hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本家族の家族機能アセスメントモデルの開発と家族看護への臨床応用の確立

日本独自の家族理論・モデルとして,新しく「家族同心球環境モデル」を提唱した.さらに,この理論に立脚して,家族インタビューを中心として家族をアセスメントするための「家族環境アセスメントモデル」,家族機能レベルを評価するための自記式質問紙である「家族環境アセスメント尺度」などを開発した.これらから家族像と家族の症候を明確にすることにより,日本人家族の家族機能を維持・向上する家族看護実践に応用できることを可能にした.日本独自の家族理論・モデルとして,新しく「家族同心球環境モデル」を提唱した.さらに,この理論に立脚して,家族インタビューを中心として家族をアセスメントするための「家族環境アセスメントモデル」,家族機能レベルを評価するための自記式質問紙である「家族環境アセスメント尺度」などを開発した.これらから家族像と家族の症候を明確にすることにより,日本人家族の家族機能を維持・向上する家族看護実践に応用できることを可能にした.国内外(長崎県,兵庫県,香港,ロサンゼルス)における日本人家族の家族機能のエスノグラフィーとFeetham家族機能調査日本語版I(FFFS)による家族機能の量的研究,家族看護相談の実施,国内外の資料の分析,専門家からの知識提供などにもとづき,家族同心球環境モデルにもとづいた家族機能のアセスメント方法として「エコロジカル家族機能アセスメントモデル」を試作した.その後,長崎県(島嶼)に在住する育児期家族19家族を対象として,このアセスメントモデルを用いて家族機能をアセスメントした.家族の参加観察,エコロジカル家族機能調査(SEFF)による量的な評価も同時に行うことで,アセスメントモデルの信頼性を確認した.これらにより,「エコロジカル家族機能アセスメントモデルI」としてアセスメント項目が確定し,これが使用可能であることが確認できた.このアセスメントモデルは,バウンダリーによって区別される単位として,スープラシステム(4項目),マクロシステム(8項目),ミクロシステム(5項目),家族システム(12項目),クロノシステム(4項目)の5システムがあり,合計33項目で構成されている.家族員への2時間のインタビューを実施形式とし,録音したインタビューの逐語録から5システム33項目の家族機能をアセスメントすることができる.また,エコロジカル家族機能調査(SEFF)による量的な評価も同時に行うことで,エコロジーに即した家族援助構造を見いだすことができる.なお,次年度の大規模調査に向けて,「エコロジカル家族機能アセスメントモデルI」とSEFFの英語版と中文版への翻訳を行った.これまでのフィールドワークの継続として,長崎県(島嶼)に在住する日本人の育児期家族3家族,香港に在住する中国人の育児期家族4家族を家族看護インタビュー(半構成面接)の対象とし,前年度に作成した「エコロジカル家族機能アセスメントモデルI」を用いて家族機能をアセスメントした.同時に,家族の参加観察,自作の家族機能尺度の日本語版と中文版(FFFS: Feetham Family Functioning Survey, SEFF: The Survey of Ecological Family Functioning)による量的な評価も同時に行うことで,アセスメントモデルの信頼性を確認した.日本人から28のカテゴリー,中国人から11のカテゴリーが抽出された.さらに,国内外の文献検討をふまえて,家族の健康とは「動的な相互作用・交互作用により家族環境に適応する家族の機能状態」と考えるに至り,家族環境の視点から家族機能アセスメントモデルを開発することに決定した.この結果から,新しい家族理論である「家族同心球環境モデル」,家族看護インタビューにより家族をアセスメントするモデルである「家族環境アセスメントモデル」,家族機能レベルを評価する自記式質問紙である「家族環境アセスメント尺度(SFE: The Survey of Family Environment)」を完成させた.なお,次年度の国外での大規模調査に向けて,Web版SEFFをJava言語で開発し,遠隔地からインターネット経由で回答・自動集計できる仕組みを構築した.長崎県A市(離島)にある幼稚園(3箇所)・保育所(25箇所)を利用している父親・母親(全数調査)に対して,家族機能尺度として前年度までに開発した家族環境アセスメント尺度(SFE:The Survey of Family Environment)の日本語版を用いた調査を実施し,有効回答が得られた683家族を対象として家族機能の特徴を量的に明らかにした.さらに,この離島で生活する教育期にある家族を対象とした家族機能のエスノグラフィー(のべ14日間)とSFEを用いた質問紙調査を実施した.13家族への家族インタビューなどから24カテゴリーの家族機能が抽出された.同時に実施したSFEの満足度得点(SS)とニーズ得点(NS)から,エスノグラフィーのエビデンスを補強することができた.また,国内の専門雑誌『家族看護』(日本看護協会出版会)の全13巻を検討し,家族同心球環境モデルに準拠した11の家族の症候を抽出した.これらの結果をもとに,家族アセスメント指標は37項目に修正した後,ロサンゼルスでの家族機能のエスノグラフィー(のべ20日間)を実施し,家族アセスメント指標の英語版を作成した,SFE日本語版の改良に加えて,香港における家族機能のエスノグラフィー(のべ12日間)を実施し,香港における質問紙調査(543家族)によりSFE中文版,ロサンゼルスでの質問紙調査(73家族)によりSFE英語版(いずれもバージョン1.1)を開発した.3年間の成果を統合し,家族環境アセスメント指標,家族内部環境地図,家族環境アセスメント尺度,家族インタビューの4つで構成される家族環境アセスメントモデル(それぞれ日本語版と英語版)を構築した.
アミノ酸栄養と脳機能に関する研究

