hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SV40の腫瘍ウイルスとしての意義の解明.日本・アジアにおける分子疫学.

SV40の腫瘍ウイルスとしての意義を解明するため,日本,韓国,台湾における悪性中皮腫,髄膜腫症例を対象にSV40-DNAの存在をPCR法によって検討した.悪性中皮腫では,PQ,SV,NKフラグメントは日本35症例中7,0,0症例に検出された.韓国4,台湾5症例ではすべて陰性であった.髄膜腫では,PCR増幅が安定しているNK断片で検討した場合,検出率は日本3.1%(5/159),韓国2.5%(6/244)であった.日本,韓国,台湾における中皮腫におけるSV40の関与は共通して乏しいが,髄膜腫については日本,韓国ともに低頻度ではあるが関与の可能性があり,分子疫学的検討がさらに必要である.Simian virus 40(SV40)は,ポリオーマウイルス科に属する環状2重鎖のDNAウイルスである.これまで,脳腫瘍(髄膜腫),悪性中皮腫,非ホジキンリンパ腫の腫瘍組織中にウイルス遺伝子断片が検出されるという報告があり,腫瘍化に関連している可能性も指摘されている.本研究では,日本・アジアにおける分子疫学的調査を含め,SV40の腫瘍ウイルスとしての意義について検討することを目的とした.(1)資料収集:日本,韓国,中華民国の諸施設に資料収集について協力を要請する.(3)DNAメチル化との関係:Toyookaらの報告(Oncogene 21 : 4340, 2002)によれば,SV40の感染を認める中皮腫細胞株では癌関連遺伝子のプロモター領域にメチル化が高率に生じている.この点についても検討する.(4)新たなポリオーマウイルス,メルケル細胞癌ポリオーマウイルス(merkel cell carcinoma polyoma virus, MCPyV)は皮膚のメルケル細胞癌に高率に検出され,腫瘍化に関わっている可能性が示唆されている(Feng et al.Science 319 : 1096, 2008).その存在についても検討を追加する.SV40の腫瘍ウイルスとしての意義を解明するため,日本,韓国,台湾における悪性中皮腫,髄膜腫症例を対象にSV40-DNAの存在をPCR法によって検討した.悪性中皮腫では,PQ,SV,NKフラグメントは日本35症例中7,0,0症例に検出された.韓国4,台湾5症例ではすべて陰性であった.髄膜腫では,PCR増幅が安定しているNK断片で検討した場合,検出率は日本3.1%(5/159),韓国2.5%(6/244)であった.日本,韓国,台湾における中皮腫におけるSV40の関与は共通して乏しいが,髄膜腫については日本,韓国ともに低頻度ではあるが関与の可能性があり,分子疫学的検討がさらに必要である.SV40の検出これまでの検討でPCRの標的とされてきた断片は,実験室で頻用されているプラスミドベクターに組み込まれており,偽陽性の原因となり可能性が高いことが指摘されている。このため,プライマーの設計については,Manfrediらの方法に準拠し(Cancer Res 65:2005),増幅の標的を2箇所追加し,Primer PQ(5027-4911),Primer SV(4476-4372),PrimerN'K'(3106-2966)の三断片の増幅でSV40の有無を検討した。ATCCより中皮細胞腫瘍株5株,RIKENより2株を購入し,培養後にDNAを抽出した。さらに東京大学医学部附属病院における胸膜中皮腫症例14例,肺癌10例,脳腫瘍(上衣腫9例,髄膜腫14例)のホルマリン固定,パラフィン包埋標本からもDNAを抽出した。DNA抽出からPCR検出までの過程の陽性コントロールとしてcdc25断片の増幅を行った。PCRサイクル数は35-40回。北海道大学医学部ウイルス研究部門田中教授より供与されたpCMV-SV40を増幅の陽性コントロールとして用いた。その結果,細胞株,臨床検体のいずれについてもSV40の断片を検出することができなかった。SV40DNA断片が検出されていると報告されている細胞株NCI-H226,NCI-H290,NCI-H2052においても陰性であった。一方,陽性コントロールのCDC25断片はすべての検体で増幅することが可能であった。さらに,検出感度を上げて,検討する必要がある。資料収集大韓民国の一施設に,利用可能な組織ブロックの保存の有無を問い合わせ,協力を要請したが,レスポンスがなかった。来年度は,現地に赴いて中皮腫などの診断について意見を交換するなどによって協力体制を構築する必要がある。資料収集今年度は連携研究者太田とともに韓国Daegu市keimyung大学病理学教室に赴き,病理診断について意見を交換した。また,keimyung大学病理学教室より髄膜腫33例,中皮腫4例の組織標本について供与を受けた.国内においては自治医科大学,愛知がんセンターなど数施設に協力を要請,倫理委員会で審査中である.

東大における胸膜中皮腫11例,肺癌10例,脳腫瘍(上衣腫8例,髄膜腫14例)(ホルマリン固定,パラフィン包埋標本),中皮腫細胞株7株のいずれにもSV40の存在は確認されなかったが,昨年度の解析によって韓国例の髄膜腫33例中1例から3断片とも検出された.今年度も引き続き,症例数を増やして検討を続ける.韓国例の中にSV40断片が検出できる症例が見出されたことから,この症例については塩基配列の確認とともに存在様式を詳細に検討する必要がある.また,臨床病理学的特徴についてKeimyung大学の協力者に詳しく検討してもらう予定である.連携研究者:太田聡講師(人体病理学分野),柴原純二助教,森川鉄平助教(医学部附属病院)資料収集:平成21年度には,台湾彰化基督教医院、台中栄民総医院に赴き,病理診断について意見を交換した上,中皮腫の組織標本について供与を受けることとなった.平成22年度は早い段階で韓国ソウル大学に協力を要請する予定である.SV40の検出:Manfrediらの方法に準拠し(Cancer Res 65:2005), Primer PQ(5027-4911), Primer SV(4476-4372), PrimerN'K'(3106-2966)の三断片の増幅でSV40の有無を検討した.悪性中皮腫については,日本(東大,自治,愛知がんセンター)36例,韓国4例,中皮腫細胞株7株のいずれにもSV40の断片は確認されなかった.一方,髄膜腫については,日本(東大)162例中0例,韓国33例中1例から検出された.免疫組織化学的にT抗原の発現を検討したが,PCR陽性髄膜腫においても陰性であった.DNAメチル化との関係:Toyookaらの報告(Oncogene 21:4340,2002)によれば,SV40の感染を認める中皮腫細胞株では癌関連遺伝子のプロモター領域にメチル化が高率に生じている.NCI-H28,NCI-H2052においてRASSF1Aのメチル化を検討したところ,彼らの報告と同様,メチル化が確認できたが,SV40の感染は確認できなかった.メルケル細胞腫ポリオーマウイルスとの関係:新たなポリオーマウイルス,メルケル細胞癌ポリオーマウイルスは皮膚のメルケル細胞癌に高率に検出され,腫瘍化に関わっている可能性が示唆されている(Feng et al.Science 319 : 1096, 2008).その存在についても検討するため,PCRによる検出条件を設定した.連携研究者:太田聡講師,後藤明輝助教(人体病理学分野)資料収集:平成20年度韓国啓明大学病理学教室における中皮腫,髄膜腫,平成21年度台湾彰化基督教医院,台中栄民総医院での中皮腫検体の収集に続いて,平成22年度には韓国ソウル大学病理学教室の協力を得て,韓国髄膜腫症例の検体を収集した.これまで,悪性中皮腫については,日本(東大,自治,愛知がんセンター)36例,韓国4例,中皮腫細胞株7株のいずれにもSV40の断片は確認されていない.一方,髄膜腫については,日本(東大)162例中0例であったが,韓国33例中1例から検出されたため,韓国ソウル大学の協力により,さらに髄膜腫237症例を検討することとした.DNA抽出後,cdc25,GADPH断片が増幅可能であった症例は212例で,通常型191例,異型髄膜腫16例,退形成性髄膜腫5例であった.PQ,SV,NK断片は通常型で13,87,4症例,異型髄膜腫で0,8,1例が増幅され,退形成性髄膜腫ではすべて増幅されなかった.通常型,異型いずれも,ほとんどがPQ-SV+NK-症例であり,PQ+SV+NK-症例は7,0例,PQ-SV+NK+症例は2,0例であった.三断片いずれも増幅された症例はなかった.三断片増幅の有無について相互の関連性を統計学的にx二乗検定したが,有意な関連性はみられなかった.連携研究者:太田聡講師,後藤明輝助教(人体病理学分野)
超流動ヘリウム中におけるレーザーアブレーションによる半導体の単結晶真球化

