hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
児童の学力、体力、身体組成の向上に寄与する生活習慣と活動量を解明するコホート研究

小学校児童489名をコホート集団として、睡眠時間等の生活習慣が、歩数等の活動量を介して、身体組成、体力、学力に与える効果と影響を縦断評価した。その結果、学年進行による生活の夜型化、休日の活動量の低下、脂質と菓子類の過剰摂取、新体力テスト総合評価と肥満児の強い相関等が確認された。本研究では、骨状態を総合判定する骨強度の評価を導入した。骨強度は、除脂肪量、高強度活動時間、栄養摂取の順に強く作用し、バレーボールなどジャンプ系種目を行う児童では特に高値を示した。カルシウムが過度に不足した児童は確認されず、これには1日の必要量の50%を含むとする学校給食のカルシウム基準が寄与している可能性が示唆された。本研究は2つのステージに分けて調査・研究している。ひとつは、児童の生活習慣、活動量、身体組成、学力、体力、メンタルの関係を横断的に評価するもので、これが今年度(平成26年度)にあたる。もうひとつは、次年度の同時期に、同児童に同調査を行うとするものである(平成27年度)。児童の日々の食を含めた生活習慣が活動量を介して、成長期の身体組成、学力、体力、メンタルにどう関連しているかを横断的かつ縦断的に評価・研究することを目的としている。平成26年度は、まず4月に採択通知を受けた後、速やかに順天堂大学医学部研究等倫理委員会へ研究倫理の申請を行い、5月末には承認を得た。その後、対象小学校校長の依頼も受けて、小学校全教職員へ研究概要の説明と協力要請を行い、対象となる児童および保護者へは、書面による調査の説明とインフォームドコンセントを実施し、同意の得られた児童のみを調査・計測の対象とした。同年67月、質問票により食を含めた生活習慣とメンタルの調査を集合調査法で学級別に実施し、活動量計を24時間連続装着してもらい、登校日(月金曜日)と休日(土・日曜日)、学校生活と家庭生活とを区分できる身体活動量を1週間分計測した。また、小学校に生体インピーダンス法による体組成測定装置や超音波式の骨強度測定装置を搬入し、筋肉量や体脂肪量、骨強度などの身体組成も計測した。学力(国語・算数)と体力(新体力テスト8項目)の成績は、小学校より提供を受けた。今年度の横断的なデータ解析の結果、児童の睡眠時間の長さと国語および算数の成績には正の相関関係が確認された。また、睡眠時間の長さと児童のストレス反応(怒り・疲労感・ひきこもり感)には、負の相関関係が確認されている。さらに、朝食を毎日食べる者のストレス反応は、朝食を週に23回食べるまたはまったく食べない者と比較すると有意に低いことなどが確認されている。初年度(平成26年度)は、児童の生活習慣、身体活動量、学力、体力、メンタル、それに食を含めた生活習慣を横断的に評価した。今年度(平成27年度)は、前年と同じ児童を対象として同時期・同評価項目で横断的かつ縦断的に評価した。前年度は調査に参加したが今年度は参加したくない児童、前年度調査に参加しなかったが今年度は参加したい児童、また転入児童への対応など本調査の前には対象小学校の教職員の協力の下インフォームドコンセントと同意書の確認を調査予定の全児童とその保護者に対して行った。結果として、今年度は学年がひとつあがったことによる体格と体力の向上は認められたものの生活習慣と身体活動量において下記の変化が認められた。前年と比較すると睡眠時間は男女で短くなり身体活動量は低下しストレス度は増加していた。しかしながら、この1年間でクラブ活動への参加した児童においてはメンタルヘルスが改善する結果が男女で認められている。当初の計画とおり、平成26年度は横断研究、平成27年度は横断研究プラス縦断研究が行われている。研究ありきの姿勢でなく、得られた各児童のデータは解析し、コメントをくわえたうえで児童およびその保護者へ返却しフィードバックもはかれた。研究としてのデータは個別でなく全体のトレンドを見出すために集団で解析していく。進捗は極めて順調である。初年度(平成26年度)は、児童の生活習慣、身体活動量、学力、体力、メンタル、栄養摂取状況を横断的に評価した。平成27年度は、同じ児童を対象として、上記評価項目を縦断的に評価した。コホートデータベースを構築し時系列解析したところ、男女で体格と体力は向上したものの、睡眠時間は短縮し、身体活動量ならびにストレス度は増加していた。最終年度(平成28年度)は、コホートデータをさらに解析し、この1年間で運動部活動に参加した者はストレスが低減したものの、運動部活動を中断した児童はストレスが増加する結果が明らかとなった。睡眠時間の長さと学力(国語の平均点)の評価では、7時間未満(53点)、78時間(61点)、89時間(63点)、9時間以上(66点)となっており、学力(算数の平均点)では、7時間未満(59点)、78時間(68点)、89時間(69点)、9時間以上(70点)となっていた。これには塾や習い事の影響が考えられるため、塾・習い事の参加の有無を考慮して解析したところ、国語で5点、算数で3点の差でしかなかった。十分な睡眠時間がないと、勉強時間を増やしたところで、学力として身に付きにくいことがデータから読み取れた。また、児童の朝食摂取状況は、どの学年においても、810%の児童が毎日は朝食を摂っていないと回答していた。

この朝食摂取状況と児童の学力を評価したところ、毎日の朝食を食べる児童と毎日は食べていない児童との学力差(平均点の差)は、国語で5点、算数で7点であった。この結果は、文部科学省の「全国学力・学習状況調査」と同様の傾向であった。栄養素別のエネルギー摂取状況を「食事バランスガイド」を用いて評価したところ、いずれの学年でも炭水化物、野菜、果物は不足しているものの、菓子・嗜好品は大幅に摂りすぎていることが認められている。小学校児童489名をコホート集団として、睡眠時間等の生活習慣が、歩数等の活動量を介して、身体組成、体力、学力に与える効果と影響を縦断評価した。その結果、学年進行による生活の夜型化、休日の活動量の低下、脂質と菓子類の過剰摂取、新体力テスト総合評価と肥満児の強い相関等が確認された。本研究では、骨状態を総合判定する骨強度の評価を導入した。骨強度は、除脂肪量、高強度活動時間、栄養摂取の順に強く作用し、バレーボールなどジャンプ系種目を行う児童では特に高値を示した。カルシウムが過度に不足した児童は確認されず、これには1日の必要量の50%を含むとする学校給食のカルシウム基準が寄与している可能性が示唆された。研究期間は、初年度(ベースライン・横断研究)と次年度(フォローアップ・横断研究と縦断研究を兼ねる)の2つのステージに分けられるが、平成26年度は初年度のベースライン研究を順調に遂行できている。研究計画当初、児童のメンタル面の評価は視野に入れていなかった。研究採択となり、対象小学校教職員との打ち合わせの段階で、児童のメンタル面の評価は、学力、体力、身体組成に強く影響を与える重要な因子である指摘を受けて、測定項目に追加された。測定項目は計画時より多くなっているが、問題なくデータを得ることができている。平成26年度の横断的データと平成27年度の横断的・縦断的データを総合的に解析していく。これまでは欠損値や異常値の確認を行いながら単純な年度差(年度比較)であったが、これからは平成26年度のデータをもとに学力および体力に影響する生活習慣要因を重回帰分析から明らかにする。コホート研究であるので重回帰分析から導かれた学力および体力に影響する生活習慣要因への曝露の有無による相対危険度と寄与危険度を平成27年度のデータから解析して評価する。平成26年度と27年度に集計されたデータをコホートデータとして構築することで、学力と体力に影響を与える要因を多元配置分散分析と共分散構造分析から特定し、ROC解析で学力および体力を向上させる活動量(歩数/日、METs/週)を評価していく。応用健康科学平成27年度は、次ステップであるフォローアップ期間にあたる。平成26年度に対象となった児童に同調査を実施し、データが得られれば、横断研究かつ縦断研究として、多元配置分散分析(学力および体力に有意な生活習慣因子を検討する)、共分散構造分析(学力、体力、身体組成、メンタルの向上に寄与する生活習慣と活動量を構造的に検討する)、ROC解析(日本肥満学会による小児肥満基準(体脂肪率:男子25%、女子30%)や新体力テスト(Cランク)をカットオフ値とした日々の生活で活用できる新たな提言を目指し解析を進めていく。来年度は最終年度にあたる。これまで取られたデータを解析するための専用ソフトと冊子の購入と最終報告書の作成・発注・印刷・送付等の費用が見込まれるため。平成26年度は、児童の活動量を計測する活動量計を国立健康・栄養研究所より借用することができた。
在宅看護における対応困難事例、暴言、暴力の現状と対策に関する研究

