hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
石炭の低温可溶・流体化によるクリーン燃料への変換

石炭を灰分や硫黄分を含まないクリーンな燃料に転換することを目的とし、流通型反応器を用いて、溶剤による石炭の高温抽出について検討した。抽出溶剤としてテトラリンと石炭由来のカルボール油、,クレオソート油を用い、350°C、10MPaにおいて20種類の石炭の抽出を実施した。石炭の高温抽出により、室温でも溶剤に溶解している溶解成分、高温では溶剤に溶解するが室温では不溶の析出物、高温でも溶剤に不溶の残渣が得られた。高温で抽出される成分(溶解成分+析出物)の収率は、テトラリンを溶剤として用いた場合、瀝青炭で6580%にも達し、析出物の収率も40%程度であった。石炭由来の実溶剤であるカルボール油を溶剤に用いると、低ランク炭でも瀝青炭同様高い抽出率を得ることができたが、析出物はほとんど得られなかった。これはカルボール油中の極性物質によって溶解力が増したためと考えられた。高温抽出により得られた抽出物は、灰分量の少ないクリーンな成分であった。硫黄分に関しては、テトラリンを用いた場合は、ほとんどが残渣に残存し、硫黄分の非常に少ない抽出物が得られたが、カルボール油の場合は、硫黄分の大半が溶解成分に流れ出た。これは、カルボール油中の極性物質がパイライトと反応し、硫黄分が溶剤に溶解する成分に転換されてしまったためと考えられた。溶剤の使用量を低減するために溶剤の循環使用を試みたところ、溶剤中に含まれる溶解成分によって溶剤の溶解力が増し、抽出率が増加することがわかった。また溶剤の循環により析出物の灰分含有量が2%程度から0.2%以下まで劇的に減少させることができた。これは溶解成分に含まれる灰分により、石炭中の灰分の凝集が促進され、より多くの灰分が残澄中に残存するためと推定できた。以上のように、提案した高温抽出法は、石炭から低灰分、低硫黄分のクリーンな成分を大量に抽出する有効な方法であることを明らかにした。石炭を水分、灰分、硫黄を含まないクリーンな液体燃料に変換できれば、今後、石炭を貴重な資源として積極的に利用していくことが可能になる。この観点から、本研究では、石炭の凝集構造を溶剤と熱エネルギーで緩和させ、できるだけ穏和な条件で、石炭中の溶解抽出成分のみを大量に取り出して低温可溶・流体化を図ると同時に、ほとんど灰分、硫黄を含まないクリーン燃料への変換する方法として以下の2項目について検討した。(1)石炭のskimmingによるクリーン液体燃料の製造流通式高温抽出装置を用いて、各種溶剤中、石炭を350°C程度まで昇温し溶解液のみを抽出することを試み、瀝青炭で60-80%もの無灰、低硫黄の抽出物を得ることに成功した。特に、タール工業で精製されるカルボール油を用いた場合にその効果は顕著で、80%ものクリーンな溶解液が得られた。(2)褐炭の新規加圧脱水法の開発高含水の低品位炭を(1)の方法で抽出し高圧液体の状態で脱水するとともに溶解液を回収することを試みた。この結果、60%も水分を含む豪州褐炭を150°Cでフェノール/テトラリン混合溶剤で処理することで、液状水の状態で水分を除去でき数%の含水率まで低下させ得ることがわかった。

また、このとき、気流乾燥の場合と異なり、褐炭構造の活性は維持されたままで、350°Cにおいて80%に近い溶解液を得られることを見出した。以上の結果から、提案法は、石炭から低エネルギーでクリーンな液体燃料を製造する方法として有効であることが明らかになった。今後、以上の結果を踏まえて、溶剤の設計、抽出条件に加えて、溶解液の反応性についても検討していく予定である。石炭を水分、灰分、硫黄を含まないクリーンな液体燃料に変換できれば、今後、石炭を貴重な資源として積極的に利用していくことが可能になる。この観点から、本研究では、石炭の凝集構造を溶剤と熱エネルギーで緩和させ、できるだけ穏和な条件で、石炭中の溶解抽出成分のみを大量に取り出して低温可溶・流体化を図ると同時に、ほとんど灰分、硫黄を含まないクリーン燃料への変換する方法として以下の2項目について検討した。(1)石炭のskimmingによるクリーン液体燃料の製造流通式高温抽出装置を用いて、タール工業で精製されるカルボール油中、石炭を350°C程度まで昇温し抽出した結果、褐炭瀝青炭の幅広い炭種で60-80%もの溶解液を得ることに成功した。また、溶解液の灰分分析、を実施した結果、得られた溶解液中の灰分は0-4wt%と非常に少ないことが明らかになった。さらに、抽出時に灰分はいったん石炭粒子外へ流出し、その後、大粒径に再凝集していることが明らかになった。これは、今後、抽出残渣も灰分を含まないクリーンコールにできることを示唆している。一方、硫黄の抽出時の挙動をCAPTO法を用いて検討した結果、Pyrite、Thiophenic sulfurのほとんどが残渣に残存もしくは抽出時にSO2に反応除去されるため、溶解液は非常にクリーンな液であることがわかった。以上、本法は、事前脱灰・脱硫法としても優れていることが明らかになった。(2)褐炭の新規加圧脱水法の開発前年度、提案した新規脱水法の低温化を図った。この結果、無極性溶剤中で150°Cという低温で、60%も水分を含む豪州褐炭を150°Cでテトラリン中、処理することで、液状水の状態で水分を除去でき2%以下のの含水率まで低下させ得ることを示した。また、提案法を既往のプロセスと比較した結果、脱水率、操作条件、エネルギー消費量とも優れていることが明らかになった。少量のエネルギーの投入によって石炭を水分、灰分、硫黄を含まないクリーンな液体燃料に変換できれば、今後、石炭を貴重な資源として積極的に利用していくことが可能になる。本研究では、石炭の凝集構造を溶剤と熱エネルギーで緩和させ、できるだけ穏和な条件で石炭中の低分子量成分のみを大量に抽出すると同時に、ほとんど灰分、硫黄を含まないクリーン燃料へ変換する方法の開発を目指している。昨年度までに、以下の2つの新しい前処理法を提案した。(1)石炭のskimmimgによるクリーン液体燃料の製造(2)褐炭の溶剤置換脱水法本年度は、(1)の方法の実用化を念頭において、種々の検討を実施した。さらに、石炭溶解物の利用法の一つとして、低温度での水熱接触ガス化による水素、メタンの製造の可能性について予備的な検討を実施した。得られた成果は次の通りである。(1)抽出物を含んだ溶剤を循環使用することによってさらに抽出率を上げることができることを明らかにした。(2)抽出物の熱分解挙動とガス化反応性を測定し、テトラリン抽出で得られたSolubleから分離したヘキサン不溶-テトラリン可溶成分(TS-HI)は非常に熱分解反応性に富んでいるが、ガス化反応性は原炭よりも小さいことを明らかにした。
メラノサイト前駆細胞の培養細胞株の樹立とメラノサイト分化に関与する因子の解析

