hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4Xのエピジェネティックな発現制御機構の解析

本研究はヒト自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減が自閉症発症の原因なのか結果なのか、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景は何なのか明らかにすることを目的としている。そこでNLGN4Xの発現制御機構について詳細に解析したところ、NLGN4Xの発現がプロモーターのCpGメチル化を介してMeCP2により調節されていること、ストレス依存的なmiR-23aによって翻訳抑制されていること、AS-NLGN4Xによって相補的に発現制御されていることが明らかとなり、エピジェネティックな発現制御を受けていることが示唆された。本研究は、ヒト自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減が自閉症発症の原因なのか結果なのか、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景は何なのか明らかにすることを目的としている。本年度は、ストレスを介したMeCP2のリン酸化、miR-23a、逆鎖long-noncoding RNA(lncRNA)による発現制御機構について解析を行った。NLGN4X遺伝子のエキソン1A及びCpGプロモーターにはMeCP2が結合し、発現抑制に関与していることがわかっている。TGW細胞株をカイニン酸を用いててんかん様刺激すると、MeCP2のリン酸化が亢進し、ヒストンH4のアセチル化に伴ってNLGN4Xの転写、翻訳が促進されることがわかった。NLGN4Xを翻訳抑制するmiR-23aは、熱ストレス刺激したミクログリアが分泌するexosome中に増加し、TGW細胞株に作用させることでNLGN4Xの発現を抑制することがわかった。また、miR-23aの新規標的因子Topoisomerase 1(TOP1)が転写レベルでNLGN4Xの発現を調節していることがわかり、miR-23aが直接的、間接的にNLGN4Xの発現を制御していることが明らかとなった。NLGN4Xの逆鎖に存在する約4kbのlncRNAを同定した。このlncRNAの発現は、TOP1阻害薬によりAngelman syndrome原因遺伝子UBE3Aと同様に増加した。UBE3Aの逆鎖lncRNAであるUBE3A-ATSはUBE3Aの転写を抑制することが知られている。そこでNLGN4XのlncRNAをノックダウンしたところ、NLGN4Xの発現が増加し、逆に強制発現すると発現が抑制された。現在、このlncRNAを介したNLGN4Xの発現制御メカニズムについて解析中である。本年度は、浸透圧ストレス存在下におけるNLGN4Xの発現調節メカニズムの解析、ならびにヒトiPS細胞の神経細胞への分化誘導におけるNLGN4Xのメチル化を介した発現調節について解析した。高浸透圧ストレスは、NLGN4Xを発現する視床下部室傍核、視索上核に存在するAVP/OXT神経でのAVP/OXT分泌を促進する。そこでNLGN4Xの浸透圧感受性を調べたところ、負荷14時間よりmRNA量が増加し、24時間以降タンパク量が増加した。この増加はAVP/OXTに比べかなり遅い変化であった。一方、NLGN4Xの発現上昇はmTORシグナルの阻害剤PP242により抑制されたことから、高浸透圧ストレスがmTORシグナルを介してNLGN4Xの転写翻訳促進に働いていることが考えられた。NLGN4XとAVPの関係を確かめるため、siRNAによりNLGN4Xをノックダウンすると、AVPの分泌上昇が観察された。また、NLGN4Xの免疫沈降により、リソゾームタンパク質の結合が観察された。このことから、NLGN4XはAVP分泌顆粒のターンオーバーに働いている可能性が考えられた。繊維芽細胞、201B7 iPS細胞、胚様体、神経幹細胞の各段階でNLGN4Xのエキソン特異的な発現に関与するプロモーター領域のCpGメチル化についてMSP-qPCRにより解析したところ、エキソン1Aでは発現上昇に伴ったメチル化の有意な減少、エキソン1Cでは完全なメチル化の消失が観察され、プロモーター領域のメチル化の消長と発現変化の関係が示された。論文作成とそれに伴った補足実験に労力を要したため、やや遅れている。本研究は、ヒト自閉症高感受性遺伝子NLGN4Xについて、自閉症での遺伝子発現の変化、それを引き起こす非遺伝的背景は何なのか明らかにすることを目的としている。まず、ストレスを介したMeCP2のリン酸化、miR-23a、lncRNAによる発現制御機構について解析を行った。細胞にカイニン酸刺激すると、MeCP2のリン酸化が亢進しヒストンH4のアセチル化に伴って転写翻訳が促進された。NLGN4Xを翻訳抑制するmiR-23aは、熱ストレス刺激したミクログリアが分泌するexosome中に増加し、細胞に作用させるとNLGN4Xの発現を抑制した。また、miR-23aの標的因子Topoisomerase 1(TOP1)が転写レベルでNLGN4Xの発現を調節した。次にNLGN4Xの逆鎖lncRNAを同定した。この発現はTOP1阻害薬により増加した。ノックダウンするとNLGN4Xの発現が増加し、逆に強制発現すると抑制された。浸透圧ストレスによる発現調節ならびにiPS細胞の神経細胞への分化誘導におけるメチル化を介した発現調節について解析した。

高浸透圧ストレスは負荷14時間よりNLGN4X mRNA量を増加し、24時間以降タンパク量を増加した。この増加はAVPに比べかなり遅くmTORシグナルにより調節されていた。次にNLGN4XをノックダウンするとAVPが分泌上昇し、NLGN4Xの免疫沈降によりリソゾームや膜小胞タンパク質の結合が観察されたことから、NLGN4XはAVP分泌顆粒のターンオーバーに働いている可能性が考えられた。iPS細胞の分化誘導過程でプロモーター領域のCpGメチル化をMSP-qPCRにより解析したところ、エキソン1Aでは発現上昇に伴ったメチル化の有意な減少、エキソン1Cでは完全なメチル化の消失が観察され、プロモーター領域のメチル化の消長と発現変化の関係が示された。本研究はヒト自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減が自閉症発症の原因なのか結果なのか、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景は何なのか明らかにすることを目的としている。そこでNLGN4Xの発現制御機構について詳細に解析したところ、NLGN4Xの発現がプロモーターのCpGメチル化を介してMeCP2により調節されていること、ストレス依存的なmiR-23aによって翻訳抑制されていること、AS-NLGN4Xによって相補的に発現制御されていることが明らかとなり、エピジェネティックな発現制御を受けていることが示唆された。ヒト検体(脳など)のゲノムメチル化の解析に労力を要したため、論文作成が遅れている。28年度はNLGN4Xの発現変化によって影響を受ける分子の探索及び解析とlncRNAによる発現制御メカニズムの解析を中心に行う。具体的には、NLGN4Xの発現変化が、どのようなしくみでAVP (またはOXT)の分泌に影響を及ぼしているのか、crinophagyなのかnascent granule degradationなのか、NLGN4Xに結合するリソソームタンパク質LAMP-2がどう関連しているのか、分泌顆粒構成分子であるAP4M1やCAPS2との結合を介して直接分泌を調節しているのかどうか調べる。次にlncRNAが直接、あるいは間接的に結合しているタンパク質、ゲノム配列をRNA-IP法により同定し、NLGN4Xとの相互発現調節機構について解析する。また、自閉症患者由来iPS細胞を用いて、NLGN4Xの発現や機能の変化と表現型(メチル化、神経突起の伸長、成熟、シナプス形成、神経伝達物質の分泌など)の相関について調べる。分子生物学27年度はNLGN4Xの転写後発現制御に関わる分子の解析とlncRNAによる発現制御メカニズムの解析を中心に行う。具体的には、スプライシングバリアント選択的なRNAの分解や保護に関わるRNA結合タンパク質、IRESに依存した翻訳制御に関わる因子、lncRNAに結合して発現制御に関わる因子について、PAR-CLIP法などを用いて同定し、siRNAによるノックダウンや変異体などの強制発現による機能解析を行う。また、これらの因子が病態に関連する外的要因
リチウム二次電池正極活物質としてのリチウム含有マンガン酸化物に関する研究

