hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工多能性幹細胞由来のマクロファージ様免疫抑制性細胞を用いたぶどう膜網膜炎の制御

In vivoでは、マウスiPS細胞から誘導したマクロファージ様免疫抑制細胞(iPS-SCs)のマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(EAU)に対する最適な投与時期について検証した。これまでは免疫の1日前にiPS-SCsを1回投与(1×106個/匹)していたが、臨床学的重症度ではiPS-SCsの投与群では対照群に比べてEAUを有意に抑制していたが、組織学的重症度では有意差は認められなかった。1回投与では日数が経つと効果がなくなってしまう可能性を考え、投与時期を免疫の1日前と6日後の2回投与(5×105個/匹)に変更した。結果は、臨床学的重症度では免疫後11日目で有意差が認められ、摘出した眼球のHE染色による組織学的重症度でもiPS-SCs投与群では対照群に比べて有意に軽症化していた。In vitroでは、免疫後9日目のマウスのリンパ節からペプチド抗原特異的なCD4+T細胞を抽出し、そこに抗原とナイーブマウス脾臓由来の抗原提示細胞とiPS-SCsを加えて共培養し、4日後にフローサトメーターでCD4+T細胞の増殖反応について検討した。iPS-SCsを加えた群では、対照群に比べて有意に抗原特異的なCD4+T細胞の増殖は抑制された。さらに、培養上清中の炎症性サイトカインについても検討した。ぶどう膜炎の病態に関与しているといわれているTh1サイトカインであるTNF-αやIFN-γはiPS-SCs投与群では対照群に比べて有意に減少していた。一方で、iPS-SCs投与群ではTh2サイトカインではIL-13が、Th17サイトカインではIL-17AとIL-17Fが有意に上昇し、それ以外にはTGF-β1と亜硝酸(NO2-)が有意に上昇していた。また、iPS-SCsは、他の細胞との接着がなくてもCD4+T細胞の増殖を抑制したことから、NO2-などの何らかの液性因子が関与していることが示唆された。マウスiPS細胞からマクロファージ様免疫抑制性細胞(iPS-SCs)を誘導し、iPS-SCsの免疫抑制能についてリンパ球混合試験にて確認した。次にマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(EAU)をiPS-SCsにより抑制できるかどうかを検証した。1回目の実験では6週齢のオスのマウス(C57BL/6)10匹を用いて(コントロール群:5匹、治療群:5匹)検討した。マウスEAUを作製するためにヒト視細胞間レチノイド結合蛋白由来合成ペプチド(hIRBP1-20)を皮下投与する(免疫)が、その1日前にコントロール群の5匹にはPBSを、治療群の5匹にはiPS-SCs(7.5×105個/匹)を腹腔内投与した。免疫1週間後から3ー4日毎に眼底検査を行い臨床スコアをつけ、21日後に眼球摘出し組織学的スコアをつけた。1回目の実験の臨床スコアでは免疫後7日目、11日目、14日目ではコントロール群と治療群の間に有意な差は見られなかったが、17日目と21日目には治療群の臨床スコアはコントロール群に比べて有意に抑制されていた。しかしながら組織学的スコアでは両群に有意な差は見られなかった。2回目の実験はマウス11匹(コントロール群:6匹、治療群:5匹)においておこなった。免疫後7日目、14日目、17日目、21日目には臨床スコアに両群間で有意な差は見られず、10日目のみ治療群の臨床スコアはコントロール群に比べて有意に抑制されていた。組織学的スコアは2回目の実験でも有意な差はみられなかった。今後は3回目の同様の実験を行うと同時に、iPS-SCsの炎症抑制効果についてin vitroで検証する。免疫後のマウスリンパ節から抽出したT細胞、抗原提示細胞、抗原(hIRBP)とともにiPS-SCsを共培養することでT細胞の増殖を抑制できるかを検証する予定である。我々の研究室で以前よりおこなっているマウスEAUの誘導は問題なくおこなわれているが、iPS-SCsをマウスへ移入するための細胞培養に予定よりも時間がかかっている。これまで2回の実験をおこなうことができたが、iPS-SCsの必要細胞数の確保が遅れているため、3回目の実験、in vitroの実験が少し遅れている。In vitroの実験では、免疫後のマウスリンパ節から抽出したCD4+T細胞、抗原提示細胞(脾臓細胞)、抗原(hIRBP1-20ペプチド)とともにiPS細胞由来マクロファージ様免疫抑制性細胞(iPS-SCs)を共培養することで抗原特異的なCD4+T細胞の増殖を抑制できるかを検証し、iPS-SCsの炎症抑制効果について調べた。結果、iPS-SCsの細胞数に依存してCD4+T細胞の増殖を抑制することがわかった。さらに、iPS-SCsはiNOSを発現し、NOを産生することによってT細胞の活性化を抑制することがすでに報告されている。本実験でも、培養上清のNO濃度を測定したところ、iPS-SCs細胞数依存的にNO濃度が高値であることがわかった。次にin vivoの実験ではマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(EAU)をiPS-SCsにより抑制できるかどうかを検証した。EAUを作成するために、マウスに免疫を行う1日前に、治療群ではiPS-SCsを腹腔内投与し、無治療群にはPBSを投与した。

その後1週間後から3-4日毎に眼底検査を行い、臨床スコアをつけ、炎症の強さを評価した。21日後に眼球摘出を行い、HE染色を行い、組織学的スコアをつけ、炎症の強さを組織学的にも評価した。昨年度は2回にわたり同実験を行ってきたが、今年度行った3回目の実験では、治療群ではiPS-SCsの細胞数は1×10^6個/匹で検討を行ったところ、臨床スコアは13日目(P = 0.0072)、17日目(P = 0.01)、21日目(P = 0.0094)で両群間に有意差が認められた。一方、組織学的スコアではP = 0.49と有意差は認めなかった。今後は、同実験を再度行うとともに、iPS-SCsの細胞数や投与時期の検討も行っていく予定である。iPS-SCsによるEAU抑制効果が当初予想していたよりも弱いことにより、臨床スコアは有意差が確認されたが組織学的スコアでは有意差が得られていない。iPS-SCsによるEAU抑制メカニズムについて今後検証していく予定である。In vivoでは、マウスiPS細胞から誘導したマクロファージ様免疫抑制細胞(iPS-SCs)のマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(EAU)に対する最適な投与時期について検証した。これまでは免疫の1日前にiPS-SCsを1回投与(1×106個/匹)していたが、臨床学的重症度ではiPS-SCsの投与群では対照群に比べてEAUを有意に抑制していたが、組織学的重症度では有意差は認められなかった。1回投与では日数が経つと効果がなくなってしまう可能性を考え、投与時期を免疫の1日前と6日後の2回投与(5×105個/匹)に変更した。結果は、臨床学的重症度では免疫後11日目で有意差が認められ、摘出した眼球のHE染色による組織学的重症度でもiPS-SCs投与群では対照群に比べて有意に軽症化していた。In vitroでは、免疫後9日目のマウスのリンパ節からペプチド抗原特異的なCD4+T細胞を抽出し、そこに抗原とナイーブマウス脾臓由来の抗原提示細胞とiPS-SCsを加えて共培養し、4日後にフローサトメーターでCD4+T細胞の増殖反応について検討した。iPS-SCsを加えた群では、対照群に比べて有意に抗原特異的なCD4+T細胞の増殖は抑制された。さらに、培養上清中の炎症性サイトカインについても検討した。ぶどう膜炎の病態に関与しているといわれているTh1サイトカインであるTNF-αやIFN-γはiPS-SCs投与群では対照群に比べて有意に減少していた。一方で、iPS-SCs投与群ではTh2サイトカインではIL-13が、Th17サイトカインではIL-17AとIL-17Fが有意に上昇し、それ以外にはTGF-β1と亜硝酸(NO2-)が有意に上昇していた。また、iPS-SCsは、他の細胞との接着がなくてもCD4+T細胞の増殖を抑制したことから、NO2-などの何らかの液性因子が関与していることが示唆された。これまで行ってきた2回の実験による臨床スコアの結果から、1回目はiPS-SCs投与群と非投与群で有意な差が見られたが、2回目は有意な差は見られなかった。そこで、3回目の実験をおこなうとともに、iPS-SCs投与の時期について検討をおこなうこととする。これまで行ってきた3回のマウスを用いた実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(EAU)において、臨床スコアではiPS細胞由来マクロファージ様免疫抑制性細胞(iPS-SCs)投与が有意にぶどう膜炎を抑制していた(1回目は21日目に有意差あり、2回目は有意差なし、3回目は13日目、17日目、21日目で有意差あり)、組織スコアではiPS-SCs非投与群との間に有意差が認められなかった。
慢性炎症性肺疾患におけるCCL18の機能的役割と意義

