hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝細胞癌の発癌・進展の分子機構:造影超音波クッパ―相と遺伝子発現を用いた融合解析

肝細胞癌の多段階発癌は、異型結節から早期肝癌を経て、多血性の中分化型肝炎に至る。その過程における造影超音波クッパー相の所見と遺伝子発現を検討した。その結果、異型結節ではほぼ全例にOATP8が発現するが、造影超音波クッパー相で低信号を呈す早期発癌ではほぼ全例においてOATP8の発現を認めなかった。また異型結節ではGlypican3,HSP70,CAP2,GS,Bmi-1の発現を認める例はなかったが、造影超音波クッパー相で低信号を呈す早期肝癌ではこれらの遺伝子群の発現を認めた。以上より、臨床的には造影超音波クッパー相で低信号を呈す結節は治療対象とすべき結節であることが確認された。EOB-MRIの肝細胞相や、ソナゾイド造影超音波のクッパー相で低信号を呈する結節の生検組織をBmi-1、HSP70、Glutamine Synthetase、Glypican3などで染色した。この結果、EOB-MRIの肝細胞相で低信号を呈する乏血性結節は、70%以上の症例においてHSP70、Glypican3、Glutamine Synthetase、Bmi-1の発現がみられ、すでに早期肝細胞癌と呼べる所見であることが判明した。また、ソナゾイド造影超音波のクッパー相において低エコーを示す結節においてはHSP70、Glypican3、Glutamine Synthetase、Bmi-1のいずれかがほぼ100%発現しており、乏血性結節であっても、ソナゾイド造影超音波で低エコーを示す結節においてはクッパー機能の低下がみられ、すでに早期肝細胞癌と呼ばれる所見であることが判明した。したがって、EOB-MRIの肝細胞相で低信号を示す乏血性結節の78割ならびにソナゾイド造影超音波のクッパー相で低エコーを示す結節のほぼすべては将来的に多血性の古典的肝癌へ進展する可能性のある結節である。また、EOBの取り込み型トランスポーターであるOATB1B3を染色したところOATB1B3はEOB-MRI肝細胞相で低信号を示す結節の全例において発現低下を認めた。このようなことから、発がん初期にはOATB1B3の発現が低下し、少し遅れてクッパー細胞が低下し、動脈血流の増加へとつながっていくことが示唆された。したがって、乏血性結節であってもCD68染色で染色されるクッパー細胞相で低エコーを示す乏血性結節は臨床的に治療対象結節であると結論することができる。対象は、2008年2月から2010年9月の期間に、2回以上のEOB-MRIで評価しえた慢性肝障害・肝硬変患者の乏血性結節、53例121結節である。病変数は1例あたり平均2.2結節であった。エントリーは初回EOB-MRI検査日とし、対象を無治療にて経過観察し、多血化発生日はEOB-MRI、造影CT、肝動脈造影下CT(CT hepatic arteriography; CTHA)、造影超音波検査のうち、多血化が最も早く確認されたモダリティの検査日とした。観察期間中に多血化がみられた結節を多血化群、みられなかった結節を非多血化群とした。中央値343(76-937)日の経過観察期間中、53例中26例(49%)に多血化を認めた。病変ベースでは、121結節中39結節(32%)に多血化を認め、Kaplan-Meier法によって求めた6ヶ月、12ヶ月での累積多血化率は、それぞれ10%、28%であった。病理組織診断は13結節に得られ、多血化群は高分化肝細胞癌8結節、中分化肝細胞癌1結節、非多血化群は異型性結節2結節、高分化肝細胞癌2結節であった。多変量Cox回帰解析を行った。説明変数には、ベースラインMRIの画像所見(T2強調画像における信号強度、脂肪成分の有無、造影前および造影後のT1強調画像における造影効果比、肝細胞相で計測した最大径)と、このときの患者背景因子(年齢、性別、Child-Pugh分類、慢性肝障害の病因、血清AFP、多血性肝細胞癌の局所治療歴、多血性肝細胞癌の併存)を含め、これらのベースライン因子と多血化の無発生生存期間との関連を評価した。トランスポーターの解析結果については肝細胞相で低信号を呈するものについてはOATP1B3が低下していた。また、造影超音波Kupffer相で低信号を示す結節内のCD68は非癌部肝組織より低下していた。

(1)EOB-MRI肝細胞相にて低信号を呈する結節の自然経過、(2)肝トランスポーターの発現解析あるいは、(3)造影超音波Kupffer相や低信号を示す結節内の生検組織のCD68染色の研究については順調に進行している。早期肝癌に発現されるとされる遺伝子を抽出し、それら遺伝子の発現変化を誘導した細胞のマイクロアレイ解析を行い、早期肝癌関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルの変化を検討する。遺伝子発現変化が大きい分子についてはWestern blotによりタンパクの発現についても検討し、新しい分子マーカーの可能性についても検討する。当然、これらの所見を呈する結節の造影超音波所見も比較検討し、癌化のプロセスのどの段階で遺伝子発現プロファイルが変化し、Kupffer細胞機能や数に影響を与えているのかについても検討する.実験用消耗品にほとんどの研究費を使用予定
リゾチーム遺伝子を導入した青枯れ病抵抗性トランスジェニック・ナス科作物の育種

