hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺組織DNAのメチル化からみた肺の成熟と分化

DNA塩基中,メチル化をうける唯一の塩基はシトシンである.メチル化シトシンはDNAの立体構造を変化させ,他の蛋白質や酵素,例えばRNA-ポリミラーゼとDNAとの結合性や親和性に変化を与える.またシトシンはDNAの調節遺伝子部分に集中的に存在することから,シトシンのメチル化がDNAの遺伝子発現の制御機構に関与していると考えられている.本研究では,胎生期より成熟・分化し,出生と同時に呼吸という重要な機能を開始する肺組織について,その組織DNA中のメチル化とその分化・成熟の程度との関係を遺伝子活性の面から明らかにすることにある.61年度までに,我々は肺組織DNA中のメチル化シトシンについてHPLCを用いて定量的分析を行った結果,(1)肺組織DNA中のメチル化シトシンは,肺の成熟過程において脱メチル化をうける可能性があること,(2)DNAのメチル化と遺伝子活性は逆相関関係にあることから,肺組織は出生を期に遺伝子活性の面からも急速に活性化されていることを示す結果を得た.本年度は, DNAのメチル化の程度と組織の分化・成熟・加齢との相関をさらに明らかにするため,ヒト胎盤組織について,妊娠初期,中期,後期の組織総DNAに対するメチル化シトシンの量を分析した.その結果,メチル化シトシンの含有率はそれぞれ0.72, 0.78, 0.92mcl%で,妊期の継続とともに上昇しており,妊娠後期胎盤における加齢の程度との相関を強く示唆するものと思われた.本研究では、胎生期より分化・成熟し、子宮外生活に不可欠のサーファクタント産生に至る肺組織について、その成熟・分化の程度と組織DNAのメチル化との関係を分析し、遺伝子活性の面から肺組織の分化(加齢)について明らかにすることを目的としている。昭和61年度には、1.ヒト白血球ならびに成人肺における組織DNAのメチル化シトシン量の分析を行い、肺組織DNAには他の臓器に比して、メチル化シトシン量が多いこと、2.ラット胎仔肺、新生仔肺ならびに成熟肺についてDNA中メチル化シトシンの定量分析を行ったところ、肺組織中のメチル化シトシンは出生を境に急速に低下し、成熟肺の値に急速に近ずくことの2点について結果を得た。以上のことから、1.肺組織DNA中のメチル化シトシンは、肺の成熟過程で脱メチル化を受ける可能性のあること、2.DNAのメチル化と遺伝子活性は逆相関々係にあることから、肺組織は出生を期に遺伝子活性の面からも急速に活性化されていることが示唆される。出生を期に肺にもたらされる内的変化ならびに血行動態や呼吸開始等の外的変化がDNAのレベルにまで影響を及ぼしている可能性が考えられ、今后も種々の要因について検討を加えたい。DNA塩基中,メチル化をうける唯一の塩基はシトシンである.メチル化シトシンはDNAの立体構造を変化させ,他の蛋白質や酵素,例えばRNA-ポリミラーゼとDNAとの結合性や親和性に変化を与える.またシトシンはDNAの調節遺伝子部分に集中的に存在することから,シトシンのメチル化がDNAの遺伝子発現の制御機構に関与していると考えられている.本研究では,胎生期より成熟・分化し,出生と同時に呼吸という重要な機能を開始する肺組織について,その組織DNA中のメチル化とその分化・成熟の程度との関係を遺伝子活性の面から明らかにすることにある.61年度までに,我々は肺組織DNA中のメチル化シトシンについてHPLCを用いて定量的分析を行った結果,(1)肺組織DNA中のメチル化シトシンは,肺の成熟過程において脱メチル化をうける可能性があること,(2)DNAのメチル化と遺伝子活性は逆相関関係にあることから,肺組織は出生を期に遺伝子活性の面からも急速に活性化されていることを示す結果を得た.本年度は, DNAのメチル化の程度と組織の分化・成熟・加齢との相関をさらに明らかにするため,ヒト胎盤組織について,妊娠初期,中期,後期の組織総DNAに対するメチル化シトシンの量を分析した.その結果,メチル化シトシンの含有率はそれぞれ0.72, 0.78, 0.92mcl%で,妊期の継続とともに上昇しており,妊娠後期胎盤における加齢の程度との相関を強く示唆するものと思われた.
糖尿病腎症患者の療養行動継続のための療養条件

先行研究の2型糖尿病腎不全患者の療養認識から作成した質問項目を用いて、糖尿病腎不全患者の療養認識を分類した。質的同様に5つに分類でき、腎機能を維持し透析導入時期を延長した療養認識は、肯定感が高く、QOL良好、腎症療養期間が長いという仮説が立証でき、この認識項目を糖尿病腎不全患者における肯定感尺度として作成した。更に、2型糖尿病腎不全患者を療養認識で分類したところ「現実逃避」「高肯定感」「原因不明感」の3パターンとなった。肯定感が高い療養認識は、「高肯定感」パターンであり、この認識の療養条件は、医療主体でなく合併症を怖いと思えることで行動変容し、主体的に療養していると自覚できることであった。昨年度、糖尿病腎不全患者の肯定感尺度を作成し、この尺度得点が高いとQOLも良いこと、腎症としての療養期間が長いことを明らかにした。本年度は、糖尿病腎不全患者の療養認識のパターン分類を行い、肯定感が高い認識パターンにおける糖尿病腎症時期の療養条件の特徴を明らかにすることに取り組んだ。2型糖尿病腎不全患者99名に面接式質問紙調査を行い、分析対象者は91名となった。療養認識の12項目の得点からクラスタ分析にて、療養認識のパターン分類を行った。Ward法で平方ユークリッド距離を使用した。デンドログラムにおいて3クラスタに分類できた。判別分析による判別的中率(交差確認済み)は94.5%であり、3クラスタに分類することは妥当といえ、療養認識は3パターンに分類された。糖尿病腎不全患者の肯定感尺度得点比較では、分散分析において、3クラスタの得点比較には有意な差(p<0.01)があった。クラスタ2の得点が一番高く、11.30±1.98(平均値±SD)点、続いてクラスタ3の得点は、6.83±1.72点、クラスタ1は4.54±1.53点であった。多重比較では、クラスタ2の得点が他の得点よりも有意に高く、続いてクラスタ3、クラスタ1の得点であり、それぞれに有意な得点差(p=0.000)があった。クラスタ2が、肯定感が高い認識パターンといえた。各クラスタの特徴として、以下が明らかとなった。クラスタ2は、透析導入時の衝撃は少ない、自己効力感が高いという特徴があった。クラスタ1は、合併症が怖いが行動変容しない、食事療法実行度・運動療法実行度・薬物療法実行度が低い、糖尿病腎症での療養期間が短い、中断経験者が多いという特徴があった。