hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地方史から見る近現代中央アジア:地域構造の再検討

中央アジアに関してはこれまで国単位の研究とコミュニティ・レベルの研究が主流であったが、本研究ではその中間である州レベルの史料を集め、分析した。中でも特色ある地域としてタジキスタン東部のパミールとカザフスタン西部の旧ボケイ・オルダに注目し、両地域における諸文化の交流や共存の様相を明らかにした。また、タジキスタン内戦やクルグズスタン革命において地方意識が持った多面的な意味を分析した。資料収集・分析:本年度は、研究に必要な基礎文献の収集と、タジキスタンを重点とした調査を行った。北海道大学附属図書館では、ロシア帝政期・ソ連期の地方研究の歴史を地理学協会史を中心に調査したほか、所蔵のタジキスタン史関係文献を網羅的に調査・分析した。またタジキスタンで現地調査を行い、首都ドゥシャンベでは、19世紀の諸侯国・都市の歴史や、地方研究の研究史に関する文献を集め、現地の研究者と意見交換を行った。カラテギン渓谷、山岳バダフシャン自治共和国およびクロブ地方では、地方史に関する情報(特に、イスラーム聖者ら地方の偉人についての情報と、ソ連期の強制移住の記憶)を集め、現地の歴史家が所蔵する史料の閲覧、遺跡の見学などを行った。特にバダフシャンでは、アフガニスタンにまたがる歴史記述の豊かな伝統を確認できた。また、以上の各市・地域で、内戦(1992-97)当時の行政官・野戦司令官らから聞き取り調査を行い、各地での戦闘と和解の経緯について従来知られていなかった情報を集めた。成果発表:ロシア帝国の統治政策の民族的・地域的多様性と、2005年クルグズスタン革命における地方ファクターについて論文等を発表した。タジキスタン調査に関する成果は未刊だが、国立民族学博物館共同研究会で報告「中央アジア民族学の形成と知識人の役割:カザフスタンとタジキスタンの場合」を行い、北海道大学スラブ研究センター専任研究員セミナーにペーパー「タジキスタン内戦と和平」を提出した。現地調査・分析:本年度は西カザフスタンでの現地調査を行った。アクトベでは州の古文書館で史料収集を行い、ロシア革命前後の地方研究機開(「キルギズ地方研究協会」など)の状況や、ソヴェト時代初期の地元の民族運動家の運命などを調査した。また現地の歴史研究者たちと面談し、著作を集め、彼らが西カザフスタンの地方史研究と並んで、ロシア領のヴォルガ・ウラル地域を含めた広域的な地域史研究に活発に取り組んでいることを確認した。アトゥラウとウラリスクでも現地の歴史研究の状況を調査し、地方による研究者の関心の違いを明らかにした。また旧ボケイ・ハン国(18011845)の中心地であるオルダを訪れて遺構を見学し、ロシア帝国が設置した小ハン国という独特の存在である同国の歴史について、博物館などで情報を集めた。これらの町を探訪することによって、遊牧民地域における都市の立地条件をも観察することができた。成果発表:ロシア革命期のカザフ民族運動において、帝政期の制度的・文化的遺産に基づく隣接諸地域との相互作用や、域内の地方的多様性が重要な意味を持ったことに関する報告を、スラブ研究センター国際シシポジウムで行った。また、地方に着目することによって国家のあり方や異文化表象のあり方についても新しい視点が得られるようになったため、帝国論やオリエンタリズム論についての論文発表・学会発表を行った。西カザフスタン調査については、総合地球環境学研究所の研究会で暫定的な成果を発表したが、より本格的な成果を平成20年度に発表する予定である。資料収集・分析:当初予定していたロシアでの現地調査は諸般の事情により実現しなかったが、別財源で行ったアルマトゥ(カザフスタン)での調査により、ロシア帝政期にヴォルガ・ウラル地域で出版されたカザフ語文献はかなり集めることができた。ロシアの地方都市(オムスク、バルナウルなど)での近年の中央アジア研究の状況や出版物については、現地の研究者とのメールのやりとりや学会参加時の聞き取りにより情報を集めた。また、近年欧米で進んでいるウズベキスタンの地方史研究に関する文献を収集した。成果発表: 2007年度に行った西カザフスタン調査の成果に基づき、西カザフスタンの歴史が多民族的・多文化的なものでありながら、帝政期のロシア人による研究においても、ソ連時代以降のカザフ人による研究においても、カザフ民族史の枠に押し込められがちであったこと、近年現地の研究者がこの枠を超えてロシアやタタール、バシキールとのつながりを重視する研究を進めていることを指摘する報告を米国の学会で行った。また、厳密な意味での中央アジアに関することではないが、2008年夏のグルジア紛争について論評する機会が多くあり、そこでも、地方の細かな状況を踏まえたうえで国際政治を論じるという、本研究で培った視点を生かすことができた。そして3年間の研究成果に基づき、タジキスタン、カザフスタン、カフカスの地方が文化交流や紛争において果たしてきた独自の役割を論じる報告を、インドの学会で行った。
オピオイドペプチドによるバゾプレシン分泌調節に関する研究

第一にバゾプレシン(AVP)分泌調節機構に与えるオピオイドペプチド(OP)の役割、特にOPのサブクラスによる作用発現の相違についてラットを用いた検討を行った。浸透圧調節系においてはオピオイドδ、κ、μ受容体アゴニストは程度差があるもののいずれもAVP分泌を抑制したが、容量調節系においてはκ、μ受容体アゴニストがAVP分泌を同様に抑制することに対し、δ受容体アゴニストはAVP分泌に対して全く影響を与えなかった。以上の結果はOPのAVP分泌調節経路上の作用点はそのサブクラスの相違により異なることを示すものであると考えられる。第二にAVP分泌制御における抑制性神経伝達物質であるγーアミノ酪酸(GABA)とOPの相互作用について検討した。SDラットを用い、GABAをあらかじめ留置したカテ-テルから脳室内投与し、浸透圧性のAVP分泌反応に与える影響を検討した。一部のラットにおいてはGABA投与前にOP拮抗剤であるnaloxone処置を行いAVP分泌の変化を観察した。高張食塩水負荷ラットにおいてはGABA脳室内投与10分後より30分後まで血漿AVPは有意に低下し、30分後においては対照群に対しても有意の抑制を生じた。高張食塩水負荷ラットにおけるGABA脳室内投与の用量反応の検討では、100μg以上の用量によってAVPは有意に抑制された。GABAおよびnaloxoneのAVP分泌に与える影響の検討では、高張食塩水投与により上昇した血漿AVPは前述したようにGABAにより有意の抑制をうけ低下を示したが、この抑制はnaloxoneの前処置により阻害された。以上のように、GABAによるAVP分泌抑制がnaloxoneの前処置により部分的に解除された事実から、GABAのAVP分泌調節系には内因性OPを介する経路が介在する可能性が考えられる。今回の研究の結果からAVPの分泌制御機構には内因性OPが神経性調節物質として強く関与すること、またAVP分泌制御に関する複数の神経伝達物質間に相互関係が存在し繊細な調節作用をもつことが強く示唆された。延髓の孤束核は、抗利尿ホルモンであるバゾプレシン(AVP)の容量受容体系の求心性神経経路の中で重要な位置を占めると考えられるが、同部におけるオピオイドペプチドの果たす役割を観察する目的で以下の検討を行った。自由飲水下(以下基礎状態とする)あるいは予めpolyethylene glycolの腹腔内投与により循環血液量低下状態とした正常S-Dラットに、ペントバルビタ-ル麻酔を施行し、脳定位固定装置による固定後、注入カニュ-レを使用してオピオイド受容体のサブクラスのうちκ受容体に強い親和性を示すアゴニストであるU50488H、あるいはδ受容体のアゴニスト作用の強いleu-enkephalinの微量投与を行った。薬剤の投与は、あらかじめラットの脳アトラスにより決定した刺入部位から金属製のカニュ-レを一側の孤束核の深さに到達させた後、マイクロシリンジにより0.2μlを1分間で投与し、直ちに反対側の孤束核に再度同量を投与した。採血は実験5-7日前にあらかじめ留置した静脈カテ-テルから経時的に施行し、各採血後直ちに採血量と同量の等張食塩水を補充した。実験終了後、孤束核内への薬剤の注入の有無を検討するために脳組織をホルマリン固定しニュ-トラルレッドによる染色を行い、刺入部位を確認した。

