hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタマテリアルを用いた超伝導フィルタの新しいチューニング手法の開発

超伝導フィルタの実用化では、中心周波数を低周波側、高周波側にシフトできる手法を開発することが重要であるが、現在までは、低周波側にシフトできる手法しか報告されていない。我々は、チューニングロッドに超伝導共振器を用い、超伝導フィルタの中心周波数シフトを検討した。その結果、小型超伝導共振器をチューニングロッドに用いると中心周波数を高周波側にシフトできることを見出した。共振器を複数配置すればメタマテリアルとなるので、メタマテリアルをチューニングロッドに用いれば、超伝導フィルタの中心周波数を更に高周波側にシフトできる可能性を見出した。平成25年度では、電磁界解析シミュレータを用いて、次のことを検討し、新たな知見を得ることができた。1.検討事項(1)誘電体、磁性体、超伝導共振器を用いたトリマーロッドを共振器上に配置させ、それを上下、軸方向に移動させた時の共振周波数シフトを電磁界解析シミュレータにより検討した。(2)中心周波数2GHzの超伝導バンドパスフィルタの周波数特性を各種トリマーでチューニングした時のフィルタ特性を検討した。2.新たな知見(1)誘電体、磁性体トリマーロッドでは、従来の結果と同様に、共振器の共振周波数は低周波側にシフトすることを確認したが、超伝導共振器を用いたトリマーロッドでは、高周波側にシフトすることを見出した。(2)超伝導バンドパスフィルタを超伝導共振器トリマーでチューニングすると、中心周波数は高周波側にシフトし、帯域はほとんど変化しないことがわかった。これは、今までに報告されていない新しい成果であり、超伝導フィルタの共振周波数を、低周波側、高周波側両方にシフトできる機構を構築できる可能性を見出した成果である。超伝導フィルタの実用化では、中心周波数を、低周波側、高周波側にシフトする手法を開発することは極めて重要であるが、今までの手法は低周波側にしかシフトできない。従って予め高周波側に中心周波数がシフトしているフィルタを作製し、チューニングをする。高周波側にシフトできる手法の開発は極めて重要である。我々は、メタマテリアルの持つ負の誘電率特性を利用して、高周波側に中心周波数をシフトすることを検討している。平成25年度では、電磁界シミュレーションによりその可能性を示唆することができた。平成26年度では、引き続き次の点を検討し成果を得た。(1)シミュレーションによる周波数シフトの検討。電磁界解析ソフトSONNET-EMにより、3段ヘアピン型フィルタの共振器端部上に、誘電体ロッド、超伝導薄膜、超伝導薄膜共振器を配置させ、周波数シフトをシミュレーションした。その結果、誘電体を配置した場合は、中心周波数は低周波側にシフトしたが、超伝導薄膜および超伝導共振器を配置した場合は高周波側にシフトすることを確認した。また、超伝導共振器は小型サイズのものが設計されていないので、2個配置しているだけである。従って、完全にはメタマテリアル特性にはなっていないが、メタマテリアル特性を持つ共振器を配置できれば、更に高周波側にシフトできる可能性があることが示唆された。(2)小型超伝導共振器の設計と試作。超伝導共振器を複数配置させメタマテリアル特性を示すためには、小型の超伝導共振器を設計する必要がある。我々は、スパイラル共振器に着目し小型共振器を検討した。その結果、1.5mm角の共振器を設計できた。またその共振器を試作し、実際に所望する共振特性を得ることができた。以上のように、超伝導フィルタの中心周波数を高周波側にシフトできる手法を開発しつつあり、本研究のゴールに向かって研究を進めている。超伝導フィルタの実用化では、中心周波数シフトを可能とする手法を開発することが極めて重要であるが、今までの手法は低周波側にしかシフトできない。従って、高周波側にシフトできる手法を開発することは極めて重要である。我々は、チューニングロッドに、負の誘電率・負の透磁率を持つメタマテリアルを用い、高周波側にシフトする手法を検討している。平成25年度では、電磁界シミュレーションによりその可能性を示唆し、平成26年度では、メタマテリアルの基本構成となる超小型超伝導共振器の設計と試作、評価を行った。超小型超伝導共振器には、3mmx3mmのGスパイラル共振器を採用した。1.52.5GHzの共振周波数をもつGスパイラル共振器を設計・試作評価した。平成27年度では、チューニングロッドにその超小型超伝導共振器を用い、ヘアピン超伝導共振器の周波数シフトを実験的に検討した。その結果、チューニングロッド共振器の共振周波数とヘアピン共振器の周波数シフトには相関があることを見出した。2GHzヘアピン共振器の共振周波数を高周波側にシフトするためには、チューニングロッド共振器の共振周波数を1.9GHz程度にする必要があることを見出した。超伝導フィルタは超伝導共振器を複数個配列させたものであり、共振周波数が高周波側にシフトできれば、フィルタの中心周波数を高周波側にシフトできることになる。以上のように、超伝導共振器を用いると超伝導フィルタの中心周波数を高周波側にシフトできることを明らかにした。共振器を複数配置すれば、メタマテリアルとなることはよく知られていることである。すなわち、メタマテリアルを用いれば、超伝導フィルタの中心周波数を高周波側にシフトできることを見出したものと同じである。