超流動ヘリウムという極低温かつ粘性が極めて小さな溶媒中で、レーザーアブレーションという、高強度光の物質への照射で表面を破壊して微小な粒子を作製する方法を実施し、世界で初めて、様々な半導体をミクロンサイズで単結晶真球化することに成功しました。半導体結晶はそれぞれ固有の結晶構造を有し、マイクロメートル程度の大きさに至ると、通常は直方体や針状などの固有な形状を示しますが、この成果を用いると、結晶構造によらず真球形状をした単結晶を得ることができます。物質に高強度レーザーを照射して表面を破壊して微小構造物質を作製することができる、レーザーアブレーションという手法を、超流動ヘリウムという特殊な環境下で行うことにより、異方的な結晶構造を有する半導体の真球を作製することを目的として研究を進めた。これまでは、六方晶のウルツ鉱型をとるため、その異方性を反映して針状結晶などに成長するのが普通であるZnO、CdSeに対して実験を行い、結晶性の高い真球が、粒径が数nmから数μmに渡る非常に広い分布をもって作製できることを見出してきた。この手法の最も大きな特徴は、粒径がμm以上のマイクロ真球を作製できることであり、そうしたサイズの真球は光を閉じ込める共振器として動作し、高効率なレーザー発振を示すなど、微小な光学デバイスとしての応用が期待される。今年度はさらに対象物質を拡大することを目指し、Si、GaAs、SiC、GaNなどに同一手法を適用し、光学応用が容易なマイクロ真球の探索を、光学顕微鏡を用いて行った。その結果、特にGaAsの真球が数多く作製できることを見出した。しかしながら、他の材料、Si、SiC、GaNにおいても、マイクロ真球と思われる微粒子の存在は確認した。超流動ヘリウム中では、レーザー照射で融解した材料が表面張力で真球状となり、それを気体ヘリウムが取り囲むことで急冷が避けられる一方、周囲の液体ヘリウムからの等方的圧力で真球形状を保ったまま結晶化したものと推定している。この際、物質の違いは、光吸収の特性、融点、熱容量や熱伝導率などの相違に基づくと推測され、物質によってレーザーアブレーションの最適条件、レーザー波長、強度などが異なるものと考えられる。物質毎に異なることが判明した最適条件の決定が今後の課題である。超流動ヘリウムという特殊な環境下で、物質に高強度レーザーを照射してその表面を破壊する、レーザーアブレーションという手法を用いることで、物質の結晶構造によらず、他の環境では作製が困難なミクロンサイズの真球状単結晶を作製することを行った。既に報告してきた、異方的なウルツ鉱型構造を有するために針状結晶などが生じやすいZnOやCdSeなどの真球形状化に加え、等方的な結晶構造を有するSi, GaAsなどにおいても結晶性の高い真球を得ることに成功し、手法の一般性を示した。超流動ヘリウム中で物質を溶融することが可能な程度の強度を有するレーザーを照射することで表面を融解させると、生成した融液は表面張力によって真球状となり、その形状を保ったまま徐冷されて結晶構造をとるものと推測される。ここで、融液の温度は一般にヘリウム温度より桁違いに高いため、真球状の融液は蒸発した気体ヘリウムで覆われていて、急冷が生じないものと考えている。この徐冷の際、融液は周囲の液体から等方的な圧力を受けているため、針状など固有の構造を取れず、真球形状が維持される。なお、具体的に名称を挙げた物質以外にも、多くの二元化合物に対して、この手法による真球状単結晶作製に成功している。一方、マイクロサイズの誘電体真球は光を閉じ込める共振器として動作し、高効率なレーザー発振や高感度なセンサーなど、数多くの応用が期待されている。実際、作製に成功したZnOやCdSeなどにおいても、そのレーザー発振に成功している。しかしながら、ZnOにおいては、バンド端の紫外発光に加えて酸素欠陥による可視発光帯も生じ、後者のレーザー発振は確認したものの、バンド端発光がレーザー発振している確証は得られていなかった。本研究では、低温におけるマイクロ球の単一粒子計測を実施し、発振の閾値を決めること、すなわち、バンド端発光においてもレーザー発振を観測することに成功した。当初の予定を前倒しし、GaAsにおいても本手法、すなわち、超流動ヘリウム中におけるレーザーアブレーションで、粒径がマイクロメートルサイズの真球を作製できることを見出した。さらに、他の材料、Si、SiC、GaNにおいても、本手法適用の可能性を見出した。光物性物理学適用可能な物質が数多いことは明らかとしたが、最適条件はそれぞれ異なることも見出した。このため、物質毎の最適条件を決定することが最も重要な課題である。この課題自体は本研究計画で想定していたことであり、次年度も計画を着実に遂行していく。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため、当初の見込額と実際の執行学が異なった。
電子状態・反応性・スピンの単分子レベル制御

