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新しい電力計測技術の開発

交流電圧標準と交流電流標準を導くサーマルコンバータを用いて、交流電力標準を構築した。現在、交流電力の国家標準は、電圧標準、電流標準、位相標準の個別の国家標準の組み立て量である。この方法では、校正された交流電圧計、交流電圧計、位相計が基準器として用いられるため、電力標準の高精度化や範囲拡張が難しい。サーマルコンバータは、電圧範囲1 mV1000 V、電流範囲1 mA100 A、周波数範囲10 Hzから1 MHzまでの任意の交流電圧及び交流電流標準の基準器として用いられており、交流電力標準として用いた場合、範囲拡張が容易となる。サーマルコンバータは経年変化も小さく、不確かさ改善やメンテナンスなどの労力の削減につながる。本研究では、電力標準の基準器として用いることができるサーマルコンバータの開発と範囲拡張が可能な電力測定システムの開発を行った。サーマルコンバータの作製については、電圧入力が10 Vまで、周波数範囲10 Hz1 kHz、電流は0.1 A、10 Hz1 kHzまで印加可能なサーマルコンバータを開発した。開発したサーマルコンバータのヒータ抵抗は、熱伝導率の高い窒化アルミ基板上に作製しており、温度変化の低減やヒータ抵抗の温度係数の改善などにより、電圧と電流とも60 Hzの周波数で、不確かさが20%改善した。また、開発した電力測定システムにおいて、電圧及び電流はサーマルコンバータを参照して校正された値を出力する。電圧と電流の位相は多相発信器の信号を参照として任意に調整することが可能である。このシステムにおいて、10 V、0.1 A、及び100 V、5 A、周波数は60 Hzの力率1の電力校正システムを構築した。値の確認のため、市販のデジタル電力計を仲介器として国家標準との比較を行い、新しく開発した電力測定システムと国家標準の校正結果は良い一致が得られた。計量標準において、交流電力標準を新しい原理で構築することを研究の目的とする。現在、交流電力の国家標準を最も精度良く確立できる方法は、電圧標準、電流標準、位相標準の個別の国家標準を組み合わせて実現する方法である。この方法は、各標準により校正されたデジタルの交流電圧計や位相計を用いて電力標準を確立しているが、デジタル機器が基準となるため、温度などの外乱の影響や経年変化により、高精度化に限界がある。また、現在の方法では、100V、5A、50 Hzの決まった値の電力の校正は可能であるが、20 V、3A, 600Hzのような中途半端な電力の基準を実現するのは手間がかかる。範囲の拡張において、50 Hzや60 Hz以外の拡張する周波数の交流電圧や交流電流の標準が必要であり、電力の国家標準において、1 kHz以上の校正を供給している国は極めて少ない。サーマルコンバータを用いた物理現象の原理に基づいた電力基準器を開発することで、電圧や周波数の拡張が容易になり、高精度化も期待できる。これまで、サーマルコンバータと呼ばれる熱-電気変換素子は、交流電圧標準と交流電流標準の基準として用いられてきた。従来のサーマルコンバータは印加できる電圧範囲が限られ、壊れ易いため、サーマルコンバータを用いた電力標準への応用研究は実績が乏しかった。本研究で開発するサーマルコンバータは、ヒータ薄膜を、熱電対とは別の熱伝導率の高い窒化アルミ基板に作製することにより、耐電圧を改善し、電圧範囲を従来の1 Vから10 Vまで拡張する。また、ヒータ抵抗値や熱的な時定数を適切に選ぶことで、50 Hzから10 kHzまでの周波数特性を改善する。サーマルコンバータを用いることで、交流電力標準の高精度化や範囲拡張が容易になり、再生可能エネルギーを利用した電力の取引や無線電力伝送技術の開発に貢献できるものである。今年度は初年度であり、サーマルコンバータのプロトタイプの作製と電力計測システムの開発に着手することが計画であった。サーマルコンバータの作製については、入力が10 Vと0.1 Aまで印加可能なサーマルコンバータを開発した。サーマルコンバータは、直流と交流の電気エネルギーを熱エネルギーに変換して比較するが、100 Hz以下の低周波では、ヒータの温度が入力交流電圧・電流の周波数変化に追随する熱リップルにより、正確な温度測定が難しくなる。また、ヒータ抵抗値の温度依存の影響でも不確かさが大きくなる。低周波範囲の交流電圧測定の不確かさ改善を行うため、ヒータ抵抗の温度係数を10 ppm以下に改善し、熱リップルの影響を小さくできる熱的時定数のサーマルコンバータを開発した。結果として、10 V, 50 Hzの交流電圧の交直差の不確かさは従来の12 ppmから4 ppmに改善した。この結果は、28年度の電気学会全国大会で発表を行った。サーマルコンバータを電力基準器とした新しい電力標準を評価するため、現在の電力計測システムと比較評価するための準備を行った。現在の電力の国家標準においては、デジタル電力計に入力される交流電圧と電流を校正して、電力標準が求められている。このため、交流電圧と交流電流が校正できるシステムの開発を行った。交流電圧については、電圧用サーマルコンバータを用いて電圧計を校正するシステムを構築した。交流電流は交流シャント抵抗と交流電圧を基準として求めているため、シャント抵抗の電圧の計測で必要となる低電圧交流電圧標準の高精度化を行った。結果として、低電圧範囲の不確かさを約2割改善し、高精度の交流電流評価が可能となった。この結果については、精密電気計測の国際学会(CPEM)で発表した。また、同内容を査読付き英文誌に投稿し、アクセプトされており、2017年度に掲載予定である。

