hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シミュレーターを用いた看護技術教育のプログラム開発と評価に関する研究

シミュレーターを用いた教育プログラム開発方法の確立を目的とし、看護実践場面の看護行為について質的方法により分析し、得られた結果を根拠とした教育プログラム開発の検証および有用性の検証を行った。看護実践の約半数(48%)は『情報を提供する』『世話をする』といった患者に対してケアをする看護行為で看護実践が成り立っていた。開発されたプログラムおよび調査結果は、ホームページおよび学術雑誌において広く公表している。シミュレーターを用いた教育施設が全国の大学や医療機関で整備されつつあるが、その教育プログラムが明確に確立されていないため、体系的な看護技術教育の実施および利用者による主体的な活用が充分とはいえない。また、シミュレーター教育の有用性やアウトカムが明らかにされておらず、シミュレーターを設置・運用することの社会的意義が明確化されていないため、その積極的な運営に対する社会的評価が得られているとはいえない。以上より、シミュレーターを用いた看護技術教育のプログラム開発とその有用性について検証することを目的として実施計画を立案した。具体的な活動実績としては、研究協力者のスーパーバイズを受けながら具体的かつ実現可能性を考慮した研究計画書を立案した。その後、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会において審査を受け、承認を得た(受付番号:2010-248)。さらに、研究対象者に対しデータ収集の協力を得るための同意を得ることに尽力し、実際のプレテストを試行した後にデータ収集を遂行した。現状としては、対象者の研究協力を得ることに時間を費やしてしまい、予定より遅い進捗である。一般化できる対象者数を満たすまで、データ収集を継続する必要がある。また、看護技術の種類(導尿、浣腸、摘便など)によっては、データ収集時に患者が差恥心を伴うため、対象を患者からシミュレーターに置換えた際の看護場面を対象とする必要があることが示唆された。データ分析については、データ収集と合わせて研究代表者が行っており、かなりの時間が分析に費やされているが(1症例5分程度につき最低1時間が必要である)、研究方法論上は問題はなく実施できており、研究活動は順調である。2011年度は、臨床看護師を対象とし、看護実践場面の看護行為について質的方法により分析・抽出し、得られた結果を根拠とした教育プログラムの開発を行うことを目的として活動を行った。具体的には、臨床の現場で行われた看護実践について観察法によるデータ収集を行い、ICNP(看護実践国際分類)を用いた看護行為の特定および内容分析を行った。これらの分析過程において、信頼性および妥当性を確保するため、複数の研究者からスーパーバイズを受け、行われた看護行為について検証し、明らかになった看護行為については類型化を行いつつある。しかしながら、未だ一般化できる対象者数を満たしておらず、2012年度も引き続き、データ収集および分析を継続する予定である。また今年度は、シミュレーターを用いた教育の実施と、臨床現場における医療安全に関連する項目との関連、職場やチームの風土、組織全体の離職率などといった組織を対象としたアウトカム評価についてアンケート調査を行う予定である。なお、本研究計画は、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会において審査を受け、承認を得ている(受付番号:2010-248)。以上より、シミュレーターを用いた看護技術教育のプログラム開発とその有用性について検証することを目的とした。対象は臨床看護師とし、看護実践場面での看護行為についてビデオカメラを用いた多方向からの観察法によるデータ収集を行った。臨床の現場で行われた看護実践についてICNP(看護実践国際分類)を用いた看護行為の特定および内容分析を行い、質的方法により分析・抽出した。分析過程における信頼性および妥当性を確保するため、複数の研究者から行われた看護行為についてスーパーバイズによる検証を受けた。看護技術ごと、看護行為の類型化を行い、どの看護師でも共通して実践された看護行為と、そうでない看護行為に分けた。

どの看護師でも共通して実践された看護行為を実践に不可欠な看護行為とし、そうでない看護行為は患者の状況や治療や検査の場面、環境に応じて対応しうる看護行為とし、プログラムの作成を行った。また、シミュレーターを用いた教育の実施と、臨床現場における医療安全に関連する項目との関連について、職場やチームの風土、組織全体の離職率などといった組織を対象としたアウトカム評価について調査を行った。研究成果は、研究者が独自に作成したホームページにより閲覧可能とし、研究成果の活用を促進するシステム作りを構築した。今年度はデータ収集を積極的に行う予定であったが、東日本大震災の影響で、院内の部署で「研究のデータ収集」に対して積極的に参加していただけない部署も見受けられ、症例数の確保に困難を極めたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究方法は、当初の予定通りに進める。本研究に対するエフォートを、当初の計画よりも高く設定して(40%とする)活動を行う。
ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼのリガンド認識機構の解明と創薬に向けた分子基盤

TAM受容体チロシンキナーゼは多様な細胞機能と疾患に関わっている。そのうちTyro3とMerについて、糖鎖修飾が施される酵母K.lactisを用いた各種試料調製方法、安定同位体標識化方法、糖鎖修飾の分析方法、相互作用解析法、各種NMR法の整備を行った。さらに、これらの方法を用いてTyro3とMerについて糖鎖修飾が構造と機能に与える影響を調べた。また、標的タンパク質に対して強く結合する分子の取得及び評価を行うための手段も得た。本研究成果をもとに、今後はTAM受容体の機能発現について立体構造ベースの知見と、TAM受容体とリガンドまたは薬剤候補分子の分子認識機構の解明に向けた研究を展開させていく。これまでに、糖鎖修飾のない2つの複合体、Axl:Gas6複合体及びTyro3ホモダイマーの立体構造を鋳型としてTyro3及びMerの立体構造モデルを構築し、各々に関してGas6との推定結合界面を同定した。そして、Tyro3については、糖鎖修飾可能なAsnがGas6との結合界面及びホモダイマーの界面に位置することを見出した。この知見に基づき2つの変異体、Asn→Arg(NR)及びAsn→Cys(NC)を作製した。ゲルろ過により、NRとNCはそれぞれモノマーとダイマーであり、野生型(WT)はモノマー/ダイマーの平衡にあること、また、NRとWTは各々Gas6と結合するが、NCは結合しないことを見出した。今年度はまず、表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いてNR、NC、WTについてGas6との結合能を解析した。その結果、NRとWTはGas6と同程度の強さで結合するとともに、いずれも一対一の複合体を形成することが示された。さらに、NRとWTについて15N標識体を調製し、NMR滴定実験によりGas6との結合界面を同定した。その結果、WTはモノマーとしてGas6と結合し、その結合界面はホモダイマー界面と重なることが示された。さらに、酵母を用いて糖鎖修飾されたTyro3(glycoTyro3)を調製し、解析を行った。まずゲルろ過によりglycoTyro3がモノマーであることを明らかにした。次に15N標識体を調製し、NMR測定を行い、糖鎖修飾部位を確定した。SPRによりglycoTyro3とGas6との結合を調べた結果、糖鎖修飾の有無は解離定数に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。現在、glycoTyro3とGas6の結合様式を明らかにするため、NMR測定を行なっている。他方、Merについては各種大量調製方法を確立し、物性、構造及び機能解析に適した条件検討を進めているところである。TAM受容体チロシンキナーゼTyro3について、標的分子であるGas6との結合解析を進めた。これまでの解析で見出した、Tyro3のホモダイマー化を解消する変異体Tyro3 NRと糖鎖修飾化された野生型Tyro3を解析の対象とした。なお、野生型Tyro3とTyro3 NRのGas6との結合の強さが同程度であることはSPRにより明らかにしている。大腸菌とK.lactisを用いてそれぞれ糖鎖修飾が無いTyro3 NRと、糖鎖修飾があるGlycoTyro3を調製し、Gas6についてはヒト細胞から調製した。まず、Tyro3 NRとGlycoTyro3のNMR解析を進め、主鎖[15N,1H]化学シフトの帰属がほぼ完了した。glycoTyro3については糖鎖切断を行い、糖鎖の有無でスペクトルを比較し、構造に大きな違いはないことを確認した。また、glycoTyro3とTyro3 NRのスペクトルの比較から、アミノ酸配列から予想された部位に糖鎖が付加されていることを確認出来た。さらに、Transferred Cross Saturation法を用いてTyro3 NR上のGas6結合部位を同定することにも成功し、その結果、Gas6結合部位と糖鎖修飾部位が互いに異なることが強く示唆された。この結果は、前年度に行ったSPRとゲルろ過による結合解析の結果を支持している。一方、もう一つのTAM受容体チロシンキナーゼMerについてはK. lactisによる大量調製方法の確立に成功したものの、選択的安定同位体標識化を試みたが、目的アミノ酸の標識効率が低いという問題に直面した。そこで、計画を変更してまずは標識効率を上げることが出来る系を開発した。Axl:Gas6複合体のX線結晶構造及び大腸菌により発現したTyro3のホモダイマーのX線結晶構造情報に基づき、Tyro3とMerの立体構造モデルを構築し解析した。その結果、Gas6の推定結合領域の近傍に各々糖鎖修飾可能部位があることがわかった。

