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X線結晶学による生物発光の分子機構に関する研究

本研究では,発光細菌Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼおよびFP_<390>を対象としてX線結晶解析を行い,それぞれの三次元構造を決定することを目的とした.Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼについては,結晶化条件の精密化を,補欠因子を含まないアポ酵素,FMNを補欠分子として含むホロ酵素,酵素,基質生成物複合体について行ったが,X線構造解析に用いるに十分な結晶は得られなかった.FP_<390>については,シンクロトロン放射光を用いて測定した3Å分解能の回折データに基づいて,分子置換法を適用することによって結晶構造の解析に成功した.さらに分解能を上げて6.02.7Åの反射に対して結晶構造の精密化を行い,最終モデルの結晶学的R値は24.0%である.FP_<390>の全体構造の特徴は,モノマー2分子が非結晶学的2回軸で関係づけられてダイマー構造をとっていることである.Q-フラビンは各モノマーにつき2分子存在し,それぞれN末端近くの分子表面とダイマーの分子境界付近に位置している.ルシフェラーゼのβサブユニットのアミノ酸残基と相同性が高い領域は2カ所に分類できるが,そのうちの1カ所は分子境界のQ-フラビンに接近している.分子境界に存在するQ-フラビンではFMNのリビチル基が溶媒領域に突きだし,ミリスチン酸部分がタンパク質分子の内部に入り込んでいる.電子密度図上ではミリスチン酸部分がはっきりと見え,カルボニル酸素はイソアロキサジン環のRe面側へ,脂肪酸鎖はSi面側へ伸びている.一方,分子境界付近のQ-フラビンの場合では電子密度図上でFMN部分が比較的はっきりと見えるが,ミリスチン酸部分は非常にあいまいで,イソアロキサジン環に対する配置を特定できていない.このような電子密度が現れる理由として,分子境界のQ-フラビン結合部位に2種類のQ-フラビン(ミリスチン酸のイソアロキサジン環との結合部位が異なるQF_1とQF_2)が混在する可能性があげられる.ルシフェラーゼの反応において、副生成物,QF_2の生成を避けることができないとすれば,FP_<390>モノマー内に2カ所存在するQ-フラビン結合部位の役割はそれぞれ異なっており,分子境界のQ-フラビン結合部位は副生成物,すなわちQF_2を収納しておく場所であると考えることができる.(1)生物界に広くみられる発光現象の反応の分子機構で中枢的役割を果たしている酵素ルシフェラーゼについては、これまでその三次元立体構造は明らかにされていない.また,ある種の発光細菌において,ルシフェラーゼがコードされているLuxオペロンに,その機能が不明なフラビンタンパク質(FP390)の遺伝子(luxF)が存在し,このEP390はルシフェラーゼβサブユニットとの相同性が高い.本研究では,発光細菌Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼおよびFP390を対象としてX線結晶解析を行い,それぞれの三次元構造を決定することを目的としている。(2)ルシフェラーゼについては,結晶化の予備実験によって微結晶が得られていたので,X線構造解析に適する大きさの結晶を得るために,多種類の沈殿剤を用いることなどを含めた結晶化条件の精密化を行った.この結晶化条件の検討は,補欠因子を含まないアポ酵素,FMNを補欠分子として含むホロ酵素,酵素-基質生成物複合体について行ったが,現在のところ,X線構造解析に用いるに十分な結晶は得られておらず,条件検索の継続が必要である.(3)これまですでに良好な結晶の得られているFP390については,シンクロトロン放射光を用いて測定した3Å分解能の回折データに基づいて,分子置換法を適用することによって結晶構造の解析に成功した.得られた初期的な結晶構造の結晶学的精密化を行い,R値23%の構造を得た.この結果,構造は一分子あたり2分子のフラビンを結合して,二重体として存在することがわかった.しかしながら,現在の回折強度データの質は必ずしも十分でなく,フラビンの詳細な構造,結合様式についての情報が得られないので,分解能の向上をも含めた回折データ再測定を行うことが必要であると考えている.本研究では,発光細菌Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼおよびFP_<390>を対象としてX線結晶解析を行い,それぞれの三次元構造を決定することを目的とした.Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼについては,結晶化条件の精密化を,補欠因子を含まないアポ酵素,FMNを補欠分子として含むホロ酵素,酵素,基質生成物複合体について行ったが,X線構造解析に用いるに十分な結晶は得られなかった.FP_<390>については,シンクロトロン放射光を用いて測定した3Å分解能の回折データに基づいて,分子置換法を適用することによって結晶構造の解析に成功した.さらに分解能を上げて6.02.7Åの反射に対して結晶構造の精密化を行い,最終モデルの結晶学的R値は24.0%である.FP_<390>の全体構造の特徴は,モノマー2分子が非結晶学的2回軸で関係づけられてダイマー構造をとっていることである.Q-フラビンは各モノマーにつき2分子存在し,それぞれN末端近くの分子表面とダイマーの分子境界付近に位置している.ルシフェラーゼのβサブユニットのアミノ酸残基と相同性が高い領域は2カ所に分類できるが,そのうちの1カ所は分子境界のQ-フラビンに接近している.分子境界に存在するQ-

フラビンではFMNのリビチル基が溶媒領域に突きだし,ミリスチン酸部分がタンパク質分子の内部に入り込んでいる.電子密度図上ではミリスチン酸部分がはっきりと見え,カルボニル酸素はイソアロキサジン環のRe面側へ,脂肪酸鎖はSi面側へ伸びている.一方,分子境界付近のQ-フラビンの場合では電子密度図上でFMN部分が比較的はっきりと見えるが,ミリスチン酸部分は非常にあいまいで,イソアロキサジン環に対する配置を特定できていない.このような電子密度が現れる理由として,分子境界のQ-フラビン結合部位に2種類のQ-フラビン(ミリスチン酸のイソアロキサジン環との結合部位が異なるQF_1とQF_2)が混在する可能性があげられる.ルシフェラーゼの反応において、副生成物,QF_2の生成を避けることができないとすれば,FP_<390>モノマー内に2カ所存在するQ-フラビン結合部位の役割はそれぞれ異なっており,分子境界のQ-フラビン結合部位は副生成物,すなわちQF_2を収納しておく場所であると考えることができる.本研究では,発光細菌Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼおよびFP_<390>を対象としてX線結晶解析を行い,それぞれの三次元構造を決定することを目的とした.Photobacterium phosphoreum由来のルシフェラーゼについては,結晶化条件の精密化を、補欠因子を含まないアポ酵素,FMNを補欠分子として含むホロ酵素,酵素-基質生成物複合体について行ったが、X線構造解析に用いるに十分な結晶な得られなかった.FP_<390>については,シンクロトロン放射光を用いて測定した3Å分解能の回折データに基づいて,分子置換法を適用することによって結晶構造の解析に成功した.さらに分解能を上げて6.02.7Åの反射に対して結晶構造の精密化を行い,最終モデルの結晶学的R値は24.0%である.FP_<390>の全体構造の特徴は,モノマー2分子が非結晶学的2回軸で関係づけられてダイマー構造をとっていることである.Q-フラビンは各モノマーにつき2分子存在し,それぞれN末端近くの分子表面とダイマーの分子境界付近に位置している.ルシフェラーゼのβ-サブユニットのアミノ酸残基と相同性が高い領域は2カ所に分類できるが,そのうちの1カ所は分子境界のQ-フラビンに接近している.分子境界に存在するQ-フラビンではFMNのリビチル基が溶媒領域に突きだし,ミリスチン酸部分がタンパク質分子の内部に入り込んでいる.電子密度図上ではミリスチン酸部分がはっきりと見え,カルボニル酸素はイソアロキサジン環のRe面側へ,脂肪酸鎖はSi面側へ伸びている.一方,分子境界付近のQ-フラビンの場合では電子密度図上でFMN部分が比較的はっきりと見えるが,ミリスチン酸部分は非所にあいまいで,イソアロキサジン還に対する配置を特定できていない.このような電子密度が現れる理由として,分子境界のQ-フラビン結合部位に2種類のQ-フラビン(ミリスチン酸のイソアロキサジン環との結合部位が異なるQF_1とQF_2)が混在する可能性があげられる.ルシフェラーゼの反応において,副生成物,QF_2の生成を避けることができないとすれば,FQ_<390>
下地コンクリ-トの表層特性と仕上げ材の剥離性状に関する研究

