hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ICG結合ナノキャリアを用いた脳腫瘍の新規化学療法

代表的な原発性脳腫瘍であるグリオーマは、重要な機能を担う脳に浸潤性に発育し、また放射線・化学療法に抵抗性であることから、極めて治癒を得ることが難しい難治性腫瘍である。その最悪性型である膠芽腫の治癒を得るためには、腫瘍細胞特異性の高い細胞死誘導法が必要となる。我々は、近赤外蛍光色素であるindocianine green (ICG)結合型リポソームを開発し、その静脈内投与で脳腫瘍組織への高度かつ長期間の集積すること、近赤外線照射によって一重項酸素による細胞死と強力な特異的抗腫瘍免疫を誘導することを証明してきた。これを新規ナノキャリアとして用い、抗がん剤を封入して局所に高濃度に分布させることによって治療効果の向上を目指している。標準治療薬であるテモゾロマイドを用いて、9L-グリオサルコーマ細胞を移植したラットの腫瘍サイズと生存期間は通常のICG結合型リポソームを用いた光線力学療法の結果と差を認めなかった。一方で、摘出標本の病理学的検索では、テモゾロマイド封入群で、より広範な壊死が観察され、同時にCD8 T細胞の浸潤増強が認められた。抗腫瘍免疫の誘導に重要なheatshock protein-70(HSP70)の誘導に関し検討を行い、テモゾロマイド封入群、非封入群ともに、コントロール群に比べ発現増強を認めた。以上より、抗がん剤を封入したICG結合型リポソームは強力な細胞死を誘導し、HSP70の関与する経路によって自然免疫の増強から特異的抗腫瘍免疫を発動させることが確認された。臨床応用を視野に、光ファイバーによるレーザー照射の治療効果を確認した。壊死領域、アポトーシス誘導に関し光照射群で増強が認められたが、生存期間の延長には結びつかなかった。代表的脳腫瘍であるグリオーマは、重要な機能を担う脳に浸潤性に発育し、また放射線・化学療法に抵抗性であることから、極めて治癒を得ることが難しい難治性腫瘍である。その最悪性型である膠芽腫の治癒を得るためには、新規の強力な化学療法が必要である。今回の研究では、この新規ナノ粒子に抗がん剤を封入し、局所に高濃度に分布させること、およびそれによる抗腫瘍免疫誘導によって治療効果の向上を目指している。本年度は、膠芽腫に対する標準治療薬であるテモゾロマイドを用いて、治療効果の増強が得られるか否かを、7テスラ動物専用MRIを用いて検証した。9L-グリオサルコーマ細胞を移植したラット(n=5)の腫瘍サイズと生存期間は通常のICG結合型リポソームを用いた光線力学療法の結果と差を認めなかった。一方で、摘出標本の病理学的検索では、広範な壊死が観察され、同時にCD8 T細胞の浸潤増強が認められた。マイクログリア/マクロファージの浸潤は有意な変化を認めなかった。未治療コントロール群においては旺盛な腫瘍増殖が確認され、壊死像は全く認めていない。以上より、抗がん剤を封入したICG結合型リポソームは強力な細胞死を誘導し、特異的抗腫瘍免疫を発動させることが確認されたが、これを有意な治療効果として得るには、投与のタイミング、光照射の回数なども検討が必要と思われる。摘出標本において、CD8 T細胞の浸潤増強が認められたが、皮下腫瘍に比べると低レベルにとどまるため、脳腫瘍局所における抗原提示を増強することが、腫瘍特異的Tリンパ球を効果的に集積させる有効な方法である可能性が高いと考られる。本年度は、Standard 51Cr release assayによる腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球誘導の定量に注力したが、良好な結果を得るに至らなかった。現在はLDH assayを中心に行い、成果が得られつつある。このICGリポソームを静脈内投与し、脳腫瘍部位に光照射を行うと、腫瘍増大の抑制と生存期間の延長、病理学的には壊死とアポトーシスが認められる。今回の研究では、この新規ナノ粒子に抗がん剤を封入し、局所に高濃度に分布させることによって治療効果の向上を目指している。標準治療薬であるテモゾロマイドを用いて、9L-グリオサルコーマ細胞を移植したラット(n=5)の腫瘍サイズと生存期間は通常のICG結合型リポソームを用いた光線力学療法の結果と差を認めなかった。さらに、今回は抗腫瘍免疫の誘導に重要なheatshock protein-70(HSP70)の誘導に関し検討を行い、免疫組織化学によってその発現増強を認めた。

以上より、抗がん剤を封入したICG結合型リポソームは強力な細胞死を誘導し、HSP70の関与する経路によって自然免疫の増強から特異的抗腫瘍免疫を発動させることが確認された。一方で、抗がん剤の高濃度分布による腫瘍増大の抑制、生存期間の延長は今の所確認されていないが、今後も抗がん剤の種類、濃度、光照射のタイミングを含め検討していく予定である。ICGリポソームを静脈内投与し、脳腫瘍部位に光照射を行うとapoptosisとnecrosisの混在した病理像が得られるが、テモゾロマイドの封入によりnecrosis成分の増加がみられることが確認された。しかしながら、平成29年度に予定されていた、MRIを用いた腫瘍体積評価において腫瘍増大の抑制は観察されず、生存期間の延長も得られなかった。投与薬剤の種類や量、あるいは光照射のタイミングと頻度などが影響していると思われる。しかしHSP70の誘導が確認され、抗腫瘍免疫誘導に関与していると考えられる。代表的な原発性脳腫瘍であるグリオーマは、重要な機能を担う脳に浸潤性に発育し、また放射線・化学療法に抵抗性であることから、極めて治癒を得ることが難しい難治性腫瘍である。その最悪性型である膠芽腫の治癒を得るためには、腫瘍細胞特異性の高い細胞死誘導法が必要となる。我々は、近赤外蛍光色素であるindocianine green (ICG)結合型リポソームを開発し、その静脈内投与で脳腫瘍組織への高度かつ長期間の集積すること、近赤外線照射によって一重項酸素による細胞死と強力な特異的抗腫瘍免疫を誘導することを証明してきた。これを新規ナノキャリアとして用い、抗がん剤を封入して局所に高濃度に分布させることによって治療効果の向上を目指している。標準治療薬であるテモゾロマイドを用いて、9L-グリオサルコーマ細胞を移植したラットの腫瘍サイズと生存期間は通常のICG結合型リポソームを用いた光線力学療法の結果と差を認めなかった。一方で、摘出標本の病理学的検索では、テモゾロマイド封入群で、より広範な壊死が観察され、同時にCD8 T細胞の浸潤増強が認められた。抗腫瘍免疫の誘導に重要なheatshock protein-70(HSP70)の誘導に関し検討を行い、テモゾロマイド封入群、非封入群ともに、コントロール群に比べ発現増強を認めた。臨床応用を視野に、光ファイバーによるレーザー照射の治療効果を確認した。壊死領域、アポトーシス誘導に関し光照射群で増強が認められたが、生存期間の延長には結びつかなかった。今年度は引き続き、LDH assayによる腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球誘導の定量を行うとともに、抗がん剤封入ICG結合型リポソームの治療効果を当初の予定通り、パクリタキセルとイリノテカンについて検討する。また、局所の強力な細胞死とともにサイトカインの高濃度分布が有効な可能性があり、サイトカインを封入したICG結合型リポソームも作成し、治療実験を行う予定である。平成30年度も、抗がん剤封入ICG結合型リポソームの治療効果をMRIによる経時的腫瘍サイズ評価と生存期間、および摘出標本における免疫担当細胞(CD8 T cell、CD4 T cell、macropahge)浸潤の程度により評価する。
火口近傍観測による火道内物理プロセスの解明　－無人ヘリによるアプローチ－

