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体外増幅自己赤芽球移植と自己骨髄単核細胞移植による血管新生治療の比較試験

重症虚血肢への自己骨髄細胞移植(BMI)による血管新生治療はある一定の効果はあるが、問題点が多い。我々は次世代血管新生治療として「重症下肢虚血に対する体外増幅自己赤芽球移植による血管新生治療の第I/II相臨床試験(EVEETA)」を開発し良好な結果を得た。本研究では従来法であるBMI療法と体外培養法によるEVEETA療法、この2つの血管新生療法の治療効果および安全性を検討した。いずれの治療法も急性期効果は得られたが、長期効果を検討するとBMI療法では1年以内に約半数の症例で何らかの切断術が施行された。EVEETA療法では下肢切断術を要する症例はなく、治療効果が長期間持続していると考えられた。本研究では重症虚血肢症例に対して、従来法である自己骨髄細胞移植(BMI)療法と体外増幅自己赤芽球移植培養法によるEVEETA療法、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を単施設無作為化並行群間比較試験において検討し、体外培養法であるEVEETAの優位性を実証し、保険収載を目指すべく、厚生労働省「ヒト幹細胞を用いる臨床試験の指針」の承認を得た後、先進医療Bに申請準備をすすめてきた。平成27年度中にEVEETA治療を1例に施行し、下肢血流の回復により安静時痛の消失、チアノーゼの消失を得られた。また平成26年11月に「再生医療等の安全性の確保に関する法律」(再生医療新法)が施行された。EVEETA,BMIいずれの手法も再生医療新法では第2種再生医療に該当するため、EVEETA, BMIそれぞれについて新規申請する必要があり、承認されるまで臨床試験の中断を余儀なくされた。EVEETA, BMIそれぞれの手法について九州大学特定認定再生医療等委員会にて厳格に審議され、平成28年1月28日付けで同委員会に承認された。関東信越厚生局にも平成28年2月に受理され、ようやく研究が再開可能となった。今後は先進医療Bへの申請を目指し、厚生労働省と協議中です。平成26年11月に「再生医療等の安全性の確保に関する法律」(再生医療新法)が施行された。本研究では重症虚血肢症例に対して、従来法である自己骨髄細胞移植(BMI)療法と体外増幅自己赤芽球移植培養法によるEVEETA療法、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を単施設無作為化並行群間比較試験において検討し、体外培養法であるEVEETAの優位性を実証し、保険収載を目指すべく、厚生労働省「ヒト幹細胞を用いる臨床試験の指針」の承認を得た後、先進医療B取得を目指し厚生労働省と審議をすすめてきた。しかし平成28年度中は適応症例がなく、追加症例はなかった。現在先進医療Bへの申請を目指し、厚生労働省と協議中です。平成28年2月にようやく研究が再開可能となったが、中断の影響もあり、関連施設からも患者が集まらない状況でした。本研究では重症虚血肢症例に対して、従来法である自己骨髄細胞移植(BMI)療法と体外増幅自己赤芽球移植培養法によるEVEETA療法、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を検討し、体外培養法であるEVEETAの優位性を実証し、保険収載を目指すべく、厚生労働省「ヒト幹細胞を用いる臨床試験の指針」の承認を得た後、先進医療Bに申請準備をすすめてきた。H27年度中にEVEETA治療を1例に施行し、下肢血流の回復により安静時痛の消失、チアノーゼの消失を得られた。EVEETA,BMIいずれの手法も再生医療新法では第2種再生医療に該当するため、EVEETA, BMIそれぞれついて新規申請する必要があり、承認されるまで臨床試験の中断を余儀なくされた。平成30年3月に強皮症による難治性血管炎症例に対しEVEETA療法を施行し、ある程度の効果が得られた。

重症虚血肢への自己骨髄細胞移植(BMI)による血管新生治療はある一定の効果はあるが、問題点が多い。我々は次世代血管新生治療として「重症下肢虚血に対する体外増幅自己赤芽球移植による血管新生治療の第I/II相臨床試験(EVEETA)」を開発し良好な結果を得た。本研究では従来法であるBMI療法と体外培養法によるEVEETA療法、この2つの血管新生療法の治療効果および安全性を検討した。いずれの治療法も急性期効果は得られたが、長期効果を検討するとBMI療法では1年以内に約半数の症例で何らかの切断術が施行された。EVEETA療法では下肢切断術を要する症例はなく、治療効果が長期間持続していると考えられた。EVEETA, BMIそれぞれの手法について九州大学特定認定再生医療等委員会にて厳格に審議され、平成28年1月28日付けで同委員会に承認された。関東信越厚生局にも平成28年2月に受理され、ようやく研究が再開可能となった。引き続き患者のリクルートを進め、同時進行で先進医療Bへの申請を目指す。医歯学系平成26年11月に「再生医療等の安全性の確保に関する法律」(再生医療新法)が施行された。EVEETA,BMIいずれの手法も再生医療新法では第2種再生医療に該当するため、EVEETA, BMIそれぞれについて新規申請する必要があり、承認されるまで臨床試験の中断を余儀なくされたため。平成26年11月に「再生医療等の安全性の確保に関する法律」(再生医療新法)が施行された。EVEETA,BMIいずれの手法も再生医療新法では第2種再生医療に該当するため、EVEETA, BMIそれぞれについて新規申請する必要があり、承認されるまで臨床試験の中断を余儀なくされた。平成28年2月にようやく研究が再開可能となったが、中断の影響もあり、関連施設からも患者が集まらない状況でした。特定認定再生医療等委員会の承認も得られ、ようやく臨床研究が再開可能となり、適応症例への臨床試験参加を積極的にすすめる。同時進行で先進医療Bへの申請作業も進めていく。患者のリクルート後、本治療に必要な各種細胞培養液などの購入を予定しています。
朝鮮燕行録とベトナム如清録から見た東アジア国際関係史研究

