hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
堆砂による路床の時空間変動の予測を基礎とした魚巣・魚溜工の設計支援手法

わが国では農業農村整備事業において,農業用排水路の魚類を保全する試みがなされつつある.対象魚にとって好ましい生育・生息場を保全するには,水域のネットワークの維持,適切な水管理が必要とされる.局地的には,魚巣,魚溜などの環境配慮工が導入されている.しかし,環境配慮工の周辺は流れが緩やかになる傾向があるために堆砂が生じ,その有効性が阻害されるケースが報告されている.本研究の目的は,農業用排水路のような小規模水域の魚類生息場保全の観点から,流れ・流砂・路床変動の数値計算によって,より有効な魚巣や魚溜を設計するために必要な手法を開発することである.環境配慮施設の生息場としての価値を評価するとともに,長期的に堆砂が生じにくく,それらが管理しやすいものとなるよう,生態水理学,土砂水理学の観点から調査,分析する.当該年度では,前年度に引き続き,対象としている排水路の魚巣・魚溜設置区間において,水理観測,路床標高の空間分布調査を,灌漑期・非灌漑期に実施した.また,対象区間上流部において,水位,水温,濁度を10分間隔で自動観測する遠隔通報システムの運用を継続した.加えて,田植え前後の路床標高の変化を詳細に調べるため,路床標高の調査と流れ・路床変動の数値シミュレーションを試みた.その結果,11月から翌年4月中旬まで魚巣内に堆積していた土砂や落葉は5月上旬にほとんど流下することがわかった.また,2016年から3年分の半年ごとの魚巣,魚溜,対象区間全体の堆砂・洗掘量を整理したところ,水路区間では堆砂量が漸増する傾向が見られた.排水路の路床変動データや水位,流量,濁度の時系列データの蓄積により,環境配慮工における堆砂や洗掘の実態把握が順調に進んだ.また,路床変動については,均一粒径,混合粒径,粒度分布の仮定など多様な場合を想定した数値計算を行った結果,改良が必要な点が明確になりつつあるため.路床標高分布の実測,水理観測を継続する.これまでに得られたデータを整理し,対象地の堆砂・洗掘発生要因の明確化を進める.また,魚巣・魚溜の規模がシールズ数の数値計算結果に与える影響を分析し,環境配慮工の設計を支援する方法について研究する.わが国では農業農村整備事業において,農業用排水路の魚類を保全する試みがなされつつある.対象魚にとって好ましい生息場を創造するため,魚巣,魚溜などの多様な環境配慮工が施工されている.しかし,環境配慮工の周辺は流れが緩やかになる傾向があるために堆砂が生じ,その有効性が阻害される問題が生じている.本研究の目的は,農業用排水路のような小規模水域の魚類生息場保全の観点から,流れと堆砂による路床変動の数値計算によって,長期的に堆砂が生じにくく,生息場としての価値が高い魚巣・魚溜工の設計を支援することである.当該年度では,魚巣と魚溜工が施工された農業用排水路の複数地点で,水深,流速,水温,溶存酸素量,底質,植生,遮蔽の状況等を観測した.水路と関連圃場の位置,路床高,路床勾配の測量を行った.魚巣,落差工の周囲や数値計算で設定する解析区間境界の水深・流速を観測し,解析区間への流入流量と水深変化量,水深変化に伴う魚巣の水没時期等の観測を開始した.区間上流からの土砂流入量を把握するため,上流側に水位,水温,濁度計を設置し,測定項目を10分間隔で自動観測できる遠隔通報システムを導入した.排水路の路床変動を引き起こすような土砂の運搬は,代掻き・田植え期のような濁水が排水路に排出される時や梅雨,台風などの豪雨時に生じると予想される.そのため,大規模出水のタイミングを水位急変時の通報により把握できるようにした.流れと路床変動の数値シミュレーションモデルの検証用に,水位,濁度の自動観測装置を現地に設置した.また,モデルを仮想水路区間へ適用した予備計算が順調に進んでいるため.わが国では農業農村整備事業において,農業用排水路の魚類を保全する試みがなされつつある.対象魚にとって好ましい生育・生息場を保全するには,水域のネットワークの維持,適切な水管理が必要とされる.局地的には,魚巣,魚溜などの環境配慮工が導入されている.しかし,環境配慮工の周辺は流れが緩やかになる傾向があるために堆砂が生じ,その有効性が阻害される問題が報告されている.本研究の目的は,農業用排水路のような小規模水域の魚類生息場保全の観点から,流れ・流砂・路床変動の数値計算によって,より有効な魚巣や魚溜の設計支援手法を開発することである.環境配慮施設の生息場としての価値を評価するとともに,長期的に堆砂が生じにくく,それらが管理しやすいものとなるよう,生態水理学,土砂水理学の観点から調査,分析する.当該年度では,前年度に引き続き,対象としている排水路の魚巣・魚溜設置区間において,水理観測,路床標高の空間分布調査を,灌漑期・非灌漑期に実施した.詳細な路床標高分布の推定により,魚巣や魚溜内の堆砂状況とそれらの時期による変化が観測された.また,土砂量収支や粒度分析により,魚巣と魚溜の特性が明らかになりつつある.

