hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞配置と力学的刺激の複合効果がもたらす毛髪および皮膚附属器官の完全生体外再生

本年度は毛乳頭および表皮細胞への分化を想定する2種の幹細胞を層状に配置したマイクロゲルビーズ作製技術を確立した.手法としては,低接着性または通常の細胞培養シャーレ上にコラーゲン溶液に懸濁したマウスES細胞をマイクロインジェクタで滴下し,さらに直上にマウス胎児由来表皮細胞を含むコラーゲン溶液を滴下することで層状のマイクロゲルビーズ構造を構築した.さらに,第1層にあらかじめ生理活性物質を包含するゲル層を用意することでゲルビーズ中心部から外縁に向かう生理活性物質の濃度勾配を構築し,それぞれの細胞の分化および2種細胞の相互作用を誘発することで毛髪組織の形成をはかった.その結果,2種の細胞の境界部で内部に角質層を有する同心円状の構造体,すなわち毛包様組織の形成を認めた.また,数値解析による生理活性物質の拡散速度評価を行ったところ,濃度勾配の形成はゲルビーズ作製後の2-5時間程度に限定され,初期の短時間の濃度勾配の形成が毛包様組織の構築に重要であることが明らかとなった.本年度はさらに上記,毛包様組織に力学的刺激を印加するためのデバイス開発のための基礎的なデータの取得を目的として,皮膚由来の細胞が組織のリモデリングを行う際に組織内部に生じる収縮力の測定を実施した.手法としては,ヒト新生児由来の細胞をコラーゲンゲルに包埋し,端部を固定してさらに一端を荷重検出器に接続することで組織のリモデリング糧における収縮力のモニタリングを行った.その結果,包含される細胞数や培養液への添加因子の有無により収縮力の変化が異なることが明らかとなった.当初予定通りにマイクロゲルインジェクションを応用した複数種の細胞を層状に包含するマイクロゲルビーズ作製技術を構築している.さらに,ビーズ中心層に生理活性物質含有層を構築し,ビーズ外縁部に向かって濃度勾配を形成させることで毛包様組織の形成を認めるまでに至った.その一方で,当初予定していたせん断力は毛髪組織形成に適する力学的因子ではない可能性が懸念されたことから,予定していた力学的刺激の印加デバイスの開発ではなく,皮膚系細胞が組織リモデリングを行う際の収縮力の測定を行うこととした.そのため,予定していた力学的因子の印加デバイス開発は未達であったが,皮膚系組織のリモデリング過程における収縮力のリアルタイム計測によって実際に組織のリモデリングにおいて必要な力学的因子が明らかになった点の意義は大きいと考えている.本年度の研究成果により,毛包由来組織を形成可能な培養組織の構築が可能となり,さらにその際に印加すべき力学的因子についても明らかになってきている.次年度は特に力学的因子に着目し,力学的因子の与え方が皮膚系組織のリモデリングに与える影響を明らかにすることで,最終目的である大規模な生体外での毛髪組織再生技術を実現するための知見を得る.本年度は毛乳頭および表皮細胞への分化を想定する2種の幹細胞を層状に配置したマイクロゲルビーズ作製技術を確立した.手法としては,低接着性または通常の細胞培養シャーレ上にコラーゲン溶液に懸濁したマウスES細胞をマイクロインジェクタで滴下し,さらに直上にマウス胎児由来表皮細胞を含むコラーゲン溶液を滴下することで層状のマイクロゲルビーズ構造を構築した.さらに,第1層にあらかじめ生理活性物質を包含するゲル層を用意することでゲルビーズ中心部から外縁に向かう生理活性物質の濃度勾配を構築し,それぞれの細胞の分化および2種細胞の相互作用を誘発することで毛髪組織の形成をはかった.その結果,2種の細胞の境界部で内部に角質層を有する同心円状の構造体,すなわち毛包様組織の形成を認めた.また,数値解析による生理活性物質の拡散速度評価を行ったところ,濃度勾配の形成はゲルビーズ作製後の2-5時間程度に限定され,初期の短時間の濃度勾配の形成が毛包様組織の構築に重要であることが明らかとなった.本年度はさらに上記,毛包様組織に力学的刺激を印加するためのデバイス開発のための基礎的なデータの取得を目的として,皮膚由来の細胞が組織のリモデリングを行う際に組織内部に生じる収縮力の測定を実施した.手法としては,ヒト新生児由来の細胞をコラーゲンゲルに包埋し,端部を固定してさらに一端を荷重検出器に接続することで組織のリモデリング糧における収縮力のモニタリングを行った.その結果,包含される細胞数や培養液への添加因子の有無により収縮力の変化が異なることが明らかとなった.当初予定通りにマイクロゲルインジェクションを応用した複数種の細胞を層状に包含するマイクロゲルビーズ作製技術を構築している.さらに,ビーズ中心層に生理活性物質含有層を構築し,ビーズ外縁部に向かって濃度勾配を形成させることで毛包様組織の形成を認めるまでに至った.その一方で,当初予定していたせん断力は毛髪組織形成に適する力学的因子ではない可能性が懸念されたことから,予定していた力学的刺激の印加デバイスの開発ではなく,皮膚系細胞が組織リモデリングを行う際の収縮力の測定を行うこととした.そのため,予定していた力学的因子の印加デバイス開発は未達であったが,皮膚系組織のリモデリング過程における収縮力のリアルタイム計測によって実際に組織のリモデリングにおいて必要な力学的因子が明らかになった点の意義は大きいと考えている.本年度の研究成果により,毛包由来組織を形成可能な培養組織の構築が可能となり,さらにその際に印加すべき力学的因子についても明らかになってきている.次年度は特に力学的因子に着目し,力学的因子の与え方が皮膚系組織のリモデリングに与える影響を明らかにすることで,最終目的である大規模な生体外での毛髪組織再生技術を実現するための知見を得る.
聴覚障害者のための音声同時字幕システムにおける最適情報呈示に関する研究

