hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内の時計細胞における概日リズム発振系と光入力系の分子解析

交付申請書に記載の研究目的に沿って概日リズムの発現と光位相シフトに関する研究を遂行し、以下の成果を得た。(1)ニワトリ松果体に発現する時計遺伝子Per2, Per3, Clock, Bmall及び新規のbHLH-PAS型転写因子Bmal2をクローニングした。機能解析の結果、BMAL2はCLOCKやBMAL1と結合し、転写の促進とその抑制という両方向性の転写調節機能を持つと推定された。また、ニワトリ松果体からCry1・Cry2遺伝子を単離し、培養松果体細胞でのmRNA量を明暗・恒暗条件下で調べた。その結果、両遺伝子の発現は概日時計のみならず光の制御を受けていることが判明し、Cry遺伝子が光位相シフトに関与する可能性が示唆された。(2)ニワトリ松果体において活性が日周変動を示すMAPキナーゼ(MAPK)は主観的暗期の光刺激により脱リン酸化(不活性化)されるが、この光応答現象がMAPKを脱リン酸化するフォスファターゼの光活性化に起因することを見出した。次に、時計細胞におけるMAPKの標的蛋白質を探索し、MAPKがBMAL1をリン酸化することを見出した。このリン酸化部位を決定し、そのうちThr534のリン酸化によりBMAL1の転写活性化能が抑制されることを明らかにした。これらの結果から、MAPKの活性リズムは概日時計の位相調節に重要な役割を果たしていると考えられた。(3)光位相シフトの分子機構を知るため、Differential Display法を用いてニワトリ松果体において時刻特異的に光誘導される遺伝子を網羅的に探索した。その結果、位相後退時に発現誘導されるbZIP型の転写因子cE4BP4を同定した。転写アッセイにおいてcE4BP4はcPer2の転写を抑制し、生体においてもcE4BP4はPer2の転写を光依存的に抑制して位相後退を誘導することから、光位相シフトの重要因子と考えられた。
Industrial Policy Implications of Encouraging Open Source Software in Commerce and Open Projects

パイソン言語の開発コミュニティの歴史について参加者のインタビュー調査とウェブ上の資料を調査し、結果をまとめた。(1)パイソンコア開発者チームは小数人から数百人に拡大した。ほとんどがボランティアである。(2)フォウンダーが最終決定権を保留しても意図的に大きい権力を持つコア開発者を育てきた。(3)人数が多いに関わらず、協力的行動が染み込んで議論の結果がコンセンサスとなる場合がほとんど。(4)コンセンサスを促す公式的な課程設置、その記録に基づいた「文化」が以降の議論コンセンサスに導く。(2から4)は日本人の価値観に近い「パイソンモデル」を日本のソフトウエア産業に導入することを検討すべきと考えられる。126年度では複数部門経済成長モデルを応用してオープンソースソフトウエア開発部門(以下、OSS)が所得なしでもボランティア労働だけで商用ソフトウエア開発部門と共存できることを証明した。具体的にバランスドグロースパスではOSSの付加価値シェアが正でゼロに収束しないことが証明されている。前提は労働者にとってOSS開発活動が上級材が十分条件である。実際にリナックスカーネルそしてほかのソフトウエアがそういう風に発展した経緯がある。そして、長期的に見たらOSSはすぐなくならないのでOSSに基づいたソフトウエア開発方法に関する研究に社会的な意義があると言える。また、OSS開発方法にメリットがあれば、OSS自体がなくならないので社会からのOSSへの支援が無駄になる可能性が低いと言える。2パイソン開発者Guido vanRossum氏をはじめ数十人の開発者にヒアリング調査を行った結果、パイソン言語開発制度と組織の様子を明らかにした。内生的に開発課題を分散することだけではなく、場合に応じて決定権を分散する仕組みになっているという。「2位ではダメだ」が明らかになったが、日本の現実はきびしくて少数の分野以外、日本のソフトウエア開発産業が2位以下だと言われている。パイソン開発グループを模範として日本人の性格またはソフトウエア開発産業の現状に合わせたOSSを利用した開発法を考えることが有効ではと考えられる。OSと言語に限らず、OSSであらゆる基本ソフトウエアの共同開発で低コストで高質かつ信頼性の高い構成部品のライブラリーを作り、ビジネスオートメーション・Web2.0・クラードサービスを促す効果があろう。これらまとめた上で日本での開発法と比較する課題に必要なデータとなる。1. Silicon Valley, Technology, and Japanese Entrepreneurship Conferenceで「Project Governance in Open Source Software: A Case Study of Python」という研究報告を行った。そこ後の意見交換で「起業活動への応用を検討すべき」という助言があったので今まで重視した枠組みを活用しながら、零細企業とベンチャー企業への応用に努力を入れると考えている。研究の結果ですが、「パイソンコミュニティー」という意識が実際に存在することを確認しました。コミュニティーメンバーとしてはパイソンソフトウエア基金という組織が知的財産(主にソフトウエアの著作権と幾つかのトレードマーク)とpython.orgドメーンとそのコンテンツを管理するが、ソフトウエア開発に直接に関わらない。各国のPyCon(パイソンユーザの大会)、企業、ユーザーグループ、と個人プログラッマーが自分のニーズを満たしたりコミュニティーのニーズに貢献したりするためにソフトウエア開発に関わります。現在パイソンはほぼボランティア活動で世界のコンピュター言語のトップ5に入ったり、アメリカで一番報酬の高い言語となっている。こういう風な産業ない協力が日本の産業にも役立つという仮説に至った。2.研究仲間だけではなく、ソフトウエア業界などから詳細に興味を示した方が多くて今までのヒアリング調査(トランスクリプトと解釈)を著書としてまとめる活動が進んだ。(今年度中出版に)3.日本でのソフトウエアエンジニアへ連絡し、ヒアリング調査に入った。大学、国立研究所、企業で働くプログラッマーとプロジェクト管理者の意見をヒアリング調査で確認する予定です。オープンソースについて意識が低いが、これから使用することを検討している人も多いと分かりました。1.上に説明したが、中間発表の際により細かい報告が調査対象者と研究者から求められて、それに対応するためにデータ整理、面接トランスクリプトの用意などである程度遅れを受け止めた。2.研究以外の業務に取り組む時間が増えてしまった。約20人のパイソンコンピュータ言語の開発に関わっている開発者とコミュニティアクティビストのインタービュー調査を行い、ウェブサイトとメーリングリストを閲覧して1980年代の後半からの歴史を調べてまとめた。日本の技術管理についての参考文献を調査した。主に以下の結果を確認した。(1)パイソン言語の開発については最初の時代には少数人の開発者から現在のコア開発者グループに拡大して数百人が「コミッター」として自分の責任でパイソンのソースコードに新しい機能とバグフィックスを加える。ほとんどの開発者がボランティアである。大成功と言える。(2)他の急成長を見せたオープンソースプロジェクトと同じく、フォウンダーのGuido vanRossum氏は今でも最終決定権を保留しているが意図的に大きい権力を持つコア開発者を育て歓迎する方針だった。(3)コミッターが多いことに関わらず、van Rossum氏のリーダーシップにより協力的行動がコミュニティに染み込んで議論が激しくてもほとんどの場合には最終結果はコンセンサスとなり、次の課題にスムーズに活動を転換することができる。(4)コンセンサスの背景に「Python Enhancement Proposal」という公式的な課程で議論を行い、その結果に加わって議論の経緯がコミュニティの「伝統」になり、以降の議論に大きな影響を与える。特にデザインと機能の選択へのコンセンサスを促す。