また,対象区間上流部において,水位,水温,濁度を10分間隔で自動観測する遠隔通報システムの運用を継続した.降雨時に連続自動採水を行い,区間上流からの流入土砂の特性を分析した.これらと並行して,流れ・流砂・路床変動の数値計算を行い,計算の妥当性について検討した.水理量の自動観測システムが概ね順調に稼働した.また,堆砂状況の調査結果の蓄積が進み,数値計算や粒度分析結果と合わせることで,環境配慮工内外の流れ,流砂の傾向がわかるようになりつつある.わが国では農業農村整備事業において,農業用排水路の魚類を保全する試みがなされつつある.対象魚にとって好ましい生育・生息場を保全するには,水域のネットワークの維持,適切な水管理が必要とされる.局地的には,魚巣,魚溜などの環境配慮工が導入されている.しかし,環境配慮工の周辺は流れが緩やかになる傾向があるために堆砂が生じ,その有効性が阻害されるケースが報告されている.本研究の目的は,農業用排水路のような小規模水域の魚類生息場保全の観点から,流れ・流砂・路床変動の数値計算によって,より有効な魚巣や魚溜を設計するために必要な手法を開発することである.環境配慮施設の生息場としての価値を評価するとともに,長期的に堆砂が生じにくく,それらが管理しやすいものとなるよう,生態水理学,土砂水理学の観点から調査,分析する.当該年度では,前年度に引き続き,対象としている排水路の魚巣・魚溜設置区間において,水理観測,路床標高の空間分布調査を,灌漑期・非灌漑期に実施した.また,対象区間上流部において,水位,水温,濁度を10分間隔で自動観測する遠隔通報システムの運用を継続した.加えて,田植え前後の路床標高の変化を詳細に調べるため,路床標高の調査と流れ・路床変動の数値シミュレーションを試みた.その結果,11月から翌年4月中旬まで魚巣内に堆積していた土砂や落葉は5月上旬にほとんど流下することがわかった.また,2016年から3年分の半年ごとの魚巣,魚溜,対象区間全体の堆砂・洗掘量を整理したところ,水路区間では堆砂量が漸増する傾向が見られた.排水路の路床変動データや水位,流量,濁度の時系列データの蓄積により,環境配慮工における堆砂や洗掘の実態把握が順調に進んだ.また,路床変動については,均一粒径,混合粒径,粒度分布の仮定など多様な場合を想定した数値計算を行った結果,改良が必要な点が明確になりつつあるため.自動採水器を設置し,対象農業水路における解析区間への流入土砂の発生時期・規模を推定する.梅雨,台風等による大洪水時に着目し,路床標高分布の測量により路床標高変化を把握する.それを流れ・路床変動モデルによる計算結果と比較する.代掻き・田植え期における排水路の流砂・堆砂への影響を分析するため,自動採水や水理量の自動観測を継続する.路床変動調査,水理観測を継続し,これまでの採取データを取りまとめる.路床変動の数値計算により,対象区における路床の時空間変動の予測を行う.路床標高分布の実測,水理観測を継続する.これまでに得られたデータを整理し,対象地の堆砂・洗掘発生要因の明確化を進める.また,魚巣・魚溜の規模がシールズ数の数値計算結果に与える影響を分析し,環境配慮工の設計を支援する方法について研究する.助成金交付決定が前年度の10月であり,濁度計や自動採水器の現地への設置許可の交渉に時間を要した.濁度計の設置はできたが自動採水器の設置はH29年度にずれ込んだ.遠隔監視システムが一時故障のため停止し,修理した.さらなる故障を想定して前倒し支払い請求したが,故障が起きなかったことが主な理由である.遠隔監視システムの使用料支払いや維持管理などに使用する計画である.現在,茨城大学で行われている学部のカリキュラムや入試等の変更に関する業務が想定以上に多く,当初計画していただけの研究時間を確保できなかった.また,2017年に機器が落雷にあい故障し,その後修繕したものの,データ観測を一時中断していたことなどが理由である.
熱ショックプロモーターによる筋分化調節因子の強制発現と再生分化誘導

FOPは筋肉や腱、靭帯、関節等が骨化する遺伝病である。本研究ではFOPの原因遺伝子であるACVR1や骨形成因子のBMP4を任意の時期、組織、細胞で強制発現させることのできるトランスジェニックメダカの作製と性状解析を試みた。内在性熱ショックタンパク質のプロモーターを利用したダブルトランスジェニックメダカ(hsp70b :: Cre xDES :: lGlBMP4)では熱ショック未処理の個体でもFOP様の表現型を示した。そこで、申請者が開発したデュアルプロモーター発現ベクターと人工熱ショックプロモーターを組み合わせたところ、熱ショック時のみにCreを発現するトランスジェニックメダカを作製できた。FOPは200万人に1人の割合で見つかる稀な疾患であり、筋肉や腱、靭帯、関節等が骨化する常染色体優性の遺伝病である。非根治治療ですら極めて困難であるため、FOP発症の分子生物学的機構を詳細に調べることが治療につながる唯一の方法である。先行研究においてFOPの原因遺伝子であるACVR1に患者型の変異を導入した変異型ACVR1とGFPの融合タンパク質を骨格筋において恒常的に発現するTgメダカの作製を試みたところ、細胞膜上に蛍光を示し、かつ筋組織に顕著な表現型を示すファウンダー(FO)を複数得ることができた。しかし、すべてのFOが死亡したためトランスジェニック(Tg)ラインを得ることはできなかった。そこで本研究では熱ショックプロモーター(hsp)により配列特異的組換え酵素であるCreを発現するTgメダカと、複数のプロモーター制御下でbmp4やACVR1を発現するTgメダカを掛け合わせることで熱ショックにより筋分化異常を誘導できるTgメダカの作製を試みた。筋前駆細胞で発現するデスミンプロモーター制御下にloxP-GFP-loxP-bmp4あるいはloxP-GFP-loxP-ACVR1を持つTgメダカを作製し、hsp::Creメダカと掛け合わせたところ、熱誘導によりGFPの消光と骨格筋形成の異常が確認できた。しかし、非加熱個体でもGFPの減光が見られたため、アクチンプロモーター下にloxP-dsRed-loxP-GFPを持つTgメダカが掛け合わせたところGFPの発現が見られ、非加熱時においてもhspプロモーターによるCreのリークが見られることが判明した。今後はゼブラフィッシュのhspや人工hspプロモーター制御下でCreを発現するTgメダカを作製し、非加熱時でのCreの発現を抑えたTgメダカの作製を試みる。昨年度はメダカ熱ショックプロモーター制御下でCreを発現するTgメダカ(Olhsp70::CreCherry)と、複数のプロモーター制御下でloxP配列の組換え後にbmp4やACVR1を発現するTgメダカを掛け合わせることで熱ショックにより筋分化異常を誘導できるTgメダカの作製を試みたが、メダカのhsp70プロモーターでは非熱ショック個体でもCreの極めて弱い発現が見られ、結果として比熱ショック下でも組換えを起こすことが判明した。そこで、本年度はより厳密にCreを制御するため、ゼブラフィッシュのhsp70(Drhsp70::CreCherry)と人工hsp(8xHSE::CreCherry)プロモーター制御下でCreを発現するTgメダカを作製し、非加熱時でのCreの発現を抑えたTgメダカの作製を試みた。Drhsp70::CreCherryは発生初期の段階で一過性に全身でCreを発現する事がわかり、本システムには適用できなかった。一方、8xHSE::CreCherryは非過熱時には蛍光は確認できず、熱ショックによりActB::loxP-dsRed-loxP-GFPメダカで蛍光の変化が見られた。超並列型シークエンサーによりloxP、loxP-Olhsp70::CreCherry、1P-8xHSE::CreCherryのTgメダカの筋組織の全遺伝子発現解析を行ったところ、FOP型ヒトACVR1の発現により発現が変動する遺伝子およそ400個を同定できた。本研究課題で作製したTgメダカは全てメダカNBRPに寄託し、他の研究者が利用できるようにする。
子どもの適応的な算数問題解決能力を育むメタ認知方略活性化システムの開発

