hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重症チアノーゼ性心疾患児への肺血管新生療法に関する基礎的研究

重症チアノーゼ性心疾患に見られる肺血流分布異常の発現機構を明らかにするため、マウス胎仔肺を用いて初期形態形成における血管発生過程を共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて時・空間的に明らかにし、VEGFを始めとする各種血管新生因子の発現様式、機能を検証した。さらに胎生6.5日の妊娠マウスにレチノイン酸投与によるHeterotaxyモデルマウスの表現系の解析を行った。これまでに肺血管形成過程は4段階に分けられ、肺上皮細胞からのparacrine形式のVEGFシグナルが血管内皮細胞の増殖、分化を促進することを明らかにした。またマウス胎仔肺組織培養の系でFlk-1/Flt-1のantisense oligonucleotideを用いて血管内皮細胞の機能阻害実験を行ったところFlk-1の機能阻害により血管網の分枝が有意に阻害され、DNA合成能低下およびアポトーシス増加に起因することが明らかになった。一方Flt-1の機能阻害により血管内皮細胞の増生とともに一様な径を有する血管網の形成が阻害され、DNA合成能亢進が関与すると考えられた。同時に血管内皮細胞の分化について検証を行ったところ、Flk-1機能阻害により動脈性血管内皮細胞マーカーであるe phrinB2の発現は低下しFlt-1機能阻害によりe phrinB2発現亢進が認められた。さらに両receptorのクロストークの有無を検証したところ、Flk-1機能阻害によりFlt-1発現は変化しないが、Flt-1機能阻害によりFlk-1発現亢進が認められた。以上よりFlk-1はFlt-1により負に制御されるのに対しFlt-1はFlk-1を介さない独自のメカニズムにより制御されていることが示された。またレチノイン酸投与により約30%の胎仔にHeterotaxia (Right isomerism)が生じるとともに肺毛細血管網と肺胞上皮に構築異常が認められた。心奇形として大血管転位、両大血管右室起始、共通房室弁孔が認められた。現在、表現系をきたすメカニズムについて検証中である。重症チアノーゼ性心疾患に見られる肺血流分布異常の発現機構を明らかにするため、マウス胎仔肺を用いて初期形態形成における血管発生過程を、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて経時的・空間的に明らかとするとともに、VEGFなどの各種血管新生因子の発現様式や機能を検証した。これまで、血管内皮細胞と肺上皮細胞との関係から肺血管形成過程は4過程に分けられ、上皮細胞からのparacrine形式のVEGFシグナルが、血管内皮細胞による血管形成を促進すると明らかとしてきた。今回は、BrdUを用いてDNA合成能を検討したところ、血管内皮細胞のDNA合成はstage I-IIは活発で、stage III以降減少した。またFlk-1/Flt-1のantisense oligonucleotideおよびsiRNAを用いて血管内皮細胞の機能阻害案験を行なったところ、Flk-1の機能阻害により血管網の分枝は有意に阻害され、Flt-1の機能阻害により血管内皮細胞の増生とともに一様な径を有する血管網の形成が阻害された。それぞれの機能阻害効果はreal-time PCRにより定量的に検証された。また血管内皮細胞の増殖動態とアポトーシスの関与を検討したところ、Flk-1機能阻害により血管内皮細胞の増殖阻害、アポトーシスの増加が確認され、Flt-1機能阻害により血管内皮細胞の過増殖が確認された。

一方、マウス胎仔肺の器官培養の系にて、両receptorが互いの発現に及ぼす影響について検討したところ、Flt-1機能阻害によりFlk-1発現が促進され、Flk-1機能阻害によりFlt-1発現は変化しないことが明らかとなった。以上よりFlt-1はFlk-1を介さない独自のメカニズムにより発現が制御されていることが示された。また、同じVEGF receptorであるFlk-1/Flt-1においても、血管内皮細胞の動脈性分化に関わるシグナル伝達機構において異なる働きを有する所見が得られた。重症チアノーゼ性心疾患に見られる肺血流分布異常の発現機構を明らかにするため、マウス胎仔肺を用いて初期形態形成における血管発生過程を共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて時・空間的に明らかにし、VEGFを始めとする各種血管新生因子の発現様式、機能を検証した。さらに胎生6.5日の妊娠マウスにレチノイン酸投与によるHeterotaxyモデルマウスの表現系の解析を行った。これまでに肺血管形成過程は4段階に分けられ、肺上皮細胞からのparacrine形式のVEGFシグナルが血管内皮細胞の増殖、分化を促進することを明らかにした。またマウス胎仔肺組織培養の系でFlk-1/Flt-1のantisense oligonucleotideを用いて血管内皮細胞の機能阻害実験を行ったところFlk-1の機能阻害により血管網の分枝が有意に阻害され、DNA合成能低下およびアポトーシス増加に起因することが明らかになった。一方Flt-1の機能阻害により血管内皮細胞の増生とともに一様な径を有する血管網の形成が阻害され、DNA合成能亢進が関与すると考えられた。同時に血管内皮細胞の分化について検証を行ったところ、Flk-1機能阻害により動脈性血管内皮細胞マーカーであるe phrinB2の発現は低下しFlt-1機能阻害によりe phrinB2発現亢進が認められた。さらに両receptorのクロストークの有無を検証したところ、Flk-1機能阻害によりFlt-1発現は変化しないが、Flt-1機能阻害によりFlk-1発現亢進が認められた。以上よりFlk-1はFlt-1により負に制御されるのに対しFlt-1はFlk-1を介さない独自のメカニズムにより制御されていることが示された。またレチノイン酸投与により約30%の胎仔にHeterotaxia(Right isomerism)が生じるとともに肺毛細血管網と肺胞上皮に構築異常が認められた。心奇形として大血管転位、両大血管右室起始、共通房室弁孔が認められた。現在、表現系をきたすメカニズムについて検証中である。
気管内麻酔中の非観血的循環動態評価法としての気管内心拍動波の研究

