hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FOXO転写因子による血管新生の制御メカニズム

血管が正常に発生するために必要なタンパクであるFoxo1の機能について胚性幹細胞の培養を用いて解析した。Foxo1が血管内皮細胞の「かたち」を調節し、さらに血管内皮細胞と血管平滑筋細胞の接着を促すことによって血管を正常に発生させることを明らかにした。Foxo1は他の遺伝子の発現を制御するタンパクであるが、どの遺伝子を制御することが血管の発生に必要であるのか探索を行い、その候補となる遺伝子を同定した。血管新生は血管内皮細胞において多くの細胞生物学的プロセスが協調的に作用することにより進行する。しかし、そのような細胞生物学的プロセスを調節する分子的メカニズムは明らかにされていない。本研究は、血管新生に必須の分子であるFoxo1転写因子の機能を明らかにすることにより、血管新生の細胞生物学的調節機構の解明を目指す。これまで、マウスES細胞から分化誘導した血管内皮細胞をOP9ストロマ細胞と共培養することにより得られる内皮細胞平板様コロニーの解析から、内皮細胞のVEGF依存的細胞伸長にFoxo1転写因子が必須であることを報告した。そこで本年度は、ES細胞から分化誘導した血管前駆細胞を1型コラーゲンゲル内で3次元培養して得られる血管様構造の解析を行い、内皮細胞の伸長と血管様構造の形成にFoxo1が必要であることを明らかにした。この血管新生モデルではストロマ細胞が介在しないため、細胞骨格の詳細な観察や阻害剤を用いた解析等が可能である。Foxo1欠損内皮細胞はアクチン細胞骨格系には顕著な異常を示さないが、微小管ネットワークの構築に異常があることを見いだした。さらに、Foxo1欠損細胞による血管様構造では内皮細胞と平滑筋細胞の会合が障害されていることを見いだした。Foxo1は微小管ネットワーク構築と血管内皮・平滑筋細胞相互作用を調節することにより血管新生を制御する可能性が示唆される。遺伝子発現レスキュー実験により、FoxoメンバーであるFoxo3はFoxo1欠損内皮細胞の異常形質をレスキューできないことを見いだした。このFoxo1とFoxo3の機能的差異を利用して、DNAマイクロアレイにより、内皮細胞の形態調節に特異的に関与するFoxo1標的遺伝子の探索を行い、幾つかの候補遺伝子を得た。今後、それら候補遺伝子の内皮細胞における発現と機能について解析を進める予定である。昨年度は、ES細胞から分化誘導した血管前駆細胞をI型コラーゲンゲル内で3次元培養して得られる血管様構造の解析を行い、VEGFに依存した内皮細胞の伸長作用と血管様構造の形成にFoxo1が必要であることを報告した。本年度は、内皮細胞の形態調節に関与するFoxo1標的遺伝子の探索を行うために、野生型内皮細胞およびFoxo1欠損内皮細胞、Foxo1もしくはFoxo3を強制発現させた内皮細胞における遺伝子発現プロファイルを、DNAマイクロアレイを用いて作成した。遺伝子発現誘導により血管内皮細胞の形態調節異常をレスキューする実験系を確立し、候補遺伝子のスクリーニングを継続的に進めている。血管内皮細胞特異的に遺伝子発現を誘導できるプロモーター・エンハンサーは内皮細胞の分化過程を特異的に操作するために有用なツールである。血管内皮細胞に特異的であると報告されているMef2cエンハンサー(F10-44)のES細胞分化系における活性について検討したところ、初期の血管前駆細胞から血管内皮細胞にいたる分化過程でF10-44がエンハンサー活性を有することを明らかにした。F10-44を利用したタイムラプス解析により、(1)中胚葉における血管前駆細胞の発生、(2)血管前駆細胞から内皮細胞への分化決定、(3)内皮細胞の運動と接着による血管新生、までの一連の過程を試験管内で観察する実験系を確立した。この実験系を用いて、ES細胞からの血管様構造の形成過程を詳細に解析する予定である。本研究は、血管新生に必須の分子であるFoxo転写因子の機能を明らかにすることにより血管新生の細胞生物学的調節機構を解明することを目的として、特にFoxo1が血管内皮細胞のVEGF依存的伸長反応を調節する分子メカニズムについて解析を行ってきた。本年度は、Foxo1による細胞形態調節の責任遺伝子の同定を試み、候補遺伝子の血管内皮細胞における機能について解析した。野生型又はFoxo1欠損型のES細胞から分化誘導した血管内皮細胞について、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現の網羅的解析を行った。その結果、野生型に比べてFoxo1欠損型で発現が減少する遺伝子を31個、増加する遺伝子を36個同定した。また、VEGFの添加による遺伝子発現の変動を野生型とFoxo

1欠損型で比較したところ、VEGFを添加した野生型だけで増加する遺伝子を21個、減少する遺伝子を54個同定した。次に、Foxo1欠損型で減少した候補遺伝子の中から心血管系細胞の機能調節への関与が報告されているものを選択し、Foxo1欠損ES細胞に強制発現させて、血管内皮細胞の伸長機能が回復するかどうかを検討した。これまで導入した17種類の候補遺伝子のうち、ある種のプロテインホスファターゼ結合因子の遺伝子を導入したFoxo1欠損細胞で伸長機能の回復が認められた。この因子は、ミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCP)を調節することが報告されており、MLCPは血管平滑筋等において細胞運動や形態変化の制御に関与することが知られている。今後、この因子の発現を誘導的に調節するFoxo1欠損ES細胞を作製し、血管内皮細胞の細胞伸長における機能について詳細に検討する予定である。
ジャスモン酸シグナル伝達経路に関するhebiba突然変異体のマップベース・クローニング

