hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Er:YAGレーザーによる初期齲蝕治療法の確立とその臨床応用

含水量の少ないエナメルで浅くなる傾向は,従来型チップと同様の傾向であった。象牙質照射の断面観察では,コルべン状のアンダーカットのある形態が観察された。これは,本チップのレーザー照射パターンが,側方に拡散するためと考えられる。また,ヒト抜去歯小窩裂溝部照射面の観察でも同様に溶解層は観察されず,エナメル小柱が観察された。以上の所見から本チップでの小窩裂溝齲蝕の除去の可能性が示唆された。今後は臨床応用における小窩裂溝齲蝕の除去の照射条件,照射方法について検討を続けたいと考えている。5月の日本歯科保存学会春季学会(第112回)にEr:YAGレーザーの臨床応用10.試作チップによる小窩裂溝齲蝕の除去という演題で発表を行った。その結果、試作チップでの小窩裂溝齲蝕の除去の可能性が示唆された。しかし、臨床応用を行うには、照射条件、照射方法については引き続き検討する必要がある。11月の日本歯科保存学会秋季学会(第113回)にEr:YAGレーザーの臨床応用11.小窩裂溝齲蝕への応用という演題で発表を行った。小窩裂溝齲蝕の除去後の修復材料について検討を行った。4種類の修復材料について辺縁漏洩度と填塞状況について実験的検討を行った。その結果、本システムに使用できる修復材料と充填方法にも改善を行わなければならない点が判明した。今後はこの点の改善と臨床応用例を増やして、実用化を目指したと考えています。今後は臨床例の例数を増やすとともに、細かい部分での問題点を解決していかなければならない。申請者が交付科学研究費の給付によりおこなった平成13年度の研究とその成果を以下に示す。Er : YAGレーザーを用いた、小窩裂溝部の齲蝕選択除去と修復法の確立を目的として,平成12年度に継続して1)使用修復材料に関する検討を行った。今回は低粘性のコンポジットレジン2種とコンポマー1種及び前装用ハイブリッドレジン1種についてその封鎖性と充塞性について抜去歯及び牛前歯を用いて、検討した。牛前歯唇側面にエナメル質の厚さが1mm程度になるよう平坦面を形成し、この面にEr : YAGレーザー(ERWIN:モリタ、京セラ)に試作小窩裂溝用チップを装着、窩洞を形成した。併せて、ヒト抜去小臼歯の小窩裂溝部にも同様に窩洞を形成し、上記の材料を用いて填塞した。これらを資料としてサーマルサイクリング試験(4°C-60°C/2000Cycle)を行いその後3%フクシン水溶液中に48時間浸漬後縦断し、封鎖性と充塞性について検討した。2)臨床検討1)より最も成績の良好であった、テトリックフロ-とパルフィークエステライトLVを用いて小窩裂溝齲蝕症例について本学附属病院を来訪した患者について適用し、術直後の状態と短期の処置成績について検討した。修復材料に関する検討では窩洞の充塞性、封鎖性ともにコントロールとして用いたエアタービンによる形成窩洞と同等の成績が得られたがコンポジットレジン材料については窩底部で50μm以上の厚さのボンディング層が観察された。この初見の修復への影響は不明であり,現在、検討を続行している。臨床検討では、3月現在25例で、平均6ヶ月、最長期観察例で10ヶ月あまりであるが、現在のところ、全症例を通じて脱落、2次カリエスの発生、変色は生じていない。さらに経過観察を続行するともに、症例数を増やしてゆく予定である。
レジオネラ菌の細胞内感染経路の解明

本申請研究では、1:細胞内に侵入したレジオネラは小胞体に向かう過程においてLCV上でRab33b-Rab6カスケードを利用することを見いだし、Rab33bをLCVに供給するエフェクターの候補因子を同定した。2:ファゴサイトーシスで細胞に取り込まれたレジオネラはLCVのリソソームへの輸送を遮断する。その際に、レジオネラはRab5をユビキチン依存的に分解することを見いだし、E3ライゲース様エフェクターを同定した。3:LCVはERとの融合において滑面小胞体より侵入し粗面小胞体で増殖することを見いだし、滑面から粗面への移行に必要な宿主因子を同定した。また、本因子を制御するエフェクター候補を同定した。レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定H26年度の解析によりRab6がレジオネラを包む小胞(LCV)をERへと誘導しているより直接的な結果を得た。まず、Rab6を発現抑制させた細胞においてLCVがERへと到達する時間に著しい遅延が生じることを見いだし、また、それに伴いRab6の発現抑制がレジオネラの細胞内増殖にも著しい遅延を生じさせることを見いだした。さらに、レジオネラ感染特異的にRab6がER上の膜融合装置であるsyntaxin 18複合体を結合することも明らかにした。これらの結果はRab6はLCVをERへと誘導し、LCVとERの効率的な膜融合を促進していることを示唆している。LCVのリソソーム融合阻害機能の解明H26年度の解析によりレジオネラによるRab5のユビキチン化が結果的にRab5のタンパク質量の減少、すわなちRab5のタンパク質分解を促進していることを示唆する結果を得た。一般的にユビキチン化による分解機構にはプロテアソームが寄与していることからレジオネラ感染と同時にプロテアソームの阻害を行なうとRab5の分解が抑制された。このことから、レジオネラはRab5をユビキチン化しプロテアソームを介した経路により分解していることを明らかにした。レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定H26年度の解析によりCLIMP-63の発現抑制によりレジオネラの細胞内増殖が顕著に抑制されることを見いだした。CLIMP-63は小胞体の内側にスペースを作り出すスペーサータンパク質として機能することが知られていることから、レジオネラは小胞体での増殖においてCLIMP-63のスペーサー活性を利用していると推測した。そして、スペーサー活性を失ったCLIMP-63を発現している細胞ではレジオネラの増殖が顕著に抑制されることを見いだした。本申請研究は、「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」、「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」、「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」を主体に行なっており、各々の進捗状況を以下に記載する。「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、昨年度までLCVを小胞体へとリクルートする過程においてRab6の機能が重要であることを見いだしていたが、本年度の研究においてRab6をLCVへとリクルートする過程においてRab33bが必要であることを明らかにした。このことから、LCVへのRab6リクルート機構には、Rab33b-Rab6というカスケードが存在していることを示すことができた。「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、昨年度までにレジオネラ感染においてRab5(ファゴソームをリソソームへと誘導する過程において重要な役割を担うRabタンパク質)がユビキチン化により分解される可能性を示していた。本年度はレジオネラエフェクターをコードする遺伝子群を欠損した種々の変異体を用いて、Rab5をユビキチン化するE3ライゲースとして働くレジオネラエフェクターをコードする遺伝子群の同定まで成功した。「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、昨年度までレジオネラが滑面小胞体を介して小胞体に侵入し、粗面小胞体で増殖する可能性を提案した。また、その過程においてRab4及びRab10を利用している可能性も示している。本年度は、小胞体膜タンパク質であり滑面小胞体と粗面小胞体を循環する分子であるBap31に着目して研究を行なったところ、小胞体に到達したレジオネラはBap31を有意に集めることを見いだし、またBap31の発現抑制により小胞体に到達したレジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと移行出来ないことを見いだした。「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、LCVへのRab6供給にRab33bと呼ばれる分子が介在していることを示すことが出来た。宿主内における小胞体への輸送経路においてRab6及びRab33bが関わっていることは明らかになっているが、この2分子の間にどのような相関性があるのかは不明である。そのような観点からも宿主内における小胞体への輸送においてRab33b-Rab6カスケードが存在している可能性を提案できる本研究内容は意義の深い内容など考えられる。「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、Rab5の分解に関わるレジオネラエフェクターの候補を含む遺伝子群を同定できたことは、本研究を遂行するにあたり意義のある内容であると思われる。

