hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規D-アミノ酸分析法のためのD-アミノ酸酸化還元酵素のメタエンザイム的探索

本研究では、温泉土壌から多様な好熱菌を得るため、培地の炭素源・窒素源(CN源)濃度とpH条件を検討した。細菌・真菌の培養に用いられるTSB培地を参考に、培地を構成する要素を、CN源、リン酸水溶液、無機塩類の3つに分け、各構成要素を調節することで、3つのCN源濃度(1×、1/10×、1/100×濃度)と3つのpH(pH 2.0、4.5、7.0)を組み合わせた計9つの培地条件を検討した。結果として、採取場所3のサンプルからは1/10×CN源濃度・pH 4.5の培地で菌の増殖を確認した。また、採取場所4のサンプルからは1×CN源濃度・pH 4.5の培地と1/10×CN源・pH 4.5及びpH 2.0の培地の計3つの培地条件で菌の増殖を確認した。採取場所5と6のサンプルからは、1×CN源濃度・pH 4.5及びpH 7.0の培地と1/10×CN源濃度・pH 4.5の培地の計3つの培地条件で菌の増殖を確認した。さらに、上記した採取場所と培養条件が異なる11種類の菌群を1 Lスケールで培養後、菌体をビーズショッカーにて破砕し、粗酵素液を得た。それぞれの粗酵素液を活性染色に供し、D-アスパラギン酸及びD-セリンを含む12種類のD-アミノ酸を基質とした脱水素酵素・酸化酵素の活性をスクリーニングした。しかしながら、D-アミノ酸に特異的な酵素活性は検出できなかった。これまでに秋田県内3カ所の温泉から温泉水または温泉土壌を採取し、それらをスターターとした高温培養を行うことで、栄養源濃度、pHを変えた種々の培地条件において50°Cで生育する13種類の菌群を得ることに成功した。平成27年度は温泉水・土壌をスターターとした好熱菌の培地条件の設定に期間を要したが、平成28年度は前年度に確立した培地条件を再現性良く調製できるよう培地組成を改良し、それらの培地を用いることで、前年度よりも多種多様な培地条件で生育する菌群を得ることに成功した。そして、得られた菌体の無細胞抽出液を調製し、活性染色法を用いてD-アミノ酸を基質とする脱水素酵素・酸化酵素活性のスクリーニングを実施してきた。しかしながら、平成28年度までに目的酵素の活性は検出できていない。一方で、酵素活性ではなく遺伝子工学的手法を用いてD-アミノ酸脱水素酵素・酸化酵素を探索するため、調製した無細胞抽出液からゲノムDNAをそれぞれ調製し、保存している。現在のところ、目的のD-アミノ酸酸化還元酵素を見出すには至っていない為、研究の進行具合はやや遅れていると判断する。しかし、これまでに確立した高温環境からの効率的な菌培養法を用いることで、より多様な好熱性菌群を獲得し、酵素活性だけでなく遺伝子工学的手法を用いることにより、本研究の目標達成を目指す。本研究では、D-アミノ酸酸化還元酵素を利用したD-アミノ酸酵素分析法の開発を目的とし、好熱菌から安定性に優れたD-アミノ酸酸化還元酵素を見出す事を目標とした。温泉土壌から好熱菌を培養し、既存の酵素のアミノ酸配列やDNA塩基配列情報に頼らず、活性染色法による酵素活性の検出から新規酸化還元酵素を見出す計画であった。平成29年度は秋田県小安峡温泉、宮城県鬼首温泉から温泉土壌を採取した。これらの温泉土壌をろ過して砂泥を除き、ろ液を2%寒天培地に塗布した後、55°Cで培養を行った。本年度は、主な窒素源及び炭素源をD-アミノ酸に限定した寒天培地を用いることで、酸化還元酵素を含むD-アミノ酸代謝関連酵素を有する好熱菌の選択的な培養を試みた。栄養源としたD-アミノ酸には、ヒトでの重要な生理機能が明らかとなっているD-アスパラギン酸(D-Asp)とD-セリン(D-Ser)を使用した。
子宮頚癌における新しいバイオ・マーカーに関する有用性の検討

子宮頸癌や前癌病変である異形成においては、90%以上の頻度でヒトパピローマウイルス(HPV)感染が認められる。このウイルス由来のE7蛋白質は癌抑制遺伝子産物であるRB蛋白質に強く結合する結果、転写因子E2FがRB蛋白質から離開し、細胞周期を持続的に回転させることにより、発癌や癌の進展に関与していると考えられている。近年、E2Fは細胞周期関連蛋白質であるP16蛋白質の発現を誘導することが明らかとなり、RB蛋白質に結合していない活性型のE2Fの発現量をP16蛋白質の発現量を指標として解析することが可能となった。現在、子宮頸部の扁平上皮系病変に関しては、異形成から扁平上皮癌においてP16蛋白質の過剰発現が報告されている。一方、子宮頸部腺癌の発癌機構についてはHPV感染の関与が議論されているものの、いまだ結論が出されていない。そこで子宮頸部腺系病変に対し、P16蛋白質の過剰発現およびHPV感染の有無について解析し、発癌機構におけるHPV感染の関与について検討した。子宮頸部腺系病変の生検組織81例(上皮内腺癌11例、腺癌62例、腺扁平上皮癌8例)のパラフィン包埋切片を対象とし、抗p16モノクローナル抗体を用い免疫組織化学染色を行ったところ、p16蛋白質の過剰発現は上皮内腺癌10/11例(90.9%)、腺癌54/62例(87.1%)、腺扁平上皮癌7/8例(87.5%)において認められた。子宮頸部腺系病変では高率にp16蛋白質の過剰発現が認められたことから、扁平上皮病変同様にHPVのE7蛋白質によりRB蛋白質の失活を介する発癌経路が重要であることが示唆された。
零スペクトル制約の通信路容量に関する研究

