hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
わが国農業・農村のダイナミズムと政策評価：ミクロデータによる実証研究

本研究の目的は、これまで蓄積されてきた農林水産統計の個票データを用いて、1わが国農業・農村の動態や農家家計の変貌、すなわち、農業・農村のダイナミズムを明らかにするとともに、2ミクロ計量経済学の手法により、農業政策の評価を定量的に行うことである。本年度は、「農林業センサス」、「農業経営統計調査」、「集落営農実態調査」や「復興定点観測調査」などの個票データを用いて、主に以下の点を明らかにした。第一に、昨年度に引き続き、「農業経営統計調査」の個票パネルデータによって、農業補助金の地代への影響を検討した。その結果、北海道では、補助金が地代に転化する現象はみられるものの、その影響はアメリカを対象とした先行研究に比して、軽微であることがわかった。わが国では、補助金の地代化は構造政策上の重大な問題とは考えにくい。第二に、「集落営農実態調査」の個票データによって、集落営農への農地集積条件を検討した。その結果、滋賀県に限定した分析ではあるものの、区画整理率などの圃場条件、集落の立地や寄合回数が農地集積と関係していることがわかった。第三に、「復興定点観測調査」の個票データによって、東日本大震災被災農家の世代間復興格差を検討した。その結果、震災から2年が経過した段階でも、その被害は生産活動に持続的な影響を及ぼしていたことや、その影響は高齢農家で強く残った可能性が示唆された。また、分析過程において、本データが深刻なサンプルセレクションバイアスを伴うこともわかった。第四に、「農林業センサス」の個票パネルデータによって、稲作単一経営のトップ経営体を対象に、その販売経路の特徴等を整理し、消費者への直接販売が農産物販売額にもたらした効果を検討した。その結果、消費者への直接販売(直販)の実施率が低下傾向にあることや、直販が家族経営体において農産物販売額を高める効果をもたらしたことがわかった。年度内に研究会を4回開催し、各研究者の研究成果の報告や進捗チェックを行うことにより、ほぼ当初の計画通り研究を推進することができた。また、得られた成果の一部を学会の特別セッションや関連学会において発表するとともに、国際的学術雑誌などで公表を図った。さらに、上記の研究実績の概要で述べた研究結果以外にも、研究成果の公表に向けて着実に研究が展開されていると考える。次年度は、本年度に得られた成果の一部を学会の特別セッションなどで発表するとともに、得られた成果を学術雑誌等に投稿し、公表を図る。また、これまでに得られた成果を学術図書としてとりまとめるための検討を進める。なお、本年度は昨年度に引き続き、主に「農林業センサス」の個票データをはじめとするミクロデータを用いて、政策評価や農村・農家行動のダイナミズムを明らかにする。具体的には、「集落営農実態調査」の個票データを用いた集落営農の効率性の計測や、「農林業センサス」個票パネルデータ等を用いた法人化のインパクト評価に取り組むとともに、ゾーニング規制が農業構造に及ぼした影響の解明などを試みる。また、得られた知見は、学会大会での発表や学術雑誌等への投稿、さらには学術図書を通じて公表を図る。本研究の目的は、これまで蓄積されてきた農林水産統計、具体的には「農林業センサス」、「農業経営統計調査」、「集落営農実態調査」、「米及び麦類の生産費調査」や「復興定点観測調査」の個票データを用いて、1わが国農業・農村の動態や農家家計の変貌、すなわち、農業・農村のダイナミズムを明らかにするとともに、2ミクロ計量経済学の手法により、農業政策の評価を定量的に行うことである。本年度は、主に「農林業センサス」や「農業経営統計調査」の個票データを用いて、暫定的ながら、以下の点を明らかにした。第一に、「農業経営統計調査」の個票パネルデータを用いて、農業補助金の地代ならびに経営規模拡大への影響について検討した。その結果、補助金が地代に転化する現象(補助金の地代化)はわずかにみられるものの、その影響は軽微であること、また、補助金が経営規模拡大を牽引していることを表すエビデンスを得ることができた。第二に、「農林業センサス」の個票パネルデータを用いて、中山間地域等直接支払制度が農業構造に及ぼした影響について検討した。その結果、制度参加集落の農家では借入の増加を通じて、経営規模が拡大しており、こうした動きは大規模農家ほど明確に表れているものの、全サンプルでは当該制度の規模拡大への効果は小さいことがわかった。第三に、「農林業センサス」の個票データを用いて、稲作単一経営のトップ経営体に着目して、その特徴と動態を整理した。その結果、トップ経営体は、他の経営体よりも借地化と法人化が進展していることや、トップ経営体の経営規模の成長速度は他の経営体よりも速く、とりわけ雇用法人経営について、このことがあてはまることなどがわかった。年度内に研究会を複数回開催し、各研究者の研究成果の報告や進捗チェックを行うことにより、当初の計画通り研究を推進することができた。また、上記の研究実績の概要で述べた研究結果以外にも、「集落営農実態調査」や「復興定点観測調査」の個票データを用いた分析についても推進しており、研究成果の公表に向けて着実に研究が展開されていると考える。

本研究の目的は、これまで蓄積されてきた農林水産統計の個票データを用いて、1わが国農業・農村の動態や農家家計の変貌、すなわち、農業・農村のダイナミズムを明らかにするとともに、2ミクロ計量経済学の手法により、農業政策の評価を定量的に行うことである。本年度は、「農林業センサス」、「農業経営統計調査」、「集落営農実態調査」や「復興定点観測調査」などの個票データを用いて、主に以下の点を明らかにした。第一に、昨年度に引き続き、「農業経営統計調査」の個票パネルデータによって、農業補助金の地代への影響を検討した。その結果、北海道では、補助金が地代に転化する現象はみられるものの、その影響はアメリカを対象とした先行研究に比して、軽微であることがわかった。わが国では、補助金の地代化は構造政策上の重大な問題とは考えにくい。第二に、「集落営農実態調査」の個票データによって、集落営農への農地集積条件を検討した。その結果、滋賀県に限定した分析ではあるものの、区画整理率などの圃場条件、集落の立地や寄合回数が農地集積と関係していることがわかった。第三に、「復興定点観測調査」の個票データによって、東日本大震災被災農家の世代間復興格差を検討した。その結果、震災から2年が経過した段階でも、その被害は生産活動に持続的な影響を及ぼしていたことや、その影響は高齢農家で強く残った可能性が示唆された。また、分析過程において、本データが深刻なサンプルセレクションバイアスを伴うこともわかった。第四に、「農林業センサス」の個票パネルデータによって、稲作単一経営のトップ経営体を対象に、その販売経路の特徴等を整理し、消費者への直接販売が農産物販売額にもたらした効果を検討した。その結果、消費者への直接販売(直販)の実施率が低下傾向にあることや、直販が家族経営体において農産物販売額を高める効果をもたらしたことがわかった。年度内に研究会を4回開催し、各研究者の研究成果の報告や進捗チェックを行うことにより、ほぼ当初の計画通り研究を推進することができた。また、得られた成果の一部を学会の特別セッションや関連学会において発表するとともに、国際的学術雑誌などで公表を図った。さらに、上記の研究実績の概要で述べた研究結果以外にも、研究成果の公表に向けて着実に研究が展開されていると考える。次年度は、本年度に得られた成果の一部を学会の特別セッションにおいて発表するとともに、得られた成果を学術雑誌等に投稿し、公表を図る。また、本年度に引き続き、主に「集落営農実態調査」や「復興定点観測調査」の個票データを用いて、政策評価や農村・農家行動のダイナミズムを明らかにする。具体的には、「集落営農実態調査」に「農林業センサス」の個票をマッチングさせたパネルデータを用いて、集落営農への支援にいなかる政策が有効であったかを評価するとともに、集落営農の効率性の計測を通じて、非効率性の要因や政策が効率性に及ぼす影響などを検討する。また、「復興定点観測調査」と「農林業センサス」個票のマッチングデータを用いて、世代間での震災からの復興格差などを検討する予定である。なお、得られた知見は、学会発表や学術雑誌への投稿等を通じて公表を図る。次年度は、本年度に得られた成果の一部を学会の特別セッションなどで発表するとともに、得られた成果を学術雑誌等に投稿し、公表を図る。また、これまでに得られた成果を学術図書としてとりまとめるための検討を進める。なお、本年度は昨年度に引き続き、主に「農林業センサス」の個票データをはじめとするミクロデータを用いて、政策評価や農村・農家行動のダイナミズムを明らかにする。
ヒト肝3α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素の胆汁酸結合能と酵素学的検討

