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未利用水産資源を機能性発酵食品へと活用するための生物有機化学的研究

本研究課題では、未利用および低利用水産資源の有効活用として、発酵食品の原料とすること、さらに作製した発酵食品から機能性物質を単離し、化学構造を明らかにすることを目的に研究を行っている。本年度に実施した研究の概要を説明する。昨年度の研究により、鹿児島湾に生息し、小型であるために利用価値の低いヒメアマエビを材料とすることで、魚醤油(ヒメアマエビ醤油)の作製が可能であることが分かった。そこで本年度はまず、機能性の高いヒメアマエビ醤油を得る目的で作製方法について再度検討することとした。検討項目は、原料として用いるヒメアマエビを生のまま使用するか、蒸煮して使用するかである。蒸煮したものよりも生のままのヒメアマエビを使用した方が、内在性のプロテアーゼの影響を受けることで、より発酵が迅速に進み機能性についても向上することが期待された。しかし、作製した2種類のヒメアマエビ醤油(蒸煮および生)のDPPHラジカル捕捉率を調べたところ、蒸煮ヒメアマエビ醤油が82.2%、生ヒメアマエビ醤油が80.2%であり、予想に反して蒸煮ヒメアマエビ醤油の方が少し機能性が上回る結果であった。そこで次に、作製した蒸煮ヒメアマエビ醤油に含まれる機能性物質として、DPPHラジカル捕捉活性を指標に化合物の単離を試みた。4リットルの蒸煮ヒメアマエビ醤油を溶媒分画後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、Sep-Pak C18カートリッジ、逆相HPLCで精製することで2.9mgの活性物質を得た。単離した物質をTLCおよびHPLC分析したところ、DPPHラジカル捕捉活性を有する単一化合物であることが明らかとなった。平成30年度では、ヒメアマエビ醤油に含まれる機能性物質の化学構造の決定までを行う予定であったが、研究代表者が異動したため、新たな所属での研究環境を整えるのに時間がかかり、研究の進捗状況に遅れが生じた。計画したよりも若干の遅れはあるものの、発酵条件の見直し、ヒメアマエビ醤油の作製規模の拡大、機能性物質の単離までの項目について研究でき、残すは単離した機能性物質の化学構造を決定するのみである。現在までの進捗状況でも記載した通り、当初の計画よりも若干の遅れが生じているものの、本研究課題で明らかにする項目は、既にヒメアマエビ醤油から単離に成功した化合物の化学構造を明らかにするのみである。そのため、研究期間を1年間延長したことで、当初の目的を達成できるものと考えている。研究を遂行する上での問題点は、現所属に化学構造決定のために必要な核磁気共鳴装置(NMR)がないことである。この点について、現時点で機器メーカーおよび他大学の機器を使用する許可を得ることができたため、外部施設の機器を使用することでこの問題は解決できている。以上の通り研究を遂行することで、蒸煮ヒメアマエビ醤油中に含まれる機能性物質の化学構造を明らかにする予定である。加工や流通の過程で廃棄される食品素材や、海洋環境中の未利用および低利用水産資源は、数、量ともに我々が想像する以上に多く存在する。その有効利用として、近年では発酵食品である魚醤油の材料に用いられることもあるが、生産されたほとんどの魚醤油は機能性研究が行われず、地域のめずらしい調味料に留まり、消費の拡大に繋がっていないのが現状である。以上の背景から、未利用水産資源を発酵することで食品へと活用すること、さらに作製した発酵食品(魚醤油)に含まれる機能性物質について生物有機化学的な手法を用いて明らかにする研究を計画した。本年度に行った研究について、得られた成果を簡単に説明する。まず、タカエビ(ヒゲナガエビ)頭部を材料に醤油用麹を用いた方法で魚醤油を作製した。次に、出来た魚醤油の機能性について検討したところ、DPPH法では市販品のナンプラーよりも、ORAC法ではナンプラー、しょっつる、大豆醤油よりも抗酸化性に優れていることが明らかになった。そこで次に、作製した魚醤油に含まれる抗酸化物質の単離を試みた。作製した魚醤油を溶媒分画、DIAION HP20カラムクロマトグラフィー、Sep-Pak C18カートリッジ、逆相HPLC等を用いて精製することで、2個の化合物を抗酸化物質として単離した。続いて、単離した抗酸化物質の各種NMRおよびMSスペクトルを測定することで、これらの化合物がバニリン酸とプロトカテク酸であることを明らかにした。以上のことで、現在大量に廃棄されているタカエビ頭部を抗酸化性に優れた魚醤油へと有効活用することができた。次に、鹿児島湾にのみに生息し、小型で低利用水産資源であるヒメアマエビについて、その有効利用を目的に魚醤油を作製した。作製した魚醤油の機能性についてDPPH法により検討したところ、タカエビ頭部を材料とした魚醤油より優れた抗酸化性を有することが明らかになった。平成28年度に計画していた研究(次の(1)から(3))はほぼ終了しており、おおむね順調に進展しているものと考える。(1)タカエビ頭部を材料に魚醤油を作製し、出来た魚醤油から抗酸化物質を2個単離した。単離した化合物は各種NMRおよびMSスペクトルを測定し、その化学構造を明らかにした。本項目はほぼ終了しているが、今後タカエビ頭部が大量に入手できれば、機能性物質に関する研究をさらに発展することも可能である。(2)所属学部所有の練習船(南星丸)を使用し、底曳網により鹿児島湾にのみ生息するヒメアマエビを獲った。

