hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケナガカブリダニにおけるメチダチオン抵抗性の分子機構

メチダチオン感受性及び抵抗性カブリダニを育成するため、野菜茶業研究所より金谷系及び石垣系カブリダニの譲渡を得、室内でナミハダニを餌として大量増殖すると共に、メチダチオンによる淘汰実験を行った。ナミハダニの増殖は、インゲン豆苗を餌として用いた。金谷系統については、メチダチオンに対する抵抗性を上げるためと感受性を上げるために、石垣系統についてはメチダチオンに対する抵抗性を上げるためそれぞれ淘汰を繰り返した。それぞれ5-8回の淘汰により、抵抗性金谷系統と感受性石垣系統とのメチダチオンに対する抵抗性比はLC50値で1.66から513に上昇した。また、金谷系統では抵抗性比は1から177に上昇した。これらの系統は、メチダチオン抵抗性及び感受性系統として、以下の実験に利用できる抵抗性比をした。ケナガカブリダニにおけるメチダチオン抵抗性機構としては、抵抗性系統におけるメチダチオンの酸化酵素による解毒分解能の上昇によることが、Sato et al.(2001)の研究で示されている。そこで、酸化酵素のモノオキシゲナーゼ活性を蛍光測定法により測定したところ、メチダチオン感受性系に比べ、メチダチオン抵抗性の金谷系統では数倍の活性を示した。従って、今回育成したメチダチオン抵抗性についても、抵抗性機構として酸化酵素の活性上昇が主因と考えられた。現在、これらメチダチオン感受性及び抵抗性系統を大量増殖し、酸化酵素のRNAを抽出すると共に、cDNAのクローニングを行っている。現在までの成果については、平成16年3月末、京都工芸繊維大学で開催される日本応用動物昆虫学会大会で発表の予定である。また、ナミハダニにおけるフェンプロキシメート抵抗性に関する論文がAppl.Entomol.Zool.誌に掲載予定である。ケナガカブリダニはカンザワハダニの有力天敵である。日本各地の茶園等では殺虫剤に抵抗性を示すケナガカブリダニの存在が知られている。報告者らの今までの研究成果から、有機リン殺虫剤のメチダチオンに抵抗性を示すケナガカブリダニでは、殺虫剤抵抗牲機構として、チトクロームP450によるメチダチオンの解毒分解活性が最も重要であることが明らかとなっている。今回は、本抵抗性の分子機構を解明するため、静岡県の茶園より採集したケナガカブリダニをインゲン葉上で大量増殖し、メチダチオンを用い淘汰実験中である。また、感受性系統ケナガカブリダニとしては、沖縄県石垣島で採集した系統を同様にインゲン葉上で大量増殖し、メチダチオンによる逆淘汰を行い、より感受性の系銃を育成中である。それぞれの系統に対し、2回の淘汰を行い、淘汰系および逆淘汰系のメチダチオンに対する感受性を調べたところ、抵抗性比約40を示す系統が育成出来た。今後、更に淘汰を続け、抵抗性比数100を示す系統の育成を目指す。今回供試した感受性系統は、前回使用した系統に比べ、メチダチオンに対する感受性が低く、野菜茶業研究所において累代飼育しているうちに、野外の抵抗性個体が侵入していることが考えられた。特に高度の抵抗性レベルを得るには、感受性系統を使っての逆淘汰がより重要と考えられた。同様に、ケナガカブリダニのチトクロームP450遺伝子のクローニングを行うための予備実験を行っており、高度のメチダチオン抵抗性ケナガカブリダニを育成出来た段階ですぐに実験に移れるよう準備中である。
異種機能集積による無線送信回路の広帯域化に関する研究

最終年度である本年は、異種機能集積技術を用いることで広帯域化を含む高機能化を実現する無線トランシーバを設計し、その試作評価を通して有効性を確認した。昨年度は、無線送信回路の高機能化について研究を進めてきた。本年度は、送信回路単体からさらに無線トランシーバにまで発展させることにより、さらなる高性能化、そして高機能化を実現した。具体的には、本無線トランシーバは、バッテリーレスで動作し、さらに周波数利用効率の高い無線通信を行うことが可能である。バッテリーを搭載せずに無線トランシーバを動作させるため、送信回路および受信回路の消費電力は極めて低くしなければならない。従来トレードオフ関係にある消費電力と周波数利用効率を、同時に向上させるため、昨年度提案した送信回路をさらに進化させた直交バックスキャタリング送信回路を提案した。直交バックスキャタリングは、異種機能集積技術をもとに考案した技術であり、従来のバックスキャタリング技術の低消費電力に加えて、直交変調を可能にすることで、周波数利用効率を向上させる。以上の無線トランシーバを、実際にSi CMOS 65nmプロセスを用いて試作し、提案技術の有効性を確認した。試作した無線トランシーバは、送信回路において、113μWの消費電力で32QAM変調という非常に周波数効率の高い変調方式を実現した。そのときの、データレートは2.5Mbpsであり、無線通信の評価指標である1bitあたり通信するのに必要なエネルギーは45pJ/bit、また周波数利用効率を示す1Hzあたりの通信容量は3.3bps/Hzである。この結果は、100μW程度という低い消費電力の無線トランシーバの周波数効率としては、非常に高いものであり、半導体のオリンピックとも呼ばれる国際固体素子回路会議(ISSCC 2015)において発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、CMOSプロセスとMEMSプロセスの融合という異種機能集積による、広帯域無線送信回路の実現である。一年目の実施計画として、送信回路を構成する要素回路の詳細な仕様の策定、その仕様を満たす要素回路技術の検討の二点を掲げていた。1年目である平成24年度は、この計画に従い、上記二点に集中して研究に取り組んだ。提案する送信回路は以下の四つの要素回路で構成される。1.広帯域パワーアンプ2.チューナブル整合回路3.MEMS制御回路4.広帯域変調回路広帯域パワーアンプについては、出力電力30dBm、動作周波数帯域0.8-6.0GHzを目指し、設計、試作評価を行った。試作評価結果より、パワーアンプの出力インピーダンスを50Ωとしたとき、22dBmの出力電力を確認した。この結果より、さらに出力インピーダンスを下げ、チューナブル整合回路と集積化することにより30dBmの出力電力及び、目標とする広帯域動作の実現の見通しを得た。チューナブル整合回路においては、MEMSプロセスを用いて可変インダクタの設計、試作評価を行った。新たなインダクタ形状を提案することで、0.8-6.0GHzで必要となるインダクタンスの可変量0.4-3.0nHに対して、1.0-3.3nHというほぼ仕様を満たす試作結果を得ることができた。チューナブル制御回路を駆動するためのMEMS制御回路では、数ボルト程度の低い電圧から、20V以上の高電圧を生成する必要があるが、制御回路を構成するMOSFFTのN-well及びP-Wellのバイアス電圧をバランスよく設定することで3.3Vの電源電圧から26Vの高電圧を作り出すことに成功した。広帯域変調回路では、0.8から6.0GHzにわたって、高い変調精度が求められる。提案する変調回路では、線形性補償回路を新たに導入することで、変調精度の劣化を防ぎ、0.8-6.0GHzにおいて、QPSK変調でEVM3%以下という広帯域動作かつ高精度な変調の実現を確認した。異種機能集積技術を用いて、無線送信回路の広帯域化すなわち、高機能化を追求する研究を行ってきた。無線送信回路の評価指標として、広帯域特性のみならず、低消費電力特性は、近年のモバイル端末やセンサ端末に向けた無線通信回路には必須の特性である。第2年目にあたる本年度は、特に無線送信回路の低消費電力化に注目して、研究を遂行してきた。送信回路の低消費電力特性を実現するために、二つのアプローチを採用した。1.パワーアンプの出力電力の最適化2.周波数シンセサイザ不要の送信回路アーキテクチャ一つ目のパワーアンプの出力電力は、所望の通信距離等によって決まるため、不必要に大きくするのではなく、所望の距離を満たす程度の出力電力に設定し、パワーアンプにおける消費電力を削減することができる。二つ目の周波数シンセサイザの消費電力は、パワーアンプの出力電力を下げ、パワーアンプの消費電力の全体に対する割合が下がってきた際にボトルネックとなる消費電力である。提案するアプローチでは、従来周波数シンセサイザが生成していた無線通信における中心周波数のキャリア信号を、親機側(RFID)システムにおけるリーダーデバイスや、無線LANにおけるルーターデバイス)から送られてくる所望周波数の1-tone信号で代替することで、低消費電力化を促進する。以上の二つのアプローチを実際に適用した無線送信回路を設計しSi CMOS 65nmプロセスを用いて試作し、測定評価を行った。測定評価結果において、250-μWと現在の製品化されている無線通信回路に比べて二桁程度低い消費電力特性を得ることができた。

