hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中心体過剰複製・染色体不安定性の誘導による悪性グリオーマの放射線増感機序の解明

ヒト悪性グリオーマ培養細胞を使い、染色体不安定性(中心体過剰複製)とSurvivinが放射線感受性に及ぼす影響を調べた。p53変異U251MG細胞はSurvivinの発現を抑制すると速やかに中心体が過剰複製されて放射線感受性が高まるが、p53野生型D54MG培養細胞は、Survivinの発現抑制後しばらくして中心体過剰複製が始まって放射線感受性が高まった。いずれの細胞もアポトーシスでは無い分裂期崩壊による細胞死が引き起こされた。臨床面でも、Survivinの細胞内局在が悪性グリオーマの治療予後に関与することを示し、染色体不安定性やSurvivinは、グリオーマ治療の重要な因子と考えられた。本年度は、RNAi法を用いたsurvivin発現抑制による悪性グリオーマ細胞の放射線増感機序についてさらに検討を進めた。実験には悪性グリオーマ細胞株U251MG(p53,変異型survivinの抑制により、染色体の不安定性の程度に比例して放射線感受性が増加することが示された。またこの効果はp53の機能の違いにより影響されることも判明した。さらにTUNEL法によるアポトーシスの評価では、survivin抑制後の放射線誘発細胞死はアポトーシスによるものではなく、細胞周期解析の結果からは異数倍体の状態から直接細胞死、publishされた(Saito, et. al., British Journal of Cancer 98, 2008)。現在、histone-GFP plasmidの導入による生細胞の核形態のタイムラプス観察を行い、細胞死の動的解析を行っている。また研究分担者の松浦と泉は、既にスピンドルチェックポイント蛋白であるMad 2に局在を示すGFPベクターと中心体複製の調節因子であるAurora Bに局在を示すGFPベクターを開発しており、今後、survivin抑制によるスピンドル形成あるいは中心体複製への影響についても、蛍光顕微鏡によるタイムラプス観察により、動的な解析を進めていく方針である。本年度は、培養細胞を用いて、RNAi法を用いたsurvivin発現抑制による悪性グリオーマ細胞の放射線増感機序についてさらに検討を進めた。実験には悪性グリオーマ細胞株U251MG(p53,変異型),D54MG(p53,野生型)を用いた。中心体の蛍光免疫染色、FISH法による解析では、survivinの抑制により、染色体の不安定性の程度に比例して放射線感受性が増加することが示された。さらにTUNEL法によるアポトーシスの評価では、survivin抑制後の放射線誘発細胞死はアポトーシスによるものではなく、細胞周期解析の結果からは異数倍体の状態から直接細胞死が誘導されており、分裂期崩壊等によることを示した。今回の研究で,悪性グリオーマ細胞におけるsurvivinの抑制により中心体数および染色体不安定性が増加することが判明した。従来、染色体不安定性は悪性性格の獲得に関与するとされていたが、我々の検討では過度の染色体不安定性の導入は、逆に放射線感受性を増加させることが示唆された。またこの効果は短期の評価において、p53のstatusの違いにより影響されることも判明した。さらにsurvivin抑制後の放射線誘発細胞死はアポトーシスによるものではなく、細胞周期解析の結果からは異数倍体の状態から直接細胞死が誘導されており、分裂期崩壊等によることが示唆された。またこれまでに我々は、悪性グリオーマ細胞においてp16などの細胞周期調節因子を強制発現させると、放射線照射後細胞周期はG1期に停止し細胞増殖抑制効果を示し、細胞分裂の異常よると考えられる多核化などの核異常を伴って、遅発性放射線細胞死が活発に引き起こされることを報告したが、p16を強制発現させた悪性グリオーマ細胞においても中心体染色を行ったところ、やはり過剰複製を認めた。これらの結果は、多核化を伴う放射線誘発細胞死と染色体不安定性との間に相関があることをさらに強く示唆するものと考えられた。近年、悪性グリオーマ細胞の放射線感受性にStem like cellが強く関与していることが示唆されていることから、本年度は悪性グリオーマ細胞株からStem like cellを樹立し、放射線感受性への影響をSurvivin発現を中心に検討した。まず各種悪性グリオーマ培養細胞を無血清培地で培養し、sphereを形成することを確認した。U251MG細胞で形成されたSphereに関して抗CD133抗体(腫瘍幹細胞に比較的特異的とされる抗体)、抗Survivin抗体で蛍光免疫染色を行い、Sphere形成細胞群では、Sphereを形成していない接着細胞群と比較して、CD133陽性細胞の割合が高く、Survivinの染色性も強い傾向が認められた。更に、他の悪性グリオーマ

