hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疑似宇宙環境における基本的生命現象の可視化

<地球環境基本データの蓄積>から<宇宙環境実験>へ細胞周期をリアルタイムに追跡する蛍光プローブ,酸化ストレスプローブ、エピジェネティクスプローブ、カルシウムプローブ、DNA損傷部位可視化プローブ、Dsup、について地球環境における様々なストレスへの応答様式についてデータを蓄積する為の実験系の整備を進めた。領域会議などにより上記蛍光プローブの実用的利用の提案を行い、宇宙環境実験系の提供および設計を目的とした連携を図った。具体的には、Fucciおよび新規Fucci(CA)を恒常的に発現するヒトがん細胞株と正常細胞株を複数樹立した。まずは地球環境において、各種抗がん剤に対する細胞応答パターンについて時空間情報を基本にデータ化することを目標にタイムラプスイメージングを行った。ハイコンテント解析により例えば細胞周期情報を可視化すると、細胞はその種類によって、もしくはおかれた環境(密集度、足場環境など)によって薬剤応答パターンが大きく異なる事が明らかであった。領域内連携により導入した3Dクリノスタットを用いて、擬似微小重力環境下における“direct visualization"プロジェクトを実行すべく、3Dクリノスタット設置型ーモバイル蛍光顕微鏡システムの開発を加速した。スマホ顕微鏡に加え、落射型蛍光顕微鏡構成を基本に、自作で蛍光顕微鏡の超小型化を目指しており、2019年度内の完成を目指す。2017年に確立したUV傷害観察の実験系を、本領域内外より提供される宇宙放射線被曝擬似実験に適用し、宇宙放射線が与える影響を“direct visualization"する実験を進めた。群馬大学・重粒子線医学研究センターにおいて、炭素線およびX線照射実験を行った。また京都大学・放射線生物研究センターにおいて、セシウムイオンの低線量率照射実験を行った。いずれも解析を進めている段階である。地球環境における様々なストレス応答様式についてデータを蓄積する為の実験系整備として、Fucciおよび新規Fucci(CA)もしくはストレス応答プローブなどを恒常的に発現するヒトがん細胞株と正常細胞株を複数樹立した。一例として、ハイコンテント解析により細胞周期情報を可視化すると、細胞はその種類によって、もしくはおかれた環境(密集度、足場環境など)によって薬剤応答パターンが大きく異なる事が分かった。今後はこれらを疑似微小重力環境でのタイムラプスイメージングへと適用していく。複数の由来の異なる細胞株を比較することで、得られる現象の普遍性もしくは異質性を抽出、議論できる基盤となると考えている。3Dクリノスタット設置型ーモバイル蛍光顕微鏡システムの開発においては、1色の蛍光を観察する為のシステムについては開発を完了したが、2色の蛍光を観察するシステムについては、想像以上に光軸調整が難航した。2019年度には、光軸調整および、クリノスタットへの安定した固定手法について、加速して開発を進める予定である。いわゆる「モバイル顕微鏡」は、研究現場のみならず、一般社会においても様々な場面において応用可能な技術である。本研究から得られるデータや蛍光画像を用いて、社会全般に分かりやすく発信していくことも命題である。実際に宇宙実験を行っている研究者からの要望を受け、モバイル顕微鏡導入検討へと橋渡しが始まっている。・クリノスタット設置型ー「モバイル蛍光顕微鏡」システム(2色の蛍光を観察するシステム)を完成させ、領域内へ提案する。・前年度までに行った各種、“direct visualization"プロジェクトの結果の解釈を進める。領域内および宮脇チームリーダーとのディスカッションを経て、軌道修正を繰り返しながら、宇宙規模での基本的生命現象の理解の収束を目指す。・平成30年に樹立したエピジェネティクスプローブ発現マウスを用いて、心的ストレス、物理的ストレスとエピジェネティクス(DNAメチル化)の関係について、プローブ発現マウスの脳を対象に「重力」「宇宙放射線」軸との関連を検討する。・地球環境、宇宙環境、放射線被曝などの環境について、これらストレスプローブを発現する細胞や動物の反応を可視化していく。この過程において、時間情報、空間情報、重力情報の観点から、ストレス感知機構の理解へとつなげていく。・JAXA「2018年度「きぼう」利用フィジビリティスタディ(FS)テーマ」に、代表;群馬大学・高橋昭久先生、研究テーマ;「宇宙での微小重力環境におけるガンの進行」の研究分担者として参画する機会に恵まれた。ここでは、本研究でFucciを用いて得られた知見を元に、基本的生命現象に関して仮説を立て、それを検証する実験系を組んでいく。すでにISSで行われている蛍光イメージングにおいては、サンプルによってその操作性を飛躍的に向上させることを狙い、「モバイル蛍光顕微鏡」システムの運用を提案する。

スマホ顕微鏡に加え、落射型蛍光顕微鏡構成を基本に、自作で蛍光顕微鏡の超小型化を目指しており、2019年度内の完成を目指す。2017年に確立したUV傷害観察の実験系を、本領域内外より提供される宇宙放射線被曝擬似実験に適用し、宇宙放射線が与える影響を“direct visualization"する実験を進めた。群馬大学・重粒子線医学研究センターにおいて、炭素線およびX線照射実験を行った。また京都大学・放射線生物研究センターにおいて、セシウムイオンの低線量率照射実験を行った。いずれも解析を進めている段階である。地球環境における様々なストレス応答様式についてデータを蓄積する為の実験系整備として、Fucciおよび新規Fucci(CA)もしくはストレス応答プローブなどを恒常的に発現するヒトがん細胞株と正常細胞株を複数樹立した。一例として、ハイコンテント解析により細胞周期情報を可視化すると、細胞はその種類によって、もしくはおかれた環境(密集度、足場環境など)によって薬剤応答パターンが大きく異なる事が分かった。今後はこれらを疑似微小重力環境でのタイムラプスイメージングへと適用していく。複数の由来の異なる細胞株を比較することで、得られる現象の普遍性もしくは異質性を抽出、議論できる基盤となると考えている。3Dクリノスタット設置型ーモバイル蛍光顕微鏡システムの開発においては、1色の蛍光を観察する為のシステムについては開発を完了したが、2色の蛍光を観察するシステムについては、想像以上に光軸調整が難航した。2019年度には、光軸調整および、クリノスタットへの安定した固定手法について、加速して開発を進める予定である。いわゆる「モバイル顕微鏡」は、研究現場のみならず、一般社会においても様々な場面において応用可能な技術である。本研究から得られるデータや蛍光画像を用いて、社会全般に分かりやすく発信していくことも命題である。実際に宇宙実験を行っている研究者からの要望を受け、モバイル顕微鏡導入検討へと橋渡しが始まっている。・クリノスタット設置型ー「モバイル蛍光顕微鏡」システム(2色の蛍光を観察するシステム)を完成させ、領域内へ提案する。・前年度までに行った各種、“direct visualization"プロジェクトの結果の解釈を進める。領域内および宮脇チームリーダーとのディスカッションを経て、軌道修正を繰り返しながら、宇宙規模での基本的生命現象の理解の収束を目指す。
ゲージ場の量子論と異常項及びその応用

