hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
基質型阻害剤との複合体構造解析に基づく非ペプチド型プロテアーゼ阻害剤の開発

さらに、プライムサイトでの相互作用増強を目指した非ペプチド型プライムサイト構造の評価によって、芳香環上への官能基導入が阻害活性に大きく影響することを初めて明らかにした。重症呼吸器症候群SARSおよびアルツハイマー病の原因は異なるが、その治療には鍵となるプロテアーゼの阻害が最も有望と考えられている。本研究では、これら疾患の発症の鍵となるプロテアーゼ阻害に基づく治療薬開発を目的として非ペプチド型阻害剤の創製を行った。各疾患の標的プロテアーゼは、SARS 3CLプロテアーゼとβセクレターゼBACE1である。申請者がこれまで進めてきた複合体構造解析研究で明らかにしたペプチド性阻害剤とプロテアーゼとの主要相互作用部位である疎水性側鎖構造を環構造に組み込んだデカリン型骨格を論理的に設計し、これまでに例のない新規非ペプチド型阻害剤を開発した。Nデカリン型SARSプロテアーゼ阻害剤開発研究では、当初計画通りの合成ルートに基づく合成法を確立した。すなわち、鎖状前駆体を二価パラジウム触媒を利用した環化反応に付すことよりデカリン型母核骨格の立体選択的構築が効率よく行えることを確認した。また、様々なアシル型置換基を持った誘導体についても最終段階でのアルデヒド体への変換をWeinrebアミドの還元反応で再現性良く行える合成ルートを確立した。得られた化合物のうちいくつかは予想通り数十μモルレベルのIC50値を示すSARS 3CLプロテアーゼ阻害活性を示し、プロテアーゼとの複合体結晶作製にも成功した。現在構造解析に基づく誘導体設計と合成を精力的に進めている。さらに、窒素原子を酸素原子に置き換えたOデカリン型阻害剤の設計と合成についても検討を進めている。本合成では、酸素官能基の立体をシャープレス不斉化反応の駆使によるコントロールで合成する経路を考案し、デカリン骨格の立体選択的合成を進めている。BACE1阻害剤開発研究では、HEA型基質遷移状態概念に基づくmimic水酸基の立体選択的構築法を確立し、阻害活性発現に最も適した中心水酸基の活性配置を初めて明らかにするとともに、BACE1との複合体X線結晶構造解析により水酸基立体配置の違いに基づく相互作用様式をはじめて原子レベルで解析した。これらの構造解析に基づき、阻害活性増強に貯血すると予想されたプライムサイトでの構造最適化を進めている。特に、芳香環の導入と芳香環上置換基にヘテロ原子を導入する事により活性増強が望めると予想している。医薬品化学Nデカリン型SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤の構造最適化;これまでに得られた阻害活性と相互作用解析結果をもとに、プロテアーゼ表面との相互作用が可能なヘテロ原子を組み込んだアシル基導入型阻害剤の設計・合成と評価を進める。本化合物タイプについてはほぼ結晶化条件が確定しているので、得られた化合物すべてについての結晶化と構造解析を行う予定である。Oデカリン型SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤に関する研究;N型とは異なる相対配置での置換基導入が可能なOデカリン型阻害剤の合成と構造解析研究を進めている。酸素原子の特性を利用した不斉反応を駆使して、立体選択的なOデカリン骨格の合成を行う。Nデカリン型阻害剤の結果をもとに、母核となるOデカリン骨格へもヘテロ原子を有する側鎖構造を導入する。
運動ニューロンの恒常性維持に関わる分子機構の解明

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンの選択的変性を特徴とする神経変性疾患である。本研究では、ALS2及びSQSTM1を疾患制御系候補として選び、ALS2及びSQSTM1が担う細胞内システム制御系の分子機構とその異常について解析し、最終的にALS発症に関わる運動ニューロン恒常性維持機構、及びその破綻の分子基盤を明らかにすることを目的とした。本研究遂行の結果、ALS2欠損が変異SOD1誘導性ユビキチン陽性凝集体及びSQSTM1凝集体の細胞外蓄積を加速させるのに対して、SQSTM1欠損はユビキチン陽性凝集体の運動ニューロン内での選択的蓄積及び細胞外蓄積の抑制をもたらすことが明らかとなった。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、上位及び下位運動ニューロンの選択的変性を特徴とする進行性運動ニューロン疾患である。本研究は、複数のALS疾患発症要因の相互連関に関するこれまでの研究から見出された“p62/SQSTM1シグナル系"を制御系候補として、p62/SQSTM1が担う細胞内システム制御系の分子機構とその異常について解析し、最終的にALS発症に関わる運動ニューロン恒常性維持機構、及びその破綻の分子基盤を明らかにすることを目指すものである。平成26年度は、ALS2及びp62/SQSTM1欠損型変異SOD1発現ALSマウスモデルの運動機能等の表現型を行動学的に解析するとともに、脊髄及び大脳皮質における遺伝子発現、オートファジー関連因子の変動、及び組織学的観察による神経細胞体・軸索変性の経時的変化、オートファゴソーム・ミトコンドリア等の細胞内小器官の構造解析を行った。その結果、p62/SQSTM1機能喪失により、変異SOD1発現ALSマウスモデルにおける疾患症状が顕著に悪化するとともに、脊髄運動ニューロン変性、軸索変性及び軸索内へのオートファゴソーム様の膜小胞の異常蓄積が顕著であることが明らかとなった。さらに、ALS2及びp62/SQSTM1の両者を欠損した変異SOD1発現ALSマウスモデルは、ALS2あるいはp62/SQSTM1を単独に欠損したALSマウスモデルよりもさらに早期に発症し、運動機能障害により早期に死亡することも明らかとなった。以上の研究結果から、ALS2及びp62/SQSTM1の機能異常は、ともにオートファジー・リソソーム系の変調をもたらし、それにより変異SOD1遺伝子発現により引き起こされる運動ニューロン変性を悪化させるものと推定された。平成27年度は、変異SOD1凝集体の蓄積量を増大させるメカニズムを明らかにするために、脊髄におけるユビキチン化タンパク質の存在量を解析した。その結果、ALSマウスモデルでは脊髄の不溶画分において発症後期から終末期にかけて顕著なユビキチン化タンパク質の蓄積が観察された。興味深いことに、そのユビキチン化タンパク質の蓄積は、p62の欠損によって抑制されていた。また、免疫組織染色を用いて脊髄におけるユビキチン化タンパク質を検出した結果も矛盾なく、ALSマウスモデルに見られるユビキチン陽性の凝集体がp62を欠損させることによってその総量は減少していた。しかし、運動ニューロン細胞体でのユビキチン陽性凝集体は逆に増加していた。これらの結果から、脊髄におけるp62やユビキチン陽性凝集体の全てが神経細胞死を誘起するものではなく、むしろ神経細胞での選択的ユビキチン陽性凝集体の蓄積が細胞死を誘起し、p62欠損は神経細胞への選択的蓄積ならびに細胞死を加速させることが新たに明らかにされた。さらに、神経細胞以外で観察されるユビキチン陽性凝集体は、神経細胞を保護するために有害物質を隔離すべく形成されているものであり、p62欠損は有害物質の無毒化作用の減弱をもたらしている可能性が示された。本研究は、多種類の遺伝子改変マウスを相互に交配することにより、複数の遺伝子の個体レベルでの影響を解析する実験を継続して実施している。多くの遺伝子改変マウスの個々の系統での繁殖状況は良好であるが、多重交配による変異マウスの作出効率は、予想より著しく低いのが現状であり、昨年度に引き続き当該問題は解決に至っていない。しかし、主要な系統の繁殖コロニーサイズを増やすことで、実験に必要な最低限の個体数は得られている。本研究は、複数のALS疾患発症要因の相互連関に関するこれまでの研究から見出された“p62シグナル系"を制御系候補として、p62が担う細胞内システム制御系の分子機構とその異常について解析し、最終的にALS発症に関わる運動ニューロン恒常性維持機構、及びその破綻の分子基盤を明らかにすることを目指すものである。平成28年度は、変異型SOD1-TG、p62-KO及びAls2-KOマウスの三重変異体マウスの解析から、変異SOD1-TGマウスにおいて、ALS2及びp62の機能喪失がいずれも疾患発症を加速させることを見出した。