Tyro3ではこの糖鎖修飾可能部位は、ホモダイマー界面近傍でもあることから、本来の生体内では多量体形成様式、およびリガンド(Gas6)結合様式が異なる可能性があると考えた。このような背景のもと、今年度はTyro3の糖鎖修飾に関する解析を開始した。野生型(WT)と糖鎖修飾部位に対する2つの変異体、Asn→Arg(NR)及びAsn→Cys(NC)について、大腸菌による大量調製系を確立した。15N標識を施しNMRスペクトルを測定した結果、いずれも構造が形成されていることがわかった。ゲルろ過により分子量を確認したところ、NRはモノマー、NCはダイマーであること、一方WTではモノマー/ダイマーが混在していることがわかった。NR置換では、ダイマー界面の静電相互作用が阻害され、NC置換ではジスルフィド結合により二量体が安定化されたと考えられる。引き続きこれらの試料について、Gas6との複合体形成能をゲルろ過により調べた。その結果、WTとNRはGas6と1:1で複合体を形成するが、NCは結合能を持たないことがわかった。WTとNRのGas6結合能について、現在表面プラズモン共鳴を用いてより詳細に解析している。糖鎖修飾は負電荷を付加する一方で嵩高いため、実際に糖鎖修飾されたTyro3の構造を調べる必要がある。現在、酵母K.lactisによる糖鎖修飾されたTyro3の大量調製に向けて、精製条件の最適化を行なっているところである。他方、Merについても大腸菌による大量調製方法を確立し、Tyro3と同様な解析に向けて準備を進めている。今年度は、TAM受容体チロシンキナーゼMerについて研究を進めた。まず、NMR研究に適した試料の調製方法を確立した。K.lactisを用い、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質としてMerを発現させた。表現形の異なる各種菌株を用い、また各種培地を検討することで、効率の良い安定同位体標識化方法を見出した。親和性カラム、タグの切除、ゲルろ過により単一標品を得た。得られたMerの15N-HSQCスペクトルを測定した結果、期待されるシグナル数の80%が観測された。マイナー成分が確認されたので、引き続き糖鎖修飾の分析を行った。メジャーとマイナー成分を分離し、各々エンドグリコシダーゼ処理後質量分析を行った結果、メジャーとマイナーは各々糖鎖が1つと2つ付加したMerであった。次に、Merの糖鎖修飾が標的分子Gas6との結合に及ぼす影響をSPRにより解析した。その結果、糖鎖付加がゼロ>1つ>2つの順番で、Gas6との結合が弱くなることが示された。Merのメジャー成分について、更に他核多次元NMR法を適用し、50%程度のシグナルについて主鎖帰属が完了した。最後に、糖鎖が付加されていないMerとGas6との結合について、これまで解析を進めてきたTyro3の場合と比較した。SPRによる結合実験を各温度で行った。その結果、Gas6との結合は概ねTyro3の方がMerよりも強いことがわかった。本研究では、がん等の疾患標的分子でもあるTAM受容体チロシンキナーゼTyro3及びMer、標的分子Gas6について、糖鎖修飾を含む試料調製法及びNMR法などの構造・機能解析方法を整備することに成功した。
災害時における応急土地利用計画に関する研究

阪神・淡路大震災において、公園は様々な復旧活動に使われた。しかしそのほとんどは非計画的であった。震災時における公園の利用については、避難場所についての計画はあるが、それ以外の計画は不十分である。そのため、本研究は、震災後のスムースな復旧活動のために、オープンスペースの計画的利用を目的として、震災後の復旧活動における公園利用のガイドラインを作成することを目的とした。研究の方法は、まず阪神・淡路大震災における公園利用の実態として、神戸市の公園を対象として、各種復旧活動を行った各種機関に、アンケート及びヒアリング調査を行った。そして、各種復旧活動別の公園利用の必要条件等について整理を行った。各種復旧活動として、自衛隊・警察・消防の活動・廃・残材の処理活動、救援物資集積・配送活動、応援活動、上水道・下水道・電力・ガス・電話復旧活動、仮設建築物の建設活動を取り上げた。まず各活動の状況を把握しピーク時における公園の利用状況を比較した。その結果、復旧工事のための一時的利用や、自衛隊のような3ヶ月程度の短期的利用、救援物資集積・配送基地のような6ヶ月程度の中期的利用、また廃・残材の処理活動や応援活動、仮設建築物の建設活動のような長期的利用があることがわかった。また公園利用の際の、各活動別の選択する公園の種別の特性がわかった。更に、仮設建築物の建設活動は他の活動に比べ、ピーク時が遅く、他の活動の終了後、仮説住宅の建設が可能となることがわかった。従って、講演を効率的に使うためには、一時的利用、短期的利用、中期的利用となる活動の状況を見ながら利用計画を立案すればよいとの知見を得、活動別の公園の種別と共に、公園利用のガイドラインを作成した。
児童養護施設退所者の後期高等教育の進路の保障