本研究は、表面吸着分子の価電子状態と反応性・スピン状態との相関を明らかにし、価電子状態を制御することで単分子レベルの物性制御を達成することを目的としている。当該年度は、走査トンネル顕微鏡(STM)による単分子レベルの物性評価手法を用いて、面方位の異なる銅(Cu)表面に吸着した一酸化窒素(NO)分子の価電子状態を調べ、表面構造が価電子軌道に及ぼす影響を評価した。さらに、非弾性トンネル分光によって、分子振動と価電子軌道との相関を調べた。下にその詳細を記す。1.Cu(111)表面およびCu(001)表面上におけるNO分子の価電子軌道の直接観察面方位の異なるCu表面にNO分子を吸着させ、低温(6 K)におけるSTM実験を行った。STMによる単分子操作と、走査トンネル分光による局所電子状態の測定を組み合わせることで、各表面上における吸着種の同定と、その価電子状態の評価を行った。特に、Cu(111)表面においては、NOは三量体を形成することで安定化することを明らかにした。これは他の表面上では報告例がなく、Cu(111)表面の3回対称性と、Cu表面上におけるNO-NO間の強い相互作用に依存した特異的な吸着種であることが示された。2.非弾性トンネル分光による分子振動の検出と、価電子軌道との相関非弾性トンネル分光(IETS)によって表面上の単分子の振動に関する情報を入手することができるが、その信号強度や選択則に関しては未だに完全な解釈がなされていない。当該年度におけるSTM実験にて、Cu(110)表面上およびCu(001)表面上のNO分子に対してIETSを測定し、そのスペクトルの解析を行った。STS測定によって特定したNO分子の価電子軌道の対称性を利用することで、IETSピークの振動モードを実験的に帰着した。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度は、走査トンネル顕微鏡(STM)による単分子レベルの物性評価手法を用いて、銅表面上に吸着した一酸化窒素(NO)分子の価電子状態の解明、および、水分子との複合体形成によるNOの価電子制御を試みた。次にその詳細を記す。1.Cu(110)表面に吸着したNOの価電子状態の解明低温において、Cu(110)表面にNO単分子は垂直に吸着しており、その価電子軌道(2π*)が分子に局在していることをSTM観察によって明らかにした。さらに、走査トンネル分光(STS)による詳細な電子状態の測定によって、直交した2つの2π*軌道は、表面の異方性に依存して異なるエネルギー準位を持つことが明らかになった。また、STMによる非弾性トンネル分光(IETS)測定によって、NO単分子の振動状態が検出された。この振動スペクトルの形状と空間分布は、NOの価電子状態・スピン状態と密接な関係があることが示唆された。2.水分子とNO間に形成された水素結合によるNOの価電子状態の変調Cu(110)表面上に水(H2O)とNOを共吸着し、STM実験を行った。STMによる単分子操作によって、NO単分子とH2O単分子を接近させることにより、複合体(NO-H2O)を作成した。STM・STS測定によって、この複合体においてNOとH2Oとの間に水素結合が形成されており、NOの2π*準位が低エネルギー側にシフトしていることが明らかになった。気相におけるNOとH2Oとの間の相互作用は非常に弱いことから、表面から分子への電荷移動によって水素結合が強められていると推測した。さらに、水素結合ドナー分子をH2Oから水酸基やアルコール分子に変更することでNOの2π*準位のエネルギー位置を変化させることに成功した。当該年度の前半は、走査トンネル顕微鏡(STM)によそ単分子レベルの物性評価手法を用いて、銅(Cu)表面に吸着した一酸化窒素(NO)分子の価電子状態の制御を試みた。さらに、後半は、ドイツ・ブリッツハーバー研究所への研究渡航を実施し、そこで探針増強ラマン分光(TERS)による数十ナノメートル規模の振動分光実験を行った。次にその詳細を記す。1.水分子によるCu(110)表面上のNO分子の還元反応の誘起Cu (110)表面に水とNOを共吸着し、低温(6K)におけるSTM実験を行った。STMによる単分子操作によって水単分子をNO単分子に接近させることで複合体を作成した。この複合体において、NOの価電子準位が水との水素結合によって銅基板からの電子移動を受けており、N-0結合が弱められていることを走査トンネル分光(STS)によって明らかにした。さらに、もう一つの水単分子をその複合体に接近させることで、更なる電子移動によってN-0結合を切断すそことに成功した。12Kという低温においてこの反応が自発的に進行することから、このNO還元反応は触媒メカニズムの理解に大きく寄与することが推測される。

2.探針増強ラマン分光法によるグラフェンナノリボンの観察探針増強ラマン分光(TERS)は、STMによる表面分子の直接観察とラマン分光による振動分光によって相補的にナノスケールの物性情報を得ることができる装置である。その利点がありながらも、先行研究では熱ドリフトや試料・探針の汚染などによってラマン信号の再現性が乏しいことが指摘されていた。今回、ナノスケール炭素材料の一種であるグラフェンナノリボン(GNR)を試料として、超高真空下で稼働するTERS (UHV-TERS)の機能性の評価を行った。金表面上に幅約1nmの均一なGNRを作成し、TERS測定を行った。グラフェン由来のピークの解析により、少数分子レベルのラマン分光において見られる明滅効果の存在を確認し、それが主に探針構造の熱的な変化によって引き起こされていることを提唱した。以上の結果から、今後高再現性のTERSデータを得るためには、安定性の高い探針や低温測定が可能な装置の開発が必要になることが示唆された。本研究は、表面吸着分子の価電子状態と反応性・スピン状態との相関を明らかにし、価電子状態を制御することで単分子レベルの物性制御を達成することを目的としている。当該年度は、走査トンネル顕微鏡(STM)による単分子レベルの物性評価手法を用いて、面方位の異なる銅(Cu)表面に吸着した一酸化窒素(NO)分子の価電子状態を調べ、表面構造が価電子軌道に及ぼす影響を評価した。さらに、非弾性トンネル分光によって、分子振動と価電子軌道との相関を調べた。下にその詳細を記す。1.Cu(111)表面およびCu(001)表面上におけるNO分子の価電子軌道の直接観察面方位の異なるCu表面にNO分子を吸着させ、低温(6 K)におけるSTM実験を行った。STMによる単分子操作と、走査トンネル分光による局所電子状態の測定を組み合わせることで、各表面上における吸着種の同定と、その価電子状態の評価を行った。特に、Cu(111)表面においては、NOは三量体を形成することで安定化することを明らかにした。これは他の表面上では報告例がなく、Cu(111)表面の3回対称性と、Cu表面上におけるNO-NO間の強い相互作用に依存した特異的な吸着種であることが示された。2.非弾性トンネル分光による分子振動の検出と、価電子軌道との相関非弾性トンネル分光(IETS)によって表面上の単分子の振動に関する情報を入手することができるが、その信号強度や選択則に関しては未だに完全な解釈がなされていない。当該年度におけるSTM実験にて、Cu(110)表面上およびCu(001)表面上のNO分子に対してIETSを測定し、そのスペクトルの解析を行った。STS測定によって特定したNO分子の価電子軌道の対称性を利用することで、IETSピークの振動モードを実験的に帰着した。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度に実施したCu(110)表面上のSTM・STS測定によって、NO分子と水素結合ドナー分子との複合体形成に伴いNOの価電子準位のエネルギー位置が変調されることが明らかになった。この複合体のドナー分子種の変更することで価電子準位のエネルギー位置を変化させることができ、研究の目的の一つであった価電子状態の制御が達成された。以上の理由から、当初の計画以上に進展したと評価した。STMによる単分子操作と局所電子状態測定を組み合わせることによって、水分子との水素結合による価電子状態の変調の制御、および、それによるNO還元反応の誘起に成功した。
ミトコンドリアDNA付加体による炎症誘導活性評価

