hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規組織イメージング法を用いた頭頸部癌免疫特性の解析

頭頸部癌をはじめ、様々な癌種で腫瘍組織内に存在する免疫細胞の組成や性質が、癌の進展や治療抵抗性と関わることが知られている。申請者はこれまでに、一枚のホルマリン固定パラフィン包埋切片から12種類のエピトープを免疫組織化学で解析できる多重免疫染色ならびにその画像定量化技術イメージサイトメトリーを開発し、3枚の切片から定量化可能な14種類の免疫細胞の組成や性質を統計解析することで、癌の亜分類や予後と相関する腫瘍の免疫的性質を報告してきた。本研究では、この多重免疫染色・イメージサイトメトリー法を用いて、HPV陽性ならびに陰性中咽頭扁平上皮癌検体を解析し、癌組織中のCD8陽性T細胞、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などの免疫細胞の細胞頻度・位置情報に基づく予後相関解析を進めた。当初の計画通り、腫瘍巣内と腫瘍周囲組織の差異、癌細胞と14種類の免疫細胞の位置関係、分布様式を調べ、予後との相関を解析した。COX比例ハザードモデルを用い、年齢、性別、HPV statusで調整した結果、腫瘍組織内のTH2リンパ球やCD66b陽性顆粒球と予後の相関が示された。また、免疫細胞の位置情報を解析するデジタル画像解析手法を最適化し、PD1陽性ヘルパーT細胞の癌組織内分布が予後不良となることを示した。本手法を応用し、Oregon Health & Science Universityと共同研究にて甲状腺乳頭癌の組織免疫特性の解析や、悪性黒色腫における腸内微生物特性と腫瘍内免疫細胞の相関の解析などを進め、成果を報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまでに、一枚のホルマリン固定パラフィン包埋切片から12種類のエピトープを免疫組織化学で解析できるmultiplex immunohistochemistry (IHC)ならびにその画像定量化技術image cytometryを開発し、3枚の切片から定量化可能な14種類の免疫細胞の組成や性質を統計解析することで、癌の亜分類や予後と相関する腫瘍の免疫的性質を報告してきた。本研究は、頭頸部癌検体を用いて、これまで解析が困難であった一方、multiplex IHC/image cytometryで解析可能な、免疫細胞の組織上での分布と細胞同士の位置関係を調べ、予後や治療反応性との相関を調べ、バイオマーカー探索の基盤形成を目的とする。平成29年度の当初研究計画では、既存のデータをDiscovery cohortとし、細胞分布形式と予後や腫瘍亜分類との相関を探索し、次年度以降の追加検体における検証への探索的解析を予定した。Discovery cohort内での免疫細胞の位置情報に基づく予後相関解析により、当初の計画通り、腫瘍巣内と腫瘍周囲組織の差異、癌細胞と14種類の免疫細胞の位置関係、分布様式を調べ、予後との相関を解析した。その結果、COX比例ハザードモデルを用いた解析により、腫瘍組織内のTH2リンパ球やCD66b陽性顆粒球と予後不良との相関が示された。これらのデータに基づき、免疫細胞の位置情報・分布の持つ意義を明らかにしていく次段階への基盤的データを得た。この研究成果の一部は、第76回本癌学会学術集会、第30回日本口腔・咽頭科学会総会ならびに学術講演会、第28回日本頭頸部外科学会総会ならびに学術講演会において発表した。平成29年度内に予定していた解析が進行し、予後と相関する免疫細胞の局在についての知見が得られている。上記の通り、当初の計画通り順調に進行している。探索的解析で得られた知見を本研究室で所有する追加検体において検証し、免疫細胞の位置情報・分布の持つ意義を明らかにしていく。1.平成29年度の研究の継続2.検証データセットのためのmultiplex IHC/image cytometry解析。平成29年度分に続き、後半の検体の染色を行う。

また、画像取得次第、順次、画像の重ね合わせ処理ならびにImage cytometry解析の画像処理を行っていく。3.免疫細胞の位置情報に基づく予後相関解析(検証)。定量化されたデータを元に、すでに利用可能な予後、臨床病理学的因子情報との関連性を解析し、探索段階で得られた知見の検証を行う。この過程では、各種クラスタリング解析や、群間の差を解析した後に必要となるマイクロアレイ解析に準じたFalse Discovery Rate Adjustmentも併用する。4.免疫細胞の位置情報解析ツールの構築・普及。上記の過程を通じて、解析ツールに改善すべき点が見つかればその都度対処、更新を行う。最終的に使用者親和性を高め、ツールの普及に向けた準備を行う。5.免疫細胞の位置情報解析ツールの構築・普及。上記で得られた知見や開発したツールを学会発表ならびに論文での発表を行い、必要に応じて、業績1と同様に公共レポジトリーを通じた公表を行う。また、別の疾患対象や、他施設から集約したより大規模なコホートで、この手法を応用して、バイオマーカー探索をすすめる計画を立案する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
絶対古地磁気強度と大気の放射性炭素濃度の関係性の研究