訪問看護師にとっての対応困難事例(暴言・暴力含む)について、次の4つの調査を行った。1文献研究、2訪問看護師と他の医療福祉職、一般の人が参加する哲学的手法を用いたグループ対話3回(24名)、312名の訪問看護師を対象とした個別面接調査、4無作為抽出した全国2000か所の訪問看護ステーションに所属する訪問看護師を対象とした自記式質問紙郵送調査である。これらの調査から訪問看護師の感じる困難要素の構造について4因子を明らかにした。療養者の自宅で単独でケアを提供するという訪問看護の場の特殊性を踏まえて、チームアプローチや、訪問看護師のスキルアップ、家族への支援といった対応を検討する必要性が示唆された。平成25年度研究実績概要は、次の4項である。(1)グループ対話(平成23年1回、平成24年2回、合計3回実施済)結果の分析と論文作成:ネオソクラティク・ダイアローグ(NSD)による訪問看護師の困難事例をテーマにしたグループ対話について、Philosophizing through Dialogue(Berli,2013/7)の学会発表をもとに論文をまとめており近く提出予定である。(2)個別面接調査の内容分析:2012/811月に訪問看護師12名を対象に実施した個別面接調査の内容分析を行い63事例が収集できた。そのうち1)暴言・暴力なし25事例、2)暴言・暴力あり38事例であった.1)には中途障害の受容支援困難,ネグレクト・DV,自傷行為.癌患者の受容支援困難,ALS患者への対応困難,家族の厳しいクレームとチェック等、2)には1セクハラ、2認知症の介在があった他、3その他として多様な要求.支払を渋る.杖をふり回して叩こうとする.援助者側の対応を責め支配的になる、刺青がある等様々な事象があった。対応に労力を要し,訪問看護活動に大きな影響があるのは,暴言・暴力がない困難事例と認知症等の介在のない暴言,暴力であると考えられた。(3)暴言、暴力事例の学会発表:2014年3月在宅医学学会にて「在宅療養者と家族らによる訪問看護師に対する暴言、暴力についての考察訪問看護師への個別面接調査から」という表題で2)の結果について、ポスター発表を行った。(4)質問紙調査内容の検討:困難の要素を見出すため、訪問看護師が困難事例であると感じているのかという視点でテキストマイニングソフトを用いた分析を実施中である。平成24年度研究実績概要は次の3項である。1)文献調査:医中誌Web版ver.4を用い2012/4/9にキーワード検索を実施した。検索キーワードは#1(対応困難、困難事例等)と#2(訪問看護、在宅看護等)で、#3(退院困難等)を除いた。検索結果54件の文献が該当し、内28件を対象に内容を検討した。検討はマトリックス方式で12項目(発行年月日、報告者の職種、職位、学術分野、困難の要素・内容等)を整理した。学術分野は社会福祉14、看護10、社会福祉と看護混合4であった。困難事例に関する文献数は少なく、社会的認知度が低いこと。また看護領域での報告が少なく、学術的には困難事例の検討・報告はあまり行われてないことが解った。2)個人面接調査:実施者2名が半構造化面接法で訪問看護師(経験者を含む)12名を対象に60分程度のインタビューを行った(2012/811月)。対象者年齢は3050歳代、全員女性。面接時間4691分。困難な事例、暴言、暴力の体験について尋ねた。音声データから逐語録を作成し、現在分析中である。困難事例は全員から、暴言・暴力もほとんどの対象者から体験を聞くことができた。3)グループ対話:『グループ対話から在宅看護の困難事例の「困難」について検討する』第1回を開催した(2013/2/16、23)。Neo-Socratic Dialogue(対話ワークショップで少人数がグループとなり、参加者が体験した事例の1つを土台に1つのテーマで話し合う)を用いた。1回目の今回は、90分のセッションを2日間で計6回設定した。参加者は男性4名、女性3名、年齢は3060歳代、職業は訪問看護師の他、大学教員、社会福祉士、会社員、自営業等であった。筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者について議論した。困難に関する質問へのグループ中の答えは、在宅ケアの特性および看護師の役割を明確に示した。平成26年度研究実績概要は次の通りである。(1)個別面接調査【実施:2012/811月、対象:訪問看護師12名】のテキストマイニングソフト(TMS)による分析:述語属性フィルタでネガティブの述語属性の単語を選択し、単語頻度集計を行った。頻出単語は20検出され、上位4つ「分かる+ない」「出来る+ない」「言う+ない」「する+ない」は20回以上で全体の42.4%であった。これらの頻出単語20の原文を、4人の研究者で参照し困難要素を検討した。上位4つの頻出単語からは訪問看護師、家族、利用者、その他の人物別に分類し18の困難要素を抽出することができた。

