hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接地圧および足関節角度に関する感覚代行機能と背屈・底屈機能を持つ能動下腿義足

平成17年度に可搬型圧縮空気ポンプ、小型電磁バルブおよび小型のエアシリンダを用いて能動下腿義足の足関節の背屈・底屈機能を実現した。しかしこの能動下腿義足は屈曲や背屈への移行速度は速いが、任意の足関節角度を簡単に設定できず、また空気ポンプの駆動音が大きいことなどの問題点も明らかになった。そこで平成18年度には別形式の能動下腿義足を試作し、空気圧駆動型能動下腿義足との比較を行った。また義足底の圧力に関する感覚代行に関する研究を進めると同時に、健常者により各種の義足を体験できる装具も試作した。具体的に行った主なものは、(1)アクチュエータを多摩川精機の5相ステッピングモータに変更すると共に専用のドライバー回路を用いて微細な足関節角度の設定を実現した、(2)歩行解析のための足に装着して足関節角度と爪先と踵の圧力を計測する計測装置を作成し、健常者の歩行データを解析した、(3)2個の小型の電流駆動型振動子に矩形波を与えて振動させて大腿部表面の2点弁別閾と振動周波数の識別閾を調べた結果、2点弁別閾は約5cm程度、振動として識別可能な上限の周波数は約13Hz程度であることが判った、(4)義足裏の圧力変化に関する感覚代行システムを感圧導電性ゴムによる圧力センサと大腿部表面につけた小型振動子とマイクロコントローラにより構築し、つま先と踵部の圧力の大きさの違いを2つの異なる振動周波数で提示した、(5)一足の下腿を切断した被験者に各種の義足(能動下腿義足および固定義足)を装着してトレッドミル上を一定の速度で歩行して貰い、腰部の左右のぶれの定量的評価と疲労感・使用感に関する主観的評価を得た、等である。なお試作した能動下腿義足に関しては軽量小型化・学習機能の付加や駆動性能の向上等、また感覚代行システムには多くの感覚情報を同時に提示可能な機能実現等の今後の課題も明らかにした。開発した義足にはアクチュエータとして2本のエアシリング(コガネイ、RBDAS 16X30-7)を互いに拮抗筋となるように配置し、常にエアポンプで充填したエアタンク内の圧縮空気を駆動源として電磁バルブ(コガネイ、110-4E1-J63またはGA010LE1)の開閉によるアクチュエータの駆動で足部の低屈(20度)と背屈(15度)を実現した。さらに足関節部の軸と組み合わせたポテンシオメータによる足関節角度センサ、脛部に装着した加速度センサ(ADXL202)、足底の前後に装着したマイクロスイッチによる接地センサ等によって足の状態を一定の時間間隔で検出して最適な駆動プログラムを選択実行する事でより円滑な歩行をさせることができた。そして今回開発した足関節が動く能動下腿義足により低屈および背屈が可能となり、よりスムースな歩行が可能となったことをトレッドミル上の被験者の歩行で確認した。また圧縮空気を駆動源とするエアシリングをアクチュエータにしたために義足の接地時の衝撃を和らげる効果やシステム全体の軽量化も確認した。この能動下腿義足の駆動システムはマイクロチップ社のPIC(16F876)を核にして、処理プログラム開発はアセンブリ言語を用いて開発され、義足の足関節角度や接地状態の情報は駆動システムへのアナログ信号としてシステムへ入力されるものとした。また直流6Vまた12Vで開閉駆動が出来る小型軽量の電磁バルブを組み込んで安全性の高いものとする事が出来た。ただし現在のシステムには基本的な歩行パターンに必要な低屈・背屈の機能を組み込んであるが、義足装着者自身の意図に基づく歩行リズムの自由な変更や起立動作の姿勢維持機能は組み込んでいない。また設置や足関節角度などの足の状態に関する情報を小型のバイブレータで大腿部へ伝える感覚代行機能を実現するシステムの設計に着手した。具体的に行った主なものは、(1)アクチュエータを多摩川精機の5相ステッピングモータに変更すると共に専用のドライバー回路を用いて微細な足関節角度の設定を実現した、(2)歩行解析のための足に装着して足関節角度と爪先と踵の圧力を計測する計測装置を作成し、健常者の歩行データを解析した、(3)2個の小型の電流駆動型振動子に矩形波を与えて振動させて大腿部表面の2点弁別閾と振動周波数の識別閾を調べた結果、2点弁別閾は約5cm程度、振動として識別可能な上限の周波数は約13Hz程度であることが判った、(4)義足裏の圧力変化に関する感覚代行システムを感

圧導電性ゴムによる圧力センサと大腿部表面につけた小型振動子とマイクロコントローラにより構築し、つま先と踵部の圧力の大きさの違いを2つの異なる振動周波数で提示した、(5)一足の下腿を切断した被験者に各種の義足(能動下腿義足および固定義足)を装着してトレッドミル上を一定の速度で歩行して貰い、腰部の左右のぶれの定量的評価と疲労感・使用感に関する主観的評価を得た、等である。なお試作した能動下腿義足に関しては軽量小型化・学習機能の付加や駆動性能の向上等、また感覚代行システムには多くの感覚情報を同時に提示可能な機能実現等の今後の課題も明らかにした。
浮遊性有孔虫の生物多様性と炭素循環の関係の解明

