hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食料輸出の多様化にともなう取引条件、契約締結プロセス及びニーズの解明に向けた研究

本研究では、国際的知名度の高い加工食品においては、民間大企業による輸出展開が海外の需要を拡大してきたが、海外原料への依存や現地生産化につながりやすく、中小企業による最近の海外展開は日本産加工食品の輸出であり、日本国内の生産拡大につながっていることを明らかにした。次に、日本ブランドと個別ブランドというダブル・ブランド戦略が有効に機能するためには、共通の優位性を前面に出しながらも、個別ブランド間の差異に対する認識を小さくしないようなプロモーションを行うべきである。5つの研究目的に沿って研究を遂行した。低コスト海上輸送普及のための課題については、新たな鮮度保持技術を利用して海上輸送を行っているケーススタディの調査に基づき、海上輸送の可能性について明らかにした。第2の課題については、アジア地域において輸入品に要請されている認証制度や食品検査制度について実態を明らかにした。これによって広義の品質問題、ブランド問題としての理論化に道筋をつけることができた。第3に、香港、タイ、シンガポールにおける外食産業の中から任意に抽出した外食産業店舗を対象にして、日本産食材に対する購買意向とニーズを把握し、その特徴をもとに分類を試みた。ベトナムの調査設計に時間を要ししたため、27年度に繰り越しをしたが、計画通り牛肉を素材として調査を進めることができた。第4に、加工品における契約取引条件の解明については、シンガポールや香港における契約取引条件の事例調査分析を行った。これをもとに、契約取引理論の枠組みでモデル化を試みた。第5に、生鮮農産物を対象にして、機能性の抽出分析を行いデータベース化する試みを行った。さらに、外食業者や加工業者に対して機能性を有した食品開発を行っている事例について調査を行い、機能性を有した加工品に対するニーズを明らかにした。これらの研究成果については、日本農業市場学会等で発表を行った。ベトナムを対象とした牛肉外食産業実需者のニーズ把握及び高級レストランにおいて牛肉を消費経験のある消費者への日本産和牛の認識調査等の設計が遅れたため、27年度に調査分析が繰り越された。しかし、27年度において計画通り調査分析が遂行され、その他の研究も含めてほぼ当初の予定通りの研究が進んでいる。1外食産業における日本産牛肉のタイの外食店舗での利用状況を調査し、等級でA4、A5クラス、部位ではサーロイン、リブ等に加え代表的な焼肉部位であるカルビー等が中心であることを明らかにした。購入者層は上位6%層とまだまだ少数であるが、日本食ブーム、円安の影響もあり、輸出量は増加していることを明らかにした。2福岡県産食材の付加価値検証のための機能性評価を行った。あまおうや甘夏や葉わさびに、有用な機能性が見いだされた。特に、葉わさびの含水エタノール抽出物に抗酸化活性、抗菌活性、抗アレルギー活性、抗肥満活性等、機能性食品・機能性化粧品への応用可能性が期待できる結果を得た。3加工食品の輸出について、順調に輸出を増加させているみそ大手企業の成功事例を取り上げ、輸出国で要求される認証の取得、社内におけるバックアップ体制の構築、安定供給できる体制の構築という対応を講じるとともに、国際展示会への参加といった対応を講じていることを明らかにした。さらに、こんにゃくの輸出に取り組む関係者への聞き取り調査を実施した。1食習慣・商習慣の国際的な違いへの対応、2震災時における輸出の一時中断とその影響力、3「有望」とされる海外現地市場の内実と第三国による国際競争の開始など、輸出の現状と課題を明らかにした。4輸出産品の認証制度等について、(株)青研における輸出向けりんご取扱の調査分析を行い、亜熱帯、熱帯における鮮度維持、GAP認証取得の要求に対応するためには、農家レベルでは機会主義的な出荷行動の抑制、収集卸売業においては農家の組織化が求められることが明らかとなった。また、輸出チャネル選択の重要性を実証すべく、日本茶の対ドイツ輸出の実態調査を実施し、ドイツ国内においてチャネル選択によって異なる日本茶の販売実態を確認した。5つの研究課題のうち4つの小課題については、順調に研究は進捗している。物流システムの課題についても予定より少し遅れているものの、とりまとめのシンポジウムを開催できたことで、おおむね順調に進捗している。わが国の農林水産物・食品輸出の特徴として、1加工食品や水産物のみで過半数を占めており、果実・野菜、畜産物、穀物等は小規模で推移している点、輸出相手国・地域の上位は概ねアジアに集中している点が明らかとなり、限定された範囲での輸出である。2輸出事業主体の中心は県等輸出促進協議会・公社及び農林水産業協同組合から食品企業・商社へと民間セクターへ徐々にシフトしている。3輸出推進政策に伴う支援事業の増加に触発され、輸出に取り組む事業主体が増えたため、日本産農産物・食品の輸出が活発な国・地域においては産地間競争が発生しつつある段階に至っている。欧州諸国をターゲットマーケットとした有機食品(緑茶、味噌、醤油など)の輸出拡大について。1有機食品の専門店は、日本食品としてのアイデンティティや価値が保持されているほか、輸出側による前方チャネルの管理が相対的に容易。2有機食品市場の成長は著しく、慣行食品の輸出より有機食品の輸出に重点を置くべきであり、輸出を意識した国内の有機食品の供給力強化のための対策を講じる必要がある。シンガポールや香港での和牛販売は増加しているが、現地での国産和牛の市場構造、輸入者の相対的に強い交渉力、輸出振興補助金のために販売費用以下で販売されていることを明らかにした。

また、ジャパンブランドと個別ブランド間でのプロモーションに関する戦略行動に関して、個別ブランド間の同質性が高い場合は、ジャパンブランドの訴求は、個別ブランド間の差異をより認識しにくいものにする可能性が高いことを明らかにした。加工食品全体を見ると、輸出金額は増大しているが、醤油、みそのような大手メーカー主導の輸出が主体である。現在わが国最大の輸出先となっている香港での輸出拡大の一因として、現地で多店舗展開する大手日系食品小売企業のチャネルが寄与していることを解明した。本研究では、国際的知名度の高い加工食品においては、民間大企業による輸出展開が海外の需要を拡大してきたが、海外原料への依存や現地生産化につながりやすく、中小企業による最近の海外展開は日本産加工食品の輸出であり、日本国内の生産拡大につながっていることを明らかにした。次に、日本ブランドと個別ブランドというダブル・ブランド戦略が有効に機能するためには、共通の優位性を前面に出しながらも、個別ブランド間の差異に対する認識を小さくしないようなプロモーションを行うべきである。27年度は当初の計画通り、第1の課題に対して海上輸送を普及するための産地集出荷体制、輸出主体の協調体制に関する条件について研究を進める。第2に、アジア地域で求められる認証制度や検査制度に対してどのような対応が求められるかを明らかにする。第3に、26年度の事例調査を受けて、外食産業における国産商品ニーズごとの軍類を行う。第4に、加工品における取引の契約理論モデルの構築を進める。第5に、機能性抽出に基づくデータベース化を進め、食品加工業者のニーズを体系化して機能性食品開発の可能性を検討する。今後の推進方策についても、1海上コンテナ輸送の拡大のための産地集出荷システムの構築、2認証制度、商標制度等の課題の解明、3外食産業における食材ニースの解明、4加工品の取引条件、5機能性の抽出とデータべース化といった課題を整理することで、最終的な課題解明に到達できると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。食料流通学28年度が最終年度であるため、記入しない。
血球分化に伴うビメンチン遺伝子の発現調節機構の解析