以上の(2)から(4)は日本人の価値観に近いことで、そして日本人の技術家には同僚や知り合いと技術を話したり分かち合ったりすることが普通である。「パイソンモデル」で日本のソフトウエア産業にオープンソース型の開発法とビジネスモデルの導入を検討すべきと考えらる。パイソン言語の開発コミュニティの歴史について参加者のインタビュー調査とウェブ上の資料を調査し、結果をまとめた。(1)パイソンコア開発者チームは小数人から数百人に拡大した。ほとんどがボランティアである。(2)フォウンダーが最終決定権を保留しても意図的に大きい権力を持つコア開発者を育てきた。(3)人数が多いに関わらず、協力的行動が染み込んで議論の結果がコンセンサスとなる場合がほとんど。(4)コンセンサスを促す公式的な課程設置、その記録に基づいた「文化」が以降の議論コンセンサスに導く。(2から4)は日本人の価値観に近い「パイソンモデル」を日本のソフトウエア産業に導入することを検討すべきと考えられる。上記の実績1で報告した「OSSの付加価値シェアが正でゼロに収束しない」の研究報告を学会などで発表したが、26年度中に専門雑誌への投稿・出版を計画していた。27年度で論文をまとめてJournal of Economic TheoryまたはEconomics Lettersへ投稿する予定である。所属する筑波大学システム情報工学研究科社会工学域の組織再編と新しい3学位プログラムの設立に伴った英語資料・広報活動が科研を申請した時点で分からなかったので実際に研究に配分した時間が計画より少なかった。上記の実績2の録音したヒアリング調査を文書化する予定ですが、推測した時間を大幅にオーバーしたため27年度中に完成する予定となった。遅れの対応は100%が難しいそうだが、本研究を優先して予定した新しい研究を6ヶ月程度遅らせばロスタイムの一部が取り戻せる。予定は以下の通りである。1.春四半期で日本でのヒアリング調査を続ける。(予定は約10名のエンジニアとマネジャー)3. 7月下旬から著書、論文作成に集中。4. 29年1月から国内研究報告、論文投稿。1現在の遅れについては、組織再編が終わったので計画通り時間を割り当てられる。トランスクリプトなしで次の段階(日本国内ヒアリング調査)へ進めるので計画全体に大きな影響はない。なお、英語トランスクリプトの遅れを参考にし、英語と日本語トランスクリプト両方により多く時間と努力を割り当てることにした。また、研究論文を作成し、投稿する。2日本でパイソンに相当する言語開発コミュニティーといえば、ルビー言語であろう。
高感度指向性ボアホールレーダによるき裂や断層の3次元位置形状計測法の開発

本研究では、ダイポールアレー型指向性ボアホールレーダを用いた地中物体の3次元イメージング法に関する研究を行った。レーダゾンデを坑井内で走査することで得られる複数深度のダイポールアレー信号から物体の3次元イメージを推定する方法を提案した。この方法を用いて中竜鉱山(福井県)にある断層の3次元イメージングをしたところ、ボーリングコア等から推定される断層の3次元位置と調和的であった。本年度の研究成果を以下に列挙する。(1)ダイポールアレーアレーアンテナの設計広帯域な特性をもつ同軸ケーブルで給電されたダイポールアレーアンテナの設計のため、アンテナ特性の理論計算と実験による評価を行った。グランドプレーンを用いた室内実験及び大気中での実験では、坑井内のアンテナを模擬するため、アンテナ周囲に水の円筒状の膜をアンテナ周囲に設置した状態で電磁波を入射させた。その結果、受信データはモーメント法による理論計算結果と概ね一致することがわかった。これは、モーメント法を用いたアンテナの設計が妥当であることを示す。(2)ダイポールアレーアレーアンテナの試作4ch.の高周波スイッチを実現するため、周波数帯域幅0.5GHzのIC型スイッチを基板上にマウントし、直径40mmの導体円柱に収納した。直径1mmの細径セミリジッドケーブルを用いて各アレー素子の受信電圧を1ヶ所へ集中させた。これら多チャンネル信号を高周波スイッチによって1本の同軸ケーブルに接続し、1組の高周波増幅器とレーザダイオードによって地表へ信号伝送するシステムとした。電気/光変換ユニットを細長い円柱導体にパックすることで、アンテナ、給電線(中央部と枝分かれ部)、電気/光変換ユニット、及び坑井の全てを含めた電磁界計算を可能にした。(3)特性評価本学四条畷キャンパスや中竜鉱山で断層の計測を行い、試作したアンテナで地中物体の3次元計測が可能であることを示した。1.ダイポールアレーアンテナによる3次元イメージング法の開発送受信アンテナを同一坑井に挿入するシングルホール計測を行うことを考えて、送受信アンテナ間の間隔を一定のまま深度方向に微小に変位させて得た2深度のアレーデータで、地中にある反射点の3次元位置推定をし、さらに、目標物体が平面であると仮定して、物体の3次元イメージング法を開発した。レイトレーシング理論によると、目標物体からの反射波で推定される反射点の位置は送信アンテナと受信アンテナの給電点を焦点とする楕円上に存在する。物体が面状であり、波が反射点で反射するならば、反射点で楕円に接する接平面が目標物体の形状と考えることができる。このとき、目標物体である平面の法線は解析的に求めることができる。計算機シミュレーションにより、目的通りの推定ができることを確認した。2.フィールド実験フィールド実験は福井県中竜鉱山内の実験場で行った。本実験場はスカルンを母岩とし、断層が存在していることが確認され、この断層を貫通するように坑井が掘削されている。本研究で提案する3次元イメージングを可能にするため、レーダの測定深度間隔を2cm、アンテナ素子数を5素子に増加させた上で、2010年9月にレーダ計測を行った。各深度で反射点の位置を推定し、その点における面の傾きを計算した。坑道壁面での目視による観察、ボーリングコアから予想される断層の位置・形状と本研究による推定結果を照合したところ、両者は調和的であることがわかった。本研究では、開口幅1mm程度以下のき裂や断層を、1本の坑井で、坑井から数m数十mの範囲で3次元位置形状計測が可能な指向性ボアホールレーダ(同軸型レーダ)を開発し、その有効性をフィールド実験によって実証することを目的とした。今年度は、次の2点の内容が成果である。第1点は、これまで成功している高周波数帯(例えば100300MHz)だけでなく、低周波数帯(例えば10100MHz)でも同時にき裂や断層の3次元イメージングが可能な同軸型レーダの設計・試作と実験による実証をした。電子回路部分を長さ40cmの導体円柱に収納することで、導体円柱とアンテナ間の干渉を抑圧することに成功し、広帯域化を図ることができた。花崗岩中の坑井に試作したアンテナを挿入し、坑井外から平面波を入射させる実験によってアンテナの有効性を実証した。第2点は、既存の地質構造に関する情報が豊富な鉱山で、3次元的な位置形状が予想されているき裂や断層などの目標物体が存在する場所を選定し、開発した同軸型レーダによって3次元的にき裂や断層を推定した。さらにこの推定結果と他の計測法による結果と比較検討した。具体的には、アレー信号の処理を計算機上で行うことで物体の位置・形状推定を行った。断層やき裂は無限平板の誘電体と考えることで散乱中心の位置を推定した。同軸型レーダでは、ゾンデの深度が1つだけで散乱中心の3次元位置を推定できる。

