hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞シミュレーションによるTNF及びTRAILシグナル伝達の細胞死誘導機構の解明

悪性腫瘍や自己免疫疾患に代表される諸疾患の応答を制御し、コントロールする誘導する事は、現在の分子標的薬の開発にむけた大きな課題である。その対象として、免疫機構で大きな役割を果たすサイトカインであるTNF (Tumor-Necrosis-Factor)やTRAIL (TNF-Related-Apoptosis-Inducing-Ligand)は、非常に注目されている。私達はこれまで、TNFを用いて線維芽細胞を刺激した際の、細胞内のシグナル伝達分子の挙動と遺伝子発現を同時に観察するシミュレーションモデルを作成した。こちらのシミュレーションモデルは、摂動応答理論をもとに作成されたモデルで、こちらのアプローチをTNFのシグナル伝達に応用し、ウェスタンブロットから得られた実験データを用いて、これらのデータに定量的に合致するモデルを作成した。さらに遺伝子レベルの発現を解析するため、モデルの拡張を行った。先行研究において、マイクロアレイ解析からTNFの刺激によって高発現する遺伝子が約180存在し、その遺伝子群を時系列発現パターンによってクラスタリングした所、発現のピークが0.5h, 2h,そして12hと大きく分けて3つに分類できる事が報告された(0.5h : Group1,2h : Group2,12h : Group3)。この現象は、mRNAの3'UTRに存在するAU配列の存在量によって誘導されるmRNA decayのバランスによって分類される事も報告された(Shengli et al. 2009)。しかしながら、これらのデータとシミュレーションモデルを用いて数理解析した結果、発現のピークが12hとなる遺伝子群については、TNFによる一次応答する遺伝子群とオートクラインが誘導する2次応答による遺伝子群が存在する事に起因する現象であるという結果を得た。次に、発現のピークが最も遅い遺伝子群について調査した結果、関節リウマチの原因の一つであるmmp (Matrix metalloproteinase)遺伝子が含まれている事がわかった。次にこのmmp遺伝子の発現を抑えるために、どのシグナル伝達分子の働きを抑制する必要があるのかについて、シミュレーションモデルを用いて解析を行った。得られたモデルの中の全ての分子をIn silicoノックアウト(KO)し、その影響を調べた。その結果、RIP1をノックダウンすることで、mmp遺伝子発現が最も抑制される事が示唆された。mmp遺伝子以外にも免疫疾患に大きく関わるVcam-1やIL-6などの遺伝子も制御される事も予測した。これらの結果を踏まえて、我々は独自にqPCRを用いて検証実験を行った。今回の実験では、Murine embryonic fibroblast (MEF)と3T3細胞を使用し、RIPの発現抑制には、その抑制剤であるNecrostatin-1 (Nec-1)を使用した。その結果、我々が予測したように、Group1-3の免疫疾患に大きく関わる遺伝子群の発現抑制に成功した。(抄録なし)悪性腫瘍である癌細胞を細胞死へと誘導する事は、現在の分子標的薬の開発にむけた大きな課題である。その対象として、免疫機構で大きな役割を果たすサイトカインであるTNF(Tumor-Necrosis-Factor)やTRAIL(TNF-Related-Apoptosis-Inducing-Ligand)は、非常に着目されている。これらのサイトカインは、癌細胞に対して細胞増殖と細胞死のシグナル伝達を誘導する事が知られているが、どのようにコントロールされているかはまだ知られていない。本研究では、TRAILをリガンドとした癌細胞内の細胞増殖と細胞死のシグナルのスイッチング機構について研究を行った。対象の癌細胞としてヒト浸潤性線維芽肉腫細胞株であるHT1080を用い、野生型およびいくつかの分子(FADD、RIP1、TRAF2およびカスパーゼ-8)のノックダウン条件で、細胞生存に関与する分子(1κB、JNK、p38)とアポトーシスに関与する分子(カスパーゼ-8、カスパーゼ-3)の経時的活性化プロファイルを、摂動応答理論を応用したシミュレーションモデルを作成し、解析を行った。その結果、1.p38とJNKを活性化するFADDとは独立した経路、2.RIPIとp38間のクロストーク、3.p62とJNK間のクロストーク、および4.JNK上流の活性化プロセスの存在が予測された。特に、その後のシミュレーションから、p62/sequestosome-1分岐点で新規分子を標的とすることで、シグナル伝達フラックスの再分配を介して細胞死が最適化されることが示唆された。さらに本手法は、物理的法則に基づいた新規手法であるため、TRAILに限らずどのようなシグナル伝達経路においても汎用的に用いる事で、様々な現象の理解にも繋がる。悪性腫瘍である癌細胞を細胞死へと誘導する事は、現在の分子標的薬の開発にむけた大きな課題である。対象の癌細胞としてヒト浸潤性線維芽

肉腫細胞株であるHT1080を用い、野生型およびいくつかの分子(FADD、RIP1、TRAF2およびカスパーゼ-8)のノックダウン条件で、細胞生存に関与する分子(IκB、JNK、p38)とアポトーシスに関与する分子(カスパーゼ-8、カスパーゼ-3)の経時的活性化プロファイルを、摂動応答理論を応用したシミュレーションモデルを作成し、解析を行った。その結果1.p38とJNKを活性化するFADDとは独立した経路、2.RIP1とP38間のクロストーク、3.p62とJNK間のクロストーク、および4.JNK上流の活性化プロセスの存在が予測された。特に、その後のシミュレーションから、p62/sequestosome-1分岐点で新規分子を標的とすることで、シグナル伝達フラックスの再分配を介して細胞死が最適化されることが示唆された。現在は、これらの予測した結果に基づきウェスタンブロットやRT-PCR,MTTアッセイなどの実験を行い、良好な結果が出てきている事に伴い、今年中に論文投稿予定である。さらにTNF刺激による線維芽細胞内の遺伝子発現の解析を行った。その結果、RIP1をノックダウンすることで、関節リウマチの原因となるmmp遺伝子発現が最も抑制される事が示唆された。こちらのプロジェクトに関しても今年中に論文を投稿予定である。本手法は、物理的法則に基づいた新規手法であるため、TRAILに限らずどのようなシグナル伝達経路においても汎用的に用いる事で、様々な現象の理解にも繋がる。悪性腫瘍や自己免疫疾患に代表される諸疾患の応答を制御し、コントロールする誘導する事は、現在の分子標的薬の開発にむけた大きな課題である。その対象として、免疫機構で大きな役割を果たすサイトカインであるTNF (Tumor-Necrosis-Factor)やTRAIL (TNF-Related-Apoptosis-Inducing-Ligand)は、非常に注目されている。私達はこれまで、TNFを用いて線維芽細胞を刺激した際の、細胞内のシグナル伝達分子の挙動と遺伝子発現を同時に観察するシミュレーションモデルを作成した。こちらのシミュレーションモデルは、摂動応答理論をもとに作成されたモデルで、こちらのアプローチをTNFのシグナル伝達に応用し、ウェスタンブロットから得られた実験データを用いて、これらのデータに定量的に合致するモデルを作成した。さらに遺伝子レベルの発現を解析するため、モデルの拡張を行った。先行研究において、マイクロアレイ解析からTNFの刺激によって高発現する遺伝子が約180存在し、その遺伝子群を時系列発現パターンによってクラスタリングした所、発現のピークが0.5h, 2h,そして12hと大きく分けて3つに分類できる事が報告された(0.5h : Group1,2h : Group2,12h : Group3)。この現象は、mRNAの3'UTRに存在するAU配列の存在量によって誘導されるmRNA decayのバランスによって分類される事も報告された(Shengli et al. 2009)。
ソフトウェアモデルの有用性優先モデリング手法の研究