クラスタ3は、定期的な通院をしていた、通院と薬と注射をしていれば大丈夫と思っていたという特徴が明らかとなった。クラスタ2が3つの療養認識パターンの中で望ましいといえた。糖尿病腎不全患者の肯定感尺度を作成し、この尺度得点が高いとQOLも良いこと、腎症としての療養期間が長いことを明らかにし、糖尿病腎不全患者の療養認識のパターン分類を行った。各パターンを命名し、認識の特徴を分析し、肯定感が高い認識の特徴を明らかにした。3つの認識パターンは、療養認識の5因子(第1因子;気にかけない、第2因子;予期せぬ進行、第3因子;肯定感、第4因子;自己責任感、第5因子;周囲の責任)において第1,3,4因子で有意差があった。認識パターン別の特徴は、パターン1は、第1因子である、気にかけないという得点が有意に高く、現実逃避パターン、パターン2は、第3因子の肯定感が有意に高い特徴があり、高肯定感パターン、パターン3は、第4因子の自己責任感が有意に最も低いという特徴があり、原因不明感パターンとした。多重比較においても、高肯定感パターンが他の認識パターンと比べ、肯定感が高い認識パターンと特定した。肯定感が高い認識である高肯定感パターンの療養条件の特徴と他の認識パターンとの比較から、現実逃避パターンは、腎症になっても気にしない気にかけない、原因不明感パターンは、自己責任感が最も低く、何が悪いのか明確にできていないと考えられ、高肯定感パターンになるためには、悪化の原因を明確にでき、糖尿病療養を気にかけることが必要といえた。また、現実逃避パターンと差がある療養条件から、高肯定感パターンは、合併症は恐いので行動変容し、食事・運動療法を実行し、糖尿病腎症療養期間が長い、さらに原因不明感パターンと差がある条件から、高肯定感パターンは、定期的な通院をしていたというより、自主的な実行があり、透析導入時の衝撃が低く、自己効力感が高くなるといえた。通院を中断しても、その後、行動変容し医療主体でなく、自主的に実行した自覚が、透析導入時の衝撃の弱さや腎症療養期間が長くなることにつながると考える。

本年度は、先行研究による質的研究から得られた結果を基に2型糖尿病性腎不全患者の「遅ればせながらできるだけ頑張ったと納得する」療養認識の構成概念を肯定感尺度として作成し、また、肯定感が高いほどQOLが良好であることを明らかにすることに取り組んだ。その結果、2型糖尿病性腎不全患者70名に面接式質問紙調査から、療養認識の構成概念12項目の質問の回答を因子分析で構成概念を確認し、内的整合性と併存妥当性の検討を行い、尺度を作成できた。3項目のCronbach's α係数は、α=0.70であり、信頼性は確保された。また、この尺度は、自己効力感に正の相関関係がみられ併存妥当性が確認された。糖尿病性腎症患者の肯定感尺度項目は、「糖尿病療養を行なってきた中で自分のできることはできるだけ頑張って行った」、「自分の努力で透析に入るのは思ったよりも遅くなった」、「糖尿病性腎症で制限した生活をしてきたので透析生活のほうが楽に思える」の3項目である。肯定感尺度とQOLについては、KDQOL-SFTM1.3尺度において社会生活、心の健康、全体的健康感、腎疾患による負担、睡眠において有意な正の相関関係があった。「遅ればせながらできるだけ頑張ったと納得する」療養認識を持てることが透析に至ってもQOLが良好であった。これは、糖尿病性腎不全患者はこれまで、透析に至った場合には否定的にとらえることが報告されており、療養にどのような意味づけをすることにより患者が前向きにとらえ取り組むことができるのかを明らかにしたものは皆無であった。「遅ればせながらできるだけ頑張ったと納得する」という肯定的な認識があることの証明とそれを糖尿病腎不全患者の肯定感尺度を作成し、この尺度得点が高いとQOLも良いことと、腎症としての療養期間が長いことを明らかにできたことは今後の糖尿病性腎症患者の療養継続に意義のあることである。初年度は、「遅ればせながらできるだけ頑張ったと納得する」という肯定的な認識があることの証明とそれを糖尿病腎不全患者の肯定感尺度を作成し、この尺度得点が高いとQOLも良いことと、腎症としての療養期間が長いことを明らかにした。2年目の今年度は、糖尿病腎不全患者の療養認識パターンによる分類を行い肯定感が高くもてる集団があることが明らかとなり、これらの人たちに特有の療養条件を明らかにした。ほぼ順調といえる。しかし、今年度末より、糖尿病腎症患者の調査に入る予定が、対象施設の都合により次年度からになったためやや遅れているとした。糖尿病性腎不全患者における肯定感尺度を作成でき,その成果を論文発表できた。しかしパターン分類し、特徴を見出すまでの対象数が取れなかったため。糖尿病性腎症患者の意識と現在の療養状況を調査する予定である。研究データ処理補助者の確保により推進されると考えている。今後、継続して調査を行い、対象者を増やし、パターン分類を行う。また、分析を進め、影響する療養条件を明らかにする。さらに、糖尿病性腎症患者の意識と現在の療養状況を調査する予定である。統計ソフトの購入。研究参加者への謝礼と質問紙の作成と送料糖尿病患者への研究内容の公表のための冊子の作成費に使用する。学会発表を予定しており、学会参加旅費は必要となる。データ処理補助者が見つからなかったため、データ処理補助用コンピューターと統計ソフトの購入が今年度は必要がなかった。また、学会発表せず、論文投稿となったため学会参加旅費は必要なかった。
大学看護学教育における専門分野認証評価の国際比較

本研究の目的は、わが国大学看護専門分野別評価システムの課題を明らかにするため、米国、豪州等のシステムを比較するとともに、教育成果等の評価の実際を検討することである。方法は、WEB上書面調査、講演記録と豪州は関係者への訪問調査である。諸外国の看護アクレディテーションシステムは、民間団体や政府の協力で実施されており、大学の自律性、自己点検・評価、ピア評価が共通の特徴であった。また看護アクレディテーション団体である米国CCNEと豪州ANMACを比較すると、CCNEの手順は我が国機関別認証評価と似ているが、ANMACは効率化等を目的に2017年からリスク評価による段階別評価の導入に大きな相違があった。本研究の目的は、わが国大学看護学教育における専門分野認証評価の課題を明らかにするため、米国、英国、豪州および日本の大学看護学教育における高等教育システムをクリティカルレビューにより比較すること、代表大学の認証評価における自己点検評価報告書の特徴と、教育プロセスの「成果」評価について、分析検討することである。