hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
瞬間低温凍結と衝撃波を利用した高効率な米粉製造技術の開発

米粉の製造は原料の米が硬く,水に浸す湿式が多い.ジェットミル・ピンミルなどで柔らかい米を粉砕して得られる.これらは製造工程で雑菌が増殖する,乾燥させるのにコストが高い,という欠点がある本研究の目的は,米を乾式にて液体窒素内で瞬間低温冷凍したのちに電極間にてコンデンサーに蓄えられた高電圧を水中にて一気に放電することによって発生する衝撃波を米に適用して粉砕(スポーリング破壊)し摩擦熱を加えず,雑菌の繁殖を抑える米粉の製造技術を開発することである.研究方法は,まず水中衝撃波を利用した米を粉砕する高圧的処理装置を製作した.内部形状は3次元楕円型の空洞形状で,水で満たされており,内部に電極を有する.交流電源100[V]を3500[V]まで昇圧し充電・放電できるコッククロフト-ウォルトン回路にて電極間で放電させ,発生した水中衝撃波の圧縮波・膨張波を内部壁面で繰り返し反射にて増幅させてエネルギを一点に集中させた.その焦点に空気で乾式にて米を送るシリコンチューブが設けられている.米を連続粉砕した後,米粉を分級機にて選別し,粒度分布・走査型電子顕微鏡観察・損傷デンプン率・滅菌の評価をおこなった.研究成果は,本装置では1回の放電あたり0.034kWh,米粉1kg製造に必要な電力量は1.976kWhであった.従来の方法と比較する大きなコストダウンとなる.滅菌は高圧的処理の米粉とジェットミルでの米粉を比較した結果,大腸菌や土壌菌はスポーリング破壊の作用を受けて破壊され,培養後にはコロニーが形成されなかった黄色ブドウ球菌もコロニー数が5%以下にまで減少した損傷デンプン率を測定したところ、ジェットミルによる米粉が9.2%であったが瞬間的高圧処理による米粉は4.9%と低くなった.走査型電子顕微鏡(SEM)写真から瞬間的高圧製粉による米粉は気流粉砕製米粉よりもデンプン粒子の形状が良好である結果が得られた.米粉の製造は原料の米が硬く,水に浸す湿式が多い.ジェットミル・ピンミルなどで柔らかい米を粉砕して得られる.これらは製造工程で雑菌が増殖する,乾燥させるのにコストが高い,という欠点がある本研究の目的は,米を乾式にて液体窒素内で瞬間低温冷凍したのちに電極間にてコンデンサーに蓄えられた高電圧を水中にて一気に放電することによって発生する衝撃波を米に適用して粉砕(スポーリング破壊)し摩擦熱を加えず,雑菌の繁殖を抑える米粉の製造技術を開発することである.研究方法は,まず水中衝撃波を利用した米を粉砕する高圧的処理装置を製作した.内部形状は3次元楕円型の空洞形状で,水で満たされており,内部に電極を有する.交流電源100[V]を3500[V]まで昇圧し充電・放電できるコッククロフト-ウォルトン回路にて電極間で放電させ,発生した水中衝撃波の圧縮波・膨張波を内部壁面で繰り返し反射にて増幅させてエネルギを一点に集中させた.その焦点に空気で乾式にて米を送るシリコンチューブが設けられている.米を連続粉砕した後,米粉を分級機にて選別し,粒度分布・走査型電子顕微鏡観察・損傷デンプン率・滅菌の評価をおこなった.研究成果は,本装置では1回の放電あたり0.034kWh,米粉1kg製造に必要な電力量は1.976kWhであった.従来の方法と比較する大きなコストダウンとなる.滅菌は高圧的処理の米粉とジェットミルでの米粉を比較した結果,大腸菌や土壌菌はスポーリング破壊の作用を受けて破壊され,培養後にはコロニーが形成されなかった黄色ブドウ球菌もコロニー数が5%以下にまで減少した損傷デンプン率を測定したところ、ジェットミルによる米粉が9.2%であったが瞬間的高圧処理による米粉は4.9%と低くなった.走査型電子顕微鏡(SEM)写真から瞬間的高圧製粉による米粉は気流粉砕製米粉よりもデンプン粒子の形状が良好である結果が得られた.
魚類ノダウイルスの遺伝子操作系の構築と病原メカニズムの解明

1.魚類ノダウイルス(ベータノダウイルス)SJNNVおよびRGNNVのRNA1とRNA2の完全長のcDNAを合成した。T7プロモーター配列を付加したプライマーを用いてPCRで増幅した後、プラスミドベクターに挿入して、大腸菌を形質転換させ、抽出したプラスミドからRNAポリメラーゼで転写産物を得た。得られた転写産物のE-11細胞およびシマアジ仔魚(SJNNV)またはマハタ仔魚に対する感染性が確かめられたことによって、本ウイルスの感染性in vitroRNA転写系を構築することに成功した。2.構築したSJNNVとRGNNVの遺伝子操作系を利用し、SJNNV(SJ1/SJ2)とRGNNV(RG1/RG2)間でRNA1とRNA2を相互に交換したリアソータントウイルス(SJ1/RG2およびRG1/SJ2)を作製した。SJ1/RG2およびRG1/SJ2のin vitro転写RNAをE-11細胞に接種した結果、どちらも親株ウイルス(SJ1/SJ2,RG1/RG2)と同様のウイルス増殖がみられた。また、SJ1/RG2あるいはRG1/SJ2ウイルスを含む培養細胞上清をシマアジおよびマハタに仔魚に浸漬接種した結果、RG1/RG2とSJ1/RG2はマハタにのみ、SJ1/SJ2とRG1/SJ2はシマアジにのみ感染が成立した。以上の結果から、RGNNVとSJNNVの宿主特異性を決定する因子は、RNA2あるいはRNA2にコードされる外被タンパク質であることが明らかとなった。3.上記4種類のリアソータントウイルスをE-11細胞に接種し、15,20,25,および30°Cの各温度で培養したところRGNV(RG1/RG2)のみが30°Cで増殖したことから、高温下(30°C)での感染性粒子の形成にはRNA1とRNA2の両者が関与することが明らかとなった。1.ウイルスRNAの感染系の確立SJNNV(SJNag93株)およびRGNNV(RGWak97株)から抽出したRNA1(ポリメラーゼ遺伝子)およびRNA2(外被タンパク質遺伝子)を材料として、E-11細胞へのトランスフェクション(リポフェクション法)による感染系を確立した。トランスフェクションによる細胞への感染の確認は、ウサギ抗血清を用いた蛍光抗体法による抗原の検出および電子顕微鏡によるウイルス粒子の観察によりおこなった。2.ウイルスRNAの末端の構造およぴ塩基配列の決定SJNNV、RGNNVともに、それらの両RNAの5'端にキャップ構造が存在し、3'端ににはタンパク質様物の修飾構造が認められた。5'-RACEおよび3'-RACEによって得た産物を直接シークエンスして両端およびその近傍の塩基配列を決定した。両ウイルスの両ゲノムの5'端(UAA)および3'端(UCGCG)にはコンセンサス配列が認められた。決定した5'端と3'端部分の塩基配列に基づいてプライマーを作製し、各ウイルスのRNA1およびRNA2の完全長のcDNAを合成した。得られた転写産物の感染性を上述のE-11細胞へのトランスフェクションにより確認した。細胞で産生されたウイルス粒子のシマアジ仔魚(SJNNV)およびマハタ仔魚への病原性を確認した。この機能性cDNAの全塩基配列を決定した。SJNNV感染細胞から抽出したRNAに、RNA1に特異的なプローブにのみ反応するに低分子のRNAの存在が認められた。このRNAはウイルス粒子からは検出されなかったことから、昆虫ノダウイルスで知られているRNA3と考えられた。

