hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎ウイルス複製効率の高い培養細胞の樹立と遺伝子型1bの感染クローンの作製

培養肝癌細胞はHCV複製が可能な細胞である。本研究ではHuh-7細胞株からHCVレプリコン複製能の高い細胞クローンを樹立した。これら複製能の高い細胞クローンではアポリポ蛋白質遺伝子の発現亢進が認められた。これらの遺伝子をノックダウンするとHCVの複製が抑制された。また、複製効率の良い全長HCVを作製するにための複製効率の良いHCVサブゲノムレプリコンを樹立できた。一方、その過程において欠損ゲノムを有するHCVを同定するとともにその感染性をin vitroで証明できた。C型慢性肝炎再発患者の血清からRNAを抽出しlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNA(遺伝子型1b)を増幅した。これをHCVサブゲノムレプリコンカセットへ挿入し、in vitro転写法によりRNAを合成しHCVサブゲノムレプリコンライブラリーを作製した。このライブラリーRNAを培養肝癌細胞Huh-7へとランスフェクションし、ネオマイシン存在下で3週間培養した。その結果9個のHCVサブゲノムレプリコン複製細胞が樹立できた。ネオマイシンとインターフェロンを同時に投与するとこれらはすべて死滅し、サブゲノムレプリコンが実際に複製していること、さらに、これらがインターフェロン感受性を有することが示された。そのうちの一つの細胞クローンをネオマイシン存在下で培養し、そこからlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNAを増幅し、さらにプラスミドカセットへ再挿入しサブゲノムレプリコンプラスミド(pSGT5)を樹立した。pSGT5からRNAを作製しHuh-7細胞ヘトランスフェクトすると、もとのライブラリ治に比べ数百倍のコロニーが得られ、pSGT5が非常に複製効率の良いサブゲノムレプリコンであることが示された。次にlong RT-PCR法にて同じ血清からHCV構造領域のcDNAも増福し、pSGT5へ挿入し、HCV全長レプリコンRNAライブラリーを作製した。これをHuh-7細胞ヘトランスフェクトすると、細胞内でコアタンパクの発現が認められた。今後、これが全長HCVの複製によるものか確認する予定である。また、樹立済みのsuper-permissiveなHuh7細胞クローンへもトランスフェクトしHCV憾染性クローンの樹立を試みることを計画している。申請者らはこれまでにC型慢性肝炎再発患者の血清からRNAを抽出しlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNA(遺伝子型1b)を増幅し、そのサブゲノムレプリコンライブラリーから非常に複製効率の良いサブゲノムレプリコン、pSGT5、を樹立することができた。さらにlong RT-PCR法にて同じ血清からHCV構造領域のcDNAも増幅し、pSGT5へ挿入し、HCV全長レプリコンRNAライブラリーを作製した。これをHuh-7細胞へトランスフェクトすると、細胞内でコアタンパクの発現が認められたが感染性は認められなかった。一方、エンベロープ1領域から非構造蛋白領域まで大きく欠損したcDNAが得られた。その存在意義を調べるために、欠損HCVをクローニングし塩基配列解析を行った結果、全てのクローンが同じin-frame breakpointを有し、かつ、それらのアミノ酸配列に不均一性があることが明らかになった。さらにその欠損HCV cDNAを同じ血清から樹立したサブゲノムレプリコンの上流に挿入したRNAを作製し培養肝癌細胞Huhに導入した結果、コアタンパクを含めたHCVタンパクの発現が認められた。これらのことから欠損HCVがHCVの複製、持続感染に役割を担っている可能性が示唆された。すなわち欠損HCVが全長HCVの複製にヘルパーとして働いている可能性があり、全長HCVと欠損HCVを同時にHuh-7細胞へトランスフェクトすることによって全長HCV複製の効率を高める予定である。本研究においてこれまでに、C型慢性肝炎再発患者の血清からRNAを抽出しlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNA(遺伝子型1b)を増幅し、そのサブゲノムレプリコンライブラリーから非常に複製効率の良い新たなサブゲノムレプリコン、pSGT5、を樹立することができた。本研究において新たに樹立されたレプリコンはこれまでに樹立されたものに加え、レプリコンの多様性を広げ薬剤スクリーニングやHCVの複製研究における選択肢を広げる意義がある。一方、同じ患者血清から構造領域の欠損したHCV cDNAをクローニングすることができた。その欠損HCV cDNAをpSGT5の上流(ネオマイシン耐性遺伝子とEMCV-IRES部分)に挿入した欠損HCV RNAを作製し培養肝癌細胞に導入した結果、HCVタンパクの発現が認められ、欠損型HCVが複製可能であることを示した。本年度はHCV再発患者血清に加え、他のHCV患者からも欠損型HCVを検出することができた。その陽性率は約22%であった。欠損ゲノムが認められた4症例から38種類の欠損HCVクローンをクローニングし遺伝子的な解析を行ったところ、HCV構造領域に広範囲な欠損が認められたが、5'非翻訳領域とコアタンパク領域は全てのクローンで保存されていた。また、全てのクローンがin-farmeでその翻訳可能性が示された。

さらに、欠損型HCVを産生する培養細胞系を樹立することに成功し、欠損HCVのインビトロでの感染、複製能を明らかにした。現在、インターフェロン治療法の選択や効果判定には5'非翻訳領域のPCRなどが用いられるが、この領域が欠損型でも保存されているとすれば、欠損型HCVと全長HCVを区別して増幅することは不可能である。したがって、症例によっては測定された血清中HCV量が必ずしも全長HCV量を反映していない可能性がある。
塩害環境下におけるコンクリート中の鉄筋腐食速度と劣化性状

