hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトORCのグアニン四重鎖結合活性の複製開始点形成における役割の解明

ヒト複製開始因子ORCはグアニン四重鎖形成配列(G4モチーフ)をもつ1本鎖DNAやRNAに優先的に結合する活性を有する。その活性の生物学的意義を解明するため、同活性を有するORC1サブユニットの解析を行った。その結果、G4モチーフ1本鎖DNA結合活性を低下させたORC1は細胞核内の局在が異常になること、同活性をもつORC1のN末端側領域にDNA超らせん誘導活性をもつ領域も存在することが明らかになった。この結果は、ORCのG4モチーフ1本鎖DNA結合活性は、ORCの適正なクロマチン結合に関わり、さらに複製開始点のDNA構造変化に関わる可能性を示す。どのような仕組みによって高等真核生物の複製開始点が染色体DNA上の特定の領域に規定されるのかを明らかにすることを目標に、複製開始点に結合するタンパク質であるORCの解析を進めた。ヒトORCのサブユニットの1つであるORC1はグアニン四重鎖構造を取り得る配列(G4モチーフ)をもつRNAや一本鎖DNAに優先的に結合する活性を有する。これまでにORC1のアミノ末端側の領域が同活性を担うことが明らかになっており、今年度はこの領域と一本鎖DNAとの相互作用の詳細な解析を進めた。連携研究者である片平正人博士(京都大学)による協力を得て、NMRによる解析を進めた結果、G4構造にORC1ドメインが結合することが確認できた。さらに、ORC1ドメインとの相互作用に関わるG4構造中の残基を推定することができた。この結果は、ORCのG4構造に結合する生物学的な意義を理解する上で重要な知見である。NMR解析と合わせて、ORC1のG4モチーフ結合ドメインの結晶構造決定に向けたタンパク質調製を進めた。しかし、大腸菌における発現量の低さ、短鎖のポリペプチドの混入およびタンパク質の不溶化という問題に直面し、期待通りの成果は得られていない。別項で記述するようにこの解析は改善を加えつつ来年度も継続する。当初の実施計画にあったように、変異ORC1のヒト細胞への導入に伴うDNA複製の影響の解析も行った。まず初めにORC1のG4モチーフ結合ドメインの過剰発現に伴う影響をヌクレオチドアナログのDNAへの取り込み量の解析から調べた結果、発現によって細胞のDNA複製活性が低下する傾向が認められた。この結果は、同結合ドメインがDNA複製の何れかのステップを阻害している可能性を示唆する。ORC1とG4との相互作用に関する構造生物学的な解析において、NMRを利用した解析は概ね順調に進んでいる。しかし、結晶構造解析の方は結晶作製に必要はタンパク質量を得るには至っておらず、進行は遅れている。細胞を用いた解析もORC1ノックダウンの条件も確立し概ね順調に進んでいる。昨年度に引き続き、どのような仕組みによって高等真核生物の複製開始点が染色体DNA上の特定の領域に規定されるのかを明らかにすることを目標に、複製開始点に結合するタンパク質であるORCの解析を進めた。ORC1サブユニットのN末端側半分の領域にG-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)に優先的に結合する活性を有するドメインがあるが、その結晶構造を決定すべく、同領域の精製を昨年より進めてきた。しかし、不溶化の問題が解決できず、思うようには進展していない。一方、ORC1のN末端側半分の領域をヒト培養細胞で発現させると、S期細胞の割合が有意に減少することを見出した。さらに、クロマチン結合活性を有するBAHドメインやHP1結合ドメインを欠いたN末端側領域を細胞で発現させ、その局在を調べた結果、既知のクロマチン結合ドメインを欠いたにも関わらず、依然としてクロマチン局在が認められた。この結果は、G-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)結合活性が、クロマチン結合に関与する可能性を示唆する。また、我々はこれまでに、ORC1のN末端側領域のG-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)結合活性を低下させるアミノ酸置換変異の同定に成功している。この変異を導入したORC1を細胞で発現させ、その局在を調べた結果、正常型ORC1の局在とは全く異なる局在を示した。その局在は、N末端側領域を欠損させたORC1の局在と似たものであった。以上の結果は、ORC1のN末端側半分の領域がもつG-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)結合活性が、ORC1の本来のクロマチンへの結合に関与することを強く示唆する。G-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)結合活性を低下させるアミノ酸置換変異を導入したドメインを有するORC1の細胞内の局在が、正常型に比べて大きく変化したことを見出したことは大きな成果であり、この点において進展したと判断している。これまでに引き続き、どのような仕組みによって高等真核生物の複製開始点が染色体DNA上の特定の領域に規定されるのかを明らかにすることを目標に、複製開始点に結合するタンパク質であるORCの解析を進めた。特にG-rich RNA/1本鎖DNA(ssDNA)結合活性を有するORC1サブユニットに着目して研究を進めた。ヒトや分裂酵母のORCにDNA超らせん誘導活性のあることがすでに報告されている。そして、我々の解析からヒトORC1がその活性を有することが明らかとなっている(未発表データ)。そこで、ORC1のどの領域がその活性を担うかを調べたところ、AAA+ドメインは含まないN末端側領域がDNA超らせん誘導活性を持つことが判明した。

この結果は、ORC1のN末端側領域が直接DNAに結合し、さらにDNAに対し何らかの作用を及ぼしている可能性を強く示唆する。また、G-rich RNA/ssDNA結合活性を有するN末端側領域を除いたORC1(477-861)を含む6量体ORCをバキュロウイルス昆虫細胞発現系によって調製し、この変異ORC6量体においてG-rich RNA/ssDNA結合活性が消失したかどうかをゲルシフト法によって調べた。その結果、予想外にも、ORC1のN末端側領域を欠除したにも関わらず、変異ORC6量体にはG-rich RNA/ssDNA結合活性が残存することが判明した。しかし、変異ORC6量体のもつ活性は、野生型ORCよりは明らかに低く、さらにゲルシフト法での結果において、野性型には見られないバンドシフトが検出された。以上の結果は、ORC1のN末端側領域以外にも、G-rich RNA/ssDNA結合活性を担うドメインが存在することを示す。この新規ドメインを同定するため、今後も継続的な解析が必要であると考えている。ヒト複製開始因子ORCはグアニン四重鎖形成配列(G4モチーフ)をもつ1本鎖DNAやRNAに優先的に結合する活性を有する。その活性の生物学的意義を解明するため、同活性を有するORC1サブユニットの解析を行った。その結果、G4モチーフ1本鎖DNA結合活性を低下させたORC1は細胞核内の局在が異常になること、同活性をもつORC1のN末端側領域にDNA超らせん誘導活性をもつ領域も存在することが明らかになった。この結果は、ORCのG4モチーフ1本鎖DNA結合活性は、ORCの適正なクロマチン結合に関わり、さらに複製開始点のDNA構造変化に関わる可能性を示す。当初の研究実施計画の通りに推進していく予定である。今まで通り、精製した変異ORCやORC1ドメインの活性を生化学的に調べていくとともに、変異ORCやORC1ドメインを細胞で発現させ、in vivoでの解析を推進していく。DNA複製の分子生物学9月に参加予定であった国際会議の開催時期が他の業務と重なったために参加できなくなり、次年度以降の国際会議で発表することとしたため。また、次年度以降、当初の計画よりもスケールを大きくした細胞培養を行って細胞を使った解析を進める必要がでてくる可能性が考えられたため、物品費の一部を来年度に支出することとした。DNA組換え実験および大腸菌での過剰発現実験などで使用する冷却装置付き振とう培養器が老朽化し、交換が必要になった。そのため、次年度の予算と合わせて購入することを、急遽計画したため。国際学会への成果発表の旅費と使用する予定である。細胞培養で使用する血清の購入で物品費を支出する予定である。上記の培養器の購入する予定である。
副甲状腺ホルモンによる接合尿細管Ca輸送の調節機序