3回の航海で集めたヒメアマエビを材料に、条件の異なる方法により魚醤油を製造した。機能性研究から、出来た魚醤油は抗酸化性に優れていることを明らかにした。本項目の28年度の計画はほぼ終了している。機能性の高い魚醤油の材料としてヒメアマエビを見出すことができ、来年度も継続して新しい素材を探索する予定である。(3) (1)および(2)で作製した魚醤油の機能性について評価した。本項目もほぼ順調に進んでおり、今後はすでに各地で生産されている魚醤油の機能性研究について、これまで以上に力を入れて取り組む予定である。数多い未利用および低利用水産資源の有効利用を目指し、発酵技術を取り入れることで食材および機能性物質の探索源として活用することを目的としている。本研究では、未利用および低利用水産資源を材料に発酵食品を作製すること、さらに作製した発酵食品(魚醤油)に含まれる機能性物質について生物有機化学的な手法を用いて明らかにする研究を行っている。本年度に行った研究について、得られた成果を簡単に説明する。まず、タカエビ(ヒゲナガエビ)頭部を材料に醤油用麹を用いた方法で魚醤油を大量に作製した。次に、出来た魚醤油の機能性について検討したところ、DPPH法、ORAC法ともにナンプラーよりも抗酸化性に優れていることが明らかとなり、昨年と同様の結果が得られ、再現性が確認できた。そこで次に、作製した魚醤油に含まれる抗酸化物質の単離を試みた。作製した魚醤油を溶媒分画、DIAION HP20カラムクロマトグラフィー、Sep-Pak C18カートリッジ、逆相HPLC等を用いて精製することで、昨年度に単離に成功した2個の化合物に加え、1個の化合物を抗酸化物質として単離した。続いて、本年度新たに単離した抗酸化物質の各種NMRおよびMSスペクトルを測定することで、本化合物がN-(4-hydroxyphenethyl)acetamideあることを明らかにした。本化合物は抗腫瘍活性が報告されており、本研究で作製したタカエビ頭部を用いて作製した魚醤油に含まれる機能性物質といえる。次に、昨年度から研究を行っている鹿児島湾にのみに生息し、小型で低利用水産資源であるヒメアマエビを材料に魚醤油を大量に作製した。作成した魚醤油の抗酸化試験を行ったところ、昨年度と同様に高い活性が明らかとなり再現性が確認できた。以上ことから新たに作製した魚醤油から機能性物質を取得するための準備が終了した。平成29年度に計画していた研究(次の(1)から(3))はほぼ終了しており、おおむね順調に進展しているものと考える。(1)平成28年度に機能性の高い魚醤油の材料としてヒメアマエビを見出すことができたため、来年度に機能性物質を単離するための材料を得ることが本年度の目的であった。本年度は計画通り、来年度に機能性物質を単離するのに必要な魚醤油を大量に作製することができた。(2)本年度は天候の問題があり計画通りに航海が実施できなかったため、研究対象をヒメアマエビに絞り、鹿児島湾内でのサンプリングを集中して行うことで、大量に材料を得ることができた。(3)タカエビおよびヒメアマエビを材料に魚醤油を作成し、DPPH法およびORAC法により抗酸化活性を明らかにし、これまでの研究結果を支持する再現性が確認できた。(4)機能性物質の単離に向けて現在研究を進めており、おおむね順調に進展しているといえる。
弾性線維マトリックスを素材とした人工血管用バイオエラスチック材料に関する基礎研究

平成5年度及び平成6年度の2年間にわたって行った。平成5年度は弾性ポリペプチド架橋重合体X-poly(GVGVP)及び弾性・細胞接着性・抗血栓性ポリペプチド架橋重合体X-poly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]を作製した。平成6年度はこれらのポリペプチド架橋重合体の細胞接着性試験及び細胞増殖性試験をウシ大動脈内皮細胞を用いて検討した。細胞接着性試験では,3時間培養後の接着細胞数をカウントし,フィブロネクチンでコートした基層上の細胞数を100%として計算した。その結果,X-poly(GVGVP)で3.5%であり,X-poly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]のa:b=1:0.002,a:b=1:0.01,a:b=1:0.017,a:b=1:0.025,a:b=1:0.05の各々の基層上の接着細胞数の割合は,それぞれ5.2%,49%,102%,103%,106%であった。このことからGVGVP配列のみでは内皮細胞は接着できず,一定量以上のGRGDSP配列が細胞接着に必要であることが示された。ついで細胞接着能を有する架橋重合体を用いて細胞増殖試験を検討した。3日間培養後の増殖細胞数は,接着能をもたないX-poly(GVGVP)の基層上の細胞数208個に比べて,接着能を有するX-poly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]のa:b=1:0.017,a:b=1:0.025,a:b=1:0.05の各々の基層上の細胞数は,それぞれ751個,734個,724個であり,一定量以上のGRGDSP配列の存在が細胞増殖に必要であることが示された。ヒト血小板を用いた抗血栓性試験では,GVGVP配列のみには血小板擬集阻害作用は認められなかったが、GRGDSP配列には血小板擬集阻害作用が認められた。本研究は平成5年度及び6年度の2年間の研究計画によって構成されている。平成5年度の計画は人工血管用バイオエラスチック材料の作製及びその材料の弾性と構造の解析である。当初の計画は、哺乳動物の弾性蛋白質エラスチンの高ホモロジー領域に共通して存在して弾性機能を発現するペンタペプチドGly-Val-Gly-Val-Pro(以下GVGVP)繰り返し配列と、フィブロネクチン、ラミニン等の接着性蛋白質に共通して存在する細胞接着性ペプチド配列Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro(以下GRGDSP)の適当量をブレンドしたブロック型ポリペプチドpoly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]及び細胞接着性ペプチドGRGDSP配列と抗血栓性ペプチド配列Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr(Me)-Pro(以下GRGDY(Me)P)の適当量をブレンドしたブロック型ポリペプチドpoly[a(GVGVP),b(GRGDSP),c(GRGDY(Me)P)]を合成し、それを弾性・細胞接着性・抗血栓性ポリペプチドとすることであった。

しかし、実験を遂行していく段階で、GRGDSP配列が細胞接着性以外に血小板凝集阻害作用を有することを見い出し、その作用機構を検討した結果、GRGDSP配列は血小板凝集過程のcritical stepであるフィブリノーゲンの血小板への結合を抗的に阻害することにより血小板凝集を完全に阻害することが明らかになった。その為、上記のGRGDY(Me)P配列の導入を中止し、代替としてGRGDSP配列の導入に変更し、弾性・細胞接着性・抗血栓性ポリペプチドpoly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]を合成した。さらにこのポリペプチドを37°C、自己集合体形成下、^<60>Coでgamma線照射したグラフト型架橋重合体を作製した。以上の如く材料を作製することはできたが、まだ量的に少なく、平成6年度に大量作製を行う予定である。また材料作製に時間がかかった為、材料の弾性と構造の解析についてはまだ検討していないので、それも平成6年度に行う予定である。本研究は平成5年度及び平成6年度の2年間の研究計画によって構成されている。平成6年度(本年度)は平成5年度(前年度)に作製した人工血管用バイオエラスチック材料である弾性・細胞接着性・抗血栓性ポリペプチドpoly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]及びその架橋重合体X-poly[a(GVGVP),b(GRGDSP)]の細胞接着性、細胞増殖性、抗血栓性を検討した。細胞接着性試験及び細胞増殖性試験にはウシ大動脈内皮細胞を用いた。細胞接着性試験では、3時間培養後の接着細胞数をカウントし、フィブロネクチンでコートした基層上の細胞数を100%として計算すると、X-poly[(GVGVP),X-poly[(GVGVP),0.002(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.01(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.017(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.025(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.05(GRGDSP)]の各々の基層上の接着細胞数の割合は、それぞれ3.5%,5.2%,49%,102%,103%,106%であった。このことからGVGVP配列のみでは内皮細胞は接着できず、一定量以上のGRGDSP配列が必要であることが示された。ついで接着能を有する架橋重合体を用いて細胞増殖試験を検討した。3日間培養後の増殖細胞数をカウントすると、X-poly[(GVGVP)の基層上の細胞数208個に比べて、X-poly[(GVGVP),0.017(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.025(GRGDSP)],X-poly[(GVGVP),0.05(GRGDSP)]の各々の基層上の細胞数は、それぞれ751個,734個,724個,であり、一定量以上のGRDGSP配列の存在下でのみの細胞増殖が認められた。ヒト血小板を用いた抗血栓性試験でも、GVGVP配列のみには血小板凝集阻害作用はみられないが、一定量以上のGRDGSP配列の存在下では血小板凝集の完全阻害が認められた。以上のことから、材料の弾性試験は検討していないが、このバイオエラスチック材料は人工血管用材料として有用である可能性が示唆された。
大口径シリコン検出器の開発

