hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大強度ミリ波光源を目指したアドバンスト・ブラッグ共鳴器の原理検証実験

大強度相対論的電子ビームをヘリカルウィーグラー磁場中に入射し、自由電子メーザー機構による電磁波発振を確認した。本研究では新規に提案したアドバンスト・ブラッグ共鳴器を用いた。通常のブラッグ共鳴器に対するアドバンスト・ブラッグ共鳴器の優位性については,いまだ検討の余地が残っているが,実験で、40GHzの自由電子メーザー発振がアドバンスト・ブラッグ共鳴器を用いることで選択的に起こることを確認した。電子ビームの改良:本研究で使用する大強度電子ビームは,ビーム半径に対して電流値が大きく,空間電荷効果が強いのが特徴である。今年度は,特に装置を含む電極部に改良をほどこし,電子ビームの時間的エネルギー変動が少なく,断面形状の輪郭のはっきりした電子ビーム生成に取り組んだ。電極部の改良,並びに電極と並列に設置した補助抵抗の調整の結果,ダイオード部でのエネルギー変動を約100ナノ秒に渡り5%程度に抑える事ができた。更に,電極部ガイド磁場に補助磁場を加える事で,ビーム断面形状の改良に成功した。これ等の結果を元に発振条件等を検討した結果,これまでのビーム半径が10mmであったが,発振に際しては更に小径の電子ビームが適しており,しかも,その生成は可能であるとの見込みから,半径5mmの電子ビーム生成のための電極部等の設計を開始した。またビームアラインメント装置に関しても設計は完成し,細径ビーム用に変更を加える。ウィーグラー磁場,電源の仕様策定:現有のガイド磁場用電源,大強度電子ビーム発生装置等のパラメーターを検討し,更に電子ビームの実験から細径ビームが可能になったことから,使用するウィーグラー磁場及び電源を設計した。更に,金沢大学で改良された電子ビームパラメーターの結果を用いて,アドバンスト・ブラッグ共鳴器の設計をロシアの共同研究者と協力して遂行した。物理的な原理検証実験を,より確実なものにするために,通常のブラッグ共鳴器との比較実験を行なうことを決定した。このため,周波数は40-50GHzに変更し,設計を行なった。設計はほぼ完了し,電子ビームの改良を急いで,実験を遂行する。当初の予定をほぼ遂行していると考えている。電子ビームの改良:本研究で使用する大強度電子ビームは,空間電荷効果が強いのが特徴である。今年度は,電極部及びビームアラインメトの改良により,ビームをやく2mにわたって,断面形状の変化無く伝搬させることに成功した。ビームエネルギーの変動に関しては,磁場偏向型エネルギー分析器を用いて測定し,100ns以上にわたって,エネルギー変動が5%以内であることを確認した。アドバンスト・ブラッグ共鳴器による発振原理は定常現象であり,ビームエネルギーの平坦化が実験に重要である。こうした結果,発振に向けて,ビームエネルギー,電流,ビーム半径等のパラメーターをかなり細かく制御する方法を確立した。エネルギーに関しては概ね500-900keV,総電流は100-400A,ビーム半径は3-15mmにわたって変更が可能となり,発振に対する電子ビームのパラメーター範囲が拡大された。今回の実験は原理検証実験であるため,ビーム電流を低くし,空間電荷効果を弱めたほうが現象の観測は容易になると考えている。アドバンスト・ブラッグ共鳴器を用いた発振実験:現有のガイド磁場用電源,大強度電子ビーム発生装置等のパラメーターを検討し,使用するウィーグラー磁場及び電源を製作した。残念ながら,製作に時間がかかり,発振実験にまでは至っていない。更に,金沢大学で改良された電子ビームパラメーターの結果を用いて,アドバンスト・ブラッグ共鳴器の設計をロシアの共同研究者と協力して遂行している。これには,ウィーグラーコイルによる発振実験の結果が大きな要素となるため,現在実験を急いでいる。大強度電子ビームをヘリカルウィーグラー中に入射する形式の自由電子メーザーの発振周波数の高周波化、周波数選択性の向上が本研究の目的である。電子ビームはエネルギー700 keV、電流400A、パルス幅150 nsであり、1 Tの軸方向ガイド磁場を併用する。これまでに、ビームエネルギーの平坦化、細径ビームの開発と、ウィーグラーコイルの設計製作を終えた。本年度は、基本的な自由電子メーザーの発振実験、ノーマル及びアドバンスト÷ブラッグ共鳴器の設計製作、アドバンスト・ブラッグ共鳴器のノーマル型に対する周波数選択の優位性の実験的検証を目的とした。結論を先に書けば、実験中のビーム発生装置の故障により予定が大幅に延びた。年度内の成果としては、40 GHz以上でのヘリカルウィーグラーコイル型自由電子メーザー発振の確認と、故障後の実験遂行可能なパラメーター探索によりブラッグ及びアドバンスト・ブッラク共鳴器の設計、製作が挙げられる。この間に、主にロシアの共同研究者によるコンピューターシミュレーション技法の開発は進み、アドバンスト・ブラッグ共鳴器の配置、複数の共鳴器の組み合わせ等のシミュレーションを行った。

大幅に改良された、現状で最適と考えられるアドバンスト・ブラッグ共鳴器の配置・組み合わせをもとに、40 GHzアドバンスト・ブラッグ共鳴器の設計製作を行い、現在実験を遂行中である。シミュレーションによるコールドテスト(電子ビームを含まない電磁波通過試験)においては、周波数40 GH付近で選択周波数幅0.1 GHz以下に制限されることが期待される。この結果は、同じシミュレーションによるノーマル・ブラッグ共鳴器使用時の周波数幅1 GHzに対して格段の優位性を示しており、今後の実験結果が期待される。
子宮内膜細胞の老化逸脱へのゲノム多様性の関与

