hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
商業環境及び消費者特性が購買行動に及ぼす影響

紙のマンガ・ライトノベル読者は、電子媒体の併読率は低く、従ってデジタルデバイスを用いた読書もあまりしていなかった。一方、電子書籍・雑誌読者は紙媒体も読んでいるものの、電子マンガ・ラノベの併読率も相対的に高かった。最後に電子マンガ・ラノベ読者は電子書籍・雑誌の併読率が高く、電子出版物の利用率が高い読者層であることが明らかになった。さらにネット書店の利用状況についても読者層の間で差があることが明らかになった。本研究は、平成28年度平成30年度の3カ年にわたって行われるものである。前年度は準備段階であり、平成29年度は、本格的調査の段階と位置づけている。しかし、前年度に当初予定よりも早くアンケート調査を実施することが出来たため、本年度はそのデータ分析及び成果の公表を行った。着実に研究成果の公表を行うことができており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。本研究は、消費者の購買意思決定に対して、消費者を取り巻く環境要因と消費者特性が及ぼす影響について考察するものであり、具体的な研究方法としては、消費者調査を軸とする。文献レビューと読書ジャンル、読書時間や出版物に関する情報探索行動及びその情報源、出版物に関する知識等に関する半構造化インタビューにおいて得られた知見に基づき、消費者の価値観を的確に把握できる質問票を作成し、リサーチ会社モニターに対する量的調査を実施した。具体的には、読書量の差がある消費者に対してアンケート調査を実施し、書籍・雑誌などの出版物購入時における消費者のチャネル選択と消費者環境、消費者属性によって、消費者の購買意思決定パターンがどのように変化するかを調査した。読書量は、一ヶ月当たりの読書冊数・書籍購入額、一日当たりの読書時間などを基準にスクリーニングを行った。本調査の結果から、日常の出版物の購買額、読書時間、読書ジャンル、出版物に関する情報探索行動と情報源、商品知識の程度等を明らかにし、購買行動との関係性を把握し、各消費者の商業環境、ICT機器の使用状況等よって、消費者の情報探索、チャネル選択、商品選択がどのように変化するかを分析する。各セグメントの消費者行動を、ICT環境、商業環境、消費者自身の特性に基づいて整理した。消費者の出版物に関する購買行動に関する分析から、新しい消費者の分類枠組みについて考察した。縦軸となるのは、出版物の情報の内容であり、横軸はモノとサービス、あるいは販売チャネルの志向であり「ネット」と「リアル」となる。そして、第三の軸として、「モノ」と「サービス」の分類がある。消費者の購買行動には周囲の商業環境や、消費財の特性等様々なものが影響を与えている。本研究では、それらの諸要素の影響関係を明らかにした。来年度以降は、前年までに行った調査結果を基に、質問票を作成し、本調査を実施する予定である。具体的には、読書量の差がある消費者に対してアンケート調査を実施し、書籍・雑誌などの出版物購入時における消費者のチャネル選択と消費者環境、消費者の関与水準によって、消費者の購買意思決定パターンがどのように変化するかを調査する。読書量は、一ヶ月当たりの読書冊数・書籍購入額、一日当たりの読書時間などを基準に三段階に分けてスクリーニングを行う。
子実体形成のトリガー -光応答分子機構の解明-

シイタケの子実体形成には光が必要である。現在までに光受容体をコードする遺伝子phrA, phrB, Le.cryを単離・同定しているが、光受容体は光を一番最初に受け取る分子であるため、これらの発現は分化ステージによらず、構成的であることが多い。そこで、きのこ類に存在する光応答メカニズムを含めた関連因子(タンパク質)を網羅するため、シイタケにおける子実体形成過程を1栄養増殖菌糸、2子実体原基、3成熟子実体に分け、各々の試料から細胞内タンパク質を抽出し、二次元電気泳動に供した。3種の蛍光染色(全タンパク質染色、リン酸化タンパク質染色、糖鎖付加タンパク質染色)を行い、モレキュラーイメージャーにて解析した。検出されたタンパク質は、各々の分化ステージにおいて約6000種類、リン酸化タンパク質は約300種類、糖鎖付加タンパク質は約30種類存在することが明らかとなった。発現に差異のあるスポットをゲルから切り出した後プロテアーゼ処理を行い、目的タンパク質の分解産物(ペプチド)画分を得た。サンプルはLC-MS/MSにてアミノ酸配列解析を行った後、タンパク質質量分析器データベース(マスコット・サーバー)に対し相同性検索を行い、目的産物タンパク質を同定・機能推定を行った。その結果、子実体形成期に特異的に発現するタンパク質は、その発現が上昇するもの(脂肪酸分解酵素、ATP合成タンパク質、G-タンパク質ファミリー、細胞骨格タンパク質、シグナル伝達関連因子等)と、一方減少するもの(カタラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ等)が同定された。これらタンパク質は、現在までのトランスクリプトーム解析によるデータと照らし合わせ、きのこの子実体形成期間に細胞内で起こっている代謝やシグナル伝達経路を如実に反映しているものと示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに光受容体をコードする遺伝子phrA, phrB. Le.cryを単離・同定している。光受容体は光を一番最初に受け取る分子であるため細胞内に常在しており、光受容体遺伝子の発現は分化ステージによらず、一般的にほぼ構成的であることが多い。そこで、きのこ類に存在する光応答メカニズムに関わる分子を網羅するため、シイタケにおいて光を照射した菌糸及び暗黒下で培養した菌糸からmRNAを抽出し、それぞれに対し次世代型DNAシーケンサーを用いたSuper-SAGE法により発現遺伝子の解析を行うこととした。Super-SAGE法は通常のショットガン・シーケシングに比較して、発現遺伝子のタグ数を非常に多くカウント出来るため、いわばデジタル・ノーザンとも言える手法である。本法で得られたデータについてバイオインフォマティクス的手法により網羅的解析を行った結果、シイタケにおける光応答発現遺伝子は、その発現が上昇するものについて3861個、一方減少するものについては483個同定することが出来た。光に応答して発現が上昇する遺伝子群の中には、シイタケの遺伝子転写制御因子で子実体形成関連遺伝子であるpriA, priB, Le.cdc5, ctg1等やcAMP系シグナル伝達経路のキーであるGタンパク質αサブユニット遺伝子等が含まれていたほか、褐変化等着色に関わるチロシナーゼ遺伝子(Le.tyr)が存在していた。こられ遺伝子の発現上昇は、光刺激によって子実体への分化が進むこと、及び光依存的に子実体の着色進むことを如実に反映している。また、発現が減少する遺伝子群に中にはラッカーゼをコードする遺伝子の一群も含まれていた。ラッカーゼは数十のアイソザイムを持つファミリーを形成しており、きのこの着色と木材分解との関係が非常に有機的で複雑な系を成していることが示唆された。

