hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
円形脱毛症発症機序の免疫学的解析

免疫組織学的解析では、毛包周囲と毛包内へのIL-17陽性細胞の浸潤を認め、これは正常頭皮と比較して優位に多く認めることを見いだした。これらは、Th17細胞が円形脱毛症病態に関与することをより直接的に示している。Th1, Th2, Th17, Treg細胞の協奏的な浸潤の中で、Th17の円形脱毛症病態における意義を解析することは、予後因子の解析と相まって、よりよい治療法の構築に寄与すると考える。円形脱毛症病型別の病変部浸潤細胞の発現遺伝子解析これまでの円形脱毛症研究は、後天的に発症した非瘢痕性脱毛を全て円形脱毛症として同一の病態形成機序が働いていると想定して行われてきた。しかし、ADTAFSを例に挙げるまでもなく、円形脱毛症は異なった病態形成機序からなる疾患の総称である可能性がある。そこで、私たちは円形脱毛症患者を1アトピー性皮膚炎合併群、2Kawamuraらの報告したADTAFSの定義に合致する群、3それ以外の群に分け、円形脱毛症病変部の遺伝子発現を検討する。2)細胞障害性タンパクの免疫染色該当なし
結膜線維芽細胞から角膜内皮細胞へのｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ

mRNA-sequencingとAffymetrix社のExon arrayを用いた網羅的遺伝子発現解析により、角膜内皮特異的な転写因子を38抽出し、このうち、培養皮膚線維芽細胞や培養角膜上皮細胞で高発現だったもの等を除き、角膜内皮特異的な転写因子として11転写因子を同定した。これら11の転写因子のlentivirus vectorを、Invitrogen社のGatewayシステムを用いて作成した。Sanger sequenceにより、open reading frame全長がクローニングできたことを確認した。HEK293FT細胞を用いてウィルス粒子を作成し、10^5/ ml以上の力価が得られた。結膜線維芽細胞と皮膚線維芽細胞に11転写因子を遺伝子導入し、角膜内皮細胞への分化誘導を試みた。まず、11転写因子を同時に導入したが、角膜内皮様の敷石状細胞への形態変化を示さなかった。次に、11個の転写因子のうち、特に角膜内皮細胞で特異性が高く、角膜内皮細胞の発生において重要と報告されている複数の転写因子を導入したが、いずれの転写因子の組み合わせにおいても、角膜内皮様の敷石状細胞への形態変化を示さなかった。しかし、11転写因子は、角膜内皮細胞のマーカー遺伝子として、有望であり、今後の角膜内皮細胞の再生医療に資するものであると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在、結膜線維芽細胞と皮膚線維芽細胞に11転写因子を遺伝子導入し、角膜内皮細胞への分化誘導を試みている。角膜特異的転写因子のOpenreading frameの全長をレンチウィルスベクターにクローニングし、初代培養細胞への感染に必要な高力価のウィルス粒子を得ることができた。結膜線維芽細胞と皮膚線維芽細胞に11転写因子を遺伝子導入し、角膜内皮細胞への分化誘導を試みている。また、角膜上皮細胞について、表皮角化細胞・結膜上皮細胞に7転写因子を導入することにより、角膜上皮細胞への分化誘導を試みている。さらに、初代培養細胞を用いた各転写因子のshによるknockdown細胞の網羅的発現解析や転写因子のChIP(chromatin immunoprecipitation)-seqによる各転写因子の下流遺伝子の同定により、角膜細胞の特異性維持の転写制御機構を網羅的に解明する。
精密インジェクタの開発

平成8年度は下記に示すような実験を行い,次のような結果および知見を得た.(1)精密シリンダの試作:現在一般に使用されているシリンジの材質は,ガラスや樹脂製である.しかし,ガラス製や樹脂製シリンダは加工精度に難があるためシリンダ内壁の面粗さは均一ではなく,吐出精度の正確さが要求される精密シリンジには向かない.特に今回,筆者が開発した「圧電インパクト駆動機構」をピストンの駆動に用いているので,特に精密な内壁加工が要求される.そこで,内面をラップ仕上げなどでRAの数値をRA=0,05μm以下の真鍮製シリンダを試作した.摩擦面を面精度をあげて均一化することにより,安定した吐出が可能になった.内径1,6mmのノズルを用いての吐出実験では,平均0,04mgの安定した吐出を確認した.(2)精密マイクロインジェクタの試作:生命工学の分野において,細胞内に精子やDNAを注入するような作業がある.現在,ほとんどの研究者は注射器とネジを組み合わせた手動インジェクタを使用しているので,微細な吐出には熟練を要している.今回,細胞操作用マイクロマニピュレータに圧電インパクト駆動インジェクタを組み込み,精子のインジェクションを試みた.細胞内インジェクションは手元スイッチで遠隔操作が可能になり手動インジェクタより精度の高いインジェクションを行うことができた.しかし,今後の課題として,粘度の高い溶液中のDNAなどを吸引し細胞内へ吐出する作業があるが,今回試作したインジェクタは高粘度溶液のインジェクションには不適であった.よって,高粘度溶液に適した改善(摩擦機構の改善,ロック機構の追加など)を行う必要があることが判明した.(3)空圧式インジェクタの試作:圧縮空気(23kg/cm^2)でピストンをインパクトしながら駆動する空圧インパクトインジェクタを試作した.圧電インパクトインジェクタと比べるとピストンの駆動力は強いが微小量域でのコントロールが難しいという問題があった.平成8年度の研究を振り返ってみて,圧電インパクト駆動インジェクタは,内面精度の良いシリンダと組み合わせることで,精密吐出が可能であることが確認できた.また,細胞操作用マイクロマニピュレータと組み合わせることで,DNAや精子のインジェクションの自動化の可能性を探求することかできた.今後は本成果を用いて全自動マイクロインジェクタを試作する.平成8年度は下記に示すような実験を行い,次のような結果および知見を得た.(1)精密シリンダの試作:現在一般に使用されているシリンジの材質は,ガラスや樹脂製である.しかし,ガラス製や樹脂製シリンダは加工精度に難があるためシリンダ内壁の面粗さは均一ではなく,吐出精度の正確さが要求される精密シリンジには向かない.特に今回,筆者が開発した「圧電インパクト駆動機構」をピストンの駆動に用いているので,特に精密な内壁加工が要求される.そこで,内面をラップ仕上げなどでRAの数値をRA=0,05μm以下の真鍮製シリンダを試作した.摩擦面を面精度をあげて均一化することにより,安定した吐出が可能になった.内径1,6mmのノズルを用いての吐出実験では,平均0,04mgの安定した吐出を確認した.(2)精密マイクロインジェクタの試作:生命工学の分野において,細胞内に精子やDNAを注入するような作業がある.現在,ほとんどの研究者は注射器とネジを組み合わせた手動インジェクタを使用しているので,微細な吐出には熟練を要している.今回,細胞操作用マイクロマニピュレータに圧電インパクト駆動インジェクタを組み込み,精子のインジェクションを試みた.細胞内インジェクションは手元スイッチで遠隔操作が可能になり手動インジェクタより精度の高いインジェクションを行うことができた.しかし,今後の課題として,粘度の高い溶液中のDNAなどを吸引し細胞内へ吐出する作業があるが,今回試作したインジェクタは高粘度溶液のインジェクションには不適であった.よって,高粘度溶液に適した改善(摩擦機構の改善,ロック機構の追加など)を行う必要があることが判明した.(3)空圧式インジェクタの試作:圧縮空気(23kg/cm^2)でピストンをインパクトしながら駆動する空圧インパクトインジェクタを試作した.圧電インパクトインジェクタと比べるとピストンの駆動力は強いが微小量域でのコントロールが難しいという問題があった.平成8年度の研究を振り返ってみて,圧電インパクト駆動インジェクタは,内面精度の良いシリンダと組み合わせることで,精密吐出が可能であることが確認できた.また,細胞操作用マイクロマニピュレータと組み合わせることで,DNAや精子のインジェクションの自動化の可能性を探求することかできた.今後は本成果を用いて全自動マイクロインジェクタを試作する.
正の調節因子に依存した遺伝情報発現の機構

