hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
椎弓根スクリュー挿入による胸椎椎体内海綿骨への影響に関する研究

【目的】Pedicle screwを用いた脊椎後方固定術は、脊椎損傷や脊椎疾患の治療に広く使われているが、最近screw looseningやscrew breakage等の合併症も多く報告されてきている。本研究の目的は、pedicle screwingの結果起こる椎体及び椎体内海綿骨の状態を、海綿骨strainの計測により検討することである。【結果】Screw挿入前の海綿骨strain分布は椎体内全域にまだらに存在したが、相対的に均一であった。Screw挿入後はhigh strainがscrewの周囲に集中し、特にscrew先端部周囲で顕著であった。Screw抜去後のstrainは、screwが存在していた部に集中していた。Screw挿入後と抜去後のmean compressive strainsのhigh rangeは、screw挿入前よりも有意に高値であった。Mid rangeとlow rangeは3群間で有意差を認めなかった。【考察】本研究により、pedicle screw挿入後にpedicle screwに接する周囲の海綿骨strainが著明に増大すること、screw抜去後はhigh strainが、screwが存在していた部に集中していたことが示された。これらは、pedicle screwingは椎体内海綿骨に局所的な歪みをもたらすこと、screw抜去後の部位が予想以上に脆弱化を呈することを示唆した。また他に、国内の関連学会、日本整形外科基礎学術集会、日本パラプレジア学会に参加し、情報収集行った。
新規徐放性ナノゲルを用いた線維芽細胞増殖因子による骨再生法の開発と分子機構の解明

Fibroblast Growth Factor (FGF)18は、個体発生において骨や軟骨の細胞分化を促進し、骨の形態形成を制御する。FGF18が骨再生促進因子として応用可能かどうか検討するために、京都大学大学院、秋吉一成教授より提供された新規ナノゲル(CHPOAナノゲル)にFGF18とBMP2を含有させ作製したハイドロゲルを頭蓋冠骨欠損マウスモデルに適用し、マイクロCTにて経時的に骨欠損部の骨再生を観察した。その結果、FGF18をBMP2と併用すると、BMP2単独に比べ、骨再生が増強されることを明らかになった。また、骨欠損作製時にアリザリンレッドで、8週後屠殺前にカルマインにて骨をラベリングし、・組織学的に検討すると、FGF18をBMP2に併用した場合に厚い新生骨形成が観察された。さらに、FGF18の骨再生促進に関連する分子を検索するため、免疫組織学的に、骨芽細胞の局在と血管新生、細胞増殖との関連性について検討を行ったところ、BMP2単独に比べ、FGF18を併用すると、新生骨の近傍にPECAM-1陽性の血管内皮細胞とPCNA陽性の骨芽細胞が散見され、FGF18が血管新生を誘導し、新生骨形成に関与する骨芽細胞の増殖を促進している可能性が示唆された。本研究を通じ、FGF18とBMP2を持続的に局所に作用させるドラッグデリバリーシステム、また骨再生のスキャフォールドとして、新規徐放性ナノゲル(CHPOAナノゲル)は有用であることが明らかとなった。今後、本研究をさらに発展させることで、将来的にヒトの骨欠損症例に対する骨再建治療の選択肢として応用できる可能性が示された。Fibroblast Growth Factor(FGF)18が個体発生過程において軟骨芽細胞や骨芽細胞の分化を促進し、骨格形成をコントロールするという生物学的機能、また、骨組織の発生過程でFGF18と協同的に働くBMPファミリーに注目し、BMP2依存的な骨修復現象に対するFGF18の生物学的作用について検討した。FGF18、BMP2を局所に効果的に作用させる方法として、京都大学大学院、秋吉一成教授により開発されたドラッグデリバリーに有用な新規ナノゲル(CHPOAナノゲル)を利用した。4週齢C57BL/6マウス頭頂骨欠損モデルを作製後、PBS、FGF18、BMP2、FGF18+BMP2を含むナノゲル架橋ゲルを欠損部位に適用し、マイクロCTによって非侵襲的に骨修復の経時的な観察を行ない、これら4群を比較検討した。その結果、FGF18単独群はPBS群に比べ骨修復能の有意な促進はなかった。BMP2単独群では有意に骨修復が促進されたものの、修復能の個体間バリエーションが大きかったのに対し、FGF18+BMP2併用群では個体間バリエーションが減少し、全体として有意に骨修復効果および効率の改善がみられた。また、術後8週後に行なった組織学的評価では、FGF18+BMP2併用群で、骨梁様構造、骨髄様構造を伴う顕著に厚い新生骨が観察され、FGF18はBMP2と協同的に骨修復促進に働くことに加え、支持組織としての骨組織構造を再構築する可能性が示唆された。このようなFGF18の新しい機能は、単純に幼弱な骨組織の増加のみにとどまらない形態的、機能的に有用な骨修復を誘導する機能タンパクとして重要な役割を果たすことが期待される。今後は、詳細な分子機構の解明を目標として研究を進めていく予定である。新規ナノゲルシステムを応用することにより、FGF18がBMP2依存的な骨修復能の有意に改善することを示すことができた。よって、おおむね順調に研究成果が得られたと評価する。

今後は、マウス頭蓋冠欠損モデルでみられたFGF18のBMP2依存的な骨修復における協同的な作用機序を明らかにするため、各種細胞増殖マーカー、骨関連マーカー、各種シグナル因子の発現量、パターンを分析し、詳細な分子機構を解明する予定である。
小胞体膜結合性転写因子ATF6の細胞内ダイナミックス

ATF6は、小胞体に埋め込まれた形で恒常的に発現している膜結合性転写因子であり、小胞体ストレス下で小胞体内に高次構造の異常なタンパク質が蓄積するとプロテオリシスを受けて活性化される。つまり、切断されて膜から遊離した細胞質側の転写因子ドメインが核へ移行して主として小胞体シャペロンをコードする遺伝子の転写を促進する。この結果、誘導された小胞体シャペロンの作用により小胞体内の恒常性が維持される。これまでにATF6の切断がセリンプロテアーゼ阻害剤AEBSFにより阻害されることを見いだしていたが、他のグループにより、ATF6はゴルジ装置に存在するS1P(セリンプロテアーゼ)とS2P(メタロプロテアーゼ)による連続的な切断を受けて活性化されることが報告された。これは、ATF6が小胞体ストレスに応答して小胞体からゴルジ装置へ移行することを意味している。また一般に、高次構造の異常なタンパク質は小胞体に留められていると考えられている。そこで、小胞体ストレス下でATF6は異常タンパク質とは選別されて輸送されるのかどうか明らかにするために、まず小胞体ストレスに応答して小胞体からゴルジ装置へ移行するATF6と緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質GFP-ATF6を作成した。折り畳み状況をモニターする基質として、温度感受性のウィルス糖タンパク質VSV-Gtsを解析した。VSV-Gtsは39°Cでは折り畳まれないために小胞体内に蓄積するが、32°Cにすると折り畳まれてゴルジ装置を経て細胞表面に到達した。このときGFP-ATF6は39°C、32°Cともに小胞体に局在したままであった。39°Cから32°Cに温度を下げるときに、1mMのジチオスレイトールを投与して小胞体ストレスを与えると、GFP-ATF6は小胞体からゴルジ装置へと輸送されたが、VSV-Gtsの場合は折り畳みが阻害されて、小胞体に留まったままであった。以上の結果から、ATF6と高次構造の異常なタンパク質との選別が確かに行われていることが実証された。今後は、この選別の仕組みを明らかにしていきたいと考えている。
慢性萎縮性胃炎における特異抗体産生細胞の同定とその意義づけ