光によってジャスモン酸合成が誘導されないhebiba突然変異体の原因遺伝子をマップベースクローニングで同定するために、hebibaとカサラスを交配し、F1のセルフによってF2集団を得た。突然変異体の選抜には、赤色光下で芽生えさせると野生型は伸長が抑えられるが突然変異体では伸長抑制が見られないと云う表現型を用いた。この表現型は、hebibaとカサラスを交配して得たF2集団でも、3:1に分離した。そこで、F2種子を赤色光下で発芽させてhebibaの表現型(幼葉鞘が長い)を示す個体を選抜し、それらからDNAを調製してSSRマーカーを用いて候補領域の絞り込みを行った。その結果、候補領域は、第3染色体の短腕に存在するRM5488(87 cM)とRM6266(84.4 cM)との間にまで絞り込めたが、その内側のSSRマーカーでは、PCRによる増幅そのものが認められなかった。そこで、大規模な欠失による突然変異と予想して解析を進め、欠失領域が少なくとも150kbに及ぶことを明らかにした。さらにその領域に、候補遺伝子として、AOC遺伝子を同定した。これを証明するために、hebibaの親品種であるニホンマサリからAOC遺伝子をクローニングし、hebibaに導入して相補実験を実施中である。前年度から継続して、STSマーカーを用いてhebiba突然変異の候補領域の絞り込みを行った。まず、CAPSマーカーのR440(88.7-89.2cM)とC136(115.6cM)が、変異部位を挟んでいることを確認した後、これらのマーカーの内側で組換えを起こしている個体(すなわち、いずれかのマーカーの遺伝子型がヘテロの個体)を選抜した。それらの個体を用いてさらに内側のPCRマーカーで遺伝子型を調べ、組換えを起こしている個体を選抜するという操作を繰り返して、RM15422とRM15424との間、約110kb、BAC clone2本分まで絞り込んだ。その後は、まだ組換え体が存在するにもかかわらず、それ以上の絞り込みが出来なかったので、候補領域に存在する予測遺伝子の発現を調べた。主な予測遺伝子は6個存在したので、プライマーを設計してRT-PCRで増幅したところ、いずれの遺伝子もhebiba突然変異体と対照とで同様に増幅した。この時点で、素直に解釈すればhebiba突然変異が点突然変異であることになるが、γ線照射で得られた突然変異体であることや強い表現型を示すことから、表現型による選抜の過程でホモ以外の遺伝子型の個体が混じっていて絞り込みを混乱させた可能性も考えられた。そこで、もう一度原点に立ち戻り、完全な変異体の表現型を示すF2個体からDNAを調製してラフマッピングをやり直すと、候補領域が少しテロメア側にずれていることが分かった。新たな候補領域に存在するマーカーを用いてマッピングを行ったところ、hebiba突然変異体では、大きな欠失が起こっていることが分かった。現在、欠失した領域の特定を行うと共に、そこに存在する予測遺伝子から候補となる遺伝子を検索中である。今後は検索された候補遺伝子を用いて相補実験を行う予定である。
中山間地域における滞在型レクリエーションのニーズと振興策

本研究の目的は、都市住民の中山間地域の農山村を舞台とした滞在型レクリエーション(=グリーンツーリズム)へのニーズに応えるとともに、中山間地域の活性化、およびそれを通じた農山村地域の環境保全を図るために、中山間地域の地域資源(自然、歴史文化、人材)をトータルに演出して観光資源として活用する方策を検討することである。最終年度である本年度は、中山間地域の滞在型レクリエーションの成功事例を比較検討し、その成功要因とともに、地域資源の観光資源としての生かし方のノウハウを探った。その結果、多くの事例は行政主導型であるが、その後の成功の如何は、主として地域住民の主体的参加および地域外の常連客(リピーター)づくりをいかに実現するかにかかっていること、その意味で、観光資源づくりの技術的なノウハウよりは、行政による住民のモチベーションの引き出し方、そして行政と住民の連携による受け入れ体制作りが重要であることが明らかになった。また、各種の施設づくり(宿泊施設、交流体験施設、直売所、農産物加工施設、飲食施設、地域の自然・歴史文化の展示施設等)やふるさと体験ツアーなどは、企画・計画策定段階から地域住民の参画を求めることによって、住民の参加意欲を引き出すことができるので、滞在型レクリエーションの受け入れ体制づくりの手段としても有効であることがわかった。さらに、持続的な滞在型レクリエーションを成立させるためには、宿泊、飲食、体験インストラクションなどについて、地域内の有機的な分業体制を敷くことが重要であることもわかり、成功事例の地域も含めて、今後の課題と言える。本研究の目的は、都市住民の新しい観光レクリエーションのニーズに応えるとともに、中山間地域の活性化を図るために、中山間地域の自然・歴史・文化をトータルに演出して観光資源として活用する方策を検討することである。本年度は、第一に、既存の文献・統計の収集、および既存の観光レクリエーション地(岩手県安比高原)の滞在客へのアンケート調査を通じて、滞在型レクリエーションの需要の質と量を検討した。その結果、大都市の3時間圏内を除くと、中山間地域への訪問は、季節的には5月の連休、7、8月の夏休み、9、10月の連休、および正月休みに集中し、滞在日数もせいぜい2泊3日まであること、自然観察、森の散策、川での釣りや水遊び、ホタル狩り、星空観察、牧場体験などへの関心が高いにもかかわらず、地元の受け入れ体制が不十分なため、実際の体験は予め組まれたプログラムに参加する場合など、少数に限られることがわかった。第二に、文献と現地調査によって先進事例の取り組みを分析した結果、自然や歴史・文化の見せ方、景観の維持、行政と地元住民の連携体制などに独自の工夫があること、また、具体的な事業に取りかかる前に、開発の理念や方法について関係者の共通認識を十分に深めておくことが重要なことが明らかになった。その反面、施設の維持管理やソフト事業の継続に課題があることもわかった。
ヒトのブラキエーション動作の運動学的・筋電図学的分析

ヒトは地上での二足歩行に適応した身体構造・機能を有するが、雲梯などに上肢で懸垂して前進するブラキエーションのようなロコモーションを行うこともできる。二足歩行とブラキエーションのように様式の異なるロコモーション間で体幹・体肢の働きを比較することで、ロコモーション全般における推進や姿勢調節の機序の一端が明らかになるのではないかと考える。本研究は、懸垂型移動行動であるブラキエーション時および二足歩行時の体幹・体肢の働きを、運動学的および筋電図学的手法によって比較分析し、ヒトの移動運動全般における姿勢調節に体幹・体肢が果たす役割を明らかにすることを目的とする。実験室内に設置した雲梯を支持基体として、ヒトのブラキエーション時の体肢運動と体幹、下肢筋活動の計測を行った。ブラキエーション動作時における脊柱起立筋の活動は、同側手での片手支持期に増し、両手支持期に減るといったphasicな活動を示し、片手支持期に体幹傾斜を引き止めて体幹姿勢を保持し、体肢の振り出しに備えていることが示唆された。下肢運動については現在分析中であるが、上肢のみで身体を支持して前進するブラキエーション動作においても、下肢運動は活発に生じており、推進や姿勢の安定に関与することが推測される。ヒトが日常的に行わないロコモーションにおいても移動が円滑になされるように、体幹や下肢は外力に応じて適切に姿勢安定と推進を補助するように活動するという可能性が考えられる。ブラキエーション動作時の筋電図と三次元運動の同時計測を、健常成人に加えて、被験者数は少ないが体操教室に通う懸垂動作に慣れた子どもにおいても行い、データを取得することができた。次年度は、追加のデータ収集を行うとともに、前年度までに計測した筋電図学的データと運動学的データの対応づけに注力する。ブラキエーション時と歩行時のデータを比較し、ブラキエーション時における体幹・下肢の筋活動パターンの特徴を分析する。ヒトは地上を二足歩行で位置移動する動物であり、その身体構造・機能は二足歩行に適応しているが、雲梯などに上肢で懸垂して前進するブラキエーションのような移動運動も行うことができる。二足歩行とブラキエーションのような様式の異なる移動運動間で体幹・体肢の働きを比較することで、移動運動全般における推進や姿勢調節の機序の一端が明らかになると考えられる。今年度は、実験室内に雲梯を設置し、ヒトのブラキエーションと二足歩行の両方における四肢運動を、三次元運動解析装置を用いて運動学的に計測・解析する環境を構築した。この環境下で、成人被験者を対象に四肢運動を計測し、特に、支持基体から離れたswing肢の状態に着目して解析を行った。その結果、上肢支持で行われるブラキエーション時にも下肢運動が活発に生じることが示された。運動様式間で比較すると、上肢・下肢の振り出される順序・タイミングにはブラキエーションと二足歩行で類似性がみられるが、ブラキエーション時の下肢は体幹回旋と同方向に、二足歩行の上肢は体幹回旋と逆方向に動く傾向があり、支持基体から離れたswing肢の働きは運動様式ごとに異なることが示唆された。今年度の目的であった、複数被験者のブラキエーション時および二足歩行時の四肢運動についての運動学的計測および比較解析を実施することができた。今後は、運動学的分析に加えて筋電図学的分析を行う。