本研究は、炭素14年代が報告されている富士火山・阿蘇火山・東伊豆の溶岩流から採取した試料に対して、LTD-DHTショー法による古地磁気強度測定を適用することで、過去3万年間における信頼度の高い絶対古地磁気強度データの復元を試みた。10溶岩76試料の測定を行い、最終的には6溶岩から信頼度の高い古地磁気強度データを得た。本研究で得られた古地磁気強度データとこれらの溶岩の炭素14年代における大気の放射性炭素濃度値の比較を行うことで、絶対古地磁気強度と放射性炭素濃度の間の関係性を定量的に捉えつつある。過去数万年間の古地磁気強度変動は、地球磁場の永年変化や地球表層への宇宙線入射量の変動を把握する上で必要な基礎データである。過去1.2万年間については、考古学試料による古地磁気強度データが多数存在するものの、ばらつきが大きく、あきらかに古地磁気強度測定の精度をこえている。このことから、現存のデータには精度の低いデータや偏ったデータが含まれていると推察される。本研究では、炭素14年代が報告されている富士火山の溶岩に新測定法を適用することで、過去1万年間における信頼度の高い絶対古地磁気強度変動の復元を試みる。さらに、このデータに加えて、他の火山の13万年前の溶岩からも古地磁気強度(数データ)を復元して、過去3万年間における絶対古地磁気強度と大気の放射性炭素濃度の関係性を検討する。平成25年度は、富士火山地域において第一回目の試料採取を行った。炭素14年代が報告されている溶岩を中心に9サイトにおいて試料採取を行い、計7ユニットの溶岩について試料採取を行うことができた。いずれの溶岩も新鮮な露頭において試料採取を行うことができた。いくつかの溶岩は、10mm程度の大きな斜長石斑晶を含んでいた。これらの溶岩試料での古地磁気強度測定が野外での風化・変質や室内加熱に伴う変質によって不成功になる場合には、斜長石斑晶を分離して古地磁気強度測定を行うことも可能である。採取した溶岩試料に対して、古地磁気方位測定・岩石磁気学的分析を開始した。過去1.2万年間については、考古学試料による古地磁気強度データが多数存在するものの、データのちらばりが大きく、あきらかに古地磁気強度測定の精度をこえている。平成26年度は、これまでに採取した富士火山・阿蘇火山の火山岩試料に対して、古地磁気強度測定・段階熱消磁・熱磁気分析を実施した。これらの測定は、実験補助員を雇用したことにより、効率的に進めることができた。これまでに75試料の古地磁気強度測定を完了した。その結果、8溶岩については数試料ずつ古地磁気強度データとして採用できる結果を得ている。これらの溶岩に報告されている炭素14年代値は、5千年前から2万5千年前であり、当初目標にしていた過去3万年間をカバーしつつある。本研究の主題である、絶対古地磁気強度と放射性炭素濃度の関係性も見えつつある。平成27年度以降は、データ数を増やすのが課題である。本研究は、炭素14年代が報告されている富士火山の溶岩流にLTD-DHTショー法(綱川-ショー法)を適用することで、過去1.4万年間における信頼度の高い絶対古地磁気強度データの復元を試みる。さらに、これらのデータに加えて、他の火山の13万年前の溶岩からも古地磁気強度(数データ)を復元して、過去3万年間における絶対古地磁気強度と大気の放射性炭素濃度の関係性を検討する。平成27年度は、これまでに行った富士火山・阿蘇火山・東伊豆の火山岩試料の古地磁気強度測定結果を検討し、データの信頼性を総合的に検討した。測定した76試料のうち59試料についてはデータ採用基準を満たす測定結果が得られた。3試料以上の測定値が得られたのは11サイト(9溶岩)であった。測定値のまとまりが良い(標準偏差が平均の15%以下であった)7サイト(6溶岩)の測定値の平均を古地磁気強度データとして採用した(4サイトについては測定値のばらつきが大きく、信頼度が低い)。得られた古地磁気強度とこれらの溶岩の炭素14年代における大気の放射性炭素濃度の比較を行った。大気の放射性炭素濃度データとしてIntCal13(Reimer et al., 2013)を参照している。その結果、絶対古地磁気強度と放射性炭素濃度の間の定量的な関係性を捉えつつある。また、本研究で得られた絶対古地磁気強度と放射性炭素濃度の関係性と既存のモデル計算の結果を比較することで、過去3万年間における平均的な太陽活動度が現在よりも低いことも示唆される。

本研究は、炭素14年代が報告されている富士火山・阿蘇火山・東伊豆の溶岩流から採取した試料に対して、LTD-DHTショー法による古地磁気強度測定を適用することで、過去3万年間における信頼度の高い絶対古地磁気強度データの復元を試みた。10溶岩76試料の測定を行い、最終的には6溶岩から信頼度の高い古地磁気強度データを得た。本研究で得られた古地磁気強度データとこれらの溶岩の炭素14年代における大気の放射性炭素濃度値の比較を行うことで、絶対古地磁気強度と放射性炭素濃度の間の関係性を定量的に捉えつつある。富士火山・阿蘇火山の8溶岩について数試料ずつ古地磁気強度の復元に成功しており、順調な進捗状況である。古地磁気学平成27年度にも、富士火山地域などにおいて引き続き試料採取を行う予定である。また、岩石磁気学的分析・古地磁気方位測定・古地磁気強度測定を引き続き行う。平成27年度中に得られたデータをまとめ、学会発表と論文執筆を行う。平成25年度には当初の計画では2回のサンプリングを行う予定であったが、1回のみにとどまった。ただし、その分は平成26年度前半に実施する予定であり、遅れた分は取り戻すことが可能である。本年度は、実験補助員の雇用に経費の大半を用いることになった。次年度の調査に備えて、残金を次年度に繰り越すことにした。平成26年度には、必要な試料採取のために、富士火山地域において第2回・第3回の調査を行う予定である。また、同年度には、実験補佐員を雇用し、岩石磁気学的分析・古地磁気方位測定・古地磁気強度測定を多数行う予定である。次年度の経費と合わせて、調査や学会発表のための旅費に主に使用する。本年度は富士火山地域において2回の試料採取調査を予定していた。1回目の調査によってある程度の試料が採取でき、その試料の古地磁気測定の進行状況が中途であったため、引き続きそれに専念することにして、2回目の調査を平成26年度前半に行うことにした。次年度配分予定の直接経費と合わせて、富士火山地域において2回の試料採取調査、ならびに実験補佐員の雇用を行う予定である。
反応物と金属試薬との電子的・立体的相互作用の類似性にもとづいた反応条件の解析

新規反応系の合理的設計のためには,任意の反応物の任意の反応条件下での反応生成物とその生成比とを正しく予測することが重要である.この定量的反応予測を実現するためには反応条件を正しく考慮することが不可欠となる.本研究では反応条件の重要な一つの因子である金属試薬に着目し,反応物と金属試薬との間の電子的・立体的相互作用に着目した反応条件解析を行うこ、とを目的とした.反応を考える際には相互作用を考慮することが必要である.3次元構造活性相関においてリガンドとの相互作用を数値化する手法としてCranlerらによって開発されたCoMFAがある.CoMFAは比較する分子同士の重ね合わせを必要とする.しかし,置換基の異なる共通骨格を持つ分子群を取り扱う薬物設計と異なり,反応物や試薬分子群を系統的に取り扱うにはそれらの大きさ形状ともに多様であるため,重ね合わせを必要とせず,かつどの分子についても同様な特性値を与える新しい手法が必要である.そこで,分子を取り囲む反応場を3次元的に特性値化する新しい方法FRAU(Field-characterization for Reaction Anaslysis and Understanding)を開発した.FRAUは仮想反応相手との相互作用にもとづいて分子を取り囲む3次元的な立体的・電子的・空間的特徴を数値化する(以下FRAU特性値と呼ぶ).FRAU特性値は各原子ごとに計算する.この各部位ごとに得られるFRAU特性値は,どの方向のどの相互作用が反応にこ大きく寄与しているかを知るための有力な情報となる.39種の金属試薬を,そのFRAU特性値を識別子としてKohonenニューラルネットワークで分類しFRAU特性値の能力を調べた.この結果,FRAU特性値が試薬の構造類似性・反応における役割の類似性をよく反映していることがわかり,FRAUの特性値化の妥当性を示した.新規反応系の合理的設計のためには,任意の反応物の任意の反応条件下での反応生成物とその生成比とを正しく予測することが重要である.この定量的反応予測を実現するためには反応条件を正しく考慮することが不可欠となる.本研究では反応条件の重要な一つの因子である金属試薬に着目し,反応物と金属試薬との間の電子的・立体的相互作用に着目した反応条件解析を行うこ、とを目的とした.反応を考える際には相互作用を考慮することが必要である.3次元構造活性相関においてリガンドとの相互作用を数値化する手法としてCranlerらによって開発されたCoMFAがある.CoMFAは比較する分子同士の重ね合わせを必要とする.しかし,置換基の異なる共通骨格を持つ分子群を取り扱う薬物設計と異なり,反応物や試薬分子群を系統的に取り扱うにはそれらの大きさ形状ともに多様であるため,重ね合わせを必要とせず,かつどの分子についても同様な特性値を与える新しい手法が必要である.そこで,分子を取り囲む反応場を3次元的に特性値化する新しい方法FRAU(Field-characterization for Reaction Anaslysis and Understanding)を開発した.FRAUは仮想反応相手との相互作用にもとづいて分子を取り囲む3次元的な立体的・電子的・空間的特徴を数値化する(以下FRAU特性値と呼ぶ).FRAU特性値は各原子ごとに計算する.この各部位ごとに得られるFRAU特性値は,どの方向のどの相互作用が反応にこ大きく寄与しているかを知るための有力な情報となる.39種の金属試薬を,そのFRAU特性値を識別子としてKohonenニューラルネットワークで分類しFRAU特性値の能力を調べた.この結果,FRAU特性値が試薬の構造類似性・反応における役割の類似性をよく反映していることがわかり,FRAUの特性値化の妥当性を示した.
特別な医療ニーズをもつ子どもと家族へのケア・コーディネーションと提供体制の評価