交流電圧標準と交流電流標準を導くサーマルコンバータを用いて、交流電力標準を構築することを研究の目的としている。現在の交流電力標準は組み立て量であるため、100V、5A、50 Hzの決まった値の電力の校正は可能であるが、65 V、4A, 600Hzのような中途半端な電力の基準を実現するのは難しく、不確かさも大きくなる。サーマルコンバータを用いることによって、電圧、電流範囲や周波数範囲の拡張が容易になり、不確かさも改善可能である。また、経変変化が小さいメリットもあり、メンテナンスなどの労力の削減につながる。今年度は、サーマルコンバータを基準器として用いたときの不確かさ評価とサーマルコンバータの開発を行った。現在の電力の国家標準との比較の目的で、電圧は100 V、電流は5 Aの測定システムの開発と不確かさ評価を行った。サーマルコンバータ素子とレンジ抵抗器を組み合わることで、任意の電圧と周波数の交流電圧標準が可能となり、また範囲拡張も容易となることから、100 V用の薄膜型レンジ抵抗器とレンジ抵抗器専用の100 Ωのサーマルコンバータ素子を開発し、不確かさ評価を行った。薄膜型レンジ抵抗器は、現在のところ、我々のグループのみで作成可能であり、電圧依存が従来より小さく、また周波数特性も小さい。この結果については、2018年の7月に開催される精密電気計測の国際学会(CPEM)で発表する予定である。5 A用のサーマルコンバータについても開発を行い、5 A、50 Hz 1 kHZの周波数範囲で不確かさ評価を行った。サーマルコンバータの開発に加えて、電力計測システムの開発も進めた。位相の精密測定に関しては、電圧と電流の位相をロックインアンプで測定するシステムを開発した。力率1を実現するため、位相の調整が必要であり、交流電圧と交流電流発生器の同期をとるシステムの開発を行った今年度は、新しい電力標準器用のサーマルコンバータの開発と電力標準測定システムの準備を進めた。国家標準と電力量を比較する目的で、100 Vの電圧と5Aの電流用のサーマルコンバータの設計と開発、評価を行った。100 V用のサーマルコンバータの設計では、抵抗値、抵抗形状、浮遊容量、誘電損失などのパラメータをモデル化して、周波数特性の解析を行い、サーマルコンバータの開発に反映させた。100 V用のサーマルコンバータはサーマルコンバータ素子とレンジ抵抗器で構成されており、レンジ抵抗器の性能が不確かさの主な要因となるため、新しい薄膜型レンジ抵抗器を作製した。開発した薄膜型レンジ抵抗器は、従来と比べ電圧依存が改善され、周波数特性も50 Hz- 1 kHzで2 ppm以内と小さい。これにより、従来の電力標準では校正が難しかった80 V、600 Hzなどの任意の電圧、周波数での校正が可能となる。新しいレンジ抵抗器の開発は国際学会(CPEM)で7月に発表予定である。電流についても5 A用のサーマルコンバータを開発し、50 Hz- 1 kHzの不確かさ評価を行った。
撥水性固体表面の不均一性が静的・動的濡れ性に及ぼす影響の実験的解明

本研究ではnmレベル及びμmレベルの物理的・化学的不均一が擬水性能に与える影響を明らかにすることを目的とした。意図的に(1)物理的不均一性、(2)化学的不均一性を付与したパターンコーティングを作製し、パターンサイズ、液滴サイズを系統的に変化させることで各項目の濡れ性への影響の検討を行った。(1)周期性の乏しい表面粗さ形状を有し、表面粗さが異なる2種類の超撥水性コーティングを作成し、それらの表面上で、水滴の蒸発過程での濡れ状態の転移(撥水性固体-液体界面での空気の含有量の変化)を詳細に観察した。各コーティングの表面形状から平均凹凸間隔と平均凹凸高さを見積り、これらを用いて濡れ状態の転移が起こる液滴径を算出したところ、実測値に近い値となることを示した。この結果から、濡れ状態の安定性を評価・比較する上で有効であることが明らかとなった。また、外部環境の変化に伴う濡れ状態の観察において、シランの分子長が濡れ状態の転移に影響を与えることを明らかとした。(2)撥水性シランを用いて分子レベルの平滑性を有したコーティングを作製し、これに対してフォトリソグラフィー法により化学的不均一部位としての親水性領域を規則的に配置した表面を作製し、これらの上で水滴の転落角と転落速度を測定した。パターンの大きさを相似的に変化させた場合、パターンサイズが大きいほど転落角が大きくなることを確認した。したがって、パターンサイズが大きいほど液滴は転落開始しづらいという傾向が明らかとなった。一方、転落速度はパターンサイズが大きいほど大きくなった。これらの結果から、液滴移動開始時と液滴移動時で表面欠陥は異なる影響を及ぼすことが実験的に明らかとなった。さらに、同様の傾向が物理モデルによる計算と流動シミュレーションからも確認された。本研究ではnmレベル及びμmレベルの物理的・化学的不均一が撥水性能に与える影響を明らかにすることを目的としている。意図的に(1)物理的不均一性、(2)化学的不均一性を付与したパターンコーティングを作製し、パターンサイズ、液滴サイズを系統的に変化させることで各項目の濡れ性への影響の検討を行っている。(1)各種固体表面にセラミックス球状粒子をランダムに堆積させたのち、援水コーティングを施すことで、nmオーダーの物理的粗さを有した超撥水性コーティングの作製に成功した。施す撥水性コーティングの種類を変化させ、固体表面の濡れ性を制御することで、濡れモード転移現象の検討を実施した。その結果、表面の濡れ性の違いにより、結露状態での濡れモード転移現象に違いがあることが明らかとなった。今後は微小液滴(ナノリットルオーダー)蒸発過程における濡れモード転移現象の表面粗さサイズ依存性を検討する予定である。(2)固体表面に撥水性コーティングを形成した後、真空紫外光(172nm)とフォトマスクを用いてコーティングの一部をエッチングする方法により、親水部を含有する撥水性パターンコーティングを4種類作製した。これらのコーティング上での水滴転落挙動を観察し、表面欠陥サイズが液滴の移動に及ぼす影響を検討した。その結果、液滴移動開始時と液滴移動時で表面欠陥は異なる影響を及ぼすことが明らかとなった。今後は計算科学的解析・流動シミュレーションを用いて、これらの現象のモデル化に取り組む予定である。
対数的スムース退化上の混合ホッジ構造の研究