体幹を中心とした骨格筋の活動を、複数筋あるいは両側で同時測定することで、ブラキエーション運動時の身体姿勢保持、推進において体幹・四肢が果たす役割を調べる。また、鉄棒などの体操競技経験者を被験者とし、慣れの影響について解析することも並行して行う予定である。次年度は、追加のデータ収集を行うとともに、前年度までに計測した筋電図学的データと運動学的データの対応づけに注力する。ブラキエーション時と歩行時のデータを比較し、ブラキエーション時における体幹・下肢の筋活動パターンの特徴を分析する。雲梯の設置が当初予定額を下回ったため、未使用額が生じた。次年度、筋電図計測システムの拡充に使用する予定である。物品費、旅費等を当初の計画よりも削減できたことにより、次年度使用額が生じた。次年度は、継続して実験の消耗品の購入等に使用する。
液体上での積層膜形成とパターニングによる無機/有機積層デバイスの作製

本研究の目的は、液体表面でのナノ薄膜および無機/有機積層ナノ薄膜の新規作製法における成膜・積層条件の検討と、考案した新規パターニング法による積層デバイスの試作およびその特性評価である。平成30年度は、液体表面での成膜・積層条件の検討のために、膜形成過程における表面・界面エネルギーの変化を追跡することを検討した。グローブボックス内にロードセルを設置し、Wilhelmy法により表面・界面エネルギー変化をその場測定することを試みたが課題が多く、得られた膜の膜厚、面積、表面平坦性などの膜質との関係を議論できるまでには至らなかった。そのため、積層後の膜についての評価ではあるが、走査電子顕微鏡による直接観察やX線回折による結晶相の評価、可視紫外分光装置による光透過特性の測定などの他に、単分子層から数ナノメートルオーダーの極めて薄い有機膜の状態を評価できるX線光電子分光法や全反射表面増強赤外吸収分光法を利用して無機膜と有機膜の界面の状態を評価することを検討した。無機層としてチタン酸バリウムゲル、有機層としてポリ乳酸からなる積層膜について検討した結果、ポリ乳酸のカルボニル基が無機膜表面に対して平行に配向していることがわかった。有機官能基の配向が確認できたことから、有機膜による無機膜内の結晶配向の制御を目的として、効果が期待される有機膜の合成研究を若干行った。今回は、光などの外場で構造や物性が変わる多置換芳香族、複素環化合物のなかで、感光体やフォトレジストとして用いられるフルオレノン骨格を有する有機分子の合成を行い、置換基の異なるフルオレノン誘導体をいくつか合成することに成功した。液体上での成膜・積層過程における表面・界面エネルギー変化のその場測定には課題が残ったため、積層後の膜についてX線光電子分光法や全反射表面増強赤外吸収分光法など幾つかの方法で評価した。このことが、当初の成膜・積層条件の検討に関して進捗状況にやや遅れが生じている要因となっている。また、今回全反射表面増強赤外吸収分光法の測定結果から有機官能基の配向が確認できたことから、有機膜による無機膜内の結晶配向の制御に効果が期待される有機膜の合成研究に時間を割いた。このことも当初の積層膜の膜厚、面積、表面平坦性などの膜質に及ぼす成膜・積層条件の影響についての検討が遅れるもう一つの要因になった。積層膜の膜厚、面積、表面平坦性などの膜質などの成膜・積層条件の検討には、積層後に全反射表面増強赤外吸収分光法などを用いて行う。令和元年度は、有機膜を換えて積層膜を作成し、膜のパターニングと、平成30年度に購入したエレクトロメータを用いた誘電特性評価を並行して実施する計画である。(理由)本年度

計上したピコアンメータについては、高電圧電源を内蔵した上位グレードものに変更し、他の予算と合算して購入した。また、表面・界面エネルギー変化を測定する目的で計上した電子天秤については、残った課題を解決できない可能性が生じたため購入を見合わせた。以上のことにより、次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度使用分は、電気的測定の精度が下がらないようするための測定環境の改善に使用することを考えている。
アトピー性皮膚炎の痒みにおける神経・内分泌・免疫のクロストーク

昨年度までにアトピー性皮膚炎(AD)モデルマウス(NC/Nga)にwater avoidance stress (WAS)による精神的ストレスを加えることで、痒み行動が生じること、また様々なメディエーターの測定を行い、精神的ストレスによりADの発症が惹起されることを確認した。痒みの指標として掻破行動を測定した。測定には、自動掻破行動測定装置であるSCLABA Realを用いて調べた。続いて、WAS負荷前にcorticotrophin-releasing factor (CRF)を投与し、ストレスによる掻破行動あるいはAD発症に対する影響について検討した。結果としては、CRFはWASによる掻破行動を濃度依存性に抑制した。また、CRF投与前にステロイド合成阻害剤を投与し、CRFによるステロイド分泌の影響を除去した後に同様の実験を行ったところ、CRFは同様にWASによる掻破行動を抑制した。このことから、CRFはステロイド分泌を介さずに掻破行動を抑えることが判明した。さらに、NC/Ngaマウスにストレスを加えることで末梢血中のNK細胞数が減少すること、オピオイド受容体の発現に影響を及ぼすことも確認した。すなわち、脳中のオピオイドμ受容体発現を促進させ、オピオイドκ受容体の発現を低下させた。CRFはこれらの発現変化を調整させる作用をもっていた。なお、皮膚表皮に関してもオピオイド受容体の発現の変化が見られたことも確認している。ストレスとNK細胞数、オピオイド受容体の相互作用の一部を確認することができた。アトピー素因のあるモデルマウス(NC/Nga)において、精神的なストレスを加えることで掻破行動が生じ、徐々にアトピー性皮膚炎様症状が惹起されることを確認した。精神的ストレスを加える方法は拘束水浸ストレスであるwater avoidance stressを用いた。ストレスが適切に負荷されているか血清中のコルチコステロン値およびfecal pelletsを測定した。ストレス負荷により、血清コルチコステロン値およびfecal pelletsの増加がみられた。痒みの指標として、自動掻破行動測定装置であるSCLABA Realを用いて掻破行動を測定したところ、掻破回数の上昇があった。皮膚炎の評価にはseverity skin scoreを用い、湿疹病変の出現があった。さらに、皮膚病理組織の免疫組織学的検討を行った。皮膚組織ではマスト細胞およびNK細胞の増加があった。免疫血清学的には血清IgE、インターロイキン(2,4,5,10,13,17)およびインターフェロンγを測定し、血清IgE値の経時的な上昇が確認できたが血清中のインターロイキンおよびインターフェロンの変化は見られなかった、皮膚組織さらに脾臓組織はマルチビーズショッカーを用いて破砕し、アイソジェンを用いてmRNAを抽出した。次いで、real-time PCR法を用いて種々のサイトカインの発現を検討したところ、インターロイキン5、インターフェロンγの上昇があった。CRF受容体のmRNA発現量、脾臓、リンパ節培養細胞上清のサイトカイン産生能の変化を現在測定中である。血清corticotropin-releasing factor (CRF)、ノルエピネフリン値、mRNAからのアドレナリン受容体発現量についてもこれから検討する予定である。基礎データは得られている。測定項目がやや少ないがおおむね順調と考えられる。アトピー素因のあるアトピー性皮膚炎モデルマウス(NC/Nga)において、精神的なストレスを加えることで掻破行動が生じ、徐々にアトピー性皮膚炎様症状が惹起されることを確認した。ストレスが適切に負荷されているかを血清中のコルチコステロン値およびfecal pelletsを測定した。その結果、血清コルチコステロン値の上昇、fecal pelletsの増加がみられた。痒みの指標として、自動掻破行動測定装置であるSCLABA Realを用いて掻破行動を測定したところ、掻破回数の上昇も伴っていた。皮膚炎の評価にはseverity skin scoreを用いた。スコアは明らかに上昇しており、湿疹病変の出現があった。皮膚組織ではマスト細胞の増加に加えて、NK細胞の増加がみられた。また、蛍光色素を用いての検討では、制御性T細胞の増加も伴っていた。進行がやや遅れているが引き続き研究を行っていきたい。具体的には、血清ノルエピネフリン濃度の測定、α、β受容体の刺激薬や拮抗薬を用いた実験が行えていない。