本研究は気管内麻酔中,気管内チューブに特殊の圧トランスデューサ,または呼吸気流計を接続して心原性の気管内心拍動波を記録し,これを解析することにより心機能に関する情報を非観血的に得ることを目的とした.1.心エコー法による麻酔中の心機能評価:麻酔中の心機能に関する情報を非観血的把握するため本研究費による超音波診断装置を用いて各種吸入麻酔中に検討を加えた.その結果,一回拍出量,収縮期血圧/左室拡張終期容量係数比,平均円周短縮速度などに比し前駆出時間/左室駆出時間比が最も心筋収縮力の減弱を敏鋭に示し,前駆出時間,駆出率などがこれに次ぎ,心収縮時相(STI)測定の意義が認められた.2.STIの測定と吸入麻酔薬の影響:従来の測定法,心エコー図による方法,及び気管内心拍動波(ITCG)によるSTIを臨床的に比較検討した結果, ITCGによるものが心エコー図によるSTIと高度の相関関係を示した.従ってITCGによるSTIの測定が容易で且つ正確なため,気管内麻酔中の心機能を非観血的に評価する手段として有用なことが認められた.本法により各種吸入麻酔薬の影響を検索したところPEPにインフルレンを除き濃度依存性の延長傾向, LVETはエンフルレンでのみ短縮, PEP/LVETはイソフルレン以外の麻酔薬で増加とそれぞれ心機能を評価出来る成績が得られた.3.心拡張期時相については心エコー法により各パラメータの詳細な分析が可能となったが,麻酔薬による影響を明らかにするまでには至らなかった.4.ITCGの流量変化における心収縮に一致する要素に麻酔薬による濃度依存性の抑制を認めた.以上の成績よりITCGを使って気管内麻酔中の心機能評価が可能であり麻酔中のモニターとしての意義を認めた.本研究は気管内麻酔中,気管内チューブに特殊の圧トランスデューサ,または呼吸気流計を接続して心原性の気管内心拍動波を記録し,これを解析することにより心機能に関する情報を非観血的に得ることを目的とした.1.心エコー法による麻酔中の心機能評価:麻酔中の心機能に関する情報を非観血的把握するため本研究費による超音波診断装置を用いて各種吸入麻酔中に検討を加えた.その結果,一回拍出量,収縮期血圧/左室拡張終期容量係数比,平均円周短縮速度などに比し前駆出時間/左室駆出時間比が最も心筋収縮力の減弱を敏鋭に示し,前駆出時間,駆出率などがこれに次ぎ,心収縮時相(STI)測定の意義が認められた.2.STIの測定と吸入麻酔薬の影響:従来の測定法,心エコー図による方法,及び気管内心拍動波(ITCG)によるSTIを臨床的に比較検討した結果, ITCGによるものが心エコー図によるSTIと高度の相関関係を示した.従ってITCGによるSTIの測定が容易で且つ正確なため,気管内麻酔中の心機能を非観血的に評価する手段として有用なことが認められた.本法により各種吸入麻酔薬の影響を検索したところPEPにインフルレンを除き濃度依存性の延長傾向, LVETはエンフルレンでのみ短縮, PEP/LVETはイソフルレン以外の麻酔薬で増加とそれぞれ心機能を評価出来る成績が得られた.3.心拡張期時相については心エコー法により各パラメータの詳細な分析が可能となったが,麻酔薬による影響を明らかにするまでには至らなかった.4.ITCGの流量変化における心収縮に一致する要素に麻酔薬による濃度依存性の抑制を認めた.以上の成績よりITCGを使って気管内麻酔中の心機能評価が可能であり麻酔中のモニターとしての意義を認めた.気管内麻酔中、気管内チューブを介して心原性拍動に伴って得られる気管内心拍動波より心機能に関する情報を得ることを目的とした本研究は心エコー図と対比することにより検索が加えられた。1気管内心拍動波における圧変化を記録し、心電図との関係から心収縮期時相(STI)の解析を行った。その結果頸動脈圧波、心音図など従来の方法により得られる心収縮時相と心エコー法よりのSTIとの間で前駆出時間(PEP)、および左室駆出時間(LVET)に関し0.85,0.84の有意の相関がみられた。一方、気管内心拍動波と心エコー法とのSTIに関してはPEP,LVETについて0.91,0.96とさらに高い相関が得られた。このことは気管内心拍動波における圧変化波形の場合、弁の開閉運動に伴うと考えられる明瞭な棘波が認められるため時相の測定が容易であることがあげられる。また、心エコー法は大動脈弁の開閉運動をとらえ、これと心電図より得られるSTIは従来の方法に比べ、より正確といわれている。気管内心拍動波のSTIがこれと極めて高度の相関を示すことは、時相に関する情報を正確に提供することを示しており、さらに心エコー法と対比することで拡張期時相解析の可能性が示唆された。2気管内心拍動波における流量変化波形には、心収縮に引き続き生じる吸気方向の流量成分が認められ、この一次微分の最大値(max dF/dt)は、心筋の収縮力の指標として評価されており、心エコー法により求められた平均円周短縮速度(mVcf)との比較においては、相関係数が0.71と良好な相関が得られた。

この様に心エコー法との比較からも示されるように、気管内に生じる心拍動波の解析により、心機能に関する情報をより高精度に抽出することが可能で、気管内麻酔中の心機能モニターとしての実用化につき今後引続き検索を続ける。気管内麻酔中、無呼吸時に気道を介して得られる心原性拍動波を解析することにより心機能を評価することが本研究の目的で、心エコー図と対比することにより各種吸入麻酔薬の影響を検討している。1.気管内チューブに接続した圧トランスデューサーより得られる圧変化から心収縮時相(STI)に相当する部分を測定し、同時に測定した心エコー図よりの心収縮時相と高度の相関が得られることを確認した。STIのパラメーターにつき各種麻酔薬の影響はハロセンの場合、濃度上昇に従い前駆出時間(PEP)に対応する部分が延長した。左室駆出時間(LVET)には明らかな変動が認められなかった。エンフルレンの場合、PEPはハロセンと同様の傾向を示したが、LVETは浅麻酔でも減少し、PEP/LVETは増加傾向を示してより強い心機能の抑制が示唆された。セボフルレンに関しては、浅・深麻酔とも上記パラメーターに有意の変動がみられず、心機能抑制の程度は前二者に比べ軽いものと考えられた。したがって、気管内心拍動波より得られる心収縮時相に関する情報から吸入麻酔中の心機能を評価できることが判った。2.気管内心拍動波に伴う気体の流量変化を呼吸流量計により測定し、心収縮に一致して気道内にみられる陰性波の一次微分量大値と心エコー図より得られる駆出率,収縮分画,平均円周短縮速度と対比した結果、相互の間に有意の相関が認められた。また、エンフルレン麻酔によりそれぞれ有意の減少傾向がみられ、心機能抑制を示す指標となり得ることが示された。3.気管内心拍動波の心拡張期時相に関するパラメーターを心エコー図よりのそれと対比した成績では、相互の間に明らかな相関が得られず、また、麻酔薬の影響についても有意の変動が認められず、今後の検索を必要とする。
有機フッ素系化合物の胎児期曝露による発育・成長への影響―エピゲノムの関与－

