hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周自然免疫として働くメンブレントラフィック機構の分子基盤解析

歯周病菌Porphyromonas gingivalisが有する顕著な宿主細胞侵入性は、歯周病の進行と慢性化に大いに貢献していると考えられている。本研究ではP.gingivalisが宿主細胞のエンドサイトーシス経路を介して歯肉上皮細胞に侵入し細胞障害を引き起こした後、さらに細胞外へ脱出し他の細胞に再侵入し、歯周感染の拡大を果たしていることを示した。また、本菌の細胞外脱出に、GTPaseであるRab11とRalA、およびExocyst complexの関与が示された。このことより、P.ginigvlaisが宿主細胞のリサイクリング経路を利用し、細胞外へ脱出し更に別細胞へ再感染することで歯周病が進行しているという、新規の歯周病態が示された。本年度は研究計画に沿った進捗が得られ良好な成果を残せた。P. gingivalisの細胞侵入に関与する宿主因子を、本菌の接着・侵入に伴ってラフトに集積してくる分子を同定した。菌感染前後の感染細胞からラフト画分を精製し、まず既知のタンパク質について検証したところ、本菌の受容体であるインテグリン、アクチン制御因子でラフトとの関連が示唆されていてかつ本菌侵入に必要な種々の分子の存在が確認された。さらに、これら分子のノックアウト、ノックダウン変異体あるいは阻害剤を用いて、細菌侵入への関与を検討した。その結果、small-GTPaseのRacl、phosphatidylinositol3-kinase, dynamin、clathrinなどの他、アクチンの再構築やエンドサイトーシスに関わる既知のタンパク質の細菌侵入への関与が示された。現在、これら分子が感染によって非ラフト画分からラフト画分に移行するか否かの検証を行っている。その結果、移行しているタンパク質を確認出来れば、薬剤でラフト破壊し、その移行が起こらない事を確認する。さらに、菌感染により同定されたタンパク質の発現に影響を受けるかをリアルタイムPCR解析システムを用いて確認する。P. gingivalisの細胞内挙動を規定する細胞マシナリーの同定と解析も行った。その結果、細胞内P. gingivalisの包む巨大なオートファゴソームの形成が顕著であり、オートファジー機構が本菌の細胞内挙動に重要な役割を果たしていることが示された。メンブレントラフィックの制御因子であるRabタンパク質が隔離膜同士の融合に関与している可能性を示すデータも得られている。またSNARE等膜融合に関わるタンパク質のどれが菌特異的オートファゴソーム形成に関わるかの網羅的検索も進んでいる。歯周病原因菌として知られるグラム陰性菌Porphyromonas gingivalis(以下P.g.)の主要な病原因子としてGingipain(cystein protease:Kgp及びRgp)、線毛、及びLPSが報告されている。P.g.はエンドサイトーシスを介して細胞内に侵入し、多種多様な細胞機能障害を引き起こす。一方、グラム陰性菌においては宿主細胞に対し病原性因子小胞を放出し様々な毒性を発揮する。P.g.においても上述の病原因子を含む膜小胞を分泌することがすでに報告されている。我々は膜小胞の細胞内侵入がRacl、アクチン、PI3P、脂質、及び膜脂質ドメインであるラフトを利用したエンドサイトーシス機構に依存しており最終的にライソソームまで移行することを明らかにした。さらに膜小胞側因子としてRgpのプロテアーゼ活性が重要であった。興味深いことに、膜小胞は細胞内に侵入した後、エンドソーム内で鉄イオン輸送体を分解し細胞増殖能、及び運動能低下を引き起こす。しかしRgpを欠損させたP.g.由来の膜小胞を処理した細胞ではこれら障害は認められなかったことから、膜小胞はRgp依存的に効率的に細胞内に侵入し鉄イオン輸送体を標的とすることで細胞障害性機能を発揮していると考えられた.これらはP.g.単独ではなくP.g.が分泌する膜小胞との相互作用により歯周組織を障害し歯周病が引き起こされる可能性があることを示した初めての知見である。歯周病菌Porphyromonas gingivalis (Pg)は歯周細胞に侵入する。この細胞内侵入に伴う細胞障害は歯周病の慢性化に関与すると考えられているが,宿主細胞内に侵入したPgの細胞内動態はよく知られていない.本研究では歯肉上皮細胞に侵入後のPgの動態について検討を加えた歯肉上皮細胞内に侵入したPgはまず初期エンドソームのマーカーであるFYVEと共局在を示し,その局在は経時的に減少した.その後,細胞内のPgの約半数がLAMP1(ライソソームマーカー)と共局在を示した.また,同じく感染1時間後,細胞内のPgの約70%はトランスフェリンレセプターと共局在を示し,その局在は経時的に減少した.

このことから,歯肉上皮細胞内に侵入したPgはまず初期エンドソームに存在し,ライソソームで分解を受ける菌がいる一方,エンドサイトーシス経路へとソーティングされる菌がいる可能性が示された,また,エンドソームから細胞膜へのリサイクリングを制御するRabファミリーGTPaseであるRabll,およびアクチン細胞骨格系の再構成を制御するGTPaseであるRalAとPgとの共局在が観察された,RabllとRalAのドミナントネガティブ型(Rabll^<25N>,RalA^<27N>)とPgとの共局在を検討したところ,野生型と比較し,その共局率は減少した.さらに,RabllとRalA遺伝子のRNAiノックダウンにより,細菌の細胞培養液中への脱出の減少と細胞内の生菌数の増加がみられた.さらに,リサイクリング小胞の細胞膜への繋留因子であるエキソシスト複合体の1つであるSec5, Sec6およびExo84遺伝子のRNAiノックダウンを行ったところ,細胞培養液中の生菌数の減少。並びに細胞内の生菌数の増加がみられたこれらの結果より,歯肉上皮細胞に侵入したPgの一部はRabllとRalAが制御するリサイクリング経路ならびにエキソシスト複合体利用して細胞外へ脱出し,さらに近接細胞へ再侵入し,歯周組織の感染拡大を果たしていることが示唆された
芳香環間のカップリング反応を基軸としたエラジタンニン類の合成研究

