hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノケージ材料からの気相O^-イオンの生成と応用

また、圧力上昇に伴い、O^-の他にO_2^-が生成することが明らかとなった。この結果から、大気圧下でもC12A7からO^-が生成することが示唆された。(2)C12A7から生成したO^-の利用率を調べるため、O^-によるシリコン酸化を試みた。その結果、C12A7から生成したO^-はほぼ100%の効率でSiO_2形成に寄与しており、O^-の反応性の高さを確認できた。(3)VOC分解実験では、本年度は、C12A7の表面反応を用いて、アセトアルデヒドとホルムアルデヒドの分解実験を行った。その結果、400°C以下の低温域においてVOC分解が確認され、さらに生成物としてCO_2が確認された。更には、ホルムアルデヒドが室温でも減少、その一部がCO_2へと転化することも確認できた。(4)ヒーター内熱型のC12A7を用いて、殺菌実験を行った。殺菌には耐熱性のバチルス芽胞菌を用いたが、殺菌の指標としてD値20分を達成することができた。このことによりC12A7を用いた医療器具殺菌への実用可能性が示唆された。本研究の目的は、ナノゲージ材料である12CaO・7Al_2O_3(C12A7)をO^-生成源として、C12A7の環境・医療技術、半導体プロセスといった分野への応用を検討することにある。これまでの研究では、主に気相中でのプロセスに着目してシリコン酸化、殺菌などの研究を行って成果を得たが、今年度はそれらに加えて、液相反応を利用した応用を検討してきた。また、昨年度に引き続きVOCの除去のためにC12A7の表面反応を用いることを検討した。その結果、以下のような知見が得られた。(1)ヒーター内熱型のC12A7を用いて生成したO^-を含むガス(He雰囲気下)を水中にバブリングさせることにより、pHの著しい低下が起こることが確認され、条件によってはpHが2という強酸性水が生成することを確認した。O^-を吹き込むことによってpHが低下する現象を明らかにするため、液相内の反応機構を考察した。反応機構は素反応の平衡計算により行い、更に液体クロマトグラフィでの分析や、ルミノール反応を用いた実験などにより、O^-は液相中でも存在している可能性が高いこと、またH_2O_2が生成している可能性が高いことが示された。(2)昨年度に引き続き、大気圧下でC12A7から生成する負イオンの測定実験を行った。昨年度は20Torrまで観測することができたが、今年度は測定感度の向上のための装置改良を行った。その結果、コロナ放電で生成する負イオン・クラスターについては、大気圧下でも十分な感度で負イオン測定が行えるようになった。引き続きC12A7について測定中である。(3)C12A7粉末を用いてホルムアルデヒドの分解実験を行った。5ppmのホルムアルデヒドを用いて実験を行った結果、高い除去率を得ることができ、分解したホルムアルデヒドのうち、約77%がCO_2に酸化されることが確認できた。更に実用化に向けて、水や共存ガス(CO_2)の影響に関して検討を行った。(4)C12A7中の活性酸素量をESRを用い定量分析を行った。C12A7中の活性酸素量は、雰囲気の酸素濃度・温度に大きく依存し600°C20%酸素雰囲気で粒径10umの粒子ならば30分程度で再生が可能である。本研究の目的は、ナノゲージ材料である12CaO・7Al_2O_3(C12A7)をO^-生成源として、C12A7の環境・医療技術、半導体プロセスなど、あらゆる分野への応用を検討することにある。昨年度までの研究では、シリコン酸化や殺菌など、主に気相中でのプロセスの他、液相反応を利用した応用の検討がなされてきた。
水酸化カルシウムによる歯髄歯周組織の治癒機転に関する細胞学的実験研究

水酸化カルシウムは歯内療法領域において覆髄剤や根管貼薬剤として広く利用されている。水酸化カルシウムの作用により歯髄創面や根尖部に骨様硬組織が添加することが病理組織学的に確認されているが、細胞レベルでの詳細な機構はまだ解明されていない。本研究の目的は、培養した歯髄細胞や培養歯根膜細胞に水酸化カルシウムを作用させ、in vitroで硬組織形成を誘導しその形成過程を明らかにすることである。まずウシの幼若永久切歯を用いて歯髄細胞の培養に着手し、歯髄の採取部位を検討した。歯髄組織を切縁寄り、歯頚部寄り、根尖寄りに区分し、さらにその表層、中間層、深層のいずれが実験に適するか、それぞれ培養を試みた。初代培養では、形態の異なる多系統の細胞が混在する像が認められたが、継代を重ねるにつれ細胞種が減少し、個々の系統を分離、精製する段階まで至らず、実験目的に合致した部位を特定し、かつ培養株を確立することはできなかった。また矯正学的理由により抜去された歯根からヒト歯根膜細胞の培養を試みたが、やはり継代するうちに初代の形質が失われ、in vivoに近い細胞種を培養株として確立することができず、石灰化を再現することはできなかった。今後組織学的手法も併用して培養手法の検討を重ね、歯髄、歯根膜細胞とも培養細胞株を確立させたのち、管腔状の微小環境下で水酸化カルシウムを作用させてその硬組織形成過程を観察し、BMP等生体由来の硬組織形成誘導因子と比較検討してゆきたい。本年度は、ウシ歯髄細胞の培養を足がかりに、ヒト歯髄細胞の培養にとりかかる計画であった。しかしながら、以下に述べる条件についてウシ歯髄を用いて実験中であり、ヒト歯髄での培養はまだ実現していない。(1)歯髄の採取法:まず、屠場より入手したウシ新鮮抜去歯を用いて、極力、歯髄細胞を挫滅・傷害させずに歯牙硬組織から採取する方法を検討した。その結果、ジスクやニッパーを用いて歯冠および歯根を割断して歯髄を採取する方法では、切削時の発熱の影響が大きく、また、歯髄塊を割断面から取り出す際に引っ張り応力の作用することが避けられないことが判った。そこで、万力で硬組織を破砕して内部の歯髄を取り出す方法を採択することにした。(2)歯髄の採取部位:歯髄のどの部位を培養すると今回の実験目的に合致した細胞(in vitroで硬組織形成能を有する細胞)が得られるか、歯髄を切縁寄り、歯頸部寄り、根尖寄りに区分し、さらにその表層、中間層、深層のいずれが実験に適するか、それぞれ培養を試みた。初代培養では、形態の異なる多系統の細胞が混在する像が認められたが、継代を重ねるにつれ細胞種が減少し、個々の系統を分離、精製する段階まで至らず、実験に適した部位を特定することはできなかった。次年度以降、組織学的手法も併用して継続して検討する予定である。(3)最適培養条件:培養期間中に真菌に感染することが多く、培地中に添加する抗真菌剤の種類とその濃度について、現在検討中である。硬組織形成能を発現させるべく、管腔状の微小環境下における培養をめざしたが、チューブの材質や太さ(内径・外径)、長さについて、現在検討中である。(4)各種細胞活性の測定:細胞株を確立後、その活性を生化学的に分析する予定であっため、本年度は定性分析に至らなかった。次年度から、特に硬組織形成を促進する成分を培地に添加し、その効果に注目してゆく。本年度は、ウシ歯髄細胞の培養を中心に行った。in vitroで硬組織形成能を有する細胞を培養株として確立することを目標として、歯髄の採取部位を検討した。

