hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MNU誘発網膜色素変性症動物モデルにおけるオートファジーの関与とその分子制御

さらに、MNU以外の化学物質誘発による網膜変性症モデルでのオートファジー機構の関与について検討を行うために、N-エチル-ニトロソ尿素(ENU)をLewis系ラットやICH系マウスに投与したときの眼球病変について精査した。その結果、ENUはラット・マウスに網膜変性症を短期間に誘発することがわかった。ヒト網膜色素変性症は視細胞の進行性の変性・消失を特徴とし、失明を来す遺伝性疾患で未だ治療法のない難病であり、その病態の理解と治療法の開発には動物モデルの存在が必須である。我々は、N-メチル-N-ニトロソ尿素(MNU)による動物モデルを確立し、その病態制御を試みてきた。オートファジー(AP)は全ての真核細胞に普遍的に備わる細胞内蛋白分解経路であり、正常細胞での細胞内成分の新陳代謝(細胞内浄化)に寄与する他、栄養飢餓、一部の神経変性疾患に加え、加齢性黄斑変性症や緑内障などの眼科疾患での関与が注目されている。網膜変性症動物モデルにおけるAPを介する視細胞の死滅機構を明らかにし、網膜でのAP発現調整によるヒト網膜色素変性症の治療法確立を目指すことが本研究の目的である。我々はこれまでにMNU誘発マウス網膜変性症モデルでのAPの関与ならびにカルパイン阻害剤による視細胞死抑制との関連に検討を行い、MNU誘発網膜変性にはAP抑制が関与し、カルパイン阻害剤による視細胞死抑制にはAP保持が関与することを明らかにした。さらに遺伝性網膜変性症rdマウスにおけるオートファジー機構の関与につき検討した。MNU以外の化学物質誘発による網膜変性症モデルでのオートファジー機構の関与について検討を行うために、昨年度、我々が確立したN-エチル-N-ニトロソ尿素(ENU)をLewis系ラット投与したときの網膜変性症モデルを用いて、LC-3免疫染色によりオートファジーの動態を検討した。時間の経過とともにENU群では網膜変性が進行したものの、網膜内層に染色されるはずのLC-3陽性像の出現が一定ではなく、LC-3免疫染色による網膜におけるオートファジーの動態観察は困難であると判断した。これまでにMNU誘発マウス網膜変性症および遺伝性網膜変性症rdマウスの2種類のモデルにおいて、その視細胞死とオートファジー機構の関連について明らかにできた。さらに、ENU投与により新たな化学物質誘発網膜変性症モデルをラットおよびマウスで確立することできた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、MNU誘発マウス網膜変性症および遺伝性網膜変性症rdマウス以外の動物モデル、すなわち新たに開発できたENU誘発網膜変性症モデルを用いて、その病理発生とオートファジー機構の関連について検討する。その結果、オートファジー機構の抑制が網膜変性症モデルに普遍的にみられる事象であるということを明らかにする予定である。
代謝制御機構の理解と有用菌株デザインに向けた大腸菌の代謝ダイナミクス解析

本研究では、代謝制御機構の理解と産業上有用とされる化合物を生産する有用菌株デザインを目的として、大腸菌の細胞内の代謝のダイナミックな変化を代謝フラックス分布の変化からとらえることを目的とした。生物の代謝は、遺伝子発現レベルでさまざまなタンパク質により制御を受けていることが知られている。代謝制御に関わるタンパク質の遺伝子を欠損させた細胞を培養することで、親株とは異なる細胞内酵素濃度組成になった状態の細胞が得られると予想される。そこで、大腸菌の野生株および細胞内代謝を制御するタンパク質をコードする遺伝子の欠損株を培養し、代謝の変化を測定した。また、野生株をさまざまな酸素レベルの状態で連続培養を行い、代謝フラックスの変化を解析した。さらには、細胞内遊離のアミノ酸についての分析データから、代謝フラックス分布を決定する手法の開発を試みた。本研究により確立された手法を有機酸などの有用物質を生産する菌株に適用させることにより、微生物を用いた有用物質生産においてさらなる生産性向上を目指した育種の指針を導出することができると期待される。本研究では、大腸菌の野生株および細胞内代謝を制御するタンパク質をコードする遺伝子の欠損株および過剰発現株について、細胞内の遺伝子発現と細胞内代謝物質濃度のダイナミックな変化を測定することを目的とする。本年度は代謝制御に関わるタンパク質の遺伝子(crr・fruR・crp・yeel)の欠損株を培養し、親株と比較してどのような生理学的な違いが見いだされるかを解析した。また、遺伝子発現や細胞内代謝物質濃度を測定するための測定系の構築を開始した。解糖系を中心とする各種中間代謝物質の標品の混合物を調製し、ガスクロマトグラフ-質量分析計(GC-MS)を用いてそれぞれの物質を分離・同定することができるかどうか検討した。現状では、数種類の物質については測定することが可能となったが、さらに測定可能となる物質の種類を増やすため誘導体化法やGC-MS測定条件の検討を行う必要がある。遺伝子発現に関しては、Genechipを用いた網羅的遺伝子発現解析に着手した。RNA調製において解析に用いるために十分な収量が得られないため、RNA調製法やRNAの増幅等をさらに検討する必要がある。大腸菌の野生株および細胞内代謝を制御するタンパク質をコードする遺伝子の欠損株を培養し、代謝フラックスの変化を測定した。代謝制御に関わるタンパク質の遺伝子を欠損させた細胞を培養することで、親株とは異なる細胞内酵素濃度組成になった状態の細胞が得られると期待される。このような大腸菌の菌株について、代謝の変動のダイナミクスを明らかにし、大腸菌の代謝制御機構の解明を試みた。
人工関節骨融解、骨吸収に関与するNFATについての研究