本研究の目的は,ソフトウェアモデルの有用性に関わる特性を評価し,有用性に見合ったそれなりの完成度を目指す有用性優先のモデリング手法を提案することである.ソフトウェアの大規模・複雑化,変化の常態化の中,過度な完成度を求めず,それなりに有用なソフトウェアを適時提供する有用性優先の考え方が提案されている.本研究ではそうした有用性優先の考え方をソフトウェアモデリングに適用し,モデルの有用性に関わる特性に基づき,過度な完成度を求めない有用性優先のモデリング手法を提案する.今年度は,モデルの有用性を定量化するための手法について検討を行った.テストにおける運用プロファイルが,利用確率の高いシナリオからテストをするというための判断に使われるように,確率情報を有用性判断に利用することを検討した.具体的には,潜在的に膨大なフィーチャ群を導出することが可能なフィーチャモデルに対して,どのようなフィーチャ構成が導出されることが高いかを推定し,導出可能性の高いフィーチャ群やそれらを含むフィーチャ構成がより重要であるとの判断に利用するという考え方である.フィーチャモデルの導出可能性を確率化するための手法としては,フィーチャ間の条件付生起確率から求める手法などが存在するが,これらの確率情報は一般に断片的にしか得られないことが多く,その結果必ずしも適切な確率情報が得られない状況があることから,フィーチャモデルからのフィーチャ構成導出プランを作成し,プランから決定木を作成して生成確率を導出する手法を提案した.この手法では,フィーチャ間の制約情報を踏まえたフィーチャ構成導出ができるため,存在し得ないフィーチャ構成が生成可能となることがありえる従来研究の欠点を改善することができる.有用性優先のモデリング手法について,以下に示すようにほぼ予定通りに研究を進めている.・応用分野として,ソフトウェアプロダクトライン開発などで重要な可変性管理で利用されるフィーチャモデルを取り上げ,フィーチャ構成導出や成果物の可変性解決といった具体的な利用を想定して検討を進めた.・昨年度示した推進方策に基づき,有用性の定量化についての検討を行い,確率的な側面からの定量化について検討を進めた.フィーチャモデルによる可変性管理を対象に,フィーチャ構成の生起確率を有用性の判断に利用する手法を提案した.・提案手法によりどのようなフィーチャ構成が有用性が高いかを求める実験を行い,確率に基づく指標が,フィーチャモデルの制約を反映した指標であることを確認した.なお確率計算の計算量は大きいため,従来から研究してきた近似的な手法がコスト面からは有利であると考えられる.・他の応用分野としてIoTシステムに関する検討も開始した.例えばIoTシステムではゲートウェイに複数種類のセンサが接続されるなどの状況があるが,これらセンサ群は類似した特長を備え製品群として捉えることができる.ここで,IoTシステムに関する可変性をセンサーに関するオントロジの特殊化であると考え,それを利用して多様性を扱う方法についての基本的な研究を行った.平成31年度は,優先度優先の定量化尺度の定義,定量化手法の実装や実験,それによって得られた有用性に関する情報の,モデリングさらには検証や確認など様々な活用方法について提案するとともに,その有効性について検討を行いたい.・30年度に提案した定量化手法を一般化して厳密に定義するとともに,それがどういう状況での有用性判断に適用できるか,その適用性について明確にする.また,既存の他の尺度と比べて,提案手法がどういう優位性を持つかをより明確にする.・定量化のための確率計算は厳密に行うと高計算量であるため,なんらかの近似的な計算が必要となる.こうした手法のスケーラビリティに関する評価を行うとともに,さらに適用例を増やして妥当性などの評価を行う.・有用性指標を,モデリングだけでなく,モデルの活用,特に検証や確認などの作業への適用方法について整理する.・可変性管理が適用できる他の分野への適用や活用について検討を行う.特にIoTシステムを高度に構成可能なシステム(highly configurable system)と捉え,そこでの適用性について整理する.本研究の目的は,ソフトウェアモデルの有用性に関わる特性を評価し,有用性に見合ったそれなりの完成度を目指す有用性優先のモデリング手法を提案することである.ソフトウェアの大規模・複雑化,変化の常態化の中,過度な完成度を求めず,それなりに有用なソフトウェアを適時提供する有用性優先の考え方が提案されている.本研究ではそうした有用性優先の考え方をソフトウェアモデリングに適用し,モデルの有用性に関わる特性に基づき,過度な完成度を求めない有用性優先のモデリング手法を提案する.今年度は,ソフトウェアプロダクトライン開発などの可変性管理に用いられるフィーチャモデルを例題に,有用性優先の観点からその妥当性を検討する手法について提案した.本手法では,まずフィーチャモデルを可変性管理を行う対象となる成果物(群)のモデル(群)と関連付ける.次に有用性に関わる要因として構造的な側面からモデル要素の数,意味的な側面から可変性モデルが表現する導出可能構成数に注目し,対象とする成果物の可変性解決という目的に照らして,それらの要因から過不足を検討する.公開されているモデル事例などに対して手法を適用し,過不足部分を特定できることを確認するとともに,手法の課題の整理を行った.また,定義されているモデルのすべてのモデル要素を活用すると高コストになる場合,ある程度モデルを近似的に扱うことで,低コストでかつ一定の有用性を確保したモデルの活用を行う手法の検討も進めた.具体的にはフィーチャモデルに基づくフィーチャ構成導出において,より小さなフィーチャ構成を近似的に低コストで行う方法を提案し,シミュレーションによって手法が有効であることを確認した.