接合尿細管(CNT)は副甲状腺ホルモン(PTH)によるCa排泄調節部位だが、単離尿細管潅流法で測定したCNTの^<45>Ca輸送は、還流速度が速い実験では遅い実験より数倍大きく、原尿の流れや管腔内圧がCa^<2+>の再吸収速度に影響する可能性がある。この仮説を確かめるため、fura2を負荷してCNTの細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)を測定した。潅流圧を0.2KPaから1.2KPaに上げると([Ca^<2+>]_i)は42±11nM上昇し、圧依存性Ca^<2+>流入が確認された。10nM PTHは、この反応を101±30nMに増大させ、同様な促進効果は、0.1mM Chlorphenyl-thio-cAMP(CPT-cAMP)でもみられた。圧依存Ca^<2+>流入は管腔内Ca^<2+>を除くと消失したが、10μMnicardipineでは阻害されない。1.2KPaで定圧潅流したCNTに10nM PTHを投与すると([Ca^<2+>]_i)は31±7nM上昇したが、0.2KPaでは6±2nMに過ぎない。10μM Gd^<3+>は50nM PTHで上昇した[Ca^<2+>]_iを90±19%抑制したが、nifedipineやbenidineは100μMでも20-30%しか抑制しない。一方、CNTの管腔側膜を反転露出し、cell-attachedパッチクランプで、200mM CaCl_2を満たしたピペットから記録した単一チャネル電流(42±2pS)は、ピペット内に-4.9KPaの陰圧をかけると平均開チャネル数(NP_0)は、0.005±0.001から0.022±0.005に上がり、0.1mM CPT-cAMPは、さらにNP_0を0.085±0.014に増大させた。同様な単一チャネル電流(173±7pS)は、140mMNaClを満たしたピペットからも記録できた。CPT-cAMPは、陰圧負荷しないチャネルの活性は促進できなかった。また、管腔内投与した10μMGd^<3+>は、PTHで引き起こされる管腔内電位の初期の過分極に影響せず、Ca^<2+>流入で起こるamiloride感受性Na^+チャネルの抑制による後期の脱分極を抑制した。圧依存性Ca^<2+>流入と膜張力依存性陽イオンチャネルの性質は一致し、膜張力依存性陽イオンチャネルが接合尿細管管腔側膜のPTH依存性Ca^<2+>流入の主要経路であること、このCa^<2+>の再吸収が管腔内圧、または、原尿の流れに依存するとことが明らかになった。

また、管腔内投与した10μMGd^<3+>は、PTHで引き起こされる管腔内電位の初期の過分極に影響せず、Ca^<2+>流入で起こるamiloride感受性Na^+チャネルの抑制による後期の脱分極を抑制した。圧依存性Ca^<2+>流入と膜張力依存性陽イオンチャネルの性質は一致し、膜張力依存性陽イオンチャネルが接合尿細管管腔側膜のPTH依存性Ca^<2+>流入の主要経路であること、このCa^<2+>の再吸収が管腔内圧、または、原尿の流れに依存するとことが明らかになった。副甲状腺ホルモン(PTH)は接合尿細管管腔側膜のCa^<2+>再吸収を促進するが、PTHが調節する輸送媒体は不明だった。私はCa^<2+>再吸収がNa^+再吸収と関連することから、管腔側膜にPTHによって調節される非選択性陽イオンチャネルがあると予測し、ウサギ接合尿細管を反転して管腔側膜を露出し、パツチクランプを試みた。その結果をまとめると、1.反転した接合尿細管管腔側膜をcell attachedパッチクランプすると、パッチピペット内に140mMNaClを満たした場合も、200mM CaCl_2を満たした場合も、そのままではほとんどチャネル活性は認められなったが、ピペット内に4.9KPaの陰圧をかけるとどちらの場合も、510倍チャネル活性が有意に上がった。これにPTHの2次メッセンジャーであるcAMPの膜透過性誘導体、chlorphenylthio-cAMPを0.1mM投与すると、活性はさらに34倍有意に上昇し、平均開チャネル数は0.080.09になった。2.ピペットに140mMNaClを満たした場合、単一チャネル電流は内向きにも外向きにも流れ、静止電位より約70mVプラス側で逆転し、単一チャネルコンダクタンスは173pSであった。200mM CaCl_2を満たした場合、内向き電流しか観察されず、単一チャネルコンダクタンスは42pSであった。静止電位で陰圧をかけた場合のチャネルの閉反応は2次反応で、それぞれ時定数はtau_<C1>=0.15msec,tau_<C2>=0.68msecおよびtau_<C1>=0.15msec,tau_<C2>=0.58cmsecで、両実験条件のtau_<C1>,tau_<C2>の間で有意差はなかった。3.陰圧をかけずにCPT-cAMPを投与しても、チャネル活性の上昇は全くみられなかった。以上から、接合尿細管管腔側膜にはcAMPを介して調節され、Na^+,K^+,Ca^+透過性の膜張力依存性チャネルが存在することが分った。膜に張力がかからないとcAMPによる活性促進がないことから、生体内でどのように膜張力がかかるのかが今後の課題となった。初年度の研究で私は、ウサギ接合尿細管の管腔側膜に膜張力依存性の非選択性陽イオンチャネルが存在し、このチャネルは張力負荷時cAMPの膜透過性誘導体CPT-cAMPによって活性が増大し、張力をかけないと活性が上がらないことを報告した。cAMPはCa排泄を調節する副甲状腺ホルモン(PTH)の2次メッセンジャーであることから、このチャネルがCa排泄の調節の主役ではないかと考え、本年度は生理的条件下で働いているかどうかを検討した。1)接合尿細管を管腔側にのみCaを加えた条件で単離潅流してfura2によって細胞内Ca濃度([Ca]_i)を測定し、このときの[Ca]_iの変化を管腔側からのCa流入の指標とした。2)1)のように測定した[Ca]_iは管腔内圧を0.2KPaから生理的な管腔内圧に近い1.2KPaに上げると約40nM上昇し、PTH存在下で同様に管腔内圧を上げると[Ca]_iの上昇分は約100nMに増加した。管腔内圧依存性のCa流入の増加はCPT-cAMPでも促進された。3)管腔内圧が1.2KPaの場合PTHを投与すると、約30nMの[Ca]_i上昇が見られたが、0.2KPaでは[Ca]_iの明らかな上昇は見られなかった。
不燃性加工液掛け流しによる加工槽を不要にする高速・省エネくり抜き放電加工法の開発

