hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多孔性ガス分離膜における分子充填透過機構の解明とサブナノ膜細孔径分布評価への応用

1.凝縮性ガス透過シミュレーションによるマイクロ孔充填・透過機構の検討非平衡分子動力学法を用いて凝縮性ガス(エタン)の透過シミュレーションを行ったところ,マイクロ孔充填相の形成による透過速度の低下が見られ,その際の圧力は細孔径が大きい方が高くなった.また,透過分子の蒸発エネルギーと吸着エネルギーを用いてマイクロ孔充填相の移動モデルを構築し,細孔径分布を考慮して数値シミュレーションを行ったところ,透過分子と膜細孔表面との相互作用および細孔径分布に由来する透過速度の減少傾向が良好に再現され,分子充填相透過現象を利用したサブナノ細孔径分布評価の理論的妥当性が示された.2.凝縮性ガスの膜材料表面との相互作用エネルギーの評価膜材料のシリカコロイドゾルを乾燥させ,1000°Cで焼成して作成した非多孔性粉体試料における標準凝縮性ガス(エタン,プロパン,ブタン)の吸着等温線を測定し,Frenkel吸着理論を用いて各ガスとシリカ材料との相互作用パラメータを求めた.シリンダー状の細孔形状を仮定することにより,非多孔性固体表面との相互作用パラメータを基準として,細孔内ポテンシャル場の細孔径依存性を得る手法を確立した.3.膜細孔径分布評価法の妥当性の検討平均細孔径が異なる3種類の実在多孔性シリカ膜において,標準凝縮性ガスの透過速度の圧力依存性を測定した.標準凝縮性ガスの細孔内ポテンシャルと細孔径の関係および吸着ポテンシャル理論を用いて,透過速度の圧力依存性を透過速度と細孔径の関係に換算することにより,ガス透過に有効な細孔径分布を推算可能であった.どの凝縮性ガスを標準ガスとして用いてもそれぞれの膜について同様な細孔径分布が得られ,また,透過速度の分子サイズ依存性から予測された細孔径との定量的な一致も見られ,マイクロ孔充填相透過モデルを利用したサブナノ膜細孔径分布評価法の妥当性が示唆された.1.多孔性シリカ膜における凝縮性ガスの透過係数の圧力依存性平均細孔径45Å程度と考えられるアモルファスシリカ膜をゾルゲル法により作成し,エタン・プロパンガスについて,透過係数の温度依存性よりポテンシャル場を考慮したガス状透過モデルにより細孔内ポテンシャル場を評価し,吸着ポテンシャル理論により,各ガスについてマイクロ孔充填相が形成される気相圧力を推算した.臨界温度以下ではどちらのガスに関しても透過係数の圧力依存性はほとんど見られなかったが,臨界温度よりも低い温度においては,予測されたマイクロ孔充填相形成圧力付近においてエタンの透過係数は大きく減少した.また,プロパンの透過係数は予測された圧力よりも若干低い圧力で透過係数の減少傾向が観測され細孔径分布の影響が示唆された.2.単成分凝縮性ガスの透過特性と凝縮性/非凝縮性2成分混合ガス透過特性の比較凝縮性ガス(エタン)と非凝縮性ガス(窒素)の2成分混合ガスについて,エタンの臨界温度以上(70°C)と以下(35°C)における透過実験を混合比を変えながら行い,凝縮性ガスのマイクロ孔充填相形成による非凝縮性ガスの透過ブロッキング効果を確認した.70°Cでは純ガス時の透過係数に等しく,相互に透過に影響を及ぼし合わないガス状態の透過・分離でが行われたが,35°Cにおいてはエタンの透過係数は純エタン透過時とほぼ同様な圧力依存性を示したのに対して,窒素は比較的エタン分圧の低い条件下でも透過係数の低下が見られ,マイクロ孔充填相形成のみならず,微量なエタンが存在することにより窒素の透過が阻害されたことが示された.3.分子動力学法による凝縮性ガス透過シミュレーションを用いたマイクロ孔充填・透過機構の検討非平衡分子動力学法を用いた理想系における凝縮性ガスの透過シミュレーションを行い,透過分子間および細孔表面との相互作用が分子の透過にどのように影響するかを検討した.細孔表面との親和性が大きくなると臨界温度以上の高温域では透過量は多くなり,臨界温度近傍およびそれ以下の温度では透過量の減少が見られた.透過分子間の相互作用が大きくなると,ガス状態での透過には影響が無く,一方,臨界温度以下では透過係数が減少し,これは平均自乗変位から計算された一次元拡散係数が低下した事からも明かであった.これらの結果は,液相に近い高密度なマイクロ孔充填相の形成によってマイクロ孔内の透過分子の移動度が低下したことを示している.1.凝縮性ガス透過シミュレーションによるマイクロ孔充填・透過機構の検討非平衡分子動力学法を用いて凝縮性ガス(エタン)の透過シミュレーションを行ったところ,マイクロ孔充填相の形成による透過速度の低下が見られ,その際の圧力は細孔径が大きい方が高くなった.また,透過分子の蒸発エネルギーと吸着エネルギーを用いてマイクロ孔充填相の移動モデルを構築し,細孔径分布を考慮して数値シミュレーションを行ったところ,透過分子と膜細孔表面との相互作用および細孔径分布に由来する透過速度の減少傾向が良好に再現され,分子充填相透過現象を利用したサブナノ細孔径分布評価の理論的妥当性が示された.2.凝縮性ガスの膜材料表面との相互作用エネルギーの評価膜材料のシリカコロイドゾルを乾燥させ,1000°Cで焼成して作成した非多孔性粉体試料における標準凝縮性ガス(エタン,プロパン,ブタン)の吸着等温線を測定し,Frenkel吸着理論を用いて各ガスとシリカ材料との相互作用パラメータを求めた.シリンダー状の細孔形状を仮定することにより,非多孔性固体表面との相互作用パラメータを基準として,細孔内ポテンシャル場の細孔径依存性を得る手法を確立した.3.膜細孔径分布評価法の妥当性の検討

平均細孔径が異なる3種類の実在多孔性シリカ膜において,標準凝縮性ガスの透過速度の圧力依存性を測定した.標準凝縮性ガスの細孔内ポテンシャルと細孔径の関係および吸着ポテンシャル理論を用いて,透過速度の圧力依存性を透過速度と細孔径の関係に換算することにより,ガス透過に有効な細孔径分布を推算可能であった.どの凝縮性ガスを標準ガスとして用いてもそれぞれの膜について同様な細孔径分布が得られ,また,透過速度の分子サイズ依存性から予測された細孔径との定量的な一致も見られ,マイクロ孔充填相透過モデルを利用したサブナノ膜細孔径分布評価法の妥当性が示唆された.
骨格筋のインスリンシグナルに及ぼす視床下部方交感神経系の調節機構とその分子機構

