hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
都市的＂性＂様式のグローバル展開とそれを基点とするグローバルシティ研究の新視座

平成26年度採用分日本学術振興会特別研究員申請書の「研究の目的」及び「研究計画」の記載内容を、平成27年6月25日に行われたSPD研究発表会を通じて得た主任研究員の助言に従って修正し、平成28年度は、主な調査活動をオランダ・アムステルダムと東京の性風俗世界に絞って以下の通り調査研究を実施した。「性風俗世界を通じたアムステルダムの都市的“性"様式に関する調査研究」として、いずれもアムステルダムで、セックスワーカーと対象とした面接調査と参与観察調査、資料収集及び分析を行った。特に、合法的セックスワークが行われる「(飾り)窓」で働くワーカー宅における住み込み調査では、ワーカーの日常を具体的かつ包括的に捕捉することができたばかりか、ワーカーの客、友人である元セックスワーカーらに対しても面接調査を行う機会を得た。更に、昨年度から重点的に研究を行っている移民セックスワーカーについては、親族を中心に形成される諸関係の実態解明に向けて更に調査を拡充させた。「都市“性"様式のグローバル展開に関する研究」としては、国際学会におけるセクシュアリティ研究のパネル組織と研究発表、国際学会と現地調査を通じた研究者ネットワークの構築と今後の共同研究に向けた調整、性風俗世界を通じた東京の都市的“性"様式に関する調査研究等を行った。なお、東京の都市的“性"様式に関する調査研究の成果は、平成29年度6月に学術単行書として出版される予定である。その他の実績には、セクシュアリティ研究の立場から行ったゲストスピーカーとしての活動がある。平成28年度は以上を中心とした調査研究活動を実施しながら、学会誌への発表2件(平成29年度の出版・公表含む)及び学会等でのパネル組織と口頭発表5件(その内、国際学会における英語での実施は3件)を成果として公開した。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度採用分日本学術振興会特別研究員申請書の「研究の目的」及び「研究計画」の記載内容に従って平成26年度に行った研究実績は以下の通りである。【性風俗世界を通じたアムステルダムの都市的“性"様式に関する調査研究】として、アムステルダムで予備調査と面接調査を実施した。予備調査では性労働を専門とする現地研究者の協力を受けながら、主に「飾り窓地区」と呼ばれる赤線地帯の詳細を把握した。(元)性労働者を対象とした面接調査では、性労働者の視点を重視した実証分析に不可欠な個人の具体的な経験の解明に努めた。一部の性労働者と更に重ねたやり取りの中では、親族を中心とするネットワークの実態など、本研究の中核概念である「性風俗世界」をより包括的に捕捉するための重要な視点を得ることができた。【性風俗世界を通じたシンガポールの都市的“性"様式に関する調査研究】では、主に性労働者が集中するゲイラン地区で予備調査を行った。更に南洋理工大学にて本研究の内容と鍵となる諸概念について講演を行った。【家族の性を通じた東京の都市的“性"様式に関する調査研究】では、4組の夫婦に対して面接調査を開始しデータを収集した。【都市的“性"様式のグローバル展開に関する研究】では、本研究の基礎であり着眼の土台でもある東京都市部の適法的性風俗店における参与観察調査の成果を精査し、都市的“性"様式のトランスナショナルな連結とそのグローバル展開の分析の核となる、諸関係の構築の方法とその実態について新たな角度から分析を深化させた。更に当初の計画にはなかったが、東京の性風俗店で海外の客が増加している実態を受け、当該性風俗店で海外からの利用者を対象とした調査を実施し、成果公表の準備を行った。平成26年度は以上を中心とした調査研究を行いながら、学会誌への発表1件及び学会等での発表3件を成果として公開した。平成26年度採用分日本学術振興会特別研究員申請書の「研究の目的」及び「研究計画」の記載内容を、平成27年6月25日に行われたSPD研究発表会を通じて得た主任研究員の助言に従って修正した。その結果平成27年度は、主な調査活動をアムステルダムと東京の性風俗世界に絞って、以下の通り調査研究を実施した。「性風俗世界を通じたアムステルダムの都市的“性"様式に関する調査研究」として、いずれもアムステルダムで、性労働者と対象とした面接調査と参与観察調査、オランダで全国紙として展開される新聞を中心とした資料収集及び分析、性労働者の住居での住み込み調査に向けた今後の調査準備等を行った。特に、多くの性労働者が国外出身者である事実を踏まえ、親族を中心に形成される諸関係の実態解明を念頭においた調査と、性労働に影響を与えるオランダの政策等の分析を重点的に実施した。「都市“性"様式のグローバル展開に関する研究」としては、国際学会におけるセクシュアリティ研究のパネル組織と研究発表、国際学会を通じた研究者ネットワークの構築、性風俗世界を通じた東京の都市的“性"様式に関する調査研究等を行った。なお、東京の都市的“性"様式に関する調査研究の成果は、平成28年度12月に学術単行書として出版されることが平成27年度に決定している。その他の実績には、セクシュアリティ研究の立場から行ったシンポジウムでの指定ディスカッサントやゲストスピーカーとしての活動がある。平成27年度は以上を中心とした調査研究活動を実施しながら、学会誌への発表2件(平成28年度の出版含む)及び学会等でのパネル組織と口頭発表6件(その内、国際学会における英語での実施は4件)を成果として公開した。平成27年度はSPD研究発表会を通じて得た助言をもとに計画を修正し、着実に実行することができた。

本研究が「おおむね順調に進展している」と考える理由について、研究の進捗状況と研究成果の公表状況の2点に分けて記す。第一に、研究の進捗状況において特に有益であったのは、平成27年度は、性労働者と元性労働者に対する聞き取り調査が着実に実施できたことに加え、その家族、親族も調査対象に据え実際に臨地調査を行う可能性が高まった点である。これにより、本研究が解明を目指す都市的"性"様式のグローバル展開について、オランダ・アムステルダムと性労働者の出身国というより広い視野から捕捉し議論する実現性が確保された。更に、オランダ語の主要な諸新聞を中心とする一次資料から性風俗世界をめぐる政治の分析に着手、遂行することで、性労働者の日常というミクロな次元の調査を主軸とする本研究の実証性を高め、より説得性の高い議論を展開することに近づいた。第二の研究成果の公表状況において最も大きな収穫は、性風俗世界で働く女性の視点から東京の都市的"性"様式の一端を実証的に解明した成果が、平成28年12月に学術的単行書として確実に刊行される運びとなったことである。また、国際学会でのパネル企画と口頭発表を実施する過程では、東京での調査研究成果の公表を行うと同時に、アムステルダムでの調査研究で得た知見を交えて議論の精緻化に努めることができた。こうした活動を通じて、平成28年度にアムステルダムで得た成果に基づいて学会誌等で発表する素地が整ったと考えている。