hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HLAを標的とする化学物質の細胞内精密デリバリーシステムの開発と医療への展開

本研究では、免疫担当細胞のエンドソームあるいはサイトゾルに精密に化学物質を送達するキャリアの開発とその医療展開を目的とする。これまで、pH応答性を有する合成高分子ポリグリシドール誘導体をリポソームに複合化することでサイトゾルデリバリー型のpH応答性リポソームを作成し、その抗原キャリアとしての有用性を示した。本年度は、このリポソームに細胞との相互作用を増強するためにカチオン性脂質導入し、その抗原デリバリー機能と免疫誘導機能への影響について検討した。その結果、カチオン性脂質をリポソーム膜中に組み込むことで、樹状細胞による取り込みが増大し、また、同時に、サイトゾルへのデリバリーからエンドソームへのデリバリーにそのデリバリー機能が変化する傾向を示した。このリポソームに抗原タンパク質であるオボアルブミンを内包させ、オボアルブミンを過剰発現するEG7-OVA細胞の腫瘍をもつマウスに皮下投与したところ、強い抗腫瘍効果を示すことがわかった。また、多糖をベースとするpH応答性ポリマーとしてカードラン誘導体、デキストラン誘導体、マンナン誘導体を合成し、それらの多糖誘導体で修飾したリポソームの細胞内デリバリーシステムとしての機能を検討した。その結果、これらの多糖誘導体修飾リポソームは樹状細胞に取り込まれてサイトゾルに内包物を導入できること、また、中でもカードラン誘導体修飾リポソームが最も効率よく樹状細胞に取り込まれてサイトゾルにデリバリーすることがわかった。これらの多糖誘導体修飾リポソームにオボアルブミンを内包させ、担癌マウスに皮下投与したところ、カードラン誘導体修飾リポソームがもっとも顕著な腫瘍縮退効果を示した。さらに、細胞融合性キャリアとして、デンドロン脂質ベシクルを開発した。エンドソーム内部の弱酸性環境下においてミセル転移を引き起こし、樹状細胞サイトゾルへの効果的タンパク導入に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究において、pH応答性ポリグリシドール誘導体修飾リポソームが細胞内のエンドソームと融合して内包する化学物質をサイトゾル内部に導入することを明らかにしている。そこで、このpH応答性リポソームのペプチドワクチンキャリアとしての機能について評価した。オボアルブミン(OVA)およびその由来ペプチドであるOVA-I(MHC class I結合性)、およびOVA-II(MHC class II結合性)を封入したpH応答性ポリマー修飾リポソームを作製し、その免疫誘導機能について検討した。E.G7-OVA腫瘍をもつマウスに、これらの抗原封入リポソームを皮下投与し、その腫瘍成長を追跡した。その結果、OVA-Iペプチドを封入したリポソームは、OVA封入リポソームと同様の腫瘍縮退効果を示したのに対して、OVA-IIペプチド封入リポソームはほとんど腫瘍成長抑制を示さなかった。また、新しいタイプのpH応答性リポソームとして、オリゴエチレングラフト鎖をもつメタクリル酸共重合体修飾リポソームの開発を行った。この共重合体で修飾したリポソームは、低温においては中性弱酸性において安定に化学物質を内包したが、体温以上においては、弱酸性環境での内包物の放出が促進された。温度応答性をもつオリゴエチレングリコール鎖とメタクリル酸ユニットのカルボキシル基の作用によって、体温以上、弱酸性条件下においてリポソームが不安定化されたものと考えられる。水溶性蛍光色素カルセインを内封した共重合体修飾リポソームを細胞に取り込ませ、共焦点レーザー顕微鏡によって観察したところ、エンドソーム内部で効率よく内包物を放出することがわかった。このリポソームは、エンドソーム内部で内包する化学物質を効果的に放出するキャリアとして利用できると考えられた。さらに、カルボキシル基を導入した多糖誘導体修飾リポソームの作製も検討した。

26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究プロジェクトでは、免疫担当細胞のエンドソームあるいはサイトゾルに精密に化学物質を送達するキャリアの開発とその医療展開を目的とする。本年度は、エンドソームの酸性環境で膜融合するpH応答性ポリマー修飾リポソームのワクチンキャリアとしての有用性について検討した。その結果、MHC Class I結合性ペプチドおよびClass II結合性ペプチドのいずれも、リポソーム化することで、その免疫誘導機能を高められることを明らかにした。特に、MHC Class I結合性ペプチドを内包したpH応答性ポリマー修飾リポソームの投与によって、担癌マウスの腫瘍体積は顕著に縮退し、効果的ながん特異的細胞性免疫が誘導されることが示された。これは、このリポソームが細胞に取り込まれてエンドソームと膜融合することでペプチドワクチンがサイトゾルに導入され、これがClass I分子に提示されてCTLが活性化され、OVAを表面に発現した腫瘍細胞を攻撃したことを示す。これらの結果は、このリポソームを用いることでペプチドワクチンの効力を高めることができることを示している。本年度は、さらに新しいタイプの機能性リポソームであるpH・温度デュアル応答型リポソームの開発に成功した。このリポソームは、生体適合性に優れるオリゴエチレングリコール鎖を多数持つメタクリル酸共重合体を用いているため、生体内への適用に有利な構造を有している。このデュアル応答型リポソームは、低温においては弱酸性環境で内包物を放出しないが、体温では、弱酸性環境で内包物の放出を引き起こす。従って、細胞に取り込まれると、弱酸性のエンドソーム内において不安定化してエンドソーム内に内包物を放出した。このリポソームはHLA関連化学物質を標的細胞のエンドソームに送達するキャリアとして利用できる。生体内での利用に適した多糖修飾リポソームの開発も評価できる。これまでに、サイトゾルデリバリー型リポソームを用いて、そのワクチンでキャリアとしての有用性を明らかにすることに成功した。このタイプのリポソームは、内包物をMHC class I分子上に提示させることができるので、細胞性免疫の誘導に適している。一方、ヘルパーT細胞を介して、液性免疫や細胞性免疫を誘導、活性化するためには、エンドソーム内で確実に内包物を放出するキャリアの利用が必要である。この様なキャリアとして、本年度開発したオリゴエチレングリコール鎖をもったメタクリル酸共重合体修飾リポソームが利用できる。次年度は、このリポソームを中心にエンドソーム放出型リポソームのワクチンキャリアとしての機能と有用性を明らかにしていきたい。また、本年度新たに開発した多糖誘導体修飾リポソームの細胞内デリバリーシステムとしての機能とそのがん免疫治療、がん化学治療への適用の可能性を明らかにしたい。
慢性腎臓病におけるインスリン抵抗性の発症機序解明と治療への応用