ナス科植物の青枯れ病・立枯病の防除には、化学的な方法、耕種的な方法および抵抗性品種の導入などが用いられてきたが、被害を皆無にするような防除方法は確立されていない。そこで本研究では、タバコ立枯病細菌感染ファージP4282からリゾチーム遺伝子を同定・単離し、さらに申請者らが長年に渡って研究してきた根組織特異的に発現するエンドウ・PAL(フェニールアラニンアンモニアリアーゼ)遺伝子のプロモータを利用し、ファージ・リゾチーム遺伝子とPALプロモータを連結したキメラ遺伝子をトマト・タバコ植物体に導入して、青枯れ・立枯れ病抵抗性トランスジェニック植物体を作出することを目的としたものである。本研究の成果として特に以下の内容は意義が大きいものと考えている。1.タバコ立枯病細菌に感染するファージP4282からリゾチームタンパク質を単離精製し、対応する遺伝子の単離、構造解析を行った。2.エンドウのPAL1プロモーター中の発現制御シスエレメント(Box I,Box II,Box IV)をタンデムにリピートさせた高発現型強力プロモーターを開発した。本プロモーターは特に根にでCaMV35Sプロモーターの6.5倍の高い発現を示した。3.恒常的に高発現するCaMVの35Sプロモーター、エンドウPAL1プロモーター及び上記リピートプロモーターとリゾチーム遺伝子を融合し、タバコに導入して形質転換体を作出した。4.上記のリゾチーム遺伝子を発現させた形質転換タバコでは高い溶菌活性を確認した。5.PAL1プロモーターとGUS遺伝子の融合遺伝子を組込んだ形質転換タバコに、LUX遺伝子を導入した青枯れ病菌を接種することにより病原菌の挙動と植物の防御応答を同時に解析できるモニタリングシステムを確立した。本研究は、ナス科植物の青枯れ病・立枯病の防除には、化学的な方法、耕種的な方法および抵抗性品種の導入などが用いられてきたが、被害を皆無にするような防除方法は確立されていない。そこで申請者らは、研究協力者らによってその遺伝子構造・諸性質が明らかにされたタバコ立枯病細菌感染ファージP4282からリゾチーム遺伝子を同定・単離し、さらに申請者らが永年に渡って研究してきた根組織特異的に発現するエンドウ・PAL(フェニールアラニンアンモニアリアーゼ)遺伝子のプロモータを利用し、ファージ・リゾチーム遺伝子とPALプロモータを連結したキメラ遺伝子をトマト・タバコ植物体に導入して、青枯れ・立枯れ病抵抗性トランスジェニック植物体を作出することを目的としている.1)ファージP4282のリゾチーム遺伝子のクローニングファージP4284を感染させた青枯れ病細菌の溶菌培地懸濁液の上清に含まれるタンパク質を電気泳動分画した後、リゾチーム活性を示すタンパク質バンドを活性染色により同定したところ、約70kDaのタンパク質であることが判明した。また、本タンパク質をゲルから抽出・精製後、アミノ酸シークエンサーで、N-末端アミド酸シークエンスを決定し、遺伝子クローニング用のオリゴヌクレオチドプローブを作製した。2)エンドウPAL(PSPAL2を中心として)プロモータとリゾチーム遺伝子を連結したキメラ遺伝子の構築代表者らが同定・開発したエンドウPALプロモータの根組織特異的発現に必要なDNAシス領域を絞り込むと同時に、傷、紫外線照射、菌感染などによる環境ストレス応答に必要なシス領域を詳細に解析し、コンパクトで、かつ遺伝子発現のon/off調節のきくユニークな植物用プロモータのいくつかの種類を作製した。現在、これらのプロモータのタバコ植物体における器官特異的発現と病原菌接種による発現様式をGUSをレポータ遺伝子として、解析している。ナス科植物の青枯れ病・立枯病細菌は、根の傷や水孔・気孔を通じて感染する。

申請者らは、研究協力者らによってその遺伝子構造・諸性質が明らかにされたタバコ立枯病細菌感染ファージP4282からリゾチーム遺伝子を同定・単離し、さらに申請者らが永年に渡って研究してきた根組織特異的に発現するエンドウ・PAL(フェニ一ルアラニンアンモニアリアーゼ)遺伝子のプロモータを利用し、ファージ・リゾチーム遺伝子とPALプロモータを連結したキメラ遺伝子をトマト・タバコ植物体に導入して、青枯れ・立枯れ病抵抗性トランスジェニック植物体を作出することを目的としている.1)エンドウPAL(PSPAL1を中心として)プロモータとリゾチーム遺伝子を連結したキメラ遺伝子の構築2年度目(平成10年度)の計画のファージP4282のリゾチーム遺伝子のクローニングは完了したので、代表者らが同定・開発したエンドウPALプロモータの野生型あるいはボックス1、ボックス2(両者ともエリシターや、その他のストレス応答に必要なシス因子)やボックス4(エンハンサー効果)のタンデムリピート配列を構築し、トランスジェニック・タバコ植物体でのGUS発現をしらべたところ、根・茎では勿論のこと、葉組織でも35Sプロモータの数倍の発現能力を示した。現在タンデムリピートプロモータと野生型プロモータに、リゾチーム遺伝子を連結し、タバコ植物体に導入して、立枯れ病菌に対する抵抗性の程度を検定している。これまでにタバコ立枯病細菌感染ファージP4282から溶菌遺伝子を単離し、構造解析の後、エンドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)遺伝子プロモーターあるいはPAL1プロモーター中の発現制御シスエレメントであるBox-I,Box-II,Box-IVのセットをタンデムに6回リピートさせた高誘導強力発現型プロモーター(リピートプロモーター)、CaMV35Sプロモーターに各々連結させたキメラ遺伝子を構築した。一方、タバコ立枯病細菌の侵入部位である根におけるこれらプロモーターの発現量をレポーター遺伝子を用いて解析したところ、PAL1プロモーターはCaMV35Sプロモーターの1.5倍、リピートプロモーターは6.5倍の高発現を示した。更に、傷処理によりこれら2種のプロモーター活性は誘導されたが、CaMV35Sプロモーターでは変化が見られなかった。溶菌遺伝子が導入された形質転換タバコにおいて溶菌タンパク質の発現量を解析する為に、溶菌タンパク質の抗体を作成することとした。まず、溶菌タンパク質をコードする遺伝子全長を大腸菌の発現ベクターに組込んで、IPTGで誘導させたが、過剰生産させた本溶菌タンパク質は大腸菌の生育を阻害し、組換えタンパク質を十分に生産することができなかった。そこで、溶菌タンパク質のアミノ末端側に相当する比較的親水性アミノ酸が多い領域のポリペプチドを大腸菌で大量生産させた。本ポリペプチドは溶菌タンパク質を検出し得る抗体作成の為の抗原になり得ると思われる。
活断層における時間的・空間的ゆらぎを考慮した活動特性の解明