浮遊性有孔虫の殻の安定炭素同位体比は、過去の海洋物質循環の指標として活用が期待されている。しかし、浮遊性有孔虫の多様性・生態、特に共生藻との関係が不明であるため、指標としての実用に至っていない。そこで、分子系統解析を基に浮遊性有孔虫の遺伝子型を同定し、海流と遺伝子流動の関係や水温と形態的多型の関係を解明した。さらに、定点での時系列解析を行い、浮遊性有孔虫と共生藻の遺伝子型の産出が季節変動を示すことを初めて解明した。また、季節間で同一宿主に共生する藻類の種・構成を比較することにより、宿主(浮遊性有孔虫)と共生藻の特異性は低いことを明らかにした。本研究では浮遊性有孔虫を材料として、それらの遺伝子型に基づき共生する生物や摂餌物の同定、また共生生物の違いが浮遊性有孔虫の炭酸塩殻の形成に及ぼす影響を評価することを目的としている。平成24年度までの研究で、土佐湾における定点試料採取を12ヶ月分連続的に採取した。これらの試料から共生生物をもつことが知られ、また殻の地球化学的分析に最もよく使用されるGlobigerinoides ruberについて研究を進めた。(1)土佐湾に産出する形態種G.ruberには、4つの遺伝子型が含まれることがわかった。本形態種では世界の海洋で6つの遺伝子型が見つかっているが、研究対象域でほとんどが産出するだけでなく、産出頻度は異なるものの季節によらず同海域に生息していることが明らかになった。(2)(1)で同定した遺伝子型について、炭酸塩殻の形態観察を行った。しかし、現時点の手法で形態形質の有意な違いを得ることはできなかった。(3)形態種G.ruberについて、真核生物用のユニバーサルプライマーを用い、Large subunit rDNA配列を得た。細胞内に含まれるものとして、共生藻として知られる渦鞭毛藻Gymnodinium beiiがほぼ全研究対象個体から得られ、他に恐らく摂餌物の残存と考えられるカイアシ類が同定された。(4)共生藻Gymnodinium beiiには複数の遺伝子型が報告されているが、本研究の試料では3遺伝子型が見つかった。しかし、(1)における宿主(浮遊性有孔虫)の遺伝子型と共生藻の遺伝子型の関係に規則性はなく、また季節別の違いも不明瞭であった。単細胞の海洋プランクトンである浮遊性有孔虫について、生物学的種(遺伝子型)の同定と炭酸塩殻の形態の違いを評価した。特に、土佐湾の定点では約2年間の月別試料を採取し、浮遊性有孔虫と共生藻の種類や産出頻度の時系列変化を解明した。1.浮遊性有孔虫・遺伝子型の殻形態の違い海洋に広く分布する浮遊性有孔虫種Globorotalia truncatulinoidesから同定した5つの遺伝子型内で、殻室の成長方向に左右二型があることを解明した。この二型は生息環境によらず遺伝的に決まっていることを示唆した。一方で、殻の外形の形態的差異は寒冷域と温暖域に生息する遺伝子型の判別に用いることができ、化石試料への応用が可能となった。このように、殻はリボソーム遺伝子によって分類された遺伝子型と一致する形質と、全く異なる形質があることが示唆された。2.浮遊性有孔虫・遺伝子型と共生藻の関係土佐湾から採取した浮遊性有孔虫種Globigerinoides ruberには、4つの遺伝子型が確認された。これらは通年で産出するが、産出頻度が季節で異なることがわかった。いずれの個体も共生藻として渦鞭毛藻Gymnodinium beiiを細胞内に持ち、共生藻にも3つの遺伝子型が存在することがわかった。宿主(浮遊性有孔虫)と共生藻(渦鞭毛藻)の関係をみると、共生藻類の宿主特異性が低いことが示唆された。しかし、季節間では優勢となる共生藻の遺伝子型が異なり、殻の同位体組成への影響が考えられる。月別の水温・塩分・栄養塩のデータと比較しながら、宿主ー共生の関係や共生藻の季節変化について結果をまとめている。一方で、共生藻の遺伝子型を蛍光プローブで識別することは難しく、他の遺伝子マーカーの開発を行う必要性が示唆され、細胞内に残存する摂餌物の検出には、室内飼育を通して浮遊性有孔虫の消化時間などを検証する必要性が示唆された。

本研究は,海洋プランクトン・浮遊性有孔虫について,(1)生物学的種の同定,(2)それら種ごとの共生藻と摂餌物の同定,(3)共生藻の違いが宿主(浮遊性有孔虫)の炭酸塩殻の形成に及ぼす影響を評価することを目的としている.初年度である平成23年度の研究では,浮遊性有孔虫2つの形態種について,small subunit ribosomal DNAの分子系統解析によって生物学的種の同定を行った.またこれら2種のうち1形態種にて,large subunitおよびinternal transcribed spacer rDNAの分子系統解析により共生藻の同定を行った.(1)浮遊性有孔虫の生物学的種の同定*太平洋からインド洋の赤道域に主に分布する1形態種では,3つの隠蔽種が初めて同定された.各々の隠蔽種は,同一の海流下にある太平洋・インドネシア海域・インド洋の3つの異なる水塊に特徴的に分布することがわかった.これにより水塊と浮遊性有孔虫の集団の関係が明確になった.*土佐湾において毎月同一地点でプランクトンネット試料を採取し,温帯から熱帯域に分布する1形態種について,生物学的種の産出を精査した.4つの隠蔽種が同定されたが,季節によってそれらの産出頻度が異なることがわかった.(2)共生藻の同定土佐湾のプランクトンネット試料から産出した上記の形態種について,共生している渦鞭毛藻類の同定を行った.まず,個体内に複数の種が共生することが確認された.また同一隠蔽種間でも異なる種が共生していることがわかりつつある.本研究の目的を達成するため、本年度は宿主と共生藻の遺伝子型の同定、といった生物情報の取得を中心に行った。これら両者の関係については、これまで世界で得られている情報を含めて様々な系統解析を試み、精査する必要がある。共生藻の違いがもたらす炭酸塩殻形成への影響は、1個体ずつの安定酸素・炭素同位体比の測定を行う必要があるが、微量サンプルとなるため、測定方法を考案する必要がある。一方、摂餌物については、野生個体を研究材料としているため消化のスピードなどがコントロールできておらず、LSU rDNA配列で認められたカイアシ類等が餌となっているかどうか明確にできない。本研究の目的を達成するため,初年度の研究では,なるべく広範囲に分布し,かつ通年的に産出する浮遊性有孔虫種の特定を行った.分子系統解析に基づく生物学的種の同定を進めており,それら種ごとの水塊に特化した分布状況や,時系列にそった産出頻度の違いは,新規の成果である.しかし,こうした宿主(=浮遊性有孔虫)の同定に対し,共生藻の同定は進捗状況が遅れをとっている.渦鞭毛藻類について試験的に同定を試みているが,試料数も多く,また簡便な同定方法を確立していないため,データの蓄積が未だ少ない.本研究課題の最終年度では、以下のように研究を完遂する。(1)共生生物および残存する摂餌物の遺伝子について蛍光プローブによる観察を試みる。(2)宿主(浮遊性有孔虫)の遺伝子型間において、殻を溶かして安定酸素・炭素同位体比の測定を行う前に、殻の形態形質の差異を抽出する。従来の手法では難しいことがわかったため、micro-focus CT-スキャンを用いて形態計測を行う。(3)殻の安定酸素・炭素同位体比の測定を行う。本研究の目的を達成させるため,平成24年度では,以下のように研究を推進する.(1)重点的に共生藻の遺伝子配列の情報を増やし,それらのデータをもとに,共生藻類の簡便な同定方法を確立する.(2)ユニバーサル・プライマーを用い,浮遊性有孔虫の個体内に含まれる真核生物由来のDNA断片を読み取り,共生藻や未消化の餌について特定する上で,データの比較がスムーズにできるよう,データベースを構築しておく.
希土類添加半導体の秩序制御と高次発光機能の発現

