hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時限付き鍵管理による組織内データの漏洩対策に関する研究

その結果,概ね良好な処理時間の範囲内で動作させることが可能であることが判明している.また,ファイル内に情報を忍ばせるための技術として,PDFファイルへの情報埋め込み方式を考案し,国際会議で発表を行った.その内容が認められ,Excellent Paper Awardを受賞するに至っている.MS-Wordファイルから変換して作成したpdfファイルにおいて,自動的に処理を行えるシステムを構築し,実際に動作確認まで行えている.複数の利用者による結託攻撃を想定して,忍ばせる情報を符号化することも検討している.電子指紋符号と呼ばれる特殊な符号において,結託攻撃によって改変された情報から,どのような改変が行われたかを推定する手法を考案した.現在はその手法の精度を高めるとともに,その成果を論文としてまとているところである.時限付き鍵管理を当初想定して研究を初めていたが,初年度の研究において欠点があるため,代替としての暗号技術を模索してきた.昨年度は,高機能暗号として知られる属性ベース暗号もしくは関数型暗号を使えば,時限付きのアイデアを包含する形で,更に柔軟な鍵管理が可能となることを確認できた.この暗号技術と電子指紋システムを階層的に組み合わせた場合の計算量の見積りを実機によって行うことができている.PDFファイルを対象とした情報の埋め込みに関しては,従来にない新しいアイディアを用いて安全性と攻撃耐性を高めた手法を提案し,その有効性も確かめられている.MS-Wordファイルから変換したpdfファイルに本手法を適用させる場合,テキストのみでなおかつ特定の後処理を加えれば,エラーを生じることなく埋め込みできるプログラムの作成はできている.電子指紋技術における結託攻撃への対策についても,従来は困難とされていた攻撃戦略の推定において,極めて高い精度で推定できる手法を考案し,その実効性を確認できている.組織内の機密データに対する漏洩対策として,暗号技術を用いたアクセス権を制御するシステムの構築と,内部の許可を受けた利用者による不正漏洩を防ぐシステムの構築を目指した方式を提案した.高機能暗号を利用してアクセス構造を2重にして,許可のない者には暗号化されたデータを閲覧できないようにして,更に許可を受けた者もファイルを復号した際に,使用した鍵によってファイル内にその利用者を特定する情報が残るような管理システムを提案した.ファイル内に情報を忍ばせるための技術として,PDF文書ファイルへの情報埋め込み方式を考案した.埋め込み可能な容量と視覚的な品質の劣化,秘匿性のトレードオフにおいて,既存手法に比べて良好な特性を示すことを数量的に示した.MS-Wordファイルから変換して作成したPDFファイル,およびLatexで作成した文書ファイルを変換したPDFファイルにおいて,自動的に処理を行えるシステムを構築し,動作確認を行った.複数の利用者による結託攻撃を想定して,埋め込む情報を電子指紋符号で符号化し,不正者の特定をするための手法も考案した.特に結託攻撃によって改変された符号語から,行われた攻撃戦略を推定する手法を考案し,最適な検出器の実現に成功した.
イオン性基質を利用する溶液反応解析と反応設計への応用

光学活性4-メチルシクロヘキシリデンメチルヨードニウム塩(1)をクロロホルム中、トリフラートイオンTfONBu_4あるいはメシラートイオンMsONBu_4と反応させると、非転位置換生成物2Sと転位置換生成物3Sが得られた。トリフラートとの転位生成物3Tfの立体化学純度は1のそれをほぼ維持していたが、メシラート生成物3Msの立体化学純度は1に比べて大きく低下していた。エキソ炭素を^<13>C標識したヨードニウム塩を用いてMsONBu_4と反応を行ったところ、標識の移動が観測でき、移動した割合は立体化学純度の低下分に相当していた。さらにMeODを添加して1・BF_4^-とMsONBu_4との反応を行ったところ、転位生成物3Msのビニル水素の一部が重水素置換されていた。次に、シクロペンタジエノン存在下に、メシラートとの反応を行ったところ、高い立体化学純度を保った3Msが低収率で生成した。それと同時にシクロヘプチンのベンゾ付加体も生成した。以上の結果から、第一級ビニルカチオンを経由することなく、転位シクロヘプテニルカチオンを経て、シクロヘプチンを生成し、この中間体にメシラートが求核付加してラセミ化した3Msを与える機構で反応が進行しているものと結論できた。(E)-および(Z)-2-フェニル-1-プロペニル(フェニル)ヨードニウムテトラフルオロポラート(E-1およびZ-1)の加溶媒分解反応をトリフルオロエタノール中、60°Cで検討したところ、E-1の反応は10分程度で完結するのに対して、Z-1の反応は2週間以上かかった(速度比約5000)。生成物分布は両者で全く異なり、E-1はヨードベンゼン、1-フェニル-1-プロパノン、1-フェニルプロピン、1-フェニル-2-プロパノン、フェニルプロパジエンを与えるのに対して、Z-1は前三者しか与えなかった.このような生成物分布および反応性の違いは,E-1がβ-フェニル基関与によってベンゼニウムイオンを生成し、さらに転位してα-メチルビニルカチオン、α-フェニルビニルカチオンを経由して反応するのに対して、Z-1はβ-メチル基関与でα-フェニルビニルカチオンを経て反応するものとして理解され、第一級ビニルカチオンは生成していないと結論される。メタノールおよび酢酸溶媒中における結果も同様の反応スキームで説明される。さらに,光学活性な(R)-4-メチルシクロヘキシリデンメチル(フェニル)ヨードニウム塩の加溶媒分解を調べたところ,主生成物の(R)-4-メチルシクロヘプタノンの光学純度は完全に基質と等しかった。この結果から、この反応においてもアキラルな第一級ビニルカチオンは中間体として含まれていないと結論できる。反応はβ-σ-結合関与によって直接転位カチオンを生成して進行しているものと考えられる。
最終処分場における焼却残渣の土壌還元化促進技術とその生物学的評価指標の確立

