hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼気ガス質量分析診断法の開発と臨床応用

本研究では独自開発の呼気ガス分析システムを用いて以下のような種々の疾患病態への臨床応用を試みた.すなわち,種々の生活習慣病を含む呼吸器・循環器・内分泌代謝疾患・消化器疾患などの患者や健康成人を合わせた1011名を対象に健康調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静座位における呼気ガス質量分析を行い低分子ガスを中心とする網羅的呼気データの収集を完了した.これにより統計的に検定可能な約30種類以上の疾患について特異的な低分子ガススペクトラムを得た.この成果を用いて低分子呼気ガスの中でもキーとなる分子種を選定し,呼気スペクトラムによる鑑別診断法のソフト開発に繋げる技術開発を予定している.これにより呼気ガス質量分析法によるスクリーニング検査法の開発と集団検診への応用が実施可能となる.また,心肺運動試験における無酸素閾値に関連する特異的な分子の質量数を特定することを目的に運動負荷に伴う酸素摂取量の推移と同期する微量ガス成分のm/zを呼気・皮膚ガス中に検出した.さらに,日常生活における食品摂取・喫煙・飲酒など種々の生活習慣の生体ガスに及ぼす影響を明らかにする目的で,飲酒に伴いエタノール代謝成分が呼気のみならず皮膚ガスにも出現しその詳細な動態を明らかにした.さらに特定食品成分により特異的に呼気成分が上昇することを明らかにした.さらに喫煙者や特定食品成分摂取における生体ガスの特長を明らかにした.これをもとに生活習慣の呼気に与える影響から生活習慣の推定が可能となった.本研究では独自開発の呼気ガス分析システムを用いて以下のような種々の疾患病態への臨床応用を試みた.すなわち,種々の生活習慣病を含む呼吸器・循環器・内分泌代謝疾患・消化器疾患などの患者や健康成人を合わせた1011名を対象に健康調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静座位における呼気ガス質量分析を行い低分子ガスを中心とする網羅的呼気データの収集を完了した.これにより統計的に検定可能な約30種類以上の疾患について特異的な低分子ガススペクトラムを得た.この成果を用いて低分子呼気ガスの中でもキーとなる分子種を選定し,呼気スペクトラムによる鑑別診断法のソフト開発に繋げる技術開発を予定している.これにより呼気ガス質量分析法によるスクリーニング検査法の開発と集団検診への応用が実施可能となる.また,心肺運動試験における無酸素閾値に関連する特異的な分子の質量数を特定することを目的に運動負荷に伴う酸素摂取量の推移と同期する微量ガス成分のm/zを呼気・皮膚ガス中に検出した.さらに,日常生活における食品摂取・喫煙・飲酒など種々の生活習慣の生体ガスに及ぼす影響を明らかにする目的で,飲酒に伴いエタノール代謝成分が呼気のみならず皮膚ガスにも出現しその詳細な動態を明らかにした.さらに特定食品成分により特異的に呼気成分が上昇することを明らかにした.さらに喫煙者や特定食品成分摂取における生体ガスの特長を明らかにした.これをもとに生活習慣の呼気に与える影響から生活習慣の推定が可能となった.平成16年度は呼吸回路システムを改良し,超高感度質量分析に対応した周辺技術を完成させ,次年度以降の臨床応用の基礎を作った.すなわち,1.高感度分析用呼吸回路の改良:(1)Jバルブ,(2)マウスピース用回路,(3)マスク用回路,(4)呼気水分分析の各パーツの内表面形状を確認しながら,汚染源となりうる接続部を極力減らした上で,呼吸回路システムを改良した.2.ガス濃縮装置の改良:液体窒素冷却ガス濃縮装置とGCと組み合わせ,ガス濃縮効率の向上をはかった.3.高感度分析用呼気採取バッグの開発:採取バッグを郵送・宅配により回収し呼気分析を行うことを念頭に置き,種々の採取バッグについて保管条件を検討し,最適な呼気採取バッグの選定と改良を行った.4.濃縮装置-GC-MS(APIMS)システムの完成:開発済みの液体窒素濃縮-GC-MSの仕様を改良し,種々のカラムの適合を検討し,呼気中の多種成分の検出が可能なカラムの選定と組み合わせを検討した.5.呼気分析の臨床試験:前年度までの基盤研究の実験計画を続行し,従来の呼吸回路を用いて,多数の被験者での呼気質量スペクトラムのデータを収集した.6.臨床応用:以上の各パーツの開発をもとにし,健康成人を対象に健康調査票(性,年齢,食事,居住環境,喫煙,生活習慣等),Cornel Medical Index等の質問紙調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静呼気を上述の呼気採取バッグにより採取し,濃縮装置-GC-MSならびにAPIMSを用いて質量分析を行い,両者の分析結果の差異を比較検討した.呼気ガス質量分析診断法の確立を目的とし,平成17年度は研究計画に基づき以下の検討を行った.(1)移動用携帯型超高純度人工空気吸入採取システムの開発上述の要素技術を開発後,ベッドサイドでも超高感度質量分析に対応した呼気ガス採取が可能とするため,移動用携帯型超高純度人工空気吸入採取システムの開発を行った.これと採取バッグシステムを組み合わせ,実際の超高感度分析の使用に耐えるように各パーツを検討し,試作機を製作した.平成18年度以降の臨床試験に実施可能なレベルにまで到達した.