基礎状態においては、対照群では生理食塩水注入前後の血漿AVPレベルに変化はみられなかったが、U50488Hを孤束核注入後、血漿AVPレベルは経時的に低下した。一方、循環血液量低下ラットにおいては、アゴニスト投与前野血漿AVPレベルは容量受容体系作動の結果、基礎状態の前値の約2倍に上昇したが、U50488H、leu-enkephalinの投与後さらに上昇を示した。血漿AVPの上昇の程度は、leu-enkephalin投与の方がより著明であった。異常の結果は、AVP分泌制御における容量受容体経路の刺激状態の相違によりオピオイドペプチドが特異的な作用態度を示すものと考えられた。昨年度までの成績からバゾプレシン(AVP)分泌制御上、オピオイドペプチドが重要な役割を持つことが明らかとなったが、今年度は中枢性の抑制性神経伝達物質であるγーアミノ酪酸(GABA)とオピオイドペプチドの相互作用について検討した。無麻酔・無拘束下のSDラットを用い、GABA実験当日7日前に脳固定装置および実体顕微鏡を用い留置したカテ-テルから脳室内投与し、高張食塩水負荷による浸透圧性のAVP分泌反応に与える影響を検討した。一方、一部のラットではGABA投与前にオピオイドペプチド拮抗剤であるnaloxone処理を行いAVP分泌の変化を観察した。高張食塩水負荷ラットにおいてはGABA100μgの脳室内投与10分後より30分後まで血漿AVPは有意に低下し、30分後においては対照群(3.4±0.76pg/ml,mean±SE)に対しても有意(P<0.05)の抑制(1.1±0.17pg/ml)を生じた。高張食塩水負荷ラットにおけるGABA脳室内投与の用量反応の検討ではGABA50μgの投与はAVP分泌に影響を与えなかったが、100μg以上の用量によってAVPは有意に抑制された。GABAおよびnaloxoneのAVP分泌に与える影響の検討では、高張食塩水投与により上昇した血漿AVPは前述したようにGABAにより有意の抑制をうけ低下を示したが、この抑制はnaloxoneの前処理により阻害された。naloxoneの単独投与はAVP分泌亢進下においても影響を与えなかった。以上のように、GABAによるAVP分泌抑制がnaloxoneの前処理により部分的に解除された事実から、GABAのAVP分泌調節系には内因性オピオイドペプチドを介する経路が介在、あるいは関与する可能性が考えられる。事実、脳内各部で同一ニュ-ロン中にGABAおよびオピオイドペプチドが共存することも報告されており、今回の研究の結果からAVP分泌制御に関する複数の神経伝達物質間に相互関係が存在し、繊細な調節作用をもつことが強く示唆された。
球状複合糖質高分子の精密構築と生化学機能材料

本年度はポリ(アミドアミン)デンドリマーよりサイズ的には少し小さいが構造欠陥が少ないポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーを用いて、グルコースおよびN-アセチル-D-グルコサミン誘導体置換セリンが球状分子表面に置換したシュガーボールの合成を行った。また、ポリ(アミドアミン)デンドリマーとガラクトース誘導体置換アミノ酸N-カルボキシ無水物(GIycoNCA)との反応により新規にガラクトシルセリン全置換ポリ(アミドアミン)シュガーボールを合成した。NCAの放射成長重合による星型デンドリマーの合成に関する検討も行った。ANSやクマシブリリアントブルーのカプセル化を行い、カプセル化前後でシュガーボールの細胞認識能に変化が無いことをヒママメレクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により明らかにした。さらに、プラスミドDNAとのコンプレックス形成についても電気泳動法などにより解析を行い、効率よくシュガーボールがDNAと複合体を形成することを確認した。CDスペクトル測定により、複合体形成に伴いDNAのコンホメーションがB型からC型に変化することが明らかになった。これらの知見は、シュガー・ボールが、新しい生医学材料として利用できる可能性を示している。
福島県の乳幼児を支援する－東日本大震災後のメンタルヘルスに関する介入研究