食餌組成(栄養条件)の変化に伴う脳内神経伝達物質及び行動への影響を調べ、相互の関係を明らかにすることを目的とした。脳内での情報を伝達するうえで重要な役割を演じている神経伝達物質は、アミノ酸そのもの、アミノ酸の修飾、アミノ酸からペプチドの合成などにより生理活性物質となるので、まず初めに食餌蛋白質と脳内神経伝達物質との関係を調べた。1食餌蛋白質として分離大豆蛋白質を用い、その制限アミノ酸であるメチオニン・スレオニンを補足した場合の栄養効果及び脳内物質との相関を調べた。対照群と比較してアミノ酸を補足した場合、一般の栄養効果(体重変化など)は改善されるが、脳内各部位でのトリプトファン・セロトニン・5ーハイドロキシ酢酸は著減した。その変動については、血液・脳関門を介しての中性アミノ酸の血中から脳への取り込み機構で証明することができた。即ち、脳内へのアミノ酸の取り込みには、主に4つの系路があり、また同一系路を介して取り込まれるアミノ酸はお互いに拮抗するので、個々のアミノ酸の相対的な割合が強く影響することになる。2脳機能の一つとして学習行動を取り上げ(オペラント型明度弁別学習試験)、脳内神経伝達物質の変化との相関を調べた。(1)トウモロコシ食にトリプトファンを補足したとき栄養価は改善され脳内セロトニン量も増加する。また学習行動にも有意な改善効果が観察された。(2)分離大豆蛋白食にメチオニン・スレオニンを添加した時、栄養価は改善されるが脳内セロトニン量は減少する。その時、学習効果は改善される。これまでセロトニン作動性ニュ-ロンの活性化と学習(記憶)とは正の相関のあることが知られていたが、今回の結果はどちからというと栄養価に依存しているように思われた。このことは、低蛋白質栄養を考える際の基礎的問題を含んでいるため、更に詳細に研究する必要がある。これまで比較的変動しにくいと思われていた脳内物質が、我々の食餌内容、或いはストレスなどにより、かなり容易に変動することがわかってきた。今回、食餌組成の変化と、それに伴う脳内神経伝達物質の変化及び、それに起因する行動への影響を解明することを目的とした。1.栄養条件の変化に起因する脳内神経伝達物質の変動(1).炭水化物摂取時には、脳内セロトニン量が顕著に増加するが、この変動機構には血中インスリン濃度が影響する。一方、インスリン分泌に及ぼす各種炭水化物の影響の仕方には違いのあることも報告されているので、その際の脳内セロトニン・カテコールアミン代謝を調べた結果、種類の違いによる差は観察されなかった。(2).インスリン・成長ホルモン・各種交感神経系薬剤の脳内セロトニン代謝に及ぼす影響を調べ、成長ホルモン分泌とセロトニン合成との相関を示した。(3).副腎皮質ホルモンの脳内トリプトファン・セロトニン濃度に及ぼす影響を種々の条件下で調べ、グルココルチコイド分泌促進(体蛋白質分解亢進)と脳内セロトニン合成との相関を明らかにした。(4).カフェイン投与時の脳内セロトニン代謝の変動を各種阻害剤を用いて測定し、またフェニルアラニンを同時投与した時の影響を調べた。カフェインによる脳内セロトニン量の増加が、フェニルアラニン同時投与で抑制されるが、この機構はトリプトファンの血液・脳関間での取り込みに対する拮抗阻害である。2.セロトニンは神経伝達物質として、セロトニン作動性神経系の調節を行っており、動物の行動制御と密接な関連がある。現在、食餌組成を変化させた時のオペラント型明度弁別学習を、スキナー箱を使用して研究中である。

食餌組成(栄養条件)の変化に伴う脳内神経伝達物質及び行動への影響を調べ、相互の関係を明らかにすることを目的とした。脳内での情報を伝達するうえで重要な役割を演じている神経伝達物質は、アミノ酸そのもの、アミノ酸の修飾、アミノ酸からペプチドの合成などにより生理活性物質となるので、まず初めに食餌蛋白質と脳内神経伝達物質との関係を調べた。1食餌蛋白質として分離大豆蛋白質を用い、その制限アミノ酸であるメチオニン・スレオニンを補足した場合の栄養効果及び脳内物質との相関を調べた。対照群と核してアミノ酸を補足した場合、一般の栄養効果(体重変化など)は改善されるが、脳内各部位でのトリプトファン・セロトニン・5-ハイドロキシ酢酸は著減した。その変動については、血液・脳関門を介しての中性アミノ酸の血中から脳への取り込み機構で証明することができた。即ち、脳内へのアミノ酸の取り込みには、主に4つの系路があり、また同一系路を介して取り込まれるアミノ酸はお互いに拮抗するので、個々のアミノ酸の相対的な割合が強く影響する。2脳機能の一つとして学習行動を取り上げ(オペラント型明度弁別学習試験)、脳内神経伝達物資との相関を調べた。(1)トウモロコシ食にトリプトファンを補足したとき栄養価は改善され脳内セロトニン量も増加する。また学習行動にも有意な改善効果が観察された。(2)分離大豆蛋白食にメチオニン・スレオニンを添加した時、栄養価は改善されるが脳内セロトニン量は減少する。その時、学習効果は改善される。これまでセロトニン作動性ニュ-ロンの活性化と学習(記憶)とは正の相関のあるとが知られていたが、今回の結果はどちらかというと栄養価に依存しているように思われた。このことは、低蛋白質栄養に対する基礎的問題を含んでいるため、更に詳細に研究する必要がある。
直接リプログラミングによる肺細胞分化誘導法の開発

現在広く研究されている幹細胞を用いた再生医療は、幹細胞残存による腫瘍形成の可能性や、長期間の組織生着の問題などが指摘されている。幹細胞から肺の上皮細胞(肺細胞)を分化させるためには複雑に培養条件を変化させる必要があり、肺再生医療の実用化には分化誘導過程の簡略化が必須でもある。そこで幹細胞を用いない新たな再生医療として、近年、体細胞に特異的遺伝子を過剰発現させ直接的に目的の細胞を分化誘導する手法(直接リプログラミング法)が注目されている。研究代表者はこの直接リプログラミング法による肺細胞の誘導法の開発を行った。まず胎生期の肺の発生過程で発現する14の転写因子を、レンチウイルスを用いて仔マウス尾部由来の線維芽細胞に過剰発現させ、肺細胞の分化マーカーであるSurfactant protein C(SP-C)、Clara Cell secretary protein(CCSP)の遺伝子発現を7日後に測定した。その結果、GFPコントロールに対しSP-C mRNAが2000倍以上、CCSP mRNAが300倍以上の上昇を認め、さらに14因子のうち特に4因子が重要であることを見出した。その4因子を過剰発現させ、7日後に蛍光免疫組織染色を施行したところ、全細胞の5ー10%程度でSP-C陽性細胞を確認した。続いて、SPC-GFPマウス(SP-C発現細胞でGFP蛍光が陽性となるトランスジェニックマウス)の胎生マウスの四肢と尾部から採取した線維芽細胞に、上述の4因子を導入した。Dexamethasone、FGF7などの成長因子を混合した培地で3次元培養を行い、培養開始後7-14日でGFP発光が陽性となることを確認した。免疫染色で、SP-Cの発現が確認された。これらの実験の結果から、研究代表者が使用した4因子によって、肺細胞を線維芽細胞から直接的に誘導することが可能と考えられた。
運動ストレスにおける細胞膜からの酵素の逸脱とそのメカニズム