今年度の目的は、1米国、英国、豪州の高等教育認証システムをクリティカルレビューし、その特徴と評価上の課題について、2わが国関連専門分野の認証システム、教育プロセスの成果評価について、その特徴、方法についてを明らかにするの2点である。1諸外国の高等教育分野における質保証システムの概要:米国、英国、豪州、韓国(独立行政法人大学評価・学位授与機構www.niad.ac.jp/n_kokusai/)をデータに、質保証制度の概要と質保障制度の種類をレビューした結果,高等教育制度の多用な審査制度の状況が把握できた。2医学教育は、日本医学教育学会医学教育分野別評価基準策定委員会が、国際認証で用いられる世界医学教育連盟(WFME)グローバルスタンダードに準拠した日本版基準(教育成果にまたがる9領域、36下位領域の構成)を平成25年7月に公表した。薬学部は、薬学教育評価機構(第三者評価機構)がわが国独自の評価基準(7大項目、13中項目、57基準、176観点)を作成し、本年度から専門分野別評価が実施されている。獣医学部は現在導入にむけて取り組み中である。工学は、専門分野別第三者評価である日本技術者教育認定機構による「JABEE」が国内外の多用な分野で用いられている。なお、教育成果の評価方法についての比較は、現在検討中である。米国看護学大学評価の専門分野評価組織であるCCNEから2名の審査委員が来日した折に、直接評価システムの情報等を得ることができた(日本看護系大学協議会主催)。本研究の目的は、わが国大学看護学教育における専門分野認証評価の課題を明らかにするため、米国、英国、豪州および日本の大学看護学教育における高等教育システムをクリティカルレビューにより比較すること、代表大学の認証評価における自己点検評価報告書の特徴と、教育プロセスの「成果」について、分析検討することである。今年度の目的は、1看護系大学教育における専門分野別評価システムの国際比較、2海外の大学看護学教育における教育プロセスの成果評価に対する方法の比較の2点である。1諸外国の看護学高等教育における認証システムについて、文献検討し、米国、英国、ドイツ、豪州、韓国、(日本)における認証システムの現状と課題・問題点を把握することができた。各国の認証システムは民間団体もしくは政府の協力によって実施されており、機関の自律性、自己点検・評価、peer evaluationが共通の特徴であり、システムの流れは、量から質へ、成果中心へ、実践看護師の参入へとむかっていることが示唆された。2世界各国でモデルとされている米国のCCNE(Commission on Collegiate Nursing Education)が2015年1月(2018年1月まで)にWebinarした「CCNEにおけるチーム報告書の書き方」を検討した。冒頭に期待される成果が述べられており、チーム報告書の要件と期待、チーム報告書におけるナラティブの書き方と展開、重要な要素間の関連性、基準IVについて、チーム報告書の最終決定、2014年からのアップデート内容から構成されており、評価基準、どのような場合にナラティブの追記が求められるか等、具体的な留意事項が述べられており、CCNE報告書作成方法の実際に関する大筋をつかむことができた。また、プログラムの有効性に関しては、その多くに客観的な指標による達成度評価が求められていた。今年度は、1現在、わが国で開発途上の看護学専門分野教育評価システムは、米国CCNEの評価システムを参考にしていることから、昨年度に引き続きCCNEにおける基準IVのセルフスタディレポーの詳細について検討した。CCNE認定プロセスはオンサイト評価で行われ、自主ドキュメントの電子版、プログラム情報フォーム(PIF)等はCCNEオンラインコミュニティとCCNEウェブサイトから入手する。なお、基準IVのプログラムの有効性は(プログラム結果の評価と達成)は、学生の成果、教員の成果およびこのプログラムによって確認されるその他の成果から評価され、A:計画的な過程をプログラムの有効性を測定するため用いるG本プログラムを策定した方針に従い、正式な申し立てを定義および再検討するまで、7設問で構成される。なお、各設問には、その具体的な内容を問う記述が示されており、それらについてプログラムの反応として、自主ドキュメントのナラティブが求められる。また、全体として学位認定プログラム1に対し、字数の制限があり、基準を遵守している裏付けとなるウエブリンク等の提供を求めている。

2昨年来日したDr.Clarkの講演内容から、学生の成績評価における、AACNによる学士課程の9つの必須要素における領域評価、コンピテンシー、マイルストーンによる評価、および個人の評価と全体的なプログラムの評価への活用についてを検討した。さらに、ジョンズ・ホプキンス大学で開始された保健専門職の技術基準<MedBiquitous>について、今後の検討が必要であることを確認した。国際学会の文献、来日講演、来日時の面接等から、米国、英国、ドイツ、豪州、韓国等の看護大学教育における専門分野別評価システムの概要ならびに国際比較についての検討はほぼ行うことができた。また、わが国における他領域専門分野の評価システムも概要についての検討もほぼ行うことができている。しかし、改訂の有無等、WEB上から現最新版の確認までには至っていない。一方、米国CCNEに関する最新版のデータ収集は概ね行うことができた。しかし、本年度中に英国と豪州においても同様に収集する予定であったが、質的分析ソフトの課題があり、次年度に繰り越しとなった。なお、この点は新たな質的分析ソフトNvivoの活用で可能であることが確認できている。したがって、計画が大幅に遅れているため、本研究を1年間延長することとした。本研究の目的は、わが国大学看護における専門分野別評価の課題を明らかにするため、米国、豪州等および日本の大学看護学教育における高等教育システムをクリティカルレビューにより比較し、大学の認証評価における自己点検評価報告の特徴と教育プロセスの「成果」評価について分析検討することである。今年度は、2010年に各州単位から国家基準に大きく変革した豪州の大学看護RNの認証評価システムの詳細を現地の聞き取り調査を踏まえて検討した。その結果1RNの資格取得は、オーストラリア看護・助産認証委員会ANMAC(Australian Nursing and Midwifery Accreditation Council)の認証指針に基づき、認証された大学の看護・助産課程修了者(学位取得者)が、オーストラリア保健医療従事者規制庁AHPRAの一部門である看護・助産委員会に自らの資格を登録し得られる(国家試験はない)。2AMMACでは、RN Accreditation Standards(2012)による認定基準を策定し、各大学の看護・助産課程は、この基準に基づき5年毎に認証評価を受ける。3各大学はApplication Packの指示に従い記入し、エビデンスを添え、電子媒体でANMACに評価資料を提出。また、毎年年次報告書を提出し、ANMACは変更がないことを確認。4ANMACは現在新たなスタンダード基準を作成中で2018年に公表予定。5メルボルンの2看護大学教員に認証評価システムについて意見を求めると、ANMACの認証評価システムによって看護レベルが全国統一されたため本システムは有用。
