hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二酸化炭素光触媒還元電位・波長の制御と光燃料電池の援用および動的過程の分光追跡

高圧CO2光燃料化ではPd/TiO2が最も高活性で、CO2 + H2下で反応させた場合には、CO2圧0.12 MPa, H2圧0.28 MPaで活性は極大となるのに対し、CO2 + moisture下で反応させた場合には、全圧0.80 MPaに至るまでラングミュア型の速度依存性を示し、メタン生成の反応次数は0.39だった。競争吸着する前者に対し、後者では水光酸化サイト(TiO2等)とCO2光還元サイト(Pd等)が有効に分離されたためと分かった。関連して、水を媒質とする両極に光触媒を用いる太陽電池で、BiOCl等の正極を背面照射とすることで、リーク電流を抑制し、開放電圧1.91 V/セルを得た。水を燃料(媒質)とする、水の酸化用光電極およびO2の還元用光電極双方を備えた光燃料電池について、生成電流および出力を支配する因子の物理化学的解明を行い、特にO2の還元用光電極の表面活性サイトの特定と高密度化する研究を行った。光電極形成法の違いによる光触媒層の密度最適化は、実験継続中であるが、起電力や生成電流値の改良については、立案時の想定を凌ぐ成果を得つつある。CO2光燃料化の光正極としては、表面プラズモン共鳴を示す金および銀ナノ粒子あるいは銅フタロシアニン色素を継続して研究している層状複水酸化物と組み合わせることで、促進効果が認められた。ここで仕事関数や電子準位の高低の違いにより、銀ナノ粒子は光で活性化された電子を層状複水酸化物に送り込むことで促進効果を示したのに対し、銅フタロシアニンは直接CO2の還元に作用した。光負極で水の酸化触媒と組み合わせる際には、プロトンからH2を生成しやすい水溶液を満たすセルではなく、CO2と化合してメタノールおよびCOを生成しやすい固体高分子型燃料電池タイプの、水蒸気を流通させるセルを用いる方針も実験的に得た。その他、光正極の光燃料化速度の抜本的な改良がこの研究分野でのブレークスルーになっており、反応圧・光量・励起光波長分布の光燃料化速度への影響評価を進めており、さらに太陽光などの光照射時にCO2 + 4H2 = CH4 + 2H2Oのような発熱反応が進む際の反応熱の影響についても評価を進めている。水を媒質とする、両極に光触媒を用いる太陽電池(光燃料電池)では動作原理に立ち返り、負極で水を光酸化して生じたO2がセル内で正極に移行し正極では光還元されて水に戻ることで、セルが独立して光をエネルギー源として発電することを示した。さらに動作過程を明らかにするために、正極光触媒にバンドギャップが4.5 Vと大きいZrO2に銀を担持して用いたところ、セル当り1.9 Vの起電力を示したが、負極の励起電子が正極の銀に直接流れ込み、セル出力に余り寄与しない過程も併発することが明らかになった。一方、正極では酸化チタンを有機-水混合溶媒中で高分散後触媒層化した場合に、水光酸化の活性点数および触媒層の通電がよく、より小さな粒径によるものと考えられた。CO2光燃料化では、まず反応速度および選択性を支配する因子の検討を行った。水素および水蒸気を還元剤に用いた場合いずれも、Pd/TiO2が概ね最も優れていた。触媒は10 mgの膜状にするのがよく、水素を還元剤に用いた場合CO2 0.12 MPa, H2 0.28 MPaの場合に極大速度でメタンを生成した。金属的なPdサイトへのCO2とHとの競合が考えられた。水蒸気を還元剤に用いた場合、メタン生成はCO2圧の0.39乗に比例して増加し、CO2 0.8 MPaでH2使用の極大速度と並んだ。水はTiO2表面で、CO2はPd表面でサイト分離されて、それぞれ酸化/還元されると考えられた。一方、BiOClおよびAg-[Zn3Ga(OH)8]2CO3_mH2O層状複水酸化物を用いると、還元剤として水素を用いるよりも水蒸気を用いる方がメタンおよびCO生成速度が速い、という常識外の結果を得た。この理由として、半導体表面における水の活性化機構と深く関わっているものと考えられるが、詳細は研究進行中である。光燃料電池については、セルの要素毎に実験的に検討を進めて起電力、出力を向上させ、その動作原理を調べていく計画であり、概ね順調に進展していると考える。一方、CO2光燃料化については、光触媒の還元電位として半導体によりマイナス側の電位をもつ添加物質およびサステイナブルな方法で負電位をかける、という計画であったが、本研究後の将来を見据えた研究開発では、半導体自身の選択、反応セルや還元剤、反応圧等根本的に検討する必要があった。上記のように2015年度にこれらを十分検討し、反応機構からの理解も進んでいる。反応サイトが競合しないよう、およびO2を脱離しやすい触媒開発等更なる進展の方向を明確にしている点でも、当初の計画以上に進展していると考える。以上、総じて当初も計画以上に進展している、と考える。水を媒質とする、両極に光触媒を用いる太陽電池(光燃料電池)は、単セルで光触媒のバンドギャップ相当の起電力が得られる。この理論起電力からの過電圧を詳細に調べた。