大口径のシリコン検出器を考えるとき、考慮すべきなのは当然のことながら読み出しのチャンネル数が厖大なものとならないことが必要である。従ってその構造は、ストリップ型のシリコン検出器であって、その測定ピッチが比較的大きなものが最も好適と考えられる。本研究では大きな測定ピッチ(100ミクロン以上)のシリコンストリップ検出器が持つべき構造について、以下の諸点について考慮した。1)広いピッチにもかかわらずシリコン内での電荷の収集効率が良いこと。2)ノイズ特性が優れていること。3)位置測定精度が測定ピッチのに比して十分良いこと。以上を条件としてデザインの検討を行うと、広ピッチのn型ストリップとその間に埋め込まれたp型ストリップ(p-ストップ)の構造が、大口径シリコン検出器にとって最も好適であるとの結論が得られた。関連企業に対する調査では、8インチウェハーのプロセスを単独に行うことは、本研究の規模ではコスト等から不可能であることが明らかとなった為、民生品として利用できる最大級の検出器ユニット(5cm長、4インチシリコン基板より製造されたもの)を、複数枚接合して、20cm級の大型検出器を組み上げる事を目指した。この接合にいおいて開発したノウハウは以下の諸点である。1)接合する検出器同士を、精度よく組み上げエポキシ接着剤で固定する。そのための治具の試作・接着剤塗布ロボットのプログラム開発。2)接合された検出器同士の力学的構造解析と、適切なリブ構造などの設計。検出器物質量、熱膨張係数、機械的強度の観点から、0.5mm厚のボロン板材(95%)に炭素繊維で補強を加えたものを新たに開発、使用した。3)両面検出器のワイヤーボンディングを行うために、特殊な治具を新たに試作した。こうして作られたプロトタイプ検出器の総合性能は、赤外線レーザーなどによってテストが行われ、位置分解能、ノイズ特性、検出効率などの点で、十分満足できるものとなった。実際のアプリケーションを考えるとき、大口径の検出器に求められるのは、究極の測定精度を持つ小口径の検出器とあまり高い精度の得られない大型検出器(例えばドリフトチェンバー)の間をつなぐような中庸の測定精度であろう。本研究では、大きな測定ピッチ(100ミクロン以上)のシリコンストリップ検出器が持つべき構造について検討を加え、大口径シリコン検出器のあるべきデザインを見いだすことを目標としている。広い測定ピッチの検出器において考慮すべきは以下の点である。これらより以下の結論が得られる。A)p型のストリップにおいては、狭ピッチでないと1)を満たさないが、狭ピッチを電気的につないで広い測定ピッチとしたとき2)のノイズ特性が問題となる。B)n型のストリップでは、広ピッチでも1)を満たすことがストリップ間にp型ストリップを埋め込むことにより可能で、2)のノイズ特性を悪化させない構造がありうる。近接ストリップへの電荷分割情報を使うことで、3)についても満足の行くものとなる。これらの考察より、広いピッチのn型ストリップとその間に埋め込まれたp型ストリップ(p-ストリップ)の構造が、大口径シリコン検出器にとって最も好適であるとの結論が得られた。

前年度の調査より、8インチウェハーのプロセスを単独に行うことは、本研究の規模ではコスト等から不可能であることがはっきりした。そこで、既存の検出器ユニット(5cm長、4インチシリコン基板より製造されたもの)を、4枚接合して、24cm長の大型検出器を組み上げる事を目指した。この接合における様々なノウハウを以下の諸点について開発した。1)接合する検出器同士を、精度よく組み上げエポキシ接着剤で固定する。そのための治具の試作した。検出器ユニットを真空吸着できる装置をスライドブッシュで組み合わせることで、再現性のよい組立治具が実現できた。また適量の接着剤を塗布するためのロボットの使用も行い塗布プログラムの最適化を行った。2)接合された検出器同士の力学的構造解析と、適切なリブ構造などの設計を行った。結果的には、検出器の背に2枚の梁を渡す方法が、簡単でありながら最も効果的であると結論した。検出器物質の量を最小とするための、使用物質の検討も併せて行い、物質量、熱膨張係数、機械的強度の観点から、0.5mm厚のボロン板材(95%)に炭素繊維で補強を加えたものを新たに開発、使用した。3)検出器の電気的接合のためのボンディング方法は、現在のところやはりワイヤーボンディングが最も効率が良かった。両面検出器のワイヤーボンディングを行うために、特殊な治具を新たに試作した。こうして作られたプロトタイプ検出器の総合性能は、赤外線レーザーなどによってテストが行われ、位置分解能、ノイズ特性、検出効率などの点で、十分満足できるものとなった。
甲状腺ホルモンの破骨細胞活性化機構に関する研究

研究者は骨芽細胞における甲状腺ホルモンのreceptor activator of NF-κB ligand(RANKL)遺伝子発現調節機構を解明し、甲状腺ホルモンによる破骨細胞の活性化機構を明確にすることを目的とし、正常ヒト骨芽細胞株(NHost)及び、ヒト骨肉腫細胞株(MG63)を甲状腺ホルモン存在・非存在下で培養し、RANKLの誘導について検討した。結果(1)両培養細胞とも甲状腺ホルモン存在下で3660時間培養することによって、甲状腺ホルモンの濃度依存的にRANKL mRNAが増加することを定量的RT-PCR法(SYBR-Green Iを用いたreal-time PCR法)を用いて確認した。(2)甲状腺ホルモンのRANKL mRNA増加作用は蛋白合成阻害剤;cycloheximide存在下で消失することから、RANKL遺伝子発現に新たな蛋白合成を要することが示唆された。これらの成績および、RANKL遺伝子のプロモーター領域には明らかな甲状腺ホルモン応答領域が存在しないことから、RANKLは甲状腺ホルモンの一次応答遺伝子ではなく未知の調節因子の介在が示唆されたため、正常ヒトgenomic DNAからRANKL遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼ発現ベクターに挿入したキメラプラスミド及び同プラスミドのプロモーター領域のdeletion-mutantを作製したが、現在のところ、RANKL遺伝子の甲状腺ホルモン関連応答領域は見いだされていない。今後も甲状腺ホルモンによるRANKLの誘導機構について解明を進める予定である。研究者は骨芽細胞における甲状腺ホルモンのreceptor activator of NF-κB ligand (RANKL)遺伝子発現調節機構を解明し、甲状腺ホルモンによる破骨細胞の活性化機構を明確にすることを目的とし、正常ヒト骨芽細胞株(NHost)及び、ヒト骨肉腫細胞株(MG63)を甲状腺ホルモン存在・非存在下で培養し、RANKLの誘導について検討した。これらの成績および、RANKL遺伝子のプロモーター領域には明らかな甲状腺ホルモン応答領域が存在しないことから、RANKLは甲状腺ホルモンの一次応答遺伝子ではなく未知の調節因子の介在が示唆された。現在、正常ヒトgenomic DNAからRANKL遺伝子のプロモーター領域を増幅し(PCR法)、ルシフェラーゼ発現ベクターに挿入したキメラプラスミド及び同プラスミドのプロモーター領域のdeletion-mutantを作製中であり、RANKL遺伝子の甲状腺ホルモン関連応答領域の解明を進めている。
三次元微細構築剖出法による顎骨基質と顎関節円板の立体超微形態学的線維構築について