さらに、当該マウスモデルにおいてALS2とp62を同時に喪失させた場合には、各々の機能喪失効果が相加的に働き、疾患発症がさらに早まることを見出した。病理組織学的解析により、ALS2欠損が変異SOD1誘導性ユビキチン陽性凝集体及びp62凝集体の細胞外蓄積を加速させるのに対して、p62欠損はユビキチン陽性凝集体の運動ニューロン内での選択的蓄積及び細胞外蓄積の抑制をもたらすことも明らかとなった。すなわち、ALS2及びp62は共にオートファジー・エンドリソソーム系に関連するALS疾患責任遺伝子産物であるが、中枢神経組織内では両者は異なるメカニズムによりタンパク質分解を制御していることが明らかとなった。次に、個体でのp62過剰発現の効果、ならびに神経特異的なp62喪失の影響を解析するため、SOD1-TGとp62-TGマウスとの交配実験を開始した。その結果、予想とは異なり、p62過剰発現SOD1-TGマウスにおいては、逆に疾患症状を悪化させることが判明した。今後、p62過剰発現及び神経特異的p62欠損の影響については更なる分子病態解析を行う計画である。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンの選択的変性を特徴とする神経変性疾患である。本研究では、ALS2及びSQSTM1を疾患制御系候補として選び、ALS2及びSQSTM1が担う細胞内システム制御系の分子機構とその異常について解析し、最終的にALS発症に関わる運動ニューロン恒常性維持機構、及びその破綻の分子基盤を明らかにすることを目的とした。本研究遂行の結果、ALS2欠損が変異SOD1誘導性ユビキチン陽性凝集体及びSQSTM1凝集体の細胞外蓄積を加速させるのに対して、SQSTM1欠損はユビキチン陽性凝集体の運動ニューロン内での選択的蓄積及び細胞外蓄積の抑制をもたらすことが明らかとなった。本研究は、多種類の遺伝子改変マウスを使用した動物実験であり、順調に繁殖を行うことができた。しかし、各々の遺伝子改変マウス間での交配による多重遺伝子改変マウスの作出効率は、予想より著しく低い(繁殖効率が単一遺伝子改変マウスより低い)ことが判明した。そのため、平成26年度は当初の計画よりも遺伝子改変マウス系統を減らして、主要な系統間の繁殖コロニーサイズを増やした。その結果、現在は多重遺伝子改変マウスの作出は軌道に乗っている。また、RT-PCRによる遺伝子発現、ウェスタンブロッティングによるタンパク質発現、さらに免疫組織学的手法による疾患マウスモデルの分子病態解析も順調に進行している。一方、疾患マウスモデルから得る初代培養細胞を用いた細胞実験については、細胞培養スペースの制限、マウスの交配成績の低さも加わり、計画の進捗度は当初の予定の50%程度に止まっている。この研究の遅れに関しては、マウス生育のスピードを加速させることはできないため、劇的な改善は期待できないが、進捗スピードを除けば、着実に解析は進行しているため、次年度以降に一定の成果が期待される。今後、実験計画の遂行を加速させることにより、最終年度である平成28年度中末までには計画するほぼ全ての実験を完結することは可能であると考えている。
機械処理のための言語構造の言語間対照研究

1.語の意味用法の対照研究として、英語の-ableのついた形容詞、日本語の「可能」のつく形容動詞を比較し、英語で受身の意味になることが多いことを計量的に明らかにした。2.照応の決定が訳語選択に重要であることを指摘し、Carterの焦点モデルを用いて代名詞を含む文の訳語選択をおこなうシステムを作成し、その有効性を検討した。また訳語関係で重要な役割を果す概念の上位/下位関係シソーラスに視点の考え方を導入し、その表現方法を提案した。3.動詞の文法を、顕在的な文法範疇(形態範疇)と潜在的な文法範疇に分け、それぞれを整理し吟味した。日本語については、前者に、ムード、テンス、ステータス、スタイル、待遇、アスペクト、ヴォイス、接続が認められた。4.日本語と英語の法情報の表現の対照分析として「天声人語」とその翻訳をデータにし、その日英語の表現の相関関係をもとにクラスター分析と数量化IV類の分析をし、日本語から英語への変換アルゴリズム作成の見通しを立てた。5.主要な機械翻訳システムの構造処理能力の評価と、これに基づく機械の自律的言語処理の可能性を追求した。6.句構造文法の枠組みで、日本語と英語の文法記述を行い、それに基づいた構文解析器を作成した。本年度は特に「長距離依存」現象の定式化を試み、束縛素性の重要性とその振舞いを明らかにした。7.日本語の語の意義素に含まれる意義特徴のうち、対者的特徴・文体的特徴等の含蓄的特徴が、英語・ドイツ語・ポルトガル語において、言語的手段によって表現されるか否かをインフォーマント調査の結果から分析し、比較した。8.会話文の意味表現のための「文意構造記述式(SD式)」を精密化し、SD式の処理環境「SDENV」をPrologで作成した。また簡単な英語文と日本語文の生成システムを試作した。会話文データベースは内容を増加させ、全体として文例数23,000をおさめるものとなった。
ゲノム編集を用いた新規的内耳遺伝子導入法の開発