「児童養護施設退所者の大学進学実現を可能にする支援について」本研究では、児童養護施設在籍者の大学等への進学希望率が低位である理由を明らかにし、在籍者が大学等の進学を可能にする支援の在り方を検討するために、大学等へ進学した児童養護施設退所者に対して面接調査を行った。作成された逐語録から、進路希望実現までの経緯について、小学校、中学校、高等学校の各時期における「生活状況、進路希望、契機」について総括表を作成した。その結果、大学等進学実現までの経過から、3つのタイプに分類した。1つ目は、一度喪失した進路希望を支援者による情報を教示されるなどの支援によって自ら意欲を再生させ高めた「自己調整型」である。2つ目は、進路希望に対する意欲は低く、自ら目標をもつことが困難であったが、他者から認められる体験や他者からの働きかけによって、意欲をもつことができた「他己調整型」である。3つ目は、もともとの進学希望が、支援者の関わりによってさらに高められた「一貫型」である。そして、進路希望を考える契機へと繋がる支援が、各時期において実践されていたことが捉えられた。それらの支援の内容および実践された時期に基づいて、2つのタイプに支援を分類した。まずは、進路希望がもてるように進路に関する社会一般的な情報についての説明や幅広い進路選択肢を提示する「情報説明型支援」、次に進路希望実現のための具体的な知識や方法などを教示する「情報教示型支援」であった。支援者による「情報説明型支援」や「情報教示型支援」によって、在籍者が進路希望を見出す過程に影響を与え、自らの進路希望を考える契機となったことが捉えられた。そして、支援者は在籍者の進路の目標となり、支援者の存在は進路決定に大きく影響することが分かった。「児童養護施設退所後の進路の希望と実際の進路を比較し、進路希望と現実との乖離の実際に関する研究」をテーマとした。全国高等学校卒業者の大学等進学を希望する進学希望率は86.7%、進学率は53.8%、その実現率は62.0%である。一方、児童養護施設退所者の進学希望率は27.0%、進学率は11.4%、実現率は42.2%である。この結果において特に注目されるのは、児童養護施設退所者の大学等進学希望率が27.0%と著しく低いことである。全国高等学校卒業者の進学希望率86.7%の3分の1に過ぎないことがわかった(厚労省,2014、ベネッセ教育総合研究所,2015)。そして、児童養護施設退所者の進路希望と現実の実態については、大学進学をした児童養護施設退所者へヒアリング調査を実施し事例研究を行った。その結果、大学進学を希望する動機となったのは、「施設職員への憧れ」、「人に喜ばれる体験」、「大学進学への肯定的なメッセージを受け取った」「退所後の生活への具体的な見通しがもてた」等であり、これらの動機に影響を与えたのは、施設職員の存在であることがわかった。施設のなかで信頼できる職員がいるか、さらに職員が社会資源の情報を把握し活用まで導いていけるかが、入所児の進路に影響を与えていると考えられた。児童養護施設退所者の大学進学実現までのプロセスでは、はじめから一貫して大学進学を希望し実現しているケースばかりではなく、大学進学の希望を喪失する体験をもっていることがわかった。しかし、その体験は、本人の努力以前の段階で進学に対する意欲の格差が生じており、施設の先輩たちの大学進学の実現性の低さから希望をもてないケースがあることをとらえることができた。しかし、入所児が進学に対して希望を喪失している状態であってもそばにいてくれる大人の存在によって、再び希望をもてることがわかった。平成28年度の研究実施計画に従って、「児童養護施設退所者の大学進学」に関する関係資料・統計データの収集や文献研究を行うことができた。それによって、児童養護施設退所後の進路希望の実態把握と先行研究での指摘についてまとめることができた。研究計画に示した「児童養護施設退所後の進路の希望と実際の進路の比較および進路希望と現実との乖離の実態」のテーマに基づき、児童養護施設退所後の進路希望の実態について、既存の統計データをもとに整理できた。さらに、児童養護施設退所者の進路希望と現実の実態については、大学進学をした児童養護施設退所者へヒアリング調査を実施し事例研究を行うことができた。平成29年度に予定していたヒアリング調査と平成28年度に予定していた質問紙調査の実施年度を入れ替えた。入れ替えた理由は、質問紙調査のための質問項目を検討するためには、当事者の方々からヒアリングした内容をもとに調査項目の検討が必要と考えたからである。この変更によって、質問紙調査実施に向けて質問項目の検討を具体的に行うことができた。それによって、大学進学を希望している児童養護施設入所児の高校生とその職員へ大学進学に関する質問紙プレ調査を行うことができた。「児童養護施設退所者の大学進学実現の経過に関する検討」児童養護施設退所者の大学進学実現までの経過を検討するために、大学に進学した児童養護施設退所者、大学進学を希望している児童養護施設入所者、進路指導を担当している児童養護施設職員に面接調査を実施した。

面接調査の内容は、大学に進学した児童養護施設退所者には、「児童養護施設での生活」と「大学在学中の生活」に分けて、各生活における「家族の状況」、「生活状況」、「進路状況」、「経済状況」、「社会資源」、「本人の心情」、大学進学を希望している児童養護施設入所者には、「幼少期の進路希望」「児童養護施設での生活」「大学進学への準備」とした。また、進路指導を担当している児童養護施設職員には、「入所児童への進路選択の支援」とした。そして、面接内容は「家族の状況」、「生活状況」、「進路状況」、「経済状況」、「社会資源」、「本人の心情」の6つの項目に分類し、それらを「小学校期」、「中学校期」、「高等学校期」の3つの時期に分けて、総括表を作成した。そして、総括表から、小学校期、中学校期、高等学校期の各時期における希望する進路に関して、「進路希望の有無」、その「契機」、具体的な進路の「名称」に分けて経過を整理した。その研究成果として、「入所者が進学に対して希望を喪失している状態であってもそばにいてくれる大人の存在によって、再び希望をもてる」ことが指摘できた。具体的には、希望を喪失した場合、その時期において支援が行われており、その支援には2種類の支援があることがわかった。その支援によって、再び希望をもてるようになったことなどが指摘できた。平成29年度前半は、関係資料収集や文献研究を行い、国による社会的養護に関わる支援の方向性および大学進学に関する傾向についてまとめることができた。それと並行して、平成28年度に当事者に面接調査した内容をもとに質問紙調査の準備を行い、大学進学を希望している児童養護施設入所者および進路指導を担当している児童養護施設職員に対して質問紙調査を実施した。平成28年度当初の予定では、質問紙調査を全国の児童養護施設を対象としていたが、その後の面接調査につなげることを目的に、調査対象者を面接調査が可能な東海3県の事例に限定した。児童養護施設職員に対する質問紙調査結果から、入所者のうち大学等進学をした者は4割程度いたが、大学進学を希望したが実現しなかった者も同程度いることがわかった。この理由には、自分のおかれている状況や環境によるものだけではなく、「施設が進学を後押しする風潮ではなかった」ことが明らかになった。これは、先行研究が指摘するように「施設間における進学率の著しい差」がみられたとする原因の一つと考えられ、さらに、児童養護施設入所者に対する質問紙調査結果から、進路決定に至る経過には多くの相談相手が介在していたことがわかった。そして、将来の夢を実現するために必要な資格取得のために大学進学を希望していた者が約70%であった。大学進学と将来の職業が直結している事例が多かった。後半は、大学に進学した児童養護施設退所者1名、大学進学を希望している児童養護施設入所者5名、進路指導を担当している児童養護施設職員5名に面接調査を実施した。面接結果について総括表を作成し、小学校期、中学校期、高等学校期の各時期における希望する進路に関して、「進路希望の有無」、その「契機」、具体的な進路の「名称」に分けて経過を整理した。さらに、昨年度に実施した面接調査結果も踏まえて、大学進学実現の経過についてまとめている。「児童養護施設退所者の大学進学実現を可能にする支援について」本研究では、児童養護施設在籍者の大学等への進学希望率が低位である理由を明らかにし、在籍者が大学等の進学を可能にする支援の在り方を検討するために、大学等へ進学した児童養護施設退所者に対して面接調査を行った。
X線分光による超強磁場下での極限電子磁気状態の同定と未知電子磁気状態の探索

