hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノム解析によるA群溶連菌の病原性とその変化に関する研究-Toxic shock-like syndromeの原因究明を中心に-

今年度はこの結果をもとにさらに1996年までに分離された重症・劇症型感染症患者の株に加え、咽頭・扁桃炎患者からのT1型A群溶連菌についてもそのゲノムプロファイルを調べた。19791991年に非化膿性合併症、敗血症患者から分離されたT1型A群溶連菌10株中8株のゲノムプロファイルは同一で、さらにこれは同時期に合併症のない咽頭・扁桃炎患者から分離された同菌48株中35株のゲノムプロファイルと同じであった。一方19921996年にTSLSなどの劇症・重症感染症患者から分離されたT1型溶連菌18株のゲノムプロファイルはすべて同一で、同時期に咽頭・扁桃炎患者から分離された19株中18株のプロファイルと同じであった。すなわち1991年以前と1992年以降において分離されたT1型A群溶連菌のゲノムプロファイルは疾患に関わらずそれぞれ同じであった。しかし1992年以降に分離された株のゲノムプロファイルは1991年以前に分離されたプロファイルと全く異なるものであった。重症感染症患者からの分離株と同様に咽頭炎患者からのT1型分離株のゲノムも1992年以降変化していることが判明した。1992年以降増加してきたTSLS患者から分離されたA群溶連菌の多くはT1型であり、この時期に一致したこの血清型のA群溶連菌のゲノム変化あるいは新しいクローン株の出現は日本におけるこうした疾患の増加の原因の1つである可能性がある。19791996年に非化膿性合併症、敗血症やtoxic shock-like syndrome(TSLS)などの重症感染症患者から分離されたMl型A群溶連菌28株および合併症のない咽頭・扁挑炎患者から分離された同菌67株の合計95株についてパルスフィールド電気泳動法によりそのゲノムプロファイルを調べた。19791991年に非化膿性合併症、敗血症患者から分離された10株中8株のゲノムプロファイルは同一で、さらにこれは同時期に合併症のない咽頭・扁桃炎患者から分離された同菌48株中35株のゲノムプロファイルと同じであった。一方19921996年にTSLSなどの劇症・重症感染症患者から分離されたM1型溶連菌18株のゲノムプロファイルはすべて同一で、同時期に咽頭・扁桃炎患者から分離された19株中18株のプロファイルと同じであった。すなわち1991年以前と1992年以降において分離されたMl型A群溶連菌のゲノムプロファイルは疾患に関わらずそれぞれ同じであった。1992年以降わが国において増加してきたTSLS患者から分離されたA群溶連菌の多くはMl型であり、この時期に一致したこの血清型のA詳溶連菌のゲノム変化あるいは新しいクローン株の出現とその広がりは日本におけるこうした疾患の増加に関連している可能性がある。
熱性痙攣素因と脳内興奮系・抑制系 ニューロンの発達に関する研究

脳の温度が上昇すると後頭部皮質では神経の発射頻度が高くなり神経の興奮性が高まっていることが観察された。また温度がさらに上昇すると神経発射がバースト状になりかつリズムをもつようになり脳波上はspike-and-waveを形成するようになることが確認された。脳内の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は、脳の温度上昇時に細胞外液中に増加するので温度上昇時の神経の興奮性の増大はこのグルタミン酸の増加によると思われる。グルタミン酸は細胞内のカルシウムを増加させ、NO合成酵素を活性化させNO合成を増加させるので理論的には脳温の上昇によってNO合成が増加することが予想される。今回の研究で実際に温熱負荷時にNO放出が増加することが明らかにされた。NO合成酵素阻害剤の前投与により温度上昇によるこのNOの増加が抑制されることから、このNO増加は温度上昇によって引き起こされたNO合成酵素の活性化によると思われた。NO合成阻害剤の投与により熱性痙攣の閾値が高くなり、発作の持続時間も短くなることからNOは熱性痙攣の惹起に寄与し、痙攣持続時間を延長する方向に作用していることが示唆された。NOはグルタミン酸などの神経伝達物質の放出を促進させることから、温熱負荷によって増加したNOが拡散し広汎な範囲の神経に作用しさらに細胞外液中のグルタミン酸を増加させ脳の興奮性を高めた可能性がある。今回の研究で脳の温度が上昇した際、グルタミン酸だけでなくNOも増加し脳の興奮性亢進に関与していると考えられた。このことは臨床的にてんかんや熱性痙攣における発作予防を考える上で、治療の手がかりを与えるものと考えられる。高温負荷が皮質神経活動に与える影響:熱性痙攣の発作発現機序を解明するために人工呼吸器下のラットの頭部に赤外線を照射し高温を負荷した。この時の後頭部大脳皮質における神経の活動電位の変化についてガラス微少電極を用いて検討した。その結果、高温負荷前、高温負荷中、負荷後の各40秒間の神経の発火頻度はそれぞれ2.2(0.0-42.0)(median,range),4.0(0.1-68.3),4.1(0.1-51.9)Hzであり、高温負荷中、負荷後で優位に増加していた(n=90,p<0.01)。また、脳波上の棘波に同期する周期性の発射は皮質の深さ633±269μmで最も早く認められた。温度上昇時の神経活動の増加が神経細胞周期のイオン濃度、神経伝達物質濃度の変化をもたらし、発作を惹起していることが推測された。高温負荷が大脳皮質からの一酸化窒素放出に与える影響について:一酸化窒素が神経伝達物質の放出を促進することが知られている。そこでラットの大脳皮質に直径5mmのカップを装着して人工髄液で還流し、高温を負荷して、人工髄液中に遊離してくる一酸化窒素を電気化学法を用いて測定した。その結果高温負荷の強さ(脳の温度上昇を積分)と一酸化窒素の放出量(一酸化窒素濃度の増加を積分)との間には正の相関(r=0.7)が認められた。温度上昇による脳内一酸化窒素の増加が神経伝達物質の放出に影響を与え、熱性痙攣の発現に関与している可能性が示唆された。また温度がさらに上昇すると神経発射がバースト状になりかつリズムをもつようになり脳波上はspike-and-waveを形成するようになることが認された。

