hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エックハルト及びドイツ神秘思想の在俗信徒・民衆の霊性に対する影響関係の解明

こうした文献の調査を通じて、特に、ドイツ神秘思想におけるエックハルトの『教導講話』(1294年頃)が、フランドル神秘思想の中心的思想家であるリュースブルクのテキストと混合され、『12の徳について』という中世オランダ語のテキストとして成立し、さらにそれが、ドイツ神秘思想のヨハネス・タウラーのテキストとして『タウラーの霊的綱要』という題で再受容され、しかも、『タウラー著作集』のラテン語訳版の中に収録され印刷されることによって、ドイツ・フランドル地域のみならず、ヨーロッパ各地に流布し、受容され、そのラテン語版から、さらに、各地域で俗語訳され、それぞれの地域における神秘思想、霊性の中に受容された状況がはっきりしてきた(とりわけスペイン神秘主義やフランスの敬虔主義への影響が大きい)。こうしたテキスト受容史から、中世末から近世のキリスト教思想史・霊性史を解明するとしてドイツ神秘思想におけるこうした集中的な現地調査を通じて、中世後期ー近世の神秘思想の展開(ドイツ神秘思想からフランドル神秘思想、デヴォチオ・モデルナに至る)について一定の展望と研究状況の知見を確保できた。これらの研究成果は、国際学会を含む学会発表で公表されるとともに、論文や翻訳を通じて公表された。海外での現地調査を通じて、新しい研究文献・資料を収集しつつ、主要な専門家と面談して自分の研究計画や問題意識について質疑を行い、有益な研究情報、助言を得たことによって、当初の研究計画で念頭に置いていた以上に、具体的で有効な研究方法・研究計画を確立することができた。また、海外の現地調査における研究者との面談を通じて、未だ研究の蓄積の少ない問題領域を主題化する本研究計画が、現在のキリスト教思想史の研究において非常に魅力的で、重要な意味があると評価を得ることもでき、今後の研究における交流・協力関係を築くこともできた。また研究成果を学会発表、論文を通じて複数の機会に公表し、また、今後も公表の準備ができている。新しく収集した研究文献・資料の調査によって、ドイツ神秘思想および、それを受容したフランドル神秘思想、さらに、デヴォチオ・モデルナの思想的展開と、同時期の一般民衆の霊性の状況にっいて多くの知見を得ることができた。特に、14-15世紀に数多く作成された霊的著作を編集・抜粋した諸写本をとりあげ、その成立状況から、その写本にかかわった人々の霊性・思想的傾向を分析することに、研究方法として、大きな可能性があることがわかってきた。これらの研究成果は学会発表、論文を通じて複数の機会に公表し、また、今後も公表の準備ができている。本年度の現地調査等で収集した研究資料を整理するとともに、引き続き、本研究課題にとって重要なテキスト(哲学・神学・霊性的著作)の思想内容の解読を進める。それによって、ドイツ神秘思想を受容したフランドル神秘思想、デヴォチオ・モデルナの思想的展開と、同時期の一般民衆の霊性の状況の解明を行うとともに、それに必要な研究資料及び研究知見を確保するため、海外における現地調査を継続して実施する。次年度は、特に、本課題に関連して研究上の重要性が認められる、フランドル宗教芸術を視野に入れた研究を行うために、H.Schwaetzer教授から紹介を受けた専門家InigoBocken教授(ナイメーヘン大学)の下で集中した研究調査を実施する予定である。また、国際学会に参加し研究発表を行うとともに研究交流を推進する(すでに複数の学会を具体的に検討中).
新規ミスマッチ依存アポトーシス制御因子の同定による発がん抑制機構の解明

アルキル化剤に起因するO6メチルグアニン(O6meG)はDNA複製においてCと同程度の割合でTと対合してO6meG/T誤対合を形成する。この誤対合はミスマッチ修復(MMR)因子により認識され、チェックポイントの活性化とアポトーシスによって細胞ごと取り除かれるが、詳細な分子機構には不明な点が多い。本研究ではアポトーシス誘導過程の詳細を明らかにするため、MMR複合体と協調して働く因子を精製し、新規因子の同定を試みた。その結果、新規アポトーシス因子として3つの遺伝子を同定することに成功した。この結果は発がん抑制のメカニズムや新規抗がん剤の開発のヒントになると考えられる。O6-メチルグアニンによりミスマッチ修復(MMR)因子が積極的にアポトーシスを誘導するメカニズムを解明するため、アルキル化剤であるメチルニトロソウレア(MNU)に依存して形成されるMMR因子複合体の精製を試みた。計画書に記載の通り、ミスマッチ認識複合体MutSaのサブユニットであるMSH2、またはMSH6とビオチンリガーゼBirAの融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作成した。BirA融合タンパク質はMSH2とMSH6のそれぞれのN末端またはC末端にBirAが融合したものを作成した。これらのプラスミドをHeLa MR細胞に導入してBirA融合タンパク質の安定発現株を樹立した。この株をMNUで処理し、O6-メチルグアニン依存的にMutSaと相互作用する因子をビオチン-ストレプトアビジンのアフィニティーを利用して精製した。この実験系が機能しているかどうかを確認するため、アフィニティー精製したタンパク質をポリアクリルアミド電気泳動に供し、既知のMMR因子に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、これまでに報告されたMMR因子はBirA融合タンパク質によってビオチン化され精製されており、BirAと融合したMSH2、またはMSH6は細胞内でMMR因子と結合していることを確認した。一方で、アフィニティー精製されるMMR因子の量が通常の免疫沈降実験などと比べ少ないことがわかった。このことを精査するため、BirA融合MSH2/MSH6の細胞内局在を確認した所、MSH2/MSH6はBirAと融合したために核への移行が抑制されており、O6-メチルグアニン依存的なクロマチンへの集積が少なくなっていることがわかった。この問題を解消するため、核移行を妨げない融合タンパク質の設計、他のMMR因子であるMLH1、PMS2とBirAの融合タンパク質の発現系の構築を試みているアルキル化剤に誘導されるミスマッチ修復(MMR)タンパク質依存のアポトーシスの分子機構を解明するため、アルキル化剤MNUの刺激によって形成されるミスマッチタンパク質複合体の精製を試みた。MutSaのサブユニットにビオチンリガーゼ(BirA)を融合させた場合、損傷部位への蓄積が阻害されたため計画を変更し、MutLaのサブユニットであるMLH1にBirAを融合させた。また、MMR複合体形成の際に内在性のMLH1との競合の可能性を排除するため、CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集によってHeLa MR細胞のMLH1遺伝子を欠損させ、この細胞を用いてMLH1-BirA融合タンパク質を発現する株を作成した。この細胞株を用いてMLH1-BirAの挙動を精査したところ、この融合タンパク質はMNU刺激に応答して核移行し、クロマチン画分への集積が観察された。またこのBirA融合MLH1タンパク質はMLH1欠損を相補したことから細胞内でも野生型MLH1とほぼ同様に機能していると予想された。次に、この融合タンパク質発現株を用いてMNU刺激後のMMRタンパク質複合体をアフィニティー精製し、既知のMMR因子に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングによりMMR複合体の形成を観察したところ、予想されたMMR複合体が精製できていることが確認できた。さらに、この精製物をポリアクリルアミド電気泳動に供し銀染色によりタンパク質を可視化したところ、MLH1-BirA融合タンパク質依存的かつMNU刺激依存的に特異的に観察されるタンパク質が複数観察された。一方で、夾雑タンパク質が非常に多いため、質量分析にはさらなる分画または分離を必要とすることがわかった。MSH2-, MSH6-BirA融合タンパク質は核移行に異常が生じたため、計画を変更してMLH1にBirAを融合したタンパク質の発現系を構築する必要があった。また、この実験系ではMMR複合体の精製量が少なかったため、精製の効率を高める必要性があった。そこで、内在性MLH1とMLH1-BirA融合タンパク質が競合しないようにCRISPR/Cas9による遺伝子編集でMLH1欠損細胞を構築し、その細胞にMLH1-BirAを発現した株を作成した。精製した複合体には夾雑タンパク質が予想したより多く、SILAC法や2次元電気泳動などの導入によってより特異的なタンパク質解析ができる実験系を組み直している。アルキル化剤によって生じたO6メチルグアニン(O6meG)に誘導されるアポトーシスにはミスマッチ修復(MMR)因子と種々の細胞周期チェックポイントタンパク質の関与が示されているが、その詳細な分子機構は明らかでない。このアポトーシス誘導の制御機構の詳細を解明するため、O6meG/T誤対合に結合したMMRタンパク質複合体と相互作用する、もしくは近傍で働く新規アポトーシス関連因子の同定を試みた。新規アポトーシス関連因子の精製にはBioID法を用いた。