光触媒側から光照射すると表面反応数で有利だが、反応点から電極までの電荷拡散過電圧(0.23-0.41 V)が見積もられた。この点で、光電極への背面照射が高起電力を得るのに有利だった。一方、負極からの励起電子が正極の電子トラップサイト(酸素欠陥や金属ナノ粒子)に直接移行してしまうリーク電流が、特に正極を正面照射としたときに認められた。BiOCl等のp型半導体光触媒を正極用に選び、正極を背面照射とすることで、正極の価電子帯に残るホールがバンドの曲がりにより電極近くに移動し、負極から移行した励起電子と有効に結合し、リーク電流を抑制した。以上より、開放電圧1.91 V、セル出力55.8 μW(セル面積は1.3 cm**2)を実現した。0.1-0.8 MPaでの高圧CO2光燃料化では、Pd/TiO2が最も高活性だが、CO2+H2で反応させた場合には、CO2圧0.12 MPa, H2圧0.28 MPaで活性は極大(主生成物はメタン)となるのに対し、CO2+moistureで反応させた場合には、0.8 MPaに至るまでラングミュア型の速度依存性を示し、メタン生成の反応次数は0.39だった。前者ではPd上のCO2吸着をHが阻害するのに対し、後者では光照射下で酸素欠陥サイトがTiO2に生じていることがTi K EXAFSおよびFTIRにより示された。水が酸化チタン表面でホール酸化される際に酸素欠陥が生じたと考えられた。すなわち、水の酸化サイト(TiO2)とCO2の還元サイト(Pd)とが有効に分離されたため、Pd/TiO2および半導体ベースの光触媒一般でCO2+moistureでの反応速度がCO2+H2での反応速度より速くなったといえる。高圧CO2光燃料化ではPd/TiO2が最も高活性で、CO2 + H2下で反応させた場合には、CO2圧0.12 MPa, H2圧0.28 MPaで活性は極大となるのに対し、CO2 + moisture下で反応させた場合には、全圧0.80 MPaに至るまでラングミュア型の速度依存性を示し、メタン生成の反応次数は0.39だった。競争吸着する前者に対し、後者では水光酸化サイト(TiO2等)とCO2光還元サイト(Pd等)が有効に分離されたためと分かった。関連して、水を媒質とする両極に光触媒を用いる太陽電池で、BiOCl等の正極を背面照射とすることで、リーク電流を抑制し、開放電圧1.91 V/セルを得た。研究計画は概ね順調に進んでいるが、CO2光燃料化および関連電池デバイスの研究の進展は非常に高ピッチであり、「研究実績の概要」の欄に記載したように、立案時には十分に想定していなかったパラメーターについても実験的検討を併せて行っているため、概ね順調という自己評価が妥当である。光燃料電池については、上記の酸化チタン層より優れた触媒層の形成法(スプレー法,異方性結晶利用等)があるか検討する。負極だけでなく、正極についても層形成の影響を調べる。また、計画した検討項目として残されている、正極にp型半導体を用いたときの性能をサイクリック・ボルタンメトリーおよび分光測定と合わせて検討してゆく。CO2光燃料化では、CO2とHとがサイト競合しないような金属表面サイト、たとえば合金サイトの開発、またH2Oから容易にO2が脱離する添加物の開発を行い、本研究のこれまでの成果で得た圧依存性、膜依存性、還元剤依存性と合わせて、更なる飛躍が十分期待できる。触媒化学、X線分光、環境化学光燃料電池については、光触媒の最適化も含めた各要素技術(光触媒の種類・層密度、基板の種類、媒質の種類、等)を最適化し、特に立案時の起電力を遥かに超えるセル構成、および廃棄物を燃料とする可能性についても併せて検討する。
痒みを特異的に伝達する脳－脊髄神経ネットワークの同定

知覚神経系に発現するgastrin-releasing peptide receptor (GRPR)が痒み特異的伝達分子として見出され、痒み独自の伝達機構の解明が急速に進んでいる。我々は、リガンドであるgastrin-releasing peptide (GRP)に着目し、光学顕微鏡と各種先端的電子顕微鏡技法を駆使し、痒み伝達神経終末の階層的形態解析を実施した。その結果、超微形態レベルで三次元的な痒み伝達シナプス構造の可視化に成功した。これまで痛みとの多くの類似性により、痒み特異的分子基盤が不明であったが、2007年に感覚神経系gastrin-releasing peptide receptor (GRPR)が初めて痒み受容器として報告され、以降、痒みの伝達に関わる様々な分子の報告がなされている。研究代表者はこれまで、GRPRのリガンドであるgastrin-releasing peptide (GRP)に着目し、感覚神経系における局在と投射先を明らかにしてきた。本研究では、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡、超高圧電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、三次元電子顕微鏡などの各種顕微鏡を用いて、GRPをターゲットとした痒み伝達神経回路の解明を目的とする。今回、近年開発された三次元電子顕微鏡のひとつである連続ブロック表面走査型電子顕微鏡に、これまで確立してきた免疫電子顕微鏡法を応用し、痒み伝達神経終末の三次元超微形態解析を実施した。その結果、免疫組織化学法、重金属染色法、試料作製法の改良を試み、脊髄後角における痒み伝達神経終末の三次元観察が可能となり、現在、セグメンテーションを実施中である。過去の透過型電子顕微鏡を用いた脊髄後角神経ネットワーク解析から得られる情報は二次元的であったため、今回の三次元構造解析の結果から、新たなシナプス構造が見出されている。また、連続ブロック表面走査型電子顕微鏡試料作製に用いる重金属染色を、超高圧電子顕微鏡の試料作製に応用したところ、試料の厚みとコントラストの問題が解決され、超高圧電子顕微鏡においてもシナプスの構造解析が可能となった。形態学解析と並行して、痒み関連分子をターゲットとした遺伝子改変動物のキャラクタライゼーションを実施中である。H27年度はH26年度に行った連続ブロック表面走査型電子顕微鏡で観察した痒み特異的伝達分子gastrin-releasing peptide (GRP)を標識した試料の三次元再構築を実施した。GRPで標識される神経終末はいくつもの膨らみが連続する数珠状構造を示し、膨らみの部分にGRP免疫陽性およびミトコンドリアの集積が見られた。また、痒み伝達神経終末に対するポストシナプスの構成要素の解析を行い、樹状突起・細胞体・有芯性小胞を含む神経終末・グリア細胞などの多数の構成要素によるシナプスの被覆がみられた。従来の電子顕微鏡法による脊髄後角神経ネットワーク解析から得られる情報は二次元的であったため、今回の三次元構造解析の結果から、多数の構成要素によるシナプス構造が見出された。このうち、想定していたよりもグリア細胞による痒み伝達シナプスの被覆の割合が多かったため、このグリア細胞の由来を同定するために、アストロサイト・ミクログリアのマーカーを用いて、新たな構造解析を実施している。本研究の解析の問題点は、三次元電子顕微鏡観察後の画像のセグメンテーションであり、数百から数千枚単位のセグメンテーションをマニュアルで行うため、予想を大きく上回る解析時間が必要となっていることである。シナプスのような近接した構造の個々の構成要素を自動的に迅速に抽出するソフトウエアの開発が望まれる。また、痒み関連分子をターゲットとした遺伝子改変動物のキャラクタライゼーションを実施した。そのうち、痒み特異的伝達分子であるGRP受容体について、脊髄から脳幹における局在解析が完了し、各種神経マーカーを用いて、体性感覚神経系におけるGRP受容体発現細胞のキャラクタライゼーションを実施した。現在GRP受容体発現細胞の投射部位の解析を実施している。今回、三次元電子顕微鏡のひとつである連続ブロック表面走査型電子顕微鏡に、目的分子を標識する免疫組織化学法を応用した技術を確立することができ、研究はおおむね順調に進んでいる。また、三次元電子顕微鏡用の試料作製方法を超高圧電子顕微鏡に応用し、超高圧電子顕微鏡に用いる数マイクロメーターの厚みの試料においても、試料の厚みとコントラストの問題が解決され、神経ネットワークとシナプス構造の解析が可能となり、現在論文にまとめている。しかし、三次元電子顕微鏡観察後の画像のセグメンテーションは数百から数千枚単位をマニュアルで行うため、予想を大きく上回る解析時間が必要となっている。現在、解析を継続中であるが、このため、痒み関連分子をターゲットとした遺伝子改変動物を用いる研究が、キャラクタライゼーションに留まっている。神経解剖学H26年度に観察した痒み伝達神経終末の三次元再構築を完成させ、痒みを伝達するシナプスの構成要素の割合と痒み刺激時の変化を調べる。さらに、二重免疫組織化学法を三次元電子顕微鏡に応用し、痒み伝達メカニズムを超微形態から明らかにする。また、現在キャラクタライゼーション中の遺伝子改変動物を用いて、痒みの指標となる掻破行動解析と組織学解析から、痒みを脊髄から脳へ伝える神経回路の同定を行う。
残存HIVの転写活性化を規定する宿主内環境因子の同定