グルタミン酸は細胞内のカルシウムを増加させ、NO合成酵素を活性化させNOの合成を増加させるので理論的には脳温の上昇によってNO合成が増加することが予想される。今回の研究で実際に温熱負荷時にNO放出が増加することが明らかにされた。NO合成酵素阻害剤の前投与により温度上昇によるこのNOの増加が抑制されることから、このNO増加は温度上昇によって引き起こされたNO合成酵素の活性化によると思われた。NO合成阻害剤の投与により熱性痙攣の閾値が高くなり、発作の持続時間も短くなることからNOは熱性痙攣の惹起に寄与し、痙攣持続時間を延長する方向に作用していることが示唆された。NOはグルタミン酸などの神経伝達物質の放出を促進させることから、温熱負荷によって増加したNOが拡散し広汎な範囲の神経に作用しさらに細胞外液中のグルタミン酸を増加させ脳の興奮性を高めた可能性がある。今回の研究で脳の温度が上昇した際、グルタミン酸だけでなくNOも増加し脳の興奮性亢進に関与していると考えられた。このことは臨床的にてんかんや熱性痙攣における発作予防を考える上で、治療の手がかりを与えるものと考えられる。
ゲージ理論と3次元多様体

3次元多様体の不変量については次の結果を得た。(1)SU(2)WZWモデルの共形ブロックの基底の、保形形式係数のリーマンテータ関数による具体的表示(2)量子クレブシュゴルダン条件のテータ関数による導出(3)射影平坦接続のテータ関数による構成(4)共形ブロックの空間の不変内積の定義(5)ハンドル体に対する真空ベクトルの定義とそのペアリングによる3次元多様体のWitten不変量の定義(6)Witten不変量の漸近挙動と3次元多様体のChern-Simons不変量、ライデマイスタートーション、スペクトルフローとの関係の導出。これらの結果はWitten不変量の幾何学的意味づけを探求する上で今後本質的に有用なものであると筆者は考える。従来の組み合わせ的なWitten不変量とは相補的な関係にあるもので、実際二つの定義はWitten不変量の異なるガウス和表示を与え、これらはフーリエ変換から導かれるガウス和の変換法則により、結びついていると考えられる。複素多様体のKahler-Einstein計量については、次の結果を得た。Hodge類とそれを第1Chern類にする複素直線束Lに対し,自己同型群の作用がLにliftするならば,いわゆるFutaki characterは自己同型群の指標にliftすることを示した.これは積分を用いてexplicitに書き表され,これをKahler計量の全体の上の汎関数とみなすと,色々なデータの選び方の任意性から,満渕のK-energyやDingの汎関数などが同時に出てくることがわかった.多重種数の変形不変性など、複素多様体の変形についての研究においては、射影的変形(代数多様体としての変形)では多重種数が変形で不変であることが証明できた。これは、30年前に飯高により予想されて以来、解決が待たれていた問題である。共形場理論のアーベル化を考察した。SU(2)共形場理論のコンフォーマルブロックの基底をブリム多様体上の保型関数係数の古典テータ関数によって表示することを行った。保型関数は3つのテータ定数の積の一次結合として具体的に表示される。この結果を利用して、コンフォーマルブロックに射影接続が導入され、不変なエルミート内積が構成される。応用として、3次元有向閉多様体のウィッテン不変量のゲージ理論的な立場からの定義が可能になる。この定義は従来の組み合わせ的なものとは異り、多くの幾何学的な情報をもたらす。SU(2)共形場理論のアーベル化を完成した。各レベルκに対するSU(2)共形場理論のコンフォーマルブロックの基底をアーベル多様体上の保形関数係数のリーマンテータ関数を用いて具体的に構成した。この過程において、コンフォーマルブロックのなすタイヒミュラー空間上のベクトルバンドルに射影平坦接続が入ることを証明した。コンフォーマルブロックの基底の構成から導かれる重要な系として、コンフォーマルブロックの空間に射影接続により保たれるエルミート内積が入ることが、そのテータ関数の空間のエルミート内積と保形関数の空間のピーターソン内積による具体的な構成により示された。また曲面の写像類群によるコンフォーマルブロックの空間の変換法則が、量子物理におけるベリー位相の現象を本質的に含む大変興味深いものであることを明らかにした。これらの結果は、従来主に代数的手法により展開されていたものを、幾何学的側面の観点から再構築することと向時に、従来の方法では得られなかった新しい知見を含んでいる。上記のSU(2)共形場理論のアーベル化の結果を用いて3次元多様体の位相不変量の構成をした。

コンフォーマルブロックの基底の具体的構成から、3次元ハンドル体に対する真空ベクトルが定義され、上記のエルミート内積を用いてヘガード分解された枠付3次元多様体の位相不変量が定義される。テータ関数の古典極限での漸近挙動についての知られた事実を用いることにより、この位相不変量の漸近挙動が3次元多様体のチャーンサイモン不変量、ライデマイスター不変量などにより記述されることを証明した。
粗視化フラワーミセルモデルを用いた会合性高分子の構造形成とレオロジー

会合性高分子が形成するフラワーミセルを単位として系を記述し,そのミセル間でブリッジ鎖・ループ鎖間の遷移が起こるとする「粗視化フラワーミセルモデル」を構築し,このモデルを用いた計算機シミュレーションにより,濃度変化によって引き起こされるゲル化やミセルの充填などの構造変化とレオロジー的性質の間の関係を解明する.この研究により,会合性高分子溶液の濃度依存性に関する知見が得られるばかりでなく,会合性高分子を含む製品を塗布した後の乾燥過程での構造変化・物性変化を予測できるようになるので,実際に会合性高分子を使用する状況下での使用感触なども考慮した材料の設計指針の構築が可能になると期待される.会合性高分子が形成するフラワーミセルを単位として系を記述し,そのミセル間でブリッジ鎖・ループ鎖間の遷移が起こるとする「粗視化フラワーミセルモデル」を構築し,このモデルを用いた計算機シミュレーションにより,濃度変化によって引き起こされるゲル化やミセルの充填などの構造変化とレオロジー的性質の間の関係を解明する.この研究により,会合性高分子溶液の濃度依存性に関する知見が得られるばかりでなく,会合性高分子を含む製品を塗布した後の乾燥過程での構造変化・物性変化を予測できるようになるので,実際に会合性高分子を使用する状況下での使用感触なども考慮した材料の設計指針の構築が可能になると期待される.
第二次大戦後のSWPC廃止過程における中小企業の位置

