hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地球潮汐による応力変動と地震活動度に関する時空間統計モデル

応力変動と地震活動との関係を調べることは、地震発生予測といった社会的に重要な課題に大きな関わりがある。本研究では、地球潮汐による応力変動、特に月齢に起因する応力変動に着目し、「点過程解析」と呼ばれる統計的手法を用い、それと地震活動との関連を調べた。その結果、応力状態が臨界状態に近く、地震が起きやすい状態になっている時、地球潮汐による応力変動と地震活動との間に相関が見られることが分かった。また、解析手法の改善により、広範囲な時空間領域データを同時に解析出来るようなアプローチの端緒を示すことも出来た。本研究は地球潮汐による応力変動と地震活動との関係を定量的にモデル化することを通じ,地球潮汐以外の要因による応力変動に対する地震活動の変化について一層の理解を深め,地震発生予測の精度向上への貢献を目指すものである.地球潮汐による応力変動は複数の周期成分の足し併せであることを考慮し,今年度は月齢に相当する成分に着目した解析を主に行った.データとしては1995年兵庫県南部地震の震源域に隣i接する丹波山地の微小地震カタログを,手法には点過程モデルを用いた.地震活動全体を「長期的なトレンド」「余震などのクラスター性」「月齢成分との相関」の3因子で表した.各因子は地球物理学および統計学の観点から鑑みて適当なパラメトリック関数で表し,月齢成分と地震活動との相関の有無,および相関の時間変動について調べた.その結果,兵庫県南部地震後,統計的に有意な相関が見られる一方で,兵庫県南部地震前には相関はないこと,また相関の強さは兵庫県南部地震直後に最も顕著でその後時間経過と共に減衰していくことが分かった.兵庫県南部地震の断層運動が,丹波山地の応力を増加させたことが他研究により既に指摘されている.このことと併せると,兵庫県南部地震後,応力状態が臨界状態に近づいた結果,地球潮汐による微小な応力変動に地震活動が反応するようになり,その後の地殻応力緩和の結果,相関の強度が減衰していったと解釈できる.さらに,上述の3因子をどのように組み合わせるべきかについても考察した.従来の研究では3因子の和で地震活動全体を表すモデルが提案されている.しかし,最近の地震学の知見からは,「トレンド」と「クラスター」の和に「相関」を掛け合わせるモデルがより適切である可能性が指摘されている.両モデルをやはり丹波山地の微小地震データへと当てはめモデル比較を行ったところ,後者のモデルが有意によいことが確かめられた.本研究は地球潮汐による応力変動と地震活動との関係を定量モデル化することで,地球潮汐以外の要因による応力変動に対する地震活動の変化について一層の理解を深め,地震発生予測の精度向上への貢献を目指すものである。地球潮汐による応力変動は様々な周期成分の足し合わせであり,ここでは特に月齢に相当する成分に着目している。今年度は,特定の関数型を仮定せずベイズ的な考え方に基づき,潮汐の月齢成分と地震活動との相関の時間変動を柔軟に捉えるための統計的手法の開発を行った。平成18年度の研究では,丹波山地の微小地震力タログにパラメトリックモデルを適用し,有意な相関の時間変動を見出すことが出来た。そこで,このデータを改めてベイズ的な手法で解析したところ,パラメ。トリックモデルを適用した場合と概ね同様の傾向を捉えつつも,地球物理的観点からよりもっともらしい時間変動の様相を得ることが出来た。この手法開発により,より広範な事例に対し,地球潮汐と地震活動との相関を検出出来るようになったという意義がある。また,地震活動解析においては,そのデータ(地震カタログ)の時間的な均一性がしばしば問題となる。特に大地震発生直後は,一時的に地震検出率が低下していることが知られているが,実際にどの程度の割合で地震が欠測しているかを定量的に調べた研究はない。そこで,やはりベイズ的なアプローチに基づき,滑らかかつ柔軟に地震検出率が時間変動するような統計的手法を用いて,欠測率を定量的に見積もった。一例として,グローバルな地震カタログへの適用を行ったところ,マグニチュード7以上の地震が起きると,半日から1日程度,全世界的に地震検出率が低下していることが確認出来た。但し,欠測率自体はさほど大きいものではなく,地震検出率低下の影響を無視しても地震活動解析において実際的な影響は殆どないことを示せたという成果があった。本研究は地球潮汐による応力変動と地震活動との関係を定量的にモデル化することで,地球潮汐以外の要因による応力変動に対する地震活動の変化について一層の理解を深め,地震発生予測の精度向上への貢献を目指すものである.地球潮汐による応力変動は様々な周期成分の足し合わせであり,本研究では特に月齢に相当する成分に着目している.

前年度までは今年度は,潮汐の月齢成分と地震活動との相関の時間変動に関する統計的手法の構築を行ってきたが,今年度はこれを時空間モデルへと拡張する試みを行った.モデル式が複雑であるがゆえに,ベイズ的な手法に基づくノンパラメトリックなアプローチにはコンピューターによる計算時間やメモリ量の限界があり,パラメトリックモデルへと立ち返り解析を行った.地震活動全体を,点過程モデルにより「長期的トレンド」「余震などのクラスター性」「月齢成分との相関」の3因子で表現するが,各因子が時間的だけでなく空間的にも変化するようなモデリングを行い,丹波山地の微小地震カタログへの適用を行った.実際の地震活動は空間的な不均一性が大きく,時間変動のみを考慮したモデルでは非常に狭い領域の地震データにのみ対象を限った解析を行うことが現実的である.しかし,本研究のように時空間モデルを適用することで,広域のデータを一度に解析することが可能となるという意義があると考えられる.さらに,昨年度行った,地震活動解析において問題の一つとなる地震カタログの均一性に関するベイズ的解析については,論文としてまとめ.出版することが出来た.
内外分泌連関に着目した膵島細胞増殖因子の解明とその治療的応用