転写因子NFAT阻害による人工関節周囲骨融解の抑制効果を、ヒト骨髄細胞及びマウス頭蓋骨モデルにおいて検討した。1.人工関節置換術患者の骨髄を培養して破骨細胞へ分化させた。PMMA投与による破骨細胞分化促進とNFAT阻害剤(CsA)による破骨細胞分化抑制効果を検討した。CsAでPMMAによる破骨細胞分化が有意に抑制された。2.Wild Typeマウス頭蓋骨にPMMAを麻酔下に頭蓋骨に負荷し、頭蓋冠周囲に骨融解を誘発した。CsAを局所投与し破骨細胞分化、頭蓋冠周囲骨融解の抑制効果を検討した。CsAによりPMMAによる破骨細胞分化、骨融解が有意に抑制された。本研究の目的は人工関節摩耗粉の刺激によってマクロファージから破骨細胞への分化が促進されるメカニズムについて、NFATとの関連を中心にそのkey mediatorとなるタンパク質、転写因子をヒトのマクロファージ及びin vivoモデルにおいて分子生物学的手法を用いて解明し、臨床応用へ進めることである。1.人工股関節置換手術患者からヒト骨髄の採取、培養。人工関節摩耗粉刺激下でNFAT阻害剤(シクロスポリンA、VIVITなど)使用による細胞内シグナル伝達、破骨細胞分化抑制人工関節置換術、及び再置換術手術患者の骨髄を採取し、マクロファージを培養して破骨細胞へ分化させる。人工関節摩耗粉はPMMA,Ti,ポリエチレンを用いて、細胞を刺激する。Osteoclst Assayで人工関節摩耗粉にて刺激した群とさらにNFAT阻害剤を加えた群でも同様の実験を行い、阻害剤の効果を比較検討した。2.マウス頭蓋骨モデルの作製人工関節周囲摩耗粉刺激下で各阻害剤を投与し、投与時期、回数、投与方法(全身、局所投与)の違いによる効果の評価Wild Typeマウス頭蓋骨に人工関節摩耗粉を麻酔下に頭蓋骨に負荷すると、破骨細胞分化及び頭蓋冠周囲に骨融解が見られる。さらに各阻害剤を局所投与、全身投与し破骨細胞分化、頭蓋冠周囲骨融解の抑制効果を検討する。頭蓋冠の破骨細胞数、及び骨面積測定のソフトウェア(NIHイメージ)にて骨溶解部の面積を計測、評価した。以上の実験結果を国内学会発表した。次年度は海外学会発表、論文投稿予定である。以上の実験結果を国内、海外学会に発表した(第25日本整形外科学会基礎学術集会で優秀ポスター賞)。海外雑誌に論文投稿中である。
複数メディア併用とセンサデータ転送によるロバストな衝突防止車々間通信システム

先年度より開発している多車線自動車専用道路での車群の走行・合流の状況に対応した、車両の相対速度・道路構造に応じて車載センサ情報の配信頻度を動的に制御する方式(PRRS: Positional Relationship and Road Structure-based method)について改良を行った。同方式では、各車両が自律的に周辺車両との相対的な位置関係を判断し、車群の中でLIDAR、カメラ等のセンサによる監視可能範囲がより広くなる車両に対してセンサ情報の配信頻度を高く与える。本方式に加え、配信頻度固定の場合、並びに信号品質・通信状態に基づいて動的に配信頻度を行う従来手法(ATB)のシミュレーションモデルを設計・実装し、性能比較を行った。この結果、提案方式は従来手法に較べて、通信トラフィックを大幅に低減しながらも自車両で直接検知できない車両の存在を高い確率で検知可能とすることが確認できた。車々間通信による車両の存在位置通知を利用して、信号機のない見通しの悪い交差点で、衝突を発生させずに交差を可能とする車両速度制御方式を設計した。シミュレーションにより同方式による通過可能交通量が向上効果、最高速度が十分低い条件での同方式に必要となる通信距離の要件を確かめた。上述した手法のためのソフトウェア実装評価のための無線LANシステムエミュレーションフレームワークを設計した。同フレームワークは、無線LANにおける信号強度変化や接続姓変化等をエミュレーションし、実際のOS、アプリケーションを用いて広範囲の移動端末の移動を想定したシステム動作確認、評価を可能とする。また、同フレームワークを用いたエミュレーションにおけるネットワーク挙動の観察を低い観測者効果の下で可能とする監視機構を設計した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。シミュレーションベースのシステム評価ツールScenargieを用い、ミクロなドライバ行動、車両挙動、電波通信、可視光・ミリ波通信および車両情報送信頻度制御アルゴリズムのシミュレーションモデルを設計した。特に隊列走行、無線通信(DSRC)・可視光通信の併用通信制御プロトコル、車車間無線通信の妨害モデルを構築した。これらのモデルを利用し、電波・可視光による通信インタフェースを連係し、電波による通信への妨害がなされていても、可視光通信によるバックアップを用いることで運転制御メッセージ伝達の損失を防ぎ、かつ短い遅延でのメッセージ配送を可能とするプロトコルを開発し、シミュレーション評価によって、その効果を明らかにした。また、車載カメラ画像の共有プロトコルの開発を行い、車車間無線通信およびセルラを併用した手法により、少ないトラフィックで効率的に画像情報を共有可能であることをシミュレーション評価で明らかにした。以上のミクロなシミュレーションベースの検討に加え、マクロなシミュレーションベースで安全と交通効率を両立する車両制御則の検討を進めた。単一車線において通信を行う自律車両とそうではない通常車両が混在する環境をシミュレーション上に構成し、ランダムに一部の車両に急減速が発生する環境において、安全率(衝突が起きなかった割合)と交通流量(時間あたりの車両の通行台数)の評価を行った。センサ観測により得られる直前の車両の位置・速度情報に加えて、車々間通信により得られる2台前の車両の位置・速度情報を用いた車両の制御則を提案し、安全率と交通効率のトレードオフのバランスを取るパラメータの最適化を行った。その結果、直前の車両の情報を用いる制御則と比較して、提案する車々間通信にもとづいた制御則が安全率・交通流量のより良いバランスを達成可能であることがわかった。当初計画していた事故発生を含む道路状況のモデリング、車両制御、通信プロトコルのシミュレーションモデルの構築、並びに複数メディアを併用した事故防止情報共有プロトコルの設計に関しては、概ね順調に進行している。特に可視光通信を併用したモデルの開発、利用したプロトコルの開発を前倒して行い、電波通信へのジャミング攻撃モデルの開発とそれを用いたプロトコルの頑健性の評価を行った。これらは当初予定よりも早く進行している。自動車関連企業との連係も進められている。一方で、計画では初年度は既存の通信制御モデル(D-FPAV、ETSI DCC、定期的出力変更方式等)の車車間通信向けの代表的な動的送信電力出力変更、送信頻度変更手法)に関して、基礎的なシミュレーションモデルを構築していくこととしていたが、これらに関しては、進行が若干遅れている。また、人間工学に関しての専門家との関係構築を行い、人間工学の見知からの制御則の検討を進めることとしていたが、こちらに関しては準備が不十分である。車車間通信に基づいて自律隊列走行を行う車両群に対し、通信妨害が行われた場合にも安全な走行を可能とする電波・可視光通信併用型の制御情報通信方式を設計、評価した。前年度までに評価した隊列制御情報の通信品質への影響に加え、隊列の行動への影響を含めて評価を進め、電波・可視光通信併用型の制御情報通信方式によって、車間距離5m, 60km/h程度での隊列走行において電波および可視光に対する妨害攻撃があったとしても衝突を十分に回避できる見込みが高いことを示した。受信電波強度、送信電波強度等の無線インタフェースの物理的制御情報の利用、操作を伴う無線ネットワークシステム実装の評価をネットワークエミュレーション環境で可能とするためのLinux上で動作する仮想ネットワークデバイスを設計・実装し、実験によりその基本的動作を確認した。車車間通信とLIDARによる周辺車両位置の検出が可能な車両(センシング車両)、ならびに通信とセンシングができない車両(非通信車両)の混在条件において、車車間通信によるセンシング情報交換によってセンシング車両による非通信車両の位置を把握する場合の位置推定精度について、様々なセンシング車両普及率、バックグラウンドトラフィックのもとでシミュレーションにより調査した。