2次の零スペクトル制約を満たす記号列を生成するラベル付き有向グラフの既約部分グラフを特定し,その容量の数値計算を行った.以下にその結果の概要を述べる.nとkを互いに素な正整数とし,f=k/nとおく.まず,2以上のnに対して2次の零スペクトル制約の標準グラフも,1次の例スペクトル制約標準グラフと同様に,いくつかの既約部分グラフに分離していることを示した.次に既約部分グラフを分類するための基本的性質として,(1)既約部分グラフの中の状態が必ず含んでいる状態の集合,2つの状態が同じ既約部分グラフの状態であるための必要十分条件を導き出した.この結果を用いて,次の結果を得た.n=2の場合には,周波数fにおける2次の零スペクトル制約の標準グラフは2つの既約部分グラフを含んでいることを示した.さらに,その既約部分グラフの容量を,そのグラフに含まれる有限有向グラフのサイズをパラメータとして数値計算によって求めた.n【greater than or equal】3であれば周波数fにおける零スペクトル制約のための標準グラフの既約部分グラフの数は,高々6^ρ^<(n)>でることを示した.ここでρ(6)はnのオイラー数である.n=3の場合の規約部分グラフの容量については,上記の結果を利用して既約部分グラフを特定しようとしている段階である2次の零スペクトル制約を満たす記号列を生成するラベル付き有向グラフの既約部分グラフを特定し,その容量の数値計算を行った.以下にその結果の概要を述べる.nとkを互いに素な正整数とし,f=k/nとおく.まず,2以上のnに対して2次の零スペクトル制約の標準グラフも,1次の例スペクトル制約標準グラフと同様に,いくつかの既約部分グラフに分離していることを示した.次に既約部分グラフを分類するための基本的性質として,(1)既約部分グラフの中の状態が必ず含んでいる状態の集合,2つの状態が同じ既約部分グラフの状態であるための必要十分条件を導き出した.この結果を用いて,次の結果を得た.n=2の場合には,周波数fにおける2次の零スペクトル制約の標準グラフは2つの既約部分グラフを含んでいることを示した.さらに,その既約部分グラフの容量を,そのグラフに含まれる有限有向グラフのサイズをパラメータとして数値計算によって求めた.n【greater than or equal】3であれば周波数fにおける零スペクトル制約のための標準グラフの既約部分グラフの数は,高々6^ρ^<(n)>でることを示した.ここでρ(6)はnのオイラー数である.n=3の場合の規約部分グラフの容量については,上記の結果を利用して既約部分グラフを特定しようとしている段階である
視覚性事象関連電位とポジトロン断層撮影を用いた定量的高次脳機能検査システムの開発

WAIS-RやWCSTなどの神経心理学的研究方法が高次脳機能検査としてこれまで,臨床現場で用いられているが、これらの神経心理学的手法を補完する「定量的・神経生理学的検査システム」を確立するために本研究を開始した。本研究では視覚性事象関連電位検査の図形課題として,形・色の2要素を含んだ図形でいずれか一方の要素に注目させる選択的視覚注意課題と形・色の2要素を含んだ図形で同時に両方の要素に注目させる分配的視覚注意課題を用いて、それらの課題の有用性を検討することとした。また、平行して電気生理学的検査である視覚性事象関連電位検査の異常が,核医学的検査である脳のポジトロン断層撮影検査における脳血流や脳代謝の定量的異常とどのような相関を示すかを検討することとした。視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定を行った.核医学的検査としては、安静時に脳のポジトロン断層撮影検査(FDG Positron Emission Tomography)を施行し、脳血流と脳代謝の定量的測定を行った.視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定値と脳血流量との相関を調べた。健康成人20例を対象として、視覚性事象関連電位を計測し、その潜時と振幅を計測した。刺激課題としては,以下の4種類を作成した.1)視覚性事象関連電位検査の図形課題として,形・色の2要素を含んだ図形でいずれか一方の要素に注目させる選択的視覚注意課題(visual selective attention paradigm)、2)形・色[赤・緑]の2要素を含んだ図形で同時に両方の要素に注目させる分配的視覚注意課題(visual divided attention paradigm)、3)立体的な錯視を呈する平面図形と平面に見える平面図形とによる立体的錯視課題(stereosopical illusory paradigm)、4)回転する錯視を呈する静止図形と静止して見える静止図形とによる回転錯視課題(roratory motor illusory paradigm)のそれぞれをマルチスチム(メジカルトライシステム社製)とパーソナル・コンピューター(PC)を用いて、PCのモニター上に図形を提示し、マルチスチムからトリガー信号で誘発電位計測装置(日本光電ニューロパック2000)の加算を駆動するプログラムの確立に成功した。記録方法であるが、脳波記録電極の部位をCz, Pz, Oz, C3,C4,P3,P4,T5,T6,O1,O2とし,基準電極はA1A2連結電極とすることにした.視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定(N100,P200,N200,P300,手指反応時間の測定)を行った.高次脳機能検査としてこれまで,WAIS-RやWCSTなど神経心理学的手法が臨床の現場で用いられているが、それら神経心理学的検査を補う,またはそれらに置き換わる「定量的・神経生理学的検査システム」を確立するために本研究を開始した。本研究では視覚性事象関連電位検査の図形課題として,形・色の2要素を含んだ図形でいずれか一方の要素に注目させる選択的視覚注意課題(visual selective attention)と形・色の2要素を含んだ図形で同時に両方の要素に注目させる分配的視覚注意課題(visual divided attention)を用いて、それらの課題の有用性を検討することとした。各種図形を用いた課題による視覚性事象関連電位検査を行い,健康成人10例、パーキンソン病10例を対象として,以下の2種類の刺激課題を用いた。視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定(N100,P200,N200,P300,手指反応時間の測定)を行った.脳波記録電極の部位はCz, Pz, Oz, C3,C4,P3,P4,T5,T6,O1,O2とし,基準電極はA1A2連結電極とした.核医学的検査としては、安静時に脳のポジトロン断層撮影検査(FDG Positron Emission Tomography)を施行し、脳血流と脳代謝の定量的測定を行った.視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定値と脳血流量との相関を調べた。