(2)上記(1)の分析経過を在宅医学学会学術大会(H27/4/25,26盛岡)において「訪問看護師にとっての対応困難事例の困難の要素についてテキストマイニングソフトを用いた個別面接調査の分析結果より」の示説発表の採択を受け、発表準備を行った。(3)質問紙郵送調査の質問項目の検討:20122013年に実施した文献研究、困難事例に関するグループ対話の結果と(1)の分析結果から、訪問看護師に対する困難事例についての質問紙郵送調査を実施するため、質問項目を検討している。(4)対応困難事例、暴言、暴力の生じている療養者と家族、または看護者への支援とリスクマネジメントについての検討:困難事例の中にはトラブルや暴力の介在もあることから、リスクマネジメントの視点で検討するため、医療安全管理者研修、医療安全対話推進者研修、看護師を対象とした危険予知トレーニング等に参加した。トラブルや暴力を回避するには、医療側と患者、家族との良好なコミュニケーションの重要性、事実関係を明確にするためカルテや看護記録の重要性、また医療事故防止だけでなく医療職者の職場安全の視点から、職場環境としての安全確保や組織的な取り組みが必要であることがわかった。1)日本在宅医学学会(2015年4月)示説発表:テーマは「訪問看護師にとっての対応困難事例の困難の要素についてテキストマイニングソフトを用いた個別面接調査の分析結果より」である。訪問看護師12名に対する個別面接調査の内容を、テキストマイニングソフトを用いて分析した結果、ネガティブな頻出単語を20検出した。その内容を複数の研究者で協議し、18カテゴリーの困難要素に分類した。2)これまで実施した個別面接調査、文献検討、グループ対話で得らえた結果を参考に、訪問看護師にとっての困難要素に関する65の質問項目を作成し、全国質問紙郵送調査を実施した。調査対象は無作為抽出した全国2000か所の訪問看護ステーションに所属する訪問看護師とした。回答数588(回収率29.4%)、うち505(有効回答25.3%)を分析対象とし、SPSSを用いて因子分析を行い、全40項目4因子を抽出した。3)日本在宅医学学会(2016年7月)発表予定(採択決定):2)の内容について発表準備中である。4)日本混合研究法学会(2016年8月)発表予定(採否未定):研究方法は質的研究の結果から訪問看護における困難要素を抽出し、その結果得られた知見をもとに、仮説検証のための量的研究につなげ統合した探索的順次的デザインで、訪問看護師の感じる困難要素の構造を明らかにした。単独で療養者の自宅でケアを提供するという訪問看護の場の特殊性を踏まえた上で、チームアプローチ、訪問看護師のスキルアップ、家族への支援といった対応を検討する必要があることが示唆された。訪問看護師にとっての対応困難事例(暴言・暴力含む)について、次の4つの調査を行った。1文献研究、2訪問看護師と他の医療福祉職、一般の人が参加する哲学的手法を用いたグループ対話3回(24名)、312名の訪問看護師を対象とした個別面接調査、4無作為抽出した全国2000か所の訪問看護ステーションに所属する訪問看護師を対象とした自記式質問紙郵送調査である。これらの調査から訪問看護師の感じる困難要素の構造について4因子を明らかにした。療養者の自宅で単独でケアを提供するという訪問看護の場の特殊性を踏まえて、チームアプローチや、訪問看護師のスキルアップ、家族への支援といった対応を検討する必要性が示唆された。平成26年度に訪問看護師を対象とした郵送質問紙調査の実施を予定していたが、発生状況に関する実態調査に留まらず、訪問看護の充実に向けた具体的な支援策、人材育成につながるよう内容の充実を図る必要性があった。
高コレステロール食慢性投与によるアルツハイマー型脳機能障害の解明と予防食の探索

本研究は、高コレステロール食(HC食:2%-,0.2%-,0.02%-)の慢性投与が脳神経系にもたらす相乗的なリスクターゲットを生化学的な手段およびマウス動物実験を用いて解明した。実験は、C57BL/6雄性マウスに4ヶ月間、高HC食および対照食(AIN93G)を経口投与し検討を行った。2%HC食マウスは、行動解析の結果、短期記憶能や社会性が低下し脳機能動態の変化が予測された。血清脂質動態は飼育4か月でTC、LDL、HDLが有意に増加し、TGが有意に低下した。また、血清レプチン、インスリンの有意な増加も認められた。LDL、TGは2%HC食負荷後、3日目で有意に増加しており、負荷後直ちに血清脂質動態が変化することが分かった。脳神経系の形態学的変化は、抗ヒスタミン陽性反応領域が減少し、神経細胞の萎縮、細胞内ゴルジ複合体の空胞化が認められ、神経ヒスタミン細胞内にアミロイドβの蓄積がみられた。このことから高HC食の負荷によって、マウスは高コレステロール血症を発症しAD様の脳機能障害と行動変化が観察された。脳内でも有意にコレステロール量が低下していたことからWestern-blotting法により、視床下部のコレステロール合成能について検討したところHMGCRなどの合成経路がたんぱく質レベルで抑制され、AMPKα1、HDCが低下していた。さらに遺伝子解析を行った結果、2%HC食マウスでは脳内の摂食シグナル因子であるAGRPの活性化と視床下部に特徴的なホルモンの分泌、またシグナル伝達ペプチドの発現が亢進していた。このことから炎症性のシグナルペプチドの増加により視床下部の神経細胞は持続的なレプチン刺激によって、炎症が励起されAGRPの異常発現活性化が伴ったと推測された。さらに脳代謝物については、メタボローム解析を行い網羅的な解析を行っている。本研究は、新規性の高い研究でもあり、得られた実験結果の解釈に時間を要している。特にメタボローム解析では、高HC投与により脳代謝動態が475成分同時に定量された。検出された結果の同定のため,データベースとの照合や,代謝マップと関連づけした構造決定を試みているが、結果が広範囲にわたり時間を要している。本年度末にこれらの同定のための解析ソフト(IPA,パウェイ解析ツールアカデミックリミテッドネームユーザー25データセット)を購入した。脳視床下部のマイクロアレイの結果と組み合わせることで、より詳細な高HC食の影響が検討できると思われる。1.メタボローム解析とマイクロアレイの結果を照合し、高HC食の慢性投与における脳機能への影響について検討する。2.遺伝子レベルでの炎症性シグナルの変化が認められたことから、Western-blottig法によりたんぱく質レベルでの変化について検証する。3.これまでの研究成果に基づき脳機能障害のターゲットに予防的に働く食品成分の検索※予測する食品成分(食事性コレステロール吸収阻害、コレステロール合成阻害、脳内摂食調整成分)のうち、特に日本人のエネルギー摂取の約50%程度を占める穀物に含まれる成分に着目し検索された成分を高HC食に添加し慢性的に経口投与し、血液動態、脳機能動態を比較検討する。高コレステロール食を習慣的に摂取するとアルツハイマー病になるのか?私たちは高コレステロール食をマウスに慢性的に投与することにより脳機能障害が発症し、それがアミロイドβの蓄積を伴うアルツハイマー型脳機能障害である可能性を発見した。本研究は、高齢化社会に向けて偏った食生活が、脳神経系にもたらす相乗的なリスクターゲットを生化学的な手段およびマウス動物実験を用いて解明し、明らかになったターゲットを抑制あるいは改善する物質を食品成分や食事に置き換えて検討することにより予防食の提案を行うことを目的とした。平成28年度は、C57BL/6雄性マウスに4ヶ月間に亘り高コレステロール食を慢性投与し、飼育期間中、食行動、飲水行動等を評価した。また、rota-rode試験、Open field試験などの行動解析を行った。行動解析後、深麻酔後に組織固定液にて灌流固定し検討臓器の摘出後、形態学的に評価した。視床下部におけるヒスタミン神経細胞数の減少・分泌能低下の検討には吻側から尾側にかけて10μmの連続切片を作成し検討を行っている。さらに、行動解析後、血液(総コレステロール、インスリン、レプチン、TG)の評価を行った。また視床下部を摘出し1Western blotting(SREBP2,HMGCR,HMGCS2, BDNF AMPKα1,HDC)、2マイクロアレイ(視床下部のmRNAを調整し遺伝子発現解析)、3メタボローム解析(視床下部の代謝産物を網羅的に解析)を行いおおよその結果を得た。以上の実験結果に基づいて慢性的高コレステロール食の摂取が、脳神経系にもたらす相乗的なリスクターゲットは何かを多角的に検討している。本研究は、当初の予定通りに実験を行い結果を得ているが、新規性の高い研究でもあり、得られた実験結果の解釈に時間を要している。特に血液中の高コレステロール血症状態を脳にセンシング・情報伝達しているものは何か?これまでの実験により、高コレステロールの慢性的負荷によって視床下部のコレステロール動態が影響を受けることは結果より得られたが、それらがどのような機序で引き起こされるのか?追加実験も含め検討する必要がある。さらに脳関門の問題等についても重大な問題であり文献的考察も含めて対応する必要がある。また、遺伝子解析の結果についても、現在、視床下部をターゲットとした研究データが乏しく、得られた情報の解析に時間を要した。

