hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＥＲＫ５による新しい神経機能調節の分子メカニズムの解明

われわれは、ERK5選択的に発現が誘導される多数の遺伝子を同定し、その中でもp36遺伝子に焦点を当てて研究活動を行った。その結果、p36はカテコラミン生合成酵素の一つであるチロシンヒドロキシラーゼを安定化して、その生合成を促進することが明らかとなった。つまり、神経細胞の分化の過程においてERK5/p36のシグナル伝達経路は、神経機能を強化する役割を担っていることが示唆された。また、ERK1/2がERK5のThr732をリン酸化することにより、ERK5の核移行が促進され、長く不明であったERK5とERK1/2のクロストークメカニズムを明らかにすることが出来た。われわれは、以前より神経細胞の分化の過程で、ERK5がp36遺伝子を誘導することをマイクロアレイ法で見出していた。さらに、このp36遺伝子はチロシンヒドロキシラーゼの発現やカテコラミンの産生に必須の因子であることを明らかにしてきた。そこで、p36遺伝子のチロシンヒドロキシラーゼの発現促進メカニズムを調べたところ、p36はチロシンヒドロキシラーゼのmRNA発現量には影響を与えなかったことから、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質の安定化に関与していることが示唆された。特に、p36がチロシンヒドロキシラーゼの分解系(ユビキチンープロテアソーム系)を抑制しているものと推定される。また、前年度に引き続き、ERK5とERK1/2のクロストーク機構の解析についても行った。Rasオンコジーンにより活性化されたERK1/2がERK5のT732をリン酸化することが確認された。さらに、NGFやEGFなどの増殖因子刺激によっても同様の現象が引き起こされ、自己リン酸化能を欠くERK5 kinase-dead変異体のT732もリン酸化された。そこで、ERK5 T732A変異体を作製し、MEF2の転写活性をレポーターアッセイ法により定量したところ、ERK5 WTと比較してERK5 T732AによるMEF2の活性化能は有意に減弱していた。以上より、ERK1/2によるERK5のリン酸化はERK5下流の転写因子の活性化に重要なことが明らかになった。われわれは、マイクロアレイ法により神経系でERK5選択的に発現が誘導される多数の遺伝子を同定したが、平成24年度はその中でもp36遺伝子に焦点を当てて研究活動を行った。その結果、ERK5により発現が誘導されるp36をsiRNA法でノックダウンすると、カテコールアミン生合成酵素の一つであるチロシンヒドロキシラーゼタンパク質の発現が大きく抑制されること、さらにドパミンやノルアドレナリンなどのカテコールアミンの生合成も抑制されることが明らかとなった。ERK5をノックダウンしても同様の表現型が示されることから、神経細胞の分化の過程においてERK5/p36のシグナル伝達経路は、神経伝達物質の生合成といった神経機能を強化する役割を担っていることが示唆された。一方、p36遺伝子をノックダウンしても、あるいは過剰発現しても神経のモデル細胞であるPC12細胞の神経突起の伸展には影響を与えなかったことから、p36は神経細胞の形態的な分化には関与しないことが示唆された。現在、p36のカテコールアミン生合成を促進するメカニズムを詳細に検討している。また、ERK5とERK1/2のクロストーク機構についても検討した。免疫沈降を行うとERK5とERK2は共沈し、両者が会合していることが予想された。また、MEK5によりERK5のT-E-Yモチーフのスレオニン残基とチロシン残基がリン酸化され、活性化したERK5はさらに自身のC末端に存在する複数のセリン・スレオニン残基を自己リン酸化する。その自己リン酸化部位を認識するリン酸化抗体を独自に作製して個々の部位のリン酸化レベルを検討していくと、ERK5のThr723はERK5の自己リン酸化ではなく、ERK1/2によりリン酸化されることが新たに判明した。今後は、このERK1/2によるERK5 Thr723のリン酸化の生理的な役割・意義を明らかにしていく。われわれは、ERK5選択的に発現が誘導される多数の遺伝子を同定したが、その中でもp36遺伝子に焦点を当てて研究活動を行った。その結果、p36をsiRNA法でノックダウンすると、カテコールアミン生合成酵素の一つであるチロシンヒドロキシラーゼの発現が抑制されること、さらにカテコールアミンの生合成も抑制されることが明らかとなった。さらに最終年度も引き続きERK5とERK1/2のクロストーク機構についても検討した。

免疫沈降を行うと、ERK5とERK2は共沈して両者が結合することが明らかになっていたが、ERK5とERK2のリコンビナントタンパク質を用いたin vitroの実験系で同様の実験を行ったところ、両者は相互作用しなかった。つまり両者は間接的に結合しているものと予想された。また、これまでにERK5のC末付近のThr732がERK1/2によりリン酸化されることが明らかになっていた。そこで、ERK5のThr732のリン酸化を模倣するERK5 T732E変異体を作製して、HEK293細胞に発現させたところ、ERK5の野生型あるいはERK5 T732A変異体が主に細胞質に局在したのに対して、ERK5 T732E変異体は核に局在する割合が大きく上昇することが示された。我々はERK5のThr732のリン酸化依存的に転写因子MEF2Cの活性が上昇することを明らかにしていたが、この現象はERK5の核移行が促進することが大きな理由の一つであることが予想された。つまり、これまで長く不明であったERK5のC末部位による転写活性化機構の一端が、本研究によって解明されたと思われる。薬理学異動があったため、研究課題申請時と研究環境が異なり、若干の遅れが出ている。研究期間を延長して対処する予定である。平成24年度は新しい研究室に異動したため、研究計画を作成した時点と研究環境が大きく異なることとなった。現在の研究室においても研究計画を十分に遂行できる研究環境ではあるが、異動のため当初の見込みより研究計画が“やや遅れている"のが実情である。計画の進行が遅れている部分があるが、必要な試薬・機器も揃ったので、遅れは取り戻せると思われる。今後は引き続き研究計画をもとに研究課題を遂行していく。計画の進行が遅れている部分があるが、今後必要な機器を購入する予定であり、遅れは取り戻せると思われる。2013年度にERK5によって発現が誘導されるmidnolin遺伝子の機能解析を行う予定であったが、研究課題申請後に異動したために研究環境が大きく変わり、研究の進捗が当初の予測よりやや遅れたため、未使用額が生じた。このため、midnolin遺伝子の機能解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。平成24年度は新しい研究室に異動したため、研究計画を作成した時点と研究環境が大きく異なることとなり、研究計画の遂行がやや遅れることとなった。そこで、一部の計画を次年度(25年度)に行うことにしたため、次年度に使用する研究費が発生した。平成25年度は、ERK5依存的に誘導される遺伝子のmRNAレベルを定量するために必須であるリアルタイムPCR用サーマルサイクラー(ロッシュ製、ライトサイクラー・ナノ)を設備備品費として計上する(定価139万円)。また、薬理学的・生化学的・分子生物学的な実験に使用する試薬や細胞培養に必要な培養器具を購入するため、妥当と思われる物品費(消耗品額)を60万円計上した。さらに、本研究課題で得られた成果を国内外の学会で発表するために旅費(41万円)を、論文投稿前の英文校閲を行うために“その他"に10万円それぞれ計上した。
人為的撹乱による景観構造の改変がハリナシバチ送粉系に与える影響

