hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウィルスベクターを用いた遺伝子導入による悪性脳腫瘍の多面的治療の基礎研究

遺伝子治療の臨床治験では主にアデノウイルスが使用されている。我々はこのベクターにp53遺伝子を組み込み、悪性神経膠腫の細胞株に使用してみたが、ほとんどの細胞で効果が認められなかった。そこでアポトーシスを誘導できるU373MG株を用いて耐性株、U373RおよびU373RCを樹立した。この耐性株は、U373Rではintegrin avb3とavb5が、U373RCではCARの発現量が親株に比べ有意に低下していた。即ち、この耐性株はベクターに対する受容体の発現が低下することによりアデノウイルスに対して耐性となっていることを証明した。これは、アデノウイルスベクター全体に関わる重要な発見であり、今後、アデノウイルスが頻繁に臨床で使われるようになったとき、このベクター耐性の腫瘍細胞が出てくることが示唆される。一方で、濱田によりアデノウイルスのfiber knob mutantが作られ、これが悪性神経膠腫で非常に有用であることが報告されている。そこでこのアデノウイルスのF/K20を耐性株に使用したところ、顕著に導入効率を上昇させた。更に、このベクターにp53を組み込んたAxCAhp53-F/K20を耐性株に応用したところ、耐性株はアポトーシスを起こすようになった。特にU373RCでは親株同等以上の効果を示し、F/K20がCARと無関係に細胞に取り込まれることを立証した。悪性神経膠腫の活動には、プロテアソームが重要であることを見つけ、その阻害によるアポトーシス誘導の機序を解明した。更に、プロテアソームの役割を利用し、p53の遺伝子治療に応用し、その有用性を証明した。また、共同研究者である濱田のグループからは、アデノウイルスベクターを用い、Fas,NF-kappaB,BAX,caspasesなどを応用した様々な遺伝子治療の基礎実験が行われ、成果を挙げた。治療実験の一方で悪性腫瘍の生物学的特性を調べこれを治療に応用することも我々の仕事の重要な要素である。転移性脳腫瘍においてgangliosideが脳転移のマーカーに成る得る事を突き止めた。また、他の悪性脳腫瘍の悪性髄膜腫やhemangiopericytomaの悪性進展にはp53の異常が重要であることを見つけ、今後この腫瘍もp53遺伝子治療の対象として考えていくための基礎を築いた。遺伝子治療を行うにあたりまず問題となるのが導入遺伝子の種類とベクターである。アデノウイルスは293細胞を利用して作り、精製後再びこの細胞でウイルス濃度を測った後に実験に利用している。このウイルス濃度の測定は常に一定の条件下で実験を進めるためには重要である。ところがアポトーシス誘導遺伝子を導入した場合その遺伝子により293細胞にアポトーシスが起きてしまい正確な濃度測定が出来ない、即ち他の遺伝子治療との比較、コントロールのデータとの比較が不可能という問題があることが判明した。このためアポトーシス耐性の293細胞を作りこれを用いてアポトーシス誘導遺伝子導入ウイルスを作製した。一口にアポトーシスといってもその経路は様々であり、まず経路の確定しているFasとFas ligandを用い、293細胞にはこれをブロックするCrmAをレトロウイルスをもちいて導入した。

この結果正確にウイルスが精製できるようになった。今後はこの手法を応用しアポトーシス誘導遺伝子導入ウイルスを作製する。特にこれまでのp53導入アデノウイルスが重要である。アデノウイルスのK20/fiberknobは悪性神経膠腫に野生型アデノウイノレスの約十倍の高効率で導入されるが、これにより非常に低い濃度でも十分量のタンパクが発現されることがインターロイキン2&12をreporter geneとして用いることにより確認できた。治療実験の一方で悪性腫瘍の生物学的特性を調べこれを治療に応用することも我々の仕事の重要な要素である。転移性脳腫瘍においてはGM3とGT1bの二つのgangliosideが脳転移のマーカーに成る得る事を突き止めた。また、悪性脳腫瘍の一つであるhemangiopericytomaの悪性進展にはp53の蓄積が重要であることを見つけ、今後この腫瘍もp53遺伝子治療の対象として考えていくための基礎を築いた。現在、遺伝子治療の臨床治験で使用されるベクターの多くはアデノウイルスである。我々はこれをベクターとして利用し、p53遺伝子を組み込んだAxClhp53を作り、悪性神経膠腫の細胞株に使用してみたが、ほとんどの細胞で有効ではなかった。そこでアポトーシスを誘導できるU373MG株を用いて耐性株、U373Rを樹立した。この耐性株に対する野生型アデノウイルスベクターの導入効率は極めて低く、親株の25分の1であった。アデノウイルスの細胞内への取り込みはfiber knob receptor即ち、CARとpenton base receptorであるintegrinの二つの受容体により行われている。これら受容体を調べたところ、U373MGではCARではなく、integrin αvβ3とαvβ5の発現量が親株に比べ有意に低下していた。即ち、この耐性株はp53に対する耐性獲得では無く、integrinの発現が低下することによりアデノウイルスに対して耐性となっていることを証明した。これは、アデノウイルスベクター全体に関わる重要な発見であり、今後アデノウイルスが頻繁に臨床で使われるようになったとき、このベクター耐性の腫瘍細胞が出てくることが示唆される。一方で、濱田らによりアデノウイルスのfiber knob mutantが作られ、これが悪性神経膠腫で非常に有用であることを以前報告した。そこでこのアデノウイルスのF/K20を耐性株に使用したところ、顕著に導入効率を上昇させ、更に、このベクターにp53を組み込んだAxCAhp53-F/K20を耐性株に応用したところ、耐性株はアポトーシスを起こした。以上より、F/K20 fibermutant adenovirusは悪性神経膠腫だけではなくアデノウイルス耐性腫瘍にも有効であることが示唆された。現在これに関しての論文を投稿中である。また、integrinの発現量低下以外の機序による耐性株も二株樹立されており、現在その機序の解明に取り組んでいる。
紫外共鳴ラマン分光法による電子トンネル及びプロトンリレーの構造化学的研究