ゾンデの深度を変化していくことで、散乱中心の3次元的な位置変化を追尾していき、物体の形状をとらえるアルゴリズムを開発し、適用した。
細胞接着斑蛋白質Hic-5によるがん細胞形質の調節機構

接着斑蛋白質Hic-5は、酸化ストレスやTGFβなどの刺激により核へ移行するが、Hic-5の構造類似体のパキシリンにはこのような性質が見られない。核外排出シグナルの阻害因子レプトマイシンB処理した細胞ではHic-5もパキシリンも核内に集積する。刺激に応答したHic-5の核移行の機構に関して、各種の変異体を作成して検討した結果、C-末端のLIM領域には核移行に必要な構造が存在し、N-末端のLD領域のLD3には核外排出シグナルが存在すると考えられた。また、酸化ストレス応答に関わる領域はLD2付近の2個のシステインであり、この配列はパキシリンには存在しない。次に、核に移行したHic-5の機能について、Hic-5強制発現細胞での遺伝子発現の変化を検討したところ、c-fosおよびサイクリン阻害因子p21遺伝子の発現が上昇した。特に、c-fos発現は酸化ストレスで上昇し、この上昇がdominant negative Hic-5発現ベクターにより阻害されたことから、酸化ストレスによる内在性c-fos遺伝子の発現にHic-5が関与すると考えられた。そこで、これらの遺伝子上流を結合したルシフェラーゼレポーターを用いてHic-5応答エレメントを検討した。その結果、Sp1エレメントが少なくとも一つの応答エレメントであることが明らかとなった。従って、Hic-5は接着斑でのインテグリンシグナルの制御に関与するだけでなく、遺伝子発現制御を通して細胞の浸潤性を含めた形質調節に関わることが示唆された。
鉱質コルチコイド／糖質コルチコイド受容体パラドックスの解明と腎臓病治療への応用

本研究では、Rac1によるMR活性化と臓器障害の機序につき検討した。足細胞特異的Rac1活性化、同Rac1 KOマウスは足細胞障害、アルブミン尿、糸球体硬化を自然発症し、Rac1活性とMR活性、MR阻害薬の保護効果が平行していた。マクロファージや心筋特異的Rac1/MR KOマウスでは心腎障害が軽微であった。肥満糖尿病性腎症、TAC心障害モデル、Ang II/食塩腎障害モデル、皮膚老化モデルにおいてRac1やMRの活性化、慢性炎症が関与し、Rac阻害薬やMR拮抗薬により病変が改善した。以上、Rac1-MR系の標的細胞とシグナルカスケードを同定し、この系が関与する新たな病態を明らかにした。本研究では、申請者が最近同定した『Rac1によるリガンド非依存的なMR活性化機構と腎障害』を腎臓病治療に応用するための基盤研究として、その分子機序や治療標的を明らかにするとともに、本系が関与する臨床例を探索することを目的とする。平成24年度は細胞特異的ノックアウト(KO)マウスを用いた標的細胞に関する検討と、『Rac1→MR活性化→足細胞障害』機序の検討、MR・GRシグナルの解析を中心に行った。1、足細胞特異的RhoGDIαKOマウスの表現型の解析とそのメカニズムの解析足細胞特異的RhoGDIαKOマウスでも全身性RhoGDIαKOマウスと同様のMR依存性足細胞障害が自然発症した。単離糸球体のマイクロアレイ解析により、対照群に比しKO群で変化し、MR阻害薬投与により改善する遺伝子に注目して、その病態のシグナルカスケードの解明を進めている。2、培養ポドサイトを用いたRhoGDIα-Rac-MRパスウェイの解析RhoGDIαノックダウンによりRac1活性上昇、RhoA活性抑制、細胞の形態変化、MRシグナルの増強が細胞レベルで示され、足細胞特異的KOマウスの結果とあわせ『RhoGDIα→Rac1→MR活性化→足細胞障害』が足細胞で生じていることが実証された。今後そのパスウェイの解析をさらに進める。3、培養ポドサイトを用いたMR・GR下流シグナルの解析ヒト、マウス由来培養ポドサイトには内因性にMR・GRが発現しており、リガンドを投与すると速やかに核に移行することが示された。そこでこれら細胞を用いてMRやGRが活性化した時に結合する標的遺伝子をChIP-seq法や次世代シークエンサーで解析中である。RhoGDIαKOマウスではRac1活性化によるMRシグナル増強が生じる。その標的細胞を特定するために、RhoGDIαの腎臓内局在を免疫二重染色により解析した所、腎糸球体ポドサイトと遠位尿細管に局在していた。すなわち、全身性RhoGDIαKOマウスではポドサイト、遠位尿細管細胞においてRac1を介するMR過剰活性化が生じているものと考えられた。そこで、MRのゲノム作用を介する腎障害メカニズムとその細胞特異性を検証する目的で、培養遠位尿細管細胞株mDCT cellsと培養ポドサイト細胞株にアルドステロン刺激を加えた際、核内受容体であるMRがどの遺伝子のプロモーター領域に結合するか、次世代シーケンサーを用いた全ゲノムクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)解析により網羅的に解析した。さらにChIP-seqとマイクロアレイ解析を組み合わせて遠位尿細管細胞、ポドサイトにおけるMR標的遺伝子を同定した。その結果、細胞毎に独自のMR結合プロファイルが観察され、腎遠位尿細管細胞株ではゲノム上の1113ケ所に有意なMR結合領域が見いだされ、標的遺伝子として既知・未知の遺伝子が同定された(Ueda eta. BBRC 2014)。培養ポドサイト細胞株では腎遠位尿細管細胞株とは全く異なる結合プロファイルを呈した。(2)足細胞特異的MR KOマウス、同GRKOマウスのポドサイト表現型の解析足細胞特異的MR KOマウスは樹立途上である。足細胞特異的GR KOマウスは通常飼育条件下では足細胞障害やアルブミン尿を生じなかったが、足細胞障害刺激を加えると、野生型ではポドシンの発現低下が見られるのに対して、GR KOマウスでは全く低下せず、障害も軽微であり、ポドサイトGRの新たな役割が示された。1.腎糸球体ポドサイト特異的RhoGDIαKOマウスと同Rac1 KOマウスを作製し、ポドサイト障害を自然発症することを見出し、その分子機序を明らかにした。前者にはRac1過剰活性化、鉱質コルチコイド受容体(MR)活性化が関与しており、糖尿病やメタボリックシンドローム、高血圧などの病態モデルにおける足細胞障害と類似しており、Rac阻害薬やMR拮抗薬が有用であった。