このRNA3の長さはは378塩基で、74個のアミノ酸からなるタンパク質(分子量:約8kDa)をコードすることが明らかになった。1.既に構築した魚類ノダウイルス(ベータノダウイルス)SJNNVとRGNNVの遺伝子操作系を利用し、SJNNV(SJ1/SJ2)とRGNNV(RG1/RG2)間でRNA1とRNA2を相互に交換したリアソータントウイルス(SJ1/RG2およびRG1/SJ2)を作製した。SJ1/RG2およびRG1/SJ2のin vitro転写RNAを培養細胞(E-11)に接種した結果、どちらも親株ウイルス(SJ1/SJ2,RG1/RG2)と同様のウイルス増殖がみられた。また、SJ1/RG2あるいはRG1/SJ2ウイルスを含む培養細胞上清をシマアジおよびマハタに仔魚に浸漬接種した結果、RG1/RG2とSJ1/RG2はマハタにのみ、SJ1/SJ2とRG1/SJ2はシマアジにのみ感染が成立した。これらの感染死亡魚について蛍光抗体法によりウイルスの局在性を調べたところ、ウイルスは脊髄、脳、網膜に局在し、親株ウイルスの場合と差はなかった。以上の結果から、RGNNVとSJNNVの宿主特異性を決定する因子は、RNA2あるいはRNA2にコードされる外被タンパク質であることが明らかとなった。2.上記4種類のリアソータントウイルスをE-11細胞に接種し、15,20,25,および30°Cの各温度で培養したところRGNNV(RG1/RG2)のみが30°Cで増殖したことから、高温下(30°C)での感染性粒子の形成にはRNA1とRNA2の両者が関与することが明らかとなった。3.魚類ノダウイルスの4遺伝子型(SJNNV,TPNNV,RGNNV,BFNNV)の代表ウイルスでウサギ抗血清を作製した。各遺伝子型株に対する中和抗体価を測定した結果、遺伝子型と血清型の間には相関性が認められ、SJNNVとTPNNVはそれぞれ血清型Aと血清型Bに、RGNNVとBFNNVは同一の血清型Cに分類された。
ストリゴラクトンシグナルの分子調節を目的とした化合物創製研究

ストリゴラクトン(SL)は植物ホルモンとして植物の生長・発達段階の多くのイベントに関わると同時に、植物の根から放出され根圏情報伝達物質としても作用する、多岐にわたる生理作用を有する小分子である。本年度はそのような多岐にわたるSLの生理作用のうち、目的とする作用のみを示す標的選択性の高いSLミミック(第二世代のデブラノン)の構造活性相関研究に関する論文の執筆に向けて、イネやシロイヌナズナにおいてこれまで報告されてきたSLの生理作用のいくつかについて、各化合物が示す活性を網羅的に評価した。また、2014年中にSLアゴニストにおいてエナンチオマーごとに示す生理活性が異なることが報告されたため、いくつかの代表的なデブラノンについてもキラルカラムを用いた光学分割を行ないエナンチオマー間での活性の差異を調べた。その結果、イネでの分げつ伸長抑制とシロイヌナズナでの枝分かれ抑制とでは構造要求性が若干異なること、また同植物体内でもいくつかの生理作用間で種々のデブラノンに対する感受性が異なることが明らかとなった。また、光学分割をしたデブラノンを用いてリコンビナントイネD14タンパク質に対する親和性の比較を行なったところ、in vitro試験系では活性の低かった化合物も活性の高い化合物と同様の親和性の高さを示したことから、各種デブラノンの標的選択性がSL受容体に対する親和性の違いのみに起因する訳ではなく、細胞内への取り込みや輸送などの動態の違いにも大きく影響を受けることを示唆する結果が得られた。以上のことから、本研究課題を通して、SLの生理機能を部分的にミミックする化合物の創製と、その選択性が何に起因するのかの原因究明に成功したと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度取り組んだ研究は、標的指向性の高いストリゴラクトン(SL)ミミック(debranones)の開発、及び新規SLミミックdebranonesがシロイヌナズナの根に与える影響の解析、の主に2つの課題である。SLはStriga属の根寄生植物に受容され種子発芽を誘導するとともに、植物体内では枝分かれを抑制するホルモンとして作用する。私は前年度までの研究により、モノ置換フェノールから合成されるSLミミックdebranoneが植物の枝分かれ抑制特異的に作用することを見出し、本年度学術論文として発表した。本研究の更なる展開として、根寄生植物に対して高い活性を有する化合物の開発を目指し合成展開を行った。その結果、植物の枝分かれ抑制活性は低いが根寄生植物に対する効果の高い化合物が取得できた。これにより、植物の枝分かれ抑制と、根寄生植物の種子発芽誘導のそれぞれに選択的に作用する化合物の開発に成功した。このように天然物が複数の作用を示す場合、そのうちの特定の作用のみを再現できる合成化合物は天然物の作用を個別に解析する上で重要なツールとなる。そこで、植物の枝分かれ抑制作用と、根寄生植物の種子発芽誘導作用に続いて、化合物が根の形態形成に与える影響を解析した。SLが根毛の伸長を促進し、側根の形成を抑制することはすでに報告されているが、詳細については未解明の部分が多く、SLの植物ホルモンとしての枝分かれ抑制作用との関連もわかっていない。そこで、先に開発した選択的化合物とSL関連変異体を用いた解析を行った。その結果、化合物の枝分かれ抑制活性と根毛伸長促進活性にはある程度の相関が示唆される結果を得た。一方で、根の形態形成に関わる植物ホルモンとして古くから知られるオーキシンとの関連を調べたところ、SL処理により根でのオーキシンの内生量が著しく減少することが明らかとなった。このことは、SLの生理作用を理解する上で考え無くてはならない、他の植物ホルモンとのクロストークを調べるための重要な手がかりであると考えられる。SLは植物体内において枝分かれを抑制するホルモンとして作用する他、最近では根の形態形成に関わること、乾燥ストレスや塩ストレスに対して耐性を付与すること、また種子発芽時における高温ストレスに耐性を与えることなどが報告され、植物の生活環の中で重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。一方で、SLは根から放出され根圏情報伝達物質としても作用しており、AM菌の菌糸分岐誘導物質として働くと同時にハマウツボ科の根寄生植物の一種であるストライガやオロバンキなどの種子発芽刺激物質としても働く。昨年までの研究により、安価で簡便に合成可能なストリゴラクトン(SL)ミミック、デブラノンの開発に成功していたが、第一世代のデブラノンは植物の枝分かれ抑制に対しては効果を示すが、他の代表的なSL活性である根寄生植物の種子発芽誘導に対してはほとんど効果を示さなかった。今年度はデブラノンの構造活性相関をやり直し、その結果どのような構造を取れば根寄生植物の種子発芽を誘導できるタイプのデブラノンが合成できるのかを明らかにした。さらに、根寄生植物には作用するが枝分かれは抑制しないタイプの化合物も合成できた。これはアフリカのサブサハラ地城などで問題となっている根寄生植物の防除法の開発に関する研究に貢献できると考えられる。また、合成した各種選択的化合物を植物体に与えたところ、これまで知られているSLの植物ホルモン活性のうち、一部分のみを示す化合物が存在した。このことは植物体内におけるSLの機能が、いくつかの独立した情報伝達経路を介して発現していることを示唆しており、今後の植物ホルモンとしてのSLの機能解明や情報伝達因子の解明に寄与すると考えられる。

