hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血清中CKアイソザイムに関する研究

クレアチンキナーゼ(CK)はクレアチンとクレアチンリン酸との問を触媒する酵素で、特に筋肉収縮時のエネルギー供給上重要な役割を果たしている。そして、そのアイソザイムには細胞質上清分画に存在するCK-MM、CK-MB、CK-BBとミトコンドリア内に存在するミトコンドリアCK(mCK)が知られている。CK-MBは心筋梗塞の、CK-BBは中枢神経疾患、悪性腫瘍の診断マーカーとして測定されている。15歳の男性にCKアイソザイム異常(CK-MM:60%、CK-MB:13%、CK-BB:37%)が発見された。症例はCK-BBが異常高値となる症状や徴候はなく、遺伝的な高CK-BB血症が考えられた。症例の姉も症状や検査異常がないにもかかわらずCK-BBが47%と高値であり、遺伝子解析を行ったが、十分な解析結果は得られなかった。このようなCKアイソザイムの遺伝的異常症例を見出すために、免疫阻害法によるスクリーニング検査を行い、CK-B活性が症例に対しては心筋マーカーの検索や分子量推定、活性化エネルギー測定によりInCKや免疫グロブリン結合CKとの鑑別を行った。今回の研究では3,015症例についてCKアイソザイム分析を行ったが、CK-B/T-CKが0.1以上であったのは287例であった。主訴や他の臨床検査所見からこれら症例の病態解析を行った結果、心疾患が231例(80.5%)と最も多く、次いで甲状腺疾患と脳疾患の15例(5.2%)、悪性腫瘍と新生児の7例(2.4%)の順であった。CK-BBが異常高値の症例は今回の研究では検出できなかった。本年度は、日常検体のスクリーニングを行った。総CK活性はJSCC準拠法、CK-B活性は抗CK-M抗体を用いた阻害法により測定した。この結果、956例の検討で、CK-B/総CK活性>0.1の検体は95例(9.94%)であった。そして、これらの臨床病態の内訳では心筋梗塞34例(35.8%)、狭心症28例(29.5%)、その他の心疾患17例(17.9%)と心疾患が79例(83.2%)を占めていた。その他には甲状腺疾患5例(5.3%)、糖尿病4例(4.2%)、悪性腫瘍3例(3.2%)、新生児3例(3.2%)であり、臨床診断がつかなかった症例も1例存在した。これらの検体については、CK-MMアイソフォーム、ミオグロビンを測定し、活性化エネルギー、薄層ゲル濾過による分子量の推定を行った。この結果は、CK-MMアイソフォームでは、組織型が主分画であり、組織から逸脱したばかりのCKが主であり、血中に長時間停滞したCKではないことが確認された。また、活性化エネルギーの検索では活性化エネルギーは低値であり、ミトコンドリア由来のCKではなく、細胞質上清分画からのCKと推測され、分子量も通常と同様な82kDaであった。今年度のスクリーニングでは、心疾患や甲状腺疾患、悪性腫瘍など従来から報告されている病態での異常CK-B/総CKであり、特別な病態での異常は認められなかった。本年度は最終年度であり、日常検体のスクリーニングと心筋梗塞早期での検索を行った。総CK活性はJSCC準拠法、CK-B活性は抗CK-M抗体を用いた免疫阻害法で行い、心筋梗塞診断には心筋マーカーであるCK-MB蛋白量、ミオグロビンおよびトロポニンIを同時測定可能な自動分析装置を用いて行った。

この結果、スクリーニングの650症例の検討では、CK-B/総CK>0.1の検体は64例(9.8%)であり、臨床病態では前2年での検討と同様に、心筋梗塞、その他の心疾患が52例(81.3%)を占めていた。その他では甲状腺疾患、糖尿病、悪性腫瘍など、これも前2年での検討と同様の結果であった。これらの症例については、CK-MMアイソフォーム、薄層ゲル濾過法により異常CKか否かの検索を行った。この結果、大部分がCK-BBを含む異常CKではないことが確認された。心筋梗塞の1例と悪性腫瘍の1例については、高分子量であることが確認され、結合免疫グロブリンの検索でIgGとの結合が確認された。今回の研究で300例近い症例をスクリーニングしたが、異常CKアイソザイム症例は発見できなかったが、研究は持続するつもりである。また、急性心筋梗塞初期患者10例の検索では、各心筋マーカーの変動に乖離が認められる例、例えばCK-MBだけが高値でトロポニンIが低値であるような症例は認められなかったが、心筋マーカーを継続して測定することで、今後異常CKが発見できるものと考える。
組合せ問題のアルゴリズムの効率化に関する研究

主に以下の四点の成果を上げた。1.代表的な組合せ問題である、和積形論理式(CNF式)充足解数数え上げ問題に関してk-CNF式の解総数を一意に定めるためには、各項を非充足とする変数割当ての集合の変数の数に関する多項式個の情報を持つことが必要十分であることを示した。また、同結果を応用し、ハイパーグラフの彩色数を一意に定めるための必要十分条件を示した。2.1に関してk-CNF式の充足解数を実際に求めるアルゴリズムを陽的に構築した。3.CNF式に対して、充足解の総数を充足解に含まれる1となる変数の数に関する事前知識を仮定することで、各々準指数時間、多項式時間の効率的なアルゴリズムが存在することを示した。
RNF43パルス樹状細胞と特異的活性化リンパ球を用いた免疫細胞療法の開発

