hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X染色体不活化を用いた胃粘膜のクローナリティーの解析及び前癌病変の同定

当初の予定通り、胃粘膜より腺管ごとの細胞を実体顕微鏡下に採取しようと試みたが、実体顕微鏡下で完全に間質を除去するのは不可能であり、クローナリテイ・マップを作成することは困難を究めた。そこで、EDTAを用いて、単一遊離腺管を作成し、ここより抽出したDNAを用いて、腺管のクローナリテイを検索した。その結果、今まで、単一腺管はモノクローナルであると考えられてきたが、胃底腺管では少なくともその約40%が、幽門腺管では少なくともその約7%がポリクローナルであることがわかった。また、腸上皮化生腺管ではその組織型、発生部位にかかわらず少なくともその約50%がポリクローナルであり、モノクローナルに拡大している前癌病変であろうという予想は大きくくつがえされた。そこで、同様のX染色体不活化を用いて組織切片上でクローナリテイを見ることはできないか調べた結果、それができるトランスジェニックマウスがメルボルン大学に存在することがわかった。これを入手し、正常胃粘膜のクローナリテイを調べたところ、以前、我々がヒト胃粘膜を用いて報告した結果と同様にマウス胃粘膜にもボリクローナルな腺管が存在することがわかった。また、ある程度の広がりを持った、モノクローナルな腺管の集合(パッチ)が存在することがわかった。このモノクローナルパッチは正常マウスの成長、発達段階において胃粘膜の拡大とともに拡大してくることがわかった。このマウスに発癌剤を投与したが、このパッチに拡大は認められなかった。当初の予定通り、胃粘膜より腺管ごとの細胞を実体顕微鏡下に採取しようと試みたが、実体顕微鏡下で完全に間質を除去するのは不可能であり、クローナリティ・マップを作成することは困難を究めた。そこで、同様のX染色体不活化を用いて組織切片上でクローナリティを見ることはできないか調べた結果、それができるトランスジェニックマウスがメルボルン大学に存在することがわかった。これを入手し、正常胃粘膜のクローナリティーを調べたところ、以前、我々がヒト胃粘膜を用いて報告した結果と同様にマウス胃粘膜にもポリクローナルな腺管が存在することがわかった。また、ある程度の広がりを持った。モノクローナルな腺管の集合(パッチ)が存在することがわかった。現在、このマウスに発癌剤を投与中である。実際に発癌過程においてこのモノクローナルパッチが拡大してくるのか否かを検討する予定である。同時にマウスにおける前癌病変を同定する予定である。ヒト胃に関する解析は、実体顕微鏡よりもさらに細かい操作が可能であり、間質の混入なく組織の採取が可能であるといわれているレーザー顕微鏡を用いて、続行する予定である。現在、レーザー顕微鏡借用の交渉中である。これを入手し、正常胃粘膜のクローナリテイを調べたところ、以前、我々がヒト胃粘膜を用いて報告した結果と同様にマウス胃粘膜にもポリクローナルな腺管が存在することがわかった。

また、ある程度の広がりを持った、モノクローナルな腺管の集合(パッチ)が存在することがわかった。このモノクローナルパッチは正常マウスの成長、発達段階において胃粘膜の拡大とともに拡大してくることがわかった。このマウスに発癌剤を投与したが、このパッチに拡大は認められなかった。
KDR、flt-1遺伝子導入ラットにおけるメサンギウム増殖性腎炎の作製とその治療に関する研究

1)すでにクローニングされているラットflt-1,KDRのシークエンスを検討し、その上流域にβ-galactosidase活性を組み込んだcDNAを合成した。市販のcationic liposomeとこのcDNAを反応させ、混合物を作製した2) cationic liposome-cDNA混合物を注入後、ラットを閉腹し、12時間後、24時間後、2日後、3日後、4日後、1週間後にラットより、腎臓、肝臓、肺を摘出し、凍結切片を用いて、β-galactosidase活性の免疫染色を行い、切片あたり陽性糸球体数を数え、導入効率を算定した。3)導入効率が安定したとろで、導入、非導入ラットで、病期に応じて尿蛋白、BUN.Crを測定し、腎臓を摘出し病理学的検討を加えた。4)遺伝子導入・非導入ラット間で、尿蛋白、BUN.Cr、組織学的に有意差は認めなかった。5)そこで、遺伝子・非導入ラットの両方にVEGFを経静脈的に投与したところ、導入ラットにおいて、増殖病変が強い傾向がみとめられた。現在さらにVEGF投与量、回数糖の実験条件をふやし、実験を継続中である。6)加えて、導入、非導入ラットにThy-1腎炎を惹起し、双方の臨床病理学的比較検討を進めている。市販のcationic liposomeとこのcDNAを反応させ、混合物を作製した。2)150200gの雄生SDラットを工-テル麻酔下に開腹し、腎門部を露出させ、腎静脈に可逆性の血管結紮器をかけると同時に腎動脈から、上述のcationic liposome-cDNA混合物をmicroinjectorを用いて、注入し、軽く圧迫止血し、腎臓内の血流を停滞させる。この際、腎臓の組織に虚血による組織障害が出現しないように、生理食塩水を注入する予備実験を何度か行い、その条件を決定した。また、cationic liposome-cDNA混合物の混合の割合、注入量も条件を変え検討した。3)cationc liposome-cDNA混合物を注入後、ラットを開腹し、12時間後、24時間後、2日後、3日後、4日後、1週間後にラットより、腎臓、肝臓、肺を摘出し、凍結切片を用いて、β-galactosidase活性の免疫染色を行い、切片あたり陽性糸球体数を数え、導入効率を算定する。現在各種条件で、導入効率を算定し、比較するところまで到達している。
高温高アルカリ環境で機能する新規微生物酸化還元・電子伝達機能の探索と開発