培養細胞についてもStem like cellの樹立が可能かどうかについての検討も行い、U251細胞以外にもSphereを形成させることに成功し、幾代かの継代も成功している。今後、腫瘍幹細胞の放射線感受性や細胞分裂、染色体不安定性への影響について検討する予定である。また、神経幹細胞の培養に有用とされる無重力の技術が、悪性グリオーマ培養細胞に及ぼす影響についても検討を行い、無重力環境下では細胞は増殖が抑制され、化学療法に対する感受性が高まることが示唆された。今後は、この技術を応用し、Stem like cellの研究を発展させることを予定している。更に、悪性グリオーマの手術・放射線・化学療法後の予後を左右する因子に関する研究も同時に行い、P27、PEA-15などの関与も新たに明らかにした。これらの知見は、今後の悪性グリオーマの放射線感受性に関わる機序の解明に向けた研究の素地になると考えられる。
地球潮汐による地震トリガ-作用の発現特性-起震応力場変化との関連性の解明-

平成20年度は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現特性を明らかにすることを目的とし,統計的手法に基づいた地震データの解析により,以下の研究を行った.2004年以降,スマトラ島沖で相次いで発生した3つの巨大地震(2004年スマトラーアンダマン地震,Mw9.0;2005年ニアス島地震,Mw8.6;2007年南スマトラ地震,Mw8.5)に注目し,その震源域周辺の地震活動について,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,いずれの領域についても,巨大地震の発生に先立ち,約10年間にわたって両者の間に高い相関が現われていたことが明らかとなった.いずれの場合も,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.このことは,得られた相関が統計的な偶然ではないことを示しており,地球潮汐による地震トリガー作用の出現の有無が大地震発生に至る応力蓄積過程に密接に関連している可能性を強く示唆している.平成17年度は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現特性を明らかにすることを目的とし,統計的手法に基づいた地震データの解析により,以下の2つの研究を行った.1.東海地域の推定固着域周辺で発生した微小地震活動について,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,両者の相関は,同地域で発生した中規模地震に先立ち,約1年間にわたって顕著となっていたことが明らかとなった.このとき,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.さらに,地球潮汐と地震発生の間に高い相関が認められる領域は,近年微小地震活動が活性化している領域内に現われることが明らかとなった.この領域はプレート境界の固着が特に強い領域に対応すると考えられており,地球潮汐による地震トリガー作用の出現の有無がプレート間の固着状況に密接に関連している可能性が示唆される[Tanaka et al.,2006].2.2004年12月26日に発生したスマトラ島沖地震の震源域周辺の地震活動について,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,本震の発生に先立ち,約10年間にわたって両者の間に高い相関が現われていたことが明らかとなった.このとき,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.