hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規アポトーシス誘導遺伝子の動脈硬化性疾患発症機構解析への応用研究

1.PL-3の発現調節機構と分子間相互作用:マウスPL-3の発現を測定するリアルタイムPCRによるアッセイ法を確立した。またPL-3タンパク質に対して特異的な抗体を作製し、ウェスタンブロットによる発現測定を可能にした。ウェスタンブロットを用いて発現解析を行ったところ、動脈硬化プラークにおいて多量に存在する酸化LDLで刺激した細胞では発現上昇がみられ、動脈硬化プラークの形成にPL-3が関与していることが示唆された。2.PL-3遺伝子における新しい疾患感受性遺伝子多型の同定:インフォームドコンセントが得られたヒト遺伝子を用いてPL-3遺伝子近傍に存在するSingle Nucleotide Polymorphysm(SNP)解析を行った結果、PL-3遺伝子と生活習慣病における関連が示唆された。3.ヒト動脈硬化プラークにおけるPL-3発現解析:大腸菌に発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製したPL-3タンパク質をウサギに感作し、高力価のヒトPL-3タンパク質抗体を得た。得られた抗血清を用いて頚動脈の動脈硬化プラークの組織学的解析を行った結果、PL-3蛋白質は動脈硬化プラーク内の泡沫化したマクロファージあるいは平滑筋細胞において発現していることが確認された。4.心筋細胞のPL-3発現抑制と虚血再還流による細胞死抑制:RNAiを導入することによりPL-3の発現を抑制したラット心筋細胞を初代培養し、虚血再酸素化の条件でアポトーシスを誘導させた結果、アポトーシスが抑制されていることが確認された。この結果から心筋梗塞治療後の心不全発症にPL-3発現が関与しているものと考えられた。1.PL-3の発現調節機構と分子間相互作用マウスPL-3の発現を測定するリアルタイムPCRによるアッセイ法を確立し、リゾフォスファチヂルコリン(LPC)によるPL-3タンパク質の発現誘導実験を行った。LPCを培養細胞に添加した結果、PL-3の発現はコントロールとほぼ同レベルであり明らかな発現誘導は認められなかった。またPL-3タンパク質と結合する細胞内因子を同定するためTwo Hybrid Panelを行ったが相互作用する因子の同定は困難であった。PL-3は細胞内に単独で存在するかあるいはbaitとして使用した融合タンパク質により結合が阻害されている可能性が示された。2.PL-3遺伝子における新しい疾患感受性遺伝子多型の同定3.ヒト動脈硬化プラークにおけるPL-3発現解析PL-3タンパク質を可溶化タグとの融合タンパク質として大腸菌に発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製した。抗体を取得するため精製したヒトPL-3タンパク質をウサギに感作し高力価の抗血清を得た。得られた抗血清を用いて頚動脈の動脈硬化プラークの組織学的解析を行った結果、PL-3蛋白質の動脈硬化プラークにおける発現が確認された。4.心筋細胞のPL-3発現抑制と虚血再還流による細胞死抑制ラット心筋細胞を初代培養し、培養した心筋細胞にRNAiを導入することによりPL-3の発現を抑制しえた。PL-3発現を抑制した心筋細胞に虚血再酸素化の条件でアポトーシスを誘導させた結果、アポトーシスが抑制されていることが確認された。PL-3の発現調節機構PL-3タンパク質に対して特異的な抗体を作製し、ウェスタンブロットによる発現定量化を可能にした。マクロファージ系の細胞であるTHP1細胞を用いて発現解析を行ったところ、酸化LDLで刺激した細胞では発現上昇がみられた。また血管平滑筋細胞においても細胞増殖因子あるいは酸化LDLの構成因子のひとつであるリゾフォスファチジルコリンによって発現上昇が認められた。これらの結果から活性化あるいは増殖中の細胞においてはPL-3が高発現しているものと考えられた。PL-3遺伝子における新しい疾患感受性遺伝子多型の同定動脈硬化プラークにおけるPL-3発現解析PL-3タンパク質に対する特異的な抗体を用いてヒト頚動脈の動脈硬化プラークにおけるPL-

3発現解析を免疫組織学的に解析した。その結果、PL-3蛋白質は動脈硬化プラーク内の泡沫化したマクロファージあるいは平滑筋細胞において認められた。心筋細胞のPL-3発現抑制と虚血再還流による細胞死抑制PL-3遺伝子発現を抑制するためのsiRNAの系を開発した。またPL-3遺伝子の発現を欠損したノックアウトマウス作製が進行中である。胎仔幹細胞の遺伝子をノックアウトするためのベクターを作製した。
ランタノイドビスフタロシアニナト錯体の電子状態の電気化学・分光学的研究

本研究は、一連のランタノイド金属イオンのビスフタロシアニナト錯体[LnPc2]^zの中心金属をLaからLuまで換えることにより、あるいは錯体の酸化状態(イオン価z)を変えることにより、錯体の電子状態および関連する物性がどのように変化するかを、電気化学及び分光学の観点から明らかにすることを目的として行われ、次の成果を得た。1.X線構造解析に用いることのできる大きさの[LnPc_2]^-[NBu_4]^+の正方晶系単結晶を、Ln=Nd, Gd, Ho, Luの4種類について、アセトン溶液から析出させることができた。X線構造解析の結果、一連の錯体においてPc環は互いに45°回転しているという従来からの定説とは異なり、二つのPc環の回転の角度は、Lu(45°),Ho(43.2°),Gd(34.5°),Nd(6.2°)であり、中心金属イオン半径の増大とともにPc環の重なりの度合いが増していることが明らかにされた。2.これら錯体が酸化還元によりその色(電子スペクトル)が変化することは、明らかにされているが、酸または塩基の添加によっても色の変化があり、これが酸塩基反応機構によるためであるという説が提出されていたが、電気化学、電子スペクトル及びESR測定の結果、微量の溶存酸素の関係する酸化・還元反応によるものであることを明らかにした。3.種々の酸化還元過程における電極反応速度パラメーターをノーマルパルス法及び交流法により決定した。いずれも10^<-2>10^<-3>cm/s程度の速度定数をもつことが判った。
アフリカ熱帯雨林における動物と植物の表象に関する民族学的研究

本調査研究では、西アフリカにおけるヨルバ、ベニン、アカン語群(特に、アシャンティ)の諸王国を主要な対象地域として、イスラーム文化とヨーロッパ文化との接触によって形成された諸文化複合を王権の標章に関する比較研究を行った。特に、西アフリカの王権の標章にみられる「象」「豹」「鯰」「鶏」「羚羊」「蜘蛛」「獅子」「鰐」「蛇」「蛙」「熱帯植物」(特に、ヤシ)をとりあげることによって、王の名称を指示するもの、王や民衆の隠喩となるもの、色彩とシンボリズム、性差や身分標識を指示するもの、動物と植物の民俗分類と寓意的表現(あるいはその神話的世界との関係)、文字の神秘性(絵文字や呪文)などの王権、図像、歴史表象に関する比較検討を行うことで、西アフリカにおける諸王国の基層文化を明らかにした。
薬剤性肝障害、肝内胆汁鬱滞症における核内オーファンレセプターCARの役割