車両の位置依存情報に関する要求の地理的分布を確率的表現によって率的に表現し、車車間通信によってそれらを効率的に共有する方法を設計し、シミュレーションによりこの効果を明らかとした。事故防止と交通効率を効率化するための車両制御則について検討を進めた。前年度に実装した単一車線での速度制御モデルを修正・検証し、安全率と交通効率の両立が可能になる条件の検証を行った。車車間通信にもとづいた提案制御則が安全率・交通流量の改善につなげられる範囲を、異なる自律車両の割合に対して同定した。事故発生を含む道路状況のモデリング、車両制御、通信プロトコルのシミュレーションモデルの構築、並びに複数メディアを併用した事故防止情報共有プロトコルの設計に関しては、概ね順調に進行しており、隊列走行制御に電波通信と可視光通信を併用した場合の電波・可視光での通信妨害攻撃の隊列走行への影響評価を行うに至った。また、センシング・通信可能車両と非通信車両の混在条件における位置推定精度の評価環境を構築し、センシング情報の共有プロトコル設計・開発の基本環境を整えることができた。また、Linux上で動作する仮想無線ネットワークデバイスの基礎的な実装を行い、センシング情報の共有プロトコルの実装を含めたエミュレーション環境による評価環境ができつつある。事故防止と交通効率を効率化するための車両制御則の設計に関しては、当初は手動運転と自動走行車両のモデル構築に難航したが、2年目となる前年度にこれらのモデルができあがり、基礎的な評価を進めることができた。一方で、既存の通信制御モデル(D-FPAV、ETSI DCC、定期的出力変更方式等)の車車間通信向けの代表的な動的送信電力出力変更、送信頻度変更手法)に関する、基礎的なシミュレーションモデルを構築していくこととしていたが、これらに関しては、進行が遅れている。また、人間工学の見知を取り入れることを本研究では狙っていたが、こちらも専門家との連携づくりが不十分である。無線LANで通信する車両の位置の変化などによる無線信号受信強度の変化、動的な信号送信電力の調整に対応可能なLinux向け仮想無線LANデバイスドライバを設計・実装し、稼働時のオーバーヘッドを測定して、これをシミュレータソフトウェアと接続することで、実際の車々間通信アプリケーション・ミドルウェアを使用しながら仮想的な車両の移動と電波通信の振舞いを模擬したエミュレーションを実行可能であるという見通しを得た。車々間通信による制御情報交換に基づいて自動隊列走行を行う車両の一部に手動運転車両を混在させ、自動走行車両群が手動運転車両の行動モデルに基づいて速度調整を行う手動車両混在型の自動隊列走行に対し、通信妨害攻撃を適用した場合の隊列制御への影響を調べ、通信妨害による隊列走行への影響が明らかに発生することを確認した。
新規水素吸入療法による院外心停止患者の予後改善を目指した臨床研究

本研究は、水素吸入療法の院外心停止蘇生後患者に臨床応用を目指したトランスレーショナルリサーチである。まず、ラット心停止蘇生後モデルを用い水素吸入の有用性の検証した。水素吸入群では、脳機能スコアおよび生存率が対照群と比較して改善した。水素吸入と低体温療法を併用することにより最も改善効果を認めた。さらに、蘇生後患者に対し水素吸入の安全性と有効性の評価を行った。事前に設定した予測しうる心停止発症後7日間以内の臨床的異常変動を観察し、副作用および臨床上の不利益をみとめなかった。対象全5例中4例が独歩退院した。今後、多施設無作為化試験により心停止後症候群患者に対する水素吸入の効果を検証する予定である。以下の動物実験を行い、非高濃度酸素下においての、水素吸入の有効性の検証を行った。[研究の背景1現在、極めて予後不良な院外心停止蘇生後患者の増加は、国際的公衆衛生上の課題となっている。現時点で心停止患者に対する特異的な治療として低体温療法が施工されているが、その効果は十分とは言えず、脳・心臓後遺症のため社会復帰率も低く、生命予後は極めて不良である。心肺停止蘇生後の臓器障害の原因である全身の虚血再灌流障害を軽減するための新規治療確立が急務である。分子状水素ガス(H2)は抗酸化物質として注目されている。[目的]心停止蘇生後症候群に対する低体温療法とH2吸入療法の予後改善効果を比較検討すること。[研究方法]Wister ST rat♂を用いて経皮的心外膜電気刺激による心室細動/心停止モデル(心停止6分間)を作成し、3分間の用手胸骨圧迫後に電気的除細動を行い蘇生した。蘇生後5分間100%酸素にて人工呼吸器管理を行った後、以下の4群にわけ呼吸器管理を行い、4時間の体温管理を行った。(1)N2群(26%02+74%N2)、(2)H2群(26%02+2%H2+72%N2)、(3)N2+低体温療法(TH:33°C)群、(4)H2+TH群の4群に分け、7日間生存、Neurologic deficit score(NDS:異常なし=0;死亡=100)を測定した。心肺蘇生には人工呼吸および用指胸骨圧迫(200回/分)、エピネフリン8μg、炭酸水素ナトリウム0.1mEq静脈投与、電気的除細動(2J)を行った。心肺蘇生開始時から自己心拍再開2時間後までの間、ガス吸入を行った。[研究結果]7日間生存率は、N2群:33.3%、H2群:66.6%、N2+TH群:66.6%,H2+TH群:83.3%であった。7日後のNDSは、H2群、N2+TH群でN2群より有意に低く、さらにH2+TH群ではH2群、N2+TH群よりも有意に低かった。心停止蘇生後群に対するH2吸入療法は、非高濃度酸素投与下の心停止モデルにおいても、脳機能予後を軽減し予後を改善し、さらに低体温療法と同等の効果および低体温療法との相乗効果を有する新規治療薬となりうると考えられる。【動物実験】昨年度に引き続き動物実験を行い、水素吸入の適正濃度、適正開始時期、非高濃度酸素濃度下での有効性の検証を行い、以下の概要を論文としてまとめ、現在国際学術誌へ投稿中である。[目的]心停止蘇生後症候群に対するH2吸入の効果を検討する。[研究方法]Wister ST ratオスを用いて経皮的心外膜電気刺激による心室細動/心停止モデル(心停止6分間)を作成し、3分間の用手胸骨圧迫後に電気的除細動を行い蘇生した。蘇生後5分後より、混合ガスの吸入を行った。1、まず水素濃度の検証のため、1%水素と2%水素の効果を比較した。2、次に以下の4群を用いて非高濃度下水素の有効性を検証した。(1) N2群(26% O2+74% N2)、(2) H2群(26% O2+2%H2 + 72%N2)、(3) N2+低体温療法(TH:33°C)群、(4) H2+TH群。[研究結果]1、7日間生存率及び脳機能スコアは、1%H2群と2%H2群で同等であり、Ctlと比して有意に良好であった。蘇生後の酸化ストレスを示す血清d-ROM値は、2%が1%より有意に低値であったが、IL6は1%、2%は同等でCtlより有意に抑制されていた。

