hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3ーイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の基質認識及び反応機構の動的解析

高度好熱菌<Thermus>___ー<thermophilus>___ーHBー8由来の3ーイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)の反応機構及び基質特異性を明らかにする目的で,ジアセトングルコ-スの分子全体の不斉構造を鋳型とし,鍵反応として[2,3]Wittig転位を用いる方法で,3ーイソブチルリンゴ酸及び2ー0ーメチルー3ーイソプロピルリンゴ酸を不斉合成した。前者はIPMDHに対するKm値はほゞ1/4であり、一方Vmaxは本来の基質である3ーイソプロピルリンゴ酸(IPM)のほゞ2倍であった。これはIPMがIPMDHの最も適した基質であると必ずしも言えないこと,すなわち,基質疎水性基に対する酵素の認識部位がIPMに対し完全に適合している訳ではないことを示唆している。後者の2ー0ーメチル体は全く基質とはなり得ず,IPMDHに対し阻害作用を示した。濃度変化によりLBプロットを取った結果、この阻害は不競争的であることが分った。二量体構造のため酵素に存在する二個所の活性部位のうち,実際には反応に関与しない側の基質認識部位と結合しているものと思われる。近縁のイソクエン酸脱水素酸素に対する2ー0ーメチルイソクエン酸の効果はこれまで全く検討されておらず、新しい知見である。さらに,機構依存型で酸素と共有結合を形成しうる阻害剤として3ー(1ーフルオロイソプロピル)リンゴ酸を設計し,既に開発していラセミ体IPMの合成法に倣ってラセミ体として合成した。IPMDHによる反応で生成するフッ素化2ーオキソイソカプロン酸からの脱フッ化水素と引き続く1,4付加反応を期待したが,本物質はIPMDHを全く阻害せず,本来の基質IPMとほゞ同等の基質活性を示した。本基質からの反応生成物の詳細な構造解析や^<19>FーNMPを活用した酵素との相互作用の検討が次の課題である。
エピ変異可視化システムの創成

昨年度までの成果として、育種したヒトDNAメチル化酵素(DNA methyltransferase; DNMT)遺伝子形質転換酵母(ヒトDNMT酵母)で顕在化した凝集反応をエピ変異原検出系のメルクマールとして利用できること、また凝集関連遺伝子の1つFLO1遺伝子プロモーター配列を用いたレポーターアッセイ系も同様に活用できる可能性を示した。本結果を受けて、最終年度となる今年度は、環境化学物質からDNAメチル化阻害作用が検出可能か検証を行った。その結果、かび毒のオクラトキシンAについては、ヒトDNMT酵母で明確に顕在化する凝集性のみならず凝集関連遺伝子FLO1の転写レベルについても抑制作用を示す可能性を見出し、ヒト由来HEK293細胞におけるゲノムDNAのメチレーションレベルも減少させ得る可能性を認めた。今回得られた結果は、化学物質による真核微生物の酵母細胞内で生じるエピジェネティック制御への撹乱作用が動物細胞においても同様に認められる可能性を環境化学物質を用いて示しており、その意義は大きいと考える。以上の一連の成果は、本研究の主要な目的となるエピジェネティックな変異原作用を可視化する検出系の構築がDNMT酵母で顕在化した凝集反応を利用することで可能となることを示唆している。ただし、今回構築した検出系の妥当性検証を継続的に実施することは実用化に向けて避けては通れない課題として以前残されており、今後さらなる研究の推進が求められるとも考えている。初年度となる今年度の主要な研究テーマとして、ヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母が示すDNAメチル化酵素阻害剤抑制性凝集機構の検討をあげていた。一連の解析から、出芽酵母の凝集関連遺伝子の1つFLO1の転写レベルが本酵母においては、その野生型酵母と比較して特異的に亢進していることを明らかにした。また、ヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母細胞内のFLO1 mRNAの上昇は、DNAメチル化酵素阻害剤、5-アザ-2'-デオキシシチジンにより抑制されることも確認した。一方で、野生型酵母においては、FLO1の転写は認められるものの、5-アザ-2'-デオキシシチジンによるFLO1 mRNA量の顕著な変化は観察されなかった。本研究から得られた結果を考察すると、エピ変異原検出系におけるヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母のアドバンテージとして可視化以外のポイントが再認識される。すなわち、ヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母細胞内において亢進したFLO1 mRNAレベルが、同酵素阻害剤処理のみでその上昇が解除された事実は、各種エピジェネティックな制御機構なかでも比較的可塑性に乏しいと推測されているDNAメチル化を酵素の阻害剤を検出するうえで大きなブレイクスルーと考える。育種したヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母をエピ変異原検出系のプラットフォームとして実用化ために不可欠な要素を具備していることが、遺伝子レベルで再確認されたともいえる。重要検討課題として本年度に掲げたヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母が示す誘導型細胞凝集機構について、その原因遺伝子がFLO1である可能性が高いことを示唆した点で、ほぼ当該年度の研究計画に沿った達成度と判断している。ただし、ヒトDNAメチル化酵素遺伝子形質転換酵母の凝集メカニズムに関するFLO1の関与を確定する研究を次年度以降に追加で組込むことについては、今後の本研究課題における要検討項目と考えている。二カ年目となる今年度の主要な研究テーマとして、ヒトDNAメチル化酵素(DNA methyltransferase; DNMT)遺伝子形質転換酵母(ヒトDNMT酵母)のDNMT阻害剤以外のエピ変異原に対する応答解析をあげていた。一連の解析から、Histone deacetylase(HDAC)阻害剤であるTrichostatin A(TSA)処理により凝集性が誘発されることを明らかにした。また、ヒトDNMT酵母細胞内のFLO1 mRNA量は、TSAにより増加することも確認した。さらに、上述の作用は野生型酵母(非ヒトDNMT酵母)においても認められるとの結果を得た。DNMTとは異なりヒストン修飾酵素については、本研究で使用している出芽酵母と哺乳類動物細胞にはホモログが存在していることから、非ヒトDNMT酵母が示した今回の応答については、この観点から矛盾はないと考えられる。本研究から得られた結果を考察すると、エピ変異原検出系におけるヒトDNMT酵母の特徴として、DNMT阻害剤に留まらずヒストンを作用点とするエピ変異原の検出能も有することが推測される。すなわち、TSAによりヒトDNMT酵母および野生型酵母においてFLO1 mRNAレベルと凝集性が促進された事実は、ユニバーサルなエピ変異原を検出するうえで大きなブレイクスルーと考える。育種したヒトDNMT酵母をエピ変異原検出系のプラットフォームとして実用化するうえで、主要なエピ変異原と考えられるDNMT阻害剤とヒストン修飾酵素阻害剤の両剤に対して応答性を確認できたことは、来年度以降に実施する予定のユニバーサルな同検出系創出にあたり必要条件でもあり、本研究の大きな成果と言える。検討課題として本年度の目標に掲げたヒトDNMT酵母が示す誘導型細胞凝集性に対するDNMT阻害剤以外のエピ変異原の応答性について、HDAC阻害剤であるTSAを被検物質に同阻害剤濃度依存的な反応を確認できたことは、ほぼ当該年度の研究計画に沿った成果と判断している。ただし、TSA以外のヒストン修飾酵素阻害剤に対する影響について検討することについては、今後の要検討項目とも考えている。今年度の主要な研究テーマとして、ヒトDNAメチル化酵素(DNA methyltransferase; DNMT)