これまで成熟個体の膵臓においてインスリンなどを分泌するβ細胞をはじめとした内分泌組織維持増殖に対する消化液を分泌する外分泌組織の関与が想定されてきたが、成熟個体での証明はされておらず、胎生期において唯一、我々がマウス胎生期において膵発生に必須の転写因子PDX1を用いた“内分泌細胞ー外分泌細胞クロストーク"を報告してきた。本研究では胎生期で示されてきた本クロストークの成熟個体における存在、意義を検討することを目的とする。成熟個体において転写因子PDX1を膵"外分泌細胞特異的"に強制発現させると、驚くべきことに内分泌細胞の増殖能が上昇し、強制発現後2ヶ月で巨大膵島を形成することが確認された。一方、外分泌細胞特異的にPDX1を欠失させたところ、糖尿病フェノタイプを示した。これらのことから成体膵内分泌組織の生理的維持においても外分泌組織由来因子による細胞非自律的制御機構が必要である事が明らかとなった。引き続きPDX1の強制発現モデルを用いて探索的にマイクロアレイによる膵外分泌細胞にて分泌上昇する因子の同定を試み、いくつかの候補遺伝子を同定した。さらに、成熟個体における本事象は遺伝子改変動物にて確認されたのみであったので、正常膵においてもそのようなメカニズムがあることを確認する必要があることから、マウス正常膵を三次元培養し、作成されたオルガノイドを用いて本候補物質を投与したところ、同様の現象が確認され、正常膵にも見られる現象であることの確認がされた。マウス成熟個体において内分泌と外分泌のクロストークを示す現象が示され、内分泌機能維持に外分泌細胞が必要であることを明らかとすることができた。現在、マイクロアレイにおいてクロストークを引き起こす原因分泌物質の候補同定が進んでいる。オルガノイドを用いた検討では、極めて重要なことに本事象が遺伝子改変動物だけではなく、正常膵においてもみられる事象であることが確認され、その意義について胎生期を含めて順調に検討が進められている。同定された、マウス成熟個体における内分泌外分泌クロストークを来す膵外分泌組織由来の候補遺伝子は、遺伝子改変マウスにおけるメカニズムにとどまらず、正常膵においても何らかの役割を果たしていることが明らかとなった。今後、増殖、血糖反応性といった機能性に対する膵内分泌細胞の反応を検討するとともにそのメカニズムを解明する。さらに、胎生期での発現について検討し、正常膵発生における候補遺伝子の膵内分泌細胞に対する意義を検討する予定である。胎生期マウスの解析のためのメスマウスの到着が遅れ、その分が次年度に繰り越す必要が生じた。次年度にはマウス胎生期における発現を確認する予定で使用する。
膵癌局所浸潤における微小環境構成因子としての脂肪組織についての解析

膵癌自然発生マウスモデルであるKPCマウスに高脂肪食を投与すると、内臓脂肪の増加と共に膵原発腫瘍の増大、遠隔転移の増加が見られた。膵癌細胞の脂肪組織内浸潤を再現した3D培養実験モデルでは膵癌細胞の紡錘状形態変化と、周辺組織の線維化亢進を認めた。膵癌細胞は脂肪細胞培養上清に含まれる遊離脂肪酸の影響によって細胞質内に脂肪滴を蓄積し、遊走・浸潤能の亢進を示した。膵癌細胞との間接共培養によって脂肪細胞は縮小し、上清中に含まれる脂肪酸は増加した。本研究の目的は、脂肪組織構成細胞と膵癌細胞との相互作用を明らかとし、膵外浸潤における新たな間質標的治療を確立することである。本年はまず、膵癌切除標本に付着した正常脂肪組織から脂肪組織由来幹細胞(ASCs)を樹立し、同一の切除標本から樹立した活性化型膵星細胞と比較することでその機能について解析した。脂肪細胞や骨芽細胞への分化誘導実験を行うことで、ASCsが間葉系細胞への多分化能を有していることを確認した。一方で、膵星細胞は脂肪細胞や骨芽細胞への分化能はみられなかった。ASCsは膵星細胞よりも増殖能は低く、遊走能は高かった。qRT-PCRで細胞外基質関連の遺伝子の発現を評価すると、ASCsは膵星細胞よりもコラーゲンIやフィブロネクチンの産生は低かった。TGFβ添加によるASCsの活性化を行うと、コラーゲンIの発現が増加した。また、間接共培養の系で、ASCsは膵癌細胞株であるSUIT2やPanc1の遊走能、浸潤能を亢進させた。マイクロアレイ解析によって、ASCsと膵星細胞の発現遺伝子の比較を網羅的に解析すると、ASCsはS100A4を高発現しており、膵星細胞と区別するマーカータンパクの候補であることが示された。また、ASCsのTGFβ添加実験でS100A4の発現は低下がみられ、ASCsは癌間質相互作用による活性化の過程でS100A4の発現が低下することが示された。以上から、脂肪組織由来幹細胞(ASCs)は膵外浸潤において、膵癌細胞の浸潤能亢進や脂肪組織の線維化に関わり、その活性化の過程でS100A4の発現変動がみられることを明らかとした。今後は、in vivoの実験によって、ASCsの癌関連線維芽細胞としての機能をさらにを明らかにする。脂肪組織由来幹細胞(ASCs)の樹立およびその分化能、増殖能、遊走能、基質産生能等の機能解析を行えた。さらに、マイクロアレイ解析にて、ASCsの発現遺伝子の網羅的な解析を行い、S100A4に着目した解析を行った。一方、in vivoでの実験や、ヒト膵癌切除本の免疫染色等による発現解析は行えていない。本年度は計画は概ね順調に進展している。本年はまず、膵癌自然発生マウスモデルであるKPCマウスに高脂肪食であるHigh fat dietを投与する実験を行い、内臓脂肪の増加が膵癌の浸潤転移に及ぼす影響を解析した。High fat dietはマウスに発生する膵原発腫瘍の大きさを有意に増加させ、更に遠隔転移も増加させた。このことから、内臓脂肪の増加は膵癌の浸潤転移に促進的な作用を及ぼすことが示唆された。次に、脂肪細胞が膵癌細胞に及ぼす影響を解析するため、in vitroで膵周囲脂肪組織浸潤を擬似的に再現した3D培養モデルをコラーゲンゲル包埋法によって作成した。マウスから採取した内臓脂肪は細かく切断してコラーゲンゲル内に埋めると少なくとも3週間はその形態が維持されることを確認した。脂肪組織を下層に、膵癌細胞を上層にそれぞれコラーゲンゲル内に埋めて2週間培養を行い、その組織学的な変化を解析した。すると、脂肪組織浸潤モデルではコントロール群と比較して、膵癌細胞は散在性かつ紡錘状の形態に変化し、その増殖能が低下することを同定した。また脂肪組織浸潤モデルでは、癌細胞周囲の線維化が亢進することも示され、膵周囲脂肪組織の線維化も重要であることが示唆された。以上から、膵周囲脂肪組織は膵癌細胞の形態や機能に影響し、線維化を伴いながら、腫瘍促進的な作用を及ぼしている可能性が示唆されたが、具体的にどの因子が癌細胞の機能に関与を解明していくのが次年度の課題である。本年度は膵癌自然発生マウスであるKPCマウスを用いた実験で有意な結果を得ることができた。また、in vitroのモデルとして3D培養による脂肪浸潤モデルを確立し、癌細胞と脂肪組織との相互作用をより生体に近い状態で解析することに成功した。新しい実験系を確立によって、脂肪組織の腫瘍促進的な作用を示すことに成功したため、本研究の進捗状況は概ね順調に進展していると言える。前年度までにIn vivoの実験において内臓脂肪の増加は膵癌の浸潤転移を促進し、in vitroの実験で膵周囲脂肪組織は膵癌細胞の形態や機能に影響し、線維化を伴いながら、腫瘍促進的な作用を及ぼしていることを明らかにした。脂肪細胞培養上清が膵癌細胞に与える影響についてさらに解析を進めると、脂肪細胞培養上清の添加によって膵癌細胞質に脂肪滴が蓄積されることが分かった。

