hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
構造多型の弁別を軸とした植物光受容蛋白質シグナルカスケードメカニズムの解析

まず申請者はX線小角散乱法(SAXS)とクライオ電子顕微鏡法(cryoEM)を組み合わせた蛋白質動態解析スキームを開発すべく、水溶性酵素蛋白質グルタミン酸脱水素酵素(GDH)ドメイン運動についてcryoEMによる溶液中での構造変化の解析を行った。GDHは2つのドメインから構成されるが、解析の結果、ドメインの相対位置の異なる複数の準安定構造が近原子分解能で得られ、中には結晶構造解析では得られなかった構造も存在した。また、分子動力学(MD)計算でサンプリングされた構造との比較を通してGDHドメイン運動の自由エネルギー地形の推定に成功した。cryoEM構造から推定された運動はMDでの運動と一致したものの、各構造の相対出現頻度はcryoEMとMDで大きく異なり、既存のMDでは現実の系における動態を限られた計算時間で再現するのは極めて困難である、という知見が得られた。これら結果をまとめ学会でポスター発表を行い、また論文を現在投稿中である。並行して、本研究の目的蛋白質フォトトロピン(phot)と類縁のフィトクロムB(phyB)についてSAXSによる解析を試みた。phyBは不活性な赤色光吸収型(Pr)と活性のある赤外光吸収型(Pfr)型の二状態を取り、光吸収によって相互に変換される。そこでまずPr型について単分散なSAXSプロファイルを取得し分子概形を推定したところ、全長150ÅのX字型の二量体構造が得られた。先行研究で明らかになっている光受容モジュールの二量体結晶構造を分子概形に重ね合わせたところ、溶液中での構造は結晶構造と異なり光受容モジュールがより開裂した構造であった。また、赤色光照射下Pr-Pfr混合状態のSAXS測定ではPfr型での光可逆的な非特異的凝集が観測された。この凝集は赤色光吸収に伴う相互作用特性の変化によるものであり、phyBの機能発現に重要な役割を果たすと考えられる。これら結果をまとめて論文を投稿した。また学会にて発表を行う予定である。本研究における具体的な課題は(i)蛋白質の動態解析スキームの開発、(ii)phot高分解能構造解析条件の検討、(iii)複合体の精製と構造解析、の三点であるが、当該年度は計画書の通り(i)、(ii)に注力し、概ね順調に進展した。(i)についてはcryoEMによってGDHの全体構造を得た後、構造が安定な領域(中心部分)と中心部分に対して相対運動をする領域(運動部分)に分けた上で運動部分について構造弁別を行うことで複数の準安定状態を取得に成功した。この際、GDHについては中心部分と運動部分が既知であることが重要であった。従って、「SAXSによって中心部分と運動部分を事前に決定した上でcryoEMによる構造弁別を行う」という提案スキームが極めて有効であることが確認でき、(i)については当該年度の目標を達成できた。(ii)についてはphotの構造解析にこそ至らなかったものの、類縁蛋白質であるphyBについて進展が見られた。まずPr型phyBについて不明であった全体形状を推定し、さらにPfr型での非特異的凝集を観測した。この凝集性とphyB自体の不安定な性質を考慮し、Pr型での化学固定後にcryoEM観察を行ったところ、凝集等のない単分散なcryoEM観察像が得られた。観察像のコントラストは低いものの、準備的な解析で8Å分解能の二次元投影像が得られており、今後の解析で高分解能な三次元構造が得られることが期待できる。また、phyBの凝集しやすく不安定であるという性質はphotと共通したものであるため、phyBの構造解析を通して得た知見はphotの構造解析にも援用可能である。従って、(ii)についても当該年度の目標を概ね達成することができた。(i)については提案スキームの有効性を確認できたため、今後はさらなる動態解析手法についての検討を行う。提案スキームの動態解析法は複数の離散的構造への分類を通して構造変化を可視化する、という方法であった。今後は連続的な構造変化の可視化、あるいは蛋白質構造変化の自由エネルギー地形の可視化の手法を検討していく。所属研究室では多様体解析と呼ばれる数学的手法を用いて蛋白質の連続的構造変化を解析した先行研究が存在するため、これを参考に具体的処方を考えていく。(ii)については当該年度でphyBについてのcryoEM観察条件検討を進め、化学固定が有効であることを確認した。従って今後はphyBのcryoEM観察条件をphotに適用することでphotの構造解析を進めていく予定である。また、photとphyBは光受容蛋白質であることや構造の不安定性など多くの性質を共有しているが、これまでの研究を振り返るとphyBはphotよりも多少扱いやすい試料である、という印象を抱いている。そのため、phyBについての解析も継続して行い、光受容に伴う動態の解析もphyBについて解析した後その知見をphotの解析にフィードバックする、という方針で進めていく。(iii)についても(ii)と同様phyBによる先行解析を行い、それに基づいてphotの解析を行う、という形で進める。幸いにしてphyBもphotと同様に相互作用蛋白質を有しており、この蛋白質と複合体を形成すると考えられている。よってまずはphyBについて複合体試料の精製方法、cryoEM観察条件を検討していく予定である。特に化学固定法は課題(ii)において蛋白質の安定化に効果を発揮したため、この課題においても有効であると期待している。

まず申請者はX線小角散乱法(SAXS)とクライオ電子顕微鏡法(cryoEM)を組み合わせた蛋白質動態解析スキームを開発すべく、水溶性酵素蛋白質グルタミン酸脱水素酵素(GDH)ドメイン運動についてcryoEMによる溶液中での構造変化の解析を行った。GDHは2つのドメインから構成されるが、解析の結果、ドメインの相対位置の異なる複数の準安定構造が近原子分解能で得られ、中には結晶構造解析では得られなかった構造も存在した。また、分子動力学(MD)計算でサンプリングされた構造との比較を通してGDHドメイン運動の自由エネルギー地形の推定に成功した。cryoEM構造から推定された運動はMDでの運動と一致したものの、各構造の相対出現頻度はcryoEMとMDで大きく異なり、既存のMDでは現実の系における動態を限られた計算時間で再現するのは極めて困難である、という知見が得られた。これら結果をまとめ学会でポスター発表を行い、また論文を現在投稿中である。並行して、本研究の目的蛋白質フォトトロピン(phot)と類縁のフィトクロムB(phyB)についてSAXSによる解析を試みた。phyBは不活性な赤色光吸収型(Pr)と活性のある赤外光吸収型(Pfr)型の二状態を取り、光吸収によって相互に変換される。そこでまずPr型について単分散なSAXSプロファイルを取得し分子概形を推定したところ、全長150ÅのX字型の二量体構造が得られた。先行研究で明らかになっている光受容モジュールの二量体結晶構造を分子概形に重ね合わせたところ、溶液中での構造は結晶構造と異なり光受容モジュールがより開裂した構造であった。また、赤色光照射下Pr-Pfr混合状態のSAXS測定ではPfr型での光可逆的な非特異的凝集が観測された。この凝集は赤色光吸収に伴う相互作用特性の変化によるものであり、phyBの機能発現に重要な役割を果たすと考えられる。これら結果をまとめて論文を投稿した。また学会にて発表を行う予定である。本研究における具体的な課題は(i)蛋白質の動態解析スキームの開発、(ii)phot高分解能構造解析条件の検討、(iii)複合体の精製と構造解析、の三点であるが、当該年度は計画書の通り(i)、(ii)に注力し、概ね順調に進展した。(i)についてはcryoEMによってGDHの全体構造を得た後、構造が安定な領域(中心部分)と中心部分に対して相対運動をする領域(運動部分)に分けた上で運動部分について構造弁別を行うことで複数の準安定状態を取得に成功した。この際、GDHについては中心部分と運動部分が既知であることが重要であった。従って、「SAXSによって中心部分と運動部分を事前に決定した上でcryoEMによる構造弁別を行う」という提案スキームが極めて有効であることが確認でき、(i)については当該年度の目標を達成できた。(ii)についてはphotの構造解析にこそ至らなかったものの、類縁蛋白質であるphyBについて進展が見られた。まずPr型phyBについて不明であった全体形状を推定し、さらにPfr型での非特異的凝集を観測した。この凝集性とphyB自体の不安定な性質を考慮し、Pr型での化学固定後にcryoEM観察を行ったところ、凝集等のない単分散なcryoEM観察像が得られた。
肺癌の放射線治療による局所制御に関連する因子の免疫組織化学的・臨床的検討