遺伝子形質転換酵母(ヒトDNMT酵母)をプラットフォームとしたユニバーサルなエピジェネティック変異原検出系の創成を掲げていた。エピ変異原検出系におけるヒトDNMT酵母の特徴として、同酵母の凝集性を指標に、DNMT阻害剤に留まらずヒストンを作用点とするエピ変異原の検出能も有する可能性がある。ヒトDNMT酵母の凝集性に関与するFLO1プロモータ一配列を用いたレポーター活性に対する既知のエピジェネティック変異原の影響を解析した結果、凝集に及ぼす作用と比較し大きな矛盾はないと推測される結果を得た。DNMT阻害剤である5-アザ-2'-デオキシシチジンがFLO1レポーター活性に示す影響は、濃度依存的な抑制効果となることが確認された。加えて、非ヒトDNMT酵母(コントロール株)においても微弱ながら同様の結果が得られた事実は、出芽酵母細胞におけるDNMT様活性の存在について慎重に再検討する必要性がないことを棄却する可能性も示している。以上一連の解析から、育種したヒトDNMT酵母をエピ変異原検出系のプラットフォームとして実用化するうえで、FLO1遺伝子プロモーター配列を用いたレポーターアッセイ系が応用可能であることが確認できたことは、来年度に実施する予定のユニバーサルな同検出系の妥当性等を確認する上で、大きな成果と捉えている。本年度は、所属する国立医薬品食品衛生研究所の移転実施年に相当した。移転作業については、諸般の事情等重なり予測不能な事態が生じることも想定し、実質の移転作業期間に加えた日数を考慮した上での計画としたが、予想を上回る準備作業等の発生により研究計画に若干の遅延が生じる結果となった。昨年度までの成果として、育種したヒトDNAメチル化酵素(DNA methyltransferase; DNMT)遺伝子形質転換酵母(ヒトDNMT酵母)で顕在化した凝集反応をエピ変異原検出系のメルクマールとして利用できること、また凝集関連遺伝子の1つFLO1遺伝子プロモーター配列を用いたレポーターアッセイ系も同様に活用できる可能性を示した。本結果を受けて、最終年度となる今年度は、環境化学物質からDNAメチル化阻害作用が検出可能か検証を行った。その結果、かび毒のオクラトキシンAについては、ヒトDNMT酵母で明確に顕在化する凝集性のみならず凝集関連遺伝子FLO1の転写レベルについても抑制作用を示す可能性を見出し、ヒト由来HEK293細胞におけるゲノムDNAのメチレーションレベルも減少させ得る可能性を認めた。今回得られた結果は、化学物質による真核微生物の酵母細胞内で生じるエピジェネティック制御への撹乱作用が動物細胞においても同様に認められる可能性を環境化学物質を用いて示しており、その意義は大きいと考える。
ヒト外尿道括約筋におけるマイオスタチンの関与とその抑制による筋再生についての研究

外尿道括約筋の横紋筋線維は遅筋成分を主体とし持続性の収縮により尿禁制に重要な役割を果たしており、外尿道括約筋の機能不全は難治性の腹圧性尿失禁の原因となる。今回我々は、外尿道括約筋から横紋筋の組織幹細胞である筋衛星細胞を用いて骨格筋特異的抑制因子であるマイオスタチンによる増殖分化制御機構について検討した。マイオスタチンはTGF-βスーパーファミリー経路のsmad-2をリン酸化し細胞周期停止をすることにより筋衛星細胞の増殖、また分化を抑制した。一方でマイオスタチンの競合的阻害因子であるフォリスタチンはsmad-2のリン酸化を阻害し筋衛星細胞の増殖抑制を阻害した。また外尿道括約筋衛星細胞にはマイオスタチンの発現が確認されたが抗マイオスタチン抗体で明らかな増殖抑制の阻害は認められずオートクリン作用は確認できなかった。マイオスタチンの発現抑制は新たな腹圧性尿失禁の治療ターゲットになる可能性がある。微量採取したヒト外尿道括約筋を抗NCAM抗体結合させた磁気ビーズを用いてMACS法に筋衛星細胞を分離、骨格筋特異転写因子(Myf-5とMyoD)の免疫染色を行い横紋筋由来であることを確認後にSV40virusのlarge T抗原を遺伝子導入して長寿化し、これらの長寿化外尿道括約筋細胞を用いて(1)Myostatinによる増殖抑制テスト及びFollistatinを用いた増殖抑制阻害テスト、(2)RT-PCRによるMyostatinの発現、(3)TGF-βsuperfamilyにおける主要なシグナル伝達経路であるsmad-2のリン酸化、について検討した。(1)Myostatinによる増殖抑制テストでは10%FBS含有F-10培地においてMyostatinはヒト外尿道括約筋衛星細胞の細胞増殖を濃度依存的(0.1μg/ml)に有意に抑制した。またMyostatinの競合的阻害因子であるFollistatin投与によりヒト外尿道括約筋衛星細胞は増殖を促進したがMyostatin無添加群とMyostatin添加群ではその増殖能に有意な差を認めなかった。(2)ヒト外尿道括約筋衛星細胞におけるMyostatinのautocrine作用の検討も試みた。RT-PCRではヒト外尿道括約筋衛星細胞はMyostatinを発現していた。(3)シグナル伝達における検討ではMyostatinは添加15分後にはsmad-2のリン酸化を亢進したが120後にはリン酸化は元のレベルまで戻っていた。FollistatinによるMyostatinの阻害の検討ではFollistatin100μg/mlではMyostatain添加群のsmad-2のリン酸を有意に抑制した。今後は外尿道括約筋の筋衛星細胞にMyostatinのレセプターであるアクチビンType II bレセプターが発現しているかを組織レベルで確認したい。また外尿道括約筋筋衛星細胞におけるmyostatinのsiRNAによる増殖、分化の抑制をfollistatin投与群と比較検討し、この結果をin vivoで証明すべく実際にラットの外尿道括約筋損傷モデルを作成しfollistatin、及びsiRNAを局所投与して筋再生が認められるかを検討したい(実際に現在ラットの外尿道括約筋損傷モデルを作成中である)。1.ラット外尿道括約筋損傷モデルの作成メスSpraque-Dawley (10-14W)の外尿道括約筋部に熱損傷を加えて外尿道括約筋損傷モデルの作成を試みた。Leak pont pressure測定では正常群と外尿道括約筋損傷群で有意差は認められず損傷モデル作成手順、および測定方法の改善が必要であると思われる。具体的には熱損傷だけでなく、ブビバカイン注射やバルーン腟拡張による括約筋損傷など。2.ヒト外尿道括約筋および肛門挙筋におけるプロテオーム解析ヒト外尿道括約筋におけるマイオスタチンの発現を調べるために抗マイオスタチン抗体を用いてヒト外尿道括約筋の薄切標本を免疫染色したところ横紋筋特異的に発現が認められたがマイオスタチンは外尿道括約筋に発現する蛋白ではない。このためわれわれは外尿道括約筋に特異的に発現すタンパクをの同定を肛門挙筋と比較して同定することを試みた。