リチウム二次電池の正極活物質に資源的に豊富なスピネルLi_xMn_2O_4を用いるための研究を行った。0.1<x<1の範囲で、立方晶スピネル構造が維持され、リチウム負極と組合せ、約4V(vs.Li/Li^+)で充放電を進めることができたが、充電により、x<0.5の状態までリチウムを脱離させると、第2の立方晶が生成し、容量が徐々に低下した。そこで、Mnの一部をCo、Niで置換した。0.2モル%程度まで置換でき、Coは3価、Niは2価で3.54.5V(vs Li/Li^+)の範囲での充放電では、格子中の3価のMnが4価にまで酸化されず、第2の立方晶の生成が抑制され、充放電のサイクル寿命が向上した。しかし、電位が4.5V程度以上になると、格子中のCo、Niが4価に酸化され、結晶構造が変化し、サイクル寿命が低下した。そこで、Mnの一部をMnよりもイオン半径の小さい典型元素であるLi、Mg、Alで置換した。Liは0.1モル%、Mg、Alは0.2モル%程度まで置換でき、充放電時Liは1価、Mgは2価、Alは3価で安定に存在し、充放電を安定に繰り返すことができた。これはMnと0の距離が近づき、結合が強化され、充電時に3価のMnが完全に4価にまで酸化されず、Liが完全に結晶格子から離脱しないので、充放電時の結晶格子の大きさの変化が少なくなり、第2の立方晶の生成が抑制されたためである。しかし、置換により、その置換量に応じて容量が低下した。置換元素が1価、2価、3価の順に容量低下の割合は小さくなった。これらの兼ね合いからAlの置換が好ましく、LiMn_<1.9>Al_<0.1>O_4を用いた場合4V、0.11Ahg^<-1>の容量が得られ、安定に充放電を進めることができた。現在、リチウム電池の正極活物質には、LiCoO_2、LiNi_xCo_<1-x>O_2が用いられているが、その原料となるコバルトは、地球での埋蔵量が少なく、マンガンなどの化合物に変えることが望まれる。そこで、リチウムと組み合わせ、約4V程度の起動を示す正極活物質としてのスピネル型LiMn_2O_4を実用化するための研究を行った。硝酸リチウムと二酸化マンガンの混合物の熱処理により合成したLi_xMn_2O_4は、xの値がx>1となると、ヤンテラー効果により、立方晶から正方晶に変化し、電位もリチウム負極と組み合わせ、約3Vに低下するので、0.1<x<1の範囲での使用に限られ、容量密度は0.13Ahg^<-1>と小さくなった。一方、xの値がx<0.5となると、結晶の崩壊を伴いながら、別の立方晶が生成し、0.1<x<1の範囲で充放電を繰り返すと、容量が徐々に低下した。xの値が0.5<x<1の範囲で充放電を繰り返した場合のみ容量の変化は認められなかったが、容量密度は.0.07Ahg^<-1>と非常に小さくなった。

そこで、LixMn_2O_4のxの値がx<0.5の範囲で、結晶が崩壊しないように、結晶のMnの位置を他の原子、Co、Niで置き換えたLi_xMn_<2-y>CoyO_4、LixMn_<2-y>Ni,O_4を合成し、X線回折により、充放電の繰り返しによる活物質の構造変化を調べると同時に、リチウムと組み合わせた電池を組み立て、充放電を繰り返した時の電位変化を測定した。Coを添加したときは、y=0.3程度まで、Niを添加したときは、y=0.2程度まで、結晶格子を変えずにそれら原子をMn位置に置換できた。活物質の容量は、Co、Niの添加により減少したが、y=0.2の場合、0.3<x<1の範囲で充放電を繰り返しても容量の変化は殆ど認められず、活物質の崩壊は認められなかった。次に、Mn位置の一部をリチウムで置換したLi_<4/3>Mn_<5/3>.O_4を合成した。Mnがすべそ+4価のスピネル超格子構造の化合物で、リチウムと組み合わせ、3Vの起電力しか示さなかったが、平坦な充放電曲線を示し、容量密度0.20Ahg^<-1>と非常に大きい値を示した。しかし、充放電の繰り返しにより、容量が徐々に低下した。超格子構造の崩壊が容量低下の原因であることを明らかにし、それを防ぐにはwn位置をTiで置換するのが効果的であった。リチウム二次電池の正極活物質に資源的に豊富なマンガン化合物、例えば、スピネル型Li_2Mn_2O_4(Mn^<3+>とMn^<4+>の等モル物質)を適用した場合、充電時に結晶格子中からMn^<2+>が溶解し、充放電のサイクル寿命が短く、その実用化は難しい。結晶格子のMn位置の一部をCo^<3+>、Ni^<2+>あるいはLi^+で置換すると、Mn^<3+>の一部がMn^<4+>に酸化されるので、初期容量は置換イオンの価数の減少とその量の増加に依存して減少するが、充放電サイクルに伴う構造変化の安定化に大きく貢献し、充放電サイクル寿命を向上させることが分かった。例えば、Mnの一部をCoで置換したLiMn_<1.9>Co_<0.1>O_4を用いた場合、リチウム基準で、4V付近での初期容量は85%程度となるが、充放電を150サイクル繰り返した後もその容量は維持された。一方、置換しないLiMn_2O_4を用いた場合は150サイクル後にはその容量は45%に減少した。Li_xMn_2O_4を充電するとLi^+が脱離し、xの値が小さくなり、立方晶スピネルの格子定数が減少し、x=0.5で新しい立方晶スピネルが生成する。この新しい結晶の生成と活物質の崩壊とが関係する。一方、Coなどで置換すると、Li^+の脱離に伴う第2の立方晶の生成が抑制され、充放電のサイクル寿命が向上することが分かった。Co置換では、Co^<3+>【double arrow】Co^<4+>、Ni置換では、Ni^<2+>【double arrow】Ni^<4+>の充放電反応がリチウム基準で4.74.9Vで進み、4.8V級のリチウム二次電池の正極活物質への適用も可能であった。Li_<4/31>Mn_<5/3>O_4は超格子構造をとり、MnがすべてMn^<4+>となり、リチウムと組合せ3Vの起電力しか得られないが、大きい容量密度が期待できる。しかし、充放電の繰り返しにより結晶が崩壊し、容量が徐々に低下した。Mn位置をNiで置換すると、充放電サイクルの安定性は向上したが、まだ十分な成果を得るまでには到っていない。平成10年度、リチウム二次電池の正極活物質に資源的に豊富なスピネルLi_xMn_2O_4を用いるための研究を行った。0.1<x<1の範囲で約4V(vs.Li/Li^+)で充放電を進めることができるが、充電により、x<0.5の状態までリチウムを脱離させると、第2の立方晶が生成し、容量が徐々に低下した。平成11年度はMnの一部をCo、Niで置換した。3.54.5V(vs.Li/Li^+)の範囲での充放電では、第2の立方晶の生成が抑制され、充放電のサイクル寿命が向上した。しかし、電位が4.5V程度以上になると、格子中のCo、Niが4価に酸化され、結晶構造が変化し、サイクル寿命が低下した。
質的研究手法を用いた統合失調症初発症例における治療へのアドヒアランスに関する研究

