hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病と動脈硬化の関連性に関する基礎研究

【目的】近年、脂肪細胞からのアディポサイトカイン産生に、マクロファージが関与する可能性が報告された。すなわち、脂肪細胞周囲血管に集積したマクロファージに由来するサイトカインが脂肪細胞に働いて、アディポサイトカイン(脂肪組織由来生理活性物質)産生が元進し糖尿病や動脈硬化が一層増悪するという、脂肪細胞・マクロファージ相互作用説である。一方、高感度CRPの上昇が虚血性心疾患の予知因子として有用であるという事実に代表されるように、軽微な慢性感染症が、動脈硬化の増悪因子として働く可能性が示唆されている。これまでに、代表的なアディポサイトカインであるIL-6およびMCP-1に注目し、脂肪細胞・マクロファージ共培養系に低濃度のLPS刺激を加えた際、LPS無刺激時と比較してIL-6で100倍以上、MCP-1セ約50倍、それらの産生性が充進することを報告した(Yamashita, et. al.,Obesity,2007)。しかしながら脂肪細胞由来アディポサイトカインは多種多様であり、マクロファージとの相互作用でIL-6やMCP-1以外の分子の産生性に変化があるか否かについては未だ明らかでない。そこで今回、脂肪細胞・マクロファージ共培養系を低濃度のLPSで作用させた場合のサイトカイン産生性の変化を知るため、抗体アレイの手法を用いて産生量が著明に増加する分子の解析を行った。【方法】1.細胞および培養マクロファージ由来細胞株RAW264.7とマウス由来前駆脂肪細胞3T3-L1を使用した。3T3-L1を分化誘導し、誘導開始から14日後の細胞を分化脂肪細胞として用いた。2脂肪細胞・マクロファージの共培養およびLPS刺激3.培養上清中のサイトカイン量の抗体アレイによる解析回収した培養上清中のサイトカインを抗体アレイ(Ray Biotech,Inc)を用いて解析した。なお、産生性の変化が著明であったものに関しては、その量をEHSAキット(R&D)にて定量した。【結果】1.抗体アレイ法により、マクロファージ・脂肪細胞共培養系を低濃度細菌LPS刺激した際、先行研究で明らかにしたIL-6およびMCP-1ともに、RANTESとKCの産生性が元進していることが明らかになった。2.ELISA法にて定量したところ、LPS刺激のあるマクロファージ・脂肪細胞共培養系では無刺激の場合よりも、RANTESについては約40倍、KCについては350倍以上に産生が元進した。【結論および考察】脂肪細胞とマクロファージをLPS刺激することで、IL-6やMCP-1以外にRANTESおよびKCといったアディポサイトカインの産生性が元進した。RANTESは脂肪細胞へのT細胞リンパ球浸潤に、KCは脂肪細胞における毛細血管新生に関与する可能性がある。すなわち、歯周病のような慢性の微細感染症に由来する抗原が、脂肪細胞における炎症性変化を充進することによって、動脈硬化や糖尿病をさらに悪化させる可能性が示唆された。【目的】近年,脂肪細胞からのアディポサイトカイン産生に,マクロファージが関与する可能性が報告されている。すなわち,脂肪細胞周囲血管に集積したマクロファージ由来のサイトカインが脂肪細胞に働いて,アディポサイトカイン産生が亢進し糖尿病や動脈硬化が増悪するという,脂肪細胞・マクロファージ相互作用説である。一方,軽微な慢性感染症が,動脈硬化の増悪因子として働く可能性が示唆されている。本感染は虚血性心疾患の予知因子である高感度CRP値を上昇させる。そこで,細菌LPSがマクロファージを活性化し,さらに脂肪細胞からの炎症性サイトカイン産生を促進するとの仮説を立てた。ここでは,マクロファージ・脂肪細胞共培養系にLPSを作用させた場合のアディポサイトカイン産生性を検討した。【方法】分化3T3-L1細胞とRAW264.7細胞の共培養系を確立し,低濃度のLPS刺激下でのIL-6,TNF-αおよびMCP-1の産生性を調べた。抗TNF-α中和抗体と外因性TNF-αがIL-6産生性に及ぼす影響も調べた。【結果】3T3-L1とRAWの共培養系にLPSを添加することで,培地中のIL-6とMCP-1濃度が相乗的に増加した。IL-6はLPS刺激のみの脂肪細胞からも産生されたことから,主な産生細胞は脂肪細胞と考えられた。TNF-αについては,共培養することによる大きな変化は見られず,LPS刺激でRAW細胞からの産生が亢進したことから主な産生細胞はマクロファージと考えられた。抗TNF-α中和抗体の添加でIL-6産生が部分的に抑制された。【結論および考察】LPSに代表される感染抗原に晒されたマクロファージがTNF-α等の液性因子を介して脂肪細胞を活性化し,脂肪細胞からのIL-6産生を促進する可能性が示された。これにより産生されたIL-6は門脈を介して肝臓に集積し,肝細胞からのCRP産生に関与することが考えられた。すなわち、脂肪細胞周囲血管に集積したマクロファージに由来するサイトカインが脂肪細胞に働いて、アディポサイトカイン(脂肪組織由来生理活性物質)

産生が元進し糖尿病や動脈硬化が一層増悪するという、脂肪細胞・マクロファージ相互作用説である。一方、高感度CRPの上昇が虚血性心疾患の予知因子として有用であるという事実に代表されるように、軽微な慢性感染症が、動脈硬化の増悪因子として働く可能性が示唆されている。これまでに、代表的なアディポサイトカインであるIL-6およびMCP-1に注目し、脂肪細胞・マクロファージ共培養系に低濃度のLPS刺激を加えた際、LPS無刺激時と比較してIL-6で100倍以上、MCP-1セ約50倍、それらの産生性が充進することを報告した(Yamashita, et. al.,Obesity,2007)。しかしながら脂肪細胞由来アディポサイトカインは多種多様であり、マクロファージとの相互作用でIL-6やMCP-1以外の分子の産生性に変化があるか否かについては未だ明らかでない。そこで今回、脂肪細胞・マクロファージ共培養系を低濃度のLPSで作用させた場合のサイトカイン産生性の変化を知るため、抗体アレイの手法を用いて産生量が著明に増加する分子の解析を行った。【方法】1.細胞および培養マクロファージ由来細胞株RAW264.7とマウス由来前駆脂肪細胞3T3-L1を使用した。3T3-L1を分化誘導し、誘導開始から14日後の細胞を分化脂肪細胞として用いた。2脂肪細胞・マクロファージの共培養およびLPS刺激3.培養上清中のサイトカイン量の抗体アレイによる解析回収した培養上清中のサイトカインを抗体アレイ(Ray Biotech,Inc)を用いて解析した。なお、産生性の変化が著明であったものに関しては、その量をEHSAキット(R&D)にて定量した。【結果】1.抗体アレイ法により、マクロファージ・脂肪細胞共培養系を低濃度細菌LPS刺激した際、先行研究で明らかにしたIL-6およびMCP-1ともに、RANTESとKCの産生性が元進していることが明らかになった。2.ELISA法にて定量したところ、LPS刺激のあるマクロファージ・脂肪細胞共培養系では無刺激の場合よりも、RANTESについては約40倍、KCについては350倍以上に産生が元進した。【結論および考察】脂肪細胞とマクロファージをLPS刺激することで、IL-6やMCP-1以外にRANTESおよびKCといったアディポサイトカインの産生性が元進した。RANTESは脂肪細胞へのT細胞リンパ球浸潤に、KCは脂肪細胞における毛細血管新生に関与する可能性がある。すなわち、歯周病のような慢性の微細感染症に由来する抗原が、脂肪細胞における炎症性変化を充進することによって、動脈硬化や糖尿病をさらに悪化させる可能性が示唆された。
液滴を用いたプラズマ誘起液相反応利用のためのプラズマと液滴の相互作用の解明