このことは,検出された相関が統計的な偶然によって得られたものではないことを示している.さらに,本震発生前に認められた高い相関は,震源域全体ではなく,破壊開始点近傍の震源域南側の領域に限定されることが明らかとなった.これらの特徴は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現の有無が大地震発生の準備過程に密接に関連していることを示しており,この現象の観測が大地震に至る応力蓄積過程の監視に有効である可能性を示唆している[AOGS2005で発表].平成18年度は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現特性を明らかにすることを目的とし,統計的手法に基づいた地震データの解析により,以下の2つの研究を行った.1.2004年12月26日に発生したスマトラ島沖地震(Mw9.0)の震源域周辺の地震活動について,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,本震の発生に先立ち,約10年間にわたって両者の間に高い相関が現われていたことが明らかとなった.このとき,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.このことは,得られた相関が統計的な偶然ではないことを示している.さらに,本震発生前に認められた高い相関は,震源域全体ではなく,破壊開始点近傍の震源域南側の領域に限定されることが明らかとなった.これらの特徴は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現の有無が大地震発生の準備過程に密接に関連していることを示しており,この現象の観測が大地震に至る応力蓄積過程の監視に有効である可能性を示唆している.2.2005年8月16日にMj7.2の地震が発生した宮城県沖に注目し,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,2002年以降,2度にわたり,両者の相関が顕著となっていたことが明らかとなった.いずれの場合も,相関が顕著な期間は約1年間であり,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.また,これらの期間において特に相関の強い領域は,直後に発生したMj6.8,Mj7.2の地震と空間的に密接に関連していることが明らかとなった.このことは,これらの大地震に約1年先行して,地球潮汐による地震トリガー作用が顕著に出現していた可能性を強く示唆している.平成20年度は,地球潮汐による地震トリガー作用の出現特性を明らかにすることを目的とし,統計的手法に基づいた地震データの解析により,以下の研究を行った.2004年以降,スマトラ島沖で相次いで発生した3つの巨大地震(2004年スマトラーアンダマン地震,Mw9.0;2005年ニアス島地震,Mw8.6;2007年南スマトラ地震,Mw8.5)に注目し,その震源域周辺の地震活動について,地球潮汐と地震発生の関係を調査した.その結果,いずれの領域についても,巨大地震の発生に先立ち,約10年間にわたって両者の間に高い相関が現われていたことが明らかとなった.いずれの場合も,地震発生は地球潮汐による応力変化が断層のすべりを促進する位相付近に集中する.

このことは,得られた相関が統計的な偶然ではないことを示しており,地球潮汐による地震トリガー作用の出現の有無が大地震発生に至る応力蓄積過程に密接に関連している可能性を強く示唆している.
ヨード131放射線内部被爆評価の為の生物モデルの開発研究