本研究では、慢性炎症性肺疾患におけるCCL18の役割について着目し、その機能的意義の解明の為に統計遺伝学的手法を用いて研究を進めた。健常者625名、喘息患者513名、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者267名、サルコイドーシス患者327名を対象に、CCL18遺伝子における-87T/C(rs2015086)と4964C/T(rs712043)の遺伝子型についてダイレクトシークエンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem Foster City, CA, USA)を用いて決定した。rs712043ではDominant modelにおいて、性別・年齢・喫煙歴・アトピー素因とは独立して喘息発症に抑制的に働く可能性が示された(OR;0.79,95%CI;0.62-0.99)。またCOPD、サルコイドーシス患者におけるアレル頻度、対立遺伝子型の割合は、健常者と比べて有意な差を認めなかったが、rs2015086におけるDominant modelでは、COPD患者を前向きに5年間経過観察した後の1秒率の低下が有意に少なく(TT0.53L(0.24-0.78L),TC-CC0.46L(0.27-0.69),P=0.015)、SGRQスコアも有意に高値であった(TT29.8(0-86.7),TC-CC36.6(7.7-70.1),P=0.034)。CCL18遺伝子におけるrs712043は喘息発症と関連する可能性が推測され、rs2015086はCOPDにおける1秒率低下、QOLスコア(SGRQ)と関連する可能性が推測された。
舌圧測定装置を用いた新しい嚥下機能検査法の開発

目的:高齢者のQOLを低下させる嚥下障害は口腔期の問題に起因しているものが多く,口腔期の中心的な役割を担う舌との関係が注目されています.舌機能評価のうち,随意的に発揮できる最大の舌圧(最大舌圧)は近年,舌機能の指標としての有用性が報告されており,簡易型舌圧測定装置による評価法は確立されてきています。本研究は,ディスポーザブルの口腔内プローブを用いた簡易型舌圧測定装置により嚥下舌圧を測定する方法を確立し,これを用いて嚥下時の舌機能を検討することを目的としました。方法:対象者は脳血管障害や神経筋疾患等の既往のない者303名(男性143名,女性160名,18-89歳)とした。簡易型舌圧測定装置を用いて嚥下舌圧の測定を行い,嚥下機能を評価するための指標として「嚥下舌圧の最大値」,「舌の予備能力」,「波形のピーク数」,「嚥下舌圧の持続時間」および「嚥下舌圧の積分値」を求めた。これらが年齢,性別および嚥下機能により受ける影響について検討を行った。結果:今回開発した嚥下舌圧測定法での分析項目のうち、嚥下舌圧の最大値は年齢,性別および嚥下機能のいずれの影響も認められなかった。その他の項目では年齢および嚥下機能による影響が認められた。ロジスティック回帰分析から波形のピーク数,嚥下舌圧の持続時間および嚥下舌圧の積分値が嚥下機能評価と有意に関連のある項目であることが明らかとなった。結論:嚥下障害に対するスクリーニング法のひとつに本舌圧測定装置を用いた舌機能評価を利用できうる可能性が示された。予備的研究として簡易型舌圧測定装置を用いて嚥下時の舌圧波形を測定し、既存の嚥下評価法との関係を明らかにして、嚥下機能評価としての舌圧波形分析の有用性を検討した。被験者には、本学附属病院受診患者15名(53-86歳、男性5名、女性11名)および特別養護老人施設に通所する要支援・要介護度1-3の高齢者17名(73-90歳、男性3名、女性14名)の協力を得た。各被験者に反復唾液嚥下テスト(RSST)および水のみテストによる嚥下機能評価を行った後、簡易型舌圧測定装置(ALNIC社製TPS-350)を用いて最大舌圧と水5mlの嚥下舌圧を3回ずつ測定した。嚥下舌圧測定時には被験者にプローブの受圧部(初期内圧:4.9kPa)をくわえたまま水5mlを嚥下するように指示した。嚥下時の舌圧波形の観察・記録は、測定装置からの出力をパーソナルコンピュータに取り込んで行い、圧力の最大値および変曲点(以下ピークとする)の数を求めた。RSST3回以上の正常群は13名、2回以下の異常群は19名、水のみテストで嚥下時間5秒以下の正常群は16名、5秒より長い異常群は16名であった。最大舌圧(33.0±9.4kPa)と嚥下舌圧(11.9±7.7kPa)の間には有意な相関が認められた(r=0.62)。RSST正常群と異常群の間に嚥下舌圧の差は認められなかったが、水のみテスト正常群に比べて異常群ではピーク数が多く波形に差がみられた(4.3±2.4 vs 8.8±6.7、P<0.05)。以上の結果より、本測定装置を用いた嚥下時舌圧の波形分析が嚥下機能評価の一助となる可能性が示唆された。予備的研究として上記の様な結果を得たため、現在まで、大規模集団660名(23-99歳、男性207名、女性453名)の嚥下舌圧など必要項目の測定を終了し、より詳細な嚥下舌圧の波形分析を行っている。

結果:今回開発した嚥下舌圧測定法での分析項目のうち、嚥下舌圧の最大値は年齢,性別および嚥下機能のいずれの影響も認められなかった。その他の項目では年齢および嚥下機能による影響が認められた。ロジスティック回帰分析から波形のピーク数,嚥下舌圧の持続時間および嚥下舌圧の積分値が嚥下機能評価と有意に関連のある項目であることが明らかとなった。結論:嚥下障害に対するスクリーニング法のひとつに本舌圧測定装置を用いた舌機能評価を利用できうる可能性が示された。
現代アフリカの国家統治：ケニアの人獣共通感染症対策を事例として