修士課程から継続して人為的撹乱による森林構造の改変がハリナシバチのコロニー数、ワーカー個体数、種構成に与える影響を調査し、論文としてまとめてBiological Conservation誌に発表した。訪花社会性ハナバチの餌探索行動の空間構造を明らかにしていくにあたって、これまで調査してきたハリナシバチよりも、遺伝マーカーが豊富に開発されており、営巣場所を特定するための優れた現地協力者を得られたオオミツバチの方が材料としてより適していることが分かったのでこれを用いることにした。オオミツバチの営巣場所であればハリナシバチよりも効率的に探せることが分かったので本研究の目的を達するのにより優れていると判断した。2年間の継続観察の結果、オオミツバチの営巣数は淡水湿地林と低地・丘陵フタバガキ林で交互に年2回のピークをもつことを発見し、DNA集団・親子解析から両植生間を年2回遊動していることを示唆した。特に淡水湿地林では毎回数十150コロニーの集団営巣が観察され、個体糞維持に重要な植生帯であると考えられた。さらに淡水湿地林の巣中貯蔵花粉・花蜜中の花粉粒の同定を進め、マテバシイ属、ヤシ科、イネ科などが主要な餌資源となっていることが明らかになった。これらの植物は雌雄異花で風媒ないし、多くの昆虫グループに訪花されるタイプの花をつけるので、オオミツバチに強く送粉を依存しているとは考えにくい。このことからオオミツバチの個体群とその送粉系は資源の獲得・送粉をしている低地・丘陵フタバガキ混交林と主に資源の獲得をしている淡水湿地林という2つの植生による非対称的なランドスケープ構造を持っていることが明らかになった。以上の成果の一部は雑文としてまとめ日本熱帯生態学会ニューズレターに掲載された。修士課程から継続して人為的撹乱による森林構造の改変がハリナシバチのコロニー数、ワーカー個体数、種構成に与える影響を調査し、論文としてまとめた。投稿・受理され現在印刷中である。訪花社会性ハナバチの餌探索行動の空間構造を明らかにしていくにあたって、これまで調査してきたハリナシバチよりもオオミツバチの方が材料としてより適していることが分かったのでこれを用いることにした。ハリナシバチはマイクロサテライトマーカーがまだ開発されておらず、その開発に相当の費用と期間がかかることが予想されるが、オオミツバチは既に数百のマーカーがセイヨウミツバチにおいて開発されており、すぐに解析に入れる。また本研究では対象種の営巣場所が特定できることが重要なのだが、優れた現地協力者を得ることによってオオミツバチの営巣場所であればハリナシバチよりも効率的に探せることが分かったので本研究の目的を達するのにより優れていると判断した。調査地域では数百のコロニーを発見し、その動態を調査した。それぞれのコロニーからワーカーを採集し、マイクロサテライトマーカーの解析を行った。マイクロサテライトマーカーはセイヨウミツバチ用マーカーのうち20近くがオオミツバチにも利用可能であることが分かったのでこれを用いた。調査地域の森林構造も調べ、開花フェノロジーセンサスも行った。開花樹木からは花粉用サンプルを集め、これまでLambir Hills国立公園で10年近く採集されてきたサンプルと一緒にプレパラートを作成し、簡便なものとはいえ東南アジア熱帯で初めての花粉Floraの作成を進めている。巣からは蜜、花粉を採集してあり、このFloraを利用して訪花植物の同定も行う予定である。以上の成果の一部は雑文としてまとめ日本熱帯生態学会ニューズレターに掲載され、また論文として執筆中である。
冷戦期東アジア国際情勢の変動と日本の出入国管理政策

本研究は、第二次世界大戦後の日本の出入国管理政策の成立を、冷戦期の東アジア国際秩序の文脈において明らかにする試みである。平成29年度は、平成28年度に実施した文献調査で得られた知見をふまえ、引き続き一次史料および関連文献の収集に努め、その成果を公表した。第一に、1950年代における日本の出入国管理行政の展開を、旧植民地出身者を「外国人」とみなして管理した外国人登録の実施過程をつうじて考察した。とくに地方自治体による外国人登録事務の取組みから、外国人管理における実務の現場を検討した。収集した史料および成果については、『同時代史研究』第10号(2017年12月刊行)において公表した。第二に、入国者収容所の被収容者に対する保釈支援や救援活動から、1950年代における日本の出入国管理政策の展開と人の移動経験の再考を試みた。1950年代初期、入国者収容所における被収容者の釈放支援に取り組んだ人々の思想や行動をつうじて、在留外国人のなかでも旧植民地出身者に対する国籍や在留の地位がどのように規定されたのかを考察した。また、一連の保釈支援の取り組みが、1950年代における出入国管理業務上の「仮放免」や「在留特別許可」の運用といかに結びついていたのかを検討した。これら成果については、2017年6月25日に東洋大学で行われた日本移民学会第27会年次大会(自由論題報告)において口頭発表を行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。2016年度は以下の2点において研究および文献調査を実施した。第一に、日本の出入国行政の展開を東アジアの冷戦の文脈から捉え直し、大村収容所が営まれてきた歴史性とその経験について可視化することを課題に据えた。6月にはAAS in Asia Conference 2016で報告をした。9月にはフィリピンで開催されたKorean Studies Association of Southeast Asiaで、報告論文の審査が受理された。これら報告および論文では、戦後日本社会における個々の集団や人々の生の経験を、東アジア地域の冷戦および戦後経験のなかにいかに位置付けられるのかを問い、朝鮮半島をフィールドとする他地域の研究者から領域横断的な幅広い知見を得ることができた。第二に、1950年代初期における出入国管理行政の展開を再検討した。これまでの研究史において、研究が乏しかった占領体制からの移行期にあたる1952年前後における外国人管理行政のあり方を再検討するために、1950年代の出入国管理および外国人管理の主要業務である外国人登録事務の実施過程に着目した。各地域の「外国人登録関係文書」の収録状況を整理し、主に長野県、京都府、高知県の公文書館が所蔵する外国人登録関係の行政文書について資料調査を実施した。その結果、従来の研究史における政策史的な観点に加えて、新たに地域史・生活史の視点から戦後日本社会との関係性のなかで営まれてきた出入国管理行政の歴史的展開を捉え直すことができた。これら成果は、研究会において発表した。さらに、文献調査をつうじて得た知見を深化させ、1950年代の大村収容所の運営の論理から出入国管理政策の展開過程について論述し、2017年6月に移民学会で発表予定である。研究初年度にあたる平成28年度は、おおむね当初の予定どおり研究を進めることができた。国内における公文書館での文献調査を実施し、貴重な一次史料を収集した。また研究報告も積極的に行い、国際学会での報告も実施した。これら文献調査および報告をつうじて、先行研究を体系的に整理し、問題意識の整理と深化を図ることができた。研究計画の2年目にあたる平成29年度は、平成28年度に実施した文献調査で得られた知見をふまえ、その成果を投稿論文として公表することを計画している。また、引き続き一次史料および関連文献の収集に努める。