我々は、チューニングロッドに超伝導共振器を用い、超伝導フィルタの中心周波数シフトを検討した。その結果、小型超伝導共振器をチューニングロッドに用いると中心周波数を高周波側にシフトできることを見出した。共振器を複数配置すればメタマテリアルとなるので、メタマテリアルをチューニングロッドに用いれば、超伝導フィルタの中心周波数を更に高周波側にシフトできる可能性を見出した。平成26年度の研究目標である、次の3項目について検討し、成果を上げた。(1)シミュレーションによる中心周波数シフトの検討(2)小型超伝導共振器の設計・試作(3)超伝導フィルタの試作と評価(1)に関しては、3次元電磁界シミュレータMW-Studioを用い、誘電体ロッド、超伝導薄膜、超伝導共振器をフィルタ上に配置した時のフィルタの周波数シフトについて検討した。その結果、超伝導薄膜、超伝導共振器を配置した時にフィルタの中心周波数が高周波側にシフトすることを確認した。(2)に関しては、スパイラル共振器を用いて所望する共振周波数を持つ共振器を検討した。その結果、1.5mm角に収まる共振器の設計に成功した。また、実際にYBCO薄膜を用いて共振器を試作し、共振特性を評価した。その結果、所望する共振特性を持つことを確認した。(3)に関しては、3段ヘアピン型超伝導フィルタを電磁界解析ソフトにより設計し、その特性を評価した。以上のことにより、おおむね順調に研究は進展していると判断できる。超伝導高周波エレクトロニクス本研究の最終ゴールは、メタマテリアルを用いて超伝導フィルタの中心周波数を高周波側シフトする機構を検討することである。ここで、メタマテリアルとは複数の小型超伝導共振器を配置させた素子を言い、それが負の誘電率特性を持つかどうかがキーポイントとなる。もし複数の共振器を配置した素子がメタマテリアル特性を示せば、超伝導フィルタの中心周波数を高周波側にシフトすることは可能となる。それは、負の誘電特性を利用すれば、共振器調を見かけ上短くできることになるからである。最終年は複数の共振器を配置した素子の特性を詳しく調べ、それがメタマテリアル特性を示すかどうかを重点的に検討する。また、今回新しく見出した、超伝導薄膜によるフィルタの中心周波数の高周波側シフトについても、その起因を検討する。超伝導ヘアピン共振器を有する、3段超伝導フィルタの共振周波数シフトについて、電磁界解析シミュレーターにより次のことを検討し、目標とした成果を得たから。得られた成果(1)ヘアピン共振器上に誘電体ロッド、磁性体ロッドおよび超伝導薄膜共振器ロッドを配置した時、ヘアピン共振器の周波数シフトがどのように変化するかを検討した。その結果、誘電体、磁性体ロッドを配置した時は、低周波側にシフト、超伝導薄膜共振器ロッドを配置すると高周波側にシフトすることを明らかにした。(2)3段ヘアピンバンドパスフィルタを設計し、その共振器上に超伝導薄膜共振器ロッドを配置した時に、フィルタ特性がどのように変化するかを検討した。
鉄欠乏、貧血、または運動が脳の機能および遺伝子・タンパク質発現に及ぼす影響

生後3週齢のラットを普通食群、100ppm群、3ppm群に分け、100ppm群および3ppm群にはそれぞれの濃度の低鉄食を20週間摂取させた。実験開始17週目における自発的運動量は、24時間あたり100ppm群で約5200回転であったが、3ppm群では約3500回転であった(p<0.05)。20週間の実験期間後、100ppm群の血液ではヘマトクリット値が約44%、ヘモグロビン含量が約15g/dlであったのに対し、3ppm群ではそれぞれ約17%と約4g/dlまで低下していた。2次元電気泳動および質量分析により、100ppm群と3ppm群で差のあったタンパク質として73kDa heat shock protein(HSP73)が同定された。ウェスタンブロット法により発現量を定量したところ、100ppm群に比べ3ppm群で約2倍の発現量が認められた。さらに、2次元電気泳動後のゲルを用いてウェスタンブロットを行った結果、両群において等電点の異なる5つのスポットがHSP73抗体によって検出されたが、それぞれのスポット濃度には差が見られなかった。以上の結果、鉄欠乏食摂取により慢性の貧血が引き起こされ、視床および視床下部においてHSP73の総量が増大することが明らかとなった。HSP73はニューロンにおいてはレビー小体などの封入体に局在することが報告されており、この発現増加は視床および視床下部ニューロンの細胞機能低下を示唆するものと言える。また、慢性貧血による自発行動量の低下や末梢組織の鉄欠乏がこのような現象の原因であったことも考えられる。摂取開始13週目にホイールケージを用いた自発運動量測定を行い、17週目に迷路水槽テストを実施した。脳のサンプリングおよび採血は20週目に行った。採取した血液を用いてヘマトクリット値および血中ヘモグロビン含量を測定したところ、通常群および100ppm群ではヘマトクリット値が約45%、ヘモグロビン含量が約15g/dlであったが、3ppm群ではヘマトクリット値は15%程度まで、ヘモグロビン含量は約4g/dlまで低下したことが確認された。自発運動量も3ppm群において、他の群と比べ約30%少なかった。迷路水槽を用いた記憶学習能の評価においては各群間に顕著な差は認められなかった。さらに、摘出した脳を部位別に分け、それぞれからタンパク質を抽出し、2次元電気泳動によるタンパク質発現比較を行った。その結果、海馬においては発現パターンに大きな変化は認められなかったものの、視床および視床下部においていくつかのスポットに発現の増減が認められた。また、視床および視床下部のタンパク質抽出液からリン酸化タンパク質を採取し同様に発現比較を行ったところ、いくつかのスポットにおいて分子量が増加するという現象が見られた。タンパク質のリン酸化は様々なシグナルを誘導することが知られており、鉄欠乏性貧血またはそれに伴う運動量低下が視床および視床下部の機能へ影響したと考えられる。
パーキン遺伝子の変異分析とパーキン蛋白の機能解析