チェルノブイリ事故後に小児甲状腺がんの急増がみられた。その原因としてもっとも疑わしいのは、放射性ヨード、特に大量に大気中に放出されたヨード131と考えられている。すなわち放射性ヨードが、甲状腺内に取り込まれ内部被爆を起こしたためと推測されている。しかし、実際に、事故直後の甲状腺内に取り込まれた放射性ヨードによる被爆量がわからないため直接の原因としての科学的な証明が困難な状況である。臨床的には、ヨード131は、甲状腺の診断や治療に使用されており、そのために甲状腺がんの発症頻度が増えたというデータはない。このような事実から、放射性ヨードが本当に甲状腺がんの発症原因になりうるのか生物モデルを用いて検討を行った。低ヨード食ラット(3週齢)に、放射性ヨード131(0、0.2、0.6、1MBq)を腹腔内投与にて注入した。1、2,6,12ヶ月観察し甲状腺がんの発症を病理的に解析した。RI施設の放射性ヨードの一日使用量に上限があるため各群10匹(n=10)で実験を行わざるえなかった。その結果、今回の実験では、どの群においても甲状腺がんの発症は見とめらなかった。例数も少ないために、放射性ヨードが甲状腺がんの発症の原因にならないという結論を導き出すことは困難であった。また、今回はFisherラットを用いたが、種により発ガンの頻度に差があることも考えられ、他の種のラットの使用も考慮すべきであると考えられた。また、新生児期の被爆がチェルノブイリでも甲状腺発症に関与していると考えられるため、放射線被爆時の週齢もさらに幼若な時期のラットを用いることを考慮すべきであると推測された。この一年で放射性ヨウ素等を用いた小児甲状腺がんのモデル実験として以下のプロトコールで実験をおこなっている。1目的チェルノブイリ原発事故後、小児甲状腺がんが増加しているが、放射線が原因であるとの最終結論にいたらず、各種についても特定されていない。今回は甲状腺に特異的に取り込まれる放射性ヨード(131-I)の発がんメカニズムへの関与を検討するため、組織の形態的変化に加えて癌遺伝子、および細胞増殖、アポトーシスに及ぼす作用について検討する。すでに下記のプロトコールに従いラットに放射性ヨード投与を行っている。2.材料3.実験方法Fisherラット(3週齢メス)を1週間低ヨードで飼育し4週齢で10および100kBq/100gBWの放射性ヨード(131-I;Na^<131>I第一化学薬品)を皮下注投与し、1、2、6、12ヶ月後に甲状腺(左側は凍結、右側はパラフォルム固定)と下垂体を摘出し以下の検討を行う。T4Replacementは4週後のホルモンデータを見てから行う。チェルノブイリ原発後の小児甲状腺がん発症のモデル作成のため、放射性ヨウ素を用いin vivoの実験を行った。2.材料3.実験方法のプロトコールと現在までの進行状況Fisherラット(3週齢メス)を1週間低ヨードで飼育し、4週齢で10および100kBq/100gBWの放射性ヨード(131-I;Na^<131>I

第一化学薬品)を皮下注投与し、1、2、6、12ケ月後に甲状腺(左側は凍結、右側はパラフォルム固定)と下垂体を摘出した。ラットは3群(Group 1Group 3)に分けGroup 1AがControl群で、50匹、Group 1Bが非照射+T4ホルモン補充で30匹、Group 2Aで、ヨード131投与(1kBq/100gBW)40匹、Group 3Aでヨード131投与(100kBq/100gBW)40匹、Group 3Bで、ヨード131投与(100kBq/100gBW)+T4ホルモン補充で30匹、それぞれ2ケ月6ケ月12ケ月目に10匹ずつとした。現在これらの実験動物を用い組織学的に甲状腺腫瘍の発生状態を解析行っている。今後さらに甲状腺及び下垂体を中心に低ヨード及び放射線による組織変化を遺伝しレベルで解析を行う予定である。チェルノブイリ事故後に小児甲状腺がんの急増がみられた。その原因としてもっとも疑わしいのは、放射性ヨード、特に大量に大気中に放出されたヨード131と考えられている。すなわち放射性ヨードが、甲状腺内に取り込まれ内部被爆を起こしたためと推測されている。しかし、実際に、事故直後の甲状腺内に取り込まれた放射性ヨードによる被爆量がわからないため直接の原因としての科学的な証明が困難な状況である。臨床的には、ヨード131は、甲状腺の診断や治療に使用されており、そのために甲状腺がんの発症頻度が増えたというデータはない。このような事実から、放射性ヨードが本当に甲状腺がんの発症原因になりうるのか生物モデルを用いて検討を行った。低ヨード食ラット(3週齢)に、放射性ヨード131(0、0.2、0.6、1MBq)を腹腔内投与にて注入した。1、2,6,12ヶ月観察し甲状腺がんの発症を病理的に解析した。RI施設の放射性ヨードの一日使用量に上限があるため各群10匹(n=10)で実験を行わざるえなかった。その結果、今回の実験では、どの群においても甲状腺がんの発症は見とめらなかった。例数も少ないために、放射性ヨードが甲状腺がんの発症の原因にならないという結論を導き出すことは困難であった。また、今回はFisherラットを用いたが、種により発ガンの頻度に差があることも考えられ、他の種のラットの使用も考慮すべきであると考えられた。また、新生児期の被爆がチェルノブイリでも甲状腺発症に関与していると考えられるため、放射線被爆時の週齢もさらに幼若な時期のラットを用いることを考慮すべきであると推測された。