続いて、WAS負荷前にcorticotrophin-releasing factor (CRF)を投与し、ストレスによる掻破行動あるいはAD発症に対する影響について検討した。結果としては、CRFはWASによる掻破行動を濃度依存性に抑制した。また、CRF投与前にステロイド合成阻害剤を投与し、CRFによるステロイド分泌の影響を除去した後に同様の実験を行ったところ、CRFは同様にWASによる掻破行動を抑制した。このことから、CRFはステロイド分泌を介さずに掻破行動を抑えることが判明した。さらに、NC/Ngaマウスにストレスを加えることで末梢血中のNK細胞数が減少すること、オピオイド受容体の発現に影響を及ぼすことも確認した。すなわち、脳中のオピオイドμ受容体発現を促進させ、オピオイドκ受容体の発現を低下させた。CRFはこれらの発現変化を調整させる作用をもっていた。なお、皮膚表皮に関してもオピオイド受容体の発現の変化が見られたことも確認している。ストレスとNK細胞数、オピオイド受容体の相互作用の一部を確認することができた。すでに回収、抽出したmRNAや培養細胞上清を用いて種々の因子の測定を効率良く行っていくことを目標とする。皮膚組織、あるいは脳組織などのCRF受容体のmRNA発現量、脾臓、リンパ節培養細胞上清のサイトカイン産生能の変化を測定していく。血清corticotropin-releasing factor (CRF)、ノルエピネフリン値、mRNAからのアドレナリン受容体発現量についても検討する。平成28年度は基礎データの集積が主であった。また測定を行う予定であったエピネフリン、CRF測定について、次年度に延期したため次年度使用額が生じた(測定延期の理由の一つは研究代表者の異動が生じたためです)。研究施設が変わったため、研究の体制を整えるのに時間を要した。平成30年度は、血清ノルエピネフリン濃度の測定、α、β受容体の刺激薬や拮抗薬を用いた実験を行い、CRFとノルエピネフリン、NK細胞の相互作用を検討する。本年度上記のエピネフリン、CRFを測定し、さらに平成29年度の予定研究を合わせて行っていく。
おとり遺伝子による癌の血管新生抑制を標的とした純国産型遺伝子治療法の開発

腫瘍が増殖を継続するためには周囲組織からの血管の導入が必須である.腫瘍細胞が産生する多彩な血管新生因子のなかで,血管内皮増殖因子(VEGF)はもっとも重要であり,低酸素環境により転写因子HIF-1の活性を介して発現が誘導される.我々はHIF-1認識する塩基配列を含んだ合成2本鎖DNA(HIF-1 decoy ODNs)を,HVJーリポソーム法を用いてSAS細胞に導入したところ,低酸素培養により亢進するVEGF発現はHIF-1 decoy ODNs導入により抑制された.従ってHIF-1 decoy ODNs導入はVEGF発現抑制による血管新生の制御に有効であることが示唆された.腫瘍が増殖を持続するためには血管新生が必須である.この腫瘍血管新生は腫瘍細胞から産生される多彩な血管新生因子が周囲組織の血管を活性化することで開始される.近年,血管新生を抑制すると腫瘍の増殖を制御できるという知見が集積され,血管新生抑制は新しい癌治療法として注目されている.しかし,既存の血管新生抑制療法は微小分子,血管新生因子に対する抗体やアンチセンス導入などで,いまだ安全性が確立されていない.そこで,本研究は独自に開発した純国産型の遺伝子導入法(HVJ-リボソーム法)を用いて,血管新生を制御している転写因子に対するおとり遺伝子を導入し,転写活性を阻害することで複数の血管新生因子の発現を同時に抑制して腫瘍増殖を制御するという,本邦独自の新規癌遺伝子治療法を確立する事を目的として研究を遂行した.培養口腔癌細胞における血管新生因子群,関連する転写因子群の解析,ならびにHVJ-リボソーム法を用いた培養癌細胞への遺伝子導入条件の確立を終了し,臨床研究にむけた動物モデルへの展開を行った.すなわち,ヌードマウスの背部皮下に,血管新生因子や転写因子の解析が終了している培養口腔癌細を2x104個移植して実験的腫瘍を作成した.成立した実験的腫瘍は病理組織学的,放射線学的に解析して,以後の血管新生抑制,転写因子制御の検証の際の対照とした.現在まで申請者は培養口腔扁平上皮癌細胞の血管新生機構を制御している転写因子として,Sp1やHIF-1の重要性について検証した.すなわち,SAS細胞やTF細胞をNFで刺激すると,刺激直後よりSp1の活性化を認め,検索した30分間は継続した.この癌細胞におけるSp1活性がVEGFやTGFβ1,PDGF,組織因子(TF)などの血管新生因子群の発現誘導に関与している可能性が高いと思われる.さらに,Sp1はuPAなどの基質破壊酵素の発現にも関与しているとされており,Sp1抑制は血管新生抑制だけでなく,基質破壊も制御し癌の浸潤を抑制できる可能性があると期待できる.そこで,当該年度は動物モデルにおける実験的腫瘍においても,Sp1の活性化がみられるか検証するとともに,Sp1を標的としたおとり遺伝子をHVJーリポソーム法により遺伝子導入し,Sp1の転写活性の抑制効果についてバンドシフトアッセイにより検証した.さらに,ヌードマウスに作成した実験的腫瘍について,ルシフェラーゼ発現プラスミド(pcDNA3-luciferase),あるいはFITC標識した合成オリゴヌクレオチドを用いて,HVJ-リポソーム法により実験的腫瘍に遺伝子導入した.その後,腫瘍組織を切除してルシフェラーゼ活性の定量的解析や,蛍光顕微鏡による病理組織学的検証により,以下に記載する導入条件を中心として,最良の導入効率となる至適遺伝子導入条件を確立した.(1)導入間隔:HVJーリポソーム法は反復導入が極めて容易であり,遺伝子発現が最大となる導入間隔を決定した.(2)導入部位:癌細胞に大量におとり遺伝子を導入するために,有効な投与経路を検索した.(3)導入量:培養細胞への遺伝子導入条件を資料として,動物モデルへの遺伝子導入に関わる至適力価を確立した.当該年度における研究成果に関して実験的腫瘍組織への遺伝子導入法や経路,すなわちin vivoにおける精密な導入導入条件の確立が重要である.そこで,ヌードマウスの背部皮下に実験的腫瘍を作成すると同時に,作成した腫瘍組織に対しての導入条件を確立した.(1)癌の血管新生に関する責任分子の選択:本研究を展開するに際し,口腔癌における血管新生機序に関わる責任因子,すなわち標的となりうる血管新生因子を明らかにして,本戦略における標的分子として選択しなければならない.そのためには,扁平上皮癌細胞を中心に培養口腔癌細胞に広範に発現している血管新生因子を検索した.また,それらの誘導を制御するサイトカインや増殖因子などの液性因子,あるいは低酸素,低栄養などの微小環境を同定して,標的血管新生因子の発現誘導を確認するとともに,関連転写因子の動態を解析し,おとり遺伝子により標的因子として,その活性を抑制すべき転写因子を解明した.(2)HVJ-リポソーム法を用いたおとり遺伝子導入による,血管新生因子発現の抑制効果の解析:培養口腔癌細胞にHVJ-リポソーム法を用いておとり遺伝子を導入し,サイトカインや増殖因子による刺激,あるいは低酸素や低栄養で培養し,血管新生因子群の発現に関する抑制効果を検索する.また,本遺伝子治療法の効果を動物モデルによる実験的腫瘍に与える抗腫瘍効果で検証し,臨床応用に際しての基礎的資料を蓄積した.腫瘍が増殖を持続するためには,周囲組織からの血管の導入,すなわち血管新生が必須である.腫瘍血管新生は腫瘍細胞から産生・放出される多彩な血管新生因子が,周囲組織の正常な血管の活性化により開始される.血管新生を抑制すると,腫瘍の増殖が制御されるという知見が集積され,血管新生抑制は癌の新しい治療法として注目されている.

