hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南北朝後期・隋唐時代における華夷意識の変容と南朝系官僚の動向

2008年度は、年次計画に沿い、以下の2点の研究を進めた。1「北周政治史研究」:昨年度に引き続き、北周政治史の分析を進め、以下の3本の研究報告を行った。会田大輔「西魏・北周・隋における対南朝意識-対南朝表現の変化を通じて-」(第57回東北中国学会、2008年5月25日)は、西魏から隋にいたる南朝意識を検討し、南朝を「夷」とする意識は、西魏・北周前半期には希薄であり、北周後半期に国力が増強し、制度・文化が整備されたことによって再び生じ、隋に継承されたことを指摘した。会田大輔「『山公寺碑』からみた北魏後半期の州府僚佐」(中国石刻合同研究会、2008年7月26日)は、北魏後半期の州府僚佐(地方下級官僚)について、新出史料の「山公寺碑」を用いて分析を加え、州府僚佐の序列・官名を特定した。また、「山公寺碑」中の州府僚佐就任者の姓名を分析した結果、〓州では下級官僚に地元の非漢族を積極的に登用し、その取り込みを図っていたことが明らかとなった。また、会田大輔「北周「延寿公碑」に関する一考察」(第45回五胡の会、2009年3月21日)では、従来等閑視されてきた北周と地方勢力の関係について、「延寿公碑」という石刻史料を用い、分析を加えた。2「隋唐における南北朝歴史像」:昨年度に引き続き、南朝系官僚の虞世南が撰した歴史書『帝王略論』の分析を進め、昨年度研究会で報告した「敦煌本『帝王略論』に関する一考察-『帝王略論』の利用状況と散逸時期をめぐって-」を論文化し、来年度、中国の学会で報告する予定である。また、日本における『帝王略論』の受容について検討を進め、『帝王略論』が日本伝来時には、簡便な中国通史として受容されたが、後に君主論として認識されていた可能性の高いことを明らかにした。2006年度は、年次計画に沿い、以下の三点の研究を進めることができた。1「北周政治史研究」:北周前半期に実権を握った宇文護に関する研究を進め、その成果を第37回五胡の会(2006年7月30日)で、「北周宇文護執政期の婚姻政策」と題して報告し、続いて第30回内陸アジア・イスラム研究者集会合宿(2006年8月20日)で、「北周宇文護執政期再考-人材抜擢・腐敗問題を中心に-」と題して報告した。その結果、腐敗した独裁政権という従来の宇文護執政期評価が誤りであり、むしろこの時期に胡族・漢族を包括する協力体制が敷かれたことが明らかとなった。2「隋唐における南北朝歴史像」:『周書』の北周歴史像を今析し、その成果を中国中世史研究者フォーラム例会(2006年11月4日)で、「令狐徳〓等撰『周書』の西魏北周像-宇文護・武帝像を手がかりに-」と題して報告した。『周書』と隋唐の諸史料を比較した結果、『周書』において宇文護執政期の評価が既められた一方で、武帝の評価が高められていたことが判明した。その背景には、唐室李氏が、唐室および北周出身者(関隴集団)の権威を「創出」するために、西魏北周の顕彰をはかり、武帝を英雄化した可能性が考えられる。また、隋に仕えた宇文述の墓誌を分析し、明治大学新収中国石刻貴重拓本展H「出展拓本をめぐる研究セミナー」(2007年3月28日)で、「「宇文述墓誌」紹介」と題して報告した。その結果、宇文述の一族の出自意識が正史と異なっていることが判明した。3「北朝隋唐の南朝系官僚の動向」:北周の{鬼偏政権である後梁を建国した薫管が、『周書』中でどのように描かれているかを分析し、「蕭〓の「遣使称藩」に関する-考察-『周書』に描かれた蕭〓像をめぐって-」(『文化継承学論集』3、2007年3月)にまとめた。その結果、『周書』の編纂者で、南朝系官僚の岑文本が、蕭〓の孫で唐の高官であった蕭〓のために、蕭〓を顕彰したことが明らかとなった。2007年度は、年次計画に沿い、以下の三点の研究を進めた。1「北周政治史研究」:昨年度に引き続き、北周前半期(宇文護執政期)の分析を進め、以下の2本の論文を発表した。会田大輔「北周「張僧妙碑」からみた宇文護執政期の仏教政策」(氣賀澤保規編『中国石刻資料とその社会-北朝隋唐期を中心に-』汲古書院、2007年9月)pp.207-238、会田大輔「北周宇文護執政期再考-宇文護幕僚の人的構成を中心に-」(『集刊東洋学』98、2007年10月)pp.20-41。その結果、従来の宇文護執政期評価と異なり、宇文護執政期に胡族・漢族・仏教勢力を含めた幅広い協力体制が敷かれていたことが判明した。2「隋唐における南北朝歴史像」:定例

中国石刻文物研究会(2007年6月9日)において、「「宇文述墓誌」と『隋書』宇文述伝-『隋書』の宇文述像形成をめぐって-」と題し、報告を行った。その結果、墓誌と『隋書』の間で宇文述像が異なっており、『隋書』の宇文述像形成の背景に、唐室の歴史政策・氏族政策が関与していることが明らかとなった。3「北朝隋唐の南朝系官僚の動向」:南朝系官僚の虞世南撰『帝王略論』の分析を本格的に開始し、第40回五胡の会(2007年7月29日)において、「敦煌本『帝王略論』に関する一考察-『帝王略論』の利用状況と散逸時期をめぐって-」と題して、唐宋代における『帝王略論』の利用状況と散逸時期を分析した。また、北斉における南朝系官僚の一動向を分析し、「北斉における蕭荘政権人士-「袁月〓墓誌」を中心に-」(公益信託松尾金藏記念奨学基金編『明日へ翔ぶ-人文社会学の新視点-1』風間書房、2008年3月)pp.1-26と題して論文化した。2008年度は、年次計画に沿い、以下の2点の研究を進めた。1「北周政治史研究」:昨年度に引き続き、北周政治史の分析を進め、以下の3本の研究報告を行った。会田大輔「西魏・北周・隋における対南朝意識-対南朝表現の変化を通じて-」(第57回東北中国学会、2008年5月25日)は、西魏から隋にいたる南朝意識を検討し、南朝を「夷」とする意識は、西魏・北周前半期には希薄であり、北周後半期に国力が増強し、制度・文化が整備されたことによって再び生じ、隋に継承されたことを指摘した。会田大輔「『山公寺碑』からみた北魏後半期の州府僚佐」(中国石刻合同研究会、2008年7月26日)は、北魏後半期の州府僚佐(地方下級官僚)について、新出史料の「山公寺碑」を用いて分析を加え、州府僚佐の序列・官名を特定した。また、「山公寺碑」中の州府僚佐就任者の姓名を分析した結果、〓州では下級官僚に地元の非漢族を積極的に登用し、その取り込みを図っていたことが明らかとなった。また、会田大輔「北周「延寿公碑」に関する一考察」(第45回五胡の会、2009年3月21日)では、従来等閑視されてきた北周と地方勢力の関係について、「延寿公碑」という石刻史料を用い、分析を加えた。2「隋唐における南北朝歴史像」:昨年度に引き続き、南朝系官僚の虞世南が撰した歴史書『帝王略論』の分析を進め、昨年度研究会で報告した「敦煌本『帝王略論』に関する一考察-『帝王略論』の利用状況と散逸時期をめぐって-」を論文化し、来年度、中国の学会で報告する予定である。また、日本における『帝王略論』の受容について検討を進め、『帝王略論』が日本伝来時には、簡便な中国通史として受容されたが、後に君主論として認識されていた可能性の高いことを明らかにした。
Neurogenesis imaging(内在性神経幹細胞画像)の確立と臨床応用