ヒト肝よりの3α-hydroxysteroid dehydrogenase(3α-HSD)の精製は以下のように行った。なお、各精製過程においては、各カラムフラクションにつき、OD_<280>、3α-HSDおよびdihydrodiol dehydrogenase(DDH)活性とリトコール酸(LC)の結合を測定した。臓器提供者の肝臓から33%ホモジェネートを作成し、100、000gで超遠心しサイトゾールを得た。これをSephadexG75 superfineカラム(5x100cm)にかけ、3α-HSDとDDH活性を有するY'分画(分子量30,000-40,000)を得た。これをAffigel blueカラムにかけ、燐酸バッファーによるgradientにより溶出したところ、2つのLC結合ピークが認められ、最初のピークにはDDH活性のピークが、2つのLC結合ピークの間には3α-HSD活性のピークが認められた。Affigel blueの3α-HSD活性を含む分画をPBE74によるクロマトフォーカシングで分離すると、pH6.0、5.7および5.4に3つの3α-HSDとDDH活性を有するピークが認められた。なお、LC結合はこれらのピークには認められず、より高いpHに3つのピークとして溶出され、そのうちの最も高い結合ピークはbile acid binderと考えられた。これら3つの3α-HSDピークをhydroxyapatite-HPLCでさらに精製するとSDS-PAGE上、すべて分子量36,000の単一バンドを示す蛋白が得られた。各種胆汁酸を基質としてこれらの酵素のenzyme kineticsを検討すると、3つの酵素とも見かけ上のKmはケノデオキシコール酸で1μM、コール酸で40μM程度であり、ラット肝3α-HSDと同程度であった。以上の結果から、ラット肝と異なり、ヒト肝では3α-HSDはbile acid binderとは別に存在し、酵素学的性格はラットに類似するものの胆汁酸結合のは持たず、ヒト肝内での胆汁酸の輸送にはbile acid binderが重要な役割を持つものと考えらた。
自然流産におけるエピジェネティックな原因と染色体・DNA微細欠失の解明

染色体異常を伴わない自然流産の原因として、エピジェネティックな異常、微細欠失、染色体構築異常等が如何に関わっているかを検討した。X染色体の不活性化を制御するXIST遺伝子の活性をRNA-FISHで測定したところ、FISHシグナルが見られないかそれが極めて弱い細胞の比率が高い検体が存在した。これらの検体の培養細胞によるX染色体のDNA複製パターンを解析した結果、不活性化X染色体のDNA後期複製を認めない細胞の頻度がかなり高く、X染色体不活性化が不完全なケースが存在していると考えられた。この結果は、X不活性化の異常が自然流産の原因として関わっている可能性が強く示唆する。これらの検体でXIST遺伝子の特定構造のPCR解析では異常は検出されなかった。解析をさらに進めるために、異常を示した検体の培養細胞からX染色体不活性化異常を示す細胞クローンの分離を図ったが、これまで得たクローンの中にはRNA-FISHシグナル等の異常は認められなかった。一方、300例以上の自然流産について全常染色体の360のマイクロサテライトの多型解析などで微細欠失を調査し、これまで常染色体にいくつかの欠失を認めた。また、Xが1個の46,XYと45,Xの症例において、X染色体の35マイクロサテライトの多型パターンを分析し、同様に欠失を認めた。これらの欠失部分の構造を明らかにするためにBACクローンを用いて解析を進めた。de novoの均衡型転座を有する自然流産の切断点遺伝子の解析を実施したが、今までのところ切断点遺伝子の特定には到達できていない。サザンブロット等によりX染色体上の遺伝子のメチレーションの異常の検出を試みたが、その異常を示す証拠は得られなかった。マイクロサテライト多型解析で新たに片親性ダイソミーを検出した。またその過程で、片親性トリソミー14を見つけたが、これは世界で最初の発見である。本研究では、染色体異常を伴わない原因不明の自然流産について、X染色体の不活性化の異常やインプリントの異常など、種々のエピジェネティックな異常の関与を解明し、さらに染色体の微細欠失の関与について明らかにすることを目的にしている。今年度はX染色体の不活性化の異常を検出するために、XIST遺伝子の特定領域のFISHプローブを作製し、この遺伝子の活性をRNA-FISHにより検出する方法の確立を図った。この方法はX不活性化異常を定量的に分析する方法として有用性がある。さらに、X染色体上の2遺伝子を用いてメチル化非感受性・感受性制限酵素を用いたサザンブロット等によりメチレーションの異常の検出方法を検討した。これらの方法を確立し、原因不明の自然流産の絨毛細胞標本を用いて、X不活性化異常の有無について解析を進めてきた。異常が検出された場合にはクローニングにより異常細胞を分離し、さらに詳細な解析を行う予定である。また、マイクロアレイ-CGH法によるX染色体上の微細欠失の解析を行うための準備を進めた。微細欠失の予備的情報を得るために、多数のマイクロサテライトの多型解析により、そのマイクロサテライトを含む領域の欠失の有無を調査した。これまでX染色体及び常染色体に欠失を示唆する情報が得られている。一方、de novoの均衡型構造異常を有する自然流産の症例について、その構造異常の切断点遺伝子の特定を図った。平成16年度は染色体7と12の均衡転座を有する症例について切断点を特定するためにBAC FISHを行うとともに、類似の転座切断点の情報を収集した。