植物性ポリフェノールの一種であるエラジタンニン類は、その分子がグルコースと没食子酸のみから構成されているにもかかわらず、数百種以上の化合物が知られている。興味深い生物活性を示すものも多く、医薬品資源としての可能性を秘めている。しかし、それらの化学合成研究は進んでおらず、比較的単純な分子の全合成例が知られているのみである。そこで本研究では、没食子酸の芳香環部分のカップリング反応を基軸として、複雑な構造を持つエラジタンニンの合成を行なった。エラジタンニン類は重要な生物活性を示すことが報告されている。しかしその全合成研究は盛んではなく、少数の合成例が報告されているのみである。本研究では、芳香環同士のカップリング反応を鍵として種々のエラジタンニン類の合成法を確立することが目的である。27年度においてはエラジタンニンの重要な部分構造であるvaloneoyl基およびwoodfordinoyl基の合成に力点を置いた。分子間Ullmannカップリング反応とUllmann縮合反応を適切に用いることで、これらの合成を達成した。実際には、最終段階で二箇所のラクトン化が進行し、valoneoic acid dilactoneおよびwoodfordinic acid dilactoneが生成した。これらの化合物はoenothein Cやcornusiin Bなどの複雑なエラジタンニンの構成要素であるため、これらの全合成への道を拓いたと考えている。軸不斉を有するvaloneoyl基の合成はすでに全メチル化体の合成が完了しているが、本課題では全ベンジル体の合成が次のテーマとなっていた。今回、Bringmannのラクトン開環法を利用し、この目的を達成した。この結果を基礎として、今後はrugosin Bやisorugosin Bの全合成を目指す。また、エラジタンニンの合成では、グルコースの水酸基を順次エステル化する工程が必要であるが、グルコースの2位と3位の区別が極めて困難であり、位置選択的なエステル化ができなかった。次年度の研究計画ではこの問題を解決することが最優先の課題となった。本課題では、グルコースの水酸基を順次エステル化する工程が必要である。しかしグルコースの2位と3位の区別が極めて困難なことが判明し、効率よく合成を進めることができなかった。このことが要因となり、研究にやや遅れを生じた。昨年度は、植物性ポリフェノールの一種であるエラジタンニン類の合成に際して、糖部分の水酸基の区別が困難であり、全合成には至らなかった。今年度では、反応条件を精査することにより、グルコースの2位と3位の反応性をある程度制御することができたため研究が大きく進捗した。1)Oenothein Cの合成:すでに、本研究においてvaloneic acid dilactoneの合成が完了していたため、その知見を基にoenothein Cの合成を完了した。すなわち、グルコースの1位にvaloneic acid dilactoneを縮合し、さらに3位に没食子酸を導入することで、標的化合物の合成が完成した。2) Cornisiin Bの合成:Oenothein Cの合成中間体を用いて、グルコースの6位と4位にパラ位を保護した没食子酸誘導体をエステルとして導入し、山田らの手法を用いた分子内酸化的フェノールカップリングを行なった。カップリングの際には、軸不斉部分は完全に立体選択的に制御され、続く脱保護の工程を経て、標的のcornusiin Bが合成できた。3)Coriariin Bの合成:これまでに合成法を確立しているデヒドロジガル酸誘導体ををグルコースの1位に結合させ、2位と3位には没食子酸を、さらに4位と6位には軸不斉を有するヘキサヒドロキシビフェニル(HHDP)基を導入することにより、coriariin Bの全合成を達成した。この際にも山田らの方法を用いて軸不斉部分を構築した。その他、現在rugosin B, isorugosin B, isoschimawalin A,などのエラジタンニン類の合成を進めており、次年度の完成を目指している。また、エラジタンニン類の重要部分構造であるイソデヒドロジガル酸や、ターガロイル酸などの合成についても検討中である。前年度に、グルコース上の複数の水酸基の区別が難しく、計画通りに合成を進めることができなかった。今年度は反応条件を精査することによって、その問題を克服できた。これにより、様々な進展がみられ、計3種類のエラジタンニンの全合成を達成した。それと同時に、これまでに合成がなされていない数種の重要部分構造の合成を行うことができた。これにより、より複雑な構造を有するエラジタンニン類の合成を行うための準備が整ったといえる。このような理由から、本研究課題は、概ね順調に進んでいるといえる。植物性ポリフェノールの一種であるエラジタンニン類および関連分子の合成を行なった。1)Nigricaninの全合成:2004年にRussula nigricansより単離構造決定された本化合物は、エラグ酸の芳香環が部分還元されたユニークな構造を持つ。本化合物の持つ潜在的な対称性に着目して、簡便合成を達成した。すなわち、安価なisovanillinを出発原料として二量化を行ない、その後分子内Cannizzaro反応を用いて分子の非対称化を施した。数工程の官能基変換を経てnigricaninの合成を達成した。2)Isorugosin Bの全合成:Liquidambar formosanaより見出された本化合物は、部分構造として、軸不斉を有するvaloneoyl基を含んでいる。

以前の研究において、全てのフェノール部位をメチル基で保護した化合物の合成を行なった。しかしながら、全部のメチル基を脱保護することは困難であり、今回保護基をベンジル基に変更して合成を試みた。Ullmannカップリング反応と、Ullmann縮合反応を組み合わせることにより、valoneoyl基の合成を行ない、その後Bringmann法によるラクトンの不斉開環により、軸不斉valoneoyl基の調製に成功した。グルコースとの縮合反応と数工程の官能基変換を経て、isorugosin Bの全合成を達成した。植物性ポリフェノールの一種であるエラジタンニン類は、その分子がグルコースと没食子酸のみから構成されているにもかかわらず、数百種以上の化合物が知られている。興味深い生物活性を示すものも多く、医薬品資源としての可能性を秘めている。しかし、それらの化学合成研究は進んでおらず、比較的単純な分子の全合成例が知られているのみである。そこで本研究では、没食子酸の芳香環部分のカップリング反応を基軸として、複雑な構造を持つエラジタンニンの合成を行なった。1)グルコースを出発原料とした場合には、2位と3位の水酸基の区別をつけることができず効率が悪いことが分かったので、別の出発原料からの合成ルートを開拓する。2)デヒドロジガル酸の合成はすでに完了しているので、続いてイソデヒドロジガル酸の合成を行なう。没食子酸を出発原料として、水酸基の位置選択的保護を施し、Ullmann縮合反応を用いればこれらの化合物の合成ができると考える。これを足掛かりとして、nilotinin M3などのエラジタンニン合成を行なう。本研究課題としてはこれまでに3種類のエラジタンニンの全合成が達成できたため、今後はより複雑な構造を持つ者の合成にとりかかる。まずは、全メチル隊の合成を完了しているisorugosin Bとrugosin Bの合成を行なう。これらの分子についてはあと数工程の段階にまで至っているものの、途中工程で再現性が乏しい個所があり改善を要する。この部分の検討を行なった後、全合成に向かう。次に、グルコースの水酸基にvaloneoyl基、galloyl基、およびvaloneoyl acid dilactoneグループがエステル結合したschimawalin Aとisoschimawalin Aの全合成を行なう。すでに、cornusiin Bの合成が完了しているので、途中工程までは同様の経路で誘導可能である。しかし、グルコースの4位と6位に結合させるべきものがvaloneoyl基であることが問題となる。Cornusiin Bの場合は、対称構造のビアリールであったが、scimawalin Aの場合は非対称ビアリールであり、従来法を用いることができない。そのための方策について詳細に検討したい。また、これまでに全合成報告がない、punicalinおよびpunicalaginの合成に挑戦する。前年度において、これら化合物の重要部分構造であるtergalloyl基の合成をラセミ体ではあるが達成した。
ジシラン資源の芳香族化による高度利用のための機能開発

