hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表皮剥脱毒素スーパーファミリーの作用機構に関する研究

黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱毒素(ET)は、新生児、幼児の伝染性膿痂疹患部皮膚に水疱形成、剥脱を引き起こす原因毒素である。ETファミリーは現在血清学的違いによりETA、ETB、ETDの3種類が報告され、Amagai、Stanley、Yamaguchiらの共同研究により、ETファミリーの標的蛋白が表皮細胞間の接着を担うデスモグレイン1(Dsg1)であることが証明された。また同じブドウ球菌属に属するStaphylococcus hyicusが同様の毒素を産生する事が知られており、血清学的に異なる4種類の表皮剥脱毒素ExhA,ExhB,ExhC,ExhDを産生する。この毒素を産生するS.hyicusは幼弱ブタに滲出性皮膚炎を惹起する。本年、私どもはブタのDsg1のクローニングに成功し、バキュロウイルスで発現させたsDsg1を用いてExhの切断活性を調べた所、ExhAExhDがブタDsg1を選択的に切断する事を明らかにした。また精製したExhAExhDを子豚の皮下に接種すると、表皮の痂皮化、剥脱を誘導する事を明らかにした。またExhA,ExhB,ExhDについて12Aの分解能で結晶構造を解いた。これらのExhの構造は既に構造が明らかにされているETに類似していることが明らかになった。また昨年度に大腸菌で発現に成功したヒトDsg1の細胞外ドメインとセリンプロテアーゼ活性基のセリンをアラニンに置換して不活化したETAを用いた共結晶化を試みた。その結果、プロペラ状の針様結晶が得られたが、結晶の増大が見られず、X線を用いた解析には至らなかった。このため、再度、ヒトDsg1の大量精製法について検討し硫安沈殿を行ったヒトDsg1を共結晶化に用いる方法を検討した。また大腸菌で作成したヒトDsg1が温度に感受性である事から、トランスジェニックカイコを用いたヒトDsg1の大量発現を目指して、その予備実験としてカイコ絹糸腺でのヒトDsg1の一過性の発現を試みた。その結果、カイコ絹糸腺でヒトDsg1の発現が認められた。またETとヒトDsg1の会合状態を調べるために、ETAを安定同位体標識し、大腸菌で発現精製したヒトDsg1とともにNMR解析することを試みた。以来ETの機能活性測定にはAmagaiらにより確立されたバキュロウイルス発現系により精製したDsg1蛋白が用いられてきた。ETファミリーとDsg1との詳細な相互作用解析を行うためには、大量で高純度なDsg1蛋白を必要とする。しかしバキュロウイルス発現系による大量の精製標品調整は労力、コストの面で多大な困難が予想される。そこで、大腸菌発現系を用いた大量精製法の確立を試みた。ヒトDsg1(hDsg1)細胞外領域の様々なtruncated formを作製し、ETに対する感受性ならびに発現量を検討した。その結果、hDsg1240545アミノ酸領域がETファミリーに対し高感受性で、もっとも高発現、高純度に精製できることを見出した。BiacoreXを用いてETファミリーとの親和性を測定した結果、hDsg1_<240-545>とETファミリーとが強い親和性を示すことが明らかとなった。同様な発現系を用い、マウスDsg1(mDsg1)_<240-545>の発現、精製を行った。ETファミリーに対する感受性、親和性に関し検討した結果、mDsg1_<240-545>はETファミリーに対する感受性は有するが、hDsg1_<240-545>に比べETファミリーに対する親和性が低いことが示された。

これらのExhの構造は既に構造が明らかにされているETに類似していることが明らかになった。また昨年度に大腸菌で発現に成功したヒトDsg1の細胞外ドメインとセリンプロテアーゼ活性基のセリンをアラニンに置換して不活化したETAを用いた共結晶化を試みた。その結果、プロペラ状の針様結晶が得られたが、結晶の増大が見られず、X線を用いた解析には至らなかった。このため、再度、ヒトDsg1の大量精製法について検討し硫安沈殿を行ったヒトDsg1を共結晶化に用いる方法を検討した。また大腸菌で作成したヒトDsg1が温度に感受性である事から、トランスジェニックカイコを用いたヒトDsg1の大量発現を目指して、その予備実験としてカイコ絹糸腺でのヒトDsg1の一過性の発現を試みた。その結果、カイコ絹糸腺でヒトDsg1の発現が認められた。またETとヒトDsg1の会合状態を調べるために、ETAを安定同位体標識し、大腸菌で発現精製したヒトDsg1とともにNMR解析することを試みた。
新理論に基づいた臨床検体中ウイルス粒子の網羅的分離・精製技術の開発

感染症病原体に対する網羅的ゲノム探索(メタゲノミック診断)システムにおいて、核酸抽出前のステップにおける技術革新を目指し、HPLCやフィールドフローフラクショネーション(FFF)等を用いたウイルス粒子の精製試験を行った。その結果、FFFと光散乱検出器を用いることにより、溶液中のウイルス粒子画分を検出し、精製することが可能である予備的な試験結果を得た。さらにハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーはウイルスを高回収率で精製することが可能である結果を得た。これまでに開発した感染症病原体に対するメタゲノミック診断システムに適用するため、核酸抽出前の段階において「ウイルス粒子の分離精製・検出」ステップを加え、より高感度かつ再現性の高い網羅的ウイルスゲノム検出システムを構築するシステムを開発することを研究課題としている。本研究では、核酸抽出前のステップにおける技術革新を目指し、フィールドフローフラクショネーション(FFF)を用いたウイルス粒子の精製試験を行った。その結果、FFFと光散乱検出器を用いることにより、発育卵しょう尿液中のインフルエンザウイルス粒子画分を検出し、精製することが可能であり、臨床検体中のウイルス粒子の検出、精製技術の確立に向けた基礎データを得ることができた。しかしながら、上記の機器は高額であり、Point of careあるいは臨床/検査への応用については課題が残された。一方、インフルエンザウイルスを細胞あるいは発育鶏卵で培養し、その培養上清、しょう尿液をハイドロキシアパタイト担体にロードしてウイルスを吸着させ、リン酸ナトリウムバッファーで溶出することが可能であった。この結果から、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは多種多様のウイルスを吸着溶出させて精製に用いることが可能であると考えられた。ハイドロキシアパタイトを基盤としたウイルスの精製・濃縮技術は臨床現場における簡易なウイルス診断キットへの応用が期待できる。申請者らがこれまでに開発した感染症病原体に対するメタゲノミック診断システムに、核酸抽出前の段階において「ウイルス粒子の分離精製・検出」ステップを加え、より高感度かつ再現性の高い網羅的ウイルスゲノム検出システムを構築することを研究課題としている。これまでに、核酸抽出における技術改良は共同研究者らのこれまでの取り組みの中で一定の成果を得ることができた。そこで本研究では、核酸抽出前のステップにおける技術革新を目指し、フィールドフローフラクショネーション(FFF)を用いたウイルス粒子の精製試験を行った。当初の目的であったフィールドフローフラクショネーション(FFF)を用いたウイルス粒子の精製に成功した。これまでに、FFFと光散乱検出器を用いることにより、精製ウイルスを高率に検出することができることを見出している。昨年度は研究代表者の異動があり、年度後半の研究が計画通りに進行しなかったことから、研究費の一部を次年度に繰り越した。昨年度に得られた成果をさらに発展、得られた技術をウイルス診断に応用することを目的とする。そのため、FFFより簡易なウイルス精製および検出システムの開発を進めていく。
コラーゲン刺激によるDDR2レセプターシグナル伝達およびその機能解析