本研究ではまずDNA付加体の網羅解析法の確立を試み、LC-MS/MSにより100種類を超える脂質-グアニン付加体の検出に成功し、そのうち2-オクテナール付加体を新規に同定した。一方、J774.1マクロファージにおける各種核酸塩基の炎症応答への作用について検討を進めた結果、P2X7受容体を介したATPによる炎症誘導機構と食品由来ポリフェノールによる阻害作用を明らかにした。また、低分子ヌクレオシド付加体による炎症誘導作用は認められなかったが、ミトコンドリア障害と炎症誘導の関連性が認められた。また、タンパク質分解系の阻害によって高分子核酸(DNAとRNA)が細胞外へ分泌されることが明らかとなった。核酸は遺伝情報を担うほか、細胞内外で情報伝達物質としても機能する一方で紫外線や発がん物質、酸化ストレス産物などによって修飾される。核酸塩基の修飾は遺伝子変異や発がんの原因として注目されてきたが、近年、修飾DNAが炎症誘導活性を有することが報告されつつある。しかし、核酸分子の感知・認識機構についてはほとんど明らかにされていない。そこで、本研究ではまず、内因性の新規修飾核酸の探索を実施した。酸化ストレスモデルとして脂質過酸化物に着目し、in vitroモデル反応における“アダクトーム解析"をLC-MS/MS分析法を用いて実施することとした。生体膜を構成するアラキドン酸と2'-deoxyguanosine(dG)を酸化条件下で反応させ、LC-MS/MSによりdG付加体の網羅的な解析を実施した。その結果、80種類以上の未知の付加体ピークを検出した。既知の付加体のうち、最も主要な2種(4-oxo-2-nonenal-dG、etheno-dG)については、安定同位体希釈法を用いることでDNA酵素消化物からの微量検出定量が可能となった。一方、未知の付加体のうち、アラキドン酸酸化により生じる2-オクテナールを介した付加体の生成が明らかとなった。この付加体は、2-オクテナールの4位の酸化を伴う新たな反応機構によって生じることが明らかとなった。このような網羅的解析法により、核酸の新しい内因性修飾を見出すことが可能となった。一方、マウスマクロファージ(J774.1)に対して、様々な低分子核酸の炎症誘導活性について評価したところ、ATPとアデノシン添加により、LPSによって誘導されるNO産生が顕著に促進されることが明らかとなった。またクロロ化アデノシンによっても類似の効果が認められたことから、修飾核酸の炎症誘導の可能性が示唆された。次年度はミトコンドリアDNAに焦点を当てた解析を進める予定である。本年度は、以下の2項目について中心的に検討した。(1)炎症応答における低分子核酸の作用機構:J774.1マウスマクロファージに様々な低分子核酸の存在下でLPS刺激し、NO産生量を検討したところ、ATPまたはアデノシン(Ado)の添加により顕著なNO産生量の増加が認められた。NO産生増加のメカニズムとして、ATPとAdoはいずれもiNOSタンパク質およびmRNA発現を増加させることが明らかとなったが、ATPは、IFN-β産生を増加させることでSTAT-1の活性化およびIRF-1の発現増加を介してiNOS発現を増加させると示唆された。また、siRNAによるノックダウン実験より、この作用はP2X7受容体を介することが確認された。(2)細胞からの高分子核酸の分泌:J774.1やマウス胚性繊維芽細胞(MEF)、ヒト子宮頸部癌由来上皮細胞(HeLa)などの細胞種を用いて細胞外の二本鎖DNAおよびRNA量を検討したところ、J774.1からの分泌量が最も顕著であった。また、J774.1においては、LPSやATPのような細胞死を誘導する処理のほか、栄養飢餓や細胞内タンパク質分解系の阻害によっても顕著な核酸分泌が認められた。また、細胞外に分泌された二本鎖DNAはヌクレオソーム単位で断片化したDNAであることが示された。各種阻害剤を用いて検討したところ、細胞内分解系の異常やタンパク質翻訳機構の異常により核酸が分泌することが示唆され、タンパク質翻訳装置であるリボソームの分泌やDNAの断片化との関係性が示唆された。オートファジーなど細胞内分解機構との関連や、分泌された核酸の修飾など構造的特徴と炎症誘導活性との関連が今後の課題である。食品科学25年度においては、内因性DNA付加体の網羅解析をLC-MS/MS法を用いて実施し、脂質過酸化によって生じる2-オクテナールが関与する新規付加体の生成を見出した。また、ATPとアデノシンがマクロファージにおいて顕著な炎症促進作用を有することを明らかとした。

26年度においてはミトコンドリアDNAに焦点を絞って付加体の炎症誘導活性を評価することを予定しており、25年度に得られたデータならびに実験条件は、これらの評価を行っていく上で非常に有用であると考えられる。26年度においては、引き続き内因性の新規DNA付加体の構造決定を継続するとともに、これら付加体による炎症誘導活性のスクリーニングを実施する。そのためには、各種モデル反応を実施し、DNA付加体を単離・精製する必要がある。また、ATPやアデノシンなどの核酸分子による炎症誘導機構について詳細な解析を進め、関与する受容体やシグナル伝達機構について理解を深めるとともに、より簡便な炎症誘導評価法を構築する。炎症誘導活性を有するDNA付加体を見出すことが出来れば、その受容体感知機構ならびに炎症誘導活性発現機構について詳細な検討を実施し、慢性炎症や各種疾病、老化への関与を議論するための知見を得る。
口腔がん多段階発がん過程におけるスフィンゴシン-１-リン酸シグナル調節機構の解明

スフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)が悪性腫瘍、動脈硬化や糖尿病、骨粗鬆症などの病態進行を調節する重要な因子として最近注目を浴びている。S1Pは様々な細胞から分泌され、5つの特異的なGタンパク質共役型受容体を介するシグナル伝達因子として、オートクライン、パラクラインに作用するが、口腔がんにおけるS1Pシグナル伝達については未だ不明な点が多い。本研究では、口腔癌細胞株を用いて、S1Pによる細胞増殖能や細胞遊走能への影響について検討し、さらに細胞株のS1P受容体サブタイプ(S1PR1-5)の発現様式を確認のうえ、そのシグナル伝達経路についていくつかの知見を得た。S1Pは様々な細胞から分泌され、5つの特異的なGタンパク質共役型受容体(S1PR1-S1PR5)を介するシグナル伝達因子としてオートクライン、パラクラインに作用している。口腔がん由来細胞におけるS1Pシグナル伝達機構は未だ不明な点が多い。本研究では、がん細胞の活性化において重要な役割を果たしているS1Pの作用に着目し、口腔がんの増殖、浸潤、転移という多段階の発がん過程におけるS1Pシグナル伝達機構の解明と新規分子標的の確立を目指し、本研究を計画するに至った。本年度は培養系実験の遂行を遂行するため,細胞株等を入手した.細胞は理化学研究所Cell Bankより入手可能な口腔由来(舌、歯肉)およびその他の臓器由来(骨、血液など)の細胞株のセットアップを行った.受容体の発現、キナーゼの活性化、転写因子の発現などについて検討を進めている。Erdemらは3種類の口腔扁平上皮癌由来の細胞株(下歯肉、軟口蓋、舌)と正常鼻腔粘膜上皮細胞株との比較において、MMP(1,2,3,9)やカテプシン(B,L)などの発現が癌細胞で増強していることを免疫染色やフローサイトメトリーで示し、口腔癌細胞のマトリックスバリアー克服にMMP高発現が重要であることを指摘している(Erdem FN, et al. J Oral Maxillofac Surg 2007)。しかし、S1Pがこれらの発現を直接的に調節しているかについての報告はない。よってS1P濃度依存性にこれらの発現が誘導されるかmRNA、タンパク質レベルで発現を検討し、また、各阻害剤を用いた実験によってシグナル特異性に発現が変化するかについて検証する予定で現在遂行中である。ヒト口腔がん由来の細胞株を理化学研究所より入手したが、培養細胞を用いた実験で発現解析を進めている。関連因子についても、現在着目因子について検討を行っている。スフィンゴ脂質が細胞遊走に深く関与している可能から、脊椎動物の発生段階において脊髄の軸策伸展方向を制御する因子として軸索ガイダンス因子との作用に関心を持っている。軸索誘導以外に細胞移動、細胞接着、細胞極性や細胞骨格などの様々な現象を調節していることが明らかとなり、最近では癌との関係も注目されている。肺癌、乳癌、及び腎癌や、肺小細胞癌細胞株であるU2020などでも関連が示唆されており[Xian J, etal. Cancer Res. 2004, 64(18):6432-7.]、これらの検討も進行中である。培養下での発現については、形質が変わっている可能性があることから、実際のヒト検体についても検討を行いたいと考え、学内倫理委員会への申請を行い承認を得た。口腔がん患者の切除サンプルを採取し、現在検体数を蓄積している。スフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は悪性腫瘍、動脈硬化や糖尿病、骨粗鬆症などの病態進行を調節する重要な因子として認知されてきた。口腔がん由来細胞におけるS1Pシグナル伝達機構は今もなお十分に解析が進んでいない。本研究では、がん細胞の活性化において重要な役割を果たしているS1Pの作用に着目し、研究計画が進められた。これまでの頭頸部がんのスフィンゴ脂質に関する報告は、野田らがpan-SphK阻害剤であるSafingolを用いた実験で、口腔扁平上皮癌由来細胞が脱接着性に細胞死を誘導するとの報告や(Noda T, et al. Apoptosis 2009)、がんの進行ならびに生存率の低下とSphK1の高発現、活性化との相関を示す報告(Facchinetti MM, et al. Cells Tissues Organs 2010; Liu G, et al. BMC Cancer 2010; Shirai K, et al. Cancer Prev Res. 2011)、SphK1の活性化が放射線抵抗性を示すとする報告(Sinba UK, et al. Head Neck. 2011)などの知見が得られている。本研究では口腔がんにおける多段階発がんのスフィンゴ脂質代謝に関する研究と位置づけ、口腔がん由来の細胞を用いて、これら代謝酵素によるタンパク質修飾について検討を加え、S1P-S1PRシグナルにおける伝達や作用を中心に研究を展開している段階である。S1Pの活性化が細胞株によってバラツキがあり、再現性を得るのに苦慮している。

レセプターの発現にも多様性があることが予想され、実験系の確立にも時間を要している。文献的な情報も参考にしながら、関連因子についても視野を広げ、新たな発見に繋げていきたい所存である。スフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)が悪性腫瘍、動脈硬化や糖尿病、骨粗鬆症などの病態進行を調節する重要因子とされる。S1Pは様々な細胞から分泌され、Gタンパク質共役型受容体(S1PR1-S1PR5)を介するシグナル伝達因子としてオートクライン、パラクラインに作用している。口腔がん由来細胞におけるS1Pシグナル伝達機構は未だ不明な点が多いことから、S1Pシグナルに着目するに至った。S1P増殖能、化学遊走能の検討などを行った。受容体はサブタイプの組織特異性や細胞の発現パターンとGタンパク質との親和性の違いによってシグナル伝達経路が異なることが分かっている。このことから口腔がん細胞やその他の臓器由来の細胞を用いてS1PR発現パターンを解析した。S1PR1ーS1PR5の発現はreal-time RT-PCRにより、口腔がん由来細胞株にいずれのサブタイプがどのような発現様式をしているかについて検討を重ねた。また、ウエスタンブロット法により、受容体タンパクの発現を試みた。S1P受容体下流のシグナル伝達の解析については既知シグナルであるp43/44 MAPK経路(選択的MEK阻害剤U0126)、PIK 3/Akt経路(選択的PI3K阻害剤wortmannin)、Ras/ERK経路(選択的AP-1阻害剤curcumin)、NF-κB経路についてはp65サブユニットのモノクローナル抗体などを用いて免疫染色を行い、NF-κB阻害剤helenalinによる選択的阻害剤を用いた阻害実験も試みた。S1PR1-5の各受容体の発現様式を検討し、S1Pシグナルにおける初期応答の活性化機序の解析、そして活性化に関与すると思われるシグナル伝達転や転写因子による長期的な活性調節の作用を中心に研究を展開してきたが、今後データ解析を進めまとめていく所存である。スフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)が悪性腫瘍、動脈硬化や糖尿病、骨粗鬆症などの病態進行を調節する重要な因子として最近注目を浴びている。S1Pは様々な細胞から分泌され、5つの特異的なGタンパク質共役型受容体を介するシグナル伝達因子として、オートクライン、パラクラインに作用するが、口腔がんにおけるS1Pシグナル伝達については未だ不明な点が多い。本研究では、口腔癌細胞株を用いて、S1Pによる細胞増殖能や細胞遊走能への影響について検討し、さらに細胞株のS1P受容体サブタイプ(S1PR1-5)の発現様式を確認のうえ、そのシグナル伝達経路についていくつかの知見を得た。臨床、教育エフォートに時間を要し、十分な研究エフォートが確保できなかった。臨床検体の収集を行うことを計画し、本学倫理委員会への申請を行った。承認後、口腔がん患者の検体についても蓄積を始めたが、検体数の確保が進まず、解析にはもうしばらく時間がかかることが予想される。文献などの情報から最新の知見を得ながら、研究の遂行に努める所存である。培養実験でのS1Pシグナルの機能を、既知の因子を中心に選択肢を広げて可及的に解析を進める。
記憶中枢の海馬で♀と♂の性差を分子論的に明らかにする