強磁場下での高エネルギーX線分光実験は、今世界中の競争のなかにある。それは例えば100T級強磁場のエルギーが交換相互作用や時には電子系のエネルギーと対等になり、様々な相転移の可能性が生じ、これまでに無い新しい相の実現が可能と考えられるからである。本研究では、磁性体におけるそのような新奇な量子現象やそれらに伴う新機能評価・探索を元素選択性、殻選択性を特徴とするX線分光を通して行うことが目的であった。私たちが先ず選んだ研究テーマは「磁場誘起価数転移のX線吸収分光による研究」である。この研究は、本特定領域研究の計画班松田(東北大)らによる実験に触発されたもので、以後その実験研究者たちとの密接な連携の下で研究が遂行された。具体的には、強磁場下におけるEuNi2(Si0.18Ge0.82)2のX線吸収スペクトル(XAS)の実験である。この実験は磁場によりEuの価数転移を誘起し、それをXASによって観測したものである。この実験は、まさにXASの元素選択性を有効に生かし、的確にEuの価数転移を捉えていることを私たちはモデル計算により示した。私たちのモデルでは基底状態において(4f)6の状態にあるEu3+と(4f)7L(Lは伝導電子帯に正孔があることを示す)の状態にあるEu2+とが、量子力学的に混成している。Eu3+はJ=0の状態にあり、Eu2+はJ=7/2の状態にあることを考慮すると、磁場によりEu2+のエネルギー利得が大きくなり、更に周りのEu2+からの平均場を考慮すると価数転移が起きることが容易に想像できる。このような状態にあるEuのXASを計算し、2ピークを持つ実験スペクトルの強度比と比較することによりEuの価数を正確に見積もれることを明らかにした。しかし問題も残されている。そのひとつに、XAS終状態に存在するコアホールによる多体問題で、価数の見積りに曖昧さを導入する。今後、その効果の役割を明らかにしたい。更に、磁場誘起価数転移とこれまでに知られている温度誘起価数転移との関係なども明らかにすること、この物質での磁気円2色性(MCD)の研究を発展させることなどが今後の課題である。この2年間,特に実験家との交流や学会などでの成果発表に努めた、このために旅費に多くの予算を割いたが、これは相互の情報交換に大層役立ち,新しい研究の展開に結びつくものである。超強磁場下における強相関電子系の新しい量子状態やそれに伴う新機能探索はチャレンジングな緊急課題である。本研究では、高エネルギーX線分光を用いたミクロな電子状態の理論的研究から強相関電子系の強磁場下における新しい量子状態の評価・探索を目的とし研究を行っている。平成18年度に実施した研究の成果は以下のとおりである:1.以前より行ってきた、遷移金属・希土類化合物中の希土類元素のL吸収端XMCDの機構を更に確固たるものにするため、遷移金属・希土類化合物に対応する電子モデルを構築し、その理論から得られる興味ある結果を検証した。計算では、伝導電子系はtight-binding近似を用い、局在電子系は原子モデルで取り扱い、出来得る限り実験結果との定量的比較に耐えうる計算を行った。特にErFe_2で観測されているMCDスペクトルの異常存温度変化が、私たちの理論で自然に説明されることを確認し、私たちのL吸収端XMCDの理論の正当性を示した。2.EuNi_2(Si_<1-x>Ge_x)で実現される磁場誘起価数転移が,高エネルギーX線分光ではどの様に観測されるかを上記1.におけるモデルを拡張し、理論的に予測した。その結果を松田(東北大)たちの最近の実験結果と比較することにより、そこから得られる情報の詳細を明らかにするとともに、現在それらの磁気円2色性(XMCD)スペクトルが、価数転移研究においていかに有用かを明らかにしつつある。3.擬1次元S=1磁性体、いわゆるハルデーン系での磁場誘起相転移を場の理論と数値計算により研究し、基底状態相図を完成するとともに秩序相間の新しい相転移を発見した。

私たちのモデルでは基底状態において(4f)6の状態にあるEu3+と(4f)7L(Lは伝導電子帯に正孔があることを示す)の状態にあるEu2+とが、量子力学的に混成している。Eu3+はJ=0の状態にあり、Eu2+はJ=7/2の状態にあることを考慮すると、磁場によりEu2+のエネルギー利得が大きくなり、更に周りのEu2+からの平均場を考慮すると価数転移が起きることが容易に想像できる。このような状態にあるEuのXASを計算し、2ピークを持つ実験スペクトルの強度比と比較することによりEuの価数を正確に見積もれることを明らかにした。しかし問題も残されている。そのひとつに、XAS終状態に存在するコアホールによる多体問題で、価数の見積りに曖昧さを導入する。今後、その効果の役割を明らかにしたい。更に、磁場誘起価数転移とこれまでに知られている温度誘起価数転移との関係なども明らかにすること、この物質での磁気円2色性(MCD)の研究を発展させることなどが今後の課題である。この2年間,特に実験家との交流や学会などでの成果発表に努めた、このために旅費に多くの予算を割いたが、これは相互の情報交換に大層役立ち,新しい研究の展開に結びつくものである。
磁気共鳴(MR)画像装置による非侵襲的局所脳血流量定量化の試み