本研究は大腸菌における遺伝子発現調節系の中で、正の調節因子(アクチィベーター)として特に興味深い側面をもつOmpRタンパク質による外膜タンパク質遺伝子ompC,ompFの発現調節系を解析することにより、正の調節因子による遺伝子の活性化の分子機構にアプローチしたものである。(1)、OmpRタンパク質の精製とompC,ompFプロモーターDNAへの結合;OmpRタンパク質の多量生産系を確立し、OmpRタンパク質を均一に、かつmgの単位で精製した。精製されたタンパク質の分子量、アミノ酸組成、N-末端のアミノ酸一次配列は、すでににDNA塩基配列から推定されていたものとよく一致した。精製OmpRタンパク質はモノマーとして存在していた。精製OmpRタンパク質は、ompC及びompFプロモーター領域を含む各々のDNA断片に特異的に結合することが証明された。また、さらに詳細な解析により、結合領域は各々のプロモーターの-35領域の上流であることが示された。以上の結果から、正の調節因子OmpRは、ompC及びompF遺伝子のプロモーター上流領域に直接結合して、両遺伝子の活性化をもたらすものと結論した。(2)、ompCプロモーター構造の解析;すでに前年度において、ompFプロモーターの構造に関しては明らかにしてきた。本年度は、ompC遺伝子の発現調節に重要なプロモーター構造を明らかにした。まずompCプロモーター近傍をlacZ遺伝子に結合した。次いでompCプロoモーター領域の一連の塩基欠失変異を作成し、その最少領域を決定した。大腸菌プロモーターの共通構造(-35,-10領域)が決定されたが、その領域のみでは十分なompC転写活性は得られず、さらにその上流領域(約60塩基対)を必須とすることが明らかになった。以上の結果をompFプロモーターの構造と比較することにより、ompC,ompF両遺伝子の発現に重要な領域と、そのDNA構造上の各々の特徴を明らかにすることができた。
噛みタバコによる口腔ガンの予防に向けた発がん機構メカニズムの解明

南アジア、東南アジアにおけるbetel quidを噛む習慣は、口腔がんの原因として重要視されている。Betel quidが口腔がんを引き起こす機序として、areca nutと消石灰の副生成物であるアレコリンの発がん性と炎症惹起作用があげられているがその詳細については不明である。本年度は、アレコリンによる発がん作用の機序を解明するために、in vitroでヒト歯肉上皮前駆細胞(HGEP)にアレコリンを長期に作用させたサンプルを用いタンパクの発現変化を解析した。HGEPはEpithelial Culture MediumにArecoline hydrobromide(Arecoline)添加および非添加を3日間毎に繰り返し、1ヶ月間培養を行った。コントロールには超純水を添加したものを用いた。これまでの結果から、アレコリン添加群でSIRT1遺伝子発現が上昇し、DNAメチル化レベルが低下することが明らかになった。今回は、培養した細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロット法を用いてタンパク質の発現を確認した。その結果、アレコリン添加群でSIRT1タンパク(120 kDa)の発現が低下していた。また、Betel quidの影響をin vivoで確認するために,スリランカのベテル噛み習慣者(BQC)および非習慣者(NC)の口腔粘膜からDNAを採取し、発がんに影響を与えると考えられるSIRT1遺伝子に対しqMSPを用いてメチル化レベルを測定した。その結果、NCと比較してBQCから得られたSIRT1遺伝子は、プロモーター領域のDNAメチル化レベルが上昇していた。以上のことから噛みたばに含まれるアレコリンは癌抑制遺伝子であるSIRT1遺伝子のプロモーター領域をメチル化することによって発現を制御し、betel quidを噛む習慣のある人々の口腔がんの原因となることが推察された。おおむね順調に進展している理由としては、細胞の長期培養とin vivoサンプルを用いた解析が順調に進んだことが挙げられる。実験の方向性も順当に進行している状況であるため、引き続き研究を追行する予定である。来年度は、スリランカのベテル噛み習慣者(BQC)および非習慣者(NC)の口腔内から採取したサンプルを用いてオーラルフローラの解析を行う予定である。本年度は、アレコリンによる発がん作用の機序を解明するために、in vitroでヒト歯肉上皮前駆細胞(HGEP)にアレコリンを長期に作用させたサンプルを用い遺伝子の変化を網羅的に解析した。HGEPはEpithelial Culture MediumにArecoline hydrobromide(Arecoline)添加および非添加を3日間毎に繰り返し,1ヶ月間培養を行った.コントロールには超純水を添加したものを用いた。それぞれRNAを抽出した後,マイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行った.得られたマイクロアレイのデータを用い、転写因子結合サイト探索解析と、その結果を利用したキーノード解析を行った。また,同様に培養した細胞からDNAを抽出し、CpGメチレーションアレイにて解析した。さらに、DNAはBisulfite処理を行い、定量的Methylation Specific PCR(qMSP)によりDNAメチル化解析を行った。また、total RNAからcDNAを作成しmRNA発現の再現性をReal-time RT-PCR法にて検討した。キーノード解析ネットワークからSIRT1のネットワークが探索されたことから、マイクロアレイでmRNA発現が著明に増加し、DNA低メチル化が起こっていたSIRT1遺伝子に対し、再現性の確認を行った。その結果、アレコリン添加群でSIRT1遺伝子発現が上昇し、DNAメチル化レベルが低下することが明らかになった。SIRT1遺伝子は癌抑制遺伝子であり、betel quidを噛む習慣のある人々の口腔がんの原因としてSIRT1が影響を与えることが推察された。おおむね順調に進展している理由としては、細胞の長期培養が順調に進んだことが挙げられる。