本研究はヒトとラットに運動を行わせ, γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP)の酵素蛋白量と活性および4種のリソゾーム酵素活性と2種のそれらの合成律速酵素活性を測定することにより,運動がミクロゾームとリンゾームに及ぼす影響を検討した.1.ヒト:男子学生に1回5km以上, 6回/週の割合で10週間のランニングトレーニングを行わせた.トレーニング前・後のVo_2maxテストでは血漿γ-GTP活性はいずれも有意に増加したが, ELISAで求めた酵素蛋白量は変動を示さなかった.一方,トレーニング後の安静値については活性は変化しなかったが,酵素量は著名に現象し,肝細胞のミクロゾーム膜のstabilityの増強あるいは血漿での比活性の上昇が示唆された.2.ラット:(1)急性運動負荷:オスのWistar系ラットについて完全に消耗状態になるまで強制遊泳させた。対照とともに肝を摘出し、細胞顆粒分画法によってミクロゾ-ムと可溶性分面(S)を分離した。ミクロゾ-ム分画については等張のショ糖溶液(M_1)、蒸留水(M_2)1時間インュベ-トしたものと、0.2%Triton X-100処理したもの(M_3)についてγ-GTPの各測定を行った運動後、M_3のγ-GTPは活性、酵素量ともに有意に低下し、逆にSでは増加傾向がみられた。Q(in vitroの膜透過性)=(M_2)/(M_2+D7、P(in vivoの膜透過性)=D7S)/(S±M_3)とそれぞれ定義すると、いずれのγ-GTPのQとPも運動後増加傾向がみられた。(2)トレ-ニング:ラットに35°Cの水温で1回3時間、5回/週の割合で10週間の水泳トレ-ニングを行わせた。肝のγ-GTP酵素量、活性のいずれのQとPも低下傾向がみられ、ヒトと同様にミクロゾ-ム膜のstabilityの増大が_3された。しかし、酵素蛋白量と活性の変動は必ずしも平行しなかった。法、肝リソゾ-ム関連酵素のうちアリルスルファイタ-ゼBのみが水泳トレ-ニング後有意に上昇した。以上の結果、急性と持続運動の肝酵素に及ぼす影響が相反することが示唆された。運動負荷によって種々の酵素が血流中に逸脱してくるメカニズムについてはまだよく知られていない。本研究ではヒトとラットに運動を行わせ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP)の酵素蛋量と活性の両方を測定することにより、運動がミクロゾーム膜透過性に対する影響を検討した。1.ヒトの運動トレーニング実験:男子学生に1回5km以上、6回/週の割合で10週間のランニングを行わせた結果、【Vo_2】maxや12分走能力は有意に上昇した。トレーニング前・後の【Vo_2】maxテストでは血漿γ-GTP活性はいずれも有意に増加したが、ELISAで求めた酵素蛋白量は変動を示さなかった。

逆に、トレーニング後の安静値については活性は変化しなかったが、酵素量は著明に減少し、肝細胞のミクロゾーム膜のstabilityの増強あるいは血漿での比活性の上昇が示唆された。一方、肝可溶性分画に多く存在する血漿AST,ALT,LDH,ALP,LAPには【Vo_2】maxテストによるAST,ALP,LAP活性の上昇がトレーニング後ASTは小さく、ALP,LAPは大きくなったが、安静値に対するトレーニング効果はみられなかった。2.ラットの急性運動負荷実験:オスのWistar系ラットについて完全に消耗状態(exhausted)となるまで強制遊永させた。コントロールとともに肝と腎を摘出し、細胞顆粒分画法によってミクロゾームと可溶性分画(S)を分離した。ミクロゾーム分画については等張のショ糖溶液(【M_1】,蒸留水(【M_2】)中で1時間インキュベートしたものと、0.2%TritonX-100処理したもの(【M_3】)についてγ-GTPの各測定を行った。運動後、【M_3】のγ-GTPは活性,酵素量ともに有意に低下し、逆にSでは増加傾向がみられた。Q(in vitroの膜透過性)=【M-2】/【M-1】、P(in vivoの膜透過性)=S/S+【M-3】とそれぞれ定義すると、γ-GTPの活性,酵素量のいずれのQとPも運動後増加の傾向が認められた。以上の結果から、運動が肝細胞のミクロゾーム膜透過性になんらかの影響を与えることが示唆された。
ドイツ大学の大学教授資格試験(Habilitation)に関する歴史的研究

本研究によって、「大学教授資格試験」のやり方について、以下のことが明らかになった。私講師になって大学の教壇に立とうと思う者は、ハビリタツィオンとよばれる大学教授資格試験を受けて「教授資格」を取得しなければならない。教授資格を取らずに私講師になる方法はなかったから、私講師志願者は教授資格試験を受けて、教授資格を取得するほかはなかったのである。志願を許可された者は試験講義を行わなければならない。そのテーマは学部から与えられるか、志願者が学部の同意を得て選ぶかのいずれかによって決められるテーマが決定してから4週間の猶予が志願者に与えられる。試験講義が終わると志願者は教授の行う口頭試問を受ける。その後、私講師として講義することを認めるか否かが学部教授会の多数決によって決定される。会議の結果は学部長がこれを本人に通知する。「大学教授資格試験」で重視されたのは、専門分野の論文であって、口頭発表能力や講義(教授)能力ではなかった。しかしながら、この試験のやり方をみて、われわれが気づかされることは、(1)志願者の研究能力のみならず、形式的にではあったにせよ、教授能力が試されていること、および、(2)志願者に教授資格を授与するか否か、さらには私講師として採用するか否かはひとえに学部の自由裁量に委ねられていたということである。私講師になることを認められた者は公開の就任講義を行なう。そのために3ケ月の猶予が与えられる。ベルリン大学の学則の規定からも明らかなように、私講師の養成と採用は、国家の関与する公の領域から全く独立して、伝統的な自治団体の原理にもとづいて行なわれていた。私講師の補充権は学部に属していたのであって、国家に属していたのではなかった。
感化院入所経緯および児童の実態と障害児への特別な処遇の展開