環境要因が次世代影響をもたらすメカニズムとして、DNAの化学修飾(エピゲノム)に基づく後天性遺伝子制御システムの関与が注目されている。本研究は、胎児期の環境化学物質曝露がエピゲノム変化の1つであるDNAメチル化変化を引き起こし、生後の発育に影響を及ぼす可能性を実証的に示す。具体的には、1難燃剤などで多用される有機フッ素系化学物質の胎児期曝露に起因する臍帯血DNAのメチル化変化をエピゲノム網羅的解析により特定し、特定したメチル化変化の中で、胎児期の発育・成長に影響を与えるメチル化変化を明らかする。さらに、3出生時から12歳までの体格に与える影響を調べ、メチル化変化の影響が何歳までの発育・成長に及んでいるかを出生前向きコホート研究により明らかにする。エピゲノムを介した胎児期環境による健康影響を引き起こすメカニズムが解明されれば、次世代の健康リスクの軽減や影響を減らすことに大きく貢献できる。今年度は、1曝露に起因するメチル化変化の中で、胎児発育に影響を及ぼすメチル化変化を明らかにするため、エピゲノム網羅的解析により特定した有機フッ素系化合物の胎児期曝露に起因する臍帯血DNAのメチル化変化について、生後の発育・成長につながる出生時アウトカムとして、出生時体格(体重・ポンデラル指数)、および、脂質代謝の指標となるアディポカインの臍帯血中濃度との関連を統計的に解析した。また、2大規模コホートの生後アウトカム追跡として、平成30年度に12歳に達する児の家庭にアンケート調査を実施し、小学校1年から6年までの学校健康診断記録から2,267名の学童期体格(体重と身長)データを得た。エピゲノム網羅的解析により明らかになった有機フッ素系化合物の胎児期曝露に起因する臍帯血DNAのメチル化変化と出生時体格、および、臍帯血中アディポカインレベルとの関連解析は順調に進んでいる。さらに、小学校1年から6年までの学校健康診断記録から、予想していた1043名を上回る2,267名の学童期体格(体重・身長)データを得ることが出来、おおむね順調に進展していると考える。1出生時アウトカムへの影響が明らかとなったメチル化変化について、曝露とアウトカムとの関連への介在の大きさをMediation Analysis(Int J Epidmiol 2016)により検討する。2結果の妥当性をパイロシークエンサーまたは次世代シークエンサーによるメチル化解析により検証する。312歳までの体格情報が得られた対象者の臍帯血DNAの抽出を行う。曝露と出生時アウトカムへの関連が認められたメチル変化部位についてパイロシークエンサーによりメチル化解析を行う。得られたメチル化率と出生から12歳までの各年齢で得られた児の体格との関連を解析し、何歳までの生後発育・成長に臍帯血DNAメチル化変化が影響を及ぼしているかを明らかにする。

得られたメチル化率と出生から12歳までの各年齢で得られた児の体格との関連を解析し、何歳までの生後発育・成長に臍帯血DNAメチル化変化が影響を及ぼしているかを明らかにする。(理由)有機フッ素化合物とDNAメチル化および出生時アウトカムとの関連は、すでに取得したデータを用いて解析を行い、費用が最低限に抑えられた。また、予定したパイロシークエンサーのアップグレードは、別の研究費により行うことができ、今年度の使用がなくなったため、次年度使用額が生じた。(使用計画)新たな曝露測定およびメチル化率の測定に必要な実験用試薬品費用、および、バイオインフォマティクス解析費用として使用する。
気液2相流体の電気流体力学現象の定量解析

本研究は、電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に、その流速ベクトル分布を定量化するために粒子画像流速測定法の適用技術を応用して、気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に、その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを目的として実施した。今後の進展が期待されているMulti Phase流体に対する電気流体力学現象の解析と理解において、本研究では以下に示す主な研究成果を得た。1.気液2相流体流場における粒子画像流速測定法の適用:本研究では分子の燐光を時間的かつ空間的に微小な時間で追跡するMolecular Tagging Velocimetryを適用した。この計測手段にはBiacetyl分子の燐光現象を用いて、10nsの時間分解能を可能とした可視化画像撮影装置を構築した。その結果、気液2相流体における電気流体力学流場の気相現象について流速計測を可能にした共に本現象の定量化と解析を実施した。2.気液2相流体流場における誘電特性と電気伝導特性の解析:気相および液相におけ誘電性効力および電気伝導性効力と、電気流体力学的誘因による流れ場の関係について流速測定値を含む実験結果に基づいた解析を実施した。その結果、本現象の物理的ファクターを定量化した。3.本現象を応用したAir Wave Type Electrohydrodynamical Pumpの開発:本研究では気液界面を含む気液2相流体の電気流体力学効果を応用して液体を汲み上げるAir Wave Type Electrohydrodynamical Pumpについて、そのポンピング性能に対する気液2相流体の電気流体力学効果の定量的な解析と実証試験を実施し、定量解析を具体化して性能評価を行った。その結果、ポンピング性能に及ぼす電気流体力学的効果を定量化した。本研究は,電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に,その流速ベクトル分布を定量化するために粒子画像流速測定法(Particle Image Velocimetry : PIV)の適用技術を応用して,気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に,その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを研究の目的として実施した。本年度は,まず本現象の流れ場計測に適用するために分子の燐光を時間的かつ空間的に追跡するPIVシステムのプログラムコード構築を完了し,次に実際に気液2相流体の電気流体力学現象の定量的な計測を行うことができた。以下に本年度の研究実施内容と成果について記述する。1.気相電気流体力学現象における粒子画像流速測定法の適用本現象における気相電気流体力学流場(Ionic Wind)の流れの計測には,トレーサ粒子の帯電を防ぐことと、電気力の集中により極端に流速値が高く局所的に速度が数m/secになる領域にも適用できることが要求される。そこで、これらの要求に適う粒子画像流速測定法として、本研究では気相中分子の燐光を時間的かつ空間的に微小な時間で追跡するMolecular Tagging Velocimetryを構築して適用した。具体的には、燐光像の時間的な対応付けに、既に開発を完了している遺伝的アルゴリズムによるトレーサ粒子の時空間対応付け最適化処理法を適用した。2.液相電気流体力学現象における粒子画像流速測定法の適用本現象における液相電気流体力学流場の流れの計測には,誘電液体(作動流体)の電気的・機械的性質を変えることなくトレーサ粒子の帯電を防ぐこととが要求される。そこで、これらの要求に適う粒子画像流速測定法として、本研究では可視化用トレーサとしてβ-quinophtalaneを原料とする蛍光染料を用いて流速計測を具体化した。