(2)種々の生活習慣病への臨床応用:健康成人ならびに循環器疾患(動脈硬化性疾患,高血圧症,虚血性心疾患等),呼吸器疾患(慢性閉塞性肺疾患,肺癌等),内分泌代謝疾患(糖尿病,高脂血症等)や消化器疾患(胃潰瘍,胃癌,肝硬変等)などの生活習慣病患者を対象に健康調査票(性,年齢,服用薬剤,食事,居住環境,喫煙,生活習慣等),General Health Questionnaire等の質問紙調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静座位における呼気ガス質量分析を行った,これにより,平成17年度末までの被験者959名における呼気ガス質量スペクトラム,水素,メタン,一酸化炭素,一酸化窒素,酸素,二酸化炭素などの呼気成分分析結果とアンケート,血液検査などの約1000項目のマトリックスデータベースを完成させた.これらのデータベースを基にし,各m/z比におけるイオン強度と種々の因子との間の相関関係を現在,解析中である.また,別プロジェクトで開発中の超高感度分析用皮膚ガス採取システムを用いて,不感蒸泄によるガス分析も同時に実施し,呼気ガス成分との対比も行った.本年度は前年度に引き続き,開発した呼気ガス質量分析システムを用いて,成人ボランティアを対象に生体微量ガス成分の調査を行った.これらの被験者には健康人の他,呼吸器疾患,循環器疾患,内分泌代謝疾患や消化器疾患などの種々の患者が含まれていた.健康調査票(性,年齢,服用薬剤,食事,居住環境,喫煙,生活習慣等),General Health Questionnaire等の質問紙調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静座位における呼気ガス質量分析を行った.呼気と皮膚ガスに代表される生体ガスを診断目的で分析する際には内因性代謝産物のみならず喫煙や大気汚染,薬剤,食事摂取などの種々の外因性化合物を念頭に置かなければならない.本年度は特に呼気・皮膚ガスにおける低分子ガススペクトラムから喫煙者における生体微量ガス成分の特徴を検討した.解析の対象とした成人ボランティアは957名で,このうち喫煙者は166名(17%)であった.被験者は早朝空腹下で手洗い・歯磨きの後,安静座位の状態でマウスピースを介した高純度人工空気の呼吸下で,呼気・皮膚ガスの酸素(O2),二酸化炭素(CO2),水素(H2),メタン(CH4),一酸化炭素(CO),一酸化窒素(NO),窒素酸化物(NOX)濃度を測定した.O2とCO2は電気化学センサーで,H2,CH4,COはガスクロマトグラフ半導体検知法,NOとNOXは化学発光法により測定した.換気量は熱線流量計で計測し,各成分の分時排気量を算出した.早朝空腹の条件下において,喫煙者では喫煙本数に依存して呼気NOの減少と呼気COの増加が認められた.他方,呼気中のO2,CO2,H2,CH4,NO2(【approximately equal】NOX-NO)ならびに皮膚ガス中のH2,CH4,COには有意に影響しないことが明らかとなった.本年度は昨年度までの調査に引き続き,これまでに開発した呼気ガス質量分析システムを用いて以下のような種々の疾患病態への臨床応用を試みた.すなわち,種々の生活習慣病を含む呼吸器・循環器・内分泌代謝疾患・消化器疾患などの患者や健康成人を合わせた1011名を対象に健康調査や種々の臨床検査情報を得た上で,安静座位における呼気ガス質量分析を行い低分子ガスを中心とする網羅的呼気データの収集を完了した.これにより統計的に検定可能な約30種類以上の疾患について特異的な低分子ガススペクトラムを得た.これにより呼気ガス質量分析法によるスクリーニング検査法の開発と集団検診への応用が実施可能となった.また,移動用携帯型超高純度人工空気吸入採取システムを実際の施設外での使用の有用性を検証する.
臨床現場の表現療法をめぐる民俗学的・心理哲学的研究

本研究の最終年度である18年度は、研究の総括の一つとして『箱庭療法の事例と展開』のという図書の中に「人形の心理学」という論考を発表した。それは、群馬地域に根付いた人形を使った儀礼を研究した一つの成果であると共に、本年度6月に調査研究に赴いた台湾において検分調査した民間療法の一つであるタンキーの霊媒的な治療を心理科学的に研究した成果を取り入れたものである。人形という私たちの身辺にあるものが、時には依代として、また時には形代として機能し、それによって心理療法における投影的な役割を担い、人形という民俗の心理治療的な意義が生まれてくる。そのような人形の心理学を、古い民俗的なものから現代の風俗的なものまで取り上げてみることで、本研究の主たる目的であった過去と現在の接点、地域と都市の接点、心理療法と科学の接点が明らかにされていった。また9月には昨年同様にドイツ連邦共和国ミュンヘン市においてWolfgang Giegerich博士と夢の民俗学的意味と夢分析の実際についてのワークショップを開き、日本で報告されている夢の事例やヨーロッパにおける夢の分析的取り扱いについて研究し、二日間にわたって意見交換し研究成果を深めていった。そこで得られた夢と言語の問題は「文献研究の意義、あるいは魂の翻訳者の使命」に、夢の実際的体験的研究としては「教育分析体験と臨床の学び」に、夢を取り扱った心理療法の実践的指導のあり方については「南部論文へのコメント」にそれぞれ発表した。夢の心理療法的取り扱いについては、「身体への症状化の問題」や「身体感覚とイメージ」の問題との関連が今後の研究課題として残されて入るが、本研究が当初目的としていたイメージを民俗学的・心理哲学的に研究した成果は以上の1図書・3論文に十分にまとめられたと思われる。また、本研究の三年間の研究成果報告として、三年間の研究を概観できる形にまとめた報告書を作成し、その総括とした。本研究の初年度であるこの一年は、多くの時間を基礎資料の収集とその整理に費やした。まずは5月にドイツに渡航し、ゲルマン文化における表現療法に関わる民俗学的資料を収集した。さらに8月末から9月にかけてスペインに渡航し、イスラム文化からの影響を色濃く残すスペイン系のラテン文化における複合的な民俗学的資料を収集した。収集整理した資料の一部、特に臨床現場の樹木画と樹木に関する民俗学的資料に関しては、「猪股剛著・樹木と人間、無意識と意識」として『バウムの心理臨床』の中に発表した。この著作では、古代から現代に至るまでの樹木に対する私たちの民俗の変遷を、主としてドイツ民俗学の資料をもとに分析し、最終的には日本の現代における樹木と人間意識のかかわりを心理哲学的に分析研究した。特に注目される成果は、樹木に対して保全的な意識で臨んでいた人間存在の意識が、燃え上がる樹木という民俗学的イメージに至り、自然への回帰あるいは自然破壊とは別の、樹木としての自然との間主観的な関係を築きつつあることである。また国内においては、群馬大学心理教育相談室において、児童生徒および成人が治療過程で描く絵画あるいはその作成した箱庭・遊戯表現を収集した。更には、本科学研究費補助金によって雇い挙げた臨床心理士の補助の下でその映像資料をデータ化整理した。また、今回整理された資料の一部は心理臨床的および民俗学的に研究され、その成果を「群馬大学教育実践研究・臨床事例編・第一号」に「猪股剛著・メランコリーと音楽と、その弁証法」として発表した。この論文では、音楽とメランコリーの関係を身体性を媒介にして論じ、ドイツ・ベルリンのシャウビューネで上演されたザーシャ・ヴァルツの舞踏の深層心理学的分析を行いながら、音楽とメランコリーが相互に治療的関係を持つ弁証法的な動きを示すものであることを明らかにした。本研究の一年目であった平成16年度はヨーロッパ文化と日本文化を横断的に研究し、特に樹木画の表現療法の研究と、音楽的表現療法の研究を行ったが、研究の二年目となる平成17年度は、昨年度収集された基礎資料の分析研究をもとに、それを夢と夢分析を中心とした表現療法へと拡張した研究を行った。その際、夢に関しての国内資料は、群馬大学心理教育相談室での相談活動の中からクライエントの報告する夢を収集するとともに、10月には県内の湯治場である草津および四万をまわり民俗的なものを収集した。またヨーロッパ文化圏の夢の資料収集とドイツでの夢分析研究の動向を知り、本研究に生かすために、9月にはドイツ連邦共和国ミュンヘン市を訪ね、バイエルン州立図書館にある研究資料を整理分析し、ドイツ・ユング派精神分析家のWolfgang Giegerich氏と意見交換も行った。その成果は、群馬大学教育学部紀要に「不可知への心理学」として発表された。そこでは、クライエントの夢、メルヴィルのバートルビーという小説、ユングの夢、日本の小説に登場する夢などを基礎資料として、夢という表現を既知のものとして百科全書的に理解しようとするのではなく、その不可解な様態と臨床的にどのように向き合い、理解に近づきながらも不可知に留まることが、いかに治療的であるかが研究されている。また、本研究から派生したものとして、従来からの個人研究の集成である書物『心理学の時間』の出版にいたった。その原案は平成15年度に提出された学位論文にあるが、平成17年度12月の出版に際して、本研究の成果が新たなものとしてそこに盛り込まれるにいたり、本書物の持つ研究の精度を高めることに貢献している。