慢性萎縮性胃炎の病因として、Helicobacter pylori感染が提唱されている。腸上皮化生巣では本菌の感染所見を認めない。本研究は、慢性萎縮性胃炎におけるH.pyloriに対する特異抗体産生の場を「酵素抗原法」を用いて証明することを目的とした。【材料・方法】胃粘膜の新鮮凍結片ないしアルデヒド固定凍結切片を対象とした。標識菌抗原の作製には、3つのアプローチがとられた。a)本菌よりureaseを精製しビオチン化する。b)ureaseのアミノ酸配列からビオチン化ポリペプチドを化学合成する。c)マルトース結合蛋白(MBP)と菌蛋白のリコンビナント蛋白を作製する。【結果】材料の収集やH.pyloriの組織化学的証明は、順調に行われた。しかし、標識抗原の作製に予想以上の困難が経験された。当初予定したa)およびb)の方法は、手技および抗原安定性からみて、不適切だった。菌粗抽出物をビオチン化し、preliminaryな酵素抗原法手技の検討が行われたが、特異的陽性像は得られなかった。c)では、MBP-vectorに本菌由来のDNAを挿入し、融合蛋白を大腸菌に発現させた。抗H.pylori抗体陽性患者血清と反応性を示したリコンビナント蛋白の1つ(分子量約60kD)を標識抗原とし、HRP標識抗MBP抗体(既に調整済み)を2次抗体とする酵素抗原法が試された。結果は残念ながら、陰性だった。【反省点】本研究の最大の特長は、従来、形態学的研究にほとんど応用されてこなかった「酵素抗原法」により、慢性胃炎粘膜および腸上皮化生における特異的抗体産生細胞の局在を観察する点にあった。「酵素抗原法」の導入には、安定した標識抗原と着実な組織化学的技法の確立が重要であるが、この点、今回の計画は少々楽観的にすぎたと思われ、大いに反省している。現在、リコンビナント蛋白の作製を含め、一からやり直している。日本人成人胃粘膜に高頻度に観察される慢性萎縮性胃炎の成因の有力候補として、Helicobacter pylori感染が提唱されている。我々は従来慢性萎縮性胃炎の局所免疫機構を追究し、慢性萎縮性胃炎の終末細織像として観察される腸上皮化生が、持続する炎症に対する胃粘膜の適応現象であると提唱してきた。即ち、分泌型IgAを介する局所免疫機構は、腸上皮化生を欠く慢性萎縮性胃炎粘膜では十分に機能していないのに対して、腸上皮化生を粘膜では極めて効率的に作動しているのである。本年度は、慢性萎縮性胃炎における抗原性物質としてH.phloriを想定し、本菌に対する特異抗体が胃粘膜のどの部位でどのように産生されるのかを、「酵素抗原法」を用いて証明するための基礎技術を検討した。多数例のヒト胃生検粘膜を組織学的に観察すると、H.pylori感染は、好中球浸潤の目立つ非化生性胃粘膜に限って認められ、腸上皮化生粘膜表面には全くみられないことが極めて特徴的であった。このことは、腸上皮化生粘膜においては、H.pyloriに対する分泌型IgAを介する局所免疫が成立している可能性をつよく示唆している。

「酵素抗原法」(標識抗原により、これに対する特異抗体産生部位を同定する組織化学的手法)のための標識抗原の作製には、予想以上の困難が経験された。培養H.pylori粗抽出物(ビチオン化)を抗原として、preliminaryな手扱的検討を行ったが、今のところ十分な特異性を示す成績は得られていない。現在、H.pyloriの抗原、とくにureaseの純化、標識を検討中である。また、大腸菌の系を用いたmaltose-linding proteinとH.pylori構成蛋白とのリコンビナント蛋白(fusion protein)の作製を計画している。慢性萎縮性胃炎の病因として、Helicobacter pylori感染が提唱されている。腸上皮化生巣では本菌の感染所見を認めない。本研究は、慢性萎縮性胃炎におけるH.pyloriに対する特異抗体産生の場を「酵素抗原法」を用いて証明することを目的とした。【材料・方法】胃粘膜の新鮮凍結切片ないしアルデヒド固定凍結切片を対象とした。標識菌抗原の作製には、3つのアプローチがとられた。a)本菌よりureaseを精製しビオチン化する。b)ureaseのアミノ酸配列からビオチン化ポリペプチドを化学合成する。c)マルトース結合蛋白(MBP)と菌蛋白のリコンビナント蛋白を作製する。【結果】材料の収集やH.pyloriの組織化学的証明は、順調に行われた。しかし、標識抗原の作製に予想以上の困難が経験された。当初予定したa)およびb)の方法は、手技および抗原安定性からみて、不適切だった。菌粗抽出物をビオチン化し、preliminaryな酵素抗原法手技の検討が行われたが、特異的陽性像は得られなかった。c)では、MBP-vectorに本菌由来のDNAを挿入し、融合蛋白を大腸菌に発現させた。抗H.pylori抗体陽性患者血清と反応性を示したリコンビナント蛋白の1つ(分子量約60kD)を標識抗原とし、HRP標識抗MBP抗体(既に調整済み)を2次抗体とする酵素抗原法が試された。結果は残念ながら、陰性だった。【反省点】本研究の最大の特長は、従来、形態学的研究にほとんど応用されてこなかった「酵素抗原法」により、慢性胃炎粘膜および腸上皮化生における特異的抗体産生細胞の局在を観察する点にあった。「酵素抗原法」の導入には、安定した標識抗原と着実な組織化学的技法の確立が重要であるが、この点、今回の計画は少々楽観的にすぎたと思われ、大いに反省している。現在、リコンビナント蛋白の作製を含め、一からやり直している。
結び目不変量の研究

