hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体肝移植後免疫抑制剤中止症例における免疫寛容成立のメカニズムの解析

生体肝移植後、免疫抑制剤中止後も、良好な肝機能を維持している、いわゆる、移植臓器に対する免疫寛容状態にある患者が存在する。しかし、その免疫寛容維持のメカニズムは不明である。昨年まで、肝移植後の患者における末梢血中の免疫反応に対し制御性に働くリンパ球の同定、機能解析を行い、生体肝移植後免疫寛容状態の患者において、その末梢血中のCD25+CD4+制御性T細胞、Vδ1γδT細胞が増加し、かつ、それらが免疫寛容状態に関与していると考えられた。本年は、臓器移植後の拒絶反応の一つである液性拒絶に関して研究を行った。液性拒絶反応は現在、十分に制御できる免疫抑制療法は確立されていない。そこで、積極的な液性拒絶反応の免疫抑制療法の検討として、ABO型不適合ドナーからの肝移植における、免疫抑制療法のプロトコールについての研究を行った。本年まで、血液型不適合間肝移植に対して、免疫抑制療法として、全身免疫抑制療法、脾臓摘出に加え、プロスタガンディン、ステロイドの肝動脈からの注入による局所療法を行うことによって、その成績は飛躍的に向上をした。しかし、脾臓摘出によっておこる高頻度の門脈血栓、また、その後に永続する易感染性と問題が多い。そのため、今回、脾臓摘出にかわる免疫抑制療法として、抗CD20抗体(リツキシマブ)の使用のプロトコールを実施し、その結果について研究した。この新しいプロトコールにより、問題となった門脈血栓については解決し、重篤な液性拒絶反応を回避できることが判明した。また、易感染性においてもウイルス感染の頻度は低下し、その点においても期待できる結果であった。さらに細胞性免疫反応による拒絶反応も有意に抑制できた。このプロトコールは今後、血液型不適合肝移植のみならず、液性拒絶反応抑制のプロトコールとして期待できると考えられる。我々の施設では、生体肝移植後、免疫抑制剤を中止した後も、良好な肝機能を維持している、すなわち、移植臓器に対する免疫寛容状態にある患者を経験している。その移植後患者における免疫寛容維持のメカニズムの解析のため、末梢血中に、免疫反応を制御するリンパ球の同定、機能解析を行った。動物実験などで注目されている、CD25+CD4+制御性T細胞につき、移植後患者における働きを研究した。FACSによる解析では、CD25+CD4+T細胞は末梢血中その絶対数、割合は増えていたが、制御性T細胞のマスター遺伝子であるFOXP3のmRNAの発現量においては、正常小児と比較しても増加は認めなかった。さらに、CD25+CD4+制御性T細胞の、移植片に対する抗原特異性の有無をリンパ球混合試験にて調べたが、抗原特異性は認めなかった。CD25+CD4+制御性T細胞が免疫寛容維持に強く関与していることを示す結果は得られなかった。また、今回、我々の研究から、移植後免疫寛容状態にある患者群において、末梢血中γδT細胞とくに、Vδ1T細胞が増加していることがわかった。移植後患者のVδ1T細胞の機能解析を行ったところ、刺激培養後にTh2サイトカインであるIL10の産生が健常人に比べ優位に増加していた。さらにVδ1T細胞のTCRの1次構造を調べたところ、ある特異的なclonalityがみられた。このことから、移植後にある特異的な抗原を認識し、Vδ1T細胞が増殖したと考えられた。移植後、全身状態が安定しているが、拒絶反応のみられる患者において、そのVδ1T細胞の増加はみられなかった。このことからVδ1T細胞が免疫反応の制御を行い、免疫寛容維持に働いている可能性が高いと考えられる。生体肝移植後、免疫抑制剤を中止した後も、良好な肝機能を維持している、いわゆる、移植臓器に対する免疫寛容状態にある患者が存在するが、その免疫寛容維持のメカニズムは不明である。免疫反応を制御するリンパ球の存在及び関与が様々な動物実験より示唆されており、生体肝移植後の患者における末梢血中の免疫反応に対し制御性に働くリンパ球の同定、機能解析を行っている。本年の研究により、生体肝移植後免疫寛容状態の患者において、その末梢血中のCD4+T細胞の移植片提供者(ドナー)に対するアロ抗原に対する免疫反応は、第3者に比べ、低下していることが判明した。その原因として動物実験などで注目されている、CD25+CD4+制御性T細胞の関与につき調べたが、CD25+CD4+T細胞がその原因となっていないことが判明した。しかしながら、CD25+CD4+T細胞のアロ抗原に対する免疫反応抑制の抗原特異性について検討を行ったが、ドナーのアロ抗原に対して、より特異的に免疫反応を抑制していることが判明した。CD25+CD4+T細胞は、ドナー抗原に対する免疫反応の低下の原因ではないが、免疫寛容状態に貢献している可能性が示唆された。また、移植後免疫寛容状態にある患者群において増加している末梢血中のVδ1γδT細胞について機能解析を行ったところ、リンパ球混合試験において、免疫反応の抑制性に働くことが判明した。さらに昨年までの研究でVδ1T細胞のTCRの1次構造に、ある特異的なclonalityがみられたが、本年、他の健常小児や、免疫寛容状態にない移植後患者において、同様の検討を行ったが、このような特異なclonalityは認めず、これは免疫抑制患者に特徴的な所見であることが判明した。

このことから、移植後、免疫寛容状態になった患者の血中、にある特異的な抗原を認識し増殖したVδ1T細胞が存在しそれが免疫寛容状態に関与していると考えられた。生体肝移植後、免疫抑制剤中止後も、良好な肝機能を維持している、いわゆる、移植臓器に対する免疫寛容状態にある患者が存在する。しかし、その免疫寛容維持のメカニズムは不明である。昨年まで、肝移植後の患者における末梢血中の免疫反応に対し制御性に働くリンパ球の同定、機能解析を行い、生体肝移植後免疫寛容状態の患者において、その末梢血中のCD25+CD4+制御性T細胞、Vδ1γδT細胞が増加し、かつ、それらが免疫寛容状態に関与していると考えられた。本年は、臓器移植後の拒絶反応の一つである液性拒絶に関して研究を行った。液性拒絶反応は現在、十分に制御できる免疫抑制療法は確立されていない。そこで、積極的な液性拒絶反応の免疫抑制療法の検討として、ABO型不適合ドナーからの肝移植における、免疫抑制療法のプロトコールについての研究を行った。本年まで、血液型不適合間肝移植に対して、免疫抑制療法として、全身免疫抑制療法、脾臓摘出に加え、プロスタガンディン、ステロイドの肝動脈からの注入による局所療法を行うことによって、その成績は飛躍的に向上をした。しかし、脾臓摘出によっておこる高頻度の門脈血栓、また、その後に永続する易感染性と問題が多い。そのため、今回、脾臓摘出にかわる免疫抑制療法として、抗CD20抗体(リツキシマブ)の使用のプロトコールを実施し、その結果について研究した。この新しいプロトコールにより、問題となった門脈血栓については解決し、重篤な液性拒絶反応を回避できることが判明した。また、易感染性においてもウイルス感染の頻度は低下し、その点においても期待できる結果であった。さらに細胞性免疫反応による拒絶反応も有意に抑制できた。このプロトコールは今後、血液型不適合肝移植のみならず、液性拒絶反応抑制のプロトコールとして期待できると考えられる。
糖尿病網膜症の硝子体中コラーゲンに対する自己免疫反応と病態との関連