1.1,1,2-トリメチルトリクロロジシラン【1!】のt-ブチルリチウムまたはネオペンチルリチウムによるアルキル化は、位置特異的に1-位に起こるのに対し、フェニルリチウムによるフェニル化は1-フェニル化体と2-フェニル化体を85:15の割合で、また臭化フェニルマグネシウムによるフェニル化は両位置異性体を40:60の割合で与えることがわかった。各異性体を特異的に与えるフェニル化条件を探索した結果CuIを触媒とするグリニャ反応で2-フェニル化体のみがほぼ位置特異的に得られた。しかし、1-フェニル化体の生成については、85%以上の選択性を実現する試みは不成功に終った。2.上で合成した1,2-ジクロロ-1-t-ブチルトリメチルジシラン【2!】および1,2-ジクロロ-1-ネオペンチルトリメチルジシラン【3!】をLi/THF及びNa/トルエンにより縮合すると、いづれのジシランもLi試剤では低分子量シクロポリシランを、Na試剤では高分子量ポリシランを与えた。また、この場合、低分子量シクロポリシランはシクロペンタシランおよびシクロヘキサシランの混合物であることが、元素分析その他の手法による生成物の構造解析により明らかとなった。一方、【1!】のPhLiによるフェニル化を合成スケールで行なって得た生成物は1,2-ジクロロ-1-フェニルトリメチルジシラン【4!】と1,1-ジクロロ-2-フェニルトリメチルジシラン【5!】の71:29の混合物であったが、これをNaで縮合してポリマーAを、【1!】のCuI接触グリニャ反応で得た【5!】(99%Pure)を同様にしてポリマーBを調製した。これらをWestのポリシラスチレン標準試料Cと共にGPCで数平均分子量を比較測定し、AおよびBのMnとして75×【10^4】および50×【10^4】という値を得た。ただし、これらの値はポリマーCを基準とするものであって、ポリスチレン基準とする値はそれぞれ0.13×【10^4】および0.09×【10^4】であり、正確な分子量は未確定である。今後はこれらの物性評価をより精密に行う予定である。
化学発がん過程におけるCーmyc遺伝子活性化の関与

1.ラット肝がん細胞におけるがん遺伝子等の発現調節.Reuber肝がん細胞をインスリン,ConA,あるいはTPAで処理したところ,処理後約2時間目にcーmyc mRNAの上昇が見られた.また, ,デキサメタゾン,シクロヘキシミドはこの上昇を抑制した.この事実は肝がん細胞においても, cーmyc遺伝子発現調節機構が残存していることを示唆する.2.cーmyc遺伝子の構造と発現の相関.ラットcーmyc遺伝子の第3エクソン3末端付近に,同mRNAの半減期を短くするのに必要な配列が存在するとを示した.3.分化におけるcーmycの関与.メタロチオネインプロモーターにcーmyc遺伝子につないだプラスミドを,プロトプラスト融合法によりマウス赤白血病細胞に導入し, Znーイオンによってcーmycを発現させたところ, DMSOによる分化誘導が阻害された.4.ニワトリcーfos遺伝子の構造とその機能領域.上記遺伝子をクローニングしそのヌクレオチド配列を決定した.その結果血清,cAMP,PDGFに反応するエンハンサー領域が推定された.さらに, invitro mutagenesisにより,トランスフォーム能に必須の領域が推定された.5.アデノウイルスE4遺伝子の発現調節機構.E4遺伝子上流-39-177の領域に, E1Aによる転写促進に必要な領域が存在することを明らかにした.6.ネコ白血病におけるcーmyc遺伝子の関与.自然発生のFeLV陽性ネコ白血病, 7例中2例に, Cーmyc上流へのFeLVの挿入,その他の,同遺伝子の構造変化を見出した.1.ラット肝がん細胞におけるがん遺伝子等の発現調節.Reuber肝がん細胞をインスリン,ConA,あるいはTPAで処理したところ,処理後約2時間目にcーmyc mRNAの上昇が見られた.また, ,デキサメタゾン,シクロヘキシミドはこの上昇を抑制した.この事実は肝がん細胞においても, cーmyc遺伝子発現調節機構が残存していることを示唆する.2.cーmyc遺伝子の構造と発現の相関.ラットcーmyc遺伝子の第3エクソン3末端付近に,同mRNAの半減期を短くするのに必要な配列が存在するとを示した.3.分化におけるcーmycの関与.メタロチオネインプロモーターにcーmyc遺伝子につないだプラスミドを,プロトプラスト融合法によりマウス赤白血病細胞に導入し, Znーイオンによってcーmycを発現させたところ, DMSOによる分化誘導が阻害された.4.ニワトリcーfos遺伝子の構造とその機能領域.上記遺伝子をクローニングしそのヌクレオチド配列を決定した.その結果血清,cAMP,PDGFに反応するエンハンサー領域が推定された.さらに, invitro mutagenesisにより,トランスフォーム能に必須の領域が推定された.5.アデノウイルスE4遺伝子の発現調節機構.E4遺伝子上流-39-177の領域に, E1Aによる転写促進に必要な領域が存在することを明らかにした.6.ネコ白血病におけるcーmyc遺伝子の関与.自然発生のFeLV陽性ネコ白血病, 7例中2例に, Cーmyc上流へのFeLVの挿入,その他の,同遺伝子の構造変化を見出した.
英学資料のテキストデータ化に関する研究

