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ヒンドゥー教における現世放棄者サードゥーの苦行実践と近現代インドの社会変容

本研究は、現世放棄者サードゥーの苦行実践と現代におけるその意味について、独自の共同性のあり方に着目して考察することを目的とした。本年度は、昨年度までに行った長期現地調査により得られた知見に基づき、論文執筆を行うことに費やした。苦行(tapas)とは、単に身体的なもののみに限らず、身体的、言語的、心的な諸次元を含む。実際には、輪廻からの究極的な解脱を志向するサードゥーという生の様式の全体を指す。苦行実践は徒弟制を基盤とした一種の規律化の過程として捉えることができるが、昨年度の長期調査では、主にサンスクリット学校における実地学習に取り組むことによって、サードゥーの共同体における聖典修得のあり方について学ぶことを主眼とした。一六世紀北東インドを中心に活躍した大聖者トゥルシーダースが記した聖典群は、ラーマーナンディー・サードゥーのあらゆる苦行実践を支える思想的根幹である。しかしながら、全てのサードゥーがこれら聖典を正確に理解しているという訳ではなく、その真の意味は苦行実践の習熟を通して初めて体得されるものである。急速な経済発展と軌を一にして社会的美徳が失われ始めている現代ヒンドゥー社会において、家住者社会の変貌は著しく、その影響が徐々にサードゥーの共同体にも波及してきていることは否定できない。このようななか、現代のサードゥーには、苦行実践に邁進することを通して聖典に込められたsakal mangal(全的な至福)を追求することが何より求められている。結果としては、期限内に思うような研究成果を形にすることができなかった。それは何よりも、自分自身の実践が未だ不十分な段階にとどまってしまっていることによる。なお、当初は本年度中にも文献収集を目的とした短期の現地調査を予定していたが、研究の進捗状況等を鑑み取り止めた。現世放棄者のもつ独自の共同性のあり方、および家住信奉者との関係性の現代的様態を把握することが本研究の目的である。その上で本年度は、あらゆる苦行実践の思想的根幹にある聖典の学習過程に着目して研究を進めた。聖典の正確な学習と伝承を大本として、そこから派生する形で様々な共同性が生まれていると考えたからである。現時点までの研究で明らかになりつつあることは、聖典でありかつ宗教詩篇であるがゆえに、一読して意味が理解出来るようなものではなく(安易な誤読は罪となる)、聖典への習熟を根幹においた苦行実践全体の過程として、初めてその真の意味が体得されるということである。すなわち、学習は、逐語的に意味を同定していくことではなく、師に従った詠唱を徹底して反復することで、当該テクストのもたらすbhava(情調)を体得してゆくことによってなされる。そのため、まずテクスト全体に対して精神的に開かれてあることが何よりの前提となる。つまり、同一性の原理に従ってなされる近代的なテクスト読解の習慣をいったん脱することが求められるということである。これは実際には極めて困難な思考様式の転換を要するが、反復して詠唱する実践のなかで過程として、聖典の内に込められた世界の全体が徐々に内面化されてゆき、テクストの全体が生きられたものとして迫ってくるようになるのは事実である。今回の限られた渡航期間で全てを把握することはもとより不可能であるが、苦行実践の全体として真のbhakti(信愛)に到達することこそが究極の目的であるということを垣間見るに至った。なお、研究実施計画では、英国での短期文献調査も計画していたが、諸般の事情により今回は断念した。
胎盤でのＮＫＧ２Ｄリガンド発現の生理的意義と疾患への関与の解明

NKG2D阻害抗体投与により、uterine NK (uNK)細胞の主要な活性化経路であるNKG2Dシステムのin vivoにおける胎盤形成への関与を検討した。NKG2D受容体阻害により、妊娠満期時点では産仔数、胎児・胎盤重量に著変はないものの、胎盤形成期においてそのサイズ、及びトロホブラストの分布に変化が見られた。また、uNK細胞によるサイトカイン産生能はNKG2Dシステムを介して調節を受け、胎盤盤形成に関与していると考えられる。平成25年度は、前年度に続いて、NKG2Dリガンド-受容体間結合が胎盤形成と胎児発育に与える影響を評価するため、着床時点(妊娠4日目)から3日毎にNKG2D阻害抗体(250 μg)腹腔内投与を施行し、胎盤形成への影響を妊娠6日目、12日目、18日目の3点で評価した。妊娠6日目においてトロホブラスト領域と血管領域の狭小化、妊娠12日目でも胎盤のサイズ縮小が認められ、NKG2Dシステムが胎盤形成に寄与していることが確認された。妊娠末期に相当する18日目においては、産仔(胎盤・胎児)数、胎盤重量、胎児重量について、対照群との差異は見られなかった。NKG2Dシステムは、妊娠全期としては何らかの代償があり、胎児の発育に大きな影響を与えないと考えられる。ものの、少なくとも妊娠中期までの胎盤形成に影響を与えることが確認された。加えて、妊娠18日目においてjunctional zoneに相当するトロホブラストの分布に乱れが認められた。これらの成因として、NKG2Dシステムを介したuterine NK細胞のサイトカイン産生能への影響と、それに伴う胎盤血管網の形成不全が最も考えられることから検討を進めた。妊娠6.5日目時点においてはuNK細胞によるサイトカイン産生(IFN-γ, VEGF)に減少傾向が見られたものの、有意差は認められなかった。uNK細胞の集積がピークに達する妊娠10日目におけるサイトカイン発現とメカニズムについて、追加検討の施行が今後必要である。胎盤形成と妊娠維持において、NKG2Dシステムの関与は胎児発育にcriticalとは言えないものの、胎盤の形成に影響を与えることが確認された。すなわち、低出生体重や胎盤形成にかかわるヒト疾患において関与することが考えられる。今後引き続いての検討とメカニズムの解明が望まれる。平成24年度は、まず本研究の基礎となるデータの確立を目的として、各NKG2Dリガンドの発現変動解析を詳細に行なった。タンパク質レベルでの発現量検討が困難であることから、real-time PCRによる検討に重点を置いた。胎盤形成期から妊娠後期にかけて、MULT-1 mRNA発現の減少とH60c mRNA発現の増加を認めた。但し、これらの発現はRae-1に比較すると低い発現量にとどまっており、病態生理学的意義が大きいとは言えない。マウスモデルを用いた実証の第一段階として、NKG2Dリガンド-受容体間のinteractionを抗体により阻害する検討を行なった。投与による産仔数には影響はなく、NKG2D受容体阻害による流産率の増加は見られなかった。妊娠期の免疫寛容への寄与はそれほど高くないと考えられた。妊娠初期のNKG2Dリガンド-受容体間阻害による影響の検討では、E6.5においてuNK細胞の浸潤数が減少し、胎盤の血管形成に関与するサイトカインIFN-γとVEGFの発現が低下する傾向が認められた。これらの傾向から、NKG2Dリガンドの発現が胎盤形成期にuNK細胞の誘導あるいは集積に関与しており、特に胎盤の血管構築に影響を与える可能性が示唆される。胎盤形成期のトロホブラスト浸潤の不全や血管形成が流産や胎児の低体重、子癇前症の要因となっていると考えられており、NKG2Dリガンド発現もその一因となっていると考えられる。本研究結果のさらなる解析が疾患のメカニズム解明に繋がるものと期待される。医歯薬学また、実験計画に従ってNKG2D受容体阻害実験を施行し、NKG2Dリガンドの関与が妊娠維持期の免疫寛容よりもむしろ、妊娠初期(胎盤形成期)のuNK誘導あるいは集積に関与していることが示唆され、研究の焦点と方向性を定めることができた。但し、統計学的な有意差が十分に確認できていないため、研究結果について多少の補完が必要である。また、これらの結果を受けて、胎盤の血管構築等への影響について、形態解析を進める予定であるが、実験手技と解析方法の確立にやや時間を要したため、その途上である。当初の実験計画で挙げていたNKG2Dリガンド発現細胞とuNKのinteractionに関する解析については、研究結果を受けて若干修正の上で施行予定である。当初の研究計画に従い、NKG2D阻害抗体投与実験結果の再確認及び詳細な胎盤形態観察を施行する。具体的には、阻害抗体投与群のサンプル数を増やすとともに、血管形成に関与するサイトカインIFN-γとVEGFのreal-time PCRによる変動の確認を最優先課題として行なう。