肝線維化の形成過程において,PDGFRを代表とするRTKやTGFβRシグナルによる肝星細胞の活性化が重要な鍵を握っていることが明らかにされている。Discoidin Domain Receptor 2 (DDR2),RTKの一つで,そのligandがコラーゲンであることが最近報告されたが,今回,そのシグナル伝達ならびにその機能について詳細に解析した。まず,肝星細胞を用いた,抗DDR2抗体による免疫沈降後のウエスタンブロットにより,DDR2は,Srcと結合することを明らかにすることができた。DDR2と結合するその他の分子を同定するため,Src kinaseを発現させたModified Yeast TwoHybridを行ったところ,Shc adaptor proteinが,DDR2と結合した。DDR2ノックアウトマウスから分離した細胞を用い,これにDDR2遺伝子を戻してやると,wild type DDR2がコラーゲン刺激によりリン酸化され,Shcと結合することが明らかになった。さらに,MMP-2の発現がSrc kinaseを含むDDR2シグナルによって誘導されることも明らかになった。そこで,Src kinaseを抑制するために,Dominant Negative SrcをCre-loxPを備えたアデノウイルスベクターに組み込み,コラーゲンプロモーターによりCre recombinaseを発現するアデノウイルスベクターと共に,培養肝星細胞やチオアセトアミド投与障害肝モデルのラットに共感染させると肝星細胞の増殖は抑制され,このとき,同時にDDR2のリン酸化も抑制されており,障害肝モデルでの線維化も組織学的に軽減した。以上,DDR2は,Src kinaseとの相互作用により,そのシグナル伝達が制御されることを明らかにした。DDR2は、RTKの一つで、そのligandがコラーゲンであることが最近明らかとなったが、今回、そのシグナル伝達ならびにその機能について解析した。まず最初に、肝星細胞を用い、コラーゲン刺激によりDDR2がリン酸化するかどうか確かめた。抗DDR2抗体による免疫沈降(IP)の後、Western Blot (WB)によって、星細胞は、DDR2を発現し、刺激によりDDR2が、リン酸化されることが明らかとなった。興味深いことに、IP-WBにより、SrcがDDR2と結合した。さらに、Src kinase inhibitor PP1やDominant negative Srcにより、DDR2のリン酸化は抑制された。続いて、DDR2に結合するその他の分子を同定するため、Src kinaseの存在下にYeast Two Hybridを行ったところShcが、DDR2と結合した。DDR2ノックアウトマウスから分離したskin fibroblastにwild type DDR2 (WT)もしくは、kinase dead DDR2mutantを組み込んだcell linesを使用し、IP-WBを行ったところ、WT-DDR2が、コラーゲン刺激によりリン酸化されるとShcとbindすることが明らかとなった。さらに、MMP-2の発現が、Src kinaseを含むDDR2 signalingによって誘導されるかどうかをMMP-2のpromoter assayを用いて検討した。DDR2 +/-cellで認められるMMP-2のpromoter activityは、DDR2 -/-cellで抑制され、さらに、active SrcによりMMP-2 promoter activityは上昇し、DN Srcにより抑制された。以上より、DDR2は、Src kinaseとの相互作用により、そのシグナル伝達が制御されることが明らかとなった。Discoidin Domain Receotor2(DDR2)は,RTKの一つで,そのligandがコラーゲンであることが最近報告されたが,今回,そのシグナル伝達ならびにその機能について詳細に解析した。DDR2と結合するその他の分子を同定するため,Src kinaseを発現させたModified Yeast TwoHybridを行ったところ,Shc adaptor proteinがDDR2と結合した。

DDR2ノックアウトマウスから分離した細胞を用い,これにDDR2遺伝子を戻してやると,wild type DDR2がコラーゲン刺激によりリン酸化され,Shcと結合することが明らかになった。さらに,MMP-2の発現がSrc kinaseを含むDDR2シグナルによって誘導されることも明らかになった。そこで,Src kinaseを抑制するために,Dominant Negative SrcをCre-loxPを備えたアデノウイルスベクターに組み込み,コラーゲンプロモーターによりCre recombinaseを発現するアデノウイルスベクターと共に,培養肝星細胞やチオアセトアミド投与障害肝モデルのラットに共感染させると肝星細胞の増殖は抑制され,このとき,同時にDDR2のリン酸化も抑制されており,障害肝モデルでの線維化も組織学的に軽減した。以上,DDR2は,Src kinaseとの相互作用により,そのシグナル伝達が制御されることを明らかにした。
視神経脊髄炎におけるアクアポリン4関連免疫病態の解明