Super-SAGE法により得られたデータについてバイオインフォマティクス的手法により網羅的解析を行い、シイタケにおける光応答発現遺伝子、その発現が上昇するものについて3861個、一方減少するものについては483個同定することが出来た。また、チロシナーゼ遺伝子及びラッカーゼ遺伝子の発現解析により、きのこの着色と木材分解との関係が非常に有機的で複雑な系を成していることが示唆されたため。26年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム解読技術の進歩により、今では生物の遺伝子(塩基)情報が容易に取得可能となった。そのため、遺伝子情報以上にその遺伝子がコードするタンパク質の機能・役割についての解析が重要となってきている。また、個々のタンパク質を解析することは生物の生体システムを理解するためにも必要不可欠な情報である。そこで、前年度の研究で子実体形成との関連が認められた遺伝子について、コードするアミノ酸配列からの解析によりドメイン探索を行い、タンパク質の機能解析に進める。そこで、タンパク質の詳細な機能を解析するため、大腸菌や酵母にて当該タンパク質を大量発現・精製したのち、DNAに結合する際に認識する塩基配列の特定や相互作用タンパク質の解析を行う。これにより、当該タンパク質の機能が明らかとなり、タンパク質-タンパク質・タンパク質-遺伝子間ネットワークが明らかとなり、当該タンパク質から伝えられるシグナル伝達経路が分かると考える。きのこ類の光応答に関する遺伝子発現解析に関し、予測したデータと違う新たな遺伝子が見出され、研究計画及び論文作成に変更が生じたため。計2,330,509円繰越額のうち、物品費872,663円、旅費847,285円、人件費・謝金500,000円及びその他110,000の予定で使用する計画である。
葉と種子での脂質合成経路の振り分けに関わる分子機構

チラコイド膜を構成するグリセロ糖脂質やグリセロリン脂質と、オイルボディに溜まる貯蔵脂質(トリアシルグリセロール)は、どちらもプラスチドで合成された脂肪酸がホスファチジン酸へと取り込まれた後、各経路に振り分けられて合成されるが、その経路転換の仕組みは明らかではない。本研究は、葉と貯蔵組織で全く異なる、脂質合成の振り分け制御機構を解明することにより、それぞれの器官の分化・発達機構を明らかにすることを大きな目的として研究を行った。その結果、phosphatidatephosphohydrolase(PAH)1/2の葉でのTAG合成における役割を明らかにすると共に、根における葉緑体膜発達の抑制に異常をきたした変異体を取得した。初年度である平成22年度は、まず目的達成のために必要な材料となる変異体の作成に特に重点をおいて研究を進めた。1.葉と種子での脂質合成の振り分け機構に異常をもつ変異体の取得(1)葉の貯蔵脂質合成を抑制する因子の単離(研究支援者、下嶋)葉で貯蔵脂質を蓄積に異常をきたす変異体を取得するため、次世代シークエンサーを用いた発現解析により得られたデータをもとに、リン欠乏時に発現量が上昇する脂質生合成系の遺伝子の変異体の単離を進めた。(2)種子の糖脂質合成を抑制する因子の単離(粟井、静岡大学生)種子のプラスチドではチラコイド膜は発達しないので、その発現を抑制するメカニズムが存在すると考えられる。そこで、MGD1プロモーターにGFP遺伝子を連結したキメラ遺伝子の発現を指標に、MGD1の発現を抑制する因子の変異体のスクリーニング、単離を行った。2.PAH1,PAH2の登熟種子での局在および機能解析(下嶋、東工大修士学生A)貯蔵脂質合成におけるPAH1,PAH2の機能をより詳細に明らかにするため、登熟過程の種子を用いて、アイ.ソトープ(^<14>C)によるラベリング実験を行った。その結果、PAH1,PAH2は種子成熟時において重複した役割を持つと同時に、別々の役割を担っていることが示唆された。3.未解明の貯蔵脂質合成経路の全容解明(太田、東工大修士学生B、C、粟井)今回我々が見出したPAH1,2は、貯蔵脂質合成に関わる初めてのPAホスファターゼであり、TAG合成に必要なDAGの供給を担っていると考えられる。そこで、このような経路に関わる別の遺伝子であるNPC5,TGD1遺伝子の変異体との掛け合わせをおこない、3重変異体の単離を進めた。1.葉と種子での脂質合成の振り分け機構に異常をもつ変異体の取得(1)葉の貯蔵脂質合成を抑制する因子の単離(研究支援者、下嶋)リン欠乏時に発現量が上昇する遺伝子のうち、脂質代謝経路に関わりがあると考えられる遺伝子の変異体をいくつか単離し、貯蔵脂質含量を調べた。その結果、そのうちCOX19-like proteinの変異体で貯蔵脂質の脂肪酸組成にやや影響が出ることがわかった。(2)種子の糖脂質合成を抑制する因子の単離(粟井、静岡大学生)MGD1遺伝子のプロモーター領域にレポータ遺伝子(GUSおよびRFP)を融合し、それらを導入した株を作出した結果、発現強度に機能していると思われる領域を特定した。また、チラコイド膜の発達しない組織(種子や根)で発現が見られないことから、これら形質転換体を変異原処理し、発現が変化する変異株のスクリーニングを開始した。2.PAH1,PAH2の登熟種子での局在および機能解析(下嶋、東工大修士学生A)登熟種子におけるPAHIおよびPAH2種子の発現箇所を調べるために、PAH1およびPAH2遺伝子のプロモーター領域にGUSを融合し、それらを導入した株を作成した。3.未解明の貯蔵脂質合成経路の全容解明(太田、東工大修士学生B、C、粟井)3重変異体pah1pah2tgd1の作成に成功した。また、3重変異体pah1pah2npc5については遺伝子座が近く単離できなかったため、pah1pah2バックグラウンドでNPC5の発現をRNAi法によりノックダウンする方法に変更し、引き続き単離を行う。植物は何故、葉で葉緑体膜を発達させ、種子で貯蔵脂質を貯めることができるのか?チラコイド膜を構成するグリセロ糖脂質やグリセロリン脂質と、オイルボディに溜まる貯蔵脂質(トリアシルグリセロール)は、どちらもプラスチドで合成された脂肪酸がホスファチジン酸へと取り込まれた後、各経路に振り分けられて合成されるが、その経路転換の仕組みは明らかではない。1.葉と種子での脂質合成の振り分け機構に異常をもつ変異体の取得