結び目,絡み目の位相不変量,特に,Vassiliev不変量についての研究を行なった.まず,3次元空間内の結び目のVassiliev不変量の一般化として4次元空間内の2次元結び目について次のような研究を行なった.2次元リボン結び目は3次元空間への射影の特異点集合が2重曲線だけからなるような2次元結び目である.したがって,1次元結び目に対してVassiliev不変量を定義したような方法で2次元リボン結び目に対してもこのような射影を使うことによってVassiliev不変量を定義することができる.葉広,志摩との共同研究では,正規化したアレキサンダー多項式をテイラー展開して得られる不変量が,ここで定義したVassiliev不変量になることを証明した.さらに,葉広,志摩は,これらの不変量がすべて2次元リボン結び目のVassiliev不変量になることを示した.また,1次元リボン結び目の位数2のVassiliev不変量を調べることにより,位数2のVassiliev不変量について,1次元結び目のときのように回帰的に計算して得られることを示した.これは,高次元結び目のアレキサンダー多項式が回帰的な方法で得られるか,という問題の部分的な解答になっている.(この問題は,高次元結び目に対して,ジョーンズ多項式のようなアレキサンダー多項式以外の新しい不変量の可能性を尋ねる問題に発展する.)また,1次元の結び目や絡み目のVassiliev不変量がなす低い次元の空間について,その基底を調べたが,特にその応用として,HOMFLY多項式のある特殊値を部分絡み目の絡み数を使って表わすことができた.これは,Hosteの公式,および,Lickorish-Millettの公式の両方の一般化となっている.結び目,絡み目の位相不変量,特に,Vassiliev不変量についての研究を行なった.まず,3次元空間内の結び目のVassiliev不変量の一般化として4次元空間内の2次元結び目について次のような研究を行なった.2次元リボン結び目は3次元空間への射影の特異点集合が2重曲線だけからなるような2次元結び目である.したがって,1次元結び目に対してVassiliev不変量を定義したような方法で2次元リボン結び目に対してもこのような射影を使うことによってVassiliev不変量を定義することができる.葉広,志摩との共同研究では,正規化したアレキサンダー多項式をテイラー展開して得られる不変量が,ここで定義したVassiliev不変量になることを証明した.さらに,葉広,志摩は,これらの不変量がすべて2次元リボン結び目のVassiliev不変量になることを示した.また,1次元リボン結び目の位数2のVassiliev不変量を調べることにより,位数2のVassiliev不変量について,1次元結び目のときのように回帰的に計算して得られることを示した.これは,高次元結び目のアレキサンダー多項式が回帰的な方法で得られるか,という問題の部分的な解答になっている.(この問題は,高次元結び目に対して,ジョーンズ多項式のようなアレキサンダー多項式以外の新しい不変量の可能性を尋ねる問題に発展する.)また,1次元の結び目や絡み目のVassiliev不変量がなす低い次元の空間について,その基底を調べたが,特にその応用として,HOMFLY多項式のある特殊値を部分絡み目の絡み数を使って表わすことができた.これは,Hosteの公式,および,Lickorish-Millettの公式の両方の一般化となっている.ホンフリー多項式の係数多項式の一つである河内が定義したC多項式については,河内がすでにその特徴付けをおこなっている.つづいて,藤井は2本橋結び目で,すでに特徴付けられることを示した.ところで,藤井の与えた2本橋結び目のC多項式の公式をよくみると,実際には,丸本が与えたフュージョン数が1の2次元リボン結び目のアレキサンダー多項式の公式と変数を除いて一致することがわかる.2次元リボン結び目のアレキサンダー多項式の特徴付けは樹下が示しているが、藤井と丸本の公式から,藤井の2本橋結び目のC多項式の特徴付けからも得られることがわかる.また,その逆もいえる.さらに,C多項式が結び目のVassiliev不変量であることから,2次元リボン結び目のアレキサンダー多項式をC多項式と同じように正規化すると,Vassiliev不変量に似た性質をもつことが予想される.実際,リボン結び目の3次元空間へのダイアグラムは特異点が2重点のみからなり,1次元の結び目と同様にVassiliev不変量が定義できて,正規化したアレキサンダー多項式の高階の微分係数がVassiliev不変量になることが証明できた.このことについては,独立に葉広と志摩がおこなっており,彼らはさらに,ここでのリボン結び目のVassiliev不変量がアレキサンダー多項式から得られるものに限ることも示している.2次元の結び目,絡み目の位相不変量,特に,Vassiliev不変量に関する研究の結果を述べる:葉広,志摩との共同研究で,1次元結び目に対してVassiliev不変量を定義したように射影を用いて2次元リボン結び目に対してVassiliev不変量を定義し,正規化したアレキサンダー多項式をテイラー展開して得られる不変量がVassiliev不変量になることを示した.

さらに,位数2のVassiliev不変量について,1次元結び目のときのように回帰的に計算して得られることを示した.次に,1次元の結び目,絡み目の位相不変量についての研究の結果を述べる:絡み目のHOMFLY多項式やKauffman多項式を係数多項式の和によって表わしたとき,最初の係数多項式はその各成分の部分結び目の最初の係数多項式と絡み数によって表わすことができることがLickorish-Millettによって知られている.これを一般化して,HOMFLY多項式,Kauffman多項式の2番目,3番目の係数多項式について同様の公式を導いた.また,HOMFLY多項式の係数多項式の特殊値であるConway多項式の最初の係数については,絡み数によって表わすことができることが,Hosteによって知られている.これに対して,絡み目のVassiliev不変量を応用した別証明を与えたが,さらに,上述のLickorish-Millettの公式の一般化から類推して,HOMFLY多項式の初めの(絡み目の成分数から1を引いた数)の係数多項式の特殊値についても絡み数で表わすことができることをVassiliev不変量を応用して証明した.
児童生徒に対する睡眠と疲労の客観的健康評価を活用した不登校予防に関する研究