WAIS-RやWCSTなどの神経心理学的研究方法が高次脳機能検査としてこれまで、臨床現場で用いられているが、これらの神経心理学的手法を補完する「定量的・神経生理学的検査システム」を確立するために本研究を開始した。本研究では視覚性事象関連電位検査の図形課題として、形・色の2要素を含んだ図形でいずれか一方の要素に注目させる選択的視覚注意課題(visual selective attention)と形・色の2要素を含んだ図形で同時に両方の要素に注目させる分配的視覚注意課題(visual divided attention)を用いて、それらの課題の有用性を検討することとした。また、平行して電気生理学的検査である視覚性事象関連電位検査の異常が、核医学的検査である脳のポジトロン断層撮影検査における脳血流や脳代謝の定量的異常とどのような相関を示すかを検討することとした。各種図形を用いた課題による視覚性事象関連電位検査を行い、平成18年度は更に症例を重ね、健康成人10例、パーキンソン病10例、アルツハイマー一病10例を対象として、以下の2種類の刺激課題を用いた。視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定(N100、P200、N200、P300、手指反応時間の測定)を行った。脳波記録電極の部位はCz、Pz、Oz、C_3、C_4、P_3、P_4、T_5、T_6、O_1、O_2とし、基準電極はA1A2連結電極とした。核医学的検査としては、安静時に脳のポジトロン断層撮影検査(FDG Positron Emission Tomography)を施行し、脳血流と脳代謝の定量的測定を行った。視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定値と脳血流量との相関を調べた。WAIS-RやWCSTなどの神経心理学的研究方法が高次脳機能検査としてこれまで,臨床現場で用いられているが、これらの神経心理学的手法を補完する「定量的・神経生理学的検査システム」を確立するために本研究を開始した。本研究では視覚性事象関連電位検査の図形課題として,形・色の2要素を含んだ図形でいずれか一方の要素に注目させる選択的視覚注意課題(visual selective attention)と形・色の2要素を含んだ図形で同時に両方の要素に注目させる分配的視覚注意課題(visual divided attention)を用いて、それらの課題の有用性を検討することとした。また、平行して電気生理学的検査である視覚性事象関連電位検査の異常が,核医学的検査である脳のポジトロン断層撮影検査における脳血流や脳代謝の定量的異常とどのような相関を示すかを検討することとした。各種図形を用いた課題による視覚性事象関連電位検査を行い,平成19年度は更に症例を重ね、大脳皮質基底核変性症10例、多系統萎縮症10例、進行性核上性麻痺10例を対象として,以下の2種類の刺激課題を用いた。視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定(N100,P200,N200,P300,手指反応時間の測定)を行った.脳波記録電極の部位はCz,Pz,Oz,C3,C4,P3,P4,T5,T6,O1,O2とし,基準電極はA1A2連結電極とした.核医学的検査としては、安静時に脳のポジトロン断層撮影検査(FDG Positron Emission Tomography)を施行し、脳血流と脳代謝の定量的測定を行った.視覚性事象関連電位の潜時・振幅の測定値と脳血流量との相関を調べた。
作物形態の定量化とゲノムとの関連の解析

作物の輪郭形状は消費者の嗜好性、輸送コスト、加工コスト等の観点から重要な育種対象となっている。修士からの研究で引き続きソルガムの種子の輪郭形状を題材として輪郭とゲノムの関連の解析を行った。輪郭の定量化手法として代表的なものに楕円フーリエ記述子を用いる方法とセミランドマーク法がある。修士ではこれらを用いて輪郭の定量化を行い、ゲノムとの関連を解析した。しかし、この2つの手法は向きと大きさの基準化と定量化手法という2つの因子が違っているため、手法比較して考察を行うことがやや難しかった。そこで大きさのスケーリングの有無、向きの基準化の手法4通り、3種類の形状記述法、計24組の手法の組み合わせで輪郭の定量化を行い、ゲノムワイドマーカーから輪郭形状の予測とゲノムワイドアソシエーション解析を行った。定量化手法として楕円フーリエ記述子を用いるか擬似標識点500点を用いるかは主成分分析の結果にほとんど影響を及ぼさなかった。スケーリングの有無、基準化手法の違いにより、主成分分析の結果は異なった。ゲノミック予測の結果では、スケーリングの有無、基準化手法の違いにより結果が異なった。スケーリングしなかった場合の方がスケーリングをする場合よりも予測制度が高かった。基準化手法は胚側と側面側で予測制度が高い手法が異なった。ゲノムワイドアソシエーション解析ではスケーリングの有無、基準化手法の違いにより異なるSNPが検出された。しかし、どの手法がゲノムワイドアソシエーション解析に適しているというものはなかった。形態の定量化をする際にどのような操作が遺伝解析にまで影響を与えるかというのはほとんど研究されてこなかった。「作物形態の定量化とゲノムとの関連の解析」という研究においてスケーリングの有無、向きの基準化の手法によって遺伝解析の結果が変わることをきちんと示せたことはこの研究が概ね順調に進展していることを示していると言える。楕円フーリエ解析やセミランドマーク法を使った幾何学的形態計測学を利用した形態の定量化と遺伝解析との関連については大いに進展したと考えている。2Dの形状解析の定量化手法が遺伝解析にどう影響するかの理解は進んだものの、3Dの形状定量化手法については研究を今後進めていく必要がある。3Dの形状定量化手法については球面調和関数を使った解析やその他の手法がどのように遺伝解析にどう影響するかの解析をする必要がある。「背景」作物の輪郭形状は消費者の嗜好性、輸送コスト、加工コスト等の観点から重要な育種対象となっている。この2つの手法は向きと大きさの基準化と定量化手法という2つの因子が違っているため、手法比較して考察を行うことがやや難しかった。そこで向きと大きさの基準化を3通り行い、基準化された輪郭を2通りの手法で定量化し、6通りの定量化された輪郭をそれぞれ2通りの予測手法でゲノムワイドマーカーから輪郭形状の予測を行った。「方法」ソルガムの遺伝資源約300系統について、1系統につき10粒ずつ、胚側と胚と直交する側からみた輪郭の座標情報を収集した。向きとサイズの基準化は、(1)一般化プロクラステス解析、(2)重心と生物学的標識点をもとにした基準化、(3)楕円をあてはめて長軸を合わせる基準化の3手法使った。輪郭の定量化手法としては、(1)楕円フーリエ解析、(2)擬似標識点500点の座標を直接用いる方法の2手法使った。SNPから形状評価値を予測するモデルを線形のGBLUPと非線形のガウスカーネル回帰の2手法を用いて構築した。最後に、計12組の手法の組合せについて予測精度の評価・比較を行った。「結果」全ての場合においてGBLUPがガウスカーネル回帰よりも高精度であった。また、全ての場合において楕円フーリエ解析が疑似標識点の座標を直接用いる方法より高い精度を示した。さらに、向きとサイズの基準化では、胚側についてはプロクラステス解析、胚と直交する側については楕円の長軸をもとにした基準化の精度が高かった。以上、作物の器官形状のゲノミック予測では、基準化・定量化・予測のための手法の違いが精度に影響する可能性が示され、最適な手法の組合せを経験的に検討することの重要性が示唆された。複数の定量化手法を組み合わせて、最適な定量化手法を見出すことができた。また、この解析を通してそれぞれの定量化手法の癖を理解することができたため、今後の輪郭形状の解析に大いに活かせる成果となった。