1)子宮内膜細胞の老化逸脱へのゲノム多様性の関与MDM2 SNP309 G/G+G/TとTP53コドン72Arg/Argの組み合わせは子宮体癌発症odds比2.53(1.03-6.21)と両遺伝子間に統計学的有意な相互作用を示し、子宮体癌発症リスクを増大する。マイクロアレイ法にてAhR下流でTCDD応答性発現変化する遺伝子を同定した。そのうちIL24遺伝子はT/T遺伝子型でC/C遺伝子型に比しTCDD非存在下の発現が有意に亢進しており、TCDD非存在性、AhR依存性AhR転写制御の存在が強く示唆された。TCDD存在下でのIL24発現もT/T型で有意に高値であった。ダイオキシン類高濃度被曝例として、油症患者の血中IL24濃度を測定した。T/T遺伝子型油症患者の血中IL24濃度はC/C遺伝子型と比較し有意に高値であった。これらの結果から、AhR-130bp C/T SNP及びIL24血中濃度はダイオキシン類による病態発症を予知出来るバイオマーカーとして使用可能であることが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。私たちはこれまで子宮体癌の発生にRas/ERα/MDM2/P53/P21シグナロリームが重要な役割を担っていることを明らかにした。これらのシグナロソームを構成する各遺伝子の体細胞変異は低率であるためSNPハプロタイプにより各遺伝子機能が変化し子宮体癌の発生に関与するかを検討した。しかしMDM2SNP309G/GとTP53Codon72Arg/Argの組み合わせは補正後の子宮体癌Odds比2.53(1.036.21)、inferactionP値0.04で、両遺伝子間に統計学的有意な相互作用を認めた。(2)ダイオキシンはAHR (Aryl Hydrocarbon Roceptor)と結合し、細胞内毒性シグナルを活性化し、がん発生を含めた健康被害の原因となる。本研究ではAHRゲノム多様性と健康被害の解析も研究目的に加えた。AHRプロモータ領域は翻訳開始点から-452bpに存在した。本領域には2種類の多型が存在するが、そのうち-130C/TSNPはAHR転写に強い影響を与えた。T/TはC/Cに比し約1.75倍の有意な転写亢進が示された。-130bp領域にはNFIC転写因子結合サイトが存在する。免疫沈降法、ゲルシフトアッセイ法さらにはNFIC蛋白に結合するAHRプロモータシークエンスをクローニングし解析した結果、NFIC蛋白はCアリルとの結合力が強く、Tアリルの場合には結合が低下することが判明した。C/C型AHRプロモータではNFICが結合しSP1を介する転写が抑制され、T/T型AHRプロモータではNFICが結合しにくく、結果としてSP1を介する転写が亢進することも判明した。一般集団でのT/T型ジェノタイプは約10%に存在し、ダイオキシンによる健康影響の程度に関与しているこが示唆された。今後、油症患者におけるAHR-130C/TSNPを解析し、症状発現の程度をCC、C/T、T/T型で解析する予定である。本研究は既に九州大学倫理委員会の承認を得ている。1) MDM2 309 G/G遺伝子型はP53コドン72 Arg/Arg遺伝子型との組み合わせにより子宮体癌発症のオッズ比を有意に(2.53)増大する。このため、G/G及びT/T遺伝子型ではP53応答性MDM2発現が異なるのではないかと示唆された。正常線維芽細胞を用い、CDDP処理によるDNA損傷時のMDM2 P1及びP2プロモータ活性の変化をG/G、G/T、T/T遺伝子型別に解析し、Allelic Expression Difference (AED)の存在について解析した。しかし、いかなる条件下においてもアリル特異的P53応答性MDM転写の変化は観察されなかった。2)ダイオキシン類存在下でのAHR mRNA及び蛋白発現はC/C型に比較しT/T型でそれぞれ1.7、2.0倍の増大が示された。-130bpAHR遺伝子C/C及びT/T型を有する線維芽細胞をDMSOまたはTCDD処理し、24時間後RNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。24遺伝子はC/C及びT/T両遺伝子型で共通に発現変化することが判明した。そのうちIL24、EDNRBはT/T型で有意な発言亢進が見られた。SERPINB2はT/T型でC/T型を比較し有意に発現低下していた。AHRはIL24とEDNRB発現を間接的に亢進させ、下流PKC/METFやJAK/STATシグナルを介してコーラーベービーや様々な皮膚疾患の発症に関与することが示唆された。またAHRはSERPINB2発現を亢進しuPA/ tPA/ plasminシグナルを抑制することが明らかになった。T/T型ではSERPINB2発現がC/C型に比し有意に抑制されるためPROMや早産のリスクが亢進すると示唆された。

3)倫理委員会の承認のもと、油症患者220名を対象にAHR遺伝多型解析を行った結果、10歳階級別の年齢分布で性差があり高齢女性においてT/T型が著しく少なかったこと、T/T型には癌の既往歴のある方が存在しなかったことが明らかになった。このことからT/T型女性は癌で早期に死亡する可能性が示唆された。1ERα、Hopx及びSRF遺伝子領域内SNPsと子宮体癌の発生の間には有意な相関を認めなかった。子宮体癌細胞では高率にMDM2高発現を認めるが、SP1阻害剤により発現抑制が導かれることからSPを介するシグナルとMDM2高発現の関連が示唆された。2MDM2プロモータ領域の詳細な解析により-470bp C/T SNP(rs2870820)を同定した。DNA損傷時のMDM2発現誘導を解析した結果、Tアリルに比しCアリルでは発現抑制を生じ、Allelic Expression Difference(AED)の原因となっていた。Tアリルの場合SP1結合サイトが形成され転写を亢進するが、CアリルではSP1結合サイトからNFkB結合サイトへの変換を生じ転写が抑制されるためと示唆された。3AHR-130bp C/CはT/Tと比較し高率にNF1Cと結合しAHRプロモータ活性が抑制された。T/TはNF1C結合親和性が低くAHRプロモータ活性の抑制をもたらさない。-130bp C/TSNPが子宮内膜癌進展にいかに関与するかを解析するため、正常健常人130例及び内膜癌患者121例の遺伝子型を決定した。T/T遺伝子型はC/C及びC/Tに比し進行癌及び未分化癌患者で有意に高率に認められた。内膜癌細胞においてAHRノックダウンによりNF1C高発現、間葉系マーカーの発現抑制、上皮系マーカーの発現誘導が観察され、AHR高発現では逆の現象が観察された。以上からAHRによる内膜癌細胞での上皮間葉系移行(EMT)が明らかとされ、未分化癌さらには進行癌発生の原因となることが判明した。1)子宮内膜細胞の老化逸脱へのゲノム多様性の関与MDM2 SNP309 G/G+G/TとTP53コドン72Arg/Argの組み合わせは子宮体癌発症odds比2.53(1.03-6.21)と両遺伝子間に統計学的有意な相互作用を示し、子宮体癌発症リスクを増大する。マイクロアレイ法にてAhR下流でTCDD応答性発現変化する遺伝子を同定した。そのうちIL24遺伝子はT/T遺伝子型でC/C遺伝子型に比しTCDD非存在下の発現が有意に亢進しており、TCDD非存在性、AhR依存性AhR転写制御の存在が強く示唆された。TCDD存在下でのIL24発現もT/T型で有意に高値であった。ダイオキシン類高濃度被曝例として、油症患者の血中IL24濃度を測定した。T/T遺伝子型油症患者の血中IL24濃度はC/C遺伝子型と比較し有意に高値であった。これらの結果から、AhR-130bp C/T SNP及びIL24血中濃度はダイオキシン類による病態発症を予知出来るバイオマーカーとして使用可能であることが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。TP53、ESR1、P21遺伝子多型と子宮体がんリスクの間に相関を認めなかったが、MDM2P2プロモータ領域内のNFKB結合サイトにSNPを同定しP53応答性MDM2P2プロモータ活性に関与している可能性を発見した。さらに、ダイオキシン類による細胞毒性シグナルの中心となるAHRプロモータ領域に新たなSNPを同定しAHR発見変化に関与していることを明らかにした。AHR下流に存在し、コーラーベービー、皮膚疾患、早産やPROMの病態に関与するシグナル伝達を明らかにした。
「加水分解産物からサリドマイドへの逆反応過程の検証と代謝経路の新規構築」

