hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵線維化における線維産生細胞の起源探求

膵線維化における線維産生細胞の起源を探求することを目的とした。コラーゲン産生細胞がGFPを発現するマウスに膵線維化を誘導すると、線維隔壁に沿ってGFP陽性細胞が出現するが、膵星細胞のマーカーであるGFAPが共陽性となる細胞は一部であった。膵より分離した細胞のFACS解析でも、線維化の誘導に伴い増加したGFP陽性細胞中のGFAP陽性細胞の割合は約20%であった。また、肝星細胞と比し、膵星細胞のLrat発現は低く、そのためretinylpalmitate含有量も極僅かであることが判った。膵星細胞以外のコラーゲン産生細胞の存在が示唆され、膵星細胞の、肝星細胞とは異なる特徴が明らかとなった。本研究は、膵臓の線維化の進展において線維(主にコラーゲン)産生細胞の起源を探求することを目的とし、コラーゲンα1タイプ1プロモータ下にGFPを発現するトランスジェニックマウス(Coll GFPマウス)を使用し実験を行った。Coll GFPマウスにセルレインを反復投与することで膵臓に著明な線維化が作成でき、蛍光顕微鏡での観察により、線維隔壁に沿ってGFP陽性細胞が存在することが判った。これらのGFP陽性領域は、活性化膵星細胞のマーカーでもあるαSMAにも陽性であることが示された。In vitro実験として、濃度勾配遠心による膵からの細胞分離を行った。分離された非実質細胞中には、細胞質内にOil Red O陽性となる脂肪滴を持った細胞が認められたが、これらの脂肪滴含有細胞は、星細胞の特徴であるビタミンAの自家蛍光を持たなかった。この非実質細胞はGFP陽性細胞を多く含み、1週間程培養を行うと、筋繊維芽細胞様に細胞質の突起を伸ばし脂肪滴を失った。また肝臓同様に小型で球形のGFP陽性細胞も認められた。これらの突起を伸ばす細胞は、αSMA、GFAPにも陽性であったことから活性化膵星細胞であると考えられた。タイムラプススタディによる観察では、これらの形態の異なる細胞は互換性のない別個の細胞であると考えられた。金コロイド抗体法を用いた免疫電顕による観察では、膵組織中のGFP陽性で脂肪滴を含有する細胞を同定し得たが、これらは同様に観察した肝星細胞に比し、その脂肪滴は非常に小さく少ないものであった。膵非実質細胞では肝星細胞に比べ、レチノールのエステル化に必須のLratの発現が非常に低いことが判った。ここまでの研究から、肝星細胞の膵カウンターパートとされる膵星細胞の、肝星細胞とは大きく異なる特徴が明らかとなり、また膵星細胞以外にも線維を産生する細胞の存在が示唆された。本研究は、膵線維化の進展においてどの細胞が線維(主にコラーゲン)を産生するかを探求することを目的とし、そのためコラーゲンα1タイプ1プロモータ下にGFPを発現するトランスジェニックマウス(Coll GFPマウス)を用いた。Coll GFPマウスに膵線維化を誘導すると、線維隔壁に沿い多数のGFP陽性細胞が観察された。このGFP陽性領域は、活性化膵星細胞のマーカーであるαSMA陽性であった。膵星細胞のマーカーであるGFAPの免疫染色を行うと、線維化膵でGFAP陽性細胞は著明に増加するが、GFP、GFAP共に陽性の細胞は一部であった。濃度勾配遠心による膵非実質細胞分離にて、細胞質内にOil Red陽性の脂肪滴を持つ細胞を得た。これらは数日間の培養で脂肪滴を失い筋線維芽細胞様に形態を変え、GFP陽性となり、更にαSMA、一部はGFAPにも陽性となり活性化膵星細胞であると考えられた。小型で球形のGFP陽性細胞も認められたが、タイムラプスでは、これらの細胞に互換性はなかった。初代培養膵星細胞では、蛍光顕微鏡でビタミンAの自家蛍光を観察できなかった。UVを用いたFACSでも自家蛍光陽性の細胞はsortされなかった。ビタミンAの細胞内貯蔵の主な形態であるレチノイン酸パルミテートの含有量を質量分析にて定量したところ、膵星細胞では肝星細胞に比べその量は極めて微量であった。膵星細胞において、レチノールのエステル化に必須の酵素LratのmRNA発現は非常に低かった。免疫電子顕微鏡による観察では、膵組織中のGFP陽性で脂肪滴を含有する細胞を同定し得たが、これらは同様に観察した肝星細胞に比し、脂肪滴は非常に小さく少ないものであった。ここまでの研究から、肝星細胞の膵カウンターパートとされる膵星細胞の、肝星細胞とは大きく異る特徴が明らかとなり、また膵星細胞以外にも線維を産生する細胞の存在が示唆された。肝胆膵外科移植外科本研究開始時の研究計画の記載通り、Coll GFPマウスを用いて膵線維化に関する研究をin vivo、in vitroである程度まで進めることが出来た。

一般的に膵線維芽細胞の起源は膵星細胞とされているが、昨年度に行った我々の実験においては、膵星細胞は既報通りの細胞ではない可能性が示唆された。また膵星細胞以外のGFP陽性(=コラーゲン産生)細胞の存在も明らかとなってきた。これまでの我々の研究で明らかになったGFP陽性細胞及び膵星細胞の特徴について、更なる追求を行う。そのため当初の研究計画通り、FACSによるGFP陽性細胞の解析とソーティングを行う。前方散乱光(FSC)、側方散乱光(SSC)の値や表面抗原マーカーの発現を基に亜集団へのグループ分けを試みる。また、肝臓においては紫外線レーザーによる星細胞の分離が行われているため、これを膵臓でも試みる予定である。しかし、これまでの我々の実験結果では膵星細胞は自家蛍光を持たず、そのため紫外線レーザーでは膵非実質細胞はグループ分けされない可能性もある。その場合は、レーザーマイクロダイセクションを用い形態の異なるGFP陽性細胞を分け、各々において培養、タイムラプス観察等を行う予定である。また特定の細胞集団へのグループ分けが可能となれば、mRNAを抽出し、マイクロアレイによる遺伝子発現パターンの解析を行うことができる。これにより膵星細胞と肝星細胞の違いや、既知の細胞とは異なる細胞集団の存在を追求する。また、これまでの我々の研究において、膵星細胞は肝星細胞と異なりビタミンAを持たない、もしくは非常に含有量が少ないという可能性が示唆された。これを明らかにするため、各々の細胞において液体クロマトグラフ質量分析計によるレチニルパルミテートの検出を試みる。以上、当初の研究計画概要に変更はない。
シーボルト収集の日本産植物標本と関連資料類の調査研究