顎骨基質ならびに顎関節円板の立体超微形態学的線維構築を前年度に引き続き観察し,応力との関係および老齢に伴う立体構築の変化を明らかにした.成体のカニクイザルの下顎体部表面を構成するコラーゲン細線維束の大部分は前後方向に走向していた。表層の細線維束が比較的疎な配列を呈している部位では、走行の異なる細線維束が深層に観察された。骨表層に凹凸の認められる部位では、細線維束の交錯が認められた。オトガイ孔の辺縁部では細線維束は孔を取り囲むように走向していた。下顎骨の正中部および歯槽部表層では細線維束は上下方向に走向していた。このような線維構造は咀嚼圧に対する応力により生じると考えられる。下顎枝部の表層では細線維束は後上方から前下方に走向し、下顎体部との移行部で細線維束の走向の変化が認められた。筋突起の中央部では細線維束は上下方向に走向し、翼突筋窩の表層では細線維束は同心円状に走向していた。下顎骨表層の細線維束の走向は咀嚼筋による外力の方向と歯槽部における咀嚼圧の方向との関係を示唆していると考えられる。ラット下顎頭関節面では、胎生後期の線維層は線維芽細胞が大部分を占め、細胞間基質の線維は網状を呈していた。1週齢では最表層は密な細線維網で占められ、深層は細線維束で形成されていた。6週齢では最線維網のほかに細線維の小束や前後方向に走向する細線維が認められた。8週齢では細線維網は疎になり、立体的に交錯する細線維束が出現した。成熟および老齢ラットでは、極めて密な網状の細線維塊、回旋、捻転する細線維小束関節面の浸蝕を示唆する細線維の断裂や、細胞の露出の特異的な構造が認められた。顎骨基質ならびに顎関節円板の老齢に伴う立体構築の変化を明らかにするために,未成熟および成熟の実験用動物の下顎骨と顎関節円板を用いて表層基質を観察した.成熟のカニクイザルの下顎骨の表層基質は束状のコラーゲン細線維で構成されており,構成線維は部位により異なる配列を呈していた.下顎体部および下顎底部では細線維束の主な配列は前後方向に密に走向していた.下顎体部では局所的にわずかに走向の異なる細線維束の交錯も認められた.オトガイ孔の周囲および下顎角部では多数の腱の侵入が認められ,基質線維は互いに交錯し,腱を取り囲むように走向していた.下顎枝部では細線維束は上下方向に走向し,下顎体部との移行部で走向が変化していた.歯槽部表面では細線維束は上下方向に走向していた.このように下顎骨の基質線維の走向は下顎骨に及ぶ張力と関連性を有することが考えられ,また,歯槽部表層の細線維束の走向は咬合時の圧力との関係を示唆すると考えられる.ラット顎関節円板については,ヒトほど顕著ではないが前方および後方肥厚部と中央狭窄部がみられた.加齢とともに,細胞の減少と線維性基質の著しい増加を伴う円板厚径の増加傾向が認められた.幼若ラットの円板表層は,大部分が密な細線維網で占められており,細線維束はほとんど認められなかった.

成熟ラットの円板表層は,細線維網によって被覆された細線維束で構成されていた.円板の下顎窩側の細線維束は中央部では前後方向に,それ以外の領域では放射状に配列されていた.下顎頭側の細線維束は、中央部では前後,内外側方向に,前後縁および内外側縁では放射状に配列されていた.このような細線維構築は,咬合運動時に発生する圧力や関節包あるいは外側翼突筋の牽引力に対して,円板が緩衝構造を持つことを示唆すると考えられる.顎骨基質ならびに顎関節円板の立体超微形態学的線維構築を観察し、応力と基質構成線維の走向との関係および老齢に伴う立体構築の変化を明らかにした。成体のカニクイザルの下顎骨表層各部の基質構成線維を観察すると、下顎体部ではコラーゲン細線維束の大部分は前後方向に走向していた。表層の細線維束が比較的疎な配列を呈している部位では、走向の異なる細線維束が深層に認められた。下顎体部の表層に凹凸が認められる部位では細線維束の交錯が観察された。下顎骨の正中部および歯槽部表層では細線維束は上下方向に走向していた。オトガイ孔の辺縁部では細線維束は孔を取り囲むように走向していた。下顎枝部の表層では細線維束は後上方から前下方に走向し、下顎体部との移行部で細線維束の走向の変化が認められた。下顎角部の咬筋粗面では、細線維束は腱の侵入部を取り囲むように走向していた。下顎骨表層の細線維束の走向は咀嚼筋による力の方向と歯槽部における咀嚼圧の方向との関係を示唆していると考えられる。ラット下顎頭関節面では、胎生後期では構成線維が網状を呈していたが、1週齢ラットでは最表層は密な細線維網で占められており、深層は細線維束で形成されていた。6週齢では細線維網のほかに細線維の小束や前後方向に走向する細線維が認められた。8週齢では立体的に交錯する細線維束が出現し、成熟および老齢ラットでは細線維束は極めて密になり、より成熟した様相を呈していた。幼若ラットの顎関節円板の円板表層は大部分が密な細線維網で占められていたが、成熟ラットの円板表層の大部分は細線維束で形成されていた。細線維束は下顎窩では中央部は前後方向、それ以外では放射状に配列されていた。下顎頭側では中央部は前後、内外方向に、前後縁および内外縁では放射状またはこれと直交する細線維束が認められた。
算数的・数学的活動の指導の体系化およびその評価方法の開発研究