本研究は、タンパク中のプロトン移動や電子移動のメカニズムを構造化学の立場から解明することを目的とするので、2種類の代表的なタンパク質分子を集中的に調べた。1つは光エネルギーでプロトンを能動輸送するバクテリオロドプシン、もう1つは電子移動で駆動されるプロトンポンプともいうべきチトクロム酸化酵素である。分子構造のプローブとして分子振動に着目した。その観測手段としてラマン分光法を用いた。分子の活性部位の構造変化は、本研究で開発した可視レーザー光用ダブルビーム式フローセルシステムによる時間分解共鳴ラマン散乱を用いて追跡した。タンパク部分の構造変化を選択的に検出するために、本研究では紫外共鳴ラマン散乱測定系を組立てた。Nd-YAGレーザーの4倍波で水素の誘導ラマンを起こし、それで得た240nmと218nmの光でチロシンアニオンやフェニルアラニン等の良好な共鳴ラマンスペクトルを得ることに成功した。続いて、鯉のヘモグロビンにそれを適用する段階に達したが、試料の量の問題で懸案の2種のタンパク分子に適用するには到らなかった。バクテリオロドプシンの可視共鳴ラマンの研究から、プロトン移動のゲートに当る部分について重要な情報が得られた。すなわち、レチナールシッフ塩基のプロトンがタンパクのアミノ酸残基にわたる部分について、そのアミノ酸残基のpkaが9付近にあり、それより高いpHではL中間体は生成されるもののその寿命は非常に短かく、中性ではみとめられない長寿命中間体ができてしまうことで、このために回転セル法とフロー法で異なる結果を与えることがわかった。チトクロム酸化酵素の研究では、鉄-ヒスチジン伸縮振動のラマン線強度が、この酵素の電子伝達活性とよい相関を示すことが明らかになった。本酵素の最終電子受容体は酵素分子であり、電子移動は酸素の活性化につながる問題であるので、その酵素反応中間体をミリストフロー共鳴ラマン法で検出した。
ソーレー効果を利用したマイクロ系の物質拡散の研究

本年度は,ソーレー効果を利用した強制レイリー散乱法の高精度化と生態系への可能性を追求し,以下のような成果を得た。(1)最適な実験条件を求めるために,レーザーによる加熱時間,干渉縞間隔,レーザースポット径,試料厚み,及び干渉性等を変化させ実験を行い,半経験的ではあるが適切な実験条件を得ることが出来た。(2)加熱レーザ光の強度がガウス分布をしていることによるサフマルレンズ効果について検討を行った。熱伝導の時定数,拡散の時定数,サーマルレンズの時定数を分離させるためには,加熱ビーム径を広げ,干渉縞間隔を1030ミクロンに狭くすることが,最も効果的であることが実験的に明らかになった。(3)この方法の大きな特徴の一つとして,拡散係数の濃度依存性が検知できる点があるため,タンパク質溶液(アルブミン+酢酸)の測定を試みた。本年度は,ソーレー効果を利用した強制レイリー散乱法の原理的な可能性を確認し,以下のような成果を得た。(1)現有の温度伝導率測定用の強制レイリー散乱法装置を,物質拡散係数測定に用いるために,幾つかの改良を加え,新たな拡散係数用測定装置を作製した。(2)各種の物質系について,ソーレー係数の値を検討し,ソーレー効果によって,物質の濃度勾配の生成が検知可能な程度まで起きうるかを考察した。その結果,ソーレー係数が10^<-3>K^<-1>程度であっても検知可能なことが明らかとなった。(3)最初の物質系として,ソーレー係数の大きいポリマー溶液(トリエン+ポリスチレン)等を用い,濃度勾配の生成や濃度勾配の減衰が回折光の強度変化として検知可能かどうか実験的に検討した。最適な実験条件を求めるために,レーザーによる加熱時間,干渉縞間隔,レーザースポット径,試料厚み,及び干渉性等を変化させ実験を行い,半経験的ではあるが適切な実験条件を得ることが出来た。(5)この方法の大きな特徴の一つとして,拡散係数の濃度依存性が検知できる点があるため,タンパク質溶液(アルブミン+酢酸)の測定を行った。
同調性産卵を行なう放卵放精型のミドリイシ属サンゴにおける配偶子種認識の解明

ミドリイシ属サンゴの配偶子認識に関して、主に1)異種間受精を示す種間で、野外で受精しうるか、2)この2種での浸透交雑の可能性、3)配偶子認識にかかわる遺伝子の種間比較を行った。1)に関して、異種間受精を示すウスエダミドリイシとドーンミドリイシを材料に、1)2種の精子を混在させた状態での受精選択実験などを行い、たとえIn vitroの系で異種間受精を示しても、異種と同種の精子を混在させると同種と選択的に受精することが判明した。一方で、組み合わせによっては、同種の精子が混在していても異種精子と受精する組み合わせもあった。このことは、野外で異種間受精する可能性を示している。また、産卵の同調性を沖縄本島近辺の3地点で調べたところ、瀬底島のドーンミドリイシは活発に産卵が見られなかった。これは、瀬底に生息するドーンミドリイシでは配偶子の形成が活発でないことに起因するようであった。この理由として、ドーンミドリイシの生息密度がウスエダミドリイシに対して少ないことが関係する可能性があった。そこで、2)これらの種で実際に交雑が起きているかを検討するために、マイクロサテライト解析(Structure, NewHybridsなど)による浸透交雑の可能性を検討した。その結果、明確なF1,F2戻し交雑は検出できなかったが、交雑体であると思われる群体は多数検出した。従って、このような種では受精の種選択が曖昧で異種間で交雑がおきている可能性があった。そこで、交雑する2種間でこれまで、候補に上がっている配偶子認識タンパク質の配列を比較するためにRNA単離を行うサンプルを採集した。2019年度にこのサンプルでRNA-seqを行い比較検討する予定である。同定した配偶子認識タンパク質の、接着に関わると推察されるドメインの機能を解析できた。今後は、他の種や近縁種での遺伝子の探索および比較を行い、ミドリイシ属サンゴの配偶子認識からの生殖隔離機構の解明を進める。今後は、RNA-seqを主に行いながら、目的タンパク質の多様性に関して研究を進めていく予定である。得られたデータより、分子進化解析なども行い、機能解析や配偶子認識タンパク質の進化をミドリイシ属サンゴの種分化とも絡めて検討していく予定である。ミドリイシ属サンゴは多くの種が同調して産卵するため、産卵後、海中には多くの卵と精子が混在した状態であると推察される。したがって、同調して産卵するミドリイシ属サンゴの生殖隔離は、受精時の配偶子認識に依存した受精の種特異性が深く関与する。これらを明らかにするため、受精の種特異性に関与するタンパク質の同定と機能解析を進めた。本年度は、1)受精の種特異性に関与する可能性のあるタンパク質に対する抗体を用いた受精実験、2)異種間受精するミドリイシ属サンゴの受精条件及び異種間受精の可能性、3)配偶子認識タンパク質の遺伝子単離のための準備を行った。1)に関して、これまでにコユビミドリイシ(Acropora digitifera)の精子を用いて、種特異的な高原決定基をもつタンパク質に対する抗体を作成している。今回は、その抗体を用いた受精阻害実験を、コユビミドリイシ及び産卵期の異なる隠蔽種sp.1を含む5種のミドリイシ属サンゴで行った。これまでに、kコユビミドリイシとsp.1は配偶子認識が似ており、種特異的な抗原決定基も似ていることが判明している。それ以外の3種(サボテンミドリイシ、トゲスギミドリイシ、ウスエダミドリイシ)は異種間受精も抗原決定基も似ていないことが判明している。これらの5種で、抗体を用いた受精阻害実験を行ったところ、コユビミドリイシ及びsp.1で受精阻害が見られたが、他の3種では受精阻害が見られなかった。この結果は、この種特異的な抗原決定基をもつタンパク質が種特異的な受精に関与することを示唆している。今後、さらなる機能解析を行う必要がある。2)に関して異種間受精するウスエダミドリイシとドーンミドリイシの異種間受精の可能性を野外の条件に近づけ検討した。3)に関して、1)の種特異的な抗原を持つタンパク質の複数種での比較をRNA-seqで行うため、サンプルの採集を行った。順調に進行していると考えられる理由として、1)受精に関与するたんぱく質の同定がほぼ出来たと考えられること、2)異種間受精する種がなぜ異種間受精能を保持しているか、その理由に迫れて来ていると予想できること、3)機能解析の具体的なプロトコールが出来たことが挙げられる。今後は、複数種での遺伝子単離を行う必要があるため、慎重に方法およびサンプルの採集時期などを検討する必要はある。