NMOはMSとは異なり、アクアポリン4抗体によるアストロサイト障害を起因として生じる疾患である事を示し、さらにアクアポリン4抗体が生体内で実際に病原性を有する抗体であることを、中枢特異的T細胞移入ラットモデルを用いて明かにした。臨床的には、髄液中GFAP濃度が臨床的な重症度や予後を判断する有用なバイオマーカーとなりうることや、アクアポリン4抗体によって生じる特徴的な病変像・治療法について報告した。<臨床的検討:NMO疾患活動性マーカーとしてのGFAPの有用性>我々は、世界に先駆けて視神経脊髄炎(NMO)病巣においてアクアポリン4(AQP4)が欠落していることを報告したが、この結果NMOの免疫病態としては、早期からアストロサイトが障害を受けるのに対して、脱髄は二次的に生じていることが示唆された。そこで、NMO患者におけるアストロサイト障害ならびに髄鞘障害を臨床的に検討することを目的に、アストロサイト障害マーカーとして髄液中GFAP、S100Bを、脱髄マーカーとして髄液中MBPを測定し、それぞれ臨床評価項目との関連解析を実施した。その結果、NMOの髄液中GFAP濃度(2476.6±8815.0ng/ml)は多発性硬化症(MS)における髄液中GFAP濃度(0.8±0.4ng/ml)と比較して圧倒的に有意に高く、一方髄液中MBP濃度には有意差が認められなかった。NMOにおける髄液中GFAP濃度は、臨床的障害度(EDSS)や脊髄病変長とも強く相関が認められ、臨床的指標として適当であると考えられた。これらの結果から、急性期におけるNMOの病態はMSとは異なる圧倒的なアストロサイト障害を背景にして生じていることが示唆され、MSにおける脱髄とは異なる病態を有することが示唆された。<アクアポリン4抗体は病原性を有する抗体である>AQP4抗体の病原性の有無を知る上では、AQP4抗体による細胞モデルや動物モデルを解析することが不可欠である。In vitroの検討では、ヒト一次培養アストロサイトを用いて、患者血清から抽出したIgGを補体介在性・非介在性に作用させ、抗アクアポリン4抗体による細胞障害の有無を検討した。その結果、アクアポリン4抗体は補体介在性に壊死性細胞障害を誘導することや、補体非依存性にアストロサイト足突起を縮退させ細胞形態を変化させることが判明し、アクアポリン抗体による細胞障害は、補体介在性・非介在性の病態があることが示唆された。我々はVienna Univ.との共同研究により、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のミエリン特異的T細胞による自然発症モデルに、NMO患者血清から抽出したIgGを腹腔内投与し、NMO患者の病理学的特徴を再現できるかを検討した。その結果、患者血清から抽出したアクアポリン4抗体によりアクアポリン4およびGFAPの脱落病変が主に灰白質周辺に再現良く生じることが見出された。これらのNMO病理は、血液脳関門が脆弱な幼少期などでは発症せず、単純に血液脳関門を越えるだけではない免疫病態の関与が示唆された。これらの結果から、抗アクアポリン4抗体は病原性を有するNMOに関連した因子であることが強く示唆され、その事実を国際誌・国際学会で発信し、この分野に貢献できていると考えている。今後は、この抗体の産生機序や治療法の開発などを含めて、さらに研究の発展を続けていく予定である。<アストロサイトの疾患活動性マーカー>NMOは、病理学的にはアストロサイトの傷害が関連するアストロサイトパチーであることは判明したが、これまで臨床的に評価することはできなかった。我々は、髄液中のアストロサイト関連淡白GFAPを測定することにより、NMOでは多発性硬化症と比較して有意に上昇し、感度・特異度ともに90%以上という有用な診断マーカーとなりうることを示した。また、髄液中GFAP濃度は、NMO患者の臨床的重症度や予後とも正の相関を示すことから、臨床的に有用なマーカーであることを示した。また、中枢特異的な疾患と考えられている中で、先行してミオパチーを来たす例があることを報告し、AQP4抗体によって起こる病態の理解に幅広く貢献した。<In vivoやIn vitroモデルによる視神経脊髄炎の病態解析>NMO病巣においては、AQP4およびGFAPは、病変の早期から慢性期にかけて染色性が低下もしくは消失していたが、髄鞘は早期病変においては比較的保たれていた。一方、多発性硬化症(MS)においては、AQP4、GFAPともに脱髄病変部でむしろ発現は亢進しており、明らかにNMOとMSの病理学的特徴は相反するパターンであった。この結果NMOの免疫病態としては、早期からアストロサイトが障害を受けるのに対して、脱髄は二次的に生じている可能性が示唆された。患者血清を用いたIn vivo及びIn Vitroモデルを作成し、NMOはMSとは異なり、アストロサイトの障害を起因として生じる疾患である事が示唆した。

In vivoでは、患者血清より抽出した免疫グロブリンがラット脳脊髄においてAQP4の脱落や脱髄を生じることを示し、その中でアストロサイトの変性は脱髄より先んじて生じ、二次的に脱髄を起こすことを示した。またIn vitroではAQP4抗体が直接的にアストロサイトの細胞膜上のAQP4を変性させて細胞内に取り込ませることを、リアルタイムにビデオで撮影することに世界で初めて成功し、その病態を明かにした。
初代培養神経虚血モデルにおける低温及び復温の神経細胞への影響について