HIV感染者の末梢血中の感染細胞では伸長が中途停止したHIV由来の60-70塩基の短鎖RNA(ST)が高頻度に産生される。我々はSTを指標に感染細胞の転写活性を評価する独自の系を考案し、治療により血漿ウイルス量が良好に制御されていても、STが高レベルで検出される患者ではCD8+ T細胞が慢性的に活性化されており、免疫力の指標であるCD4+細胞数の回復が鈍いことを見出した。この知見は血漿に反映されないウイルスの持続的な転写活性化が抗HIV療法下の患者においても惹起されている確固たる証拠であると同時に、低レベルなウイルス複製と慢性炎症が互いに刺激しあう悪循環に陥っている可能性を示唆している。我々が考案したHIV LTRの転写活性をウイルス由来の短鎖RNAを指標として鋭敏に検出する定量的RT-PCR法は、体内に潜む転写のアクティブな感染細胞の検出に成功した。我々はこの検出法を用いて、抗ウイルス薬により血漿中のウイルス量が検出限界未満となりながらもHIV LTRの転写活性化が検出される患者では、免疫力の指標であるCD4+細胞数の十分な回復が得られにくいという事実を見出している。この現象は、残存ウイルスの転写活性化が患者の免疫力改善を妨げる何らかのリスクを反映していることを意味する。しかし現在、残存感染細胞の活性化と体内環境の相関については未解明な部分が多い。本研究では、上述で見出した残存感染細胞の活性化を惹起する細胞内環境要因の解明を進め、残存ウイルスの転写活性化と免疫力の回復不全の因果関係の理解を試みることとした。平成27年度はCD4+およびCD8+T細胞の活性化・疲弊に関する各種表面マーカーの発現を解析し、短鎖RNAと炎症との相関を中心にウイルスの転写活性が高いレベルで保持される環境要因の同定を進めた。その結果、血漿ウイルス量が検出限界未満となりながらもウイルスHIV LTRの転写活性が見られる患者では、CD8+T細胞表面におけるCD38およびHLA-DRの発現が上昇していることが分かった。この事実は感染細胞の転写活性化が起きている患者では血漿ウイルス量の抑制が免疫の鎮静化に結びついていないことを表しており、患者の病態を把握する上でも感染細胞の転写活性を測定することが重要であることを示している。残存感染細胞の活性化と相関のある患者体内の環境要因として、免疫の持続的な活性化を同定した。この内容を短鎖RNAの検出方法と併せて学術論文として発表した(Journal of Virology, in press)。背景:我々が考案したHIV LTRの転写活性をウイルス由来の短鎖RNAを指標として鋭敏に検出する定量的RT-PCR法は、体内に潜む転写のアクティブな感染細胞の検出に成功した。成果:血漿ウイルス量が検出限界未満となりながらもウイルスHIV LTRの転写活性が見られる患者ではCD8+T細胞表面におけるCD38およびHLA-DRの発現が上昇しており、免疫が活性化され続けていた。また、これらの患者では未治療時に非常に強くCD8+ T細胞の活性化が起きており、それが治療後も高活性化状態が維持されていることが分かった。この事実から、治療後も高レベルでSTの発現が続く背景には、未治療時の過度な免疫の活性化により免疫系が受けた不可逆的なダメージがあると推察できる。本研究により、STの治療後も続く慢性的な免疫活性化のマーカーとしての有効性が示唆された。次年度は、短鎖RNAの発現量とin vitroにおけるウイルス産生能の関係や、CD4細胞数を指標とした治療効果との関係を精査し、残存ウイルスが病態に及ぼす影響の本質的な理解に努める。ウイルス学平成27年度は実験計画が順調に遂行されたため、若干の未使用額が生じた。平成28年度の物品費に組み込む。
マウス各発達段階組織を用いたヒト小児肝腫瘍、腎腫瘍における腫瘍関連遺伝子の検討