またその時、BPSK変調において1.8%のEVM、16-QAM変調においても4.9%と非常に良好な送信回路の変調特性を実現していることを確認した。最終年度である本年は、異種機能集積技術を用いることで広帯域化を含む高機能化を実現する無線トランシーバを設計し、その試作評価を通して有効性を確認した。昨年度は、無線送信回路の高機能化について研究を進めてきた。本年度は、送信回路単体からさらに無線トランシーバにまで発展させることにより、さらなる高性能化、そして高機能化を実現した。具体的には、本無線トランシーバは、バッテリーレスで動作し、さらに周波数利用効率の高い無線通信を行うことが可能である。バッテリーを搭載せずに無線トランシーバを動作させるため、送信回路および受信回路の消費電力は極めて低くしなければならない。従来トレードオフ関係にある消費電力と周波数利用効率を、同時に向上させるため、昨年度提案した送信回路をさらに進化させた直交バックスキャタリング送信回路を提案した。直交バックスキャタリングは、異種機能集積技術をもとに考案した技術であり、従来のバックスキャタリング技術の低消費電力に加えて、直交変調を可能にすることで、周波数利用効率を向上させる。以上の無線トランシーバを、実際にSi CMOS 65nmプロセスを用いて試作し、提案技術の有効性を確認した。試作した無線トランシーバは、送信回路において、113μWの消費電力で32QAM変調という非常に周波数効率の高い変調方式を実現した。そのときの、データレートは2.5Mbpsであり、無線通信の評価指標である1bitあたり通信するのに必要なエネルギーは45pJ/bit、また周波数利用効率を示す1Hzあたりの通信容量は3.3bps/Hzである。この結果は、100μW程度という低い消費電力の無線トランシーバの周波数効率としては、非常に高いものであり、半導体のオリンピックとも呼ばれる国際固体素子回路会議(ISSCC 2015)において発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究実施計画に従い、ほぼ計画通りに研究を進めてきた。研究実施計画の一年目では大きく二点の到達目標があり、一点目は詳細な仕様の策定、二点目は仕様を満たす要素回路の開発である。その二点ともおおよそ満たすような研究結果が得られており、一年目の進捗としてはおおむね順調だと考えている。前年度からのペースを保ちながら、着実に研究を前に進めていった。無線送信回路の広帯域化、高機能化を実現すべく、周波数シンセサイザ不要のアーキテクチャを採用するという大胆なアプローチを提案し、それを実際に設計して、試作を通して実現した。またその測定評価の結果も一定の性能を得られている。以上のことを踏まえて、最終年度に向けて計画は順調に進展している。一年目が終わり、研究実施計画通り順調に進捗しているため、今後二年目も計画に基づき研究を進めていく。具体的には、一年目に検討した要素回路を組み合わせ、部分的に集積化していく。その際に、集積化により発生する問題点を予測し、パッケージ方法や最適なレイアウトにより対策を立てる。
低酸素ダイナミクスに着目した悪性グリオーマの病態解明と効果的治療法の検討