BioID法では、近傍のタンパク質を非選択的にビオチン化する大腸菌BirAの変異体とMMRタンパク質の融合タンパク質を細胞内で発現させ、O6meG/T誤対合に結合したMMRタンパク質と相互作用する、もしくは近傍で働くタンパク質をビオチン化し、それらをビオチン-ストレプトアビジンの強力な親和性を利用して精製して質量分析にて解析する。本研究ではMMR複合体のうちMLH1のN末端にBirAを融合したタンパク質を用いた。この融合タンパク質がMMR複合体形成とDNA損傷応答、アポトーシス誘導において野生型MLH1と同程度に働くことができることを確認した。MLH1-BirA融合タンパク質を発現する細胞をアルキル化剤MNUで処理しビオチンでラベルした。ビオチンラベルされたタンパク質をストレプトアビジン磁気ビーズを用いて精製し、SDS-PAGEで分離の後、銀染色にて可視化した。これらのタンパク質をLC-MS/MSにて解析して同定した。同定したタンパク質のうち、特異性が高く、MNU処理に依存して増加が見られる15種類を選択し、siRNAを用いてその遺伝子をノックダウンし、それらがアルキル化剤に応答したアポトーシスに関与するかどうかを検討した。その結果、3つの遺伝子を新規アポトーシス関連因子として同定することに成功した。アルキル化剤に起因するO6メチルグアニン(O6meG)はDNA複製においてCと同程度の割合でTと対合してO6meG/T誤対合を形成する。この誤対合はミスマッチ修復(MMR)因子により認識され、チェックポイントの活性化とアポトーシスによって細胞ごと取り除かれるが、詳細な分子機構には不明な点が多い。本研究ではアポトーシス誘導過程の詳細を明らかにするため、MMR複合体と協調して働く因子を精製し、新規因子の同定を試みた。その結果、新規アポトーシス因子として3つの遺伝子を同定することに成功した。この結果は発がん抑制のメカニズムや新規抗がん剤の開発のヒントになると考えられる。BirA融合MSH2/MSH6タンパク質が他のMMR因子と結合できることを確認したが、予想に反してポジティブコントロールとなるMMR因子がアフィニティー精製で少量しか精製されないことがわかった。この原因を調べた所、O6-メチルグアニン依存的なクロマチンへの集積が抑制されていることがわかった。これはMSH2/MSH6とBirAが融合したために核移行が阻害されていると予想された。このため、融合タンパク質の発現コンストラクトの再設計を余儀なくされた。そのため核移行を妨げない融合タンパク質の設計と発現系の構築、他のMMR因子であるMLH1、PMS2とBirAの融合タンパク質の発現系の構築を試みている。MLH1-BirA融合タンパク質がMMR複合体の精製に有用であることが示されたため、これを用いてアルキル化剤に応答して形成されるMMR因子複合体の質量分析、新規因子の同定を進める。これを実行するためには、より多くの精製物と、より特異的な分離分画法の確立が必要であるため、MLH1-BirA発現株の大量培養と2次元電気泳動法などによる分離を行う。また、人工基質を用いて、in vitroで形成された複合体を精製する方法の検討も行う。
タンパク質結晶-容液界面におけるタンパク質1分子の吸着・脱離・拡散ダイナミクス

