hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
風疹ウィルス構成タンパク質の生物学的性状に関する研究

1.E1及びE2蛋白の単離が困難であった為ウィルスを免疫抗原にして、単クローン抗体の作製を行なった。(1)新たなE1の抗原部位を認識する抗体が得られ、この結果少なくともE1には4つの抗原部位が存在することが分った。(2)抗C単クローン抗体が得られた。(3)(1)及び(2)の抗体は生物活性を示さなかった。2.風疹ウィルスの被膜糖蛋白質の性状を下記の処理により調べた。(1)pH6処理で風疹ウィルス感染細胞は融合を起こす。(2)pH5処理でウィルスのHA活性は減少し、更にトリプシン処理を加えるとHA活性は低下する。(3)トリプシン消化に対し、E1は抵抗性に、E2はやや感受性に変る。(4)pH5処理によりウィルスはリポソーム結合能を獲得する。これらの結果から、低pHによる惹き起こされる被膜蛋白質の構造変化は、ウィルス被膜とライソゾーム膜との融合の過程を再現していると考えられた。3.風疹ウィルス感染細胞から抗原の一部が失われている可能性について検討を行った。感染細胞の培養液から超遠心分離でウィルス粒子を除いた残りに分子量42Kの蛋白が検出された。これは、単クローン抗体との反応性からE1と同定された。ウィルス粒子のE1の分子量が58Kであることからこの42Kの蛋白は蛋白分解酵素によりE1の一部が切られ培養液中へ遊離したものと考えられた。より増殖性の高い宿主細胞の検討の為、Vero細胞を用いて風疹ウイルスの増殖性を調べたが、徒来用いているBHK細胞に比べウイルス収量が若干低かった。前回と同様の免疫方法及び抗体のスクリーニング法で新たに得た単クローン抗体の抗E1,15クローン,抗C,2クローンについて性状を調べた。抗E1抗体は、赤血球凝集阻止(HI)活性の有無にかかわらず、ウイルスの中和能を示さなかった。既報の抗E1の3クローンとの認識抗原部位の同異については、目下解析中である。一方被膜ポリペプチドのE1とE2の構造とその生物活性との関連を知る為に、ウイルス粒子を2メルカプトエタノール又は、低pH処理したところ、ウイルス粒子の赤血球凝集(HA)能が消失した。処理後、トリブシンによる分解を行なうと、両者の分解産物は異なり、こうした処理で生じる構造変化が両者で異なることが判った。低pH処理ウイルスは赤血球溶血能を有するので、細胞融合に関与する構造変化が非可逆的におきたものと思われる。現在の所、トリプシン処理によってE1又はE2を高純度に分離することはできなかった。既に得られていた風疹ウイルスに対する単クローン抗体の認識抗原部位を解析した結果抗E1抗体15クローンの内4クローンが既知の3つの抗原部位に属さず,新たに4番目の抗原部位を認識していることが分った.これらの抗体は,赤血球凝集阻止(HI),ウイルス中和(NT)活性をもたない. 2種の抗Cクローンは,同一抗原部位に対する抗体であった.又,未同定であった1クローンOS,免疫沈降反応で分子量38Kのポリペプチドを沈降させることから,抗E_2抗体と考えられた.更に抗体のウイルス特異性を検討している.現在,ポリエチレングリコールを用いずに超遠心で濃縮したウイルスで頻回免疫を行ない,再度単クローン抗体の作製を試みている.他方,風疹ウイルスの構成蛋白の性状を,酵素処理,低PH処理等により解析した.低PH処理ウイルスは,フオスファティジルコリンで作ったリポソームに結合するように変化し,両親媒性(amphipbilicity)を獲得した.これはおそらくE1がトリプシン抵抗性に変った事と相関しており,ウイルス被膜と宿主細胞膜との融合機構を反映しているものと思われる.ポリエチレングリコールを用いず遠心のみで濃縮したウイルスを頻回免疫して得た51種の抗体の性状を調べた。

免疫沈降反応で細胞成分や分子量26Kの未知の蛋白と反応する抗体が多く、ウイルス特異性が確認出来た抗体は7種で全てE1と反応した。それらの認識抗原部位や生物活性及び未同定の抗体の性状について更に解析を続けている。現在迄の所、反応性の強いE2抗体や、高い中和活性を有する抗体が得られてない為本年度の研究課題である抗体を用いたウイルス構成蛋白の性状と機能の解析に着手出来なかった。他方、風疹ウイルス感染細胞から抗原の一部が失われている可能性について調べた。感染細胞の培養液に庶糖密度勾配遠心法によりウイルス粒子とは明らかに異なる沈降係数を示す分子量42Kの蛋白質が認められ抗E1単クローン抗体との反応性からE1と同定された。E1の分子量が58Kであることからこの42Kの蛋白は蛋白分解酵素によりE1の一部が切られ培養液中へ遊離したものと考えられた。
性ステロイドホルモンはストレス性脳組織変性による学習成績低下を防ぐか?

性ステロイドホルモンがストレスによる神経細胞破壊の防御機構としての働きを持つこと、特に記憶に関与する神経系において重要な役割を演じている可能性を検証するため、ストレス負荷とアンドロジェンレベル、そして学習成績の相互関係について検討した。去勢群、去勢群+テストステロン、対照群のラットを5週間の寒冷曝露負荷の有無により6群にわけた。明を正刺激とするスキナ-型明暗弁別学習(元学習)では3-6セッションにおいて去勢群は他群に比べ正反応率は有意に低い値を示したが、その他の30セッションまでの間と続いて行った暗を正刺激とする逆転学習の30セッションでは、いずれの群間においても差は認められなかった。このことは、テストステロンが寒冷ストレスによる学習初期の成績低下を防ぐことを示している。一方、明暗弁別学習は扁桃核が深く関与すること、また脳組織標本の観察から扁桃核ではこの種のストレスの影響は小さいことが示唆された。海馬と扁桃核のアセチルコリン放出量を測定したが群間差は見られなかった。脳組織標本は、海馬の神経細胞の変性はストレスを負荷した去勢群において顕著であることを示した。また、海馬へ投射する中隔アセチルコリン作動性ニューロンの絶対不応期は他群に比べ去勢群に有意な延長が認められた。これらの結果より、アンドロジェンが記憶に関与する海馬神経細胞および海馬へのアセチルコリン作動性ニューロンのストレス性組織変性および機能低下の阻止作用を持つことが判明した。従って、海馬の重要な役割の1つである空間認知の試験等を行う必要がある。
アメリカ中学高校教科書におけるマーク・トウェイン-その改変と自己検閲の系譜-