さらに、これらの結果に基づく追跡および再現性実験には、本実験のマウス飼育期間が4ヶ月と一定期間が必要であることなどからも、本研究の機序におけるリスクターゲットの最終決定が平成29年度にまたがることとなりやや遅れが生じている。C57bl6雄性10週齢マウスに高コレステロール食(HC食(2%-,0.2%-,0.02%-))および対照食(AIN93G)を経口慢性投与した。BioLis15ineo(関東化学)を用い血清脂質動態を評価した。飼育4か月でTC,LDL,HDLが2%HC食で有意に増加し、TGが有意に低下した。また、血清レプチン、インスリンの有意な増加も認められた。LDL,TGは2%HC食負荷後、3日目で有意に増加しており、負荷後直ちに血清脂質動態が変化することが分かった。さらに飼育4か月で視床下部ヒスタミン含有量が低下し、行動解析では社会性行動、短期記憶能が低下した。形態学的変化は、抗HDC陽性反応領域が減少し、神経細胞の萎縮、細胞内ゴルジ複合体の空胞化が認められ、神経ヒスタミン細胞内にアミロイドβの蓄積がみられた。慢性的HC食の負荷によって、高コレステロール血症を発症しAD様の脳機能障害と行動変化が観察された。メタボローム解析を用いて脳代謝物を網羅的に解析した結果、2%HC食慢性投与では有意に脳内コレステロール量が低下していた。Western blotting法により、視床下部におけるコレステロール合成能について検討したところHMGCRなどのコレステロール合成経路がたんぱく質レベルで抑制され、AMPKα1、HDCが低下していた。マイクロアレイ解析では、p<0.01かつRatio>2.0の遺伝子が75genes検出された。これらをGene Ontology解析を行った結果、2%HC食慢性投与群では脳内の摂食シグナル因子であるAGRPの活性化と視床下部に特徴的なホルモンの分泌、またシグナル伝達ペプチドの発現が亢進していた。炎症性のシグナルペプチドも増加しており、視床下部の神経細胞は持続的なレプチン刺激によって、炎症が励起されそれによってAGRPの異常発現活性化が伴ったと推測できた。平成29年度当初計画では、平成28年度の結果から脳機能障害のターゲットを解明することで、これらに予防的に働く食品成分を検索することを予定していた。予測する食品成分として食事性コレステロール吸収阻害(水溶性食物繊維;海藻・果物・野菜ほか)、コレステロール合成阻害(βグルカン;大麦、ジンゲロール・シトラール;しょうが、EPA・DHA;青魚、フェルラ酸;米ぬかほか)、脳内摂食調整成分(γオリザノール;玄米)が挙げられた。特に日本人のエネルギー摂取の約50%程度を占める穀物に含まれる成分に着目し検討することで予防成分を多く摂取できる可能性を予測していた。しかし、C57bl6雄性マウスに高コレステロール食を慢性投与することによって高コレステロール血症を発症することは分かっていたが、負荷後どの程度の期間で血清脂質動態、特にLDLが上昇するのかの検討が遅れていたため、食品成分の決定にも遅れが生じた。
Suwon, Korea 3次元培養モデルを用いた前立腺発癌機構の解析とバイオマーカーの検索

前立腺癌の発癌・増殖機構は未だに不明な点が多い。本研究では、より生体に近い実験系として3次元培養法を用いた解析を行い、前立腺発癌機構解析のための新たな解析手法を確立した。同手法により、アネキシンA1抑制によるIL-6を介した前立腺癌への関与を明らかにした。また、前立腺の正常な腺管形成にアンドロゲンレセプター(AR)が重要な役割を果たしていることをみいだし、ARの発現制御に関与する分子の機能解析をすることで前立腺癌への寄与を明らかにした。これまでに前立腺正常細抱であるRWPE-1細胞を用いた3次元培養法を確立し報告してきた。今回、この3次元培養モデルを用いて、前立腺癌においてその発現が抑制されているアネキシンA1 (AnxA1)の機能解析を行った。同研究では、RWPE-1細胞を用いてAnxA1の発現を抑制したところNFκBの活性化がみられ、標的分子の一つであるIL-6が分泌亢進されることを示した。同細胞の細胞増殖能は2次元培養条件ではコントロールとの間に差を認めなかったが、3次元培養ではAnxA1発現抑制により腺腔様構造の形成が遅延し、さらに同現象がIL-6の分泌を介するものであることを示した。(Inokuchi et al., Carcinogenesis)同研究は、前立腺発癌におけるNFκBの関与を示すとともに、前立腺細胞の2次元培養と3次元培養環境下での差を示した点で非常に有意義な報告であったと考える。さらに、同研究で鍵となったサイトカインであるIL-6に注目し、実際の臨床サンプルを用いて前立腺周囲脂肪から分泌されるIL-6をはじめとするサイトカインと前立腺癌の組織学的悪性度との相関を検討した。その結果、前立腺周囲脂肪組織から分泌されるIL-6と組織学的悪性度には相関を認め報告した。(Finley et al., J.Urol)これまでに前立腺正常細泡であるRWPE-1細胞を用いた3次元培養法を確立し、同培養法を用いてアネキシンA1(AnxA1)の発現抑制によりNFκBが活性化され、標的分子の一つであるIL-6の分泌が亢進されることにより前立腺発癌に関与することを示してきた。同研究は、前立腺発癌におけるNFκBの関与を示すとともに、前立腺細胞の2次元培養と3次元培養環境下での差を示した点で非常に有意義な報告であったと考える。また、IL-6に注目し、実際の臨床サンプルを用いて前立腺周囲脂肪から分泌されるIL-6をはじめとするサイトカインと前立腺癌の組織学的悪性度との相関を検討したところ、前立腺周囲脂肪組織から分泌されるIL-6と組織学的悪性度には相関を認めた。そこで3次元培養モデルを用いて、細胞の癌化に重要な働きをしていると予測される細胞極性、分化、細胞間接着などにおいて鍵となる分子機構の解析を目的として、2次元及び3次元培養環境での遺伝子発現の違い、あるいはIL-6に暴露した3次元培養状態での遺伝子発現の違いを、cDNAマイクロアレイ法を用いて網羅的に解析を行っているところである。また、これまでにRWPE-1細胞では2次元培養環境下では発現していないARが3次元培養にて発現誘導されることを確認した。ARの異常な活性化はホルモン不応性前立腺癌の原因の一つであり、その活性化の調節機構は不明な点が多い。一方、コレステロール降下薬として使用されるスタチン製剤により、血清PSA値の下降や前立腺癌リスクの低減がみられるという報告がある。そこで我々は、ARに注目して解析を行い、in vitroにおいてスタチン製剤がARの蛋白分解を促進し、ARの発現量を低下させることで感受性が低下し、前立腺癌細胞の増殖抑制がみられることを報告した。これまでに前立腺正常細胞であるRWPE-1細胞を用いた3次元培養法を確立し、同培養法を用いてアネキシンA1(AnxA1)の前立腺発癌への関与を明らかにしてきた。同研究は、前立腺細胞の2次元培養と3次元培養環境下でのmRNA発現、蛋白発現に重要な違いがあることを示した点で非常に意義のある報告となった。そこで、3次元培養モデルを用いて、前立腺細胞の癌化において鍵となる働きをしていると予測される細胞極性、分化、細胞間接着などの分子機構の解析を目的として、2次元及び3次元培養環境での遺伝子発現の違いを、cDNAマイクロアレイ法を用いて網羅的に解析を行った。同網羅的解析の結果、およびWestern blot法を用いた蛋白発現解析により、RWPE-1細胞を用いた3次元培養環境下では、2次元培養環境下では発現していないARが発現誘導されることを確認した。ARの異常な活性化は去勢抵抗性前立腺癌の原因の一つとも考えられているが、その活性化の調節機構は不明な点が多い。そこで、ARに注目して解析を進めた。これまでに、コレステロール降下薬として使用されるスタチン製剤により、血清PSA値の下降や前立腺癌リスクの低減がみられるという報告がなされている。