1.肝内胆汁鬱滞起因性薬剤のIn vitroでの代謝酵素への影響2.CARノックアウトマウスを用いた解析四塩化炭素による急性肝障害をCARノックアウトマウス(KO)とワイルドタイプマウス(WT)で比較した。KOではWTに比べ、肝障害が血液生化学的にも組織学的にも軽度であった。肝障害はCARのinducerであるphenobarbital(PB)で前処置することにより著明となり、逆に、CARに抑制的に働くandrostanolを投与することにより軽度となった。四塩化炭素の主要な代謝酵素であるCYP2Eの発現にWTとKOで差は無かった。WTではPB刺激によりCYP2B、CYP3A、GSTpi、p-450 reductaseが誘導されるのに対し、KOでは誘導されなかった。四塩化炭素による急性肝障害は、主に四塩化炭素の活性代謝体(CCl_3,Cl_3COO)によって起こると報告されている。肝臓組織中の還元型グルタチオンは産生された活性代謝体量を反映するが、PB処置により還元型グルタチオンの減少が著明になっていた。すなわち、CARにより誘導された(CYP2E以外の)代謝酵素群が四塩化炭素を代謝し、その活性代謝体が増加し肝障害を惹起するためWTではKOと比べ肝障害が強くなった。1.肝内胆汁鬱滞起因性薬剤のIn vitroでの代謝酵素への影響2.CARノックアウトマウスを用いた解析四塩化炭素による急性肝障害はCARノックアウトマウス(KO)では、ワイルドタイプマウス(WT)に比べ、血液生化学的にも組織学的にも,軽度であった。肝障害はCARのinducerであるphenobarbital (PB)で前処置することにより著明となり、逆に、CARに抑制的に働くandrostanolを投与することにより軽度となった。WTではPB刺激によりCYP2B、CYP3A、GSTpi、P-450 reductaseが誘導されるのに対し、KOでは誘導されなかった。四塩化炭素による急性肝障害は、主に四塩化炭素の活性代謝体(CCl_3,Cl_3COO)によって起ると報告されている。肝臓組織中の還元型グルタチオンは産生された活性代謝体量を反映す局が、PB処置により還元型グルタチオンの減少が著明になった。すなわち、CARにより誘導された代謝酵素群が四塩化炭素を代謝し、その活性代謝体が増加し肝障害を惹起するためWTではKOと比べ肝障害が強くなった。1.肝内胆汁鬱滞起因性薬剤のIn vitroでの代謝酵素への影響2.CARノックアウトマウスを用いた解析四塩化炭素による急性肝障害はCARノックアウトマウス(KO)では、ワイルドタイプマウス(WT)に比べ、血液生化学的にも組織学的にも軽度であった。WTではPB刺激によりCYP2B、CYP3A、GST pi、p-450 reductaseが誘導されるのに対し、KOでは誘導されなかった。肝臓組織中の還元型グルタチオンは産生された活性代謝体量を反映するが、PB処置により還元型グルタチオンの減少が著明になった。他の薬剤による肝障害や胆管結紮時の肝障害についても検討した。
計算物理学分野のGRIDアプリケーションと並列プログラミングシステムの研究

本研究の目的は、計算物理学分野のアプリケーションに焦点を当て、Grid技術による広域並列分散コンピューティングにより新たな展開が可能になる応用の探索的技術開発と、それを支援する並列プログラミングシステムを構築することである。このために、Grid環境の標準的なミドルウエアであるGlobusシステム上に、遠隔の計算機上でプログラムの一部を実行可能にする遠隔手続き呼び出し(RPC)機構を中心とした、Grid上の並列分散プログラミングシステムを開発し、並列プログラミングインタフェースOpenMPを利用して、簡便に並列プログラミングができるようにする。さらに、計算物理学分野のアプリケーションを調査、Grid環境に適したアプリケーションを選定し、開発したGrid並列プログラミングシステムを用いて実装を行う。広域分散ネットワーク環境において、開発したアプリケーションの性能評価を行い、Grid技術についての知見を得、開発したプログラミングシステムの改善を行う。当該研究期間においては、Grid環境において遠隔の計算機上でプログラムの一部を実行可能にする遠隔手続き呼び出し(RPC)機構の基本設計とベースシステムの実装、対象となるアプリケーションの調査を行った。詳細は以下の通り:1,OpenMPプログラムと協調して、並列の遠隔呼び出しを行う機構OmniRPCの実装を行った。クラスタ環境にて性能評価を行った。さらに、Grid環境にGlobusを用いて拡張し、予備評価を行った。2,格子QCDや宇宙物理学などの計算物理学分野のGridアプリケーションについて調査を行った。3,設備備品として、16台のPCからなるクラスタを構築し、Globusを経由して利用できるようにした。
酸素センサー付フロートによる表層溶存酸素の短期変動とその季節変動への寄与の解明

東北大学と海洋研究開発機構が、2005年以降、北太平洋中緯度域に展開してきた酸素センサー付プロファイリングフロートによる水温・塩分・密度および溶存酸素の鉛直プロファイル時系列データを解析し、亜表層酸素極大層の消長と密度成層の季節変化の関係を調べた。その結果、夏季の季節密度躍層の発達に伴い、一次生産によって生成された酸素が躍層内およびその直下に捕捉され、酸素極大層が形成されることを確認した。さらに、秋季の混合層の発達に伴い、夏季の一次生産によって蓄積された酸素が、比較的短期間のうちに大気に放出されることを見出した。この過程に伴う、秋季(811月)の北太平洋中緯度帯(35°N45°N)における海洋から大気への酸素フラックスは10mmolm^<-2>day^<-1>と見積もられ、これは、従来の大気化学的手法による秋季の酸素フラックスにおける生物過程の寄与を説明するのに十分なフラックスといえる。また、溶存酸素の海洋内の再配置を担うサブダクション過程について、海洋研究開発機構学術研究船白鳳丸KH-08-3次航海による観測データおよびプロファイリングフロートのデータを用いて調査した。その結果、冬季に40°N以北の混合層で形成された水が、水温・塩分・密度の鉛直一様性と高い濃度の溶存酸素を保持したまま、レンズ状の亜表層中規模渦によって、西向きおよび東向きの平均流を横切るように、約半年で1000km以上南まで運ばれていたことを見出した。これは、亜表層海洋の酸素等の物質収支を考える上で、従来全く考慮されていなかった現象であり、海洋の3次元物質分布の維持・変動メカニズムの理解に貢献する発見といえる。東北大学と海洋研究開発機構が、2006年度までに北太平洋に展開してきた9台の酸素センサー付プロファイリングフロートのデータを解析し、北太平洋中緯度域表層における溶存酸素の季節変化を調べた。解析に先立って、既存の船舶観測資料との統計的比較により、フロートによる酸素データの精度を検討し、その誤差は季節変化のシグナルに比べて十分小さいことを示した。各フロートの漂流海域の海洋構造や流速分布を考慮し、フロートによる水温・塩分・溶存酸素プロファイルの時系列のうち、主に鉛直1次元過程に支配されている部分に着目して、水温場・密度場の変化と溶存酸素の変化との関係、および、それらの関係の深度依存性について考察した。従来、表層100mを鉛直平均した溶存酸素と水温の気候値データから、中緯度表層の溶存酸素の季節変化は水温変化に伴う飽和酸素量の変化に主に支配されていると報告されていたが、本研究の解析から、夏季の昇温期には、季節密度躍層以浅では過飽和度が、その下層で不飽和度が、それぞれ時間とともに増すことが明らかとなった。表層100m平均で溶存酸素の変化が飽和酸素量の変化で見かけ上説明できたのは、季節密度躍層以浅の過飽和とその下層の不飽和が相殺された結果であることがわかった。季節密度躍層内の過飽和は一次生産によるものであり、その下層の不飽和は有機物の分解や呼吸によるものと推定された。さらに、晩秋の混合層の発達により季節密度躍層が破壊されるのに伴い、過飽和が解消され、晩冬期までに表層100mの溶存酸素はほぼ一様で、やや不飽和となることなどがわかった。3日間隔でプロファイリングを行って短期変動を調べるための、新たな酸素センサー付プロファイリングフロートの仕様を検討した上で、購入し、陸上試験を終えて、平成20年度の観測の準備を完了した。
高分子反応場を利用するヘテロ環化反応