本研究は,電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に,その流速ベクトル分布を定量化するために粒子画像流速測定法(Particle Image Velocimetry : PIV)の適用技術を応用して,気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に,その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを研究の目的として実施した。本年度は、電気流体力学現象が流体内部の誘電的特性と放電による電気伝導特性の単独作用あるいは複合作用が支配的な要素であるために、まず気相および液相における誘電的特性および電気伝導特性を測定した。次に気相および液相におけ誘電性効力および電気伝導性効力と,電気流体力学的誘因による流れ場の関係について流速測定値を含む実験結果に基づいた解析を行った。以下に本年度の研究実施内容と成果について記述する。1.気相および液相における誘電的特性および電気伝導特性本現象は気相微弱放電がきっかけとなっていることから,これに伴う各相流体内部のマクスウェル応力の変化を定量的に算出すると同時に,電気伝導に伴う荷電粒子に働く電気力を算出した。前者の誘電体に働く応力については,誘電特性測定装置を使用して誘電性効力を解析した。後者の電気力に関しては,荷電粒子の移動速度が高速であるために時間分解能の高い同期信号装置を用いて荷電粒子の電荷量と移動速度を定量化し,その電気伝導特性から電気伝導性効力を解析することができた。2.液相電気流体力学現象における粒子画像流速測定法の適用本研究は,電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に,その流速ベクトル分布を定量化するために粒子画像流速測定法の適用技術を応用して,気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に,その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを目的として実施した。今後の進展が期待されているMulti Phase流体に対する電気流体力学現象の解析と理解において、本研究では本年度に以下の研究成果を得た。1.気液2相流体流場における粒子画像流速測定法の適用本研究では分子の燐光を時間的かつ空間的に微小な時間で追跡するMolecular Tagging Velocimetryを適用した。この計測手段にはYAGレーザーの高調波(266nm)で燐光波長(525nm)付近の可視光を放出するBiacetyl分子をトレーサに使用し、10nsの時間分解能を可能とした可視化画像撮影装置を構築した。その結果、気液2相流体における電気流体力学流場の気相現象について流速計測を可能にした共に本現象の定量化と解析を実施した。本研究では気液界面を含む気液2相流体の電気流体力学効果を応用して液体を汲み上げるAir Wave Type Electrohydrodynamical Pumpについて、そのポンピング性能に対する気液2相流体の電気流体力学効果の定量的な解析と実証試験を実施し、定量解析を具体化して性能評価を行った。その結果、ポンピング性能に及ぼす電気流体力学的効果は、第1に気相のコロナ放電によるGas-Phase EHD Flowの発生と、第2にLiquid-Phase EHD Flowの誘導によるものであることを明らかにし、液体を重力に逆らって液体溜めから外部へ汲出す電気流体力学効果の無次元化パラメータを定量化した。
細胞増殖抑制因子の精製

細胞の生理活性を調節する因子を検索し、豚脊髄の塩粗抽出液から細胞増殖の抑制効果を示す分画をみつけた。この画分をMDCK細胞(Maden Darby canine kidney cell line)の培養液に加えると細胞が偽足をちぢめて丸い形態となり、増殖をしなくなった。また、この画分を培養液に加えたMDCK細胞はトリパンブルーの色素排除活性を保っていた。そこで、増殖抑制活性の測定には、イ-グルMEM培地に2X10^4cells/mlで懸濁したMDCK細胞を96穴プレートに0.15mlまき、これにPBS(-)にとかした画分を0.15ml添加して一晩培養した後の細胞の形態変化を観察した。さらに、培養液を5%alamar Blueを含むものにかえ、alamar Blueの酸化・還元状態変化(細胞の還元活性を反映する)による吸光度変化から、細胞増殖活性を定量的に測定した。豚脊髄の塩粗抽出凍結乾燥物は、1mg/ml濃度で細胞増殖活性を半分に抑制した。この塩粗抽出凍結乾燥物をセファデクスG-25によるゲルろ過クロマトグラフィーにかけると、280nmの紫外吸収で4つのピークに分かれ、増殖抑制活性は2番目のピークにあった。これは分子量約1キロダルトンの溶出位置であった。この活性画分をQ-セファロースによるイオン交換クルマトグラフィーにかけると280nmの紫外吸収成分はほとんど吸着したが、この吸着成分には増殖抑制活性はなく、素通りした画分(280nmの吸収の1割以下)に活性があった。この素通折り画分は0.03mg/ml濃度で細胞増殖活性を半分に抑制した。したがって、この段階でこの増殖抑制因子は約300倍精製された。
活動依存的な細胞標識技術を用いたフェロモン記憶形成におけるシナプス伝達変化の解析

当研究室では学習記憶の神経機構を解明するため、雌マウスに形成される雄フェロモンに対する記憶をモデルシステムとして用いてきた。その記憶の座が副嗅球であることを見出したが、シナプスレベルでの記憶の神経機構の詳細は不明のままであり、個々の細胞レベルでの解析が切望されていた。本研究は、フェロモン刺激に応答した細胞を持続的に可視化できる(刺激終了後も可視化される)遺伝子改変マウスを用い、フェロモン記憶を支える副嗅球内でのフェロモン情報の処理機構を、電気生理学的手法およびレーザフォトリシス法を適用することにより、シナプスレベルで解明する。
原虫感染症治療薬を目指した鍵化合物BNTXの作用機序解明、及び、構造活性相関研究