インフォームド・コンセントの得られた前立腺全摘および膀胱全摘症例より前立腺尖部に付着する外尿道括約筋、および肛門挙筋を微量採取しイソペンタン下に急速冷凍し、10μm厚の連続薄切標本を作製、一部はHE染色、ATPase染色を行い、TYPE1線維、TYPE2線維を区別、一部をトルイジンブルー染色し、Laser Microdissection(AS LMD)を用いて外尿道括約筋および肛門挙筋のType1, Type2線維をタンパクを回収した。検討した3例においてRSで特異的に発現を認めたスポットは、typelでは5個、type2では10個であった。また、LAでの特異的発現部位はtypelでは7個、type2では4個であった。今回の検討では回収したタンパク量が少ないためタンパク同定までは行えなかった。回収タンパク量を増やすためには採取量を増やすと同時にLaser Microdissectionにて目的筋線維を切り出した後の速やかなdenature bufferでの処理が必要となる。また回収タンパク量が少ないと思われ質量分析に十分なタンパク量が得られない可能性がある。この場合は筋線維型で分別せずにType 1,2を合わせて解析を行うことも考慮している。前年度までに我々はヒト外尿道括約筋を分離培養後SV40 T抗原を遺伝子導入して長寿化し、これらの長寿化外尿道括約筋細胞を用いてmyostatinが外尿道括約筋衛星細胞の増殖をTGF-βsuperfamilyであるsmad-2を介して濃度依存的に抑制し、またmyostatinの競合的阻害蛋白であるfollistatin投与により外尿道括約筋衛星細胞の増殖が促進されることを明らかにした。今回我々は1.外尿道括約筋衛星細胞におけるMyostatinの増殖抑制効果の細胞周期レベルでの検討、2.Myostatinが筋分化に及ぼす影響について検討した。1.Myostatin投与により外尿道括約筋衛星細胞はcdk-2の発現が低下しp21の発現増加が認められた。一方フローサイトメトリーによる細胞周期解析では、Myostatinの濃度依存的にsub G1分画の増加とG2/Mの減少傾向を認め、follistatinの前処理によりsub G1分画の増加は抑制された。つまり外尿道括約筋衛星細胞のMyostatinの増殖抑制効果はアポトーシス誘導によるものではなく細胞周期停止によるものであると思われた。また、この増殖抑制効果Myostatinの阻害因子であるFollistatinにより抑制された。2.外尿道括約筋衛星細胞に温度感受性SV40T抗原を遺伝子導入し、33°Cで培養し増殖させた後に39°Cに培養環境を変化させるとSV40T抗原が失活するために.これを筋分化誘導培地に変更後にMyostatinを濃度依存的に添加し、ミオシン重鎖の発現をリアルタイムRT-PCR法にて検討した.この結果Myostatinは濃度依存的にミオシン重鎖mRNAの発現を抑制した。しかしMyostatinの阻害剤であるFollistatinによる筋分化抑制は確認できなかった。外尿道括約筋衛星細胞の明確なオートクリン作用は確認されていないがMyostatinの増殖阻害効果は腹圧性尿失禁に対する新たな治療として有効な可能性がある。
新規ＫＲＡＢ－ＺＮＦ　タンパク質によるエピジェネティック修飾の維持伝達機構の解明

ジェネティックバックグラウンドをC57BL/6に三回戻し交配したZfp483の変異マウスを使用し、発生に与える影響を検討した。ヘテロ変異マウス同士の交配によって、ホモの変異を持つ産仔を得られた。さらに成熟し妊性も有していた。つまりこの遺伝子はマウスの発生に影響を与えないことが示唆された。上記の研究に付随した研究により、マウスジェネティックバックグラウンドに依存する遺伝子を200個以上同定した。さらにこの遺伝子群は、転写制御領域にSNPsやレトロトランスポソンの挿入多型が高頻度で存在し、それによって転写が制御されていることが明らかとなった。さらにその転写抑制にKRAB zinc fingerタンパク質のZfp57が関与することを始めた明らかとした。これらの研究成果は、マウス亜種間においてシス配列の多様性が遺伝子発現を制御し、そのエピジェネティックな制御にZfp57が関与することを明らかとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請書の実験計画通りCRISPR/Cas9systemの系を用いて、Zfp483およびZfp496のノックアウトマウス作成を試みた。まずターゲットとなる遺伝子のコーディング領域を標的とするようにベクターを作製した。CRISPR/Cas9のベクターを自然交配によって得られたマウス受精卵にマイクロインジェクションを行い、受精卵の移植実験を行った。その結果、Zfp483に変異をもつ産仔を得たが、一方でZfp496の変異を持つ産仔は得ることができなかった。現在、Zfp483の変異マウスのジェネティックバックグラウンドをC57BL/6由来にするために3世代の戻し交配が終了した。上記に付随した研究を並行して行っている。近年、ES細胞においてこれまでのインプリント遺伝子と似たような発現を示す複数の単アレル性発現遺伝子が存在することが報告された。この遺伝子群は、細胞の多様性やヒト常染色体優性遺伝病に関係することが示唆され注目を集めている。そこで、野生型ES細胞2種(JF1 x C57BL/6JもしくはC57BL/6J x JF1のジェネティックバックグラウンドを持つ)を用いてアレルを区別したmRNA-seq解析をおこない、587個の単アレル性発現遺伝子を同定した。両方のES細胞に共通していた遺伝子は215個あり、これらの大部分の発現は、由来するマウスジェノタイプに依存的であった。さらにインプリント遺伝子の発現制御に必須のKRAB zincfiger 57 (Zfp57)の変異ES細胞を用いた解析から、単アレル性発現遺伝子の約1/3がZfp57によって制御されていることを明らかにした。昨年度に予定していたヘテロに変異を持つES細胞を用いたノックアウトマウスの作製には失敗したが、新しいゲノム編集技術を取り入れることによって、ノックアウトマウスおよびノックアウトES細胞の作製に成功した。またそのマウスの作製期間に付随した研究として、次世代シークエンサーおよび計算サーバーを用いて単アレル性発現遺伝子の発現制御メカニズムの一端を明らかにした。今後は、Zfp483変異マウスの発生およびゲノムインプリンティングに与える影響について検討を行う予定である。本年度に作製したZfp483のノックアウトマウスの表現型を観察する。まず、Zfp483のヘテロ変異マウス同士の交配により産仔の有無を検討する。Zfp483のホモ変異マウスが致死でない場合は、そのマウスを用いて次世代の産仔が得られか検討を行う。この発生に与える影響についての検討に半年を予定している。発生に与える影響がある場合、網羅的なDNAメチル化解析のためにノックアウトマウスの精子、卵子、着床前胚のDNAを回収する。対照群として同じ発生ステージのサンプルを回収する。そのDNAを用いて少量のサンプルでDNAメチル化解析のできるPBAT法を用いて網羅的にDNAメチル化を検討する。とくにインプリント制御領域に絞って解析を行う。この実験と並行して野生型およびノックアウトマウスの精子、卵子、着床前胚のRNAを抽出し、mRNA-seq法にて網羅的に既知のインプリント遺伝子の発現解析を行う。この解析に伴ってJF1マウスを用いることによってアレルを区別した発現解析を行う予定である。
国際会計基準（IFRS）任意適用企業の会計実務と利益調整行動の実証研究