脂肪細胞培養上清にはコントロールに比べてオレイン酸やリノレン酸、パルミトレイン酸などの脂肪酸が多く含まれており、中でもリノレン酸の添加は癌細胞内の脂肪滴を増加させ、遊走能、浸潤能を強く亢進することが分かった。In vivoにおける病理組織学的検討でも、膵癌細胞で脂肪滴の増加が確認できた。次に膵癌細胞が脂肪細胞に与える影響について解析するため、マウス内蔵脂肪から樹立した脱分化脂肪細胞(DFAT)をインスリン添加によって成熟脂肪細胞へ分化誘導した。樹立した成熟脂肪細胞と膵癌細胞を間接共培養すると、コントロールに比べて膵癌細胞共培養群では脂肪細胞のサイズが縮小し、脂肪細胞特異的マーカーであるホルモン感受性リパーゼ(HSL)やペリリピンの発現が低下することがわかった。ヒト膵癌切除標本の検討でも浸潤先端近傍にある脂肪細胞はその他の脂肪細胞に比べて明らかに小さく、癌細胞は脂肪細胞に対して脂肪分解を誘導し、脂肪酸の放出を促している可能性が示唆された。以上から膵癌細胞は脂肪細胞に対して脂肪酸の放出を誘導し、放出された脂肪酸、特にリノレン酸などを細胞内に取り込んで腫瘍浸潤や転移の促進に利用している可能性が示唆された。膵癌自然発生マウスモデルであるKPCマウスに高脂肪食を投与すると、内臓脂肪の増加と共に膵原発腫瘍の増大、遠隔転移の増加が見られた。膵癌細胞の脂肪組織内浸潤を再現した3D培養実験モデルでは膵癌細胞の紡錘状形態変化と、周辺組織の線維化亢進を認めた。膵癌細胞は脂肪細胞培養上清に含まれる遊離脂肪酸の影響によって細胞質内に脂肪滴を蓄積し、遊走・浸潤能の亢進を示した。膵癌細胞との間接共培養によって脂肪細胞は縮小し、上清中に含まれる脂肪酸は増加した。脂肪組織を構成する細胞は、脂肪細胞やペリサイト等も存在する。次年度は脂肪細胞の分化誘導方法や3次元の系での培養方法について確立を行い、脂肪組織浸潤の新たな浸潤機序について解析を進めていく予定である。特に、我々は局所浸潤における浸潤を先導するleading cellに関する研究も進めており、脂肪組織浸潤におけるleading cellの同定を3次元培養の系を用いて進めていく予定である。脂肪組織が膵癌細胞に及ぼす影響を更に解析するため、脂肪組織培養上清を作成し、それを添加した際の遊走能・浸潤能・増殖能の変化を解析する予定である。また、脂肪組織培養上清中の質量分析を行って、培養上清中の因子の中で癌細胞の機能変化に重要な因子を同定することを計画している。また、癌細胞が脂肪細胞に及ぼす影響についても解析するため、ヒトおよびマウスの脂肪組織由来幹細胞を初代培養・樹立し、成熟脂肪細胞への分化誘導を行う予定である。医歯薬学研究計画は順調に進展しており、資金を有効に使用できたため。本研究の進捗状況は概ね順調に進展しており、資金を有効に使用できたため。試薬類、抗体、培養用試薬、培養器具等培養用試薬、培養用器具、抗体、KPCマウス作成費用等
脳におけるニューロトロフィンの動態と機能の解析

ほ乳類のニューロトロフィンには4種類あることが知られており、それぞれのニューロトロフィンが時間的および空間的に異なった作用を担っていると考えられている。私たちは、これまでに確立した高感度酵素免疫測定系を用いて、脳由来神経栄養因子の合成促進剤について検索した。また、ニューロトロフィンの生物活性を阻害する抗体を調整し、これを脳室内投与し、観察される形態学的変化を調べ、脳におけるニューロトロフィンの機能解明を試みた。その結果、以下のことが明らかになった。1)生後7日齢のラット側脳室にニューロトロフィン-3抗体を投与すると、小脳における顆粒細胞の分裂阻害や細胞死とBergmannグリアの脱落が観察された。この効果は、前者が小葉特異的に観察されるのに対し、後者はすべての小葉で観察された。2)海馬における脳由来神経栄養因子の合成促進剤の大半は神経細胞死をも誘発したが、リルゾールは細胞死を誘発することなく、脳由来神経栄養因子の合成を促進した。3)リルゾールの連続投与は、海馬の顆粒細胞の脳由来神経栄養因子を高レベルに保つだけでなく、この栄養因子を介して成体海馬における神経細胞新生を促進することも判明した。本年度は、ニューロトロフィン-3(NT-3)抗体を生後7.5日齢のラット側脳室に投与することによりNT-3の機能の解明を試みた。その結果、NT-3抗体投与後の小脳の湿重量減少は、外顆粒層の分裂細胞数の減少とアポトーシスにより死にいたると推定される萎縮した顆粒細胞数の増加および内顆粒層のアポトーシスを起こしている顆粒細胞数の増加によることが明らかとなった。これらの所見は、小葉V-VIIIでおもに観察されたが、生後30日齢における内顆粒層形成の遅れと一致していた。さらに、小脳でNT-3濃度の高い小葉と、NT-3の欠損によって変化の生じる小葉が一致していた。この研究の進行過程において、NT-3欠損マウスの小脳で、小葉VII-VIIIのfoliationの形成不全が報告されたが、これは、これらの小葉における顆粒細胞の分裂低下で説明できた。また、アストログリアの細胞死が観察されることも報告されたが、NT-3抗体投与のアストログリアヘの影響は小葉1-VIIIで観察されることから、顆粒細胞に対するNT-3の影響とは明らかに違うことが判明した。これまでに、ラット脳において、痙攣誘発物質が脳由来神経栄養因子の合成を促進することを明らかにしてきた。本年度も、ひき続き、ラット脳における脳由来神経栄養因子の合成促進剤について調べた。脳由来神経栄養因子の合成は、神経細胞の活動に依存して活性化されると言われており、イオンチャネルによる制御が考えられた。そこで、本年度は、電位依存性イオンチャネルの活性化剤や阻害剤の効果について検討し、以下の結果を得た。1電位依存性カルシウムチャネルの活性化剤であるBay-K8644が、大脳皮質の神経細胞における脳由来神経栄養因子の合成を特異的に促進した。一方、阻害剤は、それ自身ではまったく影響しなかったが、活性化剤の作用を明らかに阻害した。2電位依存性ナトリウムチャネルの阻害剤であるリルゾールが、海馬顆粒細胞の脳由来神経栄養因子の合成を特異的に活性化した。さらに、リルゾールのグルタミン酸放出阻害作用に合成促進作用のあることが明らかになった。一方、活性化剤は影響しなかった。3電位依存性カリウムチャネルの阻害剤である4-アミノピリジンが、海馬と嗅内皮質の脳由来神経栄養因子合成を促進したが、リルゾールに比べるとその作用は弱く、不安定であった。活性化剤は、この場合も、それ自身ではまったく影響しなかった。電位依存性ナトリウムチャンネルの阻害剤であるリルゾールが海馬顆粒細胞における脳由来神経栄養因子の合成を促進することをすでに報告しているが、本年度は以下のことを明らかにした。1)リルゾールの連続投与は、海馬における脳由来神経栄養因子の高レベルを長期的に維持し、ニューロトロフィン-3のレベルを減少させた。一方、神経成長因子のレベルには影響しなかった。これらの変化は、シナプスにおける長期増強が誘発される状況と類似していた。2)リルゾールの連続投与は、海馬顆粒細胞の前駆細胞の分裂を促進した。

