hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先進磁気センサを用いた複雑形状き裂の非破壊評価・解析システムの構築

複雑形状き裂、欠陥の定量的な評価を行うために、フラックスゲートセンサのような先進磁気センサを用いて、様々な欠陥近傍の漏洩磁束密度分布の測定を行った。また、得られた漏洩磁束密度分布と欠陥に生じる磁荷、磁気双極子モーメントとの関係を定式化し、漏洩磁束密度分布から複雑形状欠陥の欠陥幅や欠陥断面形状を求める電磁逆解析を行った。さらに、先進磁気せんさを用いた漏洩磁束密度測定と電磁逆解析とを統合することにより、複雑形状き裂、欠陥に適用可能な非破壊評価・解析システムを構築した。近年開発された優れた感度を有する先進磁気センサを用いた非破壊評価システムを構築し、複雑き裂の定量的評価を行うため以下の実験に着手した。1先進磁気センサを用いた非破壊評価システムの整備・貫通き裂、欠陥材の試験の実施先進磁気センサのなかでも特に優れた感度を有し、測定範囲も広いフラックスゲートセンサ(FGセンサ)を用いて、漏洩磁束法(MFL法)に基づく非破壊評価システムの整備に着手した。鋼材の2次元貫通き裂を対象に、欠陥幅やリフトオフ(試料-センサ間距離)と漏洩磁束密度との関係を取得した。また、環境磁気ノイズの影響等先進磁気センサを用いた非破壊評価試験に関する基本的な特性評価を行い、次年度以後のシステム改良指針をまとめた。2き裂形状再構成手法の開発き裂近傍で測定される漏洩磁束密度を、磁化後のき裂を磁気双極子に置き換えることにより、コンボリューション型の積分方程式で定式化した。また、本積分方程式にフーリエ変換、デコンボリューション、逆フーリエ変換を行うことにより、磁化分布から漏洩磁束密度を求める順解析、および漏洩磁束密度から磁化分布やき裂長さを求める逆解析プログラムを作成した。加えて、特異値分解法を用いた逆解析プログラム開発にも取り組み、十分微小な特異値を消去し対角マトリクスのランク数を減少させる逆解析プログラムを作成した。本プログラムではき裂深さの推定も可能であることを示した。これらの解析プログラムの有効性に関して、実験で得られた測定データを用いた検討にも着手した。近年開発された優れた感度を有する先進磁気センサを用いた非破壊評価システムを構築し、複雑形状き裂の定量的評価を行うため以下の実験を継続した。(1)先進磁気センサを用いた非破壊評価装置の整備の継続平成20年度に引き続き、先進磁気センサであるFGセンサを用いた非破壊評価システムの整備・開発を継続した。SS400材を用いて貫通欠陥、非貫通欠陥等様々な欠陥の漏洩磁束密度測定を行い、それらのデータを取得・集積した。また、周辺磁気ノイズを低減するためのプローブの多連化について検討を進めた。(2)き裂形状再構成手法の高度化平成20年度に引き続き、順・逆解析プログラムを高度化し、非貫通き裂等の複雑形状き裂へ拡張した。漏洩磁束密度と欠陥に生じる磁荷との関係を複雑形状欠陥についてもコンボリューション型の積分方程式に定式化した。また、逆解析に関しても、従来のフーリエ変換、逆フーリエ変換を用いる方法に加え、特異値分解法、Tikhonovの方法についても実施した。さらに、測定点数、リフトオフ等の測定条件、および実際の測定において漏洩磁束密度データに含まれるノイズ等の逆解析に及ぼす影響を調べるために、それらを種々変化させた場合の解析を行った。(3)解析結果と実験結果との統合の着手FGセンサにより測定した漏洩磁束密度を用いて、開発したき裂形状再構成のための順・逆解析プログラムにより欠陥形状再構成を行い、開発したプログラムにより十分に欠陥寸法や形状が同定できる可能性を有することを示した。先進磁気センサであるFGセンサを用いた非破壊評価システムを整備するとともに、本システムを用いた様々な欠陥近傍の漏洩磁束密度の計測およびその計測データの解析プログラムの開発を継続した。(1)先進磁気センサを用いた非破壊評価装置の整備の継続・従来の非破壊評価システムとレーザー変位計とを組み合わせることにより、先進磁気センサによる計測が試験片上で自動的に開始できるように改良した。また、複数のセンサを用いてセンサ間の干渉を検討した結果、センサ間距離が10mm以上互いに離れていれば干渉は生じないことを確認した。・複雑形状の欠陥評価として、平面板上の表面欠陥のみならず、円柱状の表面欠陥、さらにはねじ状の表面欠陥についての漏洩磁束密度をFGセンサを用いて計測し、試験片形状および欠陥形状と漏洩磁束密度の違いを明らかにした。(2)解析結果と実験結果との統合平成21年度に引き続き、順・逆解析プログラムを高度化し、非貫通複雑形状解析き裂へ拡張した。これまで実施してきたフーリエ変換、逆フーリエ変換を用いる方法、特異値分解法、Tikhonovの方法について高度化を進めた。特に、実験結果と対応することができるよう、円筒状の欠陥等平板以外の場合に関しても逆解析を実施できるように解析プログラムを拡張した。(3)解析結果と実験結果との統合の着手

(1)で計測した様々な複雑形状欠陥の漏洩磁束密度をもとに、(2)の解析を行い、高感度磁気センサによる計測、およびその漏洩磁束密度データを用いた逆解析の結果を統合し、非破壊評価システムを構築した。本システムを用いることにより、平板上の表面欠陥のみならず円筒状の表面欠陥等の様々な形状の複雑形状欠陥の評価まで可能であることを示した。
モデル法による担持白金系超微粒子の界面構造と電極触媒特性の解明

1.塩触媒を用いる均一なサイズの白金超微粒子の調製及びモデル触媒電極化任意の平均粒子サイズを有する白金モデル触媒電極を容易に作製する手法を確立するために、塩を触媒に用いるという新しい触媒概念に基づいて、直径が1-30nmの白金コロイドの調製に成功した。ただし、白金超微粒子の凝集抑制に用いたPVPの完全除去には、水素流通下400°Cでの熱分解除去操作が必要であった。種々の平均粒子サイズを有するPt/GCモデル触媒を作製し、過塩素酸水溶液中でのメタノールの酸化の比活性は、定電位分極下での定常電流密度は白金粒子サイズが小さいほど低く、吸着COの酸化は、白金粒子サイズが小さいほど過電圧が大きいことを見出した。3.Pt/CB及びPt-Ru/CB電極のメタノール酸化特性:モデル法との比較塩素を含まず比較的低温で熱分解するPt(NO_3)_2(NH_3)_2錯体とカーボンブラック粉末(CBと略記)からPt/CB粉末を調製し、これを電極化した。メタノール酸化の比活性は、白金粒子サイズが小さいほど定常電流密度が低い値を示し、吸着COの酸化挙動もモデル触媒の場合と同様の傾向を示した。つづいてPt(NO_3)_2(NH_3)_2錯体と種々のルテニウム錯体からPt-Ru/CB触媒粉末を調製した。固溶化にはRu(NO_3)_3が有利であるが、微量のCOを含む水素、メタノール及び吸着COの各酸化には、Ru_3(CO)_<12>を用いたPt-Ru/CB電極が高い活性を示すことを見出した。また、最高活性を示した組成のPt_<50>-Ru_<50>/CB触媒のメタノールの酸化活性は、粒子サイズが大きいほど比活性が高いことが判明し、COの酸化もそれを支持する結果を得た。
スフィンゴ脂質、特にSPCの創傷治癒促進機序の解析