これは、瀬底に生息するドーンミドリイシでは配偶子の形成が活発でないことに起因するようであった。この理由として、ドーンミドリイシの生息密度がウスエダミドリイシに対して少ないことが関係する可能性があった。そこで、2)これらの種で実際に交雑が起きているかを検討するために、マイクロサテライト解析(Structure, NewHybridsなど)による浸透交雑の可能性を検討した。その結果、明確なF1,F2戻し交雑は検出できなかったが、交雑体であると思われる群体は多数検出した。従って、このような種では受精の種選択が曖昧で異種間で交雑がおきている可能性があった。そこで、交雑する2種間でこれまで、候補に上がっている配偶子認識タンパク質の配列を比較するためにRNA単離を行うサンプルを採集した。2019年度にこのサンプルでRNA-seqを行い比較検討する予定である。同定した配偶子認識タンパク質の、接着に関わると推察されるドメインの機能を解析できた。今後は、他の種や近縁種での遺伝子の探索および比較を行い、ミドリイシ属サンゴの配偶子認識からの生殖隔離機構の解明を進める。今後の研究の推進方策として以下の項目が挙げられる。1)機能解析を行うにあたり、複数種より遺伝子の単離を行うためRNA-seqを行うこと。これは、配偶子認識タンパク質が多型に富むため通常のTAクローニンングでは単離が困難であることがわかったためである。2)配偶子認識タンパク質の精子での詳細な局在の検討をするため、透過型電子顕微鏡を用いた免疫染色が必要であるため、こちらも筑波大学下田臨海実験所で解析を行う。3)配偶子認識タンパク質の競合阻害実験を行い、種特異的な配偶子認識タンパク質の受精への関与を調べる。今後は、RNA-seqを主に行いながら、目的タンパク質の多様性に関して研究を進めていく予定である。得られたデータより、分子進化解析なども行い、機能解析や配偶子認識タンパク質の進化をミドリイシ属サンゴの種分化とも絡めて検討していく予定である。予定よりも研究が進行したため、次年度にくりこした。大きな理由として、次年度にRNA-seqを行うため、費用を少しでも押さえておきたかったため。今年度は、繰越した金額を物品費及び解析費用として使用する。
オピオイド耐性の克服:二量体化オピオイド受容体における解析

本研究では二量体化オピオイド受容体の脱感作に与える影響を一量体受容体と比較検討し、各種オピオイド製剤の二量体化オピオイド受容体に対する反応性の違いを検討する。このことによって各種オピオイドの効果的な使用方法、オピオイド耐性形成における二量体受容体の役割を分子生物学的に明らかにした。(方法)1、μオピオイド受容体、δオピオイド受容体の細胞内局在の検討(共焦点レーザーによる受容体細胞内局在の検討)2、各種オピオイド製剤を使用し、受容体のinternalizationを可視化3、二量体化の証明。(共焦点レーザーを用いたFRET解析).(結果)1、モルヒネ刺激ではμオピオイド受容体はinternalizationを引き起こさなかった。一方、フェンタニル刺激ではinternalizationを引き起こした。2、μ-δヘテロ二量体化受容体では、モルヒネもフェンタニルと同様、受容体のinternalizationを引き起こした。3、μ-δヘテロ二量体受容体発現細胞においてモルヒネ、フェンタニルでinternalizationされた受容体は二量体であった。さらにGRK2、GRK4がμオピオイド受容体の脱感作に与える影響を検討した。(方法)クローン化μ受容体のC末端、ならびにGRK2,4のC末端にVenus,Ceruleanをそれぞれ連結したものを作製する。さらにμ受容体のN末にT7-Tag,GRK2,4のN末にFLAG-tagを導入しBHK細胞に発現させμ受容体の脱感作を検討した。(結果)GRK2はμ受容体の脱感作を引き起こし、GRK4は起こさなかった。現在日本において臨床で用いられているオピオイド製剤はモルヒネ、フェンタニル、オキシコドンの3剤である。今回のモルヒネ、フェンタニルでの検討に加えオキシコドンについても、オピオイド耐性と二量体化受容体との関連についてさらに検討していく予定である。二量体化オピオイド受容体の脱感作に与える影響を一量体と比較検討し、各種オピオイドの二量体化オピオイド受容体に対する反応性の違いを検討を行った。このことによって各種オピオイドの効果的な使用方法、オピオイド耐性形成における二量体受容体の役割を分子生物学的に明らかにしていきたい。私達はこれまでに(1)二量体化オピオイド受容体のみをアッセイするシステムの構築について以下の実験を行った。(1)受容体局在化、ならびにFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)アッセイに利用クローン化μ受容体のC末端、ならびにクローン化δ受容体のC末端に蛍光波長の異なる蛍光蛋白(Yellow fluorescent protein (YFP), Cyan fluorescent protein (CFP))をそれぞれ連結させたものを作製した。さらにμ受容体のN末にT7-tag遺伝子、δ受容体のN末にFLAG-tag遺伝子を導入した。(2)μ受容体、δ受容体にそれぞれ細胞内カルシウム動態をアッセイできるキメラ蛋白G_<qi5>を連結させた。(3)これらの融合クローンをBaby Hamster Kidney(BHK)cellに発現させ(1)(1)で作成したクローンを用いて受容体の細胞内局在を検討した。免疫蛍光組織化学ならびに共焦点レーザによる受容体細胞内局在ならびにウェスタンブロットによる受容体二量体化の確認を行った。(2)(2)で作成したクローンを用いて受容体刺激による細胞内カルシウム濃度上昇の可視化(カルシウムイメージング)を行った。次年度は(2)GRK4がμオピオイド受容体の脱感作に与える影響の解析(1)μオピオイド受容体の細胞内局在の検討(共焦点レーザによる受容体細胞内局在の検討)(2)FRETを用いたμオピオイド受容体・GRK4複合体化の検討(3)さらにμオピオイド受容体-YFP-G_<qi5>という3連結蛋白を用いて(作成済み、Functionalであることも確認)μオピオイド受容体-YFP-G_<qi5>とGRK4-CFPとの蛋白-蛋白複合体化とμオピオイド受容体の機能との関連、特に受容体の脱感作について細胞内カルシウム濃度上昇を指標として解析を行う予定である。(方法)クローン化

