hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＲＮＡとＤＮＡデータの複合解析で明らかにする遺伝性疾患の新規発症メカニズム

本研究ではエクソーム解析で原因解明のできない症例に対して、RNA・DNAデータを統合して解析するための基盤研究と、実際の検体での検討を行った。まず最初にRNA-Seq単体に加えて、エクソームキャプチャーを加えたRNA-Seqを開発し、どちらがより本申請の達成に有利かを検討した。次にアレル特異的発現を示す遺伝子を網羅的に検索した。290の候補の中には、23のインプリント遺伝子が含まれていた。その他にアレル特異的発現が知られているMRPL43やERAP2遺伝子なども検出された。さらに候補遺伝子が疾患の発症に寄与しているかを検討するために、有害な変異候補を持つ臨床検体のスクリーニングまでを行った。[研究の目的・意義]申請者はこれまでにエキソーム解析を主軸とした遺伝性疾患における新規原因遺伝子の研究を進めてきた。その中で単純にDNAを調べるだけでは原因が不明なままの症例が多く存在することに気付いた。本申請はこのような症例のRNAレベルで起きている配列変異・発現異常が遺伝子疾患の発症機序にどう関わっているかを明らかする。[平成24年度での計画実行]1.細胞内の発現量に左右されずに、RNAを平均的にシークエンスする系の作成を行った遺伝子のエキソン部位に相補的な合成オリゴを用い、サンプルRNA(cDNA)とハイブリダイズ後、回収し、シーケンスする系を構築した。2.RNAデータとDNAデータを統合した解析によるRNA変異の基礎研究を行ったDNAデータからは変異アレルの真の発現状態を見ることができない。そのため具体的には以下の2つについて研究を進めた。a特定のアレルだけが発現している遺伝子の同定まず3サンプルについて、DNA exome/RNA-seq/cDNA-basedexomeの3手法によるデータを揃えた。加えてRNA-seqを17サンプルにおいて行った。これらのデータを比較することで、片アレルに偏って発現している遺伝子候補を複数抽出できた。この中には既に偏りを受けると知られている遺伝子がいくつか含まれていた。上記の解析とは逆にDNAレベルでは変異がなく、RNAレベルで初めて変異が入ったと考えられる塩基の同定も行った。全体的に想定した形で進んでいる。ただしRMA-seqの検討を入れた部分で遅れが生じた。得られたデータを検証した段階で想定した遺伝子が含まれており、計画どおりに進められている。今後、解析手法のブラッシュアップを進めつつ、次年度の実験を行なっていく。1.特定のアレルだけが発現している遺伝子の同定: RNA/DNAのデータを比較することで、片アレルに偏って発現している遺伝子候補を複数抽出できた。この中には既に偏りを受けると知られている遺伝子が少なくとも10以上含まれていた。本年度の解析で複数サンプルで同様の偏りが見出された候補もあり、新規のアレル特異的発現、またはインプリント遺伝子の同定に有用なデータである。2. RNAレベルで置換されている塩基の同定:上記の解析とは逆にRNAレベルで初めて塩基置換が入ったと考えられる候補の同定も引き続き行った。シーケンスの性質上、候補内での疑陽性率が高いため、本年度内に発表された解析プロトコールも参考にしつつ、候補の絞り込みを行った。3.複合データでの変異解析: 2と並行して、実際の検体で疾患の原因となりうるデータの探索を行った。本年度ではアレル特異的発現をする遺伝子候補の中から、ミトコンドリア関連遺伝子であるもの、かつ実際の検体にレアバリアントが存在するものを探索した。全体的に想定した形でデータを得る部分は進められている。得られた遺伝子発現データは疾患原因遺伝子の探索においても有効に活用できている。解析の優先順序を変更し、疾患発生機序にインパクトを与えやすい特定アレルだけが発現している遺伝子の解析を先に進めた(上記3)。ここで得られた候補については実際に発症の原因となるものか検証実験を進めていく。これまでにcDNA-bas edexomeの実行とRNA-seqのデータ解析を進められている。コストを抑えるために、RNA-seqを外注する部分で遅れを生じることになった。当初の計画の20サンプルは越して(23取得済み)おり、24年度計画に挙げた1・2a・2cはおおむね達成できた。

計画の一部を変更し、シーケンス部分を外注したことの遅れで2b(同義置換の影響の解明)の進捗がなかったため、自己点検の評価は3とした。25年度が最終年度であるため、記入しない。24年度の計画に沿って、初年度の基礎データは遅れがあったものの計画どおりに得ることができた。解析結果についても事前調査から予想していた挙動を示すことから、ほぼ変更なく推進していく考えである。今年度に2回・3回目のシークエンスデータを取得し、並行して計画に沿って解析を進めていく。シーケンス部分に関してはコスト抑制のため、手法検討以外の部分は外注することに転換した。これによりデータを得るまでに時間がかかり、計画より解析を行える時期にずれが生じた。繰り越した部分は2回目のシークエンスに充てる予定だったもので、25年度前半にそのままの目的で使用していく。またその他の部分で変更はない。
歯髄幹細胞分化における転写因子ネットワーク機構の解明

歯髄幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、神経細胞等への分化能を有する体性幹細胞の一つである。これまでの研究成果から、歯髄幹細胞に特徴的に高発現している転写因子MSX1が歯髄幹細胞の高い骨分化能と関係していることが明らかになってきた。そこで、MSX1の作用機構を解明するためにMSX1の下流で働く因子を、DNAマイクロアレイによって網羅的に解析した。未分化状態の歯髄幹細胞をMSX1siRNAで処理し、MSX1の発現をほとんど消失させた。その細胞からRNAを抽出し、コントロールの歯髄幹細胞(コントロールsiRNAで処理した細胞)のRNA発現量と比較した。その結果、NF331,ZNF730などのzincfingerタンパク質やDACT1, WNT2, SHISA3, RPS6KA2などのシグナルタンパク質をコードする遺伝子の発現が、MSX1ノックダウンによって増加していた。一方、FOXS1やFOXA1などの転写因子、細胞間シグナル伝達に関わるセマフォリンファミリー遺伝子の発現がMSX1ノックダウン細胞では低下していた。我々は、骨芽細胞に分化誘導した歯髄幹細胞でも同様の実験を以前行っており、今回の結果と比較した。そして、共通してMSX1ノックダウンにより影響を受ける遺伝子群(Wntシグナルに関わる遺伝子等)、および骨芽細胞分化時にのみ発現変化が見られる遺伝子群(コレステロール代謝に関わる遺伝子等)を特定した。歯髄幹細胞に特異的に高発現している遺伝子としてMSX1, MSX2, TBX2に注目して、研究を進めている。歯髄幹細胞分化におけるMSX1の解析(特に骨芽細胞分化との関係)は進んでいるが、他の2つ遺伝子についてはまだあまり進展していない。その理由として、MSX1と比べMSX2とTBX2の歯髄幹細胞での発現量は細胞差が大きく、結果にばらつきが見られやすいためである。個体差の影響を無くすために、複数の歯髄幹細胞を用いて解析を行う必要があると考えている。マイクロアレイ実験で得られた候補遺伝子から、MSX1の下流で作用し歯髄幹細胞分化を制御している遺伝子を絞り込む。また、骨芽細胞分化以外の分化(脂肪分化や神経分化)に対するMSX1の作用メカニズムを解明するために、MSX1のノックダウン実験を行う。MSX2,TBX2については、MSX2,TBX2の発現量の異なる複数の歯髄幹細胞を用いて分化誘導実験を行い、発現量と分化能の関係性について調べる。遺伝子ノックダウン実験および遺伝子発現解析に必要な費用が最初の予想よりも少なかったために、次年度使用額が生じた。当初の研究計画に追加して、新たに脂肪細胞分化誘導した歯髄幹細胞のMSX1下流シグナル経路の解析実験を行う。次年度使用額はこれらの実験等に使用する。
高機能性人工タンパク質の化学合成

