hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温熱刺激によるグリオーマのアポトーシス誘導機構解明と治療への応用

今後、温熱刺激によるグリオーマのアポトーシス誘導機構解明を本研究の主目的とし、1)アポトーシスに至る過程でbax,bcl-2,bcl-x,ICEなどアポトーシスに直接関連する遺伝子群がどのように動くのか、2)このアポトーシスはp53がwid typeのグリオーマ細胞株に限られるのか、3)p53がmutant typeの細胞株でも正常なp53遺伝子を強制発現させればアポトーシスに導くことが出来るのか、4)このアポトーシスにp21は関与しているのか、5)担脳腫瘍ラットでも温熱刺激によりアポトーシスを刺激できるのか、などを明らかにする予定である。温熱療法は悪性グリオーマ治療法の一つとして有望視され,臨床応用も試みられている.しかしその抗腫瘍機構の詳細は不明であった.我々はすでに,特定のグリオーマ細胞株(A172)では温熱刺激によりG1期で停止し,アポトーシスが誘導されることを示した.その際にアポトーシス関連因子であるbax mRNA,bax蛋白およびp53蛋白が増加すること,また同時にcyclin dependent kinase inhibitors(CKIs)の一つであるp21の発現を伴うことを明らかにした(Fuse T et al,Biochem Biophys Res Commun,1996).これは温熱療法の理論的裏付けとして重要な意味を持つものと考えられる.一方p53がmutant typeのグリオーマ細胞株(T98G)でも温熱刺激によりアポトーシスに陥る.この細胞株ではp53の誘導なしにp21 mRNAと蛋白の発現が亢進することからCKIsへのシグナル伝達にp53とは独立した経路があることを明らかにした(Fuse T et al,Neurosurgery 1998).このようにp21はグリオーマ細胞の増殖制御に関わる重要な因子であり,治療上key pointとなる遺伝子である.今年度はグリオーマの薬物治療に研究を発展させ,p21発現へ及ぼす影響を検討した.Prostaglandin Aseriesは細胞増殖抑制効果がin vitroおよびin vivoにおいて示されており,抗腫瘍剤としての効果が期待されているが,その分子生物学的な作用機序は明らかでなかった.我々はグリオーマA172細胞株を用いて,Prostaglandin A1の抗腫瘍効果を解析した.Prostaglandin A1の投与でグリオーマ細胞はG1期で停止し,細胞増殖は抑制された.これはp21の発現亢進とcyclin Eの抑制という2つの異なったメカニズムにより引き起こされることを明らかにした(Tanikawa M et al,J Biol Chem 1998).現在我々は,温熱治療とともにグリオーマ細胞へのp53およびp21遺伝子導入による抗腫瘍療法を目標に研究を進めている.
初発肝細胞癌の多中心性発生と多段階発癌の研究

原発性肝癌の多中心性発癌は、合計9結節まで認めた。背景肝別に1症例当たりの結節数を見てみると、おのおのの結節数全てにおいてHC群に多く認めた。早期肝細胞癌、結節内結節型肝細胞癌および辺縁に早期肝細胞癌の領域を持つ肝細胞癌の腫瘍径の中間値は、それぞれ2.2cm(範囲:0.4-4.0cm)、3.0cm(1.0-5.0cm)および5.5cm(0.4-9.5cm)であった。早期肝細胞癌の検出率は、腹部超音波で96%、腹部CTで87%および腹部血管造影で65%であった。その他の結節の検出率は、各々ほとんどが100%であった。多段階発癌の頻度を腫瘍径別に解析すると、1cm以下が101結節中75結節(74%)、1-2cmが224結節中141結節(63%)、2-3cmが210結節中80結節(38%)、3-4cmが131結節中33結節(25%)、4-5cmが94結節中22結節(23%)と腫瘍径が増大するほど多段階発癌の頻度は減少傾向にあり、5cm以上では220結節中8結節(9%)であった。以上からC型肝炎の場合、慢性肝炎から前癌病変である腺腫様過形成を経て、早期肝細胞癌そして内部の脱分化が発生し結節内結節型肝細胞癌さらに進行癌へと進行していく。腫瘍がより増大すると、内部の進行癌が辺縁部に存在する早期肝細胞癌の領域を圧排し、早期肝細胞癌の領域が縮小し、最終的には全てが進行癌に置き換わることが推奨される。この過程は、B型およびC型の両者が重複感染している時にも、同様の傾向を示すことが今回の研究でわかった。B型肝炎の場合は、多段階に発癌するよりも、de novo発癌する傾向を示した。すなわち、ウィルスDNAがヒトの遺伝子に組組み込まれることが発癌の引き金となり癌化することが推測される。この過程は、非B非C型の肝炎にも同様の傾向を示すことが今回の研究でわかった。背景因子を5項目に分け、多段階発癌及び多中心性発癌を組織学的に定義し、その実際の頻度、背景因子との関連について系統的検討をした。対象は、10年間に外科的切除された初発肝細胞癌664例、980結節とした。背景肝は、HBs抗原陽性をB群、HCV抗体陽性をC群、HBs抗原陽性+HCV抗体陽性をBC群、HBs抗原陰性+HCV抗体陰性で肝障害を伴う群をNBNC群、HBs抗原陰性+HCV抗体陰性で正常肝の群をnormal liver群とし合計5項目に分けた。次に、多段階発癌は、早期肝細胞癌あるいは肉眼的及び組織学的に結節の周囲に早期肝細胞癌の領域が存在する結節と定義した。多中心性発癌は、より小さい結節が多段階発癌の定義をみたす症例あるいはおのおのの結節が異なった組織所見を示す症例と定義した。結果は、多段階発癌の頻度は、980結節中367結節(37.7%)に認めた。背景因子別に見ると、C群が46%と高頻度に認められ、B群の19.1%と比較すると有意に高率であった(P<0.0001)。一方、BC群、NBNC群を見てみるとBC群はC群に近い頻度であるのに対し、NBNC群はB群に近い頻度であった。多中心性発生の頻度は、664症例中177症例(26.7%)に認められた。背景因子別に見ると、C群は34.1%と高頻度に認められ、B群の16.5%と比較すると有意に高率であった(P=0.0046)。Normal liver群は、ターナー症候群であった1例を除いては多中心性発癌を認めなかった。それぞれの背景肝に関しての進行度具合は、慢性肝炎、肝硬変の頻度に差がなく、多中心性発癌の違いは背景肝の進行度の違いによるものではないと考えた。980結節の中で369結節(37.7%)が多段階発癌と診断された。多段階発癌の頻度を腫瘍径別に解析すると、1cm以下が101結節中75結節(74%)、1-2cmが224結節中141結節(63%)と腫瘍が大きくなればなるほど低い傾向にあった。腫瘍径が増大するほど多段階発癌の頻度は減少することから、腫瘍がより増大すると、やがては内部の進行癌が辺縁部に存在する早期肝細胞癌の領域を圧排し、早期肝細胞癌の領域が縮小し、最終的には全てが進行癌に置き換わることが予想された。