本研究は、日本で最初の児童福祉に関する法律である感化法に規定された感化院の入所児童の入所経緯、および児童の実態や特別な処遇の展開を明らかにする研究の一環である。感化院長会議録や少年教護法制定過程において、入所時の児童鑑別や入所児童中の障害児への特別な処遇の是非など障害児問題に関する論点、科学的かつ教育的児童鑑別と保護児童本意の感化教育の在り方を示した池田千年の保護教育論の構造、感化院要覧や入所児童記録などをもとにした入所後の特別な処遇・措置変更などの展開の一斑を明らかにした。21年度は研究仮説の提示、および資料の発掘・整理などの基礎作業を実施した。なお、資料調査・研究対象の時期は、感化教育が進展し不良・浮浪少年中の障害児問題が顕在化・展開した1910年代から1940年代半ば(主として終戦まで)としている。1,感化法改正、少年教護法成立の過程(帝国議会での審議を含む)における論点の整理本研究の分析の枠組みを定めるための基礎作業として、少年教護法成立過程の分析に取り組んだ。具体的には、各施設における障害児への特別な処遇の確立については、児童鑑別による分類処遇など、法律の規定(少年教護院内に児童鑑別機関の任意設置が盛り込まれた少年教護法)に影響を受けたことをふまえ、感化法制定(1900年)少年教護法の成立(1933年)までの論点整理を行った。2,大阪修徳学院、京都府立斯陽学校、兵庫県立明石学園所蔵の資料調査入所児童の実態を把握する上で、施設要覧などの施設刊行物をはじめ関連する資料の豊富な3施設に加えて、京都府立総合資料館などの資料館・図書館に所蔵されている、各施設に関する資料をもとに、入所児童記録の実態・入所経緯・退院の経緯・予後の整理を行った。22度は、21年度に行った研究成果の一部の発表および、資料収集・資料整理を継続して実施した。具体的には以下の2点である。1.感化法改正、少年教護法成立の過程(帝国議会での審議を含む)における論点の整理本研究の分析の枠組みを定めるための基礎作業として、少年教護法成立過程の分析に取り組んだ。各施設における障害児への特別な処遇の確立については、児童鑑別による分類処遇など、法律の規定(少年教護院内に児童鑑別機関の任意設置が盛り込まれた少年教護法)に影響を受けたことをふまえ、少年教護法の成立までの論点整理を行った。2.感化院・少年教護院入所児童の実態に関する資料整理と分析入所児童の実態(心身の状態、家庭環境、入院理由など)を記した、感化院(現在の児童自立支援施設)刊行の冊子(『大阪府立修徳学院所蔵資料1感化法改正問題奮闘記』『大阪府立修徳学院所蔵資料5大阪府少年教護改革私案』『兵庫県立明石学園所蔵資料1県立土山学園・県立農工学校出版物』『兵庫県立明石学園所蔵資料2県立農工学校出版物』『京都府立淇陽学校所蔵資料1』など)、雑誌掲載の報告、入所児童記録などをもとに、入所児童の実態を明らかにするための資料整理と分析を行った。以上の成果の一部を第48回社会事業史学会で発表した。また、茂木俊彦監修(2010)『特別支援教育大事典』にて「感化教育と障害児問題」「少年教護法」「感化救済事業」「少年教護協会」などの項目の執筆を依頼され分担した。本研究の成果をまとめ、以下のように発表した。1.感化院対象者・入所経緯・入所後の処遇を規定する感化法の改正、少年教護法成立の過程における論点の整理各施設における障害児への特別な処遇の確立については、児童鑑創による分類処遇など、法律の規定(少年教護院内に児童鑑別機関の任意:設置が盛り込まれた少年教護法)に影響を受けたことをふまえ、感化法改正期成同盟の感化法改正案・衆議院に上程された少年教護法案および衆議院・貴族院での審議過程の分析を行った。この研究成果の一斑を「少年京教後法案成立経緯に関する研究-法案内容の変遷に着目して-」『和歌山大学教育学部紀要(教育科学)』第62集として発表した。2.入所児童の実態調査および児童の実態に応じ特別な処遇を講じた池田千年(兵庫県立土山学園長)の保護教育の検討入所児童の実態が入所後の処遇に与えた影響を明らかにする一斑として、精神科医でもあった池田千年を取り上げた。彼の保護教育論は、精神医学的知見をベースとして、感化教育を「保護教育」ととらえなおし、不良行為の原因を遺伝あるいは社会環境による不利益によるものとの立場から、(1)保護児童の教育保障を社会全体の課題として位置づけたこと、

(2)少年教護法制定前後より、「少年の不良化防止、感化のため」の手段として保護教育をとらえるのではなく、保護児童の教育保障自体に意義と価値を見いだす論調に変化したことを明らかにした。
ポストニュートニアン近似による合体する連星の運動方程式

レーザー干渉計重力波検出器の主要なターゲットである,コンパクト連星からの重力波について研究を行った.連星がスピン角運動量を持つ場合について,連星の運動方程式をポストニュートニアン近似によって,これまで求められていなかった2.5次のオーダーまで導出する研究を完成させた.方法は,星をデルタ関数で表すモデルを導入し,アインシュタイン方程式を解くものを用いた.これは大橋,Owenとの共同研究で行なった.また,重力波の理論波形を,実際のTAMA300検出器からのデータの解析に適用するための,デーダ解析コンピュータプログラムの開発を行い,さらに合体するコンパクト連星からの重力波の探査を行った.連星からの重力波を特徴づける質量パラメータとして,パラメータ空間を探査する際に非常に有用な質量パラメータの記述法を発見した.また,波形探査するさいのパラメータ空間探査方法として,2段階探査の方法,理論波形生成および理論波形とデータの相互相関計算の計算コスト削減方法などを開発した.以上のプログラムを1999年9月に取得されたTAMA300のデータに適用して,合体する連星からの重力波探査を行った.そして,0.3倍から10倍の太陽質量の連星についてのイベントレートの上限値を導出した.レーザー干渉計重力波検出装置の建設が日本を始めとして,世界各地で進んでいる.それらの検出器の最も有力な重力波源は合体する連星からの重力波である.これに関係する研究を行った.まず重力波の波形を理論的により正確に求めるための研究を行った.ポストニュートニアン近似により,自転角運動量(スピン)をもつ連星の運動方程式を,これまで求められていない2.5次のポストニュートニアン近似のオーダーまで求めた.星をデルタ関数で表すモデルを導入して、アインシュタイン方程式を解く方法を用いた.その際に自己重力発散の正則化の方法として,Hadamardの正則化を導入した.また,重力波の理論波形を,レーザー干渉計からのデータを用いたデータ解析に用いるための研究を行った.連星からの重力波を特徴づけるパラメータとして,パラメータ空間を探査する際に非常に有用なものを発見した.また,そのパラメータ空間を探査する際の計算コストを減少させる方法として,2段階探査の方法,理論波形生成の計算コスト減少法などを開発した.それらの方法を用いて、実際のコンピュータプログラムを作成した.更に,レーザー干渉計TAMA300の実際のデータ解析に応用した.レーザー干渉計重力波検出器の主要なターゲットである,コンパクト連星からの重力波について研究を行った.連星がスピン角運動量を持つ場合について,連星の運動方程式をポストニュートニアン近似によって,これまで求められていなかった2.5次のオーダーまで導出する研究を完成させた.方法は,星をデルタ関数で表すモデルを導入し,アインシュタイン方程式を解くものを用いた.これは大橋,Owenとの共同研究で行なった.また,重力波の理論波形を,実際のTAMA300検出器からのデータの解析に適用するための,デーダ解析コンピュータプログラムの開発を行い,さらに合体するコンパクト連星からの重力波の探査を行った.連星からの重力波を特徴づける質量パラメータとして,パラメータ空間を探査する際に非常に有用な質量パラメータの記述法を発見した.また,波形探査するさいのパラメータ空間探査方法として,2段階探査の方法,理論波形生成および理論波形とデータの相互相関計算の計算コスト削減方法などを開発した.以上のプログラムを1999年9月に取得されたTAMA300のデータに適用して,合体する連星からの重力波探査を行った.そして,0.3倍から10倍の太陽質量の連星についてのイベントレートの上限値を導出した.
縄文・弥生時代における石製製粉具の研究-中国・四国・近畿地方を中心として-