慢性腎不全(CKD)患者で合併するインスリン抵抗性(IR)の発症機序は未だ不明である。骨格筋ミトコンドリア(Mt)でアセチルCoA(AcCoA)が増加すると,細胞内代謝が停滞してIRが惹起されると考えられる。本研究では,CKD患者の腎機能低下に伴う血清AcCT濃度の有意な増加を確認した。また,骨格筋培養細胞では,アセチル基の転換酵素(CrAT)により,AcCTがAcCoAとCTへ逆変換され,Mt内AcCoAが蓄積する事で,IRが惹起される事を確認した。したがって,CKD患者では,血中で増加するAcCTが骨格筋Mt内でAcCoAの蓄積を引き起こしてIR発症をもたらす機序が示唆された。本研究では,慢性腎臓病(CKD)患者に合併する原因不明のインスリン抵抗性(IR)の発症機序について検討を行っている。CKD患者では,多くの物質と同様に,腎機能の低下による尿排泄低下が生じ,骨格筋エネルギー代謝に関与するカルニチン関連物質(アセチルカルニチン)の血液中濃度も上昇していると考えられ,IRの発症機序に関与している可能性が示唆される。そこで,今年度は,CKD患者(75名)において,血液中のカルニチン,アセチルカルニチン濃度を,対照群(腎臓病非罹患者48名)と比較し,さらに,腎機能との関連性を検討した。その結果,CKD群では,対照群と比較し,血清アセチルカルニチン濃度の有意な上昇が見られた。また,CKD患者の腎機能(eGFR値)の悪化に伴い,血清アセチルカルニチン濃度が高まる事が確認された。一方,血清カルニチン濃度には,CKD群と対象群とに差は見られず,eGFR値の関与もなかった。初年度の結果から,CKD患者で観察された腎機能の悪化に伴う血清アセチルカルニチン濃度の有意な上昇が,骨格筋のエネルギー代謝を介して,IRの発症に影響している可能性が示唆された。初年度は,CKD患者の血液サンプル等を用いて,インスリン発症に関連する因子を探索する研究を計画であった。検討の結果,CKD患者血清で,骨格筋エネルギー代謝に関与するカルニチン関連物質の上昇を見出した。初年度の成果により,次年度以降のインスリン発症の機序を解明する裏付けと手がかりが得られた。慢性腎臓病(CKD)患者に合併する原因不明のインスリン抵抗性の発症機序解明を目的に,昨年度までの検討の結果,CKD患者では対照群(腎臓病非罹患者)と比較して,腎機能(eGFR値)の悪化に伴い血清アセチルカルニチン濃度の有意な増加がみられた。アセチルカルニチンは,主に,骨格筋における脂肪酸β酸化の代謝産物として,血液中に放出されることから,CKDでは,骨格筋における糖ー脂質エネルギー代謝異常が生じている事が,インスリン抵抗性の発症に関与している可能性が示唆される。そこで,今研究では,CKDにおける骨格筋における糖ー脂質エネルギー代謝状態を評価するためのCKDモデルラットを作成した。CKDモデルは,左腎動脈枝2本と右腎動静脈全枝を結紮処理し腎摘出した5/6腎臓摘出を施し,10週間飼育し作成した。飼育後,血液と腎臓,肝臓,骨格筋を摘出して,カルニチン関連物質を測定した。その結果,5/6腎臓摘出モデルラットでは,偽手術を施したコントロールラットと比較して,腎機能の低下は見られるものの,血液中アセチルカルニチン濃度の増加は見られず,寧ろ,有意な低下が生じ,患者病態を反映していなかった。アセチルカルニチンの前駆物質であるカルニチンも同様に有意な減少が見られた。カルニチンは,腎臓にて合成されることから,腎摘出モデルではカルニチン代謝そのものが欠落している事が,ヒト患者病態を反映しない原因であることが推測された。昨年度の慢性腎不全(CKD)患者における臨床検体での検討に加え,今年度は,動物モデルでの検討を実施した。当疾病動物モデルは,CKD患者の病態を反映するものではなかったが,病態の解明には骨格筋のみに焦点をあてる必要があることが確認でき,次年度の骨格筋培養細胞における検討に繋がった。慢性腎臓病(CKD)患者に合併する原因不明のインスリン抵抗性の発症機序の解明を目的に検討した結果,前年度までに,CKD患者では腎機能(eGFR)の悪化に伴い血中アセチルカルニチン(ACT)濃度が有意に増加している事が明らかとなった。ACTは,骨格筋に生体中の95%以上が含まれるカルニチン(CT)の代謝物であり,骨格筋の脂肪酸β酸化反応の最終産物として血中に放出される。そのため,CKD患者では糖-脂質エネルギー代謝に異常が生じ,インスリン抵抗性が発症する可能性が考えられる。本年度は,骨格筋培養細胞を用いて,ACTの細胞中動態と糖の取込みに及ぼす影響について検討した。マウス筋芽細胞株C2C12とヒト筋芽細胞を筋管細胞に分化させ,ACT暴露によるインスリン依存性の糖取込み能の変化を,2-デオキシグルコースを用いて評価した。さらに,ACT,ならびに,CT安定同位体を筋細胞に添加し,ACTとCTの安定同位体と非同位体の量,アセチルCoAと遊離CoAをLC-MS/MS装置により測定した。さらに,筋細胞よりミトコンドリアを単離し,ACTと遊離CoA存在下で,アセチルCoAと遊離CT量を評価した。その結果,ACTの添加により,骨格筋細胞への糖の取込みが有意に抑制され,添加されたACTは細胞内でCTへ逆転換された。それに伴って,ミトコンドリア内のアセチルCoA/遊離CoA比が有意に増加した。