高温・高アルカリの藍染工程から、硝化脱窒や酵素電池などに有用な酸化還元反応に優れた微生物の単離を行い、得られた菌株の酸化還元機能を評価した。新たに構築した定量評価法を用い、154株の藍染工程分離株から10株の高活性菌を選抜した。最も高い活性を示したAlkalibacterium sp. SH2-1株は、既報の微生物よりも高い活性を示し、電子供与体・グルコースの存在下にて、メディエーターに依存しない直接電子移動による活性を示した。また、藍葉に含まれるemodinをはじめ、アントラキノン化合物がメディエーターとして効率的に機能した。また、植物体としての藍を効率よく分解する微生物を取得した。藍染めに関与する複合微生物系は、高温・高アルカリ条件下において、電子伝達が関与した酸化反応(有機物の無機化)および還元反応(インジゴの還元)を行うユニークな特性を有している。酸化反応(有機物の無機化)に関して、アルカリ条件において植物組織等の有機物を分解する微生物の取得に成功し、また、アルカリ条件において硝化活性を評価するための複合微生物系モデルを構築した。還元反応(インジゴの還元)に関して、藍染めの染色液やすくも、乾燥葉などを菌の分離源とし、炭酸ナトリウムでpH10に調整した標準寒天培地を用いて28°C、嫌気条件下で培養し、154株の微生物を単離した。単離した微生物について、0.03%インジゴを含むアルカリ標準培地で3日間培養を行い、インジゴ還元能を評価した。評価方法としては、遠心後の培養液上清に溶けているロイコインジゴを空気に晒すことでインジゴへ酸化し、600 nmの吸光度を測定することでインジゴ還元能を定量的に評価した。その結果、インジゴ還元能の高い10株の菌株の所得に成功した。最もインジゴ還元能の高いSH2-1株について、16S rRNA解析を行ったところ、Alkalibacterium pelagiumとの99%の相同性が見いだされた。さらに、得られたインジゴ還元菌についてインジゴ還元の条件検討を行ったところ、グルコースやフルクトースがインジゴ還元に有効であることを明らかにした。また、インジゴの還元はメディエーターを介さない直接還元である可能性が示唆された。アルカリ条件下でインジゴを効率的に還元する微生物を取得し、効率的にインジゴを還元する菌株を選抜した。また、それらの電極への電子伝達能力についても評価した。また、アルカリ条件において植物組織等の有機物を分解する微生物群を取得にも成功している。さらに、アルカリ条件において硝化活性を評価するための複合微生物系モデルを構築しており、おおむね順調に進展していると言える。藍染めは、タデアイ葉由来インジゴの微生物還元を利用して行われている。藍色成分である非水溶性色素のインジゴは、アルカリ条件下で微生物により水溶性のロイコインジゴへと還元され、布に吸着できるようになる。現在、インジゴ還元菌の単離に成功した報告はあるが、インジゴ還元能を定量的に評価した報告はない。そこで本研究では、インジゴ還元能の定量法を確立し、これを用いたインジゴ還元菌の探索を行った。さらに、インジゴの還元に関与する酵素の機能解析を目的とし、インジゴ還元反応における還元力供給系やメディエーターの検討を行った。藍染めの染色液や染料の素であるすくも、タデアイの乾燥葉などを菌の分離源とし、アルカリ・嫌気条件下で微生物の単離を行った。得られた微生物について、ふすまを含む培地での培養に伴う還元能や、休止菌体反応における還元能を評価した。評価方法としては、遠沈後の培養液上清に溶けているロイコインジゴを空気に晒すことでインジゴへと酸化させ、スペクトルを測定することでインジゴ還元能を定量的に評価した。それにより得られたインジゴ還元能の高い菌株について16S rDNA解析による菌の同定を行い、Alkalibacterium属、Clostridium属、Paraclostridium属であることを明らかにした。さらに、これらの菌株を用いてインジゴ還元反応における還元力供給系やメディエーターの影響等の条件について検討を行った。メディエーター非存在下でも一定の還元反応が認められ、直接電子移動の可能性も示されたが、アントラキノン存在下で、ロイコインジゴ量の増加が確認された。アントラキノン類について幅広く検討を行った結果、sodium anthraquinone-β-sulfonateに高い活性を認めた。また、タデアイ葉に含まれるアントラキノン誘導体であるemodinにも高い活性を認めた。有機物無機化微生物群を探索・選抜し、これらを用いて、高温高アルカリで機能する酸化酵素群(脱水素酵素やラッカーゼ等)を取得する。

ジクロロインドフェノール(DCIP)等を用いて酸化能力を検討していく。すくも作り由来のアンモニア酸化菌、亜硝酸酸化菌を含む有機物無機化微生物群を用いて、高温高アルカリ下で機能する硝化プロセスを構築する。申請者らがすでに構築している硝化プロセスと比較することで高温高アルカリ硝化プロセスの特徴を明らかにする。細胞外電子伝達能力が高い菌株に対して、サイクリックボルタンメトリーによる細胞表面シトクロムの詳細な解析を行う。さらに、得られた菌株の最適な培養条件や反応条件を検討し、得られた菌株をアノードへ利用した高温高アルカリ下で機能する微生物燃料電池の作成を試みる。応用微生物学
酸素漂白条件下における多糖類およびリグニン分解機構の基礎的解析