下地コンクリ-トの表層特性と仕上げ材のはく離性状の関係を明かにするために行った本研究で得られた知見は以下の通りである。1.高水セメント比、若材令のコンクリ-ト表層ほど大きな径の細孔空げき量が多いため透水性は大きい。しかし、浸透圧が生じる場合の水の移動は、大きな細孔空げきでの水の移動と、小さな細孔空げきによる半透過特性が相互に関係するため、水セメント比、材令による差異は一概には言えない。2.若材令から乾燥されるコンクリ-トほどその表層は極端に粗い組織となる。したがって、十分養生してから乾燥させることにより、コンクリ-トスラブ表層の透過性は減少する。3.コンクリ-ト空げき内の水分保持状態は細孔空げき構造および乾燥度により異なる。大きな細孔空げき量の多い組織の粗いコンクリ-ト表層は、高湿度にも拘らず、非凝縮空げき量が多く、結露等が生じた場合水分が集積しやすく、水も移動しやすいと考えられる。4.はく離再現実験の結果、はく離は環境温度一定条件では生じにくく、仕上げ材、コンクリ-ト間で温度勾配があり、結露しやすい場合に発生する。浸透圧の生じないラテックス系の接着剤では、コンクリ-ト表層の組織が粗く、乾燥度の低いものにはく離が生じた。一方、浸透圧の生じるエポキシ系の接着剤の場合、乾燥度低いものほどふくれが生じやすかったが、水セメント比、材令による違いは複雑である。これらの結果は、1.3.で述べたコンクリ-ト表層の基本特性でほぼ説明できると思われる。コンクリ-トの表層特性(細孔空げき構造および水分状態)を把握するために、まず、水分を含んだ状態での細孔空げき構造を明らかにする方法を考案した。すなわち、水銀ポロシメ-タ-、気体置換法による真密度計、吸着理論に基づくKelvinの式を利用することにより、凝縮細孔空げき(水分で満たされている空げき)および非凝縮細孔空げき(水分がない空げき)の量、および、その細孔分布領域を実験的に把握することが可能であることを明らかにした。この手法も利用し、コンクリ-トおよびモルタルの各種養生(乾燥)条件での表層特性について検討した結果、以下のことが判明した。1)コンクリ-トは水セメント比の違いだけでなく、養生(乾燥)条件で表層組織の細孔空げき構造は大きく変化する。2)特に、打設後早期の乾燥は、コンクリ-ト表層のち密化を著しく阻害する。3)組織のち密化が阻害されるのは、乾燥により、非凝縮状態となった細孔の水和の進行が停止し、その空げきの細孔径が小さくならないためである。4)実環境おけるコンクリ-ト表層は、水分状態だけでなく、細孔空げき状態も含めた様々の特性をもちうる。さらに、これらの表層特性と、透気性、透水性、さらに、半透過性などの関係を検討した結果、特に、透気性および半透渦性にその影響が顕著に現れることが明らかになった。なお、本年度は達成できなかったが、今後は、様々な表層特性をもつコンクリ-トに仕上げ材の接着剤やプライマ-を含浸させた場合の透気性、半透過性の変化を検討することで、含浸状態と表層特性の関係を明らかにし、さらに研究を進める予定である。下地コンクリ-トの表層特性と仕上げ材のはく離性状の関係を明かにするために行った今年度の実験検討項目は以下の通りである。(1)水銀ポロシメ-タ-の細孔容積測定によるコンクリ-ト表層への仕上げ材の接着層(プライマ-)の含浸程度の評価。(2)環境条件がはく離性状に及ぼす影響、およびはく離メカニズムの把握(3)コンクリ-ト表層の浸透圧の測定実験以上、

(1)、(2)、(3)の結果、及び昨年度の知見から以下のことが明かになった。(1)ある程度の乾燥したコンクリ-トでなければ含浸度は低く、接着力を低下させる可能性がある。すなわち、水分量のコンクリ-ト表層では、より大きな径の細孔がプライマ-で閉塞されないことになり、液水が移動しやすく、結果的に、ふくれはく離につながりやすいと考えられる。(2)環境条件の影響は、単純に温度一定条件では、ふくれ、はく離は起こりにくく、コンクリ-ト中で温度匂配があり仕上げ材裏面に結露水などの生じる可能性がある条件がはく離を促進する。また、コンクリ-ト表層の組織が粗いほどはく離を促進し、これは、液水の移動のしやすさに起因するものと考えられる。(3)ふくれ、はく離が生じる場合、仕上げ材裏面に圧力が生じている。この圧力は接着剤の水可容性成分を含む水容液が浸透圧を引き起こすためと考えられる。(4)コンクリ-トの表層特性としては、細孔組織が粗く、かつ水分量が多い場合にはく離が生じやすいといえる。これは、水分量が多いとコンクリ-トの半透過性により浸透圧を引き起こし、組織が粗い場合には、浸透圧による水分移動量が多いためである。
神経軸索ガイダンス因子レセプターの大規模探索-後脳展開培養標本を用いた研究-