後者ではMRシグナルは低下しており、MR拮抗薬は無効で、異なるメカニズムの関与が示された。2.培養ポドサイト細胞株においてRac1活性を変化させると、Rac1活性化により細胞のmotilityが亢進し、Rac1 knockdownではmotilityが低下した。また、局所におけるRac1活性を検出することに成功し、活性化部位にフォーカスしてその形態機能解析を進めたところ、cortical F-actin ring形成、リン酸化カスケードの賦活化などを見出した。また、Rac1活性とMRの間に相関が認められた。3.ポドサイト特異的GR KOマウスを作製したところ、通常飼育下ではポドサイト障害を発症しなかった。一方、LPSによるポドサイト障害はKOマウスで軽微であり、GRがポドサイト障害機転において障害性に働くものと考えられた。GRシグナルの標的遺伝子も同定しており、腎障害におけるGRの、抗炎症とは異なる新たな役割を明らかにすることができた。ネフローゼ症候群に対するステロイド治療時に、このポドサイトGRシグナルがどのように影響を受けるかについては臨床的にも重要な問題であり、今後さらなる検討を要する。4.マクロファージ特異的Rac1 KOマウス、MR KOマウスを用いて腎障害モデルを作製し、浸潤マクロファージにおけるRac1-MR系のクロストークが炎症性サイトカイン産生を介して腎障害の炎症機転に寄与することを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。腎臓病学、解剖学、内科学26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞特異的ノックアウトマウスで予想された表現型が出現し、順調に進展していると考えている。今後in vivoとin vitroの系でそのパスウェイの新たなメカニズムを見出し、よりハイレベルな研究成果に発展させて論文化をはかる。足細胞特異的RhoGDIαKOマウスが全身性KOマウスと同等のポドサイト障害を自然発症すること、本マウスのポドサイトにおけるRhoGDIα-MRパスウェイ亢進が病態に深く関与することが示された。足細胞特異的MR KOマウス作製用の交配でホモオスマウスがまだ1匹しか得られておらず、in vivoポドサイトにおけるMRとGRの対比の解析が行えていないものの、足細胞特異的GR KOマウスのポドサイトの表現型を新規に見出すことができ、ポドサイトGRの新たな役割が明らかになってきている。またMRのChIP-seq解析法を確立し、遠位尿細管細胞株におけるMR結合サイトならびに標的遺伝子の網羅的解析に成功し、その成果を論文発表した。ポドサイトに関してはウイルスベクターを用いたトランスフェクションが必要で、解析に時間がかかったが、データの取得はすでに済ませており、現在論文投稿準備中である。以上より、おおむね順調に進展していると考えている。ノックアウトマウスや培養細胞を用いた解析は今後も概ね計画通り進める。臨床への橋渡しとしてRhoGDIα→Rac→MR系が関与する腎臓病患者の探索を行う予定であったが、平成24年度に海外よりRhoGDIα遺伝子変異による小児ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の症例報告がなされたため、腎Rac1/MR活性診断法、特に腎生検検体に応用できる方法を開発し、臨床例の探索を進める。(1)足細胞特異的MR KOマウスの樹立と足細胞障害の解析
雷空電の球面波伝搬効果解明とポータブル雷モニタへの応用展開

本研究は、雷から放射される電磁波(雷空電)を対象に、平面波伝搬近似が成立たなくなる100 km圏内の近距離の雷活動を把握する一地点観測による落雷位置推定法と小型軽量な雷活動モニタシステムの開発に関する研究を行った。落雷位置推定法に関し、雷空電直接波を用いることで従来の反射波のみを用いる場合に比べ、近距離で推定値誤差の改善に効果があることが分かった。そして、システム開発に関して、近距離の雷空電観測に重要となる電磁界センサの広帯域化を図り、アナログASICによるシステムのアナログ部の超小型化を推し進めた。本年度は、極近距離雷(10 km圏内)から放射された電磁波と超音波の観測による落雷位置推定のフィールド実験、及び広い周波数帯(数Hz数MHz)にまたがる雷空電に対して、小型電磁界センサの一種であるサーチコイル磁力計の広帯域化について改良を行った。極近距離から放射される雷空電は、位置推定に必要な電離層からの反射波の時間差が得られない。このため本研究では電磁波以外の情報として超音波と電磁波の時間差を考えた。超音波と電磁波の時間差は、両者の到来方位が一致する場合を対象とする。このため、基礎実験として、雷から放射される超音波の到来方位を推定するために、6個の超音波センサのアレイを開発し、電磁波と超音波の到来方位の同時推定実験を行った。一方で、近距離の雷空電を対象とする際、伝搬距離が短いため数十kHz以上の電磁波の減衰の影響が軽減され、電磁界センサの広帯域化が重要なシステム開発要素の一つとなる。従来のサーチコイル磁力計は、一つのコイルの共振周波数(数kHz)をもち、これによりセンサ感度および周波数帯域が決まり、1 MHz程度までの広帯域化は困難であった。本研究では、数kHzと100 kHz付近に共振特性をもつ二つのコイルをコンデンサにより容量性結合し、さらに磁性体コアを共有させることで、ある周波数帯では誘導性結合も伴うような新しいサーチコイルを開発した。特に誘導性結合において、負の相互インダクタンスの影響により、コイルの浮遊容量をキャンセルできることがわかった。これにより、二つの共振点を作ることができ、1 MHzまでの広帯域な感度特性を有するサーチコイルを新規に開発することができた。本年度は、ポータブル雷モニタの小型化のために、特にアナログ回路の小型化について、複数のアナログ回路をCMOSデバイスで一つの集積回路にまとめたアナログASIC(Application Specific Integrated Circuit)導入の検討を行った。雷から放射される電磁波(雷空電)の主な周波数帯は数十kHz以下であり、このような低周波ではCMOSデバイスのフリッカ雑音が支配的となる。フリッカ雑音は、MOSトランジスタのサイズを大きくすることで低雑音化が可能であるが、一般的に同じサイズであればバイポーラトランジスタの方が、電圧雑音が小さく低雑音特性を有する。一方で、MOSトランジスタは、電圧雑音特性は悪いが、電流雑音特性はバイポーラトランジスタのpA/√Hzオーダーに比べてfA/√Hzを有し、極めて低い電流雑音特性を有している。このように、MOSトランジスタの低電流雑音特性に着目し、雷空電の誘導電流を検出する電磁界センサとCMOSデバイスを用いたアナログASICプリアンプを用いることが有効であると分かった。実際に5 mm角のチップに4入力分の超低雑音電流アンプ、ゲイン調整アンプと定電圧回路を含んだASICプリアンプと誘導電流を検出する電磁界センサ(長さ10 cm)を用いてセンサ感度を測定したところ、1 kHzで40 fT/√Hz、10 kHzで80 fT/√Hzの特性を得た。これらは、従来の電磁界センサとディスクリート部品で組まれたアナログ回路による感度特性と同等の性能である。よって、アナログASICにより従来と同等の感度を有しながら、システムのアナログ部を極端に小型化可能であるという有益な技術指針を得た。近距離(100 km圏内)の雷活動(位置と規模)を検出する小型軽量な単体システムを開発するという目的に対し、本年度は、雷空電直接波の一地点観測落雷距離推定法への影響について重点的に理論解析を進めた。雷空電(数百Hz数十kHz)は、落雷点から観測点に直接到達する直接波と電離層ー大地導波管内を多重反射して到達する反射波に分類できる。従来、一地点観測による落雷距離推定法は、電離層ー大地導波管モード伝搬もしくは平面波近似に基づいており、比較的長距離(数百km)の落雷を検出するのに適していた。しかし、波長に対し近距離といえる100 km圏内の落雷に対しては、推定法の近似が成立しなくなるため、落雷距離を推定することができないという技術的問題点があった。一方で、雷空電直接波は大地導電率の影響により、その見かけの伝搬速度は光速よりも遅くなるため、一地点観測による落雷距離推定法には用いられてこなかった。