【目的】小・中学生における疲労と睡眠の状態を調査し、健康教育に活用できる疲労と睡眠の客観的な特徴を明らかにする。【対象】調査を希望した和歌山県A市の放課後等デイサービスの小学生29名、中学生6名、高校生7名、合計42名を対象とした。検査結果は、大阪府B市の小・中学生の結果と比較した。【方法】問診票を用いた自覚症状調査とともに、自律神経機能評価、睡眠・覚醒リズム解析を実施し比較検討した。【結果】放課後等デイサービスの小学生は、中・高校生と比較すると、自覚的な疲労調査や睡眠調査の結果、精神疲労度、総合疲労度、睡眠得点ともに有意に低く、自覚的には健康的に生活していることが判明した。しかし、それぞれをB市の小・中学生と比較すると、小学生は、精神疲労度、総合疲労度が有意に高値であり、中・高校生は、精神疲労度、総合疲労度、睡眠得点が有意に高値であることがわかった。自律神経機能評価では、放課後等デイサービスの小学生は、中・高校生と比較して差はみられなかったが、B市と比較すると、小学生、中・高校生ともに、自律神経活動のバランスが有意に高値であることが判明した。睡眠・覚醒リズム解析では、放課後等デイサービスの小学生は、中・高校生と比較して、覚醒時活動量が有意に高値で居眠り回数が少なかったが、B市と比較すると、小学生は覚醒時活動量が有意に低く、睡眠効率が悪く、中途覚醒回数が多く、中・高校生は覚醒時活動量が有意に低く、居眠り回数が有意に多いことが判明した。不登校傾向の児童生徒への調査に関しては、公的機関では調査が難しく、放課後等デイサービスに依頼し実施している。同じ地域の中学生と比較することで、不登校や体調不良に結びつく自覚症状や睡眠・自律神経機能などの客観的な指標の詳細な特徴を明らかにしたい。和歌山県A市の放課後等デイサービス2教室に在籍する児童生徒に同様の調査を実施している。不登校の児童生徒は、日中の居眠り回数が増加することや夜間睡眠中の中途覚醒回数が増加して睡眠効率が低下すること、相対的な交感神経系の過緊張が睡眠の質の低下に結びついていることなどが判明しており、客観的な睡眠・覚醒リズム解析の結果から児童生徒の健康状態を評価していく。<平成29年度研究実績>【対象と方法】2017年に調査を希望した和歌山県A市中学生1・2・3年生200名を対象とした.検査結果は,大阪府B市中学生69名の結果と比較した.ピッツバーグ睡眠質問調査票(PSQI)と文部科学省研究班発表の疲労度自覚的調査問診表を用いた.客観的な疲労評価としては,ライフ顕微鏡を3日間装着して,1覚醒時活動量,2覚醒時居眠り回数,3睡眠効率,4睡眠時中途覚醒回数,5睡眠時間の項目について検討した.自律神経機能については,「疲労・ストレス検診システム」を用いて,心拍の周波数解析により自律神経機能を評価した.【結果と考察】A市中学生をB市中学生と比較すると,自覚的な疲労調査や睡眠調査の結果,身体疲労得点(p<0.05),精神疲労得点(p<0.05),総合疲労得点(p<0.05),睡眠得点(p<0.05)ともにA市中学生の方が有意に低く,自覚的に健康的に生活していることが判明した.学年別に見ると学年が上がるにつれて,疲労度が増加していた.自律神経機能評価でも,A市中学生はB市中学生と比較して,交感神経活動と副交感神経活動のバランスを表すlogLF/HFが有意に低く(p<0.05),自律神経バランスが安定していることが明らかになった.睡眠・覚醒リズム解析では,A市中学生はB市中学生と比較して,覚醒時活動量が有意に低く(p<0.01),日中の活動量が少ないことが判明した.【不登校傾向にある児童生徒の調査】和歌山県A市の放課後等デイサービス2教室に在籍する児童生徒に同様の調査を実施し解析している。同じ地域の中学生と比較することで、不登校や体調不良に結びつく自覚症状や睡眠・自律神経機能などの客観的な指標の詳細な特徴を明らかにすることができると考える。当初、同じ児童生徒が小学校から中学校に進学する前向き調査を考えていたが、同じ校区での小学校と中学校の調査協力が校長や養護教諭の異動により難しい状況になったので、同じ中学校での前向き調査に切り替えて実施している。中学校1年生が中学校3年生になる間にどう調査結果が変化していくかを検討したい。また、不登校傾向の児童生徒への調査に関しては、公的機関では調査が難しく、放課後等デイサービスに依頼し実施している。【結果】放課後等

デイサービスの小学生は、中・高校生と比較すると、自覚的な疲労調査や睡眠調査の結果、精神疲労度、総合疲労度、睡眠得点ともに有意に低く、自覚的には健康的に生活していることが判明した。しかし、それぞれをB市の小・中学生と比較すると、小学生は、精神疲労度、総合疲労度が有意に高値であり、中・高校生は、精神疲労度、総合疲労度、睡眠得点が有意に高値であることがわかった。自律神経機能評価では、放課後等デイサービスの小学生は、中・高校生と比較して差はみられなかったが、B市と比較すると、小学生、中・高校生ともに、自律神経活動のバランスが有意に高値であることが判明した。睡眠・覚醒リズム解析では、放課後等デイサービスの小学生は、中・高校生と比較して、覚醒時活動量が有意に高値で居眠り回数が少なかったが、B市と比較すると、小学生は覚醒時活動量が有意に低く、睡眠効率が悪く、中途覚醒回数が多く、中・高校生は覚醒時活動量が有意に低く、居眠り回数が有意に多いことが判明した。不登校傾向の児童生徒への調査に関しては、公的機関では調査が難しく、放課後等デイサービスに依頼し実施している。同じ地域の中学生と比較することで、不登校や体調不良に結びつく自覚症状や睡眠・自律神経機能などの客観的な指標の詳細な特徴を明らかにしたい。【児童生徒の調査】平成30年度は、同一地区における前向き調査研究として、中学生を対象に、29年度と同様に問診票を用いた健康評価、自律神経機能評価、睡眠・覚醒リズム解析を実施して客観的指標を評価し、不登校につながる客観的な特徴を明らかにする。中学生では、学年が上がるにつれて不登校率が急増することが知られているが、平成29年の児童生徒が進級しており、同一集団においての不登校につながる指標を解析していきたい。客観的なバイオマーカーにて異常がみられた児童生徒に対しては、養護教諭やスクールカウンセラー、スクールソーシャルワーカーと連携してセルフケアを中心とした支援プログラムを実施していきたい。【不登校傾向にある児童生徒の調査】和歌山県A市の放課後等デイサービス2教室に在籍する児童生徒に同様の調査を実施する。不登校の児童生徒は、日中の居眠り回数が増加することや夜間睡眠中の中途覚醒回数が増加して睡眠効率が低下すること、相対的な交感神経系の過緊張が睡眠の質の低下に結びついていることなどが判明しており、客観的な睡眠・覚醒リズム解析の結果から児童生徒の健康状態を評価していく。和歌山県A市の放課後等デイサービス2教室に在籍する児童生徒に同様の調査を実施している。放課後等
植物体からの窒素揮散のメカニズムの動的解析