上述のサイトカインの変化により胎盤形成期の血管構築への影響が予想されることから、既に得られている胎盤のホルマリン固定標本を用いて、詳細な画像解析を行ない検討する。また、NKG2Dシステムの阻害によりuNK数が減少する機構について、NKG2Dリガンド発現細胞とuNKとのinteractionをin vitroで検討する。uNKにはDBA (Dolichos Biflorus Agglutinin)陽性を示しVEGFを産生する群と、DBA陰性でIFN-γを産生する群が存在することが報告されている(Chen Z etal. Biol Reprod 87:81, 1-9, 2012)。これらの遺伝子発現とサイトカイン産生についても検討に加える。平成25年度は、流産モデルマウスを用いた疾患への関与の検討を予定している。最近、NKG2D阻害抗体投与により、poly(I:C)投与モデルにおいて流産が抑えられることが他の研究グループにより発表された(Thaxton JE et al. J Immunol 190:3639-47, 2013)。これはIL-10及びTLR活性化経路を介して、胎児の傷害・吸収に関する報告である。今回我々の着目している胎盤形成期への影響について、これらの報告を踏まえて種々の流産モデルを用いた解析を引き続き行なう。これらに加えて、ヒト流産検体、あるいは症例数が限られているものの妊娠期病理解剖症例でのNKG2Dリガンド発現とNK細胞浸潤の関連について検討を進める。次年度使用額は1,259円であり、概ね平成25年度研究費の当初の研究費使用計画に沿って施行予定である。
シマリス初代培養肝細胞を用いた冬眠特異的タンパク質の発現調節機構の解析

昨年度は、シマリス冬眠特異的タンパク質(HP)の血中量の年周変化の創出には冬眠中のHP発現抑制は継続的な抑制因子の働きかけが必要と考えられること、培養細胞でのHP発現に対して既知の神経伝達物質、ホルモン類、サイトカイン類、計38種のうちチロキシンが特に強いHP発現抑制効果(コントロールの1/4以下)を持つことを報告した。今年度はチロキシンに注目し、シマリス血漿中のチロキシンおよびその誘導体であるトリヨードサイロニンの濃度をラジオイムノアッセイ法で測定し、同一個体の冬眠期(血中HP濃度が低い)、非冬眠期(血中HP濃度が高い)で変化が見られるかどうかを調べた。測定した5個体すべてで、チロキシンおよびトリヨードサイロニンの濃度は前者で低く、後者で高いという結果を得た。また、チロキシンを約20日間シマリス生体に投与(25μg/100gb.w./day)したところ6個体中4個体で血中HP濃度が減少した。このうち2個体に投与を継続し、7月、8月に低温室(5°C全暗)に移したところ、およそ1ヶ月後に冬眠に入った。これらのことは、一見矛盾するようではあるが、1)生体でのHP調節にはチロキシンのみではなく他のホルモン類の協調作用が必要である、2)肝細胞、HP遺伝子のチロキシンに対する感受性が活動期、冬眠期で変化している、の2点を考慮すれば合理的に説明できる可能性がある。一方、昨年度に集めた覚醒中、冬眠中のシマリス血漿中からHP発現を調節する因子を検索するために、血漿をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画したが、HPがどの分画にも混入してくるため、HPを含まない分画を得るための方法を検討中である。冬眠特異的蛋白質(HPs)の血中量は、活動期のシマリスで高く、冬眠期のそれではほとんど消失する。活動期のシマリスから確立された初代培養肝細胞では、培養上清中にHPsが見られるが、冬眠中のシマリスから確立された初代培養肝細胞において、HPsが発現するかどうかを確かめた。分散後1日目には発現が見られなかったが、2日目以降培養上清中への分泌量が増加し、7日目には、ほぼ活動期のシマリス由来の細胞と同程度のHPs分泌が観察された。このことから、冬眠中のHPsの発現抑制は継続的な抑制因子の働きかけが必要と考えられ、この因子がなくなれば、抑制が解除されることが予想される。多くの物質の中からシマリス初代培養肝細胞でのHPs発現に影響を与えるものを探す方法の一つとして、既製の神経伝達物質、ホルモン類、サイトカイン類、計38種を培養液に添加し、HPsの培養液中への分泌量をウエスタンブロット法により比較した。その結果、これまでに抑制的に働くことがわかっていたチロキシンに加えて、抑制的に働くものとしてPTH、TSH、プロラクチンが、促進的に働くものとしてテストステロン、コルチコステロン、TRHが新たに見出された。これらのうち特に作用の強いチロキシン(コントロールの1/4以下)とテストステロン(コントロールの2倍以上)を添加した細胞についてノーザンブロット法によりHP-25遺伝子のmRNA量を調べたところ、HPs分泌量の変化はmRNA量の変化によることがわかった。また、来年度に行う予定の血漿に含まれるHPs発現を調節する因子の検索の準備のため、覚醒中、冬眠中のシマリスの血漿を集めた。
Csk類似Chkチロシンキナーゼによる細胞分裂異常の分子機構