本研究では、算数的・数学的活動を通した授業の在り方とその指導の効果について、授業研究および調査研究を中心に考察した。3年間で、73名の研究協力者による173の事例に加え、授業研究会や提言、さらには授業者対象の調査など、様々な見地から研究を推進した。その結果、児童・生徒の算数・数学の確かな学力の育成を図る上で、算数的・数学的活動を通した授業のあり方について11の知見を得ることができた。昨年度に引き続き、3地区(岩手、東京・神奈川、北海道)の小・中学校教員を中心とした協力者76名(小学校教員34名、中学校教員32名、高等学校教員1名、指導主事6名、大学教員3名)による算数的・数学的活動を通した授業の継続的な実施を試み、授業研究の立場から算数的・数学的活動を通した授業の様相とその体系化について明らかにしていこうと試みた。その結果、以下の5点が明らかになってきた。1.授業者は、算数的・数学的活動を通した授業を、算数・数学の授業づくりと算数・数学の学習の目的の2つの視点から捉えようとしている。2.算数的・数学的活動を通した授業では、数学的な関係や性質・方法などを見いだすこと、結果や考えを説明し伝え合うこと、などが数多く計画されている。3.授業者は、算数的・数学的活動を通した授業を通じて、学習内容とその意味についての理解を実感している。4.算数的・数学的活動を通した授業では、学習内容の取り扱いの不足、教材研究や指導の工夫の不足、などを実感する授業者が少なくない。これらは、授業者にとっての算数的・数学的活動を通した授業づくりの課題となっており、授業者自身の授業に対する満足感や達成感にも影響を与えている。5.授業者は、算数的・数学的活動を通した授業を通じて、数学的に考える力をつけていきたいと考えているが、その効果を実感するまでには至っていない。これらの知見をもとに、以下の4点を今年度までの成果とした。1.算数的・数学的活動を通した授業について5つの様相をもとにした授業づくりが求められること。特に、授業展開の様相、説明し伝え合う活動の様相については特徴的であること。2.長期的な授業実践のさらなる継続的な試みとその効果が求められること。3.算数的・数学的活動の質的な評価とその体系化が求められること。4.より一層の授業の評価および子どもの評価の方法の在り方が求められること。本研究の目的の一つである、小・中学校の体系的な視点から見た「算数的・数学的活動」を通した指導の効果について、岩手、東京・神奈川、北海道の3地区による授業研究をもとに分析を試みた。その結果、次の2点について知見を得た。1「算数的・数学的活動を通した授業」に対する授業者の考え授業者は、算数的・数学的活動を通した授業を、「子どもたちが、何らかの数学的な表現を用いて考え、それをお互いに説明したり、伝え合えるようにしたりすることができる授業」、「子どもたちが数学的な興味・関心を持って取り組める授業」と捉える傾向にあった。授業の多くは、数学的な関係や性質を見いだし、その見いだした事柄を数学的に表現したり、数学的に考え判断したことをもとに、数学的に説明したり伝え合ったりする、といった一連の流れで構成されていた。授業者は、算数的・数学的活動を通した授業では、活動しながら考えること、活動を通して数学的な興味・関心を高めること、活動の中からやり取りを生み出していくこと、を大切にしていた。授業者は、そのような授業から、算数・数学の学習に対する子どもたちの前向きな態度を求めていこうとしている。2「算数的・数学的活動を通した授業」の効果と課題算数的・数学的活動を通した授業の効果について、授業者は、学習内容とその意味についての理解が期待できると考えている。また、言葉や数、式、表、グラフなどを用いて考えたことを伝え合えること、子どもたちの主体的な活動が見られることも期待していた。小学校の教員は、算数的活動に伴う子どもの発言や気づきなどをもとに授業を展開することができたことも評価している。中学校の教員は、数学の学習に対する生徒の興味・関心が高まることが期待できる、という効果もあげている。また、このような効果は、継続的な授業実践や長期的な視座に立った授業計画をすることでも期待できそうである。本研究の目的は、小・中学校の体系的な視点から見た算数的・数学的活動を通した授業の効果を明らかにするとともに、その評価方法の開発を試みることであった。岩手、東京・神奈川、北海道の3地区の小・中学校の教員73名による、3年間での173事例の授業研究ならびに調査研究を行い、以下の知見を得た。

体系的な視点から見た算数的・数学的活動を通した授業の効果については、1算数的・数学的活動を通した授業は、すべての学年、領域で実施することができること、2授業者は、算数的・数学的活動を通した授業に目的(ねらい)を持っていること、3「子ども自らが、数学的な性質や関係を見いだし、伝え合う」といった算数的・数学的活動は、授業者の多くが取り入れていること、41単位時間の授業の中で取り入れられる算数的・数学的活動は、必ずしも一つではないこと、5授業者は、算数的・数学的活動は、平時の授業でも取り入れることができると感じていること。ただし、そのための指導の工夫が必要であるとも感じていること、6「式と図などを関連付けたり、式や図などの表す意味を読み取ったりする活動」、「多様な方法や手順を考える活動」、「数や図形などの性質や関係などを発展し、統合する活動」、「式や図、グラフなどを基に、数学的に判断する活動」なども、大切な算数的・数学的活動であること、7算数的・数学的活動を通した授業では、教師の介入も必要であること、8算数的・数学的活動を通した授業では、算数・数学の学習内容の意味や必要性を理解し、実感した子どもが多かったと感じていること、9算数的・数学的活動の内容は、算数・数学の学習内容に即していること、が明らかになった。また、評価方法については、1小・中連携した算数的・数学的活動の在り方を意識することが大切であること、2授業者は、算数的・数学的活動を通した授業の評価の難しさを感じていること、が明らかになった。数学教育学研究推進にあたっては、当初の研究計画に則り、今年度も3地区による地区会を各地区2回ずつ開催し、授業の計画とその評価について継続的に検討するとともに、3地区代表者による全体会において研究内容の共有化を図ることができた。今年度は、76名の研究協力者による、小学校21事例、中学校23事例、計44事例の授業研究が実施された。これで、授業研究の事例数は、4年間で、小学校64事例、中学校70事例、計134事例となり、算数的・数学的活動を通した授業の体系的な様相が少しずつ明らかになってきている。算数的・数学的活動を通した授業を具体化し、さらにはより質の高い授業実践の実現を目的とした授業研究会についても、各地区で1回ずつ開催した。以上のことから、授業研究を中心とした研究の推進とその共有化を図ることができたと考えている。また、昨年度からの課題となっていた、長期にわたる授業研究についても、今年度までに計4例実施することができ、長期的な視座から算数的・数学的活動を通した授業の効果についても少しずつ明らかになってきている。さらには、算数的・数学的活動を通した授業の評価方法についても、その資料収集が始まっている。これらの研究推進の状況と得られた知見を鑑み、算数的・数学的活動を通した授業の体系化、およびその評価方法について、2年次までの研究推進はおおむね順調であったと考えている。ただし、授業研究という質的な研究方法を採用しているがために、その授業分析については、必ずしも十分とはいえず、さらにより客観的な判断が必要であると考えている。また評価方法の開発については、まだ十分な検討がなされているとはいえない。引き続き、最終年度の課題としていきたい。これらの研究成果については、今年度も日本数学教育学会等の数学教育関連の学会でも継続的に公表している。研究推進にあたっては、当初の研究計画に則り、3地区による地区会を各地区2回ずつ開催し、授業の計画とその評価について検討を行うとともに、3地区代表者による全体会も1度開催し、各地区の授業研究の成果を共有化を図ることができた。また、今年度は、算数的・数学的活動を通した授業について、78人の研究協力者により3年間で小学校43事例、中学校47事例、計90事例の授業研究を実施し、分析することができた。
哺乳類網膜神経節細胞の樹状突起上の抑制性シナプスの分布と視覚情報処理機能との関係