本年度の研究は、第二次大戦時における中小企業専管機関SWPCの創設・運営・廃止過程の実態を解明し、その意義を明らかにした。研究の視点は、上記過程において、関係する利害集団と、swpcに対する政策志向を抽出した上で、それらの相互作用と帰結に注目した。研究方法は、主たる資料として議会・委員会議事録と各政府機関の文書を丹念に読み込み再構築するという方法であった。研究成果の具体的な内容は、以下のとおりである。第一に、SWPCの創設過程を分析し、連邦議会内の両院中小企業委員会とWPBという2つのアクターの間で、「中小企業支援目的」と「戦時生産目的」という2つの政策志向の対立と妥協の中で、SWPCが創設された事実を明らかにした。第二に、SWPCの運営過程孕検討し、ホランド、ジョンソン、マヴェリックの3議長の政策運営の実態を、契約配分手法に注目して解明した。まず、ホランド期においては、組織の人員確保に失敗したため、SWPCが機能不全に陥った。次に、ジョンソン期においては、大企業での経験を生かしSWPCの機能化に成功するも、中小企業の下請化が積極的に推進された。最後に、マヴェリック期においては、SWPCが連邦政府の中小企業政策形成過程において、一定地位を占めるようになり、廃止議論も踏まえつつ、再転換や余剰資産の処分といった新しい権限を獲得していったことを示した。本研究の意義は2点である。第一の意義は、日本国内における、第二次大戦時の米国戦時経済研究では、大企業や巨大機関に分析の力点をおきがちなため、蓄積が薄いとされる中小企業専管機関SWPCの実態を明らかにした。またそれを通じて、戦時経済の実像をより鮮明にした。第二の意義は、研究対象時期がSBA以降に集中しがちな、米国中小企業政策史研究にとって、SBA設置以前に遡っての中小企業専管機関の起源・経過を明らかにした点である。以上の研究は、第二次大戦期以降、現在にいいたるまで、米国経済の重要部位を占め続ける「軍拡経済」の本質を解明する上での一助となる重要性をもつものである。
小胞体回避モチーフ作用因子の同定への挑戦

疎水性の配列を持つ多くの膜タンパク質は小胞体膜へ合成と同時に組み込まれる。一方、ペルオキシソームなどのものは、小胞体標的化を回避する。今回の研究で、ペルオキシソームの主要膜タンパク質PMP70のアミノ末端に短いアミノ酸9残基のモチーフが膜タンパク質の小胞体標的化を抑制することを見出した。この作用には5番目のアミノ酸がセリンであることが必須であった。そのモチーフは分泌タンパク質の小胞体標的化も抑制した。そのモチーフに結合する因子を化学架橋で探索したところ、50kDaおよび20kDaのタンパク質が結合することを見出した。この研究で、小胞体標的化抑制作用という新奇機能を提唱した。真核細胞の分泌経路のオルガネラ膜の膜タンパク質は、小胞体で膜に組み込まれ、小胞輸送で最終存在部位へ運ばれる。小胞体への標的化は、疎水性の高いアミノ酸配列からなるシグナル配列によって担われている。一方、ミトコンドリアやペルオキシソームの膜タンパク質は高い疎水特性を有するにもかかわらず、この小胞体標的化機構を回避して、合成完了後にそれぞれへ移行する。ABC輸送体ファミリーのペルオキシソーム型アイソフォームであるABCD3のN-末端に、小胞体標的化を抑制するモチーフ(N12と略)が存在することを見出し、作用特性を研究してきた。本研究では、N12に作用するタンパク質因子の解明を通して小胞体回避機構の解明を目指した。N12との化学架橋反応を活用した生化学手法や、N12に近接するタンパク質をビオチン化によって追跡する細胞生物学的手法、酵母ツーハイブリッド法など、原理の異なる複数の手法を試みた。BioIDを活用したビオチン化による検出、酵母ツーハイブリッド法による結合因子のスクリーニングでは有意な因子の検出同定には至らなかった。無細胞系で作成したN12をアミノ末端に含む新生ポリペプチド鎖リボソーム中間体と化学架橋反応を利用して、2種のタンパク質性因子の検出に成功し、この複合体をショ糖密度勾配法で精製することによって架橋効率が格段に向上することを明らかにした。この架橋反応系を指標として、ウサギ網状赤血球溶血液より、硫安分画、疎水性クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフ、ショ糖密度勾配遠心分画によってN12作動性因子の精製を実行した。その結果、活性と相関良く分画される数本のポリペプチド鎖の検出にまで至っている。本研究では、真核細胞でのオルガネラ生合成に際して、膜タンパク質の小胞体標的化を抑制し、独立オルガネラであるペルオキシソームへの翻訳後標的化を可能にする、小胞体標的化抑制(ER-targeting suppressor、ETSと略)作用因子の解明に挑戦した。真核細胞では、疎水性配列を特徴とするシグナル配列を小胞体に標的化する強力な分子機構が存在する。したがって、疎水性配列を持つ膜タンパク質はその特性ゆえに、小胞体へ標的化される運命にある。一方、ペルオキシソーム膜タンパク質は、この機構を免れて、直接的にペルオキシソームへ標的化される。我々は、70 kDaペルオキシソーム膜タンパク質(PMP70)のアミノ末端に疎水性タンパク質の小胞体標的化を抑制する要因があることを発見し、ETSと命名した。ETSは特異的なアミノ酸配列によって担われており、疎水性シグナル配列の小胞体標的化を抑制することを見出した。数多くの試行の後、リボソーム結合新生鎖を精製して化学架橋反応を行うことで、ETSは細胞内のタンパク質因子に結合すること、その因子は分子量50 kDaであることを見出した。この実験系の設定が端緒になって、化学架橋を指標に、ETS結合因子の分離精製が可能となった。複数のタンパク質分離技術、クロマトグラフ技法を用いて、結合因子画分を濃縮し、質量分析にて可能性の高い候補タンパク質の同定にまで至った。この研究で、ペルオキシソーム膜タンパク質にETS作用が存在し、小胞体標的化が抑制され、翻訳後の標的化が実現しているという概念を提案することができた。さらに、ペルオキシソーム膜タンパク質の少なくともあるグループのものは、小胞体を作用因子に依存して回避していることが強く示唆された。本研究では、化学架橋反応を活用し相互作用因子の検出に成功し、さらに架橋プローブであるリボソーム新生鎖複合体をショ糖勾配遠心で部分精製することによって架橋反応を効率化できた。さらに、生化学的分画後の因子の検出が可能になった。この成果は、親和性クロマトグラフ法、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法、BioIDによるビオチンラベル法、などの多様な方法論でも達成できなかった後、可能となった。この検出系を使って、様々なクロマトグラフィー画分での因子の検出が、再現性良く定量的に可能となった点は評価に値すると考える。分画を進めて、結合因子と考えられる候補タンパク質の絞込みが可能な段階に到達している。