本研究は,(i)誘電体バリア放電へ液滴を導入した系,(ii)コロナ放電を伴うエレクトロスプレーの系,の2種の系において,実験とモデリング・数値解析からプラズマと液滴の相互作用の解明を目的とする。2018年度は,以下の成果を得た。系(ii)における液滴の動的挙動の観測:液体を満たしたノズル電極に負極性高電圧を印加したとき,テイラーコーン形成に伴ってトリチェルパルス放電様の電流パルス群(各電流パルス幅:100 ns程度,パルス電流頻度:100kHz-1MHz,パルス群の周期:100 us程度)から構成されるコロナ放電が生じる。高速カメラでの観測により,液滴放出はテイラーコーン先端部の微小振動により,電流パルス群の最初の電流に伴ってのみ放出されること,液滴の帯電量はレイリー限界よりも低いために放出以降の分裂を伴わないこと,放出された液滴は5 m/s程度の速度で輸送されること,などが明らかになった。また,正極性高電圧を印加した場合はテイラーコーン先端の微小振動やコロナ放電は生じず,より微小な帯電液滴が放出されることが観測された。モデリング・数値解析では,大気圧He中の平行平板型誘電体バリア放電を1次元流体モデルで表し,この中に微粒子を導入した際のプラズマと微粒子の相互作用について検証を行った。放電プラズマ中の微粒子は電子流とイオン流のバランスによって負に帯電するが,誘電体バリア放電中の電子密度は周期内で変化するために帯電量も大きく変化すること,僅かな微粒子導入も電子やイオンの消滅項となるために放電維持を困難とすること,などが示された。更に,液滴表面へ到達した荷電粒子やラジカルによるプラズマ誘起液滴内液相反応をモデル化する第一段階として,プラズマ中に置かれた単一液滴の帯電過程のモデルを,荷電粒子のドリフト・拡散流,液滴や空間電荷による電界歪みを考慮して構築した。2018年度の当初研究計画では,系(i)ついては,放電チャンバーや電極を設計・製作し,プラズマ-液滴相互作用の計測に適した安定なプラズマ源の実現を目標としていた。また,系(ii)については,放出される液滴挙動の観測に加え,レーザ誘起蛍光法によるOHラジカルの計測を挙げていた。系(i)については,放電用電源の購入,放電チャンバーの製作が遅れたために予定通り進行しておらず,これは2019年度の前半に進める計画を立てている。また,レーザ誘起蛍光法によるOHラジカル計測については,他の研究課題(Oラジカル,Nラジカルの計測)でも同レーザを利用していることに加え,レーザ制御用パソコンの不調もあり,当初予定通りに進行していない。これも2019年度中に進める予定である。モデリング・数値解析に関する研究は予定通りに進行している。また,実験での遅れを最小限に留めるために,当初は2020年度に計画していた研究課題を先行して開始し,研究実績の概要でも記した通り,既に基盤となるモデル構築を行った。従って,本研究の終了年度までには,予定した研究を十分に遂行できるものと考えている。実験:系(i)はチャンバー製作等の遅れにより,液滴を含む安定した誘電体バリア放電の形成に至っていないが,2019年度の早期にプラズマ-液滴相互作用の計測に適する安定したプラズマ生成を実現する。これを実現した上で,電圧電流特性等の電気的特性,発光分光等の光学的な特性などの詳細を調査する。更に,大気圧のみならず,0.1気圧程度の減圧環境下でも同様の実験を行う。系(ii)については,液滴の放出,動的挙動とコロナ放電形成との関係を調べ,一定の成果を得ている。しかし,印加電圧とその極性,液体の導電率・表面張力・粘性率などの様々なパラメータにも依存した状態の変化が推測されるため,様々な条件下において詳細な特性を調べる。更に,コロナ放電の発生頻度を制御することを目的として,大気圧のみならず,0.1気圧程度の減圧環境下でも同様の実験を行う。得られた実験結果を詳細に解析することで,プラズマ-液滴相互作用に関する新たな知見を得る。モデリング・数値解析:系(i)に対しては空間一次元の流体近似モデルにより,誘電体バリア放電の数値解析を行う。既に,大気圧He中の誘電体バリア放電に固体微粒子を投入した場合の,放電構造に対する微粒子の影響を評価した。今後はこれを発展し,He/H2O混合ガス中での誘電体バリア放電に対して固体微粒子,及び,液滴を投入した場合の数値解析を行い,放電構造,及び,反応場の特徴を明らかにする。また,0.1気圧程度に減圧した場合の数値解析も実施する。更に,微視的な観点でのプラズマ-液滴相互作用を明らかにするために,陽光柱に相当する均一なプラズマ中に単一液滴を置いた際の液滴の帯電,液滴へのラジカルの拡散,及び,液滴中の化学反応を考慮した物理モデルを構築する。系(ii)に対しては,テイラーコーン形成過程,これに伴う電界計算を行い,帯電液滴放出に関する定量的な物理量に関する知見を得る。