我々は過去数年間に渡り、III-V族半導体中で希土類元素を原子のレベルで操ることにより、新しい物性・機能を効果的に発現させるとともに、それらを有効に活用した新規デバイスを創出することを目指している。現在のところ、Er原子周辺局所構造がEr-20配置へ秩序制御されたEr,0共添加GaAs(GaAs:Er,0)を取り上げ、それを活性層とした電流注入型1.5μm帯Er発光ダイオードの室温動作に世界に先駆けて成功している。また、Er発光ダイナミクス測定から電流注入下でのEr励起断面積を見積り、活性層厚300nmにおいて1x10^<-15>cm^2という巨大な値を得ている。昨年度は、発光デバイス性能をより一層向上させる指針を得ることを目的に、GaAs:Er,0におけるポンプ・プローブ光反射率測定を行い、ピコ秒の時間軸で発現する特徴的な励起機構を明らかにした。また、光励起下でのEr発光特性の解析より、Er濃度に依存する非輻射プロセスを明らかにした。今年度は、有機金属気相エピタキシャル法によりEr添加濃度が極めて低いGaAs:Er,0(1x10^<17>cm^<-3>程度)を作製し、Er発光特性や光励起キャリアダイナミクスの評価を通じて、Erイオンの励起および緩和過程に関する理解をより一層深めることを目指した。得られた知見は下記の通りである。(1)77Kにおいてフォトルミネッセンス測定を行ったところ、すべての試料において、GaAsバンド端発光とEr-20発光の両方が観測された。また、それらの発光強度が作製時のEr流量(Er添加量)に依存して相補的に変化することを明らかにした。(2)そのGaAs:Er,0を活性層としたGaInP/GaAs:Er,0/GaInPダブルヘテロレーザ構造を作製し、室温においてGaAsバンド端でのレーザ発振を観測した。また、その発振閾値電流はEr添加量とともに増大した。(3)非平衡キャリアダイナミクスを調べるために、ポンプ・プローブ光透過率測定系を新たに構築した。Er添加特有の早い緩和成分を見出し、GaAs:Er,0においてより顕著であることを明らかにした。現在のところ、Er原子周辺局所構造がEr-2O配置へ秩序制御されたEr,O共添加GaAs(GaAs : Er,O)を取り上げ、それを活性層とした電流注入型1.5μm帯Er発光ダイオードの室温動作に世界に先駆けて成功している。また、Er発光ダイナミクス測定からEr励起断面積を見積もったところ、活性層厚が大きくなるに伴い、指数関数的に減少することを見出している。今年度は、発光デバイス性能をより一層向上させる指針を得るために、GaAs : Er,Oにおける光励起キャリアダイナミクスやEr発光特性を評価し、Erイオンの励起および緩和過程を定量的に明らかにすることを目指した。(1)GaAs : Er,Oにおける光励起キャリアダイナミクスをポンプ・プローブ光反射率測定により調べた。その結果、Er濃度に依存してピコ秒の時間スケールで発現する特徴的な緩和プロセスを見出し、それがErトラップによるキャリア捕獲によることを明らかにした。(2)Er添加濃度が異なる試料において、発光強度のフォトンフラックス密度依存性および時間展開を解析することによりEr光励起断面積を見積もった。Er励起断面積は、高濃度試料(Er添加濃度:7x10^<18>cm^<-3>)では4x10^<-16>cm^2、低濃度試料(8x10^<17>cm^<-3>)では1x10^<-15>cm^2となり、Er濃度に依存する非輻射プロセスが存在することを明らかにした。

また、それらの発光強度が作製時のEr流量(Er添加量)に依存して相補的に変化することを明らかにした。(2)そのGaAs:Er,0を活性層としたGaInP/GaAs:Er,0/GaInPダブルヘテロレーザ構造を作製し、室温においてGaAsバンド端でのレーザ発振を観測した。また、その発振閾値電流はEr添加量とともに増大した。(3)非平衡キャリアダイナミクスを調べるために、ポンプ・プローブ光透過率測定系を新たに構築した。Er添加特有の早い緩和成分を見出し、GaAs:Er,0においてより顕著であることを明らかにした。
サンゴ骨格中のホウ素同位体比を用いた過去の海洋表層ｐＨ復元

年度始めには、前年度から査読・改訂が続いていたタヒチ産化石ハマサンゴに対する実験結果を報告する論文がNature姉妹誌のScientific Reports誌に受理され、公表の際には東京大学伊藤謝恩ホールにて記者会見を行うなど、貴重な経験となった。その後、研究成果は2015年2月12日付けで公表されたMartinez-Boti et al. (2015, Nature)をはじめとして、3つの国際学術論文に引用されるなど、早くも注目を浴びている。本年度は、前年度に得た小笠原産ハマサンゴに対する実験結果に対する考察を深めた。さらに気象研究所海洋・地球化学研究グループとの共同研究を通じて、海水炭酸系に関する近年の観測記録とも併せて議論をより深めた。研究成果は主著論文1報としてまとめ、Nature姉妹誌のNature Climate Change誌に投稿した。ピアレビューの結果、受理には至らなかったものの、大変高評価のコメントをいただいた。別の島から得られた別のハマサンゴ群体に対して追加実験を行い、再投稿したいと考えている。また国内で行われた3つの学会(地球惑星科学連合大会・日本第四紀学会・大気海洋研究所-ハワイ大学ジョイントシンポジウム)において成果を発表した。次年度には地球惑星科学連合大会における招待講演を1件予定している。本年度は博士課程の最終年ということで、学位論文執筆やプレゼン・手続き等で多くの時間を費やした。結果として新たな試料の分析や海外における学会発表を行うことが叶わなかった。しかしそのおかげで順調に学位審査が進み、2015年3月に無事博士の学位を取得することができた。特別研究員DC1の採用期間は終了したが、今後も本研究課題とその発展に当たるプロジェクトを継続し、世界トップレベルの研究成果を追求していきたいと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の最終目的は、最終退氷期と呼ばれる古気候学における非常に重要な気候イベントが生じた期間における、赤道太平洋を中心とした古環境を復元することである。目標達成には海洋表層水のpHの間接指標になると考えられているサンゴ骨格中のホウ素同位体を用いる。人間活動によって放出された二酸化炭素の海水への溶け込みが原因で生じるpH低下は海洋酸性化と呼ばれ、現在人類が直面する国際的な環境問題の一つとして注目を集めており、その過去の復元には社会的にも大きな意義がある。高精度のpH復元を達成するためには、まずホウ素同位体-pH関係を野外に生息している現生サンゴおよび海水pHを制御して飼育されたサンゴの両方を用いて厳密に評価する必要がある。さらに最近の研究から、海水pHだけでなく、サンゴ体内のpHの影響も古環境解析を行う上で考慮する必要性が示され、事態は複雑化している。当該年度は研究実施計画に書かれた実験計画のうち、野外で採取された現生サンゴ試料に対する測定を行ったものの、予期せぬ機械トラブルにより、飼育実験の試料までは測定することが適わなかった。さらに野外試料を用いて得られたデータも、再測定を行うことにより、再現性を確認する必要性が生じている。その後飼育実験による試料の分析を予定している。これらの一連のデータが得られることで、ハマサンゴのホウ素同位体を用いたより正確なpH復元を行うことが可能となり、学会および社会における影響力は大きいと思われる。また当初の計画よりもさらに時間分解能を増やし、より厳密な記録を得ることを計画している。当該年度において学会発表は精力的に行い、東京大学大気海洋研究所-ハワイ大学合同シンポジウム、2012年度日本地球化学会年会、アメリカ地球物理学会2012年秋期大会にて成果を発表した。本年度前半は前年度に引き続き,以前得られたタヒチの化石サンゴのホウ素同位体データを学術誌に投稿するために共著者と議論を重ね, 2013年9月に初投稿に至った(論文1).その後,複数の科学雑誌への投稿を試みるも論文受理は適わなかった.2014年3月にNatureの姉妹紙であるオンライン科学雑誌Scientific Reports誌の査読者から好意的なコメントが返され, 3ヶ月以内に返答を作成し,論文原稿の改訂を行う運びとなった.現在もその改訂作業を続けており,近日中に完成する見込みとなっている.論文1の内容は「2013年度地球惑星科学連合大会」で口頭発表,「第16回AMSシンポジウム」「11th International Conferenceon Paleoceanography」でポスター発表を行った.これを受け、タヒチのサンゴ試料分析のみならず、小笠原諸島・父島で得られた現生ハマサンゴ骨格のホウ素同位体分析を通じて,過去120年間の海洋酸性化の復元およびそのサンゴ石灰化への影響の評価を開始した.論文の査読コメントにも記されていたことであるが、野外で採取された現生サンゴに対するホウ素