蛋白質と核酸の相互作用は生命現象にとり最も重要なものの一つであるとの認識にもとずき「高機能性人工タンパク質の化学合成」のタ-ゲットとしては魚類プロタミン等DNA結合蛋白質を中心に研究を進めた。また当初の計画にはなかったが、癌転移抑制能という高機能をもつ人工タンパク質の合成に成功した。(1)プロタミンによるDNA凝集・凝縮機能はArg残基による静電的な相互作用のみでは説明がつかず、プロタミン分子中央部に2ヶ存在するPro残基が関与した折れ曲り構造によるDNA凝集メカニズムが示唆されたため、この部分を単純化したプロタミンモデルペプチド類を合成した。(2)プロタミンの2量体、3量体を化学合成し、これの機能をプロタミンと比較した結果、1で述べたDNA結合メカニズムを考慮すると結果が矛盾なく説明できる事がわかった。(3)そこで次に折れ曲り構造に大きく関っていると思われるプロタミン中の2つのPro残基をArgに置換したプロタミンアナログを全合成しこれのDNAとの相互作用を詳細に調べたところ、このアナログはプロタミン機能の多くの特色を失っていた。Pro残基の重要性が具体的に示唆されたと言える。(4)(1)で合成について述べたProを含む単純化したプロタミンモデルやこのモデル中のProをGlyに置換したペプチド、さらにはこのProを含まないArgのみのペプチドにつき、そのコンホメ-ションやDNAとの相互作用を比較し多くの知見を得た。(5)転写の過程で主役を演じるRNAポリメラ-ゼ中に見出されたペプチド繰り返し配列部分の役割につき知見を得るためこの部分の合成をスタ-トした。(6)フィブロネクチンやラミニン等の細胞接着部位の配列を繰り返しもつポリペプチド類を合成した。これらは癌の転移を著明に抑制し、高機能性人工タンパク質の化学合成が成功を収めた一例となった。蛋白質-核酸相互作用は生命現象にとり最も重要な生体内相互作用(生命現象)の一つであるとの認識にもとずき、高機能性人工タンパク質の化学合成例としては精子特異性DNA結合タンパク質であるプロタミンをモデルとし、この蛋白質の機能を発現するより単純な(ポリ)ペプチド合成を試みてきた。プロタミン機能に関する現在までの研究の結果、この塩基性蛋白質とDNAとの結合は単なる静電時あるいは疎水的相互作用のみでは説明できず、なにかより高度な機能発現メカニズムがあり、それには多くのプロタミン類の一次構造中に共通して存在する分子中央部の2つのPRO残基が関与し、この残基付近での折れ曲がり構造がこの機能に強く貢献している事が示唆された。従ってまず、1.プロタミン機能発現にとり重要と思われる分子中央部を単純化したアルギニンとプロリンよりなるペプチドを合成した。この部分はプロタミン分子中の折れ曲がり構造部分と推定され、非常に重要な部分であるが、この部分だけでは低機能しか示さないと思われる。2.上記1のペプチドの折れ曲がり構造に大きく関与するプロリン残基をグリシンに変えたペプチドを合成した。(ネガティブコントロール)3.上記1と2で合成した2種類のペプチドのアミノ末端及びカルボキシル末端にアルギニンペプチドを結合させた2系統のペプチドを合成した。4.3で述べた2種類のペプチドにつきDNA結合能、DNA凝集能等のプロタミン様機能を測定している。予想どうりプロリンを含むペプチドがよりプロタミン様であれば、さらにプロタミンに近い機能を発現するもう一歩複雑化したモデル(ポリ)ペプチドを合成し、"高機能性人工タンパク質"の化学合成を実現する予定である。「高機能性人工タンパク質の化学合成」のタ-ゲットとしては、昭和63年度に引き続き魚類精子核中のDNA結合蛋白質プロタミンを中心に研究を進めた。

また、より高度なDNA認識機能をもつと思われるDNA結合蛋白質、RNAポリメラ-ゼにつきその合成化学的な研究をスタ-トした。さらに、当初の計画にはなかったが、癌の転移を抑制するという高機能性人工タンパク質の化学合成において大きな成功を収めた。(1)プロタミンの構造-機能関係を調べるための合成化学的アプロ-チとしてプロタミンの2量体、3量体、等を合成し、これとプロタミンとの機能の比較からプロタミンのDNA凝集メカニズムは単にArg残基による静電的な相互作用のみでは説明がつかず、プロタミンの折れ曲り構造のような立体構造の関与が示唆された。(2)そこで次に折れ曲り構造に大きく関わっていると思われるプロタミン中の2つのPro残基をArgに置換したプロタミンアナログを全合成しこれのDNAとの相互作用を詳細に調べたところ、このアナログはプロタミン機能の多くの特色が消失していた。Pro残基の重要性が具体的ち示唆されたといえる。(3)そこで、昭和63年度より進めてきたProを含む単純化したプロタミンモデルやこのモデル中のProをGlyに置換したペプチド、さらにはこのProを含まないArgのみのペプチドにつきそのコンホメ-ションやDNAとの相互作用を比較し多くの知見を得た。(4)RNAポリメラ-ゼIIの最大サブユニット中に最近見出されたヘプタペプチドの繰り返し部分をペプチド合成の手法とDPPAを用いる重合法で合成しつつある。(5)細胞接着性の蛋白質であるフィブロネクチンやラミニン中の細胞接着部位ペプチド配列を繰り返しもつ規則配列ポリペプチドを合成した。このポリペプチドは癌の転移を著明に抑制し、高機能性人工タンパク質の化学合成が大きな成功を収めた例と言える。
近世におけるオランダ船誂物輸入の研究