記憶・学習中枢である海馬の性差解明を目的とし、雌は性周期毎に解析した。(1)海馬内の性ステロイド濃度には明確な性差があった。海馬の女性ホルモンは、雄が、性周期変動をする雌より高かった。海馬の男性ホルモンも雄の濃度が高かった。しかし、雌で性周期変動をしなかった。(2)性ステロイド合成酵素と受容体のmRNA発現は、驚くべきことに性差も性周期に伴う変動も見られなかった。(3)雌海馬神経スパインは性周期に伴って変動した。スパイン密度の変動はPro→Est↓→D1↑→D2↓→Pro↑のように増大・減少を繰り返し、性差が存在した。雌では海馬内性ステロイドとスパイン密度の変動が一致していた。記憶・学習中枢である海馬の性差を解明するために、(1)性ステロイド濃度、(2)性ステロイド合成酵素と受容体のmRNA発現量、(3)記憶部位の神経スパイン(シナプス後部)の密度について雌雄の比較を行った。雌は性周期(Proestrus: Pro, Estrus: Est, Diestrus1: D1, Diestrus2: D2)がある。海馬の女性ホルモンEstradiol(E2)は、雄(8.4 nM)が雌(0.5ー4.3 nM)より高かった。雌の海馬では、E2はProで最大値4.3 nM、D1で最低値0.5 nMであった。これらの変動は血中の変動パターンと似ているが、海馬の濃度のほうが高かった(E2は血中の40ー100倍)ので、E2は海馬で合成されて性周期変動を起こしている。海馬の男性ホルモンTestosterone(T)は、雄は17 nMで雌は1-2 nMであり雄の濃度が高かった。Tは雌で性周期変動をしなかった。海馬のステロイド合成能は性別・性周期ステージに依存せず、ほぼ一定とみなせる。従って性周期に伴う海馬E2の変動は、血中の変動するPROGを基質として海馬内で生成されたものと考えられる。(3)海馬神経スパインは性周期に伴って変動した。密度は雄≒雌Pro≒雌D1 >雌Est ≒雌D2であり、性差が存在した。雌のスパイン密度が高いProとD1は海馬内E2, PROGが最大となるステージであり、海馬内性ステロイドとスパイン密度の変動が一致していた。以上、海馬内で合成される性ステロイドには大きな性差が存在し、それが記憶貯蔵部位であるスパイン密度の性差を決める重要な因子であることが示唆される。(A)質量分析を繰り返し行い、「♀海馬内でのエストラジオール(E2)は、血中の生理周期による変動にほぼ比例する形で変動する」ことを見出した。海馬と血中でE2変動の位相にずれはないようであった。共にProestrus (Pro)で最高値を示した。但し、海馬中のE2は血中のE2より濃度が30倍も高かったので、血中から海馬にE2が流入しているのではなく、海馬自身の合成だと言い切れる。(B)海馬ではPROGとE1という女性ホルモンも変動を示した。海馬PROGは血中PROGの2倍の濃度であり、共にDiestrus-1 (D1)で最高値を示した。(C)海馬内の女性ホルモン合成酵素(P450(17α),17β-HSD, P450arom)のmRNAを生理周期で解析したところ、驚くべきことに全く変動がみられなかった。従って、PROGの生理周期変動によってPROG→ADinone→E1→E2という変換によって、E2の生理周期変動が発生したのではないか、と考えられる。ただPROG, E2の最高値の日はずれているので、変換中に位相がずれている。ADinone→E1の時にPro以外の濃度が低下し、大きく位相がずれている。(D)女性ホルモン受容体[ERα, ERβ, PR]のmRNA発現量は生理周期で変動が全く無かった。これも予想外であった。(E) ♀海馬のテストステロンTは生理周期でほぼ全く変動しなかったので。従って、性ホルモン関連でも、全てが大きく変動するわけはなかった。

♀海馬の記憶機能が、生理周期で大きく変化することはないということが、これまでの神経行動学の報告で出ている(モリス水迷路などの成績は♀の生理周期で変動すると言う報告と、変動しないと言う報告が両方ある)。この空間学習能が男性ホルモンTに支配されているとすると、変化しなくてもよいと考えられる。当該年度の計画に書いた(A),(B),(C),(D),(E)が、ことごとく達成されているから。(F) ♀で卵巣を摘出して、血中からのPROG, E1,E2,Tの寄与をなくした場合、海馬のPROG, E1,E2,T濃度はどうなるか?合成酵素[P450(17α),17β-HSD, 3β-HSD, P450arom]のmRNAの発現に影響は及ぶのか?という問題を追及する。(G) ♂海馬(既に多くのデータ蓄積あり)と、♀とを比較する(Hojo et al.,2009 Endocrinology; Kimoto et al., 2010 Endocrinology)。♂は♀(予備測定)よりも海馬内E2濃度が8倍程度高いので、これから性差が引き起こされるはずだと考えられる。スパイン密度や頭部に差が出るのか出ないのか?も解析する神経シナプスの長期増強(電気生理)の差(♂>♀)がE2濃度の差(♂>♀)だけで説明できるのかどうかも考える。消耗品と人件費にあてる
金属ガラスの変形・破壊の分子動力学シミュレーション:局所格子不安定性による検討

