hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顕微鏡画像解析による炭素収支の水圏高度精度評価

地球レベルでの二酸化炭素の収支が大きな社会的関心を集めているが、このような大きなスケールでの議論では、もっとも精度荒くデータが集められた部分がシュミレーションモデルの結果を左右する。そこで、水圏生態系における重要度の大きな微小プランクトンの現存量の高精度測定法の確率に取り組んだ。手法としては、落射蛍光・位相差顕微鏡に画像解析装置を接続し、位相差による細胞外部形態の測定と同時に、異なった蛍光染色による細胞パラメーターの測定を試みた。バクテリアを材料としたモデル実験から、DAPI染色によって細胞核の形状情報が、またAcridine orange(AO)染色からRNA含量の変化が把握されうることを確認した。成果は、平成6年(1994年)10月に東京で行われた国際シンポジウム、"Microbial Diversity in Time and Space"で報告し、さらに論文としてPlenum出版社から1995年に出版される同名の成書に掲載される(成果1)。ついで、同じくバクテリアを材料に増殖速度と各種細胞パラメーターの変動の関係について実験的解析を行った。その結果、増殖速度と細胞サイズには密接な関係があることを見いだした。さらに細胞サイズを支配するのはRNA含量であることが、従来化学分析から認められていたが、これを直接顕微鏡下で確認し、その変動は細胞周期に左右されていることを明らかにした。またバクテリア研究にとって重大きな課題であった、どのようなバクテリア細胞は培養が可能であり、またどのような細胞は培養できないかについて、細胞周期やRNA含量との関わりで、これに新たな解釈を加えることができた。成果2としてこれをとりまとめ、現在Applied and Environmental Microbiologyに投稿中である。本研究は、顕微鏡画像解析により海洋の重要な優占種である珪藻をはじめ、最近になってさまざまな水域でその重要度が指摘されはじめた微小藍藻や、微生物ループの主要な担い手であるバクテリアのバイオマスを精度高く見積もることである。微小藍藻のモデルともなるバクテリア(E.coli)を対象に増殖過程(Growth phase-生理状態を反映していると考えられる)の異なる細胞の各種パラメーターについて興味深い知見を得た(下表)。現存量(細胞バイオマス)の迅速で精度の高い測定が本研究の第1の目的であるが、その変動についての知見を加えることができるとの見通しが立った。上に結果の一部を示したように本研究の前段階は予定通り進行している。ただ酵素処理によるAO染色領域の内容評価については、成果が出ておらず目下最重要課題として取り組みつつある。また細胞成分のうち炭素量については、測定機器の準備が完了したので本年度後半期にこれに取り組む。本研究の目的は、水圏生態系の物質循環において重要な位置を占める微小プランクトンの現存量を顕微鏡画像解析装置を導入して精度高く見積もる手法を確立することと、細胞サイズの変動要因について基礎的な知見を得ることである。アクリジンオレンジによる一本鎖RNA染色法が、物質循環研究の目的にかなった感度と内容をもつ細胞染色法であることは、バクテリアをモデルに、増殖速度を異にした細胞のDNA含量とRNA含量の個別測定を行うことにより確認された。また、バクテリアから藻類にわたる水圏生態系を構成する主要なプランクトンを材料に、アクリジンオレンジによる染色領域と炭素含量の間によい相関のあることが確認されつつある。成果の一部は“Microbial Diversity in Time and Space"(Ed. by U. Shimidzu,Plenum,1995)に発表した。本研究の所期の目的に到達するには、さらに細胞の増殖速度や環境への応答がアクリジンオレンジにより正確に評価出来るかどうか、バクテリア同様の知見を微小藻類についても得る必要がある。これについては現在、昼夜培養による細胞の応答を主題に共同研究者と実験を継続して行っている。
脳動脈瘤多発家系を用いた責任遺伝子の解明

平成16年度は、(1)感受性遺伝子の存在領域の探索、(2)相関研究のための患者対照参加者唐の血液の収集、(3)既に相関が報告されている遺伝子群との相関の確認の3つを行った。(1)家系を用いた連鎖解析:平成16年度に引き続き、西日本を中心に、家族集積性のある脳動脈瘤家系を地域の中核病院を中心に検索した。その結果17cent、19q13,Xp22の3領域を候補遺伝子の存在候補部位として見出した。(2)相関研究のための患者対照参加者唐の血液の収集:MRAあるいは手術により脳動脈瘤の存在が確認されている参加者をケースとし、MRAで所見がなく40歳以上で家族歴がなく脳血管疾患の既往のない参加者をコントロールとした。ケース362名、コントロール332名の参加を得た。我々の参加者では、相加モデルを採用した場合、リスクハプロタイプのリスク比1.2とした場合、検出力は85%以上である。(3)相関の検討:Elastin(7q11),NOS2A(17cent),APOE(19q13),ACE2(Xp22)および17centにおける遺伝子群のSNPsを用いて(2)で収集した集団で検討した。家系から1名を選び全エクソンの配列決定を行い、SNPsを見出し検討した。これらSNPsのうち我々の集団のハプロタイプの80%以上をカバーするようSNPsを選択し相関研究を行った。その結果、Elastin(7q11),MRIP(17cent),NOS2A(17cent),APOE(19q13),ACE2(Xp22)には有意な連鎖は見出されなかった。この一方、17centにおけるTNFRSF13Bでは、リスクを有するハプロタイプの外、ケースでエクソン3,4においてNonsense mutationsを見出した。その結果、TNFRSF13Bが感受性要因を高める可能性が示唆され,免疫系の関与が示唆された。
JCウィルスをもちいた行旅死亡人の関する研究

