hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性呼吸不全・COPD患者の意思決定支援プログラムの開発と有効性の検証

本研究の目的は、慢性呼吸不全患者および家族の終末期の意思決定支援のニーズと看護師による支援の現状を明らかにし、治療やケア内容を含めた「人生の見通し」を共有し患者と家族の意思を反映できるケアプログラムを作成することである。患者は、COPDの自己管理のために重要であると医療者が考えている管理方法について知識・情報が不足しており、その情報を必要としている。特に、「食事療法」や「呼吸のコントロール」、「呼吸リハビリテーション」についての自己管理の知識を含むプログラムを作成した。調査対象病院呼吸器内科において、呼吸器疾患で受診している患者で、本研究の趣旨を説明し、同意を得られた7名に半構成的面接調査を行なった。医療者がCOPDの自己管理において重要であると考えている、「病気についての自己学習」、「禁煙」、「服薬についての知識とコンプライアンス」、「食事療法」、「呼吸リハビリテーション」、「予防接種」、「呼吸のコントロール」を自らおこなっているか尋ねた。また、Home oxygen therapy( HOT)やNon-invasive positive pressure ventilation (NPPV)の存在の認識について尋ねた。さらに病気に対する思いと最期をどのように迎えたいと考えているのか、それに関連した医療者に望むことに関する語りを整理した。すべての患者が「服薬についての知識とコンプライアンス」は問題ないと答えた。6人が「喫煙」と「予防接種」を実施できていた。一方「呼吸リハビリテーション」は3人の患者が実施していた。「病気についての自己学習」は唯一の2人で行われ、「食事療法」や「呼吸のコントロール」については一般的なバランスのとれた食事や経験上身に付けた呼吸法でCOPDに推奨される自己管理の知識がなく実施されていなかった。4人の患者は、既にHOTを受けていた。NPPV療法を受ける可能性については唯一1人が知っていると語った。特に、「食事療法」や「呼吸のコントロール」、「呼吸リハビリテーション」についての自己管理の知識の教育は、重要だと推察される。インタビュー結果は分析中である。慢性呼吸不全患者への終末期の意思決定支援の現状とその影響要因を明らかにするため、「COPD・慢性呼吸不全の緩和・終末期ケアの意思決定支援」について医師と看護師に調査を行った。項目は、属性とし、性別、年齢、教育歴、経験年数、呼吸器病棟勤務年数、呼吸器疾患管理に特化した資格及び免許、職位、学齢、「患者の緩和・終末期ケアの意思決定を支援する看護や医療に関する学習経験」や「呼吸看護の専門資格」、「専門医資格」、「病院の分類」、「勤務場所」などとする。また、「事前指示書を使用しているか」、「緩和ケア病棟があるか」、「呼吸ケアチームが活動しているか」、「緩和ケアチームがあり相談をしているか」、「緩和・終末期の意思決定を支援する看護や医療ケアに関する学習経験」、「麻薬を末期の呼吸不全患者に使用するか、「安定期にHOTやNPPVについて話をしているか」とした。その結果、「症状が安定している時期に在宅酸素療法やNPPVについて話しをするか」についてあまりしていないが50%であった。「終末期の意思決定について症状が安定している時期から終末期の治療について患者の意思を確認しているか」についてあまりしていない33%、ときどきしている50%、何時もしている17%であった。「終末期の治療についてリビングウィルなどの書面で意思決定しているか」について全くしていない33%、あまりしていない50%、時々している17%であり、意思決定支援は、進んでいない現状があった。「終末期の症状緩和のゴールについて医療チームで話し合いをしているか」について「いつもしている」と答えた看護師は8%、医師は16%であり認識に違いがあることが示唆された。COPD患者が、安定した療養生活を長く維持するためには、看護師本人の能力だけではなく、看護実践環境の影響を明らかにし、早期に、薬物療法、運動、栄養・食事、酸素療法、心理的援助、社会資源調整などの教育指導が提供できる看護組織の構築が重要であると考えられる。COPD患者への看護介入において、個々の看護師の個人的資質が大きく影響するか、看護実践環境に起因するものかを明らかにすることを目的とし、看護実践環境に関しての調査票は、国際的に信頼性妥当性が証明された尺度であるThe Practice Environment Scale of the Nursing Work Index(以下PES-NWI)日本語版を使用する。また、個人の看護実践能力の自覚評価には、6-Dimention Scale of Nursing Performance(以下6D-Scale)日本語版を用いる。アンケート調査を行った。特定機能病院、慢性呼吸器疾患看護認定看護師の勤務する病院、慢性疾患看護専門看護師の勤務する病院の看護部長に研究計画書および、質問用紙、呼吸器疾患看護に携わる看護師数を含む研究協力依頼書を送付。研究協力の了承を得られた病院の看護部長に、質問用紙配布を依頼。慢性疾患看護専門看護師(サブスペシャリティ呼吸器疾患)慢性呼吸器疾患看護認定看護師に質問用紙を配布した。病態把握し管理とケアができる、スピリチュアルな問題理解解決のための援助ができる、呼吸リハビリテーションを実践できる、役割モデルを示し、看護職者への指導相談ができるについては、専門資格を有する看護師のほうがいつも、時々できていると自己評価する割合が高かった。専門資格の有無による慢性呼吸器疾患患者に対する、職場環境、看護実践能力について比較した結果、看護実践能力に差があった。

COPD患者への看護介入において、個々の看護師の個人的資質が大きく影響するか、看護実践環境に起因するものかを明らかにすることを目的とし、看護実践環境に関しての調査票は、国際的に信頼性妥当性が証明された尺度であるThe Practice Environment Scale of the Nursing Work Index(以下PES-NWI)日本語版を使用する。また、個人の看護実践能力の自覚評価には、6-Dimention Scale of Nursing Performance(以下6D-Scale)日本語版を用いる。アンケート調査を行った。特定機能病院、慢性呼吸器疾患看護認定看護師の勤務する病院、慢性疾患看護専門看護師の勤務する病院の看護部長に研究計画書および、質問用紙、呼吸器疾患看護に携わる看護師数を含む研究協力依頼書を送付したが、目標数に達していない。そのため、統計学的分析が途中のため遅れていると判断した。慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease;以下COPD)は、肺胞破壊、気道病変が緩やかに進行し、喀痰の過剰分泌や気道閉塞によって労作性呼吸困難を呈する不可逆性の疾患である。近年では、薬物療法、呼吸リハビリテーション、栄養療法などを組み合わせることにより、全体の5年生存率は、7080%に改善している。特に、リハビリテーションの実施は、呼吸困難の軽減、健康関連のQOLの向上、入院回数と入院日数の減少、COPDによる不安と抑うつの軽減に最も強く推奨される介入(エビデンスA)と位置づけられている。リハビリテーションの介入は、看護師が外来通院中の患者への意思決定支援を継続する患者教育の機会であると考えられる。しかし、「在宅呼吸器ケア白書」において意思決定支援が必要となる在宅酸素や人工呼吸器実施群で呼吸ハビリテーションの指導を受けた人は、66%にとどまった。そこで、研究計画を変更し、呼吸リハビリテーションの看護介入に影響している要因を看護実践環境に焦点を当て明らかにすることを目的とした。【研究方法】特定機能病院、慢性呼吸器疾患看護認定看護師、慢性疾患看護専門看護師の勤務する病院の呼吸器疾患看護に携わる看護師におこなった。調査票は、看護実践環境に関しての国際的に信頼性妥当性が証明された尺度であるThe Practice Environment Scale of the Nursing Work Index(PES-NWI)日本語版を使用した。【結果】呼吸器疾患患者の看護に携わる看護師312名より回答を得た。属性の「男女」と「呼吸器疾患や呼吸管理に関連した資格及び免許の有無」、看護実践環境の「医師と看護師は、仕事上の関係が良い」が「病態・症状に応じた呼吸リハビリテーションを実践できる」に関連があった。慢性呼吸不全を呈する患者や家族の緩和
日本式高専のモンゴル・マレーシアへの輸出と定着に関する研究