下垂体腫瘍形質転換遺伝子(PTTG)の時期特異的発現と腫瘍形成機構の解明

下垂体腫瘍形質転換遺伝子(Pituitary Tumor Transforming Gene,PTTG)は、ラット下垂体腺腫由来の細胞株GH4から単離された細胞周期制御因子である。これまでの研究により、PTTGが下垂体腫瘍形成における重要因子であることは明らかとなっているが、PTTGが胎児期の下垂体形成時に高発現することが腫瘍形成に必須であるのか、あるいは発生分化が終了(生後、個体成熟後)した後においてもPTTGの発現誘導が腫瘍形成を誘発しうるのか、が焦点となっている。多様なヒト下垂体腺腫の発生機序は全く不明であるが、成熟後の個体にPTTGの発現誘導を行うことで腫瘍形成が可能であれば、ヒトの下垂体腺腫の発生機序の分子機構解明に大きな進展がもたらされるものと考えられる。そこで本研究では、PTTGの腫瘍発生における役割を精査する目的で、任意の時期にターゲット分子の発現誘導が可能であるエクジソン(Ecdysone)システムを用いたPTTGのconditional transgenic mouseの作製を試みた。現在、2種類のベクター系(Regulation Vector,Expression Vector)の作成と培養細胞(LβT2細胞)での発現系が確立され、2系統のTgマウス(F3)まで作製が完了している。引き続き繁殖・継代し純系(F4)を作製し、実験には純系(F4)を用いる予定である。本研究では、任意の時期にターゲット分子の発現誘導が可能であるEcdysoneシステムを用いて、胎児期、出生直後、性成熟期、老齢期の各時期の動物の下垂体にPTTGを発現させ、どの時期でのPTTG発現誘導が下垂体腫瘍の形成を誘発しうるかを検討し、下垂体腫瘍形成過程の分子機構を追及することを目的とし、トランスジェニック(Tg)マウスの作製を行っている。Tg動物作製の前に、マウス下垂体培養細胞株(LβT2)を用い、EcdysoneシステムによるPTTG発現の検証を行った。上記で作製した2種類のVbctorを同時に、リポフェクチン法を用いてLβT2細胞に導入した。細胞を回収後、Immuno-blotting法を用いてPTTG発現解析を行ったところ、EcdysoneシステムよってPTTGが誘導されることを確認した。そこで、実際にマウスへの導入を試みた。作製されたTgマウスは、交配・継代し、純系(F3)を作製し、解析に用いることとする。現在、F1の作製まで完了しており、Line1で3匹のhetero、Line2で15匹のheteroのTgマウスが完成している。このTgマウスが完成し、成熟後の動物においてPTTGの過剰発現により下垂体腫瘍が認められれば、成年期以降の遺伝子発現の異常(変異)により誘導されると考えられているヒト下垂体腺腫の良い実験動物モデルとして期待される。
中高年のセクシュアリティの実態と主観的幸福感との関連

現在日本は超高齢社会を迎え、高齢者がよりよい生活を送るため、高齢者の生活の質(以下QOL:Quality of life)について考えていく必要がある。QOLに関連する要因の一つとして、人間の基本的欲求である性に関する事柄が挙げられる。加齢に伴う身体的変化に伴い、高齢者の性機能・性的欲求には性差や年代差が生じることが推測され、その差は夫婦間の関係性に影響を与える可能性がある。特に夫婦間で性交渉のニーズが一致しない場合には、パートナーとの性生活に大きな影響を及ぼす可能性があると共に、パートナー間の人間関係に影響を及ぼす可能性がある。そのため、高齢者夫婦間の性交渉のニーズの一致度や、夫婦間での性交渉のニーズが不一致の際に夫婦どちらのニーズが優先されているかを把握する必要があると考えられる。