計画書年度のH30年度は,申請時の研究計画通りに,加工液かけ流し速度の効果検証を行った.ただし,当初は工作物を斜めに配置して加工実験を行う予定だったが,加工液に対する重力の影響を排除するために,工作物を水平に配置して実験を行った.この実験のために,工具電極を水平に取り付け,加工液を電極間に噴射するノズルを工具電極に対して一定の位置関係で取り付け可能なホルダを設計・製作した.さらに,加工液の噴流速度を6段階に変更するために,ノズル出口面積を変更できるノズルを設計・製作した.加工液の噴流速度を1.12.2[m/s]の範囲で変更した結果,加工液の掛け流し速度が増すと,加工速度も上昇する結果が得られ,噴流速度が1.6[m/s]を超えると加工速度が収束する傾向がえられた.さらに,電極間への加工液の進入状況を把握するために,除去領域には到達しているが貫通はしていない細い止まり穴を工作物にあけて,工具電極が通過することにより,この穴を貫通させる瞬間に加工液を採取した.採取した加工液中の加工屑の量を重量で推定した結果,電極間に加工液が進入する側では加工屑が少なく,反対側の加工液が電極間から出る側では加工屑が多いことが分かった.また,噴流速度が増すと,加工屑の量が減少し,加工液の入口側と出口側での加工屑量の差も減少することがわかった.以上のことから,加工液の噴流速度を増すと,電極間の加工屑をより多く排除していることが明らかになった.当初から初年度に計画していた,加工液かけ流し速度の効果検証をほぼ想定通りに行うことができたため.初年度はほぼ想定通りの研究成果が得られたので,当初の計画通り,計画2年目は,まず高速加工を可能とするくり抜き加工経路の最適化に取り組む.また,初年度の個々の実験結果を比較すると,効果のばらつきも見られる.そのため,ばらつきの範囲を確定するための追加実験を行う予定である.計画書年度のH30年度は,申請時の研究計画通りに,加工液かけ流し速度の効果検証を行った.ただし,当初は工作物を斜めに配置して加工実験を行う予定だったが,加工液に対する重力の影響を排除するために,工作物を水平に配置して実験を行った.この実験のために,工具電極を水平に取り付け,加工液を電極間に噴射するノズルを工具電極に対して一定の位置関係で取り付け可能なホルダを設計・製作した.さらに,加工液の噴流速度を6段階に変更するために,ノズル出口面積を変更できるノズルを設計・製作した.加工液の噴流速度を1.12.2[m/s]の範囲で変更した結果,加工液の掛け流し速度が増すと,加工速度も上昇する結果が得られ,噴流速度が1.6[m/s]を超えると加工速度が収束する傾向がえられた.さらに,電極間への加工液の進入状況を把握するために,除去領域には到達しているが貫通はしていない細い止まり穴を工作物にあけて,工具電極が通過することにより,この穴を貫通させる瞬間に加工液を採取した.採取した加工液中の加工屑の量を重量で推定した結果,電極間に加工液が進入する側では加工屑が少なく,反対側の加工液が電極間から出る側では加工屑が多いことが分かった.また,噴流速度が増すと,加工屑の量が減少し,加工液の入口側と出口側での加工屑量の差も減少することがわかった.以上のことから,加工液の噴流速度を増すと,電極間の加工屑をより多く排除していることが明らかになった.当初から初年度に計画していた,加工液かけ流し速度の効果検証をほぼ想定通りに行うことができたため.初年度はほぼ想定通りの研究成果が得られたので,当初の計画通り,計画2年目は,まず高速加工を可能とするくり抜き加工経路の最適化に取り組む.また,初年度の個々の実験結果を比較すると,効果のばらつきも見られる.そのため,ばらつきの範囲を確定するための追加実験を行う予定である.加工時間をある程度短縮する目的で,当初の想定よりも小さな板状の工作物を加工することにしたため,素材費が想定よりも少なくて済み,またこれに伴い,加工液や各種フィルタの交換も想定より少なく済んだことが,次年度使用額が生じた主な理由である.計画2年目の研究では,くり抜き加工経路を検討するため,ブロック形状の工作物が必要になる.そのため,初年度より格段に工作物の必要量が増えることから,これに充当する予定である.また,当初計画では想定していなかった,工具電極の素材変更による加工速度向上にも取り組む予定のため,この実験にも充当する予定である.
癌化、アポトーシスにおけるカルシニューリン情報伝達系の解析

カルシニューリンはこれまでの我々の研究によりカルシウム依存性のアポトーシスを制御している可能性を報告した。さらにBcl-2との直接結合やmRNA注入によるXenopus Oocytesでの神経系の著明なアポトーシス誘導作用等、アポトーシス制御に重要な因子であることが判明してきた。我々はこのカルシニューリンが関わる情報伝達系、特にその下流にある基質やアポトーシス制御メカニズムを詳細に解明するため、1)カルシニューリンによるBcl-2のリン酸化、脱リン酸化制御機構2)カルシニューリンによるアポトーシス誘導に関わる因子の検索3) Bcl-2キナーゼの同定を目的に研究を進めてきた。本年度1年間にアポトーシスに関わるカルシニューリン情報伝達系とBcl-2famiymemberとの関連を解析し、以下の諸点を明らかにした。1.カルシニューリンはBcl-2とBH4domainを介して直接結合し、Bcl-2のserince残基を脱リン酸化する。2.この脱リン酸化はBcl-2の抗アポトーシス機能を保持するために必須であり、BH4に存在する24番目のserine残基(S24)を介して行われることが判明した。3. S24のsingle polnt mutantであるBcl-2-S24Aは脱リン酸化型を模倣した変異体で,Bcl-2-S24Dはリン酸化型を模倣したBcl-2の変異体であるが、BaxはBcl-2-S24Dには結合せずBcl-2キナーゼによるリン酸化がBcl-2Baxの乖離に働いている可能性を示唆した。4.この可能性に基づいてBcl-2キナーゼを精製し、分子量約50kDaの単一標品を得た。このキナーゼは自己リン酸化、およびBcl-2をリン酸化するとともに、Bcl-2/Bax複合体を乖離した。5.これまでにカルシニューリン依存性アポトーシスの存在がBHK細胞への遺伝子発現やXenopus Oocytesを用いた実験より示唆されていたが、実は、カルシニューリンがBadを脱リン酸化することによりアポトーシスを制御していることが判明した。今後ともさらに詳細な解析を進める予定である。さらに実験動物においてカルシニューリン情報伝達系を解析するためにそのdominat negative変異体を用いたtransgenic ratを作成している。動物モデルができ次第様々な細胞、臓器におけるカルシニューリンの影響を調べる。
触発する形象―芸術制作／経験における形象の身体的=物体的力の解明