1.目的磁気共鳴(MR)画像装置を用い、超高速撮像法であるEPI(echo planar imaging)法による簡易で非侵襲的な局所脳血流量の定量的測定を実現するための基礎的検討を行い、撮像条件の最適化と撮像結果の処理法を確立する。3.結果(1)1.5Tの静磁場強度においてinversion pulse(以下IP)印加による撮像面上流の流入血液への標識は1秒程度で縦磁化の緩和により消失する。(2)観察される信号変化は非常に微弱である(数%)。(3)今回用いたIP slabについては、profile端の立ち上がりが不明瞭で撮像面への影響を防ぐためにslabと撮像面を30mm以上離す必要がある。さらに人体に適用した場合(4)本法は基本的にsubtraction法であるため呼吸、心拍動などに起因するところの動きに非常に敏感で信号収集の不安定を引き起こす。等の問題が明らかになった。4.結論、今後の課題局所脳血流量の定量的測定を本研究の目的としていたが、信号収集の段階で解決すべきいくつかの問題があきらかになった。微弱な信号を受信するための高感度(高SNR)受信コイルの作成、IP slab profileの改善(adiabatic IPの使用)と本法と同種のEPIベースのspin tagging法ではあるがsubtraction法を用いない方法の採用が必要であると考えられた。
低対称で三次元的な有機分子を用いた磁性・伝導体の開発とその結晶構造、物性研究

新規錯体、(ET)_4M(CN)_6(N(C_2H_5)_4)(H_2O)_2 (ET ; bis(ethylenedithio)tetrathiafulvalene, M ; Co^<3+>,Fe^<3+>)を作成した。これらの錯体中で、ET分子はk-phaseと呼ばれる他の有機超伝導体と同様の充填様式を有していた。冷却に伴いET分子が価数の揺らぎを示し、除々に0価と1価の分子の割合を増した。100K付近の構造解析の結果、低温でET分子の変形を伴う電荷整列が起きていることが示された。磁性および導電性をも合わせた解析により、150K付近において、電荷の揺動を伴うモット絶縁相から分子変形を伴う電荷整列相への相転移が起きていることが示された。電荷整列相の詳細な解析により、分子変形、対イオンによる静電ポテンシャル、および電子相関が相転移の発現に重要な役割を果たしていることが示された。(BO)[M(isoq)_2(NCS)_4];M=Cr^<+3>(1),Fe^<+3>(2),isoq=isoquinoline, BO=bis(ethylenedioxo)-tetrathiafulvalene、の磁性および導電性について詳細な検討をおこなった。ESR測定の結果、ドナー分子とアニオンのスピンとに由来する信号を分離することができず、π電子とd電子の間の相互作用の存在が示された。静帯磁率の温度変化はキュリー・ワイスの法則に従い、ドナー分子およびアニオンのスピン間に反強磁性的な相互作用が働いていることを示した。しかし、磁気的な長距離秩序は2Kまで起きなかった。このような磁気的な挙動は、同じアニオンで異なるドナー分子(BEDT-TTF, BDH-TTP)を用いた1:1錯体との比較から直接構造的な要因に帰することができて、わずかの分子間相互作用の違いが、フェリ磁性や強磁性などの長距離秩序の有無と密接に関係していることが示された。導電性については、組成が1対1であり、ドナーとアニオンが交互積層構造をとっていたことから、高い電気抵抗を示した(>1.5GΩcm)。(EDO)_2X(X=GaCl_4,ReO_4)の単結晶を電解酸化法によって得、結晶構造および導電性について研究した。2種類の塩は室温で互いに同型構造であり、300Kから200K付近まで金属的な導電挙動を示した。平成14年5月から平成15年3月までの期間、フランス、レンヌ第一大学、化学研究所において、L.Ouahab教授の指導を受けて研究を行った(京都大学から研究指導を委託した)。新規錯体、(ET)_4M(CN)_6(C_2H_5)_4N(H_2O)_2(ET=bis(ethylenedithia)-tetrathiafuivalene,M=Co,Fe)を電解酸化法により作成し、その結晶構造を解析した。これらの錯体中で、ET分子はK-phaseと呼ばれる、他の有機超伝導体と同様の充填様式を有していた。室温において、ET分子は結合距離の比較から、すべて均等な電荷(+0.5価)を持つことが示された。各ET分子は平面的な構造を示した。115K(M=Co)および106K(M=Fe)において、両錯体中で半数のET分子が折れ曲がっていた。結合距離の比較から、折れ曲がったET分子がほぼ中性であり、平面的なET分子がほぼ+1価の電荷を持つことが示された。280K付近で新奇な金属一絶縁体相転移を起こす(EDO-TTF)_2PF_6(EDO=ethylenedioxo)について、X線散漫散乱の測定を行った(レンヌ大学、H.Cailleau教授のグループとの共同研究)。
甲状腺癌の特異的新規再配列遺伝子のクローニングと機能解析

甲状腺癌では、Ret遺伝子の再配列異常の他に、組織特異的な癌遺伝子は、未だに発見されていない。そこで、甲状腺癌における新たな変異遺伝子の発見を目的として本研究を行なっている。まず、悪性度の高い甲状腺癌手術摘出組織を患者からインフォームドコンセントを得て提供を受け、RNAの抽出を行なった。次に、少量(1μg)のRNAよりSMART法(クローンテック社)を改良した方法で、完全長のcDNAライブラリーを作成した。両端にPCRで増幅可能なプライマーサイトを作成してある。このcDNAライブラリーをレトロウイルス・ベクターに組みこんだ後、NIH3T3細胞に導入し、フォーカス形成能を調べた。この結果、4個のフォーカス形成が見られた。それぞれのフォーカスから細胞を単離してヌードマウスに移植し、腫瘍形成能を確かめた。得られた4クローンともに、2-3週間で腫瘍形成を確認することができた。次いで、マウスに形成した腫瘍からDNAを抽出して、特異的なプライマーを用いることにより、MIH3T3細胞内の染色体に組み込まれたヒト遺伝子の確認作業を行なった。増幅したDNAをシークエンス解析し、Genbankに照合することにより遺伝子の同定を行なった。その結果、1クローンからは、Raf-1遺伝子の5'側の欠損したものであり、他の3クローンからはBRAF遺伝子の5'側欠損タイプであることがわかった。Raf遺伝子に関しては、変異により活性型になり、MAPKシグナルを活性化させ細胞増殖を促進する。BRAFの変異を甲状腺癌細胞株および甲状腺癌組織から抽出したDNAを用い調べたところ、6細胞株のうち4株で変異を認めた。また、186症例の甲状腺腫瘍の解析で48例(25.8%)にBRAF変異認めた。変異は乳頭癌に多く、臨床ステージの悪性度に相関していることが明かになった。次いで、マウスに形成した腫瘍からDNAを抽出して、特異的なプライマーを用いることにより、NIH3t3細胞内の染色体に組み込まれたヒト遺伝子の確認作業を行なった。その結果、1クローンからは、Raf-1遺伝子の5'側の欠損したものであり、他の3クローンからはB-Raf遺伝子の5'側欠損タイプであることがわかった。Raf遺伝子に関しては、5'側が欠損することで、活性型になることがわかっており、引き続きRas-MAPKの活性を増加させ細胞増殖を促進することが示唆された。今後、この得られた遺伝子が甲状腺癌の形成に関与しているかどうかについて検討してゆく予定である。

