hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の筋特性の評価および運動速度可変型筋力トレーニング法の開発

研究Iでは高齢者における筋特性と運動機能および姿勢アライメントとの関連性について検討した。その結果、筋の質の変化は筋力や筋パワーに影響を及ぼすこと、体幹筋の筋萎縮は姿勢アライメントと関連することが示唆された。研究IIでは高齢者を対象に運動速度をゆっくりとするスロートレーニングと運動速度を素早くするパワートレーニングを実施し、どちらのトレーニング法が高齢者の筋特性、運動機能、生活活動量および精神心理機能の改善に有効であるかを検証した。その結果、両トレーニングともに筋力や筋特性の改善には有効であるが、筋力以外の運動機能や生活活動量、精神心理機能に及ぼす効果は不十分であることが示唆された。平成25年度の研究目的は、1)若年者と高齢者の筋硬度や筋厚、筋輝度(筋内脂肪)といった筋特性を評価し、加齢による筋特性の変化を明らかにすること、2)加齢による筋特性の変化が高齢者の姿勢アライメントに及ぼす影響について明らかにすることとした。研究1)対象は健常若年女性16名および健常高齢女性34名とした。超音波診断装置を用いて大腿四頭筋の筋厚および筋輝度を測定した。なお、筋輝度は筋内の脂肪や結合組織などの非収縮組織の割合を反映するとされており、筋輝度の上昇は筋内脂肪などが増加していることを意味する。また、筋硬度計を用いて大腿四頭筋の安静時および最大収縮時の筋硬度を測定した。若年者と高齢者の筋硬度を比較すると、安静時筋硬度では2群間で有意差がみられなかったが、収縮時筋硬度および収縮時の変化率は高齢者で有意に低い値を示した。筋厚は若年者と比較して高齢者では有意に低値を示した。筋輝度は若年者と比較して高齢者では有意に高値を示した。本研究の結果、加齢に伴い筋厚、筋内脂肪、筋硬度といった筋特性の変化が生じることが示唆された。研究2)対象は健常高齢女性20名とした。Spinal Mouseを用いて安静立位姿勢での胸椎後彎角度、腰椎前彎角度および骨盤前傾角度を測定した。超音波診断装置を使用して、腹直筋、内・外腹斜筋、脊柱起立筋、多裂筋の筋厚および筋輝度を測定した。結果、胸椎後彎角度は腹直筋の筋厚とのみ有意な負の相関が認められた。腰椎前彎角度は多裂筋の筋厚、骨盤前傾角度は脊柱起立筋および多裂筋の筋厚とのみ有意な正の相関が認められた。本研究の結果、高齢者の姿勢アライメントに対する運動療法として、これら体幹筋の筋萎縮を予防することが重要であることが示唆された。平成26年度の研究目的は1)高齢者における骨格筋の質の変化が運動機能や動作能力に及ぼす影響について明らかにすること、2)高齢者を対象に運動速度をゆっくりとするスロートレーニングと運動速度を素早くするパワートレーニングを実施し、どちらのトレーニング法が高齢者の運動機能や歩行能力の改善に有効であるかを検証することとした。研究1)対象は健常高齢女性34名とした。大腿四頭筋を対象筋として、超音波診断装置を用いて筋輝度(筋内非収縮組織の割合)、筋硬度計を用いて筋硬度を測定した。運動機能として等尺性膝伸展筋力、動作能力として5回立ち座りテストを評価した。相関分析の結果、筋力は筋輝度と有意な相関を認め、筋内非収縮組織の割合が増加するほど、筋力は低下することが示された。また立ち座りテストは筋収縮時筋硬度および筋輝度と有意な相関を認め、収縮時筋硬度が減少・筋内非収縮組織の割合が増加するほど、立ち座り能力は低下することが示された。本研究の結果、高齢者における大腿四頭筋の質の変化は筋力や立ち座り能力に影響を及ぼすことが示唆された。研究2)対象は健常高齢者32名とした。スロートレーニングを実施するスロー群、パワートレーニングを実施するパワー群に分類し、両群とも週1回8週間の下肢筋力トレーニングを実施した。運動機能として膝伸展筋力、歩行能力として最大努力歩行時の速度、ケーデンス、ストライド長、立脚期時間の左右非対称性、歩行周期変動性を評価した。介入後、膝伸展筋力は両群ともに有意な増加がみられ、両群の筋力増加率に有意差はみられなかった。歩行能力はスロー群の立脚期左右非対称性と歩行周期変動性のみ有意に減少した。本研究の結果、スロートレーニングとパワートレーニングはともに筋力の改善に有効であり、加えてスロートレーニングは歩行特性の改善にも有効であることが示唆された。本研究は運動速度をゆっくりとするスロートレーニングと運動速度を素早くするパワートレーニングのどちらの筋力トレーニング法が高齢者の運動機能や生活活動量、精神心理機能の改善に効果的であるかを多面的に検討した。対象は地域在住高齢者51名(年齢77.9±5.6歳)とし、スロートレーニングを実施するスロー群、パワートレーニングを実施するパワー群、トレーニングを実施しない対照群の3群に分類した。スロー群およびパワー群には週1回8週間の筋力トレーニングを実施した。スロートレーニングでは求心性・遠心性フェーズともに5秒かけて運動を行った。パワートレーニングでは求心性フェーズはできるだけ速く動かし、遠心性フェーズでは2秒かけて運動を行った。運動機能として筋力、バランス、柔軟性、敏捷性を評価した。また、Life Space-Assessment(LSA)により生活空間を評価した。歩行量として3軸加速度センサーを用いて1日あたりの平均歩数と歩行時間を求めた。