本研究は標準治療不応の進行固形腫瘍患者で、HLA-A*2402またはHLA-A*0201を有し、かつ腫瘍にRing finger protein 43(RNF43)が高発現している患者を対象としたRNF43を用いた免疫細胞療法第1相臨床試験である。これまでに7例の患者が登録され、5例において試験が完遂した。主要評価項目である安全性評価では本療法に起因すると考えられる重篤な有害事象を認めず、本療法の忍容性は高いと考えられる。副次評価項目である抗腫瘍効果評価では5例中4例がSD(stabl edlsease)であり、そのうち2例が腫瘍マーカーの低下を認めた。現在投与症例における免疫学的解析を実施中である。現在まで臨床試験にて標準治療不応性固形腫瘍患者4例に免疫細胞療法を行った。細胞調製は全てGood Manufacturing Practiceレベルに準拠し、無菌検査、生存率、細胞表面マーカー(T細胞分画、樹状細胞の成熟化)による品質検査を行い、全て適合して患者に投与することができた。また有害事象評価ではGrade3(血液学的に関してGrade4)以上の重篤な有害事象は認めず全例安全に遂行することができ、本免疫療法の安全性が示唆されている。抗腫瘍効果はRECISTガイドラインに則り2例がSD(安定),2例がPD(進行)であった。免疫学的解析ではSD症例で末梢血中のナイーブ、セントラルメモリーCD8+T細胞分画の増加を認めた。誘導した細胞傷害性T細胞はCD107amobilization assayにてHLA拘束性にRNF43陽性細胞株への傷害を認めた。また患者末梢血単核球も同様にRNF43陽性細胞株に対して本免疫療法前と比べ細胞傷害活性の上昇を認めた。前投与薬シクロホスファミド投与により末梢血中の制御性T細胞数が投与前と比べ減少を示す傾向を認め、制御性T細胞が排除されている可能性が示唆されている。今後も抗腫瘍効果を増強する免疫制御因子および抗腫瘍効果を阻害する免疫寛容因子の正負2因子のモニタリングを行い治療効果との関連性を見出していく。さらに免疫応答の評価として各症例Intracellular cytokine assayを行い患者末梢血単核球のRNF43ペプチド特異的IL-2,TNF-α,IFN-γを測定したが各症例で検出されるものが各々異なり、今後症例数を増やし検討する予定である。また既に臨床試験を終了された患者も定期的に経過観察を行い生存期間の追跡調査を行っている。有効例では免疫応答が示唆されており、バイオマーカーの検索等免疫療法のエビデンスや改善に寄与できると考えられる。昨年に引き続き本免疫細胞療法臨床試験を行い、本年度は4候補患者を九州大学病院先進医療適応評価委員会において検討した。その結果、2例が適応症例と認められ、1例が投与完了、1例が現在投与継続中で、本年4月12日に完了予定である。残り2例は同委員会において適応外症例と判定された。免疫細胞の調製はGMP (Good Manufacturing Practice)に準拠しそ行うために、妥当性確認を厳密に行った。本試験はRNF43特異的活性化リンパ球の2段階容量漸増試験(各レベル5例)であり、レベル1の5例を完遂したため、昨年10月同委員会においてレベル2への移行について審議された。主要評価項目の安全性評価はCTCAEv4.0に則り、1例が肝機能障害(Grade3)、原病の進行によるものと判断されたが、規定に従い1名を追加し、6例目の検討を現在行っている。それ以外にGrade3以上の重篤な有害事象は認められなかった。抗腫瘍効果についてはRECIST基準に則り評価し、免疫療法特有に認められる遅延反応効果の可能性も考慮し、細胞療法終了1週間と4週間後の2点で評価した。2点とも5例中3例がSD(安定),2例がPD(進行)であった。またSD症例の1例に腫瘍マーカーが4週間後に低下し、遅延反応効果を示唆した。免疫学的評価において、SD症例で末梢血中のRNF43ペプチド特異的CTL誘導がCD107a/bアッセイ法によって確認された。また免疫寛容関連因子として血清中のIL-6,IL-10濃度がPD例で試験期間中に上昇し、SD例では低値継続であったため、これらはバイオマーカーの指標となる可能性が示唆された。さらに末梢血中制御性T細胞(Treg)数は5例中3例(SD2例、PD1例)でシクロホスファミド(CY)投与後に低下し、CY投与によって臨床効果を低下させることなくTregを排除できる可能性が示唆された。
光電子角度分布に対する、電子相関の影響の理論的解明

電子状態が縮重している分子のの二光子イオン化過程を理論的に検討した。電子相関の影響で光電子角度分布の対称性が低下する場合があることを明かにした。光照射前に,分子が固定されている場合と,ランダムに整列している場合を調べた。後者の方が実験は容易であり,円偏光とハイブリッド遷移を利用すれば,光電子角度分布の対称性の低下が観測できる。対称性の低下は,異なる電子配置間の干渉の結果である。干渉パターンの解析は,分子軌道の可視化を越え,多電子波動関数の可視化の第一歩になると期待できる。原子・分子の理論計算において、定量的予測を目指すなら、電子相関を考慮することが重要である。理論と実験との不一致は、電子相関による部分が大きい。しかし、問題は電子相関のみに敏感な観測量が少ないことである。通常の計算には電子相関以外の部分でも多くの近似が入っているため、理論と実験の比較からは、電子相関についての明確な情報が得られない。それでは、実験で直接、電子相関を観測できる物理量はないだろうか?本研究の目的は、電子相関の有無で定性的なレベルで異なる物理量を探し、新しい実験方法を提案することである。現時点で、多配置波動関数でなければ説明できない現象はわずかしかない。そのような物理量の一つに、光電子スペクトルにおける衛星線がある。ただし、その場合複数の電子配置の寄与は独立で非干渉である。一方、対称性に注目すると、個々の軌道の対称性を固定した単一電子配置は電子間の相互作用があるために真の固有関数ではない。電子配置に含まれる軌道の対称性は、一般には電子配置ごとに異なる。その観点にもとづき、電子相関の有無で光電子角度分布の対称性が大きく崩れる例(シクロプロパン:点群C3v)を見出している。課題は、現象の一般性(他の点群でも起こるか)および、実験の容易さ(実験室系でも可能か)、他の過程との競合の可能性(ヤーン-テラー効果の影響)の3点を明かにすることである。本年度は一般性に関して調べた。具体的には、Clebsch-Gordan係数をあらわに考慮して、分子座標系での光電子角度分布の公式を導いた。そこから、光イオン化の始状態と終状態がともに二重に縮退した電子状態である場合には、波動関数が単一電子配置か多配置かで光電子角度分布が定性的に異なることを明かにした。二原子分子分子(C∞v,D∞h)を含む点は重要である。なぜなら、二原子分子関してはヤーン-テラー効果と競合することがないからである。しかし、電子相関を実験で研究する手段は限られている。例えば、電子相関エネルギーは真のエネルギーとHartree-Fockエネルギーの差で定義できるが、観測できる量ではない。というのは、Hartree-Fockエネルギーは独立電子近似で得られる理論値であるからである。そこで、独立粒子近似ではありえない現象あるいはゼロとなる物理量が、電子相関の影響を実験で検証するには重要となる。この研究の目的は、縮重電子状態の光電子角度分布に限定し、そのような物理量を探すことである。前年度までは、分子固定系での光電子角度分布を調べてきた。しかし、分子固定系での光イオン化過程の観測は実験の難易度が高い。本年度は、実験室系での光電子角度分布を調べた。その結果、円偏光を利用し2段階イオン化(共鳴2光子イオン化)すれば良い事がわかった。シクロプロパン分子について数値計算でも確認した。また1光子過程における光電子角度分布では不可能であることも示すことができた。よって、実験室系で2段階イオン化による光電子角度分布が、電子相関を観測する最も単純な系であるといえる。電子相関の影響(複数の電子配置間での干渉効果を含む)を光電子角度分布上で確認する、実験手法を検討してきた。光電子角度分布は、固定された分子およびランダムな整列状態の分子両方で観測可能である。ただし、後者の方が実験が容易であり、実現可能性が高い。昨年度は、円偏光を併用すれば、整列していない分子に関しても、光電子角度分布に電子相関の影響を確認できることを示した。一方で、円偏光を併用した場合は、系の円筒対称性を崩すような偏光の組み合わせにすることが、意味のある情報を得るためには必要である。そのような、実験例は少なく理論研究例も限られている。そこで、本年度はこの励起過程のメカニズムと、別の課題への応用を検討した。そのためにまず、円偏光励起のメリットがどこに由来するのかを検討した。その結果、ハイブリッド遷移(複数の回転主軸に遷移モーメントの成分がある遷移)を利用した分子整列状態を作ることで、電子相関の影響が見えやすくなっていることが判明した。ハイブリッド遷移の利用というのは、キラルな分子の観測における廣田の方法と同様である。廣田の方法ではマイクロ波分光を利用しているが、ここでは光電子分光を利用してキラルな分子の観測が可能かどうか検討した。キラルな分子の観測は、一般的には円二色性を測定するが、感度を上げて気相への応用可能性が近年複数のグループで検討されている。今回の研究では、キラルな分子を一つ選び、光電子角度分布の異方性パラメータを多重散乱法で計算した。