コンクリート中の鉄筋腐食速度を求めることを目的として,本研究ではコンクリート中に浸透する塩化物イオン量を水セメント比,環境条件,暴露経過年を入力値としてニューラルネットワークにより推定する手法を開発した。本ニューラルネットワークシステムでは,塩化物イオン濃度がコンクリート内部において濃度ピーク位置を形成する状況もシミュレートでき,既往の暴露実験によるコンクリート中の塩化物イオン量との比較においても満足のいく精度であることが確認された。さらに,コンクリート表面に塗膜が施された場合や,柱や梁の偶角部等のように塩分浸透表面が2方向の場合でもコンクリート中の塩化物イオン量が予測できる様にニューラルネットワークを用いて拡散方程式を数値解析的に解く際の境界条件および拡散係数を同定した。得られた境界条件および拡散係数を用いて,FEM解析で様々な塩害環境下におけるコンクリート中の塩化物イオン量分布を求めたところ実測値と解析値はよく一致した。塩害によるコンクリート中の鉄筋腐食速度実験については,今回は測定期間が短いこともありデータがばらつき有意なデータが得られなかった。しかし,既往の腐食速度に関する研究成果と,本研究で開発したニューラルネットワークで境界条件および拡散係数を設定したFEM解析手法を用いて,鉄筋コンクリート構造物の塩害による寿命をコンクリート中の鉄筋の腐食程度から予測するシステムを提案した。一般に鉄筋コンクリート構造物の寿命と定義されるかぶりコンクリートのひび割れ発生時の鉄筋腐食減量については,電食実験および解析結果は健全時の鉄筋重量の1%未満の小さな値となった。そしてこの程度の腐食では鉄筋の性能に大きな影響を及ぼさないことが分かった。しかし,自然暴露試験によるひび割れ発生時の鉄筋腐食減量は電食実験および解析結果より大きくなることが予想されるため,さらなる検討が必要である。本年度は,様々な塩害環境下におけるコンクリート中に浸透する塩化物イオン量をニューラルネットワークにより推定する手法を開発した。このニューラルネットワークのシステムは,過去12年間に発表されたデータ等を基に構築したもので,水セメント比,環境条件(暴露塩所,飛来塩分量,水掛かり),暴露経過年を入力すると,コンクリート中の任意位置における塩化物イオン量が推定できる。また,コンクリート中の鉄筋の塩害による腐食速度は,鉄筋位置の塩化物イオン量と比例関係にあることが既往の研究により分かっているので,このニューラルネットワークシステムを適用し,経時的に鉄筋位置における塩化物イオン濃度の変化する場合の鉄筋の腐食量を推定する手法も開発した。塩害によるコンクリート中の鉄筋腐食速度に関する実験は,湿度75%,温度20,50,70度の恒温恒湿試験器内において,水セメント比(40,50,60%),塩分量(NaCl:2,4,6kg/m^3),かぶり厚さ(2,4,6cm)を実験変数として腐食速度測定実験を行い,継続中である。なお,同様の実験変数で,屋外暴露による腐食速度測定実験も並列して行っている。さらに本年度は,沖縄県の海岸沿いに建設し8年経過した実大RC暴露構造物を解体し,コンクリート中の塩化物イオン量や,仕上げの条件と鉄筋の腐食状況との関係についてもデータを蓄積している。
ウイルスベクターとジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた高効率相同組み換え法の開発

近年、ZFN、TALEN、Cas9-CRISPRなどのゲノム編集技術の進歩により相同組み換えによる遺伝子改変動物作製は飛躍的に容易になった。これらはNucleaseがゲノム上の特定の場所を切断することで細胞のDNA修復機構が働き、さらには相同組換えを誘導することができるという方法である。これらの方法では複数のコンポーネントを同時に発現させることが必要であり、初代培養細胞などの遺伝子導入が難しい細胞では効果は得られにくいという問題がある。そこで本研究では複数コンポーネントをレンチウイルスベクター上に導入し、高効率な相同組み換え法の開発を目指した。Zinc Finger NucelaseやTALENなどのnucelaseは細胞のゲノム修復機能を惹起し、相同組み換えの効率を上昇させることができる画期的なツールである。本研究では、このnucelaseとHIV integraseを融合した分子により相同組み換えドナーを組み込んだレンチウイルスベクターがnuclease標的部位に誘導され積極的に相同組み換えを起こさせるようなベクターシステムの開発を目標としている。昨年度までにnucleaseとintegraseの融合タンパク質がnucleaseの機能を失っていないことを確認した。しかしながら、これらの融合タンパク質とレンチウイルスベクターを組み合わせて細胞に感染させたところ標的部位への感染が認められなかった。これはおそらくnucleaseとintegraseの融合タンパク質の分子量が大きく、Zinc Finger NucelaseまたはTALENの活性に必要な左右二つのnucelaseを効率良くウイルス粒子に取り込めなかった、またはタンパク質でのこれらの分子の取り込みはnuclease活性に必要十分でなかったという2点が考えられる。これらの発見は今後より良いシステム構築の為の有意義な材料になると考える。ZFNやTALENとはゲノム上の任意の場所の両側数塩基に特異的に結合できるよう人工的に合成されたDNA結合タンパクとFokI制限酵素のエンドヌクレアーゼ領域を結合させたキメラヌクレアーゼである。本研究ではHIVインテグラーゼとこれら人工ヌクレアーゼの融合タンパク質をレンチウイルスベクター粒子内に封入し、相同組み換えドナーを組み込んだレンチウイルスベクターがゲノム上の標的領域に挿入されるようなベクターシステムの開発を目標としている。昨年度までにすでに報告されているOPEN methodによってZFNを作製することに成功したが、その後ZFNよりも活性が強く作製も簡単なTALENが報告された為、こちらを実験に用いた。インテグラーゼとTALENの融合タンパクのnuclease活性を確認し、レンチウイルスベクターに封入して細胞に感染させたが、標的部位への挿入は確認できなかった。これはヌクレアーゼの活性に必要な左右二つのヌクレアーゼを効率良くウイルス粒子に取り込めなかった、またはタンパク質でウイルス粒子内に取り込まれたヌクレアーゼは活性が必要十分ではなかったことが原因であると考えられる。近年Cas9/CRISPRシステムという新しいヌクレアーゼシステムが開発された。このシステムではタンパク質ではなくRNAが鋳型に結合し、そこに導かれたヌクレアーゼがゲノムを切断する。このシステムは上記の実験結果を克服できる可能性があると考えた。レンチウイルスベクターにヌクレアーゼであるCas9と鋳型に導くガイドRNAを組み込み、感染させたところ、非常に効率良く標的部位を切断することができた。このシステムを利用すれば通常の遺伝子導入法では導入困難なPrimaryの細胞にも効率良く変異を導入することができる非常に有意義なシステムである。現在相同組み換えが可能であるかの検討を行っている。近年ZFNまたはTALENを用いた高効率な相同組み換え法が開発されている。ZFN、TALENとはゲノム上の任意の場所の両側9塩基に特異的に結合できるよう人工的に合成されたDNA結合領域とFokI制限酵素のエンドヌクレアーゼ領域を結合させたキメラヌクレアーゼであり、FokIが二量体を形成しゲノム上の特定の場所を切断することで細胞のDNA修復機構が働き、さらには相同組換えを誘導することができる。これらを用いることで相同組み換えの効率は150%と飛躍的に良くなることが報告されている。一方で問題点は、ZFN 2種類とターゲッティングコンストラクトの3種類の遺伝子を同時に発現させることが必要であり、初代培養細胞などの遺伝子導入が難しい細胞では当然ZFNの効果は得られにくいということである。改善策として考えられる方法は、「細胞への導入効率を上げる。」「ZFNとターゲッティングコンストラクトをシングルベクターで導入する。」「相同組み換え効率を上げる。」という三点である。この三点を達成すべく本研究では本研究ではHIVインテグラーゼとZFNの融合タンパク質およびブルーム抑制カセットをターゲッティングコンストラクトが組み込まれたレンチウイルスベクターに封入し初代培養細胞および受精卵での相同組換えを試みる。当該年度にはまず、ZFNとインテグラーゼの融合タンパク質をターゲティングコンストラクトと共に細胞に導入するとターゲティングコンストラクトのみの場合の5倍以上相同組み換えを促進することが確認できた。またZFNを既報にあるOPEN法で作成し、その活性を確認した。さらにTALENにおいても同様に活性が確認できた。