本研究では,活断層における古地震活動時期の解明と地震時変位量の高精度解析に基づいて,活動間隔のゆらぎを考慮した断層の活動特性の解明ならびに,断層帯のセグメンテーションについて考察することが目的である。研究対象地域は,岐阜県東部を北西南東方向に走る阿寺断層帯である。18年度には断層位置の把握と,断層帯中部の活動履歴調査によって,最新活動を明らかにした。19年度は上桑原トレンチ近傍において,平面ピットを開削し,最新活動における横ずれ変位量の確認・計測を行った。その結果,阿寺断層帯中部,上桑原地点の最新活動における水平変位量は,約1.2mであることが明らかになった。阿寺断層帯において,過去の活動における一回変位量が明らかになったのは初めてであり,極めて重要な資料を提示することができた。また一つ前の活動は4000年前より古く,活動間隔は断層帯中北部よりも有意に長い。したがって,阿寺断層帯加子母地区は,中北部の小和知断層,下呂断層などとは別個の活動サイクルを持つ可能性が高い。さらに断層帯中北部において,詳細が不明な宮地断層について調査を行った。近年空中写真判読により作成された都市圏活断層図によって,飛騨川を越えてさらに北西へ断層が連続することが明らかにされた。この断層線における地形,地質学的調査を実施した結果,明瞭な破砕帯露頭や河川屈曲など小規模な変動地形を確認し,宮地断層が従来よりも倍以上長い断層であり,起震断層になりうることを明らかにした。今後宮地断層の活動履歴についても明らかにし,これも含めた活動性やセグルテーションを議論していくことが今後の課題である。本研究では,活断層における古地震活動時期の解明と地震時変位量の高精度解析結果に基づいて,活動間隔のゆらぎを考慮した断層の活動特性の解明並びに断層系のセグメンテーションについて考察することを目的としている.研究対象地域は,古地震の活動履歴情報の集積が最も多い断層系の一つである阿寺断層帯とする.18年度は断層帯の位置や形状を把握するために,阿寺断層帯の主に中北部について空中写真判読と現地踏査を実施した.その後活動履歴と変位量把握のために,トレンチ調査候補地点の中津川市加子母上桑原地区において試錐調査,地下レーダ探査を実施した.その後トレンチ掘削調査を実施した.トレンチ調査地点は,谷側である断層南西側が隆起し,堰き止め状の地形を呈する地点であり,この凹地を横切る掘削穴の壁面には,地形と調和的な南西側隆起を示し,完新世の地層を変位させる複数の断層を見いだした.地層は黒色の礫を含んだ腐植質シルト層が大半であり,途中に砂礫層を挟在し,これらは層相に基づいて下位から4層最上位の1層まで区分できる.断層は最下位の4層までを変位させるものと,さらに上位の2層までを変位させるものから,少なくとも過去2回の断層活動が認められた.各地層の堆積年代については,放射性炭素年代測定と火山灰分析ならびに,考古学的遺物の鑑定に基づいている.これらの産出層序と断層変位の関係から,断層の最新活動時期は,3,030±30y.B.P.以降,300±30y.B.P.以前であることが明らかとなった.また一つ前の活動は約3000年以前であり,4層中から産出したK-Ahテフラ(約6300年前)よりもおそらく後と考えられる.最新活動にともなう変位量は平面掘削により2層を刻む小流路の変位より約1m未満であったが,認定に不明確な部分もあり,追加的に確認を行う.これら阿寺断層の古地震活動に関わる成果は,活断層研究27号に関連する内容を投稿しており,今秋以降の学会でも発表予定である.本研究では,活断層における古地震活動時期の解明と地震時変位量の高精度解析に基づいて,活動間隔のゆらぎを考慮した断層の活動特性の解明ならびに,断層帯のセグメンテーションについて考察することが目的である。
細胞障害により惹起される分子指標を用いた新らしい抗癌剤感受性試験

【目的】近年,進行胃癌に対し新規抗癌剤の効果が期待される一方,これらの抗癌剤に対するnon-responderも存在し,こうした症例の早期発見が重要である。我々は、癌化学療法の効果予測を治療早期に予測しうるassayの開発を目的として検討を行った。【方法と対象】化学療法開始早期に細胞死に先立ち変化を来たす遺伝子の候補としてgadd153、p21,c-junを採用した。(in vitro)ヒト胃癌細胞株TMK-1,MKN-45,MKN-74を,低高濃度5-FU,CDDPにそれぞれ曝露後,経時的に各遺伝子のmRNAの発現を定量した。抗腫瘍効果はMTT assayを用いて判定し、無治療群を対照群とした.(in vivo)ヒト胃癌細胞株TMK-1をnude mouseに皮下移植し腫瘍を作成した後,低高濃度5-FU,CDDPを腹腔内投与した。薬剤投与後48時間に皮下腫瘍を回収しm-RNAを同様に定量した。また、それぞれの薬剤濃度による抗腫瘍効果は薬剤投与後21日目に評価した。(臨床例)高度進行胃癌患者11人に対し化学療法施行前と、施行後1週間以内に胃内視鏡下生検にて癌組織を採取、m-RNAを定量し、治療効果との関係を検討した【結果】(in vitro)全ての細胞株において,用量,曝露時間に比例し癌細胞増殖阻害を認め、遺伝子発現を強く認めた。細胞間、薬剤間にmRNA発現量に差を認めず、抗腫瘍効果を予測するcut off値をROC曲線からgaddl53 1.3、p21 1.8、c-Jun2.1と算定しえた。(in vivo)in vitroの実験と同様に、腫瘍増殖抑制を認めた高濃度5-FU,CDDPで、薬剤投与後48時間での各mRNA発現増強を認め、同様にcut off値をROC曲線からgadd153 1.8、p21 1.9、c-Jun2.2と算定しえた。(臨床例)治療開始前後のmRNA発現量は、PRの症例がPDの症例より増加傾向にあった。【結語】化学療法開始後早期の遺伝子発現量は抗腫瘍効果を反映する可能性が示唆された。【目的】近年,進行胃癌に対し新規抗癌剤の効果が期待される一方で,これらの抗癌剤に対するnon-responderも存在し,こうした症例を早期発見することが重要である。今回われわれは、癌化学療法の効果予測を、治療早期に予測しうるassayの開発を目的として、in vitro, in vivoの系を用いて検討した。【方法と対象】化学療法開始早期に細胞死に先立ち変化を来たす遺伝子の候補としてgadd153 (DNA damage inducible gene), p21, c-junを採用した。(in vitro)ヒト胃癌細胞株TMK-1,MKN-45,MKN-74を,低濃度高濃度5-FU,CDDPにそれぞれ曝露後,経時的に各遺伝子のmessenger RNA (mRNA)の発現を定量した。抗腫瘍効果はMTT assayを用いて判定し、無治療群を対照群とし治療群との比を求めた.(in vivo)ヒト胃癌細胞株TMK-1をnude mouseに皮下移植し腫瘍を作成した後,低濃度高濃度5-FU,CDDPを腹腔内投与した。薬剤投与後48時間に皮下腫瘍を回収し,m-RNAを同様に定量した。【結果】(in vitro)全ての細胞株において,曝露後早期(24時間)と比較し,後期(72時間)で明らかに癌細胞増殖阻害を認めた。高濃度5-FU,CDDPでは,全ての細胞で遺伝子発現を強く認めた。TMK-1においては高濃度5-FUで,gadd153で18.5倍,p21で39.3倍,c-junで2.2倍であった.高濃度CDDPでも同様の結果が得られた。低濃度ではいずれも遺伝子発現は対象群の0.6-1.5倍にとどまった.用量,曝露時間に,遺伝子発現量は比例し,抗腫瘍効果を予測すべくcut off値を算定しえた。(in vivo)in vitroでの実験と同様に、腫瘍増殖抑制を認めた高濃度5-FU,CDDPでは、薬剤投与後48時間でのgadd153,p21,c-junの発現増強を認めた。【結語】化学療法開始後早期の遺伝子発現量は,化学療法の抗腫瘍効果を反映する可能性が示唆された。抗腫瘍効果はMTT assayを用いて判定し、無治療群を対照群とした.(in vivo)ヒト胃癌細胞