統合失調症治療において、ノン・アドヒアランスは再発率を高める一因である。本研究は、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索するため、質的研究手法を用いてアドヒアランスの実態を明らかにし、概念構築することを目的とした。その結果、アドヒアランスの実態は1)アドヒアランス良好型、2)中間型、不良型、の3型があり、それには1)患者因子、2)薬剤因子、3)患者-医師関係、4)家族、5)デイケア、6)友人、7)将来への展望が関わっていた。さらに、家族との関係が密な反面、友人関係の構築が進まない状況が明らかになり、デイケア等を基盤として社会的ネットワークを拡充し、家族負担を減らすことが課題と思われた。平成25年度、5月に東京慈恵会医科大学倫理委員会に本研究の許可申請をおこない、7月付で研究遂行の許可を得た。以降、研究の参加者を募集し、当大学の関連病院である復光会総武病院にて5名の研究参加希望者が得られた。各々の参加希望者には、研究の背景、目的、方法、に加え、研究に参加する利益と不利益、データの取り扱い、プライバシー保護に関する配慮を説明した。さらには研究の参加の有無にかかわらず、治療において不利益を被らず、いつでも研究の参加を取り消せる旨を口頭および文書で十分に説明を行い、同意書にて同意を得た。各研究参加者に対しては、平成26年3月から4月にかけて、主観的・客観的アドヒアランス、精神症状、および患者背景等の調査を行ってデータを収集し、続いて被験者にアドヒアランスに関する15分程度のインタビューをおこなった。同意者5名によるフォーカスグループディスカッションは4月24日に行う予定である。今後はさらなるフォーカスグループディスカッションを行うべく、募集を継続していく。統合失調症では、初期治療で多くのものが寛解する一方で、再発率が高くリカバリーやQuality of Lifeが障害される。この一因として、治療への良好なアドヒアランスが得にくいことが挙げられる。本研究の目的は、数人の統合失調症者でおこなわれたアドヒアランスについてのフォーカスグループディスカッションをおこない、質的研究技法であるグランデッドセオリー法にて分析し、統合失調症者のアドヒアランスの実態と患者心性を明らかにし、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索していくことである。現在まで、H26年4月24日に5人のメンバー、10月8日に3人のメンバーでフォーカスグループディスカッションを行い、各々のディスカッションにつき2名の研究者で分析した。その結果、治療に対する態度として、Non- adherent、アンビバレント、Adherentという3様式があったことと、各々の治療に対する態度に対し、1)患者、2)服薬、3)患者ー医師関係、4)家族、5)デイケア、6)友人、7)将来への展望という因子が関与していたことがわかった。この結果は、第10回日本統合失調症学会にて発表した。統合失調症の再発率が高い一因として、アドヒアランスが十分でないことが挙げられる。本研究は、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索するため、質的研究手法を用いてアドヒアランスの実態を明らかにし、概念モデル化することを目的とした。文書で同意取得後、アドヒアランスに関する議論指針に沿い、H26年4月24日および10月8日にフォーカスグループディスカッション(Focus Group Discussion; FGD)をおこなった。録音データを文書化した後、グラウンデッドセオリー法を用い分析した。結果は以下のようであった。1.アドヒアランスの状態は1)アドヒアランス良好型、2)中間型、不良型、の3型があった。その関連因子は1)患者因子、2)薬剤因子、3)患者-医師関係、4)家族、5)デイケア、6)友人、7)将来への展望であった。2.アドヒアランスのあり方は、病識、症状、生活状況の状態、治療環境により異なっていた。3.服薬に関しては、「副作用を減らしたい気持ち」と「症状悪化の恐怖」との間で揺れていた。4.家族関係や患者ー医師関係の状態でアドヒアランスは大きく変化した。5.友人との関係は希薄で、交流を躊躇し社会的ネットワークの拡大が進まないようであった。6.デイケアは、生活リズム形成、自宅以外の居場所、症状体験の共有など多くの役割を担っていた。2つのFGDメンバーでは、家族との関係が密な反面、友人関係の構築が進まない状況が明らかになった。以上より、デイケア等を基盤として社会的ネットワークを拡充し、家族のケア負担を減らすことが課題と思われた。この結果は、平成27年6月に開催された第111回日本精神神経学会総会において発表し、優秀発表賞(ポスター部門)を受賞した。その後も、平成27年6月10日および12月18日にFGDをおこない、解析を行っている。予定では理論的飽和に至るまで、6つのFGDを予定しているが、現在までのところ4つ終了しており、研究の進行がやや遅れている。理由としては、結果の質的分析に時間がかかっていること、同意が得られるメンバーを得るのに時間がかかっていることである。[目的]統合失調症の再発率が高い一因として、アドヒアランスが十分でないことが挙げられる。本研究は、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索するため、質的研究手法(GT法)を用いて統合失調症者のアドヒアランスの実態を明らかにし、概念モデル化することを目的とした。[対象と方法]