ZFNとインテグラーゼの融合タンパク質の活性が確認されたことは本研究達成の為の大きな前進であると考える。目的部位への遺伝子挿入に向けたシステム開発に向けての課題が明らかになり、今後の方針が決定できたため。当該年度の研究目標は1、ZFNコンストラクトおよびレンチウイルスベクターの作製、2、293T細胞における変異GFPの修復実験、3、Foxn1をターゲットとするZFNの探索であった。1に関してはFoxn1ゲノム配列の複雑性からいまだ達成されていないが、リコンビネーションを利用したBACからのクローニングで改善されている。2、3は完全に目標が達成されている為おおむね順調であると評価した。Zinc Finger NucelaseやTALENに代わるnucleaseのシステムCRISPR-Cas9システムが最近報告された、このシステムではZinc Finger NucelaseやTALENと違いRNAが標的部位に結合することで、Zinc Finger NucelaseやTALENのように左右二つのDNA結合タンパクが必要ない。したがってこのシステムを利用すればウイルス粒子へのタンパクの取り込み量を考慮する必要が無くよりシンプルなシステムが構築できる。今後はCRISPR-Cas9システムをレンチウイルスベクターに組み込み目的部位への遺伝子挿入を試みる。今後はFoxn1をターゲットとするZFNの初代培養細胞での効果の確認およびヌード変異の遺伝子治療を行う。申請者はすでにヌードマウスよりmouse embryonic fibroblast (ヌードMEF)およびinduced puluripotent cell (ヌードiPS)を作製している。さらに正常Foxn1を過剰発現させたヌードiPSをヌードマウス胚盤胞に注入すると正常な胸腺が発生することも確認している。このヌードMEFに作成したZFNおよびTALENとターゲッティングコンストラクトとして野生型Foxn1を持つAll-in-Oneレンチウイルスベクターを感染させ、Foxn1領域のシークエンスおよびサザンブロットを行う。その結果から最も高効率で相同組み換えが起きかつランダムインテグレーションが無い組み合わせを選択する。Foxn1が正常化したヌードMEFよりiPSを誘導し、ヌードマウス由来胚盤胞に注入することでヌードマウスに胸腺が再生されるか確認する。さらにZFNがFoxn1以外に影響を与えていないかマウスの表現型を観察する。
分子遺伝学的解析によるX連鎖高IgM症候群の重症度評価

X連鎖高IgM症候群(XHIM)の責任遺伝子はX染色体短腕のCD40リガンド(CD40L)遺伝子である。治療として早期の造血幹細胞移植が推奨されていが、XHIMの一部に致死的な感染を認めない軽症例が存在し、移植の適応において問題となる。重症度の異なるXHIMの変異CD40L機能を解析した。患者は、免疫グロブリン補充療法が必要な1例(Pt1)、治療が不要な1例(Pt2)および移植が行われた1例(Pt3)を選択した。変異CD40Lの機能を解析するため、それぞれの変異CD40Lを発現したtransfectantを作成した。Transfectantは、フローサイトメーターでもっとも発現しているものを選択したが、Pt2およびPt3の発現は、抗CD40L polyclonal抗体を用いてもわずかだった。そのため、遺伝子の移入を健常人と患者で同程度のmRNAの発現により証明した。また、western blottingでは、健常人とPt1はほぼ同程度のCD40L蛋白の発現が認められた。Pt2およびPt3でも弱いが同じ大きさのCD40L蛋白の発現を確認した。免疫グロブリン産生に対する作用では、IL-10存在下で、正常transfectantのみが多量のIgG、IgA、IgMを産生したが、3患者の変異trasfectantは、産生を増強しなかった。B細胞の活性化に対する影響では、すべてのtrasfectantにおいてB細胞上のCD80の発現に明らかな差はなかった。CD86の発現は、正常のみ増強作用を認めた。B細胞の増殖に対する作用については、正常transfectantでは、投与量に依存したB細胞の増殖作用を認めた。しかし、変異transfectantは、B細胞増殖に対する増強効果が無かった。単球由来未熟樹状細胞のIL-6産生に対する作用も、正常trasfectantのみIL-6を産生する傾向があった。今回の実験系ではB細胞への作用に関して重症度の差を説明できなかった。今後、樹状細胞や単球のIL-12などのサイトカイン産生に対する作用を解析する。
水と液体のTHz領域の緩和と振動に対する新しい視点

1)水および同位体水(H_2O、D_2O、H_2^<18>O、D_2^<18>O)のTHz領域のラマンスペクトルを測定して解析した。慣性項と熱浴側のメモリー効果を実効的に取り込んだ二状態遷移模型(MRT模型)に基づく緩和関数と減衰振動子2個でスペクトルを極めてよく再現できた。この解析から、190cm-1モードは、水分子5個からなる四面体的構造における酸素原子間の伸縮振動モードである事、50cm-1のピークは水分子同士の変角振動モードとMRT模型での緩和モードの一部になっていることがわかった。2)H-water(H_2O、H_2^<18>O)の緩和時間は、D-water(D_2O、D_2^<18>O)の緩和時間に比べて常に短いことがわかった。これらの緩和時間のArrhenius plotは、どの同位体水でも約300Kで折り曲がりが見られ、この温度付近で水素結合の状態変化がある事がわかった。3)エタノール/水二成分系のTHz領域のラマンスペクトルを測定し、解析した結果、分子間振動モードが主体の40cm^<-1>以上の領域のスペクトルは、すべての濃度で、純物質の和スペクトルで再現されたが、緩和モードが主体の40cm^<-1>以下の領域では、実測スペクトルと和スペクトルの間で系統的なずれがあることが明らかになった。このずれの積分強度の濃度依存性は、水のモル分率0.6付近で極大を持つ。また、0.5cm^<-1>以下の領域で、レーリー散乱の成分とブリュアン散乱の成分の強度比、(Landau-Placzek比)を濃度に対してプロットすると、水のモル分率0.8付近で鋭い極大を示すことが明らかになった。これは、超音波吸収から得られている、濃度揺らぎの最大の濃度にも対応している。これらの解析をメタノールと1-プロパノール、2-プロパノールについても適用し、それぞれのアルコール水溶液系における、分子レベルでの混合の均一性について議論した。1)水、重水、および、その混合系について、分子間振動の現れる低振動数領域のラマンスペクトルと、分子内振動が現れる高振動数領域のスペクトルについて検討した。特に混合系について、低振動数領域でのスペクトルの濃度変化を系統的に解析した。また、高振動数領域については、水/重水のモル比1:1であるHDOの分子振動について解析した。この結果、THz領域の緩和に関して、水、重水、混合系では、緩和時間にわずかな差が現れる以外、大きな差がない事がわかった。また、HDOの高振動数領域の分子内振動に対しては、水素結合でつながった四面体的構造が、C_1対称性まで低下しているとしたときの基準振動を考えると、ラマンスペクトルのパターンがよく説明される事がわかった。2)最近、エタノール水溶液系の40cm^<-1>から400cm^<-1>までの低振動数ラマンスペクトルが、純水と純エタノールの和スペクトルで再現されるという結果を基に、水とエタノールは、分子レベルでは完全には混ざっていないかもしれないと言う報告がなされた。この報告に触発され、我々のところで得られている、2cm^<-1>までの低振動数ラマンスペクトルの解析をやり直した。