今年度は中国・近畿地方の日本海側の縄文・弥生時代の磨石類・右皿の調査を行い、全体を総括した。また、研究方法として形態の把握にかかわる部分においてZinggの図表を採用した。これは地質学において河川転礫の形状を示すのに用いられているものである。この図表と図表により分類できた形態の重量構成の検討から、磨石類の分類と時期的変遷、機能の推定に成果をあげることができた。磨石類について使用痕により8種類に分類したが、このうち形態と重量構成から製粉具の可能性が高いものは典型的な磨石が持つ凸面傾向の磨面、そして凹面傾向の磨面の一部とアバタ状敲打痕の一部のものである。凸面傾向の磨面を持つ石器について具体的に見れば、縄文早期に出現し、前期、中期にかけて磨面が次第に球面化する。また磨面の状況から石器の使用方法が一定方向の前後運動(早期・前期)から円運動を含めた不定方向の運動(中期以降)に変化する。これは製粉技術の発達を示すと考えられた。また、凸面傾向の磨面を持つ石器は縄文後期に大型のものが出現するが、これは製粉対象の変化ではなく、製粉作業を行う集団の変化によるものと考えた。そして弥生時代に入り、日本海側や西部瀬戸内などの一部の地域に残る。しかし残存する地域では特に微粉化のできる形態が残り、それは雑穀を栽培する地域に多いようである。凹面傾向の磨面とアバタ状敲打痕の一部に関しては実際の使用面を検討したところ、製粉には不向きでありそのように評価できなかった。また赤色顔料、特に朱の製粉具については岩を砕く生産地遺跡の石器と朱を溶く程度の集落遺跡の石器は全く異質であることを明らかにできた。出土資料の磨石・敲石・凹石・石皿を集成し、遺物の実見については四国及び近畿地方太平洋側については終了した。現在、瀬戸内地域について調査を継続している。平成14年度では、磨石・敲石・凹石・石皿の大まかな形態分類を設定することができた。磨石では、3種類,敲石・凹石では6種類,石皿は3種類であり,さらに細分できる見通しを持っている。また,この研究では,石質への視点として,石材の特定の他,比重,粒度についても調査している。これは先に述べた形態ごとに偏りがみられる。こうしたことは,分類を保障するものであり,機能や用途を推定する手がかりになるものと考えている。これらをふまえた上で,製粉具となりうる形態の絞り込みを行っている。時期的な分布について形態により,縄文時代のみ現れるもの,弥生時代に出現するものがあり,ある程度の編年が可能になっている。また形態によっては,地域性を示すものがあり,これらの,特徴の意味を現在検討している。結果については,次年度以降,論文等で発表する予定である。
臨床検査への応用を目的としたオートファジー活性測定法の開発

オートファジーは、細胞内に蓄積した不要物質を分解することで細胞内の恒常性を維持する機構であり、その機能低下は様々な疾患に関連すると考えられている。しかしながら、オートファジー活性を測定できる臨床検査は存在しない。本研究では、オートファジー活性を測定する為に、pH依存的に励起波長が変化する蛍光タンパク質Keimaを発現させた培養細胞(Keima細胞)を作成し、それらの細胞を利用して細胞内で起こったオートファジーを蛍光顕微鏡により観察する実験を行った。Keima細胞を用いることで、高感度かつ半定量的にオートファジーを観察できた。オートファジーは細胞内の分解機構であり、医学的には細胞内に蓄積した不要物質を捕まえて、分解することにより細胞の恒常性をいじする「細胞内の掃除システム」としての働きがあると考えられている。オートファジーの活性は、加齢に伴い低下し、また肥満、高血糖などでも低下することが明らかになってきた。このようにオートファジーの活性が低下すると、細胞内に不要物が蓄積し、細胞機能が低下することで、老化の促進やメタボリックシンドロームを加速させる原因になりうる。このため、医療の場において、患者個人が持つオートファジー活性は、患者の治療方針の決定や予後の予測に有用であると考えられるが、これまでにオートファジー活性を測定する臨床検査法は開発されていない。本研究課題では、オートファジー活性を測定する検査法を開発する予備研究として培養細胞レベルでのオートファジー活性測定法の開発を行うことを目的とする。HeLa細胞、A549細胞、SH-SY5Y細胞など種々の培養細胞にpH依存的に励起波長が変化する蛍光タンパク質Keimaを発現させた細胞を作成した。Keimaは、周囲の環境が細胞質のような中性では440nmで、オートリソソーム内のように酸性では590nmで励起される。それぞれの細胞を用いて、アミノ酸飢餓、ラパマイシンによる刺激でオートファジーを誘導した場合に、いずれも、最初の数時間は時間依存的に、ラパマイシンの場合はさらに濃度依存的にKeimaのリソソームへの取り込み、即ち590nmで励起されるドッドが観察された。このことから、Keimaを用いたオートファジーの観察法はある程度定量性があることが確認できた。同様に、Keimaにミトコンドリア移行シグナルを付けたmt-Keimaを発現させてオートファジーによるミトコンドリア分解(マイトファジー)を観察した所、こちらも飢餓時間依存的にマイトファジーが誘導されることが確認できた。オートファジーは、細胞内に蓄積した不要物質を分解することで細胞内の恒常性を維持する機構である。動物モデルでは、オートファジー不全により種々の疾患を呈することが明らかになり、医学的にもオートファジーを理解することが重要となりつつある。また、オートファジーの活性は、加齢に伴い低下し、肥満、高血糖などでも低下することが明らかになってきた。オートファジー活性が低下すると、細胞内に不要物質が蓄積し、細胞機能が低下することで、老化の促進やメタボリックシンドロームを加速させる原因になりうる。こうした背景から、医療の場において、患者個人が持つオートファジー活性を知ることは、治療方針の決定や予後の推測に重要な情報となると考えられるが、現状では臨床検査としてオートファジーを測定することはほぼ不可能で、その予備検討すらほとんど行われていない。本研究課題では、オートファジー活性を測定する検査法を開発するための基盤研究として、培養細胞レベルでオートファジー活性測定法を開発し、個体での検査に応用することを目的としている。これまで、HeLa細胞、A549細胞、SH-SY5Y細胞などの培養細胞においてpH依存的に励起波長が変化する蛍光タンパク質Keimaを発現させた細胞を作成しオートファジーが観察できることを確認している。今年度は、Keima発現細胞が正確に定量的にオートファジーを反映できるかの検証を行った。本細胞では、飢餓によるオートファジー誘導時の時間経過に従って590nmで励起されるシグナルが増加することから、このシグナルが半定量的に誘導されたオートファジーの量を表していることが示された。また、本細胞で観察される現象は、オートファジーに必須のVps34やUlk1のノックダウンにより強く抑制されることから、観察されている現象はオートファジーの結果であることが確認された。本法は、オートファジー活性測定に有用な方法であると考えられる。オートファジーは細胞内の分解機構であり、医学的には細胞内に蓄積した不要物質を捕まえて、分解することにより細胞の恒常性をいじする「細胞内の掃除システム」である。このようにオートファジーの活性が低下すると、細胞内に不要物が蓄積し、細胞機能が低下することで、老化の促進や疾患の増悪因子になりうる。