同位体の報告例は極めて少なく,また所属研究グループはインド・太平洋熱帯域のサンゴ試料を多数有しているため,これまで得られたタヒチの結果のより詳細な検証と、この海域の高精度かつ良質なデータを世界に先立って提供できることが期待される. 2013年11月2014年3月の間に3度,それぞれ23週間ずつ,海洋研究開発機構・高知コアセンターに滞在し,表面電離型質量分析器および多重検出器型質量分析器を用いて測定を行った.分析によって得られた結果は極めて興味深く、これまで報告がないような記録である可能性が高いことが明らかになったため,今後考察と議論をさらに深め, 2014年度前半には国際学術誌にて公表するべく執筆作業を開始した(論文2).並行してこれらのデータについては,「2014年度地球惑星科学連合大会」などで随時報告を行っていく予定である.生物源炭酸塩の微量・局所分析手法は、ホウ素同位体比や微量金属分析にとともに、本研究テーマと密接な関係を持つ.本年度後半は研究室に卒論生として配属された2人の学部4年生とともに,レーザー・アブレーション型質量分析装置の測定法について習熟することができた.その際に得られたデータをもとに2編の学術論文を主著1編および共著1編で執筆予定である(論文3・4).年度始めには、前年度から査読・改訂が続いていたタヒチ産化石ハマサンゴに対する実験結果を報告する論文がNature姉妹誌のScientific Reports誌に受理され、公表の際には東京大学伊藤謝恩ホールにて記者会見を行うなど、貴重な経験となった。その後、研究成果は2015年2月12日付けで公表されたMartinez-Boti et al. (2015, Nature)をはじめとして、3つの国際学術論文に引用されるなど、早くも注目を浴びている。本年度は、前年度に得た小笠原産ハマサンゴに対する実験結果に対する考察を深めた。さらに気象研究所海洋・地球化学研究グループとの共同研究を通じて、海水炭酸系に関する近年の観測記録とも併せて議論をより深めた。研究成果は主著論文1報としてまとめ、Nature姉妹誌のNature Climate Change誌に投稿した。ピアレビューの結果、受理には至らなかったものの、大変高評価のコメントをいただいた。別の島から得られた別のハマサンゴ群体に対して追加実験を行い、再投稿したいと考えている。また国内で行われた3つの学会(地球惑星科学連合大会・日本第四紀学会・大気海洋研究所-ハワイ大学ジョイントシンポジウム)において成果を発表した。次年度には地球惑星科学連合大会における招待講演を1件予定している。本年度は博士課程の最終年ということで、学位論文執筆やプレゼン・手続き等で多くの時間を費やした。結果として新たな試料の分析や海外における学会発表を行うことが叶わなかった。しかしそのおかげで順調に学位審査が進み、2015年3月に無事博士の学位を取得することができた。特別研究員DC1の採用期間は終了したが、今後も本研究課題とその発展に当たるプロジェクトを継続し、世界トップレベルの研究成果を追求していきたいと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。機械の不調が主な原因で、満足のゆくデータを得ることが適わなかった。そのため、当初予定した実験計画に遅れが見られている。本年度、論文の投稿に至ったことを評価した。ホウ素同位体比分析の実験操作は困難を伴うが、昨年に比べて技術も向上し,安定したデータが取れるようになってきた。2本目の投稿論文も準備中で、1本目の投稿/査読プロセスの経験を活かし、完成度の高い論文に仕上げられるよう、最大限努力するつもりである。日本第四紀学会
コンポスト中の拮抗微生物のトマト疫病菌に対する作用機構の解析

コンポストから分離、選抜した拮抗微生物(10株のBacillus属細菌と1株の糸状菌)のトマト疫病(Phytophthora infestans)に対する抗菌作用を明らかにするために,それらの生産する抗菌物質の分離、同定と抗菌活性の検定を行った。前年度、10株のBacillus細菌が3タイプの抗菌物質(塩基性と酸性の揮発性化合物、Amberlite XAD-2に吸着される化合物)を生産していることを明らかにしている。HPLC分析により培養液中に400500mg/LのNH_4^+が検出されたことから塩基性の揮発性抗菌物質はNH_3と考えられた。NH_4ClとNH_4SO_4に比べて、NH_3の方がより低濃度でP.infestansの生育を強く阻害したことから、NH_4^+よりNH_3に強い抗菌活性があると考えられた。GC分析により培養液中に最大で約100mg/Lのイソ酪酸、2-メチル酪酸、イソ吉草酸が検出された。これらの揮発性の低級脂肪酸は、100mg/LでP.infestansの生育を100%阻害した。また、NH_3とこれらの低級脂肪酸は、他のトマト病原菌に対してよりもP.infestansに対して特に強い抗菌活性を示した。Amberlite XAD-2に吸着される画分のTLC bioautographyの結果から、6株の細菌に抗菌物質が確認され、その内4株についてはLCMS分析から、iturinAを同定した。他の2株については未同定である。糸状菌の培養液の酢酸エチル抽出物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離した3種の抗菌物質を、NMRとMSスペクトル分析により、それぞれterphenylin,candidusin A,3-hydroxyterphenyllinと同定した。terphenyllinと3-hydroxyterphenyllinは、100mg/LでP.infestansの生育をそれぞれ約90、60%阻害した。トマトを再現性良く罹病させることができなかったため、これらの拮抗微生物のトマト疫病に対する防除効果については今後の検討課題である。コンポストから分離したトマト疫病菌(P.infestans)に対する拮抗微生物(60株の細菌と11株の糸状菌)の中から、抗菌作用の強い10株の細菌と2株の糸状菌を選抜した。10株の細菌の培養液は強い抗菌活性を示し、クロマト分離等による抗菌活性の挙動から、抗菌作用は3つのタイプに分けられた。3株(MMB-13-2,-13-8,-15-4)は揮発成分に強い抗菌活性が認められ、培養液のpHを10にすると揮発成分の抗菌活性は非常に高くなり、その臭いからアンモニアと考えられた。また、pHを4にすることでも揮発成分の抗菌活性が少し高くなることから、低級脂肪酸の抗菌作用が示唆された。最も抗菌活性の強い細菌株(MMB-15-5)は、Bacillus属と同定し、その培養液中の抗菌物質は、Amberlite XAD-2に吸着され、MeOHで溶出され、次いで、MeOH-CHCl_3-H_20(65:30:5)によるシリカゲル力ラムクロマトグラフィーでよく分離された。TLC bioautographyの結果から、1種の抗菌物質の存在が示唆され、それはニンヒドリン陽性で、Rf値から、既にBacillus subtilisから単離されているiturinAと推定された。2株の糸状菌(MMF-15-1,-15-2)の培養液中の抗菌物質は、酢酸エチルで抽出された。酢酸エチル抽出物中の代謝産物がTLCで一致したことから、この2株は同種の菌と考えられた。また、TLC bioautographyの結果から、少なくとも3種の抗菌物質の存在が示唆された。シリカゲル力ラムでMeOH-CHCl_3の溶媒系により数回分離し、3種の抗菌物質(A,B,C)を単離した。MSスペクトルにより、それぞれの分子量が338、352、354と判明した。NMRスペクトルから、いずれも芳香族の化合物で、同様の基本骨格を有すると推定されたが、構造の確定には、更に各種スペクトル、化学反応等による検討が必要である。