更に平成27年度は、平成26年度を通じて構築した海外研究者との関係を発展させ、実際に国際学会のパネルで互いに発表を行い、議論を行うこともできた。こうした具体的な協働活動は、国際的研究者ネットワークを強固にするという意味で非常に有意義であったと考えている。平成26年度採用分日本学術振興会特別研究員申請書の「研究の目的」及び「研究計画」の記載内容を、平成27年6月25日に行われたSPD研究発表会を通じて得た主任研究員の助言に従って修正し、平成28年度は、主な調査活動をオランダ・アムステルダムと東京の性風俗世界に絞って以下の通り調査研究を実施した。「性風俗世界を通じたアムステルダムの都市的“性"様式に関する調査研究」として、いずれもアムステルダムで、セックスワーカーと対象とした面接調査と参与観察調査、資料収集及び分析を行った。特に、合法的セックスワークが行われる「(飾り)窓」で働くワーカー宅における住み込み調査では、ワーカーの日常を具体的かつ包括的に捕捉することができたばかりか、ワーカーの客、友人である元セックスワーカーらに対しても面接調査を行う機会を得た。更に、昨年度から重点的に研究を行っている移民セックスワーカーについては、親族を中心に形成される諸関係の実態解明に向けて更に調査を拡充させた。「都市“性"様式のグローバル展開に関する研究」としては、国際学会におけるセクシュアリティ研究のパネル組織と研究発表、国際学会と現地調査を通じた研究者ネットワークの構築と今後の共同研究に向けた調整、性風俗世界を通じた東京の都市的“性"様式に関する調査研究等を行った。なお、東京の都市的“性"様式に関する調査研究の成果は、平成29年度6月に学術単行書として出版される予定である。その他の実績には、セクシュアリティ研究の立場から行ったゲストスピーカーとしての活動がある。
ボンベシン様ペプチド受容体による摂食と脂肪代謝調節機構の解析

BRS-3のもつ摂食と代謝調節という重要な機能が発現されるしくみを解明することを目的として、BRS-3が視床下部においてどの様な食欲制御ペプチドとその受容体と関わって食欲制御ネットワークを形成しているのかを調べた。BRS-3欠損マウスではレプチンによる食欲抑制効果が減弱しており、レプチン抵抗性を示すこと、またこれは、食欲増進効果をもつメラニン凝集ホルモンの働きが昂進していることが一つの原因となっていることが明らかとなった。実際に視床下部におけるメラニン凝集ホルモンとその受容体の発現量が増加していることも確認できたので、BRS-3はメラニン凝集ホルモンのシグナリングを制御することにより、摂食・エネルギー代謝の調節をしていることが示唆された。BRS-3を組織特異的、発生段階特異的に過剰発現するマウスを作成するために、CAGプロモーターの下流にloxPをはさんでコンディショナルにBRS-3を発現できるようなベクターを構築した(Novak et al.,2000)。これをES細胞に導入し、クローンを単離してマウス胚盤胞に注入することによりキメラマウスを得た。一方、種を越えた普遍的な役割を調べるために、鳥類におけるボンベシン様ペプチド受容体の探索を行った結果、chGRP-RとchBRS-3.5が新しくクローニングされた。前者は両生類・哺乳類GRP-Rとアミノ酸の相同性が高く、そのボンベシン様ペプチドに対する親和性もそれらと似ていた。chBRS-3.5は鳥類に特異的な受容体であるが、両生類BB4や哺乳類BRS-3の両者とある程度の相同性を有し、ボンベシンに高い親和性を示した。脳内ではchGRP-Rは視床下部にほぼ限局した発現をしているのに対し、chBRS-3.5はpalliumを中心とした領域に広く分布していた。この結果は、種を越えたボンベシンペプチド系の重要性を示唆している。ボンベシン様ペプチド受容体に分類されるBRS-3(ボンベシン様ペプチド第3受容体)、あるいはGRP-R(ガストリン放出ペプチド受容体)を欠損したマウスでみられる摂食異常がおこるメカニズムについて解析した。BRS-3欠損マウスでは、過食に続き、肥満の発症と共に血漿中のレプチン過剰や脳におけるレプチン耐性がおきていた。摂食調節に関与することが知られている様々なニューロペプチドをマウス脳室内投与することにより、BRS-3欠損マウスでは、メラニン凝集ホルモン(MCH)による摂食促進作用が増進していることが明らかになった。この変化はGRP-R欠損マウスでは見られなかった。さらに、BRS-3欠損マウスでは視床下部でのMCH受容体とMCH前駆体のmRNAの発現が野生型マウスに比べ、有意に増加していた。この結果から、BRS-3は、レプチンによるMCH受容体発現抑制作用に関わり、BRS-3の不活性化はこのようなレプチンの働きを抑えてしまうこと、しかしながらBRS-3のこのような働きはGRP-Rが関与している神経ネットワークとは独立していること、が示唆された。前者は両生類・晴乳類GRP-Rとアミノ酸の相同性が高く、そのボンベシン様ペプチドに対する親和性もそれらと似ていた。

chBRS-3.5は鳥類に特異的な受容体であるが、両生類BB4や哺乳類BRS-3の両者とある程度の相同性を有し、ボンベシンに高い親和性を示した。脳内ではchGRP-Rは視床下部にほぼ限局した発現をしているのに対し、chBRS-3.5はpalliumを中心とした領域に広く分布していた。この結果は、種を越えたボンベシンペプチド系の重要性を示唆するものであった。BRS-3のもつ摂食と代謝調節といった重要な機能が発現されるしくみを解明することを目的として、BRS-3が視床下部においてどの様な食欲制御ペプチド及びその受容体と関わって食欲制御ネットワークを形成しているのか、また、BRS-3を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成して過剰発現時の病態生理を把握することにより、BRS-3による食欲・脂肪代謝調節機構に関するさらなる知見を得ること、を目的とした。BRS-3欠損マウス及び野生型マウス脳室内にカニュレーションを行い、各種食欲増進ペプチド、あるいは抑制ペプチドを投与したときの摂食量の変化を比較した。その結果、BRS-3欠損マウスではレプチンによる食欲抑制効果が減弱しており、レプチン抵抗性を示すこと、またこれは、食欲増進効果をもつメラニン凝集ホルモンの働きが昂進していることがひとつの原因となっていることがあきらかとなった。実際にBRS-3欠損マウスでは視床下部におけるメラニン凝集ホルモンとその受容体の発現量が増加していることも確認できたので、一つのメカニズムとして、BRS-3はメラニン凝集ホルモンのシグナリングを制御することにより、摂食・エネルギー代謝の調節をしていることが示唆された。BRS-3を組織特異的、発生段階特異的に過剰発現するマウスを作成するために、CAGプロモーターの下流にloxPをはさんでコンディショナルにBRS-3を発現できるようなベクターを構築した(Novak et al.,2000)。BRS-3にはHAタグをつけ、また、IRESをはさんでEGFPを発現するようにデザインされている。このベクターをES細胞に導入し、クローンを単離した。Cre非存在下では、LacZが発現するので、これらのクローンの中からLacZを強く均一に発現するクローンを選別してマウス胚盤胞に注入することによりキメラマウスを得ている。キメラはC57BL6/Jと交配して、ES細胞のgermline transmissionを確認した。