オランダのライデンにあるオランダ国立植物標本館においてシーボルトが日本で収集した各種の植物標本の調査を行った。800種3,500枚を調べることができたので、これまでの累計は1,200種,6,000枚に達した。タイプと日本人から贈られた標本に重点を置いて調査を行った。シーボルトは様々な日本人から標本を貰っている。伊藤圭介、水谷助六などからである。しかし、日本人が特定できない標本がかなりある。産地は全国各地に及び、蝦夷産のものもある。一方、ドイツのミュンヘンにあるバイエルン州立植物標本館においても調査を行った。そこでシーボルト収集標本について総合的な調査研究を行ったのは、我々が最初である。ライデンから移管された標本類がある。タイプを主とした200枚を見つけ、調査した。バイエルン州立植物標本館にあるシーボルト収集標本の点数はそれほど多くない。また、標本の質はライデンにあるものに比較して劣る場合が多い。しかし、タイプの割合が高い。オランダ国立植物標本館では西暦2000年が日蘭修好400周年になることを記念して、シーボルト収集標本の中から、特に重要、あるいは興味深い700枚を選び出してCDを作成することになった。我々は各種の資料と情報を提供すると共に、標本の選定と説明文(英文)の執筆、校正に協力した。CDは2000年3月初めに完成した。日本国内の研究機関にもいずれ配布される予定になっている。オランダ、ドイツで調べた標本はいずれもカラーで写真撮影を行っている。将来データベースとして提供できるように整理を行った。1.オランダにおける植物標本調査。ライデン市の国立植物標本館において調査を行った。シーボルトの「フローラ・ヤポニカ(日本植物誌)」において紹介された種、日本人の本草学者達がシーボルトに贈呈した標本、ならびにシーボルト標本によって記載された種のタイプに重点を置いて調べた。さらに、シダ類の標本についての調査を深めた。合計して1,640葉の標本を見つけ出し、記録・撮影した。シーボルトに対して日本人の本草学者が様々に協力している。木曽や日光などの高山植物や蝦夷地産の標本も進呈されていることが明らかになった。それらの一部はタイプにもなっている。一方、生薬類の標本について予備的な調査を行った。シーボルトは医師であったから、日本でどのような薬物が使用されているのか興味を抱き、収集を行っていた。しかし、中国からの渡来品が多く、内容の具体的な把握は必ずしも容易ではない。2.都立大に保管されているシーボルト由来の標本についての調査:日本人の本草学者達の協力状態についての知見を深めることができた。3.ハーグの国立公文書館における文書類の調査:シーボルトがオランダ政府に提出した文書類について調査を行った。オランダ政府から総額でどれだけの研究費を支給され、植物学の研究に際してどのように支出していたのかを把握することができた。収集とか出島の植物園の維持のためにはかなり大きな支出をしているが、植物写生画に関連した支出は意外に少なかったことが判明した。450種2,000枚を調べた。タイプ、日本人から贈られた標本に重点を置いたが、シーボルトの収集構想と広がりを把握するため、今回は栽培植物に関しても調査を試みた。その結果、シーボルトは必ずしも日本原産にこだわらず、日本で植裁されていたものすべてを対象として標本収集を行っていたことが判明した。トウモロコシ、タバコ、サツマイモ、ナス、カボチャ、ダイコンなどの標本が収集されている。シーボルトはそれらが日本原産で無いことを知っていたが、どういう植物が日本で栽培されているかを把握する目的で調べていた。

また、ドイツのミュンヘンにあるバイエルン州立植物標本館においても調査を行い、タイプを主とした200枚について調査を行った。オランダ国立植物標本館では西暦2000年が日蘭修好400周年になることを記念して、シーボルト収集標本の中から、特に重要、あるいは興味深い700枚を選び出してCDを作成することになった。我々は各種の資料と情報を提供すると共に、標本の選定と説明文(英文)の執筆、校正に協力した。CDの原盤はすでに完成しており、日本国内の研究機関にもいずれ配布される予定になっている。オランダ、ドイツで調べた標本はいずれもカラーで写真撮影を行っている。将来データベースとして提供できるように整理を行った。
屋久島におけるニホンザルと寄生虫を支える食物網の構造とエネルギー論に関する研究

本研究は2006年2008年の間の24ヶ月に渡り、霊長類研究所(犬山)と鹿児島県屋久島西部林を研究拠点にし、生息する野生ニホンザルを対象に調査を行った。個体識別によって、16メス個体の行動観察、対象群れの生息地中の採食可能な食物(植物、昆虫等)、実際に摂取する食物の量を測定、定期的にサルの糞を採集、6週間おきに犬山に戻り、集められた資料の分析やデータ整理をした。20年度の分は9月初めまで続いた。全調査は計画通り終了した。合計519.5(1,039/30分セッション)観察時間を得て、対象個体から159糞サンプルも採集した。これらの資料を用いて解析をした結果、ニホンザルの腸内寄生虫種のダイナミクスについていくつもの新しい視点を得ることができた。一番多く検出された寄生虫の2種はStreptophargus pigmentatusとOesophagostomum aculeatumである。S.pigmentatusは、サルに感染するためには中間宿主である昆虫を通して宿主に食べられなければならない。本調査の研究では、屋久島ニホンザルが採食するOnthophagus lenzii(糞虫)がその中間宿主であることが明らかになった。この糞虫の活動状態を示す月別捕獲率は強い季節性を示しており、サルたちが一番多くの昆虫を採食した真夏にもっとも高くなっていた。実際、集めたO.lenziiから、この寄生虫の幼虫が見つかり、S.pigmentatusの生活環に突き止めるごとができた。また、O.aculeatumに関しても、強い感染の季節性を認めることができた。それは、雨の一番多い時期と重なることがわかった。一方サルの行動観察によってメス間の順位関係を明らかにした。現在、各寄生虫種の感染の度合いと年齢、性別、社会的順位による感染度の変異や寄生虫のバイオマスの社会的および季節的な変異を解析している。予備的な結果として、メスのストレスホルモン量(糞中のcortisol濃度)を計ってストレスと順位の間の関係を調べたところ、低順位個体の方が糞虫のcortisol濃度が高いことが分った。これらの成果をいくつもの論文にわけて作成しているところである。本研究の目的は、ニホンザルと食糞性甲虫類ならびに寄生線虫類を含む陸上性食物連鎖における季節パターンを明らかにすることである。特に、各栄養段階の相対的生物体量において、ピラミッド型が見られるのかどうかという単純な疑問を検証することを目的とする。具体的には以下のことを明らかにする:(1)西部林道に生息するニホンザル(ウミ群)の食性と活動時間配分に関する行動観察(昆虫、特に甲虫類を食べる行動について記録する)、(2)ニホンザルの糞の採取と、糞に含まれる寄生虫の存在及びその頻度の測定、(3)食糞性甲虫類の採取並びに幼若期の寄生虫に感染している種の特定とその頻度における季節変動の測定。本実績報告は第一期(環境評価、対象個体選択、個体識別、各種調査許可の獲得等の準備・2006年9月29日2007年3、月31日)の成果を紹介するものである。この地域はおよそ8,000m2で、その大部分が二次林である。ウミ群が生息する地域は、標高、物理的環境、植物群落構成がとても変化に富んでいる。物理的に環境に重大な影響を及ぼすことなく、できるだけ多くの生息地における食糞性甲虫類群集の構造の変化を検討するため、ウミ群の生息地域内で無作為に32プロット(10m×10m)を定め、サンプルを採取する準備まで設置できた。食糞性甲虫類群集および感染レベルに統計学的に差が見られるかどうかを検出するため、一般線形モデルの変数として標高並びに植物群落構造に関するデータを含めるサンプル採集器具等の準備も完了した。ウミ群から16個体のオトナザル(13♀、3♂)を選んで、個体識別を完了した。個体追跡法によって行動観察(計48時間)と糞採集(64サンプル)を行った。行動観察記録の解析と採集した糞の寄生虫同定は現在進行中であるが、屋久島ニホンザルを感染すると報告されている5種の線虫と未報告種として2種の原虫の確認ができた。なお、国立公園内の昆虫採集許可獲得が遅れたため、昆虫採集は第二期(2007年4、月1日2008年3月31日)から始める。Hernandez博士は、5月までの予備結果をメキシコ、メリダ市で開催される2007年度アメリカ寄生虫学会大会において発表する予定でいる。18年度に引き続き、霊長類研究所と屋久島の調査地に1ヶ月おきに滞し、ヤクシマザルの寄生虫生態学的調査を行った。調査地では、16個体のオトナメスを定期的に個体追跡して行動観察と糞の採取を行うとともに、トラップを仕掛け、サルが採食する昆虫類を捕獲した。現時点では、採取した糞サンプル96個及びその隣接群から20個(8個体)について、研究所の実験室での分析が済んでいる。これらの資料に基づいて、ニホンザルの腸内寄生虫種のダイナミクスについていくつもの新しい視点を得ることができた。本年度の研究では、ヤクシマザルが採食するOnthophagus lenzii(糞虫)がその中間宿主であることが明らかになった。