sphingosylphoshorylcholine(以下SPCと略す)はスフィンゴ脂質の一つで、生理的には生体内には存在しないが、1)線維芽細胞の増殖を促進させること、2)動物も出るの創傷治癒を促進させること、が知られている。そこでSPCの創傷治癒促進機序を明らかにする目的で、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル収縮と細胞外マトリックス、特にファイブロネクチン(FN)の発現に対する影響を検討した。細胞は包皮由来のヒト真皮線維芽細胞を用いた。(2)細胞をSPCで処理し、FNのmRNAならびに蛋白レベルの変化をnorthern blotting,immunoblottingで調べた。その結果、SPCは濃度依存性に線維芽細胞FNのmRNAと蛋白量を増加させた。さらにSPCを添加した時に線維芽細胞が産生するTGF-b,PDGF-BB,IL-4,IL-6の量をELISA法で調べたところ、IL-6の分泌だけが亢進した。northern blottingでは、IL-6がFNの発現を増加させ、SPCによるFNの増加作用がIL-6中和抗体の添加により抑制されたことからSPCのFN増加作用の一部はIL-6によることが示唆された。以上の結果からSPCの創傷治癒促進作用は再上皮化の促進だけでなく、創収縮や細胞外マトリックス合成の促進が関与していることが示唆された。sphingosylphoshorylcholine(以下SPCと略す)はスフィンゴ脂質の一つで、生理的には生体内には存在しないが、1)線維芽細胞の増殖を促進させること、2)動物モデルの創傷治癒を促進させること、が知られている。そこでSPCの創傷治癒促進機序を明らかにする目的で線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル収縮におけるSPCの影響を検討した。(1)Matreya SPC(purity95%)を、単層培養した線維芽細胞にSPCを添加して、alamar blueの代謝活性を検討したところ、従来の報告に比較し、細胞増殖促進活性はほとんど認められなかった。また細胞毒性は高濃度においてのみ認められた。(2)浮遊させた線維芽細胞を可溶化typeIコラーゲンと混合してゲル化させ、このゲルの収縮を経時的に測定して、SPCの収縮に及ぼす影響を調べた。その結果SPC依存性の収縮は10μMを至適濃度として濃度依存性に観察され、添加1時間後から48時間以上続いた。類似構造のスフィンゴ脂質ではスフィンゴ1リン酸に同様な作用を見いだしたが、スフィンゴシンやセラミドにはこのような作用はなかった。またα2β1インテグリンの抗体やcytochalasinDの添加によりゲル収縮は完全に抑制された。ゲル収縮を惹起することが知られているPDGFやTGF-βの抗体は影響を与えなかった。さらにシグナル伝達関連物質のpertussis toxin、staurosporine、H7はゲル収縮を抑制し、genistein、tyrphostin A47は影響を与えなかった。以上の結果からSPCはGi protein coupled receptorとprotein kinaseを介して作用することが判明した。昨年度はSPCが線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルの収縮を促進させることを報告した。本年度はSPCが細胞外マトリックス、特にファイブロネクチン(FN)の発現を増加させるかどうかを検討した。細胞をSPCで処理し、時間、濃度によりFNのmRNAならびに蛋白レベルがどのように変化するかRT-PCR,northern blotting,immunoblottingで調べた。northern blottingでは、IL-6がFNの発現を増加させ、SPCによるFNの増加作用がIL-6中和抗体の添加により抑制された。
毛細血管と脂肪の接触構造を作るラミニン-8の超分子会合

ラミニンは組織構築に重要な細胞外マトリックスの主成分である。α,βとγの3本のペプチド鎖が会合した十字架状分子で、5種類のα鎖、4種類のβ鎖と3種類のγ鎖が互換的に会合した19種類のラミニンがある。α4β1γ1の鎖組成を持つラミニン-8は、毛細血管外壁を作る内皮細胞や脂肪前駆細胞が分泌する。脂肪形成過程の電子顕微鏡切片像では、成熟中の脂肪細胞が毛細血管の外壁の内皮細胞に張り付いて血液から栄養分を吸収している様子が見える。わずか0.2μmの細胞間隙には薄いマトリックス構造が見え、これが細胞間の接触構造を支えている。本研究では、この本体が血液(プラスミノーゲン)と脂肪細胞(プラスミノーゲン活性化酵素)の接触点で起こるラミニン-8のG領域の切断で誘発される超分子会合によることを実証する。すなわち、分泌直後には5連球であるα4鎖C-末端のLG1-LG5は、毛細血管と脂肪細胞の接点で生じるプラスミンによって3連球と2連球に分けているリンカー部で切断され、正四面体の3陵をなすα4鎖LG1-LG3の3連球が"頭と頭"で会合した6球体構造を取る。これで二量体化したラミニン-8全体は、短腕でのカルシウム依存性のβ1鎖とγ1鎖の会合も手伝って超分子化して細胞間の接触構造を構築する。こ実証のために、CHO/DHFR系で量産したα4鎖LG1-LG5をエラスターゼ処理してLG1-LG3とα4鎖LG4-LG5を取得した。比較のために、α1鎖LG1-LG5からもLG1-LG3とLG4-LG5を取得した。これらを可溶化基底膜(マトリゲル)とbFGFに様々な濃度で混合してマウス皮下に注射して体内でゲルかさせたところ、内在性内皮細胞と間葉系幹細胞の侵入、増殖、分化による脂肪新生が顕著に抑制された。α4鎖の場合は、LG4-LG5、LG1-LG3、LG1-LG5の順で抑制効果を示した。α1鎖の場合には、LG1-LG3もLG1-LG5も効果を示さなかったにもかかわらず、LG4-LG5はα4鎖に匹敵する抑制を示した。α,βとγの3本のペプチド鎖が会合した十字架状分子で、5種類のα鎖、4種類のβ鎖と3種類のγ鎖が互換的に会合した20余種類のラミニンがある。