本研究では,金属ガラスの変形・破壊のメカニズム解明を目的として,分子動力学を用いて種々のシミュレーションを行うとともに,各原子位置における原子弾性剛性係数の正値性という独自の視点(局所格子不安定性解析)から議論することを試みている.昨年度までの検討で,局所格子不安定性解析による新たな知見を多数得ることが出来たものの,降伏などの巨視的な系の応力-ひずみ応答と系および局所の弾性剛性係数の変化とを直接的に結びつけることは容易ではなかった.そこで本年度は,Ni単元系アモルファスについて,全原子を不安定原子とそれ以外の安定原子とに分け,それぞれの応力平均の変化を見ることによって,アモルファス金属における安定,不安定原子の力学状態ならびに役翻について検討した.不安定原子の平均応力は,安定原子のそれより常に大きく,大きく変形している弱い部分であると解釈できること,流動変形へ遷移するまでの複雑な応力-ひずみ応答がこの不安定原子の横方向強度の異方性に起因していることなどを明らかにした.すなわち,構造の幾何学関係では見いだすことのできないアモルファス中の「欠陥」を,局所格子不安定解析により明らかにすることが出来る.続いて,球状の価電子分布を持つNiとの比較として,電子分布に方向性を持ち共有結合(ボンド)的な性質を有するAlの単元系アモルファスについても同様に検討した.不安定原子の系全体における割合変化を検討した結果,Ni単元系アモルファスでは不安定原子が増加して変形を吸収するのに対して,Al単元系では,不安定原子が減少することによって変形を吸収していることを明らかにした.すなわち,NiとAlいずれも動径分布関数などの構造解析ではアモルファスと判断されても,変形メカニズムがまったく異なることを局所格子不安定性解析によって明らかにした.本研究では,金属ガラスの変形・破壊のメカニズム解明を目的として,分子動力学を用いて種々のシミュレーションを行うとともに,各原子位置における原子弾性剛性係数の正値性(局所格子不安定性)という独自の視点から議論することを試みている.まず初めに,ひずみ・応力制御の違い,引張軸に対して垂直方向の拘束,ひずみ速度などの境界条件を変化させた種々の引張シミュレーションを行った.その結果,横拘束下の引張では,ひずみ・応力制御のいずれにおいても系全体の弾性剛性係数が不安定に達した時にアモルファス内部にボイドが発生することにより不安定挙動が生じることなどを明らかにした.しかしながら,これら全方向周期境界条件の下で行うバルク材のシミュレーションでは,せん断帯などの大域的な不均一変形が観察しにくい.そこで,自由表面を有する薄膜アモルファス金属の引張シミュレーションを行うことによって,アモルファス金属の変形の局所化挙動について検討した.その結果,Ni単元系アモルファスにおいては,応力-ひずみ曲線のピークにおいて,薄膜側面のくびれ部分から大きく結晶化が生じており,結晶化によって応力緩和が引き起こされること,結晶化することによってアモルファス中の不安定原子が安定原子へと遷移するために不安定原子が減少すること,NiA1二元系アモルファスにおいて結晶化は大きく生じないが,側面のくびれ部を起点としてせん断帯のような大きなひずみの局所化挙動が観察されることなどを明らかにした.本研究では,金属ガラスの変形・破壊のメカニズム解明を目的として,分子動力学を用いて種々のシミュレーションを行うとともに,各原子位置における原子弾性剛性係数の正値性という独自の視点(局所格子不安定性解析)から議論することを試みている.昨年度までの検討で,局所格子不安定性解析による新たな知見を多数得ることが出来たものの,降伏などの巨視的な系の応力-ひずみ応答と系および局所の弾性剛性係数の変化とを直接的に結びつけることは容易ではなかった.そこで本年度は,Ni単元系アモルファスについて,全原子を不安定原子とそれ以外の安定原子とに分け,それぞれの応力平均の変化を見ることによって,アモルファス金属における安定,不安定原子の力学状態ならびに役翻について検討した.不安定原子の平均応力は,安定原子のそれより常に大きく,大きく変形している弱い部分であると解釈できること,流動変形へ遷移するまでの複雑な応力-ひずみ応答がこの不安定原子の横方向強度の異方性に起因していることなどを明らかにした.すなわち,構造の幾何学関係では見いだすことのできないアモルファス中の「欠陥」を,局所格子不安定解析により明らかにすることが出来る.続いて,球状の価電子分布を持つNiとの比較として,電子分布に方向性を持ち共有結合(ボンド)的な性質を有するAlの単元系アモルファスについても同様に検討した.不安定原子の系全体における割合変化を検討した結果,Ni単元系アモルファスでは不安定原子が増加して変形を吸収するのに対して,Al単元系では,不安定原子が減少することによって変形を吸収していることを明らかにした.すなわち,NiとAlいずれも動径分布関数などの構造解析ではアモルファスと判断されても,変形メカニズムがまったく異なることを局所格子不安定性解析によって明らかにした.
酸化LDLによる内皮細胞の産生する血液凝固調節因子の発現異常:機構解析と修復薬物の検索

本研究代表者は、動脈硬化巣に蓄積し動脈硬化の進展に関与する酸化LDLが内皮細胞の抗血栓性因子であるトロンボモジュリン(TM)の発現を低下させ、逆に血栓形成因子である組織因子(TF)の発現を誘引する現象をすでに見いだした。本研究はこの現象の機構を解明すべく計画され、動脈硬化巣で血栓が発症しやすい原因を解き明かすものである。以下の新知見を得た。以下の項目番号は科学研究費補助金交付申請書の研究実施計画に記載した番号と一致する。1.酸化LDLによるTM発現低下の機構解析(1)酸化LDLによるTM発現の低下はスカベンジャー受容体は介していない。(2)酸化LDL中の脂質成分によってTMの発現が低下する。(3)酸化LDLによるTM発現の低下は遺伝子転写活性の阻害による。(4)酸化LDLによるTM遺伝子転写活性の阻害は酸化LDLに対して特異的な受容体を介してリソゾームに取り込まれ、リソゾームで代謝を受けた過酸化脂質によってもたらされる。2.酸化LDLによるTF発現誘導の機構解析(1)酸化LDLによりTFは約6時間をピークに抗原量として発現が誘導される。(2)その発現量は酸化LDLの酸化程度に比例する。(3)遺伝子レベルでの機構までは明らかにできなかった。3.酸化LDLによるTM発現低下とTF発現誘導を抑制する薬物の検索細胞内サイクリツクAMP濃度を上昇させる物質およびレチノイン酸に本目的効果のあることが明らかになった。以下の新知見を得た。
ヒトフィブリノーゲンによる歯周病原性菌の共凝集の阻害機序