そこで我々は、ARに注目して解析を行い、in Vivoにおいてスタチン製剤がARの蛋白分解を促進し、ARの発現量を低下させることで感受性が低下し、前立腺癌細胞の増殖抑制がみられることを報告した。また、前立腺癌の発癌に関して、アスピリンが発癌リスクを軽減するという報告がなされている。我々は、アスピリンが前立腺癌に対してARの発現抑制を介して増殖抑制を誘導することを示した。さらに、このAR制御がプロスタグランジンEレセプターのサブタイプであるEP3を介したものであることを示した。
神経系における熱ショックたんぱく質の発現低下が統合失調症に及ぼす影響の解明

統合失調症の発症には遺伝的要因や環境要因が関与していることが知られているが、確実な病因遺伝子や要因は同定されておらず、発症の分子メカニズムは不明である。これまでに申請者は熱ショックたんぱく質であるHSP70(Heat Shock 70kDa Protein)が統合失調症の病態に関わる有力な候補因子であることを突き止めている。この因子をもとに、統合失調症における分子の動態を詳細に解析する必要があり、本研究では神経系細胞レベルにおけるHSP70の特異的な分子情報伝達経路を同定すること、個体レベルにおける行動や脳の形態構造について明らかにすることを目的とする。
網羅的細菌叢解析を用いた誤嚥性肺炎における原因菌のエビデンスの構築

気管支洗浄液を採取した肺炎患者(177名)を対象に16SrRNA遺伝子を用いた網羅的細菌叢解析法を用いて、誤嚥リスク因子の有無により分類し原因菌解析を行った。誤嚥リスク有群(83名)では口腔レンサ球菌が有意に多く検出され、その規定因子として、全身状態不良や1年以内の肺炎の既往が抽出された。これにより、口腔内常在菌として過小評価されてきたレンサ球菌が、誤嚥性肺炎の原因菌として重要なことを明らかにした。また、口腔衛生状態と原因菌との関連性の検討(n=34)では、口腔内衛生状態(OHI)が不良群で嫌気性菌の検出が有意に多く、口腔内不衛生が下気道検体の嫌気性菌の検出に関与すると考えられた。本研究は、気管支肺胞洗浄液中の16S ribosomal RNA遺伝子の解析を行うことにより、呼吸器感染症の原因菌を明らかにすることに加えて、これまでの細菌培養法を中心とした原因菌の検討では評価が困難であった口腔内常在菌や嫌気性菌の原因菌としての意義を含め、今後高齢化に伴い増加することが予測される誤嚥性肺炎における新たなエビデンスを構築することを目的としている。われわれはこれまでに市中肺炎64例、医療介護関連肺炎82例に対して網羅的細菌叢解析法を用いた原因菌の検討を行い、特に高齢者において、口腔内常在菌である連鎖球菌が肺炎の原因菌として重要であることを示した。連鎖球菌が高齢者の肺炎患者で多く検出されたことに着目し、気管支洗浄液の細菌叢解析の結果を誤嚥のリスク因子の有無によって分類して解析した。対象患者177名(上記146名を含む)のうち、誤嚥のリスク因子を有する患者は83名であった。誤嚥のリスクの有/無での年齢は、それぞれ、76.6/64.5歳であり、リスク有の群で有意に高齢であった。また、誤嚥のリスク有/無での口腔内連鎖球菌の割合はそれぞれ31.0/14.7%であり、誤嚥のリスクを有する群で有意に多くみられた(p=0.009)。また、多変量解析の結果では、口腔内連鎖球菌は、全身状態不良な患者(ECOG performance status 3以上)、一年以内の入院歴が多い患者ほど多く検出される傾向があった。これらのことから、これまで口腔内常在菌として過小評価されていた連鎖球菌が、誤嚥性肺炎においてより重要であることを明らかにした。上記の結果から、次の段階として、口腔内の衛生状態や細菌叢と誤嚥性肺炎との関わりについて検討を行う予定である。現在、歯科口腔外科の協力のもと、プラークを含めた口腔内検体の細菌叢の評価や口腔衛生状態と気管支肺胞洗浄液の細菌叢との比較を行っている。本研究は、気管支肺胞洗浄液中の16S ribosomal RNA遺伝子の解析を行うことで、呼吸器感染症の原因菌を明らかにすることに加え、これまでの細菌培養を中心とした原因菌の検討では評価困難だった口腔内常在菌や嫌気性菌の原因菌としての意義を含め、今後高齢化に伴い増加することが予想される誤嚥性肺炎における新たなエビデンスを構築することを目的としている。われわれはこれまでに市中肺炎64例、医療介護関連肺炎82例に対して網羅的細菌叢解析を用いた原因菌の検討を行い、特に高齢者において、口腔常在菌である連鎖球菌が肺炎の原因菌として重要であることを示した。連鎖球菌が高齢者の肺炎で多く検出されたことに着目し、気管支肺胞洗浄液の細菌叢解析の結果を誤嚥のリスク因子の有無によって分類して解析した。誤嚥のリスクの有/無での年齢は、それぞれ76.6/64.5歳であり、リスク有で有意に高齢であった。また、誤嚥のリスク有/無での口腔連鎖球菌の割合はそれぞれ31.0/14.7%であり、誤嚥のリスクを有する群で有意に多くみられた。(p=0.009)。上記の結果から、次の段階として口腔内の衛生状態や細菌叢と誤嚥性肺炎との関わりについて検討中である。歯科口腔外科の協力のもと、プラークを含めた口腔内検体の細菌叢の評価や口腔衛生状態や気管支洗浄液の細菌叢との比較を行っている。現在35症例蓄積しており、さらに症例数を増やし解析を行う方針である。上述したように、細菌叢解析によって得られた結果を用いて、誤嚥性肺炎の口腔内連鎖球菌の臨床意義については、解析を終了した。現在、論文を投稿中である。一方で、今回得られた結果をもとにした我々の最終的な目的は、口腔内(上気道)の細菌叢の状態と肺炎(下気道)との因果関係について検討を行うことであり、次の段階として、上述した下気道の細菌叢の結果がいかに口腔内の細菌叢や衛生状態と関与しているかということを解明する必要がある。