活動的火山において、マグマの上昇経路である火道内の物理プロセスを解明し噴火予測精度を上げることは火山防災上極めて重要である。しかし研究者が火口近傍に近づいて観測を行うことは噴火の危険があるために困難である。そこで、自律型無人ヘリコプター(無人ヘリ)をベースに,空中からの映像撮影や磁場などのデータ収集、地震計などの観測装置の設置、火山灰などの試料採取を遠隔操作で行うことのできる「無人ヘリ火山観測システム」の開発を行った。活発な活動を繰り返す桜島や近年噴火した霧島,口永良部島および小笠原諸島の西之島を主実験場として無人ヘリ観測手法の改良・高度化を行った。火山の火口近傍は観測上の重要地点である.本研究は,既存の自律型無人ヘリをベースに,空中からの映像やデータ収集に加え,センサー設置や火山灰などの試料採取を遠隔操作で行える「無人ヘリ火山観測システム」を開発して火口近傍へ安全かつ自在にアクセスできる方法を確立し,火道内の物理プロセスの解明と噴火予測精度の向上を目指す.活発な活動を繰り返す桜島,最近噴火した霧島や口永良部島を主実験場として無人ヘリ観測手法の改良・高度化を進めることを目的とする.平成26年度の成果は,以下のとおりである.(1)無人ヘリ火山観測システムを構成する「設置システム」と「観測モジュール」の開発・改良を進めた.「設置システム」の主要部であるウインチ装置の耐久性と部品可換性を向上させるために,構成部品における市販品の利用率を減らし,自ら制作した部品の割合を増やした.また,観測モジュールの設置・回収時の操作性向上と時間短縮を目的として,装置全体の軽量化とモータの交換による巻き上げ速度の向上を図った.センサーとデータ収録装置,データ伝送装置,電源装置から構成される「観測モジュール」については,電力の不足とモジュール全体の機械的共振によるノイズの発生という問題点を改善するため,電源部の改善と共振ノイズの低減に重点を置いた地震観測モジュール改良を進めた.センサー及びバッテリーを地面に近い脚部に移し,共振ノイズを低減し,強風による転倒を避けるため,重心が低く,横風に強いモジュールを開発した.(2)桜島において,気候が安定する10月下旬に火口近傍への地震観測モジュールの設置実験を行った.以前設置した地震計モジュールと空振計モジュールの回収し,地震計を再設置した.また,2011年に噴火した霧島・新燃岳において空中磁気観測を行い,山頂火口を満たしているマグマが噴火後は順調に冷却を続けていることを示す結果を得た.火山の火口近傍は観測上の重要地点である.本研究は,既存の自律型無人ヘリをベースに,空中からの映像やデータ収集に加えてセンサー設置や火山灰などの試料採取を遠隔操作で行える「無人ヘリ火山観測システム」を開発して火口近傍へ安全かつ自在にアクセスできる方法を確立し,火道内の物理プロセスの解明と噴火予測精度の向上を目指す.活発な活動を繰り返す桜島や最近噴火した霧島,口永良部島を主実験場として無人ヘリ観測手法の改良・高度化を進めることを目的とする.平成27年度の成果は以下のとおりである.(1)これまでの観測モジュールの伝送システムは通信速度不足と大きな消費電力のために,一部のデータを間欠的に送ることしかできず,リアルタイム性が不十分であった.この欠点を克服するため以下の2つの改造を施した.1)データ基板を改良し,組み込み型の携帯通信チップを用いることで,低消費電力化と通信の高速化を実現した.低消費電力化した地震計は桜島観測で使用した.2)上下動記録のみを必要とする観測においては,消費電力の大きい加速度計でなく,電力を消費しないムービングコイル型の速度センサーを使用する.これにより,低消費電力型基板よりも更に消費電力を抑えることができる.必要となる太陽電池パネルの数を減らすことができるため,風にあおられて飛ばされる危険が大幅に減少する.このタイプの地震計は口永良部島において使用している.(2)4月と9月に,口永良部島において地震計の設置,空中時期測量,画像撮影,ガスサンプリングを実施し,噴火直前の地震活動の変化や10月以降の火山活動鎮静化を多項目の観測から確認することができた.また,11月には桜島において地震観測モジュールの再設置を行った.以前設置した地震計モジュールを回収し,上述の低消費電力型地震計に置き換えることで,連続観測データを準リアルタイムで得ることが可能になった.本年度は,(1)無人ヘリ火山観測システムの開発と改良,(2)活動的火山における設置実験,(3)火道浅部のマグマプロセスの検討,の3点を行う計画であった.このうち,(1)については観測モジュールの伝送システムの低消費電力化や消費電力の少ないセンサーの採用,太陽光パネル数の削減等,観測目的に応じた改良を施すことができた.これまでのロガーでは一部のデータを間欠的に送ることしかできなかったため,研究上重要な連続データを得るためにはモジュールの回収を待たなければならなかった.また,リアルタイム性に劣るため,防災的な応用には向いていなかった.これに対して今年度改良を加えた観測装置は,連続データをわずかの時間遅れで送ってくるため,古いモジュールの欠点はほぼ解消したと言える.(2)については,桜島において低消費電力基板を用いた観測モジュールを設置し,以前の観測装置では不可能だった連続データの準リアルタイム取得に成功している.