系(ii)における液滴の動的挙動の観測:液体を満たしたノズル電極に負極性高電圧を印加したとき,テイラーコーン形成に伴ってトリチェルパルス放電様の電流パルス群(各電流パルス幅:100 ns程度,パルス電流頻度:100kHz-1MHz,パルス群の周期:100 us程度)から構成されるコロナ放電が生じる。高速カメラでの観測により,液滴放出はテイラーコーン先端部の微小振動により,電流パルス群の最初の電流に伴ってのみ放出されること,液滴の帯電量はレイリー限界よりも低いために放出以降の分裂を伴わないこと,放出された液滴は5 m/s程度の速度で輸送されること,などが明らかになった。また,正極性高電圧を印加した場合はテイラーコーン先端の微小振動やコロナ放電は生じず,より微小な帯電液滴が放出されることが観測された。モデリング・数値解析では,大気圧He中の平行平板型誘電体バリア放電を1次元流体モデルで表し,この中に微粒子を導入した際のプラズマと微粒子の相互作用について検証を行った。放電プラズマ中の微粒子は電子流とイオン流のバランスによって負に帯電するが,誘電体バリア放電中の電子密度は周期内で変化するために帯電量も大きく変化すること,僅かな微粒子導入も電子やイオンの消滅項となるために放電維持を困難とすること,などが示された。更に,液滴表面へ到達した荷電粒子やラジカルによるプラズマ誘起液滴内液相反応をモデル化する第一段階として,プラズマ中に置かれた単一液滴の帯電過程のモデルを,荷電粒子のドリフト・拡散流,液滴や空間電荷による電界歪みを考慮して構築した。2018年度の当初研究計画では,系(i)ついては,放電チャンバーや電極を設計・製作し,プラズマ-液滴相互作用の計測に適した安定なプラズマ源の実現を目標としていた。また,系(ii)については,放出される液滴挙動の観測に加え,レーザ誘起蛍光法によるOHラジカルの計測を挙げていた。系(i)については,放電用電源の購入,放電チャンバーの製作が遅れたために予定通り進行しておらず,これは2019年度の前半に進める計画を立てている。また,レーザ誘起蛍光法によるOHラジカル計測については,他の研究課題(Oラジカル,Nラジカルの計測)でも同レーザを利用していることに加え,レーザ制御用パソコンの不調もあり,当初予定通りに進行していない。これも2019年度中に進める予定である。モデリング・数値解析に関する研究は予定通りに進行している。また,実験での遅れを最小限に留めるために,当初は2020年度に計画していた研究課題を先行して開始し,研究実績の概要でも記した通り,既に基盤となるモデル構築を行った。従って,本研究の終了年度までには,予定した研究を十分に遂行できるものと考えている。実験:系(i)はチャンバー製作等の遅れにより,液滴を含む安定した誘電体バリア放電の形成に至っていないが,2019年度の早期にプラズマ-液滴相互作用の計測に適する安定したプラズマ生成を実現する。これを実現した上で,電圧電流特性等の電気的特性,発光分光等の光学的な特性などの詳細を調査する。更に,大気圧のみならず,0.1気圧程度の減圧環境下でも同様の実験を行う。系(ii)については,液滴の放出,動的挙動とコロナ放電形成との関係を調べ,一定の成果を得ている。しかし,印加電圧とその極性,液体の導電率・表面張力・粘性率などの様々なパラメータにも依存した状態の変化が推測されるため,様々な条件下において詳細な特性を調べる。更に,コロナ放電の発生頻度を制御することを目的として,大気圧のみならず,0.1気圧程度の減圧環境下でも同様の実験を行う。
ロタキサンを用いた分子の整列化と配列化:自己複製人工DNAへの展開

効率的なロタキサン合成法の開発:2級アンモニウムとジベンゾ24クラウン8(DB24C8)との間に働く水素結合を用い、擬ロタキサンを形成し、その末端封鎖によるロタキサン合成を以下の示す2法確立した。両法ともロタサキン軸主鎖に異なる置換基を同一の方法論で導入できる点が利点である。1.アセチレン-コバルトクラスター形成による合成法:末端にアセチレン部を持つ2級アンモニウム軸分子と24クラウン8(DB24C8)からin situに擬ロタキサンを形成し、さらにジコバルトオクタカルボニルを作用し、ロタキサンの合成を達成した。本法は1置換アセチレンにおいて高収率で目的物を生成し、また立体的に混み入った2置換アセチレンにおいても比較的高い収率で目的物を与えた。2.Ru触媒を用いたプロパルギルアルコールからのロタキサン合成:上記同様に、末端にプロパルギルアルコール部を持つ2級アンモニウム軸分子に、DB24C8存在下Ru触媒と種々の求核剤を作用し、ロタキサン合成に成功した。求核剤としては、アニリン、アミド、スルフォナミド、ケトン等価体等を用い、いずれの場合も高い収率でロタキサンを与えた。オリゴロタキサン合成:我々が以前に開発したエステル化によるロタキサン合成を用いて、オリゴロタサキンの合成を検討したものの目的物の合成は達成できなかった。しかしながら、上記方法のうち、Ru触媒を用いたロタキサン合成について検討した。その結果、[3]ロタキサンの合成を達成し、また、液性変化による環部位の選択的な固定化にも成功した。圧力によるロタキサン形成:圧力変化に伴うロタキサンの形成速度について検討した。その結果、圧力上昇に応じロタキサン形成速度の上昇が観測された。また圧力と反応速度の相関より、遷移状態のおける体積変化(活性化体積)を算出した。ポリロタキサン合成の検討2級アンモニウムとジベンゾ24クラウン8(DB24C8)との間に働く水素結合を用いたロタキサン合成に成功した。本法は末端部位にα-メチルスチルベンを持つ擬ロタキサンのかさ高さの調節を2重結合の光異性化によって行い、高収率でロタキサンを与える手法であり、共有結合を見かけ上形成しないことから全く新しい合成法である。またこのシス・トランス異性化は平衡でありため、条件により可逆的にロタキサン合成とその解離を可能にする。ロタキサン合成に成功したので、次に本法、あるいは以前に我々が開発したジアリルジアゾメタンを用いるエステル化による合成法によって、オリゴロタキサンの合成を検討したが、軸部位となるオリゴアンモニウムの有機溶媒への溶解性が乏しいため、これらの方法を用いた効率的なオリゴロタキサン合成は達成できなかった。そこで溶解性を向上する目的で、オリゴエチレングリコール-金属イオン間の結合を用いたロタキサン合成の検討を開始した。本結合を用いたロタキサン合成には、成功していないものの、軸と環双方にエチレンレンコール単位を持つロタキサンにおいて、アルカリ金属イオンとの選択的な認識を確認した。今後、オリゴエチレングリコールとクラウンエーテルと金属イオンの3成分からオリゴロタキサンの合成を実施する予定である。オリゴ及びポリロタキサン合成では、均一なロタキサン部位の構築が問題となる。そこで高比率でオリゴロタキサンを形成するために、アンモニウム-クラウン間に働く水素結合に加え、π-π相互作用を用いたロタキサン形成を検討した。その結果、π欠如-π過剰系相互作用が効果的に働き、ロタキサンの結合定数で2倍の改善が見られ、今後オリゴロタキサン合成に展開予定である。計画に従し,1)π-π相互作用を用いる方法,2)2個の軸分子を束ねる方法と,さらに3)金属イオンの配位による方法にて,分子の整列化と配列化に関する研究を実施した.1)π-π相互作用を用いる方法:まず環状分子として,電子欠如な芳香族(ナフラリミド部)と電子豊富な芳香環(トリフェニレン)とを持つクラウンエーテルを合成した.一部のクラウンエーテルと2級アンモニウムとの間に働く水素結合によって,ロタキサンが形成されることを見出した.2)2個の軸分子を1個の環が束ねる方法:2個の軸分子を認識する環分子(28-38員環クラウン)の合成を行い,続いて嵩高さの異なる末端部位を持つ軸分子を数種合成し,軸分子の認識能をそれぞれ観測した.その結果,本環分子群の軸分子認識は,24員環クラウンに比較しあまり強くないことが確認された.また,末端部位の嵩高さの違いによる擬ロタキサンの形成・解離速度の変化も観測した.3)金属イオンの配位による方法:複数の環部位間に働く相互作用を期待し,ダイマー形成能を持つクラウンエーテルとオリゴアンモニウムとのロタキサン2重線の合成を検討したものの,複雑な混合物を与えるに留まった.これは,環が軸上で自由に回転していることに基づくものと考察した.そこで環の軸部への緩やかな固定化を期待し,ロタキサンの金属イオン取り込みについて検討した.その結果,導入したオリゴエチレングリコール部位とアルカリ金属イオンとの配位結合によって,環の固定化が行われていることが示唆された.