ストリゴラクトン(SL)は植物ホルモンとして植物の生長・発達段階の多くのイベントに関わると同時に、植物の根から放出され根圏情報伝達物質としても作用する、多岐にわたる生理作用を有する小分子である。本年度はそのような多岐にわたるSLの生理作用のうち、目的とする作用のみを示す標的選択性の高いSLミミック(第二世代のデブラノン)の構造活性相関研究に関する論文の執筆に向けて、イネやシロイヌナズナにおいてこれまで報告されてきたSLの生理作用のいくつかについて、各化合物が示す活性を網羅的に評価した。また、2014年中にSLアゴニストにおいてエナンチオマーごとに示す生理活性が異なることが報告されたため、いくつかの代表的なデブラノンについてもキラルカラムを用いた光学分割を行ないエナンチオマー間での活性の差異を調べた。その結果、イネでの分げつ伸長抑制とシロイヌナズナでの枝分かれ抑制とでは構造要求性が若干異なること、また同植物体内でもいくつかの生理作用間で種々のデブラノンに対する感受性が異なることが明らかとなった。また、光学分割をしたデブラノンを用いてリコンビナントイネD14タンパク質に対する親和性の比較を行なったところ、in vitro試験系では活性の低かった化合物も活性の高い化合物と同様の親和性の高さを示したことから、各種デブラノンの標的選択性がSL受容体に対する親和性の違いのみに起因する訳ではなく、細胞内への取り込みや輸送などの動態の違いにも大きく影響を受けることを示唆する結果が得られた。以上のことから、本研究課題を通して、SLの生理機能を部分的にミミックする化合物の創製と、その選択性が何に起因するのかの原因究明に成功したと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画とは異なるが、実用上の利点を持つストリゴラクトンミミックの合成に成功し、その応用展開を模索できる段階まで研究が進んでいること、及び近年注目されている植物ホルモン間のクロストークに関して、ストリゴラクトンとオーキシンの関係を新たな角度から調査できるきっかけを掴んだことが理由として挙げられる。ストリゴラクトンは近年その植物ホルモン活性が明らかにされた化合物であり、現在世界中で活発に研究が行われているため、関連する研究の進展がめざましく当初の予定とは状況が異なっているが、SLミミックとして複数の生理活性のうち目的とする作用のみを発揮する化合物は現在ほとんど報告されておらず、オリジナリティのある研究として展開できているから。申請当初、ストリゴラクトンの生合成研究を課題としていたが、本年度当該研究分野において非常にインパクトのある論文が他の研究グループから報告されたため、今後の研究で成果を上げることが非常に困難であると考えられる。一方で受容体研究においても多数の論文が報告されているが、受容体を特定する決定的なデータは報告されていないため、ストリゴラクトンの受容体特定に対するケミカルバイオロジー的アプローチを新たな課題として設定するとともに、研究に伴うケミカルツールの開発も新規課題として取り組むこととする。また、本年度の研究において端緒の得られたストリゴラクトンとオーキシンのクロストークに関しても、詳細に調査していくこととする。
電気化学的二酸化炭素還元のルイス塩基による高効率化