リゾチーム(モデルタンパク質)結晶表面上での蛍光ラベル化リゾチーム(F-L)と蛍光ラベル化リゾチームダイマー(F-D)の吸着過程を1分子その場観察するとともに,リゾチーム結晶表面上の分子(単位)成長ステップの挙動をその場観察した.その結果,個々の分子の吸着・脱離過程が結晶-溶液界面に特有な描像を示すこと,およびそれらに対して結晶表面上の分子成長ステップが顕著な応答を示すことを見いだした.1)吸着・脱離過程のダイナミクス平衡状態に保ったリゾチーム正方晶系結晶{110}面上での個々のF-L分子の吸着・脱離過程を1分子その場観察し,F-Lが結晶表面上のテラスではなくステップに選択的に吸着することを明らかにした.また,吸着はある待ち時間(誘導期)を経た後に急激に進行すること,および結晶表面上での滞在時間が長い分子ほど吸着速度が速いことを見いだした.これらの結果は,吸着が1つの素過程で進行するのではなく,多段階の逐次的な素過程を経て徐々に進行することを示す.現在のところ,タンパク質分子表面に強く吸着した水和水の脱離過程がこの多段階素過程にあたると推測している.2)分子成長ステップの応答溶質分子と構造が類似したタンパク質(F-L)は目的タンパク質結晶表面のステップに吸着するが,分子サイズの差異が大きくなると(F-D)テラスに吸着することを見いだした.また,吸着サイトが異なると,分子ステップの前進速度の過飽和度依存性に大きな差が現れることを見いだすとともに,この違いを吸着サイトに基づき説明することに成功した.さらに,結晶表面上に吸着したこれらのタンパク質は,低下飽和度下では結晶表面上での不均一2次元核形成を顕著に促進することを見いだした.タンパク質の1分子観察技術を応用し,タンパク質結晶-溶液界面における個々のタンパク質分子の表面拡散・吸着過程をその場観察し,下記の成果を得た.1.分子位置決め精度の向上:除振台を新規購入するとともに,剛性を有し試料位置を精密に制御できる顕微鏡ステージを新規作成し,位置決め精度50nmを達成した.2.表面拡散過程のその場観察:モデルタンパク質・リゾチームの正方晶系結晶{110}面-溶液界面において,蛍光ラペル化リゾチーム分子の拡散挙動を追跡した.まず,蛍光分子の焦点深度内での滞在時間と移動距離より,本手法で観察される蛍光分子はバルク溶液中のものではなく,結晶表面から水素結合の到達距離内に存在し,結晶表面と強く相互作用して極めて遅い拡散運動をしている分子であることを明らかにした.即ち,固体表面上の厚さ数nm程度の極めて薄い溶液層内での遅く2次元的な拡散運動こそが,固液界面における表面拡散の猫像であることを見出した.次に,293分子について結晶のc軸に平行・垂直方向の拡散係数を決定した:それぞれ8.6x10^(-15),5.1x10^(-15)[m^2/s].本結果は,固液界面での拡散が,(1)バルク溶液中での拡散(1x10^(-10)[m^2/s])に比べて4-5桁遅いこと,および(2)異方性を有することを意味する.拡散の異方性は,リゾチーム分子の正味電荷および結晶表面上での電荷分布の異方性より説明できた.3.ステップ前進過程の活性化エネルギーの測定:表面拡散よりも観察が容易なステップ前進過程の活性化エネルギーの測定を試みた.しかし,タンパク質結晶において実験可能な5-30°C程度の温度範囲では,優位差を検出できなかったため,計画を断念した.4.吸着過程のその場観察:蛍光化リゾチームが結晶表面上のテラスではなくステップに優先的に吸着することを見出した.リゾチーム(モデルタンパク質)結晶表面上での蛍光ラベル化リゾチーム(F-L)と蛍光ラベル化リゾチームダイマー(F-D)の吸着過程を1分子その場観察するとともに,リゾチーム結晶表面上の分子(単位)成長ステップの挙動をその場観察した.その結果,個々の分子の吸着・脱離過程が結晶-溶液界面に特有な描像を示すこと,およびそれらに対して結晶表面上の分子成長ステップが顕著な応答を示すことを見いだした.1)吸着・脱離過程のダイナミクス平衡状態に保ったリゾチーム正方晶系結晶{110}面上での個々のF-L分子の吸着・脱離過程を1分子その場観察し,F-Lが結晶表面上のテラスではなくステップに選択的に吸着することを明らかにした.また,吸着はある待ち時間(誘導期)を経た後に急激に進行すること,および結晶表面上での滞在時間が長い分子ほど吸着速度が速いことを見いだした.これらの結果は,吸着が1つの素過程で進行するのではなく,多段階の逐次的な素過程を経て徐々に進行することを示す.現在のところ,タンパク質分子表面に強く吸着した水和水の脱離過程がこの多段階素過程にあたると推測している.2)分子成長ステップの応答溶質分子と構造が類似したタンパク質(F-L)は目的タンパク質結晶表面のステップに吸着するが,分子サイズの差異が大きくなると(F-D)テラスに吸着することを見いだした.また,吸着サイトが異なると,分子ステップの前進速度の過飽和度依存性に大きな差が現れることを見いだすとともに,この違いを吸着サイトに基づき説明することに成功した.さらに,結晶表面上に吸着したこれらのタンパク質は,低下飽和度下では結晶表面上での不均一2次元核形成を顕著に促進することを見いだした.
子宮の低酸素誘導因子による着床制御機構の解明

妊娠におけるHIFの機能を明らかにするために、子宮特異的HIF1α、HIF2αの遺伝子欠損マウス(各々HIF1αcKO, HIF2αcKO)を用いて解析を行った。HIF1αcKOでは、そのコントロールマウスと比較して約40 %の産仔数低下が認められたが正常新生仔が得られた。一方HIF2αcKOは産仔が得られなかった。次に不妊の表現型が強いHIF2αcKOに注目し解析を進めた。排卵、受精率、着床前の胚盤胞数は、HIF2αcKOとそのコントロールマウスで同等だった。HIF2αcKOでは胚接着の物理刺激で開始する子宮間質の細胞増殖による膨大化(脱落膜化)が肉眼的に明瞭化する時期である妊娠6日目(妊娠1日目=腟栓確認日)において、HIF2αcKOでは脱落膜化が認められ胚接着部位の数と重量は正常であったが、妊娠8日目にはHIF2αcKOの脱落膜化部位は不明瞭化した。HIF2αcKOでは子宮管腔上皮が消失し胚の栄養膜細胞の間質への浸潤が開始する時期の妊娠5日目夕において、HIF2αcKOでは胚接着部位の子宮管腔上皮の消失が認められず栄養膜細胞のアポトーシスが認められ、さらに妊娠6日目には胚の組織学的崩壊が起こっていた。レーザーマイクロダイセクションで採取した妊娠5日目夕の胚接着部位の子宮管腔上皮のマイクロアレイによりHIF2αcKOにおける増殖因子PlGFや接着因子PECAM-1の発現低下が認められ、免疫染色によりHIF2αcKOにおける胚接着部位の栄養膜細胞のpAKTの低下が認められた。以上の結果から、子宮のHIF2αcKOは、増殖因子や接着因子を介して胚盤胞活性化の指標である栄養膜細胞のPI3K-AKT経路活性化、胚生存・浸潤を誘導し、胚着床を調節していることが明らかとなった。マウスモデルを用いた研究が順調に行われており、その成果も順調に得られている。これらの成果をさらに発展させ、次年度以降の研究の更なる進展が期待できる。順調に進展し成果を上げているため、研究計画通りに進める予定とする。妊娠初期のヒト子宮内膜は生理的に低酸素状態であること、マウス着床期子宮において低酸素で誘導される転写因子として広く知られるHIF1αおよびHIF2αが子宮内膜に発現していることが報告されている。子宮内膜の低酸素状態によって、HIFが子宮内膜に誘導されて作用すると推測されるものの、その役割は不明であった。本研究では、マウスモデルを用いて子宮の低酸素とHIFの意義を調べた。野生型マウスに対し低酸素プローブを用いて着床直前の子宮内膜が低酸素であり着床後酸素化が促進されることを示した。次に子宮のHIFに着目し、HIF1α-loxPマウスまたはHIF2α-loxPマウスをPgr-creマウスと交配させて子宮のHIF1α欠損マウス(1αKO)およびHIF2α欠損マウス(2αKO)を作成し、妊娠の表現型を調べたところ、2αKOからは産仔が1匹も得られず、1αKOは産仔数が減少することが判明した。完全な不妊である2αKOの異常が妊娠のどの段階で起こっているのかを調べたところ、子宮内膜への胚接着が認められるものの子宮内膜管腔における胚接着位置の子宮血管側への変位が起こっており、胚接着後に胚発育停止が認められた。着床直後の着床部位では着床に必須のサイトカインであるLIFの発現低下を認めたため、2αKOに対してLIFを投与したところ、着床部位の改善は認めたがその後の胚発育は改善しなかった。以上の結果から、着床期子宮内膜が低酸素であること、子宮のHIFが胚接着位置の決定、着床後の胚発育に関与していることが明らかとなった。本研究により、子宮の低酸素がHIFを誘導し着床を調節している可能性が示された。HIF2αcKOでは子宮管腔上皮が消失し胚の栄養膜細胞の間質への浸潤が開始する時期の妊娠5日目夕において、HIF2αcKOでは胚接着部位の子宮管腔