これらの検体の収集及び解析は、文部科学省等三省合同による「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」等を遵守して実施した。染色体異常を伴わない自然流産の原因として、エピジェネティックな異常と染色体微細欠失の関与を検討した。(1)X染色体の不活性化を制御するXIST遺伝子の活性をRNA-FISHで測定したところ、FISHシグナルが全体的に弱い検体やシグナルが極めて弱い細胞の比率が高い検体などを認めた。また、それらの検体の培養細胞によるX染色体のDNA複製パターンを解析した結果、一方のX染色体のDNA複製遅延を認めない細胞頻度が高いものがあった。この結果は、X染色体不活性化異常が自然流産の原因として関わっている可能性を示唆する。また、これらの検体でXIST遺伝子の特定領域の構造についてPCRで解析を試みたが、異常は検出されなかった。解析を進めるためにこれら検体の培養細胞からX染色体不活性化異常細胞のクローニングを図ったが、これまで分離したクローンにはRNA-FISHシグナルの異常は認められなかった。(2)多数のマイクロサテライトの多型解析などにより、染色体微細欠失(各マイクロサテライトのプライマーで挟む領域)を調査した。これまでに常染色体及びX染色体の8箇所に欠失を認めた。de novoの染色体7と12の均衡型転座を有する自然流産で切断点遺伝子の解析を実施したが、特定遺伝子の欠失には繋がっていない。また自然流産に見られる転座切断点の情報を収集したが、共通する切断点をもつ症例はまだ限られる。(3)メチル化感受性制限酵素などを用いたサザンブロット等によりX染色体上の遺伝子のメチレーションの異常の検出を試みたが、異常を示唆する検体は得られなかった。なお、これらの検体の収集及び解析においては、文部科学省等三省合同による「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」等を遵守した。
ニューロン・グリア実時間同時イメージングによる脊髄神経可塑性の解析

本研究では、痛覚過敏モデル動物を用いて脊髄後角におけるグリア細胞の形態および数の変化、神経興奮へのグリア細胞の作用、グリア細胞の活動性の変化について、特にグリア細胞に存在するP2X受容体の1つであるP2X_4受容体に注目して実験を行った。実験の結果、グリア細胞で形態の肥大化、数の増加が見られた。また、ノーマルラットに比べて、P2X_4受容体を介したカルシウムシグナルがより多くのグリア細胞で見られ、より活性化されていることがわかった。また、グリア細胞の活動の抑制やP2X_4受容体の阻害は、神経興奮を減少させた。目的神経可塑性の1つである脊髄後角での中枢性感作は、炎症や神経損傷によって引き起こされる痛覚過敏やアロディニアのメカニズムと考えられている。また、近年、脊髄後角におけるグリア細胞が、これらの痛みに直接的に関与していることが示唆されている。本研究では、脊髄後角での中枢性感作へのグリア細胞の関与について、炎症性疼痛と、神経因性疼痛の2種類のモデルラットを用いて調べることを目的とした。方法炎症性疼痛ラットは、フロインドアジュバンドを後肢の足裏に注射することによって作成し、神経因性疼痛ラットは、坐骨神経の中の第5腰髄神経のみを結紮し、末梢側で切断することによって作成した。これらのラットの脊髄後角の神経興奮は、電位感受性色素を用いた光イメージングによって解析した。また、免疫染色によってグリア細胞の形態変化および、p38MAKのリン酸化を可視化した。実験結果実験の結果、どちらの疼痛ラットもvon Freyfilamentによる触刺激に対する痛み行動の閾値の低下を示した。また、後根への単発刺激によって起きる脊髄後角での神経興奮は、ノーマルラットに比べて増大していた。また、ミクログリア抑制剤であるminocyclineは、ノーマル、炎症性疼痛、神経因性疼痛のすべてのラットの神経興奮を抑制したが、特に、神経因性疼痛ラットで顕著であった。非選択的ATP受容体阻害薬であるsuraminは、炎症性疼痛、神経因性疼痛ラットのどちらの神経興奮も抑制したが、特異的P2X1,2,3,5受容体拮抗薬PPADSは、炎症性疼痛ラットの神経興奮を著明に抑制した。また、PPADS投与後の特異的P2X1,2,3,4受容体拮抗薬TNP-ATPの投与では、神経因性疼痛ラットの神経興奮のみが著明に抑制された。したがって、炎症性疼痛の神経興奮の増大にはP2X4受容体以外のATP受容体が関与しており、神経因性疼痛の神経興奮の増大にはP2X4受容体が関与していると考えられる。また、p38MAPキナーゼの阻害薬であるSB203580は、すべてのラットにおける神経興奮を抑制したが、特に、神経因性疼痛ラットで顕著であった。これらの結果を、免疫染色によって検証した結果、神経因性疼痛ラットの脊髄にのみ、ミクログリアの形態変化およびp38MAPキナーゼのリン酸化の増大が見られた。これらの結果は、炎症性疼痛と、神経因性疼痛では、どちらも脊髄後角で感作が起こるが、そのメカニズムは異なり、ミクログリアは、特に神経因性疼痛に大きく関わっていることを示唆する。今後、これらの疼痛ラットの脊髄ミクログリアのATP刺激によるカルシウム応答を〓神経可塑性の1つである脊髄後角での中枢性感作は、炎症や神経損傷によって引き起こされる痛覚過敏やアロディニアのメカニズムと考えられている。実験の結果、ミクログリア抑制剤であるminocyclineは、ノーマル、炎症性疼痛、神経因性疼痛のすべてのラットの神経興奮を抑制したが、特に、神経因性疼痛ラットで顕著であった。非選択的ATP受容体阻害薬であるsuraminは、炎症性疼痛、神経因性疼痛ラットのどちらの神経興奮も抑制したが、特異的P2X1, 2, 3, 5受容体拮抗薬PPADSは、炎症性疼痛ラットの神経興奮を著明に抑制した。また、PPADS投与後の特異的P2X1, 2, 3, 4受容体拮抗薬TNP-ATPの投与では、神経因性疼痛ラットの神経興奮のみが著明に抑制された。

また、p38MAPキナーゼの阻害薬であるSB203580は、すべてのラットにおける神経興奮を抑制したが、特に、神経因性疼痛ラットで顕著であった。これらの結果を、免疫染色によって検証した結果、神経因性疼痛ラットの脊髄にのみ、ミクログリアの形態変化およびp38MAPキナーゼのリン酸化の増大が見られた。また、ノーマルラットに比べて、P2X_4受容体を介したカルシウムシグナルがより多くのグリア細胞で見られ、より活性化されていることがわかった。これらの結果は、痛覚過敏が、脊髄後角内のグリア細胞にP2X_4を介した可塑的変化が起き、その変化が神経興奮を促進させるために起こることを示唆する。
牛呼吸器病症候群における複数病原体感染による重症化機序の解明