サリドマイド(TD)の第一段階の加水分解産物3種類(CBG,PIG,PG)の有機溶媒中における擬脱水反応を詳細に解析した。恒温静置したCBG, PIG,PGのアセトニトリル溶液をHPLC分析することで、CBGのみ擬脱水反応が起こることを明らかにした。反応速度の解析から通常の一次反応ではなく、TDとCBGが共に触媒的に作用する反応であることが示唆された。CBGのエナンチオマーの擬脱水反応ではキラリティの変化は確認されず、不斉炭素における水素の脱着は起こらないと考えられる。TDからCBGへの加水分解反応におけるエネルギー障壁を量子化学計算により求め、約42kcal/molと見積もられた。サリドマイドの第一段階加水分解産物3種類(CBG, PIG, PG)の有機溶媒中における擬脱水反応の条件検討を試みた。各加水分解産物及びサリドマイドを定量するためのクロマトグラフィー分析条件の検討を行った結果,各加水分解産物とサリドマイドの良好な分離条件が得られた。1年以上密閉放置したCBG/エタノール溶液をHPLC分析した結果,溶液中にサリドマイドが産生されていることが確認された。また,同溶液において溶液の底面に結晶の沈殿が確認されその結晶を分析したところサリドマイドの結晶であることが明らかとなった。以上の結果よりCBGはエタノール中において擬脱水反応によりサリドマイド化が起こることが確認された。PIG,PGのエタノール溶液及びアセトニトリル溶液の経時変化をHPLCで測定したが,サリドマイドの溶出時間にピークは得られなかったため,PIG,PGはエタノール溶液中およびアセトニトリル溶液中においてサリドマイド化しないと考えられる。HPLC分析では定量分析が困難であったため反応速度の算出は行えなかった。CBGの擬脱水反応の経時測定をHPLC分析より定量性を持って行うことを目的としIRスペクトルの計測を試みた。しかしながら,エタノール自体が持つ赤外吸収領域と観測したいCBGの赤外吸収領域が重なってしまい目的とするIRスペクトルは得られなかった。溶液中の組成を見るためにCBG, PIG, PGのエタノール溶液の質量分析を行ったところ全てにおいて2倍の分子量の分子の存在が確認され,溶液中で二量体構造を持つことが新たに明らかとなった。量子化学計算を用いて加水分解産物からの擬脱水反応経路の詳細な解析と実験結果との比較を行うために必要なサリドマイド分子,CBG分子,PIG分子,PG分子の立体構造の最適化を量子化学計算用ワークステーションで行い最適化に成功した。本研究では、サリドマイドの第一段階加水分解産物3種類(CBG, PIG, PG)の有機溶媒中における擬脱水反応速度の定量を試みた。各加水分解産物及びサリドマイドを定量するためのHPLC分析条件を検討し、各物質の良好な分離条件を得た。一定温度のもとで放置したラセミ体CBG/エタノール溶液をHPLC分析した結果、サリドマイド由来のピークを確認した。また、同溶液において生成した結晶をX線構造解析したところ、サリドマイドの結晶構造が得られた。アセトニトリルを用いて同様に実験したところ、この場合にもサリドマイドの産生が認められた。以上よりCBGはエタノール及びアセトニトリル中において擬脱水反応によりサリドマイドに変化することが確認された。グルタルイミド環が開裂しているPIG及びPGはエタノール及びアセトニトリル中でサリドマイドへと変化しなかったことから、CBGにおけるフタルイミド環の再生成が最も優先的に起こり得ることが分かった。量子化学計算(B3LYP/6-31+g(d,p))ではサリドマイドからCBGへの加水分解反応の反応エネルギー障壁は150 kcal/mol程度であると見積もられるが、有機溶媒中では開裂したフタルイミド環の側鎖の挙動により、逆反応に要するエネルギー障壁が低くなることでこの逆反応が緩やかに起きていると考えられる。CBGのエナンチオマーを用いて同様な実験を行ったところ、擬脱水反応中でキラリティの反転は確認できなかった。よって、この擬脱水反応中では不斉炭素における水素原子の脱着は起こらないことが示された。反応温度を28°Cから45°Cと変化させると、反応速度はおよそ6倍となった。初期濃度を変化させると(0.2 mM及び5 mM)、反応速度に大きな差が見られた。これより、サリドマイドへの擬脱水反応は通常の一次反応ではなく、サリドマイドとCBGが互いに触媒的に作用する反応であることが示唆された。第一段階加水分解産物の反応条件をHPLC分析を用いて比較した。HPLGを用いてCBGのサリドマイド化の経時測定による反応速度の算出を試行したが、条件設定が最適でなかったためか成功しなかった。

さらにIRスペクトル測定による反応速度の算出も良好なスペクトルが得られなかったために算出が困難であった。ドッキングシミュレーションや遷移状態の探索を行うために必要な分子の構造最適化を量子化学計算用ワークステーションで行い成功した。溶液中でCBG, PIG, PGが二量体を形成することを新たに発見した。キラル科学サリドマイド化する際にキラリティーの変化も同時に生じるか否かをキラルカラムを用いた測定により明らかにする。HPLCでの定量分析をオートサンプラーにより行い,反応速度並びに熱力学的パラメータの算出を行う。CBGのサリドマイド化を触媒する生体物質の探索を行う。量子化学計算により擬脱水反応において形成しうる中間体や遷移状態の構造を決定し,反応に必要なエネルギー障壁を予測し実験結果との比較を行う。CBGに似た構造を持つ化合物で同様な反応が起こるか調べる。材料費が当初予想していた金額より低価格におさえることができたために若干残った。次年度に当初予定していた材料費に加えて使用する予定である。
左室拡大合併による僧帽弁逸脱の偽正常化現象

僧帽弁逸脱症(MVP)により生じる重症僧帽弁閉鎖不全症(MR)は、心不全の合併や心臓死につながる。MVP重症度判定は一般に「弁輪に対する弁尖の逸脱(上方・左房方向への変位)」で評価されるが、MR重症度としばしば解離する。そこで我々は、MVPに左室拡大が合併すると、弁尖逸脱・非逸脱弁尖はともに下方(心尖方向)へ牽引(テザリング)され、逸脱弁尖の弁輪に対する逸脱(上方変位)が軽減(偽正常化)されるのではないかと考えた。さらに我々は、弁輪に対してではなく非逸脱弁尖に対する弁尖逸脱の指標がより良いMVPの指標になりうると考え、それらを解明することを目的とする。
ラットおよび北極圏動物を用いたビタミンAの吸収・輸送・貯蔵の研究