高分子反応場の擬似的な高度希釈効果を活用して、アニオン種の分子内求核反応の選択性を検討するために、亜鉛アート錯体を用いる高分子に固定化した基質のハロゲン-亜鉛交換反応について検討し、化学選択的なメタル化-環化反応を行なった。ヨードアニリン高分子誘導体を固定化し、ジヨードプロパンを用いてN-アルキル化して得られるジヨード化合物を選択的に芳香環のみ亜鉛化し、分子内のアルキル化を試みたところ反応は円滑に進行し、還元的な切り出しによりテトラヒドロキノリンが良好な収率で得られた。官能基との共存の可能性を明らかにするために、エステル結合で高分子上に固定化した基質についても検討したところ、6員環については反応が円滑に進行し環化成績体を得ることができた。さらに大きい環の合成を検討しているが、7員環化合物については反応が進行するものの収率には難があり、さらにトランスメタル化を含めて反応条件等の検討を要する。7員環、8員環の形成については溶液反応で同様な閉環を試みたところある程度環化成績体が得られていることから、さらに反応条件の検討を行なっている。また別のアプローチとして環化反応とともに生成物が高分子から切り出されるシクロリリース法の試みとして、スルフォン酸エステル結合でアルキル側鎖の末端を固定化したヨードアニリン誘導体を基質どする反応を行なったところ収率には改善の余地があるものの環化成績体が得られた。この際よりアルキル化反応が進行しやすい銅化合物へのトランスメタル化が重要と考えられ、さらに用いる銅化合物の検討により改善をはかりうるものと考えられる。高分子上においても選択的なモノメタル化続く分子内アルキル化反応を達成することができた。
アシドーシスに対する新生児脳神経細胞の防御反応に関する核磁気共鳴研究

本研究においては、動物実験により各種の負荷によるアシドーシスに対し新生仔脳の神経細胞がいかに反応するかを検討し、以下の結果を得た。1.低酸素症による新生仔脳出血マウスにおいてその血液pH(pHb)と脳細胞内組織pH(pHi)をリン核磁気共鳴法(MRS)を用いて比較したところ負荷1時間pHiは7.20±0.03から7.36±0.03まで有意に上昇し、その後徐々に低下したが、負荷終了時においても負荷前値より高かった。蘇生後も一旦上昇傾向を示した。pHbは負荷前値7.39±0.01から負荷開始後徐々に低下し、負荷終了時には7.16±0.01であった。以上の結果から、体アシドーシスが存在しているときに、新生仔脳ではアルカローシスを来たす場合があることが初めて実験的に示され、新生仔脳には体アシドーシスに対する何らかの保護機構が存在する可能性が示唆された。2.生後14日目の新生仔犬を用いて、麻酔下での高炭酸ガス負荷が脳の電気活動とミトコンドリア呼吸に及ぼす影響を脳波とMRSによって検討した。人工呼吸器による吸入ガスの酸素濃度を正常に保ち、炭酸ガス濃度を13%、20%、30%と上昇させたところ、血液ガスの炭酸ガス分圧はおよそ70、100、140mmHgと上昇した。またpHiはそれに伴って7.11から6.99,6.87,6.76まで低下した。脳のfree ADP21.5mMから18.1,14.8,12.9mMまで減少し、脳の電気活動も20%、30%、40%と低下した.したがって、高炭酸ガス血症によるアシドーシスは新生仔脳の活動を抑制してエネルギー消費を減少させ、脳にとって好ましい方向へ作用していることが示唆された。またこの時、ADPがミトコンドリア呼吸を調節していること、およびアシドーシスがミトコンドリアにおける呼吸の基質の調節を障害しないことが判明した。本年度は.低酸素症による新生仔脳出血マウスにおいてその血液ガスと脳細胞内組織pH(pHi)をリン核磁気共鳴法(MRS)を用いて比較することによって、低酸素症に伴うアシド-シスに対する新生児脳神経細胞の防御反応を検索した. ^<31>P MRS(JEOL SCMー200spectrometer)の測定には、生後0ー1日のJcにICR系マウスを密閉容器に入れ,頭部が表面コイルに密着するように個定した。room airにて負荷前の測定後.5%酵素ー95%窒素混合ガスによる8時間の低酸素負荷を行い.その間のスペクトルを連続的に測定した.その後再びroom airにて蘇生し、蘇生3時間後まで測定した。MRSの測定は繰り返し時間2.0sec.積算回数1800回,RFパルス幅9μsecで行なった。混合動静脈pH(pH6)の測定は密閉容器にマウスを入れて同様の負荷を行い.1時間間隔で各々5匹の生存マウスを断頭して30μlの混合動静脈血をヘパリン処理した毛細管に採取し、pHを測定した。負荷後生存していたマウスについても、1時間間隔で蘇生3時間後まで測定した。^<31>P MRSの測定では20匹中11匹が生存し、生存例では負荷1時間後pHiは7.20±0.03から7.36±0.03まで有意に上昇し.その後徐々に低下したが.負荷終了時に於いても負荷前値より高かった。