本研究により、自発的な甘味飲料の摂取が、視床下部オレキシン・ニューロンを活性化し、視床下部腹内側核-交感神経-β2アドレナリン受容体経路を介して骨格筋でのグルコース代謝を促進することが明らかとなった。上記経路を介したオレキシンシステムは、味覚刺激を伴う報酬作用により賦活化し、骨格筋における糖代謝を調節することで、生体内の恒常性を巧みに維持および制御すると考えられ、同時に、この経路の破綻は、肥満や糖尿病の形成につながる可能性がある。低容量のオレキシンA(5pmol)を視床下部腹内側核(VMH)に投与すると、交感神経系の活性化を伴って、骨格筋において顕著にグルコースの取り込みが上昇し、同時に、骨格筋では、PI-3K活性、AktおよびAS160のリン酸化が増強していた。しかし、インスリン受容体のリン酸化に変化は無かった。また、血糖値、血漿インスリン濃度、血漿エピネフリン濃度、摂食量および運動量に変化は無かった。オレキシンによるグルコース取り込み促進作用は、アドレナリンβ受容体ノックアウトマウスでは起こらなかったが、electropolation法によりβ2受容体を骨格筋に発現させると、オレキシンの作用が回復した。さらに、マウス脳スライス標本を用いて電気生理学的な検討を行ったところ、オレキシンは多くのVMHニューロンを興奮させることが分かった。一方、マウスに自発的にサッカリン溶液を摂取させると、インスリンによる骨格筋でのグルコース取り込み作用が増強した。また、サッカリンによるグルコースの取り込み促進作用は、オレキシン受容体拮抗薬をVMHに投与、あるいはβ2アドレナリン受容体拮抗薬の全身投与により低下した。さらに、サッカリンの摂取によりオレキシン・ニューロンにおいてc-Fosの発現が有意に増加した。本研究により、甘味刺激は、視床下部オレキシン・ニューロンを活性化し、VMH-交感神経-β2アドレナリン受容体経路を介して骨格筋でのグルコースの取り込みを促進することが明らかとなった。またその作用は、PI3K、Akt、AS160のシグナル分子を介する可能性が高い。オレキシンAを視床下部腹内側核(VMH)に投与すると、骨格筋に分布する交感神経活性が上昇したのに加え、骨格筋でのPI3-kinase以降のインスリンシグナルを活性化するとともに、骨格筋におけるグルコースの取り込みが上昇した。同時に、インスリンによる骨格筋でのグリコーゲン合成酵素活性が上昇し、グリコーゲン合成速度が増加した。これらのオレキシン作用は、動機づけ行動による自発的な甘味飲料の摂取に起因するオレキシン・ニューロンの活性化を伴った場合にも認められた。オレキシンによるグルコース取り込みおよびグリコーゲン合成促進作用は、アドレナリンβ受容体ノックアウト(β-less)マウスでは起こらなかった。Electroporation法により骨格筋特異的プロモーターであるHSA-promoterを用いてβ2受容体をβ-lessマウスの骨格筋に発現させると、オレキシンによるグルコース取込み促進作用が回復したが、グリコーゲン合成促進作用は回復しなかった。そこで、非特異的プロモーターであるCAG-promoterを用いて標的骨格筋周辺にβ2受容体を発現させると、オレキシンによるグリコーゲン合成促進作用が回復した。組織学的にGFP発現を調べると、どちらのプロモーターを用いた場合でも骨格筋細胞においてGFPの発現は認められたが、CAG-prolnoterを用いた場合では血管壁においてもGFPの発現が見られたのに対し、HSA-promoterを用いた場合では見られなかった。本研究により、自発的な甘味摂取が、視床下部オレキシン・ニューロンを活性化し、VMH-交感神経-β2アドレナリン受容体経路を介して骨格筋でのグルコース代謝を促進することが明らかとなった。また、この作用には、骨格筋およびその周辺に分布する血管壁におけるβ2アドレナリン受容体を必要とすることが示唆される。
体細胞を用いた新しい個体作出法に関する基礎的研究

マウス未受精卵細胞質中には,体細胞核を初期化する因子が含まれていると考えられるが,人為的に活性化処理を施すと,この初期化作用は消失する。そこで,活性化処理を付与した卵子と付与していない卵子との間で,発現している遺伝子の差違を調べるため,differential display法を試みた。まず,予備実験として,マウス細胞に有効なDifferential display法のプライマーについて検討した。3種類のoligo-d(T)primerを用いて,cDNAを合成し,PCRでは20種類の任意プライマーを用い,マウス細胞で増幅しやすいものを選別した。また,RIを用いる実験系と非RIの実験系でDNAフラグメントの検出程度を比較した。その結果,非RI系の実験系においても比較できる程度の検出が可能であることが明らかとなった。また,できる限り細胞数を少なくして解析するため,卵子数の検討を行ったところ,10個程度であれば,比較できるプライマーの組み合わせが20組程度できることが明らかとなった。胎子期生殖細胞ならびに体細胞を用いて,未受精卵を用いた核移植実験系を確立した。確立した未受精卵への核移植技術を用いて,初期化因子を含む卵細胞質と,消失したと考えられる卵細胞質を作出することに成功した。また,卵細胞質を多量に回収し,卵細胞質中に含まれる因子を回収後,消失した卵細胞質に注入する実験を行なったが,現在までのところ,消失した卵子に初期化因子を復活させるには至っていない。卵細胞質因子の回収方法や濃縮方法をさらに検討する必要があると考えられた。マウス卵子よりmRNAの採取を試みたが,サンプルサイズが小さく,効率が悪いため,今後,採取方法,動物種等のさらなる改善が必要と考えられた。すなわち,マウス数百匹に過剰排卵処理を施し,未受精卵を回収後,mRNAを採取したが,回収できたmRNAは極めて微量であり,一回の採取でdifferential displayやマイクロインジェクション等の実験を繰り返し行なうことは困難であると考えられた。そのため,回収した卵子のmRNAを効率良く使用するため,まずは,予備実験として,マウスの培養細胞を用いて,バンド数が比較的多数出現するdifferential display用プライマーのスクリーニングを行なった。来年度は,予備実験で選別したプライマーを用いて初期化因子を保有するものと消失したマウス卵細胞質間で,differential displayを行なうと共に,より回収効率の良いmRNA回収方法を検討する予定である。
胚性がん細胞を用いた中枢ニューロンの分化機構の解析