北緯圏に位置するスバルバール群島(ノルウェー領)にて、知事の許可を得て、1997年8月と1998年4月に以下の哺乳類および鳥類を捕獲して肝臓を、高速液クロによるビタミンAの分析、および形態学的手法(塩化金法、ビタミンAの自家蛍光観察のための蛍光顕微鏡、透過型電顕、石井-石井鍍銀法、アザン染色、HE染色、Sudan III脂肪染色)によって解析した。捕獲した哺乳類は北極グマ(2頭)、北極キツネ(8匹)、ヒゲアザラシ(6頭)、ワモンアザラシ(6頭)、スバルバールトナカイ(7頭)であり、鳥類はシロカモメ(22羽)、ウミガラス(4羽)、ニシツノメドリ(6羽)である。高速液クロによる分析では、北極グマ肝臓が最も高濃度にレチニルエステル(23,300nmole/g wet weight)を貯蔵しており、ついで北極キツネ(18,439±2,314)、ヒゲアザラシ(5,956±5,857)、ワモンアザラシ(1,551±2,486)、スバルバールトナカイ(921±264)であり、鳥類ではシロカモメ(4,710±3,164)、ウミガラス(1,589±225)、ニシツノメドリ(1,183±589)であった。塩化金法では肝臓星細胞が特異的に黒染し、蛍光顕微鏡下にこれらの細胞の脂質滴から強いビタミンAの自家蛍光が発していた。北極グマおよび北極キツネ、ヒゲアザラシの肝臓ではHE染色、Sudan III脂肪染色でも容易に星細胞の脂質滴が認められた。また、これらの動物は自然のなしたビタミンA過剰症といえるが、肝臓には線維化などの病理学的所見は見られなかった。透過型電顕を用いたモルフォメトリーでは、星細胞の数はヒトやラットを含む他の動物と差は無かった。しかし、透過型電顕で星細胞に含まれる脂質滴の占める面積は北極グマおよび北極キツネ、ヒゲアザラシでは有意に大きかった。北極グマおよび北極キツネ、シロカモメ、ヒゲアザラシなど北極圏における食物網(food web)の上位に位置する動物は大量のレチニルエステルを肝臓星細胞に貯蔵している。モルフォメトリーでは、これら動物においては星細胞の数は他の動物と差は無かった。しかし、各細胞に含まれる脂質滴の占める面積が有意に大きかった。すなわち、各々の星細胞のビタミンA貯蔵能が高いことが示唆された。北極圏の食物網の上位に属する哺乳類と鳥類は星細胞にヒトやラットなどの動物の20-100倍高濃度のレチニルエステルを貯蔵していた。北極圏動物は大量のビタミンAを体内に貯蔵しているにもかかわらず、ビタミンA過剰症には罹患していない。ヒトやラットではビタミンAは主として肝臓星細胞(hepatic stellate cells;ビタミンA貯蔵細胞)に貯蔵されている。

そこで、これらの動物におけるビタミンA貯蔵の分子・細胞メカニズムを明らかにする目的で、北極圏スバルバ-ル群島に赴き、北極キツネ、ヒゲアザラシ、ワモンアザラシ、スバルバ-ルトナカイ、シロカモメ、ニシツノメドリ、ウミガラスを捕獲して、肝臓、腎臓、膵臓、小腸(空腸)、肺を高速液体クロマトグラフィーおよび、種々の形態学的手法(塩化金法、蛍光顕微鏡によるビタミンA自家蛍光観察、透過型電顕、脂肪染色、H.E.染色)により解析した。北極キツネの肝臓(n=5)には18,438±2.314nmol/g wet weightのレチニルエステルが存在していた。ビタミンAは肝臓星細胞の細胞質にある大小多数の脂質滴に貯蔵されていた。他の動物の肝臓におけるレチニルエステルの量はヒゲアザラシ9,956±5,857(以下いずれもnmol/g wet weight.n=9)、シロカモメ4,710±3,164(n=22)、ウミガラス1,589±225(n=4)、ワモンアザラシ1,551±2,486(n=6)、ニシツノメドリ1,183±589(n=6)、スバルバ-ルトナカイ921±264(n=7)であった。いずれも肝臓星細胞の脂質滴に貯蔵されていた。これだけ大量のビタミンAを肝臓星細胞が貯蔵していても、他の器官のビタミンA貯蔵量はわずかであった。以上の結果は北極圏の哺乳類と鳥類はヒトやラットと同じく肝臓星細胞にレチニルエステルを脂質滴の形で貯蔵することを示している。北緯80度に位置するスバルバール群島(ノルウエー領)にて、知事の許可を得て、1997年8月と1998年4月に以下の哺乳類および鳥類を捕獲して肝臓を、高速液クロによるビタミンAの分析、および形態学的手法(塩化金法、ビタミンAの自家蛍光観察のための蛍光顕微鏡、透過型電顕、石井一石井鍍銀法、アザン染色、HE染色、Sudan III脂肪染色)によって解析した。捕獲した哺乳類は北極グマ(2頭)、北極キツネ(8匹)、ヒゲアザラシ(6頭)、ワモンアザラシ(6頭)、スバルバールトナカイ(7頭)であり、鳥類はシロカモメ(22羽)、ウミガラス(4羽)、ニシツノメドリ(6羽)である。高速液クロによる分析では、北極グマ肝臓が最も高濃度にレチニルエステル(23,300nmole/g wetweight)を貯蔵しており、ついで北極キツネ(18,439±2,314)、ヒゲアザラシ(5,956±5,857)、ワモンアザラシ(1,551±2,486)、スバルバールトナカイ(921±264)であり、鳥類ではシロカモメ(4,710±3,164)、ウミガラス(1,589±225)、ニシツノメドリ(1,183±589)であった。塩化金法では肝臓星細胞が特異的に黒染し、蛍光顕微鏡下にこれらの細胞の脂質滴から強いビタミンAの自家蛍光が発していた。北極グマおよび北極キツネ、ヒゲアザラシの肝臓ではHE染色、Sudan III脂肪染色でも容易に星細胞の脂質滴が認められた。また、これらの動物は自然によるビタミンA過剰症といえるが、肝臓には線維化などの病理学的所見は見られなかった。透過型重顕を用いたモルフォメトリーでは、星細胞の数はヒトやラットを含む他の動物と差は無かった。しかし、透過型電顕で星細胞に含まれる脂質滴の占める面積は北極グマおよび北極キツネ、ヒゲアザラシでは有意に大きかった。北極グマおよび北極キツネ、シロカモメ、ヒゲアザラシなど北極圏における食物網(food web)の上位に位置する動物は大量のレチニルエステルを肝臓星細胞に貯蔵している。モノレフォメトリーでは、これら動物においては星細胞の数は他の動物と差は無かった。しかし、各細胞に含まれる脂質滴の占める面積が有意に大きかった。
リパーゼ超誘導の分子機構解明と高立体選択性リパーゼの創製