牛呼吸器症候群の実態を明らかにするために、牛呼吸器由来上皮細胞株の樹立に取り組んだ。牛呼吸器上皮細胞モデルの作製を試みた。宮崎県食肉検査処理場から健康牛(黒毛牛N=3)から喉頭、気管支、肺胞器官を入手し、気管上皮、気管支上皮、肺胞上皮細胞の初代培養系を作製した。これらの細胞は、継代4代目で95%以上が上皮細胞であることを上皮細胞特異的蛋白質パンサイトケラチンの発現量を測定することにより確認した。また20代目まで細胞生存性に影響なく継代することを確認した。これらの上皮細胞に牛RSウイルスを感染させると、感染5日目において下部気道由来の気管支上皮細胞(8.14 log10/ml)、肺胞上皮細胞(8.15 log10/ml)におけるウイルス増殖性は、上部気道由来の気管上皮細胞(7.34 log10/ml)よりも有意に高くなった(p < 0.05)。また細胞変性効果に関しては、気管上皮細胞では観察できなかったが、肺胞上皮細胞においては顕著な合胞体の形成がみられた。また肺胞上皮細胞における炎症性サイトカインmRNA(IL-1、IL-6)の発現は、気管上皮細胞よりも有意に高かった。これらのBRSV感染呼吸器由来上皮細胞におけるPasteurella multocida細菌の付着性について検討した。下部気道由来の気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞においては、ウイルス感染日数に依存して、P. multocidaの付着性亢進が確認できた。これに対して、上部気道由来の気管上皮細胞においては、ウイルス感染日数が経過するにつれてP. multocidaの付着性が減少するという相反する結果が得られた。以上の結果より、牛の上部気道由来上皮細胞と下部気道由来上皮細胞においてはBRSV感受性、およびBRSV感染後の二次感染を想定したP. multocidaの付着性に大きな違いがあることを明らかにした。当初の予定通り、H30年度に健康牛由来呼吸器器官より、喉頭、気管支、肺胞器官に由来する気管上皮、気管支上皮、肺胞上皮細胞の培養細胞の樹立に成功した。また、これらの細胞列を用いたBRSV感染性および二次感染を想定したP. multocidaの付着性についても評価することに成功した。この結果より、上部気道と下部気道における上皮細胞における病原体感受性が異なることを明らかにすることができた。今年度樹立したそれぞれの細胞列が、牛呼吸器症候群に関連する病原体の病原性解析を行うためには非常に重要なツールであることを意味する。しかしながら、BRSV感染に誘導されるP. multocidaの付着増強因子の同定に至っていない。BRSV感染牛呼吸器上皮細胞において、細胞側の細菌接着因子(ICAM-1、PAF受容体など)の発現レベルを測定し、ウイルス感染による細菌接着因子発現の影響を明らかにする。誘導調節を受ける接着因子、サイトカインの発現誘導に関わる各種情報伝達転写因子の発現をmRNA、ウエスタンブロットにより測定し、ウイルス感染を基盤とした細菌感染の重症化経路を明らかにする。また細胞障害性亢進が確認できた場合には、アポトーシス誘導経路の関与、タイトジャンクション発現への影響を、ウエスタンブロット、mRNAの発現により評価する。混合感染により誘導される転写因子が同定できれば、それらの転写因子遺伝子プロモーター組み換え発光系プラスミドを作製し、病原体の各種タンパク質遺伝子発現プラスミドと共発現させることにより、直接的な転写因子活性を証明する。これにより、重症化機序に関わる病原因子を同定することを目指す。牛呼吸器症候群(BRDC)の実態を明らかにするために、牛呼吸器スワブにおけるBRDC関連病原体遺伝子の検出を試みた。さらに呼吸器上皮細胞を用いたウイルスと細菌の複合感染モデルを作成し、ウイルス感染が及ぼす細菌付着性への影響を調べた。牛呼吸器スワブ101検体においてRT-PCR/PCRにより牛RSウイルス(BRSV)、牛ウイルス性下痢ウイルス、牛パラインフルエンザ3型、牛ヘルペスウイルス1型、Pasteurella multocida、Mannheimiahaemolytica、Histophilussomni、Mycoplasma bovisの遺伝子検出を行った。また、ヒト呼吸器上皮細胞A5492にウイルスを感染させた後、細菌を処理し、細胞表面の細菌付着性を評価した。BRDC病原体遺伝子陽性率は81%であり、陽性検体中の57%から2種以上の病原体遺伝子が検出できた。2種類以上の病原体遺伝子が検出された検体において、ウイルスと細菌の組み合わせが49%を占めた。これらのウイルスと細菌の複合検出検体の組み合わせとしては、BRSVとP. multocidaの組み合わせが多くみられた。しかしながら、病原体の分離は成功しなかった。BRSV先行感染した呼吸器上皮細胞においてP. multocida付着性を調べたところ、BRSVの感染により、P. multocidaの細胞付着率が有意に増加した(p<0.005)。ウイルスと細菌の複合検出率が高く、BRDCには単独ではなく複数の病原体が関与し、ウイルスと細菌による複合感染が高頻度で起きていた。呼吸器上皮細胞へのBRSVの先行感染が、P. multocidaの付着を増強していることが明らかになった。当初の予定では、H29年度に、牛呼吸器症候群に関連する病原体の汚染状況を、新規複合診断方法うにより明らかにする予定であった。食肉衛生検査所、農場、大学附属農場における検体採集が順調に進み、その調査が予定より早く進行した。

本来なら本研究で開発すべき牛呼吸器症候群に対する複合診断方法が、他研究機関より牛呼吸器症候群に対する複合診断開発が行われてしまったために(Kishimoto et al., JVMS, 2018)、我々は、コンベンショナルPCRを用いた解析を行った。この開発時間を利用して、H30年度に予定していたウイルスの先行感染による細菌の上皮細胞付着性への影響を調べることに着手できた。その結果よりBRSVの先行感染が、パスツレラ菌の上位細胞付着性を増強し、同時に炎症性サイトカイン誘導性を活性化することがわかり、ウイルスと細菌の複合感染が重症化に関連している可能性を指摘することができた。牛呼吸器症候群の実態を明らかにするために、牛呼吸器由来上皮細胞株の樹立に取り組んだ。牛呼吸器上皮細胞モデルの作製を試みた。宮崎県食肉検査処理場から健康牛(黒毛牛N=3)から喉頭、気管支、肺胞器官を入手し、気管上皮、気管支上皮、肺胞上皮細胞の初代培養系を作製した。これらの細胞は、継代4代目で95%以上が上皮細胞であることを上皮細胞特異的蛋白質パンサイトケラチンの発現量を測定することにより確認した。また20代目まで細胞生存性に影響なく継代することを確認した。これらの上皮細胞に牛RSウイルスを感染させると、感染5日目において下部気道由来の気管支上皮細胞(8.14 log10/ml)、肺胞上皮細胞(8.15 log10/ml)におけるウイルス増殖性は、上部気道由来の気管上皮細胞(7.34 log10/ml)よりも有意に高くなった(p < 0.05)。また細胞変性効果に関しては、気管上皮細胞では観察できなかったが、肺胞上皮細胞においては顕著な合胞体の形成がみられた。また肺胞上皮細胞における炎症性サイトカインmRNA(IL-1、IL-6)の発現は、気管上皮細胞よりも有意に高かった。これらのBRSV感染呼吸器由来上皮細胞におけるPasteurella multocida細菌の付着性について検討した。下部気道由来の気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞においては、ウイルス感染日数に依存して、P. multocidaの付着性亢進が確認できた。これに対して、上部気道由来の気管上皮細胞においては、ウイルス感染日数が経過するにつれてP. multocidaの付着性が減少するという相反する結果が得られた。以上の結果より、牛の上部気道由来上皮細胞と下部気道由来上皮細胞においてはBRSV感受性、およびBRSV感染後の二次感染を想定したP. multocidaの付着性に大きな違いがあることを明らかにした。当初の予定通り、H30年度に健康牛由来呼吸器器官より、喉頭、気管支、肺胞器官に由来する気管上皮、気管支上皮、肺胞上皮細胞の培養細胞の樹立に成功した。また、これらの細胞列を用いたBRSV感染性および二次感染を想定したP. multocidaの付着性についても評価することに成功した。この結果より、上部気道と下部気道における上皮細胞における病原体感受性が異なることを明らかにすることができた。今年度樹立したそれぞれの細胞列が、牛呼吸器症候群に関連する病原体の病原性解析を行うためには非常に重要なツールであることを意味する。
分子イメージングPET核種を用いた頭部外傷における脳虚血の検出

