hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
β2受容体による細胞内情報伝達の組織多様性に関する研究

選択的β2アドレナリン受容体作動薬の光学異性体(+)(-)(±)が筋と骨への作用の違いを検討した(+)体tulobuterolが骨芽細胞のβ2受容体を介し破骨細胞分化を促進させ、μCTによる骨量測定では、(-)体は影響がなく(+)体投与により、骨密度低下と骨吸収亢進が明らかになった。一方、筋肥大は(-)体で伸張し、(+)体では認められなかった。血圧測定結果から血管平滑筋作用も同様であった。以上の結果により、β2作動薬は(-)体に精製すれば、骨代謝に影響を及ぼすことなく、安全に気管支喘息治療薬として使用される可能性を明らかになった。選択的β2アドレナリン受容体作動薬の代表薬であるtulobuterolは、気管支拡張作用を有し、気管支喘息治療薬として用いられている。近年、交感神経系を介した骨代謝調節機構の存在が報告されているが、骨格筋と同様の機序であるのか否か、その詳細は明らかではない。そこで本研究では、RANKL遺伝子を導入した骨髄間質細胞株ST2-T細胞と骨髄細胞による共存培養を用いた。β2作動薬の光学異性体(+)(-)(±)をST-2T細胞に添加する破骨細胞形成系を確立した。RT-PCR法およびWB法により、骨髄問質細胞および骨芽細胞でβ2アドレナリン受容体の発現が確認された。ところが、血管平滑筋弛緩作用を持たない(+)体tulobuterolが最も強く破骨細胞形成を促進した。また、β2アドレナリン受容体拮抗薬であるbutoxamineにより、各種tulobuterolによる破骨細胞形成は阻害された。一方、骨髄細胞単独培養系に各tulobuterolを添加しても、破骨細胞は形成されなかった。さらに(+)tulobuterol添加によりST2-T細胞におけるreceptor activator of NF-kB ligand(RANKL)mRNAの発現亢進よびcyclic adenosine3'5'-monophosphate (cAMP)が最も強く上昇した。(+)体選択的β2アドレナリン受容体作動薬による破骨細胞形成には、骨格筋同様にcAMP伝達系が関与していることが推察された。以上の結果から、筋への作用を持たない(+)体tulobuterolが骨芽細胞のβ2アドレナリン受容体を介して、RANKL発現を亢進させ破骨細胞へと分化させることが明らかになった。気管支喘息治療薬として用いられている選択的β2アドレナリン受容体作動薬の光学異性体(+)(-)(±)がβ2受容体を発現する骨格筋と骨芽細胞への作用の違いを細胞レベルで昨年報告した。本年度は、その詳細をin vivoレベルで明らかにした。つまり、マウスに、3種類の光学異性体β2作動薬を注射投与した。4週間後に屠殺し、遅筋繊維の多いヒラメ筋・心筋と、速筋繊維の多い長指伸筋の筋湿重量を比較した。この場合はMHC同定蛋白の発現の変化及び筋肥大は(-)体で伸張し、(+)体では作用が認められなかった。投与された直後に血圧測定し、血管平滑筋に及ぼす影響臭い手も同様に結果が得られた。一方、骨組織のμCTによる骨量測定を比較検討したところ、逆に(-)体は影響がなく(+)体投与群では、骨密度の低下が認められた。また尿中ピリジノリンを測定結果により、(+)体投与群では骨吸収が亢進していることが明らかになった。β2拮抗薬によって、骨代謝に及ぼす影響も阻害された。以上の結果により、リガンドの違いにおける筋組織に見られる筋肥大作用と骨量低下作用は、光学異性体の相反関係と一致することが示唆された。従来交感神経刺激による骨代謝に及ぼす影響は、筋細胞への活性体とされている(-)体による作用が認められなかったことから直接作用が不明であったが、今回の我々の報告から骨代謝に及ぼす影響が明らかになった。また気管支喘息治療薬として使用されるβ2作動薬は(-)体に精製して生体に投与すれば、骨代謝に影響を及ぼすことなく安全に使用される可能性を明らかになった。気管支喘息治療薬として用いられている選択的β2アドレナリン受容体作動薬の光学異性体(+)(ー)(±)がβ2受容体を発現する骨格筋と骨芽細胞への作用の違いを細胞レベルからin vivoレベルで明らかにした。

この場合はMHC同定蛋白の発現の変化及び筋肥大は(ー)体で伸張し、(+)体では作用が認められなかった。投与された直後に血圧測定し、血管平滑筋に及ぼす影響臭い手も同様に結果が得られた。一方、骨組織のμCTによる骨量測定を比較検討したところ、逆に(ー)体は影響がなく(+)体投与群では、骨密度の低下が認められた。また尿中ピリジノリンを測定結果により、(+)体投与群では骨吸収が亢進していることが明らかになった。β2拮抗薬によって、骨密度増加が認められ、骨代謝に及ぼす影響も確認された。以上の結果により、リガンドの違いにおける筋組織に見られる筋肥大作用と骨量低下作用は、光学異性体の相反関係と一致することが示唆された。従来交感神経刺激による骨代謝に及ぼす影響は、筋細胞への活性体とされている(ー)体による作用が認められなかったことから直接作用が不明であったが、今回の我々の報告から骨代謝に及ぼす影響が明らかになった。また気管支喘息治療薬として使用されるβ2作動薬は(ー)体に精製して生体に投与すれば、骨代謝に影響を及ぼすことなく安全に使用される可能性を明らかになった。前年得られた業績どおりに、動物実験においても証明できつつあるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。β2受容体と密接な関係のあるα2受容体及びα2作動薬との協力作用の有無を検討していく。また降圧作用を持つACE阻害薬にはMMP活性阻害作用があることがわかりMMP活性阻害薬との協力作用についてもあわせて検討していく。
インプラント材料の骨結合強化システムの確立