μ受容体のC末端、ならびにGRK2,4のC末端にVenus,Ceruleanをそれぞれ連結したものを作製する。さらにμ受容体のN末にT7-Tag,GRK2,4のN末にFLAG-tagを導入しBHK細胞に発現させμ受容体の脱感作を検討した。(結果)GRK2はμ受容体の脱感作を引き起こし、GRK4は起こさなかった。現在日本において臨床で用いられているオピオイド製剤はモルヒネ、フェンタニル、オキシコドンの3剤である。今回のモルヒネ、フェンタニルでの検討に加えオキシコドンについても、オピオイド耐性と二量体化受容体との関連についてさらに検討していく予定である。
ヒト口腔扁平上皮癌の発生過程における第3染色体短腕欠失の役割

1)我々は、マウス造腫瘍性口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3細胞に微小核細胞融合法を用いヒト正常第3染色体を移入し、16個の細胞クローンを単離した。それらの細胞クローンについて造腫瘍能と第3染色体短腕領域の相関性について検討した。その結果、3p25あるいは3p21.2-p21.3のいずれか一方の領域が移入されることにより、造腫瘍能が著しく抑制されることがわかった。したがって、これら2領域に口腔扁平上皮癌の発生や進展に関わる癌抑制遺伝子が存在することが強く示唆された。2) 20例の口腔扁平上皮癌組織を対象に3p25-pterの5領域のLOH解析を行った結果、20例中10例(50%)に少なくとも1領域のLOHが認められ、この領域上の遺伝子が本腫瘍の発生や進展に関与していることが示唆された。3)既に第3染色体短腕上より単離された癌抑制遺伝子候補の一つであるFHIT遺伝子について検討した。口腔癌由来の細胞株については3/15(20%)において異常を認めたが、口腔癌原発巣組織を対象にRNAレベルの発現をRT-PCR法を用いて解析した結果、すべての検体において正常な発現が確認された。これは、正常組織の混入のためなのか、これらの癌細胞では異常なかったのか不明のため、更なる検討が必要である。4)口腔扁平上皮癌由来の14種の細胞株を対象に第3染色体短腕上におけるホモ欠失領域について調査した。その結果、2種の細胞株において、FHIT遺伝子が位置している3pl4.2領域がホモに欠失していることがわかった。現在、今回認められたホモ欠失がFHIT遺伝子の異常に関与しているか検討中である。我々は、ヌードマウスに対する造腫瘍性を有する口腔偏平上皮癌細胞株HSC-3細胞に微小核細胞融合法を用いてヒト正常第3染色体を移入し、既に得たクローンも含め16個の細胞クローンを単離した。それらすべての細胞クローンについてQバンド分染法による染色体解析を行った結果、既に論文(Oncogene11:1197-2004,1995)で用いた1つのクローンのみが完全な状態でヒト第3染色体が移入されていることが解った。従って、他の15クローンは部分的に第3染色体が移入されていることになる。そこで、すべての細胞クローンよりDNAを抽出し,第3染色体短腕上に位置しているDNA多型性マーカーを用いたサザンブロット法、さらに、マイクロサテライトマーカーを用いたPCR法により移入された第3染色体短腕の領域を決定した。その結果、3クローンは第3染色体短腕の大部分が移入されていることが確認できたが、他の12クローンはごく一部しか移入されていないことが解った。さらに、それら16クローンのヌードマウスに対する造腫瘍性について調べたところ、一部しか移入されていないクローンのうち4クローンは親株とほぼ同様な造腫瘍能を有していたが、他の12クローンでは著しく造腫瘍能が抑制されていた。現在、造腫瘍能と移入された第3染色体短腕領域の相関性につい検討中である。また、既に第3染色体短腕上より単離された癌抑制遺伝子候補の一つであるFHIT遺伝子について検討した。口腔癌由来の15細胞株を対象にRNAレベルの発現異常をRT-PCR法を用いて解析した結果、12細胞株(80%)において正常な発現が確認されたが、残りの3細胞株(20%)では発現が認められなかった。今後、臨床検体を対象とした解析を行い、FHIT遺伝子の異常が口腔癌発生・進展に関与しているか否か明らかにしてゆく予定である。

1)我々は、マウス造腫瘍性口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3細胞に微小核細胞融合法を用いヒト正常第3染色体を移入し、16個の細胞クローンを単離した。それらの細胞クローンについて造腫瘍能と第3染色体短腕領域の相関性について検討した。その結果、3p25あるいは3p21.2-p21.3のいずれか一方の領域が移入されることにより、造腫瘍能が著しく抑制されることがわかった。したがって、これら2領域に口腔扁平上皮癌の発生や進展に関わる癌抑制遺伝子が存在することが強く示唆された。2) 20例の口腔扁平上皮癌組織を対象に3p25-pterの5領域のLOH解析を行った結果、20例中10例(50%)に少なくともl領域のLOHが認められ、この領域上の遺伝子が本腫瘍の発生や進展に関与していることが示唆された。3)既に第3染色体短腕上より単離された癌抑制遺伝子候補の一つであるFHIT遺伝子について検討した。口腔癌由来の細胞株については3/15(20%)において異常を認めたが、口腔癌原発巣組織を対象にRNAレベルの発現をRT-PCR法を用いて解析した結果、すべでの検体において正常な発現が確認された。これは、正常組織の混入のためなのか、これらの癌細胞では異常なかったのか不明のため、更なる検討が必要である。4)口腔扁平上皮癌由来の14種の細胞株を対象に第3染色体短腕上におけるホモ欠失領域について調査した。その結果、2種の細胞株において、FHIT遺伝子が位置している3pl4.2領域がホモに欠失していることがわかった。現在、今回認められたホモ欠失がFHIT遺伝子の異常に関与しているか検討中である。
ヒツジを用いた変形性関節症のモデル作出と治療の試み