有用性優先のモデリング手法について,以下に示すようにほぼ予定通りに研究を進めている.・応用分野として,ソフトウェアプロダクトライン開発などで重要な可変性管理で利用されるフィーチャモデルを取り上げ,フィーチャ構成導出や成果物の可変性解決といった具体的な利用を想定して検討を進めた.・有用性に関わる要因に関し,フィーチャモデルを対応する成果物の可変性解決に利用するというコンテキストを考えた場合には,対象成果物と関連づけられるモデル要素数や,導出可能構成数などが有用性議論の要因となりうる.これら要因に照らしてフィーチャモデルの記述の妥当性を有用性の観点から定性的に判断する手法を定義し.事例に適用して評価した.まだ手法としての改善や洗練の余地は多いが,有用性議論のためにモデル利用の目的やコンテキストを明確化し,定義された要因に照らして分析的にモデルの妥当性を検討するという基本的な枠組みは一定の妥当性を持つと考える.・提案する手法は,モデル作成中であっても適用できる.本手法はモデルの特定の部分(フィーチャモデルの場合は特定の可変性を表現している部分)ごとに適用できるため,どの部分が有用性が高く,どの部分が低いかの判断の指標を与える.それに基づいて限られたモデル構築時間をどの部分の記述に費やすべきかのガイドとすることが考えられる.・当初計画時には考慮していなかったが,有用性優先の考えはモデル利用時にも適用できることがわかった.モデルの形式的な解析などを考えた場合,モデルの複雑化は計算コストの増大につながる.モデルを近似的に処理することで計算コストが低下し,かつ利用目的に照らしてそれなりの有用性が得られるのであれば,複雑なモデルをそのまま処理することは妥当でないと考えられる.こうした処理の観点からの有用性の検討も進めることができた.本研究の目的は,ソフトウェアモデルの有用性に関わる特性を評価し,有用性に見合ったそれなりの完成度を目指す有用性優先のモデリング手法を提案することである.ソフトウェアの大規模・複雑化,変化の常態化の中,過度な完成度を求めず,それなりに有用なソフトウェアを適時提供する有用性優先の考え方が提案されている.本研究ではそうした有用性優先の考え方をソフトウェアモデリングに適用し,モデルの有用性に関わる特性に基づき,過度な完成度を求めない有用性優先のモデリング手法を提案する.今年度は,モデルの有用性を定量化するための手法について検討を行った.テストにおける運用プロファイルが,利用確率の高いシナリオからテストをするというための判断に使われるように,確率情報を有用性判断に利用することを検討した.具体的には,潜在的に膨大なフィーチャ群を導出することが可能なフィーチャモデルに対して,どのようなフィーチャ構成が導出されることが高いかを推定し,導出可能性の高いフィーチャ群やそれらを含むフィーチャ構成がより重要であるとの判断に利用するという考え方である.フィーチャモデルの導出可能性を確率化するための手法としては,フィーチャ間の条件付生起確率から求める手法などが存在するが,これらの確率
シリカエアロゲルの粒子識別装置への新しい応用に関する基礎的研究

本研究では、シリカエアロゲルの新しい応用として、リングイメージング型チェレンコフ検出器(RICH)幅射体としての応用に関する基礎的研究を行った。研究の骨子と得られた結果は、以下の如くである。1.シリカエアロゲルの透過率の最適化:シリカエアロゲルの透過率改善を目指して、原料材料混合比、ゲル熟成期間、超臨界抽出条件の最適化を行い、波長400nmの光に対して約30mmの透過長が得られた。この透明度の高さは世界最高のものである。2.光学系等のデザインの最適化:チェレンコフ光をレイトレイスする計算コードの開発を行い、その結果、厚さ約5cmの幅射体と曲率半径300mmの凹面鏡を組み合わせた光学系でビームテストを行うこととした。3.イメージインテンシファイヤー(IIT)を使ったビームテスト:KEK12GeV陽子加速器のπ2ビームラインで行ったビームテストでは、凹面鏡フォーカス面に口径10cmの大型IITを設置し、屈折率1.03のエアロゲルから放出されるチェレンコフ光リングイメージを鮮明に撮像するこに成功した。ビデオテープに記録されたIIT画像データのオフライン解析により、イベント当たりの平均光量として約10p.e.が得られている。以上で得られた結果は、シリカエアロゲルがしきい値型のみならずリングイメージ型のチェレンコフ検出器に対しても有効な幅射体であり、将来の実験に応用可能性があることを如実に示している。これにより、従来は困難であった4GeV数10GeV領域でのπ/K識別が可能になると期待できる。今後は、ビームテストの結果をモンテカルロ計算と詳細に比較して定量的に理解し可能な改善点を探る必要がある。また、強磁場中や高計数率では使用困難なIITに替わる位置検出型光検出器の開発が重要になる、と考えられる。
新規鎖状ポリエン抗生物質エナシロキシンの生合成に関与する酸化酵素に関する研究

エナシロキシンIIa生合成の中間体と思われるエナシロキシンIVaを酸化して、エナシロキシンIIaとするエナシロキシン酸化酵素が生産菌の培養上清に見いだされ、この酸化酵素の精製を試みた。アカパンカビNeurospora crassaIFO 6068株をCzapek-Dox培地で培養し、その培養上清にFrateuria W315株を30°C30時間培養した。その遠心上清を粗酵素液とし、限外ろ過、超遠心、硫安塩析、Butyl-Toyopearl 650M,Hydroxylapatite等を用いて精製した。その結果SDS-PAGEにおいて単一なバンドとなる標品が得られ、非活性は170倍に上昇した。SDS-PAGEとゲルろ過(FPLC)により、分子量はそれぞれ約73kDa、約79kDaと推定され、本酵素はモノマーであることが示唆された。また至適温度は60°C、至適pHは9.0、等電点は6.2であった。基質としてはエナシロキシンIVaおよびIIIa以外は全く反応せず、特異性が非常に高かった。本酵素はMg^<2+>、Ca^<2+>を要求し、二価の重金属イオンやカルボニル試薬により阻害され、キレート剤、SH試薬そしてKCNやNaN_3等により殆ど影響を受けなかった。また本酵素から補酵素を取り除いたアポ型の酵素にピロロキノリンキノン(PQQ)とMg^<2+>を添加したところ活性が回復した。しかし本酵素から単離した補酵素画分のスペクトル解析によりPQQと異なる吸収ピークが検出され、また薄層クロマトグラフィでもRF値が異なるので、PQQ類縁ではあるが新しい補酵素である可能性が示唆された。
高機能性新規ポルフイリンの光励起分子内電子移動過程に関する研究