またこの配位においては,エーテル部位の酸素の塩基性度が重要であることが判明した.効率的なロタキサン合成法の開発:2級アンモニウムとジベンゾ24クラウン8(DB24C8)との間に働く水素結合を用い、擬ロタキサンを形成し、その末端封鎖によるロタキサン合成を以下の示す2法確立した。両法ともロタサキン軸主鎖に異なる置換基を同一の方法論で導入できる点が利点である。1.アセチレン-コバルトクラスター形成による合成法:末端にアセチレン部を持つ2級アンモニウム軸分子と24クラウン8(DB24C8)からin situに擬ロタキサンを形成し、さらにジコバルトオクタカルボニルを作用し、ロタキサンの合成を達成した。本法は1置換アセチレンにおいて高収率で目的物を生成し、また立体的に混み入った2置換アセチレンにおいても比較的高い収率で目的物を与えた。2.Ru触媒を用いたプロパルギルアルコールからのロタキサン合成:上記同様に、末端にプロパルギルアルコール部を持つ2級アンモニウム軸分子に、DB24C8存在下Ru触媒と種々の求核剤を作用し、ロタキサン合成に成功した。求核剤としては、アニリン、アミド、スルフォナミド、ケトン等価体等を用い、いずれの場合も高い収率でロタキサンを与えた。オリゴロタキサン合成:我々が以前に開発したエステル化によるロタキサン合成を用いて、オリゴロタサキンの合成を検討したものの目的物の合成は達成できなかった。しかしながら、上記方法のうち、Ru触媒を用いたロタキサン合成について検討した。その結果、[3]ロタキサンの合成を達成し、また、液性変化による環部位の選択的な固定化にも成功した。圧力によるロタキサン形成:圧力変化に伴うロタキサンの形成速度について検討した。その結果、圧力上昇に応じロタキサン形成速度の上昇が観測された。また圧力と反応速度の相関より、遷移状態のおける体積変化(活性化体積)を算出した。
糸球体蛋白透過性における荷電障壁の関与 ーその定量化に関する検討ー

糸球体基底膜(GBM)における高分子蛋白の透過性について、主としてヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)よりなる荷電障壁の重要性が報告されている。従来、これら荷電障壁を形成する陰荷電物質を染色する目的で、各種陽荷電プロ-ベが使用されているが、これらを定量化することは困難であり、さらに電顕にて観察されたこれらの形態は、HSPGの分子構造形態とは著しく矛盾すると指摘されていた。最近、我々はCuprolinic blueという銅を含む色素を用いて、まずGBM陰荷電物質を、その分子構造形態に近い形で捉え、さらに定量的評価としてこの色素中に銅が含まれることに着目し、GBM陰荷電物質に結合した銅を原子吸光分析装置にて測定し、陰荷電性の定量的指標化とすることに成功した。この方法にて、ラットのアミノヌクレオシド誘発ネフロ-ゼモデルにおけるGBM陰荷電物質の変化を検討した。即ち、本色素を臨界電界質濃度法に従って左腎を灌流し、一部を一般電顕観察用に試料を作成した。他方、GBMを単離し、GBM結合銅両を原子吸光分析装置にて測定し、単位蛋白当たりで示した。正常対照群では、GBM内外透明層に、足突起直下よりGBM緻密層に垂直に伸展する長さ約3040nmの線維状構造が認められた。実験群では、極期に多量の蛋白尿が出現し、上記線維状構造は減少し、その配列も不規則となっていた。GBM結合銅量(μg/mg蛋白)も、対照群7.9±0.43に比し、3.7±0.33と有意に減少していた。以上の如く、本法により陰荷電障壁の定量化に成功し、さらにアミノヌクレオシド誘発ネフロ-ゼモデルにおける蛋白尿の成因の一つにGBM陰荷電障壁の減少が関与することを示した。従来、これら荷電障壁を形成する陰荷電物質を染色する目的で、各種陽荷電プローベが使用されているが、これらを定量化することは困難であり、さらに電顕にて観察されたこれらの形態は、HSPGの分子構造形態とは著しく矛盾すると指摘されていた。最近、我々はCoprolinic blueという銅を含む色素を用いて、まずGBM陰荷電物質をその分子構造形態に近い形で捉え、さらに定量的評価として、この色素中に銅が含まれることに着目し、GBM陰荷電物質に結合した銅を原子吸光分析装置にて測定し、陰荷電性の定量的指標化を行うことに成功した。この方法にてラットのアミノヌクレオシド誘発ネフローゼモデルにおけるGBM陰荷電物質の変化を検討した。即ち、本色素を臨界電解質濃度法に従って左腎を灌流し、一部を一般電顕観察用に試料を作成した。他方、GBMを単離し、GBM結合銅量を原子吸光分析装置にて測定し、単位蛋白量あたりで示した。正常対照群では、GBM内外透明層に足突起直下よりGBM緻密層に垂直に伸展する長さ約3040nmの線維状構造が認められた。実験群では、極期に多量の蛋白尿が出現し、上記線維状構造が減少し、その配列も不規則となっていた。GBM結合銅量(μg/mg蛋白)も対照群7.9±0.43に比し、3.7±0.33と有意に減少していた。以上のごとく、本法により陰荷電障壁の定量化に成功し、さらにアミノヌクレオシド誘発ネフローゼモデルにおける蛋白尿の成因の一つにGBM陰荷電障壁の減少が関与することを示した。

糸球体基底膜(GBM)における高分子蛋白の透過性について、主としてヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)よりなる荷電障壁の重要性が報告されている。前回、申請者らCuprolinic blueという銅を含む色素を用いて、GBM陰荷電物質を、その分子構造形態に近い形で捉え、さらに定量的評価としてこの色素中に銅が含まれることに着目し、GBM陰荷電物質に結合した銅を原子吸光分析装置にて測定し、陰荷電性の定量的指標化することに成功した。さらに、この方法によってラットのアミノヌクレオシド誘発ネフロ-ゼモデルにおいてGBM結合銅量は、対照に比し有意に減少し、本症における蛋白尿の成因の一つにGBM陰荷電障壁の減少が関与することを報告した。今回は、本陽荷電プロ-ベが、果してGBM中のどの陰イオンに結合するかを知る目的で、in vitroで一定イオン強度のもとに、溶液のPHを0.7から8.0まで変化させ、Cuprolinic blueのGBMへの結合性を検討した。即ち、GBMは無処理ラットより腎を摘出し、sieving法にて糸球体を単離、その後超音波処理により単離GBMを得た。この単離GBMを0.3MMgCl_2加酢酸Na緩衝液中で、PHを変化させ、Cuprolinic blueのGBMへの結合性をGBM単位蛋白当りで示した。この結果、PH2.0ではPH5.6に比し半減しており、Carboxyl陰イオンのPKが5.0、sulfate陰イオンのPKが2.0であることを考え合わせると本陽荷電プロ-ベは、carboxyl基に比し、優位にsulfate基に結合すると考えられた。GBMの陰荷電障壁は主としてHSPGより形成されると考えられるので、以上の結果は、GBM陰荷電障壁の定性的及び定量的評価に本方法は適当な手段であると考えられた。
Barrett上皮の腸上皮化生と胃の腸上皮化生の比較による前癌病変の分子機構解析