本研究により我々はマウス神経冠由来メラノサイトおよびメラノブラストを世界で初めて長期培養することに成功した。平成10年度の成果1:胎生期のメラノサイト前駆細胞であるマウス神経冠細胞をstemcell factor(SCF)とendothelin3(ET3)にて培養、継代を重ねることにより、メラノサイト及びメラノブラストを長期培養することができた。これまでに新生マウスの表皮からメラノサイト及びメラノブラストのcell lineが樹立されているが、神経冠細胞に由来するものはこれが初めてである。2:この培養細胞は分化段階の低い細胞と高い細胞が混在しているため、培養条件を変えてみた。ET3のみを培地に添加したところ、DOPA陽性の分化段階の高い細胞のみの細胞群となった。SCFのみを培地に添加した場合、DOPA陽性、陰性両者が存在したが、もとの細胞より陰性の細胞が増えた。平成11年度の成果SCFのみで培養した細胞のなかでDOPA陰性の細胞は多角形であったため、その形状の細胞をコロニー分離を2回繰り返し純化したところ、全てDOPA陰性の細胞群が得られた。この細胞はSCFのかわりに12-o-tetradecanoyl-13-acetate(TPA)とcholera toxinを培養液に添加すると,DOPA陽性のメラノサイトに分化することを確認できたことから,この細胞は成熟メラノサイトに分化する能力を持ったメラノサイト前駆細胞であることがわかった。現在、当教室の研究者により、この細胞群の1個の細胞由来のcell lineが確立されつつある。このcell lineはメラノサイトの分化及び色素産生の研究に非常に有用な手段となると期待される。現在、当教室において、胎仔マウス神経冠細胞由来の培養メラノサイトを長期維持している。この細胞は、c-KIT、チロジナーゼおよびその関連蛋白を保有し、ドーパ陽性であるが、メラニン沈着はない。またこの細胞はstem cell factor(SCF)とendothelin-3(ET-3)に依存性でどちらが欠けても増殖が停止する。本年度の研究では、1)樹立した神経冠細胞培養株の長期維持およびこの細胞が胎生期メラノサイトの特徴を継続して保持するか確認を定期的に行い、1; C-KIT,TRP-1,TRP-2,チロジナーゼが継続して発現していることを免疫染色により確認した。2;FACS解析によりc-KIT,TRP-1,TRP-2,チロジナーゼ陽性細胞の割合は、それぞれ98%、67%、46%、60%であった。異なった分化段階の細胞が混在している可能性が考えられる。3;チロジナーゼ活性を継続して保持していることをDOPA反応により確認した。4;電子顕微鏡により、ステージlと思われるメラノソームのが殆どであった。2) SCFおよびET-3に対する依存性の確認。1; Alamr blue法にてこの細胞の増殖率の比較を行った結果、基本培地のみ(15%FCS添加E-MEM培地)で培養した場合は全く増加しなかったのに対し、SCF+ET-3では経時的に増加した。SCFあるいはET-3の場合もSCF+ET-3より少ないが、増殖が認められた。SCFとET-3の両者に生存を依存する細胞とSCFあるいはET-3単独で生存可能な細胞が混在すると考えられる。2; SCF+ET-3で培養し、コンフルーエントに達した時点でSCFとET-3を除去し、Apop Tag^<TM>キットを用いて核の断片化を検討した結果、経時的にApop Tag^<TM>陽性細胞が増加したため、SCFとET-3非存在下ではこの細胞はアポトーシスに陥いることが示唆された。

以上の結果からこの培養細胞は分化段階の異なった細胞が混在していることが明かとなったため、一定の分化段階の細胞集団が得られるか培養条件をSCFあるいはET3単独に変更し、検討中である。前年度の本研究において、胎生期のメラノサイト前駆細胞であるマウス神経冠細胞をstem cell factor(SCF)とendothelin3(ET3)にて培養、継代を重ねることにより、メラノサイト及びメラノプラストを長期培養することができた。これまでに新生マウスの表皮からメラノサイト及びメラノプラストのcell lineが樹立されているが、神経冠細胞に由来するものはこれが初めてである。平成11年度の成果この培養細胞は分化段階の低い細胞と高い細胞が混在しているため、培養条件を変えてみた。ET3のみを培地に添加したところ、DOPA養成の分化段階の高い細胞のみの細胞群となった。SCFのみを培地に添加した場合、DOPA陽性、陰性両者が存在したが、もとの細胞より陰性の細胞が増えた。SCFのみで培養した細胞のなかでDOPA陰性の細胞は多角形であったため、その形状の細胞をコロニー分離を2回繰り返し純化したところ、全てDOPA陰性の細胞群が得られた。この細胞はSCFのかわりに12-oーtetradecanoyl-13-acetate(TPA)とcholera toxinを培養液に添加すると、DOPA陽性のメラノサイトに分化することを確認できたことから、この細胞は成熟メラノサイトに分化する能力を持ったメラノサイト前駆細胞であることがわかった。現在、当教室の研究者により、この細胞群の1個の細胞由来のcell lineが確立されつつある。このcell lineはメラノサイトの分化及び色素産生の研究に非常に有用な手段となると期待される。
バイオフィルム形成能を高度に維持するアクチノマイセス菌株のゲノム解読と変異解析