すなわち、分泌直後には5連球であるα4鎖C-末端のLG1-LG5は、毛細血管と脂肪細胞の接点で生じるプラスミンによって3連球と2連球に分けているリンカー部で切断され、正四面体の3陵をなすα4鎖LG1-LG3の3連球が"頭と頭"で会合した6球体構造を取る。これで二量体化したラミニン-8全体は、短腕でのカルシウム依存性のβ1鎖とγ1鎖の会合も手伝って超分子化して細胞間の接触構造を構築する。このモデルを実証するために、CHO/DHFR系で量産したα4鎖LG1-LG5をエラスターゼ処理の後にヘパリンカラムで精製してα4鎖LG1-LG3とα4鎖LG4-LG5を取得する方法を確立した。現在、これらが化学架橋剤の存在下で2量体を形成するか否かを検討している。興味深いことに、これらの断片を脂肪新生系に添加するとα4鎖LG1-LG5では弱く、α4鎖LG1-LG3では強く、α4鎖LG4-LG5では非常に強く脂肪形成が抑制されることを発見した。この際のα4鎖LG4-LG作用濃度は20nMと極めて低い。このことは、α4鎖LG4-LG5がラミニン-8のα4鎖LG1-LG3における二量体化を競合的に阻害して脂肪細胞と毛細血管の接触構造形成を抑制することを示唆する。ラミニンは組織構築に重要な細胞外マトリックスの主成分である。α,βとγの3本のペプチド鎖が会合した十字架状分子で、5種類のα鎖、4種類のβ鎖と3種類のγ鎖が互換的に会合した19種類のラミニンがある。α4β1γ1の鎖組成を持つラミニン-8は、毛細血管外壁を作る内皮細胞や脂肪前駆細胞が分泌する。脂肪形成過程の電子顕微鏡切片像では、成熟中の脂肪細胞が毛細血管の外壁の内皮細胞に張り付いて血液から栄養分を吸収している様子が見える。わずか0.2μmの細胞間隙には薄いマトリックス構造が見え、これが細胞間の接触構造を支えている。本研究では、この本体が血液(プラスミノーゲン)と脂肪細胞(プラスミノーゲン活性化酵素)の接触点で起こるラミニン-8のG領域の切断で誘発される超分子会合によることを実証する。すなわち、分泌直後には5連球であるα4鎖C-末端のLG1-LG5は、毛細血管と脂肪細胞の接点で生じるプラスミンによって3連球と2連球に分けているリンカー部で切断され正四面体の3陵をなすα4鎖LG1-LG3の3連球が"頭と頭"で会合した6球体構造を取るこれで二量体化したラミニン-8全体は、短腕でのカルシウム依存性のβ1鎖とγ1鎖の会合も手伝って超分子化して細胞間の接触構造を構築する。こ実証のために、CHO/DHFR系で量産したα4鎖LG1-LG5をエラスターゼ処理してLG1-LG3とα4鎖LG4-LG5を取得した。比較のために、α1鎖LG1-LG5からもLG1-LG3とLG4-LG5を取得した。これらを可溶化基底膜(マトリゲル)とbFGFに様々な濃度で混合してマウス皮下に注射して体内でゲルかさせたところ、内在性内皮細胞と間葉系幹細胞の侵入、増殖、分化による脂肪新生が顕著に抑制された。α4鎖の場合は、LG4-LG5、LG1-LG3、LG1-LG5の順で抑制効果を示した。α1鎖の場合には、LG1-LG3もLG1-LG5も効果を示さなかったにもかかわらず、LG4-LG5はα4鎖に匹敵する抑制を示した。
多結晶半導体材料の準位に基づくエレクトロナノメカニクスへの期待

最終年度である本年度は昨年度に明らかとなった電極の問題に鑑み、より基本的な単結晶シリコンを用いて、機械的損傷に伴う準位の評価可能性を確たるものとするための基礎的な検討を行った。シリコンウエハに導入した損傷を持つ表面にショットキー電極を直接形成し、アドミッタンスの周波数依存性とDLTSとの両方による評価を試み、結果を比較した。アドミッタンスの計測結果には低周波領域において特徴的な信号が現れたが、数週間の後には観察されなくなる等の顕著な時間変化が認められた。これは電極材料と損傷との間に何らかの反応が発生したものと考えられ、安定した電極の形成が今後の課題として残された。しかし、いずれの結果にも損傷の有無による信号の差異が見出され、損傷を電気的に評価することが基本的に可能であることを確認した。また、検出感度の点ではDLTSがはるかに優れるため、今後はDLTSによりどこまで微小な欠陥を評価できるかに期待がかかることとなった。昨年度より継続した機械疲労試験のデータの蓄積により、静的強度および疲労寿命が大きくばらつくこと、またそれらがワイブル統計により説明できることが明らかとなった。強度分布から初期欠陥の大きさの分布を特徴づけ、異なる形状の試験片に対して統計的に強度予測を行った結果、実験により得られた見かけの強度変化と極めてよく一致することを見出した。また、疲労き裂進展則をあわせて適用することにより、任意形状の試料の疲労寿命をも予測可能であることが示唆された。これらの成果は学会において合計3件の講演として発表された。気相合成ダイヤモンドとシリコンとのヘテロ接合における疲労によるはく離と準位との関連についても基本的な疲労試験結果を得、2006年5月の国際会議で発表予定となっている。また電極を付与した試験片の作製が現在進んでおり、この系についても電気的な評価の可能性に期待が持たれる。
急性・慢性砒素中毒におけるDNA損傷に関する研究

平成14年●急性・慢性砒素中毒患者におけるDNA損傷の解明急性及び慢性砒素中毒事例の患者から提供されたサンプルを用いて、ヒトでの砒素曝露によるDNA損傷を80HdGから検討した。急性砒素中毒患者63名のうち、検査の同意が得られた52名について検討した。この集団は、曝露1日後の無機砒素濃度が8013±5715μg/g cr.、代謝産物のメチル化砒素が705±495μg/g cr.、ジメチル化砒素が306±257μg/g cr.であった。患者群を成人と小児に分け、尿中80HdG濃度を経時的に調べた。成人の尿中80HdG濃度は曝露10日後で24.4±11.3ng/mg cr.、小児では28.7±10.1ng/mg cr.であった。健常者に比較して成人では、曝露90日後でも有意に高値で、小児は健常者小児に比較して曝露30日後まで有意に高値となった。さらに曝露10日後の80HdG濃度と推定された亜ひ酸摂取量との間に統計的に有意な相関が認められた。以上の結果、砒素曝露によるDNA損傷は経過とともに改善され、DNA修復の進んだことが確認された。また、その修復は成人に比較して小児がより迅速であることが明らかになった。慢性砒素中毒患者は中国内モンゴルにおける井戸水由来の患者165名について検討した。この集団の砒素濃度は、無機砒素およびその代謝産物であるメチル化砒素とジメチル化砒素の総和として258±236μg/g cr.であった。患者群の尿中80HdG濃度を調べた結果、17.7±9.61ng/mg cr.であり、健常者に比較して有意に高値であることが明らかになった。以上の結果、尿中80HdG濃度の測定は砒素曝露の有効な生物学的曝露モニタリング法であると考えられた。平成13年●砒素暴露とDNA損傷に関する実験動物モデルでの検証DNA損傷物質である8-OHdGに関する基礎的研究(局在性・性差・加齢)は未だ十分に解明されていないことから、実験動物を用いて臓器局在性を検討した。また、3価と5価の砒素暴露の生体毒性について臓器中8-OHdGとの関連性についても検討した。8週齢の雄性New Zealand White種(家免)を一群5匹で実験に用いた。ヒ素投与群は亜ひ酸ナトリウム(無機の3価ヒ素;10%-NaAsO_2)とひ酸2ナトリウム(無機の5価ヒ素;10%-Na_2HAsO_4)、そして、対照群には水道水を自由摂取させ、18週間飼育した。飼育期間中は経時的に尿を採取した。飼育最終週に屠殺し臓器を採取した。臓器中80HdG濃度の測定は2種類の方法を用い、臓器中8-OHdGはHPLC-電気化学検出器測定法、尿中8-OHdGはELISA法でを用いた。3と5価ヒ素投与群の肝臓と腎臓中8-OHdG濃度は共に対照群に比べて、4.89-5.68倍の高値に上昇し、有意な増加が確認された(t-test ; P<0.001)。しかし、肺中8-OHdGに顕著な変化は示されなかった。さらに、無機の3と5価ヒ素投与群には異なる傾向は示されなかった。ヒ素投与後の尿中8-OHdG濃度について検討した。無機の3と5価ヒ素投与群共に投与後、尿中8-OHdG濃度は徐々に上昇する傾向が示され有意な増加を示した(t-test ; P<0.05)。その後、6週目以後では平行状態が保持される傾向が示された。無機の3と5価ヒ素投与群における尿中8-OHdG濃度は、無機の5価ヒ素が3価ヒ素に比較してやや高値である傾向が認められた。急性と慢性ヒ素中毒患者において尿中8-OHdG濃度は無機ヒ素曝露により上昇する現象は確認していたが、本動物実験において、8-OHdGの生成は無機ヒ素の化学形態に関して特に顕著な違いの存在しないことが示唆された。