1論文発表、口頭発表:論文「日本のキリスト教禁制による不審船転送要請と朝鮮の対清・対日関係-イエズス会宣教師日本潜入事件とその余波-」が、査読制の学術誌『史学雑誌』に掲載された。また燕行録研究について、仁荷大学韓国学研究所にて韓国語で口頭発表する機会も得た。2史料調査:国際関係に関する史料を、東洋文庫、国立公文書館、韓国国史編纂委員会、台湾中央研究院、ベトナム漢喃研究院にて収集した。ベトナム如清録に関しては、2010年に出版された『越南漢文燕行文献:越南所蔵編』には収録されていない、またはテキストが異なる如清録があるか、越南本コレクションを有する東洋文庫を調査した結果、5件発見することができた。しかし、越南本の多くは筆写本であるため、他の筆写本との関係を把握するのは容易ではなく、現存するテキストを全部集めて検討するという根本的な整理から行う必要があることを痛感した。そのため漢喃研究院では、『越南漢文燕行文献』には影印収録されなかった別の筆写本や関連史料を調査した。なお、黎貴惇『北使通録』(『越南漢文燕行文献』に収録)の別写本があるとされていたフランスでも調査を行うことを予定していたが、『越南漢文燕行文献』の編集に関与し、フランスでも調査を行った方から、フランスに現存している『北使通録』が『越南漢文燕行文献』収録のものと同じだと御教示頂いたため、調査は断念した。3燕行録精読と北京現地調査:李義鳳(初名、李商鳳)の漢文燕行録『北轅録』と同書のハングル版燕行録の精読を進めた。ハングル版の翻刻本が最近出版されたため、『北轅録』と比較して読み進めていった。その結果、翻刻者は基本的にハングル本は漢文本を直訳したものと指摘しているが、翻訳をしていない部分や、逆に詳しく説明を加えている部分等の異同を確認することができた。また、朝鮮使節が滞在した北京の地理を把握するため、現地調査を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は燕行録研究を進めるため、韓国・ソウル大学奎章閣国際韓国学研究センターでの研究指導委託による在外研究を開始した。そのため朝鮮燕行録の精読と、目本と韓国での資料収集を中心に行い、東京大学史料編纂所、ソウル大学奎章閣韓国学研究院、韓国国史編纂委員会での未刊行史料の調査を行った。本年度の成果としては京都大学人文科学研究所「東アジア地域間交渉と情報」共同研究班で行った口頭発表「日本のキリスト教禁制による不審船転送要請と朝鮮の対清・対日関係」がある。本研究課題では清への燕行録、如清録を主な研究対象とするが、朝鮮は漢人の王朝であった明は「中華」として尊敬していたが、「夷狄」の満人の王朝であった清へは蔑視を持ち、朝鮮自身を中華の後継者とみなす小中華思想を持つようになっていった。そのため明への燕行録と清への燕行録では書き手の中国に対する考え方が異なっている。明清交代期にどのような過程を経て朝鮮が清朝との関係を築いていったのか、そしてそれが対日関係とどのような関係にあったのかを明らかにすることは、それ以後の朝鮮燕行録から東アジアの国際関係を探る上で非常に重要である。そのため本発表では、燕行録をはじめとする朝鮮史料や宗家文書、『清実録』等、朝鮮・日本・清三国の史料を用い、1640年代前後の中国の明清交代と日本の「鎖国」体制形成の狭間で、朝鮮が対清、対日関係をどのように行っていたのかを、日本の朝鮮に対する不審船転送要請を題材に実証的に提示した。朝日清三国の関係のみならず、日本の沿岸警備体制や当時のイエズス会の布教活動についても新たな視点を提示できたと考えている。本発表の内容はすでに論文として完成しており、近日中に査読誌に投稿予定である。

なお、黎貴惇『北使通録』(『越南漢文燕行文献』に収録)の別写本があるとされていたフランスでも調査を行うことを予定していたが、『越南漢文燕行文献』の編集に関与し、フランスでも調査を行った方から、フランスに現存している『北使通録』が『越南漢文燕行文献』収録のものと同じだと御教示頂いたため、調査は断念した。3燕行録精読と北京現地調査:李義鳳(初名、李商鳳)の漢文燕行録『北轅録』と同書のハングル版燕行録の精読を進めた。ハングル版の翻刻本が最近出版されたため、『北轅録』と比較して読み進めていった。その結果、翻刻者は基本的にハングル本は漢文本を直訳したものと指摘しているが、翻訳をしていない部分や、逆に詳しく説明を加えている部分等の異同を確認することができた。また、朝鮮使節が滞在した北京の地理を把握するため、現地調査を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究の基盤となる史・資料の収集は、日韓での収集に関しては順調に進んだ。本年度は残念ながら成果を論文の形で発表することはできなかったが、論文はほとんど完成しており、一定の成果を挙げられたと考える。まだ如清録を用いた成果は準備できていないので、こちらの研究の成果も出せるよう努める。本年度は、予定していた古典ハングル文の勉強を本格的には始められなかったが、次年度からはソウル大学の研究者、学生と共に勉強会を行い、李義鳳(初名:李商鳳)のハングル燕行録『셔원녹』を精読する予定である。習得には当初の想定よりさらに時間が必要と判断したため、在外研究期間を延長する予定である。また韓国での在外研究を開始し、研究環境に慣れるまで予想より時間が掛かってしまったため、初年度は日本と韓国での史料調査しかできなかった。次年度は調査に行けなかったベトナム、中国、台湾で史・資料の収集を行う予定である。
特異性をもつ方程式に対する超高性能数値解法の開発と理論動作保証