さらに近年、オートファジーによるミトコンドリア分解(マイトファジー)と神経変性疾患などとの関わりが明らかになり、非常に注目されている。このため、医療の場において、患者個人が持つオートファジー活性やマイトファジー活性を知ることは、患者の治療方針の決定や予後の予測に有用であると考えられるが、これまでにオートファジー活性、マイトファジー活性を測定する臨床検査法は開発されていない。本研究課題では、オートファジー活性を測定する検査法を開発する予備研究として培養細胞レベルでのオートファジー活性測定法の開発を行うことを目的としてスタートした。HeLa細胞、A549細胞、SH-SY5Y細胞など種々の培養細胞にpH依存的に励起波長が変化する蛍光タンパク質Keimaを発現させた細胞作成し、昨年度は、オートファジーをある程度定量出来るようになったが、今年度はさらに、オートファジーによるミトコンドリア分解を観察できるミトコンドリア移行Keima(mt-keima)を発現させた細胞の作成にも成功している。初代培養細胞にウイスルベクターを使ってKeima遺伝子を導入する計画であったが、研究施設を移動によりウイルスが利用できないため、電気穿孔法での導入を試みている。一方で、mt-keima発現細胞を利用して研究を進めた所、副次的にマイトファジーを制御する分子機構が明らかになってきている。今年度の研究では、予定していた最も重要な部分である、Keimaを用いたオートファジーの想定法に定量性があることの確認に成功している。このことは、細胞の種類やオートファジーの誘導法を変えての普遍である。また、電子顕微鏡でもオートファジーを観察しており、測定法の信用を高めている。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究期間中に研究代表者が九州大学から新潟大学に移動した。研究機器、資料の移動と、研究代表者自身、ポスドク、学生の大掛かりな引越しが必要で、研究活動の一時中断を余儀なくされた。また、一部の研究協力者は新潟大学に移動できなかったため、研究計画から離脱した。さらに、新潟大学における遺伝子組み換え実験など法令等を尊守するための設備と申請にも時間がかかり、当初の予定を遅らせたり、変更する必要が生じている。こうした事情があり、予定通りに進んでいない部分がある。一方で、研究実績の概要に示すように、新たにマイトファジーの活性測定法の開発にも取り組んでおり、予想以上の成果が上がっている。また、論文等としての成果報告も順調に行えており、全体としてはおおむね順調であると判断される。今後、設備等の問題で若干の計画変更を行う必要があるが、代替法を用いたり、複数の実験系を利用することで、順調に研究が推進できるものと考えている。次年度以降は、レンチウイルスを用いてマウスの諸臓器から採取した初代培養細胞にKeimaを発現させ、初代培養レベルでのオートファジーを観察し、さらに細胞を採取するマウスの加齢に伴い、Keimaを用いて観察できるオートファジーの量が低下していくかどうかを観察する。また、高カロリー食による肥満モデルマウスの諸臓器の初代培養細胞でも、正常マウスと比べてどの程度オートファジーの活性が低下しているかを観察していく。
ヒト歯肉毛細血管内皮細胞の機械的刺激に対する応答性

1.ヒト歯肉をコラゲナーゼ処理後機械的に擦過し,血管内皮細胞を遊離させた。その細胞懸濁液を96ウェルプレートに均等に播種し,培養した。3-4週間後,形態的に均一でコンフルエント時に敷石状を呈したウェルの細胞を,以後継代培養した。2.単離細胞の単層敷石状配列.関節免疫蛍光抗体法によるvonWillebrand factorの存在,Ac-LDLの取り込みおよびMatrigel上での血管様網目構造の形式を確認して,ヒト歯肉毛細血管内皮細胞と同定した。分離の成功率は,歯肉提供者の年齢が10-20歳代で16例中5例(31.1%),30歳代以上で35例中6例(17.1%)であった。3.ヒト歯肉毛細血管内皮細胞は,MCDB 107培地に20%牛胎児血清(FBS), 75μg/mlの内皮細胞増殖因子(ECGS), 30μg/mlのヘパリンを添加した培養条件で良好な増殖を示した。4.ヒト歯肉毛細血管内皮細胞は,ヒト臍帯静脈血管内皮細胞と比較して,Ac-LDLの取り込みがやや弱く,また,細胞増殖においてFBS濃度依存性が大きいことが観察された。さらに、プロスタグランジンE_2の産生能が高いことが示された。5.ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養細胞伸展装置フレキサ-セルを使用して刺激したところ、間欠的な刺激に対して細胞増殖が促進された。6.今後機械的刺激に対する代謝産物の変化についても検討を加えていく予定である。1.ヒト臍帯血管内皮細胞の培養法の追試ができたJaffeらの方法によりヒト臍帯から血管内皮細胞を分離した。これにより、臍帯内皮細胞を歯肉内皮細胞に対するコントロールとして使用することが可能となった。2.血管内皮細胞の同定3.ヒト歯肉血管内皮細胞の分離・同定(1)ヒト歯肉を23mmの小片に切り、0.5%コラゲナーゼで37°C、1時間インキュベート。(2)20%FBS含有培養液中で軽く擦過し、内皮細胞を遊離させた。(3)線維芽細胞など他細胞の混入を防ぐ目的で、96穴プレートを使用し、1穴に1コロニーが入る様に細胞浮遊液を希釈しプレートに播種した。(4)形態学的に内皮細胞と思われるコロニーを継代していき、上記三方法により同定した。4.最適培養条件の決定(計画中)今後、歯肉血管内皮細胞の増殖に最適な血清濃度、成長因子などを検討していく予定である。本年度の研究実施計画は、ヒト歯肉毛細血管内皮細胞培養法の最適条件の検討と、ヒト臍帯内皮細胞およびヒト歯肉線維芽細胞の機械的刺激に対する応答性の二点であった。ヒト臍帯内皮細胞およびヒト歯肉線維芽細胞の応答性については、フレクサ-セルの納入が11月と遅れたため、現在実験中である。ヒト歯肉毛細血管内皮細胞培養の最適条件は、MCDB107培地に20%の牛胎児血清、75μlの内皮細胞増殖因子(ECGS)、30μg/mlのヘリンパ、1μg/mlのインシュリン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを添加したものが最適であることが分かった。増殖因子として、血管内皮細胞に特異的に作用するVEGFについても検討した。ヒト歯肉毛細血管内皮細胞では、VEGFはECGSの59%の増殖効果を示すにとどまった。またECGSはヘパリン添加によって、1.3倍の増殖促進作用を示したのに対し、VEGFではヘパリンの添加の効果は観察されなかった。