Amberlite XAD-2に吸着される画分のTLC bioautographyの結果から、6株の細菌に抗菌物質が確認され、その内4株についてはLCMS分析から、iturinAを同定した。他の2株については未同定である。糸状菌の培養液の酢酸エチル抽出物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離した3種の抗菌物質を、NMRとMSスペクトル分析により、それぞれterphenylin,candidusin A,3-hydroxyterphenyllinと同定した。terphenyllinと3-hydroxyterphenyllinは、100mg/LでP.infestansの生育をそれぞれ約90、60%阻害した。トマトを再現性良く罹病させることができなかったため、これらの拮抗微生物のトマト疫病に対する防除効果については今後の検討課題である。
内皮細胞が発現する抗血栓性因子トロンボモジュリンの酸化LDLによる発現低下機構

本研究は動脈硬化巣に血栓が生じやすい原因を血管内皮細胞における抗血栓性因子トロンボモジュリン(TM)の発現低下機構の解析から明かにすべく計画された。本研究によって以下の新知見が得られた。1.正常内皮細胞の膜表面で抗血栓機能をあらわすTMは動脈硬化巣に蓄積する酸化型低比重リポタンパク質(酸化LDL)の酸化程度の増加に比例して抗原量および抗血栓活性が低下する。2.その発現低下はリソゾームでのTMの分解亢進によるものではない。3.その発現低下はTMmRNA量の低下にもとずく、TM蛋白の生合成低下による。4.その発現低下はスカベンジャー受容体経路を介するものではなく、酸化LDL中のリゾレシチンや酸化コレステロール以外の酸化脂質が原因物質であることが明かになった。5.内皮細胞TMの酸化LDLによる低下はレチノイン酸および細胞内cAMPを上昇される物質によって抑制されることが明かになり、薬物開発の糸口が開かれた。
ケイ酸塩を主体とする高速リチウムイオン導電性混合アニオンガラスの合成と物性

化学的に安定で、耐電圧性に優れ、取り扱いも極めて容易な含リチウムアルミノシリケートガラスのリチウムイオン導電性を混合アニオン効果により高めることを目的としてLi_xAl_<1/3>SiO_<(5+x)/2>で表されるガラスにLi_3PO_4、Li_3VO_4、Li_2WO_4等を混合し、交流インピーダンス法により導電性を測定した。ガラスは、白金バスケット中で都市ガス-酸素炎を用いて出発試料を溶融し、2030分後に透明となった溶融物を、白金線を引いてバスケットを開くことにより落下させ、2枚の金属板の間で急冷することによって調製した。Li_yAl_<1/3>SiO_<(5+y)/2>のガラス化領域は式中のyの値で0.89≦y≦1.44と決定された。この中で最も高いリチウムイオン導電性を示したLi_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>にLi_3PO_4、Li_2WO_4を混合した。(1-x)Li_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>+xLi_3PO_4系では0≦x≦0.15でガラスが得られ、導電率はx=0.1でピークとなった。(1-x)Li_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>+x Li_3VO_4系のガラス化範囲は0≦x≦0.20であり、この範囲内でリチウムイオン導電率はxの増加とともに大きくなった。最も高い導電性は(1-x)Li_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>+xLi_2WO_4系で得られたが、この系ではx=0.1においても完全にガラス化することは困難であった。0.9Li_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>+0.1Li_pMO_4(M=P、V、W)中でのリチウムイオン導電率を170°Cで比較すると、アニオンを混合していないとき1.8×10^<-5>Scm^<-1>であるのに対し、M=Pのとき6.3×10^<-5>Scm^<-1>、M=Vのとき3.8×10^<-5>Scm^<-1>、M=Wのとき4.0×10^<-5>Scm^<-1>であった。完全にガラス化した試料においてはCole-Coleプロットに粒界抵抗を示す半円は見られなかった。0.9Li_<1.44>Al_<1/3>SiO_<3.22>+0.1Li_pMO_4(M=P、V、W)中でのリチウムイオン導電率を170°Cで比較すると、アニオンを混合していないとき1.8×10^<-5>Scm^<-1>であるのに対し、M=Pのとき6.3×10^<-5>Scm^<-1>、M=Vのとき3.8×10^<-5>Scm^<-1>、M=Wのとき4.0×10^
細胞層の透過率分布の可視化に基づく新しい有害・有用物質スクリーニング法の研究