さらに,ACTは,ミトコンドリア内でCTへ逆転換され,その結果,アセチルCoAが生じる事が明らかとなった。本研究により,CKD患者では尿排泄障害により血中で増加するACTが骨格筋細胞に再取り込みされ,カルニチンアセチルトランスフェラーゼによりカルニチンに逆転換される事で,ミトコンドリア内のアセチルCoAが増加し,その結果,インスリン抵抗性が生じる可能性が示唆された。慢性腎不全(CKD)患者で合併するインスリン抵抗性(IR)の発症機序は未だ不明である。骨格筋ミトコンドリア(Mt)でアセチルCoA(AcCoA)が増加すると,細胞内代謝が停滞してIRが惹起されると考えられる。本研究では,CKD患者の腎機能低下に伴う血清AcCT濃度の有意な増加を確認した。また,骨格筋培養細胞では,アセチル基の転換酵素(CrAT)により,AcCTがAcCoAとCTへ逆変換され,Mt内AcCoAが蓄積する事で,IRが惹起される事を確認した。したがって,CKD患者では,血中で増加するAcCTが骨格筋Mt内でAcCoAの蓄積を引き起こしてIR発症をもたらす機序が示唆された。初年度の検討の結果,CKD患者の血清にて,アセチルカルニチンがeGFR値の低下に比し,有意に上昇している事が明らかとなった。この上昇は,腎機能低下に伴う,尿排泄不全が理由であろうと推測される。次年度は,腎不全モデル動物(5/6腎摘出ラット)を作成し,尿排泄不全によるアセチルカルニチンの血液中濃度上昇と骨格筋組織内蓄積,インスリン抵抗性との関連性を検討する予定である。さらに,次年度以降,アセチルカルニチンが,骨格筋のインスリン抵抗性の発症機序に及ぼす影響について,骨格筋培養細胞を用いて,基礎的に評価を行う予定である。インスリン抵抗性を伴う慢性腎臓病(CKD)患者では,腎機能の悪化に伴って血液中アセチルカルニチン濃度が増加しており,骨格筋におけるインスリン抵抗性の発症機序に関与している事が示唆されるが,動物モデルでの検証に限界がある事がわかったため,今後は,骨格筋培養細胞を用いて,アセチルカルニチンがインスリン抵抗性の発症に及ぼす機序を検証する予定である。腎臓病学研究が計画通りに進み,予定していた実験等が少なく済んだため。本年度,実施した慢性腎不全ラットが,検証の結果,疾患モデルとして,ヒト臨床上との乖離がある事が判明し,予定していた詳細な検討を行う必要が生じなかったため。計画が順調に進んでおり,次年度からは,動物実験も行う予定であり,さらに,成果発表も見据えて,計画的に研究費を使用する様に心がける。次年度から実施する培養細胞での検討で,より詳細な疾病発症のメカニズム解明に研究費を使用する予定である。
鉄筋コンクリート杭を用いた基礎構造の終局耐力算定法と地震後の健全度評価法の提案

本研究は下記2点を研究課題と設定する。1杭部材の損傷を考慮した極大地震時の建物挙動解明と下部構造の終局耐力算定法誘導、2地中杭部材の損傷を地上部に設置したセンサから同定する手法の提案課題1に関しては、実験例のない鉄筋コンクリート杭基礎構造建物の終局・極限状態を解明し、下部構造の終局耐力算定式提案をめざす。課題2に関しては、構造物の健全度判定の中でも研究例の少ない下部構造の杭部材を対象とする。提案手法の幅広い普及展開を見据え、長い工期と多額の費用がかかる地盤掘削を行わない条件をあえて課し、建物地上部に配したセンサの鉛直振動特性に着目(詳細は後述)した健全度評価をめざす。
魚類のなわばり行動関連因子の探索

本研究は、異なる種族の野生型メダカ(北日本集団および南日本集団)を用いて、魚類のなわばり行動すなわち他個体への攻撃行動の誘発に関連する新たな生体内因子を探索することを目的として実施した。材料には、従来から研究代表者が飼育維持してきた北日本集団(新潟産)および南日本集団(奈良産)のクローズドコロニーを用いた。昨年度までに、雌雄共に奈良産の方が新潟産に比べて高い攻撃性を有することを明らかにした。また、安静な条件下で単独飼育した奈良産および新潟産の脳視索前野におけるアルギニンバソトシン(AVT)含有ニューロン数が奈良産の方で新潟産に比べて多いことを明らかにした。視索前野におけるAVT発現は、鳥類や両生類において攻撃行動に深く関与することが報告されている。そこで本年度は、両種族の攻撃行動に際する視索前野AVT含有ニューロンの動態について精査した。実験では、雄の奈良産または新潟産をそれぞれ個別に3日間馴化後、共通の標的であるヒメダカ雄と混合飼育し、ヒメダカに対する攻撃行動を観察するとともに、混合飼育直後の脳視索前野におけるAVT含有ニューロン数および細胞体サイズを計測した。その結果、奈良産では、攻撃行動回数およびAVT含有ニューロンの数ならびに細胞体サイズのいずれにおいても新潟産に比べて約2倍高い値を示した。この際、AVT含有ニューロン数は安静時とほぼ同値であったが、安静時には認められなかった顕著に大きい細胞体サイズを有するAVT含有ニューロンが確認された。以上の結果は、ニホンメダカ種族間における攻撃性の違いに、脳視索前野のAVTニューロン細胞体サイズの違いが深く関連することを示唆している。本研究の目的は、2つの野生型メダカ(北日本集団および南日本集団)を用いて、魚類のなわばり行動を誘発する新たな生理的または生化学的因子を探索し、個体間競争を主とした動物行動に関する新たな基礎的知見を得ることである。本年度は、北日本集団(新潟産)および南日本集団(奈良産)の近交系を兄妹交配によりそれぞれ作出するとともに、なわばり行動の観察実験を行った。近交系の作出では、新潟産および奈良産ともに第6世代の作出まで完了したが、近交系確立には、さらなる兄妹交配を継続する必要があり、今後の急務課題である。なわばり行動の観察実験では、第5世代の新潟産および奈良産メダカを用いて、両者における排他行動の相違を観察した。実験は、同性、同齢、同サイズの新潟産および奈良産メダカの成魚各1尾を別々の水槽にて、同性、同サイズのヒメダカ1尾とともに一定時間内飼育観察し、ヒメダカに対する新潟産および奈良産メダカの排他行動(退かす・追いかける・突く)の回数を計測した。行動観察実験は雌雄別に20個体行った。その結果、雄では、奈良産メダカの方が新潟産に比べて排他行動が約2倍有意に多く認められた。一方、雌では、いずれのメダカにおいても雄に比べて排他行動が少ない傾向にあったが、奈良産メダカの方が新潟産に比べて約1.4倍多い傾向にあった。このように、雌雄を問わずニホンメダカ種族間において、なわばり行動に違いが存在するという非常に興味深い知見が得られた。今後は、ニホンメダカ種族間で認められたなわばり行動の違いを誘発する生理・生化学的因子の探索を新潟産および奈良産メダカを用いて行う。本研究の目的は、異なる種族の野生型メダカ(北日本集団および南日本集団)を用いて、魚類のなわばり行動を誘発する新たな生理的または生化学的因子を探索し、個体間競争を主とした動物行動に関する新たな基礎的知見を得ることである。これまでに作成した北日本集団(新潟産)および南日本集団(奈良産)のクローズドコロニー間において、雌雄共に奈良産の方が新潟産に比べて排他行動が顕著に多いことが示されていることから、本年度はこのような排他行動の違いを誘発する生理・生化学的因子を探索するために、鳥類や両生類で攻撃行動関連因子として報告されているアルギニンバソトシン(AVT)の発現に注目して解析した。同齢、同サイズの新潟産および奈良産の成魚各1尾を3日間個別に馴化後、全脳を摘出し、定量的RT-PCR法により脳内AVTmRNAの発現量を調べた。また頭部を固定後パラフィン切片を作成し、AVTの局在性について免疫組織学的に調べた。さらに脳内含有タンパクの相違について2次元電気泳動により解析した。その結果、全脳内のAVTmRNA発現量については、雌雄共に両種族間で顕著な差は認められなかった。一方、免疫組織学的解析の結果、脳の視索前野におけるAVT含有細胞数が、雄において奈良産の方で新潟産に比べて約1.6倍多く認められた。雌に関しては現在解析中である。なお、2次元電気泳動で得られた泳動像パターンに両種族間で顕著な違いは認められなかったが、これに関しては引き続き詳細な解析を要する。以上の結果は、魚類において脳視索前野におけるAVT発現が排他行動の誘発に関与している可能性を強く示唆するとともに、ニホンメダカ種族間における排他行動の違いに及ぼす視索前野AVTの関連性を示している。今後は、視索前野で認められたAVT含有細胞内における排他行動前後のAVT発現様相の変動や、AVT受容体の局在性について精査する予定である。