また、N12作用に決定的に重要な5番目のSer残基に重要性を全長のABCD3分子で確認できていなかったが、細胞内分解による複雑さを克服して、全長においてSer5Ala変異体は小胞体に標的化することを実証した点も特筆すべき進展である。分子細胞生物学今後、生化学分画によって絞られたタンパク質を質量分析法によって同定し、候補タンパク質の組み換え型を発現し、それらの精製標品を使った結合活性の確認、ドミナントネガティブ作用の検討、ノックダウンの効果の検討、ノックアウト動物の作出と表現形の検討、過剰発現の効果の検討、培養細胞での局在の検討などを通して、小胞体標的化抑制因子としての作用を明らかにする。さらに、抗体作成を行い、その阻害作用、内在性タンパク質の細胞内局在、臓器による発現の違いを調べる方向性で鋭意進行の予定である。今年度、化学架橋によるアッセイでN12モチーフ作用因子の精製のメドがたったが、その同定のための質量分析が次年度に持ち越しとなったため、その費用を次年度使用とした。次年度使用額は、タンパク質の質量分析のための、タンパク質の精製、電気泳動機器の整備、質量分析の委託費用として使用する予定である。
スタチン系薬剤の徐放システムによる顎骨再生とそのメカニズムの解明

我々は、高脂血症治療薬(スタチン系薬剤)の1つであるフルバスタチンを用いて、新しい骨再生材料の開発を行った。フルバスタチンを含有するゼラチンハイドロゲル・スポンジを作成し、薬剤溶出特性を調べた。フルバスタチン含有ゼラチンハイドロゲル・スポンジは、水中で急速に溶解したが、ゼラチンとフルバスタチンの分子は結合した状態にあり、結合状態でも薬理活性を有していることが明らかとなった。さらに動物実験では、フルバスタチン含有ゼラチンハイドロゲル・スポンジは、低代謝型骨粗鬆症モデル動物において、新生骨の形成量を有意に増加させることが明らかとなった。本研究の目的は、高脂血症治療薬(スタチン系薬剤)を用いて、新しい骨再生材料を開発することである。スタチン系薬剤の1つであるフルバスタチンを含有するゼラチンハイドロゲル・スポンジを作成し、薬剤溶出特性を調べた。フルバスタチンを含有するゼラチンハイドロゲル・スポンジは水中で急速に溶解したが、スポンジ溶解後もゼラチンとフルバスタチンの分子は結合した状態にあり、結合状態でも薬理活性を有していることが明らかとなった。このフルバスタチンとゼラチンの関係性は、Tanabe K, Miura T, Yoshinari M. Electrostatically Coupled State of Fluvastatin with Gelatin in Vitro. Journal of Hard Tissue Biology. 2013;22(4):451-4.に掲載された。この結果、フルバスタチンは、巨大分子であるゼラチンに結合することで、血流に流されることなく局所に長期間留まることが明らかとなった。しかし、フルバスタチンがゼラチンと結合したまま細胞に効果を示すかが明らかでない。スタチン系薬剤には至適濃度が存在するため、このメカニズムの解明は、今後の創薬デザインに大きな影響を及ぼすことが予想される。そのために、次年度には動物実験および動物細胞で実験を行い、フルバスタチン・ゼラチン結合物の、海綿骨内での効果の確認と、細胞への効果を検証していく必要がある。さらに動物実験を行い、フルバスタチン・ゼラチン結合物の、生体内での骨形成能を検証した。高血圧自然発症ラットを低代謝型骨粗鬆症モデルとして用い、フルバスタチン・ゼラチン結合物を大腿骨に埋入した。骨形成の経時的な観察と定量化を行い、併せて骨形成領域の病理組織学的観察も行った。その結果、観察した全てのラットで、フルバスタチン・ゼラチン結合物が投与された領域で、新生骨形成と骨形成量の増加が有意にみられた。次に、低代謝回転型骨粗鬆症モデルマウスを用いて、効果と濃度依存性についても検討した。正常マウスと低代謝回転型骨粗鬆症モデルマウスに、それぞれ濃度の異なる3種類のフルバスタチン・ゼラチン結合物を埋入し、骨形成の経時的な観察と定量化を行った。その結果、正常マウスと低代謝回転型骨粗鬆症モデルマウスでは、至適濃度が異なることが明らかとなった。歯科医用工学・再生歯学フルバスタチンを含有するゼラチンハイドロゲル・スポンジは、当初予想された薬剤徐放メカニズムでなく、スポンジ形状崩壊後もゼラチン分子と結合することによって、もう1段階の徐放メカニズムとなっている事が明らかとなった。このため、当初予定された実験計画は行えず、フルバスタチン・ゼラチン結合物の細胞への効果を検証する必要性がでてきた。しかし、この徐放メカニズムが明らかとなったことは大きな進歩であり、次年度に予定されている動物実験を行う上で、たいへん有効な情報と考えられる。フルバスタチン・ゼラチン結合物の細胞への効果の検証は、薬剤が細胞に到達するまでの、いわば骨再生メカニズムの一部とも考えられ、次年度に予定されている内容でもあることから、おおむね順調に進展していると思われる。次年度に予定している動物実験を、研究計画に沿って遂行する予定である。これに加え、本年度の結果から、フルバスタチン・ゼラチン結合物の細胞への効果を検証する必要性が生じたため、これを追加して行う予定である。

フルバスタチンを含有するゼラチンハイドロゲル・スポンジは、当初予想された薬剤徐放メカニズムでなかった。このため、当初予定された実験計画は行えず、次年度使用額が生じることとなった。次年度に予定している動物実験を、研究計画に沿って遂行する予定である。これに加え、本年度の結果から生じた、フルバスタチン・ゼラチン結合物の細胞への効果を検証を、次年度使用額で行う予定である。
液胞の分化からみた植物器官形成

目的発熟期の種子の液胞が蓄積型のオルガネラとして機能し、乾燥期には種子タンパク質を蓄積するプロテインボディに変換する。このプロテインボディは種子の発芽に伴い互いに融合し、分解型の液胞へと変化していく。この液胞のオルガネラとしての機能変換が、種子の貯蔵器官から分解器官への転換を引き起こしていると考え、植物の器官の可変性を細胞内のオルガネラの可変性としてとらえて器官代謝機能の転換について理解を深めようとしている。本研究では、子葉の形成から老化までの一連の過程における液胞の機能転換の機構を明らかにすることを目標としている。成果の概要(1)液胞プロセシング酵素(VPE)は登熟期の種子タンパク質の成熟化に関与する酵素として見いだされたものであるが、これと同様のプロセシングが葉や根などの液胞タンパク質にも起こっている。最近、アラビドプシスのゲノミックライブラリーから2種類の液胞プロセシング酵素の遺伝子(VPE-A,VPE-B)をクローニングし、各々が異なる組織特異性を示すことを明らかにした。(2)乾燥種子のプロテイングボデイに特異的に蓄積する4種類の幕タンパク質(MP23,MP27,MP28,MP32)のcDNAを単離し、それらの構造を明らかにした。MP27とMP32は一本のポリペプチドとして合成され液胞へ輸送された後に、液胞プロセシング酵素によって2本のタンパク質に分断される。一方、MP23とMP28は6つの膜貫通領域を有するα-TIP(tonoplast intrinsic protein)であり、MP23は、生合成の過程でN末端側の一つの膜貫通領域が除去されることが判明した。
脳腫瘍幹細胞およびニッチにおけるキヌレニン経路の阻害効果