その結果、NCと比較してBQCから得られたSIRT1遺伝子は、プロモーター領域のDNAメチル化レベルが上昇していた。以上のことから噛みたばに含まれるアレコリンは癌抑制遺伝子であるSIRT1遺伝子のプロモーター領域をメチル化することによって発現を制御し、betel quidを噛む習慣のある人々の口腔がんの原因となることが推察された。おおむね順調に進展している理由としては、細胞の長期培養とin vivoサンプルを用いた解析が順調に進んだことが挙げられる。実験の方向性も順当に進行している状況であるため、引き続き研究を追行する予定である。口腔上皮由来細胞をアレコリンにて長期刺激を行い、ChIP法でヒストン修飾の確認を行う。来年度は、スリランカのベテル噛み習慣者(BQC)および非習慣者(NC)の口腔内から採取したサンプルを用いてオーラルフローラの解析を行う予定である。旅費を使用しなかったため、次年度に使用する。オーラルフローラ解析に関わる費用を翌年度分として請求したため。
脊椎動物のボディープランの分子的基盤(計画班)

ボディープランの中での「シグナル分子班」のこの班での研究はかなり充実した成果内容となっている。浅島はアクチビンやレチノイン酸time-lay法によって膵臓形成をin vitroで行って、そこからインスリンやグルカゴンなどのホルモンを分泌する内分泌器官を未分化細胞から初めてつくった。またアクチビンによって活性化される新規の遺伝子としてMig30,XSIP-1などの初期発生に重要な遺伝子をクローニングし解析した。上野はBMPの標的遺伝子の解析を行って、Msx-1、VPMsx-1との関係を明らかにしたし、wntとTGF-βのクロストークについても証明した。また、線虫C.eleganceの体長を調節するリガンドCet-1の作用とその標的遺伝子としてlon-1をクローニングし、そのメカニズムを明らかにした。井出はニワトリやマウスの肢芽形成に関与する因子としてfgf-10とHoxa13,msx-1が大きな役割を担うことを明らかにした。野地はニワトリの胚が形成において特に四肢筋肉形成におけるcdf-8の役割を明らかにするためにトランスジェニックマウスを作製した。岡野は哺乳類神経幹細胞の自己複製に関してMsilとNotchシグナリングに注目して大きな成果をあげた。MsilはRNA結合性タンパク質であり、神経幹細胞に強く発現している。また、このMsi-1がNumbやHubと深く関与していることもわかった。佐藤はホヤを用いて脊索形成に関して、内胚葉分化とβカテニンとの関係や内胚葉からのシグナル分子としてのbFGFの同定、Brachyury遺伝子の標的遺伝子としてnetrin,prickle相同遺伝子、ERM、レプリカンなどそのカスケードを明らかにした。これらは更に新しくTbx-6の解析につながっていった。内山は、新しくTbx-6のクローニングと解析をした。動物の形態形成での最初の分子シグナルであるアクチビンの卵内へのとりこみと細胞分化との関係が明らかにされた。また、アニマルキャップアッセイ法を用いて、血球、筋肉、脊索の他に、心臓、肝臓、中枢神経などの形成も可能となってきた。それらの器官形成に関与するいくつかの新規の遺伝子がクローニングされ、解析された。また、follistatinがBMP結合蛋白質である可能性について検討した。その結果、follistatinはBMPによる腹側化、神経分化抑制などすべての作用を阻害した。ES細胞から中胚葉、血管血液への分化をembryoidbodyやfeeder cellに依存することなく再現する実験系を完成させ、血液、血管までの分化で通過する中間段階の細胞を同定し、生きたままソ-トする細胞表面マーカーを確立し、これらを用いたprogressive lineage analysisの結果、血管内皮の分化が血液への分化より先行して起こる新しいモデルを提唱された。一方、FGFによる四肢誘導の研究において、FGF10は四肢の形成領域に発現し、しかも過剰肢を誘導することからFGF10は内在性の肢誘導因子であることを見出した。更にニワトリ胚肢形成因子、特に背腹組織間の相互作用を実験的に明らかにし、腹側で発現する遺伝子En-1を過剰発現させた外胚葉細胞の移植により、過剰指を形成させた。そして、体側部にAERを形成させるシグナル分子として、KGF(角化細胞増殖因子)の作用を見いだした。ショウジョウバエArgosはEGFモチーフを有する分泌性の蛋白質で、Ras/MAPKシグナルを抑制して細胞分化を制御する。Argosの機能欠損変異体においては、眼原基における細胞死の抑制が起こり、一方過剰発現では細胞死を誘導する。この細胞死の誘導機構を詳細に解析した結果、Argosによる細胞死はP35蛋白質の共発現によって抑制されるためと考えられた。動物の初期発生における組織および器官形成について分子生物学的および発生生物学的に調べた。まず筋肉分化と形態形成運動が調べられ、筋肉分化には細胞運動が必要なことが明らかになった。その時アクチンフィラメントの形成やMyoDやXbraの発現との相関関係もわかった。また神経形成や器官形成に関与する新規の遺伝子が次々とクローニングされ、その機能についても調べられた。また神経形成におけるパターン形成についてBMPとフォリスタチン、コーディンとの関係について調べ、BMPの機能を明らかにした。更に線虫C.eleganceを用いて、体の長さを調節するリガンドCet-1の遺伝子をクローニングし、その機能を明らかにした。神経形成に重要と思われるBMPの細胞内シグナル伝達機能、特にいくつかのSmadの役割を明らかにし、細胞内のクロストークについての新しい機構を提唱した。更にニワトリの肢芽形成におけるAER細胞の発生段階と位置情報について細胞の選別とその機能発現について調べた。その結果、新規の細胞接着分子もみつけられた。それと同時に進行帯細胞間の選別におけるPTKの機能をはじめて明らかにすることができた。そのような時PTKと細胞選別および中胚葉分化に強い相関があることがわかった。また脊椎動物の左右軸に関する新規の遺伝子Pitx-2とPitx-3が発見され、これらの遺伝子が動物の胚発生で左右非対称な形態形成を生ずる重要な遺伝子であることを明らかにした。そして、Pitx-2は単に体の非対称性を決めるだけでなく、肢芽の筋芽細胞の分化にも大きな役割を果たしている。一方、ショウジョウバエのArgosによるEGF受容体の制御機構とRas/MAPKシグナルの制御に関する新規の遺伝子の同定を行った。