その結果、振動モードが主体の40cm^<-1>以上の領域では、すべての濃度で、和スペクトルで再現されたが、緩和モードが主体の40cm^<-1>以下の領域では、実測スペクトル和スペクトルの間で系統的なずれがあることが明らかになった。このずれの積分強度の濃度依存性は、水のモル分率0.6から0.8の間で極大を持つ。また、0.5cm^<-1>以下の領域で、レーリー散乱の成分とブリュアン散乱の成分の強度比、(Landau-Placzek比)を濃度に対してプロットすると、水のモル分率0.8付近で鋭い極大を示すことが明らかになった。今後、これらの結果を整合性よく説明するピクチャーを構築していきたい。1)水および同位体水(H_2O、D_2O、H_2^<18>O、D_2^<18>O)のTHz領域のラマンスペクトルを測定して解析した。慣性項と熱浴側のメモリー効果を実効的に取り込んだ二状態遷移模型(MRT模型)に基づく緩和関数と減衰振動子2個でスペクトルを極めてよく再現できた。この解析から、190cm-1モードは、水分子5個からなる四面体的構造における酸素原子間の伸縮振動モードである事、50cm-1のピークは水分子同士の変角振動モードとMRT模型での緩和モードの一部になっていることがわかった。2)H-water(H_2O、H_2^<18>O)の緩和時間は、D-water(D_2O、D_2^<18>O)の緩和時間に比べて常に短いことがわかった。これらの緩和時間のArrhenius plotは、どの同位体水でも約300Kで折り曲がりが見られ、この温度付近で水素結合の状態変化がある事がわかった。3)エタノール/水二成分系のTHz領域のラマンスペクトルを測定し、解析した結果、分子間振動モードが主体の40cm^<-1>以上の領域のスペクトルは、すべての濃度で、純物質の和スペクトルで再現されたが、緩和モードが主体の40cm^<-1>以下の領域では、実測スペクトルと和スペクトルの間で系統的なずれがあることが明らかになった。このずれの積分強度の濃度依存性は、水のモル分率0.6付近で極大を持つ。これは、超音波吸収から得られている、濃度揺らぎの最大の濃度にも対応している。これらの解析をメタノールと1-プロパノール、2-プロパノールについても適用し、それぞれのアルコール水溶液系における、分子レベルでの混合の均一性について議論した。
神経回路におけるタンパク合成モニタリング法の開発と応用

局在タンパク翻訳は細胞局所のシグナル伝達を効率化し、細胞内情報の保持・統合・読み出しを制御し、細胞外変化に適応するために重要な役割を果たしていると考えられる。特に神経細胞において局所タンパク翻訳はシナプスの機能修飾など神経の機能に深く関与しており、この機構を明らかにすることは神経細胞の恒常性・可塑性および疾患メカニズムの解明のため重要である。本研究は、神経細胞における局所タンパク翻訳を可視化・定量する方法を確立し、また、シナプス刺激により任意のタンパク発現を制御することを目的とする。本年度はこれまでの成果を基に、以下の発展を得た。1.部位特異的タンパク蛍光ラベル法を用いた新規タンパク合成検出プローブの改良を行い、よりシグナル・ノイズ比の高いプローブを作成した。2.新規のタンパク蛍光ラベル基質開発の共同研究を行い、シグナル検出感度を高めた。3.神経活動依存的な遺伝子発現制御エレメントを利用した遺伝子活性化プローブを開発し、(1)蛍光タンパクや発光タンパクの合成を単一神経細胞においてリアルタイムで観察する系の構築に成功した。また、(2)このプローブをレンチウイルスベクターに挿入し、この組換えウイルスのインビボ感染法させることにより個体動物の大脳おいて活動依存的なタンパク合成の検出に成功した(Kawashima et.al., PNAS, 2009)。特に神経細胞において局所タンパク翻訳はシナプスの機能修飾など神経の機能に深く関与している可能性が高く、この機構を明らかにすることは神経細胞の恒常性・可塑性および疾患メカニズムの解明のため重要である。しかしながら、これまでは技術的制約により樹状突起上の個々のシナプスレベルでの局所タンパク翻訳の制御機構は解析が困難であった。平成19年度においては局所タンパク翻訳の可視化法の開発および改良を目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.神経細胞における活動依存的、局所タンパク合成の可視化・定量(1)部位特異的タンパク蛍光ラベル法を用いた新規タンパク合成検出プローブの開発・改良を行った。(2)上記プローブを神経細胞に導入して単離樹状突起における局所タンパク合成の可視化に成功した。(3)薬剤または神経活動依存的な遺伝子発現制御システムと組み合わせ、さまざまな時間枠におけるタンパク合成の検出系を構築した。2.レポーターの神経回路への導入上記プローブを効率よく神経回路へ導入する手段として(1)レンチウイルスベクターを用いたインビボ感染法(2)子宮内エレクトロポレーション法(3)遺伝子銃を用いた脳スライスへの遺伝子導入法等の方法の条件検討を行った。
過活動膀胱に対する低反応レベルレーザー照射療法の有用性の有無に関する検討