本研究ではゲノム編集を用いた内耳への遺伝子導入ならびに遺伝子点変異による感音難聴の新規治療を目指して技術の確立とゲノム編集による細胞の表現型回復を目指して研究を進めている。今年度は妊娠マウスを用いて胎仔の耳胞への遺伝子導入手法の確立ならびに内耳感覚上皮細胞への遺伝子導入効率の向上を目指して各種条件のタイトレーションを行なった。遺伝子導入効率の確認にはCMVプロモーター下にEGFPを発現するレポーターコンストラクトを用いて、胎児の耳胞内にプロモーターを注入しエレクトロポレーションにより遺伝子導入を行なった。胎生12日目の耳胞に対して遺伝子導入を行い、生後1日目にEGFPの発現を検証したところ、当初は少数の非感覚上皮細胞に遺伝子導入を確認することができたが、感覚上皮細胞での遺伝子導入は得られなかった。エレクトロポレーションのパルス条件ならびに投与試薬の条件を変化させたところ、感覚上皮細胞にもEGFPの発現を得られた。生後1日目の内耳においてEGFP陽性細胞をカウントしたところ、感覚上皮に含まれる有毛細胞ならびに支持細胞のうち約5%の細胞でEGFP発現が陽性であることを確認できた。また、ゲノム編集による遺伝子治療のターゲットとなる感音難聴に関して、本邦で同定された遺伝子点変異による遺伝性難聴を候補として、モデルマウスを用いてその病態ならびに遺伝子発現に関する解析を行なった。候補遺伝子はヒト遺伝性難聴の原因遺伝子であり、細胞内アクチン制御に関わっていることが知られている。同分子の局在を免疫組織化学法を用いて調べたところ、不動毛ならびに細胞間結合に集積することが判明した。また、同分子の変異により、有毛細胞の不動毛形成の障害およびシナプス障害を生じることが判明した。現在点変異の修復に用いるためのコンストラクト作成を行なっており、完成すれば実際のゲノム編集効率を検討する予定である。内耳は解剖学的にアプローチが難しい臓器であり、ゲノム編集を用いた遺伝子治療を実現する上では、内耳への遺伝子導入技術の確立が必須となる。特に本研究においてはエレクトロポレーションによる生体内への遺伝子導入が必要となるが、このような手法は一般には確立されておらず、各施設において技術の修得が必要となる。研究の端緒として胎生マウスを用いて胎児の耳胞に対する遺伝子導入を行ったが、当初の手法では胎生致死となることも多く技術的な困難に直面した。しかしながら、今年度の研究においては胎児への投与時期、投与の条件を改善し、結果として胎生致死の確率を大幅に減少することができ、生後マウスにおける導入遺伝子の発現を十分に観察しうるだけの実験系が確立された。また、本研究で対象となる遺伝子は感覚上皮細胞でのゲノム編集が必要となるが、一般に感覚上皮細胞への遺伝子導入は非感覚上皮細胞に比べて導入効率が低い。この点に関してもエレクトロポレーションのパルス強度の調整やコンストラクト濃度の調整により導入効率を高めることができ、結果として感覚上皮細胞においても5%の細胞で発現を得ることができた。今後の実験において細胞の形態学的な検討をしうる条件が整い、研究の速やかな進行が期待される。また、ゲノム編集技術を内耳疾患に応用するためのモデルとして、特定の遺伝性難聴モデルマウスの組織学的ならびに分子生物学的解析を進めることができた。ヒトの表現型から推測すると同モデルマウスにおいては、内耳のみならず骨髄細胞においても表現型が出ると予想され、今後は内耳と比べて遺伝子導入や表現型解析が容易な骨髄細胞に対しても実験系を拡大することができ、内耳への適応を進めるためのポジティブコントロールとして用いることができると考えている。これにより、遺伝子導入効率ならびにゲノム編集効率の検証が容易となり、研究のさらなる加速が可能となる。今後はまずターゲットとなる遺伝性難聴に対するプラスミドコンストラクトの作成とCRISPR/Casシステムの機能検証を行う。標的配列切断用のCRISPR/Cas9コンストラクトと、HDR用またはNHEJ用の2種類のドナーDNAコンストラクトを作成し、正常配列を含む2種のドナーDNAコンストラクトも同時に作成する。ミスマッチ切断アッセイにより標的遺伝子の切断が生じることを確認し、完成したコンストラクトを用いて野生型マウス耳胞での遺伝子導入効率の確認を行う。また、ゲノム編集効率については、手技的に難しい生体内耳での実験に先立って、骨髄系細胞を摘出培養し同じコンストラクトの遺伝子導入を行うことで、より容易に検証することができる。生体への遺伝子導入にはこれまでに確立した手法を用いて、子宮壁から耳胞にマイクロインジェクションし、エレクトロポレーションを用いて遺伝子導入する。次いで摘出した内耳を用いて遺伝子修復効率を検証する。変異型マウスで発現する変異遺伝子と正常型遺伝子それぞれの特異的プライマーセットを用いて、定量的PCRによりmRNAの発現量を比較する。さらに遺伝子修復が生じれば同遺伝子の発現が回復するため、免疫組織化学で発現する細胞数をカウントし、修復効率を確認する。また、ゲノム編集促進剤であるSCR7等をプラスミドと同時にインジェクションし、条件のタイトレーションを行う。次に細胞の機能修復について、遺伝子導入したマウスの内耳を用いて組織学的に検証する。まずゲノム編集で遺伝子修復が生じれば、分子の正常な発現パターンを呈するはずであり、これを免疫組織化学で検証する。さらに変異マウスでは分子の機能欠失により生後直後から不動毛の形態やシナプス形成に異常がみられるため、このような形態異常が正常化するかどうか、光学顕微鏡と走査電子顕微鏡を用いて検証する。

本研究ではゲノム編集を用いた内耳への遺伝子導入ならびに遺伝子点変異による感音難聴の新規治療を目指して技術の確立とゲノム編集による細胞の表現型回復を目指して研究を進めている。今年度は妊娠マウスを用いて胎仔の耳胞への遺伝子導入手法の確立ならびに内耳感覚上皮細胞への遺伝子導入効率の向上を目指して各種条件のタイトレーションを行なった。遺伝子導入効率の確認にはCMVプロモーター下にEGFPを発現するレポーターコンストラクトを用いて、胎児の耳胞内にプロモーターを注入しエレクトロポレーションにより遺伝子導入を行なった。胎生12日目の耳胞に対して遺伝子導入を行い、生後1日目にEGFPの発現を検証したところ、当初は少数の非感覚上皮細胞に遺伝子導入を確認することができたが、感覚上皮細胞での遺伝子導入は得られなかった。エレクトロポレーションのパルス条件ならびに投与試薬の条件を変化させたところ、感覚上皮細胞にもEGFPの発現を得られた。生後1日目の内耳においてEGFP陽性細胞をカウントしたところ、感覚上皮に含まれる有毛細胞ならびに支持細胞のうち約5%の細胞でEGFP発現が陽性であることを確認できた。また、ゲノム編集による遺伝子治療のターゲットとなる感音難聴に関して、本邦で同定された遺伝子点変異による遺伝性難聴を候補として、モデルマウスを用いてその病態ならびに遺伝子発現に関する解析を行なった。候補遺伝子はヒト遺伝性難聴の原因遺伝子であり、細胞内アクチン制御に関わっていることが知られている。同分子の局在を免疫組織化学法を用いて調べたところ、不動毛ならびに細胞間結合に集積することが判明した。また、同分子の変異により、有毛細胞の不動毛形成の障害およびシナプス障害を生じることが判明した。現在点変異の修復に用いるためのコンストラクト作成を行なっており、完成すれば実際のゲノム編集効率を検討する予定である。内耳は解剖学的にアプローチが難しい臓器であり、ゲノム編集を用いた遺伝子治療を実現する上では、内耳への遺伝子導入技術の確立が必須となる。特に本研究においてはエレクトロポレーションによる生体内への遺伝子導入が必要となるが、このような手法は一般には確立されておらず、各施設において技術の修得が必要となる。研究の端緒として胎生マウスを用いて胎児の耳胞に対する遺伝子導入を行ったが、当初の手法では胎生致死となることも多く技術的な困難に直面した。しかしながら、今年度の研究においては胎児への投与時期、投与の条件を改善し、結果として胎生致死の確率を大幅に減少することができ、生後マウスにおける導入遺伝子の発現を十分に観察しうるだけの実験系が確立された。また、本研究で対象となる遺伝子は感覚上皮細胞でのゲノム編集が必要となるが、一般に感覚上皮細胞への遺伝子導入は非感覚上皮細胞に比べて導入効率が低い。この点に関してもエレクトロポレーションのパルス強度の調整やコンストラクト濃度の調整により導入効率を高めることができ、結果として感覚上皮細胞においても5%の細胞で発現を得ることができた。
テトラフルオロエチレンの選択的三量化反応の開発