網膜組織培養法と遺伝子銃によるRGCへの遺伝子導入を、霊長類(マーモセット)網膜に応用し、成功させた。とくに、マーモセット網膜に対してGFPの遺伝子導入を行い、これまで主として考えられていたMidgetやParasol神経節細胞以外のさまざまな種類の網膜神経節細胞を発見した。また、その神経回路基盤として、シナプス統合過程が、細胞ごとにどのように違うのか、PSD95-GFPの遺伝子導入により明らかとした。これによって、とくにナローソニー神経節細胞が特異的にDB6双極細胞とシナプス結合し、さらに、視床の外側膝状体のK1層に投射している事実を明らかとした。本研究は、生体哺乳類網膜の視覚情報処理において異なる機能を示す12種類の網膜神経節細胞(RGC)のシナプス統合過程の違いを知るため、樹状突起上の抑制性シナプスの空間的な分布の特徴を明らかにし、視覚情報処理機能との関係を調べることである。そのために、申請者の開発した生体哺乳類の網膜組織培養法を用いて、遺伝子銃によって抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)を遺伝子導入し、樹状突起上の抑制性シナプスの位置を可視化して、その分布特性を解析することを目的とした。これまでに網膜組織培養法についてはげっ歯類動物とウサギで成功していたが、平成25年度は、網膜組織培養法と遺伝子銃によるを、霊長類(マーモセット)網膜に応用し、成功させた。霊長類網膜の情報処理は比較的シンプルで単純なものと考えられていたが、これまで知られていたよりも複雑で多様であることが明らかになった。本研究は、成体哺乳類網膜の視覚情報処理において異なる機能を示す12種類の網膜神経節細胞(RGC)のシナプス統合過程の違いを知るため、樹状突起上の抑制性シナプスの空間的な分布の特徴を明らかにし、視覚情報処理機能との関係を調べることである。そのために、申請者の開発した成体哺乳類の網膜組織培養法を用いて、遺伝子銃によって抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)を遺伝子導入し、樹状突起上の抑制性シナプスの位置を可視化して、その分布特性を解析することを目的とした。平成24年度は、まず、網膜組織培養法と遺伝子銃による遺伝子導入を確立させた。成体のウサギおよびげっ歯類(主としてラット)網膜に対して遺伝子銃を用いて遺伝子導入を行った。ウサギの網膜は12種類のRGCの形態と機能が明確に記述されており、本研究の対象に最適であるが、ウサギそのものが高価で貴重である。そこで、以下、抑制性シナプス・マーカーの探索には、より安価で簡単に手に入れることができるげっ歯類(主としてラット)網膜をまず用いた。次に、より忠実に抑制性シナプスをラベルする抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)の探索を行った。いくつかの抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)の候補について、これらの遺伝子を成体げっ歯類網膜に対して遺伝子導入し、RGCの樹状突起上において、より忠実に抑制性シナプスの分布を可視化する抑制性シナプス・マーカーを探索した。本研究の目的は、生体哺乳類網膜の視覚情報処理において異なる機能を示す12種類の網膜神経節細胞のシナプス統合過程の違いを知るため、樹状突起上の抑制性シナプスの空間的な分布の特徴を明らかにし、視覚情報処理機能との関係を調べることである。そのために、申請者の開発した生体哺乳類の網膜組織培養法、および、遺伝子銃による遺伝子導入を行った。平成25年度までに、霊長類(マーモセット)網膜に、本手法を適用し、成功させ、霊長類網膜でも、他の哺乳類に見られるような多様性があることを明確にした。本年度は、その成果を総説記事としてまとめた。また、本年度は、げっ歯類網膜における生理学的反応、とくに、青や緑といった色に反応する網膜神経節細胞の神経回路基盤を明らかにすることを目的とし、遺伝子導入によって形態学的な解析を行ったのち、パッチクランプ法によって電気生理学的に色に反応する網膜神経節細胞を同定し、解析を行った。緑に対して反応する網膜神経節細胞に比して、青色に対する網膜神経性細胞の反応は、これまで知られていたものと違う層でのシナプス結合を有することが明らかとなった。こうした一連の結果は、網膜神経節細胞は、げっ歯類や霊長類など、どの種の哺乳類であっても多様性をもち、複雑な神経回路基盤を持っていることを強く示唆している。

生理学的な反応を生み出す基盤として、興奮性入力だけでなく、抑制性入力の分布が、より重要であることがわかった。神経生理学網膜組織培養法を、より高度な視覚情報処理をしていると考えられる霊長類網膜にも応用し、成功させた。より良い抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)の候補の絞り込みを行う段階に達している。霊長類網膜の神経節細胞のdiversityを探索するとともに、その基盤となる抑制性シナプス入力の違いを明らかにする。より忠実に抑制性シナプスをラベルする抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)候補の探索を引き続き行う。研究を行う部屋の引っ越しに伴い研究がストップしたため。引き続き、網膜組織培養法と遺伝子銃を用いた遺伝子導入を行う。とくにパッチクランプ法を用いた色反応の解析を行い、それぞれの色反応に対する網膜神経節細胞におけるシナプス統合過程の違いを明らかとする。抑制性シナプス・マーカー(プラスミド)候補の分布の忠実さを、免疫染色によって内在性のGephyrin(抑制性シナプスの裏打ち分子)と共存しているかどうかで判定する。
次世代の国際VLBI観測網で明らかにする巨大ブラックホールジェットの磁力線構造

巨大ブラックホールから噴出する相対論的ジェットの生成・収束・加速機構の解明は現代天文学における究極的課題の1つである。本研究では230GHz帯国際VLBI観測網(Event Horizon Telescope)によるジェット生成領域の高解像度観測と、22/43GHz帯東アジアVLBI観測網による「収束・加速領域」の偏波観測を組み合わせることで、世界に先駆けて生成・加速・収束領域における「磁力線構造」の解明を試みる。そのために今回は石垣・小笠原局の両偏波受信システムを整備する。そして得られた磁力線構造を我々の先行研究結果と結びつけ、現在最有力とされる理論「磁場駆動型モデル」の妥当性を確かめる。
アドリアマイシン心筋症における細胞内Caオ-バ-ロ-ドの役割の検討