また,口永良部島においては,低消費電力化した基板に加え,更に,ムービングコイル型の電力消費のないセンサーを採用した観測モジュールを作成して火口近傍に設置し,現在も順調に連続データを得ることができている.観測データは関係機関に送られ,防災上の判断材料にも用いられている.(3)についても,口永良部島の火口近傍に地震計を設置できたことにより,噴火前後の火口周辺の地震活動の変化をとらえることに成功している.このような噴火前の地震活動の変化は火道浅部での物理プロセスを理解するうえで重要な知見である.以上から,研究の目的はおおむね順調に達成されつつあると言える火山の火口近傍は観測上の重要地点である.本研究は,既存の自律型無人ヘリコプター(無人ヘリ)をベースに,空中からの映像やデータ収集に加えてセンサー設置や火山灰などの試料採取を遠隔操作で行える「無人ヘリ火山観測システム」を開発して火口近傍へ安全かつ自在にアクセスできる方法を確立し,火道内の物理プロセスの解明と噴火予測精度の向上を目指す.活発な活動を繰り返す桜島や近年噴火した霧島,口永良部島および小笠原諸島の西之島を主実験場として無人ヘリ観測手法の改良・高度化を進めることを目的とする.平成28年度の成果は以下のとおりである.1、平成27年度までに,通信部分にユビキタスモジュールを用いて低消費電力化と準リアルタイムでのデータ転送を可能とした観測基板を開発し,桜島および口永良部島における観測を継続した.平成29年4月現在も安定した観測が継続できており,新たに開発した基板の信頼性が確認された.また,ムービングコイル型センサーの水平動成分を使用するために必要となるジンバルのプロトタイプを作成した.2、平成25年末から噴火を開始し,溶岩流により大きく成長した小笠原諸島西之島において,無人ヘリを用いた画像撮影と火山砕屑物のサンプリングを実施した.西之島噴火は火山島の成長過程の研究にとって極めて貴重な機会であったが,活動中は火口から1.5km以内に立ち入り禁止域が設定されており,唯一の近接観測手段は船舶から禁止区域内へ無人ヘリを飛ばす事であった.立ち入り禁止域に接近した船から無人ヘリを飛ばし,高解像度の静止画・動画の撮影とスコリアのサンプリングを行った.離発着時の船の揺れをキャンセルする特殊な離発着台や,電波が海面に反射することによる通信への影響を避けるアンテナアレイの導入など,船上離発着では地上における離発着とは異なるノウハウが必要であり,西之島の調査を通じて必要なノウハウが得られた.活動的火山において、マグマの上昇経路である火道内の物理プロセスを解明し噴火予測精度を上げることは火山防災上極めて重要である。しかし研究者が火口近傍に近づいて観測を行うことは噴火の危険があるために困難である。そこで、自律型無人ヘリコプター(無人ヘリ)をベースに,空中からの映像撮影や磁場などのデータ収集、地震計などの観測装置の設置、火山灰などの試料採取を遠隔操作で行うことのできる「無人ヘリ火山観測システム」の開発を行った。活発な活動を繰り返す桜島や近年噴火した霧島,口永良部島および小笠原諸島の西之島を主実験場として無人ヘリ観測手法の改良・高度化を行った。本年度は,(1)無人ヘリ火山観測システムの開発と改良,(2)桜島における設置実験,(3)火道浅部のマグマプロセスの検討,の3点を行う計画であった.
災害弱者としての成人透析患者の震災前後の死因別死亡リスクの変化に関する疫学研究

東日本大震災では透析患者の死亡率が上昇した可能性がある。本研究では、震災前後で年間換算死亡率を求めた。2011年3月11日から4月10日までの急性期死亡率は198.6(/1000人年)であり、それ以外の期間の死亡率(90112(/1000人年))のほぼ2倍であった。3月11日に死亡した16名を除いた急性期の年間換算死亡率は137.1であった。沿岸地域の震災急性期死因では震災死亡が全体の22.9%を占めていた。循環器疾患死亡・感染症死亡割合が低かった。岩手県全体で観察された震災後急性期死亡率の高さには、震災死亡のみならず、内陸地域で増加した循環器疾患死亡が関与した可能性がある。岩手医科大学5月倫理委員会で本研究の倫理審査を実施して承認を得た。引き続き岩手県末期腎不全登録事業実施について岩手県医師会を通じて岩手県内44透析施設に周知を図った。6月から岩手県末期腎不全登録事業協力に関する覚書取り交わしを実施し、引き続き7月から末期腎不全登録事業を開始した(岩手県立宮古病院H24年7月、後藤皮膚科泌尿器科医院7月、後藤医院8月、済生会岩泉病院8月、県立久慈病院8月、二戸クリニック9月、岩手沼宮内クリニック9月、県立一戸病院9月、国保種市病院9月、いするぎ医院10月、三愛病院10月、矢巾クリニック10月、三島内科医院10月、篠村泌尿器科クリニック10月、盛岡赤十字病院11月、孝仁病院11月、盛岡友愛病院12月、山田クリニック12月、大日向医院12月、県立二戸病院11月、宝陽病院H25/1月、新里医院1月、美希病院1月、日高見中央クリニック1月、国保沢内病院2月、県立中部病院2月、奥州病院2月、県立遠野病院2月、きたかみ腎クリニック2月、県立胆沢病院2月、北上済生会病院3月、小原クリニック3月、総合水沢病院3月)。登録事業と同時に収集データの編集作業を実施した。平成22年1月から平成23年12月までに収集した41施設の登録データ件数は3500件で、複数の施設で重複した642件を削除し、他医療機関重複データ311件を新たに追加した結果3169件となった。このデータセットにおいて、透析導入日が空欄(32件)、性別が空欄(1件)、住所空欄(1件)、透析治療年度最初日空欄(13件)、平成年の入力ミス(3件)を確認し、適宜追加調査スケジュールを組んだ。データ不備例を含めずに集計を行って、第23回日本疫学会(H25年1月)に県内透析患者の実態を報告した。さらに、平成22年度と23年度の新規透析治療導入者数と死亡者数について岩手県北部地域で算出して日本循環器病予防学会に応募して採択された。平成25年6月に発表予定である。平成25年度の末期腎不全登録事業は以下のスケジュールで実施した(7月16-18日に県立釜石病院とせいてつ記念病院、7月24-25日に県立大船渡病院と地の森クリニック、8月19日に西城病院、8月23日、24日に岩手クリニック一関、8月26日に県立千厩病院、9月10-11日に松原クリニック、9月18-19日に済生会岩泉病院、9月24-25日に国保種市病院、9月25、26、30日、10月15-17日、11月12日、12月11、12日に県立胆沢病院9月26日に県立江刺病院、10月7、9日に県立一戸病院、10月31日、11月1日に県立久慈病院、11月12-14日に県立宮古病院と宮古後藤医院、11月19-20日に二戸クリニック、11月21-22日に沼宮内クリニック、11月28日に雫石篠村クリニック、12月9-10日いするぎ医院、12月16-18日県立中部病院、12月16-17日三島内科、12月18-20日孝仁病院、12月24-25日盛岡赤十字、12月26日大日向医院、1月14-17日矢巾クリニック、1月20-24日三愛病院)。まず平成25年5月の時点でデータ入力作業の終了した岩手県北部地域のデータ(沿岸地域:岩泉町、久慈市、宮古市、山田町、洋野町、内陸地域:一戸町、岩手町、雫石町、盛岡市、二戸市、矢巾町)の集計を行って、岩手県北部内陸沿岸地域での震災前後の透析患者死亡率変化について第49回日本循環器病予防学会に公表した。更に新規透析患者数の推移を第72回日本公衆衛生学会総会に公表した。津波被害の甚大であった沿岸地区で透析患者新規導入者が多かったことを見出し、2013年アメリカ腎臓学会学術集会の場で口述発表した。尚、2014年2月には岩手県全域でのデータセットを完成させ、2014年ヨーロッパ腎臓学会に演題応募して採択された。