本研究は、異なる種族の野生型メダカ(北日本集団および南日本集団)を用いて、魚類のなわばり行動すなわち他個体への攻撃行動の誘発に関連する新たな生体内因子を探索することを目的として実施した。材料には、従来から研究代表者が飼育維持してきた北日本集団(新潟産)および南日本集団(奈良産)のクローズドコロニーを用いた。昨年度までに、雌雄共に奈良産の方が新潟産に比べて高い攻撃性を有することを明らかにした。また、安静な条件下で単独飼育した奈良産および新潟産の脳視索前野におけるアルギニンバソトシン(AVT)含有ニューロン数が奈良産の方で新潟産に比べて多いことを明らかにした。視索前野におけるAVT発現は、鳥類や両生類において攻撃行動に深く関与することが報告されている。そこで本年度は、両種族の攻撃行動に際する視索前野AVT含有ニューロンの動態について精査した。実験では、雄の奈良産または新潟産をそれぞれ個別に3日間馴化後、共通の標的であるヒメダカ雄と混合飼育し、ヒメダカに対する攻撃行動を観察するとともに、混合飼育直後の脳視索前野におけるAVT含有ニューロン数および細胞体サイズを計測した。その結果、奈良産では、攻撃行動回数およびAVT含有ニューロンの数ならびに細胞体サイズのいずれにおいても新潟産に比べて約2倍高い値を示した。この際、AVT含有ニューロン数は安静時とほぼ同値であったが、安静時には認められなかった顕著に大きい細胞体サイズを有するAVT含有ニューロンが確認された。以上の結果は、ニホンメダカ種族間における攻撃性の違いに、脳視索前野のAVTニューロン細胞体サイズの違いが深く関連することを示唆している。
in situ(RT-)PCR法を応用した歯周ポケット底部接合上皮周辺の病態解析

歯周病の病態を的確に捉えるためには、歯周ポケット接合上皮周辺の病態、すなわち歯周病関連細菌と接合上皮との関係、さらには上皮から惹起される接合上皮下の結合織との関係を明らかにしなけれはならない。まず歯周組織切片中の歯周病関連細菌をin situ PCRおよび免疫染色して検索した結果,Porphyormonas gingivalisやActinobacillus actinomycetemcomitansが少数例において検出された。歯周病関連細菌EiKenella corrodensは上皮からインターロイキン6やインターロイキン8のような炎症性サイトカインを産生させることを明らかにした。この現象には、E.corrodensが直接的に上皮細胞に付着する必要はなく、E.corrodensの分泌物によっても起こることを明らかにした。さらに、E.corrodensは上皮細胞に付着することにより、上皮細胞にICAM-1の発現を増強することを明らかにした。これは上記のサイトカインの誘導と異なり、E.corrodens菌体の上皮細胞への付着が必須であり、ICAM-1発現誘導因子は、E.corrodensの付着因子であるレクチン用物質(EcLS)であることを明らかにした。これは、細菌性レクチンが上皮のICAM-1を誘導するという数少ない報告の一つであると自負している。ついで、E.corrodensが歯肉上皮細胞からcyclooxygenase2(COX-2)の発現増強やプロスタグランジンE2の産生を増強することを明らかにした。これらの因子の発現には、E.corrodensが直接上皮細胞に付着しなくても生じること、すなわちE.crrodensが分泌する可溶化物質によるものであることを明らかにした。さらにこの物質の性状を探求していくと、未知の分子量10kDa以下の低分子量物質であることをつきとめた。最後に、ICAM-1、炎症性サイトカインの上皮での産生機構を明らかにするために、E.corrodensが上皮に付着することにより生じる上皮細胞内のシグナル伝達機構の解明を試みた。Neisseriaなどでいわれているように、ICAM-1におけるE.corrodensによるシグナル伝達は阻害実験の結果、p38やp42/44MAPキナーゼが関与している系であることが明らかになった。本研究では,歯周炎における病態を解明する目的で歯周ポケット底部の接合上皮周辺に棲息している細菌をDANあるいはmRNAレベルで高感度にかつ特異的に検出することを目的としてin situ-PCR法の確立を試みた。まず,in situ-PCRの条件を検討するために,外科手術時に得られた歯肉上皮に既知の細菌を注入し,細菌侵入のモデルを作製し,この試料を用いて連続切片を作製した。Porphyromonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcomitans,Treponema denticolaなど8菌種の歯周病関連細菌に対するプライマーを作製し,連続切片の半分に種々の条件でin situ-PCRを行い,残りの半分に免疫染色を施した。このモデル系においてin situ-PCR法の特異性および免疫染色法との感度の比較を行った。