埋立1年後の焼却残渣のpHは11の高アルカリを示しているものの,埋立前のpH13より低下し,塩類濃度も0.020.2%と,埋立前の0.64.8%の約1/10以下に低下していた。一方,溶解性有機物量は主灰平均38μg/g,飛灰平均75μg/gで,主灰は埋立前の平均44μg/gとほぼ等しい値であったが,飛灰の有機物量は埋立前(飛灰平均183μg/g)の約半分に減少していた。これら化学性状から,1年間の降雨によってアルカリ性の塩類や飛灰中の有機キレート剤等が埋立層外へ流出し,減少していることがわかった。また、27年経過した焼却残渣と不燃残渣の混合廃棄物のpHは,埋立開始時点のpHと等しい値でほとんど低下が見られなかったが,Cl含有量はいずれの灰も0.01以下の低い値で,埋立開始時点の0.40.5%の1/50以下であったことから,27年間の降雨により混合廃棄物中に含有されていた塩類のほとんどが洗い出されていることがわかった。さらに,表層では27年前の実験開始時点の溶解性有機物量300μg/g及び130μg/gに比べて多く、有機物の増加が見られた。表層では植物が繁茂し,一般に土壌形成段階に見られる植物遺体の分解による有機物の集積がみられた。以上のこと及びこれら廃棄物試料の一般細菌数が一般土壌の菌数レベルであったことやこれら試料中に添加した土壌細菌の生残率は130%で高く,生物多様性レベルも高かったこと等から27年経過した焼却残渣試料は土壌還元化の最終段階にあると評価された。特に有機物の集積が見られた表層の廃棄物における土壌細菌の生残率及び生物多様性が高く,生態的にも安定化しているものと評価された。pHや塩類濃度等の化学指標では埋立深さによる違いはほとんど見られないことから,生物指標は有効であることがわかった。焼却灰の土壌還元化促進のために生ごみ堆肥を覆土材に用いて3年放置した焼却灰試料について、16SrDNA解析による細菌群集解析及びBiolog試験による基質利用性について調査し、覆土材に真砂土を用いた場合と比較した。その結果、真砂土を覆土材に用いた場合、Lysobactor yangpyeongensisやHydrogenphaga taeniospiralis等の火山灰や温泉・熱水孔等の極限環境に生息する細菌群が主体であるのに対して、生ごみ堆肥を用いた場合、Salinicoccus carnicancriやDehalogenimonas alkaerigignens等の好塩菌や脱塩菌を主体とする細菌群で、生菌数は真砂土の1000倍であった。これらのことから、覆土材に生ごみ堆肥を適用することによって焼却灰中に耐性菌を中心とした微生物群が集積され、それらによって土壌還元化が進行することがわかった。また、生ごみ堆肥を適用した場合、焼却灰の生菌数は一般土壌と同程度であったが、基質利用性は一般土壌の1/1000以下と低いことから、細菌群集の活性が低いことが分かった。このことから、細菌群集の解析に加えて、基質利用性試験を行うことによって、焼却灰の土壌還元化の進行度を評価することが可能であることがわかった。さらに、焼却灰に堆肥溶出液を混合後に堆肥溶出液中の生菌及び芽胞の生残率を測定した場合、生菌ではpH10以上、芽胞ではpH11以上において生残率が低下した。一方、土壌溶出液の場合、生菌及び芽胞共にpHに関係なく、生残率は1/10以下で、堆肥溶出液の場合に比べて化学性状で評価できない影響が見られた。これらのことから、焼却灰の土壌還元化を評価する生物指標として細菌の生残性試験は有用であり、生残性試験の種菌として用いる細菌群集を選択することによって、その進行度を評価できることがわかった。当初予定していなかった実最終処分場の焼却灰(埋立直後及び1年経過後)及び生ごみ堆肥と焼却灰が混合埋立され、約30年経過した焼却灰混合廃棄物を採取でき、その化学性状調査及び生菌数試験から、焼却灰の洗浄や二酸化炭素吹込みなどによって模擬的に土壌還元状態を再現した試料よりも、さらに土壌還元が進行した試料であることがわかった。これらを用いることによって、筆者らが提案している生物指標の有効性の裏付けが取れる可能性が高い。平成28年度に確立した土壌細菌の生残率指標によって焼却灰の安定化評価を行った結果、焼却灰中の生物生育阻害要因であるアルカリ塩類の洗出し及び中性化を促進することが重要であることがわかった。そこで、平成29年度は固化した焼却灰をバックホウ等で破砕処理し,焼却灰が水やガスと接触し易くすることにより,塩類の洗い出しや堆肥から供給された二酸化炭素や炭酸イオンとの反応を促進させることが実用レベルで可能かを明らかにすることを目的として、実埋立場に2.5m×2.5mの試験埋立区画を作成後、1固化による焼却残渣の物理化学特性の変化,2固化した焼却残渣の破砕処理による物理化学特性の変化,3破砕不燃物と焼却残渣の混合処理による物理化学特性の変化について調査し検討した。また,焼却残渣の水和物形成を防止する方法としての焼却残渣と破砕不燃物の混合の有効性についても検討した。

その結果、1埋立4週間後破砕処理した焼却灰は,破砕処理をしない場合に比べ,塩類の洗い出しが7倍促進されること、2破砕不燃物を混合処理した埋立4週間後の焼却灰は,処理をしない場合に比べ,塩類の洗い出しが3倍促進されるが,混合割合が9:1でも7:3でもさほど変わらないこと、3埋立前処理(固化して破砕処理,破砕不燃物との混合)は,焼却灰の透水性を上昇させるため塩類の洗い出しの促進手法として有効であるが,固化後の破砕処理の方が破砕不燃物混合処理より塩類の洗い出しが2倍促進されること、4しかし、これら処理によって塩類の洗出しは進行するが、生物生育の最大の制限要因であるpHの低下が小さいため、土壌細菌の生残率の上昇は緩慢で、塩類の洗出しに加えてpHの低下を促す前処理が必要であることなどが明らかになった。本研究の協力者である福岡市及び大成管理開発株式会社とは永年共同研究を実施しており、十分な協力体制を構築できていたため、実埋立場における試験区画の作成及び焼却灰の採取等がスムーズに実施できた。埋立1年後の焼却残渣のpHは11の高アルカリを示しているものの,埋立前のpH13より低下し,塩類濃度も0.020.2%と,埋立前の0.64.8%の約1/10以下に低下していた。一方,溶解性有機物量は主灰平均38μg/g,飛灰平均75μg/gで,主灰は埋立前の平均44μg/gとほぼ等しい値であったが,飛灰の有機物量は埋立前(飛灰平均183μg/g)の約半分に減少していた。これら化学性状から,1年間の降雨によってアルカリ性の塩類や飛灰中の有機キレート剤等が埋立層外へ流出し,減少していることがわかった。また、27年経過した焼却残渣と不燃残渣の混合廃棄物のpHは,埋立開始時点のpHと等しい値でほとんど低下が見られなかったが,Cl含有量はいずれの灰も0.01以下の低い値で,埋立開始時点の0.40.5%の1/50以下であったことから,27年間の降雨により混合廃棄物中に含有されていた塩類のほとんどが洗い出されていることがわかった。さらに,表層では27年前の実験開始時点の溶解性有機物量300μg/g及び130μg/gに比べて多く、有機物の増加が見られた。表層では植物が繁茂し,一般に土壌形成段階に見られる植物遺体の分解による有機物の集積がみられた。以上のこと及びこれら廃棄物試料の一般細菌数が一般土壌の菌数レベルであったことやこれら試料中に添加した土壌細菌の生残率は130%で高く,生物多様性レベルも高かったこと等から27年経過した焼却残渣試料は土壌還元化の最終段階にあると評価された。特に有機物の集積が見られた表層の廃棄物における土壌細菌の生残率及び生物多様性が高く,生態的にも安定化しているものと評価された。pHや塩類濃度等の化学指標では埋立深さによる違いはほとんど見られないことから,生物指標は有効であることがわかった。平成28年度に焼却灰の破砕処理が実施できたので、平成29年度は予定通り、1年経過時点における焼却灰の調査を実施し、破砕処理による生物の生育阻害物質であるアルカリ塩類の洗い出しの促進効果が持続できるか評価する。また、平成28年度に採取した30年経過後の焼却灰混合物について細菌の生残性試験を実施し、土壌還元化の生物学的評価指標としての生残性試験の有用性を確認するとともに、その試験に有用な種菌についても明らかにする。焼却灰の中性化には炭酸化が需要であり、その炭酸の供給方法として、筆者らが提案している生ごみ堆肥を山土に混合した堆肥覆土材や有機質土壌の適用効果を実埋立地レベルで検討する必要がある。イタリアパドヴァ大学の大学院生(Ms,Miriam Luison)を研修生として受け入れ、本研究テーマについて、共同で研究を実施した。本学で実施した研究成果をベースに修士論文を作成し、最高判定を獲得した。
脂肪由来幹細胞の免疫抑制作用の解明と高機能化