岩手、宮城、福島の3県の甚大被災地において、5歳児を中心に子どもとその保護者に対して心理検査等を実施した。その結果、WISCの絵画完成得点などで有意な遅れが認められた。保護者の約3割に何らかの精神科的症状が認められた。また福島県沿岸部の幼児を対象に視線解析装置を使用し注意機能の検討を行った。注意の切り替えについては、家庭環境が気になる児は、何かに注意を向けているときには他のものに注意を切り替えづらい特徴があり、児の固有の発達特性(特徴)と家庭環境は、児の「人に対する関心」と「注意の切り替え」にそれぞれ異なる影響を与えている可能性が示唆された。本年度は、東日本大震災による津波や長期の低線量放射線不安が乳幼児の行動にどのような影響を与えるのか明らかにするため、福島県浜通りに位置するA市の乳幼児健康診断の乳幼児健診記録のデータ収集と分析を行った。また、並行して発災後より地元に密着した支援活動を実施している。データ収集については、H21H25までの健診記録ならびに、H24以降は自閉症特性とストレスに関する質問紙についてもデータ収集を行った。分析については、H22及びH23の震災前後における1歳半健診(682例)と3歳半健診(762例)の問診票について実施した。χ二乗検定及び差の検定の結果、1歳半、3歳半健診ともに、震災後の母親の育児負担とメンタル面の悪化が有意であり、子どもの身体発達については3歳半児においてH23群でカウプ指数が有意に高かった。また、多動などの発達障害に類似した症状をもつ児が有意に高いことが明らかになったが、これは、震災後の支援活動での印象と一致していた。多動症状の要因について検討するため相関分析を行ったところ、H23群において多動症状とASD特性、言語発達、子どものメンタルヘルス、身辺自立がそれぞれ有意な相関を示した。このことから、震災前に適応していた自閉症的特性の強い子どもが震災後の急激な生活環境の変化によって適応が難しくなったという仮説を立て、多動症状とASD特性を示す3変数を用いてMplusで解析を行ったところ仮説を支持する結果と考えられた。しかしながら、ASD特性の指標についても有意ではないもののH22群と比べてH23群で高い値を示していることから、震災後にASD特性自体が現れる傾向が高くなった可能性やASD特性を持つ子どもの避難率が低かった可能性も考えられる。なお、不適切な養育環境によって多動症状を呈している子どもが少なからずいるという印象もあり、この側面についても検討を加える必要がある。【研究1:震災前後の乳幼児全般の行動の変化の調査】南相馬市において震災前後4年間(H21年580例; H22年539例;H23年158例;H24年162例)の1歳半健診受診児総計1439例の記録183項目について調査した。3歳半健診についても震災前後4年(H22年555例;H23年207例;H24年230例;H25年215例)の受診児総計1207例の記録222項目について調査した。その結果1歳半健診については「周囲の人や他人の子どもの関心を示さない児」が3歳半健診においては、自分の名前が言えない、多動衝動性があるなどの項目が震災後より有意に高値であることなど、重要な所見が明らかになった。【研究2:視線解析による発達障害と環境因性の対人社会性の課題を鑑別する研究】幼児を対象に(1)静止画(人物vs幾何学)、(2)動画(動物アニメ[中心視領域]と風船[周辺視領域]のgap-overlapパラダイム)を実施し視線を測定・分析した。日常エピソードから協力児を社会性が気になる群)と気にならない群に分けて結果を比較した。(1)については、人物の領域の第1注視時点から人物領域を注視が外れるまでの時間等で有意差が(2)については、gap条件と、overlap条件で異なる反応がみられた。(3)人物・幾何学模様の選好視、(4)動画(動物[中心視]と風船[周辺視]のgap-overlapパラダイムを実施した。協力児を社会性が気になる群と気にならない群に分けて結果を比較した。やはり両群で有意差がみられた。【研究3:子どものストレス要因とレジリエンス要因を明らかにする】平成27年度は、岩手、宮城、福島の3県の沿岸部激甚被害地域にあたる保育園を対象として、園児およびその保護者、それぞれ約80名に対して面接調査と質問紙調査を実施した。発達評価を実施したところ、平均的には大きな遅れは認められなかったが、何らかの発達障がいを有する可能性がある幼児が、各県で数ケースずつ確認された。今後保育園と連携し、幼児への介入や保護者支援を実施していく。福島県沿岸部の乳幼児健診データ収集、視線解析測定、保育園での面接調査など、ほぼ計画的に進捗し、それぞれ重要な所見が得られ、最終年度の研究につなげることができた。平成28年度は前年度に引き続き岩手、宮城、福島の3県の甚大被災地において、5歳児を中心に子どもとその保護者に対して心理検査や質問紙調査、および構造化面接を実施した。その結果、WISCの絵画完成得点や絵画語彙検査の得点において、有意な遅れが認められた。さらに、保護者に対する構造化面接においては、約3割に何らかの精神科的症状が認められた。

保護者と保育者による子どもの評価(CBCLおよびSDQ)に大きな乖離が見られ、その原因と影響についてさらに検証する必要性が認められた。さらにH28年度は、東日本大震災後に誕生した子どもとその保護者のメンタルヘルスについて、質問紙による調査を福島県内陸部にて実施した。対象は震災後に誕生した子ども(2011年4月2012年5月)とその保護者、及び担当保育士とし、95組(1市6園)が参加となった。現在、データ入力までが完了しており、今後は沿岸部のデータと比較し、解析を進める。また、参加した市や園と連携し、対象児や保護者への支援の検討を行う。また福島県沿岸部に居住する親子の家庭環境の変化が児に与える影響を検討するため当該地区の保育園に通園する21ヶ月34ヶ月の幼児を対象に視線解析装置を使用し注意機能の検討を行った。注意の切り替えについては、家庭環境が気になる児は、何かに注意を向けているときには他のものに注意を切り替えづらい特徴があり、児の固有の発達特性(特徴)と家庭環境は、児の「人に対する関心」と「注意の切り替え」にそれぞれ異なる影響を与えている可能性が示唆された。岩手、宮城、福島の3県の甚大被災地において、5歳児を中心に子どもとその保護者に対して心理検査等を実施した。その結果、WISCの絵画完成得点などで有意な遅れが認められた。保護者の約3割に何らかの精神科的症状が認められた。また福島県沿岸部の幼児を対象に視線解析装置を使用し注意機能の検討を行った。浜通りのA市のおけるデータをを十分に収集することができ、興味深い結果が得られた。データを分析する上で、現在のデータのみでは解釈が難しい部分が明らかになりさらなるデータ収集が必要になることも明らかになった。支援者に関するデータはアンケート調査などよりデータは収集できたが、解析は現時点では不十分であり、今後、解析を行う予定である。研究1、3については、今後も継続して震災後のデータを集積解析する。研究2についても重要な知見が得られたので、今後症例数を増やして検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。児童精神医学今後は引き続きデータ収集を行い、ストレス状況下での発達障害と環境因性の行動特徴の鑑別指標を見いだすため、他の年度のデータも合わせ詳細な分析を行う(研究1)。発達障害が疑われる子どものストレス要因とレジリエンス要因を明らかにするため、臨床的支援を行った子どものうち保護者の同意が得られたケースに対して追跡調査を実施し、コホートデータベースを作成し、定量的な縦断研究を実施していく(研究2)。乳幼児検診の場において何らかの支援や経過観察が必要とされた群ならびに、過去の巡回医療相談や福島県発達障がい者支援センターでの実際の支援と得られた定量データの分析を通して有効な支援方法について検討する(研究3)。また、福島県沿岸部の支援サービスの低下や支援者の減少は深刻な状態が継続しており、改善のきざしは乏しく、今後数年は同様の状況が継続する可能性が高い。よって、本研究において適切な支援者支援の方法を職種別に検討していく(研究4)。
馬媾疹の迅速診断法と貼るワクチンによる新規予防法の確立