音声認識を用いたリアルタイム字幕システムの研究を行っている.現状では精度100%の字幕の提供は困難であり,字幕には誤認識単語などの間違いが含まれた不完全な文章になる.重要なのは伝達する内容の理解を100%に近づけることであり,そのためには不完全部分を補うための情報を最適に呈示することが重要になる.本年度は,次の2つの小項目に関し,被験者を増やした時に同様の傾向が得られるかを確認した.1.不完全な文に対し話者の顔などのノンバーバル情報の活用による効果とその最適表示の方法,1-1ノンバーバル情報として顔のどの領域を呈示するのが良いか.1-2ノンバーバル情報と字幕との呈示タイミングをどう制御するのが良いか.1-1では,不完全文からなる字幕のみの呈示(字幕のみ)をコントロールとして,不完全文に対し話者の発話時の顔全体映像を付加した場合(字幕+顔),同状態における口元近接映像を付加した場合(字幕+口元)の3種で比較した。完全文(正解文)に対する回答文の正答率を文理解の向上の指標として健聴者と聴覚障害者に対し実験を行った結果,いずれの被験者群においても正答率は,「字幕のみ」<「字幕十顔」<「字幕十口元」となる傾向を示した.このことからノンバーバル情報を付加することで文理解が向上する傾向が確認された.聴覚障害者においては統計的にこの傾向が確認された.1-2では,ノンバーバル情報として話者の発話時の顔全体映像を用い,ノンバーバル情報に対して不完全文の呈示に時差(-5秒+5秒)を設けた試料に対し,いずれの時差が文理解の向上に貢献するかを比較した.先の実験と同様に正答率を聴覚障害者と健聴者で求めた結果,正答率は時差なし(±0秒)ではあまり向上が認められず,字幕先行側に1秒ずらした場合(-1秒(字幕先行1秒))が高くなる傾向を示した.また字幕先行側に外れるほど正答率が単調増加する傾向を示した.これらの傾向は聴覚障害者・健聴者を問わず確認された.聴覚障害者の情報保障手段として音声認識認識を用いたリアルタイム字幕システム(音声同時字幕システム)の研究を行っている.現状では精度100%の字幕の提供は困難であり,字幕には誤認識単語などの間違いが含まれた不完全な文章になる.精度100%の字幕の提供は重要であるが,より重要なのは伝達する内容の理解を100%に近づけることである.そのためには,不完全部分を補うための情報を最適に呈示することが重要になる.そこで本課題では,次の2点に関して取り組むこととする.1.不完全な文に対し話者の顔などのノンバーバル情報の活用による効果とその最適表示の方法,2.文字自体に付加情報を持たせることによる効果とその最適表示の方法.H17年度は項目1.に関し,以下のようにさらに小分類し取り組んだ.(1)ノンバーバル情報として顔のどの領域を提示するのが良いか,(2)ノンバーバル情報と字幕との呈示タイミングをどう制御するのが良いか.(1)に関しては,不完全文からなる字幕のみの呈示(字幕のみ)をコントロールデータとして,不完全文に対し話者の発話時の顔全体映像を付加した場合(字幕+顔)と同様の口元近接映像を付加した場合(字幕+口元)とで比較した.完全文(正解文)に対する回答文の正答率を文理解の向上の指標として健聴者と聴覚障害者に対し実験を行った結果,いずれの被験者群においても正答率は,字幕のみ<字幕+顔<字幕+口元となる傾向を示した.このことからノンバーバル情報を付加することで文理解が向上することがわかった.(2)に関しては,ノンバーバル情報として話者の発話時の顔全体映像を用い,ノンバーバル情報に対して不完全文の呈示に時差(-5秒+5秒)を設けた試料に対し,いずれの組合せ(時差)が文理解の向上に貢献するかを比較した.先の実験と同様に回答文の正答率を健聴者と聴覚障害者で求めた結果,いずれの被験者においても正答率は,時差なし(±0秒)ではあまり向上が認められず,字幕先行側に1秒ずらした場合(-1秒(字幕先行1秒))が比較的高くなる傾向を示した.また顔先行側に対して字幕先行側が高くなる傾向を示した.このことから顔情報に対し字幕情報を先行呈示することが文理解の向上に寄与することが示唆された.音声認識を用いたリアルタイム字幕システムの研究を行っている.現状では精度100%の字幕の提供は困難であり,字幕には誤認識単語などの間違いが含まれた不完全な文章になる.重要なのは伝達する内容の理解を100%に近づけることであり,そのためには不完全部分を補うための情報を最適に呈示することが重要になる.本年度は,次の2つの小項目に関し,被験者を増やした時に同様の傾向が得られるかを確認した.1.不完全な文に対し話者の顔などのノンバーバル情報の活用による効果とその最適表示の方法,1-1ノンバーバル情報として顔のどの領域を呈示するのが良いか.1-2ノンバーバル情報と字幕との呈示タイミングをどう制御するのが良いか.1-1では,不完全文からなる字幕のみの呈示(字幕のみ)をコントロールとして,不完全文に対し話者の発話時の顔全体映像を付加した場合(字幕+顔),同状態における口元近接映像を付加した場合(字幕+口元)の3種で比較した。

完全文(正解文)に対する回答文の正答率を文理解の向上の指標として健聴者と聴覚障害者に対し実験を行った結果,いずれの被験者群においても正答率は,「字幕のみ」<「字幕十顔」<「字幕十口元」となる傾向を示した.このことからノンバーバル情報を付加することで文理解が向上する傾向が確認された.聴覚障害者においては統計的にこの傾向が確認された.1-2では,ノンバーバル情報として話者の発話時の顔全体映像を用い,ノンバーバル情報に対して不完全文の呈示に時差(-5秒+5秒)を設けた試料に対し,いずれの時差が文理解の向上に貢献するかを比較した.先の実験と同様に正答率を聴覚障害者と健聴者で求めた結果,正答率は時差なし(±0秒)ではあまり向上が認められず,字幕先行側に1秒ずらした場合(-1秒(字幕先行1秒))が高くなる傾向を示した.また字幕先行側に外れるほど正答率が単調増加する傾向を示した.これらの傾向は聴覚障害者・健聴者を問わず確認された.
芳香族ポリケタイド生合成の理解・分解・再構築

III型ポリケタイド合成酵素は、単独でポリケタイドの伸長と環化反応を触媒すると考えられていた。我々は、III型ポリケタイド合成酵素の反応に関与する新奇環化酵素を微生物および植物から探索した。Streptomyces sp. NRRL S-340のゲノムに存在する機能未知遺伝子、III型PKS様遺伝子、脱水酵素様遺伝子[IG64_RS22470(70)、IG64_RS22475(75)]で構成されるオペロンに着目し、このオペロンの機能解析を行った。当該オペロンが生産する化合物を明らかにするために、S. coelicolor M1146を宿主として、70および75を共発現しところ、6,8-dihydroxy-3-methylisocoumarin(isocoumarin)が蓄積されることを明らかにした。70および75の機能を明らかにするために、組換え70および75を調製し、そのin vitro反応液のHPLC分析を行った。結果、70と75が共存する時のみisocoumarinが生産された。70のみを用いたin vitro反応液のLC/HRMS分析から、蓄積した中間体と考えられるpentaketide-CoAに相当するイオンピークを検出した。さらに、70、75のin vitro反応液のLC/HRMS分析ではpentaketide-CoAが脱水環化され、芳香環化したaro-pentaketide-CoAに相当するイオンピークが検出された。そのイオンピークを粗精製し75と反応させた結果、isocoumarinの生成が確認された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Dihydroxynaphthalene(DHN)メラニンは、1,8-DHNが酸化的重合した茶褐色の高分子であり、主にカビが生産する。1,8-DHNの生合成酵素群は、真核微生物に特異であると考えられている。しかしながら、粘液細菌Sorangium cellulosum由来のsoceCHS1を含むオペロンの異種発現を行い、このオペロン(bacterial DHN synthaseオペロンと命名)が1,8-DHN合成酵素群であることを我々は明らかにしていた。今回我々は、bdsオペロンのBdsAおよびBdsBの機能解析を行った。Bds合成酵素の組換えタンパク質を調製し、in vitro反応を行った。SoceCHS1は、malonyl-CoAからT4HNを与えた。BdsAは、NADPHを補酵素としてT4HN、T3HNからそれぞれscytalone、vermeloneを与えた。scytaloneの絶対立体配置は、旋光度よりR体であると決定した。また、scytaloneの光学純度は>99.5%であった。さらに、反応速度論解析の結果、BdsAのKmは95 μMであり、kcatは0.1 sec-1であった。BdsBは、(R)-scytalone、(R)-vermeloneからそれぞれT3HN、1,8-DHNを与えた。反応速度論解析の結果、BdsBのKmは5.5 μMであり、kcatは4.9 sec-1であった。カビのDHN合成酵素と細菌のBds合成酵素は以下の点で異なる。ポリケタイド合成は、カビではモジュール型のI型PKSであるが、細菌では単独型のIII型PKSである。T4HNの還元反応は、カビのHNRはSDRスーパーファミリー(SF)であり、BdsAはAKR SFであり、両者は全く異なる。Scytaloneの脱水反応は、カビのSDと細菌のBdsBは共にNTF2-like SFである。本年度は、水層に存在するCoA中間体の構造決定を可能とする13Cを用いた反応系の構築、西洋オトギリソウ由来emodin anthroneの合成を担う新規環化酵素の探索を予定したいた。それらは予定通りに進行し、さらに、DHNメラニンの酵素群の解析を行ったため。
Na^+ポンプにおける真時間での構造変化と分子内のカチオン移動