蘇生後も一旦上昇傾向を示した。pHbは負荷前値7.39±0.01から負荷開始後徐々に低下し、負荷終了時には7.16±0.01であった。以上の結果から、体アシド-シスが存在している時に、新生仔脳ではアルカロ-シスを来たす場合があることが初めて実験的に示され、新生仔脳には体アシド-シスに対する何らかの保護機構が存在する可能性が示唆された。そしてまた、仮死児に対しては通常、アシド-シスの補正のために重炭酸ソ-ダが投与されるが、低酸素症における脳神経細胞の防御を第1に考えるなら、アシド-シスの補正のための重炭酸ソ-ダの投与は問題が存在する可能性が示唆された。本研究においては、動物実験により各種の負荷によるアシドーシスに対し新生仔脳の神経細胞がいかに反応するかを検討し、以下の結果を得た。1.低酸素症による新生仔脳出血マウスにおいてその血液pH(pHb)と脳細胞内組織pH(pHi)をリン核磁気共鳴法(MRS)を用いて比較したところ、負荷1時間pHiは7.20±0.03から7.36±0.03まで有意に上昇し、その後徐々に低下したが、負荷終了時においても負荷前値より高かった。以上の結果から、体アシドーシスが存在しているときに、新生仔脳ではアルカローシスを来たす場合があることが初めて実験的に示され、新生仔脳には体アシドーシスに対する何らかの保護機構が存在する可能性が示唆された。2.生後14日目の新生仔犬を用いて、麻酔下での高炭酸ガス負荷が脳の電気活動とミトコンドリア呼吸に及ぼす影響を脳波とMRSによって検討した。人工呼吸器による吸入ガスの酸素濃度を正常に保ち、炭酸ガス濃度を13%、20%、30%と上昇させたところ、血液ガスの炭酸ガス分圧はおよそ70、100、140mmHgと上昇した。またpHiはそれに伴って7.11から6.99、6.87、6.76まで低下した。脳のfree ADPも21.5μMから18.1、14.8、12.9μMまで減少し、脳の電気活動も20%、30%、40%と低下した、したがって、高炭酸ガス血症によるアシドーシスは新生仔脳の活動を抑制してエネルギー消費を減少させ、脳にとって好ましい方向へ作用していることが示唆された。またこの時、ADPがミトコンドリア呼吸を調節していること、およびアシドーシスがミトコンドリアにおける呼吸の基質の調節を障害しないことが判明した。
“リチウムプローブ”によるイオン伝導度イメージング

正極材料/全固体電池での界面抵抗の解明を目的としたイオン伝導度のイメージング、充放電特性、サイクル特性の評価を行う。本研究では、電気化学シグナルを利用したポジショニング技術、ナノスケールの電気化学計測に特有の高速・高感度な電気化学計測の原理、0.2 pAの低ノイズ計測を実現する独自の電気化学計測システムなど、申請者が開発したシステムをベースし、そのシステムの改良を行った。従来の大気環境だけでなくグローブボックス内での計測が可能なシステムの開発、固体電解質プローブの開発、電子伝導度・イオン伝導度同時イメージングに向けたプローブの開発、イメージングの解像度の向上を図った。安全性の優れた全固体電池は、材料の物性としては実用レベルに達しているが、電池を組むと、固体電解質と正極材料の間で異常な界面抵抗が生じる。この界面抵抗は、空間電荷効果、界面の化学的な変性、格子の不整合など様々な要因があげられている。しかし、これまでの手法は、充放電中に界面でのイオン伝導度を可視化できないため、界面でどのような現象が起こり、界面抵抗が生じるのかがわからない。このほかにも材料内のクラックの形成による材料の利用率の低下など多くの問題を抱えている。そのため、固固界面でのイオン伝導度の不均一性を明らかとする必要がある。そこで、リチウムプローブを用いて、固固界面でのイオン伝導をその場で計測する手法の開発に取り組んだ。平成27年度は、リチウム金属ではなく、固体電解質であるオハラガラスにリチウムイオン2次電池の正極として利用されるLiFePO4の合材電極を接着したものをプローブとして利用して、LiFePO4に接触させた状態でCV測定を行った。金属リチウムではなく、オハラガラスを使用した理由としては、電子伝導性とイオン伝導性を混合することなく、イオン伝導のみを計測するには、電子d年動静が極めて低く、イオン伝導性を有する材料を使用する必要があるためである。測定の結果、サンプルであるLiFePO4でのLiの挿入脱離に伴う電流を観察することができた。通常のナノスケールの接触ではなく、umスケールの接触をさせたにもかかわらず、応答は5 pAに満たない非常に小さなものであった。その理由として、オハラガラスと接着したLiFePO4とサンプルとLiFePO4との間でのリチウムイオンの移動距離が長いためと考えられ、平成28年度は、プローブの微細化にも取り組む予定である。固固界面の計測モデルとして、LiFePO4とオハラガラスを重ね合わせたものをプローブとして使用し、LiFePO4と接触させた状態でCVを計測すると、LiFePO4に対するLiイオンの挿入脱離に対応する電流を観察することができた。このことから、固体電解質をプローブとして利用し、固固界面を局所的に形成させることが可能であることが分かり、原理的に提案している手法が実現可能であることが示された。イオン伝導・電子伝導の同時計測局所的なイオン伝導と電子伝導を従来のインピーダンス計測ではなく、局所的な電気化学イメージング中に区別して計測するため、PtやAuをコーティングしたガラスキャピラリーを作製し、外側の金属部分で電子伝導性を評価し、内側のギラスキャピラリー内に電解液を充填してイオン伝導性を評価するプローブを開発した。このプローブを用いて、正極材料LiFePO4表面でのイオン伝導・電子伝導の同時イメージンを行い、イメージを取得することができた。今後は、得られた電流を定量的に評価し、計測の妥当性を検証する。また、局所的なインピーダンス計測の検討も行っており、その実現に向けた独自の微小電流計測器の開発も行い、現在周波数応答性を評価している。機能性保護被膜の形成正極材量表面に金属酸化物層をナノスケールで堆積させることで、サイクル特性の向上が報告されており、その金属酸化層の最適化には、保護膜の材料や厚さや分散状態が、電池特性に与える影響を評価する必要がある。しかし、通常の電気化学計測では、空間分解能を有さないため、空間的な情報を得ることができない。そこで、電気化学セル顕微鏡を用いて、LiCoO2表面に金属酸化膜をナノスケールで形成し、金属酸化膜の被膜形態と電池材料特性への影響を電気化学的にイメージングにより評価した。その結果、不均一な金属被膜の形成と、金属酸化膜の厚さと電気化学特性が密接に関わっていることが示された。全固体電池の充放電中に生じるクラックは、材料中のイオン移動を断絶してしまうが、クラックが生じた際のイオン電導度へ影響や活物質の利用率の関係は、依然として明らかとなっていない。これは、局所的なイオン電導度を計測する技術がないためであり、平成28年度は、固固界面での計測を応用して、実際に問題の生じている電極材料中のイオン電導度を電気化学イメージとして可視化する技術を創生する。分析化学
低エネルギー軽重イオン7次元情報検出器系の開発と天体核反応データ収集への応用