本研究では,3分子のテトラフルオロエチレン(TFE)からの選択的なペルフルオロヘキサン誘導体の合成を目指す.ペルフルオロアルキル基を含むポリ(メタ)アクリレートは優秀な撥水撥油剤である.原料の1-ヨードペルフルオロヘキサンはTFEから合成されているが,3分子を選択的に反応させることはできず,2分子または4分子以上が反応した生成物が副生する.本研究では,遷移金属原子を含む環状化合物を経由する反応に着目し,選択的なペルフルオロヘキサン誘導体の合成法を開発する.本研究では,3分子のテトラフルオロエチレン(TFE)からの選択的なペルフルオロヘキサン誘導体の合成を目指す.ペルフルオロアルキル基を含むポリ(メタ)アクリレートは優秀な撥水撥油剤である.原料の1-ヨードペルフルオロヘキサンはTFEから合成されているが,3分子を選択的に反応させることはできず,2分子または4分子以上が反応した生成物が副生する.本研究では,遷移金属原子を含む環状化合物を経由する反応に着目し,選択的なペルフルオロヘキサン誘導体の合成法を開発する.
職域での集団認知行動療法を活用した睡眠教育プログラムの開発と効果検証

本研究の目的は、職域において睡眠健康教育の実施し、自記式質問票や通信機能付小型活動量計を用いて検討することであった。研究デザインは準ランダム化比較試験である。某製薬企業の参加者を2群に群別し、介入群には1回あたり50分の全3回(計150分)を1クールとした睡眠健康教育を5カ月間で行った。対照群には資料による教育とした。ドロップアウトの7名を除いた70名を分析した結果、対照群と比較して介入群で有意に介入後の平日睡眠時間が約12分増加していた。その他データについては介入群と対照群で有意な変化は認められなかった。本研究により、睡眠健康教育が労働者の睡眠不足を軽減できることが示唆された。本研究は,職域における集団認知行動療法を活用した睡眠教育プログラムを開発し,通信機能付携帯活動量計を活用して,労働者の身体的・精神的健康面での効果を検証することを目的とした。H26年度は,H27年度の睡眠教育プログラムの実施,睡眠測定に向けた準備として位置づけた。研究計画については所属大学に倫理申請を行い、承認を得た。睡眠教育プログラムについては,睡眠健康教育に関する知識の習得を図り,また認知行動療法専門家数名よりスーパーバイズを得て,睡眠に関する基本的な習慣の修正を目的とした「睡眠衛生教育」を主軸に,行動理論を背景とした「行動療法」,認知的側面を扱う「認知療法」を加えた,約6か月間にわたって,複数回のセッションでの労働者に対する睡眠教育プログラムの開発を行った。さらに,睡眠システムメーカーと連携しながら,通信機能付携帯活動量計を用いた睡眠状況(就寝時間,起床時間,睡眠時間,睡眠の質)や活動量を測定するための睡眠測定システムを構築した。H27年度に睡眠教育プログラムを用いて教育を実践・睡眠測定を行うに当たり,ある企業に研究協力の依頼を行い,研究実施の同意を得,実施に向けた調整を図った。その後,同企業の2事業場に勤務する労働者(約500名)に対し,研究協力者を募った。研究に協力の意思を申し出た労働者(約80名)に対して,同意説明・取得を行った。さらに,介入・ランダム化割付を行うに当たり,大学病院医療情報ネットワーク(UMIN-CTR)に登録し,ランダムに介入群と非介入群に2群化した。平成27年度は,ある企業の3事業所の労働者(約400名)を社員番号(奇数/偶数)により割付けを実施し、奇数群(Group A)、偶数群(Group B)の2群に割付けした。4月9月にはGroup Aに対し、全3回各回50分の睡眠健康教育(第1回:睡眠の基礎知識、第2回:睡眠障害と良い睡眠をとるための工夫、第3回:総まとめ(クイズ形式での理解度確認や健康づくりの睡眠指針2014を用いた総復習)、睡眠日誌などのセルフモニタリングを含めた睡眠教育プログラムを実践し、Group Bにはパンフレットによる教育とした。10月3月にはGroup Bに対し、同睡眠教育プログラムを実践し、Group Aにはパンフレットによる教育を行った。睡眠教育プログラム実施前後の効果評価のために研究協力に同意を得た75名に対し、通信機能付携帯活動量計と自記式質問紙調査を用いてデータ収集した。通信機能付携帯活動量計については、介入前から介入後までの1年間で7回(1回あたり約1週間)の睡眠関連データ(平日・休日別の睡眠時間、睡眠効率、睡眠潜時)を収集した。また、自記式質問紙調査(Epworth sleepiness Scale(ESS)、アテネ不眠尺度、Patient Health Questionnaire(PHQ-9)、WHO QOL 26)については、介入前(4月)、Group Aへの介入後(10月)、Group A/Bともに介入後(3月)に実施した。アテネ不眠尺度、PHQ-9、自記式質問紙調査を行った。評価項目は活動量計のデータ(平日・休日別の睡眠時間、睡眠効率、睡眠潜時)であった。Group Aへの介入後の効果評価を行った結果、Group A40名(男性26名、女性14名平均年齢43.8±8.0歳)、Group B35名(男性21名、女性14名平均年齢42.8±8.3歳)の2群間での差は認められなかった。しかし、Group Aの平日睡眠時間(+16.4分)、休日睡眠時間(+13.0分)が増加し、平日睡眠効率が向上(+1.2%)、平日睡眠潜時が低下(ー0.4分)していた。研究計画では、ある企業のA事業場に勤務する労働者約200名を調査対象として,集団認知行動療法を活用した睡眠教育プログラムを実施することとしていたが、ある企業のA事業所を含めた3事業所に勤務する労働者約400名を調査対象としたこと、集団認知行動療法は不眠などターゲットとする対象者の集団を対象にする必要があり、一般労働者に対しては、「睡眠衛生教育」を主軸とした睡眠教育プログラムに修正したこと、が変更点である。また、通信機能付携帯活動量計を用いたデータ収集方法として、研究協力者への負担軽減のため、データ収集回数を7回(1回あたり1週間程度)とした。睡眠教育プログラムの効果評価について、t検定や分散分析を用いて、先に介入したGroup Aと非介入のGroup Bの介入前、介入後のデータにより2群間での評価を行った。本研究は、職域における集団認知行動療法を活用した睡眠教育プログラムを開発し、通信機能付携帯活動量計を活用して、労働者の身体的・精神的健康面での効果を検証することを目的とした。