我々は過去に、δオピオイド受容体(DOR)拮抗薬BNTXが、熱帯熱マラリアに対し強力なクロロキン耐性解除活性を示す事を見出した。このBNTXの活性発現機序を解明し、より効果的なリード化合物を開発する為、改良したKnoevenagelタイプの合成法によって約30個のBNTX誘導体を効率的に合成した。マラリア研究の1次スクリーニングとして抗トリコモナス活性試験を採用し検討した結果、それらは全て2080μMのMICで抗トリコモナス活性を示した。また、オピオイド受容体結合試験の結果、それらの化合物はオピオイド受容体と高い親和性を有する事も分かった。また、構造中の二重結合も活性発現には重要であった。本研究は、オピオイドδ受容体拮抗薬である7-ベンジリデンナルトレキソン(BNTX)誘導体の構造活性相関研究を通じて、新たな原虫感染症治療薬の創製に繋げる事を目的としている。以前我々は、BNTXがクロロキン耐性マラリアに対して耐性解除活性を有する事を報告した。そしてこの活性発現にはBNTXのδ拮抗作用と生体内チオール(SH基)捕捉作用の両方が重要であるという仮説を提唱した。このチオールというのは、原虫が生体内で生存するために利用する抗酸化物質全般を示し、例えばマラリアではグルタチオン、トリコモナスではタンパク質のフェレドキシンがこれに当たる。まず本仮説を証明するため、当初はマラリアのアッセイ系を利用する事で詳細な構造活性相関研究を行う予定であったが、我々が所有しているマラリアのin vivoアッセイ系では検体数を稼ぐ事が出来ない為、新しく効率的なアッセイ系を構築する必要があった。そこで、先行研究にてBNTXがin vitroで著しい抗トリコモナス活性を示した事に着目し、これを構造活性相関研究に利用する事とした。またこれまでのBNTX誘導体の合成法は、市販のナルトレキソンと種々のアルデヒドをAldol縮合していたが、収率が低い上に合成出来ない検体もあった。そこで、新たな合成法を検討した結果、ピぺリジンを塩基として用いるKnoevenagel縮合条件で劇的にBNTX誘導体の収率が向上する事を見出した。そして、この反応条件で合成した種々の検体について抗トリコモナス活性を調べたところ、既存薬であるメトロニダゾールには及ばないものの、ジメチルアミノ誘導体やメトキシ誘導体等、強力な活性を有する化合物を創出する事に成功した。当初はマラリアのin vivoアッセイ系を利用して、クロロキン耐性マラリアの耐性解除活性を中心に構造活性相関研究を進める計画であったが、検体数を稼ぐ事を優先してin vitroの抗トリコモナスアッセイ系を指標として研究を進める事とした。また、これまで問題点のあったBNTX誘導体の合成法を改良し、高効率的なサンプル供給を可能にした。この構造活性相関研究を通じて、強力な抗トリコモナス活性を示すBNTX誘導体の創出に成功した。この結果は我々が提唱する仮説、すなわち、オピオイドδ受容体拮抗作用とチオール(SH基)捕捉作用の両方を有するBNTX誘導体は、生体内で抗酸化物質を利用している原虫が媒介となる感染症の新しい治療薬になる可能性を示唆している。現在、BNTX誘導体の持つ共役二重結合が重要であること、ベンジリデン部位の芳香環は必ずしも必要で無い事が分かったので、構造変換部位をさらに拡大し、より詳細な構造活性相関研究を進める段階である。本研究は、オピオイドδ受容体(DOR)拮抗薬である7-ベンジリデンナルトレキソン(BNTX)誘導体のSAR研究を通じて、新たな原虫感染症治療薬の創製に繋げる事を目的としている。そしてこの活性発現にはBNTXのDOR拮抗作用と生体内チオール捕捉作用(不飽和二重結合の存在)の両方が重要であると考え、この仮説を証明する為に、マラリアと同様に生体内酸化ストレスの防御機構を持つトリコモナスのアッセイ系を標的としてSAR研究を開始した。27年度は独自に開発した効率的なBNTX誘導体合成法を利用して、既存薬(MIC:5μM)には及ばないものの、強力な活性を有するジメチルアミノ誘導体やメトキシ誘導体(共にMIC:20μM)を見出した。また28年度は、ベンジリデンのフェニル基をシクロヘキシル基に置き換えた誘導体や二重結合を還元した誘導体を含めて約30種類のBNTX誘導体を合成した。これらのBNTX誘導体はいずれもMIC:2080μMで抗トリコモナス活性を示し、またいずれもDORと親和性を示した。シクロヘキシル基に置換した誘導体は抗トリコモナス活性を保持していたが、二重結合を還元した誘導体ではMICがやや減弱した。この事実は、我々の仮説通り、BNTXの持つ共役系(生体内チオール捕捉部位)が活性に関与している可能性を示唆している。また、BNTXの3位フェノール性水酸基をメチル基で保護した化合物はオピオイド受容体との親和性が失われる事が知られているが、実際、この化合物も抗トリコモナス活性は80μMまで減弱した。この事実も我々の仮説通り、BNTXの持つDOR拮抗作用が活性に関与している可能性を示す。しかし被験化合物数は未だ十分では無く、活性発現機序を解明する為には今後より詳細なSARの結果が必要と考える。

このBNTXの活性発現機序を解明し、より効果的なリード化合物を開発する為、改良したKnoevenagelタイプの合成法によって約30個のBNTX誘導体を効率的に合成した。マラリア研究の1次スクリーニングとして抗トリコモナス活性試験を採用し検討した結果、それらは全て2080μMのMICで抗トリコモナス活性を示した。また、オピオイド受容体結合試験の結果、それらの化合物はオピオイド受容体と高い親和性を有する事も分かった。また、構造中の二重結合も活性発現には重要であった。BNTX誘導体のベンジリデン部位の芳香環をアルキル基に変換した検体を合成する。アルキル基に関しては立体障害や水溶性官能基の有無が活性にどのような影響を与えるか検討する。また、BNTXのエーテル酸素を除去し、骨格に自由度を持たせた場合の検討も行う。また、17位窒素上の置換基をこれまでのシクロプロピルメチル基から種々の置換基に切り替えた時、活性がどのように変化するか検討する。さらにベンジリデン部位の共役二重結合に脱離基を導入し、チオールが捕捉された場合、不可逆的な生体反応が進行する様、分子変換を行う。抗トリコモナス活性についてはMICだけではなく有力な検体についてIC50を算出し、またオピオイド活性については各受容体への親和性の検討だけではなくGTPγS結合試験も行う。有力な検体や構造活性相関研究により得られた情報については、再びマラリアの薬剤耐性解除活性試験へとフィードバックし、in vivo活性試験を行う。さらに最近、BNTX誘導体の合成過程において新規転位反応が進行することを見出した。今後は有機合成化学上興味深い本反応についても研究展開する予定である。有機合成化学当初は構造活性相関の指標として、これまでの研究に倣いin vivoにおける耐性マラリアの耐性解除活性を利用する計画であった。しかし、BNTX誘導体の合成法を改良する事に成功して効率良く多くのサンプルをアッセイ試験に供給する事が可能となった為、in vitroの抗トリコモナス活性試験をベースとした構造活性相関研究に計画を切り替えた。その為、マウス等のin vivo試験に計上していた予算を削減する事が出来、その分を有機合成試薬や溶媒の購入予算に切り替えた。抗トリコモナス活性をベースとした構造活性相関研究が非常に順調な為、有機合成試薬や溶媒への予算計上を当初の計画よりも増やし、BNTX誘導体のサンプル数を充実させる。これまではベンジリデン部位の変換(ベンゼン置換体を中心とした芳香族)、二重結合の還元、フェノール性水酸基の保護(オピオイド受容体への親和性を意図的に低下させる為)を検討してきたが、今後はベンジリデン部位をアルキル基へ変換したり、17位窒素上のシクロプロピルメチル基を他の置換基へ変換した誘導体の合成を試みる。また、BNTXの母骨格であるエーテル酸素を除去する事で分子全体の自由度を上げ、活性への影響を検討する。活性試験は引き続き抗トリコモナス活性とオピオイドへの親和性を検討するほか、オピオイド受容体へのGTPγS試験(作動活性試験)も新たに検討する。また、耐性マラリアのモデルマウスを用いて、薬剤耐性マラリアの耐性解除活性についても検討する。
rTMS・tDCSの定量的評価および治療応用システムの開発