化学イメージセンサは、イオンなどの化学種の分布を可視化するセンサである。本研究では、従来よりはるかに小型で安価、かつスタンドアロン動作可能なポータブル化学イメージシステムを構築した。また、従来型の化学イメージセンサも併用しながら、細胞層の電気抵抗分布を可視化することに初めて成功した。これは、細胞間のタイトジャンクションの分布を電気的な特性をもとに可視化することに繋がる極めて重要な成果であり、今後の新規細胞アッセイへの展開が期待できる。さらに、研究の過程で、電極を用いて細胞層の測定する従来のTER測定を同時に4サンプルまで測定できる装置も開発した。本研究の目的は、「ポータブル化学イメージシステムを用いた細胞層の透過率分布の可視化により、有害・有用化学物質の新規スクリーニング法を提案・実証」することである。昨年度までに、化学イメージセンサシステムの小型化を行い、ポータブルかつスタンドアロン動作可能な測定システムを開発した。細胞間接合の分布変化に基づく新しい細胞アッセイを提案し、効率的な化学物質スクリーニング法を確立するためには、このシステムを元として細胞層の透過率分布観察を行うための測定系の整備を行っていく必要がある。本年度は、半導体センサを用いた測定の前段階として、メンブレン上に単層培養された腸管上皮細胞の電気特性を、金属電極によって測定するシステムを製作した。従来、細胞層の電気抵抗測定は手動によって1つずつ行われており、経時的な測定は煩雑で熟練を要するものであった。本システムでは、試料と電極を設置した後は、測定ボックスごと細胞培養器内に導入して自動測定を行うことができるため、簡便かつ高時間分解能の測定が可能となった。さらに、上記システムを改良し、同時に4検体を測定できるように拡張した。抵抗値測定のみであれば最大4検体、位相遅延・進みまで含めた電気特性では最大2検体を各周波数で測定することができる。この系を用いた測定から、通常の化学イメージセンサ測定よりも低い周波数で光源を変調した方が電気特性の差違がはっきりと観測される可能性が示唆された。また、研究代表者の宮本が以前から提案している位相モード測定も適用可能である可能性が示された。さらに、測定ウェルの設計やシールドボックスの構造など化学イメージセンサを用いた測定系の構築に向けて様々なノウハウを蓄積することができた。以上の成果について本年は2件の学会講演(うち1件は招待講演)を通じて外部に発信した。前年度までに、ポータブルシステムを開発し、今年度は、細胞層の透過率分布の可視化実験を行った。まず、細胞培養用の透過メンブレン上に樹脂パターンを形成し、従来型の化学イメージシステムで測定を行った。化学イメージより、樹脂パターンの有無が光電流の分布として観測され、これは抵抗率の空間分布が反映されたものであると確認された。また、実験を繰り返すことによって、メンブレン裏面とセンサ面が密着していることが重要であると判明し、適切な状態にメンブレンを設置するための専用治具を設計・製作した。次に、メンブレン上に腸管細胞の単層培養を行い、実際の腸管壁と同様に対とジャンクションを形成した状態で細胞層の化学イメージを取得した。細胞層にごく一部欠損を形成した場合、化学イメージ中に欠損パターンと同様の形状で明瞭な電流分布を確認した。これは、細胞層中の抵抗率分布を反映していると考えられ、世界初の成果であると同時に、化学イメージセンサによる透過率分布の可視化が可能であることを示すものである。今後は、均一な細胞層に対して薬物刺激を与えた場合についても研究を進め、細胞層内の抵抗率分布を可視化をスクリーニング手法として確立する。なお、研究の主要な成果は日本動物細胞工学会(招待講演)および、応用物理学会(講演奨励賞受賞)にて報告した。ポータブル化学イメージシステムは、手のひらサイズでありながら、注目領域の空間分解能を自在に変更しつつセンサ面上の化学種の分布を化学イメージとして取得可能であり、細胞層の透過率分布の可視化に最適である。細胞層の透過率分布観察によって、細胞間接合の分布変化に基づく新しい細胞アッセイを提案し、効率的な化学物質スクリーニング法を確立する。平成23年度には、研究分担者と協議を重ねながら、スタンドアロン動作可能な「ポータブル化学イメージシステム」を構築した。システム全体の制御にはバッテリ駆動可能なマイクロコントローラを使用した。測定に必要な走査型変調光源には、有機ELディスプレイ上に表示される光点を用いた。マイクロコントローラの制御プログラムには、測定モードとして、センサ基板上のpH二次元分布を取得する`化学イメージ測定モード

'と、センサ基板上の1点でpHを精密に測定するために、交流光電流-バイアス電圧特性(I-V特性)を取得する`I-V特性測定モード'の2つを実装した。それぞれのモードで取得した測定データは装置上面のディスプレイパネルに表示すると同時に、SDメモリカードに記録されるため、測定終了後にPCなどに読み込んで任意の解析処理を行う利便性も備えている。さらに測定システムの評価も行った。pH4,5,...,8のpH標準液の交流光電流-バイアス電圧特性(I-V特性)を取得し、I-V特性曲線の変曲点電圧のプロットから,pH感度51.4mV/pHでpH変化を検出可能であることを確認した。この値を用いることでpH未知の溶液を測定することができる。これまでに構成したポータブル化学イメージシステムを用いて細胞層の抵抗率分布を可視化するために、専用の測定系を新たに構築して細胞層の周波数特性を調査し、さらに細胞培養器内でリアルタイム観測を行うためのノウハウを蓄積した。申請書の段階では、細胞層をセンサ表面に直接培養することを検討していたが、細胞層に本来の機能を持たせるためには透過性のメンブレン上に培養することが望ましいようであるため、測定系の設計を変更した。つまり、センサ表面に測定ウェルを設置し、測定時のみセルカルチャーインサートを挿入して測定を行う。この構成は、先行研究で用いられてきた培養表面を用いるため、センサ表面の修飾や培養液中での長期安定性を考慮する必要がなくなる利点もある。以上の成果に加えて、ハン博士の協力の下に、腸管上皮細胞の培養系を宮本の在籍する東北大学でも確立し、より迅速な研究をすすめる体制を整備した。当初の計画通りに、ポータブル化学イメージシステムの構築を行った。持ち運びが可能、かつスタンドアロン動作が可能であり、さらに2つの測定モード、測定データの表示・保存など従来の測定システムを大幅に凌駕する特徴を持つシステムを構築することが出来た。今後、本システムを利用した細胞アッセイ法への進展が期待される。これまでに蓄積した技術によって、メンブレン上に培養された細胞層の抵抗分布を測定する。焦点になると考えられるのは(1)メンブレンとセンサ表面をできる限り接近させ、かつ固定する機構(2)センサ表面に微細構造を設計することによってセンサ電流の経路を制限する機構の2点である。これらの機構を適切に設計し、細胞層の抵抗分布測定に基づいた新しい化学物質スクリーニング法を提案する。今年度に開発したポータブル化学イメージシステムによって、細胞層の透過率分布測定を行う技術を開発し、新しいアッセイ系の提案を行う。重要と考えられるのは、センサ表面の改質による細胞接着性の向上である。センサの表面状態は、細胞活性に大きく影響することがよく知られているため、細胞の接着性の向上は測定の品質に直結すると考えられる。
新規ＮＡＳＨモデルを用いたマクロファージの病態生理的意義の解明と医学応用