免疫組織学的検討から膠芽腫組織内においてIndoleamine 2,3 dioxygenase(IDO)発現細胞が、膠芽腫を特徴づける組織形態を構成する細胞とoverlapすることが示唆された。また浮遊細胞塊法にて濃縮培養されたsphere(脳腫瘍幹)細胞では、sphere細胞を血清刺激して得た分化型腫瘍細胞よりもIDO遺伝子発現レベル、酵素活性レベル、双方において高い状態であることも示唆された。これらの結果は、膠芽腫においてIDO強発現細胞、すなわち脳腫瘍幹細胞を標的とする治療戦略が、IDO阻害効果による自己免疫寛容状態からの解放作用と重なり極めて効果的である可能性を支持するものである。第1段階の目的であった実際のglioblastoma(GBM)患者組織中におけるIndoleamine 2,3 dioxygenase(IDO)の割合と局在や、幹細胞マーカー発現細胞との位置関係を免疫組織学的に検証した。すなわち実際のGBM患者組織切片、あるいは組織マイクロアレイを用いてIDOのGBM組織内における局在と、stem cell markerを発現する細胞の局在の検討を行い、(1)正常脳やびまん性星細胞腫と比較して悪性神経膠腫、特にGBMにおいて特にIDO陽性細胞が認められること、(2)IDO強陽性細胞の分布は腫瘍血管周囲やpseudopalisading周囲にみられること、(3)それらIDO陽性細胞の分布は、Nestin陽性細胞やSox2陽性細胞の分布とoverlapすること、を確認した。またこれらの中間結果を、第71回日本脳神経外科学会総会(2012)、日本脳腫瘍学会(2012)にて発表した。以上の結果を踏まえ、患者由来GBM組織片から脳腫瘍幹細胞株を樹立し、その細胞を用いてKynurenine経路におけるIDO活性の測定、阻害効果、を調べる第2段階へ進んだ。現在までに同意が得られた4例のGBM患者からの脳腫瘍幹細胞の樹立を試み、1株の樹立に成功した。現在その1株を用いて幹細胞性や分化能の確認、IFNγ刺激下でのIDO活性の測定をTandem mass spectrometryにて行っているが、pilot studyからの結果ではpositive controlとして使用した既存の商業ベースGBM細胞株と比較して、幹細胞、分化細胞ともにかなりIDO活性が低いことが示されており、今後樹立されてくる複数の幹細胞株との比較や条件設定の変更を考えている。第1段階目的であったglioblastoma(GBM)患者組織中におけるIndoleamine 2,3 dioxygenase(IDO)の発現と局在,幹細胞marker発現細胞との位置関係を免疫組織学的に検証した.その結果,(1)正常脳やびまん性星細胞腫と比較して悪性神経膠腫,特にGBMにおいてIDO陽性細胞が認められること,(2)IDO強陽性細胞の分布は腫瘍血管周囲やpseudopalisading周囲にみられること,(3)それらIDO陽性細胞の分布はNestin陽性細胞やSox2陽性細胞の分布とoverlapすること,を確認した(これら中間結果は第71回日本脳神経外科学会総会,第30回日本脳腫瘍学会にて発表).次に患者由来GBM組織片から脳腫瘍幹細胞株を樹立,その細胞を用いてKynurenine経路におけるIDO活性の測定,阻害効果を調べる第2段階へ進んだ.現在までに同意が得られた5例のGBM患者摘出組織から脳腫瘍幹細胞の樹立を試み,1株の樹立に成功した.その1株についてまず,sphereforming assay,血清刺激による分化誘導,stem cell markerの遺伝子発現レベルを調べた.その後IFNγ刺激下でのIDO活性をTandem mass spectrometryにて測定したところpositive controlの既存商業ベースGBM細胞株(LN229)と比較して,幹細胞,分化細胞状態ともにかなりIDO活性が低いことが示された.一方で幹細胞状態と分化細胞状態におけるIFNγ刺激時のIDO活性の比較に注目すると,幹細胞状態の方がIDO活性が高い結果が示された.さらにこの際のIFNγに対する幹細胞状態と分化細胞状態での遺伝子発現レベル変化をcDNAマイクロアレイにて網羅的に解析したところ,IDO遺伝子の発現レベルについては幹細胞状態の方が分化状態に比べて約10倍発現が上昇していた.今後こられの結果をもとに複数のGBM幹細胞での普遍性の確認を行い,in vivoでのGBM幹細胞腫瘍モデル作成,IDO阻害効果判定へと進めていく予定である.免疫組織学的検討から膠芽腫組織内においてIndoleamine 2,3 dioxygenase(IDO)発現細胞が、膠芽腫を特徴づける組織形態を構成する細胞とoverlapすることが示唆された。Glioblastoma(GBM)、特にGBM stem cells及びそのnicheにおけるIndoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)の持つ意義を解明する第一歩として、実際のGBM臨床サンプル組織を用いてIDOモノクローナル抗体による免疫染色を行い、GBM組織におけるIDO陽性細胞の分布状況を観察した。IDO陽性細胞はGBM組織中広範囲に認められたが、IDOモノクローナル抗体への反応の程度は領域により強弱が認められた。用いた臨床サンプル3例のうち、すべてにおいて壊死組織周辺、いわゆるpsuedopalisadingを形成する細胞にIDO強陽性細胞が多く認められた。一方、注目していた腫瘍血管周囲においてはIDO強陽性細胞が多く認められるもの、認められないものとまちまちであった。GBM stem cellsマーカーの一つであるNestin