前年度から継続していた、日本国内高専の留学生へのアンケート調査の準備を踏まえ、国立高専機構の協力を得て、5月にアンケートの全国調査を実施した。その後、回収作業を行い、集計分析を行うと共に、モンゴル語版のアンケートを作成し、9ー10月にモンゴルでの現地調査及びアンケート調査を実施した。また海外調査では、高専輸出の実態を見るために、10月ー11月にベトナムハノイ校外のベトナム商工短大附属高専での現地調査を行った。この他、国内調査については、11月16日に都城高専でのモンゴルとの協力の実情に関する面接調査、9月には北九州高専で日本高専学会での招待発表を行った。この中では日本式高専の特徴として、高専の学習方式、進路、留学生から見る高専教育への評価、国際化への課題、高専教育への理解度や受容を通してみた高専の海外での通用性や課題について論述している。特に、実験や実習への評価が高い一方で、厳格な教育体制は多様な留学生に対して変容が求められていることが明らかになった。高専での高い評価も項目をアピールポイントとして、低い評価項目への対処を行っていくことが、高専の海外進出と国際的評価を得るために必要とされていることを具体例を挙げながら占めることができた。最終年度に実施予定であったマレーシア調査が、相手方の不手際で、連絡調整がスムーズに行われなかったこのため、最終年度内で調査予定が立てられず、次年度に繰り越すこととなった。但し、この結果、分析作業の時間も十分取ることができるため、この繰り越し時間を活用し、より十分な研究分析を行っていくこととした。但し、現在マレーシア側の担当者と調整中であり、6月中旬に調査を行う予定である。現在、マレーシア調査版のアンケートの作成作業に入っており、マレーシア側との連絡が取れ次第、モンゴルと同様の調査を実施する計画である。調査は、6月中旬を予定している。現地調査後に、これまでの集計データの整理分析をすすめ、その成果を学会や紀要等で研究論文等で公表していく予定である。本年度は当該研究プロジェクトの第1年度に当たり、調査資料の収集と共に、国内の高専調査研究として、東京の国立高専機構への調査、国内高専への訪問調査、マレーシアの日本式高専の準備教育プログラムへの訪問調査と調査協議を中心に行った。国内および海外で実施予定の調査について独立行政法人国立高等専門学校機構本部事務局との打ち合わせ、日本及びモンゴル、マレーシア、ベトナムへの高専の輸出状況について情報収集を行うと共に、日本の高専での教育カリキュラムの特色、国際展開としての国際交流、留学生受入、海外への輸出に関わる障壁などについて協議すると共に、今後の調査協力についての承諾を得た。高専への学校訪問調査では一校しか訪問できなかったが、本研究の第一段階としての高専の実情に関する資料収集と聞き取りを行った。高専の教育スピリット(ethos)の教育実態としては教師と生徒の距離の近さと専門教育における実技の重視、カリキュラムの構造としては高校教育を2年間で行う一方教養教育を精選している状況、人口減と地方の産業の変化による志願者の減少への対応と高専教育への適合性の選考方法について、留学生の準備教育と高専教育への評価と将来志望等についての情報を収集した。また、今後の調査への協力依頼も了解を得ることができた。INTEC教育カレッジ内にある「東方政策プログラム高等専門学校予備教育コース」を訪ね、学生の指導に当たっている先生方に教育内容や学生の特徴等について伺い、また質問紙調査の詳細について相談した。学生は日本語を全く分からないところからわずか2年間で日本での受講に耐えられるまで(文科省作成の試験に合格する必要がある)にレベルアップする必要があり、他の海外派遣の学生に比べてかなり過密なスケジュールで修学している。高専進学後はほとんどが大学への編入又は高専内の専攻科への進学という道をたどる。部局の副学府長、副研究院長に就任したため、殆ど毎週の会議の運営・参加をすることとなり海外調査が滞った。また、熊本地震とそれによる大学支援と親族への支援、避難所提供、併せて、家族内での親族の逝去に伴う介護、疾病、事故等により、十分な調査研究機関の確保が困難であった。本年度は研究プロジェクトの第2年度として以下の調査研究を行った。モンゴル現地調査は9月に実施した。〇高専リエゾンオフィス:目的と機能、モンゴルと日本との接続や調整に関する状況について聞き取り、モンゴル高専の世界展開構想とハブ機能への期待、モンゴルにおける高専の社会や産業への貢献と認知について情報収集した。○モンゴル国立科学技術大学付属工科大学高専技術カレッジ:国立大学付属の唯一の高専の運営方式やカリキュラム、学生受入、教育体制、教師教育体制について聞き取りを行い、日本の高専との学生交流、教師の研修制度などについても情報を得た。○新モンゴル高専:私立で最も設備的に整備されている高専で、モンゴルの高専に関する国内調査結果等の情報を得た。○モンゴル工業技術大学付属モンゴル高専:最も伝統のある高専であり、私立大学付属で施設設備が充実している状況について、日本の大学、高専との交流、母体である工業大学との関係、企業との関係について聞き取りを行った。高専の中で実施されているプロジェクト形式の研究推進部からも、高専の役割やその教育的機能についてもディスカッションを行った。○モンゴル科技大付属PIU高専留学プロジェクト:日本の高専に送り出すための、日本語教育、専門科目教育についての聞き取りを行った。特に、マレーシアと同じ機関であり、比較対象として学習特有の特徴についての情報収集を行った。