対数的スムース退化の一典型例である、ログ・デフォメーションの相対対数的ドラーム・コホモロジー群上に、自然な「積」および「トレース射」を構成した。さらに、これらが混合ホッジ構造の「偏極」を与えることを証明した。ここで「偏極」とは、ウエイト・フィルトレーションの各次数化上で個別に定まるものではなく、コホモロジー群全体で定義され各次数化上ではモノドロミー作用と上手く両立するような双線形形式のことである。対数的スムース退化の一典型例である、ログデフォメーションの相対対数的ドラーム複体のコホモロジー群上のモノドロミー作用について考察を進める中で、コホモロジー群上の「偏極」を構成することが、対数的ホッジ構造の研究とも相俟って、重要であることを見出すに至った。ここで偏極とは、スティーンブリンク・ズッカーが定義した、ウェイトフィルトレーションの各次数化上に個別に定まるものを指すのではなく、各次数化上ではモノドロミーの作用と上手く両立するような、コホモロジー群全体の上に定まる双線形形式のことである。(この意味での偏極は、カタニ・カプラン・シュミット等がベキ零軌道定理に関連して用いている。)そこで、このような偏極を構成するための第一段階として、ログデフォメーションの相対対数的ドラームコホモロジー複体上に「積構造」を定め、これが各次数化上では、既約成分であるコンパクト複素多様体のコホモロジー群における積から導かれるものと一致することを証明した。その際、スティーンブリンクによって構成された混合ホッジ複体と、単体的手法によって構成された混合ホッジ複体の間に自然な同型が存在することを明らかにした。そこで、最高次数のコホモロジー群からのトレース射を見出すことが次の課題となるが、これについても、然るべき候補を発見することに成功した。この候補がトレース射として期待される性質をもつかどうかを調べることが、次の課題である。平成20年度からの継続として、対数的スムース退化の典型例であるログデフォメーションの相対対数的ドラームコホモロジー群上に「偏極」を構成することに取り組んだ。平成20年度の研究により、ログデフォメーションの相対対数的ドラーム複体上に「積構造」が定まることが示されており、次に取り組むべきは、最高次数のドラームコホモロジー群からのトレース射を見出すことであった。そのためには、ウェイトフィルトレーションから定まるスペクトル列のE_1-項から積分によって与えられる射が、E_2-項からの射に降下することを確かめれば良いことが、既に昨年度の研究によって示されていたが、平成21年度には、この「降下」を示すために、上記スペクトル列のE_1-項の間の射をギシン射と制限射を用いて記述した上で、積分とこれらの射との間に成り立つ関係式を正確に計算することに取り組んだ。その結果、従来からの単体的手法に改良を加えることによって、この計算をより正確に、しかも見通し良く実行することができることを見出し、最終的に然るべきトレース射を構成することに成功した。(この成果の一端を京都大学数理解析研究所で行われた研究集会「高次元代数幾何の周辺」において発表する機会を得た。)平成20年度・21年度の研究により、ログデフォメーションの相対対数的ドラームコホモロジー群上に「偏極」を構成するためのデータである「積」と「トレース射」を構成することができた。従って、これらのデータがまさしく「偏極」を定めるものであることを確かめることが来年度の最初の課題となる。本年度は、まず、前年度までの研究で得られていた「積」および「トレース射」が、ログデフォメーションの相対対数的ドラーム・コホモロジー群上に「偏極」を定めることの証明に取り組んだ。その結果、齋藤盛彦氏や、ギレン・ナヴァロ-アスナール氏等による先行結果を参照することにより、上記「積」および「トレース射」が、実際に「偏極」を与えていることを証明することができた。さらにその系として、ログデフォーメションの相対対数的ドラーム・コホモロジー群が、標準対数的点(スタンダードログポイント)上に、(偏極可能な)対数的ホッジ構造の変動を引き起こすことを示した。現在これらの結果について論文を執筆中である。また、近く京都大学数理解析研究所から出版されるRIMS Kokyuroku BessatsuB24「Higher Dimensional Algebraic Geometry」の中にその要約が掲載される予定である。今後、ログデフォメーションの一般化である対数的スムース退化に対して、この結果を拡張することにが、研究を進展させる手掛りになるものと考えている。一方、年度当初に第2の研究課題として挙げていた、被約でない対数的スムース退化の相対対数的ドラーム複体の考察については、時間の制約のため目立った成果を得ることができなかった。巡回被覆を用いて、モノドロミー作用がべき単の場合へ帰着する方法を始めとして、幾つかの手掛りは得られており、今後の研究課題としたい。
化学蒸着法によるゼオライト外表面酸点の不活性化

シリカ化学蒸着はゼオライト触媒の形状選択性を高める修飾方法として広く用いられている。ゼオライトにシリカ蒸着を行うと、ゼオライト内部の酸性質は変えずに、細孔入口径の制御および外表面酸点の不活性化が可能である。しかし、工業的に多く使われているY型ゼオライトへの応用については、大きいシラン化剤分子であるテトラメトキシシランが細孔内に入るという報告があるのみである。Y型ゼオライト触媒の触媒特性を高める方法として脱アルミニウムする方法があり、この方法で調製したY型ゼオライトは熱安定性が増すことが知られている。そこで本研究では、Y型ゼオライトを脱アルミニウムし、アルミニウム濃度が異なるY型ゼオライトを調製しシリカ蒸着を行い、細孔入口径の制御を試みた。シリカ蒸着の際、シラン化剤が触媒の外表面だけに存在するか、または細孔の中まで入るかを調べるため、窒素吸着による表面積の変化とIRによる触媒の酸性水酸基の変化を調べた。また、シリカ蒸着による触媒の細孔入口径の変化を調べるため、1,3,5-トリイソプロピルベンゼンの吸着実験をマイクロバランスを備えた真空装置で行った。その結果、アルミニウム濃度が多いY型ではシラン化剤の蒸着により細孔が閉鎖されるに対して、脱アルミニウムしたY型ではシラン化剤の蒸着により細孔の入口径が制御できることを見出した。この触媒を用いて、2-イソプロピルナフタレンのイソプロピル化反応を行い、多環芳香族反応においての触媒性能を調べた結果、2,6-ジイソプロピルナフタレンの選択性が向上することがわかった。さらに、この触媒は優れたクラッキング触媒(FCC触媒)としても期待できる。
S.mutansの蛋白質抗原におけるT細胞エピトープおよびアグレトープの解析

う蝕発症に重要に関わるS.mutansの菌体表層蛋白質抗原(PAc)は、う蝕用ワクチンの候補として注目されている。そこで申請者は、このPAcを用いてより最小単位で免疫原性の強く安全性の高いうう蝕用ワクチンを開発することを目的とし実験を行った。PAc遺伝子工学的手法を用いて7つに分割しその断片中に存在するT細胞エピトープの解析を行なった。その結果アラニンの豊富な繰り返し領域を含むPAc-2フラグメントに、多数のT細胞エピトープが存在していることが認められた。アラニンの豊富な繰り返し領域はう蝕発症の起点となるS.mutansの歯への付着に関わっているという他のグループによる報告もあることから、この領域をカバーするアミノ酸残基4個をオーバーラップしたアミノ酸残基19個のペプチドを合成し、その合成ペプチドに存在するT細胞エピトープの検討を行なった。PAcの自然抗体を有する被験者由来の末梢血単核細胞と合成ペプチドを用いてT細胞の増殖実験を行なうと、PAc(アミノ酸残基番号,196-214),PAc(211-229),PAc(241-259),PAc(301-319),PAc(407-425)の5つのペプチドにおいてT細胞の増殖活性が認められた。5つのペプチドのアミノ酸配列の共通性を検討すると、Y-AKL--YQ、NAAN-A-YQ、NA-AKAAY--AVAANの3つの共通アミノ認められた。よって合成ペプチドにはこの共通アミノ酸配列を含んだT細胞エピトープが存在していることが示唆された。また同時にこの共通アミノ酸配列を含むアグレトープも存在していることが示唆された。このようなT細胞エピトープとアグレトープおよび申請者より解析中であるB細胞エピトープを含めてアミノ酸配列を設計することにより、目的としたより最小単位で免疫原性の高く安全性の高いう蝕用ワクチンを開発することができる。今後より詳細な検討のために、この共通アミノ酸配列を含んだペプチドを合成し、T細胞エピトープとアグレトープの解析を行う予定である。
農薬パラコートの生体内解毒機構の研究