しかし、落雷距離推定法に用いる雷空電パルス間の時間差パラメータの微小変動に対する推定値変動が、反射波のみを使用する従来法は無限大に漸近してしまうのに対し、直接波を用いることで光速に漸近させられることがわかった。つまり、時間差パラメータの誤差に対し、推定結果の変動は直接波を用いることで従来法に比べ小さくすることができ、推定精度改善に原理的に有効であることがわかった。これは、従来の反射波を用いた一地点観測による落雷位置推定システムの近距離雷に対する欠点を補うものとして重要な知見を得ることができたといえる。当初の予定通り、電磁波と超音波を用いた落雷位置推定法の実験に加え、近距離の雷電流の推定に重要な雷放電の特徴量を検出するためにサーチコイル磁力計の広帯域化を図ることができた。特にサーチコイル磁力計の広帯域化は、一組のセンサと増幅回路で二つの共振点を実現し広帯域化を図った。このサーチコイルは、雷空電観測だけでなく地球周辺で観測されるプラズマ波動観測用としても十分な性能を有していることも確認できた。このため、科学衛星搭載用交流磁界センサとしての応用も期待できるものである。これまでの研究で、一地点観測による落雷距離推定法の誤差率は100 km400 km圏内の遠距離雷に対して±20%以内で推定出ることが分かっていた。さらに、本年度の解析により数十km100 km圏内の近距離雷に対して、直接波を用いることで誤差率±20%で推定できる見通しが立ち、計画通り推定法の適用限界の検討を進めることができているため。これまでの研究成果を集約し、雷空電の一地点観測情報から100 km圏内の雷活動をモニタできる小型軽量な単体システム開発のための技術指針を明らかにする。特に大幅なシステムの小型化のため、回路のASIC化についても検討を行いたい。一地点観測の電磁波情報だけでは、原理的に落雷位置の推定が困難な極近距離(数十km圏内)の落雷に対し、新しい位置推定法の開発について検討を進める。特に、雷から放射される電磁波と超音波の観測点までの到来時間差を利用して距離推定法の確立を目指す。該当なし雷空電の一地点観測落雷距離推定法の適用限界に見通しをつけるため、直接波の推定法への影響について力点を置き理論解析を進めた。このため、雷空電のフィールド観測が十分に行うことができなかったため、次年度に使用する研究費が生じた。平成24年度以降に十分なフィールド観測とシステム開発(特に小型化の検討)に研究費を使用する。
MAMP受容体を介した細胞壁での防御応答機構

植物と病原菌は細胞表層・アポプラストにおいて、侵入しようとする菌の検出と植物側の防御応答の起動を巡ってさまざまな形で攻防を行っている。我々は植物キチン受容体を中心に、細胞表層におけるMAMPリガンドを介した受容体活性化機構解明および病原菌感染やエリシター刺激時の局所的カロース蓄積に関わる膜交通系因子の解明を目指した。受容体活性化機構の解明において、キチン受容体CERK1の428番目のチロシン及び479と573番目のスレオニン残基が自己リン酸化に関与し、キチンシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを明らかにし、論文で発表した。MAMP受容体直下でカロース蓄積を正に制御する因子として、E3ユビキチンリガーゼPUB4を見いだし、pub4変異体の解析によりキチン誘導性活性酸素生成及びカロース蓄積が低下することを確認した。またCERK1キナーゼドメインの発現タンパク質を用いた実験により、CERK1がPUB4を直接にリン酸化することを確認し、これらのリン酸化部位はPUB4の特定の部分に集中していることを見出した(論文投稿準備中)。また基生研の上田グループとの共同により、さまざまな膜交通系因子変異体のカロース蓄積について検討した結果、特定の膜交通系因子がキチン応答・カロース蓄積に関わる分子の輸送に寄与することを示唆する結果を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物と病原菌は細胞表層・アポプラストにおいて,侵入しようとする菌の検出と植物側の防御応答の起動を巡ってさまざまな形で攻防を行っている。我々はこれまで真菌類の代表的な微生物分子パターン(MAMP)であるキチンの断片に対するキチン受容体(CEBiP型およびCERK1型)を同定し,その受容体の活性化機構を解明してきた。本研究では,植物の細胞表層における植物の病原菌認識が分子レベルでどのように行われ,下流のシグナル伝達活性化につながるか,また,どのようにして細胞壁レベルでの防御応答に結びつくかを明らかにすることを目指している。本年度は,キチン受容体を中心に,受容体の細胞表層における局在性と動態を明らかにし,リガンドによる受容体活性化機構の解明を行った。そのため生物活性を保持した受容体の適正な蛍光タグの導入位置の探索および異種発現系を用いた目的タンパク質の発現とそれを利用した機能解析についての検討を行い,またリガンド依存的に受容体活性化の動的変動についても解析を進めた。植物は菌の侵入に対して局所的に物理的障壁としてカロースを主成分とするパピラ形成することが知られている。我々はキチン誘導性カロース蓄積機構の解析が,パピラ形成のメカニズムの理解につながると考え,事実,我々はこれまでエリシター処理時のカロース蓄積を顕微鏡下で観察されるスポット像に基づいて定量的に解析するプログラムを開発し,この解析法による変異体を利用した解析から,キチンエリシター処理によるカロース合成は,病原菌感染時のカロース合成で中心的な役割を担うGSL5/PMR4によることを確認している。このキチンの認識が細胞表層レベルでの防御応答であるカロース蓄積にどのようにしてつながるのかを受容体下流でカロース蓄積制御に関わるシグナル伝達系上流因子の同定と機能解析を行うとともに,病原菌感染やエリシター刺激時の局所的カロース蓄積に関わる膜交通系因子の同定を目指す。キチン受容体の細胞表層における局在性、リガンドを介した受容体の動態の変化及びその制御の解析をおこなうために、ベンサミアナタバコ一過的発現系を用い、キチン結合活性を保持したCEBiPにGFPを導入する位置を決定した。またCEBiPと高い構造類似性をもち、キチン結合能をもつCEBiP2がCEBiPと異なる局在性を示すことにより異なる機能を持つ可能性を示し、植物のもつキチン防御応答系の意義の解明につながることが示唆された。しかしCEBiP-GFPを導入したCEBiP欠損変異体を用いた予備実験では、GFPの蛍光観察ができていない課題点が残っている。一方、シロイヌナズナでは、キチンオリゴ糖処理により、ユビキチン化されたCERK1の膜画分での一過的増加とその後の大幅な減少が見られることから、リガンドにより活性化されたCERK1の特異的なダウンレギュレーション或は再配置が起きている可能性が示唆された。MAMP受容体直下でカロース蓄積を正に制御する因子として、E3ユビキチンリガーゼであるPUB4が見いだされた。pub4変異体の解析により、キチン誘導性活性酸素生成及びカロース蓄積の低下が確認されたが,これらに反してMAPKの活性化や防御応答関連遺伝子の発現誘導が亢進していることが明らかになり、植物ホルモンの関与が示唆された。また菌の侵入に伴うパピラ形成のモデルとして、キチン誘導性カロース蓄積機構を用いて検討を行った。さまざまな膜交通系因子変異体のキチン応答・カロース蓄積について検討した結果、RAB5に分類されるARA7とRHA1の変異体ではキチン誘導性のカロース蓄積が著しく低下するが、活性酸素生成などの他の防御応答指標には明確な影響が見られなかった。これらの結果から、特定のRAB5がキチン誘導性のカロース蓄積に関わる分子の輸送に寄与することが示唆された。