本研究の目的は、ヒト腎臓に寄生するJCウィルスのDNA型判定が、日本における身元不明死体の生前の居住地判定に応用可能かを検索することにあった。この目的のため、法医学教室において解剖された、出身地が明らかである日本人または外国人遺体から供された死体腎を用い、JCウィルスのDNAを抽出しPCRにて増幅後型判定を行った。その結果、以下の知見が得られた。1.6割程度の死体腎からJCウィルスのDNA型が検出される。2.死後数ヶ月を経た腐敗死体からも検出が可能。3.ホルマリン保管された腎臓標本からも検出が可能4.日本人からは日本型であるCYまたはMY型のみが検出される。5.インド、ミャンマーなどに居住していたものからは日本型であるCYやMYは検出されず、その地域に特徴的な型が検出された。6.死後10ヶ月経過したイギリス人の死蝋化死体からはヨーロッパに検出されるBlc型が検出された。これらの結果から、死後経過時間の長い遺体場合や、ホルマリン標本となった標本など、法医学領域で扱う遺体や試料においても本方法が適応可能で、さらにはCYやMY型以外の型が検出された場合は日本人でない可能性が高いことが示され、本方法が法医学領域においても十分応用可能であることが期待された。今後、さらに日本人、外国人両方の検体数をふやし、CYまたはMY型以外が出た場合の、外国人である確率などを算定する必要があると考えられた。また、本方法はヒトDNAでなく、寄生生物のDNAに着目することが、出身地域推定により有用である事を示した点で大変意義深いと考えられた。従来のヒトDNA型の判定によっては、身元不明死体が外国人であるか、日本人であるかの判定を行うことは困難とされてきた。本研究は、寄生ウィルス、特にヒト腎臓に寄生するJCウィルスに着目し、そのDNA型の判定が、日本における身元不明死体の生前の居住地の判定に応用できるかを検索することを目的として行われた。我々は、東京大学法医学教室で解剖された64体の腎臓と、36体の尿検体につき、PCR法によってJCウィルスのIG領域を増幅しその検出率の測定および、型判定を行った。その結果、腎臓からの検出によっては45%、尿からの検出によっては33%の検出率でJCウィルスが検出された。検出は死後10日経過した遺体からも可能であった。また、一体から、左右の腎臓、尿などの複数の検体でJCウィルスが検出された場合、JCウイルスのDNA型はいずれも同一であり、死体においてもヒト1個体に存在するJCウィルスは1種類しか存在しないことが示された。一方、東京を中心として、日本を東北地域と南西地域に分けた場合、東北地域に出生地を有する遺体からはMY型、南西地域に出生地域を有する遺体からはCY型のJCウィルスが主に検出された。これらの結果から、死後相当日数経過した遺体からもJCウイルスが検出可能で、それによってある程度は、遺体の出身地が東北地域なのか南西地域なのかが示されうることが示唆された。これらを考慮すると、身元不明の行旅死亡人の身元判定にJCウィルスの検出とその型判定が有用であり、その普及が必要であると考えられた。
動的非線形特性に基づく高次元情報を活用した化学センサの開発

味覚・嗅覚において重要となる、神経細胞の電気インパルスの発生と伝播が、非線形・非平衡下で生じる現象であることに着目して、非線形・非平衡を活用した分子認識システムの開発について研究を行った。まず、半導体ガスセンサの非線形応答を指標としたガス分析について、これまで識別が困難であった炭化水素ガスを定量的に判別することが可能になった。これは、センサとガス種との表面反応の違い(反応速度、活性化エネルギー、反応過程)が非線形応答として反映されることを利用したもので、入力信号に対する出力信号の歪み(非線形応答)をフーリエ変換の高調波成分として定量的に評価する方法である。また、混合ガス系についても、応答波形の重ね合わせから2成分ガスからの特定ガスの検出が可能になった。次に、ガス種の非線形応答を理論的に解明するために、半導体のバリアポテンシャル、電子密度、化学反応速度、活性化エネルギーをパラメータとした計算機シミュレーションを行った。これにより、活性化エネルギーや反応速度の違いにより特徴的な非線形応答を再現することに成功した。また、電気化学的非線形性を指標としたタンパク質の吸着特性の評価への応用についても研究を行った。実際には、吸着物質により形成される電気二重層容量は、タンパク質の化学構造に依存して特徴的な電圧依存性を示す。実際には、チオール基を導入したタンパク質を金電極に共有結合で固定化し、電極界面のみの情報を抽出した。また、原子間力顕微鏡観察、水晶振動子による測定を行い、電極表面への定量的な吸着量や吸着状態の確認をした。
肺水腫回復過程におけるENaC遺伝子発現制御の分子機構と生理的意義

肺胞上皮はNa^<+>を一方向に輸送する機構を備えている。生理的条件下ではこの機構により肺胞腔内は水分のない状態に保たれ、肺胞・毛細血管防御壁の重要な構成要素となっている。高濃度酸素肺障害において上皮型ナトリウムチャネル(Epithelial Na^<+>Channel:ENaC)の遺伝子発現・蛋白発現の低下のみならず機能においても低下することを確認した。さらに、糖質コルチコイドによりENaC遺伝子・蛋白発現の亢進がみられ、ENaCによる水腫液の回収が増強した。生理的条件下ではENaCは肺胞腔内からの水分の輸送に関与し、肺胞腔内をfluid-freeの状態に維持している。これが、肺胞腔内における水分調節機構の本態であり、実験モデルを用いて急性肺損傷の発症にENaCが重要であることは研究されている。エンドトキシン、炎症性サイトカインがENaCの発現を低下させること、あるいは酸化ストレスが糖質コルチコイド依存性のENaCの転写を障害することが報告され、急性肺損傷の発症にENaCの遺伝子・蛋白発現の低下、機能の低下が重要であることが示されている。しかし、急性肺損傷の回復においてENaC遺伝子発現・機能が重要であるという発想に基づいて行なわれた研究の報告はなく、この点で本研究は独創的である。また、急性肺損傷において種々の薬剤によるENaC発現調節が急性肺損傷の回復にどのような影響を与えるかをみた報告もない。高濃度酸素暴露肺障害マウスモデルを作成し、ENaC遺伝子の発現・機能に及ぼす影響を検討した。高濃度酸素に72時間暴露し、肺障害マウスモデルを作成する。暴露する酸素濃度60%、80%、100%の3群作成した。1)ENaC遺伝子および蛋白発現の酸素暴露による影響摘出肺を用いて、ENaC遺伝子発現・蛋白質発現をReal Time RT-PCR法、免疫組織染色により検討すると、濃度依存性に抑制された。2)組織学的検討100%酸素暴露により肺胞隔壁の肥厚、炎症細胞浸潤が確認されたが、60%酸素暴露では、ほぼ、正常であった。3)肺血管透過性100%酸素暴露により摘出肺の湿乾重量比は有意に増加した。暴露した酸素濃度に依存して、湿乾重量比の増加がみられた。4)パッチクランプ法による機能解析マウス肺からII型肺胞上皮細胞を分離培養し、培養環境の酸素濃度を室内気、60%、80%の3群で以下の実験を行ない、酸素暴露による影を検討した。単一イオンチャネル電流および全細胞電流を測定し、ENaCのチャネルゲーティイングキネティークス(opening rateおよびclosing rate)およびENaCの膜上での密度を検討したところ、酸素暴露によりENaCの質的量的減少がみられた。5)酸素暴露による酸化ストレス抗8-OHdG抗体により摘出肺を免疫組織染色したところ、肺胞上皮の細胞核に抗8-OHdgが認められ、高濃度酸素による酸化ストレスがみられた。ENaC蛋白修飾における糖質コルチコイド、甲状腺ホルモンのシグナルカスケード高濃度酸素肺障害マウスをにおいてSGK1活性は、糖質コルチコイド、甲状腺ホルモンにより増強した。すなわち、糖質コルチコイド、甲状腺ホルモンがSGK1を介して、ENaCを肺胞腔側へ移動させ、ENaCを膜表面に発現させ、水腫液の回収を増強させた。SGK1は、Nedd4-2をリン酸化する。リン酸化を受けたNedd4-2では、ENaCの細胞内取り込み活性が抑制される。すなわち、SGK1はNedd4-2のリン酸化を介して、肺胞腔側膜に存在するENaCの数を増大させる。糖質コルチコイド、甲状腺ホルモンによりNedd4-2のリン酸化を介したENaCの膜表面の発現は増強した。ガス交換能糖質コルチコイド、甲状腺ホルモンにより、動脈血酸素分圧は改善した。
アルツハイマー病の予防・治療の両方に効果を示す化合物の探索