虚血後に生じるグリア細胞の過剰増殖を検出可能な手法として、マンガン造影剤を利用したMR画像法を示し、低濃度の造影剤を用いた場合にもグリオーシス領域を検出できることを示した。また、梗塞巣を伴わない脳虚血研究において、グリアの増殖が生じる前の海馬領域にマンガン取り込みによる緩和時間の短縮が検出された。マンガンの緩和機構にタンパクの結合が大きく寄与する可能性を示した。成体脳における内在性神経幹細胞による神経再生の過程をin vivoにおいて画像化することを目的に,造影効果の強いMnを細胞に取り込ませて画像化するMEMIの手法を発展させて詳細な画像測定を行った.1)高分解能3D-MEMRI測定法を用いてa)ラット正常脳におけるMn造影画像と病理組織切片との精密な比較解析を行った.その結果,正常脳で特に造影効果が著明である海馬周辺領域において,細胞内に分布するMnによるMRIの造影効果が確認された.内在性神経幹細胞が多く存在するとされる海馬や傍側脳室領域では,経静脈的に全身に投与されたMnが脈絡叢から脳脊髄液に入り,最初に脳実質内に入る領域に相当する.この領域で造影される細胞は神経細胞,グリアおよび内在性神経幹細胞が含まれるものと考えられた.さらに,b)ラット実験的虚血モデルにおけるMn造影画像の解析を行った.ラット中大脳動脈閉塞モデルにおいては脳梗塞周辺部にMEMRIにてMnの取り込みによる信号強度の増大を認め,この信号強度の増加した領域は,病理組織学的検討によりGFAP染色にて陽性をしめすグリア細胞(星状神経膠細胞)の増殖領域に一致していた.また,ラット四主幹動脈結紮による一過性前脳虚血モデルにおいては虚血72時間後に海馬のCA1およびCA2領域においてMEMRI上信号増加が確認された.これは虚血損傷部のミクログリアの活性を反映することが示唆された.In vivoにおいてこれらの細胞活動の変化を画像化することが可能となり,今後の研究の基礎として重要な成果であったと考える.成体脳における内在性神経幹細胞による神経再生(neurogenesis)をin vivoにおいて画像化することを目的として,造影効果の強いMnを細胞に取り込ませて画像化するMEMRIの手法を発展させて3D-MRIによる詳細な画像測定および解析法の確立を試みた。a)正常脳におけるMn造影画像の精密な解析:ラット正常脳における3D-Mn造影画像を撮影して精密に解析した結果,Mn投与のよって造影される領域は細胞内に存在するcalbindinやparvalbuminなどのカルシウム結合タンパクの分布と一致することから,Mnは細胞内においてこれらのタンパクと結合して存在し緩和効果を増強することが示唆された.b)実験的脳虚血におけるMn造影画像の解析:これまで中大脳動脈一過性閉塞モデル(temporary MCA occlusion : tMCAO)において反応性グリア(活性化アストロサイト)の脳梗塞巣周辺への集積の画像化に成功し報告してきた.今回さらに,四主幹動脈結紮による一過性前脳虚血モデルを対象に,虚血後2日,3日,10日後にMEMRIを撮影し,GFAP染色,NeuN染色による組織学的検討を併せて行った.CA1において3日後,10日後にMnによる有意なT1低下が認められた.この所見は,3日後にはGFAP陽性は有意ではないため,蛋白産生の増加やミクログリア活性を反映すると考えられた.10日後には神経細胞の脱落が明らかになるとともにGFAP陽性が有意となり,アストロサイトの活性化を示すものと考えられた.反応性グリアは乳酸産生によるアシドーシス,グルタミン酸取り込み低下,spreading depression,細胞性浮腫の増強,種々のサイトカインの放出などによって神経障害性に作用するとされ,この機能制御による脳梗塞の治療法が期待される.成体脳における内在性神経幹細胞による神経再生過程をin vivoにおいて画像化することを目的に研究を実施した。造影効果の高いマンガンを細胞に取り込ませて画像化するMEMRIの手法により、組織の反応を高い空間分解能で観察することが可能である。ラットにマンガンを投与した精密な造影画像より、マンガンは細胞内においてタンパクと結合して存在し、水溶液以上に緩和効果を増強する可能性が示された。追加で実施したイメージングファントムを用いた実験においてもアルブミンの有無によって緩和時間が変化したことから、タンパクがマンガンの緩和能に強く影響を及ぼすことが示された。これらの基礎データを元にして、低濃度の造影剤を投与した際の反応を画像化した。マンガンは重金属であるが食べ物にも含まれる元素であり、濃度の薄いマンガン水溶液は、投与しても緩和時間に変化を及ぼすほど組織に蓄積することは無い。しかし、アストロサイトの活性が見られるgliosisと呼ばれる領域においては、通常蓄積しない程度のマンガンであっても組織コントラストに変化を及ぼすことが明らかとなった。ガドリニウム製剤においても、血漿中のアルブミンと結合する置換基を導入した製剤で高い緩和効果が報告されており、緩和剤とタンパクとの関係性が示されている。

グリアのダイナミックな動きが見られる虚血モデルとカルシウムチャネルを介するマンガンのような造影剤を組み合わせた研究手法は、将来的な臨床応用を目指した薬剤開発に応用可能な画像手法になり得る。
CFRPを活用した歩行支援装具の開発