ある企業の3事業所の労働者(約400名)を社員番号(奇数/偶数)により割付けを実施し、奇数群、偶数群の2群に割付けした。4月9月には奇数群に対し、全3回各回50分の睡眠健康教育(第1回:睡眠の基礎知識、第2回:睡眠障害と良い睡眠をとるための工夫、第3回:総まとめ、睡眠日誌などのセルフモニタリングを含めた睡眠教育プログラムを実践し、偶数群にはパンフレットによる教育とした。10月3月には偶数群に対し、同睡眠教育プログラムを実践し、奇数群にはパンフレットによる教育を行った。睡眠教育プログラム実施前後の効果評価のために研究協力に同意を得た75名に対し、通信機能付携帯活動量計と自記式質問紙調査を用いてデータ収集した。通信機能付携帯活動量計については、介入前から介入後までの1年間で7回(1回あたり約1週間)の睡眠関連データ(平日・休日別の睡眠時間、睡眠効率、睡眠潜時)を収集した。また、自記式質問紙調査(Epworth sleepiness Scale(ESS)、アテネ不眠尺度、Patient Health Questionnaire(PHQ-9)、WHO QOL 26)については、介入前(4月)、奇数群介入後(10月)、2群介入後(3月)に実施した。アテネ不眠尺度、PHQ-9、自記式質問紙調査を行った。評価項目は活動量計のデータ(平日・休日別の睡眠時間、睡眠効率、睡眠潜時)であった。睡眠教育プログラム実施後の結果は、介入群の平日の睡眠時間が有意に12分長くなっていた。その他のデータは有意差がなかった。睡眠教育を実践することで、平日の睡眠時間が長くなり、平日の睡眠不足の軽減が期待できると考えられる。本研究の目的は、職域において睡眠健康教育の実施し、自記式質問票や通信機能付小型活動量計を用いて検討することであった。研究デザインは準ランダム化比較試験である。某製薬企業の参加者を2群に群別し、介入群には1回あたり50分の全3回(計150分)を1クールとした睡眠健康教育を5カ月間で行った。対照群には資料による教育とした。ドロップアウトの7名を除いた70名を分析した結果、対照群と比較して介入群で有意に介入後の平日睡眠時間が約12分増加していた。その他データについては介入群と対照群で有意な変化は認められなかった。本研究により、睡眠健康教育が労働者の睡眠不足を軽減できることが示唆された。初年度であるH26年度の計画として,1集団認知行動療法を活用した睡眠教育プログラムの開発,2通信機能付携帯活動量計を用いた睡眠測定システム構築,3研究の同意取得とランダム化割付,の3つを挙げた。1については,集団認知行動療法での睡眠教育プログラムを開発することとしていたが,集団認知行動療法は不眠などターゲットとする対象者の集団を対象にする必要があり,一般労働者に対しては「睡眠衛生教育」を主軸とし,一部認知行動療法の手法を用いる方が効果的であるという専門家のアドバイスにより,睡眠教育プログラムの修正を行った。2については,当初スマートフォンのアプリケーションを用いることとしていたが,アプリケーション開発メーカーによるAndroidとiOSの2つのOSに対応するアプリケーションの開発遅延に伴い,NFC(Near Field Communication)を用いたパソコン上でのデータ通信方法に変更した。3については,予定通り研究の同意取得とランダム化割付を行った。
微小ビトリナイト粒子による断層付近温度マップ分析技術の開発

ビトリナイト反射率は300°C程度までの優れた地質温度計であるが,従来は100μm程度の大きな試料しか分析できなかった.本研究により,産状観察に基づく新しい微小ビトリナイトの判別法を見出し,かつ特殊用途の照明装置を併設した新しい分析機を開発したことで約1.6μmの微粒子まで分析できるシステムの開発に成功した.これにより断層周辺の温度マッピングが可能となった.ビトリナイト反射率は300°C程度までの優れた地質温度計であるが,従来は100μm程度の大きな試料しか分析できなかった.本研究により,産状観察に基づく新しい微小ビトリナイトの判別法を見出し,かつ特殊用途の照明装置を併設した新しい分析機を開発したことで約1.6μmの微粒子まで分析できるシステムの開発に成功した.これにより断層周辺の温度マッピングが可能となった.ビトリナイト反射率は、堆積岩の優れた地質温度計であるが、油田・炭田地域で開発された手法であるため、数100μm以上の大きな石炭粒子を対象とし、断層帯のような微小な破砕粒子の到達温度の推定は難しかった。そこで微小分析装置の開発を目指した。そのアプローチとして、本計画では分析エリアの微小化ではなく照明エリアの微小化に主眼をおいた。それは次のような理由による。たとえ分析エリアを微小化したとしても、岩石試料には様々な高輝度鉱物が遍在し、それらに照明光が当たれば強い散乱ノイズを発生させてしまう。一方で対象物以外に照明が当たらなければ、散乱の影響がないばかりか、分析エリアを絞る必要も無くなるからである。一般的なケラー式照明装置は広視野均質光源として観察用に優れているが、光束を数10μm以下に絞ることはできない。一方で半導体の検査用やレーザ共焦点顕微鏡など特殊なケースで用いられているクリティカル照明装置は、点光源に優れているが広視野観察には向かない。これら二つの照明装置を落射顕微鏡に搭載し、広視野観察と微小部分析とを両立した。観察時にはケラー式の照日装置を用い、測定にはこれを遮断し、微小部のみを照らして反射率を測定する。これにより従来は直径100μmくらいの照明エリアが、約1.6μmまで微小化することに成功した。きわめて単純なアイデアだが、特殊な用途に限られているクリティカル照明装置を流用したことがポイントである。ビトリナイト反射率は表層から300°C程度までの優れた地質温度計であるが,従来は石炭のみからなる試料の平均的な値しか分析できなかった.本補助金での研究の結果,従来よりもはるかに微小で,かつ不均質な試料中の温度分布マッピングが可能な分析機の開発に成功した.試料の前処理,ビトリナイトの同定方法,新開発の分析装置に分けて説明する.試料の前処理:従来はビトリナイトを含む試料を破砕・単離した後に琢磨して測定試料としていた.これを破砕せずに琢磨することで産状情報を保持した.ビトリナイトの同定方法:従来は石炭化過程におけるゲル化によって源植物の細胞組織が失われている点が基準だったため,細胞組織サイズより小さな破砕片の判別はできなかった.しかし産状が保存されている場合は,ゲル化したビトリナイトが周辺砕屑粒子の隙間に入り込むため,注入構造の有無で判別できる.分析装置:従来の顕微測定装置は,観察用のケラー式照明を分析にも兼用していた.そのため光束を100μm程度までしか絞れなかった.石炭のみを単離した試料ならこれでもいいが,石炭のみを単離していない試料の場合は,高輝度鉱物の散乱光ノイズが問題となる.そこで分析用にクリティカル照明装置を併設し,観察と分析の照明を独立させた.その結果,広域の観察と,約1.6μmまで微小部測定が両立可能となった.このクリティカル照明は,半導体検査顕微鏡や共焦点顕微鏡といった特殊用途に開発されたもので,これを一般的な落射顕微鏡に適用したことがポイントである.
土砂氾濫を伴う浸水被害の早期警戒避難システム構築に関する研究