株TMK-1をnude mouseに皮下移植し腫瘍を作成した後,低高濃度5-FU,CDDPを腹腔内投与した。薬剤投与後48時間に皮下腫瘍を回収しm-RNAを同様に定量した。また、それぞれの薬剤濃度による抗腫瘍効果は薬剤投与後21日目に評価した。(臨床例)高度進行胃癌患者11人に対し化学療法施行前と、施行後1週間以内に胃内視鏡下生検にて癌組織を採取、m-RNAを定量し、治療効果との関係を検討した【結果】(in vitro)全ての細胞株において,用量,曝露時間に比例し癌細胞増殖阻害を認め、遺伝子発現を強く認めた。細胞間、薬剤間にmRNA発現量に差を認めず、抗腫瘍効果を予測するcut off値をROC曲線からgaddl53 1.3、p21 1.8、c-Jun2.1と算定しえた。(in vivo)in vitroの実験と同様に、腫瘍増殖抑制を認めた高濃度5-FU,CDDPで、薬剤投与後48時間での各mRNA発現増強を認め、同様にcut off値をROC曲線からgadd153 1.8、p21 1.9、c-Jun2.2と算定しえた。(臨床例)治療開始前後のmRNA発現量は、PRの症例がPDの症例より増加傾向にあった。【結語】化学療法開始後早期の遺伝子発現量は抗腫瘍効果を反映する可能性が示唆された。
アルツハイマー病遺伝子が誘導する神経細胞死抑制因子受容体の同定と機能解析

1.細胞表面の受容体数の予測細胞死抑制因子のS14G変異体の合成ペプチドをI-125で標識し、培養神経細胞F11に添加した後に架橋剤を用いて結合蛋白に固定して、細胞の放射活性を測定した。この放射活性は非標識体ペプチドを過剰に添加すると低下し、細胞死抑制効果のない変異体ペプチドでは顕著な変化が認められず、特異的な受容体の存在が再確認された。F11細胞に結合した放射活性量から、細胞表面のレセプター数は数百個程度と概算された。2.受容体下流のシグナル分析細胞内シグナル因子の阻害剤を用いて細胞死抑制因子の効果への影響を薬理学的に検討した。抑制因子の作用は、MAPキナーゼ阻害剤PD98059やPI-3キナーゼ阻害剤wortmanninでは変化がなく、チロシンキナーゼ阻害剤genisteinで完全に抑制された。さらに、チロシンキナーゼのひとつJAK2キナーゼ阻害剤AG490でも抑制された。よって、細胞死抑制因子のシグナルは受容体からチロシンキナーゼ特にJAK/STAT系を介して伝達されると推測された。3.レセプター同定への検討JAK/STATを活性化させる受容体として、成長ホルモンの様な単一受容体とサイトカインのようにgp130と共同で受容体の機能を果たす受容体が考えられた。パニング法による受容体探索が成功しなかったことから、この神経細胞死抑制因子の受容体は後者である可能性が高いと推測された。そこで、gp130を必要とする既知の受容体のアミノ酸配列から機能的には未知の複数の受容体候補を探索してその機能を確認している。1.受容体分子の分子量の予測FLAGタグを付加した細胞死抑制因子のS14G変異合成ペプチド及びそれをI-125で標識したペプチドを用いて、無傷のF11細胞とインキュベーションした後、架橋剤を用いて結合蛋白と架橋させてから細胞膜分画を調製し、抗FLAG抗体により免疫沈降させる。沈降した蛋白をSDSゲル電気泳動を用いて分離し、分離した蛋白の移動度から、受容体蛋白の分子量を推定した。予備的検討で得られた130kDaに加えて新たに80kDaの分子が確認された。2.ライブラリーのスクリーニングこれまでに、i)pEF-BOS,pCMV-SPORTベクターに組み込んだアルツハイマー病患者の大脳cDNA発現ライブラリー,ii)pEF1-MycHisベクター組み込んだマウス胎児大脳cDNA発現ライブラリーをCOS-7細胞にリポフェクション法とプロトプラストフージョン法を用いて導入し蛋白を細胞に発現させた。FLAGタグを付加した細胞死抑制因子のS14G変異合成ペプチドをプローブとしてパニング法により目的とする受容体遺伝子の濃縮を試みた。しかし、導入したベクターが組換えを起こしCOS-7細胞から直接回収が困難であることが判明したので、現在,pEF1-MycHisベクター組み込んだマウス胎児大脳cDNA発現ライブラリーを用いて、サブプールを作製しsiblingによりスクリーニングを鋭意続行中である。
口蓋粘膜瘢痕組織形成過程を制御するシグナル伝達機構の解析

本研究の目的は、1.器官培養系を用いたラット口蓋粘膜の創傷治癒モデルを確立、2.筋線維芽細胞の分化におけるSmad系を介したシグナル伝達機構、およびアポトーシスにおけるASK1-MAPKを介したシグナル伝達機構の解析である。1.実験動物にはラットを用い、器官培養系における至適条件は、無血清のWeymouth's MB752/1培地を用い、培地と気相の界面にて培養、37度湿潤下、55%酸素/5%二酸化炭素であることを確認した。2.FGFは細胞の増殖や分化に関与し、創傷治癒や組織のリモデリングに深く関与する。そこで、瘢痕形成におけるシグナル伝達にFGFが関与している可能性を検討するために、FGFリセプター(FGFR)の発現をin vitroの系をもちいて確認した。ラット口蓋粘膜切除後28日の瘢痕組織について、FGFR発現を検討した。その結果、瘢痕組織中の筋線維芽細胞の核に、FGFR1の強い発現を認めた。一方、FGFR2に関しては、FGFR1よりも発現が弱く、FGFR3の発現は認められなかった。そこで、瘢痕形成期に出現する筋線維芽細胞の分化誘導因子であるTGF-β1を作用させて、in vivoの実験を行った。ラット口蓋粘膜組織由来線維芽細胞を培養し、その培地にTGF-β1(5ng/ml)を作用させた。48時間後、FGFRの発現を上記同様の手法にて検討した。その結果、TGF-β1を作用させない群においては、いずれもFHFRもその発現を認めなかった。一方、TGF-β1を作用させた群においては、FGFR1の強い発現を認めた。また上記、in vitroの実験と同様、FGFR2に関しては、FGFR1よりも発現が弱く、FGFR3の発現は認められなかった。これらの結果より、口蓋粘膜創傷治癒過程において、FGFR1とFGFR2が何らかの役割を果たしていることが示唆された。本研究は、器官培養系を用いて、口蓋粘膜の創傷治癒モデルを確立する。瘢痕形成期に出現する筋線維芽細胞の細胞培養系は、従来当分野にて用いられてきたが、器官培養系を用いて、瘢痕形成に関わる因子を検索しようとする試みは皆無であった。口蓋粘膜瘢痕組織形成過程を制御するシグナル伝達機構の解析をおこなう前準備として、以下の検討を行った。実験動物にはラットを用い、口蓋部の粘骨膜を剥離した後の形成過程の瘢痕組織、および正常口蓋粘膜組織を対照として、in vivoおよび器官培養系における瘢痕組織および筋線維芽細胞を観察した。組織片は、培地と気相の界面にて培養、無血清のWaymouth's MB 752/1培地を用い、気相は、37度湿潤下、55%酸素/5%二酸化炭素とした。3日間の培養の後、培養組織片の状態を確認するために、組織学的観察およびBrdUの取り込みについて検討した。器官培養後の口蓋粘膜瘢痕組織は、in vivoに類似して、細胞には分裂活性が認められ、基底膜の保存が確認された。また、培養組織中の筋線維芽細胞及び平滑筋細胞にはin vivoと同様にalpha-smooth muscle actinの発現を認めた。一方、対照の培養正常口蓋粘膜組織においては、血管の平滑筋細胞のみにalpha-smooth muscle actinの発現が認められ、その他の結合組織中には認めなかった。以上の結果より、本実験系が確立すれば、口蓋粘膜瘢痕組織および筋線維芽