神経回路形成のメカニズムを明らかにするためには、神経軸索ガイダンス因子からの信号を成長円錐内の細胞骨格に伝え軸索伸長を制御するレセプターに対する理解が必須である。多種多様なガイダンス因子に対するレセプターをすべて明らかにするためには、レセプター分子の遺伝子を大規模かつ系統的にスクリーニングするアプローチが有効であり、これを具現化するためには、簡便迅速な候補遺伝子の機能スクリーニング系の確立が必要である。我々はマウス後脳二次元展開標本中の一次前庭小脳線維を培養下で発達させる技術を持っている。この培養系に候補遺伝子のアンチセンスオリゴによるタンパク合成阻害技術を適用することによって、一次前庭小脳線維のガイダンスに関与するレセプター遺伝子の培養下での大規模な機能スクリーニングを試みるのが本研究の目的である。本年度は昨年度に引き続き、培養系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドによる蛋白質翻訳阻害系の確立を主目的とした。モデル因子として免疫グロブリンスーパーファミリーに属し一次前庭小脳線維に発現するMuSC分子の機能解析を試みた。MuSCを強制発現させたCOS細胞は接着活性を示し、精製MuSCタンパクを与えると凝集が抑えられた。このことはMuSCが接着活性を介して神経細胞形成に関与してることを示している。培養系における遺伝子ノックダウン技術の確立のためのモデル分子として、イミュノグロブリンスーパーファミリーに属するMusSC分子を用いているため、基礎実験として発生胚芽におけるMuSCの発現パターンの解析を行った。またマウス後脳二次元展開標本の培養技術の確立、及び培養標本におけるMuSCの発現も確認した。培養標本に遺伝子操作を行う必要があるので、エレクトロポレーションによって標的部位特異的に遺伝子を導入する技術も確立した。遺伝子ノックダウン技術として、当初はアンチセンスオリゴ方を用いる予定であったが現在までの実験において成功せず、方法的に遺伝子配列依存的であること、効果のあるアンチセンス配列を予測し、選択することの困難さから、未知分子に汎用化するのは難しいとの判断を下した。現在これに代わる方法としてdsRNAによる遺伝子ノックダウンを検討中である。もともと線虫で発見されたこの方法は、生体のウイルスに対する防御機構を利用した特異的遺伝子ノックダウン法であり、線虫では最も強力な方法として普及し始めている。この方法がほ乳類に適用可能かどうかを現在検討中である。予備的な段階ではあるがMuSCのdsRNAを用いてMuSCの発現が抑制されることを確認している。
テイラー・クエット流れを用いた古典流体力学と量子電磁力学のアナロジー理論の検証

本研究の目的は、テイラー・クエット流れと呼ばれる回転二重円筒間の流れの数値解析を通して、我々が1993年頃から独自に提唱している古典流体力学と量子電磁力学のアナロジー理論の有効性を検証することである。またそれは世界的にも前例のない挑戦的な試みでもある。最終年度にあたる2010年度に行った研究では、数値解析に関する技術的問題などいくつかの課題が浮かび上がった。そのため当初の研究目的をすべて完全に達成するまでには至らなかったが、アナロジー理論の検証作業を進める中で、近い将来への展望を示すことができ、ある程度の成功を収めることができたと考えている。これは古典流体力学分野においても量子電磁力学分野においても、また基礎科学的にも応用工学的にも、発展の可能性を秘めた重要な成果であると言える。具体的には、テイラー・クエット流れの非定常2次元問題と非定常3次元問題の数値解析において、レイノルズ数を増加させていったところ、円筒断面を貫く循環が比例関係からずれて、ステップ状に変化するようにも見える箇所を捉えることができた。このようなテイラー・クエット流れにおける循環の量子化とも言える現象は、円筒形の超伝導体を貫く磁束の量子化に対応しており、我々が1993年頃から独自に提唱しているアナロジー理論の有効性を示す一つの証拠となる。これらの研究成果の一部については、日本機械学会流体工学部門講演会において口頭発表を行った。その後も研究を継続し、最終的な研究成果については、適切な学術雑誌に論文を投稿する予定である。交付申請書の「研究の目的」に示した具体的な目的は、テイラー・クエット流れを数値的に解析してアナロジー理論を検証することであった。これに向けてテイラー・クエット流れの数値シミュレーションを実行する環境を青山学院大学と山形大学に整備した。青山学院大学では、汎用流体解析ソフトウェアCFD++を利用してテイラー・クエット流れの三次元数値計算を数例実行した。速度の時間履歴のFFT解析を行い、ある特徴的な周波数が複数存在することを確認し、実験で報告されている結果と比較を行った。特徴的な周波数の相対的な位置関係と強度については、実験結果と似た傾向がみられたが、絶対的な値のズレについては検討の余地がある。山形大学では、オリジナル計算コードにより二次元計算と三次元計算を比較しながら、流れの三次元効果について検討した。二次元計算では速度の時間変動が現れずに定常状態に達するが、三次元計算では激しい振動が見られ、非定常状態が続くことが確認できた。周方向に緩やかにねじれて波打つ渦輪のような三次元渦構造を捉えることができた。これが三次元計算で見られた激しい速度振動の原因ではないかと思われる。以上のように青山学院大学と山形大学で数値シミュレーションの実行環境を整え、計算を実行し、FFT解析まで行えたことで、研究の基盤ができた。年度末には流体力学関連の会議における発表の検討も行い、初年度としては、計画通りの有意義な成果が得られたといえる。2009年8月に山形大学において、相互の研究の進捗状況を話し合い、今後の計画を立てた。以下、それぞれの大学での概要をまとめる。1.青山学院大学2008年度は、商用の汎用熱流体解析ソフトウェアのCFD++を用いて解析を行い、ある特徴的な周波数が現れる事を確認した。2009年度は、計算技術や循環の特性について議論を行うために、テイラー・クエット流れの計算コードを開発し、自由にデータを扱えるようにした。しかしながら、非定常の三次元計算は計算負荷が非常に高く、検証を十分行える余裕が無かった。2010年度は、検証を十分に行いたいと考えている。また、数値計算を実行するための計算機環境の整備を行った。201G年度は、これまでの成果を学会で発表する予定である。2.山形大学アナロジー理論を検証するため、円筒形超伝導体における磁束の量子化に類似した形で、テイラー・クエット流れにおける循環の量子化が起こりうるのかどうかを、オリジナル計算コードを用いた3次元数値シミュレーションによって調べた。その結果、循環の量子化と言えるほど明確なものではないが、レイノルズ数が1000<Re<1500あたりの範囲で、循環のステップ状の変化の兆候らしきものをとらえることができた。2009年度までの結果だけではアナロジー理論の有効性を十分に示すことはできなかったが、2010年度も研究を継続することで、より明確に有効性を示すことができる可能性がある。また2010年度は、これまでの成果を学会で発表する予定である。具体的には、テイラー・クエット流れの非定常2次元問題と非定常

3次元問題の数値解析において、レイノルズ数を増加させていったところ、円筒断面を貫く循環が比例関係からずれて、ステップ状に変化するようにも見える箇所を捉えることができた。このようなテイラー・クエット流れにおける循環の量子化とも言える現象は、円筒形の超伝導体を貫く磁束の量子化に対応しており、我々が1993年頃から独自に提唱しているアナロジー理論の有効性を示す一つの証拠となる。これらの研究成果の一部については、日本機械学会流体工学部門講演会において口頭発表を行った。その後も研究を継続し、最終的な研究成果については、適切な学術雑誌に論文を投稿する予定である。
風力発電設備の風車本体が発する音が人間にもたらす心理的影響