スケーリングの有無、基準化手法の違いにより、主成分分析の結果は異なった。ゲノミック予測の結果では、スケーリングの有無、基準化手法の違いにより結果が異なった。スケーリングしなかった場合の方がスケーリングをする場合よりも予測制度が高かった。基準化手法は胚側と側面側で予測制度が高い手法が異なった。ゲノムワイドアソシエーション解析ではスケーリングの有無、基準化手法の違いにより異なるSNPが検出された。しかし、どの手法がゲノムワイドアソシエーション解析に適しているというものはなかった。形態の定量化をする際にどのような操作が遺伝解析にまで影響を与えるかというのはほとんど研究されてこなかった。「作物形態の定量化とゲノムとの関連の解析」という研究においてスケーリングの有無、向きの基準化の手法によって遺伝解析の結果が変わることをきちんと示せたことはこの研究が概ね順調に進展していることを示していると言える。楕円フーリエ解析やセミランドマーク法を使った幾何学的形態計測学を利用した形態の定量化と遺伝解析との関連については大いに進展したと考えている。作物形態の定量化を行う上で輪郭だけでなく色や模様、面積等の定量化を行うことも重要であると判断した。また、既存のゲノムと形質の関連の解析手法は多形質を扱うことをうまく想定できていないものも多いため、ゲノムとの関連を解析する手法の開発も同時に行う必要がある。また、ダイズの遺伝資源を撮影できることとなったのでダイズの輪郭形状の解析を行う予定である。2Dの形状解析の定量化手法が遺伝解析にどう影響するかの理解は進んだものの、3Dの形状定量化手法については研究を今後進めていく必要がある。3Dの形状定量化手法については球面調和関数を使った解析やその他の手法がどのように遺伝解析にどう影響するかの解析をする必要がある。
骨代謝細胞ネットワークのインビトロにおける再構成と蛍光技術を駆使した時空間的解析

骨の恒常性を制御している細胞間の相互作用を解明するために、これらの細胞と基質から成る生体内の環境を生体外で再構築し、2光子励起顕微鏡を用いた解析が可能な新規の系を確立した。骨を形成する骨芽細胞を長期分化培養し、同一部位を経時的に観察することで、基質の増加、骨代謝を調節する骨細胞の出現、骨基質上の骨芽細胞の形態変化と言った骨モデリング過程で生じる現象を再現し、定量的に証明した。さらに、長期培養骨芽細胞と骨を吸収する破骨細胞との共存培養において、破骨細胞による基質吸収、成熟骨芽細胞の吸収窩における出現、吸収窩の再充填といった、骨リモデリング過程における現象を細胞レベルで捉え、定量化した。骨の恒常性を制御している破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞の細胞間相互作用を解明するために、これらの細胞と骨基質から形成される生体内の骨代謝細胞ネットワークをin vitroにおいて再構築し、2光子励起顕微鏡や第2次高調波発生といった非線形光学技術を駆使した解析が可能な系の確立を試みた。マウスより採取した骨芽細胞分化培養系において、3週間の長期培養により基質中に出現する細胞が骨芽細胞であることを、骨細胞マーカーに対する免疫染色や、骨細胞を蛍光標識可能であるDMP1-Cre/flox-tdTomato由来の細胞を用いた培養を行うことで確認した。この系において、同一部位を経時的に2光子励起顕微鏡で観察し、基質の増加、骨細胞の出現とともに骨基質上の骨芽細胞の形態が立方形から扁平状へと変化することを定量的に証明した。さらに、骨芽細胞長期培養4週の時点で、破骨細胞を特異的に蛍光標識可能であるCatKp-Cre/flox-tdTomatoマウス由来の骨髄マクロファージと共存培養し、さらに3週後に骨芽細胞分化培地に戻したところ、基質吸収部において骨芽細胞が扁平状から立方形へと変化し、その後新しく合成された基質によって吸収窩が再充填される様子を捉えることができた。すなわち、骨リモデリングサイクルにおける破骨細胞と骨芽細胞のカップリング現象を細胞レベルでとらえることに成功した。カップリングの生じる頻度、カップリングにより十分な基質再充填が生じる頻度について定量化を行い、先行文献におけるin vivoの解析と同等の結果を得た。また、基質吸収部の再充填を、基質体積を解析することで定量的に表すことが出来た。さらに、骨芽細胞が自ら産生した基質に埋まっていく様子も観察できた。得られた結果については論文として投稿、受理され、既に公表されている。マウスより採取した骨芽細胞分化培養系において、3週間の長期培養により基質中に骨細胞が出現することを確認した。さらに、骨芽細胞長期培養4週の時点で、破骨細胞を特異的に蛍光標識可能であるCatKp-Cre/flox-tdTomatoマウス由来の骨髄マクロファージと共存培養し、さらに3週後に骨芽細胞分化培地に戻したところ、骨リモデリングサイクルにおける破骨細胞と骨芽細胞のカップリング現象を細胞レベルでとらえることに成功した。カップリングの生じる頻度、カップリングにより十分な基質再充填が生じる頻度について定量化を行い、選考文献におけるin vivoの解析と同等の結果を得た。得られた結果については論文投稿を行い、既にインターネット上で公開されている。最終年度にはさらに、破骨細胞が出現する部位と骨芽細胞形態との関連や、培養期間をさらに延長した際の、休止していた破骨細胞前駆細胞の分化によると思われる破骨細胞形成、基質吸収および吸収窩の再充填についての解析を行った。当初の予定では、平成26年度は骨芽細胞から骨細胞への分化の経時的観察、および破骨細胞分化とその支持細胞の検討を行う予定であった。前者については、骨芽細胞分化培養系において同一部位を経時的に観察し、基質の増大と共に、基質内の骨細胞の増加を認めている。これに加え、骨細胞分化に伴って生じる現象と考えられる、骨芽細胞の形態変化を定量化することにも成功している。