その結果,今回作製したプライマーはin situ-PCRにおいても菌特異的であり,免疫染色法よりもin situ-PCR法の方が検出感度がよいことが明らかになった。次に,本実験に同意が得られた患者から可及的に歯周ポケットを再現した抜去歯およびコントロールとして便宜抜去歯を試料として採取した。これらの試料を我々の方法(日歯周誌1994)に基づいて連続切片を作製した。この試料をモデル試料で確立したin situ-PCR法を用いて細菌を検出した結果,P.gingivalisが接合上皮周囲に認められたので,現在本菌の局在の解析を進めている。歯周病の病態を的確に捉えるためには、歯周ポケット接合上皮周辺の病態、すなわち歯周病関連細菌と接合上皮との関係、さらには上皮から惹起される接合上皮下の結合識との関係を明らかにしなければならない。歯周病関連細菌Eikenellacorrodensは上皮からインターロイキン6やインターロイキン8のような炎症性サイトカインを産生させることを明らかにした。この現象には、E.corrodensが直接的に上皮細胞に付着する必要はなく、E.corrodensの分泌物によっても起こることを明らかにした。さらに、E.corrodensは上皮細胞に付着することにより、上皮細胞にICAM-1の発現を増強することを明らかにした。これは上記のサイトカインの誘導と異なり、E.corrodens菌体の上皮細胞への付着が必須であり、ICAM-1発現誘導因子は、E.corrodensの付着因子であるレクチン用物質(EcLS)であることを明らかにした。これは、細菌性レクチンが上皮のICAM-1を誘導するという数少ない報告の一つであると自負している。ついで、E.corrodensが歯肉上皮細胞からcyclooxygenase 2(COX-2)の発現増強やプロスタグランジンE2の産生を増強することを明らかにした。これらの因子の発現には、E.corrodensが直接上皮細胞に付着しなくても生じること、すなわちE.corrodensが分泌する可溶化物質によるものであることを明らかにした。さらにこの物質の性状を探求していくと、未知の分子量10kDa以下の低分子量物質であることをつきとめた。最後に、ICAM-1、炎症性サイトカインの上皮での産生機構を明らかにするために、E.corrodensが上皮に付着することにより生じる上皮細胞内のシグナル伝達機構の解明を試みた。Neisseriaなどでいわれているように、ICAM-1におけるE.corrodensによるシグナル伝達は阻害実験の結果、p38やp42/44MAPキナーゼが関与している系であることが明らかになった。
すばるHSC観測と宇宙再電離大規模シミュレーションによる電離度マップの描画

観測的宇宙論最大の課題である宇宙再電離を理解するため、銀河間水素電離度を描画する新手法を開発した。すばる望遠鏡Hyper Suprime-Cam (HSC)による観測と、再電離数値シミュレーションにもとづくライマンα輝線銀河(LAE)モデルを利用する方法である。LAEシミュレーションは査読付き学術論文に成果を出版した。HSC観測は5枚のHSC用狭帯域フィルターを用いたすばるインテンシブプログラムCHORUSに拡張した。並行して、赤方偏移3付近の原始銀河団領域の銀河間水素、赤方偏移3付近の銀河の電離光子放射率、原始銀河のスペクトルモデル、高赤方偏移銀河の酸素の観測という多数の研究成果を挙げた。すばるHSC(Hyper Suprime-Cam)にわれわれのグループで製作した中帯域フィルターIB945を装着した観測計画について、連携研究者の大内正己(東京大学)および柏川伸成(国立天文台)、また研究協力者の嶋作一大(東京大学)と、研究会やテレビ会議等を通じて検討を重ねた結果、他の複数の狭帯域フィルターによる観測と組み合わせたインテンシブ観測(2年20夜)として提案することになった。今後さらに半年をかけて計画を練り上げ、S16A期(2016年2月から7月、2015年9月締切)に向けて観測提案書を準備することになった。並行して、京コンピュータによる宇宙再電離大規模数値シミュレーションを進めた。宇宙再電離輻射輸送計算の土台となる、ダークマター構造形成の大規模N体シミュレーションが、連携研究者の石山智明(筑波大学)により実行された。次に、各ダークマターハローの電離光子放射率および電離光子スペクトルのモデル化のため、高空間分解能の数値輻射流体銀河形成進化計算にもとづく“レシピ"の作成が、連携研究者の長谷川賢二(筑波大学)により行われた。この成果は2015年春の天文学会において発表され、現在、論文執筆中である。また、Lyα輝線銀河(LAE)のモデル化にはLyα光子輸送シミュレーションが必要となる。連携研究者の長谷川賢二の協力により、今年度後半からその開発に着手し、いくつかのテスト計算を実施した。その他、宇宙再電離過程に重要な役割を果たした初代銀河を発見するための観測手法についての研究と、銀河の電離光子放射率の観測的制限についての研究を、海外の共同研究者らと実施し、それぞれ、論文を出版した。すばる望遠鏡Hyper Suprime-Cam (HSC)にわれわれが開発した中帯域フィルターIB945を搭載した観測を実施するに当たり、連携研究者の大内正己(東京大学)、柏川伸成(国立天文台)、研究協力者の嶋作一大(東京大学)、および、本科研費で雇用した博士研究員の馬渡健や、他の関係研究者らと協議した結果、IB945と前後して製作した4枚のHSC用狭帯域フィルターを、IB945と合わせて合計5枚使用するインテンシブ観測プログラムとしてまとめて提案することになった。テレビ会議等を通じた打ち合わせを重ね、9月上旬に、S16A期(2016年2月から7月の観測)のインテンシブプログラムとして提案した。10月下旬にすばる望遠鏡側からヒアリングを受け、研究体制やプログラム全体のレガシー性は高く評価されたものの、すばる望遠鏡戦略的大規模プログラムや他の強力なインテンシブプログラムなどのため、すばる望遠鏡の共同利用夜数が全体的に少なくなっている状況の下、われわれの提案は採択されるには至らなかった。28年度にS16B期における採択を目指す。並行して、京コンピュータによる宇宙再電離大規模数値シミュレーションを実施する作業を進めたが、京コンピュータの他のプログラムとの兼ね合いでわれわれの計算が思うように進捗せず、28年度に持ち越しとなった。その他、宇宙再電離後の銀河間空間に残った中性水素雲について観測的に調べた研究を博士研究員の馬渡健と行ない、論文を出版した。宇宙再電離期の銀河からの輝線スペクトル強度を予想する理論シミュレーションを清水一紘(大阪大学)らと行なった。結果をまとめた論文を学術誌に投稿した。宇宙再電離期の銀河をアルマ望遠鏡で観測した成果をまとめた論文を学術誌に投稿した。すばる望遠鏡HSCにわれわれの開発した中帯域フィルターIB945を搭載した観測を実施するにあたり、他の狭帯域フィルターと組み合わせてより系統的で大規模に宇宙再電離過程の解明に迫ることができる。そこで、インテンシブプログラムとして提案したのであるが、それが採択に至らず、観測の実施時期が遅れることになった。28年度に必ず採択されるよう万全の準備をするつもりである。また、提案が採択されても、すばる望遠鏡の運用の都合上、当初計画の2年で観測を完結させることは難しく、3年程度かかると予想される。本研究課題は、宇宙再電離と呼ばれる現象において、電離光源の正体と電離度の時間・空間的進化の解明を目的としている。具体的には、再電離完了期である赤方偏移z=6.6の宇宙を、すばる望遠鏡の新主焦点カメラHyper Suprime-Cam (HSC)に特製フィルターを装着して観測し、その時代のLyα輝線銀河とライマンブレイク銀河の空間分布を比較する。それにより、世界で初めて電離度の空間分布を観測的に描き出す。同時に、銀河形成進化を詳細に考慮し、かつ、広大なHSC探査領域に匹敵する大規模な宇宙再電離数値シミュレーションを行い、HSC探査の結果と比較検討することで、電離光源に対しても制限を与えることを目指している。今年度の成果は以下の通りである。