○モンゴル国立科技大付属高専技術カレッジ:日本語教育のレベルや日本語能力の確認を行った。国内高専調査については、米子高専と東京高専への訪問調査を行った。また同時に、高専学会への参加、高専機構本部でのアンケート調査等の協議打合せを行った。この他、高専研究者(熊本崇城大学)への聞き取り調査等を実施し、情報収集を行った。1月には高専連続国際シンポジウムで日本型高専教育の海外輸出について報告した。国内の高専への調査受入が厳しく、時間を要した。高専研究者のつてを得て、9月はじめの高専学会への参加によって高専機構及び高専学会関係者の多くの協力者を得て、国内調査が軌道に乗り始めた。また、高専機構本部との協議でアンケート調査実施についての目処が立ち、次年度に調査を実施し、合わせて、海外版を作成し実施する予定である。海外調査については、既に、前年度までに協力依頼と了解を得ており、今後調査研究は進展すると考えている。前年度から継続していた、日本国内高専の留学生へのアンケート調査の準備を踏まえ、国立高専機構の協力を得て、5月にアンケートの全国調査を実施した。その後、回収作業を行い、集計分析を行うと共に、モンゴル語版のアンケートを作成し、9ー10月にモンゴルでの現地調査及びアンケート調査を実施した。また海外調査では、高専輸出の実態を見るために、10月ー11月にベトナムハノイ校外のベトナム商工短大附属高専での現地調査を行った。この他、国内調査については、11月16日に都城高専でのモンゴルとの協力の実情に関する面接調査、9月には北九州高専で日本高専学会での招待発表を行った。この中では日本式高専の特徴として、高専の学習方式、進路、留学生から見る高専教育への評価、国際化への課題、高専教育への理解度や受容を通してみた高専の海外での通用性や課題について論述している。特に、実験や実習への評価が高い一方で、厳格な教育体制は多様な留学生に対して変容が求められていることが明らかになった。高専での高い評価も項目をアピールポイントとして、低い評価項目への対処を行っていくことが、高専の海外進出と国際的評価を得るために必要とされていることを具体例を挙げながら占めることができた。最終年度に実施予定であったマレーシア調査が、相手方の不手際で、連絡調整がスムーズに行われなかったこのため、最終年度内で調査予定が立てられず、次年度に繰り越すこととなった。但し、この結果、分析作業の時間も十分取ることができるため、この繰り越し時間を活用し、より十分な研究分析を行っていくこととした。但し、現在マレーシア側の担当者と調整中であり、6月中旬に調査を行う予定である。今年度まで副研究院長の職にあるが、その他の障壁は回避できると考える。本年度の本格的な調査準備は既にはじめており、期間の確保に努め、調査遂行を優先させる様計画中である。アンケート調査と訪問調査を集中的に実施するために、次年度に調査経費を移しており、効率的に調査研究を進める予定である。
ユダヤ系アメリカ文学に於けるイスラエル表象と平和のレトリックの考察

ユダヤ系アメリカ文学におけるイスラエル表象および、ユダヤ系アメリカ人作家の作品特有の平和のレトリックを考察した。主にソール・ベローの作品に多くの時間を費やすことになった。研究成果としては、論文3本を執筆したことが挙げられる。最初の1本「ビリー・ローズ『記憶』を問う」については、発表した学会誌『Soundings』に於いてその年の優秀論文賞である刈田賞を受賞した。3本目に執筆した論文「鉛とシクラメン:『学生部長の十二月』における弱さの考察」で展開したテクスト分析に於いては、このテーマの考察を続ける中で、次の新たなテーマへと繋がるものとなった。平成26年度はユダヤ系アメリカ文学におけるイスラエル表象と平和のレトリックの研究を開始するにあたり、その土台作りを中心に行った。まずは資料を集めるところから始めた。特に刻々と進展するイスラエル・パレスチナ問題に関する資料、シオニズムの歴史と発展、そして戦争論、平和論に関する資料を重点的に集めた。資料集めと同時に、ユダヤ系アメリカ人作家の代表格であるソール・ベロー(Saul Bellow)の作品に於けるイスラエル表象を確認する上で、唯一のノンフィクションであるにもかかわらず、従来の研究では取り上げられることの殆ど無かったTo Jerusalem and Back(1976)の丹念な読み直しを行った。一方でホロコーストを扱ったベローの作品の中でも、従来の研究では充分論じられてこなかった後期の作品『ベラローザ・コネクション(The Bellarosa Connection)』(1989)を取り上げ、その分析を行った。『ベラローザ・コネクション』は、ベローのホロコーストを扱った代表作『サムラー氏の惑星(Mr. Sammler's Planet)』(1970)から19年後に書かれている。この作品に於いてベローは、ホロコーストの悲劇、特にその表象にまつわる問題点、特にホロコーストそのものを体験していないユダヤ系アメリカ人作家としてこの犯罪を如何に表象するか、というユダヤ系アメリカ人作家にとって重要な問題に対するベローなりの回答を示した。その回答の中で、ベローがホロコーストに軸足を置きながらも既にイスラエル・パレスチナ問題にも視線を向けていることが見受けられた。この点を拙論「ビリー・ローズ『記憶』を問う:The BellarosaConnection再読」にまとめた。現在は『サムラー氏の惑星』に於けるイスラエル表象を分析する研究を始めている。平成27年度は前年度に引き続き、ユダヤ系アメリカ文学に於けるイスラエル表象と平和のレトリックの研究に必要な資料を集めることを中心に行った。研究を進めるにつれて、特にヴィクトール・フランクル、エマニュエル・レヴィナス、ジュディス・バトラーといったユダヤ系思想家たちの論の中にホロコーストとパレスチナ・イスラエル問題をつなぐ視点、そして平和のレトリックを考えるのに有効な手掛かりがあることに気づいた。前半はフランクル関連のもの、後半はレヴィナスとバトラーの著作を読みすすめた。女性作家のシンシア・オジックの著作も研究の視野に入れつつも、昨年度から取り組んでいるソール・ベローの作品の分析も続けた。特に彼の習作と見なされ、代表作の影に隠れて充分論じられることの少なかった長編第2作目『犠牲者(The Victim)』(1947)に関する分析を論文にまとめた。この作品に見られる「他者」との遭遇による「主体性」の問い直しというテーマで「他者と出会う街ニューヨーク」という論文を書いた。現在は、ソール・ベローの初期短編"Leaving the Yellow House"ともう一人の研究対象であるシンシア・オジックの長編小説『プッターメッサー・ペイパーズ』の中に見え隠れするイスラエルのモチーフを探っており、それを次年度に続けて、論文にまとめたいと思っている。昨年度から継続してこの研究の基礎を成す作家のソール・ベローの作品を中心に論文を執筆しているため、今年度開始する予定であったシンシア・オジックの作品の分析がやや追いついていない状況であるが、徐々にどの観点で分析するかなど、研究と論文の骨組みは出来つつある。「ユダヤ系アメリカ文学に於けるイスラエル表象及び平和のレトリック」というテーマを考察していく中で、何度も立ち戻らなくてはならないのが、やはりユダヤ系文学に於けるホロコーストのテーマである。ソール・ベローの作品の初期の作品の中でとくにホロコーストのテーマが色濃く反映されているのが、第二次世界大戦終了から2年後に出版された『犠牲者』(1947)である。本研究に於いて多大な示唆を与えてくれるエマニュエル・レヴィナスの「他者」の概念と、その概念を独自に展開しているジュディス・バトラーの「応答」という二つの思想を主に援用しながら、「他者」というキーワードから作品分析を試みた。その試みは、ベロー作品に於けるニューヨークという特定のトポスの持つ意義をも再確認することになった。この論文の中では、作品の主人公が「他者」と出会うことにより、新たな「主体」、すなわち「倫理的な主体」を獲得するまでのプロセスが描かれていることを論じた。また、ベロー文学とは無関係に思われる「環境」という観点からベロー後期の作品『学生部長の12月』(1982)を分析した。この作品は、主に身体への具体的な「暴力」を巡る物語であり、「暴力」を巡る倫理的なテーマを、より宇宙的な規模で捉えた作品である。