近年アフリカの国々では、人獣共通感染症の対策が策定、実施されている。この問題については、多様な分野の専門家が分野の境界線を越えて連携する動きが広がっている。そうしたなかで、感染症対策において人間と非人間の動物の生存と健康や、それらに関する知識がどのように「もつれあっている」のかへの関心が、人類学者のあいだで高まっている。本研究では、ケニアのリフトバレー熱対策を事例としながら、人獣共通感染症対策が策定され、実施される過程で人間と非人間がどのように「もつれあっている」のかを明らかにすることを試みる。それによってこの地域の国家を非人間を含む生き物の集合的な統治という視点から捉えなおすことを試みる。
星間雲での光化学反応によるダイヤモンドの生成機構

隕石中のプレソーラーダイヤモンドおよび星間雲で観測されているダイヤモンドの起源を解明するために,星間雲で氷に紫外線が照射されて有機物ができる過程,およびその有機物がさらに低密度雲で紫外線を照射される過程を再現する実験をおこなった.超高真空容器中の金属板をヘリウム冷凍機で12Kに冷却する.H20:CO:NH3:CH4=4:2:2:1に混合したガスを真空容器中に導入し,アモルファス氷の薄膜を作った.氷薄膜に紫外線を10Kで照射し,照射終了後,金属板の温度を室温まで上昇させた.アモルファス氷は200Kまでに蒸発し,室温でも蒸発しない有機物が残った.その有機物が低密度雲でさらに紫外線照射を受ける過程を再現する実験も行った.生成された有機物の高分解能透過型電子顕微鏡観察の結果,分子雲で生成された有機物中に1nm程度のダイヤモンド微結晶(ダイヤモンド前駆体)が生成されたことが明らかになった.これはまったく新しいダイヤモンドの生成法であり,これまでの常識を覆す発見である.さらに,低密度雲でのさらなる紫外線照射によりダイヤモンドが5nm程度まで成長することがわかった.以上の結果から,隕石中のいわゆるプレソーラーダイヤモンドは,炭素星や超新星起源ではなく,星間雲起源だと考えるとこれまで問題になっている事を無理なく説明できることが明らかになった.隕石中のプレソーラーダイヤモンドおよび星間雲で観測されているダイヤモンドの起源を解明するために,星間雲で氷に紫外線が照射されて有機物ができる過程,およびその有機物がさらに低密度雲で紫外線を照射される過程を再現する実験をおこなった.超高真空容器中の金属板をヘリウム冷凍機で12Kに冷却する.H20:CO:NH3:CH4=4:2:2:1に混合したガスを真空容器中に導入し,アモルファス氷の薄膜を作った.氷薄膜に紫外線を10Kで照射し,照射終了後,金属板の温度を室温まで上昇させた.アモルファス氷は200Kまでに蒸発し,室温でも蒸発しない有機物が残った.その有機物が低密度雲でさらに紫外線照射を受ける過程を再現する実験も行った.生成された有機物の高分解能透過型電子顕微鏡観察の結果,分子雲で生成された有機物中に1nm程度のダイヤモンド微結晶(ダイヤモンド前駆体)が生成されたことが明らかになった.これはまったく新しいダイヤモンドの生成法であり,これまでの常識を覆す発見である.さらに,低密度雲でのさらなる紫外線照射によりダイヤモンドが5nm程度まで成長することがわかった.以上の結果から,隕石中のいわゆるプレソーラーダイヤモンドは,炭素星や超新星起源ではなく,星間雲起源だと考えるとこれまで問題になっている事を無理なく説明できることが明らかになった.ダイヤモンドの合成法としては,高圧法,CVD法の2通りの方法が知られている.私たちは,10Kでアモルファス氷(H_2O, CO, CH_4,NH_3)に紫外線を照射すると1-2nmのダイヤモンドが生成されることを発見した(Kouchi et al.,準備中).これはまったく新しいダイヤモンドの生成法であり,これまでの常識を覆す発見である.しかし,最終的な生成物のみを透過型電子顕微鏡で観察しただけなので,ダイヤモンドの生成機構は不明のままである.そこで,本研究計画では,高感度反射赤外分光法を適用したin-situ分光により,ダイヤモンドの生成機構を議論する上で重要となる基礎データを取得しようとするものである.平成15年度は以下の研究を行った:1)極低温超高真空光化学反応装置の改良現有の極低温超高真空光化学反応装置を改良し,真空度の向上および試料からの蒸発ガスの分析が可能となるようなシステムを製作した.2)高感度反射赤外分光システムの製作現有のFTIRおよび高感度反射用の外部光学系を1)の装置に適合するように改造し,アモルファス氷薄膜および有機物薄膜の赤外線吸収スペクトルの変化を高感度に測定できるようにした.3)有機物の作製実験アモルファス氷(H_2O, CO, CH_4,NH_3)を10Kの金属基板上に作製し,それに紫外線を照射する.照射終了後,基板の温度を室温まで上昇させ,有機物の薄膜を作製した.隕石中のプレソーラーダイヤモンドおよび星間雲で観測されているダイヤモンドの起源を解明するために,星間雲で氷に紫外線が照射されて有機物ができる過程,およびその有機物がさらに低密度雲で紫外線を照射される過程を再現する実験をおこなった.超高真空容器中の金属板をヘリウム冷凍機で12Kに冷却する.H2O:CO:NH3:CH4=4:2:2:1に混合したガスを真空容器中に導入し,アモルファス氷の薄膜を作った.氷薄膜に紫外線を10Kで照射し,照射終了後,金属板の温度を室温まで上昇させた.アモルファス氷は200Kまでに蒸発し,室温でも蒸発しない有機物が残った.その有機物が低密度雲でさらに紫外線照射を受ける過程を再現する実験も行った.生成された有機物の高分解能透過型電子顕微鏡観察の結果,分子雲で生成された有機物中に1nm程度のダイヤモンド微結晶(ダイヤモンド前駆体)が生成されたことが明らかになった.これはまったく新しいダイヤモンドの生成法であり,これまでの常識を覆す発見である.