とくに、1950年代に展開された入国者収容所の被収容者に対する保釈支援や救援活動が、1960年代後半における市民運動やベ平連の活動、反「入管体制」運動にいかに接続していったのかを考察し、19501960年代における日本の出入国管理政策の展開と人々の移動経験を再考する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
基盤型キラル分子ツールの開発と展開

リン原子上に光学活性なビナフチル基を組込んだセレノリン酸塩化物を出発化合物に用いて、光学活性な二級アルコールを識別する方法、脂肪族置換基のみを有するアルコールやアミンを高い光学純度で導く方法の開発を行った。すなわち塩化物をセレノリン酸エステルに変換し、1^H,<13>^C,<31>^Pさらには<77>^Se NMRの化学シフトの一般的傾向からアルコールの絶対配置を推定する方法を確立した。またエステルとアミンとの反応は立体反転で進行することを利用して、光学活性な2-アルキルピペリジンを導く一般的な方法も開発した。塩化物をセレノリン酸塩さらにはセレノリン酸へと変換し、有機触媒としても用いた。また一連の研究の中で、フッ素原子のリン原子への高い親和性が明らかになった。すなわちセレノリン酸エステルやリン酸エステルに対してフッ化テトラブチルアンモニウムを作用させることで、これらエステルのフッ素化加水分解が進行しモノフッ化リン酸塩を導くことができることも見いだした。光学活性ビナフトール、三塩化リンおよび粉末セレンから調製されるセレノリン酸クロリド(BISEPCl)を新しいキラル分子ツールとして利用することを検討した。まずBISEPCIに対して、水、Et_3Nを加え、光学活性セレノリン酸アンモニウム塩を調製した。それに対してハロゲン化アルキルを加え、セレノリン酸Se-エステルをジアステレオマー混合物として得た。この混合物を液体クロマトグラフで分離することで、単一のジアステレオマーを得た。これに対してBu_4NF/THF溶液を反応させると、選択的P-Se結合切断が進行し、その後空気酸化を経て、光学活性ジセレニドを高収率で合成することに成功した。またBISEPC1とラセミ体であるキラルニ級アルコールとの反応から、様々な置換基を有するセレノリン酸0-エステルを、ジアステレオマー混合物として導いた。およそ15種類の誘導体のジアステレオマー間の31P, 77Se, 13Cおよび1H NMRの化学シフトの相対的差を一覧表として、これらのスペクトルから、絶対構造未知の誘導体のそれを類推する手法を開拓した。すなわち、1-アリール-2-プロパノール由来のジアステレオマーでは、R, R体に相当する77Se NMRは低磁場側に観測され、一方31P NMRは、高磁場側に観測された。同様に1H, 13C NMRでもキラル炭素やそれに隣接する炭素上のプロトンは、一定の高磁場、低磁場シフトが観測された。その結果をもとに1-(4-フルオロ)フェニル-2-プロパノールの絶対配置を決定した。たとえばBISEPClとラセミ体であるキラル二級アルコールとの反応から、様々な置換基を有するセレノリン酸0-エステルを、ジアステレオマー混合物として導いた。およそ15種類の誘導体のジアステレオマー間の^<31>P, ^<77>Se, ^<13>Cおよび^1H NMRの化学シフトの相対的差を一覧表として、これらのスペクトルから、絶対構造未知の誘導体のそれを類推する手法を開拓した。すなわち、1-アリール-2-プロパノール由来のジアステレオマーでは、R,R体に相当する^<77>Se NMRは低磁場側に観測され、一方^<31>P NMRは、高磁場側に観測された。同様に^1H, ^<13>C NMRでもキラル炭素やそれに隣接する炭素上のプロトンは、一定の高磁場、低磁場シフトが観測された。さらに水酸基のβ位にアルコシキカルボニル基やアミド基、ハロゲンなどを有する誘導体についても検討し、この一般的なルールが適用できる場合とできない場合を明らかにした。ついて遠隔位に四級炭素キラリティを有するジオールの片側を保護し、片側にBISEPClを結合させそのジアステレオマーのNMRによる識別、さらには分離を行い、光学的に純粋な化合物として得る事ことにも成功した。本研究では、リン酸エステルのP=O酸素原子を硫黄またはセレン原子に置き換えた誘導体、なかでもビナフチル基を有するものを新しいキラル分子ツールとして開発することを目指し、以下の成果を得た。まず塩基存在下、1,1'-ビ-2-ナフトール、三塩化リンおよび粉末セレンを反応させることでセレノリン酸塩化物を高収率で得た。

これに対して様々な炭素数の脂肪族2級アルコールを反応させてエステルとした。いずれの場合も二つのジアステレオマーをほぼ同じ程度の比で与えた。しかもそれらを31Pおよび77Se NMRスペクトルで区別することができた。またその化学シフトが観測される位置について一般的な傾向を見いだした。これを用いることで、ジアステレオマーの絶対配置さらにはそれを導くキラル2級アルコールの絶対配置を類推する方法を提供できた。実際には1-アリール-2-プロパノールを対象に、芳香環に異なる置換基が導入された誘導体のリン酸エステルを調製し、31P,77Seに加えて1H,13CNMRの化学シフトを一覧にした。それをもとに絶対配置が決定されていなかった1-(4-フルオロフェニル)2-プロパノールの絶対配置を決定した。またエステルと過剰のBuLiとの反応はP-O結合の切断を伴って進行し、対応するアルコールを切り出すことができる。これを用いて再結晶などによって光学純度を向上させたエステルから光学活性1-(4-フルオロフェニル)2-プロパノールも単離することができた。ただしこの絶対配置決定法は、類似の置換様式を有するアルコールからエステルを合成し、先に示した四つのNMRの一般的な傾向が同じであることを示した後に、絶対配置が未決定な誘導体に適用しなければならない。アミド、エステルなどのカルボニル基を有するアルコールに適用する場合には注意を要することもわかった。
必須・有害重金属の分別認識を目的としたフィトケラチンの生合成調節機構の解析