神経分化させた胚性がん細胞からクローン化したnecdin遺伝子の発現調節機構とnecdinの作用を検討した。クローン化したnecdin遺伝子の5′上流領域の欠失変異を作製し、それにレポーター遺伝子を連結して、神経分化特異的配列を明らかにした。その結果、necdin遺伝子の5′上流領域には典型的なTATAボックスやCAAT配列は認められなかったが、ショウジョウバエの神経発生に重要な転写因子であるsingle-minded(SIM)遺伝子と結合する可能性のあるxenobiotic responsiveelementを含むpostmotitic neuron specific elementが存在することを明らかにした。次に、そのプロモーターがin vivo状態で活性を示すか否かをゼブラフィシュ胚の発生系で検討した。necdinのプロモーター調節領域にレポーター遺伝子を連結したベクターを受精卵に微量注入して発生を進行させたところ、分化したニューロンに特異的に発現した。一方、necdinの生理機能を調べるため、necdin cDNAを発現誘導性ベクターに挿入してNIH3T3細胞に安定的に遺伝子を導入した。遺伝子導入細胞を誘導物質で発現を活性化したところ、細胞分裂を停止させることが判った。細胞内発現したnecdinは細胞核に集積していた。これらの結果、necdin遺伝子は分化した神経細胞に特異的に発現する遺伝子発現調節領域をもっていること、さらに、necdinは細胞分裂に抑制的に作用し、分化ニューロンの最も基本的な形質である分裂終了機構に関与しているものと推定される。
αシヌクレインのクリアランスを基盤とした神経変性疾患治療薬の創出

α-シヌクレイン(α-syn)は神経細胞内に蓄積することや、細胞外に放出されたα-synがミクログリアに作用することで脳内の炎症を惹起することが報告されている。本研究ではパーキンソン病原因遺伝子の1つであるDJ-1がα-synによって引き起こされる細胞応答に対してどのような作用をもつか調べた。その結果、神経細胞内においてはDJ-1の欠損によりα-synの細胞内凝集が増加することが判明した。ミクログリアにおいては、DJ-1への結合が予測される化合物が炎症応答を減弱させることを見出した。このことから、DJ-1はα-synにより引き起こされる神経変性に対しての治療標的となり得ることが示唆された。パーキンソン病をはじめとしたシヌクレオパチーはαシヌクレイン(α-syn)の凝集・蓄積を主徴とする疾患である。本研究ではα-synのクリアランスにパーキンソン病原因遺伝子DJ-1が関わることを想定して以下の項目に取り組んだ。1.神経細胞内のα-syn分解機構の探索:神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いて細胞内のα-syn分解に対するDJ-1の機能を調べた。α-synをコードするSNCA遺伝子をSH-SY5Y細胞に強制発現させた後、繊維状α-synを処置すると細胞内にα-synの凝集が確認される。SH-SY5Y細胞に対してDJ-1をノックダウンさせるとα-syn凝集の著明な増加が確認できたことから、DJ-1が細胞内でα-synの分解に関与することが示唆された。2.ミクリグリアによるα-synの取り込みに対するDJ-1の機能解析:ミクログリアがα-synを取り込むという既報をもとに検討を行った。マウスミクログリア細胞株BV-2細胞に対しリコンビナントヒトα-synを処置した結果、α-synの取り込みを確認することができなかった。3. α-synによるミクログリアの活性化に対するDJ-1の抗炎症効果の検証:α-synオリゴマーがミクリグリア細胞膜上のToll様受容体2(TLR2)を介して炎症を誘導することが報告されている。今年度はTLR2リガンドであるペプチドグリカンでミクログリアを刺激した結果、炎症性サイトカインのmRNAレベルが増加した。これに対してDJ-1のノックダウンを行うと炎症性サイトカインのmRNAレベルが有意に増強された。上記のように本年度は神経細胞およびミクログリアの細胞株を用いてα-synの分解やα-synによる炎症の誘導に対するDJ-1の関与を見出してきた。本年度は研究計画に従って、in vitro細胞培養系を用いてα-シヌクレイン(α-syn)とDJ-1の関係に関する研究に取り組んだ。神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞を用いた検討の結果、DJ-1がα-synの凝集・分解に関係することを見出した。また、マウスミクログリア細胞株であるBV-2細胞に対してTLR2リガンドであるペプチドグリカン(PGN)を処置して炎症を誘導した際にDJ-1が炎症応答抑制的に働くことを見出した。昨年度に引き続き以下の項目に取り組んだ。1.神経細胞内のα-シヌクレイン(α-syn)分解機構の探索:ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に対して、α-synをコードするSNCA遺伝子を強制発現させた後、α-syn preformed fibrils (pffs)を処置すると細胞内にα-synの凝集が確認される。これに対してDJ-1をノックダウンさせるとα-syn凝集の著明な増加が確認できたことから、DJ-1が細胞内でα-synの分解に関与することが示唆された。さらに、DJ-1と細胞内タンパク質分解系(特にオートファジー)の関与が近年明らかにされていることから、オートファジー関連マーカーのタンパク質発現量を調べたところ、DJ-1ノックダウンによりオートファジーに変調をきたすことが示唆された。2. α-synによるミクログリアの活性化に対するDJ-1結合化合物の抗炎症効果の検証:α-synオリゴマーがミクリグリア細胞膜上のToll様受容体2 (TLR2)を介して炎症を誘導することが報告されている。昨年度はTLR2リガンドであるペプチドグリカン(PGN)でミクログリアを刺激すると炎症性サイトカインのmRNAレベルが増加することを見出した。過去に我々の研究グループではDJ-1に結合し作用を表す化合物を見出しており、これがミクログリアにおけるPGN誘発性の炎症反応に対し抑制作用を持つか調べた。その結果、DJ-1結合化合物の前処置により、PGNによって誘導される炎症性サイトカインmRNAの増加が抑制されることが分かった。さらに、炎症性シグナル伝達において重要な転写因子であるNF-κBの核内移行を抑制することも見出された。以上の結果により、DJ-1は神経細胞内でのα-syn蓄積およびα-synによるミクログリアでの炎症誘導いずれにおいても治療標的となりうることが示唆された。

このことから、DJ-1はα-synにより引き起こされる神経変性に対しての治療標的となり得ることが示唆された。本年度は昨年度のin vitroの実験系に加えて、in vivoの実験系を加えた以下の4項目について検討を行う。1.神経細胞内のαシヌクレイン(α-syn)分解機構の探索:ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いた前年度の結果(α-synの細胞内凝集に対してDJ-1が抑制的に働くこと)に関して、詳細なメカニズの解析を行う。なお、DJ-1のノックダウンによりオートファジーマーカーであるLC3タンパク質の局在が変化することを見出していることから、オートファジーに着目した解析を行う。2.ミクリグリアによるα-synの取り込みに対するDJ-1の機能解析:昨年度はマウスミクログリア細胞株BV-2細胞に対してリコンビナントヒトα-synを処置しても取り込みを確認できなかったため、実験系を確立したのちDJ-1の関与を明らかにする。なお、BV-2細胞で既報と同様の結果が得られない場合にはラット初代培養ミクログリアを用いて検討する。3. α-synによるミクログリアの活性化に対するDJ-1の抗炎症効果の検証:TLR2リガンドであるペプチドグリカンをBV-2細胞に対して処置した際に誘導される炎症応答に対してDJ-1が抑制的に機能することを見出した。本年度はα-synによる炎症誘導に対してもDJ-1が抑制的に機能するか、また、DJ-1に作用する薬物が炎症応答を抑制するか検討する。(4)in vivoにおけるα-synクリアランスに対するDJ-1の機能解析:ラット脳内にα-synオリゴマーを注入することでα-synの凝集が起こるモデルが報告されている。このモデルに対してDJ-1を欠損させたときあるいはDJ-1に作用する薬物を投与したときにα-synの凝集・沈着が抑制されるか検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。薬理学、神経科学、神経免疫学29年度が最終年度であるため、記入しない。
長時間作用性β２刺激薬による気道粘液分泌亢進と気道クリアランス障害の分子病態