ヒト小児肝腫瘍、腎腫瘍の発生・進展に関わる遺伝子の探索を目的として、候補遺伝子のゲノムメチル化状態を、マウスの各発達段階の肝・腎組織において定量的に検討した。その結果、肝組織の発達に伴いメチル化レベルの亢進していたZSCAN10、SlC16A5について、肝腫瘍・腎腫瘍細胞株並びに当科で保存している臨床検体における発現状態を定量的に解析したが、一定の結果は得られなかった。そこで、別の新規候補遺伝子であるTfap2eの肝芽腫細胞株における機能解析を行なったところ、Tfap2e抑制での細胞増殖亢進と過剰発現での細胞増殖低下が確認され、がん抑制遺伝子としての可能性が示唆された。本年度は、これまで我々が神経芽腫で報告してきた新規腫瘍関連遺伝子について、組織発達段階で変化を認める遺伝子の絞込みを行った。マウス各発達段階での候補遺伝子におけるDNAメチル化状態および遺伝子発現を解析するために、マウス(C57BL/6)の胎生15日、出生0または1日、12週齢の肝臓・腎臓を3検体ずつ摘出した。各組織からRNAおよびDNAを抽出し、これまで神経芽腫での新規腫瘍関連遺伝子として報告してきた4遺伝子(AD)について、Real-time PCRによる発現解析およびMassARRAY Epityperによる定量的DNAメチル化解析を行った。その結果、腎組織では3遺伝子(A、C、D)、肝組織では2遺伝子(C、D)で、発達に伴いその発現とDNAメチル化状態に段階的な変化を認めた。この各遺伝子につき、肝ではヒト小児正常肝組織3検体とヒト肝芽腫細胞株2株(HepG2、Huh6 clone5)間で、腎ではヒト小児正常腎組織3検体とヒト腎芽腫細胞株2株(SK-NEP-1、G401)間で、Real-time PCRにて定量的発現解析を行った。その結果、肝芽腫細胞株で2遺伝子(C、D)、腎芽腫細胞株で2遺伝子(A、D)が発現に有意な差を認めた。現在この遺伝子についてMassARRAY Epityperによる定量的DNAメチル化解析を行っている。DNAメチル化に正常組織との差を認めた遺伝子・細胞株につき、随時機能解析を行っていく予定である。本年度は、これまでに絞り込みを行った、肝芽腫細胞株で2遺伝子(C、D)、腎芽腫細胞株で2遺伝子(A、D)についてMassARRAY Epityperによる定量的DNAメチル化解析を行い、それぞれ正常肝および腎組織とDNAメチル化状態を比較検討した。その結果、肝芽腫細胞株で1遺伝子(D)、腎芽腫細胞株で1遺伝子(A)に正常組織とメチル化状態について変化を認めた。この結果より我々は、肝芽腫における遺伝子(D)の機能を解析するため、遺伝子(D)に対するsiRNAを用意し、肝芽腫細胞株(HepG2、Huh6、clone5)に導入したところ、遺伝子(D)が有意に抑制されることを確認した。また、遺伝子(D)のfull lengthのcDNAを用意しており、肝芽腫細胞株へLipofection法で導入し、定常発現株の作製を試みている。抗生剤存在下でセレクションし、シングルクローンを30株ほど得たため、現在、real-time PCRおよびWestern blottingで発現の定量を行っているが、安定発現株の樹立はできていない。腎芽腫においても、遺伝子(A)に対してのsiRNAおよびfull lengthのcDNAを用意しており、現在、肝芽腫と同様の手法で、腎芽腫細胞株(SK-NEP-1、G401)に対して、siRNAの発現抑制の確認および定常発現株の樹立を試みている。今後、肝芽腫細胞株、腎芽腫細胞株でそれぞれ遺伝子(D)、遺伝子(A)の発現抑制および強制発現で、細胞の増殖・遊走・浸潤能の機能を解析し、変化を認めた場合には、下流遺伝子の発現状態についての詳細な解析を行い、新規治療標的遺伝子となり得るかを検討する。肝芽腫細胞株、腎芽種細胞株と正常肝および腎組織を用いて、MassARRAY Epityperによる定量的DNAメチル化解析の結果、それぞれの候補遺伝子が1つに絞り込まれた。現在それぞれの遺伝子について、細胞株を用いた機能解析をするための予備実験として、発現抑制および強制発現の効果を検討している。今後、遺伝子の機能解析を行う準備として順調に実験計画が進行している。前年度までに、絞り込みを行なった候補遺伝子のうち、2遺伝子については肝芽腫細胞株におけるゲノムメチル化状態を、別の2遺伝子については腎芽腫におけるゲノムメチル化レベルを、MassARRAY Epityper法を用いて定量的に解析した。その結果、正常組織と比較して腫瘍組織において遺伝子Aのメチル化状態が変化していたことから、本年度は臨床検体における遺伝子Aの発現レベルの解析、および培養系における遺伝子Aの機能解析を行なった。当科で保存している肝芽腫臨床検体4症例に対して、遺伝子Aの発現解析を行なった所、腫瘍の方が高発現であった症例と低発現であった症例が2例ずつであった。このことから、現時点では腫瘍組織における遺伝子Aの発現状態について一定の見解は得られていない。次に、培養系における機能解析を行うために、肝芽腫細胞株2種類(HepG2,Huh6)における遺伝子Aの発現レベルをReal-time-PCRにより調べたところ、Huh6で高発現であることを確認した。そこで、Huh6に対してsiRNAを導入し、遺伝子Aの発現抑制を行い、細胞機能の影響を調べた。Real-time-PCR、Western blottingを用いて発現抑制効率を確認した後、増殖能や浸潤能の解析を行っているが、現時点では一定の結果は得られていない。

また、full lengthのcDNA導入による定常発現株作成を試みているが、樹立には至っていない。今後は、実験条件の再検討を行い、遺伝子Aの抑制による細胞機能の変化について引き続き解析するとともに、肝芽腫および腎芽腫細胞株に対して遺伝子Aを一過性に過剰発現させ、機能解析を行う予定である。ヒト小児肝腫瘍、腎腫瘍の発生・進展に関わる遺伝子の探索を目的として、候補遺伝子のゲノムメチル化状態を、マウスの各発達段階の肝・腎組織において定量的に検討した。その結果、肝組織の発達に伴いメチル化レベルの亢進していたZSCAN10、SlC16A5について、肝腫瘍・腎腫瘍細胞株並びに当科で保存している臨床検体における発現状態を定量的に解析したが、一定の結果は得られなかった。そこで、別の新規候補遺伝子であるTfap2eの肝芽腫細胞株における機能解析を行なったところ、Tfap2e抑制での細胞増殖亢進と過剰発現での細胞増殖低下が確認され、がん抑制遺伝子としての可能性が示唆された。候補遺伝子に対するマウスおよびヒト検体でのDNAメチル化解析および遺伝子発現解析により、候補遺伝子はさらに絞り込まれた。ヒト臨床組織検体とヒト肝芽腫および腎芽腫細胞株における定量的DNAメチル化解析は現在解析中であり、比較的早期に解析終了する。今後の遺伝子機能解析を進めるにあたり大きな支障はないと考えられる。肝芽腫細胞株、腎芽種細胞株を用いてそれぞれ遺伝子(D)、遺伝子(A)の発現抑制および強制発現を行い、細胞増殖、浸潤、遊走能などに影響を与えるかどうか、in vitroで検討する。変化を認めた場合には、下流遺伝子の発現やリン酸化状態についてReal-time RT PCRおよびWestern blottingで詳細な解析を行う。定常発現株が樹立できた場合には、ヌードマウスを用いて、細胞株をヌードマウスに移植し、腫瘍モデルマウスを作製する。コントロールとしてMockベクター導入細胞株を移植した腫瘍モデルマウスを作製し、腫瘍の増殖、転移を比較検討する。これまでのin vitro、in vivoの結果をもとに、それぞれの遺伝子が肝芽腫、腎芽種における新規治療標的の遺伝子となり得るか検討する。小児外科学マウス発達段階およびヒト臨床検体と細胞株を用いた解析で有意差を認めた遺伝子・組織につき、ヒト肝芽腫細胞株またはヒト腎芽腫細胞株を用いた機能解析を行う。候補遺伝子に対してsiRNAによりKnock down細胞株やfull length cDNAを含んだプラスミドベクターを用いた強制発現細胞株による実験系は当施設内で確立されており、候補遺伝子の絞込みが終了次第解析可能である。
人工酸素運搬体及び類縁体を用いた酸素代謝障害の革新的治療法の研究