細胞に関する、in vivoの実験にきわめて有用であることが示唆された。しかしながら、現在のところは、培養系の安定化及び長期の培養が困難であり、これらの点が、今後の課題となる。従って、来年度は、器官培養系の至適化および安定化をはかるとともに、in vivoの系を用いた実験の並行についても検討する。本研究の目的は、器官培養系を用いたラット口蓋粘膜の創傷治癒モデルを確立し、このモデルを用いて、i)筋線維芽細胞の分化における、Smad系を介したシグナル伝達機構について、ii)筋線維芽細胞のアポトーシスにおけるASK1-MAPKを介したシグナル伝達機構について解析することである。FGFは細胞の増殖や分化に関与し、創傷治癒や組織のリモデリングに深く関与する。そこで、瘢痕形成におけるシグナル伝達にFGFが関与している可能性を検討するために、FGFリセプター(FGFR)の発現をin vitroの系をもちいて確認した。ラット口蓋粘膜切除後28日の瘢痕組織について、FGFR1、FGFR2およびFGFR3の発現を、免疫組織化学的手法を用いて検討した。その結果、瘢痕組織中の筋線維芽細胞の核に、FGFR1の強い発現を認めた。一方、FGFR2に関しては、FGFR1よりも発現が弱く、FGFR3の発現は認められなかった。そこで、瘢痕形成期に出現する筋線維芽細胞の分化誘導因子であるTGF-β1を作用させて、in vitroの実験を行った。ラット口蓋粘膜組織由来線維芽細胞を培養し、その培地にTGF-β1(5ng/ml)を作用させた。48時間後、FGFRの発現を上記同様の手法にて検討した。その結果、TGF-β1を作用させない群においては、FGFR1、FGFR2およびFGFR3いずれもその発現を認めなかった。一方、TGF-β1を作用させた群においては、FGFR1の強い発現を認めた。また上記、in vitroの実験と同様、FGFR2に関しては、FGFR1よりも発現が弱く、FGFR3の発現は認められなかった。これらの結果より、口蓋粘膜創傷治癒過程において、FGFR1とFGFR2が何らかの役割を果たしていることが示唆された。
マニラ大都市圏における郊外化と中心都市問題

戦後急激に人口が都市に集中するのは世界的な現象であるが、発展途上国においてはこのような傾向が特に首位都市において著しいものである。その結果、雇用吸収力をはるかに超える人口が集中し、都市問題が発生している。本研究の対象地域であるマニラ大都市圏も同様であり、スラムやスクオッターなどの都市貧困層が総人口の新1/3を占めるまでになってきている。このような貧困層の分布は、マニラ大都市圏の地域構造と密接な関係があり、人口の郊外化に伴い貧困層の分布も郊外化の傾向を示している。これはアメリカの都市社会を分析したバージェスの同心円理論とは異なり、発展途上国の都市における貧困層の分布は、水位遅滞への集住ではなく、都市地域全域に分散することを示している。この点は先進工業国と発展途上国の都市化のパターンの違いが反映されたものだと考えられるのであろう。すなわち、発展途上国の都市化は必ずしも工業化と結びついて進行していないために、工業立地との相関関係は低く、むしろインフォーマル・セクターの職を得やすい商業地域の立地と関係が深いと考えられるのである。商業立地が進むとそれに伴って貧困層もそこに集住機能していなかったという点も本研究で明らかになった。今後はさらにこの研究を進める同時に、他の都市との比較研究も重要であろう。本年度は本研究の初年度であり、関連機関における資料収集,聴き取り調査が中心であった。現在諸機関で収集した資料の整理・分析を行なっている段階であるが、本研究を始めるに当って作業仮設的に出したマニラ大都市圏の地域区分にそれほどの差異はなく、来年度以降もその地域区分に沿って研究を進めていくつもりである。その地域区分とは以下の通りである。(1)マニラ市を中心とする中心都市とその周辺ー中心都市(2)マカティーを中心とする商業都市ー郊外都市ケソン市を中心とする行政都市ー郊外都市(3) (2)の郊外ー郊外都市(4)マニラ大都市圏の周辺地域ー農村地域これら3地域の地域特性をつかむため、人口統計資料,および関連資料の収集を行い、現在それらの整理・分析を進めている最中である。また、1986年度の政変により、行政機構にも大きな変化がみられ、それに伴い本研究とも関連の深いマニラ大都市圏の都市計画や都市政策にも大幅な修正が加えられていると考えられる。特に、都市貧困層であるスラムやスクオッター居住区の住民に対する再居住・環境整備などの施策も前政権とは異なり、出来れば早急にそれらの資料を入手して本研究に組み入れていく必要があると考えられる。今年度はマニラ大都市圏の都市構造に関する資料・文献を入手した.これらの資料と1980Census of Populationの統計資料および人口移動に関する文献・資料をあわせて用い,マニラ大都市圏の郊外化現象について1.1948年以前2.19481980年に分けて分析した. 1.においてはフィリピンの社会・経済構造と関連させ歴史的観点より分析し, 2.においては人口・社会統計と資料を用いて,マニラ市を中心核としたマニラ大都市圏の郊外化現象をスラム・スクオッター人口の分布を加えつつ分析した.今年度の分析により,マニラ大都市圏はマニラ市を中心都市としてケソン市とマカティへと扇形理論を示すように郊外化していることが判明した.また, 1970年以降には1976年のマニラ大都市圏の範囲(National Capital Region)を越えた外周部の農村地域にも拡大郊外化しており,マニラ大都市圏内部と外周部を地区別にみると住民の所得階層区分ごとの居住がみられる地区も存在していことがわかった.以上のような成果を踏えて,昭和63年度は次のような研究を進める.1.マニラ大都市圏の郊外にも分布する貧困層であるスラム・スクオッターに関する分析を1948年1983年の期間について分析を行なう.2.本研究の最終年であるため, 1.に加えて本研究のまとめを行なう.本年度は本研究の最終年度であるため過去2年間の研究の整理とまとめを中心に行ってきた。マニラ大都市圏における人口の郊外化現象と貧困層の分布とは密接な関係があり、それを規定している要因として工業立地と商業立地とが重要であるが、発展途上国においては商業立地との関係の方がより深いものであることが明らかになってきた。