浅島はアクチビンやレチノイン酸による腎臓形成をin vitroで行って、腎臓形成に関与する新規の4つの遺伝子のクローニングと解析を行った。その中にはヒトの腎疾患と結びつけるものもあった。また感覚器官としての目や耳を未分化細胞より試験管内でつくることにも成功しており、それらの器官や組織形成に関連する遺伝子を解析した。上野はBMPの標的遺伝子の解析を行って、Msx-1、Msx-2、Dlx-5などのホメオボックス遺伝子を標的にしていることを明らかにした。また、線虫C.eleganceの体長を調節するリガンドCet-1の作用メカニズムを明らかにした。井出はニワトリやマウスの肢芽形成に関与する因子としてfgf-10とfgf-8が大きな役割を担うことを明らかにした。西川は色素細胞の移動に伴う細胞接着分子の変化を調べ、E-カドヘリンとP-カドヘリンの発現と相関関係にあることを示した。野地はニワトリの胚が形成において特に四肢筋肉形成におけるPitx-2の役割の中でc-metとLbx-1の発現が深く関与していることを示した。また胚体内の器官形成におけるlefty遺伝子について更に解析を行って、Pitx-2はnordalによって誘導されることを明らかにした。またlefty遺伝子とshh、アクチビンとの遺伝子の相関についても明らかにし、初期発生における発生過程の時間軸と器官形成について新しい知見を示した。岡野は細胞間のコミュニケーションにおけるRasシグナル系の中で特にArgosとspitzについて調べた。そしてArgosによるEGF受容体の制御機構の解明とRas/MAPKシグナル制御に関する新規遺伝子の同定を行った。ボディープランの中での「シグナル分子班」のこの班での研究はかなり充実した成果内容となっている。浅島はアクチビンやレチノイン酸time-lay法によって膵臓形成をin vitroで行って、そこからインスリンやグルカゴンなどのホルモンを分泌する内分泌器官を未分化細胞から初めてつくった。またアクチビンによって活性化される新規の遺伝子としてMig30,XSIP-1などの初期発生に重要な遺伝子をクローニングし解析した。上野はBMPの標的遺伝子の解析を行って、Msx-1、VPMsx-1との関係を明らかにしたし、wntとTGF-βのクロストークについても証明した。また、線虫C.eleganceの体長を調節するリガンドCet-1の作用とその標的遺伝子としてlon-1をクローニングし、そのメカニズムを明らかにした。井出はニワトリやマウスの肢芽形成に関与する因子としてfgf-10とHoxa13,msx-1が大きな役割を担うことを明らかにした。野地はニワトリの胚が形成において特に四肢筋肉形成におけるcdf-8の役割を明らかにするためにトランスジェニックマウスを作製した。岡野は哺乳類神経幹細胞の自己複製に関してMsilとNotchシグナリングに注目して大きな成果をあげた。
金属触媒を用いるβ-水素脱離を制御したオレフィンへの求核付加反応の開発

[RuCl_2(p-cymene)]_2をAgOTfで処理して得られる錯体にホスフィン配位子を組み合わせると,クロロホルム中で本反応に対する触媒活性を示すことが明らかとなった。スルホンアミド類とスチレンの反応においては二座ホスフィン配位子の利用が効果的であり,80%を超える収率で目的物を与えた。ルテニウム前駆体に1,2-ビスジフェニルホスフィノベンゼン(DPPBen)を作用させた後,AgOTfで処理して得られた錯体の^1H NMRからp-シメンがルテニウム上に芳香環として配位していること,^<19>F NMRからルテニウムに配位したOTfと配位していないOTf^-が存在すること,^<31>P NMRからジホスフィン配位子がキレート配位していることが明らかとなった。また,単結晶X線構造解析にも成功し,NMRの解析結果が正しいこと,並びに,ルテニウムに配位したOTfは単座型であることが示された。単離・構造決定したルテニウム-DPPBen錯体を用いてスチレンに対する各種ヘテロ求核剤の付加反応を検討したところ,アルコールやカルボン酸さらにはスルホンアミドがスチレンに効率よく付加することを見出した。Xantphos-ルテニウムカチオン性錯体は良好な触媒活性を示し,これまで反応の進行がほとんど見られなかったオレフィン類に対しても付加反応が進行することが示された。2-フェニル安息香酸のオレフィンに対する付加反応では,オレフィンとして1-ヘキセンや1-オクテンのような直鎖アルケン,(Z)-二置換であるシクロヘキセンでも80%を超える収率で反応が進行した。さらには,これまで反応しなかった脂肪族カルボン酸でも付加が観察され,マンデル酸が芦アリルアニソールに付加し,64%収率でマンデル酸3-(4-メトキシフェニル)-2-プロピルを与えた。カルボン酸類のオルフィンへの付加反応として,o-アニス酸と2-ノルボルネンの反応をルテニウム触媒〔(Cp^*RuCl_2)_2 1mol%,トリフルオロメタンスルホン酸銀6mol%、トリフェニルホスフィン2mol%〕存在下、85°Cで18時間反応させると、2-メトキシ安息香酸exo-2-ノルボルニルが71%の収率で得られた。このタイプの付加反応は酸触媒でもいくらか進行することから、10mol%のトリフルオロメタンスルホン酸のみを触媒に用いて反応させたところ、29%の収率で炭素-炭素二重結合にカルボン酸の付加した生成物が得られた。興味深いことに、この酸触媒で得られた生成物はexo/endo比が3:1であり、ルテニウム触媒反応ではexo選択的に反応が起こるのとは異なる選択性であった。カルボン酸としてp-アニス酸を用いた場合、収率にほとんど違いはなかったが、安息香酸を用いると収率の低下が見られ(70%)、酢酸では反応はまったく進行しなかった。さらに、オレフィンとしてアリルベンゼンを用いた場合,トリフェニルホスフィン配位子を使うことにより50%収率で生成物が得られた。アルコール類のオレフィンへの付加反応として,2-フェニルエタノールをスチレンとルテニウム触媒〔(Cp^*RuCl_2)_2 1mol%,トリフルオロメタンスルホン酸銀6mol%、トリフェニルホスフィン2mol%〕存在下に反応させたところ、2-フェニルエチル1-フェニルエチルエーテルが最高83%で得られた。2-ノルボルネンと2-フェニルエタノールとの反応からは、カルボン酸の場合と同様、exoにアルコキシ基が結合した生成物を89%の収率で与えた。また、1-オクテンと2-フェニルエタノールとの反応でも、ルテニウム触媒を基質に対して10mol%用いることにより、2-オクチル2-フェニルエチルエーテルが収率66%で得られた。2-フェニル安息香酸のオレフィンに対する付加反応では,オレフィンとして1-ヘキセンや1-オクテンのような直鎖アルケン,(Z)-二置換であるシクロ

ヘキセンでも80%を超える収率で反応が進行した。さらには,これまで反応しなかった脂肪族カルボン酸でも付加が観察され,マンデル酸が芦アリルアニソールに付加し,64%収率でマンデル酸3-(4-メトキシフェニル)-2-プロピルを与えた。
地域住民の食行動変容段階の主観評価と客観指標の一致性に関する疫学研究