独自に開発した低血清培養脂肪由来間葉系幹細胞(LASC)と従来の高血清培地で増幅したASC(HASC)の細胞特性の違いを明らかにするために、オートファジー系、代謝経路、解糖系、細胞内代謝産物、分泌サイトカインに関して網羅的に解析した。LASCではHASCと比較してオートファジーの亢進が観察されたが、その作用機序は明確になっていない。ラパマイシン処理ではオートファジーは亢進しなかった。解糖系にも有意な差は見られなかった。サイトカイン分泌については、LASCではMIP-1 alphaの分泌が上昇し、Fractalkine/CX3CL1の分泌が低下していた。申請者らは脂肪由来間葉系幹細胞(ASC)に着目し血清培養法を開発した。これまでに低血清培養脂肪由来間葉系幹細胞(LASC)が骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、強い再生促進作用と免疫抑制作用を有することを見出し、その効果を各種動物実験で実証してきた。しかし、その作用機序には依然不明な点が多い。細胞治療を普及させるためには、動物由来物質の排除つまり無血清培養の開発が必要である。本研究課題は、1.飢餓状態で亢進するオートファジーとLASCの免疫抑制作用との関連を明らかにすること、2.LASCと免疫細胞との間の情報伝達機構を明らかにすること、そしてその知見に基づき3.高機能を維持したASCの無血清培養法を開発することを目的とした。まず、オートファジー(自食作用)に着目して検討を行った。オートファジーは飢餓状態で亢進する現象で、細胞内浄化作用・老化抑制などに作用する。LASCではHASCと比較してオートファジーが亢進していることを確認した。続いて、LASCのオートファジーをさらに亢進させる方法を模索した。低血糖培養液使用、あるいはmTOR阻害薬であるラパマイシンを用いてLASCに刺激を与えたが、オートファジーは有意に変化しなかった。さらに、HGFをはじめとする成長因子も変化しなかった。そこで、低血清培養の後に無血清培養を行ったところ、HGFの分泌が亢進していた。免疫抑制能に関しては、現在こうして得られたLASCを中心に、従来のLASC、HASCとの比較を進めている。さらに、その違いにおける分子機序を明らかにするために、蛋白アレイを用いた網羅的解析も進めている。低血清培養脂肪由来間葉系幹細胞(LASC)は高血清培養ASC(HASC)や骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)と比較して、強い再生促進作用と免疫抑制作用を有する。LASCからの再生促進因子としては、hepatocyte growthfactor (HGF)が重要であることを見出している。また、免疫抑制作用のひとつとして、免疫調整性M2型マクロファージを誘導することを見出した。しかし、その分子メカニズムには依然不明な点が多い。まず、オートファジーに着目して検討を行った。本年度は、LASCではHASCと比較してオートファジーが亢進していることを、条件を変えて検証した。低酸素状態や低ブドウ糖培養液では、LASCのオートファジーに明確な影響は見られなかった。ラパマイシン以外のmTOR阻害薬の影響を試したが、LASCのオートファジーをさらに亢進させることはできなかった。そこで、LASCとHASCの代謝を比較する目的で、代謝産物を網羅的に調べ比較検討した。現在、LASCでは解糖系が亢進し、TCA回路は抑制されている可能性につき検討している。これまでにラットLASCがIL-6を分泌して、M2マクロファージを誘導することを見出していた。本年度は、ヒトのLASCとHASCおよび骨髄由来幹細胞(BM-MSC)が分泌するサイトカインを網羅的に検出し、比較検討した。LASCはHGFやMCP-1を多く発現していた。ヒトにおいては、IL-6の発現量に明確な差はみられなかった。ヒト、ラット、マウスでは、同じLASCでも発現する分子が違っている可能性があるため、各動物に共通する因子に着目して検討することが有用と考えている。申請者らは脂肪由来間葉系幹細胞(ASC)に着目し、独自に低血清培養法を開発した。この低血清培養脂肪由来間葉系幹細胞(LASC)は従来の高血清培養したASC(HASC)や骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)に比べて再生能・免疫抑制能に優れていることを見出し、報告してきた。LASCの具体的な効力として、腎疾患領域に関しては腎再生に関わる重要因子として肝細胞増殖因子(HGF)分泌能が高いこと、免疫抑制作用としてT-cell増殖抑制能が高いこと、炎症性M1マクロファージを抑制し、抗炎症性M2マクロファージに誘導する能力が高いことをHASCやBM-MSCと比較して示してきた。しかしながらこれらの作用の分子的メカニズムについては依然明らかにされていない点が多い。HASCとLASCの細胞性質は、樹立工程から見て血清濃度によるものであると推測される。そこで、低血清(飢餓状態)において亢進すると考えられるオートファジー系からメカニズムの解明を試みたが、LASCのオートファジー亢進と免疫抑制能との関連を示すことはできなかった。そこで本年は代謝経路、解糖系に着目し、細胞の活性・バイオプロセスの面からのアプローチを試みた。