重金属抱合ペプチドであるフィトケラチン(PC)の重金属に対する高い親和性と重金属認識機能を利用すれば、水圏における有害重金属の効率的な除去や高感度モニタリングのための技術開発が可能である。そこで本研究では、このような応用研究に有用な基礎情報を得るために、海産性微細藻類Dunaliella tertiolectaにおけるPC調節機構について検討を行った。重金属の種類と濃度のPC合成に対する影響について詳しく検討を行った結果、カドミウムよりも亜鉛でPC合成が強く誘導されること、銅や鉛、ニッケルではPC合成は誘導されないこと、合成されたPCの重合度は4あるいは5の割合が2に比べて高いこと、各重合度のPCの細胞内レベルが重金属処理時間の経過にともなってほぼ同時にしかも直線的に上昇すること、PCの合成量にかかわらず生合成の基質であるグルタチオンの細胞内レベルは変化しないこと、というこれまで報告されている高等植物や藻類とは異なったPC合成に関する特性が確認された。これは、本株のPC合成酵素の重金属による活性化機構やPC分子に対する基質特異性などが他の生物とは異なることを示唆するものである。そこで、PC合成酵素の一次構造の違いや、タンパク質レベルでの重金属による活性化機構や酵素特性の違いを明らかにするために、まずD.tertiolectaの本酵素遺伝子をクローニングすべく検討を始めた。現在のところcDNAライブラリーの作製と、高等植物の遺伝子の塩基配列を参考にしたプライマーの作製を完了し、プラークハイブリダイゼーション法による本遺伝子の同定を進めている段階である。
ドープしたDNAの電子状態と磁性

近年、DNAの物性については、とてもバラエティに富んだ、言い換えれば、非常に矛盾に満ちた実験結果がNature, Science, PRLと言った権威ある雑誌に報告されてきた。本研究では、物性という面から見たときに、DNAの真の性質は何であるのかを、これまで指摘されてきた直接電気伝導測定法の問題点の影響を受けない、磁気的側面から迫ることを目的とした研究の成果をまとめる。(1)天然のDNAの物性最初に、何ら人工の手を加えない状態のDNAがどの様な物性を持つのかを調べた。その目的で、2種類の精製度合いの異なる鮭の精巣由来のDNAのESRを調べた。その結果から、粗精製の鮭DNA粉末が、塩基対を単位として、約0.2%程度のスピンを持つこと、一方、更に精製した鮭DNA繊維では、約50ppm/bpと非常に弱く、不純物に由来した信号と解釈され、実質的に、DNAは磁性を示さないことが確認された。この事実は、天然のDNAがフェルミエネルギーの位置に状態を持たない半導体であることを示唆している。このことは、DNAがオームの法則に従う金属的伝導を持つ、或いは、1K以下の低温で、超伝導になった金属電極のクーパー対が流れ込むような近接効果が観測される、と言った報告と矛盾しており、従来の報告は慎重に検討が必要なことが確認できた。これは、最近報告された光学吸収の4eV程度のエネルギーギャップや、他の半導体的な伝導度測定の結果と一致する。(2)2価金属イオンをドープしたDNAの物性近年、DNAが多くの研究者の関心を集めている理由は、DNAの持つ優れた設計性と自己組織化力にある。塩基配列は自由に設計が可能なので、DNA2重螺旋によりナノサイズの正八面体の作成の報告もされている。しかし、天然のDNAは電気伝導性を持たない半導体なので、電荷担体を賦与して伝導性を持たすことが可能かどうか興味深い。本研究では、2価の金属イオンを塩基対の間に導入することにより、電荷移動を起こし、導電性のDNAによるナノワイヤの実現可能性も視野に入れて研究を進めた。2価の塩化物水溶液によりCa, Mg, Zn, Cu, Mn, Co, Ni等の多くの金属イオンをドープしたが、全て2価のままDNAの塩基対間に入るため、新たな電荷移動は起こらないこと、磁性イオンを入れると、DNAをテンプレートとした磁気相互作用の舞台として使えること、Feを入れた場合だけはDNA中で3価に変わり、電子一つを塩基対のπバンドにドープできることなどを見出した。Mn-DNAでは、未ドープのDNAと同様に、B-formとA-form間の相転移が起こり、磁気的相互作用が顕著に変わることも見出した。Fe-DNAでは、πバンドの伝導は顕著ではなく、電子状態を反映した1次元特有の基底状態を持つことを示唆する結果も得られた。今後、電気伝導度と組み合わせて更に研究を進めていき、ナノワイヤの応用の可能性まで明らかにしていきたい。

2価の塩化物水溶液によりCa, Mg, Zn, Cu, Mn, Co, Ni等の多くの金属イオンをドープしたが、全て2価のままDNAの塩基対間に入るため、新たな電荷移動は起こらないこと、磁性イオンを入れると、DNAをテンプレートとした磁気相互作用の舞台として使えること、Feを入れた場合だけはDNA中で3価に変わり、電子一つを塩基対のπバンドにドープできることなどを見出した。Mn-DNAでは、未ドープのDNAと同様に、B-formとA-form間の相転移が起こり、磁気的相互作用が顕著に変わることも見出した。Fe-DNAでは、πバンドの伝導は顕著ではなく、電子状態を反映した1次元特有の基底状態を持つことを示唆する結果も得られた。今後、電気伝導度と組み合わせて更に研究を進めていき、ナノワイヤの応用の可能性まで明らかにしていきたい。本年度は、磁性を持つ2価金属イオンとして、Mnを導入したMn-DNAの物性を調べた。概要を以下に整理する。1.MnイオンをドープしたMn-DNAの合成原子として磁性を持ちうる遷移金属イオンとして、MnCl_2水溶液を用いてMnイオンをDNAに導入し、その電子状態を調べた。DNA水溶液とMnCl_2水溶液を混合することにより、MnイオンがDNA中に配位した、Mn-DNAの合成が出来る。この時に、Mnの黒色酸化物の生成を防ぐために、中性の水溶液を用いた。その後、-15度C程度の冷やしたエチルアルコールを等量以上加え、Mn-DNAを沈殿させる。綿のように絡んだ沈殿物を分離し、純エタノール中で超音波洗浄した後、フィルムとしてキャストした。外観は、無色透明のフィルムで、2価のMnイオンの導入が、DNA本来のエネルギーギャップを持つ半導体的な性質を大きくは変えていないことが推測できる。まず、SQUID磁束計を用い、磁化率の測定を行った。キュリーワイス温度が1K前後のキュリーワイス則に従い、2Kで測定した磁化曲線は、スピンS=5/2のブリルアン関数で綺麗に再現できた。次に、XバンドESRの測定を行った。ESRスペクトルは、予想通りS=5/2のスピンに期待されるg値がほぼ2を持つローレンツィアンとガウシアンの中間の線形が得られた。一方、雰囲気を脱気することにより水蒸気圧を下げて測ると、線形が単一のローレンツィアン型に変わった。この変化は、雰囲気水蒸気圧にDNAの構造が依存することから来ると期待される。水蒸気圧が高い時には、DNA骨格内に水分子が多数配位し、生体中で安定な構造である有名な2重螺旋構造のB-formを取る。この時のMnの位置は、J.Lee氏が提案した、2重螺旋の階段を構成する塩基対の水素結合と入れ替わった中央に来ると期待できる。即ち、Mnイオン鎖はほぼ1次元的な鎖を構成すると考えられる。そこで、B-formのMn-DNAのESRスペクトルの線形を解析したところ、1次元磁性体に期待される典型的な線形になっていることが示され、実際に、Mnイオン鎖が、塩基対の中心に配位した1次元構造を取っていると考えられる。この結果は、Mnイオン間の双極子相互作用からも確認できた。低水蒸気圧下のA-formでは、Mnイオンは3次元的に広がった構造を取り、3次元で期待される線形を取ったことが理解され、DNAが、磁性などの物性研究の新たな舞台として使えることが示された。本年度は、電荷担体導入を目的とした2価金属イオンを導入したDNAの物性を主に調べた。2価金属イオンをドープしたDNAの物性天然のDNAは、自由に電気が流れる金属ではなく、エネルギーギャップを持つ半導体と結論してきた。そこで、電気を運ぶ電荷担体を導入するための一つの方法として、金属イオンをDNAに導入し、その電子状態を調べた。
顎関節炎症におけるインフラマソームと分子プロセス研究