反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)や経頭蓋直流電気刺激(tDCS)は脳の興奮性を変化させることができることから,うつ病,パーキンソン痛,脳卒中の後遺症,慢性疼痛,ジストニアなどの治療に応用されている.しかしながら, rTMSやtDCSの臨床応用に関する報告では,疾患に対する効果や有効性は確認されているものの,刺激を行う際の刺激条件が客観的に定められていないとう問題がある.そこで,本研究ではrTMS・tDCSの刺激効果を定量的に評価し,疾患を入力することで, rTMS・tDCSの最適な刺激条件が出力されるシステムの開発を行う.まず,運動野において, μ波とrTMS・tDCSの刺激効果の関係性について調べた.その結果, μ波のERDは促進性の刺激であるAnodal tDCSにより,有意的に増加し,抑制性の刺激である1Hz110%RMT rTMSとCathdal tDCSにより有意的に減少した.次に, rTMSの刺激条件と刺激効果の関係性を調べるために,抑制効果を誘発すると言われている1HzのrTMSを左半球の第一次運動野に与え,運動誘発電位(MEP)を計測することで,大脳皮質興奮特性の変化を評価した.更に,その実験結果を用い,重回帰分析によりrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.実験により,刺激強度が強いほど,パルス数が多いほど,抑制効果が強く生じることが分かり, MEPの振幅変化と刺激強度,パルス数の関係が非線形である可能性があることが分かった.また,樹木モデルを計測データにあてはめ,独立変数間の交互作用を調べた.その結果,刺激強度とパルス数の間に交互作用がある可能性が示唆された.これらの結果から,初期のモデルに,刺激強度の二乗,パルス数の二乗,刺激強度とパルス数の積を含むモデルを用い,重回帰分析を行うことでrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.刺激の効果が被験者により異なることがある為,クラスター分析により被験者を分類し,モデルを分けて作成することで,モデルの精度向上を行った。当初の予定では,シミュレーションにより, rTMS・tDCSが誘発する大脳皮質興奮特性の変化を評価することを予定していたが,生体の複雑さから,被験者毎の興奮特性をモデルとして作成することは困難であった.そこで,実験を行い,脳波,筋電位を計測することで興奮特性の変化の定量化を行った.その結果, rTMSの刺激効果は評価できつつあるが,被験者毎に効果が異なるという問題もあり,研究計画に少し遅れが生じた.クラスター分析により被験者を分類し,モデルの作成を行った, rTMSを与える前の状態(安静時運動閾値, rTMSを与える前のMEPの波形)などから,計測データに違いがあるかを調べた結果, MEP波形の立上りの潜時, MEPのピーク間振幅,変動値に違いが生じた.違いが生じた理由を明確にする必要がある為,検証実験を行う.次に, tDCSにおいても同様のモデルを作成する, tDCSにおいては, MEP計測時にtDCSの電極を取り外し, TMSにより計測しなければならないため,刺激部位が動く可能性があるので, MRIと赤外線カメラを用いた刺激位置決め装置で場所の確認を行いつつ実験を行う.最終的にrTMS・tDCSの治療応用システムの開発を試みる。反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)や経頭蓋直流電気刺激(tDCS)は脳の興奮性を変化させることができることから,うつ病,パーキンソン病,脳卒中の後遺症,慢性落痛,ジストニアなどの治療に応用されている.しかしながら,rTMSやtDCSの臨床応用に関する報告では,疾患に対する効果や有効性は確認されているものの,刺激を行う際の刺激条件が客観的に定められていないとう問題がある.そこで,本研究ではrTMS・tDCSの刺激効果を定量的に評価し,疾患を入力することで,rTMS・tDCSの最適な刺激条件が出力されるシステムの開発を行う.まず,運動野において,μ波とrTMS・tDCSの刺激効果の関係性について調べた.その結果,μ波のERDは促進性の刺激であるAnodal tDCSにより,有意的に増加し,抑制性の刺激である1Hz 110%RMT rTMSとCathdal tDCSにより有意的に減少した.次に,rTMSの刺激条件と刺激効果の関係性を調べるために,抑制効果を誘発すると言われている1HzのrTMSを左半球の第一次運動野に与え,運動誘発電位(MEP)を計測することで,大脳皮質興奮特性の変化を評価した.更に,その実験結果を用い,重回帰分析によりrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.実験により,刺激強度が強いほど,パルス数が多いほど,抑制効果が強く生じることが分かり,MEPの振幅変化と刺激強度,パルス数の関係が非線形である可能性があることが分かった.また,樹木モデルを計測データにあてはめ,独立変数間の交互作用を調べた.その結果,刺激強度とパルス数の間に交互作用がある可能性が示唆された.

これらの結果から,初期のモデルに,刺激強度の二乗,パルス数の二乗,刺激強度とパルス数の積を含むモデルを用い,重回帰分析を行うことでrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)や経頭蓋直流電気刺激(tDCS)は脳の興奮性を変化させることができることから,うつ病,パーキンソン痛,脳卒中の後遺症,慢性疼痛,ジストニアなどの治療に応用されている.しかしながら, rTMSやtDCSの臨床応用に関する報告では,疾患に対する効果や有効性は確認されているものの,刺激を行う際の刺激条件が客観的に定められていないとう問題がある.そこで,本研究ではrTMS・tDCSの刺激効果を定量的に評価し,疾患を入力することで, rTMS・tDCSの最適な刺激条件が出力されるシステムの開発を行う.まず,運動野において, μ波とrTMS・tDCSの刺激効果の関係性について調べた.その結果, μ波のERDは促進性の刺激であるAnodal tDCSにより,有意的に増加し,抑制性の刺激である1Hz110%RMT rTMSとCathdal tDCSにより有意的に減少した.次に, rTMSの刺激条件と刺激効果の関係性を調べるために,抑制効果を誘発すると言われている1HzのrTMSを左半球の第一次運動野に与え,運動誘発電位(MEP)を計測することで,大脳皮質興奮特性の変化を評価した.更に,その実験結果を用い,重回帰分析によりrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.実験により,刺激強度が強いほど,パルス数が多いほど,抑制効果が強く生じることが分かり, MEPの振幅変化と刺激強度,パルス数の関係が非線形である可能性があることが分かった.また,樹木モデルを計測データにあてはめ,独立変数間の交互作用を調べた.その結果,刺激強度とパルス数の間に交互作用がある可能性が示唆された.これらの結果から,初期のモデルに,刺激強度の二乗,パルス数の二乗,刺激強度とパルス数の積を含むモデルを用い,重回帰分析を行うことでrTMSの刺激効果予測モデルを作成した.刺激の効果が被験者により異なることがある為,クラスター分析により被験者を分類し,モデルを分けて作成することで,モデルの精度向上を行った。当初の予定では,シミュレーションにより,rTMS・tDCSが誘発する大脳皮質興奮特性の変化を評価することを予定していたが,生体の複雑さから,被験者毎の興奮特性をモデルとして作成することは困難であった.そこで,実験を行い,脳波,筋電位を計測することで興奮特性の変化の定量化を行った.その結果,rTMSの刺激効果は評価できつつあるが,研究計画に少し遅れが生じた.当初の予定では,シミュレーションにより, rTMS・tDCSが誘発する大脳皮質興奮特性の変化を評価することを予定していたが,生体の複雑さから,被験者毎の興奮特性をモデルとして作成することは困難であった.そこで,実験を行い,脳波,筋電位を計測することで興奮特性の変化の定量化を行った.その結果, rTMSの刺激効果は評価できつつあるが,被験者毎に効果が異なるという問題もあり,研究計画に少し遅れが生じた.ます,rTMSの刺激効果予測モテルの精度の向上を試みる.被験者のコンディションによりrTMSの効果は影響を受けるため,rTMSを与える前の状態(安静時運動閾値,rTMSを与える前のMEPの波形)などから,計測データに違いがあるかを調べる.次に,tDCSにおいても同様のモデルを作成する.tDCSにおいては,MEP計測時にtDCSの電極を取り外し,TMSにより計測しなければならないため,刺激部位が動く可能性があるので,MRIと赤外線カメラを用いた刺激位置決め装置で場所の確認を行いつつ実験を行う.最終的にrTMS・tDCSの治療応用システムの開発クラスター分析により被験者を分類し,モデルの作成を行った, rTMSを与える前の状態(安静時運動閾値, rTMSを与える前のMEPの波形)などから,計測データに違いがあるかを調べた結果, MEP波形の立上りの潜時, MEPのピーク間振幅,変動値に違いが生じた.違いが生じた理由を明確にする必要がある為,検証実験を行う.
尿解析による腎疾患の診断に関する検討