このことは、H2が多面的効果を有し、1%においても生存や脳機能を改善することが示唆された。2、7日後脳機能スコア、H2群、N2+TH群でN2群より有意に低く、さらにH2+TH群ではH2群、N2+TH群よりも有意に低かった。脳組織の病理学的検討においても、神経保護作用、抗炎症作用において、H2は低体温療法と同等、相加的な効果をみとめた。【臨床研究の遂行】蘇生後患者に対する水素吸入療法の安全性と有効化の検討(単施設非盲検、Single arm study with historical control study)を計画し、慶應義塾大学医学部の倫理委員会に申請し、2013年6月に承認を得た。現在、当科において同臨床研究を開始し遂行中である。【動物実験】心停止蘇生後に対する水素吸入の臨床応用に向け、より臨床に即した条件、すなわち心停止蘇生後から、低濃度酸素吸入下においても心肺停止から蘇生後のラットの脳に発生する神経学的後遺症を水素吸入が抑制できるか、詳細な検証を試みた。ラット心室細動心停止モデルを用いた。蘇生後7日目の行動試験では水素吸入により、対照と比して認知機能の低下が抑制された。低体温療法と水素吸入を組み合わせることにより最も高い効果を認めた。蘇生7日後の脳組織学的検討では、脳海馬における生神経細胞数、軸索損傷、ミクログリア、および大脳皮質の神経細胞変性やアストロサイトの変化を各群間で比較した結果、対照では神経細胞死や炎症反応が著明に認められたのに対し、水素群ではそれらが抑制された。低体温療法と水素吸入の併用より最も高い効果を認め、行動実験や生存実験の結果を裏付けるものと考えられた。【臨床試験】当院倫理委員会の承認を得て、心停止蘇生後患者に対する水素吸入療法の安全性と有効性の評価を行った。対象患者は、20歳以上80歳以下の院外心停止により救急搬送され、救急搬送中または救急外来で自己心拍が再開した蘇生後患者で、事前に設定した選択基準を満たすもの。代諾者から文章による同意を得られた心停止患者5例を対象に人工呼吸下で2%水素+50%酸素の吸入を連続18時間行った。安全性評価として、事前に設定した本病態で予想しうる心停止発症後7日間以内の臨床的異常変動(53項目)を詳細に観察した。有効性の検討として水素の体内動態および酸化ストレス、サイトカイン、脳機能予後を観察記録した。結果、血中水素濃度は、吸入開始とともに速やかに2%まで上昇し、吸入中止後速やかに低下した。水素吸入による副作用および臨床業務遂行上の不利益をみとめなかった。さらに、水素吸入を行った5例中4症例が意識生命となり独歩退院した。26年度が最終年度であるため、記入しない。救急医療26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は世界で初めて、蘇生後症候群患者に水素ガスを人工呼吸器下に投与する臨床研究である。そのため、動物実験を用いて、水素ガスの安全性や有効性を十分に検証する必要がある。初年度は、動物実験で非高濃度酸素下においても水素が抗酸化物質としての有効性を検証した。同時に、臨床研究開始に当たり、倫理委員会への申請書類を提出した。蘇生後患者に対する水素吸入療法の安全性と有効化の検討(単施設非盲検、Single arm study with historical control study)を計画し、慶應義塾大学医学部の倫理委員会に申請し、2013年6月に承認を得た。また、同臨床研究は、今後、多施設介入研究に発展させることを目標としており、現在準備中である。
海流散布植物の歴史的な分布拡大規模の解明~環太平洋域を網羅したテリハボクの解析

海流散布植物における遺伝子流動の潜在的可能性を推定することを目的に、テリハボクの遺伝構造等の解析を行った。2つの手法(EST-SSR分析およびMIG-seq分析)を用いて解析した結果、南太平洋域(ソロモン諸島、バヌアツ共和国、フィジー共和国、トンガ王国)と台湾および日本の間には大きな遺伝的分化があり、両地域間では遺伝子流動が制限されてきたと考えられた。一方、南太平洋と台湾・日本のそれぞれの地域内では、経度に沿った遺伝構造が検出され、一定の遺伝子流動が成立してきたことを示唆していた。これらのことから、島嶼間であっても、海流散布による数百キロメートルレベルの遺伝子流動は成立し得ると考えられた。課題実施以前より入手できていた日本および台湾産の試料について、先行的にEST-SSR分析を行った。同分析では、台湾と日本間との間には高い遺伝的分化があること、また、台湾では比較的高い遺伝的多様性が保持されている一方、小笠原諸島では遺伝的多様性が特に低く、先島諸島で中間的であることが明らかとなった。これらの成果はAnnals of Forest Science誌にて公表した。南太平洋域における試料収集については、フィジー1島、ソロモン2島、バヌアツ2島から合計150点のDNA分析用試料を採取することができ、本研究の遂行に必要な最低限の試料を入手できた。遺伝的分化や分布変遷の評価を実施するためのマーカー開発については、今年度は葉緑体DNA(cpDNA)の一塩基多型(SNP)の探索について取り扱った。多くの被子植物に適用可能な葉緑体DNA増幅用のPCRプライマーを多数設計し、フィジー、台湾、日本産のテリハボクそれぞれ2個体を対象に、long-range PCRによって410KbpのcpDNA断片を合計で約60Kbpを増幅し、次世代シーケンサを用いて塩基配列を決定後、変異箇所(SNP)を探索した。本研究では、葉緑体ゲノムの5分の3程度の塩基配列を取得・比較できたと考えられるが、台湾と日本産の個体間では変異は観察されず、フィジー産の個体のみから5つの変異(SNP)が同定された。今後、これらをcpDNAのSNPをマーカーとして解析に用いることが可能になったことに加え、分布のほぼ南限域と北限域に分布する個体間においても、cpDNA上の遺伝的変異は非常に小さいことを明らかにすることができた。本成果については、第61回日本生態学会大会にて公表した。本研究では、1)核および葉緑体DNAの多数の一塩基多型(SNP)を用いて遺伝構造を明らかにし、2)環太平洋域を網羅した島嶼集団間の遺伝子流動の規模を明らかにすることを目標としている。昨年度までに、南太平洋地域のバヌアツ、フィジー、トンガ、ソロモン、およびアジア地域の台湾、日本の八重山諸島、宮古諸島、大東諸島より解析用試料を収集し、今年度はこれらのサンプルについての遺伝構造の解析に着手した。次世代シーケンサを用いたISSRの応用的実験手法(Mig-seq法)を用いて上記の集団それぞれの約半数のサンプルを解析し、約100遺伝子座の塩基配列を取得することができた。それらの遺伝子座から得られたSNPデータを基にSTRUCTURE解析を実施した結果、南太平洋地域と、日本および台湾のアジア地域間で非常に明瞭な遺伝的分化の存在を明らかにすることができた。これらに加えて、既存の研究事例との比較を可能にするため、EST-SSRによる遺伝子型同定にも着手している。葉緑体DNAについては、昨年度までに4つの領域(ndhJとtrnF-GAGの遺伝子間領域、rps15とndhHの遺伝子間領域、ycf1とndhFの遺伝子間領域、trnV-UACとndhCの遺伝子間領域)に合計5つのSNPが存在することを明らかにできたため、今年度はこれらの領域について多数のサンプルを用いて解析を開始した。現在までに4つのうち2領域(3つのSNP)について解析を終え、南太平洋の国々と、台湾および日本の2つの地域間でハプロタイプが分かれることを明らかにしている。一方、それぞれの地域内の島間ではハプロタイプの変異は観察されておらず、明瞭な分化は検出されなかった。本課題では、環太平洋の亜熱帯海岸域に広く分布する海流散布植物テリハボクの島嶼集団に着目し、遺伝的多様性や遺伝構造を明らかにすることで、広域に渡る遺伝子流動の可能性や歴史的な種の分布拡大を考察することを目的とした。試料を南太平洋域のトンガ2島、フィジー共和国1島、バヌアツ共和国2島、ソロモン諸島2島および台湾島、日本の沖縄県内の7島から収集し、解像度の異なる2つの手法(EST-SSRの11遺伝子座および、MIG-seq法によるゲノムワイドな一塩基多型)を用いて遺伝子型を明らかにすることで、遺伝的多様性および遺伝構造を評価した。両手法は遺伝的多様性および遺伝構造の両方で概ね共通した傾向を示し、南太平洋地域では東側の国々(トンガやフィジー共和国)においてヘテロ接合度および対立遺伝子数(Allelic richness)といった遺伝的多様性に関する指標値がやや低下する傾向が見られた。台湾および日本においても、宮古諸島や大東諸島など東部の島々においてヘテロ接合度がやや低下する傾向となった。また、南太平洋の島々と台湾・日本の間には非常に大きな遺伝的分化が検出されたが、それと比較して南太平洋内および台湾と日本の島々といったそれぞれの地域内では遺伝的分化の程度は低くかった(Gst値はどちらの地域でも0.07程度)。