1.放射線誘導アポトーシスと関連する遺伝子(産物)の免疫組織化学的検索:ヌードマウス可移植性ヒト腫瘍を用いた実験結果からは,照射後6時間で採取した組織中に出現するアポトーシスの頻度と放射線感受性との間には相関性が認められた.とくに,放射線感受性の高い上衣芽腫ではp53依存性のアポトーシスが誘導されることから,放射線治療開始前のp53の検索が照射効果の先行指標となりうる可能性が示唆された.2.病理組織学的所見・アポトーシス関連遺伝子蛋白の発現と照射効果との関連性の検討:放射線治療を主体に治療を行った非小細胞肺癌36症例について生検組織標本のp53蛋白発現の有無と治療成績を検討した.その結果,p53蛋白発現が陰性の症例は陽性例にくらべて有意に照射効果が良好で,生存率も延長する傾向が認められ,生検組織標本でのp53蛋白の染色性の有無が照射効果の先行指標となる可能性が示唆された.3.局所制御に要する線量に関する腫瘍径・組織型別検討:末梢型非小細胞肺癌の局所制御に要する線量を検討すると,Tlは線量7075Gyで80%,T2は5cm以下であれば75Gy以上の線量で5070%の局所制御が期待された.治療後2年非担癌症例の組織型別の予後をみると,扁平上皮癌症例の97%は5年生存しており,扁平上皮癌は局所制御がそのまま治癒に結びつく疾患で,放射線治療の良い適応疾患であると考えられた.4.抗癌剤の放射線増感剤としての作用機序:アポトーシスを誘発するとされている新抗癌剤Taxolと放射線との併用効果をin vitroの系で,同一起源であるが,放射線感受性の異なる2種類の腫瘍を用いて検討した.検索した範囲では,薬剤の併用によりアポトーシスの頻度が増加しても,放射線感受性は相加効果の域を超えていなかった.しかし,放射線低感受性腫瘍では併用による利益が期待された.1.放射線誘導アポトーシスと関連する遺伝子(産物)の免疫組織化学的検索:ヌードマウス可移植性ヒト腫瘍を用いた実験結果からは,照射後6時間で採取した組織中に出現するアポトーシスの頻度と放射線感受性との間には相関性が認められた.とくに,放射線感受性の高い上衣芽腫ではp53依存性のアポトーシスが誘導されることから,放射線治療開始前のp53の検索が照射効果の先行指標となりうる可能性が示唆された.2.病理組織学的所見・アポトーシス関連遺伝子蛋白の発現と照射効果との関連性の検討:放射線治療を主体に治療を行った非小細胞肺癌36症例について生検組織標本のp53蛋白発現の有無と治療成績を検討した.その結果,p53蛋白発現が陰性の症例は陽性例にくらべて有意に照射効果が良好で,生存率も延長する傾向が認められ,生検組織標本でのp53蛋白の染色性の有無が照射効果の先行指標となる可能性が示唆された.3.局所制御に要する線量に関する腫瘍径・組織型別検討:末梢型非小細胞肺癌の局所制御に要する線量を検討すると,Tlは線量7075Gyで80%,T2は5cm以下であれば75Gy以上の線量で5070%の局所制御が期待された.治療後2年非担癌症例の組織型別の予後をみると,扁平上皮癌症例の97%は5年生存しており,扁平上皮癌は局所制御がそのまま治癒に結びつく疾患で,放射線治療の良い適応疾患であると考えられた.4.抗癌剤の放射線増感剤としての作用機序:アポトーシスを誘発するとされている新抗癌剤Taxolと放射線との併用効果をin vitroの系で,同一起源であるが,放射線感受性の異なる2種類の腫瘍を用いて検討した.検索した範囲では,薬剤の併用によりアポトーシスの頻度が増加しても,放射線感受性は相加効果の域を超えていなかった.しかし,放射線低感受性腫瘍では併用による利益が期待された.1.放射線誘導アポトーシスと関連する遺伝子(産物)の免疫組織化学的検索ヌードマウスを用いた実験結果からは,照射後6時間で採取した組織中に出現するアポトーシスの頻度が高い腫瘍の放射線感受性は高く,頻度の低い腫瘍の放射線感受性が低いことは明らかになってきた.しかし,検索した範囲内での癌関連遺伝子の発現とアポトーシスならびに放射線感受性とには明らかな関連性を認めることはできていない.今後の期待としては,p53の発現とアポトーシスとの関係で,p53に依存するアポトーシスが存在する腫瘍もあるので,放射線治療開始まえのp53の検索が先行指標となりうる可能性が示唆された.2.アポトーシスを誘発するとされている開発中の化学薬剤Taxolとの併用効果の検討Taxolと放射線との併用効果をin vitroの系で2種類の腫瘍を用いて検索した範囲では,アポトーシスの頻度が増加しても,放射線感受性は相加効果の域を超えていなかった.今後は,腫瘍による差異をヌードマウス可移植腫瘍を用いて検討する.3.病理組織型別の局所制御率とアポトーシスとの関係を明らかにし放射線感受性の再評価扁平上皮癌については,p53の発現と予後について検討し,p53陰性腫瘍の予後がやや良好であることを示唆するデーターをえた.さらにアポトーシスとの関係へと発展させたい.