「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、小胞体に到達したレジオネラがBap31と呼ばれる滑面小胞体と粗面小胞体を循環できる小胞体膜タンパク質の機能を利用して小胞体内を移行していることを見いだせた点が極めて重要だと考えられる。これまで、Bap31の小胞体内循環に関して、その生理的意義は不明であったことから、レジオネラ感染を通じてBap31が宿主内で司っている生理機能にも迫ることができるのではと考えている。本申請研究は、「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」、「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」、「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」を主体として行なっており、各々の進捗状況を以下に記載する。「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、昨年度までにRab6がLCVに集積することがLCVの小胞体への移行過程に必要であること、また、Rab6のLCVへの集積はRab33bを介して引き起こされることを見いだしている。このことから、レジオネラは小胞体へと向かう際に、LCV上でRab33b-Rab6というカスケードを利用していることを明らかにしている。本年度はRab33bをLCVへ集積させる為のレジオネラエフェクターの同定を試み、Rab33bをLCVへと供給させるレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定に成功し、候補となるエフェクターを数種類同定している。「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、昨年度までにRab5をユビキチン化し分解するレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定まで成功していたが、本年度はRab5に対するE3ライゲースの候補の同定まで成功した。更に、当該エフェクターを単独で培養細胞に発現させるだけで、Rab5のユビキチン化及び分解が起こることを見いだした。「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、昨年度までにレジオネラがまず滑面小胞体と接触した後に粗面小胞体へと移行し増殖すること、また滑面小胞体から粗面小胞体への移行にBap31と呼ばれる宿主タンパク質を利用していることを見いだした。本年度は、レジオネラが小胞体へと到達した後に、Bap31を利用するレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定まで成功している。「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、Rab6のLCVへの集積にはRab33bが必要であることから、何らかのレジオネラエフェクターがRab33bをLCVにリクルートしていると考えた。そこで、レジオネラエフェクターをコードする複数の遺伝子群を欠損した株を用いて解析を行なったところ、一つの遺伝子群の欠損株においてLCVへのRab33bの集積が消失した。また、本遺伝子群にはRabと結合するモチーフを持ったエフェクターがコードされており、現在Rab33bとの相互作用を検討している。「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、Rab5に対するE3ライゲース活性を持つレジオネラエフェクターの同定に成功しており、当該エフェクターを細胞内に発現させるとRab5のユビキチン化及びRab5のタンパク質量の減少を検出することが出来た。また、当該エフェクターの遺伝子破壊株の作製も完了しており、本株の感染においてRab5のユビキチン化が検出されなくなることから、レジオネラ感染においてRab5をユビキチン化する責任分子を同定することに成功した。
ウェーブレット解析におるトレーニングの適時性に関する検討

研究の目的:トレーニングの適時性の意味について、成長学的に観て、人が身体的にトレーニングされうる可能性を示す適切な時期と概念規定し、その意味において、成長学の立場から、運動選手群および一般群の身長と体重における発育速度曲線のパターンとそれに現れるMPVを、ウェーブレット解析によって明確にしょうとしたものである。特に、ここでは男子について報告するものである。研究の方法:高校3年時点で、全国レベルに到達している男子の運動選手(50名:バスケットボール、バレーボール、野球、陸上競技、)において、小学1年から高校3年までの身長と体重の縦断的測定値が得られた。得られた男女の身長、体重の発育現量値に対して、エェ-ブレット解析を適用し、発育現量値曲線および速度曲線をコンピューターシミュレーションにより描いた。そして描かれた速度曲線からMPVを特定し、身長と体重におけるMPVの関係を検討した。研究の結果と考察:運動選手群の身長、体重の発育現量値にWIM(Wevelet Interpolation Method:ウェーブレット補間法)を適用し、発育速度曲線とMPV年齢を求めた。その結果、MPV年齢は先の研究で示された一般男子のMPV年齢と比較して早く出現することが示された。このことは、今までに経験的には示唆されているようであるが、明確な根拠を示した報告はない。したがって今回、ウェーブレット解析により始めて明確な理論的根拠の基に解明されたと考えられる。そして、ここで扱われている全国レベルの運動選手群は少なくとも中学、高校の6年間のトレーニングを継続してきた者達と考えれば、ちょっど身長のピーク年齢(MPV年齢)を経過したころからのトレーニング効果が高校に入学して示されたと考えられる。つまり、身長のMPV年齢がトレーニングの適時性に大きく関与していることが推察される。
バイオテロを含むボツリヌス中毒への新しい対策の確立と毒素の治療への応用