計算の結果、たしかに円偏光を使った2光子過程の光電子角度分布を測定すれば、キラルな分子を区別できることがわかった。さらに、ハイブリッド遷移を使わない、直線偏光励起および円偏光イオン化過程に比べ、ハイブリッド遷移を使う円偏光励起の方が、感度が良いことを示唆する結果が得られた。これらの結果をまとめて、学会発表を行った。電子状態が縮重している分子のの二光子イオン化過程を理論的に検討した。電子相関の影響で光電子角度分布の対称性が低下する場合があることを明かにした。光照射前に,分子が固定されている場合と,ランダムに整列している場合を調べた。後者の方が実験は容易であり,円偏光とハイブリッド遷移を利用すれば,光電子角度分布の対称性の低下が観測できる。対称性の低下は,異なる電子配置間の干渉の結果である。干渉パターンの解析は,分子軌道の可視化を越え,多電子波動関数の可視化の第一歩になると期待できる。実験室系での観測手法を見出せたのは大きな成果である。学会での報告(2件)をし、論文[投稿済み(Physical Review A)]にもまとめることができた。理論化学これまで、数値計算の対象としてシクロプロパン分子(D3h点群)のみを扱ってきた。一方、多原子分子はJahn-Teller効果の影響は完全には無視できないと考えている。そこで、二原子分子を計算対象に加え、実現可能な実験条件を検討する。本年度は、まず理論公式の導出を行った。光イオン化においては、電子相関は、光学遷移の行列要素を介して光電子角度分布に影響を与える。電子縮重は、結合係数(Clebsch-Gordan係数)を使って公式に取り込んだ。分子の場合は、ボルン-オッペンハイマー近似を仮定し、イオン化過程では分子の対称性が崩れないとした。分子座標系での光電子角度分布に関して、電子相関の光電子角度分布への影響をまとめた。当初C3v点群に関して成り立つことを確認していた事柄を二重縮重状態をもつすべての点群に一般化した。また、計算機を導入し数値計算の準備を始めた。論文の受理が遅れ、年度内に出版料がかからなかったため。分子座標系での実験は、対称性分解光電子分光として確立しているが、多原子分子に関しては容易ではない。そこで、実験室系での光電子角度分布について、電子相関と偏光の影響を含む公式を整理する。それにより、実験室系でも電子相関により、光電子角度分布が定性的にことなる可能性があるか明かにする。また、数値計算からヤーン-テラー効果の影響と電子相関の影響がどの程度競合するか調べる。論文の出版と、学会参加を予定している。計算機の構成を見直した事ととソフト等の導入が済んでいないために残額が生じた。今後、電子状態計算ソフトを導入し現象の定量的に評価をする。また、バックアップ機器の購入、国際学会参加を予定している。
小脳シナプス可塑性における一酸化炭素の役割

我々はいままで小脳LTDにおいてNOが促進的に作用することを見いだした。しかし海馬LTPではNOだけではなくCOも促進的に作用するとされている。CO合成酵素は小脳プルキンエ細胞において高濃度で存在することが知られているので小脳LTDにおいてもCOが関与している可能性がある。小脳LTDに対するCO合成酵素阻害剤(プロトポルフィリンの亜鉛錯体)の効果をみたところLTDは阻害されず、むしろ促進される傾向があった。外来性のCOを投与しつつLTDを起こすと40nMの濃度でむしろ抑制された。以上から小脳においてはCOはNOとは異なり、むしろ抑制的に作用するという可能性がある。COが刺激に応じて分泌される情報伝達物質として作用するのかそれとも一定量代謝回転によって生成されるCOがたまたま生理活性を持つのかということを知るためにはCOが刺激によって放出されるか否かを検討しなければならない。我々は既にNOの電気化学的プローブを開発しているが、これは酸化されやすいガス状の物質であればこれをNOと同様に捉えることが期待される。従ってNO電極に対するCOの感受性を解析したところCOに対して幾分のクロストークを示した。薬理学的な実験から推定されるCOの放出レベルは10nM以上なので、現在これに相当するCOの放出が起きるか否かを検討中である。NOやCOの作用は従来小脳や海馬のシナプス可塑性において検討されているが、大脳皮質では比較的データが少ない。我々は既に大脳聴覚野において長期増強が起きることを示したがさらにこの解析を進め、浅層錘体細胞出力の増加が長期増強に対応して起きていることが判明した。現在この現象についてのNO、COの機能を探るべく準備中である。
コーポレート・ガバナンス形態,会計情報開示政策,企業業績の相互関連性に関する研究