電気化学的二酸化炭素還元において,ルイス塩基としてピリジンを添加した結果,添加濃度によって反応活性が変化し,ピリジンが銅電極に吸着することが示唆された。次に種々のアニオン性のルイス塩基を添加した結果,トリフルオロメタンスルホン酸イオンを添加すると,ー1.2 V(vs.Ag/AgCl)で,特異的に水素の生成量が低下し,メタンの選択率が高くなることが分かった。添加されたルイス塩基は,二酸化炭素分子の活性化よりも,水素発生の抑制に寄与していることが明らかになった。競合反応である水素生成が抑制された結果,過電圧がー1 V程度という,低過電圧でメタン生成が進行し,また選択率が向上した。平成25年度は,次の2点について研究を進めた。1点目は銅の平板電極を用いてルイス塩基効果について検証した。光電気化学系などにおいて報告があるピリジン系(ピリジン,ピコリン)を電解液に添加し,リニアスウィープボルタンメトリーおよびパルス定電位電解を行い,生成ガスをガスクロマトグラフィーおよび質量分析装置にて分析した。まず再現性の向上のため,セルの最適化を行い,電解電位やピリジン濃度などの条件を変えて二酸化炭素の電解還元を行った。その結果,ピリジン/銅電極系において,二酸化炭素の還元による炭化水素生成の促進は確認されなかった。2040 mMのピリジン濃度では,還元反応の促進が見られたものの生成ガスは主に水素で,選択比に変化は見られなかった。60 mM以上ピリジンを添加すると,還元電流は低下した。これは銅電極をピリジンが被覆し,還元が抑制されていることを示唆するし。この結果より,銅電極とピリジンの組み合わせが良くないと考えられる。すなわち,ピリジンによって二酸化炭素への配位が生じたとしても,銅電極は水素過電圧が大きいため,電位を低くしないと反応が進行しない。2点目は,ガス拡散電極を用いた気相系における評価である。銅ナノ粒子を多孔カーボンに担持した試料を作製し,同様にリニアスウィープボルタンメトリー,パルス定電位電解を行ったが,メタンの生成はわずかであり,過電圧の低下は確認できなかった。二酸化炭素を電気化学的に還元し,メタンなどエネルギー源を生成することができれば,カーボンニュートラルなエネルギーシステムを構築でき,さらに既存のエネルギーインフラや装置を利用できる。これまで,銅を電極に用いることで,電気化学的還元によってメタンが得られることが報告されていたが,過電圧が大きく,実用的ではなかった。本研究では,過電圧の要因として考えられている,二酸化炭素分子の活性化に着目し,ルイス塩基を用いることで,反応中間体を安定化させることを試みた。平成25年度はルイス塩基としてピリジンを添加した系に対して系統的に評価を行った結果,ピリジン濃度によって,反応活性が変化することがわかり,ピリジンが銅電極に吸着することが示唆された。そこで平成26年度は,ピリジンに加えて種々のアニオン性のルイス塩基を添加して,その効果を検証した。その結果,二酸化炭素を飽和させた電解質溶液中にトリフルオロメタンスルホン酸イオン(CF3SO3ー)を添加すると,ー1.2 V (vs. Ag/AgCl)で,特異的に水素の生成量が低下し,メタンの選択率が高くなることが分かった。系統的な実験より,添加されたルイス塩基は,二酸化炭素分子の活性化よりも,水素発生の抑制に寄与していることが明らかになった。従来は,多量の水素が発生するために,メタン生成への水素の反応が抑制されていたが,水素発生を抑制した結果,過電圧がー0.6 V程度という,従来になく低い過電圧でメタン生成が進行し,また選択率が向上したと結論付けた。電気化学平成25年度には,有機分子分散系での評価に加えて,電極固定系での評価を行う予定であった。再現性を向上するため,セルの再設計などを行ったことにより当初は遅れ気味であったが,有機分子分散系での評価することはできた。ここでの結果が良好ではなかったため,電極固定系での評価は行っていない。また平成26年度に実施予定のガス拡散電極での評価の準備も並行して進めることができた。前年度の結果を鑑み,平成26年度は,電極金属種およびルイス塩基種の一方あるいは両方の種類を変えて検討する。電極金属には,水素過電圧が小さい金属として,白金やニッケル,チタン,カーボンを検討し,ルイス塩基の効果を検証する。またルイス塩基として,ピリジン等に加え,酸化マグネシウムや酸化セリウムなどの無機物を検討する。無機物を用いる場合,電子伝導性がほとんどないため,導電体とのナノ複合化が必要である。例えば,カーボン担体への担持や,耐還元性の差を利用したナノ複合体の作製を試みる。
セラミックガスタ-ビンを用いたコ-ジェネレ-ションシステムの特性評価

ファインセラミックスの特性を利用し,多種の燃料が使用可能で熱効率が高い熱機関として,セラミックガスタ-ビン(以下CGTという)の開発を実施することにより,小型発電システムの開発が推進され,ひいては,コ-ジェネレ-ションシステム(以下CGSという)等のより高効率なエネルギ-システムの開発が可能になる等,省エネルギ-,燃料の多様化,省資源,さらには環境適合性等に資することができる。本研究は以上の認識のもとに,CGTを用いたCGSの特性を熱力学的ならびに経済的な観点から評価し,具体的な提言を行おうとするものである。すなわち,研究の前半においては,全員荷運転重視のCGTを対象として全体システムとしてのサイクル計算を実施し,熱力学的な特性を明らかにした。研究の後半においては,上記システムを実際の建物に導入した場合に,実機運転に近い状態での年間(8,760時間)にわたるシミュレ-ションを実施し,従来のシステム(電動タ-ボ冷凍機十蒸気ボイラ)と比較して省エネルギ-性及び経済性を試算した。結果を要約して次の結論を得た。(1)高温のCGT排気の持つ排熱をボイラで回収することにより,約78%に及ぶ高い熱利用率を得ることができる。熱利用率は熱/出力比の低下に伴って減少する。(2)熱利用率に及ぼす排熱回収の限界温度の影響は顕著である。良質の燃料を用いて低温腐蝕問題を避ければ,熱利用率は85%を超える高い値を得ることができる。(3)本システムを事務所ならびに店舗に導入し経済性を試算した結果,経済的に有利(単純投資回収年数5年以下)な場合があり,潜在市場があるものと考えられる。
拡張型心筋症の病態における自然免疫の役割

我々は、EpithelialMembraneProtein3のトランスジェニックマウス(Emp3Tg)の作製および解析を行い、同マウスが自然発症性に拡張型心筋症様の病態を呈することを見出した。全身性にEmp3およびCre遺伝子を発現するEmp3Tg/CAG-Cre(n=11)は23週齢までに100%が死亡し、その多くが拡張型心筋症様の症状を呈した。しかし、Emp3TgマウスからCAG-Cre遺伝子を除くことで拡張型心筋症は発症しなくなるという予想外の結果となった。CAG-Creマウス自体にはDCM様症状は全く認められないことから、Cre遺伝子の強制発現により誘導される何らかの異常をEmp3が増長すると考えられる。今後、CAG-Creマウスで誘導されると予測されるERストレスなどにおけるEmp3の役割の解明が求められる。特発性心筋症の一種である拡張型心筋症(DCM)は、心筋の収縮不全と心腔の拡張を特徴とする難治性疾患である。同疾患には発症要因に不明な点が多く、心臓移植以外には有効な治療法が存在しないという現状がある。我々は、自然発症性に拡張型心筋症様の病態を呈するEpithelial Membrane Protein 3のトランスジェニックマウス(Emp3 Tg)の解析を行い、同疾患における原因の解明を試みた。CAG-Creマウスとの交配で得られた全身性にEmp3を発現するEmp3 Tg/CAG-Cre(n=11)は23週齢までに100%が死亡し、その多くで拡張型心筋症様の症状が認められた。また一部個体では小腸炎の発症も確認された。一方、LysM CreやTie2 Creマウスとの交配で得られたマクロファージまたは血球系細胞全般においてEmp3を強制発現するConditional Emp3 Tgではこれらの表現型は全く認められなかった。しかしながら、CAG-Cre遺伝子を除いた全身性にEmp3を発現するEmp3 Tgマウスにおいても拡張型心筋症や小腸炎が発症しなくなるという予想外の結果が得られた。CAG-Creマウスが高率に無症候性の突然死をすることを考慮すると、Cre遺伝子の強制発現により誘導されていた何らかの異常をEmp3が増長することで疾患の発症につながったのではないかと考えられる。またEmp3は病原体センサーToll Like Receptor(TLR)に会合する分子であることからEmp3 TgまたはEmp3 KOマウスにおけるTLR応答の網羅的な解析を行ったが、TLR応答に顕著な変化は認められなかった。今後、CAG-Creマウスで誘導されていると予測されるERストレスなどにおけるEmp3の役割の解明が求められる。
mTOR阻害薬による川崎病患者血清特異的物質の炎症惹起作用抑制の検討