本研究の目的は「低酸素領域の量ではなく変動度合いがグリオーマの治療予後に大きく関わっている」と仮説を立て、これを検証する事であった。まず18F-FMISOを複数回投与して連続撮像するsequential PETによって間欠的低酸素の描出を試みたが、放射能減衰には長時間必要であり短時間で変動する間欠的低酸素を明らかにすることは出来なかった。しかし、電子スピン共鳴ESRを用いることでマウスグリオーマ内の低酸素領域を描出する事に成功し、間欠的低酸素の解析法として利用できる可能性を示すことが出来た。加えて、グリオーマに対する低酸素細胞標的放射線増感剤としてドラニダゾールが有効であることも明らかにした。悪性脳腫瘍の予後には低酸素領域が関与していることが知られている。また低酸素状態には従来からよく知られている慢性低酸素に加え、短時間で変化する間欠的な低酸素が存在し、より転移などの腫瘍の悪性形質の原因となっていることが分かってきた。本研究の課題は「低酸素領域の量ではなく変動度合いがグリオーマの治療予後に大きく関わっている」と仮説を立て、これを検証することであった。25年度では、引き続きC6ラットグリオーマモデルを樹立し、PETによって間欠的な低酸素領域の変化を試みた。しかし、18F-MISOのような低酸素トレーサーは標的領域への蓄積や、生体クリアランスおよび放射能減衰に時間がかかるため、間欠的低酸素領域を描出する事はできなかった。次に、電子スピン共鳴(ESR)を用いた腫瘍酸素分圧のイメージングを試みた。ESRの原理は不対電子のスピンを共鳴させて信号を読み取るものであるが、トリチルラジカルという周囲の酸素分圧と相互作用してESRスペクトルを変化させるフリーラジカルを酸素プローブとして用いた。実験モデルとしてはヌードマウス脳室内にU251およびU87グリオーマを接種し、MRIで腫瘍生着を確認した後、ESRイメージングを行った。その結果、トリチルラジカルが腫瘍内に分布していることが確認され、そのESRスペクトル線幅から酸素分圧を算出することでグリオーマ内の酸素分圧画像を取得することに成功した。以上、低酸素ダイナミクスを追跡することは依然として困難であったが、ESRを用いることで、グリオーマ内の低酸素領域を描出することに成功した。24年度では低酸素増感剤ドラニダゾールが低酸素領域の放射線感受性を増強することを明らかにしている。本挑戦的萌芽研究で得られた成果をもとに、今後はESRを用いた酸素イメージングを利用して、間欠的低酸素を含む治療抵抗性領域への薬効評価を行っていく予定である。悪性脳腫瘍は依然として根治困難な疾患であり、その予後に低酸素領域が関与していることが分かっている。一方、低酸素状態には従来から良く知られている慢性低酸素に加え、短時間で変化する間欠的な低酸素が存在し、より浸潤転移などの腫瘍の悪性形質獲得に影響を与えることが分かってきた。本課題の目的は、「低酸素領域の量ではなく変動度合い(間欠的低酸素)がグリオーマの治療予後に大きく関わっている」と仮説を立て、これを検証することである。24年度では、C6ラットグリオーマモデルを樹立し、18F-FMISOを間隔をあけて投与することで低酸素領域の変化を描出するSequential PET撮像を試みた。microPET装置を使用することによって、18F-FMISOの低酸素領域への集積をPET画像として画像化することに成功した。しかし、このsequential PET法では、PETの解像度で認識できる領域の変化を認めることはできなかった。次に低酸素ダイナミクスを標的とした治療法の開発に向けて、まず新規低酸素細胞標的放射線増感剤ドラニダゾールのC6ラット悪性脳腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果を検討した。その結果、ドラニダゾールがC6ラットグリオーマの血液脳関門の破綻を介して脳腫瘍内に到達すること、またX線照射との組み合わせにより、効果的な抗腫瘍効果の増感が得られることを明らかにした。以上、これまでの実験により、低酸素ダイナミクスを追跡することは依然難しいが、microPET-CTを用いることで、ラットグリオーマ内の低酸素領域を描出することに成功し、この領域に効果的に作用する制がん剤の薬効評価を行うことが可能となった。本課題の目的は、腫瘍内の低酸素変動が悪性グリオーマの治療予後に大きく関わっていると仮説を立て、低酸素ダイナミクスの評価とそれに対する治療法を探索することである。この目的の達成のため、二ヵ年を通して、1ラットグリオーマの低酸素ダイナミクスを画像化する試みおよび2グリオーマに対する様々な低酸素標的治療の早期効果判定法の樹立を目指す。24年度では、まず18F-FMISOを用いたsequential PET法により低酸素変動の検出を試みた。

その結果、microPET-CTによりラットグリオーマ内の低酸素領域を鮮明に画像化することが可能となった。18F-FMISOの生体クリアランスと低酸素領域の変動周期との兼ね合いから、sequentialPETによる低酸素領域変動を検出するには至らなかった。従って、1に掲げられた目標が一部達成された。一方で、低酸素を標的とした治療薬の候補として、新規ニトロイミダゾール系化合物であるドラニダゾールを取り上げ、その抗腫瘍効果を検討した。その結果、C6グリオーマ坦がんラットに処置することで、ドラニダゾールは血液脳関門の破綻を介して脳腫瘍内に取り込まれること、また放射線との組み合わせにより非常に強く腫瘍成長の抑制効果を示すことに成功した。この結果については、23年度中に、国際学術誌BMC Cancerに採択され、論文化された。低酸素ダイナミクスを標的とする治療の樹立に向けて、一部その目標が達成されたと考えられる。25年度の実験については、本課題の目的に沿って、まず18F-FMISOと123I-IAZAの2つの核医学トレーサーを時間差で投与するsimultaneous PET/SPECT法を試験する。これにより、sequential PETで成し得なかった低酸素変動のイメージングを試みる。次に、C6グリオーマモデルだけでなく、WHO悪性度分類において、RG2やF98といった異なるグレードの脳腫瘍モデルを作成し、その低酸素変動の強度を比較する。また病理学的検査による浸潤性・転移性を指標とし、イメージングで得られた結果を腫瘍悪性度と比較する。またもう一つの目的である様々な低酸素標的治療の効果判定と効果的治療タイミングの検討についても引き続き行う。24年度の実験で有望な結果が得られたドラニダゾールについては、PET、SPECTによる非侵襲的なイメージングでの薬効評価を行う。また、その裏付けのため、組織切片上での間欠的低酸素領域の変化についても検討する。ドラニダゾールの他には、腫瘍の再酸素化を通して機能的な血管構築を誘導できると考えられている放射線の頻回照射やアバスチンなど血管新生阻害剤についても、腫瘍内酸素環境に与える影響を評価する。その上で、酸素以外の微小環境因子である糖代謝、細胞死ならびに細胞増殖などについて、それぞれの指標となるグルコーストランスポーター1(GLUT-1)、cleaved caspase3、Ki-67といったタンパク質発現を免疫組織化学にて検出する。さらに、上記、低酸素環境を標的とする治療が寛解率あるいは再発率といった予後に与える影響について検討する。当初、初年度に予定していたPET/SPECT/CTによる低酸素ダイナミクスイメージングの確立が、SPECT製剤の準備が遅れたため遂行できなかった。そのため、予算計画に計上していた実験動物やSPECT製剤にかかる研究費を25年度に先送りする。この次年度使用研究費の使途として、上記実験動物代、SPECT製剤にかかる費用、さらには得られた結果を裏付けするためのタンパク質発現評価のための抗体購入費として使用する。
2次元原子薄膜上の自己集合ペプチドと脂質二重膜によるイオン制御