腎疾患の最終診断は、主に腎生検にゆだねられているが、腎生検は侵襲的な検査で、10個前後の糸球体形態から全体を予測する方法自体に限界も指摘されている。一方、尿検査は非侵襲的で、腎疾患の診断・予後判定上の有用性が考えられる。そこで尿沈渣中の細胞を免疫細胞学的あるいはmRNAの発現レベルにより検討した。その結果、尿沈渣中のCLDN1、CD68、NE陽性細胞数、尿沈渣中のAQP2で補正したCLDN1 mRNAレベル、CD68 mRNAレベルおよび尿沈渣中のAQP2で補正したM2 Mφ関連のmRNAレベルが、半月体形成など腎疾患の活動性と相関し、腎疾患の病状把握、治療薬の調整の際に有用であると思われた。腎生検に比較し、尿検査は非侵襲的で、腎臓全体の病態を反映して変化する可能性から診断・予後判定上の有用性が考えられる。そこで、尿沈渣中の細胞成分や尿上清中の蛋白質を解析することにより、より正確で安全な腎疾患の診断や予後判定を確立することを目的として研究を進めている。初年度に採取を開始し保存してきた、各種腎疾患患者の尿検体は、約200例となった。パイロットスタディーの結果に基づき、腎臓由来の細胞のマーカーとして、CD68(マクロファージ)、好中球エラスターゼ(好中球)、サイトケラチン(尿細管上皮細胞)、クローディン1(ボーマンのう上皮細胞)、シナプトポディン(足細胞/ポドサイト)を使用することを決定した。これらに対する抗体を使用して、200例の患者の尿沈渣中の細胞を、蛍光免疫細胞染色で同定・評価した。さらに、これらのうち、腎臓の炎症と関連がみられそうであった、マクロファージ、ボーマンのう上皮細胞に関しては、それらマーカーのmRNA発現をreal time RT-PCR法により定量した。今後、これらの結果と、臨床検査所見・腎生検組織所見から評価した腎疾患の診断や活動性との関連を検討し、臨床応用を考え、検討したマーカーのなかで、腎疾患の診断や病状・予後判定に有用な解析を選び出し、中でも感度・特異度の面から最も有効で、簡易な尿検査法の組み合わせを、各マーカーに関するROCカーブを作成し、決定する予定である。これは、より安全で効果的な、腎疾患治療体系の確立につながることから、非常に意義深いものと考える。尿沈渣中の細胞成分の蛋白やRNAを解析することにより、より正確で安全な腎疾患の診断や予後判定を確立することを目的として研究を進めている。平成24年度までに、採取・保存してきた、各種腎疾患患者200例の尿沈渣中の細胞を使用し、蛍光免疫細胞染色でCD68(マクロファージ)、好中球エラスターゼ(好中球)、サイトケラチン(尿細管上皮細胞)、クローディン1(ボーマンのう上皮細胞)、シナプトポディン(足細胞/ポドサイト)の蛋白レベルでの発現解析を終了した。平成25年度は、蛋白レベルで腎臓の炎症との関連がみられた、CD68(マクロファージ)、好中球エラスターゼ(好中球)、クローディン1(ボーマンのう上皮細胞)に関して、mRNAレベルでの発現を尿沈渣から抽出したtotalRNAを用いたreal time RT-PCR法により解析した。CD68、クローディン1のmRNAは特に問題なく評価できたが、好中球エラスターゼのmRNAは全く検出できなかった。そこで、好中球と関連した3分子(CD66b, CD16a, myeloperoxidase)のmRNAの発現も解析したが、これら全てが全く検出できなかった。一方、血液由来の白血球から抽出したRNAを用いると、これら全ての発現が確認できたことから、尿中の好中球は蛋白合成能を喪失し、mRNAレベルでの検出に向かないものと思われた。今後、mRNAレベルでの解析結果と、臨床検査・組織所見との関連性を検討し、腎疾患の診断や病状・予後判定に有用な解析を選び出していく予定である。このような結果は、より安全で効果的な、腎疾患治療体系の確立につながることから、非常に意義深いものと考える。腎生検に比較し、尿検査は非侵襲的で、腎臓全体の状況を反映して変化する可能性から診断・予後判定上の有用性が考えられるため、尿沈渣中の細胞成分や尿上清中の蛋白質を解析することにより、より正確で安全な腎疾患の診断や予後判定を確立することを目的として研究を進めている。初年度は、まず各種腎疾患患者の尿サンプルを採集し、適切に処理し、保存することを進めた。サンプルは順調に採取できており、まもなく目標数に到達できそうである。さらに、尿沈渣中の細胞の同定に使用可能な抗体を、一部のサイトスピンスライドを用いて、実際に蛍光免疫細胞染色を実施して選定した。これにより、マクロファージ、好中球、尿細管上皮細胞、ボーマンのう上皮細胞、足細胞(ポドサイト)などのマーカーとして使用する抗体を決定できた。今後、これらマーカーを用いて、採取・保存中のすべての尿サンプルに関して、尿沈渣細胞の分画割合を蛍光免疫細胞染色にて評価する。