アドヒアランスに関する議論指針に沿い、数人のグループでFGDをおこなった。録音データを文書化した後、GT法を用い分析した。[結果]現在まで5回計26名)のFGDをおこなった。その結果は以下のようである。1アドヒアランスの状態は1)アドヒアランス良好型、2)中間型、不良型、の3型があった。2その関連因子は1)患者因子、2)薬剤因子、3)患者-医師関係、4)家族、5)デイケア、6)友人、7)将来への展望であった。3アドヒアランスのあり方は、病識、症状、生活状況の状態、治療環境により異なっていた。4服薬では、「副作用を減らしたい気持ち」と「症状悪化の恐怖」との間で揺れていた。5家族関係や患者ー医師関係の状態でアドヒアランスは大きく変化した。。6友人との関係は発症とともに希薄になり、改善後も社会的ネットワークが拡大しなかった。一方デイケアは、生活リズム形成、自宅以外の居場所、症状体験の共有など多くの役割を担っていた。またこの安心できる環境で、ノーマライゼーションがなされ、自信の回復と社会性の向上がなされていた。7疾患を受容し、人生の目標を持つことが良好なアドヒアランスを促進していた。[考察]統合失調症者のアドヒアランスには、患者自身ばかりでなく、服薬、家族、患者ー医師関係、デイケア、友人関係、将来への展望が関与していたこと、また、初期には家族や医療関係者との関係が密で、社会的ネットワークが拡大しないこと、一方デイケアがノーマライゼーションや社会性の向上に重要な役割を果たしていることがわかった。統合失調症治療において、ノン・アドヒアランスは再発率を高める一因である。本研究は、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索するため、質的研究手法を用いてアドヒアランスの実態を明らかにし、概念構築することを目的とした。その結果、アドヒアランスの実態は1)アドヒアランス良好型、2)中間型、不良型、の3型があり、それには1)患者因子、2)薬剤因子、3)患者-医師関係、4)家族、5)デイケア、6)友人、7)将来への展望が関わっていた。さらに、家族との関係が密な反面、友人関係の構築が進まない状況が明らかになり、デイケア等を基盤として社会的ネットワークを拡充し、家族負担を減らすことが課題と思われた。H26年4月24日に5人のメンバー、10月8日に3人のメンバーでフォーカスグループディスカッションを行った。今後4回のフォーカスグループディスカッションを目標としているが、同意がえられるメンバーを得るのに時間がかかっており、まだ実施できていない。理論的飽和に達すると思われる6回のFGDまで、今後少なくとも2回のFGDをおこない、統合失調症者のアドヒアランスの実態と患者心性について最終的なテーマを見出し、統合失調症治療に有用な知見を探っていきたい。医歯薬学今後、4回のフォーカスグループディスカッションを行い、統合失調症者のアドヒアランスの実態と患者心性のテーマをみいだし、統合失調症の再発予防への新たな介入方法を探索していく。フォーカスグループディスカッション1件を平成25年度中におこなう予定であったが、実際には平成26年4月に行うことになった。今後は、ペースを早めて研究参加者を募集していく。
リン酸化を介してHMGB1の分泌を制御する因子の探索と制御機構の解明

High mobility group box 1 (HMGB1)には2つの核移行シグナル(NLS1およびNLS2)が存在し、その中のセリン残基のリン酸化はHMGB1の核から細胞質への移行と分泌に関わると考えられている。本研究で、これらセリンの脱リン酸化を行うホスファターゼとしてPP2Aに着目した検討を行ったところ、PP2AはNLS1中の複数のリン酸化セリンの脱リン酸化に関わることが示唆された。次に、NLS1内部のリン酸化を行うキナーゼを探索したところ、プロテインキナーゼC(PKC)がHMGB1の核から細胞質への移行に関わるSer46をリン酸化することが示唆された。PP2Aの阻害剤であるendothallによってマウスのマクロファージ細胞株であるRAW264.7を処理すると、HMGB1が細胞外へ漏出するという現象がこれまでに認められていた。平成25年度は「PP2AによるHMGB1の分泌抑制メカニズムの詳細の解明」を目指し、主にHMGB1の細胞内局在とPP2Aの酵素活性との関連に関する研究を行った。当初の計画通り、GFPを融合したHMGB1の変異体を多種調整し、細胞内局在を調べた。HMGB1の細胞質への移動は、蛍光顕微鏡による上記GFP融合HMGB1の細胞内局在の観察にて評価した。その結果、HMGB1のNLS1およびNLS2は独立した核移行シグナルとして機能し、NLS1ではSer46のリン酸化がNLS1の核から細胞質への移動に関与することを示唆する結果を得た。次にproximity ligation assayを用いて、RAW264.7内にて、内在性ののHMGB1とPP2Aがどの場所で相互作用しているかを調べた。その結果、両者は主に細胞質中で相互作用を示すことを確認した。PP2Aの阻害タンパク質の発現はHMGB1の分泌を引き起こすことが考えられたため、PP2Aの阻害タンパク質として知られるCIP2AをGFP融合HMGB1とともに発現させ、CIP2AによるPP2Aの阻害がHMGB1の細胞質への移行に与える影響を評価した。その結果HMGB1の核から細胞質への移行にPP2Aがタンパク質レベルで関わっていることを示唆する結果が得られた。これまでに、HMGB1は配列中に2つの核移行シグナル配列(NLS1およびNLS2)を有することが明らかとなっており、この核移行シグナル中のセリン残基のリン酸化は、HMGB1の核から細胞質への移行、及びその後の分泌に関与するという結果が得られている。前年度までにプロテインホスファターゼ2A(PP2A)がこの脱リン酸化に関与し、細胞質へのHMGB1の移行を抑制していることを報告した。また、変異体を用いた実験から、PP2Aにより脱リン酸化をうけるセリン残基を特定した。平成26年度は、核から細胞質への移行に重要と考えられたこれらの核移行シグナル中のセリン残基のリン酸化を行うキナーゼの探索を行った。多くのキナーゼには、リン酸化を行うために必要な配列モチーフが知られており、配列情報からリン酸化を行うキナーゼの推定が可能である。そこでPhosphomotif FinderというWeb上のキナーゼ推定プログラムを用いて、上記のセリン残基のリン酸化を行うキナーゼを探索したところ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3 (GSK-3)、カゼインキナーゼ2 (CK2)、プロテインキナーゼC (PKC)の3種類のキナーゼがその候補として推定された。そのうち、PKCはNLS1中のSer46と、NLS2中のSer181をリン酸化することが明らかとなった。GFPを融合したHMGB1の変異体の細胞内局在を解析したところ、Ser46のリン酸化はNLS1の核外への輸送に関わる結果が示唆された。本研究の研究対象である核内在性炎症メディエータであるHMGB1は、核移行シグナル(NLS)のリン酸化によりマクロファージなどの自然免疫細胞からの分泌が調節されると考えられている。これまでにこのリン酸化にはGSK-3が関与すると考えていたが、実際にはGSK-3以外のキナーゼによるリン酸化が分泌に関わることが示唆される結果が得られた。最終年度である平成27年度は、HMGB1と相互作用を示すキナーゼまたはホスファターゼを探索し、リン酸化を介してHMGB1の分泌に直接関与する因子の解明を目指した。まず、LPS刺激したマクロファージ細胞株RAW264.7ライセート中、HMGB1と直接的に結合するキナーゼあるいはホスファターゼの探索を計画したが、HMGB1と結合するキナーゼ、ホスファターゼの同定には至らなかった。そこで、前年度の検討結果やこれまでの報告を踏まえ、HMGB1の分泌に密接にかかわる可能性が高いプロテインキナーゼC(PKC)の関与について、より詳細な検討を行った。蛍光タンパク質を融合させたHMGB1中のNLS内部の、PKCによるリン酸化を受けると考えられたセリン残基である、Ser46およびSer181をアラニンに置換した変異体を細胞内で発現させたうえで、PKCを活性化させたところ、HMGB1の核から細胞質への移行は優位に抑制された。この結果はPKCがHMGB1の分泌を亢進するという従来の報告を支持した。