タブレット端末のコンピュータにメタ認知方略(自己説明)を組み込んだ算数問題解決システムを開発し、児童に算数問題を解決させた。研究期間は児童が小学5年生になった4月から6年生の12月までであった。研究の結果、6年生の12月に実施した転移テストで、上位群と下位群の成績の差異が小さくなった。このことは、メタ認知を組み込んだシステムの開発によって、適応的な算数問題解決者が育ってきたことを示すと指摘できる。今年度は以下の3点(1ー1、1ー2、2)を実施し、次年度以降の具体的な研究を実施するためのセッティングができた。1例題学習ツールの改良1ー1:例題学習ツールに含む算数文章題を1つの教科書からだけでなく他の教科書からの文章題も参考にするために、以前の研究に用いた啓林館の5年生と6年生の算数教科書に含まれる算数文章題だけでなく、東京書籍の5年生と6年生の算数教科書に含まれる文章題の分析も並行して行った。その結果、「少数の除法に関する問題」、「連立方程式の解決につながる問題」、「逆向きの思考を利用し方程式のつながる問題」、「2次元表の作成と読解に関する問題」、および「割合の問題」の5タイプの問題群から、いくつかの問題を取捨選択して例題学習ツールに含む算数文章題とした。1ー2:選択された文章題の解決過程をより解きやすい形式に改良するために、いくつかの文章題において解決のステップ数を増やした。また、それらの各解決過程に対する解答を34つの選択肢群として用意した。学習者は各解決ステップの問題を自己説明するかわりに、選択肢群から正解を選択させるようにした。こうして、改良した例題学習ツールを作成し、それらをメタ認知方略活性化システムとして、新たにタブレット型端末のコンピュータにインストールできるように、以前と異なる新たなプログラムを開発した。2文献研究:児童のメタ認知方略として自己説明を使った文献を渉猟し、それらの成果をメタ認知方略を含む学習環境に関する2つの紀要論文としてまとめた。昨年度に研究依頼した小学校において、本年度は、小学5年生を対象に5粘性からの2年間の縦断的研究の最初の年として、メタ認知方略である自己説明を組み込んだ、タブレット型端末を利用した算数文章題の実証的研究を実施した。具体的には、1タブレット型端末を21台用意した。それらのタブレット型端末を5年生3クラス各34名のクラスに7台ずつ配置して児童に使用させた。2タブレット型端末には、小学5年生で学習する算数文章題を20問組み込まれていた。各文章題は、7 14程度の解決ステップに区分され、児童はそれらの解決ステップをキーボードないしは付属のペンで解答した。解決ステップは、自己説明できるステップを組み込んで構成したものであった。3児童は授業のあき時間等を利用して、これらの算数文章題解決の学習を週1回、2週間にわたって2回実施した。また、1学期から3学期の3学期間、学期の終わりの時期にこれらの学習をおこなった。タブレットの学習後、当該の学期に関係する文章題を8題用意し、本テストとして児童に実施した。4現在のところ、3学期までの本テストの成績と児童の学習履歴、およびpaper and pencil形式の自己説明質問紙への回答分析を行なっている。本テストに関しては3学期分の集計を終えたところであり、通常の算数授業のみを実施している学校の児童(統制群)の本テスト成績とを比較したところ、授業のみの統制群である児童に比べて、若干よい成績であることが分かった。今後は、タブレット型端末による児童の学習履歴やpaper and pencil形式の自己説明質問紙への回答分析を丁寧に実施しなければならない。小学5年生の3学期を通して、当初に予定した計画通り、確実に各学期のデータを収集していることによる。ただし、児童一人ひとりの学習履歴や自己説明質問用紙の分析を丁寧にすることが必要である。そのために、学習履歴の利用方法や分析方法、表計算ソフトに移し換えた自己説明のっプロトコールの分析を工夫することに時間を要している。今年度(最終年度)に実施した研究は、昨年度からの継続である小学生の算数問題解決の縦断的研究であった。すなわち、小学6年生になった児童に、タブレット端末にメタ認知方略(具体的には、児童が問題解決のステップを自己説明する)を組み込んだ算数問題を解かせた。1学期と2学期の各学期に、児童に20分程度のタブレット端末による算数問題解決を2回実施し、その後、本テスト、ならびに自己説明テスト用紙への回答をさせた。あわせて、研究の最終段階として、2学期には転移テストを実施した。その結果、1児童を昨年度の5年生1学期の成績に基づいて、上位群、中位群、並びに下位群の3群に区分したとき、算数問題解決の成績のパターンには変化は見られなかったが、下位群の児童でも積極的に自己説明できるようになってきた。2転移テストに関しては、上位群と下位群の間にそれほど顕著な差異が認められず、自己説明の効果がみられたともいえるだろう。本研究は1年目に研究の準備のために小学校での実証研究はできず、縦断的研究は昨年度の小学5年生の1学期から今年度の小学6年生の2学期までの2年間であった。

その結果、1コンピュータ室に備え付けられているデスクトップ型のコンピュータではなく、児童が教室で空き時間に利用できるタブレット端末のコンピュータにより、算数問題解決の課題に気軽にアプローチできること、2児童を小学5年生1学期の成績に基づいて上位群、中位群、並びに下位群の3群に区分し、自己説明というメタ認知方略をコンピュータに組み込むことで算数問題の解決を吟味したとき、言葉を必要とする算数問題(転移課題)で上位群と下位群の差異が小さくなったことは、児童の適応的な処理の開発を試みた本研究成果として指摘できる。タブレット端末のコンピュータにメタ認知方略(自己説明)を組み込んだ算数問題解決システムを開発し、児童に算数問題を解決させた。研究期間は児童が小学5年生になった4月から6年生の12月までであった。研究の結果、6年生の12月に実施した転移テストで、上位群と下位群の成績の差異が小さくなった。このことは、メタ認知を組み込んだシステムの開発によって、適応的な算数問題解決者が育ってきたことを示すと指摘できる。当初は先行研究で使用した算数文章題を改良することで例題学習ツールを作成する予定であったが、研究を実施する小学校で試験的にタブレット型端末を使用したい旨の話があり、先行のプログラムを全面改良することとなった。その結果、プログラムが作成できたのが3月下旬であり、まだ完全にプログラムのチェックを終えていない。それゆえ、「おおむね順調」と回答した。今後の研究の推進方策は以下の2点である。1小学5年生時にとった児童一人ひとりの学習履歴や自己説明質問用紙の分析を丁寧にすること。2小学5年生時と同様に、小学6年生になった児童のデータを収集すること。ただし、小学6年生の3学期はたいへん忙しく、収集できるデータは2学期までである。教育心理学13年計画の2年目は、小学校に行き、5年生を対象に、1学期の終わりころに例題学習ツールを用いたタブレット型端末のコンピュータ利用の実証的研究を実施する。その後、2学期、3学期と、同じような研究セッティングによって、学習の実証データを得る。23年計画の最終年は、6年生になった児童に、1学期と2学期に、5年生時と同様の研究を実施し、3学期は研究成果のまとめを行う。海外の学会での発表を取り消すことによって、助成金が「0」より大きくなった。タブレット型端末のコンピュータを使って小学校で研究するため、児童数が30名を超える学級の児童対応として、少なからずタブレット型端末のコンピュータを購入する必要が生じたこと。小学校ではタブレット型端末のコンピュータを用意できないとのこと。次年度の8月には、海外の学会での発表を予定している。タブレット型端末のコンピュータの現在の在庫数は十数台である。これに78台程度をプラスすることで、各クラスの児童2名に1台の貸与が可能となる。
アトピー性皮膚炎増悪化予防に資する脂肪酸素材の微生物変換法と酵素法による生産