我々のグループでクローニングに成功したパーキン遺伝子の変異解析とパーキン蛋白の機能解析を中心に研究を行った.更にパーキン遺伝子変異陰性の家系について,最近相次いで発見された家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるPINK1,DJ-1,LRRK2についても解析を行い,PINK1変異8家系,LRRK2変異10家系,alpha-synuclein変異2家系を発見した.DJ-1変異はなかった.E3ユビキチンリガーゼとしてのパーキンの活性調節に14-3-3蛋白が関与していることを発見した.14-3-3は,パーキンのリンカー部分に結合し,パーキンの活性を抑制している.酸化的ストレスなどでalpha-synucleinの発現が上昇すると,14-3-3蛋白に結合し,この複合体はパーキンから離れ,活性が上昇する.酸化的ストレスの低い所では,alpha-synucleinの高発現がなく,パーキンがinactiveであっても,神経変性は起きないと推定される.黒質においては,高濃度のドパミンのため,酸化的ストレスが強くパーキンを必要とすると考えられた.パーキンノックダウン細胞におけるドパミンの自動酸化物であるドパミンクロームの上昇も明らかにしたが,この所見と一致する.AR-JP脳においては,パーキンの基質蓄積が証明できなのが謎であったが,パーキンがユビキチンのリジン63残基のポリユビキチン化も促進することを見いだし,これはプロテアソムにおける分解シグナルとはならず,パーキン機能探索の新たな入り口になっている.更にalpha-synucleinをAAVベクターに組み込み黒質細胞にトランスフェクトすることによりパーキンソン病のモデルラットの作成に成功し,更に本モデルでの黒質神経細胞死がパーキンのコトランスフェクションで軽減できることを見いだした.これはパーキンソン病の遺伝子治療に応用可能な成果である.我々のグループでクローニングに成功したパーキン遺伝子の変異解析とパーキン蛋白の機能解析を中心に研究を行った.更にパーキン遺伝子変異陰性の家系について,最近相次いで発見された家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるPINK1,DJ-1,LRRK2についても解析を行い,PINK1変異8家系,LRRK2変異10家系,alpha-synuclein変異2家系を発見した.DJ-1変異はなかった.E3ユビキチンリガーゼとしてのパーキンの活性調節に14-3-3蛋白が関与していることを発見した.14-3-3は,パーキンのリンカー部分に結合し,パーキンの活性を抑制している.酸化的ストレスなどでalpha-synucleinの発現が上昇すると,14-3-3蛋白に結合し,この複合体はパーキンから離れ,活性が上昇する.酸化的ストレスの低い所では,alpha-synucleinの高発現がなく,パーキンがinactiveであっても,神経変性は起きないと推定される.黒質においては,高濃度のドパミンのため,酸化的ストレスが強くパーキンを必要とすると考えられた.パーキンノックダウン細胞におけるドパミンの自動酸化物であるドパミンクロームの上昇も明らかにしたが,この所見と一致する.AR-JP脳においては,パーキンの基質蓄積が証明できなのが謎であったが,パーキンがユビキチンのリジン63残基のポリユビキチン化も促進することを見いだし,これはプロテアソムにおける分解シグナルとはならず,パーキン機能探索の新たな入り口になっている.更にalpha-synucleinをAAVベクターに組み込み黒質細胞にトランスフェクトすることによりパーキンソン病のモデルラットの作成に成功し,更に本モデルでの黒質神経細胞死がパーキンのコトランスフェクションで軽減できることを見いだした.これはパーキンソン病の遺伝子治療に応用可能な成果である.約500家系の家族性パーキンソン病についてパーキン遺伝子の変異分析を行い,劣性遺伝の家系の約60%にパーキン変異が認められることを明らかにした.残りの40%の家系の一部に,染色体1番に連鎖する家系を見いだした.また一見優性遺伝に見える家系の中にも,約10%にパーキン遺伝子の変異をホモあるいは複合ヘテロの状態で有する家系のあることを明らかにした.更に若年発症孤発例の約13%にパーキン遺伝子変異を見いだした.更にパーキンがユビキチンリガーゼの一種であることを明らかにした.パーキンと特異的に結合するユビキチン結合酵素UbcH7とパーキンのメッセンジャー発現をラット脳にて解析し,胎生19日から両者とも発現が見られ,両者の分布は極めて一致していることを明らかにした.またパーキンは,Golgi装置を経て軸索輸送小胞に結合し,シナプス小胞に運ばれ,その膜に存在することを明らかにした.更にパーキン蛋白の基質候補として,22kDa-α-synuclein, PAEL-receptor, CDCrel-1を同定した.またこれらの物質が,パーキン遺伝子変異を有して死亡した症例の脳に蓄積しているかどうかを解析し,前2者は蓄積が認められるのに対し,後者はパーキンと結合はするが,蓄積はせずパーキンの基質とはならないことを明らかにした.このことは,パーキン蛋白には,ユビキチンリガーゼとしての機能の他に,神経伝達に関連した機能の存在を示唆し,今後この方面の研究の必要性が認識できた.またノックウアウトアニマル,トランスジェニックアニマルの作製に取り組んでいる.パーキン蛋白はUbiqutin ligaseでことが明らかにされている.従って,劣性遺伝性パーキンソン病ではloss-of-function的にUbiqutin ligase活性が低下或いは消失し,パーキン蛋白の基質が分解されずに蓄積することで神経細胞死が起こると推定される.

我々はシナプス小胞上に存在するパーキン蛋白の特性を考え同じようにシナプス小胞上に存在するCDCrel-1に注目し,パーキン蛋白のexocytosisへの効果を検討した.ハムスターinsulinoma由来HIT-T15細胞を使い,ヒトGrowth Hormoneをtracerに野生型,変異型パーキン蛋白のexocytosisへの効果を検討した.結果はT415Nの変異パーキン蛋白は濃度依存性にexocytosisを抑制した.このことはパーキン蛋白がexocytosisに影響を与えていることを示す.次にParkin全長にたいするantisense adenovirusを作成しretinoic acidにより分化誘導したヒトneuroblastoma cellに感染させ,内因性のParkin proteinのknock down解析を行った.感染した細胞は,adeno virus titer依存的にviabilityの低下を認めた.Viabilityの低下した細胞はTUNEL陽性でありCaspase9,3,6,7の活性化が認められapoptosisであることが証明された.またNeuroblastoma細胞以外のヒト由来の細胞系では同様の結果は認めなかった.Knock downによるapoptosisは神経系の培養細胞に特異的であり,またapoptosis signalはmitochondriaに由来しており細胞死の原因がmitochondriaの機能不全に起因するものであることが推測される.パーキン蛋白はユビキチンリガーゼであることがわかっており,基質の蓄積が細胞死を惹起させることが推定される.現在まで9種類の基質候補が報告されているが,細胞死発症機序については何も分かっていない.Loss-of-function型変異効果が疾患発生に関わっているため,アデノウィルスベクターに全長のアンチセンスパーキンを構築し,パーキン蛋白をノックダウンさせた.アデノウィルスのtiterに依存して,ドパミン神経細胞様であるSH-SY5Y細胞に細胞死が誘導された.この細胞死はTUNELにて染色され,caspase6,3の活性化が観察された.これによりパーキンアンチセンス効果による細胞死がミトコンドリアを介したアポトーシスであることが証明された.SH-SY5Y細胞は内在性α-シヌクレインが極めて少なく,このためにパーキンアンチ効果が顕著になったことを考え,アンチセンスパーキンとセンスα-シヌクレインを感染させた.アンチセンスパーキンによる細胞死はα-シヌクレインを発現させてやると抑制された.コントロールとしてβ-ガラクトシダーゼを感染させると細胞死の抑制は観察されなかった.パーキン遺伝子変異よる若年性パーキンソン病ではLewy小体が一般に観察されない.一方,Lewy小体の形成にドパミンキノン体とα-シヌクレインの複合体が関わっているとする報告があることより,ドパミンキノン体に注目して検討した.キノン体の変わりにドーパ
新しく見出した牛ウイルス性下痢ウイルス関連疾患の病態解明と新規関連病態の探索