特異性をもつ関数を含む微分方程式や積分方程式は,物理・化学などでしばしば現れるが,特異性のために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.仮に既存手法を適用したとしても,従来通りの性能が出なかったり,そもそも解に収束する保証がなかったりした.そこで本研究では,特異性に強いSinc数値計算法をベースとした研究を行い,非常に高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行った.本研究の目的は,特異性をもつ方程式に対し,これまでになく高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行うことである.対象とする方程式は物理・化学などでしばしば現れるが,特異性をもつ関数が現れるために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.ただし,その特異性は境界にのみ現れ,内部では性質のよい「解析関数」になることが多く,そのような場合にはSinc数値計算法が非常に有効である.実際に研究代表者によって,特異性をもつ関数に対し,Sinc数値計算法に基づく高性能近似公式がいくつか提案されている.そこで本研究では,この成果をもとに,特異性をもつ方程式に対する超高性能数値解法の開発を行うこと,さらに理論解析によってその動作保証も厳密に行うことを目的とする.平成24年度では,Abel核と呼ばれる,積分核が「代数的」な特異性をもつ場合で研究を行ったが,平成25年度は積分核が「対数的」な特異性をもつ場合について研究を進めた.代数的な特異性の場合は,Sinc数値計算法による基本近似公式に対して明示的な誤差上界を与える解析結果が与えられているが,対数的な特異性の場合はまだ与えられていないために,まずその基本となる部分から解決する必要があった.Sinc数値計算法では「SE変換」と呼ばれる変数変換と組み合わせる方法と,「DE変換」と呼ばれる変数変換と組み合わせる方法の二種類があるが,これら二種類のいずれの場合についても理論解析を行った.代数的な特異性の場合とは異なり,解析に自由度がある部分があったが,実用的な観点から妥当と思われるものを選択して解析を進めた.また,平成26年度の研究(特異性をもつ微分方程式に対する研究)を見越して,微分が含まれた方程式に対する研究も進めた.本研究の目的は,特異性をもつ方程式に対し,これまでになく高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行うことである.対象とする方程式は物理・化学などでしばしば現れるが,特異性をもつ関数が現れるために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.ただし,その特異性は境界にのみ現れ,内部では性質のよい「解析関数」になることが多く,そのような場合にはSinc数値計算法が非常に有効である.実際に研究代表者によって,特異性をもつ関数に対し,Sinc数値計算法に基づく高性能近似公式がいくつか提案されている.そこで本研究では,この成果をもとに,特異性をもつ方程式に対する超高性能数値解法の開発を行うこと,さらに理論解析によってその動作保証も厳密に行うことを目的とする.平成24年度に研究のメイン対象とした方程式は,「Abel核」と呼ばれる弱特異な積分核をもつ方程式であり,このタイプには大きく分けて二通りある.一つは積分範囲が不定な(不定積分),Volterra型と呼ばれるタイプであり,もう一つは積分範囲が確定している(定積分),Fredholm型と呼ばれるタイプである.これらの方程式に対するSinc数値計算法に基づいた数値解法は提案されており,「SE変換」と呼ばれる変数変換と組み合わせる方法が有名である.さらに高性能化を図ったものとして,「DE変換」と組み合わせた数値解法もあり,これら二種類の数値解法の動作保証に対する理論解析の研究を進めた.特にDE変換と組み合わせる方法には,既存の理論解析法では難しい部分があったが,そのような困難な場合において有用な新たな誤差解析手法を構築した.これは今後の対象とする方程式に対しても有用な結果である.本研究の目的は,特異性をもつ方程式に対し,これまでになく高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行うことである.対象とする方程式は物理・化学などでしばしば現れるが,特異性をもつ関数が現れるために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.ただし,その特異性は境界にのみ現れ,内部では性質のよい「解析関数」になることが多く,そのような場合にはSinc数値計算法が非常に有効である.実際に研究代表者によって,特異性をもつ関数に対し,Sinc数値計算法に基づく高性能近似公式がいくつか提案されている.そこで本研究では,この成果をもとに,特異性をもつ方程式に対する超高性能数値解法の開発を行うこと,さらに理論解析によってその動作保証も厳密に行うことを目的とする.これまでは積分が含まれた方程式に対する研究が主であったが,平成26年度は,微分も含まれている方程式(微積分方程式)に対する研究にも精力を注いだ.ここでの主なアイディアは,与えられた方程式を積分することで微分をなくすよう変形し,積分方程式に帰着することである.これによってこれまでの積分方程式に対する成果を使用することができ,数値解法の導出およびその動作保証を実現した.さらに精度保証を行うことも考えているが,今回の変形により不定積分型の二重積分が現れるため,これに対する精度保証が必要となる.この研究は平成27年度に実現させる予定である.さらに隣接するサブテーマとして,多角形領域のラプラシアンの固有値の精度保証も行った.

この計算には端点に特異性をもつ積分値を精度保証つきで求めることが必要となるが,これまでの研究成果を工夫することで実現した.本研究の目的は,特異性をもつ方程式に対し,これまでになく高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行うことである.対象とする方程式は物理・化学などでしばしば現れるが,特異性をもつ関数が現れるために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.ただし,その特異性は境界にのみ現れ,内部では性質のよい「解析関数」になることが多く,そのような場合にはSinc数値計算法が非常に有効である.実際に研究代表者によって,特異性をもつ関数に対し,Sinc数値計算法に基づく高性能近似公式がいくつか提案されている.そこで本研究では,この成果をもとに,特異性をもつ方程式に対する超高性能数値解法の開発を行うこと,さらに理論保証によってその動作保証も厳密に行うことを目的とする.平成26年度において,微分と積分が含まれた方程式の数値解法の研究を行ったが,そこでは与えられた方程式を積分して微分項をなくすように変形し,積分方程式に帰着していた.その際に二重積分が現れるため,今後精度保証付き数値計算を考える際には,二重積分に対する精度保証付き数値計算が必要となることがわかった.そこで平成27年度は二重積分に対するSinc数値計算法の誤差を詳細に解析し,明確な誤差上界を与えた.この結果によって許容誤差をみたす近似値を得ることが可能になった.さらに隣接するサブテーマとして,ガンマ関数や変形ベッセル関数の精度保証付き数値計算法の開発も行った.これらの関数は,原点で特異性をもつ関数の積分を計算することで求まるが,これまでの研究成果を工夫することでこの精度保証付き数値計算を実現した.また他にも,無限領域上の二重積分に対する数値計算法についても考察した.平成26年度に新たに現れた課題「二重積分をSinc数値計算法によって精度保証付き数値計算を行う」ための最も重要な部分である,誤差上界を得ることに成功した.この上界を計算することで厳密に誤差を見積もることができ,許容誤差をみたす近似値を得ることが可能になった.その他にも,ガンマ関数や変形ベッセル関数の精度保証付き数値計算法の開発など,さらなる成果を積み重ねている.また並行して,Sinc数値計算法の性能を超える超高性能数値計算法を鋭意開発中である.本研究の目的は,特異性をもつ方程式に対し,これまでになく高い性能をもつ数値解法を開発し,さらに理論的に動作保証も行うことである.対象とする方程式は物理・化学などでしばしば現れるが,特異性をもつ関数が現れるために数値シミュレーションが難しく,既存の汎用手法ではうまく扱えない.ただし,その特異性は境界にのみ現れ,内部では性質のよい「解析関数」になることが多く,そのような場合にはSinc数値計算法が非常に有効である.実際に研究代表者によって,特異性をもつ関数に対し,Sinc数値計算法に基づく高性能近似公式がいくつか提案されている.
看護実践におけるフィジカルアセスメントの効果