硝子体の主要成分であるII型コラーゲンに対する抗原抗体反応が糖尿病網膜症の病態に関係しているかを検討した。硝子体手術を施行した糖尿病網膜症17例と年齢・性別を一致させた非糖尿病患者15例及の血清および硝子体中の抗II型コラーゲンIgG抗体価をELISAにて測定した。その結果,糖尿病網膜症患者の血清中抗II型コラーゲンIgG抗体価はコントロール群に比較して有意に高値を示した。抗II型コラーゲンIgG抗体価の測定が網膜症の病態把握に有用となる可能性がある。我々は,糖尿病網膜症の発症機序に一つに硝子体腔に存在するII型コラーゲンおよび網膜内境界膜に存在するIV型コラーゲンに対する自己抗体が産生され,それが糖尿病黄斑浮腫や増殖糖尿病網膜症の発症機序の一つになっているのではないかという仮説をたて,実験を開始した。インフォームドコンセトを得たうえで,増殖糖尿病網膜症および裂孔原性網膜剥離(全身的に糖尿病なし)の患者の硝子体手術時に採取した硝子体ゲルおよび同症例の血清をサンプルとして,その中の抗II型コラーゲン抗体をELISA法を用いて定量した。硝子体では糖尿病網膜症の1例において抗II型コラーゲン抗体が検出され,血清では有意差は得られなかったものの(p=0.17),糖尿病網膜症は裂孔原性網膜剥離よりも高い傾向が認められた。・裂孔原性網膜剥離34.2±38.9unit/ml (n=20)今後はさらにサンプル数を増やして,有意差がでるか検討する予定である。また,硝子体では1例にしか抗II型コラーゲン抗体が検出されなかったが,ELISA法の感度を上げることができるか検討する予定である。コントロールも裂孔原性網膜剥離以外に黄斑上膜や黄斑円孔の症例も対象とする予定である。一方,網膜ではII型コラーゲンが胎児期を過ぎても産生されている可能性が指摘されているが,低酸素負荷によりII型コラーゲンの産生が亢進することが報告されている。そこで,低酸素負荷マウス(大阪医大第三内科との共同研究)を用いて,網膜におけるII型コラーゲンを定量し,正常マウスと比較したが,現時点の結果では有意差が得られなかった。今後,さらに条件を変えて実験を継続する予定である。その結果,糖尿病網膜症は裂孔原性網膜剥離よりも高い傾向が認められた。・裂孔原性網膜剥離34.2±38.9unit/ml(n=20)網膜ではII型コラーゲンが胎児期を過ぎても産生されている可能性が指摘されているが,低酸素負荷によりII型コラーゲンの産生が亢進することが報告されている。そこで,今回,低酸素負荷マウス(大阪医大第三内科との共同研究)を用いて,網膜におけるII型コラーゲンを定量し,正常マウスと比較したが,現時点の結果では有意差が得られなかった。今回はさらに,硝子体中のVEGF,MM-2, MMP-9濃度の測定上記の各群の硝子体中におけるVEGF, MMP-2, MMP-9をそれぞれ測定した。その結果,増殖糖尿病網膜症の硝子体中のVEGF, MMP-2, MMP-9は,いずれもコントロールの黄斑上膜と黄斑円孔に比較して有意に高値を示した。我々は,増殖糖尿病網膜症時に生じる眼内血管新生緑内障が,慢性関節リウマチで関節腔内に生じる血管新生と類似していることから,糖尿病網膜症の発症機序に一つに硝子体腔に存在するII型コラーゲンおよび網膜内境界膜に存在するIV型コラーゲンに対する自己抗体が産生され,それが糖尿病黄斑浮腫や増殖糖尿病網膜症の発症機序の一つになっているのではないかという仮説をたて,実験を開始した。昨年の報告では,血清中の抗II型コラーゲン抗体をELISA法を用いて定量した結果,糖尿病網膜症はコントロールのよりも高い傾向が認められた。

・コントロール34.2±38.9unit/ml (n=20)網膜では低酸素負荷によりII型コラーゲンの産生が亢進することが報告されているので,低酸素負荷マウス(大阪医大第三内科との共同研究)を用いて,網膜におけるII型コラーゲンを定量し,正常マウスと比較したが,残念ながら最終的に有意差は得られなかった。また,硝子体手術時に得られる硝子体サンプルを用いて,硝子体内の抗R型コラーゲン抗体の測定を試みたが,硝子体出血をきたしている1例のみで検出可能だったが,その他は検出限界以下であった。硝子体中の抗体の検出率が低かったのは,免疫複合体で存在しているためではないかと考え,コラゲナーゼで分解して測定を試みたが,やはり検出できなかった。さらに特殊な標識技術により、通常のELISAの1千倍から1万倍の感度の超高感度超抗体試薬を使用して,再度実験を試みる準備をしていることころであるが,残念ながら研究期間内に結果をだすことはできなかった。しかし,引き続きこの研究は続行していく予定である。
インテグリン分子のリンパ球・血液細胞の分化に果たす役割