糖類のモデル化合物メチルβ-D-グルコピラノシド(MGP)、MGPの各炭素の立体配置が異なるMGPの異性体、そして、MGPの各炭素に結合する水素を重水素ラベルした重水素化MGPを、活性酸素種生成源となるフェノール性化合物と共に酸素漂白条件下で処理することによって、糖モデル化合物の各炭素の立体配置の相違が、それらと活性酸素種との反応に影響を及ぼすこと、そして、実際に活性酸素種がMGPの各炭素に結合する水素を引き抜くことを、明らかにした。本研究では、製紙用化学パルプの酸素漂白過程で重大な問題となる多糖類の分解を抑制し、脱リグニンを飛躍的に向上させる技術の開発に貢献するため、上記漂白過程における多糖類とリグニンの化学反応について、モデル化合物を用いて、単量体分子レベルで詳しく解明することを目的とする。多糖類の分解は、リグニンのフェノール性部位と酸素との反応で二次的に生成する活性酸素種によって引き起こされるが、本研究では、この活性酸素種(AOS)が、多糖類のどの部分構造と優先的に反応するかについて、定量的に解析するため、糖モデル化合物としてメチルβ-D-グルコシド(MGP)を用い、研究を進めている。酸素漂白過程において多糖類は酸素に対して抵抗性を持ち、その分解は主としてリグニン中のフェノール性部位と酸素との反応によって二次的に生成する活性酸素種(AOS)が引き起こす。この反応を機構的に解明するのが、本研究の目的である。本年度においては、多糖類のアノマー位に注目してこの機構を検討するため、多糖類のモデル化合物methylβ-D-glucopyranoside (MGPβ)と、これとアノマー位立体配置の異なるmethylα-D-glucopyranoside (MGPα)を、フェノール性化合物と共に酸素漂白条件下で処理した。その結果、MGPβの方が速く分解され、アノマー位立体配置の相違が、フェノール性化合物と酸素との反応で生成するAOSとこれらモデル化合物との反応に影響を与えることが明らかになった。さらに、実際にアノマー位がAOSによって攻撃されるかどうかを検討するため、MGPβとアノマー位に重水素を持つmethylβ-D-(1-^2H)glucopyranosideを、フェノール性化合物と共に酸素漂白条件下で処理した。その結果、MGPβの方が速く分解され、速度論的同位体効果が観測されたため、実際にAOSによってMGPβのアノマー位水素が引き抜かれることが示唆された。一方、MGPαとアノマー位に重水素を持つmethylα-D-(1-^2H)glucopyranosideを、フェノール性化合物と共に酸素漂白条件下で処理したところ、これらの分解はほとんど同程度であり、MGPαのアノマー位水素はAOSによって引き抜かれないことが示唆された。これらの結果は、MGPβのアノマー位炭素-水素結合が、立体電子効果によって、水素引き抜き反応に対して比較的活性化されているという事実よって、合理的に説明される。酸素漂白過程において問題となる多糖類の分解は、主としてリグニン中のフェノール性部位と酸素との反応によって二次的に生成する活性酸素種(AOS)によって引き起こされる。本年度においては、多糖類のC-2位に注目してこの機構を検討するため、多糖類のモデル化合物メチルβ-D-グルコピラノシド(MGPβ)と、これとC-2位の立体配置が異なるメチルβ-D-マンノピラノシド(MMPβ)を合成して、フェノール性化合物2,4,6-トリメチルフェノール(TMPh)と共に酸素漂白条件下で処理した。その結果、MMPβの方がかなり速く分解され、C-2位の立体配置の相違が、TMPhと酸素との反応で生成するAOSとこれらのモデル化合物との反応に大きな影響を与えることが明らかになった。さらに、実際にC-2位がAOSによって攻撃されるかどうかを検討するため、MGPβとMGPβのC-2位が重水素化されたメチルβ-D-(2-^2H)グルコピラノシド(MGPβ-2D)を、TMPhと共に酸素漂白条件下で処理した。その結果、MGPβの方が速く分解され、明瞭な速度論的同位体効果が観測された。したがって、実際にTMPhと酸素との反応で生成するAOSによって、MGPβのC-2位水素が引き抜かれることが示唆された。一方、MGPβとMGPβ-2Dに対して、これらを攻撃するAOSがヒドロキシルラジカルの共役塩基であるオキシルアニオンラジカルに限定され得るアルカリ性過酸化水素で処理した結果、明瞭な速度論的同位体効果は観測されなかった。これらのことから、MGPβのC-2位水素を引き抜くのは、オキシルアニオンラジカル以外のTMPhと酸素との反応で生成するAOSであることが示唆された。酸素漂白過程において問題となる多糖類の分解は、主としてリグニン中のフェノール性部位と酸素との反応によって生成する活性酸素種(AOS)によって引き起こされる。このAOSの反応を機構的に解明するのが、本研究の目的である。

これまでに、多糖類のモデル化合物であるメチルβ-D-グルコピラノシド(MGP)と、MGPのアノマー位またはC-2位水素を重水素に置換した化合物を酸素漂白条件下でAOSと反応させ、AOSとMGPのアノマー位およびC-2位水素との反応性を調べた。その結果、酸素と反応してAOS生成源となるフェノール性化合物として2,4,6-トリメチルフェノール(TMPh)を使用した場合には速度論的同位体効果が観測され、AOSによってアノマー位およびC-2位水素が引き抜かれることが確認されたが、フェノール性化合物として4-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアルコール(Valc)を使用した場合にはこれが観測されず、これら二つの水素の引き抜きが確認されなかった。本年度は、AOSがMGPのどの水素と優先的に反応するのかについてより詳細に検討するため、MGPとMGPの炭素に結合する全ての水素を重水素に置換した化合物を酸素漂白条件下でAOSと反応させ、速度論的同位体効果の発現について詳しく調べた。その結果、フェノール性化合物としてTMPhとValcのどちらを使用し場合でも、速度論的同位体効果が観測され、これらから生成するAOSがMGPの水素を引き抜くことが確認された。この結果とこれまでに得られた結果から、TMPhとValcから生成するAOSは全く同じ組成ではなく、少なくともValcからは生成せずにTMPhからのみ生成する化学種が存在し、これがMGPのアノマー位とC-2位水素を引き抜くことが確認された。酸素漂白過程において問題となる多糖類の分解は、主としてリグニン中のフェノール性部位と酸素との反応によって生成する活性酸素種(AOS)によって引き起こされる。これらのAOSと、パルプ構成成分である多糖類とリグニンとの反応を機構的に解明することが、本研究の目的である。本年度は、糖モデル化合物としてセルロースのモデルであるメチルβ-D-グルコピラノシド(MGPβ)と、MGPのそれぞれアノマー位、C-2位、C-3位、および、C-4位エピマーであるメチルα-D-グルコピラノシド(MGPα)、メチルβ-D-マンノピラノシド(MMP)、メチルβ-D-アロピラノシド(MAP)、および、メチルβ-D-ガラクトピラノシド(MGaP)を用いて、これらとAOSとの反応におけるモデル化合物の立体配置相違の影響について、検討を行った。なお本研究では、フェノール性化合物である2,4,6-トリメチルフェノール(TMPh)と酸素の反応によって、AOSを系中でin situに発生させた。糖モデル化合物として1種類のみをTMPhと共に酸素漂白条件下で処理し、これらとAOSとの反応について検討したところ、MGPα、MGPβ、MGaP、MMP、そして、MAPの順に分解量が多くなった。特にMAPの分解は、他の化合物よりもかなり激しかった。この結果から、各炭素における立体配置の相違が、これら糖モデル化合物とAOSとの反応に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。MGPβと共にもう1種類計2種類の糖モデル化合物をTMPhと共に処理したところ、MMPの存在のみが共存するMGPβの分解を促進したが、これ以外の化合物の存在はMGPβの分解に大きく影響しなかった。MGPβ以外のモデル化合物から見ると、MGPβの存在はMMPの分解を促進し、MGaPの分解は抑制し、そして、MGPαとMAPの分解には影響しなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。
リセ ルイ・ル・グランの研究(フランス中等教育制度の一側面)

フランスのリセの一大典型であるリセルイ・ル・グランの19世紀初頭から20世紀第一・4半期までの実態について研究している。(研究)1学校管理面(1)理事会(2)校長職(3)副校長職については、すでに研究していた。平成2年度は、引き続き次の点について研究した。(4)会計係官の呼称、任用、前歴、俸給、職務権限、特性(5)学監長の呼称、任用、俸給、特性、評価研究の一端については、雑誌論文(松山大学論集第2巻第5号、1990年)で発表した。2人的組織面(1)教育職員の定数、種類、任用、待遇、職務、勤務条件、権威、専門的知識・技術、教歴(2)生徒生徒数、種類、年齢、出身階層、地理的分布、給費、クラス規模、規律、卒業後の進路、人材育成については、目下研究中。(研究実施方法)1設備・備品費フランス中等教育制度関係図書及び基本図書(52.3万円)簡易製本器(1点2.3万円)資料の整理のために使用中。2消粍品費キャノン・カ-トリッジ、資料のコピ-に使用中。カ-ド、ノ-ト、製木セット等文具類(15.4万円)資料の整理3旅費(東京と広島への調査・研究旅費(9.4万円)4謝金セルフサ-ヴィスで行なったため使用せず。5その他文通・郵送費(0.7万円)フランスのリセの一大典型であるリセルイ・ル・グランの19世紀初頭から20世紀第一・4半期までの実態について研究している。5その他文通・郵送費(0.7万円)
ラオスの農村における貧困削減戦略の探求