後者については、より早期から破骨細胞を観察する必要が認められたため、破骨細胞前駆細胞に発現する分子RANKのプロモーター活性によりCreリコンビナーゼを発現するマウスを入手する手続きを行っている。また、平成27年度に破骨細胞による骨吸収後の骨芽細胞recruitmentの検討を行う予定であったが、既に平成26年度中に、長期培養骨芽細胞と骨髄マクロファージ共存培養系における同一部位の経時的観察により、骨吸収窩に骨芽細胞が動員されることを確認している。これに加え、さらに吸収部の基質の再充填までが観察され、これまで観察することができなかった基質の吸収から再充填までの骨リモデリングの全過程をin vitroにて再現し、観察することに成功している。得られた結果については論文投稿を行い、既にインターネット上で公開されている。骨代謝、再生医療破骨細胞をより早い分化段階から蛍光標識するために、RANKのプロモーター活性によりCreリコンビナーゼを発現するマウスを導入して、LoxP配列に挟まれたStop配列の下流に赤色蛍光蛋白質tdTomatoの配列を持つマウスとかけ合わせることにより、破骨細胞前駆細胞を蛍光標識し、破骨細胞形成過程をより早期から観察する。この過程において隣接する骨芽細胞の有無やその形態に注目した観察を行う。を阻害する可溶型Sema4Dなどといった薬剤の基質再充填率への影響を検討する。さらに、投与法により骨量への影響が異なるPTHの影響を、確立した系において連続あるいは間歇投与し、各細胞の動態や基質の再充填への影響を検討する。これらに加えて、カップリング阻害因子のスクリーニング系構築のために、確立したin vitro系において、リモデリング過程ををより簡便に検討可能な方法について検討を行う。具体的には、吸収窩を特異的に染色可能な方法、新生基質を特異的に染色可能な方法などについて検討する。
デンマーク宗教改革に関する基礎的研究

本研究の目的は北欧史にとって重要なテーマの一つであるデンマークの宗教改革に関して、主に政治的な観点から基礎研究を行うことである。具体的には、デンマーク宗教改革の実現過程を明らかにし、その特徴を明確にすることである。デンマーク宗教改革は次の3段階に分けることが出来る。(1)ルター主義伝播の段階(1517-33年)、(2)内戦である伯爵戦争の段階(1534-36年)、(3)国王クリスチャン3世のコペンハーゲン入城以降の段階(1536年8月1550年)。まず第1段階では、1519年頃にルターの教えがデンマークに伝わり、その後はルターの薫陶を受けたハンス・タウセンらがヴィボー等の地方都市を中心にその教えを広めていった。デンマーク国王フレデリック1世は即位憲章に縛られて公的にはルター主義を公認しなかったが、私的な形、例えばタウセンに保護状を与えたり、息子の嫁には新教徒を迎えるなど、寛容な姿勢をみせた。また諸侯会議を通じて、ローマ教会からの独立を図りカトリックの国家教会体制の端緒を開いている。第2段階では、1533年の諸侯会議で次期国王を決定できず、貴族勢力の台頭に危機感を抱いたハンザ同盟の外圧により、国内を二分する伯爵戦争が勃発した。当初劣勢であったクリスチャン公(後のクリスチャン3世)がスウェーデン等からの援助も受け、最終的には勝利を得た。この戦争終結により、様々な矛盾を含んだデンマークの中世は終わったのである。第3段階では、宗教改革が一気に進んだ。まず、司教全員を逮捕・拘留した上で、教会関係領を王領に編入した。その後身分制議会を召集し、諸身分に司教の逮捕と教会関係領の没収を承認させた。この後、1537年には教会の基本法である教会法が制定され、聖職者を養成するコペンハーゲン大学も再興された。1550年にはデンマーク語訳聖書を出版している。以上みてきたデンマーク宗教改革の特徴は、伯爵戦争後僅か数ヶ月という短期間に進んだことであり、国王主導の上からの変革であった。国王が名実共に教会の長となり、貴族と共に国政を担っていった。また、宗教改革を機に使徒伝承の伝統も途切れてしまった。さらに、宗教改革実現過程を政治的に見る場合、中央集権化の進展と捉えることが出来、ある意味で1661年の絶対王制導入の嚆矢ともなっている。交付申請書に記載した研究計画に基づき、本研究初年度の本年度は、まず関西学院大学(兵庫県)、大阪外国語大学(大阪府)、東海大学(神奈川県)、デンマーク(王立図書館、国立文書館)への文献資料調査出張により、"Dansk Historisk Tidsskrift(大阪外国語大学附属図書館所蔵)"、"Scandinavian Economic History Review(東海大学附属図書館所蔵)"、"Scania(関西学院大学中央図書館所蔵)"における宗教改革関係の論文データーを抽出した。そのデーターと本学中央図書館所蔵の"The Journal of Scandinavian History"のバックナンバーにおける同様のデーターを総合し、本研究の基盤となるデンマーク宗教改革に関する文献目録を作成した。

またデンマーク出帳中、国立文書館及び王立図書館で"Kirkehistoriske Samlinger","Fortid og Nutid"等の雑誌バックナンバーから上記と同様のデーターを抽出し、文献目録に加えた。そして、その文献目録中より必要な文献をデンマークの古書店を通じて入手した。さらに論文に関しては、デンマーク王立図書館に文献複写を依頼して入手した。複写した史・資料等は製本或いは、ドキュメントファイルを用いて整理した。今後は上記の基礎資料をもとに、年表作成過程で再確認できたデンマーク宗教改革の過程を次の3つの時期、即ち(1)ルター主義の伝播(1534年以前)、(2)伯爵戦争(1534-36年)、(3)クリスチャン3世の首都入城以後、に区分して、詳細に考察していく予定である。(1)に関しては、1519年頃にルターの教えがデンマークに伝わり、その後はルターの薫陶を受けたハンス・タウセンらがヴィボー等地方都市を中心にその教えを広めていった。デンマーク国王フレデリック1世は即位憲章に縛られて公的にはルター主義を公認出来なかったが、私的な形、例えばハンス・タウセンを私的に保護したり、長男クリスチャン公の嫁に新教徒を迎えたり、娘のドロテアをドイツの新教徒の元へ嫁がせたりして、ルター主義に寛容な姿勢を見せたのであった。また諸侯会議(1526、1527、1530)を通じてローマ教会からの独立を図り、カトリックの国家教会体制の端緒を開いている。結果的にフレデリック1世は、カトリックあるいはルターという、どちらか一方の側に立つのではなく、政治的にバランスを取りながら両者を利用していたといえる。(2)に関しては以下の通りである。伯爵戦争以前からデンマークは社会的・経済的・宗教的な危機を迎えていた。そして1533年の諸侯会議で次期国王を決定できなかったことにより、一気に政治的危機に陥り、国内を2分する伯爵戦争が勃発した。戦争自体は当初劣勢であったクリスチャン公側がスウェーデン等からの援助を受け次第に盛り返し勝利した。ハンザ同盟やそのライバル国オランダも巻き込んだこの戦争は、結局、デンマークの中世を終わらせ、近代の始まりをもたらしたのであった。交付申請書に記した今年度の研究実施計画に基づいて研究を行った。特に、本研究の実施最終年度にあたる本年は、デンマーク宗教改革実施過程最終段階、即ちデンマーク国王クリスチャン三世のコペンハーゲン入城(1536年8月)以後の動きを考察した。概要は以下の通りである。クリスチャン三世は顧問と軍上層部との秘密会合を行った上で、1536年8月12日に予告なしに7人いるカトリックの司教を全員逮捕し、拘禁した。そして、王国顧問会議を招集してその逮捕を認めさせ、新たにルターの教えを国教に採用することを承認させた。10月中旬には聖職者以外の諸身分を首都に集め、伯爵戦争(1534-36)の戦費調達に関する諸侯会議が開催された。この会議の結果は即位憲章及び協定に結実している。その主な内容は次の通りである。(1)カトリック聖職者の罷免、教会関係領の没収、(2)国政は国王と王国顧問会議が共同して行うこと、(3)引き続き選挙王制を維持すること、
乳幼児と母親及びきょうだいとの争いやからかいに見られる情動調律と他者の心の理解

