hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄幹細胞からのインスリン産生細胞の分化誘導の試み

本研究では、骨髄細胞にPDX-1など膵β細胞の発生・分化に関わる転写因子の遺伝子を導入し、インクレチンの一つであるGLP-1刺激を加えることにより、幹細胞からのより効率の高いインスリン産生細胞の発現を目指し、その分化プロセスに関わる転写因子発現などの解析を行った。その結果、PDX-1の強制発現よりGLP-1アナログの投与の方が、よりインスリン産生細胞の出現率を増加させ、双方の刺激を加えると相加的効果があることが示された。また、得られたインスリン産生細胞はβ細胞に特異的なinsulin-1、insulin-2、PDX-1、GlucoseTransporter2、glucokinase、GLP-1受容体等の遺伝子の発現が認められた。研究概要:骨髄細胞よりインスリン産生細胞(IPC)を作成し移植に使用することが出来れば、根本的糖尿病治療法となりうる。本研究では、骨髄細胞にPDX-1など膵β細胞の発生・分化に関わる転写因子の遺伝子を細胞に導入し、インクレチンの一つであるGLP-1の刺激を加えることにより、幹細胞からのより効率の高いIPCの発現を目指し、その分化プロセスに関わる転写因子発現などの解析を行った。1. 68週齢のマウスから単離した骨髄幹細胞を、単離後2日間DMSO添加したFCS(-)培養液で培養し、その後4.5g/L DMEMで培養すると約1421日目に約半数のdishで細胞の集簇、膵島様細胞塊が形成された。2. CMV promoter下にPDX-1を発現するプラスミドをリポフェクション法により培養1014日目に骨髄幹細胞に遺伝子導入を行い、培養42日目にIPCの出現率を検討したが、PDX-1の発現はIPCの誘導にほとんど影響を及ぼさなかった。3.インクレチン刺激がIPCの誘導に寄与するかを検討するため、GLP-1アナログのExendin-4(Ex-4)を培養液に10nM加え、PDX-1の強制発現の有無とEx-4の有無でIPCの出現率を検討したところ、Ex-4刺激下で有意にIPCの発現増加を認めた。4. IPCのプロファイルを検討するため、β細胞に特異的なinsulin-1、insulin-2、PDX-1、GlucoseTransporter2、glucokinase、GLP-1受容体等の発現をRT-PCR法により検討したところ、PDX-1以外の発現は認められたが、PDX-1については強制発現していないものでは僅かな発現しか認められず、骨髄幹細胞からIPCへの分化誘導の際には重要な因子ではない可能性が示唆された。今後IPCの分化誘導により重要な働きを持つ因子を検索し、IPC分化誘導効率を検討する予定である。骨髄細胞よりインスリン産生細胞(IPC)を作成出来れば、根本的糖尿病治療法となりうる。本研究では、骨髄細胞にPDX-1など膵β細胞の発生・分化に関わる転写因子の遺伝子を細胞に導入し、インクレチンの一つであるGLP-1刺激を加えることにより、幹細胞からのより効率の高いIPCの発現を目指し、その分化プロセスに関わる転写因子発現などの解析を行った。2. PDX-1発現プラスミドをリポフェクション法により培養1014日目に骨髄幹細胞に遺伝子導入を行った群とGLP-1アナログ投与群を比較したところ、IPC陽性率はEx-4投与群で有意に高かった。また、PDX-1発現とGLP-1の同時投与は相加的にIPC発現率を上昇した。3. β細胞に特異的なinsulin-1、insulin-2、PDX-1、GlucoseTransporter2、glucokinase、GLP-1受容体等の発現をRT-PCR法により検討した結果、PDX-1以外の発現は認められたが、PDX-1については強制発現していないものでは僅かな発現しか認められなかった。4. Ex-4投与群では、非投与群に比し21mMブドウ糖培養液に対する24時間インスリン分泌量が約12倍高く、Ex-4による刺激がIPC産生を誘導すると共にインスリン合成・分泌にも促進的に働いている可能性が示唆された。
下肢障害のある人の住宅選択・確保の過程から分析した住宅支援施策の課題

本研究では、脊髄損傷による下肢障害のある人を対象とした質問紙および面接調査と、その居住自治体の支援サービスに関する調査から、住宅選択・確保する際に直面する困難およびその構造の一端を明らかにした。すなわち、(1)住宅改善が障害のある人の経済的負担や賃貸住宅での入居制限などの住宅確保の困難につながっていること、(2)この背景には、障害のある人の住宅に対する公的支援の限界、バリアフリー化住宅の量的不足があり、(3)ひいては住宅確保を国民の自助努力とし、住宅を個人の資産ととらえてきたわが国の住宅支援施策からもたらされていること、である。平成21年度では研究実施計画に基づき、以下を行った。1.平成19年度に実施済みの「下肢障害のある人の住宅確保及び支援の実態に関する質問紙調査」の再分析上記調査の再分析によって、入居拒否に見られる住宅確保上の障壁は実際にあるが、地域差はあまり認められないこと、そして住宅支援に関する情報に接する機会や支援を受けた経験は首都圏居住者にやや多い傾向があることなどが明らかになった。しかし、いずれも大きな有意差は示されなかったことから、下肢障害のある人の状況はさまざまであり、具体的かつ詳細に実態を把握する必要性を確認した。すなわち次年度以降に計画している面接調査を実施することの有用性が確認できた。2.住宅支援施策および障害者施策に関する文献の収集上記調査の再分析および次項のプレ調査に集中して取り組んだため、文献、先行研究とも最近刊行・発表されたものの収集にとどまっている。次年度も継続して行う必要性がある。3.平成22年度に行う予定の面接調査に関するプレ調査の実施6名の下肢障害のある人に対してプレ調査を実施した。調査データの整理を終えた段階であり、本調査項目の検討と決定が次の作業として残っている。なお、本年度では面接調査への協力依頼を行う予定だったが、上記の質問紙調査結果の報告を兼ねて行うことで調査に協力くださる人が増えると考え、報告書の作成を行うことにした。そのため年度内に完了しなかった。(2010年4月末現在、調査依頼済み)本年度は、本研究の中心となる下肢障害のある人に対する面接調査を企画、実施した。350名に面接調査を依頼し、本年度は全国各地に住む18名が調査に協力くださり、調査を実施した(ただし、調査時に本人が不在である、体調不良であるなどによる無効データが3件ある)。また、調査対象者が居住する自治体における障害者支援、住宅支援に関する資料の整理を進め、調査対象者の住宅確保の過程とともにその推移を把握した(居住地9自治体うち3自治体は文書保存期間を設定していたことにより必要なデータが収集できなかった)。この全国各地に住む下肢障害のある人に対する面接調査の結果の整理を進めた結果、21年度に分析した質問紙調査では明らかにならなかった地域間における格差の存在が示唆され、下肢障害のある人に対する面接調査の意義が改めて確認できた。また、上記の21年度に分析した質問紙調査(2007年実施)結果についての成果発表(平成22年9月)を行った。そして、障害のある人に対する住宅支援に関する文献の収集を引き続き行ったが、特に5年以内に発行された書籍が少なく、障害のある人の住宅支援施策に着目して調査を続けることの重要性が示唆された。なお、22年度は繰り越し申請を行っている。申請時に実施を予定(23年6月実施予定)していた、下肢障害のある人への面接調査(1件)は調査協力者と研究代表者の予定が合わず、23年度(23年910月)に行うこととし、23年度に行う予定であった成果発表を先に行っている。本年度は22年度の震災により延期した調査の実施、および昨年度実施した調査の分析および成果発表を計画していた。前者については、平成23年11月に下肢障害のある人1名のヒアリング調査とその居住自治体での資料収集を行い、新たなデータを加えることができた。そして、昨年度実施した調査の分析の結果からは、下肢障害のある人の住宅確保における住宅の選定に当たっては、障害などの身体状況以上に受障以前の住宅や生活スタイルによる影響を受けていることが明らかになった。また、調査対象者が居住する自治体における障害者支援、住宅支援に関する資料の整理を進め、調査対象者の住宅確保の過程とともにその推移を把握した。その結果、調査対象者自身の状況、また受障当時の社会背景も異なっているものの、住宅確保の過程においては公的支援を受けず、その住宅確保は自助努力によっていること、したがって、施策における個人の住宅の位置づけについて検討する必要があることも見いだされた。以上から、特に障害のある人の住宅確保と社会的環境や経済状況との関連を裏付ける上で、障害のある人の側から把握した資料が得られたことは大きな成果である。