再生可能エネルギーの原子力発電や火力発電に代わり、風力発電に期待が集まっている。風力発電設備の問題の一つとして、低周波などの騒音が人間の健康に影響があるといわれている。風力発電設備において発生する音が被験者に与える心理的影響を脳波を測定器によって調べ、その関係を調査した。測定場所は、浜松風力発電所(静岡県浜松市滝沢地区)にて行った。収音装置SONY製PCM-D1(サンプリング周波数96KHz、量子化24bit)にて録音した音を研究室で被験者(筆者)に聴かせた。用意した音は、風車のヨー(モーター)駆動音、ブレード(風車の羽根)回転音、クラシック音楽(モーツァルトの楽曲)、無音の4つである。これら4つの音を毎回聴かせる順番を変え、脳波測定器(FUTEK製BrainPro FM-929)により被験者の脳波の出力を記録した。採取した被験者の脳波の出力をエクセルによりデータ化し、1秒毎に縦軸に被験者の脳波の出力(単位は1μV)を取り、横軸に脳波の周波数、α波8.0-〓3.0Hz(05Hz刻み)を取った。ヨー駆動音、ブレード風切音など4つの音源と被験者より採取されたα波(被験者が寛いだ状態で出る脳波)の脳波の関係を調査したところ、無音の場合は他の4つの音と比べて、α波の20秒間の合計出力が一番高かった割合は36%(11回のうち4回;(1日の合計)最大値672μV)であった。又、ヨー駆動音においては、他の4つと比べてα波の出力が一番高かった割合は9%に留まった(H回のうち1回;最大値517μV)。従って、風車のヨー稼動音を被験者が聴取している時には、他の3つの音と比べて寛いだ状態には成り難い事が明らかになった。又、ブレード回転音聴取時にα波が一番高かった割合は27%(11回のうち3回;最大値844μV)でクラシック音楽聴取時と同じ27%(11回のうち3回;最大値678μV)であった。
レム睡眠中枢による咀嚼運動リズム生成の神経機構の解明

本年度は、レム睡眠調節機構と咀嚼リズム発生機構との機能的な相関を調べるため、咀嚼リズム発生機構に実験的に興奮性入力を与える錘体路電気刺激の効果を調べた。その結果、ノンレム睡眠では、開口筋のみにリズムが生じるものと、開口筋に遅れて閉口筋にリズムが生じる2つのパターンがあった。これらリズムを生じる開閉口筋のバースト間隔は、開口筋が閉口筋の2倍の時間であった。したがって、ノンレム睡眠では、錘体路電気刺激によって賦活する咀嚼リズム発生機構の神経モジュールが修飾されることなく賦活する可能性が示唆された。また、閉口筋は開口筋と比べると、リズムが発生する頻度が低く、発生潜時が長い。しかし、開閉口筋活動の発生に伴って、一過性に脳波の速波化や心拍数の増加を認め、運動終了後には覚醒せず睡眠に戻った(J Sleep Res 2019)。レム睡眠では、レム睡眠期間がノンレム睡眠よりも短かったが、開口筋にリズムを誘発させることができた。しかし、ノンレム睡眠と比べて、高い刺激強度が必要で、閉口筋が活動しなかった。また、麻酔深度の変化に伴ってリズミカルな咀嚼筋活動が発生していることがわかった。レム睡眠による咀嚼筋活動特性を調べるため、ヒトの睡眠中のデータも解析した。睡眠時ブラキシズム患者は健常者と比べて、レム睡眠においてリズム性咀嚼筋活動の発生数が高く、レム睡眠全体の咀嚼筋活動が健常者と比べて有意に高いことが分かった。さらに、睡眠段階移行を定量化して調べると、StageN2とレム睡眠の連続性が短いが、レム睡眠の分断には咀嚼筋活動の発生自体が関与している可能性が少ないことがわかった。本年度は、咀嚼リズム発生機構をノン睡眠中に賦活させる実験には成功したが、レム睡眠の占有時間が少ないことから、レム睡眠中のデータ数を増やす必要がある。また、複数部位の脳活動を記録する実験系の確立が遅れている。次年度は、咀嚼リズム発生機構をレム睡眠に賦活させる実験を遂行すると同時に、麻酔下の動物において複数部位から同時に脳波活動を記録する実験方法を確立すると同時に、レム睡眠発生に関与する脳幹や皮質下領域を実験的に賦活して、顎運動や咀嚼筋活動に変化を示す領域を明らかにする実験を行う。また、ヒトのレム睡眠において、咀嚼筋活動と脳波活動の特性を詳細に解析する。
胃粘膜の腸上皮化生と胃癌発症機序の解明

胃癌の抑制効果の可能性が報告されているアスピリン、非ステロイド消炎鎮痛薬と腸上皮化成、胃癌の関連について、別の患者コホートを用いた解析を行い、アスピリン、非ステロイド消炎鎮痛薬は腸上皮化成や胃癌のリスクの増加と関連しないことを明らかにし、結果は国際誌Cancer Prev Resに掲載された。また、胃癌のリスクの増加との関連の可能性が報告されているプロトンポンプ阻害薬について、腸上皮化成が進行している患者において、プロトンポンプ阻害薬の使用はヘリコバクターピロリ菌除菌後胃癌の発生を有意に増加させる可能性があることを明らかにし、その結果は国際誌Gutに掲載された。さらに、ヘリコバクターピロリ菌の除菌療法が成功した患者データを詳細に解析した。組織学的解析を行い、酸分泌抑制薬を使用している患者は、除菌療法が成功した後も、胃前庭部、体部の両方において、萎縮の改善効果が低下することを明らかにした。この結果は国際誌International Journal of Molecular Sciencesにアクセプトされた。ヘリコバクターピロリ菌の除菌療法が成功した患者285人のデータを詳細に解析した。組織学的解析を行い、腸上皮化成は胃前庭部、胃体部の両方において除菌後も統計学的に改善しないことを明らかにした。一方、萎縮は胃体部で、好中球浸潤は胃前庭部、胃体部、単球浸潤は胃前庭部、胃体部において除菌後に改善することも明らかにした。腸上皮化成について、解析集団285人の個々の組織データをさらに詳細に検討を行うと、約7割の患者では腸上皮化成に変化はみられなかったが、2割の患者で腸上皮化成が改善、1割の患者で増悪していることも明らかになった。免疫組織化学検討を行うと、CDX2の発現の減少が腸上皮化成の改善、CDX2の発現の増加が腸上皮化成の増悪と関連している可能性が明らかになった。その他、胃癌の抑制効果の可能性が報告されているアスピリン、非ステロイド消炎鎮痛薬と腸上皮化成、胃癌の関連について、別の患者コホートを用いた解析を行い、アスピリン、非ステロイド消炎鎮痛薬は腸上皮化成や胃癌のリスクの増加と関連しないことを明らかにした[Cancer Prev Res (Phila). 2018Feb 16. doi: 10.1158/1940-6207]。さらに、最近胃癌のリスクの増加との関連の可能性が報告されているプロトンポンプ阻害薬について、腸上皮化成が進行している患者において、プロトンポンプ阻害薬の使用はヘリコバクターピロリ菌除菌後胃癌の発生を有意に増加させる可能性があることを明らかにした[Gut. 2017Dec22. pii: gutjnl-2017-315710.doi: 10.1136/gutjnl-2017-315710]。ピロリ菌除菌後の腸上皮化成や関連する因子の変化に関する、組織学的な検討がすでに完了している。免疫組織化学に関する検討もおおむね順調に進展している。また、腸上皮化成と発癌に関して、リスク薬剤との関連を疫学研究から明らかにし、論文報告を行っているため。今後も腸上皮化成のnatural historyに関連する免疫組織化学に関する検討を継続していく。さらに、腸上皮化成に顕著な変化を認めた症例、その後除菌後胃癌の発癌に至った症例に関して胃粘膜の遺伝子解析も行う予定である。遺伝子解析は、ヒトのエクソンシークエンスを予定しているが、これまでの結果から、胃粘膜内の細菌側の遺伝子が疾患と関連することが考えられる場合は、胃内細菌の遺伝子解析も行うことを予定している。当初計画していた免疫組織化学の消耗品に関連する経費の支出が少なかったため。
解析関数の値分布論とその微分方程式への応用,並びにその関連分野の研究