本年度は、昨年度対象資料として選定した『春秋雑誌会話篇』(英学資料『Kuaiwa Hen』(明治6年刊)の国字テキスト)に対して、データの作成とタグ(メタデータ:コーパスなどの大規模データの検索等に参照され得るデータ)の入力を行った。作業は、作業協力者とともにテキストデータに対して、どのタグをどのようにつけていくのかという検討・調整を行いつつ進めた。実際に作業してみると、想定していない問題もままみられ、データ化の難しさを知ることとなった。特に後半のルビ付きの漢字仮名交りテキストはルビや送り仮名を中心に、自由度の高い表記(当時としては当然の表記と考えられる)がみられることから、その処理について苦慮することも多かった。そこで、データ整備、タグ付けの検討・試作に際しては、国立国語研究所の近藤明日子氏に協力を依頼し、国立国語研究所で公開されている日本語歴史コーパスにおけるタグ付けの詳細を学びつつ、作業ツールに関する情報提供や指導をいただく機会を得た。年度末には一通りのタグ付けを終えたものの、なお不明の点や、不統一の面が残っており、今後の調整が残る状況である。上記の作業と並行し、英学資料や対象資料を日本語史の研究資料として活用する方法についても考察を行い、その成果の一つとして「幕末明治期における日英対訳会話書の日本語ー数量の多さを表す句との対応からー」(『日本語の研究』第14巻2号)を公表した。データ入力・点検、タグ入力・点検を行った。主なタグ入力については第一次入力は終了したが、今後、最終的な段階にまとめるまでには、タグ等についてなお調整の必要が残っている状態である。ほぼ第二年度の計画通りに進めることができた。本年度は『Kuaiwa Hen』の国字データの完成と年度末の公開を目標として作業を進める予定である。広く活用できるデータの公表に向けて、作業協力者の確保、作業指導、作業点検など、調整をしつつ進めていきたい。また、併行して、資料に関する日本語研究を行い、今後、本研究の成果を応用しうる資料についても見通しをつけていきたい。本年度は、英学資料のデータ化に関して資料の選定を行い、試作データの作成に着手した。データ試作の対象としては明治6年刊『Kuaiwa Hen』を選定した。その理由は、話しことばの収録された資料であること、ローマ字和文、国字和文の揃った資料であることに注目したためであった。具体的な作業に関しては、作業協力者1名とともに版本からの翻字作業を含めて、第一次のデータ入力・点検を終了した。また、今後のデータへのタグ付け等の検討・調整に向けて、国立国語研究所でコーパス作成についての聞き取りと現状の視察を行った。さらに、データ化の作業と並行して、英学資料・対象資料の特徴を生かしながらデータ化を進めるための課題について検討を行い、2件の口頭発表の機会を得た(「英学資料の可能性ー会話書を中心にー」通時コーパスの構築と日本語史研究の新展開コーパス活用班近世・近代グループ・文体・資料性グループ合同研究会2017年8月20日、「英学資料とコーパスー『会話篇』の試みー」通時コーパスシンポジウム20182018年3月10日)。データ入力・点検、タグ入力などには当初の予定よりは時間を要しているが、現在のところ、ほぼ初年度の計画通りに進行している。スムーズな計画遂行のために、作業指導・作業点検などに、さらに時間が必要であることが判明したため、作業協力者の確保を含めて、作業計画の微調整を行う予定である。また、今後、より着実に、汎用性の高い作業を進めるために、コーパスのタグ付けに関する情報提供を国立国語研究所に依頼し、他の資料と互換性のあるデータ化を視野に入れた作業計画を検討していく予定である。

広く活用できるデータの公表に向けて、作業協力者の確保、作業指導、作業点検など、調整をしつつ進めていきたい。また、併行して、資料に関する日本語研究を行い、今後、本研究の成果を応用しうる資料についても見通しをつけていきたい。作業協力者の作業時間が当初の予定より少なくなり、差額が生じた。2018年度は作業協力者を複数配置することで、作業時間を確保する予定である。当初の予定していた作業協力者が、途中から作業できなくなったことと、その後の協力者の確保が十分にとれなかったことが理由の一つとしてあげられる。また、外部大学への図書閲覧の出張を予定していたが、こちらも日程等の調整がつかず、実施できなかったことがその理由であると考えられる。作業進行とも大いに関係のあるところなので作業協力者の確保と出張計画を早めに対応していきたいと考えている。
魚類の精子を用いた遺伝資源の保存と個体再生に関する研究

本年度は、初年度に開発した技術の応用と個体の解析に主眼をおいて研究を行った。凍結保存精子からの個体再生実験では、ドジョウ凍結精子と通常卵との受精からは孵化仔魚を得ることができたが、凍結精子を用いた人為雄性発生では生存性の孵化仔魚を得ることができず、精子ゲノムのみでの個体再生には至らなかった。しかしながら、ドジョウ精子の凍結保存方法を他のドジョウ属魚類(カラドジョウ、フクドジョウ、エゾホトケドジョウ)へ応用したところ、本実験で用いたドジョウ属魚類の凍結精子は解凍後にも運動性を示したことから、本研究で開発した凍結保存方法が広範囲のドジョウ属魚類に応用可能であることが示された。二倍性精子に関しては、まず、初年度に作製した新四倍体系統が産する二倍性精子に由来する雄性発生個体の雄の妊性を確認した。これらの成熟した個体からは受精能を有する半数性精子が産出され、正常個体が生じたことから、新四倍体系統の産する二倍性精子は再生産可能な二倍体個体を作出できることが明らかとなった。次に、本年度ではポリエチレングリコール溶液(PEG)と高カルシウム溶液(高Ca)を用いた化学処理を施し、通常二倍体が産する半数性精子の接着・融合による倍加法を検討した。核とミトコンドリアを蛍光染色した精子の形態観察では、処理群においてのみ接着・融合している精子が観察された。また、各化学処理を比較したところ、PEG処理では僅かに接着・融合精子が見受けられるものの、PEG濃度の増加とともに精子の運動性が顕著に低下し、多数の精子凝集塊が生じた。一方、高Ca処理では、精子の運動性は濃度や処理時間によって大きな影響は受けず、PEG処理よりも多数の接着・融合精子が生じた。このことから、高Ca処理は精子の接着・融合に有効な処理方法であると考えられた。本研究は初年度において、魚類精子の凍結保存技術の確立、二倍性精子の作出、顕微授精技術の高度化という観点からドジョウ属を材料に研究を行った。精子凍結保存技術に関しては、ドジョウに特徴的な少量の精液でも凍結保存が可能となるように、凍結保存容器と装置を開発した。また、凍結保存に最適な冷却速度(37.5°C/min)、精子希釈液(63.5mM NaCl,114mM KCl,20mM Tris)、凍害防御剤ならびにその濃度(内部凍害防御剤:10%メタノール、外部凍害防御剤:BSA 1%もしくはglycine 0.5%)を決定した。本研究で開発した方法は絶滅が危倶されるドジョウ属魚類に応用が可能である。二倍性精子の作出に関しては、自然四倍体由来の二倍性精子と通常二倍体由来の半数性卵との受精後、第二極体放出阻止によって作出した新四倍体系統から二倍性の精液を大量に得ることができた。さらに、人為雄性発生法によって二倍性精子ゲノムのみで遺伝情報が構成される正常な二倍体個体を作出することができた。このことは、本研究で誘起した新四倍体系統由来の二倍性精子のゲノムのみで個体の再生が可能であることを示している。魚類の顕微授精技術の高度化に関してはまず、精子の蛍光色素による可視化を行った。その結果、Hoechst 33342によって精子が可視化できることが分かった。しかし、一部の死んだ精子においてのみ強い蛍光が観察され、生細胞の均一な染色は困難であった。一方、ミトコンドリアを特異的に染色できるMito-trackerでは全ての精子で均一な染色が可能であり、蛍光色素による精子の可視化に適していた。顕微注入法については卵膜除去卵、未受精卵、賦活化卵について検討し、ピエゾマイクロマニピュレーターシステムを用いることによって卵膜除去卵と賦活化卵に容易に顕微注入することが可能となった。