ゲージ場の量子論に関する基礎的な面では,速度位相空間および位相空間におけるゲージ変換の生成演算子を求める一般的な定式化が木村によってなされた.弦理論への応用を目的に,久保はPoincare上半面での経路積分を厳密に実行することに成功し,従来のものを特別な場合として含む一般的処方を確立した.本研究の中心課題である量子異常項に関しては多くの成果を得た.藤川はGaussの演算G^a(x)が, (αG^a(x))/(αt)=chiral anomaly,という関係式を導き,量子異常を含む理論の量子化の特質を明確にした.同時に,重力を含む場の理論の経路積分による定式化をより一層簡単に,厳密に遂行した.これを適用して,弦理論等に現われる演算子代数のなかのC数項が量子異常項から導かれることを示し,弦理論におけるBRS対称性が一般の共形ゲージを用い26次元以下の時空においても保たれることを示した.更に藤川は,弦理論をその極限に持つように膜の量子論を展開した.いわゆるWess-Zumino項に弱い相互作用場Wμを導入する時の一般的な難点の解決法も藤川によって示された.このように弦理論と異常項との間の関係が経路積分による量子化法によって明白になった.トーションを含んだ重力とゲージ場が共存する時,高次元時空での量子異常項が,位相幾何学的方法および経路積分法によって求められ,両方法間の関係づけが木村によってなされ, 6次元時空で共変的重力異常項が消去されないことも示された.場の理論の応用として,木村はNewton近似より2次高い近似での多体系の重力ポテンシアルを求め,その加速度依存性と重力場のゲージとの関係を示した.この近似での多体系の慣性中心も求められた.藤川は原子核の回転運動をHiggs機構として捉えることが可能であることを示した.ゲージ場の量子論に関する基礎的な面では,速度位相空間および位相空間におけるゲージ変換の生成演算子を求める一般的な定式化が木村によってなされた.弦理論への応用を目的に,久保はPoincare上半面での経路積分を厳密に実行することに成功し,従来のものを特別な場合として含む一般的処方を確立した.本研究の中心課題である量子異常項に関しては多くの成果を得た.藤川はGaussの演算G^a(x)が, (αG^a(x))/(αt)=chiral anomaly,という関係式を導き,量子異常を含む理論の量子化の特質を明確にした.同時に,重力を含む場の理論の経路積分による定式化をより一層簡単に,厳密に遂行した.これを適用して,弦理論等に現われる演算子代数のなかのC数項が量子異常項から導かれることを示し,弦理論におけるBRS対称性が一般の共形ゲージを用い26次元以下の時空においても保たれることを示した.更に藤川は,弦理論をその極限に持つように膜の量子論を展開した.いわゆるWess-Zumino項に弱い相互作用場Wμを導入する時の一般的な難点の解決法も藤川によって示された.このように弦理論と異常項との間の関係が経路積分による量子化法によって明白になった.トーションを含んだ重力とゲージ場が共存する時,高次元時空での量子異常項が,位相幾何学的方法および経路積分法によって求められ,両方法間の関係づけが木村によってなされ, 6次元時空で共変的重力異常項が消去されないことも示された.場の理論の応用として,木村はNewton近似より2次高い近似での多体系の重力ポテンシアルを求め,その加速度依存性と重力場のゲージとの関係を示した.この近似での多体系の慣性中心も求められた.藤川は原子核の回転運動をHiggs機構として捉えることが可能であることを示した.木村は4次元時空において、Weylフェルミオンが重力場とU(1)ゲージ場と同時に結合している時のローレンツ異常項をグラフ及びトポロジカルな方法によって求めた。更に6次元空間における共変ローレンツ異常項も径路積分及びトポロジカルな方法で求め、各々の方法による結果を比べた。結果の違いはカウンター項により除去され、異常項を求める種々の方法の整合性を明らかにした。木村はまた速度位相空間及び相空間におけるゲージ場のゲージ変換の生成演算子を求める一般的な定式化の方法を開発した。両空間における生成演子の間の関係をHamiltonヴェクトルの助けによって明らかにした。藤川はゲージ場及び重力場におけるカイラル異常項を計算するSchwingerの固有時の方法と一次元超対称径路積分の方法との間の関係を調べた。この際に用いた修正一次元径路積分の方法がカイラル異常項を求める最も簡単な方法であることを示した。また、Schwinger項と呼ばれる異常項の現れる機構を系統的に調べた。この際、BRS対称性から生ずるSlavnov-Taylon恒等式が中心的な役割を果すことを示し、この恒等式から直接ヴィラソロ代数を導いた。久保は径路積分の測度が、時間変数の変換によって如何に変るかを調べ、径路積分の評価に有効な公式を見つけた。以上は、論文として発表した。ゲージ場の一種である重力場は、その異常項等を通じ、最近の超弦理論や宇宙初期の問題と深い係りを持ち重要な研究対象になって来た。一般研究(C)

「初期宇宙と銀河形成」(課題番号61540185、代表者冨田憲二)と共同で、本研究所に於て、昭和62年1月26日から28日迄の3日間、「重力理論と初期宇宙」という研究会を開催した。東京大学,名古屋大学,京都大学,大阪大学等から20名程度集まり、活発な討論が行われた。
大規模離散事象システムの階層型状態フィードバック制御とそのFMSへの応用