4.局所制御に要する線量を腫瘍径・組織型別に検討し至適線量を求める.放射線治療を行った肺癌症例につき検討し,扁平上皮癌については,肉眼的腫瘍の存在しない縦隔の予防照射では,40Gyでほぼ制御できることがわかった.1.放射線誘導アポトーシスと関連する遺伝子(産物)の免疫組織化学的検索ヌードマウスを用いた実験結果からは,照射後6時間で採取した組織中に出現するアポトーシスの頻度が高い腫瘍の放射線感受性は高く,頻度の低い腫瘍の放射線感受性が低いことを明らかにした.しかし,検索した範囲内での癌関連遺伝子の発現とアポトーシスならびに放射線感受性とには明らかな関連性を認めることはできていない.p53の発現とアポトーシスとの関係で,p53に依存するアポトーシスが存在する腫瘍もあるので,放射線治療開始まえのp53の検索が先行指標となりうる可能性が示唆された.とくに,髄芽細胞腫では,照射によって野性型p53が発現し,ひきつづきアポトーシスが誘発されることがわかった.2.放射線増感剤の作用機序:放射線誘導アポトーシスを指標とした放射線の増強効果について新しい抗癌剤であるTaxolと放射線との併用効果をin vitroの系で2種類の腫瘍を用いて検索した範囲では,アポトーシスの頻度が増加しても,放射線感受性は相加効果の域を超えていなかった.in vitroの系でさらに検討中である.3.病理組織型別の局所制御率とアポトーシスとの関係を明らかにし放射線感受性の再評価扁平上皮癌については,p53の発現と予後について検討し,p53陰性腫瘍の予後がやや良好であることを示唆するデータをえた.さらにアポトーシスとの関係へと発展させたい.4.局所制御に要する線量を腫瘍径・組織型別に検討し至適線量を求める.放射線治療を行った肺癌症例につき検討し,扁平上皮癌については,肉眼的腫瘍の存在しない縦隔の予防照射では,40Gyでほぼ制御できることがわかった.1.放射線誘導アポトーシスと関連する遺伝子(産物)の免疫組織化学的検索ヌードマウス可移植腫瘍を用いた実験結果からは,照射後6時間で採取した組織中に出現するアポトーシスの頻度が高い腫瘍の放射線感受性は高く,頻度の低い腫瘍の放射線感受性が低いことを明らかにした.しかし,検索した範囲内での癌関連遺伝子の発現とアポトーシスならびに放射線感受性とには明らかな関連性を認めることはできていない.p53の発現とアポトーシスとの関係で,p53に依存するアポトーシスが誘発される腫瘍もあるので,放射線治療開始前のp53の検索が照射効果の先行指標となりうる可能性が示唆された.とくに,上衣芽腫では,照射によって野性型p53が発現し,ひきつづきアポトーシスが誘導されることがわかった.2.腫瘍の病理組織学的所見・アポトーシス関連遺伝子蛋白の発現と照射効果との関連性の検討放射線治療を主体に治療を行った非小細胞肺癌36例を対象として,照射前に採取された生検組織標本を用いてp53蛋白の免疫組織染色を行い,p53蛋白発現の有無と照射効果,生存率との比較を行った.その結果,p53蛋白発現が陰性の症例は陽性例にくらべ有意に照射効果が良好で,生存率も延長する傾向が認められ,p53蛋白の染色性の有無が照射効果の先行指標となる可能性が示唆された.3.抗癌剤の放射線増感剤としての作用機序:放射線誘導アポトーシスを指標とした放射線の増強効果について新しい抗癌剤であるTaxolと放射線との併用効果をin vitroの系で,同一起源であるが放射線感受性の異なる2種類の腫瘍を用いて検索した範囲では,薬剤の併用によりアポトーシスの頻度が増加しても,放射線感受性は相加効果の域を超えていなかった.しかし,低感受性の腫瘍では併用による利益が期待された.
河川における新しい数理生態モデルの展開

河川植物の生態に関する新たな数理モデルを開発するため,植生の繁茂した砂州における水・栄養塩動態に関する現地観測・数値解析を実施した.観測,解析の結果,砂州上の植生の繁茂の有無によって砂州伏流水の動態が大きく異なっていることが明らかになった.また,砂州伏流水の動態を記述する数値解析モデルを構築した.これらの研究の成果より,砂州植生の生息に重要となる水輸送機構を明らかにした.また,砂州上での植生繁茂域の予測に重要となる植生の侵入・定着過程について現地観測より実証的に明らかにした.植生の侵入・定着域は洪水時の冠水域と密接に関連しており,冬季最大出水での冠水域により植生の侵入域が決まり,侵入した植生が年最大出水時に流出しない場合に植生の定着が生じることが示された.河川水中の主な一次生産者である付着藻類の動態について,砂河川を対象として現地観測・数値実験を実施した.現地観測の結果,砂河川においても河床材料の移動が生じない期間には付着藻類の大量繁茂が生じることが確認された.現地観測結果から,砂河床上での藻類繁茂動態を記述する数値計算モデルの開発を行った.モデルでは,河川流の解析から河床材料の移動の有無を判別し,河床材料が移動しない期間については,ロジスティック方程式を用いた藻類の増殖解析を行った.数値解析の結果,解析対象とした河川においては,付着藻類の一次生産量が河川流量の増加とともに低減することが示された.本研究では,礫床河川の河床付着藻類繁茂動態を予測する数値解析モデルを構築した.モデルでは,付着藻類量の時間的変化を増殖,代謝,剥離効果を取り入れたロジステック型方程式で表現し,増殖,代謝に関しては,日射,水温,栄養塩フラックス等の環境要因への依存性を考慮した関数系で定式化した.藻類剥離効果については,サルテーション砂礫の河床礫への衝突の影響をして定式化した.構築されたモデルを用いて,ダム下流部の低撹乱礫床河川の付着藻類動態予測に適用したところ,実河川で見られた付着藻類量の増減を再現出来た.また,平坦河床上での付着藻類の増殖と糸状藻・非糸状藻間の種間競争を考慮に入れた数値解析モデルを開発した.開発されたモデルによって,付着藻類の増殖過程について定量的に再現できること,増殖に伴って非糸状藻から糸状藻を中心とする群落へと種の遷移が生じることを再現できることが示された.河床礫間に網状の巣を作り,礫を固結化して生息する造網型トビケラについて,その河床固結化メカニズムに関する現地観測,実験および数値解析による検討を行った.現地観測では造網型トビケラの個体の成長率について湿潤重量調査より明らかにし,室内実験では生物量と固結強度の関係について引張,せん断強度を測定する装置を作成して計測を行った.観測,実験の結果,造網型トビケラの営巣時間が長くなるにつれて河床の固結強度が強くなることが明らかになった.これら実験的に得られた知見と個体群動態シミュレーションの結果として得られた生物量から,河床材料の固結化の影響を定量的に評価した.河川植物の生態に関する新たな数理モデルを開発するため,植生の繁茂した砂州における水・栄養塩動態に関する現地観測・数値解析を実施した.観測,解析の結果,砂州上の植生の繁茂の有無によって砂州伏流水の動態が大きく異なっていることが明らかになった.また,砂州伏流水の動態を記述する数値解析モデルを構築した.これらの研究の成果より,砂州植生の生息に重要となる水輸送機構を明らかにした.また,砂州上での植生繁茂域の予測に重要となる植生の侵入・定着過程について現地観測より実証的に明らかにした.植生の侵入・定着域は洪水時の冠水域と密接に関連しており,冬季最大出水での冠水域により植生の侵入域が決まり,侵入した植生が年最大出水時に流出しない場合に植生の定着が生じることが示された.河川水中の主な一次生産者である付着藻類の動態について,砂河川を対象として現地観測・数値実験を実施した.現地観測の結果,砂河川においても河床材料の移動が生じない期間には付着藻類の大量繁茂が生じることが確認された.現地観測結果から,砂河床上での藻類繁茂動態を記述する数値計算モデルの開発を行った.モデルでは,河川流の解析から河床材料の移動の有無を判別し,河床材料が移動しない期間については,ロジスティック方程式を用いた藻類の増殖解析を行った.数値解析の結果,解析対象とした河川においては,付着藻類の一次生産量が河川流量の増加とともに低減することが示された.
パピローマウイルス感染におけるDNAワクチン創製の基礎的研究