水耕栽培した水稲、トウモロコシを各生育時期に密封した透明な容器にいれ、植物体から発生するガスを採取または捕集し、ガスクロ、イオンクロマトグラフィーで測定した。1.窒素の揮散と生育時期Tの関係水稲では、栄養成長期では、窒素の揮散はわずかであったが、開花期には多量の植物体からの揮散が観察された。2.揮散窒素化合物の形態水稲の開花期に植物体から揮散する窒素化合物は、すくなくともN_2O、NH_3が確認され、その他過マンガン酸カリウム溶液で酸化されなかった窒素化合物例えばNO、NO_2の揮散も推定された。3.窒素ガスの揮散水稲の開花期に15Nでラベルした硝酸アンモニウムを吸収させ、容器中に含まれるN_2のnatural abundanceを測定したところ、高くなったことから、根から吸収されたNH_4-N、NO_3-Nが植物体からN_2ガスとして、揮散するものと考えられた。4.揮散窒素化合物のパターン水稲の開花期に硝酸アンモニウムを供給した場合、先ず、アンモニアが吸収されるためNH_3が揮散し、その後硝酸の吸収によりNOxが揮散するものと推定された。5.トウモロコシによる揮散トウモロコシも水稲と同様に栄養性長期の窒素化合物の揮散は少なく、開花期に多量のN_2O, NH_3などの窒素化合部の揮散が観察された。6.現在、小麦でも同じような実験を行っているが、水稲、トウモロコシと同様の結果が得られつつある。正しい施肥法を推定し、農作物から大気中へのアンモニアによる汚染をコントロールすることを手助けするかもしれないが、植物の窒素の揮散のメカニズムについて目的とするものである。アンモニアと硝酸の動的な解放がトウモロコシ,大豆,水稲,小麦を使用して研究された。透明な容器(25x25x80または130cm)に水耕法で生育させている植物を入れ,エアポンプで空気を送り込み,出てきた空気のアンモニアを0.5M H_3BO_3で,また0.5M H_2SO-0.10KMnO_4で酸化し、NO_3-Nとして1M Na_2CO_3でトラップした。トラップしたアンモニア態と硝酸態窒素はイオンクロマトグラフィで測定した。1.水稲の生育期によるアンモニアの揮散:水稲からのアンモニアの揮散は幼穂形成期がもっとも高く、その後減少した。これは窒素の転流と高温に起因しているかもしれない。2.珪素の影響:体内のアンモニア濃度を低下させることにより珪素の添加はアンモニアの揮散を抑制した。3.培養液中の窒素濃度の影響:培養液中の窒素濃度を増加させると,植物体内のアンモニアと揮散するアンモニアが増加された。4.-800°Cで保存された植物サンプルのグルタミン合成酵素動態は現在分析中である。その後,植物の窒素の揮散との関係を検討する5.透明容器から出てきたガスサンプルをテドラーバッグで収集した。今月県農業試験場のガスクロマトグラフィで分析する予定。
不正咬合発症機序におけるプロテオグリカンの役割

BALB/c-bm/bmマウスは、約10%のものが水平(左右)的交叉咬合あるいは、反対咬合を自然発症する。このマウスは先天的に軟骨のプロテオグリカンの低硫酸化を認めるが、このことと交叉咬合自然発症の関連について詳細な点についてはいまだに明らかになっていない。今年度は昨年度予備実験として撮影したマイクロCT画像より、下顎骨体長の左右差、及び頭蓋骨正中の偏位度を計測するポイントの設定を行い、3次元画像での評価方法の検討を行った。さらに、頭蓋骨の軟骨結合部の構造の変化について出生後からBALB/c-bm/bm系マウス群は対照群をHE染色を行い比較した。その結果、蝶形骨問軟骨結合においては生後7日ではBALB/c-bm/bm系マウス群でも軟骨の正常な柱状構造を認め、対照群とも差が認められなかったが、14日目では不規則な構造に変化し、BALB/c-bm/bm系マウス群と対照群とのに明らかな差が認められた。一方、蝶形後頭軟骨結合においては7日目14日目共にBALB/c-bm/bm系マウス群と対象群とで差が認められた。この結果より、軟骨細胞の分化に関わる因子の発現に正常マウスと差が生じている可能性が示唆された。今後さらに、この結果を確認しこれら2つの軟骨結合部の軟骨の分化の過程のどの段階での影響があるのか比較することを目的として、生後から14日までの間において、軟骨の分化の過程で発現するSox9、Runx2、II型コラーゲン、X型コラーゲン、Ihh, FGFなどの各種についての発現を、免疫染色、in situハイブリダイゼーションを行い、さらに精査比較を行うとともに、不正咬合マウスの頭部マイクロCTを3週から18週まで採得し、成長による形態変化を比較検討する予定である。BALB/c-bm/bmマウスは、先天的に短肢症を生じるマウスであるが、このマウスのうち、約10%のものが水平(左右)的交叉咬合あるいは、反対咬合を自然発症する。本年は、頭蓋顎顔面部の骨の形態の精査、および、蝶後頭軟骨結合部組織学的検討について予備実験を行い、サンプル採得時期を決定する事を目標とした。上記研究計画に基づき、サンプル採得を行うためにまず初めに、BALB/c-bm/bm系マウスの交配から開始した。このマウスは他のマウスと違い交配の確立が極めて悪く、また一度に出生する個体数も少ない(24)ことと、出生後に死亡するマウスの率も高かったため、BALB/c-bm/bm系マウスのサンプルを得ることに時間がかかったが、得ることができた。続いて、BALB/c-bm/bm系マウス群と、対照群としてBALB/c系マウス群の生後4, 8週齢の頭蓋骨の組織標本を作製した。顎顔面頭蓋のgrowth siteといわれている蝶形骨間軟骨結合部の組織標本を作成し、軟骨結合部での硫酸化を、アルシアンブルー臨界濃度法、および増感鉄ジアミン染色を行い比較した。その結果、BALB/c-bm/bm系マウス群は対照群と比較して軟骨細胞の配列も不正なうえに軟骨基質が明らかに低硫酸化していることが認められた。以上より、BALB/c-bm/bm系マウス群では、頭蓋底の発育が軟骨結合部の軟骨の低硫酸化による影響を受けている可能性が示唆された。今後頭蓋骨の軟骨結合部での免疫組織学的検討を予定しており、蝶形骨間軟骨結合部の組織標本を作成し、軟骨結合部で軟骨形成の各段階に発現する因子について免疫染色を行う予定である。これについては現在すでに標本作成を開始している。また、頭蓋顎顔面部の形態学的検討も予定している。これについては、既に予備実験としてマイクロCTでの撮影を行っており、今後各週齢での撮影及びデーターの解析を進める予定である。今後さらに、この結果を確認しこれ

ら2つの軟骨結合部の軟骨の分化の過程のどの段階での影響があるのか比較することを目的として、生後から14日までの間において、軟骨の分化の過程で発現するSox9、Runx2、II型コラーゲン、X型コラーゲン、Ihh, FGFなどの各種についての発現を、免疫染色、in situハイブリダイゼーションを行い、さらに精査比較を行うとともに、不正咬合マウスの頭部マイクロCTを3週から18週まで採得し、成長による形態変化を比較検討する予定である。
環境行動論におけるトランザクショナリズムからみた環境デザインに関する考察