平成5年度は,研究の焦点を,β_1インテグリン分子のうちのVLA-4分子におき,その血球上の発現と機能についてひととおりの知見を得た.フローサイトメトリー上,抗VLA-4モノクローナル抗体(PS/2.3)と,血球のlineage markersを用いた多重染色でVLA-4の発現を調べたところ,VLA-4分子は,未熟リンパ球,c-kit^+/lin^-血液幹細胞に強く表現され,細胞の成熟にともなって発現量が減弱した.VLA-4分子を介する接着/シグナルがin vivoでの血球発生に果たす役割を調べるため,PS/2.3(胎盤を通過)を妊娠マウス腹腔内に投与し続けると,著しい貧血マウスが生まれた.出生前後の主たる造血器である肝臓では,赤芽球の島状増殖像がほぼ消失し,肝単離細胞をフローサイトメトリーで調べると,TER119^+赤芽球が対照マウスの1/15以下に減少していた.また,in utero抗体投与胎仔肝に由来するBFU-E,CFU-Eは対照の1/2程度に減少,肝臓には幹細胞はある程度存在するが,成熟停止状態におかれていることが示唆された.一方,同マウスのCFU-Mix,CFU-GM,CFU-G,CFU-Mも,各々対照の約1/3,1/2,2/3,4/5に減少していたが,胎仔肝,末梢血中とも,顆粒球,リンパ球の量的,質的異常は認められなかった.VLA-4分子による以外の機構が代償的に働いて,これらの系統の分化,増殖を促しているものと考えられた.VLA-4のリガンドの一つ,VCAM-1に対する抗体をin utero投与しても,マウスには貧血はおこらなかった.赤芽球生成では,VLA-4/VCAM-1の接着より,VLA-4とそのもうひとつのリガンド,Fibronectin(FN)との接着が重要であるらしい.以上の結果は,VLA-4分子がin vivoでは赤芽球生成においてのみ重要な働きをしていることを示し,これまでのin vitroの報告と一部異なっていた(投稿中).現在,我々の研究室で作製した抗体VLA-5抗体を用いて,FNをリガンドとするVLA-5分子の役割を検討している.平成5年度は,研究の焦点を,β_1インテグリン分子のうちのVLA-4分子におき,その血球上の発現と機能についてひととおりの知見を得た.フローサイトメトリー上,抗VLA-4モノクローナル抗体(PS/2.3)と,血球のlineage markersを用いた多重染色でVLA-4の発現を調べたところ,VLA-4分子は,未熟リンパ球,c-kit^+/lin^-血液幹細胞に強く表現され,細胞の成熟にともなって発現量が減弱した.VLA-4分子を介する接着/シグナルがin vivoでの血球発生に果たす役割を調べるため,PS/2.3(胎盤を通過)を妊娠マウス腹腔内に投与し続けると,著しい貧血マウスが生まれた.出生前後の主たる造血器である肝臓では,赤芽球の島状増殖像がほぼ消失し,肝単離細胞をフローサイトメトリーで調べると,TER119^+赤芽球が対照マウスの1/15以下に減少していた.また,in utero抗体投与胎仔肝に由来するBFU-E,CFU-Eは対照の1/2程度に減少,肝臓には幹細胞はある程度存在するが,成熟停止状態におかれていることが示唆された.一方,同マウスのCFU-Mix,CFU-GM,CFU-G,CFU-Mも,各々対照の約1/3,1/2,2/3,4/5に減少していたが,胎仔肝,末梢血中とも,顆粒球,リンパ球の量的,質的異常は認められなかった.VLA-4分子による以外の機構が代償的に働いて,これらの系統の分化,増殖を促しているものと考えられた.VLA-4のリガンドの一つ,VCAM-1に対する抗体をin utero投与しても,マウスには貧血はおこらなかった.赤芽球生成では,VLA-4/VCAM-1の接着より,VLA-4とそのもうひとつのリガンド,Fibronectin(FN)との接着が重要であるらしい.以上の結果は,VLA-4分子がin vivoでは赤芽球生成においてのみ重要な働きをしていることを示し,これまでのin vitroの報告と一部異なっていた(投稿中).現在,我々の研究室で作製した抗体VLA-5抗体を用いて,FNをリガンドとするVLA-5分子の役割を検討している.
重力波を用いた重力理論の精密な検証

(1)修正重力理論の重力波伝播への影響連星系からの重力波は宇宙大規模構造中を伝播する際に弱い重力レンズ効果により増光・減光を受ける。従来、この重力レンズ効果は観測における系統的雑音として考えられていたが、その大きさは宇宙大規模構造の成長具合に関する情報をもたらすので、宇宙膨張や修正重力理論での重力の強さを測るのに役立つ。我々はまず、重力波の受ける重力レンズ効果が宇宙論パラメータにどう依存するかを調べた。そして、複数の連星からの重力波を観測することにより将来の銀河サーベイ等を上回る精度で宇宙論パラメータ(物質パワースペクトル)を決定出来ることを示した。また、パラメータ化した修正重力理論のトイモデルでも非常に良い精度で宇宙論的距離での重力の強さを測定出来ることを示した。(2)連星系からの重力波の偏極モードによる重力理論の検証重力理論を修正すると一般的に重力の自由度が増えるので、重力波の偏極モードの数も一般相対性理論と比べて増える。この余分な偏極モードの有無を観測的に調べることによりモデルに依存しない重力理論の検証が出来る。前年度までの研究において背景重力波の観測による重力波偏極モード探査について調べたが、本年度は連星系や超新星爆発等からの重力波に対しても適用可能な偏極モード探査法を構築し、現実的な検出器雑音を取り入れた数値シミュレーションによってその解析方法の有効性を示した。(3)初期宇宙における重力理論の検証前年度までの研究では、f(R)重力という修正重力理論について調べ、インフレーションと現在の宇宙加速膨張の両方を統一的に説明出来るモデルを構築出来ることを確認した。本年度は重力波観測からそのようなモデルに対して観測的制限を与えることを試みた。まず、インフレーション時期に生成される背景重力波スペクトルを計算した。そのスペクトルの周波数依存性からビッグバン元素合成からの観測的制限が最も厳しいことが分かり、上記モデルの典型的なパラメータ領域は既に観測的に棄却されているという結果を得た。本研究は、ダークエネルギーの物理的起源や初期宇宙での物理を明らかにするために、修正重力理論としての可能性に着目し、次世代の精密天文学としての重力波を用いてその性質を明らかにすることを目的としている。具体的には、重力波の波形やスペクトルが予言可能な連星系からの重力波及び背景重力波に焦点を当て、修正重力理論の検証のための理論的枠組の構築および修正重力理論への制限に関する研究を行う。初年度は、連星系から重力波による宇宙加速膨脹の測定に関する研究を行った。このテーマに関する研究は計画以上に順調に進行し、我々は、スペース重力波検出器の将来計画において遠方(高赤方偏移)の宇宙までのハッブルパラメータを電磁波の観測よりも精度良く決定出来ることを示した。また、従来から問題であった電磁波観測によって連星系のホスト銀河を特定しなければならないという点について新たに研究を進めた。その結果、重力波観測単独でも原理的には宇宙膨張を測定出来ることを示し、将来スペース重力波検出器では連星系のホスト銀河を特定せずとも精度良く宇宙加速膨張を調べられることを明らかにした。背景重力波の直接観測による重力波偏極モード探査に関しては、我々はまず、修正重力理論検証のための理論的枠組および観測手法を構築した。修正重力理論に制限を課すためには重力波の生成も修正重力理論によって扱う必要があるが、我々は重力の高次曲率項がインフレーションを起こすモデルに着目し、生成過程を解析した。そして、数値計算によって重力波スペクトルの計算を行った。現時点で、重力波スペクトルに修正重力理論の特徴が現れること、それを重力波検出器の将来計画で検証出来る可能性があることが分かっている。これについては次年度も研究を継続する予定である。本研究は、ダークエネルギーの物理的起源や初期宇宙での物理を明らかにするために、次世代の精密天文学としての重力波を用いて重力理論を検証することを目的としている。具体的には、重力波の波形やスペクトルを予言可能な連星系からの重力波及び背景重力波に焦点を当て修正重力理論の検証のための理論的枠組の構築および修正重力理論への制限に関する研究を行う。連星系から重力波による宇宙加速膨脹の測定に関しては、遠方(高赤方偏移)の宇宙までのハッブルパラメータを各赤方偏移で測定するという研究テーマについて、スペース重力波検出器の将来計画を用いればそれが可能であることを示した。また、宇宙膨張を測定するには電磁波観測によって連星系のホスト銀河を特定こと必須であったが、我々は新たに重力波の振幅情報だけでなく位相情報も用いることにより、電磁波観測の助けを借りずに宇宙膨張を測定出来るという結果を得た。さらに、その結果を応用し、ダークエネルギーを必要とせずに宇宙加速膨張を説明する非一様宇宙モデルに対して重力波を用いれば決定的な検証を行えることを示した。以上の結果は、将来的に重力波でダークエネルギー探査を行うための具体的方法として重要である。もう1つの研究トピックは背景重力波の直接観測による重力波偏極モード探査である。修正重力理論に制限を課すためには重力波の生成も修正重力理論によって扱う必要があるため、重力の高次曲率項がインフレーションを起こす理論モデルについて研究を行った。その結果、インフレーションを起こし、その後観測と矛盾せずに現在の宇宙を実現出来る修正重力理論を構築出来ることが分かった。そして、数値計算によって重力波スペクトルの計算を行い、重力波スペクトルに修正重力理論の特徴が現れること、それを重力波検出器の将来計画で検証出来る可能性があることを示した。(1)修正重力理論の重力波伝播への影響