本システムは、全体で9個のサブシステムの構成となることを示した。中でも、浸水被害予測と住民の避難行動のサブシステムが主要部分を形成している。そこで、まず、浸水被害予測のサブシステムとして、福岡市の那珂川下流域を事例として、家屋が密集した河岸における越流量公式の提案、及び、地上・地下空間に対する平面2次元浸水被害予測シミュレーション手法の構築を行った。これに基づく予測情報を住民に提供して早期避難を図るため、次に、避難のサブシステムについて、豪雨時における住民の予測・避難情報に対する危険性の認識と避難行動との関係性などを明らかにした。本研究は、福岡都市圏流域の河川を対象とし、リアルタイム降雨・水位情報と気象庁による降雨予測情報を併用した、土砂氾濫も考えた浸水被害早期予測システムの構築を図るとともに、それに基づいた避難システムのあり方について検討を行うものである。平成20年度は、以下のふたつの課題について研究を実施した。(1)福岡都市圏流域における浸水被害の早期予測技術の開発福岡市の中心地の天神・中洲地区を流れる那珂川下流域を対象とし、1999年6月29日の集中豪雨を想定降雨として、密集市街地における浸水被害の予測技術について検討した。まず、Dynamic Waveモデルに基づく不定流計算を行い、河道の任意地点における洪水位予測と、家屋が密集した河岸における越流点・越流量の検出・評価法を明らかにした。次に、建物密度を考慮した平面2次元氾濫計算を行い、道路や地下空間、特に天神地下街や地下鉄駅の浸水被害の予測技術について検討した。(2)避難システム構築に関する研究災害過程に関する新しい研究動向をフォローし、災害に対する地域社会の脆弱性と復元=回復力を規定する諸要因について検討を行い、コミュニティのサイズや歴史的特性、住民どうしの紐帯の質がそうした脆弱性や復元=回復力を左右するのではないかという暫定的知見を得た。その上で、2003年九州北部豪雨災害および2006年鹿児島北部豪雨災害を対象に、その後の防災対策や避難対策の展開についてフォローした結果、地域住民の自主的な取り組みや組織化が活発な地域とそうでない地域とが存在することを明らかにした。平成21年度は、以下のふたつの課題について研究を実施した。(1)福岡都市圏流域における浸水被害予測システムの開発福岡市の中心地の天神地区を流れる那珂川下流域を対象とし、1999年6月29日の集中豪雨を想定降雨として、密集市街地における浸水被害の予測システムについて検討した。まず、Dynamic Waveモデルに基づく不定流計算を行い、河道の任意地点における洪水位予測と、家屋が密集した河岸における越流量公式の提案を行った。次に、建物密度を考慮した平面2次元氾濫計算を行い、地上・地下空間(地下街および地下鉄駅)を一体化した浸水被害の予測システムを構築した。さらに、土砂を含む氾濫計算法についても検討した。(2)避難システム構築に関する研究2003年九州豪雨災害、2006年鹿児島北部豪雨災害、2009年中国・九州北部豪雨災害など複数の豪雨災害を対象に、災害の時間的な経緯、地域の被災経験および地域社会(コミュニティ)の特質と避難行動との関係について、関連データを収集・整理し、分析を行った。被災経験の活用やコミュニティ・レベルでの対応など地域資源を動員することによって、住民の迅速な避難行動や有効な緊急対応行動を促すことが可能である点を明らかにした。本研究は、福岡都市圏流域の河川を対象とし、リアルタイム降雨・水位情報と気象庁による降雨予測情報を併用した、土砂氾濫も考えた浸水被害の予測システムの構築を図るとともに、それに基づいた早期警戒避難システムのあり方について検討を行うものである。平成22年度は、以下の課題について研究を実施した。(1)福岡都市圏流域における浸水予測システムの開発2003年7月、福岡都市圏を流れる御笠川、宇美川において土砂を伴った洪水氾濫が発生した。さらに福岡市の中心部の密集市街地を流れる那珂川は洪水氾濫の危険性が指摘されている。このような洪水氾濫に有効な予測システムとして、家屋が密集した河岸における越流量公式の提案、及び、建物密度を考慮した、地上・地下空間(地下街および地下鉄駅)一体化した平面2次元浸水予測システムの構築を行った。(2)地域住民の避難行動に関する研究災害時における地域住民の避難行動の実態と、その後の行政の対応、地域レベルでの対策について、緊急対応や応急復旧に関する最新の研究動向(特に災害に対する地域社会の脆弱性と回復力をめぐるアプローチ)をフォローした。その結果、被災地域においては、住民と行政とが連携して、避難場所・避難経路の再検討や防災教育の推進など、地域の防災力向上をめざした取り組みが着実に進められつつあることを明らかにした。(3)早期警戒避難システムの構築浸水被害の早期警戒避難システムは、全体で9個のサブシステムの構成となることを示した。

特に,避難のサブシステム構築の重要性を指摘した。急激な豪雨時における予測・避難情報の提供の在り方、住民の予測・避難情報に対する危険性の認識と避難行動との関係性などにシステム構築の課題があることも示した。
博物館から考える民俗学の実践的応用