口腔内の細菌叢を評価するため、歯科口腔外科の協力のもと、口腔内プラークを含めた口腔内の検体や口腔衛生状態の評価を同時に行う患者のさらなる症例のさらなる蓄積が必要である。現在、35症例蓄積しており、さらに症例数を増やし解析を行う方針である。本研究は、通常行われる細菌培養法に加えて、同一検体を用いて気管支肺胞洗浄液中の16S ribosomal RNA遺伝子の解析を行うことで、今後高齢化に伴い増加することが予想される誤嚥性肺炎における原因菌、これまで細菌培養での原因菌の検討では評価困難だった口腔内常在菌や嫌気性菌の原因菌としての意義を含め、新たなエビデンスを構築することを目的とした。我々は、これまでに市中肺炎、医療介護関連肺炎の細菌叢解析を用いた原因菌の検討で、特に高齢者において、口腔内常在菌であるレンサ球菌が肺炎の原因菌として重要であることを示したが、これまでの知見として気管支肺胞洗浄液の細菌叢解析の結果について誤嚥リスク因子の有無によって分類して解析した。対象患者177名のうち、誤嚥リスク因子を有する患者は83名であった。誤嚥リスクの有/無での年齢は、各々76.6/64.5歳であり、誤嚥リスク有で有意に高齢であった。また、誤嚥リスクの有/無での口腔レンサ球菌の割合はそれぞれ31.0/14.7%であり、誤嚥リスクを有する群で有意に口腔レンサ球菌が多くみられた(p=0.009)。また、多変量解析の結果では、口腔レンサ球菌は、全身状態が不良な患者(ECOG PS3以上)、一年以内の入院歴が多い患者ほど多く検出される傾向があった。以上より、これまでの喀痰培養検査で口腔内常在菌として過小評価されていたと考えられる口腔レンサ球菌が、誤嚥性肺炎において肺炎の原因菌としてより重要であることを明らかとした。次の段階として、歯科口腔外科と共同で、口腔内衛生状態の評価を行い、口腔内衛生状態と、口腔内の細菌の16SrRNA遺伝子を用いた細菌叢解析を用いた細菌叢と肺炎の気管支肺胞洗浄液を用いた細菌叢解析による原因菌との関連性を検討する。現在、34症例であり、さらに症例数を増やし解析を行う。気管支洗浄液を採取した肺炎患者(177名)を対象に16SrRNA遺伝子を用いた網羅的細菌叢解析法を用いて、誤嚥リスク因子の有無により分類し原因菌解析を行った。誤嚥リスク有群(83名)では口腔レンサ球菌が有意に多く検出され、その規定因子として、全身状態不良や1年以内の肺炎の既往が抽出された。これにより、口腔内常在菌として過小評価されてきたレンサ球菌が、誤嚥性肺炎の原因菌として重要なことを明らかにした。また、口腔衛生状態と原因菌との関連性の検討(n=34)では、口腔内衛生状態(OHI)が不良群で嫌気性菌の検出が有意に多く、口腔内不衛生が下気道検体の嫌気性菌の検出に関与すると考えられた。上述したように、細菌叢解析によって得られた結果を用いて、誤嚥性肺炎における口腔内連鎖球菌の臨床的意義については解析を終了した。現在、論文投稿中である。また、解析症例数が最終的に177例に達し、100例を超える解析ができたことを考慮し、この一年における当初の目的を達成することができたものと考える。一方で、今回得られた結果をもとにした我々の最終的な目的は、口腔内(上気道)の細菌叢の状態と肺炎(下気道)との因果関係について検討を行うことであり、次の段階として、上述した下気道の細菌叢の結果がいかに口腔内の細菌叢や衛生状態と関与しているかということを解明する必要がある。口腔内の細菌叢を評価するため、歯科口腔外科の協力のもと、口腔内プラークを含めた口腔内の検体や口腔衛生状態の評価を同時に行う患者のさらなる症例追加が必要となる。また、並行して、現在、口腔内検体の細菌叢解析を開始したところであり、次の一年でさらなるデータの集積と解析を行う予定である。
多層グラフェン薄膜の乱層構造に起因する特異物性の研究