なお、所属機関の移動に伴う環壕の変化などに適切に対応できず、当初予定していた成果発表が十分に行えなかったことを反省するとともに、研究年度の終了後にも引き続き成果発表を行っていく予定である(平成24年5月に2件の成果発表を予定)。
高分解能角度分解光電子分光による低次元化合物における電荷密度波・超伝導の研究

低次元化合物における電荷密度波・超伝導の起源を明らかにするために、高分解能光電子分光装置の改良を行った。改良した装置と高輝度放射光施設を用いて、T=60Kにおける輸送現象の異常が報告されているタングステン酸化物であるP_4W_<12>O_<44>の高分解能角度分解光電子分光を行った。フェルミ準位近傍において3本のバンド分散の観測に成功し、バンド計算との良い対応を得た。フェルミ面を実験的に決定し、一部の波数領域でネスティングの存在を見出した。T=20Kにおいてフェルミ準位上の強度の波数分布を測定した結果、ネスティングの存在を見出した。T=20Kにおいてフェルミ準位上の強度の波数分布を測定した結果、ネスティング条件の良い波数領域ではギャップ構造が存在する一方、ネスティング条件の悪い波数領域ではフェルミ準位上の強度が残っており、伝導に寄与することを見出した。この実験結果から、P_4W_<12>O_<44>の電荷密度波状態における金属的伝導の起源を明らかにした。また、超伝導と電荷密度波状態の存在が示唆されているK_<0.25>WO_3単結晶に対する高分解能ARPESを行った。実験的にバンド分散形状およびフェルミ面形状を決定し、VASPコードを用いたバンド計算結果との比較を行った結果、両者の間に良い対応を見出した。これにより、フェルミ面が複数の一次元的バンドにより形成されていることを明らかとした。一元的フェルミ面は互いにネストする形状を示し、そのネスティングベクトルQ=(1/2a^*-1/2b^*)が電子回折実験で報告されている散乱ベクトルの値と一致することを見出した。これらの実験結果から、K_<0.25>WO_3における一次元的バンド構造が電荷密度波不安定性を有しており、このことが高温の輸送特性に現れる異常と深く関係していると結論した。特に、低温における精密測定を実現するために、開放型ヘリウムクライオスタットの改良を行った。改良した装置を用いて、ペロブスカイト型タングステン酸化物Na_xWOx_3の金属絶縁体転移前後における角度分解光電子分光を行い、組成xに依存した電子状態を精密に決定することに成功した。絶縁体領域の組成(x<0.25)では、バンドがフェルミ準位を横切らず、擬ギャップが開いていることを見出した。この擬ギャップの起源として、強い格子欠陥やWO_3格子のランダムな配置によるアンダーソン局在の可能性を示唆した。また、高結合エネルギー側において、ポーラロンの存在を示す異常なスペクトルの温度変化を観測した。金属領域(x>0.25)では、Γ(X)点を中心とした電子的フェルミ面を観測し、バンド計算で得たW 5d t_<2g>バンドの振る舞いと良い一致を示すことを見出した。さらに、金属領域で得られたフェルミ面のトポロジーが絶縁体領域で見られるフェルミ1面の名残構造に類似していることから、絶縁性の起源として、アンダーソン局在によるクーロンギヤップの生成を示唆した。また、K_xWO_3における電荷密度波転移の起源を明らかにする目的で、高分解能角度分解光電子分光を行った。その結果、価電子帯において明確なバンド分散を観測することに成功した。フェルミ準位近傍の電子状態を二次元的な波数空間にプロットした結果、得られたフェルミ面が複数の隠れた擬一次元的フェルミ面で構成され、各々のフェルミ面がネスティングを満たしやすい形状をしていることを見出した。さらに、その形状がバンド計算と非常に良い一致を示すことを明らかにした。以上の実験事実から、K_xWO_3における電荷密度波転移は、隠れた一次元的フェルミ面のネスティングによって説明されると結論した。

一元的フェルミ面は互いにネストする形状を示し、そのネスティングベクトルQ=(1/2a^*-1/2b^*)が電子回折実験で報告されている散乱ベクトルの値と一致することを見出した。これらの実験結果から、K_<0.25>WO_3における一次元的バンド構造が電荷密度波不安定性を有しており、このことが高温の輸送特性に現れる異常と深く関係していると結論した。
日本の保健医療改革における米国フィランソロピーの影響