このような現象はバージェスの同心円理論とは異なり、発展途上国の都市における貧困層の分布は、推移地帯(Zoon of Transisiton)への集中ではなく、都市地域全域にわたって散在しているという状況である。この点は先進工業国と発展途上国の都市化のパターンの違いが反映されたものだと考えられるであろう。すなわち、発展途上国の都市化は必ずしも工業化と結びつかずに進行しているため、工業の分布との相関関係が低くなっているのである。それに対して、マニラ大都市圏の貧困層の多くが就労するインフォーマル・セクターの職が得やすい商業地域では、貧困層もその周辺に集住するという形態が見られるのである。すなわち、商業地域が郊外に移るにつれて、貧困層もそれを追うようにして郊外へと集中するという現象がみられるのである。このように貧困層の分布は、マニラ大都市圏の地域構造とひじょうに密接な関係にあることが明らかになった。
MOA II 1.8m望遠鏡による重力波天体の追観測

重力波検出器LIGOの最初本格運用O1終了を受け、重力波事象の追観測体制およびデータ解析法の見直しと改善を実施した。重力波のアラートは、ガンマ線バースト用のアラートシステムGCNから直接受け取る様にし、重力波検出後最短で20分以内に観測を開始できる様にした。また、O1の際には2分露出での浅い観測だったが、限界等級20等以上を達成するために、10分露出に変更した。また、小惑星などの移動天体と区別するために、同じ場所を時間をおいて2回以上観測することにした。データ解析は、画像同士の引き算と行う差分法を導入し、自動化を進め、観測後3日以内に結果が出る様にした。この結果、中性子星連星合体などによるキロノバなどの電磁波放出が継続している10日以内に、対応天体を特定してスペクトル観測などによる詳細な研究が可能となった。この手法に基いて、LIGOグループの第2の本格運用O2の観測を実施中である。O1の際には、他目的のサーベイ観測を含めて大量のデータを保有していたが、これらの解析をすべて終了した。その結果、O1のデータの中には候補天体は無いという結論になった。これは、O1で追観測を行った2個の事象が、いずれも電磁波放射が期待できないブラックホール連星の合体だったこととつじつまが合う。O1の観測結果については、日本天文学会の欧文誌PASJの論文2本に発表するとともに、日本天文学会年会や重力波研究会などで発表している。本研究終了後もLIGOグループの観測は継続している。また、VIRGOやKAGRAなどの新しい重力波検出器が稼働に向けて準備が進んでいる。新グループの参入によって位置決定精度が向上し、電磁放射を伴う事象が発生すれば、本研究で確立した手法に基いて重力波天体を同定できる。それに基づき、スペクトル観測が実施されれば、重元素の起源など宇宙の謎の解明が期待できる。28年度が最終年度であるため、記入しない。重力波の直接検出は、極限状態における重力理論の検証やブラックホールの形成過程を知る上で重要である。しかし、重力波検出のみでは重力波源を特定できず、物理パラメーターの不定性も大きい。このため、電磁波、特に可視光や赤外線等による追観測で重力波源を特定することが重要となる。本研究は、ニュージーランド・マウントジョン天文台の1.8m望遠鏡および61cm望遠鏡を使い、重力波が検出された事象の光学的な追観測を実施して、重力波を放出した天体を特定することを目指している。今年度は、LIGOが最終感度の1/3まで感度を上げ、9月から正式な観測を始めた。本研究では、この時期に合わせて追観測の準備を整え、観測に備えた。9月16日に、LIGOから重力波事象の候補を検出したとの情報が受け取り、61望遠鏡を使いLIGOのスカイマップの中から100Mpc以内の近傍銀河18個の追観測を実施した。この時点では、不確実性が高いと思われていたこの事象は、LIGOによるその後の解析で最初の重力波直接検出であることが明らかとなった。追観測の画像データから星のイメージを抽出し、既知の星と比較した結果、我々のデータからは候補天体を発見することができなかった。これは、LIGOのデータから得られた410Mpc離れた30太陽質量のブラックホール連星の合体という結果と矛盾しない。この事象(GW150914)の追観測については、J-GEMグループによる追観測の一環として論文を投稿中である。上記以外にも、大量のサーベイ観測を実施した。これらの中から、重力波源を発見すべく精力的に解析を進めている。当初の計画では、重力波の直接検出自体がまだ先で、そのためのハード・ソフト・観測体制を整備して、試験観測を実施する予定だった。9月の時点で、一応の観測体制を整え重力波アラートに備えるところまで準備した。実際に起きたことは、まったく想定外であり、本物の重力波検出が起きてしまった。アラートの配信なども、通常の方法とは違っていて判断が難しかったが、追観測を行うことに成功した。本物の重力波検出事象で追観測に成功したのは、予想外の進展である。この時点で、まだ解析プログラムは未整備で、すぐに結果が出せる状態ではなかったが、その後LIGOの正式発表(2月)までの間、解析を実施してプログラムを整備した。その結果、重力波源を特定するには至らなかったが、結果をまとめて論文を投稿できたのは、まったく予想外の成果である。この間に整備したプログラム等は、今後起きる事象の解析に有効に活用され、観測後早い時点で結果を出せる様になることが期待される。発見された事象は、当初予想されていた中性子星連星の合体ではなく、ブラックホール連星の合体だった。重力波源までの距離も、約400Mpcと当初の予想(< 100Mpc)よりかなり遠かった。このため、観測戦略の再構築を迫られたが、このことが分かったこと自体が大きな進展と言える。総じて、重力波天文学の幕開けを迎え、予想外の事態に直面したが、それらを乗り越えて追観測を実施し、結果をまとめることができた。これにより、将来起きる事象の追観測に展望が開けたといえる。