安定かつ高立体選択的リパーゼは、工業的利用の観点から注目されている。ステアリルアルコールの添加は、オリーブ油で生育させた場合に比べて、熱安定・高立体選択的リパーゼ活性の数十倍以上の増強をもたらした。リパーゼのみならず表面活性タンパク質(EliA)が多量に強く誘導、分泌した。我々の実験結果から、ステアリルアルコールのような難水溶性のリパーゼ超誘導剤の添加、EliAの誘導と分泌、分泌EliAによるステアリルアルコールの乳化と細胞内への取り込み、リパーゼ大量誘導と分泌の機構を提案することができる。この機構の応用により高立体選択的リパーゼを大量に得ることが可能になった。昨年度までに解析されたリパーゼ超誘導剤添加時におけるリパーゼ(LipA)と界面活性保有15kDaタンパク質(EliAと命名)の相互関連性に、機能未知の17kDaタンパク質(P17)を加えて、超共分泌システムの統一的分子機作を解明するために、難水溶性高級アルコールのstearylalcohol(SA)あるいは水溶性長鎖エーテルのpolyoxyethylene (20) oleyl ether(Brij 98)を添加して培養し、分泌タンパク質と膜タンパク質のプロテオーム解析を行った。二次元電気泳動とPeptide Mass Fingerprinting(PMF)法により各誘導条件下で特異的に発現する幾つかのタンパク質を同定することができ、この共超発現・分泌ネットワークの統一的理解が可能になると考えられる。P17については、タンパク質の分泌装置を構成するパーツと示唆されているタンパク質と高相同性があった。熱安定性を有するLipAはtert-butyl-3-acetoxybutanoateやphenethylbutanoate等に対する基質特異性が高かったが、部位特異的変異法に加えて分子進化工学的手法による、更なる高立体選択性LipAの創製を試みている。遺伝子操作技術によりLipA高活性発現株の作製に成功した。この高発現株はstearyl alcoholあるいはBrij 98の添加により、野生株とほぼ同量のLipA超発現・分泌能力を有するが、SAの添加で超発現・分泌された高発現株由来LipAの比活性は野生株由来LipAの約15倍に達したことから、SAによってLipAの活性を高める新たな因子が誘導されていることが示唆され、LipA超発現・分泌システムとLipA高活性化システムの組み合わせによる大量生産コンビナトリアルシステム構築の目途が立ったと言える。1.難水溶性の高級アルコールを誘導剤として用いた場合、P15界面活性タンパク質遺伝子破壊株ではリパーゼ分泌量が著しく低下したが、P15遺伝子補完株では回復した。このタンパク質をEliA(effector protein of lipase induction)と命名し、FEMS Microbiology Letter誌に掲載されたが、更にEliAの構造と機能の詳細を明らかにするために、ドイツ、フライブルク大学のOliver Einsle教授とEliAタンパク質の結晶化と構造解析に関する共同研究を行っている。EliAの結晶を得ることが出来、X線回折実験により2.13.0Åの解像度が得られた。高相同性配列を有するタンパク質あるいはペプチドのX線結晶解析はされていないので、位相を特定するために重原子置換法、あるいはSe-Met置換タンパク質創製法を試みている。2.リパーゼ遺伝子とeliAの転写調節領域の塩基配列相同性がほとんどないことから別の転写制御を受けていると示唆された。3.リパーゼ超誘導剤添加時におけるリパーゼとEliAの超共分泌システムの統一的分子機作を解明するために、難水溶性高級アルコールあるいは水溶性長鎖エーテルを添加して培養し、分泌タンパク質と膜タンパク質のプロテオーム解析を行った。4.難水溶性高級アルコールを誘導剤として用いた場合、ポリエステル(PHB)と多糖が蓄積したが、EliA欠損株では蓄積しなかったので、脂質代謝におけるEliAの更なる重要性が示唆された。リパーゼ(LipA)超誘導発現において、難水溶性のstearyl alcohol及び水溶性のBrij 98を培地に添加すると、LipA遺伝子の転写活性が非常に増大することが確認された。Brij 98の方がstearylalcoholより早い段階でLipA遺伝子の転写が増加していた。LipA遺伝子転写促進因子が結合すると推定される反復配列を見出し、反復配列破壊実験による転写活性の減少が見出された。転写促進因子遺伝子候補のうちの1つの機能解析に成功した。翻訳阻害剤存在下で、Brij 98がLipAの菌体外への分泌を促していることが確認できた。界面活性タンパク質(P15)遺伝子の転写活性も、超誘導剤によって非常に高くなることが確認された。

P15遺伝子破壊株ではLipA分泌量が低下したが、精製P15添加によりLipA生産が相補できることがわかった。P15遺伝子とLipA遺伝子の転写調節領域の塩基配列相同性がほとんどないことから別の転写制御を受けていることが考えられる。P15の機能を解明するため、P15を大量発現させて精製し、その特性を評価した結果、溶液の表面張力を低下させる能力を確認した。LipAとP15との共超発現・分泌ネットワークの予備検討のために、stearyl alcoholとBrij 98:を用いて培養し、分泌タンパク質のプロテオーム解析を行った。LipA超誘導剤の添加よって菌体外に分泌される機能未知タンパク質(P17)についても、その機能の特定を試みた。部位特異的変異法によりLipAの熱安定性に関与すると推定されるアミノ酸残基の特定を行った。また、LipA特異的シャペロン固定化カラムを用いた相互作用によるLipA精製法を確立して、至適温度、至適pH、熱安定性を決定した。高立体選択性LipA創製が成功すれば、改変LipAの迅速な精製が可能になると期待できる。「研究の目的」の達成度について、今年度の研究実施計画に基づいて、リパーゼ(LipA)と界面活性保有15kDaタンパク質(EliAと命名)の超誘導システムの詳細と相互の関連性に加えて、17kDaタンパク質(P17)の機能の一端が明らかになった。超誘導剤を用いた培養分泌外液と膜タンパク質のプロテオーム解析を行い「第1段階:リパーゼ・スーパーインデューサー作用ネットワーク機構の総合的解明」に向けた第2年目の結果を得ることができた。更に、遺伝子操作技術により作製したLipA高活性発現株では、stearyl alcohol (SA)の添加で超発現・分泌された高発現株由来LipAの比活性は野生株由来LipAの約15倍に達したことから、SAによってLipAの活性を高める新たな因子が誘導されていることが示唆され、超発現・分泌システムと高活性化システムによる大量生産コンビナトリアルシステム構築の目途が立ったと言える。これにより「第2段階:このシステムを利用した、改良型高立体選択性リパーゼや他の一般有用タンパク質の大量分泌システム確立」への着実な進展があった。「研究の目的」の達成度について、今年度の研究実施計画に基づいて、リパーゼ、P15界面活性タンパク質超誘導(転写、分泌レベル)の詳細が明らかになった。翻訳レベルについても検討中である。リパーゼ遺伝子発現制御因子の1つを見出すことに成功した。超誘導剤を用いた培養分泌外液のプロテオーム解析を行い、「第1段階:リパーゼ・スーパーインデューサー作用ネットワーク機構の総合的解明」に向けた第1年目の結果を得ることができた。部位特異的変異法によりリパーゼの熱安定性に関与すると推定されるアミノ酸残基の特定を行った。また、リパーゼ特異的シャペロン固定化カラムを用いた相互作用によるリパーゼ精製法を確立して、至適温度、至適pH、熱安定性を決定した。
ナノバブルを用いたIGF-I長期発現プラスミドによる新たな顎骨再生治療法の開発