二次元スピン系及び電子系における多体効果の計算物理学的研究

1.正方格子J_1-J_2模型に基づき、フラストレーションと量子ゆらぎとの競合を研究し、スピン波分散と副格子磁化を1/S展開で二次の補正まで計算を行った。両方の量とも、線形スピン波理論の結果への補正は、フラストレーションが増すにつれて増大する。二次の補正はJ_2/J_1<0.35では小さく、展開はよく漸近収束している様に見え、よい定量的評価を与えると思われる。補正項はJ_2/J_1<0.4で正の値をもち、線形スピン波理論の結果と較べて、ネール秩序を安定化することが、見い出された。このことは、線形スピン波理論は量子ゆらぎを過大評価しており、それから導かれるJ_2/J_10.5付近でのスピン流体相の存在は、存在するとしてもより限られた領域に制限されるものと考えられる。J_2/J_1>0.4では、2次の補正は絶対値の大変大きな負の値をとり、展開が悪くなることを示している。以上の計算においては、波数に関する多重積分の計算が必要になるが、本年度補助金により増強したワークステーションの利用が大変有効だった。2.t-J模型に基づき、ハイゼンベルグ反強磁性体に低濃度ドープされたホールの運動を研究し、ドルーデ強度と光学伝導度の計算を行なった。slave-fermion Schwinger-boson表示に基づき、ホールのグリーン関数を、自己無撞着ボルン近似を用いてドーピング濃度δの一次の範囲まで正確に求めた。ドルーデ強度Dは、ゲージ不変性とワード恒等式の助けを借りて決定された。Dはδに比例し、又、上記ホールポケットの準粒子有効質量の逆数に比例することがわかった。又、DはJ/tの増加に伴いゆっくりと増加する。有限振動数での伝導度も計算され、スピン励起に特徴的な振動数の近くに大きな強度が見いだされた。これは実験で観測されているmidinfrared bandに対応するものと考えられる。
微量組織からの年齢推定に関する研究:DNA酸化障害の加齢変化による解析

法医実務上,年齢の推定が個人識別を行う上にきわめて重要であり,硬組織を試料とした研究がその主流をしめていた。我々は軟組織からでも年齢を推定できることを明らかにするため,以下の研究を行った。核酸の一種である8ーハイドロキシー2'ーデオキシグアノシン(Oh^8dG)が加齢とともに増加するかをマウスとヒト賢臓を用いて実験した。雌性マウス(BALB/C)を生後0,5,10,15,20,25週ごとに5匹ずつを一群とし,常法に従がい賢臓からDNAを抽出した。抽出したDNAはヌクレア-ゼで処理した後,アルカリホスファタ-ゼ処理し構成成分であるヌクレオシドまで分解した。このヌクレオシド中のOh^8dGをHPLCを用いて測定した。HPLC条件は次のとおり:カラム;Yanapa KODSーA,φ4.6×250,溶離液;10%メタノ-ル含有10mM酸酸アンモニウムBuffer pH5.5,検出器;電気化学的検出器。試料としたヌクレオシドはDNA量として,約200μgをHPLCに導入した。UV検出器では他のヌクレオシドの影響でクロマトグラムはオ-バ-スチ-ルするが,電気化学的検台器を用いると8位のーOHの酸化還元電位により,選括的にOh^8dGを検出し得,1100ngの範囲で検量線は直線を示した。マウス賢臓から抽出したDNAのμg当りのOh^8dGのフェムトモル量は10100の範囲で増加傾向を示し,正の相関があることが明らかになった。次に当教室で司法解剖した症例の中から20,30,40,50,60,70才台を代表する8試料を選び,マウスと同様に賢臓からDNAを抽出し処理した。ヒトの場合は試料数が少ないこともあるが,総じて加齢とともにOh^8dGは増加し,正の相関があることが明らかになった。ヒトの他の臓器についても検討を加える一方,試料数を多くすることにより,精度を高めていくことを検討中である。
血中シアロ糖タンパクと病態との関連性に関する研究-病態シアロームの提唱-

新たな病態マーカーの探索を目的として、血中に存在するシアル酸含有タンパク(シアロ糖タンパク)について、二次元電気泳動法により複数の健常人血漿を用いて解析したところ、その候補となり得るタンパクが数種類見つかった。今後、これらのタンパクについて、各種疾患群との比較を行ったり、糖鎖修飾を詳細に解析したりすることで、新たな臨床的意義を見出せる可能性が高く、本研究の高い有用性が示された。血中タンパクの大部分が糖タンパクであり、糖鎖末端に結合するシアル酸によりミクロヘテロジェニティが形成される。この多様性の程度と病態との間には密接な関係があることが示唆され、詳細な解析を行うことで新たな病態マーカーを見出せる可能性がある。当該年度における研究実施計画としてな、臨床的有用性をもつ可能性のある血中シアロ糖タンパクを見出すために、まずはプロテオミクス的手法を用いた解析方法の確立を目指した。1)試料の前処理方法:試料として血漿を用いるため、最初に試料の前処理法を確立した。血中タンパクの8割以上を占めるアルブミン、IgGなどのアバンダントなタンパクを効率的に除去するために、Agilent社製のMultiple Affinity Removal Spin Cartridge(MARS)システムを採用し、アルブミン、IgGだけでなく、IgA、フィブリノーゲン、α_1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビンの計7種類のタンパクをあらかじめ除去することとした。次に、シアル酸含有糖タンパクの解析を目的としているため、ノイラミニダーゼによるシアル酸の酵素的除去法の最適化条件を検討した。さらに、二次元電気泳動の-次元目として等電点電気泳動を行うのに最適な試料の脱塩方法についても検討を行った。2)二次元電気泳動法:現時点では、まずは血中シアロ糖タンパクを網羅的に解析することを目的として、二次元電気泳動の条件の確立を目指した。