重力波のアラートは、ガンマ線バースト用のアラートシステムGCNから直接受け取る様にし、重力波検出後最短で20分以内に観測を開始できる様にした。また、O1の際には2分露出での浅い観測だったが、限界等級20等以上を達成するために、10分露出に変更した。また、小惑星などの移動天体と区別するために、同じ場所を時間をおいて2回以上観測することにした。データ解析は、画像同士の引き算と行う差分法を導入し、自動化を進め、観測後3日以内に結果が出る様にした。この結果、中性子星連星合体などによるキロノバなどの電磁波放出が継続している10日以内に、対応天体を特定してスペクトル観測などによる詳細な研究が可能となった。この手法に基いて、LIGOグループの第2の本格運用O2の観測を実施中である。O1の際には、他目的のサーベイ観測を含めて大量のデータを保有していたが、これらの解析をすべて終了した。その結果、O1のデータの中には候補天体は無いという結論になった。これは、O1で追観測を行った2個の事象が、いずれも電磁波放射が期待できないブラックホール連星の合体だったこととつじつまが合う。O1の観測結果については、日本天文学会の欧文誌PASJの論文2本に発表するとともに、日本天文学会年会や重力波研究会などで発表している。本研究終了後もLIGOグループの観測は継続している。また、VIRGOやKAGRAなどの新しい重力波検出器が稼働に向けて準備が進んでいる。新グループの参入によって位置決定精度が向上し、電磁放射を伴う事象が発生すれば、本研究で確立した手法に基いて重力波天体を同定できる。それに基づき、スペクトル観測が実施されれば、重元素の起源など宇宙の謎の解明が期待できる。今回の事象(GW150914)により、重力波源の多くは近傍(< 100Mpc)の中性子星連星の合体ではなく、遠方で起きるブラックホール連星の合体である可能性が高いことが判明した。従来は、中性子星連星の合体を想定して、近傍銀河を個別に観測する戦略を中心に実施する予定だった。しかし、100Mpc以上の距離の有効な銀河カタログは現時点では無いので、この戦略は変更を迫られる。当面考えられる方法は、アラートを受け取った後、ただちに広視野の1.8m望遠鏡によるサーベイ観測を実施することである。広域サーベイとなるので、膨大な星の中から重力波源を特定することになるので、解析はより困難となる。GW150914を含めたLIGO O1の期間の事象に対する、1.8m望遠鏡によるサーベイ観測も行っており、すでに大量のサーベイデータを保有している。現在、これらのデータの解析を進めている。これにより、膨大な星の中から変光天体や超新星、移動天体などを除いて重力波源を特定する手法を確立することができると考えている。J-GEMの中には、ガンマ線バーストの専門家のほかにも超新星や小惑星の専門家が入っており、こうした専門家の助言などを受けて、解析手法を確立する。また、今後大口径望遠鏡によるスペクトル解析を実施する必要性が高まることが予想される。このためには、リアルタイム解析によって、早い時期に重力波源の位置を特定する必要がある。このため、グリッド技術などを利用した解析の高速化を行う。今年(2016年)8月には、新しいLIGOの観測期間O2が始まる。
生体膜によるDNA修復制御機構の研究

プロカインやクロルプロマジン(CPZ)などの薬剤は細菌などの細胞膜に特異的に結合し、膜の構造・機能変化を引き起こす。我々は、この薬剤の性質を利用して、DNA修復の過程に膜が関与しているかどうかを検討した。その結果、UV照射後の大腸菌の除去修復がプロカインやCPZあるいはフェネチルアルコ-ル(PEA)の添加によって阻害されること、PEAはDNA-膜結合を解離させ、除去修復の最初のステップであるincisionを阻害するのに対して、プロカインにはこれらの作用はなく、ただし、修復合成のステップを阻害することが分かった。CPZは、用いた膜作用試薬のなかでも最も低い濃度で修復阻害が現れた。これらの阻害の構造、とくに膜に結合している修復因子が何であるのかについてはまだ解明できていないが、CPZには強い細胞呼吸に対する阻害効果が観察できた。熱処理(大腸菌を48°Cで処理)もCPZと同様に呼吸の阻害(CN抵抗性呼吸の割合が増大)を引き起こす。この呼吸能低下が修復に必要なエネルギ-の産生を抑制したことも原因の1つとして考えられる。一方、呼吸の阻害は正常な電子伝達系を乱し、O_2-を発生させることが示唆されている。そこで、大腸菌のsodAおよびnfo遺伝子の発現(O_2-誘導性)をこれらの遺伝子とlacZとの融合遺伝子を作製して調べた。その結果、CPZやプロカインを添加すると、その濃度に依存してβ-ガラクトシダ-ゼ(lacZの産物)の合成増大が見られた。また、SOD酵素活性が実際に増大することも活性電気泳動法で確認した。これらの応答には、酸素の存在が必須であった。また、CPZには強い蛋白質合成に対する阻害効果があり、除去修復酵素の誘導が抑制されることも修復阻害の原因と考えられたが、CPZやプロカインのこの作用はrecA変異株でも観察できたので、除去修復阻害は修復酵素誘導の低下が主因ではないことが分かった。
上場企業の現代的課題に対応した企業法制の検討

本研究では、上場企業をめぐる現代的課題を明らかにするとともに、同課題を踏まえた望ましい企業法制のあり方について探求する。上場企業またはその株主が今日直面している状況のうち、特に重要性が高いものとして、1株主の機関化の進展と2MBOや締出しなどによる退出リスクの高まりを取り上げ、12に伴い生じうる法的問題を分析・検討するとともに、企業価値または株主価値の向上という観点から制度改善の提言を試みる。
若年世代からの生活習慣病予防に向けた分子疫学的アプローチ

メタボリック症候群の概念の普及とともに、生活習慣病予防の重要性がクローズアップされてきている。生活習慣病の進展による血管病変=動脈硬化は、心血管病変の原因として極めて重要であるが、その進行は幼少時、若年時からすでにはじまっていることが近年の研究から明らかにされてきており、若年世代からの動脈硬化の予防が今後ますます重要になってくると考えられる。その一方で、若年世代における食生活の乱れや運動不足に伴う肥満割合の増加が大きく取り上げられるなど、この世代における栄養状況の改善を通じた、生活習慣病の予防が重要課題となっている。そこで本申請では、日本人若年者を対象として動脈硬化関連因子について分子疫学的調査を行い、エビデンスに基づいた若年時からの栄養指導、保健指導による生活習慣病の予防を行った。対象者の身長、体重に加えて体組成計を用いて体脂肪率、筋肉量、推定骨量、さらに基礎代謝量、腹囲の測定を行い、空腹時採血を行い、赤血球、血漿、血清を分離し、レプチン・アディポネクチンといったアディポサイトカインやグレリン等の測定を行った。さらに超音波検査によって頸動脈内膜中膜複合体厚を、さらに血圧脈波装置によって心臓足首血管指数と血圧の測定を行い、一日度運動活動量についても加速度計を用いて評価を行った。その結果、血清中のレプチン・アディポネクチン比は他の関連因子と独立して頸動脈内膜中膜複合体厚と有意に相関することが明らかになり、またグレリンは運動活動量に関連することが明らかになった。以上より、これらの指標が今後の若年者における動脈硬化の指標として有用であることが示唆された。そこで本申請では、日本人若年者を対象として赤血球中葉酸及び遺伝子多型を含めた動脈硬化関連因子について分子疫学的調査を行い、エビデンスに基づいた若年時からの栄養指導、保健指導による生活習慣病の予防を目指す。すでに対象者の身長、体重に加えて体組成計を用いて体脂肪率、筋肉量、推定骨量、さらに基礎代謝量、腹囲の測定を行い、空腹時採血を行い、赤血球、血漿、血清を分離し、保存を開始している。また超音波検査によって頸動脈内膜中膜複合体厚を、さらに血圧脈波装置によって心臓足首血管指数と血圧の測定を行っている。一方、得られた赤血球を用いて赤血球中葉酸濃度を測定するため、赤血球を分離の上、測定のために米国に送付し、得られた結果を解析予定である。次年度はさらに遺伝子多型等の解析をすすめ、総合的な若年者における生活習慣病予防に向けた分子疫学的アプローチを行う予定である。