原子薄膜を生体分子で修飾した新しいセンサ界面の構築を目指した本研究では、ペプチドだけでなく脂質がMoS2原子薄膜の電子状態にどのような影響を与えるのかについての基礎情報を得ることに成功した。特に、MoS2がその界面における電気化学的なイオンの状態に敏感に反応し、その電子状態を変調させることがわかった。その変調は、表面の自己組織化ペプチドによっても変化することがわかり、ペプチドによる界面設計の可能性が示された。今後は、より実用的なセンシングを可能にするため、形成する平面脂質膜をより多様な組成で形成する。その脂質膜に他の生体分子を修飾し、さらなる機能を付加するなどの工夫が必要と考える。自己集合ペプチドの安定性制御:足場となるペプチド構造体の安定性は固定される脂質二重膜の流動性を制御することに繋がる。個々のペプチドは、原子薄膜に非共有結合性の相互作用によって吸着しているので、液中においては一定の割合で絶えず吸着脱離を繰り返し平衡状態を保つ。これまで使用していたペプチドは、平衡状態から離れ、バッファー水溶液等で洗浄した場合に、著しい脱離を生じることが知られていた。今回の研究によって、ペプチド間の相互作用を強くするようなアミノ酸配列を採用することによって、水溶液で洗浄しても被覆率の低減がほとんど見られないペプチド自己組織化膜の形成に成功した。具体的には、異なる電荷を有するアミノ酸をペプチドのアミノ酸配列にそれぞれ挿入することによって、ペプチド間のクーロン相互作用を増強するアミノ酸配列を設計した。このペプチドは、グラファイトおよび二硫化モリブデンの原子平坦面に自己組織化構造を自発的に形成する。これらのペプチドを1から3時間程度の間、自己組織化させ、その後、水溶液で複数回洗浄した後にその表面を原子間力顕微鏡で観測したところ、ペプチドの種類の寄っては、自己組織化構造のモルフォロジーが洗浄後に変化したものもあったが、洗浄前後での被覆率の変化はほとんど観測されなかった。また、洗浄前後でモルフォロジーがほとんど変化しないペプチドもあった。これらを足場ペプチドとして、今後の実験を進めていく。一方で、ペプチド自己組織化膜上への平面脂質膜の形成は、成功はするものの、まだ歩留まりが悪い。また、2重膜を形成スべきところであるが、多層膜が形成されることも観測により分かった。脂質の種類も含め、脂質膜形成のプロセスを見直す必要がある。ペプチドの自己組織化構造の設計および評価において、当初は原子間力顕微鏡と走査型トンネル顕微鏡を使用する予定であったが、走査型トンネル顕微鏡を使用した実験では、有効な画像を再現性よく観測することができなかった。これは、自己組織化ペプチドが電圧印加下において構造が不安定になることを示唆している。一方で、原子間力顕微鏡を用いた実験では、液中で高空間分解の画像の取得に成功し、自己組織化ペプチドが数ナノメートルの間隔で規則正しく整列したナノワイヤー構造が緻密に整列した構造であることがわかった。また、その周期は、使用するペプチドによって異なることも観測から明らかになった。また、液中で安定なペプチドの開発に成功した。これらのペプチドは、ペプチド間の相互作用が強い上に、2次元ナノ材料表面との相互作用も強いため、厚さがそれまでのものに比べて薄い自己組織化膜を形成することがわかった。一方で、脂質膜の形成には課題が残る。脂質のガラス転移点によって、自己組織化ペプチド膜上での平面脂質膜の形成頻度が異なることが示唆される結果が得られた。今後は、脂質膜形成の時間や温度もふくめ、脂質の種類を複数検討する。2次元ナノ空間におけるイオン伝導観測(光学測定):2次元ナノ空間に閉じ込められたイオンによる原子薄膜の電子物性変化を最も簡便に観測する方法として光学測定系作製した。油浸レンズを用いたMoS2の高空間分解発光イメージングを行った。最終目標はイオンがイオンチャネルから原子薄膜と脂質二重膜の平面空間に侵入した際に、空間的にイオンがどのように閉じ込められたかを観測し、そこから水平方向にイオンが拡散・伝導する様子を観測することであるが、その前に、MoS2が電解質水溶液中で電圧印加下でどのような発光スペクトルを持つのかについて詳細な測定を行った。これにより、印加する電圧によってMoS2からの発光が増強される現象を発見した。また、ペプチドを用いてMoS2表面に自己組織化膜を形成したところ、発光強度が変調されることがわかった。また、ステップ型電圧印加に対するMoS2発光の時間応答が、ペプチドの有無や、電解質水溶液中のイオンの種類によって変化することがわかった。電気化学的電界効果型トランジスタ(電気測定):将来のバイオセンサ応用を考える際、勘弁かつ迅速な検出手段である電気伝導によるセンシングは不可欠である。そのため、グラフェンの電気化学的電界効果型トランジスタ構造を形成し、その電気伝導特性を評価した。

ここでは、液中に白金参照電極を挿入し、原子薄膜に電圧を印加することによって、原子薄膜内の電子濃度を変調し、デバイスのスイッチングを行った。脂質膜とペプチド自己組織化膜の組み合わせによってグラフェン・トランジスタの閾値電圧が変化することがわかった。脂質膜中に膜貫通ペプチドを用いたイオンチャネルを形成する実験を行ったところ、電流の変調は観測されたが、イオンチャネルの数の制御などの困難さから、実際にイオンチャネルを介した電流であるかは今後のさらなる調査が必要であることがわかった。脂質膜中のイオンチャンネルを介したイオン伝導の計測1:2次元ナノ空間におけるイオン伝導観測(光学測定):2次元ナノ空間に閉じ込められたイオンによる原子薄膜の電子物性変化を最も簡便に観測する方法は光学測定である。油浸レンズを用いたMoS2の高空間分解発光イメージングを行う。イオンがイオンチャネルから原子薄膜と脂質二重膜の平面空間に侵入した際に、空間的にイオンがどのように閉じ込められたかを観測し、そこから水平方向にイオンが拡散・伝導する様子を観測する。同時に、MoS2からの発光スペクトルを観測することにより、イオンによってMoS2内の電子状態が受ける変調を励起子や荷電励起子などの発光ピークから検証する。2:MoS2の電気化学的電界効果型トランジスタ(電気測定):将来のバイオセンサ応用を考える際、勘弁かつ迅速な検出手段である電気伝導によるセンシングは不可欠である。そのため、原子薄膜の電気化学的電界効果型トランジスタ構造を形成する。これは、液中に白金参照電極を挿入し、原子薄膜に電圧を印加することによって、原子薄膜内の電子濃度を変調し、デバイスのスイッチングを行うものである。モデル計算を用い、2次元ナノ空間に閉じ込められたイオン濃度を伝導特性から定量的に見積もる。これにより、本センサ機構が既存のものと比して感度やノイズ低減の点で優位性があることを実証する。バイオ・ナノ界面29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
自然免疫系を制御する脂質メディエーター