これらのことから、南太平洋と台湾および日本の間での遺伝子流動は極めて限定的であった一方、それぞれの地域内においては海流散布による歴史的な遺伝子流動が成立してきたことが示唆された。上述の遺伝的多様性の地理的傾斜と合わせて考えると、本課題で解析した地域のテリハボクは東南アジアやインド等西部の地域を起源とし、北東および南東への分布拡大に伴う遺伝的浮動の影響を反映した遺伝構造が保持されているのではないかと推察された。海流散布植物における遺伝子流動の潜在的可能性を推定することを目的に、テリハボクの遺伝構造等の解析を行った。2つの手法(EST-SSR分析およびMIG-seq分析)を用いて解析した結果、南太平洋域(ソロモン諸島、バヌアツ共和国、フィジー共和国、トンガ王国)と台湾および日本の間には大きな遺伝的分化があり、両地域間では遺伝子流動が制限されてきたと考えられた。一方、南太平洋と台湾・日本のそれぞれの地域内では、経度に沿った遺伝構造が検出され、一定の遺伝子流動が成立してきたことを示唆していた。これらのことから、島嶼間であっても、海流散布による数百キロメートルレベルの遺伝子流動は成立し得ると考えられた。概ね順調に実験が進んでおり、地域間の遺伝的分化を明らかにするところをまで進行している。分子生態学今後は、今年度と同様の手法を用いて残りのサンプル及び遺伝子座等の解析を推進する予定である。また、全てのデータが出そろい次第、遺伝子流動の規模や分布変遷を推察する各種統計解析を行う。試料の収集とDNA抽出試料の収集については、目標通りに南太平洋地域からの収集を達成することができた。現在、全てのサンプルからのDNA抽出を実施しているところであり、概ね目標を達成できている。2)DNAマーカーの開発cpDNAのSNP探索については、次世代シーケンサを利用した新規的なアプローチに成功し、目的を達成することができた。一方、核DNAのSNP探索については、全サンプルからのDNA抽出が完了した段階で順次実施する予定である。概ね計画通りに執行したが、一部の試薬類の価格が想定よりも安価になったため、余剰が生じた。核DNAのSNPを探索してマーカー化し、採取した全試料の分析を行う。核DNAのSNP探索にあたっては、近年Rad-sequence法やGenotyping by sequence法などが多く用いられているが、これらの手法は手順が煩雑であることに加え、安定的な結果を得るためには非常に質の高いDNAが求められる。本研究では海外における試料収集に長期間を要し、試料を冷凍保存することができず、試料を乾燥標本として保存した。必ずしも十分な質のDNAが抽出できない可能性があるため、上述の手法は本研究にはあまり適さない可能性があり、代替する手法を検討する必要が出てきた。そこで、より簡便かつDNAの質に頑強な最新の手法であるMig-seq法(陶山ら2014)を取り入れ、核DNA配列の網羅的な取得とSNP探索を行うことを再計画している。SNPを同定後は、各国における遺伝子型頻度等に配慮しながらSNPの選抜およびマーカー化を行い、SNPタイピングシステム(ep1システム;フリューダイム社)を用いて全試料のSNPタイピングを実施する。
宿主細胞接着因子を標的とした新規滑走細菌症ワクチンの開発