本研究で、これらセリンの脱リン酸化を行うホスファターゼとしてPP2Aに着目した検討を行ったところ、PP2AはNLS1中の複数のリン酸化セリンの脱リン酸化に関わることが示唆された。次に、NLS1内部のリン酸化を行うキナーゼを探索したところ、プロテインキナーゼC(PKC)がHMGB1の核から細胞質への移行に関わるSer46をリン酸化することが示唆された。平成26年度には、GSK-3が核移行に関わるキナーゼかどうか、また、PKCはGSK-3のプライミングキナーゼとなるのかという点について検証を行うことを予定していた。本年度の検討で、GSK-3は核移行シグナル中のセリン残基のリン酸化には関与しないということが示唆され、上記の仮説には沿わなかったものの、PKCはNLS1中のセリン残基をリン酸化し、またその個所を正確に特定することに成功した。生化学引き続き、HMGB1のリン酸化に関与する因子の探索とそれらのリン酸化特性の解析ををおこなう。平成25年度に計画していた「PP2AによるHMGB1の分泌抑制メカニズムの詳細の解明」を終了し、平成26年度に計画している「HMGB1の分泌におけるGSK-3の役割の解明」の内容を遂行中であり、現在までに予定していた内容の大部分を完了した。想定していた仮説と異なる研究結果が出たため、実験内容を若干修正したことに加え、本年度は異動により所属機関が変更となったため、移行期間は実験が一時的に中断した。平成26年度の研究計画を完遂し、直ちに平成27年度の研究計画である「HMGB1のリン酸化に直接関与する因子の探索とそれらのリン酸化特性の解析」に移りたい。異動の為の移行期間中に中断した実験に使用する。購入予定であった抗体が、現在メーカーで生産中であり、この抗体の完成時期が未定との連絡を受け、注文は昨年度一旦キャンセルしたため次年度使用額が生じた。キャンセルした抗体が完成次第、当該の次年度使用額をこの購入費用に充当したい。
膵β細胞増殖を促す迷走神経由来因子の探索

膵β細胞は肥満などのインスリン抵抗性状態において代償的に増殖を起こしてインスリン分泌を亢進することによって血糖値の上昇を抑制する。研究代表者は以前、この膵β細胞代償反応の機序として肝臓がインスリン需要の増加を感知して、臓器間神経ネットワークを介して膵β細胞に代償性反応を惹起していることを示した。本研究ではこの神経ネットワークにおいて、膵島に分布する迷走神経末端からどのような因子が分泌されて膵β細胞増殖を引き起こすのかを明らかにすることを目的とした。単離膵島を用いて迷走神経末端からの分泌が報告されている因子について検討を行った結果、いくつかの迷走神経由来因子によって膵β細胞増殖が亢進することが明らかになった。さらにこれらの迷走神経由来因子の刺激により、膵β細胞において、増殖につながる転写因子やその下流にある細胞周期関連遺伝子の発現増加を見出した。その意義を検討するためにこの転写因子の膵β細胞特異的ノックアウトマウスを作成した。このノックアウトマウスにおいては、臓器間神経ネットワークを活性化した際や高脂肪食を負荷して肥満を起こした際の膵β細胞増殖亢進が抑制されることが明らかになった。一方、延髄より起こった迷走神経1次ニューロンは膵臓内の副交感神経節で2次ニューロンに神経を乗り換えて膵島に分布することが知られている。そこで、神経ネットワークが活性化している状態や肥満の状態において、実際にin vivoにおいて我々が明らかにした迷走神経由来因子が迷走神経で増加しているのかを検討するために膵臓内副交感神経節の同定を行った。コリン作動性ニューロンのマーカーであるvesicular acetylcholine transporterを用いてヒト、マウスの膵臓の免疫染色を行うことにより、膵臓内に散在する副交感神経節の同定に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者は肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークが極めて有望な糖尿病治療の標的になるものと考え、膵迷走神経が膵β細胞増殖に及ぼす効果に着目し、これまで報告されている膵迷走神経由来因子の膵β細胞増殖に及ぼす影響について検討を進めた。その結果、膵迷走神経由来因子によって膵β細胞の増殖が亢進するという有望な結果を得た。そこで本研究ではこれら膵迷走神経由来因子が膵β細胞増殖を起こす分子機構をさらに詳細に明らかにすることを目的とした。その結果、迷走神経由来因子の刺激により、マウスやラットの単離膵島において、増殖につながる転写因子やその下流の標的遺伝子産物である細胞周期関連たんぱくの発現が増加していることを見出した。in vivoにおけるそれらの意義を検討するために、この転写因子のfloxマウスを入手し、ラットインスリンプロモーター下にタモキシフェン誘導性Creを発現するマウスと交配することにより、タモキシフェン誘導性に膵β細胞でこの転写因子がノックアウトされたマウスの作成に成功した。このマウスにおいては、本ネットワーク活性化による膵β細胞増殖が阻害されるという有望な結果を得ており、本ネットワークによる膵β細胞増殖にこの転写因子が重要な役割を果たしていることが示唆される。さらに迷走神経由来因子の絞り込みを進め、数種類の迷走神経由来因子を組み合わせたものをマウス、ラットの単離膵島に作用させることにより、膵β細胞において増殖が有意に増加すること、さらに上述の転写因子の活性亢進とその標的遺伝子産物である細胞周期関連たんぱくの発現が亢進することも明らかになった。