上皮の消失が認められず栄養膜細胞のアポトーシスが認められ、さらに妊娠6日目には胚の組織学的崩壊が起こっていた。レーザーマイクロダイセクションで採取した妊娠5日目夕の胚接着部位の子宮管腔上皮のマイクロアレイによりHIF2αcKOにおける増殖因子PlGFや接着因子PECAM-1の発現低下が認められ、免疫染色によりHIF2αcKOにおける胚接着部位の栄養膜細胞のpAKTの低下が認められた。以上の結果から、子宮のHIF2αcKOは、増殖因子や接着因子を介して胚盤胞活性化の指標である栄養膜細胞のPI3K-AKT経路活性化、胚生存・浸潤を誘導し、胚着床を調節していることが明らかとなった。マウスモデルを用いた研究が順調に行われており、その成果も順調に得られている。これらの成果をさらに発展させ、次年度以降の研究の更なる進展が期待できる。順調に進展し成果を上げているため、研究計画通りに進める予定とする。平成29年度日本内分泌学会研究奨励賞、廣田泰。平成28年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞、大学院生:平岡毅大。
安定解空間内強化学習法の提案と多重連結型ロボットの走行制御への適用

本研究では、(1)強化学習による制御ルールの発見、(2)多重連結型ロボットの作製と制御システムの構築、(3)制御系のロバスト安定解析、の3項目を実現し、多重連結型ロボットの走行制御を行った。申請者は多重連結型ロボットの簡易なものであるトレーラ・トレック(スモ-ルスケールの模型)を用いた制御システムの構築(1994)を前段階として行っていたが、ここで開発された制御システムでは以下の問題点が存在した。(1)CCDカメラを用いて位置検出を行っているが、ほとんどがソフトウェアで処理しているためその速度が遅い。とくに、複数の運搬専用ロボットが存在すると、その数だけ位置情報の検出が必要になり、より高速な画像処理が要求される。(2)CCDカメラはロボットとは別の場所(天井)に固定されているため、実際の作業を行わせるときに不都合である。これらの問題点を改善することにより、制御システムの構築を行った。また、本研究では、強化学習により、一部の制御ルールを獲得するアルゴリズムを構築した。具体的には、有効な制御を実現するために、ロバスト安定条件を満足する解空間を求め、この空間内での制限付き強化学習法を提案した。解空間を求める場合、3つの安定条件を用意し、段階的にその条件を緩めることのよって解空間の拡大を試みた。ロバスト安定条件を満足する解空間を導く場合、この制御システムが非線形であるので線形のロバスト安定論を適用できない。申請者は非線形の制御対象に対して、sector nonlinearity(SN)の概念を適用した安定解析の一手法(1993)を提案してはいるが、多重連結型ロボットのモデル化時の誤差を考慮する必要があるため、その方法をそのまま適用することもできなかった。本研究では、そのSNの概念を拡張し、ロバストな安定条件を導くことに成功した。
ハイリスク児の心理診断からみた発達予測に関する検討

本研究では、ハイリスク児の中でとくに発達の道筋が明らかにされていない超低出生体重児を対象として、発達援助に役立てるために低年齢の段階からの発達予測の可能性について検討した。その手掛かりを得るために超低出生体重児を対象として1歳から4歳までの4年間にわたって遠城寺式乳幼児発達検査を実施し、発達年齢(DA)および発達指数(DQ)の両指標をもとに発達的変化を分析し、発達予測の可能性を検討した。その結果、「移動運動」、「手の運動」、「基本的習慣」、「対人関係」、「発語」、「言語理解」の各領域において、発達プロフイルやその速度に違いはあるが、いずれの領域においても加齢に従って上昇が認められ、4歳までに健常児の水準にほぼ到達した。DAやDQを指標として、加齢に伴う発達水準の変化や1歳時および2歳時を基準とした変化を検討した結果、発達プロフィールの特徴的変化や個人差だけでなく、発達領域別における変化も認められた。一般的に、発達の推移は複雑であり、予測方法についてはさらなる検討の必要性が示唆されたが、いくつかの手掛かりが得られた。第一に、「移動運動」および「手の運動」の変化は年齢間の相関値が比較的高く、発達予測の指標として利用可能であることがわかった。第二に、1歳時から4歳時までの発達分析の結果、発達予測は複雑な要因が含まれているので、かなり困難であるが、2歳児を基準とした発達予測は、分散も小さくなり、予測性が高まることがわかった。第三に、学習障害や行動障害などを弁別する他の指標と合わせ検討すれば、その有用性がさらに高まることが示唆された。発達の初期において何らかの要因により順調な精神および神経の発達が阻害されたり、障害が発生する可能性を高く有する乳幼児のことをハイリスク児と呼ぶ。出生体重は今日使用されている重要な指標の一つであるが、これを基準として分類した場合、1,500グラム以下を極低出生体重児、1,000グラム未満を超低出生体重児として区別される。ハイリスク児の発達の法則性を明らかにするためには、彼等の発達の推移を明確にすることが大きな手掛かりになる。それにより発達予測に関係する指標を検出し、比較的早期の段階で援助が必要か否か、援助の内容や時期についての判断ができるような心理診断システムを構築することが可能になると考えられる。本年度は諸種の心理検査の結果を収集することに重点をおいたが、すでに収集された諸種のデータを分析中であるが、1歳時、1歳半時、2歳時、3歳時、4歳時に縦断的に行った超低出生体重児における遠城寺式乳幼児発達検査の結果によれば、3歳までの発達指数の増加が著しく、3歳から4歳にかけて安定していることがわかった。移動運動、手の運動、基本的習慣、対人関係、発語、言語理解などの下位項目においてもほぼ同様の傾向が示されていることから、3歳の時期には、ある程度の発達状況と発達の可能性を把握することが可能であることが示唆されると同時に、発達に歪みがある子どもについては詳細な発達分析と援助内容に関する検討の必要性が確認された。なお、注意散漫や落ち着きのなさ、動きの少さなどの行動特徴が知能や発達に影響を及ぼす可能性もあり、この点も他の心理検査の結果と併せて検討を進めているところである。本研究では、ハイリスタ児の中でとくに発達の道筋が明らかにされていない超低出生体重児を対象児として、発達援助に役立てるために低年齢の段階からの発達予測の可能性について検討した。その手掛かりを得るために超低出生体重児を対象として遠城寺式乳幼児発達検査を1歳4歳までの4年間にわたって実施し、発達年齢(EA)および発達指数(EQ)の両指標をもとに発達的変化を分析した。