本研究の目的は、芸術の制作と経験において形象が身体をどのように触発するかを、具体的分析と理論研究により解明することだ。研究の焦点は2つ。(1)荒川修作+マドリン・ギンズの映画の分析を出発点に、1970年代以降の芸術表現を事例として、具体的形象が作者と観者の身体をどのように触発し変容させるかを分析する。(2)さらに対象を広げ、身体を触発する形象の力を、人類学・心の哲学・物質論・身振り論等を横断して理論的に研究する。これらを通し、芸術表現の核をなす形の「力」を解明したい。研究の焦点は2つ。
計算機実験による核酸結合蛋白質の塩基配列認識能力の予測と制御

本研究の目的は、筆者が開発してきた蛋白質の熱安定性変化の一連の計算手法(アミノ酸置換→分子動力学シミュレーション→自由エネルギー計算)を拡張して、核酸結合蛋白質と核酸との結合親和力変化の計算を可能にすることであった。また、それによって、核酸結合蛋白質が核酸塩基の種類を認識する分子機構を解明することであった。目的を達成するために、まず、筆者の蛋白質のアミノ酸置換の手法を拡張して、核酸の塩基を置換することを単純な塩基について可能にした。更に、一般的な塩基間の置換を行うために必要な計算手順を、明確に示した。また、蛋白質と核酸との複合体は、一般に規模が大きく計算時間がかかるために、シミュレーションのプログラム(COSMOS90)の並列化による高速化を行った。これらの一連の手法を開発することによって、DNA結合蛋白質(λ-repressor)が、DNAコンセンサス配列のチミンとウラシルを認識し分ける機構を解明した。これらの計算手法には任意パラメターが一切含まれていないために、核酸塩基の置換による結合自由エネルギー変化を予測することが原理的に可能になった。核酸結合蛋白質は、特定の塩基配列部位を正確に認識する。この機構の研究は、主に実験によってなされてきた。すなわち、核酸塩基対やアミノ酸を置換して機能への影響を調べた。しかし、これらを系統的に行うためには、かなりの時間と労力と経費がかかる。このような実験を計算機で行うことが本研究の目的である。まず初めに、違いの最も小さい塩基どうしを置換する。違いの最も小さいのはチミンとウラシルである。チミンのメチル基1個を水素原子に置き換えることによって、ウラシルに変換できる。筆者は、λ-repressorが結合するDNAコンセンサス配列のチミンをウラシルに置換して、λ-repressorの結合自由エネルギー変化を求めた。その結果、計算値(1.5kcal/mol)は、実験値(1.8kcal/mol)と良く一致した。次の段階として、メチル化されたDNA塩基対を認識する転写リプレッサー(MBD1)に適用する。MBD1は、メチル化されたシトシン-グアニン対を認識することが、横浜市大の白川グループによって報告された。また、彼らは、メチル化DNAとMBD1との複合体の溶液構造を明らかにした(2001年)。申請者の計算機実験の方法で、シトシン-グアニンのメチル基を分子置換法によって生成消滅させ、その際の結合自由エネルギーの変化を求め、白川グループの実験結果と比較し検証する。まず、メチル化されたシトシンの原子電荷をab initio分子軌道法によって決定した。現在、シミュレーションの準備が整ったところである。すなわち、特定の塩基対やアミノ酸を置換した核酸や蛋白質を合成することによって、置換が機能へ及ぼす影響を調べた。しかし、これらの実験を系統的に実施するためには、専門家がかなりの時間と労力と経費をかけなければならない。まず初めに、違いの最も小さい塩基どうし(チミン-ウラシル)を置換した。その結果、計算値(1.5kcal/mol)は、実験値(1.8kcal/mol)と良く一致した(PROTEINS,2003に発表)。次の段階として、メチル化されたDNA塩基対を認識する転写リプレッサー(MBD1)に適用している。MBD1は、メチル化されたシトシン-グアニン対を認識することが報告された(横浜市大、白川グループ)。彼らは、メチル化DNAとMBD1との複合体の溶液構造を明らかにした。まず、シトシンとメチル化されたシトシンの原子電荷をab initio分子軌道法によって決定した。更に、一般的な核酸塩基間の置換を行うために、その他の核酸塩基(アデニン、グアニン、シトシン)の原子電荷の計算を行った。

現在、アデニンとグアニン、シトシンとチミンの間の置換を行うために、分子置換のプログラム(PERTURB)を改良している。改良を終わりしだい、直ちにシミュレーションに取りかかる。
電気刺激による視覚回復の基礎的・臨床的研究