生体内の血液循環はポンプとしての心臓、回路としての血管、循環液としての血液からなり、何れを欠いても循環不全となる。本研究では血液の側からの治療として、人工酸素運搬体を用いた動物実験において、1)気管支、胃、脳、内耳、皮膚、骨格筋などの虚血・再灌流における保護作用、2)大量投与後も網内系の抗原認識機能に競合的阻害を来さず、3)担癌マウスに併用することで放射線療法を増感し、化学療法での遠隔転移を抑制した。作用機序として、酸素による「好気的代謝」という従来の考えから、HIF-1aを介したシグナル伝達系の抑制による「抗炎症作用」が実験結果をより妥当に説明すると考えられる。人工酸素運搬体およびその類縁体(以下、合成薬剤)を用いて以下の実験を行なってきた。α)適応疾患・応用範囲の拡大: I)呼吸不全、II)心不全、III)虚血再還流の動物モデルで合成薬剤の有用性を検討する。β)作用点・作用機序の解析:現在までに効果の見られた疾患モデルにおいて、A)微小血管造影法、B)電気生理学的方法、C)生理活性物質モニター、D)免疫組織化学染色を含む形態学的検査、E)免疫学的手法により、人工酸素運搬体投与前後および長期的効果を比較検討する。また、酸素に対する水素などの拮抗物質を前投与することなどで作用機序の検索および確認を行う。γ)合成薬剤の更なる修飾による最適化:リポゾーム封入ヘモグロビン(LEH)、Hemocyclodexytorin(HemoCD)、Corrphycene-Myoglobin(CpMb)のそれぞれについて、サイズ・表面処理・カプセル素材・酸素親和性などについて病態においてて検討し、対象とする病態モデルそれぞれに最適となるように、調整して、疾病毎に酸素親和性を最適化した人工酸素運搬体としている。また、その類縁体としてImCD(シアンイオンへの親和性が高い)やHemoCD3(シアンイオンへの親和性が更に高い)などを作成しシアン中毒(酸素代謝障害の例)における解毒剤としての効果を検証している。α)適応疾患・応用範囲の拡大脳虚血・再還流における投与タイミングを検討した。β)作用点・作用機序の解析内耳虚血への効果から虚血中のO2代謝のみならず、最還流後のNO代謝の関与があることが判明した。γ)人工酸素運搬体の合成シアン及び酸素に強い結合定数及び結合速度を有するHemo CD3を開発した。人工酸素運搬体およびその類縁体(以下、合成薬剤)を用いて以下の実験を行ってきた。α)適用疾患・応用範囲の拡大: I)呼吸不全、II)心不全、III)虚血再還流の動物モデルで合成薬剤の有用性を検討する。β)作用点・作用機序の解析:現在までに効果の見られた疾患モデルにおいて、A)微小血管造影法、B)電気生理学的方法、C)生理活性物質モニター、D)免疫組織化学染色を含む形態学的検査、E)免疫学的手法により、人口酸素運搬体投与前後および長期的効果を比較検討する。γ)合成薬剤の更なる修飾による最適化:リポゾーム封入ヘモグロビン(LEH)、Hemocyclodexytorin(HemoCD)、Corrphycene-Myoglobin(CpMb)のそれぞれについて、サイズ・表面処理・カプセル素材・酸素親和性などについて病態において検討し、対象とする病態モデルそれぞれに最適となるように調整して、疾病毎に酸素親和性を最適化した人工酸素運搬体としている。また、その類縁体としてImCD(シアンイオンへの親和性が高い)やHemoCD3(シアンイオンへの親和性が更に高い)などを作成しシアン中毒(酸素代謝障害の例)における解毒剤としての効果を検討している。26年度が最終年度であるため、記入しない。循環不全26年度が最終年度であるため、記入しない。α)適応疾患・応用範囲の拡大については、脳虚血・再還流における投与タイミングを違えて検討している。創傷治癒についても効果確認できている。放射線療法と併用することで抗腫瘍効果を増強し、化学療法剤と併用することで転移時期を遅延し転移巣を縮小することを見いだした。β)作用点・作用機序の解析については、各種臓器(気管支・皮膚・全脳・悪性腫瘍・内耳・骨格筋)の虚血再還流実験が進み、人工酸素運搬体の効果が虚血中の酸素代謝のみならず、HIF-1αの核内移行を抑制し、再還流後の一酸化窒素(NO)代謝の関与を示唆するなどデーターが得られつつある。

また、放射線療法の抗腫瘍効果を増強するのは腫瘍の酸素化によるものであり、化学療法剤との併用で転移時期を遅延し転移巣を縮小するのは、HIF-1αとMMP2を抑制する作用によるものであることを見いだした。γ)人工酸素運搬体の合成については、同志社大との連携により、シアンによる酸素代謝障害=シアン中毒への解毒剤としてImCDを開発し実験を行った。更にシアンイオンへの結合定数及び結合速度を有するHemoCD3を開発し、動物実験をおこなっている。α)適応疾患・応用範囲の拡大については、脳虚血・再還流における投与タイミングを多数例に検討できた。β)作用点・作用機序の解析については、各種臓器の虚血再還流実験が進み、人工酸素運搬体の効果が虚血中の酸素代謝のみならず、再還流後の一酸化窒素代謝の関与を示唆するデーターが得られた。γ)人工酸素運搬体の合成については、同志社大との連携により、シアン及び酸素に強い結合定数及び結合速度を有するHemo CD3を開発した。α)適応疾患・応用範囲の拡大:I)呼吸不全、II)心不全、III)虚血再還流の動物モデルを用いて各人工酸素運搬体の有用性を検討する。β)作用点・作用機序の解析:現在までに効果の見られた疾患モデルにおいて、A)微小血管造影法、B)電気生理学的方法、C)生理活性物質モニター、D)免疫組織化学染色を含む形態学的検査、E)免疫学的手法により、人工酸素運搬体投与前後および長期的効果を比較検討する。また、拮抗物質を前投与することなどで作用機序の検索および確認を行う。γ)人工酸素運搬体の合成・修飾による最適化:リポゾーム封入ヘモグロビン(LEH)、Hemocyclodexytorin(HemoCD)、Corrphycene-Myoglobin(CpMb)に限らず、新たな2原子分子(O2,H2,NO,CO,CN)の運搬・抱合・拮抗・代謝薬を開発し、それぞれの代謝効果・薬効を検討する。それぞれについて、サイズ・表面処理・カプセル化・酸素親和性などについて病態において検討し、対象とする病態モデルに最適となるように調整して、疾病モデル毎に最適化した人工酸素運搬体・類似薬として開発する。平成24年に挙げた研究α(適応・応用範囲の拡大)、β(作用機序の解析)、γ(酸素運搬体の最適化)を平成25年以降も同時および逐次行う。実施項目は多岐にわたるが、共同研究として全6施設8グループで別々に取り組むため、同時遂行が可能である。予想外の問題が生じた場合でも、研究施設、対象、疾患病態モデル、解析評価法も複数が稼動するため、全体が中断することなく逐次実験を遂行できる体勢として組織している。施設東海大(再生医療・救急医学・神経学)、国立循環器病研究センター(研究所・生理学)、同志社大(工)、千葉大(薬)、大阪府立大(リハビリテーション)対象人工酸素運搬体(LEH、HemoCD、CpMb、など)が複数あり、疾患病態モデルとして、I外呼吸=呼吸不全、II循環=心不全の他に従来からのIII内呼吸=還流不全(脳梗塞、創傷治癒、突発性難聴、糖尿病性腎症・網膜症、脊椎神経障害、褥創、酸素代謝阻害物質:一酸化炭素中毒、シアン中毒、硫化水素)などでの酸素代謝改善における有効性について順次検討する。
新しい好酸球走化性因子「エカレクチン」の遺伝子クローニングとその性質の解析