馬媾疹は、馬ヘルペスウイルス3型(EHV3)に起因し、主に交配で伝播する。本病を発症すると外部生殖器に丘疹や水疱が生じ、痛みを伴うため交配が約2週間不可能となり、交配料の高い種牡馬では数億円の損害に達する。本研究では、本病を現場で迅速に診断できるEHV3検出キットの開発と生殖器への感染防御を目的として感染防御抗原をコードするmRNAを微小針に封入した貼るワクチンによる経皮ワクチンを開発する。平成30年度の研究で以下の成績を得た。1.EHV3検出キット開発:EHV3を免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合し抗体産生細胞クローンを35種類得た。それらをマウス腹腔内に移入したところ、30種類の高濃度の抗体を腹水として得た。それらの抗体のアイソタイプは、IgG1が14種類、IgG2aとIgG2bがそれぞれ1種類、IgMが12種類、IgG1とIgMの混合が1種類、そしてIgG3とIgMの混合が1種類であった。抗体価は、IgG1クローン14種類中10種類が25600以上の高い値を示し、次いで6400倍が2種類、1600倍と400倍が1種類であった。IgG2aとIgG2bのクローンは6400倍であった。IgMのクローン12種類では6400倍が2種類、1600倍が8種類、残り2種類が100倍であった。2種類のアイソタイプを持つクローンは、6400倍(IgG1とIgM)と1600倍(IgG3とIgM)であった。ウサギ2頭にEHV3を免疫して高度免疫血清を得た。抗体価は何れも320倍であった。2.経皮ワクチン開発:感染防御抗原の候補となるウイルス蛋白13種類(エンベロープ糖タンパク:gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gMとgN;遺伝子発現調節蛋白:ICP22)をコードする領域をPCRで増幅し、動物細胞発現ベクターへのクローニング用に精製を終えた。研究の進展に最も大きな影響を与えると考えられたモノクローナル抗体の作出が予想以上にうまくいった。ウサギの高度免疫免疫血清も予定どおり作出しすることができた。感染防御抗原をコードする領域のPCRでは、試行錯誤して増幅用プライマーを設計し、予定していたウイルス蛋白全てのコード領域を増幅することができた。それらのPCR産物の精製も無事終えた。研究実施計画どおり研究を進める。1.馬媾疹の迅速診断法の確立:平成30年度に作出した30種類のモノクローナル抗体と2種類のウサギ高度免疫血清を精製して、EHV3を最も感度よく検出する抗体の組み合わせを探索する。その組み合わせを用いて、北海道の簡易キット開発メーカーと共同で簡易キットを構築する。さらに、モノクローナル抗体については、ウエスタンブロット法などにより認識しているウイルス蛋白を同定する。2.馬媾疹の予防法の確立:13種類の感染防御候補蛋白をコードする領域を動物細胞発現用プラスミドにクローニングし、ウイルス蛋白を培養細胞で発現させる。それらのウイルス蛋白とEHV3感染馬の抗体を反応させて、抗体誘導に有効と思われる蛋白を同定する。感染防御抗原をコードする遺伝子をPCRで増幅し、mRNA合成用プラスミドにクローニングし、mRNAを大量に合成する。mRNAの細胞内の安定性を高めて蛋白発現量を多くするため、mRNAの合成はUTPの代わりに1-methylpseudouridine-5'-triphosphateを用いる。皮膚に接すると溶解する素材でできた微小針内に候補となるウイルス蛋白のmRNAを封入し、貼付け型経皮ワクチンとする。この工程は京都のメーカーと共同で行う。試作した貼付け型経皮ワクチンを野外馬に応用し、抗体の誘導能を中和試験で調べる。その成績をもとに、ワクチンを構成するmRNAの種類を決定し、最終候補ワクチンとし、再度、野外試験を実施して、抗体の誘導効果を調べる。

IgMのクローン12種類では6400倍が2種類、1600倍が8種類、残り2種類が100倍であった。2種類のアイソタイプを持つクローンは、6400倍(IgG1とIgM)と1600倍(IgG3とIgM)であった。ウサギ2頭にEHV3を免疫して高度免疫血清を得た。抗体価は何れも320倍であった。2.経皮ワクチン開発:感染防御抗原の候補となるウイルス蛋白13種類(エンベロープ糖タンパク:gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gMとgN;遺伝子発現調節蛋白:ICP22)をコードする領域をPCRで増幅し、動物細胞発現ベクターへのクローニング用に精製を終えた。研究の進展に最も大きな影響を与えると考えられたモノクローナル抗体の作出が予想以上にうまくいった。ウサギの高度免疫免疫血清も予定どおり作出しすることができた。感染防御抗原をコードする領域のPCRでは、試行錯誤して増幅用プライマーを設計し、予定していたウイルス蛋白全てのコード領域を増幅することができた。それらのPCR産物の精製も無事終えた。研究実施計画どおり研究を進める。1.馬媾疹の迅速診断法の確立:平成30年度に作出した30種類のモノクローナル抗体と2種類のウサギ高度免疫血清を精製して、EHV3を最も感度よく検出する抗体の組み合わせを探索する。その組み合わせを用いて、北海道の簡易キット開発メーカーと共同で簡易キットを構築する。さらに、モノクローナル抗体については、ウエスタンブロット法などにより認識しているウイルス蛋白を同定する。2.馬媾疹の予防法の確立:13種類の感染防御候補蛋白をコードする領域を動物細胞発現用プラスミドにクローニングし、ウイルス蛋白を培養細胞で発現させる。それらのウイルス蛋白とEHV3感染馬の抗体を反応させて、抗体誘導に有効と思われる蛋白を同定する。感染防御抗原をコードする遺伝子をPCRで増幅し、mRNA合成用プラスミドにクローニングし、mRNAを大量に合成する。mRNAの細胞内の安定性を高めて蛋白発現量を多くするため、mRNAの合成はUTPの代わりに1-methylpseudouridine-5'-triphosphateを用いる。皮膚に接すると溶解する素材でできた微小針内に候補となるウイルス蛋白のmRNAを封入し、貼付け型経皮ワクチンとする。この工程は京都のメーカーと共同で行う。試作した貼付け型経皮ワクチンを野外馬に応用し、抗体の誘導能を中和試験で調べる。その成績をもとに、ワクチンを構成するmRNAの種類を決定し、最終候補ワクチンとし、再度、野外試験を実施して、抗体の誘導効果を調べる。応募した研究計画調書の研究経費に対して、交付予定額が圧縮され、特に研究2年目の研究経費が不足する可能性があったため、1年目の研究経費をできるだけ節約して翌年度に繰り越した。繰り越した助成金については、「その他」の部分の経費に充てる予定。
ヒトBCL6遺伝子の発現調節機構の解析