本研究は,炭素繊維強化プラスチック(CFRP)を活用した軽量かつ高強度な歩行支援装具の開発を目的としている.金属フレーム装具は運動障害者の歩行支援に有用だが,重い(約2kg)ため,使用を断念する患者も多い.申請者は,金属に比べ軽量であるCFRPに着目し,パラリンピック選手用の義足を参考にした装具を考案した.この装具の開発のため,まず1脚が受ける反力と支援効果の大きさを考慮し,装具全体の設計を行う.次いで,2脚と接する箇所を中心に装具のトポロジ最適化を行い,軽量化を図る.最後に,3実際に作製した装具を用いて歩行試験を行い,その支援効果を明らかにする.本研究は,炭素繊維強化プラスチック(CFRP)を活用した軽量かつ高強度な歩行支援装具の開発を目的としている.金属フレーム装具は運動障害者の歩行支援に有用だが,重い(約2kg)ため,使用を断念する患者も多い.申請者は,金属に比べ軽量であるCFRPに着目し,パラリンピック選手用の義足を参考にした装具を考案した.この装具の開発のため,まず1脚が受ける反力と支援効果の大きさを考慮し,装具全体の設計を行う.次いで,2脚と接する箇所を中心に装具のトポロジ最適化を行い,軽量化を図る.最後に,3実際に作製した装具を用いて歩行試験を行い,その支援効果を明らかにする.
ラフトタンパク質PFOの構造・相互作用解析と核酸性イオンチャネルの創製

(1)PFOタンパク質を用いたラフトの機能解析と構造解析に向けた基盤の確立PFOタンパク質のC末端側コレステロール結合ドメイン(D4)を、アルギニン法によってリフォールディングした。これによりコレステロール結合能を有するD4を調製することに成功した。この試料を用いてD4の共鳴線の帰属を進行させた。得られた帰属結果は、今後D4とコレステロールの膜中における相互作用をTCS法等によって解析する際に、基盤として利用する事ができる。(2)核酸性イオンチャンネル創製の試み4重鎖核酸構造の中にカリウムイオン等が結合している様子が、カリウムイオンチャネル中に同イオンが結合している様子によく似ている事から、核酸がイオンチャネルとして動作するのではないかと思い至った。異なる3種の実験系から、核酸を介したイオンの移動が生じている事を示唆する結果が得られた。(3)ロングレンジの構造情報を用いたマルチドメインからなるタンパク質の構造決定法の確立神経幹細胞の分化を制御するMusashiタンパク質は、タンデムに連なった2つのRNA結合ドメインを有している。常磁性緩和促進(PRE)と残余双極子結合(RDC)に基づいたロングレンジの構造情報を含めた結果、2つのドメインの相対配置に関して複合体中で十分な精度(r.m.s.d.0.7A以下)で決定できる事が分かった。(4)抗HlV活性を有するAPOBEC3Gタンパク質によるデアミネーション反応のリアルタイムモニタリングヒトのAPOBEC3Gタンパク質は、HIVが感染した際に生合成される同ゲノムのマイナス鎖DNAに作用し、シチジンをデアミネーションしてウリジンに変換する。これによってHIVのゲノム情報は不活化される為、APOBEC3Gは抗HIV活性を有する。APOBEC3Gの立体構造及び1本鎖DNAとの相互作用様式の決定を行なった。さらにAPOBEC3Gによるデアミネーション反応がNMR試料管内で生じ、それをNMRシグナルを用いてリアルタイムでモニターできる事を示した。1本鎖DNAに複数の反応部位が存在する場合、APOBEC3Gは3'→5'の順序をもってデアミネーション反応を進行させる事が分かった。(1)PFOタンパク質Perfringolysin Oはコレステロールに富む膜領域に選択的に結合する性質を持つ。無毒化誘導体を用いたT細胞脂質ラフトの解析から,加齢に伴うその量的/質的変化を示唆する結果を得た。脂質ラフトはT細胞活性化の初期反応の「場」と考えられることから,ラフトに局在するシグナル伝達関連分子群を解析したところ,T細胞活性化を「負」に制御する分子群の加齢変化を見出した。T細胞の活性化能は加齢に伴い著しく低下することが知られているが,上記の結果は,脂質ラフトの量的/質的変化がその原因の一つであることを示唆するものと考えられる。PFOのコレステロール結合ドメインであるD4は凝集しやすいが,凝集防止剤を添加する等の工夫を行うことで,共鳴線の帰属をある程度まで進める事ができた。(2)核酸性イオンチャネルリポソームに4重鎖核酸を組み込み,4重鎖核酸にチャネル活性があるのかを検証した。リポソーム内に金属イオンと蛍光性のpH指示薬を封入し,これをリポソーム内に比べ金属イオン濃度とpHが低い水溶液に移した。ここにプロトンイオノフォアを添加する事で,リポソームからの4重鎖核酸を介した金属イオンの流出とそれとカップルしたリポソーム内へのプロトンイオノフォアを介したプロトンの流入が生じるのかを,蛍光性pH指示薬の蛍光強度の変化を蛍光分光器でモニターする事によって,検証した。リボソームに4重鎖核酸を組み込んだ時のみ,プロトンイオノフォアの添加に添うリポソーム内の蛍光強度の減少(pHの低下)が見られた。これは金属イオンの流出とそれにカップルしたプロトンの流入が生じている事を示しており,4重鎖核酸がチャネル活性を有する事が示唆された。目下コントロール実験や他の手法による検証も併せて行い,この事のさらなる検証を進めている。(4)抗HlV活性を有するAPOBEC3Gタンパク質によるデアミネーション反応のリアルタイムモニタリングヒトのAPOBEC

3Gタンパク質は、HIVが感染した際に生合成される同ゲノムのマイナス鎖DNAに作用し、シチジンをデアミネーションしてウリジンに変換する。これによってHIVのゲノム情報は不活化される為、APOBEC3Gは抗HIV活性を有する。APOBEC3Gの立体構造及び1本鎖DNAとの相互作用様式の決定を行なった。さらにAPOBEC3Gによるデアミネーション反応がNMR試料管内で生じ、それをNMRシグナルを用いてリアルタイムでモニターできる事を示した。1本鎖DNAに複数の反応部位が存在する場合、APOBEC3Gは3'→5'の順序をもってデアミネーション反応を進行させる事が分かった。
重症難治性喘息への挑戦　抗炎症性脂質メディエーターの作用解析から創薬へ向けた研究