本ネットワークによる膵β細胞増殖において重要な役割を担う転写因子について、膵β細胞特異的なノックアウトマウスの作成に成功しそれを用いた解析を開始しており、本ネットワークによる膵β細胞増殖について、分子機構の一部が明らかになりつつあることから、概ね順調に進展しているものと考える。この転写因子のfloxマウスはmix backgroundであるため、現在congenic化を進めてさらに正確な検討を行うことを予定している。さらに膵臓内副交感神経節を単離同定することにより膵β細胞増殖を促す新規迷走神経由来因子を検索することを予定している。
医療保障の観点からみた医療専門職の職業遂行の法的規律に関する日仏比較法研究

フランスにはさまざまな医療専門職があり、その職業遂行は主に公衆衛生法典で規律されているが、特に医師、歯科医師、助産師、薬剤師、看護師、理学療法士、足部治療・歩行訓練士の7つの医療専門職については、同法典で専門職同業団体の組織と強制加入が定められており、その適正な職業遂行の確保について、倫理規程の策定権、会費徴収権、懲戒権等を有する専門職同業団体による職業的自律が期待されている。今日では、保健医療サービスを取り巻く諸条件の変化に伴って、多職種協働によるチーム医療の増加など、医師以外の多様な医療専門職(+福祉専門職)が保健医療サービスの提供過程に関わっており、医師を含む医療専門職相互間での適切な役割分担と連携が課題となっている。このような状況を踏まえ、本研究は、1日仏両国における医師その他の医療専門職の職業遂行形態の実情とそれを支える法制度の分析・検討、及び、2医療保障という視点からの、これらの医療専門職の職業規律のありようを考察し評価することを目的としている。初年度である平成25年度は、上記目的のうちの1を中心に、分析・検討のための基礎資料となる、日本及びフランスの関連文献の収集・調査を積極的に行った(ただし、日程等の都合によりフランスでの現地調査を行うことはできなかった)。医師以外の医療専門職には多様な職種があるが、その中でも特に、医師と同じく専門的職能団体を有し、かつ、医療機関の内外において専門的業務を遂行している看護師(infirmière)と薬剤師(pharmacien)を中心として、その職業遂行の法的規律の枠組に関する基礎資料を広く収集することになった。今後は、収集した文献資料を基に、2の観点からの検討を行っていくことになる。なお、平成25年度には、本研究課題に関連して、医療保障法の領域において、日本の子ども医療費助成制度に関する現状把握と考察を行った論攷と、フランスの医療保険の給付範囲に関する法制度の現状と動向を検討した論攷の2つを公表した。本研究課題は、今日の保健医療サービス提供過程においては、医師のみならず多様な医療専門職が関わっており(多職種協働)、医師その他の医療専門職相互間の適切な役割分担と連携の確立が課題となっていることを踏まえ、日本と同じく、自由開業制を基本としつつ公的医療保険制度を中心とした医療保障制度を有するフランスを比較対象国としたうえで、1日仏両国における各医療専門職の職業遂行形態の実情と、それを支えている法制度の把握とその分析・検討、及び、2医療保障という視点から、各医療専門職の職業遂行に対する法的規律のありようを比較考察し、評価することを主たる目的とするものである。上記の目的を踏まえ、平成26年度も、前年度に引き続き、関連文献の収集・調査、及び、関係者や他の研究者との意見交換等を通じて、日仏両国における医療専門職の職業遂行に関する実態の変化や法的規律の動向等を探り把握する作業を積極的に行った。また、得られた資料等に基づく分析・検討を開始した。なお、平成26年度には、本研究課題に関連して、制度の創設から平成26年の医療介護総合確保推進法による法改正までの介護保険制度改革を概観し検討した論攷や、フランスの公的医療保険における現金給付(傷病手当金及び終末期の看取り手当)の現状に関する論攷などを公表するとともに、本研究課題により得られた知見をも踏まえ、共編著で社会保障法に関する概説書を執筆し公表した。最終年度である平成27年度においては、主に、医師以外の医療専門職に関する法制度として、薬剤師及び薬局制度に関する比較法的検討を行った。このうち、フランスの薬剤制度と薬剤師の役割等に関する研究については、その成果を雑誌論文の形でとりまとめて公表したところである。医薬分業体制が進んでいるフランスでは、薬剤師は独自の公的な組織(強制加入団体としての薬剤師会)と種々の権能を有しており、薬剤政策においても、例えば、後発医薬品(ジェネリック)の使用促進政策において、調剤薬局の薬剤師に後発医薬品の代替調剤権が認められるなど、多くの重要な役割を与えられていることが確認された。研究期間全体を通じて、フランスでは、医師以外の医療従事者もそれぞれの公的な職能団体(専門職同業団体など)と私的な職業団体(医療従事者の組合など)に組織され、さまざまな自律的な権能を認められており、医療保障政策を進めるうえで重要なパートナーとなっていることが改めて確認された。そして、日本とフランスでは、前提となる法制度や実態などに相違はあるものの、量と質がともに確保された医療保障体制であるためには、医療に従事する当事者間に適切な役割分担がなされることが必要であること、そのためには、各医療従事者の役割を整理して法的に位置づけたうえで、相互の連携体制の構築を考えることが求められること、実効性という点では、各医療従事者の自律的な取り組みにも期待すべきこと、などの結論を得た。上述の通り、初年度に引き続き、平成26年度も、関連文献の収集・調査及び関係者や他の研究者等との意見交換等を通じて、日仏両国における医療専門職の職業遂行に関する実態の変化や法的規律の動向等を探る作業を行うことができた。

ただ、平成26年度も、諸般の事情により海外での現地調査はできなかった。社会保障法平成27年度は本研究課題の最終年度に当たるので、引き続き最新の動向の把握に努めるとともに、これまでの調査内容を踏まえて、1日仏両国における医療専門職の職業遂行に関する法的規律の現状と課題を整理するとともに、2医療保障という視点から、日仏両国の法制度の比較検討を行い、研究成果を論文等の形で取りまとめ、いずれかの媒体で公表する予定である。平成25年度は、関連文献の収集・調査及び関係者等へのヒアリングを通して、まずは、医療専門職の種類、各医療専門職の養成課程、各医療専門職の職業団体とその法的性格等を明らかにすることを予定していた。残念ながら日程等の関係でフランスに渡航して現地調査・ヒアリングを行うことはできなかったが、国内において日仏両国の基本文献の収集に努め、分析・検討のための基礎資料をある程度揃えることができた。平成26年度は、これまでに収集した基本文献による知見を踏まえ、国民に適時に適切な水準の保健医療サービスを総合的に保障するという意味での「医療保障」という視点からの分析・検討を進める予定である。また、新たな文献等の収集や関係者へのヒアリング等を通して、引き続き、日仏両国における医療専門職の職業遂行に関する実態の変化や法的規律の動向等の把握に努めたい。これらの作業を踏まえて、研究最終年度である平成27年度には、法的規律の現状と医療保障という視点からの評価について、研究報告書にまとめ、公表したいと考えている。
立体構造情報にもとづく制限酵素FokIのDNA切断反応機構の解明

