあり、その大きさがよく知られている物をパターン化して提示すれば、そのサイズからも奥行きの手がかりが得られるため、より精度の高い奥行き知覚が実現できることがわかった。3.シミュレーションによる評価手法の確立:本研究を効率よく実行することを目的に、大画面3D映像による仮想環境で奥行き知覚の評価が可能であることを示し、かつその手法を確立した。最終年度である22年度は、奥行き知覚のモデル化に取り組むとともに、カーナビゲーション応用に向けた基本検討を行い、以下の成果を得た。(1)奥行き知覚の支配的生理的要因の明確化とモデル化本研究では、拡張現実感と同様の技術により実空間中に仮想対象を重畳表示する。このような環境において表示像のピント位置、両眼視差、運動視差の視覚系に仮想対象の奥行き知覚を生じさせる3つの生理的要因が、それぞれ視覚系に異なる奥行き情報を与える場合、通常では両眼視差の影響を最も強く受ける数m程度の像位置においても,観察者が運動しているときは運動視差の影響を最も強く受けるという新しい知見を得た。この結果を基盤として、特に運動視差が他の奥行き手がかりと独立して提示される場合の奥行き知覚のモデル化に着手した。(2)ナビゲーション応用に向けた基本検討上記(1)で得た結果に基づき、人工的運動視差により生じる奥行き知覚をカーナビゲーションに応用する際、表示する仮想標識の像位置を観察者から数mの近い位置に設定できるため光学系を小型化できること、そしてこれより車載装置として現実的なサイズで装置化が可能であることを明らかにした。また、ナビゲーション用として仮想標識をフロントガラス前方に実風景に重畳して表示する場合、視認性を考慮した最適な表示方向は前方水平線上の数度上方であることを明らかにした。そして、この方向に表示する場合のフロントガラスと装置の光学系構成の配置における必要条件を明らかにし、この条件が現状の大半の乗用車において適用可能であることを明らかにした。
拘束コンクリートの圧縮破壊エネルギーおよび圧縮破壊性状の評価

角柱拘束コンクリート供試体ならびに寸法を変化させた円柱拘束コンクリート供試体を作成し、その一軸圧縮試験をひずみ軟化領域に至るまで行うとともに、終局時に至るまでの圧縮破壊領域(ひずみの局所化領域)の広がり、および破壊の進展度(局所化の程度)を実験的に明らかにした。実験変数としては供試体形状ならびに横方向拘束力をとりあげた。供試体形状に対しては断面形状と供試体寸法を、横拘束力に対しては横方向鉄筋量、横方向鉄筋間隔の影響を検討し、以下の成果が得られた。実験結果より得られた軟化域を含む荷重変位関係の検討より、(1)拘束効果を考慮した円柱ならびに角柱コンクリートの圧縮破壊エネルギー算定式の作成、(2)寸法の影響を考慮した拘束コンクリートの最大応力ならびに最大応力時ひずみの算定式の作成を作成した。これにより、拘束を考慮したコンクリート構造物の軟化域の解析において唯一性ならびに信頼性が向上した解析解を得ることを可能にした。一方、局所化ひずみの測定結果に基づき、拘束力の相違が破壊進展に与える影響を明らかにするとともに、破壊領域(ひずみの局所化領域)が断面形状や拘束力にそれほど影響せず、ある一定の大きさになることを明らかにした。また、作成した拘束コンクリートの圧縮破壊エネルギーを考慮した力学モデルを有限要素解析に組み込み、横方向鉄筋を有するRC部材の最大耐力ならびにポストピーク挙動をより妥当に評価可能にした。横方向鉄筋で拘束されたコンクリート円柱供試体を作成し、その一軸圧縮試験をひずみ軟化領域に至るまで行うとともに、終局時に至るまでの圧縮破壊領域(ひずみの局所化領域)の広がり、および破壊の進展度(局所化の程度)を実験的に明らかにした。実験変数としては横方向拘束力をとりあげ、横方向鉄筋量、横方向鉄筋間隔の影響を検討した。今年度は以下の成果が得られた。実験結果より得られた軟化域を含む荷重変位関係の検討より、(1)拘束効果を考慮した円柱コンクリートの圧縮破壊エネルギー算定式の作成、(2)寸法の影響を考慮した拘束コンクリートの最大応力ならびに最大応力時ひずみの算定式の作成を作成した。一方、局所化ひずみの測定結果に基づき、拘束力の相違が破壊進展に与える影響を明らかにするとともに、破壊領域(ひずみの局所化領域)が拘束力の増加とともに小さくなる事を見いだした。さらに、拘束コンクリートの挙動は一般に横方向鉄筋の影響を含んだものとして与えられるが、鉄筋とコンクリートが吸収するエネルギーを分離して評価することで、拘束コンクリートの挙動に及ぼす鉄筋の役割を検討し、最大荷重時付近は鉄筋のエネルギー吸収により拘束コンクリートの挙動が支配されていることを明らかにした。