本研究は,GBR法をインプラント-骨界面の骨結合強化法として確立させ,臨床応用の可能なものにすることを目的としている.しかし,過去の報告からも,GBR法では外部からの機械的刺激によって膜が押し潰される等の指摘があり,適応症の拡大は容易ではない.このため本研究では,遮蔽膜として吸収性のポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体膜を用い,これが骨結合強化に有効であるか否か,また,骨補填材としての天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用することによって,十分なスペースメイキング効果を有するかどうかについて検討した.実験には,ニュージ-ラント白兎を用いた.脛骨を露出し,通法どおりインプラント窩を形成してインプラント頸部が約1mm露出するようにアパタイトインプラントを埋入した.インプラントは吸収性膜で被覆する群,同じ膜と天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用する群,膜を使用しない対象群の3群にわけ,組織学的な検索を行った.本研究から,以下のような結果が得られた.1.遮蔽膜群では,新生骨は対象群と比べてはやいスピードで露出したインプラント頸部を被い,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.2.骨補填材併用群では,遮蔽膜群に比べて新生骨形成のスピードは遅れるものの,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.3.遮蔽膜は,新生骨でaquired spaceがほぼ満たされた8週においても,外形が保たれていた.4.骨補填材は,新生骨形成を遅延させたものの,十分な骨量を得るためのスペースを獲得するのに有効であった.本研究は,GBR法をインプラント-骨界面の骨結合強化法として確立させ,臨床応用可能なものにすること目的として行っている.一連の研究から,我々の用いた種々のメンブレンはインプライト頸部の骨結合を確実するだけでなく,骨増生に対して促進的に働くことが示唆された.しかしながら,適応症の拡大を図るには未だ問題点も残されている.特に,メンブレンの機械的性質の向上が吸収性のそれにおいて実現され,しかもその場合,骨形成とメンブレンの吸収のバランスを考えた上で適切な時期に吸収されるものの開発が必要となってくる.本研究では,この条件を満たしうるメンブレンを開発し,動物実験によって実証する予定である.7年度はメンブレンの開発とともに,新しい骨形成の評価法の開発に充てられた.メンブレンの開発に関しては,先の研究で報告したコラーゲン製メンブレンの持つ生体吸収性と骨形成促進作用に着目し,早期にメンブレン自身が石灰化して骨形成の足場となり,その石灰化によって出来たスペース内で骨形成の行われるメンブレンの開発に力を注いできた.しかしながら,動物実験はまだ行われて居らず,その有効性については今後の検討が必要であると考えている.今年度中には,ウサギを用いて,脛骨あるいは大腿骨への埋入を行い,来年度にはデータを集め,臨床作用に向けての検討を行いたいと考えている.また,評価に関して,我々は新しい手法を確立し,これによってインプラント骨周囲組織の3次元的観察および分析が可能となった.本研究にもこの手法を応用し,より客観的な量的評価を行っていきたいと考えている.本研究は,GBR法をインプラント-骨界面の骨結合強化法として確立させ,臨床応用の可能なものにすることを目的としている.しかし,過去の報告からも,GBR法では外部からの機械的刺激によって膜が押し潰される等の指摘があり,適応症の拡大は容易ではない.このため本研究では,遮蔽膜として吸収性のポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体膜を用い,これが骨結合強化に有効であるか否か,また,骨補填材としての天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用することによって,十分なスペースメイキング効果を有するかどうかについて検討した.実験には,ニュージ-ラント白兎を用いた.脛骨を露出し,通法どおりインプラント窩を形成してインプラント頸部が約1mm露出するようにアパタイトインプラントを埋入した.インプラントは吸収性膜で被覆する群,同じ膜と天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用する群,膜を使用しない対象群の3群にわけ,組織学的な検索を行った.本研究から,以下のような結果が得られた.1.遮蔽膜群では,新生骨は対象群と比べてはやいスピードで露出したインプラント頸部を被い,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.2.骨補填材併用群では,遮蔽膜群に比べて新生骨形成のスピードは遅れるものの,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.3.遮蔽膜は,新生骨でaquired spaceがほぼ満たされた8週においても,外形が保たれていた.4.骨補填材は,新生骨形成を遅延させたものの,十分な骨量を得るためのスペースを獲得するのに有効であった.本研究は,GBR法をインプラント-骨界面の骨結合強化法として確立させ,臨床応用の可能なものにすることを目的としている.

しかし,過去の報告からも,GBR法では外部からの機械的刺激によって膜が押し潰される等の指摘があり,適応症の拡大は容易ではない.このため本研究では,遮蔽膜として吸収性のポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体膜を用い,これが骨結合強化に有効であるか否か,また,骨補填材としての天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用することによって,十分なスペースメイキング効果を有するかどうかについて検討した.実験には,ニュージ-ラント白兎を用いた.脛骨を露出し,通法どおりインプラント窩を形成してインプラント頸部が約1mm露出するようにアパタイトインプラントを埋入した.インプラントは吸収性膜で被覆する群,同じ膜と天然焼成骨-コラーゲン複合体を併用する群,膜を使用しない対照群の3群に分け,組織学的な検索を行った.本研究から,以下のような結果が得られた.1.遮蔽膜群では,新生骨は対照群と比べてはやいスピードで露出したインプラント頸部を被い,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.2.骨補填材併用群では,遮蔽膜群に比べて新生骨形成のスピードは遅れるものの,8週ではacquired spaceはすべて新生骨で満たされていた.3.遮蔽膜は,新生骨でaquired spaceがほぼ満たされた8週においても,外形が保たれていた.4.骨補填材は,新生骨形成を遅延させたものの,十分な骨量を得るためのスペースを獲得するのに有効であった.
LIF培養造血幹細胞を利用した新規の免疫細胞療法の開発

マウスより造血幹細胞を採取し、LIF(leukemia inhibitory factor)を添加して一週間ex vivoで培養した。そのin vitro培養細胞を放射線照射したCD45.1バックグラウンドのRAG欠損マウスに移植することによりin vivoでのT細胞への分化能を評価したところ、LIFにはT細胞への分化能をex vivoで長期間維持する作用があることが示された。そこで、次にST2ストローマ細胞にNotchリガンドであるDLL1遺伝子を導入し、Zuniga-Pfluckerらの方法に従って、LIFで培養した造血幹細胞をストローマ上で培養してin vitroでのT細胞の分化誘導実験を試みた。in vitroでのT細胞(thy1陽性細胞)の分化を誘導することはできなかったが、ST2-DLL1と共に培養した造血幹細胞はin vivoでの再構成実験系では非常に効率よく胸腺細胞を再構築した。当初の実験計画のようにin vitroで造血幹細胞の分化を誘導することはできなかったが、in vivoにおいてはLIFが造血幹細胞のT細胞への分化を増強することが明らかとなり、本研究の結果は、患者本人の造血幹細胞を長期間ex vivoでLIFと共に培養して患者へと戻すことによって患者の体内でT細胞数を増加させるような治療法の開発に応用できることが明らかとなった。このようなT細胞増強療法は、がん細胞の免疫学的治療における重要な一歩となるものと考えられる。
水中毒発生機序に関わる向精神薬長期投与の影響についての実験的研究