精神心理機能として、Geriatric Depression Scale-15(GDS-15)により抑うつ状態、転倒に対する自己効力感スケール(Fall Efficacy Scale;FES)により転倒恐怖感の程度を評価した。8週間の介入後、膝伸展筋力は対照群では変化がみられなかったが、スロー群とパワー群では介入後に有意な増加がみられ、両群の筋力増加率に有意差はみられなかった。膝伸展筋力以外の運動機能はいずれの群も変化がみられなかった。生活空間や歩行量、抑うつ状態や転倒恐怖感は3群いずれも変化がみられなかった。これらのことから、スロートレーニングとパワートレーニングはともに筋力の改善に有効であるが、筋力以外の運動機能や生活空間、歩行量、精神心理機能に及ぼす効果は不十分であることが示唆された。研究Iでは高齢者における筋特性と運動機能および姿勢アライメントとの関連性について検討した。その結果、筋の質の変化は筋力や筋パワーに影響を及ぼすこと、体幹筋の筋萎縮は姿勢アライメントと関連することが示唆された。研究IIでは高齢者を対象に運動速度をゆっくりとするスロートレーニングと運動速度を素早くするパワートレーニングを実施し、どちらのトレーニング法が高齢者の筋特性、運動機能、生活活動量および精神心理機能の改善に有効であるかを検証した。その結果、両トレーニングともに筋力や筋特性の改善には有効であるが、筋力以外の運動機能や生活活動量、精神心理機能に及ぼす効果は不十分であることが示唆された。平成26年度は高齢者の筋の質の変化と運動機能・動作能力との関連について明らかにすること、運動速度を変化させた筋力トレーニングが高齢者の運動機能や歩行能力へ及ぼす効果について明らかにすることを目的として研究を実施した。本研究の結果、筋内非収縮組織の増加や収縮時筋硬度減少といった筋の質の変化は高齢者の筋力や立ち座り能力に影響を及ぼすこと、運動速度を変化させた筋力トレーニング(スロートレーニングとパワートレーニング)はいずれも筋力の改善に有効であることが示唆された。しかしながら、運動速度を変化させた筋力トレーニングが筋力以外の運動機能や生活活動量等に及ぼす影響については、さらなる検証が必要である。理学療法学平成27年度は運動速度を変化させた筋力トレーニングを実施する群と、トレーニング介入を行わないコントロール群を設定し、高齢者の筋力・バランス能力・柔軟性・敏捷性といった運動機能や、生活空間・1日の歩数や歩行時間といった生活活動量等へ及ぼす効果について多面的に検証する。平成25年度は筋特性(筋硬度、筋厚、筋内脂肪)の加齢変化を明らかにすること、高齢者の筋特性と立位姿勢アライメントとの関連について明らかにすることを目的として研究を実施した。本研究の結果、加齢に伴い筋厚減少や筋内脂肪の増加といった筋特性の変化が生じ、これら筋特性の変化は高齢者の姿勢アライメントに影響を及ぼすことが示唆された。しかしながら、高齢者の筋特性や姿勢・動作を改善するためには、どのような運動トレーニングが有効であるかについては検証が必要である。平成26年度の研究においては、運動速度を変化させた筋力トレーニングが高齢者の筋力や歩行能力へ及ぼす効果について検証した。
非典型小児白血病を対象とした体細胞変異と生殖細胞系列変異の統合解析

本研究は、小児白血病の中で臨床的な「outlier」に焦点を絞り、体細胞変異と生殖細胞系列変異の両者の観点から「outlier」たる分子遺伝学的基盤を明らかにすることが目的である。急性前骨髄性白血病の中で、典型的なRARA転座が検出されない症例を集積して集中的なゲノム解析を行った結果、新規のTBL1XR1-RARB転座を特定した。この転座はレチノイン酸経路をdominant negativeに抑制することで白血病の発症に貢献するだけでなく、典型的な急性前骨髄性白血病に著効する合成レチノイドが無効であることも確認された。急性前骨髄性白血病の一部を占める新たな疾患群につながる知見である(Osumi T et al. Cancer Res 2018)。また、急性リンパ性白血病の中で極端に6-mercaptopurine(6MP)への感受性が高い患者の原因となるNUDT15多型について、複数の多型を持つ場合に正確なアレル構成を把握するdiplotype法を開発し、より精密に6MPの感受性を予測することを可能にした。また、NUDT15多型のある患者でもメソトレキセートへの感受性は低下していないことを示した(Tsujimoto S et al. Leukemia 2018)。このように、「outlier」の解析を通じて新たな知見が得られ、結果的には「outlier」でない一般の小児白血病の全体の病態の理解につながる成果が達成できている。計画通りの解析で、病態の理解につながる新たな発見が得られている。ここまでの成功を踏まえ、現在の戦略での解析を進める。さらに、多数例での解析を行うとともに、小児白血病の根幹である生殖細胞系列の遺伝学的病態の理解についてはさらに中心的に勧める。本研究は、小児白血病の中で現在の標準治療をもってしても再発する症例や、標準的な用量の治療でも重篤な合併症をきたす「outlier」に焦点を絞り、白血病細胞に生じた体細胞変異についてのゲノム解析と、生殖細胞系列のゲノム解析とを統合することで、「outlier」たる分子病態の基盤を明らかにすることが目的である。急性前骨髄性白血病の中で、典型的なRARA転座が検出できない症例に着目してゲノム解析を行い、対象とした5例中4例がRARB転座を持つことを明らかにした。新たに特定したRARB転座は、RARA転座と同様にレチノイン酸経路を抑制し、細胞の分化を停止させ増殖活性をもたらすことで悪性形質の獲得に寄与していることが確認できた。一般的な急性前骨髄性白血病は、長期生存率が80-90%に至っているが、対象とした5例の無イベント生存率は20%と低く、新たな治療戦略の構築が必要なサブグループを特定する成果と考えられる(論文投稿中)。また、急性リンパ性白血病の治療に用いるメルカプトプリンの感受性に影響を及ぼすNUDT15多型の正確なアレルごとのタイピング方法を確立し、有害事象の予測を可能にする成果につなげた(論文投稿中)。このように、小児の血液・腫瘍疾患のゲノム解析を包括的に行うことで、非典型な「outlier」の分子病態の理解を深める成果を得ることができた。計画通りに非典型的な小児血液疾患の症例を集積しゲノム解析及び機能解析を遂行でき、病態の解明につながる新規の発見につなげることができている。これまでの成果を活かし、さらに他の非典型的な経過をとる小児血液・腫瘍疾患を集積してゲノム解析を行う。また、昨年度までの成果として得られた新規の転座について、治療標的となりうるような分子の探索を行い、治療への応用についてさらなる発展を狙う。
歯周組織細胞のインターロイキン-6産生能