口腔細菌Actinomycesのバイオフィルム形成機構の解明を目指し,バイオフィルム形成能を高度に維持しているK20株,MG-1株のゲノム解析と遺伝学的解析を行った.K20株のゲノムを解読し,得られたゲノムデータを公共データベースにアップした(DDBJ,BABV01000001-BABV01000771).また,変異解析によりバイオフィルム関連遺伝子をいくつか同定し発表するに至っている.Actinomyces orisのバイオフィルム形成機構の解明を目指し,バイオフィルム形成能を高度に維持しているK20株,MG-1株を供試菌として用い,次の2つの実験系列を並行して実施した.1つ目は,既にドラフト情報が得られているK20株ゲノムの解読である.その高いGC含量のため完全解読には至らなかったが,コンティグ配列の連結を進め,得られたゲノムデータを公共データベースにアップするに至っている(DDBJ, BABV01000001-BABV01000771).また,得られたゲノム情報を既知のMG-1ゲノム情報とin silico解析で比較し,バイオフィルム形成に関わる遺伝子や発現制御系をいくつか同定し発表した.2つ目は,トランスポゾンを用いた変異導入によるバイオフィルム欠損株の単離とその原因遺伝子の同定である.MG-1株において40株のバイオフィルム欠損株を得ており,そのうち12株においてトランスポゾン挿入部位の決定に至っている.本研究課題の遂行により,初期付着細菌であるActinomyces属細菌のバイオフィルム形成に関わる重要な遺伝子候補がいくつか同定されてきた.本研究課題をさらに進めることで,この細菌種のゲノムレベルでの分子解剖を可能にし,口腔プラークの初期形成段階の機構の解明にも大きなインパクトを与えるものと確信している.そして,本研究課題で明らかになったバイオフィルム関連遺伝子の機能発現の全容を明らかにし,これを阻止することによってバイオフィルム形成を制御する方法の開発につながるものと考えている.口腔細菌Actinomycesのバイオフィルム形成機構の解明を目指し,バイオフィルム形成能を高度に維持しているK20株,MG-1株のゲノム解析と遺伝学的解析を行った.K20株のゲノムを解読し,得られたゲノムデータを公共データベースにアップした(DDBJ,BABV01000001-BABV01000771).また,変異解析によりバイオフィルム関連遺伝子をいくつか同定し発表するに至っている.Actinomyces orisのバイオフィルム形成機構の解明を目指し,高度にバイオフィルム形成能を維持しているK20株,MG-1株を供試菌として用い,次の2つの実験系列を並行して遂行している.1つ目は,既にドラフト情報が得られているK20株ゲノムの解読である.まだ完全解読には至ってはいないが,現在コンティグ配列をサンガー法を用いて順次連結している途中である.また,得られたゲノム情報を既知のMG-1ゲノム情報とin silico解析で比較し,バイオフィルム形成に関わる遺伝子や発現制御系の同定を試みている.2つ目は,トランスポゾンを用いた変異導入によるバイオフィルム欠損株の単離とその原因遺伝子の同定である.MG-1株において12株のバイオフィルム欠損株を得ており,そのうち3株においてトランスポゾン挿入部位の決定に至っている.本研究課題の遂行により,初期付着細菌であるActinomyces属細菌のバイオフィルム形成に関わる重要な遺伝子候補がいくつか同定されてきた.本研究課題をさらに進めることで,この細菌種のゲノムレベルでの分子解剖を可能にし,口腔プラークの初期形成段階の機構の解明にも大きなインパクトを与えるものと確信している.そして,本研究課題で明らかになったバイオフィルム関連遺伝子の機能発現の全容を明らかにし,これを阻止することによってバイオフィルム形成を制御する方法の開発につながるものと考えている.pyrosequence法により既に得られているA. oris K20株の約1,300のコンティグ配列をサンガー法を用いて連結している.また,トランスポゾン挿入によるバイオフィルム欠損株の単離については,MG-1株において12株のバイオフィルム欠損株を得ており,そのうち3株においてトランスポゾン挿入部位の決定に至っている.これらは当初予定していた平成23年度の研究計画のとおりであり,研究計画は概ね順調であると認識している.基本的には,当初の計画通り「3.バイオフィルム形成に関わる遺伝子群の同定」,「4. K20株とMG-1株ゲノムを用いたバイオインフォマティクス解析」,「5.相同組換えによるバイオフィルム欠損株の作成」について実験を進めていく予定である.この中で,「5」については計画ではgalK遺伝子をカウンターマーカーとして用いる計画にしているが,これに加えて新規にmCherryをカウンターマーカーとする系も構築する予定である.次年度における研究経費は,大きく1)細菌培養に関わる費用,2)分子生物学的解析に関わる経費である.具体的には,1)細菌の分離・培養に関連する器具および培地の費用,培養装置維持費など,2)トランスポゾン・PCR・RT-PCR・プライマー合成・制限酵素・ベクター・シークエンスなどの費用が含まれる.その他は成果発表のための経費である.また,平成23年度は科研費支給の決定が遅かったため,研究費の一部を平成24年度に繰り越しているが,繰り越した研究費を効率的に実験を実施する為の消耗品購入に充てる予定にしている.
時間分解全反射蛍光法による液/液界面の微視的構造に関する研究:界面電位依存性

時間分解全反射蛍光法を用い、界面吸着した蛍光プローブ分子の回転自由度を測定することにより、プローブ分子の周りの局所的な溶媒構造(10Å)、つまり界面の厚さに関する情報を得ることが出来る。また、界面吸着分子間での励起エネルギー移動消光ダイナミクスの解析からは、比較的広範囲(70Å)での、油/水界面の空間的な乱れを評価することが可能である。これら二つの実験的手法を、水/シクロヘキサン、水/四塩化炭素、水/トルエン、水/クロロベンゼン、水/ジクロロベンゼン、水/ジクロエタンの六種類の油/水界面に適応し、界面の微視的構造に関する系統的な比較検討を行った。分子回転自由度、励起エネルギー移動次元ともに、界面張力(界面自由エネルギー)及び、溶媒間の溶解度との間に相関があることを見出した。つまり、油/水界面の微視的構造は、水分子と油分子の親和性に依存することを実験的に明かにした。更に、界面の微視的構造が界面分子認識にどのように影響するのかを明らかにすることを目的とし、油/水界面における水素結合を介した分子認識系を構築した。リボフラビンを水相に溶解し、その人工レセプターである2,4-ジアミノトリアジン誘導体を有機相に溶解し、時間分解全反射蛍光法を用いて界面で形成する分子認識錯体を直接観測する事に成功した。今後、界面張力測定などの定量的な議論を併せて行っていく事で、界面における水素結合相互作用の特異性と界面微視的構造の関係を明かとし得るものと確信する。以上のように、時間分解全反射蛍光法を駆使した系統的な研究を行うことにより、これまで分子動力学計算によってのみ予想されてきた液/液界面の分子レベルでの構造、及び、界面の微視的構造に影響を与える因子に関して、始めて実験的な検証を示すことが出来た。これら二つの実験的手法を用いることにより、水/四塩化炭素界面は分子レベルでシャープな界面(<10Å)が、比較的広範囲(70Å)に平らな界面を形成していることが分かった。一方、水/ジクロロエタン界面は、厚さ10Åの界面が70Åの空間範囲において揺らいでいる事が分かった。また同様の測定を、水/シクロヘキサン、水/四塩化炭素、水/トルエン、水/クロロベンゼン、水/ジクロロベンゼン、水/ジクロエタンの六種類の油/水界面に適応し、界面の微視的構造に関する系統的な比較検討を行った。このことは、油/水界面の微視的構造が、水分子と油分子の親和性に依存することを示している。このような時間分解全反射蛍光法を駆使した系統的な研究を行うことにより、これまで分子動力学計算によってのみ予想されてきた液/液界面の分子レベルでの構造、及び、界面の微視的構造に影響を与える因子に関して、始めて実験的な検証を示すことが出来た。
２０世紀初頭の中国における知の形成とナショナリズムー周作人と民俗学