健常群の排尿機能および脊髄損傷、パーキンソン病、膀胱炎モデル群といった各モデル動物(ラット)の過活動膀胱に対する仙髄神経根への経皮的低反応レベルレーザー照射の有用性の再確認と安全性に関する追加検討を行った。これらの結果をもとに特許の申請(国内)と臨床試験の申請を行った。別に過活動膀胱の主症状である尿意切迫感およびその背景に存在する排尿筋過活動の近赤外線分光分析法(near-infrared spectroscopy:NIRS)を用いた他覚的評価法を新規に考案し、ヒトにおいてその有用性について検討、確認した。本評価法に関しても特許申請を行った。初年度は、健常群、脊髄損傷・パーキンソン病モデル群(脊髄・大脳/脳幹病変による神経因性の過活動膀胱モデル)、膀胱炎モデル群(炎症性の過活動膀胱モデル)といった各モデル動物(ラット)に対して、下部尿路支配神経系の神経根(ラットではL6前後)に経皮的に低反応レベルレーザー照射を行い、以下に述べる多角的な評価を、照射の前後または有無による比較によって行い、過活動膀胱に対する低反応レベルレーザー照射療法の安全性(特に排尿機能以外への影響)について検討した。安全性の評価としては、(1)照射部位の皮膚、皮下組織、筋、神経・神経根および骨盤内臓器の膀胱、尿道、卵巣、腸管の形態学的変化(線維化、変性など)の有無の観察、(2)行動監視システムによる性周期や生殖行動の変化の有無の観察を行った。(2)については、現在、引き続き観察中である。2年目は、1年目の続きとして、健常群、脊髄損傷・パーキンソン病モデル群(脊髄・大脳/脳幹病変による神経因性の過活動膀胱モデル)、膀胱炎モデル群(炎症性の過活動膀胱モデル)といった各モデル動物(ラット)に対して、下部尿路支配神経系の神経根(ラットではL6前後)に経皮的に低反応レベルレーザー照射を行い、以下に述べる多角的な評価を、照射の前後または有無による比較によって行い、過活動膀胱に対する低反応レベルレーザー照射療法の安全性(特に排尿機能以外への影響)について検討した。さらに上記にて安全性の確認が一応ではあるができたため、基礎研究の結果の報告論文を作成しているほか、臨床試験に移るべく、自主臨床試験の手続きを開始した。また人での検討にあたり、過活動膀胱の主症状である尿意切迫感の他覚的評価システムとして、近赤外線分光分析法(near-infrared spectrocopy : NIRS)を利用するシステムを現在構築中である。プレリミナリーな検討では、評価可能な結果が得られている。本年度は、基礎研究の成果の論文発表の準備に加え、ヒトでの検討を行う上で必要な倫理委員会(または治験(自主臨床試験)審査委員会)の承認を得るために、審査上で必要とされた項目を検討すべく、追加で基礎実験を行った。また臨床研究を行うにあたり、過活動膀胱の主症状である尿意切迫感の他覚的評価が必要であると考えられた。しかし、従来の尿意切迫感の評価法はすべて主観的なものであり、不十分であったため、独自に近赤外線分光分析法(near-infrared spectroscopy:NIRS)を用いた排尿症状、特に尿意切迫感の評価システムを新たに考案した。その後、本システムの有用性を検討すべく、別の臨床研究を組み、排尿症状、特に尿意切迫感時の所見の収集および従来の尿意切迫感の評価法や排尿機能検査との比較を行った。本成果については、国内および海外の関係学会で報告を行ったほか、本システム自体のみで新規の発明となるため、特許申請を行った。本件に関しては、今後、使用している機器のメーカーほかいくつかの企業が興味を示していることから、システムの改良・発展において相談し、より完成したものを構築することを考えている。さらに、以上の追加実験の結果と成果を加え、ヒトでの過活動膀胱に対する低反応レベルレーザー照射療法の安全性と有用性に関する探索的研究を初めに行うために、倫理委員会(または治験(自主臨床試験)審査委員会)の最終申請を行った。
TLR4のシグナル伝達におけるPHISPHOLIPASED(PLD)の役割

樹状細胞やマクロファージなどの細胞表面上に発現しているToll-like receptor 4(TLR4)が、グラム陰性細菌の成分であるリポポリサッカライド(LPS)のレセプターであることは明らかであるが、どのようにしてLPSに結合した後に活性化するのかに関して明らかでは無かった。我々はまずそれを明らかにした。TLR4がその細胞外領域にMD-2と呼ばれるアダプター分子と結合しており、CD14を介してLPSがMD-2に結合することでTLR4が多量体を形成することを明らかにした。そしてTLR4は多量体を形成することで活性化することを明らかした。次にTLR4の多量体形成にはMD-2が深く関わっていることを明らかにした。MD-2がなければTLR4は多量体を形成しないばかりか、MD-2のアミノ酸配列を変えることによって、LPSの種類の中であるものがアゴニストになったりアンタゴニストになったりすることを示した。アゴニストの場合、アゴニストがMD-2に結合した後にTLR4の多量体形成が認められ、アンタゴニストの場合TLR4の多量体形成は認められなかった。このよう'なTLR4の多量体形成は我々が作成したTLR4GFPとTLR4Flagを発現させたBa/F3細胞を用いて、容易に検討できるようになった。つまりこの細胞を用いてTLR4のアゴニストとアンタゴニストの検討が可能であることを示したと考えている。さらにTLR4の多量体形成後を詳しく調べることにより、TLR4は細胞表面上より細胞内にエンドサイトーシスすることを明らかにした。そしてTLR4がエンドサイトーシスしなければ、TLR4の多量体形成が長く続いてしまうことも明らかにした。つまりTLR4はエンドサイトーシス後にエンドソームやライソソームに入り、そこでTLR4の多量体は解体した。我々は今、細胞内でのTLR4の活性化とTLR4のエンドサイトーシス、そしてMyD88非依存的シグナル伝達の活性化を検討していくつかのデータを得ている。そこにPHOSPHOLIPASE D(PLD)が関わっているのかどうか検討中である。Phospholipase D(PLD)は細胞内に存在する脂質を修飾する酵素で、PLD1とPLD2の二つのアイソホームが発現している。PLDはホスファチジルコリンを加水分解してホスファチジン酸とコリンを産生することは良く知られている。そしてTLR4のリガンドのLipopolysaccharide(LPS)刺激により、PLDが活性化して細胞内のホスファチジン酸量が増加することが報告されている。またPLDはARFやRho family分子などの細胞骨格や細胞内輸送に関わる分子と結合し活性化して、細胞輸送などを調節していることが最近明らかとなりつつある。我々はこのPLDがTLR4とどのように関わって機能しているのかに興味を持ち、まずはPLDのインヒビターである1-Butanolを用いてLPS刺激時における細胞の反応を解析した。すると1-Butanol処理により細胞の反応性が著しく減少した。実際TLR4と直接結合しているのかどうかを、HEK293細胞にFlagないしはGFPタグを付けたTLR4とHAタグを付けたPLD1ないしはPLD2を発現させると、TLR4とPLD2の結合が確認された。この結合はTLR4特異的ではなくTLR2とも結合することが明らかとなった。しかし、TLR9とPLD2は結合しなかった。もう一つのPLD1はTLR2そしてTLR4のどちらとも結合していなかった。ただ今、レトロウイルスベクターを用いてPLDをノックダウンする計画が進行中であり、RAWや骨髄由来のDC細胞のPLDをノックダウンする予定である。RAW細胞においてはいくつかノックダウンできた細胞が得られたので、それらを解析していくつもりである。