重症頭部外傷患者における^<18> F-フルオロミソニダゾール(FMISO)を用いた陽電子断層撮影(PET)検査では挫傷部周辺に低酸素領域は確認できなかった。その後、FMISO-PETを用いて脳梗塞と脳腫瘍症例において低酸素領域の検出を試みた。急性期脳梗塞症例では、全例にMRI拡散強調画像での高信号の周辺にFMISO集積領域を認め、その領域の一部は後日梗塞巣へ移行した。また悪性神経膠腫において全例に低酸素領域を認め、その体積はメチオニン-PETでの活動性腫瘍体積と有意な相関関係を認めた。【研究の意義】中枢性ベンゾジアゼピン受容体を定量的に測定できるPET分子イメージングトレーサである11C-フルマゼニル(11C-FMZ)を用いたPET検査を応用した頭部外傷後の高次脳機能障害の病態解明のための研究を平成21年度に実施した。当初の計画では18F-ミソニダゾールを用いた頭部外傷急性期に脳虚血の研究を初年度に進める予定であり症例の蓄積中であるが、急性期に測定が困難で十分な症例が得られないため、慢性期の神経細胞脱落と高次脳機能障害に関する研究を主に行った。【具体的内容】データベース作成のための正常被験者は、男性9名、女性10名の19名(平均年齢24.9±4.0歳、2235歳)であった。また患者群として重症頭部外傷後に高次脳機能障害を後遺した男性4名、女性3名の7名(平均年齢24.6±6.3歳、1936歳)で、原因となった頭部外傷は、びまん性軸索損傷5名、脳挫傷1名、急性硬膜下血腫1名であった。脳挫傷の症例を除いて形態学的画像診断では強い局所性脳損傷は確認されなかった。PET検査は、11C-FMZ静注後60分間のダイナミック撮影を行い、撮像開始後2040分間の画像を収集しbinding potential(BP)画像を作成した。【結果】正常被験者では比較的均一なBP画像が得られ、統計学的画像解析のためのデータベースが得られた。脳挫傷症例では損傷部に一致してFMZ BPの低下が認められた。また他の症例においては、形態学的画像診断では明らかな損傷を認めなかった前頭葉内側(前部帯状回)、前頭葉眼窩面などに共通してFMZ BPの低下が検出された。【結論】正常被検者19名を対象に統計学的画像解析のための正常データベースの構築を行った。頭部外傷に伴う高次脳機能障害患者においてFMZ-PETを施行することにより、形態学的画像診断では異常を認めない部位にも大脳皮質神経細胞脱落が確認された。【具体的内容】急性期のPET検査は、脳挫傷を認めた22名(男性16名、女性6名)を対象とした。また脳内微小透析法(MD)による局所脳代謝と生化学的パラメータの測定は、重症頭部外傷例8名(全例男性)を対象とした。検査は、(1)脳循環代謝測定は、^<15>Oガス吸入法により脳血流量(CBF)、脳酸素代謝率(CMRO_2)、脳酸素摂取率(OEF)を定量的に測定し画像化した。(2)低酸素領域の検出には、FMISOを用いて有意な集積部位を描出した。(3)MDは、プローブを局所性脳損傷では脳挫傷周辺部に留置して1時間毎に連続測定を行った。結果として、(1)脳挫傷周辺部におけるCBFは対側大脳皮質に比較して約89%と軽度の低下であったが、CMRO_2、OEFはそれぞれ約67%、75%と強度に低下しており脳挫傷周辺部において脳血流障害に比して強い脳酸素代謝の障害が認められた(相対的贅沢灌流状態)。(2)今回検討した症例には、脳挫傷周辺部に明らかな低酸素部位は同定できなかった。(3)脳挫傷周辺に留置したプローブからの測定で、乳酸/ピルビン酸比が上昇した症例があった。【意義】脳挫傷周辺ではいわゆる相対的な贅沢灌流状態が、急性期のみならず亜急性期まで持続することが明らかとなった。またFMISOを用いたPET検査により脳挫傷周辺部では明らかな低酸素領域は確認できなかったが、MDでは乳酸/ピルビン酸比が上昇した症例があった。以上の結果から、脳挫傷周辺部にはペナンブラと考えられる低酸素領域は存在せず、急性期から亜急性期にかけて脳血流は改善傾向を示すが、脳酸素代謝障害が長く続くことが明らかとなった。MDで認められた乳酸/ピルビン酸比の上昇は脳虚血以外の要因があると考えられた。【重要性】PETによる研究を積み重ねていくことで頭部外傷に伴う二次的脳損傷に及ぼす脳虚血や低酸素の存在の有無を明らかにすることができると考えられる。

平成22年度の研究で重症頭部外傷患者において^<18>F-fluoromisonidazole(FMISO)を用いた陽電子断層撮影(PET)検査を施行し脳挫傷周辺部での低酸素領域の検出を試みたが、明らかなFMISOが集積亢進を示す低酸素領域は確認できなかった。そのため平成23年度の研究では、FMISO-PETを用いて脳梗塞と脳腫瘍症例においての低酸素領域の検出を試みた。脳梗塞における対象症例は、虚血性脳血管障害の診断、治療の目的で当院に入院しFMISO-PET検査を施行した10例(男性6名、女性4名、平均年齢60.5±19.2歳、27-82歳)である。脳梗塞発症2日以内の急性期に施行した症例は3例、発症3週間以内の亜急性期に施行した症例は3例であり、残りの4例は慢性期の脳梗塞症例である。結果は、急性期症例(発症3040時間)では全例にMRI拡散強調画像での高信号の周辺にFMISO集積領域を認め、その領域の一部は後日梗塞巣へ移行した。亜急性期症例の1例(発症7日後)にもFMISO集積領域を認めたが、その後の脳梗塞巣の拡大はなかった。一方脳腫瘍における対象症例は、病理学的に膠芽腫と診断され、術前にFMISOとアミノ酸代謝を評価するメチオニン(MET)を用いたPET検査を施行した10例(男性7名、女性3名、平均年齢57.8±12.7歳、27-72歳)である。全例に低酸素領域を認め、その体積はMET-PETでの活動性腫瘍体積と有意な相関(r=0.94,P<0.01)関係を認めた。また低酸素領域の体積は、造影MRIで求めた腫瘍体積と同等であった。結論:脳外傷患者においてはFMISOで集積亢進を示す低酸素領域は確認できなかったが、虚血性脳血管障害では発症急性期の症例、悪性脳腫瘍(膠芽腫)では全例に低酸素領域を認めた。低酸素状態は、脳梗塞の進展や悪性脳腫瘍の治療抵抗性に重要な役割を有していると考えられている。FMISOを用いたPET検査を応用することで種々の脳疾患において非侵襲的に低酸素領域を描出することが可能であった。
新型焼結ダイヤモンドを用いた多アンビル型装置による超高圧発生と鉱物合成法の開発