本研究では、大量製造可能な酸化グラフェン(GO)から反応性雰囲気での超高温処理により低欠陥・乱層・多層グラフェン薄膜を形成し、そこから単層に類似した優れた特性を引き出して乱層構造の物性優位性を検証することを目的とする。今年度は、本研究の1年目で見出した成果、すなわち高空隙スポンジ状GOの超高温処理による低欠陥・乱層グラフェンのスケーラブル形成を発展させ、物性計測に適した試料構造の作製を試みた。さらに乱層グラフェン試料を用いた物性評価を推し進め、炭素材料における特異構造である乱層構造から単層に類似した優れた物性を発現させる可能性について検証した。物性解析に向けた薄膜試料作製法として、まずGO分散液を凍結乾燥して得られる自立構造体である多孔質GOスポンジを超高温で処理して、低欠陥・多層の3次元グラフェン集積体を作製した。このグラフェン構造体を100t以上の高圧で薄膜状に圧縮成型することを試みたが、この圧力でも弾性変形し、元の形状が維持されることが判明した。そのため、多孔質GOスポンジはそのままの形状を活かして電気化学電極としての性能検証へと展開することとした。物性解析試料の代替として、吸引濾過による薄膜形成法の検討を進めるとともに、化学気相法を用いて石英基板上に乱層グラフェンを形成する手法を開発した。得られた乱層グラフェン薄膜をチャネルとして電界効果トランジスタやホール素子を作製し、キャリア輸送特性を解析した。得られたキャリア移動度・密度などについてグラフェン層数・測定温度依存性を解析した結果、単層類似の輸送特性や基板近傍グラフェン層によるスクリーニング効果を明らかにした。この結果は、乱層構造を持つ多層グラフェンの物性的な優位性を示しており、今後の応用展開が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、大量製造可能な酸化グラフェン(GO)から反応性雰囲気での超高温処理により低欠陥・乱層・多層グラフェン薄膜を形成し、そこから単層に類似した優れた特性を引き出すことが目的である。本研究1年目の平成29年度では、物性測定に適した乱層グラフェン形成法の確立を進めた。当初計画では、薄膜形成プロセスとしては、低反応性基板上薄膜を加熱処理する直接的な作製法に加えて、1400°C以上での処理が可能なグラファイト加工基板上に架橋した酸化グラフェンを転写する手法を予定していた。しかし予備検討の結果、入手できた高融点酸化物・窒化物基板は超高温で炭素といわゆるcarbothermal反応を起こして分解することが判明した。またGOを架橋させる凹形構造のサイズが熱伝導計測などに必要な5μm以上とすると加熱処理後に凹形構造の溝に落ちてしまい、架橋構造を維持できないこともわかった。そのため、GO分散液の凍結乾燥で得られ、自立可能な高空隙スポンジ状GO(サイズ:1cm角)から低欠陥・乱層グラフェンを形成する手法の開発を重点的に進めた。自立構造体のため基板にグラファイト自身を使用でき、超高温でも基板材料との反応は無視できる。しかも電気炉を用いた複数試料の同時処理というスケーラブルなプロセスも可能となった。さらに乱層構造の形成は、従来のGO凝集体では試料表面付近に限られていたのに対し、高空隙GOスポンジを用いると内部に至るまで乱層構造となっており、しかも欠陥修復も進行していた。しかし、ラマンスペクトルの挙動から、積層構造は不均一であり、物性計測で単層類似の特性を引き出すにはプロセスの改善が必要であることもわかった。今後は、スポンジ状GOの構造均一性を向上して単層状物性を示す比率を向上するとともに、自立乱層構造グラフェンやそれを基板上に転写した薄膜による電気・熱物性測定へと展開する。交付申請書では、(1)物性解析に向けた低欠陥・乱層グラフェン薄膜作製法開発、(2)乱層グラフェン薄膜におけるキャリア輸送特性・熱伝導特性解析方法の確立の2項目を今年度に実施するとしていた。しかし、(2)の前提となる乱層・多層グラフェン薄膜作製プロセスにおいて、当初予定していた低反応性基板上薄膜を加熱処理する直接的な作製法や、1400°C以上での処理が可能なグラファイト加工基板上に架橋した酸化グラフェンを転写する手法が困難であることが判明した。そのため、自立可能な高空隙スポンジ状GOから低欠陥・乱層グラフェンを形成するという新たな手法に特化して進めることとした。その結果、cmスケールの試料全体が内部に至るまで乱層構造となるという当初は想定していなかった成果を得ることができた。来年度においては、得られたグラフェンを絶縁物基板上に転写して電界効果トランジスタ(FET)構造やホール効果測定素子を作製し、キャリア輸送特性の解析から乱層構造の特異性を検証することが可能となった。また、この試料を用いると、薄膜では困難であったバルクスケールでの熱伝導計測手法で評価できる可能性がある。以上のように、予定通りの項目をすべて達成しているわけではないが、当初想定していなかった課題を克服する手法を提案・実施して、来年度の研究につなげており、おおむね順調に進捗していると評価する。

今年度は、本研究の1年目で見出した成果、すなわち高空隙スポンジ状GOの超高温処理による低欠陥・乱層グラフェンのスケーラブル形成を発展させ、物性計測に適した試料構造の作製を試みた。さらに乱層グラフェン試料を用いた物性評価を推し進め、炭素材料における特異構造である乱層構造から単層に類似した優れた物性を発現させる可能性について検証した。物性解析に向けた薄膜試料作製法として、まずGO分散液を凍結乾燥して得られる自立構造体である多孔質GOスポンジを超高温で処理して、低欠陥・多層の3次元グラフェン集積体を作製した。このグラフェン構造体を100t以上の高圧で薄膜状に圧縮成型することを試みたが、この圧力でも弾性変形し、元の形状が維持されることが判明した。そのため、多孔質GOスポンジはそのままの形状を活かして電気化学電極としての性能検証へと展開することとした。物性解析試料の代替として、吸引濾過による薄膜形成法の検討を進めるとともに、化学気相法を用いて石英基板上に乱層グラフェンを形成する手法を開発した。得られた乱層グラフェン薄膜をチャネルとして電界効果トランジスタやホール素子を作製し、キャリア輸送特性を解析した。得られたキャリア移動度・密度などについてグラフェン層数・測定温度依存性を解析した結果、単層類似の輸送特性や基板近傍グラフェン層によるスクリーニング効果を明らかにした。この結果は、乱層構造を持つ多層グラフェンの物性的な優位性を示しており、今後の応用展開が期待される。本研究の1年目で見出した成果、すなわち高空隙スポンジ状GOの超高温処理による低欠陥・乱層グラフェンのスケーラブル形成を発展させ、物性計測に適した試料構造を作製する。得られた試料を用いて、物性評価を推し進め、炭素材料における特異構造である乱層構造から単層に類似した優れた物性の発現を検証する。(1)物性解析に向けた低欠陥・乱層グラフェン薄膜作製法開発:高空隙スポンジ状GOの超高温処理による低欠陥・乱層グラフェン薄膜形成条件を最適化し、欠陥密度をさらに低減するとともに、乱層構造の比率を高める。処理条件としてはエッチング作用を持つ水蒸気や炭素供給力を高める炭化水素ガスを添加し、欠陥修復と乱層構造の維持が両立する条件を探索する。得られたグラフェン構造体について、物性測定に必要な絶縁物基板への転写やペレット状への成型技術を確立する。(2)乱層グラフェン薄膜における物性解析:(I)キャリア輸送特性:項目1で得られた乱層グラフェンを絶縁物基板上に転写して得られる薄膜をチャネルとして電界効果トランジスタ(FET)構造やホール効果測定素子を作製し、電気的な特性評価をおこなう。FET特性やホール測定から乱層グラフェンにおけるキャリア移動度・密度の膜厚依存性を解析し、乱層構造による単層に類似した特異性発現を検証する。(II)熱伝導特性:乱層グラフェンの熱伝導特性を数層の架橋薄膜とプレス成形で得られる自立膜(サイズはcmスケール)の両面から評価し、乱層構造による熱伝導率の向上効果を検証する。(III)電気化学特性:優れた電気伝導度と高空隙構造を活かした応用として、電気化学電極としての活性を評価し、そのポテンシャルを検証する。活性はサイクリックボルタンメトリーでのピーク電流やその電極電位から解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ニホンナシの芽の休眠の生化学的機構と打破技術の確立