本研究の目的は、IFRSの任意適用が会計実務に与える影響と利益調整行動との関係、およびその経済的帰結を検証することである。IFRSは、会計情報のグローバルな比較可能性を高めるべく作成された会計基準の世界標準であるが、IFRSを適用するとしても会計情報の比較可能性は必ずしも高まらない可能性がある。会計実務は、その作成者のインセンティブの影響を受けており、作成者のインセンティブが変わらなければ、企業の会計実務も変わらないはずだからである。本研究はこのような問題意識に基づき、IFRSを任意適用する日本企業の会計実務の実態を確認し、利益調整行動との関係、およびその経済的帰結について、実証研究を行う。
親支援施策化のための1歳から3歳の育児支援ニーズに関する縦断的研究

1歳6か月児健診から3歳児健診までの期間に、成長過程にあった情報を紙媒体やメール等で発信し、母親の潜在的虐待・社会的健康度・母性意識、サービスの利用状況等を対照群と比較し、効果的な情報提供のあり方を分析した。その結果、紙媒体を送付した群に身近な子育てサポートを利用する人が多い傾向がみられ、子育ての制約感の軽減に一定の効果がみられた。さらにメールによる介入を行った群に潜在的虐待の予防効果があった。本研究の目的は、一定地域において1歳から3歳にかけて前向きに養育者の育児状況、健康状態、育児サービスの認知・利用状況の調査を通じて必要とされる支援の仕組みや内容を分析するとともに、分析結果を踏まえ成長過程に応じた介入として携帯電話等を用いた情報提供と個別相談の効果的な活用方法を探ることである。20年度は、研究倫理審査の承認を得た上で、研究対象である介入群、対照群の選定とデータ連結のためのコード化、1歳6か月児養育者の調査票の作成と調査の実施、情報提供用のホームページの開設と情報の集約、介入群への情報提供を実施した。介入効果を評価する項目として虐待行動尺度、社会的健康度尺度、養育者の情報収集行動やサービスの認知・利用状況を選定した。既存の尺度では養育者の社会的健康度にっいて充分測定できる尺度がなかったため、母親の社会的健康度について今回、新しく尺度開発を行った。その結果、社会的健康度には「社交性」「子育ての負担感」「地域社会との関わり」「自己コントロール」の4つの因子構造が明らかになり、クロンバックのα係数はすべて0.7以上の値が得られ、尺度の信頼性が認められた。また尺度の妥当性では母性意識尺度との相関係数を求めたところ、肯定的意識得点とは有意な正の相関、否定的意識得点とは有意な負の相関がある等、ある程度の関連が認められた。今回開発した社会的健康度尺度を用いて、社会との関わりを促進するための介入方法を実証的に分析することで、育児不安や虐待発生の予防のみならず、家族のヘルスプロモーションに向けた関わりの手がかりが得られると考えられる。実際、1歳6か月の時点では、保育園の園庭開放や子育てサロン等の利用経験は10-15%にとどまっており、携帯電話を利用した身近な情報提供により介入の効果が分析でき、効果的な親支援施策の基礎資料となると考えられる。本研究の目的は、一定地域において1歳から3歳にかけて前向きに養育者の育児状況、健康状態、育児サービスの認知・利用状況の調査を通じて必要とされる支援の仕組みや内容を分析するとともに分析結果を踏まえ成長過程に応じた介入として携帯電話等を用いた情報提供と個別相談の効果的な活用方法を探ることである。21年度は20年度に構築した情報提供システムを用いて、介入群(介入当初391名)への情報提供として、3回の紙媒体「ハッピー子育て新聞」の作成と発送、5回携帯電話等へのメールの送信、身近な子育て情報を集約したホームページの作成と管理運営を行った。アンケート調査から養育者の特徴として、出生順位別にパートナーとの協力状況や潜在的虐待傾向に差異がみられ、出生順位が上がるほどパートナーとの協力状況が低下するの層が認められ、養育態度における潜在的虐待も有意に高くなっていた。また養育者の年齢や出生順位により、必要としている情報内容と情報収集手段の差異が明らかになり、各層の特徴や多様なニーズに対応できるように情報のナビゲーション機能を強化することの必要性が示唆され。20年度に新しく開発した母親の社会的健康度尺度の結果も含めて、3編の学会発表を実施し、2編の学術論文の投稿を行った。本研究では、社会的健康度尺度を用いて、社会との関わりを促進するための介入方法を実証的に分析することで、育児不安や虐待発生の予防のみならず、家族のヘルスプロモーションに向けた関わりの手がかりが得られると考えられる。1歳6か月の時点では、保育園の園庭開放や子育てサロン等の利用経験は10-15%にとどまっており、携帯電話を利用した身近な情報提供により介入の効果が期待でき、効果的な親支援施策の基礎資料となると考えられる。本研究の目的は、一定地域において1歳から3歳にかけて前向きに養育者の育児状況、健康状態、育児サービスの認知・利用状況の調査を通じて必要とされる支援の仕組みや内容を分析するとともに成長過程に応じた介入として紙媒体によるチラシの送付と希望者に対する携帯電話等を用いた情報提供の効果的な活用方法を探ることである。22年度は20年度に構築した情報提供システムを用いて、介入群(介入当初391名)への情報提供として携帯電話等へのメールの送信、身近な子育て情報を集約したホームページの管理運営を行った。また、最終評価年度にあたることから、アンケート調査票を作成し、介入群・対照群を含む合計746名に配布し、回収された223名のデータの分析を行った。記号化したデータ連結を行ったところ、介入前後両方にアンケート回答があったのは介入群・対照群ともに69名であった。