我が国のワイン産業振興における地理的表示制度の課題と地域連携および大学の役割

2)国税庁の地理的表示のガイドラインに記されている、土地・風土とワインのつながりを示す、地域特性について、千曲川流域と日本各地の圃場の調査を通じて、地域特性についての検証を行った。1地質(ブルゴーニュの地質学者と長野県の13箇所の圃場の調査、北海道の調査への同行)2地理(標高や傾斜など)3収穫されたワインの成分(シャルドネの成分について長野県のみならず日本各地の圃場からもデータを集めた)である。結果千曲川流域には明快な地域特性が見られた。3)日本国内の苗木商について、ブドウ苗の供給実態調査。特に主要3社については、出荷している品種の内訳も調べ、各地域の産地化の動きと各地域と各品種の動向を探り、課題を抽出した。また新興産地、伝統産地において適性品種の選定、開発、苗木供給体制の確立のためのスキームの検証を始めた。4)長野県のワイナリーをイギリス人ジャーナリスト視察。産地形成についてのモデルを検証した。5)産官学連携のベースとなるネットワークを作った。特にブドウ苗の供給のための産官学連携は実際に共同研究としてスタートした。6)海外では、スペインで開催されたマスターオブワインシンポジウムと、韓国で開催されたアジア・コンフェランスで発表を行った。また、長野県内や他の都道県においても研究成果をもとに講演を行った。平成28年度は、本研究を進める実地調査を中心に活動。1)千曲川ワインバレー東地区のワイナリーへの訪問聞き取り調査を開始。(たとえば、地理的表示制度の指定における生産者の課題抽出のため、本制度自体の生産者の受容性、国税庁の本制度のガイドラインにも示されている生産者が考えるワインと土地・風土を関連付ける要素の抽出、ブドウ農家やワイン生産者が必要とする情報、さらには地域大学への要望抽出も実施。2)長野県千曲川ワインバレー東地区以外のワイナリーへの訪問聞き取り調査を開始。3)国内他地域の現状把握のため、北海道や山梨の生産者と本制度指定までの課題について意見交換。特に本制度の指定への動きがある北海道では、小規模ワイナリーだけでなくワイン用ブドウ栽培農家にも調査を実施して、課題を抽出。4)国税庁の審議官および酒税課の課長へのヒヤリング。地理的表示制度の生産者の理解を深めるための今後の対策について意見交換した。5)長野県の農業情報インフラ構築のための研究会のメンバーとしてブドウ農家、ワイン生産者、行政、大学の連携体制について意見交換を実施。6)バージニアなど海外の振興産地において、地理的表示制度導入までの大学、行政、生産者の連携事例調査を開始。7)ワインと土地・風土との関係を検証する客観的・科学的手法についての参考文献を入手。8)カリフォルニアのナパバレーの産地発展における産官学の連携について調査を実施。9)千曲川ワインバレー東地区のワイナリーをブルゴーニュ在住のマスター・オブ・ワインと視察。産地形成からみたワインの水準について意見交換をした。初年度の活動全般を通じて、ワイン産地におけるブランド構築の要は、適性品種について知見の蓄積と共有、その苗の供給体制だという感触(仮説)が得られたため、次年度は、苗木供給体制に関する産学連携や政策についての事項も国内・海外調査の重点項目とする予定。1)長野県内におけるワイナリーへのアンケートを行い、ワイン生産者における地理的表示制度の受容度について実態の把握はできたが、今後はワイン用ブドウ農家に対して調査をさらに進める必要がある。ただし県内のワイン用ブドウの新規就農者は激増しており、なかなか実態がつかみにくいという背景がある。2)現在日本各地ではワイナリー設立が活発化している。地理的表示制度の導入は長野県だけでなく、日本全体の状況を見据える必要がある。そのため長野県だけでなく、北海道、山形、岩手、新潟、九州における、産地形成の実態を把握しなければならないが、動きが見込み以上に早急である。3)平成28年度内に海外出張に出かける予定だったが、先方と日程の調整が合わず、平成29年度に延期した。平成29年度は、本研究を進める国内外の実地調査を続行。1)千曲川ワインバレー東地区のワイナリーとブドウ農家への訪問聞き取り調査を継続。例:地理的表示制度の指定に際しての課題における、ワイナリーとブドウ農家のクラスターごとの違いも検証。国税庁の本制度のガイドラインに示されているワインと土地・風土を関連づける、生産者が考える要素の抽出を継続。ブドウ農家やワイン生産者が必要とする情報のクラスターごとの検証の継続。2)地理的表示の指定を受けている山梨ワインのブランドの牽引役的な位置づけの山梨県内のワイナリーへの訪問聞き取り調査。3)伝統産地である南仏のモンペリエ大学教授との山梨の産地視察と意見交換。4)本年、地理的表示制度が指定される北海道の行政担当者(北海道庁の各担当者、余市町役場町長および担当者、空知総合振興局職員)および生産者と、本制度指定の課題と制度の運用方法についての調査および意見交換。5)国税庁の審議官および酒税課の課長や担当者へのヒヤリングの継続。地理的表示制度の生産者の理解を深めるための対策についても意見交換。5)北海道の研究機関の研究者(農研機構)との意見交換。6)新興産地であるバージニアの地理的表示制度の導入に際しての大学、行政、生産者の連携と産地形成事例の調査を継続。7)ワインの伝統産地であるフランスにおける産地維持のための大学、行政、生産者の連携スキームの調査。8)新興産地、伝統産地において、適性品種の選定、開発、苗木供給体制の確立のためのそれぞれのスキームの調査。

フランスとアメリカの両国において適性品種の研究と苗木供給の中心的役割を果たしているそれぞれの研究所や組織の働きを調査。9)国内の苗木業者の苗の供給体制の調査。10)長野県のワイナリーをイギリスとブルゴーニュ在住のジャーナリスト、およびブルゴーニュの生産者と視察。産地形成の課題について意見交換。1)長野県内におけるワイナリーへのアンケートを行い、ワイン生産者における地理的表示制度の受容度についての実態の把握をしたが、新たな生産者が激増しており、30年度に設立されるワイナリー数は多く、40軒を超える見込みである。こうした状況のなか追加調査も必要になった。ただし、県内のワイン用ブドウの新規就農者の激増により、実態の把握が難しくなっている。2)30年度は北海道が新たに地理的表示として指定される見込みである。抜本的な制度の見直し後、初の指定となり、北海道における制度運用について追加で検証する必要が生じた。3)ワイナリー設立の動きは長野県と北海道だけでなく、この1,2年は北東北で俄に活発化している。日本全国でのワイナリー設立数は昨年が25軒、今年は30軒とも言われている。長野県のみならず、北海道、北東北、西日本、大阪の産地形成における産官学連携の動きを把握しなければならないが、動きが早急である。4)平成29年度内に海外出張に出かける予定だったが、先方と日程調整が合わず、平成30年度に延期した。2)国税庁の地理的表示のガイドラインに記されている、土地・風土とワインのつながりを示す、地域特性について、千曲川流域と日本各地の圃場の調査を通じて、地域特性についての検証を行った。