この調査の目的は、ラオスの農村地域の貧困から抜け出す手段を明らかにすることである。チャンパーサック県、サバナケット県、サイニャブリー県の525世帯から集めた調査データから、農地不足の悪化と非農業部門の開発遅延のまっただ中にあるラオスでは、タイへの越境移住が貧困から抜け出す重要な手段であることが判明した。越境する可能性が最も高いのは、女性、若者、教育水準が低い者である。この調査の政策的含意は、貧困層の最も重要な資産が労働力であるために人的資源(の健康面および教育面)に投資するべきということである。また、人的資源への投資をインフラと信用供与で補完する必要がある。本研究課題は、(1)研究対象であるラオスの農村部、サイニャブリー(Xaignabouli)県、サバナケット(Savannakhet)県、チャンパーサック(Champasak)県の3県6郡に点在する6カ村の家計所得及び相続調査、(2)子ども調査の2つの調査により構成されている。(1)の調査は、2009年度から2010年度にかけて実施し、すでに完了している。2010年度から2011年度にかけては、(2)の子ども調査の準備に着手し、アンケート案を作成し、現地語への翻訳、実験サンプルを使った予備テスト、などを行った。また、すでに実施した家計所得と相続調査に関するデータを整理し、分析に使えるようにデータセットを整えた。研究成果の公開としては、これまでの成果を、相続調査のデータを使った論文"Job Choice Across Three Generations in Rural Laos"としてまとめることができた。本論文は、開発研究の学会誌「Journal of Development Studies」へ投稿する準備ができている。2011年度から2012年度は、当初の予定では昨年度中に完了しているはずであったが、ラオスのほぼ全域を襲った深刻な洪水被害のために今年度に延期することとなった、(2)の子ども調査に実際にとりかかる予定である。平成23年度の主な活動は1.ラオス子ども調査の準備、2.調査の施行、3.家計・子ども調査のデータ分析である。準備のために質問表の作成、サンプルデザインの考案、ラオス政府の機関(NERI)にて調査員の訓練を行い、調査対象の村とその他の地方都市、大・小規模の都市において子ども達にインタビューを行った。最終的に調査結果・データを"Job Choice of Three Generations in Rural Laos"という論文にまとめた。調査準備として年齢、学校、相続による農地、15才以上の職業選択の経歴を調べるために質問票を作成した。NERIの協力者(Mr. SaygnasakSeng-Arloun)と他のNERIのスタッフは子どもを無作為に抽出したが、他の地域に移住した子ども達の追跡を試みたので、無作為抽出法は現在調査対象地に住んでいる子ども達のみに適用された。結果的に全229名の子ども達(173名は調査対象の村、28名は他の村々、14名は他の地区、2名は他の県、そして12名はVientianeの主要都市)に調査を行うことができた。調査を基に主な仮説としてラオスの田舎に住んでいる人々にとって、貧困を脱出するには移住は効果的な戦略である、ということが見出された。調査結果を反映した学術論文“Job Choice of Three Generations in Rural Laos"において、ラオスの田舎における女性・男性の職業選択がどのように家計の収入源に変化をもたらすかということと、農業と非農業の労働に対する利益の変化を探求することを目指している。主な結果として女性・若者そして教育レベルの低い者たちは、ラオスの田舎においては職業不足が進んでいるため、タイに移住する可能性がとても高いと言える。今年度はラオス農村地域の貧困家計の世帯調査をおこなった。世帯調査での最初の大きな発見は、タイへの移住が、(1)海に面していない国土への高い人口圧力のために縮小する農地規模、(2)非農業部門の開発の遅れ、および(3)農業の近代化の遅れ、という3つの好ましくない状況にあるラオス農村地域の世帯にとって、貧困から抜け出す重要な手段であるということだった。2番目の大きな発見は、親たちはかつてのように男子だけを優先せず、男女の区別なく子どもたちに比較的平等に教育を受けさせている点である。つまり、女子も労働人口に数えられるようになれば、まともな、より良い職に就くことができるということである。貧困層の主要な資産は労働力であることから、今回の調査では、労働生産性および収入の増加をもたらす人的資源の健康面および教育面への投資の重要性が明らかになった。農村地域の住民に仕事をもたらすのは物理的インフラと金融インフラであることから、電気、水道および道路などのインフラのほか、信用も無視することはできない。25年度が最終年度であるため、記入しない。来年は予定されている家計・子ども調査によるデータ分析を行う。

この分析のために、子ども達の収入をより念入りに精査し、下記のように地域別にグループ分けをしてグループ間の収入を比較する。(1)調査対象の村々、(2)その他の村々、(3)その他の地域、(4)その他の件、(5)Vientianeさらに移住した子ども達の収入源の違いを探求し、調査対象の村に帰った両親の収入源と比較することを計画している。このようにして貧しい家庭に生まれた子ども達が貧困から抜けれる可能性を高めることができるかどうか、追求することが可能になるだろう。25年度が最終年度であるため、記入しない。
縦断的調査による場面緘黙の実態解明と効果的な介入手法の確立

本研究は「場面緘黙」を対象とした大規模な実証的研究である。場面緘黙は話す力があるにも関わらず学校等で話せなくなってしまう状態である。適切な治療によって症状の改善が可能であるが、学校や医療現場において認知度が低く適切な対応が得られていないケースが多い。本研究では、縦断的調査によって場面緘黙の実態を解明し効果的な介入手法を確立することを目的とする。幼児期から中学生までの場面緘黙児200名を対象に、心理検査及び半構造化面接によって不安症や発達障害の併存、学校への適応状態、発症要因等を評価する。また5年間の縦断研究により心理療法等の介入の効果を比較することで、より効果的な介入方法を明らかにする。
脳腫瘍発生過程における悪性化進展及び不均一性獲得機序の解明