染色体は3q27関連の相互転座は非ホジキン悪性リンパ腫に高頻度に認められ、中でも日本人に多く認められる大細胞型のリンパ腫に特徴的といわれている。3q27上に新たなるがん遺伝子が存在することが以前から推定されていたが、我々のグループは染色体転座t(3,22)を有する症例から,遺伝子BCL6のcDNAのクローニングに成功し報告した(Blood,86,26,1993.Blood,86,217,1993)。新しい転座関連遺伝子BCL-6はそのDNA塩基配列からzinc-fingerドメインを有する転写因子としての機能が推定され、B細胞性悪性リンパ腫の発生に大きく関与していると考えられた。この遺伝子のB細胞における分化、増殖、あるいは増腫瘍性などのメカニズムの解明のために、我々はcDNAのクローニングに引き続いて、BCL-6の発現実験およびポリクローナル抗体の作成や遺伝子の構造解析などをすすめた。BCL-6遺伝子の構造に関し全長で26Kbであり、9つのexonからなることを報告し(Leukemia,8,1327,1994)、さらに遺伝子発現調節領域に関しては、正確な転写開始点の決定、さらに上流領域に関して転写活性を制御するプロモーター領域を同定、報告した(Biochem Biophys Res Commun,214(2),461,1995)。BCL-6遺伝子については、転写開始点上流-657bpまでに強いプロモーター活性があり、5′側上流領域1,5Kbまでの間にはCACCC、E-BOX、GATA-1のなどのモチーフがみとめられており、現在解析が進んでいる。しかしながらこれらのエレメントが実際に転写調節に機能しているか否かは、今後の更なる解析が待たれる。BCL-6遺伝子は正常では、成熟リンパ球以外ではその強い発現は筋細胞に限られており、また遺伝子上流領域には筋細胞に特異的エンハンサーとして働くコア配列であるE-boxやE-boxと協調して働くとされるCACCCといったエレメントの存在がみられるなど、BCL-6遺伝子の組織特異的な発現調節の可能性、またそれに関わる新たなトランス作動性因子の存在も想定された。今後の研究では、これらのエレメントに関して、その特異性や新たな結合因子の関与の解明を行い、遺伝子レベルで解析を行う予定である。
情報環境の多様化が国際関係にもたらす影響：観衆費用・陽動理論の社会心理学的再検討

前年度に掲載が決定していたマスメディアの信頼の測定項目による差異について扱った論文が発表された。また、この論文では項目の差異による影響の存在を指摘するに留まっていたが、ベイズ統計モデリングによって補正することで、この問題に対して事後的に対処する方法について検討を行った。この研究については、2018年度日本選挙学会研究会において発表するとともに、「評定尺度法の反応ラベルによる影響の補正:公的組織への信頼を題材として」というタイトルの論文としてまとめ、社会心理学研究誌への掲載が既に決定している。加えて、メディアへの接触変数の精緻化のため、過去に行われてきた社会調査の項目を整理し、Web調査実験を用いて、妥当性の高い調査項目を作成することを試みた。その結果、世論研究の分野においては、ジャンルを限定しないテレビ視聴時間を項目として用いることは好ましくないと考えられること、週単位でのニュースや新聞の接触頻度を具体的な日数を挙げて尋ねる形式の妥当性が高いこと、具体的な番組視聴について尋ねる形式は生活時間帯の影響を強くうけ、平日夜および休日のニュース番組接触のみが、有効な項目であることなどが明らかになった。この結果については、日本社会心理学会第59回大会において発表した。加えて、2018年12月に日本の海上自衛隊の哨戒機に対して、韓国海軍の駆逐艦がレーダーを照射した事件が起こったため、12月末、1月、3月の3回においてWeb調査データを取得し、事件に対する日本国民の反応について調べた。メディア接触の影響を検証するためには、接触の効果を測る妥当性の高い質問項目が不可欠といえる。本研究課題においては、過去の社会調査において用いられてきた質問項目を収集するとともに、Web調査実験を繰り返すことで、質問項目の妥当性の検証を行うことができた。これは2019年度以降にメディアへの接触効果を検証する研究を行うための準備段階であったが、これに関連した研究成果として、査読付き学会誌に2本の論文が掲載されたことは予想外の成果といえる。一方で、2018年12月に本研究課題において極めて重要な事象といえる日韓レーダー照射事件が発生したため、予定を変更し、この事件に関連した調査データを取得することとした。これにより、2018年度は科研申請当初に計画していた仮想状況を設定した上でのサーベイ事件という形式でのデータ取得を行うことはできなかった。しかし、通常時においては取得することのできない貴重なデータを取得し、研究成果を発表することは、重要なことと考えられる。このように、実際の国際関係を取り巻く状況や研究の進展に伴い、当初の予定とは異なる形でのデータ取得や成果発表を行う状況となっているが、国際関係におけるメディアコミュニケーションの影響を検討するという本研究の課題自体に照らして重要な知見やデータが得られており、進捗状況には問題ないと考えられる。まずは2018年度に取得した日韓レーダー照射事件に関する3回の調査データの分析を行う。それとともに、この事件に関連した2018年12月から2019年3月にかけてのマスメディア・インターネット上での言説について、テキストデータを取得し、調査データと結びつけることで、同時期におけるメディア接触が、日本の有権者の韓国への態度にもたらした影響について検証を行う。この成果については、2019年度の日本社会心理学会で発表を行うとともに、早期に論文化し、査読付き学術誌への掲載を目指す。さらに、2019年9月以降に、当初予定していた通り、多様化するメディア環境における議題設定効果について、検討するためのパネル調査を実施する。また、それらと並行して、メディア・コミュニケーション研究を俯瞰する書籍の執筆が進行中であり、こちらについても2020年中には出版を目指す。2017年度は、リサーチアシスタントの協力を得て過去に行われた社会調査のデータを収集・整理し、メディアへの接触およびマスメディアへの信頼を測定する際に用いられる質問項目のバリエーションについて検討を行った。その上で、過去の調査を参考にしながら、クラウドソーシングサービスの登録者を対象として、両変数についての測定方法を回答者ごとに変更したランダム化比較実験を行うことで、質問項目の相違が回答にもたらす影響についての検討を行った。マスメディアへの信頼については、1.選択肢の「信頼している」の前に「とても」「かなり」といった副詞を付した場合、「非常に」「やや」など他の副詞を付した場合に比べて、信頼が低く評定される。2.「新聞(新聞社)・雑誌(出版社)」への信頼をまとめて尋ねた場合、「新聞(新聞社)」単独の信頼を尋ねた場合に比べて、信頼が低く評定される。3.対象が「テレビ局」「新聞社」「出版社」といった組織であることを明示すると、信頼が低く評定されるといったことが明らかになった。これらの結果は、2017年10月に開催された日本社会心理学会にて「マス・メディアというアクターに対する信頼感の研究」というタイトルで発表を行うとともに、『社会心理学研究』誌に投稿を行い、既に掲載が決定している。また、新聞社から論文についての取材を受けるとともに、マスコミ各社に対してプレスリリースを行う準備を行っている。メディアへの接触については、2018年8月に行われる予定の日本社会心理学会にて「マスメディアへの接触変数の測定に関する研究」というタイトルで発表を行う予定となっている。2017年度は以降の研究の準備段階であり、調査に用いる項目の選定を行うことが主たる目的であったが、この過程で独立した業績として、査読付き学術誌への投稿論文の掲載が決定したということは当初予定していた以上の進捗であった。それに加えて、過去に行われた調査についてのある程度網羅的かつ見やすいデータベースを作成することができたことも、今後の研究の進展にとって重要であった。