牛ウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)は、感染個体に消化器疾患を惹起する。BVDVが免疫系の確立していない胎子に感染すると持続感染が成立し、様々な病態に関与することが知られている。本研究では、新たに見出したBVDV持続感染関連疾患である中枢神経白質でのグリオーシスと髄鞘低形成を特徴とする中枢神経白質異栄養症と全身の細小血管が糸球体様を呈する糸球体様血管症の病態を明らかにした。また、BVDV感染個体での特徴病変の1つである血管傷害を伴う病態や神経疾患など、複数の未解明疾患について、BVDV感染関与の可能性を検討したが、BVDV感染が関与する新たな病態の発見には至らなかった。牛ウイルス性下痢(Bovine Viral Diarrhea: BVD)・粘膜病は、BVDウイルス(BVDV)感染に起因する消化器粘膜の潰瘍を伴う疾病であるが、免疫系が確立していない時期の胎子感染によって持続感染が成立し、様々な病態を引き起こすことが知られているものの、不明な点が多い。本年度は申請者が新たに見出したBVDV持続感染関連病態の1つである、中枢神経白質異栄養症(硬化症:髄鞘低形成)について、1農場の6例で集団発生した症例を用いて詳細な病理像および病理発生機序解明研究を行った。症例は、412日齢のホルスタイン牛6例である。病理解剖では、これらの症例の中枢神経白質の硬度は増していた。病理組織検索では、全症例の中枢神経白質において、広範囲にわたるグリオーシスおよび髄鞘形成不全を特徴とする病変が認められた。臨床症状の程度と、中枢神経病変の分布および程度との間には、明確な関連性は認められなかった。また、全症例の血清から得られた原因ウイルスの5'非翻訳領域の塩基配列は同一であり、系統学的検索から既存のBVDVIb型株と98%の相同性が示された。BVDVIb型ウイルスは過去にも中枢神経白質異栄養症の一つである髄鞘形成不全の子牛から分離されていることから、中枢神経白質異栄養症の発生は、ウイルス株の遺伝子型に依存している可能性が指摘された。ウイルス遺伝子をパラフィン材料上で証明する手掛かりとして、症例のパラフィン切片からRNAを抽出し、RT-PCRにてウイルス遺伝子が検出できることを確認した。また、保存血清を用いたBVDV関連新規病態の探索については、壊死性変化がみられる子牛の神経疾患症例を対象として検索を実施したが、BVDV持続感染が関与する病態は見出せなかった。本年度はBVDV持続感染関連病態の1つであることが疑われている、糸球体様血管症についての詳細な病理像および病理発生機序解明研究を行った。2例のBVDV持続感染症例で本変化が出現することを確認し、詳細な病理組織学的検索、免疫組織化学的検索および超微形態学的検索を行い、増殖細胞間に線維素および血小板が介在性に存在することを明らかにした。本結果より、本変の発生機序に血栓の形成が深く関与していることが疑われた。ウイルス遺伝子をパラフィン材料上で証明する手掛かりとして、BVDV持続感染症例の中枢神経組織に対して、PCRラベリング法にて作製したプローブを用いたタイラマイド増感in situ Hybridization法を実施し、予備的な結果を得た。また、BVDV感染は視覚路に様々な異常を引き起こすことが知られていることから、申請者らが見出した黒毛和種牛の視覚路変性にBVDV持続感染が関与しているか否かについて検討し、本病態形成にBVDV感染が関与しないことを明らかにした。本年度は、BVDV感染によっても病変が形成されることが分かっている疾患・病変のうち、原因が未解明である神経疾患および糸球体疾患について、BVDV持続感染がこれらの病態形成に関係しているか否かを検討した。その結果、出生直後から神経症状が認められるのにも関わらず明瞭な形態変化が認められないという原因不明の病態である子牛症例、およびウシでの病因が未解明である両側対称性脳軟化症や脳室周囲白質軟化症症例では、BVDVの持続感染が関与しないことが明らかとなった。また、糸球体係蹄壁での硝子様物質沈着が認められる糸球体病変にもBVDVの持続感染が関与しないことが明らかとなった。BVDV遺伝子の組織内分布をパラフィン切片上で検出する方法の信頼性評価には比較対照を確保することが重要となる。本邦では、パラフィン切片に利用できる有用な抗体が入手不可能であるため、パラフィン切片ではなく、凍結切片や培養細胞系で使用されている複数の抗体がパラフィン切片に応用可能か否かについて検討した。その結果、これら抗体がパラフィン切片に対しては応用不可能であることを確認した。