皮膚の微生物は健康と疾病に相関することから、アトピー性皮膚炎の炎症悪化に関与する黄色ブドウ球菌と、健康に寄与する表皮ブドウ球菌に注目した。Aeromonas hydrophilaは9cis-C18:1含有植物油を基質とした時、7cis-C16:1と5cis-C14:1を生産する。7cis-C16:1は黄色ブドウ球菌の生育を抑制し表皮ブドウ球菌の生育を抑制しない選択的抗菌活性があることから、この脂肪酸の精製を試みた。酵素法による精製は困難であったが、ODSカラムを用いれば7cis-C16:1を86%まで精製することができ、選択的抗菌活性が確認された。近年、アトピー性皮膚炎(Atopic dermatitis, AD)の対策が急務である。ヒトの皮膚には多種類の微生物が存在し、Staphylococcus aureus (Au)とS. epidermidis (Ep)に関する研究が盛んである。健常者の皮膚ではAuよりもEpが優勢に存在するが、AD患者の炎症部ではEpよりもAuが優勢に存在し、全菌数に占めるAuの比率が平均65%である(健常者;約1%)。このAuがADの炎症悪化に関与している。一方、Epは健常者の皮膚におけるAuの生育を阻害している。そこで、皮膚の菌叢を好ましい状態に保つ、つまりAuを抑制しEpを抑制しない素材の研究を目的とした。本年度は、ヒトの皮脂中に存在する6c-C16:1(サピエン酸)の異性体で、限定的な植物油に存在する9c-C16:1(パルミトオレイン酸)の、AuとEpに対する抗菌活性に及ぼす培地の初発pHの影響を調べた。pHを5.08.5の範囲とし、微量液体希釈法による最少生育阻止濃度を測定した結果、pH依存性が認められ、Auに対する抗菌活性が最も強いpHは6.0、Epに対するそれは7.0であり、中アルカリ性領域では両菌株に対する抗菌活性が同等であったが、弱酸性領域では選択的抗菌活性を示す、つまりAuを抑制しEpを抑制しないことが分かった。これらの結果より、ADと健常者の皮膚表層pHと6c-C16:1含量、ADでAuが増える現象との相関関係が説明できる。また、AuとEpを混ぜたpH6.0の培地に9c-C16:1を添加すると、Epだけが生育し、目的とする素材として有用であることも分かった。また、近畿大学農学部岸本憲明教授との共同研究の結果、9c-C16:1を暴露したAuは、低分子のタンパクを培地に放出しており、これが抗菌活性に寄与していることが示唆された。微生物と健康の関わりは腸内細菌だけではない。皮膚の菌叢も健康と疾病に大きくかかわっている。ここでは、アトピー性皮膚炎(Atopic dermatitis, AD)などの皮膚疾患と菌叢の関係に注目した。健常者の皮膚ではAuよりもEpが優勢に存在するが、AD患者の炎症部ではEpよりもAuが優勢に存在し、ADの炎症悪化に関与している。従来の活性評価法は、液体培地を用いた単一微生物に対する最少生育阻止濃度である。本研究の最終目的は、複数微生物が混在する皮膚へ塗布する医薬部外品・化粧品素材であり、前記の評価法は実情に合致しない。そこで本年度は、Epだけが生育してくる素材開発を目的とし、皮膚塗布モデル系として、AuとEpが共存する寒天培地を用いて、どちらの微生物が優先化するかを調べる新規抗菌活性評価法を開発した。詳細な手法は略するが、両菌株を塗布した寒天プレートに、配合品(この中に9c-C16:1を懸濁)を、化粧品の現実的な塗布量に近い2mg/cm2で寒天表面に塗布して培養した。生育してきた菌を回収し、両菌の違いの判別が可能な卵黄添加マンニット食塩寒天培地に塗布後、生育してきた両菌株の相対比を求めた。その結果、皮膚表層が弱アルカリ性であるアトピー性皮膚炎を模したpH7.5の寒天培地の時、C16:1が2500ug/mLの試料懸濁液を塗布してもAuが抑制されず、両菌株がほぼ同等に生育した。寒天培地のpHが酸性側にシフトするにつれて、Auが抑制される傾向が認められた(Epは生き残る)。健常者の皮膚を模したpH6.0の寒天培地を用いた時、C16:1が156ug/mL以上の試料懸濁液を塗布したとき、Auが完全に抑制され、Epが生き残る選択的抗菌活性が認められた。年度当初の計画は新しい抗菌活性の評価法である。この評価法を完成し、また、健常者とアトピー患者の菌叢の違いも証明できたことから、本年度の計画は順調に進展した。我々が単離した細菌Aeromonas hydrophila N-6 (以下N6株)は、植物油(TAG)を基質とした時、原料油を構成する脂肪酸の炭素数を2-4個減少させ、ワックスとして菌体内に蓄積する。

9cis-C18:1(オレイン酸)を豊富に含む向日葵油(9cis-C18:1含量81%)を基質としたとき、7cis-C16:1と5cis-C14:1の混合物(N6脂肪酸)が蓄積されるため、得られた脂肪酸混合物から7cis-C16:1を精製する必要がある。N6脂肪酸とラウリルアルコールをリパーゼ(R. japonicusまたはC. rugosa由来)でエステル化後、エステル画分と未反応脂肪酸画分の脂肪酸組成を調べた。その結果、いずれのリパーゼを用いても、9cis-C18:1は除去できたが、5cis-C14:1が除去されず、7cis-C16:1を精製できなかった。これは、両リパーゼは、カルボン酸と、カルボン酸側から最初に来る二重結合の距離が重要であり、9cis-C18:1に良く作用するが、7cis-C16:1と5cis-C14:1の作用性に差がないためである。従って、リパーゼによる7cis-C16:1と5cis-C14:1の分画は困難と判断した。次に、工業スケールに適用可能なODSオープンカラムを用いた精製を試みた。ODSを充填したカラムにN6脂肪酸をアプライし、メタノール:水:トリフルオロ酢酸=95:5:0.05で溶出させたところ、7cis-C16:1と5cis-C14:1が分画され、7cis-C16:1含量が86%になった。抗菌活性を調べたところ、Auを抑制しEpを抑制しない選択的抗菌活性が認められた。本研究の目的は7cis-C16:1の精製である。ODSオープンカラムで精製できたが、最も研究成果を望んでいた酵素法による精製は、リパーゼの基質特異性に問題があり、達成できなかった。研究期間を延長し、より良い研究にするため、その原因について調べる。我々が単離した細菌Aeromonas hydrophila N-6 (以下N6株)は、植物油(TAG)を基質とした時、原料油を構成する脂肪酸の炭素数を2-4個減少させ、ワックスとして菌体内に蓄積する。昨年度は、N6脂肪酸とラウリルアルコールをリパーゼでエステル化後、エステル画分と未反応脂肪酸画分の脂肪酸組成を調べた。その結果、9cis-C18:1は除去できたが、5cis-C14:1が除去されず、7cis-C16:1を精製できなかった。延長した本年度では、その原因を突き詰めた。9cis-C18:1と9cis-C16:1が等量混合しているシーベリーという植物油を用いて前記と同じ手法で反応させたところ、9cis-C18:1よりも9cis-C16:1の方が反応速度が早いことが分かった。つまり、反応性の順番は、9cis-C16:1>9cis-C18:1>7cis-C16:1, 5cis-C14:1であり、C. rugosaリパーゼは、9位にcisのある脂肪酸に最も良く作用する事、同じ9位にcisがある場合は炭素数18個よりも16個の方が反応速度が速いことが分かった。皮膚の微生物は健康と疾病に相関することから、アトピー性皮膚炎の炎症悪化に関与する黄色ブドウ球菌と、健康に寄与する表皮ブドウ球菌に注目した。Aeromonas hydrophilaは9cis-C18:1含有植物油を基質とした時、7cis-C16:1と5cis-C14:1を生産する。7cis-C16:1は黄色ブドウ球菌の生育を抑制し表皮ブドウ球菌の生育を抑制しない選択的抗菌活性があることから、この脂肪酸の精製を試みた。
界面応力伝達を考慮した繊維強化金属の強化機構