(1)葉の貯蔵脂質合成を抑制する因子の単離(研究支援者、下嶋)本年度はリン欠乏で誘導される2つの新規ホスファターゼの機能を詳しく調べ、これらがリン欠乏時に果たす役割を考察した。また、PAH1,PAH2が、デンプン合成の欠損時に見られるTAGの蓄積に重要な役割を持つことを明らかにした。(2)種子の糖脂質合成を抑制する因子の単離(粟井、静岡大学生)種子のプラスチドではチラコイド膜は発達しないので、その発現を抑制するメカニズムが存在すると考えられる。昨年度までに、MGD1プロモーターにレポーター遺伝子を融合した配列を導入した株を作製した。本年度は、それらの株の種子に変異原処理したもののスクリーニングを行い、チラコイド膜の発達しない組織(根)でレポーター遺伝子の発現が見られる変異体をスクリーニングした結果,8ラインの変異株を単離することができた。これらの株は共通して葯の開裂異常を示した。このことから根で糖脂質合成の抑制に関わる遺伝子が存在し、その遺伝子は正常な花の形態形成に必要であることも明らかになった。本基盤研究終了後も引き続きこの遺伝子に関して解析を進める予定である。変異体の取得と解析について、各項目ともに順調に進んでいる。しかし、唯一、pah1pah2npc5の3重変異体の取得については、方法を変えるという方向転換を行ったため、すこし遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、いずれの項目においても変異体および形質転換体の解析を進めることが重要であると考えている。特に研究計画の変更は、3重変異体pah1pah2npc5の作成法についてのみで、これについてはすでに対応済みであるので、引き続き進めて単離を急ぎたいと考えている。
慢性疼痛(線維筋痛症)における脳機能画像診断と睡眠障害に対する認知行動療法に関する研究

線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して^<99m>Tc-ECDを用いたPatlakプロット法に基づいた測定法にて脳血流シンチグラフィー(SPECT)を施行し、SPM解析を加え検討を行った。これまで線維筋痛症のSPECT研究の報告はわずかであり、一貫した結果は得られていない。薬物治療効果を含めた臨床症状と脳血流の相関解析を行い、今まで注目されていなかった新たな領域の関与を示唆する結果を得ており、これをまとめた論文雑誌Arthritis Research & Therapyに掲載された。これは線維筋痛症の病態解明に重要な結果であり、今後は症例数を増やし、PETなどの別の脳画像を用いてさらに検討していく予定である。平成19年度は線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して^99mTc-ECDを用いたPatlakプロット法に基づいた測定法にて脳血流シンチグラフィー(SPECT)を施行し、データ収集を行った。データ解析には竹内らが開発した自動ROI解析プログラム:FineSRT(Frackowiakらの開発したSPMにより設定されるMNI座標系上の標準脳に一定の普遍的ROIを構築しており、ROI内の数値解析を行うソフト)を使用し、検討を行っている。今回FineSRTを用いて、さらに細分化した解析を行うことにより、新たな領域の関与を示唆する結果を得ている。これは線維筋痛症の病態解明に重要な結果であり、来年度症例数を増やし、更なる検討していく予定である。また慢性落痛疾患に対しこのソフトを用いたSPECT研究の報告は無く、このソフトの有用性を確認することにより、臨床現場における慢性終痛の画像診断法の確立の一助となることが予想され、この点でも本研究の意義は大きい。痛みを伴った糖尿病性神経障害、帯状萢疹後痩痛、などの他の慢性癒痛患者群については現在データを収集課程であり、引き続き平成20年度はこれら疾患のデータを収集し、解析していく予定である。また線維筋痛症患者および他の慢性疹痛患者に対し、SPECTと同時に、疼痛スケール、ピッツバーグ睡眠質問票、エップワース眠気尺度を用いて、痛みと睡眠状態の評価をおこなっており、痺痛に対する治療前後での脳機能画像所見と睡眠状態の変化に関するデータ収集を行なっており、平成20年度にはデータ解析し有意義な結果を示す予定である。平成21年度は前年度に引き続き線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して^<99m>Tc-ECDを用いたPatlakプロット法に基づいた測定法にて脳血流シンチグラフィー(SPECT)を施行し、データ収集を行った。データ解析には前年度の自動ROI解析プログラム:FineSRTに加え、全世界的に用いられているSPM解析を加え検討を行った。今回FineSRTとSPM解析を行い、さらに薬物治療効果を含めた臨床症状との相関解析を行い、今まで注目されていなかった新たな領域の関与を示唆する結果を得ており、現在論文を投稿中である。痛みを伴った糖尿病性神経障害、帯状疱疹後疼痛、などの他の慢性疼痛患者群については現在データを収集課程であり、引き続きこれら疾患のデータを収集し、治療効果を含めて解析していく予定である。また線維筋痛症患者および他の慢性疼痛患者に対し、SPECTと同時に、痔痛スケール、ピッツバーグ睡眠質問票、エップワース眠気尺度を用いて、痛みと睡眠状態の評価をおこなっており、疼痛に対する治療前後での脳機能画像所見と睡眠状態の変化に関するデータ収集を行なっており、今後はデータ解析し有意義な結果を示す予定である。
機能性食品中の腫瘍細胞への作用物質としてのポリフェノールの研究