RGC5の培養系に対して電気刺激を与えた結果、IGF1のmRNAの増加が認められ、神経保護の機構にIGF1が寄与している可能性が示された。ラマン顕微鏡で、神経細胞死の過程でのチトクロームCの細胞内での変化が画像として時間的に示された。網膜色素変性兎モデルに対して経角膜網膜電気刺激(TES)を行うと、外顆粒層の減少が有意に抑制され、電気刺激による視細胞保護効果が証明された。TESでは刺激周波数により、網膜の賦活の程度が異なることが、ネコ網膜の内因性シグナルの検討で示された。視神経刺激型人工視覚の臨床研究では、長期埋植例でも患者は電気刺激に対して、フォスフェンを自覚することが示された。1.電気刺激による神経保護の分子機構:不死化培養網膜神経節細胞(RGC5)に対して、グルタミン酸(400mM)を加えて細胞死を誘導し、ラマン分光法を用いてチトクロームCのラマンシフトをもとに画像を経時的に再構築した。グルタミン酸投与30分後にはドット状のチトクロームCのシグナルが融合し始め、120分では核の輪郭が完全に消失した。この結果は、ラマン画像が神経細胞死の細胞内過程を反映していることを示唆する。2.網膜色素変性兎モデルに対する経角膜網膜電位刺激(TES)の神経保護効果:ロドプシン変異Pro347Leuをもつトランスジェニックウサギに対して,1回/週で生後6-12週までTESを行い、刺激眼と僚眼の明順応ERGを比較したところ、刺激眼の方が有意にa波、b波の振幅が大きかった。この結果はTESの錐体視細胞に対する神経保護効果を意味する。3.TESによる網膜刺激部位の、機能画像による評価法の確立:Optical Imaging眼底カメラを用い、TES後の眼底の二次元機能画像を取得した。その結果、眼底からの反射の変化はTES開始の2-3秒後から起こり、約8秒以内に終息した。変化の多くは、網膜血管とその近傍の網膜に生じていた。グレースケール値で20以上のシグナル変化の起こした面積を比較すると、同じ電流量のTESにおいて、10-30Hzの刺激頻度の場合に大きな反応が生じる傾向が見られた。この結果は、TESによる神経保護治療の際の刺激パラメーターの選択の一助となる。4.視神経刺激型人工視覚の開発:視神経刺激型人工視覚の臨床試験について、電極埋植患者に対して、2年以上の経過観察を行い、経時的な電気刺激試験のデータ蓄積を得た。その結果、2年以上経過しても視神経乳頭電気刺激によりフォスフェンの自覚が得られること、また、フォスフェンの位置が電極毎に限局し再現性があることが確認された。この結果は、視神経刺激型人工視覚の長期的な安定性を示唆する。1.電気刺激による神経保護の分子機構:不死化した網膜色素上皮細胞(ARPE-19)および網膜神経節細胞(RGC-5)の培養系に対して二相性パルスで30分電気刺激を与え、3時間後にmRNAを抽出しReal Time PCRにて解析を行った。その結果、ARPE-19細胞ではGDNFの、RGC-5細胞ではIGF1のmRNAの増加が認められ、眼内での神経栄養因子のDrug Delivery Systemに寄与すると期待された。グルタミン酸(400mM)をRGC-5に投与し、ラマン顕微鏡で細胞内のcytochrome cの振動スペクトル(752cm^<-1>)を画像として経時的に観察し、Mitotrackerおよび抗cytochrome c抗体を用い免疫染色を行ったところ、ラマン像と同様、Mitotracker、cytochromecのシグナルは細胞質内に粒状に分布していたのが経過とともに拡散した。この変化はミトコンドリアの変化を捉えていると考えられ、神経細胞死を実時間で画像的に評価できることが示唆された。2.電気刺激による網膜刺激の、機能画像による評価法の確立:プラチナ電極による局所的網膜電気視的の網膜機能画像による評価法を確立した。本法は人工網膜による網膜刺激の有効性の評価法として有用であることが示唆された。3.視神経症の症例に対する経角膜電気刺激の臨床研究:外傷性視神経症48例48眼に対し、電気刺激治療し、治療開始3か月後の視力を比較検討した。治療前光覚なしの症例は全例光覚なしのままであったが、それ以上の視力の例では視力が改善した。この結果は、少しでも網膜の機能が残存している例であれば、電気刺激治療によって視機能が改善する可能性があることを示された。4.視神経刺激型人工視覚の開発:視神経乳頭電極を埋植した網膜色素変性患者に対し、長期の経過観察を行った結果、一部の症例で電気刺激閾値の上昇がみられた。原因についてはさらに検討を進める予定である。

ラマン分光を用いてCytochrome Cの細胞内の分布を1細胞単位で画像として表示するシステムを、不死化した網膜神経節細胞(RGC5)の培養系に対して用い、Glutamate投与によって細胞死を起こし、細胞死に至る過程でのCytochrome C細胞内分布の画像変化をモニターした。その結果細胞死が通常の顕微鏡で観察できない細胞死の初期においても、ラマン画像には変化が見られ、これはマイトトラッカーを用いて細胞内のミトコンドリアの分布を示した画像と比較して、類似のパターンを示したことから、ラマン像は、細胞内のミトコンドリアの動態を示していると考えられた。今後ラマン画像をもちいることで、継時的に細胞死に至る細胞内動態をラマン画像で追える可能性がある。ラミニンをコートした培養皿上で不死化したRGC細胞を培養し、電気刺激による神経細胞の軸索伸展を起こす条件を、RGC5を用いて検討した。Staurosporineを添加すると、軸索伸長が見られたが、その数は少なく、また電気刺激で有意に伸長が増加する条件を見いだせなかった。今後は網膜の器官培養を用いて検討する予定である。経角膜電気刺激で、ネコ網膜を広い範囲に刺激した場合の反射率の変化を網膜機能イメージング法で評価した。その結果刺激周波数20 Hzが最も反射率変化が大きく、この周波数が電気刺激治療に有効であることをサポートするデータとなった。神経細胞死の新しい評価法としてラマン分光の有用性が示され、また培養網膜色素上皮細胞の電気刺激を、神経栄養因子の眼内deliverysy stemとして利用できる可能性が示されたことは、基礎研究として順調に成果が出ていることを表している。また、視神経症の症例に対する経角膜電気刺激法の適応基準が示され、視神経刺激型人工網膜の長期埋植の問題点を抽出できたことは、電気刺激による視覚回復の臨床的研究面でも成果が順調に出ていることを示している。25年度が最終年度であるため、記入しない。基礎研究としては、ラマン分光を用いて、Pre-Apoptosisの状態の網膜神経節細胞の判定方法を確立し、電気刺激で細胞死に至る過程の神経細胞が生存できるか否かを画像的に検討する。また、網膜神経節細胞と、網膜グリア細胞の共培養系を用いて、より効果的に神経栄養因子が放出されるか否かを検討し、眼内delivery systemとして発展させる。臨床的には、経角膜電気刺激治療を多施設研究として発展させるための、プロトコール作り、視神経刺激型人工網膜の、次世代型の発展形を検討する。
質感の記憶―表象構造と精度の定量化と神経基盤の解明

「質感の視覚性短期記憶」、「質感カテゴリ記憶の神経基盤」、「質感の長期記憶」の3つの課題を設定して研究を推進した。「質感の視覚性短期記憶」:記憶すべき質感特徴として表面の粗さと鏡面反射率を用い、実験では標準刺激提示後、遅延時間の後に比較刺激を提示し、比較刺激を調整して粗さもしくは鏡面反射率を一致させる課題を行い、記憶の精度を測定した。また、対照実験として標準刺激と比較刺激を同時提示する知覚課題も実施した。記憶課題の成績は、照明が変化する条件では知覚課題に対する成績低下が比較的小さく、照明に依存しない質感の短期記憶表象の存在を示唆する。また、粗さと反射率の同時記憶課題において、両特徴の記憶成績の間に相関はなく、粗さと反射率が独立に保持されていることを示唆する。最後に、複数の球体画像の同時記憶課題では、先行研究とは異なり、少なくとも球体3つまでは記憶精度は低下しなかった。「質感カテゴリ記憶の神経基盤」:カテゴリ記憶課題を用い、頭頂間溝と紡錘状回を関心領域として、質感のカテゴリ記憶の神経基盤を検討した。物体の材質カテゴリを記憶する課題,同じ刺激を使って物体画像そのものを記憶する課題の成績と脳活動を比較した。行動データから、物体の画像そのものよりも、物の材質情報を記憶する方が困難であることがわかった。脳活動の分析から、物の材質カテゴリの情報は紡錘状回に保持されている可能性が示された。また、紡錘状回と中心前回・中心後回の脳活動の関連が示され,物の材質の記憶に手触りの感覚情報処理が関与する可能性がある。「質感の長期記憶」: 4択の再認記憶課題におけるエラーのパターン分析により、質感と形状の間には統計的に有意な依存関係があるのに対し、質感と光源の間には依存関係が見られず、質感情報は、物体に内在する特徴と結びついた形で保持されていることを示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、質感の視覚性短期記憶、視覚性長期記憶、質感記憶の脳機能計測の3つのプロジェクトを進めた。質感の視覚性短期記憶については、光沢の心理物理次元のモデルに基づいて、鏡面反射率と粗さの2次元をパラメトリックに操作した刺激セットを用い、表面の光沢の視覚性短期記憶の精度測定実験を実施した。知覚マッチングと記憶マッチング条件を設定してその成績の低下率を記憶コストと定義し、同一照明条件と異種照明条件で記憶コストを比較すると異種照明条件では記憶コストが縮小することが分かった。このことは、照明条件に依存しない表面特性の記憶は、表面の画像特徴に比べて頑健である可能性を示唆する。また、記憶コストは、鏡面反射率と粗さでほぼ同一であり、光沢次元によらない一般的な記憶特性が存在する可能性を示唆する。質感の長期記憶実験については、物体の形状、素材質感、視点・光源の情報が相対的にどのように記憶されるのか、またこれらの記憶が独立に保持されるのか否かを検討することを目的とした。自然画像では、刺激画像が統制できないため、レンダリングソフトを用いて、大量の物体画像を作成し、さらに、形状、素材質感、視点の類似性が平均的にはそろうような画像セットを作成した。刺激セットが完成し、実験を開始する準備が整った。質感記憶の脳機能計測については、質感の知覚に関連するとされる下側頭葉と視覚性短期記憶保持に関与するとされる頭頂間溝が質感の短期記憶の際にどのような役割分担、また相互作用をするのかを検討することを目的とした。まず、行動実験課題を作成した。素材質感を個々の画像として記憶する場合と質感をカテゴリ的に記憶する場合を比較検討するために画像記憶課題とカテゴリ記憶課題を作成した。行動実験の結果、カテゴリ課題で有意に成績が低下したため、現在、課題難易度を揃えるために刺激の調整を行っている。