ボツリヌス菌や毒素、抗毒素抗体の検出方法と毒素の治療への応用を検討した。菌の検出法としては、AF型毒素遺伝子を増幅できるPCRを開発した。毒素の検出法としてはイムノクロマト法を開発したが、現在、改良中である。抗体の検出法としては、毒素の一部を結合させたカラムを用いて抗体を濃縮して検出する方法を開発した。治療への応用としては、三叉神経痛と前立腺肥大症に適用できることをとラットを用いて実証した。以下の点を行った。1)C型D型の安全で効果のあるワクチンとして、大腸菌でGST融合タンパク質として作製した、神経毒素のC端側5万の部分(Hc;これは標的細胞へのBinding domainである)が使用できることを詳細に検討し報告した(Microbiol.Immunol)。2)上記と同様にして各型のHcの作製を試みたところ、A,E,F型で成功した。これらで家兎を免疫し、各型の特異抗体を得、これまでA,C,D型毒素検出用のイムノクロマトを開発した。毒素検出感度はそれぞれ900,20,200MLD程であったので、現在、もう少し感度を良くする方法を試みている。3)精製A型神経毒素を用いて、18名の尿失禁の患者さんを治療した結果を報告した(FEMS immunol.Med.Microbiol).その後、数名の患者さんを追加すると共に、数度治療を行った患者さんでは、微量ではあるが毒素の中和抗体が生ずる場合があるので、その検出方法として、His-typeA-Hcタンパク質を利用して抗A型神経毒素抗体を捕獲&濃縮した後、ELISA法で検出する方法(His pull-down法)を開発している。4)神経毒素で三叉神経痛が治療できるかを確かめるため、ラットの三叉神経や座骨神経を絞搾し、三叉神経痛類似のモデルを作製した。このモデルに毒素を投与したところ、効果が認められたので、今後、その詳細を検討する予定である。5)これまで、HAは小腸のムチンや上皮細胞膜に存在する糖鎖(ガラクトースやシアル酸)へ結合することを報告してきたが、HAの3次構造と結合との関係、細胞内への侵入と移動、細胞から出てきた後の機能などを明らかにした(J.Mol.Biol.,Cell Microbiol.,Biochim.Biophys.Acta.,Biochem.Biophysic Res.Communi.など)。ボツリヌス菌や毒素の簡単な検出方法と毒素の治療への応用、毒素による治療を行った際に時に産生される微量の抗毒素抗体の検出方法を検討した。菌の検出法としては、AF型毒素遺伝子を増幅できるPCR用のプライマーを2種類(2セット)開発した。1つはnon-toxic non-HAの特定の配列を利用し500600bpのプロダクトを得るものであるが、これではF型菌の一部において増幅されないものが認められた。2つ目は神経毒素の軽鎖と重鎖の配列を利用し約2,000bpのプロダクトを得る方法であるが、両領域は各毒素間で多少塩基配列が異なることからmix primerを開発したところ、上記のF型菌も含め全ての菌でプロダクトが得られた。今後はこれらのPCRで、食品中に存在する芽胞の検出を試みる予定である。毒素自体の検出法としてはイムノクロマト法を開発したが、多少感度が低いので、毒素をラクトースゲルカラムや抗HA抗体を利用して濃縮する方法を検討中である。微量抗体の検出法としては、重鎖のC端側約5万の領域をHis-リコンビナントタンパク質として作製し、これをニッケルカラムに結合させた後、検体(血清)を流し、抗体を濃縮して検出する方法を開発した。毒素の応用としては、精製A型神経毒素とラットを用い、三叉神経痛および前立腺肥大症への適用を検討した。前者では眼窩下の神経を圧迫して起こした三叉神経障害に対して、近くの部の皮下に接種した毒素は治療効果があることを、後者では、毒素をラットの前立腺に接種すると、上皮中に存在するsynaptophysin陽性細胞が減少し前立腺が小さくなることを認めると共に、10名の軽度の前立腺肥大症の患者に投与し良い治療効果を得た。その他、ボツリヌスC2毒素遺伝子が存在するプラスミドの全塩基配列の決定や、C型の赤血球凝集素(HA)の構成成分であるHA3の3次構造の決定を行った。
プロポリスとその起源植物に関する化学生物学的研究

プロポリスはミツバチが周辺の植物を集めて作った樹脂状物質のことである。本研究では、プロポリスとその起源植物に関し、化学的および生物学的アプローチから、構成成分、生理活性、成分の体内動態を明らかにすることを目的に研究を進めた。まず、日本で多く消費されているブラジル産プロポリスについて、化学的分析とミツバチの行動学的解析により、その起源植物を解明した。次に、世界各地の様々な産地のプロポリスの構成成分の分析を行い、抗酸化活性との関連性について考察した。また、研究がほとんど行われていない日本産のプロポリスの構成成分についてもHPLCによって詳細に分析し、抗酸化活性との関連性について考察した。その結果、秋田(南秋田郡)産のプロポリスが高い抗酸化活性を有しており、このプロポリスにはカフェ酸フェネチルエステルなどの抗酸化活性の高い成分が多く含まれていることを明らかにした。また、沖縄産プロポリスの抗酸化活性も高く、他産地には見られない特異的な成分を含んでいることも見出し、新規化合物を含むプレニルフラボノイドを構造決定した。韓国産プロポリスについても、同様な成分分析を進め、産地による成分組成の違いを明らかにした。また、プロポリス成分の体内動態研究も行った。すなわち、ウルグアイ産のプロポリスをラットに経口投与し、一定時問後に血液と尿を採取して、そこに含まれる成分の分析を行った。その結果、血液と尿中にプロポリス由来のフラボノイドの存在を明らかにすることができ、プロポリス中の成分が体内に吸収されて取り込まれることを初めて示すことができた。一方で、プロポリスや起源植物に対するミツバチの行動学的解析も実施し、同じ巣箱由来のプロポリスでも季節により成分に変動があり、それはミツバチが運んで来る起源植物が異なることを証明した。本年度は、プロポリスとその起源植物に関し、化学的および生物学的アプローチから、構成成分、生理活性、成分の体内動態を明らかにすることを目的に研究を進めた。まず、日本で多く消費されているブラジル産プロポリスについて、LC/MS(高速液体クロマトグラフィー/質量分析)による化学的分析と、ミツバチの行動学的解析により、その起源植物を解明した。この植物は、ブラジル現地ではアレクリンと呼ばれているバッカリス・ドラクンクリフォリア(Baccharis dracunculifolia)というキク科の植物であり、ブラジルのミツバチは、この植物の新芽や葉の先端部をかじりとって巣に持ち帰り、プロポリスを作りあげていることが明らかになった。さらに、ブラジルを含む世界各地の様々な産地のプロポリスの構成成分の分析を行い、抗酸化活性との関連性についても考察した。一方で、日本産のプロポリスをHPLCによって詳細に分析し、他産地のプロポリスと成分の比較を行った。その過程で、沖縄産プロポリスが他産地には見られない特異的な成分を含んでいることを明らかにした。それらの成分を単離してNMRやMSによる機器分析を行ったところ、それらは新規化合物を含むプレニルフラボノイドであった。プロポリス成分の体内動態に関する研究に関しては、ウルグアイ産のプロポリスをラットに経口投与し、一定時間後に血液と尿を採取して、そこに含まれる成分の分析を行った。本研究では、プロポリスとその起源植物に関し、化学的および生物学的アプローチから、構成成分、生理活性、成分の体内動態を明らかにすることを目的に研究を進めている。