細胞増殖・活性化にはチロシンリン酸反応が深く関わっている。Src型チロシンキナーゼの恒常的活性型への変異体は発癌遺伝子産物として知られている。Src型チロシンキナーゼの活性は、増殖因子などの刺激後G_0からG_1期および細胞分裂M期において、それぞれ一過性の活性上昇が見られ、Src型チロシンキナーゼの活性はCskによって常に抑制的に調整されている。我々は、Csk homologous kinase(Chk)がCskとファミリーを形成すること、膜結合型Chkを介したLynキナーゼ選択的なSrcチロシンキナーゼ制御機構が存在することなどを明らかにしてきた。本研究では、ヒト血液系細胞を用いて、ChkによるSrc型チロシンキナーゼ制御の細胞増殖に対する役割を検討した。まず、chkをヒト未塾骨髄系細胞KMT-2に過剰発現したところ、増殖の遅延・多核化などが見られ、M期染色体の動態異常が観察された。Src型チロシンキナーゼLynとc-Yes」・チロシンフォスファターゼSHP-1・pp80・pp64のチロシンリン酸化蛋白及びChk・CskがM期染色体に強固に会合していた。そして、Chk過剰発現によりLynの自己リン酸化の減少を伴うpp80・pp64のチロシンリン酸化の変動が見られた。Src型チロシンキナーゼとその調節因子群による染色体会合蛋白のチロシンリン酸化がM期染色体の動態に重要な役割をもつことが示唆された。以上、Src型チロシンキナーゼが細胞膜直下のシグナル伝達ばかりでなく、染色体の機能にも関わることが考えられた。
ピロリ菌CagAタンパク質による病原シグナル生成の構造-機能連関解析

ピロリ菌病原因子CagAが宿主細胞内において発揮する病原シグナル生成を生化学的に解析するため、胃がんの多発する東アジア諸国に蔓延する東アジア型CagAならびに東アジア以外に蔓延する世界標準型の欧米型CagAそれぞれについてチロシンリン酸化型および非リン酸化型全長CagAを大腸菌体内で発現させ大量に調製する方法を樹立した。また、CagAが標的とする宿主PAR1b、SHP2およびCskの組み換えタンパク質をそれぞれ大量に調製した。欧米型CagA結合における各因子間の影響を検討した結果、CagA-PAR1b相互作用はCagA-SHP2相互作用を促進する一方、CagA-Csk相互作用は顕著にCagA-SHP2相互作用を低下させることを見出した。今後、東アジア型CagAについても同様の試験を行い、これらの標的分子との相互作用におけるCagAサブタイプ間の差異を検討する。CagA-PAR1b相互作用ならびにCagA-SHP2相互作用に関してX線結晶構造より、CagAサブタイプ間におけるPAR1bおよびSHP2結合能の違いを検討し、その構造-機能連関をSci Rep誌に報告した。CagAは細胞内においてPAR1b二量体(多量体)との相互作用により間接的に二量体化する結果、SH2ドメインを2つ有するSHP2との相互作用が増強するモデルが提唱されているが、本研究の遂行過程で組換えPAR1bは単独では二量体化せず、因子Xが二量体化に必要であることがわかった。一方、上述の結果から因子X非存在下においてもPAR1bはCagA-SHP2相互作用を促進したことから、従来のCagA-PAR1b-SHP2複合体形成モデルとは異なる相互作用機序が存在していることが示唆された。今後、因子X存在下ならびに非存在下での複合体結晶化を進めるとともに、さらなる生化学的解析を実施していく。PAR1b多量体化に関して、病原シグナル生成のための既存の相互作用モデルとは異なる相互作用モデル構築を視野にとらえており、新たな知見が得られているため。PAR1bの多量体化に必須な因子Xを新たに複合体形成モデルに導入し、生化学的相互作用解析を実施していくと共に、病原シグナル複合体の共結晶化を通したX線結晶構造解析を試み、構造と機能の関連を明らかにしていく。
ゼブラフィッシュを用いたInv細胞内局在機能の解明

ゼブラフィッシュを用いて繊毛分子であるInvの細胞内局在と生体での機能の関連について検討した。Invはカルモジュリン結合領域であるIQドメインを2つ有するため、この機能について検討した。その結果、IQドメインを欠失するInvは繊毛に局在せず、Inv異常により引き起こされる嚢胞腎や左右異常を改善できなかった。以上から、Invはカルモジュリン依存的な細胞内局在制御がなされ、これが生体内での機能に必要であることが強く示唆された。Invは繊毛基部に局在するが、Invがいつ、どのように、どこで機能するのかは未だに不明である。本研究はInv細胞内局在と生理的機能の関連について、ゼブラフィッシュを用いた生体レベルでの解明を目的に研究を行っている。本年度、Invが有するカルモジュリン結合領域(IQドメイン)の機能について検討した結果、Invが生体レベルで正常に機能するにはIQドメイン依存性の繊毛局在が必要であることが示唆された。以下に結果を記載する。まず、InvにはIQドメインが2つ存在するため、これらのIQドメインを欠失したマウスInvコンストラクト(mInv△IQ)を作製した。Inv^<-/->マウス由来腎尿細管上皮細胞株を用いて細胞内局在を検討したところ、mInv△IQは繊毛に局在せず、細胞質内に留まることを見出した。また、ゼブラフィッシュ野生型Inv (zInvWT)とIQドメインを欠失したInv (zInv△IQ)を作製し、細胞内局在を検討したところ、zInvWTは繊毛に局在するが、zInv△IQは繊毛に局在せず、基底小体に局在した。次に、Invに対するモルフォリノ(in vMO)をゼブラフィッシュ初期胚へ注入し,Inv機能を阻害すると、嚢胞腎およびcurly tail downといった染毛異常に特有の表現型が生じた。zinvWT mRNAを作製しin vMOと同時に初期胚へ注入すると表現型異常は改善された。しかし、IQドメインを欠失したzinv△IQ mRNAをin vMOと同時に注入したところ、表現型異常は全く改善されなかった。以上より、Invが正常に機能するにはIQドメイン依存性の繊毛局在が必要であることが示唆された。IQドメインは他の繊毛タンパク質にも存在することが知られ、Inv以外の分子にも類似の制御機構が働く可能性が考えられる。IQドメインが繊毛局在・機能の制御に関与することは初めて見出されたものであり、繊毛機能の解明へ向けて重要であると考える。Invは腎臓形態形成や左右軸決定に重要であり、繊毛基部に局在する分子である。しかしInvがいつ、どのように、どこで機能するのかは未だに不明である。本研究はInv細胞内局在と生理的機能の関連について、ゼブラフィッシュを用いた生体レベルでの解明を目的に研究を行った。昨年度、Invが有するカルモジュリン結合領域(IQドメイン)の機能について検討した。その結果、IQドメイン依存性のInv繊毛局在が腎臓形態形成に必要であることが示唆された。本年度さらに詳細な検討を行った結果、カルモジュリンとの結合依存的なInv繊毛局在が、腎臓形態形成のみならず左右軸決定も制御することが明らかとなった。詳細結果を以下に記載する。まず、昨年度までの結果を詳細に解析する系を構築するため、改変型Tol2トランスポゾンを用いてゼブラフィッシュ前腎(腎臓)と心臓で蛍光発現するトランスジェニックラインを作製した。このラインに対しInv発現を抑制することで、嚢胞腎形成過程をリアルタイムで観察できた。これにより、昨年度明らかになったIQドメイン依存性の腎臓形態制御機能を明確かつ定量的に示すことが可能となった。また野生型において、心臓の位置は2日胚の段階で左側に位置し左右非対称性を示すが、inv発現を抑制することで心臓が右側に位置する個体が有意に多く観察された。しかも、IQドメインを欠失したInvを注入しても左右非対称性の異常は改善されなかった。以上からIQドメイン依存的なInv機能が生体制御に関与することが示唆された。
レドックスによる血管内皮細胞機能制御に関する研究