そのうち、介入前後ともに母親からの回答であった133名の分析結果において、介入前後で、差がみられたのは社会的健康度と潜在的虐待であった。社会的健康度の子育ての制約感は介入後で対照群に有意に上昇した。メール介入群は社会的健康度の子育ての制約感の上昇、家族以外との交流・社交性の低下があった。潜在的虐待尺度では、介入後の3歳時点では対照群・介入群ともに自己肯定感を育む育児態度が低下していた。しかし、メール介入群では潜在的虐待で介入前後の有意差がなかった。介入群に介入後、子育てサロン、育児サークル、親子ふれあい広場等を利用する者が多かったが、有意ではなかった。本研究では情報提供を中心とした介入であったが、子育てサロン、育児サークル等の身近な子育て支援の利用の促進や子育ての制約感の予防にある程度の効果が示唆された。またメール介入支援において潜在的虐待の予防の効果が示唆された。
悪性高熱症モデルと成り得る変異体細胞バンクの樹立

本研究の目的は、悪性高熱症(MH)患者の症例報告における1型リアノジン受容体(RyR1、Ca2+放出チャンネル)の遺伝子変異体を作製し効率的に発現する細胞株の樹立法を確立する。さらにCa2+イメージング-システムと組み合わせることによりMH型RyR1遺伝子変異による薬物感受性の変化の有無を解析して、RyR1遺伝子変異部位とMH病態の関連を明らかにしてMH遺伝子診断の根拠を提供すると共にMHモデル細胞とすることを目的とした。Flp-In細胞株(HEK293およびCHO)を用いて、これまでの実験で樹立した野生型RyR1発現細胞の細胞内Ca2+動態をコントロールとしてMH型RyR1変異体の場合と比較した結果、数種のMH型RyR1変異体発現細胞には薬物に対する感受性の変化が確認されて、MHモデル細胞になり得ることが示された。しかし、解析の際にHEK293は剥がれ易く、接着の良いCHOが推奨されるが、CHOでの変異体の発現を誘導する際に必要なTet-Expressが一昨年より販売中止となったので、この代替えとなる膜透過性転写因子の作製をタカラバイオの担当者(林延江氏)と共に検討したが、発売元のクローンテック社からは明確な回答は得られなかったので、断念して、他の方法(Tet-Oneシステム等)も検討する事とした。また、MH型変異体を設計する際に、利用していた「アミノ酸配列はそのままで、その制限酵素切断部位を挿入出来る可能性のある位置」を教えてくれるネット上の"DNA sequence Design Supporter"が昨年初めより閉鎖されてしまい、変異体の塩基配列の設計が困難な状態陥っていたが、当サイトを運営した東京理科大学(山登一郎氏(名誉教授)と久保田幸雄氏(情報管理課))のご配慮により再利用が可能となり、昨年11月より変異体の設計を再開することが可能となった。悪性高熱症(malignant hyperthermia、MH)患者の臨床症例に報告されている細胞内カルシウム(Ca2+)放出チャンネルであるリアノジン受容体1型(RyR1)遺伝子変異体をテトラサイクリン(Tet)の添加により発現誘導できる培養細胞株を樹立して、対照コントロールとなり得る野生型(wt)RyR1を介した細胞内Ca2+動態と比較するためのハイコンテンツスクリーニング(high contents screening、HCS)により解析するシステムの構築を目指した。1. Flp-In T-Rexシステム(Invitrogen社)のFRT部位を染色体上に持つHEK293細胞に加えて、培養用ディッシュへの接着能がより強く細胞内Ca2+動態のイメージング操作に適したCHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)細胞においても、FRT部位を有する新たな細胞株を樹立した。2.以前の研究課題(H9-10)で構築した「カセット構造化したRyR1cDNA」を1)で樹立したFRT部位を持つ培養細胞に遺伝子導入して、Tet添加により野生型(wt)RyR1発現を誘導できる安定発現細胞株を樹立した。研究を始めるに当たって、約5000アミノ酸残基から成る巨大なイオンチャンネルであるRyR1をコードする全長cDNAが15000ベースを超える長鎖になるために、培養細胞への遺伝子導入が困難となることが予測されたので、比較的に導入効率の高いとされるHEK293細胞を選択して実験をスタートした。また、RyR1の強い持続的な発現状態は細胞死(アポトーシス)を引き起こす報告があるので、Tet誘導性発現系であるFlp-In T-Rexシステムを用いることとした。この結果で樹立されたTet誘導性RyR1発現293細胞株では、遺伝子導入操作毎の導入・発現の効率のバラ付きが少なくなって、一定量のRyR1発現量を持つ安定細胞株として継代して維持することができるようになった。次に、樹立したTet誘導性RyR1発現293細胞の細胞内Ca2+動態の解析のために、Ca2+蛍光指示薬fura2を負荷して、顕微鏡一体型HCS(Image XpressMICRO、モレキュラーデバイス社)を使って得られた蛍光画像の解析から細胞内Ca2+イメージングを行うことができた。しかし、カフェインなどRyR1刺激薬を添加して測定する際に、HCS機器のプログラムから自動的に添加される溶液の流速(液圧)により、細胞が培養ディッシュから剥離してしまい観測が困難になる場合が多かった。このために、培養ディッシュ接着能がより強く細胞内Ca2+動態のイメージング操作に適すると考えられるCHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)細胞にも、FRT部位を有する新たな細胞株を獲得して樹立した。1.以前に作成した「カセット構造化したRyR1cDNA」を用いて、約5000アミノ酸残基コードするRyR1cDNAのアミノ基末領域11か所と中央部14か所(合計25か所)にアミノ酸配列の変異をコードするMH型RyR1遺伝子変異体クローン(合計25種)を構築した。4.同時に、細胞内Ca2+貯蔵部位である小胞体内部のCa2+濃度もイメージングするためにCa2+感受性の蛍光蛋白質を強制発現さることにより、RyR1のCa2+放出チャンネル活性のモニタリングも行った。本研究の基盤となる野生型RyR1(wtRyR1)をテトラサイクリン(Tet)誘導性に発現する培養細胞の樹立に続いて、MHに関する症例報告等に記載されたRyR1のアミノ基末領域11か所と中央部領域14か所の変異部位を各々コードするRyR1cDNA変異体(25種類)を作製してTet誘導性にMH型RyR1変異体を発現させられる培養細胞株を樹立することができた。