Na^+,K^+-ATPaseをBIPMとFITCとで2重標識した標品を用いて、リン酸化反応中間体(EP)の形成と分解及び蛍光強度変化を追跡した。BIPMからFITCプローブへの蛍光エネルギー移動はNa^+結合酵素の状態を基準にとると、Na^+閉塞酵素で減少し、酢酸感受性リン酸化酵素(E_1P)で増加、K^+感受性リン酸化酵素(E_2P)で最大に達し、K^+結合酵素で減少、Na^+結合酵素基準値に戻ることが示された。本酵素標品を用い、ポリクロメーターによる各反応中間体と分解のプロセスの測定を行った。Na^+閉塞酵素にアセチルリン酸(Acp)を添加すると、BIPM蛍光励起によるBIPM蛍光の増加(5/s)とBIPMプローブからFITCプローブへのエネルギー移動によるFITC蛍光の増加(11/s)と減少(0.7/s)が観察された。FITCプローブの単独励起でも増加(5/s)と減少(0.05/s)が観察された。BIPM蛍光は増加と共にred shift、エネルギー移動に基づくFITC蛍光はわずかにblue shift、直接励起のFITC蛍光はred shiftした。両プローブ間距離をForsterの式を用いて計算した。その結果Cys-964に結合しているBIPMプローブからLys-510に結合しているFITCプローブ距離は約36Aと推定された。各反応中間体形成と分解に伴うプローブ間距離の変化は約1A以内と推定された。現在この距離の算定に用いて配向性因子の値が各中間体形成と分解に伴って変化するか否かを検討中である。H^+,K^+-ATPaseをBIMPプローブで修飾すると反応中間体形成に伴い、Trp残基とは相を異にするBIPM蛍光の変化が観察された。又EP形成に伴いTrp残基からBIPMプローブへの蛍光エネルギー移動の増加が示された。BIPM結合部位はCys-241と同定された。H^+ポンプへのATP結合とAcpからのEP形成量及びATPからのEP形成量が2:2:1であることが示された。これはH^+ポンプが2量体でATPを加水分解していることを示している。Na^+,K^+/ATPaseをPLPで修飾しPLPプローブがLys-480に結合していること及びMgATP結合に伴う構造変化を初めて検出することに成功した。1.Na^+,K^+ーATPase α鎖Cysー964にNー[Pー(2ーbenzimidazolyl)phenyl]maleimide(BIPM)とLysー501にFluoresceinisothiocyonate(FITC)を導入し、反応中間体形成に伴うBIPMプロ-ブからFITCプロ-ブへの蛍光エネルギ-移動を測定した。その結果、NaE_1からE_1P、E_1PからE_2P形成に伴って、BIPMからFITC

プロ-ブへの蛍光エネルギ-移動が増加することが示された。特にNaE_1からE_1P形成に伴って速い成分とおそい成分とからなる2相性のエネルギ-移動の増加が観察された。E_2PからKE_2及びKE_2からNaE_1への変換に伴って、今度は逆のエネルギ-移動の減少が観察された。各反応中間体形に伴う両プロ-ブ間距離の変化を定常状態での蛍光測定から推定した結果は実験誤差内でほぼ一定であった。現在、時間分解、蛍光偏光解消法によりこの点をさらに研究中である.2.E_2PからKE_2への変化に際して、脱リン酸化の速度は140/S<であり、構造変化に基づくBIPM及びFITC両プロ-ブの蛍光変化はこれより約1桁及び2桁おそい2相性の変化を示した。現在、補助金で購入したラピッドフィルトレ-ション装置を用い、この構造変化とイオンの結合の時間経過の測定を行なっている。又、KE_2からNaE_1及びNaE_1からKE_2への蛍光変化にはMg^<2+>をまったく必要といないことも明らかになった。従って構造変化はリン酸化、脱リン酸化によって生じるのではなく輸送されるイオンの分子内移動を反映することを示している。Na^+,K^+-ATPaseに2種の蛍光プローブBIPMとFITCをCys-964とLys-501に導入した。種々の反応中間体形成に伴う両蛍光プローブの蛍光強度変化とプローブ間のエネルギー移動を測定した。酵素をアセチルリン酸でリン酸化し最初に発現するリン酸化酵素(E_1P)形成に伴い、BIPMとFITC蛍光変化は相を異にした変化を示すと共に、BIPMからFITCプローブへの蛍光のエネルギー移動の増加が観察された。E_1Pから次に形成されるリン酸化酵素(E_2P)形成に伴い再び相を異にした変化が生じ、蛍光のエネルギー移動の増加が観察された。E_2PへのK^+の結合で生じるKE_2形成で再び相を異にして変化と蛍光エネルギー移動の減少がさらにKE_2へのNa^+の結合で生じるNaE_1の形成の伴い相を異にした変化と蛍光エネルギー移動の減少が観察された。これらの結果はNa^+,K^+-ATPaseのα鎖Cys-964とLys-501付近の微小環境がNa^+とK^+の濃度勾配に逆らった輸送に伴って相を異にして変化し、両プローブ間距離を変化していることを示している。本研究により従来解析できなかったNa^+,K^+-ATPaseの分子構造変化の定量化が可能になると思われる。Na^+,K^+-ATPaseをBIPMとFITCとで2重標識した標品を用いて、リン酸化反応中間体(EP)の形成と分解(モールド研究室)及び蛍光強度変化(ビーチャム研究室)を追跡した。BIPMからFITCプローブへの蛍光エネルギー移動はNa^+結合酵素の状態を基準にとると、Na^+閉塞酵素で減少し、酢酸感受性リン酸化酵素(E_1P)で増加、K^+感受性リン酸化酵素(E_2P)で最大に達し、K^+結合酵素で減少、Na^+結合酵素基準値に戻ることが示された。本酵素標品を用い、ポリクロメーターによる各反応中間体と分解のプロセスの測定を行った。Na^+閉塞酵素にアセチルリン酸(Acp)を添加すると、BIPM蛍光励起によるBIPM蛍光の増加(5/s)とBIPMプローブへからFITCプローブのエネルギー移動によるFITC蛍光の増加(11/s)と減少(0.7/s)が観察された。FITCプローブの単独励起でも増加(5/s)と減少(0.05/s)が観察された。
糖転移酵素制御因子として同定したENPP3と糖ヌクレオチド代謝の生物学的意義

エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ(ENPP)3は、ヌクレオチドの加水分解酵素である。ENPP3の発現は細胞のがん化と関連が深く、バイオマーカーとしての意義が示唆されている一方で、がん化に関わるメカニズムは未解明のままである。最近私達は、ENPP3が糖ヌクレオチドの加水分解を介して糖鎖修飾を制御する因子であることを発見した。本研究ではENPP3の糖鎖修飾制御機能をより詳細に解析するため、ENPP3の発現を抑制したがん細胞の機能とグライコームの変化を解析する。さらに糖転移酵素の強制発現あるいは発現抑制により、改変された糖鎖修飾を元に戻す。これら解析を通じてENPP3がどのような糖鎖構造の付加を制御し、それがどのようにがん化に関わるのかを解明していく。本年度は、ENPP3によるグライコーム改変の全容と、それががん細胞機能に及ぼす影響を統合的に把握することを目的として、1)ENPP3の発現を特異的に抑制(ノックダウン)できる3種類のmiRNA発現ベクターを構築した。さらに2)本酵素を内在性に発現するWalker 256細胞に導入した。その後3)抗生剤(ブラストサイジン)を用いた薬剤選別により、数種類の薬剤耐性がん細胞を取得した。今後、取得した薬剤耐性株におけるENPP3発現の抑制を、RT-PCRあるいはウェスタンブロッティングにより評価するとともに、ENPP3の発現抑制ががん細胞機能(増殖、浸潤、転)に及ぼす効果をin vitroあるいはin vivoの評価系を用いて検討していきたい。
アフィニティ膜濾過による遺伝子治療用プラスミドDNA精製プロセスの開発

近年、先天性疾患の治療法としてプラスミドDNAを用いる遺伝子治療や遺伝子ワクチンが注目され、医療品純度のプラスミドDNAの精製プロセスの開発が希求されている。本研究では、リガンドの探索を行い、これを用いるアフィニティ膜濾過法の適用可能性を検討した。本システムにおける、リガンドに対するプラスミドDNAの吸・脱着特性および膜ファウリングを明らかにした。回収液のアガロース電気泳動分析により、プラスミドDNAを精製できることがわかり、本手法の有用性が確認された。本研究では、スケールアップが可能なプラスミドDNAの精製および濃縮法として膜濾過法に着目し、プラスミドDNAと親和性のあるリガンドを探索するとともに、リガンドと分離膜とを用いるアフィニティ膜濾過法を確立し、プラスミドDNAの精製プロセスを開発することを目的とする。本年度は、リガンドおよび分離膜を選定し、アフィニティ膜濾過条件の探索を行った。様々な物質を用いてプラスミドDNAの吸・脱着試験を行い、pH8付近に等電点があり、pH7以下では正、pH9以上では負に帯電するα-Fe_2O_3をリガンドとして選定した。プラスミドDNAは、ポリアニオンであるため、試料液のpH変化による吸・脱着が可能となった。吸着挙動はLangmuir式で近似され、pHが小さい程、より多くのプラスミドDNAを吸着できることが明らかとなった。また、吸着後にpHを10程度に変化させることで、リガンドに吸着したプラスミドDNAの大部分が脱着されることがわかった。膜濾過実験の結果、プラスミドDNAは精密濾過膜を透過するが、リガンドのα-Fe_2O_3は精密濾過膜で阻止できたことから、プラスミドDNAをα-Fe_2O_3に吸着させて精密濾過することで膜面上に保持でき、その後α-Fe_2O_3から脱着させることでpDNAを精製できるものと考えた。そこで、プラスミドDNAの劣化が生じないpH5の条件で吸着濾過を行い、その後生成したα-Fe_2O_3ケークにα-Fe_2O_3の等電点よりも大きなpH9および10のbufferを透過させた。プラスミドDNA量の指標となるOD_<260>は、pH1Oのbunfferの透過初期に顕著な値となり、プラスミドDNAが脱着されることが確認され、アフィニティ膜濾過が精製法として有用なことを示すことができた。本年度は、超音波処理による菌体破砕法の導入、アフィニティ膜濾過条件の確立を行った。超音波処理の導入により、従来法と比較して薬品使用量を大幅に低減できることを明らかにした。プラスミドDNAの吸・脱着試験から、pH8付近に等電点があり、pH7以下では正、pH9以上では負に帯電する酸化鉄をリガンドとして選定した。膜濾過実験の結果、プラスミドDNAは精密濾過膜を透過するが、リガンドの酸化鉄は精密濾過膜で阻止できたことから、プラスミドDNAの劣化が生じないpH5の条件でリガンドに吸着させて濾過を行い、その後pH9および10のbufferを透過させて、吸着したプラスミドDNAを脱着させる精製プロセスを確立した。本年度は、ジルコニアビーズによる菌体破砕法の導入、アフィニティ膜濾過条件の確立を行った。従来、菌体内に存在するプラスミドDNAを取り出すために、アルカリ、タンパク質変成剤、酸などを添加して、溶菌等を行い、その後分離操作により溶液として得る手法が用いられてきたが、有害物質を含む様々な薬品を使用したり、一連の操作が煩雑であるという問題があった。本研究において、ビーズ破砕を導入することにより、薬品使用量を大幅に低減でき、簡便な精製プロセスを確立できることを明らかにした。破砕後の懸濁液には様々な物質が含まれているが、リガンドとしてシリカおよび酸化鉄を用いる2段のアフィニティ膜濾過法により精製が可能である。

1段目のシリカを用いるアフィニティ膜濾過では、負に帯電したシリカに様々な不純物を吸着させ、ポリアニオンであるプラスミドDNAを濾液として得る。次に、pH 8付近に等電点があり、pH 7以下では正、pH 9以上では負に帯電する酸化鉄を用い、試料液のpH変化によりプラスミドDNAを吸・脱着させる2段目のアフィニティ膜濾過で高精製度のプラスミドDNA溶液を得ることができた。本年度の目標である、超音波処理による菌体破砕法の導入、アフィニティ膜濾過条件の確立を行うことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に従って順調に成果が得られているので、当初の計画通りに進め、プラスミドDNA精製プロセスの構築を行う。
リアノジン受容体構造安定化による心不全・心肥大・致死的不整脈の包括的治療戦略