さらに,低密度雲でのさらなる紫外線照射によりダイヤモンドが5nm程度まで成長することがわかった.以上の結果から,隕石中のいわゆるプレソーラーダイヤモンドは,炭素星や超新星起源ではなく,星間雲起源だと考えるとこれまで問題になっている事を無理なく説明できることが明らかになった.
細胞侵入性細菌における菌体のユビキチン化関連因子の解析

損傷を受けたミトコンドリアや変性タンパク質からなる細胞内凝集体と同様に、細胞内侵入性細菌に付加されたポリユビキチン鎖はオートファジーによって分解・除去すべき異物認識のための目印となる。本研究では、リステリア(Listeria monocytogenes) actA欠損株に対するユビキチン化機構の解明を試みた。LC-MS/MS解析の結果、actA欠損株のユビキチン化に関わる可能性のある3種類のユビキチンリガーゼ(E3)が得られた。actA欠損株感染細胞内におけるこれらE3の局在を観察したところ、菌体のユビキチン化が始まる感染1時間後に1つのE3が菌体周囲に集積していることが分かった。リステリアは宿主細胞内に侵入後、菌体表面に発現したActAタンパク質により宿主タンパク質を積極的に集積することで宿主の細胞骨格を再構築し、その推進力を利用して細胞内を運動する。ActAタンパク質が菌体表面に発現しない、または菌体表面に発現していても機能的に宿主タンパク質を集積できない場合、菌体が宿主細胞のユビキチン修飾系により直接ユビキチン化される。これが発端となり、ユビキチン化されたリステリアは細胞内分解系の一つであるオートファジーにより認識され、選択的に捕捉・分解される。そこで本研究では、宿主タンパク質を集積できないリステリア菌体側のユビキチン修飾を受ける分子や宿主側のユビキチン修飾分子の同定および解析を試み、ユビキチン修飾系の宿主細胞の自然免疫システムにおける役割の解明を目的とした。本年度は、前年度までに得られた菌側候補因子についてさらに解析を行った。菌側候補因子について、リコンビナントタンパク質を作製し、これらを用いてin vitroで直接的なユビキチン化を観察することができた。しかし、いずれも宿主細胞内での菌体表面における発現は観察されなかった。また、酵母Two-Hybridシステムにおいても菌側候補因子と結合する宿主タンパク質は確認されなかった。以上の結果から、菌体表面に発現する分子が直接宿主細胞のユビキチン修飾系に認識されているのでなく、ActAタンパク質がない、または機能しない場合に菌体表面に結合する宿主細胞タンパク質を通して間接的にユビキチン化されている可能性が高いことが判った。細胞内侵入性細菌であるリステリアは、細胞内運動性に関与するActAタンパク質により宿主タンパク質を菌体周囲に積極的に集積することで、オートファジーを回避する。欠損または機能不全により、ActAタンパク質が宿主タンパク質を集積できない場合、菌体が直接ユビキチン化され、細胞内分解系の一つであるオートファジーにより選択的に捕捉・分解される。また、サルモネラなどリステリア以外の細胞内侵入性細菌でも、菌体のユビキチン化がオートファジーによる菌体の認識に重要な役割を果たすことが報告されている。しかしながら、直接的な菌体へのユビキチン化の機序は未だ明らかでない。そこで本研究では、リステリア菌体側のユビキチン修飾を受ける分子や宿主側のユビキチン修飾分子の同定および解析を試み、ユビキチン修飾系の宿主細胞の自然免疫システムにおける役割の解明を目的とした。まず、in vitroユビキチネーションアッセイと液体クロマトグラフィー質量分析法を組み合わせた方法にて得られた、リステリア菌体側の2種類の候補分子について解析を行った。それぞれリコンビナントタンパク質を作製し、in vitroユビキチネーションアッセイを試みたところ、このうち1種類の菌体側因子が直接ユビキチン化を受けることが分かった。しかしながら、この候補因子の菌体表面での発現は、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光抗体法では観察されなかった。また、平行して、得られた宿主側の候補因子について解析を行った。RNAi法にてそれぞれ宿主側候補因子の発現をノックダウンさせたMDCK細胞に、オートファジーに認識されるリステリアactA変異株を感染させた。その結果、ノックダウンにより、菌の宿主細胞への侵入効率およびユビキチン化される菌体の割合を低下させる候補因子が存在することが分かった。リステリアは細胞内に侵入すると、菌体表面に発現したActAタンパク質により宿主タンパク質を積極的に集積させ、細胞内を運動する。しかし、ActAタンパク質の欠損または機能不全により、菌体周囲に宿主タンパク質を集積できない場合、菌体は直接ユビキチン化され、選択的オートファジーによる分解が誘導される。しかしながら、直接的なリステリア菌体へのユビキチン化の機序は未だ明らかでない。そこで本研究では、リステリア菌体のユビキチン修飾に関わる分子の同定およびその機能解析を通し、宿主細胞の自然免疫システムにおける役割の選択的オートファジーの認識機構の解明を目的とした。in vitroユビキチネーションアッセイと液体クロマトグラフィー質量分析法を組み合わせた方法にて、菌体のユビキチン化に関わる候補分子が得られたが、このうち、リステリア側の分子はいずれも菌体表面に発現していることは確認できなかった。

昨年度までに、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来MDCK細胞において、宿主側候補因子の一つであるユビキチンリガーゼの発現をノックダウンすると、ActA欠損株の宿主細胞への侵入効率およびユビキチン化される菌体の割合が低下することが分かっている。しかし、MDCK細胞に対して、市販の抗体が反応せず、解析が困難であった。そこで、宿主細胞をヒト結腸がん由来SW480細胞に変更し、MDCK細胞と同様に効率良くActA欠損株に対するオートファジーが誘導されることを確認したうえで、このユビキチンリガーゼの挙動を解析したところ、菌体のユビキチン化の開始と同時期である感染1時間後から、ActA欠損株の菌体周囲に集積することが分かった。医歯薬学本研究では当初、菌体成分および宿主細胞成分の両方を対象としており、その候補分子の数が膨大であった。本年度の結果より、菌体側候補分子が直接的なユビキチン化の標的となっていない可能性が強く示唆されたことから、対象を宿主細胞側の因子に絞ることができた。また、これらの遺伝子発現解析のためにリアルタイムPCR装置の設置が完了している。in vitroユビキチネーションアッセイの後に、6 Mグアニジン添加による変性条件下でユビキチン化タンパクを精製し、得られた2種類のリステリアのユビキチン化に関連する菌側因子をさらに解析した。その結果、いずれも菌体表面にて、直接的にユビキチン化の標的となる証拠は観察されなかった。このことから、宿主細胞内でリステリアの菌体表面の構造は、直接ユビキチン化を受けていない可能性が示唆された。したがって、in vitroユビキチネーションアッセイ後、非変性条件下でユビキチン化タンパク質の精製を行い、菌体表面に結合している宿主ユビキチン化タンパク質を含め、さらに網羅的な解析が望まれる。細胞内運動性に関与する宿主タンパク質を集積できないリステリアがユビキチン化を受け、オートファジーに認識されることを合わせると、菌体の間接的なユビキチン化を仲介する宿主タンパク質は、細胞侵入性細菌の細胞内センサーとして機能している可能性が考えられる。宿主側の候補因子の探索では、ノックダウンにより、リステリアの宿主細胞への侵入効率およびユビキチン化される菌体の割合が低下した候補因子が得られた。in vitroユビキチネーションアッセイにて、この候補因子が直接的に菌体のユビキチン化に関与している証拠が得られるならば、宿主細胞の病原体に対する防御機能のさらなる解明につながるものと期待される。リステリアの感染時における宿主細胞側因子の挙動解析に焦点を当てる。これまでは、リステリアactA変異株のユビキチン化およびオートファジーを最も観察しやすいMDCK細胞を用いていたが、遺伝子導入や遺伝子発現解析時に操作上困難な点が多かったことから、宿主側候補因子の発現ベクターをHeLa細胞など別の培養細胞株に導入し、恒常的に過剰発現させた細胞を用いて解析する。リステリア菌体のユビキチン化に関与する因子の探索において、ユビキチン化タンパク質の精製を非変性条件下でのプルダウンアッセイでも行い、液体クロマトグラフィー質量分析法で解析する。
生活研究生成期における生活概念の形成と変容過程