さらに、新たに新生した細胞の約9割が神経細胞に分化することが判明した。3)脳由来神経栄養因子の抗体をリルゾール投与ラットの脳室内に注入すると、前駆細胞の分裂阻害が観察され、前駆細胞の分裂における脳由来神経栄養因子の関与が示唆された。これらの結果は、リルゾールの連続投与が海馬の脳由来神経栄養囚子の上昇を介して、新生する顆粒細胞数を増加させることを示している。さらに、脳由来神経栄養因子の減少によっておきる記憶障害改善の足がかりになると考えられる。
高分子ゲルの分子論的研究

A.ポリビニルアルコ-ル(PVA)の小角中性子散乱(SANS)実験硼酸イオンを含むPVA水溶液のゾル-ゲル転移前後の小角中性子散乱実験を行い、濃度揺らぎの空間的広がりを示す相関長の温度および濃度依存性について系統的な実験を行った。その結果、ゲル状態では相関長ξは110A^^゚でほぼ一定であるが、温度の上昇に伴って系がゾル化すると次第に減少することが認められた。またゲル状態における実測散乱強度関数I(q)(qは散乱ベクトルの絶対値)は強度をI(q)/Cξ^3で、qをqξで規格化することにより普遍関数化できることを示した。ここでCはPVA濃度である。これよりゲルの構造は、互いに空間相関のない大きさξ程度のクラスタ-が密に集合し、そのクラスタ-内ではフラクタル次元D<3)をもつ枝別れ分子として記述できることを示した。またPVAの固相押しだしフィルムでは延伸倍率が約5倍程度までPVA分子がアフィン的に延伸されていることが認められた。B.PVAー硼酸イオン水溶液の相分離挙動とゾル-ゲル転移毛細管粘度計によるPVAー硼酸イオン水溶液の粘度測定と相分離挙動の観察より、孤立分子鎖の広がりとゲル化の前駆現象および相の安定性の研究を行った。その結果、(1)あるPVA濃度(C*;分子が絡み合いを始める濃度)以上で硼酸濃度の上昇とともに透明ー白濁ー透明転移が見られること、(2)極限粘度は硼酸濃度の上昇とともに一旦減少し、その後上昇すること、(3)PVA濃度が充分高いときには、系が白濁(相分離)する事なく可逆的なゾル-ゲル転移が観察されることなどがわかった。これらは、すべてPVA分子と硼酸イオンとの化学平衡、PVA分子鎖に結合した硼酸イオン間の静電相互作用、およびPVAと溶媒間の相互作用により理論的に説明されることを示した。C.強制レ-リ-散乱法(FRS)による拡散測定2)一方では、Poly(2ーhydroxyethyl methacrylate)(PHEMA)の2ーbutanol溶液のゲル化過程を蛍光偏光解消法によって追跡した結果、試験管傾法で観測されたゾル-ゲル転移温度付近の領域において、PHEMA鎖にラベルしたアントラセンの回転緩和時間の発散が見られた。水素結合の切断試薬として知られているformamideを約1wt%の濃度で溶液に展開した場合、ゾル-ゲル転移が消減したことが観測された。これらの結果はformamideの存在下での音速の増大と吸収係数の低下の結果と定性的に一致している。D.二様分子量分布をもつ高分子網目のシミュレ-ション複分散高分子網目の物理的性質とその局所構造との関係を解明するために、2次元正方格子および3次元正方格子上の複分散網目をコンピュ-タ-シミュレ-ションにより作成し、それらの統計的解析を行った。その結果、架橋点の官能性の大小は網目構造に大きく影響すること、モデル複分散網目は多くの網目欠陥を持ち、実際の架橋ゴムの網目構造の種々の特微を再現していることが、確認された。C.強制レ-リ-散乱法(FRS)による拡散測定2)一方では、Poly(2ーhydroxyethyl methacrylate)(PHEMA)の2ーbutanol溶液のゲル化過程を蛍光偏光解消法によって追跡した結果、試験管傾法で観測されたゾル-ゲル

転移温度付近の領域において、PHEMA鎖にラベルしたアントラセンの回転緩和時間の発散が見られた。水素結合の切断試薬として知られているformamideを約1wt%の濃度で溶液に展開した場合、ゾル-ゲル転移が消減したことが観測された。これらの結果はformamideの存在下での音速の増大と吸収係数の低下の結果と定性的に一致している。D.二様分子量分布をもつ高分子網目のシミュレ-ション複分散高分子網目の物理的性質とその局所構造との関係を解明するために、2次元正方格子および3次元正方格子上の複分散網目をコンピュ-タ-シミュレ-ションにより作成し、それらの統計的解析を行った。その結果、架橋点の官能性の大小は網目構造に大きく影響すること、モデル複分散網目は多くの網目欠陥を持ち、実際の架橋ゴムの網目構造の種々の特微を再現していることが、確認された。
牧畜文化解析によるアフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明とその現代的動態の研究