心血管病の発生や進展に活性酸素種は重要な役割を果たす.今回,血管内皮細胞に発現する活性酸素種産生酵素Nox4に注目した検討を行った.Nox4は正常成人個体でその発現は抑制されるが,虚血組織細小血管において高度に誘導され,低酸素応答を増強させるとともに,血管新生・炎症誘導分子の産生を増加させた.Nox4の生理的役割は血管新生誘導作用と考えられるが,急激なNox4誘導により脳虚血など特定の病態下では不利に働く場合があると考えられる.心血管病の発生や進展に活性酸素種は重要な役割を果たす.今回,血管内皮細胞に発現する活性酸素種産生酵素Nox4に注目した検討を行った.Nox4は正常成人個体でその発現は抑制されるが,虚血組織細小血管において高度に誘導され,低酸素応答を増強させるとともに,血管新生・炎症誘導分子の産生を増加させた.Nox4の生理的役割は血管新生誘導作用と考えられるが,急激なNox4誘導により脳虚血など特定の病態下では不利に働く場合があると考えられる.細胞内において発生する活性酸素種(ROS : Reactive Oxygen Species)は,単に細胞傷害性分子として作用するのみならず,様々な細胞機能を制御する細胞内シグナル伝達物質として作用する.ROSはミトコンドリア電子伝達系におけるATP産生の副産物として生じると考えられてきたが,近年,ROSを積極的に産生するNADPHoxidase (Nox)familyタンパク質が同定され,その役割解明が急務とされている.我々はこれまでに,心血管系細胞にNox4が強く発現していることを明らかにし(Circulation 2004, Stroke 2005),生体における機能解析を進めている.まずトランスジェニックマウス作製が容易な心筋特異的ヒトNox4過剰発現マウス(cNox4-Tg)を作製した.cNox4-Tgは加齢性変化や心肥大刺激に伴い容易に心不全に陥ることを見出した.心筋細胞においてNox4はミトコンドリア近傍に局在し,cNox4-Tgの心臓ではミトコンドリア画分で著明なROS産生増加を認めた.さらにミトコンドリア内の重要なタンパク質が酸化されることによってタンパク質の機能低下が生じ,心組織の機能不全が誘発されることを証明した(Circ Res 2010).一方で,血管内皮細胞および平滑筋細胞におけるヒトNox4過剰発現マウスの作製も行った(eNox4-TgおよびsNox4-Tg).内皮細胞はTie2,平滑筋細胞はSM22αのプロモーター領域を用いた.両マウスにおいて,血管壁のNox4発現上昇とROSの産生増加を確認した.意外なことに,eNox4-Tgでは血圧低下,sNox4-Tgでは血圧上昇を認め,同じNox4の過剰発現でも内皮と平滑筋では表現型が異なるという興味深い所見が得られた.これらの知見は,AHA Scientific Sessions 2009, USAにて発表した.さらにこれらの動物を用いて機能解析を継続中である.血管内皮細胞は代謝の盛んな細胞であり,ミトコンドリアや種々の酵素による活性酸素種産生が多い細胞である.相対的な酸化ストレスの増加は,内皮機能障害発生の重要な成因であり,高血圧・糖尿病・高脂血症など生活習慣病に共通する病態である.ゆえに,血管内皮細胞における活性酸素種の産生・消去機構を正確に理解することは重要な課題である.血管内皮細胞に高発現する活性酸素種産生酵素Nox4が,内皮細胞における酸化ストレスの発生に重要な役割を果たすと考え研究を行っている本年度は,我々が作製した血管内皮細胞特異的Nox4過剰発現マウス(昨年度報告)の解析を本格的に開始した.正常型Nox4過剰発現マウス(eNox4-Tg)と活性酸素種を産生することができない1アミノ酸置換(P437H)変異体・過剰発現マウス(eNox4-DN-Tg)を用い,レーザー光凝固による中大脳動脈閉塞・脳梗塞モデルにおける表現型変化を検討した.野生型マウスに比し,eNox4-Tgでは脳梗塞サイズが有意に拡大し,逆にeNox4-DN-Tgでは脳梗塞サイズが有意に縮小したこの分子メカニズムを明らかにするために,アデノウイルスを用いたNox4過剰発現による細胞内シグナル伝達の変化についてヒト脳微小血管内皮細胞を用いて検討した.Nox4の過剰発現は用量依存性に,Akt(Ser-473)のリン酸化,Aktの下流に存在し内皮細胞の機能遂行に重要な役割を果たす内皮細胞一酸化窒素合成酵素(eNOS)Ser-1177のリン酸化を有意に抑制した.eNOSノックアウトマウスでは脳梗塞モデルにおいて,梗塞サイズが拡大することが知られており,このシグナル伝達の変化は,eNox4-Tgの脳梗塞における表現型変化をよく説明するものと考えられた.また,高血圧・糖尿病は脳梗塞発生の危険因子であるとともに重要な増悪因子でもあり,これらの危険因子におけるNox4の関与を示唆する所見と考えられた.さらに,Nox4によるAkt・eNOS制御機構について検討を行っている血管壁における酸化ストレスの増加は動脈硬化を助長し虚血性疾患の原因となるのみならず,虚血性病態を修飾する重要な因子と考えられる.我々は,脳虚血マウスモデルを用いて,血管壁酸化ストレスの役割を解析している.