本研究の目的は、ローカル商品や伝統食をめぐる動きに博物館学芸員が積極的に介入し、それにかかわる多様な人びととの協働を通して、地域文化の持続や活性化を図り、地域社会に変革をもたらすことにある。今年度は博物館学芸員である研究代表者が「越後えご保存会」の活動に一員として参加し、会員とえご食文化に関する知識を交換・共有した。具体的には同会で毎月開催する会員同士の情報交換会に出席して講演を行ったほか、毎月発行の会報にえご漁や食文化に関する情報を連載寄稿した。えご食文化を普及啓発するための社会実践として、保存会会員の協力を得て、試食及び調理体験をともなう形式での講座を長岡市と柏崎市で開催した。会員有志との協働でえご漁や食文化に関する現地調査を実施した。調査の折に現地で採集した海藻サンプルについては、新潟大学海藻学研究室の協力を得て、海藻種の分類・同定分析を実施。その結果、えご草として現地で認識されている柏崎市笠島の「オバエゴ」、佐渡市の「ケイゴ」、糸魚川市藤崎の「イギス」の呼称をもつ海藻は、すべて「アミクサ」であった。次年度以降は、別種の海藻をエゴノリに混和させる調理法が各地に伝承されている背景について明らかにすることが課題となる。食品としてのえごの味を第三者に伝達するための試みとして、人間の五感による官能評価と、測定機器を用いた物性値測定の分析を行った。これは保存会会員が独自に動きまわって着手した試みで、新潟県水産海洋研究所の協力を得て分析を進めている。日本酒の味わいが淡麗辛口などのチャート図で示されるように、最終的には各地に伝わるえご食文化の特性を消費者に向けて視覚的にわかりやすく表現することが当面の課題である。えご食をめぐる動きが、保存会や博物館の活動の枠を越えて、各方面に波及した。海藻の同定や食品分析を調査に加える発想は当初計画していなかったものの、博物館での集い、そこでの深い学習が、新たな知の生産につがっている。えご漁や食文化に関する調査研究を継続するとともに、2020年に予定されている越後えご保存会主催のPRイベントの開催に向けて協働で準備を進め、えご食文化の活性化を図っていきたい。現地調査のための旅費、調査記録に必要なカメラ等の機器購入に使用する計画である。
神経可塑性の誘導閾値制御における代謝型グルタミン酸受容体の役割の解明

記憶・学習に深く関与する海馬での神経可塑性においてはNMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)が重要な役割を担うことが知られている一方、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)の役割には不明な点が多い。今回我々は、脱分極パルスによりVDCC依存的かつ非ヘブ型のLTPが誘導されること(J. Neurosci. 29 : 11153, 2009)、さらにmGluR5がIP3受容体、L型VDCCと機能的複合体を形成し、このLTPを増強することを見出した(J. Physiol. 2012 in press)。今後はこれらmGluR依存的非ヘブ型可塑性と従来のNMDA依存的ヘブ型可塑性との相互作用およびその生理的意義解明を目指したい。記憶・学習に深く関与する海馬において誘導される長期増強(LTP)にはNMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)が重要な役割を担うことが知られている。一方、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)のLTP誘導における役割に関しては部分的報告があるものの、その詳細な分子機構には不明な点が多い。従来の報告により、mGluR刺激がNMDA電流を増大させることや(J. Neurosci.22:5452,2002)リン酸化を亢進すること(J.Neurosci.24:9161,2004)などが示されていることから、mGluRがリン酸化を介してNMDARの機能修飾を行うことが示唆される。一方、電位依存性カルシウムチャネル(voltage-dependentcalciumchannel;VDCC)依存的LTPの詳細な分子機構には不明な点が多かったが、今回、申請者らは脱分極パルスによりVDCC依存的にLTPが誘導されること、さらにこのLTPがNMDAR依存的LTPと異なりシナプス入力非依存的であることを見出した(J.Neurosci.29:11153,2009)。VDCCはmGluRにより修飾を受けることが様々な系で報告されている(Nature,382:719,1996)ことから、次年度以降は、海馬の可塑性誘導閾値調節におけるmGluRの役割を、特にターゲットとしてNMDARおよびVDCCの修飾機構に焦点をあてて明らかにすることを目指す。従来の報告により、mGluR刺激がNMDA電流を増大させることや(J.Neurosci.22:5452,2002)リン酸化を亢進すること(J.Neurosci.24 : 9161, 2004)などが示されていることから、mGluRがリン酸化を介してNMDARの機能修飾を行うことが示唆される。一方、電位依存性カルシウムチャネル(voltage-dependentcalciumchannel ; VDCC)依存的LTPの詳細な分子機構には不明な点が多かったが、申請者らは脱分極パルスによりVDCC依存的にLTPが誘導され、かつこのLTPがNMDAR依存的LTPと異なりシナプス入力非依存的であることを報告している(J.Neurosci.29 : 11153, 2009)。さらにこのVDCC依存的LTPはmGluRによる修飾を受けることも見出した(論文投稿中)。そこで、次年度以降は海馬の可塑性誘導閾値調節におけるmGluRの役割を、特にターゲットとしてNMDARおよびVDCCの修飾機構に焦点をあてて明らかにすることを目指す。これまで、mGluR刺激によるNMDA電流の増大(J.Neurosci.22:5452,2002)やリン酸化の亢進(J.Neurosci.24:9161,2004)などが報告されており、mGluRによるNMDARの機能修飾が示唆される。一方、電位依存性カルシウムチャネル(voltage-dependentcalcium channel;VDCC)

依存的LTPの詳細な分子機構は不明な点が多かったが、申請者らは脱分極パルスにより誘導されるシナプス入力非依存性のVDCC依存的LTPを見出した(J.Neurosci.29:11153,2009)。mGluRによるVDCCの修飾は様々な系で報告されている(Nature,382:719,1996)ことから、本研究計画では海馬の可塑性誘導閾値調節におけるmGluRの役割を、特にターゲットとしてNMDARおよびVDCCの修飾機構に焦点をあてて明らかにすることを目的とした。申請者らはVDCC依存的NMDAR非依存的LTPを報告していることから(J.Neurosci.29:11153,2009)このVDCC依存的LTPのmGluRによる修飾に着目した。mGluR5がIP3受容体、L型VDCCと機能的複合体を形成し、VDCC依存的LTPを増強すること、さらにmGluR5欠損マウスでこの作用が消失していることを見出した(論文投稿中)。これらの結果から、mGluRを介した非ヘブ型可塑性調節への新規のシグナル制御機構が示唆された。さらに生化学的解析によりmGluRとNMDARとの相互作用が示唆されていることから、今後はこれら非ヘブ型可塑性と従来の活動依存的NMDA依存的ヘブ型可塑性との相互作用を、mGluRとNMDARとの相互作用という観点から解明することを目指す。
硬膜動静脈奇形の成因に関する研究(ラットADFモデルを用いた検討)