しかし,既存の血管新生抑制療法は微小分子の投与,血管新生因子に対する抗体やアンチセンスの導入などで,安全性が十分に確立されていない.本研究は独自に開発した新しい遺伝子導入法(HVJ-リポソーム法)により,血管新生を制御している転写因子の結合を阻害するためのおとり遺伝子を導入し,転写活性を抑制することで複数の血管新生因子を同時に抑制して腫瘍増殖を阻害するという新しい概念に基づく癌遺伝子治療法を確立する事を目的としている.培養癌細胞における血管新生因子群を解明し,関連する転写因子群の同定,ならびにHVJ-リポソーム法による培養癌細胞への遺伝子導入に関する至適導入条件を確立し,臨床研究にむけた動物モデルへの展開を行った.ヌードマウスの背部皮下に中心となる血管新生因子や,重要な転写因子の解析を終了させた培養口腔癌細を2x104個移植して実験的腫瘍を作成した.成立した実験的腫瘍は病理組織学的,放射線学的に解析して,以後の血管新生抑制,転写因子制御の検証の際の対照とした.腫瘍が増殖を継続するためには周囲組織からの血管の導入が必須である.腫瘍細胞が産生する多彩な血管新生因子のなかで,血管内皮増殖因子(VEGF)はもっとも重要であり,低酸素環境により転写因子HIF-1の活性を介して発現が誘導される.我々はHIF-1認識する塩基配列を含んだ合成2本鎖DNA(HIF-1 decoy ODNs)を,HVJーリポソーム法を用いてSAS細胞に導入したところ,低酸素培養により亢進するVEGF発現はHIF-1 decoy ODNs導入により抑制された.従ってHIF-1 decoy ODNs導入はVEGF発現抑制による血管新生の制御に有効であることが示唆された.申請者らは当該課題にて従来の合成リポソームに安定的におとり遺伝子を封入する方法を確立した.一方で受精鶏卵を使用し,HVの大量培養法を確立している.培養したHVJに紫外線を照射して,ゲノムRNAを断片化し失活させ,HVJウイルスの外套蛋白の融合能のみを保存させたHVJ particleを調製した.このHVJ particlesとおとり遺伝子を含有するリポソームを厳重な温度制御により融合させ,おとり遺伝子含有HVJ-リポソームを作成した.このHVJ-リポソームを培養液に添加し,さらに詳細な温度制御により培養癌細胞と膜癒合により封入されたおとり遺伝子を培養癌細胞に導入させることを可能にした.本法にておとり遺伝子を導入すると,おとり単独添加群や従来のリポソーム法に比較して大量の遺伝子が導入できることが観察されたまた,FITC標識したおとり遺伝子をHVJ-リポソーム法で培養口腔扁平上皮癌細胞により作成した実験的腫瘍に遺伝子導入し,フローサイトメトリーにて導入効率を確認した.対照群として遺伝子単味での遺伝子導入群あるいは従来のリポソーム法にて導入した細胞を用いて,各群の導入効率を比較検討した.導入後6時間にて細胞内のFITC励起を観察し,蛍光強度を導入効率として比較検討した.おとり遺伝子単独群(培養液添加)や,従来のリポソーム法に比較して,HVJ-リポソーム法にて遺伝子導入した細胞は蛍光励起が右方にシフトしており,100%の細胞に導入が可能であった.27年度が最終年度であるため、記入しない。実験腫瘍学
キチンおよびキトサンの機能性化に関する研究