精神分裂病患者における水中毒は病的多飲を特徴とし、意識障害、痙攣などの重篤な症状を引き起こす。また、この水中毒は抗精神病薬の長期服用によっても発症することが報告されている。しかし、この水中毒の発症機構については未だ不明な点が多く、一致した見解はない。我々は、慢性の抗精神病薬服用患者における抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)が水中毒発症に関係していることを指摘している(Kishimoto et al, Jpn. J. Psychiatr. Nerurol. 43,161-169,1989)。今回、この水中毒発症機構の基礎的研究の一環として抗精神病薬長期投与とSIADHとの関係を明らかにする目的で、ラット視索上核(SON)への高張artificial cerebrospinal fluid (aCSF)の注入刺激後のアルギニンバソプレッシン(AVP)遊離と行動変化に及ぼすデカン酸ハロペリドール長期投与(20mg/kg/2weeks,i.m.)の効果について検討した。下記に、デカン酸ハロペリドールを8週間長期投与したラットにおいてえられた結果を示す。1)SONにおける高張性aCSF注入による刺激は、刺激終了後30分間の飲水行動量を増加させた。また、同処置ラットの移所運動量は増加する傾向を示した。2)SONにおけるAVP濃度は、上述の高張刺激後、同様に増加した。3)同処置ラットにおいて、線条体ドパミン濃度は対照群と比較して減少した。デカン酸ハロペリドール長期投与ラットにおいて、SONへの高張性aCSFの刺激は飲水行動量の増加および同部位のAVP遊離を引き起こした。また、デカン酸ハロペリドール長期投与によって線条体ドパミン濃度の減少が認められた。以上の結果から、SONへの高張性aCSF注入刺激によって発現する飲水行動の増加およびAVP遊離は、中枢ドパミン神経系との密接な関係が推測される。我々は精神障害者における抗精神病薬の長期服用中に報告されている多飲傾向および水中毒の発症のメカニズムについて検討している。現在まで、抗精神病薬の長期服用によるこれらの発症とバソプレシンの分泌異常との関係を指摘してきた。本年度は、抗精神病薬の長期服用によるバソプレッシン分泌異常と水中毒発症メカニズムを明らかにする研究の前段階として、ブレインダイアリシス法によるラットの視索上核(Supraoptic nucleus:SON)への高張脳脊髄液(1M NaCl含有)刺激実験を行った。実験方法:Wistar雄性7週齢ラットを用いて、アンビュロ・ドリンコメーター内のケージで約10日間適応させ、適応中の飲水および移所運動量を測定した。適応後SONにガイドカニューレを植込み、3-4日間後ブレインダイアリシス法による高張脳脊髄液による刺激実験を行い、その間の透析液を採取、飲水および移所運動を経時的に測定した。また、刺激後約24時間の各運動量を測定し、線条体採取後ホルマリン固定しガイドカニューレの位置を脳切片により確認した。なお、線条体のモノアミン濃度はHPLC-ECD法で測定した。実験結果:1)高張脳脊髄液刺激による急性の行動変化:今回の条件では飲水および移所行動の顕著な変化は観察されなかった。しかし、高張液刺激後、対照群に比較してfacewashing,sniffing,rearingなどの行動変化が肉眼的に観察された。

2)高張脳脊髄液刺激による24時間の行動および線条体モノアミンの変化:移所運動の減少が刺激および対照群において観察された。飲水行動については刺激群において増加傾向は観察された。線条体モノアミン濃度については著変は観察されなかった。バソプレシンについては現在、測定中である。以上、今回のSON刺激による結果では、刺激直後の飲水および移所運動では変化が認められなかった。しかし、肉眼による行動観察では、刺激後にface washing,sniffing,rearingなどの行動増加が観察されたことから、SON刺激による行動変化の可能性が考えられる。24時間の行動変化では、マイクロダイアリシス法による非特異的影響が考えられ、さらに観察期間を延長する必要があると思われる。今後、刺激条件の検討と抗精神病薬の長期投与について検討する。精神分裂病患者における水中毒は病的多飲を特徴とし、意識障害、痙攣などの重篤な症状を引き起こす。また、この水中毒は抗精神病薬の長期服用によっても発症することが報告されている。しかし、この水中毒の発症機構については未だ不明な点が多く、一致した見解はない。我々は、慢性の抗精神病薬服用患者における抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)が水中毒発症に関係していることを指摘している(Kishimoto et al,Jpn.J.Psychiatr.Neurol.43,161-169,1989)。今回、この水中毒発症機構の基礎的研究の一環として抗精神病薬長期投与とSIADHとの関係を明らかにする目的で、ラット視索上核(SON)への高張artificial cerebrospinal fluid(aCSF)の注入刺激後のアルギニンバソプレッシン(AVP)遊離と行動変化に及ぼすデカン酸ハロペリドール長期投与(20mg/kg/2weeks,i.m.)の効果について検討した。下記に、デカン酸ハロペリドールを8週間長期投与したラットにおいてえられた結果を示す。1)SONにおける高張性aCSF注入による刺激は、刺激終了後30分間の飲水行動量を増加させた。また、同処置ラットの移所運動量は増加する傾向を示した。2)SONにおけるAVP濃度は、上述の高張刺激後、同様に増加した。3)同処置ラットにおいて、線条体ドパミン濃度は対照群と比較して減少した。デカン酸ハロペリドール長期投与ラットにおいて、SONへの高張性aCSFの刺激は飲水行動量の増加および同部位のAVP遊離を引き起こした。また、デカン酸ハロペリドール長期投与によって線条体ドパミン濃度の減少が認められた。以上の結果から、SONへの高張性aCSF注入刺激によって発現する飲水行動の増加およびAVP遊離は、中枢ドパミン神経系との密接な関係が推測される。
冥王代地球