幹細胞ではエネルギー産生を抑えることで幹細胞性を維持しているとの報告があるが、ミトコンドリア活性を検討するために細胞培養上清中に分泌される乳酸/ピルビン酸比(L/P比)を見てもHASC/LASC間において有意な差は認められず、細胞当たりのグルコース消費量や乳酸産生量に関しても差を示すことはできなかった。細胞内の代謝産物に関しても網羅的な解析を実施したが、これまでのところエネルギー代謝経路に関わる明らかな差は認めていない。今後低血清培養の作用についてはさらなる検討を要する。独自に開発した低血清培養脂肪由来間葉系幹細胞(LASC)と従来の高血清培地で増幅したASC(HASC)の細胞特性の違いを明らかにするために、オートファジー系、代謝経路、解糖系、細胞内代謝産物、分泌サイトカインに関して網羅的に解析した。LASCではHASCと比較してオートファジーの亢進が観察されたが、その作用機序は明確になっていない。ラパマイシン処理ではオートファジーは亢進しなかった。解糖系にも有意な差は見られなかった。サイトカイン分泌については、LASCではMIP-1 alphaの分泌が上昇し、Fractalkine/CX3CL1の分泌が低下していた。本研究は、当初オートファジー(自食作用)に着目して検討を開始した。オートファジーは飢餓状態で亢進する現象で、細胞内浄化作用・老化抑制などに作用する。申請者は免疫染色および電子顕微鏡による観察で、LASCではHASCと比較してオートファジーが亢進していることを見出した。そこで、申請者は「LASCにおける免疫抑制作用にはオートファジーが関与する。」という仮説を立てた。しかし、LASCにおいてオートファジーはすでに亢進しており、薬剤や培養条件を調整することでさらに亢進させることは困難であることが判明した。そこで、LASCとHASCとBM-MSCの比較をすることで、LASCの特徴を明確にして、LASCの高機能化の方向性を探るという方針転換を行ったため、当初の進捗予定とはずれを生じている。また、研究途中で、ヒト、ラット、マウスのLASCで発現する分子は必ずしも一致しないことが明らかになった。研究は、あくまでヒトの細胞を中心として、進める必要があり、若干の方向転換を要した。腎臓病学LASCには、強い再生促進作用と免疫抑制作用がある。その分子メカニズムの一部として、HGFを介した血管新生や臓器再生、IL-6やPG-E2を介したM2型マクロファージ誘導を見出している。これまでは、ラット、マウス、ヒトの脂肪を用いて、各種検討をしてきたが、必ずしも分子発現プロファイルが一致しない。そこで、今後の研究の推進方策として、まずはヒトのLASCを中心に据える。最終的には、ヒト細胞の治療効果を明確にする必要があるが、そのためのin vivoの系を構築する必要がある。具体的には、ヒトLASCをラットおよびマウスの障害モデルに投与し、その治療効果を確認する。現在、通常のラットおよび免疫不全ラット(Nude rat)、通常のマウス(C57B6)とNODーSCIDマウスを準備し、それぞれで腎障害モデルを作成する。そこに、同種あるいは異種の細胞製剤を投与して、治療効果を確認する。現在、そのための準備を進めている。
コンドロイチン硫酸の発現制御機構と疾患糖鎖生物学

コンドロイチン硫酸(CS)鎖は,脳神経系の主要な細胞外マトリックス成分であり,多様な硫酸化パターンを持つ直鎖状の硫酸化糖鎖である。CS鎖は,障害を受けた成体脳において軸索再生を阻害する分子として振る舞う一方,神経突起の伸長を促進する分子としての一面も併せもつ。これまでに我々は,海馬神経細胞において,高硫酸化CSサブタイプの1つであるCS-Eが,神経細胞特異的な細胞接着分子であるContactin-1(CNTN-1)のリガンドとして機能することにより,軸索様の神経突起形成を促進することを明らかにしている。一方で興味深いことに,CS-Eとは異なる硫酸化パターンをもつ高硫酸化CS-Dは,CS-Eとは異なり,樹状突起様の神経突起形成を促進する作用を示す。これらのことから, CS-E受容体であるCNTN-1とは異なる細胞接着分子がCS-D受容体として機能することが示唆されるが,その同定には至っていなかった。そこで本年度は,CS-D受容体の候補分子として細胞外マトリックス受容体の代表格であるインテグリン(ITG)ファミリーに着目し,CS-Dによる神経突起形成メカニズムの解析を試みた。CS-Dにより促進される海馬神経細胞の神経突起伸長は,ITGシグナルの主要な細胞内シグナル伝達経路であるFAK-Src/Fynカスケードの活性化を介することが判明した。さらに, CS-D依存的な神経突起伸長に関与するITG分子を探索した結果,特定のITG分子がCS-Dと結合親和性を示すこと,その分子の機能阻害によってCS-Dによる神経突起形成が有意に抑制されることを見出した。これらのことから,特定のITG分子がCS-D受容体として機能することにより,CS-Dによる樹状突起様の神経突起形成が制御されている可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。コンドロイチン硫酸鎖は、様々な細胞増殖因子や細胞外マトリックス成分と相互作用し、細胞接着、移動、増殖、分化、形態形成といった様々な細胞活動を制御している。本年度は、多様な生理活性を持つナマコ(Apostichopus japonicas)由来のフコシル化コンドロイチン硫酸に着目し、この神経突起伸長促進活性の解析を試みた。まず、A. japonicusから精製したフコシル化コンドロイチン硫酸の構造解析と神経突起伸長活性の評価を行った。次に化学合成したフコシル化コンドロイチン硫酸三糖β-D-GalNAc(4,6-O-disulfate)(1-4)[α-L-fucose (2,4-O-disulfate) (1-3)]-β-D-GlcAを用い、フコシル化コンドロイチン硫酸の神経突起伸長活性と構造との相関を解析した。A. japonicus由来フコシル化コンドロイチン硫酸は、E unit [GlcA-GalNAc(4,6-O-disulfate) ]を主要構成二糖単位にもつコンドロイチン硫酸鎖を基本骨格として、様々なパターンの硫酸化フコース分枝をもつ硫酸化多糖であった。フコシル化コンドロイチン硫酸の神経突起伸長活性は、E unitが比較的少ないにもかかわらず、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸-Eに匹敵した。さらに化学合成したフコシル化コンドロイチン硫酸三糖は、同じく化学合成したコンドロイチン硫酸-E四糖と同程度の神経突起伸長活性を示した。これらのことから、フコシル化コンドロイチン硫酸中のフコース分枝はコンドロイチン硫酸-E介在性神経突起伸長の活性を相補する働きがあると考えられた。このようなフコシル化コンドロイチン硫酸三糖構造の生理活性とコンドロイチン硫酸-E四糖構造の生理活性との相関は、コンドロイチン硫酸鎖の生理活性の発現機構を包括的に理解する一助となりうると考えられた。フコシル化コンドロイチン硫酸の神経突起伸長活性とコンドロイチン硫酸-Eの神経突起伸長活性との相関を明らかにでき、コンドロイチン硫酸鎖の生理活性の発現機構を解明できたため。がん細胞の浸潤は、がん細胞と標的組織の細胞外マトリクス(ECM)が結合することにより始まり、この過程でECMからがん細胞に種々のシグナルが入力される。それゆえ、がん細胞の浸潤を制御するシグナルの入力に関わるECM分子の同定と入力されたシグナルによってがん細胞内で起こる事象を理解することが重要である。今回、我々はECM成分の一つ、コンドロイチン硫酸(CS)によって高転移性のbasal-like型乳がん細胞株BT-549細胞の浸潤が促進することを見出した。BT-549細胞の表面にはN-カドヘリンが存在し、この分子にCSが結合すると、カベオラ依存的にN-カドヘリンが細胞内に取り込まれた。取り込まれたN-カドヘリンはプロテアーゼにより膜近傍で切断され細胞質ドメインが遊離した。この遊離した細胞質ドメインにはβ-カテニンが結合しているため、これらが核へ移行するとβ-カテニンによる転写が活性化すると考えられた。実際、β-カテニンの下流でマトリクスメタロプロテアーゼ9遺伝子の発現が上昇し、BT-549細胞の浸潤が促進した。このようなエンドサイトーシスを介するN-カドヘリン/β-カテニン経路の活性化による浸潤能の上昇は、外来性CSの添加により促進され、逆にCSの主要な合成酵素の一つ、コンドロイチン4-O-硫酸基転移酵素-1 (C4ST-1)のノックアウトにより抑制された。