本研究は、西洋近代の学問方法を受容することによって、中国の民俗のあり方を究明しようとした中国知識人・周作人の学問的営為を分析対象とした。西洋近代の学問に通じ、かつ知日家だった周作人が創出した中国民俗学を検討することは、ひいては、西洋・日本・中国における近代学問の伝播のあり方や系譜を明らかにすることを可能にした。具体的には、周作人の民俗学研究の源泉に関する検討(A.ラング、フレイザー、柳田国男、柳宗悦)を通じて、20世紀初頭の中国における知の形成を、ナショナリズムとの関係から考察し、一定の成果を得た。周作人が創出した中国民俗学は、folklore(英)、Volkskunde(独)、柳田国男(日)の影が色濃い。彼が西洋の学術思想全般を広く摂取し、同時に柳田の著作に接したのは、日本留学期(1906-1911)に遡る。特に、イギリスを中心とするヨーロッパで19世紀末に盛んになった人類学へ傾倒することで、民族、宗教、風俗、性学への理解を深めており、中でもJ.G.フレイザーへの評価が高い。周作人はフレイザーの代表的著作(『金枝篇』、『サイキスタスク』等)を受容することで、「野蛮人」に対する理解を、国民性批判へと応用する(1920年代)。その一方で、原始宗教が生成される根源ともいえる死者に対する恐怖、タブーといったものへ共感を寄せながら、中国の死後の世界観(「鬼」)を語り始める。その語り方や手法が、フレイザーのそれと非常に近似している点から、中国人の「真心」(「鬼」)を知る術として、フレイザーの研究手法と文章スタイルが応用されたことがわかる。周作人における民俗学とは、資料的価値そのもの(「無用の用」)であり、独立した学問として成立することに懐疑的立場を取るものだった。そこでは知的暴力の介在を避けたいという強い意志が読み取れ、西洋近代の価値観を受容し、相対化することで、自国の民俗に対する視座を獲得していたと考えられる。以上、周作人の民俗学形成の思想的源泉の一端を整理したことにより、中国民俗学創出との関係を探る為の準備作業を一つ終えたことになる。中国学術史における民俗学の思想史的意義を検討していく作業は継続するが、周作人の民俗学とは何かを検討しながら、周作人というケーススタディーを通して、中国への西洋学問伝播の形態を解明していくことの重要性が再認識されることとなった。本研究課題の二年目にあたる2015年度においては、主として周作人と日本民俗学の関係に焦点を絞って研究を進めてきた。具体的には周作人が注目した、ないしは受容し(かつ拒絶し)た、柳田国男民俗学および、彼の強い影響下にあった江間修・三枝子夫妻の活動に関して調査検討することによって、柳田国男の郷土研究から、『ひだびと』(戦時下)、約10年継続された地方民俗誌。柳田ら中央から高い評価を得たもの)の受容のあり方を検討した。上記の作業を通じて、『ひだびと』は、飛騨高山という地方(柳田のいう郷土)が舞台であった点で、柳田国男の郷土研究を実証的に行う場として機能する側面がった。主催者の江間夫妻が、直接間接に柳田の強い影響下にあったこともそれを後押しした。そうした『ひだびと』に、日本の民俗を好んだ周作人もまた好意を寄せた。周作人が柳田民俗学の郷土観念に対して、反発する部分を持ちながらも評価していた理由でもある。『ひだびと』は戦局の悪化に伴い停刊を余儀なくされるが、ちょうどその頃、周作人と柳田国男が直接会見する可能性があった(1943年)点も興味深い。日本研究屋をたたむことを公言して占領下北京に留まることを決意しながらも、日本民俗学と向き合い続けた周作人の思考法は、様々な評価を得てきた。だが、『ひだびと』に集った柳田民俗学門下の活動との接点から、全体主義体制が確立するのを目の当たりにしつつ、それへの「抵抗」という顕在的行為は示さずとも、より深い意識の中でそれに一体化しない工夫が、周作人の民俗学研究の中に見出すことが可能ではないかという結論に達した。その成果の一部は、「周作人の郷土をめぐる葛藤ー柳田国男『郷土研究』と江馬修の『ひだびと』」(土田哲夫編著『近現代東アジアの文化と政治』中央大学政策文化総合研究所研究叢書19所収、2015)と題して公表済みである。研究二年目に行う予定であった周作人民俗学と柳田民俗学の学術的発想のあり方、研究手法の特徴や形成過程、両者の学術的な影響関係、戦争と民俗学の問題は、一定の成果を得、その一部はすでに公表済みであることから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。また具体的テーマとして取り上げた『ひだびと』(戦時下の地方民俗誌)関連資料を調査する為、実際飛騨高山へ行く予定にしていたが、幸い国立国会図書館デジタルライブラリーで『ひだびと』が公表されており、関連資料も容易に入手が可能であったため、調査旅行を取りやめその分の費用を、図書購入に回すことでより実証的な研究が可能になった。最終年度は、一年目(周作人と人類学周辺:フレイザー)、二年目(周作人と日本民俗学:柳田国男「郷土研究」と江馬修『ひだびと』)の研究成果を踏まえ、周作人と日本民俗学との重要な関連性を補足する意味で、周作人と柳宗悦(日本民藝運動)に関して集中的な検討を行ってきた。

柳宗悦(1889-61年)とは、周作人が柳田国男と並び称する形で自身の民俗学形成に際して敬意を以て接したという記述を残す人物である。『白樺』同人であり宗教哲学者にして日本民藝運動の創始者であることはよく知られる。朝鮮の民藝美に強く魅せられた柳宗悦の、朝鮮人に対する日本の軍国主義に抗議した姿勢は、日本の人情美に魅せられ、日本文化に並々ならぬ関心を寄せた周作人にとって、相応の意味を有したと推測される。とりわけ、柳宗悦の民藝運動が周作人の民俗学形成に与えた意味は大きく、その意味を考察することは、ひいては日本占領下で日本と決別しながらも、例外的に日本の民俗だけは語りえたことの真意を探ることを可能にする。以上の問題関心に基づき、必要な貴重資料の収集購入(雑誌『民藝』ほか)、テクストの集中的精読を経て、考察した。その成果を、中国文芸研究会に学会誌『野草』に投稿し、査読を経て掲載の運びとなった。その後、同学会の書評の会で取り上げられ、論文評を得、今後の課題が明確になった(関西で開催された。申請者も参加予定であったが校務を優先せざるを得ず、スカイプで参加した)上記の仕事と並行して、申請者が作成中であった「周作人・民俗学関連書講読年表1912-1934(未定稿)」が一応の完成をみた。以上の三年間の研究から、中国民俗学の形成を通じて、周作人が20世紀に初頭に掲げた「知」のあり方の、学術的意味の一端を証明することが可能となり、今後、総括していく予定でいる。本研究は、西洋近代の学問方法を受容することによって、中国の民俗のあり方を究明しようとした中国知識人・周作人の学問的営為を分析対象とした。西洋近代の学問に通じ、かつ知日家だった周作人が創出した中国民俗学を検討することは、ひいては、西洋・日本・中国における近代学問の伝播のあり方や系譜を明らかにすることを可能にした。具体的には、周作人の民俗学研究の源泉に関する検討(A.ラング、フレイザー、柳田国男、柳宗悦)を通じて、20世紀初頭の中国における知の形成を、ナショナリズムとの関係から考察し、一定の成果を得た。一年目に予定していた「周作人と人類学周辺」(西洋民俗学と中国民俗学)というテーマにそくして、とりわけ周作人の民俗学形成の重要な源泉であったフレイザーとの思想的接点をおよそ整理し終えた。併せて周作人の人類学受容のあり方をたどることで、20世紀初頭の中国における西洋近代学問の伝播形態を探る端緒を得たといえる。なおフレイザー以外にも周作人が吸収した知的養分として、H.エリスや、A.ラング等との関係性をより詳細に分析するという検討課題は残されているものの、二年目に予定している「周作人と日本民俗学」(日本民俗学と中国民俗学)というテーマへ進めていくことが可能となった。2016年度は本研究の総括にあたる年になる為、一、二年目の研究成果を基に、周作人自身のテクストの精読と関連資料の調査に重点を置くことになる。その前に、二年目でやり残した周作人と日本民俗学の関係のうち、柳宗悦の日本民藝運動との関係を検討しておく必要を感じており、先に取り組む予定である(必要資料はすでに購入済みである)。さらに研究と並行して作成してきた、「周作人、民俗学関連講読年表」を完成させる予定でいる。近年、周作人のテクストの整理刊行が進み、より体系的に彼の膨大な仕事を検討することが可能になった。同じく、中国民俗学関連資料のうち、未整理なものを整理し体系化することは、ひいては、周作人の中国民俗学創出(近代言説)のあり方を、歴史的、思想史的に位置づけ、その意義を探る手掛かりになることと思われる。
真性粘菌変形体の結合振動子力学系としての自己組織化過程と機能