本計画研究班では、地球史研究から導かれる「生命誕生の器」としての原始地球表層環境を定量的に復元し、冥王代地球表層環境進化の過程を具体的に解明することを目的としている。H29年度の研究は主に5つのテーマで実施された。[1]生命誕生場と生命誕生のプロセスの解明:生命が誕生するためには、水があるだけでは不十分で、それ以外にも複数の環境条件が満たされることが必要である。そこで、諸条件の中から生命誕生場に必要な9つの条件を抽出してまとめた。[2]白馬地域の地質の継続調査と古環境の分類:冥王代類似環境としての白馬地域の特殊な水環境について比較分析し、水環境場を4つのタイプに分類した。白馬で特徴的な蛇紋岩熱水系温泉水は、高アルカリかつ水素ガスを大量に含んでおり、特に、H2を含むため貧酸素水であり、そのため冥王代型の微生物生態系が形成されていることが明らかになった。[3]オクロの自然原子炉の研究:ガボン国内の数地域で露頭周辺の調査を集中的に行い、最適と思われる掘削地点を三か所抽出した。[4]地球の起源と新たな太陽系惑星形成論の展開:太陽系進化の初期条件を決めるうえで、太陽系組成ガスから凝縮した最古の物質であるCAIの理解を深めることが重要である。そこで、始原的隕石ALLENDEに含まれる3種類のCAIに注目し、それらの核合成起源Sr同位体異常(μ84Sr)を高精度で測定した。その結果、μ84Sr値の大きさはFTA > Type B >FSの順であることが判明した。[5]継続的なブレインストーミングの実施:2件の国際ワークショップと4件の国内向けワークショップ実施した。これまで成果をまとめると次のようになる。(1)ABELモデルの提案:地球は裸の岩石惑星として誕生したあと、二次的に揮発性成分が付加し、大気・海洋を持つ惑星に至ったとするモデルである。加えて、大気・海洋・大陸が共存した結果、初めて生命惑星になりえたことを説明した(Maruyama and Ebisuzaki, 2017)。(2)自然原子炉間欠泉モデルの提案:生命誕生には、前駆的化学進化を促進する高密度のエネルギー源が必要で、その役割を果たしたのがウラン鉱床(自然原子炉)である。生命は、自然原子炉と間欠泉の組み合わさった自然原子炉間欠泉で誕生したと説明した(Ebisuzaki and Maruyama, 2017)。(3)生命誕生場に必要な条件の抽出:生命の誕生に水の存在は必要不可欠であるが、それだけでは生命誕生には至らない。そこで、生命誕生場に必要な環境条件を抽出し、前述したエネルギー密度も含めて根拠とともに9個を挙げた(査読中)。(4)生命誕生までの三段階モデルの提案:ダーウィンは「環境が変わらなければ、進化はない」と名言を残した。つまり、生命の誕生と進化を支配したのは環境の変動である。我々は、復元された冥王代の表層環境と自然原子炉間欠泉モデルから、どのように原始生命が生まれたかをまとめ、三段階モデルを提案した(準備中)。これら4点の成果は、「生命の起源」研究において画期的提案であり、本研究領域を大きく前進させた。また、A03班によるHakuba OD1の解析によって、この微生物は遺伝子数が400に満たない40億年前の「生きた化石」であることが分かった。今後は生命誕生場の模擬実験装置を作り、最小遺伝子微生物である「生きた化石」を組み込むことによって、「生命の起源」の実証実験が視野に入ってきた。こうした成果は、当初の計画以上の発見に基づく進展である。最終年度にあたり、これまでの研究成果を論文としてまとめることが第一に重要な点である。この点については、成果を日本語で分かりやすく解説することも重要と考え、地学雑誌特集号「冥王代の世界」へ12論文を投稿済み(冥王代生命学他班を含む領域全体の成果数)で、更に10編程度の論文の投稿を準備中である。本年度の研究推進方策については下記のとおりである。[1]生命誕生場と先駆的化学進化のプロセスの解明:岩石ー水相互作用による二次変質に伴って生成する低温の変質鉱物が金属たんぱく質の合成反応に関与するプロセスを再現実験する。これはA02班との共同作業となる。また、冥王代型の環境下で生きている化石生物の分類を進め、微生物ゲノムの系統的解析に向けた、世界標準の地下水生態系を確立するための予備調査としたい。[2]冥王代地球表層環境進化のモデルのまとめ:地球が生命惑星となった出発原因を説明した新しい地球形成モデル「ABEL(生命元素降臨)モデル」はすでに論文となったが、炭素循環に関する新モデルの論文化の作業が次の課題である。定量的な議論を可能にするために、A05班と共同作業を進め、「生命惑星存続」の条件を決める。[3]オクロの自然原子炉の研究:ガボン共和国オクロの自然原子炉の層準を貫く掘削を計画している。本年度は、掘削と試料の回収を進める。[4]地球のような生命惑星を生むことが可能な原始惑星円盤の初期条件を探る:CAIに残された原始惑星の初期条件、および、ABEL爆撃時代に絶妙の揮発性物質の量が降臨した条件を探る。

(1)大気CO2がマントルに吸収される速度の評価:本研究は、原始地球を実験室で再現し、原初大陸表層の岩石種と原始大気の組成を再現することから始めた。そして、温度低下によって出現する原始海洋の化学組成を実験から見積もり、中性化した海洋下における中央海嶺熱水循環によって冥王代中・後期から大気のCO2がマントルへ輸送されたとするモデルに基づき実験、分析を進め、ほぼ最終段階まで詰めた。しかし、原初大陸の分布面積の計算には、室内実験に基づくアノーソサイトの風化速度と物質循環の速度が与える海洋のpH変化速度の見積もりが最後の鍵となり、これを次年度に持ち越す。(2)生命誕生に先立つ化学進化の地球化学的環境の再現:生命誕生に先立つ化学進化を進めるA02班を以下の3点でサポートした。1還元的リアクターにおける化学反応の研究、2酸化的リアクターにおける化学反応の研究、3合流リアクターにおける化学反応の研究)。具体的には、冥王代の地球表層環境を復元し、多様な表層環境それぞれを構成した、岩石、鉱物、多様な大気環境、水環境を特定し、学際研究のブリッジの役割を果たした。特に間欠泉と周辺の酸化場が生命誕生場の最有力候補地であるとの結論に達した。更に触媒となる岩石と鉱物を特定し、A02とA03班へ情報を伝え、それぞれ室内実験を順調に開始した。(3)他の班とのリンク:学際研究を牽引するにあたって、各班とのディスカッションを進めた。たとえば、A02班とは、ボトムアップの前駆的進化の化学実験の出発実験材料を吟味してA01班の低温NH3合成実験と予測結果を見せて意見の交流を図るなど、積極的な働きかけを各班に対して行った。(1)大気CO2がマントルに吸収される速度の評価:原始地球を実験で再現するための実験と並行して行った隕石の同位体組成の研究のまとめから、地球が、二段階で形成されたことがわかり、ABELモデルとしてまとめた。冥王代原初大気の総量と組成を計算から求め、85気圧CO2+270気圧H2O+1気圧N2=約360気圧を求めた。冥王代地球表層の原始大気の組成と量を実験的に決めるために、久城アドバイザーのコメントに従って、冥王代大気の化学組成を求める実験の概要を作った。これが次年度の実験となる。(2)生命誕生に先立つ化学進化の地球化学的環境の再現:冥王代ジルコンの包有物、隕石、及び月の地質(冥王代地球表の原初大陸のアナログ)を組み合わせ、冥王代表層環境を復元した。それらは、以下の7点が鍵になっている。1巨大陸地の存在、2そこから導かれる多様な表層環境、とりわけ間欠泉(最重要な生命誕生場の候補)、3Fe3P鉱物の存在、4原初大陸の主要構成岩石であるアノーソサイト+KREEP、5原初大陸に貫入・噴出したコマチアイト、6猛毒海洋、7多種多様な前駆的化学進化場と、その場所で合成された有機物が下流側で合流する場。熱水環境場は、そのような場の一つではあるが、乾湿サイクルが期待できない為にアミノ酸の重縮合は起こりえず、前駆的生命進化の場としては不適当であることを導いた。(3)原始地球表層の生命誕生場の整理と触媒科学のブレーンストーミング:生命誕生場として、自然原子炉間欠泉を提案し、間欠泉内部と表層の間の物質循環が導く「生命誕生の3ステップモデル」を提案した。今後は、間欠泉内部の各場における化学反応や触媒の種類、具体的な生命体についてさらに研究を進める。
統合失調症脆弱性遺伝子ディスバインジンの遺伝子改変動物による分子病態解析