以上のことから、高齢夫婦が、自身の身体的機能の衰退をどのように捉え、老年期の夫婦のあり方を作りあげているのかを把握していく為、本研究では高齢者を対象とし、1高齢者の性に関する実態2夫婦間の性交渉のニーズの一致度と夫婦間における性交渉のニーズの優先性を把握することを目的とした。調査には性に関する無記名自記式質問紙を用いた。さらに質問紙回収後、統計学的分析として、各質問項目に対し、性別、年代別の回答の差異についてクロス集計を行い、χ二乗検定、Mann-whitneyのU検定を行った。結果、夫婦間での性交渉のニーズ一致群は31名(66%)であり、高齢夫婦間のニーズは一致していると回答した者が全体の半数以上となった。性交渉のニーズ不一致群は、16名(34%)であり、男性で有意に多かった。さらに、夫婦間で性交渉のニーズが一致しない際、配偶者のニーズを優先している者は27名(77.1%)であり、対象者全体の4分の3以上の者が配偶者のニーズを優先していた。28年度が最終年度であるため、記入しない。看護・介護職において、高齢者の性についての学習経験があるもので高齢者の性に対する好意的なイメージや寛容な態度をもつことが報告されている。そのため、高齢者に接する者が、性的トラブルに遭遇した時に、性について偏見のない正しい見識を持ち対処することができるよう、高齢者の性に関しての教育の場が必要であり、教育のためにはセクシュアリティの実態を正確に把握する必要がある。しかし、高齢者の性に関する研究は日本ではあまり多くはなく、その実態について正確に把握できていない部分があるという現状がある。本研究は、45歳以上の有配偶者男女への性に関する自記式質問紙調査により、中高年のセクシュアリティの実態、中高年の性についての男女の認識の相違、中高年のセクシュアリティと主観的幸福感との関連を明らかにすることを目的としている。調査対象者は45歳80歳代までの地域在住有配偶者男女で、今年度は中高年の性に関する文献検討を行いながら、自記式質問紙の記入内容を元に、統計ソフトSPSSに質問紙内容の転記を行った。また、次年度の統計学分析への準備を行った。統計学的分析は、以下の手順で順次行っている。1.回収した質問紙項目全項目に大して、中高年の性の実態を把握する為、記述統計量を求める。2.質問項目に対して、性別、女性閉経前後別、年代別の回答の差異について、クロス集計を行い、カイ二乗検定、Mann-whitneyのU検定等を行う。統計学的分析は次年度も引き続き行い、中高年の性に関する実態や生じている問題等を明確化していく。研究計画では、本年度に質問紙データを順次分析ソフトに転記していくことまでを目標としていた。本年度はすでに文献検討を行い、質問紙データの転記を終了し、統計学的分析にとりかかっていることより、おおむね順調に進展していると考えられる。性交渉のニーズ

不一致群は、16名(34%)であり、男性で有意に多かった。さらに、夫婦間で性交渉のニーズが一致しない際、配偶者のニーズを優先している者は27名(77.1%)であり、対象者全体の4分の3以上の者が配偶者のニーズを優先していた。次年度は、収集したデータのさらなる統計学的分析を行い、中高年の性の実態や性別・年代別等の相違、またそれらの相違がどのような背景要因により生じるかを検討し、論文発表を行う。また研究者・地域在住高齢者との性に関する積極的な意見交換を行っていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞間シグナルによる中枢神経系ニューロン・グリア突起の分岐パターン制御機構

本研究では、中枢神経系回路網で相互作用するニューロンとグリアが、細胞間シグナルを介して突起パターンを獲得する機構の解明を目指した。主な足がかりとして、中枢神経系ニューロンの樹状突起に特異的に発現するNotchリガンドであるDNERの機能解析を行った。回路形成期に隣接する樹状突起間の相互作用でDNER-Notchシグナルが活性化し、樹状突起分岐パターンが調節される可能性を検証するため、DNER欠損動物の大脳皮質ニューロン樹状突起パターンをin vivo, in vitroで定量的に比較解析した。その結果、DNER欠損動物で樹状突起の分岐が増加することが明らかになった。また樹状突起分岐パターン決定の細胞・分子ダイナミクスを明らかにすることを目指し、小脳顆粒細胞とプルキンエ細胞を用いて以下の解析を行った。