発現細胞とIDO陽性細胞との分布比較ではpseudopalisading領域では良く一致していたが、腫瘍血管周囲においては、Nestin陽性細胞率が高いものの、IDO陽性細胞率はまちまちであった。また最近GBM幹細胞マーカーとして報告されたCD90陽性細胞とIDO陽性細胞との分布比較も行ったが、用いた3サンプルすべてにおいてCD90陽性細胞は腫瘍血管内皮細胞のみにしか認められず、腫瘍塊中に存在するIDO陽性細胞の分布とは一致しなかった。これらの臨床サンプルを用いた結果を参考にし、IDOとSox2、CD133等の幹細胞マーカーとの二重免疫染色を用いてGBM幹細胞自身のIDO発現有無と組織内分布を確定する予定であるが、これまでの結果からはGBM組織内でもIDO発現細胞の分布に偏在が存在することが確認され、同じ腫瘍内部でもIDOによる複雑な局所環境が混在していることが示唆された。・IDO monoclonal抗体とCD133抗体、あるいはSox2抗体との2重染色の条件設定困難。・GBM患者組織からの脳腫瘍幹細胞株樹立成功率の低さ。以上2点が実験計画遅延の主原因となっている。第一にIDOや幹細胞マーカーとして使用する抗体の選択に時間を要した。これまでグリオーマ幹細胞マーカーとして用いられてきたCD133に対する信頼性の高い組織用モノクローナル抗体が存在しないことが原因として上げられる。第二に本研究に使用する患者由来GBM stem cells株樹立が遅れているため、細胞を用いたin vitro実験の大幅な遅れとなっている。複数のGBM患者由来幹細胞株の樹立を行う。それらを用いてIDO活性評価を行い、脳腫瘍幹細胞、分化細胞におけるIDO活性状態を評価する。すなわち、幹細胞維持のためにIDO活性が必要かどうか、分化においてIDO活性がどう変化するか、を検討する。平行してIDO阻害が脳腫瘍幹細胞にどのような影響を与えるかを調べ、IDO阻害が今後の脳腫瘍治療の選択肢となりうるかどうかを検討する。In vitroにて期待される結果が得られた場合にはマウス腫瘍移植モデルを作成し、in vivoでの検討へと進む。IDO monoclonal抗体とCD133抗体、あるいはSox2抗体との2重染色の条件設定困難とGBM患者組織からの脳腫瘍幹細胞株樹立成功率の低さ、からの実験計画遅延により未使用研究費が生じた。この未使用額については延長期間内において主に脳腫瘍幹細胞樹立、継代培養に使用する予定である。H23年度に本研究に使用する患者由来GBM stem cells株樹立が遅れているため生じた繰越研究費については本来使用予定であった免疫組織学的実験とGBM stem cells
アルコール依存症者の回復過程と支援ネットワーク

本研究は、アルコール依存症者の「回復」過程を自己意識の視点から取り上げ、その「回復」像を明らかとした上で、現存する支援ネットワークを手掛かりに、当事者が支援を受けやすく、支援者も支援しやすい環境を作っていくために必要なことは何かを検討するものである。今年度については、国のアルコール健康障害対策基本計画の策定などを受け、既存のネットワークの現状及び、重要な社会資源である自助グループの機能について検討した。その結果、アルコール依存症の自助グループは当事者の回復に重要な役割を果たしている一方で、運営の会員負担などには課題が残り、支援が必要であること、従来とは異なる自助グループネットワークの構築が必要であることが示唆された。さらに、今後の支援ネットワーク構築にあたり欠かせない自助グループの活性化に、アルコール健康障害対策基本法が寄与できる可能性が高く、今後各地方自治体が作成するアルコール健康障害対策基本計画の動向には注意が必要である。さらに、支援ネットワークの現状を知るための予備調査の一環として、精神疾患に理解がある司法関係者への聞き取りを行ったが、実際にアルコール依存症への理解(例:難治性疾患であることなど)は浸透しておらず、知識を持っていない司法関係者が多いことが示唆された。アルコール依存症は家庭内暴力をはじめとした暴力事件など、司法との接点は多いため、アルコール関連問題への介入が困難である社会基盤の問題が改めて浮き彫りとなった。
物理・心理・生理指標を用いた“空気の質のよさ”意識構造の解明

室内化学物質濃度と建築材料や室内環境要因の間には密接な関連が認められた.築後月数,床材,壁・天井材,構造などの要因の影響が大きい.材料の種類と大きさの違いは,材料の印象に影響を与える可能性が示唆された.また,化学物質への感受性によって,材料の印象の強弱が異なる可能性が示された.生理反応としての脈拍数および脈拍比は,空間の差異により影響を受けている可能性が示唆された.総括すると,“空気の質のよさ"意識構造は,環境物理量のみではなく,空間構成要素と組み合わせ,印象の度合い,個人の感受性などによって,複合的に構成されている可能性が示唆された.本研究では“空気の質のよさ"がどのように評価されているか,という点に着目する.実住宅での環境物理量を測定し被験者実験より体感・心理量と生理データを得る.これらデータの統計解析を通じ“空気の質のよさ"意識構造を明らかにすることを目的とするものである.平成25年度について以下の項目を実施した.<環境物理量の測定>対象室の化学物質濃度,換気量,各部の大きさを測定し,調査対象室の環境物理量を明らかにした.<生理データの取得>生理指標の測定実験として,被験者に,異なる実験室にて加速度脈波を測定し,脈拍,心拍数等の自立神経機能などの生理データを計測し,併せてSD法による心理評価を得た.結果,生理反応と心理評価間に関係が見受けられた.室内化学物質濃度と建築材料や室内環境要因の間には密接な関連が認められた.築後月数,床材,壁・天井材,構造などの要因の影響が大きい.材料の種類と大きさの違いは,材料の印象に影響を与える可能性が示唆された.また,化学物質への感受性によって,材料の印象の強弱が異なる可能性が示された.生理反応としての脈拍数および脈拍比は,空間の差異により影響を受けている可能性が示唆された.総括すると,“空気の質のよさ"意識構造は,環境物理量のみではなく,空間構成要素と組み合わせ,印象の度合い,個人の感受性などによって,複合的に構成されている可能性が示唆された.本研究では“空気の質のよさ"がどのように評価されているか,という点に着目する.実住宅での環境物理量を測定し被験者実験より体感・心理量と生理データを得る.これらデータの統計解析を通じ“空気の質のよさ"意識構造を明らかにすることを目的とするものである.研究初年度となる平成24年度について以下の項目を実施した.<環境物理量の測定>対象室の化学物質濃度,換気量,各部の大きさを測定し,調査対象室の環境物理量を明らかにした.<心理量の測定>実空間体験後,被験者8名による評価グリッド法により“空気の質のよさ"に関する評価概念を試験的に抽出した.結果,開口部が大きいほど空気の質が高いと評価された.これは換気量の多さとの相関が想定しうる.<生理データの取得>生理指標の予備的測定実験として,被験者に,異なる実験室にて加速度脈波を測定し,自立神経機能などの生理データを計測し,併せてSD法による心理評価を得た.結果,生理反応と心理評価間に関係が見受けられた.現在,研究中間年度として上記の3指標相互のプレ解析を進めている.また,実住宅を用いた本実験の準備を開始しており,実施後,データ解析を進め“空気の質のよさ"意識構造を明らかにする予定である.本研究では空気の質のよさがどのように評価されているか,という点に着目する.実住宅での環境物理量を測定し被験者実験より体感・心理量と生理データを得る.これらデータの統計解析を通じ空気の質のよさ意識構造を明らかにすることを目的とするものである.平成26年度の研究実績の概要は以下の通りである.平成24年,25年に実施した研究成果を踏まえて,室内化学物質を低減した商業施設を計画・工事監理と濃度評価を実施した結果を解析し,平成26年室内環境学会学術大会にて発表した.また,住空間の化学物質の低減を目的とし,室空間を構成する様々な要因と室内TVOCの関係を解析した結果よりTVOCを低減した室空間の計画・設計支援ツールを開発した.開発したツールを用いて設計・計画した実住宅の濃度と予測結果を比較し,ツールの有効性を確認した.これらの研究成果を広く社会に還元するために,これから住宅を計画・建設する施主や施工者が,ツールを用いたシミュレーションを実施できるよう,ツールをウェブサイトにアップロードした.本研究課題を構成する,室内化学物質濃度と建築材料の関係に関する研究,建築材料の種類と大きさの違いが材料の印象評価に与える影響に関する基礎的研究,脈拍数の測定と脈拍比による分析:空間の差異と生理反応・心理評価の研究を総括し,研究報告書をまとめた.そして,一連の研究成果を,次世代社会基盤の構築,予防医科学と建築・都市デザインの連携として総括し,第12回日本予防医学会学術総会にて発表した.都市計画・建築計画本研究課題は<1環境物理量の測定>,<2心理量の測定>,<3生理データの取得>の3つの骨子からなり,平成25年度についてはいずれも実験を遂行できた.研究内容の妥当性が得られ,国際学術集会での発表に至ったことから“おおむね順調"と評価した.現在、3指標相互のプレ解析をすすめ,“空気の質のよさ"意識構造について鋭意究明を進めている.