平成26年度の末期腎不全登録事業は以下のスケジュールで実施した(7月14-16日に県立宮子病院と宮古市後藤泌尿器科皮膚科医院、7月23-24日に岩手県立久慈病院、7月25日に国保種市病院、7月30-31日にせいてつ記念病院、8月20-21日に松原クリニック、8月20-22日に県立大船渡病院、8月27-29日に県立釜石病院、9月8日に遠野市新里医院、9月10-11日に地の森クリニック、9月16-17日に岩泉済生会病院、9月18-19日に県立遠野病院、10月9、10日に日高見クリニック、10月16、17日に宝陽病院、10月21、23日に二戸へクリニック、11月19日、20日に北上済生会病院)。登録事業と同時に収集データの編集作業を実施した。平成25年中に入力作業を実施した岩手県北部地域のデータ(沿岸地域:岩泉町、久慈市、宮古市、山田町、洋野町、内陸地域:一戸町、岩手町、雫石町、盛岡市、二戸市、矢巾町)の集計結果を2014年ヨーロッパ腎臓学会に演題応募して採択された。しかし、学会発表の5月は岩手県内透析施設との交渉ならびに岩手県医師会事務との協議が重なり、国際学会発表を取りやめざるを得なかった。上記データセットに加えて、平成26年に新たに収集した岩手県中央病から県南部の調査データの入力を順次行った上で、第50回日本循環器病予防学会に震災前後の死亡率の推移について検討した演題を公表した。更に、震災翌年の透析患者新規罹患率と透析患者死亡率を検討した演題を2014年アメリカ腎臓学会学術集会の場で口述発表した。平静27年度の末期腎不全登録事業は平成27年8月に岩手医科大学と岩手県医師会での登録事業に関する業務委託契約取り交わしを開始して10月に提携にこぎつけた。昨年度登録調査の行われなかった6施設(西城病院、岩手クリニック一関、総合水沢病院、奥州病院、矢巾クリニック、三愛病院)を10月から11月に訪問して登録調査に関する覚書取り交わしを進めたが、2施設では、新たにすべての患者からのインフォームドコンセント取得について要望が出され、期間内での実施が困難であり調査を諦めた。覚書取り交わし終了後に行った平成27年度の末期腎不全登録事業スケジュールは以下の通りである。平成28年1月12日一関市西城病院(35件登録)、1月13日西城病院46件登録、1月14日西城病院18件登録、平成28年1月25日盛岡市三愛病院168件登録、1月26日三愛病院138件登録、1月27日三愛病院95件登録、1月28日三愛病院102件登録、1月29日三愛病院77件登録、2月8日紫波郡矢巾町矢巾クリニック110件登録、2月9日矢巾クリニック97件登録、2月10日矢巾クリニック48件登録、2月15日奥州市総合水沢病院39件登録、2月16日33件登録。計1001件の登録が行われた。登録票は岩手県医師会に郵送され、順次コンピュータ入力作業を実施している。平成27年6月に大阪で行われた第51回日本循環器病予防学会では、岩手県末期腎不全登録事業のデータベース利用申請を行って、地域住民からどの程度の透析患者が発生しているのかを前向きコホート研究の成果として公表した。また平成27年11月にサンディエゴで行われたアメリカ腎臓学会では、透析患者の疫学研究としてCHADS2Vascスコアで層別化した予後検討結果を公表した。東日本大震災では透析患者の死亡率が上昇した可能性がある。本研究では、震災前後で年間換算死亡率を求めた。2011年3月11日から4月10日までの急性期死亡率は198.6(/1000人年)であり、それ以外の期間の死亡率(90112(/1000人年))のほぼ2倍であった。3月11日に死亡した16名を除いた急性期の年間換算死亡率は137.1であった。沿岸地域の震災急性期死因では震災死亡が全体の22.9%を占めていた。循環器疾患死亡・感染症死亡割合が低かった。岩手県全体で観察された震災後急性期死亡率の高さには、震災死亡のみならず、内陸地域で増加した循環器疾患死亡が関与した可能性がある。末期腎不全登録事業登録事業が計画通りには進捗できなかった。奥州市、一関市、盛岡市の一部では調査時期が冬にずれ込み、調査する看護師の手配が十分に出来なかった。また、平成25年から26年にかけて収集した調査票の電子化作業は、入力担当者の予期せぬ退職と、後任者の選定がうまくいかずに、データ入力が完全には終了しなかった。
神経・骨連関による頭蓋顎顔面領域の成熟機能骨・再生機構の解明

本研究では、三叉神経をはじめとする感覚神経による成熟機能骨の再生調節機構を明らかにする。これまでの予備観察から成熟機能骨の獲得には1副甲状腺ホルモン(PTH)の作用リズム、2感覚神経での骨・神経血管リモデリング因子の発現、および3神経概日リズム調節が相互連関することを観察している。これらの知見を発展させ遺伝子改変動物による骨再生実験系によりこれらの連関機構を検証する。野生型および概日リズム障害(全身性、神経特異性)ラットに、PTH投与による頭蓋骨欠損・再生モデルを適用する。組織再生の解析系として、骨再生と血管および神経軸索リモデリングの相関を解析するための、定量的3次元蛍光イメージング法を応用開発する。分子オミクス解析等を加え、形態と分子の両面から解析する。全身骨代謝状態をモニターすることにより、骨代謝と骨再生の関連を解析する。このような統合的アプローチにより「神経・骨連関」による組織再生という新たな学問的視点と新たな解析法を提示し、新規の骨再生創薬基盤創出へ発展させる。概日リズム障害(全身性、神経特異性)ラットを用いる予定であったが、胚の凍結保存を委託した会社の統廃合などにより、当該ラインの存在確認が遅れた。また年度後半に、研究代表者が移籍したことも重なった。そのため、ラット・コロニーの再樹立が遅れている。そこで、共同研究者の沼野らのグループで系統維持している概日リズム障害マウスを用いて、実験を開始した。概日リズムを発光で可視化できるマウスを用いて三叉神経にリズムがあること、またPTHがそのリズム調節に関わる分子である可能性を示唆するデータを得ている。また、三叉神経由来の骨形成・再生因子を同定するためのオミクス解析を開始した。研究代表者の移籍先である北海道大学において遺伝子組み換えラットの飼育環境を整え、ラット・コロニーの再樹立を予定している。同時に、共同研究者の沼野らのグループで系統維持している概日リズム障害マウスを用いた代替え実験を継続する。主にマウス代替え系を用いて、三叉神経における、概日リズムが、PTH、骨形成・再生因子の発現連関を解明していく。
インクジェット法による薄膜形成に関する移動現象の総合解析