この作品を、一見ベロー文学研究に於いて無関係に思われながら、度々作品の中で言及されるシカゴの「鉛公害問題」という観点から分析することによって、ベローが後期にかけて、伝統的な小説というスタイルからより新しい文学スタイルの構築を目指していたこと、またテーマに於いては、自身の内面よりも自分の「外」へと関心を広げていく手法をとるようになったことを確認した。「他者」と「環境」というキーワードは、今後「イスラエル表象と平和のレトリック」という観点で研究を進めていく上で重要なものになると思われる。当初の目的としては、ソール・ベローと二人の女性作家の作品分析を行う予定となっていたが、ベローの研究に思いの外時間がかかり、女性作家Cynthia OzickとGrace Paleyの作品分析には未だ至っていない。Cynthia Ozickについては、ある程度準備が整い始めているので、論文としてまとめたいと思っている。Paleyについては、特に環境保護の持つ「平和」のレトリックという観点から作品分析を行いたいと思っている。ベロー作品における「環境問題」を論じた研究を土台に、今度はPaleyの作品分析を行いたいと思う。「ユダヤ系アメリカ文学に於けるイスラエル表象と平和のレトリック」という課題を三人のユダヤ系アメリカ人作家Saul Bellow, Cynthia OzickそしてGrace Paleyに焦点を当てて考察してきた。この研究は、彼らの作品研究を通して、ユダヤ民族の一員でありながらも、イスラエルから遠く離れたアメリカからイスラエル問題を眺め、文学の中でこの問題と如何に格闘してきたか、その軌跡を確認すること、そしてユダヤ系アメリカ人作家だからこそ編み出される平和の提言を読み取ることを目標としてきた。最終年度はその前年度に引き続き主にOzickの作品に於けるイスラエル表象を論じる論文執筆の為の準備に時間をあてた。Ozickがホロコーストを文学作品に描く際に採用した「描かずして描く手法」を分析するために、彼女の長編小説The Puttermesser Papersの中で最もユダヤ色の薄い章に焦点をあてることに決め、その為にその章でOzickが言及するイギリス人作家George Eliotの作品も研究対象に含めることとなった。George Eliotの作品に目を配りながら、Ozick作品やエッセイも含めテクストの分析を行った。もう一人の研究対象であるPaleyについては、短編小説研究という方法で、Bellowの短編小説と比較することによってイスラエルを巡る表象と二人の作家それぞれの平和のレトリックを論じたいと考えており、その準備も開始した。現在、エルサレムを巡るイスラエルとアメリカの複雑な関係は、世界政治の中でも注目されている。このテーマの抱える現代性を改めて思うと共に政治ではなく、文学の、それもユダヤ系アメリカ文学の果たし得る役割について考察する意義を改めて確信した。ユダヤ系アメリカ文学におけるイスラエル表象および、ユダヤ系アメリカ人作家の作品特有の平和のレトリックを考察した。主にソール・ベローの作品に多くの時間を費やすことになった。研究成果としては、論文3本を執筆したことが挙げられる。最初の1本「ビリー・ローズ『記憶』を問う」については、発表した学会誌『Soundings』に於いてその年の優秀論文賞である刈田賞を受賞した。3本目に執筆した論文「鉛とシクラメン:
エンドセリンA受容体における複数のG蛋白質の活性化制御機構の解明

エンドセリンA受容体は,下垂体からの神経内分泌において重要な役割を担う受容体である。これまでの解析では,エンドセリンA受容体を介した神経内分泌には,Gq蛋白質の活性化を介する作用とGs蛋白質の活性化を介する作用が報告されていたが,その活性化の選択制御機構については不明である。そこで,ラット下垂体組織に着目しエンドセリンA受容体の情報伝達を解明すべく,まずエンドセリンA受容体の発現を解析したところ,C末端鎖のみの異なるスプライシング、アイソフォーム(C13)のクローニングに成功した(Mol.Endocrinol.掲載)。また今回得られたC13の配列は,ラットのみではなく,マウスやヒトのゲノムにおいても保存されていることが確認された。本アイソフォームの生化学的機能について解析した結果,従来報告されているエンドセリンA受容体と比較して,リガンド選択性には大きな違いがなかったにも関わらず,Gq蛋白質活性化における感受性が低下した。この結果より,エンドセリンA受容体のGq蛋白質の活性化に,受容体のC末端鎖が重要な役割を担うことが示唆された。そこで,C末端鎖の配列に着目したところ,従来報告のある受容体には,プロテインキナーゼCによるリン酸化部位が多く存在していることが明らかとなった。また,これらリン酸化部位は,全哺乳類のエンドセリンA受容体に保存されていた。そこで,エンドセリンA受容体によるGq蛋白質の活性化とプロテインキナーゼCとの相関についてPKC阻害剤を用いて解析したところ,Gq蛋白質の持続的な活性化は,プロテインキナーゼCの活性化により遮断されることが明らかとなった(日本薬学会第128年会報告)。本研究課題において,エンドセリンA受容体によるGq蛋白質の活性化により,プロテインキナーゼCの活性化が引き起こされることで,Gq蛋白質の活性化はフィードバック的に遮断され,他のG蛋白質への活性化へとスイッチすることが明らかとなった。
ラットHUSモデルにおける新たな治療法の検討