胃の腸上皮化生と比較して,Barrett上皮の腸上皮化生は1)Barrett上皮腸上皮化生のムチンの形質は胃型(MUC5AC),腸型(MUC2)の混合型が多い.2)Barrett癌とその隣接するBarrett粘膜は腸型,特に大腸型sulfo-Lewis^a mucinを強く発現する.胃の腸上皮化生粘膜では小腸型ムチン(sialyl Tn)がdominantであった.3)Barrett粘膜の増殖活性(CyclinD1,Ki-67)は特殊円柱上皮>移行型上皮>胃底腺型上皮であり,特殊円柱上皮のKi-labeling indexは胃の腸上皮化生粘膜のそれより高値であった.4)Barrett上皮の腸型形質発現はepigeneticalにhomeobox genefamily(HOXB6,CDX-1,-2),p16 promoter領域のmethylation或いはdemethylationと関連があった.5)Barrett粘膜の実体顕微鏡・拡大内視鏡観察で腸型,移行型,胃型のムチンを発現する粘膜はそれぞれ特異なpit patternを示す.腸型のpit patternはtubulovillous patternで複雑な分岐を示す脳回転状鎖状のパターンで中心部に毛細血管を認める.胃の腸上皮化生粘膜は比較的単純な樹枝状パターンで毛細血管を認めることはまれであった.6)Barrettの腸型,移行型,胃底腺型粘膜および正常重層扁平上皮ではcytokeratin 7/20/14の発現パターンが異なる.腸型Barrett粘膜では腺管の表層がCK20陽性で中深層でCK7が陽性であるが,胃幽門部腸上皮化生では一定の傾向は認められなかった.7)Barrett粘膜の腸型形質のpit pattern(tubulovillous pattern)を示す粘膜は狭帯域フィルター拡大内視鏡(Narrow Band Imaging endoscope)により異常な毛細血管networkを示し,8)かつ,この腸型粘膜ではVEGFなどのangiogenetic factorが胃の腸上皮粘膜に比し高発現を認めることが明らかであった.以上からBarrett粘膜の腸上皮化生は形質的には胃腸混合型でhybrid patternを示し,特に大腸型の硫酸型糖鎖を持つムチンが特徴的であり(ムチン発現と拡大内視鏡所見は対応しており),このような粘膜は細胞回転が亢進し,血管新生因子を高発現し,拡大内視鏡的にも異常な毛細血管network patternを確認できた.胃の腸上皮化生と比較して,Barrett上皮の腸上皮化生は1)Barrett上皮腸上皮化生のムチンの形質は胃型(MUC5AC),腸型(MUC2)の混合型が多い.2)Barrett癌とその隣接するBarrett粘膜は腸型,特に大腸型sulfo-Lewis^a mucinを強く発現する.胃の腸上皮化生粘膜では小腸型ムチン(sialyl Tn)がdominantであった.3)Barrett粘膜の増殖活性(CyclinD1,Ki-67)は特殊円柱上皮>移行型上皮>胃底腺型上皮であり,特殊円柱上皮のKi-labeling indexは胃の腸上皮化生粘膜のそれより高値であった.4)Barrett上皮の腸型形質発現はepigeneticalにhomeobox genefamily(HOXB6,CDX-1,-2),p16 promoter領域のmethylation或いはdemethylationと関連があった.5)Barrett粘膜の実体顕微鏡・拡大内視鏡観察で腸型,移行型,胃型のムチンを発現する粘膜はそれぞれ特異なpit patternを示す.腸型のpit patternはtubulovillous patternで複雑な分岐を示す脳回転状鎖状のパターンで中心部に毛細血管を認める.胃の腸上皮化生粘膜は比較的単純な樹枝状パターンで毛細血管を認めることはまれであった.6)Barrettの腸型,移行型,胃底腺型粘膜および正常重層扁平上皮ではcytokeratin 7/20/14の発現パターンが異なる.腸型Barrett粘膜では腺管の表層がCK20陽性で中深層でCK7が陽性であるが,胃幽門部腸上皮化生では一定の傾向は認められなかった.7)Barrett粘膜の腸型形質のpit pattern(tubulovillous pattern)を示す粘膜は狭帯域フィルター拡大内視鏡(Narrow Band Imaging endoscope)により異常な毛細血管networkを示し,8)かつ,この腸型粘膜ではVEGFなどのangiogenetic factorが胃の腸上皮粘膜に比し高発現を認めることが明らかであった.以上からBarrett粘膜の腸上皮化生は形質的には胃腸混合型でhybrid patternを示し,特に大腸型の硫酸型糖鎖を持つムチンが特徴的であり(ムチン発現と拡大内視鏡所見は対応しており),このような粘膜は細胞回転が亢進し,血管新生因子を高発現し,拡大内視鏡的にも異常な毛細血管network patternを確認できた.Barretts上皮の腸上皮仮生と胃幽門部の腸上皮仮生巣はMUC2コアpeptideの発現は両者に差は認められなかったが,アポムチンA3D4の発現はBarrett