ノイラミニダーゼ未処理試料について二次元電気泳動を行うと、タンパクの大部分は中性域に存在するため、一次元目の等電点電気泳動のpHレンジを310のノンリニアタイプとし、長さ13cmのドライストリップを用いることとした。二次元目のSDS-PAGEについても網羅的な解析を行うにあたり必要十分な条件として、アクリルアミド濃度を10%とした。1枚の二次元電気泳動ゲルにアプライするタンパク量を100μgとしたことから、タンパクの検出は、スポットを感度良く検出するために、汎用されるCBB染色ではなくコロイドCBB染色により行うこととした。スポットの解析は二次元電気泳動解析ソフトを用いて行うこととした。当該年度においては、試料の前処理方法ならびに二次元電気泳動条件を確立できた。二次元電気泳動により検出したスポットについては、これから質量分析装置を用いたプロテオミクス的手法により同定を行っていく。平成19年度に、試料とする血清の前処理方法ならびに二次元電気泳動法について、本研究課題の目的に見合ったプロトコールの確立を行った。ところが、血清は血液を凝固させて得られるものであるため、生体内における血中タンパクの動態をより網羅的にとらえるためには、血液凝固というプロセスを介さずに得られる血漿を試料として用いる必要があるという考えに至った。すなわち、血漿を用いることで、血液凝固に伴うフィブリノーゲンをはじめとする血液凝固因子やその他諸因子の分解や損失を回避することが可能となる。また、世界的な動向として、HUPO(The Human Proteome Organisation)が主催するHPPP(Human Plasma Proteome Project)を踏まえたうえでも、やはり試料には血漿を用いるべきと考え、平成20年度は血漿を試料としたときの前処理条件を検討した。血漿を得るためには、血液を採取する際に、抗凝固剤の添加が必要となるが、現在、臨床検査に用いられる抗凝固剤は複数種存在し、頻度良く用いられるものとしては、EDTA、クエン酸、ヘパリンがあるため、これら抗凝固剤の種類の違いによる検討を行った。血漿は、あらかじめAgilent社製のMultiple Affinity Removal SpinCartridge Hu-PL7により、血漿中にアバンダントに含まれる7種類のタンパク(アルブミン、IgG、IgA、α_1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビン、フィブリノーゲン)を除去後、試料とした。抗凝固剤の違いにより、アバンダントな蛋白の除去効率が異なるという結果が得られた。特にフィブリノーゲンの除去効率には明らかな違いが認められ、EDTAを用いたとき残存率が高いことがわかった。しかしながら、クエン酸、ヘパリンを用いた際においても、必ずしもフィブリノーゲンが完全に除去されるわけではなく、むしろ、安定してフィブリノーゲンが残存すること、検査室の現場において使用しやすいことを考えると、血漿を試料とする場合には、むしろEDTAが望ましいと判断した。これまで血漿を試料として二次元電気泳動を行う際、用いる抗凝固剤についてはあまり議論されることは無かったが、我々は臨床検査に応用することを想定しているため、検査室の現場で安定して、再現性ある結果を出すためには、今回の検討は非常に意義があるものと考えている。

平成21年度は、過去2年間かけて確立した血漿を試料としての二次元電気泳動法を駆使し、健常者27名分(男性11名、女性16名、2159歳(平均40.4歳))のEDTA加血漿を用いて、血中シアロ糖タンパクの網羅的比較を行った。このとき、健常者間で量比の変動が著しいタンパクは、患者群との比較を行う際の疾患マーカーとしての候補には成り得ないと考え、まずは健常者群内での比較・解析を行うことにより疾患マーカーの候補タンパクを探索した。まず、EDTA加血漿からアバンダントなタンパクを除去後、ノイラミニダーゼ処理前後での二次元電気泳動を行った。次いでCBB染色後の電気泳動ゲルを二次元電気泳動画像解析ソフト(PDQuest)を用いて非常に数多く存在する血中シアロ糖タンパクを詳細に比較・解析した。これまで同定(マッピング)できていなかったタンパクについては、その都度、LC-MS/MS分析により同定を行った。その結果、疾患マーカー候補として、Adipocyte plasma membrane-associated protein (BSCv protein), Afamin, Alpha-1-microglobulin (Protein HC), Alpha-1B-glycoprotein, ApolipoproteinD, Apolipoprotein-L1, Beta-2-glycoprotein I (Apolipoprotein H), Gelsolin, Glutathione peroxidase 3 (GPx-3), HepatQcytegrowthfactor-like protein (Macrophage stimulatory protein, MSP), Histidine-rich glycoprotein (Histidine-proline-rich glycoprotein, HPRG), Leucine-rich alpha-2-glycoprotein, Zinc-alpha-2-glycoproteinなどが挙げられた。これらほぼ全てのタンパクは、従来の臨床検査項目として日常的には測定されることはない、血中には微量にしか存在しないタンパクばかりであった。今後これらのタンパクについて、各種疾患群との比較を行うことや糖鎖修飾(特にシアル酸修飾)を詳細に解析することで、それぞれのタンパクにおける臨床的意義が見出される可能性は高く、今回行った血中シアロ糖タンパクについての二次元電気泳動による解析の有用性を物語る結果となった。
導電性アモルファス酸化物の超薄膜からなる規則多孔体の作成