根尖病巣や歯周疾患による歯槽骨の吸収には種々の細菌やその代謝産物、また宿主の炎症や免疫応答が深く関与している。また、歯槽骨は他の骨組織とは異なり歯肉や歯根膜と接していることから、歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞の産生する因子の影響を受けていると考えられる。一方、plasminはlatent collagenase及びprekallikreinを活性化するといわれているおり、細胞外matrixの炎症と破壊に深く関与しているものと考えられる。また、IL-6は骨破壊を伴う慢性関節リウマチ等の研究より骨吸収因子として注目されるようになったcytokineで、破骨細胞の形成を促進すると言われている。本研究では、歯周疾患関連細菌のlipo-polysaccharide(LPS)をヒト歯肉線維芽細胞(Gin)及びヒト歯根膜細胞(PDL)に作用させ、plasminogen activator(PA)-plasmin系、IL-6のrelease及び遺伝子発現を検索した。GinにC.r.LPSを作用させるとGinの培養液中のplasmin活性は作用させたLPSの作用時間、作用濃度に応じて上昇した。また、C.r.LPSによりGinのPA活性も上昇した。C.r.LPSによって上昇したGin由来のplasminはヒト血清中のprekallikreinを活性化した。GinにC.r.LPSを作用させてIL-6のreleaseを測定したところ、GinのIL-6releaseは作用させたC.r.LPSの作用時間、作用濃度に応じて上昇した。そして、これはGinのIL-6遺伝子発現の上昇によるものであった。PDLについてもP.e.LPSを作用させてIL-6releaseを測定したところ、PDLのIL-6releaseも作用させたP.e.LPSの作用時間及び作用濃度に応じて上昇した。そして、PDLのIL-6releaseの上昇は、IL-6遺伝子発現の上昇によるものであった。以上の結果より、C.r.及びP.eのLPSはGin及びPDL PA-plasmin系、IL-6release及び遺伝子発現を上昇させることにより、歯周組織の破壊に関与していることが示唆された。根尖病巣による歯槽骨吸収には種々の細菌やその代謝産物、また宿主の炎症や免疫応答が深く関与していることが明らかとなってきた。本研究ではグラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)をPorphylomonas endodntalis(P.e.),P.gingivalis(P.g.),Prevotella loesheii(P.l.),Wolinella recta(W.r.)より抽出し、ヒト歯肉線維芽細胞(Ginl)、ヒト骨芽様細胞(Saosー2)に作用させ、その培養上清中のInterleukinー6(ILー6)量を測定した。更に細胞外マトリックス分解に関与しているといわれているPlasmin活性も検索した。<方法>(1)P.e.,P.g.,P.l.,W.r.を大量培養し、hot phenol法にてLPSを抽出した。(2)各細胞を24well plateにまき、confluenceになったら培養液を交換後LPSを作用させ、経時的に培養上清中のILー6量をELISA法で、Plasmin活性を合成基質を用いて測定した。<結果>(1)Ginー1は何も作用させなくとも少量のILー6を産生しており、LPSを作用させるとILー6は約2.5倍に上昇した。

Saosー2は何も作用させなくても少量のILー6を産生しており、LPSを作用させても有意なILー6の上昇は認められなかった。しかし、ILー1βを作用させた時は約2倍に、TGFーβでは約3倍に上昇した。(2)Ginー1のPlasmin活性は、LPSを作用させることにより有意に上昇した。Saosー2はLPSを作用させないコントロ-ルの細胞においてもconfluence直後より,Plasmin活性の上昇が見られた。LPSを作用させたものはコントロ-ルに比べPlasmin活性は高かったが、有意差は認められなかった。<考察>ILー6は破骨細胞に作用することによる骨吸収に、またPlasminは細胞外マトリックスの分解に関与するといわれている。感染根管より分離される菌から抽出したLPSの刺激により歯肉線維芽榜胞のILー6産生とPlasmin活性が上昇することから、これらの菌が根尖病巣の骨吸収に関与していることが示唆された。<結果及び考察>Gin cellsのIL-6 releaseは作用させたC.r.LPSの作用時間、作用濃度に応じて上昇し、これはGin cellsのIL-6遺伝子発現は上昇によるものであった。PDL cellsのIL-6 releasseは作用させたP.e.LPSの作用時間及び作用濃度に応じて上昇し、これはPDL cellsのIL-6遺伝子発現の上昇によるものであった。以上の結果より、C.r.及びP.e.のLPSはGin及びPDL cellsのIL-6 release及び遺伝子発現を上昇させることにより、歯周組織の破壊に関与していることが示唆された。
in plantaで発現するFusarinm oxysporum遺伝子

1)キュウリ導管液中で特異的に発現するキュウリつる割病菌の遺伝子について、mRNAおよびタンパク質レベルで調査した。キュウリつる割病菌のmRNAを用いてサブレッションサプトラクティブハイブリダイゼーションを行い、キュウリ導管液中で特異的に発現する29個のcDNAクローンを得た。これらのcDNAの塩基配列を決定し、データベースの既知配列との相同性を検索するとともに、宿主体内での発現をRT-PCRによって調べた。この結果、NIPSNAPと高い相同性をもつcDNA(#151)および陽イオントランスポーターと高い相同性をもつcDNA(#83)は、キュウリ体内でも発現していることが確認された。一方、タンパク質レベルでは、導管液中に分泌蓄積されるキュウリつる割病菌タンパク質を二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2DSDS-PAGE)で分離した。導管液中で特異的に蓄積するタンパク質スポット22個について、MALDI-TOF MSを用いたペプチドマスフィンガープリンティング解析を行った。得られた結果をもとにタンパク質のデータバンクを検索したが、相同な既知タンパク質は見い出されなかった。2)宿主体内での発現することがすでにわかっているトマト萎ちょう病菌のトマチナーゼ遺伝子を標的にした遺伝子破壊を試み、本遺伝子、の病原性への関与を調べた。得られた形質転換体(18株)においては、α-トマチン感受性が増大し、トマチナーゼ活性が低下していた。形質転換体によるトマトへの接種実験の結果、病原性が有意に低下していた。このことから、トマト萎ちょう病菌においては、トマチナーゼ遺伝子が病原性に関与することが示唆された。形質転換体を用いたノーザン解析の結果、トマチナーゼ遺伝子のアンチセンスRNAが発現していることが明らかになった。このことから、形質転換体におけるトマチナーゼ活性の抑制には、転写後ジーンサイレンシングが関係していることが示唆された。宿主体内で発現するFusarium oxysporum遺伝子のcDNAをクローン化するための実験を行った。F.oxysporumを接種したダイコン幼苗からpoly(A)^+RNAを回収し,cDNAを合成した。これを鋳型にして,ふたつの異なる方法(RNAディファレンシャルディスプレイおよびサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション)によって,接種した宿主で特異的に発現しているmRNA(cDNA)をクローン化した。得られたcDNAクローンがF.oxysporumの遺伝子由来であることをDNAドットブロット解析で確認した。これまでに,F.oxysporum由来のcDNAが5個得られた。F.oxysporumの相同組み換えによる遺伝子破壊法についてもモデル実験を開始した。モデル遺伝子としてF.oxysporumのniaD遺伝子を選び,プラスミドにクローン化した。この遺伝子のSalI部位に,hph(ハイグロマイシン耐性遺伝子)を挿入した。このベクターを用いてF.oxysporumの形質転換を行った結果,10^5受容細胞あたり1個の形質転換体が得られた。宿主体内(導管液中)で特異的に発現するF.oxysporum遺伝子のcDNAをクローン化する目的で,F.oxysporum f.sp.cucumerinumをキュウリ導管液で培養し菌体からmRNAを精製した。同様に,PD液体培地でも培養し菌体mRNAを精製した。これら2種類のmRNA集団を用いてサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションを行い,導管液中の菌に特異的なcDNAクローン候補を約600個を得た。