初代培養では、形態の異なる多系統の細胞が混在する像が認められたが、継代を重ねるにつれ細胞種が減少し、個々の系統を分離、精製する段階まで至らず、実験目的に合致した部位を特定することはできなかった。次年度も引き続き、組織学的手法も併用して検討を重ねていく。ヒト歯髄細胞の培養は、材料の入手がウシ歯髄に比較すると困難であるが、便宜抜去、智歯、便宜抜髄の症例から健康歯髄を入手すべく努力を続ける。培養細胞株を確立させたのち、培養歯髄細胞に硬組織形成能を発現させるべく、管腔状の微小環境下における培養に移り、チューブの材質や太さ(内径・外径)、長さを工夫し、単層培養ではなく三次元的な重層培養の実現に向け、実験を進めてゆく。継代培養期間中の感染コントロールに充分留意し、各種細胞活性を生化学的に分析、水酸化カルシウムを作用させて、細胞活性の変化や硬組織形成が生じるか観察する。BMPなどの硬組織形成を促進する成分を培地に添加した場合と比較し、被蓋硬組織形成という覆髄・断髄後の歯髄創傷治癒のメカニズムを解明する。水酸化カルシウムは歯内療法領域において覆髄剤や根管貼薬剤として利用されている。水酸化カルシウムの作用により歯髄創面や根尖部に骨様硬組織が添加することが病理組織学的に確認されているが、細胞レベルでの詳細な機構はまだ解明されていない。本研究の目的は、培養した歯髄細胞や培養歯根膜細胞に水酸化カルシウムを作用させ、in vitroで硬組織形成を誘導しその形成過程を明らかにすることであった。そこでウシの幼若永久切歯を用いて歯髄細胞の培養に着手し、歯髄の採取部位を検討した。歯髄組織を切縁寄り、歯頚部寄り、根尖寄りに区分し、さらにその表層、中間層、深層のいずれが実験に適するか、それぞれ培養を試みた。また歯周病以外の原因で抜去された歯根からヒト歯根膜細胞の培養を試みたが、やはり継代するうちに初代の形質が失われ、in vivoに近い細胞種を培養株として確立することができなかった。今後組織学的手法も併用して培養手法の検討を重ね、歯髄、歯根膜細胞とも培養細胞株を確立させたのち、管腔状の微小環境下で水酸化カルシウムを作用させて、その硬組織形成過程を観察していく予定である。単層培養ではなく三次元的な重層培養を実現し、BMP等生体由来の硬組織形成誘導因子と比較してゆきたい。
アニオン交換性層状希土類水酸化物を基盤とした新規固体触媒の設計と協奏機能の開拓

層状希土類水酸化物(Layered Rare-earth Hydroxide; LRH)の特性,特にアニオン交換能に着目し,新規な不均一系塩基触媒の開発を行った.特に,イットリウム水酸化物で構成されるY-LRHは,ピラーゲストとして直鎖状のモノカルボン酸アニオンをインターカレーションすると,炭素鎖長に依存した層間距離の拡大が確認された.なかでも,酢酸アニオンを導入したCH3COO-/Y-LRH触媒は,水溶媒中でのシアノ酢酸エチルとベンズアルデヒドとのクネベナーゲル縮合反応に高い活性を示した.水分子が層間内に侵入し,特異的に層間距離が拡大し,反応活性が向上したと考えられる.本申請研究では,アニオン交換能を有する層状希土類水酸化物の化学的・構造的特性を巧みに利用し,無機マトリックス中への複数の反応活性点を同時に集積するのみならず,層状構造を形成する基本層をも触媒活性点として機能させることを目的としている.希土類元素の中で,イットリウムカチオンから成る層状水酸化物(Y-LRH)の合成に成功し,長鎖アルキル基を有するカルボン酸アニオンをピラーゲストとしてインターカレーションし,層間隔の精密制御を施した各種触媒を合成した.合成した触媒は,水溶媒中でのシアノ酢酸エチルとベンズアルデヒドとのクネベナーゲル反応において高い活性を示し,有効な固体塩基触媒として機能することを見い出した.Y-LRH触媒の高い塩基性を利用し,重水中でのカルボニル隣接プロトンの重水素交換反応も効率良く進行した.例えば,シクロヘキサノンの2,6-位の水素原子は,ほぼ100%重水素原子に置換することができた.以上のように,層状イットリウム水酸化物のマトリックス内に存在する強い塩基点を触媒活性点とする触媒設計を行った.今後,希土類元素特有のルイス酸性をも利用できる触媒反応系について探索を進める.本申請研究では,アニオン交換能を有する層状希土類水酸化物の化学的・構造的特性を巧みに利用し,無機マトリックス内への複数の反応活性点を同時に集積するのみならず,層状構造を形成する基本層をも触媒活性点として機能させることを目的としている.希土類元素のなかで,Y(III)カチオンからなる層状水酸化物(Y-LRH)の合成に成功し,長鎖アルキルカルボン酸アニオンをピラーゲストとしてインターカレーションし,層間隔の精密制御を施した触媒を合成した.層間隔を制御した触媒を用いて反応を行ったところ,Y(III)カチオン基準の触媒回転数はほぼ一定であったが,酢酸アニオン導入型の触媒(C2/Y-LRH)は,水溶媒中でのみシアノ酢酸エチルとベンズアルデヒドとのクネベナーゲル縮合反応において特異的に高い触媒活性を示し,有効な固体塩基触媒として機能することを見出した.水溶媒中では,C2/Y-LRH触媒の層間隔が膨潤し,反応に有効な空間が形成されたことが粉末X線回折から明らかとなった.また,速度論的考察を行ったところ,本反応では二次反応速度式で良好にフィッティングでき,アレニウスの式より反応速度定数を算出した.また,重水中でケトン類のα位のプロトンが重水素交換されたこと,および反応速度がドナーの濃度にのみ依存したことから,本反応機構における律速段階は活性メチレン化合物のプロトン引抜き過程であることが示された.本申請研究では,アニオン交換能を有する層状希土類水酸化物の化学的・構造的特性を巧みに利用し,無機マトリックス内への複数の反応活性点を同時に集積するのみならず,層状構造を形成する基本層をも触媒活性点として機能させることを目的としている.希土類元素のなかで,Y(III)カチオンからなる層状水酸化物(Y-LRH)の合成に成功し,長鎖アルキルカルボン酸アニオンをピラーゲストとして導入し,層間隔の精密制御を施した触媒を合成した.層間隔を制御した触媒を用いて水溶媒中でのシアノ酢酸エチルとベンズアルデヒドとのクネベナーゲル縮合反応を行ったところ,酢酸アニオンを導入したY-LRH触媒(C2/Y-LRH)が特異的に高い触媒活性を示し,有効な個体塩基触媒として機能することがわかった.粉末X線回折結果より,水分子により層間隔が拡大したことから,高活性が発現した要因は,反応溶媒での層間距離の拡大であることがわかった.その他,Gd(III)およびYb(III)からなるC2/Gd-LRHあるいはC2/Yb-LRHも合成し,C2/Y-LRHと触媒性能を比較したところ,活性の大きな差異は見られなかったが,長鎖アルキルカルボン酸アニオンのインターカレーションによる層間隔の精密制御は可能であった.またY-LRHは,他の層状水酸化物と比較してアニオン交換速度が大きいことも明らかになり,これを利用した不安定なアニオン種,例えば高原子価マンガン種である過マンガン酸アニオンの導入についても検討を行った.層状希土類水酸化物(Layered Rare-earth Hydroxide; LRH)の特性,特にアニオン交換能に着目し,新規な不均一系塩基触媒の開発を行った.