19世紀前半に、蘭船が日本に持ち渡った誂物(=注文品)に焦点を絞り、その輸入実態を日蘭両側の貿易史料を照合・解明し、日蘭貿易における誂物の位置付けを試みた。まず、享和3年弘化4年の蘭船輸入誂物の用語集を完成させ、今まで発表してきた誂物に関する論考を加えて著書としてまとめた。その後、将軍の誂物である御用御誂物に注目し、幕末になるに従って貿易品の中で、それが最も重要視させてきていることを明らかにした。今年度は、19世紀前半、特に1840年代の日本にオランダ船が持ち渡った誂物(=注文品)に焦点を絞り、その輸入実態(品目名・種類・数量・原産地等)を日本・オランダ両側の貿易史料を照合しながら解明し、国際的商品流通ならびに長崎を起点とする国内流通とその文化的影響について調査研究をおこなった。その手段として、日本側史料としては、主に長崎歴史文化博物館の史料を調査検討し、オランダ側史料としては、東京大学史料編纂所に所蔵されているオランダ国立中央文書館所蔵史料のマイクロフィルム(写真版)を中心に調査検討した。その過程で特に力を入れたことは、今後の誂物研究の基礎的データとなるように、従来の報告者の誂物に関する研究成果と今回の成果を合わせる形で、享和3年(1803)弘化4年(1847)のオランダ船輸入の誂物の用語に関して、A4判110頁におよぶ蘭日対照表(abc順)と日蘭対照表(あいうえお順)を作成したことである。これらの表は、現在予定している来年度の研究成果、ならびに報告者のいままでの誂物および日蘭貿易に関する研究成果とあわせて、来年度著書としてまとめ刊行する予定である。さらに今年度は、誂物にも使用されていた更紗をめぐって、九州天草に残る更紗を現地調査し、その多くがヨーロッパ更紗であったことを確認した。また、19世紀前半のオランダ船の更紗輸入の傾向をまとめ、「インド更紗からヨーロッパ更紗へ-江戸時代後期のオランダ船更紗輸入-」と題して発表した。今年度は、昨年度の研究成果をもとに、19世紀前半にオランダ船が日本に持ち渡った誂物(=注文品)に焦点を絞り、日蘭両側貿易史料を照合しながら解明を進めた。はじめに、昨年度よりまとめてきた享和3年(1803)弘化4年(1847)のオランダ船輸入誂物の用語に関する蘭日対照表(abc順)と日蘭対照表(あいうえお順)を完成させ、さらに報告者がいままでに発表してきたオランダ船の誂物輸入および日蘭貿易に関する研究に加筆修正をおこない、1冊の著書にまとめた(『日蘭貿易の構造と展開』吉川弘文館、平成21年)。本書は3部構成からなっているが、第1部「近世後期の日蘭貿易」の第5章「高島秋帆の洋式砲輸入とその影響」、および、第2部「近世後期の蘭船誂物輸入」・第3部「誂物の基礎的研究」では、今回の研究課題である近世におけるオランダ船の誂物輸入を扱った。その後、オランダ船の誂物輸入に関する研究を継続・発展すべく、誂物の内、特に近世後期における将軍の誂物である御用御誂物に焦点を絞って考察をおこない、日蘭貿易における御用御読誂物の位置付けを試みるために「近世後期におけるオランダ船の御用御誂物輸入について」(『鶴見大学紀要』第47号第4部、平成22年)を報告した。考察の結果、日蘭双方にとって御用御誂物は、幕末になるに従って本方貿易用の荷物よりも重要視されてきていることが判明した。また、その過程でオランダ側が日本側の要求に何とか応えようとする姿勢がみてとれ、それは、オランダ側の日本貿易を介しての対日交流継続に対する強い姿勢のあらわれと読み取った。今年度は、平成20・21年度の成果をもとに、19世紀前半にオランダ船が日本に持ち渡った誂物(=注文品)に焦点を絞り、日蘭両側貿易史料と現物とを照合しながら解明を進めた。はじめに、長崎歴史文化博物館所蔵の「諸書留」3冊とオランダ側史料とを照合する形で調査・分析し、誂物として輸入された品の一部が長崎会所で取引にかけられていたことを解明した。次に、その成果をもとに、昨年度報告した「近世後期におけるオランダ船の御用御誂物輸入について」で得た成果をより具体的に継続・発展するため、将軍の注文品である御用御誂物の内、特に染織品に焦点を絞り、実物の裂を貼り込んでいる「御用御誂切本」(鶴見大学図書館所蔵)をオランダ側史料と突き合わせることにより、その詳細な取引を明らかにし、御用御誂物における染織輸入の実態と意味を解明すべく「御用御誂物としての染織輸入-

「御用御誂切本」の紹介を兼ねて-」(『鶴見大学紀要』第48号第4部)を報告した。その結果、数多くのことが判明したが、その中の一つを記せば、本方荷物の取引から御用御誂物にされた品物(染織品)については、本来の本方取引時と御用御誂時では、オランダ側の日本への売値はほぼ同じであるが、長崎会所の五ヶ所商人等への売値は、御用御誂物が本方荷物よりも2倍近くの価格がついており、同じ品物でも御用御誂物としての商品価値が本方荷物よりも高く、当時いかに御用御誂名目に価値が置かれていたかが判明した。また、本稿で考察対象とした「御用御誂切本」は文政7年(1824)から天保7年(1836)までの御用御誂物としての反物の内、長崎会所で取引にかけられる反物の裂を貼り込んだ「切本」であり、御用御誂物として日本側に入った反物の取引を記し、また、一部ではあるが現物の裂を確認することができる実際的な史料として非常に価値の高いものであることを明らかにした。
ホヤ胚の脊索形成にかかわる遺伝子カスケードの解析