本研究の最終年度である18年度は、研究の総括の一つとして『箱庭療法の事例と展開』のという図書の中に「人形の心理学」という論考を発表した。それは、群馬地域に根付いた人形を使った儀礼を研究した一つの成果であると共に、本年度6月に調査研究に赴いた台湾において検分調査した民間療法の一つであるタンキーの霊媒的な治療を心理科学的に研究した成果を取り入れたものである。人形という私たちの身辺にあるものが、時には依代として、また時には形代として機能し、それによって心理療法における投影的な役割を担い、人形という民俗の心理治療的な意義が生まれてくる。そのような人形の心理学を、古い民俗的なものから現代の風俗的なものまで取り上げてみることで、本研究の主たる目的であった過去と現在の接点、地域と都市の接点、心理療法と科学の接点が明らかにされていった。また9月には昨年同様にドイツ連邦共和国ミュンヘン市においてWolfgang Giegerich博士と夢の民俗学的意味と夢分析の実際についてのワークショップを開き、日本で報告されている夢の事例やヨーロッパにおける夢の分析的取り扱いについて研究し、二日間にわたって意見交換し研究成果を深めていった。そこで得られた夢と言語の問題は「文献研究の意義、あるいは魂の翻訳者の使命」に、夢の実際的体験的研究としては「教育分析体験と臨床の学び」に、夢を取り扱った心理療法の実践的指導のあり方については「南部論文へのコメント」にそれぞれ発表した。夢の心理療法的取り扱いについては、「身体への症状化の問題」や「身体感覚とイメージ」の問題との関連が今後の研究課題として残されて入るが、本研究が当初目的としていたイメージを民俗学的・心理哲学的に研究した成果は以上の1図書・3論文に十分にまとめられたと思われる。また、本研究の三年間の研究成果報告として、三年間の研究を概観できる形にまとめた報告書を作成し、その総括とした。
肥満細胞の開口分泌機構:分泌を惹起する細菌金属プロテアーゼの標的膜蛋白質の確定

補因子としてZn^<2+>を要求するビブリオ・バルニフィカスの金属プロテアーゼ(VVP)は,in vitroおよびin vivoにおいて,ラット肥満細胞に対しヒスタミン開口分泌応答を惹起する。本研究では,開口分泌応答の際,VVPの標的となっている肥満細胞膜蛋白質について検討した。標的膜蛋白質を解析するためには,基質との親和力が増減した酵素アナログの利用が有効であると思われた。そこでZn^<2+>をCu^<2+>と置換したVVPアナログを調製した。その結果,基質との親和力が3倍増強したVVPアナログとなった。一方,Ni^<2+>で置換した場合には,親和力が著しく低下したアナログとなった。次に,ヒスタミン分泌活性を比較したところ,Cu^<2+>置換体は強い活性を示し,Ni^<2+>置換体は極めて弱い活性を示した。さらに,N末側の触媒ドメイン(VVP-N)およびその置換体を調製した。この場合にも,VVP-NとCu^<2+>置換体は強いヒスタミン分泌活性を示したが,Ni^<2+>置換体は明らかに弱い活性しか示さなかった。したがって,VVPの触媒ドメイン(VVP-N)の活性中心が肥満細胞の標的膜蛋白質と結合することにより,ヒスタミン開口分泌応答が惹起されると結論された。近年,細胞外からの情報を受け取る膜蛋白質としてGPIアンカー型蛋白質が注目されている。そこで,この蛋白質がVVPの標的膜蛋白質であるか否かについて検討した。GPIアンカー型蛋白質が集積するラフト分画を調製し,その共存下においてヒスタミン分泌応答を惹起させた。しかし,惹起された開口分泌応答は,共存させたラフトの量には関係がなく,つねに同じ強さであった。したがって,ラフト分画にはVVPの標的蛋白質が存在しないと結論された。本年度はVibrio vulnificus金属プロテアーゼ(VVP)によって惹起されるヒスタミンの開口分泌に関し,以下のような研究結果を得た。1.C末端側ドメインの寄与に関する研究VVPは2つの機能ドメイン(N末端側の触媒ドメイン,およびC末端側の蛋白質結合ドメイン,より構成されている。そこで,ヒスタミンの開口分泌を惹起する生理作用において,C末端側ドメインが重要な寄与をしているか否か検討した。この目的のため,まず最初に,VVPのN末端側ドメイン(VVP-N)を調製した。そして,VVP-Nの生理作用をin vivoモデルであるラットの血管透過性亢進作用により検討した。その結果,VVP-Nにも十分なヒスタミン分泌の惹起作用が認められ,VVPがC末端側の関与なしに,ヒスタミンの開口分泌を惹起することが示された。したがって,VVPは触媒ドメインのみの働きにより,ある特定の蛋白質を分解し,あるいはその蛋白質と結合し,結果的にヒスタミンの開口分泌を惹起させると考えられた。2.VVPアナログの調製プロテアーゼの標的となっている蛋白質(つまり基質となっている蛋白質)を確定する研究においては,蛋白質との親和性が増強されたプロテアーゼアナログの調製と使用が,大いに威力を発揮する。そこで本研究でも,VVP-Nにおいてアナログ酵素の調製を行った。さてVVP-Nは,亜鉛イオンを補因子としているが,これを銅イオンで置換したVVP-Nアナログは,アゾカゼイン等の基質蛋白質に対する親和性が3倍程度増強していた。よって,このアナログ酵素は肥満細胞膜上のVVP標的蛋白質を確定するための,強力な研究ツールになると考えられた。