このデータベースを更新・活用しながら、今後の調査を行う際に質問項目の選定を行っていく。さらには、2017年10月に衆議院が解散され、衆議院議員選挙が行われたことで、それに関連する調査データを取得することができたことも、予想外の成果となった。前年度に掲載が決定していたマスメディアの信頼の測定項目による差異について扱った論文が発表された。また、この論文では項目の差異による影響の存在を指摘するに留まっていたが、ベイズ統計モデリングによって補正することで、この問題に対して事後的に対処する方法について検討を行った。この研究については、2018年度日本選挙学会研究会において発表するとともに、「評定尺度法の反応ラベルによる影響の補正:公的組織への信頼を題材として」というタイトルの論文としてまとめ、社会心理学研究誌への掲載が既に決定している。加えて、メディアへの接触変数の精緻化のため、過去に行われてきた社会調査の項目を整理し、Web調査実験を用いて、妥当性の高い調査項目を作成することを試みた。その結果、世論研究の分野においては、ジャンルを限定しないテレビ視聴時間を項目として用いることは好ましくないと考えられること、週単位でのニュースや新聞の接触頻度を具体的な日数を挙げて尋ねる形式の妥当性が高いこと、具体的な番組視聴について尋ねる形式は生活時間帯の影響を強くうけ、平日夜および休日のニュース番組接触のみが、有効な項目であることなどが明らかになった。この結果については、日本社会心理学会第59回大会において発表した。加えて、2018年12月に日本の海上自衛隊の哨戒機に対して、韓国海軍の駆逐艦がレーダーを照射した事件が起こったため、12月末、1月、3月の3回においてWeb調査データを取得し、事件に対する日本国民の反応について調べた。メディア接触の影響を検証するためには、接触の効果を測る妥当性の高い質問項目が不可欠といえる。本研究課題においては、過去の社会調査において用いられてきた質問項目を収集するとともに、Web調査実験を繰り返すことで、質問項目の妥当性の検証を行うことができた。これは2019年度以降にメディアへの接触効果を検証する研究を行うための準備段階であったが、これに関連した研究成果として、査読付き学会誌に2本の論文が掲載されたことは予想外の成果といえる。一方で、2018年12月に本研究課題において極めて重要な事象といえる日韓レーダー照射事件が発生したため、予定を変更し、この事件に関連した調査データを取得することとした。これにより、2018年度は科研申請当初に計画していた仮想状況を設定した上でのサーベイ事件という形式でのデータ取得を行うことはできなかった。しかし、通常時においては取得することのできない貴重なデータを取得し、研究成果を発表することは、重要なことと考えられる。
単分域化したボラサイト化合物における光学的電気磁気効果

本研究では強磁性強誘電体であるボラサイト化合物を対象として、方向二色性を調べた。この中で特にCo3B7O13Iでは磁化の磁場履歴に対応した光吸収変化を観測した。単結晶化に成功した他の物質についても、遷移金属イオンのd-d遷移に対応した光吸収において方向二色性が現れることがわかった。本研究で目的とした外場を用いた単分域化は達成されていないものの、イメージングの手法を用いることによって分域がそろった領域における方向二色性の評価を行うことができるようになった。今後は本研究で構築した測定系および得られた知見をもとに光学的電気磁気効果の研究を推進していく。本研究は光学的電気磁気効果に由来する方向二色性の巨大化への指針を得るために、強磁性強誘電体のボラサイト化合物を対象として、電場および一軸応力によって強誘電分域構造を制御し、光学的電気磁気効果の物質依存性を明らかにすることを目指している。本年度の成果として、育成条件の最適化によって室温より高い温度で強誘電相へ相転移するCu3B7O13Clの大型単結晶を育成できたことが挙げられる。この物質は100°C付近で強誘電相転移するため、室温においてクロスニコル配置での偏光顕微鏡観察を行うと、屈折率の異方性に由来して分域構造が観測される。このため偏光顕微鏡にヒーター及び放射温度計を設置し、転移点近傍での分域構造の変化の観察及び応力による制御を試みた。実験から相転移点近傍での分域構造の形成過程を観測することに成功した。応力印加による分域構造の制御については[001]方向への応力印加では分域構造の変化が見られなかった。今後は相転移後に格子定数が短いb軸となる[110]方向への応力印加と電気分極が現れる[001]方向への電場印加を組み合わせることにより、強誘電分域の単分域化の方法を確立する。また、強磁場下で方向二色性を観測するために、超伝導マグネット付属のヘリウムフロー冷凍機に光ファイバーを通し、新しく光学測定系を構築した。この測定系を使用することで9テスラまでの磁場印加下での測定が可能となるため、ボラサイト化合物の弱強磁性相にて磁化の磁場履歴曲線に対応する測定を行うことが可能となった。本年度は強磁場下での測定を効率よく行うため、広い波長範囲を同時に測定できるよう新たに回折格子を導入した。これにより比較的ブロードな吸収ピークを持つボラサイト化合物での測定に適した光学系を構築することができた。前年度育成したCu3B7O13Clの単結晶試料について光吸収測定を行い、900nm付近にCuのdーd遷移に伴う大きな吸収が観測できた。しかし、吸収が大きいため測定では試料の厚さを20μm程度まで薄くする必要があり、一軸応力による単分域化はまだ達成できていない。室温で結晶学的な分域の制御を行える物質であるため、今後は試料を割ること無く応力印加できるような治具を作成し、結晶学的な分域を揃えた状態を実現することに注力する。同じく前年度育成したNi3B7O13Iについては、吸収係数の温度依存性測定、線二色性、磁場印加下での吸収係数の温度依存性測定をそれぞれ行い、磁気転移温度以下において方向二色性が現れることを確かめた。この研究を進める中で、他の類似物質における方向二色性の観測も行った。特にCuB2O4においては発光の方向二色性を観測することができた。これは吸収係数が大きいボラサイト化合物における方向二色性の測定に活かせる知見であると考えられる。単結晶試料の育成過程で石英管が爆発してしまい、予定していた組成を全て網羅することが難しくなっている。一方でコバルトやニッケルおよび銅を含むボラサイト化合物の合成には成功しており、特にこれらの物質ではスピン軌道相互作用も大きいため方向二色性も大きくなることが予想される。このため今後はコバルト、ニッケル、および銅を含むボラサイト化合物について、ハロゲン元素を変えた物質の作成を重点的に行う。また、Cu3B7O13Clにおいては光吸収が大きく、吸収測定のためには試料を20μm程度まで薄くする必要があり、一軸応力の印加が困難であった。今後は試料を割ること無く応力印加できるような治具を作成し、結晶学的な分域を揃えた状態を実現することに注力する。強磁性強誘電体では物質中の磁化と電気分極が互いに相関を持ち、磁場による電気分極の操作あるいは電場による磁化の操作が可能となる。この現象は電気磁気効果と呼ばれ、1960年代から研究が行われている。しかし、実際に強磁性強誘電体となる物質は限られており、近年活発に研究が行われたマルチフェロイクスにおいても多くは反強磁性体であった。本研究で対象としたボラサイト化合物は強磁性強誘電体として1960年代に合成された。この物質群では実際に電場による磁化向きの制御などの電気磁気効果が報告されている。この電気磁気効果は電場や磁場のような外場だけではなく、光の振動電場や振動磁場に対しても応答する。