平成17、18年度に群馬県倉渕村(現高崎市倉渕町)で行われた基本健康診査を受診し、本研究に同意した者(平成17年度:1412名、平成18年度:1058名)を対象に、基本受診項目に加え、スポット尿を採取し、尿中ナトリウムとカリウムおよびクレアチニンを測定し、Tanakaらの推定式(Tanaka T et al.J Hum Hyp2002)より1日あたりのナトリウム、カリウム、塩分摂取推定量を求めた。質問票により減塩行動段階を昨年と同様に5つのステージ(維持期、行動中、準備期、静観、静観以前)に分類した。解析の際は、3つのステージ(維持期+行動中、準備期、静観+静観以前)にまとめ、各年度の各ステージ別の1日あたりの尿中塩分排泄推定量を求め、時間断面的に解析を行った。さらに、平成17年度のステージが1年後の尿中塩分排泄量に反映されているかどうか調べるため、両年度ともに受診した参加者899名において、平成17年度のステージ別に平成17、18年度の尿中塩分排泄量の変化率の解析をKruskal Walllis検定により行った。各年度のステージ別尿中塩分排泄量(中央値)は、平成17年度(静観以前+静観:9.7g(男)/9.2g(女)、準備期:10.Og/9.7g、行動+維持期:9.4g/9.4g)、平成18年度(静観以前+静観:10.1g(男)/9.4g(女)、準備期:9.3g/9.5g、行動+維持期:9.7g/9.4g)間に統計学的な有意差は認められなかった。平成17年度のステージ別の尿中塩分排泄量変化率は、静観以前+静観で男女それぞれ+3.4%/-4.3%、準備期では、-4.2%/-1.3%、行動+維持期では、+2.7%/-3.5%であり(P値:男性0.086、女性0.778)統計学的に有意な差は認められなかった。行動+維持期の塩分排泄量が他のステージと比して既に低い傾向にあり、変化率にも差が無かったことより現在も減塩行動を継続していることが示唆された。また、準備期の男性の変化率はマイナスであり、減塩行動を実行していることが示唆された。しかし、いずれも統計学的に有意な差は認められず、本研究では、食行動変容段階の主観評価と客観指標の尿中塩分排泄量との一致性を明確に示すことができなかった。平成17年度は、群馬県倉渕村(現高崎市倉渕町)の全住民(約4,800名)のうち、基本健康診査(毎年9月初旬)を受診し、本研究に同意した者約1500名を対象に、基本健康診査の基本受診項目(身体状況、血圧、血液成分等)に加え、スポット尿を採取し、尿中ナトリウムとカリウムおよびクレアチニンを測定し、Tanakaらの推定式(Tanaka T et al. J Hum Hyp 2002)より1日あたりのナトリウム、カリウム、塩分排泄量を求めた。基本健康診査を受診しかつ減塩に関する行動変容ステージ質問票に解答した1,427名のうち、尿を採取できた1,406名(61.7±15.3歳)について解析を行った。減塩行動段階を次のような5つのステージ(維持期:減塩を6ヶ月以上実行している、行動中:減塩を実行中(期間6ヶ月未満)、準備期:減塩を近い将来行う意図がある、静観:減塩へ変容することを考えているが、減塩をはじめようとすることが6ヶ月以内、静観以前:食事の変容を試みる意図が全くない)に分類し、各ステージ別に1日あたりの尿中食塩排泄量を推定、比較した。各段階の内訳は、維持期:507名(36.1%)、行動期:59名(4.2%)、準備期:217名(15.4%)、静観:63名(4,4%)、静観以前:560名(39.8%)であった。また、1日あたり尿中塩分排泄量(平均値±標準偏差)は、全体では、9.6±2.2g、維持期:9.5±2.2g、行動期:9.3±2.2g、準備期:9.9±2.1g、静観:9.6±2.2g、静観以前:9.6±2.2gであり、各ステージ間に有意な差は認められなかった。1日あたりの尿中カリウム排泄量は、維持期(42.2±9.4mEq)と静観以前(40.2±8.9mEq)間において有意な差が認められた。来年度も同様の調査を行い、行動変容ステージと生体指標との関連を更に検討する予定である。

解析の際は、3つのステージ(維持期+行動中、準備期、静観+静観以前)にまとめ、各年度の各ステージ別の1日あたりの尿中塩分排泄推定量を求め、時間断面的に解析を行った。さらに、平成17年度のステージが1年後の尿中塩分排泄量に反映されているかどうか調べるため、両年度ともに受診した参加者899名において、平成17年度のステージ別に平成17、18年度の尿中塩分排泄量の変化率の解析をKruskal Walllis検定により行った。各年度のステージ別尿中塩分排泄量(中央値)は、平成17年度(静観以前+静観:9.7g(男)/9.2g(女)、準備期:10.Og/9.7g、行動+維持期:9.4g/9.4g)、平成18年度(静観以前+静観:10.1g(男)/9.4g(女)、準備期:9.3g/9.5g、行動+維持期:9.7g/9.4g)間に統計学的な有意差は認められなかった。平成17年度のステージ別の尿中塩分排泄量変化率は、静観以前+静観で男女それぞれ+3.4%/-4.3%、準備期では、-4.2%/-1.3%、行動+維持期では、+2.7%/-3.5%であり(P値:男性0.086、女性0.778)統計学的に有意な差は認められなかった。行動+維持期の塩分排泄量が他のステージと比して既に低い傾向にあり、変化率にも差が無かったことより現在も減塩行動を継続していることが示唆された。また、準備期の男性の変化率はマイナスであり、減塩行動を実行していることが示唆された。しかし、いずれも統計学的に有意な差は認められず、本研究では、食行動変容段階の主観評価と客観指標の尿中塩分排泄量との一致性を明確に示すことができなかった。
口腔扁平上皮癌幹細胞の同定とその表現形質の解析

口腔扁平上皮癌細胞株に含まれる癌幹細胞の同定と、その表現形質の解析を主たる研究目標とした。実験には造腫瘍能の異なる口腔扁平上皮癌細胞株を用い、これらの細胞に存在する癌幹細胞を、既知のマーカーである(1)CD133陽性、(2)CD44陽性、(3)CD44陽性/CD24陰性を指標にflowcytometryを用いて確認した.その結果、各種マーカーの割合は癌細胞株の造腫瘍能を反映しており、口腔扁平上皮癌細胞における癌幹細胞はCD44陽性細胞群を指標に分離できる可能性が示唆された。当研究室にて樹立された4種類の口腔扁平上皮癌細胞株(BHY、HNt、IH、B88)に存在する癌幹細胞を、幹細胞マーカーとして一般的に用いられているCD133を指標にflow cytometryにより確認した。その結果、CD133陽性細胞は検討したいずれの細胞においてもごく少数(0.13.9%)しか存在しておらず、分離培養や今後の解析が困難であることが予想された。そのため、乳癌、膵臓癌などの他の固形癌において癌幹細胞の細胞表面マーカーとして用いられているCD44陽性/CD24陰性細胞群の存在をflow cytometryにより確認した。その結果、CD44陽性/CD24陰性細胞群は、これらの口腔扁平上皮癌細胞中に3.4974.84%の割合で存在していた。これら細胞群の割合はヌードマウス腫瘍原性能の高いB88細胞では74.84%と高値であり、腫瘍原性能の低いHNt細胞では3.49%と低値であった。すなわち、その割合は腫瘍原性能を反映している傾向にあった。以上の研究結果から我々が保有する4種の口腔扁平上皮癌細胞株から癌幹細胞を分離培養し表現形質を解析するには、CD44陽性/CD24陰性細胞群の使用が適切であることが明らかとなった。現在、CD24陰性細胞群のnegative selectionとCD44陽性細胞群のpositive selectionをmagneticcell sorting(MACS)法を用いて行い、分離された細胞群における表現形質(細胞増殖能、腫瘍形成能、抗癌剤・放射線感受性)について解析中である。本研究は当研究室にて保有している口腔扁平上皮癌細胞株(HSC-2、HSC-3、HNt、IH、B88)に含まれる癌幹細胞の同定と、その表現形質の解析を主たる研究目標とした。実験には造腫瘍能の異なる口腔扁平上皮癌細胞株を用いた。これらの細胞に存在する癌幹細胞を、既知のマーカーである(1)CD133陽性、(2)CD44陽性、(3)CD44陽性/CD24陰性を指標にflow cytometryを用いて確認し、癌幹細胞数の割合とヌードマウス背部皮下における造腫瘍能との関連性を検討した。前年度に解析した、CD133陽性細胞は、検討したすべての細胞でごく少数(0.13.9%)しか存在しておらず、造腫瘍能との関連性も認められなかったが、CD44陽性細胞(またはCD44陽性/CD24陰性細胞)の割合は、ヌードマウス背部皮下で造腫瘍能の高いB88細胞では100%(82%)と高値を示したが、造腫瘍能が中等度であるHSC-2とHSC-3細胞ではそれぞれ37.3%(35.2%)と313%(23%)、造腫瘍能の低いHNtとIH細胞ではそれぞれ13.1%(12%)と19%(10.8%)であり、癌細胞株の造腫瘍能を反映していた。以上のことから、口腔扁平上皮癌細胞における癌幹細胞は、CD44陽性細胞群を指標に分離できる可能性が示唆された。そこで、分離された細胞群についての培養条件を検討したが、癌幹細胞様のphenotypeを維持させる至適培養条件が得られなかったため、in vivo解析を進めているところである。つまり、各種癌細胞株からMACSにて分離されたCD44陽性/CD24陰性細胞群を、ヌードマウス(生後8週齢)咬筋内に移植し、移植部位における腫瘍形成能およびリンパ節転移能の有無、遠隔転移の有無を病理組織学的に解析中である。
バントゥ諸語における名詞修飾形式と意味関係に関する記述言語学的研究