生成期(1910年代1930年代)の生活研究の特徴と生活概念の内容を、大阪時代の大原社会問題研究所を軸として考察した。1.この時期の生活研究は社会事業や都市政策の模索および労働と生活のあり方に関する労働者・企業経営者双方の試み、社会科学の成立と関連しつつ展開されたことを特徴としている。大原社研は設立経緯からも研究活動の面でも、これら諸要因の交錯をよく示している。2.大原社研の生活研究は近代的労働者の生活変動分析であり、労働者の主体性の主張と体制・階級の矛盾への批判を特徴とする。しかし、研究の視点・理論と事実発見の手法が乖離し、生活概念の媒介の側面が意識化されず、ミクロレベルの現象を把握できなかったところに課題を指摘することができる。3.生活研究生成期は救済事業から社会事業への移行期でもある。社会事業を支える思想についてさまざまな立場から論争されたが、現場従事者や社会事業実践にはほとんど影響を与えず、後者では「天皇の赤子」としての対象への「聖恩仁慈」という受け取り方が濃厚であった。社会事業の対象課題は貧困問題に集中するが、生活・生活者に対する認識や分析方法への意識化はなされていない。4.倉敷紡績を近代的企業に成長させた大原孫三郎は、企業経営だけでなく、社会事業等の社会的活動に力を注いだ。企業活動によって蓄積した資本を、企業と労働者の共同の利益を実現する為に、労働者や社会の為に利用することを本気で考えた経営者である。そして、労働者や社会の生活の安定を図ることによって、能率的労働を確保し、経営効率を高めるという、労使の利益の一致点を見出している。そうした、大原孫三郎の経営理念は、何を基準として形成されているのか、大原家の経営理念と孫三郎の天職概念をもとに分析、彼の経営思想を明らかにした。本年度は、1910年代1930年代における生活概念の形成過程を中心に検討した。結果を要約すれば次の通りである。1、この時期の生活研究が社会事業や都市政策の模索および労働と生活のあり方に関する労働者・企業経営者双方の試みと関連しつつ展開されたことを、改めて確認した。大原社会問題研究所は設立経緯からも研究活動の面でも、これら諸要因の交錯を非常によく示している事例である。2、1923年1936年に『大原社会問題研究所雑誌』に掲載された生活研究に属する論文の「生活」概念は、生活者=近代的労働者の生活変動を基盤とし、労働者の主体性の主張と体制および階級の矛盾への批判とを含んでいる。背景にはイギリスの社会改良思想の影響が観察される。また、生活問題解決にあたって当事者の自己教育と連帯による組織的取り組みの必要性を強調していることも特徴と言えるが、実際の分析枠組にはほとんど組み込まれていない。3、社会福祉事業の対象としては「生活問題」という用語が使われてきたが、厳密な定義や分析がなされていない。実際上は貧困問題に注意を集中させており、研究対象が労働能力を欠く者に限定され、労働問題ないし社会問題と生活問題が分離していく結果となっている。4、倉敷紡績は、地場資本が中央資本にまで成長した点、資本の側が生活者の貧困の克服という命題を掲げて企業活動を行った点で、注目に値する。大原孫三郎の社会的活動を支えた経済的基盤を確認するとともに、その企業経営理念におけるイギリス社会改良思想の影響を明らかにした。1.初期(1910年代30年代)生活研究における生活概念の論理構成およびその変容にかかわる内的要因の分析を行った。(1)具体的に取り上げたのは権田保之助の生活論である。

権田の"生活"は分析概念ではなく当為概念である。その基本要素は民衆(=近代的労働者)の自立性と総体性および体制からの自律である。(2)後半期には論理構成そのものが変化し、「国民」と教化・指導が構成要素となっている。同時に、労働関係が前提から欠落している。(3)生活思想としては労働者の自己教育と連帯が重視されているが概念構成要素にはなっておらず、家計分析や地域調査にも活かされていない。この点の不備が後半の概念変容を容易にしたと言える。2.この時期の社会福祉・社会事業における生活問題認識の特徴と問題点を明らかにした。(1)社会事業の対象=生活問題=貧困問題という認識は一貫しており、上記1.のような転換は見られない。ただ、生活研究全般の変化に応じて労働・労働関係に対する視点は一層薄れている。(2)前半期にはイギリス社会改良思想の導入が図られているが、前項(1)(2)の流れの中で労働・住宅・医療などを含めた総合的な地域分析・政策という考え方が定着せず、社会福祉・社会事業のその後の展開に重大な影響を及ぼしたと言える。3.大原孫三郎の経営思想と社会事業思想を検討した。(1)大原の企業経営と社会的事業に通底する理念は非キリスト教的・合理的科学主義であることを、各種資料の比較考察によって明らかにした。(2)労働者の生活全体の質の向上や利潤の社会的還元などの考え方はオーエンのそれと類似性が認められる。ただし、自立的コミュニティの形成については大原では明確ではない。また、大原の企業経営・企業の社会貢献のあり方は社会的に継承されていない。なお、オーエンとイギリス社会事業思想との関連については社会福祉セミナー(2004年3月、於福岡市)で口頭発表した。1.1930年代までの大原社会問題研究所に関わりを持った社会学者としては、米田庄太郎、新明正道、戸田貞三が挙げられる。新明、戸田の関わりはごく短期間で大原社会問題研究所からみると小さなエピソードに過ぎないと言える。これには偶然的な要素とともに基本的な社会観・イデオロギーと社会分析の方法論の相違が大きく作用していたと考えられる。また、米田は今日ではほとんど忘れられた社会学者であるが、米田門下生が大阪・京都の生活調査を担ったことは初期生活研究の中で特筆に値する。2.大原社会問題研究所を含め初期生活調査・生活研究は、都市問題への基本的認識やテーマの設定を開拓すると同時に都市生活の解明に膨大なモノグラフを残しており、都市社会学の源流としての役割は正当に位置付けられるべきである。たとえば磯村英一は、さまざまな調査や都市行政を通して、大原社会問題研究所の研究や研究員と直接的・間接的に交流があり、その業績は初期生活研究の特徴(「都市」や「労働者」、「社会病理」などに対する問題意識の鋭さや理論的枠組みの未完も含めて)を最もよく引き継いでいると思われる。3.大原孫三郎の企業経営と社会思想に関して、今期明らかにしたのは、大原孫三郎の経営の中核となる巨大地主としての大原と近代産業の紡績会社社長としての大原の経営理念と社会思想である。その思想の鍵は、孫三郎が設立した大原農業研究所(大原奨農会)、社会問題研究所、労働科学研究所や石井十次記念愛染園等の石井十次関連の社会事業を通して見えてくる徹底した科学尊重主義である。これまでキリスト教社会主義者等とカテゴリー化されてきた孫三郎の経営理念、思想の実像を科学という新たな側面から明らかにした。
象牙質コラーゲンの強化による接着耐久性の向上を目的とした象牙質処理法の構築