本研究課題は<1環境物理量の測定>,<2心理量の測定>,<3生理データの取得>の3つの骨子からなり,平成24年度についてはいずれもプレ実験を遂行でき,特に1については対象室の詳細を確認することができた.研究方法の妥当性が得られ,今夏開催される国際学術集会への発表を予定するまでに至ったことから“おおむね順調"と評価した.3指標相互のプレ解析をすすめ,“空気の質のよさ"意識構造について鋭意究明を進めている.研究目的の骨子の一つである<3生理データの取得>について,さらにその検証を進めることが課題といえる.生理データについては,環境物理量の違いに起因する変化であるのか,バイオリズム的変化であるのか,個人差や生活習慣,測定のタイミングなど,多様な要素が関連している.有用な生理データを得るためには,環境物理量の設定が非常に重要であり,この点についてより深い検証が必要であると考えている.今年度は,年齢と性別について調整した結果を得た.今後は、対象者のうち数名について長期に渡る計測を実施し、確認する予定である.研究遂行の中間年度を迎え、研究目的の骨子の一つである<3生理データの取得>について,さらにその検証を進めることが課題といえる.これまでに,環境物理量と心理量に関するデータや知見は蓄積されてきているが,生理データについては,環境物理量の違いに起因する変化であるのか,バイオリズム的変化であるのか,個人差や生活習慣,測定のタイミングなど,多様な要素が関連している.有用な生理データを得るためには,環境物理量の設定が非常に重要であり,この点についてより深い検証が必要であると考えている.未使用額が生じた理由は,研究プロトコルの精査により,測定器の物品購入の必要が無くなったことと,研究代表者自らがデータ整理を実施したため,謝金が発生しなかったことなどである.最終年度として、主として報告書作成費及び、成果発表のための国内旅費及び外国旅費,資料整理や論文校閲などの研究推進に使用する予定である.そのほか研究遂行必要経費として,交通費,印刷費,消耗品費などに使用する予定である.主として成果発表のための国内旅費及び外国旅費,資料整理や論文校閲などの研究推進に使用する予定である.そのほか研究遂行必要経費として,交通費,印刷費,消耗品費などに使用する予定である.未使用額が生じた理由は、研究プロトコルの精査により、測機器の物品購入の必要性が無くなったことと、研究代表者自らがデータ整理を実施したため、謝金が発生しなかったことなどである.
細胞死を制御する microRNA の同定とそのがん化における役割

WT1遺伝子は白血病をはじめ種々の固形癌において過剰発現し、抗アポトーシス機能など癌遺伝子様機能を果たすことによりがん化に深く関与する。本研究では、WT1遺伝子を直接の標的としその発現を抑制するmicroRNAとしてmicroRNA-A(miR-A)を同定した。miR-A欠損マウスは、末梢血、脾臓、骨髄において成熟骨髄系細胞の増加を特徴とする骨髄増殖性疾患(MPD)を発症した。miR-A欠損MPD発症マウスの骨髄では、造血幹前駆細胞(LSK細胞;Lineage-Sca-1+c-Kit+)の増加、LSK細胞におけるWT1の発現上昇が認められた。さらにLSK細胞におけるWT1の発現抑制は骨髄系細胞の増殖を抑制した。以上より、miR-Aは骨髄造血幹前駆細胞においてWT1の発現を調節し、その調節機構の破綻は骨髄増殖性疾患発症に繋がることを明らかにした。WT1遺伝子は白血病をはじめ種々の固形癌において高頻度に過剰発現し、がん化に深く関与する。したがって、WT1の発現を調節する機序の解明は、がんの発症や進展の機序を理解するうえで重要である。次に、生体内におけるmiR-Aの機能解析を目的とし、miR-Aノックアウトマウスを作成し解析した。miR-A(+/-)ヘテロ欠損マウスおよびmiR-A(-/-)ホモ欠損マウスはともに、末梢血、脾臓、骨髄において成熟骨髄系細胞の増加を特徴とする骨髄増殖性疾患(MPD)を発症した。MPDを発症したmiR-A欠損マウスの骨髄では、造血幹細胞分画(LSK細胞分画;Lineage-Sca-1+c-Kit+)が増加していること、増加したLSK細胞においてWT1の発現が上昇していること、LSK細胞におけるWT1の発現抑制は骨髄系細胞の増加を抑制することを確認した。これらの結果は、miR-Aは造血幹細胞分画においてWT1の発現を調節することにより骨髄系細胞の産生を制御していることを示している。さらに、MPDを発症していないmiR-A(-/-)ホモ欠損マウスのLSK細胞分画では、microRNA-X (miR-X)の発現が誘導されていること、miR-XもまたmiR-Aと同様にWT1の発現を抑制することを明らかにした。これらの結果は、骨髄造血幹細胞におけるWT1の発現は2種のmiRNAにより調節されており、その調節機構の破綻がMPD発症に繋がる可能性を示している。WT1遺伝子は白血病をはじめ種々の固形癌において高頻度に高発現し、がん化に深く関与する。しかし、WT1遺伝子の発現を調節する分子機序の詳細は未だ明らかにされていない。本研究では、WT1遺伝子を直接の標的としその発現を抑制するmicroRNAとしてmicroRNA-A(miR-A;仮称)を明らかにした。さらに生体内におけるmiR-Aの機能解析を目的とし、miR-Aノックアウトマウスを作成し解析した。その結果、miR-A(+/-)ヘテロ欠損マウスおよびmiR-A(-/-)ホモ欠損マウスともに、末梢血、脾臓、骨髄において成熟顆粒球の増加を特徴とする骨髄増殖性疾患(MPD)を発症することを明らかにした。さらにMPDを発症したmiR-A欠損マウスの造血幹細胞を多く含むLSK細胞分画(Lineage-Sca1+cKit+)において、標的遺伝子WT1の発現上昇が認められ、WT1-shRNA処理によるその発現抑制は、骨髄系細胞の増殖を阻害することを確認した。これらのことは、造血幹細胞分画においてmiR-Aは標的遺伝子WT1の発現を調節し、骨髄系細胞の産生を制御していること、さらにその制御機構の破綻が骨髄増殖性疾患の発症や維持に関与している可能性を示している。次年度は造血幹細胞において細胞内分子レベルでの詳細な解析を進めるとともに、これらマウス解析から得られた知見とヒト白血病との関連性を検討していく。今年度は、作成したmiR-A欠損マウス解析をとおし、miR-Aは特に造血幹細胞分画で重要な機能を果たしていること、そしてその欠損マウスは造血幹細胞異常を原因のひとつとする骨髄増殖性疾患を発症しうることを明らかにし、おおむね期待通りの知見が得られており順調に進展しいている。miR-Aノックアウトマウス解析より、miR-A欠損は造血幹細胞レベルの異常に起因する骨髄増殖性疾患につながることが明らかになってきた。