家畜文化を有したアフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明が人類文明発展の中心にあった。家畜は蛋白資源生産(肉、乳、毛、皮)に止まらない。化石エネルギー使用以前人類が利用しうる最大の自然パワーであった。移動・運搬手段として長距離交易と都市文明を可能にし、政治軍事手段としては巨大帝国形成を可能にした。これにより、旧大陸内陸部にグローバルな乾燥地文明が形成された。しかしこの文明は内的に多様であり、4類型にわけられ。1ウマ卓越北方冷涼草原、2ラクダ卓越熱帯砂漠、3小型家畜中心山地オアシス、4ウシ中心熱帯サヴァンナ、である。しかし海洋中心の西洋近代文明、化石燃料時代の到来とともに、乾燥地文明は衰退する。本研究は、アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明を牧畜文化の4類型に注目して、その内的構造と歴史変化を明らかにすることを目的とする。そのために以下5項目の研究計画を実施した。(1)海外研究協力者4名をふくめた全体集会が3回名古屋大学で開催された。その結果、「アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明」という新文明概念がアフロ・ユーラシア内陸乾燥地域の研究者に広く共有されることになった。その内的多様性が同時に確認され、この詳細を明らかにすることが、今後の研究課題となった。全体集会には、予定の海外研究者以外に、フィンランド大学、イリノイ大学、中国中央民族大学、モンゴルのウランバートル大学の研究者が参加し、海外研究者が参加しやすい海外研究集会開催はかるべしという提案もあり、国際学会への反響が大きかった。(2)4類型地域対象に、のべ18回に及ぶ海外調査が行われ、地域別専門別に研究プロジェクト発展させるという第3の研究項目の計画もすすんだ。(4)(5)研究成果の公表に関しては、現在国際的な編集委員会を組織して準備中である。しかし、中国昆明で開催された第16回国際人類学・民族学学術大会に、嶋田を座長として、Afro・Eurasian Inner Dry land Civilizationの名前で、9名のプロジェクトメンバー(4名は海外研究協力者)によるパネル発表を開催できた。研究成果はこのほか、今村編集責任の『文化人類学』誌の「人類史再構築特集」(嶋田は「アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明の4類型」を寄稿)、池谷和信編著『地球環境史からの問い』(嶋田、縄田寄稿)(岩波書店)、楊海英『墓標なき草原』上下(岩波書店)、布仁青格勒『『オルドス民謡(グル・ドー)について初期探索』(蒙古語)』(モンゴル教育出版社)、縄田、鷹木、石山、児玉らによる『沙漠辞典』(丸善)などの、著作によっても公表された。本研究は、アフロ・ユーラシア大陸中央に広がる「アフロ・ユーラシア内陸乾燥地」に成立した文明を生態、社会、歴史、文化の観点から、以下の4類型にわけて比較検討することを目的とする。I.冷帯草原型乾燥地文化研究,II.熱帯砂漠型乾燥地文化研究,III.熱帯サヴァンナ型乾燥地文化研究,IV.山地オアシス型乾燥地文化,V/乾燥地文明の生態・地理学的基礎の通文化的研究。このために16名のメンバーがそれぞれ分担分野の海外調査をおこない、3回の国際シンポジウムを開催した。1.モンゴル乾燥地文化とモンスーン文化2010年7月1213日。2.サハラ文明2010年12月22-24日。3.変化中の乾燥・半乾燥地域の生態と文化2011年2月27-28日。さらに、嶋田、池谷、縄田、ブレンサイン、平田、児玉らは海外国際学会の研究発表をこなった。研究成果の出版活動も、代表の嶋田は『黒アフリカ・イスラーム文明論』(創成社)によって熱帯サヴァンナ文明をイスラーム文明の観点から論じ、今村は『砂漠に生きる女たち』(どうぶつ社)で、カラハリ狩猟採集民の女性の日常と儀礼を論じ、池谷はアフロ・ユーラシア地域の家畜文化、平田は発酵乳文化を概観する連載を開始した。特筆すべきは、楊海英が社会主義時代中国のモンゴル牧畜民がうけた過酷な政治弾圧を描いた『墓標なき草原(上・下)』(岩波書店2009)で、14回司馬遼太郎賞をを受賞したことである。これは、中国問題と言う以上に、近代における牧畜民の共通の運命を考える上で、世界的にも貴重な貢献である。このほか、星野によるアフロ・ユーラシア乾燥地域の衛星画像にる水系データ収集、坂田によるアフロ・ユーラシアの家畜統計分析、また嶋田今村によるアフロ・ユーラシア文明の写真・映像、音楽データ収集、中川原による中央アジア動物彫刻・画像の収集、縄田・石山・中村によるオアシス・マングローブ・ラクダ文化資料の収集もすすんだ。平成23年度は、こうした2年間の研究蓄積の出版に全力をあげる。本研究は、アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明を4類型にわけ、その内的構造と歴史動態の解明を目的とした。

本年の成果は以下の如し。1.3年間の研究成果を、アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明研究3巻(1巻はイタリアなど4ケ国海外研究書と日本人研究者による欧文論集)と、アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明研究叢書4巻を発刊:児玉香菜子『内モンゴル牧畜民の現代的変容状況における「砂漠化」と「脱社会主義政策」』、楊紅『現代満州族シャーマニズムの研究』、中山千冬『アフリカ文学と西洋文明』、水谷徹哉『キブツ・サマール』。2.雑誌論文は86本(査読43本)、学会発表65(招待3)、図書12。3.国際セミナー「岩絵のメッセージ:遊牧・牧畜民の信仰と宗教」「西アフリカイスラーム文明」を開催。嶋田、今村、児玉、星野、サコは第二回オックスフォード砂漠会議(オックスフォード大学)で研究発表し、海外砂漠研究者との共同研究推進に合意。このほか、国際セミナー参加と主催は多数あった。4.分野別研究も旺盛であった。冷帯草原型文化研究:児玉5本、ブレンサイン3本、大野(楊)4本。昨年司馬遼太郎賞受賞の大野は、本年も『続墓標なき草原』により社会主義時時代中国の過酷な牧畜民弾圧史を明らかにした。児玉論文は改革開放時代の牧畜民動態研究。熱帯砂漠型乾文化研究:縄田4本、中村3本、石山2本、今村5本によるラクダ文化解明。熱帯サヴァンナ型文化:サコ住文化論4本、石山1本。山地オアシス型文化:鷹木5本、中川原3本。乾燥地の通文化的研究:平田乳文化論21本、星野環境分析18本、坂田ラクダ研究2本。平田はアフロ・ユーラシアの乳文化論を展開し、新フード・インダストリー誌にて乳文化論を13回連載。池谷も獣医畜産新報に「人と家畜のエピソード」を12回連載。星野も生態学エッセイを酪農ジャーナルに12回連載。5.大学院生の研究参加による若手研究者育成もすすんだ。本年の研究成果は論文総数42本、書籍30冊に及んだ。本年の課題アフロ・ユーラシア中央部研究推進は、本研究の「叢書」4巻と「研究」4の発刊、5回の国際シンポジウム・Wショップ開催により試みられた。叢書8.大野編『中央ユーラシアにおける牧畜文明の変遷と社会主義」、10.児玉、サランゲレル他編『極乾内モンゴル・ゴビ砂漠、黒河オアシスに生きる男たち23人の人生』、国際シンポジウム7.「アフロ・ユーラシア内陸乾燥地文明総合シンポジウム」、8.「岩絵文化と人類文明の形成」、9.「中国北部辺境地域における多民族地域社会の再編」、Wショップ7.「ユーラシア乾燥地における遊牧民の定住化と社会主義」などである。全体として、モンゴル近代文化史、中央アジア文化、中東・サハラ文化研究に成果が得られた。モンゴル文化研究では、大野の『中国とモンゴルのはざまで』と『モンゴル人ジェノサイドに関する基礎資料』、6.ブレンサインの『戦前期モンゴル社会関連実態調査資料集成』第一部が注目される。中央アジア研究では、社会主義、岩絵文化に注目するとともに、カザフ考古学の碩学R.Sala教授、新疆の研究者を招聘し共同研究の基礎を得た。
シリル化求核性モノマーを用いる縮合系高分子の合成