ディスバインジン(Dysbindin:DTNBPI: dystrobrevin-binding protein 1)は、世界中の多数の民族において統合失調症との関連が確認されているもっとも有力な統合失調症脆弱性遺伝子の一つである。統合失調症の死後脳研究において、ディスバインジン発現レベルの低下が認められることが報告されている。我々は抗精神病薬を長期投与したマウス脳においてディスバインジンmRNA発現の変化が認められないことを報告した。よって統合失調症脳におけるディスバインジンの発現レベルの低下は抗精神病薬投与による影響を受けているのではなく、統合失調症の病態に関連していると考えられる。これらの結果から、ディスバインジンのノックアウトマウスが統合失調症のモデルマウスとして有用である可能性が示唆される。よってこのマウスを用いて、行動解析を行った。オープンフィールド試験においては、ノックアウトマウスは前半の15分間において行動量が低下しているが、後半の15分においては行動量の変化は認められなかったため、新奇環境における探索意欲が減退していると考えられた。高架式十字迷路において不安の増強が認められた。社会的行動測定テストにおいてノックアウトマウスではコンタクト回数が減少していたが、PPIにおける異常は認められなかった。これらの結果は、ディスバインジンのノックアウトマウスでは、不安の増強に加え、意欲や社会行動の障害が認められることを示唆する。統合失調症のモデルマウスにおいては、このようなフェノタイプを示すものは報告されていない。よってこのマウスは新たな統合失調症のモデル動物として興味深いと考えられる。さらにディスバインジンの過剰発現マウスの作成に成功し、今後、統合失調症モデルとなる環境負荷に対して保護的に働くかどうかについての検討を行う。ディスバインジン(Dysbindin : DTNBP1:dystrobrevin-binding protein 1)は、世界中の多数の民族において統合失調症との関連が確認されているもっとも有力な統合失調症脆弱性遺伝子の一つである。この結果から、ディスバインジンのノックアウトマウスが統合失調症のモデルマウスとして有用である可能性が示唆される。またフィールドの真ん中での滞在時間がノックアウトマウスで減少しており、不安が増強している傾向があると考えられた。次に、高架式十字迷路においては、オープンアームにいく回数が前半の10分では変わらないが、後半の10分で少なくなっており、これも不安を反映していると考えられた。社会的行動測定テストにおいてノックアウトマウスではコンタクト回数が減少していた。
南部アフリカ山岳地における社会変化と農村環境史

本研究では、南部アフリカ山岳地の土壌浸食の現状を問題視し、原因を単に人口圧や過放牧とするのではなく、南部アフリカ全体の社会情勢との関係を踏まえた地域生態論の視座を用いて、農村レベルの土地利用変化を考察してきた。具体的には、南部アフリカのドラケンスバーグ山脈がまたがる、レソト王国および南アフリカ共和国という2つの国の山岳地域を調査対象とし、村内の「生業ー自然」関係の変遷を、社会変動の文脈の中に位置づけることを目的とした。本研究では、南部アフリカに位置するドラケンスバーグ山脈が広がる、レソト王国および南アフリカ共和国の2つの国家の山岳地を調査対象地域とし、山岳地に暮らす人々と自然との関係史を、社会経済的な変動のなかに位置づけることを目的とする。同一の生態環境で国家が異なる2つの地域において、人々の生業活動と自然環境との関わりがどのように変遷してきたのかを比較することで、社会的背景が異なることで、どのように土地利用に違いが生まれるのかを明らかにする。平成24年度では、イギリスへ渡航し、レソトの植民地期(1800年代末1966年)に関する文献収集をおこなった。その結果、レソトで深刻な土壌浸食問題は植民地期からすでに問題視されており、国家政策だけでなく、海外からの援助団体も介入する大きなプロジェクトがたてられていたにもかかわらず、有効な結果が得られないまま現在に至っていることが分かった。平成25年度は新たな調査地に選定した南アフリカのクワクワ地域に渡航し、生業や土地利用に関するインタビュー調査を行なった。その結果、農業を営む住民はおらず、ほぼ全員が現金収入を得る就労を得ていることがわかった。農業と出稼ぎ労働が複合的に営まれているレソトの調査村とは生業の形態が異なった。また補助金の種類が充実しいる点もレソトとは異なり、住民の重要な現金収入源となっていた。本研究では南部アフリカに位置するドラケンスバーグ山脈が広がる、レソトおよび南アフリカの2つの国家の山岳地を調査対象地域とし、山岳地に暮らす人々と自然との関係史を社会経済的な変動の中に位置づけることを目的とする。レソトにおいても、南アフリカにおいてもイギリスによる植民地化は重要な歴史であり、当時の植民地政府の政策は現在の国家の基礎の一部を形作っているといえる。宗主国であったイギリスには当時の刊行物・文献が豊富に所蔵されている。それらを分析し、レソト・南アフリカ両国の現在の国家政策について考察を深めることが重要である。平成24年度はイギリスに渡航し、植民地時代の文献収集をおこなった。その結果、植民地期よりレソトの土壌浸食は深刻であり、様々な対策がたてられたことが明らかになった。国家政策だけでなく、海外からの援助団体も介入し、国中で土壌浸食防止プロジェクトがたてられた。しかし有効な結果は得られず、土壌浸食による耕作地・放牧地の減少は現在まで続くことになった。こうした成果の一部は、英文学術雑誌(MILA)への投稿と、著書(単著)の出版の達成に結び付いた。最終年度は、南アフリカの調査地へ2度目の渡航を実施した。46人の村人に対し、ライフヒストリーの聞き取りを行い、調査村の現在の生業形態と生業変遷を調査した。また耕作地の測量調査より、土地利用が生業変遷とどのように関わっているのかを考察した。その結果、現在農業のみで生計を立てている世帯はおらず、ほとんどの世帯が現金収入を得る就労を得ていることが分かった。生業は、村内のピースワーク、もしくは近隣の都市へ通いで就労しているものが多く、主な職種としてドライバー、農作業、オフィスワークなどが挙げられる。女性も工場などでの働き口があり、重要な現金収入源の一つとなっていた。耕作地では、トウモロコシや野菜類が栽培され、自家消費されていた。耕されていない耕作地も、多く見受けられた。調査村において農耕は、現金収入源としての役割はみられなかった。これは、農業と出稼ぎ労働が複合的に営まれているレソトの調査村とは生業の形態が異なる。また、政府による補助金が充実しており、重要な現金収入源となっている点も異なった。アパルトヘイト時代のホームランドであったクワクワは、当初から耕作に適した土地が広大にあるわけではなかった。先に居住していたものが耕作に適した土地と、首長へのアクセスを確保し、のちに移住してきたものはわずかな土地および村内でのピースワークで食いつないでいく必要があったと思われる。90年代以降、産業の空洞化を背景に村内の雇用機会がさらに減少し、インフォーマルセクターでの小売り業に参入する人が増えた。