そしてTLR4がエンドサイトーシスしなければ、TLR4の多量体形成が長く続いてしまうことも明らかにした。つまりTLR4はエンドサイトーシス後にエンドソームやライソソームに入り、そこでTLR4の多量体は解体した。我々は今、細胞内でのTLR4の活性化とTLR4のエンドサイトーシス、そしてMyD88非依存的シグナル伝達の活性化を検討していくつかのデータを得ている。そこにPHOSPHOLIPASE D(PLD)が関わっているのかどうか検討中である。
国際公共財としての知的所有権システムと特許競争のフロンティア

(1)1998年、アメリカで特許に関する印象的な出来事が2つ、相次いで起きた。1つは、7月23日に連邦巡回控訴裁判所(CAFC)がステート・ストリート銀行事件に関してビジネス方法に特許性を認める判決を下したこと。もう1つは、10月6日にインサイト社が米国特許商標庁(USPTO)から遺伝子断片特許を付与されたたこと。以来、ビジネス方法とバイオテクノロジーを中心にUSPTOに対する特許出願が急増をみた。ビジネスの手法や遺伝情報には国際公共財としての性格があるので、その出願ブームとともに人類共通の利益と知識・情報の私有化との相克が深まることになった。(2)近年における特許のバイオ研究への拡張は、希少資源の過少消費を意味する「反共有地の悲劇」(ヘラー=アイゼンバーグ論文、1998年)が起こりつつあることを示唆する。ゲノム創薬プロセスの上流における遺伝子特許の乱立は、遺伝子情報という基礎研究成果-以前ならパブリック・ドメインに置かれて誰もが自由に使えたであろう-の私有化によって、製薬会社によるそれらの利用を制限し、下流の診断・治療薬開発のコストを高め速度を遅らせることになろう。USPTOは特許プールの活用で問題を解決できると主張しているが、ゲノム創薬の領域では特許プールの効果は疑わしい。(3)ステート・ストリート判決以降、ビジネス方法特許とくにEコマース特許の激増がみられた。この近年の特許洪水に伴って、幾つかの問題(質の低い特許、訴訟の増加、累積的革新の遅れ等)が生じた。USPTOはビジネス方法特許の質を向上させる諸措置(2003年のアクションプラン)を講じたが、より根本的な問題が残されている。最も重要なのは、今日のビジネス方法への特許保護が米国特許法の主目的である技術革新を促すよりもむしろ遅らせるものであり、ゆえに特許制度改革を具体的に構想するべきだということである。当初予定に沿って2種類の作業を並行的に進めた。第一に、米国の知的所有権制度・政策がしばしば「ニューエコノミー」と表現されてきた経済構造の変化と深く関連し合っている点を意識して、米国ニューエコノミーの全体像とその中心的内容を明らかにすることに努めた。これについては、いわゆるニューエコミー論の来歴、類型区分とそれらの相互関係、中心的な論理構造とそこに潜む矛盾点、時の流れに沿った重点の移行等を一通り検討し、その基本的な特徴を検出することができた。また、ニューエコノミー論台頭の背景をなした米国の「20世紀末景気」(1991年3月2001年3月)に焦点を合わせ、大局的にみたその特徴をつかもうという意図のもとにNIPAデータの分析を試みた。第二に、ビジネスモデルやバイオ特許といった国際特許競争のフロンティア領域に関して、今日的な問題状況を把握するための第一歩と位置づけて、国内外の雑誌、新聞、インターネット上の関連論文・.記事の収集・検討にあたった。同時に、当該分野における研究の現在水準とより深めるべき問題ないし論点を探る目的で、国内外の学術研究および概説書の内容を吟味する作業にも取り組んだ。研究予定に従い2通りの作業を並行して進めた。第一に、バイオ関連特許やビジネス・モデル特許について、今日的な問題状況の正確な把握に努める見地から、国内外の専門的学術研究および概説書、雑誌、新聞、インターネット上の関連記事を数多く収集・検討し、また関連分野の研究者と必要な意見交換をおこなった。その一環として80年代後半から90年代にかけてバイオ新薬のホープとして注目されていた血栓溶解剤TPAをめぐる日米特許紛争についてケーススタディを試みたが、疾病の予防・治療という公共財に密接に関わる分野での知的所有権保護のあり方に改めて関心を深めるところとなった。

とくにゲノム創薬やイネ・ゲノムをめぐっては、市場経済性の優先視により国際公共財性が軽視される危険が痛感されるので、今後より重点的な考察を期したいと思っている。第二に、米国の知的所有権制度・政策が1990年代に顕現した経済構造の変化-しばしばニューエコノミー化と呼ばれる-と関連し合ってきた点を意識しつつ、米国ニューエコノミーのダイナミズムを解明することに努めた。ニューエコノミーが必ずしも安定的な経済発展を約束するものではなく、むしろ経済の安定を掘り崩しかねない性格を帯びている点を析出したが(たとえばニューエコノミーの象徴的存在とされたエンロンの破綻にしても、単なる不正会計問題による悲劇というにとどまらず、ビジネス・モデル面での問題が強く災いしたのではないかとの感触を得ている)、それが知的所有権制度・政策の運営といかなる関係にあるのかを明確に見定める課題はまだ未決のまま残されている。本研究の最終年であるので、追加的な資料収集・解析や関連研究領域における最近の業績の検討など必要な補充的作業をおこないつつ、研究計画の完遂と成果の集約に努めた。アメリカの知的所有権制度・政策の運営と米国経済のニューエコノミー化との関連に留意しつつ、その時代状況の中でバイオ関連特許やビジネス方法特許をめぐってどのような動きがあったのかを詳細に跡づけ、その経済的意味を探ることに努めた結果であるが、2編の論文をまとめるに至った。「米国バイオ関連特許の発展とその含意」(『経済論叢』)では、1980年代の米国バイオ産業の発展と特許の役割、90年代のヒトゲノム解読とインサイト・ショック、遺伝情報をめぐる公的プロジェクトとバイオベンチャー企業の攻防戦を明らかにした上で、遺伝子特許競争がポストゲノム時代に及ぼす影響に説き及んだ。特許乱立がポストゲノム技術に内在する全人類的なヘルスケア利益を損なってしまうおそれを、80年代からの流れの中に位置づけて指摘することができたと考える。「アメリカにおけるビジネス方法特許の動向とその問題点」(『KIER』)では、ステート・ストリート銀行事件判決を機に90年代末にビジネス方法特許ブームが現出した経緯、特許紛争の勃発とビジネス方法特許に対する世界的規模での懐疑・批判の高まり、米国政府・特許商標庁等が講じた対応策およびそれによる過渡的問題の解消、未解決のまま残されている本質的な問題を、順を追って検討した。ここでもやはり、国際公共財の性格を有するビジネス方法の特許化が科学技術や産業の発展にマイナス作用を及ぼす懸念を禁じえないこと、それは特許制度本来の趣旨にもとるものであること、への注意を喚起する形になった。
脂質構成成分の磁気共鳴法による画像化法の確立と応用