HUSは腸管出血性大腸菌によって産生排出されるベロ毒素がその病態形成に関与していることが想定されているが,どのように全身の炎症反応を惹起し,HUSを引き起こすかは多くの謎がある.その治療法を開発するにあたって,HUSモデルラットの開発は絶対に必要な過程であるため,前年度に引き続いて実際の臨床と比較してフィッティングの良いモデルの作成を主な目標とした.昨年度は,3回に分割してベロ毒素を腹腔内投与することによって急激な循環動態の変化を来さずにHUSを発症させられないか検討した.一回の注入量を0.1μg/kg, 0.2μg/kg, 0.3μg/kg, 0.5μg/kgの4群で検討した.群とも3日毎に一回注入量0.1μg, 0.2μg, 0.3μg, 0.5μgをそれぞれ注入し死亡率を算出した.死亡率としては0.2μg/kg×3回, 0.3μg/kg×3回の腹腔内投与が今後の治療法の検討を行う上で有用であると考えられた.採血結果の検討においては,2回目のベロ毒素投与後より死亡率の上昇が認められるため,3回目のベロ毒素投与後ではなく2回目のベロ毒素投与24時間後に採血を行った.0.1μg/kg群,0.2μg/kg群ともに有意な腎障害,LDHの上昇を認めなかった.0.3μg/kg群, 0.5μg/kg群では,有意な腎障害,LDHの上昇を認め,よりHUSのモデルに近いことが示唆された.組織学的な検討がまだなされていないので,更に組織学的な検討も行っていきたい.HUSモデルラットの作成が困難で,試行錯誤しながら作成努力を続けている.本年度もHUSモデルラットの作成を目標とし,臨床像とよくマッチしたモデルラットを早急に作成したい.HUS(溶血性尿毒症症候群)は,EHEC(腸管出血性大腸菌)感染によって産生されたベロ毒素による微小血管障害が病態と考えられている.ベロ毒素による微小血管障害は,微小血管障害そのものによる臓器障害だけでなく,血管内皮障害によって生じる高サイトカイン血症が病態をさらに悪化させている可能性がある.しかしベロ毒素がどのように炎症反応を惹起し,HUSを引き起こすかは多くの謎がある.またその治療法を開発するにあたって,HUSモデルラットの開発は絶対必要な過程であるため,本年度の研究としては,HUSモデルラットの作成を主な目標とした.HUSモデルラット作成のため,ベロ毒素2(from E.coli O-157, NAKARAI TESQUE, INC, Japan)を腹腔内に1μg/kg投与し生存率を検討した(n=20).5日間の生存率は20%であり,LDHの著増とBUN,クレアチニン値の上昇を認めたが,HUSの特徴である貧血と血小板減少を認めず,むしろ血液濃縮を示唆する所見であった.また,腎の顕微鏡的所見では,微小血管の血栓閉塞を認めたが,炎症細胞浸潤やアポトーシスは認めなかった.また,血中サイトカイン値もほとんどのラットで変化が見られなかった。以上より,HUSを発症しての死亡というよりもむしろベロ毒素2により全身血管から血管内容量の漏出が生じ,これによるショック,全身過凝固による血栓症によって死亡したものと考えられた.HUSモデルラット作成が困難であるため,いろいろ試行錯誤をしている.HUSは腸管出血性大腸菌によって産生排出されるベロ毒素がその病態形成に関与していることが想定されているが,どのように全身の炎症反応を惹起し,HUSを引き起こすかは多くの謎がある.その治療法を開発するにあたって,HUSモデルラットの開発は絶対に必要な過程であるため,前年度に引き続いて実際の臨床と比較してフィッティングの良いモデルの作成を主な目標とした.昨年度は,ベロ毒素2を腹腔内に1μg/kg投与し生存率を検討したが,生存率としては20%程度のモデルとなったが,血液検査にてHUSによる死亡というよりはむしろ全身の血管透過性上昇からショックをきたして死亡したと考えられる所見であった.本年は,1回の腹腔内投与ではなく,3回に分割してベロ毒素を腹腔内投与することによって急激な循環動態の変化を来さずにHUSを発症させられないか検討した.一回の注入量を0.1μg, 0.2μg, 0.5μgの3群で検討した.3群とも3日毎に一回注入量0.1μg, 0.2μg, 0.5μgをそれぞれ注入し死亡率を算出した.死亡率としては0.2μg×3回の腹腔内投与が臨床的であった.採血の結果がまだ取れていないので,今後は採血結果においてHUSの特徴である溶血性貧血,破砕赤血球,血小板減少,LDH高値,BUN上昇,クレアチニン値上昇などを確かめていき,組織学的な検討によってHUSの微小血管障害の存在を同定することでモデルとしてよいか検討したい.HUSモデルラットの作成が困難で,試行錯誤しながら作成努力を続けている.HUSは腸管出血性大腸菌によって産生排出されるベロ毒素がその病態形成に関与していることが想定されているが,どのように全身の炎症反応を惹起し,HUSを引き起こすかは多くの謎がある.

その治療法を開発するにあたって,HUSモデルラットの開発は絶対に必要な過程であるため,前年度に引き続いて実際の臨床と比較してフィッティングの良いモデルの作成を主な目標とした.昨年度は,3回に分割してベロ毒素を腹腔内投与することによって急激な循環動態の変化を来さずにHUSを発症させられないか検討した.一回の注入量を0.1μg/kg, 0.2μg/kg, 0.3μg/kg, 0.5μg/kgの4群で検討した.群とも3日毎に一回注入量0.1μg, 0.2μg, 0.3μg, 0.5μgをそれぞれ注入し死亡率を算出した.死亡率としては0.2μg/kg×3回, 0.3μg/kg×3回の腹腔内投与が今後の治療法の検討を行う上で有用であると考えられた.採血結果の検討においては,2回目のベロ毒素投与後より死亡率の上昇が認められるため,3回目のベロ毒素投与後ではなく2回目のベロ毒素投与24時間後に採血を行った.0.1μg/kg群,0.2μg/kg群ともに有意な腎障害,LDHの上昇を認めなかった.0.3μg/kg群, 0.5μg/kg群では,有意な腎障害,LDHの上昇を認め,よりHUSのモデルに近いことが示唆された.組織学的な検討がまだなされていないので,更に組織学的な検討も行っていきたい.HUSモデルラットの作成が困難で,試行錯誤しながら作成努力を続けている.本年度もHUSモデルラット作成を目標とし,臨床像とよくマッチしたモデルラットを早急に作成したい.本年度もHUSモデルラットの作成を目標とし,臨床像とよくマッチしたモデルラットを早急に作成したい.本年度もHUSモデルラットの作成を目標とし,臨床像とよくマッチしたモデルラットを早急に作成したい.HUSモデルラットの作成に難渋し,計画通り実験が進まなかった.予想よりもHUSモデルラットの作成に時間を要しており,治療法の検討まで進んでいないため,試薬,試験薬の投与まで到達していないため.今年度は,血液検査,組織検査等も予定があり,昨年度未使用であった額の使用を考えている.予想よりもHUSモデルラットの作成に時間を要しており,治療法の検討まで進んでいないため,試薬,試験薬の投与まで到達していないため.昨年度未使用であった額の使用を考えている.実験ペースを上げて取り組む予定.
膜電位イメージング法による三叉神経痛覚情報の大脳皮質感覚野への投射地図作成