2.研究実施計画の(2)の分担者の立川は,時間変数の微分と差分近似と変分解析の直接法を組み合わせた方法によって、近似解を構成し、さらに、その近似解に対するエネルギー評価によってその近似解の収束を示すという方法により、準線形波動方程式の一般化となる準線形双曲型偏微分方程式系の弱解を構成した。3.実施計画(5)の分担者の小野は(位数有限の完全クラブKnの因子分解{Hi}でKnの項点の集合V(Kn)の置換BがHiからHinへの同型写像となるものを周期的同型因子分解と呼ぶ。)がβがこのような周期的同型因子分解を誘導する置換となるための形を決定した。さらに,各因子がr-正則の場合を考え,次の定理を得た。『Knの1-正則周期的同型因子分解が存在するための必要十分条件はnが偶数であることである。』,『Knの2-正則周期的同型因子分解が存在するための必要十分条件はnが奇数である事である。』2.研究実施計画の(2)の分担者の立川は,時間変数の微分と差分近似と変分解析の直接法を組み合わせた方法によって、近似解を構成し、さらに、その近似解に対するエネルギー評価によってその近似解の収束を示すという方法により、準線形波動方程式の一般化となる準線形双曲型偏微分方程式系の弱解を構成した。』
IL-6遺伝子導入による膵癌に対する癌免疫遺伝子療法の開発

膵癌血行性肝転移におけるIL-6の関与をより明確にすべく,遺伝子導入法を用いた実験をおこなった.IL-6非産生膵癌株に発現プロモーターを備えたIL-6のcDNAを組み込んだプラスミドを導入してIL-6高産生株を作成して,ヌードマウス肝転移結節数を観察した.その結果,IL-6高産生株は親株であるIL-6非産生株と比較して有意に肝転移結節数が減少した.IL-6高産生膵癌細胞を投与したヌードマウスにおいてのみ血漿中のIgGクラス膵癌反応性抗体活性が認められ,また,膵癌反応性IgGの増強とともに抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)が有意に亢進することから,転移抑制効果にはADCCが関与していると考えられた.また、申請者らはこれらの研究と並行して,RAS抑制変異体N116Yを用いた遺伝子治療の研究をおこなってきた.遺伝子導入効率が良く,CEA産生膵癌特異的な遺伝子発現を目的とし,CEAプロモーターを組み込んだアデノウイルスベクターAd CEA-N116Yを作成し,in vivoにおける肝転移抑制効果について検討した.ヌードマウス肝転移モデルにAd CEA-N116Yを脾注して6週後の肝臓標本で転移結節数を計測すると,モデル作成1日後に脾注した場合には肝内に転移結節を認めず,また,5日後に脾注した場合でも転移結節数が有意に減少した.このことから,脾注されたAd CEA-N116Yは膵癌細胞に特異的に作用し,肝転移を効果的に抑制することが明らかとなった.臨床応用として,膵癌手術前後の潜在的肝転移に対して,N116Yを遺伝子導入することで肝転移を抑制することが期待でき,膵癌に対する有効な遺伝子治療となり得る可能性があると考える.膵癌血行性肝転移におけるIL-6の関与をより明確にすべく,遺伝子導入法を用いた実験をおこなった.IL-6非産生膵癌株に発現プロモーターを備えたIL-6のcDNAを組み込んだプラスミドを導入してIL-6高産生株を作成して,ヌードマウス肝転移結節数を観察した.その結果,IL-6高産生株は親株であるIL-6非産生株と比較して有意に肝転移結節数が減少した.IL-6高産生膵癌細胞を投与したヌードマウスにおいてのみ血漿中のIgGクラス膵癌反応性抗体活性が認められ,また,膵癌反応性IgGの増強とともに抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)が有意に亢進することから,転移抑制効果にはADCCが関与していると考えられた.また、申請者らはこれらの研究と並行して,RAS抑制変異体N116Yを用いた遺伝子治療の研究をおこなってきた.遺伝子導入効率が良く,CEA産生膵癌特異的な遺伝子発現を目的とし,CEAプロモーターを組み込んだアデノウイルスベクターAd CEA-N116Yを作成し,in vivoにおける肝転移抑制効果について検討した.ヌードマウス肝転移モデルにAd CEA-N116Yを脾注して6週後の肝臓標本で転移結節数を計測すると,モデル作成1日後に脾注した場合には肝内に転移結節を認めず,また,5日後に脾注した場合でも転移結節数が有意に減少した.このことから,脾注されたAd CEA-N116Yは膵癌細胞に特異的に作用し,肝転移を効果的に抑制することが明らかとなった.臨床応用として,膵癌手術前後の潜在的肝転移に対して,N116Yを遺伝子導入することで肝転移を抑制することが期待でき,膵癌に対する有効な遺伝子治療となり得る可能性があると考える.この研究課題においてはRAS抑制変異体N116Yのもつ、膵癌細胞増殖抑制能、足場非依存性増殖能、細胞コロニーの形態的変化などがin vitroにおいて確かめられているが、さらに臨床応用へ向けて1.in vivo治療モデルにおけるN116Yの腫瘍抑制効果.2.正常組織への副作用の検討.3.副作用対策と遺伝子導入効率の上昇をめざした腫瘍特異的プロモーターの開発および遺伝子導入による二次発ガン予防策としてのN116Y、C末端欠損体の作成などを行った。これまでにin vivo(nude mice)モデルにおいてN116Yによる延命効果を確認しさらに、CEAプロモーターを用いN116Yが腫瘍特異的に発現するレトロウイルスベクター(LN-CEAp-N116Y)を作成した。さらにC-末端欠損体としてRAS蛋白がファルシネル化される部位である4アミノ酸を欠損させたN116Y C-del.1とH-、K-、N-RASそれぞれにおける共通部位を温存させ24アミノ酸を欠損させたN116Y C-del.2の2種を作成している。今後このプラスミドを用いた膵癌細胞増殖抑制効果の検討を行う予定である。膵癌血行性肝転移におけるIL-6の関与をより明確にすべく,遺伝子導入法を用いた実験をおこなった.IL-6非産生膵癌株に発現プロモーターを備えたIL-6のcDNAを組み込んだプラスミドを導入してIL-6高産生株を作成して,ヌードマウス肝転移結節数を観察した.その結果,IL-6高産生株は親株であるIL-6非産生株と比較して有意に肝転移結節数が減少した.IL-