インクジェット法によって形成される薄膜を平坦化する方法を実験と実験両面から検討した.まず,実験および数値解析により蒸発する液滴内の内部流動を解析した.本解析系において,溶質濃度差由来と温度差由来のマランゴニ力が内部流動に影響し,それらの力は自由界面上で逆方向の流れを発生させる.基板温度の上昇とともに溶質濃度差由来より温度差由来のマランゴニ力が大きくなる.しかし,蒸発が進行すれば,最終的には溶質濃度差由来のマランゴニ力が流れを支配する.2成分溶媒を用いて薄膜が平坦化できる理由は,2つの溶媒の表面張力差を利用して内部流れを制御できるためと考えられてきた.しかし,本研究では,溶媒濃度差由来より溶質濃度差由来のマランゴニ力が大きいために,溶媒の表面張力差から予想される内部流動状態と膜形状は必ずしもを相関していないことが示唆された.結論として,薄膜形状はself-pinning位置に影響され,それを制御するためには粘度,接触角,蒸発速度を操作し,膜形状を微妙に制御するためマランゴニ力を操作する方法を考案した.それに従って,薄膜を平坦化することができた.インクジェット法によって形成される薄膜を平坦化する方法を実験と実験両面から検討した.まず,実験および数値解析により蒸発する液滴内の内部流動を解析した.本解析系において,溶質濃度差由来と温度差由来のマランゴニ力が内部流動に影響し,それらの力は自由界面上で逆方向の流れを発生させる.基板温度の上昇とともに溶質濃度差由来より温度差由来のマランゴニ力が大きくなる.しかし,蒸発が進行すれば,最終的には溶質濃度差由来のマランゴニ力が流れを支配する.2成分溶媒を用いて薄膜が平坦化できる理由は,2つの溶媒の表面張力差を利用して内部流れを制御できるためと考えられてきた.しかし,本研究では,溶媒濃度差由来より溶質濃度差由来のマランゴニ力が大きいために,溶媒の表面張力差から予想される内部流動状態と膜形状は必ずしもを相関していないことが示唆された.結論として,薄膜形状はself-pinning位置に影響され,それを制御するためには粘度,接触角,蒸発速度を操作し,膜形状を微妙に制御するためマランゴニ力を操作する方法を考案した.それに従って,薄膜を平坦化することができた.本年度は,主にプログラムコードの改良を行うとともに,その妥当性を実験的に検証した.主な成果は以下の通りである1)等温系に対するプログラムコードを用いて,溶質濃度差に起因するマランゴニ対流とレイリー対流が内部循環流構造に及ぼす影響を示すマップを作成した.内部循環流構造は大きく3つの領域に分類でき,そのうち2つの領域にインクジェット成膜の操作条件が存在することを見出した2)等温系に対するプログラムコードを非等温系に適用できるように改良した.その際,従来の解析コードでは液滴と基板の領域を考慮していたが,気相も解析領域に加えることによって,任意の温度・圧力雰囲気における解析が可能になった.加熱基板上における内部流動可視化実験も行うことによって,改良した解析コードの妥当性を確認した.ただし,基板温度の上昇とともに蒸発速度の予測誤差が大きくなる傾向にあること,粘度が増加すると収束が悪化することなどの問題もあり,今後の検討課題である3)上記のプログラムコードを用いて,基板温度が内部流動に及ぼす影響を検討した.その結果,基板温度の上昇とともに温度差マランゴニ対流が支配的になるが,時間の経過とともに溶質濃度差マランゴニ対流も流動に影響を及ぼし始め,複雑な内部循環流構造を形成することを見出した.また,溶質濃度差マランゴニ対流は接触線付近の溶質濃度を上昇させるように作用し,薄膜形状に影響することが予測された4)さらに,接蝕線付近の溶質濃度に注目して接触線の固定条件を検討した結果,数値解析結果は実験結果と定性的に一致した.一般的に,基板温度の上昇とともに接触線の固定は早くなるが,ある基板温度領域においてその関係が逆転する場合があり得ることを数値解析は予測しており,今後実験的に確認する必要がある本年度は,マランゴニ対流が薄膜形状に及ぼす影響を実験・理論の両面から検討した.主な成果は以下の通りである.1)2成分溶媒系の液滴内部には,溶質と溶媒の濃度勾配によって2種類のマランゴニ対流が生じる.2成分溶媒に関する既報の論文を再調査した結果,ほとんどの研究では溶媒濃度差対流の影響のみを取り上げており,溶質濃度差対流の存在を無視していることがわかった.これを考慮すれば,内部循環流の方向が異なってくる可能性があり,既報の実験結果の多くは接触線固定時の溶液粘度からも説明できることを明らかにした.2)溶媒の組合せ,混合比,溶質濃度などを実験パラメータとして,円形パターン基板上における薄膜形成実験を行った.その結果,操作因子による薄膜形状の相違は,単一溶媒の場合と同様に,接触線固定時の接触角,粘度および蒸発速度の3つの因子との相関から説明できる.しかし,いくつかの2成分溶媒に関しては,これら3因子だけでは説明できず,マランゴニ対流が寄与していることが示唆された.