今年度はホヤ胚の脊索形成に関わる遺伝子カスケードを解析するために、脊索で特異的に発現するマボヤAs-T(Brachyury)のシスエレメントとトランス因子の解析を行った.また、Brachyury遺伝子の下流で働く遺伝子を同定するために、マポヤの脊素細胞に特異的に発現する遺伝子の解析、および、カタユウレイボヤCi-Bra(Brachyury)によって発現が誘導される下流遺伝子群の解析を行った.1.As-Tの5'上流領域の解析:マボヤ受精卵へ顕微注入を行い、脊素特異的エンハンサーを含む領域を限定すると、上流領域-289bpではLacZ活性が脊素細胞のみで発現するが、,-270bpでは発現が見られない.さらにAs-T遺伝子が発現する原腸胚期の核抽出液中に、脊索での発現に必須な30bpの配列に特異的に結合する因子が存在した.また、As-T遺伝子の上流領域-171bPから-152bpの間に存在するBrachyury結合配列を除くと脊素での発現は検出されず、脊索細胞のみで発現する5'上流領域As-TLacZコンストラクトとAs-TmRNAを同時に顕微注入した胚では異所的にLacZ活性が検出されることから、As-T自身がAs-T遺伝子の発現をオートレギュレーションしている可能性が示唆された。2.Brachyury下流遺伝子の解析:マボヤ尾芽胚の尾部(脊索を含む)のみに発現する遺伝子として、脊素および神経索に発現し、SH2ドメインを含む新規遺伝子Hr-SH2をクローニングした。また、カタユウレイボヤのBrachyury(T)ホモログCi-Braをエレクトロポレーションにより過剰発現させ、Ci-Braによって発現が誘導される501クローンの下流遺伝子群を単離した.501全てのクローンについてin situハイブリダイゼーションを行い、脊索細胞で特異的に発現する遺伝子のcDNAクローンが48クローン含まれていることが明らかになり、現在これら遺伝子の解析を進めている.今年度はホヤ胚の脊索形成に関わる遺伝子カスケードを解析するために、脊索で特異的に発現するマボヤAs-T(Brachyury)のシスエレメントとトランス因子の解析を行った.また、Brachyury遺伝子の下流で働く遺伝子を同定するために、マポヤの脊素細胞に特異的に発現する遺伝子の解析、および、カタユウレイボヤCi-Bra(Brachyury)によって発現が誘導される下流遺伝子群の解析を行った.1.As-Tの5'上流領域の解析:マボヤ受精卵へ顕微注入を行い、脊素特異的エンハンサーを含む領域を限定すると、上流領域-289bpではLacZ活性が脊素細胞のみで発現するが、,-270bpでは発現が見られない.さらにAs-T遺伝子が発現する原腸胚期の核抽出液中に、脊索での発現に必須な30bpの配列に特異的に結合する因子が存在した.また、As-T遺伝子の上流領域-171bPから-152bpの間に存在するBrachyury結合配列を除くと脊素での発現は検出されず、脊索細胞のみで発現する5'上流領域As-TLacZコンストラクトとAs-TmRNAを同時に顕微注入した胚では異所的にLacZ活性が検出されることから、As-T自身がAs-T遺伝子の発現をオートレギュレーションしている可能性が示唆された。また、カタユウレイボヤのBrachyury(T)ホモログCi-Braをエレクトロポレーションにより過剰発現させ、Ci-Braによって発現が誘導される501クローンの下流遺伝子群を単離した.501全てのクローンについてin situハイブリダイゼーションを行い、脊索細胞で特異的に発現する遺伝子のcDNAクローンが48クローン含まれていることが明らかになり、現在これら遺伝子の解析を進めている.
2段階コアセルベーション法による低融点水溶性微粒子のマイクロカプセル化

1.コアセルベート生成条件ポリスチレン-ジクロロメタン溶液にキサンを15倍量加え,振盪,静置して生成した液滴を観察した。その結果,多数の微細なコアセルベート滴を生成させるためには,ヘキサン2倍量の添加が最も有効であることを見出した。2.芯物質粒子の調製りん酸水素2ナトリウム12水をヘキサン中で融解させて(w/o)分散系を調製した後,急冷凝固させて芯物質粒子を調製した。界面活性剤濃度2.03.0mol・cm^<-3>,攪拌速度5.07.0s^<-1>の非常に狭い範囲でのみ,凝集のない微粒子を得ることができた。得られた芯物質粒子はほぼ真球状であり,表面は平滑であった。粒径は界面活性剤濃度と攪拌速度により制御できた。3.マイクロカプセルの調製第1段階として非溶媒を添加し,第2段階として良溶媒を蒸発・除去する2段階コアセルベーション法によりマイクロカプセルを調製した。得られたマイクロカプセルの壁厚は攪拌速度を大きくすると厚くなり,調製時間を短縮することが可能となった。これは芯物質粒子とコアセルベートとの衝突頻度が増大するためである。壁厚はまた界面活性剤濃度を大きくすると薄くなる傾向が認められた。このことから,コアセルベーションの条件ばかりでなく,芯物質の調製条件もまたマイクロカプセルの調製過程に影響を及ぼすことを見出した。本研究の一部の成果については,化学工学会つくば大会にて口頭発表を行った。現在,投稿準備中である。
異種電気物性領域をもつビスマス層状構造酸化物の設計

ビスマス層状構造酸化物は、ビスマス層と疑ペロブスカイト層が積層された結晶構造をもち、物性異方性の強い強誘電・圧電材料として知られている。しかし、その結晶構造(特にペロブスカイト層内の酸素八面体の数m)、強誘電性相転移温度と強誘電物性の相関はまだ十分に明らかでない。また、2種のペロブスカイト層が規則的に配列した交代層構造体では、強誘電性はほとんど調べられていない。本研究では、種々のビスマス層状構造酸化物の単結晶を育成し、結晶軸毎にその構造と強誘電物性の相関の評価を行うとともに、いくつかの交代層構造体を合成しその相転移および強誘電物性を調べた。さらに、方向により強誘電性、導電性が同時に発現する結晶体の設計・創製を目的に、半導性をもつビスマス層状構造酸化物の探索を行った。単結晶での強誘電性評価から、残留分極値はキュリー温度に、抗電界と分極反転速度はペロブスカイト層内の酸素八面体の数mに強く依存することが明らかとなった。また、mが1と2、2と3および3と4からなる交代層構造体の多結晶体の合成に成功し、それらの強誘電性相転移と強誘電物性を初めて明らかにした。mが1と2、2と3の系では、それを構成する単層体の相転移温度付近に2つの相転移が、またmが3と4の系では、単層体の相転移温度の中間付近に1つの相転移が見られることを確認した。交代層構造体では交代層を構成する単層体よりも大きな残留分極値をもつものを見出した。さらに、チタン酸ビスマスおよびBi-Te-Fe-O系酸化物のTiあるいはFeの一部をMnで置換した固溶体では、Mn固溶量とともに導電率が増大しp型半導性を示すようになることを明らかにした。ビスマス層状構造酸化物は、ビスマス層と擬ペロブスカイトブロックが積層された結晶構造を有し、その構造に由来する異方性電気物性をもつ。本研究では、導電性のべロブスカイト層と強誘電性のべロブスカイト層が絶縁性ビスマス層をはさんで規則的に配列した層状構造結晶を作製することにより、方向により強誘電性・高導電性という異種物性が同時に発現する材料を設計・開発することを目的とする。平成10年度は以下の研究成果が得られた。(1)導電性ペロブスカイト層をもつ酸化物合成:高導電性が予想された材料系の中から、ペロブスカイトBサイトにMnを含むBi_5Ti_3MnO_<15>(BTM)を選び、その多結晶体作製と物性評価を行った。ホール係数および導電率測定から、導電キャリアはホールであり、ホール濃度・導電率はこれまでに報告されているビスマス層状構造酸化物の中で最大であった。導電率の酸素分圧依存性および移動度の温度依存性から、ホールのホッピングによるp型半導性であると考えられた。(2)異なるペロブスカイト層をもつ交代層構造体の作製:上記のBTMと代表的強誘電体であるBi_4Ti_3O_<12>(BIT)からなるBi_9Ti_6MnO_<27>(BTBM)多結晶体を作製した。格子定数は、c軸方向でBTMとBITのそれぞれの値の和の1/2に相当し、他の交代層で見られる結果と一致した。