在宅療養を必要とする子どもと家族へのケア・コーディネーション(必要なケア・サービスの検討・手配・調整等)の有無,関連要因,実践内容を明らかにし,これらの子どもと家族へのコーディネートされたケア・サービスの提供体制に向けた課題を検討した。これらの子どもの親,相談支援専門員をはじめとした専門職への調査を行い,成長発達する子どもへのタイムリーで質の高いケア・サービス,子育ての負担感軽減に向けた家族全体を捉えた生活や親自身の支援のためには,ケア・コーディネーションの提供が急務である。また人材を含む社会資源の整備や多職種の連携・協働は重要であり,中でも学校を含む調整,相談支援専門員への支援が課題である。本研究の目的は、わが国における在宅の特別な医療ニーズをもつ子どもと家族へのケア・コーディネーションの有無と特徴、ケア・コーディネーションの効果、ケア・コーディネーションを行う看護職の実践と役割について明らかにし、これらの研究成果に基づき、わが国の在宅における特別な医療ニーズをもつ子どもと家族への“コーディネートされたケア・サービス提供体制"について提言することである。平成26年度(1年目)は、本調査の実施に向けて、研究協力者の操作的定義、データ収集を実施するフィールドなどについて具体的な検討を実施した。また、国外における先行研究のレビューも継続し、収集するデータの内容および測定方法などについても検討を開始したところである。また本研究の予備的調査として実施した特別なヘルスケアニーズをもつ子どもと家族へのケア・コーディネーションの経験に関する研究では、主たる育児を担う母親の心理的負担の軽減、タイムリーなケア・サービスへのアクセスなどをはじめとする種々のケア・コーディネーションの効果について質的記述的に明らかにした。本研究の目的は、わが国における在宅生活する特別な医療ニーズをもつ子どもと家族へのケア・コーディネーションの有無とその関連要因について明らかにし、それに基づき、これらの子どもとその家族に対するコーディネートされたケア・サービスの提供体制と看護のあり方について提言することである。2年目にあたる平成27年度は、研究代表者が在外研修となったため、当初、予定していた調査を最終年度である平成28年度(3年目)に実施することとし、それに向けた準備として、下記の3点について本研究を推進した。1点目は、在宅で生活している特別なヘルスケアニーズをもつ子ども、中でも医療ニーズの高い子どもと家族の定義、そしてそれらの子どもと家族に対するケア・コーディネーションに関する国内外の先行研究のレビューをさらに網羅的に進めた。2点目には、研究代表者の在外研修先であるミネソタ大学看護学部に所属する小児・家族看護学研究者と1年間の研修期間に渡ってこの問題について議論した。3点目には、米国とミネソタ州におけるこれらの子どもと家族へのケア・コーディネーションのシステムと実践への理解を深めるために、特別なヘルスケアニーズをもつ子どもの小児専門病院、大学病院等のスペシャル・クリニック、プライマリケア・クリニック、学校等におけるケア・コーディネーションの実践の見学と関係者へのインタビュー等を実施した。これらの研究活動を通じて、研究・法制度や政策・実践の3つの側面から、このテーマに関する概念およびそれぞれの現状について包括的に把握することができ、それによって理解を深めることができた。このことは次年度に予定している調査の実施、最終年度の成果報告に向けて意義があり、大きな成果であった。平成27年度(2年目)は研究代表者が在外研修となったため、当初、予定していた調査を平成28年度(3年目)に実施することとした。そしてそれに向けた準備として、下記の3点について本研究を推進した。1点目は在宅生活する特別なヘルスケアニーズをもつ子ども、中でも医療ニーズの高い子どもと家族の定義、そしてこれらの子どもと家族へのケア・コーディネーションに関する国内外の先行研究のレビューをさらに網羅的に進めた。海外、特に米国においてこれらの子どもとその家族へのケア・コーディネーションの問題は喫緊の課題となっており、研究成果が数多く発信されている。しかし、近年、わが国では小児在宅医療への関心が高まりつつあるものの、このテーマに関する研究成果はそう多くない。この問題に関する文献レビューを網羅的に実施できたことは、次年度の調査実施に向けて意義があった。2点目には研究代表者の在外研修先であった米国・ミネソタ大学看護学部に所属する複雑なヘルスケアニーズをもつ子どもと家族への高度実践看護師によるテレナーシングを用いたケア・コーディネーションの効果に関して多くの研究成果を発信する小児・家族看護学研究者と1年間に渡ってこの問題に関する議論を行った。3点目には米国とミネソタ州における特別なヘルスケアニーズをもつ子どもへの小児専門病院、大学病院等のスペシャル・クリニック、プライマリケア・クリニック、学校等においてケア・コーディネーションの実践の見学と関係者へのインタビュー等を実施した。これらの研究活動を通じて、研究・法制度や政策・実践の3つの側面から、このテーマに関する概念、それぞれの現状について包括的に把握し、理解を深めることができた。このことは次年度の調査実施、最終の成果報告に向けて大きな成果であった。また今年度のこれらの研究成果は別途、学会発表・学術論文として公表しているところである。本研究の目的は、在宅生活している特別な医療ニーズがある子どもと家族へのケア・コーディネーションの有無とその関連要因について明らかにし、それに基づき、わが国における特別な医療ニーズがある子どもと家族へのコーディネートされたケア・サービス提供と看護のあり方を提言することである。3年目にあたる平成28年度は、主に次の3点を実施した。1.在宅生活する特別な医療ニーズがある子どもの保護者を対象とした量的調査、障がい児相談支援事業所の相談支援専門員を対象とした量的調査の実施に向けて、先行研究およびこれまでの研究成果に基づき、質問紙を完成させ、データ収集を実施した。