我々の開発した静脈瘻モデルを用いて以下の点を解明した。1)静脈圧亢によりAVFが新たに発生する機序について:basic fibroblast growthfactor(bFGF)に対するmonoclonal抗体を用いた免疫組織学的手法で人硬膜動静脈奇形の静脈洞(Acta Neurochir 1996 in press)静脈圧亢進ラットの静脈および静脈洞にbFGFが発現することを確認した。このことより、静脈壁に生じるangiogenic factorが硬膜動静脈瘻の発生に何らかの関与をしていることが示唆された。2)AVF発現を修飾する因子(estrogen)の検討:estrogen投与ラットと非投与ラットの間でAVFの発生率に差ができるかを検討したが、有意の差は出現しなかった。以上より、estrogen自体はAVFの発生そのものには影響しないと考えられた。3)動静脈瘻発生機序に関する組織学的検索:静脈圧亢進ラットの、樹脂注入による鋳型標本の走査電顕による3次元構造の観察は、再度注入条件を変更し試みたが、やはり静脈洞近傍の血管がきれいに描出できなかった。ラットでは樹脂標本による組織学的検索は困難と考えられた。4)今後の検討:従来の我々のモデルを用いて実験を行う予定であったが、Herman(J.Neurosurg,539-545,1995)らが、我々と類似の静脈圧亢進モデルに静脈洞閉塞を加えることにより硬膜動静脈瘻が約40%に出現したという報告を出したため、我々も従来のモデル(動静脈瘻発生は約10%)に静脈動閉塞、静脈洞損傷を加えることにより、より高頻度に硬膜動静脈瘻が形成されるかをまず、検討している。我々の開発した動静脈瘻モデルを用いて以下の点を解明した。1)静脈圧亢進によりAVFが新たに発生する機序について:basic fibroblast growthfactor(bFGF)に対するmonoclonal抗体を用いた免疫組織学的手法で静脈圧亢進ラットの静脈および静脈洞にbFGFが発現することを確認した。2)AVF発現を修飾する因子(ラット性別、年齢、血圧差により、またestrogen投与により、AVF発現率が変化するか)の検討:estrogen pellet(0.75mg/pellet,60 days release)投与メスラット38匹と非投与メスラット(control)17匹に静脈圧亢進を負荷し、60日後に静脈圧亢進を解除し、AVFの発生率に差がでるかを検討した。Estrogen負荷ラットで38匹中2匹にAVFが出現し、control群では17匹中AVFの出現は認めなかった。これら2群の間には有意の差は認めなかった。また、前回オス静脈圧亢進ラットではAVFは22匹中3匹に出現したが、この群との間にも有意差はなかった。以上より、estrogen自体はAVFの発生そのものには大きな影響はしないと考えられた。1)動静脈瘻発生機序に関する組織学的検索静脈圧亢進ラットの、樹脂注入による鋳型標本の走査電顕による3次元構造の観察は、再度注入条件を変更し試みたが、やはり静脈洞近傍の血管がきれいに抽出できなかった。そこで、犬を用いで同様のモデル作成が可能かを検討した。犬の血管撮影を行ったところ、静脈系の構造はラットと類似しており、ラットと同じ手術で静脈圧亢進モデルが作成できることを確認した。雑種成犬1頭で本モデルを作成したが、翌日死亡した。本検討はしばらく中断している。

2)3)動静脈瘻モデルラットの自然経過、動静脈瘻の発現を修飾する因子これらに関しては、従来の我々のモデルを用いて実験を行う予定であったが、Herman(J.Neurosurgery,539-545,1995)らが、我々と類似の静脈圧亢進モデルに静脈洞閉塞を加えることにより硬膜動静脈瘻が約40%に出現したという報告を出したため、我々も従来のモデル(動静脈瘻発生は約10%)に静脈洞閉塞、静脈洞損傷を加えることにより、より高頻度に硬膜動静脈瘻が形成されるかをまず、検討した。ラット20匹に動静脈シャントによる静脈圧亢進状態を作成後、10匹には静脈洞損傷を加え、10匹には静脈洞閉塞を加えたラットを作成した。本年度4月末にこれらのラットに血管撮影を行い、動静脈瘻の発生頻度が増加したかどうかを調べる予定である。
白血病モデルマウスに対する分子標的療法の遺伝子発現光画像法によるモニタリング

平成16年度に樹立したルシフェララーゼ安定発現白血病モデル細胞を用いて白血病モデルマウスを作成した。野生型BALB/cマウスに皮下接種すると細胞は生着しなかったが、BALB/cヌードマウスに皮下接種すると局所で増殖した。BALB/cヌードマウスに様々な数の細胞を静注して生体発光画像法で追跡したところ、肝、脾、骨髄に対応する部位に増殖が観察され、白血病モデル動物として使用可能なことが示唆された。この実験の結果に基づいて、至適静注細胞数を決定した。また、基質であるルシフェリンを投与してからの時間と発光量の関係、撮像時のマウスの姿勢と収集される信号の関係、バックグラウンド信号の量と分布を検討し、撮像方法・データ処理方法を決定した。予備実験で決定された方法で、白血病モデルマウスの病変進行を生体発光画像法を用いて同一マウスで追跡したところ、いずれのマウスでも発光信号量は経時的に増加した。信号増加の速さ、静注後の生存期間には大きな個体差があったが、死亡時の信号量はほぼ同等で、信号量が疾患の重篤度を反映することが示唆された。また、細胞静注後の様々な時点で、生体発光画像法で撮像した後に速やかに臓器を摘出して撮像し、病変進行を臓器毎に評価した。肝、脾、骨髄における増殖が証明され、各臓器の信号は経時的に増強し、生きたマウスを撮像して得られた信号量とよく相関した。肝、脾の湿重量も経時的に増大し、摘出後の信号強度と相関した。また、臓器毎の評価にあたり、摘出臓器の発光には空気との接触が必要であり、骨髄中細胞を評価するには骨破壊が必要であることを示した。進行白血病モデルマウスに対するイマチニブ治療では有意の信号低下はみられず、効果を得るにはより軽症の時点で治療を開始する必要があると考えられた。ルシフェラーゼ(Luc)安定発現白血病細胞株を樹立するため、ホタルLuc遺伝子を発現するレトロウィルスベクターをヒト急性骨髄性白血病細胞株に感染させ、G418を用いて安定発現細胞を選択した。感染後早期には良好なLuc発現が得られたものの、発現は経時的に減弱し、治療モニタリングに適さないと判断された。同じレトロウィルスベクターをインターロイキン3依存性マウスB前駆細胞株に感染させ、G418を用いて安定発現細胞を選択した。得られたLuc発現細胞および親細胞に対して、さらに野生型もしくはキナーゼ変異型のBCR-ABL遺伝子を導入してからクローニングを行い、Luc発現急性リンパ性白血病モデル細胞株を樹立した。Luc遺伝子を導入した細胞株では、長期間の安定発現が得られた。いずれの細胞株でもインターロイキン3非依存性の細胞増殖がみられ、Luc遺伝子の有無で増殖速度に違いはみられなかった。野生型BCR-ABL遺伝子を導入した細胞株と比較し、キナーゼ変異型遺伝子を導入した細胞株では、イマチニブ感受性が低下していた。細胞数とLuc発現量は高い正相関を示したが、細胞増殖を生細胞数とLuc発現で追跡すると、増殖活性低下時に1細胞当たりのLuc発現は低下し、生細胞数とLuc発現強度に乖離を生じた。また、イマチニブによる低下は、生細胞数よりもLuc発現について、速やかにまた強く生じた。Luc発現細胞をマウスに皮下注または静注し、高感度CCDカメラで細胞分布を体外から画像化できることを確認した。