本研究は、膠芽腫のマウスモデルやそれらマウスから樹立した脳腫瘍細胞株を用いて、脳腫瘍・脳腫瘍細胞株のそれぞれのサブタイプの分子背景及びサブタイプを規定する因子を明らかにし、また、脳腫瘍形成におけるそれら因子の役割を明らかにすることを目的とする。本研究成果は、膠芽腫のサブタイプを規定する因子を標的とした新たな治療戦略の開発に貢献が期待される。これまでの形態学的な解析によりMADMマウスの脳腫瘍及び腫瘍幹細胞には少なくとも2種類以上のサブタイプが存在し、更にアレイデータの主成分解析の結果、形態学的な解析と同様に腫瘍細胞株は2つのクラスターに分類されることが分かっている。平成30年度には、これらサブタイプに特異的な治療法の開発を目的として、既存薬ライブラリーを用いた細胞増殖アッセイによるドラッグスクリーニングを行った。上皮成長因子受容体(EGFR)の発現上昇を認めるタイプの腫瘍幹細胞では、EGFRによる細胞増殖シグナルに依存しているため、そのシグナル伝達を抑制する薬剤が有用であり、また、血小板由来成長因子受容体(PDGFRα)の発現上昇を認めるタイプの腫瘍幹細胞では、calcitriolによる増殖抑制が顕著であることが分かった。今後は、それぞれの腫瘍幹細胞と候補薬剤を用いて、コントロール群と薬剤投与群で薬剤投与による遺伝子発現の変化をRNA-seq法で解析し、それぞれの薬剤の正確な作用機序を解明し、腫瘍抑制を誘導するメカニズムや新たな治療薬として有用か評価を行う。これまでの形態学的な解析により、本研究で用いる膠芽腫の自然発生マウスモデルの腫瘍及びそれらから樹立した細胞株には少なくとも2種類以上のサブタイプが存在するのを確認している。平成29年度には、樹立した全ての腫瘍細胞株を用いてマイクロアレイ解析を行い、それぞれの細胞株の遺伝子発現解析を行なった。アレイデータの主成分解析の結果、形態学的な解析と同様に、腫瘍細胞株は2つのクラスターに分類されることが分かった。それぞれのサブタイプで発現している特徴的な遺伝子発現プロファイルを同定したため、それら遺伝子群や細胞表面マーカーの違いを元にサブタイプを規定する因子の同定を進めている。また、主成分解析の結果を元にそれぞれのサブタイプの代表的な腫瘍細胞株を抽出し、既存薬ライブラリーを用いて薬剤スクリーニングを行なった。その結果、既存薬の中でサブタイプ毎にそれぞれ腫瘍抑制効果を有する薬剤の候補を数種類同定した。候補薬剤が腫瘍抑制を誘導するメカニズムや新たな治療薬として有用か評価を行う。当初の予定通り、病理学的解析や遺伝子発現解析により、腫瘍サブタイプの同定を進め2つの腫瘍サブタイプを同定した。ただし、脳切片培養法を用いて腫瘍サブタイプ毎の細胞動態や腫瘍の増大をリアルタイムで観察し、サブタイプ毎の浸潤性の違いや腫瘍形成能の違いを評価を行う実験は、サブタイプの同定に時間を要したため実施できていない。また、次年度に予定していた既存薬ライブラリーを用いたサブタイプ毎に治療効果を有する薬剤を同定する一次スクリーニングはすでに終了し、既存薬の中でサブタイプ毎にそれぞれ腫瘍抑制効果を有する薬剤の候補を数種類同定した。2つの腫瘍サブタイプをそれぞれマウスの脳へ移植を行なった後、脳切片培養法を用いて腫瘍サブタイプ毎の細胞動態や腫瘍増大を観察し、浸潤性の違いや腫瘍形成能の違いを評価し、サブタイプ毎の腫瘍特性を明らかにする。既存薬ライブラリーの一次スクリーニングで同定したサブタイプ毎に有用な既存薬はすでに数種類同定した。それら薬剤がサブタイプ毎に腫瘍抑制を誘導するメカニズムや、新たな治療薬として有用かを当初の予定通りin vitro, in vivoの実験系で評価を行う。
ニュートリノ質量測定のための、水素ガスからの二光子対超放射の制御方法開発

原子を用いたニュートリノ質量測定を目指し、原理実証の一つである、外部トリガによって誘導されたコヒーレントな二光子放出を観測した。実験では78Kに冷却した60kPaのパラ水素ガスに532nm, 684nm, 4587nmの3色のパルスレーザーを入射し、二光子放出の信号である5048nmを観測する方法を用いた。検出信号強度は自然放出に比べ10の18乗以上の増幅を示した。レーザーパワー依存性や時間依存性などを検証し、数値計算による定性的な理解が得られた。本課題ではマクロコヒーレント増幅機構の研究にパラ水素ガス・コヒーレンス生成用532 nmレーザー及び684 nmレーザー(以下ドライビングレーザー)・トリガー用中赤外パルスレーザー(以下、トリガレーザー)を用いる。このうちパラ水素ガス・ドライビングレーザーは既存設備を使用するため、トリガレーザーを開発すれば研究が可能となる。今年度は二光子対超放射を誘導するためのトリガレーザーの開発を行った。当初の実験セットアップでは、トリガレーザーのポンプ光源に、ドライビングレーザーと同じNd:YAGレーザーを使用し、非線形光学結晶を用いてPPLN+LBO+PPLNの3段階の波長変換を行い、そのシード光に865nm及び1068nmの自作外部共振器型CWレーザーを用いた。約20uJの中赤外光の発生に成功したが、一方で安定性に問題があることが分かり、より安定性を高めるための改良を行った。新しいセットアップではトリガレーザーのポンプ光源に、他と独立のNd:YAGレーザーを用意し、非線形光学結晶をPPLN+LBO+KTAの組に交換、シード光には864nmの自作外部共振器型CWレーザーを用いた。前回のセットアップでの不安定性の主要因は開口部が0.5×0.5mmしかないPPLNを2つ使用していたことであったため、開口部4×4mmのバルクのKTAを用いることにより安定性の改善を見込んだ。またPPLNは波長変換効率が高過ぎ、ポンプ光をあまり導入できないという問題もあったため、バルクのKTAで強いポンプ光を入れられるようにすることで高出力化も見込んだ。結果、トリガレーザー出力50uJを超え、一週間以上にわたり調整不要の安定なトリガレーザーの開発に成功した。今年度はさらにトリガレーザーを用いた実験を開始した。二光子対超放射の誘導に成功し、プレリミナリな結果を日本物理学会にて口頭発表を行った。昨年度に制作した中赤外トリガレーザーに改良を加え、出力を50uJから400uJまで増加することに成功した。それによって、二光子対超放射も1桁強い出力が得られ、より高感度の測定が可能となった。二光子対超放射は自然放出に比べ10の18乗以上の増幅に成功した。定量的な測定では、主に出力のトリガレーザーパワー依存性、トリガの遅延時間依存性を評価した。トリガレーザーパワー依存性は、ほぼ線形な依存性を確認、遅延時間依存性では励起レーザーに対して約2nsほど遅れて最大値を取ることが確認された。どちらも適当なパラメータを用いた数値計算で定性的に再現可能であり、巨視的コヒーレンスによる増幅(マクロコヒーレント増幅機構)と矛盾しない結果が得られた。これらの結果は査読付オープンアクセス誌であるProgress of Theoretical and Experimental Physics誌に掲載し、国際学会(Topics in Astroparticle and Underground Physics 2015 )にて口頭発表を行った。申請時の研究計画では、今年度トリガレーザーの開発を行うことを目標としていたため、計画通りに進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。素粒子・原子核・宇宙線・宇宙物理トリガレーザーの開発が完了したため、これからは実際にパラ水素ガスを用いて二光子対超放射の定量評価を行っていく。実験データを理解し、将来のニュートリノ質量分光につなげるためには数値シミュレーションとの比較が重要である。Maxwell-Bloch方程式を用いた数値シミュレーションを行う予定である。
DNAメチル化の網羅的解析による潰瘍性大腸炎術後回腸嚢炎発症の機序解明