その結果、「移動運動」、「手の運動」、「基本的習慣」、「対人関係」、「発語」、「言語理解」の各領域において、いずれの領域においても加齢に従って上昇が認められ、4歳までに健常児の水準にほぼ到達した。EAやEQを指標として、加齢に伴う発達水準の変化や1歳時および2歳時を基準とした変化を検討した結果、発達プロフィールの特徴的変化や個人差だけでなく、領域別における変化も認められた。一般的に、発達の推移が複雑であり、予測方法についてはさらなる検討の必要性が示唆されたが、いくつかの手掛かりが得られた。第一に、「移動運動」および「手の運動」の変化は年齢間の相関値が比較的高く、発達予測の指標として利用可能であること、また1歳児から4歳児の発達像を予測することはかなりの困難であるが、2歳児での予測は、分散も小さくなり、予測性が高くなることがわかった。他の指標についても、他の心理検査や認知・行動特徴の関係を分析することによってその有用性が高めることが示唆された。
志賀毒素１と２を交差性に中和するＨＵＳヒト型モノクローナル抗体治療薬の開発

腸管出血性大腸菌(EHEC)はHUSの原因となるStx1と2を産生する。しかしワクチン開発は成功していない。我々は両毒素に対する経鼻投与ワクチン及び抗体治療薬の作成を試みてきた。その結果ワクチン候補としてStx2B-Hisの作成と抗Stx2B-His抗体が両毒素を交差性に中和すること(Vaccine, 26:469,2008、2092.2008)、経口投与治療薬の可能性のあるStx1と2を交差性中和するニワトリIgYの作成(PLos One, e26526,2011)に成功した。そこで今回、両毒素を交差性に中和するヒトまたはマウスMAbを分離し、HUS治療薬としての臨床応用を目的とした。腸管出血性大腸菌(EHEC)はHUS等の重篤症状を引き起こす原因毒素、志賀毒素(Stx)を産生する。Stxは2種類の亜型(Stx1と2)があり、Stx2がHUSの主な原因である。そこで抗原性が低いが、副作用の少ないStx2のBサブユニット(Stx2B)を用いワクチン開発が行われてきた。しかし、いまだに成功していない。我々はStx1と2を交差性に中和する抗体を誘導する経鼻投与Stx2誘導体ワクチン、及び治療薬として両毒素を共に中和するニワトリIgYやマウスまたはヒトMAbの開発実験を行ってきた。その結果、粘膜アジュバントとして毒素原性大腸菌のLTの変異毒素(mLT)を用い、マウスの経鼻免疫でStx2の中和抗体を誘導するHis-tagged Stx2B(Stx2B-His)の作成に成功した。また、抗Stx2B-His抗体は両毒素を交差性に中和することを明らかにした(Vaccine, 24:3591.2006、26.469. 2008、26:2092.2008)。さらにニワトリ抗Stx2B-His IgYが両毒素を交差性に中和することも明らかにし、将来HUS予防の経口投与治療薬として利用できることを明らかにした(PLos One、e26526、2011)。従って、本企画は第1にmLTとStx2B-Hisの同時経鼻投与により誘導できた抗Stx2B-His抗体が、Stx1と2を交差性に中和することを解明した点、非常に独創性が高い。さらにPhage display法により毒素中和能に優れたヒト型抗Stx1モノクローナル抗体(MAb)の分離にも成功している(Vaccine,29:5340,2011)。腸管出血性大腸菌(EHEC)はHUSの原因となる2種類の毒素(Stx1と2)を産生する。その結果Stx2中和抗体を誘導するStx2B-Hisの作成と抗Stx2B-His抗体がStx1と2を交差性に中和すること(Vaccine,24:3591,2006、26:469,2008、26:2092.2008)、経口投与治療薬の可能性のあるStx1と2を交差性中和するニワトリIgYの作成(PLos One,刷中,2011)、静注用抗Stx1ヒトモノクローナル抗体(MAb)(Vaccin,29:5340,2011)の分離に成功した。そこで今回、Stx1と2を交差性に中和するヒトまたはマウスStxB MAbを分離し、HUS治療薬としての臨床応用を目的とした。その結果Stx2中和抗体を誘導するStx2B-Hisの作成と抗Stx2B-His抗体がStx1と2を交差性に中和すること(Vaccine,24:3591,2006、26:469,2008、26:2092.2008)、経口治療薬の可能性のあるStx1,2の中和ニワトリIgY作成(PLos One,e26526,2011、MI印刷中2015)、抗Stx1ヒトモノクローナル抗体(MAb)作成(Vaccin,29:5340,2011)、大量Stx2精製(PLos One,e83557, 2013)に成功した。

そこで今回これらの経験の基、HUSの主な原因毒素Stx2を中和するヒトMAbを作製し、HUS治療薬としての臨床応用を目的とした。そこで以下の3項目の研究計画を遂行した。1Stx1,2の交差性中和抗体を産生するStxB誘導体の作成と交差中和抗体に成功した。2自己免疫疾患マウスを用いStx1,2を交差性に中和する抗Stx2B MAbの分離を試みた。その結果、Stx1または2のどちらか一方を強力に中和するが、他方の毒素に関しては中和能力が弱い2種のMAbの分離に成功した。これらのMAbは毒素の受容体結合部位、特にStx2の受容体へのStx2の結合を阻害した。3抗体工学によりマウスMAbをマウス/ヒトキメラ及びヒト型抗体へ変換は、現在も本学総合医科学研究所の黒澤教授との共同実験で行っているが、結果はまだ出ていない。細菌学Stx1と2を交差性に中和するヒトまたはマウスStxB MAbを分離し、HUS治療薬としての臨床応用を目的とし、マウスのMAbの分離を試みてきた。その結果、両毒素の交差性に中和できる抗体を数種類分離には成功している。しかしながら、これらの抗体は主にIgMタイプであった。しかも、両毒素の対する中和能力が弱い。一方、両毒を同時に中和するIgGタイプのMAbの分離は非常に困難であった。Stx1、Stx2のどちらか一方を強力に中和できる抗Stx2B抗体の分離には成功しているが。今後IgGタイプの両毒素を同時に中和できる抗体の分離を試みる。本研究は、腸管出血性大腸菌(EHEC)への治療薬の開発を行い、HUSによる小児死亡を減少させることを目的としている。そこで以下の4項目の研究計画を遂行する。1Stx1,2の交差性中和抗体を産生するStxB誘導体の作成と交差中和抗体の解析。これは既に終了している。2自己免疫疾患マウスを用いStx1,2を交差性に中和する抗Stx2B MAbの分離行う。現在2個のクローンの分離に成功して性状の解析を実施している。3抗体工学によりマウスMAbをマウス/ヒトキメラ及びヒト型抗体へ変換は現在計画中にある。4Phage display法によりStx1,2を交差性に中和するヒト抗Stx2B MAbの分離を試みている。尚、3と4は本学総合医科学研究所の黒澤教授との共同実験で行う。より多様なMAbの分離に成功したと報告されている免疫不全マウスBxSB/MpJ Jms SRcを用いて、MAbの作成を試みる。免疫不全マウスを毒素原性大腸菌の産生する下痢毒(LT)の変異体とStx2B-Hisを混合して、2週間ごとに3回経鼻免疫を行う。最後の投与後2週間してStx2B-Hisでブースターをかけ、3日後に常法に従い、細胞融合を行い、MAbの分離を試みる。本研究は、EHECへの治療薬の開発を行い、HUSによる小児死亡を減少させることを目的としている。既に、Stx1,2の交差性中和抗体を産生するStxB誘導体の作成と交差中和抗体の作成に成功している。さらに、自己免疫疾患マウスを用いStx1,2を交差性に中和する抗Stx2B MAbの分離行い、現在2個のクローンの分離に成功して性状の解析を実施している。そこで、今後以下の2項目に関して実施計画を立てている。1抗体工学によりマウスMAbをマウス/ヒトキメラ及びヒト型抗体へ変換を実施したい。2Phage display法によりStx1,2を交差性に中和するヒト抗Stx2B MAbの分離を試みる予定である。次年度の研究に本年度よりも経費が必要であり、研究の継続のため次年度に使用額が生じた。次年度には全額を消費予定している。
炎症性腸疾患におけるインターロイキン１１を介した粘膜修復機構の解明