牛胎児血清の濃度は、ヒト臍帯内皮細胞では30%以上では増殖能が低下するが、ヒト歯肉毛細血管内皮細胞では、20%と40%の間に有意な差がないものの40%まで濃度依存的に増殖能の増加が認められた。また、歯肉提供者の年齢、性別、湿重量と毛細血管内皮細胞の分離の関係を調査したところ、10歳代・20歳代で43%、30歳代・40歳代では25%の確率で分離が出来、50歳代以上では5例中1例も分離することが出来なかった。このことから、年齢が若いほど高い確立で細胞分離が出来ることが分かった。性別、湿重量と分離できる確率との間には、相関はみられなかった。今後は、ヒト歯肉毛細血管内皮細胞を分離する確率をさらに高くする方法を工夫する必要がある。これが確率されれば、歯周病における宿主側の細胞因子に関する研究は、飛躍的な進歩を遂げるものと期待される。細胞伸展装置フレキサ-セルを使用して,刺激の強さと間隔の違いによるヒト臍帯動・静脈血管内皮細胞の応答性を検討した。まず,ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に対して,6%,12%,24%の力でそれぞれ9日間連続刺激を与え,刺激後1,3,5,7,9日後の細胞数をコールターカウンターで測定した。どの条件においても,刺激を加えた方が,刺激を加えなかったものに比較して,細胞数が少なかった。また,ヒト臍帯動脈血管内皮細胞に対して24%の力で9日間連続して刺激を加えたところ,臍帯静脈血管内皮細胞と同様の傾向が認められた。次に,24%の力で刺激の間隔を変化させてヒト臍帯動・静脈血管内皮細胞を刺激し,最も刺激のかかるウェル辺縁の細胞数を写真撮影により測定した。臍帯動・静脈血管内皮細胞はともに,連続刺激した場合と24時間おきに刺激した場合において,静置培養した対照よりも,細胞数が増加する傾向が認められた。しかし,6,12,24時間刺激後静置した場合においては,刺激しなかったものと細胞数がほとんど同じであった。連続刺激した場合と刺激しなかった場合の細胞数が,コールターカウンターで測定した時と辺縁を写真撮影して測定した時とでは異なる結果が得られた。フレキサ-セルで機械的刺激を加えるとその構造上ウェル辺縁部に最も応力がかかることが知られている。例えば,24%の応力をかけてもウェル中央部は1%程度の応力しかかからない。機械的刺激の応答性をより精密に観察するために,今後辺縁部の細胞数を顕微鏡下で測定することにした。以上の結果から,血管内皮細胞は,間欠的な刺激に対して細胞増殖が促進されることなどが示された。今後機械的刺激に対する代謝産物の変化についても検討を加えていきたい。
変異Ki-Rasにより発現制御される癌関連遺伝子の同定・機能解析

大腸癌細胞株とそれらの活性化Ki-rasを特異的に欠損させた細胞を利用することにより、活性化Ki-rasにより直接的、間接的に発現制御される癌関連遺伝子を同定し、さらにそれらの分子と会合する分子も癌関連遺伝子の候補として単離し、それらの機能を細胞生物学的に、また遺伝子破壊マウスを樹立することにより解明することを目的とする。この解析の結果は、変異Ki-rasの発癌における役割を解明するのみならず、新規の癌関連遺伝子およびそれらと会合する分子の同定・機能解析は、その他の癌発生における分子機能の解明につながると考えられる。本年度は、変異Ki-rasにより発現制御される遺伝子の同定・機能解析とそれらの分子に会合する分子も癌関連遺伝子として同定し、以下のことを明らかにした。(1)活性化Ki-rasにより発現誘導されるEGFファミリーに属するepiregulinがAPC^<Min>マウスの腸管ポリープで、ポリープの増大に伴い発現が上昇してくることを見出し、更にepiregulin遺伝子欠損マウスを樹立し、epiregulin欠損マウスの解析及びepiregulinとAPC^<Min>マウスの交配を開始した。(2)活性化Ki-rasにより発現制御される遺伝子としてアダプター分子と考えられるMig-6を同定し、Mig-6がNF_KBの経路を活性化している所見を得た。又、Mig-6と会合する分子として、Ring fingerドメインを持ち、酵母よりヒトに至るまで強く保存されているMigBP#3を単離し、定型通りにMigBP#3ヘテロマウスの樹立を行った。(3)活性化Ki-rasにより発現制御される新規の遺伝子としてSEPTを単離し、SEPT遺伝子欠損マウス作製のためのES細胞・キメラマウス樹立を行った。又、SEPTと会合する分子として、他種類の癌細胞株で強発現しているSEPT BP#1を単離した。
ＣａＭＫＩδの新規活性化メカニズム及び軟骨形成における生理機能の解明

当研究室では以前、ゼブラフィッシュ胚発生過程の鍵酵素としてカルモジュリン依存性プロテインキナーゼIδ(CaMKIδ)を同定した.CaMKIはCa2+シグナルの下流で働き、CaMKKによるリン酸化を受け強く活性化する.本研究では、CaMKIδの詳細な活性調節機構や器官形成における生理機能の解明を目的とした.1.新規活性化メカニズムの解析我々は、大腸菌で発現させたCaMKIδ(1-299)がCaMKKのリン酸化を受けなくても活性化していること、そして高度に自己リン酸化していることを見出した.自己リン酸化と酵素活性の因果関係を調べるために、λホスファターゼを発現する大腸菌株を開発し、これを用いて取得したCaMKIδ(1-299)のキナーゼ活性を調べたところ、CaMKIδ(1-299)のCaMKK非依存的活性化には自己リン酸化が必須であることが判明した.MS/MS解析と部位特異的変異体を組み合わせた解析を行った結果、CaMKIδ(1-299)はSer296の自己リン酸化によって活性化していることが明らかになった.このことから、CaMKIδアイソフォームにはSer296のリン酸化を介した新規の活性化機構が存在することが示唆された.2.軟骨形成における生理機能の解明ゼブラフィッシュ胚においてCaMKIδの遺伝子ノックダウンを行うと軟骨に異常が観察される.この分子メカニズムを明らかにするためにCaMKIδの結合タンパク質を解析したところ、転写因子(Dlx1とDlx5)が同定された.Dlx1,5は変性条件下で精製された場合にはCaMKIδによってリン酸化されたが、GST融合タンパク質として精製したDlx1,5はCaMKIδによってほとんどリン酸化されなかった.このことからCaMKIδは生理的な条件下ではDlx1,5を基質としないことが示唆された.CaMKIδ(1-299)の新規活性化メカニズムについて、昨年度は未だ活性化に関わるCaMKIδ(1-299)の自己リン酸化サイトは同定できていなかったが、今年度実施したMS/MS解析と様々な点変異体を組み合わせた解析から、その責任リン酸化サイトはSer296であることを明らかにした.また、リン酸化ミミック変異体を用いた実験から、Ser296の自己リン酸化はFLにおいても活性化に寄与することが強く示唆されており、Ser296のリン酸化介した新規活性化機構が生理的にも意味を持つ可能性を示している.本年度明らかにしたCaMKIδ(1-299)の新規活性化メカニズムについては現在論文を投稿中である.また、CaMKIδの軟骨形成に関わる新規基質の探索について、可溶性画分から取得したGST-Dlx1,5をCaMKIは好んでリン酸化しないことを明らかにした.このことから、CaMKIδとDlx1,5は結合するものの酵素ー基質の関係では無いこと、軟骨形成に関わるCaMKIδの基質タンパク質は別に存在することが強く示唆された.以上のように、新規活性化メカニズムについては活性化に関わるサイトの同定が完了し、現在論文を投稿中であること、もう一方のテーマについても基質候補について慎重に吟味しながら真の分子メカニズムの解明へと着実に進んでいることから、本研究は順調に進展していると評価できる思われる.1.新規活性化メカニズムの解析CaMKIδ(1-299)においては、Ser296のリン酸化によってCaMKK非依存的に活性化することが明らかになったが、full-lengthのCaMKIδ[CaMKIδ(FL)]において、この活性化メカニズムが生理的に存在するかは定かではない.そこで、今後はまずリン酸化Ser296に対するリン酸化部位特異的抗体を作製し、CaMKIδ(FL)のSer296が生体内でもリン酸化されているかどうかを調べようと考えている.もし生理的に起こるメカニズムであれば、CaMKIδのSer296は他のキナーゼによりリン酸化されている可能性が高いため(Ser296の自己リン酸化反応はかなり非効率的である)、その責任キナーゼを同定していきたいと考えている.2.軟骨形成における生理機能の解明変性条件で取得されたDlx1,5はCaMKIδによりリン酸化されたが、可溶性画分から精製したDlx1,5(ネイティブ)はCaMKIδによってほとんどリン酸化されなかった.このことは、CaMKIδがDlx1,5とは異なる別のタンパク質をリン酸化することで、軟骨の形成に寄与していることを示唆している.そこで今後は、CaMKIδの良好な基質となり、軟骨形成に関わる新規基質を探索していく予定である.特に軟骨形成に関わる転写調節因子に着目した解析を行っていく.当研究室では、ゼブラフィッシュ胚発生過程の鍵酵素としてカルモジュリン依存性プロテインキナーゼIδ(CaMKIδ)を同定した.CaMKIはCa2+シグナルの下流で働き、上流のCaMKKによるリン酸化により強く活性化する.本研究では、CaMKIδの詳細な活性調節機構や器官形成における生理機能の解明を目的とした.1.新規活性化メカニズムの解析我々は、大腸菌で発現させたCaMKIδ(1-299)がCaMKKのリン酸化を受けなくても活性化していること、そして高度に自己リン酸化していることを見出した.自己リン酸化と酵素活性の因果関係を調べるために、λホスファターゼを発現する大腸菌株を開発し、これを用いて取得したCaMKIδ(1-299)の自己リン酸化状態及びキナーゼ活性を調べたところ、λホスファターゼによりCaMKIδ(1-299)の自己リン酸化は無効化され、さらにキナーゼ活性も消失することが明らかになった.