この糞虫の活動状態を示す月別捕獲率は強い季節性を示しており、サルたちが一番多くの昆虫を採食した真夏にもっとも高くなっていた。実際、集めたO.lenziiから、この寄生虫の幼虫が見つかり、S.pigmentatusの生活環を完全に突き止めることができた。またO.aculeatumに関しても、強い感染の季節性を認めることができた。それは、雨の一番多い時期と重なることがわかった。一方、サルの行動観察によってメス間の順位関係を明らかにし、各寄生虫種の感染の度合いとサルの順位との関係を検討している。また、メスのストレスホルモン量(糞中のcortisolの濃度)を計ってストレスと順位の間の関係を調べたところ、低順位個体の方が糞中のcortisol濃度が高いことがわかった。本研究は2006年2008年の間の24ヶ月に渡り、霊長類研究所(犬山)と鹿児島県屋久島西部林を研究拠点にし、生息する野生ニホンザルを対象に調査を行った。個体識別によって、16メス個体の行動観察、対象群れの生息地中の採食可能な食物(植物、昆虫等)、実際に摂取する食物の量を測定、定期的にサルの糞を採集、6週間おきに犬山に戻り、集められた資料の分析やデータ整理をした。20年度の分は9月初めまで続いた。全調査は計画通り終了した。合計519.5(1,039/30分セッション)観察時間を得て、対象個体から159糞サンプルも採集した。これらの資料を用いて解析をした結果、ニホンザルの腸内寄生虫種のダイナミクスについていくつもの新しい視点を得ることができた。一番多く検出された寄生虫の2種はStreptophargus pigmentatusとOesophagostomum aculeatumである。S.pigmentatusは、サルに感染するためには中間宿主である昆虫を通して宿主に食べられなければならない。本調査の研究では、屋久島ニホンザルが採食するOnthophagus lenzii(糞虫)がその中間宿主であることが明らかになった。実際、集めたO.lenziiから、この寄生虫の幼虫が見つかり、S.pigmentatusの生活環に突き止めるごとができた。また、O.aculeatumに関しても、強い感染の季節性を認めることができた。一方サルの行動観察によってメス間の順位関係を明らかにした。現在、各寄生虫種の感染の度合いと年齢、性別、社会的順位による感染度の変異や寄生虫のバイオマスの社会的および季節的な変異を解析している。予備的な結果として、メスのストレスホルモン量(糞中のcortisol濃度)を計ってストレスと順位の間の関係を調べたところ、低順位個体の方が糞虫のcortisol濃度が高いことが分った。これらの成果をいくつもの論文にわけて作成しているところである。
道路特殊部における騒音伝搬メカニズムの解明と騒音予測モデルの開発