初年度は羊の前十字靭帯切断による変形性関節症(骨関節炎、以下OA)モデルの作成を試みた。健康な羊に対し左膝関節の前十字靭帯切断術を実施し、4週ごとに関節液を採材し生化学的検索を行った。術後12週および24週に膝関節を採材し、関節面の肉眼的検索、組織学的検索および生化学的検索を行った。処置後の跛行のピークは48週であった。形態学的評価では、12週までに軟骨の変成や破壊およびそれに伴う骨の変形が起きているのが認められたが、12週と24週の差は大きなものではなかった。軟骨および関節液の生科学的検索では明らかな変動は認められなかった。以上の結果から、羊の前十字靭帯を切断することにより切断後12週目にはOAと考えられる病態が発生し、これがOAモデルとして適切であることを示すものであった。次年度はこのモデルを用い、ヒアルロン酸(HA)およびマトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤(MMPI)による、OAの進行に対する効果を比較した。左膝関節に十字靭帯切断術を行ったヒツジを4群に分け、それぞれ生理食塩水(Nacl群)、HA関節腔内(HA-ia群)、HA静脈内(HA-iv群)、およびMMPI(MMPI群)を、術後11週まで計13回投与した。術後12週まで初年度と同様の検索を行い、OA進行の程度を検討した。跛行スコアおよび生化学的評価では各群間に有意差は認められなかった。形態学的評価において、HA-iv群はNacl群よりも有意に低いスコアを示しており、軟骨の変性はあきらかに軽度であった。一方、HA-ia群の形態学的スコアはNacl群よりも若干低く、MMPI群はNacl群とほぼ同程度であった。以上の結果から、HAの静脈内および関節内投与はOAに対する有効な治療法であると考えられた。MMP阻害剤の関節腔内投与によるOAに対する有効な効果はほとんど認められなかった。当該年度は羊の前十字靭帯切断による変形性関節症(骨関節炎、以下OA)モデルの作成を試みた。健康な羊に対し左膝関節の前十字靭帯切断術(切断群)および右膝関節の膝関節包切開術(非切断群)を実施し、それぞれ術後12週問および24週間経過を追跡した。安楽死後に膝関節を採材し、関節面の肉眼的検索、組織学的検索および生化学的検索を行った。また4週ごとに関節液の採材を行い、生化学的検索を行った。対照群についてはいずれの手術も実施せず、同様の採材および測定を行った。処置後の跛行のピークは48週であり、その後はほぼ正常な歩行を示した。肉眼的な軟骨の評価では、軟骨の糜爛が切断群に多く認められ、特に脛骨側で顕著であった。また明らかな骨棘形成が術後12週目までに主に関節の辺縁部に認められた。組織学的にも軟骨層深層までの裂溝・糜爛、およびメタクロマジーの消失が切断群に多く認められ、細胞のクラスターも裂溝などの構造の変化が認められた部位に多く存在していた。しかし、12週と24週間の差は大きなものではなかった。一方、関節液量や総蛋白量は術後切断群が非切断群に対し有意に高値を示し、滑膜炎の存在を示唆した。しかし、関節液中の関節マーカーであるS-GAG量やMMP-1活性値では、実験期間を通じ切断群が非切断群よりも高値を示したものの、明らかな差は認められなかった。

以上の結果から、羊の前十字靭帯を切断することにより切断後12週目にはOAと考えられる病態が発生したことが明らかとなった。しかしその後の進行は緩やかであり、軟骨の修復が生じたものと考えられた。これらの病態は推移はOAの一つの特徴であり、これがOAモデルとして適切であることを示すものであった。現在この方法を用いて作成したOAモデルに対し、各種薬剤投与による予防法および治療法の検討を行っており、計画は順調に進行している。論文としての発表は現在準備中である。当該年度は、昨年に作成法を確立した前十字靭帯切断ヒツジ変形性関節症(OA)モデルを用い、関節軟骨の保護作用および抗炎症作用を持つとされる高分子多糖体であるヒアルロン酸(HA)および軟骨変性に主要な役割を果たすマトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤(MMPI)による、OAの進行に対する効果を比較した。左膝関節に前十字靭帯切断術を行った22頭のヒツジを4群に分け、それぞれ生理食塩水(NaCl群)、HA関節腔内(HA-ia群)、HA静脈内(HA-iv群)、およびMMPI(MMPI群)を、術後11週まで計13回投与した。術後4週ごとに跛行のスコアリングおよび左膝関節からの関節液採取を行い、生化学的検索を行った。術後12週に膝関節を採材し、関節面の肉眼的および病理組織学的評価からOA進行の程度を検討した。跛行スコアおよび関節液量、総蛋白量、グリコサミノグリカン量、MMP-1活性値の変動は各群間に有意な差は認められなかった。骨棘の肉眼スコア、軟骨の肉眼スコア、軟骨の組織スコアにおいて、NaCl群はいずれも高いスコアを示したのに対し、HA-iv群では軟骨の肉眼スコア、軟骨の組織スコアにおいてNaCl群よりも有意に低いスコアを示しており、軟骨の変性は軽度であった。しかし骨棘の肉眼スコアはHA-iv群でNaCl群よりも高いスコアを示していた。一方、HA-ia群の形態学的スコアはNaCl群よりも若干低く、MMPI群はNaCl群とほぼ同程度であった。以上の結果から、HA-iv群、HA-ia群の両方で、程度の差はあるものの軟骨変性制御と考えられる所見が形態学的に認められ、HAの静脈内および関節内投与はOAに対する有効な治療法であると考えられた。MMP阻害剤の関節腔内投与によるOAに対する有効な効果はほとんど認められなかった。
計算統計学に基づく効率的な大域的最適化アプローチの開発