多糖に新しい機能を付与すべく申請者は今までD-グルコースを繰り返し単位に有する各種多糖にシアノエチル基の導入を試み、また、生成物の物性について研究を行ってきた。本研究では、再生可能な生物資源の一つである多糖としてキチンおよびその脱アセチル化物であるキトサンを採り上げた。既往の研究成果および申請者の過去の研究で得た知見を基に、まず、キチンおよびキトサンのシアノエチル化を行った。シアノエチル基の導入は、赤外分光スペクトル法にて2250cm^<-1>付近のシアノ基の吸収で確認した。合成したシアノエチル化キチンおよびキトサンの、熱分解性、金属イオン吸着性、誘電性、溶解性をそれぞれ評価しそれぞれの出発物質と比較した。シアノエチル化キトサンのDSC曲線には、525°Cに大きな発熱ピークを観測し、シアノエチル化に起因すると考えられた。また、誘導体を、金属イオンを含む酢酸緩衝液中に入れ、金属イオンを吸着させ、溶液部分に残存する未吸着金属イオン濃度を測定したところ、特に、シアノエチル化キトサンはpH6の際に二価の銅イオンに対し大きな吸着量(6.09.6mole/10^5g)を示した。一方キトサンの場合は、未処理の場合および誘導体はそれぞれ0.91.3,1.42.4mole/10^5gであった。またシアノエチル化キトサンの誘電率は、常温で1000Hz付近で20を越す値を示し、セルロースの15などと比較してかなり大きな値であった。キチンの場合、シアノエチル化によってpH5の酢酸緩衝液に対する溶解性が3.44%から40.5%に上昇したのに対し、キトサンは、98.98%から69.70%に減少し、金属イオンを吸着するにつれてさらに溶解性が低下した。本研究で物性を測定した多糖およびその誘導体のなかで特にシアノエチル化キトサンは、今後の利用について金属捕集剤(凝集沈殿剤)としてもまた高誘電体としても期待される新しい機能を有する誘導体となると考えられた。
脳卒中後誤嚥性肺炎の予測因子と高齢者自由嚥下の特徴との関連解析

高齢者のQOL維持の観点から「口から食べること」が推奨されるが,高齢者の死亡原因の上位に位置している肺炎は,その多くが誤嚥性肺炎だと言われており,その予防のため摂食・嚥下障害について多くの検討がされている.本研究では健常成人の自由嚥下の計測を行い,摂食・嚥下機能に影響を与える要因の1つである食品の種類と至適嚥下量との関連を検討した.【方法】摂食・嚥下障害のない健常成人205名(65歳未満群115名:平均年齢36.0±12.2歳,65歳以上群90名:平均年齢75.5±6.6歳)を対象に食性の異なる4食品(チキンライス,カステラ,ヨーグルト,水)を自由に摂取させ,摂食行動および嚥下音を記録した.記録をもとに,摂食回数と嚥下回数を測定し,1回摂取量を食品重量/摂取回数,1回嚥下量を食品重量/嚥下回数として算出した.【結果・考察】測定の結果,1回摂取量および1回嚥下量は,すべての食品間で違いが認められた.このことは,食性の違いが,摂食・嚥下機能において何らかの点で影響することを示した.年齢による比較では,すべての食品で,65歳以上の高齢群が65歳未満群に比べて1回摂取量および1回嚥下量が減少する傾向を認めた.高齢群で1回摂取量・1回嚥下量とも減少したことは,摂食・嚥下障害の自覚のないものであっても,加齢に伴う口腔・咽頭機能の低下を意識下または無意識下に認知し,1回摂取量および1回嚥下量を自然に調整している可能性があることを示唆していると考えられた.【結論】本研究により,健常成人の自由嚥下時の摂取量,嚥下量は食品の性状よって変化し,加齢によって減少する傾向があることが示された.脳卒中患者の誤嚥性肺炎の予防を目的に,誤嚥性肺炎の予測因子の検討がされている.なかでも誤嚥性肺炎の発症には誤嚥の関与は重要であり,脳卒中患者を対象に嚥下障害と誤嚥の予測因子やスクリーニングテストの重要性について報告されているが報告により結果は異なる.そこで,誤嚥性肺炎の予測因子の検討と平行して,従来いわれている脳卒中患者の嚥下障害と誤嚥の予測因子や嚥下障害スクリーニングテストの有用性の検討を行い,さらに,従来の報告以外にVF検査での誤嚥を予測する関連因子の抽出を試みた.【対象】急性期病院に入院し神経内科または脳卒中科で嚥下障害を疑われ,嚥下機能評価のために口腔外科に依頼をされた脳卒中患者88人(年齢:中央値72歳(50-89歳),男性65人,女性23人)を対象とした.【方法】VF検査での誤嚥と各検討項目の関連を多変量解析にて検討し,関連を認めた項目は感度,特異度および陽性反応的中度,陰性反応的中度,オッズ比と95%信頼区間から有用性を検討した.【結果】VF検査で誤嚥を確認できたのは67人(76.1%)であった.本研究で検討可能であった従来の誤嚥予測因子(構音障害,咽頭反射),障害スクリーニングテストは統計学的に有意ではなかった.VF検査での誤嚥を予測する因子として「modified Rankin Scale(mRS)」,「歩行」,「食事時介助」が抽出された.【結論】本研究でVF検査での誤嚥と関連する因子として有用性の示唆された「mRS」,「歩行の可否」と「食事時介助の有無」は,嚥下機能を熟知していなくても簡便に評価できるため,脳卒中後の誤嚥を予測する良い指標になり得ると考えられた.【背景】脳卒中後の重要な合併症である肺炎は,罹患することで脳卒中発症後30日間の死亡率は3倍になり,その肺炎の多くは誤嚥性肺炎(Aspifation Pneumonia:以下AP)といわれている.そこで,脳卒中患者を対象にAPの発症に影響する因子の検討がされている.しかし,嚥下機能評価に基づいた栄養摂取経路・食性の変更,訓練といった対策による影響を考察した研究はない.本研究では,嚥下機能評価に基づいた誤嚥に対する対策の影響を考慮してAP発症の関連因子を検討した.【対象】脳卒中発症から7日以内に急性期病院に入院し,嚥下障害があると疑われ口腔外科で評価をした143人(年齢:中央値72歳(43-92歳),男性103人,女性40人)を対象とした.【方法】脳卒中発症後1年以内のAP発症と各検討項目との関連を検討した.脳卒中発症後1年以内のAP発症は,APの発症時期を嚥下機能評価の前後で分け,1)嚥下機能評価前のAP発症と2)嚥下機能評価後のAP発症を比較して,それぞれで多変量解析した.嚥下機能評価後にはすべての例で摂食嚥下機能訓練などの介入を行っている.【結果】脳卒中後1年間に,APに罹患したのは35/143人(24.5%)であった.APの発症と関連を認め認めた項目は,1)嚥下機能評価