またデータセットを作成し、分析の準備を整えた。2.平成27年度(2年目)に、米国・ミネソタ州において特別なヘルスケアニーズがある子どもと家族へのケア・コーディネーションを行うナースケアコーディネーターの実践を明らかにすることを目的としたインタビューを実施し、今年度はデータの分析を完了した。特別なヘルスケアニーズがある子どもと家族へのナースケアコーディネーターのケア・コーディネーションの実践として、“多職種共同のケアプランを一緒につくる" “コミュニケーションとコラボレーション" “ケアチームのメンバーへの教育" “管理上の仕事"の4つの実践内容が明らかになった。本研究の成果はThe 13th International Family Nursing Conferenceにおいて発表を予定している。3.在宅生活する特別な医療ニーズがある子どもの保護者、障がい児相談支援事業所の相談支援専門員への質的調査のデータ収集を開始しており、順調にデータが収集できている。平成28年度までの進捗状況は、以下の理由からやや遅れていると判断した。本研究については、当初は3年間の計画であったが、平成27年度(2年目)に研究代表者の長期在外研修が重なり、本研究で計画していた国内での調査の実施に着手することができなかった。そのため、研究期間を1年間延長し、今年度、在宅生活する特別な医療ニーズがある子どもの保護者を対象とした量的調査、障がい児相談支援事業所の相談支援専門員を対象とした量的調査を実施の上、データ収集を完了させた。加えて、在宅生活する特別な医療ニーズがある子どもの保護者、障がい児相談支援事業所の相談支援専門員への質的調査のデータ収集も開始した。当初、特に在宅生活する特別な医療ニーズがある子どもの保護者への質的調査において、研究協力者のリクルートが可能かどうか懸念されたが、同対象への量的調査を通じて、本研究の目的を達成しうる研究協力者の協力が得られており、現在、着実にデータが収集できている。また当初には計画していなかったが、米国での長期在外研修を通じて、特別なヘルスケアニーズがある子どもと家族へのケア・コーディネーション概念やモデル、システム等についての知見を深めることができた。さらに特別なヘルスケアニーズがある子どもと家族へのケア・コーディネーションを行うナースケアコーディネーターの実践内容についてもオリジナルデータを用いて明らかにすることができた。次年度が最終年度にあたるが、基本的には研究計画の内容の変更はせずに、これまでの実績を統合しながら、予定していた研究目的の達成に向けて、本研究を推進していく。
加齡に伴う免疫機能低下の環境遺伝的統御と老化病態発症及び寿命との関連について

(1)飼育環境がSAMマウスの免疫及び老化病態発症に及ぼす影響;通常環境下で低応答のSAMはSPF環境下での応答能は正常値を示したことから、これは遺伝的に固定されたものではないといえる。SPF下飼育のSAMを通常環境に移した後12ヵ月間は正常応答値を示したので、単なる細菌感染などの免疫系攪乱などによる形質変化ではなく、長期に互っての生理状態変化を意味する。老化アミロイドーシスはSPF環境下で著しく軽減された。2.免疫能低下に関わる遺伝子(群)の特定;推測していた第7染色体上Gpi-1より動原体方向をAkv-1内因性ウイルスプローブで解析した。想定遺伝子はAkv-1か或いはこれと接近していると判定された。マイクロサテライト法によるさらなる検索は特定のマーカーが無く、断念した。3.免疫応答能、遺伝子型と寿命の関係;遅延型過敏反応(DTH)および抗体産生反応能は相互に正の相関を示した。また、これと寿命との関係については、(1)低応答で短命、(2)高応答で長命、および(3)高応答で比較的長命の3群に分かれた。(1)は殆どがApoa2cホモで老化アミロイド症を呈し、(2)は全てApoa2a/cかa/aで老化アミロイド陰性であり、(3)はApoa2c/cとa/cを含み、前者は老化アミロイド症を、また後者は炎症性アミロイド症を呈した。4.Apoa2c/cの個体に於ける関連性;免疫応答能と寿命の長さは正の相関を示したものの、自己抗体(抗DNA抗体)力価と寿命およびDTH反応は負の相関を示した。一方、自己抗体力価と抗体産出能との関連性は認められなかった。免疫組織学的検索から、SAMP1マウスが短命であることの理由として、低免疫応答性によって助長される老化アミロイドの組織沈着が強く関わっていると結論された。一方、老化アミロイド嫌発系(Apoa2a/a,Apoa2a/c)では、寿命の短縮には炎症性アミロイド症が関わっているものと推察された。平成8年度研究実施計画に基づいて研究を進めてきた.(1)飼育環境がSAMマウスの免疫能及び老化病態発症に及ぼす影響:通常環境下SAMの抗体産生能が低いことは重ねて報告してきたが,これが遺伝的(先天的)に固定されたものであるのか或いはバクテリア侵襲などの"免疫ストレス"の結果(あるいは連動)であるのかは重要な課題である.SPF環境下でのSAMマウスの応答は正常値であったことから後者といえる.また,このマウスを通常環境に移行して1ヶ月後では正常応答で,5ヶ月後には低応答を示したことから,SAMの低応答能が単なる細菌感染の急性変化では無く,長期に亘って生理状態に"刻印"されたものといえる.これが,授乳によって"刻印"されたものではないことは既に報告した.また、老化病態の一つである老化アミロイドーシスはSPF環境下で著しく軽減され,個体全体の老化度評点も有意に軽減された.(2)免疫能低下に関わる遺伝子(群)の特定:

B10.BRとの交雑実験から関連遺伝子の一つは第7染色体動原体方向,Gpi-1に近いことを報告したが,より動原体に近い内因性ウイルスAkv-1プローブで解析したところ,関連遺伝子はAkv-1か或いはこれと接近している断定された.マイクロサテライト法による更なる追究は,残念乍SAM,B10.BRマウス間でAkv-1近傍を特定できるマーカーが見つからず,達成されていない.(3)免疫能の低下と老化病態との関連について:SAMとB10.BRとの交雑マウスを作成し,2ヶ月齢時での免疫能を調べつつ進行中である.系統別に特徴ある老化病態を示し、短命な老化促進モデルマウス(SAM)では、老化病態発症に先駆けて免疫能が低下し、また、老化病態としての老化アミロイド症にはApoa2c遺伝子が密接に関わっていることが分かっている。本研究課題では、(1)免疫能の加齢に伴う低下、(2)老化病態、(3)寿命の3つの事象間の関連性を知る目的で、と正常対照マウス(B10.BR)との間で交雑マウスを作成し、種々機能および遺伝子マーカーを用いて検討した。その結果、1,免疫応答能、遺伝子型と寿命の関係について;遅延型過敏反応(delayed-typehypersensitivity,DTH)および抗体産生反応能は相互に正の相関を示した。また、これと寿命との関係については、(1)低応答で短命、(2)高応答で長命、および(3)高応答で比較的長命の3群に分かれた。(1)は殆どがApoa2cホモで老化アミロイド症を呈し、(2)は全てApoa2a/cかa/aで老化アミロイド陰性であり、(3)はApoa2c/cとa/cを含み、前者は老化アミロイド症を、また後者は炎症性アミロイド症を呈した。2,Apoa2c/cの個体に於いては、(1)免疫応答能と寿命の長さは正の相関を示し、(2)自己抗体(抗DNA抗体)力価と寿命およびDTH反応は負の相関を示した。一方、自己抗体力価と抗体産生能との関連性は認められなかった。免疫組織学的検索から、SAMP1マウスが短命であることの一理由として、低免疫応答性によって助長される老化アミロイドの組織沈着が強く関わっていると結論された。一方、老化アミロイド嫌発系(Apoa2a/a,Apoa2a/c)であっては、寿命の短縮には炎症性アミロイド症が関わっているものと推察された。
生徒の行動観察による喫煙,飲酒防止教育の評価

本研究の目的は,生徒のコミュニケーションスキル,特に喫煙や飲酒などの望ましくない行動をすすめられた場合のコミュニケーションスキルを行動観察によって評価する方法を開発することである。具体的には,ロールプレイングを用いて,実際に子どもが「喫煙,飲酒をすすめられた場面での断る様子」をビデオカメラで撮影し,その映像から生徒のコミュニケーションスキルを複数の評価者によって観察評価することであった。これまでの予備調査において,生徒の行動観察評価の信頼性に問題がみられた「ノンバーバルな行動に関する評価規準」を再検討し,観察評価者の一致度が高まるような評価規準となるように研究協力者等との検討を踏まえて評価規準を修正した。しかし,残念ながら,性別,教職暦を考慮して選別された37名の学校教員(観察評価者)によって行動観察評価の信頼性等の検討の結果からは,喫煙,飲酒防止教育の評価指標としておおむね活用可能であることが伺えたものの,継続的な改善の必要性が残された。また,コミュニケーションスキルに焦点をあてた教育プログラムを試作し,予備実験授業を行って研究協力者と共に検討を行なった。その結果,実際の学校において授業を進める上での教育プログラム上の改善が求められる点等が明らかとなった。初年度に当たる平成18年度においては,予備調査で生徒の行動観察評価の信頼性に問題がみられた「ノンバーバルな行動に関する評価規準」を再検討し,観察評価者の一致度が高まるような評価規準となるように研究協力者等との検討を踏まえて評価規準を修正した。修正された評価規準に基づいて,性別,教職暦を考慮して選別された37名の学校教員(観察評価者)によって行動観察評価の信頼性等の検討を行った。その結果,性別や教職暦,あるいは教員免許の取得状況等によってややバラつきはみられるものの,改善された評価規準が喫煙,飲酒防止教育の評価指標としておおむね活用可能であることが伺えた。しかし,これまで報告されている喫煙,飲酒防止教育の評価で用いられているような指標(生徒の喫煙,飲酒に対する知識や意識,心理測定尺度等)との関連についても検討する必要性が残された。
新開発の宿主ベクター系を用いたP.gingivalis遺伝子の発現調節の解析

申請者らは、平成56年度に研究費補助金を受けて、P.gingivalisにおける宿主-ベクター系の開発を行い、同菌種への外来遺伝子の伝達に成功した。そこで、本研究ではP.gingivalisに線毛の構造遺伝子を伝達し、その発現調節につき検討した結果、次のような知見が得られた。1.P.gingivalis線毛の基本構造サブユニット遺伝子fimAをYH522株に伝達したところ、同遺伝子は安定に保持され、その遺伝子産物FimAの発現とともに宿主菌の固有線毛とは免疫学的に異なるリコンビナント線毛が産生された。2.リコンビナント線毛の発現に伴い、宿主の本来の線毛の形成が抑制されることが判明した。3.fimA遺伝子の伝達の結果リコンビナント線毛を発現している菌は、その親株に比較して、他菌との凝集性、自己凝集性、ヒト口腔上皮細胞への付着性等がいずれもが低下していたことから、リコンビナント線毛は、天然の線毛に比べて、他の細胞(細菌)との相互作用に係わる活性が低いと考えられた。これらにより、P.gingivalisの線毛には本来備わるがリコンビナント線毛には欠ける因子が存在し、それが他の細胞等との相互作用(付着)に係わっているのではないかと考えられる。これは、P.gingivalisの線毛の構造に関する新事実である。本研究で得られた線毛構造にとその発現調節に関する知見は、歯周病原細菌P.gingivalisの病原性と深く係わる菌の定着のメカニズムを解明する上で、極めて重要なものであると考えられる。1.大腸菌でクローン化されているP.gingivalis 381株の線毛構成蛋白質(フィンブリリン)遺伝子(fimA_<381>)をプラスミドベクターpYH420中にサブクローン化し、P.gingivalisの制限酵素非保有変異株であるYH522を受容菌として電気パルス法により遺伝子伝達を行った。2.伝達の結果、宿主菌中にfimA_<381>遺伝子がプラスミド状で存在することが確認され、また同プラスミドDNAが回収された。3.fimA_<381>遺伝子をプラスミド状で保有するYH522株では、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより、フィンブリリン蛋白質が発現されていることが確認された。上記の株には、電子顕微鏡的観察により、特有の線毛構造物が多量に観察された。その線毛は宿主菌固有の線毛とは形態的に明らかに異なり、長く、また密であった。5.イムノゴールド法により、前記の線毛構造物が外来遺伝子(fimA_<381>)に由来のものであることが証明された。6.上記の知見は、歯周病原細菌として広く研究対象となっているP.gingivalis菌への遺伝子伝達の成功、並びにその発現を確認した初のケースである。7.伝達したのが線毛構成蛋白質の構造遺伝子のみであるにもかかわらず、それにより電子顕微鏡的に可視的な構造物(線毛)の形成が見られたことは興味のあるところである。次年度以降、それに関する詳細な検討を加える計画である。前年度、大腸菌でクローン化されているP.gingivalis 381株の線毛構成蛋白質(フィンブリリン)遺伝子(fimA_<381>)をプラスミドベクターpYH420中にサブクローン化し、P.gingivalisの制限酵素非保有変異株であるYH522を受容菌として電気パルス法により遺伝子伝達を行った。その結果、fimA_<381>遺伝子にコードされたフィンブリリンを基本構造とする特有の線毛構造物が多量に形成されることが電子顕微鏡観察により明らかとなった。この知見は、歯周病原細菌として広く研究対象となっているP.gingivalis菌への遺伝子伝達の成功、並びにその発現を確認した初のケースである。