我々は植物キチン受容体を中心に、細胞表層におけるMAMPリガンドを介した受容体活性化機構解明および病原菌感染やエリシター刺激時の局所的カロース蓄積に関わる膜交通系因子の解明を目指した。受容体活性化機構の解明において、キチン受容体CERK1の428番目のチロシン及び479と573番目のスレオニン残基が自己リン酸化に関与し、キチンシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを明らかにし、論文で発表した。MAMP受容体直下でカロース蓄積を正に制御する因子として、E3ユビキチンリガーゼPUB4を見いだし、pub4変異体の解析によりキチン誘導性活性酸素生成及びカロース蓄積が低下することを確認した。またCERK1キナーゼドメインの発現タンパク質を用いた実験により、CERK1がPUB4を直接にリン酸化することを確認し、これらのリン酸化部位はPUB4の特定の部分に集中していることを見出した(論文投稿準備中)。また基生研の上田グループとの共同により、さまざまな膜交通系因子変異体のカロース蓄積について検討した結果、特定の膜交通系因子がキチン応答・カロース蓄積に関わる分子の輸送に寄与することを示唆する結果を得た。キチン受容体の細胞表層における局在性、動態と機能の解析を行うため、種々の蛍光タンパク質のCEBiP受容体への付加および発現等の条件の再検討を行い、その情報に基づいて形質転換体を作製する。形質転換体における蛍光付加した目的受容体タンパク質の発現や生物活性の保持を確認後、受容体活性化及び機能の解析を進める。また活性化された受容体がどのようにダウンレギュレーションおよび再配置されるのかについての解析は、蛍光標識CERK1受容体を導入した形質転換体を作製し、リガンドの存在及び非存在下における受容体の動態解析、及び種々のユビキチンの特異抗体を用いた生化学的解析や阻害剤による薬理学的な実験を組み合わせて分析をおこなう。受容体を介したカロース蓄積制御に関わる受容体下流因子の探索を継続するとともに、すでに同定されたカロース蓄積を正に制御するPBL27を含めたシグナル伝達系上流因子とMAPKカスケードの関係、カロース蓄積との関係を調べる。一方、菌の侵入に伴う物理的障壁的役割をもつパピラ形成のモデルとして、キチン誘導性カロース蓄積の制御過程に関与する膜交通系因子を明らかにするため、さまざまな膜交通系因子変異体でのキチン応答・カロース蓄積についてさらに検討を重ねる。またパピラ形成に関わるカロース合成酵素GSL5/PMR4および膜交通系因子の動態を観察するため、GFP融合タンパク質を発現するコンストラクトおよび形質転換体作出を行い、解析を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。
クライオサンプリングによる成層圏大気中の微量成分の研究

昭和61年5月28日、岩手県の宇宙科学研究所三陸大気球実験所(39°09′30′′N,141°49′30′′E)よりクライオジェニックサンプラーを装備した大気球を放球し成層圏大気を凍結捕集した。昨年度より大型の気球を用いたため、本年度は35kmの高度まで6個の試料を得ることができた。圏界面は10kmと18kmの二層であった。クライオジェニックサンプラーは7本の試料容器とこれらを冷却する液体ヘリウムを入れるデュワー瓶、容器を地上からの指金によって開閉するリモートコントロールされた真空バルブ類よりなっている。試料採取容器およびこれらの連結管や大気導入管はあらかじめ高真空に排気しておく。大気の採取は大気球の降下時に希望の高度でバルブを所定時間開放して行なった。この時大気球よりのヘリウムその他の脱ガスによる汚染を最小限に抑えるため、サンプラーを塔乗したゴンドラは大気球より100m以上下方につり下げ、さらに大気吸入孔をゴンドラより4m下につり下げた。海上にて回収されたサンプラーはまず富永研究室にて圧測点とハロカーボン、メタン測定用試料を分取したのち、東北大学田中研究室に送られ、非分散型赤外分析装置にて二酸化炭素の含有量が精密に測定された。次いで残りの大気より二酸化炭素を分離、精製し、東大酒井研究室にて【N_2】O【^(13)C】【^(18)O】濃度が測定された。本年度は二酸化炭素の濃度、同位体比の分布が昨年度より若干異なる結果が得られた。しかし、高度が高くなるほど【δ_(13)】Cと【δ_(18)】Oが増大する傾向においては全く変わらない。昨年度の結果と合わせて考察すると、成層圏における炭素同位体比と二酸化炭素濃度の関係は対流圏と異なるらしいことがわかった。
新規ナノ相分離機構によるネットワーク状高分子ナノファイバーの創成