今年度は(1)滑らかな関数の数値積分を目的とした準モンテカルロ法の理論と(2)大域的最適化手法である焼きなまし法への準モンテカルロ法の応用について研究した。(1)については、昨年度の成果をさらに発展させ、被積分関数の滑らかさに応じて最適な収束レートを達成するような決定的な点集合の構成法について研究した。従来知られていた構成法にhigher order polynomial lattice ruleというものがあったが、点集合の構成には滑らかさに応じて指数的な計算量が要求されるものであった。そこで、interlaced polynomial lattice ruleという方法を考え、最適な収束レートを達成できることを証明するとともに、この方法を用いれば滑らかさに応じて線形な計算量で点集合が構成できることを示した。また、higher order polynomial lattice ruleを用いた点集合の構成に要する計算量そのものを低減するために、tent変換と呼ばれる方法で点集合の配置を変えるというアプローチを考え、これによって良い点集合を構成するのに必要な計算量を減らせることを示した。以上の結果は、それぞれ論文にまとめ学術雑誌に投稿中である。一方、(2)に関する研究では、焼きなまし法と呼ばれる大域的最適解の探索アルゴリズムにおいて、解候補の提案ならびに受理・棄却の過程に準モンテカルロ法を用いることを考えた。理論的な解析を行い、入力に用いられる点集合がある十分条件を満たせば、決定的な入力によっても大域的最適解が得られる、という結果を得た。しかし、そのような十分条件を満たす点集合は存在しないことが文献上分かったため、現時点の試みでは成功していない。したがって、より詳細な解析を行い、満たすべき十分条件を弱められないか、といった検討が今後必要である。「研究実績の概要」に記した(1)については当初の計画以上に様々な新しい研究成果を得ることができ、複数の論文を投稿している。一方、(2)については現時点では否定的な研究成果しか得ていないが、これを受けて今後検討すべき具体的な項目をいくつか挙げることができた。以上から本研究はおおむね順調に進展したと考えている。焼きなまし法のような解探索アルゴリズムにおいて候補の提案ならびに受理・棄却に準モンテカルロ法を用いる、という研究においてはそもそも理論的な正当化が現状では困難である。今後の研究方策として、理論的解析だけでなく、実際に数値実験を行って、その結果から何らかの示唆を得る、という必要もあると考えられる。今年度は(1)最適化する関数が持つ可分離性を推定する手法の開発と(2)高次元単位立方体内に一様に分布する点列の構成法について研究した。(1)は高次元の最適化問題を互いに依存性のない複数の低次元の最適化問題に帰着させるための試みであり、(2)は大域的最適化において確率変数空間に一様な点列を発生させることで最適解の探索効率を改善することを目的としている。また、一様分布列はマルコフ連鎖モンテカルロ法にも用いられることから、焼きなまし法などの最適化アルゴリズムにおいて候補の提案にも用いることができると考えられる。ただし、これについては今後の研究課題である。今年度の成果は以下の通りである。(1)についてはANOVA分解で用いられる関数の分解公式を用いて、分離可能な関数が満たす必要十分条件を導出し、それに基づいて近似的に可分離性を推定するためのアルゴリズムを提案した。これは与えられた互いに素な変数の集合に対する可分離性の推定法であるが、このアルゴリズムを拡張して、可分離な変数の集合の数と各集合の要素を全て推定するアルゴリズムを提案した。また、(2)についてはL_2ディスクレパンシーという一様性を測る量に着目し、それを確率的に小さくするような点列の構成法とそれによって得られる点列に対するL_2ディスクレパンシーの上界について議論した。さらに、既存のよく知られる一様分布列をスクランブリングと呼ばれる方法でランダム化した場合に、L_2ディスクレパンシーの平均二乗偏差が最適な収束レートを達成できることを証明した。このように一様性の高い点列は大域的最適化への応用にも適していると考えらえる。以上の(1)と(2)の成果について、いずれも論文にまとめ投稿している。

理論的な解析を行い、入力に用いられる点集合がある十分条件を満たせば、決定的な入力によっても大域的最適解が得られる、という結果を得た。しかし、そのような十分条件を満たす点集合は存在しないことが文献上分かったため、現時点の試みでは成功していない。したがって、より詳細な解析を行い、満たすべき十分条件を弱められないか、といった検討が今後必要である。「研究実績の概要」に記した(1)については予定通りに研究が進展し、論文を投稿している。ただし、最適化する関数の性質を推定するという観点からはまだ一部分のみの理解であり、多峰性など他の性質について推定するアルゴリズムの開発を必要であると考えている。一方、(2)については当初の計画以上に理論、実装とも研究成果が挙げられた。以上から本研究はおおむね順調に進展していると言える。「研究実績の概要」に記した(1)については当初の計画以上に様々な新しい研究成果を得ることができ、複数の論文を投稿している。一方、(2)については現時点では否定的な研究成果しか得ていないが、これを受けて今後検討すべき具体的な項目をいくつか挙げることができた。以上から本研究はおおむね順調に進展したと考えている。おおむね順調に進んでいることから大幅な研究計画の変更はない。軽微な変更としては、当初考えていたように一様分布列をそのまま大域的最適化に用いるのではなく、焼きなまし法のような解探索アルゴリズムにおいて候補の提案ならびに受理・棄却に用いることにより、効率的な大域解の探索を行うようなアルゴリズムを考えている。したがって、その整合性を理論的に示すための数理的アプローチの考究に時間を費やすことが必要であり、実装は理論的検証を終えてから行う。焼きなまし法のような解探索アルゴリズムにおいて候補の提案ならびに受理・棄却に準モンテカルロ法を用いる、という研究においてはそもそも理論的な正当化が現状では困難である。今後の研究方策として、理論的解析だけでなく、実際に数値実験を行って、その結果から何らかの示唆を得る、という必要もあると考えられる。
プラーク細菌によるインプラント周囲炎の発現機構に関する研究

イヌの顎骨内に植立したオッセオインテグレイテッドインプラントの周囲組織に長期間プラークを自然に蓄積させ、その影響を臨床的、細菌学的に検索する目的で行った。成犬4頭を用い、下顎左右前臼歯の抜去3ヶ月後にBranemark implant(BR)、Integral implant(IN)を8本埋入した。3ヶ月にアバットメントを連結し、プラークコントロールを1ヶ月行い上部構造を装着した。対照歯として左右第一後臼歯を選択した。この時点から、プラークコントロールを中止した。臨床検査、X線診査、細菌学的検索は上部構造装着時、3ヶ月、6ヶ月後に行った。臨床検査で行ったProbing、Plaqueindex、プロービングによる出血陽性率は、どの群も3ヶ月後に増加し、高い値を示していた。動揺度に顕著な変化は見られなかった。またX線所見において、明らかな骨吸収像は認めなかった。1.すべてのインプラントは、インプラント周囲組織に著しい炎症性細胞浸潤を認め、歯槽骨頂部は骨吸収を生じていた。しかし、骨髄組織への炎症性細胞浸潤は観察されなかった。2.対照歯では、プラーク沈着による歯周組織変化は認められなかった。3.プラーク細菌は、インプラント周囲組織に対して組織破壊因子として作用する可能性が示唆された。4.リガチャーによるプラーク沈着の助長を行わず、プラーク沈着のみにより誘発されたperi-implantitisにおいても、長期観察により、プラーク細菌により更なる骨吸収が進行することが考えられる。プラークとインプラント周囲炎との関連性に関しては、あまり検索が進んでいない。したがって、インプラントに対し、プラーク細菌はあまり関与していないとする報告もある。一方、荷重に起因する骨喪失においてはインプラント周囲溝内のプラーク関与は少なく、インプラント周囲の軟組織に臨床的炎症兆候はみられない。このインプラント周囲の病変は力学的過剰荷重が原因である。過剰荷重と感染が同時に存在する場合にインプラント周囲の骨喪失が加速されるか否かは、現在の所不明である。そこで、本研究はまずインプラント周囲組織にプラーク細菌が及ぼす影響について検索する。この研究は3年間にわたるものであり、初年度である平成8年度は実験系の確立にある。実験方法としては、実験動物として体重16kg前後の雑種成犬4頭を用いた。下顎の両側第3・4前臼歯を抜歯し、インプラント埋入母地とした。実験に使用したインプラントはBranemark implant(以下BR)およびIntegral implant(以下IN)の2種類、対照として天然歯の第1後臼歯を用いた。抜歯3カ月後にBRおよびINの各インプラント計8本ずつ埋入した。下顎両側にそれぞれ2本を並行に埋入した。術直後、感染予防の目的で懸濁水性マイシン注NZ0.05ml/kgを筋肉内注射した。インプラント埋入後8週にヒーリングスクリューを除去し、アバットメントを装着した。その後は1wに1回軟毛の歯ブラシと0.12%クロルヘキシジンにてプラークコントロールを行い、1カ月後ブリッジタイプの上部構造を装着した。その後6カ月間プラークコントロールを中止した。その間、犬には、プラークを堆積させる目的で軟食を与えた。臨床的診査はPlaque Index(PLI)、Mobility(MO)はPeriotestを用いた。Probing depth(PD)は歯週ポケット自動計測器を用いた。Bleeding onprobing(BOP)はプロービング時の出血の有無を記録した。イヌの顎骨内に植立したオッセオインテグレイテッドインプラントの周囲組織に長期間プラークを自然に蓄積させ、その影響を臨症的、細菌学的に検索する目的で行つた。成犬4頭を用い、下顎左右前臼歯の抜去3カ月後にBranemark implant(BR),Integral implant(IN)を8本埋入した。3カ月にアバットメントを連結し、プラークコントロールを1カ月行い上部構造を装着した。対照歯として左右第1後臼歯を選択した。