まず、悪性度の高い甲状腺癌手術摘出組織を患者からインフォームドコンセントを得て提供を受け、RNAの抽出を行なった。次に、少量(1μg)のRNAよりSMART法(クローンテック社)を改良した方法で、完全長のcDNAライブラリーを作成した。両端にPCRで増幅可能なプライマーサイトを作成してある。このcDNAライブラリーをレトロウイルス・ベクターに組みこんだ後、NIH3T3細胞に導入し、フォーカス形成能を調べた。この結果、4個のフォーカス形成が見られた。それぞれのフォーカスから細胞を単離してヌードマウスに移植し、腫瘍形成能を確かめた。得られた4クローンともに、2-3週間で腫瘍形成を確認することができた。次いで、マウスに形成した腫瘍からDNAを抽出して、特異的なプライマーを用いることにより、NIH3T3細胞内の染色体に組み込まれたヒト遺伝子の確認作業を行なった。増幅したDNAをシークエンス解析し、Genbankに照合することにより遺伝子の同定を行なった。その結果、1クローンからは、Raf-1遺伝子の5'側の欠損したものであり、他の3クローンからはBRAF遺伝子の5'側欠損タイプであることがわかった。Raf遺伝子に関しては、変異により活性型になり、MAPKシグナルを活性化させ細胞増殖を促進する。BRAFの変異を甲状腺癌細胞株および甲状腺癌組織から抽出したDNAを用い調べたところ、6細胞株のうち4株で変異を認めた。また、186症例の甲状腺腫瘍の解析で48例(25.8%)にBRAF変異認めた。変異は乳頭癌に多く、臨床ステージの悪性度に相関していることが明かになった。
超塑性下動的連続再結晶のメカニズム解明

本科学研究費補助金による研究成果の概要は次のように2つに分けてまとめられる。(1)アルミニウム合金の超塑性変形下で生じる動的連続再結晶パンケーキ状結晶粒組織を有する7075A1合金の高温変形中に微細粒組織の形成と超塑性が同時に起こることを見出し、動的連続再結晶に伴う細粒化過程をSEM/EBSDを用いてその場観察を系統的に行った。EBSDににより局所的な結晶方位データ、特に粒界方位差ならびに粒界性格を解析した。40°以上の高傾角粒界の割合は変形中ほぼ一定であるに対し、15°以下の低傾角粒界の割合は変形開始と共に急減した。パンケーキ状粒界における局部的粒界すべりとそれに伴うサブグレン回転が変形初期から局部的に生じる結果、サブ粒界の方位差は変形に伴い増加した。それが全域へ伝播することで細粒化が進展することなどが明らかになった。(2)マグネシウム合金AZ31の高温変形による微細粒組織の生成軽金属材料の高温変形下で生じる動的再結晶に注目し、それが生じる条件や新粒の形成過程及びその機構を明らかにすることを目的として、市販のAZ31Mg合金を用いて、自家製の高温加工急冷試験機によって高温圧縮試験とSEM/EBSD観察を系統的に行った。動的再結晶過程及びその機構について立方晶金属の結果と比較しながら検討を加え、次の諸結果を得た。1)変形曲線は急速な加工硬化と比較的低ひずみで応力ピークを示してから加工軟化して高ひずみ域で定常状態変形を示す。微細粒はε_p附近から凹凸化した粒界上で出現し、加工軟化中に急速に広がり、高ひずみでほぼ等軸状の微細粒組織が一様に生じる。2)変形初期からキンク帯が凹凸化した粒界附近や結晶粒内で頻繁に生じており、キンク帯境界の方位差は加工軟化中に急増し、その平均値は高ひずみで飽和値約43°に近づく。新粒の形成過程やその変形挙動との関係などの特徴は、多くの点で通常の不連続再結晶と一見類似している。3)本合金における新粒の動的形成は、変形に伴うキンク帯の形成とキンク帯境界の方位差が変形中に連続して増加する反応、すなわち連続動的再結晶によると結論される。パンケーキ状結晶粒組織を有するアルミニウム合金の高温変形中に微細粒組織の形成と超塑性が同時に起こる現象に関して、市販のSUPRAL100と7075アルミニウム合金を用いて、自家製の高温引張-急冷試験機によって高温引張試験とSEM/EBSD観察を系統的に行った。動的連続再結晶に伴う細粒化過程及びその機構について検討を加え、次の諸結果を得た。1.試験片縦断面における高傾角粒界の存在比は板面のそれに比べて大であり、逆に低傾角粒界の割合は明らかに小であった。2.40°以上の高傾角粒界の割合は高温変形中ほぼ一定であるに対し、15°以下の低傾角粒界の割合は高温変形開始とともに急減し、高ひずみでは全領域の大部分が高傾角粒界を有する等軸状結晶粒組織が生じた。

3.微細粒は粒界三重点近傍で優先的に出現し、変形と共にそれが隣接領域内へ伝播する。4.引張方向に平行なパンケーキー状粒界での粒界すべりとそれに伴いサブゲレン回転が変形初期から局部的に生じ、それが全域へ伝播することで細粒化が進展する。軽銀材料の高温変形下で生じる動的再結晶に注目し、それが生じる条件や新粒の形成過程及びその機構を明らかにすることを目的として、市販のマグネシウム合金AZ31を用いて、自家製の高温加工急冷試験樹こよって高温圧縮試験とSEM/EBSD観察を系統的に行った。高温変形に伴り細粒化過程及びその機構について立方晶金属の結果と比較ながら検討を加え、次の諸結果を得た。(1)σ-ε曲線は急速な加工硬化と比較的低ひずみ(ε_P=0.12)で応力ピークを示してから加工軟化して高ひずみ域で定常状態変形を示す。微細粒はε_P付近から凹凸化した粒界上で出現し、加工軟化中に急速に広がり、高ひずみでほぼ等軸状の微細粒組織が一様に生じる。(2)変形初期からキンク帯が凹凸化した粒界附近や結晶粒内で頻繁に生じており、キンク帯境界の方位差は加工軟化中に急増し、その平均値は高ひずみで飽和値約43°に近づく。キンク帯境界で分割された領域の大きさと微細粒の大きさは同じである。新粒の形成過程やその変形挙動との関係などの特徴は、多くの点で通常の不連続再結晶と一見類似している。本マグネシウム合金における新粒の動的形成は、変形に伴うキンク帯の形成とキンク帯境界の方位差が変形中に連続して増加する反応、すなわち連続動的再結晶によると結論される。
γ線摂動角相関法によるフラーレン超伝導体の局所磁場測定