透過型電子顕微鏡で格子像を観察した結果、部分的にではあるが交代層構造が形成されていることが確認された。この多結晶体の導電率はBTMとBITの導電率の間にあり、BTMにより近い値を示した。(3)単結晶化の試み:BTBMの単結晶を温度勾配徐冷法およびフラックス法により試みたが、得られた結晶はMnが固溶したBITであり、BTBMの単結晶はまだ得られていない。今後さらに単結晶化を試み結晶方位毎の物性評価を行う予定である。ビスマス層状構造酸化物は、ビスマス層と疑ペロブスカイト層が積層された結晶構造をもち、物性異方性の強い強誘電・圧電材料として知られている。しかし、その結晶構造(特にペロブスカイト層内の酸素八面体の数m)、強誘電性相転移温度と強誘電物性の相関はまだ十分に明らかでない。また、2種のペロブスカイト層が規則的に配列した交代層構造体では、強誘電性はほとんど調べられていない。本研究では、種々のビスマス層状構造酸化物の単結晶を育成し、結晶軸毎にその構造と強誘電物性の相関の評価を行うとともに、いくつかの交代層構造体を合成しその相転移および強誘電物性を調べた。さらに、方向により強誘電性、導電性が同時に発現する結晶体の設計・創製を目的に、半導性をもつビスマス層状構造酸化物の探索を行った。単結晶での強誘電性評価から、残留分極値はキュリー温度に、抗電界と分極反転速度はペロブスカイト層内の酸素八面体の数mに強く依存することが明らかとなった。また、mが1と2、2と3および3と4からなる交代層構造体の多結晶体の合成に成功し、それらの強誘電性相転移と強誘電物性を初めて明らかにした。mが1と2、2と3の系では、それを構成する単層体の相転移温度付近に2つの相転移が、またmが3と4の系では、単層体の相転移温度の中間付近に1つの相転移が見られることを確認した。交代層構造体では交代層を構成する単層体よりも大きな残留分極値をもつものを見出した。さらに、チタン酸ビスマスおよびBi-Ti-Fe-0系酸化物のTiあるいはFeの一部をMnで置換した固溶体では、Mn固溶量とともに導電率が増大しp型半導性を示すようになることを明らかにした。
規格緩和下における民営型農業技術開発・普及システムの構築に向けた日欧比較研究

デンマーク、オランダにおける農業技術開発・普及システムの民営化の経過と特徴を整理した。両国における普及(アドバイス)の内容から各経営に即したオーダーメイドのアドバイスが行われていることを明らかにし、それが成立する要因を検討した。また、日本における公的普及システムを概観するとともに、民間型技術普及の実態を施設園芸資材販売会社の取り組みから特徴を整理した。デンマークの農業普及システムは、2つの農民組合を核として組織された「デンマーク農業」の傘下にあるナショナル・アドバイザリーセンター(The Danish Agricultural Advisory Centre:DAAC)と地域センターからなる。この普及組織は行政からも民間企業からも独立し、農家への支援のみを目的として組織されている。DAACは普及に供しうる情報や新知識の収集、技術やソフトの開発等と地域センターへの情報提供を行っている。地域センターはDAACや大学、研究機関、民間企業から支援を受けるが、その運営方針、人事、財政は独立している。普及員の最も重要な業務は農家に必要な情報や知識、技術を提供し、求めに応じて農家の相談相手(スパーリングパートナー)になることである。農家は自分の経営に適した最新の技術や情報、アドバイスを地域センター、ナショナルセンターの普及員から入手できる。また、民間企業から直接入手することも可能である。提供される情報はいずれも有償であるため、農家は支払った料金に見合ったものかどうかを厳密に評価する。つまり、各普及センターや企業は技術や情報の最終消費者である農家を巡って競争関係にあり、それが高水準の情報提供とタイムリーな顧客ニーズへの対応、効率的な組織運営の源泉となっていると考えられる。わが国の農業普及システムは、農業改良助長法に基づき都道府県ごとに設置された公的組織である。普及に対しては農家の経営改善に果たすスペシャリスト機能と地域農業の振興等関係機関や団体との協力体制の構築や調整を行うコーディネート機能の2つが要求されている。後者の機能があるのは、経営体の確立や農業・農村の振興というような地域農業レベルでの活動が求められていることによる。この点が農企業経営を対象にスペシャリスト機能のみのデンマークの普及システムと大きく異なる点である。オランダの技術普及は1990年まで当時の農業省の中央と州事務所が担当していたが、財政の緊縮や多様化・個別化・高度化した技術ニーズへの迅速な対応への要請、民間の普及サービスの向上など背景に公的普及の民営化が進められた。民営化された普及組織がDLVである。民営化の過程で農業省のアドバイザーが個人コンサルタントとして独立や民間の資材会社やコンサルタント会社に移る動きが加速され、その結果、技術サービスを提供する主体が多様化した。これらは競争関係にあり、的確なアドバイスを与えることが顧客確保に結びつくため、その内容は「需要主導型アドバイス」へと転換した。このアドバイスを実現するには相手の要求を正確に聞き取る能力及びこちらが提供できるサービス内容を的確に伝える能力(コミュニケーションスキル)が新たに必要となるが、その能力獲得のためのコミュニケーション一般の教育やOJTなどの教育メニューが確立されている。同時にアドバイザーは特定の作物の栽培管理技術のスペシャリストだけでなく、マーケティングまでカバーするジェネラリストとして顧客である経営者のすべての要求に応える能力も求められている。こうしたアドバイザーの能力向上とその支援が有料化した技術普及システムを成立させている。わが国の民間型技術普及のひとつである資材販売会社(施設園芸)の技術指導の内容をみると、販売した栽培システムの管理や施肥・防除資材の使用に関する指導が中心で、これらはいずれも無料で行われている。中でも資材会社開発の栽培システムを導入した農家に対しては出荷目標など経営管理に関するアドバイスも行われており、オランダのそれに近いものと考えられる。しかし、資金導入では制度資金借入のため公的普及機関の指導に依存しており、公的部門が一定の役割を果たしている。
新規アポトーシス遺伝子の作用機構と臨床応用に関する研究