これらの結果から、がん細胞が組織に浸潤しようとする際、がん細胞は宿主側のCS及びがん細胞自身がつくるCSを利用して浸潤能を高めている可能性が示唆された。したがって、C4ST-1によって合成されるCSはbasal-like型乳がんの治療標的になる可能性がある。コンドロイチン硫酸鎖のN-カドヘリンを受容体とする乳がんの転移促進機構が解明できたため。コンドロイチン硫酸(CS)鎖は,脳神経系の主要な細胞外マトリックス成分であり,多様な硫酸化パターンを持つ直鎖状の硫酸化糖鎖である。CS鎖は,障害を受けた成体脳において軸索再生を阻害する分子として振る舞う一方,神経突起の伸長を促進する分子としての一面も併せもつ。これまでに我々は,海馬神経細胞において,高硫酸化CSサブタイプの1つであるCS-Eが,神経細胞特異的な細胞接着分子であるContactin-1(CNTN-1)のリガンドとして機能することにより,軸索様の神経突起形成を促進することを明らかにしている。一方で興味深いことに,CS-Eとは異なる硫酸化パターンをもつ高硫酸化CS-Dは,CS-Eとは異なり,樹状突起様の神経突起形成を促進する作用を示す。これらのことから, CS-E受容体であるCNTN-1とは異なる細胞接着分子がCS-D受容体として機能することが示唆されるが,その同定には至っていなかった。そこで本年度は,CS-D受容体の候補分子として細胞外マトリックス受容体の代表格であるインテグリン(ITG)ファミリーに着目し,CS-Dによる神経突起形成メカニズムの解析を試みた。CS-Dにより促進される海馬神経細胞の神経突起伸長は,ITGシグナルの主要な細胞内シグナル伝達経路であるFAK-Src/Fynカスケードの活性化を介することが判明した。さらに, CS-D依存的な神経突起伸長に関与するITG分子を探索した結果,特定のITG分子がCS-Dと結合親和性を示すこと,その分子の機能阻害によってCS-Dによる神経突起形成が有意に抑制されることを見出した。これらのことから,特定のITG分子がCS-D受容体として機能することにより,CS-Dによる樹状突起様の神経突起形成が制御されている可能性が示唆された。今後は、現在解析中であるコンドロイチン硫酸鎖の構造変化が、乳がん細胞の骨や脳への転移や神経疾患発症にどのように関わるのかを検討し、これらに関わる“疾患糖鎖"を糖鎖構造・生合成の面から明らかにしたい。本年度は、最近新たに見出したコンドロイチン硫酸鎖の神経突起伸長に関わる受容体の解析と、以前から作成していたコンドロイチン硫酸鎖の合成に関わる様々な酵素遺伝子の欠損マウスを用いて、コンドロイチン硫酸鎖の構造変化と機能の解析を行い、統合失調症などの疾患の発症に関わる“疾患糖鎖"を糖鎖構造・生合成の面から明らかにしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
磁性金属に連結した伝導系の開発とスピンエレクトロニクス材料への応用

TTFを中心とする分子性導体において、より強い磁気的相互作用を発現させるため、有機ドナーに常磁性金属イオンが直接配位できるサイトを導入したTTF-配位子の合成とそれを基にした磁性-伝導系の開発ならびに物性研究を行った。シッフ塩基型TTF-配位子を新規に開発し、磁性と伝導性が共存する系や酸化還元能をもつスピンクロスオーバー錯体の開発に成功した。ピラゾール型TTF-配位子からは極低温で単分子磁性を示す物質の開発に成功した。分子性導体の主要な構成分子であるテトラチアフルバレン(TTF)誘導体と量子スピン系を与える多核遷移金属クラスター錯体を用いることにより,磁性と伝導性が強くカップルした新しい物質系の開発を行い,スピンエレクトロニクス材料としての可能性を検討することが本研究の目的である。本年度は,常磁性金属イオンに直接配位することができるTTF系伝導体として,aminoethylthio-TTFから誘導されるシッフ塩基配位子を有するTTF誘導体であるHsae-TTFとNi(II),Cu(II)との金属錯体を合成し,さらに定電流電解法により部分酸化しラジカル塩の作製を行った。Hsae-TTFが金属イオンに配位した錯体は,Hsae-TTF二分子が金属に4配位平面四角形型に配位した中性錯体である。金属配位部分はTTF二分子に挟まれたサンドイッチ構造をとっている。この塩を定電流電解法により酸化することにより,[MII(sae-TTF)2]PF6(M=Cu,Ni,Pd)が得られた。錯体の構造は中性錯体同様,4配位平面四角形型であったが,中性錯体と異なり,TTF部位がスタックした構造を取っていた。組成比から、TTF部位は+0.5価の部分酸化状態であったが,この塩は電気伝導性は半導体であった。また磁性はCu(II)イオンが支配的な常磁性Curieであった。極低温では磁性イオン間に反強磁性的相互作用が存在したが,伝導電子と局在スピン間に強い相互作用は確認されなかった。そこで,配位部位をジエタノールアミンやアセチルアセトナートなどシッフ塩基配位子以外の部位へと変換した化合物を合成し,金属イオンとの錯形成を試みたが,金属錯体は得られなかった。これまで試みてきた系は,金属イオン周りの立体的柔軟性を確保するため,TTF骨格の一カ所に配位部位を導入したものであった。今後,錯形成能を改善するため,配位部位の導入箇所を増加させる必要があると考えられる。本年度は,常磁性金属イオンに直接配位することができるTTF系伝導体として,aminoethylthio-TTFから誘導されるシッフ塩基配位子を有するTTF誘導体であるHsae-TTFが配位したCu(II)錯体を定電流電解法により部分酸化したラジカル塩,[CuII(sae-TTF)2]PF6の圧力下における輸送特性の評価を行った。この塩は常圧では半導体であり,伝導電子と局在スピン間の相互作用は弱いと考えらる。約14kbarの圧力までの測定を行ったところ,電気抵抗の温度依存性に約8kbar付近から大きな変化が見られなくなった。これは,分子積層方向への外圧による圧縮を立体的に大きな新属錯体部位が阻害しているため,ある程度の圧力以上では,分子間相互作用に大きな変化が生じなくなったためと考えられる。また,バンド構造等の電子状態を解明するため,バンド計算を行ったところ,分子間相互作用の観点からは室温において既に4量化しており,パイエルス絶縁体状態になっており,バンド構造からもバンド絶縁体であることが明らかとなった。このことから,従来の磁化率の温度依存性の解釈と整合性がなくなった。また,新しいTTF-金属錯体としてシッフ塩基配位部位が2つある4座配位型の配位子,ならびにマクロサイクリックな配位部位をもつ6座配位型配位子を新たに合成し,それらを用いた金属錯体の合成にも成功している。中でもマクロサイクリック型配位子から得られるCo(II)錯体は,250K付近でスピンクロスオーバ-を示すことを確認した。磁性と伝導性が競合する分子性物質の開発に取り組んでおり、分子性導体の主要構成分子であるテトラチアフルバレン(TTF)が常磁性金属イオンに直接配位することができる配位子とそれを用いた金属錯体の合成をおこなってきた。