本研究は、行政学及びガバナンス論の視点から、戦後の日本の保健医療改革における所謂占領軍の公衆衛生福祉局と米国フィランソロピー、特にロックフェラー財団との協働を明らかにすることを目的としたものである。連合国司令部公文書、米国国務省文書、公衆衛生福祉局長のサムス准将の書簡の調査や米国のフィランソロピー研究者のインタビューを行った。戦後の日本の国立保健医療科学院及び聖路加国際病院の再構築において連合国司令部はロックフェラー財団の専門的知識の提供や財政的支援を受けつつ、協働してプロジェクトを行っていたことが明らかになった。平成21年10月から平成22年3月まで、主に国立国会図書館憲政資料室及び米国スタンフォード大学フーバー研究所で資料調査を実施した。まず、憲政資料室で占領期におけるGHQ/SCAPの資料を中心に調査し、新たに公衆衛生福祉局の行政組織構造およびさ乳幼児死亡率低下や伝染病予防のための対策について資料を収集した、平成22年3月には、フーバー研究所に所蔵されている公衆衛生福祉局長のサムス准将についての17箱にもおよぶ公文書や個人の書簡を調査した。本研究調査にとって重要な公文書の一つは、1951年1月22日付けの米国国防省宛ての書簡であり、占領終了時期が近くなり、サムス准将は、特にロックフェラー氏に、占領期終了後の日本における公衆衛生福祉諮問委員会の設置について会議を実施するようにと記している。更に、以前にロックフェラー公文書館での調査においてロックフェラー財団国際保健部のオリバー・マッコイ医師を公衆衛生福祉局に配属させたことを記した文書の存在を鑑みると、政府(GHQ/SCAP)と財団(ロックフェラー財団)との連携が強いことが明らかである。特に医療保健制度においては、官民の連携が重要であることが明らかである。第2点目に、占領期の医療保険制度へのサムス准将の考え方がひとつの書簡の中に記されている。1973年5月24日のTOSHIO TAHARAに宛てた書簡の中に、当時米国内では、英国の制度に類似した強制国民健康保険構築に向けた動きがあり、社会保障派遣団が来日した際に、日本で同様な医療保険制度をまず実施し、米国の模範的な先例となるようにということをサムス准将に伝えていることが記されている。日本では、サムス准将の考えに基づき、国民皆保険制度が実施された一方で、米国内では、現在と同様に1946年から50年の間でも、米国医師会では強制国民保険の実施についてはとても強い抵抗があり、終わりのない強制国民保険への抵抗の存在が記されている。平成22年度においては、8月31日から9月2日までにニューヨーク市立大学バルーク・カレッジのChambre教授を訪問しロックフェラー財団のアジアのみではなくヨーロッパにおける医療活動について意見交換を行った。タイの医療教育制度における同財団の影響を調べるために9月20日には、タイバンコクのマヒドン大学医学部のSanya教授を訪問し、1920年代にタイに同財団の専門家を派遣しタイにおいてアメリカの医療教育制度の確立に貢献した事をお話いただいた。同財団がタイの医療制度確立に貢献しているということも学ぶ事が出来たと同時に、同財団の医療教育における影響力も大きいということが聞きとり調査により判明した。タイの事例について更に比較研究として調査を深めるため、ロックフェラー公文書館での調査を実施したいと考える。12月には、米国国立公文書館においてロックフェラー財団と米国政府との協力について様々な切り口から文献調査をしたが、保健医療関係に直接関係する文書を見つけることは出来なかったが、国務省文書の中に教育及び文化における同財団の戦後の日本との教育・文化交流・外交への発展についての文書を発見する事が出来、教育文化交流に対する助成金及び事業型財団の役割について今後の研究課題として調査をしたいと考える。平成23年3月には、追加調査として、私費でロックフェラー公文書館において戦後の日本における看護教育改革の同財団の影響について調査を行い、GHQと同財団の協力関係が明らかになった。膨大な数の資料及び平成21年度及び22年度において調査を行った内容を含め、国内外の学会で発表する予定である。本年6月には、ニューヨーク市立大学バルーク・カレッジNPO戦略・マネージメント研究所のworking paperに掲載される予定である。また、今後は、米国NPO学会、占領期・戦後史研究会で発表し、海外の研究者の協力を得て上述の研究課題について調査を行いたい。
筋収縮調節タンパク質トロポニンの起源

1.抗トロポニンIモノクロ-ナル抗体のin vitroimmunization法による作製:in vivoではTnIの保守的機能領域に対する抗体の作製は困難であると考えられたので、in vitro immunization法による作製を試みた。得られた抗体のうち5Hはウサギ骨格筋およびウシ心筋のTnIと結合したが、カルデスモンとは反応しなかった。また5HはTnIと結合したがTnCが共存した場合には結合しなかった。これらの結果は、5Hは、TnCが結合する領域すなわちTnIのN末端側27アミノ酸残基を認識していると判断された。しかし、各器官ホモネゲ-トに対するblottingでは、TnI相当バンド以外にもバンドが観察された。保守的機能領域に対する抗体がin vitroimmunization法によってえられたが特異性の点で問題があり、免疫化に際しTnIのCNBr切断ペプチド断片を用い特異性の高い局所構造を識別する抗体をうることを試みたが、成功しなかった。2.ザリガニ(Astacus loptodactylus)トロポニンIの一次構造:ザリガニの尾筋からえたTnIの一次構造を決定した。このTnIは201残基からなりアミノ末端はブロックされていた。脊椎動物TnIと比較したところ20-25%程度の相同性を示した。又、アクチン結合部位にトリメチルリジンが2残基存在していた。3.トロポニンCとトロポニンIの相互作用領域:TnCのN-末端から25番目のMet残基と93番目のCys残基をそれぞれ蛍光標識したDN2-TnC、IAE-TnCを調整し、これにTnIのCNBr切断でえたペプチドCN4、CN5を種々の条件下で加えて蛍光スペクトルの変化を追跡した。その結果、TnCのNドメインとTnIのN末端側領域、TnCのCドメインとTnIのinhibitory regionが相互作用していることを示す結果を得た。I抗トロポニンIモノクローナル抗体のin vitroimmunization法による作成:アクチンとミオシンの相互作用を阻害するトロポニンI(TnI)に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いてトロポニンI様タンパク質の分布の探索を行うことを計画した。in vivoではTnIの保守的機能領域に対する抗体の作製は困難であると考えられたので、in vitro immunization法による作製を試みた。得られた抗体のうち5HはSDS電気泳動に対するblottingの結果、ウサギ骨格筋およびウシ心筋のTnIと結合したが、カルデスモンとは反応しなかった。また未変性TnIのdot blottingでは、5HはTnIと結合したがTnCが共存した場合には結合しなかった。これらの結果は5HはTnCが結合する領域すなわちTnIのN末端側27アミノ酸残基を認識していると判断された。しかし、各器官ホモゲネートに対するblottingではTnI相当バンドンスチトにもバンドが観察された。保守的機能領域に対する抗体がin vitroimmunization法によってえられたが特異性の点で問題があり、今後免疫化に際しペプチド断片を用い特異性の高い場所構造を識別する抗体をうることが必要である。II.ザリガニ(Astacuvo leptodactylus)トロポニンIの一次構造:ザリガニの尾筋からえたTnIの一次構造を決定した。また、アクチン結合部位にトリメチレリジンが2残基存在していた。