ヒトパピローマウイルス(HPV)が種々の前癌ならびに癌病変に検出されることから、HPV感染と発癌との関連が多くの注目を集めている。しかし、HPVには種特異性があり、HPVは動物に感染しないことから、HPVについてのin vivoでの感染実験を用いた癌化の証明は不可能である。我々は、dimethyl benzanthracene(DMBA)を用いて6-8週という短期間にハムスターの口腔粘膜に上皮性異形成、扁平上皮癌を誘発できる実験系を確立した。この方法により誘発された上皮性異形成(前癌病変)にパピローマウイルス共通抗原が検出された。そこで我々は、この病変から新しいハムスター口腔パピローマウイルス(HOPV)の分子クローニングを行い、この発癌モデルにおけるHOPVの関与について解析した。HOPVのゲノムのうち、ウイルス粒子の主要構造蛋白をコードする遺伝子L1を培養細胞に発現させ、ウイルス様粒子を産生して免疫用の抗原を作成して、これによりHOPVの免疫を獲得したハムスターでは、発癌処置を加えても発癌に至らなかった。この結果、癌化過程でHOPVが重要な働きをしていることが明らかになりワクチン接種が癌抑制に有用であることが示唆された。本研究では、上記の結果をふまえて、DNAワクチンの創製についての検討を行なった。HOPVのゲノムを培養細胞に発現させ、各主要遺伝子を増幅して発現プラスミドに挿入し、HOPVのnaked pDNAを作成した。これらのHOPVのnaked pDNAを上記の発癌モデルに接種して、その効果を検索したところ、HOPVのゲノムの主要遺伝子、特にE6,E7,L1領域のnaked pDNAを接種したときに癌抑制効果があることが示唆された。ヒトパピローマウイルス(HPV)が、種々の前癌ならびに癌病変に検出されることから、HPV感染と発癌との関連が多くの注目を集めている。そこで本研究では、ハムスター口腔パピローマウイルス(HOPV)の発癌に関与している可能性を探るため、あらかじめハムスターにパピローマウイルスに対する免疫を獲得させた後、発癌実験を行い、前癌病変もしくは癌病変の形成の有無を解析した。この免疫方法としては、クローニングしたHOPVのゲノムのうち、ウイルス粒子の主要構造蛋白をコードする遺伝子Llを培養細胞に発現させ、ウイルス様粒子virus likeparticleを産生し、密度勾配法により精製して免疫用の抗原を作成し、この粒子をハムスターに皮下接種した。実験動物(雄性ゴールデンハムスター)は、対照群と免疫群および非免疫群の3群に分けた。対照群は、無処置とした。非免疫群は、発癌処置のみを行った。免疫群には2回の皮下接種を3週の間をおいて行い、その後発癌処置を行った。発癌処置は、4週間dimethyl benzanthracene(DMBA)を週3回、舌尖に塗布しその後創傷を加え、さらに.DMBA塗布を連続して、13日間行った。各群の動物は、発癌処置後、病理組織学的に検索した。免疫群では、対照群と同様に通常の舌組織を示し、体重増加も認められた。非免疫群では、体重減少と舌組織に前癌病変が認められた。また、発癌の早期(前癌病変)にすでにHOPVが舌上皮細胞に認められ、癌化に関連すると思われる遺伝子E6、E7の発現も観察された。これらの結果より、癌化にHOPVの関与が強く示唆され、特に遺伝子E6、E7が重要であり、この遺伝子によるDNAワクチンの有効性が示唆された。

我々は、dimethyl benzanthracene(DMBA)を用いて6-8週という短期間にハムスターの口腔粘膜に上皮性異形成、扁平上皮癌を誘発できる実験系を確立した。この方法により誘発された上皮性異形成(前癌病変)にパピローマウイルス共通抗原が検出された。そこで我々は、この病変から新しいハムスター口腔パピローマウイルス(HOPV)の分子クローニングを行い、この発癌モデルにおけるHOPVの関与について解析した。HOPVのゲノムのうち、ウイルス粒子の主要構造蛋白をコードする遺伝子L1を培養細胞に発現させ、ウイルス様粒子を産生して免疫用の抗原を作成して、これによりHOPVの免疫を獲得したハムスターでは、発癌処置を加えても発癌に至らなかった。この結果、癌化過程でHOPVが重要な働きをしていることが明らかになりワクチン接種が癌抑制に有用であることが示唆された。本年度では上記の昨年度の結果をふまえてDNAワクチンの創製についての検討を行なった。HOPVのゲノムを培養細胞に発現させ、各主要遺伝子を増幅して発現プラスミドに挿入し、HOPVのnaked pDNAを作成した。これらのHOPVのnaked pDNAを上記の発癌モデルに接種して、その効果を検索したところ、HOPVのゲノムの主要遺伝子、特にE6,E7,L1領域のnaked pDNAを接種したときに癌抑制効果があることが示唆された。
腸管上皮細胞におけるストレス蛋白質の構造と抗原提示機能の解析