前のAP発症では「男性である」・「構音障害あり」・「義歯の使用あり」で,2)嚥下機能評価後のAP発症ではCT/MRI画像所見で「脳萎縮あり」・「大脳基底核に梗塞巣あり」・「入院前のBarthel Indexが100点未満」であった.【結論】嚥下機能評価を行った後に引き続いて実施された食性の変更,訓練などの治療によりAPの発症率は減少し,さらにAPの発症に関連する因子の重みは変わることが示唆された.高齢者のQOL維持の観点から「口から食べること」が推奨されるが,高齢者の死亡原因の上位に位置している肺炎は,その多くが誤嚥性肺炎だと言われており,その予防のため摂食・嚥下障害について多くの検討がされている.本研究では健常成人の自由嚥下の計測を行い,摂食・嚥下機能に影響を与える要因の1つである食品の種類と至適嚥下量との関連を検討した.【方法】摂食・嚥下障害のない健常成人205名(65歳未満群115名:平均年齢36.0±12.2歳,65歳以上群90名:平均年齢75.5±6.6歳)を対象に食性の異なる4食品(チキンライス,カステラ,ヨーグルト,水)を自由に摂取させ,摂食行動および嚥下音を記録した.記録をもとに,摂食回数と嚥下回数を測定し,1回摂取量を食品重量/摂取回数,1回嚥下量を食品重量/嚥下回数として算出した.【結果・考察】測定の結果,1回摂取量および1回嚥下量は,すべての食品間で違いが認められた.このことは,食性の違いが,摂食・嚥下機能において何らかの点で影響することを示した.年齢による比較では,すべての食品で,65歳以上の高齢群が65歳未満群に比べて1回摂取量および1回嚥下量が減少する傾向を認めた.高齢群で1回摂取量・1回嚥下量とも減少したことは,摂食・嚥下障害の自覚のないものであっても,加齢に伴う口腔・咽頭機能の低下を意識下または無意識下に認知し,1回摂取量および1回嚥下量を自然に調整している可能性があることを示唆していると考えられた.【結論】本研究により,健常成人の自由嚥下時の摂取量,嚥下量は食品の性状よって変化し,加齢によって減少する傾向があることが示された.
時空間分析としての地理情報システム

環境変化の分析において、地理情報システムの利用は一般化しつつあるが、まだ、さまざまな問題点が残されている。本研究においては、システム、デ-タベ-スにおける問題点の抽出とその解決をめざしている。まず、地理情報の理論的問題点として、扱うデ-タの種類と構造の問題がある。本年度においては、マルチメディア地理情報に関する基礎的な研究を行なった。マルチメディア情報においては、単に異種デ-タの扱いだけでなく、空間、時間に関する検討も必要である。これと関連して、従来の2次元地理情報シテスムの3次元・4次元への拡張に向けた研究を行なった。さらに、これを実現する方法として、オブジェクト指向型のデ-タベ-ス構造に関して研究を行なった。地理情報システムの発展に伴い、デ-タ取得に関しても新たな技術の要求が強まりつつある。地球測位システム(GPS)、リアルタイム情報収集システムなど、新世代のデ-タ取得システムに関する研究を行なった。また、リモ-トセンシングと地理情報システムの総合化に関する研究を行なった。さらにこれらの新世代システムの実験を行うため、テスト地域を数ケ所設定し、実際にデ-タを取得し、分析を行った。また、地理情報システムの普及において、適切な教科書が不足していることが指摘されているが、これに対処するため、アメリカの国立地理情報分析センタ-(CNGIA)が出版した「GISコアカリキュラム」の日本語訳を行い出版した。これらの研究成果を一般に広めるため、「マルチメディア地理情報システム」、「GPSとGIS」、「GISコアカリキュラム」のワ-クショップを開催した。
原子テンプレート法による有機分子超構造作成手法の開拓

一連のファインプロセス、熱履歴処理、プローブ顕微手法等によって原子レベルにて加工、調整された基板表面の局所構造を有機分子の自己組織化現象を制御する「原子テンプレート」として利用しつつ、従来行われてきた化学合成手法によって有機分子超構造の自立形成を意図的に制御する「プログラム自己組織化」の自由度を高めた。これにより、これまでの手法では実現困難な有機分子超構造の作成手法に道を開いた。本課題は情報通信研究機構が有する有機超分子構造合成・作成技術と大阪大学が有する基板表面原子組み替え技術を融合し、基板上の任意の位置に目的とする超分子構造を作成し固定する手法を走査型プローブ技術をベースとして開拓しようとするものである。本年度は必要となる実験環境の整備と基盤となるファインプロセス技術の開発を進めた。具体的には、市販のSPM汎用コントローラーを新規導入しこれをべ一スにして必要となるファイン制御機能を大阪大学からの技術供与に基づき開発・付加した。さらにこれらを情報通信研究機構が有するオミクロン社製SPM装置(VT-SPM)に接続して実際の原子テンプレート作成作業に必要となる作業精度や実験手順、必要となる追加改造などについて検討した。実験装置の整備と並行して、超分子構造作成のパーツ部分となる有機分子体の合成・蒸着・観察実験も進めた。具体的には、官能基の化学反応性を調整した環状ポルフィリン誘導体をポテンシャル特異点である基板上テラスエッジにトラップさせ、分子同士を強制的に近接させることで生ずる局所コンフォメーション変化を調べた。実験は進行中であるが、その官能基の相対的な距離に依存して各分子がその相対位置をフリップフロップ的に自律調整する様子がSTMによって観測されている。これらは超分子構造の形成過程を理解するうえで重要であり分子動力学的なモデリングによる解釈を現在進めている。また、超高真空中にて再構成された清浄TiO_2基板面に配置されたポルフィリン誘導体の一分子コンフォメーションを詳細に調べた。その結果、基板上の分子吸着位置はポルフィリン環周辺の電化分布と基板上の原子配列の整合性に強く依存することがわかった。これは基板上の原子配列パターンが有機分子ユニットの配列に大きく影響することを実際に示しており、原子テンプレート設計に際しての重要な知見を与える。本年度は前年度に導入された改良型SPMコントローラーの立ち上げと性能評価に着手した。その際に判明したいくつかの技術問題を解決しその動作精度と制御自由度を向上させる目的でSPMコントローラーと走査型プローブ装置間のインターフェース部分について改良を進めた。また、大阪大学側にて開発されその有用性が検証されたアトムトラッキング機能とそれらをベースとしたフィードフォワード機能を情報通信研究機構側の装置にも実装し、室温観測における熱ドリフトキャンセル機構を強化した。また、原子テンプレート素材として有望と考えられる原子種について大阪大学側にて探索研究を実施、その基礎実験データと情報通信研究機構側の分子合成グループの意見を反映させる形で3元素同時精密蒸着装置を試作、情報通信研究機構側の真空プロセスチャンバーに取り付けて性能評価を行った。これらの作業と並行して、超分子構造作成のパーツ部分となる有機分子ユニットをポルフィリン構造をベースとして複数種類合成し、それらの基板上における凝集形態の制御を試みた。特に、前年度に発見したポルフィリン誘導体の擬2量体形成現象を発展させ、性質の異なる2種類のポルフィリン誘導体を逐次蒸着することによって、1次元的なポテンシャル特異点である基板上テラスエッジ端構造をテンプレートとして9nmピッチの分子グリッド超構造を金基板上に自発的に形成させ、プローブ顕微鏡によってその形成過程を分子分解能にて画像化することに成功した。これらは分子デバイスやより高次な分子超構造の基本となるものである。本課題は有機分子の自己組織化に基づく超構造作成技術とこれらを配置する基板表面構造の原子スケール調整技術を融合し、通常の熱緩和的な方法では形成困難な超分子構造を基板上に作成し固定する基盤技術を開拓しようとするものである。本年度は前年度までに実施された金基板上分子グリッド構造の形成条件を解明し制御性を高めるとともに、この技術を絶縁性酸化物基板上に移植するためのコンセプト探索を行った。まずは、分子グリッド構造の個々の分子パーツと下地基板との接続様態を調べるために、分子を基板に対して固定するアンカーとして機能していると思われるSCH_3基とテンプレートであるテラスエッジ部位との相対的なポテンシャル差異をケルビン力顕微鏡によって観測した。その結果、この官能登が基板構造に対して局所的な親和力を発揮し、構造形成において重要な秩序を与えていることを示唆する結果を得た。また、代表的な酸化物であるTiO_2単結晶基板に熱還元処理を行うことで0.9nmピッチの周期的1次元構造を作成し、この構造が特定の分極官能基を導入したポルフィリン分子に対して、分子配置制御用のテンプレートとして機能することをSPM観測によって確認した。