本研究により以下の成果が得られた.1.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象システムに対して,事象と状態の部分観測列に基づく分散ス-パバイザ制御が可能であるための必要十分条件を明らかにした.2.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象システムに対して,不可観測事象が存在する場合にも適用できるような,事象と状態の部分観測列に基づくス-パバイザを提案し,そのス-パバイザが存在するための必要十分条件を明らかにした.3.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象シテムに対して,コマンドを出すことによってシステムを制御するようなコマンド型ス-パバイザが部分観測のもとで存在するための必要十分条件を明らかにした.4.制御仕様が述語で与えられるような無限状態をもつ離散事象システムにおいて,状態フィードバックが存在するような最大部分述語を求めるアルゴリズムを束理論の観点から与えた.5.制御仕様が述語で与えられるような離散事象システムに対して,部分観測のもとでの状態フィードバックが存在するようなすべての部分述語を特徴づけた.さらにそれらの部分述語が極大・最大部分述語であるための十分条件を明らかにした.6.ペトリネットでモデル化された離散事象システムにおいて,複数の述語の交わりで与えられる制御仕様に対する最大許容フィードバックの部分観測のもとでのモジュラ設計が可能であるための必要十分条件を明らかにした.本研究により以下の成果が得られた.1.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象システムに対して,事象と状態の部分観測列に基づく分散ス-パバイザ制御が可能であるための必要十分条件を明らかにした.2.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象システムに対して,不可観測事象が存在する場合にも適用できるような,事象と状態の部分観測列に基づくス-パバイザを提案し,そのス-パバイザが存在するための必要十分条件を明らかにした.3.制御仕様が形式言語で与えられるような離散事象シテムに対して,コマンドを出すことによってシステムを制御するようなコマンド型ス-パバイザが部分観測のもとで存在するための必要十分条件を明らかにした.4.制御仕様が述語で与えられるような無限状態をもつ離散事象システムにおいて,状態フィードバックが存在するような最大部分述語を求めるアルゴリズムを束理論の観点から与えた.5.制御仕様が述語で与えられるような離散事象システムに対して,部分観測のもとでの状態フィードバックが存在するようなすべての部分述語を特徴づけた.さらにそれらの部分述語が極大・最大部分述語であるための十分条件を明らかにした.6.ペトリネットでモデル化された離散事象システムにおいて,複数の述語の交わりで与えられる制御仕様に対する最大許容フィードバックの部分観測のもとでのモジュラ設計が可能であるための必要十分条件を明らかにした.
幼児の体格・運動能力の年代変化　ー愛知県における50年間の調査からー

これまでの40年間にわたる幼児の体力・運動能力、身体活動、遊び内容、生活習慣調査に引き続き、2019年にも同様の項目について愛知県を中心に測定・調査し、20世紀後半から21世紀にかけての半世紀(50年間)にわたる幼児の身体発達の変容を把握し、21世紀の幼児教育・保育の課題を探索するとともに、保護者の子育て支援に必要な知見を得て、有用な情報として発信・提供できるよう検証することを目的とする。また、幼児期における成熟度の早期化現象から、児童・青少年の体力・運動能力における年次推移傾向との違いを検討し、幼児の体力・運動能力の独自の年次変化傾向についてwavelet補間法を用いて検証する。
ジョセフソンプラズマ共鳴現象を用いたテラヘルツレーザー開発のための基礎研究

今年度は高強度なTHz電磁波放射源開発のため以下の研究を行った。(1)フォトミキシング技術の確立高温超伝導体のJPRを利用したコヒーレントなTHzレーザー光源の開発のため、フォトミキシング技術を確立した。現在は半導体の光スイッチを用いた基礎研究段階であるが、100GHz程度の電磁波放射およびジョセフソンアレイ素子を用いた検出に成功している。今後、この技術を高温超伝導体光スイッチへ応用していく。(2)高強度THz電磁波放射源開発のための基礎研究高温超伝導材料およびホールキャリア濃度の違いによる電磁波放射特性の違いについて検討するため、THz電磁波パルスの透過特性、遮蔽特性、放射特性について様々な試料について検討した。その結果、高温超伝導体では、キャリア濃度や材料の違いに依存して、高周波で応答できるキャリアの数が異なっており、一般に、アンダードープ領域になるつれ、またYBCO→TBCCO→BSCCOとなるにつれ高周波応答できるキャリアの数が極端に減少してくることが判明した。これは、試料の次元性に強く依存したもので、二次元性の非常に強いBSCCOでは、CuO_2面間の超伝導的結合が弱く、このためJPR周波数も100GHz程度と低くなること、また、この面間で高周波の超伝導キャリアが誘起できない結果をもたらしている。また、その結果として、非常に大きなTHz電磁波の透過率をもたらし、さちにフェムト秒レーザー照射によって発生するTHz電磁波の帯域も極端に狭くなることが判明した。また、このことがJPR周波数とカットオフ周波数の関係を与えていることも判明した。(3)磁気光学顕微鏡を用いた磁束量子状態の直接観察JPRによるTHz電磁波放射は、外部磁場を印加した状態でフェムト秒レーザーを照射することにより生じる。現在は永久磁石を用いて外部磁場を印加しているが、磁場印加用超伝導コイルを電磁波放射デバイスと同じ基板上に配置した一体型の素子を構築することにより、発信周波数の電気信号制御が可能なコンパクトな放射素子を構築することができる。この構築を目指して、実際のTHz電磁波放射デバイス中の磁束量子分布を直接観察可能な高感度、高分解能な磁気光学顕微鏡の構築を行った。現在までに、高温超伝導体中の磁束量子分布状態や、微細加工した高温超伝導ストリップラインに電流を流したときに発生する磁界の観測などに成功している。以上、今後継続し追求すべき課題もあるが、高効率なコヒーレントテラヘルツ放射源の開発に向けた基礎研究は、この2年間にわたる研究を通して大幅に進展しており、今後のさらなる発展が期待される。外磁場印加状態でアンダードープTl_2Ba_2CaCu_20_8(TBCCO)にフェムト秒レーザーを照射することにより共鳴的なテラヘルツ(THz)電磁波の放射が生じる。この現象は、フェムト秒レーザー照射により超伝導体試料中に取り込まれたボルテックス周辺の周回電流に超高速変調が生じ、これに呼応してボルテックスの共鳴的な振動(ジョセフソンプラズマ:JPR)が生じるためと理解している。本年度は、共鳴THz電磁波発信材料の探索を行うため、オーバードープのTBCCO薄膜試料を用いた電磁波放射測定、および新たな高温超伝導材料としてキャリア数を制御したYBa_2Cu_3O_<7-d>(YBCO)薄膜を用いた電磁波放射特性の観測を行った。オーバードープTBCCOを用いた結果として、アンダードープ同様JPR現象に基づく共鳴THz電磁波放射が観測されるものの、キャリアのスクリーニング効果が強く働くため、放射される電磁波の強度がかなり弱く時間領域波形の時間微分においてようやく認められる程度の振動波形が観測された。このTBCCOの結果をもとに現在他の酸化物高温超伝導体としてYBCOに関する研究を進めている。今年度はアンダードープの試料を再現性よく作成するための還元アニール炉の構築を行った。これを用いて作成したアンダードープYBCO薄膜(膜厚200nm、T_c=47K)で同様の測定を行ったところ、TBCCO同様JPR励起に伴う共鳴的な電磁波放射が生じることが判明した。今後このYBCOにおいてキャリア数を系統的に制御し高効率電磁波放射のための条件探索を行うとともに、フォトミキシング技術を利用したCWTHz波発信を試みる予定である。この他、本年度はJPR現象と密接に関係するボルテックス状態を直接観察するため、ファラデー効果を利用した磁気光学顕微鏡を構築した。これを用いて高温超伝導体試料中の磁束分布観察に成功している。