本研究は,企業のコーポレート・ガバナンス形態が経営者の会計情報開示政策および企業業績にどのような影響を与えているかについて,理論的かつ実証的に明らかにしようとするものである.この目的のため,平成19年度では,平成18年度に行われた福島県内の製造業企業に対するアンケート調査結果を再集計するとともにより詳細な分析を行い,経営者行動に影響を与える要因を抽出した.その結果,中小規模の製造業企業において自社の持つ技術的要因のみならず,資金調達可能性や人材の確保および内部組織形態のあり方など,財務的要因や組織的要因が経営者の事業拡大意欲に影響を与えていることが明らかになった.これによりコーポレート・ガバナンス・システムと企業業績とが関連しうることを示す重要な証左を得た.これらの成果は,「産学連携の新たな方向性」奥本英樹著,高崎経済大学経済学部監修『新地場産業への産学官からの挑戦』,日本経済評論社,pp.83-104, 2007年において発表されている.また,19年度ではコーポレート・ガバナンス・システムおよび企業財務報告システムにおいて,その充実がいまだ図られていないと考えられる建設業企業に着目し,それらのシステムの確立度合いやそれらに対する経営者の意識等と企業業績との関連を分析した.当該分析では,福島県に存在する15社の建設業企業に対してヒアリング調査を行った.この研究によって,コーポレート・ガバナンス・システムや財務報告システム等の確立度合いおよびそれらに対する経営者の意識が,企業業績のみならず経営行動にも大きな影響を与えていることが明らかになった.この成果については,「福島県建設業界の現状と課題」奥本英樹著,『地域創造』第20巻第1号,福島大学地域創造支援センター,pp.16-24, 2008年において発表されている.本研究は,企業のコーポレート・ガバナンス形態が経営者の会計情報開示政策および企業業績にどのような影響を与えているかについて,理論的かつ実証的に明らかにしようとするものである.この目的のため,平成19年度では,平成18年度に行われた福島県内の製造業企業に対するアンケート調査結果を再集計するとともにより詳細な分析を行い,経営者行動に影響を与える要因を抽出した.その結果,中小規模の製造業企業において自社の持つ技術的要因のみならず,資金調達可能性や人材の確保および内部組織形態のあり方など,財務的要因や組織的要因が経営者の事業拡大意欲に影響を与えていることが明らかになった.これによりコーポレート・ガバナンス・システムと企業業績とが関連しうることを示す重要な証左を得た.これらの成果は,「産学連携の新たな方向性」奥本英樹著,高崎経済大学経済学部監修『新地場産業への産学官からの挑戦』,日本経済評論社,pp.83-104, 2007年において発表されている.また,19年度ではコーポレート・ガバナンス・システムおよび企業財務報告システムにおいて,その充実がいまだ図られていないと考えられる建設業企業に着目し,それらのシステムの確立度合いやそれらに対する経営者の意識等と企業業績との関連を分析した.当該分析では,福島県に存在する15社の建設業企業に対してヒアリング調査を行った.この研究によって,コーポレート・ガバナンス・システムや財務報告システム等の確立度合いおよびそれらに対する経営者の意識が,企業業績のみならず経営行動にも大きな影響を与えていることが明らかになった.この成果については,「福島県建設業界の現状と課題」奥本英樹著,『地域創造』第20巻第1号,福島大学地域創造支援センター,pp.16-24, 2008年において発表されている.当該研究は,各企業におけるコーポレート・ガバナンス・システムが経営者の会計情報開示政策に対してどのような影響を与え,またそのもとで開示される会計情報が当該企業業績に関してどの程度の情報内容をもっているのかについて,経済学的な視点から分析することを第一の目的とし,さらに,コーポレート・ガバナンス・システムおよび経営者の会計情報開示政策が,企業業績とどのように関連しているのかについて実証的に明らかにすることを第二の目的として取り組むものである.この目的のため,平成18年度では,経営者行動に影響を与える要因を抽出することに主眼を置き,過年度に行った福島県内の製造業企業に対するアンケートによる聞き取り調査の再集計およびより詳細な分析を試みた.この結果,中小規模の製造業企業では,自社の持つ技術的要因のみならず,資金調達可能性や人材の確保および内部組織形態のあり方など,財務的要因や組織的要因が経営者の事業拡大意欲に影響を与えていることが明らかになった.このことは,コーポレート・ガバナンス・システムと企業業績とが関連しうることを示す重要な証左である.したがって,平成19年度においては上記の調査結果を踏まえつつ,より詳細で精度の高い調査を大企業も含めたより広範囲な企業に対して行うことで,より普遍的かつ頑健性ある結果を得たいと考えている.なお,上記の調査結果は,高崎経済大学経済学部編集による新書(平成19年6月発行予定)において,論文として掲載されることとなっている.当該研究は,各企業におけるコーポレート・ガバナンス・システムが経営者の会計情報開示政策に対してどのような影響を与え,またそのもとで開示される会計情報が当該企業業績に関してどの程度の情報内容をもっているのかについて,経済学的な視点から分析することを第一の目的とし,さらに,コーポレート・ガバナンス・システムおよび経営者の会計情報開示政策が,企業業績とどのように関連しているのかについて実証的に明らかにすることを第二の目的として取り組むものである.この目的のため,平成19年度では,昨年度に行われた経営者行動に影響を与える要因を抽出する目的での福島県内の製造業企業に対するアンケート調査の再集計およびより詳細な分析における結果を論文としてまとめた.

ここでは,中小規模の製造業企業において自社の持つ技術的要因のみならず,資金調達可能性や人材の確保および内部組織形態のあり方など,財務的要因や組織的要因が経営者の事業拡大意欲に影響を与えていることが明らかになった.これによりコーポレート・ガバナンス・シシステムと企業業績とが関連しうることを示す重要な証左を得た.また,19年度ではコーポレート・ガバナンス・システムおよび企業財務報告システムにおいて,その充実がいまだ図られていないと考えられる建設業企業に着目し,それらのシステムの確立度合いやそれらに対する経営者の意識等と企業業績との関連を分析した.当該分析では,福島県に存在するおよそ200社の建設業企業に対してヒアリング調査を行った.この研究によって,コーポレート・ガバナンス・システムや財務報告システム等の確立度合いおよびそれらに対する経営者の意識が,企業業績のみならず経営行動にも大きな影響を与えていることが明らかになった.当該研究の結果は,20年度において論文として発表する予定である.
酵素の精密制御固定化技術の確立と次世代高機能化バイオリアクターの構築