申請者らはメラノコルチン4型受容体欠損マウス(MC4R-KOマウス)を用いて、肥満による代謝障害を背景に脂肪肝から肝線維化を発症する新規NASHモデルを確立し、NASHの肝臓において細胞死に陥った肝細胞をマクロファージが取り囲むhCLS(hepatic crown-like structure)が多数認められることを見出した。既にhCLS数が肝線維化の程度と相関することを報告しているが、実際にマクロファージを消去することでNASHの病態形成におけるhCLSの関与を検討した。単純性脂肪肝ではクロドロネートリポソームによってマクロファージが効率的に消失し、炎症・線維化マーカーの発現が有意に低下した。一方、NASHを発症したMC4R欠損マウスに対してクロドロネートリポソームを投与すると、hCLS特異的にマクロファージが残存し、炎症・線維化マーカーの発現や活性化筋線維芽細胞のマーカーであるαSMAの陽性面積にも変化は認められなかった。以上から、hCLS構成マクロファージは散在性マクロファージとは異なる性質を持ち、炎症・線維化促進に作用することが示唆された。次に、hCLS構成マクロファージがCD11c陽性であることから、ジフテリア毒素(DT)投与によってCD11c発現細胞を消去できるマウス(CD11c-DTRマウス)の骨髄を移植したMC4R欠損マウスにNASHを誘導し、DTを単回投与後、経時的に観察した。組織学的解析においてDT投与1日後にはhCLSが消失し、5日後には回復した。hCLS消去に伴ってTGFβやPDGF-Bなどの発現が低下し、hCLSが線維化促進因子のソースとなってNASH発症に寄与していることが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)はメタボリックシンドロームの肝臓における表現型であり、慢性炎症から組織リモデリングに至る病態である。申請者らは既に、独自に確立したNASHモデルであるメラノコルチン4型受容体欠損マウス(MC4R欠損マウス)を用いて、NASHの肝臓では細胞死に陥った肝細胞をマクロファージが取り囲む構造(hCLS: hepatic crown-like structure)が多数認められ、hCLSが炎症・線維化の起点となって肝線維化の発症に関与することを報告している。本研究では、NASH発症過程におけるマクロファージ走化性因子MCP-1とその受容体であるCCR2系の関与を検討した。MC4R欠損マウスに対して野生型あるいはCCR2欠損マウスの骨髄を移植し、4週間の回復期間をおいた後に、20週間の高脂肪食負荷によってNASHを誘導した。肥満のMC4R欠損マウスでは脂肪組織における浸潤マクロファージ数および細胞死に陥った脂肪細胞をマクロファージが取り囲むCLSの数が増加するが、骨髄のCCR2を欠損するとこれらの変化は認められなくなった。一方、肝臓の非実質細胞分画を用いてFACS解析を行うと、NASHの肝臓ではF4/80を高発現する常在性マクロファージには変化がなく、CD11bを高発現する浸潤性マクロファージの増加が認められた。骨髄のCCR2を欠損するとF4/80高発現マクロファージ数には変化がなく、CD11b高発現マクロファージが著明に減少した。しかしながらhCLS数には変化がなく、活性化筋線維芽細胞マーカーであるαSMAの陽性面積および線維化面積にも変化は認められなかった。以上から、hCLSはF4/80高発現マクロファージが中心となり、MCP-1/CCR2系非依存的に形成されると考えられた。本年度は申請者が中心となって確立した新規マウスモデルを用いて、肝線維化の起点と考えられるhCLS形成に対するMCP-1/CCR2系の関与を検討した。

骨髄移植実験にて組織学的解析、遺伝子発現レベルの解析に加え、FACS解析によって、NASH病態形成過程における単球・マクロファージの動態と肝線維化との関連が明らかになった。細胞死に陥った細胞とマクロファージが相互に作用する場であると考えられるCLSは、肥満脂肪組織・NASHの肝臓に共通して認められるが、その構成マクロファージの動態は異なることが示唆された。CLS構成マクロファージの動態および機能的変化を明らかにすることで、各臓器における線維化発症の分子機構に対する理解が深まることが期待される。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。NASHの病態形成過程においてマクロファージの由来は均一ではなく、さらにマクロファージの機能・分布が局所的に変化してhCLSという構造を形成することで、炎症・線維化の起点となることが示唆されている。マクロファージの動態に関しては、adoptive transferや蛍光色素を用いたトレーシング実験など複数の実験を組み合わせることで、hCLSの形成過程を明らかする。さらに、hCLS局所におけるマクロファージの機能的変化を捉えるため、ソーティングあるいはマイクロダイセクションによりhCLS構成マクロファージを単離し、網羅的解析を行う。また、脂肪組織における線維化が脂肪蓄積機能を障害し、肝異所性脂肪蓄積を促進すると考えられるため、CLS数と線維化発症の経時的変化を検討し、FACS解析や組織学的解析などによってマクロファージの極性変化や線維化関連細胞の分布を明らかにする。
ヒメツリガネゴケで植物ホルモンオーキシン、サイトカイニン機能解明への網羅的研究

本研究では、ヒメツリガネゴケをモデルとして、オーキシンとサイトカイニンの生合成、受容、情報伝達に関わる遺伝子を誘導cDNAアクチベーション法(全長cDNAを過剰発現プロモーターによって発現させ、変異体を得る方法)により網羅的に単離することを目的としている。1.mRNAの5'末端に存在するキャップ構造を利用してヒメツリガネゴケ完全長cDNAライブラリーを作成した(理研篠崎研、林崎研との共同研究)。現在、オーキシン処理、サイトカイニン処理したヒメツリガネゴケ由来の完全長cDNAライブラリーを作成中である。2.作成したヒメツリガネゴケ完全長cDNAライブラリーのうち、1000クローンの塩基配列を決定した結果、90%以上が、完全長cDNAであることがわかった。来年度末までに3万クローンの配列決定、カタログ化を行う予定である。3.被子植物のオーキシン応答プロモーターであるDR5、GH3プロモーターにGFPをつないだコンストラクトを作成し、ヒメツリガネゴケのニュートラルサイトであるPpHB9サイトに導入した。その結果、GH3プロモーターがヒメツリガネゴケ内で局所的に発現していることがわかり、オーキシンの分布の指標として使える可能性があることがわかった。4.2で塩基配列決定したクローンを、順次、オーキシン応答プロモーター::GFPを持つヒメツリガネゴケに導入し、過剰発現株の作成を開始した。来年度末までに7千変異体の単離をめざしている。
ブドウ果実におけるフラボノイド代謝に関与する遺伝子の機能解析