本研究は表面ゾル-ゲル法とテンプレート合成法を組み合わせることにより、導電性金属酸化物のナノ構造体により骨格形成された、規則多孔体を作成することを目的としている。前年度までの研究において、我々はセルロース繊維(ろ紙).をテンプレートに用いて表面ゾル-ゲル法をおこなうことにより、壁厚:10-20nm、直径:100-300nm、長さ:2-15μmのチューブ状インジウム-スズ複合酸化物(ITO)が3次元的に絡み合った多孔質構造体を生成することに成功した。これらのITO多孔質構造体は、高い気孔率(>80vol%)であるにもかかわらず室温において高い導電率を示し、中でもインジウムとスズの元素比(In/Sn)が9/1のものは最も高い導電率、0.53Scm^<-1>を示した。In/Sn=9/1の試料に対し、空間充填率を用いて理論密度100%のときの見かけの伝導率を計算したところ、20Scm^<-1>となり、これはスパッタリング法で作成した厚さ20nmの高品質ITO薄膜の導電率とほぼ等しいことがわかった。本研究で作成したITO多孔質材料では、セルロース繊維におけるマクロスケールのネットワーク構造がそのままITOネットワークとして転写されている。従って、そのITOネットワーク構造が電子のパーコレーション経路を形成し、高い気候率にもかかわらず良い導電性を生み出すものと考えられる。これらのITO多孔質構造体は、その構造的・電気的特徴から、センサー、光電変換システムなど、様々な次世代デバイスへの応用が期待される。本研究は表面ゾル-ゲル法とテンプレート合成法を組み合わせることにより、導電性金属酸化物のナノ薄膜により骨格形成された、規則多孔体を作成することを目的としている。そのためにはまず、ボイド・クラックの無い緻密な酸化物超薄膜を生成する方法を確立することが望ましい。そこで研究の第一段階として、表面ゾル-ゲル法およびスピンコーティング法により、シリコン基板上に酸化ハフニウム超薄膜を作成し、両者の微細構造を比較検討した。表面ゾル-ゲル法で得た膜は、ボイドや粒界のない、非常に緻密なアモルファス酸化物層であるのに対し、ゾル-ゲルスピンコーティング法により生成した薄膜は、アモルファス相ではあるが、多くの粒界・空孔を含んでいることを見出した。この結果は、表面ゾル-ゲル法では液相中平衡反応下で酸化物ゲルの析出が起こるため、均質なゲル薄膜が得られ、それにより金属-酸素架橋ネットワークが二次元的に発達した、緻密な酸化物薄膜を生成できることを意味している。これに基づき、研究の第二段階として、表面ゾル-ゲル法により導電性インジウム-スズ複合酸化物超薄膜からなる多孔質材料の形成を検討した。具体的には、ろ紙を基板としてインジウムおよびスズアルコキシドの混合前躯体による表面ゾル-ゲル法を行い、最後にセルロース繊維を燃焼除去した。その結果、厚さ20nm程のインジウム-スズ複合酸化物超薄膜がセルロースファイバーをテンプレートとして直径100nm、長さ数μmのチューブ状に成長し、更にそれが3次元的に絡み合って多孔質構造を形成していることが判明した。この多孔質構造体作成法は、従来のラテックス粒子等の自己組織化構造を利用する方法よりも安価であり、またその多孔体はナノチューブのネットワークにより高い電子伝導性を示すものと期待される。
ゲノム編集技術と核移植を併用した短期間での遺伝子改変クローン集団の作出

CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術は遺伝子機能解析に有効である。しかし、同じ操作を行っても変異の入り方が個体により異なることから、解析のために必要な同一変異個体集団を得るためには、その子孫を得る必要がある。そのため、性成熟期間が長い動物では、実際に解析可能な個体数を確保するために長い時間を要するという欠点があった。そのことを克服ため、無尾両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis)を用いて、核移植により同一遺伝子変異を持つクローン個体集団の作出を行った。また、凍結した細胞の核を用いた核移植胚が正常に発生したことから、有用変異個体の凍結による長期保存が可能になった。1.TALEN等の人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、遺伝子機能の解析に有効な技術である。無尾両生類アフリカツメガエルにおいても人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は可能であるが、性成熟期間が長いため、F1個体やF2個体の作出により同一変異個体群を得るためには時間を要する。この問題を解決するために、核移植によるクローン作出技術を併用し、短期間で解析に必要な個体群を得る実験系を確立することが本研究の目的である。これまでに、除核法、および供与核の調整時期を検討し、微小ピペットを用いた吸引法による卵核の除去、および原腸胚外胚葉細胞から供与核を調整することにより、実験開始当初ほぼ0%であった正常卵割率が平均50%まで上昇した。その後の発生において奇形になる個体が数多く生じるのが現状であるが、正常に変態した幼体を得ることができたことから、実験条件としては問題ないと判断している。2.発生が進んだ細胞の核を用いた場合、核移植効率が激減する。そこで、ゲノム編集操作を行ったどの個体に目的の変異が入っているか解析が完了するまで細胞を凍結保存できないか簡易ガラス化法を用いて検討した。初期原腸胚を凍結・解凍後、死細胞を染めるトリパンブルー染色を行ったところ、染色されない細胞が存在する条件を見出した。しかし、この細胞核を用いて核移植を行ったが、未だ卵割を開始する卵を得ることには成功していない。変異解析のための時間を確保する目的で、1週間培養した胚細胞を用いて核移植を行った。卵割率は15%であったが、この割球を用いて再度核移植を行ったところ、正常卵割率が約40%まで上昇した。この方法を用いて、変異解析後に核移植によるクローン作出が可能になった。3.生殖細胞特異的に発現するXtr遺伝子の機能破壊を行うためにTALEN mRNAを作成し、効率よく変異を入れることができるmRNAを選別することに成功した。1.核移植の条件がほぼ確立した。2.人工ヌクレアーゼにより変異を入れた胚細胞の中で、どの細胞に目的の変異が入っているか調べる間、細胞を凍結する計画をしていたが、未だ凍結保存法は確立していない。しかし、1週間培養した胚細胞の核を用いてクローン個体を作出できることが明らかになったことから、変異解析を行う時間を確保することが可能になった。このことから、当初の計画は達成できなかったが、目的は達成できた。3. venus遺伝子を挿入したtransgenic個体を用い、このvenus遺伝子に変異を入れるTALEN mRNAもしくはCRSPR mRNAの作成を計画していたが、手持ちのtransgenic個体卵の正常発生率が悪かったことから、この計画を断念した。代わりに、既に報告があるtyrosinase遺伝子に変異を入れるCRISPR mRNAを作成している。Xtr遺伝子に変異を入れることができるTALEN mRNAの選別は、既に終えた。