これまで研究申請者は、獲得免疫系を持たないために自然免疫系だけを選択的に解析できる昆虫を用いて、昆虫が病原体の感染に応じて少なくとも8種類の脂肪酸を生合成することを明らかにした。これらは、一連のシグナル伝達カスケードの中間体であると考えららたが、このカスケードは、植物の防御反応カスケードと哺乳動物のアラキドン酸カスケードと共通項を示していた。そこで本研究では、このシグナル伝達カスケードが、自然免疫系のメディエーターとして働いているかどうか、遺伝子導入ショウジョウバエを用いて明らかにすることを目的とした。昨年度、レポーター遺伝子導入ショウジョウバエを用いて、ホスホリパーゼA2(PLA2)の阻害剤が、エンドトキシンで誘導された自然免疫の活性化を抑制することを明らかにした。さらに、アラキドン酸とγ-リノレン酸だけが特異的にこの抑制をキャンセルし、このほかの脂肪酸にはその活性がないことを明らかにした。そこで本年度は、内在性の免疫応答遺伝子の発現について解析した。その結果、PLA2の阻害剤が、自然免疫の活性化を抑制すること、さらに、アラキドン酸とγ-リノレン酸だけが特異的にこの抑制をキャンセルすることが確認できた。この結果は、病原体の感染に応じて誘導されたPLA2により、リン脂質より脂肪酸が遊離し、アラキドン酸とγ-リノレン酸が中間体となる活性化型脂質メディエーターに変換され、この脂質メディエーターが、自然免疫系を制御していることを示唆している。これまで、獲得免疫系を持たないために自然免疫系だけを選択的に解析できる昆虫を用いて、昆虫が病原体の感染に応じて少なくとも8種類の脂肪酸を生合成することを明らかにした。これらは、一連のシグナル伝達カスケードの中間体であると考えられるが、このカスケードは、植物の防御反応カスケードと哺乳動物のアラキドン酸カスケードと共通項を示していた。そこで本研究では、この昆虫の脂質によるシグナル伝達カスケードが、自然免疫系のメディエーターとして働いているかどうか、遺伝子導入ショウジョウバエを用いて明らかにすることを目的とした。まず、リン脂質から脂肪酸を遊離するホスホリパーゼA2(PLA2)の活性が、病原体の感染に応じて一過的に上昇することを見出した。次に、新たに遺伝子導入ショウジョウバエを用いて開発したin vitro系を用いて、自然免疫系の活性化にPLA2の活性化が関与しているのかどうか調べた。その結果、PLA2の阻害剤が、エンドトキシンで誘導された自然免疫の活性化を抑制することを明らかにした。先にセンチニクバエで同定した8種類の脂肪酸のうち、アラキドン酸とγ-リノレン酸だけが特異的にこの抑制をキャンセルし、このほかの脂肪酸にはその活性がないことが明らかとなった。アラキドン酸とγ-リノレン酸そのものには、自然免疫系を活性化する活性はないことから、アラキドン酸とγ-リノレン酸は活性化型脂質メディエーターの中間体であると考えられる。これらの結果は、病原体の感染に応じて誘導されたPLA2により、リン脂質より脂肪酸が遊離し、アラキドン酸とγ-リノレン酸が中間体となる活性化型脂質メディエーターに変換され、この脂質メディエーターにより、自然免疫系が制御されている可能性を示している。次年度は、この活性化型脂質メディエーターを明らかにする。
クラゲ刺胞由来タンパク毒の化学的性状および作用機序の解明

刺胞動物門に属するクラゲはすべてが刺胞毒を有し、そのうち強力な刺胞毒を有するいくつかのクラゲは世界中で海水浴客や漁民に刺傷被害を与え、死亡例も報告されている。クラゲの毒素の化学的性状の解明についてはほとんど手つかずの状況であった。これは、それまで研究されたすべてのクラゲ毒素が非常に不安定であることに主に起因していた。このような状況のもと、我々は非常に不安定なクラゲタンパク質毒素を比較的安定に取り扱う方法を見出し、クラゲ数種からタンパク質毒素を活性を保持したまま単離することに成功した。さらに分子生物学的手法を用いてアンドンクラゲ(Carybdea rastoni)、ハブクラゲ(Chiropsalmus quadrigatus)、Carybdea alataの計三種の立方クラゲのタンパク質毒素の全アミノ酸一次配列の解析に成功した。これはクラゲ毒素類の化学的性状が明らかにされた初めての例である。これら立方クラゲ類の毒素同士は相同性があるが、既知のタンパク質とは全く相同性を有していなかった。つまり、我々の研究により新奇な生理活性タンパク質ファミリーの一群を見出すことができた。アンドンクラゲ(Carybdea rastoni)のタンパク性の刺胞毒は非常に不安定なことで知られていた。今回の研究で本刺胞毒を安定した形で単離、保存することに成功した。それにより、単離できた化合物を加水分解後、いくつかのフラグメントを得てそれらの配列を解析した。その情報をもとにプライマーを作製し、アンドンクラゲ触手由来のmRNAから合成した1st strand cDNAに対してRT-PCRを行った。得られたPCR産物の情報に基づき、5',3'-RACEを行いアンドンクラゲ刺胞毒をコードする遺伝子の全長および刺胞毒のアミノ酸一次配列を明らかにすることができた。これはクラゲ毒の化学的性状が明らかにされた世界初の例である。またアンドンクラゲ蛋白毒は同一のアミノ酸配列を基本とする分子量4万3千と4万6千の毒素の二つがあることを明らかとし,実際に刺傷被害を引き起こす刺胞の中には分子量の小さい毒素のみが局在することを明らかにした。つまり当初分子量の大きな毒素が生産されたあと、切断などの修飾を受けて小さな毒素となって刺胞内に移行するシステムの存在が示唆された。また本毒は膜脂質構成成分の一つであるガングリオシドGM1によって、その強力な溶血活性が阻害されることを見いだした。この結果は本毒素の生体に対する最初の標的分子が細胞膜上の糖脂質である可能性があることを示唆するものである。立方クラゲの一種であるCarybdea alataのタンパク質毒素の研究を行った。本種は世界中の熱帯・亜熱帯域に広く生息する種類であり、ハワイにおいて刺傷被害の多いことが知られる。CaTX-A(43kDa)およびCaTX-B(45kDa)と命名した二つの強い溶血活性を示すタンパク質毒素をC.alataの触手から効率的に単離した。毒素の単離に用いた方法はアンドンクラゲ由来のタンパク質毒素精製時に開発したものであるが本法は不安定な海産動物由来の不安定なタンパク質毒素の精製に有効であることが改めて示された。単離したC.alataの刺胞から毒素を精製したところ得られたにはCaTX-AのみでありCaTX-Bは得られなかった。このことはアンドンクラゲ同様、刺胞に局在する分子量のやや小さいCaTX-Aが刺傷被害時の炎症の主活性成分として働いている可能性を示している。そこでこのタンパク質毒素CaTX-Aについてその化学的性状の追求を行った。その結果、CaTX-Aをコードとする全長塩基配列とそれに対応する463個のアミノ酸からなる一次配列を明らかにすることができた。このC.alata由来のCaTX-Aは、アンドンクラゲ由来のCrTX-Aと43.7%の相同性を示した。これら両タンパク質毒素ともに分子内に両親媒性のα-ヘリックス構造部分を持つ可能性が示唆された。これらクラゲ由来の両毒素とも既知のタンパク質とはまったく相同性を示さなかった。従って、今回得られた結果は全く新規な一連の生理活性タンパク質群の一端を明らかにしたものと位置づけられる。猛毒で知られるハブクラゲの刺胞から粗毒素液を抽出し、SDS-PAGE(ポリアクリルアミド電気泳動)に供した。