本研究は、環境行動論における人間-環境関係に関するトランザクショナリズムの視点から、デザイン行為の目的・内容・方法について、その意味・可能性あるいは問題点を、理論的ならびに事例的に考察し、新しい“環境デザイン観"探求の契機を開こうとするものである。具体的には、(1)人間-環境関係に関する環境決定論・相互作用論・トランザクショナリズムなど関連モデルを含む理論的検討を行い、(2)トランザクショナリズムの特質を把握し、(3)それに基づく“環境デザイン"の意味・目的・内容・方法について考察する。昨年度は、独立住宅の場合を採り上げ、建築主3例・設計者2例ならびに工業化工法住宅供給者3例に対する個別面接調査を行って、住宅に関する意識構造とその形成過程を探ったが、今年度は、戸建て注文住宅の建築主・設計者・施工者ならびに不動産取引に関連する主体を含む全24例の詳細面接調査を行い、戸建て住宅「生産行為」全貌の把握を試みた。本研究では、生産行為は「環境層」と呼ばれるいくつかの次元とそれぞれの次元における様々な広がりと異なる次元間の繋がりからなる、という概念モデルを考え、得られた情報にKJ法の適用を計ってこのモデル上に再構築した。今回のモデルでは、“日常行為層"“接触行為層"“準接触行為層"“社会的行為層"からなる4つの次元とした。その結果から、生産行為に関連して、現代社会に満ちあふれている“豊富で"“正しい"情報よりも、いわゆる“ふつうの人々"の介在や接触が決定的な意味を持ち、私的体験故にその事実がむしろリアリティをもって、生産行為の根拠となっていることが明らかになった。以上は、今回取り上げた戸建て注文住宅の事例に留まらず、多くの計画・設計行為において認められるものと想定され、このような社会的状況における“環境デザイン"のあり方を検討し、その新たな構造を展開させる必要性と可能性が窺われた。本研究は、環境行動論における人間-環境関係に関するトランザクショナリズムの視点から、建築あるいは都市のデザイン行為の目的・内容・方法について、その意味・可能性あるいは問題点を、理論的ならびに事例的に考察し、新しい“環境デザイン観"探求の契機を開こうとするものである。そのために、(イ)基礎的文献等による分析考察を行うとともに、(ロ)関連する事例の資料を収集し、(ハ)いわゆる設計者・居住者・管理者等関係者への詳細面接調査を実施し、(ニ)当該“環境デザイン"活動とそれによって得られた環境の多面的評価を試みる。今年度は、(1)特徴的な環境デザイン事例のリストアップと関連資料収集を集めている。特徴的な環境デザインとは、デザインの過程・方法・関係者等に特徴のあるものを指す。例えば、非専門家による設計、いわゆる市民・住民・居住者参加による設計、多数の設計者の共同プロジェクト、極めて長期に渡る設計・建設による環境形成、深刻な紛争等を経た設計、などを想定している。さらに、(2)試行的な調査として、独立住宅の場合を採り上げ、建築主3例・設計者2例ならびに工業化工法住宅供給者3例に対する個別面接ヒアリング調査を行い、住宅に関する意識構造とその形成過程を探っている。その結果から、関係者それぞれにおける“住宅像"とでも云うべきものの形成の様相、それに基づく様々な判断のなされ方、ならびにそれらの変容の要因等が窺われ、そうした事例の考察を通じてより一般的な構造の把握に至る方法を検討している。
金属錯体上でのヒドリド性能値の序列化を核とする持続循環型水素化反応の創出

有機化合物の水素化は,広範な材料開発において最も重要な化学変換の一つであるが,水素供与体として用いられる水素ガスの安全性および枯渇資源由来であるという点を考慮すると,従来の水素ガスに代わる安全かつ再生可能な水素供与体を利用した持続循環型プロセスの開発が急務である。本研究は,金属錯体上に様々な水素供与部位を構築し,これらの水素供与能を数値化することで,従来不可能であったヒドリド性能を直接比較し,再生可能なヒドリド生成法と融合することで,革新的な持続循環型水素化反応を創出することを目的としている。昨年度,最初のステップとして金属ヒドリドおよび有機ヒドリド部位の両方を同一分子内に含むルテニウム錯体の合成に成功した。この成果を受けて本年度は,金属ヒドリド部位のみを含むルテニウム錯体の合成について多角的に検討した。原料ならびに合成法を種々検討した結果,二つの方法で選択的に所望のルテニウム錯体が生成することを見出した。第一の方法は,カルボニル配位子と水素化ホウ素ナトリウムとの反応である。ヒドリドイオンの配位カルボニルへの求核攻撃により生成した不安定なホルミル基が脱離し,空いた配位座に過剰のヒドリドイオンが配位したものと推測した。第二の方法は,溶媒として用いたエタノールの配位を経由したエトキシ配位子のベータ水素脱離反応である。これらのヒドリド錯体は,同一の分子構造であることを確認した。特に後者の合成法は,水素源としてエタノールを用いていることから,従来の化石資源由来の水素化反応とは異なり,再生可能な水素源となり得る。よって,当初の目的とする持続循環型の水素化反応に適用できるものと考えている。当初の研究計画では,2年目までに同一の金属錯体骨格に複数のヒドリド種を導入する方法を見出すこと,各種分光測定およびX線回折実験により分子構造を明らかにすることを目指していた。今年度までの研究において,所望の異種ヒドリドを複数のルートで合成することに成功し,かつ分子構造を含めた同定を実行できたことから,現時点で本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。次年度は,残るヒドリドとして有機ヒドリドのみを含むルテニウム錯体の合成法を確立すること,さらに,合成した3種のヒドリド(金属ヒドリド,有機ヒドリド,両方を含むハイブリッドヒドリド)を用いてヒドリド供与能を評価するため,ヒドリド移動反応を行いヒドリド性能の数値化を行う。本研究は,金属錯体上に様々な水素供与部位を構築し,これらの水素供与能を数値化することで,従来不可能であったヒドリド性能を直接比較し,再生可能なヒドリド生成法と融合することで,革新的な持続循環型水素化反応を創出することを目的として研究を遂行した。本年度は,同一の金属錯体骨格に異種ヒドリド源(有機ヒドリドおよび金属ヒドリド)を導入するため,中心金属をルテニウムとした金属錯体の創成を試みた。最初に,有機ヒドリド部位と金属への結合サイトを併せ持つ配位子を合成し,この配位子をルテニウムと結合させて所望のヒドリド前駆錯体を合成した。次に,ヒドリド前駆錯体を化学的に還元することにより,目的とする異種ヒドリド含有錯体の合成に成功した。合成したヒドリド錯体について,IRやNMRなどの各種分光分析,X線回折実験による分子構造決定,および錯体中の電子状態を実験的(電気化学測定)ならびに理論的(量子化学計算)に確認した。本研究により,同一分子骨格上に異なる性質を有するヒドリド(金属ヒドリドおよび有機ヒドリド)を高収率で創成する手法を確立することができた。当初の研究計画では,初年度に同一の金属錯体骨格に異種ヒドリドを導入する方法を確立し,さらに各種分析手法を駆使してヒドリドの存在を確認することとした。今年度の研究において,所望の異種ヒドリド金属錯体の合成に成功し,かつ分子構造を含めたキャラクタリゼーションを実行することができたことから,現時点で本研究計画は概ね順調に進捗していると判断した。