本研究では、酵素・タンパク質を多孔性担体に固定化する際に問題となる固体表面との接触あるいは化学結合に際して生じる酵素・タンパク質の変性・失活と活性発現に不利な配向を防ぐ方法の開発を目的として研究を行った。具体的には、酵素をシリカやポリスチレンなどの固体表面に特異的親和性を有するペプチドタグを連結することにより、酵素を固体表面にほぼ不可逆的に固定化できるだけではなく、付着状態の構造と配向の制御が可能であることを示唆する結果を得た。本課題では、次世代高機能化固定化酵素バイオリアクターの構築のための基盤技術となる、固体表面親和性ペプチドを利用した、付着酵素分子の配向・構造制御が可能な精密制御固定化法の確立を最終目標としている。本年度は、酵素の精密制御固定化に適したシリカ表面親和性ペプチド群を、そのC末端に遺伝子工学的に連結したGlutathione S-transferase (GST)の多孔性シリカ粒子への付着特性について実験的検討を行った。すなわち、E. coli鞭毛ランダムペブチドライブラリーシステムを用いてスクリーニングされたシリカ表面に特異的親和性を示すペプチド(GlsX)、がGSTのC末端側が入るようにGlsX配列をコードするDNA断片をライゲーションし、各種ベクターpGEX-GlsXを構築した。構築したベクターを用いてE. coliBL21 (DE3)株を形質転換し、タンパク質を発現し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したGlsX連結酵素を用いて、粒径7nmのfumed silicaと粒径70nmのsilicon dioxideへの付着挙動を調べた。その結果、塩基性アミノ酸を4残基含む12アミノ酸残基からなるGls16連結GSTが直角平行型の不可逆的吸着平衡等温線を示すことが示された。一方,親和性ペプチドを連結していない野生型GSTは、吸着量と吸着力ともに低い値を示した。親和性ペプチドの吸着特性の違いについて基礎的な知見を得るため,分子動力学計算により吸着形態と吸着エネルギーを計算する方法を確立した。シリカ表面は,H-O-分子をO-(オーマイナス)を上向きに0.32nm間隔で271分子並べることによって構築し、モデルガラス表面の3nm上方にペプチド分子を置いた状態で分子シミュレーションを開始し,ペプチド分子を吸着させた。さらに、次年度に固定化のモデルタンパクとして使用するβ-ガラクトシダーゼの精製方法を磯立した。本年度の研究では、昨年度に見出したSiO_2表面親和性プチド(Silica-tag)を連結した酵素を多孔性シリカ粒子に固定化し、その固定化特性及び反応特性を調べることを目的とした。Bacillus circulans起源のβ-galactosidaseの精製に時間を取られたために、固定化対象酵素として以前に精製方法を確立したAspergilu niger由来のβ-glucosidase(J.Biosci.Bioeng.,110,281-287(2010))を用いた。先ず、前年度に検討した複数のSiO_2親和性ペプチドと多孔性シリカゲルの種類と酵素の固定化量の関係について調べた。その結果、親和性ペプチドとしてGLS5-16を用い、市販多孔性シリカ粒子Fractosil 500に固定化した場合に、β-glucosidaseの固定化量が最大となった。この結果は、親和性ペプチドを付与しない酵素を用いた結果の2.5倍以上であった。GLS5-16をグルタルアルデヒドを介して化学的にβ-glucosidaseに結合した固定化酵素を用いると、少なくとも5回以上の繰り返し反応後も活性の低下はみられなかった。一方、ペプチドタグを連結していない酵素を用いた場合は、3回目で活性が半減した。これらの結果は、親和性ペプチドタグの有用性を示唆するものである。一方、Bacillus circulans起源の複数のβ-galactosidaseの精製方法の確立を行った。今後、C-末端にペプチドタグを連結した変異酵素の調製と固定化を行い酵素の固定化特性を調べる必要がある。昨年度の研究でクローニングした分子量が約18万のB. circulans起源Beta-galactosidase(Gal-A)に着目して研究を進めた。配向制御固定化の対象タンパク質としてGal-Aと分子中に存在するガラクトオリゴ糖に特異的親和性を示すDS domainを取り上げた。先ず、これらのタンパク質の大量発現と精製条件を確立した。Gal-Aの配向制御固定化では、遺伝子工学的にN末端のみにタグを連結する方法では、既往の知見により、分子量が18万の巨大なタンパク質の固定化には十分な結合力が得られなことが考えられた。そこで、化学的方法により精製Gal-Aに親水性ポリスチレン特異的ペプチドタグ(mPS tag)を結合した。mPS tagは我々が見出した(Biotechnol. Prog., 22, 401(2006))PS tagのアミノ酸残基2つを置換した変異ペプチド(KRAFLASRRIRRP)である。

先ず、mPS tagをグルタルアルデヒドで処理後にGal-Aに結合させた。結合により酵素の比活性は約40%に低下した。このmPS tag連結Gal-Aを、濃度を変えて細胞培養用の親水性96穴プレートの底面に固定化した。固定化後にウェルに基質(0.24%p-nitrophenyl beta-D-galactopyranoside)を添加し、恒温槽内の水面にプレートを設置し、37°Cで反応を行った。一定時間後に、プレートから反応液を回収し、10%炭酸ナトリウム溶液に加え吸光度を420 nmで測定した。いずれの濃度の酵素溶液を用いた場合も固定化酵素の活性には大きな差は認められなかったことから、固定化に大過剰の酵素量が使用されたことが推定された。基質のみを交換して繰り返し反応を行ったところ、固定化酵素の活性は回数と共に緩やかに低下したが一定値に近づく傾向を示した。野生酵素の精製とタグ付き変異酵素作成の準備に予定していた以上の時間を要したこと、並びに平成23年4月に以前に勤務していた大学から転勤した新任地でのスタートアップに予想以上の時間がかかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究では、シリカゲルに特異的親和性を示すペプチドをタグとして用いて検討を行った。親和性タグを用いる酵素の固定化法における最も重要な特性は付着力の強さであるので、他の親和性ペプチドを用いた結果と比較する必要がある。最後の年は、以前の研究(J.Biotechnol.,127,288(2007))においてELISA法に使用していた親水性ポリスチレン親和性ペプチドをタグとして用い、担体としてはポリスチレン表面を用いて検討することを考えている。
遮熱コーティングの高温焼結中における全方向弾性係数の共鳴超音波その場計測