機能性食品として使用される植物を中心にタンニンの探索を進め、エジプト産ギョリュウ科植物から新規化合物を含む多様なタンニンを単離し、それらの中に、培養口腔がん細胞に対する選択的な毒性を示すものを見出した。また、Tamarix tetrandra由来の培養細胞でのそれらのタンニンの生産に成功した。さらに、オリゴ糖をベースにした、抗腫瘍作用を示す人工タンニンをも新規に合成した。エジプト産のギョリュウ科植物Tamarix niloticaから、新規物質を含めて、種々の加水分解性タンニンを単離し、それらの同定・構造解明を進めた。それらの中には2量体以上のオリゴマー構造を有するものがあった。本植物は砂漢地帯の過酷な条件でも生育し、植物資源としての有効利用が期待される。それらのタンニンの多くに、ヒト口腔扁平上皮がん細胞に対する強い細胞毒性を示すものがあることを認めた。それらの中に、ヒト正常口腔細胞(歯肉線維芽細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞)に対する毒性が相対的に低く、腫瘍選択性の高いものを見出すことができた。口腔扁平上皮がん細胞に誘導される細胞死のタイプに関しては現在検討中である。また、顕著な細胞毒性を示す(-)-epigallocatechin gallate (EGCG)の安定性についても検討し、その産物の構造についても新たな知見が得られ、これは、EGCGの作用と考えられているもののうち、少なくともその一部は、こうした変化産物が実際に作用していることを意味する。強い抗腫瘍作用を認めたタンニンの組織培養による生産について、日本国内で園芸植物として入手が可能なTamarix属植物について検討し、Tamarix tetrandraについては、そのシュート化に成功し、さらに継代培養を行うことができた。このシュートからもタンニンを単離して、その生産を確認するとともに、植物組織培養によるタンニン生産の条件についても検討を進め、光および栄養源がタンニン生産に関してその含量に大きく影響することを見出した。さらに、多糖を基礎とし、これに保護したgalloyl基を結合させたのち、脱保護することによって、人工タンニンを合成した。人工タンニンにも抗腫瘍作用を認めた。その基礎となる多糖の構造により、その作用や腫瘍選択性に差異があることをも見出した。機能性食品に広く含まれる各種ポリフェノール類についてこれまでに腫瘍細胞への作用を検討してきた結果、タンニンに分類される比較的高分子のポリフェノール系化合物群に、期待されるような作用を有するものがあることを見出してきた。中でも、砂漠の過酷な条件でも生育し、植物資源としての有効利用が期待されるギョリュウ科植物のうち、エジプト産のTamarix niloticaからは、新規化合物のnilotinin M4,D7,D8,D9など、種々の加水分解性タンニンを単離し、それらの同定・構造解明を進め、それらの中には大環状構造を有するものがあることをも明らかにした。さらに、それらのタンニンの多くに、口腔がん細胞に対する強い細胞毒性を示すものがあることを認め、正常細胞に対する毒性が相対的に低く、腫瘍選択性の高いものがあることを見出してきた。このような天然物質を開発の基本とする場合、その安定供給の確立が重要となることから、さらに本年度は、植物組織培養によるこれらの物質の安定的な生産条件の確立を進めることとした。日本国内で園芸植物として入手が可能なギョリュウ科植物のうちTamarix tetrandraから、インドール酢酸およびベンジルアデニンを含有する培地によってシュート培養を誘導・確立し、このシュート培養から14種のエラジタンニンを単離し、この手法によるタンニンの確保が可能であることを確かめた。さらに、ホルモン無添加培地によって、このシュート培養から根の分化の促進が可能となり、この過程を通じて再生した植物は、通常の土壌および天候下での馴化・生育が可能となることをも明らかにした。すなわち、このような再生植物を大量増殖させることによって、その成分としてのタンニンの安定的な供給が可能であることが示された。これらに加えて、さらに人工タンニンについても関連構造の物質の精査を進めており、構造によって作用が大きく異なることを見出した。食品や薬用植物・生薬として使用される植物を中心に、抗腫瘍作用が期待される高分子タンニンについて引き続き探索を進めた。その結果、食品として使用される植物オランダイチゴFragaria ananassaの未利用部分の果蒂部分に、抗腫瘍性を有するエラジタンニン二量体を含んでおり、これが抗菌作用をも示すことを見出した。また、ギョリュウ科植物のTamarix niloticaから、さらに9種の化合物を単離することができた。これらのうち5種は新規化合物で、各種スペクトルデータおよび化学反応による既知化合物への誘導などにより、構造を解明した。これらはそれぞれ、エラジタンニン単量体、二量体、および三量体であって、それらのグルコース核にgalloyl基、hexahydroxydiphenoyl基、dehydrodigalloyl基、およびisodehydrodigalloyl基がアシル基として結合した構造を有している。また、他の4種は既知の単量体三量体ではあるが、本植物からの単離は初めてであることが明らかになった。これらの中には、腫瘍細胞に対する高い選択毒性を示すものがあることを見出した。

さらに、タンパク質を中心とし、これにタンニンがその周囲に結合した、一種の超分子体の形成についても検討を進め、弱い会合体を形成している初期過程からの時間的経過により質的な転換が起こっていること、こうした超分子構造の形成時に、その構成要素となるポリフェノール単体の場合と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性の変化が見られる場合のあることを見出した。これらの他、多様なフェノール性アシル基を有する化合物群の合成的な生成およびその精製方法についても検討し、そのさらなる効率化を進めた。植物性食品やその他の資源植物からの機能性物質抗腫瘍作用物質開発の過程で、新規構造を確立してきた天然物質や、関連の合成化合物について、培養がん細胞に対する細胞毒性を見出してきた。また、天然物質の植物組織培養による生産条件を確立し、さらに植物資源自体の大量増殖をも可能とするような分化の手法をも確立してきた。これらに加えて、多剤耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用や、耐性抑制作用を有することを見出すことができた。これらは当該物質開発の意義・価値をさらに高めるものと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。予備的検討によって、これまでに抗腫瘍作用を見出してきた天然物質に関連の構造を有する物質の存在が期待される資源植物についても、成分の精製単離、構造解明を進め、その抗腫瘍作用について検討を進めるとともに、これら天然物質をモデルとして合成したフェノール系化合物についても、その構造と作用との関係について検討を進めることとしている。
椎間板変性におけるWntシグナルを介す転写制御機構の解析と新規腰痛治療薬の探索

前年度に引き続き,椎間板変性に至る分子メカニズムの解明について研究をおこなった.本年度は大型動物椎間板変性モデルを用いたWntシグナルと抗Wnt抗体(抗Sclerostin抗体)や抗NGF抗体における椎間板変性抑制効果を明らかにすることを目的としていたが、予算の関係から、in vitroでのWntシグナル解析にとどまったから椎間板変性に関わるシグナル解析をすすめることで,腰痛治療に関与する分子標的薬の開発につなげたいと考えている課題としては臨床研究に至るまでのin vivoでの動物実験が必要であるが,研究費が多くかかるため現状の獲得研究費だけでは大型動物を用いた研究が難しいと考えている.これまで椎間板におけるWntシグナルと神経栄養因子とのシグナルメカニズムは不明であった.そこでWntシグナルによるNGFの影響を引き続き解析した。実験はSpragueーDawley(SD)ラット(n=32,11週齢)から採取した髄核細胞を用いた。採取した髄核組織を分離後に、単層培養を行い各々実験に用いた。WntシグナルによるNGFの影響を解析するため、Wnt活性化剤であるBIO(6ーbromoindirubinー3ーoxime)を24時間添加しNGFの転写活性を評価した。その結果、Wntの活性化剤であるBIOを添加後(0.1μMー1.0μM)のNGFの転写活性には非添加群と比較し有意な変化はみられなかった。またNGFのレポーターとWtーβーcateninとの遺伝子導入後のNGFの転写活性の評価でも同様の結果であった。転写レベルではWntシグナルの活性化によってNGFの発現変化はみられなかったため、引き続き遺伝子や蛋白レベルでの解析をおこなった。BIOを添加後のNGFの遺伝子発現量やそのレセプターである低親和性受容体p75、高親和性受容体TrkAの遺伝子発現量には非添加群と比較して有意差はなかった。Western blot法を用いた蛋白発現量の解析でも、BIO添加後(24時間)のNGF蛋白発現量にには非添加群と比較して有意差はなかった。以上の結果から、椎間板細胞ではWntシグナルの活性化は神経栄養因子NGFの発現に影響がないことが示唆された。この事からWntシグナルは直接的な神経成長因子NGFの発現には関与せず、疼痛伝達においてはWntシグナル以外の因子が間接的に関わっている可能性が示唆された.平成30年度は大型動物椎間板変性モデルを用いたWntシグナルと抗Wnt抗体(抗Sclerostin抗体)や抗NGF抗体における椎間板変性抑制効果を明らかにすることを目的としていたが、予算の関係から、in vivoでの解析にとどまっており、in vitroの解析からも当初の研究開始の予想と反する結果が得られているため前年度に引き続き,椎間板変性に至る分子メカニズムの解明について研究をおこなった.本年度は大型動物椎間板変性モデルを用いたWntシグナルと抗Wnt抗体(抗Sclerostin抗体)や抗NGF抗体における椎間板変性抑制効果を明らかにすることを目的としていたが、予算の関係から、in vitroでのWntシグナル解析にとどまったから大型動物椎間板変性モデルを用いたWntシグナルと抗Wnt抗体(抗Sclerostin抗体)や抗NGF抗体における椎間板変性抑制効果を明らかにするためには外部からの獲得資金が必要である。また抗Wnt抗体(抗Sclerostinヒト化抗体;romosozumab、現在国内未承認)や抗NGF抗体(fasinumab;REGN475、現在国内未承認)については腰痛治療や椎間板変性抑制効果が期待されるためin vitroでの解析を推進していく。椎間板変性に関わるシグナル解析をすすめることで,腰痛治療に関与する分子標的薬の開発につなげたいと考えている課題としては臨床研究に至るまでのin vivoでの動物実験が必要であるが,研究費が多くかかるため現状の獲得研究費だけでは大型動物を用いた研究が難しいと考えている.
社会的利益の実現メカニズムにおける政治家の役割についての実証分析