対象者の身長、体重に加えて体組成計を用いて体脂肪率、筋肉量、推定骨量、さらに基礎代謝量、腹囲の測定を行い、空腹時採血を行い、赤血球、血漿、血清を分離し、レプチン・アディポネクチンといったアディポサイトカインやグレリン等の測定を行った。さらに超音波検査によって頸動脈内膜中膜複合体厚を、さらに血圧脈波装置によって心臓足首血管指数と血圧の測定を行い、一日度運動活動量についても加速度計を用いて評価を行った。その結果、血清中のレプチン・アディポネクチン比は他の関連因子と独立して頸動脈内膜中膜複合体厚と有意に相関することが明らかになり、またグレリンは運動活動量に関連することが明らかになった。以上より、これらの指標が今後の若年者における動脈硬化の指標として有用であることが示唆された。
最大級のイオン濃度勾配を形成する胃プロトンポンプ作動機構の解明

胃プロトンポンプは胃酸分泌を担う膜タンパク質であり、故に胃酸抑制剤のターゲット分子である。本研究課題では、胃プロトンポンプを対象とした、電子線結晶学による立体構造解析、及び変異体による機能解析や高分解能構造解析を見据えた哺乳動物細胞発現系の構築を行った。胃酸抑制剤結合状態における構造を6.5Åで決定し、変異体及び胃酸抑制剤の類縁化合物を組み合わせた機能解析と併せて、胃酸抑制剤の結合部位を推定した。哺乳動物細胞による大量発現系を構築し、三次元結晶を得ることに成功した。X線結晶構造解析によって、H+を胃の中に輸送するメカニズムが理解できた。膜輸送体の中でも最大級のイオン(プロトン)濃度勾配を形成できる胃プロトンポンプの作動機構の理解の為に、本年度は以下の項目についての成果が得られた。(1)イオン輸送サイクルの構造解析E2P状態におけるいくつかの構造を電子線結晶学によって決定し、これまで報告した他の構造と合わせて分子のコンフォメーションを体系的に比較することで、E2P状態において引き起こされる重要なイベントである、胃管倥へのイオンのゲーティングに必要なメカニズムを明らかにした(Abe et al., 2014 J. Biol. Chem.)。(2)プロトンポンプ組み替え体発現系の構築哺乳動物細胞を用いた発現系の構築に成功した。いくつかの変異体による機能解析を進めている。膜輸送体の中でも最大級のイオン(プロトン)濃度勾配を形成できる胃プロトンポンプの作動機構の理解の為に、本年度は以下の成果が得られた。(1)高親和性胃酸抑制剤結合構造:電子線結晶学により、胃酸抑制剤結合構造を解析し、以前よりも改善された6.5A分解能による解析を行い、立体構造を得ることができた。胃酸抑制剤非存在下の構造と比較することで、胃酸抑制剤の結合による構造変化を同定した。具体的には、胃酸抑制剤の結合に伴い、M3M4ヘリックスが外側に開き、これと連動してM1M2ヘリックスが阻害剤結合サイトに近づくという、TMヘリックスの再配向が明らかになった。(2)胃酸抑制剤の結合状態に関する解析:上記(1)よりホモロジーモデルを作成し、変異体による胃酸抑制剤結合部位の検証を行った。構造変化を加味して作成したドッキングモデルにおいて、TMヘリックス2が結合している胃酸抑制剤に非常に近いことが示唆された。そこで、この部位に系統的変異導入を行い、胃酸抑制剤の結合親和性に対する影響を検討した。TM2の片側に分布するアミノ酸(D137, N138)への変異導入によって、野生型と比較して20倍以上の親和性の減少を示した。これら変異導入による影響は、過去に報告された胃酸抑制剤の結合に関与すると考えられるアミノ酸の変異と同程度に多きなものであり、M2ヘリックスが胃酸抑制剤の結合に関与することが、機能的に検証された。(3)哺乳動物細胞による大量発現系の構築:発現量やスケールを改良し、精製条件を最適化した。最終精製タンパク質は0.2 mg/1L culture程度の収率を与える。大量発現ー精製系の構築に成功した為。胃酸抑制剤の結合構造に基づいた結合モデルが、変異体解析によって検証されつつあり、概ね正しいことが予想される為。生命の根幹である物質不均衡を形成する能動輸送体の中でも、ヒト組織において最大のカチオン濃度勾配を達成することができる胃プロトンポンプを研究対象とした。この分子の作動機構理解の為、反応中間体の構造を明らかにすること、得られた構造情報を検証する為の変異体発現系およびクリーンバイオケミストリーを実践する為の精製系の確立を目指した。電子線結晶学により、E2P状態におけるいくつかのsub-stateの構造解析に成功し、胃内腔へ向けたプロトンの排出及びカリウムイオンの取り込みに必要なゲーティングの為の構造変化を理解した(2014 J. Biol. Chem.)。また、胃酸抑制剤のプロトタイプ化合物が結合した構造を以前より高い分解能(6.5Å)で解析した。この構造から得られた情報に基づいた変異体の解析により、胃酸抑制剤との相互作用に重要なアミノ酸を同定した(論文投稿中)。さらに、本研究課題で確立した動物細胞による大量発現精製系の確立に成功し、高分解能構造解析への見通しが立ったので、研究最終年度の前年度において他の研究課題に切り替えて研究を推進する。イオン輸送サイクルの構造解析を進めることができた。発現系の構築も順調に進んでいる。高分解能構造解析については、これまでで最も分解能の高い立体構造が得られているが、さらに分解能を亢進する為に引き続き研究を推進する。高分解能構造解析を推進する。組み替え体を用いた構造研究を展開する。

胃酸抑制剤の結合状態の検証をさらに推進し、合成した類縁化合物による結合状態の特定を目指す。膜輸送体28年度が最終年度であるため、記入しない。イオン輸送サイクルの構造解析では、E1, E2状態の構造解析を目指す。胃酸抑制剤の結合した構造によって高分解能化を進めているが、得られた構造情報に基づいて、変異体や類縁化合物を用いた阻害剤結合様式の同定を進める。大量発現系の構築、及びクリーンバイオケミストリーの実現に向けた安定な再構成系の確立を目指す。大量発現系の維持の為に、インキュベーターが必要であるが、これが高額である為に次年度への経費の繰り越しが必要となった。28年度が最終年度であるため、記入しない。前年度に計画していた昆虫細胞による発現系の構築が、早い段階で全く役に立たないとこが判明したので、哺乳動物を用いた発現系を利用することにした為。CO2インキュベーターの購入に充てる予定である。予定していた昆虫細胞発現系に係る予算を、哺乳動物培養関連品に充てる予定である。昆虫細胞よりも必要な消耗品が高額であり、また初期投資として培養器具や消耗品に使用する予定である。