川崎病は主に乳幼児に発生する急性熱性疾患であり、全身の血管炎を特徴とする。様々な原因因子や遺伝的素因について報告があるが、それらが川崎病すべての症例の原因として証明されていない。我々は末梢血の遺伝子発現やヒト冠動脈内皮細胞による刺激実験などから、川崎病の発症に自然免疫が大きく関わっていることを明らかにした。さらに、自然免疫の一つであるNod1のリガンドをマウスに投与することにより、川崎病類似冠動脈炎が起こることを報告した。川崎病の原因は未だ不明であるが、川崎病の疫学的特徴である季節性・地域性に関する研究では、それを証明しうる特異的物質を検出できている。現在、構造解析中であり、判明すれば特異的にマーカーになる可能性も考えられる。本研究において川崎病類似Nod1リガンド誘発冠動脈炎モデルを使ったmTOR阻害薬による炎症惹起作用抑制についての研究を行った。FK565(Nod1リガンド)を川崎病特異的物質と想定し、様々なmTOR阻害薬により冠動脈炎が改善するかについて検討を行ったところ、mTOR阻害薬の中のテムシロリムスにより冠動脈炎の改善を認めた。mTOR阻害薬にはオートファジー亢進機能があるため、オートファジー亢進により、冠動脈炎が改善したと仮定し、オートファジー抑制機能があるバフィロマイシンで冠動脈炎の悪化がみられるかを確認したところ、悪化はみられなかった。また、ヒト冠動脈内皮細胞でのin vitro実験でもサイトカイン上昇所見はなかった。以上より、テムシロリムスによる冠動脈炎改善はオートファジー以外の効果によるものと考えられた。川崎病の原因は未だ不明ではあるが、川崎病の疫学的特徴である季節性・地域性に関する研究では、それを証明する川崎病特異的物質を見いだすことができている。現在、川崎病特異的物質の同定中である。そのため、本研究では川崎病類似Nod1リガンド誘発冠動脈炎モデルを使ったmTOR阻害薬による炎症惹起作用抑制についての研究を中心に行った。FK565(Nod1 ligand)を川崎病特異的物質と想定し、mTOR阻害薬であるテムシロリムスを投与したところ冠動脈炎は抑制された。mTOR阻害薬はオートファジー亢進機能があるため、そのオートファジー抑制機能があるバフィロマイシンを投与したところ、十分な血管炎増悪効果が得られなかった。mTOR阻害薬による冠動脈炎改善はオートファジー以外の効果による可能性があると考えられた。そこで、ヒト冠動脈炎内皮細胞(HCAEC)を用いて、mTOR阻害薬による作用機序を遺伝子発現にて解析を行うこととした。FK565でHCAECを刺激したあとHCAECを回収し、マイクロアレイ解析を行い、pathway解析を行ったところ、mTOR阻害薬の作用である細胞周期に関する遺伝子は影響を受けていたものの、炎症性サイトカイン・ケモカインについては大きな変動を認めなかった。以上より、mTOR阻害薬の冠動脈炎作用は血管内皮に対する直接作用ではないと考えられた。冠動脈炎発症に血管内皮だけでなく、そこに遊走するマクロファージが大きな役割を果たしていると考えられているため、現在、mTOR阻害薬のマクロファージに対する反応について研究を遂行している。川崎病特異的物質は同定されていないため、同定されたときに速やかに実験が進められるよう、代替物質を用いて冠動脈炎発症機序解析を行い、順調に進展している。また、本研究において川崎病類似Nod1リガンド誘発冠動脈炎モデルを使ったmTOR阻害薬による炎症惹起作用抑制についての研究もH28年度より併行して行っている。mTOR阻害薬にはオートファジー亢進機能があるため、そのオートファジー抑制機能があるバフィロマイシンで冠動脈炎の悪化がみられるかを確認したところ、悪化はみられなかった。以上より、テムシロリムスによる冠動脈炎改善はオートファジー以外の効果によるものと考えられる。また、冠動脈内皮細胞におけるオートファジー機能はあまり解明されておらず、LC3-GFPを用いた蛍光実験など併行して今後も行っていく。マウス冠動脈炎の発症にマクロファージが重要であることがわかっており、そのマクロファージに対する作用について、遺伝子発現やサイトカイン・ケモカインの測定を行っている。川崎病特異的物質の同定はすすんでおり、同定されたときに速やかに実験が進められるよう、代替物質を用いて冠動脈炎発症機序解析を行っている。

川崎病の原因は未だ不明であるが、川崎病の疫学的特徴である季節性・地域性に関する研究では、それを証明しうる特異的物質を検出できている。現在、構造解析中であり、判明すれば特異的にマーカーになる可能性も考えられる。本研究において川崎病類似Nod1リガンド誘発冠動脈炎モデルを使ったmTOR阻害薬による炎症惹起作用抑制についての研究を行った。FK565(Nod1リガンド)を川崎病特異的物質と想定し、様々なmTOR阻害薬により冠動脈炎が改善するかについて検討を行ったところ、mTOR阻害薬の中のテムシロリムスにより冠動脈炎の改善を認めた。mTOR阻害薬にはオートファジー亢進機能があるため、オートファジー亢進により、冠動脈炎が改善したと仮定し、オートファジー抑制機能があるバフィロマイシンで冠動脈炎の悪化がみられるかを確認したところ、悪化はみられなかった。また、ヒト冠動脈内皮細胞でのin vitro実験でもサイトカイン上昇所見はなかった。以上より、テムシロリムスによる冠動脈炎改善はオートファジー以外の効果によるものと考えられた。mTOR阻害薬のマクロファージに対する炎症抑制作用機序を継続して行っていく。川崎病特異的物質の同定が出来た場合には、それを用いて、マクロファージに対する作用について解析を行い、冠動脈炎発症機序を解明していく。川崎病特異的物質の同定が出来た場合には、それを用いてマクロファージに対する作用解析を行う。また、論文化できるようオートファジー関連実験も併行して行っていく。予想より容易に動物実験で結果が得られたため。予定より実験が速やかに進行したため、次年度使用額が生じた。その分を細胞実験、動物実験に使用していく。川崎病特異的物質の同定が出来たときに、再び動物実験を行うために使用する。
生活の場である特別養護老人ホームでの看取りにおける看護・介護連携モデルの構築