664症例の中で177症例(26.7%)が多中心性発癌と診断され、多中心性に生じた結節の数は最多で9結節であった。HBs抗原陽性群、HCV抗体陽性群、HBs抗原+HCV抗体陽性群、HBs抗原+HCV抗体陰性で肝障害を伴う群、正常肝群の多段階発癌の頻度は、それぞれ19.1%、46.0%、37.9%、23.9%、0%であった。同様に多中心性発癌の頻度は、それぞれ16.5%、34.1%、31.5%、12.8%、3.1%であった。多段階的発癌と多中心性発癌の頻度は共に、HBs抗原陽性群よりHCV抗体陽性群の方が高かった(p<0.0001、p=0.046)。HBs抗原+HCV抗体陽性群は、HCV抗体陽性群と同様の傾向が認められ、一方HBs抗原+HCV抗体陰性で肝障害を伴う群は、HBs抗原陽性群と同様の傾向を認めた。正常肝群では、ターナー症候群の1症例を除いて、多中心性発癌を認めなかった。それぞれの群の背景肝に関しての進行度具合は、慢性肝炎、肝硬変の頻度に差がなく、多中心性発癌の頻度の違いは、背景肝の進行度の違いによるものではないと考えた。原発性肝癌の多中心性発癌は、合計9結節まで認めた。背景肝別に1症例当たりの結節数を見てみると、おのおのの結節数全てにおいてHC群に多く認めた。早期肝細胞癌、結節内結節型肝細胞癌および辺縁に早期肝細胞癌の領域を持つ肝細胞癌の腫瘍径の中間値は、それぞれ2.2cm(範囲:0.4-4.0cm)、3.0cm(1.0-5.0cm)および5.5cm(0.4-9.5cm)であった。早期肝細胞癌の検出率は、腹部超音波で96%、腹部CTで87%および腹部血管造影で65%であった。その他の結節の検出率は、各々ほとんどが100%であった。多段階発癌の頻度を腫瘍径別に解析すると、1cm以下が101結節中75結節(74%)、1-2cmが224結節中141結節(63%)、2-3cmが210結節中80結節(38%)、3-4cmが131結節中33結節(25%)、4-5cmが94結節中22結節(23%)と腫瘍径が増大するほど多段階発癌の頻度は減少傾向にあり、5cm以上では220結節中8結節(9%)であった。以上からC型肝炎の場合、慢性肝炎から前癌病変である腺腫様過形成を経て、早期肝細胞癌そして内部の脱分化が発生し結節内結節型肝細胞癌さらに進行癌へと進行していく。腫瘍がより増大すると、内部の進行癌が辺縁部に存在する早期肝細胞癌の領域を圧排し、早期肝細胞癌の領域が縮小し、最終的には全てが進行癌に置き換わることが推奨される。この過程は、B型およびC型の両者が重複感染している時にも、同様の傾向を示すことが今回の研究でわかった。B型肝炎の場合は、多段階に発癌するよりも、de novo発癌する傾向を示した。すなわち、ウィルスDNAがヒトの遺伝子に組組み込まれることが発癌の引き金となり癌化することが推測される。この過程は、非B非C型の肝炎にも同様の傾向を示すことが今回の研究でわかった。
振動回転波束イメージングに基づく広帯域・高分解能分子分光法の開発

本研究では、分子の超高速振動・回転波束運動をスナップショット的に画像化する申請者独自の技術を用いた新しい分子分光法を開発・展開する。新手法は分子運動における動的挙動を画像の時間変化として観測し、そのフーリエ変換から周波数領域の分光情報を抽出するものである。本手法により従来の周波数領域高分解能分光では研究が困難とされてきた永久双極子をもたない分子種の分光実験が可能になる。また、1台のレーザー光源による一度の実験で、広い周波数範囲の測定が可能となる。さらに、波束観測から得られる波動関数の情報をもとにしたスペクトルの帰属が可能な、新しい切り口からの分子分光法として展開が期待される。
統合失調症の個別化医療：疾患感受性遺伝子を用いたＰＫーＰＤーＰＧｘモデルの構築

抗精神病薬の急性期の効果予測として薬物濃度と受容体遺伝子多型に着目した。リスペリドンではDRD2遺伝子の-141Ins/Del多型によって異なった治療効果-薬物濃度関係となった。一方、抗精神病薬の長期投与は肥満や耐糖能異常といった副作用を引き起こすが、この候補遺伝子の解析を行い、GSTT1欠損者にはメタボリック症候群が多く、CLOCK C3111TのCアレル保有者ではメタボリック症候群や高血圧が多かった。以上より、薬部濃度と作用部位の遺伝子多型や副作用と関連する遺伝子の解析は抗精神病薬の個別化医療に寄与する可能性が高いことが示された。この研究は統合失調症患者で、メタボリック症候群などの代謝異常と抗酸化体酵素の潜在的機能多型との間に関係があるかどうかを調査した。統合失調症の喫煙者では、GSTM1遺伝子欠失者の方がGSTM1非欠失者より過体重とHDLコレステロール減少のリスクが高かった(オッズ比3.20, p=0.03および3.15、p=0.04)。一方非喫煙者では、GSTM1遺伝子欠失者の方が異常胴囲のリスクが低かった。GSTM1遺伝子欠失とGSTT1遺伝子非欠失の組み合わせで他の遺伝子の組み合わせに比較し、HDLコレステロール減少のリスクは高かった(オッズ比3.60、P < 0.01)。SOD2 Val16Ala遺伝子多型は、どちらのグループでも代謝異常の危険性と関係していなかった。本研究結果はGSTM1遺伝子欠失型が、喫煙あるいはGSTT1遺伝子非欠失型と合わさった状態で統合失調症の代謝異常と関連することが明らかとなった。統合失調症における疾患感受性遺伝子と薬物応答性との関連をみた。全対象に採血(5ml)を行い,血液サンプルよりDNAを分離し,疾患感受性遺伝子NRG1の1221533, COMTのVal158Met, DISC1のrs821616, DRD2のTaq1および-141C Ins/Delの遺伝子多型を同定した。NRG1221533, DISK1 rs821616, COMTval/metにおいては治療前のtotal BPRSスコアや4週目の%改善率に差を認めなかった。一方、陽性症状,興奮症状,陰性症状,認知症状,不安抑うつ症状に分類し,治療反応性を見た場合、NRG1221533では不安症状に、COMTval/metでは陽性症状および認知機能の改善率に差を見た。上記3多型で重回帰分析を行ったところ、陽性症状改善率にはCOMTval/met多型に、不安抑うつ症状にはNRG1221533との間に有意な相関が認められた。DRD2に関してはTaq1多型と-141C Ins/Delを組み合わせた場合,陽性症状に有意差が認められた。上記の遺伝子を網羅的に解析できるDNAチップが開発されれば,現在のような試行錯誤的医療ではなく,患者本人の体質,病勢に応じた個別化医療の進歩に大きく貢献する可能性が広がると考えられる。【背景】ミトコンドリア内での高酸化ストレスとミトコンドリア機能障害は、統合失調症(SCZ)患者で、体重増加または代謝異常と関係している。グルタチオンS-transferase Kappa 1(GSTK1)には、ミトコンドリア内の外在性および内在性酸化ストレスから細胞を保護し、ジスルフィド結合を形成することによりadiponectin多量体化を触媒することが知られている。【方法】本研究では、14人の統合失調症患者と20名の健常人から末梢血サンプリングを行い、末梢血単核細胞(PBMCs)中のGSTK1 mRNA濃度とGSTK1の主要多型(rs1917760)を調べた。さらに、329名の統合失調症患者と体重と年齢をマッチさせた305例の健常人における過体重やメタボリック症候群のリスク因子について検討した。【結果】統合失調症患者においては、GSTK1 T/T遺伝子型とGSTK1 mRNAの低濃度と相関していたが、健常人ではそのような傾向は認められなかった。GSTK1 T/T遺伝子型は、男性統合失調症患者の過体重とBMIに正相関した、女性統合失調症患者ではGSTK1 T/T遺伝子型はBMIと負の相関を示した。しかし、コントロール群ではこのような傾向は認められなかった。【結論】これらの結果は、GSTK1 T/TがGSTK1 mRNA濃度を低下させ、その結果として男性統合失調症患者の過体重の新しいリスクになりえることを示した。臨床精神神経薬理学今回の研究で統合失調症患者におけるメタボリック症候群のリスク遺伝子が一部解明できた。ただし、血中濃度と副作用の関連はまだ見ていない。