1870年代から2000年代におよぶアメリカの主に中学・高校教科書におけるマーク・トウェインの文学作品の使用状況の概要を分析した。特に、130年余りにわたって非常に早い段階から繰り返しトウェイン作品がアメリカの様々な学校教科書で利用されていたことや、トウェイン作品が同時代の文学研究やトウェイン研究の潮流にしばしば影響される形で教科書に利用されていった点などが本研究により初めて明らかになった。アメリカ中学高校教科書におけるトウェインヘの言及とトウェイン作品の使用状況の調査分析。調査対象となる時代は、18701990年代。平成19年度は、今後分析の対象となる必要資料の収集を進めた。夏期に2週間、春期に10日程、米国ワシントンDCに滞在し、米国議会図書館でマーク・トウェイン作品が掲載されるか、またはトウェインへの言及がある中学・高校教科書の調査と収集を進めた。この調査によって、同図書館が所蔵する1900年代1950年代の資料の調査と収集はほぼすべて完了した。収集した大量の資料はすべて複写をとって年代ごとにファイルに分類し、それぞれの学校教科書における掲載作品の記録と、掲載教科書の書誌作成を行った。収集した資料の詳細な内容分析まで進めることはできなかったが、当初予測していたよりもかなり早い時期(最初期は1870年代)からトウェインがアメリカの中高の文学教科書や読解教科書(Reader)で取り上げられていたことが判明し、アメリカの教育現場においてトウェイン文学が早くから浸透していたことが明らかになった。また、20世紀後半においては、トウェインの代表作Adventures of Huckleberry Finn(1885年)が最も頻繁に文学教材として利用されたことは常識であるが、20世紀前半までは同作品よりも、むしろ西部旅行記のエピソードやスピーチといった現在注目されることの少ない初期のスケッチ風の作品の方が頻繁に教科書に登場しており、学校教科書を通してトウェイン文学への理解や評価の時代的変遷を垣間見ることができた。また、20世紀前半までの中高のアメリカ文学教科書では、ユーモアのセクションでトウェインが紹介されることも多く、明るい笑いの要素が強調される傾向が強いことが明らかになった。しかしその一方で、トウェインの真剣な社会批判やペシミズムへの言及がなされることは少なく、同文学の幅広い要素への理解や関心が、20世紀前半までは教育現場で必ずしも浸透していなかったことも明らかになった。平成19年度に引き続き、平成20年度も主にアメリカの学校教科書、特に初等高学年、中等教育レベルのアメリカ文学と読解分野の教科書の収集を行った。特に、夏期には比較的長期にわたってワシントンDCの米国議会図書館に滞在することができ、未見の1870年代から20世紀前半に及ぶ300点におよぶアメリカ文学と読解の学校教科書を調査することができた。また、高校レベルまでの学校教科書が主な対象とはいえ、大学レベルの教科書との互換性や影響関係もあるので、著名なものについては、通常は大学レベルで使用される教科書についても収集と分析を進めた。加えて、近年の電子資料媒体の急速な発展により、版権の切れた教科書についてはその多くがオンライン上でも閲覧できるようになっているので、主として「Internet Archive」というウェブサイトを利用したオンライン上での資料収集も積極的に進めた。その結果、1945年以前においては130点ほどの学校教科書において、マーク・トウェインへの言及、分析、作品の抜粋掲載などがなされていることを突き止めた。分析を通して、同時代の教育現場におけるトウェインの正典化の流れが徐々に明らかになりつつある。また、資料収集に加えて、トウェインが生存した時代(1910年以前)については、収集した教科書の内容分析も進めた。まだ論文の形としてはまとまっていないが、現時点では500枚近い内容分析に関するカードを作成中である。同時代については、更なる分析を行い"Mark Twain and American SchoolTextbooks ; 1870s-1910"として、来年度の平成21年度、8月にアメリカで開催される国際大会で発表を行う予定。すでに同学会の審査委員会より発表承認の通知をを受けている。収集した教科書資料のうち1910年までに出版された教科書の分析を行った。分析の結果、これまでいずれの研究者も指摘してこなかった数々の事実を突き止めることができた。中でも、1873年という極めて早い段階で、マーク・トウェイン作品の抜粋が米国教科書に採用されていた事実を示すことができたことは重要である。掲載作品は旅行記からの抜粋で、教育現場で極めて早い時期から小説より旅行記の作者としてトウェインが認識されていた事実を明らかにできた。さらに20世紀初頭までの米国教科書においては、トウェインは主としてユーモア作家として偏向した紹介がなされたことを明らかにした。同時代作家が小説家として紹介される中で、トウェインは「ユーモア」関連の章で繰り返し紹介されることが多く、彼の鋭い社会批評家として側面は無視ないし軽視されていることが明らかになった。特に、米国における19世紀最大のベストセラー教科書『マガフィー読本』においてトウェインが徹底して軽視されていることは注目に値する。

トウェイン作品を紹介した例は、わずか1回、高校生用の『マガフィー読本』(1889年)が掲載した初期旅行記の抜粋のみで、最高傑作と多くが認める『ハック・フィン』に対しては最低の評価を下して言及している。『ハック・フィン』評価の浮沈は多くの研究者に指摘されてきたが、出版当初から教科書においても『ハック・フィン』評価が困難に直面していたことを示すことができた。これらの事実を同時代米国のトウェイン観や文学観と有機的に関連付けて分析した成果を、2009年8月に実施された米国ニューヨーク州で開催された第6回国際マーク・トウェイン学会、および同年9月に実施された日本児童文学学会例会で発表した。また、英語論文としても2010年3月刊行の学術誌『早稲田教有評論』に発表した。本年度は、研究対象であるマーク・トウェインの没後100周年と重なったこともあり、研究内容について内外の研究者と交流する機会を多く持つことができた。特に、秋に開催された日本アメリカ文学会全国大会での記念シンポジウムでは、アメリカ文学の研究や教育における最も重要なテクストである4つの主要アメリカ文学史におけるトウェイン紹介に関する研究成果を発表する機会を持った。研究対象として、北米で出版された1910年代から2000年代のおよそ100年近くに及ぶ主要文学史を設定したが、研究の結果、トウェインに関する記述が、西部性の愛国的言説の強調から次第に多文化主義的言説にとって代わられる状況を明らかにすることができた。特に、文学史編集者や執筆者の学問的スタンスや、第二次大戦などの編集を取り巻く愛国的社会状況、80年代以降の多文化主義によるマイノリティ重視の学問潮流など、同時代の様々な影響の跡をみることで、文化的・社会的解釈を踏まえたより深い考察になるように留意した。尚、本シンポジウムでの成果は、2011年4月に出版予定の日本マーク・トウェイン協会の機関誌に発表される。また、トウェイン没後100周年を記念して出版された日本初のトウェイン事典(『マーク・トウェイン文学・文化事典』)の主要編集・執筆者として研究の成果を一般読者に分かりやすい形で紹介する機会を持った。同事典では、主にトウェインと日本観連の記述を担当したが、トウェインの没後年表の作成においては、本研究を進める過程で発見した内容などを盛り込むことができた。さらに、資料収集が遅れていた1960年代以降の教科書資料に関しては、2011年3.月にスタンフォード大学教育図書館教科書コレクションで集中的に収集を行った結果、教師用指導書を含め様々な貴重な教科書関連資料を入手することができた。
低温ストレス応答におけるｍＲＮＡ合成と分解の協調的制御システム