健常者に比較して成人では、曝露90日後でも有意に高値で、小児は健常者小児に比較して曝露30日後まで有意に高値となった。さらに曝露10日後の80HdG濃度と推定された亜ひ酸摂取量との間に統計的に有意な相関が認められた。以上の結果、砒素曝露によるDNA損傷は経過とともに改善され、DNA修復の進んだことが確認された。また、その修復は成人に比較して小児がより迅速であることが明らかになった。慢性砒素中毒患者は中国内モンゴルにおける井戸水由来の患者165名について検討した。この集団の砒素濃度は、無機砒素およびその代謝産物であるメチル化砒素とジメチル化砒素の総和として258±236μg/g cr.であった。患者群の尿中80HdG濃度を調べた結果、17.7±9.61ng/mg cr.であり、健常者に比較して有意に高値であることが明らかになった。以上の結果、尿中80HdG濃度の測定は砒素曝露の有効な生物学的曝露モニタリング法であると考えられた。
窒化ガリウムおよびその混晶の異種界面制御と高電子移動度トランジスタへの応用

本年度の主目標は、高品質GaN上に形成したMOSダイオードのPost Metallization Annealing(PMA)効果を詳細に評価することである。窒素雰囲気中300-400°CでPMA処理を行うことで界面準位密度が1桁以上低減し、1Hzから1MHzと広い周波数範囲においても分散の見られない極めて良好なC-V特性が得られた。また、c面GaNに形成したMOS構造断面を高解像度透過電子顕微鏡(HRTEM)で観測し、Geometric Phase Analysis (GPA)解析を適用することによって、PMA前ではAl2O3/GaN界面においてGaNの格子定数が不均一に分布していることが明らかとなった。PMA処理を行うことで界面近傍の格子定数分布が均一になることが確認でき、GaNの表面付近に存在している欠陥やボンド乱れがPMA処理により回復したことを示唆する結果を得た。また、c面GaNに形成したMOSダイオードでは、しきい値電圧の温度依存性が明確に観測された。焦電効果によってGaNの有する自発分極が温度上昇に伴い変化したと考えられる。一方、無極性面であるm面GaN上のMOSダイオードでは、しきい値電圧の温度依存性は観測されず、安定動作の観点から重要な結果である。以上、絶縁ゲート型GaNトランジスタの動作安定性向上に関して、重要な知見を得ることができたと判断できる。m面GaN基板上にn-GaNをエピタキシャル成長させた試料が入手できたため、いままでほとんど評価されることのなかったm面GaN上MOS構造の界面特性を明らかにできた。PMA処理を行うことでc面GaN上MOSダイオードと同様にC-V特性が理想値に非常に近い良好な結果を示し、界面準位密度はc面GaN MOSダイオードと同程度であった。一方でPMAを行っていない試料においてはc面GaN MOSダイオードと比較して低界面準位密度であった。最表面にGaとNが共に存在するため、Ga-Nダイマーを均一に形成したことで界面準位が低密度に抑えられている可能性が考えられるが、詳細については今後詳しい研究が必要である。また、両者の温度依存性を比較することによってc面GaNにおいてしきい値電圧の温度依存性が明確に観られ、極性面において焦電効果によってGaNの有する自発分極が温度上昇に伴い増強されたものであると考えられ、、c面GaN上にデバイスを作製した場合、しきい値電圧の温度依存性が本質的に出現することを示した極めて重要な結果である。また、c面、m面GaNでは、MOS構造だけでなくショットキーバリアダイオードにおいても障壁高さが異なる等の報告が多数存在しており、物性的特徴が結晶面に大きく依存していることから表面の結晶構造や焦電効果の有無が電気的特性に与える影響についてより詳細な研究を行う。

また、c面、m面GaNでは、MOS構造だけでなくショットキーバリアダイオードにおいても障壁高さが異なる等の報告が多数存在しており、物性的特徴が結晶面に大きく依存していることから表面の結晶構造や焦電効果の有無が電気的特性に与える影響についてより詳細な研究を行う。
長期持続型経鼻ワクチンの開発とその有効性に関する研究

樹状細胞の増殖因子であるFlt3 ligandをコードしたプラスミド(pFL)並びにCpG配列を含んだオリゴデオキシ核酸(CpGODN)はいずれも粘膜アジュバント活性を持つことがわかっている。これらのDNAアジュバントを同時併用する複合DNAアジュバントとして、抗原(卵白アルブミン: OVA)と共にBALB/Cマウスへ経鼻投与すると、各DNAアジュバントを単独使用した場合と比較してより強力な上気道粘膜での抗原特異的免疫グロブリン(分泌型IgA)産生及び血中における抗原特異的免疫グロブリン(IgG)産生が得られた。これらのマウスを経時的に観察すると、初回投与から27週目まで粘膜及び全身免疫応答が持続した。興味深いことに経鼻免疫にかかわる臓器からは遠隔部位にある膣からの分泌液においても、分泌型IgA産生上昇が長期間にわたって持続することがわかった。以上の結果を元に、複合DNAアジュバントと既知の強力な粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)との比較を行った。老齢マウス(2年齢)を用いて、OVA抗原と各アジュバントからなるワクチンにて経鼻免疫を行い、全身性免疫及び粘膜免疫応答を測定した。その結果、CTでは全身性免疫のみ上昇し粘膜免疫応答は得られなかったのに対して、複合DNAアジュバント使用群では全身性免疫及び粘膜免疫の有意な上昇を認めた。以上の結果より、複合DNAアジュバントは老化による免疫応答の低下があっても有効な免疫応答を生み出すことがわかり、高齢者に対するワクチン開発に大きく寄与することが示唆された。樹状細胞の増殖因子であるFlt3 Iigandをコードしたプラスミド(pFL)並びにCpG配列を含んだオリゴデオキシ核酸(CpGODN)はいずれも粘膜アジュバント活性を持つことがわかっている。これらのDNAアジュバントを同時併用する複合DNAアジュバントとして、抗原(卵白アルブミン:OVA)と共にBALB/Cマウスへ経鼻投与すると、各DNAアジュバントを単独使用した場合と比較してより強力な上気道粘膜での抗原特異的免疫グロブリン(分泌型IgA)産生及び血中における抗原特異的免疫グロブリン(IgG)産生が得られた。また、鼻腔粘膜、顎下腺より単核球を分離し、IgA抗体産生細胞数をELISPOT法にて調べたところ、複合DNAアジュバント使用群では各DNAアジュバント単独使用群と比較して有意な細胞数増加を認めた。興味深いことに経鼻免疫にかかわる臓器からは遠隔部位にある腟からの分泌液においても、分泌型IgA産生上昇が長期間にわたって持続することがわかった。次に抗原特異的CD4陽性T細胞によるサイトカイン産生の測定を行った。磁気ビーズ細胞分離法(MACS)を用いて経鼻免疫後マウスの頸部リンパ節よりCD4陽性T細胞を分離し、OVAおよび抗原提示細胞と培養することで抗原特異的なサイトカイン産生を調べた。ELISA法において、pFL使用群ではIL4のみが上昇しCpG ODN使用群ではインターフェロンγのみが上昇していたのに対し、複合DNAアジュバント使用群ではIL4およびIFNγの有意な上昇を認めた。さらにこれらの現象はmRNAレベルでも確認された。このことから複合DNAアジュバント群ではTh1・Th2いずれもバランスよく上昇することで免疫応答を高めていることが示唆された。
植物における硝酸シグナル伝達の総合理解