昨年に引き続き新規な光増感剤と電子伝達体とを結合し、光励起分子内電子移動が容易に進行する錯体の合成を行なった。この錯体は1分子で光増感剤と電子伝達体との両方の機能を持つことを明らかにした。具体的成果は以下の通りである。ビオローゲン結合型ポルフイリンの構造と機能との関係を調べるために一連の化合物を合成し、この化合物の蛍光強度、蛍光寿命、T-T吸収の減衰とメチレン鎖長との関係を調べ、特にポルフイリンの光励起一重項状態を経由したメチルビオローゲンへの電子移動過程に焦点をあてて実験を行った。ビオローゲン結合型ポルフイリンの蛍光強度は、ビオローゲンの結合していないポルフイリンの蛍光強度と比べて小さく、メチレン鎖長が短くなるほど小さくなることがわかった。すなわち、メチレン鎖長が短くなるほどビオローゲンによる蛍光の消光がよく起こっていることを示している。ビオローゲン結合型ポルフイリンではいずれのメチレン鎖長の場合にも蛍光の減衰は2成分であった。長寿命の蛍光を示す成分はビオローゲンの結合していないポルフイリンの寿命とほぼ同一であるが、短寿命成分はメチレン鎖長に大きく依存していることがわかった。これらのビオローゲン結合型ポルフイリンには2種類のコンフォーメーションがあり、短寿命成分は分子内電子移動が可能なコンフォーメーションに起因していると思われる。ビオローゲン結合型亜鉛ポルフイリンではT-T吸収の減衰に対応して還元型ビオローゲンの生成も観測される。さらに生成した亜鉛ポルフイリンカチオンと還元型ビオローゲンとの反応(逆反応)過程を測定した。その結果、還元型ビオローゲンの寿命は約1μsと長寿命であることがわかった。これらビオローゲン結合性ポルフイリンを用いた光水素発生が見られた。
生体高分子に対する分子インターフェイスを用いた蛋白質の集積・機能化

本研究では、タンパク質の特定部位に分子認識性の人工分子インターフェイスを導入して、任意の組織構造化能を有する機能性人工タンパク質の設計指針を確立することを究極の目的としている。本年度は、そのような人工インターフェイスの検索を行い、2つの有効な機能分子を見い出した。一つは、水中でも糖類などと結合可能なフェニルホウ酸である。これを導入したミオグロビンは、糖類の結合によって安定化し、かつ触媒活性が糖類に応答して増幅することが明らかになった。もう一つは、遷移金属イオンと高い錯化能をもつイミノニ酢酸であり、これは金属イオン添加に応答して電子伝達速度の加速をミオグロビンにもたらすことがわかった。これら2つのインターフェイス分子を導入したタンパク質の界面での配向性などを現在さらに検討中である。
非アルコール性脂肪性肝炎の発症・進展メカニズムの分子病理的解析と予防的治療戦略

非アルコール性脂肪性肝炎"non-alcoholic steatohepatitis(NASH)"は、糖尿病や肥満、高脂血症などめ「生活習慣病」を背景として出現する進行性肝疾患である。「NASH予備軍」は増加の-途にあると推測され、その3%が将来的に肝硬変・肝癌に進展するとの報告もあることから、早急な社会的対応が望まれている。しかしながら、NASHの病態はいまだ十分に解明されておらず、診断法の確立や適切な予防法・治療法の開発が急務である。本研究では、ヒト肝生検組織、及びNASH、モデル動物を用いて、NASHの発症・進展メカニズムを多角的に解析するとともに、比較的侵襲が少なく、長期にわたって生活改善効果が期待される天然薬物による発症予防効果の検証を目的とした。2年間の研究成果は以下に集約される。1.NASHの発症進展メカニズムの解析従来のNASHモデルは脂質代謝の鍵分子の変異や特殊な食餌による強制的・重篤なモデルが主であり、ヒトのNASH自然史の病態解析には不向きである。我々は異なるメカニズムによって発症する新規NASHモデル動物を4つ報告した。また、これらのモデル動物やヒト組織を用いた検討により、NASHの発症に酸化ストレスや糖化反応(特にAGE-RAGE系)が関与していることを明らかにした。2.NASHの治療戦略NASHモデル動物を用い、西洋薬、及び漢方薬による予防的効果を検証し、漢方薬の一つ、桂枝茯苓丸が優れたNASH予防効果を示す事、その機序には星細胞の活性化抑制とアディポネクチン増加作用が関与している事を明らかにした。非アルコール性脂肪性肝炎"non-alcoholic steatohepatitis(NASH)"は、糖尿病や肥満、高脂血症などの「生活習慣病」を背景として出現する進行性肝疾患である。「NASH予備軍」は増加の一途にあると推測され、その3%が将来的に肝硬変・肝癌に進展するとの報告もあることから、早急な社会的対応が望まれている。本研究では、ヒト肝生検組織、及びNASHモデル動物を用いて、NASHの発症・進展メカニズムを多角的に解析することを目的としている。平成18年度は病態機序の解明に取り組み、酸化ストレスの関与や糖化反応(特にAGE-RAGE系)の関与を明らかにした。また、異なるメカニズムによって発症する新規NASHモデルを2つ報告した。1.ヒト肝生検組織を用い、DNA酸化ストレスの指標である80HdGがNASH患者の肝細胞の細胞質に特異的に発現することを見出し、これらがミトコンドリアDNA酸化を反映していることを明らかにした。(Nomoto K, et al. AIMM)。2.高コレステロール食を8-12週投与したウサギがヒトNASHと類似する組織像を呈することを見出し、新規NASHモデルとして報告した。このウサギはインシュリン非抵抗性であり、DMを背景としないモデルとして新規性が高いと考えられた(Kainuma M, et al. J Gastroenterol)。3.ガレクチン3欠損マウスが6ヶ月齢以降、オスに有意にNASH様病変を自然発症することを見出した。このマウスは糖化反応に関与するAGE-RAGE系を過剰発現しており、NASHの病態形成にAGE-RAGE系の関与が推測された(Nomoto K, et al. J Pathol)。4.NASHの病態形成とAGE-RAGE系の関与を検討するための基礎的実験として、マウスにおけるRAGEやそのバリアントの発現パターンを検討した(Harashima A, et al. Biochem J)。