特に,イットリウム水酸化物で構成されるY-LRHは,ピラーゲストとして直鎖状のモノカルボン酸アニオンをインターカレーションすると,炭素鎖長に依存した層間距離の拡大が確認された.なかでも,酢酸アニオンを導入したCH3COO-/Y-LRH触媒は,水溶媒中でのシアノ酢酸エチルとベンズアルデヒドとのクネベナーゲル縮合反応に高い活性を示した.水分子が層間内に侵入し,特異的に層間距離が拡大し,反応活性が向上したと考えられる.本申請研究では,触媒反応空間をも精密制御した機能集積型固体触媒の開発を展開するものである.新たな反応活性点を導入する触媒設計,例えば,過マンガン酸アニオン(MnO4-)を導入したところ,アルデヒドのアンモ酸化が低収率ながら進行し,ニトリルが得られることがわかった.今後,高収率が得られるよう,反応条件の最適化等を実施していく.触媒化学上述のように,新たに触媒活性種を導入する設計を進める.また,基本層のブロンステッド塩基性を利用した触媒の開発は行うことができているが,例えば,1,3-ジカルボニル化合物とエノンとのマイケル付加反応は進行しないことがわかっている.この結果は,基本層とジケトンが強く相互作用(Lewis酸点との相互作用)していることを示唆するものである.このような複数機能を利用したOne-pot反応系の構築を進め,高付加価値生成物の合成へと応用する.本申請研究では,触媒反応空間をも精密制御した機能集積型固体触媒の開発へと展開し,種々の環境調和型one-pot有機反応による高付加価値生成物の合成へと応用することを目的としている.具体的には,(1)アニオン交換反応を駆使した層間内への複数機能の集積,および(2)ピラーゲスト導入による反応空間の精密制御,を施した有機ー無機ハイブリッド型のナノ構造触媒の合成に焦点を絞る.現在までの進捗状況は,(1)に関しては,触媒活性種として機能するアニオン性Pd錯体を導入し,アルコール酸化ーアルドール反応のone-pot物質変換は達成できなかった.これは,層状マトリックスのルイス酸性が反応基質を多点配位させ,反応の進行を阻害しているものと考えられる.これを明らかにするため,ランタンやイッテリビウム等の層状化合物を合成し,反応評価すべきであるが,未だ明確な層構造が得られていない.(2)に関しては,Y-LRHのアニオン交換能を用いた層間修飾は実現できた.今後,多種多様なゲストアニオンを用いた触媒設計を行っていく.ランタン,イッテリビウム等の希土類元素カチオンで構成される層状水酸化物を合成し,無機マトリックスが有するルイス酸性について評価する必要がある.また,異種触媒活性種として様々な遷移金属アニオン性錯体を導入し,基本層のみならず層間内でも逐次的な触媒反応を促進する触媒設計を施し,種々の環境調和型one-pot有機反応による高付加価値生成物の合成へと応用する.
サルのお腹は世界を救う～葉食いザルからの植物バイオマス分解微生物の取得と応用～

石油や石炭、天然ガスといった化石エネルギー資源の消費量削減は今や世界的な課題となっている。この消費量削減に役立つと期待されているのが、植物性バイオマスを原料にしたエタノール生産などのエネルギー変換技術である。しかし、トウモロコシなどに含まれるデンプンと異なり、草本・木本性バイオマスに多く含まれるセルロースやヘミセルロースなどは粉砕などの物理的処理に加え、酸やアルカリなどによる前処理なしでは糖化効率が低く、非食用植物のバイオマスを利用したエタノール生産には糖化工程の高効率化が重要とされている。そこで本研究では、葉食いザル(アカアシドゥクラングール, Red-shanked Douc Langur)のもつ微生物群集構造を解析することで、新たな木質系バイオマス分解微生物の取得と応用、さらには絶滅危惧種である同サルの健康管理に有益な知見を得ることを目指している。アカアシドゥクラングールのもつ微生物群集構造を解析することで、新たな木質系バイオマス分解微生物の取得と応用、さらには絶滅危惧種である同サルの健康管理に有益な知見を得ることを目指し、以下に示す研究課題に取り組んだ。まず、アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、サクラやヤナギ、トウネズミモチなどサルの好む葉を培地に用いて微生物の単離を行った。同時に、アカアシドゥクラングール糞便中に存在する菌相を解析するために、DNA抽出・PCRなどを行った。そこで本研究では、葉を主食にしている生物由来の微生物群を解析することで新たな植物バイオマス分解微生物の取得を目指す。対象としたのは、木の葉などを主食としているアカアシドゥクラングールである。このサルは、生存がきわめて危険な状態にある「絶滅危惧種」とされ、日本では神奈川県横浜市のよこはま動物園でのみ飼育されている。しかし食餌として与える葉の種類が切り替わる際に時折体調を崩し、1週間以上食餌を取らなくなる個体がでることがあり、同サルの飼育上の問題となっている。本研究では、アカアシドゥクラングールのもつ微生物群集構造を解析することで、新たな木質系バイオマス分解微生物の取得と応用、さらには絶滅危惧種である同サルの健康管理に有益な知見を得ることを目指し、以下に示す研究課題に取り組んだ。まず、アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、微生物の単離を行った。同時に、アカアシドゥクラングール糞便中に存在する菌相をPCR-DGGE法等で解析するために、DNA抽出条件などの検討を行った。アカアシドゥクラングールの糞便の定期的にサンプリングを行い、微生物群集構造(菌相)解析と体調変化の相関関係などが解析できるように試料を保存している。アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、同サルが食べている葉の粉末や非食用・混合植物バイオマスを加えた培地、色素結合セルロース、色素結合ヘミセルロースを炭素源として用いて単離を試みている。現在、単離できた候補株については、セルロース、へミセルロースを基質として生成した還元糖量をDNS(Dinitro salicylic acid)法で定量、バイオマス分解酵素活性を検討し、選抜中である。これらにより酵素活性が確認できた単離菌株が多数に及ぶ場合は、効率的な同定を行うために、一旦PCRにより16S rDNA約1.5 kbpを増幅した後に制限酵素で切断し、切断パターンの違いを利用したRFLP (restriction fragment length polymorphism)によるグループ分けを行う。単離菌株に新規分類群に属する可能性の高いものが含まれていた場合には、国際的に認められる新規菌株としての提案に必要な実験を行う予定である。サルの糞便中には葉に含まれるポリフェノールなどが多く含まれるため、通常のDNA抽出キットでは充分なゲノムDNAが得られなかった。そのため、抽出試薬の種類、処理を検討し、安定してDNAが抽出できるようになった。