本研究の目的は、生活の場である特別養護老人ホームにおいて、高齢者と家族の希望に沿った看取りケアを実践するための看護・介護連携モデルを開発することである。文献研究および、先駆的に看取りケアに取り組んでいる看護・介護職への個別面接調査を基に、看取りにおける看護・介護職の連携内容を体系的に分類・整理し、看護・介護連携指標原案を作成した。さらに、特養に勤務する看護・介護職へのアンケート調査により、原案の項目を精錬、修正し、看取りにおける看護・介護連携指標を開発した。本研究の目的は、生活の場である特別養護老人ホーム(以下、特養とする)において、人生の終末期にある高齢者一人ひとりの個別性を重視した看取りを支援するための看護・介護連携モデルを開発することである。平成25年度は看取りケアにおける看護・介護職の連携内容と方法を体系化し、実践への応用可能性の高い看護・介護職連携モデル試案の考案を目的とした。研究方法は面接調査による質的帰納的分析である。対象は、看護・介護職の連携に関する実践報告を専門誌に発表する等、連携への意識が高いと考えられる特養11施設に研究協力を得て、看取りケアでの看護・介護職連携を積極的に実践している看護職12名、介護職15名とした。面接調査では、看取りケアにおいて相手職種と連携している実践内容を具体的に話してもらい、職種ごとに分析した。その結果、看護職が介護職と連携している実践内容には【双方の専門性を活かした連携】【介護職のスキル向上に向けた支援】【連携を円滑にするための基盤づくり】の三つの枠組みがあり、《医療職としての判断や予測を伝える》《介護職のケアを医療面からバックアップする》《医療的なケアや判断を具体的に指導する》《介護職の不安を軽減するために一緒にケアを行う》《介護職から情報を得てアセスメントする》など13のカテゴリーが見いだされた。介護職が看護職と連携している実践内容では【看護職と連携して看取りケアを円滑に進めるための地盤づくり】【実践の中での看護職との連携】【介護職のスキル向上のための連携】の三つの枠組みがあり、《看護職との信頼関係を構築する》《連携の基盤となる体制をつくる》《看護職の医療的知識を活用する》《看護職の支えにより主体的にケアに取り組む》など7カテゴリーを見出した。これらのカテゴリーともとに、職種ごとの連携モデル原案を作成した。施設での看取りに先駆的に取り組み、実績を持つ特別養護老人ホーム(以下、特養)において、看護・介護職がどのように連携しているのか、その実態を詳細に明らかにすることを今年度の目的とした。初めに、施設での看取りに先駆的に取り組んでいる特養に関する情報を収集するため、関連学会(認知症ケア学会、老年看護学会、看護科学学会、在宅ケア学会等)に参加した。さらに、学術雑誌及び専門雑誌等の文献検討から、調査対象となる施設に関する情報収集を行った。また、特養における看取りに関する国内外の実践報告及び総説、解説等の文献検討から、看護職及び介護職の看取りにおける役割と連携について整理した。特に、生活の場である特養ならではの特徴が明確に示されるよう、面接調査のインタビューガイドを作成した。以上のような準備を経て、看取りについて先駆的に取り組み、かつ実績のある特養3施設において、看護職、介護職それぞれ4名(合計8名)に面接調査を実施した。地域による文化的背景や高齢者ケアシステムの違いなどを考慮し、面接調査の対象となる特養を全国的に探索し、なるべく地域の偏りがないよう選択をした結果、初年度に実施した面接調査の対象施設は、大阪、東京、愛媛の3施設となった。これらの面接調査の結果をもとに、看取りにおける看護職と介護職の連携内容の大枠を明らかにするとともに、生活の場ならではの特徴がより明確になるようインタビューガイドの検討を行い、追加や修正を加えた。本研究の目的は、生活の場である特別養護老人ホーム(以下、特養とする)において、人生の終末期にある高齢者一人一人の個別性を重視した看取りを支援するための看護・介護連携モデルを構築することである。平成26年度は、特養での見取りにおける看護・介護職間の連携を評価するためのツールとして、「特別養護老人ホームにおける看護・介護職の連携指標」を開発した。前年度に実施した看護・介護職への面接調査をもとに連携指標原案を作成し、全国の特養から無作為抽出した看護職119名、介護職198名を対象とした郵送による無記名自記式質問紙調査により、連携指標原案の各項目の内容妥当性指数(CVI)を計算し、追加項目等に関する自由記述内容を質的に分析した。連携指標(看護職用)は、【双方の専門性を生かした連携】【介護職のスキル向上に向けた支援】

【連携を円滑にするための基盤づくり】で構成され、原案74項目中57項目の内容妥当性が確認され、追加項目として<デスカンファレンスを行い振り返る><死後の処置を一緒に行い、できる場合は介護職主体でやってもらう>などが挙げられた。連携指標(介護職用)は、【実践の中の連携】【看取りのスキル向上のための連携】【連携を円滑にするための基盤づくり】で構成され、原案59項目中38項目の内容妥当性が確認されたが、21項目については特養のケアとして汎用性の低いものや表現がわかりにくいとして、項目の修正が必要であった。いずれの連携指標も、各施設の状況やシステムに左右される内容や方法に限定せず、意図や目的に沿った普遍的な表現へと修正する必要があると考えられた。また両職種の専門性を踏まえたうえで、具体的な実践内容が示されるよう、項目をさらに精錬する必要があると考えられた。老年看護学当初は面接調査から連携モデル原案を作成し、グループインタビューによる内容の精錬によって試案作成を目指していたが、特養職員の職務上の問題からグループインタビューの実施が困難と判明したため、個別インタビューの強化を図ったものの、モデル原案の作成にとどまり、適用可能性を検討する試案レベルにまでは至らなかったため先駆的に看取り取り組んでいる特養に勤務する看護・介護職への面接調査について、平成24年度に10施設程度を対象に行う予定であったが、専門雑誌や学会誌等に掲載されている特養での看取りに関する実践報告や総説の数も少ないうえ、地域の偏りが最小限になるよう対象施設を選択することに時間がかかってしまった。また研究依頼を行い、承諾を得て面接調査を実施するまでのプロセスにも時間がかかりすぎてしまい、平成24年度中には3施設しか実施することができなかった。当初計画していたグループインタビューの実施が難しいため、研究計画を見直し、適用可能性の検討方法について修正する。具体的には研究者間によるモデル原案の検討をもとに試案V1を作成し、この試案をデルファイ調査によって内容検討、修正を加え精錬する。実践への適用可能性の検討については、大阪府内の特養看護職を中心として立ち上げた研究会でのディスカッション、研究会メンバーの所属施設におけるアクションリサーチによって行う予定である。平成24年度中に予定していた面接調査が終わらなかったが、対象となる特養のピックアップはすでに進んでおり、平成25年度前半に残り5施設程度の面接調査を実施する予定で協力依頼を行っている。また、当初は看護学研究者のみの研究組織であったが、本研究では看護・介護職の連携モデルの構築を目的とし、連携の具体的な内容と方法を明らかにするための面接調査を両職種に対して行うことから、平成25年度より介護福祉系の専門雑誌や学会にも精通した研究者を新たに追加した。これにより、介護福祉学の観点から調査対象施設の選択や分析を加えることで、より円滑な研究の推進を目指す。また、面接調査終了後は研究者間の討議を踏まえ、看取りに実績を持つ特養での看護・介護職の連携に関する実践的知識からモデル案を作成し、デルファイ調査による内容の検討、修正などを行う郵送によるデルファイ調査が実施できなかったことにより、次年度使用額が生じた。次年度にデルファイ調査を実施する。平成24年度に実施できなかった面接調査について、予定数より少ない施設にしか実施できず、交通費等が使用しきれなかったため、平成25年度の前半までに残りの面接調査を行う。
国際規律の形成・受容・確保に関わる統治構造理解の前提の変容と憲法的統制の再構築