バントゥ諸語には類似した構造の名詞修飾節が見られるが、それらが修飾できる名詞との意味関係の範囲は言語によって異なっている。バントゥ諸語は名詞修飾節の形式と主名詞との意味関係によって、(1)主名詞と修飾部の関係によって異なる形式が用いられる言語、(2)主名詞と修飾部の関係に関係なく同じ形式が用いられる言語、(3)「内の関係」と「外の関係」だけでなく主名詞が修飾節の主語の場合とそれ以外の場合で異なる形式が用いられる言語、(4)主名詞が修飾節の主語の場合のみ異なる形式が用いられる言語、(5)内の関係の名詞のみ修飾できる形式とどんな関係の名詞でも修飾できる形式の両方を持つ言語、の5タイプに分けられる。●調査:バントゥ諸語のなかには主名詞と修飾部との意味関係が名詞修飾の形式に反映される言語とされない言語があるが、25年度は、前者の例としてヘレロ語、後者の例としてスワヒリ語を取り上げ、それぞれの詳細について調査を行った。まず、これまでの現地調査で収集したデータやこれらの言語で書かれた民話等のテキストデータから名詞修飾形式をピックアップし、修飾部と主名詞の意味関係を確認していく作業を行った。また8月にタンザニア(スワヒリ語)、9月にナミビア(ナミビア)でそれぞれ2週間のフィールドワークを実施し、これまでのデータの確認と補完、新たなデータの収集を行った。さらに、研究協力者から提供されたその他のバントゥ諸語のデータについて比較・検討を行った。●成果:上記の調査から、1「内の関係」でも主名詞の文法関係によって異なる形式が用いられる言語があること、2スワヒリ語の2つの関係節はアクセントフレーズが異なる(つまり主名詞と修飾節との緊密性に違いが見られる)こと、3スワヒリ語の名詞修飾形式には方言差があって関係節が1つしかない方言も少なくないこと、などが明らかになった。これらの成果の一部を論文「バントゥ諸語における名詞修飾節の形式と意味」にまとめた。また日本語との対照研究を論文“Noun-modifyingconstructions in Swahili and Japanese."にまとめた。これは2016年度に発行される予定である。この他、国内外の学会と研究会において、アクセントフレーズ成果を発表した。●国際研究者交流:2013年4月にはベルリン・フンボルト大学(ドイツ)において海外の研究協力者との研究打合せと研究会を行った。2014年3月にはロンドン大学東洋アフリカ学院(英国)において国際バントゥ諸語ワークショップを開催し、研究代表者と国内外のが2013年度の成果発表を行った。●調査と成果:バントゥ諸語の中には主名詞と修飾部との意味関係が名詞修飾の形式に反映される言語されない言語がある。26年度の調査では、現在執筆中の論文に用いているスワヒリ語例文の確認およびヘレロ語の追加のデータ収集を行った。この成果は、昨年から執筆している論文“Noun-modifying constructions in Swahili and Japanese"に反映させた。さらに、これまで中心的にデータを収集してきたスワヒリ語とヘレロ語に加えて、タンザニアではヤオ語とケレウェ語、ナミビアではクワニャマ語のデータ収集を行った。これらの調査から、ヘレロ語とクワニャマ語は言語的類似性が極めて高いと言われているにも拘らず、名詞修飾の形式はかなり異なっていることが明らかになってきた。ヤオ語とケレウェ語については、現在データの整理・検討をすすめている。また、26年度からプロジェクトに加わった研究協力者の小野田は、出身地・年代の異なるタンザニア人作家によるスワヒリ語小説をタンザニアのダルエスサラームにおいて収集し、それらのなかから「amba関係節」「amba-less関係節」「所有辞+不定詞名詞修飾」を抜きだし、これらの形式と主名詞との意味的関係をまとめる作業を行った。この作業および検討・分析は現在も進行中である。●国内研究会および国際研究者交流:2015年3月にロンドン大学東洋アフリカ学院(SOAS)において海外の研究協力者と研究会を持ち、2014年度の研究成果報告および今後の共同研究の打合せを行った。国内の研究協力者たちとの研究会は8月と11月に行った。2015年度はこれまでの調査・分析のまとめの他、A.国際学会で成果発表、B.国際研究者交流、C.ザンビアでの現地調査、を行った。A. 7月と8月に2つの国際学会での成果発表を行った。詳細は「学会発表」の欄を参照のこと。B. 8月に海外研究協力者のLutzMarten氏(ロンドン大学教授)を招聘し、国内研究協力者とともに研究会を開催した。この研究会ではこれまで対象としてきたバントゥ諸語のデータの共有と今度の研究への発展の可能性について検討した。C.代表者の米田と研究協力者の牧野が9月にザンビアでの現地調査を行い、ベンバ語、ララ語、トンガ語、ニャンジャ語のデータを収集した。多くのバントゥ諸語に類似した構造の名詞修飾節が存在するが、それらが修飾できる主名詞との意味関係の範囲は言語によって異なっている。昨年までの調査でバントゥ諸語の名詞