トロポニンI/in vitro immunization/モノクローナル抗体/一次構造/収縮調節タンパク質本研究はトロポニンIの抗体を作製して、それを利用して、これ迄にトロポニンを持たないことが知られている筋のタンバク質中に、この抗体と反応するタンパク質を求め、トロポニンIの前身となったタンパク質を探ることを目的としたものである。本年度の研究概要は以下の通りである。1.抗トロポニンIモノクロ-ナル抗体のinvitro immunization法による作製:昨年度行った方法に種々の改良を加えた抗体の作成を試みたが、昨年度報告した以上の抗体は得られなかった。2.トロポニンIのペプチドの抗体の作成:昨年度の結果の反省から、トロポニンIをCNBrで切断し、生じた10ケのペプチドを分離、精製した。これらのペプチドに対する抗体を順次作成中であるが、現在までに、その後の研究に使用できる標品の作成に性向していない。3.トロポニンIの抗体と反応するナマコ縦走筋のタンパク質:上記1で得た抗体と反応するタンパク質をナマコ縦走筋の可溶性タンパク質に求めたが、その分離、同定には到っていない。4.トロポニンCとトロポニンIの相互作用領域:トロポニンCとIの相互作用領域および相互作用の様式を知ることは、トロポニンの起源を知る上で重要である。トロポニンCのN-末端から25番目のMet残基と93番目のCys残基をそれぞれ蛍光標識したDN2-TnC,IAE-TnCを調節し、これに上記2でトロポニンIから分離、精製した。CN4,CN5を種々の条件下で加えて蛍光スペクトルの変化を追跡した。その結果、トロポニンCのNドメインとトロポニンIのN末端側領域、トロポニンCのCドメインとトロポニンIのinhibitory regionが相互作用していることを示す結果を得た。
学生は多機関との連携にどう関わることができるか－外国人児童生徒の支援に向けて－

愛知教育大学で必修化された外国人児童生徒に関する授業の受講生や近隣の連携都市の小中学校で外国人児童生徒へのボランティア活動を行っている学生達が、「乳幼児期から青年前期までの多機関との連携にどのような役割を果たせるか」を明らかにし、一方通行の連携になりやすい連携から「学生の関わり」による双方向の連携の可能性を追求するため、2018年度は、主に下記の取り組み(3つの調査)を行った。これまで試みた連携体制構築の問題点を洗い出すため、2つの調査(調査1ボランティア学生と受け入れ機関からの活動報告書の分析、調査2ブラジル人学校の学園祭参加に関する調査)を行った。調査1では、ボランティア学生とボランティア学生の受け入れ機関からの報告書分析し、ボランティア学生の学びとボランティアをするにあたり抱えている悩み、学生受け入れのプラス面とマイナス面などを分析した。この結果、学校側からの期待を負担に感じているケース、自分の支援内容に不安を抱えているケース、学校側とのコミュニケーションに問題を抱えているケース等が明らかになった。これに対して、ボランティア学生の受け入れ機関は、受け入れにあたり、マイナス面はほとんど感じていないことが分かった。調査2では、大学祭に参加したブラジル人学校の児童生徒と彼らを案内するボランティア大学生へのアンケート調査と学祭への参加の様子を観察した結果、これまで実施してきた参加形態を見直す必要性が明らかになった。必修化された授業が学生に与える影響を調べるため、調査3ボランティア登録した学生の分析を行ったところ、授業を受けたことで、実際にボランティアをやってみようという学生はほとんどいなかったことが明らかになった。この原因については引き続き分析する必要がある。本研究の目的である「学生の関わり」による双方向の連携の可能性を追求するためには、ボランティア学生を受け入れている機関の実際の受け入れ状況を明らかにするする必要がある。活動報告書からは、受け入れにあたっての問題点は見えてこなかったが、ボランティア学生の状況からは受け入れ側は、様々な問題を抱えていると予想される。これらを明らかにするために、今後どのように、また、誰を対象にインタビュー等を実施したらいいか検討する必要がある。2019年度は、前年度の調査結果を活かし、adに取り組む。a連携活動の実施。洗い出したこれまでの連携の問題点から連携の改善案を作成し、ボランティア学生と受け入れ機関に提案し、連携活動をスタートさせる。調査1:年度末に連携における問題点の洗い出しとして学生と受け入れ機関にインタビューを実施(12機関と学生12人)。bスタディーツアーの実施(国内:ブラジル人学校、保育園など海外:ペルーの日系人学校ラ・ビクトリア校で帰国生徒と日本語を学習するペルー人学生との交流)。これまでとは違った視点で子ども達への支援を考える。ペルーの学校では、主に「日本で教師にこうしてほしかった」などの意見を日本滞在経験のある生徒から直接聞く。c学生の意識調査。調査1:必修化された授業からボランティアを始めた学生へのインタビュー調査。実際のボランティア経験で学んだこと、連携の可能性について、d情報共有会の開催。2018年度、2019年度に行った2年間の学生の関わりによる連携を目指した活動において、学生と受け入れ機関、サポート側である大学との情報を共有する会を開催する。a連携活動の実施。

調査1:年度末に連携における問題点の洗い出しとして学生と受け入れ機関にインタビューを実施(12機関と学生12人)。bスタディーツアーの実施(国内:ブラジル人学校、保育園など海外:ペルーの日系人学校ラ・ビクトリア校で帰国生徒と日本語を学習するペルー人学生との交流)。これまでとは違った視点で子ども達への支援を考える。ペルーの学校では、主に「日本で教師にこうしてほしかった」などの意見を日本滞在経験のある生徒から直接聞く。c学生の意識調査。調査1:必修化された授業からボランティアを始めた学生へのインタビュー調査。実際のボランティア経験で学んだこと、連携の可能性について、d情報共有会の開催。2018年度、2019年度に行った2年間の学生の関わりによる連携を目指した活動において、学生と受け入れ機関、サポート側である大学との情報を共有する会を開催する。予定していたブラジル人学校での交流会が2019年度に延期されたため、予定していた旅費の一部を次年度使用することにした。
ウシ胎盤性ラクトジェンの生理的意義の解明