本年度はラット腹腔より単離した肥満細胞に対するヒスタミン遊離作用について検討した。まず,金属プロテアーゼ(VVP)とその金属置換体のヒスタミン遊離作用を比較した。活性中心の基質への親和性が低く蛋白質分解活性も低いVVP(Ni^<2+>)は,VVPよりもはるかに弱いヒスタミン遊離作用を示した。一方,活性中心の基質への親和性が高いVVP(Cu^<2+>)は,蛋白質分解活性が低いにもかかわらず,VVPより僅かに強いヒスタミン遊離作用を示した。次に,N末側ドメイン(VVP-N)とその金属置換体のヒスタミン遊離作用を比較した。VVP-Nを肥満細胞に作用させたところ,用量依存的にヒスタミン遊離応答が惹起され,VVPと同用量で応答がプラトーとなった。よって,ヒスタミン遊離作用にC末側ドメインは必須でないと結論された。しかし,プラトーにおけるヒスタミン遊離率はVVPの1/3であり,ヒスタミン遊離応答を強く惹起するためにはC末側ドメインが必要であると考えられた。また,VVP-N(Ni^<2+>)はVVP-Nよりもはるかに弱いヒスタミン遊離作用を示し,VVP-N(Cu^<2+>)はVVPよりも強いヒスタミン遊離作用を示した。したがって,ヒスタミン遊離作用は,VVP-Nの活性中心と肥満細胞の標的膜成分との結合により惹起されると推察された。さらに,ヒスタミン遊離応答のキネティクスを比較した。その結果,VVPでは遊離応答が瞬時に惹起され30秒後に終了した。一方のVVP-Nでは30秒の遅延時間の後に遊離応答が惹起され,60秒後に終了した。以上,本年度の研究により,(1)VVPではC末側ドメインを介して速やかに細胞膜と結合するため,短時間にまとまった強い刺激が与えられる。(2)VVP-Nでは細胞膜との結合が遅く,しかもそれが同調しないため,ヒスタミン遊離応答を惹起させうる刺激の伝達に30秒を必要とする。(3)VVP-Nでは刺激の伝達量が少ないため,ヒスタミン遊離応答が弱いことが明かとなった。1.ウサギ赤血球での研究:昨年度までの研究により,ラット肥満細胞のモデルとなり得ることが示されたウサギ赤血球を用い,VVPとGPIアンカー型蛋白質との結合性について検討した。まず,GPIアンカー型蛋白質のみを特異的に赤血球膜から遊離させるPI-PLC (phosphatidylinositol specific phospholipase C)の効果を調べた。ウサギ赤血球膜を様々な濃度のPI-PLCで処理し,各々についてVVPの結合量を測定した。しかしながら,いずれの赤血球膜においてもVVPの結合量に違いは認められなかった。次に,GPIアンカー型蛋白質が集積するラフトと呼ばれる膜分画を調製し,これにVVPが結合するか否か調べた。しかし,VVPの有意な結合は観察されなかった。よって,ラフト分画以外にVVPの標的膜蛋白質が存在すると結論された。2.ラット肥満細胞での研究:まず,ラット肥満細胞をPI-PLCで処理することにより,VVPの惹起するヒスタミン遊離反応が減弱するか否か検討した。しかしながら,PI-PLC処理自体でヒスタミン遊離反応が惹起され,明確な結果を得ることはできなかった。そこで,肥満細胞よりラフト分画を調製し,これの共存下においてヒスタミン遊離反応を惹起させた。
実験的自己免疫性脳脊髄炎発症と抑制におけるケモカインCCL19/CCL21の役割

実験的アレルギー性脳炎(Experimental Allergic Encephalomyelitis : EAE)は、多発性硬化症の疾患モデルとされている。我々はケモカインCCL19/21の発現を欠く突然変異マウス(Paucity of Lymph Node T cells : plt)を見出し、免疫反応におけるこれらのケモカインの役割を検討しているが、pltマウスにEAEの誘導を行ってもほとんど発症しないことを見出した。pltマウスではなぜEAEの発症がみられないのか、検討を続けているが、本研究課題を実施することで次のような結果が得られた。1.これまでEAEを発症するのは、MOG (Myelin-oligodendrocyte glycoprotein)ペプチドなどに特異的なTh-1細胞によるとされていたが、最近の報告によるとTh-1でもTh-2でもなく、IL-17を産生するヘルパーT細胞(Th-17)によってEAEは発症する。pltマウスをMOG_<35-55>ペプチドで免疫しても、所属リンパ節にTh-IL-17が認められなかった。2.IL-17の産生には、抗原提示細胞によるIL-6、TGF-β、IL-23が必要とされている。免疫したpltマウスの所属リンパ節細胞ではIL-6とTGF-βの産生は野生型マウスと同等であったが、IL-23の産生が低下していた。CCL21を添加すると、IL-23と皿,-17の産生が回復した。3.CCL23を添加することで、pltマウスCD4^<+T>細胞にはIL17を産生するTh-17が誘導された。4.CCL21をpltマウスCD4^<+T>細胞に加えたのでは、Th-17は誘導されなかった。5.CD11c^+樹状細胞にCCL21を添加するとIL-23産生の回復を認めた。6.CCR7欠損マウスの樹状細胞にCCL19やCCL21を加えても、IL-23産生はみられなかった。これらの結果から、pltマウスではTh-17の誘導が出来ないこと、この誘導に必要な樹状細胞によるIL-23の産生が低下していることが判明した。このIL-23産生低下は、CCL19/CCL21によるCCR7の刺激が欠如しているためであることも判明した。今後は抗IL-23抗体を用いるなどして、発症後のEAEを抑制できるか、すなわちMS患者の治療に応用できるかどうか、検討していきたい。