心筋虚血後の再潅流障害の発生に、虚血・再潅流に伴う細胞内Ca^<2+>イオンのoverloadが重要な役割を演じていることが、我々の研究をはじめとして多く報告されている。さらに、虚血を伴わない細胞内Caのoverloadによっても心筋の収縮性の低下が引き起こされることが報告されている。一方、抗癌剤の一つであるアドリアマイシンは、古くから心毒性を有することが知られているが、その機作については、未だ不明な点が多く、従ってその有用な予防法も知られていない。本研究では、従来より我々が使用している弗素NMR(FーNMR)を用いた摘出潅流心での細胞内Ca^<2+>イオン濃度測定法を用い、アドリアマイシンによる心収縮性の障害における細胞内Ca overloadの関与を検討し、併さて、アドリアマイシンに対する心筋保護法を細胞内Ca^<2+>イオンの動態に基づく観点から開発・検討した。弗素化合物5FーBAPTAは、Ca結合型と非結合型でFーNMR上異なった化学シフトを示し、両者の比よりCa^<2+>イオン濃度の測定が可能である。まず、フェレットの摘出潅流心標本をモデルとし、アドリアマイシン(30mg/l)を潅流液中に加える前、投与中、投与30分後のwashoutにおける細胞内Caイオン濃度([Ca^<2+>]i)の時間平均値を観測した。[Ca^<2+>]iは、対照時381+66nM(n=5,mean+SEM)より、30分投与中、有意に増加した(789+171nM)。さらにwashout30分後においても[Ca^<2+>]iの増加は有意であった。左室内に挿入したバル-ンにより測定した等容性左室発生圧は対照時の81+9%まで低下し(n=12,p〈0.05)、washout後も改善を認めなかった。次に7例においてアドリアマイシン投与による高エネルギ-燐酸代謝変動をP^<31>ーNMRにより検討したが、無機燐、ATP、クレアチン燐酸とも有意な変化は認めなかった。以上より、アドリアマイシンによるCa overloadが投与中止30分後も持続し、虚血を伴わない心収縮能低下を惹起している可能性が示唆された。(業績は現在投稿中)心筋虚血後の再潅流障害の発生に、虚血・再潅流に伴う細胞内Ca^<2+>イオンのoverloadが重要な役割を演じていることが、我々の研究をはじめとして多く報告されている。(業績は現在投稿中)
シリル基を有する遷移金属錯体によるニトリルのC-C結合切断反応

シリル基を有する鉄錯体であるCp(CO)_2FeSiMe_3とジアミノ置換ホスファイトを含むアセトニトリル溶液に光照射を行うと、鉄-メチル錯体と鉄-シアノ錯体が生成し、これよりアセトニトリルのC-C結合が切断されることを明らかにした。この反応にはシリル配位子が必須であることも分かった。共存リン化合物としてPPh_3やPMe_3を用いても同様のC-C結合切断反応が起こることが分かった。また、アセトニトリルの代わりにベンゾニトリルを用いてもC-C結合切断が起こる。理論計算より、この反応はまず光照射により生じた配位不飽和種のCp(CO)FeSiMe_3にニトリルがエンドオンで配位し、その後サイドオン配位へ変換し、それから鉄上のシリル基がニトリルの窒素に転位してイミノ錯体となる。その後C-C結合が切断されて、メチル-シリルイソシアニド錯体となる。反応後、系中に存在する有機物を調べたところシリルシアニドの生成は確認されたが、理論計算から予想される中間体はいずれも単離できず、またスペクトル的にも検出できなかった。これに対して、Cp(CO)_2FeSiPh_3にPPh_3共存下アセトニトリル中で光照射を行ったところ、赤色結晶を得ることができた。この錯体のX線構造解析より、Cp(PPh_3)(Me)Fe-(CNSiPh_3)が生成していることが明らかとなった。各種NMR測定により、この錯体は溶液中でもこの構造を保持しいていた。これより、理論計算で推定した反応機構の妥当性が支持された。シアノ錯体の生成についても理論計算を行った。シリルイソシアニド錯体からシリルイソシアニドが解離し、シリルシアニドへの異性化し、その後鉄に配位して最終的にシアノ錯体へと変換する経路を提案した。シリル基を有する鉄錯体CpFe(CO)_2(SiMe_3)をアセトニトリル中、ジアミノ置換ホスファイト(L)共存下で光照射を行ったところ、CpFe(Me)(CO)L, CpFe(Me)L_2,CpFe(CN)L_2が生成することを見いだした。この反応でのSiMe_3基の行方を調べたところ、Me_3SiCNが錯体に対して66%の収率で生成していることが明らかとなった。この反応でMeCNを溶媒として用いずに、THFを溶媒として当モルのMeCNを反応させてもほぼ同様な反応が進行した。また、CH_3CNのかわりにCD_3CNを反応させたところ、CD_3を有する錯体CpFe(CD_3)(CO)LおよびCpFe(CD_3)L_2が生成した。以上より、この反応ではアセトニトリルのC-C結合が切断されたことが明らかとなった。CpFe(ER_3)(CO)_2中のER_3をSiMe_3からCH_3,GeMe_3,SnMe_3に変えた錯体を用いて同様の実験を行ったところ、いずれの場合もMeCNのC-C結合切断反応は起こらず、CO/L置換生成物であるCpFe(ER_3)-(CO)Lが生成した。これより、MeCNのC-C結合切断反応には鉄上のシリル配位子が必須であることが明らかとなった。鉄シリル錯体によるMeCNのC-C結合切断の反応機構を明らかにする目的で、密度汎関数法を用いた理論計算を行った。その結果、光照射により生成する16電子錯体のCpFe(SiMe_3)(CO)にアセトニトリルがη^2-配位し、その窒素原子にSiMe_3基が鉄から転位し、その後C-C結合が切断されてメチル基とシリルイソシアニドを配位子とする鉄錯体が生成する経路により、反応が進行することが提案された。

これより、理論計算で推定した反応機構の妥当性が支持された。シアノ錯体の生成についても理論計算を行った。シリルイソシアニド錯体からシリルイソシアニドが解離し、シリルシアニドへの異性化し、その後鉄に配位して最終的にシアノ錯体へと変換する経路を提案した。
GPIアンカー膜蛋白GFRA2が心筋緻密化障害心筋症の病理病態に果たす役割の解明