6高産生膵癌細胞を投与したヌードマウスにおいてのみ血漿中のIgGクラス膵癌反応性抗体活性が認められ,また,膵癌反応性IgGの増強とともに抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)が有意に亢進することから,転移抑制効果にはADCCが関与していると考えられた.また,申請者らはこれらの研究と並行して,RAS抑制変異体N116Yを用いた遺伝子治療の研究をおこなってきた.遺伝子導入効率が良く,CEA産生膵癌特異的な遺伝子発現を目的とし,CEAプロモーターを組み込んだアデノウイルスベクターAdCEA-N116Yを作成し,in vivoにおける肝転移抑制効果について検討した.ヌードマウス肝転移モデルにAdCEA-N116Yを脾注して6週後の肝臓標本で転移結節数を計測すると,モデル作成1日後に脾注した場合には肝内に転移結節を認めず,また,5日後に脾注した場合でも転移結節数が有意に減少した.このことから,脾注されたAdCEA-N116Yは膵癌細胞に特異的に作用し,肝転移を効果的に抑制することが明らかとなった.臨床応用として,膵癌手術前後の潜在的肝転移に対して,N116Yを遺伝子導入することで肝転移を抑制することが期待でき,膵癌に対する有効な遺伝子治療となり得る可能性があると考える.
運動力学に基づいての人間質量パラメータ同定と人間認識

本研究では開発した力学同定手法の実用を広げるために計測環境を開発する。また得られた結果から人の識別をする。人間の力学同定をするために外力とモーションデータが必要です。今まで光学的なモーションキャプチャーと床反力計を使用することは普通です。しかし、高価的で日常生活で使用できない設備である。モーションキャプチャー-なしで、床反力計だけで同定の可能性を調べました。また、現在の人体の力学特性の計測の問題点を解決するために、ステレオカメラを用いてヒトの動作解析を行う。光学式モーションキャプチャーと異なりマーカレスであり、実験環境を限定せず、実験室を持たない病院や社会で使用できる。しかし、ステレオカメラに測定対象の消失という問題点があり、それを解決するために一体になるジャイロセンサーと加速度センサーとステレオカメラを融合的に測定することが最終的な目的です。本プロジェクトでは、最初に今まで開発した同定手法の応用を広げていく。具体的にはモーションキャプチャ-無で、床反力計だけで同定の可能性を調べている。もし不十分の場合はジャイロセンサを含めて同定を行う。具体的に床反力計の上で決めている動作を生成し、モーションデータベースからモーションを認識し、同定行う。認識をするため、データベースと撮った外力データ力学シンクロし、比較する。運動データはデータベースから認識した動作を使う。外力データは不十分な場合、ジャイロセンサは必要である。どんな場所、どんな体の部分で付けたら方がいい(ノイズの影響、精度の影響)を調べることは必要である。データベースは過去に作った、5人の29種類のテレビ体操の動作を記録したものを用いる。この動作の特製は十分なEXCITATIONを持ち、再製できる動作である。この目的を満たすため精度が高い計測装置が必要であり:床反力計の精度が高めるためアンプリーファイアー、ケーブル、計測装置を止まるシステムが重要とする。備品費が全体の90%を超える理由は計測装置の精度が高めるのためである。カメラに基づいてのモーションキャプチャを開発するためシミュレーション環境で、人間の運動学に基づいて、アルゴリザームを実現する。本研究では、現在の人体の力学特性の計測の問題点を解決するために、ステレオカメラを用いてヒトの動作解析を行う。更には、民生用のパーソナルコンピュータの性能の向上により画像処理も個人レベルで可能になってきていることから、個人としても使用することができる。しかし、ステレオカメラに測定対象の消失という問題点があり、それを解決するために一体になるジャイロセンサーと加速度センサーとステレオカメラを融合的に測定することが最終的な目的である。具体的に、本年度では画像より対象の動作を測定するオプティカルフロー手法の制度向上法と、オプティカルフローを使用したステレオカメラの三次元測定がアルゴリザームを実現する。また、画像から得られた3次元の速度データと加速度センサー合わせ、ジャイロデータをしようする、アルゴリザームを実現する。
19世紀英国における自然神学思想と経済思想の関連

3年計画の最終年にあたる平成13年度は、前年度までに得られた新たな知見である、成立期の経済思想と自然神学思想の深い内在的連関の存在を、啓蒙期ブリテンの社会科学成立史全体の中でどのように位置付けるのかに絞って考察した。こうして得られた新たな知見は、第一に総括的視点として、杜会科学成立史を検討するにあたっては、経済学の成立と体系化の過程を考える際にも、その社会と時代の宗教的背景に対する配慮が不可欠であるという点である。神学的には18世紀におけるスミスの「見えざる手」や「自然価格」概念以来の自然神学と、政治的には、ペイリーやいわゆるキリスト教経済学に曲型的示される一つの政治的レジームとしてのイギリメ国教会のイデオロギーとの連関の問題が挙げられる。従来のわが国の経済学成立史では、こうした視点が欠落していた。第二に、より具体的に経済思想や社会科学の成立と体系化に対して、自然神学の果たした役割は自然科学の場合とは異なり、一面でその体系化を促進した一方で、体系化を企図すればするほ結果として神学からの乖離を促したという、複雑で逆説的な経緯が見られるということを示しえた点である。この相互関係の視点も、従来の研究では十分省みられることがなかった。第三に、これらの検討が、個別的設問の枠を超えて大きく「近代」とは何かという設問につながる形で示される必要があるという点を明らかにした。結果として、心理的快楽主義という反宗教性を体現したベンサムの功利主義が経済学の規定的イデオロギーとして定置されたように、啓蒙期以来の世俗化の過程が感覚的人間から出発する近代的認識の典型が経済学といえる。第一年度は、わが国で研究蓄積がほとんどなかった社会科学と自然神学との関連につき、1999年10月より2000年1月までの短期サバティカル期間を利用してロンドン大学ユニヴァーシティ・カレッジにて、当該課題についての英国での研究史の回顧を主に行った。具体的には、上記カレッジのベンサム・プロジェクトにおいて客員研究員としてペイリーの神学的功利主義からベンサムの世俗的功利主義への転換にかかわる研究文献の渉猟を行った。そこで明らかになった新たな知見は、英語圏の文献においても19世紀自然科学の展開に対する自然神学の影響関係につきダーウィニズムを主題とした科学史の業績は枚挙に暇がないほど存在するが、社会科学の成立と展開との関連についてはほとんど研究業績が存在しないことが明らかとなったことである.確かに、スコットランド啓蒙におけるスミス経済学の成立と理神論との関連については主題的な研究が数多くなされてはきたが、それ以降の経済学を中心としたとりわけてイングランドの社会科学と自然神学との影響関係については、ベンサムの宗教批判の意義についての否定的な個別研究が1990年代に入ってなされただけであることも新たな知見として獲得された。これらを、次年度に予定している渉猟・収集した文献の解読と整理を中心とした研究につなげたい。なお、外国旅費によって1999年7月にオーストラリア経済思想史学会に参加し、ベンサムの経済学の方法論的についての報告を行い研究交流を深めた。3年計画の2年次にあたる平成12年度は、自然科学史の研究成果を利用しつつ、19世紀イギリス自然神学の推移のうち神学的功利主義から世俗的功利主義への転換と言われるウィリアム・ペイリーとジェレミー・ベンサムとの対比的検討と、ダーウィン主義が自然神学的保守主義に与えることになる打撃的影響の前史に研究の焦点を絞った。社会科学的視点からのこうした研究の成果の一部を、オーストラリア経済思想史学会(2000年7月)においてベンサムに関する報告という形で発表した。この間に得られた新たな知見は、第一に、広く受容されたペイリー自然神学の持つ二面的性格、すなわち啓蒙期以降の自然科学上の新知識を巧みに取り入れつつも、社会観や人間観では既存の秩序やモラルを維持するという本質的な保守性を保っていたことを、『自然神学』(1802)の記述に即して明確に示した点である。第二に、批判されることの多い物的快楽も含む心理的快楽主義に立つベンサムの功利主義が、従来のキリスト教的倫理に背反的な人間観を提示すると同時に、貧困や犯罪に象徴される現実社会の不完全さを示すことでペイリー流の現状肯定とは逆の、実は改革に向けての社会の可変性をうたう革新的な思潮であることを積極的に示したこと。第三に、ヴィクトリア時代イギリスの保守主義的社会観・人間観に最終的に打撃を与えたものがダーウィンの『種の起源』(1859)であり、ペイリー信奉者であったダーウィンの基本アイディアに対してマルサスの『人口論』が影響を与えていたという科学史上の周知の事実を、社会科学と自然神学との関係という視点から評価し直したことである。これらは、自然神学・功利主義・社会科学の相互関係を解析するという点において、19世紀イギリス知性史の新たな視点からの研究の萌芽となりうるものと考える。