我が国は、高齢者の増加に伴い、痴呆症の数が増大している。痴呆症の約60%以上はアルツハイマー病が原因と言われている。従ってアルツハイマー病は大きな社会問題となっている。その原因はアミロイドβの凝集が原因と考えられているが、その治療薬はまだ承認されていない。そこで治療薬のリード化合物の候補になりえる化合物を天然資源、特に研究があまり進んでいない海洋由来真菌類に求めることにした。初めに我々の研究室の海洋由来真菌の培養抽出物ライブラリーを用いて、ランダムスクリーニング(Th-T法:アミロイドβ凝集試験)を行った。その結果凝集抑制の認められたGalactomycespseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスとMPUC 239の酢酸エチル抽出エキスに関して活性試験を行いながら、分離操作を行っている。現在Galactomyces pseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスからは1種の新規化合物を含め合計3種の化合物を,MPUC 239の酢酸エチル抽出エキスからは2種の化合物を単離しそれぞれ構造を明らかにした。このうち、Galactomyces pseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスから単離した既知化合物SC2051は強いアミロイド凝集抑制活性を示した(IC50 = 2.5 μM)。一方ランダムスクリーニングでアミロイドβ凝集抑制活性を示した別の海洋由来真菌MPUC 239の酢酸エチル抽出エキスに関しても活性試験を行いながら分離操作を行った。初めにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで5個の画分に分画した(Fr.1Fr. 5)。活性画分Fr.2をさらに分離を行い、Fr. 3-2から化合物AをFr. 3-4から化合物Bを単離した。次に各化合物の各種スペクトルデータから構造解析を行い、化合物Aはnaphtho-γ-pyrone類の既知化合物fonsecin、化合物Bもnaphtho-γ-pyrone類の既知化合物rubrofusarinであった。1. 2018年度活性があり構造も明らかとなったbis (naphtho-γ-pyrone)類の既知化合物SC2051について、電気泳動を用いて凝集が抑制されることを証明する。2.海洋由来真菌MPUC 239の酢酸エチル抽出エキスの活性画分からのさらなる化合物の単離を目指す。ここで得られた化合物は各種スペクトルデータから構造を解明する。さらに得られた化合物に関し、Th-T法でアミロイドβ凝集抑制活性を調べ、活性を示した化合物については、電気泳動を用いて凝集が抑制されることを証明する。我が国では高齢者の増加に伴いアルツハイマー型認知症の患者が増加している。認可された薬剤も対症療法を目的とするもので、根本治療を目指したものではない。そこで、病因の一つと考えられているアミロイドベータタンパク質の凝集に着目(アミロイド仮説ではアミロイドベータのオリゴマーが病因と言われている)し、試験法として一般に用いられているチオフラビン-T法を用いた。この評価法を用いて、海洋由来真菌培養物からアミロイドベータタンパク質凝集抑制化合物を単離し、さらに各種スペクトルデータから構造を解明する事とした。まずはじめに、海洋由来真菌培養物抽出エキス200以上について、チオフラビン-T法を用てアミロイドベータタンパク質凝集抑制を示すエキスを調べた。その結果、MPUC398培養物のクロロフォルム抽出エキスおよび酢酸エチル抽出エキスが阻害活性を示した。この内、酢酸エチル抽出エキスについてチオフラビン-T法で凝集を評価しながら各種クロマトグラフィーを行い化合物の単離を行った。その結果、阻害活性画分Fr. Eから2種の化合物を単離することが出来た。まだ他にも活性を示した画分Fr.Cやクロロフォルム抽出エキスに関してもアミロイドベータタンパク質凝集抑制化合物の存在が考えられるので、凝集抑制化合物の単離を行い、得られた阻害活性化合物に関してはさらに細胞を用いた試験を行う予定である。本研究で得られた化合物がシード化合物となり、今だ開発されていないアルツハイマー型認知症治療薬の開発の一助となりえる事を期待している。保有する海洋由来真菌培養抽出物の内クロロフォルム抽出エキス94種、酢酸エチル抽出エキス120種についてチオフラビンーT法を用いてアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性を試験したところ、3種の抽出エキス(MPUC398のクロロフォルムおよび酢酸エチル抽出エキス、MPUC385の酢酸エチル抽出エキス)が強い阻害活性を示した。このうち0.05 mg/mLの濃度で約90%の阻害を示したMPUC398の酢酸エチル抽出エキスについて、阻害活性化合物の探索を行った。海洋由来真菌MPUC398を麦(3 kg使用)-人工海水培地を用いて培養を行い、得られた培養物をクロロフォルムおよび酢酸エチルで順次抽出を行い、クロロフォルム抽出エキス13.2 gおよび酢酸エチル抽出エキス8.0 gを得た。得られたMPUC398酢酸エチル抽出エキス8.0 gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画を行い7画分(Fr. AFr. G)を得た。得られた7画分について凝集抑制活性試験を行ったところ、Fr. C(2.3 g)とFr. E(0.9 g)に阻害活性が認められた。