本研究ではNRG1, COMT, DISC1, DRD2の疾患感受性遺伝子多型の治療反応性における影響を解析し、一定の研究成果を得ている。サンプリングはほぼ終了し、部分的な解析も終了している。今後は包括的な研究成果をまとめる。これまで、臨床効果に関する解析と副作用に関する解析を平行に行ってきたが、今後は同時に解析を試みる。そのためには共分散構造分析などの新たな統計的手法を用いて、臨床的に意義のある要因を解明してく予定である。今後は副作用に関する疾患感受性遺伝子の解析を始める。具体的には統合失調症300名の糖尿病や高血圧などで現在明らかになっている遺伝子多型を解析し、抗精神病薬の副作用との関連を検討する。さらに薬物標的部位であるドパミンD2,ドパミンD3,ドパミンD4,ドパミントランスポーターおよびセロトニン受容体5HT各種の遺伝子多型の同定する。さらに薬物動態学的遺伝子CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A5, MDR1, MRP2遺伝子の多型を解析する。該当なし
新消化管ペプチド・アドレノメデュリンに関する病態生理学的研究

まず、ヒトとラットの消化管における詳細なアドレノメデュリン(AM)の組織分布についてradioimmunoassay(RIA)を用いて調べた結果、AMは胃から大腸にかけて広範に450-520fmol/gwet tissueの濃度で分布していることが判明した。その大部分は筋層でなく粘膜層に分布しており、高速液体クロマトグラフィーを用いた組織内の分子型の検討では、AM免疫活性は生理活性を持つ成熟型AMと一致した。ノザンプロット法を用いたAMの消化管における遺伝子発現の検討でも、AM遺伝子は胃、小腸、大腸の各消化管組織での発現が認められた。胃の免疫組織学的検討では、AMは胃粘膜のクロモグラニン陽性内分泌細胞に分布しており、さらにガストリン抗体を用いた詳細な検討によりAM陽性細胞はG細胞であることが判明し、AMが生理活性物質としてG細胞に存在し、ガストリンをはじめとする胃内分泌機構に対して何らか関与している事が示唆された。また胃におけるAMの生理学的変化を調べるためにラットを24時間絶食にしてAMの組織内濃度や遺伝子発現を検討したところ、コントロール群と比較して組織内AM濃度は175%の増加を認め、遺伝子発現は約3倍のレベルに達する事が判明した。AMは強力な血管拡張作用を持ち、絶食によってもたらされる胃粘膜の血流低下を調節している可能性が考えられた。これらの結果よりAMは消化管に広く分布し、胃などの消化管機能を維持するような生理物質として作用している事が示唆された。
体内侵入多種混合揮発性化学物質群の同時検出法に関する研究

法医学では、死後に遺体の体組織中薬毒物濃度を測定し,生前や死亡時の状態を知る必要がある.今回,日常生活の中で接触し,かつ事故発生の機会も多い揮発性物質に焦点を合わせ研究を行った.硫化水素中毒を鑑定する上での問題点は、硫化水素の濃度が腐敗の影響により変化するということである.そこで,これらを対象化合物として,動物実験および中毒事例を検討し,定量値の法医学的意義付けを行った.その結果,硫化水素中毒を証明するために硫化物そのものを定量するよりも代謝物であるチオ硫酸塩を指標とする方が良いとの結果を得た.その理由としてチオ硫酸塩の方が安定および高濃度であることが挙げられる.解剖事例におけるチオ硫酸塩を分析する際の対象試料としては,肺,脳もしくは血液が適当であると考えられた.また,生存した事例においては,血液よりも高濃度であることと,より長く出現することから,尿の分析が適当であると考えられた.入浴剤等に含有している多硫化物による中毒の証明に,体組織から多硫化物そのものを初めて分析した.その結果,分析に最も適切な試料は血液であった.また,硫化物の濃度は多硫化物中毒における補助的な指標となることが判った.煙草の成分であるニコチンは,煙草や煙草の侵出液の誤飲によって引き起こされる中毒の原因物質である.ニコチンおよびその代謝物の体組織中からの分析法を確立し,実際の体組織中ニコチンおよびその代謝物コチニンの体内分布を検討した.その結果,血液が得られない場合の測定対象試料として筋肉が適当であると考えられた.本研究は,法医学の実際の鑑定に役立つ分析方法の確立を行ったと同時に,中毒分野において,さらに社会に対して貢献し得るものであったと考えられる.法医学では、死後に遺体の体組織中薬毒物濃度を測定し,生前や死亡時の状態を知る必要がある.今回,日常生活の中で接触し,かつ事故発生の機会も多い揮発性物質に焦点を合わせ研究を行った.硫化水素中毒を鑑定する上での問題点は、硫化水素の濃度が腐敗の影響により変化するということである.そこで,これらを対象化合物として,動物実験および中毒事例を検討し,定量値の法医学的意義付けを行った.その結果,硫化水素中毒を証明するために硫化物そのものを定量するよりも代謝物であるチオ硫酸塩を指標とする方が良いとの結果を得た.その理由としてチオ硫酸塩の方が安定および高濃度であることが挙げられる.解剖事例におけるチオ硫酸塩を分析する際の対象試料としては,肺,脳もしくは血液が適当であると考えられた.また,生存した事例においては,血液よりも高濃度であることと,より長く出現することから,尿の分析が適当であると考えられた.入浴剤等に含有している多硫化物による中毒の証明に,体組織から多硫化物そのものを初めて分析した.その結果,分析に最も適切な試料は血液であった.また,硫化物の濃度は多硫化物中毒における補助的な指標となることが判った.煙草の成分であるニコチンは,煙草や煙草の侵出液の誤飲によって引き起こされる中毒の原因物質である.ニコチンおよびその代謝物の体組織中からの分析法を確立し,実際の体組織中ニコチンおよびその代謝物コチニンの体内分布を検討した.その結果,血液が得られない場合の測定対象試料として筋肉が適当であると考えられた.本研究は,法医学の実際の鑑定に役立つ分析方法の確立を行ったと同時に,中毒分野において,さらに社会に対して貢献し得るものであったと考えられる.我々はガソリン,灯油,軽油などの可燃性混合物について,これらの成分の体組織中からの検出方法を確立し,さらに検出された成分の種類あるいは濃度差によって混合物の異同鑑別を試みてきた.今回,ガソリンが作用した組織において,ガソリン成分がどの程度の期間,正確に検出され得るかということについて若干の知見を得た.また,腐敗によって付随的に産生される物質についても併せて研究を行った.ウィスタール系雄性ラットをガソリン蒸気に30分間暴露後,屠殺.室温放置し,体組織を採取した.採取した試料はガスクロマトグラフィー・質量分析計を用いて気化平衡分析を行った.死後7日目に得られた肝臓試料では炭素数58の鎖状および芳香族炭化水素が検出され,これらはガソリン成分のそれらと一致した.同様のパターンは心臓血について死後48時間,その他の臓器についても死後7日間を通じて認められた.なお,コントロールの試料からはいずれもガソリン成分は検出されなかった.肝臓試料を用いて揮発性腐敗物質について同時分析を行ったところ,死後24時間から,イソプロパノール,ジメチルスルフィドおよびイソバレルアルデヒドが徐々に出現,増加し,さらに4日目からはエチルアセテートおよびジメチルジスルフィドが検出された。これらの物質は微生物の作用によって産生されたものと考えられ,それぞれのピークはm/z4394の特徴的イオンをモニターすることによって,ガソリン成分とは明瞭に区別することができた.さらに,ガソリン蒸気暴露において,体組織中芳香族炭化水素の濃度は死後7日間を通じてほぼ一定しており,従って,死直後の濃度推定が可能と考えられた.本研究は人体に侵入する薬毒物の微量検出法の確立およびその定量値の解釈の検討を目的として行っている.本年度は,対照薬毒物として多硫化物に焦点をあてて,検討を行った.これまで,多硫化物(入浴剤ムトウハップなど)中毒の証明には,血液および体組織中から分解物である硫化物を分析していた.