看護におけるフィジカルアセスメントはクライエントの頭から足先までの状態を的確に系統的に把握する技術であり、看護者が行う身体査定である。その目的は身体の構造・機能についての正常・異常を判別し看護実践に活かすことにある。看護者が実践するフィジカルアセスメントの効果を明らかにすることを目的に、地域で生活している健康な人と入院患者の双方から検討した。その結果、健康な人に対してフィジカルアセスメントを実施することは、対象者自身が身体の状態を客観的に理解し、健康に向かう意思と力を再確認する機会になった。一方、健康障害があり入院している人に対して看護師が行うフィジカルアセスメントは、モニタリングを目的に頻繁に実施されているが、モニタリングから得られた情報を生活援助のためのケア決定に活かされていることが明らかとなった。看護師が実践するフィジカルアセスメントは対象者とともにアセスメントから得られた所見を共有する過程において、エンパワメントの視点で対象者自身に働きかけ、健康問題への取り組みに対して対象者の意思を反映することができる。しかし医師が行うフィジカルイグザミネーションはあくまでも診断や治療を目的としており、生活を援助する看護の視点とは異なっている。医師と看護師が行うフィジカルアセスメントはその目的や対象者への援助方法において相違をみることができる。今回の研究より、看護師が実践するフィジカルアセスメントはエンパワメント、モニタリング、さらにはモニタリングを通して対象の健康状態に即した必要なケア方法を決定するという効果があることが分かった。看護におけるフィジカルアセスメントは、クライエントの頭から足先までの全身の状態を的確に系統的に把握する技術であり、看護者が行う身体査定である。その目的は身体の構造・機能についての正常・異常を判別し看護実践に生かすことにある。看護者が実践するフィジカルアセスメントの効果を明らかにすることを目的に、平成14年度の計画に基づき実施した。資料収集期間は平成14年7月22日8月21日であった。対象は、比較的健康状態が良い有料老人ホーム入所者にフィジカルアセスメントの目的および方法を説明し、承諾を得て実施した。診査は、フィジカルアセスメント技術の訓練を受けた教員2名が実施した。対象者は男性15名、女性35名であり平均年齢は78.18歳であった。フィジカルアセスメントの項目は、全身の概観・皮膚・爪・頭頚部・眼・耳・呼吸器・心血管・乳房・腹部・筋骨格・神経であり、一人のアセスメントの時間は問診を含めて約60分80分であった。アセスメントの結果は診査中に対象者に伝えると同時に、アセスメントの結果と今後の生活に向けてのアドバイスを郵送し、それに対する質問や身体診査を受けての感想等を収集した。アセスメントを受けた対象の反応は「全身を細かく見てもらえて安心して生活できる」と良好であった。また、さまざまな正常・異常所見が親察されたが、それらは「加齢による身体変化と考えられるもの」「生活習慣に関連するもの」「健康障害の徴候と考えられるもの」等があったが、看護実践との関連については次年度の研究をも含めて分析する。看護におけるフィジカルアセスメントはクライエントの頭から足先までの全身の状態を的確に系統的に把握する技術であり、看護者が行う身体査定である。看護者が実践するフィジカルアセスメントの効果を明らかにすることを目的に平成15年度の計画に基づき実施した。対象はフィジカルアセスメントの教育を受けた成人病棟に勤務する看護師10名である。研究の目的や方法を看護師や患者に説明をし同意を得たのち、参加観察法にて看護場面を収集した。記録用紙に記載された看護場面ごとの「患者の状態」「看護ケアの内容」「患者の反応」から実施されたフィジカルアセスメントの項目を抽出し、さらにアセスメントの意味とケア場面との関連をベナーの看護実践の領域を主軸に分析を行った。

その結果、50の看護場面のうち、フィジカルアセスメントの技術として最も多く使われていたのがバイタルサインの測定であり、次に全身の皮膚の視診、関節可動域の視診・触診、呼吸器の視診・触診の順であった。実施されたフィジカルアセスメントの意味とケアとの関連については「診断機能と患者モニタリング機能」のうち「患者の状態から重要な変化を検出し記録する」が最も多く、「問題を予知する:先の見通しを立てる」がそれに次いだ。臨床場面で用いられるフィジカルアセスメントは、患者のモニタリングを通して得られた情報を生活援助のためのケア決定に活かされていることが明らかとなった。
プロテインキナ-ゼC群の分子多様性及びその構造と機能の分子生物学的解析

前年度までにPKC群各分子種についてCOS細胞におけるcDNA発現系を用いて種々の生化学的性質の検討を行なってきた。その過程でnPKCεが従来のPKC(α,β,γ)とは質的に異なる新しい蛋白質である事を明らかにした。本年度はこれをさらにおし進め、キナ-ゼの基質特異性、細胞膜との相互作用、down-regulation等について各分子種の比較を行ない、明確な差のある事を見い出した。同時に各分子種のcDNAを3Y1細胞に導入する系を用いて生細胞レベルでの機能をその転写活性化能を指標として検討し、各PKC,nPKC分子種間に大きな差異のある事を見い出した。以下順を追って述べる。1.COS細施のcDNA発現系を用いて精製したPKCα,nPKCεとを用いて種々の精製蛋白質に対するリン酸化能を試験管内で検討した。その結果多くのPKC基質がnPKCεの基質にもなる事が明らかとなった。一方徴小管結合蛋白質群(MAPs)の一つtの分画に混在する蛋白(p140)がnPKCεによってのみきわめて効率よくリン酸化される事を見い出した。2.PKC,nPKCをoverexpressionさせた細胞を用いてホルボ-ルエステル処理後の各分子種の細胞内での動態を検討した結果、nPKCεについても細胞膜への移行、down-regulationという現象の起る事が明らかとなった。しかしその速度、様式は異なっていた。試験管内での細胞膜との結合実験においてPKCとnPKC間でそのco-factor依存性の明確な差のある事が確認された。3.ホルボ-ルエステル応答性遺伝子の転写活性化能をPKC,nPKCについて生細胞レベルで検討した結果、各分子種間でその遺伝子特異性に明確な差が認められた。以上を総合するとPKC,nPKCε各分子種は細胞内で異なった生理機能を担っている事が示された。
有限差分法と有限体積法ハイブリッド型津波数値モデルによる津波予測精度の高度化