食品蛋白質は熱や酸処理などにより変性した形態で摂食され、各種の腸管免疫を誘導する。変性蛋白質が腸管上皮細胞においてどのようにプロセシングされ、抗原提示されるかは不明である。本研究において、申請者は、まず食品蛋白質の代表である卵白アルブミンの熱変性状態の構造を解析した。従来まで、卵白アルブミン溶液を加熱すると会合体を形成するため、加熱変性分子の正確な立体構造の解析は困難とされてきた。この会合体形成は、溶液の蛋白質濃度、pHおよびイオン強度に左右される。低濃度の卵白アルブミン溶液を低イオン強度下で、pH7.5に調節し、80°Cにおいて短時間加熱すると、熱変性しているにもかかわらず単量体で存在する分子を取得することに成功した。熱変性分子の2次構造は未変性分子のそれとほとんど変わらなかったが、芳香族アミノ酸残基近傍の環境は大きく壊されており、分子内部に存在する疎水性領域が露出していることが判明した。また、この熱変性分子は時間経過とともに変性分子と同じ構造に巻戻ることを見い出した。次に、ポリペプチド鎖に結合し、誤った折り畳みや会合が起こらないように蛋白質の機能的立体構造の形成に関与しているストレスタンパク質(熱ショック蛋白質,hsp)を用いて解析した。可逆変性過程の中間体を認識するGroEL(hsp60)が熱変性卵白アルブミンを結合することから、熱変性分子はモルテングロビュール様構造をとっていることを明らかにした。さらに、Hsp70(hsp72,BiP)ファミリーのストレスタンパク質のC末端ペプチド結合ドメインの構造は、そのアミノ酸の1次配列から抗原提示に関与する主要組織適合抗原クラスIのエピトープ結合ドメインに類似していると推定されている。そこで、BiPと相互作用する卵白アルブミン熱変性単量体分子の配列を調べた結果、M末端側22残基のalphaヘリックスを形成するペプチドが結合するという新たな知見を得ることに成功した。
低温・短時間焼結プロセスによる高性能・高信頼性AlNセラミックスの作製法の確立

ホウ素を少量含む低温焼結助剤と通電加圧焼結プロセスである放電プラズマ焼結を併用することで、従来よりも低温・短時間の焼結により緻密かつ微細な組織を持つAlNセラミックスを作製した。さらに、針状のAlN結晶であるAlNウィスカーをAl系融液の直接窒化により合成し、原料粉末へ添加することでAlNセラミックスの組織制御を試みるとともに、緻密化や熱伝導性、機械的強度へのウィスカー添加の影響を明らかにした。今年度はAlNの低温・短時間焼結プロセスを確立させることを目的として、常圧焼結または加圧焼結の一種である放電プラズマ焼結(SPS)で緻密なAlNセラミックスを作製し、焼結収縮挙動や微構造、熱伝導率の評価を行った。放電プラズマ焼結(SPS)では、低温焼結助剤としてこれまで用いてきたY2O3-CaO-B系に加え、より緻密化効果が高いと考えられるY2O3-CaO-LaB6系の助剤を利用し、1500°C以下の焼結での緻密化を目指した。いずれの助剤でも1500°C-10 minの焼結で相対密度98%以上とほぼ完全な緻密化が達成できていたが、焼結収縮挙動の解析によりY2O3-CaO-LaB6系の助剤の方がやや早い段階で緻密化することが明らかとなった。そこで、この助剤を利用してSPSの際の加圧力を2倍にしたところ、1450°C-20 minで完全な緻密化を達成した。得られた焼結体は粒径1 um程度の微細な組織を持ち、熱伝導率は1650°Cで焼結したAlNセラミックスと同等の80 W m-1 K-1であった。SPSでの焼結実験の結果を踏まえ、常圧焼結においてはY2O3とCaOを量を変えずに助剤中のBの添加量のみを変化させ、緻密化への影響を調査した。Bの添加量が00.64 wt%の範囲においては、Bの添加量を増加させるほど緻密化が進み、それに伴って熱伝導率も向上する結果が得られた。上記の研究と並行して、次年度以降に行うAlNセラミックスの柱状組織化の研究で使用する針状AlN種結晶について予備的な合成実験を実施した。Al2O3の炭素還元窒化プロセスでは微細なAlN粉末が得られたが、Al合金のメルトを直接窒化するプロセスを利用することで、所望のアスペクト比が10100以上の針状AlN単結晶を合成できることが明らかとなった。AlNの超低温・短時間焼結化における焼結助剤の検討により、助剤中のB成分の添加方法・添加量を変化させることで緻密化の改善を確認することができている。加圧力を増大させてSPSで焼結するというやや特殊なプロセスによるが、1450°C-20 minの焼結でもほぼ完全な緻密化と従来の低温焼結AlNと同等レベルの熱伝導性も達成できている。一方で、熱伝導率は100以下とAlNセラミックスとしては依然として低い値に留まっているが、次年度以降の組織制御の研究の進展による向上は十分に期待できる。次年度以降のAlNセラミックスの柱状組織化の研究に必要になる針状AlN種結晶の合成については既に予備実験を行っており、Al合金メルトの組成や窒化温度の制御による結晶形態の制御も可能であることを確認している。今年度は針状AlN単結晶の合成実験に本格的に着手するとともに、合成した単結晶を市販のAlNおよび低温焼結助剤と混合して焼結させることでAlNセラミックスの組織制御が可能かどうかを検証した。針状AlN単結晶の合成はAl-Siの2成分系の融液を直接窒化させることで実施した。N2ガスの流量を1 L/minとしてAl:Si=1:3の融液を窒化させた場合、直径が数ミクロンでアスペクト比が20を超えるウィスカー状結晶が得られたが、Alの比率を増やすと直径が100ミクロンを超える太い針状結晶も見られるようになり、形状もランダムに変化する傾向が見られた。さらに、Siを含む融液から合成されたウィスカーの元素分布をSEM-EDSで調査したところ、数at%のSiが含まれていることが確認された。また、N2流量を1/10にするとウィスカーの直径は減少し、収量は大きく増加することが明らかとなった。得られたウィスカーを市販のAlN粉末に対して5vol%程度添加し、さらに低温焼結助剤を添加して放電プラズマ焼結により1650°Cで焼結させ、得られた試料の密度や微構造、さらに熱伝導率の評価を実施した。得られた試料の相対密度は98%以上とほぼ完全に緻密化しており、少なくともこの添加量では緻密化に悪影響を及ぼさないことが確認された。また、試料の微構造観察により、添加したウィスカーはそのままの状態で試料中に分散して存在していることが確認された。試料の熱伝導率はウィスカー無添加の場合とほぼ同レベルの80 W m-1 K-1程度に留まった。ウィスカーの添加量が少ないことや、低温焼結が原因でウィスカーが組織全体の柱状化のための種結晶として働かず、単なる高熱伝導性の粗大粒子としてのみ働いたことが原因として挙げられた。