1.【目的】虚血に対する低温の神経保護作用についてin vitro神経細胞傷害モデルで検討した2.【方法】(1)培養開始後7-14日のラット海馬初代培養細胞を実験に用いた。(2)種々の濃度のグルタミン酸を37°Cで15分負荷し、37°Cで24時間培養を継続し生存細胞数を算定した(3)種々の濃度の代謝阻害剤iodoaceatate(IAA)を37°Cで5分間負荷し、負荷後37°Cで24時間培養を継続し生存細胞数を算定した。培養液の低温下による神経細胞保護作用についてはIAA負荷後の30分間を30°Cとし生存細胞数を算定した。3.【結果】(1)37°Cでグルタミン酸を15分負荷したところ、100μMにおいて有意な神経細胞傷害を認めた。(2)30°Cでグルタミン酸を15分負荷しても、低温化による神経保護作用は認められなかった。(3)37°CでIAAを培養神経細胞に5分間作用させるとIAAの濃度依存性に細胞死の発現をみた。(4)IAA負荷終了後の30分間を30°Cにすると細胞死の発現は有意に抑制された。4.【結論】(1)グルタミン酸が負荷されると培養液を低温としても神経保護効果のないことが判明した。(2)IAA負荷に対する低温による神経保護作用はhydroperoxideが関与するoxidative stressを抑制する点にその作用機序があるものと思われた。培養神経細胞を用いたin vitro実験系で、低温の神経保護作用のメカニズムについて検討した。1、<方法>(1)ラット海馬初代培養神経細胞の樹立。胎生1719日のラット胎仔脳の海馬から初代培養神経細胞を樹立し、培養開始後1014日の神経細胞を実験に用いた。(2)グルタミン酸による神経細胞傷害。種々の濃度のグルタミン酸(10μM,100μM,1mM)を、海馬培養神経細胞に、37°Cあるいは30°Cで15分間負荷し、37°C条件下で24時間培養を継続した。細胞の形態学的変化を指標に生存細胞数を算定し、細胞傷害の程度を判定した。2、<結果>(1)グルタミン酸による神経細胞傷害。37°Cの条件下で海馬神経細胞にグルタミン酸負荷を加えたところ、グルタミン酸濃度が100μM,1mMにおいて有意なものになった(2)低温による影響。30°Cの条件下においても、100μM,1mM濃度のグルタミン酸負荷は生存神経細胞を有意に減少させ、その程度は37°C条件下と同様であった。3、<考察>グルタミン酸負荷による神経細胞死の発現は、37°C条件下と同様に30°C条件下でも認められ、培養液の低温化が神経細胞に対し保護的に作用することはなかった。今回の実験結果より培養液を低温(30°C)としても、グルタミン酸負荷による神経細胞死の発現は阻止されないことが判明した。今後、他の神経細胞傷害モデルにおいて低温による神経細胞保護作用がみられるか否か検討する予定である。1、【目的】虚血に対する低体温の神経保護作用についてin vitro神経細胞傷害モデルを用いて検討した。2、【方法】(1)ラット海馬初代培養細胞を無血清培養液を用いて樹立した。培養開始後7日の神経細胞に代謝阻害剤iodoacetate(IAA)を種々の濃度(1.0、2.0、3.0mM)で5分間(37°C)負荷した。IAA負荷終了後、無血清培養液内で24時間培養(37°C)を継続し生存細胞数を算定した。培養液の低温化による神経細胞保護作用についてはIAA負荷後の30分間を30°Cとし生存細胞数を算定し検討した。

(2)IAA負荷後3時間で培養神経細胞にdichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)を取り込ませ535nm波長下でこれらの細胞の蛍光像を撮影した。3、【結果】(1)37°CでIAAを培養神経細胞に5分間作用させると24時間後にはIAAの濃度依存性に細胞死の発現をみた。しかしIAA負荷終了後の30分間を30°Cにすると細胞死の発現は有意に抑制された。(2)培養細胞内のdichlorofluorescein(DCF)はIAA負荷終了後3時間で検出された。一方、IAA負荷終了後の30分間を30°Cにすると細胞内DCFの検出は不良となり培養液の低温化はhydroperoxideの生成を抑制するものと思われた。4、【結論】低温による神経保護作用はhydroperoxideが関与するoxidative stressを抑制する点にその作用機序があるものと思われた。
マガキの流通過程における品質変化に関する研究

マガキは水揚げ後の流通過程において、空気に暴露され、生きた丸貝として輸送、保存される。その間、大きな温度変化に加えて、数時間、ときには数週間低酸素状態に晒される。このような状態で長期間生存できる低酸素耐性などのストレス応答能力は、マガキが浅海に生息する固着性二枚貝であり、潮汐により空気中に露出するなど、様々なストレス条件下に置かれることから遺伝的に獲得してきたものであろう。しかし、それらの輸送中に晒されるストレスへの応答機構の詳細はほとんどわかっていない。また、マガキの流通過程を想定した空気中保存による低酸素状態の進行に伴って増減を示すタンパク質を2次元電気泳動法により検出・同定した。ストレスを与えたマガキ組織においていくつかの増減を示すタンパク質スポットを確認した。それらのタンパク質のN末端および内部アミノ酸配列情報をもとにデータベース検索を行い、それらタンパク質の同定に成功した。また、ストレスに応答して発現量の変動するタンパク質のマガキOgu1を認めた。部分アミノ酸配列をもとに完全長cDNAをクローニングしところ、マガキOgu1は343アミノ酸よりなり、等電点6.7、分子量38kの新規タンパク質であった。その間、数時間、ときには数週間低酸素状態に晒される。このような状態で長期間生存できる低酸素耐性能は、マガキが浅海に生息する固着性二枚貝であり、潮汐により空気中に露出するなど、低酸素状態にしばしば置かれることから遺伝的に獲得してきたものであろう。しかし、この低酸素耐性機構の詳細はほとんどわかっていない。本研究では、マガキの流通過程を想定し、空気中保存による低酸素状態の進行に伴って増減を示すタンパク質を検出・同定してマガキの低酸素耐性機構の一端を明らかにすること、さらに、それらのタンパク質の発現をマガキのストレス程度判定指標に応用することを目的としている。本年度は空気中保存に伴い増減するタンパク質の検出、ならびにこれまでに報告者がクローニングした一連のストレスタンパク質に関してそのmRNAのストレスに伴う発現を検討した。福井県小浜湾産活マガキ(Crassostrea gigas)を水揚げ後、4°C、20°Cそれぞれの空気中で保蔵し、低酸素ストレスを与えた。開殻後、閉殻筋、体幹部、鰓、外套膜を切り取り、PBS(4% TritonX-100、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む)中でホモジナイズした。遠心分離して得た上清にトリクロロ酢酸を加えタンパク質を沈殿させた。これをIPG(Immobilized pH gradient)ゲル膨潤溶液(8M尿素、2%CHAPS、0.5%IPG Buffer)に溶解したものを二次元電気泳動に供した。また、ストレスタンパク質HSP70ファミリーmRNAの発現をノーザンブロット分析により検討した。ストレスを与えたマガキの体幹部、鰓においていくつかの増減を示すタンパク質スポットを確認した。体幹部では、20°Cで3日保蔵の個体および4°Cで10日保蔵の個体において、44.6kDa・5.0pIのスポットの消失および、44.6kDa・5.13pIのスポットの出現が確認された。鰓では、4°Cで1-5日保蔵および20°Cで2日保蔵の個体において34.5kDa・6.5pIのスポットの出現が確認された。また、HSP70ファミリーmRNAは空気中保存により発現量が増加することが示された。このような状態で長期間生存できる低酸素耐性能は、マガキが浅海に生息する固着性二枚貝であり、潮汐により空気中に露出するなど、低酸素状態に置かれることで遺伝的に獲得してきたものであろう。本年度は、マガキの流通過程を想定した空気中保存による低酸素状態の進行に伴って増減を示すタンパク質を検出・同定することを目的とした。福井県小浜湾産活マガキ(Crassostrea gigas)を用いた。水揚げ後、4°C、20°Cそれぞれの空気中で保蔵し、マガキに低酸素ストレスを与えた。