Type IIS制限酵素は特定のDNA配列を認識し、認識配列とは離れた箇所においてDNAを切断する。しかしながらType IIS制限酵素が、どのようにして認識配列から正しい距離を測って切断箇所を決めているのか、どのような触媒機構でDNAを切断しているのか、まだ不明な点が多い。これまでに報告されてきたFokIの結晶構造は、FokIの触媒中心とDNA上の切断箇所が遠く離れており、活性構造ではないことが明らかとなっている。そこで本研究では、X線構造解析によりFokIと基質DNAとの複合体の結晶から、活性型の構造を解き明かすことを目的とする。1年目においては、第一に、大腸菌においてFokIタンパク質を発現精製する条件を決定した。FokIMメチラーゼを微量に発現させることによりFokIRタンパク質を効率よく発現させることに成功した。次に、結晶化条件について検討を実施した。基質DNAの周辺構造により結晶化が異なることが予想されたことから、複数の基質DNA配列を用いた。数百種類の結晶化条件を検討したところ、特定の基質DNA配列と沈殿剤の組み合わせにおいて、回折像の見られる結晶を得ることに成功した。今後は現在得られている結晶化条件をさらに細かく検討することにより、分解能の高い結晶を獲得し、結晶構造を解析する予定である。当初の計画では1年目に結晶化を行うこととしており、本研究の成果として回折像の見られる結晶を得ることに成功した。当初の計画では2年目以降において、得られた結晶を元にX線構造解析を行うこととしている。計画通り、X線結晶構造解析を実施する。概ね計画通りに進められたところではあるが、タンパク質の精製条件において当初計画していたプロテアーゼ切断を実施しなくとも良好な結晶が得られたため、消耗品を安価にすることができた。翌年度以降は結晶化条件を拡大させ、予算を満額実施する予定である。
中国国民政府の日本政治分析と日中戦争-1928～1937年-

本研究は、中国国民政府が日本政治をどのように分析し、最終的に日中戦争を決意するに至ったのかを、中国駐日公使館を対象として、実証的に検討するものである。本研究の結果、(1)駐日公使らは軍部を含む日本政界の上層部は中国との和平を望んでいるとの情報を本国へ送り続けたこと、(2)その情報に基づき、中国側が日本の外務省と共に平和攻勢に出た結果、かえって日本軍部を硬化させ、和平の可能性を大きく狭めてしまったこと、が主に明らかとなった。本研究は、中国国民政府が1920年代から30年代にかけて日本の政治や外交をどのように分析し、その結果としてなぜ日中戦争を決意するに至ったのかを、日中両国の一次史料を駆使して検討するものである。本研究は、当該期の中国がどの程度正確に日本の政治状況を把握し、対中政策に反映させたかという斬新かつ重要な視角を設定している点で独創的である。というのも、こうした視角は日中戦争の原因を解明する上で必要であるにもかかわらず、日本政治史と中国近代史にまたがる研究領域であるため、これまで双方の研究動向を踏まえた精力的な研究がなされてこなかったのである。そこで、日本政治史を専門とする研究代表者はそうした課題を克服すべく、平成20年度において日中台の基本的な公刊史料を徹底的に収集した上で、平成21年3月1114日に台湾へ渡り国民政府に関する膨大な一次史料(「蒋中正総統文物档案(大渓档案)」など)を所蔵する国史館を中心に史料収集を行い、中国でも特に駐日外交官や軍人の日本政治分析の検討を行った。その結果、(1)彼らが、日本の政治上層部は日中親善を図る穏健派(軍部を含む)であると認識し、その穏健派を通じて日中関係の改善を模索していたこと、(2)陸軍の統制が悪化した1937年初頭には、中国が日本の穏健派に失望し、戦争決意を一層強めたこと、等が明らかとなった。研究代表者はこれらの研究成果をこれまでの研究成果と併せて、平成21年3月末に研究書『日本陸軍と日中戦争への道』にまとめた(平成21年9月刊行予定)。来年度は、北伐から満州事変までの時期にも分析対象を広げ、更に日中戦争後の見通しを踏まえ、学術雑誌や学界などで体系的な研究成果を公開、報告していくことにしたい。そこで研究代表者は平成20年度に引き続き、日中台の基本的な公刊史料を徹底的に収集した上で、とりわけ中国駐日公使館の外交官や駐在武官たちの日本分析に焦点をあてて研究を行った。その成果は、第1に研究書『日本陸軍と日中戦争への道』を2010年1月にミネルヴァ書房から出版したことである。日本政治史研究でありながら、中国側の新史料までをも駆使し、日中戦争に至る過程における日中の相互誤解という側面を明らかにした本書の反響は予想以上に大きかった。出版後は、1、KSS研究会(H22.2/20、東京大学)、2、憲法史研究会(H22.3/6、京都大学)の2つの学会に、コメンテーター(1)や報告者(2)として招かれた。とりわけ、中国史研究者の学会であるKSS研究会において、中国史研究者との討論を行うことができたのは大きな収穫であった。第2に、平成22年3月2125日に台湾へ渡り、駐日公使館に関する膨大な未公刊史料(「外交部档案」など)を収集した結果、国民政府は北伐完了後(1928年)の混乱期にあって、公使館全体が外交手段として十分に機能していなかったことが明らかとなった。そして1931年の満州事変以降も駐在武官同士の内部対立などにより、正確な日本政治分析が本国へ送られていなかったことも明らかとなった。これらの事実は、中国の日本不信を過剰に増大させ、日中全面戦争の一つの遠因となったものとして重要な意義を持っているといえる。
深層水ソースの変換は気候変動を増幅するか抑制するか:硫黄同位体比の海洋事変層序