本研究では、新たに見出したBVDV持続感染関連疾患である中枢神経白質でのグリオーシスと髄鞘低形成を特徴とする中枢神経白質異栄養症と全身の細小血管が糸球体様を呈する糸球体様血管症の病態を明らかにした。また、BVDV感染個体での特徴病変の1つである血管傷害を伴う病態や神経疾患など、複数の未解明疾患について、BVDV感染関与の可能性を検討したが、BVDV感染が関与する新たな病態の発見には至らなかった。本研究全体の目的は、病理診断症例の中から申請者がこれまでに見出している複数の病態、1)中枢神経白質異栄養症(硬化症)・糸球体様血管症の病態を明らかにすること、2)日常の病理検索の中で保存している血清を用いて、信頼性・特異性の高い方法にてBVDV(持続)感染の有無をスクリーニングし、新規病態を探索するとともに、3)通常のRT-PCR法を用いた検討でBVDVの持続感染が確認できていないものの、血管壁のフィブリノイド変化や血管炎などのBVDVの特徴所見の1つが認められる疾患群、原因不明の神経疾患群などについて、一次感染の可能性を考慮し、ISH法などを利用した病態解析を行い、未解明疾患に対するBVDV感染関与の有無を検討し、明らかにすることにある。本年度の予定は、1)のうち、糸球体様血管症に関する研究と2)に関する研究を行うこととしていた。上述のとおり、本年度の研究では、まだ完全とは言えないものの、糸球体様血管症の病態を病理発生機序の一端を明らかにすることができた。また、ウイルス遺伝子をパラフィン材料上で証明する手掛かりとして、PCRラベリング法にて作製したプローブを用いたタイラマイド増感in situ Hybridization法を実施し、予備的な結果を得ることができた。また、保存血清を用いたBVDV関連新規病態の探索については、申請者らが見出した黒毛和種牛の視覚路変性にBVDV持続感染が関与しているか否かについて検討し、本疾患にBVDV感染は関与しないことを明らかにした。従って、研究は概ね順調に進んでいる。ただ、in situ Hybridization法の信頼性の確認作業に手間取っているため、総合評価としては少し遅れていると判断した。獣医病理学本研究全体の目的は、病理診断症例の中から申請者がこれまでに見出している複数の病態、1)中枢神経白質異栄養症(硬化症)・糸球体様血管症の病態を明らかにすること、2)日常の病理検索の中で保存している血清を用いて、信頼性・特異性の高い方法にてBVDV(持続)感染の有無をスクリーニングし、新規病態を探索するとともに、3)通常のRT-PCR法を用いた検討でBVDVの持続感染が確認できていないものの、血管壁のフィブリノイド変化や血管炎などのBVDVの特徴所見の1つが認められる疾患群、原因不明の神経疾患群などについて、一次感染の可能性を考慮し、ISH法などを利用した病態解析を行い、未解明疾患に対するBVDV感染関与の有無を検討し、明らかにすることにある。H27年度の研究の目的・内容は、2)について、対象疾患を更に広げ(壊死性変化を伴わない子牛の神経疾患や腎臓糸球体疾患など)、信頼性・特異性の高い方法にてBVDV(持続)感染の有無をスクリーニングし、新規病態を探索すること、および3)についての検討を行う。
表面テクスチャリングによる安定かつ高摩擦な表面創製

本課題では,金属表面へのレーザマイクロテクスチャリングによって初期における高摩擦係数を達成するものであり,平成30年度は真空中における摩擦係数の測定およびその場k名冊装置の作成,および,本来は31年度に予定していた一般鋼材等における効果についても検証を実施した.真空中での摩擦試験は,大気中における組立部品が真空中に運ばれたときにおいても高い摩擦を発現することを想定しており,また,真空中における摩擦力と同等の高い摩擦力が大気中でも発現することを確認することが目的えある.真空中における純アルミニウム同士の摩擦では,瞬時に酸化膜が形成する大気中と異なり,一度摩耗した表面には酸化膜は再生成しないと考えられる.これは酸化膜を介さない金属同士の接触を促進することで高い摩擦を発現するからである.宇宙空間は真空環境であるため,以上の理由からテクスチャリングをしなくても高い摩擦を発生させるが,実験の結果,テクスチャリング無しでも摺動を繰り返すことによって摩擦係数は1を超えるほどに増加し,テクスチャリングをした表面においても繰り返し摺動した後の摩擦係数は同様に高い数値を示すことが明らかとなった.特に,動作開始時の摩擦係数はテクスチャリングによって二割昇したことは本技術の成果と言える.摩擦面のその場観察装置についての開発も予定通り進んでおり,装置作成が完了している.一般鋼材に対する本技術の適用についても先行して進めており,本技術によって高い摩擦力が得られた.そのため,本技術の適用範囲を更に広げることができるものと冠柄レル.ただし,鋼材においては熱処理による金属組織の変態や結晶粒径の微細化などにより高摩擦が発現するため,テクスチャリングによる効果が,形状からくるものなのか,熱影響から来るものなのか,について引き続き検討している.予定通りの実験計画に沿って,順調に進んでいる.また,H31年度に実施すべき内容について,当初の計画よりも早い段階で検討することができている.予定に沿って計画を進める本課題は,レーザーマイクロテクスチャリングによる初期摩擦の向上を狙ったものである.金属同士の摩擦では酸化膜や汚染層が初期の摩擦係数を低くしている.宇宙機部品など,特殊環境下で作動する機械に使用される締結部材としては,締結直後から最大摩擦係数を発揮することが求められる.レーザーマイクロテクスチャリングは,高アスペクト比形状の表面粗さ突起を表面に作り出すことで,表面突起もしくは相手面が,しゅう動なしで押圧により塑性変形し高摩擦を発現する可能性がある.そこで,1年目は,アルミ合金および純アルミニウムにおいてテクスチャリングの効果を実証すること,および効果発現メカニズムを詳細に明らかにすることを目的とした.その結果,表面テクスチャリングにより0.8を超える静止摩擦係数が発現し,当初の目的を達成することができた.また,3年目に実施予定であった鋼材についても検討を行い,同様の効果が鋼材においても得られることを確認した.具体的には,テクスチャリングを施して突起を有する面が,相手面よりも硬質である場合には,掘り起し抵抗が増大すると考えられていた(チタン合金材料で実証した).しかし,アルミニウム合金を使用した例では,突起側が軟質であっても突起自身の塑性変形により金属の新生面が露出することが高摩擦に寄与することが明らかとなり,より多様な材料組み合わせでも本効果が得られることが判明した.3年目に実施予定の鋼材においても本課題提案の技術を適用し,その効果を検証した.本課題では,金属表面へのレーザマイクロテクスチャリングによって初期における高摩擦係数を達成するものであり,平成30年度は真空中における摩擦係数の測定およびその場k名冊装置の作成,および,本来は31年度に予定していた一般鋼材等における効果についても検証を実施した.真空中での摩擦試験は,大気中における組立部品が真空中に運ばれたときにおいても高い摩擦を発現することを想定しており,また,真空中における摩擦力と同等の高い摩擦力が大気中でも発現することを確認することが目的えある.真空中における純アルミニウム同士の摩擦では,瞬時に酸化膜が形成する大気中と異なり,一度摩耗した表面には酸化膜は再生成しないと考えられる.これは酸化膜を介さない金属同士の接触を促進することで高い摩擦を発現するからである.宇宙空間は真空環境であるため,以上の理由からテクスチャリングをしなくても高い摩擦を発生させるが,実験の結果,テクスチャリング無しでも摺動を繰り返すことによって摩擦係数は1を超えるほどに増加し,テクスチャリングをした表面においても繰り返し摺動した後の摩擦係数は同様に高い数値を示すことが明らかとなった.特に,動作開始時の摩擦係数はテクスチャリングによって二割昇したことは本技術の成果と言える.摩擦面のその場観察装置についての開発も予定通り進んでおり,装置作成が完了している.一般鋼材に対する本技術の適用についても先行して進めており,本技術によって高い摩擦力が得られた.そのため,本技術の適用範囲を更に広げることができるものと冠柄レル.ただし,鋼材においては熱処理による金属組織の変態や結晶粒径の微細化などにより高摩擦が発現するため,テクスチャリングによる効果が,形状からくるものなのか,熱影響から来るものなのか,について引き続き検討している.予定通りの実験計画に沿って,順調に進んでいる.また,H31年度に実施すべき内容について,当初の計画よりも早い段階で検討することができている.当初の予定通り,2年目には真空条件下での実験を行い,宇宙空間などの極限環境下(清浄面による凝着促進条件下)で本課題の提案する摩擦係数増加効果が得られることを,純アルミニウムなどで実証していく.効果が小さい場合には,一方の材料を加工硬化などで硬さ調整を行い最適な摩擦組み合わせを模索する.予定に沿って計画を進める