これまで、大腸癌の増悪に関わると考えられていたInterleukin (IL)-11の腸管恒常性維持における役割は不明な点が多い。本研究より我々は、IL-11は腸炎の誘導に伴い傷害を受けた箇所より非骨髄由来の細胞より産生されること。そして、産生されたIL-11は、非骨髄由来の細胞、恐らく粘膜上皮に作用することで、腸炎の減弱、恒常性維持に関与していることを現在までに見出している。消化管の恒常性は、外来性因子に対する宿主の様々な組織の応答が、適切に制御されることによって維持されている。この中で我々は最近、消化器がんの悪性化に関与すると考えられているサイトカインIL-11が、実は腸管炎症に伴って産生され、炎症性腸疾患の病態減弱に関わる因子であることを示す予備的知見を得た。本研究は、腸管の恒常性維持におけるIL-11の具体的な役割と、その産生制御機構を明らかにすることを目的とする。腸炎に伴い産生されるIL-11の具体的な役割を明らかにする目的で、潰瘍性大腸炎モデルの一つであるデキストラン硫酸誘発性腸炎モデルを、IL-11の機能欠損マウスであるIL-11受容体欠損マウスを用いて作出し解析を行った。その結果、IL-11受容体欠損マウスにおいては対照群と比較して、生存率の低下、病変部位における炎症系サイトカインの産生量や免疫細胞浸潤の亢進がみられた。また、IL-11の標的細胞同定を目的に骨髄キメラマウスを作製し解析を行った結果、IL-11は非骨髄由来の細胞に作用することで、病態の増悪に抵抗性を示していることが明らかとなった。加えて、粘膜炎症時のIL-11産生制御機構を明らかにするために、我々が新たに樹立したIL-11レポーターマウスを使用して、生体でのIL-11産生細胞の同定を試みた。その結果、腸炎誘導に伴いIL-11産生細胞は、粘膜上皮が脱落した炎症部位に特異的に集積しており、産生細胞における各細胞特異的分化マーカー分子を解析したところ、産生細胞は非骨髄由来の細胞であることを明らかとした。すなわち我々は新たに、IL-11は腸炎の誘導に伴い非骨髄由来の細胞より産生されること。そして、産生されたIL-11は、非骨髄由来の細胞に作用することで、腸炎の減弱、恒常性維持に関与していることを現在までに見出している。消化管の恒常性機構の破綻は慢性炎症性疾患やがんの発生と深い関わりがあることが示されているが、その詳細なメカニズムに関して未だ不明な点が多い。本年度では研究計画に従い、以下の三項目の解析を行った。(1:腸炎時におけるIL-11の役割)腸炎発症時におけるマウス病理像をIL-11受容体欠損マウスと対照群である野生型マウスとで比較した。その結果、粘膜上皮の傷害が見られ始める早期に、IL-11受容体欠損マウスでは粘膜上皮細胞の細胞死が亢進しており、病理像の増悪も認められた。すなわち、IL-11は粘膜バリア構造維持の促進に寄与していることを示す結果が得られた。(2:粘膜炎症時におけるIL-11産生機構)IL-11の産生機構を明らかにする目的で、産生誘導因子の探索を行った。具体的に、腸炎発症に伴い発現が亢進する分子の遺伝子欠損マウスおよび中和抗体を用いて探索を行った。その結果、がんの増悪に関与することが報告されているサイトカインに対する中和抗体を用いた際に、IL-11の発現が有意に減少することが判明した。また抗生物質を飲水させ無菌状態にした後で腸炎を誘導した場合にも、IL-11の産生が認められなくなることを見出した。現在、具体的なこのサイトカインの産生細胞を特定するとともに、どのような機構を介して腸内細菌がこれらの機構に関わりを持つのかを解析している。(3: IL-11産生細胞の同定)IL-11産生細胞の特徴を明らかにする目的で、腸炎時のIL-11産生細胞をセルソーターを用いて分取し、DNAマイクロアレイ解析を行ったところ、ゲノムワイドに特徴的に発現している遺伝子を同定した。その結果IL-11産生細胞は、組織修復や管腔形成だけでなく、腫瘍形成に関わる遺伝子を高く発現している細胞であることが明らかとなった。現在、これらの分子が蛋白質レベルとどの程度相関しているか解析を行っている。研究開始からの課題であった(1)腸管炎症時におけるIL-11の役割の解明、(2)粘膜炎症時のIL-11産生機構の解明(3)IL-11産生細胞の特徴という項目に関して研究を進めた結果、今後の研究の進展において基盤となる研究成果を得ることができていると考えられる。また、IL-11の産生機構に関しては、当初予期していなかったがん発生機構ともつながる知見を得られ始めていることから、計画以上に研究を発展させることができると考えている。消化管恒常性の破綻は、慢性炎症性疾患やがんの発生と深い関わりがあることが示されているが、その詳細なメカニズムに関しては未だ不明な点が多い。本年度では、研究計画に沿い以下の三項目に着目して解析を行った。(1 :腸炎時におけるIL-11の役割)前年度までに我々は、IL-11は粘膜バリア構造維持の促進に作用していることを見出した。