これまでに大脳皮質感覚野での触覚から疼痛への移行過程を調べた研究は少ない。本研究では、フラビン蛋白蛍光イメージング法を麻酔したマウスに適用し、三叉神経支配領域を刺激し大脳皮質感覚野の興奮を空間的・時間的に検討した。上顎頬部に触刺激を与えた場合は外側尾側部に興奮部位が認められた。頬部の刺激によって興奮する部位はバレル野と呼ばれる部位に相当していた。下顎部の触刺激ではバレル野よりも吻側部に興奮が認められた。また、カプサイシンを皮膚に塗布した後は、触刺激に対して感覚野の興奮の増強と側抑制がみられた。これは大脳皮質感覚野において感覚の質が触覚から痛覚に変化したことを捉えているものと思われた。三叉神経の支配領域からの痛覚情報は三叉神経脊髄路核尾側亜核(Sp5c)から視床の腹側基底核群に到達し、さらに大脳皮質体性感覚野に到達することが組織学的および電気生理学的に調べられている。これらの経路の機能的役割や視床および大脳皮質での慢性疼痛への移行過程を詳細に調べた研究は少ない。本研究では、膜電位イメージング法を用い,in vivoラットあるいはマウスの脳内神経回路網における三叉神経から延髄三叉神経尾側亜核および大脳皮質感覚野の興奮伝播様式を空間的・時間的に解明し、慢性疼痛への移行過程を解明することを目的とした。これまでに我々は新生ラットの単離脳幹標本(in vitro)を用いて、三叉神経根の電気刺激後の脳幹背側部における興奮の伝播を膜電位イメージング法によって測定している。平成26年度はin vivo標本における膜電位イメージング法の手技、測定法を確立することを目的とした。当初は、実験動物として幼若ラットを用いる予定であった。しかしながら、脳幹背側部を露出する手術には、成マウスの方が適していたため、麻酔した成マウスを用いた。脳幹背側部を露出し、膜電位感受性色素(RH1691)を含む人工脳脊髄液(aCSF)を露出部に満たし染色を行った。その後、aCSFで洗浄し、MICAMシステムにおいて計測を行った。上顎前歯髄あるいは頬部皮膚の電気刺激によるSp5cの興奮部位を調べた。その結果、上顎前歯髄の刺激では、Sp5cの吻側正中部が興奮し、頬部の刺激ではSp5cの尾側外側部が興奮することが明らかとなった。この部位は、これまでに報告されている部位よりも正中に位置しているため、さらなる検討が必要と考えられた。平成27年度はウレタンで麻酔したマウスを用い顔面に電気刺激を与えた時の大脳皮質感覚野の興奮部位を膜電位イメージング法によって測定した。一側の大脳皮質感覚野を露出した後、膜電位感受性色素(RH1691)を含む人工脳脊髄液(aCSF)を露出部に満たし約30分間染色を行った。双極電極を顔面皮膚に当て電気刺激を行い、蛍光の変化する部位を観察した。その結果、顔面吻側部を刺激した場合は大脳皮質の外側吻側部に、頬部を刺激した場合は外側尾側部に興奮部位が認められた。しかしながら、未だ安定した記録ができていないため、興奮の空間的時間的変化の解析は十分といえない。実験動物の選定および手術法の確立に手間取ったため、やや遅れている。また、結果の再現性が不安定である。その原因を調べる必要がある。本研究では、膜電位イメージング法を用い,in vivoマウスの脳内神経回路網における三叉神経から延髄三叉神経尾側亜核および大脳皮質感覚野の興奮伝播様式を空間的・時間的に解明し、慢性疼痛への移行過程を解明することを目的とした。平成2627年度はウレタンで麻酔したマウスを用い顔面に電気刺激を与えた時の脳幹背側部および大脳皮質感覚野の興奮部位を膜電位イメージング法によって測定した。当初は膜電位感受性色素(RH1691)を用いた。

しかしながら、膜電位感受性色素を適用するには脳表面をきれいに露出する必要があるため、開頭、硬膜切除、脳表面露出、染色、記録まで行うことは困難を極め、十分に解析できるデータは得られなかった。平成28年度は脳活動に伴う内因性蛍光タンパク(フラビンタンパク)の変化を捉える方法に変更した。これにより、頭皮を剥離するだけで頭蓋骨越しに大脳皮質の興奮部位を容易に記録することに成功した。頬部に触刺激を与えた場合は外側尾側部に興奮部位が認められた。頬部の刺激によって興奮する部位はバレル野と呼ばれる部位に相当していた。耳介の触刺激ではバレル野よりもやや内側尾側部、足底部の触刺激では内側部に興奮が認められた。また、カプサイシンを皮膚に塗布した後は、触刺激に対して感覚野の興奮の増強と側抑制がみられた。これは大脳皮質感覚野において感覚の質が触覚から痛覚に変化したことを捉えている可能性が示唆された。これまでに大脳皮質感覚野での触覚から疼痛への移行過程を調べた研究は少ない。本研究では、フラビン蛋白蛍光イメージング法を麻酔したマウスに適用し、三叉神経支配領域を刺激し大脳皮質感覚野の興奮を空間的・時間的に検討した。上顎頬部に触刺激を与えた場合は外側尾側部に興奮部位が認められた。下顎部の触刺激ではバレル野よりも吻側部に興奮が認められた。これは大脳皮質感覚野において感覚の質が触覚から痛覚に変化したことを捉えているものと思われた。実験動物の選定および手術法の確立に手間取ったため、やや遅れている。また、結果の再現性が不安定である。その原因を調べる必要がある。1顔面および口腔内の電気刺激を行い大脳皮質感覚野の膜電位変化を計測し、刺激部位と大脳皮質感覚野内投射部位の対応地図を作成する。2前もって顔面皮膚にカプサイシンを注入し、顔面慢性疼痛モデルマウスを作成する。顔面への電気刺激を与えた場合の大脳皮質感覚野の応答をコントロール動物と比較検討する。神経科学1先行研究で行われている電気生理学的手法を併用して、得られたデータの正当性を検討する。2顔面および口腔内の電気刺激を行い大脳皮質感覚野の膜電位変化を計測し、刺激部位と大脳皮質感覚野内投射部位の対応地図を作成する。この実験においても手術手技の確立を目指す。実験動物をラットからマウスに変更したため、動物購入費が予定より少なかったため。当大学で飼育しているマウスを実験に使用したため、実験動物(ラット)の購入費が予定よりも少なかったため。膜電位感受性色素(RH1691)の購入に充てる。実験動物(ラット)の購入に充てる。
高脂溶性含フッ素有機リチウム塩を用いた新規リチウム電池電解質溶液の開発研究