本研究の目標は、九州大学質量分離器焦点面検出器としての利用を第一義に考えた低エネルギー軽重イオン7次元情報検出器系を構築することにある。本検出器系は2次元位置感応型マイクロチャネルプレート(MCP)2台とシリコン半導体検出器(SSD)より構成され、これらからの信号より低速軽重イオンビームの位置(2次元)、角度(2次元)、飛行時間、エネルギー及び原子番号情報を導出する。本研究実施当初は、大面積SSDを焦点面より後方に設置することにより粒子の飛行距離を長く取る設計とし、高精度での飛行時間決定を可能とする計画であった。しかしながら、九州大学タンデム加速器からのビームを用いた大面積SSDの性能テストの結果、原子番号10以下の粒子に対してすら波高欠損に顕著な元素依存性が見られた。このような依存性は通常のSSDには見られないものである。このため大面積SSDの採用は取りやめ、SSDは焦点面に設置するものとした。原子番号同定法としては、MCPによる二次電子検出量から求める手法を採択することとし、開発を進めた。市販の薄膜の厚さ非一様性を九州大学タンデム加速器からの^<12>Cビームを用いて精密に測定し、X線蛍光分析用マイラー薄膜が3%以下と最も非一様性が小さいことを見出した。この薄膜をイオン通過による二次電子発生に利用した場合についてエネルギーストラグリングを考慮した評価を行い、0.2MeV/u,0.5MeV/uの^<16>Oに対する原子番号分解能が各々0.2,0.1と非常に高い分解能を達成できることを明らかとした。本検出器系の全系としての最終性能テストを現在進めており、間もなく質量分離器と本検出器系を利用した天体核反応^4He+^<12>C→^<16>O+γの反応断面積直接測定実験を本格的に開始する予定である。マイクロチャネルプレートをシリーズに設置して、低速軽重イオンビームの位置(2次元)、角度(2次元)、飛行時間を導出し、さらに最下流に大面積のシリコン半導体検出器を設置してエネルギー情報を精密に導出する。また、原子番号同定のための新たな手法を開発する。本研究初年度に当たる本年度においては、当初の予定通り、焦点面検出器としての最適化に最重点を置き、検出器系の基本的設計の確立を図った。具体的には、九州大学質量分離器を用いた天体核反応データ測定の第一の研究候補としている^4He+^<12>C→^<16>O+γ反応への応用を念頭に、マイクロチャネルプレートを用いた飛行時間測定系の詳細設計を行った。質量分離器のイオン光学特性を精密に調査し、測定すべき反跳^<16>O粒子を損なうことなく、かつ飛行時間およびエネルギー情報のみの利用でも理論上バックグラウンド^<12>C粒子の除去能力1/10^5を達成することを目標として個々の検出器の仕様及び検出器の配置を詳細に検討し、最終決定した。現在、個々の検出器の基本性能試験を進めている。今年度行った具体的設計では、理想的状況において7次元のうち2次元情報のみでも十分天体核反応データ直接測定に求められるバックグラウンド除去水準を実現するよう配慮したが、さらに複雑であろう現実に対応し、また実験データをより信頼性の高いものにするには、位置(2次元)、角度(2次元)情報の導出による飛跡追跡の実現が不可欠と考えている。次年度より検出器系

全系の製作、性能試験を行い、さらに位置、角度情報導出に向けた開発実験を進める予定である。また、原子番号同定に向けた技術開発にも取り組んでいく。本研究の目標は、九州大学質量分離器焦点面検出器としての利用を第一義に考えた低エネルギー軽重イオン7次元情報検出器系を構築することにある。マイクロチャネルプレートをシリーズに設置して、低速軽重イオンビームの位置(2次元)、角度(2次元)、飛行時間を導出し、さらに最下流に大面積のシリコン半導体検出器を設置してエネルギー情報を精密に導出する。また、原子番号同定のための新たな手法を開発する。本研究2年度目に当たる本年度においては、当初の予定通り、個々の検出器の製作及び基本性能試験を行った。具体的には、九州大学質量分離器を用いた天体核反応データ測定の第一の研究候補としている^4He+^<12>C→^<16>O+γ反応への応用を念頭に、マイクロチャネルプレートを用いた飛行時間測定装置の製作及びその基本性能の検査、ならびに大面積シリコン半導体検出器の基本特性調査を行った。マイクロチャネルプレートに関しては、時間測定について所期の目標を達成することが確認できたが、さらに2次元位置情報の導出により飛跡追跡が可能となるよう開発を続けている。また、シリコン半導体検出器の特性については、イオン種による応答の相違が大面積検出器において顕著であり、さらに詳細な応答関数の調査を続けている。一方、質量分離器自身のバックグラウンド除去能力を高めるため、本年度、分離器の光学系に改良が施された。その結果、イオン光学特性に変化が生じ、それに伴い検出器系全体の基本設計の見直しを余儀なくされた。現在、新たな光学系におけるイオン光学特性を精密に調査するとともに、検出器全系の基本設計の再検討を進めている。マイクロチャネルプレート(MCP)をシリーズに設置して、低速軽重イオンビームの位置(2次元)、角度(2次元)、飛行時間を導出し、さらに最下流に大面積のシリコン半導体検出器を設置してエネルギー情報を精密に導出する。本研究最終年度である本年度においては、最も困難が予想された原子番号情報取得法の開発を進めた。原子番号同定には、ある厚さの物質を通過する際の粒子のエネルギー損失量と全エネルギーとの相関より原子番号を求めるカウンターテレスコープ法がよく用いられる。本研究では、エネルギー損失量をMCPによる二次電子検出量から求める手法の開発を進めた。具体的には、エネルギーストラグリングによるエネルギー広がり、及びエネルギー損失量と二次電子発生量の相関について系統的に調査し、また低エネルギー重イオンに適用するために必要不可欠な厚さ数ミクロンの薄膜の厚さ非一様性を九州大学タンデム加速器からのビームを用いて精密に測定した。これらの結果から、X線蛍光分析用マイラー薄膜を利用することにより、この新たな原子番号同定法が本検出器系を用いた天体核反応データ測定の第一の研究候補としている^4He+^<12>C→^<16>
救急救命士における特定行為指示の実施状況の解析と包括指示下プロトコル開発