マウス気管上皮細胞におけるDNA合成およびタンパク合成を測定した実験系では,サルメテロールの存在下で濃度依存的に増加し,β2受容体アンタゴニストにより完全に抑制された.また,サルメテロール刺激は上皮細胞EGFRのリン酸化とMUC5AC発現を誘導し,これらの反応はEGFRチロシンリン酸化阻害薬やH-Rasのdominant negative mutantにより有意に抑制されたことより,上記の細胞内シグナル伝達におけるRas-ERKの関与が示唆された.さらに,サルメテロールはマウス気管粘膜における粘液線毛輸送速度や線毛運動周波数を増加させ,気道クリアランスの賦活作用を有することも明らかとなった.1.気道上皮細胞の増殖およびムチン分泌反応(in vitro):マウス気管粘膜上皮細胞を短時間作用性β2刺激薬であるサルメテロール存在下で培養し,タンパク合成とDNA合成を測定した.その結果, [3H]-thymidineと[3H]-leucineの取り込みはいずれも濃度依存的に増加した.また,サルメテロール刺激によるMAC5AC mRNA発現をRT-PCRとNorthern blotにて評価すると,かかるムチン遺伝子の発現が誘導された.さらに,上記のいずれの効果もICI-118551の前投与により消失したことより,気道上皮細胞β2受容体の活性化を介していることが明らかとなった.2.ERK活性化の評価(in vitro):サルブタモール刺激の後,ERK(非活性型)とリン酸化ERK(活性型)のそれぞれのモノクローナル抗体を用いた免疫染色を施すとともに, Western blotを行った.その結果,この短時間作用性β2刺激薬はリン酸化ERKの発現を惹起し,さらにphenyulmethyl sulfonylfluorideの存在下で測定したERK活性も濃度依存的に上昇した.3.アダプター分子の会合(in vitro):EGFRとGrb2関連蛋白のイムノブロット解析を行い,サルメテロールによるEGFRのリン酸化以降の細胞内シグナル,特にRas-ERKカスケードの関与について検討した.サルメテロール刺激はEGFRおよびShcの発現を誘導することが判明し,Shcのリン酸化は特異的HB-EGFブロッカーである[Glu52]diphtheria toxinによって有意に抑制された.さらに,HB-EGFの産生は1,10-phenanthrolineにより消失した.したがって,本実験系系のシグナル伝達においては,蛋白分解酵素によるHB-EGFのsheddingの関与の関与が推測された.1.気道上皮細胞の線毛運動周波数:マウス気管上皮培養細胞をローズチェンバーにマウントし,微分干渉装置付顕微鏡の保温ステージに設置した.線毛部分の画像は,CCDカメラにて70枚/秒で連続撮影したものを解析装置に取り込み,線毛運動によって光が遮られて生ずる輝度変化をフーリエ変換し線毛運動周波数(CBF)を得た.その結果,サルメテロールはCBFを急速,かつ濃度依存的に増加させ,最大反応の50%を惹起するのに必要なサルメテロール濃度(EC50)は2.4±0.7nMであった.また,以上のは特異的β2受容体アンタゴニストであるICI-118551およびcAMP阻害薬であるRp-cAMPSの前処置により完全に消失した.さらに,気管培養上皮細胞における細胞内cAMP量を[3H]-cAMPを用いたRIA法により測定した結果,非刺激下に比較して,サルメテロールを添加しインキュベートすることによりcAMP濃度はサルメテロールの濃度依存的に増加した.2.粘液線毛輸送および気道クリアランス:マウスを麻酔しレスピラータに装着した後,気管全面を横切開した.次いで,露出させた膜様部粘膜表面の気管分岐部より1.5cm中枢側にEvans blue(EB)色素を静置した.その後,経時的に気管を摘出し,気管分岐部から喉頭側に向かって1cm毎の組織片4個を切り出した.これらの組織片はフォルムアミドに24時間浸漬し,抽出したEB色素は比色光度計にて測定した.その結果,サルメテロールの投与により,気管分岐部近傍の組織内EB濃度は急速に減少し,それに伴い中枢側の気管内EB濃度は経時的に増加した.これらの効果は用量依存的であり,β2刺激薬による気道クリアランスの改善が示された.マウス気管上皮細胞におけるDNA合成およびタンパク合成を測定した実験系では,サルメテロールの存在下で濃度依存的に増加し,β2受容体アンタゴニストにより完全に抑制された.また,サルメテロール刺激は上皮細胞EGFRのリン酸化とMUC5AC発現を誘導し,これらの反応はEGFRチロシンリン酸化阻害薬やH-Rasのdominant negative mutantにより有意に抑制されたことより,上記の細胞内シグナル伝達におけるRas-ERKの関与が示唆された.さらに,サルメテロールはマウス気管粘膜における粘液線毛輸送速度や線毛運動周波数を増加させ,気道クリアランスの賦活作用を有することも明らかとなった.マウス気道上皮培養細胞を,長時間作用型β2刺激薬であるサルメテロール(1nM100μM)の存在下で72時間培養を行い,コントロール群では生理食塩水を添加して同様に培養した.DNA合成およびタンパク合成は,各々細胞内への[3H]-thymidineと[3H]-leucineの取り込みにて評価を行った.その結果,サルメテロール群ではDNA合成,タンパク合成ともに濃度依存的に増加した.