まず、アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、微生物の単離を行った。同時に、アカアシドゥクラングール糞便中に存在する菌相を解析するために、DNA抽出・PCRなどを行った。アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、同サルが食べている葉の供与を受け、凍結乾燥後に粉砕し、炭素源として用いた。さらに草本、木本系植物混合バイオマスを炭素源として加えた培地も用いて単離を試みた結果、約500株が得られている。これらのなかから、バイオマス分解酵素活性をもつ微生物を効率的に選抜するために、以下に示す色素結合セルロース、色素結合ヘミセルロースを炭素源として用いてセルラーゼ、ヘミセルラーゼ活性の有無を判定し、一次選抜を行った。石油や石炭、天然ガスといった化石エネルギー資源の消費量削減は今や世界的な課題となっている。この消費量削減に役立つと期待されているのが、植物性バイオマスを原料にしたエタノール生産などのエネルギー変換技術である。しかし、トウモロコシなどに含まれるデンプンと異なり、草本・木本性バイオマスに多く含まれるセルロースやヘミセルロースなどは粉砕などの物理的処理に加え、酸やアルカリなどによる前処理なしでは糖化効率が低く、非食用植物のバイオマスを利用したエタノール生産には糖化工程の高効率化が重要とされている。そこで本研究では、葉食いザル(アカアシドゥクラングール, Red-shanked Douc Langur)のもつ微生物群集構造を解析することで、新たな木質系バイオマス分解微生物の取得と応用、さらには絶滅危惧種である同サルの健康管理に有益な知見を得ることを目指している。アカアシドゥクラングールのもつ微生物群集構造を解析することで、新たな木質系バイオマス分解微生物の取得と応用、さらには絶滅危惧種である同サルの健康管理に有益な知見を得ることを目指し、以下に示す研究課題に取り組んだ。まず、アカアシドゥクラングールが最も活発に葉を摂食する5ー7月に採取する試料を主な単離源として用い、サクラやヤナギ、トウネズミモチなどサルの好む葉を培地に用いて微生物の単離を行った。牛と異なり単胃であるサルは、テングザルなど一部を除き反芻は確認されていない。アカアシドゥクラングールが反芻なしで十分な栄養を吸収するためにも、腸管内に強力な木質系バイオマス分解菌が存在し、葉の消化を補助している可能性がある。体調不良の原因については、食餌の葉の変化と消化管内の微生物の種類が適合するのに時間がかかるため、適切なバイオマス分解酵素が腸管内で生産されないことによる「胃腸のもたれ」である可能性もあるが、サルの腸管内微生物群集構造(菌相)と体調変化に関する報告は殆どない。
微粒子性薬物キャリアーを用いた細胞選択的薬物ターゲティングシステムの開発

我々はこれまでに、生体内非分解性で粒子径が50mmのポリスチレンナノスフェアー(NS-50)を用いて、種々の検討を行い、微粒子の表面に吸着する血清タンパク質の種類が異なれば、その取り込みに関与するレセプターのみならず、その細胞内動態まで大きく変化することを明らかにしている。そこで本年度は、表面に吸着する血清タンパクの種類を決定づけている因子を解明することを目的として、NS-50と、それとは表面特性の異なるレシチンコーティッドポリスチレンナノスフェアー(LNS-50)を用いて、検討を行った。まず、微粒子の表面疎水性を評価した結果、微粒子自身の表面疎水性はLNS-50よりもNS-50の方が高いものの、血清中における見かけの表面疎水性は、逆にLNS-50の方が高くなっていることが明らかとなった。一方、両微粒子を静脈内投与したところ、血清中での見かけの表面疎水性がNS-50よりも高いLNS-50の方が顕著に高い血中滞留性を示した。また肝灌流実験において、LNS-50の肝移行にはNS-50の場合と異なり、血清中のオプソニンが表面に吸着することによるレセプター介在性の特異的な取り込み機構はほとんど関与していないことが示唆された。さらに、以前の我々の検討により、NS-50の肝取り込みにオプソニンとして作用することが明らかとなった数種の血清タンパク質の吸着の程度は、NS-50と比べてLNS-50において顕著に低いことが明らかとなった。これらのことから、微粒子の体内動態を決定づけているのは、微粒子表面に吸着するオプソニンの量であることが明らかとなった。以上のことから、微粒子の表面に吸着するタンパク質の種類は微粒子の物理化学的特性によって支配されており、それを制御することにより、微粒子の体内動態及び細胞内動態を厳密に制御できることが推察された。これまでの我々の検討結果から、粒子径50nmのポリスチレンマイクロスフェアー(MS)の肝臓実質細胞への移行は、血清中のタンパク質が粒子表面に吸着し、それらが細胞膜表面の複数のレセプターによる認識を受け、最終的に細胞内に取り込まれることにより達成されることが明らかとなっている。そこで本年度はこれらのレセプターの寄与、およびレセプターを介して取り込まれたMSの胆汁中への排泄動態を検討することで、MSの肝臓実質細胞での細胞内動態を決定づけている因子の解明を試みた。肝臓実質細胞へのMSの取り込みに関与しているレセプターとしてアシアロ糖タンパク質レセプターとアポEレセプターに着目し、それぞれのレセプターの寄与率を検討したところ、MSの肝臓実質細胞への取り込みには、いずれのレセプターも関与しているものの、アポEレセプターの方がより大きく寄与していることが明らかとなった。しかしながら、MSの胆汁中排泄においては、アシアロ糖タンパク質レセプターによるMSの肝臓実質細胞への取り込みを阻害した場合、その後のMSの胆汁排泄量が大きく低下するのに対し、MSの肝臓実質細胞への取り込みにより大きく寄与していることが明らかとなったアポEレセプターによる取り込みを阻害した場合には、その胆汁排泄量には若干の減少傾向が見られたにすぎなかった。これらのことから、MSの肝臓実質細胞への取り込みにはアポEレセプターを介した取り込みの方が寄与が大きいものの、その後の胆汁中排泄においてはアシアロ糖タンパク質レセプターを介して取り込まれたMSの寄与がより大きいことが示唆された。これらの結果から、微粒子の表面に吸着する血清タンパク質の種類が異なれば、その取り込みに関与するレセプターのみならず、その細胞内動態まで大きく変化すると推察された。
ウェーブレット圧縮画像データベースからの類似画像検索