今までに報告されていない重要な全く新しいTリンパ球由来の好酸球走化性因子があると考え、その物質の遺伝子クローニングを試み、成功した。抗原刺激を受けたTリンパ球により産生されるこの物資は糖結合性蛋白であり、ガレクチンに属するためエカレクチンと命名した。エカレクチンを高産生するヒトTリンパ球株を樹立し、cDNAファージライブラリー作製した。また、このTリンパ球株の培養上清より部分精製したエカレクチンをウサギに免疫し、エカレクチン活性を吸収するポリクローナル抗体を得た。得られた抗体を用いてライブラリーのスクリーニングを行ったところ、約30個の陽性クローンが得られたが、それらをプラスミドに変換し、コス細胞に打ち込んだところ、好酸球走化性を示したのはそのうち3個であった。この3個はそれぞれ少しづつ長さの違う独立のクローンであるが、いずれも同一の遺伝子をコードしている。そのDNA配列(全長1623ヌクレオチド、オープンリーディングフレーム:601028番)からこの物質、エカレクチンは323個のアミノ酸より成ることが分かり、ホモロジー検索により、サイトカインやケモカインファミリーではなく、糖結合性蛋白であるガレクチンファミリーに属していることが判明した。エカレクチンの性質を調べるためには一過性発現だけでなくリコンビナントエカレクチンを大量に作ることが必要だが、昆虫細胞での発現等を試みたところ、あまり活性の高いエカレクチンは得られなかった。そこで、リンパ球系細胞であるジャーカット細胞を用い、ジェネティシン耐性により選択したステーブルトランスフォーマントを作製したところ、高活性エカレクチンが得られた。次に糖結合性を利用して精製を試み、単一のバンドを得ることができた。
興奮性アミノ酸による神経細胞死を抑制する薬物の研究

グルタミン酸は中枢神経系において興奮性神経伝達物質としての機能を果たすとともに、脳神経細胞を破壊する作用を持つ。興奮性アミノ酸と神経細胞死との関係は、脳虚血後の神経細胞死や水難事故などのケースではほぼ確実なものとなっているが、老化に伴う痴呆性症患やその他の神経難病もかなりの程度関わっていると思われる。本研究は神経細胞死を阻止する薬物を自ら検索し、それを用いて神経細胞死の機序に迫ろうとしたものである。今までは代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)の選択的アゴニストとして、(1S,3R)-ACPDという、その程強力でないアゴニストしか存在しなかったが、L-CCG-I、DCG-IV、cis-MCG-Iなどの新しいmGluRアゴニストが、本研究により新たに見いだされた。ラット脳室内にDCG-IV(100pmoles)を単回適用し、カイニン酸5mg/kgを全身投与すると、神経学的な症状観察では、カイニン酸による中枢興奮作用がある程度軽減するように思えた。カイニン酸の作用を確実に軽減させるために、生体内埋めこみ用浸透圧ポンプにより、DCG-IVをラット側脳室内に持続注入(15hr)しておいて、そこにカイニン酸を2nmoles/rat側脳室に適用して、ラットの症状を観察したところ、痙攣発生を顕著に抑制するケースが認められた。更に、DCG-IVの投与量を変動させて(24-240pmoles/hr)、定量的に実験を行った結果、用量依存性にlimbic seizuresの発生を抑制することが判明した。しかも、極めて低い用量で有効であり、痙攀抑制にほぼ対応して、海馬CA3や扁桃核におけるカイニン酸誘発神経細胞死の発現頻度を有意に低減させた。バルビタールのように、麻酔作用によって意識が喪失するような薬物が、カイニン酸による痙攀や神経細胞死を抑えることは既に判明しているが、意識の低下を伴なわずにカイニン酸の激烈な中枢興奮作用を抑える薬物は、少なくとも現在は極めて稀である。今までのグルタミン酸の生理作用に関する研究は、主として、イオンチャネル型受容体を中心にして行われてきたが、このような作用を持つmGluRアゴニストが出現したことは神経細胞死の今後の研究を進める上で画期的なことである。興奮性アミノ酸と神経細胞死との関係は、脳虚血後の神経細胞死や水難事故などのケースではほぼ確実なものとなっているが、脳老化の伴う痴呆性疾患やその他の神経難病もかなりの程度その関係が見込まれている。本研究は神経細胞脳死を阻止する薬物を自ら検索し、それを用いて神経細胞死の機序に迫ろうとするものである。新規のピロリドン誘導体のNMDA庶断薬やその他の薬物の作用を検討したが、明快な結論を得るに至らず、計画を中途変更し、最近私どもが発見した2,3の代謝調節型グルタミン酸アゴニストの作用の検討に入った。これらのアゴニストは2-(カルボキシサイクロプロピル)グリシンの誘導体であり、その立体配座を伸展型に固定した化合物である。

ラットの脊髄標体制は脊髄反射の単シナプス性興奮を極めて低い濃度で抑制し、神経終末からの神経伝達物質の遊離を調節する生理機能が明らかになった。脳虚血による神経細胞死は大量のグルタミン酸が海馬領域より遊離する結果であることが報告されており、このグルタミン酸遊離を抑制すれば虚血性神経細胞死の発現は抑制することが期待できる。また、カイニン酸は著しいグルタミン酸の遊離を起こすことが知られており、この遊離されたグルタミン酸とカイニン酸との協同作用が神経細胞死に関係することも否定できない。最近私どもが発見した代謝調節型グルタミン酸受容体アゴニストの一つDCG-IVをカイニン酸とともに脳室内投与すると、カイニン酸による初期の痙攣症状はかなりの程度軽減された。一方、ラット4血管結紮法による虚血では、海馬領域に明らかな神経細胞死抑制を示すケースが認められている。これらの結果が実験誤差なのか真の結果なのかを現在検討中である。今までは代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)の選択的アゴニストとして、(1S,3R)-ACPDという、それ程強力でないアゴニストしか存在しなかったが、L-CCG-I、DCG-IV、cis-MCG-Iなどの新しいmGluRアゴニストが、本研究により新たに見いだされた。ラット脳室内にDCG-IV(100pmoles)を単回適用し、カイニン酸5mg/kgを全身投与すると、神経学的な症状観察では、カイニン酸による中枢興奮作用がある程度軽減するように思えた。カイニン酸の作用を確実に軽減させるために、生体内埋めこみ用浸透圧ポンプにより、DCG-IVをラット側脳室内に持続注入(15hr)しておいて、そこにカイニン酸を2nmoles/rat側脳室に適用して、ラットの症状を観察したところ、痙攣発生を顕著に抑制するケースが認められた。更に、DCG-IVの投与量を変動させて(24-240pmoles/hr)、定量的に実験を行った結果、用量依存性にlimbic seizuresの発生を抑制することが判明した。しかも、極めて低い用量で有効であり、痙攣抑制にほぼ対応して、海馬CA3や扁桃核におけるカイニン酸誘発神経細胞死の発現頻度を有意に低減させた。バルビタールのように、麻酔作用によって意識が喪失するような薬物が、カイニン酸による痙攣や神経細胞死を抑えることは既に判明しているが、意識の低下を伴なわずにカイニン酸の激烈な中枢興奮作用を抑える薬物は、少なくとも現在では極めて稀である。今までのグルタミン酸の生理作用に関する研究は、主として、イオンチャネル型受容体を中心にして行われてきたが、このような作用を持つmGluRアゴニストが出現したことは神経細胞死の今後の研究を進める上で画期的なことである。
「住民を対象にした生涯スポーツの行政評価と参加者による学習評価に関する実証的研究」