海水魚の滑走細菌症はTenacibaculum maritimumが海水魚に感染して起こす感染症である。本症は様々な養殖魚種で発生し、国内外の海産養殖業で経済的損害を与えている。日本では水産用ワクチンはなく、水産医薬品も魚種とサイズの制限のため使用は限定的であるため、養殖現場は対策に苦慮しており、ワクチンの開発が望まれている。本研究は滑走運動に着目したワクチン開発を目指し、滑走運動変異株を作製し、次世代シークエンサーにより変異遺伝子の解析を行った。滑走細菌症は様々な海水魚で発生し、国内外の稚魚の生産場や養殖場で問題となっている細菌感染症である。日本の養殖魚種では本症に使用できる治療薬はなく、また、ワクチンもない。本研究は、原因菌Tenacibaculum maritimumに対するワクチン開発を目指す。ワクチン候補分子として、T. maritimumの菌体表面にあると推測される接着因子に着目した。T. maritimumやその近縁種では固形物に張り付き、固形物の表面上を這うように動く運動(滑走運動)を行うことが知られている。滑走運動を行う細菌では、菌体表面の接着因子で固形物に張り付くことが知られており、病原性細菌ではこの接着因子が宿主への定着に関与することが知られている。そこで、T. maritimumの接着因子がワクチンとして有用ではないかと考えた。T. maritimumの滑走運動に関する科学的知見は非常に乏しく、接着因子も含めて滑走運動に関与するタンパク質はまったく同定されていない。そこで、近縁種の土壌細菌Flavobacterium johnsoniaeの滑走運動に重要な遺伝子群に着目した。F. johnsoniaeの接着因子のremA遺伝子とrprB遺伝子も含め、すべての遺伝子がT. maritimumにも保存されていることが分かった。T. maritimumの滑走変異株について、これらの遺伝子群をシークエンスしたところ、gldK, gldJ,あるいはsprB遺伝子に変異を持つ株が見つかった。これら3遺伝子はT. maritimumにおいても滑走運動に関係していることが推測される。今後はT. maritimumのRemAおよびSprBの滑走運動における機能を解析し、これらのワクチンとしての有用性を今討する予定である。F. johnsoniaeの滑走遺伝子群をTenacibaculum maritimumで探索し、遺伝子配列が未同定であったsprB遺伝子の配列を決定した。滑走変異株の解析をほとんど完了できた。滑走細菌症は様々な海水魚で発生し、国内外の稚魚生産場や養殖場で問題となっている細菌感染症である。日本の養殖魚種では本症に使用可能な治療薬はなく、また、ワクチンもない。ワクチン候補分子として菌体表面に存在する分子に着目した。T. maritimumが属するフラボバクテリウム科の菌には、固形物に張り付き、固形物の表面を這うように動く運動(滑走運動)を行う菌種が多数知られている。滑走運動を行う病原細菌では滑走のための接着因子が宿主への定着に関与することが知られている。そこで、本研究ではT. maritimumの接着因子がワクチンになりうると考えた。本菌の滑走運動の機序に関する研究報告はこれまでにないため、滑走運動について研究がなされている同科のFlavobacterium johnsoniaeの滑走運動関連遺伝子群に着目した。T. maritimumにおいても、接着因子をコードするsprB遺伝子およびremA遺伝子を含め、すべての滑走関連遺伝子が保存されていることが分かった。また、紫外線照射変異誘導によって作製した滑走変異株の中に、gldJ遺伝子、gldK遺伝子、sprB遺伝子に変異を持つ株が見つかった。これらの遺伝子はT. maritimumにおいても滑走運動に重要な役割を持つことが予想される。SprBのワクチン分子としての可能性が示唆された。ワクチン分子は菌株を問わず菌体表面に発現していることが望ましい。T. maritimumに感染するファージを分離し、その中に、溶菌する宿主域が広いファージを見つけた。このファージは溶菌しない菌株の菌体表面にも結合することが分かった。本ファージのレセプター分子は幅広い菌株で発現している可能性が高く、ワクチン分子候補となりうる。当該年度の当初に大学における業務が急増したため、研究活動への十分な時間が確保できなかった。また、大学内の配置換えに伴うオフィスおよび実験室の移動もあり、研究活動が長期にわたり中断を余儀なくされた。特に、業務増加と配置換えは急な決定であったため、研究活動の計画が大きく狂うこととなった。海水魚の滑走細菌症は様々な養殖魚種で発生し、日本だけでなく、世界的に海産養殖産業の重要な細菌感染症の一つである。しかし、日本では滑走細菌症のワクチンはなく、養殖魚の滑走細菌症治療に使用できる水産医薬品は魚種や魚体サイズが限られているため、養殖現場では滑走細菌症の対策に苦慮しており、滑走細菌症ワクチンの開発が強く望まれている。滑走細菌症の原因菌Tenacibaculum maritimumは固形物に張り付いて、固形物の表面上を這うように動く滑走運動を行う。T. maritimumの滑走運動の分子メカニズムについては研究報告がなく、不明な点が多い。本研究は滑走運動に着目して、T. maritimumのワクチンおよび治療法の開発を目指した。

滑走運動に重要な遺伝子の同定を目的として滑走変異株を24株作製し、次世代シークエンサーMiseqを用いて変異解析を行った。T. maritimumと同じくフラボバクテリア科に属する土壌細菌Flavobacterium johnsoniaeで滑走運動に関与する遺伝子が変異遺伝子として見つかった。F. johnsoniaeでは、接着因子が菌体表面上をらせん状に動くことで、菌体が押し出されると考えられている。接着因子は9型輸送装置によってペリプラズムから菌体表面に輸送される。T. maritimumとF. johnsoniaeの滑走運動は、運動パターンが非常に似ており、エネルギー源も同じくH+である。F. johnsoniaeの滑走遺伝子群をT. maritimumも持ち、滑走変異株でこれらの遺伝子に変異が見つかったことから、共通の滑走装置を持つことが示唆された。また、ペリプラズム-菌体外における輸送装置やペリプラズムシャペロンなどの遺伝子に変異が見つかった。変異遺伝子はペリプラズムから菌体外へのタンパク質輸送に関与することが示唆された。海水魚の滑走細菌症はTenacibaculum maritimumが海水魚に感染して起こす感染症である。本症は様々な養殖魚種で発生し、国内外の海産養殖業で経済的損害を与えている。日本では水産用ワクチンはなく、水産医薬品も魚種とサイズの制限のため使用は限定的であるため、養殖現場は対策に苦慮しており、ワクチンの開発が望まれている。本研究は滑走運動に着目したワクチン開発を目指し、滑走運動変異株を作製し、次世代シークエンサーにより変異遺伝子の解析を行った。T. maritimumのRemAおよびSprBの組換えタンパク質を作製し、これらに対する抗体を作製する。作製した抗体を用いてRemAおよびSprBの滑走運動における機能を解析する。接着因子であることが確認できたら、ワクチンとしての有用性を検討する。滑走変異株の変異解析を進め、T. maritimumの滑走運動に関係する遺伝子を探索する。SprB組換えタンパク質を作製し、本タンパク質に対する抗体を作製する。抗体を用いて運動解析を実施し、滑走運動におけるSprBの機能を調べる。また、T. maritimumのファージのレセプター分子を同定する。細菌学情報収集のための学術集会への参加を予定していたが、大学行事の都合により、参加できなくなったため、旅費の支出が減った。予期せぬ大学業務の増加と配置換えによる研究活動中断によって、計画が遅れたため、繰越金が生じた。余剰分は次年度の消耗品購入および旅費に使用する予定である。繰り越し分は次年度の消耗品購入および旅費に使用する予定である。
RNA-蛋白質複合体マシーナリー・リボソームの構造研究