口腔には顎骨の破壊や吸収を伴う疾患が多く存在し、自家骨や人工骨を用いた再建治療が行われているが、必ずしも満足な結果は得られていない。これまで我々は、「自らが持つ骨形成能による骨再生」を目指し、細胞増殖作用を有するInsulin-like growth factor I(以下IGF-1)に着目した一連の研究を行ってきた。そこで本研究は、IGF-1の骨形成促進作用に着目し、ナノバブルと高周波超音波装置による最新の遺伝子導入システムを用いて、新たな顎骨再生治療を目指すものである。平成23年度において、1)TNF-α発現プラスミドDNAを作製し、ナノバブルと超音波を用いた分子導入法による遺伝子治療実験を行った。その結果、腫瘍の縮小と腫瘍血管の密度の減少が確認でき、この技術をIGF-1の遺伝子導入システムにも応用できるものと思われる。2)IGF-1の全身投与を行なったラットを用いて、エックス線検査を行ない、顎骨、特に歯槽骨に与える影響について検討を行なった。その結果、IGF-1は歯槽骨の海面骨に比べ、皮質骨の骨密度を増加させ、その効果は投与後も持続することが明らかとなった。この結果は、将来の顎骨再生部へのインプラント治療への応用を考えると、非常に有用な情報である。3)顎骨欠損モデルの作製のために、各週齢のラット下顎臼歯抜歯と歯槽骨削除を行なってみた。その結果、ラットは5週齢を越すと抜歯が非常に難しくなることや、抜歯窩の骨形成は4週間ほどで単純エックス線写真においても確認できることが明らかとなった。今後は、この結果をもとに顎骨欠損モデルを作製していくこととする。これまで我々は、「自らが持つ骨形成能による骨再生」を目指し、細胞増殖作用を有するInsulin-like growth factor I(以下IGF-I)に着目した一連の研究を行ってきた。そこで本研究は、IGF-Iの骨形成促進作用に着目し、ナノバブルと高周波超音波装置による最新の遺伝子導入システムを用いて、新たな顎骨再生治療を目指すものである。本年度に行った研究およびその結果は、以下の通りである。1)ナノバブルと高周波超音波装置を用いた画像診断システムの有用性について、マウスに埋め込んだ微小腫瘍の観察を行い検討した。その結果、これら画像診断システムを用いることにより、腫瘍内血管密度の評価などが可能であることが明らかとなった。2)本研究は治療薬を標的組織内で血管外漏出させることを試みているために、血管透過性を定量化する必要がある。エバンス・ブルーを全身投与したラット咬筋に対し、血管透過性を亢進させるために痛み刺激を与え、組織内エバンス・ブルー量の測定が血漿漏出の定量化として有用であるか否かを検討した。その結果、エバンス・ブルー法は血管透過性の評価として有用であることが明らかとなった。3)ラットに対してIGF-Iの過剰投与を行い、顎骨の骨形態の変化について検討した。その結果、IGF-Iの過剰投与は、顎骨の側方拡大方向に骨形成が行われることが明らかとなった。
総義歯におけるCAD/CAMの利用-アクリリックレジン切削による総義歯の複製-

1.新たに製作した計測用固定治具を用いた総義歯の形状計測において,計測方向(計測角度)について検討した.これまでと同様の,0度と180度の方向だけでの計測では,アンダーカットになる部分が必ず生じるため,この2方向に加えなるべくアンダーカットが生じない角度を検討した.その結果,計測用固定治具の形状も考慮し,30度での計測の場合が最も良好な計測データが得られた.2.各計測方向(計測角度)からの計測データより,CAM用のG-CODEを各種作成した.これまでのプログラムに改良を加え,より容易にCAM用のG-CODEが作製できた.3.アクリル樹脂製の切削用ブロック(樹脂ブロック)の準備方法について検討した.樹脂ブロックの大きさが150×125×40mm程度必要であるため,ブロック内部の気泡の発生が抑えられず,製作は非常に困難である.今後,この点に関しては検討が必要である.4.樹脂ブロックの切削手順について検討した.ブロックの固定方法に関しては,新たに作製した切削用固定治具に,専用のネジを使用して固定した.また,切削開始基準点の付与方法に関しては,プログラムを改良して対処した.これらの点は,樹脂ブロックの製作が困難であるため,ワックスにて検討した.切削は,PCNC加工機(現有設備)にて行った.1.機能印象を行った総義歯の形状計測について検討した.現在,義歯を3点でネジ止めするタイプの計測用固定治具を製作し,この治具に義歯を固定して,形状計測の方法について検討した.さらに,粘膜面に機能印象材(Visco-gel)を適用した義歯についても同様の方法で計測したが,透明な機能印象材では十分な精度の計測結果が得られず,白色粉末を印象面に噴霧して計測を行い,改善をはかった.2.計測データの全周合成を行い,CAM用のG-CODEを作製した.これまで,0度および180度の方向の2面の計測データの合成を行い,G-CODEを作製した.今後,計測面数を増加させて,計測データの合成を行う予定である.3.アクリル樹脂の切削用ブロックの基準方法について検討した.切削用ブロックの大きさは,9×12×5cm程度必要だが,重合操作よる作製では,その内部に気泡が生じた.現在,積層法について検討中である.4.切削用樹脂ブロックの固定方法(主要設備)ならびに切削開始基準点の付与方法について,治具の作成を含み検討中である.5.ブロックの切削手順については,2面からの計測データをもとに,すでにワックスにて検討した.現在,3方向以上からの計測データをもとに,切削まで行えるプログラムを開発中である.1.新たに製作した計測用固定治具を用いた総義歯の形状計測において,計測方向(計測角度)について検討した.これまでと同様の,0度と180度の方向だけでの計測では,アンダーカットになる部分が必ず生じるため,この2方向に加えなるべくアンダーカットが生じない角度を検討した.その結果,計測用固定治具の形状も考慮し,30度での計測の場合が最も良好な計測データが得られた.2.各計測方向(計測角度)からの計測データより,CAM用のG-CODEを各種作成した.これまでのプログラムに改良を加え,より容易にCAM用のG-CODEが作製できた.3.アクリル樹脂製の切削用ブロック(樹脂ブロック)の準備方法について検討した.樹脂ブロックの大きさが150×125×40mm程度必要であるため,ブロック内部の気泡の発生が抑えられず,製作は非常に困難である.今後,この点に関しては検討が必要である.4.樹脂ブロックの切削手順について検討した.ブロックの固定方法に関しては,新たに作製した切削用固定治具に,専用のネジを使用して固定した.また,切削開始基準点の付与方法に関しては,プログラムを改良して対処した.これらの点は,樹脂ブロックの製作が困難であるため,ワックスにて検討した.切削は,PCNC加工機(現有設備)にて行った.
半数体植物を利用した植物のゲノム安定性維持機構の解析