連続繊維強化金属の力学的特性に及ぼす界面力学特性の影響ならびに界面力学特性の評価解析手法について検討した。界面力学特性を調べるためにプッシュアウト試験装置を試作し、sic繊維(scs-6)強化Ti系複合材料を用いて界面せん断エネルギー解放率、界面せん断滑り応力を定量的に求めることが可能となった。複合材料の界面せん断エネルギー解放率は反応層厚さによらずにほぼ一定の値であり、界面せん断滑り応力は反応層厚さではなく剥離した界面の凹凸により大きく異なることが明らかになった。また、界面せん断滑り応力は滑りが生じている界面の凹凸の形状、界面摩擦係数、および、繊維半径方向の残留熱応力成分を求めることにより定量化することが可能となった。界面せん断力学特性、複合材料を構成する繊維、マトリックスの特性を含む形の複合材料の引張強度を与える理論式を導きsic繊維強化Ti系複合材料を用いて実験結果との対応を調べた。その結果、本研究で求めた界面力学特性を含む複合材料の理論式は、複合材料強度の試験片寸法依存生、複合材料強度の温度依存性を定量的に評価することが可能であった。さらに、この理論式に用いられている界面せん断力学特性を項のプッシュアウト試験から求められる界面力学特性を支配する因子をパラメータとして組み込んだ理論式を導出した。以上のように本研究により(i)繊維強化金属の界面せん断力学特性の実験的評価手法、(ii)界面せん断力学特性を用いた複合材料強度の定量的理解が可能となった、(iii)複合材料の引張強度に及ぼす構成素材、界面力学特性の定量的解釈、などの点が明らかになった。連続繊維強化金属の界面応力伝達機構の解明および界面力学特性の複合材料特性に及ぼす影響を実験的に調べた。その結果、次の結論が得られた。(1):繊維強化金属の界面応力伝達機構は大別して(1)繊維ーマトリックス間の化学的結合によるもの、(2)繊維ーマトリックス間の物理的状態によるもの、の2種類に分類することができる。前者の化学的結合は界面が剥離する前に支配的な機構であり繊維ーマトリックス界面の反応性に大きく依存する。一方、後者の物理的な状態によるものでは界面の滑りが最も重要な機構であり、繊維強化金属ではこの状態にある場合の界面せん断応力C^^はC^^(]SY.apprxeq.[)μσγで記述できることが明らかとなった。ここで、μは界面のすべり摩擦係数、σγは繊維軸に垂直な方向の応力(半径方向の応力)であり繊維強化金属の場合には降状応力で与えられる。(2):繊維強化金属の引っ張り特性に及ぼす界面力学特性の影響を調べた結果、複合材料の引っ張り特性は従来から広く用いられている連続繊維強化金属の引っ張り強度に関する複合則は試験片形状が特別な場合にのみ適用することが可能であることが確かめられた。また、実験との対応は、従来の短繊維型の複合則に界面せん断力学特性を組み込むことにより正しく行なえることが明らかとなった。(3):(1)、(2)の項目を実験的に証明するためにSiC繊維強化Ti基複合材料を用いて、(1)界面せん断力学特性の測定、(2)引っ張り強度の温度依存性を調べた。その結果、複合材料の力学特性(特に引っ張り特性)は実測した界面せん断特性と修正した複合則を用いて表わすことができることが確かめられた。本年度は昨年度試作した界面力学特性測定装置を用いて、SiC繊維強化Ti系複合材料を用いて薄板プッシュアウト試験ならびにプルアウト試験を行った。その結果を用いて界面せん断滑り応力の発生機構について考察した。せん断滑り応力(τ_s)が界面の半径方向応力(σ_r)と界面の摩擦係数(μ)の積で表わされる(τ_s=μσ_r)と仮定し、μおよびσ_rを定量的に求めた。

その結果、界面せん断滑り応力は(1)界面の凹凸によるインターロッキング機構、(2)マトリックスの塑性変形による繊維半径方向の拘束、(3)試験時の繊維半径方向のポアッソン比の拘束、によるものであることが明らかになった。(1)(3)の値を具体的に求めて比較すると、せん断滑り応力の発生に最も大きく影響する因子は製造時にプロセス温度から室温までの冷却時に発生するマトリックス中の残留熱応力であることが明らかになった。繊維強化金属系複合材料の引張強度を界面せん断力学特性を用いて定量的に求めるための理論式を作製した。理論では、複合材料に加わる引張応力により界面の剥離、滑り挙動を組み込んだものとした。界面せん断剥離、滑り応力を含む形の複合則を理論的に求め、プッシュアウト法により求めた値を用いて複合材料の引張強度を求めて理論値と比較検討した結果良い一致が得られた。特に、従来から繊維強化金属系複合材料の引張強度の温度依存性については明確な理論式が提案されていなかったが本研究で提案した理論式を適用したところ実験結果を説明することが可能であった。繊維強化金属の界面力学特性と複合材料の引張強度との関連性を検討した。実験にはSiC(SCS-6)繊維強化Ti系複合材料を用いてプッシュアウト法による界面せん断剥離エネルギー開放率ならびにせん断滑り応力を求めた。SiC繊維強化Ti-15-3複合材料の場合、界面せん断剥離エネルギー開放率は10J/m^2以下であり、界面せん断滑り応力は80120MPa程度であった。この界面せん断剥離エネルギー開放率は、反応層が破断した後にクラックは繊維の破断を生じずにディフレクトする条件範囲であり、界面せん断滑り応力はマトリックスのせん断降状応力よりも小さな値であった。プッシュアウト法により求められる界面せん断力学特性を用いて複合材料強度を求める理論式を理論式を導出した。また、導出した理論式と複合材料の引張強度の対応について検討した。その結果、複合材料の実験により求めた引張強度と理論値はよく一致した。また、複合材料の引張強度と界面せん断力学特性との間の相関性についてシミュレートすることが可能となった。以上のことから連続繊維強化金属の引張特性を界面応力の伝達機構を含む形の複合則により定量的に表現しうることが確認された。また、前年度までの結果を再整理することにより、界面特性制御によるによる複合材料強度向上の可能性ならびにSiC繊維強化Ti系複合材料での実験的検証を行うことができた。なお、本研究で得られた基本的な考え方は他種の繊維強化金属へも適用することが可能である。
スルメイカ神経系の新規アスパラギン酸ラセマーゼに関する生化学的研究