本研究は、象牙質と接着性レジンセメントの化学的接着に重要な樹脂含浸層の耐久性を向上させるために、タンニン酸による象牙質コラーゲンの強化を目的としている。これまでに、牛歯象牙質をダイヤモンドバーを装着したエアータービンにて切削し、作製した象牙質粉末(タービン粉末)、または、エアータービンを使用せずに象牙質をブロックとして切り出し、クラッシャー等で機械的に粉砕し作製した象牙質粉末(機械粉末)を、それぞれEDTAにて脱灰、象牙質コラーゲンを抽出し(それぞれ、タービンコラーゲン、機械的コラーゲン)、熱変性温度を測定した結果、タービンコラーゲンで約51°C、機械的コラーゲンで約72°Cを示したことから、タービンでの切削によって、コラーゲンの3重らせん構造の破壊には至っていないものの、象牙質コラーゲンの構造に何らかの影響を与えていることがわかっている。次に、両者の象牙質コラーゲンを1%タンニン酸溶液に7日間浸漬後、洗浄・自然乾燥し、両者の熱変性温度を測定した結果、タービンコラーゲンで約65°C、機械的コラーゲンで約76°Cを示し、タンニン酸処理によって、タービンコラーゲンで約14°C、機械的コラーゲンで約4°Cの上昇を示した。樹脂含浸層の生成には、象牙質切削面を酸処理することが必要であり、この操作がコラーゲンの変性を引き起こし、樹脂含浸層の崩壊を招くとされていることから、タンニン酸処理コラーゲンを40%リン酸にて処理したところ、タンニン酸処理を行わない象牙質コラーゲンはゲル状となり、3重らせん構造が破壊されたことを示したが、タンニン酸処理コラーゲンでは、原型を留め、象牙質コラーゲンが強化されたことが示された。現在、これらのコラーゲンの変化の本質を捉えるべく、ラマン分光分析を行い、その結果を分析中である。また、臨床応用を目的とし、EDTAの作用時間、タンニン酸の濃度と作用時間について検討中である。牛歯エナメル質を削除した後、ダイヤモンドバーを装着したエアータービンにて象牙質を切削し、切削粉末を粒径200μm以下に調整した(タービン粉末)。また、エアータービンを使用せず、ダイヤモンドソーにて象牙質をブロックとして切り出し、クラッシャー等にて機械的に粉砕し、粒径200μm以下に調整した(機械的粉末)。両粉末6gをEDTA溶液120ccに、1、3、6、12、24時間浸漬、脱灰後、洗浄・乾燥して、象牙質コラーゲンを抽出し(それぞれタービンコラーゲン、機械的コラーゲン)、熱変性温度を測定した。その結果、EDTA処理時間の違いに関わらず、タービンコラーゲンは約52°C、機械的コラーゲンは約72°Cを示した。タービンコラーゲンでは、3重らせん構造は維持されているものの、何らかの変化が生じていることが示された。象牙質コラーゲンの強化を検討するため、EDTAに6時間浸漬し、脱灰して得られたタービンコラーゲンおよび機械的コラーゲンを、1%タンニン酸溶液に7日間浸漬後、洗浄・乾燥し、熱変性温度の測定を行った。その結果、タービンコラーゲンでは約65°C、機械的コラーゲンでは約76°Cを示し、タンニン酸処理前の測定値よりタービンコラーゲンで約13°C(処理前約52°C)、機械的コラーゲンで約5°C(処理前約71°C)の上昇が認められた。レジンセメントで歯冠修復物を装着する際、象牙質面を処理するが、この操作が象牙質コラーゲンにダメージを与え、樹脂含浸層の崩壊の一因となるとされている。そこで、それぞれのタンニン酸処理コラーゲンに、40%リン酸溶液を10秒間作用させ、洗浄後の変化を肉眼で観察した。その結果、タービンコラーゲン、機械的コラーゲンはゲル状を示したが、タンニン酸処理コラーゲンは、両者とも原型を保っていた。従って、タンニン酸処理により、象牙質コラーゲンが強化され、酸に対する抵抗性を示したことがわかった。現在までに、象牙質コラーゲンをタンニン酸処理することによって、熱変性温度が上昇し、40%リン酸溶液に対する抵抗性が獲得できたことから、タンニン酸処理によって象牙質コラーゲンが強化されることがわかった。しかし、これまでのタンニン酸による象牙質コラーゲンの強化の実験は、タービン粉末及び機械的粉末を、EDTAに6時間浸漬し、脱灰した象牙質コラーゲンに対し、1%タンニン酸溶液を7日間作用させた場合についてのみの結果であり、臨床応用を考慮した場合、診療時間内で作用させることは困難である。また、機械的コラーゲンにおいては、タンニン酸処理により象牙質コラーゲンが強化されているものの、熱変性温度の上昇は約4°Cに留まっている。報告者が象牙質コラーゲンと同型のI型コラーゲンであるテンドンを用いて行ったタンニン酸による強化は、タンニン酸溶液の濃度と作用時間によって大きく異なっていることが判明していることから、今後は、臨床応用に向け、EDTAの処理時間、タンニン酸濃度及び作用時間を検討する予定である。また、これらの条件の違いによる象牙質コラーゲンへの影響が判明した段階で、その条件を用いた象牙質切削面の処理を行い、最終目標である象牙質とレジンセメントとの接着耐久性の向上を実現する予定である。