これらは基板上の電荷配列パターンと分子内電荷分布のスケール的なかみ合いによるものと解釈され、配置する分子の構造や分極パターンを適宜調整することで金基板上のグリッド構造と同等の構造が作成可能と予想される。これと並行して、よりエンジニアリング性の高いSrTiO_3基板上でのテンプレート構造作成にも取り組み、適切な熱処理を施すことによって原子レベルで平坦化された基板表面上で5nm幅1次元テンプレート構造の形成に成功した。これら一連の研究結果は基板上での分子自己組織化制御に有用なものであり、今後の有機分子ナノ構造作成技術の発展に大きく寄与するものと考える。
虚血性脳障害モデルにおける神経細胞死の誘導メカニズムの解析

近年、虚血性ストレスによる脳神経系の組織障害が問題となっている。我々は、急性・慢性的な虚血や癲痛性発作等における局所的な脳組織障害の発生に、p53分子を介する脳神経特異的な細胞死へのシグナルが大きく関与していることを明らかにした。本研究では、虚血性ストレスによる脳神経組織障害発生のメカニズムを解明する一つの手段として、p53遺伝子ノックアウトマウスを用いて、虚血性神経細胞死の誘導と、脳神経組織・細胞内のp53の動態、及びp53有無に付随して発現や機能を調節されるシグナルネットワークに関わる分子群を検索/同定し、これらのタンパク質レベルでの構造と機能解析を行い、p53を介して誘導される脳神経細胞死に関連するシグナル分子の検索を行った。p53正常(+/+),ノックアウト(-/-)マウスの総頸動脈結紮による海馬・線条体神経細胞の再現性のある虚血性遅延障害モデルを開発し、各脳組織・細胞のプロテオーム及びトランスクリプトーム解析の方法論を確立した。プロテオミクス融合解析法は、2種類(2D-DIGE法・iTRAQ/cICAT法)のproteomic differential display法を同時進行で行うとともに、DNAチップによるmRNA発現差異解析を行った。現在までに、2D-DIGE法においては、約4000個の全蛋白質から213個の特異的な蛋白質(p53遺伝子の有無に関わる93個、虚血性アポトーシスに関わる53個、p53およびアポトーシス両者が特異的に関わる39個)が検出された。又、iTRAQ/cICAT法による解析においては297個の特異的な蛋白質がp53およびアポトーシスに関わる分子として同定された。さらに、DNAチップ法によって特異的に変動する分子群合計294個(上昇195,減少79)をプロテオミクスの結果と融合させ、これらの結果をシグナルネットワーク解析ソフトに供与して特異的p53依存性のアポトーシスシグナル経路を抽出したところ、caspase9を介したアポトーシス経路に加え、レドックス関連因子群、notch,wint,cadherin,IF等の関与するシグナル系がユニークな経路として検出された。本研究によってp53及び関連分子の神経細胞死に関わるシグナル伝達機構の一旦が明かになり、これらの分子シグナルの活性を調節する薬剤やターゲット分子が、脳神経系組織障害の予防や治療へ応用できる可能性が示唆された。
粘弾性特性のリアルタイム同定とファジィ理論を応用した食道狭窄拡張制御装置の開発

本研究の目的は、食道狭窄症の治療法としての拡張術を安全かつ効率的に行うシステムを開発しようというものである。その基本的発想はまず拡張装置によって狭窄部食道の粘弾性特性を測定し、computerによってリアルタイムで最適な拡張条件を計算する。そしてその条件に基づいてcomputerに拡張作業の制御を行わせるというものである。まず食道拡張用のバル-ンの特性について、バル-ン内圧の変化から拡張力と周長を推定する方法が新しく開発された。しかし実際に動物モデル(イヌ)で測定実験を行ってけると拡張に伴って周長の増加と共に張力の変化が不規則な振る舞いを示す例があり、粘弾性特性の非線形性が問題となった。数学モデルから得られた関数の能力に限界があることが分かった。このため、システムにNeural Networkを導入した。Neural Networkの構成は入力、中間、出力層の3層構造、素子数はそれぞれ3、9、1のものを2つ用いた。学習方法としてはバックプロパゲ-ションを採用した。このNeural Networkに食道健常部と狭窄部での内圧、送水量を入力し、周長と拡張力を計算させた。弾性材料を用いたモデルによる学習実験を行った。得られた結果はいずれも実測値からの誤差は5%以内であり、極めて良い推定ができた。更にこの学習結果は様々な食道壁の弾性に対応したものであり、バル-ンへの送水量、食道の周長の伸びと、健常部、狭窄部の内圧値の関係が3次元空間で良く補完されていた。このように粘弾性特性の推定に大きな進歩が得られたので、この学習させたニュ-ロを用いてどんな拡張用のバル-ンにも対応できるようバル-ン特性を正規化して入力するようにした。以上の結果をふまえ、イヌの食道狭窄モデルの拡張実験を行ったところ、狭窄部と健常部とで拡張にさいしての圧力変化の差がはっきり同定できることが確認された。現在実際の臨床応用へむけて実験を続けている。本研究は実験的に作成した狭窄部食道を粘弾性的特性の面から検討して拡張方法の理論的根拠を確立し、これに基づき個々の症例の粘弾性特性を測定して最適な拡張条件を計算しながらその条件下に作動する効率的でしかも安全なmicrocomputer制御の食道拡張制御装置を開発しようとするものである。本研究はまだ継続中であるが現在までに以下のような成果をあげている。1.食道狭窄モデルの作成。イヌを用いて胸部食道に食道狭窄を作成することに成功した。頚部食道を約3cm切除して吻合に緊張をもたせ密な一層縫合をすると狭窄を最もきたしやすいということが明らかになった。2.拡張バル-ン及びmicrocomputerを用いた拡張制御システムの製作。拡張バル-ンとしてはシリコンゴムを用いて2つの径8mmの球形バル-ンの中間に円筒が挟まれた形状のものを製作した。拡張制御装置は16bit microcomputerによって制御され(1)12VDCギヤモ-タ-を用いた2系統の注射器駆動系(2)圧力トランスデュ-サ-及び歪ゲ-ジ、直線褶動ポテンショメ-タ-による測定系、(3)12bitのA/D,D/Aコンバ-タ-による変換入力系の3系統からなるシステムを構築した。3.バル-ンの特性解析による拡張量の測定理論の開発および実際の測定の予備実験