一方、高Ca処理では、精子の運動性は濃度や処理時間によって大きな影響は受けず、PEG処理よりも多数の接着・融合精子が生じた。このことから、高Ca処理は精子の接着・融合に有効な処理方法であると考えられた。
採卵・顕微注入・移植を要しない、新しい遺伝子改変マウス作製法の開発と応用

従来のゲノム編集マウス作製法では、(1)受精卵の回収、(2)CRISPR関連試薬の顕微注入、(3)注入卵の偽妊娠マウスへの移植、という熟練した技術と高価な設備を要する3つのステップが必須であった。今回、受精卵を有する妊娠メス卵管へのCRISPR関連試薬の注入、続く卵管全体へのin vivo電気穿孔を行うことで、上述した3つのステップ全てを省いてゲノム編集マウスが作製できる新手法「GONAD」の開発とその応用を進めた。前年度までに、妊娠雌マウスの卵管にRNAを注入し、エレクトロポレーション処理する(GONAD法)ことにより、卵管内に存在する2細胞期胚にRNAを導入してゲノム編集を行うことが可能であることを示した。しかしながら、この時点では着床前胚の結果のみしか得られていなかったため、平成27年度は本手法にてゲノム編集着床後胚、およびマウス個体を得ることを目指した。また、最適条件の検討と標準プロトコル作成も進めた。まず、2細胞期胚である1.5日胚の受精卵(交配しプラグが確認された次の日)を含む卵管にCas9とsgRNA(eGFPに対するもの)をRNAとして導入し、エレクトロポレーションを施した。これは0.5日胚の受精卵は卵丘細胞に覆われており、核酸が受精卵に到達するための物理的障害となるためである。着床後胚(13.519.5日)で解析したところ、57個体回収した胚のうち14個体(25%)で遺伝子が破壊されていることを確認した。しかしながら、2細胞期胚での導入はモザイク率が高くなると考えられる。そこで次に、卵丘細胞との接着が緩んできていると考えられる0.7日胚の受精卵に対してGONAD法を施した。この際に、白内障の原因遺伝子と考えられるFoxe3遺伝子に対するsgRNAを用いた。8個体の妊娠マウスに対して実施したところ、計36個体の仔を出産し、そのうち10個体(28%)に変異が導入されていることを確認した。これは、実用性としても十分な効率である。さらに0.7日胚で処理することは(i)卵管内の受精卵の存在位置が限局されている(核酸溶液の注入が容易になる)、(ii) 0.7日胚は後期1細胞期胚であると考えられ、2細胞期胚である1.5日胚にGONAD処理を施す場合と比較してゲノム編集のモザイク率が低いことが期待される、と言った利点を有すると考えられる。平成27年度は、GONAD法に関してこれまでの結果を論文化(Takahashi et al. Sci Rep 2015)するなど、複数の業績に繋げることができた。化学工業日報や科学新聞等にプレスリリースをしただけでなく、Nature Japanサイトでも「注目の論文」として取り上げられる(https://www.natureasia.com/ja-jp/srep/abstracts/ 66946)などの反響が大きいものであった。また、本研究を実行した高橋氏は北海道実験動物研究会で口頭発表を行い、若手優秀賞を受賞した。さらに、本手法のプロトコル論文も発表した(Gurumurthy et al. Curr Protoc Hum Genet 2016)。以上より、当初の予定よりも早く成果を上げることができたと言える。一方で、DNAベクター(piggyBacも含め)を導入してGONADを行う実験はまだ実施しておらず、その点では一部遅れている実験もある。以上のことから、概ね順調に進展しているという評価とした。2016年度は、白内障モデルの開発に成功しただけでなく、GONAD法の改良に多くの時間を割き、以下の結果を得た。最近、mRNAではなくタンパク質のCas9を用いて、より効率よくゲノム編集を行える報告がある。そこで今回、Cas9タンパク質とcrRNA/tracrRNAを用いてGONAD法によるゲノム編集が可能かを調べた。その結果、Cas9タンパク質とcrRNA/tracrRNAのRNPを用いたGONADが可能であること、また極めて高効率で変異マウスが得られることが示された。上記結果から、RNPを用いればノックインも可能であるのではないかと考え、その検証実験を行った。ICRマウスのチロシナーゼ遺伝子の変異領域にgRNA標的配列を設計し、野生型配列を有するssODNを導入することによるレスキュー実験を進めた。その結果、おおよそ50%もの高効率で、GONAD法でのssODNのノックインが可能であることがわかった。また、チロシナーゼ遺伝子レスキューについては、GONAD法が顕微注入法よりも効率が良い結果が得られた。ここまでの実験は古いBTXのエレクトロポレーター機器を用いて行ったものである。本実験系の汎用性の高めるためには、誰でも入手可能な機器を用いる必要がある。そこで、最新型のエレクトロポレーターの一つであるNEPA21を用いてGONADによるゲノム編集マウス作製の可能性を検討した。最終的に、NEPA21でもBTX T820と同程度の効率でのGONADが可能であることが示された。ゲノム編集法を用いると、大きなDNA領域の欠損作製を受精卵で行うことが可能である。そこで、本研究では、GONAD法でも欠失を作製できるか否かを検討した。B6マウスのアグーチ遺伝子のイントロンに存在するretrotransposon配列を欠損の標的として実験を行った結果、GONAD法を用いて欠失個体を作製できることが示された。