我々は,培養・内皮細胞ならびに平滑筋/周皮細胞において,Nox4と呼ばれる活性酸素種産生酵素が発現していることを明らかにしたが,個体では脳梗塞時,梗塞巣周囲領域の血管壁細胞に限局してNox4が非常に強く発現誘導されることを見いだした.その意義を明らかにするために,内皮細胞特異的Nox4過剰発現マウスを作製し,表現型変化とそのメカニズム解析を行った.Nox4過剰発現マウスでは脳梗塞サイズが有意に拡大した.Nox4過剰発現マウスの脳ではAngiopoietin-2(Ang-2)の産生が有意に増加しており,Nox4過剰発現・内皮細胞ではAng-2の発現が有意に上昇することから,脳内におけるAng-2の産生増加は内皮細胞に由来すると考えられた.Ang-2は脳微小血管において周皮細胞から分泌されるAng-1と拮抗し,内皮細胞と周皮細胞の相互作用を減弱させる.このことは周皮細胞によって制御される内皮細胞による血液脳関門の脆弱化を意味する.これに一致して,Nox4過剰発現マウスの脳梗塞周囲領域では,血管壁の漏出が有意に増加していた.また周皮細胞によるAng-1の内皮細胞への作用減弱により,内皮細胞におけるAkt→eNOS活性化シグナルが抑制されることも見いだした.eNOS活性の抑制は,脳梗塞病態のさらなる悪化に寄与すると考えられた.また,脳血管内皮細胞を用いたマイクロアレイの検討から,Nox4を過剰発現させた内皮細胞では,血液凝固を亢進させる分子群の発現が有意に亢進することや,細胞外マトリックスを分解するメタロプロテアーゼの発現が上昇することなどを同定しており,Nox4過剰発現マウスにおける脳梗塞病態の悪化に関与する可能性が高いと考えている.一方で,Nox4過剰発現内皮細胞ではPDGF-Bの発現が増加するなど,成熟した血管新生を促す可能性も示唆されており,Nox4の生理的意義を明らかにすべく更なる分子メカニズムの解析を行っている.さらに平滑筋・周皮細胞特異的Nox4過剰発現マウスを作製し,脳梗塞における表現型変化の解析も開始しており,興味深い結果が得られつつある.血管壁における酸化ストレスは虚血性疾患の発症原因となるのみならずその病態を修飾する.我々は活性酸素種産生酵素NADPHoxidaseの1つであるNox4が血管内皮細胞・周皮細胞に強く発現することを報告し,生物学的意義について検討している.Nox4は発現量により活性酸素産生量が規定される.発現制御に最も重要な因子は低酸素刺激であった.代表的な低酸素関連転写因子であるHIF-1をknockdownしてもNox4の発現は抑制されず,逆にNox4を過剰発現すると正常酸素下においてもHIF-1タンパク質の発現が観察された.Nox4過剰発現によりHIF-1を分解誘導するPHD-2の発現が抑制されており,Nox4はHIF-1を介した低酸素応答を増強させると考えられた.これに一致し,内皮・周皮細胞にNox4を過剰発現してマイクロアレイを行うと,いずれの細胞においてもHIF-1制御分子群,血管新生関連分子群の発現が有意に増加していた.さらにNox4がミトコンドリアに局在し,ミトコンドリア膜電位を低下をさせ,NFkBの活性化を生じさせる(=炎症を誘導する)ことを明らかにした.これらの現象を個体で確認するため,内皮細胞ならびに周皮細胞特異的Nox4過剰発現マウスを用いて検討した.中大脳動脈閉塞による一過性および永久虚血の両者において,これらのマウスでは脳梗塞サイズが有意に拡大した.
立体構造情報に基づいた白血病原因蛋白質に結合する新規RNAアプタマーの創製

本研究ではAML1に対するRNAアプタマーの立体構造の情報を基に,RNAアプタマーを設計し,Runtへの親和性の向上を目指した.1.融合型RNAアプタマーのApt14において,Runtへ高い親和性を示すことが明らかとなった.2.Apt14変異体とRuntの相互作用解析から,内部ループと末端のステム構造が重要であることが示唆された.本研究ではAML1に対するRNAアプタマーの立体構造の情報を基に,RNAアプタマーを設計し,Runtへの親和性の向上を目指した.1.融合型RNAアプタマーのApt14において,Runtへ高い親和性を示すことが明らかとなった.2.Apt14変異体とRuntの相互作用解析から,内部ループと末端のステム構造が重要であることが示唆された.本研究では,白血病原因蛋白質のRuntドメインに対するRNAアプタマーについて,その立体構造から,Runtドメインに対し,より高い親和性を有するRNAアプタマーを創製することが目的である.応募者は,このRNAアプタマーの立体構造を決定することに成功し,DNAを擬態した構造であることを明らかにしている.そこで,この立体構造情報を基にしてRuntドメインに高い特異性を有すると期待できる新規RNAアプタマーのデザインを行った.まずは,SELEXによって得られているRNAアプタマーについて,DNA擬態モチーフの立体構造情報をベースとし,二種類のRNAアプタマーを融合させたRNAアプタマーをデザインした.一通りデザインされたRNAアプタマーが用意できたら,それらとRuntドメインの相互作用解析を行うことで,デザインの妥当性について検討した.この際に,もともとSELEXで得られていたアプタマーも比較のために相互作用解析を行っている.立体構造情報に基づいたデザインの妥当性については,RNAアプタマーとRuntドメインの相互作用について生体分子間相互作用解析装置(SPR)や等温滴定カロリメトリー(ITC)を用いて検討した.その結果,DNA擬態モチーフの近辺のインターナルループのサイズと向きが重要であることが示唆された.これらが立体障害の起こらないように配置され,さらにRuntとの相互作用が存在する場合に,もともとSELEXで得られたRNAアプタマーを超える親和性を得ていることが示唆された.このように従来のSELEXでは得られない配列をデザインし,親和性の向上に成功した-今後,さらに改良を加え,より強力なアプタマーを立体構造情報に基づいでデザインすることができれば,RNAアプタマーを用いた治療薬やセンサーなどの開発に貢献できると考えられる.本研究では、白血病原因蛋白質のRuntドメインに対するRNAアプタマーについて、その立体構造から、Runtドメインに対し、より高い親和性を有するRNAアプタマーを創製することが目的である。応募者は、このRNAアプタマーの立体構造を決定することに成功し、DNAを擬態した構造であることを明らかにしている。そこで、この立体構造情報を基にしてRuntドメインに高い特異性を有すると期待できる新規RNAアプタマーのデザインを行った。まずは、SELEXによって得られているRNAアプタマーについて、DNA擬態モチーフの立体構造情報をベースとし、二種類のRNAアプタマーを融合させたRNAアプタマーをデザインした。一通りデザインされたRNAアプタマーが用意できたら、それらとRuntドメインの相互作用解析を行うことで、デザインの妥当性について検討した。立体構造情報に基づいたデザインの妥当性については、RNAアプタマーとRuntドメインの相互作用について生体分子間相互作用解析装置(SPR)を用いて検討した。その結果、SELEXで得られたRNAアプタマーを超える親和性を持つRNAをデザインすることができた。さらに、そのRNAアプタマーを短鎖化することにも成功し、それらの結果からDNA擬態モチーフの上流および下流にインターナルループが配置し、その後ろにループを閉じるためのステムが必要であることが分かった。特にインターナルループの長さか塩基の種類、またはその両方が必要であることが示唆された。このように従来のSELEXでは得られない配列を立体構造情報を基にデザインすることで,親和性を向上させることに成功した。このような、より強力なアプタマーを立体構造情報に基づいでデザインすることは、RNAアプタマーを用いた治療薬やセンサーなどの開発に貢献できると考えられる。本研究では,白血病原因蛋白質のRuntドメインに対するRNAアプタマーについて,その立体構造から,Runtドメインに対し,より高い親和性を有するRNAアプタマーを創製することが目的である.その目的に向かい,初年度において予定通り,従来のアプタマーを上回る活性を持つアプタマーデザインを実現した.このまま順調に進めば,さらに強力なアプタマーを創製することができると考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の今後の推進方策については,現在までに,大まかなアプタマーデザインができているので,さらに修飾体を用いるなど,細かいデザインを行っていくとともに,原子レベルでの詳細な相互作用を見るために,アプタマーとRunt複合体の立体構造を明らかとしていきたい.これらにおいては,結晶化が困難である可能性が非常に高いが,応募者はRNA-タンパク質複合体の構造解析に対する知見を多く持っているので,それらを駆使して研究を進めて行きたいと考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
トピック抽出を用いたコードクローン検出手法