上皮に強く発現し,またこの側鎖と考えられる硫酸化糖鎖の発現も同様の傾向を示した.Ki-67による細胞増殖活性はBarrett上皮腸上皮化生=胃不完全型腸上皮化生>胃完全型腸上皮化生であった.Barrett上皮を有する患者30名の拡大内視鏡観察を行い,粘膜微細構造を5型に分類した.点状ならびに直線状のpitはアポムチンMUC5ACならびにMUC6を強く発現し(75%),管状,絨毛状のpitはアポムチンMUC2ならびに硫酸化糖鎖sulfo-Lewisa,シアル酸化糖鎖sialyl Tnを高頻度(90%)に認められた.また長楕円型のpitはMUC5ACとMUC2の両者を混在して発現する傾向を見せた。PCNAlabelingindexは絨毛状>管状>長楕円状>直線状・点状pitであった.胃の腸上皮化生と比較して,Barrett上皮の腸上皮化生は1.Barrett上皮腸上皮化生のムチンの形質は胃型(MUC5AC),腸型(MUC2)の混合型が多い.2. Barrett癌とその隣接するBarrett粘膜は腸型,特に大腸型Sulfo-Lewis^a mucinを強く発現する.胃の腸上皮化生粘膜では小腸型ムチン(sialyl Tn)がdominantであった.3. Barrett粘膜の増殖活性(CyclinDl, Ki-67)は特殊円柱上皮>移行型上皮>胃底腺型上皮であり,特殊円柱上皮のKi-labeling indexは胃の腸上皮化生粘膜のそれより高値であった.4. Barrett上皮の腸型形質発現はepigeneticalにhemeobox gene family(HOXB6, CDX-1, -2),p16 promoter領域のmethylation或いはdemethylationと関連があった.5. Barrett粘膜の実体顕微鏡・拡大内視鏡観察で腸型,移行型,胃型のムチンを発現する粘膜はそれぞれ特異なpit patternを示す.腸型のpit patternはtubulovillous patternで複雑な分岐を示す脳回転状鎖状のパターンで中心部に毛細血管を認める.胃の腸上皮化生粘膜は比較的単純な樹枝状パターンで毛細血管を認めることはまれであった.6. Barrettの腸型,移行型,胃底腺型粘膜および正常重層扁平上皮ではcytokeratin 7/20/14の発現パターンが異なる.腸型Barrett粘膜では腺管の表層がCK20陽性で中深層でCK7が陽性であるが,胃幽門部腸上皮化生では一定の傾向は認められなかった.7. Barrett粘膜の腸型形質のpit pattern(tubulovillous pattern)を示す粘膜は狭帯域フィルター拡大内視鏡(Narrow Band Imaging endoscope)により異常な毛細血管networkを示し,8.かつ,この腸型粘膜ではVEGFなどのangiogenetic factorが胃の腸上皮粘膜に比し高発現を認めることが明らかであった.以上からBarrett粘膜の腸上皮化生は形質的には胃腸混合型でhybrid patternを示し,特に大腸型の硫酸型糖鎖を持つムチンが特徴的であり(ムチン発現と拡大
膜2回貫通型カリウムチャネルの分子機能調節と生体機能異常

本研究で得られた実績は以下のとおりである。(1) ATP感受性カリウムチャネルA)血管平滑筋型ATP感受性カリウムチャネルがスルホニルウレア受容体SUR2bと膜2回貫通型カリウムチャネルKir6.1の複合体として構成されることを世界で初めて明らかにした。その構成ユニットの違いによりATP感受性カリウムチャネルが、細胞内ヌクレオチドやチャネル開口薬により異なる調節を受けることを明らかにした。B)ATP感受性カリウムチャネルのチャネルコンダクタンスの違いが、イオン透過孔を構成する膜2回貫通型カリウムチャネルKir6.0の分子構造中のポア領域に存在することをKir6.1とKir6.2のキメラ体を作成することにより明らかにした。(2) G蛋白調節性カリウムチャネルA)黒質線条体のドーパミンニューロンのG蛋白調節性カリウムチャネルが、kir3.2a、Kir3.2cから構成されることを明らかにし、この分布にPSD系列のアンカリング蛋白が関与していることを示唆した。B)脳下垂体前葉甲状腺刺激ホルモン(TSH)分泌細胞において、分泌顆粒上にKir3.1が存在していることを見い出し、TSH分泌刺激により細胞膜に分泌顆粒が融合し機能的チャネルを発現することを見い出した。C)心臓からkir3.0の新たなサブユニットkir3.1bを単離し、その活性を調べることによりG蛋白質によるチャネル活性化にチャネルのカルボキシル末端が重要であることを示唆した。(3)その他の膜2回貫通型カリウムチャネルA)Kir2.Oサブファミリーが中枢神経系において嗅球に階層状に発現していることを見い出した。B)kir4.1が中枢神経では内耳の内リンパ胞、グリア細胞、脳室上皮細胞の基底膜側、網膜ミュラー細胞に発現していることを見い出した。C)新しい膜2回貫通型カリウムチャネル検索の過程で心臓から新たな膜4回貫通型チャネルCTBAKをクローニングした。内向き整流カリウムチャネル(Krec)ファミリーは、古典的内向き整流性(IRK)、G蛋白制御性(GIRK)、ATP感受性(K_<ATP>)およびATP抑制性(K_<AB>)に分類することができる。本年度において我々はGIRKファミリーに属する新たなクローンの単離を行い、報告した(Isomoto S. et al. Biochen. Biophys. Res. Commun. 218:286,1996)。このクローンはGIRK2のsplice variantであり、GIRK2Bと名付けた。GIRK2BはGIRKファミリーの別のサブユニットであるGIRK1とのヘテロ重合体としてG蛋白制御性カリウム(K_G)チャネルを形成するが、他のGIRKファミリーに比べて広範囲な組織に発現が認められており、組織によってはその他の機能を有している可能性が示唆された。また、GIRK1に特異的な抗体を用いて脳を免疫染色するとシナプス前ニューロンが染まるという所見を得た(Morishige K. et al. Biochen. Biophys. Res. Commun. 1996,in press)。これはGIRK1の中枢における調節のメカニズムがシナプス前抑制であることを強く示唆している。さらに、この抗体を用いた生化学的検討により、前脳におけるK_GチャネルがGIRK1およびその結合蛋白との4量体として形成されることも推測された(Inanobe A. et al. Biochen. Biophys. Res. Commun. 217:1238,1995)IRKファミリーに属する3種類のクローン(IRK1.2.3)についてin situ hybridizationを用いて中枢神経系での発現分布を検討した。

その結果、これらIRKファミリーは脳内においてそれぞれ異なった発現分布を示しており、それぞれの中枢における機能調節も異なっていることを強く示唆している(Horio Y. et al. FEBS Lett. 379:239,1996)。膜2回貫通型カリウムチャネルの全貌を明らかとするために脳cDNAライブラリーから、新たなチャネルGIRK2Bをクローン化した。また、GIRK1についてもG蛋白質βγサブユニットの結合部位を欠くバリアント(GIRK1B)があることを最近見いだした。一方、ATP感受性カリウムチャネルについてチャネルサブユニットであるBIRとuK_<ATP>をクローン化し、さらにそれに結合するスルフォニル尿素受容体SUR2Bを新たにクローン化した。SUR2Bの発現は広く分布しており、uK_<ATP>と共に培養細胞HEKに発現させたところ血管平滑筋に存在するATP感受性カリウムチャネルに非常に似た性質チャネルを発現することがわかった。これははじめての血管平滑筋型ATP感受性カリウムチャネルのクローニングである。ゲノム遺伝子のクローニングについても既にIRK3 geneを単離していたがさらにK_<AB>-2、GIRK1 geneを単離した。一方クローン化したチャネルについては、まず、古典的内向き整流カリウムチャネルのIRK1,IRK2,IRK3についてはin situ hybridizationによって脳内の詳細な分布を明かとし、ATP依存性カリウムチャネルのK_<AB>-2の分布について網膜のグリア細胞であるMull細胞や内耳血管状のなかのMarginal細胞に特異的に発現していることを明かとした。また、GIRK1については生化学的解析からG蛋白質βγサブユニットが直接チャネルに結合すること、免疫電顕によりGIRK1はプレシナプスに存在することを明らかとした。チャネル電気生理学的解析ではK_GチャネルやIRK2の内向き整流特性が細胞内ポリアミンによってもたらされること、1つのK_Gチャネルの開口には複数個(おそらく4つ)のG蛋白質βγサブユニットが必要であること、また、脳内向き整流カリウムチャネルが_CAMPや_CGMPで抑制されることを明かとした。神経の興奮性はNO等の各種の伝達物質でカリウムチャネルを介して調節されている可能性が高いことが判明した。本年度に本研究で得られた実績は以下のとおりである。1.K_<ATP>チャネル関連:(1)血管平滑筋型K_<ATP>チャネルが、スルフォニールユレア受容体SUR2Bと2回膜貫通型K^+チャネルサブニットKir6.1の複合体として構成されることを、世界で初めて見いだした。またSUR2B/Kir6.1チャネルが、Kir6.2を含む心筋・膵臓型の古典的K_<ATP>チャネルとは全く異なる、細胞内ヌクレオチドによる調節、K^+チャネル開口薬による活性化を受けることを見いだした。(2)古典的K_<ATP>チャネルは細胞内
敗血症などの代謝亢進状態における臓器酸素化指標としての消化管トノメーターの有用性