硝酸応答型NLP転写因子が直接制御する遺伝子候補であるアスパラギン酸オキシダーゼ(AO)遺伝子がNLP転写因子によって制御されていることを確認するため、転写抑制型へと変換したNLP転写因子を発現している形質転換シロイヌナズナを用いてqRT-PCR解析を行った。その結果、NLP転写因子によるAO遺伝子の発現制御が確認されたことから、次にAOプロモーター中のNLP結合部位を電気泳動移動度シフトアッセイによって同定した。このNLP結合部位に点変異を持つ変異型AOプロモーターを作製して、変異型プロモーターはNLP転写因子によって活性化されないこと、また、硝酸誘導性も失っていることを明らかにした。そこで、次に、野生型AOプロモーターの制御下で発現するAO遺伝子と変異型プロモーターの制御下で発現するAO遺伝子を用いてAO機能欠損株の相補実験を実施した。AOはde novoのNADH合成経路の鍵酵素であり、そのため変異型AO遺伝子をホモに持つ個体は致死となる。そこで、変異型AO遺伝子をヘテロに持つシロイヌナズナに遺伝子を導入した。その結果、野生型AOプロモーターを使用した場合でも、変異型AOプロモーターを使用した場合でも、内在性のAO遺伝子が変異型となっている形質転換シロイヌナズナを作出することができた。しかしながら、変異型AOプロモーターを用いた場合は生育不良を示した。変異型AOプロモーターを用いたことの影響は、新鮮重あたりのNADHやNADPH含量に対しては比較的小さいと評価されたが、個体あたりのNAD合成量は半減していたことにより、硝酸シグナル伝達によりAO遺伝子の発現が誘導されて成長量に見合ったde novo NAD合成が維持されることはシロイヌナズナの成長に重要であることが示された。植物は主たる窒素源である硝酸イオンを感知し、遺伝子発現や代謝バランスを大きく変化させ、窒素栄養環境に合わせた成長の最適化を行う。この最適化のための応答は硝酸シグナル応答と呼ばれるが、硝酸シグナル応答を引き起こす最初の転写因子がNLP転写因子であることから、NLP転写因子の標的遺伝子の同定やこの転写因子の活性調節の解析などによって植物における硝酸シグナル伝達に関する総合理解を達成することが本課題の目的である。この目的に沿って、NLP転写因子の新規標的遺伝子としてAO遺伝子を同定し、これによって、これまで全く明らかにされてこなかった、代謝調節に硝酸シグナル伝達が大きな影響を及ぼすことの理由を解明しつつある。このことから、進捗状況は、ほぼ順調であると評価される。平成30年度の解析によって、NLP転写因子を介して硝酸シグナル伝達によって成長量に見合ったNAD合成が維持されていることが示唆された。そこで、本年度は、まず、野生型AOプロモーターの制御下で発現するAO遺伝子と変異型プロモーターの制御下で発現するAO遺伝子を用いて作製したシロイヌナズナ形質転換体のメタボローム解析を行い、硝酸シグナルによってde novoのNAD合成が促進される意義を精査する。一方で、NLP転写因子によって発現が促進される転写抑制因子の標的遺伝子に、リン飢餓応答を引き起こす転写活性化因子の抑制因子が含まれることがわかってきた。そこで、NLP転写因子を起点とした転写カスケードによって硝酸シグナル伝達がリン飢餓応答に影響を及ぼしている可能性を検討する。また、硝酸シグナル応答の多様性に迫るために、シロイヌナズナに9つ存在するNLP遺伝子の個々の変異体の解析を進めた結果、NLP7に加えて、NLP2も成長制御に大きな役割を持つことがわかってきた。そこで、nlp2変異体を用いたトランスクリプトーム解析を行い、NLP2とNLP7の標的遺伝子の重複と相違を明らかにし、NLP転写因子を介した硝酸シグナル伝達の全容に迫る。また、平成30年度には、NLP転写因子のタンパク質化学的解析に向けてシロイヌナズナのNLP6とNLP7を大腸菌で発現させる試みも実施していた。組換えNLPタンパク質を部分精製しゲルろ過クロマトグラフィーによって挙動を調べたところ、このタンパク質は大腸菌由来のタンパク質と結合している可能性が示唆されたことから、今年度は小麦胚芽タンパク質合成系による無細胞タンパク質合成によって組換えNLPタンパク質の調製を試みる。この試みによっても適切な試料が得られない場合は、植物個体あるいはプロトプラストを用いた実験系の構築を試みる。