海洋深層水の急激な変動をとらえ,それに対し如何に気候が反応するか,を理解することが目的であった.手法として硫黄同位体比の利用を目指し,平成20年度末に質量分析装置を導入しその立ち上げを行うと同時に,試料の準備方法および分析手法の確立を行った.硫黄同位体データでは目的の議論ができないことが判り,炭素同位体比を用いた地層の高解像度解析を中心とした議論と理論を中心とした議論に切り替え,白亜紀中期の深層水循環速度の推定までを行なった.またCO2増加に伴う海洋環境変化評価のためのモデルを構築した.海洋深層水の急激な変動をとらえ,それに対し如何に気候が反応するか,を理解することが目的であった.手法として硫黄同位体比の利用を目指し,平成20年度末に質量分析装置を導入しその立ち上げを行うと同時に,試料の準備方法および分析手法の確立を行った.硫黄同位体データでは目的の議論ができないことが判り,炭素同位体比を用いた地層の高解像度解析を中心とした議論と理論を中心とした議論に切り替え,白亜紀中期の深層水循環速度の推定までを行なった.またCO2増加に伴う海洋環境変化評価のためのモデルを構築した.20年度は,研究遂行に必要不可欠な安定同位体比質量分析装置を導入した.申請書に記載の通り,低コスト・高パフォーマンスの研究を目指しているため,国立大学ではあまり例がない中古品(オーバーホール品)の購入を行った.そのため,発注から海外メーカーによるオーバーホールのための移送,設備(オーバーホール条件なども含む)の諸条件などについて納入業者との交渉に時間が必要となり,設置が12月となった.地方大学の予算状況を鑑みて,低コストでの機器導入は,非常に貴重な経験となった.機器は,高価な消耗品の関係上,頻繁に炭素分析と硫黄分析のモードを変更することはできないため,まず炭素分析モードでの調整を行った.標準試料の入手に1ヶ月程度を要したが,1月末までには標準試料の配置,使用ガスの純度,予備分析の導入などを試みた結果,炭素分析で±0.1‰で分析するための試料処理・試料導入方法を確立した.この精度は,同グレードの機種の中では高いレベルである.炭素同位体比分析と同時に行うことのできる窒素同位体比についても±0.3‰以下の精度での分析が可能となった.硫黄の同位体比に関しては,入手が限定されている複数の国際標準試料を入手した.実際の試料の分析はまだ分析していないが,資料調査を行い,Paleocene/Eocene境界の温暖化極大現象を含めた古海洋循環解読に関するレビューを行い,国内研究者啓蒙の意味も含め,日本有機地球学会の機関誌「Researches in Organic Geochemistry」および「月刊地球」に総説を投稿・掲載した.21年度は,代表者の長谷川は主に,前年度に導入した安定同位体比質量分析装置の立ち上げ,調整を行った.申請書に記載の通り,低コストの研究を目指し,中古品(オーバーホール品)を導入したため,実際の運用のためのコンディショニングに時間を要している.機器は,高価な消耗品の関係上,頻繁に炭素分析と硫黄分析のモードを変更することはできないため,前年度末に開始した炭素分析モードでの調整を継続して行い,実際に堆積物の有機炭素の同位体比分析を行った.その結果,炭素分析では常に±0.1‰前後での分析ができ,北海道やニュージーランドなどの白亜紀海洋無酸素事変OAE2に相当する時代の堆積物試料の炭素同位体比変動を明らかにすることができた(公表論文欄).西部太平洋の北半球中緯度に位置する日本と対を成す,南半球高緯度のニュージーランドの堆積物についてOAE2相当層準を特定できたことは,当時の深層水の循環がどのように変化したのかを考察するうえで重要である.また堆積岩中の硫黄の挙動については,手取層群の試料を用いて考察を行い,論文として公表した(公表論文欄).21年度後半には,質量分析装置を硫黄同位体比測定のためのセッティングに変更を行った.22年度は主にODP試料を用いて炭酸塩に包含される硫酸態硫黄(CAS)の同位体比分析を行うが,その準備が整った.分担者の田近は既存のデータを用いて,白亜紀の海洋無酸素事変や古第三紀の暁新世-始新世温暖化極大事件(PETM)の海洋循環に関連したモデリングについて研究を行った.金沢大学予算により,新しい質量分析装置が入り,初年度に購入した同位体質量分析装置を硫黄同位体比測定専用にする条件が揃ったので,長谷川は,分析システムの構築・確立を進めた.また新しい分析ソフトウェアのインストールも行い,硫黄同位体比を連続測定する体制が整った.その手法の構築,手順に関しても,ほぼ確立できた.硫酸態硫黄の同位体比測定を,硫黄同位体比測定専用装置により連続的に(かつ自動で)行うことができ,国内の研究施設は数少なく,古環境分析用として同装置が確立したことは,日本の古環境解析に硫黄同位体比法を導入し,普及させていく上で非常に意義がある,現在,ODP Leg208の試料について,特に新生代全体を通じて分析を進める計画を立て,測定を進めている.炭酸塩の炭素・酸素同位体比分析は,金沢大学予算により導入した質量分析装置により分析を進める予定であるが,装置の調整が終了していない硫黄の含有量を,海洋環境の指標とする手法については,北陸地域に分布するジュラ-白亜系手取層群を用いて手法開発を行い,さらにそれを応用して海水(または汽水)か淡水かを評価することが可能になった.これはHasegawa et al.(2010)として公表した.

この手法は海洋の貧酸素化の評価も行うことができると期待され,海洋事変の評価への応用を見込む.共同研究者の田近は海洋深層循環に関連して極度の無酸素状態ができる条件について,モデル構築の面から研究を進め,Ozaki et al.(2011)などの論文を公表した.
新規のCCR5阻害剤の同定・開発とCCR5を介したHIV感染の分子機構の解明

平成16年度は変異CCR5とAK602の結合親和性(K_D値)等の基礎データを更に蓄積しAK602/GW873140(AK602)のCCR5での結合部位を同定するとともに、これらの変異CCR5を用いてHIV感染やケモカインの結合に重要なCCR5部位について検討した。30余種類の変異CCR5強制発現CHO細胞を作成し、AK602の放射線ラベル(^3H)体とこれらの変異CCR5を用いてK_D値の変化を調べ、G163,K191,E283などAK602の結合がほぼ完全に阻害される部位と結合が中等度阻害される部位等を同定した。これらの部位をmappingしたところ、CCR5のsecond extracellular loopとその直下の上部膜貫通ドメインにAK602の結合に重要と考えられるアミノ酸のクラスターが結合に関連する疎水性ポケットを形成することがわかった。このような結果をもとにAK602および他のCCR5阻害剤のCCR5への結合部位について更に詳細な比較検討を行っている。またAK602単剤での高い抗HIV活性(Maeda&Mitsuya, J Virol.78:8654-8662,2004)とモデルマウスを用いたin vivoでの活性を確認(Nakata&Mitsuya, J Virol.79:2087-96,2005)、他方で一連の抗HIV薬との併用効果の評価を行ったところ、逆転写酵素阻害剤(AZT、NVP)、プロテアーゼ阻害剤.(IDV)、侵入阻害剤(AMD3100、TE14011、TAK779、SCH-C、sCD4)、融合阻害剤(T-20)との併用において、他のCCR5阻害剤との間で弱い相乗効果から相加効果に留まった他はいずれの薬剤とも相乗効果を認め、特にR5-HIVとX4-HIVを1:1に混合した状態でX4阻害剤と併用した場合に最も強い相乗効果を示した。AK602はエイズ患者を対象とした米国での第二相臨床試験(IIa)で著明な抗ウイルス効果が示され(10日間の投与で2logのHIV量の減少)、現在拡大臨床試験(IIb)が進行中である。