3)昨年度までの単一溶媒滴に対するプログラムコードを2成分溶媒系に拡張した.可視化実験結果と定量的に一致させるまでにはプログラムコードの改良が必要であるが,溶質と溶媒の各濃度差により対流が複雑に絡み合って,循環流方向が途中で変化すること,ある2成分溶媒では流れに振動が生じること,などの実験結果を定性的に説明できた.4)上記のプログラムコードとは別に低接触角を想定した接触線固定時のプログラムコードの開発を行った.解析では液滴界面が微小に振動する現象が観察され,当初は計算誤差と思われたが,詳細に検討した結果,これはマランゴニの不安定性に起因した振動であり,実験的にも観察される現象であることがわかった.また,このコードを用いて,薄膜形状の予測を行った結果,定性的に実験結果と一致した.本年度に引き続き,マランゴニ対流が薄膜形状に及ぼす影響を実験・理論の両面から検討した.主な成果は以下の通りである.1)昨年度の研究でマランゴニ対流の関与が予想できる溶媒の組合せに対して液滴内部流動の可視化を行った結果,液滴内部には大きな循環流が生じており,その方向は溶質濃度の上昇とともに,溶媒濃度差支配から溶質濃度差支配へ移行することを見出した.既報の研究では溶媒の表面張力差のみに注目して膜形状の説明が試みられてきたが,溶質濃度差によるマランゴニ対流も考慮すべきであることを示した.2)膜の平坦化が顕著な条件では,溶媒濃度差によるマランゴニ対流の方向と関係づけられるが,溶質濃度差支配であることを考慮すれば対流の方向に依存していないことを見出した.結論として,膜平坦化に影響するのは,マランゴニ対流の方向だけではなく,接触線付近の流動現象の複雑さも関与していることが明らかとなった.3)昨年度作成した2成分溶媒系液滴内部の輸送現象解析プログラムコードを改良し,可視化実験結果との比較を行った結果,昨年度よりプログラムの予測精度が向上した.また,これとは別に,昨年度から進めている低接触角を想定した接触線固定時のプログラムコードの改良も行った.4)これまで得られた知見の検証として,有機EL膜を対象とした薄膜形性実験を行った.triphenyldiamineを溶質として3種類の溶媒を用いた.その結果,表面張力と接触角を添加溶液で調整し接触線固定の位置を制御することによって,平坦膜を形成することに成功した.本申請課題の最終目的である薄膜制御に関して,実験的検討により,従来研究の見落としが明らかとなり,数個の直接的因子まで絞ることができた.また,数値解析プログラムも完成に近づいている.申請期間内には,最終目的を達成できると考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。薄膜形状に影響する因子について,従来マランゴニ対流の寄与と考えられていた実験結果の一部が,他因子の影響の方が大きい可能性を見出した.したがって,マランゴニ対流を中心にそえた申請計画を微修正し,最終年度は,他因子の影響についても検討する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
太陽風プラズマにおける温度異方性とベータ比の逆相関についての研究

本年度は、前年度から引き続いて磁場擾乱の自発的励起過程(衝突過程・離散粒子効果)と太陽風のグローバルな非一様性の効果が温度異方性ーベータ比や不安定性へ与える影響の解明に取り組んだ。本研究では、初期状態(太陽近傍)ではプロトンサイクロトロン不安定な状況から計算を始めた。これは、太陽近傍においてサイクロトロン波が励起されていることを想定してのものである。一様プラズマ中では温度異方性が不安定性条件を満たさなくなった段階で系は安定化するが、非一様性がある場合は、太陽風の膨張の効果によって温度異方性が変化し続け、温度が等方に近づく辺りで励起されたイオンサイクロトロン波が減衰してしまうことが分かった。これは先行研究で導出されたモデル[Yoon+Seough, J. Geophys. Res., 2014]でも見られた傾向だが、波のWKB的な発展も正しく取り入れた本モデルでも同様の振る舞いを確認することが出来た。一方で、先行研究[Yoon+Seough, J. Geophys. Res., 2014]で示されていた値よりも、励起された波の強度は一桁ほど小さくなることが分かった。また、衝突項の効果を含めた場合、パラメータ平面上の軌跡が高ベータ側へシフトし、斜め伝搬ファイアホース不安定性が生じる可能性が示唆された。また、昨年度得られていたアルファ粒子による平行方向・斜め方向のファイアホース不安定性の解析結果をPhys. Plasmas誌上にて発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。9月末からの研究開始であったが、本年度は以下のような結果を得ることが出来た:(a)粒子シミュレーションを用いて電子ファイアホース不安定性が非熱的陽子を生成する過程を示した、(b)粒子シミュレーションを用いてホイッスラー不安定性によりコア電子に対して相対速度を持つ電子ハロー分布から電子ストロー分布が生成される過程を示した、(c)ブラソフ系の線形解析よりアルファ粒子と陽子間のドリフト速度差がアルファ粒子ファイアホース不安定性へ及ぼす影響(平行方向ファイアホース不安定性の成長率が伝搬方向に対して非対称になること、平行方向ファイアホース不安定性・斜め方向ファイアホース不安定性双方の成長率が上昇すること)を示した、(d)陽子温度異方性を記述するグローバル運動論モデルにおける不定性と適用限度を特定した。具体的には、(i)非一様磁場における平衡状態の決め方、(ii)非一様な背景場を考えるときの準線形理論における近似の妥当性、(iii)波の発展方程式(wave equation)における非一様性の効果とそれにより非線形発展が受ける影響、(iv)座標系に対する発展方程式及び分散関係式双方の無矛盾性、が具体的な検討課題であることを明らかにした。上記を簡単にまとめると、(1)プラズマの温度異方性や成分間の相対速度から非熱的成分が生成される過程、(2)プラズマの成分間の相対速度が温度異方性による不安定性へ与える影響、(3)太陽風プラズマのグローバルな非一様性の影響を含む運動論モデルの再構築、について幾つかの結果が得られたということになる。本年度は、太陽風プラズマが太陽から離れるにつれ膨張する効果を近似的に記述するモデル(膨張箱モデル)と2体衝突の効果を準線形理論に導入し、これらの効果が温度異方性により生じる不安定性へ及ぼす影響を調べた。また、前年度得られた成果の論文化を進め、電子のストロー分布生成の結果はApJLに掲載された。ファイアホース不安定性に関する線形解析の結果も現在投稿準備中である。議論の対象を電子やアルファ粒子の効果まで広げたため前年度の進捗はやや遅れていたが、本年度は非一様性(膨張箱モデル)の効果とクーロン衝突の効果の準線形理論への導入がスムーズに行われ、トータルの進捗状況はほぼ当初の予定通りとなった。残った課題である斜め伝搬波動を励起する不安定性の議論で電子・アルファ粒子に関する物理過程も考慮するという側面からも、現在の進捗は順調であると言える。