さらに、樹立した各種Tet誘導性RyR1発現細胞株(HEK293細胞、CHO細胞)にCa2+蛍光指示薬fura2を負荷して、顕微鏡一体型HCS(モレキュラーデバイス社)を使って細胞内Ca2+動態のイメージング解析を行ったところ、MH型RyR1を発現した各種の細胞においてwtRyR1に比べて、RyR1刺激薬であるカフェインに対する感受性の明らかな上昇がみられた。さらに、Ca2+感受性の蛍光蛋白質を強制発現さることにより、細胞内Ca2+貯蔵部位である小胞体内部のCa2+濃度も同時に観測してRyR1のCa2+放出チャンネル活性のモニタリングをすることも可能となった。これらの結果、25種類のMH型RyR1変異体を発現する培養細胞株はMH疾患モデル細胞になり得ることが示唆された。但し、薬物を添加して測定する際に、特にHEK293細胞を用いた場合には、HCS機器から自動的に添加される溶液の流速(液圧)により細胞が培養ディッシュから剥離してしまい観測が困難になる場合が多かった。この問題の克服のために、比較的培養ディッシュへの接着能が強いCHO細胞を使用すると細胞内Ca2+動態のイメージング解析に改善がみられた。しかし、CHO細胞におけるRyR1発現の制御に用いているTet-Expressシステム(Takarabio-Clontech社)が、2017年11月に突然に販売終了となった。本研究の目的は、悪性高熱症(MH)患者の症例報告における1型リアノジン受容体(RyR1、Ca2+放出チャンネル)の遺伝子変異体を作製し効率的に発現する細胞株の樹立法を確立する。さらにCa2+イメージング-システムと組み合わせることによりMH型RyR1遺伝子変異による薬物感受性の変化の有無を解析して、RyR1遺伝子変異部位とMH病態の関連を明らかにしてMH遺伝子診断の根拠を提供すると共にMHモデル細胞とすることを目的とした。Flp-In細胞株(HEK293およびCHO)を用いて、これまでの実験で樹立した野生型RyR1発現細胞の細胞内Ca2+動態をコントロールとしてMH型RyR1変異体の場合と比較した結果、数種のMH型RyR1変異体発現細胞には薬物に対する感受性の変化が確認されて、MHモデル細胞になり得ることが示された。しかし、解析の際にHEK293は剥がれ易く、接着の良いCHOが推奨されるが、CHOでの変異体の発現を誘導する際に必要なTet-Expressが一昨年より販売中止となったので、この代替えとなる膜透過性転写因子の作製をタカラバイオの担当者(林延江氏)と共に検討したが、発売元のクローンテック社からは明確な回答は得られなかったので、断念して、他の方法(Tet-Oneシステム等)も検討する事とした。また、MH型変異体を設計する際に、利用していた「アミノ酸配列はそのままで、その制限酵素切断部位を挿入出来る可能性のある位置」を教えてくれるネット上の"DNA sequence Design Supporter"が昨年初めより閉鎖されてしまい、変異体の塩基配列の設計が困難な状態陥っていたが、当サイトを運営した東京理科大学(山登一郎氏(名誉教授)と久保田幸雄氏(情報管理課))のご配慮により再利用が可能となり、昨年11月より変異体の設計を再開することが可能となった。今後は、培養用ディッシュ接着能が強く細胞内Ca2+
南アジアとその周辺地域における作物遺伝子資源と食糧開発に関する研究

本研究は昭和50年実施の「第1次ネパ-ルにおける栽培植物と生活様式の関連についての基礎研究」,昭和58年実施の「第2次ネパ-ルにおける稲・雑穀・香辛料の栽培と利用に関する研究」をふまえて、主要な栽培植物としてイネ,オオムギ,ソバ,トウガラシを中心に、それらの遺伝子レベルでの変異を調査するとともに、その利用状況,農業構造を検討し、将来の農業開発・食糧開発に今回の調査が資するよう考察した。1)研究会の実施.東京女子大学文理学部にて実施.平成3年8月6日調査にあたって既存資料の収集,および研究方法の検討,平成3年8月27日調査内容・項目の検討および調査実施準備,平成4年2月18・19日調査結果まとめ・考察.2)現地調査実施.ネパ-ル国カトマンズ,ポカラ,バルバット地域においてトリビュ-バン大学S.B.Gurung教授と共同して調査を実施した。平成3年9月2410月2日ブ-タン国ティンプ-,プナカ,トンサ周辺においてP.Wangchhuk長官の協力で調査を実施した。3)研究発表ー講演会開催,英文報告書作成.平成3年11月6日福田・山本・佐藤が「ヒマラヤ王国ブ-タンー現存する古代社会の稲作と唐辛子」を東京女子大学で講演.平成4年3月31日英文報告書""を完成し,印刷へまわす.4)研究成果の概要.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのイネ》西ネパ-ルでは2,000mの地点までイネがつくられていたが、ジヤポニカ型赤米が夛く、極めて変異に富む。ブ-タンの最変地点は2600mであるが、これはDasho Nishiokaによって日本から輸入されたタカネニンキなど耐寒性がある品種であった。しかし、もっとも強い品種は赤米であった。プナカ周辺にはインデイカ型が入っていたが,これはIRRIでつくり出されたものに存来種が交雑してできたものであった。ブ-タンのイネの特徴は、草丈,籾の色,種子稔性などの形質が示す著しい不均一性で、遺伝的に注目される.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのオオムギ》西ネパ-ルでは皮性オオムギと裸性オオムギが栽培されていたが、ブ-タンでは裸性オオムギだけであった.エステラ-ゼ同位酵素(EST),アスパラギン酸アミノ転移酵素(AAT)のアイソザイム分析では、集囲内・集囲門に顕著な変異性が認められ,その遺伝的変異性の動向かうネパ-ルのオオムギはインドから,ブ-タンのオオムギはチベットから来たものであると考えられた.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのソバ》ソバの起源と推定される野生種が大西(本研究分担者)によって中国の雲南であることが見出されたが,今回の調査によって、その発祥の地から西方へ伝播してブ-タン,ネパ-ルへ移っていたことがアイソザイム分析を通じて明らかにされた。さらに今回の調査で、中央ブ-タンでソバ粉から麺をつくっているところを見つけた。《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのトウガラシ》西ネパ-ルの山岳地帯ではグルン族が住んでおり、その村を訪れての調査ではトウガラシは高度1,000mから1,500mにわたってドクレ・クルサニイと呼ばれる大きく長い実の品種が主で、1,500mから2,000mではジャシマラ・クルサニイ,チエチエ・クルサニイ,ジレ・クルサニイといった小さい,丸い実の品種が栽培されている.高度に応ずる適応の栽培選択が人間の手で生じている。ブ-タンでは,1,500m以上2,500mまでRed Bell Pepperの品種のみが栽培されていたが,エステラ-ゼのアイソザイム分析では、この品種内に極めて高い変異性が高度に応じてみられる.これは人間がこの地に導入して以後極めて短い期間に植物自身が適応して遺伝子機構をつくりあげてきたものと注目される.以上,今回の調査では栽培植物が有する遺伝機構に、人間の選抜が加って、極めて重要な遺伝子保有がネパ-ル,ブ-タンに維持されていることがわかった。これらを活用して食糧開発をはかりたい。