本研究では,ウェーブレット画像圧縮技術を用いて圧縮され圧縮画像データから画像内容に基づいた類似画像検索に必要な索引および検索キーとなる特徴量を抽出するための特徴量抽出手法,索引生成手法について研究を行うものであった.特徴量抽出手法に関して、圧縮過程から抽出可能雲である特徴量,圧縮データのビットストリームから算出可能である特徴量について検討し,それら特徴量が画像内容に基づく類似画像検索に有効であるかどうかを検討することであった.本年度の目標は,1)圧縮画像データから,例示画像検索,輪郭画像検索のための特徴量の抽出の検討,2)類似画像検索システムの試作であった.目標1に対して,JPEG2000(Jasper)で圧縮された画像から例示画像検索,輪郭画像検索のための特徴量抽出の検討を行った.しかし,圧縮データのどの情報を用いれば効果的な検索が可能であるかどうかの検討がさらに必要であることがわかり,今後さらに特徴量について検討が必要であることがわかった.目標2に対して,デジタルカメラのズーム機能を用いて画角を変化させ類似画像検索評価画像を撮影した.それら画像をJPEG2000圧縮(Jasper)し,画像データベースを作成した.類似画像検索システムは,既に提案しているウェーブレット変換を用いた類似画像検索の枠組みを用いて,索引空間を生成する.同様に問合せとなるJPEG200画像からの特徴量を抽出し,索引空間の各点との距離を計算し類似画像検索を行うというものであった.すなわち,既に提案しているシステムと一貫した類似画像検索システムができる可能があるということがわかった.現在までに研究代表者は、ウェーブレット変換を用いた類似画像検索のための特徴量抽拙方法、テクスチャ画像解析への応用など類似画像検索の基礎技術に関して提案してきた。本研究では、これまでに研究代表者らが行ってきたウェーブレット変換を用いた類似画像検索の枠組みの上で、ウェーブレット圧縮された画像から類似画像検索に用いることが可能な特徴量を抽出するための方法、効果的な検索を可能とする索引生成方法について研究を行う。平成15年度は、ウェーブレット変換を用いた画像検索方法であるJPEG2000を調査し、そのレファレンスソフトウェアのソースを入手し、ソースの解析を行った。解析の結果、ウェーブレット圧縮過程の中で例示画像検索に用いることが可能であるような特徴量が算出されていることがわかった。ただし、特徴量抽出に関しては、まだ多くの検討課題があることから、今後も慎重に研究を進める必要もわかった。また、JPEG2000リファレンスソフトウェアをグレースケールの画像3000枚(歴史民俗学博物館保管)に適用し、小規模のウェーブレット庄縮画像データベースの構築を行った。さらに、購入した一眼レフタイプのデジタルカメラを用いて、約8000枚の画像データベースの構築を行った。本研究では,ウェーブレット画像圧縮技術を用いて圧縮され圧縮画像データから画像内容に基づいた類似画像検索に必要な索引および検索キーとなる特徴量を抽出するための特徴量抽出手法,索引生成手法について研究を行うものであった.特徴量抽出手法に関して、圧縮過程から抽出可能雲である特徴量,圧縮データのビットストリームから算出可能である特徴量について検討し,それら特徴量が画像内容に基づく類似画像検索に有効であるかどうかを検討することであった.本年度の目標は,1)圧縮画像データから,例示画像検索,輪郭画像検索のための特徴量の抽出の検討,2)類似画像検索システムの試作であった.目標1に対して,JPEG2000(Jasper)で圧縮された画像から例示画像検索,輪郭画像検索のための特徴量抽出の検討を行った.しかし,圧縮データのどの情報を用いれば効果的な検索が可能であるかどうかの検討がさらに必要であることがわかり,今後さらに特徴量について検討が必要であることがわかった.目標2に対して,デジタルカメラのズーム機能を用いて画角を変化させ類似画像検索評価画像を撮影した.それら画像をJPEG2000圧縮(Jasper)し,画像データベースを作成した.類似画像検索システムは,既に提案しているウェーブレット変換を用いた類似画像検索の枠組みを用いて,索引空間を生成する.同様に問合せとなるJPEG200画像からの特徴量を抽出し,索引空間の各点との距離を計算し類似画像検索を行うというものであった.すなわち,既に提案しているシステムと一貫した類似画像検索システムができる可能があるということがわかった.
ケラチノサイト増殖因子内包化多角体を用いた上皮細胞の三次元培養モデルの構築

化粧品開発における動物実験は、動物愛護の観点や膨大な維持費がかかるという理由から、その代替となる皮膚モデルの開発が渇望されている。しかし、モデルの作製において再現性に問題がある。昆虫ウイルスのタンパク質微結晶である多角体は、内部にタンパク質を内包化し保護するだけでなく、少しずつ放出する性質をもつ。本研究では、上皮層と真皮層それぞれの細胞の増殖を促す、2種類の増殖因子を多角体に内包化させ、さらにそれらの多角体を含有した絹糸素材であるテグスを得るための遺伝子組換えカイコを作出した。このテグスは細胞増殖因子を長期間放出する性質を持つ。この性質を利用し、上皮層と真皮層からなる皮膚モデルの構築を試みる。
血管再生における虚血組織環境因子が骨髄幹細胞の生存と分化に及ぼす影響