また、昨年度得られていたアルファ粒子による平行方向・斜め方向のファイアホース不安定性の解析結果をPhys. Plasmas誌上にて発表した。当初の計画では主に陽子の温度異方性に注目して研究を行う予定であったが、来日までの間にSeough氏が粒子シミュレーションに習熟していたため、より包括的に陽子温度異方性を議論するため、電子およびアルファ粒子分布の非熱的性質についても解析を行うことにした。実際、上記の結果(a)で触れたように電子が駆動する不安定性が陽子の非熱的成分を生成する過程や、陽子ーアルファ粒子間の相対速度差がアルファ粒子が駆動する不安定性を変質させることが発見されており、陽子の温度異方性の解明における粒子種間の相互作用の重要性が明らかになったことは大きな収穫である。当初予定していた斜めファイアホース不安定性の準線形理論解析がまだ未完了であるため進捗状況は(3)としたが、非一様モデルの検討などは順調に行われており、過度に手を広げ過ぎず堅調に進捗すれば、最終的な科学的成果は当初の計画を上回ることが期待される。準線形理論に斜め伝搬波動を励起する不安定性と熱ノイズを導入し、温度異方性-ベータ比のパラメータ空間における発展過程に対するそれらの過程の影響を議論する。28年度が最終年度であるため、記入しない。複数の粒子種・成分を取り扱うことの重要性が明らかとなったため、今後はその事実を踏まえて当初予定されていた(1)斜めファイアホース不安定性の解析、(2)磁場揺動の自発励起、(3)グローバル運動論モデルを用いた解析、を進める。(1)に関しては、出来るだけ早い段階で当初予定されていた作業(準線形解析)を終わらせ、多成分プラズマにおける粒子シミュレーションの検討を進める。(2)に関しては、近年報告された多種プラズマ中の電磁場揺動に関する理論(Navarro et al, Phys. Plasmas, 2014)も踏まえ、プラズマ中の不安定性へ与える影響について議論を行う。(3)に関しては、現在挙げられている課題について、成行とSeough氏とで分担して検討を進める。
ユマニチュードを用いた「対話的保育のための行動指針」の作成

本年度は、ユマニチュードのケア行動における「対話的」特性が、保育者の行動特性にどのように表れているかを、児童発達支援の場において検証した。今年度の研究のフィールドとした児童発達支援の実践現場は、子どもとの対話的関係性を重視し実践し、且つ効果を上げている。研究フィールドとした児童発達支援センターにおいて、保育者、保護者の承諾を得た上で、1対1の個別指導の場面における保育者の行動をビデオで記録し、映像記録を下に検証した。本調査ではレット症候群のお子さんに協力頂いた。レット症候群は、主に女児に発症し、多彩な神経症状が年齢依存性に出現する遺伝子を原因とする神経発達障害である。以前は出来ていた運動機能・言語機能を喪失する退行現象がみられ、言語によるコミュニケーションが困難であると考えられている。本調査において、保育者の行動特性を検証した結果、保育者は幼児の自己決定、意志の表出の為に時間をかけて「待つ」ことを繰り返していることが顕著に見出された。この特性を検討、考察した結果、「待つ」ことは、「待つ」側にとってはいつまで待つのか分からない不確実さの中で、その不確実さに堪えつつ、子どもへの信頼と尊重の意識を継続するという能動的行為であり、「待たれる」こととは、保育者からの注目を感じ続けることであると共に、「待たれる」に足る自己存在の価値を内在化していくことであることが示された。「待つ」行為は、ユマニチュードの基本行動には無いが、ケアに入る際の行動として示された手順には、「待つ」行動が指示されている。ユマニチュードの技術においても「待つ」行動によって、患者は自分の意志が尊重されたという心地良い感情記憶を定着させるということが示されている。「待つ」行動を能動的行為として、子ども尊重の具体的方法として意識することの必要性が示されたと言える。調査対象が障害をもつお子さんであるため、対象園のすべての保護者から録画の承諾を得られなかったこと、個別指導が月に1回であるが日程が流動的であるため、録画の機会が十分に得られなかったことなどから、研究に必要な調査内容の収集が予定通りに進まなかったことが主たる要因である。本年度と同じフィールドで調査を継続する。継続することで、保護者の方からの協力も得られ易くなっていくことが予想される。また本年度協力下さったご家族から継続して調査対象となって頂ける内諾を既に得ているため、研究のスピードアップが図れると考えている。本研究は、子どもとの個別的関わりにおいて子ども尊重を実践する行動を「対話的」関わりとし、包括的ケアメソッドである「ユマニチュード」を用いて、「対話的保育のための行動指針」を作成することを目的とする。「ユマニチュード」は、近年フランスで考案された認知症ケアのメソッドで、「優しさを伝えるケア技術」とも言われる。この技術の基本行為は「見る」「話す」「触れる」「立つ」の4つとされる。「見る」「話す」「触れる」は、ケア提供者の基本的行為であり、「立つ」はケア対象者にとっての「立つ」ことの重要性を示したものである。そこで本研究ではケア提供者の3つの基本行為に焦点を当て、この技術を保育の場において応用することによって、子ども尊重を保育の行為において具体化することを目指す。本年度は、「ユマニチュード」哲学の構造分析と、保育者と子どもとの対話的場面における保育行動の分析を行った。「ユマニチュード哲学」の第1の特徴は、ケア対象者の人間の尊厳を哲学の根本原理に据えている点である。人間とは、ケア対象者とはどのような存在かに関する人間学的考察を深めた上で、ケア行為において尊厳を侵害する行為の発生要因を明らかにしている。この考究に基づいて、ケア提供者の3つの基本行動の質の在りようと具体的方法が示される。これらの3つの行動はケアの場に限定されるものではなく、他者に対する尊重の感情を表現する具体的行為と言える。そこで、保育行為におけるこれらの状態を検討するため、保育所、幼稚園において観察調査を行った。その結果、保育者と子どもとの個別的な対話場面の出現頻度は保育カリキュラムに極めて左右されること、また、ユマニチュードにおいては好意的感情を伝える「触れる」行為が保育においては稀であり、「注意」や「制止」といった行為に付随する頻度は高いことが明らかとなった。ユマニチュードに関する情報収集に制限が生じたことが第1の原因である。現在ユマニチュードの研修は申込者が殺到しているため、介護、看護の現職者に限定しているとのことで、研修に参加することができず、具体的な行動様式に関する情報が不十分なままである。第2に、保育者の行動特性の観察において、対話的関わりの発生頻度が当初の予想よりも低かったため、「対話的関わり」の行動特性の詳細な検証対象となる場面を十分抽出することができなかったことが理由である。これは、各園の保育カリキュラムに起因するところが多く、協力園の保育方針との関連性を検討しつつ進める必要がある。本研究は、対話的保育実践のための保育者の行動指針を作成することを目的としている。対話的保育とは、保育者が子ども尊重を実践するための具体的方法であり、本研究においては、その具体的行動の在り方を、認知症介護としてフランスで開発されたケア技術「ユマニチュード」を元にして考案していく。