スルメイカTodarodes pacificus神経系における遊離アスパラギン酸(Asp)含量を確認するため、視神経節におけるL体およびD体のAsp含量を測定した。その結果、組織1gあたりL-Aspは1.83μmol、D-Aspは1.57μmol存在し、全Aspの46.2%がD体であった。また、スルメイカ視神経節におけるアスパラギン酸ラセマーゼ(AspRase)活性を調べるために、視神経節から粗酵素液を抽出した。その粗酵素液に、基質としてL-Aspおよび補酵素としてピリドキサール-5'-リン酸を加え、37°Cで16時間インキュベートしたところ微量のD-Aspが生成した。L-AspからD-Aspへの粗酵素活性は28nmol/mg・hと低い値であった。次に、発現クローニングによりスルメイカ視神経節からのAspRase遺伝子の単離を試みた。まず、cDNAライブラリーを作製する必要があるため、視神経節からRNAを抽出した後、二本鎖cDNAの合成を行った。しかしながら、二本鎖cDNAが充分量合成できなかったため、ライブラリーサイズが極端に小さなものとなってしまった。したがって、まずは充分量の二本鎖cDNAを合成するため、数種類のキットを用いたが、どの場合においても良い結果は得られなかった。また、二本鎖cDNAのベクターへのライゲーション効率も悪く、発現クローニングを行うに充分なクローン数を得ることができない一因となった。今後は、発現クローニングを行うためにも二本鎖cDNAを効率よく合成し、充分なクローン数を得る必要がある。本研究では、アスパラギン酸(Asp)のラセミ化を触媒する酵素であるアスパラギン酸ラセマーゼ(AspRase)遺伝子のクローニングを目的とした。試料として用いたのは、多量のD-Aspの存在が確認されているスルメイカTodarodes pacificusの視神経節である。はじめに、HPLCを用いてスルメイカ視神経節におけるAsp含量の測定を行ったところ、D-Aspの存在が確認されるとともに、D体とL体の比がほぼ1 : 1であることが明らかとなった。同じ頭足類であるマダコOctopus vulgarisの視神経節では、D体の含量の方が多いため、種によってその比率が異なる可能性が示唆された。次に、スルメイカ視神経節におけるAspRase活性の測定を行った。L-Aspを基質とし、視神経節から得られた粗酵素液を加え37°Cで24時間インキュベートしたところ、少量のD-Aspの生成が確認された。粗酵素液におけるAspRase活性は非常に低いものであったが、HPLCで確認可能であることが示された。さらに、AspRase遺伝子クローニングのための準備も進めている。スルメイカ視神経節からAspRase様遺伝子は得られているが、大腸菌をはじめ様々な発現系を用いて、リコンビナントタンパク質を発現させたが、すべてにおいて活性は検出されなかったため、新たなAspRase遺伝子候補の探索が必要となっている。したがって、視神経節由来のcDNAライブラリーを作製した後、遺伝子を動物細胞に発現させ、その活性を追うことで最終的に単一クローンにするという発現クローニングの手法を用いる。現在、cDNAライブラリーを作製中である。当初は、すぐにスルメイカ視神経節からcDNAライブラリーの作製を行う予定であったが、スルメイカ視神経節におけるアスパラギン酸のD, L比やアスパラギン酸ラセマーゼ活性についての情報が乏しかったため、はじめにそれらの測定を行った。それらの測定が完了してからcDNAライブラリーの作製に取り掛かったため、予定より遅れてしまうこととなった。目下、スルメイカ視神経節由来のcDNAライブラリーを作製中である。作製が完了次第、発現クローニングが実施できる状態にある。したがって、今後は発現クローニングによりアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子の単離を試みる。

遺伝子を単離した後は、塩基配列の解析を行い、他生物種の各種アミノ酸ラセマーゼとの分子系統関係を明らかにする。本研究によって明らかとなった塩基配列情報をもとに他の頭足類や哺乳類のAspRase遺伝子同定の足掛かりとする。次に、大腸菌によるリコンビナントAspRaseの発現および活性測定を行い、最適温度や最適pHなどの酵素学的特徴を明らかにする。また、活性中心と予想されるアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変異体を作製し、AspRase活性にどのような変化が現れるのかを調べ、活性に重要なアミノ酸残基を特定する。さらに、スルメイカの神経系におけるアスパラギン酸ラセマーゼの分布についても検討する。まず、大腸菌発現系で得られたAspRaseをもとに抗体を作製する。次に、視神経節や脳神経節の切片を作製し、AspRase抗体による抗体染色を行う。D-Asp抗体による染色も同時に行い、神経系におけるD-AspとAspRaseの分布領域を明らかにする。AspRaseの特異的抗体が作製できなかった場合はin situハイブリダイゼーションを行い、AspRase遺伝子転写産物の分布を明らかにする。平成29年度は発現クローニングを行う予定であったが、当初の予定より遅れたために発現クローニングを行うことができなかった。したがって、その予算を使うことができず、次年度使用額が生じた。平成30年度は発現クローニングを行うので、次年度使用額をその費用として用いる。また、今年度予算は当初の予定通り、リコンビナントタンパク発現や抗体作製および実験系プラスチック類などに用いる予定である。
蛍光プローブによる生きたガン細胞での脂肪酸代謝活性解析と阻害剤開発