本年度は、前年度の成果を踏まえ、P.gingivalisの天然の線毛と、遺伝子の伝達の結果形成された「人工線毛」との間の差異について検討した。その結果、次のような、いくつかの興味ある知見を得た。(1)人口線毛は、天然線毛が備える「マイナー・コンポーネント」である、分子量50k、および80kの成分を欠いていた。(2) fimA_<381>遺伝子の伝達・発現により、宿主菌の本来の線毛形成が低下していた。(3)人口線毛が多量に形成された菌は、親株と比較して、他の口腔細菌との共凝集能が低下していた。(4)人口線毛が多量に形成された菌は、親株と比較して、口腔内上皮細への付着性が低下していた。(5)人口線毛の形成は、菌の血球凝集能に対しては影響を与えなかった。歯周病原細菌のP.gingivalisの線毛は同菌が口腔内に定着するための重要因子であるにもかかわらず、機能や構造について未知の点が多い。本研究課題は、申請者が以前に補助金を受けて開発に成功した遺伝子伝達系により同菌に他株から遺伝子を伝達し、人工線毛を発現させることで、線毛形成のメカニズム、線毛の発現調節、構造と機能の関係などの解明を試みたものである。その結果、研究期間内に次のような多くの興味ある知見が得られた。1.線毛の基本構造ユニットをコードする遺伝子(fimA)を伝達することにより、電子顕微鏡で観察可能な線毛様構造物(リコンビナント線毛)が形成されることが判明した。2.fimA遺伝子伝達による遺伝子産物の発現量には、受容菌株による差が見られた。もともと線毛を持たない株として知られるW50株が受容菌である場合、その発現量は最も少なかった。3.リコンビナント線毛の形成量と遺伝子産物の発現量との間には比例関係が見られた。4.外部からのfimA遺伝子の伝達とその発現は、宿主菌の本来のfimA遺伝子の発現の抑制をもたらし、その結果、リコンビナント線毛の産生が見られた菌では本来の線毛量が低下していた。5.リコンビナント線毛が産生され、その結果天然の線毛量が低下すると、宿主菌の各種活性(同菌の自己凝集、他菌との共凝集、口腔上皮細胞等への菌の付着等)が一様に低下した。これらの知見を総合すると、天然の線毛はfimA遺伝子の伝達で産生されるリコンビナント線毛に欠ける何らかの因子を欠き、その因子が付着性に強く係わるという事実が判明した。
環境要因がヒラメ仔稚魚の内分泌系および消化器系の発達におよぼす影響

京都大学フィールド科学教育研究センター舞鶴水産実験所においで、ヒラメ仔稚魚の内分泌系及び消化器系の発達におよぼす環境要因の影響を調べるために、飼育実験及びフィールド採集調査を行った。4月末から7月下旬まで、卵から育てた仔稚魚を用いて以下に関する飼育実験を実施した。1.ヒラメの孵化から変態後28日まで、正常に飼育した場合の消化器管形成過程、消化酵素発現過程、コーチゾル産生過程2.飢餓がヒラメ浮遊期仔魚の消化管の発達と消化酵素発現に与える影響3.高密度飼育がヒラメ浮遊期仔魚に与えるストレスの影響4.高密度飼育がヒラメ着底稚魚に与えるストレスの影響5.河口域の成育場で経験するであろう塩分の急激な変化が、ヒラメ着底稚魚に与える生理的影響飼育実験後、上記の全飼育実験区で得られた標本について、仔稚魚期の形態発達、成長、蛋白質量、リパーゼ活性、トリプシン活性を測定した。この結果、正常な飼育下でのタンパク質当たりリパーゼ活性は、浮遊仔魚期初期から増加し中期以降ほぼ一定となったが、トリプシン活性は変態中に明瞭に低下し、その後一時増加するものの稚魚期に入り徐々に低下するという、興味深い現象が捉えられた。消化酵素の活性は摂餌状態と明瞭な対応関係を示し、仔稚魚の健康状態の指標となる可能性が示唆された。また、由良川河口域で天然ヒラメ稚魚を採集し、人工飼育条件下でのヒラメ稚魚の発育や生理状態との比較分析を行っている。1月から京都大学(京都市)において放射性同位体を用いたコーチゾル濃度の測定を実施中である。上記の他、Sergio Nestor BOLASINAは、平成16年10月にスペインバルセロナで開催されたヨーロッパ養殖学会に参加し研究発表を行った。スペインはヨーロッパでは海産魚類の養殖技術研究が最も盛んであり、その現状を調べるために、学会終了後いくつかの拠点となる研究施設を訪問し、貴重な情報を収集することができた。
樹状細胞オートファジーによる腸管粘膜免疫系ホメオスターシスの制御