本研究は、金属原子がC_<60>の結晶中にドープされたフラーレン化合物の超伝導性を不純物をプローブとして調べることを目的としている。炭素中での不純物ドーパントの価数に関する情報を得るため、炭素の同素体である高配向熱分解グラファイトを対象とし、γ線摂動角相関法による実験を行った。プローブの試料への導入法としては、原子炉で生成された核分裂片を電場で加速して向位体分離し、目的核種の^<140>C_s(遂次β崩壊によって^<140>Ceが生成される)を植え込む手法を採用した。角相関測定では外部磁場を印可し、ラーモア歳差運動の周期からプローブ核の電子状態を調べた結果、Ce原子が複数の酸化状態をとっていることが示唆された。現在これを報文にまとめる作業を行っている。また、同手法によってフラーレンC_<60>分子とプローブとして導入した^<140>Ceとの相互作用を観察した結果、前年度の実験結果を再現することを確認した。即ち、高温で徐々に減衰する角相関の異方性が低温では急激に緩和する。これはプローブ核と核外場との相対的な熱運動が低温になる程抑制され、相関時間が長くなる現象を示唆している。この振舞いが不純物として極微量に存在するプローブ特有の現象であるかどうかを調べるため、金属ランタンとC_<60>粉末との直接固相反応によって、超伝導状態を発現するLa_3C_<60>を生成し、原子炉において中性子照射[^<139>La(n,γ)^<140>La反応]を行い、同じプローブで角相関測定を行った。データ解析の結果、電場勾配による電気四重極相互作用を示唆する静的な振動成分が時間スペクトルに現れており、極微量の状態とは異なる観測結果が得られた。今後、外部磁場を印可した実験を行うことにより、超伝導性と試料中でのプローブ原子密度についての詳細な情報が得られるものと期待される。上記の研究成果の一部は2004年の8月と9月に開催された二つの国際会議で報告した。本研究では、アルカリ金属原子がC_<60>の結晶中にドープされたフラーレン化合物の超伝導性を不純物をプローブとして調べることを目的としている。本年度はその基礎実験として、γ線摂動角相関法によってフラーレンC_<60>分子とプローブとして導入された^<140>Ceの相互作用を観察した。プローブの導入法としては、原子炉で生成された核分裂片を電場で加速して同位体分離し、目的核種の^<140>Cs(逐次β崩壊によって^<140>Ceが生成される)を錠剤成型した粉末C_<60>に植え込む手法を採用している。室温以下でγ線摂動角相関測定した結果、角相関スペクトルに温度依存性が観測された。即ち、高温では徐々に角相関の異方性が崩れてゆく現象を示しているのに対して、低温では急激に緩和する。現在、緩和定数の温度依存性を詳細に検討し、スペクトルの解釈を進めているところである。また、この実験に先立って、炭素と^<140>Ceプローブとの相互作用に関してより理解を深めるため、炭素の同素体である高配向熱分解グラファイトを対象として同様の実験を試みた。グラファイト層間でのプローブ核の動的挙動と角相関スペクトルの結晶軸方向依存性について興味ある知見が得られたので、これを報文にまとめた。電子回路を含めた検出系の開発も進行中である。本年度は新しい測定システム構築の一環として、BaF_2シンチレーターと光電子増倍管をそれぞれ4台ずつ購入した。また、測定系の改良を図るため、現在測定回路の見直しとデータ解析プログラムの作成を行っている。この振舞いが不純物として極微量に存在するプローブ特有の現象であるかどうかを調べるため、金属ランタンとC_<60>粉末との直接固相反応によって、超伝導状態を発現するLa_3C_<60>を生成し、原子炉において中性子照射[^<139>La(n,γ)^<140>

La反応]を行い、同じプローブで角相関測定を行った。データ解析の結果、電場勾配による電気四重極相互作用を示唆する静的な振動成分が時間スペクトルに現れており、極微量の状態とは異なる観測結果が得られた。今後、外部磁場を印可した実験を行うことにより、超伝導性と試料中でのプローブ原子密度についての詳細な情報が得られるものと期待される。上記の研究成果の一部は2004年の8月と9月に開催された二つの国際会議で報告した。
インスリンによる糖輸送促進機構への時間的空間的アプローチ

インスリン受容体を発現させたCHO細胞(CHO-IR細胞)ではインスリンを添加すると、Akt1は細胞膜(特にmembrane ruffle)へトランスロケーションし、そこでリン酸化を受け、この移動とリン酸化にはPI3kinase活性化が必須であること、Akt1の移動にはPH domain(PIP3やPIP2と結合する)が必須であるがキナーゼ活性は必要でないことを明らかにした。さらに、membrane ruffleにPI3kinaseも移動すること、ARNOやGRP1のPH domainを発現させると、インスリン刺激によりmembrane ruffleに移動することから、この部位でPI(3,4,5)P3が産生されていると考えられた。すなわち、細胞膜のmembrane ruffle部が、PI3kinase,PI(3,4,5)P3,Akt1の反応の「場」となっていると考えられた。インスリンによる糖輸送促進が顕著に認められる3T3-L1脂肪細胞で、このような「場」の形成とそこへのGLUT4の集合を想定して検討したが、確認できなかった。次に、PI3kinaseとAkt1をつなぐシグナル分子、すなわち、PI3kinase活性化によって増加するPIP3やPIP2に反応してAkt1をリン酸化する分子として同定されたPDK1について検討を進めた。Akt1 308位スレオニン(T308)はインスリン刺激後すでに1分後には最大にリン酸化され、その後急速に脱リン酸化された。野生型PDK1の過剰発現では、上記の現象がさらに増強されて認められ、PI3kinase活性化がPDK1を介してAkt1をリン酸化することを支持したが、dominant negative型PDK1の過剰発現ではAkt1のリン酸化状態が15分後にも維持されており、T308の脱リン酸化が生じないという予想外の結果を得た。検討を進めた結果、インスリン刺激によりAkt1をリン酸化する酵素であるPDK1は、同時に脱リン酸化酵素、おそらくはPP2Aを活性化して、T308を脱リン酸化すると考えられた。一方、473位セリン(S473)はインスリン刺激1分でリン酸化され、15分後にも同じレベルで持続されており、リン酸化レベルがPDK1の酵素活性と相関したことから、T308の早期脱リン酸化後もS473のリン酸化状態によって活性が維持されていると考えられた。なお、我々の検討ては、atypical PKCやAkt1がPDK1-PI3kinaseの下流でインスリンによる糖輸送促進に少なくとも大きな役割は演じていない。PI3キナーゼの次のシグナル伝達分子として注目されているAkt(protein kinases B)に着目して検討した。CHO-IR細胞に野生型Aktを発現させると、インスリン非存在下では細胞質に濔慢性に存在し、特に核に多く存在した。インスリン添加により、Aktは細胞膜に認められるようになり、アクチンの染色により、この部位がmembrane ruffleであることが判明した。