多発外傷および重症熱傷による外傷性ショック、食道癌術後、遊離小腸移植後、胸腹部大動脈癌術後および敗血症例、計38例を対象に、経時的に胃トノメーターによる胃粘膜pH(以下pHi)を測定し、次の結果を得た。1)胃トノメーターによる胃粘膜内PH値(phi)は、外傷性ショックからの蘇生後、あるいは大手術直後には、7.3以下に低下したが、大部分の症例で、浸襲暴露から72時間以内に、7.3以上に回復した。しかし、7.3以下を72時間以上遷延した症例は、臓器不全の合併を認め予後不良であった。2)外傷性ショック15例について、pHi値と、他の指標との関連を見ると、受傷後72時間以内では、乳酸値・IL-6・動脈血中ケトン体比(AKBR)・好中球エラスターゼ(PMNE)・PAI-1と有意の相関を認め、浸襲の程度とpHiとの間に密接な関連を認めた。3)Swan-Ganz catheterによる循環諸量について検討すると、pHiと酸素供給量(Do2)との間に、有意の負の相関が認められたが、酸素消費量(Vo2)との間には、認められなかった。従って、敗血症など代謝亢進状態における消化管粘膜の酸素化状態は、Swan-Ganz Catheterによる酸素需給の指標と一致せず、pHiのモニタリングは、組織酸素代謝の新たな情報を提供するものとして意義が認められた。4)腹部臓器血流改善策としてDopaminおよびPGE1の投与を行ったが、後者に比較的、pHiの改善を認めた。5)胃液pHとpHi値との間に有意の負の相関があり、pHi測定に当たっては、H2ブロッカーの投与が必要と考えられた。以上より、浸襲下における臓器酸素化指標として、胃トノメーターの有用性を示唆するデータが得られたが、今後は、代謝亢進状態における組織の酸素摂取率を上昇させ、酸素消費量の改善をいかにして行うかが次に課せられた問題と考えられる。1多発外傷、重症熱傷などの外傷性ショック10例、食道癌、腹部大動脈瘤などの大手術後5例を対象に、臓器酸素化指標としての消化管トノメーターの有用性について検討した。2胃トノメーターによる胃粘膜内pH値(pHi)は、外傷性ショックからの蘇生後、及び大手術直後には7.310±0.046に低下したが、12時間後にはさらに7.295±0.027に低下した。しかし、24-48時間後には正常値へ復した。侵襲直後24時間における消化管虚血と、その後に生ずる敗血症との関連が示唆された。3pHi値と有意の相関を示したものは、乳酸値(r=-0.079)、IL-6値(r=0.565)、TAT値(r=-0.642)、PAI-1値(r=-0.634)、好中球エラスターゼ値(r=-0.622)であり、臓器障害の種々の誘因との密接な関連が示唆された。4敗血症における代謝亢進状態(SVR↓、CO↑、DO_2↑、VO_2↓、VO_2/DO_2↓)とpHiの変動は必ずしも一致しないが、病勢の早期予知及び予後判断に、よく反映されていた。5組織酸素摂取率の低下に対して、全例Dopamineを使用したが、第2年度には、PGE_1の効果を検討することにした。

6胃液pH値とpHi値との間には、有意の相関は認められなかった。以上により、外傷性ショック後及び大手術後における臓器酸素化指標として、また、敗血症における臓器障害の予知あるいは予後指標として、消化管トノメーターの有用性を示唆するデータが得られたが、今後は症例を重ねると同時に、酸素摂取率の低下した組織をいかに改善させ、そしてトノメーターがその指標となり得るかを課題として検討する。1 30例の重症例(多発外傷10、重症熱傷5、大手術後15)を対象に、臓器酸素化指標としての胃トノメーターの有用性について検討した。2胃トノメーターによる胃粘膜内pH値(pHi)は、外傷性ショックからの蘇生後、あるいは大手術直後には、7.3以下に低下したが、大部分の症例で、侵襲暴露から72時間以内に、7.3以上に回復した。しかし、7.3以下を72時間以上遷延した症例は、臓器不全の合併を認め予後不良であった。3外傷性ショック15例について,pHi値と、他の指標との関連を見ると、受傷後72時間以内では、乳酸値・IL-6・動脈血中ケトン体比(AKBR)・好中球エラスターゼ(PMNE)・PAI-1と有意の相関を認め、侵襲の程度とpHiとの間に密接な関連を認めた。4 Swan-Ganz catheterによる循環諸量について検討すると、pHiと酸素供給量(Do2)および酸素消費量(Vo2)との間に、有意の負の相関が認められた。従って、敗血症など代謝亢進状態における消化管粘膜の酸素化状態は,Swan-Ganz catheterによる酸素需給の指標と一致せず,pHiのモニタリングは、組織酸素代謝の新たな情報を提供するものとして意義が認められた。5腹部臓器血流改善策としてDopaminおよびPGE1の投与を行ったが、後者に比較的,pHiの改善を認めた。6胃液pHとpHi値との間に有意の負の相関があり,pHi測定に当たっては、H2ブロッカーの投与が必要と考えられた。以上により、外傷性ショック後および大手術後における臓器酸素化指標として、また、敗血症における臓器障害の予知あるいは予後指標として、胃トノメーターの有用性を示唆するデータが得られたが、今後は、代謝亢進状態における酸素摂取率の低下をいかに改善させるかが臨床上の課題と考えられる。
虚血心筋障害、リモデリングにおける心筋間質の病態と血管新生の画像化に関する研究