平成2年度に行なった先行研究に関する文献収集、諸予点に関する新聞等の資料収集、さらに国会議員に対する初歩的なインタビュ-調査等にもとづき、政治家の予点認知と有権者の予点認知が異なるようなケ-スを延び出し、これらの基礎的な分析から得られた仮説にもとづいて、再度茨城県内で有権者に対する小規模を調査を行ない、それと政治家の行動との比較分析を行なうことが平成3年度の作家とする。特にここでは平成3年度に最も大きな予点であって政治改革問題に至点を置き、有権者の意識分析と政治家の発言等を中心とする行動分析との比投を行なった。その結果、この予点に関しては、マクロレベルでは有権者と政治家の認知には相違はみられていないものの、ミクロレベル、すなわち、具体的に制度選択局面においては、有権者と政治家の間に相違が発生する。すなわち、有権者は比例代表的制度を多く選択し、それは支持政党では若干の差異はみられるものの、必ずしも有為な差といなっていない。これに対し、政治家に関しては、一般に野党については阿部政党の主張の下に認知も置かれる傾向がみられる。しかし、自民党議員の割合は、一般に政府・与党家に同調する傾向はあるが、公然と自らの認知を表出する者もある。ここでは必ずしも有権者の志向が政治家を通して政策に表出されるメカニズムになっているとは言い難いことが明らかにされた。これらの分析から日本における社会的利益実現メカニズムにおける政治家の役割は必ずしも利益代表モデルというよりは信託モデルの近い形になっているといえる。又、因果分析をする上では与党と野党という組織的問題がモデルの一般化を難しくしており、セグメント化が異変な意味を持つことも明らかにされた。なお、最終的な分析は「国家議員の研究」とい本として出版を予定している。平成2年度は、先行研究に関する文献の収集、検討、新聞等の資料収集を精力的に行なった。その過程で予算との関係から一部の計画の絞り込みを行ない、有権者利益について、争点を8つ程度に限定し、分析を行なうことにした。それにもとづき、11月に小規模な有権者忠誠調者をパイロットスタディ-として行ない、有権者年金と地元利益優先志向との間に正の高い相関性があること、農村部においては、有権者と政治家との関係が言われているよりも強いことなどが明らかにされ、本研究の仮説についての立証の可能性が高まった。同時に国会議員に対するインタビュ-調査も開始したが、この内、女性議員に対するものは「文芸春秋」誌上で公表した。ただ、本研究が対象としている茨城をはじめとする北域出身政治家へのすべてのインタビュ-は完了するに至っていない。政治家に対するインタビュ-で明らかになったことは、地元利益実現のそめにどのような活動を具体的に行なっているかであり、特に野党議員の活動の実態である。そこでは具体的な事例調査をもとに野党議員が官係に対し事実問題を提示し、それにもとづき、官係の議量範囲で影響力を行使するというものである。さらに近年では、北方議員を通じての社会の実現のメカニズムが、野党にせよ与野にせよ、国会議員を通じて行なれている場合が急増し、地方政治家の役割が増加する一方で、国会議員の役割が大きなものになっていると同時に北方レベルの予算面については知事の役割が増加していることも明らかになりつつある。現在2月に行なった茨城県における有権者意識調査を元に本格的な国会議員調査の準備を進めており、平成3年度にこれを実施し、両者の実見デ-タを比技することを通じ、有権者の役割期待と政策決定メカニズムとの質問を明らかにして行く予定である平成2年度に行なった先行研究に関する文献収集、諸予点に関する新聞等の資料収集、さらに国会議員に対する初歩的なインタビュ-調査等にもとづき、政治家の予点認知と有権者の予点認知が異なるようなケ-スを延び出し、これらの基礎的な分析から得られた仮説にもとづいて、再度茨城県内で有権者に対する小規模を調査を行ない、それと政治家の行動との比較分析を行なうことが平成3年度の作家とする。
微視構造を考慮した傾斜機能材料の熱的・力学的特性に関する温度依存性の評価