一方,β1アゴニストであるドブタミン,β3アゴニストであるCL316243による刺激も行ったが,これらの薬剤ではいずれの合成も観察されなかった.β2受容体アンタごニスとであるプロプラノロールによる前処置を行うと,サルメテロールの効果は完全に消失したことより,気道上皮細胞のβ2受容体を介する反応であることがわかった.次に,サルメテロールの効果における上皮成長因子受容体(EGFR)の関与を検討するため,リン酸化EGFRモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行ったところ,サルメテロール刺激によりEGFRのリン酸化が誘導されることが確認された.さらに,EGFRのチロシンリン酸化の特異的阻害薬であるAG1478およびBIBX1382の効果も検討した.その結果,これらの阻害薬は上皮細胞の無刺激状態におけるDNAおよびタンパク合成には影響を与えなかったが,サルメテロールに対する反応を有意に抑制した.次いで,細胞内シグナル伝達におけるRas-MEK-ERK (extracellular regulated protein kinase)カスケードの役割も検討し,上皮細胞にH-Rasのdominant negative mutant (AdRasY57)をトランスフェクトにより[3H]-thymidineおよび[3H]-leucineの取り込みが著明に抑制されることが示された.気道上皮細胞の増殖およびムチン分泌反応(in vitro)の検討においては,β2受容体刺激によるタンパク合成とDNA合成の増加反応を定量的に評価することにより,当初の仮説を検証することができた.しかし, dominant-negative Ras mutant (AdRasY57)を用いた実験では,アデノウイルスによる上皮細胞へのトランスフェクションが不十分であり,シグナル伝達経路におけるRas-ERKカスケードの関与を直接証明するには至らなかった.一方, ERK活性化の評価(in vitro)については,蛋白質発現とリン酸化のいずれの実験も有意な所見が得られ,気道上皮細胞のβ2受容体刺激は本酵素のリン酸化をきたし活性型ERKの発現を促すことが明らかとなった.また,ERKの活性測定においても,β2刺激薬が本酵素活性を濃度依存的に上昇させることが証明され,当初の実験計画に沿って施行することが可能であった.アダプター分子の会合(in vitro)に関する検討においても, EGFRとGrb2関連蛋白のイムノブロット解析,特異的HB-EGFブロッカーによる阻害実験とも成功し,気道上皮細胞の増殖に関わるアダプター分子の会合や,その効果におけるHB-EGFの役割も明らかとなった.HB-EGFのsheddingとmetalloproteinase(in vitro)の検討でも,[Glu52]
近世スウェーデン塩取引情報の分析　―在ポルトガル『領事報告書』を中心に

平成28年度の研究実績の概要は、以下三点に集約される。1)平成28年6月から10月にかけて、ユーテボリ大学の訪問研究員として研究滞在を行い、王立軍事文書館などの関係施設にて史資料収集活動を行った。この活動により、スウェーデン王国政府における塩供給問題について、多角的な検討を行うことができた。特に、塩輸入・塩供給問題に関する法的整備の展開について、同国の水産経済政策や外交通商政策の観点から考察を深めることができた。2)『領事報告書』の分析を行う中で、ポルトガルにおける塩生産や塩輸出の状況について、スウェーデン領事がポルトガルの塩生産・塩輸出の状況についていかなる情報を有していたのかについて、一定程度明らかとなった。さらに、大北方戦争(1700-1721)中に活動していたリスボン領事が作成した領事報告書の分析を通じて、領事が有事の際にどのような活動を行っていたのかについて考察することができた。この成果の一端については、2017年5月に一橋大学にて開催される日本西洋史学会で報告することが決定しており、その際の批判をふまえて年内に査読誌に投稿することを目指す。3)研究が進展する中で、王国政府による塩供給に関する政策や関連する水産経済政策の問題について検討する必要が発生したため、該当する諸史料の分析も平行して行った。これにより、18世紀スウェーデンの塩供給問題が同国の経済政策、ならびにその構想過程において、いかなる議論が展開されてきたのかについて知見を得ることができた。本研究成果の一部については、2017年2月に一橋大学で開催された「歴史と人間」研究会における口頭発表、さらには法文化学会の論集に所収される論文にて報告を行った。このほかにも、『北欧文化事典』にて「北欧における製塩と塩輸入の歴史」などの項目を担当し、一般向けの研究成果発信についても随時行ったところである。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度の研究実績は以下の通りである。第一に、在ポルトガルスウェーデン領事経験者であり、かつスウェーデン重商主義者であったアンデシュ・ノルデンクランツ(Anders Nordencrantz, 1697-1772)の刊行史料の分析を行った。第二に、18世紀スウェーデン塩取引において影響のある施策の一つであるスウェーデン航海法の分析、および関連する諸研究の検討を行った。第三に、本研究課題における最重要史料である『領事報告書』の収集と分析を開始した。1)在ポルトガルスウェーデン領事を経験(1727-1738)したアンデシュ・ノルデンクランツの刊行史料分析を通じて、スウェーデンにおける塩供給の問題、さらには塩の問題と密接な関係がある漁業の問題について特に研究を進めてきた。スウェーデンにおける製塩環境の問題については『北欧史研究』に掲載された。本稿では、上記のノルデンクランツがスウェーデンの塩生産問題についていかなる認識をもっていたのかについて検討したものである。また、スウェーデン漁業、特に漁業経済振興問題に関するノルデンクランツの構想について検討した内容を世界経済史会議にて発表し、様々なフィードバックを得ることができた。2)18世紀スウェーデンにおける重要な施策の一つであるスウェーデン航海法の分析を行った。本史料の分析および関連する先行研究の分析を通じて、スウェーデン航海法起草に関わる利害関係者の様相を明らかにし、その一部を法文化学会において発表した。3)本研究課題において最重要史料の一つである「領事報告書」の収集を行った。スウェーデン王立軍事文書館にて史料収集活動をおこなった。具体的には、18世紀において在ポルトガルスウェーデン領事が記した報告書やその他関連史料を収集し、分析を開始した。また、同国滞在中には現地の書店にて関連する文献を収集することができた。まず、本研究課題における重要史料である『領事報告書』の収集、分析を計画通り進めたこと。さらに、漁業や海洋政策の観点からも塩取引の問題について検討することができたため。また、研究成果については学会報告や論文投稿を行うことができたため、平成27年度の研究は順調に進展したと判断することができる。

本研究成果の一部については、2017年2月に一橋大学で開催された「歴史と人間」研究会における口頭発表、さらには法文化学会の論集に所収される論文にて報告を行った。このほかにも、『北欧文化事典』にて「北欧における製塩と塩輸入の歴史」などの項目を担当し、一般向けの研究成果発信についても随時行ったところである。平成28年度は、主に4名の『領事報告書』の分析に注力し、セトゥバルをはじめとするポルトガル産の塩生産・塩輸出についてどのような情報を有していたのかを究明する。そして、その情報をふまえ、スウェーデンの輸入産品としてポルトガル産塩を領事がどのような評価を行っていたのかを考察する。さらに、スウェーデン商務顧問会議の議事録などを活用し、ポルトガルとの塩取引関係だけではなく、フランスなどとの塩取引についても検討する。これに加えて、塩の使用用途に関する問題として漁業についてこれまで検討を行ってきたが、この点についても引き続き検討を行うこととする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
胚を活性誘導するヒト子宮内膜上皮の接着分子の同定とその発現機構の分子生物学的解析