本研究は、実務等で使用される津波数値モデルの高度化を目指し、有限体積法で計算する外洋伝播域と陸上遡上域の間に非構造格子で構成された接続領域を有限体積法で解くハイブリッド型津波数値モデルの開発を目的としている。新たに構造格子と非構造格子を接続する水深データの作成アルゴリズムと、非構造格子による線形分散波理論の数値モデルを開発した。開発した手法は線形分散波理論の理論解に良好に一致することを確認し、2011年東北地方太平洋沖地震津波の再現計算から実地形への適用も可能であることを明らかにした。本研究課題は、実務等で使用される津波数値モデルの高度化を目指し、有限差分法(FDM)で計算する外洋伝播域と陸上遡上域の間に非構造格子で構成された接続領域を設け有限体積法(FVM)で解くハイブリッド型津波数値モデルを開発することを目的としている。平成26年度は、非線形分散波理論に基づく非構造格子FVMプログラムの検討を行った。既開発の浅水理論によるFVMモデルを基にして、新たにポテンシャル法による分散項の導入を試み、モデルの定式化を行った。本モデルを理論解や既往のベンチマーク実験の結果と比較し、津波伝播による分散性の発生を良好に再現可能であることを確認した。次に、構造格子FDMモデルと非構造格子FVMモデルの接続手法の開発を試みた。当初、両者の接続は、既往の浅水理論の手法をそのまま利用することで比較的容易に完成すると考えられたが、非構造格子FVMモデルを定式化する際に変数の定義等を一新したため、新たな接続アルゴリズムを開発した。同手法を実験ベンチマークの再現計算に適用したが、現段階では接続領域において計算の不安定性が見られるため、今後も継続して検討を行う必要がある。本研究は、実務等で使用される津波数値モデルの高度化を目指し、有限差分法(FDM)で計算する外洋伝播域と陸上遡上域の間に非構造格子で構成された接続領域を有限体積法(FVM)で解くハイブリッド型津波数値モデルの開発を目的としている。本年度は、開発したモデルの実地形問題への適用性を検証するため、2011年東北地方太平洋沖地震津波の数値計算を行った。本研究を実施するにあたり、新たに構造格子と非構造格子を接続する水深データの作成アルゴリズムを開発した。既存の構造格子で構成されている水深データについて、GISソフトウェアにより全領域の座標系を統一し、非構造格子の重心位置に構造格子を平面補間することで水深データを与えた。これにより、外洋域と沿岸域(三陸沿岸から福島沿岸)複数の領域を構造格子とし、その間を非構造格子でシームレスに接続する地形データを作成することに成功した。線形分散波理論の伝播計算から、沖合で観測されたGPS波浪計による津波の水位変化を概ね良好に再現できた。また、従来のFDMによる計算と比較してもほぼ同等の結果となることを確認した。陸上遡上域のモデル化や計算時間の短縮に課題は残ったものの、今後さらにモデルの精度を検証し、アルゴリズムを改良することで、高精度な津波予測モデルの一手法として活用できると考えられる。平成26年度は、非線形分散波理論の非構造格子FVMプログラムの開発を行い、さらに当該年度中にFDMプログラムとFVMプログラムの接続手法の開発を完了する予定であったが、同手法のテスト計算を行ったところ不安定な挙動を示す場合があり、未だ問題解決に至っていない。接続域付近における非構造格子の格子サイズの設定等が原因と考えられ、問題解決に向けて検討中する。水工学今後は、平成26年度に達成できなかったFDM・FVMの接続手法の完成を目指す。ベンチマーク実験において適用し、再現精度が十分であると判断した上で、実地計算への適用(2011年東北地方太平洋沖地震津波の再現計算)に着手する。予定していた研究打ち合わせの回数が少なくなったことや、電算機用消耗品の購入が当初予定よりも少なく済んだため。今年度残高は旅費での使用を予定している。
経営的収益性と環境負荷を統合的に評価した農地及び水利システム管理モデルの開発

近年,農業経営における収益性の向上や,農地から肥料成分などが河川や湖沼へと流出するノンポイント汚濁の排出源管理が課題となっている.そこで本研究では,経営的収益性と環境負荷を統合的に評価し,収益性の向上と汚濁負荷量の削減を目指した農地及び水利システム管理モデルの開発を行った.今年度における研究実施状況をまとめると,(1)農地及び水利システム管理モデルの開発と改良(2)モデルパラメータ同定のためのデータの収集の2点である.(1)農地及び水利システム管理モデルの開発と改良前年度に引き続き農地及び水利システム管理モデルの開発を行った.圃場一筆ごとの栽培作物を選定する決定変数を設定した混合0-1計画問題として定式化し,重み係数法を用いて多目的を設定し,経営的収益性と環境負荷を統合的に評価した.農業経営における収益性の向上目指す目的関数は,栽培作物の収量,栽培経費などの栽培管理における統計データを用いて,圃場一筆ごとの栽培作物を的確に選定するように定式化した.また,環境負荷に関する目的関数では,水路内での汚濁負荷に対する自浄作用をモデル化し,農業地域の水利システムから外部の河川や湖沼へと排出される汚濁負荷を,水路内での自浄作用により効率的に削減するように定式化した.開発したモデルを仮想の農業地域に適用し,全窒素負荷量と農業収益との間のトレードオフ関係を定量的に評価し,この結果は農地管理者にとって作付計画の際の意思決定に有用な判断材料となることを示した.これら成果は論文にとりまとめ学術誌への掲載を予定している.さらに,開発したモデルの改良を行った.複数の水質項目(硝酸態窒素,アンモニア態窒素,全リン)に関して汚濁負荷量が評価できるよう改良し,また汚濁魚荷の原単位や収益性に関する不確実性を考慮するため確率計画法によるシナリオやファジィ目標を導入し,より実用性の高い最適化モデルを構築した.最適化モデルを後述の滋賀県の農業地域に適用し,これらの成果を関連学会において発表し,論文にとりまとめ学術誌へ投稿中である.(2)モデルパラメータ同定のためのデータの収集前年度から継続して滋賀県の農業地域において現地調査を行い,圃場からの排水や水路での採水サンプルを集め,硝酸態窒素,アンモニア態窒素,全リンなどの水質分析を行った.その結果,調査地域内における各水路での自浄係数や,圃場での作付の変化による排出される汚濁負荷量の増減が明らかとなり,これらのデータからモデルパラメータが同定された.近年,農業経営における収益性の向上や,農地から肥料成分などが河川や湖沼へと流出する面源汚濁の排出源管理が課題となっている.そこで本研究では,経営的収益性と環境負荷を統合的に評価し,収益性の向上と汚濁負荷量の削減を目指した農地及び水利システム管理モデルを開発する.今年度農地及び水利システム管理モデルを,圃場一筆ごとの栽培作物を選定する決定変数を設定した混合0-1計画問題として定式化を行った.最適化において多目的を設定し,重み係数法を用いて経営的収益性と環境負荷を統合的に評価した,農業経営における収益性の向上目指す目的関数は,栽培作物の収量,栽培経費などの栽培管理における統計データを用いて,圃場一筆ごとの栽培作物を的確に選定し,収量変動リスクを低減させるように定式化した.また,環境負荷に関する目的関数では,水路内での汚濁負荷に対する自浄作用をモデル化し,農業地域の水利システムから外部の河川や湖沼へと排出される汚濁負荷を,水路内での自浄作用により効率的に削減するように定式化した.構築したモデルを仮想の農業地域に適用し,排出汚濁負荷量と農業収益との間のトレードオフ関係を定量的に評価し,この結果は農地管理者にとって作付計画の際の意思決定に有用な判断材料となることを示した.これら成果を関連学会において発表し,論文にとりまとめ学術誌への掲載を予定している.さらに,モデルパラメータ同定のためのデータ収集を行った.栽培作物の収量,栽培経費などの栽培管理における統計データを文献調査により収集した.滋賀県の農業地域において現地調査を行い,圃場からの排水や水路での採水サンプルを集め,硝酸態窒素,アンモニア態窒素,全リンなどの水質分析を行った.その結果,栽培作物による排出される汚濁負荷量の違いや,水路による自浄係数の違いが明らかとなり,これらのデータからモデルパラメータを同定した.近年,農業経営における収益性の向上や,農地から肥料成分などが河川や湖沼へと流出するノンポイント汚濁の排出源管理が課題となっている.そこで本研究では,経営的収益性と環境負荷を統合的に評価し,収益性の向上と汚濁負荷量の削減を目指した農地及び水利システム管理モデルの開発を行った.今年度における研究実施状況をまとめると,(1)農地及び水利システム管理モデルの開発と改良(2)モデルパラメータ同定のためのデータの収集の2点である.(1)農地及び水利システム管理モデルの開発と改良前年度に引き続き農地及び水利システム管理モデルの開発を行った.圃場一筆ごとの栽培作物を選定する決定変数を設定した混合0-1計画問題として定式化し,重み係数法を用いて多目的を設定し,経営的収益性と環境負荷を統合的に評価した.農業経営における収益性の向上目指す目的関数は,栽培作物の収量,栽培経費などの栽培管理における統計データを用いて,圃場一筆ごとの栽培作物を的確に選定するように定式化した.