ウシ胎盤性ラクトジェン(bPL)の生理的役割について、特に胎盤で産生される酵素による切断に注目し、切断されて生じるN末端断片の生理活性について検討した。bPLは、マトリックスメタロプロティナーゼやカテプシン類によってC末端側が切断され、完全長型よりも約6kDa小さなN末端断片が生じる。このN末端断片は、bPLが本来有するプロラクチン様活性を持たないが、血管内皮細胞の増殖を抑制作用が認められた。酵素切断処理をしていない完全長型のbPLは血管内皮細胞の増殖に影響を与えなかった。本研究によって、bPLは酵素切断によって本来のプロラクチン活性とは全く異なる新規の生物活性が発現する事が確認された。小課題1「bPLの酵素切断の可能性の探索と切断部位の同定」において、ヒト由来株化細胞である293細胞を用いてN末端にFLAGタグとHisタグを有する組換えbPLを発現させ、677 μgの精製bPLを得た。次いでこの組換えタンパク質を胎盤組織の培養上清とインキュベートして抗FLAG抗体でウェスタンブロットしたところ、インキュベーションによって32kDaの組換えタンパク質のC末端側が切断されて25kDa前後のN末端断片が生成する事を確認した。胎盤の培養上清を抗bPL抗体でウェスタンブロットすると、同様のサイズのバンドが検出された。この事から、胎盤の培養上清は組換えbPLのC末端側を切断する活性があり、これによって生じるN末端断片は胎盤組織の培養上清中にも存在している事が示された。培養上清中に存在するbPLを切断する活性はタンパク質分解酵素によるものと想定し、組換えbPLがマトリックスメタロプロティナーゼ(MMP)によって切断を受けるか否かを検討したところ、MMP-8, -9および-13によって切断されて約25kDaのN末端断片が生成した。MMP-8および-13はコラゲナーゼ、MMP-9はゼラチナーゼであることから、胎盤の培養上清中のMMP活性をカゼインザイモグラフィとゼラチンザイモグラフィで検討したところ、胎盤培養上清中の両酵素の活性が証明された。MMP-13のmRNA発現をin situハイブリダイゼーションで検討したところ、MMP-13は栄養膜細胞で発現している事が示された。以上の成績から、ウシの胎盤の培養上清中にはbPLを切断する活性があり、MMPがbPLの酵素切断に関与している事が示唆された。昨年度の成績から、ウシ胎盤性ラクトジェンはマトリックスメタロプロティナーゼによってC末端側を切断されて、分子量が25kDa前後のN末端断片を生じる事が判明し、該当するMMP活性が胎盤の培養上清中に確認され、MMPタンパク質の存在をイムノブロットで確認した。今年度は酵素切断によって生じるN末端断片を組換え発現で作成し、その生物活性を検討した。酵素切断で切断されると想定される部位以降のアミノ酸配列を欠失したウシ胎盤性ラクトジェンの組換えタンパク質を大腸菌の発現系で作成した。対照として、酵素切断を受ける前の成熟型ウシ胎盤性ラクトジェンも同じ発現系で作成した。完全長とN末端断片という2種類のウシ胎盤性ラクトジェンの組換えタンパク質の生物活性を検索した。組換えタンパク質のプロラクチン活性をNb2細胞(ラットリンパ腫由来細胞株で、プロラクチン依存的に細胞増殖を示す)を用いて検定したところ、完全長ウシ胎盤性ラクトジェンは、標準品として用いたヒツジプロラクチン(NIDDK oPRL-19)と同等の活性を示したが、ウシ胎盤性ラクトジェンのN末端断片にはプロラクチン活性は全く認められなかった。また、組換えタンパク質の血管新生に及ぼす影響をウシ血管内皮細胞の増殖を指標として検定したところ、完全長ウシ胎盤性ラクトジェンは血管内皮細胞の増殖に影響を与えなかったが、ウシ胎盤性ラクトジェンのN末端断片は用量依存的に血管内皮細胞の増殖を抑制した。今年度の成績から、ウシ胎盤性ラクトジェンは酵素切断の前後で生物活性が全く異なる事が示され、胎盤から分泌された後に酵素による切断を受ける事によって胎盤血管新生を抑制的に制御している事が示唆された。27年度は子宮組織におけるマトリックスメタロプロティナーゼの活性を胎子胎盤側と母体胎盤側に分けて検討し、胎盤性ラクトジェンの酵素切断に及ぼす影響について検討した。胎盤組織の器官培養上清を用いたゼラチンザイモグラフィ解析の結果、ゼラチナーゼ活性は胎子胎盤側よりも母体胎盤側で高かった。また、母体胎盤組織から分泌されるbPLは、酵素切断がより効率的に生じている事がわかった。これらの成績は、胎盤から分泌されるbPLの免疫活性と生物活性の相関性が胎子胎盤由来bPLと母体胎盤由来bPLで異なり、母体胎盤由来のbPLが生物活性が低く、分子量が正常なサイズとは異なるとする研究担当者の既報の論文と一致していた。27年度に得られた以上の成績から、母体胎盤組織と胎子胎盤組織では共にbPLが分泌されるものの、その後の酵素切断の効率が異なり、この違いが母体側と胎子側の血管新生作用に影響を与えている事が示唆された。

3年間に渡る研究期間の中で、初年度は組換えbPLを胎盤組織の培養上清とインキュベートして抗FLAG抗体でウェスタンブロット解析をしたところ、32kDaの組換えbPLが胎盤培養上清とのインキュベーションによってC末端側が切断されて、25 KDaのN末端断片が生成する事を確認した。二年目は酵素切断によって生じるN末端断片の血管内皮細胞の増殖に及ぼす影響を検討したところ、完全長の組換えbPLは血管内皮細胞の増殖に影響を与えなかったが、C末端側が短縮した組換えbPLは血管内皮細胞の増殖を抑制した。本研究の結果、bPLは酵素切断によってプロラクチン活性とは全く異なる新規の生物活性が発現し、胎盤の血管新生を抑制的に制御している事が明らかになった。ウシ胎盤性ラクトジェン(bPL)の生理的役割について、特に胎盤で産生される酵素による切断に注目し、切断されて生じるN末端断片の生理活性について検討した。bPLは、マトリックスメタロプロティナーゼやカテプシン類によってC末端側が切断され、完全長型よりも約6kDa小さなN末端断片が生じる。このN末端断片は、bPLが本来有するプロラクチン様活性を持たないが、血管内皮細胞の増殖を抑制作用が認められた。酵素切断処理をしていない完全長型のbPLは血管内皮細胞の増殖に影響を与えなかった。本研究によって、bPLは酵素切断によって本来のプロラクチン活性とは全く異なる新規の生物活性が発現する事が確認された。今年度の研究で、分泌型タンパク質とN末端断片型の2種類の組換えタンパク質を取得し、その生物活性を評価した。また、ウシ胎盤性ラクトジェンのN末端断片の標的細胞探索の為に、ウシ胎盤性ラクトジェンN末端断片のN末端側にアルカリフォスファターゼを融合させた融合タンパク質を発現させて、アルカリフォスファターゼを指標にして標的細胞を探索する実験系を構築した。このような進捗は本年度の計画に沿ったものであり、研究は概ね順調に進捗している。家畜繁殖学平成27年度の研究計画平成26年度から継続して、ウシ胎盤性ラクトジェンN末端断片の標的細胞の探索を実施する。既に実験系は確立しているので、凍結切片上でアルカリフォスファターゼ融合タンパク質と標的細胞を反応させて特異的結合を発色によって検出する。ウシ胎盤性ラクトジェンを切断する活性を有する胎盤特異的タンパク質を検索し、組換えタンパク質を作成してその生物活性を検証する。具体的には、ウシ妊娠関連糖タンパク質に焦点を当て、その組換えタンパク質の活性を検索する。本年度の研究で、研究全期間を通じて使用可能な量の組換えbPLを作成した。このbPLは、天然型のbPLに類似した糖鎖付加があり、生物活性も天然型に遜色ない事が確認されている(未発表データ)。また、今年度は胎盤の培養上清中にbPL切断活性がある事を確認し、MMP活性が存在する事も確認した上で、MMPがbPLを切断してN末端断片を生成する事を示した。よって、本研究は今年度の計画に沿って概ね順調に進展している。平成26年度の研究計画小課題2. bPLのN末端断片のPRL様生物活性と血管内皮細胞増殖活性の評価上記の小課題1で明らかになったbPLの酵素切断部位に関する情報を元にbPLのN末端断片を組換え発現で作成する。申請者は予備実験を行った結果、人為的に短縮したポリペプチド断片の発現はうまく行かない事が多いことを経験している。そこで、本研究ではbPLをコードする配列にサイレント変異を導入することによって翻訳効率を高めて効率的に組換えタンパク質を生産する。申請者が他のタンパク質で実験してみたところ、変異挿入の効果は高く十分な量のタンパク質を得る事が期待される。サイレント変異のデザインはウェブベースのソフトで対応する。
虚血脳への羊膜細胞移植