pltマウスではなぜEAEの発症がみられないのか、検討を続けているが、平成17年度には以下のような結果が得られた。(1)これまでEAEを発症するのは、MOG(Myelin-Oligodendrocyte glycoprotein)ペプチドなどに特異的なTh-1細胞によるとされていたが、ごく最近の報告によると、Th-1でもTh-2でもなく、IL-17を産生するヘルパーT細胞(Th-_<IL-17>)によってEAEは発症する。pltマウスをMOG_<35-55>ペプチドで免疫し、所属リンパ節のT細胞をin vitroで抗原刺激をしてみると、対照マウスでみられるIL-17の産生が認められなかった。(2)IL-17の産生には、抗原提示細胞によるIL-23が必要とされている。免疫したpltマウス所属リンパ節細胞によるIL-23の産生も低下していた。(3)CCL21を添加すると、IL-23とIL-17の産生が回復した。(4)免疫後のpltマウス所属リンパ節T細胞をin vitroで抗原刺激した後に無処置マウスに移入してもEAEを発症することはないが、CCL21を添加して抗原刺激しておいたT細胞を用いると、発症がみられた。これらの結果から、pltマウスではTh-_<IL-17>の誘導が出来ないこと、この誘導に必要なIL-23の産生が低下していることが判明した。実験的アレルギー性脳炎(Experimental Anergic Encephalomyehtis : EAE)は、多発性硬化症の疾患モデルとされている。我々はケモカインCCL19/21の発現を欠く突然変異マウス(Paucity of Lymph Node Tc ells : plt)を見出し、免疫反応におけるこれらのケモカインの役割を検討しているが、pltマウスにEAEの誘導を行ってもほとんど発症しないことを見出した。pltマウスではなぜEAEの発症がみられないのか、検討を続けているが、昨年度までに以下のような結果が得られた。1.これまでEAEを発症するのは、MOG (Myehn-oligodendrocyte glycoprotein)ペプチドなどに特異的なTh-1細胞によるとされていたが、最近の報告によるとTh-1でもTh-2でもなく、IL-17を産生するヘルパーT細胞(Th-17)によってEAEは発症する。pltマウスをMOG_<35-55>ペプチドで免疫しても、所属リンパ節にTh-IL-17が認められなかった。2.IL-17の産生には、抗原提示細胞によるIL-6、TGF-β、IL-23が必要とされている。免疫したpltマウスの所属リンパ節細胞ではIL-6とTGF-βの産生は野生型マウスと同等であったが、IL-23の産生が低下していた。CCL21を添加すると、IL-23とIL-17の産生が回復した。平成18年度には、pltマウスの所属リンパ節細胞にCCL21を加えておくと、IL-23とIL-17の産生が回復するメカニズムを検討し、以下のような結果が得られた。1.CCL23を添加することで、pltマウスCD4^+T細胞にはIL-17を産生するTh-17が誘導された。2.CCL21をpltマウスCD4^+T細胞に加えたのでは、Th-17は誘導されなかった。3.CD11c^+樹状細胞にCCL21を添加するとIL-23産生の回復を認めた。
脳梗塞後の痙縮出現と脳幹網様体での恒常的シナプス可塑性変化の関係についての研究

本研究は以下の2点を明らかにすることを本研究の目的とした。1マウス脳梗塞後の脳幹網様体神経細胞の活動性亢進は恒常的シナプス可塑性に関連するか、恒常的シナプス可塑性に関連する分子の発現変化を検討する。2脳梗塞後の脳幹神経細胞の活動性亢進と痙縮出現は関連するか、マンガン造影MRI撮像を用い、経時的な脳幹網様体領域の神経活動変化と痙縮の出現の相関を検討することを計画した。研究結果について、1については、恒常的シナプス可塑性の関与を確認するために、大脳皮質神経細胞を標識し、先行研究で報告されている恒常的シナプス可塑的変化に関与する分子(GluR1,2, TNF-α,Pum2,Nav1.6など)の発現変化を免疫組織染色法で半定量的解析により検討すると計画した。標識方法としては順行性トレーサーのBDAを使用し、脳梗塞モデル作成前に損傷予定領域の神経細胞に注入し標識し、脳梗塞を作成して1週間後のサンプルにおいて、GlurR1をはじめとする恒常的シナプス可塑的変化に関与する分子の発現変化を確認している。1週後のサンプルでは、標識終末とシナプスを形成するシナプス数は有意に減少し(脳梗塞群=30, sham群=42 p<0.01)、標識終末とシナプス形成するシナプスに発現するGluR1の発現面積を面積組織染色法で確認すると有意に大きい結果が確認された(脳梗塞群=25%, sham群=21% p<0.01)。今後他の分子についても、検討していく予定である。また2についてはマンガン造影MRI撮像プロトコルは確立できているが、撮像時のマウス頭部固定が不良のため撮像画像の再現性が取れない問題があり、頭部固定器を3Dプリンターを用いて作成した。またマンガンが血液脳関門に阻まれて脳内に一定濃度を届けることが難しい課題に面していたが、直接第4脳室にマンガンを投与することで解決でき、今後予定通り進めていく。研究計画1について、研究結果も出始めており、概ね順調に進んでいる。研究計画2については、頭部固定器の作成や血液脳関門にマンガンが阻まれるという課題に面していたが、試行錯誤を行い、高濃度なマンガンを脳内に届けることが可能なり、良好なMRI画像が撮像でき、大きな進捗の遅れはでておらず概ね順調に進展している。研究計画1については、恒常的シナプス可塑性に関連する他の分子についても同様の方法で確認をとっていく予定である。また脳幹網様体における興奮性神経細胞の神経活動をc-fosの発現変化で確認することを予定しているので、実験を行う予定である。研究計画2については、今後脳梗塞モデルとshamモデルでの経時的な脳活動観察を実施する。また痙縮を誘発した際の脳活動も合わせて観察を行なっていく予定である。

また脳幹網様体における興奮性神経細胞の神経活動をc-fosの発現変化で確認することを予定しているので、実験を行う予定である。研究計画2については、今後脳梗塞モデルとshamモデルでの経時的な脳活動観察を実施する。また痙縮を誘発した際の脳活動も合わせて観察を行なっていく予定である。
色素体とミトコンドリアの分裂マシーンの分子生理機構の解明