この時点からプラークコントロールを中止した。臨床検査、X線診査、細菌学的検索は上部構造装着時、3カ月、6カ月後に行つた。臨床検査で行つたProbing,Plaqueindex,プロービングによる出血陽性率は、どの群も3カ月後に増加し、高い値を示していた。動揺度に顕著な変化はみられなかつた。またX線所見において、明らかな骨吸収像は認めなかつた。細菌学的検索において、BR,IN,天然歯の細菌叢に大きな違いはなく、形態学的観察において球菌の割合は、装着時にBR-64%、IT-86%が、6カ月後にBR-38%、IN-54%、天然歯-52%と低下した。運動性菌の割合はBRが4%から19%に、INは0.8%から15%に、天然歯は1.5%から14%に上昇した。培養法におけて、黒色色素産性グラム陰性桿菌の割合はBRは11%から28%に、INは11%から17%に、天然歯では7%から23%に上昇した。A.actinomycetemcomitans類似菌は、検出されなかつた。以上の結果から、インプラント周囲組織は天然歯と比較してプラークの蓄積に対し破壊されやすい可能性、天然歯の歯肉溝の細菌はインプラントサルカスの細菌に影響を及ぼす可能性が示唆された。イヌの顎骨内に植立したオッセオインテグレイテッドインプラントの周囲組織に長期間プラークを自然に蓄積させ、その影響を臨床的、細菌学的に検索する目的で行った。成犬4頭を用い、下顎左右前臼歯の抜去3ヶ月後にBranemark implant(BR)、Integral implant(IN)を8本埋入した.3ヶ月にアバットメントを連結し、プラークコントロールを1ヶ月行い上部構造を装着した.対照歯として左右第一後臼歯を選択した.この時点から、プラークコントロールを中止した.臨床検査、X線診査、細菌学的検索は上部構造装着時、3ヶ月、6ヶ月後に行った.臨床検査で行ったProblng、Plaque index、プローピングによる出血陽性率は、どの群も3ヶ月後に増加し、高い値を示していた.動揺度に顕著な変化は見られなかった.またX線所見において、明らかな骨吸収像は認めなかった.1.すべてのインプラントは、インプラント周囲組織に著しい炎症性細胞浸潤を認め、歯槽骨頂部は骨吸収を生じていた.しかし、骨髄組織への炎症性細胞浸潤は観察されなかった.2.対照歯では、プラーク沈着による歯周組織変化は認められなかった.3.プラーク細菌は、インプラント周囲組織に対して組織破壊因子として作用する可能性が示唆された.4.リガチャーによるプラーク沈着の助長を行わず、プラーク沈着のみにより誘発されたperl-implantitisにおいても、長期観察により、プラーク細菌により更なる骨吸収が進行することが考えられる。
顎関節におけるRANKL/Fasシグナルクロストークによる骨・軟骨破壊の制御

本研究の目的はRANKL刺激により活性化した樹状細胞を関節リウマチモデルマウスに移入し関節病態への影響を解析することである。In vivoにおける結果として、RANKL刺激樹状細胞を関節炎モデルマウスに繰り返し移入するとT細胞のアポトーシス亢進や自己免疫性関節リウマチの病態抑制効果がみられた。これらの結果より自己免疫性関節リウマチの病熊形成機構にRANKLシグナルが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。関節リウマチ(RA)は顎関節を含む全身の関節における骨破壊を主徴とする炎症性疾患であるが、その病態形成機構については不明な点が多い。本研究ではRA自然発症モデルFas欠損MRL/lprマウスの樹状細胞(DC)の機能を詳細に解析するとともに、DC活性化因子であるRANKLシグナルを介したDCの活性化機構を明らかとすることを目的とした。さらに、MRL/lprマウスにRANKL刺激DCを移入することによる関節病変への影響についても検討した。IL-4, GM-CSFにてマウス骨髄細胞からDCを誘導し、RANKL刺激によるDC表面上の各種マーカー(MHC ClassII, CD86, CD80)、細胞内のシグナル分子、および各種サイトカイン産生能について検討した。また、MRL/lprマウスに蛍光標識したDCを移入後、経時的に各臓器への移入DCの集積状況の解析や膝関節および顎関節の病理組織学的検索を行った。MRL/lprマウスDCをRANKLで刺激するとDC活性化の指標であるMHC ClassII, CD86,およびCD80発現の亢進がみられ、抗アポトーシス分子(Bcl-2, Bcl-xL)の発現とNF-κB(p 65, p 50)活性が亢進された。さらに、RANKL刺激DCをMRL/lprマウスに移入すると骨破壊を伴うRA病変の増悪が観察された。MRL/lprマウスのRA病態形成にDCの機能異常が重要な役割〓果たしていることに加え、DCの末梢での維持機構にRANKLおよびFasシグナルのクロストークが関与〓ていることが示唆された。関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis : RA)は顎関節を含む全身の関節における骨破壊を主徴とする自己免疫疾患であるが、その病態形成機構については不明な点が多い。最近、RAマウスモデルであるFas欠損MRL/1prマウスの病態形成においてRANKLシグナルにより活性化した樹状細胞が重要な役割を果たすことを報告したが、活性化した樹状細胞がRA病態においてT細胞をどのように制御しているかはまだよくわかりていない。そこでRANKL刺激により活性化した樹状細胞をRAモデルマウスに移入しT細胞の機能解析を行うとともにRA病態への治療効果について検討した。RANKL刺激により活性化した樹状細胞をRAモデルに移入するとMRL/1prマウスの病理所見である脾腫や鼡径部リンパ節腫脹の軽減がみられ、フローサイトメトリー解析によりCD4陽性T細胞のアポトーシス亢進を認めた。さらに、どのようなアポトーシス関連分子が関与しているかを同定するためにリアルタイムPCRアレイにてRANKL刺激による活性化MRL/1prマウス樹状細胞移入群と対照群のT細胞を解析したところ、TRAILレセプター、TRAF-3、Caspase 8などのアポトーシス関連遺伝子発現が2倍以上増加していることが判明した。これらの結果よりRA病態における末梢での活性化樹状細胞によるT細胞維持機構にはFasシグナル非依存的にTRAIL-R/TRAILシグナルを介したアポトーシスを誘導する新規経路が存在する可能性が明らかとなった。
炭酸脱水酵素を利用した選択的二酸化炭素捕捉水和触媒の開発と固体炭酸への転換