これは、試料の次元性に強く依存したもので、二次元性の非常に強いBSCCOでは、CuO_2面間の超伝導的結合が弱く、このためJPR周波数も100GHz程度と低くなること、また、この面間で高周波の超伝導キャリアが誘起できない結果をもたらしている。また、その結果として、非常に大きなTHz電磁波の透過率をもたらし、さちにフェムト秒レーザー照射によって発生するTHz電磁波の帯域も極端に狭くなることが判明した。また、このことがJPR周波数とカットオフ周波数の関係を与えていることも判明した。(3)磁気光学顕微鏡を用いた磁束量子状態の直接観察JPRによるTHz電磁波放射は、外部磁場を印加した状態でフェムト秒レーザーを照射することにより生じる。現在は永久磁石を用いて外部磁場を印加しているが、磁場印加用超伝導コイルを電磁波放射デバイスと同じ基板上に配置した一体型の素子を構築することにより、発信周波数の電気信号制御が可能なコンパクトな放射素子を構築することができる。この構築を目指して、実際のTHz電磁波放射デバイス中の磁束量子分布を直接観察可能な高感度、高分解能な磁気光学顕微鏡の構築を行った。現在までに、高温超伝導体中の磁束量子分布状態や、微細加工した高温超伝導ストリップラインに電流を流したときに発生する磁界の観測などに成功している。以上、今後継続し追求すべき課題もあるが、高効率なコヒーレントテラヘルツ放射源の開発に向けた基礎研究は、この2年間にわたる研究を通して大幅に進展しており、今後のさらなる発展が期待される。
炭素繊維強化複合材料用新規熱硬化性マトリックス樹脂の創製およびその分子設計

本年は、目的を達成するための基礎研究として、硬化剤としてフェニルエチニルカルボニル基を有する酸無水物を用いたビスフェノールA型エポキシ樹脂の硬化反応および硬化物の特性についてまず検討した。その結果、酸無水物とエポキシ基が100120°C付近で先に反応が進行し、その後300°C前後でフェニルエチニルカルボニル基同士の反応が進行することがわかった。すなわち、DSC測定の結果から、100°C付近に酸無水物とエポキシ基の反応に由来する発熱ピークが観測された。また、300°C付近にはフェニルエチニルカルボニル基の重合反応に由来する発熱ピークが観測された。本来、フェニルエチニル基の重合反応は、およそ200°C近辺で進行するが、300°Cという非常に高温側に発熱ピークが観測された。これは、エポキシ樹脂との配合系においては、まずエポキシ基と酸無水物基との反応が先に進行するため、フェニルエチニルカルボニル基の分子運動が妨げられることに起因していると考えられる。ただし、フェニルエチニル基の発熱ピーク温度である350ー370°C比べ、そのピーク温度は約50°C程度低下させることができることが明らかになった。硬化物の特性を検討した結果、フェニルエチニルカルボニル基を有する酸無水物で硬化したエポキシ樹脂は非常に優れた耐熱性および耐熱分解性を示すことがわかった。これらの優れた熱的性質は、フェニルエチニルカルボニル基の重合により生成するアルケンや多環芳香族構造により、分子間相互作用が強くなること(分子パッキング)、および分子鎖の動きが抑制されることによるものと考えられる。しかしながら、硬化温度が300°C付近のものは加熱により主鎖が熱分解で結合が切断され、耐熱性をはじめとして強度などが低下する傾向にあった。目標とした内容(樹脂組成物の硬化性や成形性、および硬化物の構造解析とその特性を評価すること)、以上の内容を達成できている。末端にフェニルエチニルカルボニル基、分子内にイミド基を2個有する新しい熱硬化性イミド化合物を合成する。得られる新規熱硬化性イミド化合物を架橋剤として用いたエポキシ樹脂の硬化挙動(反応性)について検討する。新規熱硬化性イミド化合物をエポキシ樹脂の架橋剤として用いるため、まずPETAをエポキシ樹脂と反応させる。それと同時に、新規熱硬化性イミド化合物も合わせて系中に配合し、フェニルエチニルカルボニル基の重合によるエポキシ樹脂の架橋を行う。得られる樹脂組成物の硬化挙動を明らかにし、さらにフェニルエチニルカルボニル基の重合挙動およびその硬化物の構造・特性を明らかにする。難燃性評価装置を購入する予定である。
ペプチドを選択的に化学変換する金属触媒系の構築

本研究は、ペプチドおよびタンパク質を科学的な方法で選択的に変換する触媒系を開発することを目的とし、以下の2種類の反応について検討した。(1)グリシンが多核金属錯体によって強力に活性化され、アルデヒドと穏和な条件下で反応する。これによってペプチド中のアミノ酸残基の化学変換ができる。・一般的にオリゴペプチドについてこの反応が進行することを示した。また、N末端のグリシン残基のみが選択的に化学変換されることを明らかにした。・二核および三核銅中心分子がこの反応を効率的に促進し、初めて触媒的に反応を進行させることを見い出した。・三核銅中心分子を用いて長時間反応させると脱アミノ化を伴うアミノ酸残基の分解反応も進行することが明らかとなった。この三核銅中心分子は酸化触媒としても有用であり、例えば過酸化水素存在下でシクロヘキセンを酸素化することができた。(2)アミノ酸残基側鎖の水酸基と亜鉛(II)の協同触媒効果により、中性条件下でペプチドを配列特異的に加水分解切断できる。・オリゴペプチドについて、この反応によって配列特異的切断ができることを示した。また、適当なアミノ酸残基(His)を近傍に配置することで金属イオンの結合を強めれば、加水分解切断を、より効率的に行えることを明らかにした。さらに、速度論的検討を行い、反応機構の詳細を明らかにした。・ペプチド側鎖にアルキル基が存在する場合、立体障害として加水分解反応速度を低下させる効果と、逆に反応速度を増大させる効果が見られることを明らかにした。β位で分枝しないアルキル側鎖をもつペプチド(Leu-Ser等)は側差をもたないGly-Serに比べてより効率的に加水分解できることが明らかとなった本研究は、ペプチドおよびタンパク質を科学的な方法で選択的に変換する触媒系を開発することを目的とし、以下の2種類の反応について検討した。β位で分枝しないアルキル側鎖をもつペプチド(Leu-Ser等)は側差をもたないGly-Serに比べてより効率的に加水分解できることが明らかとなった本研究は、ペプチドおよびタンパク質を化学的な方法で選択的に変換する触媒系を開発し、タンパク質の機能を制御あるいは変換するための手法を新たに確立することを目的とする。申請者らが最近見い出している次の2種類の反応について検討を進めた。(1)グリシンのα位が多核金属錯体によって強力に活性化され、アルデヒドと穏和な条件下で反応する。これによってペプチド中のアミノ酸残基の変換が期待できる。・各種ペプチドについて検討しグリシンの24量体について反応が進行することを明らかにした。また、この際、N-末端のグリシン残基のみが選択的にセリンまたはスレオニンに変換されることを明らかにした。・各種アルデヒドによる、グリシン残基の選択的変換が可能となった。・反応中間体を明らかにし、多核金属中心によるアミノ酸の活性化について重要な知見を得た。・新な多核金属錯体系を合成し検討した。特に鉄(III)と亜鉛(II)を1個づつ有する異核2核中心は加水分解触媒としてユニークな特製を示すことが明らかとなった。・オリゴペプチドの加水分解を検討した。トリペプチドGly-Ser-Glyにおいて、Gly-Ser結合のみが選択的に切断することを明らかにした。しかし、ペプチド鎖が長くなるに従い、反応の効率が次第に低下した。そこで、金属イオンとの相互作用が期待できる側鎖をもつアミノ酸残基をGly-Serに隣接させて配置させたところ、加水分解切断が可能となった。また、速度論的検討を行い、反応機構の詳細を明らかにした。・蛋白質の加水分解切断への応用を試みた。蛋白質の場合には重金属の存在により不溶性の会合体を生じやすく、これが反応の障害になることが明らかとなった。この問題は、適切な金属錯体の設計、および、各種の塩を添加することで解決可能と考えられる。