ほとんどの生物は植物の葉緑体(色素体)の光合成に依存して生きている。葉緑体は分裂マシーンを使って分裂・増殖する。葉緑体の分裂マシーンは、FtsZ,(葉緑体基質側)、外PD(細胞質側)、そしてダイナミン(細胞質側)リングの順に形成され、ダイナミックトリオと名付けた。PDリングの主たる構造は5-7nmの細いナノの繊維である。ミトコンドリアの分裂マシーンも類似のダイナミックトリオから成る。ダイナミックトリオを骨格にした両分裂マシーンの働きを分子生理学的に解明した。本研究は、原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(略称シゾン)の同調培養系を使って、先ず葉緑体の分裂装置を解析し、次にミトコンドリアの分裂装置でMDリング複合体を大量かつ無傷に単離し、それを構成する全タンパク質とその遺伝子をMALDI TOF-MS法を使って同定することである。さらに現在、開発中の遺伝子破壊技術を用いて、これらの遺伝子の機能を解析することである。またこの思考を基盤に細胞機能の全貌を解明することである。申請者らは,1986年に世界ではじめて色素体(葉緑体)が独自の分裂装置(色素体分裂リング;PDリング)を使って分裂増殖していることを原始紅藻Cyanidium caldariumで発見した。更に1986年に真正粘菌で,続いて1993年に原始紅藻Cyallidioschyzon merolae(略称シゾン)でミトコンドリアが分裂装置(ミトコンドリア分裂リング;MDリング)を使って分裂。増殖していることを発見した。更に,シゾンで,色素体の分裂装置を構成するリング類がミトコンドリアにも存在することを明らかにし,現在では両オルガネラとも"ダイナミックトリオ(FtsZリング,PD/MDリング,ダイナミンリング)"を使って分裂していることが明らかとなった(Nishida, et. al.PNAS2003;Miyagishima, et. al.Plant Cell 2001,2003;Yoshida, et.al.Science2006)。本研究の目的は,これまでの成果を踏まえ,葉緑体の分裂装置であるPDリング複合体を大量かっ無傷に単離し,それを構成する全タンパク質の遺伝子を同定すること,及び葉緑体の解析系を使って,ミトコンドリアの分裂装置であるMDリング複合体を無傷に単離し,構成する全タンパク質とそれらの遺伝子を同定することであった。初年度はこの最初の段階の研究を進め,先ず葉緑体分裂装置を単離した。これから電気泳動により,タンパク質を分離するとともに,それをTOF-MSにかけ,100%ゲノムの配列を読んだ情報を使って,遺伝子を同定した。約20種余りのタンパク質と遺伝子を同定できた。更に詳しい解析を抗体などの作製により行った。またミトコンドリアなど他のオルガネラに関しても同様の方法で単離することを開始した。申請者らは、1986年に世界ではじめて色素体が独自の分裂装置を使って分裂増殖していることを原始紅藻Cyanidium caldariumで発見した。更に1993年には色素体とミトコンドリアの分裂装置をCyanidioschyzon merolae(略称シゾン)で発見した。現在色素体とミトコンドリアは基本的にはダイナミックトリオ(FtsZ, PD/MD,ダイナミンの各リング)を使って分裂増殖していることが明らかとなった(Nishida et al. PNAS2003;Miyagishima etal. Plant Cell2003;Yoshida et al. Science20006).本研究の目的は、これら及び18年度の成果を踏まえて、色素体の分裂装置であるPDFマシーンを無傷に単離し、それを構成する全タンパク質とその遺伝子を同定すること、及びミトコンドリアの分裂(MDF)マシーンの全タンパク質とその遺伝子を同定することであった。しかしそれぞれが極めて小さく、また弱いこともあり、単離は困難を極めた。そこで、それぞれの分裂マシーンの挙動を参考に単離することにした。色素体のPDFマシーンの長さは5ミクロン、ミトコンドリアの分裂マシーンは1ミクロンであった。これが分裂期の初期には接着しているが、後期になると分離することが分かった(Int. Rev. Cell Mol. Biol.2008)。この性質を利用して、先ず後期の細胞からPDFマシーンを単離し、前期の細胞から、PDFマシーンとMDFマシーンの複合体を単離することであった。そしてプロテオーム解析を行い、複合体の分画から色素体分画の部分を引くことよってミトコンドリア核のタンパク質のMALDITOF-MS解析をした。こうして現在20種あまりの色素体とミトコンドリアのタンパク質の存在が明らかとなった。

次にこの一つずつを解析し、先ずミトコンドリアのMDFFマシーンの内側にあり、FtsZと密接に働くタンパク質とその遺伝子を同定することに成功した(Curr. Biol. in press).現在こうした方法で得られた分裂に関わるタンパク質を一つずつ解析を進めるとともに、他の生物での一般性を明らかにするため、緑藻や高等植物での色素体とミトコンドリアの挙動を、生活環にそって解析している。本研究の目的は、原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(略称シゾン)の同調培養系を使って、葉緑体の分裂装置であるPDリング複合体を大量かつ無傷に単離し、それを構成する全タンパク質とその遺伝子をMALDI TOF-MS法を使って同定することである。次に葉緑体の解析系を利用して、ミトコンドリアの分裂装置であるMDリング複合体(分裂マシーン)を無傷に単離し、構成する全タンパク質とそれらの遺伝子を同定することである。さらにシゾンで現在開発中の遺伝子破壊技術を用いて、これらの遺伝子の機能を同定することであった。分裂期前期にあるPDFとMDFマシーンの複合体を持った細胞を集め、フレンチプレスを使って破砕する。これをパーコールの密度勾配遠心で、細胞核、色素体-ミトコンドリア複合体、その他に分け、分裂装置を持った色素体とミトコンドリアを大量に集める。次にノニデットP40をはじめOGのような各種界面活性剤で処理し、遠心を繰り返し、PDFとMDFマシーン複合体の沈査を大量に得る。また分裂期後期の細胞からPDFマシーンを持った細胞を集め、各種界面活性剤処理を行い、無傷PDFマシーンを得る。こうした過程は主に蛍光顕微鏡と電子顕微鏡観察やウエスタンブロッティング法で各画分を確認しながら進め、MALDI TOF-MSにかけ、遺伝子を同定した。その結果ミトコンドリア分裂装置内でFtsZと協調して働く、新たなZED遺伝子を発見した。
プロスタグランディンを中心とする免疫系・神経系間の情報伝達機構の解明―炎症性疼痛モデルを用いて

免疫系・神経系間の情報伝達機構をプロスタグランディン(PG)に着目し研究した。炎症性痛覚過敏の発症機序において、初期の段階では炎症局所でマクロファージ、単球などにより産生されるPGが、知覚神経末端の興奮性増強作用を介し関与する。またPG合成の律速酵素であるシクロオキシゲナーゼ2(COX-2)合成阻害剤の局所的予防的投与が、痛覚過敏症の予防に有効であった。次に炎症発症後、中期から後期において、脳脊髄液中のPGE_2レベルが著増し、PGE_2の増加も痛覚過敏もCOX-2阻害剤を炎症中期に全身投与することにより制御されるが予防的投与は無効であること、特に痛覚過敏の制御には脊髄くも膜下膣投与が少量で有効であること、痛覚過敏症状とPGE_2レベル、COX-2発現の程度が相関することが明らかになった。中枢神経系におけるPGE_2産生細胞の同定を行ったが、COX-2、PGE_2合成の最終段階酵素であるPGE_2 synthase (PGES)及びPGES mRNAは中枢神経血管内皮細胞に存在すること、COX-2、PGESは同一血管内皮細胞に共存し共存率は90%以上であること、さらにこれらの細胞は脳・脊髄に広く分布することが分かった。これは、COX-2発現、PGE_2産生が神経細胞でおこるという既存の説に対し、画期的で、末梢性炎症に伴う発熱、全身倦怠痛覚過敏その他の全身性の中枢神経症状発症機序の解明に有力な手がかりになるのみならず、血管内皮細胞上の受容体にサイトカインが結合するとPG合成がおこるという研究結果から、局所からの炎症情報が中枢神経系に伝達される機序に関する仮説の有力な根拠となった。つまり局所で産生される炎症性サイトカインが血行性に中枢神経血管内皮細胞に情報伝達を行うという仮説で、関与するサイトカインの同定に関して初期の結果は得たが、その確定、メカニズムの全容解明が今後の課題である。免疫系と神経系の間の情報伝達機構に関する本研究により現在までに得られた知見は以下の通りである。1、カラゲニンによる炎症性疼痛モデルにおいて、脳、脊髄内の血管内皮細胞に、シクロオキシゲナーゼー2(COX-2)免疫陽性細胞が多数観察された。COX-2が血管内皮細胞の核膜近辺に存在することが、多重免疫組織化学により確認できた。なお、正常状態では、大脳皮質、海馬など脳の一部にCOX-2免疫陽性神経細胞が認められるのみであり、脊髄では免疫陽性細胞は認められなかった。炎症部位においてもマクロファージなどの細胞にCOX-2免疫陽性細胞が認められた。2、脳及び脊髄におけるCOX-2免疫陽性血管内皮細胞を経時的に定量した。カラゲニンモデルにおいて、カラゲニン注射3時間目より出現し、6時間後には最高値に達した。24時間後でも免疫陽性血管内皮細胞はわずかながら認められた。3、脳脊髄液中のプロスタグランディンE_2は、注射3時間後より検出されはじめ、6時間後に最高値を示した。4、痛覚過敏は注射1時間後より観察され、経時的に増強し2-3時間後に最高値を示し6時間後までプラトーの状態が持続した。また、注射2時間後に選択的COX-2阻害薬を腹腔内及びくも膜下腔に投与したところ、痛覚過敏に対して治療的効果が認められた。以上より、カラゲニン誘発性の痛覚過敏にはCOX-2が深く関与していること、さらに3時間後以降には中枢性のCOX-2が関与していることが示唆された。初期の痛覚