目的:これまでにヒト羊膜細胞は免疫学的に寛容な細胞であり、種々のLysosomal Enzymesの合成活性やカテコーアミンおよびアセチルコリンの産生能を有することも報告されている。今回、各種培養液にて培養したラットの羊膜細胞を形態学的、免疫学的などの手法により比較検討した。さらに培養羊膜細胞の脳内移植により中枢神経系における本細胞の特性と可能性を検討してみた。方法:ラット羊膜細胞は妊娠17日のWistar ratより分離しB27-supplemented Neurobasal Medium(Neurobasal Medium/ B27,Gibco)あるいは10% FCS/ DMEM(DMEM/FCS,Gibco)の2種類の培養液によって一定期間培養した後培養羊膜細胞に関して各種検討を行った。さらに培養羊膜細胞を正常ラット脳に移植しその動態を観察した。結果:初代培養当初、ラット羊膜細胞は円形から楕円形を呈していたが一週後はNeurobasal/B27で培養すると細胞の形態は数本の長い突起にて細胞が結びつき網目状の配列をとった。同様に培養した羊膜細胞の電子顕微鏡画像では、発達した粗面小胞体とミトコンドリアなどから活発な細胞内活動が予想された。しかしシナプスなど神経細胞に特徴的な構造は観察されなかった。一方、DMEM/FCSでは細胞は突起はなく平板な細胞形態となった。免疫組織染色ではNeurobasal Medium/ B27培養ラット羊膜細胞は,MAP2などの神経細胞のマーカーに陽性となりGFAPには陰性であった。DMEM/FCSで培養した羊膜細胞はGFAP、TH、ChATおよび一部nestinに陽性となったがNFには陰性であった。またウェスタンブロットによっても同様にNeurobasal Medium/ B27で培養したものの方がDMEM/FCSで培養した細胞に比較してneurofilament,MAP2を強く発現した。GFAPに関しては逆の結果となった。さらにフローサトメトリーを用いた細胞周期解析ではNeurobasal Medium/ B27ではG1-G0期(85.58%)、G2-M期(0%)となり羊膜細胞の分裂がほぼ停止していた。同種脳内移植実験では羊膜細胞は脳内において3ヶ月以上の長期わたり生着し免疫学的にはneurofilamentを発現していた。考察:ラット羊膜細胞は形態学的、免疫組織学的にNeurobasal Medium/ B27により神経細胞類似の細胞に変化した。また一部には神経幹細胞を含む可能性が示唆された。以上の性質を応用することにより羊膜細胞は中枢神経疾患に対する神経幹細胞移植に代わる細胞腫として、あるいは遺伝子治療でのドナー細胞となる可能性があると思われる。目的:ラット羊膜より初代培養細胞を樹立し、これを神経様細胞へ分化誘導せしめることを試みた。さらに、これらの細胞を用いて脳内移植実験を行った。方法;妊娠Wisterラット

羊膜より初代培養細胞を樹立、これを10%FCS/D-MEM(以下DMEMと略す)とB27/Neurobasal Medium(以下NBMと略す)(GIBCO)の2種類の培養液を用いて培養した。培養1週間後にそれぞれの細胞を、神経細胞および神経膠細胞のマーカーに対する抗体を用いて免疫染色した。同時に、これらの細胞の細胞周期解析を、フローサイトメトリーを用いたDNA含量測定により行った。NBMで培養した羊膜細胞については、これを正常ラット脳および一過性虚血後の砂ネズミ脳海馬CA1領域に定位的に移植した。結果:DMEMで培養したラット羊膜細胞は、平板な形態を呈し敷石状に配列するが、NBMで培養すると、数本の長い突起を有する細胞質の小さな細胞が網目状の配列した。免疫染色の結果は、DMEMで培養した細胞はTyrosine hydroxylase(TH),GFAPに陽性、Neurofilament(NF)に陰性となったが、NBMではMAP-2,Synaptophysin,TH,ChAT,NFいずれも陽性、GFAPには陰性となった。細胞周期解析の結果、NBMで培養した羊膜細胞は、細胞分裂を停止することが明らかとなった。正常ラット脳へ羊膜細胞を移植すると、その後8週間にわたり生着することが確認された。さらに一過性脳虚血負荷を加えた砂ネズミの海馬CA1領域に移植した羊膜細胞はより長期間にわたり生着し、一部の移植細胞は神経細胞様に形態変化した。結論:ラット羊膜細胞は多能性神経幹細胞としての特性を有し、神経移植治療のドナー細胞となりうる可能性が示唆された。目的:神経幹細胞としての分化能を有している可能性のある培養羊膜細胞を、虚血脳に移植しこれらの細胞が最終的に神経細胞として機能し得るか否かについて検討した。方法:(1)妊娠ラットより培養羊膜細胞を樹立しDMEM培養液およびNeurobasal medium(Gibco)により培養した。(2)上記(1)の細胞を、各種抗体により免疫組織染色した。(3)砂ネズミ両側総頚動脈閉塞モデル及び自然発症高血圧ラット中大脳動脈閉塞モデルの動物脳に、上記(1)の培養羊膜細胞を定位脳手術的に移植した。一定期間の後に動物脳を還流固定、連続脳切片を作成し羊膜細胞が虚血巣に生着しているか否かを検証した。同時に、一部の切片は上記(2)と同様の免疫染色に供した。結果:(1)ラット羊膜細胞をNeurobasal mediumで培養すると、細胞は神経細胞様の形態を呈し、免疫組織学的には各種神経細胞マーカーに対し陽性となった。(2)脳内移植実験では羊膜細胞は6ヵ月間脳内に生着しており、やはり各種神経細胞マーカーに陽性であった。また、一部の細胞は細胞突起様の構造を有していた。考察:今回の実験結果は、培養羊膜細胞が移植後長期にわたり虚血脳に生着し、さらにこれらの移植細胞は神経細胞様に分化する可能性を示すものであった。
サルにおけるATL関連ウイルスの感染モデル