本研究においてわれわれはRyR結合CaMの親和性を制御することによりRyRの構造を安定化することに成功し、さらにはRyRの構造安定化は不全心筋のCaハンドリングを改善し、心不全の有効な治療法となりえることが分かった。また、RyRの構造安定化はRyRからのCaMの乖離を防ぐことで心肥大の抑制をも可能となることも解明できた。最後にRyRの構造安定化により遺伝的致死的不整脈や実験的心不全モデルにおける致死的不整脈をも治療することが可能であることが解明された。Alexa633あるいはHiLyteFluor 647でラベルしたCaM(F-CaM)をサポニン処理した単利心筋細胞に添加し、サルコメア上にならんだ蛍光強度を定量することでRyR2に結合したCaMを測定可能である。申請者らはCaM LD内に突然変異をもつRyR2 N4103K KIマウス、TACマウス、Glu160欠損HCM型トランスジェニックマウスにおいても同様にF-CaMを用いてCaMのRyR2に対する結合親和性を測定するとともに、RyR2高親和性GSH-CaMによる介入でCa2+ハンドリングの改善、抗不整脈効果が認められるか否かを検討する。実験ではTACモデルにおいてCaMのRyR2に対する親和性が低下していることが判明した。またRyR2高親和性GSH-CaMによりCa2+ spark頻度の低下や、SR Ca2+ contentの増加などCa2+ハンドリングの改善も認められた。さらにRyR2 N4103K KIマウスにおいても同様にCaMのRyR2に対する親和性が低下していることが判明した。申請者らはすでにCaM BDに点突然変異を組み込んだペプチドを28種類作成した。作成した多数のCaM BDの変異ペプチドの中からCaMへの結合が最も強いものを2種類の方法でスクリーニングした。こうしてCaM高親和性RyR2変異を決定し、その変異を組み込んだKIマウスを申請者らは2013年1月にES細胞作成し、2014年3月納入、現在順調にmatingを続けhomo miceも誕生している。RyR N4103K/+ knock-in(KI)マウスにおけるRyR2へのCaMの親和性の検討ではRyR2に対するCaMの親和性の低下していることが分かった。さらにこの低下はβ刺激前からすでに生じている点、ダントロレンが親和性の改善を起こさない点でcentral domainの突然変異によるKIマウスとは異なっていた。TroponinT Glu160del HCM型transgenic(TG)マウスにおけるCaM親和性の検討は現在進行中で、低下していると考えられるが、確実に有意な結果を得るにはさらに実験が必要。CaMのaffinityを高めたGSH-CaMのKIマウスが作成できた。GSH-CaM KIマウスの作成においては28年夏までに納品が可能な見込み。CPVTマウスとCaMHAマウスの交配も順調で、計画通りに進んでいる。計画と比べTroponinT Glu160欠損HCM型トランスジェニックマウスの部分はやや遅れているが、CaM高親和性RyR knock-in(KI)マウスの部分では進んでいるところもある。ロードマップに従って心不全、HCM, CPVTの各モデルに対して2つの手法でTransmitter(T)への介入を行う。すなわち1つは高親和性CaMであるGSH-CaMの添加が与える影響を見ることである。すでにTAC心不全モデル、CPVT不整脈モデルでは予備実験が終了しておりTACモデルではGSH-CaMでCaMの結合親和性が上がり、Ca spark頻度が減少しSR Ca含有量は上昇するという結果を得ている。今後はHCMモデルにおいてGSH-CaMの投与がカルシニューリン(Cn)、NFATなど肥大シグナルに与える影響を検討する。もう一つの手法はCaM高親和性マウスに対するTAC手術の影響、およびCaM高親和性マウスとHCMマウス、CPVTマウスの掛け合わせである。CaM高親和性ホモマウスを作成後に、CPVTヘテロマウス、HCM型Tgマウスと交配することで効率よく掛け合わせが可能となる。循環器内科学今後新たな心不全・心肥大・致死的不整脈の包括的治療戦略を確立するため、最新の知見をもりこみつつ、計画の実行に向けて努力する。今回の研究遂行のため非常に重要なマウスの作成の計画を旧来のES作成方式で計画していたが、ゲノム編集の技術が時間的にも経済的にも有利であるためCAS9を用いたゲノム編集によるKIマウス作成に切り替えたため、当初の予算について未使用額が生じた。この未使用額については、現在ゲノム編集を用いたKIマウスの作成が大変順調に進んでおり、このマウス作成に使用する予定である。
抄物目録の完成

抄物は日本語研究資料として価値が高いにもかかわらず、その発掘・整備が遅れており、限られたほんの一部の資料しか利用されていないという状態がながく続いている。本研究は、抄物を発掘・調査し、伝存する抄物の総目録を完成して、日本語研究に資せんとするものである。平成19年度においては次の成果を得た。1、現地調査お茶の水図書館・国立公文書館・高山寺・阪本龍門文庫・天理図書館・大阪府立中之島図書館・武田科学振興財団杏雨書屋等において抄物を発掘し、調査不十分な抄物を再調査した。その結果『人名略』をはじめとする新資料を発掘できたほか、抄物ならびに書入れ仮名抄を多く発掘することができた。2、複写物入手一々の抄物の資料的性格を解明するために、駒沢大学図書館・国立国会図書館・学習院大学図書館・蓬左文庫・京都大学附属図書館・天理図書館・九州大学図書館・上海図書館等が所蔵する抄物ならびにその関連資料の複写物を入手した。3、資料性の解明漢籍子部の『蒙求抄』諸本の資料的性格を解明し、仏書と国書の一々の資料的性格の解明を進めた。特に、特定の原典を持たない一種の抄物のうち医書の抄物『和名集并異名製剤記』については、前年度に引き続いて研究を進め、諸本の関係、各本の言語の性格等について明らかにすることができた。4、目録作成今年度に新しく発掘・調査することができた抄物を「抄物目録稿」(『訓点語と訓点資料』70 1983年、113 2004年)に組み込んだ。仏書の抄物、国書の抄物、書入れ仮名抄、特定の原典を持たない一種の抄物、の目録化も進め、完成させた目録のうち、『日本書紀抄』の目録を発表した。現存する諸本をほぼ網羅できたものと思われる。完成させた目録のその他のものについても、続けて癸表して行きたい。抄物は日本語研究資料として価値が高いにもかかわらず、学界において利用されている資料はほんの一部にとどまっている。平成17年度においては次の成果を得た。1、今年度の現地調査お茶の水図書館・宮内庁書陵部・国立公文書館・東京都立中央図書館・建仁寺大中院・叡山文庫・高山寺・国際日本文化研究センター・阪本龍門文庫・新潟大学附属図書館等において新しい抄物を発掘し、また調査不十分な抄物を再調査した。2、資料性の解明写本・古活字版・整版の、それぞれの抄物の資料的性格について考察した。特に、『中華若木詩抄』古活字版の誤植と印刷現場におげる活字の配列、『四部録抄』整版諸版の関係と室町末江戸初期の関東における出版活動、五山版と宋・元・明版への書き入れ抄の日本語研究資料としての価値、などについて考察した。それらの一部については、お茶の水図書館において、「抄物の整版から-東西方言の違いは、いつ、なぜ生じたか-」「成簣堂文庫所蔵の五山版から-中世における中国文化受容の一面-」と題して2回研究発表を行った。3、今年度の目録作成新しく発掘・調査した抄物を、既に作成できている目録の部分については組み込んだ。進行中の仏書に対する抄物目録の作成を進めた。抄物は日本語史研究資料として価値が高い。