13年度の研究成果より,マウスにおいてパラコート(PQ)解毒系として,肝臓の薬物代謝系酵素(NADPH-cytochrome P450 reductaseおよびCYP3A,2B)が働いていることがin vivo実験で明らかとなった。そこで,本年度はPQ代謝経路がどの様に関わっているかを更に詳細に明らかにするため,マウス肝ホモジネートよりポストミトコンドリア画分,ミクロソーム画分およびサイトゾルを調製し,in vitroでのPQ代謝活性を測定した。マウス肝ホモジネートをPQとNADPHとともに反応させると,PQが減少し,代謝中間体であるparaquat-monopyridone(PM)が生成した。CYP3A阻害剤であるtroleandomycinはPQの減少を抑制し,PMを増加させた。また,PMはミクロソーム画分ではなくサイトゾルで生成していた。フェニトインによってマウス肝のCYP3Aおよび2Bを誘導すると,ポストミトコンドリア画分でのPM生成が減少したが,サイトゾルでは変化が見られなかった。これらの結果より,PQはサイトゾルでPMとなった後,小胞体薬物代謝酵素系によって水酸化解毒されることが明らかとなった。これまでに我々はPQ毒性発現がミトコンドリアにおけるフリーラジカル生成によるものであること,細胞膜透過性フリーラジカルスカベンジャーが毒性を抑制することを明らかにしている。そこで次に,リファンピシンやフェニトイン処理によってCYPを誘導したマウスにPQを投与し,引き続きフリーラジカルスカベンジャーであるα-トコフェロール(α-T)を繰り返し静注投与した。その結果,PQ単独投与では生存率が40%だったのに対し,CYP誘導とα-T投与によって100%にまで回復した。以上のことから,PQ中毒においてCYP誘導とα-T投与が有効な治療となりうることが強く示唆された。パラコート(PQ)解毒に対する薬物代謝酵素系の関与を明らかにするため,マウスにシトクロムP450(CYP)誘導剤,または,抑制・阻害剤を投与した後,PQ(50mg/kg)を投与してその生存率を測定した.薬剤処理しないマウスの7日後の生存率は41%であったが,CYP誘導剤であるフェニトイン,フェノバルビタールおよびリファンピシン投与マウスではそれぞれ88,64,69%と有意に上昇した.フェニトインは肝ミクロゾーム中のNADPH-シトクロムP450リダクターゼ(CPR),CYP3A,CYP2B,CYP2C活性および蛋白量を3-4倍に増加させた.フェノバルビタールとリファンピシンはCPRに加えてCYP2BとCYP3Aをそれぞれ増加させた.3-メチルコランスレン処理では酵素活性,生存率共に変化は見られなかった.一方,CYP合成阻害剤である塩化コバルトおよびCYP活性阻害剤であるSKF525-A処理したマウスでは5日目に全てのマウスが死亡した.塩化コバルト処理により,肝ミクロゾーム中のCYP活性,酵素量は減少していた.また,CYP3A阻害剤であるトロルアンドマイシン処理により生存率が12%に減少した.以上のことから,マウスにおいて薬物代謝酵素系は,従来より定説となっていたPQ毒性機構に関与しているのではなく,むしろPQ解毒系として働いていることが明らかとなった.現在,マウス肝臓ホモジネートのsubfractionを用いて,パラコート代謝産物の測定を行っており,来年度はパラコート解毒機構の更に詳細な解析を行う予定である.13年度の研究成果より,マウスにおいてパラコート(PQ)解毒系として,肝臓の薬物代謝系酵素(NADPH-cytochrome P450 reductaseおよびCYP3A,2B)が働いていることがin vivo実験で明らかとなった。
凍結乾燥法を基盤とした幹細胞製剤化技術の構築

本研究では、非侵襲的な肺胞幹細胞移植の実現を目指して、幹細胞の吸入製剤化技術の構築を行い、製剤の有効性および安全性を明らかにすることを目的として研究を行った。肺胞再生治療法が確立できれば、治療法のないCOPDや難治性の肺線維症の根治、手術後の肺再建が可能となり多くの患者の命を救う革新的な再生治療技術となる。申請者は、世界に先駆け、PI3K阻害剤などがヒト肺胞上皮幹細胞を効率的に分化誘導し肺胞再生効果を有するという新規の知見を発見した。本研究では、重篤な肺胞破壊病変の再生を可能とする非侵襲的な肺胞幹細胞移植の実現を目指して、凍結乾燥法を基盤としたヒト肺胞幹細胞の凍結乾燥吸入製剤を開発を行った。本研究では、非侵襲的な肺胞幹細胞移植の実現を目指して、肺胞幹細胞の凍結乾燥技術および幹細胞の吸入製剤化技術の構築を行い、製剤の有効性および安全性を明らかにすることを目的として研究を行った。肺胞再生治療法が確立できれば、治療法のない慢性閉塞性肺疾患(COPD)や難治性の肺線維症の根治、外科的手術後の肺再建が可能となり多くの患者の命を救う革新的な再生治療技術となる。申請者は、COPDの根治的治療法の確立を目指して、破壊された肺胞の再生を作用点とする新規化合物の探索を行った。その結果、世界に先駆け、合成レチノイドAm80やPI3K阻害剤などがヒト肺胞上皮幹細胞を効率的に分化誘導し肺胞再生効果を有するという新規の知見を発見した。軽度の肺胞破壊モデルでは発見した分化誘導剤が肺胞の再生を誘導する優れた効果を示したが、完全に肺胞構造が破壊された重症例では分化誘導剤の投与のみでは肺胞再生効果が不十分であり治癒には至らなかった。一方で、幹細胞を肺に直接移植すると顕著な肺胞の修復が確認されているが、非侵襲的に肺胞幹細胞を移植する製剤は存在しない。本研究では、重篤な肺胞破壊病変の再生を可能とする非侵襲的な肺胞幹細胞移植の実現を目指して、当研究室の山下教授が開発した凍結乾燥法を基盤とした粉末吸入システム(世界72ヶ国で特許取得済み、(2010))を用いたヒト肺胞幹細胞の凍結乾燥吸入製剤を開発を行った。今年度は以下の項目を予定しており、すべての項目において順調に研究が進んでいる。一部の添加剤の検討は予定以上に多くの物質を評価することが出来、予定以上に進んでいる。新規の凍結装置を用いた検討においては、機器の導入時期が予定より1、2カ月遅れたため予定より遅れて検討を始めたが、概ね予定通りの研究が進展している。【本年度の検討項目】I.ガラス化、医療用CASおよび段階的乾燥法を利用した肺胞幹細胞の凍結乾燥技術を確立した。既に樹立済みのヒト肺胞上皮幹細胞をガラス化溶液(0.5Mトレハロース、45%エチレングリコールを含む)で培養し、緩慢もしくは急速凍結を行った。凍結1週間後に恒温槽にて融解し、幹細胞培養液にて培養開始後からの継時的な細胞生存率をMTTアッセイにより評価した。さらに特殊なCAS発生装置を使って細胞の中にある水分子を振動させ細胞壁や細胞膜を安定に凍結することが可能な医療用CAS:Cell Alive System(現有機器)を用いて肺胞幹細胞に最適な凍結速度と振動を検討し幹細胞の凍結技術を検討した。II.当研究室の特許技術を基盤とした肺胞幹細胞の粉末吸入製剤を構築した。疎水性アミノ酸であるフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンを各バイアルに0.11mg添加し医療用CASと棚方凍結乾燥機(現有機器)にて凍結乾燥にて行った。吸入剤の性能は米国薬局方に準じた試験装置MSLI(現有機器)で肺分布を示す5μm以下の微粒子割合により判定した。組織の効率的な再生治療法が確立できれば、治療法のない難治性疾患や外科手術後の組織再建が可能となり、多くの患者の命を救う革新的な医療技術となる。現在、幹細胞を移植する方法は、侵襲的な外科治療が主であり、今後、再生治療が広く普及するためには、非侵襲的な幹細胞の移植技術の開発が急務の課題である。そのため、既存の再生治療材料の概念にとらわれない治療材料の開発を進めていかなければならない。本研究では、このような課題を解決するため、幹細胞の性質の理解と、非侵襲的な再生治療細胞材料の開発、そして臨床応用に向けた安全性および有効性の評価を進めている。幹細胞の性質を理解した細胞製剤の開発を進めるため、幹細胞の周辺環境に着目した。