1.小脳顆粒細胞は生後細胞移動し、その最後の相の先導突起は樹状突起に分化することが我々の研究で明らかになっている。そこでin vivo電気穿孔法で移動中の顆粒細胞を蛍光標識し、スライス培養下で細胞移動と樹状突起分化のダイナミクスをタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて観察する系を確立した。さらに、神経細胞移動を制御すると報告のあるCdk5の活性を抑制すると、先導突起形態に著しい異常をきたすことを明らかにした。2.プルキンエ細胞が小脳皮質で扇状に樹状突起を展開する分子機構を解析するため、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて蛍光標識し、個々の細胞形態を可視化し、立体構造を解析する系を確立した。樹状突起の発達過程を追跡した結果、突起の平板性は一次樹状突起が決定し、分岐を開始する直後に獲得されることが明らかになった。
耕地土壌における脱窒のエコ・ゲノミックス-根粒菌共生系のN_2Oパラドックスの解明と土壌微生物集団ゲノム科学の基盤構築-

土壌のない実験室系では根粒はN_2Oを吸収か非発生であるが、圃場ダイズ根粒はN_2Oの発生源であった。圃場を模した土壌栽培系とダイズ根粒菌変異株の実験より、nosZを欠損株は硝酸からN_2O発生を起こし、その硝酸は硝化細菌により供給されていた。ゲノム比較等により農耕地土壌のBJ_2クラスターに属するダイズ根粒菌は、nosZを欠損し、最終産物としてN_2Oを生成した。以上の結果は、少なくともダイズ根粒菌のnosZ遺伝子型と硝化細菌の共同作用により圃場ダイズ根粒からN2_O発生が生ずることを示唆している。根粒菌共生系のN_2O吸収還元:N_2O還元酵素遺伝子nosZを保有しているUSDA110株形成根粒のダイズ根系は、大気レベルのN_2O(310ppb)を吸収還元し、20ppb以下の濃度になることが分かった。これは、土壌中のN_2Oを根粒根圏が除去できることを示している。ダイズ根系における硝酸由来のN_2O発生:実験室栽培ダイズに経根的に硝酸を投与し、根粒からのN_2O発生を測定した。その結果、nosZ破壊株形成根粒根系から、投与した硝酸由来のN_2O発生が観察された。野生株接種根系からは硝酸由来のN_2O発生は見られなかった。nosZと硝酸還元酵素遺伝子napA等の二重破壊株の形成根粒から硝酸由来のN_2O発生は検出されなかったので、根粒表面から吸収された硝酸が根粒バクテロイドに到達し、根粒菌の異化的硝酸還元系でN_2O発生が起こっていることが明らかとなった。亜酸化窒素(N_2O)は強力な温室効果ガスあり、オゾン層の破壊効果もある。地球全体のN_2O発生の約40%は農耕地から発生しており、従来は窒素肥料が主な原因だとされてきた。しかし、根粒着生系統ダイズ畑圃場からのN_2O発生が非着生系統圃場3-4倍のfluxに達するなど、マメ科作物の根粒に起因するN_2O発生の寄与が大きいという意外な事実がある。本年度は登熟期のダイズ根系から発生するN_2Oの原因をさぐるために、圃場およびモデル実験系を用いて以下のような成果が得られた。圃場ダイズにおいて、老化根粒から明らかにN_2Oが発生していた。そこで、レオナルトジャーを用いてダイズエンレイにnos遺伝子を欠損しているダイズ根粒菌Bradyrhizobium japonicum T9株を無菌条件で接種し、栽培後30日目に根粒老化を促進する地上部切断処理および土壌接種処理を行い、根粒根圏から発生するN_2Oを測定した。その結果、地上部切断処理および土壌接種の同時処理の場合のみN_2Oの有意な発生が認められ、根粒老化時には土壌生物がN_2O発生に関与していることが分かった。前年度のRISA解析でN_2O発生への関与が考えられる細菌、カビ、線虫などの分離を行った。本年度は、「N_2O発生に関与する土壌生物の特定」の実験系およびN_2O発生関与生物の収集ができ、来年度以降の研究の基盤を作った。本研究の目的は、農耕地土壌として特徴のある根粒根圏と水田土壌を対象として微生物による窒素変換過程(脱窒)を明らかにし、土壌窒素循環系のエコ・ゲノミクスの研究基盤を作ることにある。