識別子名の類似性に基づくコードクローン検出ツールを開発し,有効性の評価を行った.本ツールは,単純に同一の識別子名を含むコード片をコードクローンとして検出するだけでなく,類似した用いられ方をしている識別子名を含むコード片もコードクローンとして検出する.コード片が類似した用いられ方をしている識別子名を含むかどうかを判定するためには,自然言語処理の分野で提案されているトピック抽出技術を用いた.本研究で提案するツールである「トピック抽出を用いたコードクローン検出ツール」の実装を行った.本ツールを実装するために,まずソースコードに含まれるトピック(対象と関連の強い単語のリスト)を抽出する機能を,自然言語処理で用いられている文章中からトピックを自動的に特定する手法を用いて実装した.次に,トピックを特定した結果を用いて,コード片間の等価性を判定する機能を実装した.高速に等価性を判定するために,コード片に含まれるトピックを特徴ベクトルで表現し,ハッシュ関数に基づくクラスタリング手法を用いた.ソースコードに含まれるトピックの抽出では,各ソースファイルに含まれる語(基本的には識別子名.ただし,複数の語からなる識別子名は各語に分割)を抽出し,トピック(ソースファイルと関連の強い単語のリスト)の特定を行った.コード片間の等価性を判定するため,構文木中の部分木に対して特徴ベクトルを付加した.特徴ベクトルは,部分木に含まれるトピックの分布を表す.次に,特徴ベクトル間の距離に基づいて部分木のクラスタリングを行った.最後に,同一クラスタに属した部分木に対応するコード片を等価なコード片として提示した.各部分木をベクトルで表現する利点は,部分木間の距離を求める問題をベクトル間の距離を求める問題に変換することで,計算量を低下させることができることである.特徴ベクトルの数が膨大になると,クラスタリングにかかる計算時間が大きくなると考えられるため,LSH (Locality Sensitive Hashing)というハッシュ関数を用いたクラスタリングを行った.LSHは,「類似したベクトルは高い可能性で同じハッシュ値になり,異なるベクトルは高い可能性で異なるハッシュ値になる」という性質を持つハッシュ関数である.提案手法の評価として,「本ツールがコードクローンとして検出したコード片が,既存のコードクローン検出ツールで検出されるか」を評価した.入手可能であり,かつ代表的なコードクローン検出ツールであるCCFinderXやDECKARD,CloneDRとの比較を行った.各ツールともに,検出するコードローンの量をパラメータで変更できるようになっているため,パラメータを変更しながら比較を行った.また,「既存のコードクローン検出ツールと比較して,本ツールのスケーラビリティ(検出時間やメモリ消費量)は高いか」についても評価を行った.次に,「本ツールが検出したクローンセット(コードクローンの同値類)を提示したとき,保守作業を行う開発者を支援できるか」を評価した.この評価については,実用的な観点から評価を行う必要があるため,企業のソフトウェア開発者の意見を積極的に取り入れた.具体的には,「検出したクローンセットがその後の保守作業において同時に修正される,もしくは同一の欠陥を含んでいるか」という評価基準を採用した.両評価ともに,オープンソースソフトウェアに含まれるコードクローンに対して提案手法は一定の有効性を示すことができた.類似した識別子名を含むコード片は,類似した機能を持つことが多く,同時にバグ修正が行われやすい.そのため,提案手法をツールとして実装すれば,オープンソースソフトウェアに含まれるコードクローンに対する保守作業を効率化できると期待される.評価実験に関して協力を得る予定だった企業のソフトウェア開発技術者との日程調整に時間がかかってしまい,評価実験に本年度末までかかってしまった.本研究の目的は,識別子名の類似性に基づくコードクローン検出ツールを開発し,有効性の評価を行うことである.本ツールは,単純に同一の識別子名を含むコード片をコードクローンとして検出するだけではなく,類似した用いられ方をしている識別子名を含むコード片もコードクローンとして検出する.その理由は,類似した用いられ方をする識別子であっても,開発者によって異なる名前が付けられることがあるため,類似した用いられ方をしている識別子名を等価であると見なした方が,類似した機能を持つコード片をコードクローンとして検出しやすいと考えられるからである.コード片が類似した用いられ方をしている識別子名を含むかどうかを判定するためには,自然言語処理の分野で提案されているトピック抽出技術を用いる.具体的には,2つのコード片間で共通するトピックが占める割合が大きいなら,それらコード片をコードクローンと判定する.有効性の評価では,本ツールがコードクローンとして検出したコード片が既存のコードクローン検出ツールで検出されるか,および本ツールが検出したクローンセット(コードクローンの同値類)を提示したとき保守作業を行う開発者を支援できるかを評価した.さらに,既存のコードクローン検出ツールと比較して,本ツールのスケーラビリティ(検出時間やメモリ消費量)は高いかも評価した.既存のコードクローン検出手法のほとんどはコンパイラで使用されている字句解析や構文解析に基づくものである.よって,自然言語処理に基づく本手法は,新しい分類のコードクローン検出手法と言える.識別子名の類似性に基づくコードクローン検出ツールを開発し,有効性の評価を行った.本ツールは,単純に同一の識別子名を含むコード片をコードクローンとして検出するだけでなく,類似した用いられ方をしている識別子名を含むコード片もコードクローンとして検出する.コード片が類似した用いられ方をしている識別子名を含むかどうかを判定するためには,自然言語処理の分野で提案されているトピック抽出技術を用いた.本研究で提案するツールである「トピック抽出を用いたコードクローン検出ツール」の実装について,概ね順調に行うことができた.