22年度は常磁性金属への配位部位としてシッフ塩基型配位子を複数導入したTTF-配位子(H_2bsae-TTF)の合成し、この配位子からNi(II)およびCu(II)の中性錯体([M^<II>(bsaeTTF)];M=Cu,Ni)の合成に成功している。中性錯体である[Cu^<II>(bsae-TTF)]の構造は、配位子であるH_2bsae-TTFとCu(II)イオンが一対一で錯体を形成し、中性のTTF部位は金属配位サイトを連結するエチレン鎖の部分で折れ曲がり、歪んだ四配位平面構造をとる金属錯体部位にかぶさった構造をとっている。この錯体を電解酸化し部分酸化塩の作製を試みたが結晶の単利に至っていない。また、シッフ塩基部位をもつ環状配位子であるmacrocyclic-TTF配位子を新たに合成し、Fe(II),Co(II),Ni(II),Zn(II)の各錯体を得ることに成功した。この錯体も種々の対イオンとのラジカル塩の作製を試みたが,現在のところTTF部位が酸化された塩の単離には至っていないものの、[Co^<II>(macrocyclic-TTF)](BF_4)_2は室温以上でスピンクロスオーバーを示すことを明らかにした。さらに、ピラゾール部位を配位子に持つTTF誘導体とピラゾリルボレートが配位したトリシアノ鉄錯体を反応させると,Fe(II),Fe(III),Ni(II)からなる8核キューブ錯体が得られた。TTFを配位子に有する金属多核錯体の報告例は非常に少なく,キューブ錯体はおそらく初めての合成例である。この錯体は、磁気測定の結果,Fe(III)-Ni(II)間には強磁性的相互作用が働き,2K以下で単分子磁石であることが明らかとなった。
正規言語間の順序同型写像の応用

正規言語間の順序同型写像の性質を探るために、順序同型写像によって極端に圧縮される言語の属について考察を行った。まず言語に対する自然な"測度"(大きさ)を定式化し、測度が0になる正規言語の代数的・オートマトン的な必要十分条件を与えた。測度が0になる正規言語は、本研究課題で提案している順序同型写像による圧縮手法によって極端に圧縮される。具体的には,次の結果を得た.(1)正規言語の測度が0になることの代数的・オートマトン的必要十分条件を与えた。また、オートマトン的な特徴付けから、「与えられたDFAの受理する言語の測度が0になるか」の判定がDFAの状態数に対して線形時間で決定するアルゴリズムを構成した。これらの成果はH26年度からの研究テーマである「閉包性の高い正規言語のクラスの考察」の延長線上にあり、証明技法はVariety Theoryと呼ばれる正規言語の理論フレームワークに則っている。(2)与えられた言語が正規言語であることの必要条件を求めた。この必要条件は(1)の成果から従うものである。得られた十分条件は言語の測度に基づくものであり、正規言語に対する既存の十分条件であるMyhill-Nerodeの定理やポンピング補題とは全く異なる条件となっている。27年度が最終年度であるため、記入しない。正規言語間の順序同型写像の性質を探るべく,まずは順序同型の計算を効率よく行える正規言語のクラスを対象として研究を進めた.DFA(決定性有限オートマトン)の隣接行列の階数が1であるような言語クラス(rank-one language)について考察し,そのような言語クラスは表現能力が弱く,また言語の(和や積などの)演算についての閉包性に乏しいものであることを明らかにした.これはH26年度前半の成果であり3度の対外発表(国際学会1つ,国際ワークショップ1つ,国内学会1つ)を行っている.また,当初研究計画のH26年度における研究の主対象である「対角化可能な正規言語」は閉包性が低いことも明らかにした.H26年度後半は,高い閉包性と順序同型写像における性質の良さを兼ね備えた正規言語のクラスを,Variety Thoeryと呼ばれる正規言語の高度な理論的フレームワークに則り,探る方向に研究を進めている.閉包性の高い言語クラスは理論的にも応用的にも良い性質を持つ場合が多い.1975年にEilenbergが創出し正規言語のVariety Theoryは,ある種の閉包性を満たす言語クラスを特徴付ける理論であり,近年でも洗練化が続いている.Variety Theoryで扱っている閉包性の枠組みに則り,本研究の対象である「順序同型写像」において良い性質を持つ言語クラスを探るべく研究を進めている(で言及した「階数が1である言語」や「対角化可能な言語」はVariety Theoryで要求されている閉包性を満たさない)正規言語間の順序同型写像の性質を探るために、順序同型写像によって極端に圧縮される言語の属について考察を行った。DC2申請時に研究対象となる予定であった「対角化可能な正規言語」について,言語の閉包性の弱さを明らかにした.さらに,圧縮における声質の良さと高い閉包性を兼ね備えた言語クラス"zero-one languages"(圧縮率が漸近的に0か1になる正規言語族のクラス)を発見し,Variety Theoryを用いてその代数的な特徴付けに成功した.当初の予定とは異なる研究対象に着目しているが,より高度な理論フレームワークに則り,順調に圧縮と正規言語クラスの関連付けが進んでいる.27年度が最終年度であるため、記入しない。Variety Theoryは「理論的に良い性質を持つ言語クラス」の指針となるフレームワーク的な理論であるが,具体的にそのような言語クラスを新規に発見することは一般に難しい.正規言語を正規表現的・代数的・論理的・オートマトン的にそれぞれ別の視点から解析することで,それぞれの視点において自然な言語クラスが多数発見されている歴史がある.本研究では,順序同型写像ともつながりの深いオートマトン的な視点から言語クラスを探る方針を取っている.そのため,申請者は2014年10月からオートマトン理論の専門家が数多くいるフランス・パリにて研究者たちと議論・交流を行いながら研究を行っている.27年度が最終年度であるため、記入しない。
リンパ節抗原移送細胞と濾胞樹状細胞の機能に関する形態学的検討