1、PL-3の物性とアポトーシス誘導機構の解析PL-3タンパク質はミトコンドリアに局在することを明らかにした。PL-3遺伝子を導入した細胞ではミトコンドリアから放出されたチトクロームcがcaspase経路を活性化してアポトーシスが誘導すること、またPL-3によるチトクロームcの放出はBcl-2ファミリータンパク質には非依存性でありPermeability Transition Poreを形成するタンパク質であるCyclophilin Dに依存性であることを明らかにした。2、動脈硬化血管における発現解析アデノウィルスによるPL-3遺伝子の導入系を確立した。ラット頚動脈内膜擦過による内膜肥厚モデルに対してアデノウィルスによるPL-3遺伝子導入によって内膜肥厚を抑制できる可能性を示した。これによって遺伝子治療への応用が可能となった。3、ノックアウトマウスの作製マウス胎児幹細胞の培養系を確立した。PL-3遺伝子のターゲティングベクターを培養マウス胎児幹細胞に電気穿孔法により導入し、遺伝子改変細胞を得た。PCRあるいはサザンプロット法により正常にターゲティングが行われた幹細胞を選別しマウスブラストシストにマイクロインジェクションした結果、数匹のキメラマウスの作製に成功した。4、平滑筋細胞の表現系と発現の解析PL-3遺伝子発現を定量するためのReal Time PCR系を確立し、合成型と収縮型の平滑筋細胞ではPL-3遺伝子発現レベルが異なることを明らかにした。平滑筋細胞増殖因子による刺激に対してPL-3遺伝子が変化することを確認した。5、アポトーシス誘導における必要十分性の検討PL-3遺伝子発現を抑制するためのアンチセンスプラスミドあるいはsiRNA導入システムを確立した。PL-3遺伝子発現を抑制した細胞はアポトーシス誘導刺激による細胞死に対して耐性となることを明らかにした。我々はマウス動脈硬化プラークからPL-3遺伝子をクローニングした。PL-3は細胞にアポトーシス(細胞死)を誘導する新規遺伝子である。PL-3遺伝子にコードされるタンパク質は細胞質内のミトコンドリアに局在する。現在までに知られている細胞質内のアポトーシス関連タンパク質は共通の構造を有していることからBcl-2ファミリーと呼ばれるファミリーを形成しているが、PL-3タンパク質はBcl-2ファミリーには属さない新しいタンパク質であることが明らかとなった。そこでBcl-2ファミリーとの機能的な違いを調べたところ、PL-3によって誘導されるアポトーシスはアポトーシス抑制タンパク質として知られるBcl-xLあるいはBcl-2による抑制を受けなかった。したがってBcl-2ファミリーとは異なる経路を介してアポトーシスを誘導しているものと考えられた。またBcl-2ファミリーに属するタンパク質tBidによって誘導されるアポトーシスはCyclosporin AあるいはL-carnitineによって抑制されなかったが、PL-3によるアポトーシスは抑制された。Cyclosporin AあるいはL-carnitineはミトコンドリア上のPermeability transition pore(PTP)と呼ばれるporeが開かないように作用する。したがってPL-3はBcl-2ファミリータンパク質とは異なり、PTPを開くことによって、アポトーシスを誘導しているものと考えられた。このことはPTP構成タンパク質のひとつであるCyclophilin Dを欠損した細胞ではPL-3によるアポトーシスが誘導されないことからも確認された。以上のことからPL-3は従来知られているアポトーシス誘導タンパク質とは異なり、ミトコンドリア上のPTPを開いてアポトーシス誘導物質(チトクロームc)を放出させているものと考えられた。1、PL-3の物性とアポトーシス誘導機構の解析PL-3遺伝子を導入した細胞ではミトコンドリアからチトクロームcが放出されてアポトーシスが誘導されることが明らかにされている。

PL-3によるチトクロームcの放出はBc1-2ファミリータンパク質には非依存性であり、Permeability Transition Poreを形成するタンパク質であるCyclophilin Dに依存性であることが明らかになった。2、動脈硬化血管における発現解析動脈硬化のモデルとしてラット頚動脈擦過による内膜肥厚モデル系を確立し、アデノウィルスによるForkhead遺伝子導入によって内膜肥厚を抑制できることを明らかにした。またアデノウィルスによるPL-3遺伝子の導入系を確立した。3、ノックアウトマウスの作製PL-3遺伝子ノックアウトマウス作製のため遺伝子ターゲティングベクターを作製しマウス胎児幹細胞に電気穿孔法により導入した。PCRあるいはサザンブロット法により正常にターゲティングが行われた幹細胞を選別しマウスブラストシストにマイクロインジェクションした結果、数匹のキメラマウスの作製に成功した。4、平滑筋細胞の表現系と発現の解析PL-3遺伝子発現を定量するためのReal Time PCR系を確立した。合成型と収縮型の血管平滑筋細胞モデルではPL-3遺伝子発現レベルが異なることを明らかにした。平滑筋細胞増殖因子による刺激に対するPL-3遺伝子発現変化を測定しPL-3遺伝子が変化することを確認した。5、アポトーシス誘導における必要十分性の検討PL-3遺伝子発現を抑制するためのアンチセンスプラスミドあるいはsiRNA導入システムを確立した。PL-3遺伝子発現を抑制した細胞はアポトーシス誘導刺激による細胞死に対して耐性を獲得することを明らかにした。
インターロイキン1インヒビターを用いた歯槽骨吸収阻害剤の開発