これについては次年度も引き続き検討する予定である。本研究は、ペプチドおよびタンパク質を化学的な方法で選択的に変換する触媒系を開発することを目的とし、以下の2種類の反応について検討した。(1)グリシンが多核金属錯体によって強力に活性化され、アルデヒドと穏和な条件下で反応する。これによってペプチド中のアミノ酸残基の化学変換ができる。・一般的にオリゴペプチドについてこの反応が進行することを示した。また、N末端のグリシン残基のみが選択的に化学変換されることを明らかにした。・二核および三核銅中心分子がこの反応を効率的に促進し、初めて触媒的に反応を進行させることを見い出した。・三核銅中心分子を用いて長時間反応させると脱アミノ化を伴うアミノ酸残基の分解反応も進行することが明らかとなった。この三核銅中心分子は酸化触媒としても有用であり、例えば過酸化水素存在下でシクロヘキセンを酸素化することができた。(2)アミノ酸残基側鎖の水酸基と亜鉛(II)の協同触媒効果により、中性条件下でペプチドを配列特異的に加水分解切断できる。・オリゴペプチドについて、この反応によって配列特異的切断ができることを示した。また、適当なアミノ酸残基(His)を近傍に配置することで金属イオンの結合を強めれば、加水分解切断を、より効率的に行えることを明らかにした。さらに、速度論的検討を行い、反応機構の詳細を明らかにした・ペプチド側鎖にアルキル基が存在する場合、立体障害として加水分解反応速度を低下させる効果と、逆に反応速度を増大させる効果が見られることを明らかにした。β位で分枝しないアルキル側鎖をもつペプチド(Leu-Ser等)は側差をもたないGly-Serに比べてより効率的に加水分解できることが明らかとなった。
間葉系組織構築を制御する増殖分化因子群

我々は典型的な無血管組織である軟骨から組織特異的に発現する血管新生抑制因子を発見し、Chondromodulin-I(ChM-I)と命名した。ChM-Iは、膜型前駆体からプロセシングされる分泌性糖タンパク質(121アミノ酸残基)で、血管新生を抑制する。組換えヒトChM-Iの局所投与は、in vivo固形腫瘍モデルにおける腫瘍血管新生を抑制した。最近、ChM-1に相同性を有する新規遺伝子として、Tenomodulin(TeM)を同定した。TeMは、腱、靭帯などの血管に乏しい強靱結合組織に特異的に発現していた。そこで、成熟型ChM-IとヒトTeMのC末端領域を発現分泌するアデノウイルスベクターを構築し、血管新生抑制作用を確認するとともに、in vivoにおける抗腫瘍活性を明らかにした。また、今回、Multiple Endocrine Neoplasia type 2(MEN 2B) Medullary Thyroid Carcinoma (MTC)に特徴的な高発現する遺伝子の一つとしてChM-Iを同定することに成功した。甲状腺C細胞におけるChM-Iの発現亢進がMEN 2B患者にみられるMarfan症候群様の骨格異常に寄与している可能性が示された。既にChM-Iノックアウトマウスで骨リモデリングの低下が認められている事実とあわせて、今後、骨・軟骨代謝におけるChM-Iのin vivo作用の詳細な解明が注目される。一方、リウマチ関節炎は関節軟骨部における血管新生のみならず病的な免疫応答による軟骨破壊を伴う。そこで、マウスに作成したリウマチ関節炎モデルを用いて、組換えChM-Iの作用を検討した。その結果、血管新生の抑制に加えて、新たにChM-IがCD4T細胞に作用して抗原特異的免疫応答を抑制すること、また、滑膜細胞の増殖を抑制することが判明した。ChM-I遺伝子の軟骨分化特異的な転写制御を解析するために、ヒトChM-I遺伝子を単離した。まず、pWEX15コスミドベクターを用いてヒトgenomic libraryを構築した。次に、ヒトChM-I cDNAをプローブにしてスクリーニングを行い、2個のコスミドクローンを得た。解析の結果、ヒトChM-Iは7個のエクソンからなる約40kbにわたる遺伝子であることが明らかとなった。TATAボックスは認められなかったが、プライマーエクステンションにより、翻訳開始ATGコドンの上流130bpに存在するT残基が転写開始点であると示唆された。また、FISH法によりChM-I遺伝子座を検索した結果、13q14-21の領域にマップされることが明らかになった。次に、ChM-I遺伝子の5-flanking領域をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子)に接続して、そのプロモーター活性をCOS7細胞、HeLa細胞、ATDC5細胞において検討した。その結果、転写開始点から約500bp上流までの領域に、プロモーター活性を検出した。この領域をGFPに接続してATDC5にトランスフェクトすると、未分化細胞からの軟骨分化に依存した遺伝子発現を示すことが判明した。一方、ATDC5によるin vitro多段階軟骨分化モデルを用いた解析では、1)軟骨分化過程におけるBMPリガンドと受容体の発現パターン、2)ドミナントネガティブなBMP type IA受容体(DN-BMPR-IA)の発現によって、内因性のBMP-4シグナルを遮断すると軟骨分化が抑制されること、3)幹細胞の旺盛な自己複製能を支持するFGFとその受容体(FGFR)の軟骨分化過程における発現パターン、4)新規にクローニングしたFGFR3 isoform(acid-box欠損型FGFR3)の反応特性を明らかにした。間葉は豊富な細胞外マトリックスを伴い、そこから筋・骨その他の結合組織が作られる。脈管系もまた、間葉から生じる。周囲の結合織が豊富な血管網を有するのに対して、軟骨は無血管で、新たな血管侵入に強い抵抗性を示す。このような「血管侵入抵抗性」は、間葉と間葉、あるいは上皮と間葉間に成立する組織間相互作用のひとつであると考えられる。本年度は、軟骨以外の組織にもこのような相互作用が働くとされる組織におけるChondromodulin-I(ChM-I)の発現動態について詳細に検討した。その結果、唾液腺多形腺腫では、侵入血管を認めない領域特異的にChM-Iの発現を認めた。一方、眼も典型的な無血管組織で、脈絡膜を除いて強い血管抵抗性を示す。in situ hybridization法や免疫組織化学を駆使して、ラット眼におけるChM-Iの発現を詳細に検討した。その結果、眼房水を産生する毛様体に強い発現を認めた他、網膜色素上皮などでの発現を明らかにした。同時に組換えヒトChM-Iがヒト網膜内皮細胞の管腔形成反応を阻害する事を明らかにした。このような血管侵入抵抗性は、発生初期にも重要な役割をすると考えられる。そこで、ゼブラフィッシュChM-Iのクローニングに成功し、ChM-I mRNAが母性mRNAとして卵母細胞に既に存在すること、脊索で最初のzygoticな発現が認められることを明らかにした。このような生理的な血管侵入抵抗性を支える分子としてChM-Iが眼を含む非軟骨組織においても機能している可能性が示唆された。また、ChM-IのC-末端領域に相同性を有する新規遺伝子をクローニングすることに成功し、これにコードされる新規の膜蛋白質をTenomodulin(TeM)と命名した。TeM遺伝子の発見は、生体内における血管侵入抵抗性の分子基盤が解明される新たな契機となるものとして期待される。