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。1.人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、遺伝子機能解析に有効な技術である。しかし、目的の変異が入った個体を選別し、遺伝子機能解析のために必要な数の変異個体集団を確保するためには、F1世代やF2世代を得る必要がある。無尾両生類アフリカツメガエルの場合、性成熟期間が長いため、同一変異個体集団を確保するためには時間を要する。この問題を解決するために、核移植により同一変異個体集団を短時間で確保することが本研究の目的である。核移植によるクローン個体作成の成功率は一般に低いことから、いかに簡便かつ短時間で操作ができ、多くの核移植個体を作成できるかが重要なポイントになる。これまで卵子の雌性核を除去する方法として微小ピペットによる物理的な除去法を開発してきたが、この方法の場合、鍛錬した技術と時間を要するという欠点があった。そこで、紫外線照射により一度に数多くの卵子の雌性核を不活化する条件を見出した。この卵子に核を移植することで正常個体を得ることができたことから、紫外線照射による発生への影響がないことを確かめた。CRISPR RNAでチロシナーゼ遺伝子に変異を入れた胚細胞を用いて核移植を行い、同一変異が入ったクローン集団を作成することに成功した。2.目的の遺伝子に変異が入った個体の細胞を用いて核移植を行うことでクローン個体集団を恒常的に確保するために、胚細胞の凍結保存法を検討している。アフリカツメガエルの初期胚細胞を凍結保存し、解凍後にその生存性を保持する技術は未だ確立していない。3.チロシナーゼ遺伝子に変異を入れるためのCRISPR RNAの作成に成功した。1.卵子の雌性核を紫外線照射により不活性化する条件を明らかにした。この卵子に核移植を行い、正常発生を行う胚を得ることができた。

正常発生する個体の率が低いという問題は残っているものの、短時間で多くの卵子に対して核移植を行うことが可能になったことで、解析に必要な個体数を確保することが可能になった。2.遺伝子解析のための時間は、一週間培養した胚細胞の核移植が成功したことにより確保できたが、目的の変異が入った個体の細胞を用いた恒常的な核移植のためには、やはり凍結保存法の確立が必要である。未だ、凍結した初期胚細胞の核を用いた核移植は成功していない。3.チロシナーゼ遺伝子に変異を効果的に入れるCRISPR RNAを作成することに成功した。このRNAを用いてチロシナーゼ遺伝子に変異を入れ、この細胞の核を移植することにより、同一遺伝子変異を有する原腸胚集団を得ることができた。しかし、その後の正常発生率が低かったため、チロシナーゼ遺伝子変異における表現型への影響については確認できていない。1.CRISPR/Cas9システムのような人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術は遺伝子の機能解析に有効であるが、解析のために必要な同一変異個体集団を得るためにはF1もしくはF2を作成する必要がある。そのため、両生類のような性成熟期間が長い動物では解析までに長い時間を要していた。その欠点を克服するために、ゲノム編集した個体の細胞核を未受精卵に核移植する技術を確立して、短時間で同一変異個体集団を作成することを試みた。昨年度までに未受精卵から簡便かつ効率よく除核する方法を確立し、核移植個体作成に成功していた。本年度は、CRISPRでtyrosinase遺伝子に変異を入れたゲノム編集個体を作成し、中期原腸胚まで発生したところで核移植を行い、さらにこの個体が中期原腸胚まで発生したところで再度核移植を行った。その結果、同一変異を持つクローン集団を作成することに成功した。2.核移植を成功させるためには、遅くとも神経胚から初期尾芽胚の細胞核を用いる必要があった。核移植後3日目には初期尾芽胚になることから、どの個体に目的の遺伝子変異が入っているか解析するには時間が短すぎる。そのことを克服するため、中期原腸胚の細胞塊を凍結保存する技術の開発を行った。一般に、卵黄が多い動物種の胚を凍結保存することは難しいとされているが、ガラス化法で凍結し解凍した細胞の核を除核卵に核移植することで、オタマジャクシまで発生した個体を得ることに成功した。この成果は、ゲノム編集した胚の中でどれが目的の変異を有しているか解析するための時間を確保できるばかりか、有用変異個体の胚を凍結保存することで、必要に応じて変異個体を入手することが可能になり、バイオリソースの観点からも注目すべき成果である。CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術は遺伝子機能解析に有効である。しかし、同じ操作を行っても変異の入り方が個体により異なることから、解析のために必要な同一変異個体集団を得るためには、その子孫を得る必要がある。そのため、性成熟期間が長い動物では、実際に解析可能な個体数を確保するために長い時間を要するという欠点があった。そのことを克服ため、無尾両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis)を用いて、核移植により同一遺伝子変異を持つクローン個体集団の作出を行った。
身体活動の向上が歯周病態を改善する機序におけるApelinの役割と予防への応用

高齢者における身体活動と口腔内の状態を追跡調査により検討したところ、ベースライン時に嚥下機能が低下していた者は1年後の身体活動と栄養状態が有意に低下していた。2年間の追跡調査の結果から、残存歯9本以下で嚥下機能が低下していた者は残存歯が10本以上で嚥下機能が正常の者と比べて死亡リスクが2.89倍高いことがわかった。身体活動と関連の深い最大呼気流量を指標に、舌清掃を加えた口腔ケアの効果について高齢者を対象に調査したところ、4週間の介入により、最大呼気流量は対照群に比べて介入群で有意に上昇していた。一方、血液中のapelinと最大呼気流量との関連は、統計的に有意な差を得ることができなかった。歯周医学の視点に立った実証研究のため、ウシ頸動脈内皮細胞株(HH細胞)でコーティングした新規微小流路チップを用いて、灌流下でマクロファージによるプラック様塊の形成を観察した。その結果、HH細胞非コーティング群では、マクロファージは付着せず、滑らかに流れた。一方、HH細胞コーティング群では、非感染マクロファージは滑らかに流れたが、歯周病原性細菌感染マクロファージは、ピラー周囲に多く付着し、流路内のHH細胞にも付着が観察された。