潰瘍性大腸炎患者に対する大腸全摘・J型回腸嚢肛門吻合術後の回腸嚢炎発症について、手術時回腸粘膜中のInterferon gamma高発現、FK506 binding protein高発現が術後回腸嚢炎発症の予測マーカーとなりえることを示した。DNAメチル化の解析に関しては、回腸嚢炎発症リスク探索のみならず潰瘍性大腸炎の慢性炎症、発癌リスクの研究に範囲を拡大し、とくに直腸粘膜の複数のmicroRNAの高メチル化が潰瘍性大腸炎関連癌の発症リスクを同定しうる可能性を報告した。潰瘍性大腸炎(Ulcerative colitis: UC)の治療においては有効な内科治療が奏功せず手術に至る症例が2-4割存在する。UCに対する標準外科治療は大腸全摘、回腸嚢肛門(管)吻合(以下IPAA)であるが、術後合併症の代表として回腸嚢炎があげられる。回腸嚢炎は手術症例の15-50%に生じ、術後QOLを大きく損なうためUC外科治療において解決すべき問題となっている。その成因、発症機序については不明な点が多く標準的治療も確立されていない。そこで我々は術後回腸嚢炎発症に関与するDNA methylationを網羅的に解析することで、回腸嚢炎発症のリスク因子、治療経過と関連する因子を同定することを目的とした。初年度の計画として回腸嚢炎のratモデルを作成し回腸嚢炎発症に関与するCpGislandmethylationおよびtarget遺伝子(mRNA)の同定を目標とした。Ratモデルの制作着手にしたが手術手技ならびに手術後の生存が困難であったため並行して他の実験を行うこととした。当科には潰瘍性大腸炎手術症例の、大腸全摘時の標本から採取した回腸末端粘膜が保管されており、クリニカルサンプルを用いた関連mRNAの同定も併せて行うこととした。大腸全摘時回腸粘膜よりtotal RNAを抽出しcDNA化、ライブラリを作成した。試験的にproinflammatory cytokinesを測定しこれらのmRNA発現と周術期因子および回腸嚢発症との関連について検討した。その結果術後回腸嚢炎を発症した患者群で非発症群より有意にIL-1βが高値でありIL-1β高値群は術後回腸嚢炎の累積発症率が高い傾向がみられた。来年度はさらに新たなtargetの検索、mRNA解析、メチル化解析を含め、鋭意、実験を計画的に進め、国内外の学会や論文等で精力的に発表を行う予定である。Shebaniら(Inflamm Bowel Dis. 2002:)はDextran sulfatesodiumを用いた回腸嚢炎ラットモデルを、Banasiewicz Tら(Med Sci Monit. 2012)肛門狭窄を人工的に作成することにより惹起された、回腸嚢炎状態を誘導している。実験的にラットモデルの制作に着手したが、大腸全摘、回腸嚢肛門吻合後の生存が非常に困難であり、安定したモデルの確立に至らなかった。そのため動物実験を中心とした実験系より計画変更となった。一方でクリニカルサンプルを用いた実験は、抽出したRNAはその後の実験に耐えうるqualityを有しておりおおむね順調に経過しているものと考える。H28年度は保存されている回腸嚢粘膜のfrozen sampleからのDNA,RNA抽出を行い、これを用いたDNA methylation statusの測定に移行した。数十例よりDNA抽出を行ったが、今後複数回の再現性検証に耐えうる質、量を有する検体は十例ほどであった。さらにパラフィン包埋された回腸末端標本を用いてもDNA抽出は困難であった。昨年度に患者回腸粘膜由来total RNAよりproinflammatory cytokinesのmRNA発現と周術期因子および回腸嚢発症との関連について検討したところIL-1βが回腸嚢炎発症と有意に相関する可能性が示唆された。mRNAの解析から、H28年度はTh1,2,17にかかわるcytokineを解析し、これらcytokineが回腸嚢炎発症に寄与することを明らかとした。上記のごとく実験に耐えうる質、量を備えたDNA抽出に時間を費やした。