虚血性疾患に対する自己骨髄細胞移植による血管新生治療は、世界中で臨床応用が行われている。しかし、正常組織と比べ、虚血組織では様々なサイトカインや血管新生関連蛋白の発現が変化しており、細胞移植治療の効果に影響を及ぼすと考えられる。本研究では、虚血急性期と慢性期における組織環境因子の変化が骨髄細胞の生存・分化、血管新生効果に及ぼす影響を調べることを目的とした。C57BL/6マウスの下肢虚血モデルを作製し、24時間後(急性期)および2週間後(慢性期)に実験に用いた。虚血下肢筋肉から抽出した蛋白液(1mg/ml)を添加して骨髄細胞を培養し、in vitroでの評価を行った。慢性期蛋白液を添加した場合よりも、急性期蛋白液を添加した場合に骨髄細胞の生存、接着、内皮細胞への分化はいずれも上昇した(P<0.05)。また、慢性期蛋白液と比較して、急性期蛋白液ではIL-1β、bFGF、MCP-1といったサイトカインが上昇していた(p<0.01)。in vivoでの評価を行うために、急性期あるいは慢性期の虚血筋肉発骨髄細胞を直接注入した。移植細胞の生存率は、急性期移植群で慢性期移植群よりも高かった(移植14日後;p<0.01)。レーザードップラー法にて血流量を測定した結果、急性期移植群では対照群(PBS投与群)と比較して血流改善効果が認められた(移植14目後;p<0.01)が、慢性期移植群では効果が見られなかった。また、急性期移植群では移植細胞の内皮への分化も認められた。以上の結果から、虚血組織環境因子は移植細胞の生存・分化や血管新生効果に影響を及ぼすことがわかった。また、細胞移植による血管新生治療は虚血急性期が最適な時期であることが示唆された。虚血性疾患に対する自己骨髄細胞移植による血管新生治療は世界中で臨床試験が行われている。しかし、正常組織と比べ、虚血組織は様々なサイトカインや血管新生関連蛋白の発現が変化しており、細胞移植治療に影響を及ぼすと考えられる。本研究は、虚血急性期と慢性期における組織内環境因子の変化が骨髄細胞の生存・接着・分化、血管再生効果に及ぼす影響を調べることを目的とする。C57/BL6マウスの左総大腿動脈結紮により下肢虚血モデルを作成し、24時間(急性期)と2週間(慢性期)後に実験に用いた。虚血下肢筋肉から抽出した組織総蛋白液を骨髄細胞に添加培養(1mg/ml)の実験では急性期が慢性期より、培養骨髄単核球細胞の生存、接着、内皮細胞への分化が有意に高かった(P<0.05)。また、In vivoによる実験で、虚血下肢筋肉内に自己骨髄単核球細胞移植治療は急性期虚血下肢に対して有意な血流改善効果を示したが、慢性期虚血下肢においては有意な血流改善効果が認められなかった。慢性期虚血下肢と比べ、急性期虚血下肢内には移植した骨髄細胞の生存と内皮細胞への分化が多く認められた。虚血組織内環境因子の変化は骨髄細胞の生存・接着・分化、血管再生効果に影響を及ぼすことが認められた。虚血急性期は骨髄単核球細胞移植による血管再生治療の最適時期と思われた。今後はMicroarrayの解析により、変化した個々の組織環境因子を明らかにしていく予定である。

本研究は、虚血急性期と慢性期における組織内環境因子の変化が骨髄細胞の生存・分化、血管新生効果に及ぼす影響を調べることを目的とする。本年度はin vivoのアプローチによる検討を行った。C57BL/6マウスを用いて左総大腿動脈とその分枝を結紮し、下肢虚血モデルを作成した。モデル作成後24時間後(急性期)、あるいは2週間後(慢性期)に、GFP-Transgenic C57BL/6マウスから採取した骨髄幹細胞を虚血筋肉に直接注入した。移植した骨髄幹細胞(GFP陽性細胞)の生存は、急性期移植群で慢性期移植群よりも高かった(移植14日後;p<0.01)。レーザードップラー法にて血流量を測定した結果、急性期移植群では対照群(PBS投与群)と比較して血流改善効果が認められた(移植14日後;P<0.01)が、慢性期移植群では効果が見られなかった。また、急性期移植群では移植細胞の内皮への分化も認められた。さらに、急性虚血組織中では、慢性虚血組織と比較して、IL-1β、FGF、MCP-1といったサイトカインが上昇していた(p<0.01)。以上の結果から、虚血組織環境因子は移植細胞の生存・分化や血管新生の治療効果に影響を及ぼすことがわかった。また、細胞移植による血管新生治療は、虚血急性期が最適な時期であることが示唆された。
汚水の生物学的浄化に有用な微小動物の生育因子による高度汚用

生活雑排水等の低濃度有機性排水の浄化槽や下水処理場反応槽等における生物学的浄化過程に着目し、これらの浄化過程に袋型動物輪虫類Philodina erythrophthalma等に代表される、ろ過摂食性の有用微小動物を高密度に生息させることにより浄化効率の高度化を目指した検討をおこなった。得られた成果は以下のように要約される。(1)これまでの検討により、フラスコスケールの室内実験で得られていた輪虫類Philodina erythrophthalmaの最大個体密度は1mlあたり10,000個体程度であったが、培養基質の入れ換え等の管理を綿密におこなうことにより連続的に1mlあたり24,000個体の生息密度を維持し得ることが可能となった。(2)輪虫類Philodina erythrophthalmaの個体密度を1mlあたり20,000個体以上に維持した場合、個体サイズが生息空間の影響等により小型化し、生物体現存量(バイオマス)としては1mlあたり10,000個体程度の場合と比較して30%程度しか増大しないが、培養時に凝集体摂食者である貧毛類Aeolosoma hemprichi等を共存させることにより全体としての総バイオマスは50%まで増大させることが可能となることが明らかとなった。(3)米に含有される微量生育因子を、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥器およびロータリーエバポレーターにより分画し大量に生成して実験に供する手法を確立した。(4)微量生育因子を活用して有用微小動物輪虫類Philodina erythrophthalmaの増食を活性化させた場合においても、混合微生物生態系を構成する他の原生動物および微小後生動物に影響を及ぼすことは無く、共存する摂殖機構を異にする凝集体摂食者Aeolosoma hemprichi等の微小動物の活性を増大させる効果を有することがフラスコマイクロコズム試験において明らかとなった。
神経ペプチドPACAPによる消化機能の調節

1.PACAPの免疫組織化学的研究:PACAP38、PACAP27およびVIPのC端部を化学合成し、サイログロブリンにコンジュゲート後家兎に免疫し、それぞれ交差性のない特異抗体を得た。PACAP特異抗体を用いて消化管におけるPACAP38および27の分布を免疫組織化学的に検索した。PACAP含有神経は、消化管の筋間神経および粘膜下神経に存在した。現在、VIP特異抗体を用いて両者の分布と関係を免疫組織化学的に検索中である。2.PACAPの免疫化学的研究:PACAPおよびPACAP関連ペプチド(PRP)ラジオイムノアッセイ系を確立し、PACAPおよびPRPの生体分布を測定した。PACAP、PRP共に中枢神経系および消化管神経系に存在していた。3.PACAPの消化管に対する作用:(1)消化管運動:VIPが胆嚢を弛緩させるのに対し、PACAPは収縮させる。この機序をモルモット胆嚢単離平滑筋標本において検討した。PACAPの胆嚢収縮作用は、アトロピン(ムスカリン受容体拮抗薬)、テトロドトキシンならびにロキシグルミド(CCK拮抗剤)により抑制されず、胆嚢平滑筋に対する直接作用であると推定された。(2)膵外分泌作用:PACAPはVIPと同じくラット単離膵腺房細胞におけるcAMPを上昇させ、アミラーゼ分泌を刺激した。(3)血流作用:単離血管平滑筋標本および血流測定プローブを左胃動脈ならびに上腸管膜動脈に埋め込んだ慢性犬を用いて、PACAPの消化管血流作用を比較した。モルモット肺動脈の単離血管平滑筋標本およびイヌの上腸管膜動脈に対するPACAPとVIPの作用には差を認めなかったが、左胃動脈弛緩作用は、PACAPがVIPの約20倍強力であった。これらの成績から、PACAPはVIP受容体のみならず、PACAP受容体を介して消化機能の調節に関与している可能性が高いことが示唆された。
非接触型振動センサーを用いた患者見守りシステムの開発