ゲノム維持機構は原始的な生命の時期に原型が作られ、少しずつ変化しながらすべての生物に引き継がれて来たと考えられる。一般に植物は動物に比べてDNA損傷に対する抵抗性が高く、進化の過程で独自のゲノム維持機構が獲得された事が予想される。本研究では、陸上植物の祖先種に近いヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)を用いて植物のDNA損傷応答や修復・突然変異機構の特徴を明らかにし、高等植物に特異的なゲノム維持機構がどのようにして獲得されたのかを明らかにする。H30年度は、DNAとDNAトポイソメラーゼ間の共有結合を切断し、ゲノムの安定性維持に働くチロシルDNAホスホジエステラーゼ(TDP1)の欠損株を作成し、トポイソメラーゼ阻害作用のある抗がん剤に対する感受性を解析した。また、シロイヌナズナのDNA損傷応答に関わる転写因子SOG1のヒメツリガネゴケホモログPpSOG1のゲノム領域をクローニングし、CRISPR/Casによる遺伝子切断と同時にプロトプラストに導入することで、遺伝子置換変異体の作出に成功した。さらに、DNA二重鎖切断修復に関わるいくつかの遺伝子の機能を解析する目的で、RAD51B、POLQ、LigIVの欠損株にガンマ線を照射し、生細胞の数を計測することで感受性を数値化しした。その結果、RAD51B欠損によりガンマ線に対する感受性が非常に高くなることがわかった。これに加え、パルスフィールドゲル電気泳動法でゲノムDNAの断片化度を計測することで、それぞれの変異体のDNA修復効率を測定した。今年度はTDP1遺伝子、SOG1遺伝子の破壊株を作成し、DNA損傷刺激に対する応答を開始した。H29年度に得られた一部の欠損株遺伝子欠損株については、継体培養中に核相が倍加する現象が見られたため、再調整を試みている。また、APT遺伝子を用いての突然変異頻度の検出では、実験系の確立にやや手間取っている。このため、今後はCRISPR/CasによるDNA切断ー再結合部位の変異を解析することで、それぞれの遺伝子のDNA二重鎖切断修復における機能解析を進める方針である。1)チロシルDNAホスホジエステラーゼ(TDP1)は、哺乳動物や高等植物でゲノム安定性維持に関わることが知られている。そこで、TDP1のヒメツリガネゴケホモログ遺伝子の配列からsgRNAを作成し、Cas9遺伝子とともにプロトプラストに導入することで、遺伝子破壊を行った。得られた変異株に対して、トポイソメラーゼ阻害試薬などを添加し、乾燥重量などを指標に耐性の検証を行った。2)NAC型転写因子であるSOG1はガンマ線照射に応答し、修復遺伝子を含む多数の遺伝子の発現を誘導する事が知られている。そこで、SOG1のヒメツリガネゴケホモログ(PpSOG1)のゲノムDNAをクローニングし、内部を薬剤耐性遺伝子と置換することで遺伝子破壊用コンストラクトを作成した。これと同時に、sgRNA、Cas9遺伝子の三者をプロトプラストに導入することで遺伝子置換変異体を得た。3)DNA二重鎖切断修復に関わる遺伝子RAD51B、POLQ、LigIVの欠損株と野生株にガンマ線を照射し、植物体の乾燥重量やプロトプラストの増殖能を指標にして感受性の違いを評価した。さらに、パルスフィールドゲル電気泳動法でゲノムDNAの断片化度を計測することで、遺伝子欠損株と野生株のDNA修復効率を測定した。前年度の解析で最も放射線感受性が高かったRAD51B欠損株に対して、CRISPR/Cas法で二重鎖切断を導入し、APT遺伝子座における変異を解析することでヒメツリガネゴケのDNA修復の特徴を解析する。1)Rad51B欠損株からプロトプラストを調整し、Cas9発現プラスミド、APT遺伝子に特異的なsgRNAを発現するプラスミド、および薬剤耐性プラスミドを挿入した後に2-フルオロアデニン(2-FA)を含む培地で培養し、形成されたコロニーの数を指標に突然変異頻度を計測する。また、コロニーの一部を取ってDNAを抽出し、APT遺伝子領域をシークエンスすることで突然変異のスペクトルを解析する。2)損傷乗り越え複製遺伝子REV3は、紫外線損傷DNAをバイパス複製する際に突然変異を誘発することが知られている。そこで、RAD51B・PpREV3の2重変異株を作成し、突然変異誘発頻度に対する効果を調べる。3)ヒメツリガネゴケゲノムは、SOG1と相同性の高い別アリル(SOG1-like)を有しており、両者が重複した機能を持っている可能性が高い。そこで、SOG!破壊株のプロトプラストにSOG1-like破壊用のsgRNAを導入することで2重破壊株を作成し、DNA損傷刺激への応答を解析する。4)突然変異検出の実験系構築に手間取った原因として、相同組換え活性の高いヒメツリガネゴケでは突然変異の誘発頻度が低い可能性が考えられる。そこで、大規模化に向かないプロトプラストではなくホモジナイザーで細断した大量の植物片を用いた突然変異検出の実験系構築を試みる。

本研究では、陸上植物の祖先種に近いヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)を用いて植物のDNA損傷応答や修復・突然変異機構の特徴を明らかにし、高等植物に特異的なゲノム維持機構がどのようにして獲得されたのかを明らかにする。H29年度は、ヒメツリガネゴケの原糸体からプロトプラストを調整し、紫外線やガンマ線を照射して応答反応曲線を作成するとともに、パルスフィールドゲル電気泳動法を用いてDNA損傷を定量し、ヒメツリガネゴケ細胞におけるDNA損傷の出来やすさや損傷に対する抵抗性を数値化した。また、アデニンホスホトランスフェラーゼ(APT)遺伝子やヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子などの内在性の遺伝子を利用することで、突然変異スペクトル検出系を構築した。さらに、放射線応答性転写因子SOG1や損傷乗り越え複製遺伝子REV3など、高等植物でDNA損傷応答や突然変異誘発に関わることが示唆されている遺伝子のヒメツリガネゴケにおけるホモログを同定し、機能ドメインやアミノ酸保存領域などの解析を行うとともに、遺伝子破壊のためのコンストラクトの作成を行った。本年度は、ヒメツリガネゴケのプロトプラストを利用することで、ヒメツリガネゴケ細胞におけるDNA損傷の出来やすさや損傷に対する抵抗性を数値化することに成功した。また、突然変異検出系や、Crisper/CASシステムによる遺伝子破壊系を確立した。1)ヒメツリガネゴケ原糸体細胞に酵素処理を行うことで均一なプロトプラストを得た。このプロトプラストにガンマ線を照射した後に培養し、形成するコロニーの数を指標に生存率を算出した。その結果、ヒメツリガネゴケはガンマ線に対して超耐性を示すことが明らかになった。2) γ線照射を行なったプロトプラストからゲノムDNAを抽出し、パルスフィールドゲル電気泳動でゲノムDNAの断片化度を計測することで、γ線で生じたDNA二本鎖切断(DSB)を定量した。その結果、ヒメツリガネゴケが多量のDSBが生じる条件下でも生存できることが明らかになった。3)損傷乗り越え複製遺伝子REV3のヒメツリガネゴケにおけるホモログ(PpREV3)を同定し、ポリメラーゼドメインのアミノ酸配列が高度に保存されていることを確認した。そこで、この保存領域のアミノ酸配列からguide RNAを作成し、Cas9遺伝子とともにプロトプラストに導入することで、PpREV3遺伝子の破壊を試みた結果、複数の遺伝子破壊株の作出に成功した。4)アデニンホスホトランスフェラーゼ(APT)遺伝子の破壊株を作成し、APT欠損株が5μMの2-フルオロアデニン(2-FA)で選抜可能であることを確認した。ゲノム維持機構は原始的な生命の時期に原型が作られ、少しずつ変化しながらすべての生物に引き継がれて来たと考えられる。一般に植物は動物に比べてDNA損傷に対する抵抗性が高く、進化の過程で独自のゲノム維持機構が獲得された事が予想される。H30年度は、DNAとDNAトポイソメラーゼ間の共有結合を切断し、ゲノムの安定性維持に働くチロシルDNAホスホジエステラーゼ(TDP1)の欠損株を作成し、トポイソメラーゼ阻害作用のある抗がん剤に対する感受性を解析した。
コネクトミクスと光遺伝学による運動回路の機能解剖