そこで、IL-11下流で活性化される転写因子STAT3の活性化を指標にIL-11の標的細胞の探索を行ったところ、IL-11受容体欠損マウスでは上皮細胞においてSTAT3のリン酸化が減少していることが示された。またこの際に上皮細胞の細胞死が亢進していたことから、IL-11は上皮細胞に作用することで、粘膜保護を増大させていることが示唆された。(2:腸炎時におけるIL-11の産生機構)現在までに抗生物質を用いた解析から腸内細菌の存在がIL-11産生には、必須であることを見出している。そこで、自然免疫シグナルの活性化に必須な分子の遺伝子欠損マウスを用いて解析を行った、その結果、この分子非依存的に大腸炎に伴ってIL-11が産生されていることが示された。すなわち、腸内細菌が直接自然免疫受容体を介してIL-11の産生を促進しているのではなく、腸内細菌の粘膜固有層への侵入により活性化される他の機構を介して促進されていることが示された。(3:腸炎時におけるIL-11の産生細胞の同定)レポーターマウスの解析から明らかになった結果が、炎症誘発性大腸癌時のIL-11産生細胞と一致するかを調べるために、IL-11レポーターマウスに炎症誘発性大腸癌マウスモデルを作出し解析した。その結果、炎症誘発性大腸癌マウスモデルにおいても同様の細胞がIL-11を産生していることを見出した。現在、ヒトにおいても同様に一致するかを調べるために、ヒト検体を用いた解析の準備を進めている。これまで、大腸癌の増悪に関わると考えられていたInterleukin (IL)-11の腸管恒常性維持における役割は不明な点が多い。本研究より我々は、IL-11は腸炎の誘導に伴い傷害を受けた箇所より非骨髄由来の細胞より産生されること。そして、産生されたIL-11は、非骨髄由来の細胞、恐らく粘膜上皮に作用することで、腸炎の減弱、恒常性維持に関与していることを現在までに見出している。研究開始当初の当該年度の課題であった、1)腸管炎症時におけるIL-11の役割の解明、2)粘膜炎症時のIL-11産生細胞の同定とIL-11産生機構の解明という項目に関して研究をすすめた結果、我々は今後の研究の進展において基盤となる研究結果を現在までに得ることができていると考えられる。また、IL-11産生細胞に関して当初予期していなかった知見も得られはじめていることから、今後さらに研究を発展させることができると考えている。現在までに腸炎の誘導に伴うIL-11の産生は、腸炎時に発現亢進が認められるサイトカイン依存性に誘導されることを見出している。しかしながら、このサイトカインがどのような細胞から産生されているのか、また腸内細菌との関連性があるのかがが不明であるため、今後これらの点を明らかにしていく。また、IL-11の産生細胞に関しても、詳細な解析を進めることで、その細胞の特徴をより明確にする。そして、IL-11の具体的な標的細胞ならびに、そのメカニズムに関しても組織学的解析を起点に分子生物学的、細胞生物学的手法をも用いて明らかにしていきたい。また、現在までに得られている知見の多くが大腸がんの発生と増悪に関与していることが報告されていることから、これらの不明点を明らかにしていくことは、大腸がんの進展メカニズムの理解にもつながると考えている。病態生化学現在までに、腸炎の誘導に伴い産生されたIL-11は、非骨髄由来の細胞に作用することで、腸炎の減弱、恒常性維持に関与していることを現在までに見出している。
核膜孔複合体における核と細胞質間の輸送選別機構:形態学からのアプローチ

1)ラット膵外分泌細胞の核膜の8種類全ての面(外核膜真表面の細胞質面と核周囲腔面、外核膜半膜のP面とE面、内核膜真表面の核質面と核周囲腔面、内核膜半膜のP面とE面)を、固定液の種類と濃度、および凍結割断時の不凍液の濃度を調整することで意図的に露出し、オスミウム蒸着を行い、超高分解能走査型電子顕微鏡画像を得た。2)核膜孔複合体の構成蛋白は0.1%オスミウム水溶液で長時間の浸軟処理を行うと核膜から除去されるため、核膜だけに縁取られた核膜孔(直径約4565nm)を細胞質側と、核質側の両方から観察・撮影することが可能となった。内核膜真表面の核質面では染色体を除去すると、核膜孔の縁がやや土手状に盛り上がり、外周直径約90nmのリングを形成していた。3)外核膜真表面の細胞質側の観察結果から、核膜孔複合体の細胞質部分を構成する8個の粒子は、球形ではなく、ラクビーボール状(長径32nm、短径26nm)を呈し、オスミウム浸軟処理により比較的容易に溶出する。粒子が溶出すると、平坦な外核膜表面が露出することから、粒子は外核膜上に接しているだけで、核膜との密接な結合はないことが明らかとなった。4)核膜孔複合体の中心部を塞いでいる構造(積荷cargoまたは輸送担体と積荷transport factors and cargoと考えられている。)は直径約2530nmを示した。その周囲を取り囲む核膜孔複合体の構成蛋白は16個の粒子がリング状(内径直径約1035nm、外径直径4565nm)に配列していた。核膜孔の外側で膜を隔てて核周囲腔内に位置するリング状構造(内径直径4565nm、外径直径90100nm)も16個の粒子から構成されていた。核周囲腔に位置する核膜孔複合体の構成蛋白と核膜孔内部に位置する構成蛋白は2個ずつのダイマーからなる8個の粒子が膜を介して強固な結合を保ちながらリングを形成していると思われる。平成14年度は核質と細胞質間の輸送選別機構解明の基盤となる核膜孔複合体の三次元微細構造を超高分解能走査型電子顕微鏡により捉えることを目標に研究を遂行した。1、現在までに、固定液の濃度と凍結割断時の不凍液の濃度を調整することで、ラットの膵臓外分泌細胞における外核膜真表面の細胞質面と核周囲腔面、外核膜半膜のP面とE面、内核膜真表面の核質面と核周囲腔面、内核膜半膜のP面とE面、全てを露出することが出来るようになった。2、これにより、核膜と核膜孔複合体の詳細な位置関係を知ることが可能となった。核膜孔複合体の内で細胞質側に位置する比較的大きな8個の粒子は、0.1%オスミウムの浸軟処理により容易に溶出すること、および、溶出した後の外核膜細胞側表面には粒子の収まっていた穴などの構造は観察されず平坦であることから、8個の粒子は核膜上に接しているだけで、核膜との密接な結合はないことが判明した。