幹細胞の組織を修復する力は、幹細胞周辺の細胞群やサイトカイン、分泌物質などにより直接的または間接的に調整されていることを明らかにしている。特に、細胞外マトリックスと呼ばれる細胞の足場を構成する分子群は、幹細胞の特性の維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、幹細胞製剤の作製に成功し、製剤の有効性、安全性の評価結果が得られた。特に、安全性の評価においては、短期における毒性は確認されず、また長期にわたる発がん性の評価を行っているが、現在のところ、発がん性において問題は確認されていない。今後は、組織の線維化などへの影響を引き続き確認する。これらの知見は、将来、非侵襲的な再生治療を実現するための基盤になると期待される。当初予定していた計画は完了し、論文発表などの成果発表も順調に進展している。加えて、作製した製剤に関して、安全性の評価が予定以上に進展しており、長期の毒性についても解明が進んでいる。今後は特性の異なる様々な幹細胞に対して、本研究で同定した添加剤や凍結および乾燥方法が有用であるか評価を行うことで本研究の実用化の範囲を広げることを目標に研究を行う。そのため、幹細胞移植の研究を行う国内外の共同研究機関と連携して研究を進めていくことを計画している。更に研究成果を広く社会に還元するため、研究業績としての論文発表や学会発表だけでなく、臨床応用を目指した産学連携への発展を目指し関連企業等への情報提供を進める予定である。再生治療今後は、引き続き、研究成果の発表を推進していく。国内外での学会発表を予定している。本年度末に投稿中の論文のリバイスの為に消耗品代および英文校正費用を計上していたが、論文の審査に時間がかかっており、論文リバイスの為の予算を来年度初めに繰り越す必要が生じたため。補助事業に関する研究成果の発表を次年度に延期したため。論文のリバイスの試薬として有機溶媒等の消耗品代を4612円使用する。論文のリバイス後の英文校正費用として40000円を使用する。次年度に延期した学会に参加するために使用する。
近赤外分光測定法を用いた、新生児の視覚機能の発達に関する研究

新生児の視機能の他覚的評価を近赤外分光法(functional near-infrared spectroscopy: fNIRS)を用い測定した。同時に異なった色(赤、青)、強さ(10または100cd/m2)の光刺激を用い、対光反射を測定し、さらに皮膚電極型網膜電図(ERG)を用い、fNIRS結果と照合し、その精度を確認した。fNIRSによる結果は他の機器を用いた結果とほぼ同様の所見を示した。さらに健常児のみならず視覚異常を有する児の検査結果も臨床所見と一致した。しかし検査毎に異なる結果が生じた症例もあり、現時点ではfNIRSの結果のみから視機能を断定せず、総合的に判断することが進められる。新生児の非侵襲的視機能評価測定目的にて、近赤外分光測定法(Functional Near-infrared Spectroscopy: fNIRS)を用い新生児の視機能を評価した。26年度は3年計画の初年度で、測定の基礎、すなわち、fNIRSにより光刺激後、安定した測定結果を得ることが出来るかを最重要課題とした。具体的には1測定部位(脳表の部位とプローブの数)、2光刺激条件(刺激色、強さ)、3新生児の条件(毛髪、体動、啼泣等)を確立すべく測定、研究を行った。対象は北里大学の新生児特定集中治療室(Neonatal Intensive Care Unit: NICU)に入院している新生児である。毛髪量や啼泣状態の程度は様々でもあり、全てを対象に測定を試みた。fNIRS装置にはPocketNIRS(ダイナセンス社)を用いた。本機器は従来型のfNIRS装置と異なり、コンパクト、軽量、易移動性であり、プローブ数も2つに限られており、送受光部が鋭利でないため装着時間は短い。そのため、NICUなどの日々の臨床現場でも手軽に測定することが可能である。非鎮静下で閉瞼状態の新生児に対し、半暗室下において視覚刺激を行った。視覚刺激には赤色(635nm)・青色(470nm)の光刺激(250cd/m2)、及び診察時に使用する双眼倒像鏡の光源を用いた。赤色及び青色の光刺激には赤外線電子瞳孔計に搭載されている光刺激プログラムを用いた。視覚刺激時間は10秒間とした。測定部位は対象が新生児であるため、国際10-20法などに従って明確な視覚野の位置を確認すると時間がかかり、その間に新生児が啼泣し測定が困難になることから、短時間で容易に視覚野の位置を確認することができる後頭結節の両側に1つずつプローブを設置した。新生児の非侵襲的視機能評価測定目的にて、近赤外分光法(Functional Near-infrared Spectroscopy : fNIRS)を用い、新生児の視機能を評価した。昨年度我々が使用したfNIRS装置(Pocket NIRS Duo,ダイナセンス社)はプローブが平坦であり、毛髪の多い新生児を対象に測定不能、また体動に大きく影響され測定不能な症例が散見された。本年度は新たにfNIRS装置の開発を行い、プローブの改良を試みた。新たに開発したfNIRS装置は昨年度使用したPocket NIRS Duoと同様に、新生児特定集中治療室(Neonatal Intensive Care Unit: NICU)に直接持ち込めるよう、コンパクト、軽量、易移動性であるものとした。Pocket NIRSは1つのプローブの1つの送光部につき1つの受光部であるが、我々の開発した装置は1つのプローブの1つの送光部につき4つの受光部を搭載した(プローブ数は2つである)。これにより、1回の測定で合計8つの波形を算出できるため、結果の信頼性の向上に繋がると考えられる。また、プローブをスポンジ構造にし、衝撃を吸収し体動に耐え易く、またどの新生児の後頭部にもフィットするような構造とした。更に、送光部及び受光部はやや突起させた形状とし、これにより毛髪を掻き分けることができると考えられる。さらに昨年度は光刺激には倒像鏡の光源を用いたが、光量を定量的に詳細にコントロールすることができないため、本年度はより低侵襲目的に段階的に光量をコントロール可能なLEDライトを閉瞼下で眼瞼皮膚に照射し、新開発のfNIRS装置と一体型とした。そのため無侵襲化が可能となり啼泣を避けて、食後に測定を試みた。視覚刺激時間は昨年度と同様、10秒間とした。その結果昨年以上に安定した波形を得ることが可能となった(達成度の項参照)。北里大学病院NICUに入院中で同意の得られた新生児8名(平均胎生週数39.9±2.5週)に対し、新たに開発したfNIRS装置を用いて視覚刺激を行った際の酸素化ヘモグロビン及び脱酸素化ヘモグロビン濃度変化を測定した。被験者8名中5名において、光刺激を与えた際に有意な酸素化ヘモグロビン濃度の上昇が認められた。また、特記すべきことにその5名中2名は有意な脱酸素化ヘモグロビン濃度の減少も認められた。他の3名は啼泣にて、測定中の体動が大きい為安定した波形を得ることができなかった。しかし日時を変えた2回目の測定にてほぼ安定した結果が得られた。以上の結果より、新たに開発したfNIRS装置を用いてベットサイドでの新生児の視機能を簡便に低侵襲、他覚的に評価することが可能となった。