今年度は、研究がほとんど行われていない日本産や韓国産のプロポリスの構成成分について、HPLCによって詳細に分析し、抗酸化活性との関連性についても考察した。その結果、秋田(南秋田郡)産のプロポリスが高い抗酸化活性を有しており、このプロポリスにはカフェ酸フェネチルエステルなどの抗酸化活性の高い成分が多く含まれていることが明らかとなった。また、沖縄産プロポリスの抗酸化活性も高く、しかも他産地には見られない特異的な成分を含んでいることを明らかにした。沖縄産プロポリスに含まれるそれらの成分については、単離・精製してNMRやMSによる機器分析を行ったところ、新規化合物を含むプレニルフラボノイドであった。韓国産プロポリスについても、同様な成分分析を進め、産地による成分組成の違いを明らかにした。プロポリス成分の体内動態に関する研究に関しては、ウルグアイ産のプロポリスをラットに経口投与し、一定時間後に血液と尿を採取して、そこに含まれる成分の分析を行った。その結果、血液と尿中にプロポリス由来のフラボノイドの存在を明らかにすることができ、プロポリス中の成分が体内に吸収されて取り込まれることを初めて示すことができた。プロポリスはミツバチが周辺の植物を集めて作った樹脂状物質のことである。本研究では、プロポリスとその起源植物に関し、化学的および生物学的アプローチから、構成成分、生理活性、成分の体内動態を明らかにすることを目的に研究を実施した。今年度は、研究があまり行われていない韓国産と中国産のプロポリスの成分分析を中心に研究を進めた。すなわち、各地域で採取されたプロポリス試料を溶媒抽出し、構成成分について、HPLCによって詳細に分析し、抗酸化活性などとの関連性について考察した。その結果、韓国の済州島産のプロポリスに他産地には見られない特異的な成分が含まれていることを見出した。これらの成分は、単離、精製後、NMRやMSなどの機器分析によって構造決定を行い、新規化合物を含むカルコン類であることが明らかとなった。これらの化合物はリポキシゲナーゼに対する強い酵素阻害活性も有していた。中国産プロポリスについては、中国各地で採取される試料の成分組成の違いを明らかにすることができた。特に、海南島産のプロポリスには他産地には見られない成分が含まれていることを見出した。プロポリス成分の体内動態に関する研究に関しては、ブラジル産のプロポリスをラットに経口投与し、一定時間後に血液と尿を採取して、そこに含まれる成分の分析を行った。その結果、血液と尿中からは代表的なプロポリス由来の成分であるアルテピリンCは検出されなかった。このことより、アルテピリンCは血中に取り込まれにくい化合物であることが示唆された。
孵化直後のニワトリヒナ脳内における摂食調節機構解明

グルカゴン様ペプチド-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)は、消化管と視床下部での存在が明らかにされた脳腸ペプチドである。近年、絶食させたラットの脳室にGLP-1を投与すると摂食行動の強い抑制が起こることが報告された。これまでに調べられている哺乳類のGLP-1のアミノ酸配列は同一であるが、ニワトリのGLP-1(7-36)のアミノ酸配列は哺乳類と4箇所で異なることが知られいる。そこでニワトリにおいてもGLP-1が同様に摂食行動に関与するかどうかについて調査した。実験はすべて2日齢のブロイラーヒナを用いて行い、脳室投与後2時間の摂食量を測定した。哺乳類およびニワトリGLP-1は用量依存的に摂食を抑制させるが、両者の効果に差は認められなかった。絶食時間の長さに関わらず、またneuropeptide Y(NPY)による摂食量の亢進に対してもニワトリGLP-1はヒナの摂食量を低下させた。次にGLP-1による摂食や飲水行動の抑制にcorticotropin releasingfactor (CRF)が関与しているかどうかについて調査した。ニワトリ脳室内にCRFを投与し、その後の摂食量を測定した。またCRFとGLP-1を投与した後の血漿コルチコステロン濃度の変化について調査した。CRFの用量に依存し、ヒナの摂食量は減少した。摂食量を抑制する水準のCRFを投与すると、血漿コルチコステロン濃度は有意に上昇するが、同じく摂食を抑制する水準のGLP-1を投与しても血漿コルチコステロン濃度の上昇は認められなかった。GLP-1のC末端側の数個のアミノ酸を欠落させると、摂食に対する効果が低下することが明らかになると共に、哺乳動物ではGLP-1の拮抗薬として働くエキセンディン(9-39)が鳥類においては無効であることも証明した。これまでに調べられている哺乳類のGLP-1のアミノ酸配列は同一であるが、ニワトリのGLP-1(7-36)のアミノ酸配列は哺乳類と4箇所で異なることが知られている。次にGLP-1による摂食や飲水行動の抑制にcorticotropin releasingfactor(CRF)が関与しているかどうかについて調査した。

摂食量を抑制する水準のCRFを投与すると、血漿コルチコステロン濃度は有意に上昇するが、同じく摂食を抑制する水準のGLP-1を投与しても血漿コルチコステロン濃度の上昇は認められなかった。グルカゴン様ペプチド-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)は、消化管と視床下部での存在が明らかにされた脳腸ペプチドである。近年、絶食させたラットの脳室のGLP-1を投与すると摂食行動の強い抑制が起こることが報告された。これまで調べられている哺乳類のGLP-1のアミノ酸配列は同一であるが、ニワトリのGLP-1(7-36)のアミノ酸配列は哺乳類と4箇所の異なることが知られている。そこでニワトリにいてもGLP-1が同様に摂食行動に関与するかどうかについて調査した。実験はすべて2日齢のプロイラーヒナを用いて行い、脳室投与後2時間の摂食量を測定した。哺乳類およびニワトリGLP-1は用量依存的に摂食を抑制させるが、両者の効果に差は認められなかった。絶食時間の長さに関わらず、またneuropeptide Y(NPY)による摂食量の亢進に対してもニワトリGLP-1はヒナの摂食量を低下させた。次にGLP-1による摂食や飲水行動の抑制にcorticotropin releasingfactor(CRF)が関与しているかどうかについて調査した。ニワトリ脳室内にCRFを投与し、その後の摂食量を測定した。またCRFとGLP-1を投与した後の血漿コルチコステロン濃度の変化について調査した。CRFの用量に依存し、ヒナの摂食量は減少した。GLP-1の末端側の数個のアミノ酸を欠落させると、摂食に対する効果が低下することが明らかになると共に、哺乳動物ではGLP-1の拮抗薬として働くエキセンディン(9-39)が鳥類においては無効であることも証明した。
DDS技術を活用した脂肪組織免疫寛容誘導機構の解明と新治療戦略の創出