神学的には18世紀におけるスミスの「見えざる手」や「自然価格」概念以来の自然神学と、政治的には、ペイリーやいわゆるキリスト教経済学に曲型的示される一つの政治的レジームとしてのイギリメ国教会のイデオロギーとの連関の問題が挙げられる。従来のわが国の経済学成立史では、こうした視点が欠落していた。第二に、より具体的に経済思想や社会科学の成立と体系化に対して、自然神学の果たした役割は自然科学の場合とは異なり、一面でその体系化を促進した一方で、体系化を企図すればするほ結果として神学からの乖離を促したという、複雑で逆説的な経緯が見られるということを示しえた点である。この相互関係の視点も、従来の研究では十分省みられることがなかった。第三に、これらの検討が、個別的設問の枠を超えて大きく「近代」とは何かという設問につながる形で示される必要があるという点を明らかにした。結果として、心理的快楽主義という反宗教性を体現したベンサムの功利主義が経済学の規定的イデオロギーとして定置されたように、啓蒙期以来の世俗化の過程が感覚的人間から出発する近代的認識の典型が経済学といえる。
フロン代替化合物1-ブロモプロパンの次世代健康への影響

【背景と目的】フロン代替化合物1-ブロモプロパン(以下1-BP)は中枢神経毒性が懸念されている。われわれは成獣ラットに1-BPを濃度200-1500ppmで長期吸入曝露すると、海馬に脱抑制が起こり、その原因機構としてGABA放出量の低下を明らかにした。女性労働者の曝露事例が報告されていることから、本研究課題では妊娠中の女性と次世代への曝露影響を2年にわたり検討した。2年めは、1)脳の発達と興奮性への影響、2)仔の性行動への影響、3)仔の脳内曝露指標としての臭素イオン半減期を検討した。【方法】妊娠ラットに1-BPを濃度700ppmで1日6時間、day1-20の20日間反復曝露した(day0は膣スメアに精子が観察された日)(保利)。対照群妊娠ラットにはチャンバー内で新鮮空気を与えた。PND5および7の仔ラット脳内臭素イオン濃度を測定した(保利)。PND12-15で海馬スライス標本を作製し、CA1錐体細胞の刺激応答性(S/R曲線)とLTPおよびLTDを調べた(笛田)。さらに関連した膜蛋白リン酸化酵素(CaMKIIα,β,PKC,MAPK等)を免疫blottingにより半定量した(福永)。昨年、次世代雌ラットの探索行動が雄レベルに減少していたので、性行動としてEar wiggling, rejection score, lordosisなどを解析した(粟生)。【結果と考察】1)一般成長指標の観察数を増やした結果、胎児曝露によって雌の肛門生殖器間距離が増加し、雌雄ともに耳介展開が遅れた。2)仔ラットの脳内臭素イオン濃度の半減期は5日となり成獣と同じであった。3)PND12-15の仔ラット海馬CA1領域では興奮性が亢進した。長期増強は抑制傾向にあったが有意な差には至らなかった。シナプシンIは減少したがCaMKIIなどリン酸化酵素系は変化しなかった。4)性行動試験では、lordosis回数に変化は無かったが、Ear wigglingが低下しrejection scoreが増加した。昨年の結果とあわせると、1-BP胎児曝露によって、仔ラット海馬における興奮性の発達が2相性に撹乱され、脳の性分化と性行動が影響をうけることがわかった。【結論】2年間の研究結果は1-BP胎児曝露が次世代の脳機能に影響を及ぼすことを示した。今後これらの指標を用いて次世代影響のNOALおよびLOALを決め、cross-fosteringによる授乳の影響などを明らかにする研究が必要となる。われわれは成獣ラットを用いて、1-BPを濃度200-1500ppmで長期吸入曝露すると、ラットの海馬に脱抑制が起こること、GABA放出量の低下を明らかにした。最近、脳の発達におけるGABA機能が注目されており、胎児への影響を明らかにするために胎児曝露を計画した。【方法】妊娠雌性ラット(12週令,12匹)に1-BPを濃度700ppmで1日6時間、day1-20の20日間反復曝露した(day0は膣スメアに精子が観察された日)(保利)。対照群妊娠ラット(同週令,12匹)にはチャンバー内で新鮮空気を与えた。出産後、産仔数を雌4匹雄4匹に調節し、'一般成長の発達指標を観察した(笛田)。Day20出産後3日の母ラットの海馬スライス標本を作製し、CA1錐体細胞の刺激応答性とフィードバック抑制を電気生理学的に調べた。仔ラットについては一般成長指標(耳介展開、眼瞼開裂、精巣下降、膣開口)を調べた。6-8週令で海馬スライス標本を作製し、母ラット同様に神経興奮性を調べた(笛田)。胎児への曝露指標として臭素イオンを測定した。海馬CA1と歯状回におけるリン酸化酵素(CαMKIIα,β,PKC, MAPK等)を免疫blottingにより半定量した(福永)。行動試験として、オープンフィールド、高架十字迷路、受動的回避学習試験、強制水泳試験を実施した(粟生)。【結果と考察】1-BPを吸入曝露した母ラット海馬CA1領域においては、興奮性の亢進と脱抑制がみとめられた。これは♂ラットで観察された現象と同様であった。臭素イオンは濃度依存性に胎児脳に移行していた。胎児曝露は産仔数、性比および一般成長指標いずれにも影響しなかった。仔ラットにおいては、成長後に興奮性が抑制されたがフィードバック抑制に変化はなかった。リン酸化酵素は歯状回において変動がみられた。行動試験では、オープンフィールド試験において雌の活動量と探索行動が低下したが、雄への影響はなかった。次年度は、初年度の結果を再確認すべく、性行動試験、組織形態学的検討を追加する。【結論】1-BP胎児曝露は仔ラットの脳の性分化を攪乱することが示唆された。