本研究では、新型焼結ダイヤモンド(ADC)の超高圧装置への適用を目的とした試験的研究をおこなた。ADCを一辺9.5mmの立方体に加工し、MA6-8型装置の第二段アンビルとして用い、各種性質のテストをおこなうとともに高温高圧下での合成実験や相転移実験を試みた。更にはADCの特徴を生かし、高温高圧下でのX線回折その場実験のためのシステムを開発した。1.ADC立方体の電気抵抗率やX線に対する透過率、また実際にアンビルとして使用した場合の強度等についての試験をおこなった。この結果、ADCは従来のこの種の製品に比べて非常に高いX線透過率を示した。一方、電気抵抗率も相対的に高いことがわかった。また、強度の点でも高圧装置用のアンビルとして十分実用的であることが明らかになった。2.ADCアンビルの特徴を生かし、"ハイブリッドアンビルシステム"を考案し、比較的容易に30GPa領域での高温高圧実験が可能になった。このシステムを用いて、いくつかのケイ酸塩試料の合成・相転移実験をおこない、このシステムの超高圧下での鉱物合成装置としての有用性を確認した。3.上記のシステムを用いてX線その場観察用のセルを開発した。これを用いて高エネルギー物理学研究所の放射光X線を利用し、26GPa・1200度C程度の条件下でのX線回折をおこなった。この結果、このシステムがこのような目的に極めて有効であることがわかった。このシステムを用いた実験により、ケイ酸塩のアモルファス化に関する従来知られていない興味ある結果が得られている。本年度は新型焼結ダイヤモンド(ADC)の基本的性質の測定とともに、これを多アンビル型装置の第2段アンビルに導入し、高圧発生試験および合成実験を試みた。またWCアンビルを用いた予備実験もおこない、この際愛媛大学の高圧装置にフレームの補強等の改良を加えた。本年度得られた結果と今後の課題について以下に示す。(1)ADCは従来の代表的焼結ダイヤモンド素材であるSYNDIE等に比べ、圧倒的にX線透過率が良いことがわかった。従ってX線その場観察用のアンビルとして実用的であり、今後放射光等を利用した高圧X線回折への応用に向け基礎的実験をおこなう予定である。(2)ADCは放電加工により十分精度よい加工が可能であり、従来品に比べ有利であることがわかった。ただし電気伝導率はSYNDIEに比べ約1桁小さく、ヒーターへのリードとしての使用は困難であることがわかった。従ってアンビルを電極としない加熱システムの構築が必要である。(3)(2)の制約から、第2段アンビルの半数(4個)をWCとし、残りをADCとするハイブリッドシステムを考案、実用化した。これにより、約30GPa、1500°C程度の合成実験が可能になった。現在更にセルの改良によりより広範な条件での安定な実験をめざしている。(4)ADCを用いて圧力発生試験をおこなった。この結果多アンビル装置において40GPa程度の圧力発生が可能であることがわかった。30GPa領域での当初の数回の実験ではADCアンビルに特に破損はみられなかった。しかしその後のくり返し使用により、一部のアンビルにクラックの発生が認められるようになった。従ってADCの強度に関し、これを実用的に用いるためには更に系統的なテストが必要である。本年度は昨年度におけるADCの性能評価および多アンビル型装置のフレーム、加圧制御装置の改良に基づき、以下のような実験をおこなった。尚、ADCの製造、供給が不安定であり、来年度はこれとともに他社の製品も用いて比較検討する予定である。(1)昨年度開発したハイブリッドアンビルシステムを用いて高温発生・測温セルの改良をおこない、30GPa、1500°C領域の安定発生が可能になった。

これにより超高圧下での相転移・紘物合成実験が従来より高い圧力のもと可能になった。(2)(1)に基づき、オリピン、パイロライト、パイロープ等の鉱物およびアントル構成物質の30GPa領域での合成・相転移実験をおこなった。しかし、特に1500°C程度の実験の後、いくつかのADCアンビルにクラックが認められた。本加熱システムではヒーターに大電流(7200A)が流れるため、アンビル付近の温度も上がりクラックの原因になっている可能性もある。ランニングコストを考えると加熱システム等に更に改良を要する。(3)上記の実験は物性研のDIA型多アンビル装置を用いておこなっている。この装置は第一段アンビルの表面アラインメントが良いがあまり一般的でない。そこで一般に普及しているMA8型のガイドブロックシステムを用いたADCのシステムテストをおこなった。このためにガイドブロックとADCアンピルの間に中間的なWCスペーサーを用いているが、現在のところ加圧途中でブローアウトが起こり、ルーチン的に使用するのは困難なようである。現在さらにこのスペーサーの形状を変えてテストを続行中である。本年度はこれまでのADCを用いた高温高圧発生セルを改良し、X線回折用のセルの試作をおこなった。このセルに、本研究で開発したハイブリッドアンビルシステムを用いて、高温高圧X線回折その場観察システムを構築した。このシステムを高エネルギー物理学研究所放射光実験施設に持ちこみ、DIA型プレス(MAX90)を用いたMA6-8型装置としてX線その場観察をおこなった。白色光にSSDを用いたエネルギー分散法によりX線回折実験をおこない、試料に混ぜたAu粉末の格子定数変化から発生圧力を見積った。この結果TEL=1.5mmを用いたシステムでプレス荷重300トンで約26-276Paの圧力発生が確認された。試料としては天然の蛇紋石を用い、そのアモルファス化と高温高圧安定相についての検討をおこなった。上記の圧力のもと、温度上昇の過程でアモルファス化の観察および結晶化の過程の観察に成功し、最終的には1200°Cで均一時間の加熱に成功した。実験後のアンビルには損傷もみられず本システムのこのような高温高圧X線その場観察実験における有用性が明らかになった。
Microcystin分解性細菌の新たなる可能性の追究