当初予定していたpiggyBacの導入実験は行わなかったが、実際にGONAD法を行う上で極めて重要な実用性の部分で大きな進展(ゲノム編集効率に関して大幅な改善を行うことに成功)があったこと、以下の実績をあげることができたことから、計画以上に進展しているという評価とした。GONAD法は新しいゲノム編集動物作製法として国内外から注目を浴びており、実際に実験手技を見学したいとの依頼を多数受けて実施している。2016年度は分子生物学会シンポジウムでの講演、SKIP×幹細胞若手の会Symposium 2016での講演依頼、先端モデル動物支援・若手技術講習会でのベストトーク賞受賞などを受けている。また、海外の雑誌Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN)で紹介されるなどした。2017年度は、GONAD法のさらなる改良と応用性の拡張を進めた。得られた結果は以下のとおりである。前年度までに、Cas9はmRNAではなくタンパク質を用いた方がゲノム編集効率が良い結果を得ていたが(i-GONAD法と命名)、今回はCas9だけでなくCpf1タンパク質を用いたゲノム編集にも挑戦した。標的遺伝子はチロシナーゼ(Tyr)とHprtである。その結果、両遺伝子座ともに高効率でゲノム編集が可能であることがわかった。我々はこれまでに、長い1本鎖DNAをドナーとして用いることで高効率にノックインマウスを作製することが可能なEasi-CRISPR法を独自に開発したが、これがi-GONAD法に応用できれば同手法の汎用性の向上につながる。そこで、i-GONAD法に使用するために大量のssDNAをivTRT法で調製し、内在性遺伝子座位へのレポーター遺伝子の挿入を目指した。その結果、Pitx3座位で15%(5/34)、Tis21座位で7%(1/14)の効率でノックインに成功した。これらの正確なノックイン個体外にも、不正確に配列が挿入されている個体や標的領域にindelが生じている個体も確認され、それらを統合すると、Pitx3座位で62%(21/34)、Tis21座位で36%(5/14)がゲノム編集個体であった。本実験結果により、i-GONADを用いてノックインマウスが作製可能であることが示された。さらに、国内(東海大)で4回のデモンストレーションを実施し、他大学/研究所の14研究室から来られた計21人の学生、研究者、技術職員に向けて講習を行った。また、海外でのワークショップは2回(ドイツ、アメリカ)で実施し、30以上の大学、研究所、企業から参加した多数の参加者に向けた講習を行った。従来のゲノム編集マウス作製法では、(1)受精卵の回収、(2)CRISPR関連試薬の顕微注入、(3)注入卵の偽妊娠マウスへの移植、という熟練した技術と高価な設備を要する3つのステップが必須であった。今回、受精卵を有する妊娠メス卵管へのCRISPR関連試薬の注入、続く卵管全体へのin vivo電気穿孔を行うことで、上述した3つのステップ全てを省いてゲノム編集マウスが作製できる新手法「GONAD」の開発とその応用を進めた。
受容体型チロシンキナーゼROR1のB細胞腫瘍における機能解析

慢性リンパ性白血病(CLL)患者に対し、自己の白血病細胞に、生体外でアデノウイルスベクターを用いてCD154遺伝子を導入し、生体内に注入するという遺伝子免疫療法がカリフォルニア大学サンディエゴ校にて施行された。この患者6人の治療後の血清について検討すると、治療前には明らかでなかったアデノウイルスに対する抗体産生が5人に、白血病細胞表面分子に対する抗体産生が、3人に認められた。詳細な検討により、この抗体の中に、受容体型チロシンキナーゼであるROR1に対する抗体が含まれていることが明らかとなった。ROR1に対する抗体を作製して検討したところ、ROR1は健常人の末梢血細胞中にはその発現は認められず、CLL細胞に特異的に発現することが確認された。ROR1には細胞外領域にWntファミリーメンバーと結合しうるCRD領域が存在するが、293細胞を用いて、各種レポーター遺伝子を導入することにより、ROR1と非典型的WntファミリーのWnt5aを共遺伝子導入するとNF-κBの活性化が起こることが明らかとなった。Recombinant蛋白を用いてROR1とWnt5aの結合はin vitroにおいて確認された。このWnt5aとROR1の結合はCLL細胞のin vitroにおける生存率を増加させる事が明らかとなった。この生存率増加は治療後の患者血清を添加すると抑えられ、患者体内でROR1のブロッキング抗体が産生されたことにより、治療効果が得られたと考えられた。ROR1遺伝子の機能解析のため,tet-onシステムを用いて、ROR1蛋白の発現が誘導されるIL-3依存細胞株を樹立した。この細胞株においては、ドキシサイクリン添加により16時間後には強いROR1蛋白の発現が誘導される事が確かめられた。これを用いてROR1の発現誘導による細胞増殖,細胞死について検討した。IL-3が十分に存在する培養下においては、その増殖にROR1の発現は影響を与えなかった。しかしながら、この細胞株をIL-3低濃度条件にして培養すると,IL-3飢餓に伴う細胞死がもたらされるが、ROR1の発現誘導した上でIL-3低濃度下で培養すると,この細胞死が抑制されることが明らかとなった。この細胞死抑制作用が,腫瘍化に寄与している可能性がある。現在この分子学的機序につき検討中である。さらにROR1からのシグナル伝達経路の解明のため、EGF受容体の細胞外ドメインと、ROR1細胞内ドメインを組み合わせたキメラ遺伝子を作成した。この受容体はEGFと結合し、チロシンキナーゼドメインを含むROR1活性化を導く事が期待される。遺伝子導入により定常的にこの遺伝子を発現する細胞株を樹立した。発現はフローサイトメトリー及び、免疫沈降法で確認した。この細胞抹を用い、EGF添加による細胞内分子の活性化を解析中である。また、in vivoにおける機能解析のため、ROR1cDNAをIgエンハンサー、プロモーターの調節下に組み込んだ遺伝子を構築し、これをマウス受精卵にインジェクションする事によって、ROR1蛋白をB細胞に発現するトランスジェニックマウスの作成を行った。現在まで、7匹のマウスにおいて、ROR1遺伝子の挿入が確認されており、それぞれのラインが確立されつっある。ROR1の発現、リンパ球分化における影響、免疫反応における影響を検索予定である。慢性リンパ性白血病(CLL)患者に対し、自己の白血病細胞に、生体外でアデノウイルスベクターを用いてCD154遺伝子を導入レ生体内に注入するという遺伝子免疫療法がカリフォルニア大学サンディエゴ校にて施行された。詳細な検討により、この抗体の中に、受容体型チロシンキナーゼであるRORIに対する抗体が含まれていることが明らかとなった。