これらの結果から、同実験系は、歯周疾患と動脈硬化の関連性の分子メカニズムを解析する上で、極めて有効なツールであることが示唆された。新規の炎症性サイトカインであるIL-33は、動脈硬化への関与が報告されている。今回、IL-33が単球・マクロファージ系に及ぼす作用について、MMP-9に着目して研究を行った。RAW264.7細胞に対して、IL-33を添加し、培養を行ったところ、刺激後の細胞において、MMP-9の遺伝子およびタンパクレベルの発現亢進が観察された。さらに培養上清に対して行ったZymogramの結果、MMP-9酵素活性の増強も確認された。このIL-33によるMMP-9の発現誘導に関わる細胞内シグナルの解析の結果、MMP-9の誘導にERK-CREB-AP-1経路およびNF-κB経路の関与が示唆された。高齢者施設で口腔ケアの際に舌に刺激を与えたところ、最大呼気量が増大した。高齢者では咳嗽力と最大呼気量は相関することが知られていることから、舌刺激は咳嗽力の維持向上に寄与するものであり、本研究の結果は、口腔ケアが誤嚥性肺炎を予防することに関する医学的根拠を与えるものである。歯周疾患と動脈硬化の関連性の分子メカニズムを解析することを目的に、歯周病原性細菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitans感染マクロファージが血管内でプラークを形成する機序を研究するにあたり、傷ついた微小血管内をピラーにより再現できたことから、有効な研究ツールを開発することができた。炎症性サイトカインであるIL-33が、単球・マクロファージ系細胞からのMMP-9の発現を亢進させることで、プラークの脆弱化や易破綻性を介して急性冠症候群の発症に関与している可能性について一定の知見を得ることができた。口腔ケアによる咳嗽力の向上について介入研究を行う高齢者施設との調整が進み、研究を推進する上で有用な研究フィールドをえることができた。福岡県久山町の研究において、対象者2343人の口腔内から唾液を採取し、16S rRNAにより口腔内細菌を系統的分類した。重回帰分析の結果から、系統分類の多様性(PD: phylogenetic diversity)が低いほど、口腔の健康度(プラーク指数、未処置う歯、歯肉出血、および喫煙習慣)は高かった。また、PDは歯の喪失とも関連があった。これらの結果から、口腔細菌叢と口腔の健康との関連を大規模調査の結果に基づきで明示することができた。嚥下機能と健康の関連についても調査を行った。居宅の60歳以上の地域住民を対象とした調査では、低栄養でない者であっても、嚥下機能が低下していると、咀嚼・嚥下可能な食品数が限定されるため、1年後に栄養状態が低下していた。これに加えて、高齢者施設入所者を対象とした調査では、舌刺激・清掃を加えた介入群では、対照群と比べて最大呼気流量が有意に増加することがわかったことから、口腔ケア時に舌に刺激を与えることで肺の機能ないしは咳嗽力が向上し、誤嚥性肺炎を予防することができる可能性が示唆された。熊本県での1377名の65歳以上の地域住民を対象とした調査では、介護認定者で主観的健康観の高い群、介護認定者で主観的健康観の低い群、介護非認定者で主観的健康観の高い群、介護非認定者で主観的健康観の低い群の4群間で、主観的な咀嚼機能との関連を解析したところ、介護非認定者で主観的健康観の高い群では、主観的な咀嚼機能の高いものの割合が72.7%であり、他の群と比べて有意に割合が高かったことから、主観的咀嚼機能は、地域で暮らす高齢者の自立度と関連があることがわかった。

運動の負荷に関するボランティアが統計解析に必要な人数分集まらなかったため血液データの検討が進んでいない福岡県での在宅高齢者に対して1年間の追跡調査の結果、聴診による嚥下機能の評価により、嚥下機能が低下した高齢者では、嚥下機能が低下していない高齢者と比較して栄養不良のリスクが5.2倍、日常生活動作の低下のリスクが6.4倍増加していた。このことは、嚥下機能は食事による栄養摂取に重要な要因であることから、嚥下機能が低下すると栄養不良により日常生活動作が低下したものと考察された。また、2年間の追跡調査の結果、嚥下機能が低下しておりかつ残存歯が9本以下の高齢者では、嚥下機能の低下がなくかつ残存歯が10本以上の高齢者と比べて、死亡リスクが2.9倍高まることもわかった。これらのことから、残存歯による十分な咀嚼と、これにより形成された食塊を嚥下する機能を保つことは、生活機能の維持とともに死亡リスクの低下につながることが示唆された。また、この嚥下機能の評価を簡便に行うため、摂食嚥下障害のアンケートで用いられるMD Anderson Dysphagia Inventoryの日本語版を作成し、その信頼性と妥当性を検討した。Cronbachのα係数は0.92で高い内部一貫性を得た。テスト再テスト法では0.84と信頼度も高かった。舌清掃を加えた口腔ケアが最大呼気流量を増加させることをこれまでの研究から明らかにしてきたことから、身体活動の指標として最大呼気流量と血中apelinの関連を調査するため、北九州市内の回復期病院および高齢者施設の入院・入所者を対象に、舌清掃を加えた口腔ケアの介入研究により、最大呼気流量と血液データの関連を調査したが、統計的に有意なデータを得ることができなかった。高齢者における身体活動と口腔内の状態を追跡調査により検討したところ、ベースライン時に嚥下機能が低下していた者は1年後の身体活動と栄養状態が有意に低下していた。2年間の追跡調査の結果から、残存歯9本以下で嚥下機能が低下していた者は残存歯が10本以上で嚥下機能が正常の者と比べて死亡リスクが2.89倍高いことがわかった。身体活動と関連の深い最大呼気流量を指標に、舌清掃を加えた口腔ケアの効果について高齢者を対象に調査したところ、4週間の介入により、最大呼気流量は対照群に比べて介入群で有意に上昇していた。一方、血液中のapelinと最大呼気流量との関連は、統計的に有意な差を得ることができなかった。心肺機能を含む高齢者の運動機能を計測するにあたり、掛けることができる負荷について今後決めるが、健康障害が出ないよう、施設側の職員との連携のあり方について今後検討する必要がある。運動負荷にかかる対象者を高齢者施設の入所者に限定し、運動負荷も軽微にして実施するよう研究デザインを再考する。口腔衛生学学会に直接参加するための旅費が発生しなかったため運動に関するボランティが平成28年度までに十分集まらなかったため、血液解析を行わなかったため学会に直接参加するための旅費を使用するとともに、実験に要する物品の計画的な購入を行う。研究対象について一部見直して、血液データの解析を行う。