非アルコール性脂肪性肝炎"non-alcoholic steatohepatitis (NASH)"は、糖尿病や肥満、高脂血症などの「生活習慣病」を背景として出現する進行性肝疾患であり、早急な社会的対応が望まれている。しかしながら、その病態はいまだ十分に解明されておらず、診断法の確立や適切な予防法・治療法の開発が急務である。本研究では、ヒト肝生検組織、及びNASHモデル動物を用いて、NASHの発症・進展メカニズムを多角的に解析することを目的としている。平成19年度は異なるメカニズムによって発症する新規NASHモデルを2つ報告し、以前に報告したNASHモデル(ガレクチン3欠損マウス、高コレステロール食負荷ウサギ)と併せて病態機序の解明や漢方薬等の効果について検討した。1.肥満、糖尿病、高血圧等を発症するモデル動物の肝病変を検討し、ヒトのNASHに極めて類似するモデル動物を新たに2つ報告した。(MSGマウス、SHR/NDmcr-cpラット)2.以前に報告したAGE受容体欠損モデルであるガレクチン3欠損マウスが、12カ月齢以降、重篤な線維化を背景に高率に肝細胞癌を発症することを報告した。3.高コレステロール食負荷ウサギの肝病変に、いくつかの漢方薬が高い予防効果を示した。なかでも桂枝茯苓丸はアディポネクチンを有意に増加させた。4.酸化ストレスが肝細胞、胆管上皮細胞に障害を与える機序について、種々のモデル動物を用い、分子病理学的、病理形態学的に検討した。
脳血管疾患による在宅胃ろう造設者への摂食・嚥下機能向上支援に関する要因の解明

在宅胃ろう患者は安全で持続的栄養摂取が可能だが、大きな役割を担う介護者の社会的孤立や生活の質の低下に関する研究は乏しい。本研究は、摂食嚥下リハビリテーションにより微量の経口摂取に回復した胃ろうをもつ在宅の脳卒中と頭部外傷患者の介護者を対象とした。在宅介護者が感じる摂食管理の負荷と、介護者の心理的側面への影響を明らかにすることを目的とした。聞き取り調査22人のデータに帰納法的質分析を実施した。「経口摂取回復が介護者に対する心理的影響」は、1家族の帰属意識の復権と強化、2経口摂取の回復と全身機能回復のつながり、3介護負担観の軽減、4社会との接点の再獲得、の4概念であり、この概念の質問票を開発した。胃ろうへの社会的関心は高まっている。しかし、その多くは、胃ろうの原因疾患、認知機能の程度、介護ケアの場所などが特化されない議論という感は否めず、学術的な研究による知見は少ない。一方、嚥下機能回復への人材育成や正しい嚥下機能評価の必要性の認識も高い。リハビリテーションは、機能回復を主眼として施行されるのが第一目的である。しかし、胃ろうを主栄養摂取手段とし胃ろう抜去の可能性が低い患者に、熱意をもって摂食嚥下リハビリテーションに取り組む在宅介護者は存在する。摂食嚥下の専門家は、このような患者の経口摂取に対し「お楽しみ」と評価してきた。しかし、食事準備の段階から労力をかけ、誤嚥の危険を帯びながらの経口摂取への介護者の努力は、「お楽しみ」の提供だけでは充分な説明がつきにくいと考える。本研究では、在宅介護者が経口摂取へ独自な意味づけが存在すると仮説を立て、質的研究デザインで研究を実施した。研究対象者の参入基準は、1)胃ろうの原因疾患は頭部外傷と脳血管性疾患2)要介護度4以上3)非言語を含む患者の意思表出能力残存4)摂食嚥下リハビリテーションを1年以上経験5)認知症の既往なし、の条件を満たす在宅患者に対し、6)食事介助を実施する主介護者である。聞き取り調査は、6名を一堂に集め、あらかじめ研究者で定めた聞き取り内容に関する問いかけに沿いつつも、自由な発言を促すという半構造化面接を用い、2時間程度実施した。発言内容は逐語録を作成し、独立する2研究者によりすべての発言を小分けにして見出しをつけるという初期の質的研究分析作業を行い、その後両者で合意形成を行った。今年度で、17名のデータ収集を終えている。次年度は、聞き取り調査の分析と並行して、質問票による横断研究の準備に取りかかる予定である。脳卒中急性期に70%ほど存在する嚥下障害は慢性期は10%となり、障害を持つ者の多くは地域で暮らしている。この集団に対して、胃ろう造設患者への摂食嚥下リハビリテーション(摂食リハ)の継続的施行により経口摂取回復をみた症例研究は散見される。しかし、地域で暮らす脳卒中慢性期患者へ科学的根拠の高い嚥下評価の機会は乏しく、嚥下能力の重症度は多様であると推測される。また、摂食リハはその効果に関するエビデンスは乏しいまま、社会的関心は高まっている。今年度、本研究は、摂食リハの在宅介護者の心理的効果に注目し、質的研究を実施している。嚥下障害が中程度(経口摂取と胃ろうでの栄養摂取が同程度)の在宅患者の介護者に対し、集団での聞き取り調査を実施した。これは昨年度実施した、嚥下障害重症者(少量の経口摂取だが主栄養摂取は胃ろうに依拠)の在宅介護者から得られた「経口摂取の持つ介護者への心理的支援・4概念」が、患者の経口摂取状況に影響されるかを比較する目的で実施した。データ分析は昨年度と同様に、発言内容を逐語録に記述し、全発言に対し見出しをつける帰納法的内容分析を、独立した2研究者により実施した。その後合意形成を行い分析用データセットを作成した。このデータセットから、発言内容の詳細な分析を実施し心理的支援・4概念に関し演繹的推論を実施し、結果を求めた。また、研究結果の信頼性を高めるために「経口摂取の持つ介護者への心理的支援・4概念」に関し、介護者の発言内容と研究者が見出した概念との間で齟齬が生じてないか検討するため、監査作業を実施した。今年度は質研究の結果から仮説を立て量研究による仮説検証を計画している。今年度の聞き取り調査は、5名の在宅介護者に対し12月に実施した。研究対象者の参入基準(65歳以上、脳卒中発症6ヶ月以上経過、在宅介護)と除外基準(失語症、重度の認知症、大うつの既往、アルコールやドラッグでの加療経験、日本語を母国語としない)は昨年度と同様であるが、比較対象とするため、嚥下障害の重症度が異なり、胃ろうと経口摂取による栄養摂取の割合が同程度である。嚥下障害重症者17名からのデータから得られた分析結果と比較する目的で実施しているため、5名のサンプリングで充分と考える。聞き取り調査は、あらかじめ研究者が定めた聞き取り内容を導く問いかけ(インタビュー・ガイド)に沿いつつも自由な発言を促すよう進行させる半構造化面接を用い、2時間半程度実施した。本研究は、在宅の胃ろう造設重度嚥下障害者の家族介護者に質的研究と量的研究を計画した。