今までの実験的研究から,傾斜機能材料(FGM)の熱的・力学的特性はその微視(ミクロ)組織に強く依存することが知られており,特に構成材料の体積分率が50%-50%付近の領域では組織構造がネットワーク状となり,実際の物性値は単純混合則から算出された物性値と大きく相違する.FGMのミクロ組織を考慮した熱的・力学的物性値を求めることは重要で,これにより実験的に確認されている複雑なFGMの物性挙動を理論的観点から検証することができる.また,熱応力緩和型FGMの材料組成設計をする上で,その物性値の温度依存性を知ることは極めて重要である.温度依存性を考慮せずに最適材料組成設計しても,実際に使用している高温度環境では熱応力緩和に最適な物性値分布を発揮せず,場合によっては熱応力増加をもたらすこともあり得る.このため,温度依存性とミクロ組織を考慮した物性値の評価が必須である.本研究では,ミクロ組織構造を考慮したFGM物性値の温度依存性を,均質化法を用いて理論的に求めることを目的とした.まず,実際に製造されたFGMのミクロ組織構造を模擬したユニットセルを市販CADソフトで作成し,その形状データを汎用メッシュジェネレータソフトに読み込ませ,メッシュ情報を生成した.次に,筆者らが開発した均質化物性値解析プログラムを用いて,FGMの均質化された(マクロな)熱的・力学的特性を評価した.この結果と,文献に掲載されているFGMの各種特性値の実測データとを比較し,本解析プログラムの妥当性を確認した.次に,物性ハンドブックに記載されている各種物性値の温度依存性データと上述のユニットセルを用いて均質化解析プログラムを走らせ,FGMのマクロな熱的・力学的特性の温度依存性を評価した.以上の事柄を代表的な構成材量の組み合わせからなる複数のFGMに対して行い,各FGMごとに資料としてまとめた.今までの実験的研究から,傾斜機能材料(FGM)の熱的・力学的特性はその微視(ミクロ)組織に強く依存することが知られており,特に構成材料の体積分率が50%-50%付近の領域では組織構造がネットワーク状となり,実際の物性値は単純混合則から算出された物性値と大きく相違する.FGMのミクロ組織を考慮した熱的・力学的物性値を求めることは重要で,これにより実験的に確認されている複雑なFGMの物性挙動を理論的観点から検証することができる.また,熱応力緩和型FGMの材料組成設計をする上で,その物性値の温度依存性を知ることは極めて重要である.温度依存性を考慮せずに最適材料組成設計しても,実際に使用している高温度環境では熱応力緩和に最適な物性値分布を発揮せず,場合によっては熱応力増加をもたらすこともあり得る.このため,温度依存性とミクロ組織を考慮した物性値の評価が必須である.本研究では,ミクロ組織構造を考慮したFGM物性値の温度依存性を,均質化法を用いて理論的に求めることを目的とした.まず,実際に製造されたFGMのミクロ組織構造を模擬したユニットセルを市販CADソフトで作成し,その形状データを汎用メッシュジェネレータソフトに読み込ませ,メッシュ情報を生成した.次に,筆者らが開発した均質化物性値解析プログラムを用いて,FGMの均質化された(マクロな)熱的・力学的特性を評価した.この結果と,文献に掲載されているFGMの各種特性値の実測データとを比較し,本解析プログラムの妥当性を確認した.次に,物性ハンドブックに記載されている各種物性値の温度依存性データと上述のユニットセルを用いて均質化解析プログラムを走らせ,FGMのマクロな熱的・力学的特性の温度依存性を評価した.以上の事柄を代表的な構成材量の組み合わせからなる複数のFGMに対して行い,各FGMごとに資料としてまとめた.
長期的成果からみた聴覚障害幼児の言語聴覚療法に関する研究

金沢大学病院で行っている聴覚障害児の言語指導法(金沢方式)を幼児期に受け現在9歳以上に達した者を対象に、ウエクスラー知能検査を実施した。対象は30名で聴力レベルは50-120dBである。訓練開始年齢は3歳以前に訓練を開始していた。言語性IQと読書力検査結果は高い相関を示したが、訓練開始年齢、聴力レベル、動作性IQは言語性IQに影響を与えていなかった。また、0歳から1歳代のもの10名の聴覚障害幼児を対象に、手話による語彙数と文の初出年齢、助詞付き文の初出と手話語彙数を検討した。その結果、2語文は10例ともに1歳代で出現し、格助詞は指文字で1歳9ヶ月から2歳5ヶ月までに全員出現した。平成23年度に引き続き平成24年度はWPPSI検査を5名、WISCーIIIを15名に実施した。補聴器装用児は8名、人工内耳装用児は10名、軽度難聴で幼児期に補聴器を装用していたが、学童以降装用をしていないものは2名であった。WPPSIの実施年齢は、3歳10ヵ月4歳7ヵ月であった。WISCーIIIの実施年齢は、5歳10ヵ月11歳8ヵ月であった。知的障害を持つ聴覚障害児は除外した。全体の平均は言語性IQ(VIQ)は98.7、動作性IQ(PIQ)は110.4であった。WPPSIを施行した5名のVIQの平均は72.4でPIQの平均は114.4であった。一方、WISCーIIIを施行した15名のVIQの平均は107.5で、PIQの平均は109.1であった。幼児期の言語性IQよりも学童以降のWISCーIIIの方が言語性IQが高い傾向を示した。幼児期でのWPPSIの検査は、聴覚障害児にとって口頭で答える課題は未だ困難な場合が多いために、PIQとVIQの差が大きい傾向にあるが、学童以降になってWISCーIII実施の時には、VIQとPIQの差が縮まる傾向を示した。本年度は5名の幼児以外は学童であったので、15名の幼児期のデータを親の記録をまとめる課題が平成25年度に持ち越しとなったが、5名の幼児については、親の記録から、聴覚読話理解は平均1089.4語、自発語は平均845.0語、文字単語理解数は平均1313.2語であった。文の発達については、論文2編を作成して受理されている。前年度に引き続きWISCーIII、WPPSI、読書力テスト(幼児児童読書テスト、教研式読書力診断検査)を行った。WPPSI検査を平成25年度に2回目の施行が可能であったものが3名で、言語性IQの平均は66、動作性IQの平均は112.3であった。また、新たにWPPSI検査を施行できたものが3名であった。さらに、WISC-IIIで前年度に引き続き施行できたものは16名であった。16名の言語性IQの平均は108.9、動作性IQの平均は110.4となった。教研式読書力診断検査に関しては、昨年度に引き続き2回目の実施が可能であったものが7名、幼児読書テストが5名であった。幼児児童読書テストは、前年度施行困難であったものも6名中5名が検査施行可能となり、読書力偏差値で平均55.2となった。前年度から積み残した親の記録からの語彙数の集計は、平成26年度に行う最終報告でまとめることにして、現在作業中である。以上の結果を国際学会、国内学会で発表するとともに、論文として2編採択された。はじめに:本年度は、研究代表者と分担者がウエクスラー知能検査(WPPSI,WISC-III)および読書力検査(幼児児童読書テスト・新読書力検査低学年用)方法をビデオを見ながら施行方法について、確認した。対象:当初の計画どおり計5名の先天性聴覚障害幼児に検査を施行した。対象児の聴力は40-110dBで、現在5-6歳代の就学前の幼児である。5名とも0歳から3歳代で訓練を開始している例であった。実施内容:4-5歳代の3名にはWPPSI検査を施行した。また、就学前の6歳児2名にはWISC-IIIを行うことができた。結果:WPPSIの言語性IQ(VIQ)の平均は102で、動作性IQ(PIQ)の平均は115.7であった。また、WISC-IIIのVIQの平均は116.5、PIQの平均は114であった。