HTLV-Iの感染経路とATLの発症機序の解明の為、サルを用いたHTLV-I及びその類似サルウイルスSTLV-Iの感染・発症動物モデルを確立し、ウイルス学・免疫学的研究を行うことを目的とした。速水・本庄・森・辻本らはSTLV-I自然感染アフリカミドリザルにおいて、ATL類似白血病による死亡例をみつけ、また分葉核リンパ球の存在とSTLV-I組込み部位からみた腫瘍細胞のモノクロナルな増殖から、ATL発症過程における種々の段階の前白血病状態のサルをみつけた。これらのサルにおいてNK様の非特異的キラー活性と特異的キラー活性がみられたが、後者に関してはキャリアーサルよりは前白血病状態のサルが強い活性を示した。またHTLV-I実験感染のキャリアーサルにおいてはメモリー細胞の状態であった。さらに大腸菌産生のHTLV-Ienv蛋白のカニクイザル免疫によりHTLV-Iに対して感染防御に働くことが示された。戸沢らはMT-2細胞から精製したgp34抗原を用いて、16種類のマウス単クローン抗体を作製した。これらの抗体を用い、種々のサル由来のHTLV-IまたはSTLV-Iで腫瘍化した株細胞の蛍光抗体染色を試みたところ、同一ウイルス感染細胞で、同じようにgag-gene産物を産生している細胞でも、由来する動物種、系統が異なると、これら単クロン抗体群との反応のパターンが異なっていることが明らかとなった。武藤らは種々のサル末梢リンパ球中のNK活性の測定を試みた。標的細胞として種々のサル由来の樹立細胞株を用い、クロミウム放出試験を行なったところ、タマリンのリンパ球は使用した全ての標的細胞を高率に傷害したが、カニクイザル、アフリカミドリザルのリンパ球はB95-8(マーモセット)、RfM26-1(ベニカオザル)、K562(ヒト)に対してNK活性を示したが、他の標的細胞は傷害しなかった。
分子吸着系の非弾性電気伝導度と疑似選択則

分子振動励起による非弾性トンネル電流に関しては、C_2H_2/Cu(001)に対し、イメージング図を描くことができた。架橋系を含む一般的な弾性電流成分に対しては、S行列理論を適用し、位相のずれを用いて電気伝導度を表すことができ、それを用いて種々の実験事実を説明した。また、チャンネルとはどういうものであるべきかを示した。超伝導系の表面近傍における対生成に対し、Laue表示を用いた定式化を行い、表面・界面に局在状態ができる場合に局在状態状態間の対生成により、表面・界面近傍で超伝導転移温度が上昇し得ることを示した。トンネル電流そのものについての理解を深めるために、散乱問題としての定式化を行い、先ず弾性電流に対して位相のずれを用いた表式を得ることに成功した。これにより、対称性を考慮することが容易になり、非弾性効果を含めた研究推進の準備が出来た。非弾性効果も含めた拡張を現在行っている。また、具体的系C_2H_2/Cu(001)に対しては、基盤金属の電子構造およひ吸着分子の準位構造と非弾性電気伝導度との関係についてつっこんだ議論ができるようにするために簡単化した模型を考えた。この模型を用いて2-3種のパラメータについて粗い計算を行い、予想通りの結果を得た。現在論文執筆中である。さらに計算精度を上げ、また、パラメータ変化の範囲を広げることにより、中間状態の異なる径路間の干渉効果について議論を進める。トンネル電流そのものについての理解を深めるために、散乱問題としての定式化を行い、先ず弾性電流に対して位相のずれを用いた表式を得、それを用いた計算の主要部は終えることが出来た。また、具体的系C_2H_2/Cu(001)に対しては、基盤金属の電子構造および吸着分子の準位構造と非弾性電気伝導度との関係についてつっこんだ議論ができるようにするために簡単化した模型が存在することを見いだし、パラメータを種々変化させて物理的内容のはっきりした議論が出来るようにした。この最初の論文は現在執筆中である。また、非弾性効果も含めたS-行列による定式化を進行させている。これにより、トンネル電流の全体像がはっきりするはずである。今年度からは、基板金属が超伝導体である場合のトンネル過程の様子を調べるため、高温超伝導あるいは重い電子系のような相関長の短い超伝導体に対する理論を、表面垂直方向は局在表示し平行方向のみ波数ベクトルで記述する表示に変更する準備を始めた。まず各層ごとにEliashberg方程式を作ることにより、表面局在電子状態が存在する等フェルミ準位近傍で状態密度が大きくなることがあれば、表面のみ超伝導転移温度が高くなることがあり得ることを示した。電子間相互作用を考慮しない範囲でのS行列を用いた電気伝導度の定式化をほぼ終え、振動モードとのカップリングを入れた場合への拡張を始めた。また、経路間の干渉の効果を調べるため、かなり簡単な模型を考え、以前のLCAO法に基づく電子状態計算による非弾性電流の結果との比較を始めた。現在のところ、吸着分子近傍に局在した電子状態を経由する経路間の干渉効果が重要であるという地検は得られたが、さらに詳細な検討を行っている。この干渉の効果が、分子振動励起の疑似選択則に重要な寄与を及ぼしていることがかなり明確に分かってきた。さらに超伝導体基盤の場合を考慮するため、表面近傍における超伝導状態がどのようになるのかを調べ始め、転移温度の変化の様子を調べ始めた。不純物層がある場合にも適用し、その層近傍のみ転移温度が上がりうることを示し、対応する実験結果があることを見いだし、詳細な検討をしている。原子・分子架橋系の電子輸送現象および非弾性トンネル分光における表面吸着分子振動励起の本質を損なうことなく模型化し、非平衡状況下での電子状態と電子輸送現象との関わりを、明らかにする事を目的として研究を進めた。分子振動および電子正孔励起による非弾性効果を中心に研究を行った。このようなトンネル分光の場合に選択則が存在しないことは明白であるが、電子・振動の結合により生ずる異なる経路間の干渉効果により、擬似的選択則はあり得るため、非弾性電流の理論を適用することにより詳細な研究の推進を計った。具体例として銅の(001)表面に吸着したアセチレン分子の振動励起を記述する際に本質を失うことなく、物理的描像をよりはっきりできるモデルを構築した。具体的計算は現在進行中でる。弾性電流成分に対する散乱理論による定式化も推進し、「位相のずれ」とフリーデル総和則との関係を考慮した場合に電気伝導度量子化現象が上手く説明できることも示した。

また、超伝導物質が関与している場合も考慮できるようにするため、超伝導相関長の短い物質の電子状態に対して層表示を用いた定式化を行い、この電子状態表示を用いて超伝導対に対する方程式の拡張を行った。これを表面系及び層状欠陥層が存在する系に対して適用し、層垂直方向にエバネッセント波となる局在電子状態内の超伝導対形成により、表面及び欠陥層近傍の超伝導転移温度が上昇し得るることを示した。これにより、実験で観測されているように、電気抵抗Oによる超伝導転移温度が比熱およびマイスナー効果による転移温度より高くなり得ることを示した。さらに、銅酸化物における電子・格子相互作用によるJahn-Teller変形がどのようなものであるのかを調べた。
非内分泌細胞を用いた糖尿病の遺伝子治療