ROR1には細胞外領域にWntファミリーメンバーと結合しうるCRD領域が存在するが、293細胞を用いて、各種レポーター遺伝子を導入することにより、ROR1と非典型的WntファミリーのWnt5aを共遺伝子導入するとNF-κBの活性化が起こることが明らかとなった。Recombinant蛋白を用いてROR1とWnt5aの結合はin vitroにおいて確認された。このWnt5aとROR1の結合はCLL細胞のin vitroにおける生存率を増加させる事が明らかとなった。この生存率増加は治療後の患者血清を添加すると抑えられ、患者体内でROR1のブロッキング抗体が産生されたことにより、治療効果が得られたと考えられた。
投資家の私的情報獲得と企業の情報開示戦略に関する理論的実証的研究

本研究は、投資家が私的情報をあらかじめ保有している状況において、会計情報の精度が価格の報知性、流動性、ボラティリティといった市場のマイクロストラクチュアに及ぼす影響を検討している。より精度の高い会計情報の公表は、価格の報知性や流動性を高め、ボラティリティを低下させる。地方、私的情報の精度が高いほど、価格の報知性やボラティリティが高くなり、流動性が減少する。この研究で示したノイズ付合理的期待モデルは、会計情報の公表と株価や取引量に関する実証研究に理論的な基礎を提供している。将来収益の高い投資案を持つ企業は、開示コストを負担しても、精度の高い会計情報を自発的に供給する供給するインセンティヴをもつ。私的情報を保有するインサイダーは、流動性の高い株式やノイズ・トレーダーの取引が活発な株式を選好する。また、私的情報が会計情報よりも十分に精緻ならば、インサイダーは精度の高い会計情報を公表する企業の株式を取引しようとする。しかし、会計情報が私的情報より十分に精緻ならば、インサイダーはできる限り精度の低い会計情報を公表する企業の株式を選好する。15EA03:会計規則は、最低水準の情報精度とみなすことができる。一国市場では、会計規則の強化は既存の株主の期待利益を減少させる。統合化されたグローバル市場において、国際会計基準は、ミニマム・スタンダードとして機能する。そこでは、一国市場の場合と同様に、国際会計基準の強化も既存の株主の期待利益を減少させる。より現実的には、完全に統合されていない分断化された市場を前提とすることが必要である。分断化された市場で、グローバルな国際会計基準が投資家に及ぼす影響については、残された課題である。
ニホンナシの自家不和合性を制御する花粉側S遺伝子の同定と自他認識機構の解明

ナシやリンゴの自家不和合性は、自家結実を阻害するので果樹生産上問題となっており、その分子機構を解明することは、植物の生殖機構を理解し、結実管理へ応用する上で重要である。ニホンナシの自家不和合性は、雌しべ側S遺伝子と花粉側S遺伝子の組であるSハプロタイプに制御される。雌しべ側S遺伝子としてS-RNaseが同定されているが、花粉側S遺伝子はまだ同定されていない。これまでに、雌しべ側の自家和合性変異体'おさ二十世紀'(S2S4sm)由来のS4smハプロタイプの解析から、花粉側S4遺伝子はS4-RNaseの上流48kb以上あるいは下流188kb以上離れた位置に存在することを明らかにしている。花粉側S4遺伝子を同定するため、S4-RNase周辺のBACコンティグを構築し、欠失領域外の塩基配列を解析したところ、S-RNase型の自家不和合性を示す他の植物の花粉側S遺伝子(SLF/SFB)と相同性を示す5つのF-boxタンパク質遺伝子が見出された。これらはいずれも花粉で特異的に発現していたことから、ニホンナシの花粉側S遺伝子の有力な候補と考えられた。また、5つのF-boxタンパク質遺伝子からSハプロタイプ間で多型を持つ花粉側S遺伝子を絞り込むため、'長十郎'からBACライブラリーを作製し、S2-RNaseの上流255kbから下流275kb以上、S3-RNaseの上流214kbから下流297kb以上をカバーするBACコンティグを構築した。ニホンナシの自家和合性変異体`おさ二十世紀'に由来するS4smハプロタイプは、S4ハプロタイプから雌しべ側S遺伝子S4-RNaseを含む領域を欠失しているが、花粉側S遺伝子は欠失していない。欠失領域を特定することで、欠失領域外に存在する未同定の花粉側S遺伝子を効率的に探索できる。これまでに、欠失はおよそ250kbに及ぶことを明らかにしている。欠失の正確な大きさを決定するため、欠失領域をカバーする4つのBACクローンをサブクローニングし、欠失領域の全塩基配列を決定した。その結果、欠失は236kbに及び、花粉側S遺伝子はS4-RNaseから上流48kb以上あるいは下流188kb以上離れた位置に存在することが判明した。欠失領域からは、S4-RNaseの他に15個の(レトロ)トランスポゾンと1個のF-box遺伝子が予測された。このF-box遺伝子は花粉で特異的に発現していたが、欠失領域に存在するので花粉側S遺伝子ではないと考えられた。花粉側S遺伝子を探索するため、欠失領域外の塩基配列を解析した。新たに見つかった1つのF-box遺伝子は、他のS-RNase型自家不和合性植物の花粉側S遺伝子SLF/SFBと相同性を示し、花粉で特異的に発現していたことから、ニホンナシの花粉側S遺伝子の有力な候補である。現在、Sハプロタイプ間の構造比較に向けて、`長十郎'のBACライブラリーからS2-RNase周辺のコンティグを構築している。一方、自家和合性品種の育種に有用なS4smハプロタイプ特異的マーカーを開発するため、欠失領域を挟むプライマーセット`SM-F'と`SM-R'を設計した。このプライマーセットを用いたPCRにより増幅される666bpの断片はS4smハプロタイプに特異的であり、このマーカーを使って実際に`おさ二十世紀'の雑種後代から自家和合性個体を選抜することができた。
臨床会計学構想の具体化に向けた経験的研究