本研究の目的は、救急救命士における特定行為指示の実施状況の解析を行うことで、救命率向上に寄与する包括指示下プロトコル開発を行うことである。研究代表者の在籍する施設がメディカルコントロールを管轄する9つの消防本部の協力の下で、研究を実施した。はじめに、特定行為の実施状況について調査を実施した。その結果、声門上器具気道確保、静脈路確保、初回アドレナリン投与(以下、薬投)、の3つの特定行為については、救急救命士の提案に対して医師が同意する形で具体的指示を行っており、99%以上の率で医師による介入(提案した処置に対する助言や修正)が無かった。この結果を受けて、北海道では平成30年4月1日から救急活動プロトコルが改訂された。それまで、薬投までに要していた2回の具体的指示(静脈路確保と、静脈路確保後の薬投に関する具体的指示)が1回(静脈路確保と、確保できた場合の薬投)となった。その結果、プロトコル改訂前後で、傷病者接触から薬投まで30秒程度の時間短縮が得られた。次に、3つの特定行為全てが包括指示化された場合の時間短縮効果について、院外心停止症例での活動シミュレーションの動画撮影を行い、接触から薬投までの時間を計測した。その結果、現行の具体的指示を要する活動と包括指示化した場合の活動を比較すると、傷病者接触から薬投までの時間は35秒短縮された。また、フィンランド共和国とアメリカ合衆国マサチューセッツ州で救急隊の現地調査を行ったところ、両国とも救急救命士をはじめとする救急隊員は多数の医療行為を実施可能であり、3つの特定行為は包括指示下で実施可能であった。平成29年3月30日発出の総務省消防庁の通知で、初期心電図波形がショック非適応リズムの場合、傷病者接触後、速やかに薬投を実施する活動を基本とすることが提案されており、特定行為の包括指示化は十分に検討に値するものである。「救急救命士における特定行為指示の実施状況の解析と包括指示下プロトコル開発」の中で、平成28年度は研究1の「特定行為における具体的指示の内容調査」を実施した。研究協力者である、当大学がメディカルコントロールを管轄する江別市消防本部、北広島市消防本部、千歳市消防本部、恵庭市消防本部、石狩北部地区消防事務組合消防本部、小樽市消防本部、北後志消防組合消防本部、羊蹄山ろく消防組合消防本部、岩内・寿都地方消防組合消防本部、の9つの消防本部から、メディカルコントロール医師による事後検証を行うために提出される事後検証票のデータベース化を実施した。救急隊が医療機関へ救急搬送する心停止症例は、全症例が医師による事後検証の対象となるため、データベース化により、救急救命士による具体的指示下での特定行為の実施状況の集計が容易になった。調査予定期間である平成28年4月1日から平成29年3月31日までの特定行為を実施した全症例の事後検証票が一部提出されていないため、その集計、解析、考察、については未実施である。症例が提出され次第、集計と解析を実施して、課題を抽出する。その成果を基にして、アメリカとフィンランドの2か国でメディカルコントロール医師と救急救命士における救急活動プロトコルの現地調査を行い、具体的指示と包括的指示のあり方と考え方について意見交換を行い、具体的指示下で実施している特定行為を包括指示下に変更した場合の効果と影響について検討していく予定である。平成28年度にアメリカにおける包括指示プロトコルの現地調査を実施する予定であったが、当大学での具体的指示の課題を抽出した上で現地調査を実施したほうが成果が上がると考え、次年度以降に延期としたため。平成29年度は主に、1特定行為における具体的指示の内容調査の解析、2具体的指示要請時の通話時間の調査、3フィンランド共和国ヘルシンキ市におけるメディカルコントロール(MC)体制の視察、の3つに取り組んだ。1については、研究協力者である、当大学がMCを管轄する9消防本部(江別市消防本部、北広島市消防本部、千歳市消防本部、恵庭市消防本部、石狩北部地区消防事務組合消防本部、小樽市消防本部、北後志消防組合消防本部、羊蹄山ろく消防組合消防本部、岩内・寿都地方消防組合消防本部)に関して作成した事後検証データベースを用いて集計と解析を実施した。心肺停止症例に対する、「声門上デバイスによる器具気道確保」、「静脈路確保」、「初回のアドレナリン投与」、の三項目については、救急救命士の具体的要請に対してMC指示医師は99%以上の割合で同意するのみであったことが示された。2については、特定行為に対してどれくらいの時間が電話通話によって要しているのか調査を実施した。各消防本部から電話会社に依頼して携帯電話の通話時間記録を入手し、事後検証票を用いて一つ一つの特定行為と通話時間を照合していった。次年度の研究ではその結果を解析する。3については、ヘルシンキ市消防本部に赴き、MC医師による講義を受けるとともに、救急車の同乗実習を行った。救急救命士の教育制度が日本とは大きく異なっているため、救急救命処置、特に包括的指示下で実施可能な処置が非常に多かった。医師、救急救命士、救急隊員、のそれぞれとディスカッションを通してお互いの病院前救急医療体制を理解することができた。予定では海外視察は平成28年度と平成29年度の2回で終了であったが、平成29年度にフィンランドを視察したのみで、アメリカでの視察を終えていないため。その他については順調に進められている。

研究代表者の在籍する施設がメディカルコントロールを管轄する9つの消防本部の協力の下で、研究を実施した。はじめに、特定行為の実施状況について調査を実施した。その結果、声門上器具気道確保、静脈路確保、初回アドレナリン投与(以下、薬投)、の3つの特定行為については、救急救命士の提案に対して医師が同意する形で具体的指示を行っており、99%以上の率で医師による介入(提案した処置に対する助言や修正)が無かった。この結果を受けて、北海道では平成30年4月1日から救急活動プロトコルが改訂された。それまで、薬投までに要していた2回の具体的指示(静脈路確保と、静脈路確保後の薬投に関する具体的指示)が1回(静脈路確保と、確保できた場合の薬投)となった。その結果、プロトコル改訂前後で、傷病者接触から薬投まで30秒程度の時間短縮が得られた。次に、3つの特定行為全てが包括指示化された場合の時間短縮効果について、院外心停止症例での活動シミュレーションの動画撮影を行い、接触から薬投までの時間を計測した。その結果、現行の具体的指示を要する活動と包括指示化した場合の活動を比較すると、傷病者接触から薬投までの時間は35秒短縮された。また、フィンランド共和国とアメリカ合衆国マサチューセッツ州で救急隊の現地調査を行ったところ、両国とも救急救命士をはじめとする救急隊員は多数の医療行為を実施可能であり、3つの特定行為は包括指示下で実施可能であった。平成29年3月30日発出の総務省消防庁の通知で、初期心電図波形がショック非適応リズムの場合、傷病者接触後、速やかに薬投を実施する活動を基本とすることが提案されており、特定行為の包括指示化は十分に検討に値するものである。研究1の「特定行為における具体的指示の内容調査」については、平成29年度中に集計と解析を実施して、その成果を日本救急医学会学術集会で発表する予定である。その成果を基に外国での現地調査を実施し、抽出された課題の解決策を講じる。研究1の「特定行為における具体的指示の内容調査」については、引き続き調査を継続し、MC指示電話の通話時間の解析を行う。研究2の「欧米における包括指示プロトコールの調査」については、平成30年度にアメリカのUniversity of Massachusetts Medical Schoolの視察を行う。アメリカ、フィンランド、日本、の3つのプロトコールを比較し、救命率向上に向けた課題の抽出を行う。研究3の「包括指示を想定したプロトコールの策定」については、現状の具体的指示を要する救急救命処置の包括指示化の妥当性を検討し、包括指示化が可能と思われる処置に関してのプロトコルを試験的に策定する。研究4の「プロトコールの検証」については、研究協力者である9消防本部に依頼して、新プロトコルを用いたシミュレーションを実施し、撮影された動画を解析して時間短縮効果を示すとともに、新たに抽出されてくるであろう課題について考察する。日本救急医療財団の救急救命処置検討委員会の「平成30年度救急救命処置の追加、除外に関する提案募集」に「特定行為「乳酸リンゲル液を用いた静脈路確保のための輸液」、「エピネフリンの投与」、「食道閉鎖式エアウエイ、ラリンゲアルマスクによる気道確保」
夜間頻尿の治療法開発を目指したテレメトリー法によるラット膀胱求心性神経活動の検討