そこで,多硫化物そのものを体組織中から分析することを試み,硫化物および多硫化物同時分析法を確立した.また,この分析法を用いて多硫化物中毒における体組織中濃度および事例への応用を検討した.(1)動物実験多硫化物入浴剤ムトウハップを用い,ラットにおける中毒時の体組織中硫化物および多硫化物の定量を行った.その結果,多硫化物濃度は血液が最も高く,続いて肝,肺および腎で,他の体組織は検出限界以下であった.硫化物はいずれの体組織からも検出されたが,濃度は血液が最も高くその値は硫化水素暴露中毒時の40倍以上であった.このことから,多硫化物中毒の証明のためには多硫化物そのものを測定することが望ましく,分析試料には血液が良いと思われる.また,血液中硫化物濃度は,多硫化物中毒の証明に補足的に使用することが出来ることが判った.(2)多硫化物中毒が疑われた2事例入浴剤ムトウハップ中毒が疑われた事例2例について多硫化物濃度測定を行った.その結果,2例ともは多硫化物濃度が動物実験の値より716倍と高い値を示し,硫化物濃度はどちらの場合も硫化水素中毒の場合より非常に高い値であった.以上の結果よりこの2例とも死亡原因は,多硫化物中毒であると判明した.以上のように多硫化物中毒における分析方法の確立,最適な分析対照試料の検討,定量結果の解釈およびその応用例について検討を行った.多硫化物による中毒は,細菌剤や農薬などの石灰硫黄合剤や含硫入浴剤ムトウハップなどを,経口的に体内に摂取することにより発生するが,このような場合に多硫化物中毒の照明をするのは,二次的に発生する硫化物の血液中濃度の測定であり,多硫化物そのものを体組織中から測定した報告はなく,多硫化物の体内分布を検討した例はない.そこで,今回ラットに多硫化物を経口投与した後,体組織中多硫化物および硫化物を測定し,その結果あら,多硫黄化物中毒を診断する上で最も適する体組織および対象化合物の検討を行った.また,実際の鑑定にも用いた.1.多硫化物および硫化物のラット体組織中の濃度:ラット体組織中の多硫化物濃度は,血液で0.196μmol/mlと一番高く,次に肝臓0.051,肺0.018および腎臓0.013μmol/mlであった.脳および筋肉では検出限界0.005μmol/ml以下であった.多硫化物はそのものを直接分析でき,また血液が分析対照試料として最も適当であることが判った.硫化物はすべての体組織から検出された.その中で血中濃度は0.518μmol/mlと最も高い値を示し,硫化水素暴露による中毒例の血中濃度の約40倍であった.2.鑑定例:多硫化物中毒が疑われた事例2例に血液から多硫化物が検出され,その値は,1.4および3.2μmol/mlと今回の動物実験の結果と比較すると7-16倍高い値であった.硫化物濃度も1.0,4.1μmol/mlと硫化水素中毒における濃度と比較して非常に高い値であった.これら2例に死因は多硫化物中毒による死亡と診断された.本例は,多硫化物中毒の証明に多硫化物そのものの濃度を用いた始めての鑑定例であった.以上の結果から,多硫化物中毒は体組織から多硫化物そのものを検出することで証明できると推定した.また,分析に最も適切な試料は血液であった.硫化物の濃度は補助的な指標となることが判った.
アミノ酸残基置換がT4ファージ尾鞘蛋白のサブユニット間相互作用と機能に及ぼす影響