読書力検査は、幼児読書テストは4歳代から5歳代の3名に行い、素点で95-105点であった。また、新読書力検査(低学年用)を施行した2名は就学前であったが、小学校1年3学期レベルから2年2学期レベルとなった。初年度は5名に施行できたが、ウエクスラー知能検査ならびに読書力検査ともに、聴覚障害児の言語力を測定することができることがわかり、意義あるものと考えられ、本研究の目的である、就学前の幼児の言語力について次年度も検討と続ける予定である。研究代表者らは、平成23年度から4年間に亘り、金沢大学病院耳鼻咽喉科で行っている聴覚障害児の言語指導法(金沢方式)を幼児期に受けた児で9歳以上に達したものを対象に、ウエクスラー知能検査を実施した。方法は、30名の聴覚障害者を対象として、訓練開始年齢、平均聴力レベル、就学前時点での読書力検査、及び就学以降のウエスクラー知能検査の言語性IQ(VIQ)、動作性IQ(PIQ)の成績を調査した。VIQ値に影響を与えると考えられる訓練開始年齢、平均聴力レベル、PIQ値、読書力偏差値を独立変数として、重回帰モデルを作成した。その結果、VIQ値と読書力偏差値は高い相関を示したが、訓練開始年齢、平均聴力レベル、PIQ値についてはVIQ値に影響を与えていないことがわかった。結論として、聴覚障害児の音声言語獲得をする上で、幼児期からの文字言語理解の早期導入が有効であることがわかった言語聴覚療法学WPPSI検査とWISCーIIIの検査については、当初予定どおりに進み、WPPSI検査を施行できた幼児についても語彙や文についてまとめることができたが、WISCーIIIを施行できた聴覚障害児の幼児期の記録を整理する課題が残った。これは、WPPSIやWISCーIIIの検査は検査施行と結果まとめに予想以上に時間がかかったためである。前年度から続けてWISCーIII、WPPSI、読書力テスト(幼児児童読書テスト、読書力診断検査)を行った。2年続けてデータをとれていないものもあったが、概ね研究は順調に進んでいる。初年度は報告書にも述べた通り、5名の対象者でウエクスラー知能検査ならびに読書力検査を行うというもので、5名のデータを収集することができていることから、概ね順調に研究が進んでいると考えている。平成25年度は前年度に積み残したWISCーIII施行できた15例の幼児期の語彙や文を整理して分析する。また、引き続き昨年度の検査実施対象児を中心に、WPPSI,WISCーIII、読書力検査を実施する。さらに、データを縦断的にも取りまとめる。平成26年度は最終年度であるので、これまでのデータをまとめ、統計分析を行い、国際、国内学会で発表する予定である。さらに、論文としても投稿予定である。次年度は検査実施対象者が初年度に比し多く、検査実施時間の確保のみならず、検査結果データを取りまとめることが必要である。当初の計画通り国際学会で発表、ならびに学会誌に投稿する予定である。研究分担者が購入予定であった図書が、最終年度のまとめの時に必要であることがわかり、次年度へ繰り越した。本年度は研究最終年度にあたるので、学会発表に加えて、英文投稿など論文作成をする予定である。当該研究費(81,316円)が残った理由は、金沢でのデータ収集や研究打ち合わせを予定していた時に、大雪のために交通事情が悪化して移動が困難となり、やむなく中止となったためである。したがって、平成24年度は研究実施2年目に入るが、もう少し季節の良い時期(春から秋)にデータの取りまとめや、研究打ち合わせを行う予定である。今年度は、新たに15名のデータを収集するとともに、研究の一部を学会報告および論文にまとめる予定である。学会発表のための旅費やデータをまとめる当たっての謝金等が発生するので、旅費、人件費、英文校正代に研究費を使用する予定である。
神経幹細胞自己再生時におけるエピジェネティクレギュレーターとしてのＥｖｉ１の役割

Evi1は嗅覚系AP前駆細胞のHes1/SOX2ポジティブで発現していた。またEvi1-/-マウスでは、AP幹細胞群が増殖サイクルの早い時期に脱しそれにより中間前駆細胞は増加し、一方でS期を短縮させていた。in vitroではEvi1/Notchはp27(kip1)の発現とG1/S期への移行を同時に制御していた。Evi1はin vivoでHes1プロモーター領域に結合し、NICDによりHes1転写誘導を増幅させていた。Evi1はNotchシグナルによって誘発された制御ネットワークの核心であり、Evi1/Notch共制御プログラムによって幹細胞の自己複製が促進されているのが明らかになった。多様な神経系細胞の発達は精確に制御された要因が影響し神経前駆細胞の増殖・分化に関与している。我々は進化的に保存されたPrdm癌原遺伝子の転写制御因子を神経発生制御の新たな候補因子と考えた。Evi1(Prdm3)はヒトやマウスに骨髄性白血病を引き起こす癌原遺伝子としてすでに同定されている。本研究ではEvi1が神経幹細胞発生時に神経前駆細胞のいくつかの領域で発現していることがわかった。Evi1はAP幹細胞群のNotch2/Sox2ポジティブで発現していた。さらに調べるとEvi1-/-マウスでは、AP幹細胞群が増殖再生周期から早い時期に脱し、Ngn1が発現している中間前駆細胞の増加につながっていた。我々はNotch標的因子であるHes1に着眼した。Hes1はNotchシグナルを介した制御ネットワークにあり、細胞自己再生を維持している。Evi1はin vivoでHes1プロモーターと結合すると、Evi1単体ではHes1の発現を誘発しないが、NICDによりHes1の発現を増幅させている。Hes1プロモーターにおけるヒストンメチル化状態を調べるとEvi1はHes1遺伝子座においてH3K4me1によるエンハンサー領域を作り出している可能性があることを示唆している。このことから、Evi1とNotchの同時制御プログラムはHes1と未知の遺伝子座を通して幹細胞自己再生と細胞周期の進行を増強していることが考えられる。総合領域平成24年度の研究実施計画であるa.ダイナミックスの発現b.Notch標的遺伝子におけるクロマチン構造の制御を調べるために嗅覚神経幹細胞モデルを作り出す。は終了した。また、嗅覚神経幹細胞においてEvi1が制御するNotchシグナル標的遺伝子を同定し数量化する実験もほぼ完了。現在平成25年度に予定した研究実施計画を行っている。今後は次の実験を行う。1.Hes1遺伝子座においてEvi1がヒストンメチル化を制御することを確認する。2.CSLを獲得することによりNotch標的遺伝子においてEvi1が転写反応を増強させていることを明らかにする。3.Evi1がいかにヒストンメチル化を促進させているかを解明する。4.エンハンサーのヒストンメチル化状態がCSLの獲得を制御するかどうか明らかにする。5.細胞自己再生を制御しているNotchとEvi1の遺伝学的なダウンストリームプログラムを解明する。他の幹細胞でも同様なメカニズムがNotch標的遺伝子エンハンサーのプライミングを媒介しているかも確認する。当該年度予算813,235円が未使用となったが、これはHes1を候補因子として予想以上に早く同定することができたためである。よって、ゲノムワイドの解析が進行していないので次年度の研究費はこの繰越額も含めて、ヒストン修飾のあらゆるタイプをチェックする試薬類、マウス、分子生物実験消耗品等に支出する計画である。
MPSTから探る精神疾患の新しい病理パラダイム