針状AlN単結晶の合成については、原料のAl:Si比の制御により、結晶のサイズや形態の制御がある程度可能であることが確認されており、N2ガス流量も併せて検討することで、AlNセラミックスの組織制御用の種結晶に適した数ミクロンサイズのものも十分な収量で得られている。ウィスカーを添加した焼結体試料の作製と特性評価については、現在狙っている組織全体の柱状化には至っておらず、熱伝導率の改善も見られていない。しかし、ウィスカー添加が緻密化にほとんど悪影響を及ぼさないことが確認されており、添加量の増加や焼結条件の検討を進めることで熱伝導率の増加は可能である。また、微構造の観察結果から、放電プラズマ焼結の際の加圧によってウィスカーが配向した状態で緻密化していることが示唆されており、最終年度の研究目標にもある熱伝導率や強度の異方性制御につながることが期待される。昨年度までの研究により、AlNウィスカーの合成とAlN焼結体の組織制御への利用に関する基礎が構築されたため、今年度はAlNウィスカーの添加量の検討と焼結体の熱伝導性以外の特性として機械的特性の評価も実施した。Alメルトの直接窒化プロセスで合成したAlNウィスカーを最大で20vol%まで添加し、さらにY2O3-CaO-B系の低温焼結助剤を添加し、常圧焼結または放電プラズマ焼結により緻密化させ、ウィスカーの添加が緻密化に与える影響を調査した。常圧焼結の場合は、ウィスカーを20vol%まで添加すると相対密度が90%以下まで低下したが、放電プラズマ焼結では同じ添加量でも相対密度は98%以上とほぼ完全に緻密化した。研磨面のSEM観察を実施したところ、常圧焼結ではウィスカーの周囲に空隙が多くみられたが、放電プラズマ焼結を利用した場合はウィスカーとAlN粒子が隙間なく強固に接合していた。いずれの場合も添加されたウィスカーは焼結体中にそのまま存在していた。得られた試料の熱伝導率はいずれの試料でも100 W m-1 K-1以下であったが、ウィスカーの添加量を20vol%とすると無添加の場合よりやや高くなる傾向は確認された。機械的特性として常圧焼結体の曲げ強度を測定したところ、無添加の試料では150 MPa程度に留まっていたが、AlNウィスカーを5vol%添加した試料は相対密度がやや低いにも関わらず200 MPaと向上していた。ウィスカー添加試料では破断までのひずみ量が増大しており、その分破断までの応力が増大していることが明らかとなった。ホウ素を少量含む低温焼結助剤と通電加圧焼結プロセスである放電プラズマ焼結を併用することで、従来よりも低温・短時間の焼結により緻密かつ微細な組織を持つAlNセラミックスを作製した。さらに、針状のAlN結晶であるAlNウィスカーをAl系融液の直接窒化により合成し、原料粉末へ添加することでAlNセラミックスの組織制御を試みるとともに、緻密化や熱伝導性、機械的強度へのウィスカー添加の影響を明らかにした。課題であるAlNセラミックスの柱状組織化に利用するAlN針状結晶の合成自体は、予定の炭素還元窒化法ではなく、より簡便なAl系メルトの直接窒化により行うことができている。今後はAlN針状結晶のモルフォロジーの制御を行いながら、当初の予定通り順次AlN-助剤混合粉末に種結晶または高熱伝導核として添加し、焼結実験と評価を進めていく。当初の計画通り、ウィスカーや針状結晶の添加によるAlNセラミックスの組織制御の研究を中心に推進していく。可能な限り低温・短時間焼結で熱伝導率を発揮させるべく、放電プラズマ焼結を駆使した試料の作製を継続しながら、通常の長時間の常圧焼結による試料の作製も並行して実施し、低温焼結と高熱伝導化の両立を目指す。また、試料の基本的な機械的特性として曲げ強度や破壊靭性の評価も進め、高性能・高信頼性AlNセラミックスの開発のための基礎研究を完成させる。無機材料化学作製した試料を加工するため、研究室内に小型の平面研削盤および研磨盤を導入する予定であった。
一酸化窒素によるタンパク修飾のパーキンソン病における役割の検討

家族性のパーキンソン病の原因遺伝子であるParkinがS-ニトロシル化による修飾が孤発性のパーキンソン病の発症に関与していると考え、修飾されているアミノ酸の同定およびその修飾機構の解明を試みたが、修飾されているアミノ酸を同定することはできなかった。一方でParkinの基質であるSynphilin-1がS-ニトロシル化されていることを示し、その安定性を制御していることを見いだした。今後も引き続きParkinの修飾アミノ酸の同定を続けるとともに、Synphilin-1のS-ニトロシル化がパーキンソン病の発症に関与しているかどうかを検討したいと考えている。一酸化窒素(NO)によるタンパク質修飾がパーキンソン病の発症に関連している可能性を検討するため、既に報告されているParkinの修飾されているシステインを同定する。まずSH-SY5Y細胞に家族性パーキンソン病関連遺伝子Parkinを一過性に強制発現させ、その細胞からFLAGタグを用いてParkinを粗精製した。そのサンプルをビオチン置換法によりNOにより修飾されたシステインのチオール基をビオチンに置換した後、ビオチン化されたタンパク質ををストレプトアビジンを使って精製した。そのタンパク質サンプルをMALDI-TOF(ABI 4800 plusを使用)にて解析し、修飾されているシステインの同定を試みた。しかし残念ながらサンプルが少なすぎて、ペプチド断片を検出する事は出来なかった。そのため神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)を強制発現させているHEK293細胞にParkinを強制発現させた細胞株を作成し、同様の実験を行ったがこれもしステンの同定には至っていない。今後はスケールアップなどにより、サンプル量を増やして解析を続ける予定である。一方で既にParkinの基質として報告されている分子に関して、NOによる修飾を受けているか検討したところ、2つの基質に関して修飾を認めた。これらに関しても上述した方法を改良してシステインの同定を行う予定である。そのためnNOSを強制発現させているHEK細胞にこの基質を強制発現させる細胞株を樹立して、発現を確認したところである。家族性パーキンソン病の原因遺伝子の一つとされているParkinが一酸化窒素(NO)による修飾、S-ニトロシル化により修飾を受け、その機能が制御されているという報告を元に、さらに詳細な機構を検討することが本研究の目的であった。まずParkinのシステインの同定を試みた。まず既報においてシステインの同定に至らなかった原因を、精製タンパク質を使って試験管内でS-ニトロシル化反応を行ったため、非特異的な反応が起こったためであると考え、培養細胞内でS-ニトロシル化させ、そのシステインを同定することを試みた。そこで培養細胞から精製したサンプルからS-ニトロシル化されたシステインのチオール基をビオチンに置換したサンプルを試料分析装置により検討したが、この方法ではサンプル量が少なすぎてシステインを同定することはできなかった。またParkinの一部を削ったミュータントを使い、修飾されているシステインを絞り込むことを試みた。すると既報と同様にRING DomainとIBR domainに修飾があることが分かった。現在、さらに詳細にポイントミューテーションを使って検討を進めている。またParkinの基質S-ニトロシル化により修飾されていることを見いだした。現在この知見に関しても解析を進めている最中である。今回申請した研究に関しては、当初考えていたような速度で検討を進めることはできなかった。これは当初予想していたより遙かに複雑にS-ニトロシル化がParkinやParkinの基質などを制御しているからだと考えている。ただParkinのシステイン同定に関しては時間がかかったものの、かなり絞り込まれておりほどなく同定できると考えている。またParkin以外にもパーキンソン病の発症機構に関与するS-ニトロシル化タンパク質が報告されており。今後のこの分野は孤発性の発症機構にますます重要な意味を持ってくると考えられる。
協同的ロタキサン反応場を活用した不斉触媒による特異的物質変換