ヒトproinsulin遺伝子を非内分泌細胞に導入し、生化学的に正しくプロセッシングを受けた正常なヒト・インスリンの分泌が可能な代理細胞の創出が可能となった.レトロウイルスベクターによりマウスの間葉系の細胞、特に前脂肪細胞、筋芽細胞にこの改変型ヒト遺伝子を移入した結果、質量分析法、および免疫学的検出法によって培養上清と細胞内にヒト・インスリンを検出した。この代理細胞の移植にはやはり隔離デバイスを必要とする.私達はモデル動物の移植治療に半透膜チャンバーを用いて検討したが、臨床応用のためには生体適合性、チャンバー内の栄養、強度などにつきさらに研究が必要であることが判明した.さらに私達は遺伝子導入と組み合わせて電気・磁気・温度といった物理刺激応答性の遺伝子プロモーター、あるいは生体内のリガンドと転写因子型受容体などのバイオ素子システムを開発した.この新しい代理細胞治療によって食事やcircadian rhythmに対応した新しいホルモン・デリバリーシステムが期待される.最終年度に当たり、これまでに得た成果をとりまとめて一部はすでにトップジャーナルに論文発表を行った。さらに最終的な研究結果も現在投稿中である。また海外での学会報告をこれまでに行った結果、世界的な注目の中から今後はtransgeneの発現調節が考慮されるべきであること、プロインスリンがプロセッシングされる際に生理的な部位と同じ2か所で双方とも切断され中間生成物が分泌されないことが必要であること、さらに本研究プロジェクトが開始となった4年前に比較して、本研究で目標とした代理細胞治療が新しく注目されるようになった組織再生とどちらが現実的なのか、など将来的展望を得ることが出来た。本研究の目的最終目標は1型糖尿病において障害された膵β細胞のインスリン分泌機能を再生することにある.今年度は非β体細胞でもプロセッシングの起こる変異インスリンcDNAをレトロウイルスベクターに組み込み、体細胞を利用した細胞治療あるいはex vivo遺伝子治療に関する基盤的研究を行う計画であった.今年度の成果1.Furinによってprocessingが起こるように変異させたヒトcDNAをretrovirus vectorにクローニングし、10^6程度の高力価ウイルスを得た.2.このウイルスを種々の培養細胞に感染させ、ヒト・インスリンを恒常的に分泌するengineered cellを作成することに成功した.3.マウス前脂肪細胞L1細胞に遺伝子を移入したL1-Insu/furの場合、基礎的な分泌は10^7細胞当たり48時間に約1fmolのインスリンを分泌した.4.L1-Insu/furは脂肪細胞への分化誘導をおこすDexamethazoneおよびMethylisobutylxanthine処理によって約5倍に分泌量が増加し、分泌調節の研究への基礎的データを得た.本研究の目的1型糖尿病における膵内分泌機能の再生を、非内分泌細胞を用いて異所性に行うことを最終目標とする.今年度は前年度までに作成したインスリン産生性線維芽細胞の細胞生物学的なcharacterizationを行う計画であった.今年度の成果1.furinによってprocessingを生じるように改変したヒト・インスリンcDNA(INS/fur)をレトロウイルスにより組み込んだマウス間葉経細胞;L1-INS/furにつき、培養上清中、細胞内のヒトinsulin、proinsulin、およびC-peptideを免疫学的に(EIA)により測定した.培養上清中ではインスリンとC-peptideとはそれぞれ63.4±4.1fmol/10^6cells/48時間と49.6±0.01fmol/10^6cells/48時間と等モルを検出し、proinsulinは3.12±0.1fmol/10^6cellsと少なかった.このことはおよそ97%のプロインスリンが正しくプロセッシングを受けたことを示唆している.2.INS/fur-GFPのfusion遺伝子をtransfectionしてみるとgranularなパターンが見られ、しかもゴルジ以降の分泌過程の阻害剤Brefeldin Aにて分泌が起こらなくなった.以上のことからtransgeneから生合成されたインスリンは細胞内のcompartmentによって輸送され、分泌されたことを示している.

これらのことからengineeringした細胞による細胞治療の細胞レベルでの可能性が示された.今年度は第一に本研究で作成したインスリン分泌能を持つ代理細胞;L1-ins/fur細胞を用い、in vivoにおける細胞移植実験を行うことで移植した際の問題点につき検討した.この移植は同種移植となるためnude mouseをrecipientとしSTZ誘発1型糖尿病マウスを作成した.このマウス腹腔内にL1-ins/fur細胞を移植したところ有意な糖代謝改善を認めたがtransformしていない細胞移植群では血糖に変化はなかった.すべてのマウスの死亡は血糖の低下した際に起こっており、血糖に応じたディマンド型のシステムの必要性が示唆された.また分泌されたインスリンの生化学的検討と前駆細胞に移入した際の効果・再生医学的考察を加えた.ヒト・インスリン遺伝子をレトロウイルスベクターにて移入した際のインスリン分泌能は、マウス間葉系前駆細胞で高いことが判明した.さらにこれらを分化させてみると約十倍の分泌能の亢進を確認した.これはtransgeneのNorthern解析では変化がないため、transcriptionalなレベルでの変化ではないことが判明した.一方、逆相カラムによるHPLC及びレーザー質量分析機を用いて細胞の培養上清を解析したところ、中間生成物は検出されず生理的なヒト・インスリンと同様なHPLC溶出パターンとヒト・インスリンと同一の質量を持つインスリンであることが明らかとなった.今年度は本研究計画の最終年度に当たり、これまでに得た成果をとりまとめて一部はすでにトップジャーナルに論文発表を行った。さらに最終的な研究結果も現在投稿中である。これまでに本研究の結果について国内外での学会報告を行ったところ、世界的な注目の中から今後の課題として、1)transgeneの発現調節が考慮されるべきであること、2)プロインスリンがプロセッシングされる際に生理的な部位と同じ2か所で双方とも切断され、片方だけの切断で生じる中間生成物が分泌されないこと、などが必要であること、さらに3)本研究プロジェクトが開始された4年前に比較して、本研究で目標とした代理細胞治療とさらに新らたに注目されるようになった組織再生とどちらが現実的なのか、などが挙げられることが判明し、将来的展望を得ることが出来た。新たな課題である発現調節に関しては、転写レベルでの調節性につき、すでに今年度内に着手し始めた.特にインスリン分泌性の代理細胞に対し、体外から物理的・化学的刺激などを加えることで転写と生合成が高まるようなシステムを考案し、in vitroにおいて検討中である.Transgeneを導入した前駆細胞の分化に伴いインスリン分泌が亢進する現象が、細胞の種類や分化のための刺激によらずに認められた.