以下の取り組みから、統合失調症の少なくとも一群には硫化水素産生亢進がみられる可能性を得た。(1)毛髪を用いた硫化水素産生酵素遺伝子MPSTの発現解析。(2)疾患特異性の検討:統合失調症以外に双極性障害、自閉症を対象とした遺伝子解析。(3) MPST以外の硫化水素産生酵素遺伝子、CBS、CTHの解析。(4)ヒト遺伝学的解析(SNP解析、DNAメチル化解析)。(5) Mpst遺伝子改変マウスの作成による行動、硫化水素代謝への影響調査。再現性の検討・疾患特異性の検討:統合失調症毛髪でのMPST発現量の増加は、当初患者群50名、対照群50名で行ったが、再現性を確認するためにその後サンプルサイズを患者群149名、対照群166名まで拡張した。この拡張したサンプルセットでも有意差が確認された(P = 0.0060)。検体採取時年齢、発症年齢、服薬量、罹病期間等の交絡因子の影響は認められなかった。疾患特異性に関しては、双極性障害、自閉症の死後脳を用いて検討したが、MPST発現量には対照群と有意差は見られなかった。ただ、統合失調症死後脳と比較してサンプル数が少ないので、検出力の問題は残る。H2Sとの関連検討:H2S産生に関与するMPST以外の他の2つの酵素遺伝子、CBSとCTHの発現量を各種検体を用いて解析した結果、両遺伝子とも統合失調症死後脳で有意に発現が増加していた。マウスを用いた研究:統合失調症で認められたH2S産生に関与する3遺伝子の発現上昇は、疾患病理として想定されている慢性軽度炎症性ストレスに対する代償性変化なのか、あるいはよりプライマリーな病理なのかを検討するために、元々プレパルス抑制(PPI)が減弱しているC3系統とPPIが良好なB6系統を用いて検討した。両系統のマウスにH2S発生剤を2週間投与後PPIを測定したところ、C3系統のPPIはさらに悪化し、B6系等のPPIには変化がなかった。この結果から、統合失調症におけるH2S産生に関与する遺伝子の発現上昇は、炎症や酸化ストレスの代償性変化でない可能性が考えられた。硫化水素産生酵素には、MPST, CBS, CTHの3種類あるが、それぞれの組織でどの酵素遺伝子が重要な役割を担っているのかを知る一助として、デジタルPCR法によって遺伝子の絶対発現量を検討した。その結果、各組織における最も発現量の高い酵素遺伝子は以下のようであった:ヒト死後脳-CBS、ヒトiPS細胞-CBS、ヒトneurosphere-CBS、ヒト毛包-MPST、ヒトリンパ球-MPST、マウス前頭葉Mpst。これらの結果は、統合失調症由来組織で硫化水素産生系が亢進しているというこれまでの解釈と合致する。次に、硫化水素産生系の亢進が実際生化学的所見として検出できるか確認した。遊離の硫化水素は、H2S, H2Snとして存在していることが知られている。硫化水素産生系が亢進していると思われるC3系統マウス脳と、そうでないB6系統マウス脳で遊離硫化水素をモノブロモビマン-HPLC (必要時さらにLC-MS/MS)測定したところ、H2SnがC3脳で有意に上昇していた。また、貯蔵型イオウには、ミトコンドリアの呼吸鎖酵素に蓄えられたacid-labile sulfurと、タンパク質のシステイン残基に蓄えられたbound sulfane sulfurがある。C3脳ではbound sulfane sulfurが有意に上昇していた。これらの結果から、C3マウス脳ではB6マウス脳に比較して硫化水素酸系が亢進している事実が生化学的所見からも確かめられた。なお、上記の測定には大量の組織を必要とするため、ヒト由来サンプルでの測定は困難である。硫化水素産生酵素遺伝子の発現量の違いの原因を探るため、DNAメチル化解析を行った。その結果、マウス脳ではC3においてMpst genebodyのメチル化亢進、ヒトneurosphereでは統合失調症由来サンプルでCBS genebodyのメチル化亢進が比較的明瞭な所見であった。硫化水素産生系亢進のエビデンスが、遺伝子発現のレベルばかりでなく生化学的所見からも裏付けが取れたので、提案命題の信頼性が高まった。またそのメカニズムの1つとして、遺伝子のDNAメチル化という後成的要因があることをつきとめた。C57BL/6N (B6)と比べてプレパルス抑制(PPI)が不良(PPIの不良は統合失調症を代表とする精神疾患のエンドフェノタイプの一つと見なされている)、かつMpstの発現量が増加しているC3H/HeN (C3)の遺伝的背景において、CRISPR/Cas9n系(ダブルニッキング法)によりMpstを破壊したマウスを計画通り作成した。最初のコーディングエクソンに4 bpの欠失があり、western解析でタンパクの発現はみられなかったので、KOマウスとして扱える。行動試験では、各プレパルスレベルでPPIの改善傾向がみられ、78 dBで有意な改善が認められた。硫化水素の生化学的解析では、acid-labile sulfurはB6 <(trend) C3であったものが、C3 WT > C3 KO、bound

sulfane sulfurはB6 < C3であったものが、C3 WT > C3 KOとなり、Mpstの発現量は硫化水素の生化学的基盤に反映されていることが確かめられた。遺伝学的過硫化ストレス亢進モデルとして、B6マウスの遺伝的背景において、Mpst Tgマウスの作成を試みた。遺伝子発現にはCAGプロモーターを採用した。平成28年度中にコンストラクトの完成、受精卵へのインジェクション、founder lineを獲得した。しかし、子の世代のオスにはトランスジーンを十分量発現する個体がいなかった。子の世代のメスに、トランスジーンを最も高発現する個体を見出した(#737)。そこでこのメスからもう一世代作成したところ、トランスジーンプロダクトを大脳皮質で内在性タンパクに比較し約30%発現するオスの個体を得た(タンパク発現量1.3倍)。今後の研究成果をより確かにするために、#737由来ヘテロ個体をそのまま解析するのは見合わせ、トランスジーンをホモにした個体を準備する作業に着手した。以下の取り組みから、統合失調症の少なくとも一群には硫化水素産生亢進がみられる可能性を得た。(1)毛髪を用いた硫化水素産生酵素遺伝子MPSTの発現解析。(2)疾患特異性の検討:統合失調症以外に双極性障害、自閉症を対象とした遺伝子解析。(3) MPST以外の硫化水素産生酵素遺伝子、CBS、CTHの解析。(4)ヒト遺伝学的解析(SNP解析、DNAメチル化解析)。(5) Mpst遺伝子改変マウスの作成による行動、硫化水素代謝への影響調査。当初の作業仮説を支持するエビデンスが、順調に積み上がっている。より確かで直接的なエビデンスを得るためと、メカニズム解明研究のため、遺伝子改変マウスの作成をすでに開始したが、今後も継続する。28年度が最終年度であるため、記入しない。精神医学、精神科遺伝学、分子細胞生物学より確かで直接的なエビデンスを得るためと、メカニズム解明研究のため、遺伝子改変マウスを作成する方針である。