ツールを実装するための情報収集についても,国内研究会への参加を通してある程度行うことができた.ただし,海外の大学に在籍する研究者からの情報収集については,学内業務の都合で国際会議に参加できなかったため,不安が残る.今年度は,昨年度実施できなかった提案手法の改善を行う.具体的には,昨年度末に企業のソフトウェア技術から提案手法の出力結果に対する意見を得ることができたため,その意見を基に提案手法の改善を行う.ソフトウェア工学これまで,ツールを実装するための情報収集については,国内研究会への参加を通してある程度行うことができた.ただし,海外の大学に在籍する研究者からの情報収集については,学内業務の都合で国際会議に参加できなかったため,情報収集や専門家との議論の深さについて不安が残っている.これを解決するために,来年度は専門家の所属大学を訪問する,もしくは専門家が集まる国際会議への参加を通して,十分な議論および情報収集の時間を確保したい.企業に在籍する協力者との日程調整に時間がかかってしまい,提案手法の評価が昨年度末までかかってしまった.そのため,当初予定していた評価結果に基づく提案手法の改善および改善した結果の学会発表を実施することができなかった.国際会議への参加を通して専門家と議論することにより実装方法に関する情報収集を行う予定であったが,学内業務の都合で実施できなかった.そのため,国際会議参加に必要な旅費および登録費が残った.提案手法の改善後に行う学会発表のための旅費およびデモンストレーション用のラップトップパソコンの購入費用にあてる予定である.海外の専門家が在籍する大学へ訪問,もしくは専門家が集まる国際会議への参加を通して情報収集を行う.これらを実施するための旅費および国際会議への登録費として使用する.
生細胞内のRNAポリメラーゼII動態の計測

真核生物のRNAポリメラーゼIIは、遺伝子の転写を担う重要な酵素であり、十数個のサブユニットから構成される。生きた細胞の中で、RNAポリメラーゼがどのように転写開始、伸長、終結を行うのかを明らかにすることは、遺伝子発現制御を理解するうえで非常に重要である。これまでにもGFP融合蛋白質を用いてRNAポリメラーゼIIの生細胞における分子動態が解析されてきたが、個々の報告で異なるモデルと結果が得られておりその全容の解明には至っていない。本研究は、RNAポリメラーゼIIの状態に応じて付加される翻訳後修飾の違いを利用して、そのプロモータ上へのリクルート、転写開始、転写伸長の各ステップに至るキネティクスを明らかにするとともに、ヒストン修飾などクロマチン構造の変化と転写制御の関係を生きた細胞で明らかにすることを目的として行った。昨年度の研究で、Fabを用いた内在性RNAポリメラーゼII検出系を構築し、転写誘導に伴うRNAポリメラーゼIIの動態を計測した。本年度は、その計測結果の定量化を行った。また、ヒストンH3K27のアセチル化の変動も合わせて解析を行った。さらに、定量的ウェスタンブロッティングにより、細胞あたりのRNAポリメラーゼIIの総量と特定のリン酸化状態にある分子数を見積もった。そして、RNAポリメラーゼIIの集積、転写開始、転写伸長のキネティックモデルの構築とシミュレーションを行い、RNAポリメラーゼIIの数と生細胞計測により得られた集積曲線に最もよく適合する数値を導き出した。その結果、遺伝子のプロモータにリクルートされたRNAポリメラーゼIIが、転写開始に至るまでに、複数回の解離と結合を繰り返すこと、また、転写開始から伸長に至る過程は比較的効率が高いこと、また、ヒストンの脱アセチル化が新規転写を抑制する可能性があることなどが示唆された。本研究では、RNAポリメラーゼIIのプロモータ上へのリクルート、転写開始、転写伸長の各ステップに至るキネティクスを明らかにするとともに、ヒストン修飾などクロマチン構造の変化と転写制御の関係を生きた細胞で明らかにすることを目的とする。具体的には、RNAポリメラーゼIIやヒストンの翻訳後修飾を特異的に認識する抗体からFabを調製し、蛍光標識したのち、生きた細胞に導入することで、内在性のヒストンとRNAポリメラーゼIIを検出する。本年度は、共焦点顕微鏡を用いて、GFP融合転写因子と二つの修飾を同時に高解像度で追跡するシステムを構築し、転写誘導が可能な遺伝子アレイを持つ細胞を用いて、刺激により転写因子とRNAポリメラーゼIIの遺伝子アレイへの集積を可視化することに成功した。さらに、その集積を定量的に解析するための独自の画像解析法を確立したほか、FPAP (fluorescence recovery after photobleaching)を用いて結合成分の割合を求めることにより、RNAポリメラーゼIIの集積と転写開始、伸長に関わる速度と量についての解析を行っている。また、修飾特異的ヒストンを同時に可視化することにより、転写誘導に伴う遺伝子アレイ上のヒストン修飾の変化を追跡することも可能になった。
歯科用チタン合金の隙間腐食に関する研究

耐食性に優れた合金であっても、応力下や間隙に置かれた場合は耐食性が劣ることが知られている。口腔内で使用される合金は常にこの様な環境にあり、隙間腐食について明らかにすることが口腔内での合金を評価する一助となる。そこで、CPチタン、Ti-6A1-4V合金、Ti-Ni合金、TypeII金合金、TypeIV金合金、金銀パラジウム合金、Ni-Cr合金(硬質)、Co-Cr合金、を試料とし、電気化学腐食測定装置(PotentiostatModel273 & Corrosion software M352C:PARC)を用い、0.9%NaClと1%乳酸の混合溶液中でのアノード分極、孔食電位および分極抵抗を測定した。溶液中でのアノード分極の結果、チタン系合金の自然電極電位は-0.1V-0.6Vの範囲にあり、経時的に貴となる傾向にあった。TypeIV金合金、金銀パラジウム合金は0.07V0.12Vの範囲にあった。Ti系合金の24時間後の分極抵抗は3050×10^5Ohm・cmの範囲にありTypeIV金合金、金銀パラジウム合金より大きな値を示した。アノード分極の結果、Ti系合金の不動態破壊電位はTiよりも低いが、全て1.0V以上にあり孔食の発生を認めなかった。TypeII金合金,TypeIV金合金およびCo-Cr合金では800mV,金銀パラジウム合金とNi-Cr合金(硬質)では200300mV付近に過不動態電位が存在した。今後ASTMの隙間腐食測定方法に準じた方法で0.9%NaClと1%乳酸の混合溶液中での隙間腐食電位を測定することによって孔食電位および分極抵抗との関係を評価しすると共に金属元素溶出量ならびに走査電子顕微鏡による表面観察を行い、隙間腐食挙動を明らかにする予定である。
膵嚢胞性腫瘍におけるムチン抗原発現の検索:その診断と治療への応用