平成19年度は,平成18年度に確立した実験(2)/(3)の方法による測定技術の安定化を行った。具体的には,以下の如くである。ウレタン麻酔下(1.2g/kg皮下注射)に下腹部正中切開を置き,膀胱を露出する。膀胱頂部より膀胱瘻カテーテル(PE-50)を挿入・固定する。下腹部を開いたまま実験を行うにあたり,臓器の乾燥を防ぐため腹腔内にミネラルオイルを満たす。膀胱内に挿入したPE-50を,三方活栓を介してシリンジポンプ(Pump22[○!R])および圧トランスデューサに接続する。シリンジポンプにより膀胱内に0.04 mlAninの生理食塩水を持続注入し,排尿反射を惹起,圧トランスデューサをPower Lab[○!R]に接続することで膀胱内圧測定を行う。続いて,気管切開によりPE-240チューブを挿入し,人工呼吸を可能とする。左骨盤神経を骨盤神経叢より中枢側で周囲組織より剥離し,記録電極1対を神経線維に掛ける。膀胱求心性神経電位を記録するため,神経線維中枢側は切断する。神経活動電位は,記録電極→高感度生体増幅器→A/D converter (PowerLab[○!R])→パソコンを接続したシステムで行う。前述のように,シリンジポンプにより膀胱内に0.04 ml/minの生理食塩水を持続注入することにより排尿反射を惹起し、同時に神経線維から活動電位を記録する。次に,神経活動電位記録時の周辺ノイズを軽減するため,筋弛緩薬ガラミン静注により横紋筋の活動電位を消失させる。同時に人工呼吸を開始する。同様に膀胱内圧測定,骨盤神経線維の活動電位を記録する。麻酔深度,手術手技,電磁波の遮蔽状況が,測定結果に影響するため,今後更なる工夫を施し,テレメトリー測定技術の基礎を確立する必要がある。平成18年度・実験(2)/(3)の方法を確立した。具体的には、以下の如くである。《ウレタン麻酔下(1.2g/kg皮下注射)に下腹部正中切開を置き、膀胱を露出する。膀胱頂部より膀胱痩カテーテル(PE-50)を挿入・固定する。下腹部を開いたまま実験を行うにあたり、臓器の乾燥を防ぐため腹腔内にミネラルオイルを満たす。膀胱内に挿入したPE-50を、三方活栓を介してシリンジポンプ(Pump22^<【○!R】>)および圧トランスデューサに接続する。シリンジポンプにより膀胱内に0.04ml/minの生理食塩水を持続注入し、排尿反射を惹起、圧トランスデューサをPowerLab^<【○!R】>に接続することで膀胱内圧測定を行う。続いて、気管切開によりPE-240チューブを挿入し、人工呼吸を可能とする。左骨盤神経を骨盤神経叢より中枢側で周囲組織より剥離し、記録電極1対を神経線維に掛ける。膀胱求心性神経電位を記録するため、神経線維中枢側は切断する。神経活動電位は、記録電極→高感度生体増幅器→A/D convertel(PowerLab^<【○!R】>)→パソコンを接続したシステムで行う。前述のように、シリンジポンプにより膀胱内に0.04ml/minの生理食塩水を持続注入することにより排尿反射を惹起し、同時に神経線維から活動電位を記録する。次に、神経活動電位記録時の周辺ノイズを軽減するため、筋弛緩薬ガラミン静注により横紋筋の活動電位を消失させる。同様に膀胱内圧測定、骨盤神経線維の活動電位を記録する。》機器の購入・設置、記録電極の作製、実験動物の準備、特に骨盤神経の同定・剥離・電極の設置手技の習得に時間を要し、今年度の目標は一部しか達成できていない。

同様に膀胱内圧測定,骨盤神経線維の活動電位を記録する。麻酔深度,手術手技,電磁波の遮蔽状況が,測定結果に影響するため,今後更なる工夫を施し,テレメトリー測定技術の基礎を確立する必要がある。
ヒゲカビchitin deacetylase遺伝子のクローニングとその利用

キトサンは医療、農業、工業など種々の分野で利用されている注目すべきバイオポリマーであり、利用範囲の広さにより年々その需要が高まっている。現在、工業的には缶詰工場などから出るカニの甲羅からキチンを精製し、キチンから化学的にキトサンに変えているが、その際に生じる高濃度アルカリの廃液が大きな問題である。しかし、これをchitin deacetylaseを用いて、酵素的に変換するのであれば、廃液の問題は解決する。そこで、我々は細胞壁の主成分がキチンとキトサンから成る接合菌類ヒゲカビのchitin deacetylase遺伝子をクローニングすることを計画した。既にケカビchitin deacetylaseのクローンがKafezopoulosらにより報告されているが、このクローンのアセトアミド基を持つ多糖類のdeacetylaseとも共通なアミノ酸配列に対応するプライマーを作成し、ヒゲカビのゲノムDNAを鋳型としてPCRによりケカビのchitin deacetylase遺伝子と高い相同性を持つ218塩基対から成るDNA断片を合成した。この断片をプローブとしてヒゲカビcDNAライブラリーからポジティブクローンをスクリーニングした処、1種類のクローンのみが分離された。このクローンのコードするであろうタンパク質は451アミノ酸から成り、ケカビchitin deacetylaseと同様N-末端にシグナル配列とC-末端に膜結合配列を持ち、アミノ酸配列及び推定三次構造の相同生も高いことから、このタンパク質はヒゲカビのchitin deacetylaseであろうと考えられ、PbCDAと名付けた。クローンニングされた遺伝子はPbCDと名付けGenBankに登録した(accession #AB046690)。これを工業的に利用するためには大腸菌など大量培養可能な微生物に遺伝子を導入し、大量に酵素を生産する必要がある。そこで、発現ベクターとしてNOVAGEN社のPET32 EK/LICにPbCDクロンを連結し、大腸菌に導入し、大腸菌抽出液からヒスチジンタグを持ったタンパク質分画として精製した。この分画にはクローンから発現したと思われるタンパク質の存在が確認されたが、酵素活性が検出されなかった。このクローンにより発現されるタンパク質g酵素活性をもつための条件を明らかにする事が我々の次のプロジェクトである。キトサンは工業、医療、農業など幅広く種々の分野で利用されているユニークなバイオポリマーである。キトサンは現在、かにの殻から化学的に処理され生産されているが、その結果大量の産業廃棄物ができてしまう。キトサン生産に酵素を用いることにより、産業廃棄物を少なくすることができるので、われわれは酵素を用いてキトサンを生産することを計画した。λ-ZAP vectorを用いてヒゲカビcDNAライブラリーを作成し、すでに報告されているキチンデアセチラーゼの共通なアミノ酸配列に対するプライマーを作成し、ヒゲカビのゲノムDNAを鋳型として、PCR法を用いてキチンデアセチラーゼに共通のアミノ酸配列を持つDNA断片を合成し、これをプローブとして用いた。その結果ヒゲカビキチンデアセチラーゼ遺伝子と思われるクローンが分離された。このクローンの塩基配列を調べた処、このクローンのコードするであろうタンパク質は459アミノ酸から成り、配列がケカビキチンデアセチラーゼとよく似ていることから、このタンパク質はヒゲカビのキチンデアセチラーゼであろうと考えられ、PbCDAと名付けた。クローンニングされた遺伝子をPbCDと名付けGenBankに登録した。登録番号はAB046690である。このクローンを発現ベクターに繋ぎ換えし、大量発現の条件を検討中である。