我々は軟骨特異的血管新生抑制因子Chondromodulin-1(ChM-1)を見いだした。本年度は、ChM-1遺伝子欠損(ChM-1 KO)マウスの作出を行い、その表現形を解析した。その結果、胎生期に器官形成等にはChM-1遺伝子欠損の影響を認めなかったが、生後12週齢では明らかな骨密度の増加が認められた。この骨密度増加の現象を詳細に解析した。すると、単位骨量(BV/TV)はKOマウスでは野生型の約2.5倍であり、骨芽細胞面と破骨細胞面ではともにKOマウスにおいて顕著な減少(それぞれ、60%,33%)が認められた。石灰化速度および吸収面もまた顕著な減少(それぞれ、37%,64%)が認められた。従って、KOマウスでは骨形成・骨吸収の双方が低下していることが分かった。骨吸収の低下の度合いが骨形成速度低下を上回ることにより骨密度増加に至ることが分かった。従って、ChM-Telに骨リモデリングファクターとしての新しい生理機能があることが明らかになった。一方、ChM-1の生物活性領域に相同性を持つ新規遺伝子Tenomodulin(TeM)を見いだした。血管新生抑制機構が発達している眼組織における発現パターンを詳細に解析した。その結果、TeMは外眼筋に連なる腱・強膜・角膜・レンズの他、網膜では神経節細胞層、内顆粒細胞層、色素上皮細胞に発現することが明らかとなった。ChM-1は腱・強膜・角膜・レンズに発現を認めないが、網膜においてはTeMとChM-1のいずれもが発現していた。さらに、アデノウイルスベクターを用いてTeMのC-末端領域を網膜血管内皮細胞に発現させてその血管新生抑制活性を確認することに成功した。間葉系組織における血管侵入障壁を組織特異的血管新生抑制因子の面から解析し、生理的な血管新生抑制因子の抗腫瘍血管阻害剤としての基盤開発を行う。本年度は、以下の成果を得た。川本法により非脱灰切片を作成後、非脱灰切片上でChM-Iのタンパクと遺伝子の発現局在について詳細な解析を行うことが可能になった。216週齢のラット脛骨・大腿骨を用いた解析から、生後の骨端成長板では、胎生期と同様に後期肥大化・石灰化軟骨層でChM-I mRNAの発現が消失しているものの、ChM-Iタンパクが検出されることが判明した。一方、軟骨形成期に先立つマウス胚発生初期においては、母性由来細胞である脱落膜が新たな発現部位であることを見出した。2)TeM遺伝子の機能的発現と解析ヒトTeMのChM-I様ドメインを含むC端側116アミノ酸領域を分泌タンパクとして発現するアデノウイルス(Ad-shTeM)を作製した。同様に、成熟型ChM-Iに相当する120アミノ酸残基を発現分泌するアデノウイルス(Ad-shChM-I)を作製した。293細胞に導入してアデノウイルス粒子を調製し、HUVECに感染させたところ、Ad-shTeMとAd-hChM-Iは、細胞増殖だけでなく管腔形成を著明に抑制した。また、VEGF応答性のHUVECの遊走をも著明に抑制することが明らかになった。
液液界面における相間移動触媒の輸送機構の理論