低温は、迅速に対応しなくてはならない主要な環境ストレスのひとつである。本研究ではマイクロアレイと転写阻害剤処理を組み合わせた“mRNA-decay array"によって,低温ストレスに応答してmRNA分解速度が大きく変化している遺伝子群を明らかにした。本年度は,mRNA-decay arrayの詳細な解析によって得られた知見を,論文として取り纏めて発表した(Chiba et al., 2013)。一方で,低温ストレスに応答して発現レベルを上昇させ,かつ不安定化される遺伝子群,なかでも低温ストレス応答に重要な転写制御機構であるCBFレギュロンの下流に位置する7つの遺伝子に焦点を絞り個別解析を行った。これらの遺伝子は,いずれも低温ストレスに応答してその発現レベルを上昇させるが,その上昇パターンは遺伝子により多様であることを見出した。発現の上昇にはCBFによる転写制御が関わっていることが明らかであり,同時にmRNAは不安定化されていることから,このような低温ストレスに応答した様々な遺伝子発現の変化パターンは転写と分解の協調制御によって実現されていると考えられる。各遺伝子の構造のうち,転写制御はプロモーター部位によって行われていると考えられるが,mRNA分解の制御に重要な領域はよくわかってはいない。実際に,低温ストレスに応答したmRNA分解制御に関わる遺伝子部位を決定するために,様々な部位をレポーター遺伝子に繋いだコンストラクトを作成した。当初はこれらの融合遺伝子を一過的発現系で発現させて,低温処理後の発現変化パターンを比較することにより,各遺伝子部位の役割評価する予定であったが,様々な実験条件を試みたにも拘らず,この方法が技術的に大変難しいことが明らかとなった。そこで,T87培養細胞を形質転換させることにより,これらの融合遺伝子の発現を調べるために,形質転換体の作成を進めた。24年度が最終年度であるため、記入しない。移動という逃避手段を持たない植物にとって、急激な環境の変化は大きなストレスであり、随時、適応していかなくてはならない。これまでのストレス応答に関わる遺伝子発現制御機構の研究は、転写制御に関するものが中心であったが、実際の細胞内のmRNA量は合成と分解のバランスにより調節されている。ゆえに合成と分解の両方の制御機構を理解して初めて,遺伝子発現における植物の持つ巧妙なストレス応答システムを真に理解したことになる。いろいろな環境変化の中でも低温は、迅速に対応しなくてはならない主要な環境ストレスのひとつである。本研究ではマイクロアレイと転写阻害剤処理を組み合わせた解析である“mRNA-decay array"によって低温ストレスに応答してmRNA分解速度が大きく変化している遺伝子を探索した。本年度はその詳細な解析を進めることによって,以下のことを明らかにした。1低温下では多くの遺伝子が安定化し,その半減期がコントロール条件下のおよそ12倍になっていることがわかった。また,この安定化は低温における一般的な酵素活性の低下によるものであることが示唆された。2低温によって引き起こされる一般的な安定化を基準に,より安定化あるいは不安定化する遺伝子群を単離したところ,数千の遺伝子群が低温ストレスに応答して,その分解の速度を変化させていることを見出した。3興味深いことに,ストレス応答あるいはホルモン応答に関わる遺伝子群が,その発現レベルを上昇させる一方で不安定化される傾向があることを明らかにした。4多くのPPR遺伝子が低温ストレスに応答して不安定化されることを見出した。5低温に応答して安定化あるいは不安定化する遺伝子の,様々な遺伝子構造上の特色を見出した。一方で,低温ストレスに応答して発現レベルを上昇させる一方で不安定化される遺伝子群に関する個別解析を進めた。mRNA-decay arrayの詳細な解析に予想以上の時間を必要としたため,個別解析が若干予定より遅れた。
言語ベース探索アルゴリズムによる名人を超えるコンピュータ将棋の実現

本研究の目的はminimax探索を基盤とするコンピュータ将棋プログラムに言語処理で培われてきたアルゴリズムを導入し,特にn-gram統計を利用したヒューリスティックを用いて強化を図り名人レベルのプログラムを実現することであった.実際,昨年度導入したn-gramを用いたキラーヒューリスティックや,浅いレベルに限定したヒューリスティックの利用は本研究室で開発を行ってきたコンピュータ将棋TACOSの強化に寄与し,その名前が先日情報処理学会から日本将棋連盟に送られた挑戦状において「名人に伍する力ありと情報処理学会が認めるまでに強いコンピュータ将棋」を実現するための一プログラムとして記されたことで,当初の目的は一定の成果を挙げた.ここ数年のコンピュータ将棋の発展を概観すると,その原動力が大規模な評価関数の自動調整と計算機速度の上昇によって可能となった網羅的な探索にあったと言える.そのような状況で我々の手法は選択的な探索を指向しており方向を異にしていた感はある.しかしながら本年度の発表に挙げたような人間の熟達度を測る指標としてのn-gram統計の利用を見出したことは,一般人がほとんど太刀打ちできなくなったコンピュータ将棋のこれからの方向性-初心者への教師としてのプログラム形成-を考えていく上で貢献できると考える.また本研究での成果はコンピュータ囲碁の発展に貢献できると考えられる.将棋では名人レベルへの目処がついたが,囲碁(19路)ではいまだアマチュアのレベルである.コンピュータチェス,コンピュータ将棋の歴史を見るといずれもヒューリスティックの効果的な利用がプログラム強化のブレイクスルーとなった時期があり,コンピュータ囲碁ではまさにその時期にあたる.本研究の延長として言語ベースアルゴリズムによる名人レベルのコンピュータ囲碁の実現を今後の課題としたい.ngramモデルを利用してゲーム木の必要な部分を深く,そうでない部分を浅く探索するようなアルゴリズムを考案した.コンピュータ将棋では鶴岡らの実現確率探索がよく知られており同様の効果を目的としている.この手法では局面の実現確率Pを,ルート局面で1,子局面では親局面の確立に指し手の確率(人の棋譜かち統計的に求める)をかけたものとして定め,確率が一定の閾値を下回るところまで探索する。この「指し手の確率」は親の局面の特徴と指し手そのものの特徴にのみ依存しており,手筋など連続性のある手順中の手は正当に評価されないおそれがある。そこでngramモデルによる確率を利用することでこの問題の解決を図った.シャノンの提案したngramモデルは語の生起する確率が先行するn-1語によって定まるとする非常に単純なものであるが連続したパターンを表現する優れた手法として認知され自然言語処理をはじめ幅広く利用されている.研究では指し手(移動前の座標,移動後の座標,移動前の駒の種類,成る成らず)を1語と見なし,プロ棋士の棋譜16000局余りから3gramモデルを構築した.このモデルによる指し手の確率を利用したプログラムと一様深さの探索を行うプログラムとを比較対戦したところ有意に勝ち越した(危険率5%で勝率59±6%).しかしながら実現確率探索には今一歩及ばなかった。また指し手予測の精度で見た場合,序盤では高く,ゲームの中盤以降に大きく悪化することが確認できた.今後の課題として(1)このようなゲームの進行との関連性を利用すること(2)モデル化に利用する指し手の特徴を検討し直すことが考えられ,これらを通して最終的なアルゴリズムの完成を目指す.本研究の目的はminimax探索を基盤とするコンピュータ将棋プログラムに言語処理で培われてきたアルゴリズムを導入し,特にn-gram統計を利用したヒューリスティックを用いて強化を図り名人レベルのプログラムを実現することであった.実際,昨年度導入したn-gramを用いたキラーヒューリスティックや,浅いレベルに限定したヒューリスティックの利用は本研究室で開発を行ってきたコンピュータ将棋TACOSの強化に寄与し,その名前が先日情報処理学会から日本将棋連盟に送られた挑戦状において「名人に伍する力ありと情報処理学会が認めるまでに強いコンピュータ将棋」を実現するための一プログラムとして記されたことで,当初の目的は一定の成果を挙げた.ここ数年のコンピュータ将棋の発展を概観すると,その原動力が大規模な評価関数の自動調整と計算機速度の上昇によって可能となった網羅的な探索にあったと言える.そのような状況で我々の手法は選択的な探索を指向しており方向を異にしていた感はある.しかしながら本年度の発表に挙げたような人間の熟達度を測る指標としてのn-gram統計の利用を見出したことは,一般人がほとんど太刀打ちできなくなったコンピュータ将棋のこれからの方向性-初心者への教師としてのプログラム形成-を考えていく上で貢献できると考える.また本研究での成果はコンピュータ囲碁の発展に貢献できると考えられる.将棋では名人レベルへの目処がついたが,囲碁(19路)ではいまだアマチュアのレベルである.コンピュータチェス,コンピュータ将棋の歴史を見るといずれもヒューリスティックの効果的な利用がプログラム強化のブレイクスルーとなった時期があり,コンピュータ囲碁ではまさにその時期にあたる.本研究の延長として言語ベースアルゴリズムによる名人レベルのコンピュータ囲碁の実現を今後の課題としたい.
子宮内膜におけるPPARgammaの生理的並びに病態的意義の解明