高分子メソ多孔体は分離機能材料の有力な候補である。汎用の工業原材料から、経済的に適用可能な耐久性のある分離機能材料を作り出すことは、未だ挑戦的な研究課題である。本研究では、高分子溶液の凍結現象を研究し新しいナノ結晶化相分離法を開発した。さらにこの新手法を利用して、汎用高分子からネットワーク状ナノファイバー材料を作製することも成功した。この高分子多孔体は、ナノ細孔と著しく大きな比表面積を有し、ガスの高速吸脱着や選択的な蒸気の凝縮性能を有する。さらに、エンジニアリングプラスチックから作製したメソ多孔体は、水中に溶解したオイル分子に対して著しく大きな「吸着量の温度依存性」を示すことを見出した。研究開始にあたる本年度は、提案した相分離機構の実験的検証とネットワーク状高分子の作製を行なった。検証実験にはモデル高分子としてポリスチレンを用いた。本アイデアの独創性は、ガラス化と冷結晶化に着目した高分子溶液の相分離現象である。そこで、高精度示差走査熱量計を用いて高分子溶液の凍結・融解過程を詳細に調べた。精力的な条件探索の結果、ガラス化(冷結晶化)する高分子濃度と溶媒種類を見出すことに成功し、提案した相分離機構の基本要件が検証できた。続いて、上記の濃度・溶媒条件を用いてネットワーク状高分子の作製に取り組み、走査型電子顕微鏡による構造の直接観察と窒素ガス吸着法による比表面積・細孔分布評価を行なった。具体的な作製手順は次の(1)-(3)である。(1)ポリスチレンの濃厚溶液を液体窒素で急冷することで、高分子溶液全体が凍結したガラス状態を得る。(2)低温のまま大量の貧溶媒を導入し、低温フリーザー中で保持する過程で、溶媒分子の冷結晶化によるナノ結晶相分離を誘起する。(3)引き続き、貧溶媒で溶媒置換することによりナノ相分離構造を固定化する。得られた試料の断面観察により、緻密で連続的につながった高分子ナノファイバーのネットワーク構造を見いだした。さらに、ナノファイバーの直径を画像解析により定量的に評価した。窒素ガス吸着法では、264m^2/gの大きな比表面積が得られ、直径10-50nmのメソ細孔に相当する細孔を多数有していることがわかった。電子顕微鏡観察で得られたナノファイバーの直径分布からみかけの比表面積を見積もると、バルク測定法である窒素ガス吸着法で得られた比表面積とほぼ一致し、ナノファイバー構造がバルク試料全体に分布していることが確認できた。さらに、溶媒の組み合わせ・濃度・凍結保持温度などの作製条件を探索し、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルイミドなど多種類の汎用高分子からもネットワーク状高分子ナノファイバーの作製に成功した。上記ように、研究計画で提案した相分離メカニズムの一般性が検証した。本年度は大規模製造に適した高分子メソ多孔体の作製法の改良を実施した。具体的には、製造設備の大型化に対応するための撹拌装置および粉砕・成形装置を導入し、操作法の標準化を実施した。また、原材料の再検討を行ない、ポリスチレンやポリスルホンなど工業的に大量に販売されている汎用高分子を入手した。製造過程で使用する溶媒も、一般に工業利用されているものへと変更し、作製条件の最適化を実施した。加工プロセスで使用する溶媒の再利用にも取り組んだ。このような多方面からの検討・改良の結果、大容量製造に適した製造プロセスを再現性良く確立することができた。また、紡糸法や塗布法といった既存の高分子加工技術との組み合わせにより、ファイバーやシート、ペレットなどの様々な形状の高分子メソ多孔体を製造できることを実証した。オイル成分が混入した高濃度汚染水(石油随伴水)は資源エネルギー・環境保全に関連した注目トピックの一つである。本年度は、高分子メソ多孔体のオイル吸着材としての応用可能性を検討した。具体的には、水中に溶解したオイル分子に対する分離性能評価を行なった。また、市販の活性炭、合成高分子吸着剤、高分子粉体に対しても吸着等温線を測定し、高分子メソ多孔体との性能比較を行なった。その結果、高濃度領域における吸脱着サイクルでの分離性能において、優位性を得る可能性を見出した。耐熱温度の高いエンジニアリングプラスチックから作製した高分子メソ多孔体では、水中のm-クレゾール(随伴水に含まれる主要な有機分子の一つ)の吸着実験で、市販の活性炭や高分子吸着材と比較して、著しく大きな「吸着量の温度依存性」が確認された。すなわち、開発されたオイル吸着材は、吸着容量の大きな温度依存性を有するため、穏和な運転条件での油/水分離プロセスの設計を可能にし、経済的に応用可能な随伴水処理システムを構築するためのコア技術として有望である。ネットワーク高分子ナノファイバーが大きな自由表面層を持つメソ多孔体である点に着目し、これまで難しかったバルク材料評価手法による高分子表面の材料物性評価を試みた。

(1)温度変調型示差走査熱量計によるガラス転移点の測定を行なった。この多孔体では、バルクのガラス転移点とそこから20°C程度低い温度で2段階のガラス転移挙動を発見した。ガラス転移点での比熱の変化を検討した結果、低い温度領域のガラス転移は高分子表面層に由来するもので、表面層の厚みは1ー2nm程度と見積もられた。(2)固体NMR分光法による緩和時間測定を用いて高分子鎖の運動性を評価した。同一条件下で測定した多孔体の炭素原子の緩和時間はバルク試料の値より大きく、多孔体試料で分子運動性が高くなっていることがわかった。一方、水素原子の緩和時間測定では、明瞭なスピン拡散の影響が見られ、その拡散距離と緩和時間の傾向からも、多孔体には分子運動性が高い領域が不均一に存在し、その空間スケールは熱測定で見積もられた表面厚みと同程度であることが示された。(3)高圧CO2吸着特性では、バルク試料の3-7倍のヘンリー定数が得られた。吸脱着ダイナミクス評価では、10気圧でのCO2吸収量は、飽和吸収量の90%までが1分以内に到達し、また減圧することで1分以内に完全に脱離できた。多孔体が連続細孔を持つことにより、ガス分子が材料全体に素早く拡散し、ナノファイバー表面領域にある運動性の高い高分子鎖が、ゴム状高分子のような高速で大容量のガス吸着特性を示すことを明らかにした。(4)蒸気吸着特性では、高蒸気圧領域で毛管凝縮による容量の大きな選択的吸着が見られた。低温での凝縮により大量のガスを液体として取り込んだ後、僅かに温度を上げることで蒸気として放出できるので、蒸気圧が小さな凝縮性ガスに対して、温度変化による効率的な分離システムが設計できる可能性を見出した。本年度に達成した点を列挙する。(1)ポリスチレンを用いて、提案したナノ相分離機構(高分子溶液のガラス化と冷結晶化)を実験的に実証した。(2)ネットワーク状高分子の作製法を確立した。(3)電子顕微鏡による直接観察と窒素吸着法による細孔評価を行ない、ナノ多孔体の構造評価(ファイバー直径分布・比表面積・細孔分布の評価)を実施した。(4)ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルイミドなど多種類の汎用高分子からもネットワーク状高分子ナノファイバーの作製に成功した。以上(1)-(4)のように、予定した研究計画を十分に達成することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)透過型電子顕微鏡を用いたナノスケールでの3次元トモグラフィを導入し、3次元再構成画像により多孔体の構造評価技術を深化させた。(2)温度変調型示差走査熱量計でガラス転移点評価し、高分子多孔体の表面層に由来する新たなガラス転移を見出した。(3)固体NMR分光法による高分子鎖の運動性評価から、マクロなガラス転移挙動と分子スケールでのダイナミクスを関連付けることができた。
血栓性微小血管障害症での高度腎機能障害の成因としてのADAMTS-13解析