15組の家庭を対象に3年間の縦断研究を行って来た。対象児が1歳半、2歳半、3歳半の時点でそれぞれの家庭での情緒的コミュニケーションをビデオ記録して来た。日常の家庭生活でのやりとりに焦点を当てたのはそこに家族一人一人の欲求、願望、意図、情動が複雑に絡み合って表現されていること、そして子どもはそのような家族とのやりとりを体験するなかで多様な心的世界を発見していくと考えられるからである。ビデオ記録された自然のやりとりの中から母子、父子、きょうだい、そしてともだちとのふざっけっこやからかいの場面や言い争いやぶつかり合いの場面を抽出し、そこに展開したエピソードを記述した。エピソードにはさまざまな感情の伝え合いや読み取りの過程がさまざまなストーリーとして展開されている。そのような心の交流の流れから、お互いの気持ちや意図の行き違いとその修正の方法、感情のぶつかり合いとその調節の仕方、楽しさの共有と親和の表出といった側面を分析した。その結果、家族やともだちとの感情のぶつかり合いやからかいのやりとりが情動調律と他者の心の理解へのきっかけになっていることがわかった。子どもは調和のある楽しい交流のみならず感情のぶつかり合いやいざこざとその調節を経験することによって自他の心の理解を発達させていくと考えられる。楽しさの共有体験やぶつかり合いの情動調律の体験には家庭による違いが多く見いだされた。各家庭において家族の成員による相互作用のあり方の違いが各家庭に特徴的な情動調律関係を形作り、それが各家庭の情緒的雰囲気の違いを特徴づけている。この違いが子どもの心の理解の違いに影響してくると推測される。ビデオ育児日記として子どもの成長を記録する目的で15家族が研究に参加してくれている。そのうち第1子は7名(男児5、女児5)、第2、3、4子は8名(男児4、女子4)である。対象児が1歳半のときに8ミリビデオカメラを各家庭に貸し出し、日常の自然な場面を母親に撮影してもらった。場面は家族そろった夕食場面、自由な遊び場面(父親、母親、あるいはきょうだいとの関わり、対象児のひとり遊びやいたずらなどを含む)、ともだち(対象児とほぼ同じ年齢の子どもや年長の対象児のきょうだいのともだち)との遊び場面の3場面である。1つの場面毎に120分テープを使い、母親の判断によって日常通りの行動を撮ってもらった。子どもの活発な行動を追うためにビデオカメラに広角レンズを装着した。撮影されていることをなるべく意識させないようにするためビデオカメラは部屋の隅に設置してそのままテープをまわしたまま放置してもらった。1カ月後テープを回収した。回収されたテープを再生しながら、まず親子間、きょうだい間、そしてともだち間でのちょっとしたいざこざ、衝突、くい違いなどの場面を抽出した。対人関係におけるノンバーバル・コミュニケーションと情動の調節について検討するため対象児および家族の情動表出を中心に分析を行っているところである。対象児が2歳になったとき母親へのインタビューを実施し、子どものことや家族のことについて語ってもらい、その様子をビデオ撮影させてもらった。この資料収集は現在進行中である。この家族訪問時に前回(1歳半)のときに撮影してもらったテープを20分程度に編集して持参した。そのテープを家族一緒に見てもらいそのときの対象児の表情や行動を撮影してもらうように依頼した。2才児の自己意識を調べるためである。この資料収集も現在進行中である。昨年度に引き続き、15の家庭が縦断研究に参加協力してくれている。対象児が1歳半及び2歳のときのデータを分析しその結果は1997年7月にアイルランドのダブリン大学で開催された第5回ヨーロッパ心理学会で発表された。そこでは自我の芽生えのときの子どもの情緒的自己表現が家族とのコミュニケーションの中でどのように発揮されているのかを観察データと実験的データで提示した。

そして子どもは自分と家族との関係をその後どのように自分の内面に形成しているのかについて考察を行っている。家庭の情緒的雰囲気や情緒的コミュニケーションの性質及びその結果としての種々の感情の体験が、子どもの自己の形成や世界についての認識形成、そして他者理解にどのような影響を及ぼすのかについて今後も探求していく。対象児が2歳半のとき、前回と同様に母親にビデオ育児日記の方法でデータ収集をお願いした。このデータは現在分析進行中である。分析の視点は2つある。第一に各家庭のもつ情緒的雰囲気である。情緒的雰囲気とは、各家庭での家族間の感情の出し方(どのような感情をどのように表現するか、例えば怒りを強く出すが、喜びをあまり出さないなど)、各家庭での顕著な感情の種類(例えば不機嫌な様子とか無表情さが多い家庭とか、よく笑い楽しさを表現する家庭など)、さらに各家庭での感情についての評価の違いなどから生み出されてくるものである。分析の視点の第二に家族間の情緒的コミュニケーションがある。それぞれの家庭の情緒的雰囲気の中で家族間でいつ、どのように情緒的コミュニケーションを行っているのかを明らかにしていく。15組の家庭を対象としてそれぞれの家庭での情緒的コミュニケーションの諸相を対象児が乳児のときから縦断的にビデオ記録してきた。日常の家庭生活でのやりとりに焦点を当てたのはそこに家族一人一人の欲求、願望、意図、情動が複雑に絡み合って現出されること、そして子どもはそのような家族とのやりとりを体験なかで自分のみならず他者の多様な心的世界を発見していくと考えられるからである。今年度の研究の焦点は、3歳半になった対象児の自他の心の理解の発達を探るためのデータを収集し、それを分析することにある。データは8ミリビデオカメラを各家庭に貸し出し、母親に子どもと家族の日常の自然場面を撮影してもらうことによって収集した。必要な場面としてお願いしたのは遊び場面と、日常の生活場面である。これら撮影された場面から自他の心がぶつかり合う場面や心が通い合う場面を抽出し、プロトコルを記述した。プロトコル分析によって明らかにされたことは次の点である。母子、父子、あるいはきょうだいとのふざけっこやからかいのやりとりのなかに親和関係や共感性が表現されていること、さらに家族やともだちとの気持ちや意図の行き違いや、感情のぶつかり合いや対立のやりとりが情動調律と他者の心の理解へのきっかけになっていることである。子どもは調和のある楽しいやりとりのみならずぶつかり合いとその調節を経験することによって自他の心の理解を次第に発達させると考えられる。また楽しさの表出やぶつかり合いの情動調律にはそれぞれの家庭による違いが多く見られた。各家庭において家族の成員による相互作用のあり方の違いが各家庭に特徴的な情動調律を形作り、それが各家庭の情緒的雰囲気の違いを特徴づけている。この違いが子どもの心の理解と関係があるかについてさらに検討中である。
子宮癌及び卵巣癌におけるサイクリン依存性酵素2の活性制御機構に関する研究