脂肪組織にはエネルギー源の貯蔵や褐色脂肪組織の熱産生といった役割が知られているが、過剰な脂質が蓄積された肥満状態の脂肪組織は炎症状態にあり生活習慣病などの危険因子と考えられている。画像診断が肥満の判定に用いられるが、MRIでは脂質の構成成分を分離して測定することが可能である。本研究ではMRIの測定手法の一つである多重共鳴法を用い、主に脂肪組織から得られる脂質構成成分毎の信号を画像化し、モデル動物を用いて定常状態から肥満に至る過程での信号変化を様々な条件下で測定した。その結果、肥満の形成にともなって飽和・不飽和鎖の信号分布が変化することが分かった。本研究では生体中での脂質分布の質的解析を多重共鳴MRI法により行い、分布の偏在がどのような要因によっているかを検討した。そのために、1)手法の条件検討、2)他解析手法との比較、3)脂質分布がどのような要因で変化するかをマウス個体を用い様々な条件下で測定した。1)手法の検討として、標準試料を用いた測定により想定される脂質構成要素(飽和、不飽和、トリグリセリドなど)由来の信号による画像構成が可能であり、濃度に比例した信号強度を得ることができたことから画像比較による定量解析が可能であると考えられた。また生体マウスでの測定においても各信号由来の画像を得られることを確認した。2)脂質構成要素の解析手法としてMALDI質量分析とガスクロマトグラフィー質量分析等を用いたが、マウス由来の生体試料では多重共鳴MRI画像から得られる脂質構成から期待される結果とは異なっていた。これはMRIで観測されている脂質は分析用に抽出された脂質の一部のみであること起因すると考えられ、比較のためには脂質抽出方法の検討が必要であることが分かった。3)マウス個体中では脂質の多重共鳴MRI信号は脂肪組織において観測されるが、脂質構成成分によっては分布の偏りがみられる。特に不飽和脂肪鎖に由来する信号は下腹部に局在してみられた。これは雌雄においてその傾向は変わらないが、食餌負荷による肥満誘導時には分布の変化がみられた。また食餌により低体重を維持させたマウスでは信号分布の変化はみられず、脂質成分画像による肥満度をとらえることができると考えられた。また2型糖尿病モデルマウスを用いると病態進行時には脂質分布の変化みられたことから、病態モニタリングにも本手法が用いることができるのではないかと考えられた。本研究で提案する多重共鳴MRI法として1H-13C HMQC(Hetero Multi Quntum Coherence)法を新たに導入されたMRI装置へ移植し、新規に導入されたコイルを用いて測定条件の検討を行った。当初利用予定の装置では感度ムラなどがあったために測定範囲の制限があったが、新しいコイルでは感度ムラもなく良好な画像が得られることが確認できた。条件検討の後に標準試料となる各種の脂質を用い空間分解能、感度性能、スペクトル分解能をそれぞれ調べた。スライス選択をしない状態では予想される画像が得られたが、スライス厚と位置の設定ができるようにしたところ、スペクトル選択に影響を受けることが判明した。その為、測定プログラムの改良が必要であることが分かった。次いでマウスを用いて、生きた状態で測定可能な条件を検討した。脂肪組織では高信号が得られるが、解析が可能な分解能を得るには一画像あたり10-20分の測定が必要であり、異なる信号毎に撮像が必要であることから、スペクトル・位置・角度を変えることで数時間の測定が必要であった。そこで、解析に必要となる最小の測定条件を整え、マウスへの負担を軽減するよう検討した。野生型マウスの測定で脂質構成成分によって分布に違いがみとめられたことから、基本的な条件でどのような差があるかを測定した。まず性差がみられるかどうかを同一系統の野生型マウスの雌雄で測定したところ、どちらも似た様な傾向があるこが分かった。年齢によって変化がみられうかどうかを11週齢と9カ月齢のマウスで測定したところ、脂肪成分の変化がみられた。本方法で得られた結果を検証するために測定後にマウスから組織を取り出し、脂肪抽出をし、脂質構成成分の依頼分析を行った。現在までの研究状況は提案した計画に含んだ実験をほぼ実施し、計画で目標とした測定手法の確立、マウスでの測定、抽出成分の分析をそれぞれ行うことができた。測定手法の確立は、測定環境の立ち上げからのスタートであったが装置利用が可能となるまでには必要な手続きを終えることができ、実験を開始することができた。当初はスライス選択を考慮していたかったが、より詳細な解析のために改良を試みたが完成には至らなかった。マウスの測定では様々な生理条件下での測定を試み、本研究での手法によりどのような変化がみられるかを測定する計画であった。性差と年齢に関しては測定実施できたたが、食餌の内容による変化や温度環境の変化などを試みるまでは至らなかった。

抽出成分の分析では抽出するための準備や方法の検討からのスタートであったが、得られた画像と対応した各部位からの脂質抽出をし分析することができるようになった。昨年度までにでてきた課題である測定手法の改良を進め、より有用な測定手法とする。当初計画のようにマウスを用いた測定で、外部刺激による信号変化を継時的に測定し、生理的な変化、免疫応答がみられるかどうか試みる。生理的な変化は飼育温度の変化により脂質構成分布に変化がみられないかどうかを検討する。マウスやヒトなどでは低温暴露によって褐色脂肪組織へのグルコースの取り込みが亢進することがしられている。本研究で用いている手法は13C標識したグルコース、または代謝物の追跡が原理的には可能であるので適用できるかどうか検討する。食餌による変化では高脂質の食餌によって肥満マウスを誘導できることから、モデルマウスを用い、肥満マウス・病態モデルマウスにおける脂質構成成分の変化を観察する。免疫応用では、LPSなどによる刺激で脾臓の脂質構成に変化があることから、本手法によって、脂質量の変化のみでなく構成成分の変化がみられないかどうかをマウスでみられないかどうか検討したい。また本研究で確立した手法と個体中での脂質構成成分の測定結果をまとめ、学会および論文発表し、今後本手法の適用できる領域を検討していく。該当なし
移植膵島内β細胞再生誘導：マウス並びに米国より搬送されたヒト膵島を用いた実験研究