また、海水から取り出した後、直ちに実験に供したものをコントロールとした。開殻後、閉殻筋、体幹部、鰓、外套膜を切り取り、PBS(4%TritonX-100、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む)中でホモジナイズした。遠心分離して得た上清にトリクロロ酢酸を加えタンパク質を沈殿させた。これをIPG (Immobilized pH gradient)ゲル膨潤溶液(8M尿素、2%CHAPS、0.5%IPG Buffer)に溶解したものを二次元電気泳動に供した。ストレスを与えたマガキの体幹部、鰓においていくつかの増減を示すタンパク質スポットを確認した。体幹部では、20°Cで3日保蔵の個体および4°Cで10日保蔵の個体において、44.6kDa・5.0pIのスポットの消失および、44.6kDa・5.13pIのスポットの出現が確認された。また、鰓では、4°Cで1-5日保蔵および20°Cで2日保蔵の個体において34.5kDa・6.5pIのスポットの出現が確認された。現在それらのタンパク質のN末端および内部アミノ酸配列決定、およびcDNAクローニングを行っている。マガキは水揚げ後の流通過程において、空気に暴露され、生きた丸貝として輸送、保存される。その間、数時間、ときには数週間低酸素状態に晒される。このような状態で長期間生存できる低酸素耐性能は、マガキが浅海に生息する固着性二枚貝であり、潮汐により空気中に露出するなど、低酸素状態に置かれることで遺伝的に獲得してきたものであろう。しかし、この低酸素耐性機構の詳細はほとんどわかっていない。本年度は、マガキの流通過程を想定した空気中保存による低酸素状態の進行に伴って増減を示すタンパク質を検出・同定した。福井県小浜湾産活マガキ(Crassostrea gigas)を水揚げ後、4°C、20°Cそれぞれの空気中で保蔵した.また、海水から取り出した後》直ちに実験に供したものをコントロールとした。開殻後、閉殻筋、体幹部、鯉、外套膜を切り取り、PBS中でホモジナイズした。これをIPGゲル膨潤溶液に溶解したものを二次元電気泳動に供した。それらのタンパク質のN末端および内部アミノ酸配列情報をもとにデータベース検索を行い、それらタンパク質の同定に成功した。また、アミノ酸配列情報からは相同性のあるタンパク質が認められなかった新規タンパク質(Ogu1)に関しては、縮重プライマーを用いた5'-および3'-RACE法によりcDNAクローニングを行った。その結果、poly A tailを含めて1260bpの完全長cDNAのクローニングに成功した。マガキOgu1は、343アミノ酸よりなり、等電点6.7および分子量38kであった。マガキOgu1の塩基および演繹アミノ酸配列をBLASTおよびFASTAアルゴリズムを用いた相同性検索に供したが、これまでに各種データベースに報告されているタンパク質とは高い相同性は認められなかった。また、モチーフ検索においても顕著な機能やモチーフを想定できなかった。
βバレルタンパク質表面を分子認識場としたアミロイド性タンパク質の機能制御

研究代表者はこれまでに、[○!R]バレルタンパク質の分子表面にアミロイド様構造をもつように設計した改変タンパク質が、標的のアルツハイマー病アミロイド[○!R]ペプチド(A[○!R])と強く結合することを見出した。本研究では、このタンパク質設計手法を用いて、Aβの神経細胞毒性の抑制について評価した。またハンチントン病関連ポリグルタミンタンパク質を標的とした研究へと展開した。タンパク質のミスフォールディングは、アルツハイマー病等の種々の神経変性疾患に深く関与している。このタンパク質のミスフォールディングの機構解明やミスフォールディングを阻害する分子の構築は、アルツハイマー病等の神経変成疾患の治療や予防に繋がるものと期待される。本研究代表者はこれまでに、βバレル構造をもつ緑色蛍光タンパク質(GFP)表面にアルツハイマー病アミロイドβペプチド(Aβ)のアミロイド構造を模倣した表面を人工的に構築し、それがAβの集合化阻害能をもつことを報告している。本研究では、この方法論で構築した擬アミロイド提示タンパク質を使って、アルツハイマー病の発症を引き起こすAβの神経細胞毒性に対する効果および作用機序について明らかにすることを目的とした。GFP表面にAβ様アミロイド構造を提示した擬Aβ提示GFPを用いて、Aβの集合化の阻害と神経細胞毒性に対する抑制作用について、神経細胞モデルであるラット副腎褐色細胞腫PC12細胞を用いて評価した。試験管内で調製した単量体Aβと擬Aβ提示GFPを混合し、インキュベート後にその溶液をPC12細胞に作用させ、Aβ集合体の毒性によるPC12細胞の細胞死を解析した。その結果、擬Aβ提示GFP非存在下に対し、擬Aβ提示GFPを混合することで、AβによるPC12細胞の細胞死が顕著に抑制された。このことから、擬Aβ提示GFPが、実際に神経細胞に対して毒性を示すようなaβの集合化を顕著に抑制していることが明らかとなった。これまでに、アミロイド構造を模倣した分子表面をもつ擬Aβ提示タンパク質によるAβの集合化阻害およびAβの神経細胞毒性の抑制について評価した。その結果、特定のモデル神経細胞に対して、擬Aβ提示タンパク質がAβの集合体形成を阻害することで、その細胞毒性を抑制できることを明らかにした。そこで、擬アミロイド提示タンパク質を用いる手法のアルツハイマー病Aβ以外での拡張を目指し、ポリグルタミン(polyQ)タンパク質を標的とした研究を行った。擬Aβ提示タンパク質の設計手法に基づき、GFPのβバレル表面にpolyQ様アミロイド構造を提示した擬polyQ提示GFPを設計・調製し、得られたタンパク質の構造特性や安定性等の性質について検討した。また標的となるハンチントン病モデルとして、種々のグルタミン鎖長をもつpolyQタンパク質を設計・構築し、擬polyQ提示GFPとの相互作用について解析を行った。構築した擬polyQ提示GFPとpolyQタンパク質との結合力は、polyQタンパク質のグルタミン鎖長に依存して強くなることが分かった。また擬polyQ提示GFPは、適度に会合したpolyQタンパク質により強く結合することも明らかとなった。以上から、βバレルタンパク質表面を分子認識場として用いる擬アミロイド提示タンパク質の有用性が明らかとなった。
分子生物学手法を用いた全身麻酔薬と中枢性GABA_A受容体との相互作用の解明