喘息は気道の慢性炎症性疾患でありステロイド吸入薬により大きな治療の進歩をとげた。しかし、重症喘息に対する適切な治療法は未だ十分とは言えないため、喘息発症・増悪をもたらす病態の解明や新規治療法の開発を目指すことを研究の目標としている。重症気管支喘息に対する新たな治療アプローチとなる可能性を秘めた新規抗炎症性脂質メディエーターに関する基礎的検討を実施している。すなわち、Resolvinなどのω3系脂肪酸から生成される炎症収束作用を持った抗炎症性脂質メディエーター群は、ホメオスタシス調整機能の一端を担う物質であるため、その産生低下や機能不全が炎症収束破綻をもたらし喘息発症、増悪などにもつながるという仮説が成り立つ。そのため、この病態の解明と治療への応用を発展させることを目的として今年度の実験を行った。ハウスダストマイト(HDM)誘導喘息モデルマウスにおけるResolvin E (RvE)群の炎症収束効果の解析を行った。HDM点鼻終了後にRvE群を投与し、メサコリンに対する気道抵抗測定、肺胞洗浄液中の炎症性細胞について解析し、比較した。肺胞洗浄液中のサイトカインについてもELISA法で評価した。次に、各RvE群の作用機序解明(in vitro実験)も行った。RvE3は、RvE1やRvE2と比較して、より強力にこのアレルギー性喘息モデルで効果を示した。また、RvE3のこの作用機序は、樹状細胞からのIL-23/IL-17産生を抑制することにより惹起されることが示唆された。以上の結果は、国際学会で発表することができ、すでに英文化して論文投稿も行うことができた。現在、査読者から要求された追加実験を行っている最中である。本研究における平成30年度の目標であるハウスダストマイト(HDM)誘導喘息モデルマウスにおけるRvE群の炎症収束効果の解析については、おおむね予定どおり実行できている。これまでの予備実験どおりRvE3投与群がRvE1投与群と同等以上の肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、好酸球、リンパ球数の減少効果を示すことがわかった。特に、総細胞数と好酸球数において、有意にRvE1やRvE2よりも抑制していることが示せた。In vivo実験において、HDM点鼻終了後にRvE群を投与し、メサコリンに対する気道抵抗を測定した結果、RvE3は気道過敏性亢進を抑制することも明らかとなった。以上より、RvE3はHDMにより惹起されるアレルギー性気道炎症を抑制し、気管支喘息の重要な指標の一つである気道過敏性も抑えることが示され、今後の治療戦略を考えるうえで有用な物質であることが示唆された。また、RvE3のこの作用のメカニズムを検討するためにin vitroの実験を行った。マウスから採取した骨髄由来樹状細胞(BMDC)をHDMで刺激するとIL-23産生が亢進するが、この反応をRvE3は有意に抑制することが明らかとなった。以上より、RvE3のHDMによるアレルギー性気道炎症を抑制する作用機序の一つは、樹状細胞からのIL-23/IL-17産生抑制によることが示唆された。しかし、RvE3の受容体に関しては未だ明らかにされていないため、課題として取り組んでいる最中である。HDMは喘息にとって最も重要な抗原であり、Th2リンパ球を介したアレルギー性炎症を惹起するのみならず、気道上皮細胞を傷害し、IL-33やTSLPを産生させ、2型自然リンパ球(ILC2)を介して多量のIL-5産生を起こす自然免疫系のnon-allergic eosinophilic inflammationも惹起していることが近年報告されている。その新しい機序と重症難治化との関連について注目されている。HDM点鼻終了後にRvE群を投与し、メサコリンに対する気道抵抗測定、肺胞洗浄液中の炎症性細胞について解析を進めていく。肺胞洗浄液中のサイトカインについてもELISA法で評価する。RvE群は樹状細胞のみならず、マクロファージ(MФ)に対しても重要な作用があると予想している。マウス骨髄由来単球をM-CSFで7日間刺激後、抗F4/80抗体磁気ビーズによりMФを単離し、これにHDM刺激に相当するIL-4, IL-33を添加すると、喘息において炎症促進性に働くM2 MФに分化し好酸球やTh2細胞を誘導するケモカインであるCCL17を産生する。RvE1,RvE3はこの産生を抑制することを予備実験で確認している。また、SPMsのうちLipoxin A4がILC2からのIL-13産生抑制をもたらすことが報告されている。RvE3に同様の作用があると予想しているため、今後は、各RvE群のILC2からの炎症性サイトカイン産生抑制作用についても解析する。Resolvin E群については、生体内で産生されるω3脂肪酸であるEPA(eicosapentaenoic acid)由来の脂質メディエーターであるため、炎症の側面をもつ他のアレルギー疾患に対する治療アプローチとしても応用できる可能性がある。

重症気管支喘息に対する新たな治療アプローチとなる可能性を秘めた新規抗炎症性脂質メディエーターに関する基礎的検討を実施している。すなわち、Resolvinなどのω3系脂肪酸から生成される炎症収束作用を持った抗炎症性脂質メディエーター群は、ホメオスタシス調整機能の一端を担う物質であるため、その産生低下や機能不全が炎症収束破綻をもたらし喘息発症、増悪などにもつながるという仮説が成り立つ。そのため、この病態の解明と治療への応用を発展させることを目的として今年度の実験を行った。ハウスダストマイト(HDM)誘導喘息モデルマウスにおけるResolvin E (RvE)群の炎症収束効果の解析を行った。HDM点鼻終了後にRvE群を投与し、メサコリンに対する気道抵抗測定、肺胞洗浄液中の炎症性細胞について解析し、比較した。肺胞洗浄液中のサイトカインについてもELISA法で評価した。次に、各RvE群の作用機序解明(in vitro実験)も行った。RvE3は、RvE1やRvE2と比較して、より強力にこのアレルギー性喘息モデルで効果を示した。また、RvE3のこの作用機序は、樹状細胞からのIL-23/IL-17産生を抑制することにより惹起されることが示唆された。以上の結果は、国際学会で発表することができ、すでに英文化して論文投稿も行うことができた。現在、査読者から要求された追加実験を行っている最中である。本研究における平成30年度の目標であるハウスダストマイト(HDM)誘導喘息モデルマウスにおけるRvE群の炎症収束効果の解析については、おおむね予定どおり実行できている。これまでの予備実験どおりRvE3投与群がRvE1投与群と同等以上の肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、好酸球、リンパ球数の減少効果を示すことがわかった。特に、総細胞数と好酸球数において、有意にRvE1やRvE2よりも抑制していることが示せた。In vivo実験において、HDM点鼻終了後にRvE群を投与し、メサコリンに対する気道抵抗を測定した結果、RvE3は気道過敏性亢進を抑制することも明らかとなった。以上より、RvE3はHDMにより惹起されるアレルギー性気道炎症を抑制し、気管支喘息の重要な指標の一つである気道過敏性も抑えることが示され、今後の治療戦略を考えるうえで有用な物質であることが示唆された。また、RvE3のこの作用のメカニズムを検討するためにin vitroの実験を行った。マウスから採取した骨髄由来樹状細胞(BMDC)をHDMで刺激するとIL-23産生が亢進するが、この反応をRvE3は有意に抑制することが明らかとなった。以上より、RvE3のHDMによるアレルギー性気道炎症を抑制する作用機序の一つは、樹状細胞からのIL-23/IL-17産生抑制によることが示唆された。しかし、RvE3の受容体に関しては未だ明らかにされていないため、課題として取り組んでいる最中である。HDMは喘息にとって最も重要な抗原であり、Th2リンパ球を介したアレルギー性炎症を惹起するのみならず、気道上皮細胞を傷害し、IL-33やTSLPを産生させ、2型自然リンパ球(ILC2)を介して多量のIL-5産生を起こす自然免疫系のnon-allergic eosinophilic inflammationも惹起していることが近年報告されている。その新しい機序と重症難治化との関連について注目されている。
脳波を用いて集中力トレーニングの効果を評価する