マウス骨髄性白血病細胞M1は、IL-6やLIFといったサイトカインによってマクロファージへと分化を誘導される。この分化に際して、貧食能や運動能といったマクロファージに特有の機能が誘導されるだけでなく、細胞質の膨大や核の偏在と言った顕著な形態的変化をも誘導される。このような変化を惹起する因子として、中間径フィラメントの関与が考えられているが、われわれはM1細胞の分化に際して、中間径フィラメントの一種、ビメンチンが顕著に誘導されてくることを見い出した。ビメンチン蛋白質の合成、その蓄積、ビメンチンmRNAの蓄積などをそれぞれ2次元電気泳動、ウエスタンブロット法、ノーザン解析などによって明らかにし、細胞内におけるビメンチン束の出現を、蛍光抗体法および電子顕微鏡による観察などによって明らかにした。またこの分化に伴うビメンチン遺伝子の誘導は、転写レベルで調節されていることが、核ランオン解析によって明らかになった。そこでこの誘導調節機構を明らかにするため、ビメンチン遺伝子のプロモータ領域を解析することにした。マウス肝細胞より、ビメンチンのgenomic DNAをクローニングした。転写開始点より上流3kbまでの塩基配列決定を行い、ヒト、マウスおよびハムスターの間で、いくつかのエレメントがよく保存されていることを確かめた。CAT遺伝子をビメンチンプロモータの下流につなぎ、ビメンチンの発現に対して働くプロモータ/エンハンサーの同定を行った。その結果、M1細胞だけでなく、その他の繊維芽細胞においてもビメンチン発現を正および負に調節する2つのエレメントを同定することができた。転写開始点上流-133bpまでの領域に存在するCAAT boxが主要な正の活性を、またCAAT boxから僅かに上流に存在するPER3エレメントが負の活性を担っている、サイレンサー活性を有することが明らかになった。この分化に際して、貪食能や運動能といったマクロファージに特有の機能が誘導されるだけでなく、細胞質の膨大や核の偏在と言った顕著な形態的変化をも誘導される。核がなぜある一定の細胞質領域に保持されているのかについては、まだはっきりとはわかっていないが、中間系フィラメントがその保持に関係していると考えられている。われわれはM1細胞の分化に際して、中間系フィラメントの一種、ビメンチンが顕著に誘導されてくることを見い出した。またこの分化に伴うビメンチン遺伝子の誘導は、転写レベルで調節されていたことが、核ランオン解析によって明らかになった。

このような変化を惹起する因子として、中間径フィラメントの関与が考えられているが、われわれはM1細胞の分化に際して、中間径フィラメントの一種、ビメンチンが顕著に誘導されてくることを見い出した。ビメンチン蛋白質の合成、その蓄積、ビメンチンmRNAの蓄積などをそれぞれ2次元電気泳動、ウエスタンブロット法、ノーザン解析などによって明らかにし、細胞内におけるビメンチン東の出現を、蛍光抗体法および電子顕微鏡による観察などによって明らかにした。またこの分化に伴うビメンチン遺伝子の誘導は、転写レベルで調節されていることが、核ランオン解析によって明らかになった。そこでこの誘導調節機構を明らかにするため、本年度はビメンチン遺伝子のプロモータ領域を解析した。ビメンチンのgenomic DNAの転写開始点より上流3kbまでの塩基配列決定を行い、その下流にCAT遺伝子をつなぎ、ビメンチンの発現に対して働くプロモータ/エンハンサーの同定を行った。この領域には、NF-IL6 binding site,PER3 sequence,CAAT boxなどのエレメントが含まれていた。また遺伝子工学的手法によって、種々のdeletion mutantを作成し、それぞれCAT遺伝子につないで、同様にM1細胞に導入することによってプロモーター活性を測定した。その結果、M1細胞だけでなく、その他の繊維芽細胞においてもビメンチン発現を正および負に調節する2つのエレメントを同定することができた。転写開始点上流-133bpまでの領域に存在するCAAT boxが主要な正の活性を、またCAAT boxから僅かに上流に存在するPER3エレメントが負の活性を担っている、サイレンサー活性を有することが明らかになった。
わが国への選択的学習指導モデルの適用

近年、授業の目的、内容、学習者の様態なでに応じて指導法を選択的に適用していく考え方が受け入れられるようになってきた。報告者は、こうした発想をいち早く提唱したムスカ・モストンの「教授スタイルの連続体モデル」を援用し、従来よりなされてきた「問題解決学習か系統学習か」といった二者択一的論議が不毛であることを指摘するとともに、わが国に適した学習指導スタイルを整備していくことの必要性を主張してきた。本研究では特に、現行の学習指導要領に示されている「学習過程のステージモデル」に焦点をあて、これが教授スタイル論的な視点からみてどのように位置づけられ、またどのような問題点をはらんでいるのかを明らかにしようと試み、以下の諸点を導いた。1)「楽しい体育」論では、素材を加工する際の視点が方法的視点に留まっており、内容的視点が欠落しているため、教材としての要件が満たされていない。2)「楽しい体育」論で提唱される「めあて学習」は、未開の知識・技術の「生産」なのではなく、既存の内容の「再生産」である。したがって、問題解決学習とは厳密に区別して、誘導発見学習、あるいは課題解決学習として位置づけるべきである。3)子どもの内発的動機に依存して自主的・自発的学習を待つのではなく、教師が次の諸点に積極的に関わることが重要である。a)子どもが各自の能力に見合った課題を解決でき、合理的・系統的な学習が可能となるようなプログラムを準備しておくこと。b)授業に積極的に介入し、授業のイニシアティブをとること。c)予備的運動を工夫し、子どもに「運動のアナロゴン」を身につけさせておくこと。本研究は、わが国に適用可能な学習指導スタイルを構築するための基礎的資料として位置づけられる。有効性が見通されるいくつかのスタイルをどのような基準で適用していくのか、そのストラテジーを確立していくことが今後の課題となる。
関節リウマチ患者登録システムと保険データベースによる分子標的治療薬の薬剤疫学研究