次年度使用額が生じた主な理由は,真空中での真実接触面観察用に購入を予定していた拡大観察用のレンズの購入を次年度に見送ったためである.ただし,次年度に見送ったことにより課題進捗が遅れることはなく(レンズ購入以外の装置設計・製作は予定通り進行している),万が一課題遂行に問題が発生した場合にレンズ購入費用を問題解決のための費用に優先的に使用することで,より効率的に課題を進められると判断できたためである.主な理由ではないが,研究が順調に進んだため,試験片・ジグなどの消耗品の購入費用が抑えられたことも一因として挙げられる.これについては,課題の進行に伴い,EBSD等の高価な分析等の費用に充て,現象理解をより進展させる予定である.当初予定していた装置については,現有設備の流用等で節約ができたが,研究が当初よりも順調に進んでいるために,金属組織の分析等にかかる費用がかかる見通しとなった.ただし,所属機関には適切な分析装置がないために,公共の研究機関への依頼試験を検討している.そこで次年度では,次年度使用額については材料組織の分析にかかる費用に充てたいと考えている.
高頻度に起こる植物のゲノム倍加の分子機構

研究代表者はこれまでに、植物細胞が継続的なストレスに晒されると、細胞周期チェックポイントの一つであるSpindle assembly checkpoint (SAC)をシャットオフすることでゲノム倍加を引き起こすことを見出した。本研究では「SACをシャットオフする機構」に注目し、上流因子としてSACの活性化に重要なMPS1そしてSACの下流として働き、ターゲットを直接阻害するBUBR1/BMF2の制御機構を理解することで、植物が高頻度で起こすゲノム倍加の原因を突き止めることを目的としている。本年度はMPS1の機能に関わると考えられるChromosomal Passenger Complex (CPC)に注目し研究を行った。動物のCPCはAurora kinase, INCENP, SurvivinそしてBorealinの4種類のタンパク質複合体から構成されることが知られているが、植物ではこれまでSurvivinとBorealinのホモログが見つかっていなかった。研究代表者はこのうちBorealinのホモログをモデル植物であるシロイヌナズナで発見し、その機能解析を行った。その結果、植物のBorealinも動物と同様にキネトコアへ局在し、他のCPC構成因子であるINCENPとAurora kinaseと共局在することがわかった。また、シロイヌナズナに存在する3つのAurora kinaseのうち、Aurora kinase 3のみがCPCとして機能することを明らかとした。さらにCRISPRを用いてBorealinの変異体を作製したところ、knockout変異体は致死であることがわかり、その原因がおもに雌側の配偶子形成の異常によることを突き止めた。しかし、Borealinのknockout変異体が致死であるために、BorealinがMPS1の制御に関わっていることを証明するには至っておらず、来年度の課題として残っている。Borealinのknockout変異体は致死であるため、Borealin変異体でのMPS1の局在解析や、SACの活性測定を行うことが出来ていない。そこで本年度は誘導型のRNAiを用いることでBorealinの発現を一過的に抑制し、その植物体内でのSACの活性を調べることとする。また、もう一つの研究課題であるBUBR1/BMF2の発現量とSACのシャットオフとの関係を明らかとするために、発現量が異なるBUBR1/BMF2植物体の選抜および確立を進める。植物体からのタンパク質精製と免疫沈降を用いた実験を計画していたが、使用する植物体の確立に時間がかかったため実行できておらず、その分の費用を次年度に繰り越すことにした。使用計画に変更はなく、タンパク質精製と免疫沈降に関する物品を購入する予定にしている。
数理モデルによる生体ネットワーク制御手法の開発