任意に選んだ90個のcDNAのRNAドットブロット解析により,導管液中の菌に特異的と判定されたcDNA(20個)の塩基配列を決定した。このうちの2個(#52および#83)は,Ac-type transposonおよびcation efflux system proteinとそれぞれ極めて高い相同性を示した。標的遺伝子として宿主体内特異的に発現する酵素トマチナーゼをコードする遺伝子(FoTom)を選び,遺伝子破壊を試みた。まず,F.oxysporumf.sp.lycopersiciのDNAからクローン化したトマチナーゼ遺伝子にhphカセットを挿入して遺伝子破壊用ベクター(pFoTom::hyg)を構築した。これを用いてF.oxysporum f.sp.lycopersiciのプロトプラストを形質転換し,形質転換体18株を得た。得られた形質転換菌の1株(#10株)は,in vitroでのトマチナーゼ誘導が抑制され,接種試験の結果トマトに対する病原性が低下していた。これらのことから,病原性因子としてのトマチナーゼの役割が強く示唆された。#10株のDNAを調べると,pFoTom::hyが異所的に挿入されていた。RNA解析の結果,FoTomの一部がアンチセンスRNAとして転写されていることがわかった。#10株ではFoTomの転写後抑制型ジーンサイレンシングが起こっていることが示唆された。平成12年度までに得られたキュウリつる割病菌のcDNAクローンを用いて、キュウリ導管液での遺伝子発現を調べた。遺伝子発現が確認されたcDNAの塩基配列を決定し、遺伝子データバンクの相同配列を検索した結果、18個のcDNAが、既知タンパク質と高い相同性を有することがわかった。これらのcDNAの宿主体内での発現をRT-PCRによって調べた結果、NIPSNAPタンパクと高い相同性をもつcDNA(#151)および青枯病菌膜タンパクと高い相同性をもつcDNA(#83)はキュウリ体内でも発現してた。これらの遺伝子の破壊を試みたが、遺伝子が破壊された形質転換体を得ることはできなかった。2導管液中に分泌されるキュウリつる割病菌タンパク質の解析むキュウリつる割病菌をキュウリ導管液で培養し、分泌タンパク質の経時変化を二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D SDS-PAGE)で解析した。導管液中で特異的に誘導分泌されるタンパク質スポット39個について、MALDI-TOF MSを用いたペプチドマスフィンガープリンティング、およびアミノ酸シケンサーによるN末端アミノ酸配列解析を行った。得られた結果をもとにタンパク質データバンクの検索を行ったが、相同な既知タンパク質は見い出されなかった。平成12年度に作製したF. oxysporum f. sp.lycopersiciのトマチナーゼ発現抑制株を用いて、トマトヘの接種実験をくり返し行い、本菌株の病原性が有意に低下していることを確認した。
赤血球中葉酸類の超高感度定量法の開発とその臨床応用

研究期間を通してヒト全血中4種の葉酸類(葉酸、テトラヒドロ葉酸、5-メチルテトラヒドロ葉酸および5-ホルミルテトラヒドロ葉酸)の定量が可能な液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を開発することができた。本法は全血中葉酸の定量に必要なバリデーションを備えていた。さらに本法を479検体の健常人血液に適用し、その実用性を示すことができた。本申請は、葉酸(FA)の長期摂取状況を反映するといわれている赤血球中のFA類の、タンデム質量分析計を備えた液体クロマトグラフィー(LC-MS/MS)システムを用いる高感度な定量法を確立することを目的としている。前年度確立したLC-MS/MS及び血液試料の前処理に用いる固相抽出条件により、FA、5-メチルテトラヒドロ葉酸(5-MTHF)に加え、テトラヒドロ葉酸(THF)及び5-フォルミルテトラヒドロ葉酸(5-FTHF)を測定対象とし、葉酸類代謝拮抗薬で構造類似体であるmethotrexate (MTX)を内標準物質として使用することで血液中での測定が可能となった。保持時間は9.4分(5-FTHF)、4.4分(5-MTHF)、9.4分(IS)、3.7分(THF)及び9.6分(FA)であった。標準添加血液を用いて算出した検出下限(シグナルーノイズ比=3)は0.160.44 nMと高感度であり、血液中葉酸類の定量が期待できた。現在、健常人血液試料400検体の測定に取り組み、本法の実用性を検証しているところである。一方、申請者らが開発したHPLC測定法(Wada M. et al., Biomed. Chromatogr., 27, 708-713, 2013)を用いて、同一被験者の血漿中ホモシステイン関連化合物濃度の測定を完了しており、その関連性を評価する予定である。本研究計画の最終年度は、共同研究者から提供を受けた健常人血液試料(n=479)中の葉酸類(葉酸、FA;テトラヒドロ葉酸、THF;5ーメチルテトラヒドロ葉酸、5-MTHF;5ーホルミルテトラヒドロ葉酸、5-FTHF)の定量を行った。その結果(中央値、括弧内は第1四分位点、Q1および第3四分位点、Q3)は、5-MTHFで477検体から186.0 nM (Q1=121.27 nM, Q3=246.06 nM)、5-FTHFで455検体から3.61 nM (Q1=2.15 nM, Q3=6.21 nM),FAで399検体から13.82 nM (Q1=3.48 nM, Q3=7.31 nM)およびTHFで353検体から13.82 nM (Q1=7.88, Q3=45.27 nM)であった。本結果は全血中総葉酸の内、5-MTHFがその主要な成分を占めており(割合79%)、これは既報(85.9%)と一致していた。研究機関を通してヒト全血中4種の葉酸類の定量が可能なLC-MS/MS法を開発することができた。本法は全血中葉酸類の定量に十分な感度(LOD at S/N=3:0.13-1.10 nM)を有しており、正確さおよび日内・日間測定精度などのバリデーションも良好であった。本法は簡便かつ迅速であり、日常分析における総葉酸類の定量に有用であるのみならず、5-MTHFおよびTHFの定量が可能であったことから、葉酸代謝酵素の1つであるMTHFR変異のスクリーニングにも適用可能であると考えている。LC-MS/MSシステムとしてWaters Quattro micro API及びWaters 2695 LCシステムを用いている。葉酸類の分離には、カラムにLuna 3u C18 (100x4.6 mm, i.d.)、溶離液として1%酢酸溶液及びアセトニトリルの混液を用い、これらによるグラジエント溶出を行った。MS条件としてイオン化モードはエレクトロスプレーイオン化ポジティブを用い、これをmultiple reaction monitoringモードで検出した。これによりFA、5-メチルテトラヒドロ葉酸(5-MTHF)及び内標準物質のメトトレキセートをそれぞれ9.5分、3.8分及び9.2分に分離定量可能であった。標準品を用いた場合の検出下限は250 nM及び1 nMと5-MTHFに関しては充分であるが、FAについてはさらなる高感度化が必要であった。これを全血試料に以下の前処理を施して測定したところ、5-MTHFの定量が可能であった。EDTAチューブにて採血した血液に1 w/v%アスコルビン酸(ASA)