103例のヒト卵巣癌の標品を用いて細胞周期関連蛋白質の発現と癌の悪性度や予後等の関連を系統的かつ網羅的に解析する試み行った。細胞周期関連蛋白質としては特にG1期ならびにG1-S変換期に関連するCDK2,CDK4,cyclin D1,cyclin E,p27,p16を選択した。それぞれに特異的な抗体により、免疫組織染色を行うと同時に、癌から抽出した蛋白質を用いてWestern blot解析を行った。さらにCDK2,CDK4についてはリン酸化酵素活性を測定した。その結果、以下のことが判明した。1.cyclin D1とp27は、良性腫瘍>境界悪性腫瘍>悪性腫瘍の順で発現量が減少していた。特にp27については悪性度との逆相関が明らかに認められた。2.CDK2及びcyclin Eに関しては、逆に良性腫瘍<境界悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量が増加していた。これは、癌細胞の異常増殖活性を反映しているものと考えられた。またCDK2リン酸化酵素活性は良性腫瘍<境界悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で高かった。3.p27は卵巣癌の悪性度の判定に有用であるとともに、予後判定にも有用であることが示唆された。卵巣癌の予後判定マーカーのしての実用性が期待できた。4.CDK4とp16との間に逆相関があることが判明した。CDK4は、良性腫瘍<境界型悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量の増加が確認された。またp16に関しては,良性腫瘍<境界型悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量の減少が確認された。5.p16のダウンレギュレーションはGrade 2,及びGrade 3においての方が、Grade 1やborderlineに比べて高頻度に起こっており、p16のダウンレギュレーションは卵巣癌の悪性化との関連が深いことが示された。以上より、G1期ならびにG1-S変換期の細胞周期関連蛋白質の発現の解析により卵巣癌の悪性度や予後を判定することが可能であることが判明した。ヒトの子宮癌及び卵巣癌のパラフィン切片を用いてCdk2,cyclin D1,cyclinE,p27に対するそれぞれ特異的な抗体により、免疫組織染色を行った。また同様の抗体により(半藤)両癌から抽出した蛋白質を用いてWestern blot解析を行った。さらにCdk2リン酸化酵素活性を[g-32P]ATPを用いて測定した。特に本年度は卵巣癌に研究の主体を置き、良性腫瘍・境界悪性腫瘍・悪性腫瘍の悪性度の違いによりこれら細胞周期関連蛋白質の発現を解析した。1. cyclin D1とp27は、良性腫瘍>境界悪性腫瘍>悪性腫瘍の順で発現量が減少していた。特にp27については、悪性度との逆相関が明らかに認められた。癌化しつつある細胞ではこの蛋白質の減少により、Cdk2酵素活性の抑制が減るため相対的にCdk2活性が上昇し、細胞周期の回転が速くなることが予想された。2. Cdk2及びcyclin Eに関しては、逆に良性腫瘍<境界悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量が増加していた。

これは、癌細胞の異常増殖活性を反映しているものと考えられた。3. Cdk2リン酸化酵素活性は予想通り、良性腫瘍<境界悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で高かった。4. p27は卵巣癌の悪性度の判定に有用であるとともに、予後判定にも有用であることが示唆された。卵巣癌の予後判定マーカーのしての実用性が期待できる。ヒト卵巣癌におけるサイクリン依存性酵素2の活性制御機構に関する研究として、本年度は以下のような結果を得た。1前年度の成果を踏まえ卵巣癌の例数を増やして、パラフィン切片を作成し、これを用いてCdk2,cyclin D1,cyclin E,p27に対してそれぞれ特異的な抗体により免疫組織染色を行った。cyclin D1とp27は、良性腫瘍>境界型悪性腫瘍>悪性腫瘍の順で発現量が減少しており統計学的に有意であった。またCdk2及びcyclin Eに関しては、良性腫瘍<境界型悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量の増加が確認され、これも統計学的に有意であった。2新鮮なヒト卵巣癌を用い蛋白質を抽出し、Western blot解析によりCdk2,cyclin D1,cyclin E,p27の各組識中の量を定量的に解析した結果、免疫染色で得られた結果が明瞭に示された。3免疫沈降法で回収したCdk2の活性を測定したところ、この活性は悪性度の高いものほど高かった。4 p27とcyclin D1の低発現およびcyclin EとCdk2の高発現が卵巣癌の悪性度と相関していることが明らかとなった。p27とcyclin D1を高発現しているものでは、比較的良い予後が認められた。p27とcyclin D1は卵巣癌の予後判定マーカーのしての実用性が期待できると判定された。以上より、p27とcyclin D1は卵巣癌の悪性化との関連が深く、Cdk2活性が相対的に高くなる結果として進行が起こることが示された。ヒト卵巣癌におけるサイクリン依存性酵素2(CDK2)の活性制御機構に関する研究として,本年度は以下のような結果を得た。1 103例の卵巣癌のパラフィン切片を用いてCdk2以外に、CDK4,cyclin D1,cyclin E,p27,p16,に対してそれぞれ特異的な抗体により免疫組織染色を行った。その結果として、CDK4とp16との間に逆相関があることが判明した。CDK4は、良性腫瘍<境界型悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量の増加が確認され統計学的に有意であった。またp16に関しては,良性腫瘍<境界型悪性腫瘍<悪性腫瘍の順で発現量の減少が確認され,これも統計学的に有意であった。2新鮮なヒト卵巣癌を用いたWestern blot解析では、p16量は悪性化と共に減少したが、CDK4の量は有意な変化がなかった。3 CDK4活性は悪性化と共に有意な増加を示した。4 p16のダウンレギュレーションはGrade2,及びGrade3においての方が、Grade1やborderlineに比べて高頻度に起こっていた。以上より、p16のダウンレギュレーションは卵巣癌の悪性化との関連が深く,その結果としてCDK4に対する抑制活性が低下するために、癌においてはCDK4活性が相対的に高くなることが示された。
抗利尿ホルモン遺伝子発現調節機構の解明