連星系からの重力波は宇宙大規模構造中を伝播する際に弱い重力レンズ効果により増光・減光を受ける。従来、この重力レンズ効果は観測における系統的雑音として考えられていたが、その大きさは宇宙大規模構造の成長具合に関する情報をもたらすので、宇宙膨張や修正重力理論での重力の強さを測るのに役立つ。我々はまず、重力波の受ける重力レンズ効果が宇宙論パラメータにどう依存するかを調べた。そして、複数の連星からの重力波を観測することにより将来の銀河サーベイ等を上回る精度で宇宙論パラメータ(物質パワースペクトル)を決定出来ることを示した。また、パラメータ化した修正重力理論のトイモデルでも非常に良い精度で宇宙論的距離での重力の強さを測定出来ることを示した。(2)連星系からの重力波の偏極モードによる重力理論の検証重力理論を修正すると一般的に重力の自由度が増えるので、重力波の偏極モードの数も一般相対性理論と比べて増える。この余分な偏極モードの有無を観測的に調べることによりモデルに依存しない重力理論の検証が出来る。前年度までの研究において背景重力波の観測による重力波偏極モード探査について調べたが、本年度は連星系や超新星爆発等からの重力波に対しても適用可能な偏極モード探査法を構築し、現実的な検出器雑音を取り入れた数値シミュレーションによってその解析方法の有効性を示した。(3)初期宇宙における重力理論の検証前年度までの研究では、f(R)重力という修正重力理論について調べ、インフレーションと現在の宇宙加速膨張の両方を統一的に説明出来るモデルを構築出来ることを確認した。本年度は重力波観測からそのようなモデルに対して観測的制限を与えることを試みた。まず、インフレーション時期に生成される背景重力波スペクトルを計算した。そのスペクトルの周波数依存性からビッグバン元素合成からの観測的制限が最も厳しいことが分かり、上記モデルの典型的なパラメータ領域は既に観測的に棄却されているという結果を得た。幾つか研究テーマについては研究計画に沿って研究を進め、その結果の論文発表を行うことが出来た。一方で、想定していなかったテーマについても研究を行ったために、まだ手を付けられていない研究計画の部分があるため。概しては研究計画に沿って、引き続き研究を進める。ただし、「修正重力理論における連星系から放射される重力波波形」に関しては研究計画提出直後にこの研究分野での幾らかの研究進展があり、連星から放射される重力波にはあまり大きな影響が無い傾向にあることが分かってきた。したがって、連星系からの重力波放射過程ではなく、重力波の伝播に着目して研究を進めていくことを予定している。
マルテンサイト系耐熱鋼の非破壊的余寿命評価法の開発

火力発電プラントの高温厚肉部材には高Cr耐熱鋼が多く使用されており,クリープ変形がおきる条件で使われている。本研究は,高Cr耐熱鋼の代表例であるマルテンサイト組織のフェライト系耐熱鋼を対象とし,クリープ条件での非破壊的余寿命評価法の確立と実用化を目的として研究し,以下の結果を得た。1.高Cr耐熱鋼のクリープ強度に影響しうる因子には,転位(マルテンサイトラス)組織,ラス境界や粒界に析出するM23C6やLaves相などの析出物,ラス内部に析出する微細なMX炭窒化物,および固溶元素(W,Moなど)の4つがある。これらのうちで転位組織は,材料中で最も密に存在する障害物で,高Cr耐熱鋼の強さを決めている。そして,転位組織の回復とクリープの進行や破壊が密接に関連している。従って,転位組織の回復を寿命消費の指標とすべきである。2.クリープ変形によって,マルテンサイトラス組織の回復(ラス幅の増大)が起きる。マルテンサイトラス幅の変化率Δλ/Δλ^*とひずみの間には直線関係があり,この関係は試験温度や応力によらない。ここで,Δλはある時点でのラス幅と初期値の差,Δλ^*はラス幅の飽和値と初期値の差である。3.これまでに得られているクリープ曲線データをθ法を使ってデータベース化すれば,クリープ曲線を容易に推定できるようになる。この結果とラス幅とひずみの関係の検量線を組み合わせれば,任意条件での余寿命が評価できる。この準非破壊的余寿命評価の手法を提案した。4.低温焼戻しのタービン用TAT650鋼では,上記のラス幅測定に基づく寿命評価が有効である。これに対して高温で焼戻したボイラ用HCM12A鋼では,粒界キャビティによる脆性破壊をし,キャビティの発生・成長に基づく寿命評価が有効である。近年,火力発電プラントの高温厚肉部材に,高Cr耐熱鋼が多く使用されている.これらの高温構造部材は.クリープ変形がおきる条件で使われる.本研究では,高Cr耐熱鋼の代表例であるマルテンサイト組織のフェライト系耐熱鋼を対象とし,クリープ条件での非破壊的余寿命評価法の確立と実用化を目的として研究を行い,以下の結果を得た.1.クリープ変形によって,マルテンサイトラス組織の回復(ラス幅の増大とラス内転位密度の低下)が起きる.マルテンサイトラス幅の変化率Δ入/Δλ^*とひずみの間には直線関係があり.この関係は試験温度や応力によらない.ここで,Δλはある時点でのラス幅と初期値の差,Δλ^*はラス幅の飽和値と初期値の差である.2. Δλ/Δλ^*とひずみの関係を,改良9Cr-1Mo鋼,およびwを含むNF616鋼,HCMl2A鋼,TAF650鋼で調査した.その結果,Δλ/Δλ^*とひずみの関係が,試験条件のみならず,材料にもよらず1本の直線で表現できることが明らかになった.この成果から,ラス幅の変化率Δλ/Δλ^*とひずみの関係の検量線は,広範な試験条件(温度,応力)や多種の材料に適用できることを実証した.3.マルテンサイト組織のフェライト系耐熱鋼でこれまでに得られているクリープ曲線データをθ法を使ってデータベース化すれば,クリープ曲線を容易に推定できるようになる.