粘菌変形体細胞内を枝状に広がっているゲルの主構成物質であるアクチンフィラメント繊維束が細胞内にあるミオシン分子と相互作用しゲル糸の弛緩-収縮を起こしている。このアクチンフィラメント分子の構造異方性による透過光を利用し,高感度位相差顕微鏡システムによるゲル糸の弛緩-収縮をアクチンフィラメントの挙動として観測した。平面状に広がっている粘菌細胞内のゲル糸の協同的振舞いを高感度ビデオカメラを使い,その画像データをデーターレコーダーに記録し,後に再生してコンピュータに取り込,画像処理を行い粘菌変形体の挙動を調べた。そして以下のような解析を行ない成果を上げた。1.一つのゲル糸の振動子としての性質粘菌変形体から5mm程度の長さのゲル糸を切り出し,これに張力負荷(1mg10mg)を過渡的に加えた時のゲル糸長の応答を調べ,その波形,振幅,周期等を解析し非線形振動子としての性質に関する知見を得た。2.結合振動子系の協同的挙動と機能数cmφ程に拡がった粘菌変形体を上記システムで観測した。外部から種々の刺激(ステップ及びパルス的温度変化,化学物質等)を局部的に与えると,変形体は刺激部から逃避或いは接近という個体運動をするが、この時変形体内に分布しているゲル糸の挙動を100×100のメッシュに分け,各場所での収縮-弛緩の時系列データを調べ,結合振動子系としてのダイナミクス関しする結果を得、現在解析中である。
リスポンシブ通信プロトコルの品質評価に関する研究

情報通信システムの大規模化,高度化に伴い,信頼性と性能の両面で最適化された情報通信サービスの提供が要求されている.このようなサービスを提供するシステムはリスポンシブシステムと呼ばれ,そのリスポンシブネスは,システムに故障が起こっても要求された情報通信サービスを指定された時間内に終了できる確率として定義される.これらの確率はタスクスケジューリング,システムアーキテクチャなどに依存するため,リスポンシブネスを一般的に求めることは困難である.本研究では,通信プロトコルに対象を絞ってこれらの確率を求め,通信プロトコルのリスポンシブネスを評価する方法について検討した.通信プロトコルにおける故障の原因には,ハードウェアの故障,ソフトウェアのバグ,通信路の不良などが考えられる.これらの回復可能なものと不可能なものに分けた.回復可能なものに対しては,回復処理時間を割り当てた.通信プロトコル上で実行可能な各遷移に対する故障の確率と,各状態から出ている遷移に分岐する確率が与えられていると仮定して,通信プロトコルのリスポンシブネスを評価する方法を提案した.具体的には,通信プロトコルに故障が起こっても遷移の実行を継続できるという仮定のもとに,性能を表す確率と信頼性を表す確率の関数としてリスポンシブネスは計算される.通信プロトコルの最終状態に時間内に到達できる確率と,通信プロトコルに故障が起こっても遷移の実行を継続できる確率を個別に求め,状態遷移系列が木状である通信プロトコルのリスポンシブネスを評価した.情報通信システムの大規模化,高度化に伴い,信頼性と性能の両面で最適化された情報通信サービスの提供が要求されている.このようなサービスを提供するシステムはリスポンシブシステムと呼ばれ,そのリスポンシブネスは,システムに故障が起こっても要求された情報通信サービスを指定された時間内に終了できる確率として定義される.これらの確率はタスクスケジューリング,システムアーキテクチャなどに依存するため,リスポンシブネスを一般的に求めることは困難である.本研究では,通信プロトコルに対象を絞ってこれらの確率を求め,通信プロトコルのリスポンシブネスを評価する方法について検討した.通信プロトコルにおける故障の原因には,ハードウェアの故障,ソフトウェアのバグ,通信路の不良などが考えられる.これらの回復可能なものと不可能なものに分けた.回復可能なものに対しては,回復処理時間を割り当てた.通信プロトコル上で実行可能な各遷移に対する故障の確率と,各状態から出ている遷移に分岐する確率が与えられていると仮定して,通信プロトコルのリスポンシブネスを評価する方法を提案した.具体的には,通信プロトコルに故障が起こっても遷移の実行を継続できるという仮定のもとに,性能を表す確率と信頼性を表す確率の関数としてリスポンシブネスは計算される.通信プロトコルの最終状態に時間内に到達できる確率と,通信プロトコルに故障が起こっても遷移の実行を継続できる確率を個別に求め,状態遷移系列が木状である通信プロトコルのリスポンシブネスを評価した.
食道癌における宿主免疫回避の分子機序の解明

難治性癌である食道癌の治療として、従来の手術、化学療法、放射線療法の3大療法の枠を超える、画期的な第4の治療法として免疫療法が注目されている。癌細胞は細胞表面にB7-H1などの抑制性共刺激因子のリガンドを発現することにより、癌細胞反応性に浸潤した免疫細胞の活性を抑制することが報告されている(Yang L, etal.Trends Immunol 2010)。近年、補助刺激シグナルは、代表的なCD28/B7-1/2以外にも複数の補助刺激シグナル経路が存在し、T細胞の免疫応答をより複雑に制御していることが明らかになりつつある(Zou W, Nat Rev Immunol 2008)。本研究では、免疫チェックポイント分子であるB7 superfamilyを実際の食道扁平上皮癌患者において評価し、局所および全身の炎症反応との関連を検討することにより、治療標的分子としての意義を確立することを目的としている。術前無治療で根治手術を施行された食道扁平上皮癌90例を対象とし、抗PD-L1抗体および抗HLA-class I抗体を用いた免疫組織科学染色を施行した。PD-L1蛋白高発現例ではより壁深達度が深く、リンパ節転移陽性率が有意に高率であった。術後全生存期間において、PD-L1蛋白高発現群では低発現群に比較して有意に予後不良であった。術後再発形式に注目したところ、PD-L1発現例ではリンパ節、局所、播種再発が有意に高頻度に観察された。今後は他のB7 superfamilyについても検討を拡大する方針である。26年度が最終年度であるため、記入しない。
独自新規法を用いた遺伝子発現に基づくデジタル脳図譜作成とその解析