本研究ではイメージトレーニング前後の脳波を測定し、はたしてイメージトレーニングの効果を脳波において評価が可能かどうかを検討する事を目的として実験を行った。評価に用いた脳波の指標としては、随伴生陰性変動(CNV)とFmθ波を用いた。被験者は成人男性6名で、イメージトレーニングは3週間行った。その結果、CNV、Fmθ波ともにトレーニング前と比較するとトレーニング後の方が振幅やパワー値が大きくなる傾向を示したが、Fmθ波に関してはトレーニング前後の差は統計的には有意ではなかった。本研究ではFmθ波の測定はLaukka et al.(1995)が示したように4-7Hzの帯域の脳波を周波数分析したが、閉眼によるイメージ想起はかなりの眼球運動を伴った。そのため眼球運動の混入が明確な差を見いだすまでにいたらなかった原因ではないかと推察された。有意な変化が見られたCNVに関しては、有意な変化はイメージトレーニングによるものではなく単に筋の収縮の違いという運動系に違いによるものではないかという指摘がなされた。そこで本研究ではさらに、CNVから実際に筋収縮による成分(motor component)とそれ以外の成分(non-motor component)とに分解することを試みた。その結果、Damen & Brunia(1994)らが示したdelayed feedback paradigmによってCNVから心理的な成分(SPN;stimulus-preceding negativity)を分離することができ、さらにこの成分が音刺激の判別の困難度といった心理的要因によって変化することが示された。今後はイメージトレーニングによるCNVの増大がこの心理的な成分によるものであることを示すために、delayed feedback paradigmを適用した脳波による評価が行われるべきであることが示唆された。
超高速スピン制御によるアハラノフ-アナンダン量子位相の観測

1.硫酸銅水溶液において、偏光を利用したポンプ-プローブ法を用いて、銅イオンの基底状態の光誘起磁化を生成し、ピコ秒領域の磁化の減衰を観測した。磁場を加えるとあるいは濃度を薄めると緩和時間が長くなることがわかった。この結果は、磁化の減衰が銅イオン間の磁気的双極子相互作用によるスピン交差緩和であることを示唆している。また、横磁場中におけるピコ秒領域の磁化の才差運動を観測し、フーリエスペクトルの尖鋭化から溶液中の錯体分子の運動について議論した。2.室温のAl_2O_3結晶中Cr^<3+>イオン(ルビー)において、光誘起磁化を生成・検出する実験を行った。光学遷移の選択則を利用して円偏光のポンプ光で基底状態に磁化を生成し、直線偏光プローブの偏光の変化として検出した。ナノ秒領域の磁化の緩和と横磁場中におけるピコ秒領域の磁化の才差運動が観測された。3.ルビジウム原子気体D_1線の基底状態にポンプ-プローブ法を適用し、光誘起磁化の生成、磁気円偏光二色性を用いた磁化の検出、磁気円偏光複屈折を用いた磁化の検出、自由誘導減衰の観測、及び光誘起スピンエコーの観測を行った。その結果、スピンの光制御に必要な磁化の光学的生成、光学的検出、及び位相の制御が実現できることがわかった。4.共鳴光励起の場合と非共鳴光励起の場合に対する光誘起スピンエコーについて、4準位系を用いたベクトルモデルを考察した。本研究で観測した光誘起スピンエコーは共鳴光励起型であり、任意軸周りのスピン回転を実現するためには吸収の影響が残り、まだ不十分である。任意の軸周りのスピン回転は、ポンプ光とプローブ光の周波数を変えたポンプ-プローブ法を用いた非共鳴光励起型の光誘起スピンエコー法で実現できると期待される。スピン回転の光制御が実現すれば量子幾何学位相の観測が可能になると思われる。1.電子スピンの状態を偏光の変化として光学的に検出するための高精度・高感度な検出器ポラリメーターを製作した。プローブ光を偏光ビームスプリッターで分けて2つのフォトダイオードで受け、それらの光電流の差をとることにより、10μrad以下のファラデー回転角を検出できるようになっている。磁気円偏光二色性を利用する場合は、1/4波長板を通し偏光面の回転に変換してファラデー回転と同様にして検出することができる。ポラリメーターにより電子スピンの磁化の大きさと向きに関する情報が得られる。2.光学ディレイラインを組んでプローブ光を高精度で遅延させ、パソコンで制御された時間分解能100フェムト秒のスピン制御検出システムを製作した。光源は現有のフェムト秒パルスレーザーを使用した。また、ポンプ光の偏光の向きを光弾性変調器でスイッチし、ロックインアンプを用いた高感度な検出を行うことができるようにした。3.室温のAl_2O_3結晶中Cr^<3+>イオン(ルビー)において、光誘起磁化を生成・検出する実験を行った。4.硫酸マンガン水溶液において、偏光を利用したポンプ-プローブ法を用いて、マンガンイオンの基底状態の光誘起磁化を生成し、ピコ秒領域の磁化の減衰を観測した。この結果は、磁化の減衰がマンガンイオン間の磁気的双極子相互作用によるスピン交差緩和であることを示唆している。

任意の軸周りのスピン回転は、ポンプ光とプローブ光の周波数を変えたポンプ-プローブ法を用いた非共鳴光励起型の光誘起スピンエコー法で実現できると期待される。スピン回転の光制御が実現すれば量子幾何学位相の観測が可能になると思われる。
ＥＭＡＳＴ大腸がんの発生機構の解明と悪性度予測因子の検索