遮熱コーティングの弾性係数は,熱応力,界面破壊靱性などの強度評価パラメータの算出に必要な基本的物性値である.1100°Cに及ぶ高温下において全方向の異方性弾性係数を評価可能な共鳴超音波スペクトロスコピーシステムを構築した.また,遮熱コーティングの全方向の異方性弾性係数の温度依存を明らかにした.遮熱コーティングは異方性が強いことが分かった.また,試験雰囲気で焼結し,各ヤング率と各せん断弾性係数が上昇する挙動を明らかにした.遮熱コーティングの弾性係数は,熱応力,界面破壊靱性などの強度評価パラメータの算出に必要な基本的物性値である.1100°Cに及ぶ高温下において全方向の異方性弾性係数を評価可能な共鳴超音波スペクトロスコピーシステムを構築した.また,遮熱コーティングの全方向の異方性弾性係数の温度依存を明らかにした.遮熱コーティングは異方性が強いことが分かった.また,試験雰囲気で焼結し,各ヤング率と各せん断弾性係数が上昇する挙動を明らかにした.弾性係数は,熱応力,残留応力などの強度評価パラメータの算出に必要な物性値であり,遮熱コーティングの設計に不可欠である.本研究では,遮熱コーティングの高温焼結中の全方向の弾性係数を評価可能な共鳴超音波計測システムを構築するとともに,焼結中の全方向の弾性係数の値とその変化挙動を明らかにすること,さらにその弾性変化に基づいたコーティングの設計指針を導出することを目的とした.本年度の研究成果は主に以下の2つに大別できる.1.高温その場共鳴超音波計測システムの構築高周波誘導加熱と加熱体からの輻射熱による間接加熱で,非導電性のジルコニア遮熱コーティングについても1100°Cまで均温加熱可能な高温その場共鳴超音波計測システムを構築した.共鳴と振動モードの検出は,レーザードップラー振動計で行い,加熱体の小型化とレーザー計測経路の冷却により,レーザー熱揺らぎを軽減することができ1100°Cまでの全方向弾性係数計測を可能とした.2.遮熱コーティングの高温焼結中の全方向弾性係数計測ジルコニア遮熱コーティングについて常温から1100°Cまでの全方向弾性係数の温度依存を明らかにした.面内等方性の弾性異方性を仮定し,独立な全て(5つ)の弾性係数を明らかにした.溶射まま皮膜では,約800°Cを超えるとヤング率が上昇し始め,約1000°Cを超えると急にヤング率が上昇することが分かった.このように試験の雰囲気温度で焼結が進むことが分かった.また事前に熱処理を施すことで,常温でも高いヤング率を呈し,溶射まま皮膜でみられた雰囲気温度での焼結挙動は見られなくなることも分かった.弾性係数は,熱応力,残留応力などの強度評価パラメータの算出に必要な物性値であり,遮熱コーティングの設計に不可欠である.昨年度は,遮熱コーティングの1100°Cに及ぶ高温焼結中の全方向の弾性係数を評価可能な共鳴超音波計測システムを構築した.本年度は,焼結中の全方向の弾性係数の値とその変化挙動を明らかにすることを主目的とした.その主な研究成果は以下の2つに大別できる.1.ジルコニア遮熱コーティングの全方向弾性係数の焼結挙動大気プラズマ溶射遮熱コーティングに対し,面内等方性の弾性異方性を仮定し,常温から1100°Cまでの全方向の弾性係数を明らかにした.ヤング率の異方性は強く,面外方向のヤング率は面内方向より低いことが分かった.溶射まま皮膜では,試験中の焼結により,約800°Cを超えるとヤング率が上昇し始め,約1000°Cを超えると急にヤング率が上昇することが分かった.この焼結によるヤング率の上昇率は,面内方向と面外方向でほぼ同じであり,焼結の方向性依存は小さいことが分かった.一方,ポアソン比の異方性は強く,各ポアソン比は温度に依存せずほぼ一定で,焼結による変化は小さいことが分かった.また,せん断弾性係数の異方性は弱く,焼結挙動はヤング率と同様であった.2.耐酸化コーティングの全方向弾性係数の温度依存遮熱コーティングのボンドコートとして用いられる耐酸化コーティングCoNiCrAlYに対し,面内等方性の弾性異方性を仮定し,全方向の高温弾性係数を測定した.組織構造の異方性が強いものと弱いものを準備し,800°C以下の高温にてその温度依存を計測した.各ヤング率と各せん断弾性係数は試験温度の上昇で低下したが,各ポアソン比の変化は小さかった.また,各弾性係数の異方性の温度依存は小さいことが分かった.
癌放射線療法に伴う晩発性正常組織障害の早期指標の開発

1.腎における遺伝子発現法の開発腎晩発障害の比較的早期の指標であるDNA合成促進をさらにそれに先立つ増殖関連遺伝子のmRNAレベルでの発現として捉える方法を検討した。K-ras,c-fosおよびc-mycのmRNAの発現について照射24時間後のマウスで検討した。9Gy照射例ではそれぞれ6、4、1個体が、12Gy照射例では7、4、6個体が、また、15Gy照射例では6、7、9個体が陽性であった。三者の中ではc-mycの陽性頻度が以前に検討した腎重量の低下と最もよく相関した。また、遺伝子の発現した個体がのちに腎晩発障害をきたすことの検討のため、左腎の半分と右腎の全部を照射し、24時間後に左腎を摘出して、増殖関連遺伝子測定用のサンプルとした。そして、照射した右腎のみとなったマウスの腎機能の変化をBUNの測定により長期に観察した。BUNの経時的変化を観察できたマウスは15匹で、うち11匹に腎機能の低下がみられたが、4匹の腎機能は不変であった。腎機能が低下した11匹のうち8匹でc-fosおよびo-myc遺伝子の発現がみられたが、3匹ではc-fosおよびc-myc遺伝子の発現がみられなかった。腎機能の不変であった4匹のいずれでもc-fos遺伝子の発現はみられなかったが、1匹でo-myc遺伝子の発現がみられた。以上よりc-fosおよびc-mrc遺伝子の晩発性放射線腎障害の早期指標としての可能性が示唆された。2.小腸晩発障害の早期指標子宮頸癌患者の放射線治療後に生ずる小腸晩発障害は、治療中に頑固な下痢の生じた例に多くみられたが、下痢と障害の程度とには相関はみられず、他の指標の開発が望まれた。腎におけると同様に、実験動物の腹部を照射し、24時間後に照射された小腸と非照射小腸を取り出し、RNAを抽出してc-myc等の有無を検討したが、これまでに傾向のあるデータは得られなかった。1.腎における遺伝子発現法の開発腎晩発障害の比較的早期の指標であるDNA合成促進をさらにそれに先立つ増殖関連遺伝子であるK-ras,c-fosおよびc-mycのmRNAレベルでの発現として捉える方法を検討した。K-ras, c-fosおよびc-mycのmRNAの発現増加は非照射マウスではそれぞれ3、1、1個体で認められた。照射24時間後マウスでは、9Gy照射例ではそれぞれ6、4、1個体が、12Gy照射例ではそれぞれ7、4、6個体が、また、15Gy照射例ではそれぞれ6、7、9個体が陽性であった。また、遺伝子の発現した個体がのちに腎晩発障害をきたすことの確認のため、左腎の半分と右腎の全部を照射し、24時間後に左腎を摘出して、増殖関連遺伝子測定用のサンプルとした。そして、照射した右腎のみとなったマウスの腎機能の変化をBUNの測定により長期に観察している。現在照射2ヶ月後までのデータが得られているが、まだ腎機能の変化はみられていない。以前に行った片腎照射マウスにおけるBUNの検討では、照射6ヶ月後より異常値がみられており、少なくとも6ヶ月以上の観察を要すると考えている。2.小腸晩発障害の早期指標