1地質(ブルゴーニュの地質学者と長野県の13箇所の圃場の調査、北海道の調査への同行)2地理(標高や傾斜など)3収穫されたワインの成分(シャルドネの成分について長野県のみならず日本各地の圃場からもデータを集めた)である。結果千曲川流域には明快な地域特性が見られた。3)日本国内の苗木商について、ブドウ苗の供給実態調査。特に主要3社については、出荷している品種の内訳も調べ、各地域の産地化の動きと各地域と各品種の動向を探り、課題を抽出した。また新興産地、伝統産地において適性品種の選定、開発、苗木供給体制の確立のためのスキームの検証を始めた。4)長野県のワイナリーをイギリス人ジャーナリスト視察。産地形成についてのモデルを検証した。5)産官学連携のベースとなるネットワークを作った。特にブドウ苗の供給のための産官学連携は実際に共同研究としてスタートした。6)海外では、スペインで開催されたマスターオブワインシンポジウムと、韓国で開催されたアジア・コンフェランスで発表を行った。また、長野県内や他の都道県においても研究成果をもとに講演を行った。平成28年度の研究を踏まえて以下のことを実施する。
前頭側頭型認知症における異常蓄積蛋白の分解・重合制御に関わる新規分子の探索と解析

ユビキチンリガーぜXIAPによるタウ蛋白ユビキチン化のリン酸化による影響を検討した。野生型タウまたはΔMetタウをリン酸化し、XIAPのタウ蛋白への結合の影響をpulll-downアッセイを用いて行い、さらに、in vitroにおけるユビキチン化へのリン酸化のを検討したが影響は認められえなかった。TDP-43はSer409およびSer410が病態脳においてリン酸化されているが、この部位の非リン酸化ペプチド、Ser409/Ser410リン酸化ペプチドを作成してリン酸化ペプチドに対する結合物を検討したところ、35kDaおよび50kDaの特異的結合蛋白が抽出された。タウ蛋白の重合・分解過程は未解明の部分が多いが、我々はタウ蛋白とタウ蛋白に対する結合蛋白との関係から研究を行ってきた。まず、神経細胞内に豊富に存在する14-3-3蛋白に注目し、14-3-3蛋白はタウ蛋白を自己重合させることが可能であること、タウ蛋白と14-3-3蛋白との結合親和性はSer214リン酸化によって著しく亢進すること、しかしタウ蛋白の自己重合はタウ蛋白のSer214リン酸化によって阻害されることなどを報告してきた。今回は、内因性アポトーシス抑性因子XIAPに注目し、XIAPはタウ蛋白と結合すること、タウ蛋白はXIAPのカスパーゼ抑制機能を低下させること、タウ蛋白をユビキチン化することを詳しく検証することにした。XIAPとタウ蛋白の結合にはタウ蛋白のN末端が部分分解されているという蛋白修飾が必要であることを我々は予備的実験から確認していたので、新しくTag-free組換え蛋白質精製システムProfiniaシステムeXact(BIO-RAD)を用いて、リコンビナントの野生型タウと第1Metの切断された△Metタウを精製し、またXIAPの欠損変異体(XIAP1-351)コンストラクトを作成し、精製して、検証をおこなうことにした。野生型タウおよび△MetタウとXIAPおよびXIAP1-351との間の結合性を検討したところ、△MetタウとXIAPおよびXIAP1-351との間の結合性は確認されたが、野生型タウとXIAPおよびXIAP1-351との間の結合性は認められなかった。また、XIAPおよびXIAP1-351のカスパーゼ抑制機能は△Metタウによって抑制されたが、野生型タウには認められなかった。そして、タウのユビキチン化に関しては、XIAPと△Metタウとの組み合わせにおいてのみ認められた。前頭側頭型認知症(FTD)には様々な神経細胞内蓄積蛋白が存在するが、タウ蛋白やTDPー43といったものは蛋白修飾としてリン酸化とユビキチン化を受けている。また、家族性FTDの原因遺伝子として、VCP、Optineurin、UBIQLN2といったものが知られており、これらはユビキチン化蛋白と結合する、運搬するあるいはユビキチン疑似体であるといった特徴を有し、ユビキチン化蛋白の分解過程に関与している。総じて、FTDにおける神経変性過程には、リン酸化およびユビキチン化される蛋白そのもの、ユビキチン化された蛋白との結合・制御に関わる蛋白が病態に深く関わっていると言える。そこで、タウ蛋白のリン酸化とユビキチン化の相互関係を検討することにした。タウ蛋白はリン酸化を受けるとHSP70/CHIP複合体と結合し、ユビキチン化を受けることが報告されている。タウ蛋白の別のユビキチン化過程として、ユビキチンリガーゼXIAPによる作用を見い出してきたが、タウ蛋白のリン酸化によってどのような影響を受けるかは明らかではなかった。そこで、このリン酸化による影響を検討した。タウ蛋白をPKA、GSK-3などであらかじめリン酸化しておき、ユビキチン化酵素E1、E2 (UbcH5c)、E3(XIAP)、と共にATP存在下でインキュベートをおこない、ユビキチン化レベルの評価をおこなった。今回の結果としては、HSP70/CHIP複合体の場合とは異なって、タウ蛋白はリン酸化による有意な影響が認められなかった。タウ蛋白の分解・重合を制御する因子を探索し検討している。タウに関してはXIAP分子を見出し、検討した。野生型タウおよびΔMetタウと野生型XIAPおよび欠失変異型XIAP1-351との間の結合性を検討したところ、ΔMetタウとXIAPおよびXIAP1-351との間の結合性は確認されたが、野生型タウとXIAPおよびXIAP1-351との間の結合性は認められなかった。また、XIAPおよびXIAP1-351のカスパーゼ抑制機能はΔMetタウによって抑制されたが、野生型タウによる抑性は認められなかった。そして、タウのユビキチン化に関しては、XIAP1-351を用いた組み合わせでは認められなかった。さらに、別の前頭側頭型認知症関連分子としてTDP-43に関しても検討を行った。

TDP-43はSer409およびSer410が病態脳においてリン酸化されることが知られているが、この部位のペプチドを作成し、非リン酸化ペプチド、Ser409 /Ser410リン酸化ペプチド、Ser409 /Ser410をAspに置換したペプチドを作成し、これをアガロースビーズに吸着させて、神経系培養細胞ホモジネートを混ぜてインキュベートし、結合物を抽出したが、Ser409 /Ser410リン酸化ペプチド、Ser409 /Ser410をAspに置換したペプチドに特異的に結合する35kDaおよび50kDaの蛋白が見出すことができた。Progranulinに関しても同様に結合蛋白を見出す検討を行ったが、特異的な結合蛋白を見出すことはできなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。老年精神医学、認知症、神経化学26年度が最終年度であるため、記入しない。今回新しくTag-free組換え蛋白質精製システムProfiniaシステムeXact(BIO-RAD)を用いて、リコンビナントの野生型タウと第1Metの切断されたΔMetタウを精製した。リコンビナント蛋白の可溶化のプロセスに時間がかかり、やや遅れている。タウに関しての検討に集中していたため、PRGNに関する検討が遅れている。次年度はPRGNを中心に進めたい。リコンビナント蛋白の可溶化のプロセスに時間がかかったため進捗に遅れが出たが、一応条件は設定されたので、今後はできるだけ一括・大量に精製して、研究を進めることにする。コンストラクトに関しては整っているので、今後は能率的に解析を進めたい。リコンビナント蛋白を一括・大量精製、およびそれを使用した研究、タウ蛋白のユビキチン化検討、PRGNの結合蛋白探索研究の推進に使用する。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。次年度にペプチド合成を集中して行い、予算を執行する。