さらに、冒頭で述べたように、本実験を実施した過程において、タービンコラーゲンと機械的コラーゲンでは、熱変性温度に約20°Cの差があり、タービンコラーゲンが低くなっていることが認められた。この結果は、象牙質をタービンで切削することによって、すでに、象牙質コラーゲンに構造的変化が生じている可能性を示しており、現在、ラマン分光分析を行って、詳細を分析中である。この結果は、今後、象牙質コラーゲンを対象とした実験を実施する上で、重要であると思われることから、別途、実験計画を立案する予定である。本研究は、象牙質と接着性レジンセメントの化学的接着に重要な樹脂含浸層の耐久性を向上させるために、タンニン酸による象牙質コラーゲンの強化を目的としている。これまでに、牛歯象牙質をダイヤモンドバーを装着したエアータービンにて切削し、作製した象牙質粉末(タービン粉末)、または、エアータービンを使用せずに象牙質をブロックとして切り出し、クラッシャー等で機械的に粉砕し作製した象牙質粉末(機械粉末)を、それぞれEDTAにて脱灰、象牙質コラーゲンを抽出し(それぞれ、タービンコラーゲン、機械的コラーゲン)、熱変性温度を測定した結果、タービンコラーゲンで約51°C、機械的コラーゲンで約72°Cを示したことから、タービンでの切削によって、コラーゲンの3重らせん構造の破壊には至っていないものの、象牙質コラーゲンの構造に何らかの影響を与えていることがわかっている。次に、両者の象牙質コラーゲンを1%タンニン酸溶液に7日間浸漬後、洗浄・自然乾燥し、両者の熱変性温度を測定した結果、タービンコラーゲンで約65°C、機械的コラーゲンで約76°Cを示し、タンニン酸処理によって、タービンコラーゲンで約14°C、機械的コラーゲンで約4°Cの上昇を示した。樹脂含浸層の生成には、象牙質切削面を酸処理することが必要であり、この操作がコラーゲンの変性を引き起こし、樹脂含浸層の崩壊を招くとされていることから、タンニン酸処理コラーゲンを40%リン酸にて処理したところ、タンニン酸処理を行わない象牙質コラーゲンはゲル状となり、3重らせん構造が破壊されたことを示したが、タンニン酸処理コラーゲンでは、原型を留め、象牙質コラーゲンが強化されたことが示された。現在、これらのコラーゲンの変化の本質を捉えるべく、ラマン分光分析を行い、その結果を分析中である。また、臨床応用を目的とし、EDTAの作用時間、タンニン酸の濃度と作用時間について検討中である。牛歯エナメル質を削除した後、ダイヤモンドバーを装着したエアータービンにて象牙質を切削し、切削粉末を粒径200μm以下に調整した(タービン粉末)。また、エアータービンを使用せず、ダイヤモンドソーにて象牙質をブロックとして切り出し、クラッシャー等にて機械的に粉砕し、粒径200μm以下に調整した(機械的粉末)。両粉末6gをEDTA溶液120ccに、1、3、6、12、24時間浸漬、脱灰後、洗浄・乾燥して、象牙質コラーゲンを抽出し(それぞれタービンコラーゲン、機械的コラーゲン)、熱変性温度を測定した。その結果、EDTA処理時間の違いに関わらず、タービンコラーゲンは約52°C、機械的コラーゲンは約72°Cを示した。タービンコラーゲンでは、3重らせん構造は維持されているものの、何らかの変化が生じていることが示された。象牙質コラーゲンの強化を検討するため、EDTAに6時間浸漬し、脱灰して得られたタービンコラーゲンおよび機械的コラーゲンを、1%タンニン酸溶液に7日間浸漬後、洗浄・乾燥し、熱変性温度の測定を行った。その結果、タービンコラーゲンでは約65°C、機械的コラーゲンでは約76°Cを示し、タンニン酸処理前の測定値よりタービンコラーゲンで約13°C(処理前約52°C)、機械的コラーゲンで約5°C(処理前約71°C)の上昇が認められた。
ネクチン-アファディン系と相互作用する分子MAGI-1・RapGEPの解析

浸潤・転移能が亢進しているがん細胞では恒常的に細胞間接着が破壊されている。このことから、細胞間接着の形成と破壊の分子機構を解明することは、がん細胞の浸潤・転移の分子機構を理解する上で極めて重要である。これまで、カドヘリン-カテニン系を中心とした細胞間接着の分子機構の解析が行われてきたが、この接着系だけでは説明できない現象が多い。私が所属する研究室では新しい細胞間接着機構ネクチン-アファディン系を見出し、上皮細胞のアドヘレンスジャンクション(AJ)とタイトジャンクション(TJ)の形成を制御することを明らかにしている。しかしながら、ネクチン-アファディン系がどのような分子機構で細胞間接着形成を制御しているのかは不明である。本年度の研究においてネクチン-アファディン系とこれと相互作用する分子による細胞間接着形成機構について以下の結果を得た。1.ネクチンによるAJおよびTJの形成には、アファディンとアクチン細胞骨格が必須の役割を果たしていた。2.AJの形成にカルシウムとリン脂質依存性にアクチン線維を結合するアネキシンII-S100A10複合体が関与していた。3.アネキシンIIをノックダウンした細胞では、TJはカドヘリンによる細胞間接着形成なしに形成された。このTJの形成にはネクチン-アファディン系は必須であった。(投稿中)このように本年度は、細胞間接着機構ネクチン-アファディン系による細胞間接着の形成機構について、当初の計画以上の成果をあげることができた。
グラム陰性菌由来リポ多糖に対する植物自然免疫の解明

リボ多糖(lipopolysaccharide;LPS)は糖鎖が連なる0抗原とコア多糖部、複数のアシル基を持つリピドA部から構成されている。LPSは菌種や環境によって0抗原のないラフ型と0抗原をもつスムース型に分けられる。また、リピドA部のアシル基の数や長さなども異なり様々な種類が存在する。AtLBPはそのN末端領域でLPSのリピドA部と結合すると予測される。今回、AtLBP-LPS結合にLPSの各部がどう関わるのかを調べた。結合様式をヒトLBPと比較することで、より詳細にAtLBP-LPS結合を理解することが出来る。AtLBPのN末端のみを組換えタンパク質として大腸菌で発現させ、Niカラムで精製した。得られたAtLBP-Nを大腸菌由来LPSとインキュベートするLPS-binding assayを行った。この際、Origami B株由来のラフ型LPS、またはATCC 25922株由来のスムース型LPSを用いた。その結果、AtLBP1、AtLBP2共にラフ型、スムース型LPSに結合した。やはりAtLBP2の方が強い結合を示した。また、どちらのAtLBPもスムース型よりラフ型LSPに対して強い結合を示した。これは、糖鎖が短いことでLPSのリン酸基が露出しやすく、AtLBPによる認識が容易になったためと考えられる。更に、ラフ型LPSのリピドA部に1本のアシル基欠損変異をもつpenta-acylated LPS(lpxM-)を用いて同様に実験を行った。その結果、大変興味深い事に、どちらのAtLBPも全く結合しないことが分かった。この結果から、AtLBP-LPS結合にはLPSの糖鎖部よりリピドA部が関わることが分かった。特に、アシル基の数が重要であることが示唆された。また、ヒトBPIはN末端のみで殺菌効果を示す。AtLBP-Nにも同様の効果があるかどうかを調べた。精製したAtLBP-Nと大腸菌をインキュベートした。大腸菌は、上記の実験より強い結合がみられたラフ型LPSをもつOrigami B株を用いた。その結果、BPIのような劇的な殺菌効果は見られなかった。C末端を含めた全長AtLBPの組換えタンパク質を用いてAtLBPの殺菌効果を調べることが重要である我々はこれまで機能未知であったAtLBPについてそのLPS結合活性を示してきた。今年度は特にLPS結合にその脂質部が重要であることを明らかにした。また、実際にシロイヌナズナを用いて生物学的視点からAtLBPの機能解明を行ってきた。これまでの結果より、特にAtL、BP2がLSPに対する自然免疫を負に調節しているのではないかという仮説に到達した。しかし、その証明までには至っていない。これまではAtLBPのN末端にのみ注目してLPS合活性を調べてきた。今後はC末端について解析を進める予定である。AtLBPの全長配列を含んだ組換えタンパク質を大腸菌を用いて発現させ、その抗菌活性を調べる。安定的に十分量の可溶性組換えタンパク質を得ることが第一の目標となる。また、シロイヌナズナを用いて生物学的機能解析も引き続き行っていく。我々はAtLBPが細胞間隙に発現し、侵入したLPSを分解すると予想している。従ってAtLBPの発現場所を特定することは特に重要である。また、ヒトLBPのようにAtLBPと相互作用する因子の有無を調べることでより詳細なAtLBPの機能解明が可能になる。更に現在、病害抵抗性にAtLBPが関わるかどうかを調べるため、病原菌P.syringae pv.tomato DC3000を野生株と変異株シロイヌナズナに感染させて、その感染数を比べている。私は、植物におけるリポ多糖(lipopolysaccharide ; LPS)認識機構の解明を目標に研究を進めている。現在、シロイヌナズナが持つリポ多糖結合タンパク質2(A. thaliana LPS-binding protein2 ; AtLBP2)に注目している。AtLBP2変異株にLPS処理を行い、耐病性関連遺伝子PR1の発現上昇をRT-PCRで調べた。その結果、AtLBP2変異株では野生株に比べ、早期にPR1発現が上昇することを明らかにした。植物のLPS認識にAtLBP2が関わっている可能性が強まったといえる。また、全長AtLBP2発現ベクターを導入した大腸菌が、発現誘導に伴い死滅する現象を確認した。AtLBP2が抗菌活性を持っている可能性がある。更に、LPSがシロイヌナズナ発芽に対して生育阻害効果を持つことを発見した。生育阻害効果はLPSの種類によって大きく異なっていた。シュードモナスとクレブシエラ由来LPSは75μg/mlで生育阻害効果を示したが、大腸菌由来LPSは1000μg/mlでも生育阻害効果を示さなかった。そこで、LPSが誘導する生育阻害と自然免疫の関係を調べた。まず、シロイヌナズナ発芽に各LPSを処理しPR1発現上昇を調べた。更に、シロイヌナズナ培養細胞に各LPS処理を行い、細胞が放出する活性酸素種の発生強度を調べた。その結果、シュードモナスとクレブシエラ由来LPS処理により自然免疫は誘導されたが、大腸菌由来LPS処理では誘導されなかった。つまり、生育阻害と自然免疫を誘導するLPSが一致していた。