子宮頸癌患者の放射線治療後に生ずる小腸の晩発障害の臨床的検討をさらに進めた。治療中に頑固な下痢の生じた例は晩発障害のおこる率が高く、急性障害と晩発障害との関連性が示唆された。しかし、その障害の程度に関しては相関がみられず、他の指標の開発が望まれる。腎における知見の応用をめざし、実験動物の腹部に照射を行い、24時間後に照射された小腸と非照射小腸を取り出し、RNAを抽出してc-mycの発現の有無を検討しているが、これまでのところ傾向のあるデータは得られていない。腎における遺伝子発現法の開発腎晩発障害の比較的早期の指標であるDNA合成促進をさらにそれに先立つ増殖関連遺伝子の発現としてとらえることができるかについて、増殖関連遺伝子の発現個体が後に放射線腎障害を発生するか否かを検討した。BUNの経時的変化を観察できたマウスは15匹で、うち11匹に腎機能の低下がみられたが、4匹の腎機能は不変であった。腎機能の低下がみられた11匹のうち8匹でc-fosおよびc-myc遺伝子の発現がみられたが3匹ではc-fosおよびc-myc遺伝子の発現がみられなかった。腎機能の不変であった4匹のいずれでもc-fos遺伝子の発現がみられなかったが、うち1匹でc-mycc遺伝子の発現がみられた。K-ras遺伝子については相関はみられなかった。以上よりc-fosおよびc-myc遺伝子の晩発性放射線腎障害の早期指標としての可能性が示唆された。
光触媒と電磁波を併用した異物関連感染症の制圧

われわれは骨折治療に用いる鋼線を光触媒処理し,紫外線照射による感染予防効果を確認し,すでに臨床応用している.しかし,生体内人工物には紫外線が到達しないため,侵入できる超音波を用いて光触媒を励起させ,殺菌やバイオフィルムの分解を行う手法を考案し,これを早期の感染症対策に応用することを目的とした.光触媒の励起状態の確認としてメチレンブルー退色試験による評価を行った.市販の超音波洗浄機を用い出力200w,発振周波数36kHzでの超音波照射を行い,光触媒群ではコントロール群に比して経時的に吸光度の減少を認め,超音波による励起により光触媒から活性酸素を生じ,メチレンブルーの退色が得られたと考える.医療の進歩によりインプラントなどの体内人工物・材料の進歩はめざましく,外傷に対する早期の社会復帰や,高齢者の健康寿命の延伸に大きな恩恵をもたらしている.一方,人工物挿入術後は,細菌感染の危険性が高く,治療として長期の抗菌薬の投与や観血手術を要することが多いが,耐性菌の出現など治療に難渋する.そこで励起により有機物の分解効果を持つ光触媒をインプラントに応用することを考えた.われわれは既に骨折治療用の鋼線を光触媒処理し,紫外線照射による感染予防効果を確認し臨床応用している.しかし,生体内部では紫外線による励起は困難であるため,電磁波や超音波を行いて体内に埋入した光触媒を励起させ,殺菌やバイオフィルムの分解を行う手法を確立し,これを人工物に起因する感染症対策に応用することを目的とする.平成26年度は,光触媒処置を行った酸化チタンプレートと純チタンプレートを用いて,各種電磁波,超音波刺激による殺菌効果とバイオフィルムの分解効果を検証し,至適な刺激強度や時間,時間を決定し実験系を確立する.平成27年度は,実験系を小動物モデルに適応し,まず生体内での安全性と生体内での殺菌,抗バイオフィルム効果を検証する.さらに,家兎を用いた骨折モデルを作製し,光触媒酸化チタンを用いて骨折部の内固定を行い,骨成熟過程に対する影響や感染予防効果を検証する.生体での実験系を確立したあと,臨床応用の基盤とするため,大動物モデル(ビーグル犬など)を用いて研究で得られた至適条件下に抗バイオフィルムの効果を検証する.研究の円滑な遂行のため,当院感染症検査室や光触媒処理業者である(有)イールド,および電磁波発生機器,超音波器機メーカーとの協議を密に行う.医療の進歩によりインプラントなどの体内人工物・材料の進歩はめざましく,外傷に対する早期の社会復帰や,高齢者の健康寿命の延伸に大きな恩恵をもたらしている.一方,人工物挿入後は,細菌感染の危険性が高く,治療として長期の抗菌薬の投与や観血手術を要することが多いが,耐性菌の出現など治療に難渋する.そこで励起により有機物の分解効果を持つ光触媒をインプラントに応用することを考えた.われわれは既に骨折治療用の鋼線を光触媒処理し,紫外線照射による感染予防効果を確認し臨床応用している.しかし,生体内部では紫外線による励起は困難であるため,電磁波や超音波を用いて体内に埋入した光触媒を励起させ,殺菌やバイオフィルムの分解を行う手法を確立し,これを人工物に起因する感染症対策に応用することを目的とする.平成27年度は,光触媒処置を行った酸化チタンプレートと純チタンプレートを用いて,各種電磁波,超音波刺激による殺菌効果とバイオフィルムの分解効果を検証し,至適な刺激強度や刺激時間を決定した.実験に使用する各種電磁波,超音波の準備に時間を費やし,その間研究が進行しなかったため.医療の進歩によりインプラントなど人工物・内固定材料を用いた治療は今日不可欠であり,特に整形外科領域では,骨折治療用の内固定材料,関節を置換する人工関節,脊柱体幹を矯正する脊椎固定・後方インストルメンテーションなど発展が著しい.一方で,人工物を挿入後には感染症の発症頻度が増加し,この異物に起因した感染症(implant related infection)は治療に難渋する.このように,異物に起因した難治性感染症治療に,超音波刺激を従来用いられている光触媒効果を付加した内固定材料に応用した技術を導入することを考え本研究の着想に至った.チタン表面を直接酸化することにより作成した,近紫外線による励起能力を持つ光触媒材料を創外固定器を用いた体外からのインプラント刺入に用いた.感染予防効果を従来型の材料と比較,評価し従来のステンレス,チタン製のインプラントより感染症の頻度減少,重症化予防に効果的であったことを確認した.また,陽極,大気酸化を中心に処理,作成し光触媒処置を行った酸化チタンプレートに対して波長・時間を変化させた超音波刺激を加え、酸化チタンプレート表面に散布したメチレンブルーの退色反応で効果を測定し、励起に至適な条件を探索した.超音波による励起がおこることは確認できたが,温度条件に工夫を要すると考えた.また光触媒処理酸化チタンプレートを濃度を変更した菌検体に接触させプレート表面でのバイオフィルム形成の評価を行った。われわれは骨折治療に用いる鋼線を光触媒処理し,紫外線照射による感染予防効果を確認し,すでに臨床応用している.しかし,生体内人工物には紫外線が到達しないため,侵入できる超音波を用いて光触媒を励起させ,殺菌やバイオフィルムの分解を行う手法を考案し,これを早期の感染症対策に応用することを目的とした.光触媒の励起状態の確認としてメチレンブルー退色試験による評価を行った.