本研究では,Porphyromonas gingivalisとStreptococcus oralisの共凝集に及ぼす各菌体とフィブリノーゲンの前処理による影響や各菌体のフィブリノーゲンに対する結合親和性を調べることにより,フィブリノーゲンが共凝集を起こす菌へどのように作用して阻害を起こすのかを明らかにすること,さらに,P.gingivalisのもつプロテアーゼがフィブリノーゲンによる共凝集阻害にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることを目的とした.その結果,プロテアーゼ非存在下ではどちらの菌体をフィブリノーゲンで前処理しても共凝集活性には影響を及ぼさなかったが,チオールプロテアーゼインヒビター存在下では,P.gingivalisフィブリノーゲンを前処理した時のみ共凝集活性が阻害された.このことより,P.gingivalisのもつプロテアーゼにより,フィブリノーゲンが分解されることが示唆された.^<125>I標識フィブリノーゲンを用いて両菌体との結合親和性を調べたところ,フィブリノーゲンはS.oralisよりもP.gingivalisに高い親和性をもつことが示された.^<125>I標識フィブリノーゲンと反応させた菌体およびその上清をSDS-電気泳動し,オートラジオグラフィを行ったところ,プロテアーゼインヒビター非存在下ではフィブリノーゲンは分解されたが,チオールプロテアーゼインヒビター存在下ではフィブリノーゲンはほとんど分解されずにP.gingivalisに結合することが示された.また,S.oralisに結合したフィブリノーゲンも認められたが,量的には,P.gingivalisに結合したフィブリノーゲンに比べると少なかった.以上の結果から,フィブリノーゲンによるP.gingivalisとS.oralisの共凝集の阻害は,主としてフィブリノーゲンがP.gingivalisに結合にすることにより生ずること,阻害効果を発揮するためには,P.gingivalisのもつプロテアーゼによる分解を受けないような環境が必要であることが示唆された.本研究では,Porphyromonas gingivalisとStreptococcus oralisの共凝集に及ぼす各菌体とフィブリノーゲンの前処理による影響や各菌体のフィブリノーゲンに対する結合親和性を調べることにより,フィブリノーゲンが共凝集を起こす菌へどのように作用して阻害を起こすのかを明らかにすること,さらに,P.gingivalisのもつプロテアーゼがフィブリノーゲンによる共凝集阻害にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることを目的とした.その結果,プロテアーゼ非存在下ではどちらの菌体をフィブリノーゲンで前処理しても共凝集活性には影響を及ぼさなかったが,チオールプロテアーゼインヒビター存在下では,P.gingivalisフィブリノーゲンを前処理した時のみ共凝集活性が阻害された.このことより,P.gingivalisのもつプロテアーゼにより,フィブリノーゲンが分解されることが示唆された.^<125>I標識フィブリノーゲンを用いて両菌体との結合親和性を調べたところ,フィブリノーゲンはS.oralisよりもP.gingivalisに高い親和性をもつことが示された.^<125>I標識フィブリノーゲンと反応させた菌体およびその上清をSDS-電気泳動し,オートラジオグラフィを行ったところ,プロテアーゼインヒビター非存在下ではフィブリノーゲンは分解されたが,チオールプロテアーゼインヒビター存在下ではフィブリノーゲンはほとんど分解されずにP.gingivalisに結合することが示された.また,S.oralisに結合したフィブリノーゲンも認められたが,量的には,P.gingivalisに結合したフィブリノーゲンに比べると少なかった.以上の結果から,フィブリノーゲンによるP.gingivalisとS.oralisの共凝集の阻害は,主としてフィブリノーゲンがP.gingivalisに結合にすることにより生ずること,阻害効果を発揮するためには,P.gingivalisのもつプロテアーゼによる分解を受けないような環境が必要であることが示唆された.
日系アメリカ人の象徴的エスニシティに関する一考察　四世のルーツ探求行為に着目して

日系アメリカ人は主流文化への同化により社会的地位の上昇を果たしたことから、成功したマイノリティと称されてきた。一方、同化が進み日本との繋がりの希薄化が指摘されている。そういった中、若い世代の間で日本語や日本文化を学ぶことを通しルーツを探求する動きがみられる。Gans(1979)は、実生活に影響を及ぼさないルーツ探求を象徴的エスニシティと呼び白人にのみ当てはまるとした。本研究では、日系四世への調査を通し、象徴的エスニシティの有無とその条件を考察、世代交代を経た日系人の文化変容と社会的位置づけ及びその要因を明らかにする。そこから、現代アメリカ社会に生きる若い世代のアジア系移民の新しい知見を得る。
慢性疼痛下のモルヒネ反復投与によるオピオイド受容体情報伝達の変容と脱感作抑制現象

臨床におけるがん性疼痛治療において、モルヒネの反復投与による耐性・依存が形成されにくいとの報告がある。我々は慢性疼痛モデル動物を作成し、上記の現象を再現することに成功し、痛み刺激によるκオピオイド受容体(κ受容体)機構の活性化や、protein kinase C(PKC)などによる受容体リン酸化の減少が耐性形成抑制を誘導する可能性を示唆してきた。さらに、昨年度の報告においては、慢性疼痛下におけるmorphineの鎮痛効果に対する耐性形成抑制は、痛み刺激によるκ受容体機構の活性化が起こることによってcPKC活性が減弱し、μ受容体リン酸化の減少、すなわちmorphine耐性形成の抑制を導く可能性を示唆した。近年、細胞接着分子の一つであるNeural Cell Adhesion Molecules(NCAM)が、モルヒネμ受容体刺激によるPKCのリン酸化シグナル伝達機構の一部を共有し、さらに細胞レベルではNCAMの発現量低下とμオピオイド受容体の発現量低下が相関していることが報告されていることから、本年度は、新たな分子種としてNCAMに焦点を当てて検討した。NCAMに対するAS-ODNの処置によって、モルヒネの耐性形成は抑制された。さらに、モルヒネ耐性形成マウスの脳中脳部位におけるcPKCタンパク質の発現上昇もAS-ODNの処置によって薬物未処置の対照群レベルに回復した。さらに、モルヒネの耐性形成時には、NCAMタンパク質発現がモルヒネ投与後数時間で消失することが明らかになった。一方、慢性疼痛下のモルヒネ耐性不形成時には、NCAMタンパク質発現に変動はみられなかった。以上、慢性疼痛下におけるmorphineの鎮痛効果に対する耐性形成抑制には、NCAMの消失そのものに起因するのではなく、モルヒネ投与後にNCAMの急激な変動が起こらないことが、cPKC活性の上昇を抑制する機序において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。臨床におけるがん性疼痛治療において、morphineの反復投与による耐性・依存が形成されにくいとの報告がある。我々は慢性疼痛モデル動物を作成し、上記の現象を再現することに成功し、痛み刺激によるκオピオイド受容体(κ受容体)機構の活性化や、protein kinase C (PKC)などによる受容体リン酸化の減少が耐性形成抑制を誘導する可能性を示唆してきた。今年度は、慢性疼痛下におけるκ受容体mRNAの発現変化、morphine耐性形成抑制時における各種PKCサブタイプの関与、さらにはPKCの変動に対するκ受容体の関与について検討した。Morphineの鎮痛効果に対する耐性が形成されたマウス脳中脳部位において、薬物未処置の対照群に比較してκ受容体mRNAの有意な発現上昇が観察された。しかしながら、慢性疼痛下のmorphine耐性不形成動物においては、κ受容体mRNA発現の顕著な変化は認められなかった。行動薬理学的検討において、cPKC型のPKCα、β、γサブタイプに対するAS-ODN処置は、慢性疼痛下と同様にmorphine耐性形成が抑制され、nPKC、aPKC型では影響は認められなかった耐性形成時にcPKCサブタイプのタンパク質発現上昇がみられたが、慢性疼痛下ではその上昇は消失した。さらに、慢性疼痛動物にκ受容体に対するAS-ODNの処置によって、耐性が形成されPKCαの発現上昇もみられた。以上、慢性疼痛下におけるmorphineの鎮痛効果に対する耐性形成抑制は、痛み刺激によるκ受容体機構の活性化が起こることによってcPKC活性の減弱し、μ受容体リン酸化の減少、すなわちmorphine耐性形成の抑制に起因するものと推察される。