劣駆動パラレルリンク機構を用いた動揺低減移乗装置に関する研究

本研究では、小型船舶を対象として、船舶の操舵では制御できないヒービング・サージング・ピッチング・ローリングの4自由度の揺れを対象とし、3-RPS機構より関節自由度を増やすことによって、省スペースを維持しつつ可動範囲を広げた4自由度劣駆動パラレルリンク機構型動揺低減装置を開発することを目的としている。平成29年度では、劣駆動パラレルリンク機構を用いた動揺低減装置の開発のため、初めに基礎研究として平面3自由度に限定したリンク機構について、陸上との接続を含めたシステムを対象とし、機構設計、制御コントローラ設計、シミュレーションを行った。そこで平成30年度は、平面3自由度機構の実験機の製作と、水槽を用いた実験環境における動揺低減装置としての評価試験を行った。初めに、実験機を設計するにあたり、動揺低減装置の各リンクパラメータを決定するための可動域計算を行った。逆運動学を解くことによって、想定する船の揺れの大きさに対してアクチュエータのストローク長が対応しているかを確認し、タラップやベースプレート長さを決定した。次に、実験機を製作して水槽実験環境における実験を行った。フィードバック入力の算出と実験の評価のため、タラップ部と船体部に加速度センサを、タラップと陸地側の接続部にリニアエンコーダを取り付けた。昨年度までに導出したコントローラをマイコンボードに実装し、船体を揺らした際にタラップ部が目標角度、目標位置を保つように動作させた。実験結果より、船体の揺れに対してタラップの揺れを抑えることができていることを確認した。また4自由度機構については、平面3自由度機構で用いたコントローラを拡張し、シミュレーションにより4自由度の船体の揺れに対して3つのアクチュエータにより制御可能であることを確認した。本課題では、小型船舶を対象として、船舶の操舵では制御できないヒービング・サージング・ピッチング・ローリングの4自由度の揺れを対象とし、3-RPS機構より関節自由度を増やすことによって、省スペースを維持しつつ可動範囲を広げた4自由度劣駆動パラレルリンク機構型動揺低減装置の開発を目的としている。平成29年度は研究計画に基づき、平面3自由度パラレルリンク機構について以下の2つに取り組んだ。1初めに船の揺れを含めず、パラレルリンク機構と陸上のみを考慮したシステムを対象として、運動学モデルに基づく制御コントローラの設計を行い、シミュレーション及び実験により、2つのアクチュエータによって出力プレートの2自由度を制御可能であることを確認した。2次に船の揺れを考慮して、船体の運動および陸側との接続を含めたモデルへと拡張し、運動学モデルに基づく可動域の解析と制御モデルの導出を行った。さらに、状態フィードバックによる制御コントローラの設計を行い、シミュレーションによって有効性を確認するとともに実験装置を製作し、実験での検証を行った。実験装置は、屋内水槽を用いて行ったものであり、船に見立てた浮体上に動揺低減装置を設置し、対象とするヒービング・サージング・ピッチングのみが生じるように浮体を拘束して行った。以上により、船体の3自由度の揺れに対して、動揺低減装置の出力プレートの位置と傾きを制御可能であることを確認した。また、以上の研究成果について国内および国際学会で発表を行っている。当初の計画通りに平面機構のシミュレーション及び実験までを行うことができた。当初の研究計画に沿って、4自由度の揺れに対応した動揺低減装置の開発を行う実験装置製作のためのネジなどの小物類によって予定額との細かな差が生じた。次年度使用額は実験装置のスペアパーツなどにあてる予定である。
環境浄化に関わる未培養微生物を生きたまま選択的に回収する技術の創成

Gemmatimonas属細菌等を利用し、本微生物群に対して特異的に結合するペプチドリガンドをファージ・ディスプレイ法で選別することが可能であった。またそれを利用しGemmatimonas菌体を生きたまま特異的に回収することが可能であることが示された。メタン回収型廃水処理プロセスに存在する未培養微生物群を標的とした選択的回収システムを構築することを試みた。各種未培養微生物細胞の高濃度、高純度取得の試みを実施した。また、その過程で得られた新規微生物については、その生理学的、遺伝学的特徴を調査し、新種記載を行った。平成22年度は、以下の(1)(3)の課題に取り組み、予定通りの成果が見られた。具体的には、(1)難培養微生物の典型的な例であるGemmatimonas属細菌とKSB3門細菌(活性汚泥、嫌気性汚泥に存在)を利用し、本微生物群に対して特異的に結合するペプチドリガンドを、M13ファージを用いたファージ・ディスプレイ法で選別することを試みた。その結果、両細菌に対して特異性があると推定されるペプチドを選別することができる技術を確立することができた。(2)得られたペプチドを利用し、活性のある複合微生物群集から特定の微生物を生きたまま回収する技術の検討を行った。磁気ビーズ得られたペプチドを固定し、磁気を利用して特定微生物菌体を回収するなどの方法により、Gemmatimonas菌体を生きたまま特異的に回収することが可能であることが示された。(3)Gemmatimonas属細菌とKSB3門細菌を対象とし、標的細菌に特異的なDNAプローブ(16S rRNAを標的)を作成、FISH法とフローサイトメータを組み合わせ、本微生物を複合微生物群集中から選択的に回収する技術を確立した。以上の検討を通じ、ファージ・ディスプレイ法による菌体特異的ペプチドの選択と、それを利用した微生物の回収技術に関する基礎的検討と、その基盤技術の確立を行った。平成23年度は、平成22年度で開発した微生物回収技術を利用し、メタン回収型廃水処理プロセス(嫌気性廃水処理プロセス)に存在する未培養微生物群を標的とした選択的回収システムを構築することを試みた。特にバルキング原因微生物、難培養細菌およびアーキア群について、その16S RNAを標的としたFluorescence in situ hybridization(FISH)用プローブの情報をまとめ、必要なプローブを設計、作製した。具体的には、バルキング原因微生物についてその分子遺伝的特徴を把握するため、バルキング汚泥を対象とした16S RNA遺伝子のパイロシークエンシングを実施し、原因微生物の特定を進めた。