産業を支える大動脈である道路交通は社会生活に不可欠であるが、その反面、騒音等の社会問題を引き起こし、我々の生活を脅かす一面を有している。特に東京およびその近郊の大都市部では膨大な交通量に起因する道路騒音が生活環境に与える影響が甚大であり、騒音対策の立案のためにも精度の高い予測法が必要である。都市部およびその近郊においては、高密度な土地利用形態が求められるため、下記に示すような騒音伝搬が複雑となる道路構造が数多くに見られる。(1)各種形状をもつ大型防音塀、(2)掘割・半地下構造道路、(3)高架・平面併設道路これらの複雑構造における騒音予測法を確立することを目的に本研究課題を計画し、下記の成果を得た。各種形状を持つ遮音壁・防音堤の減音効果に関する検討遮音壁はもっとも一般的な騒音対策法として広く用いられている。近年、騒音激甚地域においては各種形状をもつ遮音壁が採用されることが多くなりつつあるが、その減音効果の予測法は確立されていない。また、防音堤についても予測計算法が詳細に検討されておらず、これらの対策法を立案するための資料の収集が必要である。そこで、各種形状をもつ遮音壁や防音堤による回折減衰効果について、波動数値解析および縮尺模型実験による解析を行い、予測モデル開発のための基礎資料を得た。波動数値解析法の適用性に関する検討形状および境界条件が複雑な場合、騒音予測のために波動数値解析が行われる。しかしながら、都市域のように非常に広がりの大きい音場を対象とする場合、音場全体を離散化することは不可能なため、対象を断面あるいは平面形状を2次元にモデル化した上で解析されることが多い。その場合に問題となる音源条件の違いに起因する解析結果の差異について、縮尺模型実験により検討した。各種形状をもつ防音塀の減音効果に着目して検討を行い、3次元音場における2種類の音源条件および2次元解析で設定される音源条件の3つの条件間の差異を定量的に把握することができた。掘割・半地下構造道路からの騒音放射特性前年度に行った掘割・半地下構造道路からの騒音放射に関する2次元数値解析に引き続き、今年度はより現実的な3次元音場における騒音放射特性を縮尺模型実験により詳細に検討した。騒音放射指向性に関する実験によって開口部からの騒音放射の特徴を把握した上で、開口部付近に仮想点音源を設定する簡易計算モデルに関する検討を行い、提案するモデルが張り出しの大きな半地下構造道路には有効に適用可能である見通しを得た。また、都内の半地下構造道路における実測を行い、騒音環境の実態に関するデータを得た。産業を支える大動脈である道路交通は社会生活に不可欠であるが、その反面、騒音等の社会問題を引き起こし、我々の生活を脅かす面を有している。特に東京およびその近郊の大都市部では膨大な交通量に起因する道路騒音が生活環境に与える影響が甚大であり、その対策立案のためにも制度の高い予測法が必要である。都市部およびその近郊においては、高密度な土地利用形態が求められるため、下記に示すような複雑な道路構造が至る所に見られる。(1)各種形状をもつ大型防音塀、(2)掘割・半地下構造道路(防音塀併設を含む)、(3)高架・平面併設道路、(4)道路沿道に建物が密集して立地している構造(ストリートキャニオン)、(5)トンネル坑口付近、(6)高速道路インタチェンジ部分これらの複雑構造では騒音伝搬の予測が非常に難しいが、大都市部ではその膨大な交通量によって騒音環境がただでさえ劣悪であるため、このような構造における高精度の騒音予測手法が強く求められている。上記の課題を解決すべく、本研究課題を計画したが、今年度は上記のうち、(1)、(2)および(4)について下記のような基礎的検討を行った。各種形状をもつ防音塀の減音効果前年度行った、各種の形状をもつ防音塀における音波伝搬のメカニズムおよびその減音効果に関する基礎的検討に引き続き、今年度はより実用的な3次元音場における効果に関する実験的検討を行った。その結果、形状の差異に伴う減音量の変化の傾向は2次元音場における解析結果と矛盾せず、ある程度の対応がとれることが分かった。掘割・半地下構造道路からの騒音放射特性掘割・半地下道路からの騒音放射は構造内部での多重反射の発生により非常に複雑となり、実用的な予測計算法が望まれているが、今年度新たに構造開口部付近に仮想的に等価な指向性音源を想定する方法について検討を開始した。2次元数値解を真値と仮定してに仮想点音源の諸パラメータを決定し、そのシミュレーション精度を調べたところ、道路構造周囲でよい精度で解析解を模擬でき、適用可能性が確認された。次年度は引き続き、実用的計算法の構築を目指して3次元音場における妥当性を調べる予定である。ストリートキヤニオンにおける音波伝搬の解析ストリートキャニオンにおけるキャニオン効果(騒音の増大)およびその対策効果について、2次元数値解析により基礎的な検討を行った。(1)各種形状をもつ大型防音塀、

(2)掘割・半地下構造道路、(3)高架・平面併設道路これらの複雑構造における騒音予測法を確立することを目的に本研究課題を計画し、下記の成果を得た。各種形状を持つ遮音壁・防音堤の減音効果に関する検討遮音壁はもっとも一般的な騒音対策法として広く用いられている。近年、騒音激甚地域においては各種形状をもつ遮音壁が採用されることが多くなりつつあるが、その減音効果の予測法は確立されていない。また、防音堤についても予測計算法が詳細に検討されておらず、これらの対策法を立案するための資料の収集が必要である。そこで、各種形状をもつ遮音壁や防音堤による回折減衰効果について、波動数値解析および縮尺模型実験による解析を行い、予測モデル開発のための基礎資料を得た。波動数値解析法の適用性に関する検討形状および境界条件が複雑な場合、騒音予測のために波動数値解析が行われる。しかしながら、都市域のように非常に広がりの大きい音場を対象とする場合、音場全体を離散化することは不可能なため、対象を断面あるいは平面形状を2次元にモデル化した上で解析されることが多い。その場合に問題となる音源条件の違いに起因する解析結果の差異について、縮尺模型実験により検討した。各種形状をもつ防音塀の減音効果に着目して検討を行い、3次元音場における2種類の音源条件および2次元解析で設定される音源条件の3つの条件間の差異を定量的に把握することができた。掘割・半地下構造道路からの騒音放射特性前年度に行った掘割・半地下構造道路からの騒音放射に関する2次元数値解析に引き続き、今年度はより現実的な3次元音場における騒音放射特性を縮尺模型実験により詳細に検討した。騒音放射指向性に関する実験によって開口部からの騒音放射の特徴を把握した上で、開口部付近に仮想点音源を設定する簡易計算モデルに関する検討を行い、提案するモデルが張り出しの大きな半地下構造道路には有効に適用可能である見通しを得た。また、都内の半地下構造道路における実測を行い、騒音環境の実態に関するデータを得た。産業を支える大動脈である道路交通は社会生活に不可欠であるが、その反面、騒音等の社会問題を引き起こし、我々の生活を脅かす一面を有している。特に東京およびその近郊の大都市部では膨大な交通量に起因する道路騒音が生活環境に与える影響が甚大であり、騒音対策の立案のためにも精度の高い予測法が必要である。都市部およびその近郊においては、高密度な土地利用形態が求められるため、下記に示すような騒音伝搬が複雑となる道路構造が数多くに見られる。(1)各種形状をもつ大型防音塀、(2)掘割・半地下構造道路、(3)高架・平面併設道路これらの複雑構造における騒音予測法を確立することを目的に本研究課題を計画し、下記の成果を得た。
口腔粘膜の癌化におけるfosおよびjun遺伝子ファミリー発現の変化

口腔粘膜の癌化過程における転写因子c-fosおよびc-junの発現を調べ、いわゆる前癌病変と呼ばれる病変のうち真に癌化するものとそうでないものとを判別できるか否かを検討した。口腔粘膜病変としては、当科で保管していた白板症、扁平苔癬、扁平上皮癌などを対象とし、正常口腔粘膜としては、各種口腔内非腫瘍性病変の手術の際に得られた口腔粘膜の一部を、本人の許可を得て用いた。採取した材料はホルマリンで固定し、パラフィン包埋して薄切々片とした。c-fosの遺伝子産物c-Fosはウサギ抗Fosポリクローナル抗体で反応させ、これにロダミンを結合した抗ウサギ抗体マウスIgGにて発色させた。c-junの遺伝子産物c-Junはヤギ抗Junポリクローナル抗体で反応させ、これにFITC蛍光抗体を結合した抗ヤギ抗体マウスIgGにて発色させた。両者を同一切片上で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。染色性の差異により、c-Fos(+)/c-Jun(+),c-Fos(+)/c-Jun(-),c-Fos(-)/c-Jun(+),c-Fos(-)/c-Jun(-)に分けた。c-Fos(+)/c-Jun(+)は正常口腔粘膜上皮、白板症、扁平苔癬の基底細胞およびその近傍、角化層直下の顆粒細胞などに陽性を示す細胞を認めた。このことは細胞の分化に関連して発現していると考えられるが、細胞が癌化するか否かの判定には用いられない。c-Fos(+)/c-Jun(-)は、正常口腔粘膜上皮に陽性細胞は少なかったが、浸潤性の扁平上皮癌、異形性の強い白板症や扁平苔癬の一部に陽性細胞を認めた。c-Fos(-)/c-Jun(+)は核分剖像の多い扁平上皮癌に散在性に認められた。以上の結果、c-Fos(+)/c-Jun(-)の白板症や扁平苔癬は癌化する可能性のある前癌病変と考えられる。口腔粘膜の癌化過程における転写因子c-fosおよびc-junの発現の変化を調べ、いわゆる前癌病変と呼ばれる病変のうち、真に癌化するものとそうでないものを判別できるか否かを検討した。口腔粘膜病変としては、患者から採取し当教室で保管していた白板症、扁平苔癬、乳頭腫、扁平上皮癌を対象とし、対照正常口腔粘膜組織としては、各種非腫瘍性病変の口腔内手術時に得られた口腔粘膜の一部を用いた。採取した組織は10%中性ホルマリンで固定してパラフィン切片とし、c-fosおよびc-junの遺伝子産物であるc-Fosおよびc-Junを免疫組織化学的に染色した。c-fosおよびc-junは、正常口腔粘膜上皮では基底層と角化直前の顆粒層の細胞核に高頻度に発現したが、扁平上皮癌では両蛋白質とも発現が低下し、分化度の低いものほどその発現頻度が低くかつ弱い傾向を示した。白板症、扁平苔癬、乳頭腫などでは、c-Fos、c-Junともに種々の強さの発現を示すとともにその上皮組織内分布にも差異を生じた。しかし、これら前癌病変は症例数がまだ少なく、一定の傾向をつかむには至っていない。