溶液を添加し10倍に希釈した。次に、1 M NaOHで暗所4時間静置しモノグルタメートとしたのち、Waters社製Sep-Pak固相抽出カートリッジを用いて洗浄後、1 w/v% ASA含有MeOHを用いて溶出し、これをLC-MS/MS分析に供した。昨年度の遅れを取り戻し、現在、健常人血液試料400検体の測定に取り組んでいる。また同一被験者の血漿中ホモシステイン関連化合物濃度の測定を完了しており、現在までの達成度は概ね順調に進展していると判断できる。現在、葉酸測定に使用しているLC-MS/MSの検出感度が当初想定していたものより低いため、試料の前処理、測定条件の最適化などに多くの時間を費やす必要があった。現在も検討を継続中である。研究計画の通り、400人の健常人血液中の葉酸類定量を完了し、同一検体の血漿中ホモシステイン関連物質濃度との相関性を検討する。この他、ホモシステイン代謝に関連する酵素の遺伝子多型や生活因子との関連性についても併せて検討する予定である。次年度では、進行に遅れがある赤血球中の葉酸類のLC-MS/MS法の確立を急ぐことを第一の取り組み課題とする。血液試料の収集及びその動脈硬化因子ホモシステイン分析を実施する予定である。また申請書類「研究が当初計画通りに進まないときの対応」にも示したように広島大学升島努教授との共同研究を進行させる。今年度の研究費については、葉酸測定用試薬、赤血球前処理カラム、HPLC用カラム、実験動物及びガラス器具などの消耗品の購入及び研究打ち合わせに必要な旅費への使用を計画している。
フィトクロムによるシグナル伝達機構の解明

本年度において我々は、花芽形成制御においてphyBとは拮抗的に働くcry2について、それがどのような組織で機能するのかを明らかにすべく、組織特異的プロモーターを用いて、cry2-GFPを組織特異的に発現する遺伝子導入シロイヌナズナ系統を作出し、その花芽形成を調べた。その結果、phyBの場合とは対照的に、cry2は下流で働くFT遺伝子の発現場所である維管束で花芽形成を制御していることが明らかになった。この結果によって、花芽形成の光制御において、葉の内部で光受容体が働く場が空間的に隔てられており、組織の間に複雑なシグナル伝達が存在することが示唆された。昨年に引き続き、phyBのN末端領域において、その生理活性を低下させる新規のアミノ酸置換変異の解析を進めた。特に、分光光学的な活性に影響を与えずに生理活性を低下させる、いわゆるシグナル伝達変異(4つ)に注目し、それらを個別に導入した全長phyBの生理活性を遺伝子導入法を用いて調べた結果、確かに、該当するアミノ酸残基がシグナル伝達に関わることがさらに示唆された。また、phyAのシグナル伝達機構をさぐるため、phyA-GFP融合タンパク質に核移行シグナル(NLS)または核排出シグナル(NES)を付けたものをシロイヌナズナのphyA変異体背景で発現させ、その細胞内分布と光応答能を検討した。その結果、連続遠赤色光に対する応答(いわゆるFR-HIR応答)においては、NLSを付けたものは正常に応答したのに対して、NESを付けたものでは活性が著しく弱まっていた。従って、FR-HIR応答においても、核内がシグナル伝達の重要な場であることが示唆された。本研究で我々は、器官/組織特異的にphyBを発現する様々な形質転換植物を作出し、その光応答を花芽形成の制御を中心に比較した。その結果、子葉の葉肉細胞phyBが維管束におけるFT遺伝子発現を抑制することで花芽形成が遅延することが明らかとなった。さらに、phyBとは拮抗的に働くcry2についても同様の解析を進めるべく、cry2-GFPを組織特異的に発現する遺伝子導入シロイヌナズナ系統を作出した。また、フィトクロムの細胞内シグナル伝達機構の解明に向けて、phyBのN-末端領域内のアミノ酸置換変異を多数同定しその性質を詳しく調べた。まず、phyBのN末端領域を発現するシロイヌナズナを変異原処理し、phyB応答である赤色光による胚軸伸長阻害が弱まった変異体を多数単離した。さらに、これらのうちからphyB遺伝子内に変異体生じたものを選別し当該遺伝子の塩基配列を決定した。この結果、phyBのN末端領域において、その生理活性を低下させる新規のアミノ酸置換変異を14見いだした。これらの変異型phyB断片について、発色団の結合、差スペクトル、暗反転速度などを調べ、分光光学的性質に直接関わる変異の多くが、直接の発色団結合サイトであるGAFドメインやPfrの安定性に関わるPHYドメイン内に存在することを見いだした。さらに、分光光学的な活性に影響を与えずに生理活性を低下させる、いわゆるシグナル伝達変異が発色団結合部位の近傍に一箇所とN-末端側のPASドメインに複数存在することが分かった。これにより、フィトクロム分子のN-末端側領域は、発色団に隣接してその性質と深く関わる領域と、下流の因子にシグナルを伝達する領域に分けられることが示唆された。本年度は、花芽形成の制御においてphyBと拮抗的に働くcry2について、cry2-GFPを組織特異的に発現する植物を用いた解析をさらに進めた。発現させた組織は、表皮、維管束、葉肉、茎頂であり、さらに対照として根で発現する系統も用いた。これらについて、cry2による花芽形成促進作用を調べたところ、維管束で発現させた場合のみ有効であった。

一方、cry2-GFPの場合も、phyBの場合と同様、維管束におけるFT遺伝子の発現を制御することで花芽形成が制御されることが確認された。これらの結果は、葉肉細胞のphyBにより花芽形成が抑制されるという結果と対照的であり、非常に興味深い。フィトクロムの細胞内シグナル伝達機病の無明に向けて、phyAにGFPを融合させた分子に核移行シグナルや核排出シグナルを付加したものを発現させ、その細胞内分布と生理機能を調べた。まず、連続遠赤色光による胚軸伸長阻害応答について詳しく調べたところ、核に局在させたphyA-GFPは有効であったが、核から排出させたphyA-GFPでは応答が見られなかった。さらに、他の応答でも同様の解析を行い、連続遠赤色光に対する応答では、phyBの場合と同様に、シグナル伝達は核内で起こることが示唆された。フィトクロムの主要分子種にはphyAとphyBがあり、その生理応答の様式は大きく異なる。この違いがどのような構造的基盤に基づくのか探るため、フィトクロム分子を4つのドメインにわけ、それぞれについてphyAまたはphyBの配列を持つようなキメラ遺伝子(合計16種類)を構築し、シロイヌナズナのphyAphyB二重変異体で発現させた。まだ全ての遺伝子について形質転換を終わっていないが、先に得られたものについて予備的な実験を行い、構築した遺伝子がフィトクロムとしての活性をもつかどうかを調べた。
極めて大きなストークスシフトを有するスペクトル変換用・耐熱発光ポリマーの実証研究