(1) HSCの特製狭帯域フィルター5枚を擁するインテンシブプログラムを組織し、審査を経て13夜の割り当てを受けた。2017年1月3月に5夜の観測を実施した。(2)宇宙再電離数値シミュレーション結果を天文学会で発表した。論文は現在執筆中。(3)再電離シミュレーションに組み込むLyα輝線銀河モデルの開発を行ない、天文学会で発表した。論文は現在執筆中。(4)銀河形成シミュレーションを用いて再電離期の銀河からの輝線放射強度予想を行なった。論文出版済。(5)再電離期の星形成銀河をALMAで観測し、酸素輝線の検出に世界で初めて成功した。電離光子の脱出率などに新たな制限を与えた。論文出版済。(6)再電離後の赤方偏移z=3.1における星形成銀河や活動銀河核の電離光子を直接観測し、脱出率に新たな制限を与えた。論文出版済。(7)赤方偏移z=3.1の星形成銀河を近赤外線分光し、電離光子脱出の物理機構に新たな制限を与えた。論文出版済。(8)赤方偏移z=3.1の原始銀河団領域での銀河間中性水素の天球面分布を初めて可視化した。論文出版済。観測的宇宙論最大の課題である宇宙再電離を理解するため、銀河間水素電離度を描画する新手法を開発した。すばる望遠鏡Hyper Suprime-Cam (HSC)による観測と、再電離数値シミュレーションにもとづくライマンα輝線銀河(LAE)モデルを利用する方法である。LAEシミュレーションは査読付き学術論文に成果を出版した。HSC観測は5枚のHSC用狭帯域フィルターを用いたすばるインテンシブプログラムCHORUSに拡張した。並行して、赤方偏移3付近の原始銀河団領域の銀河間水素、赤方偏移3付近の銀河の電離光子放射率、原始銀河のスペクトルモデル、高赤方偏移銀河の酸素の観測という多数の研究成果を挙げた。すばるHSCを用いた観測計画の立案過程で、他のフィルターと組み合わせた大規模観測計画とする方がサイエンスが大きく広がるとの判断から、当初計画より1年遅れとなるもののS16A期からの観測を目指すこととなった。観測実施時期の1年程度の遅れはもともと可能性があると見込んでいたものであり、大きな遅れとは考えていない。すばる望遠鏡HSCによる観測を実施するためには、まず、観測提案が採択される必要があるため、28年度に確実に採択されるよう準備に万全を尽くす。また、観測実施計画が当初の想定より1,2年長くなると予想されるので、何らかの継続的な研究費の確保を目指す必要がある。宇宙再電離数値シミュレーションについては28年度に実施し、論文出版にまでこぎつけたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。天文学すばるHSC観測については、他のフィルター製作グループと合同で大規模観測計画としてS16A期に提案を行ない、2年間で実施する。並行する宇宙再電離大規模数値シミュレーションは予定通り進捗させる。研究費を必要な経費にしぼって適正に使用して行った結果、約4万円の次年度繰り越しが発生した。今年度後半は、米国カリフォルニア州に長期出張となったため、本研究課題に関する研究発表を実施せず、出張旅費に余剰が出た。また、本研究課題に関する物品購入も実施しなかったため。
再分配カスケードモデルは実際の組織全体を模した仮想細胞配列上でＰＣＰを再現するか

平面細胞極性に関して、前年度までに得られた結果を発展させ、タンパク質の局在から細胞間の順序関係を得る数理モデルを用い、上皮組織がどのような細胞パッキングパターンを持っていても境界伝播モデルによる極性の成立が可能であることを示した。内耳の毛細細胞と支持細胞や表皮の毛根を形成する細胞群と上皮細胞など、細胞極性を持つ組織の多くは複数の細胞種を含み、細胞パッキングパターンも様々であるが、本研究によりこれらの組織で平面細胞極性が形成される仕組みの一端を解き明かすことができた。この結果を論文にまとめ、Journal of Theoretical Biologyにて発表した。また、関連した研究として、上皮組織において細胞内、細胞間に発生している張力の可視化の研究を行った。共同研究者により開発されたFRET-based張力センサーを用い、初期発生段階のアフリカツメガエル胚で張力センサーの機能評価と張力測定を行なった。FRET-based張力センサーはもともと培養細胞系で開発されたもので、これを脊椎動物の組織に応用したのは本研究が世界でも初めてである。解析の結果、外胚葉において分化しつつある予定神経領域と表皮領域の間で前者により高い張力が発生していることがわかった。また、組織の形態形成を観察したところ、予定神経領域とそこに隣接する表皮領域は同様に前後軸方向に大きく伸長していたが、細胞単位の振る舞いに注目すると予定神経領域では細胞の再配列によって組織の変形していたのに対し、表皮領域では細胞の変形により組織が変形しており、細胞内の張力と細胞の変形のしやすさ、組織の変形の仕方が関連していることを示唆していた。これらの結果を論文にまとめ、Scientific Reportsにて発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。平面細胞極性に関して、先行研究ではすべての細胞を双極的な極性を持つとし、その平面内での極性の方向が揃っているかどうかを平面細胞極性の有無の基準とされてきたが、細胞接着タンパク質の局在が4区分以上に分かれる多極的な極性の可能性は無視されてきた。そこでこの多極的な極性を持つ細胞が上皮組織に混在した時に平面細胞極性がどのような影響を受けるかという点に注目し、様々なパッキングパターンを持つ細胞配列上で境界伝播によって誘導された接着タンパク質の局在を解析した。多極細胞は、出現頻度が低い時には全体の平面細胞極性を損なうことはなかった。また、多極細胞は近傍に周回するように並べられた双極細胞を伴う場合が多く観察された。そこで、細胞間の接着タンパク質の極性から細胞間の二項関係を定義し、この二項関係が順序関係になる場合(細胞配列内に周回するように並べられた細胞がない場合)と、ならない場合(周回するように並べられた細胞がある場合)について調べた。細胞間の二項関係が順序関係であるためには細胞配列に多極細胞が含まれないことが必要かつ充分であること、さらに同条件が平面細胞極性があることと同一視できることがわかった。再分配カスケードモデルによって誘導される細胞配列上の接着タンパク質の局在を定性的に推測するモデルを構築し、多極細胞が含まれるかどうかによって平面細胞極性の有無を評価したところ、極性の境界伝播は細胞のパッキングパターンに依存しないことが確かめられた。これらの結果をまとめ、論文を執筆し投稿した。先行する類似の研究で用いられていたシミュレーションモデルよりも簡略化したモデルを用いることで、多極的な極性を持つ細胞というより複雑な場合を扱うことができるようになり、平面細胞極性に対する新しいアプローチが可能になった。これにより、細胞の順序関係という抽象的な概念で平面細胞極性を記述できるようになり、これまでの平面細胞極性の誘導モデルで無視されてきた細胞のパッキングパターンをモデルに組み込むことができた。これらの結果は新規性、意義共に査読有りの学術誌で発表するに充分足るものであったので、論文にまとめ投稿した。