本研究では、研究代表者らが開発した脂肪組織の血管に対する選択的なナノ送達システム(ナノDDS)を活用し、脂肪血管にアポトーシスを誘導した際に組織内で引き起こされる反応と肥満治療効果との関連性を明らかにすることを目指して研究を開始した。脂肪組織中に存在するマクロファージ、制御性T細胞、iNKT細胞の割合を定量的に評価する系を確立するとともに、これらの細胞の機能をin vivoで評価するために必要なナノDDSを大量調製する手法を開発した。現在、メカニズムの解明に向けて機能評価を進めている。平成27年度は、高脂肪食誘導性肥満モデルマウスおよび同系統の健常マウスを用い、脂肪組織中の免疫抑制性細胞群(制御性T細胞、NKT細胞および制御性B細胞)をフローサイトメトリーにより定量的に検出する条件の洗い出しを行った。そのうち、制御性T細胞とNKT細胞については、高脂肪食誘導性肥満モデルマウスの脂肪組織において、健常マウスよりも有意に減少することが確認できた。一方、制御性B細胞については、申請者らの実験条件下で、過去の文献で報告されている状況を再現できなかったため、追跡を中断することとした。また、脂肪血管標的型DDSを用いたin vivo検討を効率的かつ再現性よく行うためには、同じ薬効を有する同一ロットのリポソームを大量に調整する必要がある。そこで、これまで試験管内で500μLスケールで調製していた手順を大幅に見直し、調製のスケールアップ法の検討した。その結果、W/O/W型エマルジョンを調製した後、溶媒を留去することにより粒子径100nm程度のリポソームを10mlスケールで調製することが可能な手順を確立した。また、本法を用いることで、これまでの調製方法では10%に満たなかった水溶性医薬分子の封入率を50%程度にまで大幅に向上させることにも成功した。さらに、この方法で調製した脂肪血管標的型DDSが脂肪組織由来血管内皮細胞の初代培養細胞に取り込まれることも確認した。免疫抑制性細胞の検出条件を決定するとともに、in vivo検討に向けたスケールアップおよび封入率の向上に成功するなど、良好な成果が得られた。平成28年度は、(1)脂肪血管標的型ナノDDSのスケールアップ調製法の最適化と(2)ナノDDSが脂肪血管内皮細胞に取り込まれる際のメカニズムの解明、の2点を達成した。(1)に関しては、平成27年度のW/O/W型エマルジョンを用いた検討結果をもとに、ナノDDSを構成する脂質を溶解するための有機溶媒の組成について最適化を行った。その結果、n-ヘキサンとジクロロメタンを3:1の比率で混合した溶媒を使用することで、水溶性タンパク質であるシトクロムCを50%という高効率で再現良くナノDDSに封入できることを見出した。また、本法で調製した蛍光標識ナノDDSをマウスに尾静脈より投与し、24時間後に脂肪組織を摘出して共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察したところ、標的化リガンド非搭載のナノDDSの脂肪血管への集積はほとんど認められなかったのに対し、標的化リガンドを搭載したナノDDSは脂肪血管に高度に分布することが明らかとなり、本法はin vivo応用に適したナノDDSの調製法として適用可能であることが判明した。(2)に関しては、これまでの研究で、脂肪血管標的化ナノDDSがprohibitinとの相互作用によるエンドサイトーシスで脂肪血管内皮細胞に取り込まれることが明らかとなっていため、さらにその詳細なメカニズムを解明する目的で、種々のエンドサイトーシス阻害剤を用いて特定の経路を阻害した場合のナノDDSの取り込みへの影響を調べた。その結果、脂肪血管標的型ナノDDSは、カベオラ/脂質ラフト介在性経路、およびPI3K非依存的マクロピノサイトーシスの2通りのメカニズムで取り込まれることが明らかとなった。さらに、PI3K非依存的マクロピノサイトーシスで取り込まれたナノDDSはリソソーム分解系を回避できることも初めて明らかとした。脂肪血管のアポトーシスによって誘導される免疫寛容が、肥満に伴うインスリン抵抗性や糖・脂質代謝を改善することをin vivoで実証するための検討を行う。薬物送達学平成28年3月に実験に使用する物品を購入、納品されたため。次年度使用額(\134,933)については、平成27年度に実施した研究の物品購入の支払いに使用する。
頚部リンパ節転移におけるFDG-PETの応用について

頭頚部悪性腫瘍のリンパ節転移の診断には従来よりMRI、CTやUSが用いられ、描出された画像の形態的な特徴から転移性リンパ節の診断が行われてきた。著者は、腫瘍細胞の糖代謝やリンパ節の血流といったリンパ節の機能面からの診断を行うべく、fluorodeoxyglucose(FDG)というトレーサーを用い、Positron Emission Tomography(PET)による転移性リンパ節の評価とカラードプラによる血流評価を行った。対象は、臨床的に転移性リンパ節が疑われ、頭頚部郭清術を施行し病理組織学的検索が行われた頭頚部悪性腫瘍患者を対象とした。病理所見とPET所見を比較した結果、FDGは生存する癌細胞にのみ集積する性質があることが予測され,たとえば大きなリンパ節であってもその細胞の割合が小さい場合にはfalsenegativeになる可能性があること、またMRIやCTで検出されるcentral nodal necrosisの部位には集積しないということがわかった。病理所見とカラードプラ画像を比較した結果、リンパ節のサイズがある程度大きなものでないとドプラ信号は検出できないことがわかった。また、転移のないリンパ節ではリンパ節門部に血流が認められるが、転移性リンパ節では内部に血流のないものが多いほか、リンパ節周囲に血流が認められる症例が多かった。今後さらに症例を重ね、転移性リンパ節と反応性リンパ節との鑑別基準を確立したい。
オーダーメード医療を目指した日本人における緑内障の原因遺伝子の解析

日本人(東北地方)緑内障患者において緑内障原因遺伝子であるMYOC遺伝子、WDR36遺伝子のスクリーニングを行い、その変異の臨床像、表現型・遺伝型を正常対照と相関解析した。検体として原発開放隅角緑内障(POAG)、正常眼圧緑内障(NTG)、正常対照を用いた。MYOC遺伝子では、若年発症のAla363Thrの変異2家系、高年発症のAsn297Hisの変異を1例に認めた(MengGe M,et al.Mol Vis.2007)。WDR36遺伝子では、POAGにおいてSer664Leuの変異を認め、Ile264Val,IVS16-30A/Gの多型がPOAGの表現型と関連していることを始めて明らかにした(Miyazawa A,et al.Mol Vis.2007)。また発達緑内障先天型のAxenfeld-Rieger症候群においてFOXC1遺伝子に新規の変異Ala85Proと437-453del17を見出した(Fuse N,et al.Mol Vis.2007)。研究前において予想される結果としては,原因遺伝子がどの位の割合で日本人(東北地方)のPOAG、NTGに関与しているのかが明らかになり欧米の結果とは違う傾向を得る可能性があるというものであった。結果として、1)MYOC遺伝子異常の頻度は欧米のものとほぼ同じであるが、変異の位置が違う2)WDR36遺伝子異常は、多型の頻度が違い日本人のPOAGに関連している3)Axenfeld-Rieger症候群におけるFOXC1遺伝子の変異の位置は日本人特有である可能性がある、という新知見を得た。日本人(東北地方)緑内障患者においてMYOC遺伝子、WDR36遺伝子のスクリーニングを行い、その頻度、その変異の臨床像、表現型・遺伝型の間の関係を検討した。またその変異が正常コントロールで1%以上見られる一塩基多型であるならば、正常対照との相関解析を行い、そのアリルが優勢のモデル、劣性のモデルにつき統計的解析を行った。検体として原発開放隅角緑内障(POAG)136例、正常眼圧緑内障(NTG)103例、正常対照118例を用いた。MYOC遺伝子に関しては、若年発症の緑内障の症例において、Ala363Thrの変異を2症例に、中高年発症のAsn297Hisの変異を1例に認めた(現在投稿準備中)。WDR36遺伝子に関しては、全18エクソンを解析した。Monemi(Hum Mol Genet.2005)らの報告したAsn355Ser, Ala449Thr, Arg529Gln, Asp658Glyは見られなかった。しかし典型的なPOAGにおいてエクソン17にSer664Leu(TCG>TTG)の変異を認めた。またIle264Val, IVS16-30A/Gの多型がPOAGに、IVS8+20C/Tの多型がPOAGとNTGにおいて、変異アレル優性としたモデルの解析から、遺伝子型と表現型が関連していることを始めて明らかにした。この結果はInvestigative Ophthalmology & Visual Scienceに投稿、現在修正のため追加実験中である。また発達緑内障先天型のAxenfeld-Rieger症候群において新規の変異Ala85Pro,フレームシフト変異437-453del17を見出し、Molecular Visionに投稿中である。