それにもかかわらず、今日まで学界において利用されている資料はほんの一部にとどまっている。本研究は、抄物を発掘・調査し、伝存する抄物の総日録を完成して、日本語研究に資せんとするものである。平成18年度においては次の成果を得た。1、現地調査駒沢大学・東京医科歯科大学・お茶の水図書館・国立公文書館・国会図書館・篠山鳳鳴高校・大谷大学・高山寺・護王会館・京都府医師会館・阪本龍門文庫・天理図書館等において抄物を発掘し、調査不十分な抄物を再調査した。その結果『雲門録抄』『従容臆断』等の新資料を発掘できた。お茶の水図書館・天理図書館・国会図書館においては原典への書入れ抄の調査を進めている。また、内藤記念くすり博物館・神戸女子大学・京都女子大学・日文研・岡山大学医学部等の抄物の複写物を入手し、考察を進めた。2、資料性の解明目録の作成は、漢籍を終え、仏書にかかっている。『百丈清規抄』『六物図抄』等、仏書の抄物の諸本を整理し、それぞれの資料性の解明を行った。また、漢籍の抄物も新たに見つかる物があり、日録補訂のために、『蒙求抄』『三体詩抄』等の資料性の解明につとめた。『虚堂録』等の書入れ抄についての研究と、『和名集井異名製剤記』等の特定の原典を持たない一種の秒物についての研究も、諸本の整備、各本の資料性の解明等を中心に、大幅に進めることができた。3、目録作成新しく発掘・調査した抄物を既に作成している目録「抄物日録稿」(『訓点語と訓点資料』70 1983年、113 2004年)に組み込んだ。仏書の抄物、書入れ仮名抄、特定の原典を持たない一種の抄物、の目録化も進めた。抄物は日本語研究資料として価値が高いにもかかわらず、その発掘・整備が遅れでおり、限られたほんの一部の資料しか利用されていないという状態がながく続いている。本研究は、抄物を発掘・調査し、伝存する抄物の総目録を完成して、日本語研究に資せんとするものである。平成19年度においては次の成果を得た。1、現地調査お茶の水図書館・国立公文書館・高山寺・阪本龍門文庫・天理図書館・大阪府立中之島図書館・武田科学振興財団杏雨書屋等において抄物を発掘し、調査不十分な抄物を再調査した。その結果『人名略』をはじめとする新資料を発掘できたほか、抄物ならびに書入れ仮名抄を多く発掘することができた。2、複写物入手一々の抄物の資料的性格を解明するために、駒沢大学図書館・国立国会図書館・学習院大学図書館・蓬左文庫・京都大学附属図書館・天理図書館・九州大学図書館・上海図書館等が所蔵する抄物ならびにその関連資料の複写物を入手した。3、資料性の解明漢籍子部の『蒙求抄』諸本の資料的性格を解明し、仏書と国書の一々の資料的性格の解明を進めた。特に、特定の原典を持たない一種の抄物のうち医書の抄物『和名集井異名製剤記』については、前年度に引き続いて研究を進め、諸本の関係、各本の言語の性格等について明らかにすることができた。4、目録作成今年度に新しく発掘・調査することができた抄物を「抄物目録稿」(『訓点語と訓点資料』70 1983年、113 2004年)に組み込んだ。仏書の抄物、国書の抄物、書入れ仮名抄、特定の原典を持たない一種の抄物、の目録化も進め、完成させた目録のうち、『日体書紀抄』の目録を発表した。現存する諸体をほぼ網羅できたものと思われる。完成させた目録のその他のものについても、続けて発表して行きたい。
向社会性の個性を生み出す分子メカニズムの解明

近年の研究の結果、向社会的行動には素早い直感的な行動と時間をかけた熟慮的な行動の2つのタイプが存在し、社会的価値志向性の違いがどちらのタイプの向社会的行動を行うかを規定していることが明らかにされた。しかし、何故、向社会性にこのような"個性"が存在するのかについては、これまでほとんど議論されてはこなかった。本研究では向社会性の"個性"はその人物が置かれている社会的環境への適応の結果生じると考え、社会的環境の違いによって向社会性の"個性"が創出されるメカニズムを分子レベルで検討することを目的とした。
ゲノム解析に基づく性成熟疾患・性分化疾患の発症機序の解明