ショウジョウバエ幼虫のぜん動運動は体の前後に沿って後から前へと筋肉が順番に収縮することで起こる。本研究で私達はコネクトミクスと光遺伝学を用い、この系ではたらく興奮性の前運動介在神経細胞群、CLIsを同定した。このニューロンは各神経節に存在し、ぜん動運動が起こる際に、後方から前方へと順番に活動する。CLIsはコリン作動性ニューロンのマーカーであるChATを発現し、運動神経が発火する直前に活動していた。さらに、CLIsを局所的に活性化すると対応する筋肉の収縮が誘導された。これらの結果はCLIsが幼虫の移動運動において体の前後に沿って運動神経細胞を直接活性化していることを示唆している。動物の行動の背景にある定型的な運動出力パターンがどのようにして生成されるのかを理解することは神経科学の中心課題のひとつである。本申請では、中枢回路研究のプラットフォームとしての整備が急速に進みつつあるショウジョウバエの幼虫において、オプトジェネティクスによる局所活動操作やコネクトミクス(電子顕微鏡画像3次元再構築)解析等の革新的技術を駆使することにより、定型運動の制御機構を理解することを目的とした。このため、運動神経細胞の上流の介在神経細胞群を系統的に同定し、その機能を解析した。本年度の実績は以下の通りである。1電子顕微鏡画像再構築による前運動神経細胞の同定と形態解析幼虫の全中枢神経系を含む電子顕微鏡画像3D空間において前運動神経細胞の再構築を行い、その形態と投射パターンを解析した。具体的には運動神経細胞上のポストシナプス終末から逆行的に軸索をトレースし、最終的に前運動神経細胞を同定し、このなかに仮にLPI(lateral premotor interneuron)と名付けた一群の介在神経細胞を同定した。2光遺伝学によるLPIの機能解析LPI細胞は各体節に存在する局所ニューロンであった。その機能を調べるために、まず当該細胞において特異的に発現するGal4系統をJanelia研究所のJim Truman博士との共同研究で探索し該当するものを見出した。次に、得られたGal4系統を用いて、光依存性活性化チャネルChannel-rhodopsin(ChR2)をLPI細胞において特異的に発現させ、光により一過的にこの神経細胞を興奮させたときの幼虫の行動への影響を調べた。その結果、筋肉の収縮が見られたことから、LPI細胞は運動神経細胞に対し興奮性の入力を与えていると示唆された。当初の計画通り新規の前運動神経細胞を同定することに成功した。昨年度計画においてコネクトミクス解析等により、前運動神経細胞として仮にLPI(lateral premotor interneuron)と名付けた一群の介在神経細胞を同定した。今年度研究においては以下の実験を行い、その結果明らかとなったLPIの機能を論文として発表した(Hasegawa et al., Sci. Rep., 2016)。尚、明らかとなった機能に基づきLPIをCLI(cholinergic lateral interneuron)と改名した。1局所光刺激による機能解析:CLIは各体節に存在し同じ体節(もしくは近接する体節)の運動神経細胞をシナプス支配する。CLIの機能を調べるために、解剖した幼虫において集光したレーザー光を各体節に照射し筋収縮への影響を調べた。その結果、局所的な筋収縮が観察されたことからCLIは局所的に運動神経細胞を興奮させることが分かった。2神経伝達物質の同定:免疫組織化学法によりCLIが興奮性のアセチルコリン作動性マーカーを発現することを確認した。3カルシウムイメージングによる活動パターンの解析:GCaMP6をレポーターとしカルシウムイメージングを行い、ぜん動運動における活動パターンを解析した。その結果、CLIの活動はぜん動運動に伴う波状の活動を示し、各体節において運動神経細胞の活動の直前に起こることを示した。本結果はCLIが各体節において運動神経細胞を活性化していることを支持するものである。当初の計画通りCLI神経細胞の機能解析・活動様式解析を進め、結果を論文として発表した。1カルシウムイメージングによる活動パターンの解析:CDLIは各体節に存在する介在神経細胞である。ぜん動運動の制御にどのように関わっているのかを探るため、カルシウムイメージングを行い、ぜん動運動における活動パターンを解析した。標本としては単離した脳神経系(脳および腹部神経節)を用い、自発的に起こるぜん動運動時(fictive movement)の神経活動を記録した。その結果、ぜん動運動の開始と同じタイミングで、体の中程の数体節において同時に活動が起こることが分かった。2コネクトミクスによる下流回路の同定:CDLIがどのような下流回路を介して運動制御に関わるのかを探るため、CDLIを起点としてコネクトミクス解析を行った。その結果、CDLIの主な下流ニューロンとして、体壁を縦に走る筋肉群(transvers muscles, TMs)を支配する運動神経細胞を阻害すると考えられるGABA作動性ニューロンを同定した。

以前にテタナス毒素を用いてCDLIニューロンを阻害すると、ぜん動運動の頻度と速度が減少することが分かっている。以上の結果を合わせると、CDLIニューロンはぜん動運動の開始時に筋肉群TMsを弛緩させることで、正常な運動を制御していることが示唆された。ショウジョウバエ幼虫のぜん動運動は体の前後に沿って後から前へと筋肉が順番に収縮することで起こる。本研究で私達はコネクトミクスと光遺伝学を用い、この系ではたらく興奮性の前運動介在神経細胞群、CLIsを同定した。このニューロンは各神経節に存在し、ぜん動運動が起こる際に、後方から前方へと順番に活動する。CLIsはコリン作動性ニューロンのマーカーであるChATを発現し、運動神経が発火する直前に活動していた。さらに、CLIsを局所的に活性化すると対応する筋肉の収縮が誘導された。これらの結果はCLIsが幼虫の移動運動において体の前後に沿って運動神経細胞を直接活性化していることを示唆している。同定した前運動神経細胞の機能についてより詳細な解析を進める。さらに別種の前運動介在神経細胞の機能解析を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経科学・神経科学一般29年度が最終年度であるため、記入しない。