全身麻酔薬は、120年以上臨床上使用されているが、いくつかの麻酔機序学説が提出されてきたにもかかわらず、全身麻酔薬の作用機序が未だ解明されていない。しかし、近年、全身麻酔薬と蛋白と特異的相互作用が注目され、特に中枢性GABA A受容体(シナプス後膜)が臨床上の麻酔作用との相関の良さという点から麻酔薬の主たる作用部位と考えられるようになっている。多くの全身麻酔薬(静脈麻酔薬及び揮発性麻酔薬)はGABA A受容体との相互作用として、C1チャンネルを直接開く作用(GABAアゴニスト様作用)とGABAで開いたチャンネルを増強させる作用(GABA増強作用)を示す。本研究の目的は、分子生物学的手法を用い、マウス脳からクローニングされたGABA A受容体の各種サブユニットcDNAをアフリカツメカエルの卵母細胞に発現させ、電気生理学手法により、全身麻酔薬との相互作用、すなわちa)GABAアゴニスト様作用b)GABA増強作用に関して、以下のことを検討するのが目的である。1)サブユニット特異性、2)キメラサブユニット、点変異サブユニット作製による作用部位を分子レベルで特定することであった。2年間の研究期間中に、我々は、1)GABA A受容体のキメラサブユニットによる研究により、静脈麻酔薬プロポフォールのGABA増強作用の作用部位がα1サブユニットの親水性NH2末端部位に存在することを証明した。2)GABA A受容体β2サブユニットの点変異(157番目チロシン→フェニルアラニン)によりGABAに対する親和性変化したGABA A受容体を用いた研究により、静脈麻酔薬(プロポフォール、エトミデイト、ペントバルビタール)のGABAアゴニスト様作用の作用部位は、GABAと異なること、またこれら麻酔薬のGABA増強作用は、GABAアゴニスト様作用の作用部位と異なることを明らかにした。本研究の目的は、分子生物学手法によりクローニングしたGABA_A受容体をアフリカツメカエルの卵母細胞に発現させ、電気生理学的に全身麻酔薬(静脈及び揮発性麻酔薬)との相互作用を検討することである。本年度(平成8年)は、マウス脳からクローニングしたGABA_A受容体サブユニット(テキサス大学Yang博士から供与)のアフリカツメカエル卵母細胞発現系を確立すると共に、PCR法によりβ2サブユニットの第157位チロシンをフェニルアラニンに点変異したサブユニット(Amin,Nature 1993)を作成した。この点変異したβ2サブユニットをα1とγ2サブユニットとともに発現させ、全身麻酔薬との相互作用、すなはち、1、GABAアゴニスト作用と2、GABA増強作用について、2電極固定法によりC1-電流を測定することにより、以下の新しい知見を得た。1に関して、GABAと全身麻酔薬の用量反応曲線よりED50を算出した。GABAについては、非点位と点位は、各々、20.3と1845(μM)と有意に変化した。しかし、ペントバルビタール、エトミデ-ト、プロポフォールについては、各々、非点位と点位で、325と320、11,2と13,2、24、0と80、1(μM)であり、点変異の影響は、GABAに比して小さかった。2に関してED20の相当するGABAによるC1-電流に対する麻酔薬(ペントバルビタール、エトミデ-ト、プロポフォール)の増強作用は、点変異の影響は認められなかった。以上の結果により、GABAアゴニスト作用の関して、上記全身麻酔薬とGABAはGABA_A受容体での作用部位が異なること、また全身麻酔薬のアゴニスト作用と増強作用の作用部位が異なることが示唆された。

これらの研究成果は、大学院生の深見が平成9年4月の日本麻酔学会総会での発表予定である。全身麻酔薬は、120年以上臨床上使用されているが、いくつかの麻酔機序学説が提出されてきたにもかかわらず、全身麻酔薬の作用機序が未だ解明されていない。しかし、近年、全身麻酔薬と蛋白と特異的相互作用が注目され、特に中枢性GABAA受容体(シナプス後膜)が臨床上の麻酔作用との相関の良さという点から麻酔薬の主たる作用部位と考えられるようになっている。多くの全身麻酔薬(静脈麻酔薬及び揮発性麻酔薬)はGABAA受容体との相互作用として、C1チャンネルを直接開く作用(GABAアゴニスト様作用)とGABAで開いたチャンネルを増強させる作用(GABA増強作用)を示す。本研究の目的は、分子生物学的手法を用い、マウス脳からクローニングされたGABAA受容体の各種サブユニットcDNAをアフリカツメカエルの卵母細胞に発現させ、電気生理学手法により、全身麻酔薬との相互作用、すなわちa)GABAアゴニスト様作用b)GABA増強作用に関して、以下のことを検討するのが目的である。1)サブユニット特異性、2)キメラサブユニット、点変異サブユニット作製による作用部位を分子レベルで特定することであった。2年間の研究期間中に、我々は、1)GABAA受容体のキメラサブユニットによる研究により、静脈麻酔薬プロポフォールのGABA増強作用の作用部位がα1サブユニットの親水性NH2末端部位に存在することを証明した。2)GABAA受容体β2サブユニットの点変異(157番目チロシン→フェニルアラニン)によりGABAに対する親和性変化したGABAA受容体を用いた研究により、静脈麻酔薬(プロポフォール、エトミデイト、ペントバルビタール)のGABAアゴニスト様作用の作用部位は、GABAと異なること、またこれら麻酔薬のGABA増強作用は、GABAアゴニスト様作用の作用部位と異なることを明らかにした。
ATPの非神経性遊離とそのシナップス調節機構への関与