歯周炎は歯槽骨の吸収を特微とする疾患である。この炎症局所の骨吸収には、マクロファージや多形核白血球が産生するインターロイキン1(IL-1)が関与していると考えられる。そこで、歯槽骨吸収阻害剤の開発を目ざしてマクロファージの培養上清からIL-1インヒビターの分離・精製し、その骨吸収阻害活性を調べた。大腸菌のリポ多糖を72時間マウスマクロファージ株化細胞P3888D_1に作用させたところ、その培養上清中にIL-1インヒビターが遊離された。そこで、このインヒビターを酢酸抽出、Bio-Gel P-60ゲル濾過法、DEAE-Sepharose CL-6Bイオン交換クロマトグラフィー、C18疎水性カラムやゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで精製した。精製したIL-1インヒビターはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量67,000付近に1本のタンパク質バンドとして認められた。等電点は4.8であった。同インヒビターは熱や酸に対して安定で、トリプシンヤdi-thiothreitolによる処理で不活化された。同インヒビターはマウスやヒト由来のIL-1によるC3H/HeJマウス胸腺細胞の増殖を抑制したが、IL-2によるIL-2依存性CTLL-2細胞の増殖や高濃度のコンカナバリンAによるC3H/HeJマウス胸腺細胞の増殖には影響しなかった。以上の所見は、今回精製したインヒビターがIL-1に特異的に作用することを示している。ついで、IL-1刺激BALB/Cマウス頭蓋骨の吸収に及ぼすマウスマクロファージ様株化細胞由来のIL-1インヒビターの影響を調べた。その結果、精製したIL-1インヒビターは15μg/mLで10^<-11>MのIL-1の骨吸収活性を完全に抑制した。この結果から、本インヒビターが歯周炎における骨吸収のコントロールに有用である可能性が考えられた。歯周炎は歯槽骨の吸収を特徴とする疾患である。この炎症局所の骨吸収には、マクロファ-ジや多形核白血球が産生するインタ-ロイキン1(ILー1)が関与していると考えられる。そこで、歯槽骨吸収阻害剤の開発を目ざしてマクロファ-ジの培養上清からILー1インヒビタ-の精製を試みた。マクロファ-ジ株化細胞P388D_1(1×10^6/ml)を10μg/mlのEscherichia coli K235由来のリポ多糖と72時間培養した。培養上清(8l)を1%酢酸で処理したあと、BioーGel Pー60でゲル濾過したところ、ILー1インヒビタ-活性をもつ2つのピ-クが溶出した。両ピ-クについてTGFβ活性を調べたところ、低分子量のピ-クに同活性が認められたので、高分子量ピ-クについてさらに精製を進めた。すなわち、DEAEーSepharase CLー6Bを用いたイオン交換クロマトグラフィ-、μBand a pack C_<18>カラムやGSー510カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ-などによって精製した。

その結果、GSー510カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ-によりILー1インヒビタ-は1本のタンパク質のピ-クとして溶離されたので、このピ-クを回収し、精製ILー1インヒビタ-標品とした。上述した精製ステップによりILー1インヒビタ-は629倍まで精製され、回収率は19%であった。精製ILー1インヒビタ-のSDSーポリアクリルアミド電気泳動上での分子量は67,000、pI値は4.8であった。現在、さらに大量のILー1インヒビタ-を精製し、その生化学的および生物学的諸性状について検討中である。歯周炎は歯槽骨の吸収を特徴とする疾患である。この炎症局所の骨吸収には、マクロファ-ジや多形核白血球が産生するインタ-ロイキン1(ILー1)が関与していると考えられる。そこで、本研究ではマクロファ-ジ株化細胞の培養上清からILー1インヒビタ-を精製し、歯槽骨吸収阻害剤としての応用の可能性を検討する。本年度は、前年度に続きマクロファ-ジ株化細胞P388D_1を大腸菌のリポ多糖で剌激し、その培養上清からカラムクロマトグラフィ-法によりILー1インヒビタ-を約200mg精製した。ついで、同インヒビタ-のアミノ酸組成を決定した。精製ILー1インヒビタ-は、56°C、30分間や100°C、5分間の加熱処理やIMHCl処理に対して安定であったが、トリプシンやDithiothreitolでの処理でほぼ完全に失活した。同インヒビタ-は、マウス由来のILー1、組換えヒトILー1αおよび組換えヒトILー1βの低濃度のコンカナバリンA・共存下におけるC3H/HeJ胸腺細胞の[ ^3H]チミジン取り込み活性を強く抑制した。しかし、インタ-ロイキン2存在下におけるCTLLー2細胞による[ ^3H]チミジン取り込みには影響しなかった。ついで、ILー1インヒビタ-の歯槽骨吸収阻害活性を評価するために、マウス頭蓋骨の器官培養を用いた骨吸収実験系を確立した。すなわち、妊娠マウスの皮下に^<45>CaCl_2して、24時間後に胎児を取り出し、その橈骨と尺骨を4872時間器官培養する。培養終了後、培養液中に遊離してきた放射能活性を測定した。器官培養時に、既に骨吸収を誘導することが知られているリポ多糖を添加したところ有意な量の^<45>Caが培養上清中に遊離された。今後、本実験系におけるILー1の骨吸収活性を測定するとともに、ILー1インヒビタ-の骨吸収阻害活性について調べる予定である。最近、歯周炎の病原菌としてActinobacillus actinomycetemcomitansやPorphyromonas gingivalisなどが注目されている。そこで、歯周炎局所における歯槽骨の吸収を誘発するような因子の産生をこれらの細菌の菌体成分が誘導している可能性が考えれる。現在、骨吸収因子の1つとしてインターロイキン1が注目されている。本研究では、骨吸収のコントロールを目的としてインターロイキン1インヒビターの開発を目ざしている。本年度も昨年度に引き続き、マウスマクロファージ株化細胞P388D_1の培養上清からインターロイキン1インヒビスターを分離し、カラムクロマトグラフィーにより精製した。ついで、精製したインターロイキン1インヒビターのアミノ酸組成を決定した。
森林源流域から進行する窒素飽和メカニズムの解明と森林炭素蓄積能力への影響評価