小売り業が飽和状態になり息詰まっても、レソトのように農耕に参入する人が少ないのは、政府による補助金が充実していることも一つの要因に挙げられる。アフリカ地域研究新しい場所で調査を始めるにあたり、多少の困難がともなった。例えば、インタビュー調査をするにあたり、住民へのアポイントを必ずとらなくてはならないことに加え、日中は多くの家が留守になるためインタビュー調査がなかなか進まなかった。土地利用の調査では、土地の持ち主が留守のため測量ができないなどの困難が多かった。何回か渡航を繰り返し同じ調査を根気よく繰り返す必要があると考える。平成24年度の研究計画は主に文献調査が中心であった。実際イギリス渡航で国立図書館や各大学図書館にて多くの文献を得ることができた。日本滞在中もその時間の多くを文献の分析に割き、南アフリカの新たなフィールド調査地、およびレソト・南アフリカ両国における植民地政府による政策の概観をつかむことができた。今後は引き続き南アフリカ・クワクワ地域での調査を続ける。測量など、調査地の自然環境や土地利用に関する調査をすすめる。また、世帯ごとの生業活動や、ライフヒストリーに関するインタビューもすすめる。そして現在の生業形態と自然環境が、どのような変遷を経てきたのかを明らかにする。今後は南アフリカでのフィールド調査をはじめる。新たなフィールド調査地となるが、調査項目はすでにレソトのフィールド調査地において実施済であるため、効率よく行うことができると考える。具体的には地形の計測や気温の測定などの定量的調査によって自然環境の特徴と土地利用形態の関係について調査する。また、世帯ごとのインタビューによって村の生業やその歴史も把握する予定である。南アフリカでの新しい調査地での調査が困難だったため、2回の渡航が1回にならざるを得ず、旅費がういてしまったため。また人件費に関しても、分析に十分なデータが得られなかったことから、補助を人に頼むことができなかった。当該助成金と翌年度の助成金を合わせ、海外への渡航調査のための旅費にあてる。次年度はアフリカへの渡航調査が含まれるため、旅費に多くの研究費をあてることになる。また、補足調査として文献収集のためのイギリスもしくはアメリカへの渡航も予定している。渡航調査における調査補助、および得られたデータの分析に、研究補助も依頼する予定であり、謝金による出費も予定している。
神経活性物質としてのガングリオシド類糖脂質の検索

ガングリオシドには多くの種類が知られており、ガングリオテトラオース系でN-アセチルノイラミン酸を含むものでけでも20種以上存在している。従来、微量成分故に同定できないものがあり、それらの中に神経活性物質として作用するものがあると期待されているところである。そこで新しい材料より未知のガングリオシドを単離、同定することを目的とした。1.方法:ラット腹水肝癌を材料として用いた。全脂質を抽出し、エステル脂質を分解除去後、完全アセチル化法により粗ガングリオシド画分を得た。そのものをDEAE-カラムにかけてシアル酸のモル数による分画を行なった。ジシアロ画分をヤトロビーズカラムで精製した。純度は薄層クロマトグラフィーで検定した。糖組成はガスクロマトグラフィーで分析し、糖結合位置は完全メチル化法で解析した。シアル酸の結合位置はシアリダーゼで、アノマー分析はNMRで行なった。2.結果と考察:ラット腹水肝癌細胞より単離された未同定ガングリオシドにGDIαの略号を付した。糖組成はグルコース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸、スフィンゴシン(1:2:1:2:1)でGDIの構造をもつものと考えられた。メチル化実験ではN-アセチルガラクトサミンに分枝構造を有する証拠が得られた。即ち、当該ヘキソサミンの6位にもう一個のシアル酸が結合していると推定された。Cl.perfringensのシアリダーゼでは全てのシアル酸が遊離したが、NeuAcα2-6Gal結合を切り難いとされているNDVシアリダーゼでは一個のシアル酸しか鈴れなかった。その際GMIαとおもわれるものを生じた。NMRでアノマー分析を行ない次の構造をもつ新しい系統のガングリオシドであることが明らかとなった。NeuAcα2-3Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAcβ1-4GalβGlcβ1-1Cer.この特異なガングリオシドについて今後神経細胞賦活作用について検討される必要がある。
モノリス型NiSn合金多孔体の創製とリチウムイオン二次電池負極への応用

共連続ミクロン孔をもつ金属多孔体である「モノリス型金属多孔体」をリチウムイオン2次電池用の負極材として応用し、この構造体が当該電極のサイクル特性の向上に有効であることを示した。ここでは、ニッケル-リン(NiP)系のモノリス型金属多孔体を集電体として用い、ここにリチウムイオン2次電池用の負極材料を担持・複合化することで電極とした。この多孔質構造により充放電時にかかる電池活物質層の負荷を緩和することで、優れたサイクル特性が発現したと考えられる。本研究の目的は、モノリス型NiSn合金を作製し、これをリチウムイオン2次電池負極材として用いることで、当該電極の高容量化、高いサイクル特性の実現を目指すものである。当初の計画は、平成25年度は、モノリス型ニッケル金属多孔体上にスズ金属を担持し、合金化することを掲げており、平成26年度には当該電極の電池特性評価ならびにスズ担持量や細孔径制御などの構造最適化を行う予定である。平成25年度は、モノリス型ニッケル金属多孔体上に電気めっきによりスズを担持し、合金化に成功した。この時、モノリス型ニッケル金属多孔体上にナノ粒子状のスズ金属を担持することができた。ニッケルースズの合金化にはめっき後、減圧下で330°Cで加熱することで達成され、これと同時に支持体であるニッケル多孔体との密着性も向上した。本年度は、金属Snを金属ニッケル多孔体上に担持し、合金化したNiSn多孔体電極を実際にリチウムイオン2次電池の負極材として評価した。金属ニッケル多孔体はエポキシ樹脂からなるポリマーモノリスを鋳型として作製した。具体的には、このポリマーモノリスにパラジウム触媒担持後、無電解めっきにより金属骨格を形成し、焼成により有機物を除去することで作製した。この金属ニッケル多孔体はシート状として得られ、工業的に使用されているニッケル発泡体よりも23桁ほど比表面積が大きいことがわかった。また、この多孔体は通液性もよく電解液が多孔体内部まで浸透できる構造であることもわかった。つづいて、この多孔体上への活物質の担持は、一般的に知られているピロリン酸系のスズめっき浴を用いた電気めっき法により行った。この電気めっき法では、定電流にて電析を行い、電析時間によって担持量を制御した。電池評価においては、1Mヘキサフルオロリン酸リチウムエチレンカーボネート/ジエチレンカーボネート電解液を用い、定電流充放電測定およびサイクル試験測定を行った。ここでは、上記のめっき処理時間により活物質の担持量を変化させて、活物質担持量が充放電特性、サイクル特性に及ぼす影響を評価した。ハイブリッド材料工学H25年度の研究目的・計画である、モノリス型NiSn合金多孔体の作製に成功しており、さらにH25年度中に、次ステップであるリチウム2次電池・負極のとしての評価を始めている。H25年度で新規に作製したモノリス型NiSn合金多孔体を用いて、リチウムイオン2次電池負極としての評価を行う。具体的には充放電特性、サイクル特性などの評価を行う。さらに、これらの評価を通して、当該多孔体の構造最適化を行う。端数。購入物品が若干安価で購入できたため。H26年度に物品費や旅費などに加算して使用する。
教科等の再編に関する基礎的研究-準拠枠と方法論の明確化-