1.gp18のドメイン構造の検討:gp18はシースの状態ではプロテアーゼによって全く切断を受けないが,単量体の状態では種々のプロテアーゼによって切断を受け,トリプシンでは分子量27K,キモトリプシンでは29K,サーモライシンでは26K,またリシルエンドペプチターゼ(API)では42Kと31Kの,プロテアーゼ抵抗性断片を生じる.これらのプロテアーゼ抵抗性領域の一次構造上の位置を同定するために,各断片を調整用SDS電気泳動により分離し,各消化断片を電気泳動的に抽出した.これらの断片のアミノ酸配列分析を行い, N末端を決定し,更に分子量とプロテアーゼの基質特異性を考慮することにより,トリプシン消化断片27KはAla82Lys316,キモトリプシン消化断片29kはGly74Phe333,サーモライシン消化断片26KはVal83Asp313であると同定され,プロテアーゼ抵抗性領域は,およそ残基番号80310までの領域であることがわかった. APIの場合, 42K断片はAsp302Gly658(gp18 C末端)であったが, 31K断片は2つのペプチドの混合物であって,一方がGlu11Lys301であるのに対して,他方はAsp302Lys568であった.APIはその高い基質特異性のために,他のプロテアーゼでは切断されやすいC末端領域が切断されずに残るものと考えられる.尾鞘は外に大きく突き出した部分を持っており,この部分がプロテアーゼでは切断されないことから,これが上記のプロテアーゼ抵抗性領域である可能性が高いと考えられる.更に種々の抗血清を用いてイムノプロッティングを行い, gp18のトリプシンとAPIによる限定水解中間体を同定することにより,切断の順序を決定した.2.光-CIDNP法によるgp18のチロシン残基の検出:2個のチロシン残基が検出され,その2つのピークはgp18をニトロ化することによって消失した.なお,収縮したシースの結晶化およびミュータントの変異部位の同定については現在進行中である.1.gp18のドメイン構造の検討:gp18はシースの状態ではプロテアーゼによって全く切断を受けないが,単量体の状態では種々のプロテアーゼによって切断を受け,トリプシンでは分子量27K,キモトリプシンでは29K,サーモライシンでは26K,またリシルエンドペプチターゼ(API)では42Kと31Kの,プロテアーゼ抵抗性断片を生じる.これらのプロテアーゼ抵抗性領域の一次構造上の位置を同定するために,各断片を調整用SDS電気泳動により分離し,各消化断片を電気泳動的に抽出した.これらの断片のアミノ酸配列分析を行い, N末端を決定し,更に分子量とプロテアーゼの基質特異性を考慮することにより,トリプシン消化断片27KはAla82Lys316,キモトリプシン消化断片29kはGly74Phe333,サーモライシン消化断片26KはVal83Asp313であると同定され,プロテアーゼ抵抗性領域は,およそ残基番号80310までの領域であることがわかった. APIの場合, 42K断片はAsp302Gly658(gp18 C末端)であったが, 31K断片は2つのペプチドの混合物であって,一方がGlu11Lys301であるのに対して,他方はAsp302Lys568であった.APIはその高い基質特異性のために,他のプロテアーゼでは切断されやすいC末端領域が切断されずに残るものと考えられる.尾鞘は外に大きく突き出した部分を持っており,この部分がプロテアーゼでは切断されないことから,これが上記のプロテアーゼ抵抗性領域である可能性が高いと考えられる.更に種々の抗血清を用いてイムノプロッティングを行い, gp18のトリプシンとAPIによる限定水解中間体を同定することにより,切断の順序を決定した.2.光-CIDNP法によるgp18のチロシン残基の検出:2個のチロシン残基が検出され,その2つのピークはgp18をニトロ化することによって消失した.なお,収縮したシースの結晶化およびミュータントの変異部位の同定については現在進行中である.
ロボットの行為に基づいた言語の学習モデル

我々の柔軟な認知的能力は記号的心的表象によって支えられている。特に、既知の経験の再利用による未知の状況への対応には、記号的表象が欠かせない。本研究は、記号的表象の知覚運動経験に基づいた獲得の計算プロセスを提案した。特に、高度に抽象化・構造化された心的表象と、具体的かつ連続的な知覚運動経験の橋渡しとして、ロボットの身体として与えられる知覚運動レベルの類似性が有効に働くことを実験的に示した。この結果に基づいて、いくつかの既存の認知発達理論を再検討し、それらの新しい計算論的解釈を展開した。本研究計画の目的は、ロボットの行為経験に接地した言語の学習モデルの実現であった。この目的を果たすために、今年度は行為のドメインにおいて組み合わせ的な心的表象の自己組織化学習実験をシミュレーション環境上で行った。結果、従来手法では不可能であった動詞概念の経験学習による獲得に成功した。具体的には、新たに提案した学習モデルを用いて、ロボットに未経験の行為を既知の動詞、名詞、副詞の新たな組み合わせとして生成させることができた。新たな行為の部品となった動詞・名詞・副詞は、ロボットが行為経験を通じて学習したものである。従来、動詞概念の学習において最も大きな障害となっていたのは「動詞が目的語や副詞と組み合わされて行為を表現する」という述語構造についての知識の獲得方法である。近年、人間の乳児の言語発達の用法基盤アプローチに基づいた研究で、この構造的な知識の獲得メカニズムヘの関心が高まっているが、具体的な計算モデルは提案されていなかった。本計画では、従来のアプローチと全く異なり、かつ、用法基盤アプローチと整合的な概念獲得の計算モデルを提案した。これまでのモデルが個々の概念を明示的に獲得することを基本に考えていたのに対し、本計画で提案したモデルは経験間の規則的な関連性を獲得することに注目した。たとえば、「投げる」という概念を獲得する場合、従来手法では「ボールを投げる」といった行為経験から「投げる」を明示的に取り出そうとした。これには述語構造を前提する必要があるので動詞概念の獲得モデルとして中途半端にならざるを得ない。これに対し、「ボールを投げる」と「箱を投げる」、さらには「ボールを蹴る」と「箱を蹴る」といった様々な行為間の関係を表象の対象とする本計画の立場では、述語構造の創発的な獲得プロセスを観察することができた。この結果をロボット研究として進めていくだけでなく、認知理論へのフィードバックをしていきたいと考えている。前年度に得た行為の概念化学習の計算モデル実験の結果を、認知心理学の視点から捉えなおすことを試みた。その目的は、従来の認知理論が計算論的な説明を与えることに失敗している諸現象に対し、ひとつの可能な計算論的解釈を与えることである。たとえば、Kamiloff-Smithが提案した概念発達のシナリオや、LakoffとJohnsonが提案した言語理論において、知覚運動経験の構造的理解のメカニズムを説明することの困難が発生しており、いまだに解決されていない。これらの困難の本質は「経験を構造的に理解するために必要な構造を、いかにして経験から獲得するか」である。この問題は矛盾を含んでおり、単純に解消することはできない。本研究は、この矛盾を解消するための理論的整備を行った。重要な発見は次のとおりである。1)認知心理学における心的概念の表象や認知言語学の意味表象において、当たり前のように用いられている役割-述語構造(role-argument structure)の背後にある1つの可能なアナログメカニズムを提案した。これによって、類似性に基づいたスキルの転移と、役割-述語構造に基づいた要素概念の組み換えによる新たなスキルの生成を、共通の計算論的枠組みで論じることができるようになった。(組み換えとは、「ボールを蹴る」と「缶を拾う」の2つの行為の経験に基づいて、新たな行為である「缶を蹴る」を生成するようなことを指す。)2)この枠組みの下で、Kamiloff-Smithが述べている概念発達のシナリオのひとつの可能な計算論を与えることができた。このシナリオはUシェーブ現象とも関係が深く、特定の状況だけに適用可能な生得的スキルが、広範な状況に対してシステマティックに対応できるスキルに取って代わるメカニズムの説明を試みている。本研究は、このメカニズムの背後にある可能な計算論的メカニズムを提案する。
極微量トリチウム分析法の開発と海水のトリチウムーヘリウム3年代測定への応用