本研究は高出力高エネルギー密度を有する新規リチウム電池の開発を目的とした基礎研究であり、リチウム電池電解質として用いる含フッ素有機リチウム塩の分子設計と実用化のための電池物性評価に関して二年間に次のような研究を行なった。1)リチウム電池電解質として用いる多フッ化アルキルスルホニル基置換リチウムアミド、多フッ化アルキルスルホニル基置換リチウムメチド、および多フッ化アルキル基置換テトラフェニエルホウ酸リチウム塩について、鎖長および構造が異なる種々の多フッ化アルキル基を有する誘導体の合成経路を開発した。特に多フッ化アルキル基置換アルコールとイミドビススルフリルクロリドから容易に得られるまったく新しいタイプの多フッ化アルコキシスルホニル基置換アミドリチウム塩とその高分子誘導体の簡便合成法を開発した。2)伝導度実験の結果、対アニオンの構造がリチウムイオンの解難度に大きな影響を与えることが明らかとなった。3)多フッ化アルキル基の鎖長および構造が異なるとアニオン種の耐酸化性の指標である最高被占軌道(HOMO)エネルギー準位が大きく変化することが明らかとなった。リチウム電池電解質のイオン伝導度に直接影響を与えるアニオン種の表面積、イオン半径、脂溶性、耐酸性耐酸化性等の分子物性値を計算化学的に算出すると共に、含フッ素有機リチウム塩について、種々の有機溶媒中での溶解度やイオン伝導度および電気化学的条件下での耐酸性耐酸化性を実験的に求め、高いイオン伝導度を発現するために必要な含フッ素有機アニオン種の構造因子を定量的に解析した。4)種々の電解質溶液と活物質とを組み合わせたリチウム電池特性試験を行い、高い安全性とエネルギー特性を兼ね備えた新しいリチウム電池の開発を現在行っている。また含フッ素有機リチウム塩の合成を工業規模で行うための大量合成経路を開発した。本研究は高出力高エネルギー密度を有する新規リチウム電池の開発を目的とした基礎研究であり、リチウム電池電解質として用いる含フッ素有機リチウム塩の分子設計と実用化のための電池物性評価に関して本年度は次のような研究を行なった。1.リチウム電池電解質として用いる多フッ化アルキルスルホニル基置換リチウムイミド、多フッ化アルキルスルホニル基置換リチウムメチド、および多フッ化アルキル基置換テトラフェニルホウ酸リチウムについて、鎖長および構造が異なる種々の多フッ化アルキル基を有する誘導体の合成経路を開発した。2.リチウム電池電解質に要求される条件のうち伝導度について実験検討した結果、リチウム塩の対アニオンの構造がリチウムイオンの解離度に大きな影響を与えることが明らかとなった。特に多フッ化アルキル基置換テトラフェニルホウ酸リチウムについては、分子量が相対的に大きいにもかかわらず現在実用化されているリチウムトリフラート塩よりも高い伝導度が得られた。3.半経験的分子軌道法を用いて種々の含フッ素有機アニオン種の軌道エネルギーを計算した結果、多フッ化アルキル基の鎖長および構造が異なるとアニオン種の耐酸化性の指標である最高被占軌道の軌道エネルギーが大きく変化することが明らかとなった。これらの結果は第183回電気化学国際会議(1993年5月ハワイ)、電池技術委員会第267会委員会(同10月東京)、電気化学討論会(同10月福岡)、第18回フッ素化学討論会(同10月横浜)、および第67日化春季年会(1994年3月東京)において講演しプロシーディングとして発表した。本研究は高出力高エネルギー密度を有する新規リチウム電池の開発を目的とした基礎研究であり、電解質として用いる含フッ素有機リチウム塩の分子設計と実用化のための物性評価に関して本年度は次のような研究を行なった。1)前年度に引き続き有機リチウム塩として、多フッ化アルキルスルホニル基置換アミドリチウム塩、多フッ化アルキルスルホニル基置換

メチドリチウム塩、および多フッ化アルキル基置換テトラフェニルホウ酸リチウム塩について、鎖長および構造が異なる種々の多フッ化アルキル基を有する誘導体の合成経路を開発した。特に多フッ化アルキル基置換アルコールとイミドビススルフリルクロリドから容易に得られる新しいタイプの多フッ化アルコキシスルホニル基置換アミドリチウム塩とその高分子誘導体の簡便合成法を開発した。2)リチウム電池電解質のイオン伝導度に直接影響を与えるこれらの化合物の表面積、イオン半径、脂溶性、耐酸性耐酸化性等の分子物性値を分子軌道法を用いて計算化学的に算出すると共に、実際に合成した含フッ素有機リチウム塩について、種々の有機溶媒中での溶解度やイオン伝導度および電気化学的条件化での耐酸性耐酸化性を実験的に求め、高いイオン伝導度を発現するために必要な含フッ素有機アニオン種の構造因子を定量的に解析した。3)これらの基礎的研究成果を踏まえて、高い耐酸化性と伝導度を兼ね備えた新しいリチウム電池電解質溶液および高分子誘導体を開発した。また含フッ素有機リチウム塩の合成を工業規模で行うための大量合成経路を開発した。4)これらの結果はフッ素化学岡山シンポジウム(1994年7月岡山)、第12回国際フッ素化学会議(1994年8月横浜)、第12回基礎有機化学連合討論会(同年10月福岡)、若手研究者のための有機化学セミナー(同年11月北九州)、第69回日化春季年会(1995年3月京都)、および電気化学会(1995年4月)において発表し、一部はプロシ-ディングおよび日本化学会欧文速報誌に発表した。現在研究成果をまとめた総合論文を準備中である。
不良新生鎖に提示される分解シグナルの解明