また、バルキング原因微生物と推定された3種の微生物群(VerrucomicrobiaやBacterieroidesに属する未培養細菌群)をFISH法で検出するためのDNAプローブを設計、作製し、それらの細胞を蛍光染色する方法を確立した。さらに、前年度に引き続きペプチドを利用した菌体回収技術に関する基礎的検討を行い、本手法を利用して実際の未培養微生物群を培養可能にするための検討を実施した。具体的には、嫌気性廃水処理汚泥への分子系統学的解析からその存在が予見されている、系統学的に新規で処理プロセスにおいて重要な未培養系統群(バルキング原因微生物など)に対して本手法を適用し、それぞれに特異的なペプチドの選定後、ペプチドリガンドを利用した各微生物細胞の高濃度、高純度取得を試みた。その結果、新規な細菌を複数種類所得することに成功した。所得、分離した株については、新種記載のための解析を実施し、その一部について論文発表を行った。平成24年度は、平成22年度で開発した微生物回収技術を利用し、平成23年度に引き続きメタン回収型廃水処理プロセス(嫌気性廃水処理プロセス)に存在する未培養微生物群を標的とした選択的回収システムを構築することを試みた。平成23年度に特定したバルキング原因微生物(VerrucomicrobiaやBacterieroidesに属する未培養細菌群)、また、嫌気性廃水処理汚泥で検出されるNitrospira、Synergistetes門未培養細菌群を対象とし、ペプチドを利用した菌体回収技術を適用した。その結果、これらの微生物群に対して選択的に結合するペプチドを選別した。ペプチドリガンドを利用した各微生物細胞の高濃度、高純度取得を試みた結果、新規な細菌を複数種類所得することに成功した。分離された細菌群は新種記載のための解析を実施した。当初の計画通り、未培養微生物群を標的とした選択的回収技術の開発が順調に進展しており、その方法を利用して分離、培養された新規微生物を複数種獲得している。論文公表も進んでおり、順調に進んでいると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き計画通り課題を実施し、論文公表等を積極的に進めたい。
顎顔面の形態発生に関与するL3/Lhx8遺伝子の機能解析

顎顔面領域における形態発生は、その形成過程が複雑な構造からなり、非症候性に発生する口唇・口蓋裂の原因遺伝子は未だ明らかではない。LIM homeobox遺伝子であるL3/Lhx8は、顎顔面領域の形成過程に重要な関連があると考えられ、われわれのこれまでの研究により、口唇・口蓋裂発生への関与が示唆されている。そこで本研究においては、ニワトリ胚を用い顎顔面領域にエレクトロポレーションの手法にてL3/Lhx8遺伝子の導入実験およびsiRNAによる阻害実験を行った。1.ニワトリ胚へのpMiwIIIベクターを用いたL3/Lhx8遺伝子導入実験動物は、発生が継続できるよう処理したHH.Stage1015のニワトリ胚を用いた。L3/Lhx8遺伝子組み込みpMiwIIIベクターは、エレクトロポレーションの手法を用い、遺伝子導入を行った。24時間後において、胚の顎顔面領域に標識としたGFPの発現が認められ、遺伝子導入を確認することができた。また、電圧、時間およびパルスの条件設定を変えても、48時間後の生存率は低いことが明らかとなった。2.ニワトリ胚へのsiRNA発現プラスミドをもちいた遺伝子阻害siRNA発現プラスミドは、pSilencer2.1-U6ベクターを用い、いくつかのパターンを構築した。HH.Stage1015の胚へのエレクトロポレーションでは、8時間後に胚の顎顔面領域にGFPの発現が認められ、遺伝子導入を確認することができた。24時間後および48時間後におけるパラフィン標本で行ったin situ hybridizationにおいて顎顔面領域にL3/Lhx8遺伝子の発現は見られなかった。実体顕微鏡における形態的観察において、顎顔面領域の明らかな形態異常は観察されなかった。1.pMiwIIIベクターへのL3/Lhx8遺伝子組み込みエレクトロポレーションに必要なニワトリ用のベクターpMiwIIIにL3/Lhx8遺伝子の組み込みを行った。制限酵素Cla IおよびHindIIIでベクターを処理し、chick L3/Lhx8を同様に処理した。両者をセルフライゲーションして、大腸菌にトランスフォームすることで必要なプラスミドが得られたことを確認することができた。このプラスミドには、GFPが組み込まれており蛍光顕微鏡により培養細胞への感染を確認し、L3/Lhx8遺伝子組み込みベクターの製作に成功した。2.ニワトリ胚へのエレクトロポレーションによるL3/Lhx8遺伝子導入1.で得られたベクターを用いて、エレクトロポレーション法によるニワトリ胚へのベクター組み込み型導入法を実施した。プーラーで作製した微小直径ガラス管により、ニワトリ胚の頭部に遺伝子組み込みベクターを注入し、エレクトロポレーション法にて遺伝子導入をおこなった。Stage10のニワトリ胚での実験では、前脳に注入できる遺伝子量の適正化が困難であった。油圧式のインジェクターにおいては、適正な注入量の確定が困難に思われたため、急遽空気圧式のインジェクターを導入したところである。現在、この装置による注入量の適正化を模索している。これまでの実験結果より、胚のstageが大きくなった場合において感染力が低下する可能性が示唆された。このことから、遺伝子導入を行う適切なstageを見極める必要性が明らかとなった。3.L3/Lhx8遺伝子導入ニワトリ胚のインサイチューハイブリダイゼーション遺伝子導入を行ったstage10のニワトリ胚については、ホールマウントならびに凍結切片にてDig-RNAプローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーション法を行った結果、顎顔面領域においてL3/Lhx8RNA発現は認められないことが明らかとなった。
複合電子分光による機能元素電子状態解析

本研究では,新しいTEM用WDX検出器,及びカソードルミネッセンス検出器を開発しこれらを一つのTEMに集約した複合電子分光電子顕微鏡の開発に成功し,さらにこれらから総合的に得られたデータから統計処理によって情報抽出する物性画像診断法を確立した.また電子を一点に集中すること無く原子サイト選択的電子状態測定を行う電子チャネリングEELS法を確立した.これらの手法の応用によって,発光材料,磁性材料,水素吸蔵材料,光触媒,リチウムイオンニ次電池正極材料等の空間構造・電子構造のナノメートル分解能での分析を行った.本班の役割分担は、高エネルギー電子を用いて機能元素の電子状態を定量的に計測・評価そして可視化するという新規材料創出にとって不可欠な基盤技術を、実材料への応用に展開することにある。具体的には(1)電子エネルギー損失分光法(EELS)及び軟X線発光分光(SXES)において、特定の原子面、界面などにプローブ電子を局在(電子チャネリング)させる位置選択的な電子状態評価を、実用材料に適用する、(2)多変量解析を応用した化学結合状態マッピングによる先端ナノテク材料の物性画像診断を実施する。