この結果とラス幅-ひずみ検量線を組み合わせれば,任意条件での余寿命が評価できる.この準非破壊的余寿命評価の手法を提案した.4.室温で測定した硬度とラス幅の逆数の間には,クリープ試験条件(温度,応力)によらない直線関係があることが明らかになった.この関係を使えば,硬度測定からラス幅の変化を非破壊的に評価できる.5.硬度とラス幅の逆数の関係の直線は,材料によって平行移動する.この移動は,材料内の炭化物析出量の差違に起因している.近年,火力発電プラントの高温厚肉部材に,高Cr耐熱鋼が多く便用されている。これらの高温構造部材は,クリープ変形がおきる条件で使われる。本研究は,高Cr耐熱鋼の代表例であるマルテンサイト組織のフェライト系耐熱鋼を対象とし,クリープ条件での非破壊的余寿命評価法の確立と実用化を目的としている。本年度はクリープを支配する組織因子の特定を目的として研究を行い,以下の結果を得た。1.高Cr耐熱鋼のクリープ強度に影響を及ぼしうる因子には,転位(マルテンサイトラス)組織,ラス境界や粒界に析出するM23C6やLaves相などの析出物,ラス内部に析出する微細なMX炭窒化物,および固溶元素(W,Moなど)の4つがある。2.固溶元素量がクリープ強度に及ぼす影響は小さい。従って,クリープ中の固溶元素の枯渇(析出物の生成)は,寿命消費の指標とならない。3.MX析出物はクリープ中に安定で,MX析出物数も寿命消費の指標とはならない。4.転位は,材料中で最も密に存在する障害物で,高Cr耐熱鋼の強さを決めている。そして,転位組織の回復と3次クリープの出現およびその後の破断は,密接に関連している。従って,転位組織の回復を,寿命消費の指標とすべきである。なお,ラス幅,ラス内転位密度などから,転位組織の回復が評価できる。5.M23C6やLaves相の析出間隔は広く,それ自体は,クリープ中の転位運動を直接支配する障害物ではない。しかし,これらの障害物の凝集粗大化は,転位組織の回復に影響し,析出物の凝集粗大化が早いと,転位組織の回復も早い。従って,これらの析出物数の変化は,寿命消費の間接的指標となる。近年,火力発電プラントの高温厚肉部材に,高Cr耐熱鋼が多く使用されている。ところで,この種のフェライト鋼は長時間試験条件で,短時間試験結果からの予測より早期に破断する。この早期破断は重大な問題であり,本年度はその原因解明と予知法の検討を中心に研究を行い,以下の結果を得た。1.高温で焼戻したボイラ用HCM12A鋼では,Laves相析出物を起点として,応力軸に垂直な粒界にキャビティが発生する。このキャビティが連結してき裂となり,脆性破壊する。この材料ではキャビティ生成による延性の低下が早期破壊の原因である。2.HCM12A鋼の脆性破壊条件では,クリープ中にはラス幅の顕著な増大は起きず,ラス幅の測定よりは,キャビティの発生・成長に基づく寿命評価が有効である。3.低温焼戻しのタービン用TAT650鋼では,キャビティの発生やそれにともなう脆性破壊ではなく,延性破壊する。この材料ではラス組織の急速な回復が早期破壊の原因である。4.TAF650鋼ではこれまで提案してきたラス幅測定に基づく寿命評価が有効である。
アレルギー患者血清に反応するコムギアレルゲン候補タンパク質の検出と解析

試料として国内産コムギの主要品種である北海道産ホクシンを用いた。コムギタンパク質の抽出条件及び2次元電気泳動の条件等の設定を行った。一次元目の展開範囲としてpI310を選択した。二次元目の電気泳動としSDS-PAGEを選択し、良好な二次元展開像を得られるようになった。しかし、15kDa以下の比較的低分子量のタンパク質については二次元目の電気泳動の泳動先端部に収束してしまい、十分な分離が得られなかった。そこで、低分子量のタンパク質を十分な分離能をもって分離するため二次元目の電気泳動の条件を検討した。低分子量のタンパク質の分離に用いられるTris/Tricine/SDSバッファー系を用いた電気泳動ではタンパク質の抽出に用いた界面活性剤がバックグラウンドとして出現し、分離を妨げた。酢酸-尿素ゲルを用いた電気泳動(AU-PAGE)を検討したところ低分子量のタンパク質の優れた分離が認められた。そこで、本研究においては、SDS-PAGEとAU-PAGEを併用して、コムギタンパク質の二次元電気泳動による分離を行った。アレルゲン候補タンパク質の検出については、市販のコムギアレルギー患者血清を6点入手した。これらの血清を用い、イムノブロッティングを行い患者血清中のIgEが認識するタンパク質をウェスタンブロッティング検出システム(ECLplus)にて検出した。いずれの患者血清においてもIgE結合タンパク質が複数個検出された。検出されたタンパク質について分子量(MW)、等電点(pI)を二次元電気泳動像解析ソフトにより算出した。これらのIgE結合タンパク質のうち、複数の患者血清によって認識されるタンパク質数種について一次構造解析に供した。N末端アミノ酸配列の解析ではピークが認識されず、N末端のブロックが推定された。質量分析(MS)においては、数種のタンパク質について同定に至った。コムギの試料として国内産主要品種である北海道産ホクシンを用いた。コムギタンパク質の抽出条件及び2次元電気泳動の条件等の設定を行い、良好な2次元展開像を得られるようになった。市販のコムギアレルギー患者血清を数点収集した。これら市販血清を用い、イムノブロッティングを行い患者血清中のIgEが認識するタンパク質を化学発光法(ECLplus)により検出した。いずれの患者血清においても患者血清IgE結合タンパク質が単数個のみでなく複数個検出された。検出されたタンパク質について分子量(MW)、等電点(pI)を2次元電気泳動像解析ソフトにより算出した。患者血清と反応性のあるタンパク質は主としてMW40kDa、pI8付近を中心とする一群のタンパク質とMW15kDa、pI7付近を中心とするタンパク質であった。質量分析(MS)においては、分析に供したタンパク質のうちMW40kDa前後、pI7付近に展開される一種のタンパク質については同定に至ったので、現在、更に詳細な検討を重ねている。しかし、他のタンパク質についてはMS解析においても明確なピークを得ることが出来ていないので、MS解析の前処理である加水分解等の条件検討を行っている。

そこで、低分子量のタンパク質を十分な分離能をもって分離するため二次元目の電気泳動の条件を検討した。低分子量のタンパク質の分離に用いられるTris/Tricine/SDSバッファー系を用いた電気泳動ではタンパク質の抽出に用いた界面活性剤がバックグラウンドとして出現し、分離を妨げた。酢酸-尿素ゲルを用い電気泳動(AU-PAGE)を検討したところ低分子量のタンパク質の優れた分離が認められた。そこで、本研究においては、SDS-PAGEとAU-PAGEを併用して、コムギタンパク質の二次元電気泳動による分離を行った。アレルゲン候補タンパク質の検出については、市販のコムギアレルギー患者血清を6点入手した。これらの血清を用い、イムノブロッティングを行い患者血清中のIgEが認識するタンパク質をウェスタンブロッティング検出システム(ECLplus)にて検出した。いずれの患者血清においてもIgE結合タンパク質が複数個検出された。検出されたタンパク質について分子量(MW)、等電点(pI)を二次元電気泳動像解析ソフトにより算出した。これらのIgE結合タンパク質のうち、複数の患者血清によって認識されるタンパク質数種について一次構造解析に供した。N末端アミノ酸配列の解析ではピークが認識されず、N末端のブロックが推定された。質量分析(MS)においては、数種のタンパク質について同定に至った。
Hox遺伝子産物による転写調節機構