本研究の枠組みにおける分析によって、国際協力の領域における国際規律の発展は、動態的な視点からみると、多層的立憲主義という形で解されることが明らかになった。多層的構成は、国際規律と国法体系の伝統的関係とは異なり、国際規律の形成・受容・確保の各段階で、国法秩序の調和化のための柔軟な解決を提供すると解される。そして、多層的立憲主義は、政府の外交活動に対する憲法的統制の理論にも一定の影響を与えるであろう。本年度は、条約締結の承認と当該条約の国内実施法の制定とが国会審議において区々に扱われている問題について検討するとともに、従来の条約とは性質を異にする国連安保理決議の国内的実施に関する問題についても検討するという計画に基づき、資料・文献を収集・考察し、関連する論文を公刊した。研究の具体的成果として、まず、多層的立憲主義の観点からの論文「新たな人権救済制度がもたらす人権規範の共通化ー個人通報制度と国内人権機関」が公刊されたが、その執筆は実質的には前年度の成果である(平成23年度の研究実績の概要において報告済み)。この論文でも打ち出した「多層的立憲主義」は、「国家間で形成され、あるいは整備が求められる法」の基盤を説明するキーワードと考えられる。そこで、昨年度に公刊した単著『憲法と国際規律』の次に続く課題を見据え、本研究の課題の位置づけと論点を俯瞰するものとして、「憲法の国際法調和性と多層的立憲主義」を所属機関の紀要に執筆した。この論文では、従来の憲法98条2項の解釈を見直すための視座を明らかにし、考察の手がかりとしてドイツ連邦共和国における「国際法調和性の原則」についての判例の展開等を確認した上で、多層的立憲主義と国際人権条約の関係を論じ、さらに、多層的立憲主義と人権以外の国際規律の関係について展望した。憲法によって設営される国内機関が、国家の領域外で活動する中で他国との間でなされた合意が国内に及ぼされ、あるいは、そのようにして創設された国際機構が国内で高権を行使することが生じるような場合(国連安保理決議の国内的実施に関する問題もここに関連する)を考えると、国家の対外権の統制について論じるのに既存の道具立てでは限界がある。そこで、国際的に活動する国内機関および国際機構の法的統制のしくみを考えるについても、多層的立憲主義の構想が有用であることを示した。本年度は、国内裁判所とりわけ最高裁判所の責務という観点から、単に裁判での条約の適用問題ではなく、国法秩序を国際規律に適合的に維持し、日本国の国際規律違反を避止し、あるいは国際紛争を法的に処理するための対応を憲法学の観点から総合的に検討するという計画に基づき、国際規律の国内的実施の確保段階の諸問題について資料・文献を収集・考察した。そうした研究の具体的成果として、第1に、共著『論点探究憲法』の改訂版を執筆し、公刊した。本書は、教科書等では記述が平板な箇所を中心に、33の項目について14名の研究者がそれぞれ専門分野を中心に執筆したものである。担当部分の1つである「人権の国際的保障」については、本研究課題が対象とする問題領域の基本的部分に関わるものであり、単に旧稿を手直しするのではなく最新の研究動向を反映して全面的に書き改めている。第2に、日本国の国際規律違反を避止し、あるいは国際紛争を法的に処理するための対応である国際規律の国内的実施の確保段階に関して、書評という形で、実務法曹の活動にコメントした。第3に、国法秩序を国際規律に適合的に維持することについての政府の対応という観点から、国際人権法学会の「多層的人権保障システム下での憲法の国際化/国際法の憲法化」研究グループにおいて報告を求められ、40名近い研究者が出席するなかで1時間程度の研究報告を行い、さらに30分程度の議論をした。議論の内容は、出席した研究者が後日公刊した論文にも反映され、本研究のまとめについても有益な示唆を得ることができた。本研究は、「国家間で形成され、あるいは整備が求められる法」の定立から実施までの過程を総合的かつ動態的に捉えて、その憲法的統制を考察することを目的とする。本年度は、条約機構や実施措置の形成過程と、これに関与する国家機関の憲法的統制のあり方を探り、多層的立憲主義論にも注目しつつ、憲法および各国法制、国際法とりわけ国際人権条約、EU法について研究するという計画に基づき、資料・文献を収集・考察した。研究の具体的成果として、第1に、単著『憲法と国際規律』を執筆し、公刊した。本書は、本研究課題が対象とする問題領域全般に関わり、平成2022年度科研費(若手研究(B))による人権・環境・安全の領域における国際規律の検討に基づきつつ考察を深めるという本研究の計画にも準拠して、単にこれまでの研究成果を束ねるのではなく、多層的立憲主義等についての本研究の成果を大幅に加筆して完成させたものである。

第2に、国際機構による実施措置の増大・高度化を考えるうえで重要な、EU法・欧州人権条約と構成国憲法の関係をめぐって、ドイツ基本法およびドイツ連邦憲法裁判所とEU法・欧州人権条約の関係についての論文を、共著『ヨーロッパ「憲法」の形成と各国憲法の変化』に掲載した(第6章「ドイツ憲法」129-149頁)。第3に、本研究課題に関わる近時の憲法学の議論の整理と展望を、国際人権法学会の学会誌『国際人権』から依頼を受けて寄稿した。第4に、国際人権条約に附随する議定書が定める実施措置として重要なB規約の個人通報制度と、立法・司法・行政の各部面での国際規律の扱いと実施措置の憲法的統制を考えるだけでは解決できない国内人権機関の問題について、多層的立憲主義の視点を踏まえつつ、論文「新たな人権救済制度がもたらす人権規範の共通化ー個人通報制度と国内人権機関」を執筆し、法律雑誌に寄稿した(2012年4月27日刊行)。国際規律の国法体系への受容段階の問題として、条約締結の承認と当該条約の国内実施法の制定とが国会審議において区々に扱われている問題について検討するとともに、従来の条約とは性質を異にする国連安保理決議の国内的実施に関する問題についても検討するという本年度の研究計画については、国連安保理決議の国内的実施に関して十分に検討を深められなかった面はあるものの、「国家間で形成され、あるいは整備が求められる法」の定立から実施までの過程を総合的かつ動態的に捉えて、その憲法的統制を考察するという本研究の課題の位置づけと論点を俯瞰する論文を所属機関の紀要に執筆しており、相応の達成度に至っていると評価できる。さらに、本研究とは別の共同研究による現地調査の際に、オーストラリアにおける条約締結の実際について調査し、現地日本大使館の書記官からも詳細な情報を得ることができた。単に「二元論」を採る国家として片付けることのできない、連邦制の事情と結びついた、条約締結後の国内的実施の実効性が担保されることを志向するオーストラリア連邦議会での手続から、本研究の目的達成のために貴重な示唆を得ることができた。これらの事情を総合的に勘案すると、当初計画以上とまではいえないが、おおむね順調に進展していると評価することができる。平成2022年度科研費(若手研究(B))による、特徴的な法規範の形成や実施措置の整備が見られる領域における国際規律の形成・実行の検討に基づきつつ、本体の条約に附随する議定書や実施措置の形成過程と、これに関与する国家機関の憲法的統制のあり方を探るという本年度の研究計画については、国家機関の憲法的統制に関して研究を十分に尽くせなかった部分はあるものの、「国家間で形成され、あるいは整備が求められる法」の定立から実施までの過程を総合的かつ動態的に捉えて、その憲法的統制を考察するという本研究の課題全般に関わる単著と共著各1冊を公刊し、雑誌論文2本を執筆しており、相応の達成度に至っていると評価できる。平成25年度は、当初の研究計画に従い、中心的なテーマとして、国際規律の国内的実施の確保段階の諸問題について検討する。国内裁判所とりわけ最高裁判所の責務という観点から、単に裁判での条約の適用問題ではなく、国法秩序を国際規律に適合的に維持し、日本国の国際規律違反を避止し、あるいは国際紛争を法的に処理するための対応を憲法学の観点とりわけ多層的立憲主義の視座から総合的に検討するものとする。平成23・24年度における考察の成果に基づき(必ずしも検討が十分ではなかった部分を補完しつつ)、研究計画全体の進捗状況や状況の変化に応じて、合理的な調整を行いつつ研究の推進を図り、3年間の研究成果をまとめて、適時に公表するものとする。
時間分解蛍光測定によるタンパク質内部運動と協奏する水和構造変化の解析