リンパ節内辺縁洞直下に存在する抗原移送細胞(ATC)と濾胞内に存在する抗原提示細胞のひとつである濾胞樹状細胞(FDC)の関係について検討した。1 Wistar系ラットに同時にHRPとKHLという2種類の抗原を用いた実験で、HRPを20回連投し、KHLを3回投与した後にそれぞれの標識抗原を投与し、抗原の局在を観察すると、(1)KHLはFDC上に観察されるが、HRPはほとんど観察されなかった。(2)ATCはKHL、HRP2種類の抗原を同時に取り込んでいた。2リポソーム封入クロドロネートの投与による実験では、辺縁洞直下のMOMA-1陽性細胞(ラットではED3に相当する抗体)が消失した。follicle内に存在するFDC上には抗原が結合していた。3抗原投与回数の増加に伴いED3陽性細胞が減少した。follicle内では40回投与でFDCのED5およびMRC OX-2に対する反応が減弱した。これらはFDCのMarkerとして有効であるとの報告からFDCの消失、あるいは膜抗原性の変化の両面が考えられた。しかし、S-100 proteinに対する染色性や電子顕微鏡による観察と合わせて考えるとFDCはfollicle内に残存し、膜抗原性に変化が生じた可能性が示唆された。MRC OX-2抗原はtype2 cytokineの産生に対するsignalとして働くことからType2 cytokine産生の抑制が、間接的にB細胞のplasma cell分化への抑制を起している可能性が示唆される。以上のことから辺縁洞直下に存在するMOMA-1陽性細胞(ED3陽性細胞)はATCと異なる細胞であること、またATCとFDCの抗原結合態度が異なることから、ATCとFDCは異なった細胞であり、FDCが過剰の抗原に対して、負のfeedbackをかけている可能性が示唆された。抗原移送細胞(ATC)は二次免疫応答時の抗原の移送、調整に関与するheterogeneousな細胞群でFDCともIDCとも異なったtypeの細胞であると考えられる。また、リンパ節内に存在するFDCは抗原提示細胞としてだけでなく、血中の抗体価調整のためのfeedback機構を担っていると考えられるがその機序やATCとの関係については未だに明確にされていない。2 FDCの抗原結合に関与するreceptorの変化を確かめるために、ED1,ED3,ED5,S-100 protein,OX-2などの抗体を用いて免疫組織化学的に検討したところ、S-100 proteinに対する陽性反応は投与回数に関係なく、胚中心の網工として顕著に認めれたが、ED5,OX-2に対する反応は20回連投群では濾胞明領域に網目状に観察されたが、40回投与群ではFDCが存在しているにもかかわらず(電子顕微鏡で確認)反応が減弱する傾向を示した。3 ED3陽性細胞はcontrol群では髄質および辺縁洞直下の皮質部に存在したがHRP連投20回、40回の群では辺縁洞直下のED3陽性細胞が減少した。以上のことから1 ATCはFDCと異なった細胞である可能性が強いこと、辺縁洞直下には種々のtypeの細胞が存在すること、ATCはED3陽性細胞とは別の細胞、すなわち非マクロファージ系の細胞であることが示唆された。

2 FDCの表面マーカーの一部が抗原結合能を反映する可能性が示唆された。二次免疫応答時に濾胞への抗原の移送に関与する抗原移送細胞(ATC)の形態的特徴や瀘胞樹状細胞(FDC)との機能的な関係について検討した。リポソーム封入クロドロネートの投与により、貪食能の盛んな細胞を減少させた後に抗原刺激を行ったラットの膝窩リンパ節に、免疫組織染色、電子染色を施し観察したところ、リポソームの投与により、(1)辺縁洞直下のMOMA-1陽性細胞(ラットではED3に相当する抗体)が消失した。FDC-M1およびFDC-M2陽性細胞は非投与群と同様に網目状に胚中心で観察された。(2)リポソーム投与群ではtingiblebody macrophageが減少し、apoptosisを起こした細胞が、FDCの突起上に存在しているのが観察された。抗原は、FDC上に観察された。(3)血中抗体価はリポソーム投与群と非投与群で差がなかった。(4)電子顕微鏡観察では大型のATCが抗原を細胞質内に取り込み辺縁洞から、胚中心へ向かい突起を伸ばしていた。互いに連絡し、網目状に分布した細胞の表面に抗原が存在した。(5)細胞質の電子密度、細胞小器官の発達や核chromatinの違いにより2つの型のFDCが存在した。MOMA-1陽性細胞が消失したにもかかわらず、FDC上には抗原が結合していたことから、ATCはMOMA-1陽性細胞とは異なった細胞である。濾胞内への抗原の移送は細網細胞様のATCにより行われたが、本細胞と形態的に異なった特徴を持つFDCとの関係については今後さらに検討する必要があると考えられた。ATCは存在部位によりその特性を異にするheterogeneousな細胞群であることが確認された。
コーピングの柔軟性に関する２過程理論の構築に向けて：柔軟なコーピングを養うために

本研究は、人が日常生活で遭遇するストレスに対してどのように対処するのか、すなわちストレス解消方法の研究です。ストレス解消方法を専門用語ではコーピングと呼んでいます。ストレスの研究では、人間が遭遇するストレスの性質や特性に応じて、ストレスに対する対処の仕方を変えることが、ストレスとうまく付き合うことができると考えられています。そのことはコーピングの柔軟仮説と呼ばれていて、本研究では、この仮説を実証しました。研究目的に照らし合わせ、主に以下の3つの研究を実施した。(1)柔軟性仮説の検証(実験):*ストレス課題初年度は、一般的に使用されているストレス課題を使用。具体的には、ストループ課題や疼痛課題。*柔軟性の測定Kato(2012)と同様*ストレス反応の測定:質問紙、生理的指標、行動観察。生理的指標としては、心拍や血圧の時系列のデータ(5分間隔)、コルチゾール、sIgA、αアミラーゼ(唾液採集:コットン法)。行動観察では、ビデオカメラを用いて瞬目や視線の移動などを測定。(2)類似概念(認知的柔軟性など)との関連性の検証(主に実験):ストレス以外の別の研究領域でにおける柔軟性研究における、研究手法を用い、コーピングの柔軟性の測定に挑んだ。2過程理論に基づいて測定したコーピングの柔軟性と、他の研究領域における柔軟性との関係を比較し、2過程理論に基づいて測定したコーピングの柔軟性が、どのような柔軟性の側面を測定しているのか、現在、分析分析中である。(3)縦断的研究(質問紙調査):申請期間を含め、5年間にわたって、コーピングの柔軟性が長期的なストレスの緩和効果(QOLも含め)が望めかどうか検証するため、平成25年度に得るべきデータを着実に収集した。申請書類通り、平成26年度において研究が計画され、実際に実施されております。詳しくは、下記のとおりです。いずれも、前年度の研究成果を受けて実施いたしました。(1)柔軟性仮説の検証(主に実験)*ストレス課題実生活により近いストレス課題を用い、柔軟性仮説を検証します。具体的には社会的ストレス課題(TSST課題)やオリジナルの課題を用いて、実験を複数回実施いたしました。(2)類似概念との関連性の検証(主に実験)前年度の研究成果を受け、主に創造性や独創性との関係について研究します。そして、コーピングの柔軟性の測定方法について再検を行うための実験を実施いたしました。(3)縦断的研究第3回から第5回(平成26年度から28年度毎年1月)質問紙調査を実施いたしました。具体的な質問紙の構成は9月から11月にかけて決定し、その後、実際の調査を実施いたしました。(4)非臨床群を対象にした、実践介入効果の検証平成25年度の研究成果を受け、平成26年度に詳細な研究計画を立てという計画に従い、平成26年度では、実際の実験を実施することなく、次年度に実施するための詳細な計画を立案しました。主たる内容は、下記のとおりであり、これも申請書と一致しております。実験協力者は日頃ストレスを感じている20歳以上の成人であり、研究機関を通じて募集します。介入(操作)はパッケージではなく、ひとつひとつの操作(訓練)に分けて行い、どの要因がどのような側面に効果を発揮したのかを検証いたします。ストレス反応は上記の実験と同じ指標を用います。研究採択時(および研究申請時)にすでに提出しました研究申請書に従い、主に、以下の点において、研究を実施してまいりました。研究のテーマは、ストレスに対するコーピングの柔軟性に関する研究であり、コーピングとはストレスに対する対処行動(ストレス解消方法を意味します)。コーピングの柔軟性とは、ストレスフルな状況に応じて、適切なコーピング方略を用いることを意味します。この研究では、ストレスは限定することなく、一般的なストレス全般に関して研究を行いました。第一に、ストレスに対して柔軟に対処するスキルが、ストレスを緩和したり、社会的適応やQOL(Quality of Life)を高めたりすることと、どのように関連しているのか、なぜ、そのような効果があるのか、実験や調査を通じて、詳細に検証しました。第二に、ストレスマネジメントへの応用を目的とした、柔軟に対処することのできるスキル獲得のための、実践向けの基礎的なデータを提供しました。この研究では、主に、抑うつ症状との関係性について調べました。上記の研究実績で記載した通り、申請した書類通り、ほぼ研究を遂行しており、問題もなく、順調に研究が推移しております。ストレス平成26年度、および、それ以前の研究を受けて、研究が順調に実施されていることから、平成27年度の研究は、申請書類通りの研究を実施する計画を立てており、平成27年4月現在、詳細な年間計画を立てております。研究計画以上の早いペースで、研究は進行している。特に、早い段階から業績を上げることができた。しかし、平成26年度は、比較的時間のかかる課題であるため、平成26年度終了時には、計画通りのペースになると推測している。