このうちTLCの結果から分離操作がより容易と思われたFr. EについてさらにODSシリカゲルを用いて分離を行い5画分(Fr. E1Fr. E5)に分画した。このうちFr. E3とE4に凝集抑制活性が認められた。Fr. E4をさらにHPLCを2度行うことによって化合物1を6.5 mg単離した。またFr. E3はメタノール可溶部と不溶部に分けることが出来不溶部はTLCで単離を確認できたので化合物2とした。我が国は、高齢者の増加に伴い、痴呆症の数が増大している。痴呆症の約60%以上はアルツハイマー病が原因と言われている。従ってアルツハイマー病は大きな社会問題となっている。その原因はアミロイドβの凝集が原因と考えられているが、その治療薬はまだ承認されていない。そこで治療薬のリード化合物の候補になりえる化合物を天然資源、特に研究があまり進んでいない海洋由来真菌類に求めることにした。初めに我々の研究室の海洋由来真菌の培養抽出物ライブラリーを用いて、ランダムスクリーニング(Th-T法:アミロイドβ凝集試験)を行った。その結果凝集抑制の認められたGalactomycespseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスとMPUC 239の酢酸エチル抽出エキスに関して活性試験を行いながら、分離操作を行っている。現在Galactomyces pseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスからは1種の新規化合物を含め合計3種の化合物を,MPUC 239の酢酸エチル抽出エキスからは2種の化合物を単離しそれぞれ構造を明らかにした。このうち、Galactomyces pseudocandidus (MPUC 398)の酢酸エチル抽出エキスから単離した既知化合物SC2051は強いアミロイド凝集抑制活性を示した(IC50 = 2.5 μM)。一方ランダムスクリーニングでアミロイドβ凝集抑制活性を示した別の海洋由来真菌MPUC 239の酢酸エチル抽出エキスに関しても活性試験を行いながら分離操作を行った。初めにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで5個の画分に分画した(Fr.1Fr. 5)。活性画分Fr.2をさらに分離を行い、Fr. 3-2から化合物AをFr. 3-4から化合物Bを単離した。次に各化合物の各種スペクトルデータから構造解析を行い、化合物Aはnaphtho-γ-pyrone類の既知化合物fonsecin、化合物Bもnaphtho-γ-pyrone類の既知化合物rubrofusarinであった。1.前年度海洋由来真菌MPUC398培養物の酢酸エチル抽出エキスについてアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性試験を評価しながら阻害活性画分Fr. Eから2種の化合物を単離できたので、この化合物の各種スペクトル測定を行い得られたデータから構造を解明する。2.酢酸エチル抽出エキスから得られたもう一つの阻害活性を示した画分Fr. Cについてもアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性試験を評価しながら阻害活性化合物の単離を行う。3.海洋由来真菌MPUC398培養物のクロロフォルム抽出エキスからもアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性化合物の単離を行う。
汚染除去可視化による清潔のセルフケア能力アセスメントツールの開発

看護師が行う日常生活動作(ADL)のセルフケア能力のアセスメントは、見た目の動きの観察による経験に頼った主観的な判断に負うところが大きい。セルフケア能力は単に動作ができる能力を意味するのではなく、動作により目的が達成できる能力を意味する必要がある。清潔では、その動作ができることではなく、「洗浄による汚染の除去」という目的を自分で達成する能力が問われる。しかし、従来のアセスメント方法では、洗浄による汚染の除去ができているかどうかは判断できない。本研究では、洗浄による汚染の除去を可視化し、清潔動作のセルフケア能力を客観的かつ簡易に判断できるアセスメントツールを開発することを目的とする。
頭頸部癌の発生を抑制する遺伝子（脱リン酸化酵素）の同定と機能解析

申請者は、ケラチノサイト特異的にPpp6cを欠損させたマウスでは、紫外線照射で皮膚扁平上皮がんが発生し、その組織ではPpp6c欠損と変異型p53が共存することを見出した。次に、ケラチノサイト特異的に2重変異(Ppp6c欠損と変異型K-ras)をもつマウスは、変異型K-rasのみをもつマウスに較べて、口唇、指、肛門などの体表面の組織が著しく腫瘍化が促進されることを見出した。本研究では、扁平上皮特異的に、2重(Ppp6c欠損+変異型K-ras、あるいはPpp6c欠損+変異型p53)、あるいは3重変異マウス(Ppp6c欠損+変異型Kras+変異型p53)を作製して、頭頸部腫瘍における、PP6の機能不全の“相乗的"作用による発がん機構を検証する。
大気中における酸素濃度の超精密測定法の開発に関する研究

本研究で試作した装置は、検出部に質量分析計を採用し、ガラス製試料導入部、精密導入圧調整部、測定データ処理部から構成されている.試料導入部と検出部の間は内径25mmのフューズドシリカキャピラリーで接続した.これにより、試料空気の流れが気体成分分別の起こる分子流とならず、しかも試料空気を大気圧で導入できるという2条件を同時に満足させることが可能になった.本装置を高精度化する過程で、空気試料の導入法の違いにより酸素濃度が130per megも変化することが明らかになった.そこで、分別が起こらない操作を実験的に見出した.また、試料が流れる配管の低温部に酸素が濃縮することも明らかになった.そのため、装置を空調した部屋に設置し、熱容量の小さいキャピラリー部を断熱材で2重に被覆した.さらに、イオン化の際に二酸化炭素から生成される一酸化炭素が酸素濃度測定の基準となっている窒素分子に対して妨害成分となること、すなわち等質量分子の干渉効果が見い出された.そこで、二酸化炭素濃度と酸素濃度の関係を実験的に求め、実試料測定の際の補正に用いることにした.本装置によって求められる酸素濃度は、ある標準試料に対する相対値であるため、基準となる安定した標準ガスが必要となる。本研究においては、容積471の4本の高圧シリンダーに除湿した外気を充填し、それを標準ガスとした。標準ガスの相互検定を頻繁に行い、各々の酸素濃度の長期安定性について調べた。今日までの相互比較の結果からは、明瞭な濃度ドリフトは見られず、全てのガスが±20per meg以内で安定しており、標準ガスとして十分に使用に耐えることが明らかになった。本計測法の総合分析精度は、119回に及ぶ標準ガスの相互検定を基にして評価され、標準偏差で±9.6permeg、標準誤差にして約±5.6per megであった。地球規模の炭素循環にとって意味のある酸素濃度の変化は有効数字の56桁目に相当しており、その測定には極めて高い精度が要求される.本研究においては、地球表層における炭素循環の定量的理解に寄与するために、この精度を満たす大気中の酸素濃度の超精密測定法の開発をおこなっている.今年度は、試料空気および標準ガスをイオンソースに導入するための調整部を設計・製作した.この調整部の材質は大部分パイレックスガラスであり、シール材にはバイトンのオーリングが用いられている.吸着や脱着などによって生じる酸素濃度のごく微量な変化を考慮して、この調整部は試料空気側と標準ガス側の接ガス部の材質や内面積が同じになるように配慮されている.試料空気や標準ガスのディテクターへの流入量を最適範囲にし、内面での同位体分別が起こらないガラス製キャピラリーを実験的に選択した.さらにスイッチングスピードの早いメタルシールバルブをあらたに質量分析計に付加して、ガラス製キャピラリーとつないだ.この試作装置を実用可能なものにするために基礎的な実験をおこなっている.これまでに明らかになった結果は以下の通りである.1)試料空気と標準ガスの圧力差が酸素濃度の測定値に影響を及ぼすことが明らかになった.圧力差と酸素濃度の間にはきれいな直線関係が成り立っていることから、実際の測定にあたっては圧力差を厳密にゼロにするか、計算により補正するかのどちらかを選ぶことが可能である.2)質量分析計のイオンソースでCO_2が分解された結果生ずるCOがO_2/N_2の測定の主要な妨害成分になることが分かっている.そこでCO_2濃度に対する妨害の大きさを実験的に評価した.本研究で試作した装置は、検出部に質量分析計を採用し、ガラス製試料導入部、精密導入圧調整部、測定データ処理部から構成されている.