京都府中部に位置する船井郡6町(八木町、園部町、日吉町、丹波町、和知町、瑞穂町)の生涯スポーツ事業の行政評価と参加者による評価について調査を行った(「生涯スポーツ事業に関する行政担当者の意識」調査:平成9年度実施。「生涯スポーツの実施とその評価に関する住民意識調査」:平成10年度実施)。これらの調査とその分析によって得られたいくつかの知見には以下のようなものがある。1. 6町で生涯スポーツ事業として56事業が実施されていた。そのうち53事業が継続事業、2事業が新規事業、1事業が単年度事業であり、8割近い44事業が行政担当者により「問題がなかった」と評価されていた。2.行政担当者はこれらの事業を行政評価する必要を自覚していたが、その客観的な評価基準をもっていなかった。3.したがって、行政評価は担当者の主観にゆだねられているが、こうした状況のもとでは、参加者や関係団体の声を聴くことがその客観性を保証していると考えられる。4.生涯スポーツを(1)一人で行うスポーツ、(2)少人数で行うスポーツ、(3)地域の運動会、(4)町や体育振興会等が行う事業、の4種に区別したが、それらのスポーツに参加する住民は参加しない住民よりも生涯スポーツを地域づくりとの関係でとらえる傾向が強かった。5.運動会参加者と事業参加者の90%以上がそれらのスポーツに満足しており、また80%以上がそれらのスポーツが近隣の人々との親睦を深める上で有効であると考えていた。京都府船井郡6町で行われる生涯スポーツについて、参加者と提供者(行政)との双方向の評価を実証的に検討する本研究において、今年度は行政による評価を明らかにするため、各町の生涯スポーツ担当者に対するアンケート調査を行った。その結果、全国の市町村の中には「生涯学習法」第5条の「生涯学習振興基本構想」に準ずる「基本構想」を任意に定めるものがあるが、調査対象町の場合、そうした「基本構想」を持つものはなかった。したがって、地方自治法第5条第5項による「総合的かつ計画的な行政の運営を図るための基本構想」に基づく生涯スポーツと「社会教育法」第17条第1項1号による「社会教育計画」に組み込まれた生涯スポーツが中心的に行われている。そうした生涯スポーツには、国体を契機にした町内外を問わない参加者を募る「6人制ホッケ-大会」から高齢者向けの軽スポーツ、さらには伝統的な地区運動会まで含まれる。アンケート結果の特徴的なものは、1.全ての町でライフステージごとに整理、体系化した生涯スポーツを推進する基本構想の必要性を認めている。2.全ての町で現行のスポーツ事業は住民のスポーツ要求を充足させる点で十分ではないと考えている。3.全ての町で生涯スポーツ事業を評価する行政指標の必要性を認めている。4.実際に生涯スポーツ事業を評価するに当たっては、(1)参加者の満足度、(2)事業目的の達成、等が指標に用いられており、(3)参加者数、や(4)予算の執行具合、は必ずしも評価の指標にはなっていない。5.生涯スポーツ事業の評価に当たって、参加者や関係団体、指導者の事業評価を考慮する必要は認められており、また実際それを行う町もある。今年度は京都府中部に位置する船井郡6町(八木町、園部町、日吉町、丹波町、和知町、瑞穂町)の生涯スポーツ事業の参加者による評価について調査を行った(「生涯スポーツの実施とその評価に関する住民意識調査」)。対象者は6町の有権者の100分の一であり、選挙人名簿から無作為に抽出した399名である。調査票は郵送し、同じく郵送で回収した。回収数は257通であり、うち有効な237通(59.4%)を解析した。1.生涯スポーツを(1)一人で行うスポーツ、(2)少人数で行うスポーツ、(3)地域の運動会、

(4)町や体育振興会等が行う事業、の4種に区別したが、それぞれの参加者数は63名(28.0%、NA=12)、86名(38.2%、NA=12)、150名(64.4%、NA=4)、67名(28.4%、NA=1)であった。2.それらのスポーツに参加する住民は、参加しない住民よりも生涯スポーツが地域づくりに寄与することを認めていた。3.運動会参加者と事業参加者の90%以上がそれらのスポーツに満足しており、また80%以上がそれらのスポーツが近隣の人々との親睦を深める上で有効であると考えていた。4.「一人で行うスポーツ」と「少人数で行うスポーツ」の参加者が孤立的、個人主義的で、地域問題の解決を人任せ(議員や行政)にする傾向が強い可能性があるように思われる。
小児脳腫瘍に対する、遺伝学・新悪性度分類の構築