前年度、microcystin分解細菌B-9株の加水分解特性を明らかにするために、次世代シークエンサーのPacBio RSを用いてB-9株の全ゲノムの塩基配列を決定した。その結果、従来知られていた3種の加水分解酵素(MlrAC)とトランスポーターであるMlrDに加えて新たな加水分解酵素(MlrEF)とアミノ酸トランスポーターの存在が明らかとなった。本年度、新たに見出された加水分解酵素MlrEおよびアミノ酸トランスポーターの機能を明らかにするため、以下の実験を実施した。まず、MlrEの機能を確認するためにL-アミノ酸から構成されるジからオクタペプチドを用いてその分解およびEDTA、PMSFによる阻害挙動を観察した。その結果、ジおよびトリペプチドまではMlrE単独で、そしてテトラペプチド以上ではMlrCとMlrEの協働で行われることが確認された。したがって、B-9株におけるMlrEはペプチド類の加水分解の最終過程、すなわちアミノ酸の生成に関与していることになる。一方、アミノ酸トランスポーターの存在および機能を確認するため、L-Trp、L-Phe、D-Trp、D-PheおよびAddaの取り込み実験を行った。その結果、取り込みは、調査したアミノ酸においてはLおよびDアミノ酸とも同等であり、EDTAおよびPMSFによりほぼ同等に阻害された。また、beta-アミノ酸で20炭素原子を有するAddaを取り込むことから基質特異性が広いことが推測された。今回の結果は、MC分解性微生物でアミノ酸トランスポーターの存在が明らかとなった初めて例である。今後、D-aminoacylaseとされるMlrFの機能およびアミノ酸トランスポーターとMlrDによるペプチド類やアミノ酸の取り込み状況を明らかにしなければならない。当研究室では、B-9株による各種ペプチド性化合物の分解挙動から湖沼生態系におけるその存在意義の解明を最終目的とし、B-9株の機能とともに貧栄養湖における栄養獲得挙動を明らかにしている。本研究では加水分解に関与する加水分解酵素MlrA, MlrB, MlrCおよびトランスポーターであるMlrDの遺伝子配列の決定、さらに遺伝子に基づくリコンビナントタンパク質の作成と酵素阻害剤の有無によるB-9による各種ペプチド類の分解挙動をHPLCおよびLC/MSで観察した。B-9株が有するMlrA、MlrB、MlrCおよびMlrDをコードするそれぞれ遺伝子の塩基配列を解読するためにゲノムDNAを抽出し、PCR法により各遺伝子のクローニングを行った。現在まで、mlrADの塩基配列はそれぞれ1011 bp、1212 bp、1450 bp、1275 bpが決定されたが、mlrCは末端部位が不完全でおり、mlrBの全長が1626 bpと報告があることから、決定されたmlrBの長さは不完全な配列であると考えられる。新たな加水分解酵素MlrEの存在およびアミノ酸までの最終過程を明らかにするため、発色団を有するL-アミノ酸ペプチド類の分解挙動を調べた。いずれのペプチドも速やかに分解され、EDTAやPMSFの阻害実験でも、加水分解が進行することが確認された。一方、加水分解されたアミノ酸は消失せず、蓄積することから、アミノ酸に至る最終過程には新たなプロテアーゼ、MlrEがLーアミノ酸を認識して分解すること、および分解されたアミノ酸が蓄積することからアミノ酸を細胞内に取り込むアミノ酸トランスポーターが存在し、それが阻害されることを示している。この結果、B-9株にはオリゴペプチドトランスポーターであるMlrDだけではなく、アミノ酸トランスポーターも存在することが示唆された。本研究は、酵素阻害剤の有無によるB-9による各種ペプチド類の分解挙動をHPLCおよびLC/MSで観察する機器分析的アプローチおよび加水分解に関与する酵素MlrA, MlrB, MlrCおよびトランスポーターであるMlrDの遺伝子配列の決定およびそれに基づくリコンビナントタンパク質を作成する分子生物学的アプローチから構成されている。前者の研究では、ペプチド類化合物を基質とし、microcystin分解性細菌B-9株との分解挙動については、良好な結果が得られていることから予定通り進行すると考えられている。後者の研究では、mlrADの塩基配列はそれぞれ1011 bp、1212 bp、1450 bp、1275 bpが決定されたが、mlrCは末端部位が不完全でおり、mlrBの全長が1626 bpと報告があることから、決定されたmlrBの長さは不完全な配列で、mlr遺伝子に関する情報は少なく、また、遺伝子がクラスターとして存在し、両方とも末端の部位に位置しているため、完全な配列を得るには至っていない。当研究室では、microcystin分解性細菌B-9株を環境中のペプチド性有害物質の浄化に適用し、その際に必要となる分解特性を詳細に理解することおよびその分解挙動に基づき貧栄養湖における分解性細菌の「栄養獲得」作戦の解明を行うことを最終目的としている。本研究では、B-9株が含有する3種の加水分解酵素(MlrAC)とトランスポーターであるMlrD、および新たな加水分解酵素(MlrE)の機能を明らかにするため、分子生物学的アプローチ(次世代シークエンサー)と機器分析アプローチ(HPLCおよびLC/MS)による実験を行った。B-9株が有する3種の加水分解酵素(MlrAC)とトランスポーターであるMlrDの遺伝子はクラスターとして存在しており、今までPCRクローニング法により不完全な塩基配列が解読されたが、今回は次世代シークエンサーのPacBio RSを用いてB-9株の全ゲノムの塩基配列を測定した。現在までにmlrクラスターが確認され、それぞれmlrADの塩基配列は969 bp、1626 bp、1497 bp、1212 bpと決定ある。

また、2種の新たな加水分解酵素(MlrEおよびMlrF)の塩基配列1218bp、1491 bpも併せて確認された。新たに見出された加水分解酵素MlrEの機能を明らかにするため、発色団を有するL-アミノ酸からなるジオクタペプチドの分解挙動を調べた。阻害剤の有無に関わらず、ペプチド類は加水分解が円滑に進行する一方、阻害剤添加した場合、ペンタペプチドまでは、加水分解が進行したが、ヘキサからオクタペプチドまでのペプチド類は残り続けた。したがって、ペンタペプチドまでの加水分解はMlrEが関与するが、ヘキサペプチド以上は他の加水分解酵素も関与すると考察された。また、阻害剤を添加した場合、分解されたアミノ酸が残存し続けたことからアミノ酸トランスポーターの存在が示唆され、MlrDとの機能の識別化が必要となった。本研究では、microcystin分解性細菌B-9による各種ペプチド類の化合物の分解挙動をHPLCおよびLC/MSで分析する機器分析的アプローチと加水分解に関与する酵素類およびトランスポーターの塩基配列の決定、それに基づくリコンビナントタンパク質を作成する分子生物学的アプローチから構成されている。機器分析的アプローチでは、ジオクタペプチドを基質とし、B-9との分解挙動や新たなアミノ酸トランスポーターなどの発見があり、ほぼ予定通り進行している。一方、分子生物的アプローチでは本課題を開始して以来1年半の間、mlr遺伝子クラスターの塩基配列が完全に解読するに至らず、前年度末になり次世代シークエンサーを用いてB-9の全ゲノムおよびmlr遺伝子クラスターの塩基配列が解読された。したがって、リコンビナントタンパク質の調製には至っていない。前年度、microcystin分解細菌B-9株の加水分解特性を明らかにするために、次世代シークエンサーのPacBio RSを用いてB-9株の全ゲノムの塩基配列を決定した。その結果、従来知られていた3種の加水分解酵素(MlrAC)とトランスポーターであるMlrDに加えて新たな加水分解酵素(MlrEF)とアミノ酸トランスポーターの存在が明らかとなった。本年度、新たに見出された加水分解酵素MlrEおよびアミノ酸トランスポーターの機能を明らかにするため、以下の実験を実施した。まず、MlrEの機能を確認するためにL-アミノ酸から構成されるジからオクタペプチドを用いてその分解およびEDTA、PMSFによる阻害挙動を観察した。その結果、ジおよびトリペプチドまではMlrE単独で、そしてテトラペプチド以上ではMlrCとMlrEの協働で行われることが確認された。したがって、B-9株におけるMlrEはペプチド類の加水分解の最終過程、すなわちアミノ酸の生成に関与していることになる。一方、アミノ酸トランスポーターの存在および機能を確認するため、L-Trp、L-Phe、D-Trp、D-PheおよびAddaの取り込み実験を行った。その結果、取り込みは、調査したアミノ酸においてはLおよびDアミノ酸とも同等であり、EDTAおよびPMSFによりほぼ同等に阻害された。
ラット顎舌骨筋神経の感覚線維の中枢投射の検討