c-fosおよびc-junの遺伝子産物c-Fosおよびc-Junは互いにダイマーを形成し、転写調節因子AP-2を活性化して次の遺伝子を発現するとされているが、c-Fosとc-Junの遺伝子ファミリーの種々の組み合わせによるダイマーが異なる遺伝子発現に結び付くと考えられる。各種前癌病変におけるc-Fosとc-Junの発現の仕方から癌化するか否かの判別が可能になるのではないかと考え、c-FosはDABで、c-JunはFITCでそれぞれ同一切片上に同時に染色する方法を検討している。口腔粘膜は重層扁平上皮で覆われている。その癌化過程は、遺伝子DNAに多段階のヒットを受け、不可逆的な遺伝子変化が蓄積され、形質変化を来すことによって進んでゆくと考えられている。前癌病変と呼ばれる種々の口腔粘膜病変にも種々の遺伝子異常が生じているものと考えられ、それに更なるヒットが加わることによって遺伝子異常が蓄積されて扁平上皮癌となり、更に悪性化も進行すると考えられている。c-Fosとc-Jun遺伝子産物あるいはc-Junどうしが互いに結合してダイマーを形成し、転写調節因子AP-2を活性化させて次々と他の遺伝子を発現させてゆくことが知られている。これら両遺伝子産物は、個々に調べた場合にはいずれも正常な重層扁平上皮組織に比較して癌化につれて減少する傾向があることを我々は報告してきた。しかし、c-FOSあるいはc-Junの減少と扁平上皮組織の癌化とは必ずしも強い相関を示す症例ばかりではない。ただ、我々はc-Fosとc-Junの発現の組み合わせに、その鍵があるのではないかと考えた。そのため、両者を同時に同一標本上で染色する方法として、c-FosはDABで、c-JunはFITCでそれぞれ染色した。その結果、c-Fosとc-Junの染色性の総和が減少するにつれて癌化の傾向が示された。次年度には症例数を増し、この傾向の有意性を証明したい。口腔粘膜の癌化過程における各種転写因子の発現を調べ、いわゆる前癌病変のうち、真に癌化するものとそうでないものを判別できるか否かを検討した。c-fosやc-junはprotooncogeneと呼ばれ、癌化を促進すると考えられている反面、転写調節因子AP-1を活性化して細胞の分化に関与したり、時にはapoptosisを促進して癌化を抑制するとの報告もある。c-fosやc-junはc-fosB, c-fra-1,c-junB, c-junDなどと遺伝子ファミリーを形成し、これらの遺伝子産物蛋白質は互いにダイマーを形成してAP-1を活性化することが知られている。このダイマーの組合せによって、次に発現する遺伝子が異る可能性が考えられる。本研究では、各種の口腔粘膜前癌病変を対象に、c-fosの遺伝子産物c-FosをDABで、c-junの遺伝子産物c-JunをFITCでそれぞれ同一切片上に同時に染色し、上皮組織を観察してc-Fosが主に発現しているもの、c-Junが主に発現しているもの、c-Fosとc-Junが同時に高頻度に発現しているもの、c-Fosもc-Junもあまり発現していないものに分類した。その結果、c-Fosとc-Junの両者が高頻度に発現している上皮組織は、異形性が強くて上皮基底層の排列に乱れがあるものが多かった。上皮基底層にはc-Fosもc-Junもほとんど発現していないものの中には明らかに癌化しているものと、反対に異形性の少ないものが含まれていた。c-Fosが主に発現しているものとc-Junが主に発現しているものは、いずれも異形性の強いものは少なかった。以上のことからc-Fosとc-Junがダイマーを作ってAP-1を活性化する場合、細胞は増殖性に傾くことが示唆されたが、c-Fosまたはc-Junが他の遺伝子ファミリー蛋白質とダイマーを作った場合、その相手によって細胞分化、細胞増殖、あるいはapoptosisなどを促進しているものと考えられる。
組合せ応力下における接着継手の疲労破壊則