REALを用いて、関節リウマチ(RA)患者におけるトシリズマブ(TCZ)の1年間の安全性を検討した。TNF阻害薬使用群に対するTCZ群(n=302)の重篤有害事象および重篤感染症(SI)のリスクはいずれも有意ではなかった。同データベースを用いて、生物学的製剤使用患者における罹病期間とSIとの関連性を検討した。長期罹患患者群(vs.早期RA患者群)のリスクは有意ではなかった。保険データベースを用いて、RA群と非RA群での合併症有病率を比較した結果、調査対象のいずれの合併症の有病率は、RA群の方が有意に高く、背景因子で調整後も虚血性心疾患・脳梗塞とRAに有意な関連性が認められた。1. REALデータベースを用いて、トシリズマブ(TCZ)使用患者群の重篤な有害事象(SAE)の発生頻度をTNF阻害薬(TNFI)使用患者群と比較し、SAEおよび重篤な感染症(SI)のリスクを比較した。解析対象症例は、TCZの投与を開始された患者(TCZ群、n=302)、および2008年以降にTNFIの投与を開始された患者(TNFI群)とした。その結果、SAE及びSIの発生率比(TCZ vs. TNFI)は1.5[95%CI0.9-2.3]、3.5[1.5-8.2]であり、TCZ群の方がTNFI群と比較してSIの発生率が有意に高かった。TNFI群に対するTCZ群のSAEおよびSIのリスクはハザード比1.3 [95% CI 0.8-2.2]、2.2[0.9-5.4]だった。本研究は実臨床において、TCZとTNFIを直接比較した初めての報告であり、生物学的製剤を正しく選択するための有用な情報となることが期待される。2.日本における分子標的治療薬使用RA患者に関するアウトカム研究(CORRECT)のwebシステムを管理し、患者登録を進め、登録患者数は平成26年3月時点で396名となった。平成25年12月までにデータが固定された患者286名(TT曝露群:150名、TT非曝露群:136)名の患者背景の記述統計を実施した。3.保険データベースを用いて、RA群(2762名)と非RA群(27620名)での合併症有病率を解析した。調査対象の各合併症の有病率(RA vs.非RA)は、狭心症(4.5% vs. 1.2%)、急性心筋梗塞(0.4% vs. 0.1%)、虚血性心疾患(5.0% vs. 1.4%)、糖尿病(6.0% vs. 2.5%)、骨粗鬆症(19.9% vs. 1.2%)といずれの合併症においてもRA群の方が非RA群と比較して有意に高かった。1.REALデータベースを用いて、早期RA患者と長期罹患患者の安全性を比較検討した。解析対象症例は、REALのフォローアップデータが得られた患者のうち、生物学的製剤が一度でも投与された患者とし、生物学的製剤開始時のRA罹病期間が2年以内の患者を早期RA患者(early RA), E群(301名、637.7患者・年[PY])とし、それ以外の症例は長期罹患患者(long-standing RA), L群(1092名、2242.8PY)とした。解析対象期間は生物学的製剤開始から3年、死亡、追跡中止日までとした。解析対象症例の背景因子を記述し、報告された重篤な有害事象(SAE)の発現率および内容を両群で比較した。その結果、L群はE群と比較して、有意に高齢で、Steinbrockerのstage分類がIII以上の患者の割合が高く、メトトレキサートの使用率はE群で有意に高く、平均投与量も有意に多かった。E群と比較してL群の粗発生率比はSAE(1.88[1.39-2.54])および重篤な感染症(SI)(2.17[1.31-3.60])で有意に高いことが明らかになった。次に、Cox比例ハザードモデルを用いて患者背景因子で調整し、罹病期間とSIとの関連性を検討した結果、L群(vs. E群)のハザード比(95%CI)は1.22(0.67-2.25)と有意なリスク因子とはならなかった。SIの有意なリスク因子として、高齢であること、SteinbrockerのStage分類(III or IV)、肺合併症を有することが抽出された。2.日本における分子標的治療薬使用RA患者に関するアウトカム研究(CORRECT)のwebシステムを管理し患者登録を進め、登録患者数は平成27年3月時点で513名となった。

平成27年1月までにデータが固定された患者327名(TT曝露群:172名、TT非曝露群:155名)の患者背景因子および観察開始一年間の治療内容、治療反応性の推移、SAEの内訳と件数の記述統計を実施した。関節リウマチにおける薬剤疫学REALを用いたTCZ使用患者とTNFI使用患者群の安全性の比較は、予定していた解析を全て終了した。保険データベースを用いた研究に関しては、RAにおける薬剤別の安全性解析を計画していたが、まずは保険データベースに登録されているRA症例の全体像を把握する必要があると判断し、各種合併症の有病率をRAと非RAで詳細に解析した。したがって、本研究課題は総合的には概ね順調に進展していると判断した。1. REALデータベースを用いて、早期RA患者と長期罹患患者の安全性を比較検討する。解析対象症例は、REALのフォローアップデータが得られた患者のうち、生物学的製剤が一度でも投与された患者とし、生物学的製剤開始時のRA罹病期間が2年以内の患者を早期RA患者(early RA), E群とし、それ以外の症例は長期罹患患者(long-standing RA), L群とする。解析対象期間は生物学的製剤開始から3年、死亡、追跡中止日までとする。解析対象症例の背景因子を記述し、報告されたSAEを分類したのち、SAEの発現率および内容を両群で比較する。次に、E群およびL群におけるSAE発現者と非発現者における背景因子の比較を行い、リスクとなる候補因子を探索する。時間依存性変数は観察期間内における変化とSAEの発現時期を考慮し、最も適切な統計学的モデルを構築する。2. CORRECTデータベースは、平成25年度に引き続きデータベースの充実化を促進させ、十分な症例数が確保されたのち、治療群間の登録時データや疾患活動性、SAEの発現頻度および内容を比較する。また、有効性に関しても患者の身体機能評価の指標も含めて比較検討する。3.保険データベースを用いた研究に関しては、RAにおける薬剤別の安全性解析実施する前に、まずはRA症例の全体像を把握する必要があると判断した。最新の保険データベースを用いて対象患者数を増やし、RA症例における各種合併症(心血管系疾患、糖尿病、骨粗鬆症など)の有病率を再度検討し、今年度の結果と比較する。また、最長3年間の入院イベントの内容および発生率をRA症例と非RA症例で比較検討する。平成25年度は概ね当初の計画通り、研究を実施したが、一部、研究内容を修正したため、費用が余った。第一の研究である、REALデータベースを用いた、早期RA患者と長期罹患患者の安全性の比較検討において、必要事務用品の購入費、統計解析費、論文作成にかかる費用として使用する計画である。第二の研究である、CORRECT研究においては、データベースのサバー管理費として使用する計画である。また、REAL/CORRECT研究会議において研究参加施設とのミーティングを行うための旅費としても使用する計画である。第三の研究である、保険データベースを用いた研究に関しては、統計解析費および学会発表の際の出張費として使用する計画である。
直交偏波4光波混合を用いた光信号分配器に関する基礎的研究