このインスリンによるAktの細胞膜へのトランスロケーションはadenovirusで発現させたAktだけではなく、内因性のAktでも同様に認められた。さらに、membrane ruffleへ移動したAktだけではなく、内因性のAktでも同様に認められた。さらに、membrane ruffleへ移動したAktはリン酸化を受けることが、リン酸化Aktに特異的な抗体を用いて示された。このようなインスリンによるAktの移動とリン酸化による活性化は、delta p85の発現やワートマニンの添加により阻止され、インスリンによるPI3kinase活性化の下流に存在すると考えられた。また、このAktのトランスロケーションは、PH domainの欠如や変異により生じなくなる一方、キナーゼ活性のないK179Mやリン酸化されないT308A/S473Aもインスリン刺激によりmembrane rulffleへ移動した。すなわち、トランスロケーションにはPH domainが必須であるが、キナーゼ活性は必要でない。さらに、このmembrane ruffleにはPI3kinaseも移動すること、また、ARNOのPH domainやGRP1のPH domainを発現させると、インスリン刺激によりmembrane ruffleに移動することが示され、この部位でPI(3,4,5)P3が産生されていると考えられた。以上の結果により、インスリンによるAktの活性化は以下のように考えられる。すなわち、インスリンによりPI3キナーゼが活性化されるが、この時、PI3キナーゼは細胞膜に形成されたmembrane ruffleに移動し、ここでPI(3,4,5)P3を産生する。AktはそのPH domainにより、このPI(3,4,5)P3に引き寄せられトランスロケートし、membrane ruffle部位でPDK1によりリン酸化を受け活性化される。以上、細胞内局在を変えることによるダイナミックな活性化機構が考えられる。インスリンによる糖輸送促進にはPI3kinaseの活性化が必須であるが、PI3kinase,PDK1,Akt1と続くと考えられているシグナル伝達経路につき、PDK1の各種変異体をアデノウイルスベクターに組み込み、CHO-IR細胞に発現させて検討した。PDK1の野性型(wt),およびK111A変異体(kinase dead:kd)をに発現させ、AKt1のT308とS473のリン酸化および脱リン酸化における役割について検討したところ、Akt1のThr308はインスリン刺激後1分でリン酸化されたが,5分後にはほぼ完全に脱リン酸化された。この上流にあるPDK1(Wt)を過剰発現すると、インスリン刺激によるT308のリン酸化を増大させたが,これも速やかに脱リン酸化された。一方、PDK(Kd)を過剰発現すると、インスリン刺激によるT308のリン酸化が持続し、15分後でもリン酸化状態が保たれているという予想外の結果を得た。すなわち、活性のないPDK1(Kd)の過剰発現は脱リン酸化を抑制しているものと考えられた。
膜タンパク破綻機構の解明とシェーグレン症候群の免疫制御

研究代表者らはシェーグレン症候群の病因と密接に関連した責任抗原として分子量120KDの自己抗原α-フォドリンを分離精製した。そこで、自己抗原120KDα-フォドリンの成立機序を解明し、疾患特異的免疫応答の制御法・治療法の確立が急務とされてきた。本研究ではシェーグレン症候群の病因抗原120KDα-フォドリンの成立機序を解明し、疾患特異的免疫応答の制御法・治療法の確立へ向けた研究を実施してきた。まず疾患特異的な病原性T細胞エピトープを解明し、その抗原ペプチドを用いて自己抗原反応性T細胞クローンを樹立し、正常動物への細胞移入により病態誘導が可能であることを明らかにした。さらに、自己抗原120KDα-フォドリンは唾液腺上皮細胞のアポトーシスに伴うカスパーゼの活性化によって分断化をうけ病因抗原として機能発現する可能性を明らかにするとともに、カスパーゼに対する特異的阻害剤をin vivoへ投与することにより病態発症をブロック出来ることを確認した。疾患モデルにカテプシンSインヒビターを投与することにより自己免疫病変が著明に抑制されたことから、抗原ペプチドのプロセッシング機構を阻止することによるシェーグレン症候群の治療の有効性が示唆された。また、自己免疫疾患は閉経期以降の女性に極めて高い頻度で発症することから、発症に関与する性差の分子メカニズムを解析してきた。エストロジェンを介したアポトーシス誘導因子の存在が想定されたことから、Differential Display法を用いて解析し、RB関連蛋白RbAp48遺伝子が同定された。また、原因不明の難病ウイリス動脈輪閉塞症(モヤモヤ病)患者血清中に高頻度に分断化された膜骨格蛋白α-フォドリンが検出され、血管内皮細胞におけるアポトーシスが病態形成に関与している可能性が初めて明らかにされた。難治性自己免疫疾患シェーグレン症候群の120KD自己抗原は分断化された膜骨格タンパクα-フォドリン断片であることから膜タンパク破綻機構の分子レベルにおける解明とin vivoにおける免疫制御法の研究開発が必要とされている。シェーグレン症候群モデルマウスやヒト患者で自己抗原が形成される機序を明らかにする目的で、生体内で起こっているタンパク分断化の分子機構の解明を試みた。その結果、自己抗原120KDα-フォドリンはカルパイン、カスパーゼ-3などによる唾液腺上皮細胞のアポトーシスカスケードの活性化によって分断化をうけている可能性が示唆された。即ち、自己抗原として精製された膜タンパクα-フォドリンは、アポトーシス過程で観察される正常膜タンパク破綻と極めて類似している。口唇腺生検材料を用いた免疫組織化学法ではシェーグレン症候群患者の口唇腺導管上皮細胞にα-フォドリンN末20残基に対するペプチド抗体に陽性所見がみられ、ウエスタンブロット法でも患者サンプルにのみ自己抗原に対する陽性所見が確認された。従って、腺組織破壊に関与するCD4T細胞の標的分子が唾液腺細胞膜上に存在する可能性が強く示唆される。自己成分としての腺上皮細胞膜タンパクの破綻に伴い自己抗原ペプチドがクラスII分子とともに提示される可能性が強く示唆され、唾液腺における自己の膜骨格タンパク破綻から抗原提示に至る全過程を解明することが必要とされている。更に、疾患特異的なT細胞エピトープを解明する目的で、α-フォドリン遺伝子全領域をカバーするpGEX発現ベクターの産生するGST fusion蛋白について制限酵素によるdeletin mutagenesis法を実施した。疾患モデル末梢またはリンパ節からT細胞を分離調整し各種リコンビナント蛋白及び合成ペプチドとの増殖反応性で解析を実施した結果、疾患特異的な自己反応性T細胞が樹立されるとともに、自己抗原のT細胞エピトープが明らかにされた。