また,環境負荷に関する目的関数では,水路内での汚濁負荷に対する自浄作用をモデル化し,農業地域の水利システムから外部の河川や湖沼へと排出される汚濁負荷を,水路内での自浄作用により効率的に削減するように定式化した.開発したモデルを仮想の農業地域に適用し,全窒素負荷量と農業収益との間のトレードオフ関係を定量的に評価し,この結果は農地管理者にとって作付計画の際の意思決定に有用な判断材料となることを示した.これら成果は論文にとりまとめ学術誌への掲載を予定している.さらに,開発したモデルの改良を行った.複数の水質項目(硝酸態窒素,アンモニア態窒素,全リン)に関して汚濁負荷量が評価できるよう改良し,また汚濁魚荷の原単位や収益性に関する不確実性を考慮するため確率計画法によるシナリオやファジィ目標を導入し,より実用性の高い最適化モデルを構築した.最適化モデルを後述の滋賀県の農業地域に適用し,これらの成果を関連学会において発表し,論文にとりまとめ学術誌へ投稿中である.(2)モデルパラメータ同定のためのデータの収集前年度から継続して滋賀県の農業地域において現地調査を行い,圃場からの排水や水路での採水サンプルを集め,硝酸態窒素,アンモニア態窒素,全リンなどの水質分析を行った.その結果,調査地域内における各水路での自浄係数や,圃場での作付の変化による排出される汚濁負荷量の増減が明らかとなり,これらのデータからモデルパラメータが同定された.
新エネルギー開発に伴うヒ素汚染防止への無毒化処理法と安全性評価の確立

無機ヒ素暴露からの健康障害の予防や根絶には、ヒ素が持つ毒性の消去が有効と考える。この様な新たな試みは、地球規模での慢性ヒ素中毒の問題、そして、シェールオイルやガス、地熱発電などへの開発支援、さらにヒ素化学兵器の安全な処理事業にも貢献が期待される。無機ヒ素の無毒化処理は酸化チタン光触媒システムの確立にて、さらにその無毒化物の安全性試験についても基礎的研究を試みた。本研究から、中毒性ヒ素である無機ヒ素化合物などを無毒化処理について、酸化チタン光触媒を酢酸存在下にて作用させた。研究結果から、迅速性や経済性など実用化に向けて進展する可能性の一端を確認した。地球温暖化対策などから新たなエネルギー源が求められ、シェールオイルやシェールガス、地熱発電などが期待されている。しかし、シェールオイルやシェールガスの掘削、地熱発電に使用する地熱水には高濃度なヒ素が含まれることから、さらなる社会への普及には環境汚染対策が求められる。無機ヒ素は強い発がん性物質であり、これまでに様々な原因から急性や慢性ヒ素中毒も世界各地で発生した。現在、アジアや中南米諸国には自然由来の無機ヒ素により生活水が汚染され、WHOは約5,000万人に慢性ヒ素中毒が発生したと報告している。本研究は、酸化チタン光触媒システムによる無機ヒ素の無毒化処理技術を検証し、ヒ素による健康障害の発生に対する予防や改善の対策支援としての意義を検証する。また、人工的に無毒化されたヒ素化合物の安全性に関する基礎的な研究を試みる。新たなエネルギー源として注目されているシェールオイルやシェールガス、地熱発電などが国際社会で広く実用化と推進されている。一方、掘削から発生する廃水にはヒ素など有害元素が含まれ、環境汚染対策の必要性が求めらているが、効果的な思考や技術が存在していなかった。本研究は、酸化チタン光触媒システムによる無機ヒ素の無毒化処理技術の可能性と実用化について検討を試みた。無機ヒ素の想定する無毒化物は、魚介類などに高濃度に含有しているアルセノベタイン(AsB)で、人は魚介類から大量のAsBを連続摂取しても生体影響はなく、動物での毒性試験からも無毒と判断され、さらに推定の半致死量は10g/kgで、三酸化ヒ素に比較して1/300の毒性である。酸化チタン光触媒、酢酸、光照射の組み合わせにより、無機ヒ素はAsBに変換されることを確認した。さらに、人及び動植物で確認されている無機ヒ素の代謝物であるモノメチルヒ素やジメチルヒ素などもAsBに変換できることを確認した。これらの人工的に合成したAsBについて細胞毒性試験を実施した結果、従来のAsBに関する無毒結果を支持することも明らかにした。新たな無機ヒ素の無毒化処理システムは、無機ヒ素の無毒化処理対象物が土壌、汚染水、ヒ素含有物など幅広く対応が可能であり、処理時間も短時間であり、処理物をピンポイントで無毒化できる可能性を持っている。現在の研究室レベルの研究成果から、新エネルギー開発からの環境汚染対策、ヒ素化合物半導体のリサイクル、非鉄製錬や精錬事業、ヒ素化学兵器などで問題となる無機ヒ素の無毒化に貢献や応用が可能である新たな技術であると考えている。2014年9月末から、公的な理由により研究活動を約半年間停止したことから、当該年度の研究成果獲得に影響した。研究の実験的な手技は停止したものの、研究の発展的な思考は多様性を持って持続していたことから、また、国内外の研究の動向を調査していた。予防医学無機ヒ素汚染している井戸水や土壌、高濃度な無機ヒ素を含有する温泉水(地熱発電と同様)やシェールオイル採掘廃水などを研究対象試料として、強い毒性がある無機ヒ素を無毒化処理する技術や無毒化生成物に対する安全性の検証を試みる。試験対象物は温泉水の原泉、慢性ヒ素中毒発生地域の井戸水や土壌は中国内蒙古自治区包頭市の試料、掘削廃水は国内事業社と交渉し獲得してそれぞれを用いる。これらの試験試料からの無機ヒ素の捕集は凝固剤、吸着剤、膜などを検討し、それらの手法を組み合わせて無機ヒ素を濃縮し無毒化処理する。無機ヒ素の無毒化は酸化チタン光触媒システムを用いる。人工合成したAsBやトリメチルアルシンオキサイド(TMAO;中間物質)について、これらのヒ素化合物に対して、細胞毒性試験はHeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)とHL-60細胞(ヒト急性前骨髄性白血病細胞)を用い、一般毒性(CCK-8法)、アポトーシス試験、DNA損傷などを組み合わせて評価する。さらに、無機ヒ素の無毒化処理の過程で混入が推測される有害元素(水銀、鉛、錫等)に対するメチル化の有無を検証する。