光信号分配器において、ON/OFF時の時間応答特性は基本的な特性であり、重要であるが、直交偏波4光波混合を用いた光信号分配器についてこの特性は詳しくは知られていない。この時間特性に関して成果が挙がったと考える。即ち、第1年目(昨年度)は書き込み光を遮断直後に出力光が一時的に増大する現象を発見し、この現象は正孔と自由電子がキャリアとして存在し、劣勢な方のキャリアによる空間電荷電界の時定数が短い場合に発生することを理論と実験から明らかにした。第2年日(今年度)は、書き込まれた屈折率格子の2つの成分の相対位相が時間応答特性に与える影響を理論と実験の両面から明らかにした。即ち相対位相がπ(逆位相)でポンプ比が小さい場合(後進ポンプ光が弱い場合)に応答が515倍程度早くなることを明らかにした。更に、全く新しいON/OFF法を提案した。すなわち外部から電界を印加することにより、屈折率格子を保存したまま、位相整合条件を満たさなくすることにより出力を切断できることを理論的に示した。この方法によれば、屈折率格子の消去・書き込みを伴う従来の応答速度を数桁改善できる可能性があることを明らかにした。以上、まとめると直交偏波4光波混合を用いた光信号分配器の基礎的特性、特に時間応答特性に多くの有用な知見を得ることができた。プローブ光と位相共役光の偏波を直交させる,直交偏波4光波混合の実験中にそれ迄の知識では説明のつかない現象を観測した.それは読み出し光(ポンプ2)を照射したまま,書き込み光(ポンプ1とプローブ光)をしゃ断すると一般にはゆるやかに回折光(位相共役光)が減少していくが,しゃ断直後一時的に増大する場合のあることを観測した.またその減少には2つの時定数が関与していることを発見した.これを説明するため数種のモデルを検討した結果,(1)正と負のキャリア(正孔と電子)の両者が存在し,(2)一方のキャリアによる空間電荷電界が劣勢でかつその時定数が短い場合に観測されることを理論と実験の双方から明らかにすることに成功した.このような現象は光信号分配器にとっては望ましくないと考えられる.これを避けるためには正・負どちらかのキャリアのみが関与するフォトリフラクティブ結晶が望ましいことが明らかになった.直交偏波4光波混合においては半透明鏡による光パワーの損失がないため,屈折率格子の書きこみや消去が速くなる.また,光信号分配器において,ON/OFF時の時間応答特性は基本的な特性であり,重要であるが,直交偏波4光波混合を用いた光信号分配器についてこの特性は詳しくは知られていない.この時間特性に関して成果が挙がったと考える.即ち,第1年目(昨年度)は書き込み光を遮断直後に出力光が一時的に増大する現象を発見し,この現象は正孔と自由電子がキャリアとして存在し,劣勢な方のキャリアによる空間電荷電界の時定数が短い場合に発生することを理論と実験から明らかにした.第2年目(今年度)は,書き込まれた屈折率格子の2つの成分の相対位相が時間応答特性に与える影響を理論と実験の両面から明らかにした.即ち相対位相がπ(逆位相)でポンプ比が小さい場合(後進ポンプ光が弱い場合)に応答が515倍程度早くなることを明らかにした.更に,全く新しいON/OFF法を提案した.すなわち,外部から電界を印加することにより位相整合条件を乱し,屈折率格子を保存したまま出力を遮断できることを理論的に示した.この方法によれば,屈折率格子の消去・書き込みを伴う従来の応答速度を数桁程度改善できる可能性があることを明らかにした.以上,まとめると直交偏波4光波混合を用いた光信号分配器の基礎的特性,特に時間応答特性に多くの有用な知見を得ることができた.
児童期におけるコミュニケーション障害の研究

本年度は、研究協議会を通じて、班としての研究の視点および研究方法について検討を行うとともに、各分担者において研究を進めた。各研究分担者の研究概要は、以下のとおりである。志村洋:教師と視覚障害児および視覚障害児同士の間の情報伝達と受容の効率性を、教科学習における事物・事象の説明場面に限定して検討を進めている。大石益男:精神薄弱養護学校における共感関係を育てる指導を、教師の指導日記の分析および行動の観察により検討している。中川辰雄:通常学級における聴覚障害児の適応について、コミュニケーションという観点から、その過程を検討している。篠原吉徳:2語文(目的語+動詞の構造を持つ)の学習の中で精神薄弱児のことばをより機能的、実用的にするための指導を検討している。緒方明子:精神薄弱特殊学級という指導場面における、有効な指導法およびプロンプトの方法について、実験学級により検討している。山下皓三:ことばに遅れのみられる肢体不自由児の授業での、ことば以外のメッセージ伝達方法について、特に教師の演示、教材及びその呈示の仕方という観点から検討している。渡辺章:意志の表出が困難な肢体不自由児の学習について、コミュニケーションエイドの使用、場の設定の仕方という観点から検討している。小山創:絵や映像を文章で描写する課題を通して、自閉症児に対する教師の質問の出し方が与える効果を記述し、改善点を検討している。川住隆一:重度・重複障害児へのかかわり方、教材の呈示の仕方がコミュニケーション関係や行動の変化に与える影響を検討している。岡田明:聴覚障害児にテレビ放送によって学習内容を伝達する場合の字幕の挿入の方法とその効果について検討している。
分子間ラジカル反応による歪曲π共役分子の合成