質的研究で、患者の摂食嚥下リハビリテーション(摂食リハ)で少量の経口摂取改善による介護者の心理的支援を探ることを目的とした。さらに、質的研究の結果を踏まえた質問票による量的研究の実施を、4年の研究計画で実施してきた。質的研究はインタビューガイドを用いたフォーカス・グループ・インタビューを平成26、27年度に4回実施し、介護者22名からデータ収集した。インタビュー平均時間は2時間25分、介護者の平均年齢60.7歳、患者の平均年齢69.3歳、胃ろうの原因疾患は頭部外傷5人と脳血管性疾患17人、患者の要介護度は4が1人、5が21人であった。帰納法的内容分析をFramework分析で実施し、摂食リハの訪問受診構造から2概念、摂食状況改善から4概念が介護者の心理的支援として抽出された。摂食リハの受診構造は「次回受診日の確定」が日常介護の励みとなり、「内視鏡による嚥下評価」が摂食レベルの遵守と、介護チーム内で食支援の合意形成ツールに役立っていた。経口摂取状況改善による4概念は「家族の帰属意識の強化や復権」「全身機能訓練の推進」「介護負担観の軽減」「介護者の社会との接点」であった。平成28年度は量的研究の質問票開発と研究フィールド調整をした。当初は横断研究を想定した量的研究は、摂食リハの効果測定や経口摂取改善状況の知見が乏しい実情を鑑み、研究デザインをコホート研究に変更し、新たな研究計画を構築した。このコホート研究は本研究の発展的研究課題として平成29年度から新たな科学研究費基金助成を受諾され、研究期間4年で着手する。食支援の社会的関心も高いが、それを支える介護者の知見は乏しい。科学的手法に基づく本研究の知見は、多職種連携による食支援推進となり、学術・実務両面に利する点が大きい。在宅胃ろう患者は安全で持続的栄養摂取が可能だが、大きな役割を担う介護者の社会的孤立や生活の質の低下に関する研究は乏しい。本研究は、摂食嚥下リハビリテーションにより微量の経口摂取に回復した胃ろうをもつ在宅の脳卒中と頭部外傷患者の介護者を対象とした。在宅介護者が感じる摂食管理の負荷と、介護者の心理的側面への影響を明らかにすることを目的とした。聞き取り調査22人のデータに帰納法的質分析を実施した。「経口摂取回復が介護者に対する心理的影響」は、1家族の帰属意識の復権と強化、2経口摂取の回復と全身機能回復のつながり、3介護負担観の軽減、4社会との接点の再獲得、の4概念であり、この概念の質問票を開発した。研究実施に先立って、関係する2研究機関での倫理委員会の承認を得た後、研究対象患者の参入基準に従い、その在宅介護者へのフォーカス・グルー・インタビューの協力者を募った。参入基準は1)脳血管性疾患による胃ろう造設1年以上2)非言語を含むコミュニケーション能力残存3)要介護度4以上4)1年以上の在宅介護5)主たる栄養摂取は胃ろう6)65歳以上、である。インタビューは11月下旬に実施した。2時間程度、インタビューガイドを用いながら、できる限り自由な発言を促すように進行に努めた。ICレコーダーにて録音、逐語録を作成した。この段階で個人情報をコード化し、連結可能な個人情報保護を行った。独立した2研究者が逐語録を切片化し、すべての言語切片データにラベルをつけるという質的研究の初期分析作業を実施し、その後両者で合議形成を行ったものを分析データセットとした。現段階では、この分析データセットを用いて、在宅介護者が摂食嚥下リハビリテーションに関して抱く意味づけに関するデータカテゴリーに注目し言語データを詳細に記述する中期分析に着手している。
オンラインアルゴリズムの自動解析技術と設計支援システムの研究

将来の入力が未知である状況をモデル化したオンライン問題において、そのアルゴリズムの解析には、問題の性質上より良い解を得るために膨大な数の場合分けを必要とすることが多く、人手で全ての場合を列挙するのは事実上困難となる。本研究ではオンラインアルゴリズムの自動解析手法とアルゴリズム設計システムを提案する。kフレーム転送量最大化問題やオンラインユニットクラスタリング問題等のオンライン問題に対してアルゴリズムを設計し、競合比解析を行った。本年は主にオンラインユニットクラスタリング問題に取り組んだ。オンラインユニットクラスタリング問題はChanらによって定式化された問題で、平面上(一般にn次元ユークリッド空間)の任意の場所に1つずつ点が与えられ、そのたびにクラスタと呼ばれる長方形(一般にn次元直方体)で点を覆わなければならない。一度配置したクラスタは平行移動することはできないが、縦横の長さが各1まで伸ばすことはできる。アルゴリズムは新しいクラスタを割り当てるか、既存のクラスタを伸ばすかを選択する。この問題はクラスタの数の最小化を目的とするオンライン最適化問題である。この問題は施設配置計画問題やデータマイニングなどに応用を持つ。この問題について、従来は競合比の下限(これ以上は改良不可能という限界値)が8/5であることが知られていたが、本研究のテーマである計算機による自動解析フレームワークを適用することで、この値を13/8に改善することができた。その証明で用いられる手法は、手動による証明は複雑で困難であり、自動解析手法が役立ったと言える。また、点が過去に現れた場所に近接した場所に与えられるという制約を仮定することで、競合比の上限が13/8であるアルゴリズムの設計を行い、数学的に解析するのに成功した。この仮定を設けない場合、証明がさらに複雑になることが想定され、自動解析手法が役立つものと思われる。本結果は、国際会議への投稿中に向けて、論文としてまとめている最中である。本年はさらにkサーバ問題について、自動解析の手法を用いた競合比解析を試みた。kサーバ問題に対して、自動生成を行うための状態設計を行ったが、状態の種類数が爆発的に大きくなるため、計算機で扱える個数にするためのさらなる工夫が必要なことが分かった。一次元オンラインユニットクラスタリング問題の一般の場合、すなわち、点が離れた場所に与えられる可能性がある場合に関しては、当初想定していたよりも、クラスタ配置の構造が複雑になり、精密にアルゴリズムを設計しなければ競合比が改善できないことが判明した。そこで、本年度は一次元オンラインユニットクラスタリング問題の一般の場合に取り組んだ。当初の研究計画で挙げたように、自動化によって、競合比が目標値を超えた部分に対して、アルゴリズムの動作を改良して状態遷移図を作成することを繰り返し、競合比が目標値を超えなくなるような状態遷移図を作成することを試みた。これによって、当初、手動で作成していたアルゴリズムより遥かに複雑なアルゴリズムを構築することができた。これは手動によるアルゴリズム設計では困難な規模であり、自動化のメリットを生かすことができた。しかしながら、問題の構造が複雑でアルゴリズムのルール記述が精密になるため、既存アルゴリズムの競合比の改善はまだ達成できていない。特に、離れた箇所に与えられた点によってできる2つのクラスタのグループが1つにまとまるときは、クラスタを表現する文字列が結合されることに相当し、左右の文字列の全パターンについて結合した文字列が生じるので、場合の数が増大し、記述すべきアルゴリズムの動作も増えていく。今後、同様の改良プロセスを続けていくことで、競合比の改善が見込まれる。その際には論文発表を行う予定である。オンラインバッファ管理問題は、ネットワーク上のルータがパケットを転送する際、バッファにパケットを一時的に溜めておき、別の経路に送出する際、溜めたパケットに優先順位をつけて送出する最適化問題である。バッファ容量には限りがあり、バッファから溢れたパケットは破棄される。本研究では、動画データ等のフレームをk個のパケットに分割して転送し、フレーム内の全パケットの転送に成功したときに限りフレームが復元可能であるという設定で、フレームの転送数を最大化する問題(フレーム転送量最大化問題)を考えた。近年のインターネットでは動画や音声等のマルチメディアデータの取り扱いは不可欠であり、フレームの破棄を少なくするアルゴリズム設計は重要な課題である。この問題を、本研究のテーマである計算機による自動解析フレームワークを適用することでアルゴリズム設計に役立てた。競合比解析を行い、既存研究の競合比がkの2乗に比例する値であるところを、本アルゴリズムによってkに比例する値へ劇的に改善することができた(競合比はアルゴリズムの性能を表し、小さな値ほど良いアルゴリズムであるといえる)。さらに、これ以上は原理的に改善できないことも証明した。また、k=2の場合、フレームの一部を既に転送しているパケットを優先するという貪欲アルゴリズムの競合比が3であることを示し、そのアルゴリズムが最適である(これ以上改善できない)ことを証明した。貪欲アルゴリズムは実装が単純であるので、性能評価は実用上の意義も大きい。アルゴリズムの解析は場合分けが多数になり、複雑であったため、自動解析の手法が重要であった。本結果は2つの論文としてまとめ、それぞれ著名な国際会議に投稿中である。