接着継手は極端に弾性率の異なる被着体と接着層の間に接合界面を持つため、接着層は引張とせん断の複雑な組合せ応力状態になる場合が多い。そのため、より高精度な接合部の疲労強度を推定するためには接着部に均一な組合せ応力状態を実現できる疲労試験を行い、その結果に基づいて強度推定を行う必要がある。そこで、比較的均一な引張とせん断の組合せ応力状態が実現できる突合せとスカーフ接着継手を用いる方法およびバタフライ型突合せ接着継手の軸芯を高精度にずらす方法により、接着層厚さをパラメータとして、接着層における引張応力とせん断応力の比率を広範囲に変化させ疲労試験を行った。さらに、有限要素法により、接合部の応力解析を行い、接着層における応力分布と疲労強度の関係について検討した。その主な結果は、(1)上記すべての接着継手の接着層における主応力比はσ_3/σ_1 vs.σ_2/σ_1空間上の1つの直線関係により示すことができた。(2)強度推定に際して基準となる境界層厚さは、接合部における主応力比の影響を受けることを見いだした。(3)10^7耐久限度と主応力比の関係式を求めることができた。上記(1)(3)のとおりである。次いで、複雑な応力分布をもつ重ね合せ継手に対して、このようにして得られた疲労破壊則の適応性を検討した。従来の半導体レーザの波長安定化では、制御信号を得る為に半導体レーザの注入電流に微小変調を加えている為、結果として半導体レーザの発振幅を広げてしまうという欠点があり、分光実験等の狭い発振幅が必要である実験での半導体レーザの応用に問題となっていた。そこで我々は、波長基準であるRb原子に磁界を印加し、ファラデー効果を利用して直線偏光の偏光面の回転に変調を加え、これを検出して制御信号を得、波長安定化する方法を提案し、発振幅を広げることなく発振波長を安定化することに成功している。今年度はおおよそ当初の計画通りに研究を進めることができた。具体的には飽和吸収分光法を用いて周波数の安定化の実験を行い、より高い安定度を達成できた。すなわち、原子の吸収線が飽和した状態でのファラデー効果を観測し、通常の吸収信号を用いた場合の結果と比較し、飽和吸収分光信号を用いた制御系を構築し、波長安定化を行った。飽和吸収分光信号を用いることで高い安定度が得られ、さらに波長安定化点となる基準周波数は増加はしたが、必ずしも全ての点が高い安定度が要求される波長安定化に用いることができる訳ではないことが分かった。またRbセルに印加する直流磁界の強さを変化することで安定化点がシフトし、吸収点のドップラー幅より広い範囲でその安定度もほぼ一定の値のまま制御できることが分かった。そしてその範囲は、これまで報告されているゼーマン効果を用いた安定化の約400MHzよりも広い範囲の制御であることを確認している。一方、飽和吸収分光光学系には幾つかの異なった光学系があるので、現在これら異なった飽和吸収分光光学系を用いることで、より高度な波長安定化、より多くの安定化点でより高い安定度を実現し、安定化された波長の掃引、制御の実験を行える光学系の検討を行っている。なおこれまでの結果は既に国際会議で報告している。従来の半導体レーザの波長安定化では、半導体レーザの注入電流に微小変調を加えている為、結果として半導体レーザの発振幅を広げてしまうという欠点があり、分光実験等の狭い発振幅が必要である実験での半導体レーザの応用に問題となっていた。そこで我々は、波長基準であるRb原子に磁界を印加し、ファラデー効果を利用して直線偏光の偏光面の回転に変調を加え、これを検出して制御信号を得、波長安定化する方法を提案し、発振幅を広げることなく発振波長を安定化することに成功した。具体的にはいくつかの飽和吸収分光光学系を用いて波長安定化の実験を行い、より高い安定度を達成した。

すなわち、原子の吸収線が飽和した状態でのファラデー効果を観測し、通常の吸収信号を用いた場合の結果と比較した上で、飽和吸収分光信号を用いた制御系を構築し、波長安定化を行った。飽和吸収分光信号を用いることで高い安定度が得られ、さらに波長安定化が可能な基準波長は増加はしたが、必ずしも全ての点が高い安定度が要求される波長安定化に用いることができる訳ではないことが分かった。またRbセルに印加する直流磁界の強さを変化することで安定化点がシフトし、吸収線のドップラー幅より広い範囲でその安定度もほぼ一定の値のまま制御できることが分かった。そしてその範囲は、これまで報告されているゼーマン効果を用いた安定化の約400MHzよりも広い範囲の制御であることを確認した。一方、飽和吸収分光光学系には幾つかの異なった光学系があるので、これら異なった飽和吸収分光光学系を用いることで、より高度な波長安定化、より多くの安定化点でより高い安定度を実現し、安定化された波長の掃引、制御の実験を行える光学系の検討を行った。なおこれまでの結果は既に国際会議並びに論文で報告している。
複素古典力学を用いた半古典経路積分法の化学反応への適用

第一に、Co-Linearの3原子化学反応に対するモデル系として、Morse-LEPSポテンシャルで記述される系を用いることが定まった。現在、その系での古典動力学・量子動力学が直接シュミレーションにより調べられている。上で述べられた系にこれから適用される半古典動力学を整備することも進んでいる。とりあえず、以前の論文と同様のKicked Rotator系に対して、複素古典力学による半古典論を数値的に適用して、プロパゲーターを、以前より長時間にわたり計算することに成功している。その結果、カオス系における半古典論による時間発展では、時間発展と共にCausticの数が極めて急速に増えることが確かめられた。また、そのようにCausticが増加するにしたがって、初期時刻におけるLagrangian多様体上での、Stokes線で分けられている「寄与する領域」と「寄与しない領域」は、Fractalに複雑に入り組んでくることが確かめられた。現在、そのように複雑なCausticたちから発生したStokes現象をどのように処理するかを研究している。
次世代分化制御薬の開発を目指した転写因子複合体の構造機能解析

細胞増殖因子の一つであるTGF-βスーパーファミリーは、細胞の様々な機能を調節する多機能性サイトカインである。本研究では、TGF-βシグナルを受容した細胞内で形成され、実際に遺伝子発現の制御を行う転写因子複合体Smad3-FoxH1に着目し、その構造と機能の解析を行った。X線結晶構造解析法によりSmad3-FoxH1複合体の立体構造を決定したところ、他の複合体構造では見られなかった、新規の相互作用面を同定することに成功した。本研究では、ES細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞の分化制御を直接担う転写因子複合体Smad3-FoxH1に焦点を当て、1.細胞分化を引き起こす転写調節が、どのような分子間相互作用を通じて引き起こされているのか、2.そのような分子間相互作用を阻害する化合物を開発することにより、細胞の分化を人為的に制御できないか、という点を明らかにすることを目標としている。本年度は、Smad3-FoxH1複合体の構造情報を得るために、Smad-FoxH1複合体のX線結晶構造解析実験を行った。大腸菌の異種発現系を利用して、ヒト由来Smad3及びFoxH1を大量発現し、in vitroで複合体の形成を行った後、精製及び結晶化実験を行ったところ、エチレンイミンポリマーを沈殿剤とする条件で、良質な結晶を得ることに成功した。得られた結晶を用い、大型放射光施設Photon FactoryのAR-NE3AビームラインにてX線回折実験を行ったところ、最高分解能が2.4ÅのX線回折データを取得することに成功した。得られたX線回折データと、既知のSmad3の立体構造を用いて、分子置換法による構造決定を行ったところ、Smad3-FoxH1複合体の立体構造を得ることに成功した。今回明らかとなったSmad3-FoxH1複合体構造では、これまでに予想されていたSmad3表面とは異なる部位にFoxH1が結合しており、FoxH1はSmad3と新規の様式で結合することが明らかになった。この結果は、Smad3が様々な因子と相互作用する際に、多種多様な分子表面を利用していることを示す重要なデータである。研究申請時の計画では、平成27年度中に、安定なSmad3-FoxH1複合体を形成するSmad3およびFoxH1の発現コンストラクトを決定し、Smad3-FoxH1複合体結晶の作出と、X線回折データの取得を完了することとしている。平成27年度に行った研究では、Smad3のC末端側領域(219残基416残基)とFoxH1のSmad3結合領域(322残基-345残基)を大腸菌の異種発現系を利用して大量調製することにより、安定なSmad3-FoxH1複合体の形成と、結晶化に成功した。また、得られた結晶を用いて、大型放射光施設Photon Factoryのタンパク質結晶構造解析用ビームラインAR-NE3AにてX線回折実験を行ったところ、構造解析に適した品質のX線回折データを取得することに成功している。以上の成果により、当初予定していた研究計画は十分に達成できている。また、平成27年度の研究では、既知のSmad3単独構造を基にした分子置換法により、Smad3-FoxH1の構造決定に成功しており、当初の計画以上に研究は進捗している。以上の理由から、本研究の達成度を「当初の計画以上に進展している」とした。本研究では、ES細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞の分化制御を直接担う転写因子複合体に焦点を当て、1.細胞分化を引き起こす転写調節が、どのような分子間相互作用を通じて引き起こされるのか、2.そのような分子間相互作用を阻害する化合物を開発することにより細胞の分化を人為的に制御できないか、という点を明らかにすることを目標としている。Smad3-FoxH1複合体は、発生の初期段階において、原条の形成に関与することが知られている。平成28年度年度は、平成27年度に得られたSmad3-FoxH1複合体の構造から推測される分子間相互作用を、点変異体解析によって確認した。その結果、Smad3とFoxH1間の相互作用には、FoxH1の両親媒性へリックスとSmad3のthree helix bundle region間の相互作用と、FoxH1のプロリンリッチな配列とSmad3のβsandwich region間の相互作用が重要であることが示された。Smad3-FoxH1の相互作用に強く関与すると示されたSmad3の分子表面上に結合する低分子化合物を、ドッキングシミュレーションソフトを用いて探索し、Smad3ーFoxH1間の相互作用を阻害する候補化合部とした。それらの候補化合物の作用を、熱変性実験やプルダウンアッセイによって評価したが、Smad3-FoxH1間の相互作用を優位に低下させる化合物を新規に発見することはできなかった。しかしながら、Smad3-FoxH1間の相互作用に関与するSmad3分子表面の情報は、TGF-βシグナルに起因する生命現象を制御する薬剤の開発において、非常に重要な知見になるであろうと考えられる。