これまで、リボソーム品質管理(RQC)においてユビキチン化された不良新生鎖の引き抜きを実行するCdc48-Ufd1-Npl4複合体のユビキチン結合コファクターNpl4がLys48結合型ユビキチン鎖に選択性をもつこと、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体によるユビキチン化基質の引き抜き活性がユビキチン化反応を終結させるというモデルを示してきた。本年度は東京大学定量生物学研究所の深井博士と共同でNpl4とLys48結合型ユビキチン鎖との結晶構造解析に成功したため、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体の生化学解析を精力的に実施した。まず、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体の試験管内再構築系により、Npl4のZFドメインがCdc48との相互作用に重要であること、Ufd1はNpl4を介してCdc48と複合体を形成すること、Npl4はUfd1存在下でCdc48との相互作用が増強することを見出した。また、同複合体のユビキチン鎖認識機構を解析したところ、Npl4のみがユビキチン鎖結合能をもつこと、構造解析より見出された新規のユビキチン結合ドメインの変異によりユビキチン鎖結合能が喪失することを明らかにした。次いで、ユビキチン化基質としてGFPに様々な長さのLys48結合型ユビキチン鎖を付加したものを調製し、同複合体の機能解析に供した。その結果、6-mer以上の鎖長をもつユビキチン化GFPを基質としたときに、Cdc48のATPase活性が検出され、複合体形成やユビキチン結合能を喪失させたNpl4変異体ではATPase活性が減弱した。さらに、酵母を用いた解析より、NPL4の各変異体中でユビキチン化基質の蓄積が観察された。これらの結果より、RQC機構の中核となるCdc48-Ufd1-Npl4複合体のユビキチン鎖認識機構の解明に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。翻訳に失敗した不良新生鎖はリボソーム品質管理(RQC)複合体とプロテアソームの連携により迅速に分解除去されるが、不良新生鎖がどのような様式でユビキチン化されるのか、そしてどのような機構によりプロテアソーム分解が保障されているのか不明である。本研究では、最も解析が進んでいる酵母を用いて、不良新生鎖に付加されるユビキチン修飾の定量解析(ユビキチン化サイト・鎖タイプ・鎖長)および試験管内におけるプロテアソーム分解再構築により、ユビキチン化による不良新生鎖のフォールディング阻害、ユビキチン選択的シャペロンCdc48/p97複合体やシャトル分子Rad23によるプロテアソームへの基質運搬など不良新生鎖を効率的に分解するための機構を明らかにすることを目的とする。平成29年度は、翻訳アレストを引き起こすモデル基質FLAG-GFP-non stopおよびFLAG-GFP-R20rareの質量分析解析により、ユビキチン化サイトが複数あること、K48連結型ユビキチン鎖が付加されることを見出した。また、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体がユビキチン化基質の鎖長制御に関与することを見出し、不良新生鎖のリボソームからの引き抜きがユビキチン鎖長により制御される可能性が示唆された。一方、試験管内においてGFP基質を効率良くユビキチン化する系を確立し、GFP基質の解きほぐしとプロテアソームによる分解をモニターする新しい実験系を作出した。GFP基質は非構造領域をもつテイルを付加することでプロテアソーム分解が促進するが、テイルが無い場合分解されない。本再構築系は、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体による解きほぐし活性の検出とポリリジンやCATテイルなどが分解効率に与える影響を解析することが可能であるため、次年度以降、それらを精査する。(1)ユビキチン修飾の質量分析解析:翻訳アレストを引き起こすモデル基質FLAG-GFP-non stopおよびFLAG-GFP-R20rareを酵母に発現させ、プロテアソーム阻害剤処理後、坑FLAG抗体によりアフィニティー精製した。次いで、トリプシン消化後、質量分析計で解析することでユビキチン化サイトおよびユビキチン鎖の種類を解析した。その結果、複数のユビキチン化サイトが同定されると共に、C末端領域のCATテイル付加が検出された。また、Ub-AQUA/PRM法によりユビキチン鎖を絶対定量したところK48鎖が主要であったことから、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体はK48鎖を認識することが細胞内の実験より明確となった。(2)Cdc48-Ufd1-Npl4複合体によるユビキチン鎖長制御:ユビキチン鎖長解析法(Ub-ProT法)を用いて、Cdc48複合体の変異体中で蓄積するユビキチン化基質の鎖長を解析した。その結果、cdc48-3変異体とnpl4-1変異体において、ユビキチン鎖が劇的に伸長していた。他のCdc48結合コファクター(SHP1、UFD2、UFD3、OTU1)の欠損株では野生型とほぼ同等の鎖長であったことから、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体によるユビキチン化基質の引き抜き活性はユビキチン化反応を終結させるというモデルを提唱した(Tsuchiya et al, Nat Commun, 2018)。

(3)試験管内再構築実験:モデル基質Ub-GFP-tailをgp78-E2融合リガーゼによりユビキチン化し、プロテアソーム精製標品による分解を試みた。その結果、非構造のtailを有する場合はプロテアソーム依存的な分解が観察された。今後、Cdc48-Ufd1-Npl4依存的な解きほぐし活性とシャトル分子RAD23依存性について検討する。これまで、リボソーム品質管理(RQC)においてユビキチン化された不良新生鎖の引き抜きを実行するCdc48-Ufd1-Npl4複合体のユビキチン結合コファクターNpl4がLys48結合型ユビキチン鎖に選択性をもつこと、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体によるユビキチン化基質の引き抜き活性がユビキチン化反応を終結させるというモデルを示してきた。本年度は東京大学定量生物学研究所の深井博士と共同でNpl4とLys48結合型ユビキチン鎖との結晶構造解析に成功したため、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体の生化学解析を精力的に実施した。まず、Cdc48-Ufd1-Npl4複合体の試験管内再構築系により、Npl4のZFドメインがCdc48との相互作用に重要であること、Ufd1はNpl4を介してCdc48と複合体を形成すること、Npl4はUfd1存在下でCdc48との相互作用が増強することを見出した。また、同複合体のユビキチン鎖認識機構を解析したところ、Npl4のみがユビキチン鎖結合能をもつこと、構造解析より見出された新規のユビキチン結合ドメインの変異によりユビキチン鎖結合能が喪失することを明らかにした。次いで、ユビキチン化基質としてGFPに様々な長さのLys48結合型ユビキチン鎖を付加したものを調製し、同複合体の機能解析に供した。その結果、6-mer以上の鎖長をもつユビキチン化GFPを基質としたときに、Cdc48のATPase活性が検出され、複合体形成やユビキチン結合能を喪失させたNpl4変異体ではATPase活性が減弱した。さらに、酵母を用いた解析より、NPL4の各変異体中でユビキチン化基質の蓄積が観察された。これらの結果より、RQC機構の中核となるCdc48-Ufd1-Npl4複合体のユビキチン鎖認識機構の解明に成功した。平成30年度も引き続き不良新生鎖のユビキチン修飾を解析し、さらに試験管内における不良新生鎖分解の再構築系を作出する。(2)デコーダー分子の解析:不良新生鎖はリボソーム上でユビキチン化された後、ユビキチン選択的シャペロンCdc48/p97により引きずり出され、プロテアソームにより分解されるが、詳細な機構は不明である。本研究者はCdc48の下流でシャトル分子Rad23、Dsk2がプロテアソームへの基質運搬に重要な機能を果たしていることを見出しているため、Rad23とDsk2の欠損株を用いて不良新生鎖の安定性を解析する。(3)試験管内再構築実験:平成29年度にユビキチンGFPのプロテアソーム分解再構築系を確立したので、Cdc48-Ufd1-Npl4やRad23をさらに添加することで、基質分解速度やGFPの解きほぐしが亢進するか解析する。次いで、ポリリジン配列やポリアルギニン配列、CATテイルを付加した基質タンパク質を作製し、プロテアソーム分解に対する影響を解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。