培養ヒト顎関節滑膜細胞(滑膜細胞)に30 kDまたは120kDaのフィブロネクチン分解産物(FN-F)を作用させ,分解産物間での作用の違いを検討した。また,滑膜細胞120 kDaフィブロネクチン分解産物を作用させ,経時的遺伝子発現解析を行った。シグナル伝達経路の検討も行った。【方法】本学倫理委員会の指針に従い,顎関節内障患者滑膜からout growth法で滑膜細胞を得た.滑膜細胞に30 kDaまたは120 kDaのFN-Fを作用させた。RNeasy Mini kitを用いてtotal RNAを抽出した。網羅的遺伝子発現解析は,Agilent SurePrint G3 HG Expression 8x60K v2 Microarrayおよび発現解析ソフトGeneSpringを用いた。タンパク質量はELISA kit,シグナル伝達経路検討はキナーゼ阻害薬を用いた。【結果および考察】6時間FN-F作用滑膜細胞のマイクロアレイ解析の結果,約45,000遺伝子中30 kDaFN-Fでは3,768遺伝子,120 kDa FN-Fでは5,517遺伝子が発現変動した。いずれでも発現変動しているのは2,150遺伝子であった。発現上昇率上位には,30 kDa FN-Fではlnc-RNA,120 kDa FN-Fではモカイン遺伝子が多く認められた。次に,120 kDa FN-Fを4, 8, 12時間作用させ,滑膜細胞の経時的遺伝子発現変動を調べたところ,経時的に発現変動した遺伝子が多かった。CXCL-2, -3は作用8時間が最も上昇した。30 kDaまたは120 kDa FN-Fは、NFκBを活性化することによってケモカインやIL-6発現を上昇させることが示唆された。以上の結果から,フィブロネクチン分解産物が顎関節の炎症亢進に関与している可能性が示唆された。変形性関節症やリウマチ患者の滑液中ではフィブロネクチン分解産物が検出され,炎症亢進に関与しているのではないかと示唆されている。また,顎関節滑膜炎では,炎症性細胞の増加が報告されている。本年度は,滑膜細胞に30 kDa, 45 kDaおよび120 kDaのフィブロネクチン分解産物を作用させ,IL-6等の遺伝子発現およびタンパク質産生を測定した。さらに,滑膜細胞とモノサイトを共培養して,IL-6等のタンパク質産生を測定した。【方法】本学倫理委員会の指針に従い,顎関節内障患者滑膜からout growth法で滑膜細胞を得た.滑膜細胞に30 kDa, 45 kDaおよび120 kDaのフィブロネクチン分解産物を作用させた。滑膜細胞とCD14+モノサイトの単独培養または共培養を行った。遺伝子発現量はreal time-PCR法で測定した。タンパク質量はELISA kitで測定した。【結果および考察】30 kDa, 45 kDaおよび120 kDaのフィブロネクチン分解産物によって,滑膜細胞のIL-6およびIL-8遺伝子発現およびタンパク質産生が上昇した。フィブロネクチン分解産物のなかで,120 kDaの分解産物が最もIL-6およびIL-8発現を上昇させた。炎症状態下で細胞外基質分解酵素産生が亢進し,フィブロネクチンが分解されると,フィブロネクチン分解産物によって炎症性サイトカイン産生が上昇し,炎症が亢進するものと示唆された。一方,滑膜細胞とモノサイトを共培養したとき,各細胞の単独培養時と比べ,IL-6およびIL-8産生は有意に上昇した。末梢血管から,モノサイトが遊走すると,滑膜細胞とモノサイト間で異種細胞間でのクロストークによって炎症性サイトカイン産生が上昇し,炎症がさらに亢進する可能性が示唆された。十数名の患者から顎関節滑膜組織を採取し,顎関節滑膜由来細胞(滑膜細胞)の分離・培養を行っており,実験に使用可能な滑膜細胞の例数は増えている.今年度は,滑膜細胞に細胞外基質のフィブロネクチンの分解産物を作用させ, IL-6等の炎症性因子の遺伝子発現やタンパク質産生が上昇することを確認している.また,IL-6産生を最も上昇させた120 kDaフィブロネクチン分解産物を選び,滑膜細胞に作用させ経時的にtotal RNAを抽出している。このtotal RNAを用いて,DNAマイクロアレイを用いた,網羅的な発現解析を進めている。また,滑膜細胞における120 kDaフィブロネクチン分解産物によるシグナリングパスウェイ解析も行っている。培養ヒト顎関節滑膜細胞(滑膜細胞)にフィブロネクチン分解産物を作用させるとIL-6等の炎症性サイトカイン発現が上昇すること,フィブロネクチン分解産物のうち120kDaが最も作用が強いことを明らかにした。本年度は,滑膜細胞に120kDaフィブロネクチン分解産物を作用させ,網羅的遺伝子発現解析を行うとともに,シグナル伝達経路の検討も行った。【方法】本学倫理委員会の指針に従い,顎関節内障患者滑膜からout growth法で滑膜細胞を得た.滑膜細胞に120 kDaのフィブロネクチン分解産物を作用させた。