プローブをスポンジ構造、また送光部及び受光部を突起させた構造としたため、どの新生児の頭にもフィットさせることができ、またある程度新生児の毛髪を掻き分けることができた。また、光量を定量的に詳細にコントロールすることができるLEDライトを光源として用いたため、異なる被験者間においても一定の安定した条件下で測定をすることができた。また無侵襲の状態での計測が可能となったため、授乳後に測定を行うことが可能となり、昨年度と比較して、測定前及び測定中に啼泣する割合を減少させることができた。現在まで達成した内容は、「近赤外分光法を用いた新生児の他覚的視機能検査の試み(第2報)」のタイトルで、第51回日本眼光学学会総会にて発表を行った。また、眼科の学術論文誌であるあたらしい眼科に「近赤外分光法を用いた新生児の他覚的視機能検査」のタイトルで、提出、受理された。小児の視機能は感受性期内に発達するため、早期より視機能異常を発見、治療することは非常に重要である。新生児は自覚的応答ができないため、視機能を評価するにはpreferential looking法やoptokinetic nystagmus法などの他覚的手法が用いられてきた。その中で、視覚反応を脳から直接捉える装置としてvisual evoked potential (VEP)がある。しかしながら、VEPは僅かな体動や静電気などのノイズの影響を受けやすく、またベッドサイドでの測定は困難である。今回、新生児用fNIRS装置、また異なった色刺激による記録が可能な赤外線電子瞳孔計を用い、新生児の他覚的視機能検査を試みた。fNIRSのプローブは後頭結節を基準に左右両側3cmの位置に設置した。波形安定後、光刺激を10秒間与え、光刺激1秒前から光刺激5秒後までの合計16秒間、酸素化及び脱酸素化ヘモグロビン(Hb)濃度変化を測定した。全測定者(40例)のうち5例の症例でそれぞれの被験者は光刺激を与えた際に左右両側共に有意な酸素化Hb濃度の上昇を認めた(p<0.01)。尚、2例の被験者は光刺激を与えた際に有意な脱酸素化Hb濃度の減少を認めた(p<0.01)。さらに健常な新生児(25例)では赤色光刺激は反応しないものの青色光刺激ではすべての症例でその反応が確認され、fNIRSとともに簡便な評価法として確認できた。新生児の視機能の他覚的評価を近赤外分光法(functional near-infrared spectroscopy: fNIRS)を用い測定した。同時に異なった色(赤、青)、強さ(10または100cd/m2)の光刺激を用い、対光反射を測定し、さらに皮膚電極型網膜電図(ERG)を用い、fNIRS結果と照合し、その精度を確認した。fNIRSによる結果は他の機器を用いた結果とほぼ同様の所見を示した。さらに健常児のみならず視覚異常を有する児の検査結果も臨床所見と一致した。しかし検査毎に異なる結果が生じた症例もあり、現時点ではfNIRSの結果のみから視機能を断定せず、総合的に判断することが進められる。赤色および青色光刺激に対する酸素化ヘモグロビン濃度及び脱酸素化ヘモグロビン濃度変化は観察されなかった。これは、閉瞼状態の新生児に対し赤外線電子瞳孔計での250cd/m2の光刺激を行っても、光量が足りないため十分な刺激が網膜に達しなかったことが原因であると考えられる。倒像鏡の光源による光刺激では測定例14例中2例においては左右両半球共に有意な酸素化ヘモグロビン濃度の上昇及び脱酸素化ヘモグロビン濃度の減少を認めた。
成人型呼吸窮迫症候群の成因究明とサーファクタント補充療法の応用

1.噴霧吸入によるサーファクタント投与実験:前年度までの研究でサーファクタントの分散液を2ml/kgあて気道内に注入すると、成人型呼吸窮迫症候群(ARDS)の症状が好転することを確認した。そこで、今年度は、噴霧吸入法による投与の効果を検討した。(1)肺洗淨ラット:肺洗淨によりサーファクタントを洗い出し、100%酸素による人工呼吸下でも、動脈血酸素分圧(PaO_2)が100mmHg以下のラットを作成した。このラットに、補充療法用サーファクタント(金沢大学で作成したSurfactant CK)を1時間噴霧吸入させたところ、PaO_2が350mmHg(mean)以上に上昇し、肺コンプライアンが24%増加した(P<0.05)。(2)エンドトキシン投与ラット:大腸菌由来のエンドトキシンを50mg/kgあて、ラットの気道に注入しARDSを発症させた。このラットに、Surfactant CKを噴霧吸入させると、PaO_2は106mmHg(mean)から300mmHg以上になった(P<0.05)。また、コンプライアンスや胸部レントゲン所見も有意に好転した。以上の結果から、噴霧吸入でサーファクタントを投与しても、治療効果が得られると結論された。噴霧吸入法は、注入法に比べて、効果が若干劣るものの、安全性の面で勝れていると判定された。2.肺サーファクタントの脂質構成に関する検討(合成製剤の開発):ディパルミトイールレシチン(DPL)、不飽和レシチン(u-L)、ホスファテイジールグリセロール(PG)の3者を種々に組合せ、それに肺サーファクタントのアポ蛋白(SP-BとSP-C)を加えた。これらの試料を、自己の肺サーファクタントが欠如しているウサギ末熟胎仔に投与して換気量を測定した。その結果、u-Lを含む試料を投与した動物の換気量は、含まない場合の約1.5倍であった(P<0.05)。u-Lは、肺サーファクタントの活性を増強する重要な因子であると判定された。1.成熟ウサギの気道内に塩酸を注入し、成人型呼吸窮迫症(ARDS)様症状を発症させたうえ、金沢大学で開発した補充療法用サ-ファクタント(Surfactant CK)を投与した。その結果、血液ガス所見、生存率、肺組織所見などが好転し、ARDSに対するサ-ファクタント補充療法の有効性が強く示唆された。2.自己の肺サ-ファクタントが欠如しているウサギ未熟胎仔に対し、段階的に濃度を変えたサ-ファクタントを補充し、換気力学や肺組織像を系統的に調査した。その結果、サ-ファクタントの濃度がある一定の値以下になると、生理学的作用が急激に消失する現象を見い出し、生理的臨界濃度という新らしい概念を提唱した。3.肺サ-ファクタントのアポ蛋白に対するモノクロ-ナル抗体を、ウサギの肺に注入したところ、ARDSに酷似した症状や肺組織像がみられた。この結果は、ARDSの成因に、サ-ファクタントの不活化が関与していることを裏付けるものと考えられた。4.酸素中毒でARDS様症状を呈しているウサギの肺水腫液中には、肺サ-ファクタントの活性を阻害する物質が存在することを確認した。