本研究は患者に触れずに心拍・呼吸情報を取得できるセンサーを開発するための研究である。科研費を使って、余分な信号を排除し、臨床的に必要なデータを得るためのプログラム作りを行うと同時に、得られた信号を既存の検査方法と比較検討し、センサーから得られる信号が臨床的に意味があるかどうかを検討する研究であった。これらのプロセスをおおむね終了することができ、在宅での使用を念頭に置きながら製品開発につなげていく予定である。生体情報を取得するS/N比の高い適切な信号処理技術の決定・制御基板・通信端末の作成を行った。呼吸波形の周波数は0.2Hz前後である一方で、心音の周波数は15Hz170Hz程度と幅が広い。ゆえに適切なサンプリングレートを決定することが心音の正確な取得に欠かせない作業となる。一方で、サンプリングレートを大きくすると、ノイズが上昇するのみならず、制御基板や遠隔システムの解析能力を高くする必要があり製品の価格が上昇する可能性がある。解析ソフトウェアを開発にあたり性能と価格のバランスを考慮した適切なサンプリングレートを決定することに重点をおく必要がある。われわれは先行研究で、市販されている信号取得技術(LabChart&#174;)で1000Hzのサンプリングレートで心拍呼吸情報が十分記録されていることを確認し、既存のセンサーと精度は同等であることを確認している。研究期間内に協力企業である日立超LSIシステムズとの共同研究によって100Hz、400Hz、1000Hzのサンプリングレートを持つ3種類のコンパクト(10cm×10cm)な制御基板を作成した上で、得られた波形を解析ソフトウェアで評価し、適切なサンプリングレートを決定した。センサーの設置位置は1箇所、2箇所、4箇所それぞれを比較検討したが、1箇所でも十分にモニタリング可能であることがわかった。試作品は既に完成した。振動センサーの設置レイアウトは既に決定し、現在は適切な信号処理技術の確認作業に入っている。信号処理技術は適切なサンプリングレートの決定、波形分離のための周波数条件を決定するのに数ヶ月の時間を要することが予想されている。また企業と連携し、制御ユニットと通信端末の作成も同時に行っていく予定である。平成28年度は生体情報を適切に取得した後の、信号処理技術の確立に主眼を置いた。取得された心拍呼吸信号から臨床的に意味のある心音情報や呼吸情報を拾い上げ、加工し、それらの信号情報から異常呼吸、不整脈疾患、心不全を診断できる自動解析ソフトウエアを開発してきた。具体的には、以下の項目について開発を進めてきた。1)心音及び心雑音解析:I音、II音の同定及び心不全患者において聴取されるIII音およびIV音の検出を行った。これらは市販されている電子聴診器に匹敵する検出率を目標としてきた。2)不整脈検出:心拍の周波数解析により心拍の規則性を定量評価してきた。不整脈の最終診断は心電図記録によるが、心房細動(一過性心房細動を含む)のスクリーニングが可能なシステムを確立した。これらは終夜睡眠ポリグラフに付属している心電図と比較検討した。3)呼吸の質評価:呼吸信号の周波数解析による呼吸規則性評価、無呼吸、チェーンストークス呼吸、いびきの自動検出を行ってきた。4)体動評価:寝返り、体動(寝返りを伴わない体の動き)の定量的評価を行った。体動回数の自動カウントとその経時変化を記録した。これらも睡眠時無呼吸の診断に用いられるポリソムノグラフとの比較検討にて精度を確認した。5)自律神経機能評価:心拍変動、体動評価により自律神経機能評価の可能性を検討した。6)呼吸の安定性から睡眠リズムを推測できるソフトウェアの作成にも取り組んできた。これも睡眠脳波との比較検討を進めている。平成27年度は適切なサンプリング周波数を決定した。そして、平成28年度は得られた生体信号を臨床的に意味のあるパラメータに加工することに主眼を置いた。そのために、生体信号を解析する自動プログラミングを作成し、得られたデータを、既存の検査機器から得られたデータと比較検討してきた。また生体信号取得システムを評価キットとして製品化することに成功し、現在をそれを使用して生体信号を取得している。これら一連の作業によって、心不全、不整脈、体動情報、異常呼吸情報を非接触で、非侵襲的に取得することに近づいている。本研究では非接触センサーから得られた生体信号をできるだけS/N比の高い条件で獲得すること、それを現場にニーズに近いニーズに加工することを目的としていた。至適なフィルタリングの設定を終了し、その後は、加工したデータが既存の臨床検査と遜色ないことを確認することを目標として設定した。心拍呼吸信号は終夜睡眠ポリグラフィーと比較検討し、遜色ないことを線形解析することによって確認した。無呼吸低呼吸指数は、極めて相関係数の高い結果が得られ、呼吸信号の正確性を示すことができた。心拍信号はポリグラフィーの心電図信号と比較し、不整脈の検知能力が遜色ないことを示すことができた。この検出能力を生かすことによって、心拍呼吸信号を既存の詳しい検査を行わずともある程度、患者の状態を定量評価できることを示すことができた。われわれが作成したセンサーは、安価で、さまざまな情報を得ることができるため、在宅での使用を念頭に置いている。また共同研究者と共に、制御基板の小型化に取り組んだ。最終的に制御基板は小型の携帯電話程度の大きさになり実臨床において患者の邪魔にならない程度の大きさにすることができた。またその際に、サンプリングレートの設定も行った。