MYOC遺伝子では、若年発症のAla363Thrの変異2家系、高年発症のAsn297Hisの変異を1例に認めた(MengGe M, et. al. Mol Vis.2007)。WDR36遺伝子では、POAGにおいてSer664Leuの変異を認め、Ile264Val, IVS16-30A/Gの多型がPOAGの表現型と関連していることを始めて明らかにした(Miyazawa A, et. al. Mol Vis.2007)。また発達緑内障先天型のAxenfeld-Rieger症候群においてFOXC1遺伝子に新規の変異Ala85Proと437-453del17を見出した(Fuse N, et. al. Mol Vis.2007)。研究前において予想される結果としては,原因遺伝子がどの位の割合で日本人(東北地方)のPOAG、NTGに関与しているのかが明らかになり欧米の結果とは違う傾向を得る可能性があるというものであった。結果として、1)MYOC遺伝子異常の頻度は欧米のものとほぼ同じであるが、変異の位置が違う2)WDR36遺伝子異常は、多型の頻度が違い日本人のPOAGに関連している3)Axenfeld-Rieger症候群におけるFOXC1遺伝子の変異の位置は日本人特有である可能性がある、という新知見を得た。
アグロバクテリウムを用いた海産プランクトンへの高効率な遺伝子導入法の開発

本研究では、まず海産プランクトンに対し、様々な条件の下でアグロバクテリウムを感染させ、その遺伝子導入を試みたが、形質転換体を得ることは出来なかった。そこで、海産藻類感染性ウイルスに由来するプロモーターを新たに用い、これを組み込んだ形質転換用プラスミドを構築した。本プラスミドを用いることにより、中心目珪藻種や羽状目珪藻種に対し、目レベルを超えて形質転換が可能であることが判明した。本結果は、海産藻類ウイルス由来のプロモーターの形質転換系への適用事例として、世界初の成果である。本研究は、様々な海産プランクトンヘ適用可能な、高効率な遺伝子導入法を開発することを最終的な目的としている。初年度は、高効率な遺伝子導入法を開発するために、まず羽状目珪藻Cylindrotheca fusiformis由来のプロモーターを用いて、同目の珪藻Phaeodactylum tricornutumに対し、パーティクルガン法を用いて形質転換を試みたところ、従来の報告と比較して最も高い効率で、この形質転換が可能であることを明らかにした。この際、構成的発現型プロモーターのみならず、誘導発現型プロモーターも使用可能であることを合わせて明らかとした。本結果については、平成19年5月に山形大学において開催された第10回マリンバイオテクノロジー学会にて報告した。また、中心目珪藻であるThalassiosira pseudonana由来のプロモーターを用いて、餌料性微細藻類として重要な中心目珪藻Chaetoceros sp。の形質転換を試みたところ、これが可能であることを世界に先駆けて明らかとした。本研究成果については、平成19年9月に北海道大学にて開催された平成19年度日本水産学会秋季大会にて報告した。また、アグロバクテリウムを用いた形質転換を試みるために、ドイツ・Regensburg大学のKroger教授らに分譲して頂いた珪藻のプロモーターを含むプラスミドpNICgfp-bleと、豪州の国際農業分子生物学応用研究所(CAMBIA)より分譲して頂いたアグロバクテリウム用のTiプラスミドpCAMBIA2301を連結し、組み換えプラスミドを作製した。次年度は、これを用いて珪藻の形質転換を試みる予定である。本研究は、様々な海産プランクトンへ適用可能な、高効率な遺伝子導入法を開発することを最終的な目的としている。まず、昨年度構築したアグロバクテリウム用遺伝子導入プラスミドをアグロバクテリウムに形質転換させ、これを用いて、無害な羽状目珪藻Cylindrotheca fusiformisに対し、一般的に用いられる感染条件のもとで遺伝子導入試験を行ったところ、形質転換体を得ることは出来なかった。そこで、本菌の感染誘導物質である糖類やフェノール化合物の濃度や、感染させる細菌濃度、温度や照度等の条件を変化させ、再度感染試験を行ったが、いずれの条件のもとでも、形質転換体を得ることが出来なかった。そこで、海産藻類感染性ウイルス由来プロモーターを用いることにより、幅広い藻類種に適用可能な形質転換系の開発を試みた。まず、海産珪藻Ckgetocerosdebilisに感染するDNAウイルスの遺伝子上流領域より、プロモーターを含むDNA断片を増幅した。同断片、抗生物質耐性遺伝子、および内在性ターミネーターを、pBluescript SK-に連結させ、形質転換用プラスミドを構築した。これを、中心目珪藻Chaetoceros sp.あるいは羽状目珪藻Phaeodaetylum tricornutumに対しパーティクルガン法で撃ち込み、形質転換を試みた。その結果、目レベルを超えて、いずれの種に対しても形質転換が可能であることが判明した。本結果は、海産藻類ウイルス由来のプロモーターの形質転換系への適用事例として、世界で初めての成果であり、本成果を踏まえ、本年1月に特許出願(特願2009-013577)に至った。
数種の生物運動原理を融合した地震レスキュー用蛇型ロボットの研究開発