3)研究発表ー講演会開催,英文報告書作成.平成3年11月6日福田・山本・佐藤が「ヒマラヤ王国ブ-タンー現存する古代社会の稲作と唐辛子」を東京女子大学で講演.平成4年3月31日英文報告書""を完成し,印刷へまわす.4)研究成果の概要.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのイネ》西ネパ-ルでは2,000mの地点までイネがつくられていたが、ジヤポニカ型赤米が夛く、極めて変異に富む。ブ-タンの最変地点は2600mであるが、これはDasho Nishiokaによって日本から輸入されたタカネニンキなど耐寒性がある品種であった。しかし、もっとも強い品種は赤米であった。プナカ周辺にはインデイカ型が入っていたが,これはIRRIでつくり出されたものに存来種が交雑してできたものであった。ブ-タンのイネの特徴は、草丈,籾の色,種子稔性などの形質が示す著しい不均一性で、遺伝的に注目される.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのオオムギ》西ネパ-ルでは皮性オオムギと裸性オオムギが栽培されていたが、ブ-タンでは裸性オオムギだけであった.エステラ-ゼ同位酵素(EST),アスパラギン酸アミノ転移酵素(AAT)のアイソザイム分析では、集囲内・集囲門に顕著な変異性が認められ,その遺伝的変異性の動向かうネパ-ルのオオムギはインドから,ブ-タンのオオムギはチベットから来たものであると考えられた.《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのソバ》ソバの起源と推定される野生種が大西(本研究分担者)によって中国の雲南であることが見出されたが,今回の調査によって、その発祥の地から西方へ伝播してブ-タン,ネパ-ルへ移っていたことがアイソザイム分析を通じて明らかにされた。さらに今回の調査で、中央ブ-タンでソバ粉から麺をつくっているところを見つけた。《ネパ-ル,ブ-タンの遺伝子資源としてのトウガラシ》西ネパ-ルの山岳地帯ではグルン族が住んでおり、その村を訪れての調査ではトウガラシは高度1,000mから1,500mにわたってドクレ・クルサニイと呼ばれる大きく長い実の品種が主で、1,500mから2,000mではジャシマラ・クルサニイ,チエチエ・クルサニイ,ジレ・クルサニイといった小さい,丸い実の品種が栽培されている.高度に応ずる適応の栽培選択が人間の手で生じている。ブ-タンでは,1,500m以上2,500mまでRed Bell Pepperの品種のみが栽培されていたが,エステラ-ゼのアイソザイム分析では、この品種内に極めて高い変異性が高度に応じてみられる.これは人間がこの地に導入して以後極めて短い期間に植物自身が適応して遺伝子機構をつくりあげてきたものと注目される.以上,今回の調査では栽培植物が有する遺伝機構に、人間の選抜が加って、極めて重要な遺伝子保有がネパ-ル,ブ-タンに維持されていることがわかった。これらを活用して食糧開発をはかりたい。本研究は昭和50年実施の「第1次ネパ-ルにおける栽培植物と生活様式の関連についての基礎研究」,昭和58年実施の「第2次ネパ-ルにおける稲・雑穀・香辛料の栽培と利用に関する研究」をふまえて、主要な作物としてイネ,オオムギ,ソバ,トウガラシを中心に、それらの遺伝子レベルでの変異を調査するとともに、その利用状況,農業構造を検討し、将来の農業開発・食糧開発に資するよう考察した。1)研究会の実施.東京女子大学文理学部にて実施.平成3年8月6日調査にあたって既存資料の収集および研究方法の検討.平成3年8月27日調査内容・項目の検討および調査実施準備.平成4年2月18・19日調査結果まとめ,考察.2)現地調査実施.ネパ-ルおよびブ-タン行.平成3年9月8日22日
子どもにおける食発達の総合的研究:養育者との葛藤・調整に注目して

哺乳・離乳・固形食摂取の発達に関連して,養育者と子どもとの葛藤や調整の問題を中心に質問紙調査(インターネット調査を含む)・行動観察・インタビュー等を行い,総合的に考察した。その結果,子どもの食が彼らの能動性の反映であり,親と子がそれぞれの主体性を示し合う場となり,それが葛藤と調整を生んでいること,そこには時代的変遷が反映されることなどが示された。本年度は大きくまとめると3つの研究を行った。一つ目は25歳から45歳までの母親を対象にしたインターネット調査で、(1)設問「ご家庭の食について,思うところを自由にお書き下さい」の回答内容について分析をおこなうとともに、(2)要求授乳・スケジュール授乳をしている母親と刹那的享楽性の高い母親を決定する要因についての分析をおこなった。現在結果を分析中である。二つ目は最近の子ども達における離乳・食発達・健康の実態を知るために、全国の保健センターによる3歳児健診の場で離乳調査への協力を依頼し、同意を得た母親から紙媒体・インターネットにより約700名の回答を得た。これは過去の調査資料と対照させて母親の離乳行動がいかに時代の影響を受けるものかを明らかにするものであり、実際に急速に離乳が後継している実態が明らかにされた。また主として固形食以降の子どもの食行動,拒否,それに対する母親の感情、さらに子の健康状態・食習慣・母親の食意識・療育態度等の把握のためのデータ入力と一部解析を行った。三つ目はその他であり、(1)子どもと養育者の対立と調整の特徴を捉えるために,乳幼児の食事場面の縦断的データの予備分析を、(2)子どもの食に関する意識の時代的推移を明らかにするため,02歳の子どもをもつ母親134名に対する質問紙調査と,母親13名・祖母11名に対するインタビュー調査を、(3)子どもの食の自立プロセスを明らかにするために,子どもが1歳になった時から,3ヶ月ごとに3歳になるまでの食事場面を、(4)幼稚園児200名・中学生300名の咀嚼能力の測定(チュウインガム法・オクルーザ法による)と子の食環境、精神的健康を含めた健康状態を把握できる調査とそのデータ入力を、それぞれ行った。(1)乳幼児の母親と乳幼児の孫がいる祖母を対象とした質問紙調査を実施した。その結果,子どもの食に関する技能の伝達は,家族・親戚経由から専門家・メディア経由へと変化していること,,専門家志向の高い母親は授乳・離乳の進め方について柔軟性が低いことし一方沖縄離島では,祖母と母親のリンクが強い群と本土出身の相対的に断絶度の強い群が併存していることが示された。(2)育児雑誌の分析:1970年代2000年代に発行された育児雑誌2誌を分析した。育児雑誌は専門的知識の伝達・指導型から,悩み共有・励まし型へと変化していることが示された。(3)47都道府県から抽出された4560名(回収675人,有効回収175人)の質問紙から子の健康状態・食習慣・母親の食意識・療育態度等の把握の解析を行った。小学生の咀嚼能力の測定と子の食環境,精神的健康を含めた健康状態を把握できる調査とそのデータ入力と一部解析を行った。(4)就学前乳幼児を養育中の母を対象に行ったインターネット調査の結果について分析を行った。1309名からの自由記述文を,「対象」「内容」「特徴」別に計31項目から内容分析をおこなった。インターネット調査において要求授乳に関する因果モデルを構築し,偏食の母親は家族に対して偏った食環境を提供していることが明らかとなり,母親の授乳スタイルは出産前の食生活から家庭において提供する食環境を予測する上でも重要な行動であることが示唆された。またインターネットで離乳を調査したところ,紙媒体での調査結果に比べてより都市部的な回答傾向が指摘された。(5)乳児の授乳場面における母子の相互作用に関する縦断的な観察研究を継続中である。(1)離乳の全国調査結果を集計し,過去の全国調査の結果と比較した。母乳期間の長期化やそれに対する保険センターの指導の影響などが明らかになった。(2)「携帯電話の通信機能を活用した食行動測定システム」を活用し,親の食意識調査と平行して親(ならびに家庭)の食行動,食卓状況の測定を試み,子の食嗜好,食行動の決定因としての,母の役割の重要性を指摘する結果が得られた。さらに,子と母の食の両者に影響を与える食環境について,フードシステムの発展・現状を分析した。(3)離乳等の世代差や世代間伝達の実態について,沖縄において母親世代と祖母世代にインタビュー調査を行った。離乳の情報源としてインターネットなどの重要性が増加し,祖母のアドバイスに対する葛藤が示唆されたがその傾向は2世代とも沖縄出身者により小さかった。(4)新生時期から生後6ヶ月までの乳児2名の授乳時の母子の相互作用を観察した。