ウサギ未熟胎仔を用いた生物学的評価系で、肺機能障害が出現する阻害物質とサ-ファクタントの量の比を求め、ARDSに対する補充療法の基礎的資料を貯積した。1.純酸素により人工呼吸されているラット(n=40)に対し、380ー500ppmの塩素ガスを210秒間吸入させた。その結果、動脈血酸素分圧(PaO_2)は500mmHg前後から100mmHg以下に低下し、呼吸窮迫症候群(ARDS)様の症状を呈した。半数のラット(n=20)に対し、金沢大学で開発したサ-ファクタント(Surfactant CK)を経気道的に補充したところ、PaO_2は253【.+ー.】130mmHg(P<0.05)に回復し、60%の動物は140分以上生存した。一方、サ-ファクタントを補充しなかった対照ラット(n=20)のPaO_2は100mmHg以下で推移し、140分後の生存率は20%以下(P<0.05)になった。以上より、塩素ガス吸入後のARDS様状態に対し、サ-ファクタント補充療法は治療効果を示すと結論された。2.肺サ-ファクタントの構成成分であるアポ蛋白質(SPーAおよびSPーB)をモノクロ-ナル抗体により選択的に遮断し、その際の肺サ-ファクタントの生理活性の変化を、ウサギ未熟胎仔を用いて検討した。その結果、SPーAはサ-ファクタントの活性にあまり関与していないことが判明した。一方、SPーBが遮断されると、サ-ファクタントの活性は消失することが明らかになった。したがって、補充療用サ-ファクタント中のSPーBは不可欠な因子の1つであり、抗原性のないヒト肺由来のSPーBを入手する研究が、今後必要であると結論された。3.11名の喘息患者を、サ-ファクタント吸入群(n=6)と対照群(n=5)に分け、サ-ファクタント吸入群には10mgの補充療法用サ-ファクタント(容量=10ml)を吸入させ、対照群には僞似薬(生理食塩水)を吸入させた。サ-ファクタント群では、自覚症状が改善し、1秒率が27%、分時最大換気量が33%増加した。対照群では、これらの改善が見られず、両群の差は有意(P<0.05)であった。サ-ファクタント補充療法は、気道の閉塞を防止し、喘息発作にも有効であると結論された。1.噴霧吸入によるサーファクタント投与実験:前年度までの研究で、サーファクタントの分散液を2ml/kgあて気道内に注入すると、成人型呼吸窮迫症候群(ARDS)の症状が好転することを確認した。そこで、今年度は、噴霧吸入法による投与の効果を検討した。(1)肺洗淨ラット:肺洗淨によりサーファクタントを洗い出し、100%酸素による人工呼吸下でも、動脈血酸素分圧(PaO_2)が100mmHg以下のラットを作成した。このラットに、補充療法用サーファクタント(金沢大学で作成したSurfactant CK)を1時間噴霧吸入させたところ、PaO_2が350mmHg(mean)以上に上昇し、肺コンプライアンが24%増加した(P<0.05)。(2)エンドトキシン投与ラット:大腸菌由来のエンドトキシンを50mg/kgあて、ラットの気道に注入しARDSを発症させた。このラットに、Surfactant CKを噴霧吸入させると、PaO_2は106mmHg(mean)から300mmHg以上になった(P<0.05)。また、コンプライアンスや胸部レントゲン所見も有意に好転した。以上の結果から、噴霧吸入でサーファクタントを投与しても、治療効果が得られると結論された。噴霧吸入法は、注入法に比べて、効果が若干劣るものの、安全性の面で勝れていると判定された。2.肺サーファクタントの脂質構成に関する検討
タンパク質を構成要素とする超分子型自己集合系の構築と高次機能の創出

本研究では、タンパク質を機能ユニットとする超分子型自己集合系の構築により創発する新たな機能性を追求している。昨年度までの成果を発展させ、以下の項目について基礎検討を実施した。まず、キチンを固相基質とする酵素分解系の構築に取り組み、西洋ワサビペルオキシダーゼによる組換えキチナーゼの超分子化と、トランスグルタミナーゼによる超分子集合体へのキチン結合能の後付けを組み合わせることで、固相基質を効果的に分解可能な人工酵素系の構築が可能なことを明らかにした。この過程において、タンパク質を超分子化する新たな生体触媒の探索も実施し、ラッカーゼによる組換えタンパク質の部位特異的多量体化と異種タンパク質集合体の調製に成功し、その成果を学術論文2編に纏めた。次に、昨年度特許出願に至ったトランスグルタミナーゼによるタンパク質の部位特異的脂質修飾法について検討を進め、疎水性部の構造の違いにより細胞との相互作用が異なることを明らかにすると共に、培養細胞の表面を蛍光タンパク質で修飾することに成功した。これらの成果を学術論文2編に纏めた。最後に、分担研究者の若林博士との協働の下、ペプチド自己集合系の後付け修飾を試みた。即ち、酵素の基質となるペプチドに自己集合性を付与し、これが形成する超分子集合体の表面を蛍光タンパク質で修飾することに成功した。また、部分変性させた天然タンパク質と相互作用可能な糖鎖からなる自己集合型ナノ粒子の調製法を確立し、疎水性の高い薬物をガン細胞にデリバリーするキャリアとして利用可能なことを示した。以上の成果を学術論文2編に纏めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の検討においては、構成ユニットとなる各種タンパク質の調製と、その空間的な配置を可能にする足場分子との融合について検討した。前者において、タンパク質自己集合体を構成するタンパク質ユニット間での協奏効果の発現を志向したバイオマス分解酵素ユニットの調製と、実バイオマスの分解における協奏性の発現について検討した。さらに、連携研究者の九州大学農学研究院日下部教授の協力を仰ぎ、カイコによる組換えタンパク質生産システムを利用して、免疫系細胞の増殖に寄与する組換えサイトカインへの基質ペプチドタグの導入、タグ選択的な部位特異的小分子導入を達成した。後者については、分担研究者の若林博士の協力を仰ぎ、合成高分子への人工リガンド分子の導入と、組換えタンパク質に導入されたタグ選択的な部位特異的修飾を通した一次元タンパク質集合系の設計について検討した。対象タンパク質として抗体結合タンパク質と酵素の融合タンパク質を選択し、抗原の高感度検出系をモデルとして、機能性組換えタンパク質の集合化による検出感度の向上についての概念実証を完了した。また、基質認識分子ユニットとして核酸アプタマーを導入した人工糖質加水分解酵素の設計についても基礎検討を実施し、塩濃度に応じて活性がスイッチする人工セルラーゼの調製に成功した。以上の成果を、学術論文3編に纏めた。さらに、本研究の更なる発展に向け、タンパク質架橋酵素そのもののタンパク質工学的機能改変も遂行し、新規概念に基づく架橋活性の向上を達成し、特許出願に至った。本研究では、タンパク質を機能ユニットとする超分子型自己集合系の構築により創発する新たな機能性を追求することを目標としている。具体的には、酵素反応を用いた独自のタンパク質修飾技術を用いて、リガンド分子が部位特異的に導入された生体分子ユニットを設計し、生体分子間に特異的な相互作用を人工的に導入することで、分子ユニットが自発的に組み上がる機能性タンパク質自己集合系の構築を第一目標としている。初年度の検討においては、当初目標に掲げた全ての項目について基礎検討を実施し、今後の展開に資する各種材料の準備ができた。また、合成高分子との融合による新たな機能の創発について、概念実証試験を実施することができた。以上の成果から、初年度の研究については概ね順調に進展していると判断した。昨年度の実績に基づき、天然のセルロース系バイオマス分解酵素システムを範とした固相基質の分解について検討した。異なる酵素ユニットとして、エンド型キシラナーゼと分岐鎖を切断するアラビノフラノシダーゼを選択し、人工ヘミセルロソームの調製を試みた。その際、ペプチド-タンパク質間での選択的共有結合形成を促進するSpyCather-SpyTagシステムを採用することで、2種酵素のモル比を制御可能な新たな足場分子の設計に成功した。さらに本系の発展型として、抗体結合ドメインと酵素の組み合わせからなる固相免疫測定系を構築し、本足場分子の汎用性を確認した。また、分岐型ビオチンをリンカーとする酵素集合系の構築において、キチンを基質とする酵素システムからなる人工キチナーゼ系の構築にも取り組んだ。また、細胞表層に存在する膜タンパク質を認識可能なタンパク質集合系の構築を試みた。具体的には、ガン細胞膜上の特定のタンパク質を認識する核酸アプタマーを分子ユニットとして導入した人工バイオプローブ分子の設計を試み、ガン細胞を選択的に染色可能な核酸-蛍光タンパク質コンジュゲート型プローブ分子の調製に成功した。また、連携研究者の九州大学農学研究院日下部教授の協力を仰ぎ、カイコによる組換えタンパク質生産システムを利用して、シグナル増幅用酵素ユニットとして、組換え西洋ワサビペルオキシダーゼの発現とトランスグルタミナーゼ基質ペプチドタグの導入、タグ選択的なビオチン化によるシグナル増幅に成功した。さらに、水溶液中で自己集合化するタンパク質からなるナノ粒子の簡便調製法も確立した。以上の成果を、学術論文4編に纏めた。さらに、本研究の更なる発展に向け、トランスグルタミナーゼによるタンパク質の部位