Hox遺伝子群はショウジョウバエAntp遺伝子群に構造が類似した遺伝子としてクローン化された哺乳類遺伝子群であり、哺乳類の発生過程を制御している転写因子をコードする遺伝子群である。本研究の目的はHox遺伝子産物の発生過程における転写調節機構を明らかにすることである。我々は転写因子の抗体を用いた標的遺伝子クローン化法によって単離したHoxA7、mg1-1などのHoxC8遺伝子の標的遺伝子の発現が、Hox遺伝子産物によってどのようにコントロールされているかを解析した。標的遺伝子の発現をHox遺伝子産物と協同的に制御している転写因子の同定をいくつかの方法でおこなったところ、酵母ツ-ハイブリッドシステムにおいてHoxC8遺伝子産物とHoxC9遺伝子産物が特異的に相互作用していると考えられる結果を得た。この相互作用は、HoxC8およびHoxC9ターゲットマウスに生じる形態異常の類似性から考えて、個体レベルでも作用しているものと考えられる。さらに、相互作用に関わる領域を詳しく解析した結果、HoxC8のセカンドエクソンと、HoxC9のファーストエクソンによってコードされる領域の間で相互作用が起こっていることが明らかになり、これまでに報告されているホメオドメイン間の相互作用とは異なる領域の間での相互作用であると考えられる。またHoxC8と相互作用する蛋白をツ-ハイブリッドシステムを用いてスクリーニングした結果、マウス胎児で発現している未知の遺伝子を得た。
高分解能電子顕微鏡による高速粒子照射した金属・合金中の損傷欠陥形成発達過程の研究

本研究では低温で高速粒子線照射した金属のクライオ・トランスファ-電子顕微鏡法を開発し、イオン及び中性子照射した金属の変位カスケ-ド損傷形成を基本とする損傷組織発達の原子レベル点欠陥過程での従来の考え方を完全に塗り変える新しい知織を得た。これらは:(1)高速で金属中を走るイオンにより中心部が高濃度の原子空孔よりなりそのまわりを格子間原子が取り囲んでいる"変位カスケ-ド損傷"が形成してその中心部の原子空孔は集まりかなり大きな電子顕微鏡で観察可能な原子空孔集合体をつくると考えられていた(カスケ-ド・コラプス)。我々はこの考え方は正しくなく、変位カスケ-ド損傷形成冷却期直後の状態では原子空孔集合体は電子顕鏡では観察出来ないくらいの非常に小さいサイズのものであり、従来は表面等のシンクに移動して消減すると考えられていた格子間原子が純金属では電子顕微鏡観察可能な集合体を形成する事を明らかにした。(2)照射した試料中には電子顕微鏡では観察困難な大きさの原子空孔集合体及び格子間原子集合体が多数形成している事をあきらかにした。(3)照射量の増大と共にこれらの観察困難な欠陥は、その近傍に形成する変位カスケ-ド損傷より放出されるエネルギ-により観察可能な欠陥に変化する。この現象をカスケ-ド・エネルギ-・オ-バ-ラップと呼んでいる。分子動力学的な方法によるコンピュ-タ-計算によりこの本質の解明を行っている。変位カスケ-ド損傷形成時にカスセ-ド芯にて発生するショック波によるもの説明した。(4)変位カスケ-ド損傷形成時に格子間原子はカスケ-ド芯より強く弾き出されてカスセ-ド芯よりかなり離れた場所で格子間原子集合体を形成する事が明らかにした。格子間原子ショック波への波乗り機構(サ-フ・ライデング)によると機構を提案している。さらに高温照射での損傷組織形成・発達につにて、特にボイド形成で、多くの新しい知見を得ている。本補助金にて購入した高分解能電子顕微鏡に米国ローレンス・リバモア国立研究所より日米協力事業による共同実験に使用して広島大学工学部に送り還えされている20Kでの中性子照射した電子顕微鏡用金属試料を極低温にてクライオ・トランスファーして発生期の損傷欠陥を観察するための装置を結合する為の工作等を一部行った.この装置は次年度は完成出来て実験がスタート出来る予定である.液体窒素温度でクライオ・トランスファーする実験は本年度で実施が可能になり一部の金属試料についての実験結果を得た.即ち回転ターゲット中性子源(RTNSーII)を使用して極低温(<20K)にて核融合中性子照射した金属試料で日本国内に低温(78K)に保ったまま送り還されてきた試料を用いて,クライオ・トランファー電子顕微鏡観察を行った.その結果中性子照射損傷の基本単位である"変位カスケード損傷"の構造は低照射量では格子間原子は観察可能な大きさに集合しているが,原子空孔は通常の回析コントラスト法では観察出来ないような小さい多数の集合体を形成している事が明らかになった.しかし中性子照射量の増加と共にカスケード・エネルギーのオーバーラップが起きて,観察出来ない様な微小集合体が格子緩和して観察可能な欠陥構造に変化する事も明らかになった.このようなクライオ・トランスファー電子顕微鏡観察では観察時の電子照射効果が欠陥構造の緩和に非常に影響を与えることも明らかにした.さらにこれらのカスケード損傷欠陥の熱的安定性を焼鈍実験により調べた.特に本研究では微小点欠陥集合体のタイプをも正確に決定して行っているのが特徴で他に類をみない納得出来る結論に到達している.高速増殖炉 ̈常陽"で高温照射したモリブデン及び鉄を用いて高温にて中性子照射中に形成する損傷欠陥発達過程を調べた.格子間原子かた位ループが大きなサイズに成長し転位組織が形成する.ボイドの形成も観察された.本研究では低温で高速粒子線照射した金属のクライオ・トランスファ-電子顕微鏡法を開発し、イオン及び中性子照射した金属の変位カスケ-ド損傷形成を基本とする損傷組織発達の原子レベル点欠陥過程での従来の考え方を完全に塗り変える新しい知織を得た。(4)変位カスケ-ド損傷形成時に格子間原子はカスケ-