試料導入部と検出部の間は内径25mmのフューズドシリカキャピラリーで接続した.これにより、試料空気の流れが気体成分分別の起こる分子流とならず、しかも試料空気を大気圧で導入できるという2条件を同時に満足させることが可能になった.本装置を高精度化する過程で、空気試料の導入法の違いにより酸素濃度が130per megも変化することが明らかになった.そこで、分別が起こらない操作を実験的に見出した.また,試料が流れる配管の低温部に酸素が濃縮することも明らかになった.そのため、装置を空調した部屋に設置し、熱容量の小さいキャピラリー部を断熱材で2重に被覆した.さらに、イオン化の際に二酸化炭素から生成される一酸化炭素が酸素濃度測定の基準となっている窒素分子に対して妨害成分となること、すなわち等質量分子の干渉効果が見い出された.そこで、二酸化炭素濃度と酸素濃度の関係を実験的に求め、実試料測定の際の補正に用いることにした.本装置によって求められる酸素濃度は、ある標準試料に対する相対値であるため、基準となる安定した標準ガスが必要となる。本研究においては、容積47lの4本の高圧シリンダーに除湿した外気を充填し、それを標準ガスとした。標準ガスの相互検定を頻繁に行い、各々の酸素濃度の長期安定性について調べた。今日までの相互比較の結果からは、明瞭な濃度ドリフトは見られず、全てのガスが±20per meg以内で安定しており、標準ガスとして十分に使用に耐えることが明らかになった。本計測法の総合分析精度は、119回に及ぶ標準ガスの相互検定を基にして評価され、標準偏差で±9.6permeg、標準誤差にして約±5.6per megであった。
エネルギー・環境調和型高効率窒素吸蔵合金の開発および機構解明

Ca-FeおよびCa-Co合金系にミリングを施すと、単体元素のみをミリングした場合のそれぞれの元素の窒素吸蔵能の和よりも吸蔵能が増加した。また、ミリング時間の増加とともに窒素吸蔵能が向上した。50時間ミリング後、Feの磁化の減少は7%であるが、Ca-Fe混合系にミリングを施すとFeの磁化は32%減少し、Ca-Co系では40.6%減少した。また純Coを50時間ミリングするとhcp相より磁化の大きいfcc相の出現や鉄不純物混入により4%の磁化増加が見られた。混合系における磁化の減少は非平衡合金相の形成を考えないと説明が難しく、x線解析の結果と考えあわせると、ミリングとともに粉末がナノレベルに混合され、アモルファス・ナノ微結晶構造を持ち窒素吸蔵能を持った新しいCa-FeおよびCa-Co非平衡合金相の形成が強く示唆される。磁化の減少はリジッドバンドモデルに基づいた原子モーメント線形dilutionモデルを用いてうまく説明される。Ca-Co合金系では最大で合金1molあたり0.2molの窒素放出が確認され、これはCa-Fe系の0.5molに比べると小さいが、もとの純元素による窒素の吸蔵能力を考慮すると13倍以上であり、ミリング処理による窒素吸蔵能の向上はCa-Co系合金の方が優れているといえる。最近は新たな窒素吸藏合金としてLi系のミリングも行い、化学真空ポンプの作製などについても活発に研究している。LiとFe, Cu, Alの組み合わせでは、金属間化合物や固溶体が生成すると(Li-Fe系は非固溶であるが過飽和固溶体が生成)、ミリング試料中のLiが窒素と反応する量が減少する。一方、熱力学的に安定で硬い酸化物(MgO、Al203)とLiを組み合わせてミリングを行うと、N2との反応性が高い微細混合物が得られた。NMRの結果よりAl203-Li系ではLiがイオン化しており02とも反応性を示した(空気吸蔵)が、MgO-Li系では金属Liのままであり、02と反応しなかった。またアルミナの結晶相の違いにより結果が異なることから、酸化物の安定度や結晶構造の相違が、原子レベルでLiと微細混合される酸化物の原子結合に影響すると推測される。Ca-Fe合金系にミリングを施すことにより、単体元素のみをミリングした場合のそれぞれの元素の窒素吸蔵能の和よりも吸蔵能が増加した。50時間のミリング後Feの磁化の減少は7%であるが、Ca-Fe混合系にミリングを施すとFeの磁化は32%減少し、この磁化の減少はCa-Fe非平衡合金相の形成を考えないと説明が難しい。x線解析の結果とも考えあわせると、ミリングによってアモルファス・微結晶構造を持ち窒素吸蔵能を持った新しいCa-Fe非平衡合金相の形成が強く示唆される。同様にCa-Cc合金系においてもボールミリング法を用いて混合した試料においては、ミリング時間の増加とともに粉末がナノレベルに混合され、X線回折分析や磁気測定、窒素吸蔵測定の結果からアモルファス・微結晶構造を持ち窒素吸蔵能を持った新しいCa-Co非平衡合金相の形成が強く示唆された。また、最大で合金1molあたり0.2molの窒素の放出が確認されたが、これはCa-Fe系合金の1molあたり0.5molの窒素の放出に比べると小さい。ただし、もともとの純元素による窒素の吸蔵能力を考慮すると、ミリング処理によって向上した窒素吸蔵能力はCa-Co系合金の方が優れているとも考えられる。また、La-Ni系合金に関しては、水素吸蔵でよく知られているLaNi5合金に焦点を当て研究を進めた。投稿論文の関係上詳細は述べることはできないが、アンモニアガスを用いた場合、LaNi5は窒素を多量に吸蔵・放出する能力があり、粉砕処理によって窒素吸蔵量が増加するが、550°C以上ではLaNを生成し窒素を放出できなくなる。また、水素ガスを用いた活性化処理は窒素ガスの吸蔵にわずかではあるが有効である。総合的に見てLaNi5は窒素吸蔵量に関しては既存の希土類合金に匹敵し、経済的に見ても最も効率的な窒素吸蔵合金の一つであることがわかった。Ca-Fe合金系にミリングを施すと、単体元素のみをミリングした場合のそれぞれの元素の窒素吸蔵能の和よりも吸蔵能が増加した。同様にCa-Co合金系においてもボールミリング法を用いて混合した試料においては、ミリング時間の増加とともに粉末がナノレベルに混合され、X線回折分析や磁気測定およびモデル分析、窒素吸蔵測定の結果からアモルファス・微結晶構造を持ち窒素吸蔵能を持った新しいCa-Co非平衡合金相の形成が強く示唆された。また、最大で合金1molあたり0.2molの窒素の放出が確認されたが、これはCa-Fe系の0.5molの窒素放出に比べると小さい。