我々は前年度の研究で,大サブユニットの結晶構造では一部決定されていない,リボソームタンパク質L5の完全な結晶構造を明らかにした.本年度は,より詳細な核酸タンパク質複合体の安定化とRNA-タンパク質認識に関する知見を得るため,L5と5S rRNA断片との複合体の結晶構造解析を行った.L5は保存された5S RNAループ-アミノ酸残基同士の水素結合による特異的で強固な相互作用により結合し,非結合型L5と比較してRNA結合による有意な構造変化は見られなかった.また,結晶格子中で隣接したL5は1分子のRNA断片を共有して結合し,本来23SrRNAと結合する湾曲したβシート表面において同様な結合様式で2重らせんRNA部分と非特異的に結合することも確認された.これらの2領域における5S rRNA-L5-23S rRNA相互作用はサブユニット構造における安定化を示唆している.真核生物翻訳因子eIF-5Aは細胞の増殖と生存に関与し,機能的な修飾アミノ酸,ハイプシンを含むことが知られている.eIF-5Aは2つのドメイン(N-ドメイン,C-ドメイン)から構成される.本研究の好熱古細菌eIF-5A(Pho IF-5A)ホモログと,既報の二種の古細菌由来eIF-5Aホモログとを比較すると,ハイプシン修飾部位を含むN-ドメインはアミノ酸配列および立体構造ともによく一致しているが,それに対してC-ドメインの配列保存性は低く,立体構造は一致していなかった.さらにPho IF-5A結晶格子に含まれる独立した3分子を比較すると,同様にC-ドメインが異なる立体配座をとりうることが明らかとなった.このドメイン間の可動性を解析したところドメイン間リンカーの自由度は7°であった.分子表面に関して,N-ドメインは正電荷に,C-ドメインは負電荷に偏っていることから,各ドメインがタンパク質,核酸のいずれにも相互作用し,その機能に可動性が関与していることを示唆する.リボソームmRNAの塩基配列に従ってポリペプチド鎖を正確に伸長して蛋白質を合成する細胞内小器官である.しばしば,細胞内の工場に例えられる通り,遺伝暗号解読,ペプチジルトランスフェラーゼ活性,トランスロケーションなど,蛋白質合成に伴う複雑な仕事を整然と遂行している.生命活動に重要な反応のほとんどすべては蛋白質が担っており,情報分子である核酸の塩基配列から機能分子である蛋白質のアミノ酸配列への正確な翻訳は,地球上のあらゆる生物にとって極めて重要かつ基本的なプロセスである.本研究では,リポソームおよびリボソームの構成成分を単離・精製・結晶化し,その立体構造解析を行ない,蛋白質合成の機構(翻訳機構)を原子の分解能で解明することを目的としている.この研究目的に従い,本年度は次の項目について研究を進めた.1.遺伝子暗号解読センターを構成する蛋白質と16S rRNAの結合部位との複合体結晶の調製:遺伝子暗号解読センターは16S rRNAを中心に,数種のリボソーム蛋白質で構成されている.平成11年度には,これらの蛋白質の内,S3,S9,S19の大量発現系を構築した.また,16S rRNAのフラグメント(926-986/1219-1393)をT7 RNA polymeraseを用いた転写系によって,大量に調製し,ハンギングドロップ法,マイクロバッチ法により複合体の結晶化を条件を検索した. 2.ペプチジルトランスフェラーゼ活性センターを構成する蛋白質と23S rRNAの結合部位との複合体結晶の調製:ペプチジルトランスフェラーゼ活性センターは23S rRNAを中心に,数種の蛋白質で構成されている.平成11年度には,これらの蛋白質の内,L5蛋白質の構造解析を行った.3.リボソーム顆粒の結晶化:超高度好熱古細菌Aeropyrumpernixと高度好熱真性細菌Phodothermusobamensisを培養してリボソームを精製し,結晶化を試みた.リボソームはmRNAの塩基配列に従ってポリペプチド鎖を正確に伸長して蛋白質を合成する細胞内小器官である.しばしば,細胞内の工場に例えられる通り,遺伝暗号解読,ペプチジルトランスフェラーゼ活性,トランスロケーションなど,蛋白質合成に伴う複雑な仕事を整然と遂行している.生命活動に重要な化学反応のほとんどすべては蛋白質が担っており,情報分子である核酸の塩基配列から機能分子である蛋白質のアミノ酸配列への正確な翻訳は,地球上のあらゆる生物にとって極めて重要かつ基本的なプロセスである.本研究では,リボソームおよびリボソームの構成成分を単離・精製・結晶化しその立体構造解析を行ない,蛋白質合成の機構(翻訳機構)を原子の分解能で解明することを目的としている.この研究目的に従い,本年度は次の項目について研究を進めた1.遺伝暗号解読センターを構成する蛋白質の構造解析:遺伝子暗号解読センターは16SrRNAを中心に,数種のリボソーム蛋白質で構成されている.平成12年度には,これらの蛋白質のいくつかの精製を行い結晶化条件を検討した.特に,Pyrococcus Horikoshii由来のS7について結晶化に成功し,Nativeのデータの収集を行うことができた.2.ペプチジルトランスフェラーゼ活性センターを構成する蛋白質と23SrRNAの結合部位との複合体結晶の調製:ペプチジルトランスフェラーゼ活性センターは23SrRNAを中心に,数種の蛋白質で構成されている.

平成12年度には,これらの蛋白質の内,Pyrococcus Horikoshii由来L13の構造解析を行い.L5-RNA複合体の結晶について,データを収集した.また,S10オペロンのmRNAのL4結合部位について調べた.一方,昨年度に構造解析に成功したL5については,RNA誌に投稿し,現在印刷中にある.リボソームタンパク質S7は30Sサブユニットのヘッドを構成するタンパク質である.16S rRNAの3'大ドメインと結合することによって,30Sサブユニットのヘッド領域の初期会合において中心的役割を果たす.また,Eサイトに結合したtRNAとコンタクトする位置にあり,遺伝暗号解読部位に唯一存在するタンパク質であり,遺伝暗号解読にも何らかの役割を果たしていることが期待されている.本年度の研究では,超高度好熱古細菌Pyrococcus horikoshii由来リボソームタンパク質S7の立体構造を2.1Åで解析した.私たちは先に真正細菌Bacillus stearothermophilus由来リボソームタンパク質S7の構造を決定しているが,S7は,5本のヘリックスからなる疎水コアドメインと,その疎水コアドメインから突き出たβアームからなる構造をとっている.真正細菌由来S7と比べて古細菌S7ではN末の領域が約50残基長く,またrRNA結合ループに挿入があることなど,構造上の重要な違いが存在する.真正細菌と一次構造の保存性がないN末(1-65残基)のうち,18-42残基はαヘリックスが形成する疎水コアと疎水コンタクトを保ち,疎水コアーの安定化に寄与すること,44-62残基はフレキシブルな構造をとることが示された.また,両タンパク質と70Sリボソームの構造を重ね合わせることで,真正細菌由来S7と古細菌由来S7とのrRNA結合様式の違いを明らかにし,リボソームの進化とタンパク質の役割について重要な知見を得た.我々は前年度の研究で,大サブユニットの結晶構造では一部決定されていない,リボソームタンパク質L5の完全な結晶構造を明らかにした.本年度は,より詳細な核酸タンパク質複合体の安定化とRNA-タンパク質認識に関する知見を得るため,L5と5S rRNA断片との複合体の結晶構造解析を行った.L5は保存された5S RNAループ-アミノ酸残基同士の水素結合による特異的で強固な相互作用により結合し,非結合型L5と比較してRNA結合による有意な構造変化は見られなかった.また,結晶格子中で隣接したL5は1分子のRNA断片を共有して結合し,本来23SrRNAと結合する湾曲したβシート表面において同様な結合様式で2重らせんRNA部分と非特異的に結合することも確認された.これらの2領域における5S rRNA-L5-23S rRNA相互作用はサブユニット構造における安定化を示唆している.真核生物翻訳因子eIF-5Aは細胞の増殖と生存に関与し,機能的な修飾アミノ酸,ハイプシンを含むことが知られている.eIF-5Aは2つのドメイン(N-ドメイン,C-ドメイン)から構成される.本研究の好熱古細菌eIF-5A(Pho IF-5A)ホモログと,既報の二種の古細菌由来eIF-5Aホモログとを比較すると,ハイプシン修飾部位を含むN-ドメインはアミノ酸配列および立体構造ともによく一致しているが,それに対してC-ドメインの配列保存性は低く,立体構造は一致していなかった.
看護学生のセルフリフレクションスキルを強化するフレームワークの開発