生命活動の素過程を担うタンパク質分子は水環境において構造形成し機能する。何故水環境を必要とするのかを理解するには、タンパク質表面での水分子の運動をピコ秒時間分解能と原子分解能で探る必要がある。本研究では、タンパク質からの時間分解蛍光測定装置を開発しながら、特徴的なドメイン運動を行うタンパク質について、その運動の原因となっている水和構造変化を蛍光測定、結晶構造解析などの実験と大規模な分子動力学シミュレーションの両面から解析することを試みた。タンパク質が水中で作動する際の水和構造の役割や影響を理解するため、2つの機能ドメインで形成されたタンパク質に着目して、そのドメイン運動における水和構造変化を結晶学的、計算科学的研究によって可視化してきた。これまでに得た知見を総合すると、ドメイン運動に要する時間は数十から百ピコ秒であり、その際には、ドメインに挟まれた領域の水和構造が協奏的に再構成するというシナリオが浮かび上がってきた。本課題では、タンパク質の内部運動と協奏する水和水集団運動の実験的検証と理解を目指し、ドメイン間領域に存在するトリプトファン周辺での水和水集団運動を、ピコ秒時間分解和周波蛍光測定法によって観測することを目的としている。本年度は、測定システム構築、改変タンパク質の作出などを実施した。A.フェムト秒蛍光時間分解測定システムの構築本年度作成したタンパク質表面トリプトファン蛍光時間分解測定システムは、光源にチタン・サファイアレーザー、3次高調波発生(THG)装置、光学遅延回路ステージ、各種反射鏡、1/4波長板、溶液試料ステージ、蛍光光を集めるための楕円鏡、非線形光学結晶(BBO)、非線形光学結晶回転ステージ、分光器、光電子増倍管、および、データ収集用電子回路等で構成される。本システム一式は、遮光用箱内の光学定盤に設置され、湿度・温度環境が保たれる。光学遅延回路ステージ、溶液試料ステージや非線形光学結晶回転ステージの制御のためにソフトウエアを自作した。B.トリプトファン改変タンパク質の作出とその立体構造解析GDH六量体の各サブユニットには12個のトリプトファンが存在する。まず、野生型の分子動力学計算トラジェクトリーにおいて、Trpの溶媒接触を評価し、水分子と直接相互作用可能なTrpを同定し、GDH遺伝子大量発現用ベクターにおいて、Trp残基をTyr、Phe、LeuあるいはAlaに改変したGDH試料を複数作出した。C.トリプトファンからの蛍光時間変化を説明する水和ダイナミクスモデルの検討トリプトファン側鎖周辺での水和水あるいはその集団運動によってトリプトファン周辺にどのような摂動が生じうるのかを、分子動力学計算トラジェクトリーを用いて考察するためのソフトウエアの雛型を開発した。本研究課題では、タンパク質のトリプトファンに由来する蛍光をフェムト秒レーザー和周波分光によって測定し、表面に露出したトリプトファン周辺での水和構造ダイナミクスを解析する測定システムを構築して、タンパク質水和ダイナミクスのより深い研究を行う。平成23年度には以下の課題を掲げて研究を遂行した。前年度に構築したタンパク質表面のトリプトファン蛍光を測定可能な時間分解測定システムを高度化するため、分光器を搭載して簡便に移動可能なステージを製作した。このステージは、分光器スリットが鉛直方向に開いているため、和周波光を捉えるために是非とも必要であった。高度化を行いつつ、標準色素溶液試料によって装置全体の評価を開始したが、グルタミン酸脱水素酵素野生型と同様に照射損傷が明らかとなってきたため、励起光側の光路、参照光側の光路の両方に、各4枚の反射率30%程度の反射鏡の組みと、迷光防止用ディフューザーから構成された減衰装置を設置して測定を行っている。前年度に作出したグルタミン酸脱水素酵素遺伝子置換体Trp89Phe,Trp89Ala,Trp92Phe,Trp92AlaのX線小角散乱実験から散乱プロファイルを得、慣性半径や分子最大長、分子形状を得た。Trp89Phe,Trp89Ala,Trp92Pheについては、結晶化に成功し、SPring-8のBL26B2にて低温回折強度データ収集を実施した。データの統計精度は良好で、高分解能での結晶学的構造精密化で得られた電子密度から、変異導入を確認した。酵素活性測定により、変異が同酵素の活性に大きな影響を及ぼさないことも確認したまた、分子動力学計算において、Trp溶媒接触を評価し、蛍光時間変化を説明する水和ダイナミクスモデルの検討するための基本計算コードを検討した。本研究は、タンパク質が水中で作動する際の水和構造の役割や影響を理解するため、タンパク質のドメイン運動と水和構造が協奏的に再構成するというシナリオを検証する。リプトファン周辺での水和水集団運動を、ピコ秒時間分解和周波蛍光測定法によって観測するとともに、結晶構造解析に基づいた分子動力学シミュレーションによって得られる実験データの理解を促す。前年度得たグルタミン酸脱水素酵素の分子動力学計算トラジェクトリーについて、水和構造解析を実施した。