マイクロサテライト不安定性(MSI)はゲノム不安定性の一つであり、高頻度のMSI-Hと低いMSI-LおよびEMASTとに分類される。EMAST腫瘍は大腸がんで約6割を占め、予後不良である。本研究ではEMAST腫瘍発生の分子機構の解明を通して大腸がんの診断や治療に結びつく研究を行うことを目的とした。培養細胞を用いて試験管内でのEMAST発生に成功し、その要因としてp53遺伝子変異と長期間の低酸素培養であることが明らかとなった。更に、Warburg効果として知られている経路や遺伝子の発現が顕著であり、特徴的な分子も見出された。これらの分子が診断等に役立つかどうかは今後の課題である。ゲノム不安定性の一つであるマイクロサテライト不安定性(MSI)は高頻度のMSI-Hと低いMSI-Lおよびこれらとは異なるスペクトラムを示すEMASTとに分類される。EMAST腫瘍は大腸がんで約6割を占め、予後不良との相関が報告されている。EMASTはDNAミスマッチ修復( MMR)遺伝子の一つであるhMSH3機能低下に起因する。本研究では(1) EMAST腫瘍発生の分子機構の解明、(2) EMAST腫瘍悪性化機構の解明、(3)臨床検体を対象に抗体染色法などの簡便検索法の開発以上の3点を中心に大腸がんの診断や予後判定に有用な因子の発見と検証を行うことを目的とした。研究の初年度である平成24年度にはEMAST腫瘍発生の分子機構の解明を中心に行い、in vitroでのEMAST発生系の確立に成功した。即ち,p53遺伝子変異大腸がん由来細胞株を低酸素下で一定期間培養することにより、EMASTは容易に生じることを突き止めた。そこで本年度は確立に成功したEMAST発生系を用いて、EMAST腫瘍悪性化機構の解明を中心に進めた。即ち、マイクロアレイ解析結果を元に遺伝子の発現変化を調べた。その結果、pathway解析からは一連の解糖系酵素やMAPK pathwayの活性化など、いわゆるWarburg effectとして知られている経路の活性化が顕著であったが、新たな活性化経路は見いだせなかった。そこで、標的分子検索を行うために、大腸がん由来細胞株をEMAST発生条件で培養し、標的分子が確定している阻害剤の細胞増殖阻害作用を調べた。その結果、活性化しているMAPK pathway上の分子標的薬は効果が減弱した。一方、Caイオン流入阻害剤や他のイオン膜輸送阻害剤は劇的な効果が見られた。また、細胞骨格に関係する分子の標的薬は効果が減弱することも明らかとなった。EMASTはDNAミスマッチ修復(MMR)遺伝子の一つであるhMSH3機能低下に起因する。本研究では(1)EMAST腫瘍発生の分子機構の解明、(2)EMAST腫瘍悪性化機構の解明、(3)臨床検体を対象に抗体染色法などの簡便検索法の開発以上の3点を中心に大腸がんの診断や予後判定に有用な因子の発見と検証を行うことを目的とした。研究の初年度である平成24年度には(1)EMAST腫瘍発生の分子機構の解明を中心に解析を行った。即ち、p53遺伝子が変異した大腸がん由来細胞株を低酸素下で一定期間培養した。hMSH3タンパク発現の低下を確認後、細胞をクローニングし、種々のローカスマーカーを用いてMSIを判定した。その結果、得られた37クローンのうち、EMASTを示したのは5クローンであり、MSI-Hを示すクローンは見いだせなかった。これらの結果は試験管内でのEMAST発生条件の確立に成功したことを意味する。次に、見いだされたEMAST発生条件を利用して、発現遺伝子の変化をAgilent Technologies社のDNAチップを用いたマイクロアレイ解析で調べたところ、変化の著しい約600の遺伝子が見いだされた。これら遺伝子の属する遺伝子群や変化の意義については現在解析中である。今後はp53遺伝子のEMAST発生への関与の検証および網羅的解析を踏まえた腫瘍悪性化に関わる遺伝子の役割解明を進める予定である。ゲノム不安定性の1つであるマイクロサテライト不安定性(microsatellite instability: MSI)は高頻度のMSI-High (MSI-H)、低頻度のMSI-Low (MSI-L)およびこれらとは異なるスペクトラムを示すElevated microsatellite instability at selected tetranucleotide repeats (EMAST)とに分類される。EMASTはDNAミスマッチ修復( MMR)遺伝子hMSH3の欠損に起因する。

本研究では(1) EMAST腫瘍発生の分子機構の解明、(2) EMAST腫瘍悪性化機構の解明、(3)臨床検体を対象に抗体染色法などの簡便検索法の開発の3点を中心に大腸がんの診断や予後判定に有用な因子の発見と検証を行うことを目的とした。(1)については、大腸がん由来細胞株SW620を用いて、低酸素とp53変異がEMAST発生の主要な要件であることを示唆する結果を得た。今年度は、さらに、EMAST発生要件を確実にするため、p53遺伝子変異の有無に着目して検討を行った。p53変異株SW620に加えて、同一患者から単離されたSW480(p53変異株でもEMAST検出に成功した。次に、p53の影響を知るために、p53変異株HCT116-null (p53-/-)への17番染色体導入やp53野生株HCT116+ch3+ch5を用いて検討を試みたが、いずれも成功せず、現在、SW620へ野生型p53発現プラスミド導入実験を行っている。(2)については、昨年度までにMAPK pathwayの活性化やCa2+流入を含むイオン輸送が重要な役割を果たしていることを明らかにした。今年度は、ケラチン関連遺伝子を中心に検討する予定であったが、年度内に結論に至っていない。(3)については、caveolinsやintegrinについて大腸がん細胞株での発現増強を見い出した。現在、大腸がんの病理検体を対象にしてステージ別に検討している。分子腫瘍学EMASTの原因遺伝子であるhMSH3の腫瘍塊における発現はまだらであり、hMSH3陽性細胞と陰性細胞が混在し、更に、陽性細胞でも発現程度が異なることから、EMAST発生モデルの確立は難しいと考えられていたので、本研究により試験管内モデルの確立に成功した意義は大きい。見いだされた条件を利用して計画通り、マイクロアレイを用いた網羅的解析を行った。しかしながら、現在にところ、大半の解析結果は従来知られている知見を確認したに過ぎず、特徴的な新たな経路は見いだせなかった。そこで若干の計画変更を行い、網羅的解析を横目で見つつ、標的分子の明らかな阻害剤を利用して、EMAST発生培養条件での細胞増殖への効果を調べ、若干の新しい知見を得た。しかしながら、分子レベルでのサポートデータの獲得には至っておらず、当初の目的にも掲げてあった標的分子の同定には至っていない。以上の点を考慮して達成度を自己評価した。EMASTの原因遺伝子であるhMSH3の腫瘍塊における発現はまだらであり、hMSH3陽性細胞と陰性細胞が混在し、更に、陽性細胞でも発現程度が異なることから、EMAST発生モデルの確立は難しいと考えられていた。本研究により試験管内モデルの確立に成功した意義は大きい。見いだされた条件を利用して網羅的解析を行った。解析結果を元に、本研究の次の段階に進むことが可能となった。しかし、試験管内モデルの確立には至ったが、EMAST発生が認められない条件の検証が中途段階である。また、増殖および生存に関わる遺伝子の同定には至っていない。以上の点を考量して達成度を自己評価した。
Shannonの通信路符号化定理に関するいくつかの未解決問題へのアプローチ