ヒドリドイオンの配位カルボニルへの求核攻撃により生成した不安定なホルミル基が脱離し,空いた配位座に過剰のヒドリドイオンが配位したものと推測した。第二の方法は,溶媒として用いたエタノールの配位を経由したエトキシ配位子のベータ水素脱離反応である。これらのヒドリド錯体は,同一の分子構造であることを確認した。特に後者の合成法は,水素源としてエタノールを用いていることから,従来の化石資源由来の水素化反応とは異なり,再生可能な水素源となり得る。よって,当初の目的とする持続循環型の水素化反応に適用できるものと考えている。当初の研究計画では,2年目までに同一の金属錯体骨格に複数のヒドリド種を導入する方法を見出すこと,各種分光測定およびX線回折実験により分子構造を明らかにすることを目指していた。今年度までの研究において,所望の異種ヒドリドを複数のルートで合成することに成功し,かつ分子構造を含めた同定を実行できたことから,現時点で本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。次年度は,残るヒドリド供与源としてホルミル基を含む金属錯体を合成するための効率的な手法を開発すること,さらに,中心金属をルテニウムに加えてマンガンに拡張したヒドリド含有錯体を系統的に創成する。金属ヒドリドおよび有機ヒドリドのヒドリド供与能を評価するため,ヒドリド移動反応を行って各種ヒドリド性能の数値化を試みる。次年度は,残るヒドリドとして有機ヒドリドのみを含むルテニウム錯体の合成法を確立すること,さらに,合成した3種のヒドリド(金属ヒドリド,有機ヒドリド,両方を含むハイブリッドヒドリド)を用いてヒドリド供与能を評価するため,ヒドリド移動反応を行いヒドリド性能の数値化を行う。国際学会の参加登録費が,為替レート変動のため当初の計画より安価になったことが原因で,若干の次年度使用額が生じた。この生じた次年度使用額は,物品費(消耗品費)に充当することにより,当該研究の推進を図ることとする。当初予定していた学会のいくつかにおいて,旅費等が所属機関から別途支給されたため,次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額は,物品費(消耗品費)に充当することにより,当該研究の推進を図ることとする。
超高層集合住宅の特徴ある対人的環境の記述・分析

超高層マンションの住戸を隣接グラフにより類型化し、居間連結型が多いことを明らかにした。また、設計者にインタビューし、意図的にこれらの型を用いて住戸間の差異化を図った設計を行っていること、また、居間連結型は小家族を念頭に設計していること等を明らかにした。さらに、超高層マンションが路地空間と併存する月島の集合住宅等の外部空間の対人的環境を調べて、路地や公園のそれと違うことを明らかにした。平成20年度は「超高層集合住宅に特徴的な居間連結型の間取りに対する評価」を得ることを目的にしていた。実際には、研究の初年度ということもあり、超高層集合住宅の現時点での建設状況を把握し,そのヴァリエーションを確認し、また、既往の研究成果をレビューした上で、当初設定した目的に着手した。具体的には以下のようなことがらを行った。1)首都圏の超高層集合住宅について、既存の資料に基づき、建物の利用目的などについて整理した。また、いくつかの超高層集合住宅については、現地に赴き視察を行った。関西地区に現存する超高層集合住宅について7施設の視察を行うとともに、関西の超高層居住の研究者(奈良女子大学大谷由紀子氏、中迫由美氏)らと意見交換を行った。また、首都圏で超高層居住の住まい方調査を継続的に実施している昭和女子大学の杉山文香氏を招いてその成果を聞き、研究内容についての意見交換をした。2)超高層集合住宅に特徴的な居間を動線上の中心とする間取りが、実際にどの程度の割合でつくられているかを明らかにするために、超高層集合住宅の住棟\住戸の設計図を集め、住棟の型別(センターコア型\ボイド型\板状型に分類される)の中で居間連結型の割合がどれほどであるかを調査した。3)2)でその割合が相当数あることを明らかにした居間連結型に対し、計画する立場の者の評価を明らかにするため、超高層集合住宅の設計者数名程度にインタビューを行い、居間連結型の住戸平面が、販売\計画上はどのように扱われ、どのように評価されているかを確認した。2)3)の内容については、平成21年度の日本建築学会大会で発表予定である。超高層集合住宅な首都圏などで一般的になりつつあるが、既往研究をみると個別の問題点への指摘はなされているものの、他の集住形態とどう異なっているか十分に検討されていない。この点を次の3つの視点、1)住戸の間取りに居間連結型が選ばれていること、2)良好な眺望を構成する環境エレメント、3)対人的環境としての超高層集合住宅の外部空間、から明らかにすることによって、超高層集合住宅を総体としての対人的環境として特徴を記述し分析するものである。1)については、超高層集合住宅に特徴的な居間を動線上の中心とする間取りが、実際に相当数あることを明らかにした。計画する立場の者の評価を明らかにするため、超高層集合住宅の設計者数名にインタビューを行い、居間連結型の住戸平面が、販売戦略上でコンパクトな住戸として重要であることを確認した。成果については、日本建築学会大会において、花里、佐々木らが発表した。また、花里らが日本建築学会計画系論文集に投稿した(掲載決定)。2)については、花里が日本建築学会大会研究懇談会資料集において、超高層分譲マンションにおける眺望の価値を論じた。3)については、超高層の外部空間の対人的環境について、月島をケーススタディとして調査し、公開空地が路地や公園等とは異なり、街路空間と同様の性格を持つことを行動面からの分析を通じて明らかにした。また、花里らが日本建築学会計画系論文集に成果を投稿した。具体的活動としては、研究会を7回行った。11月16日には、月島地区の超高層集合住宅の見学及びヒアリング(URリバーシティ21、ライオンズタワー月島)を行った。3月17日には外部講師(貞包英之氏・映画専門大学院大学)を招き、研究報告「超高層住宅と感覚の高度化」を聴講した。本研究では、超高層集合住宅について、3つの視点、1)住戸の間取りに居間連結型が選ばれていること、2)良好な眺望を構成する環境エレメントがあること、3)対人的環境としての超高層集合住宅の外部空間が特徴的なこと、から明らかにすることによって、超高層集合住宅の対人的環境として特徴を記述し分析することを目的としていた。これらについて以下のような結果が得られた。(1)超高層マンションの住戸の間取りに注目し、隣接グラフによる分析を行い、居間連結型が設計上で選ばれていることを明らかにした。この類型は設計計画上の判断として住棟計画との関係を考えた上で選ばれており、間口の少ない、コンパクトな住戸の供給のために採用されていると考えられる。しかし、従来中高層マンションで多用されてきた定型3LDKとは異なるもので、対人的環境の面からは、家族間のコミュニケーションを期待させる居間を中心とした生活を予想させる間取りである。