臨床検体の網羅的ゲノム解析によって、ヒト性成熟疾患・性分化疾患の新たな発症メカニズムを解明することを目的として研究を行った。代表的成果は下記のとおりである。(i)ゴナドトロピン欠損症や非症候性尿道下裂における既知遺伝子変異の寄与の程度、および、既知遺伝子変異異常症の新たな臨床スペクトラムを明確とした。(ii)正常月経周期を認める女性において新規男性ホルモン産生経路が男性ホルモンの供給源として機能していることを明確とした。(iii) NR5A1遺伝子変異が遺伝的女性における精巣形成を招くことを初めて明らかとした。(iv)NR0B1変異が、思春期早発症の原因となることを明らかとした。本研究の目的は、性成熟疾患・性分化疾患患者のゲノム解析によって、新たな疾患発症メカニズムを解明することである。ヒト性成熟と性分化には多数の遺伝子と環境要因が作用すると推測されるが、その大部分は未解明である。そのため、性成熟疾患・性分化疾患患者の中で既知遺伝子変異が同定される症例は半数以下である。平成26年度は、主として先行研究で集積した46,XY・46,XX性分化疾患、ゴナドトロピン欠損症、中枢性性早熟症などの臨床検体を対象に、次世代シークエンサーを用いた既知疾患責任遺伝子と候補遺伝子の網羅的変異スクリーニングおよびアレイcomparative genomic hybridizationを用いた全ゲノムコピー数解析、既知DMRのメチル化解析やマイクロサテライト解析などを行った。さらに、in vitro解析、バイオインフォマティックス解析を行い、同定された変異の病的意義の有無の解明および既知遺伝子臨床スペクトラムの解明を行った。これによってゴナドトロピン欠損症、非症候性尿道下裂などの疾患における既知原因遺伝子変異の寄与の程度を明確とし、片親性ダイソミーに起因する劣性変異顕在化など新規発症機序を解明した。さらに、胎児期精巣分化の分子基盤解明を目指したモデル動物解析に着手した。平成27年度以降には、初年度の成果を発展させ、新たな疾患成立機序の解明を目指す。さらに、多数の患者のデータを集積し、日本人患者の変異パターンおよび臨床像を明らかとする。本研究の目的は、患者のゲノム解析に基づき、ヒト性成熟疾患・性分化疾患の発症メカニズムを解明することである。ヒト性成熟と性分化には多数の遺伝子と環境要因が作用すると推測されるが、本症患者の中で既知遺伝子変異が同定される症例は半数以下である。本研究では、網羅的遺伝子変異解析や遺伝子機能解析、バイオインフォマティックス解析などにより新規遺伝学的異常の解明を目指す。平成26年度は、先行研究で集積した数百例の臨床サンプルを対象に、次世代シークエンサーを用いた既知疾患責任遺伝子と候補遺伝子の網羅的変異スクリーニング、アレイcomparative genomic hybridizationを用いた全ゲノムコピー数解析、バイロシークエンスを用いた包括的メチル化解析やマイクロサテライト解析などを行った。平成27年度は、上記の成果をもとに、疾患発症責任遺伝子や候補遺伝子の同定、ゲノム構造異常の解明を行った。最終年度は、これまでの成果を発展させ、性成熟疾患・性分化疾患の新たな成立機序を解明する。とくに、平成27年度に同定された性分化疾患責任候補遺伝子のin vitro機能解析やin silico機能予測、および、ゲノム微細構造異常に起因する疾患発症メカニズムの解明などを推進する。また、論文や学会発表などで研究成果に関する情報発信を行う。本研究のよって得られる知見は、性成熟疾患・性分化疾患患者の診療に役立ち、普遍的な遺伝子発現制御メカニズムおよび遺伝子ー環境因子相互作用の理解につながると期待される。計画通りの進展が認められた。これまでの代表的成果は下記のとおりである。[1]明らかなcampomelic dysplasia骨変形を伴わない46,XY性分化疾患患者3例においてSOX9遺伝子ミスセンス変異と遺伝子上流微小欠失を同定し、SOX9異常症の新たな表現型を明らかとした。また、SOX9の精巣特異的遠位エンハンサーのゲノム上の位置を限局化した。[2]SOX10遺伝子異常症患者の遺伝学的および臨床解析に基づき、本症の主病変が視床下部であること、本症が優勢阻害効果でなく半量不全によって発症すること、SOX10変異が明らかなWaardenburg徴候を伴わないゴナドトロピン欠損症の原因となることを明らかとした。[3]非症候性尿道下裂患者におけるゲノムコピー数解析を行い、本症発症におけるY染色体微細構造多型の寄与は限定的であることを明確とした。[4]正常月経周期を認める女性において新規男性ホルモン産生経路backdoor pathway由来代謝産物の定量を行い、この経路が男性ホルモンの供給源として機能していることを明確とした。[5]先天奇形を伴う46,XY性成熟疾患患者1例において4番、7番、X染色体の複雑構造異常を同定し、これらの染色体上に疾患関連遺伝子が存在する可能性を見出した。臨床サンプルを対象に、次世代シークエンサーを用いた既知疾患責任遺伝子と候補遺伝子の網羅的変異スクリーニング、アレイcomparative genomic hybridizationを用いた全ゲノムコピー数解析、バイロシークエンスを用いた包括的メチル化解析やマイクロサテライト解析などを行った。本年度の代表的成果は下記のとおりである。(i)原因不明の46,XX性分化疾患患者の全エクソーム解析によって、血縁関係のない2例にNR5A1遺伝子の同一ミスセンス変異p.R92Wを同定した。

さらにin vitro発現実験によってこのNR5A1変異体がNR0B1による抑制を逃れることで未分化性腺におけるSOX9過剰発現を招く可能性を見出した。本研究により、単一遺伝子ミスセンス変異が遺伝的女性における精巣形成を招きうることが初めて明らかとなった。(ii)合併症のない思春期早発症を呈する男児1例でNR0B1フレームシフト変異を同定した。この成績は、NR0B1のN末端欠失変異タンパクが、副腎機能低下を伴わない性早熟を招く可能性を示唆する。変異陽性患者では、ゴナドトロピン依存性および非依存性に性早熟が生じると推測される。(iii)思春期遅発症を呈する男性患者でKAL1遺伝子を包含するXp22.31領域の染色体微細欠失を同定した。切断点の構造解析によって、このようなゲノム微細構造異常がmicrohomology-mediated break-induced replicationの機序で生じること、および隣接遺伝子欠失症候群の1症状としてのゴナドトロピン欠損症を招くことを見出した。(iv)明らかな眼球形成異常のないゴナドトロピン欠損症患者でSOX2変異を同定した。これにより、SOX2異常症の新規表現型スペクトラムが明らかとなった。臨床検体の網羅的ゲノム解析によって、ヒト性成熟疾患・性分化疾患の新たな発症メカニズムを解明することを目的として研究を行った。代表的成果は下記のとおりである。(i)ゴナドトロピン欠損症や非症候性尿道下裂における既知遺伝子変異の寄与の程度、および、既知遺伝子変異異常症の新たな臨床スペクトラムを明確とした。(ii)正常月経周期を認める女性において新規男性ホルモン産生経路が男性ホルモンの供給源として機能していることを明確とした。(iii) NR5A1遺伝子変異が遺伝的女性における精巣形成を招くことを初めて明らかとした。(iv)NR0B1変異が、思春期早発症の原因となることを明らかとした。計画通りの進展が認められた。[1]ゴナドトロピン欠損症患者を対象とした既知責任遺伝子のターゲットリシークエンスおよびアレイCGHによる全ゲノムコピー数解析を行い、58例中14例において明らかな病的遺伝子変異を同定した。まれな遺伝子異常として、複合型下垂体機能低下症患者におけるWDR11スプライス変異、単独ゴナドトロピン欠損症患者におけるFGFR1欠失とSOX3ポリアラニン欠失を同定した。これによって、日本人患者における既知遺伝子変異の寄与の程度および既知遺伝子変異異常症の臨床スペクトラムが明確となった。[2]非症候性尿道下裂患者の網羅的遺伝子変異解析およびコピー数解析を行い、本症患者の10%以上に既知単一遺伝子変異もしくはモザイク染色体構造異常が存在することを見出した。陰茎部開口尿道下裂を呈する比較的軽度な症例においても、病的単一遺伝子変異が存在することが明らかとなった。
カルシウムナノドメインの感受機構:機能解析技術の開発と生理的意義の解明