前年度は、保育実践の行動の基準とするユマニチュードについて、実践の原則である哲学構造とその内容について分析、整理を行い、ユマニチュードにおける介護者の基本行動である「見る」「触れる」「話す」を中心に行動の在り方と行動が伝達する意味とを検討した。またこれらの結果を踏まえ、保育者の行動特性に関する調査を開始した。本年度はまず前年度開始した調査の詳細な分析を行った。日常の保育場面を録画したビデオから、保育者の子どもに対する対話的行動を抽出し、関わりの在りようをユマニチュードの基本行動「見る」「触れる」等の行動毎に1秒単位でカウントし、時間的特徴について検討した。その結果、保育者の「見る」「触れる」行為は保育者が子どもと個別的関わりが前提であること、個別的関わりが生起しない所では子どもに対する「見る」「触れる」行為もまた生じないことが明らかとなった。また、子どもを「見る」時間と対話の対象を見る時間を比較すると、“モノ"を見る時間の方が長いことや、子どもの側からの「見る」「触れる」行為は、子どもから保育者への非言語的対話の行為であることが示唆された。これらの結果から、保育において子どもとの非言語的対話方法である「見る」「触れる」行為の重要性はまだ保育の現場において認識されていないこと、また子ども尊重の保育実践の為に、それらの行動が保育者において意識化される必要があると言える。とりわけ、保育における個人対話の重要性とその実践のためにユマニチュードを基準とした保育者の行動の在りようを示すことが極めて重要である。保育者の行動特性の分析に当初の予定以上に時間を要し、また当初の予測とは大きく異なる結果となったため、ユマニチュードに基づく行動指針を作成していく上で、調査のフィールドを再考しなければならず、その選定と決定にも時間を要したため。本年度は、ユマニチュードのケア行動における「対話的」特性が、保育者の行動特性にどのように表れているかを、児童発達支援の場において検証した。今年度の研究のフィールドとした児童発達支援の実践現場は、子どもとの対話的関係性を重視し実践し、且つ効果を上げている。研究フィールドとした児童発達支援センターにおいて、保育者、保護者の承諾を得た上で、1対1の個別指導の場面における保育者の行動をビデオで記録し、映像記録を下に検証した。本調査ではレット症候群のお子さんに協力頂いた。レット症候群は、主に女児に発症し、多彩な神経症状が年齢依存性に出現する遺伝子を原因とする神経発達障害である。以前は出来ていた運動機能・言語機能を喪失する退行現象がみられ、言語によるコミュニケーションが困難であると考えられている。本調査において、保育者の行動特性を検証した結果、保育者は幼児の自己決定、意志の表出の為に時間をかけて「待つ」ことを繰り返していることが顕著に見出された。この特性を検討、考察した結果、「待つ」ことは、「待つ」側にとってはいつまで待つのか分からない不確実さの中で、その不確実さに堪えつつ、子どもへの信頼と尊重の意識を継続するという能動的行為であり、「待たれる」こととは、保育者からの注目を感じ続けることであると共に、「待たれる」に足る自己存在の価値を内在化していくことであることが示された。「待つ」行為は、ユマニチュードの基本行動には無いが、ケアに入る際の行動として示された手順には、「待つ」行動が指示されている。ユマニチュードの技術においても「待つ」行動によって、患者は自分の意志が尊重されたという心地良い感情記憶を定着させるということが示されている。
筋および細胞骨格蛋白質の発生と心筋細胞の分化ならびにその異常

1.筋原線維形成過程におけるアクチンおよびミオシンの動態:ニワトリ胚心室筋由来の培養細胞に、ビオチン標識アクチンまたはミオシン軽鎖をmicroinjectionし、1分1時間後に抗ビオチン抗体および5nmコロイド金標識二次抗体で処理し(ある場合には銀増感も行った)、超薄切片を電子顕微鏡で観察した。アクチンを導入すると、筋原線維の近位部(末端以外の部分)ではそのA帯レベルの周辺が標識され、またミオシンを導入すると、I帯レベル(特にA-I接合部付近)が標識された。このことは、アクチンとミオシンの重合は、相互の蛋白質の存在下に起こることが考えられ、この機構で筋原線維の直径が増加することが考えられた。また筋原線維の遠位部(末端)では、終末筋節の終末アクチンフィラメントの存在する部位に両蛋白質の取り込みがみえ、この部において活発なフィラメント形成と代謝回転の起こっていることが考えられた。さらに、筋原線維の延長線上にも膜と密接な関係をもってアクチン分子が集合しているのがみえ、これは筋原線維の延長と、初期のアクチンフィラメント束の形成に関係していることが考えられた。2.心筋型トロポニンI(CTnI)cDNAの幼若骨格筋細胞への導入による筋原線維形成機構の解析:胚骨格筋細胞ではCTnIの発現はみられない。そこで培養幼若骨格筋細胞およびC2C12細胞にCTnIのcDNA(ほぼ全長)を導入(lipofection法)してCTnIを強制発現させることにより、筋原線維形成機構を解析した。導入した細胞をCTnI抗体で免疫蛍光染色すると、横紋のない線維束は反応したが、明らかな横紋のある筋原線維は反応しなかった。すなわち成熟筋原線維には、そこに本来(発生期にも、成熟しても)存在しないCTnIの取り込みを阻止または取り込まれたものを排除するような機構が存在すると考えられた。
ＥＰＳ生産性窒素固定エンドファイトによるイネの生育促進と分子メカニズム

本研究は、EPS生産性エンドファイトによる窒素固定能を利用したイネの生育促進を目的とする。そのために申請者が単離したBurkholderia vietnamiensis RS1株をEPS生産性エンドファイトのモデル菌株として、窒素固定やイネの生育を促進するメカニズムとこれらに寄与するEPSの機能を解明する。1. RS1株によるイネの生育促進メカニズムの解明育苗培土に播種したイネ種子にRS1株の菌懸濁液を接種し、21日間栽培した結果、RS1株を接種したイネ苗では乾物重が有意に増加した。また総根長や平均根直径、および総窒素吸収量もRS1株の接種により増加した。RNA-seq解析の結果から、RS1株は、植物ホルモンを介した根系の発達や、硝酸トランスポーターおよびアンモニウムトランスポーターの発現誘導による土壌からの窒素吸収促進によってイネの生育を促進すると示唆された。2. RS1株の分泌する菌対外多糖類(EPS)の役割の解明RS1株におけるEPS生成と窒素固定活性の関連性を明らかにするため、大気酸素濃度条件でEPSを生産しない変異株の作出を試みた。変異体群のスクリーニングの結果、大気酸素濃度条件下でも液体培地を固化しない1変異体が選抜された。この変異体では、野生株と比較して、窒素固定活性(ARA)および窒素固定関連遺伝子(nifH、nifD、nifK)の発現が顕著に低下していた。さらにインバースPCR法によってトランスポゾン挿入部位を調べたところ、膜タンパク質であるDsbDをコードする遺伝子dsbDにトランスポゾンが挿入されていることが明らかとなった。以上の結果からdsbD遺伝子がEPSの生成や分泌に関与し、酸素存在下における窒素固定活性の維持に不可欠であることが示唆された。EPS変異株の作出を完了した。RS1株によるイネ生育促進のメカニズムを明らかにした。今後は作出したEPS変異株(ΔdsbD)を用いて、植物根への接着、および植物体内での窒素固定や生育促進におけるEPSの機能を明らかにする。