独自の3次元遺伝子発現分布地図作成法(トランスクリプトーム・トモグラフィー:TT法)を高精度化し、脳を俯瞰する形での網羅的発現情報を発達期マウスで経時的(生後3日、7日、3週、8週)に測定した。これを、共発現等のバイオインフォマティクス解析とMRI等の画像情報処理を融合したアトラスインフォマティクスという新手法で捉え、神経科学基盤となる遺伝子発現データベース(ViBrism DB)を構築した。独自に開発したTranscriptome Tomography(TT法:対象に発現する全ての遺伝子の分布を、解剖学的仮想3次元ex vivo空間で測定する方法)を高精度化し、発達期マウス脳で経時的な発現情報を詳細に測定・データベース化し、脳が恒常性を維持しながら形態を変え・機能を獲得する仕組みを、遺伝子共発現解析などのインフォマティクス手法と脳形態・組織情報を融合して解析するアトラスインフォマティクスという新手法で捉える目的で、1年目の研究を行った。1.発達期のマウス脳(生後3日、7日)で、画像解像度50ミクロン、遺伝子発現解像度は各500、1000ミクロンの発現地図を作成するため、マイクロアレーを用いて、発現測定を行った。(1)想定通り、500ミクロンの解像度で検体採取ができ、従来法では不可能な小検体を用いて俯瞰的で詳細な網羅解析が可能となった。(2)研究予算額のため2点での測定となった。生後3日脳での発現マップを500ミクロン解像度で詳細に作成し、7日脳については成体と同じ1,000ミクロンとして、他研究費での、生後35日、56日脳測定結果と合わせて、計4点で経時的に比較する事とした。(3)TT法で得られる脳内部の解剖学的形状も位置合わせ情報として用いる方法を、確立した。当初予定より高度な最新画像処理プログラム(非線形変換を画像全体に対して行い、二つの画像情報の差を最小にする)を用いて実行する事が出来た。(4)既知遺伝子について空間解像度・推定精度を検証した。2.発現データベースの相互利用を可能にするシステム作成のため、遺伝子発現画像とMRI画像との位置合わせ法を最新の非線形変換を用いて検討した。3.共発現ネットワーク解析によって発現類似性を相関係数を指標に表示し、形態情報と合わせて解析するアトラスインフォマティクス手法をまとめ、論文投稿した。独自に開発した遺伝子発現3次元地図作成法(トランスクリプトーム・トモグラフィー:TT法)を高精度化し、可塑性の高い発達期マウス脳で経時的な発現情報を詳細に測定・データベース化し、脳が恒常性を維持しながら形態を変え・機能を獲得する仕組みを、遺伝子共発現解析などのインフォマティクス手法と脳形態・組織情報を融合して解析するアトラスインフォマティクスという新手法で捉え、神経科学の基盤となる、ウェブ上で双方向に利用可能な遺伝子発現脳図譜の構築をめざして研究を行った。TT法を使って、C57BL/6Jマウスの発達期脳での網羅的遺伝子発現情報を13年度2時点、14年度に新たに1時点、合計生後3日、7日、3週で取得し、既に3次元地図化した8週と合わせ4点での発現情報データを得た。其々の脳について、MRI画像(T1, T2強調)も取得した。TT法で作成した3次元遺伝子発現データとMRI画像やこれを基にして作成した脳解剖領域地図を同一空間上に位置合わせする方法を確立し、相互に比較できるWEBシステムの構築した。更に、TT法で得られる発現情報を用いた共発現解析を行い結果をネットワーク図として表示し、これを遺伝子発現地図情報と統合して解析できる手法を開発した。これらの手法について、Scientific Reportに論文を発表した。国際ニューロインフォマティクス統合機構(INCF)で共同研究を行い、8週マウスについては国際標準脳空間WHSでの解析が可能となった。更に発達期では、本研究での画像を標準空間として用いるシステムを作成した。これによって、発達段階を通じて遺伝子発現パターンをMRI画像の解剖学的位置に照らして解析できるようになった。更に、遺伝子共発現ネットワーク構造の発達過程での遺伝子発現の安定性と、脳機能部位形成過程での変容を示す解析結果を得たので、成果論文を作成している。複合領域予定通り、遺伝子発現測定を終了した。解剖画像を含めた共発現ネットワーク解析法を確立して、論文の形にまとめて投稿した。発現地図作成について、当初予定より高度の方法論を導入できた。これら2点は当初の予定以上に進展している。高度の発現地図作成方法論導入後の評価に時間を要したので、発現地図作成がやや遅れているが、より精度の高い発現地図が得られるメドが立ち、全体として概ね順調に進んでいる。現在進行中の発現地図作成を速やかに完成する。遺伝子発現を基準にした脳領域図譜、3次元共発現ネットワーク図の2つを、4時点(新規2+既得2)について作成し、WHS標準脳空間にアップロードする。この空間にある全ての情報を活用するアトラスインフォマティクの手法を使って、発達期の遺伝子発現の恒常性と変容を、解剖学的分布とネットワーク構造の両面から解析する。

結果について、論文化し、その後発現図譜作成・解析法も含めて発現地図を公開して、双方向性を持ったWEB上の標準脳空間の枠組みを広く提示する。測定点をもう1点追加するには、総予算額は75万円程度不足で、新規測定が2点になった。マウス購入も2測定点分となった。また遺伝子発現測定の全処理について、研究所内のリソースを活用できた。残額はH26年度分と合わせて、発現測定の再検など、解析に必要なデータの作成に用いる。
悪性胸膜中皮腫に対する特異的免疫療法の構築