これまでにヒト胚着床現象において分泌期中期の子宮内膜上皮細胞のみ接着能があること、およびそのヒト子宮内膜上皮細胞の接着能および胚の浸潤能の制御に局所の免疫細胞が関与している可能性や胚由来の因子がその免疫細胞の作用を増強している可能性を提示してきたが、胚が子宮内膜上皮との接着から次の子宮内膜内浸潤へと至るためには胚の活性化が必須とされ、その過程には子宮内膜上皮細胞とその接着により胚に対して何らかのシグナルが伝達される機構の存在が推察されてきた。今回、本研究で明らかとなったヒト子宮内膜上皮細胞と胚の接着機構、および胚活性化機構について総合的に整理すると、子宮内膜上皮細胞にはALCAM,ephrinA1などの接着に密接に関わる分子が発現していることが確認された。また、マウス胚盤胞にも、ALCAM,ephrinA1などの接着に密接に関わる分子が発現していることが確認された。残念ながら子宮内膜上皮細胞に発現する分子の胚へのシグナルの流れは明らかにできなかったが、これらの接着分子は、ヒト子宮内膜上皮細胞や胚の細胞膜表面に発現して子宮内膜上皮に接着した胚の活性化をおこし、胚着床現象において重要な物質である可能性が十分に考えられる。さらなる解析により、子宮内膜上皮細胞に発現するこれら分子あるいは新しく同定される分子の胚へのシグナルの流れが明らかにされ、胚着床機構の解明、難治性着床障害の治療法開発の可能性も期待される。胚着床機構の解明さらには難治性着床障害の治療法開発の可能性に繋がるものと考えられる。これまでにヒト胚着床現象において分泌期中期の子宮内膜上皮細胞のみ接着能があること、およびそのヒト子宮内膜上皮細胞の接着能および胚の浸潤能の制御に局所の免疫細胞が関与している可能性や胚由来の因子がその免疫細胞の作用を増強している可能性を提示してきたが。胚が子宮内膜上皮との接着から次の子宮内膜内浸潤の段階へと至るためには胚の活性化が必須とされ、その過程には子宮内膜上皮細胞との接着により胚に対して何らかのシグナルが伝達される機構の存在が推察されている。本研究では、免疫細胞の作用により接着能を獲得した子宮内膜上皮培養細胞に発現する遺伝子群をDNA array法で選別し、胚に対する新たなシグナル分子の同定を目指しているが、現在スクリーニングの途上である。またシグナル伝達作用のある細胞接着分子との観点から、ヒト子宮内膜上皮およびヒト胚にEph-ephrin系分子が発現することを明らかにしてきたが、今回これらの分子とヒト子宮内膜上皮細胞およびマウス胚との結合能を確認したことから着床時に相互作用する分子の候補であると考えられた。そこでヒト子宮内膜上皮細胞およびマウス胚盤胞を用いたEph-ephrin分子のbioassay系を作成した。その結果、Eph分子はマウス胚盤胞の接着を抑制する可能性、またephrin分子は子宮内膜上皮細胞の細胞間接着を減弱する可能性が得られた。この分子のヒト子宮内膜上皮細胞や胚に対する作用についてさらに詳細に解析をすすめて、得られた知見からヒト胚着床機構における役割について検討する予定である。これまでにヒト胚着床現象において分泌期中期の子宮内膜上皮細胞のみ接着能があること、およびそのヒト子宮内膜上皮細胞のみ接着能および胚の浸潤能の制御に局所の免疫細胞が関与している可能性や胚由来の因子がその免疫細胞の作用を増強している可能性を提示してきたが、胚が子宮内膜上皮との接着から次の子宮内膜浸潤へと至るためには胚の活性化が必須とされ、その過程には子宮内膜上皮細胞とその接着により胚に対して何らかのシグナルが伝達される機構の存在が推察されている。

本研究では、免疫細胞の作用により接着能を獲得した子宮内膜上皮培養細胞に発現する遺伝子群をDNA array法で選別し、胚に対する新たなシグナル伝達作用のある細胞接着分子との観点から、ヒト子宮内膜上皮およびヒト胚にEph-ephrin系分子が発現することを明らかにしてきた。また、これらの分子とヒト子宮内膜上皮細胞およびマウス胚との結合能を確認したことから着床時に相互作用する分子の候補であると考え、ヒト子宮内膜上皮細胞およびマウス胚盤胞を用いたEph-ephrin系分子のbioassay系を作成して検討を加えたところ、Eph分子はマウス胚盤胞の接着を抑制する可能性、またephrin分子は子宮内膜上皮細胞の細胞間接着を減弱する可能性が考えられた。この分子のヒト子宮内膜上皮細胞や胚に対する作用について、現在さらに詳細に解析をすすめており、今後、遺伝子改変操作などを含めた実験系の整備を行うなどの課題が残った。
薬害ＨＩＶ感染被害者による「当事者運動」理念の再構成と分析

いわゆる「薬害HIV」感染と性行為感染とを区別しない現在の日本のHIV/AIDSに対する医療体制の確立に、「薬害」感染被害者Y氏による諸活動が大きく寄与していた。故人の関係者への聞き取り調査や資料分析により、大学生時代の自立生活運動へのコミット、サンフランシスコでの性感染者との出会いが、「良心的支援者」としてY氏がHIV/AIDS問題へと関わる経験となったことを明らかにした。「薬害HIV」感染被害者Y氏が目指した「当事者運動」の理念を彫り出すために、本調査研究では故人に縁のある人々に対する聞き取り調査にとどまらず、書簡や写真、映像資料などの遺品を収集し、Y氏の評伝を製作する。昨年度は前年度に引き続き、故人と縁のある地方および海外在住の方々への追加・補足インタビューをおこなった。Y氏の来歴は大きく、(1)高校在学まで(19581978年)、(2)大学在学期(19781983年)、(3)当事者運動の準備期(19831988年)、(4)当事者運動を展開していた時期(19881996年)、(5)薬害HIV訴訟和解後から死去するまで(19962003年)、のように区分することができる。昨年度はそのうち(2)(3)の期間の動向を追跡することに時間を割いた。結果、HIV感染告知を受け、活動のあり方を模索する中で、サンフランシスコを訪問し、現地の薬害HIV感染被害者や医療関係者と多数会うことで、自らのアイデンティティと活動方針を練っていたことがわかった。この訪問を境にY氏はHIV/AIDSや血友病に対する向き合い方について、チーム医療の重要性やNPO・ボランティアベースによる当事者支援活動の意義について確証を得ていたことになる。加えて、HIV訴訟期での国会陳情では、積極的に共感する議員の元に足を運び、薬害感染者と性行為感染者を区別しないかたちでの医療支援体制の構築を訴えていたことがわかった。以上のHIV/AIDSをめぐる集合行為のあり方について、運動参加プロセスに焦点を合わせた論考の投稿、Society for the Study of Symbolic Interaction AnnualMeeting (New York, 2013年8月)での口頭報告を調査研究の中間報告の一部とした。昨年度は研究費を活用して、故人と縁のある地方および海外在住の方々へのインタビューを重点的におこなった。Y氏の来歴は大きく、1高校在学まで(19581978年)、2大学在学期(19781983年)、3当事者運動の準備期(19831988年)、4当事者運動を展開していた時期(19881996年)、5薬害HIV訴訟和解後から死去するまで(19962003年)、のように区分することができる。昨年度はそのうち23の期間の動向を追跡することに時間を割いた。結果、HIV感染告知を受け、活動のあり方を模索する中で、サンフランシスコを訪問し、現地の薬害HIV感染被害者や医療関係者と多数会っていたことがわかった。さらに、自身のHIV/AIDSとの闘病生活の様子について、当時の担当医師にインタビューをおこない、抗HIV薬による副作用に苦しめられていた様子について、部分的にではあるが明らかにした。以上のHIV/AIDSをめぐる集合行為のあり方について、運動参加プロセスに焦点を合わせた論考「訴訟運動参加プロセスにみる「薬害HIV」概念の再検討」『社会学年報』42号(印刷中、2013年7月刊行予定)を投稿し、調査研究の中間報告の一部とした。「薬害HIV」感染被害者Y氏が展開した、「薬害」感染と性感染を区別しない運動理念の形成の考察をおこなった。今年度は、Y氏が大学時代に経験した自立生活運動と、HIV感染後に訪問したサンフランシスコでの経験に照準して、運動史をまとめた。自立生活運動では、それまで血友病患者であることの自覚に乏しかったY氏が、自立生活運動とその当事者との接触により、身体障害者と健常者とのあいだに身を置くことの重要性を体得した。サンフランシスコ訪問では、保守的で医療者に依存する傾向の強かった血友病患者に比して、苦しい中で声を上げようと奮闘するゲイや性感染の人々からの「歓待」に心を惹かれ、感染者の人権擁護のための運動に身を投じることの意義を確信した。