計画次年度として,以下に示す検討を行った。1.高発光性ポリイミド(HLPI)の完全無色透明化を目指して,新規の含フッ素ジアミンの精製とそれを用いた高発光性ポリイミド(HLPI)の合成・評価を試みたが,水素添加により合成した脂環式ジアミンの精製が極めて難しいため,無色透明化の方策として青色発光性PIと臭素を含む燈色燐光発光性PIの共重合を試みたところ,量子収率の向上ともに発光色を青水色白色黄色と自在に変化させることに成功した.また,青色発光性PIの分子鎖末端に臭素を含む燈色燐光発光性イミド基を結合させることでも,透明性が高くかつStokes Shiftの大きな新規のHLPIの合成と評価に成功した。2.HLPIのStokes Shiftを拡大する「第3の方策」として,PI分子鎖へのドナー・アクセプター相互作用の導入を検討した。強いドナー基としてピペリジル基とピロリジル基を選択し,フタル酸無水物に導入してそのモデル化合物の発光特性から最適な置換基を選択したのち,青色発光性PIの分子鎖末端に同様の構造を結合させることで,透明性が高くかつStokes Shiftの大きな新規のHLPIの合成と評価に成功した。3.擬似的な太陽光として白色のXe光源を用い「太陽光波長変換スペクトル」を簡易に計測できるシステムを構築した。第二世代HLPIに対して,UV-A光をほぼ吸収し緑色光または青色+赤色光を15%以上増強させる効果を確認した。研究実績の概要(上記)に示したとおり,計画次年度であるH30年度は,所期の目標をほぼ計画通りに達成したと考えている。最終年度は2年間の検討で得られた各種HLPI膜の光学特性の知見を基盤とし,実用的な波長変換膜として使用できる大面積HLPI膜の合成・製膜・評価技術を確立するとともに,ペロブスカイト型太陽電池に装着して,発光波長と変換効率の制御性,耐熱性・耐光性を計測し,太陽光波長変換膜としての実証化検討を進める.特にHLPIに対してUV-A光をほぼすべて吸収し,そのエネルギーを緑黄燈色光に20%以上の効率で増強させる効果を確認する.また,波長変換された発光の外部取出し効率の向上を目指して,HLPIのナノファイバ化を試みる。ファイバ径を発光波長程度に制御することで,薄膜導波路の閉込め構造が抑止され,高い波長変換効率と高い外部取り出し効率を両立させた理想的な波長変換膜を形成できる可能性がある。計画初年度として,以下に示す検討を行った。1蛍光量子収率(Φ)のさらなる向上のために,発光性PIの励起状態における光物理過程を解明し,それらを精密に制御することが必要とある。そこで,各世代の高発光性ポリイミド(HLPI)のモデル化合物(溶液)と薄膜の発光寿命を,本科学研究費で購入した蛍光寿命測定装置により室温極低温また大気中/真空下で測定し,発光過程と無輻射遷移の速度定数から光物理過程を解析して,無輻射遷移を引き起こす機構を特定した。2次いで,HLPIの無色透明化を目指し,新規のジアミン構造の導入を試みた。モデル化合物(溶液)は無色透明だが,対応する構造のPIは凝集体由来の黄色を呈し,青色光を吸収する。ジアミンDC6Fは2つの-CF3基による立体効果が有効と期待されることから,凝集の阻害効果とともに耐熱性と機械特性の向上が期待されるが,合成における水素化反応の収率が十分でなく,また精製が困難であったため,ジアミン構造の改良によるHLPIの無色透明化の検討は引き続きH30年度に継続する.3臭素(Br)やヨウ素(I)を置換したカルボニル化合物において大きなStokes Shiftを示す「室温燐光」が観測されている。そこで,Brを置換した新規イミド化合物とポリイミドを合成し,Stokes Shiftの大きな燈色発光を観測した. Stokes Shiftの小さな蛍光も同時に観測され,これは励起三重項を経由した「遅延蛍光」の可能性がある。今年度に導入した蛍光寿命測定装置にりん光計測補助ユニットを装着して光物理過程を解析し,ミリ秒単位の寿命を得たことから,燐光/遅延蛍光の確証を得ることができた。研究実績の概要(上記)に示したとおり,計画初年度であるH29年度は,所期の目標をほぼ計画通りに達成したと考えている。

強いドナー基としてピペリジル基とピロリジル基を選択し,フタル酸無水物に導入してそのモデル化合物の発光特性から最適な置換基を選択したのち,青色発光性PIの分子鎖末端に同様の構造を結合させることで,透明性が高くかつStokes Shiftの大きな新規のHLPIの合成と評価に成功した。3.擬似的な太陽光として白色のXe光源を用い「太陽光波長変換スペクトル」を簡易に計測できるシステムを構築した。第二世代HLPIに対して,UV-A光をほぼ吸収し緑色光または青色+赤色光を15%以上増強させる効果を確認した。研究実績の概要(上記)に示したとおり,計画次年度であるH30年度は,所期の目標をほぼ計画通りに達成したと考えている。計画の次年度として以下の検討を行う。1.HLPIの完全無色透明化を目指し,新規の含フッ素ジアミンの完全精製とそれを用いた高発光性ポリイミド(HLPI)の合成・評価を行う。また,臭素・ヨウ素を導入した燐光/遅延蛍光発光性ポリイミドの検討も継続的に進める。さらにHLPIのStokes Shiftを拡大する「第3の方策」として,ドナー・アクセプター相互作用の導入を検討する。PIのイミド基部分は電子受容性(アクセプター)であるため,π共役構造でつながった部分に強い電子供与性基(ドナー)を導入すると,励起状態において顕著な電荷移動(CT)状態が惹起され,その安定化効果によりStokes Shiftの大きな蛍光発光が生ずると期待される。ここで強いドナー基として,ピペリジル基,ピロリジル基,ジフェニルアミノ基,ナフチルアミノ基などが想定されるが,初年度の検討と同様,モデル化合物の発光特性から最適な置換基を選択し,HLPIの合成・評価に繋げていく。2.擬似的な太陽光としてXe光源を用い「太陽光波長変換スペクトル」を簡易に計測できるシステムを構築する。第二世代HLPIに対して,UV-A光をほぼ吸収し,緑色光を20%以上増強させる効果を確認する。次いで,到達目標に最も近い物性を示すHLPI群の構造と製膜法の絞り込みを行い,人工太陽光照射装置を用いて太陽光変換スペクトルを計測するとともに,発光波長と変換効率の制御性,耐熱性・耐光性を計測して,波長変換膜としての実証化検討を進める。最終年度は2年間の検討で得られた各種HLPI膜の光学特性の知見を基盤とし,実用的な波長変換膜として使用できる大面積HLPI膜の合成・製膜・評価技術を確立するとともに,ペロブスカイト型太陽電池に装着して,発光波長と変換効率の制御性,耐熱性・耐光性を計測し,太陽光波長変換膜としての実証化検討を進める.特にHLPIに対してUV-A光をほぼすべて吸収し,そのエネルギーを緑黄燈色光に20%以上の効率で増強させる効果を確認する.また,波長変換された発光の外部取出し効率の向上を目指して,HLPIのナノファイバ化を試みる。ファイバ径を発光波長程度に制御することで,薄膜導波路の閉込め構造が抑止され,高い波長変換効率と高い外部取り出し効率を両立させた理想的な波長変換膜を形成できる可能性がある。
一次二次救急施設における自殺企図者と非自殺企図者(自傷・自殺念慮患者)の比較研究