本年度の研究のねらいは、前年度までの教育課程の再編事例の分析等を受けて、教科等の再編の準拠枠や方法論を整理すると同時に、教科等の再編の手続きの試案を作成することにあった。調査研究の結果、次のようなステップを手続き案として提示した。1ステップ1現在の教育課程の課題の把握と必要性の把握(1)子供の実態や特性から導かれる必要性の把握、(2)社会的要請事項の検討、(3)教育課題や教育的要請の把握、(4)教育課程の運営の課題、(5)その他の要請と必要性の検討2ステップ2教育課程の再編の必要性の吟味検討教育課程の課題解決の方法として、合科的方法や指導方法の改善等で克服することができるのか、それとも教育課程の再編を必要としているのかの見極めを行なう。3ステップ3教科等の再編のタイプの検討(1)指導内容の移動・削除・追加等による既存教科の廃止と新教科等の設置(2)既存教科等の目標・内容・方法等の相互関連の検討を踏まえた教科等の再構成(3)必要とされる知識や能力等の区分に基づく教育課程の機能領域の設定と教科等の開発(4)教科外領域の再編4ステップ4教育課程の開発試案の作成と試行実施、カリキュラムの評価ステップ3の各類型を参考に開発された教育課程を実施し、学習効果等を多角的に吟味検討する。特にカリキュラムの学習効果の側面とカリキュラムの運営にかかわる側面の峻別が必要である。また、開発された教科等の実施と他の教科等の関連の二つの面から効果と課題を整理する必要がある。教科等の再編にかかわる契機は、ア.それを必要とする要因や背景、イ.教科等の再編の必要性についての社会的合意、ウ.教科等の再編の手続きや方法論、エ.再編された教科等の構成の妥当性の確保等にあると想定される。本研究は、以上のような教科等の再編を構成する諸契機について、さらに具体的に論点を明確にし、教科等の再編にかかわる準拠枠と方法論を具体的に示すことを目的とする。この目的を実現するため、平成17年度においては、次の2点について研究を進めた。1文部科学省研究開発学校の研究成果の分析文部科学省研究開発学校のうち、平成9年度指定以降の学校(31組)の教育課程の研究開発について次の視点から分析した。(1)教育課程の研究開発のねらい開発のねらいとしては、(1)指定研究のテーマとの関連、(2)児童生徒に身に付けさせたい資質や能力、(3)学校間の接続と連携の改善、(4)児童生徒の発達等に区分できることが分かった。(2)教育課程の開発方法開発の方法としては、(1)教育課程の全体を領域等に再編、(2)教育課程の一部を再編し、新教科等を設置、(3)既存の教育課程に「英会話科」等の新教科を追加、が見られた。2研究開発学校に対する質問紙調査の準備各学校における研究開発の背景や体制等を把握するため、平成9年度指定以降の研究開発学校に対して、教育課程の開発の必要性、教育課程の開発方法、研究体制、カリキュラムの評価等について把握することをねらいに、アンケート項目の作成を行った。この目的を実現するため、平成18年度においては、次の点について研究を進めた。○文部科学省研究開発学校の研究成果の分析平成17年度に実施した文部科学省研究開発学校の教育課程の分析を引き続き実施した。その結果明らかになった点は次のとおりである。(1)教育課程の研究開発のねらい研究開発のねらいには、大きく次のようなタイプがみられた。(1)指定研究のテーマとの関連、(2)児童生徒に身に付けさせたい資質や能力、(3)学校間の接続と連携の改善、(4)各教科等の指導の改善等。(2)教育課程の開発方法開発の方法としては、(1)教育課程の全体を領域等に再編、(2)教育課程の一部を再編し、新教科等を開発、(3)既存の教育課程に新教科を追加、等の方法がみられた。また、教育課程の研究開発に当たって、既存教科等の個々の指導内容等の配置編成を行う方法は少なく、全体として教科等の構成を課題としている学校が多いことが分かった。さらに、教育課程の全体を見直す研究開発は小学校に多く、中学校の場合、教育課程の一部の再編を検討する傾向がみられた。1ステップ1現在の教育課程の課題の把握と必要性の把握(1)子供の実態や特性から導かれる必要性の把握、(2)社会的要請事項の検討、(3)教育課題や教育的要請の把握、(4)教育課程の運営の課題、(5)その他の要請と必要性の検討

2ステップ2教育課程の再編の必要性の吟味検討教育課程の課題解決の方法として、合科的方法や指導方法の改善等で克服することができるのか、それとも教育課程の再編を必要としているのかの見極めを行なう。3ステップ3教科等の再編のタイプの検討(1)指導内容の移動・削除・追加等による既存教科の廃止と新教科等の設置(2)既存教科等の目標・内容・方法等の相互関連の検討を踏まえた教科等の再構成(3)必要とされる知識や能力等の区分に基づく教育課程の機能領域の設定と教科等の開発(4)教科外領域の再編4ステップ4教育課程の開発試案の作成と試行実施、カリキュラムの評価ステップ3の各類型を参考に開発された教育課程を実施し、学習効果等を多角的に吟味検討する。特にカリキュラムの学習効果の側面とカリキュラムの運営にかかわる側面の峻別が必要である。また、開発された教科等の実施と他の教科等の関連の二つの面から効果と課題を整理する必要がある。
レーザー照射による認知症治療