大気又は排出CO2を固体炭酸として貯蔵するCCS技術が注目を浴び低コストを実現する触媒開発が待望される.本研究ではCaCO3を主成分とする貝殻の形成にCa2+結合型炭酸脱水酵素が関与することに着目,本酵素の3つの性質「低濃度CO2選択的捕捉する特異性/高いCO2水和触媒能/Ca2+結合能」による貝殻形成に係る仕組みが適切に模倣されれば,CO2を効率的にCaCO3結晶に転換する仕組みを開発することが可能となる.今回,高活性酵素変異体と新たに見出した結晶析出法を利用,固体炭酸形成反応を高効率化し,同時に本酵素触媒機構から中心的機能を抽出し,実用性の高い触媒モジュール開発を目的とする研究を行った.大気又は排出CO2を固体炭酸として貯蔵するCCS技術が注目を浴び,低コストを実現する触媒開発が待望される.しかし安価なCa2+をうまく利用する方法がない.そのような中本研究は,CaCO3を主成分とする貝殻の形成に貝由来Ca2+結合型炭酸脱水酵素(Nacrein)が関与することに着目する.本酵素の性質「低濃度CO2選択的捕捉特異性/高CO2水和触媒能/Ca2+結合能」による貝殻形成に係る仕組みが適切に模倣されれば,CO2を効率的にCaCO3結晶に転換する仕組みを開発することが可能となる.今回高活性酵素変異体と報告者が見出した結晶析出方法を利用して固体炭酸形成反応を高効率化すること,同時にこれまでに明らかとした本酵素の触媒機構から中心的機能を抽出することで,実用性の高い触媒モジュール開発を目的とする研究を行う.Nacreinは炭酸脱水酵素様触媒反応部位(約300残基)とCa2+結合部位(CaB(約100残基))からなるが,本年度,報告者は,大腸菌遺伝子大量発現系を用いて15N安定同位体標識されたCaB(15N-CaB)を取得した.そのNMR測定の結果,シグナルの散らばり具合の低いスペクトルを得られたことから,明らかな2次構造をもたないと考えられた.その一方,Ca2+の有無によって異なるケミカルシフトをもつシグナルが幾つか存在することがわかった.現在、そのシグナルの変化を基に結合に関する情報を抽出する.計算科学的手法を用いた炭酸脱水酵素触媒反応部位モデルの解析では,亜鉛結合水と亜鉛結合ヒドロキシド,イミダゾール基の三態とその回転,そしてそのイミダゾールと他の芳香環との間の相互作用を考慮することによって,2つの芳香環のπ-stackingの影響下そのイミダゾール基の回転が水素結合を引き千切るために必要とされるエネルギーの値を初めて理論的に算出するに至った.これによって,二酸化炭素水和反応に先んじる水の解離によって生成されるプロトンが放出される経路の全貌がさらに露となった.大気又は排出CO2を固体炭酸として貯蔵するCCS技術が注目を浴び低コストを実現する触媒開発が待望される.本研究ではCaCO3を主成分とする貝殻の形成にCa2+結合型炭酸脱水酵素が関与することに着目,本酵素の3つの性質「低濃度CO2選択的捕捉する特異性/高いCO2水和触媒能/Ca2+結合能」による貝殻形成に係る仕組みが適切に模倣されれば,CO2を効率的にCaCO3結晶に転換する仕組みを開発することが可能となる.今回,高活性酵素変異体と新たに見出した結晶析出法を利用,固体炭酸形成反応を高効率化し,同時に本酵素触媒機構から中心的機能を抽出し,実用性の高い触媒モジュール開発を目的とする研究を行った.大気又は排出CO2を固体炭酸として貯蔵するCCS技術が注目を浴び,低コストを実現する触媒開発が待望される.しかし安価なCa2+をうまく利用する方法がない.そのような中本研究は,CaCO3を主成分とする貝殻の形成に貝由来Ca2+結合型炭酸脱水酵素(Nacrein)が関与することに着目する.本酵素の性質「低濃度CO2選択的捕捉特異性/高CO2水和触媒能/Ca2+結合能」による貝殻形成に係る仕組みが適切に模倣されれば,CO2を効率的にCaCO3結晶に転換する仕組みを開発することが可能となる.今回高活性酵素変異体と報告者が見出した結晶析出方法を利用して固体炭酸形成反応を高効率化すること,同時にこれまでに明らかとした本酵素の触媒機構から中心的機能を抽出することで,実用性の高い触媒モジュール開発を目的とする研究を行う.本年度までに,報告者は,人工遺伝子合成法を用いて貝由来Ca2+結合能をもつCaBの遺伝子を合成し,分子生物学的手法を用いてこの遺伝子を有する大腸菌遺伝子大量発現系を構築,またhCAIIループのコード領域にこの遺伝子を挿入,より高いCO2水和活性をもつhCAII-CaBキメラの遺伝子を作成した.一方, hCAIIより4.8倍高機能なhCAIIY7F変異体遺伝子を作成し,これらの発現系をCaB同様に構築,CA阻害剤等を結合させたアフィニティーカラムによってそれぞれ蛋白質調製系を確立,収量>30mg精製標品/1L培養の系を作成し,安定同位体標識CaBを得ることによってその構造情報を取得した.また,提供を受けた中空糸繊維を用いてナノバブルCO2溶液作成を行い,CO2濃度を水酸化バリウム-逆滴定法によって決定する系を確立,分光学的手法による酵素活性測定系を構築した.現在これらすべての系を組み合わせることによって大気中CO2を固体炭酸に転換する手法の効率化を図る.大気又は排出CO2を固体炭酸として貯蔵するCCS技術が注目を浴び,低コストを実現する触媒開発が待望される.しかし,安価なCa2+をうまく利用する方法がない.