液液界面のイオン輸送においてはリガンド種とcomplex形成をすることで輸送を促進することがあり、それはfacilitated ion transferと呼ばれてセンサーや相間移動触媒など多くの応用例がある。ただし、バルク相中でcomplexの形成がみられないようなごく微量のリガンドを加えたときでも、イオンの界面輸送速度が劇的に向上することがあることが電気化学的な輸送速度測定の実験から知られ、液液界面においてのみ一時的にcomplexが生じて界面輸送を触媒的に促進する場合がありえることが示唆されていた。本研究では、その界面での触媒的な輸送促進機構の分子論的な実体を、分子シミュレーションに基づく多次元自由エネルギー面の計算によって解明した。さらに輸送されるイオン種やリガンドの種類によって、界面輸送においてそのような触媒作用を示す場合と示さない場合の区別が生じる理由も解明した。たとえば水-有機溶媒界面でのフッ素イオンの輸送において、テトラブチルアンモニウムイオンは触媒機能を示さないが、テトラヘキシルアンモニウムイオンではごく微量でも触媒機能を示すことが実験で報告されているが、本研究はその違いも説明した。輸送されるイオン種やリガンドの違いによって、多次元自由エネルギー面上の最適反応経路が切り替えられるメカニズムも明らかにした。これは従来からのfacilitated ion transferの概念を拡張し、界面での一時的な触媒機能が一般にありえることを解明する成果を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。液液界面でのイオン輸送を制御する相間移動触媒の機能を、従来の現象論的な速度論や計算化学を超えた新たな視点で解明する。界面の構造とゆらぎが果たす大きな影響をあらわに取り入れて、相間移動触媒の効果を分子レベルで捉える理論を開発し、分子動力学計算で実証する。さらにメソスケールの拡散二重層と界面のミクロな構造を同時に扱うマルチスケールの方程式を解いて、輸送自由エネルギーの全貌を明らかにする。初年度にはこれまでに界面のミクロな構造を特徴づける界面ゆらぎを適切に表す座標の理論を確立し、今後の自由エネルギー計算への道を拓いた。界面の構造とゆらぎが果たす大きな影響をあわらに取り入れて、相間移動触媒の効果を分子レベルで捉える理論を開発し、分子動力学計算で実証する。イオンが水相から油相に移動する直後には、水和水を引き連れてwater fingerと呼ばれる特徴的な構造をとることが知られているが、本年度ではその構造の形成・切断の遷移がイオンの輸送自由エネルギーの形状を決める要因となっていることを明らかに示すことができた。前年度にイオン移動に伴う界面構造の特徴的なゆらぎであるwater finger構造を適切に表現できる新たな座標wを水素結合ネットワークの解析をもとに開発し、それに基づいてイオン輸送の自由エネルギー面をイオンの位置座標zとwater finger座標wの2次元面上で計算することができた。これは液液界面の電気分析化学においても新たな知見であり、当初の研究目的を具体化することができた。液液界面でのイオン輸送を制御する相間移動触媒の機能を、従来の現象論的な速度論や計算化学を超えた新たな視点で解明した。液液界面をイオンが通過する際には、油相中に入ったイオンが水和水を引き連れてwater finger構造を作ることが従来から計算化学的に知られていたが、その機能に対する意味を分子レベルで示された例はなかった。本研究では、water finger構造の形成と切断を表す座標を導入してその座標上での自由エネルギー面を計算化学的に求めることに成功し、その構造遷移に伴って自由エネルギー障壁が存在することを明らかとした。これは、液液界面のイオン移動速度が拡散律速よりも数桁遅くなる理由となることを解明した。water finger形成・切断を示す座標を定義するうえで、界面水の水素結合ネットワークの連結性をグラフ理論に基づいて簡便に与えることができることを示した。water finger形成・切断に伴うダイナミックスを解明するため、その自由エネルギー面上のランダム力や摩擦係数を分子シミュレーションから求め、その摩擦係数の振る舞いには界面での異常性が存在しないことも示した。界面イオン輸送は、界面近傍で拡散係数に異常性が現れるのではなく、従来知られていなかった自由エネルギー障壁によって遅くなることを示した。油相中に移動したイオンのwater fingerが切れた直後の水和水の状況を示し、バルク中での水和クラスターの分布よりも水和水を過剰に伴っていることも明らかとした。本研究で目標として掲げたように、イオン輸送を制御する界面ゆらぎの効果を定量的かつ明確な描像として示すことに成功した。water finger座標の定式化は、今後の液液界面での物質輸送にとって大きな意味をもった成果である。その成果に基づいて、イオン輸送のダイナミックスについても分子レベルの実体を明らかにしつつあり、さらに今後の方針に示すような水和の効果、イオンペア形成に伴うfacilitated ion transferのメカニズムについても研究が進展している。

液液界面をイオンが通過する際には、油相中に入ったイオンが水和水を引き連れてwater finger構造を作ることが従来から計算化学的に知られていたが、その機能に対する意味を分子レベルで示された例はなかった。本研究では、water finger構造の形成と切断を表す座標を導入してその座標上での自由エネルギー面を計算化学的に求めることに成功し、その構造遷移に伴って自由エネルギー障壁が存在することを明らかとした。これは、液液界面のイオン移動速度が拡散律速よりも数桁遅くなる理由となることを解明した。water finger形成・切断を示す座標を定義するうえで、界面水の水素結合ネットワークの連結性をグラフ理論に基づいて簡便に与えることができることを示した。water finger形成・切断に伴うダイナミックスを解明するため、その自由エネルギー面上のランダム力や摩擦係数を分子シミュレーションから求め、その摩擦係数の振る舞いには界面での異常性が存在しないことも示した。界面イオン輸送は、界面近傍で拡散係数に異常性が現れるのではなく、従来知られていなかった自由エネルギー障壁によって遅くなることを示した。油相中に移動したイオンのwater fingerが切れた直後の水和水の状況を示し、バルク中での水和クラスターの分布よりも水和水を過剰に伴っていることも明らかとした。本研究で目標として掲げたように、イオン輸送を制御する界面ゆらぎの効果を定量的かつ明確な描像として示すことに成功した。water finger座標の定式化は、今後の液液界面で>の物質輸送にとって大きな意味をもった成果である。その成果に基づいて、イオン輸送のダイナミックスについても分子レベルの実体を明らかにしつつあり、さらに今後の方針に示すような水和の効果、イオンペア形成に伴うfacilitated ion transferのメカニズムについても研究が進展している。前年度には、有機相中におけるイオン水和の分布および吸着・脱離レートについて計算化学による微視的な描像を明らかにする成果を報告した。液液界面のイオン輸送においてはリガンド種とcomplex形成をすることで輸送を促進することがあり、それはfacilitated ion transferと呼ばれてセンサーや相間移動触媒など多くの応用例がある。ただし、バルク相中でcomplexの形成がみられないようなごく微量のリガンドを加えたときでも、イオンの界面輸送速度が劇的に向上することがあることが電気化学的な輸送速度測定の実験から知られ、液液界面においてのみ一時的にcomplexが生じて界面輸送を触媒的に促進する場合がありえることが示唆されていた。本研究では、その界面での触媒的な輸送促進機構の分子論的な実体を、分子シミュレーションに基づく多次元自由エネルギー面の計算によって解明した。さらに輸送されるイオン種やリガンドの種類によって、界面輸送においてそのような触媒作用を示す場合と示さない場合の区別が生じる理由も解明した。たとえば水-有機溶媒界面でのフッ素イオンの輸送において、テトラブチルアンモニウムイオンは触媒機能を示さないが、テトラヘキシルアンモニウムイオンではごく微量でも触媒機能を示すことが実験で報告されているが、本研究はその違いも説明した。
胎盤における一酸化窒素産生制御とニトロシル化タンパク質の関与