非神経性に遊離したATPの生理的役割を明らかにするために計画された実験によって得られた結果を以下に示すように項目別にまとめて報告する。後シナップス性遊離ATPのectoenzymeによる代謝実験モルモット精管および回腸縦走筋標本をbath中に懸垂し、これにATP(10^<-7> M)を加えてその経時的変化をIuciferin-Iuciferase法で測定した結果、いずれの標本でも投与後15分でほぼATPは完全に失活した。両標本でのATP減衰曲線に対してecto-ATPase阻害剤(FSBAとDFDNB)およびecto-5'-nucleotidase阻害剤(α,β-methylene ADP)はほとんど影響しなかった。一方、両標本からの刺激薬による遊離ATPい対して、これら阻害剤はほとんど影響せず、DFDNBはむしろ逆に抑制を示したが、これは、平滑筋からのATPの遊離阻害に基づくものと考えられる。後シナップス性遊離ATPによるACh遊離抑制実験モルモット回腸縦走筋標本の電気刺激によるACh遊離をHPLC-ECD法で測定し、これに対するα,β-methylene ATP(α,β-mATP,P_2-受容体刺激薬)の効果を検討したところ、本剤はACh遊離を抑制した。この抑制作用はtheophylline(P_1-受容体遮断薬)によって、さらにはsuramin(P_2-受容体遮断薬)およびα,β-methylene ADPによって拮抗された。またα,β-mATP存在下の同標本からのATP遊離実験でこれは、Ca^<2+>除去やatropineで影響されず、suraminによって拮抗されることにより、P_2-受容体刺激による平滑筋由来のATP遊離であることが確認された。従ってこれらの結果から、副交感神経からのACh遊離にα,β-mATPによる抑制作用のメカニズムとして、本剤が後シナップスP_2-受容体を刺激し、非神経性にATPを遊離させ、このATPはectoenzymesによってadenosineまで代謝され、このadenosineが副交感神経終末のP_1-受容体に作用して、いわゆるtranssynaptic neuromodulationを引起したものと考えられる(Life Sci.53,911,1993)非神経性に遊離したATPの生理的役割を明らかにするために計画された実験によって得られた結果を以下に示すように項目別にまとめて報告する。従ってこれらの結果から、副交感神経からのACh遊離にα,β-mATPによる抑制作用のメカニズムとして、本剤が後シナップスP_2-受容体を刺激し、非神経性にATPを遊離させ、このATPはectoenzymesによってadenosineまで代謝され、このadenosineが副交感神経終末のP_1-受容体に作用して、いわゆるtranssynaptic neuromodulationを引起したものと考えられる(Life Sci.53,911,1993)ATPの神経機能に関する研究は、現在、神経伝達物質として自律神経終末より遊離する可能性について多くの関心を集めている。報告者らは最近、ATPがα_<1->受容体およびM_<3->受容体刺激により各種平滑筋組織より非神経性に遊離することを見い出して来た。本研究において、このような受容体刺激により遊離したATPの代謝へのectoenzymeの関与、さらにはectoenzyme阻害剤などの影響について検討を行った。実験は、常法通り遊離ATPをluciferin-luciferase法によって定量した。モルモット摘出精管および回腸縦走筋標本において、それぞれnoradrenalineおよびbethanechol刺激によって引起こされるATP遊離に対してectoATPase阻害剤の1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzene(FFD)および5'-fluorosulfonylbenzoyl adenosine(FSBA)は予期に反して、全く増加せず、むしろFFDはいずれも著しく抑制した。

また、5'-nucleotidase阻害剤であるα,β-methylene ADPおよびadenosine取込み阻害剤のdipyridamoleによって、これらのATP遊離はほとんど影響を受けなかった。しかしながら、外液に加えられたATP(0.1μM)の経時的な減衰は両標本共にほぼ同程度(t_<1/2>=約1.7min)に見られたことより、ectoenzyme活性の存在は確認された。従って、以上の結果からこれらの被験薬は平滑筋由来のectoenzymesに対してほとんど阻害効果を有しないものと考えられる。ところで、FFDは、外因性ATPの分解には全く影響せず、受容体刺激時のATP遊離のみを特異的に抑制することより、本剤は、ATPの非神経性遊離機構の解明に対して有効なtoolとなる可能性が示唆されるので、現在、平滑筋由来のATP遊離に対するFFDの抑制作用機序の詳細な検討を行なっている。平成5年度の研究は伝達物質受容体刺激により非神経性に遊離したATPの生理的役割を明らかにする目的で以下の実験が行われた。モルモット回腸縦走筋標本の電気刺激によるACh遊離をHPLC-ECD法で測定し、これに対するalpha,beta-methylene ATP(alpha,beta-mATP,P_2-受容体刺激薬)の効果を検討したところ、本剤はACh遊離を抑制した。この抑制作用はtheophylline(P_1-受容体遮断薬)によって、さらにはsuramin(P_2-受容体遮断薬)およびalpha,beta-methylene ADP(ecto-5′-nucleotidase阻害剤)によって拮抗された。またalpha,beta-mATP存在下の同標本からのATP遊離実験で、これは、Ca^<2+>除去やatropineで影響されず、suraminによって拮抗されることより、P_2-受容体刺激による平滑筋由来のATP遊離であることが確認された。従ってこれらの結果から、副交感神経からのACh遊離にalpha,beta-mATPによる抑制作用のメカニズムとして、本剤が後シナップスP_2-受容体を刺激し、非神経性にATPを遊離させ、このATPはectoenzymesによってadenosineまで代謝され、このadenosineが副交感神経終末のPP_1-受容体に作用して、いわゆるtrans-synapticneuromodulationを引起したものと考えられる(Life Sci.53,911,1993)。次いで、モルモット心房筋の電気刺激実験で、isoproterenolおよびforskolinによって収縮力の増大とATP遊離の増加が見られたが、同じく心室筋では、これらの刺激によって収縮力は増大したにもかかわらずATP遊離はほとんど変化しなかった。一方、心房筋標本へのadenosine投与では1100muMまで濃度依存性に収縮力の抑制を示したが、心室筋に対してはadenosineの100muMでも全く収縮抑制は認められなかった。これらのことより、心房筋から遊離したATPは細胞外のectonucleotidasesによってadenosineに分解され、これがP_1-恐らくA_1-受容体を介して収縮抑制を示したものと考えられる(Life Sci.53,961,1993)。
戦後韓国における「分断イデオロギー」教育の形成と展開―教科書・体験学習を中心に―