その結果、以前アミノ酸一次配列を明らかにしたハブクラゲの主要毒素CqTX-A以外にも、刺胞内に大量に含有されるいくつかのタンパク質の存在が明らかとなった。それらを、各々PVDF膜に転写後、N末端アミノ酸配列の解析を行った。CqTX-Aと極めて相同性の高いN末端を有する3種類以上のタンパク質の存在が確認された。これらはすべてCqTX-Aよりも分子量が小さかった。しかしN末端アミノ酸配列がCqTX-Aと若干異なることからCqTX-Aの一部が切断されて生成したものではないことは自明である。今後、これらタンパク質の活性などの確認を行う予定である。東京湾で2001年夏にミズクラゲの試料収集を行った。ハブクラゲに用いたのと同様の手法を使ってミズクラゲの刺胞のみを単離することに成功した。ミズクラゲ刺胞の特徴は刺胞のサイズが毒性が強いといわれる立方クラゲ類の刺胞と比較してサイズが30分の1程度と非常に小さいことであった。ミズクラゲ刺胞粗抽出物もヒツジ赤血球に対して溶血活性を示し、溶血毒素の存在が示唆された。ミズクラゲ刺胞の粗抽出物についてもSDS-PAGEを行ったところ複数のタンパク質の存在が確認された。このうち量が多く含まれていた4本のバンド(分子量3万から10万)をPVDF膜に転写後、プロテインシークエンサーによりN末端配列の解析を行った。しかし、すべてN末端がブロックされているためか配列を読むことができなかった。今後、溶血活性を指標に活性本体を単離し、その化学的性状を明らかにしていく予定である。刺胞動物門に属するクラゲはすべてが刺胞毒を有し、そのうち強力な刺胞毒を有するいくつかのクラゲは世界中で海水浴客や漁民に刺傷被害を与え、死亡例も報告されている。クラゲの毒素の化学的性状の解明についてはほとんど手つかずの状況であった。これは、それまで研究されたすべてのクラゲ毒素が非常に不安定であることに主に起因していた。このような状況のもと、我々は非常に不安定なクラゲタンパク質毒素を比較的安定に取り扱う方法を見出し、クラゲ数種からタンパク質毒素を活性を保持したまま単離することに成功した。さらに分子生物学的手法を用いてアンドンクラゲ(Carybdea rastoni)、ハブクラゲ(Chiropsalmus quadrigatus)、Carybdea alataの計三種の立方クラゲのタンパク質毒素の全アミノ酸一次配列の解析に成功した。これはクラゲ毒素類の化学的性状が明らかにされた初めての例である。これら立方クラゲ類の毒素同士は相同性があるが、既知のタンパク質とは全く相同性を有していなかった。つまり、我々の研究により新奇な生理活性タンパク質ファミリーの一群を見出すことができた。
非水系バイオ燃料電池の構築

本研究では先ず、非水系バイオ燃料電池の構築に先立って、水系におけるバイオ燃料電池の高出力化を目指した。酵素の多量固定化とそれによる酵素バイオ燃料電池の出力向上を目的として、高い実効面積を有する金ナノ粒子修飾電極を作製した。その電極上ヘフルクトース脱水素酵素とビリルビン酸化酵素をアノード及びカソード触媒としてそれぞれ固定化し、フルクトース/O_2型バイオ燃料電池を構築した。この酵素バイオ燃料電池の電極反応は、アノードとカソードいずれも酵素-電極間の直接的な電子移動(DET)反応に基づくものであり、メディエーターやセパレーターを必要とせず、非常にシンプルなセル設計での発電が可能であるという特徴がある。フルクトースが溶解したpH6の緩衝液中において発電特性を評価した結果、溶液を攪拌させた条件において、開回路電位は720mV、最大電流密度は4.9mAcm^<-2>、最大電力は0,87mWcm^<-2>(300mVにおいて)となり、DET型のバイオ燃料電池としては非常に高い出力を得ることに成功した。12時間連続で発電させた場合においても、初期発電量の85%を維持しており、酵素を固定化した金ナノ粒子修飾電極は高い安定性を有していることが明らかとなった。次に、非水系バイオ燃料電池を構築するため、イオン液体中での酵素の電極反応について検討した。その結果、アニオンとしてビス(トリフルオロメタンスルフォニル)イミド(TFSI)を有する数種のイオン液体中に微少量の水を添加した際に、ビリルビンオキシダーゼのDET反応が観測されることが明らかとなった。電気化学測定の結果、ビリルビンオキシダーゼは、水中と同様に、イオン液体中でも酸素の四電子還元反応を触媒していることが明らかとなった。現在までに報告されているバイオ燃料電池には、電流密度が小さいという問題点がある。この要因としては、酵素-電極間の電子移動速度が遅いことや、酵素は分子サイズが大きいために電極上における触媒としての密度が低くなってしまうことなどが挙げられる。非水系バイオ燃料電池の構築に先立って、水系におけるバイオ燃料電池の高出力化を目指した。先に挙げた問題点を解決するため、酵素を固定化する電極に、金ナノ粒子修飾電極を用いた。金ナノ粒子修飾電極を用いることで、電極面積を大きく増大させることに成功し、酵素-電極間の直接電子移動反応に基づく高い電流密度が得られることを明らかにした。特に、フルクトースデヒドロゲナーゼを固定化した電極では、フルクトースの酸化反応において、約14mA/cm^2もの高い電流密度を示した。この電流密度は、これまでに報告されているバイオアノードの中で最高値である。次に、非水系バイオ燃料電池を構築するため、イオン液体中での電子移動反応について検討した。我々が用いたイオン液体は、タンパク質の保存溶媒として既に報告しているhydrated choline dihydrogen phosphateである。このイオン液体中に、電子伝達タンパク質であるシトクロムcを溶解させると、水を溶媒とする場合よりもタンパク質を変性させることなく安定に保存できる。このイオン液体を溶媒として、フルクトースデヒドロゲナーゼ固定電極の電極応答を観測した。その結果、フルクトースの触媒酸化電流が観測され、この電極はイオン液体中でも機能することが明らかとなった。
ソリトンの振る舞いとその大容量光通信への応用に関する研究