ただし、もとの純元素による窒素の吸蔵能力を考慮すると、ミリング処理によって向上した窒素吸蔵能力はCa-Co系合金の方が優れているといえる。また、La-Ni系合金に関しては、水素吸蔵でよく知られているLaNi5合金について研究を進めた。アンモニアガスを用いた場合、粉砕したLaNi5は窒素を合金1モルあたり1.5モル吸蔵し、0.5モル放出する能力があり、粉砕処理によって窒素吸蔵量が増加するが、550°C以上ではLaNを生成し窒素を放出できなくなる。また、水素ガスを用いた活性化処理は窒素ガスの吸蔵にわずかではあるが有効である。総合的に見てLaNi5は窒素吸蔵量に関しては既存の希土類合金に匹敵し、経済的に見ても最も効率的な窒素吸蔵合金の一つである。また最近は新たな窒素吸藏合金としてLi系のミリングも行い、化学真空ポンプの作製などについても活発に研究している。Ca-FeおよびCa-Co合金系にミリングを施すと、単体元素のみをミリングした場合のそれぞれの元素の窒素吸蔵能の和よりも吸蔵能が増加した。また、ミリング時間の増加とともに窒素吸蔵能が向上した。50時間ミリング後、Feの磁化の減少は7%であるが、Ca-Fe混合系にミリングを施すとFeの磁化は32%減少し、Ca-Co系では40.6%減少した。また純Coを50時間ミリングするとhcp相より磁化の大きいfcc相の出現や鉄不純物混入により4%の磁化増加が見られた。混合系における磁化の減少は非平衡合金相の形成を考えないと説明が難しく、x線解析の結果と考えあわせると、ミリングとともに粉末がナノレベルに混合され、アモルファス・ナノ微結晶構造を持ち窒素吸蔵能を持った新しいCa-FeおよびCa-Co非平衡合金相の形成が強く示唆される。磁化の減少はリジッドバンドモデルに基づいた原子モーメント線形dilutionモデルを用いてうまく説明される。Ca-Co合金系では最大で合金1molあたり0.2molの窒素放出が確認され、これはCa-Fe系の0.5molに比べると小さいが、もとの純元素による窒素の吸蔵能力を考慮すると13倍以上であり、ミリング処理による窒素吸蔵能の向上はCa-Co系合金の方が優れているといえる。最近は新たな窒素吸藏合金としてLi系のミリングも行い、化学真空ポンプの作製などについても活発に研究している。LiとFe, Cu, Alの組み合わせでは、金属間化合物や固溶体が生成すると(Li-Fe系は非固溶であるが過飽和固溶体が生成)、ミリング試料中のLiが窒素と反応する量が減少する。一方、熱力学的に安定で硬い酸化物(MgO、Al203)とLiを組み合わせてミリングを行うと、N2との反応性が高い微細混合物が得られた。NMRの結果よりAl203-Li系ではLiがイオン化しており02とも反応性を示した(空気吸蔵)が、MgO-Li系では金属Liのままであり、02と反応しなかった。またアルミナの結晶相の違いにより結果が異なることから、酸化物の安定度や結晶構造の相違が、原子レベルでLiと微細混合される酸化物の原子結合に影響すると推測される。
膜貫通ヘリックス固定型tethered膜の作製と膜内タンパク質補足計測

本研究では膜内で相互作用する膜貫通ヘリックスの片方をガラス基板上に固定した繋ぎ止め膜(テザー膜)を作製し、蛍光標識したもう片方の分子と可逆に相互作用する際に、側方拡散が抑制される事を利用して蛍光相関分光法(FCS)や光褪色後蛍光回復法(FRAP)で相互作用力を迅速に評価しうる系を開発する。昨年度に引き続き、ポリエチレングリコール(PEG)でカバーガラス表面をコーティングし、かつ一部のPEGの先端に膜貫通ヘリックスを付加したガラス基板の作製を行った。これまでに、ガラス表面への膜の固定が十分でなく、膜貫通ヘリックス上部に膜が存在しても膜挿入速度が遅い事が課題だった。コーティング手順を変更し、リン脂質DPPEとPEGの結合体DPPE-PEGを付加したカバーガラスに大きな一枚膜ベシクル(LUV)を添加しインキュベートし、さらに乾燥・再水和することで、より高効率で平面膜が得られることが明らかになった。また、これまで用いてきたblue dextranでは、膜の欠陥部位から色素が流入し膜の裏表が区別できない問題があるため、ビオチン標識した膜貫通ヘリックスDye-K(biotin)-AALALAA AGLALGAAALALAAをアビジン標識量子ドットで検出する方法を採用した。これらの改善により、モデル膜貫通ヘリックスを固定した状態で平面膜を形成できること、固定化したペプチドの膜挿入トポロジーをコントロールできることが明らかになった。ポリエチレングリコール(PEG)でカバーガラス表面をコーティングし、かつ一部のPEGの先端に膜貫通ヘリックスを付加したガラス基板の作製を行った。蛍光色素carboxyrhodamine110またはtetramethylrhodamineを標識したモデル膜貫通ヘリックス(色素ーAALALAAAGLALGAAALALAA)を平均分子量5000のPEGを介してカバーガラス表面にコーティングした。まず、PEGをガラス表面に付加し、次に有機溶媒TFE中で膜貫通ヘリックスに付加したazideとPEGに付加したDBCOをclick chemistryによって反応させる手順でヘリックスをPEGコーティングの表面に均一に付加できることが明らかになった。ヘリックス色素の蛍光強度を共焦点顕微鏡で定量し、巨大一枚膜ベシクルに組み込んだ蛍光標識脂質の蛍光強度との比較から、脂質/ヘリックス比(700)を見積もった。またFCS法により、ガラス表面に載せた巨大一枚膜ベシクル中に組み込んだ蛍光標識ヘリックスおよび蛍光標識脂質の側方拡散を測定することができた。しかしながら、PEG表面にコーティングした膜貫通ヘリックスが巨大一枚膜ベシクルに挿入する速度が非常に遅く、一晩インキュベート後でも殆ど膜挿入が見られないことが明らかになった。膜貫通ヘリックスがPEG上で凝集、あるいはガラス表面に吸着したために、上部に膜が存在しても膜挿入速度が遅くなっている可能性が考えられる。初年度は膜貫通ヘリックスアンカー型繋ぎ止め膜作製・FCS測定による側方拡散測定の抑制を目標に研究を行った。tethered膜の形成に必要なコーティング技術および測定法を確立する事ができた。特に膜貫通ヘリックスを均一にコーティングする方法を確立できたことから目標の大部分は達成できた。ガラス表面への膜の固定が十分でなく、膜貫通ヘリックス上部に膜が存在しても膜挿入速度が遅い事が課題だった。コーティング手順を変更し、リン脂質DPPEとPEGの結合体DPPE-PEGを付加したカバーガラスに大きな一枚膜ベシクル(LUV)を添加しインキュベートすることで、自発的に膜融合が起き蛍光標識脂質の側方拡散が見られる条件を見出した。また、分子量の大きい消光剤であるblue dextranを添加することで、作製した平面膜の蛍光標識脂質の蛍光強度が約半分に減少したことから、膜の表側(ガラスと反対側)のみを消光でき、膜の裏表の区別が可能であることがわかった。また、DPPE-PEGの一部をDBCO-PEGに置き換えて、蛍光色素TMRで標識した膜貫通へリックスをDBCOに付加したところ、側方拡散しないペプチド由来の蛍光が観測され、ヘリックスが固定化されていることが確認できた。安定な平面膜の作製手順および、blue dextranを用いた膜の裏表を区別して消光する手法を見出す事ができた。今後、膜貫通ヘリックスの膜挿入の確認を行うことで、膜内へリックス相互作用による側方拡散測定を行う準備が整うと考えられる。