X線結晶構造解析法によりSmad3-FoxH1複合体の立体構造を決定したところ、他の複合体構造では見られなかった、新規の相互作用面を同定することに成功した。平成27年度の研究では、細胞分化の制御を行う主要な転写因子複合体Smad3-FoxH1のX線結晶構造解析に成功したため、平成28年度は、その複合体の生化学的な解析と、Smad3とFoxH1の複合体形成を阻害するような化合物のスクリーニング研究を行う。具体的には、Smad3-FoxH1複合体の構造決定により、分子間相互作用にかかわる残基を特定できたため、Smad3及びFoxH1それぞれに対し点変異体を作製し、その重要性を定量的に解析する。また、in silicoスクリーニングにより、Smad3-FoxH1の相互作用を阻害するような化合物を選別し、実際に阻害剤としての機能があるか否かを、プルダウンアッセイ等のin vitro解析によって確認する。構造生物学
器官再生における体細胞リプログラミング機構の解明

本研究では,翅成虫原基内で隣接するpouch領域とhinge領域に着目し,pouch領域切除後,hinge細胞がどのようにしてpouch領域を再構築するのか明らかにすることを目指した.器官再生プロセスを発生と切り離して解析するために,erg2酵母を用いて蛹化を抑制した幼虫を用いた.Pouch領域に損傷を加えると,hinge領域を含む損傷部位周辺領域の細胞で細胞周期re-entryが起こり,細胞の形態を変えpouch方向へ移動する様が観察された.また,翅成虫原基で特徴的な発現パターンを示すWinglessの発現パターンが,損傷後約72時間かけて再構築されることを明らかにした.本研究では,翅成虫原基内で隣接する二つの領域,pouch領域とhinge領域に着目し,pouch細胞を遺伝学的に切除後にhinge細胞がどのようにしてpouch領域を再構築するのかを明らかにしたい.この目的のために本年度は,(1)pouch領域の切除と,(2)hinge由来細胞のトレーシング,さらには(3)再生されたpouch細胞の可視化を,一個体内で同時に行える系の確立を目指した.まず,pouch領域,hinge領域にそれぞれ特異的なエンハンサーを選定し,トランスジェニックショウジョウバエの作成を行った.並行して,本系の主要の一つであるerg2欠失酵母を用いたショウジョウバエ幼虫の蛹化抑制を用いて,発生を止めた幼虫(3齢幼虫,中-後期に相当)の成虫原基においても再生能が維持されていることを実証した.まず,pouch領域における遺伝学的損傷に対し,hinge領域を含む損傷周辺領域の細胞で顕著な細胞周期re-entryとpouch領域へ向けた細胞移動が観察された.さらに,新たに出来上がった原基細胞層(disc proper cell layer)には,pouch領域とhinge領域に特徴的な発現パターンを持つWinglessの発現が再構築されたことから,再生された原基組織が正常発生時と同様のパターンを再獲得することを確認した.一方,pouch領域から出た大量の死細胞は,その大半が除かれることなくその場所に留まっており,再び出来上がった原基細胞層と囲芽膜(peripodial membrane)との原基内腔に残っていた.最近発表された別グループの研究により,成虫原基の再生能が発生過程の進行に伴い3齢幼虫後期には低下することが示唆されていたが,erg2欠失酵母を摂取して発生停止状態にある3齢後期幼虫には成虫原基の再生能が維持されることが明らかとなった.研究目的を満たすための系の確立のために,申請時に考えていたトランスジェニックショウジョウバエの遺伝子型に幾つかの改善が必要であることが分かった.そのため当初の計画を変更し,系の確立により大きな時間を割く必要があった.本研究では,翅成虫原基内で隣接する二つの領域,pouch領域とhinge領域に着目し,pouch領域を遺伝学的に切除後にhinge細胞がどのようにしてpouch領域を再構築するのかを明らかにしたい.この目的のために,(1) pouch領域の切除と,(2) hinge由来細胞のトレーシングを同時に行い,さらには(3)再生されたpouch細胞の可視化を,一個体内で同時に行える系の確立を行ってきた.Pouch細胞での遺伝子発現操作のために,当初QF/QUASシステムを利用することを考えていたが,遺伝子発現のON/OFFをGAL80で制御できるLexA::GAD/LOPシステムを用いる方が,本実験系をスクリーニングで用いる場合に適していることが分かったため変更を加え,系の改良を行った.並行して,本研究で重要な役割を果たす,erg2欠失酵母によるショウジョウバエ幼虫の蛹化抑制の実験系を用いて,実際に再生中の細胞リプログラミングが見れる系であることを確認した.3齢幼虫中後期で発生を止めた幼虫の翅成虫原基において,Pouch領域を遺伝学的に切除すると,確かにhinge領域を含む損傷周辺領域の細胞で顕著な細胞周期re-entryと損傷部位を塞ぐように進む細胞移動が観察された.さらに,翅成虫原基においてpouch領域とhinge領域で特徴的な発現パターンを示すWinglessを用いて,pouch領域損傷後に発現パターンが再構築される過程を継時的に観察し,約72時間かけて完全にパターンが再構築されることを明らかにした.