女性労働者の曝露事例が報告されていることから、本研究課題では妊娠中の女性と次世代への曝露影響を2年にわたり検討した。2年めは、1)脳の発達と興奮性への影響、2)仔の性行動への影響、3)仔の脳内曝露指標としての臭素イオン半減期を検討した。【方法】妊娠ラットに1-BPを濃度700ppmで1日6時間、day1-20の20日間反復曝露した(day0は膣スメアに精子が観察された日)(保利)。対照群妊娠ラットにはチャンバー内で新鮮空気を与えた。PND5および7の仔ラット脳内臭素イオン濃度を測定した(保利)。PND12-15で海馬スライス標本を作製し、CA1錐体細胞の刺激応答性(S/R曲線)とLTPおよびLTDを調べた(笛田)。さらに関連した膜蛋白リン酸化酵素(CaMKIIα,β,PKC,MAPK等)を免疫blottingにより半定量した(福永)。昨年、次世代雌ラットの探索行動が雄レベルに減少していたので、性行動としてEar wiggling, rejection score, lordosisなどを解析した(粟生)。【結果と考察】1)一般成長指標の観察数を増やした結果、胎児曝露によって雌の肛門生殖器間距離が増加し、雌雄ともに耳介展開が遅れた。2)仔ラットの脳内臭素イオン濃度の半減期は5日となり成獣と同じであった。3)PND12-15の仔ラット海馬CA1領域では興奮性が亢進した。長期増強は抑制傾向にあったが有意な差には至らなかった。シナプシンIは減少したがCaMKIIなどリン酸化酵素系は変化しなかった。4)性行動試験では、lordosis回数に変化は無かったが、Ear wigglingが低下しrejection scoreが増加した。昨年の結果とあわせると、1-BP胎児曝露によって、仔ラット海馬における興奮性の発達が2相性に撹乱され、脳の性分化と性行動が影響をうけることがわかった。【結論】2年間の研究結果は1-BP胎児曝露が次世代の脳機能に影響を及ぼすことを示した。今後これらの指標を用いて次世代影響のNOALおよびLOALを決め、cross-fosteringによる授乳の影響などを明らかにする研究が必要となる。
前立腺癌の骨転移に関する基礎的臨床的研究

造骨性変化を主体とする前立腺癌骨転移の機序を明らかにするために、基礎的臨床的研究を行った。1.前立腺細胞培養と増殖因子:ラット前立腺組織を分離後、各種増殖因子を加えて培養すると、上皮細胞ではホルモン依存性が、間質細胞ではFGFによる影響が認められた。2.前立腺癌患者の骨代謝動態:骨形成に関与すると思われるCA、P、オステオカルシン値の上昇はほとんど無く、逆に骨吸収マーカーである尿中ハイドロオキシプロリンの上昇をみたことより、臨床的にみとめられる骨形成像は骨芽細胞以外の因子の存在が示唆された。3.骨塩量の測定:X線上明らかに骨転移をみとめた椎体では骨塩量の増加をみとめたが、組織学的にのみみとめたれた転移巣ではむしろ低下していた。4.転移骨の組織学的検索:画像解析法を用いて骨梁の変化の定量化を行ったところ、造骨性変化を示した骨では明らかに骨梁の増加を示した。5.前立腺上皮細胞のレクチン結合性:各種レクチンを用いて、細胞表面における糖鎖発現の相違について検討したところ、正常細胞に比し、癌細胞ではレクチンの結合は高度であった。6.骨及び前立腺細胞における接着因子の存在:ECF及びC-erb B-2 proteinの発現を免疫組織学的に検索したところ、転移巣での発現は極めて低率であった。以上の結果より、Ca^+^+の異常取り込みである前立腺癌の造骨性骨転移は、骨あるいは宿主の骨代謝動態からみて、癌化に伴う特有の変化によると思われ、今後前立腺癌細胞の生物学的特性をさらに研究する必要がある。1.培養前立腺細胞と増殖因子ラット前立腺をトリプシンおよびコラゲナーゼ処理後、二種類すなわち(1)EGF、インスリン、コレラ毒素、牛下垂体抽出物を含むWAJC404培地、(2)コレラ毒素、牛下垂体抽出物、牛血清アルブミンを加えたMEM培地にて、培養を行うと、(1)では上皮細胞を、(2)では間質細胞を選択的に分離培養させることができた。上皮細胞は男性ホルモン添加にても増殖率の増加はみられず、ステロイド投与にて逆に増殖抑制をみとめた。一方間質細胞はEGF、インスリンでは増殖を示さず、性ホルモンによる影響は認められなかった。現在他種類の増殖因子、Ca、Mg、Pなどの陽イオン、および細胞外マトリックスを加えて細胞増殖に及ぼす影響を検討中である。2.前立腺癌患者の骨代謝動態造骨性骨転移を特徴とする前立線癌症例の骨代謝動態を測定した所、血清Ca、Pは他臓器癌の骨転移症例と比べて差はなかった。しかしvitD代謝産物はわずかに低値を示し、尿中ハイドロオキシプロリンの上昇をみたことにより、骨吸収の亢進が存在すると考えられた。しかし骨形成の指標であるオステオカルシンの上昇はほとんどなく、臨床的にみとめられる骨形成像は、骨代謝にみられる骨茅細胞の関与しない機序の存在を示唆するものであった。3.ヒト前立腺組織における増殖因子の組織化学的検討手術標本、あるいは剖検で得られた前立腺および骨組織について、EGF、TGFなどの増殖因子、フィブリノレクチン、ラミニンなどの分化因子およびオステオカルシンなどの局在について、モノクロナール抗体を用いて現在検討している。I.前立腺上皮細胞及び癌細胞の表面糖鎖癌細胞の臓器特異的転移に関して、癌細胞のもつ親和性並びに標的臓器における受容体の存在を検討するため、(1)分離正常前立腺上皮細胞、(2)樹立前立腺癌細胞株を用いて細胞表面糖鎖の発現をレクチンを用いて観察した。前立腺癌細胞株では、用いた全てのレクチン結合が認められたが、正常前立腺上皮癌ではPNAのみの結合が認められた。即ち癌細胞では接着因子レセプターとしての糖鎖異常が存在すると思われた。