曲面構造をもつπ共役分子は曲面に起因する特異な機能性を発現するため、新たな機能性分子としての応用が期待されている。本研究では、アニリンおよびフェノールの酸化反応をモチーフとした分子間ラジカル反応を用いることで、曲面構造をもつ様々なπ共役分子を穏和な条件で合成し、その機能性を明らかにした。具体的には、ポルフィリンを縮環構造で多量化することにより、これまで最大のねじれを持つ分子の合成を達成した。また、アントラセンを基質としたヘリセン分子を合成し、優れたキラル発光特性を明らかにした。さらにこれまで合成が不可能とされてきた、窒素を内部に含むバッキーボウルの合成に成功し、その物性を明らかにした。本年度は申請者がすでに開発しているアミノ基導入による酸化的二量化反応の汎用性を示すため、他のπ共役分子を基質として反応を行った。まず、蛍光特性に優れた分子であるBODIPYの2位にアミノ基を導入して酸化を行ったところ、縮環構造をもつ三量体を中程度の収率で得ることに成功した。また、3位に置換基を持つBODIPYに対して適用することでdiazo結合を介した二量体、四量体を合成することに成功した。これらはいずれも近赤外吸収を持ち、簡便に近赤外吸収色素を合成する手法である。以上の結果はChemical Communications誌に掲載およびOrg. Lett.誌に掲載予定である。特に前者はBack Coverに選定されるという高い評価を得た。次にフェナントレンの9位にアミノ基を導入し酸化を行ったところ、ピロール縮環体およびピラジン縮環体が高収率で得られることを見いだした。特にピロール縮環体はX線結晶構造解析により、想定通り歪んだ構造を有していることを明らかにした。最後に、四置換ポルフィリンに対して置換基を種々検討し酸化を行ったところ、かさ高い置換基においても反応が良好に進行することが分かった。生成物はX線構造解析によりねじれた構造をしていることが分かった。これはねじれた構造をもつ分子を簡便に合成できる手法として画期的である。さらに、反応条件を検討したところ収率の大幅な向上にも成功した。本反応はアミノ基の導入および酸化を繰り返すことで多量体の逐次合成が簡便に行える。実際にポルフィリン二量体において検討したところ、四量体の合成に成功した。各種スペクトル測定により以前としてねじれた構造を有していることを見いだしており、ねじれた分子多量体合成達成に関する重要な知見を見いだしたと考えている。現在論文投稿に向けて準備中である。H26年度は前年度合成を達成したねじれたポルフィリン二量体を用いてさらなるねじれをもつ分子の合成を行った。具体的にはねじれたポルフィリン二量体をアミノ化し、酸化することで目的の四量体を良好な収率で得ることに成功した。大阪大学の久木助教の協力のもとX線構造解析に成功し、四量体が一方向にねじれた構造をもつことを明確に同定した。その結果、これまで報告されている中で最大のねじれ角をもつ分子であることが判明した。さらに、多量化に伴いねじれの反転の活性化障壁が高くなっていることをNMR測定により明らかにした。この結果は高分子ではよく知られている例であるが、π共役分子では初めて観測された現象である。以上の成果は米国化学会誌J. Am. Chem. Soc.に発表し、有機合成として優れたな成果であるとしてSynfactでハイライトされた。また、アントラセンを出発原料として用いることにより高発光性ヘリセンの合成にも成功した。アントラセンにヒドロキシを導入し、酸化することで通常不安定である脱芳香環化したジケト二量体の安定単離に成功した。さらにこれを前駆体として高度な歪みをもつオキサヘリセンの合成を達成した。いずれの反応も室温で行っており、低温でπ共役平面を曲げる反応を開発したと考えている。オキサヘリセンは優れた発光特性を示し、高いキラル発光特性を持つことを明らかにした。さらに、固体でも優れた発光特性をもつことを見いだした。以上の成果は英国化学会誌Chemical Communications誌に発表した。さらに、高度な歪みをもちこれまで合成が困難とされてきたアザバッキーボウルの合成に挑戦した。その結果、合成に成功しX線構造解析によりそのお椀型構造を明らかにした。この成果は第95回日本化学会春季年会にて報告した。本年度は前年度合成に成功した初めての窒素含有お椀型分子「アザバッキーボウル」の物性解明を行った。まず、光化学測定を行ったところ、これまで報告されているお椀型分子中において優れた蛍光量子収率をもつ発光を示すことを見いだした。また、C60と強い会合挙動を示すことをNMR測定および光化学測定により明らかにした。最終的には会合体の構造をX線構造解析により明らかにした。また、この会合体のキャリア移動度を測定したところ、C60が存在しない状態に比べて約10倍のキャリア移動度を示すことを見いだした。最後に、中心の窒素元素の塩基性を明らかにするべく、酸の添加実験を行ったところ、酸性溶媒中でUV吸収スペクトルが劇的に変化することを見いだした。このスペクトルは一電子酸化によっても得られることから、アザバッキーボウルは酸性溶媒中で容易に酸化され、ラジカルカチオンを生成する性質があることを見いだした。以上の結果はNat. Commun.に報告し、Nature Asia Japanにハイライトされた画期的な成果となった。

ねじれたポルフィリンでは、中心に亜鉛金属を配位させることに成功し、その構造解析から、ニッケル錯体と同様のねじれた構造をとることを明らかにした。この亜鉛錯体にキラルアミンを添加したところ、コットン効果を示すCDスペクトルが得られることを見いだした。このことはキラルアミンによってポルフィリンのねじれが誘起されたことを示す結果である。また、X線構造解析により、キラルアミンとメゾ位の置換基の立体的な相互作用が二つの光学異性体のエネルギー差を生み出していることを明らかにした。この結果はChem. Asian. J.に報告し、同誌のInside Coverに選定された。曲面構造をもつπ共役分子は曲面に起因する特異な機能性を発現するため、新たな機能性分子としての応用が期待されている。本研究では、アニリンおよびフェノールの酸化反応をモチーフとした分子間ラジカル反応を用いることで、曲面構造をもつ様々なπ共役分子を穏和な条件で合成し、その機能性を明らかにした。具体的には、ポルフィリンを縮環構造で多量化することにより、これまで最大のねじれを持つ分子の合成を達成した。また、アントラセンを基質としたヘリセン分子を合成し、優れたキラル発光特性を明らかにした。さらにこれまで合成が不可能とされてきた、窒素を内部に含むバッキーボウルの合成に成功し、その物性を明らかにした。H26年度は当初の計画の目標の一つであったねじれ分子の多量体の合成を達成することができた。さらに、ねじれた分子およびヘリセンの思わぬ機能性発現を見いだし、さらなる発展が期待できる成果を出すことができた。また、当初の研究計画では挑戦的なテーマであったお椀型分子の合成にも早期に成功した。以上の結果は、当初3年で達成する目標として設定していた成果の予想を超える進度であり、さらなる研究の発展を期待できるものである。構造有機化学今後は合成したねじれおよび歪み分子の機能性を追求する。ねじれたポルフィリン多量体についてはさらなる多量化による可溶性分子ワイヤーの創出、および生体関連物質としての応用など機能性を重視した研究の推進を行っていく。また、ヘリセンについては光による変換が可能な分子および金属錯化の多彩な分子を用いて磁性および光物性にすぐれた歪み分子の創出を行う。また、開発した合成法を用いたさらなる大きな歪みを持つ分子の合成を継続して行っていく予定である。現在までに、ポルフィリンを用いたねじれた多量体合成の達成およびBODIPYを用いた多量体合成による近赤外吸収色素の簡便合成を達成した。特に前者はねじれた分子ワイヤーを構築できる手法として有用であり、本研究の目的達成に向けて一歩前進したと考えている。BODIPYに関して本反応の適用性を確認できたことは、本反応の基質一般性について重要な知見であると考えている。さらに、フェナントレンを基質とした反応において本研究の核となるお椀構造分子の前駆体までの合成ルートを確立した。現在最終ステップの反応について精密な検討を行っている。全ての成果について関連学会において発表を複数行っている。本研究についての論文も国際誌に2報掲載しており、うち一方はback coverに選定されるといった評価を得た。
ナノ領域の温度・歪み検出素子の創出