青少年の生活習慣病予防医療を目的とした地域連携型研究・教育拠点の構築

本研究の目的は、学術的研究および社会啓発活動により、青少年の生活習慣病予防医療を目的とした地域連携型研究・教育拠点の構築を計ることである。本研究の結果、学童・小児の血清HDL-Cと生活習慣、生活習慣病関連検査項目の基準値、ピロリ菌感染症の頻度、血清中脂肪酸に関する新たな学術的知見が得られた。また、市民公開講座、生活習慣病予防外来、出前クリニックなどの社会啓発活動を実施し、遠隔健康教育システムを開発した。さらに、成果をまとめて“信州発"青少年の健康教育プログラムを発刊した。以上、本研究は目的に向けて貢献するものと考えられる。科研費助成金交付2年目は、長野県内モデル3中学校の学校健診で従来の調査研究を継続し、以下の結果を得た。1.科学的エビデンスの構築:1)生活習慣病関連検査項目の基準値:過去7年間に県内3中学校で収集した2,750名(男子1,444名、女子1,306名、12.1-15.0歳)の健康診断検査値から統計的手法により、基準値が設定された。2)血中ピロリ菌抗体検査:3-4%の生徒に陽性者が存在するデータが得られ、引き続き対象を増やして調査を継続中である。2.社会啓発活動:1)第7回学術講演会開催(メインテーマ:生活習慣病研究の最近のトピックス、一般講演3題、参加者150名)、2)第5回市民公開講座開催(メインテーマ:青少年の高血糖と糖尿病、特別講演3題、パネルディスカッション、出席者150名)、3)第27回松本市健康フェスティバルで医療チームによる「家族で予防生活習慣病:ミニドックから健康相談まで」を出展、4)中学校で「出前クリニック」実施(3校、各1回)、5)食育講座開催(1回)、6)信州大学医学部附属病院で青少年とその家族を対象とした「生活習慣病予防外来」実施(3日間、10家族32名)、7)食育を中心に、テレビ会議システムによる学校遠隔健康教育支援を実施(5回)した。3.自治体による青少年の生活習慣病予防事業支援:1)こどもの生活習慣改善事業(松本市)ならびに親子の食育講座(安曇野市)を強力に支援した、2)平成26年3月健康長寿を基盤とする活力ある地域づくりの推進などを目的として締結された、信州大学医学部と従来から私たちがモデル中学校での取り組みを実施している男性長寿日本一(2013年厚生労働省発表)の長野県松川村の地域連携により、同村での生活習慣病予防事業をより一層推進・発展させることになった。科研費助成金交付1年目は、長野県内モデル3中学校の学校健診で従来の調査研究を継続し、以下の実績を得た。1.科学的エビデンスの構築:一般中学生1064名を対象とした検討により、男女いずれもHDL-Cの低値は日常運動習慣の低下と関連を示した。また、4分位法により男子のHDL-C最低位群では最高位群に比較して、2項目以上の生活習慣病を集積するリスクが有意に高値を示した〔補正オッズ比(95% CI) 4.79 (1.45-16.0)〕。一方、女子では有意差がみられなかった。2.社会啓発活動:1)第4回市民公開講座開催(特別講演1:「子どものピロリ菌感染症と生活習慣病の予防」、特別講演2:「食習慣が子どもの成長に与える影響」、2)第26回松本市健康フェスティバルで医療チームによる「家族で予防生活習慣病:ミニドックから健康相談まで」出展(身体測定、血液検査、個別の結果説明、食事・生活指導)、3)中学校で「出前クリニック」(医療チームによる生徒の集団健康教育および保護者を交えた健康・食事・生活の個別指導)(1回)、出前授業(生活習慣改善、生活習慣病予防)(1回)実施、4)食育講座開催(1回)、5)信州大学医学部附属病院近未来医療推進センターで、夏休みおよび春休み期間中に青少年とその家族を対象として、健康的な食生活・運動習慣の提案、推進に重点を置いた国内初の「生活習慣病予防外来」を実施し、高い評価を得た。6)モデル中学校のひとつと光ファイバー回線で結び、テレビ会議システムを用いて学校遠隔健康教育支援システムを開発した。3.自治体による青少年の生活習慣病予防事業支援:全国に先駆けて開始したこどもの生活習慣改善事業(松本市)および親子の食育講座(安曇野市)を強力に支援し、こどもの頃からの健康に関する保護者の意識の向上などの成果が得られている。科研費助成金交付3年目は、長野県内モデル3中学校の学校健診における調査研究および社会啓発活動などを実施し、以下の結果を得た。1.科学的エビデンスの構築:

1)小児、新生児における質量分析法による血清中脂肪酸の解析:微量検体により主要脂肪酸の定量が可能となり、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸で年齢差が認められることを明らかにした。2)青少年とその家族を対象とした「生活習慣病予防外来」の調査結果:約2/3の家族が子どもの肥満体型をきっかけに、また、過半数が養護教員からの紹介を介して受診した。子どもの多くは肥満に悩む成長期の小・中学生であったため、主な介入は身体的成長を見込んだ体重維持のための生活アドバイスであった。アンケート調査結果からは、本外来が受診者の生活習慣の見直しに有用である可能性が示唆された。2.社会啓発活動:1)第8回学術講演会開催(メインテーマ:青少年のピロリ菌感染症と予防・対応策、特別講演2題、参加者110名)、2)第9回食育推進全国大会しあわせ信州食育フェスタ2014にブースを出展、3)第28回松本市健康フェスティバルで医療チームによる「家族で予防生活習慣病:ミニドックから健康相談まで」を出展、4)平成26年度健康日本21推進松本大会にブースを出展、5)中学校で「出前クリニック」実施(2校、各1回)、6)信州大学医学部附属病院で「生活習慣病予防外来」実施(計3日間、13家族34名)3.自治体による青少年の生活習慣病予防事業支援:1)「こどもの生活習慣改善事業」(松本市)を強力に支援した。同事業は平成26年版厚生労働白書に、全国的にも先進的な健康寿命延伸事業のひとつとして掲載された。2)平成26年3月に締結された信州大学医学部と松川村(男性長寿日本一)の地域連携事業の一環として、松川中学校で生活習慣病調査および食育講座(3回)を実施した。健康・スポーツ科学・応用健康科学1.科学的エビデンスの構築:多数の日本人一般中学生を対象として、生活習慣病関連検査項目の基準値が設定された。また、中学生において、血清シスタチンCが血清尿酸値と関連を有すること、血中ピロリ菌抗体陽性者は3-4%であることが明らかになりつつある。2.新たな科学的エビデンスや社会的取り組みから得られた成果をまとめて、2011年1月に初版が発刊された「“信州発"青少年の健康教育プログラム:生活習慣病予防を目指して」の改訂第2版の準備作業が年度内に終了し、2014年4月に発刊された。3.従来から実施している自治体との連携事業のほか、信州大学医学部と男性長寿日本一の自治体との連携協定が締結され、より強力な支援が可能となった。1.科学的エビデンスの構築:日本人一般中学生におけるHDL-Cと生活習慣、生活習慣病との関連および生活習慣病集積予測マーカーとしてのHDL-Cの意義を明らかにした。さらに、新たな生活習慣病集積予測マーカーの解析および中学生におけるピロリ菌感染の実態把握と予防の研究を開始した。2.従来から実施している地域と連携した各種社会啓発活動、生活習慣病予防外来を継続、推進した。また、新たに、モデル中学校のひとつと光ファイバー回線で結び、テレビ会議システムを用いて学校遠隔健康教育支援システムを開発した。1.科学的エビデンスの構築:1)青少年における血清シスタチンCと生活習慣病、特に、早期腎障害、高尿酸血症との関連について、更に詳細を解析中である、2)青少年における血中ピロリ菌抗体陽性者の頻度を引き続き解析し、予防法、治療法につて研究を進める、3)社会的取り組み、特に、国内で初めて実施された「生活習慣病予防外来」、「出前クリニック」に関するデータ収集を進め、論文執筆を目指す。
脂質メディエーターの細胞外放出機構の解明

脂質メディエーターを初めとするいくつかの情報伝達物質では、細胞内での生合成過程、その標的レセプターに結合した以降のシグナル伝達経路についての解析は良く進んでいるが、生成された細胞からどのような機構で分泌されるのかが未だによく分かってないものが存在する。私は、これが情報伝達におけるmissing-linkの1つであると捉え、このような放出機構の分かっていない情報伝達物質が特定の輸送体によって細胞外に放出されているのではないかとの仮定のもと、その放出機構を詳細に検討すると共に、輸送体本体の同定を目指した。その中で血液中に存在する重要な脂質メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸(S1P)の血小板活性化に伴う細胞外への放出にABCA型と性質の似た輸送体が関与することを明らかにした。