この2つの経験は、「薬害」感染による「被害者アイデンティティ」の承認要求よりも、「薬害HIV」感染者が被害者としてではなく、あたりまえの社会的支援や医療が提供されるようにするための人権運動として自身の運動理念を形成する素地となった。Y氏はHIV感染させられたことやその後の対応に対する怒りに関しては、他の血友病のHIV感染者と共通してはいたものの、医師をはじめとした医療体制や社会を変えないことには、「自分たち(=HIV感染者全般)」は生きていけないことを強く意識していた。このことは、1988年に感染者支援のNPOを立ち上げ、公的なHIV感染のカミングアウトによる運動性の増幅よりも、行政や病院内で「公然の秘密」で発言・行動することにつながった。以上のY氏の運動理念形成史は、第87回日本社会学会大会での口頭報告「HIV感染者支援の理念形成過程」、および感染原因となった血液凝固因子製剤をめぐる問題系については、『ソシオロジ』183号「血友病補充療法の進展にみる医師役割の変質」(2015年7月発行予定)として調査研究成果をまとめた。医療社会学評伝の制作上、重要な聞き取りは昨年度中におおよそ終わらせる予定であったが、キーパーソンへの複数回のインタビューに加え、サンフランシスコ訪問時の足取りに不鮮明な点が多く、追加・補足のインタビューに多くの時間を割かなければならなくなった。それゆえ、Y氏が大学に進学するまでの話や障害者運動に傾倒した時期の活動、および訴訟期のより具体的な活動の様子についての調査研究が遅れている。しかし、現在もインフォーマントや依頼者との連絡調整を頻繁におこなっており、調査研究自体の継続には障害はなく、今後も引き続き詳細なインタビューをおこない、Y氏の足跡を丹念に再構成し、最終年度(26年度)には研究成果の暫定的なまとめを作成する予定には変わりがない。評伝の制作上、重要な聞き取りは昨年度中におおよそ終わらせる予定であったが、キーパーソンへの複数回のインタビューに加え、サンフランシスコ訪問時の足取りに不鮮明な点が多く、インタビューに多くの時間を割かなければならなくなった。それゆえ、Y氏が大学に進学するまでの話、訴訟期のより具体的な活動の様子についての調査研究が遅れている。しかし、現在もインフォーマントや依頼者との連絡調整を頻繁におこなっており、調査研究自体の継続には障害はなく、今後も引き続き詳細なインタビューをおこない、Y氏の足跡を丹念に再構成し、最終年度(26年度)には研究成果をまとめる予定には変わりがない。本年度は評伝の制作を進めるために、インタビュー調査はもちろんのこと、故人の遺した文書資料の内容分析を重点的におこなう。インタビューでは、Y氏が大学進学するまでの様子、当事者運動から一歩引いた形となった後年の様子を中心に対象者を選定する。さらに、Y氏が本名・仮名それぞれで執筆・投稿した文書資料を引き続き収集し、Y氏の考える当事者運動の理念を彫り出すことを試みる。さらに、本調査の中間・最終報告として、日本社会学会(11月2223日、神戸大学)での口頭報告、および『Symbolic Interaction』へ投稿する。本年度は評伝の制作を進めるために、インタビュー調査に加えて、故人の遺した文書資料の内容分析をおこなう。さらに、Y氏が本名・仮名それぞれで執筆・投稿した文書資料を収集し、Y氏の考える当事者運動の理念を彫り出すことを試みる。
SAGE法で抽出した新規胃がん特異遺伝子の機能解析と診断・治療への展開

本研究は、SAGEライブラリーの比較から新しい胃癌特異的発現遺伝子を抽出し、標的治療を視野に入れた診断系を確立することを目的に行ない、以下の結果を得た。(2)免疫染色による蛋白発現の検討において、MIAとMMP-10では発現と悪性度、予後との相関が見い出された。REGIVでは、胃癌の他に、大腸癌、膵癌、消化管カルチノイドが陽性であった。(4)新規癌特異的遺伝子候補の機能解析に関しては、REGIVにおいて、5-FUによるアポトーシスの抑制には、EGFRのリン酸化、caspase-9の抑制が関与することを明らかにした。SPC18については、発現がステージ・転移と相関すること、胃癌細胞株のSPC18強制発現系において細胞浸潤を促進することを確認した。(5)胃癌特異的発現遺伝子のSNPの分子疫学的検討に関しては、胃癌の新規癌抑制遺伝子の候補であるCLDN-18遺伝子において、5'UTRにG/AのSNPを同定し、ジェノタイプについての症例対照研究の結果、A/GおよびG/G型が胃癌症例で有意に高頻度であり、Odds ratioは5.17(2.01-13.3)であった。(6)SAGEで同定した癌特異的発現遺伝子を含む207遺伝子を搭載する三次元オリゴDNAカスタムアレイを用いた約20症例の胃癌における発現と臨床病理学的事項との解析より、T/N/stageと有意に相関する23遺伝子を同定した。胃癌と正常臓器のSAGEライブラリーの比較から新しい特異的発現遺伝子を抽出し、標的治療・予防を視野に入れた診断系の確立を目的として、本年度は以下のとおり研究を実施した。2)Recombinant蛋白の調整およびモノクローナル抗体の作成:上記9遺伝子の内、抗体の得られていないものについて、順次Recombinant蛋白を精製し、常法に従いモノクローナル抗体の作成を行っている。得られた各クローンについて、液相系、ウエスタンブロット、免疫染色にて反応性、特異性を確認している。3)免疫組織化学による蛋白の局在と臨床病理学的事項との関連解析:抗体が入手可能なMIA,DKK4,MMP-10および独自に抗体を作成したREGIVでは、免疫染色において発現を検討し、MIAとMMP-10では発現と悪性度、予後との相関が見い出された。5)SAGEライブラリーに基づいた胃癌組織解析用カスタムアレイによる解析:上記で抽出した癌特異的発現遺伝子を含む207遺伝子を搭載する三次元カスタムアレイを新たに作成し、約20症例の胃癌を解析し臨床病理学的事項との検討を行った。(1)SAGEデータ解析による新規癌特異的遺伝子候補の抽出と機能解析:胃癌と正常臓器のSAGEライブラリーの比較と定量的RT-PCR法により抽出した新規癌特異的発現遺伝子の内、REGIVについては、5-FUによるアポトーシスの抑制には、EGFRのリン酸化、caspase-9の抑制が関与することを明らかにした。癌特異的遺伝子DKK4に関連して解析したWNT-5aについては、その発現が胃癌の悪性度・予後と相関すること、細胞浸潤を促進することを確認した。一方、新しい癌特異的発現遺伝子Xを同定し、細胞外分泌を確認し、ELISAによる血清診断系を確立した。(2)胃癌特異的発現遺伝子のSNPの探索および分子疫学的検討:同様に、SAGEデータ解析に基づいて新しい胃癌の癌抑制遺伝子として同定したClaudin-18(CLDN-18)