神経回路は神経細胞から伸びた軸索突起が標的に到達して構築される。軸索先端部(成長円錐)は、細胞外のガイダンス因子を読み取り、正しい方向に旋回する。本研究課題では、誘引性旋回は小胞体のCa^<2+>チャネル周囲に形成されるCa^<2+>ナノドメインを介すること、このCa^<2+>ナノドメインをミオシンVaが感知し、Ca^<2+>チャネルから解離することで下流にシグナルを伝えることを明らかにした。さらに、ミオシンVaがCa^<2+>チャネルから解離することが、誘引性旋回の十分条件であることを証明した。発生過程の軸索先端部(成長円錐)は細胞外環境のガイダンス分子に応じて細胞質カルシウム濃度を変化させ、正しい方向へ旋回する。この際カルシウム濃度の上昇は神経突起の誘引と反発のような相反する細胞応答を媒介する。本研究は細胞内カルシウムシグナルが細胞応答の特異性と多様性を獲得するメカニズムの解明を目的とした。まず、成長円錐の旋回運動に対して解離速度定数が異なる2種類のカルシウムキレート剤の効果を調べた。その結果、反発性旋回運動は低濃度カルシウムシグナル(低特異性)、誘引性旋回運動は高濃度カルシウムシグナル(高特異性)の伝達様式を有していることを明らかした。ミオシンVaは高濃度カルシウムシグナル伝達に関わるで因子であるが、本研究においてミオシンVaとカルシウムチャネルが数十ナノメートルの範囲内に局在することを1分子レベル免疫染色法により明らかにし、ミオシンVaとカルシウムチャネルが直接結合することを生化学的手法により証明した。さらにミオシンVaのカルシウムチャネル結合部位を同定し、その部位が高濃度カルシウムイオン依存的にカルシウムチャネルから解離することを明らかにした。以上より、高濃度カルシウムシグナルは、ミオシンVaがシグナル伝達分子としてカルシウムチャネルに直接結合し、高濃度のカルシウムイオンにのみ応答することで高い特異性を獲得することを明らかにした。次に、高濃度カルシウムシグナルの可視化を試みたが、ミオシンVa全長を使用したプローブでは有為なシグナルを検出出来なかった。今後はミオシンVaのカルシウムチャネル結合部位にカルシウム感受性蛍光タンパク質を融合したプローブを作製する予定である。高濃度カルシウムシグナル感受機能欠失マウスの作製に関しては、ミオシンVaとカルシウムチャネルの結合阻害ペプチドの効果を1分子レベル免疫染色法により確認でき次第、計画を進める予定である。本研究の目的は細胞内微小領域での高濃度カルシウムシグナル(Ca2+ナノドメイン)が細胞応答の特異性と多様性を獲得するメカニズムを明らかにし、生体内での機能的意義を解明することである。平成23年度は研究実施計画に基づいて、以下の実験を行った。1. Ca2+感受性蛍光タンパク質連結型Ca2+ナノドメインセンサー分子の作製Ca2+ナノドメインセンサー分子であるミオシンVaに低親和性Ca2+感受性蛍光タンパク質(Cameleon YC3.60)を連結した。この遺伝子を導入した神経細胞に対して人為的に神経突起誘引シグナルを発生させたところ、Ca2+シグナルが検出された。しかし、そのシグナルは極めて微弱であった。2.免疫電子顕微鏡法によるCa2+ナノドメインセンサー分子の局在解析神経細胞の成長円錐において、Ca2+ナノドメインを発生するCa2+受容体とミオシンVaの局在を免疫電子顕微鏡法により解析した。しかし神経細胞の調製段階で、固定化剤により成長円錐の細胞内構造が崩れてしまうことが判明したため、両者の局在情報を得ることは出来なかった。3. Ca2+ナノドメイン感受機能欠失マウスの解析Ca2+受容体とミオシンVaの結合を阻害するペプチドをマウスに導入する計画であったが、免疫沈降実験においてその阻害ペプチドが条件によっては活性を持たないことが判明した。そのため生体内で活性を保持することに確証が持てなかったため、トランスジェニックマウスの作製は進んでいない。Ca2+感受性蛍光タンパク質連結型Ca2+ナノドメインセンサー分子の作製においては、Ca2+シグナルに応答して発生したシグナルが弱く、人為的にCa2+ナノドメインを発生させた時と発生させなかった時のシグナル強度の差を有為に検出することが出来なかった。センサー分子であるミオシンVaがCa2+チャネルから発生するCa2+ナノドメインのみを感知していることを示すには、Ca2+感受性蛍光タンパク質が発生するシグナル強度を増強させるシステムが必要となる。現在そのシステムを構築している。免疫電子顕微鏡法においては、神経細胞の成長円錐が構造的に弱いため、通常の固定法では崩れてしまい観察できなかった。様々な固定法を試したが細胞内の構造を保持した状態を作り上げることは困難であった。そのため、免疫電子顕微鏡法によってミオシンVaとCa2+チャネルの局在情報を得ることは出来なかった。現在は超解像度の蛍光顕微鏡システムを使用して、両者の局在情報の取得を計画している。Ca2+ナノドメイン感受機能欠失

マウスの解析においては、その準備途中でCa2+受容体とそのセンサー分子の結合を阻害するペプチドが、ある条件ではその活性を失うことが免疫沈降により判明した。そのため、実際に細胞内で阻害ペプチドとして働くことを証明する別の実験が必要となった。そのため、計画していた実験は進んでいない。Ca2+感受性蛍光タンパク質連結型Ca2+ナノドメインセンサー分子の作製においては、Ca2+感受性蛍光タンパク質の連結位置、培養条件、顕微鏡システムの改変を行い、シグナル強度の改善を目指す。改善に成功したら、Ca2+ナノドメインセンサー分子であるミオシンVaがCa2+ナノドメインを実際に感受していることを証明し、Ca2+ナノドメインと神経突起の誘導方向との関連性をリアルタイムで明らかにする。改善が見込めない場合は、ミオシンVaのCa2+チャネル結合部位を免疫沈降により同定し、その結合領域とCameleonを融合させ、より小さなCa2+ナノドメインセンサーの作製を試みる。電子顕微鏡で成長円錐を観察することは困難であるため、数十ナノメートルの空間分解能を有する蛍光顕微鏡システムを使用してCa2+受容体とミオシンVaの局在を明らかにする。さらに、両者の結合阻害ペプチドの効果を同顕微鏡システムで解析する。阻害ペプチドの効果が細胞内で証明できたら、トランスジェニックマウスの作製を進める。研究費の1100千円は消耗品(生化学試薬、分子生物学試薬、細胞培養試薬、顕微鏡関連消耗品、細胞培養実験器具、蛍光指示薬、実験動物)に使用する。また、トランスジェニックマウスの作製費用として400千円使用する予定である。
がん抗原を外殻成分とした新規マイクロバブルの創製とがん免疫療法への応用

まずはじめに、モデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を外殻成分としたマイクロバブルの調製法に関する検討を行った。動的光散乱法・コールターカウンター法・ガスクロマトグラフィにより、マイクロバブル粒子径・粒子数・気体成分の含有量を評価し、再現性良く抗原からなるマイクロバブル調整法を確立した。次に、本調製法により調製したマイクロバブルに超音波を照射した際の抗原の細胞内動態を検討した。アジ化ナトリウム処理したマウス骨髄由来樹状細胞にAlexa 488で蛍光ラベルしたOVAを組み込んだマイクロバブルを添加し、超音波照射後、直ちに細胞を洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。その結果、OVAからなるマイクロバブルを添加し、超音波照射した樹状細胞において、細胞膜周辺にOVA由来の蛍光が観察された。このことから、抗原からなるマイクロバブルに超音波照射することで、エンドサイトーシス非依存的に細胞内に抗原送達可能であることが示唆された。次に、MHCクラスI抗原提示誘導について検討した。樹状細胞にOVAからなるマイクロバブルを添加し、超音波照射した。1時間培養後、細胞を洗浄し、樹状細胞のMHCクラスI上のOVAエピトープを認識し、IL-2を産生するCD8-OVA1.3細胞と共培養した。20時間培養後、培養上清に含まれるIL-2をELISAにより測定した。その結果、OVAからなるマイクロバブルに超音波を照射することで、高いIL-2産生が認められた。このことから、抗原からなるマイクロバブルに超音波照射することでMHCクラスI抗原提示を誘導可能であることが示唆された。