当ラボはADAMTS13活性測定が実施可能な本邦の代表的施設として、平成18年12月末までに783例の血栓性微小血管障害症(TMA)のADAMTS13活性測定を終了した。その中で、ADAMTS13活性が3%未満に低下しているADAMTS13依存性の症例は258例で、33%であった。全症例中、先天性が56例、後天性が727例であったが、後天性のうち基礎疾患が存在しない特発性が338例、二次性が389例であった。このうち、腎機能障害が有意なため特発性HUSと臨床診断された症例は94例であった。二次性の中では、マイトマイシンによる薬剤性と大腸菌O157によるものは臨床的にHUSと診断される。特発性HUSでは腎障害が高度であるのに対して、これら二次性の症例は、必ずしも腎障害は高度ではなかった。HUSと臨床診断された症例で、ADAMRS13活性が著減している症例は一例も存在しなかった。膠原病によるTMAは187例で、二次性TMAでは最も多かった。膠原病では腎障害が予後を決定することが多い。膠原病の中で、SLEが74例と最も多く、続いて強皮症(SSc)が44例であった。皮膚筋炎(PM/DM)12例、関節リウマチ(RA)8例、MCTD7例、シェーグレン症候群(SjS)7例、抗リン脂質抗体症候群(APS)6例などであった。一般的に最も患者数が多いとされるRAではTMAの合併頻度が少なく、SScでは合併頻度が高いことが明らかとなった。ADAMTS13依存性症例は、SjS63%, MCTD57%, APS44%と頻度が高く、SLE25%, RA22%であった。SScは5%とADAMTS13が関与しない症例がほとんどであることが判明した。HUSの原因としてのfactor H解析に関しては、血漿からfactor Hを精製し、抗factor Hポリクローナル抗体を作成した。これを用いたロケット電気泳動でfactor Hの抗原量を測定する方法を確立し、上記のTMAで抗原量を検査した。しかし、我々の集積したTMAにはfactor Hが著減している症例は存在しなかった。最近の海外からの報告では、factor Hの以上は、完全欠損ではない症例が多く、遺伝子解析が必要であると指摘されている。そこで先天性が疑われるADAMTS13非依存性TMA2家系でfactor Hの遺伝子解析を行った。その結果、アミノ酸置換を伴う変異を発見したが、健常人の解析でも同じ異常が発見され、責任遺伝子変異は同定できていない。今後factor Hの遺伝子異常を確認するためには、まず健常日本人における遺伝子多型の解析を行う必要があると考えている。

そこで先天性が疑われるADAMTS13非依存性TMA2家系でfactor Hの遺伝子解析を行った。その結果、アミノ酸置換を伴う変異を発見したが、健常人の解析でも同じ異常が発見され、責任遺伝子変異は同定できていない。今後factor Hの遺伝子異常を確認するためには、まず健常日本人における遺伝子多型の解析を行う必要があると考えている。血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)はMoschowitzの5徴候を主徴とする全身性重篤性疾患である。これに対して、溶血性尿毒症症候群(HUS)は、Gasserの3徴候を特徴とする疾患であるが、この3徴候はTTPの5徴候に含まれ、TTPとHUSを臨床的に鑑別することは困難で血栓性微小血管障害症(TMA)と診断されることが多かった。これらの中で、腎機能障害が強い症例はHUSと診断されることが多く、また膠原病合併TTPの症例、特に強皮症で高度腎障害の症例が多数認められる。また、腎機能障害が予後因子となることが多く、高度腎障害例は予後が悪い。近年、血漿von Willebrand因子切断酵素(VWF-CP、別名ADAMTS13)活性とこのインヒビターの測定法が確立され、同活性著減によりTTPの確定診断が可能となった。このアッセイの基本はVWFマルチマー解析であるが、私のラボはこれが実施可能な本邦の代表的施設として平成16年10月末までに493例のTMAのADAMTS13活性およびインヒビターの解析を終了した。その中で、後天性特発性TTPは166例あり、93例(56%)の症例で、インヒビターの存在によって、ADAMTS13活性が著減していた。膠原病合併TTPは111例あり、そのうちADAMTS13活性が著減する症例は18例(16%)に過ぎず、23例(21%)は活性がほぼ正常であった。また、後天性HUSは71例あり、特発性:48例、0157:17例、Mitomycin:6例であった。HUS症例では、1例もADAMTS13活性が著減している症例を認めなかった。これらの、膠原病合併TTPやHUS症例の中に、高度の腎障害例が存在しているが、ADAMTS13活性が著減している症例は極めて少数例で、これらの症例はADAMTS13以外の病因が予想される。その候補として、補体調節因子であるfactor Hがあるが、これに対するモノクローナル抗体を6種類作成し、現在解析中である。今後、集積した症例の中で高度の腎機能障害例を抽出し、これらの症例においてADAMTS13とfactor Hの解析を行っていく予定である。血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)と溶血性尿毒症症候群(HUS)は、臨床的に鑑別することは困難で血栓性微小血管障害症(TMA)と診断されることが多かった。最近、von Willebarand因子(VWF)を特異的に切断する酵素(ADAMTS13)の活性測定法が確立され、TMAの診断にブレークスルーをもたらした。本研究では、TMAの中で、腎機能障害が強い症例を中心に、ADAMTS13活性の検討を行い、病因を明らかにすることを目的とした。腎機能障害が強い症例は、一般にはHUSと診断されることが多く、また膠原病関連TMAの症例、特に強皮症で高度腎障害の症例が多数認められる。奈良医大輸血部では、平成17年11月末で、643例のTMAにおいてADAMTS13活性の測定を終了した。これらの症例を、臨床診断をもとに分類すると、先天性TMAが46例であった。後天性の中でTTPと診断された症例は498例、HUSと診断された症例は99例であった。HUSと診断された症例の中には、ADAMTS13活性が3%未満に著減する症例は1例も無く、本酵素の病態への関与は少ないものと考えられた。