遺伝子において、5'UTRにG/AのSNPが存在することを新規に見い出した。そこで、胃癌症例(約150例)と健常対照症例.(約300例)についてジェノタイプ解析を行ったところ、A/GおよびG/G型が胃癌症例で有意に高頻度であり、Odds ratio (OR)は5.17(2.01-13.3)であった。(3)胃癌診断用カスタムアレイの分子病理診断への導入:SAGEで同定した癌特異的発現遺伝子を含む207遺伝子を搭載する三次元カスタムアレイにより、約20症例の胃癌における発現と臨床病理学的事項との解析より、T/N/stageと有意に相関する23遺伝子を同定した。
糖鎖を介する生体内機能分子へのレクチン経路の関与と疾病への影響

L-フィコリン(L-FCN)とH-フィコリン(H-FCN)は、日齢0-5で血清値の上昇傾向が認められ、出生前後での急激な外界変化への対応のために、これらが上昇したものと考えられた。生体内機能性糖蛋白に活性酸素による酸化ストレスを加えると、マンノース結合レクチン(MBL)との結合性の上昇が認められた。このことから、MBLを中心としたレクチン経路が活性酸素による虚血再灌流障害発症の一因をなす可能性が示唆された。塩基性蛋白に対し、ヒトMBLはCa依存性に、ヒトL-FCNはCa非依存性に結合したが、ヒトH-FCNでは結合は認められなかった。ヒストンなどの塩基性蛋白の処理にMBLやL-FCNが関与している可能性が示された。ヒト免疫グロブリン(Igs)を始めとする生体内機能性糖蛋白を固相化したマイクロタイタープレートに、37度、過酸化水素-硫酸銅溶液による酸化ストヒスを加え、活性酸素で変性した機能性糖蛋白へのヒトMBL(マンノース結合レクチン)の結合性を調べた。糖鎖含量が多いヒトミエローマIgE(Des)やIgM(Loy)IgA2m2(Kur)では、MBL結合性の上昇が認められた。酸化試薬濃度、反応時間、両者共に多すぎると結合性が低下し、糖蛋白質の個々に至適濃度、至適反時間があることが分かった。結合はEDTAで阻害され、Ca依存性であると考えられた。マンナンも同様の反応を行うと、ある至適条件下では結合性め増大が認められた。生体内に生じた活性酸素がN型糖鎖を切断するとの報告があることより、結合性の増大は、活性酸素により糖鎖末端のシアル酸やガラクトースを含む部分が除去され、マンノースなどが末端に露出したことにより生じ、結合性の低下は、活性酸素による糖鎖の切断が更に進み、マンノースなどが除去されたことにより生じたと考えられた。臓器移植や心臓・大血管の手術後、再度血流が回復する場合に臓器障害が認められるが、その再灌流障害を引き起とす原因はいまだに明らかとなっていない。最近、虚血再灌流(I/R)により傷害を受けた血管内皮細胞にMBLが結合、レクチン経路が活性化されるという報告がなされた。MBLは、糖鎖末端のシアル酸やガラクトースを除去したり、酸などで変性したIgsと結合し、レクチン経路を活性化することを我々は確認しており、I/R障害に関しては、急激な血流再開と酸素負荷により活性酸素が生じ、血管内皮細胞表面分子やIgsなどの糖蛋白の糖鎖を切断し、それにMBLが結合する、あるいは傷害された血管内皮細胞に変性Igsが結合し、それにMBLが結合、レクチン経路が活性化される、という可能性が考えられる。補体活性化レクチン経路を起動するフィコリンの生体内動態を知る目的で、L-フィコリン(L-FCN)とH-フィコリン(H-FCN)各々の酵素免疫測定系を確立し、血清濃度測定を行った。特に出生直後の変動にスポットをあて、臍帯血(日齢0)ならびに日齢1から5までの毎日の静脈血につき測定を行った。その結果、MBL(マンノース結合レクチン)程の顕著な上昇ではないものの、L-FCNとH-FCN共に日齢05で血清値の上昇傾向が認められた。このことは、MBLと同様に、出生前後での急激な外界変化への対処のために、L-FCN,H-FCNも上昇したものと考えられた。マイクロタイタープレートを塩基性蛋白でコートし、塩基性蛋白とヒトMBLとの結合性を調べた。塩基性蛋白として、Histone,Protamine,Poly-L-Lys,Poly-D-Lys,Poly-L-Arg,Poly-(Lys-Tyr=4:1)がCa依存性にMBLと結合した。MBLと塩基性蛋白とのCa依存性の結合は、MBLの糖鎖認識部位と結合しうる単糖(マンノース、Nアセチルグルコサミン、フコース、グルコース)による阻害が見られたが、完全阻害には至らなかった。別の単糖(ガラクトース、Nアセチルガラクトサミン)や塩基性アミノ酸(L-リジン、L-アルギニン)では阻害は認められなかった。各種血清蛋白とPoly-L-Lysとの結合をみると、CRP(C反応性蛋白)やSAP(血清アミロイドP成分)では結合がみられたが、アルファ2マクログロブリン、C1q、C1インヒビター、IgA、IgG、IgMでは結合が認められなかった。

ヒストンなどの塩基性蛋白は細胞がアポトーシスなどにより死滅した際に体内に放出されるが、これら塩基性蛋白の処理にCRPやSAPなどが関与しているといわれており、MBLもその一翼を担う可能性が考えられる。