自傷、希死念慮、自殺企図に共通して言えるのは、相談先の整備、リスクのアセスメントと対処が必要であることなどである。希死念慮に関しては、精神科診療において希死念慮の同定とそれへの対処が要求される。自殺企図を防止する方策としては、精神科医ばかりでなくプライマリケア医や周囲のサポートが不可欠である。特に、全般的重症度とストレス値の把握は自殺企図のリスクの評価に有用であり、両者とも精神科臨床やプライマリケアの現場で積極的に取り入れていくべきと考えられる。また、精神科の早期受診や相談先などの環境整備が自殺防止に寄与するものと考えられた。本研究では身体的重症度は高くなく自力または同伴者と受診する自殺企図症例の実態調査を2年間実施し、自傷、希死念慮で受診する患者群を対照群としたケースコントロール・スタディを行う。付加的にすでに平成17年度まで4年間実施しているデータとの年次推移も踏まえながら、得られた成果を精神科救急医療における自殺企図対策、再企図予防、うつ病予防に役立てることを目的としている。本年度は平成19年4月1日平成19年12月31日の期間に、岩手医科大学付属病院一次二次外来の総受診件数1,022件であり、そのうち自殺企図・自傷・抑うつ気分症例128件の情報を集積した。合わせて、平成14年4月1日から5年間に一次二次外来を受診した自殺企図363件を抽出し、「救急外来患者受付情報用紙」の調査項目(性別、年齢、自殺未遂の既往、同居状況、医療機関の受診状況、自殺の動機、ICD-10に基づく診断、治療、受診経路、転帰等)、に関して39歳以下の青年群300件と40歳以上の中高年群63件の2群に分け比較検討を行った。また、「ホームズ社会的再適応評価尺度」を用いて、自殺企図前のライフイベントについて調査し、点数化して評価・比較検討を行った。背景因子の検討から、中高年群では複数回の自殺企図行動をとることは少ないが、重症度が高い状態で自殺企図をして救急外来を受診していることから、相談体制の整備や周囲の気づきの重要性が示唆された。非雇用者の割合が高いことや経済的な困窮を動機とするケースが約13%存在することから、雇用対策や社会保障の充実も中高年め自殺率減少に寄与するものと考えられた。さらに、岩手医科大学付属病院一次二次外来、三次外来(岩手県高度救命救急センター)を受診した全ての自殺企図、自傷患者1,220件を対象として、上記調査項目の情報を集積し、青年群と中高年群を比較検討した結果を解析中である。[目的・方法]平成14年4月1日から6年間に、岩手県高度救命救急センター及び岩手医科大学附属病院一次二次外来を受診した精神科救急受診ケースの中から、(1)希死念慮を呈しているが自殺企図に至っていないケース(以下、希死念慮群)227件、(2)希死念慮がなく自傷行為(過量服薬を含む)後に受診しているケース(以下自傷群)482件、(3)岸らの自殺・自殺企図の診断基準を満たしているケース(以下、自殺企図群)1,436件を対象とした。対象者に対して性別、年齢、教育年数、相談の有無、通院先などを調査した。さらにICD-10診断、自殺企図前の相談の有無、過去の自殺関連行動の既往(生涯、過去1年以内)、ホームズ社会的再適応評価尺度の生活変化単位(LCU)、総合評価尺度(GAS)を調査した。[結果]各群とも女性の件数が多く、年齢は自殺企図群が有意に高く、教育年数は希死念慮群が他群に比し高値であった。GASscoreは自傷群が高値であり、LCUscoreは自殺企図群が高値であった。相談先の有無については自傷群の約7割、自殺企図群の約6割が相談先が無い状態で受診となっていた。自傷と自殺企図の手段では、自傷群の約4割、自殺企図群の約5割で薬物が用いられていたが、自傷群では刃器や刺器による割合が最も高く(43%)、自殺企図群では毒物(7%)、ガス(4%)、飛び降り(4%)なども認められた。精神科診断ではF3とF4の合計が各群とも6割以上を占めていた。自殺関連行動の既往では、希死念慮群と自傷群で6割以上がその存在を認めていた。医療機関の受診歴に関しては、希死念慮群で、約8割が精神科通院歴を有するのに対して、自殺企図群では約5割であった。[結論]自傷、希死念慮、自殺企図の各群に共通して言えるのは、相談先の整備が急務であること、F3とF4の症例に対して重点的にリスクのアセスメントと対処が必要なことである。
メゾスコピック領域で見られる生物の機械的で熱的な動作のしくみと操作