また、kサーバ問題の計算機による自動解析について、検討を開始した。当初予定していた、オンラインユニットクラスタリング問題のアルゴリズムの設計を行うことができた。自動解析の汎用化に向けて、本技術の適用例を増やすことができた。このため、計画はおおむね順調に進んでいるといえる。当初予定していた、オンラインバッファ管理問題のアルゴリズムの設計を行うことができた。今後はオンラインユニットクラスタリング問題について、点が過去に現れた場所に近接した場所に与えられるという仮定の無い一般的な場合について自動解析を行う。用いるアルゴリズムは仮定のある場合と同様であるが、考慮しなければならない場合の数が増えるので、その部分について自動解析を用いる。さらに、kサーバ問題について、自動解析の手法を用いた競合比解析を行う。kサーバ問題は、平面上にk個のサーバが配置されており、ある場所にサービスの要求が次々と与えられ、そのたびにいずれかのサーバをその場所に移動させることを考える問題である。移動距離の最小化が目的である。kサーバ問題の競合比の最悪値はkであるという予想がなされているが、その予想の証明がオンラインアルゴリズムの分野の1つの有名な未解決問題である。予想に近づく結果を得ることが当面の課題である。前年度に引き続き、kサーバ問題に本手法を適用することを通じて、本手法の一般化、汎用化を検討する。今後は当初の予定通り、kサーバ問題について、自動解析の手法を用いた競合比解析を行う。kサーバ問題に本手法を適用することを通じて、本手法の一般化、汎用化を検討する。また、フレーム転送量最大化問題については、k of nと呼ばれる、n個のうちk個のフレームの転送に成功すればフレームが復元可能であるという、より現実的な設定を考えることができ、こちらについても検討を進める。平成24年度に予定していた情報収集、研究発表のためのセミナー、学会参加が平成25年度に延期になったため、平成24年度は未使用額が生じた。次年度は論文発表や情報資料収集のための国際会議
巨大ユニットセルを持つ炭素ナノ構造体の理論研究総合システムの構築

ナノカーボン系の重要性は、その原子配置を変化させることにより、電子物性、さらには機械的物性が多種多様な系を実現できることにある。しかも、その原子配置の取り得る多様性は、フラーレン系・ナノチューブ系それぞれで、無限種類あるといっても過言ではない。これが、ナノサイエンス・ナノテクノロジーにおいてナノカーボン系が最重要物質群とされ、研究が集中的に行われている理由である。しかし、その多様性こそが、ナノカーボン系に対する統一的な研究手法の確立を困難にしている。即ち、周期系で定義される、いわゆる「ユニットセル(単位胞)」が巨大な系が多いこと、そして、そのために、それぞれの系で、用いることのできる理論手法が異なるからである。本研究では、炭素系に関して、各種の手法(モデルポテンシャル法、分子動力学法、タイトバインディング法、密度汎関数法等)に対して、全く同一フォーマットのインプットファイル、即ち、「原子配置」をインプットとして統一して用いることのできる総合的な理論研究システムを立ち上げた。通常、各種法において必要となるインプットの多くの部分は、扱う元素の種類に強く依存している。無論、それにより、各種元素からなる化合物の構造予測・物性予測が可能になる。ただ、炭素系に限った計算を実行する、という場合には、そのインプットファイルの多くの部分は、普遍の部分として固定できるものである。即ち、インプットファイルから消去可能である。本研究では、このことを利用して各種理論研究手法のプログラムを炭素系を扱う場合に特化してコーディングし直した。これにより、原子配置からなるインプットファイルによる計算が可能となった。炭素ナノ構造体の理論研究総合プログラムシステムの構築を最終目的とする本研究課題の初年度として、まず、タイトバインディング法に基づく分子動力学計算プログラムを作成した。炭素ナノ構造体のダイナミクスを研究する際には、sp2混成軌道を取る炭素原子の織りなす2次元平面間の相互作用を記述できることが重要である。本研究で組み込んだタイトバインディング法は、この面間の相互作用を密度汎関数法と同レベルで記述出来る様に当研究室でパラメータを新たに定めたものである。他方、分子動力学手法部分には、温度一定の条件の下で系の時間発展を追うプログラムに加えて、圧力一定の条件の下で系の時間発展を追うプログラムを完成させた。これまで、新たな炭素ナノ構造体の合成研究では、既知の系への加熱のみならず、系に圧力をかけることによって達成されてきた。組み込まれた分子動力学法の多様性から、本総合プログラムシステムは、実験研究の解析のみならず、実験に先立って理論的に新構造を予言することも研究目的となりうるものとなった。その応用例として、カーボンナノチューブ固体を加圧した場合に体心正方格子を組んだ新しい炭素結晶相があり得ることが示唆される結果を得ている。炭素ナノ構造体の研究にタイトバインディング法を用いる利点は、第一原理電子構造計算手法に比較し、その扱える系の大きさが数倍10倍ほど大きいことであるが、それでも、さらに大きな系の研究が必要となる場合も多い。その場合に有効となる原子間モデルポテンシャル法の一つであるTersoffポテンシャルの精度確認とその利用を進めている。カーボンナノチューブ・フラーレンをはじめとする炭素ナノ構造体には、結合トポロジーの異なる無限のバリエーションがあり、実際、今日でも新結晶相の発見が続いている。また、ナノチューブの精製研究では、直径と螺旋度の完全制御はまだこれからの課題である。現在のところ幾つものトポロジーの異なるチューブの混在した試料しか得られていないのが現状である。このような状況下、理論研究の果たすべき役割は多岐にわたっている。即ち、新構造の電子物性・安定性の予言研究、高温処理・高圧処理による各種ナノ構造体の構造相転移研究、さらには、STS/STMや光電子分光スペクトルなどの実験研究との対応研究など、多くの重要な役割が期待されている。