様々な疾病での代謝経路の活性は通常細胞と大きく異なるため、代謝経路活性の評価は疾病メカニズムの解明や創薬に必須である。最近では細胞ごとの代謝不均一性の解明が求められているが、従来の安定同位体標識化合物の代謝挙動を追跡する手法では細胞集団の平均化された情報しか得ることができない。一方蛍光プローブは酵素活性を細胞レベルで検出することが可能であり代謝経路活性の評価の強力なツールとなりうるが、代謝酵素の基質選択性の高さからそのような蛍光プローブは開発されていない。そこで、代謝経路活性を検出可能な蛍光プローブの開発を目指しており、本研究では重要なエネルギー生産経路である脂肪酸β酸化(β酸化)に着目した。前年度において生細胞内でβ酸化を検出可能な蛍光プローブを開発した。本年度では、外部刺激によるβ酸化活性変化を検出可能か検討した。β酸化の活性化剤や阻害剤を培養細胞に添加したところ、細胞内のプローブ蛍光が薬剤濃度依存的に増加または減少した。さらに、マウス肝臓の初代培養細胞でのβ酸化活性の検出を検討した。肝臓ではβ酸化が亢進されているが、大きな健康問題であるNASH(非アルコール性脂肪肝炎)とβ酸化の関連が報告されている。まず健常マウス肝臓の初代培養細胞でβ酸化活性を検出できることを、蛍光イメージングとHPLCで確認した。続いてNASHマウス肝臓の初代培養細胞にプローブを添加したところ、プローブ蛍光は大きく減少した。さらに、NASHのモデル薬剤を経口投与したNASHマウス肝臓の初代培養細胞ではプローブ蛍光が大きく上昇したことから、本プローブを用いて培養細胞やマウス肝臓の初代培養細胞でもβ酸化活性の変化を検出可能であることがわかった。さらに、本プローブを用いてβ酸化活性を変化させる化合物を探索するスクリーニング系を構築した。今後β酸化活性を変化させる新規化合物の発見が期待される。ガン細胞での代謝は通常細胞と大きく異なるため、これを解明し創薬につなげる研究が盛んに行われている。しかし、従来の同位体標識した化合物などを用いる手法では細胞を破砕するため、生細胞での情報を得ることは難しい。そこで生細胞での解析を可能とする蛍光プローブの開発が望まれるが、代謝関連酵素の基質選択性の高さなどが原因となり、代謝経路を検出するための蛍光プローブの開発例はほとんど無い。本研究では代謝経路、特に最近ガン細胞での重要性が指摘されて始めた脂肪酸β酸化を検出するための蛍光プローブを初めて開発することを目指す。これによりガン細胞の脂肪酸β酸化依存性を生細胞で初めて明らかにすること、さらに蛍光イメージングを利用した新規阻害剤の探索を目標とする。平成29年度においては、脂肪酸β酸化を蛍光イメージングするシステムの構築を目指した。脂肪酸β酸化の進行に伴う色素の自発的脱離を蛍光センシングシステムとして採用し、蛍光色素に脂肪酸を導入したプローブを設計した。基質となる骨格を探索するために様々な骨格の蛍光色素を有するプローブ群を合成し、これらを肝臓ガン由来のHepG2細胞に添加しその挙動をHPLCで解析した。その結果クマリンを有するプローブが脂肪酸β酸化の基質となりうること、さらにクマリン骨格を検討することでβ酸化の進行とともにクマリンが放出されるプローブの開発に成功した。この挙動は共焦点レーザー顕微鏡でも確認され、脂肪酸β酸化の生細胞でのイメージングに初めて成功した。本システムは、従来の単一の酵素反応のみを検出するのではなく、複数の酵素群からなる代謝経路を検出可能である点でも新しい手法である。脂肪酸β酸化の進行に伴い蛍光色素が放出されるシステムの構築に成功したこと、さらにそれを用いて生細胞での脂肪酸β酸化の検出に初めて成功したことから、本研究計画は概ね順調に進展していると考えている。

今後β酸化活性を変化させる新規化合物の発見が期待される。他のガン細胞株での脂肪酸β酸化の検出を行うことで、ガン細胞株ごとの脂肪酸β酸化活性の違いを生細胞蛍光イメージングによって検討する。また、様々な刺激に伴う脂肪酸β酸化活性の変化を生細胞で初めて明らかにし、本システムが脂肪酸β酸化活性を生細胞で評価可能であるツールであることを示す。さらに、脂肪酸β酸化の阻害剤はほとんど知られていないことから、蛍光イメージングを基にした阻害剤アッセイにも挑戦する。
時間相関型イメージセンサの実用化開発と新しいパターン計測技術への応用研究

本研究では,時間相関イメージセンサデバイスの性能向上と応用計測技術の発展の両面に関して、飛躍的な進展を実現することができた。デバイス面では,企業との密接な協力のもと,これまでの研究で明らかになった設計指針と理論的数値的な解析によって基本設計を行い,この設計を企業側が固有の半導体プロセスに適合させるように修正し,また固有のIPを組み合わせることにより具体設計を行い,320x256画素の実用に近いデバイスを完成させた。またカラー化,多チャンネル化も実現した。応用計測技術の面では,上記デバイスを用い,科学技術研究ならびに産業応用向けの新規で高性能な計測技術と映像化技術の実現に向けた研究開発を遂行した。原理的ならびに技術面でのポイントは,1)三相型によって可能になる振幅と位相の同時検出能力の活用,2)種々の物理量-光変換効果との連携による光以外の場のパターン計測法への展開,3)波長領域の赤外への拡張による物質分布・特定への応用,が研究の主要な方針となる。1)については,新たにレーザと音響光学素子によるヘテロダイン干渉法と組み合わせた実時間三次元画像化法ならびに実時間音響振動映像法を実現した。2)においては,実時間の白色干渉イメージャと光コヒーレンストモグラフィーイメージャの実現,鋼板表面の漏洩磁束とファラデー結晶・偏光計測手法を用いた表面検査映像法を実現した。3)においては,特にスペクトルマッチングイメージャの波長領域の拡張に関して,本研究での成果を受け手の浜松の知的クラスタ事業と連携した展開を現在進めている。本研究は,平成11年度から科学研究費の補助により基礎研究を進めてきた時間相関型イメージセンサのさらなる発展と展開を目的とする。ここで時間相関型イメージセンサとは、入力光パターンと全画素共通の参照信号との時間相関を各画素ごとに生成し出力する,申請者の提案による新規で独自な集積化半導体デバイスであり、能動的手段により入力光パターンに時間変調を与え,それをセンサ上で復調するという新しい画像計測の原理を与えるものである。本年度の成果は以下のようにまとめられる。1)多重極タグによる位置・姿勢推定背面に反射板を接着させた偏光板により空間的な偏光パターンを持つタグを作成し,これを偏光面が回転する直線偏光光で照明することで,多重極タグと呼ぶ時空間光強度パターンを生成する.この多重極タグの持つ性質を明らかにし,時間相関イメージセンサにより撮像することで,タグの位置・姿勢を推定するシステムを構築した.2)時空間変調による光通信通常モードでは通信対象を面的に探索し、対象を発見し通信を確立すると数ピクセルの縮小領域を高フレームレートでスキャンすることで,より高速な通信帯域を持つ通信を実現するシステムを構築した,本手法では,1)光強度の振幅・位相に情報を符号化すること,2)縮小操作によるフレームレートの増大,により広帯域での光通信が可能となった.3)実時間白色干渉イメージャ白色干渉計にピエゾアクチュエータを用いたミラーの微小振動と時間相関イメージセンサを組み合わせることにより、微細構造物の三次元形状計測および任意断面実時間モニタリングを実現した.4)オプティカルフロー推定時間相関イメージセンサの参照信号として正弦波を用いた複素正弦波変調撮像法により得られる強度画像と相関画像の間にオプティカルフロー恒等式が成立することを導いた.これにより,時間差分を必要とせず1フレームにてオプティカルフローの復元が可能となった.正弦波変調撮像法によるオプティカルフロー検出の実現従来の撮像装置により取得された画像はシャッター時間の積分により動きによりボケが生じてしまうという問題があある。参照信号として正弦波を用いた場合に時間相関イメージセンサによって得られる強度画像・複素正弦波変調画像の間に厳密に成り立つオプティカルフロー恒等式を導いた。