プラズモン増強電場と単層カーボンナノチューブ(SWNT)を組み合わせ、従来の微細加工技術では実現不可能なナノメートルサイズの温度・歪みセンターとしての基礎的動作の検証を行った。その結果、プラズモン増強電場によるSWNTの表面増強ラマンスペクトルを評価することで、SWNTの温度上昇および歪みを高感度で検出可能であることを明らかにした。プラズモン増強電場と単層カーボンナノチューブ(SWNT)を組み合わせ、従来の微細加工技術では実現不可能なナノメートルサイズのセンシング素子を創製する。上記目的を達成するために、表面増強ラマン散乱活性な金属ナノダイマー構造と単一SWNTを組み合わせ、ナノ温度・変位センサーの基礎的概念の実証を試みた。センサー分子であるSWNTは、そのラマンスペクトルが光学異方性及び温度依存性を持つことで知られている。まずはじめに、照射するレーザー強度を変えることで金属ナノダイマー構造の温度を制御し、その構造に担持された単一SWNTの表面増強ラマン(SERS)スペクトルのピークシフト量変化と温度依存性について評価を行った。照射するレーザー強度を変化させるると、照射するレーザー強度に比例してグラフェン構造由来のGバンドのピーク値が低波数側にシフトするのが明らかとなった。この結果から、SWNTを用いたナノ金属構造の温度をモニタリングするナノ温度センサー実現に向けた基礎的動作原理に関する知見を得ることに成功した。つぎに、入射偏光に円偏光を用いた場合のGバンドスペクトルの応答性について検証を行った。金属ダイマー構造に円偏光が照射された際、ダイマーのギャップ部において旋光方位に依存した局所電場が形成される。そこで、SWNTを担持した金属ナノダイマーに対して右円偏光ならびに左円偏光を照射し、円偏光SERS測定を行った。その結果、各入射円偏光に対するSERSシグナル強度、Gバンドスペクトル形状変化が観察された。この結果から、単一SWNTの変位により、ギャップ内のSWNTに印加されている局所電場の偏光方位が変化、このときのSERSシグナル強度、Gバンドスペクトル形状変化を読み取ることで、SWNTの変位量を見積もれることを示唆する。以上、ナノ温度・変位センサーの基礎的動作原理に関する知見を得ることに成功した。
二重房室伝導経路の臨床電気生理学的所見の経年的変化およびその臨床的意義

〔目的〕二重房室結節伝導路(Dual A-V Nodal Pathways以下, DAVNPW)は発作性上室性頻拍(以下, PSVT)などの不整脈の機序として重要である.DAVNPWは,解剖学的異常ではなく,機能的縦解離と考えられているが,不明な点も多い.本研究では,これらの点と関連して, DAVNPWの経年変化,順行性および逆行性DAVNPWの頻度, PSVTとの関係などを検討した.〔対象および方法〕対象は, 1975年から1984年までの10年間に観血的な臨床心臓電気生理検査である心房期外刺激法を行った499例である. DAVNPWの経年変化の検討には非観血的な経食道心房ペーシング法を用いた心房期外刺激法を行った.〔結果〕(1)6104ケ月(平均40ケ月)の間隔で, DAVNPWの経年変化を検討した18例中16例(88.9%)においてその再現性が確認された.(2)Jumpの大きさ,不応期の長さにも有意の再現性を認めた.(3)DAVNPWは,心房期外刺激法を行った499例中120例(24.0%)に認められた.(4)逆行性DAVNPWは,順行性DAVNPWの10.5%に認められた.(5)DAVNPW例で, PSVTが誘発されたのは逆行性伝導が保たれ,また,その逆伝導能の良好な例であった.〔総括〕DAVNPWは比較的頻度の多い房室結節伝導異常である.また,経年的な変化を検討したところ,その出現の有無のみならず不応期などの電気生理学的測定値にも再現性を認めたことから,房室結節の単純な機能的縦解離ではなく形態学的な異常も示唆さる結果が得られた.また, DAVNPWは興奮の旋回路となり得るものであるが,実際に房室結節リエントリーを生じることは少ない. DAVNPWで房室結節リエントリー性頻拍が誘発されたのは,逆行伝導が保たれ,かつ,その逆伝導能とともに順行伝導能も良好な症例であった.〔目的〕二重房室結節伝導路(Dual A-V Nodal Pathways以下, DAVNPW)は発作性上室性頻拍(以下, PSVT)などの不整脈の機序として重要である.DAVNPWは,解剖学的異常ではなく,機能的縦解離と考えられているが,不明な点も多い.本研究では,これらの点と関連して, DAVNPWの経年変化,順行性および逆行性DAVNPWの頻度, PSVTとの関係などを検討した.〔対象および方法〕対象は, 1975年から1984年までの10年間に観血的な臨床心臓電気生理検査である心房期外刺激法を行った499例である. DAVNPWの経年変化の検討には非観血的な経食道心房ペーシング法を用いた心房期外刺激法を行った.〔結果〕(1)6104ケ月(平均40ケ月)の間隔で, DAVNPWの経年変化を検討した18例中16例(88.9%)においてその再現性が確認された.(2)Jumpの大きさ,不応期の長さにも有意の再現性を認めた.(3)DAVNPWは,心房期外刺激法を行った499例中120例(24.0%)に認められた.(4)逆行性DAVNPWは,順行性DAVNPWの10.5%に認められた.(5)DAVNPW例で, PSVTが誘発されたのは逆行性伝導が保たれ,また,その逆伝導能の良好な例であった.〔総括〕DAVNPWは比較的頻度の多い房室結節伝導異常である.また,経年的な変化を検討したところ,その出現の有無のみならず不応期などの電気生理学的測定値にも再現性を認めたことから,房室結節の単純な機能的縦解離ではなく形態学的な異常も示唆さる結果が得られた.また, DAVNPWは興奮の旋回路となり得るものであるが,実際に房室結節リエントリーを生じることは少ない. DAVNPWで房室結節リエントリー性頻拍が誘発されたのは,逆行伝導が保たれ,かつ,その逆伝導能とともに順行伝導能も良好な症例であった.二重房室結節伝導路(dAVNPW)は、房室結節リエントリー性頻拍の機序となり得るものではあるが、房室結節の機能的縦解離によるものか、あるいは器質的解剖学的異常によるものかが問題となっている。また、通常型の房室結節リエントリー性頻拍の逆行伝導路となる速伝導路に関しては、これが房室結節内経路か、結節外伝導路であるかについても論義がある。そこで、臨床電気生理学的および薬理学的にこれらの問題点について検討した。対象および方法:臨床心臓電気生理検査にて順行性にdAVNPWが診断された32例であるが、17例にはいわゆる薬理学的自律神経遮断(propranolol 0.2mg/kg+atropine 0.04mg/kg静注)を行い、別の15例にはCa拮抗薬(diltiazem 0.4mg/kg,あるいはverapamil 0.1mg/kg)を静注して、薬剤静注前後の臨床電気生理検査の結果を対比検討した。結果:

(1)薬理学的自律神経遮断を行った17例中14例には遮断後もdAVNPWを認めた。(2)自律神経遮断後もdAVNPWを認めた14例では、速伝導路有効不応期が遮断後に短縮傾向を示した他は、遅伝導路有効不応期やjumpの大きさはほゞ不変であった。(3)遮断前に房室結節リエントリーが誘発された5例のうち、遮断後に誘発されなくなったのは1例のみであった。(4)dAVNPWのうちの速伝導路に対するCa拮抗薬の効果であるが、速伝導路の順伝導有効不応期は15例中14例で延長したが、逆伝導不応期の場合はその効果が一様でなく、著名な延長例がある一方では短縮例も存在した。速伝導路に対するCa拮抗薬の効果が順伝導と逆伝導で全く異なる例が少なくなかった。以上の結果から、dAVNPWは自律神経の影響によらない房室結節の構造的な原因によるものが多いことが示唆され、また、逆行伝導路となる速伝導路には副伝導路的性質を有する経路もあるように思われた。
妊娠高血圧腎症妊婦から出生した児におけるDOHaD仮説の検証と早期介入への戦略

妊娠高血圧腎症は妊娠により血圧上昇、蛋白尿を来す疾患である。近年の疫学調査により、妊娠高血圧腎症を発症した妊婦から生まれた児は、脳性麻痺や自閉症などのリスクが高いことや、将来心血管障害やメタボリック症候群などを発症しやすいことが明らかになってきた。我々は妊娠中の「異常炎症」による胎内環境の悪化が出生後の疾患リスクの上昇に関与するのではないかという仮説を立て、動物モデル(炎症誘発性妊娠高血圧腎症モデル)や臨床検体(早産児の在胎修正40週頭部MRI画像)を用いて検証することを研究目的とした。
補体反応を活用した抗腫瘍免疫誘導法の研究

腫瘍細胞膜上には、自己補体の反応を抑制する種特異的補体制御膜糖蛋白が存在しており、自己補体の反応を防ぐ仕組みになっている。一方細胞膜上の補体制御膜糖蛋白の機序を抑制するモノクロ-ナル抗体の探索を行い、ラットのDAFに対するモノクロ-ナル抗体を得た。マウスのDAFに対する抗体は、精製したマウスDAFをウサギに免疫して抗血清を得た。これらのDAFに対する抗体でラットやマウスの腫瘍細胞を処理すると同種血清の補体とも反応するようになり、C_3の沈着が認められるようになった。ラットの腫瘍細胞をDAFに対するモノクロ-ナル抗体を用いて蛍光染色し、フロ-サイトメトリ-によりDAF陽性とDAF陰性細胞にソ-ティングし、これらの細胞を同系ラットに移植した。その結果、DAF陽性の腫瘍細胞はDAF陰性のものに比して腫瘍増殖性が強かった。このことから、DAFは腫瘍細胞を補体反応から守って腫瘍の増殖を助けていると考えられた。そこで、ラット腫瘍細胞をDAFに対するモノクロ-ナル抗体で処理してから同系ラットに接種してみたところ、腫瘍は生着がむずかしくなり多くのラットで腫瘍拒絶がみられた。このラットに、抗DAF抗体未処理の腫瘍を接種してみたところ、腫瘍に対する免疫が誘導されており、生着しなくなっていた。このことは、抗DAF抗体で腫瘍細胞を処理すると腫瘍細胞に対する自己補体の反応が許されるようになり、その結果、抗腫瘍免疫が効率よく誘導されるようになったという解釈ができると考えられた。更に実験条件を詳細に検討し、ヒト腫瘍細胞を抗DAF抗体で処理してワクチンに用いる道を拓いてゆきたいと考えている。
生体イメージングを用いた触角と触角葉における性フェロモン情報提示機構の解明

ショウジョウバエは、嗅覚情報をもとに求愛相手を識別しているが、識別に使用される嗅細胞や嗅物質の全容は、未だ明らかにされていない。本研究では、嗅細胞の応答を記録する生体イメージング法を確立し、求愛相手識別を担う嗅覚応答の網羅的地図の作成を行った。その結果、成熟度や交尾経験のことなるハエの体表抽出物に対する嗅覚応答に差を見出した。こうした結果から、求愛相手の識別における神経基盤では、ハエの匂いとエサの匂いの情報統合が行われていることが示唆された。昨年度までで、嗅覚応答記録がほぼ終わり、今年度は、中枢における介在神経を介した嗅覚情報伝達機構と処理経路の同定を目的として研究を進めた。しかし、これまで使用していた機器の使用が難しくなったことと、介在神経の活動を観察するための新たな観察法を確立する必要があったため、今年度は、取り出した脳を利用し、シナプス小胞分泌を観察する生体イメージング法の確立を目指し実験を始めた。VMAT-pHluorinは、シナプス小胞の分泌に応じて蛍光を発する蛍光タンパク質である。中枢の特定の神経細胞でVMAT-pHluorinを発現させ、蛍光シグナルを観察したところ、自発的な神経応答を反映していると考えられる蛍光が観察できた。そこで、新規のシナプス分泌を記録するため、強い蛍光の照射によるPhoto-Bleachを行い、自発的神経活動に依存した蛍光を退光させたのち、蛍光シグナルの回復を記録した。神経活動に異常が生じるタンパク質・変異体parkinを発現させた神経において、この手法で新規のシナプス分泌を観察し、退光後の蛍光の回復が低下することを確認した。この結果から、この手法を利用することで、分子遺伝学的・薬理学的手法により嗅細胞や介在神経の神経活動を操作した時のシナプスを介した情報伝達の記録が可能となった。また、嗅細胞や介在神経の神経活動を任意のタイミングで制御するため、温度感受性のチャネルタンパク質TrpA1やshibireを神経で発現させ、神経応答を操作するための温度刺激の与え方も確立している。これらの手法を組み合わせることで、嗅覚情報伝達回路網の詳細な情報伝達・処理機構の解明が可能となった。ショウジョウバエのフェロモン受容機構の包括的解明のため、嗅細胞の投射先である触角葉のハエの匂いやエサの匂いに対する応答を、生体イメージングにより観察した。これまでの研究では、性フェロモンはtrichoid感覚子で受容されると考えられてきたが、それ以外の感覚子に接続する嗅細胞においても、匂い情報をもとに、ハエの成熟度や性別、交尾経験を識別しているという結果が得られている。また、飼育時のエサの状態に応じて、匂いが変化する可能性も示唆された。こうした結果から、ハエが匂い情報を用いて他のハエの状態を識別し、行動の制御に利用する過程の、最初の識別機構を解明するための基礎データを得ることができた。これまでに明らかになった結果は、ハエの状態に応じた匂いの違いが、複数の嗅細胞を介して識別されている可能性を示している。また、ハエが、求愛相手の性別や成熟度、交尾経験を識別することは、これまで行動レベルでしか示されていなかったが、こうした識別機構を生理レベルで明らかにした点でも意義がある。これまでに得られた結果をもとに、今後は、識別に利用されている嗅覚受容体や匂い物質の同定を進めていく。また、飼育中のエサの種類が、ハエの匂いの違いを生むという結果は、エサの匂いとハエの匂いの組み合わせが、行動の制御に対し相互作用している可能性を示唆しており、複雑に組み合わさった匂いに対する嗅覚応答の解明につながる結果である。ショウジョウバエの嗅覚におけるフェロモン受容と求愛相手の識別のメカニズムの解明のため、生体イメージングを利用した解析を行った。体表クチクラに含まれる物質をヘキサンにより抽出し、カルシウム感受性GFPを嗅細胞で発現させたショウジョウバエの触角を刺激した時の応答を記録した。これまでの実験から、成熟度や交尾経験に応じて、体表抽出物の組成が変化すること、一部の嗅細胞は、体表抽出物だけでは雌雄の違いを区別できないが、エサの匂いと組み合わせることで、雌雄の体表抽出物に対し異なる応答を示すことが明らかになり、求愛相手識別において、体表抽出物とエサの匂い情報の統合が重要であることが示唆された。しかし、カルシウム感受性GFPを用いた実験では、応答の時間・空間分解能が低く、詳細なデータの解析が必要とされていた。そこで、最終年度では、統計解析に長けた研究者にアドバイスを求め、詳細なデータ分析を進めた。また、情報統合の阻害が嗅覚情報識別機構に与える影響を調べるため、神経伝達を制御可能な温度制御・液体潅流システムを構築した。温度感受性TRPチャネル(TRPA1)やshibire ts1を神経で発現させ、温度条件を変えることで、任意の神経活動を亢進・抑制することが可能である。