平成30年度は、研究対象地域として選定した源流域から窒素飽和が進行している可能性がある北海道標茶町の北海道研究林(落葉広葉樹林)の林内部と農畜産由来の大気アンモニアの沈着の影響を受けやすい林縁部に複数の調査区を設けた。生育期における観測結果により、以下のことが明らかになった:林縁部では林内部に比べて、(1)大気アンモニアの地上濃度とその窒素沈着量は高く、(2)O層における有機物の炭素貯留量とC/N比は低かったがδ15Nは高く、(3)表層土壌(0-5 cm層)の細菌量が多く、(4)土壌中の硝酸態窒素の現存量と硝化活性がO層および表層土壌で高く、(5)立木の胸高断面積合計の増加量が高かった。以上の結果から、空間的に不均一な窒素沈着が落葉広葉樹林の窒素・炭素動態に影響している可能性を明らかにした。当初予定していたコアサイトでの大気・土壌・植物・陸水等の観測を順調に行うことができた。得られた結果から、空間的に不均一な窒素沈着が落葉広葉樹林の窒素・炭素動態に影響しているかもしれないという学術的価値の高い結果を得ることができた。平成31年度は、成果発表に向けて京都大学北海道研究林標茶区の複数の調査プロットで下記の追加観測を行う:複合気象測定システムとパッシブサンプラーによる気象要素と無機窒素成分の大気濃度の測定、複数の雨量計とバルクサンプラーを用いた林内雨の測定、リタートラップを用いた樹木から土壌への炭素・窒素のインプット量の測定、(サーマル)ドローンを用いた森林構造と渓流水の水温の面的測定。必要に応じて、微生物群集構造等の土壌有機物動態に影響を及ぼしうる土壌・微生物特性の分析も行う。得られた成果は学会や学術論文の形で発表するとともに、東京農工大学の大学院講義やシンポジウム・ワークショップを通じた大学教育や学術界・一般社会への還元も検討する。地球規模で問題となっている大気中の反応性窒素の生態系への過剰負荷による窒素飽和は、自然の窒素循環を乱して富栄養化をもたらすだけでなく、森林の炭素蓄積機能にも影響を及ぼす。しかし、森林への窒素負荷をもたらす窒素沈着量は、集水域内でも空間的ばらつきが極めて大きく、従来のように限られた一地点でのモニタリングから窒素負荷の影響を評価することは難しい。本プロジェクトでは、源流域から窒素飽和が進んでいる森林集水域において、大気・土壌・植生・河川を包括した窒素・炭素循環の多地点同時観測を行い、大気から森林への窒素負荷の空間分布を評価する。さらに、窒素負荷と渓流水質の関係に基づいて窒素飽和の進行メカニズムを解明し、窒素負荷の度合いに応じて樹木や土壌の炭素蓄積機能がどのように変化するかを明らかにすることを目指す。本年度は、北海道東部の京都大学フィールド科学教育研究センター標茶研究林にある放牧地に隣接した森林集水域での大気アンモニア濃度・林内雨・渓流水質の多地点観測を行った。定点観測の期間は2017年5月から10月であり、微気象要素・大気アンモニア濃度・林内雨量・雨水中窒素濃度を観測した。また、2017年8月6日および10月5日には、コアサイトの集水域で渓流水中無機窒素濃度を測定した。得られたサンプル中の無機イオン濃度は、北海道立総合研究機構ならびに茨城大学でイオンクロマトグラフ法により定量した。その結果を解析したところ、林縁の窒素負荷量は林内のおよそ2倍になることと、その原因の一つとして農牧地由来の大気アンモニアの乾性沈着が考えられることがわかった。得られた成果を第65回日本生態学会大会等で発表した。平成29年度は、当初予定していたコアサイトである北海道東部の標茶研究林における大気・集水域定点観測と多地点水質観測を順調に行うことができた。定点観測では、窒素負荷や水質汚染度と森林炭素収支の季節変化を把握するための大気中のアンモニアガスと霧水中のアンモニウム成分濃度、林内雨の観測を樹木の生育期を通じて行うことに成功した。また、植物生育期で農業活動が活発になる春から秋にかけて、コアサイトのいくつかの集水域で多地点水質観測を行い、同一集水域内で渓流水質が明瞭に異なる地点を抽出し、次年度以降の大気ー土壌ー植生系の本観測を行う上で適切な集水域を決定することができた。さらに、予備観測の結果から林縁の窒素負荷量は林内のおよそ2倍になることと、その原因の一つとして農牧地由来の大気アンモニアの乾性沈着が考えられるという学術的価値の高い結果を得ることができた。

得られた結果から、空間的に不均一な窒素沈着が落葉広葉樹林の窒素・炭素動態に影響しているかもしれないという学術的価値の高い結果を得ることができた。当初の計画通り、平成29年度に選定したコアサイトにおける6つのプロットで、大気ー土壌ー植生系の多地点同時観測を行う。大気中濃度と森林への窒素負荷量の観測では、森林の影響が少ないと思われるギャップ等に簡易自動気象測定システムとパッシブサンプラーを複数台設置し、沈着量を見積もるための気象要素と無機窒素成分の大気濃度を測定する。また、複数の雨量計とバルクサンプラーを用いた林内雨の測定によって、森林樹冠への窒素沈着量を測定する。負荷された窒素の植物・土壌への分配の観測では、生葉やリター、土壌試料を採取し、採取した試料の炭素・窒素・リン含有量および比と、土壌水の無機窒素濃度などを測定する。さらに、降水・林内雨・渓流水の窒素や酸素、渓流水の溶存有機炭素の同位体比を測定する。土壌呼吸と土壌有機物動態の観測では、土壌試料を化学的方法または物理的方法で分画した後、各有機物画分の炭素含有量、安定炭素・窒素同位体比を測定する。必要に応じて、土壌pH、微生物バイオマス炭素量、微生物群集構造等の土壌有機物動態に影響を及ぼしうる土壌・微生物特性の分析を行う。樹木光合成および活性と群落構造の観測では、樹木の葉の生理特性や形質、窒素負荷量の空間分布や葉群光合成に影響する樹木位置・葉面積指数の鉛直分布・樹高・胸高直径などを測定する。平成31年度は、成果発表に向けて京都大学北海道研究林標茶区の複数の調査プロットで下記の追加観測を行う:複合気象測定システムとパッシブサンプラーによる気象要素と無機窒素成分の大気濃度の測定、複数の雨量計とバルクサンプラーを用いた林内雨の測定、リタートラップを用いた樹木から土壌への炭素・窒素のインプット量の測定、(サーマル)ドローンを用いた森林構造と渓流水の水温の面的測定。必要に応じて、微生物群集構造等の土壌有機物動態に影響を及ぼしうる土壌・微生物特性の分析も行う。得られた成果は学会や学術論文の形で発表するとともに、東京農工大学の大学院講義やシンポジウム・ワークショップを通じた大学教育や学術界・一般社会への還元も検討する。