UCに対する標準外科治療は大腸全摘、回腸嚢肛門(管)吻合(以下IPAA)であるが、術後合併症の代表として回腸嚢炎があげられる。回腸嚢炎は手術症例の15-50%に生じ、術後QOLを大きく損なうためUC外科治療において解決すべき問題となっている。その成因、発症機序については不明な点が多く標準的治療も確立されていない。そこで我々は術後回腸嚢炎発症に関与するDNA methylationを網羅的に解析することで、回腸嚢炎発症のリスク因子、治療経過と関連する因子を同定することを目的とした。H28年度は回腸嚢炎発症にかかわる複数の候補mRNAを同定した。Frozen sampleからはある程度のtotal RNAが抽出可能であったため、H29年度はmiRNAの検討を行うこととした。回腸嚢炎発症群と回腸嚢炎非発症群より背景が類似した症例をそれぞれ4例抽出した。これらの大腸全摘時に採取した回腸粘膜よりtotal RNAを抽出しmiRNAarrayを行った(受託解析)。結果、回腸嚢炎発症群で、非発症群に比し有意差をもって上昇するmiRNA 4種が同定された。またDNAメチル化解析に関しては、回腸嚢発症リスクのみならず潰瘍性大腸炎の慢性炎症、さらには発癌リスクに至るまで研究範囲を進めており、DNAメチル化解析を行うと潰瘍性大腸炎の全大腸において回腸末端から直腸に向かうにつれ、いくつかのmiRNAのメチル化は高頻度におこり、特に直腸粘膜の高メチル化が、罹病期間と相関するほか、潰瘍性大腸炎関連癌発症リスクを同定しうる可能性を報告した。潰瘍性大腸炎患者に対する大腸全摘・J型回腸嚢肛門吻合術後の回腸嚢炎発症について、手術時回腸粘膜中のInterferon gamma高発現、FK506 binding protein高発現が術後回腸嚢炎発症の予測マーカーとなりえることを示した。DNAメチル化の解析に関しては、回腸嚢炎発症リスク探索のみならず潰瘍性大腸炎の慢性炎症、発癌リスクの研究に範囲を拡大し、とくに直腸粘膜の複数のmicroRNAの高メチル化が潰瘍性大腸炎関連癌の発症リスクを同定しうる可能性を報告した。当初の予定では、回腸嚢炎ラットモデルを用いた、treatment naive modelからの回腸嚢炎発症の病態機序解明を目指したが、動物モデルの作成が困難であり今後はクリニカルサンプルを用いた実験に移行する方針である。具体的には保存されている大腸全摘時回腸末端粘膜を用いてDNAを抽出し、これよりDNAmethylation array、pyrosequencerによるDNAmethylation statusの評価に移る予定である。保存されている回腸粘膜の例数は限定されており、いずれも少量のサンプルであることから、解析困難であることも予想される。その際は、病理評価用にパラフィン包埋された回腸末端のブロックを薄切し、回腸粘膜をマイクロダイセクションすることでサンプル採取し、DNA抽出することで代用することとする。DNA抽出に難渋した一方でRNAを用いた実験系は比較的順調に推移し、回腸嚢炎発症にかかわる複数の候補mRNAを同定した。
界面近傍における特異現象解明のための近赤外エバネッセント波を利用したアプローチ

原子間力顕微鏡(AFM)を用いたこれまでの検討により、有機溶媒中における親水性表面間には、特異的に大きな引力が作用することを発見している。この引力はファンデルワールス力の推算値よりも大きく長距離性であり、水中では現れないが、その出現確率や大きさは条件によりまちまちである。これらの結果に対しては、水などの不純物の吸着や架橋による引力、表面における局所的な相分離、DLVO理論におけるヘテロ相互作用など種々の要因が推測された。本研究は、このメカニズムの解明を行うことを最終目標とし、そのために分光学的手法による観点からのアプローチを試みたものである。前年の検討の結果から、特異的引力は、静電気による影像力であると推定されたが、その帯電メカニズムは不明である。本年は、溶液中や表面に吸着した水分などの不純物と帯電の関係を明らかにすることを試みた。赤外・近赤外分光分析装置を用いた検討では、わずかなコンタミの影響が無視できず、分光分析の光路や試料部の真空化などを試みたが、表面における水分子の凝縮を実証することはできなかった。現時点では吸着水分子の分布状況をnmオーダで微細にマッピングすることは困難である。結果として表面間の接触点近傍において生じる水の毛管凝縮はたかだかnmオーダであることが示唆された。また水以外の不純物の影響を検討した。HLB値の高いすなわち親水性の界面活性剤を添加した場合、長距離引力が出現した。現段階では検討中であるが、ミセル同士またはミセル-表面間の摩擦帯電や接触帯電について検討するいつ用があると考えられる。本年度は、第一段階として、まず従来から使用してきた原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、表面微細構造が表面間力に大きな影響を及ぼしていると考えられるがメカニズムが未解明である系として、シクロヘキサン中における雲母平板間相互作用力について検討を行った。シクロヘキサン中においては、時として、ファンデルワールス力では説明できない、超長距離引力が働くことを発見した。これは検討の結果、時間とともに減衰すること、静電気による影像力が深く関わっていることが明らかになった。またこの長距離引力は溶液中や表面に吸着した水分などの不純物により強く影響を受けることがわかった。この静電気電荷の発生は表面の状態や溶液条件に強く影響を受けることが予想される。これらの表面状態の評価の一つとして通常用いられるのが分光分析である。AFMと類似の機構を持つ走査型近接場光顕微鏡(SNOM)などを用いると、in-situ微細分光分析を行うことができる可能性がある。ただしソースが非常に弱くなりS/Nが悪くなるという弱点が予想されるため、まず通常のFTIRでどこまで感度があるのかを検討した。その結果、赤外及び近赤外のいずれの領域においても、わずかなコンタミの影響が無視できず、分光分析の光路や試料室を真空化するとか、高純度な光ファイバーを用いるなどの工夫が必要であることが明らかになった。そのため、微細分光分析への応用は来年度、装置の改良を行う予定である。
リアルタイムグラメトリシステムの開発と8GeV放射光心筋微小血管造影への応用

本年度は計測上の問題点の改善を中心に研究を進めた。前年度進めていた心筋表面の位置情報収集方法の改良と共に、心拍拍動に伴う撮影対象のブレの補正、心筋位置制御システムとリアルタイムグラメトリシステムとの統合を試みた。心筋表面のマーカーを外部CCDビデオカメラ(1/4型CCD素子、155万画素)にて撮像し、これを対象画像の位置情報とした。具体的にはラット摘出心拍動モデルを用い、心筋微小血管の造影する際の撮影対象の血管のサイズを、およそ十数十数ミクロンオーダに想定して実験を行った。外部カメラによる撮影時の光学的な拡大の程度は、ラットの心臓(縦およそ15mm、横およそ10mm)がほぼ14インチモニタ上にほぼ一杯に収まる程度まで拡大して行った。撮影対象に任意の大きさのROIを設け、ROI上の任意のマーカーをもとに、注目点(対象血管)をトラッキングすることを実施し、貫通枝血管が最も認識しやすいように、View Pointの制御等の付加を検討した。しかし、1分間に250300回の拍動を繰り返すラット摘出拍動心から得られる画像が対象であること、生理的状態の維持のため物理的な動きの抑制は廃除も同時に考慮することなど、一律なシステムの構築には至らなかった。総括としては、撮像系の改善により心臓表面の血管から、幾つかのサンプルにおいて心筋表面から内部に心臓表面貫通する貫通枝血管の観察像の取得に成功した。しかし、その拍動特性を解析するには画像のブレの排除、解像度の改善が不可欠であり、今後更に検討・改良を行う必要があることが窺われた。本年度の研究実績の概要を以下に示す。・心筋表面の位置情報収集方法の確立心筋表面に直径15μm可視光マーカーを塗布、または埋込み、外部CCDビデオカメラ(1/4型CCD素子、155万画素)にて撮像し、位置情報収集の基礎データを集めた。具体的には心筋に表面に塗布する密度や、埋込む深さの条件を変えながら行なった。なお、実験にはラット摘出心拍動モデルを用いた。また、心筋微小血管の造影する際の撮影対象の血管のサイズを、およそ十数十数ミクロンオーダに想定した。外部カメラによる撮影時の光学的な拡大の程度は、ラットの心臓(縦およそ15mm、横およそ10mm)がほぼ14インチモニタ上にほぼ一杯に収まる程度まで拡大した。上記のような撮影条件で外部カメラによる位置情報収集の基礎データを収集したが、心拍拍動に伴う撮影対象のブレが予想以上に大きく、マーカーのトラッキングには何らかの工夫を施す必要性があることが分かった。トラッキング用に撮影した画像上では、心筋表面に塗布マーカーは数十数百μm程度のクラスター状に観察できる。この拡大倍率のマーカーの大きさは、血管造影する際の撮影対象の血管のサイズ、およそ十数十数ミクロンオーダと対応させて考えると十分ではないが、倍率を上げることは容易で、これで十分対応可能であると思われた。当初、撮影対象に任意の大きさのROIを設け、ROI上の任意のマーカーをもとに、注目点(対象血管)をリアルタイムにトラッキングすることを検討していた。しかし、ラットの心拍動はおよそ300回/分であり、これに伴う心臓表面のマーカーの動きを標準的なビデオフレームレート(30枚/秒)で捉えると、状況によってはトラッキングに用いるには十分でない画像クオリティーとなった。特に、今後更に高倍率でトラッキング用の画像を撮影する必要あり、考慮すべき問題点は多い。次年度は、これらの問題点を解決しながらカーボンメッシュを利用してトラッキングを行なうこと、位置制御システムの改良によるトラッキング精度の向上、三次元座標情報の収集手法の確立へと継げて行く計面である。次いで、心臓表面の血管から、心筋表面から内部に心臓表面貰通する貫通枝血管の造影に応用可能なリアルタイムグラメトリシステムへと発展させて行く計画である。
角膜実質再生を目指した骨髄線維芽細胞移植のバイオイメージング解析