尿沈渣細胞に関しては、浮遊させてFACSによる解析も予定していたが、パイロット的に実施したところ、死細胞が多いためか、陽性、陰性の判定が困難な状況で、解析を進めるには死細胞などを除去する工夫が必要だと思われる。パイロットスタディーの結果で選択したマーカー分子は、さらにそのmRNA発現をreal time RT-PCR法により定量することにより蛍光免疫細胞染色の結果との相関性を確認する予定である。最終的には、これらの結果と、臨床検査所見・腎生検組織所見から評価した腎疾患の診断や活動性との関連を検討し、臨床応用を考え、検討したマーカーのなかで、腎疾患の診断や病状・予後判定に有用な解析を選び出し、中でも感度・特異度の面から最も有効で、簡易な尿検査法の組み合わせを決定する予定である。これは、より安全で効果的な、腎疾患治療体系の確立につながることから、非常に意義深いものと考える。腎生検に比較し、尿検査は非侵襲的で腎臓全体の病態を反映して変化する可能性から診断・予後判定上の有用性が考えられる。尿沈渣中の細胞成分の蛋白やRNAを解析することにより、より正確で安全な腎疾患の診断や予後判定を確立することを目的として研究を進めている。平成26年度は平成25年度に続き、尿沈渣から抽出したtotal RNAを用いたreal time RT-PCR法による解析を実施した。平成25年度の解析で、好中球関連のmRNAの発現は解析できないことが判明したため、平成26年度はマクロファージ関連マーカーに関して、より詳細に解析を進めた。マクロファージには炎症誘導性に働くM1マクロファージと、炎症抑制性・修復に働くM2マクロファージの2種類が存在することが知られている。この点に関してM2マクロファージのマーカーとして、CD163, CD204, CD206, IL-10を、M1マクロファージの指標として、iNOS, IL-6を選んで、それらのmRNAの発現レベルを解析した。その結果、M1マクロファージのマーカーには、腎疾患の診断や病態が変わっても変化がなかったが、M2マクロファージのマーカーは半月体形成を伴う腎疾患で半月体形成を伴わない腎疾患に比して有意に発現が増強していることが判明した。この結果から、半月体形成を伴う活動性腎疾患の尿中にはM2マクロファージが主として増加し、M2マクロファージ関連マーカーのmRNAレベルでの解析は、腎炎活動性の指標として有用である可能性が考えられた。腎生検に比較し尿検査は非侵襲的で、腎臓全体の病態を反映して変化する可能性から診断・予後判定上の有用性が考えられる。尿沈渣細胞成分の蛋白やRNAを解析することにより、より正確で安全な腎疾患の診断や予後判定を確立することを目的として研究を進めている。平成27年度は平成26年度までに出そろった各種尿沈渣細胞成分の蛋白レベルやRNAレベルでの発現結果に関して、臨床検査成績・腎組織病理所見などとの関連性を統計学的に解析し、腎疾患病態把握における有用性を検討した。これらの発現レベルは、各種糸球体疾患の鑑別診断という意味では有用性が低かったが、一部のマーカー(CD68, claudin-1,好中球エラスターゼの蛍光抗体での発現レベル、CD68, claudin-1, macrophage M2マーカーのmRNA発現レベル)は、糸球体における活動性病変(半月体形成)と有意に関連し、腎疾患の病態把握・予測に有用であることが判明した。これらのマーカーの発現と糸球体における半月体形成に関するLogistic regression解析を実施したところROCカーブのAUCは0.60-0.69で全て統計学的に有意であった。ただし、このAUCは血尿レベルによるAUC(0.70)よりも低く、血尿レベルと合わせて評価する方が良いことが判明した。
高融点を有する新規生分解性高分子の開発

本年度は昨年度合成したポリマーの物性や生分解性を調べ,その結果を新たなポリマーの合成にフィードバックして,高融点を有し,物性ならびに生分解性にも優れた高分子の開発を目指した.100°C以上の高融点を有するポリマーとして,(R)-β-ブチロラクトン[(R)-β-BL]/ε-カプロラクトン(CL)共重合体((R)-β-BL/CL>75/25),_L-ラクチド(_L-LA)/CL共重合体(_L-LA/CL>85/15),および_L-LAと_L-DMO(_L-3,_<DL>-6-ジメチル-2,5-モルフォリンジオン;環状デプシペプチドの一種)との共重合体(_L-LA/L-DMO>85/15)などが得られた.このうち,酵素(エステラーゼやプロテアーゼなど)による分解性に優れていたのは^L-LA/_L-DMO共重合体であった.続いて,この_L-LA/_L-DMO(=92/8)共重合体の熱的および機械的特性を測定した.その結果,共重合体の熱的特性や引張り強度はポリ(_L-ラクチド)[poly(_L-LA)]に比べほとんど低下せず良好であったが,poly(_L-LA)固有の脆さ(柔軟性の欠如)の改善は達成できなかった.そこで,柔軟性の付与が期待されるCLユニットを導入して_L-LA/_L-DMO/CL三元共重合体を合成し,その物性や生分解性を調べた結果,CLを10mol%程度導入した(例えば,_L-LA/_L-DMO/CL=88/4/8)三元共重合体においてかなりの伸び(柔軟性)が発現し,引張り強度や酵素分解性も良好に保持されていることが判明した.今後,_L-LAと各種デプシペプチドおよびまたはラクトン類との共重合体を中心に合成し,さらに物性と生分解性に優れた新規高分子を開発する予定である.本年度は昨年度合成したポリマーの物性や生分解性を調べ,その結果を新たなポリマーの合成にフィードバックして,高融点を有し,物性ならびに生分解性にも優れた高分子の開発を目指した.100°C以上の高融点を有するポリマーとして,(R)-β-ブチロラクトン[(R)-β-BL]/ε-カプロラクトン(CL)共重合体((R)-β-BL/CL>75/25),_L-ラクチド(_L-LA)/CL共重合体(_L-LA/CL>85/15),および_L-LAと_L-DMO(_L-3,_<DL>-6-ジメチル-2,5-モルフォリンジオン;環状デプシペプチドの一種)との共重合体(_L-LA/L-DMO>85/15)などが得られた.このうち,酵素(エステラーゼやプロテアーゼなど)による分解性に優れていたのは^L-LA/_L-DMO共重合体であった.続いて,この_L-LA/_L-DMO(=92/8)共重合体の熱的および機械的特性を測定した.その結果,共重合体の熱的特性や引張り強度はポリ(_L-ラクチド)[poly(_L-LA)]に比べほとんど低下せず良好であったが,poly(_L-LA)固有の脆さ(柔軟性の欠如)の改善は達成できなかった.そこで,柔軟性の付与が期待されるCLユニットを導入して_L-LA/_L-DMO/CL三元共重合体を合成し,その物性や生分解性を調べた結果,CLを10mol%程度導入した(例えば,_L-LA/_L-DMO/CL=88/4/8)三元共重合体においてかなりの伸び(柔軟性)が発現し,引張り強度や酵素分解性も良好に保持されていることが判明した.今後,_L-LAと各種デプシペプチドおよびまたはラクトン類との共重合体を中心に合成し,さらに物性と生分解性に優れた新規高分子を開発する予定である.