平成26年度は、比較的時間のかかる課題であるため、平成26年度終了時には、計画通りのペースになると推測している。ただし、提出した研究計画通りに、研究を進める。
超効率バイオアッセイシステム開発のためのインクジェット技術の確立

インクジェットプリンタにより培地及び細菌を紙に印刷し、顕微鏡によりコロニー成長を評価することで数時間のうちに最適環境条件を決定できるバイオアッセイシステム開発を目指した。ポリスチレンのトルエン溶液に浸漬し全面疎水化したろ紙に、培地を形成したい区画にだけトルエンを印刷してポしスチレン樹脂を溶かし出し、親疎水性パターンを作製した。印刷中のゲル化を押さえるため、インクカートリッジの加熱と寒天の硫酸加水分解による粘度調整を行って寒天水溶液を印刷した。その上でバクテリアが24時間成長を続けることも確認した。さらに重合開始剤を含むポリビニルアルコール培地の印刷によってもバイオアッセイシステムを構築できた。バクテリアの一例として遺伝子組み換え大腸菌の分散液を用い、試験用インクジェット印刷機を使ってシート状に成型した寒天培地上に印刷した。ピエゾ方式で吐出されるときのせん断力下でも大腸菌が生存し、2日後にどのドットでもコロニーの成長が確認された。次にインクジェットで吐出される1滴あたりのバクテリアの数が一定になるかどうかを確認するために、バクテリアのモデルとして直径1μmのアクリルラテックスエマルションをインクジェット紙上に吐出し電子顕微鏡で観察して粒子数を数えた。粒子数は±10%程度の誤差に収まっていた。さらに、複数の生育環境条件を小面積で実現することに加え、操作性、印刷作業性、易廃棄性の向上のために、培地を保持する容器であるシャーレに代えて紙を使用できないかどうかを検討した。まず、ポリスチレン(高い疎水性)のトルエン溶液にろ紙を浸漬し乾燥させることにより全面を疎水化した。その上に培地エリアとなる5mm×7mmの矩形を配置したパターンをトルエンで印刷しエッチングを行った。トルエンは既に紙上にあるポリスチレンを溶解し、周囲部分に流し出すので矩形内は親水性に戻る。またトルエンに青色染料を溶解させておくことにより親水性部分を可視化することができた。培地水溶液をこの親水性エリアに印刷し、さらにその上にバクテリアをインクジェット印刷し、コロニー成長を観察することになるが、この段階はまだ手作業で行っている。培地水溶液をインクジェットプリンタで印刷できるように寒天を硫酸で加水分解し、粘度及びゲル化温度の調整を行っている。また、成長後のコロニーの面積など評価には、共焦点レーザー走査顕微鏡を使い、レーザーの波長を切り替えることにより識別して親水性のエリア、培地の分布をそれぞれマッピングできることに成功した。昨今、センサーやエレクトロニクス機能を持つ紙基板デバイスが盛んに発表されており、紙が高機能素材として利用されている。紙は単に安価であるに留まらず易廃棄性やリサイクル性の高く、他材料にはない多孔質構造由来の液体輸送/保持機能がここでは活用されている。その応用の1つとして、生物学における迅速バイオアッセイシステムへの紙の活用を本研究の目的とした。通常の微生物や細胞の培養では、シャーレに寒天培地を固定し菌を接種する作業が人の手によって行われ、接種の形状や細胞数が一定ではなく、網羅的実験には多くのシャーレを要する。インクジェットプリンタ(IJP)により培地及び細菌を紙に印刷し、紙の多孔構造にそれらを固定できれば迅速な培地作製と接種が小面積で行うことができ、顕微鏡によりコロニー成長を評価すれば数時間のうちにバイオアッセイが終了する。このようなシステム開発を行った。IJPと紙を組み合わせて使う目的はろ紙上で培地をパターニングし、栄養条件やpHが異なる複数の小区画を作り出すことにある。寒天を紙の上に直接保持するためには周囲が強い疎水性でありながら弱親水性の区画が必要となる。そのため、3%のポリスチレンのトルエン溶液にろ紙を2時間浸漬して乾燥し、点在するポリスチレンによりろ紙全面を疎水化した。培地形成区画箇所にトルエンだけを印刷してポリスチレンを溶出し、弱親水性化した。硫酸加水分解により寒天粘度を調整してゲル化までの時間を制御し、IJPにより寒天培地を区画上に形成した。手作業でバクテリアを接種したところ、コロニーが成長したことを確認した。24時間経過すると寒天が乾燥しはじめ、繁殖が止まったが、本システムでは24時間以内に判別できるシステムを目指しているため問題ではない。使用後は焼却により廃棄が簡単という利点もある紙培地とIJPによる高精度分注との連動による新たなバイオアッセイシステムの基礎が確立された。超効率バイオアッセイシステム開発を目的としたインクジェット技術の確立を目指す研究という位置づけで実験を開始した。実験は、微小液量の吐出制御を自由に行うことができるインクジェット技術を確立することと、シート形状培地を使うことが初期段階の目標であった。