膵島細胞障害制御後には再生が誘導されるのではないかと想定し、同種同系マウス膵島移植、さらに米国より搬送されたヒト膵島を免疫不全マウスに移植する実験系を用いて、移植膵島を対象に膵β細胞の再生について解析した。その際、Receptor for Advanced Glycation Endoproducts (RAGE)に着目した。その結果、RAGE欠損マウス膵島ではGLP-1Rの発現が優位に上昇し、移植膵島障害は発現しないのみならず、移植膵島のインスリン含有量が2倍に上昇することが判明し、移植膵島の再生を示す知見が得られた。ヒト膵島ではマウスで有用性が判明したRAGE阻害剤を用いて検討している。本研究では膵島移植の手法を用い、移植膵島に於けるインスリン産生細胞の再生誘導を明らかにすることを目的とした。予備実験で明らかとなった新規知見、すなわち高血糖による膵島細胞死がReceptor for Advanced Glycation Endoproducts(RAGE)を介した経路による治験に基づき、RAGEノックアウトマウスの単離膵島をドナーとして用い、STZ糖尿病同種同系マウスの腎皮膜下移植の実験系で移植膵島の再生に関し以下の成果を得た。#1.移植膵島機能。野生型マウス単離膵島をドナーとして用いる場合、一匹のドナーから単離できる膵島数、200個の移植でSTZ糖尿病マウスレシピエントの血糖は正常化したが、50個の移植では高血糖で推移した。対照的に、RAGEノックアウトマウス膵島がドナーの場合、50個膵島の移植でSTZ糖尿病レシピエントの血糖は正常化した。#2.組織学的検索。野生型vs RAGEノックアウトマウスの移植膵島を光顕ならびに電顕で観察した。移植後60日目の光顕で野生型移植膵島は明らかに変性し、免疫染色でβ細胞の脱顆粒が認められたが、RAGEノックアウト移植膵島は正常形態を示した。移植後14日目の電顕像では野生型膵島β細胞の細胞質に著しい空胞変性があったが、RAGEノックアウトマウス移植膵島β細胞は正常形態を保持していた。#4.米国より搬送されたヒト単離膵島の至適ドナー膵島数の決定。STZ-糖尿病NODscidマウスの腎皮膜下に単離ヒト膵島を移植し、移植後レシピエント血糖が正常化しない最大の膵島数をドナー膵島数(marginal mass)として決定する必要があり、実験の結果、1000 IEQ(Islet Equivalent)であることが判明した。本研究は膵島移植の手法を用い、移植膵島障害の制御により発現すると考えられるインスリン産生細胞の再生誘導の解明を目的にしている。並行して新規知見のヒト膵島への適応を考え、米国から搬送されたヒト単離膵島をドナーとしてSTZ-糖尿病NODscidマウスに移植する実験系を確立した。平成26年度はRAGE欠損vs野生型マウス単離膵島を用いて両者の違いをマイクロアレーで抽出し、RAGE欠損膵島ではGLP-1Rの発現が優位に上昇していること、またRAGE欠損膵島をGLP-1阻害剤(Exendin 9-37)で移植前処置すると効果がなくなることにより、RAGE欠損膵島の生着率向上はGLP-1Rを介した経路によるが証明できた。更には野生型マウス単離膵島にGLP-1アナルグ(liraglutide)で前処置、移植後はレシピエントに投与(皮下、60日間)すると移植膵島障害が制御できることも明らかにした。平成25ー26年度の研究でRAGE欠損マウスを用いて移植膵島障害にRAGEが必須の役割を担い、その成因としてRAGE欠損マウスではGLP-1Rが優位に発現しGLP-1ーGLP-1Rを介したシグナルが関与、さらにはluciferase assayでRAGEとGLP-1Rの直接的リンクを明らかにすることができた。更にはドナー膵島のRAGEシグナルをブロックする目的でsoluble formRAGE(sRAGE)を導入し、その存在下でドナー膵島を24時間培養後に移植すると移植膵島障害が制御できることを明らかにした。また米国より搬送されたヒト膵島を用いてSTZ糖尿病免疫不全マウスマウス(NOD/scid)に移植する実験系を確立した。平成27年度は最終年度としてRAGE欠損マウス膵島の移植後障害の制御により発現すると想定される移植膵島再生に関し解析した。さらに成果の臨床応用を目指してRAGE阻害剤としてのsRAGE代わる化合物を探索した。またヒト膵島ではsRAGEのヒト移植膵島への効果を検証した。RAGE欠損マウス移植膵島は移植後120日でインスリン含有量が2倍になることが判明した。InsI, InsII, glucagon, somatostatin, PP, Pdx1, Ngn3の検索と染色は現在進行しており間もなくデータが完結する予定である。RAGE阻害剤に関してはすでに臨床使用されている薬剤でRAGE阻害作用を有する化合物を見出しており、現在マウス膵島での効果を検討している。なおヒト膵島をドナーとしてSTZ-NOD/scidマウスに移植する実験系でsRAGEのヒト移植膵島障害の制御効果は明らかにできていない。

その際、Receptor for Advanced Glycation Endoproducts (RAGE)に着目した。その結果、RAGE欠損マウス膵島ではGLP-1Rの発現が優位に上昇し、移植膵島障害は発現しないのみならず、移植膵島のインスリン含有量が2倍に上昇することが判明し、移植膵島の再生を示す知見が得られた。ヒト膵島ではマウスで有用性が判明したRAGE阻害剤を用いて検討している。実験計画通りに研究成果が得られており、順調に推移している。27年度が最終年度であるため、記入しない。移植外科学平成26年度までの成果でRAGE欠損膵島をドナーとして用いるとGLP-1Rを介して移植膵島障害が発現しないことが明らかになった。移植膵島障害が制御後には膵島再生が誘導されている可能性が高く、事実予備実験でRAGE欠損移植膵島のインスリン含有量は移植後120日で単離膵島の2倍であった。平成27年度では移植後経時的に移植膵島インスリン含有量を測定し、増量時期を同定する。更にはインスリン産生細胞分化にかかわるメッセージを探索する。特に前駆細胞であるNgn3細胞に着目し、解析を行う。Ngn3細胞は胎児膵臓に発現する膵内分泌細胞前駆細胞で、予備実験で移植後60日以降に移植膵島に発現する知見を得ている。soluble RAGEを含め、RAGE阻害剤の効果を野生型マウス単離膵島をドナーとして用い判定し、有用性が確認できればヒト膵島に応用する。当初25年度の研究実施計画として#1、同種同系野生型vsRAGE欠損マウス移植膵島再生に関する解析。(1)移植膵島機能評価、(2)移植膵島の組織学的(光顕、電顕)解析、(3)移植膵島ホルモン含有量測定、#2.米国より搬送された単離ヒト膵島のSTZ-糖尿病NODscidマウスへの移植実験であったが、研究実績の概要に記載したように概ね計画通りに研究は進んでいる。当初の研究計画通りに平成26-27年度は、RAGE欠損マウス移植膵島に発現するインスリン産生細胞再生に関する解析に関し、インスリン産生細胞再生誘導に関連した転写因子の探索(message and protein levels)、野生型vs RAGE欠損マウス移植膵島のマイクロアレーによる再生因子の探索、ならびにsRAGEのヒト単離膵島への効果を検証し、再生誘導因子の同定を目指す。