さらに、リンパ管から血管へのリンパ球の移行に必要なS1Pの濃度勾配形成の中心的役割を担う赤血球からのS1P放出も輸送体が関与するが、血小板とは異なり活性化の刺激が必要ないことを明らかにした。さらに、赤血球の反転膜を用いることで、S1Pの輸送活性を直接測定できる系を確立した。S1PはATP濃度依存的に輸送され、その輸送はABCA型輸送体の阻害剤であるGlybrideによって阻害された。これは血小板の輸送体の性質と似ており、ABCA型の輸送体の関与が示唆された。そこで、ABC輸送体のA型ファミリーに属するオーファン輸送体の中からABCA7が血小板に強く発現することを見いだした。これまでにABCA7ノックアウトマウスの構築に成功し、このマウスは生殖能力や形態上に顕著な異常がないことを確認した。脂質メディエーター等の脂溶性の高い細胞間情報伝達物質の細胞からの放出機構を明らかにするために以下の研究を進めた。我々はこれまでに血小板内に高濃度に蓄積し、細胞外の刺激により放出されるS1Pが、血小板内に多く存在する分泌顆粒内に蓄積して開口放出により分泌されるのではなく、細胞膜の細胞質側に局在して輸送体により放出される可能性を示している。本年度はこの輸送機構のエネルギー源を明らかにし、エネルギー依存的な輸送活性を指標にして、膜から単離した輸送体の再構成により輸送体本体の同定を目指した。ラットから調製した血小板にα-Toxinを作用させ、細胞膜にのみ穴をあけることができる条件で、S1Pを細胞内に維持したまま細胞内のATPや各種イオン等が枯渇したセミインタクト細胞を作成した。この細胞では、開口放出を起こすにはATPとCa^<2+>が同時に必要であったが、S1Pの放出はATPとCa^<2+>を別々に加えた場合でも観察できた。この事からS1PはATPもしくはCa^<2+>をエネルギー源とした細胞膜上の輸送体によって細胞外へ放出される事がわかった。このうち、ATP依存性の放出は、ABC輸送体であるMDRやMRPの阻害剤では阻害されなかったが、ABCA1の阻害剤として知られているGliburideによって阻害された。これらの結果はABCA型の輸送体がS1Pの輸送に関与している事を示唆している。この輸送体の生化学的性質を明らかにするため、反転膜を用いてS1Pの取込みを測定できる系の構築を行ない、弱いながらもATPに依存した取込み活性が見られるようになった。また我々は、多数の機能未知のオーファンABC輸送体を解析する中で、ABCA型輸送体の一員であるABCA7が血小板に多く発現している事を明らかにし、さらにABCA7は血小板の細胞膜に局在している事を見いだした。これらの結果から、S1PはABCA7によって細胞外へ放出されている可能性を考えている。

脂質メディエーターを初めとするいくつかの情報伝達物質では、細胞内での生合成過程、その標的レセプターに結合した以降のシグナル伝達経路についての解析は良く進んでいるが、生成された細胞からどのような機構で分泌されるのかが未だによく分かってないものが存在する。私は、これが情報伝達におけるmissing-linkの1つであると捉え、このような放出機構の分かっていない情報伝達物質が特定の輸送体によって細胞外に放出されているのではないかとの仮定のもと、その放出機構を詳細に検討すると共に、輸送体本体の同定を目指している。本年度はスフィンゴシン1リン酸(S1P)の赤血球からの放出が輸送体を介した者である可能性を明らかにした。この赤血球からの放出は血小板とは異なり輸送の活性化に何の刺激も必要なかった。そこで赤血球の反転膜を用いることで、S1Pの輸送活性を測定できる系を確立した。S1PはATP濃度依存的に輸送され、その輸送はABCA型輸送体の阻害剤であるGlybrideによって阻害された。これは血小板の輸送体の性質と似ており、ABCA型の輸送体の関与が示唆された。そこで、ABC輸送体のA型ファミリーに属するオーファン輸送体の中からS1P輸送体の同定を試みている。これまでに血小板にABCA7が強く発現していることを見いだし、ABCA7のノックアウトマウスの作成を進めてきた。本年度、ノックアウトマウスの作出に成功した。ノックアウトマウスは正常に出産、生育し生殖能力に異常は認められなかった。また、形態上の顕著な異常は見られなかった。そこで、このマウスより血小板を調製し、刺激に依存したS1Pの放出を調べたが野生型と大きな違いはなかった。ABCA7の欠損により他のABCA型輸送体の発現量も変化していなかったことから、血小板からのS1Pの放出にはABCA7は関与していないことが明らかになった。