申請者は,腸管関連リンパ組織(GALT)の樹状細胞(DC)では構成的にオートファジーが誘導されていること,また同機構の誘導には腸内常在菌の細胞内捕捉が重要であることを明らかにした.腸炎モデルの検討から, DCオートファジーを欠如するマウスでは,腸炎回復期における粘膜組織の再生遅延が観察された.またこの遅延は, DCオートファジー不全によるDC内常在菌数の増加に伴うIL-6およびTNF-〓の生産レベルの増加,ならびにDCによるIL-23の生産レベルの減少およびIL-23依存性に誘導される,組織修復を促すIL-22の大腸組織からの生産レベルの減少によることが判明した.これらの結果から, GALT DCの構成的オートファジーは定常状態では腸内常在菌の刺激依存性に誘導されること,炎症状態では回復時の粘膜治癒機構に深い関わりがあることが明らかとなった.腸管樹状細胞(DC)における構成的オートファジーの生理的役割を明らかにすることを目的として研究を遂行し、以下の成果を得た。ATG5-floxマウスとCD11c-creマウスを交配し、DCのみオートファジーが誘導されないATG5-DCKO(cKO)マウスを作製し、定常状態における腸間膜リンパ節DC内の腸内常在菌を検出、同定したところ、いずれのマウス由来DCにおいてもEnterococcusが検出されたが、その菌体数はcKOマウスの方が多かった。常在菌捕捉とオートファジーの関連性を解明するために、オートファジー関連分子LC3-GFPマウス由来DCとEnterococcusを共培養したところ、DC内に捕捉された常在菌はすべてLC3分子に覆われていたことから、構成的オートファジーは常在菌の捕捉により誘導されることが判明した。炎症状態におけるDCオートファジーの役割を解明する目的で、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の飲水投与による炎症性腸疾患モデルを適用し検討をおこなった。その結果、DSS投与期間中はcKOマウスおよび対照マウスともに経時的な体重減少、大腸短縮、上皮損傷に伴う出血が観察された。DSS投与終了後、対照マウスでは体重や大腸組織が回復するのに対して、cKOマウスではこれら回復が遅延することが観察された。腸炎回復時における腸管DCの機能を調べたところ、cKOマウス由来DCでは細胞内菌体数の増加および炎症性サイトカイン(TNF、IL-6)生産量の著増が認められた。また、cKOマウス由来DCではIL-23生産量の減少、ならびにIL-23依存性に誘導され上皮修復を促すIL-22の大腸組織からの生産量の減少が認められた。これらの結果から、腸管DCの構成的オートファジーは常在菌の刺激依存性に誘導され、腸管ホメオスターシスの維持に重要な役割を演じていることが明らかとなった。申請者は,腸管関連リンパ組織(GALT)の樹状細胞(DC)では構成的にオートファジーが誘導されていること,また同機構の誘導には腸内常在菌の細胞内捕捉が重要であることを明らかにした.腸炎モデルの検討から, DCオートファジーを欠如するマウスでは,腸炎回復期における粘膜組織の再生遅延が観察された.またこの遅延は, DCオートファジー不全によるDC内常在菌数の増加に伴うIL-6およびTNF-〓の生産レベルの増加,ならびにDCによるIL-23の生産レベルの減少およびIL-23依存性に誘導される,組織修復を促すIL-22の大腸組織からの生産レベルの減少によることが判明した.これらの結果から, GALT DCの構成的オートファジーは定常状態では腸内常在菌の刺激依存性に誘導されること,炎症状態では回復時の粘膜治癒機構に深い関わりがあることが明らかとなった.平成23年度は、腸管樹状細胞(DC)における構成的オートファジーの生理的役割についての検討をおこない、以下の成果が得られた。まず、DCのみにオートファジーが誘導されない(ATG5-DCKO)マウスを作製した。具体的には、ATG5-flox/floxマウスとCD11c-creマウスの交配を繰り返すことで、ATG5-DCKOマウスとその対照(ATG5-flox/flox)マウスが同腹仔として生まれる系を確立し、これらマウスを以下の実験に供した。定常状態における腸間膜リンパ節DC内の腸内常在菌の有無をqPCR法で検出したところ、対照マウスと比較してATG5-DCKOマウスではEnterococcusが多く存在していた。この結果から、ATG5-DCKOマウスでは抗体生産が亢進していることが予測されたが、同マウスの血清および糞便IgA量や血清IgG1量は正常であった。また、腸管粘膜固有層および腸間膜リンパ節のDCサブセットの頻度も正常であった。定常状態では構成的DCオートファジーの重要性が認められなかったので、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の飲水投与による炎症性腸疾患モデル(DSS大腸炎)を適用し検討をおこなった。その結果、DSS投与期間中はATG5-DCKOマウスおよび対照マウスともに経時的な体重減少、大腸出血、大腸短縮、上皮損傷、粘膜内リンパ小節形成など、DSS大腸炎に特有の症状を示した。興味深いことに、DSS投与終了後、対照マウスでは経時的な体重増加や大腸回復が観察されたのに対して、ATG5-DCKOマウスではこれら回復が著しく遅延することが判明した。

また組織学的解析から、この回復遅延は上皮細胞の再構築(粘膜治癒)の遅延よるものであることが推察された。さらに、大腸炎を誘導したATG5-DCKOマウスでは腸管DCの頻度が著しく減少することも明らかとなった。本研究課題の主たる部分を担う遺伝子改変マウスは、当初の計画通り平成23年度内に作製することができ、現在は安定した生産が可能な状況にある。これらマウスの解析から、定常状態における構成的なDCオートファジーが一部の腸内常在菌(Enterococcus)の細胞内捕捉機構に重要な役割がある可能性を示唆する結果が得られた。一方、平成24年度の実験計画予定であるIgA生産誘導機構についての予備実験をおこなったところ、DCにおける構成的オートファジーの欠如あるいはそれを原因とするDC内常在菌数の増加が定常状態のIgA生産レベルに影響を及ぼすことはなかった。この結果は当初の予想に反するものであり、申請時のIgA研究計画を継続することは困難であることから、研究内容の一部変更が必要であると判断した。そこで申請者は、構成的なDCオートファジーの重要性は定常状態よりもむしろ炎症などの生体に負荷がかかった際に発揮されるのではないかと考え、炎症性腸疾患モデルであるDSS大腸炎を適用し検討をおこなった。その結果、ATG5-DCKOマウスでは大腸炎の回復が著しく遅延するという興味深い結果が得られた。さらに、その原因としては粘膜治癒の遅延による可能性が示唆されたことから、同研究課題は平成24年度も継続する価値があると思われた。上述のように、平成23年度は申請時の計画とは異なる研究内容に一部変更したものの、変更後の進捗状況はおおむね順調であるといえる。平成23年度の研究成果から、構成的DCオートファジーは同細胞内における腸内常在菌の保持や炎症性腸疾患の回復期に重要な役割を担っていることが示唆された。その一方で、IgA生産については研究を継続するための十分な結果が得られなかった。また当初予定していた経口免疫寛容の研究(平成24年度計画)には、大量のOT-II Rag2欠損マウスを必要とするが、当該研究室の学内移設(平成24年3月)、それに伴うマウス飼育室(当該研究室保有)の縮小化により同研究の遂行が困難な状況にある。したがって、今後は炎症性腸疾患モデルの解析を継続したいと考えている。これまで、炎症性腸疾患の原因は明らかにされていないが、その病態形成には腸内常在菌が重要であることが報告されている。この機序の詳細もまた不明であるが、平成23年度の成果から、腸管DCにおけるオートファジーの欠如が同細胞内での常在菌の長期生存あるいは大量捕捉を可能とし、これが炎症性腸疾患の粘膜治癒過程に重大な損傷を与えている可能性が考えられた。今後は、DSS大腸炎の回復期に焦点を絞り検討をおこなう。まず、腸炎回復期の大腸および腸間膜リンパ節のDCにおける炎症性サイトカイン生産や細胞内常在菌数をATG5マウス間で比較し、オートファジー関連分子LC3-GFPマウスの回復期においてオートファジーが誘導されているLC3陽性DCの局在や同DC内常在菌数を解析することで、腸炎回復におけるDCオートファジーと腸内常在菌との関連性を明らかにする。申請者は、骨髄細胞中に腸管指向性DCの前駆細胞である単球サブセットを見出している(未発表データ)。ATG5-DCKOマウスに対照マウス由来単球サブセットを移植することで、腸炎の早期回復に繋がるかどうか検討する。
骨誘導能を有する超生体活性多孔金属の開発