また、潅流システムを用いることで、薬剤処理による神経伝達の阻害が可能である。ドーパミン神経でシナプス小胞分泌時に蛍光強度上昇が記録できるVMAT-pHluorinとTRPA1を発現させたハエの脳を解剖し、20°Cの培養液中での蛍光を観察した。高温の培養液を還流させTRPA1により神経活動を起こさせたところ、蛍光強度の上昇を確認した。エサや体表抽出物に対しては、広範な嗅細胞が応答するが、このシステムを用いることで、特定の嗅細胞だけを興奮させることが可能となり、そこからの修飾を受ける嗅細胞の投射領域の特定を進めることができる。神経科学当初の予定では、中枢の神経伝達・情報処理機構を解明する予定であった。しかし、これまで利用していた機器や手法では、脳の表面にある嗅覚葉の神経活動の記録は可能であったが、より深い領域の神経活動の記録は難しかった。さらに、これまで使っていたカルシウム感受性蛍光タンパク質の利用では、情報伝達に至る活動電位の発生を完全に記録することができないため、活動電位の記録やシナプス分泌を指標に神経活動を記録する手法を新たに確立する必要があることが判明した。これらの問題に対処するため、取り出した脳を利用した生体イメージング法の確立とシナプス小胞分泌を蛍光シグナルで記録できるVMAT-pHluorinの利用、任意に神経活動を制御することが可能なtrpA1やshibireの利用法を確立する必要があった。これらの手法を確立するため、当初の予定より実験の進捗がやや遅れているが、いずれの手法も既にほぼ確立できていることや、シナプス分泌といった実際の神経情報伝達を記録する手法を確立できたことで、当初の予定以上の詳細な解析が可能となっている。研究期間を延長したことで、当初の目的を更に進めた結果を得ることが期待できる。刺激に用いたハエの成熟度や、性別、交尾経験に依存して、複数の嗅細胞における嗅覚応答が異なっていることを示すことができた点は、当初の予測通りであり、順調に研究が進んでいる。また、エサの匂いとハエの匂いの組み合わせることで、単独の匂いに対する応答からの変化が生じることが明らかになった点やエサの匂い受容に関わると考えられてきた嗅細胞が、ハエの匂いの違いを識別している可能性が示された点は、予想を超える発見である。しかし、予想以上に多い嗅細胞が、ハエの匂いの識別に関わっていることが明らかになっており、個々について詳細に調べる必要が出てきた。そのため、十分に意義のある結果を示すには、さらに研究を進める必要がある。昨年度は、新たな実験手法の確立に時間がかかったが、結果的に、当初の計画以上に詳細な神経伝達の記録が可能となった。そこで、今年度は、嗅細胞を起点とした、中枢における嗅覚情報処理機構の解明を進める。匂い刺激は、それ自身が神経細胞の膜組成やイオン組成に影響を与える可能性が考えられるが、VMAT-pHluorinを利用したシナプス分泌記録法では、膜組成やイオン組成の変化の影響があっても、シナプス伝達が起きない場合は、蛍光シグナルの変化が記録されないことから、匂い刺激に対するアーティファクトな応答を排した神経伝達を記録することが可能である。
プログラム細胞死を実行するプロテアーゼI CE/CED-3ファミリーの活性調節機構

CED-4はcaspaseの活性化因子として細胞死の実行に深く関与している。CED-4の機能解析を生化学的・分子遺伝学的に行うことを目的としてショウジョウバエを用いたCED-4の機能評価系を確立した。ショウジョウバエ由来の培養細胞であるS2にCED-4を過剰に発現させることによってcaspaseの活性化を伴う細胞死を誘導することが出来た。CED-4によって活性化されるcaspaseをaffinitylabelによって同定した結果、dr ICEが活性化されていることが明らかになった。免疫沈降実験によって細胞内ではCED-4とdr ICEが複合体を形成することが明らかになり、caspaseとの直接の相互作用がその活性化に必要であることが示唆された。また、CED-4内のP-loopmotifがcaspaseの活性化に重要であり、P-loopmutationはdominant negativeにCED-4による細胞死を抑制した。ショウジョウバエ複眼に過剰発現させたCED-4はcaspaseの活性化を伴った細胞死を誘導し、生体でのCED-4の機能を評価する系が確立された。酵母を用いたtwo hybrid systemを用いてICE/CED-3ファミリー、BCL-2/CED-9ファミリーと複合体を形成する蛋白質をcDNAライブラリーよりスクリーニングし、細胞死の実行に関与するICE/CED-3ファミリーの活性化につながる経路を明らかにしょうと試みた。a)ICE/CED-3ファミリー、BCL-2/CED-9ファミリーとGal4あるいはLexADNA結合トメインの融合遺伝子の構築b)スクリーニングICEの発現が確認されている細胞である、lymphoma HeLa細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングに用いた。wild type Iceをyeastに発現させるとyeastの成長が著しくそこなわれたため、スクリーニングには不適切と考えられた。そこでプロテアーゼ活性を欠いたmutant Iceをスクリーニングに用いた。X-Galを用いた検出法で約100万個のHeLa cDNAライブラリーの中から2つのオーバーラップする、mutant Iceと結合すると考えられるクローンが得られている(4E、10F)。ced-3に関しては100万個のlymphoma cDNAライブラリーから2クローン(3T-1, 3T-3)、ced-9に関しては10万個のlymphoma cDNAライブラリーから1クローン(9T-4)が得られた。in vitroあるいは哺乳類細胞での発現系を用いて結合の特異性を検討中である。また、ICEやCED-3と結合するクローンについては基質になる可能性もありそれもあわせて検討している。