これらの結果を論文にまとめ、Scientific Reportsにて発表した。FRETを用いた張力センサーはもともと培養細胞系で作られた実験手法で、組織に応用した例はまだ少なく、脊椎動物に応用するのは本研究が最初のものとなる。坪井准教授(東京大学)、北口准教授(早稲田大学・WABIOS)より提供されたFRET-basedアクチニン張力センサーをアフリカツメガエルの胚に導入し、機能評価と張力測定を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞外基質の硬さに応答するシグナル活性の生体イメージング

上皮細胞は細胞間接着を維持しながら集団で遊走することが知られている。MAPキナーゼ分子であるERKの活性は集団遊走時に遊走先頭の細胞から後方の細胞へと波のように繰り返し伝播し、集団遊走を促進する。しかし、ERK活性の伝播メカニズムは明確になっていない。昨年度までに、集団遊走の過程で個々の細胞は伸展・収縮を繰り返しており、細胞が伸展後にERK活性が上昇し、その後に収縮するという時系列があることを明らかにした。また、細胞を外的に伸展させるとERK活性が上昇するという因果関係があることを示した。そこで、本年度はERK活性の上昇と細胞収縮との因果関係を検討し、さらにこの細胞収縮とERK活性伝播との関連について調べた。まず、光遺伝学的手法を用いてERK活性を上昇させたところ、細胞収縮が誘導された。種々の阻害剤を用いた解析により、こうしたERK活性上昇依存的な細胞収縮には細胞骨格を制御するキナーゼ分子であるROCKの活性が必要であることが分かった。これにより、ERK活性化はROCKを介して細胞収縮を誘導することが示唆された。次に、細胞収縮が隣接細胞のERK活性に与える影響を調べた。そのために、薬剤添加依存的に細胞収縮を誘導するDrug-inducible RhoGEFsystemを用いた。その結果、薬剤添加による細胞収縮の誘導により、収縮した細胞の周辺細胞が伸展し、ERKが活性化した。よって、ERK活性化依存的な細胞収縮は隣接細胞の伸展を誘導し、その隣接細胞へのERK活性伝播が引き起こされることが示唆された。以上の結果から、集団遊走の過程では細胞の伸展がERKを活性化させ、またそのERK活性化が細胞収縮を引き起こすことにより隣接細胞の伸展が誘導されるという仕組みで、ERK活性が細胞間を伝播していくことを明らかにした。当初の予定通り、ERK活性や細胞収縮を操作する系を用いることにより、これらの現象の因果関係を明確化することに成功した。これにより、ERK活性が細胞の形態変化と共役しながら細胞間を伝播することを明らかにした。ERK活性伝播がなぜ遊走先頭から後方の細胞へ一方向的に起こるのかを明らかにするために、細胞の形態的異方性に注目した解析を進める。さらに、ERK活性伝播が細胞の運動を促進する機構についても解析する予定である。本年度はまず、ERK, ROCK, FAKのFRETバイオセンサーを安定発現する培養細胞を樹立することを目指した。コドンや細胞への導入手法の最適化、フローサイトメーターを用いた高発現細胞の選抜により、顕微鏡観察に十分な発現量を持つ細胞を得た。また、各分子に対する阻害剤処理を行い、FRETバイオセンサーが機能することを確認した。さらに本年度は上皮細胞の集団遊走時のERK活性伝播と細胞の形態変化の関連についての解析を行った。集団遊走中の細胞は遊走方向への異方的な伸び縮みとERK活性の増減を繰り返しており、伸びた細胞では高いERK活性が観察された。また、ERK活性は遊走先頭の細胞から後方へと波のように伝播することが報告されているが、細胞の伸び縮みもERK活性と同様に細胞間を伝播していることが明らかになった。さらに、細胞の伸び縮みとERK活性変化との相互相関解析を行ったところ、細胞が伸び始めた後にERK活性が上昇し始め、縮み始めてからERK活性が減少し始めるという前後関係があることが示唆された。そこで次に、細胞の伸びがERK活性変化に与える影響を調べた。その結果、弾性のあるシリコン基板上に播種した細胞を一軸方向に引き伸ばすことによりERK活性が上昇することが明らかになった。さらに、ERK活性が細胞の形態変化に与える影響を調べるために、ERKの活性を阻害する薬剤を添加したところ、集団遊走中の細胞の伸び縮みが抑制された。このことから、集団遊走過程では細胞の形態変化がERK活性を制御し、またERK活性が細胞の形態を制御するというフィードバック系が存在していることが示唆された。当初の計画通りFRETバイオセンサーを安定発現する培養細胞を樹立し、分子の活性を長時間かつ安定的にライブで観察する系を確立した。また、集団遊走時のERK活性と細胞形態変化に関する理解が深まり、ERK活性伝播のメカニズムの解明に向けて大きく前進したと考えられる。

次に、細胞収縮が隣接細胞のERK活性に与える影響を調べた。そのために、薬剤添加依存的に細胞収縮を誘導するDrug-inducible RhoGEFsystemを用いた。その結果、薬剤添加による細胞収縮の誘導により、収縮した細胞の周辺細胞が伸展し、ERKが活性化した。よって、ERK活性化依存的な細胞収縮は隣接細胞の伸展を誘導し、その隣接細胞へのERK活性伝播が引き起こされることが示唆された。以上の結果から、集団遊走の過程では細胞の伸展がERKを活性化させ、またそのERK活性化が細胞収縮を引き起こすことにより隣接細胞の伸展が誘導されるという仕組みで、ERK活性が細胞間を伝播していくことを明らかにした。当初の予定通り、ERK活性や細胞収縮を操作する系を用いることにより、これらの現象の因果関係を明確化することに成功した。これにより、ERK活性が細胞の形態変化と共役しながら細胞間を伝播することを明らかにした。集団遊走時のERK活性伝播メカニズムについてさらなる検討を行う。そのために、ゲノム編集による遺伝子欠損や光遺伝学による分子活性操作などの摂動がERK活性伝播に与える影響を明らかにする。ERK活性伝播がなぜ遊走先頭から後方の細胞へ一方向的に起こるのかを明らかにするために、細胞の形態的異方性に注目した解析を進める。さらに、ERK活性伝播が細胞の運動を促進する機構についても解析する予定である。
病原細菌の宿主適応とニッチ拡散：定着因子の分子進化から拓く微生物生態学の新展開