看護実践能力の向上には、看護職が自らの看護実践を批判的に問い直すリフレクションスキルが必要である。研究者は、これまで教員と看護学生との対話的リフレクションにおいて、学生のリフレクションを促進させるための発問ガイドを作成し、その有効性を検証してきた(矢田,2018)。しかし、対話的リフレクションは教員主導であり、効率性においても課題があった。そこで、本研究はその発問ガイドを活用し、学生が一人でリフレクションスキルを強化することができるフレームワークの開発を目的とする。フレームワークの活用により、学生のセルフリフレクションスキルの強化への効果が期待できる。
PDX-1プロモーター/EYFP遺伝子導入マウスを用いた膵器官形成の研究

そこでPDX-1プロモーターを蛍光発生蛋白遺伝子、EYFP上流に結合し、これらを導入したtransgenic mouseの作成を試みた。8系統の導入マウスが得られ、うち7系統ではF1マウスの作成に成功し、以後系統を維持した。著明な外表奇形は認めず、出生率の低下や成長遅延等は観察さなかった。また、これらの随時血糖は122mg/m1と正常と有意な差異を認めなかった。一方、膵の組織学的検索において、膵島はいずれの系統でも大型化しており、インスリン陽性のβ細胞数も増加していたが、グルカゴン陽性α細胞は局在に異常が見られた。さらにサイトケラチン陽性の膵管細胞も増成傾向があり、この変化も多系統で認められた。今後遺伝子導入によるこれらの表現型とPDX-1および膵特異的転写因子の発現・機能との関連の検討、さらに形態形成との関連につき検討が必要と考えられる。膵臓の発生、β細胞の分化およびこれらの起源となる幹細胞の研究は糖尿病の病態解析・新たな治療法の確立に重要であり、pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1)がマスター遺伝子として機能していることは広く認められているが、本遺伝子のノックアウトおよびトランスジェニックマウスでは膵の形成不全が生じ、これらの解明には必ずしも十分でない。申請者らはラットPDX-1遺伝子をクローニングし、そのプロモーター領域が培養β細胞で機能することを確認しているが、本研究ではこれらPDX-1プロモーターを蛍光発生蛋白の遺伝子、EYFP、上流に結合し、生体レベルでPDX-1の膵器官形成、β細胞の分化過程を検討し、さらに成体レベルでの発現を検討すべく、ラットPDX-1プロモーター(PDX1P)(-6200+67bp)/pEYFPをC57BL/6Nマウス前核期胚200個に注入し同遺伝子のトランスジェニックマウスを試みた。産子は25匹得られ、このうち8匹に目的の遺伝子導入が確認された。このうち1系統はF1が得られず、モザイク状の挿入と考えられたが、他の7系統ではF1マウスの作成に成功した。なお、現在のところ著明な外表奇形は認めず、出生率の低下や成長遅延等は観察されていない。今後これらマウスの血糖、膵形態、インスリン産生能とともにYFP蛍光の分布・強度などを組織学的に検討していく予定であり、その分離を試みる。膵臓の発生、β細胞の分化およびこれらの起源となる幹細胞の研究は糖尿病の病態解析・新たな治療法の確立に重要であり、pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1)がマスター遺伝子として機能していることは広く認められている。我々はラットPDX-1プロモーターを蛍光発生蛋白の遺伝子、EYFP、上流に結合し、生体レベルでPDX-1の膵器官形成、β細胞の分化過程を検討し、さらに成体レベルでの発現を検討すべく、ラットPDX-1プロモーター(PDX1P)(-6200+67bp)/pEYFPをC57BL/6Nマウス前核期胚200個に注入し同遺伝子のトランスジェニックマウスを試み,7系統の樹立に成功した。これらは著明な外表奇形は認めず、出生率の低下や成長遅延等は認めなかった。これらの膵臓をパラホルムアルデヒド固定の後、凍結切片を作成し、YFP蛍光を観察したところ、膵島に極めて僅かな蛍光が観察されたが、生後・成体で著明な変化はなく、FACSで分離できるような強い蛍光活性ではなかった。PDX-1プロモーター(-6.2Kb)は培養β細胞では十分な活性を示したが、in vivoレベルでは組織特異的な十分な活性を示さなかった。さらに上流のトランスエレメントが必要である可能性が示唆された。
ラティーノとアジア系の相互関係と社会包摂－1960～80年代米国南西部を中心に－

本研究の目的は、19601980年代にメキシコ系農業労働者と日系人農家が農業を通して相互に対立・依存しながらアメリカ社会に包摂されていったプロセスを考察することである。本年度は、(1)メキシコ系アメリカ人(およびメキシコ人移民)と日系アメリカ人(および日本人移民)の相互関係を中心に、アメリカにおける異なるエスニック集団問の関係等の先行研究を調べること。(2)そのような相互関係について具体的な地域や年代を調べ、海外調査のための準備を進めること。(3)環太平洋地域における移民の動態について理解を深めるため、移民に関連する学会や研究会に積極的に参加することである。(1)の点については、アメリカで出版された書籍を中心に読んだ。1970年代カリフォルニア州で、日系、メキシコ系、アフリカ系の左翼活動家の若者らが、アメリカ社会におけるマイノリティの被抑圧的立場について互いに共感しながら運動を展開していたこと(Pulido 2006)や、1965年以降ラテンアメリカとアジアからの移民が急増し異なるエスニック集団問の連携の契機が生まれた一方で、リベラル多元主義的な言説がアメリカ社会のエスニック集団間の格差を覆い隠していること(Deverell and Hise eds 2010)などについて理解を深めた。また、人種的・民族的に多様な社会にこそ、排他的な国民国家の概念を変容させる可能性があること(Faulks 2000)など、マイノリティと市民権の関係について理論的な考察も深めた。(2)については、『南加州日本人七十年史』(南加日系人商業会議所1960)を参考に、日本人移民とその子孫が戦後のカリフォルニア州において、どの地域でどのような規模の農業を再開し、メキシコ人労働者をどの程度必要としていたのかについて具体的な情報を調べた。その過程で、オレンジ郡では日系農家と白人農家が共同で農家組合を組織し、メキシコ人労働者と日本人労働者を受け入れる準備をしていたことが分かり、今後の海外調査の足掛かりになると考えている。(3)については、5月に関西アメリカ史研究会例会にて、修士論文の成果を発表した。また、同月、立命館大学に在籍する若手研究者を中心に結成された「環太平洋におけるトランスナショナリズム研究会」に参加し、移民研究について意見交換した。