本研究では、シリル化された求核性モノマーを用いる縮合系高分子の新規な合成法としてシリル化法を確立するために、以下の研究テーマについて検討した。1.N-シリル化芳香族ジアミンを用いる有機ポリマー/無機ハイブリッドの合成法の開発まず、N-シリル化芳香族ジアミンと6-置換1,3,5-トリアジンジクロリドの重縮合により、シリルクロリドを脱離しながら容易に高分子量の芳香族ポリグアナミンが生成する。この重縮合は中性条件下で高分子量のポリマーを容易に与えるため、従来法と比較して優れた合成法である。このシリル化法をゾル-ゲルプロセスによるポリマー/シリカ複合体(ハイブリッド)の合成に応用することができる。つまり、N-シリル化芳香族ジアミンとアルコキシシリル基置換トリアジンジクロリドの重縮合によりアルコキシシリル基を側鎖に有する芳香族ポリマーを合成し、次いで、このポリマー存在下でテトラエトキシシランのゾルーゲル反応を行い、ポリマーマトリックス中にシリカ微粒子が共有結合を介して均一に分散した有機ポリマー/無機ハイブリッドを容易に合成できることを明らかにした。2.N-シリル化脂肪族ジアミンを用いる脂肪族系ポリイミドの合成法の開発まず,N-シリル化脂肪族ジアミンとテトラカルボン酸二無水物の重付加により,高分子量のポリアミド酸シリルエステルが容易に生成した。このシリル化前駆体ポリマーを加熱イミド化することで、脂肪族系ポリイミドを得ることができた。さらに,シリル化剤を重合系に添加させるin-situシリル化法を新たに開発し,脂環式ポリイミドをより簡便に合成することができた。以上のように,N-シリル化ジアミンを用いるシリル化法により,従来法に比べてより簡便に有機ポリマー/無機ハイブリッドや脂環式ポリイミドを合成することができ,さらにシリル化法の改良法としてin-situシリル化法を開発することができた。N-シリル化アミン類を求核性モノマーとして用いることにより、ポリアミド、ポリアゾール、ポリアミン、ポリイミドおよびポリ尿素などの縮合系高分子を簡便に合成できることを明らかにしてきた。そこで、シリル化求核性モノマーを用いる縮合系高分子の合成研究の一環として、本研究では、N-トリメチルシリル化第一級アミンとビスエポキシ化合物の重付加反応により新規なポリアミンを合成し、その特性を明らかにすることを目的とした。まず、ポリマー合成のためのモデル反応として、N-トリメチルシリル化第一級アミンとエポキシ化合物の付加反応を検討した。エポキシ環の開環の際にトリメチルシリル基が親和性の高い酸素原子に移動して、トリメチルシロキシ基を有するアミン化合物が生成することを見いだした。次に、このモデル反応に基づき、N-トリメチルシリル化第一級アミンとビスエポキシ化合物の重付加反応を検討した。その結果、トリメチルシロキシ基を側鎖に有する綿状の新規なポリアミンを得ることができた。N-シリル化第一級脂肪族アミンを用いた重付加は150°Cで良好に進行したが、N-シリル化第一級芳香族アミンを用いた場合は反応性が低いために200°Cの重合温度を必要とした。ポリアミンの固有粘度は0.30.5dL/gであり、重量平均分子量は23万である。このポリマーはテトラヒドロフラン、クロロホルムおよびトルエンなどに可溶であり、無色透明なキャストフィルムを作製することができた。フィルム表面の水の接触角は90度付近であり、ガラス転移温度は4050°Cであった。

ポリアミンは側鎖に非極性基であるトリメチルシロキシ基を有しているために、有機溶媒可溶性、疎水性および低いガラス転移温度を示すことが明らかとなった。脂肪族ポリイミドは,芳香族ポリイミドに比べ耐熱性に劣るものの,分子間電荷移動錯体を形成しないため着色しにくく,高い光透過性を示し,光学用電子材料として注目されている。しかし,テトラカルボン酸二無水物と脂肪族ジアミンを用いる従来の合成法では,前駆体ポリマーであるポリアミド酸のカルボキシル基とジアミンモノマーが反応して溶媒に不溶な塩が生成し,重合が均一溶液で進行しないため,高分子量の脂肪族ポリイミドが得られないという問題があった。そこで,本研究では,上記の問題点を解決するために,脂肪族ジアミンの代りにN-トリメチルシリル化脂肪族ジアミンを用いて,芳香族テトラカルボン酸二無水物と重付加を行い,得られたポリアミド酸トリメチルシリルエステルを加熱することにより,脂肪族-芳香族ポリイミドを合成し,その特性を明らかにした。N,N′-ビス(トリメチルシリル)へキサメチレンジアミンと芳香族テトラカルボン酸二無水物の重付加反応は,均一な重合溶液で進行し,高分子量のポリアミド酸シリルエステルが得られることを見いだした。このポリマー溶液を250°Cで加熱イミド化することによって,容易に脂肪族-芳香族ポリイミドを得ることができた。エーテル基,スルホン基およびヘキサフルオロイソプロピリデン基を有するポリイミドは,有機溶媒に可溶であり,透明で柔軟なキャストフィルムを与える。このフィルムは120165°Cのガラス転移温度を有し,350nm600nmの可視光領域に吸収がなく,光透過性が良好であった。以上のことから,本研究で開発したシリル化法は,脂肪族ポリイミドの優れた合成法であることが明らかとなった。N-シリル化アミン類は有機ケイ素化合物の中で反応性に富む求核剤であり,カルボン酸クロリド,カルボン酸無水物,イソシアナート,エポキシドなどの求電子試薬と反応することを応用して,ポリアミド,ポリイミド,ポリ尿素,ポリアミンが合成できることを既に見いだしている.そこで,本研究では,本シリル化法が縮合系高分子の有用な合成であることを明らかにするために,活性な芳香族ジハライドである6-置換-1,3,5-トリアジン-2,4-ジクロリドとN-シリル化芳香族ジアミンとの重縮合により,芳香族ポリアミン(ポリグアナミン)の合成を検討した.脂肪族アミノ基および芳香族アミノ基を有するトリアジンジクロリドとN,N'-ビストリメチルシリル化
マクロファージにおける細胞死制御機構とその生理的意義