このことから、CaMKIδ(1-299)は自己リン酸化により高活性化することが判明した.さらに興味部深いことに、CaMKIδ(1-299)の自己リン酸化部位は、CaMKKによるリン酸化部位と同一でないことが判り、CaMKIδ(1-299)はこれまでに報告のない部位のリン酸化を介した新しいメカニズムで活性化することが示唆された.2.軟骨形成における生理機能の解明ゼブラフィッシュ胚においてCaMKIδの遺伝子ノックダウンを行うと軟骨に異常が観察される.この分子メカニズムを明らかにするためにCaMKIδの結合タンパク質を解析したところ、転写因子(Dlx1とDlx5)が同定された.そこで大腸菌でDlx1, 5を発現させたところ封入体を形成したため、可溶化精製後に再生化し、キナーゼアッセイの基質に用いた.その結果、CaMKIδはDlx1,5をリン酸化することが明らかになった.CaMKIδ(1-299)の活性化メカニズムについては、MSによるリン酸化部位の同定を試み、活性に重要なリン酸化部位がかなり絞られてきている.また、脱リン酸化型CaMKIδ(1-299)の取得に際して、大腸菌内でプロテインホスファターゼと共発現させるという新たな手法を開発し、CaMKIδ(1-299)が大腸菌内で高度に自己リン酸化することで高活性化することを直接的に証明した.さらに、この実験のために開発した大腸菌株BL21(DE3)pλPPは、自己リン酸化により不活性化してしまうカゼインキナーゼを始めとした他のプロテインキナーゼの調製にも非常に有用であり、この手法に関する論文をAnalytical Biochemistry誌に発表した.また、CaMKIδの新規基質候補であるDlx1,5についてもさらなる発現条件検討を経て、可溶性画分での発現精製に成功したため、より生理的な条件での解析が可能になった.以上より、順調にかつ着実に研究が進展していると評価した.当研究室では以前、ゼブラフィッシュ胚発生過程の鍵酵素としてカルモジュリン依存性プロテインキナーゼIδ(CaMKIδ)を同定した.CaMKIはCa2+シグナルの下流で働き、CaMKKによるリン酸化を受け強く活性化する.本研究では、CaMKIδの詳細な活性調節機構や器官形成における生理機能の解明を目的とした.1.新規活性化メカニズムの解析我々は、大腸菌で発現させたCaMKIδ(1-299)がCaMKKのリン酸化を受けなくても活性化していること、そして高度に自己リン酸化していることを見出した.自己リン酸化と酵素活性の因果関係を調べるために、λホスファターゼを発現する大腸菌株を開発し、これを用いて取得したCaMKIδ(1-299)のキナーゼ活性を調べたところ、CaMKIδ(1-299)のCaMKK非依存的活性化には自己リン酸化が必須であることが判明した.MS/MS解析と部位特異的変異体を組み合わせた解析を行った結果、CaMKIδ(1-299)はSer296の自己リン酸化によって活性化していることが明らかになった.このことから、CaMKIδアイソフォームにはSer296のリン酸化を介した新規の活性化機構が存在することが示唆された.2.軟骨形成における生理機能の解明ゼブラフィッシュ胚においてCaMKIδの遺伝子ノックダウンを行うと軟骨に異常が観察される.
ウシ白血病の細胞病理学的分類試案の作成に関する研究

ウシ白血病は臨床病理学的に流行性性格で発生する成牛型白血病と散発的に発生をみる犢型,胸腺型および皮膚型に分類されている。近年の免疫学の進歩により、それら腫瘍細胞の発生由来については、成牛型ではBリンパ球、散発型ではTリンパ球由来であることが判明しつゝある。本研究は194例のウシ白血病の腫瘍細胞の形状について走査電子顕微鏡による表面構造,電子顕微鏡による微細構造,TおよびBリンパ球に対する免疫学的形質ならびに酵素細胞化学的性状について検討を加え、本病の細胞病理学的分類を試案したものである。その結果、ウシ白血病の各型は次の様に分類された。以上、免疫学的および酵素化学的性状を加味した細胞学的分類は、ウシ白血病の各型の特性を反映していると看做される。すなわち成牛型はBリンパ球、その他の型はTリンパ球起源とすることを提示しているとともに、それはまたリンパ球の各分化段階の腫瘍病態を比較的よく表現しているものと看做される。