子宮内膜、胎盤におけるPPARgammaの生理的役割の解明並びに子宮内膜癌及び子宮内膜増殖症におけるPPARgammaの病因・病態との関連解明を目的として、本年度は、子宮内膜の正常各期、胎盤、各分化度の子宮内膜腺癌および子宮内膜増殖症症例において、PPARgammaの発現に関する免疫組織化学的検索を行なった。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を使用して、子宮内膜正常増殖期、子宮内膜正常分泌期、卵巣、胎盤、及び、その他の正常臓器一通りに関して、また、病変としては、子宮内膜腺癌(高分化型、中分化型、低分化型)、子宮内膜増殖症、卵巣癌、及び、比較として結腸癌、膀胱癌、腎癌に関して、免疫組織化学的にABC法を用いて検討した。結果として、子宮内膜増殖期5例はいずれも免疫組織化学的にPPARgamma陰性、子宮内膜分泌期もPPARgamma陰性であった。一方、胎盤にはPPARgamma陽性像が得られた。卵巣間質の一部もPPARgamma陽性であった。肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、大動脈、副腎、膵臓等の正常臓器では陰性であったが、胃腺窩上皮の一部に陽性像を認めた。病変に関しては、子宮内膜腺癌では、高分化型腺癌4例ではいずれもPPARgamma陰性であったが、中分化型腺癌2例はいずれも陽性、低分化型腺癌1例も陽性であった。一方、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌の各1例および腎癌2例は陰性であった。子宮内膜増殖症もPPARgamma陰性であった。現在、子宮内膜正常各期、内膜腺癌各分化度及び増殖症の各型ごとに症例数を増やして更に解析を進めている。
乳児期における移動運動と社会性の初期発達

本研究は、運動発達を単純な身体の成長過程としてではなく、「心」の発達と深く関連したものとして捉える立場である。とりわけ、生後8ヶ月近辺に獲得される移動運動発達に注目し、移動獲得に伴う様々な心理的変化を実証的に明らかにすることを第1の研究課題としている。今年度は、昨年度から継続して取り組んでいる母子間相互作用の縦断的観察データの解析を進展させた。結果から、乳児の移動獲得に伴い、母子相互作用の形態(身体距離や対面頻度)が変化することが明らかになった。このことは、"生後9ヶ月の奇跡"と称される生後1年目後半の飛躍的な社会的認知能力の高まりが"どのようにして"生み出されるのかという発達機序の一端を明らかにしたと考える。次に本研究の第2の研究課題として、運動発達を中核に据えた発達の相互性という見地から、運動障害のある人達への発達支援法の構築がある。研究の第1課題が人間の発達メカニズムを明らかにする試みと位置づけると、この第2課題は第1課題で得られた知見の妥当性と社会的貢献度を見極める試金石であると言える。今年度は、運動障害のある子ども・成人に対して、移動運動発達の支援を行い、心理面の変化について詳細な検討を行った。その結果、運動障害のある人達も、移動獲得に伴い、他者への関心や社会的行動の獲得といった心理的側面に大きな変化が生じることが明らかになった。このような研究成果は、障害のある人達の「発達的」変化という側面への注目を喚起するものであると考えている。以上の研究成果は、ヨーロッパ発達心理学会や日本心理学会、日本特殊教育学会などで発表された。とりわけ、生後8ヶ月近辺に獲得される移動運動発達に注目し、移動獲得に伴う様々な心理的変化を実証的に明らかにすることを第一の研究課題としている。平成16年度は、移動獲得期にある乳児の空間認知能力に関する実験を行い、乳児は生後8ヶ月頃に効率的な視覚的注意を獲得することを明らかにした。また、乳児の移動獲得に伴う養育者の変化が乳児の社会的発達を促進するといった先行知見を詳細に検討する為、数十名の母子を対象に生後6ヶ月から10ヶ月までの母子相互作用を縦断的に観察した。その結果、乳児の移動獲得に伴い、母子相互作用の形態(身体距離や対面頻度)が変化することが明らかになりつつある。現在、本データを用いた論文を準備中である。平成16年度は、運動障害や知的障害のある人達に対して、動作発達支援を行い、心理面の変化について詳細な検討を行った。その結果、障害のある人達も、動作発達に伴い、他者への関心や社会的行動の獲得といった心理的側面に大きな変化が生じることが明らかになった。このことは、従来のリハビリテーションが身体機能の向上を重視し、障害のある人達の「発達的変化」という側面への注目が相対的に希薄であったことを明らかにしたと考える。以上、本研究は発達の基礎的メカニズムの検討とその臨床的応用の2つの研究課題について一定の成果を得た。平成17年度は、より精緻な実験的検討と臨床的応用を行うこととしたい。
建築および環境教育におけるデザインプロセス指導に関する実験的研究