一昨年,昨年と継続的に研究をしてきた成果として,すなわち,符号長nシンボル,情報記号数kシンボルの最大距離分離符号に対して,符号語の重みWを,さらに情報記号部の重みW_<inn>,と検査記号部の重みW_<che>に分離し,それらの重みを有する符号語の総数を解析的に示し,この結果を直接適用して,(1)2値に展開された一般化リードソロモン符号に対して,見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与えた.同時に,これらの上界式,下界式の有効性を数値計算により示した.(2)内部符号の2元重み分布が既知である連接符号を2値に展開して得られる符号に対して,(1)と全く同様の考え方で,これらの2値に展開された連接符号の見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与え,数値計算を行い,それらの有効性を示した.以上の内容を電子情報通信学会への論文として投稿する.そして,今年度の新しい成果としては,構成的に与えられる漸近的に能率の良い符号であるJustesen符号の2元重み分布が陽に与えられている集合族に対して,(3)個々の集合族の最小重みを用いて,漸近的距離比の収束点を特定し,その集合族が有する漸近的能力を明らかにした.この内容についても電子情報通信学会への論文として投稿する.一昨年,昨年と継続的に研究をしてきた成果として,すなわち,符号長nシンボル,情報記号数kシンボルの最大距離分離符号に対して,符号語の重みWを,さらに情報記号部の重みW_<inn>,と検査記号部の重みW_<che>に分離し,それらの重みを有する符号語の総数を解析的に示し,この結果を直接適用して,(1)2値に展開された一般化リードソロモン符号に対して,見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与えた.同時に,これらの上界式,下界式の有効性を数値計算により示した.(2)内部符号の2元重み分布が既知である連接符号を2値に展開して得られる符号に対して,(1)と全く同様の考え方で,これらの2値に展開された連接符号の見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与え,数値計算を行い,それらの有効性を示した.以上の内容を電子情報通信学会への論文として投稿する.そして,今年度の新しい成果としては,構成的に与えられる漸近的に能率の良い符号であるJustesen符号の2元重み分布が陽に与えられている集合族に対して,(3)個々の集合族の最小重みを用いて,漸近的距離比の収束点を特定し,その集合族が有する漸近的能力を明らかにした.この内容についても電子情報通信学会への論文として投稿する.符号理論の未解決問題の1つに,非2元符号の完全重み分布を陽に与えるという問題がある.今年度はこの問題の解決の糸口として,最大距離分離符号,例えば,Reed-Solomon符号など,の重み分布について極めて興味深い構造を明らかにした.符号長nシンボル,情報記号数kシンボルの最大距離分離符号に対して,重みWを有する符号語の総数が既に解析的に示されている.すなわち,その重み分布は既に陽に与えられている.そこで本研究課題では,符号語の重みWを,さらに情報記号部の重みW_<inf>と検査記号部の重みW_<che>に分離し,それらの重みを有する符号語の総数を解析的に示した.そしてさらに一般的に,符号語のmシンボル中に重みW_m,かつn-mシンボル中に重みW_<n-m>を有する符号語の総数を解析的に示した.この結果,2値に展開された一般化Reed-Solomon符号や2値に展開された連接符号の見逃し誤り確率の上界式と下界式をそれぞれ与えることができる.また,最大距離分離符号の完全重み分布を陽に与える問題へのひとつのアプローチが新たに開け,次年度の研究に続く.符号理論の未解決問題の1つに,非2元符号の完全重み分布を陽に与えるという問題がある.昨年度,この問題の解決の糸口として,最大距離分離符号,例えば,一般化リードソロモン符号など,のハミング重み分布について極めて興味深い構造を明らかにした.すなわち,符号長nシンボル,情報記号数kシンボルの最大距離分離符号に対して,符号語の重みwを,さらに情報記号部の重みw_<inf>と検査記号部の重みw_<che>に分離し,それらの重みを有する符号語の総数を解析的に示した.そこで,今年度は昨年度の結果を直接適用して,(1)2値に展開された一般化リードソロモン符号に対して,情報記号部の2元重み母関数は明らかに陽に与えられるが,検査記号部の2元重み母関数は未知である.そこで,検査記号部のw_<che>個の非ゼロシンボル全てに対して,シンボル単位で2元重みが最小(2元対称通信路を仮定して,生起する確率が最大)の場合,2元重みが最大(同確率が最小)の場合を仮定して,それぞれが見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与えた.同時に,これらの上界式,下界式の有効性を数値計算により示した.(2)内部符号の2元重み分布が既知である連接符号を2値に展開して得られる符号に対して,外部符号の情報記号部に相当する連接符号の2元重み母関数は明らかに陽に与えられるが,外部符号の検査記号部に相当する連接符号の2元重み母関数は未知である.

そこで,外部符号の検査記号に相当する部分に対して,(1)と全く同様の考え方で,2値に展開された連接符号の見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与え,数値計算を行い,それらの有効性を示した.一昨年,昨年と継続的に研究をしてきた成果として,すなわち,符号長nシンボル,情報記号数kシンボルの最大距離分離符号に対して,符号語の重みwを,さらに情報記号部の重みW_<inn>と検査記号部の重みW_<cho>に分離し,それらの重みを有する符号語の総数を解析的に示し,この結果を直接適用して,(1)2値に展開された一般化リードソロモン符号に対して,見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与えた.同時に,これらの上界式,下界式の有効性を数値計算により示した.(2)内部符号の2元重み分布が既知である連接符号を2値に展開して得られる符号に対して,(1)と全く同様の考え方で,これらの2値に展開された連接符号の見逃し誤り確率の上界式,下界式を与える2元重み母関数を与え,数値計算を行い,それらの有効性を示した.以上の内容を電子情報通信学会への論文として投稿する.そして,今年度の新しい成果としては,構成的に与えられる漸近的に能率の良い符号であるJustesen符号の2元重み分布が陽に与えられている集合族に対して,(3)個々の集合族の最小重みを用いて,漸近的距離比の収束点を特定し,その集合族が有する漸近的能力を明らかにした.この内容についても電子情報通信学会への論文として投稿する.
次世代臨床検査法としての新規幹細胞・癌幹細胞検出技術の確立