メゾスコピック領域の「力」は、近年のメカノバイオロジーの興隆により再認識されはじめた。しかし熱、そして温度は、いまだにマクロなパラメータとして扱われることが多い。(1)「仕事(力)」と(2)「熱(温度)」という2つのエネルギー量を、メゾスケールで扱える技術を開発し、新規で生物学的に重要な事象の発見を目的として研究を行った。(1)細胞シートを調製し、負荷刺激系を組み合わせた顕微観察系を用いて細胞シートの外部負荷応答を解析した。(2)細胞の熱パルス応答を見出した。1細胞の温度変化を検出するプローブおよび手法を新規に開発し、これを応用した。従来の生物学では多くの場合にマクロスケールのパラメータとして捉えられる(1)「仕事(力)」と(2)「熱(温度)」という2つのエネルギー量を、メゾスケールで扱える技術を開発し、新規で生物学的に重要な事象の発見を目的とする。2011年度は、(1)アクチン-GFP、-RFPを発現する細胞を用いて細胞シートを調製し、負荷刺激系を組み合わせた顕微観察系の最適化を進め、蛍光タンパク質が外部不可に応答する様子を確かめた。本研究成果に関する予備的結果について、EMBO Meeting 2011において学会発表を行った。また(2)単離したラット心筋細胞の近傍に集光した赤外レーザーで局所的な熱パルスを発生させたところ、この熱パルスが心筋細胞の収縮を誘導することを見出した。この収縮中にCa2+濃度変化は見られず、また細胞膜を除去した心筋細胞でも収縮は誘導された。このことから、熱パルスがCa2+の変動無しに筋収縮を制御できることを見出した。この現象は、Ca2+ダイナミクスに異常のある心疾患において、拍動を誘導する新たな手法につながる可能性がある。本研究成果について、Biochemical and Biophysical Research Communications誌に論文発表した。さらに細胞内の局所的かつ僅かな温度変化の測定を可能にする新たな手法を開発した。今回開発した蛍光ナノ温度計粒子の蛍光強度(明るさ)は温度によって変化し、他の環境因子(pHとイオン強度)には影響されない。そのため、環境が時々刻々変化する細胞内の局所的な温度を、正確に素早く測定することが可能となった。さらにこのナノ温度計は細胞内で分子モーターによって輸送され、「細胞内を歩くナノ温度計」として働くことが見いだされた。本成果についてLab on a Chip誌に論文発表した(印刷中)。2013年度は、(1)昨年度までに準備を進めていた論文について、追加の実験を行った。また(2)昨年度までに改良に成功していたナノ温度計を培養細胞HeLaへ応用した。HeLa細胞にはふりかけるだけで自発的にとりこまれること、エンドサイトーシスで取り込まれた後は酸性オルガネラであるエンドソームに存在すること、エンドソーム内と細胞外とに温度差の無いことが確認された。さらに一個の細胞からの発熱を検出する試みに成功した。細胞内Ca2+濃度を強制的に急上昇させると、細胞内の各部位で温度の上昇が観察された。温度上昇の時間変化は、部位毎に異なっていた。また細胞全体のCa2+濃度上昇と温度変化とを比較すると、正の相関が見られた。これは個々で見られた発熱現象の熱源が、Ca2+によって活性化される分子または機構であることを示唆している(Takei, Y., Arai, S., Murata, A, Takabayashi, M., Oyama, K., Ishiwata, S., Takeoka, S. and Suzuki, M. , ACS Nano, 8(1), 198-206, 2014)。2012年度は、(1)RFP-アクチンと共にGFPと融合した接着結合タンパク質、および接着斑タンパク質を共発現する細胞を作成し、これらを用いて細胞シートを調製した。負荷刺激系を組み合わせた顕微観察系とウエスタンブロットにより、これら細胞シートの外部負荷応答について、解析を進めた。以上により、外部負荷によるタンパク質の局在変化とリン酸化を確認した。応答の分子メカニズムの一端を解明したことを報告する論文の準備を開始した。

また(2)細胞内の局所的かつ僅かな温度変化の測定を可能にする新たな手法の開発において、2012年に掲載されたナノ温度計を改良することに成功した。本年度、新規に開発した蛍光ナノ温度計粒子には二種類の蛍光色素を封入してある。一方の蛍光強度(明るさ)は温度によって変化し、温度計分子として機能するが、もう一方の蛍光強度は温度により変化しない。そこでこれら二種の蛍光強度比をとることで、絶対温度を測定できるレシオ型温度計ナノ粒子の開発に成功した。温度を測定する一方で、他の環境因子(pH、イオン強度、粘性、タンパク質濃度)に測定値が影響されない性能は、昨年の粒子と同等以上であった。このレシオ型ナノ温度計を培養細胞へ導入し、一個の細胞からの発熱を検出することを試みた。(1)では当初の計画通り、顕微鏡観察系がほぼ完成し、継続して実験を行うことが可能となった。しかし成果発表をするのに足るほどのまとまったデータを取得するには至っていない。一方の(2)は当初の計画をやや上回る形で進展し、2つの小テーマについて論文発表をすることができた。以上のことから、現在までの達成度を「(2)おおむね順調に進展している。」とした。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)では顕微鏡観察系が完成し、継続して実験を行うことが可能となった。成果発表できる段階に至った。(2)は、温度計ナノ粒子に関する学会発表において、ポスター賞を受賞できた。また、新たな温度計の開発に成功した。レシオ測定できるものの開発を完了し、ヘテロな熱発生のイメージングに成功した。以上のことから、現在までの達成度を「(1)当初の計画以上に進展している」とした。現在までに、研究計画を大きく変更する方針はない。
軸索損傷神経細胞の生存・軸索再生の分子メカニズムの解析

本年度の研究実施計画に記載した2点について以下のように実施した.(1)損傷舌下神経cDNAライブラリーを用いたランダムクローニングによる遺伝探索1000匹のラットの損傷舌下神経核を回収し作成したcDNAライブラリーを用いて、ランダムに750クローンをとりだし、それらにつて部分塩基配列を決定した.これらのうち約100クローンについては、片側の舌下神経核を損傷した組織切片を用いてin situハイブリダイゼイションを行った.その結果約25%のクローンにおいて、mRNAの増加を確認した.この割合は極めて高いもので、本方法が損傷関連遺伝子探索に極めて有効であることを示している。本結果はMol.Brain Res.に発表すると同時に、得られたクローンのうちNOSの活性を上昇させることによりNO産生を促進するDDAHと呼ばれる酵素に関しては、その発現動態を詳細に検討しEur.J.Neurosci.誌に投稿受理されている(印刷中).(2)アデノウイルスベクターによる損傷神経への選択的遺伝子導入法の確立と応用アデノウイルスに神経再生関連分子のGDNF、GFRa-1、MEK及びPKBなとの遺伝子を導入し、予め培養細胞系で発現することを確認の後、ラットの舌下神経核に導入を試みた.動物での遺伝子発現は培養系に比べると低いものの、実際に発現していることは確認された.本遺伝子の導入による神経生存や再生に及ぼす影響については現在検討中である.本年度の研究実施計画に記載した2点について以下のように実施した.(1)損傷舌下神経cDNAライブラリーを用いたランダムクローニングによる遺伝探索1000匹のラットの損傷舌下神経核を回収し作成したcDNAライブラリーを用いて、ランダムに750クローンをとりだし、それらにつて部分塩基配列を決定した.これらのうち約100クローンについては、片側の舌下神経核を損傷した組織切片を用いてin situハイブリダイゼイションを行った.その結果約25%のクローンにおいて、mRNAの増加を確認した.この割合は極めて高いもので、本方法が損傷関連遺伝子探索に極めて有効であることを示している。本結果はMol.Brain Res.に発表すると同時に、得られたクローンのうちNOSの活性を上昇させることによりNO産生を促進するDDAHと呼ばれる酵素に関しては、その発現動態を詳細に検討しEur.J.Neurosci.誌に投稿受理されている(印刷中).(2)アデノウイルスベクターによる損傷神経への選択的遺伝子導入法の確立と応用アデノウイルスに神経再生関連分子のGDNF、GFRa-1、MEK及びPKBなとの遺伝子を導入し、予め培養細胞系で発現することを確認の後、ラットの舌下神経核に導入を試みた.動物での遺伝子発現は培養系に比べると低いものの、実際に発現していることは確認された.本遺伝子の導入による神経生存や再生に及ぼす影響については現在検討中である.