建築及び環境デザインの指導に関し、神戸芸術工科大学における環境デザイン実習において、その学生(1学年定員80名)を対象にいくつかの試みを行い、その状況を記録し、成果と問題点について考察した。(1)課題プログラム編成では、小から大、私的から公共的といったオーソドックスな順序をとらず、小→大→小といった振幅の大きい順序、また比較的初期に公共的、複合的群建築の課題を課すなどを試みた。成果についてはまだ必ずしも明らかではないが、おおむね良好である。ただし、初期の2年次は段階的に構成し、3年次以降に変化をつけるのがよいとする意見もある。(2)種類の異なるA・B課題を異なるグループに対して同時並行的に課し、次にはこれを交替して課すという方式は、多人数学生を教育する場合には有効である。(3)デザイン指導は本質的に学生個人々々に対する一対一の指導にならざるを得ない。学習の初期には課題ごとに重点的習得テーマを定めて指導することもありうるが、デザインの総合性、学生の能力差などから、これにも限界がある。初期には学生を少人数(20人程度)に分割して担当するという方式が有効である。(4)作品の講評では、学生各人に口頭説明を行わせることは必要であるが、人数の多さから講評会が長時間に亘り緊張感を保ちにくい。一方、少数の代表作のみを講評することも、個人指導の実を挙げにくい。多人数を対象とする場合は、講評を興味あるイベントとする演出が必要である。(5)作品をある期間掲示して学生の目に触れさせることは、評価を共有のものにする意味で有効である。(6)スタジオ(設計製図室)の空間構成については、低学年(2年次)は比較的オープンに、高学年ではやや小空間に区分する等の変化をつけること、上下の学年の接触を多くすること、作品展示の場を設けること、スタジオを訓練の場としての雰囲気を持たせること(禁煙、清掃、壁面構成等)などが重要である。1.多人数学生に対するデザイン指導日本の大学では学生数が多いことが一般的で、その効果的な指導法の確立が一つの中心課題である。このために本研究では、1学年学生数約80名に対しさまざまな実験を試み、その成果を観察・記録・評価した。実験・考察を試みたのは以下の諸項目である。(1)課題プログラム、(2)グループ設計、(3)A・B課題同時並行交替方式、(4)エスキス指導および講評のあり方、(5)コンペ参加、(6)スタジオの空間構成、(7)作品展示および作品集、(8)卒業制作のあり方、(9)デザイン開始時期について、(10)デザイン基礎指導について、(11)賞のあり方以下にその特徴的な結果について記述する。2.グループ設計について建築および環境デザインでは共同設計が不可欠であるので、早い時期(2年後期)から共同設計を課し(まちなみのデザイン、5人共同)、以後も数回実施した。結果は、デザインプロセスの客観化、共同作業の訓練などの意味で成果があり、学生たちの取り組みも極めて意欲的かつ活発で完成後の満足感も大きかったが、逆に完成後の虚脱感も生じ、その後の課題への影響が大きい。大勢でにぎやかにまとめる能力は育てるが、独りでこつこつ取り組む慣習を育てないのではないかとの反省もある。3.A・B課題同時並行交替方式クラス(約80名)を、2グループに分け、前半・後半に別課題を課し交替する方式で、後半は期間が短いにもかかわらず総じて作品の質が高い。

前半の制作や講評会が製作者以外にも学習効果のあることが確認された。建築及び環境デザインの指導に関し、神戸芸術工科大学における環境デザイン実習において、その学生(1学年定員80名)を対象にいくつかの試みを行い、その状況を記録し、成果と問題点について考察した。(1)課題プログラム編成では、小から大、私的から公共的といったオーソドックスな順序をとらず、小→大→小といった振幅の大きい順序、また比較的初期に公共的、複合的群建築の課題を課すなどを試みた。成果についてはまだ必ずしも明らかではないが、おおむね良好である。ただし、初期の2年次は段階的に構成し、3年次以降に変化をつけるのがよいとする意見もある。(2)種類の異なるA・B課題を異なるグループに対して同時並行的に課し、次にはこれを交替して課すという方式は、多人数学生を教育する場合には有効である。(3)デザイン指導は本質的に学生個人々々に対する一対一の指導にならざるを得ない。学習の初期には課題ごとに重点的習得テーマを定めて指導することもありうるが、デザインの総合性、学生の能力差などから、これにも限界がある。初期には学生を少人数(20人程度)に分割して担当するという方式が有効である。(4)作品の講評では、学生各人に口頭説明を行わせることは必要であるが、人数の多さから講評会が長時間に亘り緊張感を保ちにくい。一方、少数の代表作のみを講評することも、個人指導の実を挙げにくい。多人数を対象とする場合は、講評を興味あるイベントとする演出が必要である。(5)作品をある期間掲示して学生の目に触れさせることは、評価を共有のものにする意味で有効である。(6)スタジオ(設計製図室)の空間構成については、低学年(2年次)は比較的オープンに、高学年ではやや小空間に区分する等の変化をつけること、上下の学年の接触を多くすること、作品展示の場を設けること、スタジオを訓練の場としての雰囲気を持たせること(禁煙、清掃、壁面構成等)などが重要である。
鳥類レプチンの単離と機能解析