ド芯より強く弾き出されてカスセ-ド芯よりかなり離れた場所で格子間原子集合体を形成する事が明らかにした。格子間原子ショック波への波乗り機構(サ-フ・ライデング)によると機構を提案している。さらに高温照射での損傷組織形成・発達につにて、特にボイド形成で、多くの新しい知見を得ている。金属を中性子照射すると中性子と金属構成原子との衝突により高速で結晶中を走る第一ノックオン原子(PKA)が発生して、この原子が停止するところに中心部が高濃度の原子空孔よりなりその周囲を格子間原子が取り囲んでいる"変位カスケード損傷(DCD)"が形成する。低温で核融合中性子照射して低温でのcryotransfer電子顕徴鏡観察法による本研究によりDCDが単独に形成する時には中心部の原子空孔は電子顕徴鏡で観察可能な点欠陥集合体には発達しないで極徴小な集合体で存在する事が明らかになった。この結果は従来信じられていたカスケード・コラプスの概念を覆すものである。格子間原子はDCD中心部より弾き飛ばされて離れた所で電子顕徴鏡観察可能な集合体をAu,Cu,Ag等では形成する。これらの格子間原子集合体はFCCでは{111}面上に板上に集合するが、従来広く信じられていたように不動転位ではなく、<110>方向に沿って全体として移動することが本研究より明らかになり、これらの動的な挙動をビデオ観察する事に成功した。この動きは表面に飛び出さない点で従来の単純な常識とは異なっている事を明らかにした。更にDCD中心部より飛び出す格子間原子の移動距離がAuでは従来信じられているreplacement collision sequenceの距離よりはるかに大きい500nmにも及んでいる事が明らかになった。他の金属ではこれらの物理定数はどの様な値を持つか今後の実験結果が待たれる。このような電子顕徴鏡実験において、gun defectと呼ばれている電子顕徴鏡のフイラメントより飛んでくるイオンによる損傷欠陥の形成の事実とそのトラブルの対応策について詳しく調べた。この点を詳しく事前にチェックした後の実験でないとこの種類の実験結果は信用おけない事を強調したい。今後に極低温で核分裂中性子照射した電子顕徴鏡用金属試料のクライオ・トランスファー実験装置の開発を行なった。ミュンヘン及び京都大学の原子炉で極低温照射を行なう予定。極低温にて核融合及び核分裂中性子照射した金属・合金の電子顕微鏡試料の液体窒素温度クライオ・トランスファ-電子顕微鏡観察による損傷形成直後の構造を調べる実験を行った。特に極低照射量の観察結果より変位カスケ-ド損傷形成時に損傷芯部の原子空孔は電子顕微鏡では観察出来ない程の極微小点欠陥集合体を形成しており、損傷部よりはじき出された格子間原子はかなり長距離にわたり移動して中心部よりかなり離れた所で集合体を形成する。格子間原子の集合体の大きさは金属の種類により非常に異なる事が判明した。照射量の増加に伴い変位カスケ-ド損傷部よりはじき出された格子間原子はそれ以前に形成している格子間原子集合体に吸収されるかまたはその近辺にて停止して新しい格子間原子集合体を形成する。このような格子間原子の長距離移動の機構は現在の所不明であるが我々が以前に明らかにしたカスケ-ド・エネルギ-・オ-バ-ラップ現象の起こす担い手であるであろう。
キラルな遷移金属触媒による不斉分子内C-H挿入反応の開発

RH_2(OAc)_4を触媒とするα-ジアゾカルボニル化合物の分子内C-H挿入反応は、優れた五員環構築法として天然物の骨格合成に利用されてきている。これまでにも各種の二価ロジウム二量体錯体が合成され、特徴ある選択性を有した触媒反応が開発されてきているが、未だ挿入位置及び不斉選択性の制御に関し問題を残している。本研究では、種々の二価ロジウム二量体錯体、及びその骨格に捕われぬ各種の金属錯体を合成し、より高い不斉選択性を発現させる触媒反応系の開発を目指した。具体的には、2-ジアゾ-3-オキソ-6-フェニルヘキサノレートエステル類を基質として用い、以下の検討を行なった。1.リン酸ビナフチル誘導体を配位子とした二価ロジウム二量体錯体を合成し、その触媒反応性を検討した。2.二価ロジウム二量体錯体以外に、ルテニウム、パラジウムなどの錯体の触媒反応性を調べた。1の検討により、新規な錯体であるロジウム(II)リン酸ビフェナンスリル錯体が、この環化反応において比較的高い不斉収率を与える触媒となることが明かとなった。2の検討に関しては、今のところ充分な収率及び選択性を与える新たな触媒の発見には至っておらず、さらに検討が必要と思われる。今後は、上記の点について検討を続けるとともに、基質に関しても展開していく予定である。
環境化学物質の代謝的毒性化機構に関する動物種間比較毒性学的研究 ー チトクロームP-450を中心として ー

肝臓の異物代謝酵素P450の変動要因としてa)遺伝的要因,b)性,年齢,c)肝障害,d)肝臓癌,e)その他の疾患,f)異物による暴露の影響が考えられる。それぞれについて実験動物を用いて変動の様子を検討した。コントロールされていない環境下に棲息する野生動物の異物代謝酵素活性について研究するに当り、問題となるのは、様々な要因により肝臓の異物代謝に変動を来している可能性である。野生エゾヤチネズミのなかにCYP2Dの異常と考えられる個体が数例含まれていた。そこで、CYP2Dに遺伝的異常が知られているDAラットをモデル動物として様々な異物代謝能力を測定すると共に、遺伝的な異常の要因を明らかにするため、遺伝子レベルでの研究を行った。DAラットにおけるCYP2D1の欠損はmRNAが何等かの理由で合成されないためであるという報告がある。この報告と同じ方法で追試したところ、mRNAは転写されており、DAラットのmRNAからCYP2D1のcDNAの配列の一部を合成出来た。DAラットに置ける活性の低下はむしろCYP2D1のアミノ酸の置換による活性喪失と考える方が妥当かも知れない。LECラットにおける自然発症肝癌組織と周辺組織でのP-450依存代謝活性を調べたところ、肝癌組織でP-450分子種選択的に活性の低下が見られた。雄の方が雌より活性の高い性差のある代謝活性はほぼ雌のレベルまで低下した。一方、雌で雄より活性の高い反応の活性は雄で上昇せず、従って、老化の場合のような機能的雌性化とは異った。また、周辺組織でも活性の低下が見られたが、癌組織ほどの低下は見られなかった。汚染環境下で野外で棲息する野生動物においては、様々な汚染化学物質が生体の異物代謝機構に影響を与えていることが考えられる。そこで、モデルコンパウンドを用いてその影響を調べ、誘導、阻害などの影響について検討した。モクズガニのP-450含量と河川の汚染の程度、特に多環芳香族炭化水素汚染との間には正の相関があった。汚染物質がP-450の誘導を行うためであると考えられる。P-450を環境汚染の指標酵素として利用することが出来ると考えられた。イヌ上科肉食動物(イヌ、キツネ、ミンク、クマ)の異物代謝酵素活性はラットと比較すると概して低いが、イヌ、キツネは活性が高く、ミンクは極めて低い値を示した。異物代謝の動物種差の検出に有用な反応を検索し、これを用いて、種々の動物の肝ミクロソームの代謝活性を調べ、環境汚染物質に対する適応性の種差、年齢差などを検討することを本年度の目的とした。(1)Propranolol代謝の基質立体選択性及び、代謝部位選択性の解毒酵素P-450分子種による違いを調べた。異なるP-450分子種は異なる選択性を示し、また、その選択性は基質濃度によっても異なった。これらのことからpropranololはP-450分子種の特性を調ベる上で有用な基質であることが示された。