また、紡錘状回と中心前回・中心後回の脳活動の関連が示され,物の材質の記憶に手触りの感覚情報処理が関与する可能性がある。「質感の長期記憶」: 4択の再認記憶課題におけるエラーのパターン分析により、質感と形状の間には統計的に有意な依存関係があるのに対し、質感と光源の間には依存関係が見られず、質感情報は、物体に内在する特徴と結びついた形で保持されていることを示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、当初から刺激作成、適切な実験パラダイムの開発にかなりの時間を必要とすることを想定していた。その意味で、まだ研究として完成したプロジェクトはないものの当初の予定におおむね沿っていると言える。質感の視覚性短期記憶については、実験系、刺激セット共に確立できたので、これからは本格的に様々な実験を実施して成果を挙げられることが見込まれる。脳機能計測実験についても、行動課題の開発過程において、課題難易度の調整に時間が取られているが、この作業は、脳機能計測実験から曖昧さのないデータを得るために不可欠であり、現時点で難易度調整のめどが立ちつつあることから計画の大きな遅延とはならないと思われる。質感の長期記憶実験は、当初の予定よりも刺激セットの作成に時間がかかり、その意味では、3つのプロジェクトの中では若干遅れ気味である。しかし、現在までに特徴の類似性等の調整もされたよく統制された刺激セットが完成しているので、今後は順調に実験を進めて行けると思われる。質感の視覚性短期記憶実験については、基本的なデータを得ることができたので、今後は記憶負荷(記憶する表面の数)と精度の関係、質感次元間の相関、符号化時間、保持期間の影響など、質感の短期記憶特性を体系的に検討していく。また、複雑な刺激特性の記憶の持つ特異性を明らかにするために、従来研究で行われていたような単純な刺激次元を用いた実験との比較検討を行う。質感の長期記憶実験においては、まず、基本データを収集するために形状、素材質感、視点の記憶成績の比較とそれらの相関関係の検討を行う。その結果を踏まえ、物体の長期記憶における物体の内在的特性(形状、質感)と環境要因による偶発的特性(視点・照明)の関係についての理論化を進めていく。質感記憶の脳機能計測においては、実験パラダイムを確立したのち、fMRI実験を実施する。脳機能計測においては、特に頭頂間溝と下側頭葉(特に紡錘状回)の活動に着目し、その活動強度を検討するとともに、両領域の活動の相関分析なども進める。
がん細胞におけるアポトーシスの誘因と機構並びにその制御に関する研究

アポトーシスは、遺伝子レベルで制御された、核破壊を伴う細胞死の一型で、遺伝子異変などを起こした細胞の増殖を阻止し、それらを殺傷排除することでがんの発生を未然に防ぐ、生体防御の役割を果たしている。このようなことからアポトーシスの機構を解明することは、がんの発生や進展の仕組みを知るだけではなく、がんの進展阻止やがん細胞の殺傷除去に関する方策を考えていく上でも重要である。アポトーシスに関する研究は、このところ急速な進展をとげ、種々のアポトーシス誘導因子や抑制因子が見いだされるとともに、シグナル伝達の仕組みについても分子レベルで検討されるようになってきた。本研究班でも、各班員が独自に開発した実験系を用いて、がん細胞におけるアポートシス発生の機構を多面的に、かつ分子レベルで理解していくことによって、アポトーシスの実態解明に向けた研究が精力的に展開されてきている。例えば哺乳動物細胞には少なくとも一種のイントロンレスmyc遺伝子が存在していることが明らかにされ、これら遺伝子の発現によってグリオーマ細胞に非常に効率よく、しかもc-Mycの場合と異なり野生型p53の発現に依存することなくアポトーシスが誘導されることが見いだされた。またこれらイントロンレスmyc遺伝子をを用いた実験からMyc蛋白質のdeath domainが初めて同定された。またアポトーシス支配因子Fasの生理的なリガンド(FasL)をコードするcDNAがヒトやマウスからも単離され、膜型および細胞質型FasLの生成機構が明らかにされた。さらに酵母の系を用いて活性型可溶性FasLの大量生産に成功し、えられたFasLを用いて種々のモノクローナル抗体が作成され、高感度のELISA法によるFasL検出システムが構築された。そしてこのシステムが、TまたはNK-LGL白血病やNKリンパ節腫瘍の患者血清での可溶性FasL蛋白質の検出に利用できることが示されたことで、がん診断への応用が期待できるようになってきた。この他、Ara-C,Vp-16,CPTなどの抗がん剤によるアポトーシスがTNFや抗Fas抗体によるものと同じくICEファミリープロテアーゼの活性化を伴うことが示されたり、アポトーシスに特異的なDNAの断片化に関与するエンドヌクレアーゼが胸腺細胞から精製され、対応するcDNAがクローニングされるなど、多くの研究成果が挙げられた。
現実的数学教育論に基づく高等学校STEMモジュールと評価問題の開発