制約モデルの代謝流束解析は、微生物を用いた有用化合物の生産に関するシミュレーションにおいて有用である。近年のDNA合成技術の発達に伴い、有用化合物を生産する最小の代謝ネットワークのデザインの計算が近い将来重要になるかもしれない。そこで本研究では、細胞の成長率と目的化合物の生産率に関する制約を小さなグリッドを用いて表し、グリッドごとに最小の代謝流束分布を計算して、最適な代謝のデザインを見つける手法を開発した。代謝流束解析において、与えられた制約の下で細胞成長率を最大化してシミュレーションを行うと、シミュレーションにおける代謝分布と実際の代謝分布が近くなりやすいことが知られている。この細胞成長率を最大化するモデルにおいて、本研究でデザインを計算した代謝ネットワークは、多くの有用化合物に対し、従来手法よりも生産率が高くなる。iAF1260はゲノムスケールの代謝の制約モデルであり、微生物の代謝シミュレーションの研究において、しばしばベンチマークとして用いられる。本研究ではiAF1260に含まれる化学反応セットの部分セットを用いて最小代謝ネットワークを計算した。なお計算機実験により、細胞の成長率と目的化合物の生産率に関する制約を表すグリッドのサイズが、計算結果に大きく影響を与えることが示された。細胞成長率が最大化される問題設定において、目的化合物の生産率の最悪ケースを考慮した場合、シミュレーション上、従来手法は実験に用いた全目的化合物の50%以下しか生産できないのに対し、開発手法は90%以上生産できる。本研究成果はBMC Bioinformatics誌より出版された。当初の研究計画では、代謝ネットワークの制約モデルに関する研究は平成28年度の計画にのみ記載されていた。本研究は制約モデルの代謝ネットワーク制御手法に関する重要な成果であり、当初の研究計画とは異なるものの、十分な成果をあげることができたと考えられる。平成30年度に開発し、BMC Bioinformatics誌で公表した成果に関し、国内外の学会で発表する。ブーリアンネットワークを初期状態から目的状態へ指定されたステップ数以内で誘導する最小数の制御節点を見つける問題のNP困難性を証明し、整数線形計画法に基づき厳密解を求める手法を開発した。また入次数の制限されたランダムに生成されたブーリアンネットワークの最小制御節点集合の平均サイズを数理的に解析した。計算機実験の結果は理論解析の結果と良い整合性を示した。実際の生物におけるブーリアンネットワークでも計算機実験を行い、理論解析の有効性と一般性を示した。この研究はブーリアンモデルの生体ネットワークを効率的に制御するための基礎的研究であり、今後ブーリアンモデルだけでなく代謝流束モデルと統合拡張していく際にも有効な手法となる可能性がある。また正常な細胞と異常な細胞の遺伝子発現データから影響度の大きい遺伝子を見つける問題に対する研究を行った。この研究では代謝ネットワークの数理モデルと、正常細胞と異常細胞における遺伝子発現パターンを組み合わせ新規的な計算手法を開発した。代謝ネットワークを異常状態へ導くk個の遺伝子ノックアウトを見つける問題をブーリアンネットワークを用いて数理モデル化し、整数線形計画問題で定式化した。この手法を正常細胞と頭頸部癌の遺伝子発現データに適用した。また計算機実験により本手法の有効性を検証した。この研究は当初予定していた最小反応削除問題を、ゲノムスケールの数理モデルに適用するために問題設定を最小化問題から定数kを与える形式に変換することにより対応したものである。ブーリアンモデルによる遺伝子ネットワークを制御するための最小数の遺伝子セットを発見するアルゴリズムの開発実装や、正常細胞と異常細胞の遺伝子発現データを代謝ネットワークと組み合わて影響度の高い遺伝子を発見する問題に対するアルゴリズムの開発実装が初年度の主な研究成果であった。これら以外にも混合整数線形制約モデルを用いて微生物の標的化合物の生産量を増大させるゲノムのデザイン戦略に関する研究も進行中であり、初年度としてはおおむね順調に進展していると言える。ブーリアンモデルの代謝ネットワークにおいて、現在生成されてしまっている不必要化合物を生成できなくし、かつ、現在生成できていない必要化合物を生成できるようにする問題を考える。ホストネットワーク内において削除する反応の数と、ホストネットワーク外に追加する反応の数の和を最小化して、かつ上述の目的を達成する問題をブーリアン代謝ネットワークの最小修正問題という。本研究ではブーリアン代謝ネットワークの最小修正問題がNP完全問題であることを証明し、かつフィードバック頂点集合と整数計画問題に基づいて高速に解く手法を開発し、IEEE/ACM Transactions of Computational Biology and Bioinformatics誌より出版した。また、ブーリアンネットワークの2つの周期的定常状態の区別に必要な最小ノード集合に関する研究も行った。この研究では、観測できるノードが1つの時は周期的定常状態を区別することができないが、観測できるノードが2つの時は周期的定常状態を区別できることを中国剰余定理を用いて証明し、Automatica誌より出版した。上記はいずれも2013年4月2016年3月における研究課題「ブーリアンモデルによる生体ネットワークの統合的な数理モデル化と解析(25730005)」より継続して本課題においても実施された内容である。ブーリアンモデルの代謝ネットワークの最小修正問題に関しては、当初予定していた複数ネットワークに対してではないものの、1つの代謝ネットワークに対する整数計画法に基づく手法を開発し、IEEE/ACM Transactions on Computational Biology and Bioinformatics誌より論文を出版できた。またブーリアンネットワークの定常状態は細胞の種類に対応すると考えられるため、Automatica誌より出版した論文は、癌治療法の数理モデルの開発の基礎につながると考えられる。以上より、おおむね順調に進展しているといえる。

近年のDNA合成技術の発達に伴い、有用化合物を生産する最小の代謝ネットワークのデザインの計算が近い将来重要になるかもしれない。そこで本研究では、細胞の成長率と目的化合物の生産率に関する制約を小さなグリッドを用いて表し、グリッドごとに最小の代謝流束分布を計算して、最適な代謝のデザインを見つける手法を開発した。代謝流束解析において、与えられた制約の下で細胞成長率を最大化してシミュレーションを行うと、シミュレーションにおける代謝分布と実際の代謝分布が近くなりやすいことが知られている。この細胞成長率を最大化するモデルにおいて、本研究でデザインを計算した代謝ネットワークは、多くの有用化合物に対し、従来手法よりも生産率が高くなる。iAF1260はゲノムスケールの代謝の制約モデルであり、微生物の代謝シミュレーションの研究において、しばしばベンチマークとして用いられる。本研究ではiAF1260に含まれる化学反応セットの部分セットを用いて最小代謝ネットワークを計算した。なお計算機実験により、細胞の成長率と目的化合物の生産率に関する制約を表すグリッドのサイズが、計算結果に大きく影響を与えることが示された。細胞成長率が最大化される問題設定において、目的化合物の生産率の最悪ケースを考慮した場合、シミュレーション上、従来手法は実験に用いた全目的化合物の50%以下しか生産できないのに対し、開発手法は90%以上生産できる。本研究成果はBMC Bioinformatics誌より出版された。当初の研究計画では、代謝ネットワークの制約モデルに関する研究は平成28年度の計画にのみ記載されていた。本研究は制約モデルの代謝ネットワーク制御手法に関する重要な成果であり、当初の研究計画とは異なるものの、十分な成果をあげることができたと考えられる。現在進行中の混合整数線形制約モデルに関する研究をさらに発展させる。反応ノックアウト戦略を計算する問題だけでなく、遺伝子ノックアウト戦略を計算する問題にも取り組む。また混合整数線形制約モデルを等価変換する問題や、生物実験のデータを用いてモデルを修正発展させていく問題も研究する。現在は微生物のモデルやデータを用いて研究しているが、中長期的には他の生物種、特に癌細胞に関する研究に取り組みたい。当初の計画では、平成30年度にはブーリアンネットワークによるiPS細胞の数理モデルの研究を予定していた。
オリンピックリフティングは脚伸展動作の力-速度関係をどう変えるか？