検証が必要な背景は、水銀は水俣病の原因物質であるメチル水銀、また、鉛は有機鉛(メチル化鉛化合物)、これらの有機金属は過去に重大な中毒事例を発症させた経緯がある。以上の結果を総合的に評価して、無機ヒ素の無害化処理は、ヒ素による環境汚染および健康障害の予防や軽減に寄与することを科学的に検証し、新たなエネルギー開発などの支援や普及に努める。2014年9月末から、公的な理由により研究活動を約半年間停止したことが主な原因であり理由である。今年度は研究の再開が可能であり、物品費、国内学会旅費、その他(主に翻訳費)に経費を使用する。
発生異常マウスの原因遺伝子の探索

本研究ではポジショナルクローニング法とトランスジェニックマウス技術を結びつけ、巨大ゲノムDNA導入によって突然変異を機能的にレスキューする手法を確立し、これを利用して突然変異責任遺伝子を同定、単離することを目的とする。対象とするのはマウス17番染色体のt-コンプレックスにマップされる発生致死変異であるtw5変異、T変異、神経系機能に関するqk(quaking)変異、或いは9番染色体にマップされる体節・骨形成に関与するtail kinks(tk)変異である.昨年度までにBAC(細菌人工染色体)導入マウス作製技術の確立を行ない,今年度はこの手法を変異遺伝子の探索,同定,あるいは機能解析に利用した.T変異に関してはすでに責任遺伝子が同定されており,これを含むBACを導入したところ,表現型の回復が確かに認められた.我々はtw5、tkの領域をカバーするBACコンティグを作製した.tk遺伝子座ではD9Mit9を中心とした約500kb、4種類のBACクローンでカバーされる領域に原因遺伝子が存在することを見出し、tw5ではH-2KからD17Mit148までの約1000kbのゲノム領域に原因遺伝子があり、その大半の部分をBACによってクローニングした.またこのゲノムDNA中に、糖鎖合成酵素である,αl,3-Fucosyltransferase IX(mFuc-TIX),他に機能の未知である遺伝子を複数発見した.tk領域では少なくとも6つの遺伝子が見つかっている.これまで4種のBACクローンを導入したトランスジェニックマウスを作製し、それぞれ複数の系統を樹立した.これらのマウスをtkマウスと交配し、その子孫の中からtk;BACを持つマウスを選択し,これをさらにtkマウスと交配し,実際に変異表現型がレスキューされたとの示唆を得ている.またqk変異に関しては候補遺伝子を含むBACクローンを導入したマウスを作製しqkマウスと交配し、そのFlをもう一度qk変異体と交配したところ、qkマウスの神経学的症状が回復することが確認された.このように,BACトランスジェネシスは変異責任遺伝子の同定,機能解析に大変有効であることが実証された.本研究ではポジショナルクローニング法とトランスジェニックマウス技術を結びつけ、巨大ゲノムDNA導入によって突然変異を機能的にレスキューする手法を確立し、これを利用して突然変異責任遺伝子を同定、単離することを目的とする。対象とするのはマウス17番染色体のt-コンプレックスにマップされる発生致死変異であるt^<W5>変異、T変異、神経系機能に関するqk(quaking)変異、或いは9番染色体にマップされる体節・骨形成に関与するtail kinks(tk)変異である.今年度はBAC(細菌人工染色体)導入マウス作製技術の確立を行った.基本的にはYAC導入マウス作製と同じ手法を用いたが、インサート長がYACよりも短いこと、大腸菌内で増殖するため取り扱いが簡便であることなどから、YAC導入に比べ高い効率で導入マウス作製に成功した.我々はtw5、tkの領域においてこれまでYACによってカバーしていた部分をBACで取り直しコンティグを作製した.

その結果、tk遺伝子座ではD9Mit9を中心とした約500kb、4種類のBACクローンでカバーされる領域に原因遺伝子が存在することを見出し、tw5ではH-2KからD17Mit148までの約1000kbノゲム領域に原因遺伝子があり、その大半の部分をBACによってクローニングした.またこのゲノムDNA中に、RINGフィンガーを持つDNA結合蛋白遺伝子、アポトーシスに関連するDaxx、他に機能の未知である遺伝子を複数発見した.tk領域では少なくとも3つの遺伝子が見つかっている.これまで2種のBACクローンを導入したトランスジェニックマウスを作製し、それぞれ複数の系統を樹立した.これらのマウスをtkマウスと交配し、その子孫の中からtk;BACを持つマウスを選択し、これを現在tkホモ個体と交配している.またqk変異に関しては候補遺伝子が発見され、遺伝子ターゲティングの方法で新たに変異マウスを作製、元々のqk変異マウスと交配させ、遺伝的相補性試験の結果、原因遺伝子であることが結論づけられた.同時にこの遺伝子を含むBACクローンを導入したマウスを作製しqkマウスと交配し、そのF1をもう一度qk変異体と交配したところ、qkマウスの神経学的症状が回復することが確認された.本研究ではポジショナルクローニング法とトランスジェニックマウス技術を結びつけ、巨大ゲノムDNA導入によって異を機能的にレスキューする手法を確立し、これを利用して突然変異責任遺伝子を同定、単離することを目的とする。とするのはマウス17番染色体のt-コンプレックスにマップされる発生致死変異であるtw5変異、T変異、るqk(quaking)変異、或いは9番染色体にマップされる体節・骨形成に関与するtail kinks (tk)変異である.昨年度までに(細菌人工染色体)導入マウス作製技術の確立を行ない,今年度はこの手法を変異遺伝子の探索,同定,あるいは機能解析に利用した.T変異に関してはすでに責任遺伝子が同定されており,これを含むBACを導入したところ,表現型の回復が確かに認められた.我々はtw5、tkの領域をカバーするBACコンティグを作製した.tk遺伝子座ではD9Mit9を中心とした約500kb、4類のBACクローンでカバーされる領域に原因遺伝子が存在することを見出し、tw5ではH-2KからDD17Mit148までの約1000kbのゲノム領域に原因遺伝子があり、その大半の部分をBACによってクローニングした.またこのゲノムDNA中に、糖鎖合成酵素である,α1,3-Fucosyltransferase IX (mFuc-TIX),他に機能の未知である遺伝子を複数発見した.tk領域では少なくともつの遺伝子が見つかっている.これまで4種のBACクローンを導入したトランスジェニックマウスを作製し、それぞの系統を樹立した.これらのマウスをtkマウスと交配し、その子孫の中からtk ; BACを持つマウスを選択し,これをさらにtkマウスと交配し,実際に変異表現型がレスキューされたとの示唆を得ている.またqk変異に関しては候補遺伝子を含むBACクローンを導入したマウスを作製しqkマウスと交配し、そのF1をもう一度qk変異体と交配したところ、qkマウス的症状が回復することが確認された.
分泌型受容体および樹状細胞による腫瘍拒絶の研究