独自の先行研究にて、神経栄養因子の受容体GFRA2は心臓前駆細胞に特異的な細胞表面抗原であり、この受容体と類縁分子GFRA1を介するリガンド(NURTURINとGDNF)に依存しない未知のシグナル経路が異常をきたすと、心筋緻密化障害心筋症が生じる可能性を明らかにした。本研究は、心筋緻密化障害に関与するGFRA1/2を介した新規シグナル経路の本態を明らかにし、多くが不明なままの難治性かつ予後不良なヒト心筋緻密化障害の病理病態と臨床遺伝学的背景の理解を深める基盤研究を行う。計画している研究項目は、(1)心臓発生に必要な新規GFRA1/2シグナル経路の解明、(2) Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析、および(3)ヒト心筋緻密化障害患者のGFRA1/2遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認である。(1)心臓発生に必要な新規GFRA1/2シグナル経路の解明に関し、マウスES細胞にてGFRA2と相互作用をする分子を探索するため、まずはCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてGFRA2タンパクにタグを標識するゲノム編集を行う。現在、マウスES細胞を用いたゲノム編集作業中である。(2)Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析を行うために、まずはGfra2を発現した細胞系譜をマウス胚体内で追跡するためのマウスと、コンディショナル・ノックアウト・マウスを作成する。現在は遺伝子改変マウスの作成中である。(3)ヒト心筋緻密化障害患者のGFRA1/2遺伝子変異探索のための研究を推進するため、研究ネットワークの構築はすでに完了した。ヒトゲノム研究の承認審査に対して、現在もなお準備中である。以下の理由により半年から1年ほどの研究計画の遅れが生じている。(1)マウスES細胞を用いた心筋の分化誘導系に重大な支障が生じている。ES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地と呼ばれる培地を用いていたが、これにより維持してきたES細胞が、継代を重ねるごとに心筋分化の効率が著しく低下した。この2年ほどで報告されているが如く、2i+LIFで維持されたES細胞は、エピジェネティックな状態に大きな変化を生じて、分化能に大きな影響が生じてしまったようである。現在、この問題を解決するための作業中である。(2)CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集方法を用いたノックインを行う実験計画であったが、どの方法を用いてもin/delに基づく変異は生じるものの、論文として報告されているような遺伝子組換え効率が全く得られなかった。そのため方針を大きく転換せざるを得ず、遺伝子改変の方法を古典的な方法に変更し、現在も改変体を得るための作業を行なっている。(3)当該年度中に、研究施設を異動する事となった。そのために、旧所属施設での研究資材の整理、異動先への研究資材の移設と必要とする研究環境の新たな整備が必要となり、実質的な研究活動を半年ほど停止せざるを得なかった。また、異動先にて、新しく研究に参画する人員を求める必要にも迫られている。これらの人員不足を含む事情が研究作業を一時的に停滞させ、スケジュールに大きな遅れを生じさせる原因となった。(4)ゲノム検体採取のためのボランティア患者のリクルートには、施設の異動に伴い、異動先でのヒトのゲノム研究の認可手続に今から着手する状況である。上述の如く、研究材料における不測の事態、研究代表者の施設間での異動、認可手続きの状況、また研究に参画する人員の絶対的な不足により、進捗状況に当初の研究計画から遅れを生じている。(1)心臓発生に必要な新規GFRA1/2シグナル経路の解明;まず、心筋分化効率の低下しない2i+LIFとは異なる古典的な維持培養を用いて、かつ遺伝子改変も基本に立ち返った古典的方法にてマウスES細胞での遺伝子改変作業を終了し、遺伝子発現解析とタンパク発現解析に着手する。(2)Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析;遺伝子改変動物の作成を本年度中に終了し、変異マウスの表現型の解析に着手にまでこぎつけたい。(3)ヒト心筋緻密化障害患者のGFRA1/2遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認;年度内に学内でのヒトゲノム研究の承認を得、附属病院小児科外来における検体採取作業へと着手出来るようにしたい。研究進捗の遅れの原因には、絶対的な人員不足も大きな要因として挙げられる。これを解消するために、大学院生のリクルートを積極的に行いたい。本研究は、マウス胚に心筋緻密化障害心筋症を引き起こすGFRA1/2を介した新規シグナル経路の本態を明らかにし、難治性かつ予後不良なヒト心筋緻密化障害に関し多くが不明なままの病理病態と臨床遺伝学的背景の理解を深める基盤研究を行う。(1)心臓発生に必要な新規GFRA

1/2シグナル経路の解明に関し、マウスES細胞にてGFRA2と相互作用をする分子を探索するため、まずはCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてGFRA2タンパクにタグを標識するゲノム編集を行う計画である。ゲノム編集作業を行うための準備(targeting vectorの構築と、CRISPR/Cas9の準備)に着手し、これを完了した。(2)Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析を行うために、まずはGfra2を発現した細胞系譜をマウス胚体内で追跡するためのマウスと、コンディショナル・ノックアウト・マウスを作成する研究計画である。この作業に必要なttargeting vectorの構築とCRISPR/Cas9の準備を完了し、マウス作成作業へ着手した。(3)ヒト心筋緻密化障害患者のGFRA1/2遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認においては、研究を推進するための研究ネットワークの構築を完了した。現在は学内でのヒトゲノム研究の承認審査に対して準備中である。3つの目標項目に関連した研究計画に従い研究を開始し、現在は以下の状況にある。(1)心臓発生に必要な新規GFRA1/2シグナル経路の解明;GFRA2と相互作用をする分子を探索するために必要なマウスES細胞のゲノム編集に用いるtargeting vectorの構築を終了し、現在はゲノム編集作業を進行中である。英国から研究環境を日本へ移したため、英国で使用していた同じ試薬・材料が手に入らない等の理由から、マウスES細胞の培養方法の最適化に時間を要した。また、当初は、targeting vectorをlong single oligo nucleotideとして用いる計画であったが、マウスES細胞では実験系が作動しなかった。現在はHomology-Independent Targeted Integration(HITI)法へと変更し実施している。(2)Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析;計画通りにtargeting vectorの構築は終了し、現在はCRISPR/Cas9を用いた遺伝子改変マウスの作成作業中である。(3)ヒト心筋緻密化障害患者のGFRA1/2遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認;検体採取のためのネットワークの構築を完了し、ヒトゲノム研究を行うための認可申請準備を行なっている。ゲノム検体採取のためのボランティア患者のリクルートには未だ着手できていない。上述の如く、英国から日本へと研究環境を移したことで不測の事態に直面したこと、認可手続きに時間を要していること、また研究に参画する人員の絶対的な不足により、やや進捗状況に当初の研究計画から遅れを生じている。独自の先行研究にて、神経栄養因子の受容体GFRA2は心臓前駆細胞に特異的な細胞表面抗原であり、この受容体と類縁分子GFRA1を介するリガンド(NURTURINとGDNF)に依存しない未知のシグナル経路が異常をきたすと、心筋緻密化障害心筋症が生じる可能性を明らかにした。