悪性胸膜中皮腫に対する新規治療法として特異的免疫療法を確立することを目的とした。悪性胸膜中皮腫2症例より腫瘍細胞株(L324MSO、K921MSO)を樹立した。L324MSO症例では自己腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球(CTLクローン)を誘導し、cDNA発現スクリーニング法によりCTLに認識される新規腫瘍抗原を試みている。次に腫瘍浸潤Bリンパ球の産生する抗体を用いたSEREX法により、新規腫瘍抗原であるGene-XとThrombospondin 2(THBS-2)を同定した。Gene X、THBS-2に対する抗体価を、悪性胸膜中皮腫患者と非悪性疾患患者を対象にELISA法で評価したところ、THBS-2において中皮腫患者で陽性率が72.2%であったが、非悪性疾患患者では4.5%であった。THBS-2に対する抗体価は、胸膜中皮腫に対する新たなバイオマーカーとしての可能性が示唆された悪性胸膜中皮腫に対する新規治療法として特異的免疫療法を確立することを目的とした。THBS-2に対する抗体価は、胸膜中皮腫に対する新たなバイオマーカーとしての可能性が示唆された本研究は悪性胸膜中皮腫患者生体内における抗腫瘍免疫応答を細胞性・液性免疫両面から解析し新規腫瘍抗原を同定してその機能や発現、抗腫瘍活性を確認することにより、予後不良で今後症例数の増加が予想される悪性胸膜中皮腫に対する新規治療法として特異的免疫療法を確立することを目的とする。本研究を遂行するため、これまでに悪性胸膜中皮腫2症例(L324症例、K921症例)より腫瘍細胞株(L324MSO、K921MSO)を樹立し、自己リンパ球を分離保存している。細胞性免疫側からのアプローチとして、K921症例では自己腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)をすでに誘導し、さらにCTLクローンを樹立中である。またL324症例では現在CTLを誘導中である。さらに新たに悪性胸膜中皮腫N407症例からも腫瘍細胞株N407MSOを樹立し自己リンパ球を分離保存できたため、こちらもCTLを誘導中である。CTLクローンが樹立でき次第、cDNA発現スクリーニング法によりCTLに認識される新規腫瘍抗原を同定する。一方、これら3症例では腫瘍組織-悪性胸膜中皮腫組織を移植したSCIDマウス血清のセットも所有している。液性免疫側からのアプローチとして、当科で考案したmodified SEREX法(プローべ:SCIDマウス血清中ヒト型IgG、cDNAファージライブラリー:腫瘍細胞株mRNAより作成)により、抗体に認識される新規腫瘍抗原を同定する。これまでに3症例全てでSCIDマウス血清中のヒト型IgGを測定しプローべとなりうることを確認し、またcDNAファージライブラリーを作成するために腫瘍細胞株のペレット作成を終了している。cDNAファージライブラリー作成後、modified SEREX法で新規腫瘍抗原を同定し抗腫瘍活性の確認および発現・機能解析を行うことで、特異的免疫療法の標的となりうる抗原を選定する。本研究は悪性胸膜中皮腫患者生体内における抗腫瘍免疫応答を細胞性・液性免疫両面からアプローチして新規腫瘍抗原を同定し、その機能や発現、抗腫瘍活性を解析することにより、悪性胸膜中皮腫に対する新たな診断・治療法を確立することを目的とする。本研究を遂行するため、これまでに悪性胸膜中皮腫3症例(L324症例、K921症例、N407症例)より各々腫瘍細胞株を樹立し、自己リンパ球の分離保存を行ってきた。細胞性免疫側からのアプローチとして、自己腫瘍-リンパ球混合培養により、自己腫瘍細胞障害性Tリンパ球(CTL)を誘導している。CTLクローン樹立と腫瘍由来cDNAプラスミドライブラリー作成を進めている。一方、液性免疫側からのアプローチとして、当科で考案したmodified SEREX法(プローベ:SCIDマウス血清中ヒト型IgG、cDNAファージライブラリー:腫瘍細胞株mRNAより作成)により、抗体に認識される新規腫瘍抗原としてこれまでに4種類(Gene-X,THBS-2,STUB-1,IFT-88)を同定した。このうちGene-XとTHBS-2は定量的RT-PCRにより、正常組織に比べ腫瘍組織で過剰発現していた。Gene X、Thrombospondin 2に対する抗体価を、50例の悪性胸膜中皮腫患者と健常者を対象にELISA法で測定した。健常者で定義したカットオフ値をこえるものを陽性として判定したところ、Gene-Xの陽性率は中皮腫患者で50例中23例(46%)、健常者は0%であった。THBS-2は中皮腫患者50例中42例が陽性で陽性率が84%、健常者では25例中2例で8%であった。

これら二つの抗原に対する陽性率と臨床因子(性別、組織型、病期)とに有意な相関は認めなかった。Gene-XとTHBS-2に対する抗体価は、新たなバイオマーカーとしての可能性が示唆された。これまでに、腫瘍浸潤リンパ球に由来する抗体に認識される腫瘍抗原4種類(Gene-X,THBS-2,STUB-1,IFT-88)を同定した。このうちGene X、Thrombospondin 2に対する抗体価を、97例の悪性胸膜中皮腫患者と22例の非悪性疾患患者(胸膜炎、胸膜プラーク)を対象にELISA法で測定した。健常者(27名)で設定したカットオフ値をこえるものを陽性として判定したところ、Gene-Xの陽性率は胸膜中皮腫患者で97例中45例(46.4%)、非悪性疾患患者は22名中1名(45.4%)であった。THBS-2は中皮腫患者97例中70例が陽性で陽性率が72.2%、非悪性疾患患者では22例中1例で4.5%であった。THBS-2に対する抗体価は、胸膜中皮腫に対する新たなバイオマーカーとしての可能性が示唆された。次にsmallinterfering RNA(siRNA)を用いて、Gene-XとTHBS-2の機能解析を行った。siRNAにてGene-Xの発現を、siRNAにて抑制したところ、コントロール群に比べ、胸膜中腫細胞株の増殖抑制が認められた。同様にTHBS-2に関しても発現を抑制することで、細胞増殖の抑制が認められた。さらに細胞増殖の抑制が、どのようなシグナル系が関与しているか解明をするために、それぞれの遺伝子を抑制した際に、アポトーシス関連遺伝子(Caspase3、Caspase9、PARP)を、細胞周期関連遺伝子(CyclinD1、p27)の遺伝子発現の変化を、Real-time RT-PCRにて解析した。Gene-Xを抑制することにより、Caspase3やCaspase9などのアポトーシス関連遺伝子が増加しており、またTHBS-2を抑制することで、CyclinD1が減少し、p27が増加した。Gene-XとTHBS-2の発現と、アポトーシス抑制遺伝子、細胞周期を制御する遺伝子へとの関連が示唆された。
水平伝播を利用した細胞間ダイレクトクローニング技術の開発