1.希塩酸処理の効果従来のアルカリ処理では表面に径100μmをピークとする微細表面網目構造が出現するが、更に希塩酸処理を追加することで500nm-1μmの網目構造が形成し、表面積も増加することがわかった。このような微細構造を持ったポーラスチタンは埋入1年にわたり生体活性能が維持されることが、兎大腿骨内埋入による骨誘導試験、ビーグル犬背筋内埋入による骨誘導能試験で確認された。更に、前臨床的な脊椎固定術モデルにおいても希塩酸処理を追加したアルカリ加熱処理ポーラスチタンの有用性が確認出来た。2.EP4アゴニストの影響骨誘導能を有する多孔体材料(b-TCP)を犬背筋内に埋入した。10μg/kgのEP4アゴニストを3週毎に投与し、3、6、12週後に取り出した。EP4アゴニストが骨誘導能に与える影響を投与群と非投与群で組織学的に比較した。埋入6週後で投与群は骨形成が有意に増加しており、12週後ではb-TCPの吸収が促進されていた。3、6週後にはTRAP陽性細胞の発現が有意に増加しており、EP4アゴニストが骨芽細胞だけでなく破骨細胞の分化を促進させ骨誘導および材料吸収に関与していることが示唆された。3.HAPを用いた骨誘導メカニズムの解明φ4mm×4mmのCa欠損HAP(Ca/P=1.61 PENTAX)をビーグル犬、ラット背筋内に埋入し、18週飼育後摘出した。犬では、4週で骨新生が認められたが、ラットでは8週経過後も認められなかった。TRAP染色では、2週から犬で多数の陽性細胞が認められたが、ラットでの発現は非常に少なかった。TEMでは、犬で発現している多核巨細胞は、破骨細胞特有の波状縁様の形態が認められたが、ラットでは認められなかった。RT-PCRでは、現在までは犬とラットで明らかな差異は認められていない。多核細胞が骨誘導能を起こす要因の一つであることが示唆された。1.希塩酸処理の効果:骨誘導能を有する多孔体生体活性チタンの骨誘導能を向上させる目的で、従来のアルカリ加熱処理に希塩酸処理を追加し、処理層内のナトリウムを完全に除去した。その結果、従来の処理では犬背筋内での骨誘導に6ヶ月要したのが、3ヶ月で骨誘導を示すことが判明し、骨誘導へのナトリウムイオンの関与および、処理層の微細構造の関与が示唆された。2.EP4アゴニストの影響:骨誘導能を有する多孔体材料(生体活性チタン、A-Wガラスセラミック、β-TCP)を犬背筋内に埋入した。3μg/kgのEP4アゴニストを埋入時に投与し、6、12、18週後に取り出し、EP4アゴニストが骨誘導能に与える影響を組織標本として比較した。EP4アゴニスト非投与群をコントロールとした。埋入6週では、いずれの材料においても骨誘導能の違いに有意な差は認めなかった。今後、12週、18週の標本を評価し、投与の影響を考察する。また投与時期の違いが骨誘導に与える影響についての考察も同時に行う。3.HAPを用いた骨誘導メカニズムの解明:φ4mm×4mmの円柱体HAP(Ca/P=1.61)を使用し、犬背筋内での骨誘導についての組織学的評価を行った。

HAP埋入4週で新生骨形成が始まり、6週では成熟した骨梁形成が十分に認められた。これに同期して、アルカリフォスファターゼ染色陽性の骨芽細胞が多数認められた。また、骨新生に先立ち、TRAP陽性の多核細胞が2週頃から材料内に出現する。この細胞は貪食系細胞と思われ、材料吸収の働きを担っているとともに骨新生にも何らかの役割を果たしていると考えられる。造血系幹細胞由来で、新生血管を通り材料内に到達し、材料吸収能を獲得するとともに最終的には破骨細胞としての機能も獲得すると考えられた。今後は血管新生、骨芽細胞誘導、破骨細胞誘導に視点をおき、蛋白、RNAレベルでの解析を行う予定である。1.希塩酸処理の効果従来のアルカリ処理では表面に径100オmをピークとする微細表面細目構造が出現するが、更に希塩酸処理を追加することで500nm-1オmの網目構造が形成し、表面積も増加することが分かった。このような微細構造を持つたポーラスチタンは埋入1年にわたり生体活性能が維持されることが、兎大腿骨内埋入による骨誘導試験、ビーグル犬背筋内埋入による骨誘導能試験で確認された。更に、前臨床的な脊椎固定術モデルにおいても希塩酸処理を追加したアルカリ加熱処理ポーラスチタンの有用性が確認出来た。2.EP4アゴニストの影響骨誘導能を有する多孔体材料(b-TCP)を犬背筋内に埋入した。10μg/kgのEP4アゴニストを3週毎に投与し、3、6、12週後に取り出した。EP4アゴニストが骨誘導能に与える影響を投与群と非投与群で組織学的に比較した。埋入6週後で投与群は骨形成が有意に増加しており、12週後ではb-TCPの吸収が促進されていた。3、6週後にはTRAP陽性細胞の発現が有意に増加しており、EP4アゴニストが骨芽細胞だけでなく破骨細胞の分化を促進させ骨誘導および材料吸収に関与していることが示唆された。3.HAPを用いた骨誘導メカニズムの解明φ4mm×4mmのCa欠損BAP(Ca/P=1.61 PENTAX)をビーグル犬、ラット背筋内に埋入し、一定期間(1? 8週)飼育後摘出した。犬では、4週で骨新生が認められたが、ラットでは8週経過後も認められなかった。TRAP染色では、2週から犬で多数の陽性細胞が認められたが、ラットでの発現は非常に少なかった。TEMでは、犬で発現している多核巨細胞は、被骨細胞特有の波状縁様の形態が認められたが、ラットでは認められなかった。RT-PCRでは、現在までは犬とラットで明らかな差異は認められていない。以上の結果より、多核細胞が骨誘導能を起こす要因の一つであることが示唆された。