本研究では,新しいTEM用WDX検出器,及びカソードルミネッセンス検出器を開発しこれらを一つのTEMに集約した複合電子分光電子顕微鏡の開発に成功し,さらにこれらから総合的に得られたデータから統計処理によって情報抽出する物性画像診断法を確立した.また電子を一点に集中すること無く原子サイト選択的電子状態測定を行う電子チャネリングEELS法を確立した.これらの手法の応用によって,発光材料,磁性材料,水素吸蔵材料,光触媒,リチウムイオンニ次電池正極材料等の空間構造・電子構造のナノメートル分解能での分析を行った.本研究の目的は,様々な材料物性発現に関与している格子欠陥などの格子不整にトラップされたドーパント元素の分析を通じて,その機能発現メカニズムを理解することによって新しい材料開発をする指針を見出すことである。本研究グループの分担は,透過電子顕微鏡(TEM)をベースとするナノ領域電子分光法による機能元素分析である。本年度の成果として以下が挙げられる:(1)電子定在波法による原子サイト選択的電子状態測定法の開発:結晶試料に入射する電子の方向を連続的に変化させ回折条件を変えて記録した電子エネルギー損失分光(EELS)スペクトルから,異なる化学環境にある元素のスペクトル成分を分離することに成功した。これらは第一原理計算による各サイトの理論スペクトルと良い一致を示した。(2)多変量解析と画像回復法を組み合わせた位置敏感ナノ分解能電子状態測定とその可視化:EELSにおいて二次元検出器(CCD)上に位置敏感スペクトルを記録し,PIXON法を用いて信号抽出をすることにより,1%未満の微量元素の位置敏感スペクトルを取得する技術を開発した。(3)TEM用波長分散型X線分光器(TEM-WDX)の改良:マルチキャピラリX線レンズ(MCX)を使ったコンパクトなWDXシステムにおいて,異なる波長に対応する分光結晶を4種類装着し,かつソーラースリットを挿入することによって,およそ150-2500eVの範囲の特性X線放出スペクトルをおよそ1eVのエネルギー分解能で取得することができるようになった。本研究の目的は、高エネルギー電子を目標の格子特異点に絞り、その場所の電子状態を定量的に計測・評価そして可視化するという新規材料創出にとって不可欠な基盤技術を確立することにある。そのために、主として(1)最近の放射光を用いても原理的に困難な、ナノ領域における材料内部の軟X線領域複合分光をするシステムを確立すること(2)上記システムにおいて、特定の原子面、界面などにプローブ電子を局在(電子チャネリング)させる位置選択的な電子状態を実際の化学反応場でその場測定すること、(3)以上を特に金属微粒子触媒-担持基板の各面反応、機能元素のナノレベル可視化、遷移金属の電子状態規則配列の直接測定などへ応用することを目的とした。本年度は、昨年度開発に成功したTEM用波長分散型X線分光器(TEM-WDX)、位置選択的電子状態測定法、及びスペクトラムイメージング(SI)の多変量解析法(MCR)を応用したナノ構造解析を行った。主として(1)電子チャネリングを利用したTEM-WDXによる価電子帯状態密度の位置選択的測定を(1)強相関電荷秩序物質、(2)スピネル型先端セラミックスへの応用、(2)SI-MCR法を(1)白色発光する炭素化ポーラス酸化シリコンナノ構造、(2)リチウムイオン二次電池正極材料のリチウム、(3)窒素添加した可視光応答型酸化チタンへと応用し、ナノメートルサイズでの軽元素の化学結合状態とその空間分布の可視化を行った。(3)位置敏感EELS測定による貴金属微粒子触媒の担持セラミックスとの界面状態の解明を試みた。これについては明確な解答が得られておらず今後継続される。またこれらの成果発表として6月末に名古屋で国際シンポジウムおよびこのサテライトワークショップを開催し、招待講演を行った。

そのために、主として(1)最近の放射光を用いても原理的に困難な、ナノ領域における材料内部の軟X線領域複合分光をするシステムを確立すること(2)上記システムにおいて、特定の原子面、界面などにプローブ電子を局在(電子チャネリング)させる位置選択的な電子状態を実際の化学反応場でその場測定すること、(3)以上を特に金属微粒子触媒-担持基板の各面反応、機能元素のナノレベル可視化、遷移金属の電子状態規則配列の直接測定などへ応用することを目的とした。本年度は、昨年度開発に成功したTEM用波長分散型X線分光器(TEM-WDX)、位置選択的電子状態測定法、及びスペクトラムイメージング(SI)の多変量解析法(MCR)を応用したナノ構造解析を行った。主として(1)電子チャネリングを利用したTEM-WDXによる価電子帯状態密度の位置選択的測定を(1)強相関電荷秩序物質、(2)スピネル型先端セラミックスへの応用、(2) SI-MCR法を(1)白色発光する炭素化ポーラス酸化シリコンナノ構造、(2)リチウムイオン二次電池正極材料のリチウム、(3)窒素添加した可視光応答型酸化チタンへと応用し、ナノメートルサイズでの軽元素の化学結合状態とその空間分布の可視化を行った。(3)位置敏感EELS測定による貴金属微粒子触媒の担持セラミックスとの界面状態の解明を試みた。これについては明確な解答が得られておらず今後継続される。またこれらの成果発表として6月末に名古屋で国際シンポジウムおよびこのサテライトワークショップを開催し、招待講演を行った。本研究の目的は,走査/透過電子顕微鏡(S/TEM)に付随した各種分光法(EELS, EDX, WDX, CL)測定を集約し,ナノメートル領域からのこれらの機能元素の分光データを総合的に解析して「物性診断」ともいうべき手法を開発・応用することである.本年度の成果は以下の通りである:(1)電子チャネリングを応用したサイト選択的電子状態測定において,動力学的電子回折理論と第一原理計算を組み合わせた,実験データと比較できるスペクトル理論予測法を確立した.これと前年度開発したPC制御ビームロッキングEELS自動測定によって,スピネルフェライトの結晶場の違いに起因するEELSスペクトルの変化をサイト選択的に測定することに成功した.(2)STEM-EELSデータを統計処理することで化学結合分布マップを作成する手法をリチウム電池正極に適用し,正極活物質表面に生成するリチウムフッ化物の同定,サイクル劣化による劣化相の生成,成長の定量評価に成功した.(3)電子チャネリング条件におけるTEM-EDXデータ測定によってサイト選択的元素分析の各種法を開発した.これらを希土類添加蛍光セラミックスCa_2SnO_4およびM型フェライトにそれぞれ適用し,添加元素の占有サイト及びそれぞれの占有率を求めた.(4)可視光応答する光触媒である窒素添加チタニアにおいて、可視光応答のための最適窒素添加量及び有効触媒厚さを評価した.また所望の量に触媒活性な窒素を効果的にチタニアに注入するためには,格子欠陥を同時に導入することが重要であることを示した.(1)高エネルギー電子ビームと材料の相互作用によって,試料の物性に関するほぼすべての情報が何らかの量子(光子,電子,X線)を通じて発信される.通常の分析STEMでは捨て去られてきた,または別々の専用機によって測定されてきたこれらの量子が運ぶ情報を,一台の装置でできうる限り同時に取得する「複合電子分光」(電子エネルギー損失分光,軟X線発光分光,カソードルミネッセンス)をほぼ確立させた.