その結果,母子の間に葛藤が生じるのは,1,2ヶ月の乳児では眠りながら飲むことが多くその状況において母親は授乳をやめようとするとき,3ヶ月以降は,乳児が遊びのみをしたり指しゃぶりをしたりするときに母親が飲ませようとするときであり,いずれの時期においても母子それぞれの駆け引きを行いながら調整されていくことが示された。また離乳食開始から1年間,計1516回の観察を母子3組について行い,離乳食を食べる-食べさせるというやりとりが,母子の間でいかに組織化されていくかを分析した。(5)保育園に通う幼児を対象としたインタビュー調査,保護者に対する質問紙調査を実施した。個人差はあるものの,幼児は保育園で経験した食に関わる活動(作物栽培活動や給食,おやつ)を,他の活動(遊びなど)より頻繁に家の人に話すこと,子どもがよく話をする家庭の親ほど,保育園の食経験を好意的にとらえていることなどが明らかになった。
レ-ザ-顕微鏡による染色体および精子の形態学的研究

共焦点レ-ザ-顕微鏡は1970年代初めに試作されたが、その優れた特性により次第に応用分野が広がり、今日ではいくつかのタイプの装置が実用化されている。1980年代中頃より始まった生物分野でのレ-ザ-顕微鏡の応用は、国内外で最近急速に盛んになってきている。本研究において、我々は従来の光学顕微鏡では得難い鮮明で立体的なレ-ザ-顕微鏡像による生物試料の微細構造観察を目的として、ヒト末梢血リンパ球染色体、植物花粉母細胞染色体、ショウジョウバエ唾液腺染色体、ヒト精子、ヒトの血尿中赤血球、尿中剥離上皮、胸水中癌細胞などの観察を試みた。その結果、観察対象によって無固定無染色で観察可能なものと、固定および染色を施した方が観察し易いものとがあることが分かった。また、ヒト中期染色体の観察において、一般の光顕ではとらえ難い重なりあう2本の染色体の上下関係の同定など、立体的な観察がレ-ザ-顕微鏡では可能であった(論文3編を発表)。更に、無固定無染色の生物試料を観察できるというレ-ザ-顕微鏡の利点に着目し、泌尿器科学的疾患である血尿の鑑別診断に応用したところ、共焦立リアルタイムレ-ザ-顕微鏡による赤血球の形態観察法は、従来の位相差顕微鏡を用いる方法より容易で確実であることが明らかになった(国内学会、外国雑誌に発表)。続いて、ヒト精子の中節部ミトコンドリアや先体の形態異常を生きたままの状態でとらえられることが分かり、男性不妊症診断における指標の一つである精子受精能判定に、レ-ザ-顕微鏡が有効な手段になり得ると考えられた。これらについては、米国泌尿器科学会(1992年5月)および米国不妊学会(1992年10月)に発表の予定である。さらに現在、癌細胞の鑑別診断への応用を試みているところである。以上のことから、本研究はレ-ザ-顕微鏡の生物試料への基礎的応用に加え、臨床部門での応用に先鞭をつけたといえよう。レ-ザ-顕微鏡は本来半導体ウエハ-の品質検査のために開発されたものであるが、一般の光学顕微鏡にない特長を備えているため、我々はこれを医学生物学方面に応用することを考えた。レ-ザ-顕微鏡は(1)共焦点光学系を採用しておりレ-ザ-光で単一の点光源を利用するので理論的にも通常の光学顕微鏡より分解能がよい(2)不要散乱光が少ないのでフレア-のない鮮明な像が得られる(3)焦点深度が通常の光学顕微鏡より深い(4)試料の雰囲気を真空にする必要がなく、熱線も含まないので生きた材料を長時間観察できる(5)生物試料を無固定、無着色で観察でき、精子や微生物などの動きのあるものも容易にビデオテ-プにおさめることができるなどの特長を有している。我々は細胞分裂中のテッポウユリ花粉母細胞の集塊をレ-ザ-顕微鏡で観察し染色体の状態により種々の分裂ステ-ジのある美しい像をとらえることに成功した。フレア-のない像は通常の光学顕微鏡でとらえたものと比較してもはるかに鮮明である。末梢血培養法で得たヒト中期染色体の観察では46本の染色体が立体的に映し出されており、染色体同士が重なっている部分では2本の染色体の上下関係が同定できた。これは通常の透過光による顕微鏡では困難である。また運動中のヒト精子の写真撮影、ビデオテ-プへの記録も行った。採取した精液は培養液で数回洗浄し、精〓を除去したあと、培養液中にしばらく放置、運動能の旺盛な精子を集めて観察した。