微生物間におけるDNAの水平伝播を模して、DNAを抽出・精製することなく、迅速かつ簡便に他の宿主に移行する「細胞間ダイレクトクローニング技術」の開発において、プラスミドDNAを保持する大腸菌をビルレントファージによって溶菌させ、溶菌液を直接用いて枯草菌を形質転換させる詳細な条件検討を行い、効率良くプラスミドDNAを大腸菌から枯草菌へ送り込む最適条件を確立することができた。連続的に用いることで枯草菌のゲノム中に外来のDNAを再構築させる実践的な活用法も開発した。さらに大腸菌→シアノバクテリアでも実施可能であり、汎用性の広い技術として今後広く活用されることが期待される。当該年度(平成26年度)はモデル実験系を用いた条件検討を行なった。供与菌として大腸菌株DH5α、DH10B、HB101を用い、受容菌は自然形質転換能を有する代表的な枯草菌株168TrpC2株またはその誘導株で制限修飾系酵素を欠損したRM125株を用いた。DNAとして受容菌でのみ発現するGFP遺伝子を有するシャトルプラスミドpGETSGFP(17.1kb)と、GFP遺伝子を有し、供与菌でのみ複製可能な大腸菌プラスミドpSHINE2121(6.6kb)を用いた。形質転換体は抗生物質とGFPの発現によりスクリーニングした。結果としてビルレントファージλgt10を供与菌の植菌時にMOI4.0で感染させ、一晩培養することで十分溶菌を誘導できた。受容菌は凍結保存することで高品質で大量供給出来ることを実証した。溶菌液には大量の大腸菌ゲノムDNAも含まれ競合阻害が生じる。そこでサイズが大きくダメージの入りやすいゲノムDNA分解のため、エキソヌクレアーゼを溶菌液に加えることで形質転換効率が上昇することを見出した。添加量5unitにより、平均してコロニー数が1.5倍程上昇することが示された。ただし5unit以上添加しても1.5倍以上の上昇は得られなかった。また供与菌として大腸菌の代表的なエンドヌクレアーゼ(endA1)を欠損したDH5α、DH10Bでは溶菌後20時間後でも安定して形質転換体が得られたが、endA1保持株(HB101)ではほとんどコロニーが得られなかった。そこでヌクレアーゼ阻害剤としてアウリントリカルボン酸(ATA)を適量加えることで、HB101株を用いた場合でも安定してコロニーが得られることを確認した。ATAは宿主の生育も阻害するため添加しすぎも逆効果だったが、最終濃度0.35mg/mLの添加が最も効果的であった。以上の結果は基本条件を確立する上で重要なデータである。当該年度(平成27年度)は、前年の成果を下に計画通り実践的で応用的なクローニング技術の開発として「複数のDNAコンティグ断片を効率よくダイレクトクローニングする技術」の開発を行なった。具体的には、以前の研究で使用したマウスのミトコンドリア(mt)DNAのコンティグクローンを用い、これらを保持する別々の大腸菌株を供与菌として使用し、受容菌である枯草菌のゲノム中に相同組み換えを利用して組込み、コンティグクローン同士を枯草菌ゲノム中で連結させるというものである。これらマウスmtDNAのコンティグクローンは4断片からなり、両端が数百bpオーバーラップした構造となっているので、溶菌液を順次受容菌細胞に混合するだけで、マウスmtゲノムを枯草菌のゲノム中に再構築させることが可能である。実際に行なったところ、プラスミドDNAを生化学的手法による精製操作を経ずに、迅速に枯草菌ゲノム中に導入できることを実証した。昨年度の条件検討の成果として、ビルレントファージ(λgt10)を効果的に活用することができ、エキソヌクレアーゼやヌクレアーゼ阻害剤としてアウリントリカルボン酸(ATA)を適量(0.35mg/mL)使用することにより、endA1保持株(JA221)をドナーとした場合も問題なく実施可能であることが示された。しかし1カ所の相同組替えによるCambell typeでゲノムに組み込まれる確率が高く予想外に効率はあまり良くなかった。これは、当該技術における溶菌液中でのプラスミドDNAが、生化学的精製操作と比べて予想以上にダメージを受けないことを示すものであり、当該技術が、精製時に物理的ダメージを受けやすい100kb以上の巨大なDNAに対して非常に効果的であることを示唆している。今後、スクリーニング操作の改良を施す必要はあるが、新規のクローニング技術として実践可能であることが確認できた。当該年度は実践的で応用的なクローニング技術の開発を目標とし、計画通り実践可能であることが示された。昨年度までに判明したビルレントファージ(virulent phage)による溶菌条件、エキソヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ阻害剤の使用条件を適用し、マウスのミトコンドリア(mt)DNAのコンティグクローンを保持する別々の大腸菌株を供与菌として用い、受容菌である枯草菌のゲノム中に相同組み換えを利用して組込み、コンティグクローン同士を枯草菌ゲノム中で連結させることに成功した。当該操作において大腸菌がエンドヌクレアーゼ欠損株(JM109)の場合はもちろん、保持株(JA221)においても枯草菌へのダイレクトクローニングが可能であることも実証した。以上のことから当該技術は既存の大腸菌ライブラリーに適用でき、またプラスミド精製操作を省略できることから迅速かつ簡便なクローニング技術であることが実証できた。問題点としては枯草菌ゲノムへの相同組替えにおいてCambell typeや二量体のプラスミドがゲノムに組み込まれる確率が非常に高いことが挙げられる。

このため目的株を得るための合理的なスクリーニング法を新たに検討すべきである。同様に複数の供与菌を同時に混合した場合においてもスクリーニング法の検討が必要であると考えられた。しかしながら、これらの問題点は溶菌液中でのプラスミドDNAが、予想以上にダメージを受けないことを示すものであり、当該技術が物理的ダメージを受けやすいサイズの大きなDNAに対して非常に効果的であることを示唆している。以上、複数の供与菌を用いて繰り返し受容菌へのクローニングする方法において当該技術は非常に効果的であることが確認され、実践的で応用的な活用を示せたことから、今年度の予定していた計画はほぼ達成できたものと考えており、おおむね順調に進展していると判断できる。これまでの研究で「水平伝播を利用した細胞間ダイレクトクローニング技術」について、ほぼ当初の計画通り研究が進行し、モデル実験系による条件検討および実践的で応用的なクローニング技術を開発することができた。最終年度である平成28年度では、これらの成果を踏まえて、受容菌として枯草菌以外の宿主へのダイレクトクローニングを試みた。対象としてシアノバクテリア7942株へのダイレクトクローニングを実施した。シアノバクテリア7942株も自然形質転換能を有する微生物として知られている。導入するDNAとして大腸菌とシアノバクテリア双方で複製可能なシャトルプラスミドp38ANLを使用し、供与菌(ドナー)として大腸菌DH5α株を用いた。大腸菌DH5α株の溶菌はこれまでと同じビルレントファージλgt10を感染させて行い、溶菌液を直接用いてシアノバクテリア7942株の形質転換を行った。抗生物質及びシアノバクテリア用の培地にプレーティングして光照射下で培養したところ、100個前後の形質転換体コロニーを得ることができた。この結果から「水平伝播を利用した細胞間ダイレクトクローニング技術」が「大腸菌→枯草菌」以外にも適用できることが確認された。別の実験系で「大腸菌→出芽酵母」や「枯草菌→出芽酵母」、「枯草菌→大腸菌」のダイレクトクローニングにも成功しており、当該技術が汎用性広く利用できることが確認されている。今回「大腸菌→大腸菌」及び「出芽酵母→培養細胞(Hela)」も試みたが、セレクション法(抗生物質または栄養要求性)がうまく機能せず確認できなかった。しかしながら当該技術は汎用性が広いだけではなく、プラスミドDNAの抽出・精製操作を含まないことから簡便・迅速で精製過程でダメージを受けやすい長鎖DNAに有効であり、将来的にますます活用され得ることが期待される。微生物間におけるDNAの水平伝播を模して、DNAを抽出・精製することなく、迅速かつ簡便に他の宿主に移行する「細胞間ダイレクトクローニング技術」の開発において、プラスミドDNAを保持する大腸菌をビルレントファージによって溶菌させ、溶菌液を直接用いて枯草菌を形質転換させる詳細な条件検討を行い、効率良くプラスミドDNAを大腸菌から枯草菌へ送り込む最適条件を確立することができた。連続的に用いることで枯草菌のゲノム中に外来のDNAを再構築させる実践的な活用法も開発した。さらに大腸菌→シアノバクテリアでも実施可能であり、汎用性の広い技術として今後広く活用されることが期待される。