(2)東京月島地区において、路地空間のある長屋や、公園、一戸建ての住宅地、低・中低層の集合住宅などという種々の外部空間を含むものとの比較において、行動マッピング調査により、超高層マンションの公開空地という、特徴的な外部空間の対人的環境を測定した。それぞれの結果を比較したところ、超高層集合住宅の公開空地の対人的環境は、路地や公園の環境とは異なり、通常の街路と似たものであることが明らかになった。(3)良好な眺望を構成する環境エレメントとして、ランドマークとなる建造物を取り上げ、都市内での見え方を検討した。特に、東京タワーを取り上げ、様々なメディアでどのように取り上げられているかを明らかにし、それらの取り上げられ方が個人化してきたという特徴を明らかにすると共に、GISを用いて東京タワーから見える超高層建造物内の場所を明らかにし、上空から東京タワーを見える場所を特定した。
創薬化学を指向した三次元構造に対する効率的変換法の開発

近年の創薬化学では、sp3炭素を多く持つ三次元構造を利用し、物性・安全性の点で優れた化合物の探索が積極的に行われている。今回の研究では、ビシクロペンタンなどの三次元多環式化合物を標的分子として、その効率的な変換法と前駆体の合成法を開発する。具体的には、幅広い誘導体化が可能な非対称二置換体の効率的な合成法、不安定で用事調製が必要であった原料の安定等価体に対する変換法を確立する。
環境汚染物質に対する自発集積能を有する高感度汚染検出システムの構築

重金属イオンを高感度にセンシング可能なセンサータンパク質の候補として、銅イオンセンサー能を有するセンサー型転写調節因子の取得、ならびにそれら銅イオンセンサータンパク質の構造解明を試みた。鉄イオンを分子中に含む有機化合物の一種であるヘムに対するセンサー能を有するタンパク質として、コリネバクテリア中においてヘム取り込みに関与しているヘム結合・輸送タンパク質(HtaA、HtaB)を対象とし、これらのタンパク質の結晶構造決定を行った。得られた構造を基に、ヘム認識の分子機構解明を行い、ヘムの認識・結合を制御している分子機構を明らかにした。本申請研究においては、センサー型転写調節因子を基盤とし、重金属イオンに対する高感度なセンシング能をもった転写調節因子をデザイン・創製することを目的の一つとして掲げている。本年度の研究では、重金属イオンを高感度にセンシング可能なセンサータンパク質の候補として、銅イオンセンサー能を有するセンサー型転写調節因子の取得、ならびにそれら銅イオンセンサータンパク質の構造と機能の解明を目的として研究を実施した。ゲノム配列データの検索を行い、4種の高度好熱性古細菌(Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus acidocaldarius、Pyrococcus furiosus、Thermoplasma volcanium)より銅イオンセンサー能を有する転写調節因子をコードしていると推定されるcopR遺伝子をクローニングした。クローニングしたcopR遺伝子をT7プロモーター下流に挿入し、CopRタンパク質発現系の構築を行った。調製した発現系を用いてCopRタンパク質の発現を検討した結果、Sulfolobus solfataricus由来のCopR(SsCopR)およびThermoplasma volcanium由来のCopR(TvCopR)では目的タンパク質の発現が確認されたが、Sulfolobus solfataricusおよびPyrococcus furiosus由来のCopRではタンパク質発現が観測されなかった。以後の実験は、最も高効率で発現が観測されたTvCopRを対象として実験を進めた。アポ型として精製されたTvCopRの結晶化スクリーニングを行ったが、現時点ではTvCopRの結晶化条件を見出すには至っていない。今後は、TvCopRの結晶構造解明に向けて、さらなる結晶化条件の検討を行う予定である。本申請研究の目的を達成するために必須な重金属イオンセンサータンパク質として、銅イオンセンサー能を有するCopRタンパク質の発現系構築、および発現したCopRの精製に成功しており、CopRの構造決定のための実験も既に開始している。これらの結果を勘案すると、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断される。本申請研究においては、重金属イオンを高感度で検出可能なセンサータンパク質のデザイン・創製を研究目的の一つとしている。平成28年度の研究では、平成27年度までに構築した発現系を用いて調製した銅イオンセンサー能を有する転写調節因子CopRの結晶構造解明を引き続き行った。Sulfolobus solfataricusおよびThermoplasma volcanium由来のCopRの結晶化スクリーリングを行ったが、構造解析に適した結晶を与える条件を見出すことはできなかった。これらCopRの高次構造を解析したところ、SDS-PAGEでは純度よく精製されており、いずれも可溶性標品として精製されているが、溶液中で凝集状態であることが分かった。このことが、結晶化がうまく進行しない原因として考えられる。そこで、抗凝集効果が期待されるグリセロール、エチレングリコール、アルギニンの添加、および塩化マグネシウム、塩化ナトリウム等を添加することにより溶液の塩強度を変化させることにより、凝集状態を解離させ、安定な二量体(生理的に機能している状態)を形成することを試みた。これら添加剤存在下において結晶化条件のスクリーリングを実施したが、結晶構造解析に適した結晶を得るには至らなかった。本研究では、外部シグナルに応答した自発的集積システム構築のための基礎的知見として、酸素に対する走化性制御系における外部シグナルセンサーとして機能するAer2の構造機能相関解明も行った。Aer2の結晶構造解析に成功し、Aer2がN末に3つのHAMPドメインが連結したpoly-HAMPドメインを有しており、その後ろにセンサーユニットとしてヘム含有PASドメインが連結していることを明らかにした。ヘムポケットに存在するTrp残基と酸素との間の相互作用が、Aer2による選択的酸素センシングに重要な役割を果たしていることが分かった。今後は、TvCopRの結晶化条件スクリーニングを引き続き実施し、できるだけ早期に最適な結晶化条件を見出し、TvCopRの決勝構造を決定する。決定した結晶構造をもとに、金属イオンセンサー部分に系統的なアミノ酸変異を導入した一連の変異体を調製し、より高感度なセンサータンパク質、およびセンシング対象を他の重金属イオンにまで拡張したセンサータンパク質等の調製をおこない、当初の目的達成を目指す。生物無機化学