この効果は光学的電気磁気効果と呼ばれ、光の入射方向の反転によって光吸収が変化する方向二色性や、屈折率が変化する方向複屈折が現れる。本研究では強磁性強誘電体であるボラサイト化合物を対象として方向二色性の検出を行い、磁性イオン、磁気構造、強誘電性、結晶学的分域構造との関連性を調べることを目的として研究を行った。ボラサイト化合物は強誘電転移と同時に結晶構造も変化する。この時に光学的異方性も変化するため、光学応答の詳細を理解するためには分域構造をそろえる必要がある。本研究では主にCo3B7O13I、Ni3B7O13I、Cr3B7O13Cl、およびCu3B7O13Clの単結晶育成に成功した。Co3B7O13I、Ni3B7O13Iにおいては低温で強誘電転移および磁気転移するが、この時の方向二色性について調べた結果、磁化と対応して吸収強度が変化することが分かった。Cr3B7O13ClおよびCu3B7O13Clに対しては室温付近で強誘電転移することから、電場および応力を加えることによる単分域化を試み、電場のみでは単分域化しないことが分かった。本研究では強磁性強誘電体であるボラサイト化合物を対象として、方向二色性を調べた。この中で特にCo3B7O13Iでは磁化の磁場履歴に対応した光吸収変化を観測した。単結晶化に成功した他の物質についても、遷移金属イオンのd-d遷移に対応した光吸収において方向二色性が現れることがわかった。本研究で目的とした外場を用いた単分域化は達成されていないものの、イメージングの手法を用いることによって分域がそろった領域における方向二色性の評価を行うことができるようになった。今後は本研究で構築した測定系および得られた知見をもとに光学的電気磁気効果の研究を推進していく。本研究では同一の結晶系において遷移金属イオンのd電子数に依存した方向二色性の大きさを系統的に調べるため、遷移金属イオンの種類を変えたボラサイト化合物の単結晶育成を行っている。本年度は化学気相輸送法によりCu及びCrの塩化物系ボラサイト化合物、Mn、CoおよびNiのヨウ素系ボラサイト化合物の単結晶試料を育成した。先行研究により結晶育成の際には原料として用いるハロゲン化物に含まれる水分が重要であるとの指摘がなされているが、多すぎると育成の際に石英管が爆発することがあるため、育成温度と共に最適化することが必要であった。それぞれの単結晶試料について磁化測定を行い磁気転移点、抗磁場の評価を行った。また強誘電転移温度が高い塩化物系のボラサイト化合物については、偏光顕微鏡に設置した高温測定系あるいは液体窒素冷凍機を使用した低温測定系を用いて、相転移前後の分域構造の形成過程の観察を行った。また、強磁場下で方向二色性を観測するために、超伝導マグネット付属のヘリウムフロー冷凍機に光ファイバーを通し、新しく光学測定系を構築した。この測定系を使用することで9テスラまでの磁場印加下での測定が可能となるため、ボラサイト化合物の弱強磁性相にて磁化の磁場履歴曲線に対応する測定を行うことが可能となった。これまでに合成に成功しているコバルトやニッケルおよび銅を含むボラサイト化合物は、スピン軌道相互作用も比較的大きいため、方向二色性も大きくなることが予想される。このため最終年度はコバルト、ニッケル、および銅を含むボラサイト化合物について重点的に研究を行う。また、ボラサイト化合物は光吸収が大きい場合が多く、吸収測定のためには試料を20μm程度まで薄くする必要があり、一軸応力の印加が困難であった。
離散気泡モデルによる沸騰二相流の熱流動ダイナミックスモデルの構築

ボイド伝播方程式を基礎式とする離散気泡モデルを発展させ,垂直上昇流におけるボイド率の時間変動挙動を定常流ならびに流動脈動下に対して数値的に再現するとともに,同モデルの水平流への拡張を実施した.また,この計算結果を管内径2.0, 3.0mmの水平ミリチャンネル内の作動圧力5.0, 6.5 MPaのCO_2で得られた実験結果と比較し,従来提案させている流動様式線図よりもよく実験結果を表現でき,特に管頂部のドライアウトが問題となるSlug-Annular flowを含むIntermittent領域の存在を上手く再現できることを示した.ボイド伝播方程式を基礎式とする離散気泡モデルを発展させ,垂直上昇流におけるボイド率の時間変動挙動を定常流ならびに流動脈動下に対して数値的に再現するとともに,同モデルの水平流への拡張を実施した.また,この計算結果を管内径2.0, 3.0mmの水平ミリチャンネル内の作動圧力5.0, 6.5 MPaのCO_2で得られた実験結果と比較し,従来提案させている流動様式線図よりもよく実験結果を表現でき,特に管頂部のドライアウトが問題となるSlug-Annular flowを含むIntermittent領域の存在を上手く再現できることを示した.離散気泡モデルの高精度化に不可欠となる基本流動特性取得のための実験装置については,ほぼ計画通り完成した.この装置を用いて定電流法によるスラグ伝播特性,高速度ビデオによるスラグ挙動観察が予定通り実施できており,この結果に対して現在評価検討中である.特に,スラグ伝播特性に関しては,H19年度は、測定プローブそのものの特性特定のために測定点を当初予定数よりも少なくして評価してきたが,これらの結果を元に指針がほぼ確立できた.H20年度は,この検討結果を元に装置をチュ-ニングすることで,当初計画のスラグ周りの特性把握がほぼ予定通り取得可能であると考えている.また,当初H20年に予定していた離散気泡モデルの高度化に関する内容を一部前倒しでH19年度に実施しており、エネルギー方程式め組み込みが既に完了し,沸騰系へと適用範囲を拡張することに成功した.このモデルを用い,飽和水が流入した場合の流動様式遷移の再現,流動変動下で逆流が発生する条件での管壁の時間変動,周期的ドライアウトをOne-way coupling法を用いて再現することに成功し,一部内容については既に学会発表を行った.また,水平管への拡張についても,水平流における気液相対速度,圧力損失を組み込み,マイクロチャンネルのような細管での流動様式が再現できるモデルの構築に成功した.沸騰関連機器の負荷変動時には大気泡が過渡的に形成されるが,高熱流束条件においてはこの大気泡周囲の液膜がドライアウトする低クオリティバーンアウトが発生し,この現象は垂直上昇流よりも特に水平流において問題となる.このような二相流に内在するダイナミクスに起因する現象は,従来の時間平均化されたモデルでは表現できない.本一連の研究では,ボイド伝播方程式を基礎式とした離散気泡モデルを発展させ,垂直上昇流におけるボイド率の時間変動挙動を定常流のみならず,流動脈動下において大気泡が過渡的に形成される様子も数値的に再現することが可能となっており,ここでは水平流への拡張を実施した.離散気泡モデルではボイド伝播方程式を基礎式とし,運動量効果として,気相の相対速度,先行気泡によるウェークの効果,気相の圧縮性,相の再配分機構のみを考慮する.これを水平流に適用するにあたり,気相の相対速度,圧力のジャンプ条件のみ変更が必要になる.気相の相対速度に関しては水平ダクト内に進入する大気泡速度を実験的,解析的に得たWeberの式を用い,圧力ジャンプ条件に関してはRegime-based modelingを用いた.以上により水平流のボイド率の時空間変動波形を数値的に得ることができ,確率密度関数を用いることで流動様式の判別を行った.この計算結果を管内径2.0,3.0mmの水平ミリチャンネルに作動圧力5.0, 6.5 MPaのCO2で得られた実験結果と比較し,従来提案させている流動様式線図よりもよく実験結果を表現でき,特に管頂部のドライアウトが問題となるSlug-annular flowを含むIntermittent領域の存在を上手く再現できることを示した.また,ウェーク効果の評価を行うために定電流法での評価手法を構築した.
EGF受容体および不良ミトコンドリアにおけるユビキチン修飾の実体解明