この関係が時間を含まずに厳密に成立することから,これまでのオプティカルフロー検出法の欠点であった時間軸方向の差分を必要とせずに単一フレームのみでピクセルごとに対象の速度ベクトルを復元でき,フレーム間差分近似の精度に由来する対象速度の制限も取り除かれる.動的な白色光干渉に基づく三次元形状・振動分布映像法の研究MEMSのような微小物体の三次元形状や振動分布をnmの精度で計測するシステムを構築した。白色干渉計に鏡の微小振動を導入し、干渉画像を時間相関型イメージセンサで復調することにより、着目する深さでの複素反射率分布を実時間で可視化する。本システムでは実時間化の他、参照信号を任意の時間波形に設定できる時間相関イメージセンサの特色を活かし、等価的な逆フィルタを相関演算で実現することにより、深さ方向の解像力が格段に向上する。さらに、近年注目を浴びているMEMS分野で多大なニーズがある多層構造物の微小振動の振幅・位相分布を計測することに成功した。時間相関イメージセンサデバイスの高性能化,高解像度化具体的には,新たな構造としてチップ内にAD変換器と加算器とメモリを導入したディジタル累積と,画素レンズの導入を行った。ディジタル累積は等価積分容量を飛躍的に増大させ,あわせて画素の積分容量の小型化を可能にし,解像度,ダイナミックレンジ,周波数特性の全てを改善する。画素数に関しては,三相で320x256を実現し,さらに3相3チャネル型時間相関イメージセンサの実現に成功した。位相スタンプ撮像による流れ場のパターン計測多数の要素が多次元を複雑に運動する流れ場の計測は,飛翔体の最適形状設計,三次元情景の動画像解析等々,さまざまな分野で重要な役割を果たしている。本研究では,時間相関イメージセンサを利用して運動体の軌跡上に時間情報を埋め込むことで,流体に混濁する個々の粒子の弁別を容易にし,それにより高時間分解能かつ高空間分解能での流れ場計測法を実現した。
モデルショウジョウバエを用いたALSの分子病態の解明と新規標的治療薬の開発

今年度我々は家族性ALSの原因遺伝子であるFused in Sarcoma(FUS)のショウジョウバエホモログであるCabeza(Caz)のノックダウンモデルと家族性ALSの危険因子でありCharcot-Marie-Tooth(CMT)病の原因遺伝子であるFactor-induced-Gene4(FIG4)のショウジョウバエホモログであるdFIG4のノックダウンモデルを用いて、複数のALSの病態に関わる因子に共通して作用する遺伝子を探索しALSの病因に関わる共通経路を見出すことを目的とした。(1) ALSの危険因子であり、CMTの原因遺伝子であるFIG4のショウジョウバエホモログdFIG4のノックダウンモデルを我々は樹立している(Exp Neurol. 2016 Mar;277:86-95)。引き続き行っている遺伝学的スクリーニングから、dFIG4モデルの表現型を修飾する新たな遺伝子としてHippo (hpo) (ヒトホモログMST)を同定した。HpoはdFIG4モデルで認められる運動障害、神経変性、リソソームの拡大などの表現型を改善することを明らかにし報告した。(2) Cazのloss-of-functionモデルで観察される成虫複眼の形態異常を指標とした遺伝学的スクリーニングから、Cazと相互作用する新たな遺伝子hpoを同定した。我々の結果では、hpoの機能を低下させるとcazの機能喪失によって引き起こされる複眼の形態異常、運動能力低下、神経筋接合部におけるsynaptic branch及びsynaptic boutonの減少が改善した。さらに、hpoの機能を低下させることにより、核内で低下したCazが、再び核内で部分的に機能していることを免疫組織学的及びタンパク化学的分析により明らかにした。他結果を合わせALSの病因に関わる重要な共通分子としてMSTを見出し報告した。本研究の目的は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のショウジョウバエモデルを用いて、1)家族性ALSの原因遺伝子Fused in sarcoma (FUS)あるいはTAR DNA-binding protein43 (TDP-43)に共通して相互作用する遺伝子を同定し、ALSの原因遺伝子および関連分子の相互作用を解明すること、及び2)新規標的治療薬候補を探索し、臨床応用への展開を目指すことである。今年度は、(1)複数のALS原因遺伝子に共通に関わる遺伝子の同定:ALSの原因遺伝子であるFUS及びTDP-43のショウジョウバエホモログCaz及びTBPHをノックダウンしたショウジョウバエモデルを用いて、その表現型を修飾する遺伝子を探索した。遺伝学的相互作用の候補分子の突然変異系統それぞれとALSモデルショウジョウバエをそれぞれ交配し、複眼の形態学的変化、運動能力の低下や神経筋接合部におけるシナプスの携帯げ区的変化などALSモデルショウジョウバエが示す表現型が改善するか検討を行った結果、複数の関連候補遺伝子を同定しつつある。これらについて現在論文にまとめており、今後投稿予定である。(2)ALS治療薬候補物質の探索:治療薬候補薬剤を、以前我々が報告しているFUS-ALSモデルショウジョウバエに経口投与し、それらが示す表現型が改善するか検討を行っている。現在、ショウジョウバエFUSノックダウンによる複眼の形態学的異常が改善する標的候補薬剤を複数同定しつつある。平成28年度の計画であるFUS及びTDP-43のショウジョウバエホモログであるCaz及びTBPHに共通して相互作用する候補遺伝子を複数同定しつつある。また薬剤スクリーニングに関しても予備実験は完了しており、特に技術的な問題点無く、現在複眼の表現型に関して解析を行うことができている。以上のことから、全体的に当初の研究計画がおおむね順調に進展していると評価した。本研究の目的は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のショウジョウバエモデルを用いて、1)家族性ALSの複数の原因遺伝子に共通して相互作用する遺伝子を同定し、ALSの原因遺伝子および関連分子の相互作用を解明すること、及び2)新規標的治療薬候補を探索し、臨床応用への展開を目指すことである。今年度は(1)前年度から引き続き行っている複数のALSモデルショウジョウバエを用いた遺伝学的スクリーニングから、TDP-43のショウジョウバエホモログであるTBPHをノックダウンして作成したモデルの表現型を改善する分子としてVCP(ショウジョウバエホモログter94)を新たに同定した。オートファジーおよび核細胞質輸送に関与する蛋白質であるVCPが、TBPHノックダウンモデルの運動障害及び運動神経変性を修飾することを明らかにし、Am J Neurodegener Disに報告した。また、FUSのショウジョウバエホモログであるCazのノックダウンモデルで観察される成虫複眼の形態異常、運動能力低下、神経筋接合部における神経変性などの表現型を修飾する新たな分子を同定し現在論文投稿中である。(2)ALS治療薬候補薬剤を、Cazノックダウンモデルショウジョウバエに経口投与し、複眼の形態学的変化を改善する標的候補薬剤を複数同定し、現在神経系における解析をすすめている。平成29年度の計画であるFUS及びTDP-43のショウジョウバエホモログであるCaz及びTBPHに共通して相互作用する候補遺伝子VCP(ショウジョウバエホモログter94)を新たに同定し、Am J Neurodegener Disに報告した。またFUSと相互作用する新たな遺伝子についても現在論文にまとめて投稿中である。