本研究は、オランダの現実的数学教育論に基づき、社会生活、職業、他学問領域との連関を重視する高等学校数学のSTEMモジュールと評価問題を開発し、高等学校数学科の内容や評価システムを刷新することを目的とした。平成30年度は、附属高校数学科と理科の教員からなるチームを編成し、現実的数学教育論を最も明確に反映している教科書、全国共通試験の問題分析、フロイデンタール研究所が中心となって開発しているMascil(Mathematics and Science for Life)モジュールの分析を行うとともに翻訳も行った。対象とした教科書は、オランダの後期中等教育の「大学準備教育コース」及び「中等職業教育準備」用のModerne Wiskunde (第11版)の数学A(文系),B(理系),C(基本),D(発展)の4科目であり、問題集は両校種向けの全国最終試験問題集(Examenbundel2017)である。毎月定例で附属高等学校数学科の教員と研究会を開催し、教科書や問題集からわが国の高校数学の内容に対応する問題場面を同定し、わが国で使用可能なSTEMモジュールや評価問題への改良を試みた。また、「オランダからの挑戦状」と銘打って附属高等学校の数学科の課外活動として定期的にセミナーを実施し、一部の問題について、日本の学校での導入可能性について検討を重ねた。さらに、現実的数学教育に基づく問題開発のためのための専門的な助言を得るため、オランダの実地調査を行うとともに、ユトレヒト大学からTom Goris氏、教育測定研究所からRuud Stolweijk氏を招へいし、授業における問題開発や試験における評価問題の作成について助言を得た。本年度の最終的な成果物として、「日常生活や社会の事象に数学を活用する力の育成」という高等学校数学科の教授資料を発行し、全国の高等学校に配布を行った。本年度に計画した具体的目標を首尾よく実現することができた。附属高等学校の数学と理科の教員と定期的に研究会を開催し、最新の教科書や問題集を分析するとともに、実際に高校生向けに試行を行い、高等学校への導入可能性についても具体的に検証することができた。オランダの教科書の執筆者や全国共通試験の問題開発の責任者を日本に招聘し、専門的な知見を得ることができた。オランダの現実的数学教育論では、社会生活、職業、他学問領域との連関を重視する数学教育を行い、国家共通試験においても良質なる評価問題を開発していることが確認できた。さらに、分析・翻訳した評価問題を高等学校数学科の教授資料として発行し、全国の高等学校に広く周知することもできた。初年度に分析し翻訳した問題はまだ一部分であり、次年度は物理・化学・生物等の教科書や試験問題も含めて、継続して分析し翻訳を進めていきたい。その際、オランダで近年導入されたSTEM的な教科である「自然・生活・テクノロジー」(Natuur, Leuven & Technologie:NLT)のモジュールについても分析と翻訳を行う予定である。今年度は附属高等学校の課外活動で開始したセミナーである「オランダからの挑戦状」をさらに充実したものにするとともに、昨年度出版した問題集を使用して、平素の数学科の授業においても一部取り入れ、高等学校における授業改善を試みてみたい。また、本年度作成した教授資料集についても、大学進学コースのみならず、職業学校でのSTEM教材や評価問題を含めて、より広範な生徒に対応可能なように教材や評価問題の範囲を広げていきたい。

オランダの現実的数学教育論では、社会生活、職業、他学問領域との連関を重視する数学教育を行い、国家共通試験においても良質なる評価問題を開発していることが確認できた。さらに、分析・翻訳した評価問題を高等学校数学科の教授資料として発行し、全国の高等学校に広く周知することもできた。初年度に分析し翻訳した問題はまだ一部分であり、次年度は物理・化学・生物等の教科書や試験問題も含めて、継続して分析し翻訳を進めていきたい。その際、オランダで近年導入されたSTEM的な教科である「自然・生活・テクノロジー」(Natuur, Leuven & Technologie:NLT)のモジュールについても分析と翻訳を行う予定である。今年度は附属高等学校の課外活動で開始したセミナーである「オランダからの挑戦状」をさらに充実したものにするとともに、昨年度出版した問題集を使用して、平素の数学科の授業においても一部取り入れ、高等学校における授業改善を試みてみたい。また、本年度作成した教授資料集についても、大学進学コースのみならず、職業学校でのSTEM教材や評価問題を含めて、より広範な生徒に対応可能なように教材や評価問題の範囲を広げていきたい。オランダの教科書は最新版が改訂中のため、一部出版されておらず購入できなかった。また、「全国共通試験問題」はweb上で無償公開されていることが判明し、購入する必要がなかった。さらに、教授資料の印刷と配布は、無償で行うことができた。さらに、オランダからの研究者招聘の際の航空運賃が想定よりも廉価であった。次年度は、未購入である教科書を購入するとともに、オランダから継続して専門家を招聘することにしたい。
CRMP-2による神経軸索・樹状突起の運命決定機構の解明

神経極性は神経細胞の基本的な形態的・機能的特性である。しかし、神経細胞の極性がいかにして形成されるのか、その分子機構はあまり理解されていない。本研究は培養海馬神経細胞を研究材料として、神経細胞の極性形成の分子基盤を明らかとすることを目指している。プロテオミクスの手法を用いて神経極性形成機構の分子基盤を解析するために昨年度開発した超高解像度二次元電気泳動法をさらに改良した(Proteomics 2,666-672,2002;BioForum Int.6,324-325,2002)。本法は従来の手法と比較して感度が飛躍的に向上し、従来の泳動法の5倍(約11,000個)の蛋白質スポットの検出に成功した。そこで、このシステムを用いてラット培養海馬神経細胞の軸索あるいは樹状突起・細胞体に濃縮する蛋白質と極性形成時に発現が上昇する蛋白質のディファレンシャル解析を行った。その結果、神経細胞に発現する細胞骨格・膜蛋タンパク質5,164個のうち4%にあたる200個ものタンパク質が軸索に、27%にあたる1,414個のタンパク質が樹状突起・細胞体に濃縮することがわかった。また。神経細胞に発現するタンパク質6,197個のうち4.3%にあたる265個のタンパク質が神経極性形成に伴って、発現が上昇することが明らかとなった。以上の結果から、神経極性の形成・維持には数多くのタンパク質のネットワークが関与するものと考えられる。現在、これらのタンパク質を質量分析法を用いて同定中であり、すでにいくつかの興味深いシグナル分子や細胞骨格調節タンパク質を同定している。今後、これらの分子群を培養海馬神経細胞を用いて発現機能解析を行い、神経極性形成を担う分子群のシグナルネットワークを明らかとしてゆく予定である。1)CRMP-2結合蛋白質の同定我々は最近、CRMP-2という細胞内蛋白質が海馬培養神経細胞の軸索に濃縮することを見いだした。また、CRMP-2を神経細胞に外来性に高レベル発現させると、神経極性に乱れが生じ通常は1本しか形成されない軸索が複数形成された。以上の結果はCRMP-2が神経細胞の軸索形成と極性形成に重要な役割をはたす可能性を示唆する。本研究ではCRMP-2による神経細胞の軸索形成と極性形成機構の解明のためにCRMP-2と相互作用する蛋白質をアフィニティーカラム法およびyeast two-hybrid法を用いてスクリーニングした。その結果、アクチンとチューブリンが同定された。2)CRMP-2の微小管形成に対する作用の解析CRMP-2のさまざまなフラグメントを用いて微小管とのcosediment assayをおこない、少なくともCRMP-2の323番目から381番目のアミノ酸の部分が微小管との結合に寄与していることが明らかとなった。この部位は、CRMPのアイソフォーム間、種間で比較的高いホモロジーを有している部位である。次にCRMP-2がチューブリンあるいは微小管に結合することによって、微小管の動態にどのような作用を及ぼすかについて、暗視野顕微鏡を用いて調べた。その結果、微小管に結合するフラグメントおよび全長のCRMP-2が微小管の重合を促進することがわかった。一方、微小管に結合しないフラグメントは微小管の重合を促進しなかった。また野生型のCRMP-2は神経細胞の突起形成を促進したが、チューブリン結合部位を欠くCRMP-2は神経突起形成を促進しなかった。以上のことから、神経軸索形成や極性形成CRMP-2とチューブリンとの相互作用が関与する可能性が示唆された。また。
宮古諸方言と他の琉球諸語―記述と比較歴史的研究