これまでに、ガラス表面への膜の固定が十分でなく、膜貫通ヘリックス上部に膜が存在しても膜挿入速度が遅い事が課題だった。コーティング手順を変更し、リン脂質DPPEとPEGの結合体DPPE-PEGを付加したカバーガラスに大きな一枚膜ベシクル(LUV)を添加しインキュベートし、さらに乾燥・再水和することで、より高効率で平面膜が得られることが明らかになった。また、これまで用いてきたblue dextranでは、膜の欠陥部位から色素が流入し膜の裏表が区別できない問題があるため、ビオチン標識した膜貫通ヘリックスDye-K(biotin)-AALALAA AGLALGAAALALAAをアビジン標識量子ドットで検出する方法を採用した。これらの改善により、モデル膜貫通ヘリックスを固定した状態で平面膜を形成できること、固定化したペプチドの膜挿入トポロジーをコントロールできることが明らかになった。今後、従来法を参考に超音波、ベシクル内外の浸透圧負荷、加熱などの処理によって、基板上で均一なtethered膜の作製を行い、膜貫通ヘリックス間相互作用による側方拡散抑制を測定しproof of conceptを行う。次に、(KR)3のような親水性タグを末端に付加した膜貫通ヘリックスを合成し、会合のトポロジー制御を試みる。さらに、GUVに組み込んだazide標識膜貫通ヘリックスを用いてtethered膜形成ができないか検討する。親水性タグ付加膜貫通ヘリックスを用いる事でGUV上でも会合トポロジー制御が可能である。GUVの代わりに細胞も用いて検討する。これらを通して、膜内タンパク質補足計測法技術を確立する。今後、膜挿入時に膜の表側、裏側にそれぞれ蛍光色素が位置するように標識した膜貫通へリックスをガラス表面に固定化し、blue dextranを用いて、ヘリックスの平面膜への挿入を確認する。次に、蛍光色素Cy5で標識した膜貫通へリックスを膜に組み込み、固定化へリックスによって側方拡散が抑制される事、そこから見積もられる会合自由エネルギーが過去の測定値と一致することを確認する。計測法が確立すればチロシンキナーゼ型受容体ErbB1とErbB2の膜貫通部位のヘテロ会合を測定する。
抗子宮体癌モノクローナル抗体を用いたミサイル療法の基礎的研究

(1)免疫複合体の作製:当研究室で作製した,子宮体癌細胞上に出現する糖鎖抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体MSN-1(IgM)と,抗癌剤アドリアマイシン(ADM),植物毒gelonin,及びコブラ毒phospholipase A_2(PLA_2)を,SPDPと2-iminothiolaneを用いてS-S結合させ,それぞれMSN-1-ADM複合体,MSN-1-gelonin複合体,MSN-1-PLA_2複合体を作製し,ゲル濾過法,陽イオン交換クロマトグラフィー法により分離精製した。電気泳動法,densitometryによりMSN-1 1分子当たり,それぞれADMが平均47分子,geloninが平均13.8分子,PLA_2が平均11.8分子結合した事が判明した。(2)in vitroにおける殺細胞効果の検討:MSN-1-PLA_2複合体をMSN-1の免疫原である高分化型子宮体癌由来培養細胞株SNG-IIに投与し,コロニー形成法により殺細胞効果を判定した結果,PLA_2単独のIC_<50>は1.64×10^<-8>M,MSN-1-PLA_2複合体のIC_<50>は6.08×10^<-10>M(PLA_2濃度換算)であった。コントロールに用いた,MSN-1に対する認識抗原を有さない子宮頸部扁平上皮癌由来培養細胞株SKG-IIIaに対するPLA_2単独のIC_<50>は3.50×10^<-8>M,MSN-1-PLA_2複合体は10^<-6>Mでも殺細胞効果を認めなかった。以上より,MSN-1-PLA_2複合体はPLA_2単独投与と比べ約30倍の高い選択的殺細胞効果を示した。(3)in vivoにおける殺細胞効果の検討:SNG-II,SKG-IIIaを同一ヌードマウスの左右背部にそれぞれ移植し,腫瘍形成確認後,MSN-1-ADM複合体,MSN-1-gelonin複合体,MSN-1-PLA_2複合体の各々につき,静注群,腫瘍局注群を設け,相対腫瘍重量比を比較して殺細胞効果を検討した。その結果,何れの複合体においてもSNG-IIのみに対し腫瘍局注群,静注群の順に選択的腫瘍抑制効果が認められた。特にMSN-1-gelonin複合体において腫瘍局注群では明らかな選択的腫瘍縮小効果を認めた。以上よりモノクローナル抗体MSN-1を用いたミサイル療法の臨床治療応用の可能性が示唆された。
MSMマウス・JF1マウス由来ES細胞を用いた遺伝子改変マウス作出と解析