未発見のニワトリレプチンを同定し、その機能解析を行い鳥類レプチンの存在意義・特異性を明らかにすることを目的とし、平成23年度は研究最終年度として、新規定性的レプチン活性測定法による鳥類レプチン様活性の検出を目的として研究を行った。ニワトリレプチン受容体とニワトリSTAT3共安定発現細胞株であるCHO-chLEPR/chSTAT3細胞を用いてニワトリ全血清のレプチン様活性検出を試みたところ、ニワトリ血清を10%、あるいは100%の濃度で添加するとSTAT3の核内移行が認められた。一方でニワトリレプチン受容体を発現させていない対照細胞株では100%ニワトリ血清を添加してもSTAT3の核内移行は全く認められなかった。このことから、ニワトリレプチン受容体特異的な情報伝達が生じたと考え、ニワトリ血清中にレプチン様物質が存在すると確信するに至った。この事実を確かめるために、限外濾過によるニワトリ血清の濃縮とレプチン様活性の変化について解析した。レプチンの推定分子量はおよそ16,000であることから、分子量30,000以上とそれ以下の分画を用いて細胞を刺激した。対照細胞株はいずれの分画を用いても核内に移動するGFP-STAT3は認められなかった。しかしCHO-chLEPR/chSTAT3では、分子量30,000以上の分画で核へ移動するシグナルが高頻度で検出された。そこで組換え型マウスレプチンを用いて同様な分画によるレプチン活性の調査を行ったところ、ニワトリ血清の場合と同様に分子量30,000以上の分画にレプチン活性が認められた。本研究の結果より、世界で始めてニワトリレプチン様活性を検出する事に成功し、さらに活性を持つレプチンは分子量30,000以上の分画に存在する事を明らかにした。未発見のニワトリレプチンを同定し、その機能解析を行って鳥類レプチンの存在意義・特異性を明らかにすることを目的とし、平成21年度は定量的バイオアッセイ法の改良と定性的レプチン活性評価法の構築、およびレプチン産生器官の特定を行った。ニワトリSOCS3の転写調節領域を用いた高感度な定量的バイオアッセイ法の開発を試みたところ、SOCS3転写調節領域は10ng/ml以下の一般的な血中濃度のレプチンに応答しなかった。このため定量的バイオアッセイ法の高感度化の限界が考えられた。そこでレプチン情報伝達の際に活性化する転写因子STAT3の挙動を蛍光顕微鏡で追跡し、定性的評価法を確立するため、ニワトリレプチン受容体安定発現CHO-K1細胞株に一過性でSTAT3を発現させた。その結果1ng/mlのレプチンにSTAT3が応答して核内移行した。このシステムの構築によってレプチン検出の高感度化が完了したと考え、定性的レプチン活性評価法を鳥類レプチン探索に向けて採用した。しかし、卵黄抽出物や正常および矮性白色レグホーン血清のレプチン活性を上記活性評価法により評価した結果、STAT3の活性化を見出すことはできなかった。この結果は、我々を含めたこれまでの報告と一致する。一方でニワトリレプチンの遺伝子欠損の可能性が報告され、鳥類レプチン探索の可能性を広く模索する必要性に迫られた。そこで調査対象をニワトリ以外の鳥類にまで広げることを考え、その一環としてハト血清およびハト肝臓抽出物を用いたレプチン活性評価を行い、レプチン様活性の検出に成功した。このことは鳥類レプチン探索に向けた大きな前進と考えられ、現在もハト生体組織を用いて鳥類レプチン単離に向けた研究を続けている。未発見のニワトリレプチンを同定し、その機能解析を行うため、これまでに定量的バイオアッセイ法の改良と定性的レプチン活性評価法の構築、およびレプチン産生器官の特定を試みてきた。これまでニワトリレプチン受容体とGFP融合型転写因子STAT3安定発現細胞株への低濃度レプチン(1ng/m1)の応答を確認するためには、さらに一過性でニワトリレプチン受容体の発現を行い、その上細胞を固定して観察する必要があったが、平成22年度においては蛍光顕微鏡の新調により細胞を生きたまま槻察できるようになり、GFP融合転写因子の核内移行観察によるスクリーニングがより簡便に行えるようになった。また、正常および倭性白色レグホーン血清のレプチン様活性が従来の評価法で確認できなかったことから、平成22年度はニワトリおよびハトを標的としてレプチン様活性を持つ器官の同定を行った。その結果、メスハト血清の血清を用いたアッセイによりレプチン様活性の検出に成功した。その一方で、肝臓をはじめとする成体組織ホモジネートを用いた実験では蛍光の散乱といった実験手法的な障害が生じ、組織抽出液の精製といった更なる改良が必要となった。一方、直近の研究により上記定性的レプチン活性評価法をニワトリ血清で評価したところ、活発な転写因子STAT3の核内移行が認められた。GFP融合型STAT3のみの安定発現細胞株では上記のような著しい転写因子の活性化は認められなかったことから、ニワトリ血清中におけるレプチン様物質の存在が示唆された。

しかしながら、我々や他の研究者らはニワトリ血清によるレプチン様活性は血中レプチン濃度の低さ故検出できない可能性をこれまで報告しており、血清中の他のサイトカインによる情報伝達の可能性も否定できないため、現在はニワトリおよびハト血清中からの鳥類レプチン単離に向け慎重に実験を進めているところである。未発見のニワトリレプチンを同定し、その機能解析を行い鳥類レプチンの存在意義・特異性を明らかにすることを目的とし、平成23年度は研究最終年度として、新規定性的レプチン活性測定法による鳥類レプチン様活性の検出を目的として研究を行った。ニワトリレプチン受容体とニワトリSTAT3共安定発現細胞株であるCHO-chLEPR/chSTAT3細胞を用いてニワトリ全血清のレプチン様活性検出を試みたところ、ニワトリ血清を10%、あるいは100%の濃度で添加するとSTAT3の核内移行が認められた。一方でニワトリレプチン受容体を発現させていない対照細胞株では100%ニワトリ血清を添加してもSTAT3の核内移行は全く認められなかった。このことから、ニワトリレプチン受容体特異的な情報伝達が生じたと考え、ニワトリ血清中にレプチン様物質が存在すると確信するに至った。この事実を確かめるために、限外濾過によるニワトリ血清の濃縮とレプチン様活性の変化について解析した。レプチンの推定分子量はおよそ16,000であることから、分子量30,000以上とそれ以下の分画を用いて細胞を刺激した。対照細胞株はいずれの分画を用いても核内に移動するGFP-STAT3は認められなかった。しかしCHO-chLEPR/chSTAT3では、分子量30,000以上の分画で核へ移動するシグナルが高頻度で検出された。そこで組換え型マウスレプチンを用いて同様な分画によるレプチン活性の調査を行ったところ、ニワトリ血清の場合と同様に分子量30,000以上の分画にレプチン活性が認められた。本研究の結果より、世界で始めてニワトリレプチン様活性を検出する事に成功し、さらに活性を持つレプチンは分子量30,000以上の分画に存在する事を明らかにした。
SPRY1によるT細胞活性化の時間的制御機構の解明