また、このクローンを基にゲノムDNAをクローニングし、塩基配列を調べた処、イントロンが存在しないことが明らかとなった。ヒゲカビの細胞壁の骨格はキチンとキトサンであることが知られているが、胞子嚢柄がミズタマカビのように膨れてしまう形態的突然変異体pil-A,pil-B.pilC,pil-Dは野生型に比べ細胞壁中においてキトサンの割合が大きい.これら突然変異体の各々からPbCDクローンを分離し、塩基配列を調べたが、いずれの突然変異体もPbCD中の読みとり枠内には突然変異を持たないことが分かった。キトサンは人工皮膚・人工骨・縫合糸・傷口保護用粉剤等の医療材料として、免疫活性を高めるための健康食品として、農作物収量増大のための土壌改良剤として年々その需要が高まっている。現在、工業的にはキチンを高濃度のアルカリによる脱アセチル化でキトサンを生成しているが、この際に生じる高濃度アルカリの廃液が大きな問題である。そこで、この脱アセチル化を酵素であるchitin deacetylaseを用いて行うことを考えた。Kafetzopoulosらにより報告されているキチンデアセチラーゼに共通なアミノ酸配列に対するプライマーを作成し、ヒゲカビのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行ったところ、約200塩基対のDNA断片が得られた。この断片の塩基配列にはKafetzopoulosらのクローンと高い相同性が観られた。λ-ZAP vectorを用いてヒゲカビcDNAライブラリーを作成し、上記DNA断片をプローブとしてchitin deacetylaseをコードする遺伝子をライブラリーからクローニングした。クローンニングされた遺伝子をPbCDと名付けGenBankに登録した。登録番号はAB046690である。この遺伝子によりコードされるであろうタンパク質についてFAMSにより立体構造解析を行ったところ、2個以上のサブドメインによって構成されており、その構造はKafetzopoulosらが報告したchitin deacetylaseと非常に類似していることが示された。このクローンを発現ベクターpET-32Ek/LICに組み込み大腸菌で発現させたところ、chitin deacetylaseを生産することが確認できた。この酵素にとっての至適条件はpH5.5,37°Cであった。また、N-acetyl-D-glucosamineのオリゴマーを基質とした場合の酵素活性は、コロイドキチンを基質とした場合の活性に比べて脱アセチル化率が高く、Chitotriose, Chitopentaoseなど、奇数の重合体に対しは偶数の重合体に比べ高い活性を示した。
プロトン駆動型べん毛モータの動態の光ナノ計測と分子シミュレーション

1.べん毛モーター固定子蛋白質MotA Pro-173の機能解析運動性細菌は、細胞膜に埋まって存在するべん毛モーターを回転させることにより、モーターに連結するべん毛繊維をスクリューのように回転させて泳ぐ。べん毛モーターはプロトンの電気化学的ポテンシャル差を回転力に変換することが知られているが、詳しい作動機構は明らかにされていない。本研究では、細菌べん毛モーターの作動機構を解明することを目的として、サルモネラ菌べん毛モーターの固定子蛋白質MotAのPro-173がAlaに変異したことにより機能が低下した、変異型べん毛モーター(P173A)について、光学顕微鏡を用いた一分子計測法による出力特性解析を行なった。直径0.1-2.0μmのポリスチレンビーズをべん毛繊維に付着させ、ビーズの位置変化をフォトダイオードや高速度CCDカメラで検出する、ビーズ法と呼ばれる手法を用いて、モーターの回転速度とトルクを求めた。その結果、P173Aモーターは野生型と同等のトルクを発生できるが、野生型に比べてプロトンの透過活性が著しく低下していることが分かった。P173Aモーターの出力特性を、動力学的モデルを用いて再現することにより、MotAのPro-173を中心とした固定子蛋白質の構造変化がプロトンの透過反応を促進しており、P173Aの変異によって正常なプロトン透過が阻害されたことが分かった。本研究の結果は、プロトン流とモーター蛋白質のダイナミクスの共役を明らかにした点で重要である。2.エレクトロローテション本研究では、高周波の回転電場中でビーズ法を行なう手法を確立した。電場の周波数や溶液導電率等を考慮した条件検討により、べん毛繊維に付着させたビーズに電場強度依存的な外部トルクを与えることに成功した。今後、この手法を用いることで、これまで以上に広範かつ多様な条件での出力解析が可能になると期待できる。1.べん毛モーターの回転計測とシミュレーションサルモネラ菌のべん毛モーターは、細胞膜を介したH^+の電気化学的ポテンシャル差を利用して回転する回転ナノマシンであることが知られているが、そのエネルギー変換機構については、未だ不明な点が多い。本研究では、サルモネラ菌べん毛モーターの化学-力学エネルギー共役の仕組みを解明することを目的として、様々なpH条件および負荷条件のもとにべん毛モーターの出力特性の解析を行った。べん毛モーターの回転計測は、べん毛繊維に付着させた様々な大きさのビーズ(直径2.0μm0.1μm)の回転を4分割センサーやEMCCDカメラで検出するビーズ法により行い、サルモネラ菌べん毛モーターの出力特性を広範な負荷条件下で解析した。細胞内外のpHを変化させながら回転計測を行い、細胞内pHの低下によりモーターの回転速度が低下あるいは停止することを明らかにした。また、モーターの出力特性に対する細胞内外のpH変化の影響を、動力学的モデルを用いたシミュレーションで再現することに成功し、固定子プロトンチャネルのプロトン結合部位からプロトンが解離する過程がトルク発生反応サイクルの律速段階であることを明らかにした。これらの結果は、プロトン駆動型モーターの入力から出力に至るまでのエネルギー変換サイクルの律速段階を明確にした点で重要である。今後は、突然変異型べん毛モーターの出力特性解析およびシミュレーションも行う予定である。2.べん毛モーター内部抵抗の計測テザードセル強制回転システムを用いて行ったモーター内部抵抗の計測では、細胞内pHの低下によってプロトンの透過速度が遅くなるとモーターの内部抵抗が変化する傾向をとらえた。今後は、負荷条件や溶液条件等を検討することにより実験系の精度を向上させるとともに、突然変異型モーターを用いた実験も行う予定である。