ラット心筋虚血再還流モデルにおいて、C-14-methionineを用い、その経時的空間的集積の動態を病理組織学的所見と対比検討した。メチオニン集積は虚血領域の中心部を主体に、ほぼTl-201の集積低下部に一致して再還流3日で最大となり、その後漸減し4週後以降は正常部とほぼ同等の集積となった。病理学的にはその集積は浸潤したマクロファージの分布(CD68陽性細胞)と一致し、血管新生に関係するmyofibroblast(SMA陽性細胞)とは相関しなかった。メチオニンイメージは梗塞後の炎症反応の評価に有用である可能性が示唆された。虚血再還流ラット(30分虚血再還流モデル)を用いて、再還流後の心筋におけるC-14-methionineの集積の空間的、経時的変化のデータと、病理組織学的所見との対比検討を行った。再還流1日後ではメチオニンの集積が低く、病理学的には好中球等の炎症細胞浸潤が始まる時期であった。メチオニン集積は再還流3日後に増加しピークを示し、以後7日、14日、28日と漸減した。このメチオニン集積はTc-99m-MIBIによるarea at riskの内部でかつ心筋viability低下を反映するTl-201の集積低下部におおむね一致しており、心筋viability低下部への集積と判定された。どのような細胞にメチオニンが集積しているかを検討するためにマクロファージに対するCD68抗体と血管新生に関与するmyofibroblastに対する抗αSMA抗体ならびに心筋のマーカーである抗トロポニンI抗体による免疫組織染色を施行し比較した。その結果、再還流3日では心筋細胞間に浸潤したメクロファージが主体で、αSMA陽性のmyofibroblastはほとんど認めなかった。7日ではマクロファージ浸潤が依然として主体であったが、有意にmyofibroblastが出現していた。14日ではマクロファージは減少し、myofibroblastが相対的に増加していた。以上の経過から、虚血再還流による心筋梗塞の亜急性期のメチオニン集積はマクロファージに主に集積していると考えられた。治療的介入として虚血後の再還流時に、血流の再開、再閉塞を10秒毎に2分間繰り返すPostconditioningを行いメチオニンの集積がどのように変化するかに関する検討を開始した。視覚的な暫定的評価では、梗塞亜急性期のメチオニン集積はPostconditioningで低下していた。虚血再還流ラット(30分虚血再還流モデル)を用いて、再還流後の心筋におけるC-14-methionineの集積の空間的、経時的変化のデータと、病理組織学的所見に関して、治療的介入として虚血後の再還流時に、血流の再開、再閉塞を10秒毎に2分間繰り返すPostconditioning(PC)を行いメチオニンの集積がどのように変化するかに関する検討を行った。再還流1日後ではPosconの有無にかかわらずメチオニンの集積が低く(正常灌流部に対する虚血部のカウント比:PCなし0.74±0.12 vs PCあり0.78±0.11, P=ns)、病理学的には好中球等の炎症細胞浸潤が始まる時期であった。メチオニン集積は再還流3日後に増加し、ピークを示したがPCにより集積は抑制されなかった(PCなし1.72±0.12vsPCあり1.64±0.24, P=ns)。しかし7日(PCなし1.44±0.13 vs PCあり1.20±0.21, P<0.05)、14日(PCなし1.25±0.04 vs PCあり1.08±0.09/,P<0.005)、は有意にPCによりメチオニン集積は抑制された。PCの有無にかかわらず病理組織学的には、再還流3日では心筋細胞間に浸潤したメクロファージ(CD68抗体陽性細胞)が主体で、αSMA陽性のmyofibroblastはほとんど認めなかった。14日ではマクロファージは減少し、特にPCではほとんど認めず、myofibroblastが相対的に増加していた。以前の検討ではメチオニン集積はマクロファージへの集積を反映していることが示されたが、病理組織学的には明確にPCの有無でのマクロファージ浸潤の変化が示されなかった。これはRIイメージングでは定量が簡単にしかも精度よく行えるのに対して、病理組織での全虚血領域にわたるマクロファージ浸潤の定量化が困難なことに起因していると考えられた。将来の生体イメージングを鑑みるとこのイメージングの利点は重要であると思われる。

虚血再還流ラットを用いて、再還流後の心筋におけるメチオニンの代謝がどのような空間的、経時的変化をたどってゆくかを病態生理との関連において検討した。ラットの左冠動脈を30分閉塞後再還流したモデルを作成し、再還流1、3、7、14、28日、3月、6月後に、C-14-methionineならびに心筋viabilityをみるためのTl-201、area at riskの描出のためのTc-99m-MIBIを用いトリプルオートラジオグラフィを施行した。視覚的評価では、C-14-methionineの集積は3日以降にTc-99m-MIBIでの血流欠損部の内部に認めた。またmethionineの集積はおおむねTl-201の集積低下部に一致して認めたので、その集積は心筋細胞以外の間質組織への集積が疑われた。Tc-99m-MIBIの血流欠損部に相当する関心領域(ROI)における、正常血流部に対するTl-201, C-14-methionineの集積比は、再還流1日後ではTl-201, C-14-methionineの集積比はそれぞれ、0.35±0.13, 0.71±0.13といずれも減少していた。しかしながら再還流3日目にはTl-201の集積は0.66±0.10へと改善したが依然として正常部に比べ大きく低下していた。しかるにC-14-methionineは1.79±0.23と大きく増加していた。その後Tl-201の集積比は6月まで0.7-0.55の間でおおむね一定していたが、C-14-methionineの集積は7日で1.52±0.20、14日で1.31±0.12、28日で1.12±0.08と徐々に低下し、3、6月ではそれぞれ1.03±0.04, 0.94±0.04とほとんど正常部と同等となった。以上より梗塞亜急性期にmethionine集積が増加することが判明した。methionineの集積機序に関する研究はおおむね順調に進んだ。Galactro-RGDの合成、作成も進み、I-125による標識は可能となったものの、多核種によるオートラジオグラフィのためのTc-99mまたはIn-111による標識が依然として難しく、問題点として残った。ただしメチオニンの集積が梗塞亜急性期では血管新生ではなく、マクロファージの浸潤を反映していることが判明したため、メチオニンとの直接比較の必要性が低下した。従ってGalactro-RGDの集積分布の検討に関しては優先順位をおとし、今後の課題とした。虚血再還流モデルにおけるモデル作成は、心電図の監視により致死性の不整脈を早期に発見できたため死亡率が有意に低下した。従ってまとまった放射性トレーサーの投与が可能となり実験効率がアップした。またmethionineの集積、分布に関する検討は3核種オートラジオグラフィでの各トレーサーの投与放射能量の最適の比率(C-14-methionine:15-20μCi, Tl-201: 300-400μCi, Tc-99m-MIBI: 5-6 mCi)が比較的早期につかめたためスムーズに進行した。一方、Galactro-RGDの合成、作成も進み、I-125による標識は可能となったものの、多核種によるオートラジオグラフィのためのTc-99mまたはIn-111による標識が難しく、問題点として残った。従ってGalactro-RGDとメチオニンの集積分布を直接比較するための2核種同時のオートラジオグラフィの検討解析が遅れている。