T細胞の過剰な活性化は各種の自己免疫疾患やアレルギー性疾患といった弊害を引き起こすが、いったん活性化したT細胞がどのようなメカニズムで沈静化するかについては、未だ十分な解析がなされていない。本研究は、SPRY1によるT細胞不活1生化機構の解明を通して、免疫系が備えている負のフィードバック機構の解明を目指すべく計画された。種々の解析から、SPRY1はPLCγ1の活1生化の抑制を介してT細胞活性化のシグナルを阻害している事が明らかとなった。一方で、PLCγ1のリン酸化に関与するZAP70の活性化や、PLCγ1と協調的にT細胞シグナル伝達経路を制御するVav・SLP76等の分子の活1生化には影響を及ぼさない事から、SPRY1の作用点はPLCγ1そのものであることが強く示唆された。さらに、その阻害様式にSPRY1の細胞内局在が大きく関わっている事を、各種の変異体を用いた解析から明らかにした。また、レンチウイルスベクターを用いて培養細胞にSPRY1を過剰発現させると、TCRシグナルによって誘導される遺伝子発現のみが特異的に抑制され、サイトカイン刺激にともなう遺伝子発現には影響を及ぼさない事が明らかとなった。この知見が生理的条件下のT細胞にも適応できるか否かを検討するために、われわれはSPRY1のT細胞特異的トランスジェニックマウスの作製を行った。目的遺伝子が導入された複数のラインが得られたものの、そのうち末梢T細胞でのSPRY1の発現レベルが高く維持されたライン(line#14)と中程度に発現するライン(line#11)についての解析を行ったところ、予想通りSPRY1の発現レベルに依存したTCRシグナルの抑制が観察された。以上の結果から、TCR刺激にともなって発現誘導を受けるSPRY1が、その後の過剰なTCRシグナルを負に制御する事により、免疫監視機構の恒常性を維持しているというスキームが強く示唆される。現在、この作業仮説を検証すべく、SPRY1のノックダウン系を構築中である。本研究は、SPRY1によるT細胞不活性化機構の解明を通して、免疫系が備えている負のフィードバック機構の解明を目指すべく計画された。本年度においては、SPRY1がPLCγ1の活性化の抑制を介してT細胞活性化のシグナルを阻害している事を見出した。予備的な解析からは、SPRY1の局在決定に低分子量Gタンパク質の一種であるRab5Bが関与することを示唆する結果を得ており、現在SPRY1の局在決定機構を解析中である。一方、SPRY1の生理的な役割を解明すべく、われわれは野生型のSPRY1ならびにSHR(SPRY-homology region)領域を欠失した優性不能型変異体SPRY1(SPRY1ΔC)のT細胞特異的トランスジェニックマウスの作製を行っている。野生型SPRY1ならびにSPRY1ΔCトランスジェニックマウスの何れについても、目的遺伝子が導入された複数のラインが得られたものの、そのうち末梢T細胞でのSPRY1(もしくはSPRY1ΔC)の発現レベルが高く維持されたラインは各々1ラインのみであった。予備的な解析からは、SPRY1ΔCトランスジェニックマウス由来T細胞において、Th1/Th2バランスの異常を示唆するデータが得られている。現在、個体数を増やしての解析に取り組んでいる。また、次年度以降の解析を視野に、さらなるトランスジェニックマウスのラインを得るべく受精卵への目的遺伝子導入を試みている。

以上の結果から、TCR刺激にともなって発現誘導を受けるSPRY1が、その後の過剰なTCRシグナルを負に制御する事により、免疫監視機構の恒常性を維持しているというスキームが強く示唆される。現在、この作業仮説を検証すべく、SPRY1のノックダウン系を構築中である。
長期間に亘る居住地運営を円滑化する権利関係調整手法に関する研究

新築一辺倒で展開されてきた日本のハウジングにおいても、今後は既存ストックの維持管理・増改築による住環境の改善・整備が大きな割合を占めてくるものと思われるが、その際には住宅の立地する土地および建物の部分の所有・利用に関する複雑な権利関係をいかに円滑に調整していくかが大きな課題となってくる。本研究では、近い将来のハウジングのあり方を考える上で意義深いと思われる、こうした権利関係調整手法に関する国際比較を試みる。(建築的)空間の所有・利用に関する権利関係には、地域・時代によって、またその明確化を促す行為や出来事の内容によって、当然のように多様性が存在しており、その多様性は、日本で概ねひとつの権利関係に対応し得る概念(住宅における「分譲」「賃貸」といった概念など)自体が、世界的に見れば決して同一の権利関係を示さないという事実を含んでいる。最終年度である本年度は、下記の事柄に関する各国の識者からの情報収集、特徴的な住宅地の現地調査、これらの総括を行った。(1)住宅(地)における権利関係の種類と、それぞれに典型的な空間・土地区分の所有、利用、更新、変更などに関する権利の状態、それらの根拠となる法制度(2)これらの権利を有する、あるいは行使する主体の属性(名称、歴史、構成員、財源、意思決定機構、根拠となる法制度など)(3)以上の成果の位置付けを明確にするための、各国における住宅政策の骨子と典型的なハウジングタイプ(4)持続性のある居住環境の運営を意図した特徴的な住宅(地)における、権利の状態の歴史的な変化(払い下げなど)新築一辺倒で展開されてきた日本のハウジングにおいても、今後は既存ストックの維持管理・増改築による住環境の改善・整備が大きな割合を占めてくるものと思われるが、その際には住宅の立地する土地および建物の部分の所有・利用に関する複雑な権利関係をいかに円滑に調整していくかが大きな課題となってくる。(1)住宅(地)における権利関係の種類と、それぞれに典型的な空間・土地区分の所有、利用、更新、変更などに関する権利の状態、それらの根拠となる法制度(2)これらの権利を有する、あるいは行使する主体の属性(名称、歴史、構成員、財源、意思決定機構、根拠となる法制度など)(3)以上の成果の位置付けを明確にするための、各国における住宅政策の骨子と典型的なハウジングタイプ(4)持続性のある居住環境の運営を意図した特徴的な住宅(地)における、権利の状態の歴史的な変化(払い下げなど)新築一辺倒で展開されてきた日本のハウジングにおいても、今後は既存ストックの維持管理・増改築による住環境の改善・整備が大きな割合を占めてくるものと思われるが、その際には住宅の立地する土地及び建物の部分の所有・利用に関する複雑な権利関係をいかに円滑に調整していくかが大きな課題となってくる。(建築的)空間の所有・利用に関する権利関係には、地域・時代によって、またその明確化を促す行為や出来事の内容によって、当然のように多様性が存在しており、その多様性は、日本語で概ねひとつの権利関係に対応し得る概念(例えば、住宅における「分譲」「賃貸」といった概念)自体が、世界的に見れば決して同一の権利関係を示さないという事実を含んでいる。本年度は、こういった多様な権利関係のあり方を洗い出し、整理を試みるために、以下の事柄に関して各国の識者から情報を収集し、データベースを作成した。(1)住宅(地)における権利関係の種類と、それぞれに典型的な空間・土地区分の所有、利用、更新、変更等に関する権利の状態(根拠となる法制度を含む)(2)これらの権利を有する或いは行使する主体の属性(名称、歴史、構成員、財源、意志決定機構、根拠となる法制度等)(3)以上の成果の位置付けを明確にするための、各国における住宅政策の骨子と典型的なハウジングタイプ(4)持続性のある居住環境の運営を意図した特徴的な住宅(地)における、権利の状態の歴史的な変化(例えば払い下げ等)新築一辺倒で展開されてきた日本のハウジングにおいても、今後は既存ストックの維持管理・増改築による住環境の改善・整備が大きな割合を占めてくるものと思われるが、その際には住宅の立地する土地および建物の部分の所有・利用に関する複雑な権利関係をいかに円滑に調整していくかが大きな課題となってくる。昨年度に引き続き本年度も、下記の事柄に関して、各国の識者から情報を収集し、データベースを作成した。