代表者らはユビキチン鎖結合プローブによるユビキチン鎖の保護とトリプシンによる限定分解を組み合わせることによりユビキチン鎖長を決定する手法を開発してきた。本研究では、代表者らが開発したユビキチン鎖長決定法および質量分析計によるユビキチン鎖の高感度絶対定量法を用いて、主要なユビキチン依存的経路である増殖因子受容体のダウンレギュレーションに焦点を当て解析した。FLAGタグ融合EGFR安定発現細胞をEGF刺激後、抗FLAG抗体により免疫沈降し、Ub-ProT法によりEGFRに付加されたユビキチン鎖の長さを検討した。この結果、EGF刺激により4-6個のK63鎖がEGFRに付加されることが明らかとなった。ユビキチンによるタンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質分解のみならず、シグナル伝達や、タンパク質の輸送など広汎な生命機能を制御することが明らかとなってきた。ユビキチン修飾が多彩な機能を発揮することを可能としているのがユビキチン修飾の構造多様性である。ユビキチン修飾の構造は、「ユビキチン鎖の種類」、「長さ」、「翻訳後修飾」、「複雑さ」の4つの要素から成り立つ。本研究では、申請者が開発したユビキチン鎖長決定法および質量分析計によるユビキチン鎖の高感度絶対定量法を用いて、2つの重要なユビキチン依存的経路(1)増殖因子受容体のダウンレギュレーションと(2)マイトファジー(ミトコンドリアのオートファジー分解)に焦点を当て解析することで、同経路におけるユビキチンシグナルの実体とデコーティング機構を時空間的に解明することを目的とする。EGFRや損傷ミトコンドリアのユビキチン化について既に数多くの報告があるが、研究者ごとに異なる結果であり、混沌としているのが現状である。その要因としてユビキチン鎖の種類のみ注目されてきた経緯が挙げられる。本研究は、申請者自身が開発したユビキチン修飾解析法により、EGFRおよび損傷ミトコンドリアに提示されるユビキチンシグナル(ユビキチン鎖の長さなどを含めたユビキチン修飾の全ての情報)を時空間的に解析する。本年度はEGF依存的にEGFRに付加されるユビキチン鎖の種類を明らかとした。EGFRはEGF刺激により数分の間にポリユビキチン化され、エンドサイトーシスにより取り込まれた後、リソソームまで運ばれ分解される。一方、エンドサイトーシスされたEGFRの一部は脱ユビキチン化酵素USP8によりユビキチン鎖が除去され再び細胞膜に局在化する(Mizuno et al, Mol Cell Biol, 2005)。先行研究によりEGFRはK11、K48、K63鎖型のユビキチン修飾を受けることが報告されている(Huang, F et al, Mol Cell, 2006)が、鎖の種類と長さの関係については依然不明である。そこでFLAGタグ融合EGFR発現細胞を作製し、EGF刺激依存的に付加されるユビキチン修飾の種類を検討した。この結果、EGF刺激依存的にEGFRは主にモノユビキチン化およびK63鎖が付加されていることが明確となった。しかしながら、「長さ」については重要な要素にもかかわらずSDS電気泳動の移動度で見積もる以外に解析法が存在しなかったためほとんど議論されてこなかった。申請者はユビキチン鎖結合プローブによるユビキチン鎖の保護とトリプシンによる限定分解を組み合わせることによりユビキチン鎖長を決定する手法Ub-ProT法(Ubiquitin chain-Protectionfrom Trypsinization)を開発してきた。本研究では、申請者が開発したユビキチン鎖長決定法および質量分析計によるユビキチン鎖の高感度絶対定量法を用いて、主要なユビキチン依存的経路である増殖因子受容体のダウンレギュレーションに焦点を当て解析することで、同経路におけるユビキチンシグナルの実体とデコーティング機構を時空間的に解明することを目的とする。本年度はEGF依存的に上皮成長因子受容体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)に付加されるユビキチン鎖の種類と長さを明らかとすることを目的として解析をおこなった。FLAGタグ融合EGFR安定発現細胞をEGF刺激後、抗FLAG抗体により免疫沈降し、Ub-ProT法によりEGFRに付加されたユビキチン鎖を解析した。FLAG

タグ融合EGFR安定発現細胞をEGF刺激後、抗FLAG抗体により免疫沈降し、Ub-ProT法によりEGFRに付加されたユビキチン鎖の長さを検討した。この結果、EGF刺激により4-6個のK63鎖がEGFRに付加されることが明らかとなった。現在までに解析のすすんでいるEGFRに焦点をあて解析を進めていく。EGF刺激後、EGFRを免疫沈降し、Ub-ProT法によりEGFRに付加されたユビキチン鎖の鎖長情報を得る。次いで、Ub-PRM法により各長さのユビキチン鎖にどのようなタイプのユビキチン鎖が含まれるか解析する。次いで、経時的に解析することで、EGFRに付加されるユビキチン修飾の変動を生化学的にモニターする。一方、USP8のノックダウン時、リソソーム阻害時において同様に解析する。ノックダウン実験と並行して阻害剤を用いた解析も並行して行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質分解28年度が最終年度であるため、記入しない。