`二十世紀'の発育枝と短果枝を11月から1月中旬まで経時的に採取し花芽の休眠の深さを調査したところChill unit400までが深い自発休眠にあたりChillunit600から1000が覚醒期にあたりChillunit1400のに完全に自発休眠は打破されるものと思われた。この期間の芽中のタンパク質含量は低温遭遇に伴い増加し、自発休眠が完全に打破されたChill unit1400の時点では低温遭遇前の約3倍の含量となった。またタンパク質を等電点電気泳動を行ったところいずれの区においてもChill unit200でpI5.6付近に新たなバンドが検出され、それ以降低温遭遇に伴い量的な増加が見られた。この部位を切り取りSDS-PAGEを行ったところM.W.約61,000及び65,000付近にChill unit200以降、二量体と思われる新たなタンパク質が検出され、低温遭遇に伴い量的に増加した。また、m-RNAを抽出し、in-vitroで無細胞質のタンパク質合成を行ないったところChill unit200以降同じ等電点のタンパク質が新たに確認された。以上のことより本研究で検出されたpI約5.6・M.W.約61,00065,000のタンパク質は低温に遭遇することで新たに合成され、ニホンナシの芽の休眠打破と何らかの関連を持つものと推察される。一方、マンシュウマメナシ青系及び白系に接木した`二十世紀'を12月から2月にかけて経時的に加温栽培したところ地上部の生育は1月中旬までの処理区で抑制された。一方、地下部の生育はマンシュウマメナシ青系で早い時期から盛んであり、新根の発生量が多かった。さらに地下部を加温せず地上部のみ加温した場合にもマンシュウマメナシ青系で新根の発生量が多かった。従って、ニホンナシにおける早期加温栽培に用いる台木種としてはマンシュウマメナシ青系が適しているものと思われる。
グリア細胞成長因子のラットアストロサイト分化誘導機構

我々はグリア細胞成長因子(GMF)のアストロサイトに対する分化誘導作用の機構を解明することを目的に、アストロサイトの細胞分化における細胞骨格の機能を研究している。培養ラットアストロサイトの粗細胞骨格画分より特異的にマイクロフィラメント(MF)とグリアフィラメント(GF)を脱重合抽出した。100mM KClと10mM MgCl_2によりMFから再構成されたマイクロフィラメント様フィラメントは直径5nmで主要構成タンパク質であるアクチンの他にビメンチンやGFAPなどの中間径フィラメント構成タンパク質など多数のマイナーなタンパク質が認められた。この再構成フィラメントから中間径フィラメント画分を除去するためにヘビーメロミオシンサブフラグメント1(S1)のアフィニティーカラムにより精製した。しかしながら精製フィラメントにおいてもビメンチンとGFAPの存在が認められた。また150mM NaClと10mM MgCl_2でGF重合して形成されたグリアフィラメントにおいてもビメンチンやGFAPの他にアクチンなど他数のマイナーなタンパク質が認められた。一方MFとGFの重合臨界濃度を上げるα-シアロシルコレステロール(SC)存在下で、MFはGFの重合を著しく上昇した。電子顕微鏡下においても、SCで重合抑制されたGFはMFによりそのフィラメント伸展が促進されることが観察された。またGFより再構成されたグリアフィラメント様フィラメントに対するSCの脱重合作用をMFは強く抑制した。以上の結果よりMFはGFとの相互作用を介して重合が促進されるものと考えられた。脳内で産生されるグリア細胞成長因子(GMF)はアストロサイトに特異的に作用するサイトカインで、その増殖と分化を促進する。GMFにより、増殖後分化して成熟した形態を獲得していく過程で、アストロサイトの細胞骨格は著しい構造変化を伴う。細胞骨格の構造変化はアストロサイトの分化において重要な要素であると考えられ、本研究では分化型アストロサイトとコントロール細胞の細胞骨格の特性を比較検討することを目的として、細胞骨格主要成分であるマイクロフィラメントとグリアフィラメントをそれぞれ特異的に脱重合抽出し、再構成系においてそれらの特性を検討した。アストロサイトより脱重合抽出されたマイクロフィラメント画分(MF)とグリアフィラメント画分(GF)は100mM Kclと10mM Mgcl_2あるいは150mM Naclと10mM Mgcl_2により重合し、それぞれマイクロフィラメント様フィラメントとグリアフィラメント様フィラメントを形成した。合成糖脂質であるα-シアロシルコレステロール(α-SC)により、MFとGFの重合は共に抑制され、これらフィラメントの主要構成タンパク質であるアクチンとビメンチンの重合もα-SCにより抑制された。これらの知見により、少なくともα-SCはアクチンとビメンチンに作用してMFとGFの重合を抑制するものと考えられた。α-SCで重合抑制されたGFは、α-SCで前処理されたMFにより著しく重合が促進された。MFは非重合状態においてGF重合促進作用が顕著であることから、MF構成タンパク質が遊離状態においてGFの重合を促進することが示唆された。α-SC存在下においてアクチンはビメンチンの重合を促進したことからMFとGFの相互作用はフィラメント関連タンパク質によって介されるのではなく、アクチンとビメンチンとの直接の結合を介したものであることが示唆された。

しかしながら精製フィラメントにおいてもビメンチンとGFAPの存在が認められた。また150mM NaClと10mM MgCl_2でGF重合して形成されたグリアフィラメントにおいてもビメンチンやGFAPの他にアクチンなど多数のマイナーなタンパク質が認められた。一方MFとGFの重合臨界濃度を上げるシアロシルコレステロール(SC)存在下でMFはGFの重合を著しく上昇した。電子顕微鏡下においても、SCで重合抑制されたGFはMFによりそのフィラメント伸展が促進されることが観察された。またGFより再構成されたグリアフィラメント様フィラメントに対するSCの脱重合作用をMFは強く抑制した。以上の結果よりMFはGFとの相互作用を介して重合が促進されるものと考えられた。
中性子小角散乱による好熱菌ATP合成酵素の構造と機能の研究

第2次分での交付であったため、試料作成と一回の実験を行ったのみである。以下に、その概要をのべる。1.試料作成について好熱菌ATPaseのα、βの各サブユニットを発現させるように遺伝子を組換えられた大腸菌を軽水培地及び重水培地で培養することで、通常のサブユニットに加え重水素化されたサブユニットも大量に得た。それらのサブユニットを再構成することにより、重水素化されたサブユニットを含む好熱菌ATPaseの活性をもつ六量体α_3β_3を得た。それらは重水素化された各サブユニットをαd,βdとするとき、次の四種類の六量体α_3β_3、αd_3β_3、α_3βd_3、αd_3βd_3である。実験について中性子小角散乱の実験は、東海村の日本原子力研究所の改造3号炉に設置された東京大学物性研究所の装置を用いて行った。まず予備的な実験として、得られるデータの精度がどの程度かを把握するために、通常の軽水素のままの好熱菌ATPase(α_3β_3)のMg-ATPの存在下および存在しない状態で、測定を行った。その結果、過去の中性子及びX線小角散乱の実験で得られたデータより非常に質が良く、より高角度側の散乱強度も精度良く測定ができた。これにより各状態での構造をより詳しく調ベることが可能と思われ、現在このデータの解析中である。今後、重水素化された試料等を用いて調べることで、目的とする好熱菌ATPaseの機能と構造の関係を明らかにしていく予定である。