顎舌骨筋に分布する顎舌骨筋枝(顎舌骨筋神経)の中枢側切断端にhorseradish peroxidase(HRP)を注入し、顎舌骨筋筋紡錘を支配する一次求心線維の起始細胞の分布様相を観察した。実際には生後8-10週のWistar系雌ラットを用いた。チオペンタール腹腔内麻酔の後、保温パッド上に固定した。手術用顕微鏡下で下顎骨内面に沿ってオトガイ下部から顎下部に至る皮膚切開を加え、下顎臼歯部付近で下顎骨内面から顎下部へ走行する顎舌骨筋神経の本幹を確認し、同神経の技である顎舌骨筋枝を可及的に末梢側へ追求した。次に顎舌骨筋枝を切断し、その中枢側切断端を5%KCI溶液を満たした先端直径100muの微小ガラス管で吸引した。その後、KCI溶液を20%HPR(3M KCI,0.05Mトリス緩衝液)で置換することにより、1-2時間神経切断端をHRP溶液に浸潤させた。動物を24時間生存させた後、2%グルタールアルデヒド-1%パラホラムアルデヒド-0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)にて潅流固定を行い、直ちに脳幹を摘出した。摘出した脳幹は30%sugar-0.1Mリン酸緩衝液中に24-48時間浸潤させた後、厚さ60muの凍結連続切片を作製した。HRPの反応はTMB法を用い、光学顕微鏡によりHRP陽性細胞の出現部位の検索を行った。その結果、実験に供した21例で三叉神経中脳路核と三叉神経運動核の腹内側部にHRP陽性細胞で認めた。なお三叉神経中脳路核におけるHRP陽性細胞の数は1検体に1-3個で、分布部位は吻尾側的に中央部だった。すなわち顎舌骨筋筋紡錘は三叉神経中脳路核由来の一次求心線維に支配されることが確認された。
メタファー的検索の定式化とそのHTML文書検索への応用

テキストコンテンツに対する構造汎化手法を、HTML文書のメタファー的検索(GのようなAを探す問題)のために必要な技法に拡張し、アルゴリズムの高速化を行った。具体的には、(1)タグとテキストコンテンツからなるHTML文書に対する構造汎化を定めるために、テキスト部分の概念グラフをノードに、HTMLタグをロールとみなしたHTML概念グラフを新たに導入し、昨年度与えた極大類比構成アルゴリズムをHTML概念グラフの極大類比を求めるものに拡張した。(2)次に、メタファー的なHTML文書検索方式として、一つの比較的に抽象的なHTML文書を検索の目的文書Aとし、比喩的例示を与えるGとしては、複数の例示文書群を与えるとする。その前提のもとに、例示文書群の汎化でAの具体化になっているものを求めることにより、Aであって、かつ、例示文書の共通性質を持つ、最も極大なもの(極大類比)を算出する方式を策定した。極大類比に包摂されるものを検索質問「GのようなA」にヒットさせる。さらに、Aとテキスト中の語彙の包摂関係が電子化辞書の品質に大きく依存する問題点を解消するために、実際にはAと概念的に近いA'で所与の例示文書群の汎化を抑制するアルゴリズムに改良した。(3)構造汎化の計算量の問題を克服するために、評価関数のもとに、最大評価値を持つ極大類比のみを高速に算出するアルゴリズムを実装し、その有効性を検証した。(3)の手法を(2)に組み込んだものは、タグ数およびテキストコンテンツが50文程度のものに対しては、3秒程度で計算が終了し、比較的に小規模のHTML文書群の処理方式としては十分に有効であることを確かめた。通常の検索は、質問式を与え、質問式を満たすものを検索する。いわゆる類似検索にしても、項をその類似項に置換えたものに広げる効果しか持っていない。このやり方は、リコールの増大には寄与するが、プレシジョンの低下につながりかねない。これは、広げ方が大きなほど、いわゆる「検索ゴミ」がヒットするからに他ならない。こうした問題点を考慮し、本年度は、類似検索に変わる方式として、メタファー的検索の一つの定式化を与え、その実験を行った。これは、状況を記述した式Qと状況式Qにより満たされる性質記述を表わすゴール式Gの両者を与え、ゴール式Qと類似な状況式Q'で、ゴール式Gを同じように説明できるものを探す問題である。状況式Qを類似性で広げると同時に、「ゴールGを同じように説明できる」強い類似性を持つ状況のみに限定する効果を持つ。定式化は、状況記述もゴールも共に、概念ノードとロール関係からなる概念グラフで記述している。したがって、ゴールも状況記述も単独の検索質問式となりえる。また、可能なゴール記述と状況記述が単一な空間内(実際には記述の束空間)に配置されているので、ゴールもしくは状況記述が不適切であった場合に、例えば、それらの兄弟ゴールや兄弟状況に変化させて検索し直す、などの問題が容易に扱える利点がある。現時点で達成されたことは、上記の定式化と、汎化のメカニズムを併用したアルゴリズムの設計と実装、およびその実験である。実験は未だ小規模であるが、HTML文書から抽出した概念グラフを対象データとした場合の対応策として、ロール制約の種類を追加し、可能な解をさらに縛りこむことを検討している。本研究では、検索対象であるHTML文書Dを演繹データベースとみなすことにより、内包述語で記述されたゴールGをDが持つビューや事実から推論できるときに、DはGを満たすと定義し、他のD'でGを同様に説明できるときに限り、D'はGに照らしてDと類似していると定める。こうした文書間の強類似性は、タグ付き文書としての構造的類似性と、テキストコンテンツ間の意味的類似性の両者を扱うことができる。本年度では、特に、テキストコンテンツの類似性に特化した研究を行った。