本研究では、ロタキサン骨格が機械的結合を介してコンポーネント同士が協同的に振舞う事に着目し、これを反応場とすることで酵素のような特性をもつ触媒構築を目指す。まずは触媒部位とロタキサン骨格を複合化したロタキサン触媒を開発し、その反応特性を明らかにし、実験とシミュレーションの双方から動的な反応場の構造効果について明らかにする事を目指す。前年度までに、アシル化触媒としてピリジン型ロタキサン触媒を設計・合成し、その触媒特性の評価と反応中間体の構造について検討した。軸成分にピリジルメチル基を有するクラウンエーテル型ロタキサン触媒の簡便な合成法を確立した。クラウンエーテルには光学活性なビナフチル骨格を導入している。メソ体のヒドロベンゾインの不斉モノベンゾイル化触媒として用いると、輪と軸を別々に触媒として用いた場合よりも反応を効果的に触媒することを明らかにした。この理由について明らかにするため、アシル化剤の塩化ベンゾイルがロタキサン触媒のピリジル基に付加した反応中間体であるアシルピリジニウム塩を単離してNMRによる構造評価を行ったところ、ピリジニウム塩部位には、クラウンエーテルが接近することがわかり、当初の狙い通りに機械結合で動的に結びつけられたコンポーネント同士が協同的に振舞うことで触媒活性が制御されていることを明らかにした。30年度は、ロタキサン骨格をこれまでのもっとも単純な[2]ロタキサンからHandcuff型と呼ばれる[2]ロタキサン構造やロタキサンゲル中で行うことを考え、各々の合成を検討した。本研究では、ロタキサン骨格が機械的結合を介してコンポーネント同士が協同的に振舞うことに着目し,これを反応場とすることで酵素のような特性をもつ触媒構築を目指す。まずは触媒部位とロタキサン骨格を複合化したロタキサン触媒を開発し、その反応特性を明らかにし、実験とシミュレーションの双方から動的な反応場の構造効果について明らかにすることを目指す。初年度は、アシル化触媒としてピリジン型ロタキサン触媒を設計・合成し、その触媒特性の評価と反応中間体の構造について検討した。まず、軸成分上にピリジルメチル基を有するクラウンエーテル型ロタキサン触媒の簡便な合成法を確立した。クラウンエーテルには光学活性なビナフチル骨格を導入し、不斉場として機能するように設計した。次に、これをメソ体のヒドロベンゾインの不斉モノベンゾイル化の触媒として用いたところ、ロタキサン触媒を用いた場合、軸と輪をそれぞれ触媒として加えた場合よりも反応を効果的に触媒することがわかった。この理由について明らかにすべく、アシル化剤の塩化ベンゾイルがロタキサン触媒のピリジル基に付加した反応中間体のアシルピリジニウム塩を単離し,NMRによる構造評価を行った。その結果、反応中間体において反応中心であるアシルピリジニウム塩部位とクラウンエーテルが近接している構造が示唆された。これは機械的結合の運動性を利用して、反応中間体のアシルピリジニウム塩のカチオン電荷にクラウンエーテルが配位し、この効果によりアシルピリジニウム塩の生成が促進されて、触媒的に反応が進行したと考えられる。当初の狙いどおり、機械結合で動的に結びつけられたコンポーネント同士が協同的に振舞うことで触媒活性を制御できる可能性が示された。初年度は、クラウンエーテルを輪成分にもつロタキサン型触媒の設計と合成を中心に研究を進め、ビナフチル基を導入したクラウンエーテルとピリジン部位を触媒とする、ロタキサン型触媒を用いてメソ体のヒドロベンゾインの不斉モノベンゾイル化を検討した。また、ロタキサン型触媒におけるコンポーネント間の協同効果について明らかにすることを目的として、反応中間体であるアシルピリジニウム塩の単離を行った。この時、コンポーネントの部分構造の異なるいくつかのロタキサン型触媒を合成し、これらをアシルピリジニウム塩にした場合に、協同効果に大きく差異が生じるという知見が得られた。一方で、触媒部位の導入方法は合成的に簡便で汎用性の高い方法を確立できたが、触媒の構造によっては立体的な問題により、適切に協同効果を発現できず、極端に触媒活性や不斉反応の場合は不斉選択性が低下することがわかり、触媒中心の構造によっては新たな触媒部位の導入方法やロタキサン骨格の設計について検討する必要があることもわかった。さらに反応条件の最適化には至っていないが、N-メチルイミダゾール型ロタキサン触媒も、Steglich型のエステル転位反応において触媒活性を示すことを見出しており、ロタキサン触媒の候補として継続して精査する。また、本研究ではロタキサンの分子不斉を活用した不斉触媒の設計も計画しており、初年度は分子不斉ロタキサンの合成と効率的な光学分割を指向した速度論分割についても検討を進めた。しかし、光学分割はHPLCに頼らざるを得ない状況であったことから、リサイクル可能な触媒を目指し、並行して高分子担持触媒の合成も行った。本研究では、ロタキサン骨格が機械的結合を介してコンポーネント同士が協同的に振舞うことを活用し、これを反応場や認識場として用いることで、酵素のような特性をもつ触媒構築を目指す。29年度は、分子不斉ロタキサンにおいて、コンポーネントの協同効果を利活用するための分子設計および分子不斉ロタキサンの光学活性体を高効率で得るための速度論的光学分割法について検討した。