本研究は、蛇の運動原理とミミズの移動原理を融合し、震災等における瓦礫の散在する環境下で生存者の探索・救援が行なえるロボットシステムを開発することを目的としている。平成22年度において、昨年度に試作された基本関節ユニット(直動駆動、ロール回転、及びピッチ回転の3自由度を持つ)を用いて、頭部と尾部をも持つロボットシステムの開発を行った。本ロボットには12自由度を有し、長さ92cm、直径10cm、重さ3.1kg、円柱型の外形を持つ。直動駆動自由度を持たせることで、このロボットは蛇型運動だけでなくミミズの移動原理も行え、蛇とミミズの移動原理を有機的に融合した超生物的な移動を実現することができる。次に、このロボットを駆動制御する制御システムを構築した。この制御システムには駆動電源を含め、サーボーモータ制御系や無線通信系などを全て各ユニット内に納め、ロボットを構成する関節同士やコード類などの相互干渉を無くすことができ、ロボットの運動性能、柔軟性、信頼性が向上できる。また、実機械モデルの開発と並列して、蛇の運動原理とミミズの移動原理を有機的に融合するための理論研究を行い、蛇型移動、ミミズ型移動、および蛇型-ミミズ型の混合移動を行う本ロボットの数学モデルを構築し、これらの運動について計算機シミュレーションで運動解析を行った。その結果として、開発されたロボットにミミズ型移動を導入することで、狭隘空間へ侵入が簡単となり、蛇型移動特有の特異姿勢問題も解決できることを判明した。本年度の研究は超多自由度多関節型移動ロボットを効率よく運動制御するための基礎を成している。本研究は、蛇とミミズの移動原理を融合し、震災等における瓦礫の散在する環境下で生存者の探索・救援が行なえるロボットシステムを開発することを目的としている。平成21年度において、蛇とミミズの移動原理を有機的に融合した超生物的な移動をロボットで実現するために、まず直動駆動自由度(3.5cmの可動距離)、ロール自由度(360°の可動回転角)、及びピッチ自由度(90°の可動回転角)を持つ基本関節ユニット(長さ:14.5cm、直径:10cm、重さ:約0.7kg)を試作した。本関節ユニットは直動駆動自由度を持つことにより、コンパクトな設計でありながら、それによって構成されるロボットシステムはその運動性能が高く、狭隘環境へのアクセス能力も優れる。次に、この基本関節ユニットを駆動する制御システムを構築した。この制御システムは電源を含め、サーボーモータ制御系や無線通信系などを各ユニット内に納められる設計となっている。そのため、ロボットを構成する関節同士やコード類などの相互干渉を無くすことができ、ロボットの運動性能、柔軟性、信頼性を向上する。また、実機械モデルの開発と並列して、本関節ユニットで構成されるロボットが蛇行運動、伸縮運動,直線運動などの各運動様式を行なうときに、効率のよい制御が行なえるための数学モデルを構築し、本ロボットの移動効率の向上に貢献している。特に力学解析を行ない、直動駆動自由度によるロボットの移動効率への貢献を検討し、本関節ユニットの有用性を検証した。この研究は蛇型移動ロボットを効率よく運動制御を行なうための基礎を成している。
片肺マウスのモノクロタリン誘発肺高血圧に対するアンチセンスNF-κBの治療効果

2年間におよぶ本研究の成果の概略を箇条書きに示す。1.マウスにおいては、MCT単独投与では、肺高血圧症を生じない。一方、ラットでは、MCT 60mg/kgを皮下注すると、4週間ほどで、マイルドな肺高血圧症を生じる2.マウス(20g)とラット(50gから300g)で、片肺摘出術を行い、ほぼ100%近い生存率を得られる技術を確立した。片肺手術のみでは、肺高血圧症にはならない。3.マウス、ラットにおける開胸肺動脈圧測定法を確立した。4.成獣ラット(週齢13週)に片肺摘出術を施行し、1週間後にMCT 60mg/kgを投与したところ、3週間後には、平均肺動脈圧は、41±3,5mmHgに上昇した。コントロール群、片肺摘出術のみを行った群、MCTのみを投与した群の平均肺動脈圧は、それぞれ18±1.1mmg、19±1.7mmHg、25±0mmHgであることから、片肺摘出術を施行することで、MCT誘発の肺高血圧の程度は約1.8倍程度増強することが示された。5.上記の各群の肺を病理組織学的に検討した。片肺摘出術のみの群では、比較的太い肺動脈の中膜の肥厚が認められ、小動脈に変化はなかった。MCT単独投与群では、小動脈に中膜の肥厚が認められてが、内膜の肥厚は認められなかった。片肺摘出とMCT投与を組み合わせた群では、小動脈に内膜の肥厚が認められた。以上の病理学的所見は、生理学的なデータである肺動脈圧とよく相関していた。6.NF-κBアンチセンスオリゴを腹腔内投与しても、ほとんど肺血管に取り込まれない。気管内投与された場合は肺血管に取り込まれる。8.小動物用にも用いることが出来る、携帯用麻酔器の開発に着手し、特許を出願した。本研究の目的は、(1)片肺摘出とモノクロタリン(MCT)を組み合わせることで、原発性肺高血圧症の病態に類似する、高度の肺高血圧症を有する動物モデルを確立すること、(2)このモデルを用い、転写因子であるNF-κBのアンチセンスオリゴを投与することで、肺高血圧症の進展を防止することができるかを検証すること、である。研究の1年目にあたる今年度で、上記(1)の目的をほぼ達成した。新たに得られた知見は以下のようにまとめられる。1.マウスにおいては、モノクロタリン単独投与では、肺高血圧症を生じない。一方、ラットにおいては、モノクロタリン60mg/kgを皮下注すると、4週間ほどで、マイルドな肺高血圧症を生じる。2.マウス(20g程度)とラット(50gから300g)で、片肺摘出術を行い、ほぼ100%の生存率を得られる技術を確立した。片肺手術のみでは、肺高血圧症はほとんど進行しない。3.ラットにおいて、片肺摘出術後1週間後に、MCTを投与すると、4週間後に高度の肺高血圧症を生じる。平均肺動脈圧は、18±1mmHgから42±3mmHg(N=4)に上昇した。マウスについては、現在実験中であり、結果は明らかになっていない。以上の知見から、この肺高血圧症モデルを用いて、アンチセンスによる治療効果の判定という上記目的(2)の検証は十分可能な段階にあると考える。