鳥類の抗利尿ホルモンであるアルギニンバソトシン(AVT)の浸透圧刺激による発現調節にTonicity-responsive Enhancer Binding Protein (TonEBP)が関与していることを明らかにした。ゲルシフトアッセイ法により、AVT遺伝子の上流にTonEBPが結合することが明らかになった。また、TonEBPの免疫陽性反応がVT陽性細胞が多いPVNとSONにおいて観察された。鳥類の浸透圧調節に、TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid)が関与することが示唆された。脳内の浸透圧受容体として、TRPファミリーのV1とV4について可能性を検討した。初めに、TRPVファミリーのアンタゴニストの脳室内投与を高浸透圧刺激の前に行い、TonEBPおよびAVTの遺伝子発現への影響を調べた。その結果、有意な変化は見られなかったが、TonEBPの遺伝子発現が浸透圧刺激のみに比べ少し減少する傾向が観察された。したがった、TRPファミリーが浸透圧受容体に何らか関係があることが示唆された。次に、TRPV1のアゴニストであるカプサイシンを脳室内に投与すると、TonEBPおよびAVTの遺伝子発現が低下することが観察された。以上の結果から、TRPV1はTonEBPの発現に抑制的に作用することから、低浸透圧の受容器と関係があるかも指令なことが、示唆された。しかしながら、今後さらにTRPV1などTRPファミリーがどのように浸透圧受容体と関係があるのか、まだ不明である。今後、TRPファミリーの脳内局在性など、検討する必要がある。鳥類のアルドステロンは、高浸透圧刺激後に増加し、腎臓におけるナトリウムチャネルの遺伝子発現を減少させることが明らかになった。このことは、従来哺乳類で考えられていた、アルドステロンとナトリウムチャネルとの関係とまったく正反対の作用であるから、今後さらにナトリウムチャネルの遺伝子発現機構を解明し、アルドステロンとの関係を明らかにする必要があることが明らかになった。ニワトリの1週齢の雄ヒヨコを用いて、3M NaCl溶液を腹腔内に投与し、高浸透圧状態にし、鳥類の抗利尿ホルモンであるアルギニンバソトシン(AVT)遺伝子発現が増加する時に、脳内での浸透圧受容器として水チャネル(アクアポリン、AQP)1が候補として可能性があるかどうか検討した。その結果、浸透圧刺激後に、視床下部におけるAQP1遺伝子発現が増加することが明らかになった。また、AQP1の脳内局在性を免疫組織化学により検討すると、commisura palliの周囲にAQP1陽性の細胞体が観察された。AQP1の遺伝子発現は、どのような機構で発現調節されているのか、また浸透圧受容器との関係についてはまだ不明であり、この点についての今後の継続した研究が必要である。ニワトリの脳内における転写因子TonEBP(tonicity-enhancer binding protein)の局在性を明らかにし、抗利尿ホルモンであるAVT(arginine vasotocin)との共存性を調べた。初めに、ニワトリのヒヨコに高浸透圧刺激(3.0M NaCl溶液)を行ない、浸透圧刺激後のTonEBPの局在性を免疫染色により調べた。その結果、TonEBPの免疫陽性反応がVT陽性細胞が多いPVN(para-ventricular nucleus)とSON(supra optic nucleus)において観察された。今後、さらにTonEBP免疫陽性反応の定量及び、AVTとの共存性を調べ、TonEBPの役割について考察する予定である。ニワトリAVT遺伝子プロモーター領域に転写因子TonEBPが、直接結合するかを明らかにするために、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた。AVT遺伝子プロモーター領域に存在するTonE(tonicity-responsive enhancer element)領域のプローブを作成し、脳から抽出した核タンパク質と結合するかを調べた結果、TonEプローブの電気泳動の位置が移動したために、TonEプローブに何らかのタンパク質が結合したと考えられた。また、TonEBP抗体をTonEプローブと反応させた後には、移動するバンドの減少が見られたことから、TonEプローブと結合したものはTonEBPであると考えられた。以上の結果から、TonEBPはAVTの転写調節に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、浸透圧受容体の候補と考えられるAQP4(aquaporin)の脳内局在性を明らかにした(Yoshimura et al., 2011)。その結果、AQP4が脳内の水分代謝調節に関与していることが示唆された。おおむね計画通りに進展しており、現時点で特に変更するような問題点はないので、当初の予定通り進める。当初の計画通りに、浸透圧刺激後のTonEBPの組織学的発現解析については、TonEBPの免疫染色を行なう条件設定が出来、定量を始める段階まで進展した。ゲルシフトアッセイ法についても、条件設定が出来、TonEBPがAVTのプロモーターに結合することが明らかになった。

今後さらに、TRPファミリーのタンパク質の脳内局在性などを明らかにし、TonEBPとの共存性など明確にし、浸透圧受容体との関係を明らかにする予定である。おおむね計画通りに進展しており、現時点で特に変更するような問題点はないので、当初の予定通り進める。24年度残額374,064円と24年度予算1,100,000円を合わせて、1,474,064円の予算となる。試薬など物品費が、874,064円、旅費(成果発表)、100,000円、人件費・謝金など500,000円の予定である。予定通り、転写因子TonEBP遺伝子発現を調節している上流の因子を検索し、浸透圧受容体の本体および脳内の情報伝達系を検索する。23年度残額776,814円と24年度予算1,300,000円を合わせて、2,076,814円の予算となる。試薬など物品費が、1,476,814円、旅費(成果発表)、100,000円、人件費・謝金など500,000円の予定である。