(1)膵嚢胞性腫瘍は、嚢胞性病変の中に乳頭状発育がみられる膵管内乳頭腫瘍(IPMT)と、嚢胞部分が多房性の膵管拡張型粘液性嚢胞腫瘍(DMCT)に大きく分類されるが、手術前に得られた超音波診断やCT等の画像診断と、手術摘出標本を照らし合わせると、IPMTでは画像診断で嚢胞性突出物を認めるが、DMCTではそれが認められないという特徴があった。(3)Villuos dark cell type16例のうち6例に粘膜癌の浸潤性増殖がみられた。非浸潤性の本体部分ではMUC1(膜型)はみられなかったが、浸潤部では6例全例にMUC1の発現がみられた。MUC1が発現する粘膜癌を持つ症例に死亡例がみられることも明らかにした。(4)細胞異型の強いCompactcell typeでは、浸潤部のみでなく、腫瘍本体でもMUC1が高率に発現する。縮小手術では再発例があり、IPMTでもこのタイプには縮小手術は不十分であることが判明した。(5)Papillaryclear cell typeにおいては、糖側鎖の多い成熟型MUC1が一部の症例に発現していたが、このタイプは予後良好で、成熟型MUC1が発現しても予後不良にならない理由はまだ不明である。(6)DMCTも、MUC5ACが陽性でMUC2が陰性という遺伝子発現様式であった。MUC1コア蛋白が陰性であるのに対し、成熟型MUC1はかなりの症例での陽性であったが、検索例全例が生存しており、MUC1の糖側鎖の結合状況と腫瘍の生物学的悪性度との関連は今後の検討課題である。(7)切除断端決定のための凍結切片による術中迅速診断標本を、術中診断後に固定してパラフィン切片とし、切除断端におけるムチン抗原の発現を検索して、術後再発との関連性の検討を開始した。
経カテーテル人工血管吻合装置による大動脈瘤治療についての研究

【目的】大動脈瘤患者に対し人工血管置換手術を低侵襲で行うための人工血管-大動脈自動吻合装置を開発し、そのin vitroでの評価について報告する。【方法】吻合装置はステンレス製で回転ダイヤル部、クリップケースを伴うクリップ押し出し部およびハンドル部より構成される。まず吻合する人工血管の断端の少し手前に吻合器回転ダイヤル部をセットする。ついでこれを吻合する大動脈断端内に内装する。大動脈の外側から回転ダイヤルにある溝に沿って軽く結紮する。この状態で人工血管内腔より大動脈の外側へ向かいU字型のクリップを打ち込み逢着する。この際受け部と押し出し部をハンドル部を閉じることにより圧着し、受け部にてU字型のクリップを大動脈外で屈曲させ人工血管と大動脈を逢着する。等間隔に回転する回転ダイヤルを回転させ同様の操作で次のクリップを人工血管-大動脈間に打ち込み、全周性に吻合する。引っ張り試験および吻合部血液漏洩試験を豚大動脈とテルモ社製woven Dacrongraftの自動吻合モデルにて行った。また対照として針糸縫合モデルを用いた。引っ張り試験では断裂する時点の張力を測定。血液漏洩試験は豚血液を100mmHgで加圧、このときの吻合部から漏洩する血液量を測定した。【結果】吻合の肉眼所見はほぼ規則的にクリップが配列し、クリップ先端の屈曲の程度も良好であった。引っ張り試験では針糸縫合で断裂時の加重が2.1-2.5Kgであったのに対し、自動吻合では4.9-5.4Kgと引っ張り強度において優れていた。血液の漏洩試験では針糸縫合3ml/min、自動吻合3ml/minと差はなかった。【考察】自動吻合は抗張力、吻合部出血の点で臨床的に有用である可能性が非常に高いと考えられる。今後より操作性の高い自動吻合装置の開発。遠隔期における吻合部位の組織学的検討を行っていく。本年度は第一段階として術中用大動脈自動吻合器の製作を行った。U字型をした3mm^*4mm幅0.5mm,厚さ0.2mmの形状記憶合金を用いたstaplerを作成した。このstaplerは室温にてこの形状を保ち、体温(摂氏36度)にてU字形の爪の部分が90度屈曲し、ちようどホッチキスを留めた形に変化するように設計されている。このstaplerにて人工血管(UBEシールドグラフト)と犬の胸部下行大動脈切離端を逢着し、十分な強度が得られるかを張力試験にて検討中である。一方このstaplerを吻合する大動脈と人工血管に等間隔で刺入すべくstapler刺入装置を製作中である。これは1/4円状となっており、大動脈内に内挿した人工血管内腔より複数のstaplerを同時に刺入する装置でこの操作を4回繰り返し、その後のstaplerの体温への上昇に伴い人工血管と大動脈断端が強固に固定されることになる。張力試験の結果、十分な張力が認められた時点でstapler刺入装置の完成を待ち、犬大動脈と人工血管の自動吻合装置による吻合を行い、耐圧水漏れ試験、大動脈、人工血管吻合部全体としての抗張力を張力試験にて行う。

この結果が良好であれば全身麻酔科に犬胸部下行大動脈を切除、この装置にて人工血管置換術の中枢及び末梢側吻合を施行、術後の血管造影にて吻合部の形態を評価、さらに吻合した人工血管、大動脈を摘出し、これを切開し内膜面より吻合部の状態の評価を行う予定である。【背景】近年高齢者の胸部大動脈瘤症例が増加しつつありこれらの症例では合併疾患が多く,high riskなため通常の外科手術を施行できない症例も多い。この様な症例に対し低侵襲の治療である(1)経カテーテル的に人工血管を移植吻合する治療(2)自動吻合器を用いて外科手術を大幅に短縮するという2つの方法を可能とするべく人工血管自動吻合装置を開発しその有効性について検討した。【方法】本研究開始当初形状記憶合金を用いたU字型のstaplerを開発in vitroの実験を行ったが、吻合後staplerによる人工血管-大動脈の吻合が不確実であっったため、staplerに改良を加え、stainless製のものを用い、staplerの打ち込みの際にはstaplerを押し出すpusherと突き抜けたstaplerを屈曲させ大動脈、人工血管を強固に固定するために吻合部の全外周に及ぶstainless製の受け皿を作成した。Staplerは一度に全周で18個を打ち出されるようにした。この装置を用いてin vitroの実験を行った。【結果】この装置によりin vitroで5回の人工血管-人工血管間の吻合を行った。staperの打ち出しはスムーズでありstaplerは残らず打ち出された後、内側に屈曲され、人工血管と人工血管の間は強固に、隙間なく接続された。引っ張り試験では20kgの張力をかけ、いずれも吻合部の形態を変化させることなく吻合部の強度を保ち得た。【考察】in vitroではこの自動吻合装置が必要かつ十分な吻合を短時間に行い得るという結果を得た。これをふまえ引き続きin vivoにてこの装置の有効性を確認していく予定である。