本研究では、スナッチやクリーン、さらにはそれらのプル系エクササイズに代表されるオリンピックリフティングが、脚伸展動作の力ー速度関係にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的としている。スクワットやバンドを付加したスクワットでは、オリンピックリフティングを行った際に期待されるトレーニング効果が得られないことが、本研究の前提にある。この前提について間違いがないか確認した。その結果、スクワットを素早く行うようにすればするほど筋に負荷がかかる相対的時間が減ることやバンドを付加してもこの問題を劇的に解決できないことがわかった。オリンピックリフティングではこういった問題が解決されることも確認した上で、最もパワーが発揮される負荷(至適負荷)が、最大挙上重量の何%にあたるか明らかにした。通常トレーニング現場や指導書などではクォータースクワット姿勢でバーベルをキャッチするように指導されているのに対し、ほとんどの先行研究ではキャッチ姿勢をパラレルスクワット姿勢を成功の基準としていた。多くの被験者は、負荷重量が軽い時はクォータースクワット姿勢でキャッチしていたものの、負荷重量が重くなるとともにキャッチ姿勢が低くなっていくことがわかった。先行研究では、最大挙上重量の6080%が至適負荷とされていたが、これはキャッチ姿勢が低くなることをトレーニング現場や指導書よりも許容した場合の値であり、実際に現場で行われるクォーター姿勢でのキャッチを基準した場合は、最大挙上重量が至適負荷となることがわかった。これらの結果から、トレーニング指導現場でクォータースクワット姿勢でキャッチするという条件にもかかわらず、その6080%に負荷を設定すると至適負荷でのトレーニングにならないことが判明した。これらの結果については、国際学会および国際誌にて発表した。2017年度の遅れが残り、追加実験および発表(学会・学術誌)に時間を割いたことでやや遅れているが徐々に遅れを取り戻しつつある。当初計画していた次の研究課題については、海外の研究グループが類似内容の論文を発表したため、計画の修正を検討している。海外の研究グループが類似内容を発表したが、計画はさらに先まであるので、その論文を引用しつつ、本研究プロジェクトをさらに進めることに大きな支障はない。本研究は、スナッチやクリーンに代表されるオリンピックリフティングが、脚伸展動作の力ー速度関係にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的としている。2017年度は、オリンピックリフティングで発揮されるパワー(力×速度)特性について明かにすべくウエイトリフターを対象に、1)パワークリーンで最も高いパワーが発揮される負荷の特定、2)パワークリーンとクリーンプルのパワー特性の比較、3)ハングクリーンにおける動作開始姿勢(バーベルの高さ)の影響についてそれぞれ検討を行った。1)パワークリーンで最も高いパワーが発揮される負荷は、先行研究同様の結果となった一方、バーベルのキャッチ姿勢の影響が大きいことも判明した。2)パワークリーンとクリーンプルのパワー特性の比較をしたところ、先行研究ではいずれの負荷でもクリーンプルの方が高いパワー発揮が可能とされていたが、本研究ではこれを支持しない結果となった。この理由として、先行研究ではオリンピックリフティングの経験のある様々な競技種目のアスリートを対象としていたのに対し、本研究ではよりオリンピックリフティングの技術レベルが高いウエイトリフターを対象とした点が挙げられた。3)バーベルが膝の高さからスナッチプルを行った場合と大腿中央の高さからスナッチプルを行った際のキネティクスを比較したところ、両者の力積には大きな差はなかったが、大腿中央からスナッチプルを行った方が時間的猶予がなく動作中の最大地面反力は高くなった。現在これらの研究結果について、発表・投稿作業を進めている。次年度はこれらの成果を踏まえ、オリンピックリフティングのパワー特性についてさらに研究を進めるとともに、トレーニング効果の検証にも進んでいく予定である。被験者との日程調整がうまくいかず、2017年度後半に開始予定だった競技特性の異なるアスリート間のパワー特性の比較を開始できなかったため。

2017年度の遅れが残り、追加実験および発表(学会・学術誌)に時間を割いたことでやや遅れているが徐々に遅れを取り戻しつつある。当初計画していた次の研究課題については、海外の研究グループが類似内容の論文を発表したため、計画の修正を検討している。2017年度に得た研究成果を学会大会や学術雑誌において発表していくと同時に、オリンピックリフティングのパワー特性についてさらに詳細な検討を行う。加えて、競技特性の異なるアスリート間のパワー特性の比較やトレーニング研究に着手したいと考えている。海外の研究グループが類似内容を発表したが、計画はさらに先まであるので、その論文を引用しつつ、本研究プロジェクトをさらに進めることに大きな支障はない。一部の実験機材を購入する必要がなくなったことや、実験が遅れたことで残額が生じた。研究の遅れを取り戻すため、研究補助者を雇用し、2017年度に実施できなかった実験を進めていく。研究の進捗がやや遅れ、縦断研究を開始できなかったため。また、研究補助者の雇用に学内の補助制度を利用することができたため。
天然物生合成におけるシトクロムP-450依存性の特殊な水酸化反応に関する研究

イソフラボン骨格合成反応について生合成レベルでの検討を進めるうちに、これが「シトクロムP-450依存性の転位を伴った水酸化反応」というp-450としては珍しい反応であることを見出した。本研究の目的は広範な天然物生合成反応の中にその類例を見出し、その概念の普遍化を図ることにある。研究計画には2つの生合成反応について記述したが、そのうち、ある程度の進展を見せたアフラトキシン生合成経路におけるAverufinから1'-Hydroxyversicoloroneへの芳香環転位反応について報告する。1.Sterigmatocystin生産菌のAspergillus versicolorを液体培地で振盪培養し、Sterigmatocystinを含めたポリケタイド系色素の定量を行った。細胞は、培養7日目ころから橙色に色付き初め、それと同時にSterigmatocystinの蓄積が始まり、12日目ころに最高値に達することがわかった。2.培養7日目のA.versicolor振盪培養にP-450阻害剤であるAncymidolを最終濃度1mMになるように無菌的に添加し、その後の色素の蓄積を経時的に分析した。3.以上の結果より、アフラトキシン生合成経路においてAverufin及びAverantin以降の比較的近い段階に、P-450依存性の反応の存在が示唆された。これが、Averufinから1'-Hydroxyversicoloroneが生成する段階であることを証明するために、現在生合成酵素レベルでの検討を進めているところである。