特異的脂質修飾系の確立も遂行し、簡便・迅速な脂質ラベル化を達成し、特許出願に至った。本研究では、タンパク質を機能ユニットとする超分子型自己集合系の構築により創発する新たな機能性を追求している。具体的には、酵素反応を用いた独自のタンパク質修飾技術に立脚し、生体由来界面において目的とする高次機能を発現する超分子型人工タンパク質集合系を創出することを目標として、基礎検討を遂行した。その結果、当初目標に掲げた全ての項目について基礎検討を実施し、それぞれの成果を学術論文4編に纏めることができ、1編の総説の依頼を受けた。異種タンパク質固定化用の新規足場分子、核酸アプタマーを認識部位とするプローブ分子、タンパク質と糖質からなるナノ粒子など、特徴的な成果物を創出できた。また、脂質分子とタンパク質の融合による新たな機能の創発に関して、一般的に困難とされる脂質修飾タンパク質の簡便調製法の確立に成功した。以上の結果から、本年度の研究についても順調に遂行できたものと判断した。昨年度までの成果を発展させ、以下の項目について基礎検討を実施した。まず、キチンを固相基質とする酵素分解系の構築に取り組み、西洋ワサビペルオキシダーゼによる組換えキチナーゼの超分子化と、トランスグルタミナーゼによる超分子集合体へのキチン結合能の後付けを組み合わせることで、固相基質を効果的に分解可能な人工酵素系の構築が可能なことを明らかにした。この過程において、タンパク質を超分子化する新たな生体触媒の探索も実施し、ラッカーゼによる組換えタンパク質の部位特異的多量体化と異種タンパク質集合体の調製に成功し、その成果を学術論文2編に纏めた。次に、昨年度特許出願に至ったトランスグルタミナーゼによるタンパク質の部位特異的脂質修飾法について検討を進め、疎水性部の構造の違いにより細胞との相互作用が異なることを明らかにすると共に、培養細胞の表面を蛍光タンパク質で修飾することに成功した。これらの成果を学術論文2編に纏めた。最後に、分担研究者の若林博士との協働の下、ペプチド自己集合系の後付け修飾を試みた。即ち、酵素の基質となるペプチドに自己集合性を付与し、これが形成する超分子集合体の表面を蛍光タンパク質で修飾することに成功した。また、部分変性させた天然タンパク質と相互作用可能な糖鎖からなる自己集合型ナノ粒子の調製法を確立し、疎水性の高い薬物をガン細胞にデリバリーするキャリアとして利用可能なことを示した。以上の成果を学術論文2編に纏めた。次年度は、主として以下の3点について基礎検討を実施する。1)高機能性タンパク質ユニットの調製:機能ユニットとなるタンパク質について、対象タンパク質のレパートリーを拡大する。
江戸時代における人口分析システムの開発

本研究では、17世紀末から19世紀中期までの期間に、原則として集落単位に毎年作成されていた「宗門改帳(しゅうもんあらためちょう)」と総称されていた古文書を原史料として、史料読解から人口学的指標算出に至る研究過程をできるかぎり自動化する人口分析システムの構築を目標としている。本年度は、人口分析システムを開発するための第1段階として、陸奥国会津郡小松川村(現在は、福島県南会津郡下郷村に所属する。)の「宗門家別人別改書上帳」(寛政4(1792)年から慶応2(1866)年)を入力史料として、「宗門改帳」古文書画像データベースを構築した。本データベースは、マイクロソフト社のACCESSをDBMSとして構築されている。ア)個人情報(データ数:7148)、イ)世帯情報(データ数:1724)、ウ)古文書画像情報(データ数:1724)、エ)史料書誌情報(データ数:75)の4つのテーブルから構成されている。利用者は、ア)、イ)の文字データとウ)の古文書画像データを、同一画面上で検索、表示することができる。したがって、データベース利用者が、文字データに誤読の疑いを抱いた場合、あるいは原史料の文字のレイアウト、筆跡、印形といった文字データとして登録することのできない画像情報を参照したい場合にも、データベース構築者の研究過程を再現、批判できる環境を整備することができた。さらに、史料読解から文字データ入力までの作業過程の効率化を図るために、年齢を表記した漢数字を対象として、古文書文字の自動認識に関する実験を開始した。3層のニューラルネットのバックプロパゲーション法を用いて、16種類の古文書文字(一、壱、二、弐、三、参、四、五、六、七、八、九、十、拾、廿、ツ)を学習させ、「宗門改帳」古文書画像データベースから152文字を採字して、判別実験を行った。認識率は、約34%であった。