ラット胎盤における血管内皮細胞増殖因子(VEGF)発現に及ぼすNOの影響を検討した。NOS阻害剤L-NAME投与後のNO産生を解析した。NO産生はL-NAMEにより対照群の約15%に減少した。VEGF発現はNOS阻害6時間では減少し、24時間では回復した。また、低酸素誘導因子(HIF)-1αと誘導型NOSの発現は増加した。組織片培養ではiNOS誘導剤であるリポ多糖により増加したVEGF発現はL-NAMEとの併用により減少した。これらの結果は、in vivoとin vitroでNOはVEGF発現を誘導し、NO産生はHIF-1aを介したVEGFとの相互作用により維持されている可能性を示唆した。代表者らは胎盤における一酸化窒素(NO)産生をスピントラップ・電子常磁性共鳴吸収(EPR)法により解析し、同時にNO合成酵素(NOS)の発現調節を検討してきた。生体におけるNO産生の解析が困難なこともあり、胎盤におけるNO産生の調節とその役割については不明な点が残されている。本年度は、ラット胎盤におけるNO産生の役割を検討する一環として、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)発現に及ぼすNOの影響を検討し、さらにタンパク質のS-ニトロシル化が関与しているか検討した。NOS阻害剤NG-nitro-L-arginine-methyl ester(L-NAME)を妊娠15日のラットに持続注入し、スピントラップ・EPR法によりNO産生量を経時的に解析した。L-NAMEの持続注入により、NO産生量は対照群より約85%減少していた。さらに、VEGF発現はNOS阻害6時間後には有意に減少したが、24時間後には回復していた。一方、低酸素誘導因子(HIF)-1αと誘導型NOSの発現は24時間後には有意に増加した。また、胎盤組織におけるタンパク質のS-ニトロシル化と核内移行、核分画と細胞質分画から抽出したタンパク質量に変化が観察され、検討中である。胎盤組織片培養においてリポ多糖(LPS)でiNOS発現を誘導すると、VEGF発現は増加傾向を示した。さらに、LPSとL -NAMEの併用によりVEGF発現は有意に減少したことから、in vitroにおいてもNOがVEGF発現を促進していることが示された。以上の結果は、in vivoとin vitroにおいてNOがVEGF発現を誘導し、ラット胎盤におけるこの時期のNO産生はHIF-1を介したNOとVEGFの相互作用により維持されていることが示唆された。また、その際タンパク質のS-ニトロシル化が関与している可能性が示唆された。代表者らは子宮・胎盤における一酸化窒素(NO)産生をスピントラップ・電子常磁性共鳴吸収(EPR)法により解析し、同時にNO合成酵素(NOS)の発現調節を検討してきた。ラット胎盤におけるNO産生を検討する一環として、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)発現に及ぼすNOの影響を検討し、さらにタンパク質のS-ニトロシル化が関与しているか検討した。一方、低酸素誘導因子(HIF)-1αと誘導型NOSの発現は、経時的に増加し、24時間後には有意差を示した。同じ妊娠日齢の胎盤を用いた組織片培養においてリポ多糖(LPS)でiNOS発現を誘導すると、VEGF発現は増加傾向を示した。さらに、LPSとL-NAMEの併用によりVEGF発現は有意に減少したことから、in vitroにおいてもNOがVEGF発現を促進していることが示された。研究代表者らは胎盤における一酸化窒素(NO)産生を直接解析し、同時にNO合成酵素(NOS)の発現を検討報告してきた。しかし、生体におけるNO産生の解析が困難なこともあり、NO産生の調節について不明な点が残されている。本研究では、胎盤におけるNO産生の調節にタンパク質のS-ニトロシル化が関与しているとの仮説の下に、まず、NO産生とNOS発現の全体像を把握し、その後、候補タンパク質のS-ニトロシル化の関与について、実験動物や培養細胞を用いて解析する。

平成23年度は、まず、妊娠ラットから経日的に胎盤組織を採取してNO産生とNOS発現を検討した。NO産生については、直接的な解析が可能な、本研究の特色であるスピントラップ・EPR法を用いて解析した。NOS発現についてはRT-PCRによりmRNAを検出し、さらに免疫組織化学染色により局在を検討した。妊娠13日から21日のラット胎盤を用いて検討したところ、NO産生は観察した妊娠13日から認められ、妊娠15日に産生ピークを示し、その後、妊娠末期の21日まで徐々に減少した。胎盤には神経組織が認められないことから、次に、3種類のNO合成酵素のうちiNOSとeNOSのmRNA発現について検討した。iNOSとeNOSのmRNAは妊娠13日から21日までともに認められ、eNOSmRNA発現はその期間ほぼ一定であった。一方、iNOSmRNA発現は妊娠15日に産生ピークを示すというNO産生パターンと良く一致していた。また、胎盤におけるNOSタンパク質の局在を観察したところ、血管内皮細胞及び栄養膜細胞で認められた。さらに、予備的に胎盤におけるS-ニトロシル化タンパク質をビオチンスイッチ法で検出したところ、妊娠15日と比較して、妊娠21日では減少する傾向が観察された。交付申請書に記載した平成24年度の研究計画のうち、実験動物を用いた研究実施計画は順調に進み、また、培養系での実験が順調に進み、一定の成果を得ている。一方、S-ニトロシル化タンパク質の検出は予備的に実施できているものの、その後の進展が少なく停滞気味であることから、全体としては概ね順調な研究達成度と判断した。交付申請書に記載した平成23年度の研究計画のうち、ラットを用いた研究計画においては、当初の計画どおり順調に実施できた。さらに、次年度に予定していたS-ニトロシル化タンパク質の検出が予備的に実施できたことから、予定以上に順調に進んでいる。一方、培養系実験がやや遅れ気味であることから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。昨年度までの研究成果によりラット胎盤におけるNO産生とNOS発現とその作用の一端は把握できたので、今年度は、これまでの予備的成果に基づいて、タンパク質のS-ニトロシル化について検討する。妊娠ラットから胎盤を採取し、ビオチンスイッチ法を用いて、候補タンパク質のS-ニトロシル化を検出し、定量的な評価を試みる。また、胎盤組織において、S-ニトロシル化されたタンパク質の量的変動を観察する。さらに、培養細胞あるいは、胎盤の組織片培養法により、低酸素培養下での検討も含めて、NO産生時に関与していることが予想されるタンパク質についてS-ニトロシル化を検討する。昨年度の研究成果によりラット胎盤におけるNO産生とNOS発現の全体像は把握できたので、昨年度の予備的成果に基づいて、今年度は候補タンパク質のS-ニトロシル化について検討する。妊娠ラットから胎盤を採取し、ビオチンスイッチ法を用いて、候補タンパク質のS-ニトロシル化を検出するとともに、定量的な評価を試みる。また、子宮胎盤組織において、S-ニトロシル化されたタンパク質の局在を観察する。