変異型AOプロモーターを用いたことの影響は、新鮮重あたりのNADHやNADPH含量に対しては比較的小さいと評価されたが、個体あたりのNAD合成量は半減していたことにより、硝酸シグナル伝達によりAO遺伝子の発現が誘導されて成長量に見合ったde novo NAD合成が維持されることはシロイヌナズナの成長に重要であることが示された。植物は主たる窒素源である硝酸イオンを感知し、遺伝子発現や代謝バランスを大きく変化させ、窒素栄養環境に合わせた成長の最適化を行う。この最適化のための応答は硝酸シグナル応答と呼ばれるが、硝酸シグナル応答を引き起こす最初の転写因子がNLP転写因子であることから、NLP転写因子の標的遺伝子の同定やこの転写因子の活性調節の解析などによって植物における硝酸シグナル伝達に関する総合理解を達成することが本課題の目的である。この目的に沿って、NLP転写因子の新規標的遺伝子としてAO遺伝子を同定し、これによって、これまで全く明らかにされてこなかった、代謝調節に硝酸シグナル伝達が大きな影響を及ぼすことの理由を解明しつつある。このことから、進捗状況は、ほぼ順調であると評価される。平成30年度の解析によって、NLP転写因子を介して硝酸シグナル伝達によって成長量に見合ったNAD合成が維持されていることが示唆された。そこで、本年度は、まず、野生型AOプロモーターの制御下で発現するAO遺伝子と変異型プロモーターの制御下で発現するAO遺伝子を用いて作製したシロイヌナズナ形質転換体のメタボローム解析を行い、硝酸シグナルによってde novoのNAD合成が促進される意義を精査する。一方で、NLP転写因子によって発現が促進される転写抑制因子の標的遺伝子に、リン飢餓応答を引き起こす転写活性化因子の抑制因子が含まれることがわかってきた。そこで、NLP転写因子を起点とした転写カスケードによって硝酸シグナル伝達がリン飢餓応答に影響を及ぼしている可能性を検討する。また、硝酸シグナル応答の多様性に迫るために、シロイヌナズナに9つ存在するNLP遺伝子の個々の変異体の解析を進めた結果、NLP7に加えて、NLP2も成長制御に大きな役割を持つことがわかってきた。そこで、nlp2変異体を用いたトランスクリプトーム解析を行い、NLP2とNLP7の標的遺伝子の重複と相違を明らかにし、NLP転写因子を介した硝酸シグナル伝達の全容に迫る。また、平成30年度には、NLP転写因子のタンパク質化学的解析に向けてシロイヌナズナのNLP6とNLP7を大腸菌で発現させる試みも実施していた。組換えNLPタンパク質を部分精製しゲルろ過クロマトグラフィーによって挙動を調べたところ、このタンパク質は大腸菌由来のタンパク質と結合している可能性が示唆されたことから、今年度は小麦胚芽タンパク質合成系による無細胞タンパク質合成によって組換えNLPタンパク質の調製を試みる。この試みによっても適切な試料が得られない場合は、植物個体あるいはプロトプラストを用いた実験系の構築を試みる。
限定合理性と社会的厚生に関する研究

本研究の基本概念は個人的選択モデルと社会的選択モデルにおける限定合理性である。個人的選択モデルにおいては、選択肢に《顕著性/目立ち度》という概念を与えて、意思決定者がいつどの選択肢を検討しているかを推論する顕示的選好モデルを拡張した。社会的選択モデルにおいては、選択範囲を指定する選択手続きを意思決定者たちがもつ投票力に関して評価した。いずれの研究も国際学会において報告済みであり、完成度は十分高いと言える。伝統的な経済学では、経済主体は合理的に行動すると仮定されてきたが、現実の経済主体は必ずしも合理的な行動をとるとは限らないということが心理・行動経済学の研究によって指摘されている。近年、そのような人間行動のアノマリーを説明するための理論モデルが構築されつつある。例えば、Masatlioglu et al.(2012)は経済主体がすべての実行可能な選択肢を必ずしも検討しないという限定合理性を導入した。彼らは検討しない選択肢がメニューから除かれたとしても検討している選択肢の集合は変化しないという弱い条件の下で、経済主体の選好と検討している選択肢をどのように推論するかという問題を顕示選好理論の枠組みを用いて分析した。本年度の研究は、このMasatlioglu et al. (2012)の選択モデルの自然な拡張を探究した。彼らのモデルでは、検討している選択肢が機会集合のみに関係づけられているが、実際は選択肢を取り巻くさまざまな属性も経済主体が検討する選択肢に関係しているかもしれない。そこで、選択肢の目立ち度を取り入れてモデルを拡張し、Masatlioglu et al. (2012)のモデルの一般化を検討した。その結果、彼らのモデルよりも幅広い状況に適用でき、さらに経済主体の選好をより多く推論できることがわかった。この結果は、例えば政策担当者がひとびとの顕示選好に基づいて評価・判断をしなければならない場合、より精確な判断ができるようになるという点で意義深い。伝統的な社会的選択理論では、最終的な帰結が選択の対象であった。近年の厚生経済学の進展により、最終的な帰結を評価するだけでなく、どの程度選択の機会が保障されていたかや、どのような選択プロセスを経て最終的な帰結がもたらされたのか、といった最終的な帰結以外の情報も取り入れて社会評価をするべきだと認識されている。本研究の主要な目的のひとつは、社会的選択のプロセスを広義の社会状態の情報的基礎として取り入れたとき、どのような社会評価が可能か検討することである。これまでの研究により、社会的選択の選択対象を内生的に定める社会的選択プロセスがアローの不可能性定理を解決するうえで重要な役割を担っていることがわかっている。しかし、現状の枠組みでは、その社会的選択プロセス自体は外生的に扱われているため、社会的選択プロセス同士の比較をすることができなかった。そこで、本年度の研究では、社会的選択プロセスを比較する方法を提案した。具体的には、協力ゲーム理論で提案されていた、投票力の分布の不平等度を評価する方法を複数の問題を同時に扱うケースに拡張し、社会的選択プロセスをそれに与える影響力の不平等度を使って評価する方法を提案した。その評価方法は、単一問題における不平等度を複数問題にわたって集計するものであり、直感的にわかりやすく規範的評価において意義があるだけなく、実際の投票制度の評価にも使える実用的なものである。研究実績の概要で説明した研究は、初稿が完成しており、来年度国内外の学会で報告することが決まっている。近い将来に海外学術誌に投稿できる水準に到達すると予想される。研究計画に含まれるそれ以外の研究についても、海外学術誌で査読中やすでに研究に着手されている段階である。伝統的な社会的選択理論では、最終的な帰結が選択・評価の対象であった。近年の厚生経済学の進展により、最終的な帰結だけを評価するのではなく、どの程度の選択機会が保障されていたかや、どのような選択プロセスを経て最終的な帰結がもたらされたのか、といった最終的な帰結以外の情報も取り入れて社会評価をするべきだという認識が広まっている。本研究の主要な目的の一つは、「社会的選択のプロセス」を広義の社会状態に含めることによって社会評価の情報的基礎を拡張したとき、どのような社会的選択・評価が可能となるか検討することである。本年度の研究は、これまで実施してきた研究枠組みにおいて、伝統的な社会的選択理論が扱うことのできなかった問題に取り組んだ。その問題とは、社会的選択の範囲と投票者の選好が同じだったとしても、選択範囲を指定するプロセスが異なる場合には、最終的な選択結果が異なることがありえるという問題である。本年度の研究において、この問題を適切に定式化したうえで、社会的選択の「社会合理性」条件が必要以上に強い条件であることを示した。さらに、「社会合理性」条件を「社会限定合理性」条件に弱めたとき、アローの不可能性定理が成立するためには、選択肢の範囲を決めるプロセスがどのようなものでなければならないかを特徴づけた。この結果は、本研究の分析枠組みの範囲内で、どのプロセスが社会的選択の可能性を広げるのかという問いに対する解答を特定したという意味で重要である。