フラボノイドはその機能性や色・呈味性から注目されている。異なる環境下で栽培したブドウ果実の各フラボノイドの量や組成とともに遺伝子発現について網羅的な解析を行った。異なる光環境下でのプロアントシアニジン(縮合型タンニン)含量の変化と呼応した発現を示す遺伝子群を抽出し、制御因子であるVvMYBPARを同定した。ブドウ培養細胞及びシロイヌナズナ・ブドウ形質転換体を用いた解析により、VvMYBPARはプロアントシアニジン特異的な制御因子であることが示された。また、既に報告のあるブドウの制御因子と異なる組織・時期特異性を示し、異なるプロアントシアニジン特異的生合成系遺伝子を制御していることが示唆された。植物の二次代謝産物であるフラボノイド化合物は抗酸化性、抗ウィルス性、抗癌性など多くの機能性をもつことから、注目される化合物である。また、色や呈味性をもち、ブドウ果実を利用した加工飲料(ワインなど)における官能特性を決定づける重要な因子でもある。平成24年度は、昨年度に行ったSuperSAGE法の結果をもとに、発達時期、各種環境下(果房周囲の光環境など)における果実中のフラボノイド(プロアントシアニジン(PA))組成変化に同調した発現変動を示す遺伝子について抽出を行った。抽出された遺伝子群には、既知のPA生合成系の構造遺伝子(VvANR,VvLAR1)に加え、グルコシルトランスフェラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼなど前駆体の修飾に関与すると考えられる遺伝子、トランスポーター、MYB型転写制御因子などが含まれていた。次に、得られたMYB型転写制御因子について全長配列を決定し、推定アミノ酸配列を他の植物で報告のあるMYB型転写因子の配列と系統樹解析を行ったところ、シロイヌナズナTT2などプロアントシアニジン生成の制御因子群とクラスターを形成することがわかった。また、ブドウの様々な組織を用いた定量PCR解析によって、このMYB型制御因子の発現は、これまでに同定されているプロアントシアニジン生成の制御因子とは部位特異性、環境応答性が異なることが示唆された。更に、機能の解析をすすめるため、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターでこの遺伝子を強制発現させたシロイヌナズナを作成し、解析を行った。マイクロアレイ解析の結果、この遺伝子はプロアントシアニジンの生成経路の遺伝子群を特異的に制御していることが示唆された。植物の二次代謝産物であるフラボノイド化合物は抗酸化性、抗ウィルス性、抗ガン性など多くの機能性をもつことから、注目される化合物である。フラボノイドの化合物組成は、種々のストレス環境下において変動することから、植物にとって、生物的及び環境ストレスに対する防御化合物としての役割をもっていることが示唆されている。これまで、ブドウ果実における主要フラボノイドであるプロアントシアニジンに着目し、異なる光環境条件下においてプロアントシアニジンの変化と呼応した変動を示すMYB型制御因子VvMYBPARをスーパーセージ法によって同定した。平成25年度はこのMYB型制御因子の機能解析を更にすすめるため、ブドウ培養細胞を用いた一過性の遺伝子発現系を用いてレポーターアッセイを行った。VvMYBPARは、これまでに報告のあるプロアントシアニジン制御因子と同様に、プロアントシアニジン特異的な経路の遺伝子に加えて、フラボノイド共通経路上の遺伝子のプロモーターを活性化するが、アントシアニン生合成経路のVvUFGTには影響がみられないことがわかった。一方、VvMYBPARの遺伝子発現は既に報告のあるVvMYBPA2と異なる、組織・時期特異性、環境応答性を示し、異なるプロアントシアニジン特異的生合成系遺伝子を制御していることが示唆された。これらの相同性の高いMYB型制御因子が機能分担してブドウ果実におけるプロアントシアニジン生成の制御を行っていることにより各部位や発達時期によるプロアントシアニジン組成の違いが生じていると推察された。これらの結果について学会発表2回、論文1報の作成を行った。植物の二次代謝産物であるフラボノイド化合物は抗酸化性,抗微生物性,抗ウィルス性,抗癌性など多くの機能性をもつことから,注目される化合物である。また,色や呈味性をもち,ブドウ果実を利用した加工飲料など(特にワイン)における官能特性を決定づける重要な因子でもある。平成23年度は、異なる環境下で栽培したブドウ果実より調整したサンプルを用いて、果実組織におけるフラボノイドの量や組成の変動について詳細に解析するとともに、遺伝子発現について、網羅的な遺伝子発現法であるSuperSAGE法を用い解析を行った。ワイン用ブドウ品種カベルネソーヴィニヨンの果房を開花期より遮光箱、UVカットフィルム等による遮光処理/遮光解除処理を行い、受光環境の異なる果皮を経時的にサンプリングした。

また、幼果をMS培地上で果粒培養し、白色光及びUV光による照射処理を行った果皮の各フラボノイド組成の解析及び既知の生合成系遺伝子群のRNA量の測定を行った。その結果、果皮の各フラボノイド(プロアントシアニジン、フラボノール、アントシアニン)の含量及び組成は、環境変化、発達時期に応じ異なる変動を示し、既知の生合成系遺伝子の発現変化とも良く対応していた。次に、これらのサンプルに、各発達時期の種子サンプルを加えた17サンプルよりRNAを調整した。制限酵素、タギング酵素によりmRNAの特定の位置より26塩基のタグを抽出し、次世代シーケンサーにてシーケンス解析を行った(SuperSAGE法)。シーケンスされたタグ(遺伝子)とタグ数からブドウ果実で発現している各種遺伝子の網羅的な発現プロファイル情報を得た。発現プロファイルを、既知のフラボノイド生合成系遺伝子の発現と比較し、同調して遺伝子発現の変化する遺伝子群を抽出した。その中にはフラボノイド生合成系の制御や前駆体の修飾などと関連すると考えられる遺伝子も含まれていた。植物の二次代謝産物であるフラボノイド化合物は抗酸化性、抗ウィルス性、抗ガン性など多くの機能性をもつことから、注目される化合物である。フラボノイドの化合物組成は、種々のストレス環境下において変動することから、植物にとって、生物的及び環境ストレスに対する防御化合物としての役割をもっていることが示唆されている。これまでに各種光環境下におけるプロアントシアニジンの生成と呼応した変動を示す制御遺伝子VvMYBPARを同定し、そのプロアントシアニジン特異的な制御機構について、シロイヌナズナ強制発現株の解析及びブドウ培養細胞を用いたレポーターアッセイを用いて明らかとしている。本年度は作成したブドウ過剰発現株の解析を行い、当遺伝子の機能について確認を行った。これらの成果については招待講演1回、論文発表1報を行った。園芸科学昨年度に実施したSuperSAGE法によって得られた遺伝子発現プロファイルデータの解析を行い、フラボノイド(特にプロアントシアニジン)の生成に関与すると考えられる遺伝子群について抽出を行った。このうち、プロアントシアニジンの制御に関連すると考えられる遺伝子について、モデル植物を用いた、形質転換体を作成し、その表現型について解析を行った結果、当遺伝子がプロアントシアニジン生合成系の新たな制御因子であることが示唆された。これらについては当初の計画以上に進展していると考えられた。実際のブドウにおけるこの遺伝子の機能解析については、当遺伝子を形質転換したブドウ毛状根を用いて解析を行ったが、この解析系の問題点が明らかとなり、今後解析系の検討も含めた検討が必要であると考えられた。以上のことより全体としては、計画通り、おおむね順調に進展していると考えられる。抽出された遺伝子のブドウにおける機能解析にあたって、パーティクルガンを用いた一過性の発現系をブドウ培養細胞を用いて立ち上げ、この遺伝子のブドウにおける機能の詳細を明らかとした。また、これまでの結果と合わせて、学会発表2回、報文作成1報を行えたのは当初の計画以上に進展していると考えられた。