過敏には末梢性つまり炎症部位におけるCOX-2の関与が示唆された。また、本モデルにおけるCOX-2免疫陽性細胞の同定が初めてなされた。現在はアジバント誘発性炎症性疼痛モデルにおいても、検討を行っている。また、さらに下流のPGE合成酵素についても検討中である。免疫系と神経系の間の情報伝達機構に関して以下の知見がえられた。1、昨年度はカラゲニンによる炎症性疼痛モデルを用いたが、さらに長期にわたる炎症モデルであるアジュヴァントモデルにおいて研究を行った。本モデルにおいてはアジュヴァント注射1日後より脳、脊髄内の血管内皮細胞にシクロオキシゲナーゼー2(COX-2)免疫陽性細胞が多数観察された。COX-2が血管内皮細胞の核膜近辺に存在することが、多重免疫組織化学により確認できた。なお、正常状態では、大脳皮質、海馬など脳の一部にCOX-2免疫陽性神経細胞が認められるのみであり、脊髄では免疫陽性細胞は認められなかった。2、脳及び脊髄におけるCOX-2免疫陽性血管内皮細胞を経時的に定量した。アジュヴァント注射1日目より出現し、免疫陽性細胞の数も免疫反応性も漸減したが24日目においても免疫陽性血管内皮細胞はわずかながら認められた。3、脳脊髄液中のPGE_2、は、注射1日後より検出されはじめ、以後漸減した。4、痛覚過敏は注射3時間後より観察され、10日目においてもプラトーの状態が持続していた。浮腫は二相性に両足に認められた。以上より、アジュヴァント誘発性慢性炎症性痛覚過敏には中枢神経系血管内皮細胞のCOX-2が深く関与していることが示唆された。さらに下流のPGE_2合成の最終段階酵素であるPGE_2 synthase(PGEs)の局在をカラゲニンモデルを用いて調べた。その結果5、PGEsは正常状態では中枢神経系において観察されなかったが、炎症誘発後中枢神経血管内皮細胞に広く分布した。6、多重免疫組織化学を用いて調べたところ、COX-2とPGEsは同一血管内皮細胞において共存していた。共存率は90%以上であった。7、PGEs mRNAも中枢神経血管内皮細胞に分布するというpreliminaryな所見が得られた。さらに中枢神経血管内皮細胞におけるCOX-2合成のトリガーになると考えられるサイトカインの定量も行い、炎症誘発後局所血管内におけるIL-1beta、IL-6濃度の上昇をpreliminaryな所見として得た。上記6およびサイトカインをはじめとするmediatorについては最終年度である本年さらに探求し、中枢神経血管内皮細胞に注目した免疫系シグナルの神経系への情報伝達のメカニズムの解明を行う予定である。平成12年度、13年度の研究では、カラゲニン誘発性炎症モデルやアジュヴァントモデルなどの末梢性炎症時におこる痛覚過敏発症の一つの原因である中枢神経系の感受性の増加つまり中枢感作に関与するプロスタグランディンE_2 (PGE_2)の産生が、中枢神経血管内皮細胞でなされていることを、PGE_2産生の律速酵素の一つであるシクロオキシゲナーゼ2(COX-2)に注目して、生化学的、分子生物学的、行動薬理学的、免疫組織化学的に証明した。平成14年度は以下のような所見が得られた。1.各種炎症性モデルにおいて、中枢神経血管内皮細胞にCOX-2とPGE_2合成の最終段階酵素であるPGE_2 synthase (PGES)が共存し、その共存率は90%を超えていた。
細胞死における細胞内情報伝達分子のターゲティング機構の解明と薬物開発への応用