また骨髄増殖性疾患を発症したmiR-A欠損マウスの造血幹細胞分画において標的遺伝子WT1の発現上昇が確認された。今後は、造血幹細胞分画においてmiR-AがWT1を含めその他にもどのような遺伝子群を調節し、どのようなシグナルを制御しているのかを分子レベルで解析していく。また、マウス解析から得られたこれらの結果が、ヒト白血病においても関連があるのかを検討するため、白血病患者骨髄の幹前駆細胞分画を分離し、miR-Aの発現や標的遺伝子の発現を解析していくことを計画している。今年度は、miR-A欠損マウス解析により、miR-Aは特に造血幹細胞分画において標的遺伝子の発現を調節し重要な機能を果たしていることを明らかにした。次年度は、造血幹細胞分画においてmiR-Aが下流標的遺伝子WT1を含めどのような遺伝子群およびシグナルを調節しているのかを分子レベルで解析することを目的に、DNAマイクロアレイ解析費用に研究費を使用することを計画している。次に、アレイ解析から抽出できた遺伝子やヒト白血病患者骨髄におけるこれらの遺伝子やmiR-Aの発現を解析するためのPCR試薬キット類、その他マウス飼育費等に研究費を使用することを計画している。
電気化学ポテンシャルを制御したカンチレバーによる静電相互作用検出の基礎と応用

近年、溶液-電極界面のイオン分布を微視的に明らかにする測定手法が望まれている。電気化学走査プローブ顕微鏡は、電極表面構造解析の要となってきたが、複雑な電気二重層によって得られたデータの解釈は困難である。昨年度は、電位制御可能な原子間力顕微鏡を開発し、イオン対の構造評価が可能なことを示した。今年度は、本システムを様々な電解質溶液中で適用し、帯電した自己組織化膜のイオン対構造を系統的に明らかにした。これまで、水溶液中で原子・分子分解能を有する電気化学走査トンネル顕微鏡(EC-STM)や電気化学原子間力顕微鏡(EC-AFM)を用いたソフトマテリアルに関する研究が多数行われてきた。近年、これらを利用した細胞膜の吸着タンパク質の構造、反応、拡散過程等の解明が、生物・医科学分野から求められている。しかしながら超高真空中とは異なり、観察中に複雑な電気二重層が形成されているため、得られたデータの正確な解釈はほぼ不可能に近いのが現状である。我々は、様々な電位プロファイルの界面を自由に形成するため、探針および試料電位を独立に制御可能なAFMシステムの構築を行った。種々の末端官能基を有する自己組織化単分子膜(SAM)間のフォースカーブ測定を行ったところ、電気化学不活性なメチル(CH_3)またはアミノ(NH_3^+)末端SAM間の場合、フォースカーブはアプローチ、リトラクト時共に電極電位に依存しなかった。その結果、本研究で用いた条件下では、電気二重層の充電による帯電効果は探針-試料間の力測定に影響を及ぼさないことが分かった。一方、電気化学活性なフェロセン(Fc)末端SAM間の場合、Fcの酸化状態に応じてフォースカーブが大きく変化し、Fcの帯電に伴う界面エネルギー変化を検出可能なことが分かった。また、ほぼ同程度の表面密度で正電荷を有するNH_3^+およびFc^+末端SAM間のアプローチカーブを比較することで、SAMと対アニオンとのイオン対の構造が両者で大きく異なることが分かった。本年度の研究によって、プローブが測定対象に及ぼす影響が明らかになり、本手法が様々な系において、定量的な相互作用評価ツールとなりえることが分かってきた。電気化学走査トンネル顕微鏡(EC-STM)や電気化学原子間力顕微鏡(EC-AFM)をはじめとする電気化学走査プローブ顕微鏡は、電解質溶液中で原子分解能観察が可能なことから、電極表面の構造解析の要となってきた。しかしながら真空中とは異なり、観察中に複雑な電気二重層が形成されるため、得られたデータの正確な解釈は不可能に近い。特に、単なる表面のイメージングを越えて原子・分子レベルでの物性測定を行うためにはこの問題を克服することが必須である。これまでのEC-STMを利用した物性測定の知見から、この問題点を解決するためにはプローブが測定対象に及ぼす影響を正確に理解する必要がある。今年度は、昨年度に構築した探針および試料電位を独立に制御可能な原子間力顕微鏡(AFM)システムを用いて、種々の末端官能基を有する自己組織化単分子膜(SAM)間のフォースカーブ測定を行った。電気化学活性なフェロセン(Fc)末端SAM間の場合、Fcの酸化状態に応じてフォースカーブが大きく変化し、Fcの帯電に伴う界面エネルギー変化を検出可できることが分かっている。この知見を基に、中性のFc末端SAMに、これを酸化できる電位に制御したCH_3末端SAM探針を近づける実験を行ったところ、CH_3末端SAMのアルキル鎖長が短くなると、探針によりFcが酸化されることを示唆するフォースカーブが得られた。これにより、探針と試料間の距離が数nm以下の場合には、探針が試料の状態を変える事が明らかになった。