菲薄化した角膜実質は角膜穿孔を招き、失明の危険がある。我々が考案した骨髄線維芽細胞の角膜実質内注入はケラトサイトを示すケラトカンの発現を得ることができ、角膜移植に代わる治療法として期待されている。バイオイメージングで検討を加えるためには、490nm, 560nmのレーザー以外で励起し、観察が可能な、Cre reporter mouseの作成を不可欠である。そこで、Cre発現細胞を青色蛍光、発現していない細胞を深赤色蛍光で識別できる【ROSA26(mR/mB)】マウスを遺伝子相同組換えにより作製するために、ROSA26の5'-7kbと3'-3kbの相同組換えアームとCAG promoterをもつROSA26 (CAG-mcs1-loxP- pgkNeo-loxP-mcs2)のmcs1にiRFP670遺伝子を挿入、mcs2にはTagBFP遺伝子を挿入し、ROSA26 (CAG-loxP-miRFP670-pgkNeo-loxP-mTagBFP)を作製した。ターゲティングベクターをB6由来のES細胞(HK3i)へ導入を行い、サザンブロットで14クローンで相同組み換えを確認した。そのうち4クローンを8細胞期のICRマウス胚に注入し、キメラマウスを作製した。キメラマウスをC57BL/6Nメスと交配して、F1マウスを作成しgenotypingを行った。キメラマウス2系統(#9と#14)においてF1マウスで相同組換遺伝子が確認された。Keratocan-IRES2-nls-Cre【KINC】と交配して、ケラトサイトでmTagBFP、それ以外の細胞でmiRFP670の発現が確認できた。現在、ケラトサイトに分化した細胞で増殖シグナルが同時に観察可能なKINC /ROSA26(mR/mB)/ FUCCIマウスを作成中である。2系統(#9と#14)ともKeratocan-IRES2-nls-Creとの交配で角膜実質細胞(ケラトサイト)に分化したときに、iRFP670の発現がTagBFPに変化することが確認できた。我々が考案した骨髄線維芽細胞の角膜実質内注入はケラトサイトマーカーであるケラトカンの発現を得ることができ、角膜移植に代わる治療法として期待されている。挿入した遺伝子の塩基配列はGenetic Analyzerで間違いがないことを確認した。ターゲティングベクターをB6由来のES細胞(HK3i)へ導入を行い、48クローンのコロニーをPCRでスクリーニングをして、24クローンの相同組み換えES細胞を得た。5'-7kbアームおよび3'-3kbアームの外側にプローブを作製し、ネオマイシン耐性遺伝子を加えた3カ所のプローブでサザンブロットを行い14クローンで相同組み換えを確認した。キメラマウスをC57BL/6Nメスと交配して、F1マウスを作成し、genotypingを行った。結果、キメラマウス2系統(9と14)においてF1マウスで相同組換遺伝子が確認され、現在はん殖中である。研究に不可欠な遺伝子組み換えマウス2系統において相同組換遺伝子が確認され、今後の研究の展開が可能になった。

ターゲティングベクターをB6由来のES細胞(HK3i)へ導入を行い、サザンブロットで14クローンで相同組み換えを確認した。そのうち4クローンを8細胞期のICRマウス胚に注入し、キメラマウスを作製した。キメラマウスをC57BL/6Nメスと交配して、F1マウスを作成しgenotypingを行った。キメラマウス2系統(#9と#14)においてF1マウスで相同組換遺伝子が確認された。Keratocan-IRES2-nls-Cre【KINC】と交配して、ケラトサイトでmTagBFP、それ以外の細胞でmiRFP670の発現が確認できた。現在、ケラトサイトに分化した細胞で増殖シグナルが同時に観察可能なKINC /ROSA26(mR/mB)/ FUCCIマウスを作成中である。2系統(#9と#14)ともKeratocan-IRES2-nls-Creとの交配で角膜実質細胞(ケラトサイト)に分化したときに、iRFP670の発現がTagBFPに変化することが確認できた。ROSA26(mR/mB)ホモのオスをES cellの相同遺伝子組換で使用したプローブを用いたサザンブロットで確認し、ライフサイエンス技術基盤研究センターで凍結胚保存する。(他施設へマウス供与)遺伝子組み換えマウスの作成に伴う費用や動物の運搬に必要な費用として必要である。ケラトサイトの3次元構築を色ごとに解析するソフトの作成を依頼しているが、作成に時間を要しているため、次年度への持越しとなった。マウスの作成は1度目のES細胞注入では、キメラからF1マウスを得ることができず、2度目のES細胞注入でF1マウスを得ることができたが、理化学研究所との取り決めでhomozygousの&#32363;殖可能な雄を凍結胚保存のために、供与するための費用が次年度への持越しとなった。それ以外の研究については、当初の予定通りに進行しており、問題はないと考えている。