網羅的遺伝子発現解析は,Agilent SurePrint G3 HG Expression 8x60K v2 Microarrayおよび発現解析ソフトGeneSpringを用いた。また,遺伝子発現量はreal time-PCR法で測定した。タンパク質量はELISA kitで測定した。シグナル伝達経路はキナーゼ阻害薬を用いて検討した。【結果および考察】滑膜細胞のマイクロアレイ解析の結果,測定した約45,000遺伝子中120 kDaのフィブロネクチン分解産物のよって発現変動したのは約1,200遺伝子であった。発現上昇した遺伝子群の上位には,IL-6の他にケモカイン遺伝子群が多く認められた。キナーゼ阻害薬を用いた実験から,120 kDaのフィブロネクチン分解産物は,滑膜細胞のインテグリンレセプターやToll like receptorを介して,NFκBを活性化することによってIL-6発現を上昇させることが示唆された。顎関節の炎症亢進には,細胞外基質分解酵素によって分解されたフィブロネクチン分解産物が滑膜細胞を刺激し,刺激を受けた滑膜細胞が炎症性サイトカイン産生を上昇することが関与している可能性が示唆された。十数名の患者から顎関節滑膜組織を採取し,滑膜細胞の分離・培養を行っており,実験に使用可能な滑膜細胞の例数は増えている。昨年度,滑膜細胞に30 kDa, 45 kDaおよび120 kDaのフィブロネクチン分解産物を作用させ,IL-6およびIL-8遺伝子発現およびタンパク質産生が上昇することを明らかにした。今年度は,最もIL-6およびIL-8発現を上昇させた120 kDaの分解産物を選択し,滑膜細胞に作用させてtotal RNAを抽出し,このtotal RNAを用いて網羅的な発現解析を進めている。また,滑膜細胞における120 kDaフィブロネクチン分解産物によるシグナリングパスウェイ解析を行うとともに,シグナル伝達経路のキナーゼ阻害剤を用いて,滑膜細胞における120 kDaフィブロネクチンシグナル伝達経路の検討も行っている。さらに,30kDaフィブロネクチン分解産物も滑膜細胞のIL-6やIL-8の遺伝子発現およびタンパク質産生を上昇させる。そこで,30kDaフィブロネクチン分解産物のレセプターやシグナル伝達経路についても検討している。培養ヒト顎関節滑膜細胞(滑膜細胞)に30 kDまたは120kDaのフィブロネクチン分解産物(FN-F)を作用させ,分解産物間での作用の違いを検討した。また,滑膜細胞120 kDaフィブロネクチン分解産物を作用させ,経時的遺伝子発現解析を行った。シグナル伝達経路の検討も行った。【方法】本学倫理委員会の指針に従い,顎関節内障患者滑膜からout growth法で滑膜細胞を得た.滑膜細胞に30 kDaまたは120 kDaのFN-Fを作用させた。RNeasy Mini kitを用いてtotal RNAを抽出した。タンパク質量はELISA kit,シグナル伝達経路検討はキナーゼ阻害薬を用いた。【結果および考察】6時間FN-F作用滑膜細胞のマイクロアレイ解析の結果,約45,000遺伝子中30 kDa
ゴマ摂取による生体内トコフェロール濃度の調節とその機構の解明

ゴマ摂取時のラット体内トコフェロール(Toc)濃度の上昇機構を明らかにするために、以下の実験を行った。1.ゴマ1日間摂取ラットの肝臓中α-トコフェロール輸送タンパク質(α-TTP)濃度の定量11週齢のWistar系雄ラットにToc無添加飼料を1週間摂取させた後、ゴマ添加(200g/kg)飼料(ゴマ群)またはγ-Toc添加(50mg/kg)飼料(対照群)を1日間摂取させた。肝臓中のα-Toc濃度は2群間に差は見られなかったが、ゴマ群のγ-Toc濃度は対照群の5.7倍に上昇していた。しかし、この時肝臓中のα-TTPレベルは2群間に明らかな差は観察されなかった。平成11年度の結果も考えあわせると、ゴマ摂取時に肝臓中のα-TTPの量的変化が起きている可能性は少ないと考えられた。2.ゴマ摂取ラットの尿中Toc代謝物濃度の測定4週齢のWistar系雄ラットをゴマ添加(200g/kg)飼料群(ゴマ群)またはγ-Toc添加(50mg/kg)飼料群(対照群)の2群に分け、8週間飼育した。主要な臓器中のα-Toc濃度は2群間にほとんど差は見られなかったが、ゴマ群のγ-Toc濃度は対照群に比べて著しく上昇していた。この時、γ-Tocの主要な代謝物である2,7,8-トリメチル-2-(β-カルボキシエチル)-6-ヒドロキシクロマン(γ-CEHC)の尿中排泄量は、対照群に比べてゴマ群で明らかに減少していた。この結果から、ゴマ摂取によるγ-Toc濃度の上昇は、γ-CEHCの生成抑制に起因することが示唆された。以上の結果から、ラットにγ-Tocを摂取させた場合には、体内ですばやく代謝されてγ-CEHCになりその大部分は尿中へと排泄されるが、同量のγ-Tocをゴマとして摂取させた場合には、γ-CEHCの生成が抑制されることにより体内のγ-Toc濃度が著しく上昇すると考えられる。申請者らは、ゴマ摂取時の体内での過酸化脂質生成抑制を認めており、通常は体内にほとんど貯留しないためビタミンE効力が小さいと考えられているγ-TocにもビタミンE効力が期待できるのではないかと考えている。今後は、ゴマ摂取によるγ-Toc代謝調節作用について、さらに詳しく調べていきたい。ゴマを摂取させたラットの体内トコフェロール濃度の上昇に、α-トコフェロール輸送タンパク質(α-TTP)が関与するかどうかを明らかにするために、以下の実験を行った。1.ゴマ摂取ラットの肝臓中α-TTP濃度の測定4週齢の雄性Wistarラットをトコフェロール無添加飼料群(欠乏群)、α-トコフェロール(α-Toc)添加(50mg/kg)飼料群(α-Toc群)、γ-トコフェロール(γ-Toc)添加(50mg/kg)飼料群(γ-Toc群)およびゴマ添加(200g/kg)飼料群(ゴマ群)の4群に分け、8週間飼育した。血漿および主要な組織中のα-Toc濃度は、他の3群に比べてα-Toc群で高かった。また、γ-Toc濃度は、血漿およびどの組織においても欠乏群およびα-Toc群ではほとんど検出されず、γ-Toc群ではわずかに検出されたのに対し、ゴマ群のγ-Toc濃度は著しく上昇していた。この時の肝臓中のα-TTP濃度は、群間で明らかな差は観察されなかった。この結果から、ゴマ摂取ラットの体内γ-トコフェロール濃度の上昇がα-TTP濃度の変動により起こる可能性は低いと考えられた。2.ラット肝臓からのα-TTPの精製12週齢の雄性Wistarラットの肝臓細胞質画分から、酸性沈殿、硫安分画、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行って、α-TTPの分離精製を試みた。今後さらに精製を進める。