しかも、炭素ナノ構造体では、扱う原子数が数百原子以上となることもあるため、いわゆる第一原理電子構造計算を用いた研究手法のみならず、原子間ポテンシャル法、タイトバインディング法などの各種研究手法を、その研究目的に応じて使い分ける必要がある。その際に準備するべき入力データファイルは、それぞれの手法によって、多様なものが要求されていたため、これまでは、各プログラムに精通した者のみ、その研究展開が可能であった。しかし、本研究において、扱う元素が炭素であるということを積極的に利用することにより、各研究手法に対して、対象とする構造体の原子の位置座標のみを基本入力データとする「インターフェースプログラム」を作成、炭素系専用の多機能プログラムシステムを構築することができた。これにより、原子間モデルポテンシャル法、タイトバインディング法、密度汎関数法、さらには、GW法に至るまで、基本的に同じインプットファイルを準備することで研究展開が可能となった。今後、広く活用されることが期待される。
ワンステップiPS細胞誘導・相同組換え法の開発

ヒトiPS細胞を利用した遺伝子修復治療において、染色体変異の蓄積を最低限にするために、iPS細胞の誘導と相同組換え体の樹立とを同一ディッシュ上で可能にする方法論の確立を目的として研究を行った。ヒト線維芽細胞株に、山中4因子をコードしたセンダイウイルスベクターを感染させて、iPS細胞を誘導した。そして、iPS細胞様コロニーをまとめて継代した後に、HPRT遺伝子座ノックアウト用アデノウイルスベクターを感染させ、3-5%の高頻度で相同組換えが得られていることを確認した。全過程を約6週間で達成可能であった。本研究では、ヒトiPS細胞を利用した遺伝病の遺伝子修復治療への治療応用を目指し、細胞操作過程での変異の蓄積等を最低限にするために、ヘルパー依存型アデノウイルスベクター(HDAdV)を用いた高頻度相同組換え法を用いて、ヒトiPS細胞の誘導と誘導されたiPS細胞からの相同組換え体の樹立を同一ディッシュ上で可能にする方法論を確立することを目標とする平成22年度においては、Nanog-GFPマウス由来胎児線維芽細胞(MEF)並びにIL2受容体γ鎖(mIL2RG)遺伝子欠損マウス由来のMEFに山中4因子または3因子をコードしたレトロウイルスベクターを感染させ、標準法に従い、iPS細胞クローンを複数クローン得た。これらのクローンに関しては、未分化細胞特異的細胞表面マーカーによる免疫染色、bisulfite sequencingによるOct3/4遺伝子プロモーター部位の脱メチル化、レトロウイルスベクターのサイレンシングなどを調べることにより、iPS細胞であることを確認した。次に、マウスiPS細胞における相同組換え法を至適化するために、ウイルスの量を変えて、正常なmIL2RGをコードした遺伝子修復HDAdVを感染させた。ウイルスの量は、細胞あたり10^4ウイルスゲノムコピーが至適で、それより高いと細胞に対して強い毒性が見られた。その結果、blasticidin耐性/ガンシクロビル耐性の二重耐性細胞コロニーの4因子では15.4%、3因子では13.0%において、相同組換えによってIL2RG座が修復されていることが明らかとなった。今後、HDAdV感染・相同組換え条件を更に至適化した後、iPS細胞誘導とHRを同時に行うプロトコールに取り組む予定である。本研究では、ヒトiPS細胞を利用した遺伝病の遺伝子修復治療への治療応用を目指し、細胞操作過程での変異の蓄積等を最低限にするために、ヘルパー依存型アデノウイルスベクター(HDAdV)を用いた高頻度相同組換え法を用いて、ヒトiPS細胞の誘導と誘導されたiPS細胞からの相同組換え体の樹立を同一ディッシュ上で可能にする方法論を確立することを目標とする平成23年度においては、ヒト線維芽細胞TIG-3株に産業技術総合研究所(AIST)の中西真人博士より分与された、山中4因子をコードしたセンダイウイルスベクターを感染させて、iPS細胞を誘導した。そして、iPS細胞様コロニーの出現に伴い、個々のコロニーをクローニングすることなくまとめて継代を繰り返した後に、6-17×10^6個の細胞に対してヒトHPRT遺伝子座ノックアウト用アデノウイルスベクターを感染させ、ベクターが染色体に組み込まれた細胞クローンをG418選択によりクローニングした。さらにこれらクローンで、相同組換えが得られるかどうかをPCR法により検討した。その結果、iPS細胞様クローンの出現後、13日目、26日目、44日目の細胞を感染した場合に、コロニー19個中1個、46個中3個、129個中4個で相同組換えが得られていた。さらにこれらの細胞クローンについて、bisulfite sequencingによってNANOG遺伝子座プロモーター領域の脱メチル化を調べたところ、ヒトiPS細胞と同様に脱メチル化されていることが確認された。これらの結果より、アデノウイルスベクターを用いた効率の良い相同組換え法を用いることによって、ヒトiPS細胞を誘導しながら同時に相同組換えによる遺伝子ノックアウトが可能であることを示すことができた。