本年度は消滅の危機に瀕している琉球諸語の現地調査を継続的に行ない、宮古語・八重山語・与那国語を中心に記述と歴史比較研究に努めた。宮古語池間方言を五十嵐陽介(広島大学)、田窪行則(京都大学)、林由華(京都大学)久保智之(九州大学)と共同で研究を行い、そのアクセント体系が先行研究の報告と大幅に異なっており、2型ではなく3型体系であることを発見した。沖縄県竹富町の黒島で調査を行い、八重山語黒島方言の数百語と談話資料等を収集した。更なる研究が必要であるが、先行研究で報告されてこなかった前舌と後舌「ア」の区別を発見した。本年度の調査で与那国語の音韻体系に対する理解を深めることができ、特に音節構造の特徴が明になってきた。例えば語頭に鼻子音だけからなる副音節が存在することを発見した。文法に関しては、与那国語が琉球列島の他の言語・方言より遥に複雑な動詞活用体系をもっていることを確認した。先行研究の報告より多くの活用クラスを立てる必要があり、更に未報告の活用形が存在することがわかった。琉球諸語全体の歴史比較研究が本研究の大きな目的の一つである。そのため本研究を通じて集めてきたデータと先行研究(特に辞書類)の資料をまとめデータベース化を始めた。琉球祖語の再建を目的とした比較語源辞典への第一歩となる。また、琉球諸語と日本語の史的関係を再検討し、いつ琉球祖語が琉球列島に入り、琉球諸語がいかに発達してきたかという問題を追求し、歴史比較言語学の研究成果を考古学や人類学の研究成果と照らし合わせた。古墳時代に琉球祖語と日本(本土)祖語が分岐し、10世紀前後に琉球祖語の話し手が九州より出発し琉球列島に移住したという結論に至った。本年度は宮古諸島(大神・西原・多良間方言)、奄美諸島(湯湾・古仁屋・諸鈍方言)、与那国島の三地域でフィールドワークを行ない、それらの言語がどれも消滅の危機状態にあり記述と記録が至急に行われる必要があることを確認し、自然談話・語彙・音声・文法の資料を収集しはじめた。琉球諸語の音声・音韻は日本語本土諸方言と著しく異なっており、類型論的に興味深い現象を数多く示している。例えば今回調査した宮古語における無声子音が音節の中心に立つ現象や奄美語と与那国語に見られる喉頭の緊張を伴う子音などは世界の諸言語から見ても非常にめずらしい特徴である。特に世界のなかで類例が数例しか知られていない宮古語大神島方言のめずらしい体系の記述を進め、話者が数十人しかいない大神島方言という小方言が人間の音声・音韻に関する一般理論にとって重要であることを示した。琉球諸語の文法体系にも興味深い現象が観察され、動詞の複合体や節連鎖・副詞従属節を中心に研究を進めた。琉球諸語全体におけるいわゆる接続形や中止形の機能と由来の相違を示したほか、本来主節の述部に現れることのない副動詞(日本語の「して」に相当)が多くの琉球諸語では脱従属化を起こし主節に現れ過去的な意味を表すことを指摘し、その現象発達の説明も提案した。また、現地調査で収集した資料を歴史比較言語学的な観点に基づいて整理し、古代日本語などとも照らし合わせ、琉球諸語と日本語が分岐する以前の状態の再建に努めた。収集した資料から琉球諸語と日本語が分かれたのは奈良時代以前で、現代の琉球諸語が最古の日本語文献に残されていない特徴を保存しており、琉球諸語の研究が日本語史の解明に大きく貢献できることを示した。特に日琉祖語の母音体系の再建を修正しなければならず、古代日本語と琉球諸語の在り方と発達の過程を無理なく説明できる新説を提案した。
学校から職業への移行支援における後期中等教育後の進路保障施策に関する研究

本研究では、学校から職業への移行支援における後期中等教育後の進路保障施策(就学と就労の柔軟な組み合わせによる多様な進路の確保施策)の分析を通して、地位の低下が見られる中等職業教育の今日的役割を解明することを目的とする。具体的には、アメリカのハイスクールを事例とし、2010年代以降の「進学とキャリアの双方」に備える(“college and career" ready)改革の実態を分析する。特に、ニューヨーク市のP-TECHの特徴を、1)学区の教育政策における位置づけ、2)プログラムの実施状況と実施に関わる諸機関の役割と連携、3)プログラムの成果と課題について明らかにする。
サイズ選択的な物質移動を実現するナノチャネル内包型ナノポーラス液晶の機能開拓

大環状化合物は、サイズと形状が均一なナノ空間を形成することで、取り込んだ分子のふるい効果や特異な反応性などの「ナノ空間内の特異性」を実現することができる。大環状化合物を一次元に積み重ねて自己組織化した組織からなるカラムナー液晶を用いれば、液晶特有の流動的な性質により、カラムナー組織の方向を自在にコントロールする「空間配向性」も可能となる。本研究では、それぞれの長所を併せ持つソフトマテリアルとして、カラムナー液晶の物質輸送や内部の反応性などを開拓し、機能性材料として開発することを目的とする。また、カラムナー構造中のナノチャネルや孤立したナノ空間を持つ超分子錯体の構造解析や機能開拓も検討する。
アブラナ科野菜の穂発芽原因遺伝子の解明

アブラナ科野菜の日本での採種時期は梅雨と重なるため、高い頻度で穂発芽が発生し、種苗業界では深刻な問題となっている。穂発芽とは、収穫前に実った種子から芽が出てしまう現象で、種子の収量減少や新品種作出時の障害などの原因となる。本申請研究では、アブラナ野菜の穂発芽原因遺伝子を明らかにし、さらに穂発芽しにくい品種の持つ穂発芽抑制遺伝子を明らかにして、穂発芽しにくいアブラナ科野菜の育種法を確立する。