一方,pouch領域から出た大量の死細胞は,その大半が除かれることなくその場所にとどまっており,再び出来上がった原基細胞層と囲芽膜(peripodial membrane)との原基腔内に残っていた.研究目的を満たすためのトランスジェニックショウジョウバエの作成に時間がかかったが,系を用いたスクリーニングの準備が整った.現在全てのトランスジーンを持ち合わせた系統を交配により作成している.本研究では,翅成虫原基内で隣接する二つの領域,pouch領域とhinge領域に着目し,pouch領域を遺伝学的に切除後にhinge細胞がどのようにしてpouch領域を再構築するのかを明らかにしたい.この目的のために,(1) pouch領域の切除と,(2) hinge由来細胞のトレーシングの遺伝子発現操作のために,当初GAL4/UASシステムとQ-システム(QF/QUAS)を併用することを考えていたが,GAL4/UASシステムと同じく遺伝子発現のON/OFFをGAL80で制御できるLexA::GAD/LOPシステムを用いるほうが,Q-システムより本実験系では適していることが分かり系に変更を加えた.本研究では器官再生プロセスを発生と切り離して解析するために,餌にerg2酵母を用いて幼虫の蛹化を抑制した.また発生停滞中の最終齢幼虫においてpouch領域を遺伝学的に切除すると,hinge領域を含む損傷部位周辺領域の細胞で細胞周期re-entryが起こり,細胞の形態を変えpouch方向へ移動する様が観察された.さらに細胞移動の様子を詳しく解析するために,共焦点顕微鏡で取得した画像をもとに3D再構築を行い解析し,創傷を塞ぐための細胞移動は,大量の死細胞からなるpouch領域の基底膜側を進み,結果として死細胞のほとんどが成虫原基から脱落することなく,原基細胞層と囲芽膜(peripodial membrane)との原基腔内に残されることが分かった.また,翅成虫原基のpouch領域・hinge領域で特徴的な発現パターンを示すWingless (Wg)の発現パターンは,pouch損傷により一旦失われるが,その後約72時間かけて完全に再構築されることを継時的な観察により明らかにした.本研究では,翅成虫原基内で隣接するpouch領域とhinge領域に着目し,pouch領域切除後,hinge細胞がどのようにしてpouch領域を再構築するのか明らかにすることを目指した.器官再生プロセスを発生と切り離して解析するために,erg2酵母を用いて蛹化を抑制した幼虫を用いた.Pouch領域に損傷を加えると,hinge領域を含む損傷部位周辺領域の細胞で細胞周期re-entryが起こり,細胞の形態を変えpouch方向へ移動する様が観察された.また,翅成虫原基で特徴的な発現パターンを示すWinglessの発現パターンが,損傷後約72時間かけて再構築されることを明らかにした.系の最適化を終え,当初の計画どおりトランスクリプトーム解析を行い,hinge細胞からpouch細胞への細胞リプログラミングに関わる遺伝子の同定を行う.予定通り,再生中hinge細胞のトランスクリプトーム解析と細胞リプログラミングに関わる遺伝子の同定を行う.発生生物学当初本年度に予定していたマイクロアレイ遺伝子発現解析,RANiショウジョウバエ系統の大規模スクリーニングなどを翌年に持ち越したため.マイクロアレイ遺伝子発現解析に必要な試薬ならびにアレイチップ,RANiショウジョウバエ系統の購入に充てる.
細胞接着因子及び遺伝子担持アパタイト層による、骨形成を促進する骨補填材の開発

骨欠損部において周囲の骨形成を促進し、周囲の骨と直接結合して一体化する材料は、骨組織再生用スキャホールドや骨補填材として有用である。本研究は、人工材料表面に細胞接着因子及び遺伝子担持アパタイト層(DF-Ap層)を形成させることにより、上記の特性を有する材料を開発するための基礎的指針を明らかにすることを目的とする。本年度は、DNAとして骨形成タンパク質-2(BMP-2)のcDNAを含むプラスミドを、細胞接着因子としてフィブロネクチンを用い、人工材料基板表面にDF-Ap層を形成させた。得られた試料の生物学的性質を、骨芽細胞様のMC3T3-E1細胞を用いたin vitro実験、及びラットin vivo実験により評価し、以下の成果を得た。in vitro実験成果:人工材料表面にDF-Ap層を形成させることにより、材料上へのMC3T3-E1細胞の接着を促進することができ、これにより同細胞の骨分化を効率的に誘導できることを明らかにした。in vivo実験成果:人工材料表面にDF-Ap層を形成させることにより、異物反応を引き起こすことなく、材料周辺の骨形成を促進できることを明らかにした。上記のin vitro及びin vivo実験の結果は、DF-Ap層からフィブロネクチンを除いた系では確認されなかった。DF-Ap層中に担持されたフィブロネクチンが細胞の接着を促すことにより、同接着細胞へのBMP-2遺伝子の導入効率を高め、MC3T3-E1細胞の骨分化並びにin vitro骨形成を促進したものと考えられる。以上の研究により、DF-Ap層による細胞への遺伝子導入システムがin vitroだけでなくin vivoにおいても有効であり、同システムを利用して骨形成を促進する材料を作製できることが分かった。本遺伝子導入システムはウィルスを用いない安全なシステムであることから、骨組織再生用スキャホールドや骨補填材への応用が期待できる。骨欠損部において周囲の骨形成を促進し、周囲の骨と直接結合して一体化する人工材料は、骨補填材として有用である。本研究は、高分子材料表面に細胞接着因子及び遺伝子担持アパタイト層を形成させることにより、上記の特性を有する骨補填材を開発するための基礎的指針を明らかにすることを目的とする。平成19年度(平成19年11月28日平成20年3月31日)に行った研究内容は以下の通りである。・ルシフェラーゼのcDNAを含むプラスミドを調整し、reporter geneとしての性能確認を行った。・溶融・プレス成型によってエチレン-ビニルアルコール共重合体(EVOH)の平板状基板(大きさ10×10×1mm^3)を作製し、同基板の表面全面にアパタイト層、及び細胞接着因子及び遺伝子担持アパタイト層を形成させるための処理条件(EVOH基板に対する前処理条件、コーティング溶液の成分濃度)を確認した。・前項で得られた試料表面においてCHO-K1細胞を3日間培養し、同細胞への遺伝子導入効率をルシフェラーゼ活性により評価した。細胞接着因子及び遺伝子担持アパタイト層表面における遺伝子導入効率が、アパタイト層表面における遺伝子導入効率よりも有意に高いことを示し、本遺伝子導入システムの再現性を確認した。・細胞接着因子の製品ロットによる遺伝子導入効率の違いを調べ、最も高い遺伝子導入効率の得られる細胞接着因子の製品ロットを選定した。