いずれの研究も国際学会において報告済みであり、完成度は十分高いと言える。研究実績の概要で説明した研究は、おおむね完成しており、国内外の学会で報告されている。近い将来には海外学術誌に投稿する予定である。研究計画に含まれるそれ以外の研究についても着実に進行しており、早い時期に論文としてまとめる予定である。研究成果を速やかに論文としてまとめ、積極的に国内外の学会・研究会で報告する。論文の完成度を上げ、順次海外学術誌に投稿する。厚生経済学研究成果を速やかに論文としてまとめ、積極的に国内外の学会・研究会で報告できるようにすることを目標としている。完成させた論文は順次海外学術誌に投稿していく。
二酸化炭素の再生利用のためのインテリジェント嫌気発酵プロセスの開発

本研究は、二酸化炭素の有効な再生利用に向けて、偏性嫌気性細菌が有する二酸化炭素の資化能力に着目し、これを菌体内有用物質生産(ビタミンB_<12>)を伴いながら、化学原料としその酢酸またはエネルギー物質としてのメタンへと変換させるインテリジェント嫌気発酵プロセスを開発することを目的とする。本嫌気発酵システムにおいては、ビタミンB_<12>生産能を有するホモ酢酸生成菌(Acetobacterium sp.)の増殖・ビタミンB12生産特性を解析し、新規な嫌気発酵プロセスを構築するアプローチをとる。今までの研究成果を以下に概略する。第一に、Acetobacterium sp.は高いビタミンB_<12>含量(5mg/g菌体)を有し、二酸化炭素・メタノールからホモ酢酸発酵を行った。二酸化炭素は補基質として利用する事からメタノール・二酸化炭素を炭素源としたケモスタット連続培養を行い、速度論的および化学量論的解析を行った。その結果、メタノール・二酸化炭素の消費モル比は2:1である事およびビタミンB_<12>、酢酸の比生成速度は比増殖速度に比例して増加する事を見出した。この知見に基づき、セラミック担体を充てんした固定床リアクターによる高希釈率下での連続培養により高速酢酸およびビタミンB_<12>生産が可能となった。第二に、本菌は酢酸生成により顕著な増殖阻害を受ける。そこで、酢酸資化糸状性メタン生成細菌Methanosaeta conciliiとの共生培養を試みた。すなわち、Acetobacteriumの二酸化炭素・メタノールケモスタット連続培養系を、M.conciliiをポリプロピレン・セラミック混成担体に付着固定した固定床リアクターに液循環し酢酸をメタンに変換した。この新規な混合培養エコシステムの構築によりAcetobacteriumの最大比増殖速度以上の希釈率で連続運転が可能となり、高速メタン生成およびビタミンB_<12>生産が可能となった。本研究では、二酸化炭素の有効な再生利用に向けて、絶対嫌気雰囲気の特殊環境に生育する編性嫌気性細菌が元来有する二酸化炭素の資化能力に着目し、これをエネルギー物質としてのメタンまたは化学源流としての酢酸へと変換させるインテリジェント嫌気発酵システムを開発することを目的とする。この嫌気発酵システムにおいては、優良菌株の育種改良と細胞内状況のモニタリング機能を備えた発酵プロセスの開発という発酵プロセスの全容を見据えた包括的なアプロ-トをとる。本年度(平成8年度)の研究成果を以下に概述する。1)偏性嫌気性細菌Acetobacterium sp.を用い、二酸化炭素・メタノールからの酢酸発酵システムを対象とした。本菌のビタミンB12含量は高いが、酢酸の生成と、それに伴う培養液のpH低下によって、増殖阻害を受ける。そこで、本研究ではまず第一に、基質と生産物の各濃度について、増殖に対する影響を速度論的に解析した結果、生成酢酸の阻害効果が確認されたが、特に、培養液のpH変動との関係から、その阻害効果は酢酸の解離したイオン型(240mM)ではなく、非解離型の酢酸による阻害(0.8mM)が著しいことが判明した。2)本酢酸発酵システムに対し、特異的な酢酸資化能を有する糸状性メタン生成細菌Methanothrix sp.をセラミック担体へ固定化したうえで擬似的に共生させることにより、二酸化炭素・メタノールからの酢酸発酵を、さらにメタン発酵へと転換する混合微生物による連続培養システムの構築を試みた。酢酸によるpH低下を指標に新鮮培地を添加したところ、メタン菌と組み合わせない単独培養系に比べ、本混合培養系では、高い希釈率を維持できる連続培養系を達成することができた。

本研究では、二酸化炭素の有効な再生利用に向けて、絶対嫌気雰囲気の特殊環境に生育する偏性嫌気性細菌が元来有する二酸化炭素の資化能力に着目し、これをエネルギー物質としてのメタンまたは化学原料としての酢酸へと変換させるインテリジェント嫌気発酵システムを開発することを目的とする。この嫌気発酵システムにおいては、有用物質生産能のある優良菌株の増殖特性を解析し、単独培養では増殖阻害を引き起こす生産物を効率的に除去するため、それを有効に資化しうる微生物を加えた新規な混合培養エコシステムを構築するアプローチをとる。本年度(平成9年度)の研究成果を以下に慨述する。第一に、高いビタミンB12含量を有する偏性嫌気性細菌Acetobacterium sp.は、二酸化炭素・メタノールからホモ酢酸発酵を行うが、酢酸生成と、それに伴う培養液のpH低下によって、顕著な増殖阻害を受ける。そこで、酢酸発酵システムに対し、特異的な酢酸資化能を有する糸状性メタン生成細菌Methanosaeta conciliiをセラミック担体へ固定化したうえで擬似的に共生させることにより、二酸化炭素・メタノールからの酢酸発酵を、さらにメタン発酵へと転換する混合微生物による連続培養システムの構築を試みた。酢酸によるpH低下を指標に新鮮培地を添加したところ、メタン菌と組み合わせない単独培養系に比べ、本混合培養系では、高い希釈率を維持できる連続培養系を達成することができた。第二に、二酸化炭素を補基質として利用することから、その取り込みに関して培養液pHの影響を受けると予想されたが、メタノール・二酸化炭素を炭素源にケモスタット連続培養を行い、pH効果を調べた結果、6.7-6.9という非常に限定された範囲において極大値を取ることが明らかになった。さらに、本連続系を用いて、動力学的およびエネルギー論的解析を行い、真の増殖収率および維持常数を求め、菌体を含めたメタノール・二酸化炭素の化学量論的な関係式を求めた。本研究は、二酸化炭素の有効な再生利用に向けて、偏性嫌気性細菌が有する二酸化炭素の資化能力に着目し、これを菌体内有用物質生産(ビタミンB_<12>)を伴いながら、化学原料としての酢酸またはエネルギー物質としてメタンへと変換させるインテリジェント嫌気発酵プロセスを開発することを目的とする。本嫌気発酵システムにおいては、ビタミンB_<12>生産能を有するホモ酢酸生成菌(Acetobacterium sp.)の増殖・ビタミンB_<12>生産特性を解析し、新規な嫌気発酵プロセスを構築するアプローチをとる。今までの研究成果を以下に概略する。第一に、Acetobacterium sp.は高いビタミンB_<12>含量(5mg/g菌体)を有し、二酸化炭素・メタノールからホモ酢酸発酵を行った。二酸化炭素は補基質として利用する事からメタノール・二酸化炭素を炭素源としたケモスタット連続培養を行い、速度論的および化学量論的解析を行った。
GUV内環境での脂肪鎖合成による動態変化観察とその物理