サンプリングレートをいくつか変更しデータを得られるかの検討も行い、最終設定も行った。追加実験として、効率よく信号を採取できるベッドマットの品質も評価し、同時に報告する予定である。本研究は患者に触れずに心拍・呼吸情報を取得できるセンサーを開発するための研究である。科研費を使って、余分な信号を排除し、臨床的に必要なデータを得るためのプログラム作りを行うと同時に、得られた信号を既存の検査方法と比較検討し、センサーから得られる信号が臨床的に意味があるかどうかを検討する研究であった。これらのプロセスをおおむね終了することができ、在宅での使用を念頭に置きながら製品開発につなげていく予定である。取得生体情報に対する自動解析ソフトの開発を行っていきたい。在・不在情報、在床時間、心音情報(1音/2音/3音/4音)、心雑音情報、心房細動情報、呼吸数や異常呼吸、心拍変動を全て自動解析できるシステムを作成していく。特に3音や4音は心不全の有無を判定する感度の高い所見であり、心不全の予知において意義のある指標である。われわれは先行研究で、本振動センサーとリットマン電子聴診器を比較検討し、3音と4音が抽出できることをすでに確認している。研究期間内に患者の背面に設置した振動センサーでこれらの心音を自動検出する方法を検討している。心音情報を分離すると確実に1音と2音が記録されることから、われわれは心電図のR波に一致する1音を選択的に抽出するプログラミングを作成し、R波の代わりに1音を解析し、周波数解析を行うと、心房細動を判別できることが明らかとなっている。また呼吸成分を解析するとチェーンストークス呼吸などの異常呼吸も鑑別することができる。自動解析するシステムを作成することによって病態把握がより可能となり、研究がより推進されることが予想される。自動解析プログラムの作成と平行して、遠隔通信システムを確立させる方針である。センサーから収集されるデータを送信する通信端末ソフトウェア、クラウドサーバ通信ソフトウェア、サービスアプリケーションは共同研究者である日立のクラウド通信システムを使用する。実証実験は秋田大学医学部附属病院あるいは関連施設を考えている。まずは4ベッドを確保し、1部屋分の通信機能を確立する。それ以降は順次ベッド数を増やしていく。本転送システムを使用するにあたっては、転送する情報量が多いと、実用化に際してコストの面から問題となる。逆に、転送前に解析して結果のみを転送しようとすれば通信コストは抑えられても、1ベッドに組み込むセンサーユニットにコストがかかる。また、原波形データに埋もれた新たな情報を探り出すことができなくなる。それらのバランスを検討する作業も盛り込む予定である。循環器内科初年度は設置レイアウトの決定と適切な信号処理技術の研究で終了した。そのためプログラミング開発のための人件費が発生しなかった。平成28年度は生体信号の解析プログラムを作成することであったが、参考資料、解析ソフトウェアなど比較的低予算である程度の完成度を得ることができた。
心水症の予防・制圧に向けた分子生態解析

心水症はリケッチアの一種Ehrlichia ruminantiumが原因となるマダニ媒介性感染症である。本菌はin vitroの継代培養で弱毒化し、生菌ワクチンとして有効であることが報告されているが、その弱毒化機序は不明である。さらに、流行地では免疫原性の異なる株の混在が示唆されており、効果的なワクチン処方には野外株の遺伝子型別が必須である。そこで、本研究では次世代シーケンサーを中心としたゲノム解析技術によりワクチン株の弱毒化機序の解明と野外流行株の系統解析を目的に研究を進めた。ヤギに強毒性を示す野外分離株であるGardel株と、それを親株として得られた弱毒Gardel株を材料に、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム配列の解読を行った。2株間のゲノム比較により、合計16箇所のゲノム差異が弱毒化に関連しうるゲノム変化として検出された。今後、発現遺伝子ならびに翻訳蛋白質の解析により、宿主への病原性を担う遺伝子の特定が可能となり、遺伝子ノックアウト技術を応用することで様々な野外流行株に対するワクチンの開発につながることが期待できる。アフリカのほぼ全域に由来する実験室分離株とウガンダの心水症流行地で採集されたエーリキア感染マダニを対象に、複数のハウスキーピング遺伝子の塩基配列に基づくMLST法により解析を行った。その結果、同一地域において地理的拘束をこえた様々な遺伝子型の混在が示された。また、複数の株間での大規模な遺伝子組換えが検出され、本菌の重要なゲノム改編メカニズムであることを明らかにした。また、より簡便・迅速な解析手法としてゲノム全域に点在する繰り返し配列をマーカーとするMLVA法を新たに開発した。既存の型別法であるPCR-RFLP法より高い多型識別能力が確認され、流行地における優勢遺伝子型群の特定が可能であり、ワクチン株を選定する上で有用な遺伝子型別法であることが示された。さらに今後、野外ワクチネーション試験において遺伝子型とワクチン効果等の臨床像の相関性を解析することで、本菌の病原性を規定する遺伝的背景の解明に活用されることが期待される。本研究では、ゲノム関連技術を心水症の予防・制圧に応用することを目的とし以下の成果を得た。(1)迅速かつ簡便な遺伝子診断法としてE.ruminantiumを特異的に検出するLAMP法を開発した。Superoxide dismutase B(sodB)遺伝子領域をターゲットとしたLAMP用プライマーを設計し、一反応中5コピー以上の遺伝子を60分以内に検出することが出来た。地理的に由来の異なる分離株との反応性を確認し、アフリカ諸国由来の野外サンプルを用いた試験では、既存のPCR法よりも多くの陽性サンプルを検出した。今後、診断設備の乏しい途上国の心水症流行地での応用が期待できる。(2)Variable Number of Tandem Repeat(VNTR)をマーカーとする、MLVA法によるE.ruminantium多型解析法を開発した。地理的に由来の異なる分離株を用いた探索の結果、11個のVNTRを多型マーカーとして検出した。さらに、蛍光プライマーを用いたマルチプレックスPCRで、各VNTRを短時間で評価できる多型解析法を開発した。今後、疾病サーベイランス、ワクチン株の選定等に応用されることが期待される。(3)次世代シークエンサーを活用してE.ruminantium強毒株、弱毒ワクチン株の全長ゲノム比較解析を行った。その結果、弱毒ワクチン株に特異的な変異として、主要抗原タンパク(map1)の欠損、複数の遺伝子(mutS、hupB、pyrH)でアミノ酸変化を伴うSNP、トランスポーター遺伝子(proP)で一塩基挿入によるフレームシフトによりアミノ酸の構造変化を突き止めた。これら弱毒ワクチン株に特異的に見られた変異に注目することで、E.ruminantiumの病原性因子の解明と効果的なワクチン開発に応用されることが期待される。【Ehrlichia ruminantium遺伝子検出法の開発】ウガンダ・タンザニア・ザンビア・ガンビアの心水症流行国で採取した家畜血液・媒介マダニサンプルを用いて、昨年度開発したE.ruminantiumを特異的に検出するLAMP法の有用性を評価した。その結果、PCR法よりも多くの陽性検体を検出し、また不顕性感染個体の血液からも検出が可能であったことから、本LAMP法は疫学研究ならびに感染家畜の診断・摘発に有効な手法であることが示された。本研究結果は、国際学術雑誌BMC Microbiologyに掲載された。【E.ruminantium遺伝子型別法の開発】昨年度開発したMLVA法を用いてウガンダの心水症流行地で採取されたマダニから検出したE.ruminantiumの遺伝子型別を行った。その結果、本法は既存の遺伝子型別法(PCR-RFLP法)に比べ詳細な型別が可能であり、クラスター解析によって株の分離地の推定にも応用できることが示された。今後、ワクチン導入前における野外株の集団遺伝学的解析に活用することで、流行地での有効なワクチン処方に貢献することが期待できる。【E.ruminantiumのSNP解析】次世代シーケンサー(Illumina Genome analyzer II)を活用してE.ruminantiumの西アフリカ由来株(Sankat、Pokoase、Kerr Seringe株)のゲノムを解読し、reference-guided assembly法によるマッピング後、各株に特異的なSNPを検出した。