細菌感染によって活性化したマクロファージはしばしば細胞死を起こす。マクロファージの細胞死は病原体と宿主の両方によって複雑に制御されており、細胞死が宿主にとって有益となるか害となるかは、感染した病原体の種類や状況によって異なる。未だ不明な点の多いマクロファージの細胞死制御機構を詳細に理解することは、感染症や敗血症の新規治療法開発に役立つ。本研究では独自の切り口でその解明に取り組み、アダプタータンパク質TAB2が、グラム陰性細菌の細胞壁成分LPSを認識したマクロファージの過剰な活性化を抑えるために必須の役割を果たすことを明らかにした。感染症や敗血症などの新規治療法開発に繋がる基盤的知見を得るため、TAK1結合タンパク質TAB2による活性化マクロファージの細胞死制御機構の解明に取り組んだ。平成25年度は、Tab2欠損骨髄由来マクロファージ(Tab2KO BMDM)にLPS刺激を与えるとアポトーシス様の細胞死に陥ること、この時、TAB2/TAK1の下流で働くp38 MAPKおよびIkappaBの活性化は正常に起こることを確認した。また、TLR4以外のパターン認識受容体を活性化させた場合の影響を調べるため、Tab2KO BMDMをPam3CSK4, poly I:C, C12iE-DAP, L18 MDPで刺激したところ、poly I:C刺激の場合のみ、LPSと同程度に細胞死が起こることを見いだした。したがって、ここで見ているTab2KO BMDMの細胞死はTRIF依存的に起こっている可能性が示唆される。さらに、TAB2による活性化マクロファージの細胞死制御が敗血症の予防に役立つかどうかを調べるために、マクロファージ/顆粒球特異的コンディショナルノックアウトマウス(Tab2-mKO)を作製した。予備実験として、野生型とTab2-mKOそれぞれ4匹ずつにLPSを腹腔内投与したところ、投与から24時間以内に全例が死亡した。この実験では、野生型とTab2-mKOとの間に差は認められなかった。今後、十分な戻し交配を重ねた上で再度実験する予定である。以上の結果の一部を、2014年2月に米国で開催された国際学会(キーストンシンポジウム、開催地:ニューメキシコ州サンタフェ市)にてポスター発表した。これまで、Tab2欠損骨髄由来マクロファージ(以下、Tab2KO BMDM)が、LPS刺激に応答してプログラム細胞死を引き起こすことを独自に見いだしていたが、その分子メカニズムは不明であった。最終年度の研究から、Tab2KO BMDMはLPS刺激に応答して成熟型IL-1bを産生することが明らかとなった。その際、Caspase-1とCaspase-11の活性化が認められたことより、canonicalまたはnon-canonicalインフラマソームの活性化が起こっていることが示唆される。腸管病原性大腸菌EPECのエフェクタータンパク質NleEがTAB2を阻害することから、Tab2KO BMDMのLPSに対する応答はEPEC感染に対抗する生体防御反応であると仮定し、EPEC野生株をBMDMに感染させて培養上清中のサイトカイン量を測定したところ、Tab2KO BMDMでは正常BMDMに比べて高いレベルでのIL-1bの産生が認められ、一方、TNFaとIL-6の産生量は正常BMDMに比べて低下していた。これらのことから、TAB2は通常ではインフラマソームの負の制御因子として働き、EPECなどの病原体感染によってその働きが阻害されると、"Signal 2"非依存的にインフラマソームを活性化させる非常ベルのような役割を果たしていると推測される。今後の課題は、貪食細胞特異的Tab2KOマウスを作製して敗血症におけるTab2の役割を明らかにすることと、正常BMDMにおけるTAB2の詳細な作用機序を分子レベルで解明することである。自然免疫Tab2KOマクロファージがLPS依存的にアポトーシス様の細胞死に陥ることを確認し、そのメカニズムとしてTRIF依存的な機構が働いている可能性を見いだしたことは大きな前進であった。コンディショナルノックアウトマウスの作製からスタートしたin vivoの実験についても、初年度中に予備実験まで行うことができた。国際学会での発表を当初予定より前倒しして平成25年度に行った。全体として当初の計画以上に進展している。最近、マクロファージにおけるLPS誘導性の細胞死にTRIF-Caspase11経路が関与することが報告され、注目を集めている。Tab2KO BMDMのLPS依存的な細胞死にこの経路が関わっているかどうかを明らかにするため、Tab2, Trif二重欠損マウスまたはTab2, Caspase11二重欠損マウスを作製して、in vitroの実験を行う。

in vivoの実験に関しては、まずは十分な戻し交配を重ねた上で検証を行うことが最優先事項であるが、TAB3がTAB2の機能を代償している可能性も考えられるので、Tab2,Tab3二重欠損のコンディショナルノックアウトマウスも作製して解析を行う。研究が当初の計画以上に進展し、国際学会での発表を1年前倒しで行った。また、計画では実験動物の飼育にかかる費用を物品費として計上していたが、実際には「その他」の項目で支出した。これらの変更があり、本年度所要額と実支出額に若干の差が生じた。次年度においても細胞培養試薬等の消耗品を必要とするので、物品費の一部として使用する計画である。
世界的ツバキ名花‘玉之浦’における覆輪形成のエピゲノム制御機構解明