MSM及びJF1は、日本固有のモロシヌス亜種から樹立されたマウス系統で、西ヨーロッパ産のマウスから派生した実験用マウスの系統とは、遺伝的にも表現型的にも大きく異なる。我々は、これらの系統で遺伝子導入や遺伝子破壊を可能にするためES細胞を樹立、それらのES細胞からは、生殖系列キメラを作製することができた。さらに、実際に遺伝子トラップによる変異マウス作製およびがん遺伝子のトランスジェニックマウス作製を行った。MSM/Ms及びJF1/Ms系統は、我が国固有のモロシヌス亜種から樹立された系統で、西ヨーロッパ産のドメスティカス亜種から派生した標準的近交系統との間で顕著な遺伝子多型を示し、その表現型も、代謝、行動、薬剤感受性・嗜好性などの点で非常に異なる。そこで、これらの系統を用いてノックアウトマウス作製・遺伝子機能解析を行うことで、従来の標準的近交系統だけからでは得られない、新たなゲノム機能の発見が期待される。我々は、Knockout Serum Replacement(KSR)を用いた培地でMSM/MsやJF1/Msの胚盤胞を培養することで、MSM/Msからは3系統(Mol/MSM-1、2、3)、JF1/Msから7系統(Mol/JF-17)のES細胞株を樹立した。これらのキメラ作製能を検証するため、ICR桑実胚とのアグリゲーションを行なった。Mol/MSM ES細胞では、すべての株からGermlineキメラが得られたが、Mol/JF ES細胞では、2系統からGermlineキメラが得られた。遺伝子操作後のキメラ形成能を検討するため、最も成績の良かったMol/MSM-lを用いて、遺伝子トラップベクターをエレクトロポレーション法により導入、得られたサブクローンを用いて桑実胚とのアグリゲーション法または胚盤法への注入法でキメラを作製した。レシピエント胚についても、ICR胚とC57BL/6XBDF1胚で成績を比較した。その結果、C57BL/6XBDF1胚を用いた胚盤法への注入法によるキメラ作製が最も効率良くキメラを得ることが出来た。これらのES細胞株は、ゲノムの多様性が表現型に与える影響の研究や新たなモデルマウス作製の有用なツールになると期待される。MSM/Ms及びJF1/Ms系統は、我が国固有のモロシヌス亜種から樹立された系統で、西ヨーロッパ産のドメスティカス亜種から派生した標準的近交系統とは顕著な遺伝子多型を示し、その表現型も、代謝、行動、薬剤感受性、発がん抵抗性などの点で大きく異なる。我々は、これらの系統で遺伝子導入や遺伝子破壊を可能にするためES細胞を樹立、昨年度は、MSM/Msから1系統(MQ1/MSM-1)、JF1/Msから2系統のES細胞株から生殖系列キメラが得られることを証明した。今年度は、生殖系列キメラ作製効率の最も成績の良かったMo1/MSM-1を用い、遺伝子トラップおよびがん遺伝子のトランスジェニックマウス作製を行った。遺伝子トラップクローンは、合計142クローンを単離、サザンプロットとPCRで100クローンがシングルコピー挿入で必要な領域が保存されていることを確認した。順次5' RACEやプラスミドレスキューにてトラップされた遺伝子を同定しており、現在までに38クローンについて結果が得られている。また、MSM/Ms系統における発がん抵抗性を検討するため、がん遺伝子であるc-Maf遺伝子を用いトランスジェニックマウス作製を行った。ヒトCD2プロモーターの下流にc-Mafを接続したトランスジーンに、ES細胞での選択のため、ネオマイシン耐性造伝子を組み込み、Mo1/MSM-1に導入、48クローンを単離した。そのうち、サザンブロットとPCRでプロモーターの5'末端まで欠失せずに保たれているクローン4つを同定した。これらのクローンを用いてキメラマウスを作製、2クローンよりマウスラインを樹立できた。胸腺での発現をリアルタイムPCRで調べたところ、両方のラインで導入したc-Maf遺伝子が過剰発現されていることを確認した。今後、これらのマウスの発ガン状況を調べる予定である。
国際法における個人責任原則の機能と動態-国際法実現プロセスの多元化に関する研究

本研究は、国際法における個人責任原則の実際的な機能を、法適用過程と法調整過程という二つのモデルを立てながら、種々の国際刑事裁判機構の設立文書・判例、個人賠償に関する国際文書などの分析を通して解明することを目的とした。国際法の個人に対する直接的な適用に基礎をおく個人責任原則が、国内法秩序との関係で複雑な問題を惹起させる点に着目し、これが現実に処理されている過程を実証的に検討し、その特質を明らかにした。平成19年度は、主として法適用過程の諸問題に関する分析を行い、個人責任原則の実体的な内容の解明を行った。具体的には、(1)ニュルンベルグ・東京裁判以来の国内判例、ICTYとICTRなどの国際判例の分析をとおして、実行責任と監督責任(上官責任)の概念的な相違とその歴史的な意義について検討した。とりわけ、1CC規程28条の成立過程を、ILC草案、Ad Hoc委員会草案、準備委員会での議論などに着目しながら検討し、上官責任の射程と要件の変容を考察した。(2)個人責任と国家責任の相互関係について、ICJのジェノサイド条約適用事件を素材として検討し、両責任原則が相互に独立して議論されながら、内実においては密接な関係性をもちうることを論証した。また、個人責任原則が、国際紛争・国内紛争の解決過程で果たす役割と問題につき、シエラレオネ特別裁判所、コソボ・パネル、東ティモール・パネル、カンボジア特別裁判所などの混合裁判と、ICIY・ICTRといった純粋な国際裁判との比較検討を行った。本研究においては、国際法における「個人責任の原則」について、法実現プロセスの多元化の一側面として、その機能に照らして包括的な検討を行った。とりわけ本研究では、個人責任原則の実際的な機能の二つの側面に着目した。第一は、国際法規範が個人に対し直接に適用され、これに義務を課すという国際法規範の適用過程における特殊性である。ここでは、これまで国家責任論において議論されてきた責任発生の要件、違法性阻却、責任の効果などの問題を、個人責任に特有の要素を考慮して再構成することを試みた(法適用過程論)。具体的には、(1)個人責任の発生要件(個人に義務を課す国際法規範の性格、実行責任と監督責任の関係)、(2)責任免除の可能性(公的資格と責任との関係、国内法上の合法措置・上官命令の抗弁)、(3)責任の法的効果(国家責任との関係、刑事責任と民事賠償責任の関係)について、国内判例や国際刑事裁判の実行を横断的に分析した。この結果、個人責任論が責任の個別化を指向しながらも、一方で集団責任の論理に傾斜する側面があることを解明した。第二は、個人への直接的な法適用が、国内法体系において潜在的に引き起こす可能性がある問題に着目し、その調整メカニズムを検討した(調整過程論)。具体的には、(1)国内法上・国際法上の責任免除原則との関係(外交免除・主権免除、国家元首の責任免除)、(2)国際刑事裁判所の手続命令・安保理などの措置要求などの国内法上の実施(憲法体制との整合性、適正手続などの国内手続法上の要請との整合性)、(3)国内人権・国際人権基準との関係(個人責任追及過程に関する人権基準適合性判断の可否、適合性判断を行うためのメカニズム)に関する分析・検討を行った。ここでは、国内法制度における調整が十分に機能せず、調整過程そのものに国際的なメカニズムが導入される傾向にあることを明らかにした。