中枢神経系におけるスフィンゴシンキナーゼ(SK)のターゲティング機構およびその役割を明らかにするために、ラット胎児海馬の初代培養神経細胞を用いて以下の解析を行った。まずラット海馬初代培養神経細胞におけるSK1の細胞内局在を調べたところ、定常状態においてSK1は前シナプス部位に限局的に発現していることが分かった。さらに脱分極刺激やグルタミン酸刺激による活動電位の誘発によって、前シナプスでのSK1の細胞質から膜へのトランスロケーションが観察された。また活動電位の誘発時にSKによるS1Pの産生増加も観察された。これらはSK1が神経細胞の前シナプスにおいて細胞質から膜ヘターゲティングしている事を示している。次にこのSK1のターゲティング機構の神経細胞機能における役割を調べた。SKの阻害剤は脱分極刺激による海馬神経細胞からのグルタミン酸の放出を抑制した。また、RNAi法によるSK1の発現抑制によっても同様に脱分極刺激によるグルタミン酸放出の抑制が観察された。これらの結果は、神経伝達物質放出機構においてSK1が重要な役割を担っている事を示している。さらに、脱分極刺激時にSKによって産生されたS1Pが前シナプス上に発現するS1P受容体に結合する事が分かった。また、外来のS1P刺激は海馬神経細胞におけるグルタミン酸の放出を誘発した。これらはS1Pが前シナプスにおいて自己分泌様に作用して神経伝達物質の放出を誘導している事を示している。本研究により、神経細胞の活動電位発生時にスフィンゴシンキナーゼ1が前シナプス膜ヘターゲティングし、S1Pの産生を促進し、このS1Pが自己分泌様に前シナプスのS1P受容体に作用し、その下流で神経伝達物質の放出および神経伝達物質放出の増強が引き起こされる、という新たなシグナル伝達機構の存在が明らかとなった。現在、細胞内情報伝達分子のターゲティング機構を光シグナルとして簡便に検出する新規プローブを開発中である。この新規プローブ開発は細胞内情報伝達分子のターゲティング機構を指標とした新規薬剤開発への応用へと発展するものと期待される。細胞周期の調節に深く関与していることが知られている細胞内情報伝達分子であるスフィンゴシンキナーゼのターゲティング機構の詳細な解析・スフィンゴシンキナーゼのセリン/トレオニンリン酸化およびチロシンリン酸化について神経系の培養細胞を用いて探索を行った。チロシンリン酸化特異的抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、TNF-α、ホルボールエステル、過酸化水素等、いずれの刺激においてもチロシンリン酸化は検出されなかった。セリン/トレオニンリン酸化に関しては既に報告されている結果と同様に225番目のセリン残基がリン酸化される事が確認された。・スフィンゴシンキナーゼは膜へトランスロケーションすることが既に報告されているが、このトランスロケーションの詳細な機構は分かっていない。そこで神経系の培養細胞を用いてスフィンゴシンキナーゼの膜へのトランスロケーションに関与する因子について解析を行った。まず膜へのトランスロケーションにおけるスフィンゴシンキナーゼ活性の関与を調べる為に、不活性型のスフィンゴシンキナーゼを構築して培養細胞に遺伝子導入し、その影響を調べたところ、このスフィンゴシンキナーゼの膜へのトランスロケーションには活性が必要である事が明らかとなった。またさらに、カルシウムおよびカルモジュリンの関与を調べたところ、カルモジュリンの関与は認められなかったが細胞内カルシウム濃度の上昇が膜へのトランスロケーションにおいて重要な因子である事が明らかになった。スフィンゴシンキナーゼのin vivoでの発現調節系の確立・スフィンゴシンキナーゼのノックアウトマウスを作製する為の遺伝子導入用プラスミドベクターの作製を行った。スフィンゴシンキナーゼのターゲティング機構の解明様々な培養細胞系に2種類のスフィンゴシンキナーゼ(1および2)にそれぞれ緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合させたタンパク質をそれぞれ発現させて、様々な刺激によるスフィンゴシンキナーゼ1およびスフィンゴシンキナーゼ2の局在の変化をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、スフィンゴシンキナーゼが、細胞の種類、刺激の種類、分子種に応じて、細胞膜、核、リソソーム、ゴルジ体などの異なる細胞内小器官へトランスロケーションすることが明らかになつた。またスフィンゴシンキナーゼのトランスロケーション先の違いによってアポトーシスや細胞増殖などそれぞれ異なった細胞応答を示すことも明らかとなった。スフィンゴシンキナーゼは様々な刺激を受けることによってその活性が上昇することが知られているが、無刺激の状態においてもその活性は比較的高い値を示す。また、スフィンゴシンキナーゼは通常細胞質に発現しているが、様々な刺激を受けてその局在を多様に変化させることが我々の結果から明らかになってきた。これらのことは、膜に存在するスフィンゴシンが代謝されて脂質メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸が産生されるためには、スフィンゴシンキナーゼの活性の上昇以外に、基質であるスフィンゴシンが存在する細胞内小器官へのスフィンゴシンキナーゼのターゲティングそのものが重要な要素となる可能性を示唆している。スフィンゴシンキナーゼのターゲティング機構の詳細な解析を進めることによって細胞内情報伝達分子のターゲティング機構の細胞応答への重要性が明らかとなるとともに、このターゲティング機構の詳細な解明が細胞内情報伝達分子のターゲティング機構を指標とした新規薬剤開発への応用へと発展するものと期待される。中枢神経系におけるスフィンゴシンキナーゼ(SK)のターゲティング

機構およびその役割を明らかにするために、ラット胎児海馬の初代培養神経細胞を用いて以下の解析を行った。まずラット海馬初代培養神経細胞におけるSK1の細胞内局在を調べたところ、定常状態においてSK1は前シナプス部位に限局的に発現していることが分かった。さらに脱分極刺激やグルタミン酸刺激による活動電位の誘発によって、前シナプスでのSK1の細胞質から膜へのトランスロケーションが観察された。また活動電位の誘発時にSKによるS1Pの産生増加も観察された。これらはSK1が神経細胞の前シナプスにおいて細胞質から膜ヘターゲティングしている事を示している。次にこのSK1のターゲティング機構の神経細胞機能における役割を調べた。SKの阻害剤は脱分極刺激による海馬神経細胞からのグルタミン酸の放出を抑制した。また、RNAi法によるSK1の発現抑制によっても同様に脱分極刺激によるグルタミン酸放出の抑制が観察された。これらの結果は、神経伝達物質放出機構においてSK1が重要な役割を担っている事を示している。さらに、脱分極刺激時にSKによって産生されたS1Pが前シナプス上に発現するS1P受容体に結合する事が分かった。また、外来のS1P刺激は海馬神経細胞におけるグルタミン酸の放出を誘発した。これらはS1Pが前シナプスにおいて自己分泌様に作用して神経伝達物質の放出を誘導している事を示している。本研究により、神経細胞の活動電位発生時にスフィンゴシンキナーゼ1が前シナプス膜ヘターゲティングし、S1Pの産生を促進し、このS1Pが自己分泌様に前シナプスのS1P受容体に作用し、その下流で神経伝達物質の放出および神経伝達物質放出の増強が引き起こされる、という新たなシグナル伝達機構の存在が明らかとなった。現在、細胞内情報伝達分子のターゲティング機構を光シグナルとして簡便に検出する新規プローブを開発中である。この新規プローブ開発は細胞内情報伝達分子のターゲティング機構を指標とした新規薬剤開発への応用へと発展するものと期待される。
非同期回路に基づく高信頼・低消費電力な次世代型身体ネットワーク用ICチップの開発

現在,生体内に配置した電子機器を用いて無線ネットワークを構築するボディエリアネットワーク(BAN)が注目されており,これに利用されるICチップには特に低消費電力性と高信頼性が要求される.本研究では,クロックを用いない非同期回路に基づいた制御手法を導入し,更なる低消費電力化と高信頼性を備えたBAN専用ICの開発を目指す.まず,非同期回路と直列演算器を併用し,演算回路の消費電力を大幅に削減する.次に,非同期回路特有のメタステーブル動作を利用して生体信号からそれ固有の暗号鍵を生成し,信頼性に優れた無線通信を実現する.そして,以上に基づいたICチップを実装し,性能解析を通じてその有効性を明らかにする.現在,生体内に配置した電子機器を用いて無線ネットワークを構築するボディエリアネットワーク(BAN)が注目されており,これに利用されるICチップには特に低消費電力性と高信頼性が要求される.本研究では,クロックを用いない非同期回路に基づいた制御手法を導入し,更なる低消費電力化と高信頼性を備えたBAN専用ICの開発を目指す.まず,非同期回路と直列演算器を併用し,演算回路の消費電力を大幅に削減する.次に,非同期回路特有のメタステーブル動作を利用して生体信号からそれ固有の暗号鍵を生成し,信頼性に優れた無線通信を実現する.そして,以上に基づいたICチップを実装し,性能解析を通じてその有効性を明らかにする.