海水中の極微量のトリチウムを精度良く分析できるシステムを開発することを目的とした。トリチウムの測定にはヘリウム-3イングロウ法を用いた。従来のβ線計測法により分析したトリチウム濃度既知の試料水を、本研究で開発したシステムで分析したところ従来法による分析値とよく一致し、検出感度や精度は従来法と同等かそれ以上であった。海洋調査船を用いて東北沖太平洋で採取した表面海水を分析したところ、海洋の表面水として妥当な結果が得られた。本研究では海水中の極微量のトリチウムを精度良く分析できるシステムを開発することを目的とする。トリチウムの測定にはヘリウム-3イングロウ法を用いる。これはトリチウムが放射壊変してできる娘核種のヘリウム-3を測定することで間接的にトリチウム濃度を分析する方法である。この方法を用いるにはまず海水に溶存しているヘリウムを完全に脱ガスし、その後密閉して数ヶ月管保管する必要がある。そのための装置をまず開発した。真空バルブを備えた金属製の容器を用意し、真空にした後密閉して空気が混入しないか確かめた。その後蒸留水を保管容器に入れ溶存ヘリウムの脱ガス方法を検討したが、完全に脱ガスすることはできず今後方法を検討し直す必要があることがわかった。2004年にニュージーランド東方沖の南太平洋で採取した海水のトリチウムーヘリウム-3年代を求め、年代の妥当性とその年代から推定される南極中層水の沈み込みについて考察した。トリチウム濃度は電解濃縮した後液体シンチレーションカウンターで分析したものを使った。求めた年代から南極中層水の沈み込みと共に年代が古くなることが確認され、沈み込みの時間スケールに関して重要な知見が得られた。東京大学海洋研究所運用の研究船白鳳丸によるインド洋を縦断する航海(KH-09-5次航海)において、南極中層水の沈み込みの研究を視野に入れて南インド洋で海水試料の採取を行なった。ヘリウム分析用は銅管に、トリチウム分析用はポリプロピレン容器に空気ができるだけ入らないように採取した。インド洋における南極中層水の沈み込みについて上記の南太平洋の観測と比較できる貴重な試料が得られた。今年度実施した研究は以下の通りである。1.イングロウ法でトリチウムを分析するために海水を長期間保管する方法を検討した。溶存ガスの脱ガスについては改善したが、長期間の保管中にバルブから大気のヘリウムが漏れることが判明したため保管容器を改良した。キャリブレーション用海水と採取した海水試料を脱ガスした後密閉容器に保管した。2.東京大学大気海洋研究所運用の海洋調査船淡青丸を用いて鹿児島湾および東北沖太平洋でヘリウム同位体分析用に海水試料の採取を行なった。3.海水に溶存しているヘリウムの濃度および同位体の分析を行なった。今年度採取した上記試料の他に、2009年にインド洋において採取した海水のうち南極中層水が存在する海域の試料を中心に分析した。その結果、南太平洋と同様に南インド洋の中層にも最近まで表層にあったと思われる水の存在が確認できた。今年度は研究を行なっているキャンパスの移転に重なり分析装置の移設に手間取り、実施計画が予定通りには進まなかった。特にトリチウム濃度をヘリウム-3として分析する希ガス用質量分析計の立ち上げに半年以上かかった。さらに3月には大地震によりこの装置や海水試料の保管容器に大きな被害を受けた。昨年3月からの度重なる地震により分析装置や試料が被害を受けたのと、夏季の節電により分析装置を停止せざるをえなかったので当初の計画通りには進まなかったが、分析法の確立という目的は達成できた。1.東京大学大気海洋研究所運用の海洋調査船である白鳳丸や淡青丸などを用いて、東北沖太平洋で数回にわけてヘリウム同位体およびトリチウム分析用に海水試料の採取を行なった。また北太平洋の広い範囲でも表層から深層までの海水を採取した。2.液体シンチレーションカウンターを使った従来法で分析したトリチウム濃度既知の試料水を標準試料として、ヘリウム-3イングロウ法による分析値の妥当性を検討した。その結果従来法による分析値と矛盾しない結果が得られ、地震により保管期間が短くなる制限があったものの検出感度や精度は従来法と同等かそれ以上であった。

3.南インド洋で採取した海水のヘリウム同位体分析の結果から、最近まで表層にあったと思われる中層水を選んで、ろ過・蒸留した後にトリチウム濃度分析用に密閉容器に入れ脱ガスしてから保管した。また東北沖太平洋で採取した表層海水のトリチウム濃度をヘリウム-3イングロウ法で分析したところ、海洋の表面水として妥当な結果が得られた。
神経栄養因子と脳移植による脳損傷後の神経機能回復の比較検討