住宅(地)における権利関係の種類と、それぞれに典型的な空間・土地区分の所有、利用、更新、変更などに関する権利の状態、それらの根拠となる法制度これらの権利を有する、あるいは行使する主体の属性(名称、歴史、構成員、財源、意思決定機構、根拠となる法制度など)以上の成果の位置付けを明確にするための、各国における住宅政策の骨子と典型的なハウジングタイプ持続性のある居住環境の運営を意図した特徴的な住宅(地)における、権利の状態の歴史的な変化(払い下げなど)今年度はさらに、中国およびイタリアにおける現地訪問調査を行った。ここでは、行政担当者、民間住宅供給者、研究者などに対するヒアリング、典型的・特徴的な住宅(地)の現地観察調査、資料収集(図面、管理規約など)を行った。新築一辺倒で展開されてきた日本のハウジングにおいても、今後は既存ストックの維持管理・増改築による住環境の改善・整備が大きな割合を占めてくるものと思われるがその際には住宅の立地する土地及び建物の部分の所有・利用に関する複雑な権利関係をいかに円滑に調整していくかが大きな課題となってくる。本研究では、近い将来のハウジングのあり方を考える上で意義深いと思われる、こうした権利関係調整手法に関する国際比較を試みる。空間の所有・利用に関する権利関係には、地域・時代によって、またその明確化を促す行為や出来事の内容によって、当然のように多様性が存在しており、その多様性は、日本で概ね一つの権利形態に対応し得る概念(住宅における分譲、賃貸といった概念など)自体が、世界的に見れば決して同一の権利形態を示さないという事実を含んでいる。本年度は、最終年度として、これまでに収集した各国のデータに関する補足調査を実施し、権利関係調整手法の類型化を行った。具体的には、(1)各国の住宅(地)に関する基本的な権利関係のあり方の類型化を行い、特に日本の関連制度の特殊性を明らかにした。(2)各国独自の歴史的な経緯から成立している特徴的な権利関係調整手法と、その手法によって継続してきた空間の特性とを抽出し、権利関係調整手法の代替案として整理した。
次世代遺伝子治療の開発研究

1.変異GFP発現細胞を用いた遺伝子修復モデル(原・續・中津・酒井)ナンセンス変異を有する変異GFP発現プラスミド,およびその変異点に特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチド(45-mer)をHeLa,HT-1080,およびMCF-7細胞に導入した.オリゴヌクレオチドの導入条件としてS化修飾やオリゴヌクレオチド濃度,さらにプラスミドとオリゴヌクレオチドの加温処理(アニーリング反応)などの効果について検討したが,GFP(緑色)蛍光を復帰した細胞は得られなかった.2.hprt遺伝子の点変異導入(原・酒井)ダイレクトシークエンス法によってHT-1080細胞が野生型hprt遺伝子を有すること,またこの細胞が6-チオグアニン感受性であることを確認した.そこでhprt遺伝子内の標的部位にナンセンス変異(R51X)を誘発させる,45-merのオリゴヌクレオチドを設計し,HT-1080細胞に導入した.HT-1080母数あたりの6-チオグアニン耐性コロニー数を計測し,オリゴヌクレオチドによるhprt遺伝子の部位特異的な変異頻度を求めた.その結果,オリゴヌクレオチド導入後のhprt遺伝子の変異頻度(3.3x10^<-6>)は,自然突然変異頻度(2.5x10^<-6>)と同一レベルであった.また形成されたコロニーについて塩基配列を確認したが,オリゴヌクレオチドによる部位特異的な点変異は認めらなかった.3.種々のオリゴヌクレオチドの合成(佐々木)6位をニトロ化した修飾グアニンを含有するオリゴヌクレオチド(DNA)を化学的に合成し,水溶液中で相補鎖DNAと二本鎖を形成させたところ,修飾グアニンの対側のシトシンが容易にチミンに変化することを見いだした.平成14年度は以下のように共同研究を進めた.1)変異GFP発現細胞,マウスの作製(原・續)ナンセンス変異を有する変異GFP発現プラスミドをHeLa細胞に導入し,緑色蛍光を発しないことをフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡で確認した.これらのプラスミドをHeLa, HT1080,およびMCF-7細胞に導入し,非蛍光性変異GFPを構成的に発現する細胞株を樹立した.また個体レベルでの遺伝子治療のモデル系を確立するために,上記変異GFPの発現ベクターをマウス受精卵に導入し,現在トランスジェニック・マウス樹立の準備段階にある.2)種々のオリゴヌクレオチドの合成(佐々木)3本鎖形成オリゴヌクレオチドに反応性核酸を組み込み,標的配列との架橋反応を行うと同時に架橋部分での変異誘起能について調べた.その結果,反応性核酸は反応点特異的に点変異を誘起し,とくにアデノシンとの反応点では細胞内での複製にともない,グアノシンに変異させることを明らかにした.3)オリゴヌクレオチドを用いた変異GFPの修復と発現(原・續・井原)4)フローサイトメトリーによる蛍光細胞の検出(原・續・井原)1)で樹立した細胞に45-merの非修飾オリゴヌクレオチドを導入したが,GFP蛍光の復帰は観察されなかった(1/10^6以下の復帰変異の頻度).FITCでラベルした15-merオリゴヌクレオチドの細胞へのとりこみ効率をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡で観察すると50%以上であったが,大部分は核外にとどまっていた.現在,核酸-ペプチド複合体による核内移行と修復効率の活性化を目指し,条件を検討中である.1.変異GFP発現細胞を用いた遺伝子修復モデル(原・續・中津・酒井)ナンセンス変異を有する変異GFP発現プラスミド,およびその変異点に特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチド(45-mer)をHeLa,HT-1080,およびMCF-7細胞に導入した.オリゴヌクレオチドの導入条件としてS化修飾やオリゴヌクレオチド濃度,さらにプラスミドとオリゴヌクレオチドの加温処理(アニーリング反応)などの効果について検討したが,GFP(緑色)蛍光を復帰した細胞は得られなかった.2.hprt遺伝子の点変異導入(原・酒井)ダイレクトシークエンス法によってHT-1080細胞が野生型hprt遺伝子を有すること,またこの細胞が6-チオグアニン感受性であることを確認した.そこでhprt遺伝子内の標的部位にナンセンス変異(R51X)を誘発させる,45-merのオリゴヌクレオチドを設計し,HT-1080細胞に導入した.HT-1080母数あたりの6-チオグアニン耐性コロニー数を計測し,オリゴヌクレオチドによるhprt遺伝子の部位特異的な変異頻度を求めた.その結果,オリゴヌクレオチド導入後のhprt遺伝子の変異頻度(3.3x10^<-6>)は,自然突然変異頻度(2.5x10^<-6>)と同一レベルであった.また形成されたコロニーについて塩基配列を確認したが,オリゴヌクレオチドによる部位特異的な点変異は認めらなかった.3.種々のオリゴヌクレオチドの合成(佐々木)6位をニトロ化した修飾グアニンを含有するオリゴヌクレオチド(DNA)を化学的に合成し,水溶液中で相補鎖DNAと二本鎖を形成させたところ,修飾グアニンの対側のシトシンが容易にチミンに変化することを見いだした.