1.適当な分散補償を行ったファイバー中での安定でしかもソリトンに比べ遙かに良好な伝送特性を持つ新しい非線形パルス(準ソリトン)を理論的に導出することに成功し、伝送途中でのパルス幅の変動が少ないために隣接パルスの相互作用が低減されること、伝送路途中の任意の点にADMを設置できることから高速時分割多重ネットワークに適していることを示した。2.正負の分散値を持つファイバーを増幅器間隔の中で交互に接続する分散マネージ伝送路での波長分割多重ソリトンの解析を行い、分散値の差∇Dを増加させることで良好な特性が得られることを示した。NRZ通信方式の理論解析を行い波形歪みの原因を解明し、その解決法を提案した。3.スライディング周波数制御を用いて2×10Gbit/sWDMソリトン伝送実験を行った。伝送路中のEDFA利得の波長依存性によって、伝送特性に変化が表れることを確かめた。また、研究分担者のスウェーデンチャルマ-ズ工科大学アンドレクソン助教授との共同研究で、光源のSN比が劣化すると伝送距離が制限されることを理論的、実験的に明らかにした。実験では、1波長10Gbit/sソリトンを伝送距離16,000kmにわたって誤り率10^9以下で伝送することに成功した。さらに、櫛形分散マネージメント伝送路を用い、増幅器間隔を分散距離の約3倍としても10ps光ソリトンを2,000kmにわたって誤り率10^9以下で伝送することに成功した。4.研究協力者である英国インペリアルカレッジのChernikov博士と共同研究を行い、誘導変調不安定を用いた極短パルス発生の実験を行って、自己相関幅3.7ps、繰り返し周波数86.8GHzのフーリエ変換限界に近いパルスの発生に成功した。5.ピコ秒ソリトン伝送において、ファイバの高次分散効果の影響は分散スロープ補償ファイバを用いた伝送制御が、自己誘導ラマン効果の影響は狭帯域光フィルタによる伝送制御が有効であることを示した。6.ファイバの曲げ損失を利用してエルビウム添加光ファイバ増幅器の低雑音化と利得平坦化が図れることを実験的に示した。7.ダ-クソリトンの伝送や解析を行い多くの点でブライトソリトンより良好な特性があることが分かった。8.波長分割多重を行う場合に四波混合の発生しない波長の選び方として、ジェネティックアルゴリズムを用いて行う手法を開発した。オハイオ大学児玉教授と共同で行っている理論分野の共同研究では、ファイバーの分散値を適当に変化させる、いわゆる分散支配の方法を用いて、波長分割多重通信において増幅器中のソリトン間の衝突時や増幅器を通過したときのソリトンから発生する放射波の影響を低減する方法を研究した。この成果は平成7年9月に行われたヨーロッパ光通信会議(ECOC)において長谷川が招待講演で発表し、また光ソリトン通信の国際シンポジウム(於京都平成7年11月1417日)でも児玉が招待講演で発表した。この方法により、従来困難とされていた光ソリトンの波長分割多重が可能になる見通しがついた。一方NRZ通信方式の理論解析を行い波形歪みの原因を解明し、その解決法を提案した。これらの結果は雑誌論文リストに示す通り、いくつかのOptics Lettersの論文として出版または投稿されている。

スウェーデンチャルマ-ズ工科大学アンドレクソン助教授との共同研究では、本年度は、国際コミュニケーション基金の援助を得て7月に約3週間招聘した。文部省科学研究費特別推進研究の援助を得て行っている10GHz光ソリトン周回伝送実験を共同で行った。また、波長多重ソリトン伝送を行う際に問題となる送信端でのソリトンの重なりを低減する一手法として、単一モードファイバの分散を利用する方法を提案した。実験でMQW変調器出力の10GHz×2波長光パルスを分散補償ファイバに伝送し、変調器の周波数チャーピングを補償しつつ、ソリトン重なりを解消できることを確かめた。1.1996年7月付けで代表者長谷川の旧友であるオハイオ州立大学数学科教授児玉裕治博士を迎え、光ソリトンの研究の陣容が充実した。2.適当な分散補償を行ったファイバー中での安定でしかもソリトンに比べ遥かに良好な伝達特性を持つ新しい非線形パルスが見つかった。この光パルスは従来のソリトン理論を適応することにより、その相互作用や時間ジッターが解析的に求まることを実証し、その相互作用はコアーのソリトン(ガイデイングセンターソリトン)によって決まることを示した。3.ソリトンに比べすそ野の広がりがガウス形に近い新しい定常なパルスを作り出す分散マネージメントの方法を検討し、準ソリトンと我々が呼ぶ新しいパルスを理論的に導出することに成功した。準ソリトンは、従来のソリトンに比べてピーク電力が低く、相互作用も少なくなることから、毎秒テラビット領域での伝送が可能になると予測される。4.代表者長谷川が発見した誘導変調不安定という方法を用い、超高ビットレートのパルス列のクロック抽出を光学的に行うことに関する理論的検討を行った。30個のパルスが欠けていえるようなソリトン列からのクロック抽出が全光学的に可能であることを証明した。5.スライディング周波数制御を用いて2×10Gbit/sWDMソリトン伝送実験を行った。伝送路中のEDFA利得の波長依存性によって、伝送特性に変化が表れることを確かめた。また、スライディング周波数制御ソリトン伝送において、光源のSN比が劣化すると、伝送距離を制限されることを理論的、実験的に明らかにした。実験では、1波長10Gbit/sソリトンを伝送距離16,000kmにわたって誤り率10^<-9>以下で伝送することに成功した。さらに、櫛形分散マネージメント伝送路を用い、増幅器間隔を分散距離の約3倍としても10ps光ソリトンを1,000km以上にわたって伝送することに成功した。また、MQW電界吸収型光変調器を用いたソリトン光源において、変調器出力光パルスのチャーピング補償の波長依存性を測定した。6.研究協力者である英国インペリアルカレッジのChernikov博士と共同研究を行い、誘導変調不安定を用いた極短パルス発生の実験をファイバーの分散マネージメント併用することにより、パルス幅0.7ピコ秒程度のフーリエ変換限界に近いパルスの発生に成功した。
異型花柱性植物を用いた送粉共生系のスケール横断的研究