非対称構造の輪成分に軸成分が貫通したロタキサンに水酸基を導入し、様々な構造の光学活性なカルボン酸を縮合し、有意なジアステレオマー生成速度差を示す条件について調べたところ、かさ高いカルボン酸を用いた場合に、ジアステレオマー生成速度差が大きくなる結果を得た。また、分子不斉ロタキサンをポリアセチレンの側鎖に導入し、ポリアセチレンのらせん構造を調べた。まず輪成分上にフェニルアセチレン構造を有し、対称な構造の軸成分をもつロタキサンモノマーを合成した。軸の対称中心上に輪成分が存在しない場合は分子不斉を生じる。これを光学分割して得られた光学活性な分子不斉ロタキサンモノマーを既知法により重合し、ポリアセチレンを得た。UV-visスペクトルとCDスペクトルの結果から、ポリアセチレン主鎖に片巻きらせん構造が誘起されており、輪成分と軸成分の相対的な位置関係を大きく変化させても、それぞれポリアセチレンに片巻きらせん構造が誘起されることがわかった。この結果から、分子不斉ロタキサンにおいて、対称性の低い輪成分が対称な軸成分の重心からわずかにずれて存在するだけで、分子不斉が生じ、ポリアセチレン主鎖の片巻きらせん構造を誘起しうるだけの不斉場を形成していることがわかった。本研究では、分子不斉ロタキサンを活用した不斉触媒の設計を計画していたが、分子不斉ロタキサンは不斉合成等が報告されておらず、光学分割法もキラルカラムを用いる方法が主であるため、効率よく分子不斉ロタキサンの光学活性体を得る方法の開発が不可欠であった。そこで29年度は分子不斉ロタキサンの速度論的光学分割について検討した。その結果、ロタキサンのコンポーネント中の水酸基に光学活性なカルボン酸を縮合させてジアステレオマー化する反応において、十分な速度差により一方のエナンチオマーが優先的に反応する速度論的光学分割を達成した。得られたジアステレオマーを単離し、加アルコール分解により光学活性なカルボン酸部位を除去することで、水酸基を有する光学活性な分子不斉ロタキサンを効率よく得ることに成功した。ジアステレオマーの分割にはまだキラルカラムが必要であるものの、ラセミ体に比べて効率よく光学分割可能であることから分子不斉ロタキサンの光学活性体を効率よく得ることが可能になった。本研究では、ロタキサン骨格が機械的結合を介してコンポーネント同士が協同的に振舞う事に着目し、これを反応場とすることで酵素のような特性をもつ触媒構築を目指す。まずは触媒部位とロタキサン骨格を複合化したロタキサン触媒を開発し、その反応特性を明らかにし、実験とシミュレーションの双方から動的な反応場の構造効果について明らかにする事を目指す。前年度までに、アシル化触媒としてピリジン型ロタキサン触媒を設計・合成し、その触媒特性の評価と反応中間体の構造について検討した。軸成分にピリジルメチル基を有するクラウンエーテル型ロタキサン触媒の簡便な合成法を確立した。クラウンエーテルには光学活性なビナフチル骨格を導入している。メソ体のヒドロベンゾインの不斉モノベンゾイル化触媒として用いると、輪と軸を別々に触媒として用いた場合よりも反応を効果的に触媒することを明らかにした。この理由について明らかにするため、アシル化剤の塩化ベンゾイルがロタキサン触媒のピリジル基に付加した反応中間体であるアシルピリジニウム塩を単離してNMRによる構造評価を行ったところ、ピリジニウム塩部位には、クラウンエーテルが接近することがわかり、当初の狙い通りに機械結合で動的に結びつけられたコンポーネント同士が協同的に振舞うことで触媒活性が制御されていることを明らかにした。
乳酸菌の細胞表層タンパク質のプロバイオティクス効果の解明

細胞表層タンパク質(SLP)は、一部細菌の最表層で細胞を包み込むように存在するタンパク質である。乳酸菌ではLactobacillus属の一部菌種がSLPを保持しており、外環境への適応因子であるとともに腸内環境では免疫調節といった宿主の生理作用発現等に関与していると考えられている。しかし、SLPの機能の詳細は不明な現状にある。そこで本研究では、SLPの機能及び乳酸菌の生理作用発現へのSLPの関与解明を目的に、SLP自体の生理作用、特に腸内環境におけるプロバイオティクス効果の解明に向けた研究を実施する。
高識別遺伝マーカーと法数学推計値による混合試料からの新しい情報抽出法の検討

今年度は実験的に混合比を変えた混合資料や微量資料における型判定を行って、関与人数に関するアリルピークの影響について検討を行った。まず、健常人の血液サンプルより抽出した5人分のDNAを等量ずつ混合し、キットに加えるDNA濃度が0.01250.5ng/μlになるように調製した試料を用いて、IdentifilerキットでDNA型判定を行った。判定結果はエレクトロフェログラムのチャートから、アリルのピーク高を読みとり解析した。また、2人のモデルをmajor contributor (MC)とminor contributor (mc)とし、その混合比率を変化させた試料を作製しDNA型判定を行い検討した。その結果、D8S1179など比較的塩基長が短いか、関与するアリルが少ないローカスにおいては、濃度増加に伴いピーク高は増加したのに対し、関与するアリル数が多いローカスにおいては、DNA量を増やしてもピーク高は増加しなくなり、反対に減少する場合も認められた。また、全く同じ試料を用いた複数回の試行でも各アリルピーク高の比率は異なっており、再現性に乏しいものもみられ、関与するアリル数が多いほど顕著になった。混合試料の分析の場合、一般に分析するDNA量が多いほど正確な結果が得られると考えやすい。しかし、今回の検討では、混合試料のDNA量を増加して検査しても、ピーク高が増加するとは限らず、ときには減少する場合が認められたため、試料中に少量しか含まれないアリルを検出しようとしても、十分に検出されるとは限らないことが示唆された。このため、検出された各アリルピークは、その真偽の判定のみにとどめて混合試料のアリルの由来を推定せず、混合試料の関与人数や尤度比計算を行う方が、ピーク高を考慮した場合よりもより現実的で偏った解釈が避けられると考えられた。混合資料からの情報抽出には、まず、(1)その資料は混合資料であるのか、もし、その場合(2)何人の資料が混合しているのか、さらに、(3)被疑者や被害者など当該と思われる人が含まれているのかというおよそ三段階で、分析を進めるのが適切な分析方法であると思われる。今回は、混合資料と判断できるのか、また、何人の資料が混合しているのかなどについて、現在わが国の法医鑑識領域において、標準的に用いられている15ローカスのSTR型を判定するアイデンティファイラー検査において検討した。まず、コンピュータにより日本人アリル頻度にほぼ従うように制御して作成した16万人分の個人STR型を作成した後、このSTR型を2人から8人まで合わせて各2万組作成して、"混合資料"の型として、その資料におけるアリル検出数を分析した。その結果、関与人数が増えれば検出アリル数も増加していく傾向がみられたが、関与人数の増加に対して、検出アリル数の増加する割合は次第に減少し、5人から8人で1ローカスあたりの検出アリル数が10以上のものは少数であり、最大でも8人混合でD13S51で検出アリル数13の1例に留まった。また、2人分から5人分の型を混合して20組の"混合資料の型判定結果"を作成し、2人から8人までの関与人数とした場合の作成可能確率を算出して検討した。検出アリル数から算出した作成可能確率の比較により混合資料における関与人数の推定が可能となったが、検出アリル数が多くなると最大確率が元の関与人数と一致しない割合が増えた。実際の混合資料では、混ざっているDNA量が極端に低いものもあり、アリルドロップアウトが起こったり、他の混合DNAのスタターバンドと判定され、正確な結果の解釈ができなくなることも考えられる。22年度は、実験的に混合比を変えた混合資料や微量資料における型判定を行って、関与人数に関する検討を行っていく予定である。