腫瘍モデルマウスを使った実験では、TGF betaを中和する分泌型TGF受容体Fc分子の投与により一度大きくなった腫瘍の退縮が起こる。この機構がどこに作用点を持つかを探る目的で、まずTGF beta1による樹状細胞(DC)活性化の変化を調べた。その結果、TGF beta1自体は樹状細胞の活性化に大きな影響を及ぼさななかったが、その過程で次の事が判明した。1)CD40シグナルはDCの活性化維持に必要。2)一時的に活性化したDCは、IL-10依存性に脱活性化する。3)脱活性化したDCは、ケモカイン受容体発現が少なくリンパ節に移行出来ない。次に活性化を維持したDCまたは脱活性化したDCでマウスを免疫したところ、前者は強いin vivo CTL活性を誘導したが、後者はCTL活性をほとんど誘導できなかった。この結果からIL-10によるDCの脱活性化に着目し、腫瘍接種マウス生体でのDC活性化を維持する目的で次の実験を行なった。OVAペプチドとともにCpGおよび抗IL-10抗体をE.G7接種マウスに投与したところ、分泌型TGF受容体Fc分子の投与と同様に腫瘍の退縮がみられた。これらを総合すると、腫瘍が免疫から逃れる機構はTGF betaおよびIL-10の相乗的な作用であると考えられた。さらに、これら2種のサイトカインのソースを調べたところ、腫瘍自体がTGF betaやIL-10を産生している訳ではなく、むしろ腫瘍周囲間質細胞(tumor induced stromal cells, TISC)が主たる産生源であることが判明した。従って、腫瘍の免疫認識からの回避は、腫瘍自体により誘導されるよりは、むしろ周囲の正常細胞側の防御反応としての作用によるものと考えられた。1.樹状細胞の特性の解析:骨髄細胞よりGM-CSFで分化させた樹状細胞(BM-DC)の、特に成熟化に関して解析を行った結果、LPSで刺激したBM-DCは一時的に成熟化してCD80やCD86の強発現を起こすが、それらはすぐにdown regulationを起こし、不活性型となることが判明した。LPSと同様の反応は外来病原体由来ではなくとも、壊死した細胞成分でも誘導でき、腫瘍周囲組織でもDCの不活性化が起こっている可能性が示唆される。また、TGFβ存在下でBM-DCの成熟化実験を行ったが、特に目立った影響は見られなかったため、こちらの関与は薄いと思われる。脾細胞からのlong term cultureDCは回収効率が悪く、実験に使用できるものではなかった。2.TGFβおよびTGFR-IgとT細胞活性化の関わり:NP366-374特異的TCRトランスジェニックマウスのT細胞と、成熟DCを抗原ペプチド存在下で培養し、TGFβやTGFR-Igを加えて増殖反応試験を行った。TGFβを添加した場合、コントロールやTGFR-Ig添加群に比べて有意に増殖反応を阻害したが、TGFR-Ig添加の場合はコントロールと有意な差は認められなかった。TGFR-Ig存在下で培養したT細胞の培養上清を他の増殖反応に加えても、増殖の阻害や促進は認められなかった。従って、TGFR-Ig自体は液性因子の調節をしていないことが判明した。1.樹状細胞による抗原特異的CTL誘導能の解析:骨髄細胞よりGM-CSFで分化させた樹状細胞(BM-DC)は抗CD40抗体刺激により活性化/成熟化が持続する事が判明した。BM-DCを用いてin vivoで抗原特異的なCTLを誘導できるかをマウスモデルで解析したところ、不活性化/脱成熟化したBM-DCのみならずLPS刺激直後の一時的活性化BM-DCもCTLを誘導する事が出来なかったが、抗CD40抗体により活性化が持続したBM-DCによる免疫ではCTLを効果的に誘導する事が判明した。実験はOVA蛋白を用いたクロスプレゼンテーションの系で行っており、CD40シグナルによるCTL誘導の優位性が実証された。2.活性型TGFβ産生の解析:腫瘍を移植したマウス血清中には活性型TGFβを有意に検出できるが、in vitroでは腫瘍細胞(E.G7)が産生/転換する活性型TGFβは検出感度以下であった。ところが抗原提示細胞については、骨髄樹状細胞および腹腔マクロファージをLPSで活性化したところ、いずれも活性化後6時間で細胞百万個あたり50pg程度の活性型TGFβが検出された。これらの結果から、腫瘍細胞は直接TGFβを活性型へ転換しておらず、樹状細胞およびマクロファージを一過性に活性化する事により活性型TGFβを誘導することが示唆された。

この結果からIL-10によるDCの脱活性化に着目し、腫瘍接種マウス生体でのDC活性化を維持する目的で次の実験を行なった。OVAペプチドとともにCpGおよび抗IL-10抗体をE.G7接種マウスに投与したところ、分泌型TGF受容体Fc分子の投与と同様に腫瘍の退縮がみられた。これらを総合すると、腫瘍が免疫から逃れる機構はTGF betaおよびIL-10の相乗的な作用であると考えられた。さらに、これら2種のサイトカインのソースを調べたところ、腫瘍自体がTGF betaやIL-10を産生している訳ではなく、むしろ腫瘍周囲間質細胞(tumor induced stromal cells, TISC)が主たる産生源であることが判明した。従って、腫瘍の免疫認識からの回避は、腫瘍自体により誘導されるよりは、むしろ周囲の正常細胞側の防御反応としての作用によるものと考えられた。