ラット大脳皮質知覚領野損傷後組織学的に検討すると同側視床では損傷後14日で急激な変性を生じていた.b-FGFを投与後,視床神経細胞の神経機能の変化を電気生理学的に検討した.組織学的にはb-FGFにて同側視床の退行変性は完全ではないが有意に退行変性は防止できた.しかし,b-FGF投与にて視床神経細胞のsynaptictransmissionはむしろb-FGF非投与群に比べ有意に障害を受けていた.大脳皮質損傷後14日では退行変性に陥っている視床ではマイクログリアと考えられるPCNA陽性細胞の出現を認めた.またラット大脳皮質梗塞モデルを使い,経時的に視床におけるグルコース代謝を検討すると,梗塞後1,7,14日ではグルコース代謝低下を認めるものの28日になると著しいグルコース代謝亢進を認めた.しかし,その時期では視床は著しい退行変性に陥っていた.また大脳皮質損傷モデルと同様に大脳皮質梗塞モデルでは14,28日目にはPCNA陽性細胞の出現を認め,また血管の増生も認めた.また線条体梗塞後,線条体と神経結合を持つ黒質にてグルコース代謝亢進を生じるが黒質神経細胞を電気生理学的に評価すると神経細胞の過興奮は認めずむしろ神経機能は低下を生じていた.ラット大脳皮質知覚領野損傷後組織学的に検討すると同側視床では損傷後14日で急激な変性を生じていた.b-FGFを投与後,視床神経細胞の神経機能の変化を電気生理学的に検討した.組織学的にはb-FGFにて同側視床の退行変性は完全ではないが有意に退行変性は防止できた.しかし,b-FGF投与にて視床神経細胞のsynaptictransmissionはむしろb-FGF非投与群に比べ有意に障害を受けていた.大脳皮質損傷後14日では退行変性に陥っている視床ではマイクログリアと考えられるPCNA陽性細胞の出現を認めた.またラット大脳皮質梗塞モデルを使い,経時的に視床におけるグルコース代謝を検討すると,梗塞後1,7,14日ではグルコース代謝低下を認めるものの28日になると著しいグルコース代謝亢進を認めた.しかし,その時期では視床は著しい退行変性に陥っていた.また大脳皮質損傷モデルと同様に大脳皮質梗塞モデルでは14,28日目にはPCNA陽性細胞の出現を認め,また血管の増生も認めた.また線条体梗塞後,線条体と神経結合を持つ黒質にてグルコース代謝亢進を生じるが黒質神経細胞を電気生理学的に評価すると神経細胞の過興奮は認めずむしろ神経機能は低下を生じていた.ラット大脳皮質知覚領野損傷(Cortical Ablation)モデルを用いた。大脳皮質損傷後,経時的に損傷された大脳皮質に神経連絡を持つ視床神経細胞の神経機能の変化を電気生理学的に検討した。すなわち損傷する知覚領域である前脚を電気刺激しその刺激により誘発される視床知覚中継核神経細胞のsingle unit responseを微小電極を用いて測定し,その視床神経細胞のsynaptictransmissionを検討した。aham controlでは30Hzでの電気刺激下でのVPL神経細胞のfiring rateは約0.7spikes/stimulusであったが,大脳皮質損傷後14日後では約0.4と低下した。一方,b-FGF投与群ではむしろ損傷後4日目で約0.1と著明に減少した。組織学的には大脳皮質損傷後14日目では視床神経細胞の変性を認めた。神経栄養因子であるb-FGF(1mug)を大脳皮質損傷直後および損傷後4日後に投与したラットではb-FGF非投与群に比べ視床神経細胞の変性の程度は軽く,これまでの報告と同様に組織学的にはb-FGFの効果を認めた。しかし、VPL神経細胞にしぼった機能の面からはむしろb-FGFは機能を抑制する働きをしていると考えられた。脳損傷後,損傷部位に一致する神経機能障害を生じる.こうした神経機能障害は時間の経過とともにある一定のレベルまでは回復する.こうした自然経過による神経機能回復のメカニズムを解明することはより一層の神経機能回復をめざす上で極めて重要な課題である.脳においては各神経組織は様々な神経連絡により神経回路網を作り,神経機能を維持している.局所の脳損傷であってもその神経連絡を通してその影響はしばしば脳損傷の遠隔部におよびうる.すなわち大脳皮質損傷後,そこと神経連絡を持つ視床において神経機能障害を生じさらに著明な組織学的な退行変性を生じる.これまでの研究により視床に退行変性に対して神経栄養因子であるb-FGFを脳内に投与することによって組織学的な改善が得られるが,しかし,大脳皮質が損傷を受けたままb-FGFにて視床の退行変性を防止するとむしろ視床神経細胞の神経機能はより障害されることが明らかになった.さらに線条体と黒質の神経回路網においても線条体の破壊により黒質が退行変性に陥るが神経伝達物質であるGABAを投与することによりこの線条体破壊後の黒質変性が組織学的に防止し得るが神経機能の回復はかえって障害を受けることが知られている.平成6年度では大脳皮質損傷の視床および線条体損傷後の黒質の病態について組織学的に検討をさらに進めた.ラット大脳皮質損傷後同側視床にproliferating cell nuclear antigen(PCNA)陽性細胞の出現を認めた.またラット線条体損傷後黒質においてもPCNA陽性細胞の出現が疑われた.

これらは形態から判断して通常のグリア細胞ではなくマイクログリアの可能性が高いと考えられる.神経機能の評価法として電気生理学的に神経活動を評価する方法の他にグルコース代謝にて神経機能を評価する方法もある.そこでラット大脳皮質梗塞モデルを使い,経時的に視床におけるグルコース代謝を検討すると,梗塞後1,7,14日ではグルコース代謝低下を認めるものの28日になると著しいグルコース代謝亢進を認めた.しかし,その時期では視床は著しい退行変性に陥っていた.グルコース代謝亢進が神経細胞に由来するものであれば神経機能の過興奮といえるが,神経細胞に由来しないのであれば別の病態を考えなければならない.組織学的には大脳皮質梗塞モデルでは14,28日目にはPCNA陽性細胞の出現を認め,また血管の増生も認め,マイクログリアなどによるグルコース代謝亢進の可能性が高いと考えられた.線条体梗塞においても線条体と神経結合を持つ黒質にてグルコース代謝亢進を生じるが黒質神経細胞を電気生理学的に評価すると神経細胞の過興奮は認めずむしろ神経機能は低下を生じていた.
13〜15世紀イスラム神秘主義研究

前年度に続き、アラビア語やペルシア語などによって書かれた現地語文献の読解を通じて、13-15世紀のイラン・中央アジアにおけるイスラム神秘主義者たちの活動を明らかにすることを目的に研究を進めた。これまでは主に公刊されている文献をもとに研究を行ってきたが、今年度はさらにウズベキスタン共和国においてイスラム神秘主義文献の写本調査を行い、多くの未公刊文献に関する情報を収集した。特に、これまで研究を進めてきたクブラウィーヤ・タリーカに所属する神秘主義者たちに関係するペルシア語やテュルク語の写本を調査し、近代に至るまでの中央アジアにおける彼らの影響を跡づけることができた。その中で、13-15世紀に生きた神秘主義者たちの思想が後世において受け継がれているばかりでなく、それらの神秘主義者たちが聖者として人々の記憶に残り、その記憶が各時代の心性を反映しながら変化しつつ受け継がれていることをいくつかの未公刊原典史料において確認することができた。現在その研究成果を論文の形で公表するための準備を進めている。さらに、自分が専門とするイラン・中央アジアの神秘主義者たちと、他地域における神秘主義者たちの活動の比較研究にも着手した。特に、神秘主義者たちが形成した教団組織に関する昨年度までの研究成果を応用し、神秘主義教団の組織形態の傾向をより一般的な形で理解するための研究を進めた。その成果のうち、教団の後継者問題に関してイスラム世界を広く見渡した論文を既に作成・提出しており、近日中に公刊される予定である。これまで13-15世紀のイラン・中央アジアにおけるイスラム神秘主義者たちの活動、特に彼らが形成した流派・教団(タリーカ)について研究してきたが、その過程でタリーカの概念そのものを再検討する必要性を認識した。タリーカは従来の研究で捉えられていたような確たる教団組織ではなく、より柔軟な存在形態を持っていたこと、またその存在形態を理解するための方法論として、タリーカの諸相を以下の五つの視点から検討すべきであることを、いくつかの事例研究から明らかにした。五つの視点とはすなわち、(1)教統(2)教義(3)教団(4)帰属意識(5)他者の認識、であり、それらを総合することで「一つのタリーカ」,「タリーカの成立」などの意味が明らかになる。タリーカがイスラーム世界史において重要な役割を演じたのは周知のことであるが、その機能を論ずるためには形態の把握が不可欠の前提であり、その意味で本研究の成果がタリーカ研究の基礎づくりに貢献し得るものと考える。この問題に関しては今年度に二度口頭発表を行い、それぞれタリーカ一般の存在形態、具体例としてのクブラウィーヤ・タリーカの存在形態について述べ、現在それらを扱った論文を準備中である。また、上記のダリーカの諸相のうち、教団組織としての面、特に教団指導者の世襲問題についても研究を進めており、教団における世襲のパターンや、血統に対する教団員の意識などについて明らかにした。その成果の一部は既に論文化しており、論文集の一編として発表予定である。
生体のエネルギー消費能力を増大させる褐色脂肪由来アディポカインの同定