3、また、従来、透過電子顕微鏡による超薄切片像においてDiaphragmaとして記載されてきた核膜孔の中心部領域では、核膜孔内部に位置する構造蛋白が膜を貫いて核周囲腔に位置する構造蛋白と連結し、外径直径90nm、内径直径約1020nmのリング状構造を形成していること、内径の大きさは核から細胞質に向かうに従って狭くなっており、核膜孔複合体のなかで核膜孔の最も狭いゲートGateを形成していることが明らかとなった。4、このリング状構造のほとんどは外核膜の核周囲腔面に観察され、内核膜の核周囲腔面では希にしか観察されないことから、リング状構造蛋白は外核膜よりも内核膜表面により強い結合があると思われる。核周囲腔に位置する構造蛋白と核膜孔内部に位置する構造蛋白は、互いに分離することなく常に一緒に結合して同じ大きさのリング状構造を示すことから、膜を介する両者の結合はたいへん強固であることが明らかとなった。平成15年度は高分解能走査型電子顕微鏡により得られた二次元画像を三次元ステレオ画像にして核膜孔複合体の三次元構造の詳細を検討することを目標に研究を遂行した。1)核膜の8種類全ての面(外核膜真表面の1.細胞質面と2.核周囲腔面、外核膜半膜の3.P面と4.E面、内核膜真表面の5.核質面と6.核周囲腔面、内核膜半膜の7.P面と8.E面)を、固定液の種類と濃度、および凍結割断時の不凍液の濃度を調整することで、偶然ではなく意図的に露出することが可能となった。2)この研究では単離・抽出した核膜孔複合体画像とは異なり、核膜との詳細な位置関係を知ることが可能である。外核膜真表面の細胞質側で核膜孔をリング状に取り巻く8個の粒子は、球形ではなく、ラクビーボール状(長径32nm、短径26nm)を呈し、オスミウム浸軟処理により比較的容易に溶出すること、溶出した場合には外核膜表面は平坦であるごとから、粒子は外核膜上に接しているだけで、核膜との密接な結合はないことが明らかとなった。3)核膜孔内部に位置する構造蛋白は膜を貫いて核周囲腔に位置する構造蛋白と連結し、外径直径90nm、内径直径約1020nmのリング状構造を形成していること、内径の大きさは核から細胞質に向かうに従って狭くなっており、核膜孔の最も狭いゲートを形成していることが明らかとなった。この構造は内核膜よりも外核膜と強い結合があることが明らかとなった。核周囲腔に位置する構造蛋白と核膜孔内部に位置する構造蛋白は、常に一緒に結合して同じ大きさのリング状構造を示すことから、膜を介する両者の結合は強固であることが明らかとなった。4)内核膜真表面の核質面は浸軟処理により染色体を除去すると、核膜は膜膜孔(直径45nm)の外周に直径約90nmの土手状の盛り上がりがあることが明らかとなった。平成16年度は核膜孔複合体の構造のうちで、透過型電子顕微鏡の超薄切片像において、核膜孔を塞いでいるように見えるdiaphragmと呼ばれてきた構造に着目して、その詳細を明らかにすることを目標に高分解能走査型電子顕微鏡画像の解析を行った。1)高分解能走査型電子顕微鏡検のために、オスミウムコーター蒸着装置(HPC-30型)を用いて膜圧2nmのオスミウム蒸着を行い、直接撮影倍率x250,000の明瞭な超高分解能画像撮影に成功した(第16回国際解剖学会京都2004)2)核膜孔複合体を構成している蛋白質は0.1%の希薄なオスミウム水溶液で長時間浸軟処理を行うと核膜から除去されるため、核膜だけに縁取られた核膜孔を細胞質側と、核質側の両方から観察・撮影することに成功し、その寸法(直径約4565nm)を測定した。3)割断時に核周囲腔に沿って核膜が露出した試料において、積荷cargoまたは輸送担体と、積荷transport factors and cargoと考えられている構造(別名central plugまたはtransporter)は、直径約2530nmであった。その周囲を取り囲む核膜孔複合体の構成蛋白は16個の粒子がリング状(内径直径約1035nm、外径直径4565nm)に配列していた。核膜孔の外側で膜を隔てて核周囲腔内に位置するリング状構造(内径直径4565nm、外径直径90100nm)も16個の粒子から構成されていることが判明した。
新しい不均一酸化物での脱ハロゲン処理　～溶解促進機構の解明とリサイクルへの応用～

廃電池や廃プラスチックを再資源化する際、フッ素や塩素等のハロゲン元素が放出されると、設備腐食や有害物質生成の問題を引き起こす可能性がある。本研究ではハロゲン元素無害化処理を目標に、固液共存の不均一酸化物中へ塩素が溶解する機構を解明した。酸化物が均一液相の場合、CaO濃度が高いほど塩素は溶解したが、これは文献値の傾向と一致していた。一方、包接化合物と呼ばれる特殊な構造を持つ化合物が生成されると、塩素の溶解が著しく促進されることを見出した。溶体モデルを適用して化学熱力学的に解析したところ、包接化合物への塩素置換反応は極めて進行しやすいことが分かった。廃電池や廃プラスチックを再資源化する際、フッ素や塩素等のハロゲン元素が反応炉内に放出されると、設備腐食や有害物質生成の問題を引き起こす可能性がある。本研究は固体と液体が共存する不均一酸化物中へハロゲン元素が溶解する機構を解明するものであり、廃電池や廃プラスチックのリサイクル時に発生するハロゲン元素の無害化処理の確立に貢献できると考える。(1)不均一酸化物中への塩素溶解度の測定、(2)液相中への固体分散による塩素溶解促進効果の微視的機構の解明、(3)包接化合物の熱化学的安定性の解明と実験室規模での排ガスの脱塩素処理、を行う。平成24, 25年度は、ガス平衡法を用いてCaO-Al2O3系、CaO-SiO2系、包接化合物12CaO・7Al2O3への塩素溶解量を測定した。実験方法の概略を以下に示す。Ar-H2ガスを塩酸浴に通じてAr-H2-H2O-HClとした混合ガスを炉内に流入すると、Cl2分圧とO2分圧は一定となる。酸化物を炉内に挿入し、1300°C1500°Cでガスから塩素を吸収させた。塩素の平衡濃度をJISに基づく滴定法により求めた。研究成果を以下に示す。塩基性酸化物である固体CaOには塩素がほとんど溶解しなかったが、CaO-Al2O3系液体酸化物中に固体CaOを分散させると塩素の溶解が大幅に促進された。固体CaOとの反応で生成した塩化物CaCl2が固体を溶解して液相量を増やし、塩素の溶解を促したためと考えられる。液相からの包接化合物11CaO・7Al2O3・CaCl2生成による塩素溶解促進効果も見出した。一方、CaO-SiO2系では固体分散による塩素溶解の促進は観察されなかった。また、包接化合物12CaO・7Al2O3への塩素置換反応は固体状態でも速やかに進行し、その反応は通常の排ガス処理に用いられる石灰よりも進行しやすい可能性があることが分かった。電解質としてリチウムイオン電池にはフッ化物塩、マンガン電池には塩化物塩が用いられている。また廃プラスチック中には塩素含有物が6%程度含まれている。(1)不均一酸化物中への塩素溶解度の測定、(2)液相中への固体分散による塩素溶解促進効果の微視的機構の解明、(3)酸化物を用いたハロゲン無害化処理による廃電池の実験室規模でのリサイクル、を行う。平成24年度は、ガス平衡法を用いてCaO-Al2O3系への塩素の溶解量を測定した。Ar-H2ガスを塩酸浴に通じてAr-H2-H2O-HClとした混合ガスを電気炉内に流入すると、Cl2分圧、O2分圧は一定となる。酸化物を炉内に挿入し、1500°Cでガスから塩素を吸収させた。塩基性酸化物である固体CaOには塩素がほとんど溶解しなかったが、液体酸化物中に固体CaOを分散させると塩素の溶解が大幅に促進された。これは固体CaOと反応して生成した塩化物CaCl2が固体を溶解して液相量を増やし、さらなる塩素の溶解を促したためと考えられる。さらに、包接化合物11CaO・7Al2O3・CaCl2生成による塩素溶解促進効果を見出した。酸化物中への塩素溶解量が最大となるのは、CaO飽和の液相組成、または包接化合物の組成であると言える。またCaO-Al2O3-CaCl2系状態図を作成した。