本研究は、人工脂質膜小胞内環境において脂肪酸を合成し、それにより誘起された膜の形態変化を観察することで、内部供給された脂質がどのように二重膜あるいは小胞形成に影響を及ぼすかというダイナミクスをモデル化して考察することである。またこれにより、自己複製脳を持ったオートポイエティックな人工細胞(Protocell)の創造を目指す。さらに、脂肪酸(Oleic acid)を用いたて巨大脂質膜小胞の調製方法について、ハーバード大学メディカルスクールのJW Szostak研究室の研究者と議論を交わし、調製プロトコルを共有した。27年度が最終年度であるため、記入しない。また、giant unilameller vesicle(GUV)の調製方法について最適化を行い、安定してGUVを形成できる条件を決定した。合成リン脂質を用いてGUVの形成を行っているが、以前より低分子の膜透過性が高いことが問題となっていた。これに対し、GUVを形成する脂質組成に5-10%のコレステロール、またはデアシルグリセロールを加えることで、uncontrollableな分子の膜透過性を抑えることが可能であることを見出した。このようなGUVの光学的観察のために、Olympus社製の倒立蛍光顕微鏡を導入し、GUVの観察するための顕微鏡環境を整えた。国内・国外を含めて10件以上の学会・ワークショプに参加し、研究発表を行った。特に2015年2月、2009年ノーベル賞受賞者であるボストン・ハーバード大学のJ. Szostak研と合同WSを行いProtocell研究の最新の知見と今後の重要性について意見を交換した。研究代表者が筆頭著者の論文が2報アクセプトされた。タンパク質精製がスムーズに進み、予定通りに精製サンプルを入手することができた。国内外の学会で多くの注目を浴びた。残る2つの酵素の精製を完了し、GUV内での脂肪鎖合成反応を行う。多チャンネルによるタイムラプス撮影を行うために、昨年度導入した顕微鏡のversion upを行う。これにより、GUVの形態変化を観察し、その物理化学的解析をおこなう。可能であれば、脂肪鎖のみで形成されるGUV内で反応を行い、GUVの自己複製を再現する。
ゲノム編集ハイスループットノックアウトによる腫瘍溶解性ウイルスの細胞傷害性の解明

本研究では、遺伝子を自由に改変できるゲノム編集という技術を用いて幅広い遺伝子を欠失させた癌細胞集団を作成する。様々な遺伝子を欠失させた癌細胞集団を用いて、腫瘍溶解性ウイルスであるコクサッキーウイルスB群3型(CVB3)の細胞傷害性及び抗腫瘍免疫誘導に必要な遺伝子を同定する。CVB3の癌細胞殺傷メカニズムを詳細に理解し、ウイルス感染に必要な受容体の発現のみならず、CVB3の殺細胞効果や抗腫瘍免疫誘導に必要な遺伝子を把握することで、治療される患者様の適応基準を科学的に設定することが可能となる。
亜鉛イオンとERp44の連携による分泌経路の新たなタンパク質品質管理機構

平成30年度初めの時点で投稿中であった亜鉛イオンによるERp44の構造機能制御に関する論文について、平成31年2月にNature Communications誌に掲載された。平成30年度は、1)ERp44の機能制御を司る亜鉛トランスポーターの同定、2)亜鉛トランスポーターZnTファミリーの高分解能構造解析の二つを主たる研究課題として進めた。1)の課題については、ゴルジ体に存在する亜鉛トランスポーターZnT4-7をそれぞれ系統的にノックダウンした細胞中でのERp44の局在とクライアントタンパク質逆輸送活性を解析し、ZnT7がERp44の機能制御を司る主たる亜鉛トランスポーターであることを突き止めた。現在、ZnT7によるERp44の機能制御機構の詳細を解明するため、野生型細胞とZnT7ノックダウン細胞における小胞体、シスゴルジ、ミディアルゴルジ、トランスゴルジの亜鉛イオン濃度を定量するための細胞イメージング実験を進めており、多くの重要な知見が得られつつある。2)の課題については、ERp44の機能制御に特に関わることが判明したZnT7にフォーカスを絞り、そのクライオ電子顕微鏡による高分解能構造解析を精力的に進めている。すでに、ZnT7を安定発現するためのヒト培養細胞を作製し、1リットルの細胞培養液から約0.3 mgの精製ZnT7を得ることに成功した。さらにZnT7をナノディスクと呼ばれる脂質二重層に再構成することに成功しており、そのネガティブ染色電顕画像を取得した結果、今後のクライオ電子顕微鏡による構造解析が十分期待できる結果であった。ZnT7の構造決定が一日も早く達成できるよう、引き続き精力的に実験を進める。研究実績の欄にも記したように、投稿中であった亜鉛イオンによるERp44の構造機能制御に関する論文について、平成31年2月にNature Communicationsに掲載された。またERp44の機能制御に関わる亜鉛トランスポーターの同定についても系統的ノックダウン実験により、非常にクリアな結果が得られ、ZnT7が主たる因子であることを突き止めた。亜鉛トランスポーターの構造解析について、最大のボトルネックは構造解析に足る量の精製タンパク質を安定に得ることと考えていたが、それについてもZnT7の安定発現細胞株を構築し、またナノディスクに再構成することでZnT7の安定化を図り、ゲルろ過カラムによる精製が可能となった。さらにナノディスクに再構成したZnTについてネガティブ染色を行い、今後のクライオ電子顕微鏡による単粒子解析が可能と思われる結果が得られた。このように、国際一流雑誌に論文を発表し、また平成30年度に掲げた二つの研究課題いずれもが予定通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。ERp44の機能制御を担う主たる因子がZnT7であることを突き止めたが、一方でZnT7によるERp44制御のメカニズムについては未だ解明できていない。一つの可能性として、ZnTファミリーによって分泌経路における局在が定められており、どのZnTがどの区画にどの程度亜鉛イオンを取り込むか厳密に制御されていることが考えられる。このことを詳細に解析するには、各区画において亜鉛濃度を正確に定量するための亜鉛特異的な高感度プローブの開発と、超解像度顕微鏡による細胞イメージングが必要である。実際、高感度亜鉛プローブを東北大学多元物質科学研究所の水上進教授との共同研究ですでに開発に至り、各ZnTノックダウン条件下での各区画における亜鉛濃度を超解像顕微鏡により解析を進めている。その結果、多くの興味深い知見が得られつつあり、ZnT7によるERp44の機能制御機構についても解明されつつある。またZnT7の構造解析について、X線結晶構造解析のみならず、クライオ電子顕微鏡による解析にも本格的に着手しつつある。すでにヒト細胞を用いた発現精製系を構築し、ナノディスクに再構成することにより安定な素性のZnT7の調製に成功している。今後、クライオ電子顕微鏡観察のためのグリッド調製条件や測定条件を詳細に検討することにより、構造解析が達成できると考えている。また、多くの膜タンパク質で成功例のあるlipid cubic phase法を用い、ZnT7の結晶構造解析にも挑戦する。我々はすでにヒト由来カルシウムポンプの結晶構造解析を同方法で成功しており、そのノウハウを有している。ZnT7の結晶構造解析についても、本研究期間中に達成できるよう最善を尽くす。