褐色脂肪組織は脂肪を燃焼して熱を産生する組織で、エネルギー消費の側面から肥満対策のターゲットとなることが期待されている。本研究では褐色脂肪細胞の量を増やす方法の解明を目指して、細胞増殖に注目して研究を行った。褐色脂肪細胞の数は、前駆細胞が増殖して褐色脂肪細胞へと分化する経路と、褐色脂肪細胞そのものが増殖する経路により制御されており、両者は異なる機構により制御されていることがわかった。また、褐色脂肪細胞数の増加は全身の基礎代謝量を増やすことがわかった。一方、誘導性の褐色脂肪細胞であるベージュ脂肪細胞は加齢に伴い減少し、その原因として前駆細胞の数の減少が関わる可能性を見出した。褐色脂肪組織は熱を産生する特殊な脂肪組織であり、脱共役タンパク質UCP1が熱産生能を担っている。UCP1が活性化すると熱産生の基質として脂肪酸が消費され、体脂肪が減少するので、エネルギー消費の側面からの肥満対策のターゲットとなる。近年、ヒト成人にも機能的な褐色脂肪が存在することが証明されたが、ヒト褐色脂肪は加齢に伴い減少し、それが加齢性肥満の増加の一因である可能性が高い。したがって、褐色脂肪の量を増やす方法を考える必要がある。応募者らは新規の自己増殖経路を見いだし、褐色脂肪細胞の数の制御に重要であることを明らかにした。そこで、本研究では褐色脂肪細胞の数の制御機構の解明に向けて、褐色脂肪細胞の自己増殖を誘導する因子の同定を目指している。本年度は、褐色脂肪細胞の増殖が誘導される条件や時期などについての検討を詳細に行なった。明らかになった条件をもとにRNAseq法による解析に用いるサンプルを採取する予定である。また、細胞増殖をより直接的に観察するために、細胞周期依存的に蛍光タンパク質を発現するFUCCIマウス(Takaya et al. Development, 2013)を理化学研究所より導入し、繁殖を行なった。これにより、今後より詳細な解析が可能になると期待される。本年度は、褐色脂肪細胞の自己増殖経路の解明に向けて以下の実験を行なった。1)これまでの結果から、寒冷刺激により褐色脂肪細胞の分裂増殖が亢進することが明らかになっていたので、交感神経の関与を明確にするために、アドレナリンβ3受容体作動薬CL316,243を投与して褐色脂肪細胞の自己増殖への影響を調べた。CL投与により増殖が亢進したことから、褐色脂肪細胞の自己増殖の制御には交感神経が重要であると考えられた。2)成熟細胞の自己増殖が褐色脂肪細胞に特異的な経路であるか否かを調べるために、成熟脂肪細胞特異的に細胞周期の進行を抑制したトランスジェニックマウスを用いて実験を行った。野生型マウスでは、CLを長期間投与すると白色脂肪組織中にベージュ脂肪細胞が誘導され、マーカー分子であるUCP1が発現した。トランスジェニックマウスにおいても、野生型マウスと同程度にベージュ脂肪細胞とUCP1発現が誘導されたことから、ベージュ脂肪細胞は自己増殖能を持たないことが推測された。3)褐色脂肪細胞の自己増殖が誘導される際に、どのような遺伝子発現の変動があるか、どのような代謝の変化があるかを明らかにするために、RNA-seq解析とメタボローム解析を行なった。現在解析を進めており、自己増殖を誘導する因子の候補を絞り込んでいる。来年度は、それらの候補因子について増殖誘導能の検証を行なう予定である。以上の結果より、褐色脂肪細胞の増殖を制御する経路の一端と、褐色脂肪細胞の特異性が明らかになった。今後は制御因子に焦点あてて研究を進めることで、褐色脂肪細胞を増やす方法の開発に向けた基礎的データを得たい。予定通りRNA-seq解析を行なうことができたが、絞り込んだ因子についてのin vitroおよびin vivoでの検証を急ぐ必要があるので、「(3)やや遅れている。」と評価した。本研究では、褐色脂肪細胞の増殖機構について焦点を当てて研究を行った。昨年度までの研究により、褐色脂肪細胞が分化後にも増殖すること、またその増殖がアドレナリンβ3受容体作動薬により誘導されることが明らかになったため、今年度はそのメカニズムについて検討を進め、1)寒冷刺激は交感神経を介して褐色脂肪細胞の増殖を誘導すること、2)寒冷刺激誘導性の増殖はアドレナリンβ3受容体のブロッカーにより抑制されたが、β1受容体ブロッカーの影響を受けないこと、3)成熟脂肪細胞の増殖を人為的に停止させたトランスジェニックマウスにおいては、β3受容体作動薬による増殖が起こらないこと、4) β3作動薬により増殖を誘導し、褐色脂肪量を増加させると全身のエネルギー消費量が増加すること、などが明らかになった。また、ヒト褐色脂肪が加齢に伴い減少するメカニズムを明らかにするために、マウスを用いて加齢と褐色脂肪量の関係について検討を行った。ヒト褐色脂肪は白色脂肪組織中に誘導される褐色脂肪細胞様のベージュ脂肪細胞である可能性が報告されているが、マウスにおいても交感神経性刺激によるベージュ脂肪細胞の誘導性が加齢に伴い減少することがわかった。そのメカニズムとして、ベージュ脂肪細胞に分化することが報告されているPDGFRα陽性のプロジェニター細胞の数の減少によることが示唆され、今後は成熟細胞のみならずプロジェニター細胞の数の制御機構についても検討していく必要があると考えられた。

本研究では褐色脂肪細胞の量を増やす方法の解明を目指して、細胞増殖に注目して研究を行った。褐色脂肪細胞の数は、前駆細胞が増殖して褐色脂肪細胞へと分化する経路と、褐色脂肪細胞そのものが増殖する経路により制御されており、両者は異なる機構により制御されていることがわかった。また、褐色脂肪細胞数の増加は全身の基礎代謝量を増やすことがわかった。一方、誘導性の褐色脂肪細胞であるベージュ脂肪細胞は加齢に伴い減少し、その原因として前駆細胞の数の減少が関わる可能性を見出した。計画では、初年度にRNA-seq法による解析を行なう予定であったが、次年度に持ち越すことになった点で、やや遅れていると評価した。遺伝子発現の網羅的解析を行なうためのサンプルを採取する条件、時期を明確することにより、今後の解析をより正確に行なうことが出来ると判断したため、そちらを優先したためである。RNA-seq解析の結果をもとに、褐色脂肪細胞の自己増殖に伴い発現や分泌が増加するサイトカインや増殖因子を絞り込み、増殖促進作用があるか否かをin vitroおよびin vivoで検証する予定である。代謝学初年度の結果をもとに、褐色脂肪細胞の自己増殖が誘導される条件において発現や分泌が増加する因子の同定を、次世代シークエンサを用いたRNA-seq法により行なう予定である。次年度使用額:383,313円のうち、353,342円は消耗品等で執行・納品済みである。初年度に実施する予定だった次世代シークエンサによる解析を2年目に行なうことにした。解析に経費がかかることが予想されるため、初年度使用額の一部を次年度に繰り越した。残り29,971円は翌年度の消耗品として使用予定。