これにより、LPSによる生育阻害が、自然免疫誘導の指標として有効であることが分かった。本研究をまとめた論文は現在投稿中である。本研究成果は、シロイヌナズナ変異株を用いたLPS受容体スクリーニング法として応用が期待できる。シロイヌナズナの持つ2つのAtLBP(A.thaliana LPS-binding protein)について、生化学的・生物学的機能解析を行った。AtLBPのN末端領域を含んだ組換えAtLBP-Nと、大腸菌由来の精製LPSをインキュベートするLPS-binding assayを行った。その結果、両者が直接結合する事が明らかになった。この結合は、大過剰のペプチドグリカンやフラジェリンの添加により阻害されなかった。AtLBPはN末端にLPS特異的な結合領域を持つと考えられる。更に、困難を極めた全長AtLBP2のクローニングに成功し、組換えAtLBP2-FLを得ることが出来た。組換えAtLBP2-FLはLPS結合活性を保持していた。今後は、AtLBP2のC末端領域を含めた機能解析が可能になった。AtLBP2変異株にLPS処理をすると、処理48h後に見られる病害抵抗性遺伝子の発現が早まる。そこで、LSP処理に伴う葉からのH_2O_2放出量を調べた。その結果、WTと.AtLBP変異株間で有意差は見られなかった。H_2O_2放出はエリシター処理後わずか数分以内に観察される急性応答のひとつである。AtLBP2はLPSに対する即時的な応答には関与せず、数時間数日後に現れる後期応答にのみ関わると考えられる。また、病原菌Pseudomonas syringe pv. tomato DC3000を使った感染実験を行ったが、WTとAtLBP変異株における感染菌数に有意差は見られなかった。DC3000はエフェクターを植物に注入し自然免疫を抑制する。エフェクターを保持しない非病原菌感染時の感染菌数おいて、WTとAtLBP変異株間で差が見られた。このことから、AtLBPがエフェクターの作用を受けている可能性が考えられる。更に、シロイヌナズナの根と葉におけるAtLBPの発現パターンを調べた。その結果、AtLBP1発現は根と葉のどちらにおいても確認されたが、AtLBP2発現は葉に多く、根に少ないことが分かった。更に、シロイヌナズナ全体にLPS処理をすると、根と葉に見られたAtLBP1発現が減少した。これらの結果は、器官特異的なAtLBP機能の違いを示唆する。今後、器官ごとのH_2O_2放出量や細菌感染数を解析すれば、より詳細なAtLBPの機能解明が期待できる。リボ多糖(lipopolysaccharide;LPS)は糖鎖が連なる0抗原とコア多糖部、複数のアシル基を持つリピドA部から構成されている。LPSは菌種や環境によって0抗原のないラフ型と0抗原をもつスムース型に分けられる。また、リピドA部のアシル基の数や長さなども異なり様々な種類が存在する。AtLBPはそのN末端領域でLPSのリピドA部と結合すると予測される。今回、AtLBP-LPS結合にLPSの各部がどう関わるのかを調べた。結合様式をヒトLBPと比較することで、より詳細にAtLBP-LPS結合を理解することが出来る。
栄養条件による脂質の吸収・輸送蛋白質の遺伝子発現の調節

ヒトを始めとした哺乳動物では多量の脂肪が摂取されているが、小腸粘膜細胞内にこれらが多量に沈着することはほとんどなく、脂質・蛋白質複合体であるカイロミクロンとして速やかに血流中へ輸送される。アポA-IVは食餌脂肪が摂取されないとリンパへの分泌が著減することから、外因性の脂肪輸送に最も密接に関係している蛋白質とみなされている。本研究では分子レベルでのこの蛋白質の合成調節機構と、多量の脂肪流入という情報を伝達する物質をつきとめるための基礎的研究として、クローン化されたラットアポA-IVcDNAを用いて、食餌脂肪の吸収が活発に行われているラット乳仔小腸における本蛋白質遺伝子発現に栄養がどのように関与しているか、更に、その調節機構についての解明を目途として行った。1.まず乳仔を一夜絶食させた場合の血清トリグリセリドとアポA-IV濃度を測定したところ、絶食時では両パラメーターとも哺乳時と比較して、著しく低下しており、特に、アポA-IV濃度は1/3にまで低下していた。また、乳仔の小腸リンパのアポA-IV濃度は成熟ラットのそれの約4.4倍であり、乳仔小腸では活発なアポA-IVの合成がおこなわれていることがうかがえた。2.一夜絶食および非絶食の乳仔小腸粘膜細胞から調製したmRNAと[^<32>P]標識アポA-IVcDNAとのDot-Blot Hybridizationを行ない、小腸粘膜細胞内のアポA-IVmRNA量を比較したところ、一夜絶食でアポA-IVmRNA量は1/(10)にまで低下していた。このことから、乳仔における母乳脂肪摂取にともなうアポA-IV分泌の増大は転写レベルでの調節に基づくことが示唆された。