この時、γ-Tocの主要な代謝物である2,7,8-トリメチル-2-(β-カルボキシエチル)-6-ヒドロキシクロマン(γ-CEHC)の尿中排泄量は、対照群に比べてゴマ群で明らかに減少していた。この結果から、ゴマ摂取によるγ-Toc濃度の上昇は、γ-CEHCの生成抑制に起因することが示唆された。以上の結果から、ラットにγ-Tocを摂取させた場合には、体内ですばやく代謝されてγ-CEHCになりその大部分は尿中へと排泄されるが、同量のγ-Tocをゴマとして摂取させた場合には、γ-CEHCの生成が抑制されることにより体内のγ-Toc濃度が著しく上昇すると考えられる。申請者らは、ゴマ摂取時の体内での過酸化脂質生成抑制を認めており、通常は体内にほとんど貯留しないためビタミンE効力が小さいと考えられているγ-TocにもビタミンE効力が期待できるのではないかと考えている。今後は、ゴマ摂取によるγ-Toc代謝調節作用について、さらに詳しく調べていきたい。
大脳皮質視覚野におけるシナプス伝達の長期増強の研究

1.大脳皮質視覚野の長期増強に対するNoradrenaline(NA)の影響を長期増強が最も発現しやすい生後45週の仔ネコより得られた切片標本において調べた。白質の試験刺激によって誘発される電場電位の電流源密度解析を行い、sinkから興奮性シナプス電流の大きさを求めた。条件刺激(2Hz、15分間)を与える前と後のsinkの大きさの比から各層での長期増強の大きさを決めた。2.コントロ-ル液では条件刺激を与えてもIV層やVI層の早い電流はほとんど変化せず、II-III層とV層の遅い電流がわずかに増大するだけであった。(1.3倍)。NA(30μM)やβアゴニストのIsopreterenol(2.5μM)を潅流液に加えると、II-III層とV層の遅い電流の増強が促進され、II-III層では1.6倍に、V層では1.9倍となった。しかし、IV層とVI層の早い電流には増強は見られなかった。3.GABA抑制をBicucullineで抑えると全層で長期増強の発現が促進された。IV層のVI層の早い電流は共に1.7倍に、II-III層の遅い電流は1.8倍に、そしてV層の遅い電流は1.7倍となった。この条件でβアンタゴニストのTimolol(20μM)を加えると、遅い電流の増強は小さくなり、II-III層で1.5倍、V層で1.1倍となった。これに対して、IV層とVI層の早い電流の増強は全く影響を受けず、IV層で1.8倍、VI層で1.6倍であった。4.IV層とVI層の早い電流は外側膝状体細胞から視覚野細胞へのシナプス伝達により生じ、II-III層とV層の遅い電流は皮質細胞間のシナプス伝達により生じている。従って、以上の結果からNAはβリセプタ-を介してII-III層とV層での皮質細胞間のシナプス伝達の長期増強の発現を促進すると論される。しかし、外側膝状体細胞から皮質細胞へのシナプス伝達の長期増強には全く関与していないと思われる。(1.3倍)。
ポスト工業化社会における環境問題

環境問題に対する法・政策の日独比較研究の意義ドイツと日本は、高度に発達した工業国家として深刻な環境問題に直面してきたが、同時に、環境問題とその対策は、両国において異なった様相のものとして表れてきた。日本の環境問題における法・政策の現状をみると、50年代末から60年代にかけて高度成長による深刻な環境汚染が発生し、健康被害・公害問題が社会問題化した。60年代後半には、住民運動が高揚し、自治体レベルの環境政策が前進し、各地において公害裁判が提訴された。70年代の半ばにはオイルショックによる環境政策の後退現象が見られた。80年代に入って、環境政策は依然として後退ないしは停滞が継続する。たとえば、環境アセスメント法案の度重なる流産、公害健康被害補償法の指定地域全面解除がこれである。しかし、80年末より90年代には、新しい動きの兆しが見られる。たとえば、93年には環境基本法が制定された。この環境基本法の意義は、公害対策と環境保護の結合、社会の在り方の変革を課題として設定、次世代に対する責務を明記し、環境基本計画を含む多様で総合的な対策を構想している点にある。しかし、問題点も少なくない。とりわけ、アセスメントの法制化を明示せず、環境権を盛り込まなかった点は問題である。これは基本法としての限界でもあり、理念が実現されるためには今後とも具体的な法制度が必要である。これに対して、ドイツにおける環境問題と法・政策は、第二次世界大戦による産業の破壊、国土の分割・縮小の後、50年代に奇跡の経済成長を遂げる一方で、ルール地方を中心として大気汚染等の環境問題が発生した。60年代から70年代初頭にかけて、環境政策・環境法が整備され、70年代半ばのオイルショックによる停滞を経て、80年代には、新たな発展を遂げている。とりわけ、環境問題に対する市民の意識の向上、緑の党の議会進出により、現在ではヨーロッパ連合の中で最も環境規制の厳しい国として評価されている。86年に連邦環境省が設置されて以降、同年、連邦廃棄物処理法改正、連邦自然保護法改正、90年には環境アセスメント法、環境無過失責任法が制定され、基本法20条には国家目標規定の中に環境保護規定が挿入され、憲法レベルにおいて環境保護が保障されるに至っている。2立命館大学・ケルン大学国際シンポジュウムの討論内容研究会においては、環境被害の実態、環境問題に対処する手法、環境行政、住民運動、政党の役割、国際的な環境保護運動の論点について活発な討議が行われた。今回の共同研究において、環境問題に対する基本的な考え方・原則に相違点があることが明らかになった。日本側の発想としては、企業には操業の自由があることが原則となっている。もちろん、他人に対して被害を生じさせた場合には責任を負うことがあるが、それは、いわば原則の例外となっている。さらに進んで、被害を生じさせないようにする規制がなされることも、営業の自由を制限しないように慎重に執り行わなければならない。チッソ工場排水による水俣湾の汚染においても、深刻な汚染にもかかわらず、操業停止や漁獲禁止・販売禁止等の行政指導は行われなかった。これに対して、ドイツ側の発想は、他人の権利を侵害する行為(汚染)は原則として違法であり、例外的に汚染が認められることがあるという点である。これは19世紀の営業法の考え方から、1900年のドイツ民法典に受け継がれたものである。74年には、連邦イミッション法が制定され、環境を汚染する企業の操業にはすべて認可が必要とされ、認可段階における厳しいチェックが行われている。ドイツでは、地理的に多くの工業国と国境を接しているという点で、はやくから国内法による解決だけではなく、国際的な取り組みを行ってきた。現在では、ヨーロッパ連合のなかでの共通の環境政策を展開する国際的な条件が整備されている。しかし、日本では、東アジアにおいてヨーロッパ連合のような共同した取り組みと政策形成を可能とする国際組織が存在しないため、当面は非政府機関による環境保護活動が極めて重要となってくるであろう。