修飾節の形式と意味関係には、1主名詞と修飾部の関係によって形式が異なる言語(ex.ヘレロ語)、2主名詞と修飾部の関係に関わらず同じ形式が用いられる言語(ex.ジャンビアニ語)、3どの関係も修飾できる形式と「内の関係」のみ修飾する形式の両方を持つ言語(ex.スワヒリ語)、4「内の関係」と「外の関係」だけでなく「内の関係」でも主名詞が修飾節の主語の場合とそれ以外の場合で異なる形式を用いる言語(ex.ケレウェ語)という4つのタイプが見つかっていたが、今回の調査の結果、新たに、5主名詞が修飾節の主語の場合のみ異なる形式が用いられ、それ以外は「内の関係」も「外の関係」も同じ形式が用いられる言語(ex.トンガ語)、という5つめのタイプの存在が明らかになった。この結果は、現在論文にまとめているところである。また2016年5月にロンドン大学のアフリカ言語学セミナー、6月にヘルシンキ大学で開催される第6回国際バントゥ諸語学会で発表することが決まっている。バントゥ諸語には類似した構造の名詞修飾節が見られるが、それらが修飾できる名詞との意味関係の範囲は言語によって異なっている。バントゥ諸語は名詞修飾節の形式と主名詞との意味関係によって、(1)主名詞と修飾部の関係によって異なる形式が用いられる言語、(2)主名詞と修飾部の関係に関係なく同じ形式が用いられる言語、(3)「内の関係」と「外の関係」だけでなく主名詞が修飾節の主語の場合とそれ以外の場合で異なる形式が用いられる言語、(4)主名詞が修飾節の主語の場合のみ異なる形式が用いられる言語、(5)内の関係の名詞のみ修飾できる形式とどんな関係の名詞でも修飾できる形式の両方を持つ言語、の5タイプに分けられる。調査対象とする言語の数は当初の計画よりも少ないが、ひとつの言語の名詞修飾構文について、とくに主名詞と修飾節の意味的関係については深く掘り下げることができているので、内容的には納得のいく調査ができている。また、国内外の研究協力者との意見交換も活発に行うことができている。さらにその議論をとおしてバントゥ諸語研究を今後どのように進めていくべきなのかという課題や海外共同研究の可能性や計画も具体的になってきたことから、ここまでおおむね順調に進展していると評価した。言語学最終年である27年度は、成果のまとめと次のプロジェクトの基盤づくりを中心に行う。論文執筆については、現在執筆中の2本に加え、これまで研究会で国内の研究協力者と議論してきた内容を共著論文としてまとめる。そのほかの成果発表としては、8月に京都大学で開催される国際アフリカ言語学会議において、国内・海外研究協力者とともにバントゥ諸語の名詞修飾に関するワークショップを開く。その内容も報告書としてまとめる予定である。現地調査については、9月にナミビアとタンザニアで行う予定である。26年度に収集できなかったンドンガ語とハヤ語のデータおよびこれまでの調査言語の補充すべきデータを収集する。さらに本プロジェクトをバントゥ諸語の総合的な複文研究に展開していく準備として、名詞修飾節とその他の従属節との関連、特に内容補充関係にある名詞修飾節(名詞補文)と動詞補文との連続性についてのデータ収集と分析を本格的に始動する。調査・研究およびワークショップの開催をはじめとする国際研究者交流については計画通りに進んでいる。これまでの成果を現時点で2本の論文にまとめ、国際ワークショップでは国内外の研究協力者たちと実りある情報交換をすることもでき、本プロジェクトは順調に進展している。これまではスワヒリ語とヘレロ語を中心に調査・分析を行ってきたが、26年度は対象とする言語を増やす。
NASH病態における腸内細菌の役割

我々は以前、NASH患者の腸内細菌叢解析を施行したところ高度線維化進展例において、糞便中のFaecalibacterium prausnitzii(F.B)が有意に低下していることを発見した。本検討では、NASHマウスモデルにおけるF.Bの効果を検討したところF.BのNASH病態への改善、特に肝脂肪化と線維化への効果が示された。その機序としては腸管内の炎症性サイトカインやタイトジャンクション遺伝子を改善することで腸管透過性を制御している可能性が示された。したがって、腸内細菌に注目した新たなNASH治療の候補として、F.Bが重要な役割を担う可能性が考えられた。本研究では非アルコール性脂肪肝炎(NASH)病態進展には血中エンドトキシン(ET)の増加が一つの鍵であると考えられ,その機序は腸管内フェカリバクテリウム(FB)低下に伴う腸管透過性亢進が関与することを検証することとした.基礎1)食事負荷NASHモデルマウスの便中細菌叢の評価を行いヒトNASHに類似するか検討する;食事負荷NASHマウスモデルに対して便メタゲノム解析を行い,健常肝マウスモデルと比較することで便中細菌叢の分布の違いを検討したところ、ヒト同様にFBの有意な低下を認めた。基礎2)食事負荷NASHモデルマウスを用いて単離したFB投与することで起きるNASH病態への影響を検討するとともにエンドトキシン濃度を検討する;食事負荷NASHモデルマウスにヒト糞便から単離精製したFBをマウスにを経口投与したところ、有意に血中ET濃度が低下していた。臨床1)ヒトNASH患者における便中代謝産物と便中ムチンの解析;ヒトNASH患者の便検体を用いて,便メタボローム解析を行ったところ、NASH患者では健常者に比較して、ビタミンB6の低下とともにカルボキシメチルリジン、コリン、トリメチルアミン、トリメチルアミンオキサイドの亢進を認めた。また,腸管バリア機能の評価のため便中ムチンを測定し線維化軽度群と線維化高度群に分類したところ便中ムチン濃度は有意な変化を認めなかった。上記をまとめにより、NASHマウスモデルはヒトNAHS病態と同様にFBの低下を示しており、FBの補充によってETの有意な改善を認めた。また、NASH病態の進展により便中の代謝産物の変化(ビタミンB6の低下とともにカルボキシメチルリジン、コリン、トリメチルアミン、トリメチルアミンオキサイド)を認めた。当初の計画では平成28度中に、動物モデルにおける腸内細菌叢の解析とヒトNASH病態における便中代謝産物の解析を検討する予定であり、予定通りの進行である。近年、次世代シーケンサーの開発により急速に腸内細菌のゲノム解析によって代謝産物の予測が可能となってきた。そこで我々は、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の線維化進展に関わる腸内細菌叢とメタボローム解析を行いさらに臨床パラメーターとの相関との関連を検討した。当院で健常ボランティア者25例、肝生検を施行して診断したNAFLD/NASH患者125例に対して次世代シーケンサーを用いて腸内細菌叢の組成を推定した。また、NAFLD/NASH患者を軽度線維化群(F0-2)72例、高度線維化群(F3-4)53例に分け腸内細菌叢の組成を比較検討したところ健常群、NAFLD/NASH群の2群比較において、門レベルではNAFLD/NASH群でBacteroiides門の減少傾向か認められた。属レベルでは、健常群に比較してNAFLD/NASH群ではStreptococcus属で有意な増加を認めるほか、Faecalibacterium属(F.B)の有意な低下を認めた。また、高度線維化NAFLD/NASHにおいては軽度線維化NAFLD/NASHに比較して、F.Bの有意な低下を示すとともに、血中エンドトキシン値の有意な増加を認めた。さらにF.Bの占拠率と血中エンドトキシン値との相関関係を検討したところ、有意な負の相関を示した(R2=0.211、P<0.0001)。またメタボローム解析の結果から高度線維化群では、ビタミンB6 (VB6)代謝の低下を認めた。メタボローム解析の結果、VB6代謝産物の有意な低下とカルボキシメチルリジン(CML)、コリン、トリメチルアミン(TMA)の有意な増加を認めた。一般的にVB6は脂肪肝に関連が、またCMLやTMAは動脈硬化などに関連するといわれている。以上の結果から、NASH病態進展やその肝外合併症である心血管イベントは、腸内細菌の関与が考えられるとともに腸内細菌の制御をすることでこれらの改善をはかれる可能性が考えられた。