まず,初年度にゲノムウォーキング法によって得られたCHSプロモーター領域の増幅産物(3,400bpおよび2,900bp)のシークエンス解析を行ったところ,いずれもCHSプロモーター領域ではないことが判明した.そこで,新たにプライマーを作成してゲノムウォーキング法を実施したところ,約1000bpの増幅産物を確認でき,シークエンス解析の結果から,CHSプロモーター領域であることがわかった.これまでにCHS遺伝子の上流から943bpまでの塩基配列を決定している.また,プロモーター領域の解析の結果,多数のCpGサイトを確認したが,CpGアイランドは存在していないことがわかった.次に,培養花弁への低温処理およびケミカル処理が覆輪形成に及ぼす影響について調査した.11月上旬,11月下旬,12月中旬に採取した花蕾から花弁を切り出してショ糖を含む液体培地に浸漬し,3日間1か月間の5°C低温処理を行った後に20°Cで10日間培養し,覆輪形成を調査した.その結果,低温処理期間,処理時期による覆輪幅の差異は認められなかった.また,異なる濃度のアザシチジン(脱メチル化剤),ピリミジン系薬剤処理が覆輪形成に及ぼす影響についても調査したが,処理による覆輪幅への影響は認められなかった.さらに,覆輪(白色)部におけるCHS遺伝子の発現抑制について,RNAiによるPTGS(post transcriptional gene silencing,転写後ジーンサイレンシング)の可能性について検討した.PTGS抑制効果が報告されているCMV(キュウリモザイクウイルス)感染が,花弁覆輪形成に及ぼす影響について調査した結果,CMV接種個体に,覆輪幅が極めて狭い花の着生が認められた.このことから,`玉之浦'花弁覆輪部におけるCHS遺伝子の発現抑制は,転写後ジーンサイレンシングによって起こっている可能性が示唆された.研究進捗をふまえて一部の計画内容を見直したが,研究目的達成に向けて概ね順調に進展している.前年度,塩基配列を決定したCHSプロモーター領域に着目し,花弁の白色部位と赤色部位から抽出したDNAを供して,バイサルファイト法により白色部位と赤色部位におけるメチル化程度を比較するとともに,転写因子の発現量の解析を行う.あわせて両部位についてMSAP法によるメチル化程度の比較も試みる.前年度の実験では,CMV接種個体において「覆輪が狭くなった花」と「対照と同程度の覆輪幅の花」とが混在していた.本年度は接種前の個体,接種後の個体,各花におけるCMVの有無について調査し,花ごとのCMV感染と覆輪形成との関連について調査する.以上の結果をもとに,`玉之浦'における覆輪形成のエピゲノム制御機構について総括し,環境依存型覆輪形成現象に関与するエピゲノム制御機構を明らかにする.まず,CHS遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を決定するために,アダプターPCR法を実施した.制限酵素DraI,EcoRV,PvuII,StuIで消化した`玉之浦'のゲノムDNAを用いて,アダプター配列特異的プライマーとCHS遺伝子配列特異的プライマーでPCRを行った結果,PvuIIで消化したDNAでのみ2つのバンドが検出された.さらに,それぞれのPCR産物でNested PCRを実施したところ,PvuIIでのみ約3400bpと約2900bpにバンドが検出された.次に,花芽発達期の低温処理が覆輪形成に及ぼす影響について調査した.11月10日(花蕾内の花弁着色開始期)以降の全期間を20°Cファイトトロンで栽培した場合に,覆輪割合が最も大きかったのに対し,11月10日から1か月および3か月の低温処理を行った後に20°Cファイトトロンで栽培すると覆輪割合が小さかった.花弁着色が進行したと思われる1月10日から1か月間の低温処理を行っても覆輪割合が大きかったことから,1月上旬までに覆輪幅は決定されており,その後の低温によって変化することはないことが示唆された.温度と光が覆輪形成に及ぼす影響を明らかにするため,in vitroで花弁培養を行った.花蕾を採取し,向軸側から3枚の花弁を取り出して,15°C,20°C,25°Cの明条件および25°Cの暗条件下で10日間の10%ショ糖溶液による培養を行った.培養後はいずれの処理区でも花弁幅は広くなり,温度が高い方がより広くなる傾向にあった.また,15°Cおよび20°Cでは覆輪幅が狭まったが,25°Cでは培養前後に有意な差は認められなかった.花弁幅に対する覆輪幅の比は花弁培養後に小さくなる傾向にあったが,処理区間での明確な比率の差異は認められなかった.いずれの実験も概ね計画通りに進捗しており,引き続き計画通りに研究を進める予定である.まず,初年度にゲノムウォーキング法によって得られたCHSプロモーター領域の増幅産物(3,400bpおよび2,900bp)のシークエンス解析を行ったところ,いずれもCHSプロモーター領域ではないことが判明した.そこで,新たにプライマーを作成してゲノムウォーキング法を実施したところ,約1000bpの増幅産物を確認でき,シークエンス解析の結果から,CHSプロモーター領域であることがわかった.これまでにCHS遺伝子の上流から943bpまでの塩基配列を決定している.また,プロモーター領域の解析の結果,多数のCpGサイトを確認したが,CpGアイランドは存在していないことがわかった.

次に,培養花弁への低温処理およびケミカル処理が覆輪形成に及ぼす影響について調査した.11月上旬,11月下旬,12月中旬に採取した花蕾から花弁を切り出してショ糖を含む液体培地に浸漬し,3日間1か月間の5°C低温処理を行った後に20°Cで10日間培養し,覆輪形成を調査した.その結果,低温処理期間,処理時期による覆輪幅の差異は認められなかった.また,異なる濃度のアザシチジン(脱メチル化剤),ピリミジン系薬剤処理が覆輪形成に及ぼす影響についても調査したが,処理による覆輪幅への影響は認められなかった.さらに,覆輪(白色)部におけるCHS遺伝子の発現抑制について,RNAiによるPTGS(post transcriptional gene silencing,転写後ジーンサイレンシング)の可能性について検討した.PTGS抑制効果が報告されているCMV(キュウリモザイクウイルス)感染が,花弁覆輪形成に及ぼす影響について調査した結果,CMV接種個体に,覆輪幅が極めて狭い花の着生が認められた.このことから,`玉之浦'花弁覆輪部におけるCHS遺伝子の発現抑制は,転写後ジーンサイレンシングによって起こっている可能性が示唆された.研究進捗をふまえて一部の計画内容を見直したが,研究目的達成に向けて概ね順調に進展している.プロモーター領域の塩基配列を決定するために,ゲル抽出によって得られたPCR産物を用いてダイレクトシークエンス解析を行う.配列決定後,花弁の白色部位と赤色部位から抽出したDNAを使用し,バイサルファイト法により白色部位と赤色部位におけるメチル化程度を比較する.花蕾内の花弁着色初期の温度処理による覆輪幅の制御が可能であることが判明したことから,この実験系を使って花弁外縁部と地色部におけるCHS遺伝子の発現量およびメチル化程度の比較を行う.In vitro実験では,覆輪形成に及ぼす温度条件について再度検討するとともに,ケミカル処理を行い,覆輪形成幅の制御を試みる.前年度,塩基配列を決定したCHSプロモーター領域に着目し,花弁の白色部位と赤色部位から抽出したDNAを供して,バイサルファイト法により白色部位と赤色部位におけるメチル化程度を比較するとともに,転写因子の発現量の解析を行う.あわせて両部位についてMSAP法によるメチル化程度の比較も試みる.前年度の実験では,CMV接種個体において「覆輪が狭くなった花」と「対照と同程度の覆輪幅の花」とが混在していた.本年度は接種前の個体,接種後の個体,各花におけるCMVの有無について調査し,花ごとのCMV感染と覆輪形成との関連について調査する.以上の結果をもとに,`玉之浦'における覆輪形成のエピゲノム制御機構について総括し,環境依存型覆輪形成現象に関与するエピゲノム制御機構を明らかにする.交付申請書作成後に,研究分担者との研究内容の打ち合わせを行った結果,2年目以降の必要経費が当初見込みよりも大きくなることが予想されたことから,初年度の実験内容を一部見直し,経費の節減に努め,研究計画の効率的な遂行に努めた.研究実施期間中に,研究分担者との研究の進捗に関する情報共有を行った上で,今後の研究内容に関する打合せを行った結果,3年目の必要経費が当初見込みよりも大きくなることが予想されたことから,本年度の実験内容を一部見直し,経費の節減に努め,研究計画の効率的な遂行に努めた.