本研究では本邦における小児脳腫瘍症例の腫瘍組織を用いて、予後に相関すると考えられている遺伝子の発現レベルを検討し、臨床像や治療効果と比較対照することにより、初発時から再発等に対するリスク分類を行い、より適切な集学的治療法を確立させることを目的とする。さらに、患者の薬剤代謝関連遺伝子のSNP解析を行い、現在化学療法で用いられている抗腫瘍薬の効果や副作用発症頻度を予測するオーダーメイド医療の基礎データを収集することを第二の目的とする。【研究方法】1)腫瘍組織よりのRNAの抽出と定量PCR反応小児悪性脳腫瘍{髄芽腫、原始神経外胚性腫瘍(PNET)など}の摘出術時に得られた脳腫瘍組織(100500mg)より総RNAを抽出し、得られたRNAを定量した。尚、コントロールとして小脳組織より得られたRNAを用いる。各遺伝子の発現量はGAPDH遺伝子など構成的に発現している遺伝子発現量と比較し、適宜、補正する。プライマーとして用いる遺伝子はTrkC、p53、c-myc、ErbB2、β-catenin、Sufu、PDGFR、PCNA、SPARC、G-CSFRを測定した。2)臨床データとの比較初発時の造影MRI像や臨床症状を播種の有無、転移性腫瘤形成の有無などにより細かく分類し、各因子の発現と比較する。各因子と密接に関係がある症状を検討する。治療成績・予後などと比較検討し治療法やその成績と関係する因子を検討し、リスク分類を行う。上記の文献の内容と定量PCRで得られた結果を比較検討し、総合的な予後因子の予想を試みた。【実験結果】今回は、まず初発髄芽腫播種症例3例から摘出した、腫瘍細胞の解析をおこなった。3例ともL-PAM+TESPA前処置による2回のPBSCTにより、造影MRI画像上で腫瘍所見は消失し、2名は外来経過観察中(小学校、および高校通学中)であり、残り1名も2回目のPBSCTよりの回復を待っているが、重篤な後遺症は認められていなかった。3例ともPDGFR、ERB2、β-catenin、PCNA,SPARKを中心にmRNAの発現量を測定。その結果、初発臨床症状的には類似していた初発髄芽腫播種症例であったが、各々の遺伝子の発現量は多彩に異なっていた。【研究方法】1)腫瘍組織よりのRNAの抽出と定量PCR反応小児悪性脳腫瘍{髄芽腫、悪性神経膠腫、悪性上衣腫、悪性奇形腫、悪性胚細胞腫のmRNAの定量など}の摘出術時に得られた脳腫瘍組織(100500mg)よりQiagen社製、RNA抽出キット(RNeasy)を用いて総RNAを抽出し、得られた総RNAより1μgを用いcDNAを合成し、Stratagene社製のサーマルサイクラー(Mx3000P)を用いてRNAを定量した。尚、コントロールとしてBDバイオサイエンス社の小脳組織より得られたRNAを用いる。プライマーとして用いる遺伝子はTrkC、p53、c-myc、ErbB2、B-catenin、Sufu、PDGFR、PCNA、SPARC、G-CSFRを測定した。2)臨床データとの比較初発時の造影MRI像や臨床症状を播種の有無、転移性腫瘤形成に有無などにより細かく分類し、各因子の発現と比較する。上記の文献の内容と定量PCRで得られた結果を比較検討し、総合的な予後因子を予想する。【実験結果】今回は、初発髄芽腫播種8症例、神経膠腫5症例、上衣腫14症例から摘出した、腫瘍細胞(計27症例)の解析をおこなった。各悪性腫瘍において遺伝子発現量は異なった。播種性髄膜腫は非播種性髄芽腫に比較してSUFU, ERBB2, and PCNAが高発現していた。その結果は、初発臨床症状的には類似していた。全ての神経膠腫症例においてPDGFRaとG-CSFRは高発現していた.上衣腫の遺伝子発現パターンは神経膠腫の遺伝子発現パターンに類似しており、髄芽腫の発現パターンとは異なる傾向を認めた。
PET、MRIを用いるiPS細胞の細胞トラッキング手法の確立とその臨床応用

放射性同位元素を用いてiPS細胞を高収率で標識することに成功し、マウスに投与したところ、PETにてiPS細胞の体内動態を明瞭に画像化することができ、iPS細胞のPETイメージングの可能性が示された。一方、iPS細胞を酸化鉄造影剤で標識することには成功したが、マウス尾静脈投与後のMRIによる画像化は困難であった。これはiPS細胞の集積部位である肺のMRI撮像は空気の影響が大きいため、画像化できなかったものと考えられる。MRIを用いてiPS細胞(人工多能性幹細胞)を画像化するために、iPS細胞のSPIO(酸化鉄製剤)標識を試みた。プロタミトンとSPIOをゼラチン塗布dish上でfeeder細胞のない状況で単独培養されたiPS細胞に加え8時間インキュベートしたところ、プルシアンブルー染色によりiPS細胞内に鉄(SPIO)が取込まれているのが確認できた。そこでSPIO標識されたiPS細胞をマウス尾静脈から投与して直後にMR装置(1.5T)で撮像を試みたが、iPS投与による画像の変化は認められなかった。FDG標識iPSを用いたPETイメージングにより、尾静注したiPS細胞のほとんどが肺にトラップされることを確認しており、MRIを用いた場合は肺にある空気のsusceptibility effectにより、陰性信号としてiPS細胞を捉えられなかったものと考えられる。今後は経静脈性経路以外の注入方法を検討する。本研究ではiPS細胞を分化誘導した後に、その細胞が臓器や腫瘍への移行性を検討することも目的としている。そこでiPS細胞の神経細胞への分化誘導を試みた。通常、feeder細胞の上で培養されるiPS細胞を細胞浮遊液の状態で血清不含の培地で培養することにより、神経系細胞への分化を行った。現在、分化に成功したかどうかを確認中である。また免疫抑制剤であるサイクロスポリンAを使用することによるiPS細胞の心筋細胞への誘導が報告されていることから、心筋への分化誘導を試みる予定である。本研究の目的は、PET、MRIを用いてiPS細胞(人工多能性幹細胞)を用いた細胞移植の画像的な評価・解析手法を確立することである。まずはMRIを用いてiPS細胞を画像化するために、酸化鉄造影剤であるSPIOによるiPS細胞の標識を検討した。その結果、iPS細胞を標識することができた。このSPIOで標識されたiPS細胞をマウスに投与して、MRIによる撮像を試みたところ、iPS細胞の画像化は困難であった。細胞を血管内に入れた場合、多くは肺にトラップされる。MRIを用いた場合は肺にある空気のsusceptibilitye ffectがあるため、陰性信号としてiPS細胞を捉えられなかったものと考えられる。実際にiPS細胞を病気の治療に用いる場合は、局所投与を行う事が想定されるため、SPIO標識iPS細胞をMRIで撮像することは十分に可能であると考えられる。PETを用いたiPS細胞の画像化としては、グルコース誘導体として細胞に取り込まれる^<18>F-FDGおよび脂溶性にて細胞内に取り込まれる^<64>Cu-PTSMによる標識を行った。両者とも細胞濃度を濃くした懸濁液中で標識することで高い標識率を得ることができた。標識体を静脈内投与し、動物用PET装置で撮像を行ったところ、予想通りほとんどが肺にトラップされた。一方、左心室腔内より投与し動物用PET装置で撮像したところ、投与早期から肺以外の各臓器への集積が認められた。このことからPETを用いたiPS細胞の画像化も可能である。以上の結果はPET、MRIによるiPS細胞の画像化の有用性を示すものである。