管理会計という実務との相互作用が無視できない重要性をもつ学問において,実務実践と理論研究との相互発展を可能とする知のあり方を「臨床会計学」として構想し,帰納的に臨床会計学的知見を蓄積するととともに、その具体化を進めるための社会的仕組みを提案し、研究主体の学問的世界の基本構造を作りかえていくという高次の再帰性を織り込んだアクションリサーチ・プログラムを実施した。臨床会計学構築に向けたメゾレベルの社会的仕組みを、「研究に基づいた教育」「教育に裏付けられた実務」「実務に基づいた研究」の善循環として実現すべく、教育制度・資格制度・会員制度のそれぞれについて具体化をはかった。本研究プロジェクトは,次の15を反復的に実施することで、臨床会計学構想を具体化するための知見を得ることを目指している。1実践的な知識と理論的な知識の相互作用に関する管理会計先行研究の検討,2臨床的な知識の発展に関する管理会計および関連分野における先行研究の検討,3管理会計の専門職業化が進んでいる諸外国における「臨床会計学」的な知識の蓄積・体系化に関する調査,4管理会計知識を専門家として活用している実務家(管理会計専門家)に対する調査、5実務家とのワークショップなどを通じた研究。平成28年度は、計画に沿って15を実施し、とくに4について、中小企業に管理会計専門家として経営アドバイスを行っている実務家に対する聞き取り調査とサーベイ調査に基づき、日本の中小企業における管理会計実践の経済的価値に関する分析を行った。本調査では、基本的な管理会計能力として,「業績評価システムを利用して経営のPDCAをまわす能力」を聞き取り調査から同定し、この意味での管理会計能力を測定するための尺度を開発し、パイロットテストを行ったうえで利用した。本調査では、管理会計専門家の協力を得ることで、専門家による中小企業の管理会計能力についての認識(expert perceptions)と現実のハードな財務データを収集し、分析に利用した。調査データを分析した結果、中小企業においても,基本的な管理会計能力を高めることで財務業績が改善しているとの仮説が支持された。、この結果は、企業規模や業種など業績に影響を及ぼすと考えられている要因をコントロールしても維持されている。また、分析によって管理会計能力と財務業績の関係は、経営状態や経営者の考え方によって左右されることが確認できた。この調査結果は、中小企業における管理会計実践の経済的価値を示すものであり、臨床会計学構想を実現する社会的意義の基礎となるものである。臨床会計学構想を実現するうえで、管理会計実践の経済的価値を経験的証拠に基づき論証することはきわめて重要な意味を持っている。研究計画では、次年度以降に獲得できれば十分であると考えられていた知見が初年度で得られた。本研究プロジェクトは、次の15を反復的に実施することで、臨床会計学構想を具体化するための知見を得ることを目指している。1実践的な知識と理論的な知識の相互作用に関する管理会計先行研究の検討、2臨床的な知識の発展に関する管理会計および関連分野における先行研究の検討、3管理会計の専門職業化が進んでいる諸外国における臨床会計学的な知識の蓄積・体系化に関する調査、4管理会計知識を専門家として活用している実務家に対する調査、5実務家とのワークショップなどを通じた研究。平成28年度は、計画に沿って15を実施し、とくに4に関して平成27年度に行った中小企業における管理会計の経済価値分析のブラッシュアップに努めるとともに、1に関してものづくり企業の管理会計における臨床会計学的検討を行った。中小企業の管理会計の経済的価値についての追加分析によって、業種・規模・設立年数などをコントロールした場合でも、管理会計能力が高ければ高いほど中小企業の財務業績が向上し、その理由としては管理会計能力によって適切な意志決定行動ができることによって、コストをかけて利益を獲得することができていることが確認できた。また、ものづくり企業における管理会計の役割を臨床会計学的観点から考察することで、経済学と会計学との限界利益概念の相違が、「時間」の取り扱い方にあり、「時間」のなかで活動する行為主体を念頭においた会計学上の概念に立脚することで、管理会計実践は「機会損失」を鍵概念として「経営の設計図」と「現場の施工図」を結びつける役割を果たしているという洞察を得た。臨床会計学構想を実現するうえで、管理会計実践の経済的価値に関する経験的調査・研究や理論的研究が計画通りに進展しているため。「臨床会計学」とは,経営者や経営企画部門スタッフによって経営現場で用いられている会計の実践的な知恵と,会計研究者の理論的知識を結びつける知のあり方である。本研究では,管理会計の分野において実践知と理論値を結びつけて活動している臨床知の持ち主(臨床会計家)を同定し,臨床会計学構築に向けた社会的ネットワークとその活用方法について検討し、その具体化をはかった。そのうえで臨床会計学構築に向けたメゾレベルの社会的仕組みを、「研究に基づいた教育」「教育に裏付けられた実務」「実務に基づいた研究」の善循環として実現すべく、教育制度・資格制度・会員制度のそれぞれについて提案し、教育制度については「経営会計士養成プログラム」として、資格制度については「経営会計士」資格として、会員制度としては「経営会計士協会」として実現した。さらに実務(家)と研究(者)を結びつける研究の場として「経営会計士研究学会」を設立する予定である。

経営会計士研究学会は、経営会計士養成プログラムで教育を受けた専門家である経営会計士が、それぞれの実務経験を持ち寄り研究者と協力しつつ、臨床会計学的知見を共有し蓄積していく「場」として機能することが期待される。また、臨床的知見としては、管理会計実践の持つリズムの抽出や内外の利害関係者との調整プロセスに関する知見を得た。管理会計という実務との相互作用が無視できない重要性をもつ学問において,実務実践と理論研究との相互発展を可能とする知のあり方を「臨床会計学」として構想し,帰納的に臨床会計学的知見を蓄積するととともに、その具体化を進めるための社会的仕組みを提案し、研究主体の学問的世界の基本構造を作りかえていくという高次の再帰性を織り込んだアクションリサーチ・プログラムを実施した。臨床会計学構築に向けたメゾレベルの社会的仕組みを、「研究に基づいた教育」「教育に裏付けられた実務」「実務に基づいた研究」の善循環として実現すべく、教育制度・資格制度・会員制度のそれぞれについて具体化をはかった。当初の計画以上の結果が得られたことを受け、この知見を活用しながら計画通り、1実践的な知識と理論的な知識の相互作用に関する管理会計先行研究の検討,2臨床的な知識の発展に関する管理会計および関連分野における先行研究の検討,3管理会計の専門職業化が進んでいる諸外国における「臨床会計学」的な知識の蓄積・体系化に関する調査,4管理会計知識を専門家として活用している実務家(管理会計専門家)に対する調査、5実務家とのワークショップなどを通じた研究、を継続する。当初の計画通り、1実践的な知識と理論的な知識の相互作用に関する管理会計先行研究の検討、2臨床的な知識の発展に関する管理会計および関連分野における先行研究の検討、3管理会計の専門職業化が進んでいる諸外国における臨床会計学的な知識の蓄積・体系化に関する調査、4管理会計知識を専門家として活用している実務家に対する調査、5実務家とのワークショップなどを通じた研究、の反復作業を継続する。とくに最終年度である平成29年度は、管理会計能力の経済的価値に関して、中小企業については大規模サンプルでの調査を実施するための継続的な仕組みを明確にすることをめざして研究を進める。管理会計