次世代臨床検査法の核となると考えられる幹細胞・癌幹細胞の新たな検出法であるFACS-mQ(quantification of mRNA after FACS)の基礎技術の確立に取り組んだ。FACS-mQではRNAを分解させることなしに細胞を蛍光標識することで、その後のFACSによる細胞の分取と遺伝子発現プロフィール解析による細胞の解析を可能とする。本研究の主な成果として1)血液・組織検体からの単一細胞調整法・保存法の確立、2)高感度の細胞蛍光標識法の確立、3)細胞分取後のRNA回収と解析法の確立が挙げられる。23年度に課題して残されたFACS-mQにおける検出感度の向上法についての検討を行った。発現量の少ない抗原に対する抗体を使用する場合、1)抗体を蛍光色素で直接標識するのではななく1次抗体に引き続き蛍光標識した2次抗体を使用すること、2)抗体反応液をCan Get Signal Immunostainに変更すること、3)蛍光色素を従来のFluoresceinやR-PEに変えてDyLightに変更すること、などにより、発現量の少ない細胞内抗原をターゲットにした場合でもFACSによって細胞の分別採取が十分可能なレベルまでシグナル/ノイズ比を改善することに成功した。また、細胞の蛍光標識の時間も従来の12時間から4時間まで短縮した。この結果、ステップが増えるにも関わらず、蛍光標識中のRNAの分解も最小限に抑えられ、定量的RT-PCRでの解析では細胞標識前前後でのRNAの有意な減少は認めなかった。当方法を使用したテストケースとしてラット甲状腺細胞株FRTL-5を使用してFACS-mQによる解析を試みた。FRTL-5細胞は甲状腺の分化因子であるサイログロブリンを発現する。抗サイログロブリン抗体によるFlow CytometryではFRTL-5はサイログロブリンの発現の程度によって高発現群と低発現群に分かれる。両群をFACSで分別採取し、幹細胞マーカーのmRNAを計測すると、サイログロブリン低発現群で幹細胞マーカーの発現が高いことが分かった。すなわち、FRTL-5の中には未分化で幹細胞様の細胞が紛れているということになる。このように、実際にFACS-mQを使用して細胞集団のさまざまな情報を得ることが可能であることが証明された。今後は臨床検体を使用した解析に移るが、甲状腺組織内の幼若な細胞成分を検出するためのマーカー遺伝子の解析を試み、候補としてN-Cadherinを同定した。本年度は昨年度までの研究実績を、実際の臨床検体を使用しての解析に応用することを目指した。甲状腺正常・腫瘍組織から単一細胞となった検体材料を得ることを試みた。まず、コラゲナーゼ、ディスパーゼを使用して濾胞レベルまで組織を分散した後、プロナーゼまたはトリプシンにて単一細胞を得る従来法を試みたが、バセドウ病組織と一部の濾胞性腫瘍組織では十分な量の細胞が回収されたものの、悪性腫瘍の大部分を占める乳頭癌組織では回収される細胞数が少なかった。そこで、酵素の種類や処理時間を変更して最適な方法を検討し、最終的にプロナーゼ、トリプシンの使用をやめ、コラゲナーゼとディスパーゼの連続長時間処理をすることによってによって、乳頭癌を含むほとんどの甲状腺組織から安定して単一細胞を得られるようになった。臨床検体では採取可能な細胞数が限られるため、少量の細胞から安定的にRNAの定量解析を行う必要がある。臨床現場ではFACS-mQのプロトコールにおいて染色が終了してから細胞採取までの過程が直ちに行えない場合が発生するため、どのような条件でどのくらいの時間の保存が可能か検討した。その結果、染色終了後DTTを加えることにより少なくとも48時間まではRNAの定量解析に影響を与えないことが分かった。ただし、同時に解析したFlow Cytometry像はわずかに変化が見られ、染色後可能な限り早くFACSによる解析をするのが望ましいと考えられた。1. FACS-mQにおける検出感度向上のための増感法の検討A.免疫蛍光抗体法:免疫蛍光抗体法においてはTSAによる増感を行うより、他の要因を調整することで十分な感度が得られることが分かった。具体的には1)ポリクローナル抗体のモノクローナル抗体への変更、2)抗体の至適希釈濃度の検討、3)抗体反応条件を4°C16時間から4°C4時間への短縮、である。これらの変更で、特定の蛋白を発現している細胞と発現していない細胞を明確に分別可能となった上に、解析時間が従来の1日半から半日に大幅に短縮となった。B.蛍光in situ hybridization法:蛍光in situ hybridizaion法ではハイブリダイゼーションの反応時間を、従来の4時間から一定の条件で16時間まで延長することで、RNAのさらなる分解を引き起こすことなくシグナル/ノイズ比を大きく改善できることがわかった。ただし、発現量の少ない遺伝子についてはこれでも感度が不十分であることが考えられ、TSAによるさらなる増感も必要であると考えられた。2.FACS-mQに用いるための臨床検体の前処理法の検討

A.血液細胞:in situ hybridizationに使用するためのパラフォルムアルデヒド固定については、大きな問題がないことがわかったが、蛍光免疫染色におけるUM-Fixによる固定では血球が塊となることがあり、条件検討が必要であると考えられた。B.甲状腺組織:甲状腺組織のFACS-mQの前処理法としては、1)カテキンを含むThelioKeepによる組織の保存、運搬、2)コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプリンの3つの酵素による分散、3)DMSOを含む溶液にによるー80°Cでの凍結保存が有効であることがわかった。23年度に課題として残されたFACS-mQの感度向上についての問題を解決できた。また、細胞株を使用してFACS-mQによってデータを取ることに成功した。甲状腺内の幼若な細胞成分を検出するための候補遺伝子ので同定に成功した。23年度はFACS-mQのプロトコールを改善して検出感度を向上させることと、臨床検体の前処理法の確立を予定していたが、これら2つの目的をほぼ達成できたと考える。FACS-mQのプロトコールがほぼ確立したため、今後は臨床検体を用いた検討を推進する。1.ヒト正常甲状腺内における幼若な濾胞上皮細胞の検出ヒト甲状腺内には通常観察される濾胞上皮細胞以外に、濾胞上皮細胞の分化、増殖をコントロールしている幼若な細胞成分が存在するのではないかと考えられている。24年度までの検討で、そのような細胞成分を検出するためのマーカーとしてN-Cadherinを同定した。バセドウ病で手術摘出された標本を使用し、N-CadherinをターゲットとしたFACS-mQにより、目的の細胞の存在の有無の確認と採取が可能な場合は遺伝子発現プロフィールを作成することによる性質の同定を試みる。2.甲状腺腫瘍における癌幹細胞の同定甲状腺腫瘍の手術標本を使用してサイログロブリンとTTF-1をターゲットとして蛍光標識する。この2重染色によって染色程度の異なる細胞群を検出、mRNAを解析して癌幹細胞の同定を試みる。1.TSAを用いたin-tube in situ hybridization法のさらなる増感23年度の検討でFACS-mQにおけるin-tube in situ hybiridization法の感度は大きく改善されたが、発現量の少ない遺伝子についてはこれでも感度が不十分であるケースが考えられる。よって、TSAによるさらなる増感過程を加えたプロトコールについて検討する。2.細胞株、臨床検体を使用したFACS-mQのトライアル24年度以降は今までのモデル実験ので確立したプロトコールを実際の解析に応用することを目指していく。具体的には以下の3項目である。A.細胞株を使用したトライアル:同一細胞株の中で特定の遺伝子を発現している分画と発現していない分画を採取し、両者の遺伝子発現プロフィールを解析し、とくに幹細胞マーカー等の発現に注目することで、細胞株の中に幹細胞様の細胞が存在するかどうか検討する。