本研究課題では中赤外光をアルツハイマー型認知症の脳組織に照射することによって、凝集したアミロイドベータを解離することができるかどうかを調べることを目的とした。適用する中赤外領域の波長は6ミクロンとした。理由はマウス脳切片に対して6ミクロンの波長の光を照射したところ、ベータシート構造を持つたんぱくの割合が減少し、アルファヘリックス構造を持つたんぱくの割合が増加したためである。昨年度は、脳試料の調整方法として、凍結脳にPBS 300ー500μlを加え、超音波で粉砕したものを使用した。このようにして調整した均一な試料を2本のチューブに分け、1本は照射を行わないコントロール試料として用いて、他の1本の試料に対しては6ミクロンの波長の光を照射した。一部の症例からの脳試料に対して、アミロイドベータ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、シグナルの強度および移動度に差は認められなかった。今年度は別の症例からの脳試料も用いた。更に、PBS内に脳を入れ、超音波で粉砕した試料に加えて、PBS非存在下で脳切片そのものに対して直接6ミクロンの光を照射したものも用意した。照射を行っていない試料と照射後の試料からたんぱくを抽出し、アミロイドベータ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。未照射および照射後のサンプル両者において、アミロイドベータに関しては、モノマーに相当するバンドに加えて、様々な移動度のバンドが見られた。更にフィブリル特異的抗体、オリゴマー特異的抗体を用いてウェスタンブロットを行った。未照射と照射後のサンプル間のシグナルのパターンの差異が、症例間および使用抗体間で異なった。今後は6ミクロンの波長を用いて、照射の強度を上げて解析を行う予定である。我々の2016年の研究成果において、中赤外領域の特定の波長(6ミクロン)の光を赤外自由電子レーザーで発生させ、それをポリグルタミン凝集体に照射したところ、凝集体を解離させる効果があることを見出した。更に、同じ波長のレーザーは培養細胞内のポリグルタミン凝集体解離にも有効であることを発見した。我々は上記知見がアミロイドベータの凝集体解離にも適用できるのではないかと考えた。6ミクロンの波長をアミロイドベータ1ー42ペプチド凝集体に照射し、赤外顕微鏡でベータシート構造を持つものの割合が減少し、電顕解析で凝集体解離を確認した。同じ波長のレーザーは他のアミロイドベータアイソフォームであるアミロイドベータ1ー40および1ー43のペプチド凝集体の解離にも有効であった。本申請ではアルツハイマー病脳切片に対してレーザーを照射し、アミロイドベータ凝集体を解離できるかどうかを調べることを目的とするが、その前段階としてアルツハイマー病モデルマウス脳切片に対して照射を行い、凝集体を形成するベータシート構造を取るたんぱくの割合が減少するかどうかを調べた。使用したアルツハイマー病モデルマウスは3xTgADマウスであり、変異アミロイド前駆体たんぱく、タウ、プレセ二リンの3種類すべてをノックインあるいはトランスジーンとして発現させたマウスである。20ミクロンの厚さのマウス脳冠状断切片にレーザーを照射し、赤外顕微鏡で大脳皮質の領域からデータをとり、構造解析ソフトを使用し、たんぱくの2次構造の解析を行った。つまりアルファヘリックス、ベータシート、ベータターン、それ以外のコンフォメーションを持つものの割合を定量した。中赤外領域の波長(5、6ミクロン)の赤外自由電子レーザーはアルファヘリックス構造を持つたんぱくの割合を有意に増やし、逆にベータシート構造を持つたんぱくの割合を有意に減らすことがわかった。本申請ではアルツハイマー病脳切片に対してレーザーを照射し、アミロイドベータ凝集体を解離できるかどうかを調べることを目的とするが、その前段階としてアルツハイマー病モデルマウス脳切片に対して照射を行い、凝集体を形成するベータシート構造を取るたんぱくの割合が減少するかどうかを調べ、結果を得ることができたから。アルツハイマー型認知症は認知症をひきおこす代表的な原因疾患であり、認知障害、記憶障害などの症状が加齢とともに進行する。病理学的にアミロイドベータが凝集し脳内に過剰に蓄積する。現在までのところ有効な治療法は確立されていない。凝集を標的とした治療研究として、本研究課題においては中赤外領域のレーザー照射がアルツハイマー型認知症の脳切片内のアミロイドベータ凝集体を解離することができるかどうかを調べることを目的とする。本研究は「人を対象とする医学系研究倫理審査委員会」に申請し、承認されている。試料として、免疫染色の結果、前頭葉でアミロイドベータ強陽性であることがわかっている、剖検アルツハイマー型認知症3例の凍結保存の脳切片を用いた。凍結脳にPBS 300ー500μlを加え、超音波で粉砕したものに対してレーザーを照射した。適用波長であるが、昨年、アルツハイマー病モデルマウス脳切片に対して5および6ミクロンの波長のレーザーを照射し、ベータシート構造を持つたんぱくの割合が減少し、反対にアルファヘリックスの構造を持つたんぱくの割合が増加したため、アルツハイマー型認知症の剖検脳に対して、最初に6ミクロンの波長を試した。照射時の熱量は5.5ー8mJで照射時間は25分間とした。

レーザー照射を行ったサンプルと行っていないもので、アミロイドベータ抗体およびフィブリル特異的抗体を用いたウェスタンブロットを行ったが、レーザー照射の前後で両抗体によるシグナルの強度および移動度に有意な差は認められなかった。アルツハイマー型認知症の脳切片内のアミロイドベータ凝集体を解離することができるかどうかを調べることが目的であり、そのための効果的な波長の決定のために予備実験として、アルツハイマー病モデルマウス脳切片に対して照射を行い、効果的な波長を決定し、6ミクロンの波長をヒト脳切片照射に対して適用したが、現在までの解析では凝集体解離を示唆する結果が得られていないから。本研究課題では中赤外光をアルツハイマー型認知症の脳組織に照射することによって、凝集したアミロイドベータを解離することができるかどうかを調べることを目的とした。適用する中赤外領域の波長は6ミクロンとした。理由はマウス脳切片に対して6ミクロンの波長の光を照射したところ、ベータシート構造を持つたんぱくの割合が減少し、アルファヘリックス構造を持つたんぱくの割合が増加したためである。昨年度は、脳試料の調整方法として、凍結脳にPBS 300ー500μlを加え、超音波で粉砕したものを使用した。このようにして調整した均一な試料を2本のチューブに分け、1本は照射を行わないコントロール試料として用いて、他の1本の試料に対しては6ミクロンの波長の光を照射した。一部の症例からの脳試料に対して、アミロイドベータ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、シグナルの強度および移動度に差は認められなかった。今年度は別の症例からの脳試料も用いた。更に、PBS内に脳を入れ、超音波で粉砕した試料に加えて、PBS非存在下で脳切片そのものに対して直接6ミクロンの光を照射したものも用意した。照射を行っていない試料と照射後の試料からたんぱくを抽出し、アミロイドベータ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。未照射および照射後のサンプル両者において、アミロイドベータに関しては、モノマーに相当するバンドに加えて、様々な移動度のバンドが見られた。更にフィブリル特異的抗体、オリゴマー特異的抗体を用いてウェスタンブロットを行った。未照射と照射後のサンプル間のシグナルのパターンの差異が、症例間および使用抗体間で異なった。今後は6ミクロンの波長を用いて、照射の強度を上げて解析を行う予定である。アルツハイマー病モデルマウス脳切片に対して行った照射、解析方法を使って、次年度はアルツハイマー病脳切片に対して同様の実験を行う予定である。アルツハイマー病モデルマウス脳切片に対しては5および6ミクロンの両方の波長のレーザーが有効であった。したがって、次年度は5ミクロンの波長を試してみる。照射試料であるが、今年度はPBSに懸濁した後の脳試料に対して照射を行ったが、次年度は脳切片に対して直接レーザーを照射する。また、解析方法として、可溶化分画、不溶化分画に分けた試料を用いたウェスタンブロットを追加する。1年前に設定した研究計画では、1年目の2016年度においてアルツハイマー病患者脳に対する照射、解析の一部をスモールスケールで行う予定にしていたため、上記金額を設定した。アルツハイマー病患者脳切片は少量しか入手できないため、使用サンプルを必要最小限にして実験を効率よく行う必要がある。その為にはアルツハイマー病モデルマウス脳切片を用いて十分な条件検討を行うことが近道である。