市販の超音波洗浄機を用い出力200w,発振周波数36kHzでの超音波照射を行い,光触媒群ではコントロール群に比して経時的に吸光度の減少を認め,超音波による励起により光触媒から活性酸素を生じ,メチレンブルーの退色が得られたと考える.実験に使用する各種電磁波、超音波の準備に時間を費やし,その間研究が進行しなかったため.平成28年度は,家兎を用いた骨折モデルを作製し,光触媒酸化チタンを用いて骨折部の内固定を行い,骨成熟過程に対する影響や感染予防効果を検証する.また臨床応用の基盤とするため,大動物モデル(ビーグル犬など)を用いて研究で得られた至適条件下に抗バイオフィルムの効果を検証する.研究の円滑な遂行のため,当院感染症検査室や光触媒処理業者である(有)イールド,および電磁波発生機器,超音波機器メーカーとの協議を密に行う.小児整形外科領域平成27年度は,実験系を小動物モデルに適応し,まず生体内での安全性と生体内での殺菌,抗バイオフィルム効果を検証する.さらに,家兎を用いた骨折モデルを作製し,光触媒酸化チタンを用いて骨折部の内固定を行い,骨成熟過程に対する影響や感染予防効果を検証する.実験に使用する各種電磁波,超音波の準備に時間を費やし,その間研究が進行しなかったため.実験に使用する各種電磁波、超音波の準備に時間を費やし,その間研究が進行しなかったため.平成28年度は,家兎を用いた骨折モデルを作製し,光触媒酸化チタンを用いて骨折部の内固定を行い,骨成熟過程に対する影響や感染予防効果を検証する.また臨床応用の基盤とするため,大動物モデル(ビーグル犬など)を用いて研究で得られた至適条件下に抗バイオフィルムの効果を検証する.日本白色家兎、ビーグル犬の購入,光触媒酸化チタン内固定材料の作製費用に使用する予定.平成27年度は,実験系を小動物モデルに適応し,まず生体内での安全性と生体内での殺菌,抗バイオフィルム効果を検証する.さらに,家兎を用いた骨折モデルを作製し,光触媒酸化チタンを用いて骨折部の内固定を行い,骨成熟過程に対する影響や感染予防効果を検証する.
自然発症ニホンザル個体を起点にした早老症モデルの確立

ヒトの早老症によく似た症状を示したニホンザルN416(シワコ、PLoS One, 2014)の病因解明のため、主要臓器、脳について元素分析を行った。DNA修復関連酵素や抗酸化酵素に関わっている亜鉛が一部の臓器で正常個体より著しく低い値を示したため、亜鉛代謝異常が早老症的症状の発現の一因かと思われたが、詳細は未解明である。特異な顔貌と四肢拘縮を示すニホンザルMff2389とその妹2頭は、尿検査、エックス線検査などの結果から、難病指定されているムコ多糖症であることが強く疑われた。遺伝子検査の結果、ムコ多糖症I型の原因遺伝子IDUAに生じた一塩基置換が症状の原因である可能性が高いことが分かった。霊長研で生まれたニホンザルN416は、皮膚の萎縮、幼児期における白内障、大脳皮質と海馬の萎縮、末梢神経伝導速度の低下、糖代謝の異常、ヒアルロン酸代謝の異常、線維芽細胞の増殖速度の低下、DNA修復能力の低下といったヒトの早老症によく似た表現型を示したが、ウェルナー症候群やロスムンド・トムソン症候群、ハッチンソン・ギルフォード症候群など広義の早老症を含む12の疾患に関わる22の遺伝子には異常が見られなかった(Oishi et al., PLOS ONE, 2014)。このニホンザル(3歳)の各種臓器について、早老症様の症状を示さなかった0歳から30歳までのニホンザル28頭とともに元素分析を行った。タンパク質含量の指標となるイオウや核酸含量の指標になるリンは他個体と比べて際立った特徴を示さなかったが、亜鉛に関しては一部の臓器で著しく低い値を示した。亜鉛はDNA修復関連酵素や抗酸化酵素などに関わっているため、その代謝の異常が早老症的症状の発現の一因となっている可能性が示唆された。ダウン症に類似した低い鼻、舌の突き出し、四肢の固縮、低成長を示すニホンザルMff2389に関しては、血縁個体、非血縁正常個体とともに骨格のエックス線撮影、骨塩測定、尿や血液の生化学分析、行動解析を行った。四肢の骨格の変形、骨塩量の減少、特定物質の異常排泄が観察された。当初疑ったダウン症ではなく、別の難病であるムコ多糖症の疑いが濃い。ニホンザルN416の微量元素分析に関しては、脳以外の組織に関して、当初の予想通りの結論が得られている。脳に関して、元素分析、組織学的検証を行えなかったため、やや遅れていると判定した。ニホンザルMff2389に関しては、予定している解析をほぼ実施し、一部は予想外の結果を得た。解析の方法を部分的に変更し、28年度の研究を進める。DNA修復能力が低下し、繊維芽細胞の増殖能力が低下しており、幼児期における白内障や大脳皮質・海馬の萎縮、糖代謝異常などの早老症的特徴が見られたニホンザルN416 (Oishi et al., PLOS ONE, 2014)に関し、平成27年度には各種臓器の亜鉛含量を調べた。平成28年度は脳の各部位における亜鉛含量を測定し、新生児から老齢個体までの13個体と比較した。検査対象としたのは、大脳皮質2部位(側頭葉、後頭葉)、海馬、大脳基底核、小脳である。腎臓や心臓とは異なり、脳ではどの部位でも加齢による亜鉛の減少は見られず、N416の亜鉛含量も他の個体とは異ならなかった。亜鉛はDNA複製や細胞分裂、糖尿病、抗酸化作用などとの関係が知られていることから、N416での低含量は早老症様症状の大きな原因であり、それは全身性の現象であると当初予想していたが、それが覆った。霊長類研究所放飼場で発見された特異な容貌と四肢固縮の見られるニホンザルMff2389とその家系の個体に関して、平成27年度に行った尿の生化学分析、エックス線撮影等を継続して実施した。それとともに、当該家系の個体および非血縁の個体の血液からDNAを抽出し、PCR、シークエンス解析を開始した。対象とするムコ多糖症原因遺伝子は、IDUA(I型)、IDS(II型)、SGSH(III型)、NAGLU(III型)、HGSNAT(III型)、GNS(III型)、GALNS(IV型)、GLB1(IV型)である。変異が発症につながる部位はヒトの症例でも一定していないため、エクソン全長にわたる解析に着手した。発症個体でホモ、非発症個体でヘテロないしは存在しない変異に注目しており、特に家系解析から、Mff2389でホモ、母親、父親でヘテロの機能喪失ないしはSNPsの存在を探索している過程である。ニホンザルN416の元素分析に関しては、脳では他の臓器と異なって亜鉛の加齢性減少がなかった。亜鉛含量の組織による差異は異なった亜鉛トランスポーターに起因することが想定できるため、変異の検討を開始した。組織学的検討を行えなかったため、やや遅れていると判定する。ニホンザルMff2389に関しては、予定している解析をほぼ実施し、遺伝解析を積極的に推進している。霊長類研究所で発見された2頭の特徴的なサルに関して早老症を疑い、解析を行った。