平成30年度には、韓国の『2015改訂教育課程道徳科教育課程』や『道徳2』における「統一教育」について考察した。戦後における「統一教育」は、「反共・安保教育」から「統一教育」へ移行していく第5次教育課程期には、「統一・安保教育」という内容変更が行われた。その後、第6次教育課程期に入り、「統一教育」は実質的な南北関係における状況を克服するために変更されていく。第7次教育課程からは、2000年南北首脳会談の影響もあり、安保的な価値よりは民族の和解という側面が強調されるようになる。2009改訂にいたっては、南北間の「民族協調」よりは、「米韓協調」が重視される内容になり、世界的な普遍性を求める傾向があらわれた。さらに、2015改訂教育課程期には、平和統一に向けた新たなビジョンが掲げられ、「平和・統一教育」を目指す方向へと変化するようになる。『2015改訂教育課程道徳科教育課程』では、北朝鮮に対するバランスのある理解、統一の意味と価値を考えさせる単元内容と目標が掲げられており、この教育課程に基づき、2018年度に新しく発行された『中学校道徳2』教科書は、全部9種類にわたる。これらの教科書は、出版社によって様々な特徴がみられた。共通してみられる特徴の中で最も注目すべきところは、統一教育院側からも指摘されている、若い世代に存在する「統一への実現意志(統一意識)離れ」に対する対策教材であった。各教科書では、「韓半島の統一価値」を分断背景から学ぶ歴史・民族的な側面だけではなく、「北韓住民の人権」を回復させるための人道主義的な側面、統一国家がもたらす経済的・文化的な効果などの側面、ひいては世界平和への貢献という側面からもその価値を位置づけている。なお、韓国の「道徳科」教科書における「統一教育」には、多文化社会という時代の流れの中で新たな課題が問われていると考えられる。本研究は、平成29年度32年度の4年計画のものであるが、平成29年度には、初等教育を中心とした内容が分析でき、平成30年度には、中等教育(とりわけ、中学校における教育課程と教科書)における「統一教育」について資料を収集、考察することができた。なお、毎年、その研究成果を日本比較教育学会(全国大会)で発表し、大学の紀要においても論文として公開できているため、おおむね順調に進展しているといえる。平成31年度には、この年に新たに発行される初等学校56年生用の教科書(道徳科)を収集し分析する。なお、平成30年度に一部収集できた戦後の道徳科教科書(初等学校、中学校)の分析とともに、収集できなかった残りの教科書も収集しつつ、残りの研究期間を考慮しながら、平成32年度のまとめ研究の準備をしておきたい。平成29年度には、韓国の『2015改訂教育課程』に基づき開発された初等学校12年生用の新しい統合教科書と『安全な生活』を検討した。統合教科書の特徴は、以下の3点にまとめられる。1.新しい統合教科書は、主題別の教科書として開発された。2.統合学習用の学習資料(教材)として、様々な体験活動ができる教材である。3.学生と教師が「作っていく」教科書である。とりわけ、「作っていく」教科書という特徴は、統合教科書のもっとも重要なポイントでもある。既存の教育課程では、到達基準に適切な内容及び活動を指定していたが、改訂教育課程では、到達基準だけを提示することにした。これにより、教師は学習主体と到達基準を考慮し、クラスや学生に合った内容や活動、方法などを設定できるようにした。統合教科書『冬1ー2』の中でも、「上位主題」である「国」や「下位主題」の「わが国」、(朝鮮半島における南北の)「統一」に関する項目を取り上げたが、ここでは、全体を通して「体験活動」学習をさせていることがわかった。また、『2009改訂教育課』の教科書に比べ『2015改訂教育改訂』の統合教科書の方が、単純なナショナリズム教育ではなく、「統一教育」まで視野に入れた教育を展開している点は、まさに新しい統合教科書の特徴であると言える。なお、『2015改訂教育課程』において、教科(群)とは別に設定されている「創意的な体験活動」を支えると期待されているものが、学校教育の外側にある「体験活動」関連施設で行われている教育プログラムや副教材による学習であることは看過できない。これらの教育プログラムや副教材は、学校教育以上に生活に根付いた感じで、学生の他、家族(保護者)向けのプログラムなども充実しており、多様なグループにも対応できる戦略的な構成となっていることを注目すべきである。本研究は、平成29年度32年度の4年計画の研究テーマであるが、初年度である平成29年度には、『2015改訂教育課程』や初等学校の統合教科書が収集でき、その成果を学会(全国大会)で発表し、大学の紀要においても論文としても公開できたため、おおむね順調に進展していると言える。

2009改訂にいたっては、南北間の「民族協調」よりは、「米韓協調」が重視される内容になり、世界的な普遍性を求める傾向があらわれた。さらに、2015改訂教育課程期には、平和統一に向けた新たなビジョンが掲げられ、「平和・統一教育」を目指す方向へと変化するようになる。『2015改訂教育課程道徳科教育課程』では、北朝鮮に対するバランスのある理解、統一の意味と価値を考えさせる単元内容と目標が掲げられており、この教育課程に基づき、2018年度に新しく発行された『中学校道徳2』教科書は、全部9種類にわたる。これらの教科書は、出版社によって様々な特徴がみられた。共通してみられる特徴の中で最も注目すべきところは、統一教育院側からも指摘されている、若い世代に存在する「統一への実現意志(統一意識)離れ」に対する対策教材であった。各教科書では、「韓半島の統一価値」を分断背景から学ぶ歴史・民族的な側面だけではなく、「北韓住民の人権」を回復させるための人道主義的な側面、統一国家がもたらす経済的・文化的な効果などの側面、ひいては世界平和への貢献という側面からもその価値を位置づけている。なお、韓国の「道徳科」教科書における「統一教育」には、多文化社会という時代の流れの中で新たな課題が問われていると考えられる。本研究は、平成29年度32年度の4年計画のものであるが、平成29年度には、初等教育を中心とした内容が分析でき、平成30年度には、中等教育(とりわけ、中学校における教育課程と教科書)における「統一教育」について資料を収集、考察することができた。なお、毎年、その研究成果を日本比較教育学会(全国大会)で発表し、大学の紀要においても論文として公開できているため、おおむね順調に進展しているといえる。平成30年度には、この年に新たに発行された初等学校3年生・4年生用の教科書(国語・道徳・社会)を収集し、分析を行う。とりわけ、「分断イデオロギー」や「統一教育」という側面から分析を行う。なお、新しく改訂される前の教科書の収集にも力をいれ、韓国の戦後において、「分断イデオロギー」というものが教科書の中でどのように変化・定着されてきたかを、残りの研究期間を考慮しながら、前段階として準備しておきたい。平成31年度には、この年に新たに発行される初等学校56年生用の教科書(道徳科)を収集し分析する。なお、平成30年度に一部収集できた戦後の道徳科教科書(初等学校、中学校)の分析とともに、収集できなかった残りの教科書も収集しつつ、残りの研究期間を考慮しながら、平成32年度のまとめ研究の準備をしておきたい。