基礎分野ではFB投与下のNASHマウスモデルに対する腸管内代謝産物の評価、FB投与下のNASHマウスモデルに対する便中ムチンの変化を検討、FB投与下のNASHマウスモデルに対する腸管透過性の評価、タイトジャンクションを反映するmRNAやタンパクを検討することで腸管透過性亢進メカニズムの解明を行う。臨床分野ではFB投与下における腸管透過性亢進メカニズムをヒトで同様に再現できるか,尿中ラクツロース・マンニトール比を用いてヒトNASH患者のFB低占拠群とFB高占拠群における腸管透過性を評価する。腸内細菌と非アルコール性脂肪肝
乳酸を介した消化管上皮細胞の摂食応答機構：健康増進のための分子基盤解明

大腸上皮細胞は、一定時間の絶食中は増殖を停止するが、再摂食すると常在細菌叢由来の乳酸により一過性の生理的過増殖状態となる。本研究では、肥満個体の大腸粘膜ではこの生理的応答の異常のため大腸発癌リスクが高まっていることを見いだした。しかし、間歇的絶食期間の設置、乳酸の再摂食などの介入により、炎症の抑制や粘膜修復を促進することができ、摂食行動によって大腸発癌リスクを避けることが可能であることも明らかとなった。本研究の目的は摂食応答としての上皮細胞動態が、摂食内容の違いや間歇的絶食期間の設置などで変化するかどうか、その機構に乳酸及び乳酸産生菌が関与しているかどうか、さらに、乳酸の持つ上皮細胞増殖促進効果のメカニズムを明らかにする事である。1)本年度はマウスの短期飼育試験として、絶食後再摂食時に高脂肪食を投与したときの大腸細胞上皮の動態をしらべ、高脂肪食の再摂食では通常食の摂食の際にみられた大腸上皮一過性過増殖反応は誘導されない事がわかった。さらに、通常食マウスで絶食を行なうと、分離した大腸上皮細胞はアノイキス耐性を獲得するが、高脂肪食を長期摂取させたマウスでは絶食しても耐性を獲得しにくい事がわかり、肥満個体にみられる消化管上皮細胞の変化として重要であると考えられる。2)絶食後のマウス大腸上皮細胞の三次元培養において、乳酸、酪酸、酢酸の添加による細胞生存率の違いをコロニー数算定によりしらべたところ、乳酸添加でのみ細胞生存率がコントロールに比べて上昇し、乳酸の特異的作用が明らかになった。3)In vivoにおいて乳酸が作用しているときの大腸上皮細胞の遺伝子発現を網羅的に比較し、パスウェイ解析を行った所、Hypoxia-induced factor 1a経路に関わる遺伝子発現が認められ、この経路が活性化されている事が示唆された。このシグナル経路が乳酸の細胞増殖作用のメカニズムの一部であると考えられる。高脂肪食摂取時の絶食・再摂食応答に違いが認められ、短期飼育試験での成果が得られた。また、乳酸のもつ細胞増殖亢進作用をin vitro実験系でも評価することができ、そのメカニズム解析を進めるための手がかりが、遺伝子発現解析から得られた。これまでの結果に基づいて、高脂肪食長期投与と、これに36時間の間歇的絶食を週一回加えた群を比較した。その結果、2群間で、摂餌量は実験期間を通して差が認められなかったにもかかわらず、間歇的絶食をおこなった群では体重増加が抑制され体重は自由摂取群の76-85%にとどまった。また、20週における間歇的絶食群の肝重量は自由摂取群の56%に有意に減少しており、体脂肪重量も減少していた。肉眼的脂肪肝の発症は、自由摂取群での100%に対して間歇的絶食群では20%と有意に低かった。高脂肪食成分の一つである遊離脂肪酸の消化管細胞への作用をIn vitroで調べた所、脂肪酸組成により細胞・ミトコンドリア傷害性に差がある事を見出した。そこでin vivoでの効果を検証するためさらに脂肪酸組成の異なる高脂肪食を考案し、これをマウスに与えた所、群間で体重増加に差が見られた。そこで、これらの餌の長期投与後のマウス大腸上皮細胞を分離し、トランスクリプトーム解析を行った。絶食ー再摂食による大腸上皮細胞増殖促進作用の応用として、マウスDSS腸炎の回復期に36時間の絶食を施し36時間の再摂食後に大腸炎の評価を行った所、自由摂取マウスに比較して組織傷害の程度が軽減しており、特に大腸上皮細胞再生の亢進と組織炎症性サイトカインインIL-1beta, IL-17, IL-6の抑制が顕著であった。乳酸が上皮細胞再生を促すというこれまでの成果に基づき、この系で乳酸を大腸で遊離する餌ハイアミロースを再摂食させたところ、さらに炎症性サイトカインの低下と、潰瘍面積の低下が認められた。また、絶食群のマウスでは、Hif1αにより誘導されて細胞増殖や血管新生を誘導する乳酸結合蛋白NDRG3の発現亢進が認められ、このシグナル経路を介して乳酸が直接上皮細胞に作用している可能性が示された。計画に従って実験を進め、総カロリーといしては同様に摂取しているにも関わらず、間歇的絶食が肥満や脂肪肝など代謝症候群の予防につながる事を見出した。さらに、当初は想定していなかったが、高脂肪食であっても、脂肪酸組成の違いにより、肥満と脂肪肝発症に差が出ることが明らかとなったため、今後はこのメカニズム解析が重要となり、高脂肪食摂取マウスの大腸上皮細胞での遺伝子発現を網羅的に解析した。また、絶食とそれに伴う乳酸の効果により、急性炎症を抑制できる事を示し、さらにこの実験系で乳酸の持つ細胞増殖作用に関わると強く示唆されるシグナル経路を見出し、論文報告した。ヒト組織での検証のための症例も順調に蓄積している。高脂肪食マウスの大腸上皮細胞の解析の結果、肥満マウスの大腸では絶食に対する細胞動態の応答に異常を来していることがわかったので、ヒトでこのフェノタイプが反映されているかどうか検証した。