1.網室でのいくつかの異なるタイプの実験により,トラマルハナバチのサクラソウへの訪花行動,受粉および花粉の持ち越しパターンを実測し,サクラソウ個体群のミクロスケールでの空間構造がマルハナバチの授粉行動に影響をおよぼすことが明らかとなった.また北海道・長野の自生地および実験個体群における遺伝解析の結果から花粉および種子を通じた遺伝子流動パターンが明らかとなった.これらの結果に基づき,ポリネータの行動からサクラソウ個体群の遺伝子流動を予測するモデルが作成された.2.北海道のサクラソウ自生地において,サイズが小さい個体群やポリネータの利用度が低い個体群では受粉数が少なく,結実が制限されていることが明らかとなった.また,個体群の縮小・孤立化を模倣した人工授粉の結果,花粉親数の制限により発芽率が低下し繁殖成功度が低くなる場合があること,送粉効率が悪いときに長花柱花の一部で生産される自殖種子も強い近交弱勢により次世代への貢献は低いことが示された.以上から個体群の孤立化が送粉への影響を介して繁殖を制限することが明らかとなった.3.サクラソウに近縁なオオサクラソウ・ユキワリソウ・カッコソウについて各自生地における個体群の分布と空間構造,訪花昆虫,種子生産,異型花柱性に関する基本的な特性の調査を行った.いずれの種も自家・同型不和合性を有し,種子生産には有効なポリネータによる送粉が必要であることが示された.4.北海道の海岸草原における送粉共生系の群集レベルでの調査に基づく送粉有効性の指標化により,冷温帯の草原生態系におけるマルハナバチ類のポリネータとしての有効性が明確に示された.5.技術者不足により発信器の開発には至らなかったが,トラマルハナバチ自然巣の発見に成功し,巣の出入りと花粉荷の分析からコロニーが利用する花資源とコロニーの発達状況に関するデータが得られた.6.本研究で得られた植物とポリネータとの送粉を介した相互作用に関わる遺伝子から景観までのスケールにわたる成果に基づき,異型花柱性植物とそのポリネータの保全の具体的指針を提案することができる.1.網室でのいくつかの異なるタイプの実験により,トラマルハナバチのサクラソウへの訪花行動,受粉および花粉の持ち越しパターンを実測し,サクラソウ個体群のミクロスケールでの空間構造がマルハナバチの授粉行動に影響をおよぼすことが明らかとなった.また北海道・長野の自生地および実験個体群における遺伝解析の結果から花粉および種子を通じた遺伝子流動パターンが明らかとなった.これらの結果に基づき,ポリネータの行動からサクラソウ個体群の遺伝子流動を予測するモデルが作成された.2.北海道のサクラソウ自生地において,サイズが小さい個体群やポリネータの利用度が低い個体群では受粉数が少なく,結実が制限されていることが明らかとなった.また,個体群の縮小・孤立化を模倣した人工授粉の結果,花粉親数の制限により発芽率が低下し繁殖成功度が低くなる場合があること,送粉効率が悪いときに長花柱花の一部で生産される自殖種子も強い近交弱勢により次世代への貢献は低いことが示された.以上から個体群の孤立化が送粉への影響を介して繁殖を制限することが明らかとなった.3.サクラソウに近縁なオオサクラソウ・ユキワリソウ・カッコソウについて各自生地における個体群の分布と空間構造,訪花昆虫,種子生産,異型花柱性に関する基本的な特性の調査を行った.いずれの種も自家・同型不和合性を有し,種子生産には有効なポリネータによる送粉が必要であることが示された.4.北海道の海岸草原における送粉共生系の群集レベルでの調査に基づく送粉有効性の指標化により,冷温帯の草原生態系におけるマルハナバチ類のポリネータとしての有効性が明確に示された.5.技術者不足により発信器の開発には至らなかったが,トラマルハナバチ自然巣の発見に成功し,巣の出入りと花粉荷の分析からコロニーが利用する花資源とコロニーの発達状況に関するデータが得られた.6.本研究で得られた植物とポリネータとの送粉を介した相互作用に関わる遺伝子から景観までのスケールにわたる成果に基づき,異型花柱性植物とそのポリネータの保全の具体的指針を提案することができる.1.個体群の縮小・孤立化による受粉パターンの変化が繁殖成功度に影響を与えていることが示唆されている異型花柱性の絶滅危惧植物サクラソウを材料とし、ポリネーターの利用性をシュミレートする人工授粉実験によって、花粉親の数および自殖の効果を検討した。北海道に自生しているサクラソウの自然個体群から複数ジェネットを採集し、環境条件の均一な栽培条件下で授粉量を制御した人工授粉によって、花粉親の数が受精・結実や次世代の生育初期の生存などの繁殖成功におよぼす影響および、ジェネット内授粉とモルフ間授粉を比較により、受精・結実、次世代の生育初期の生存および成長へ自殖の影響を検討した。その結果、和合な個体間の交配は、結実までは高い繁殖成功度をもたらすが、花粉親が1個体の場合は、花粉親の違いによる発芽率のばらつきが大きいこと、低い成功度は花粉親を複数にすることで回復がみられる場合があることが示された。また、長花柱型では部分的な自家和合性が存在するが、自殖による後代は、その後の生存や成長段階において強い近交弱勢がはたらくため、モルフ間授粉の後代に比べると繁殖成功度が著しく低いことが明らかにされた。

2.網室実験によりマルハナバチの女王がサクラソウを訪花した際の花粉の持ち越しパターンを実測した。花粉供給が長花柱花と短花柱花の場合では、受粉量や持ち越しパターンに大きな差異が認められること、訪花順の遅い花でもかなりの持ち越し花粉の授粉が期待されることが示された。3.今年度トラマルハナバチ用に開発した発信器はやや重すぎ、自然な飛行を妨げることが示された。来年度により重量を抑えた発信器の開発が望まれる。1)サクラソウとその主要なポリネータであるトラマルハナバチの女王との生物間相互作用にとって重要な意味をもつ花の形の変異を詳細に分析し、野外で、花の形に係わる自然淘汰、すなわちモルフも係わらず柱頭を高くする方向への自然淘汰を検出し、そのような自然淘汰が生じるメカニズムに関して、授粉パターンおよび花粉持ち越しパターンの詳細な分析を試みた。その分析においては、異型花柱の両モルフについて、多数の試料における花粉のサイズ(モルフ間で明瞭な差異がある)、葯における花粉生産、トラマルハナバチ女王の訪花に伴う葯からの花粉持ち出し、女王蜂の口吻への付着、訪花順に応じた柱頭への授粉などを測定し、低い位置にある長花柱花の葯からの花粉はポリネータの体への付着において効率が低く、低い位置にある柱頭は適法・不適法を問わず受粉の効率が低いことが明らかにされた。また花粉の持ち越しは相当大きく、クローン間での送粉に十分寄与する可能性が示唆された。2)茨城県笠間市の県立自然公園を主な調査地として、花資源の分布とコマルハナバチの訪花頻度に関するデータを季節を通じてとり、コロニー分布を検討するシミュレーションモデルを作成した。3)北海道の約20局所個体群における個体群の空間構造とトラマルハナバチの訪花がサクラソウの有効な受粉(異型花粉の受粉)に及ぼす影響を検討した。また、長野県軽井沢においてサクラソウが残されている約10箇所において、クローン数、花型構成、個体群の空間構造、開花フェノロジーおよびトラマルハナバチ女王の訪花など生物間相互作用と種子生産について基礎的な調査を行った。4)これまでほとんどその生態が明らかにされていない異型花柱のサクラソウ属高山植物のユキワリソウについて、ポリネータとの生物間相互作用の研究を行うために浅間山のカルデラ荒原湯の平で、局所個体群の分布、個体群の空間構造、フェノロジー、訪花昆虫、種子生産、異型花柱に関する基本的な特性についての調査を実施した。湿原と崖地というようにかなり環境の異なる場所に局所個体群が認められ、クローン成長に違いが認められたが、いずれの場所でも種子生産は良好でしばしば訪花するオドリバエの1種がポリネータとしての役割を担っている可能性が示唆された。1)ポリネータとの相互作用がサクラソウの受粉・配偶パターンの形成に及ぼす影響を個体群レベルで把握するために、北海道日高地方の自生地で、個体群サイズと送粉者の利用度の異なる8つのサクラソウ個体群種子生産と受粉パターンとの対応関係を分析した。個体群サイズが小さい個体群と送粉者の利用度が低い個体群では、個体群サイズが大きく送粉者の利用度の高い個体群と比較して、受粉数が有意に小さいこと、長花柱花の受粉数が多く、長花柱花での高い種子生産には受粉数と自殖能の両方が寄与したことが明らかにされた。2)個体群の空間構造とポリネータの行動を介した受粉パターンの形成メカニズムを明らかにするため、生産花粉、ポリネータの一回の訪花に伴う花からの花粉の持ち出し、それらが異型花へ分散される際の花粉の持ち越しをいくつかのタイプの実験的によって詳細に定量した。