これに対して、ドイツにおける環境問題と法・政策は、第二次世界大戦による産業の破壊、国土の分割・縮小の後、50年代に奇跡の経済成長を遂げる一方で、ルール地方を中心として大気汚染等の環境問題が発生した。60年代から70年代初頭にかけて、環境政策・環境法が整備され、70年代半ばのオイルショックによる停滞を経て、80年代には、新たな発展を遂げている。とりわけ、環境問題に対する市民の意識の向上、緑の党の議会進出により、現在ではヨーロッパ連合の中で最も環境規制の厳しい国として評価されている。86年に連邦環境省が設置されて以降、同年、連邦廃棄物処理法改正、連邦自然保護法改正、90年には環境アセスメント法、環境無過失責任法が制定され、基本法20条には国家目標規定の中に環境保護規定が挿入され、憲法レベルにおいて環境保護が保障されるに至っている。2立命館大学・ケルン大学国際シンポジュウムの討論内容研究会においては、環境被害の実態、環境問題に対処する手法、環境行政、住民運動、政党の役割、国際的な環境保護運動の論点について活発な討議が行われた。今回の共同研究において、環境問題に対する基本的な考え方・原則に相違点があることが明らかになった。日本側の発想としては、企業には操業の自由があることが原則となっている。もちろん、他人に対して被害を生じさせた場合には責任を負うことがあるが、それは、いわば原則の例外となっている。さらに進んで、被害を生じさせないようにする規制がなされることも、営業の自由を制限しないように慎重に執り行わなければならない。チッソ工場排水による水俣湾の汚染においても、深刻な汚染にもかかわらず、操業停止や漁獲禁止・販売禁止等の行政指導は行われなかった。これに対して、ドイツ側の発想は、他人の権利を侵害する行為(汚染)は原則として違法であり、例外的に汚染が認められることがあるという点である。これは19世紀の営業法の考え方から、1900年のドイツ民法典に受け継がれたものである。74年には、連邦イミッション法が制定され、環境を汚染する企業の操業にはすべて認可が必要とされ、認可段階における厳しいチェックが行われている。ドイツでは、地理的に多くの工業国と国境を接しているという点で、はやくから国内法による解決だけではなく、国際的な取り組みを行ってきた。現在では、ヨーロッパ連合のなかでの共通の環境政策を展開する国際的な条件が整備されている。しかし、日本では、東アジアにおいてヨーロッパ連合のような共同した取り組みと政策形成を可能とする国際組織が存在しないため、当面は非政府機関による環境保護活動が極めて重要となってくるであろう。
顆粒膜細胞増殖に関わる細胞内刺激伝達機構の生化学的並びに分子生物学的研究

顆粒膜細胞の増殖・分化が卵胞発育の必須条件であり、主として卵胞刺激ホルモン(FSH)によって司られている。FSHの顆粒膜細胞内刺激伝達経路はprotein kinase A(PKA)系とPKC系が知られているが、細胞増殖にはtyrosine kinaseを介したmitogen-activated protein kinase(MAPK)カスケードが重要である。そこで本研究は、細胞増殖や分化に関わるearly immediate geneの内のc-fosとjun family遺伝子に着目して、それらが顆粒膜細胞内でFSHによって発現されるか、またそれに至る経路は何かを、MAPK活性と共に、検討することとした。その結果、1.培養顆粒膜細胞においては、MAPK活性はFSH添加5分後より有意に上昇し、15分でプラトーに達した。またFSHの濃度依存性に増加した。PKC促進剤(PMA)を添加すると有意な活性の上昇がみられたが、PKA促進剤(forskolin、8-Br-cAMP)では有意の上昇はみられなかった。さらに、FSHと共にPKC阻害剤(staurosporine)を添加すると濃度依存性に抑制された。2.幼若雌ラットにPMSGを投与すると、30分後にc-fosとjun BのmRNA発現は有意に増加し、60分後にプラトーに達し、4時間後に前値に戻った。jun Dはやや増加するも有意ではなく、c-junはまったく発現しなかった。hCGを投与してもこれらの遺伝子の発現はみられなかった。3.培養顆粒膜細胞にFSHを添加すると、c-fosとjun B遺伝子発現は30分後に最高に達し、2時間後には元のレベルに戻った。PMAを添加すると有意に両遺伝子の発現は増加したが、forskolinでは有意ではなかった。FSHと共にstaurosporineを添加すると有意に発現は抑制されたが、PKA阻害剤(Rp-cAMP)では抑制はみられなかった。以上の成績より、MAPKおよびc-fosとjun B遺伝子の発現はFSHにより有意に促進され、これらに至る経路はPKC系が関与していることが明らかとなった。顆粒膜細胞の増殖や分化は下垂体から分泌されるゴナドトロピン、特に卵胞刺激ホルモン(FSH)によって主として司られている。本研究ではFSHの顆粒膜細胞における作用機序を解明する目的にて、細胞内刺激伝達経路として考えられるいくつかの経路について、培養顆粒膜細胞にFSH、PKC刺激物質(PMA)、PKA刺激物質(forskolin)等を添加して、種々の細胞内物質の発現を、生化学的にあるいは分子生物学的に検討した。1.まず、顆粒膜細胞の細胞周期がFSHによって誘導されるか否かを検討した。その結果、FSH添加により約60分以降にM期の細胞が有意に増加することが、フローサイトメトリーにより明らかになった。2.次にチロジンキナーゼカスケード上にあるmitogen-activated protein kinase(MAPK)の発現について検討した。MAPKの活性をMBPを基質とした燐酸化能として測定した。その結果FSH、PMA、forskolin、さらにEGFのいづれによってもMAPK活性は有意に上昇し、その発現は物質添加5分後に認められ、15分でプラトーとなった。3.次いで、転写因子であるAP-1を構成するfosとjun family遺伝子の発現を、Northern blot法にて検討した。

その結果FSH添加30分よりc-fosとjunBが有意に上昇し、60分をピークとしてその後漸減し、2時間後では前値に回復した。その他のjun family遺伝子はほとんど有意な増加は認められなかった。これらの遺伝子の発現はFSHの濃度依存性に有意に上昇した。以上の成績より、FSHが種々の生物学的作用を発揮するに際しては、少なくとも細胞内のMAPKやAP-1を介した刺激伝達経路が存在することが強く示唆された。G蛋白と結合した受容体を有するFSHは、protein kinase A(PKA)系あるいはPKC系を介してその生物学的効果を発現するとされている。そしてステロイド産生にはPKA系が関与し、一方我々の研究より顆粒膜細胞の増殖にはPKC系が重要であることが示唆されている。しかし細胞増殖には一般にtyrosine kinase活性を有する受容体からシグナルを受け、その後Mitogen-activated protein kinase(MAPK)を経た刺激伝達系が重要であることが示されているが、顆粒膜細胞ではこの経路はまだまったく明らかにされていない。そこで本研究では、昨年に引続き、FSHよりMAPKに至る経路と、さらにFSHからc-fosならびにjunB遺伝子発現に至る経路を明らかにすることを目的とした。以上の成績より、FSHよりMAPKおよびc-fosとjunB遺伝子に至る経路はいずれもPKA系ではなくPKC系が重要な役割を担っていることが、初めて明らかとなった。