本研究の目的は、(1)片肺摘出とモノクロタリン(MCT)を組み合わせることで、原発性肺高血圧症の病態に類似した、肺小動脈の内膜増生を伴う高度の肺血管閉塞病変を有する動物モデルを確立し、(2)転写因子であるNF-κBのアンチセンスオリゴが肺血管リモデリングを阻害できるかどうかを検証する、ことである。本研究の2年目にあたる今年度で、新たに得られた知見は以下のようにまとめられる。1.成獣ラット(週齢13週)に片肺摘出術を施行し、1週間後にMCT60mg/kgを投与したところ、3週間後には、平均肺動脈圧は、41±3.5mmHgに上昇した。コントロール群、片肺摘出術のみを行った群、MCTのみを投与した群の平均肺動脈圧は、それぞれ18±1.1mmg、19±1.7mmHg、25±0mmHgであることから、片肺摘出術を施行することで、MCT誘発の肺高血圧の程度は約1.8倍程度増強することが示された。2.上記の各群の肺を病理組織学的に検討した。(1)摘出術のみの群では、比較的太い肺動脈の中膜の肥厚が認められ、小動脈に変化はなかった。(2)MCT単独投与群では、小動脈に中膜の肥厚が認められてが、内膜の肥厚は認められなかった。(3)片肺摘出とMCT投与を組み合わせた群では、小動脈に内膜の肥厚が認められた。3.以上の病理学的所見は、生理学的なデータである肺動脈圧とよく相関していた。4.NF-κBアンチセンスオリゴを腹腔内投与しても、ほとんど肺血管に取り込まれない。5.今後は、アンチセンスオリゴをいかに肺血管に取り込ませるかが課題であり、現在、大阪大学で開発されたHVJ EnvelopeベクターによるNF-κBデコイを検討中である。
衝撃加圧固化成形法による金属-窒化物ナノ結晶複合材料の作製

Fe-TiおよびNi-Ti混合粉末を窒素雰囲気中でMA処理することにより、Fe-TiおよびNi-Tiナノ結晶複合粉末を作製した。これらの粉末を火薬衝撃銃を用いて衝撃固化成形を行なった。これらバルク試料の密度、結晶粒径、硬度を測定した。その結果を以下に示す。(2)上記で作製したFe-TiおよびNi-Ti衝撃固化材を用いて、ナノ結晶材の結晶粒径の変化に伴う硬度変化を測定した。Fe-63vol.%Ti材では結晶粒径が約14nmでHv>1400DPNにまで急激に硬化し、その後軟化する傾向を示した。また、Ni-TiN材ではいずれも結晶粒径が10-15nm付近までは結晶粒の微細化にともないHall-Petchの関係に従い直線的に硬化し、その硬化の傾きは粗大粒組織の純Ni材から求めたデータの外挿値と良く一致していた。さらに微細化すると逆に軟化する傾向を示した。(3)Fe-63vol.%TiNおよびNi-58vol.%TiNナノ結晶材料を用いて、高温ビッカース硬度を測定した。結晶粒径が60nm付近まで微細化するといういずれの試料も約650K付近できな軟化が観察され、この軟化温度は結晶粒径の微細化と伴に約500Kまで低下した。結晶粒の超微細化により比較的低温でも粒界すべり生ずると考えられた。また、高温ビッカース硬度をダイヤモンド圧子への負荷時間を種々に変化させて測定すると、両材料ともに負荷時間の増大とともに硬度の低下が認められ、その後一定値に飽和する傾向を示し、その飽和値は温度の上昇とともに低下する。このような硬度の負荷時間依存性は変形に必要な臨界応力の存在を意味していると考えられる。Fe-TiおよびNi-Ti混合粉末を窒素雰囲気中でMA処理することより、Fe-TiNおよびNi-TiN結晶複合粉末を作製した。この粉末は火薬衝撃銃を用いて衝撃固化成形を行った。(1)Fe_<50>Ti_<50>,Ni_<100-X>Ti_X(X=5,10,20,30,50)の混合粉末を窒素雰囲気中でMA処理することにより、結晶粒径が5nm程度のFe-TiN,Ni-TiNナノ結晶複合粉末を作製することができた。これらナノ結晶複合粉末を約40GPaで衝撃固化成形するとともに、比較のために800°Cおよび1000°Cにおいて超高圧焼結法(約5GPa)により固化成形を行なった。これらの方法によりいずれも理論密度に対して95%以上の高密度バルク材をつくることができた。このうち、衝撃法では平均結晶粒径が5nmから8nmのバルク材が製作でき、800°Cにおける超高圧法では10nmのバルク材の作製が可能であった。また、Ni_<50>(TiN)_<50>粉末を600°Cで38GPaの衝撃固化成形を行なった。これにより衝撃材特有のマクロなクラックの発生を抑制でき、最大3mm角のクラックのない試料を切り出すことができた。(2)Fe_<50>(TiN)_<50>およびNi_<50>(TiN)_<50>衝撃固化材を用いて、ナノ結晶材の結晶粒径の変化に伴う硬度変化を測定した。その結果、結晶粒径が10-15nm付近までは結晶粒の微細化にともないHall-Petchの関係に従い硬化するが、さらに微細化すると逆に硬化する傾向を示した。

Fe_<50>(TiN)_<50>材では結晶粒径が約14nmでHv>1400DPNにまで急激に硬化した。(3)Fe_<50>(TiN)_<50>およびNi_<50>(TiN)_<50>衝撃固化材を用いて、ナノ結晶材の高音ビッカース硬度を測定した。結晶粒径が60nm付近まで微細化するといずれの試料も約650K付近で大きな軟化が観察され、この硬化温度は結晶粒径の微細化と伴に約500Kまで低下した。これから、結晶粒の超微細化により比較的低温でも粒界すべりが生ずると考えられた。Fe-TiおよびNi-Ti混合粉末を窒素雰囲気中でMA処理することにより、Fe-TiNおよびNi-TiNナノ結晶複合粉末を作製した。これらの粉末を火薬衝撃銃を用いて衝撃固化成形を行なった。これらバルク試料の密度、結晶粒径、硬度を測定した。その結果を以下に示す。(2)上記で作製したFe-TiNおよびNi-TiN衝撃固化材を用いて、ナノ結晶材の結晶粒径の変化に伴う硬度変化を測定した。Fe-63vo1.%TiN材では結晶粒径が約14nmでHv>1400DPNにまで急激に硬化し、その後軟化する傾向を示した。また、Ni-TiN材ではいずれも結晶粒径が10-15nm付近までは結晶粒の微細化にともないHall-Petchの関係に従い直線的に硬化し、その硬化の傾きは粗大粒組織の純Ni材から求めたデータの外挿値と良く一致していた。さらに微細化すると逆に軟化する傾向を示した。(3)Fe-63vo1.%TiNおよびNi-58vol.%TiNナノ結晶材料を用いて、高温ビッカース硬度を測定した。結晶粒径が60nm付近まで微細化するといずれの試料も約650k付近できな軟化が観察され、この軟化温度は結晶粒径の微細化と伴に約500Kまで低下した。結晶数の超微粒化により比較的低温でも粒界すべりが生ずると考えられる。また、高温ビッカース硬度をダイヤモンド圧子への負荷時間を種々に変化させて測定すると、両材料ともに負荷時間の増大とともに硬度の低下が認められ、その後一定値に飽和する傾向を示し、その飽和値は温度の上昇とともに低下する。このような硬度の負荷時間依存性は変形に必要な臨界応力の存在を意味していると考えられる。