定着因子は細菌表面に局在するタンパク質であり,宿主細胞と特異的に接着する機能を持つ.中でも,F4因子は様々な宿主から広く見出されている点で特徴的である.本課題では,F4因子の多様性と宿主適応の関連性に着目し,様々な生物種から同因子を保有する菌を網羅的に探索する.それらのDNA配列から分子進化学的検証を行い,宿主の壁を越えて感染を拡げる病原体のしたたかな生存戦略を解明する.病原細菌学的には,人獣共通感染症としての潜在的リスクを提唱し,医学・獣医学へのフィードバックの足がかりとする.こうした研究展開を微生物生態学と病原細菌学の双方にインパクトを与えうる「病原細菌の適応進化学」として確立する.定着因子は細菌表面に局在するタンパク質であり,宿主細胞と特異的に接着する機能を持つ.中でも,F4因子は様々な宿主から広く見出されている点で特徴的である.本課題では,F4因子の多様性と宿主適応の関連性に着目し,様々な生物種から同因子を保有する菌を網羅的に探索する.それらのDNA配列から分子進化学的検証を行い,宿主の壁を越えて感染を拡げる病原体のしたたかな生存戦略を解明する.病原細菌学的には,人獣共通感染症としての潜在的リスクを提唱し,医学・獣医学へのフィードバックの足がかりとする.こうした研究展開を微生物生態学と病原細菌学の双方にインパクトを与えうる「病原細菌の適応進化学」として確立する.
脂質二分子膜中のレセプター蛋白による超分子形成とその機能の発現

本研究は,イオンチャンネル蛋白等のレセプター蛋白を用い,人工脂質二分子膜を特異的複合場として,レセプター蛋白が構造識別に基づいて生体イオン,分子を認識して発現するtrans-membrane signallingの機能の特性を,基質認識に伴う情報変換・増幅の選択性,感度などの観点から評価することを目的とした.1)ラット脳から抽出したグルタミン酸受容イオンチャンネル(GluR)蛋白質を用い,それを平面脂質二分子膜に包埋して,膜成形初期の膜抵抗とチャンネル電流発現の関係を検討した.その結果,膜抵抗値とGluRのプロテオリポソーム融合の確率の間に経験則を見い出した.また,平面脂質二分子膜に同時にNMDA及びnon-NMDA型GluRを包埋し,アゴニストであるNMDA及びグルタミン酸イオンを順次,膜に接する溶液に加えることにより観測されるNMDA及びnon-NMDA型のGluRによるチャンネル電流を測定した.チャンネル電流の大きさの比をチャンネル活性の指標とすることにより,抵抗値の異なる膜間でもその比を基にアゴニスト同士の化学選択性を定量的に評価できることが分かった.2)カルモジュリン(CaM)は膜蛋白質ではないが,CaMをCa^<2+>に対する感応素子として利用し,Ca^<2+>の結合により誘起したCaMと固定化した合成ペプチドM13との結合による三元錯体の量からCa^<2+>濃度を求める新規化学センシング法を創製し,三元錯体の量を評価するためには,表面プラズモン共鳴(SPR)を使用し,CaM-金属イオン錯体が金電極上のデキストラン膜に固定化されたM13に結合することにより生ずる化学修飾膜の誘電的変化に起因する表面プラズモン変化から,カルシウム濃度依存性と金属イオンに対する選択性を評価した.その結果,Ca^<2+>の検出限界として3.2×10^<-8>Mが得られた.更にMg^<2+>,Li^+,K^+の共存下Ca^<2+>に対して"all or none"型の特異的応答が得られた.3)トリフルオロメチル置換テトラフェニルホウ酸(TFPB)等の負の荷電サイトを平面脂質二分子膜包埋することにより,TFPB濃度と膜コンダクタンスの間に相関を見い出した.この結果は,包埋する荷電サイトの数を制御することによって,任意の膜抵抗を有する二分子膜系で作成できる可能性を示す.更に,その結果インピーダンスマッチングの関係で測定が容易でなかったあるいは不可能であった脂質二分子膜系の膜電位の測定を実際に多くの膜系で飛躍的に容易にした.本研究は,イオンチャンネル蛋白等のレセプター蛋白を用い,人工脂質二分子膜を特異的複合場として,レセプター蛋白が構造識別に基づいて生体イオン,分子を認識して発現するtrans-membrane signallingの機能の特性を,基質認識に伴う情報変換・増幅の選択性,感度などの観点から評価することを目的とした.1)ラット脳から抽出したグルタミン酸受容イオンチャンネル(GluR)蛋白質を用い,それを平面脂質二分子膜に包埋して,膜成形初期の膜抵抗とチャンネル電流発現の関係を検討した.その結果,膜抵抗値とGluRのプロテオリポソーム融合の確率の間に経験則を見い出した.また,平面脂質二分子膜に同時にNMDA及びnon-NMDA型GluRを包埋し,アゴニストであるNMDA及びグルタミン酸イオンを順次,膜に接する溶液に加えることにより観測されるNMDA及びnon-NMDA型のGluRによるチャンネル電流を測定した.チャンネル電流の大きさの比をチャンネル活性の指標とすることにより,抵抗値の異なる膜間でもその比を基にアゴニスト同士の化学選択性を定量的に評価できることが分かった.2)カルモジュリン(CaM)は膜蛋白質ではないが,CaMをCa^<2+>に対する感応素子として利用し,Ca^<2+>の結合により誘起したCaMと固定化した合成ペプチドM13との結合による三元錯体の量からCa^<2+>濃度を求める新規化学センシング法を創製し,三元錯体の量を評価するためには,表面プラズモン共鳴(SPR)を使用し,CaM-金属イオン錯体が金電極上のデキストラン膜に固定化されたM13に結合することにより生ずる化学修飾膜の誘電的変化に起因する表面プラズモン変化から,カルシウム濃度依存性と金属イオンに対する選択性を評価した.その結果,Ca^<2+>の検出限界として3.2×10^<-8>Mが得られた.更にMg^<2+>,Li^+,K^+の共存下Ca^<2+>に対して"all or none"型の特異的応答が得られた.3)トリフルオロメチル置換テトラフェニルホウ酸(TFPB)等の負の荷電サイトを平面脂質二分子膜包埋することにより,TFPB濃度と膜コンダクタンスの間に相関を見い出した.この結果は,包埋する荷電サイトの数を制御することによって,任意の膜抵抗を有する二分子膜系で作成できる可能性を示す.更に,その結果インピーダンスマッチングの関係で測定が容易でなかったあるいは不可能であった脂質二分子膜系の膜電位の測定を実際に多くの膜系で飛躍的に容易にした.