(2)低濃度のpropranololを基質として用いた場合、ラットの肝臓でpropranolol7位水酸化体は主代謝物の一つであるが、イヌ、クマ等では7位水酸化体生成が欠損していた。(3)イヌ科のイヌ、ミンク、クマ、キツネの肝ミクロソームを用いて、P-450 2Dの活性の指標としてbunitrolol代謝活性を測定したところ、PCB汚染に弱いといわれるミンクで活性が顕著に低かった。また、これらの動物のなかでP-450含量はミンクが最も低く、キツネが最も高かった。(4)Western blot法により、ラットの各P-450分子種と免疫学的に類似のP-450分子種の存在をコイ、フナ、ヤツメウナギ、モクズガニで調べたところ、モクズガニでP-450 2Dと免疫交差性のある蛋白の存在が認められたが、その他のP-450分子種では免疫交差性が認められなかった。(5)ラットにおける変異原物質の代謝的活性化と年齢の関係をAmes法及びその変報を用いて検討した。Benzpyreneを変異原物質とした場分、活性中間体の生成はyoungの方がoldより顕著に多かった。ところがこれを無毒化する補酵素の存在下では両者に大きな差はなかった。従って、Bemzpyreneの消失は、大量に中間体の出来るyoungの方が早いといえ、発癌の危険性はyoungの方が少ないといえる。直接変異原物質、AF2を用いた場合、youngとoldに差はなく、nitrofluoreneを用いた場合ではoldの方が顕著に変異原性が高かった。以上の結果から、oldラットの方が化学物質による発癌のリスクが大きいことが明かになった。1、植物の葉緑体による異物代謝の研究から、有機溶媒中で葉緑素と基質が光存在下で高い効率で脱メチル化を受けること、脱メチル化にはシングレットオキシジェンが関与していることが分かった。葉緑体による異物の解毒と代謝的活性化の研究に重要な発見である。2、日本をはじめ、アジア地域に広く分布しているモクズガニのP-450レベルおよびその活性が河川の汚染度の指標となる可能性が示された。日立利根川、石狩川、茨戸川、尻別川より得たモクズガニの肝膵臓P-450含量は各河川のベンズピレン濃度に良い相関を示した。P-450は全ての哺乳類に存在すると考えられ、この酵素が汚染の指標になることは環境評価の上から重要である。3、ミンクはP-450含量が他のイヌ上科の動物よりはるかに低く、ミンクがPCB等の汚染に弱い事実と関連がありそうである。このような対応関係は汚染に強い動物と弱い動物の予測に重要な意味を持つ。4、ミンクはプロプラノロール7位水酸化酵素であるP-450BTL含量が極めて低く、それに対応して7位水酸化活性も無視できるほどの活性しかなかった。プロプラノロール代謝活性である程度P-450分子種レベルの予測が可能なことが示された。5、イヌの肝臓より異物を高い親和性で代謝するP-450分子種を精製した。N-末端のアミノ酸配列はP-4502Dサブファミリーのそれと一致した。コントロールされていない環境下に棲息する野生動物の異物代謝酵素活性について研究するに当り、問題となるのは、様々な要因により肝臓の異物代謝に変動を来している可能性である。肝臓の異物代謝酵素P450の変動要因としてa)遺伝的要因,b)性,年齢,c)肝障害,d)肝臓癌,e)その他の疾患,f)異物による暴露の影響などが考えられる。
力学刺激の減少に伴い起こる培養系筋萎縮は臨床の廃用性筋萎縮モデルになりうるか？

前年度に引き続き、実験に適切な培養細胞による筋萎縮モデルの確立のために、筋培養細胞に活動負荷を与えた状態で培養した後、脱負荷状態に切り替えて培養し萎縮の形態学的検証を行った。具体的には、モデルとして適切な活動負荷時間・強度・頻度、脱負荷時間と萎縮や肥大の変化を組織学的、生化学的に検証した。そして、本モデルが理学療法効果判定のモデルとして適当かどうかを検証した。蛋白質合成機構については、PI3K/ Akt/ mTOR経路、mTOR/ p70S6K経路、MAPK/MEK/ERK経路などに関わる分子の活性をウエスタンブロット法により検証した。ユビキチンープロテアソーム系の蛋白質分解機構は、ユビキチンリガーゼE1阻害剤(UBEI-41:BIOGENOVA)を培地に添加して、本モデルにおける筋管細胞の横径の減少抑制の有無を検証した。またプロテアソーム阻害剤を培地に添加して、プロテアソームで認識されるK48ポリユビキチン鎖によって修飾されたタンパク質の増加を検証した。オートファジー系の蛋白質分解機構は、オートファジーに重要な分子であるLC3の活性をウエスタンブロット法により確認した。オートファジーの活性は、LC3II/LC3Iの値で評価した。その結果、これまでに明らかになってきた刺激強度のコントロール、刺激時間と休息時間のサイクルに関してその詳細がほぼ明らかになった。これに加えて本モデルが、高負荷トレーニングにおける過負荷時の回復のメカニズムを明らかにするためのモデルとして有効となる可能性も示唆された。廃用性筋萎縮に効果的な理学療法を解明するには、培養細胞を用いた廃用性筋萎縮モデルが不可欠である。薬物投与による培養筋萎縮モデルの報告はあるが、シグナルの一部を止めただけのモデルである。蛋白質分解・合成機構が絡む複雑なメカニズムを持つことが推測される臨床の廃用性筋萎縮のモデルとしては不十分であると考える。そこで本研究の目的は、臨床を模擬し、運動の脱負荷による培養筋萎縮モデルを確立させることにある。そして、本モデルがヒトや動物で起こる廃用性筋萎縮と同様の細胞内応答が起こるかどうか、異なる点はどこかを調べることにより、廃用性筋萎縮モデルになりうるかどうかを検証する。最終的には、いまだ不明な点の多い廃用性筋萎縮のメカニズムに迫るとともに、新しい理学療法の方策の検証へと萌芽させる。当該年度は、実験に適切な培養細胞による筋萎縮モデルの確立のために、筋培養細胞に活動負荷を与えた状態で培養した後、脱負荷状態に切り替えて培養し萎縮の形態学的検証を行った。具体的には、モデルとして適切な活動負荷時間・強度・頻度、脱負荷時間と萎縮や肥大の変化を検討した。その結果、これらのパラメータの中で、特に活動負荷時間や強度に関して、目的に合った条件がおおむね判明した。特に、刺激強度に関してのコントロールは非常に重要であり、刺激強度が強すぎると通常の運動状態から比べて過負荷トレーニング状態を模擬しており、刺激中止(特に中止直後の数時間)は休憩状態を模擬していることを示唆する結果を得た。当該年度の目標であった、筋培養細胞に活動負荷を与えた状態で培養した後、脱負荷状態に切り替えて培養し萎縮の形態学的検証(モデルとして適切な活動負荷時間・強度・頻度、脱負荷時間と萎縮や肥大の変化)を行った結果、その条件の中で、特に活動負荷時間や強度に関して、おおむね判明したため。ユビキチンープロテアソーム系とオートファジー系との両蛋白質分解機構や合成機構が、本筋萎縮モデルで活性化しているかどうか、またそれが必須かどうかを明らかにする実験を加えた。その結果、昨年度おおむね明らかになってきた、モデルとして適切な活動負荷時間・強度・頻度、脱負荷時間と萎縮や肥大の変化との関係を確定させた。特に、昨年度明らかになった刺激強度に関してのコントロールに加え、刺激時間と急速時間とのサイクルが非常に重要であることが判明した。当該年度の目標であった、筋培養細胞に活動負荷を与えた状態で培養した後、脱負荷状態に切り替えて培養し萎縮の形態学的検証(モデルとして適切な活動負荷時間・強度・頻度、脱負荷時間と萎縮や肥大の変化)を組織学、生化学的に行った結果、その条件の中で、特に活動負荷時間や強度に加え、刺激時間と急速時間とのサイクルに関して判明したため。