ジャスモン酸12位水酸化酵素の同定及び、傷害応答性移動シグナル分子の解明

昨年度はジャスモン酸不活性化に関する研究をさらに応用し、ジャスモン酸によって誘導されるイネのファイトアレキシンの一種であるPhytocassaneの生合成に関する研究を行った。Phytocassaneの生合成は、前駆体となるゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)が二種の環化酵素により環化を受け炭素骨格が形成されent-cassadieneとなり、その後シトクロムP450等により修飾を受け生合成される。先行研究により2種の環化酵素及びシトクロームP450であるCYP71Z7、CYP76M7、CYP701A8が同定されている。CYP71Z7、CYP701A8、CYP76M7はそれぞれent-cassadieneの2位、3位、11位を水酸化する活性を有する。私は、生合成に関与する環化酵素及びシトクロームP450をコードする遺伝子で形質転換した大腸菌を用い低分子化合物を得るmetabolic engineeringsystemを活用し、Phytocassane生合成に関与すると予想されるシトクロームP450のさらなる評価を行った。前述のようにent-cassadieneの2位水酸化酵素として報告されているCYP71Z7の酵素活性をより詳細に解析し、CYP71Z7はent-cassadieneの2位に水酸基を導入するのみでなく、2位をさらに酸化しカルボニル基とし、その後3位に水酸基を導入する活性を有することが明らかとした。CYP71Z7には90%以上の相同性を示すCYP71Z6が存在する。またイネはent-cassadieneの他にも数種類のジテルペンを有することが知られている。そこで、metabolic engineeringsystemを用いてCYP71Z6及びCYP71Z7の基質特異性を調べた。その結果ent-コパニル二リン酸から生合成されるent-kaurene、ent-isokaurene、ent-sandaracopimaradiene、ent-cassadieneを基質とした際、CYP71Z6は2位のみを水酸化するが、CYP71Z7に関しては2位水酸化体に加えて3位水酸化体、2-keto-3-olを与えることが明らかとなった。水酸化体の位置選択性は、ent-cassadieneを基質とした際はほぼ2位水酸化体のみを与え、ent-sandaracopimaradieneを基質とした際は、2位水酸化体と3位水酸化体を同程度与えるといったように基質に依存することが示された。これら反応特異性は基質によって酵素の活性中心であるヘムとの位置関係が基質によって異なることによって生じると予想される。購入したシロイヌナズナ水酸化酵素シトクロームP450欠損株50種におけるジャスモン酸類の内生量の側定を行い、ジャスモン酸類水酸化酵素候補遺伝子の探索を行った。その結果、野生株に比べジャスモン酸イソロイシンが多く蓄積しツベロン酸イソロイシンの量が顕著に減少する変異株cyp94b3を得た。候補遺伝子の機能をさらに調べるために、CYP94B3を組み換え導入したメタノール資化酵母を作成し、そのジャスモン酸イソロイシンの水酸化活性を調べた。その結果、CYP94B3を導入した株で水酸化活性の顕著な増加がみられ、CYP94B3がジャスモン酸イソロイシン水酸化酵素であることが示唆された。ジャスモン酸噴霧時及び傷害応答時の、CYP94B3の発現パターンを調べたところジャスモン酸噴霧時及び、傷害応答時ともに発現の誘導が確認された。今後はこの酵素の機能をさらに検証していく予定である。ジャスモン酸は植物ホルモンの一種であり、植物体内において傷害応答、病害応答、成長など様々な機能を果たしている化合物である。今回発見した酵素による水酸化反応は主要な代謝経路であることが予想され、ジャスモン酸の内生量を決定する上での重要な因子である。すなわち、この酵素に関する遺伝子組み換え植物を作成することや、この酵素の阻害剤を利用することによりジャスモン酸類の内生量を操り、植物病原菌に耐性を持つ植物や農薬など、農業分野等で応用できると考える。また水酸化されたジャスモン酸は移動シグナルとして馬鈴薯の塊茎形成や傷害時に植物体全体でおきる防御応答に重要な役割を果たすと考えられている。今回の変異株等を用いてさらなる実験を進め、ジャスモン酸類の移動に関しても明らかにしていきたい。昨年度ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)12位水酸化酵素としての機能を明らかにしたCYP94B3の基質特異性を調べ、変異株における生成物と基質の内生量を測定し、この酵素が、JA-Phe及び、JA-Valの水酸化活性を有する事を明らかにした。変異株cyp94b3と野生株をJA-Ile存在下で育成したところ、変異株cyp94b3でより強くJA-Ileの効果が観察された。これは変異株cyp94b3においてはJA-Ileを不活性化することができず、より多くのJA-Ileが植物体内に蓄積したためと考えられる。12位の水酸化がJA類の不活性化として働くことを指し示すために、JA-Ile、JA-Val、JA-Phe及び、それぞれの12位が水酸化された化合物の生物活性を、シロイヌナズナ根伸長阻害試験を用いて評価した。その結果、JA-Val、JA-PheがJA-Ile様の作用を示すこと、すべての化合物において生物活性が12位の水酸化により低下する結果が得られた。