昨年度確立したレオナルドジャー栽培接種系等を用いて、根粒着生ダイズ根系の老化根粒からのN_2O発生に関与する生物の特定を検討した。nosZ遺伝子を保有する野生型のダイズ根粒菌B. japonicum USDA110を対照として、nosZ遺伝子を保有しないダイズ根粒菌BradyrhizobiumjaponicumT7とnosZ遺伝子を人為的に破壊したダイズ根粒菌B. japonicumUSDA110変異株の、ダイズへの接種実験による比較を行った。具体的には、30日間栽培した接種ダイズを、無処理、老化処理(D)、土壌添加処理(S)、D+S処理を行い、処理10日後の根圏から放出されるN_2Oの測定を行った。その結果、接種したダイズ根粒菌のN_2O還元酵素遺伝子nosZが存在しないと、老化根粒からのN_2O発生が顕著に増えることが明らかとなった。また、ダイズ根粒菌の硝酸還元酵素napAとnosZの2重変異株を作成し同様の検討を行ったところ、初歩的な結果ではあるが、当該2重変異株ではN_2O発生が観察されなかった。

N_2Oの発生過程の一つであるNO還元酵素遺伝子norB遺伝子の公表されているプライマーを用いてPCR法による増幅とTRFLP解析を行ったが、検出された配列はすべてダイズ根粒菌Bradyrhizobium japonicumと相同性の高い配列であった。以上の結果より、老化根粒近辺の硝酸がN_2Oの発生源になっており、根粒菌が脱窒細菌としてN_2O発生に関与していることが示唆された。本研究の目的は、農耕地土壌として特徴のある根粒根圏と水田土壌を対象として微生物による窒素変換過程(脱窒)を明らかにし、土壌窒素循環系のエコ・ゲノミクスの研究基盤を作ることにある。レオナルドジャー栽培接種系による根粒着生ダイズ根系からのN_2O発生に関与する生物と窒素変換過程を検討した。nosZ遺伝子を保有する野生型のダイズ根粒菌B.japonicum USDA110を対照として、nosZ遺伝子破壊株の、ダイズへの接種実験による比較実験を行った。具体的には、30日間栽培した接種ダイズを、無処理、老化処理(D)、土壌添加処理(S)、D+S処理を行い、処理後の根圏から放出されるN_2Oの測定を行った。その結果、接種したダイズ根粒菌のN_2O還元酵素遺伝子nosZが存在しないと、老化根粒からのN_2O発生が顕著に増えることが明らかとなった。さらに、ダイズ根粒菌の硝酸還元酵素napAとnosZの2重変異株を作成し同様の検討を行ったところ、当該2重変異株ではN_2O発生が減少する傾向が観察された。また、硝酸および亜硝酸添加により老化根粒からのN_2O発生が促進され、硝化抑制剤で顕著にN_2O発生が抑制された。したがって、老化根粒からのN_2O発生は、土壌中の硝化細菌の硝化過程を経て、根粒中のダイズ根粒菌が脱窒過程を担って発生していると結論された。また、N_2O発生を起こしている圃場栽培ダイズでは、土壌の細菌捕食性線虫が増殖していることが、DNA多型解析と顕微鏡観察から明らかとなり、根粒タンパクのアンモニアへの無機化に関与している可能性も考えられた。以上の結果より、根粒根圏からのN_2O発生の最終過程は、nosZ-型土着ダイズ根粒菌が担っていたので、日本全国のダイズ圃場を検討した。その結果、nosZ+型が優占土壌とnosZ-型が優占圃場の存在が明らかとなり、黒ボク土壌でnosZ-型が優占している傾向が観察された。
在宅医療を受ける子どもの成人期自立モデルの考案

本研究の目的は子どもの頃から在宅医療を受けている成人と保護者および関係者を対象とし、在宅医療を続けながら社会生活を営む生活の様子やこれまでの経緯などをインタビュー調査し、在宅医療を受ける子どもの自立について考察することである。具体的な計画では、在宅医療を受けながら社会生活を営む成人、在宅医療を受けている子どもを育てる保護者、当事者を支援する医療福祉等関係者にインタビュー調査を行い、その内容をデータとして質的に分析する。現在は調査協力に同意が得られた数名の対象者のインタビュー調査を終えており、今後も引き続きデータ収集を継続する予定である。研究が予定より遅延している理由は、在宅医療を行いながら就労している成人(目標としている対象者数)のリクルートが困難なためである。これまでは、研究協力者は医師より紹介を受けて病院を受診する方を対象としていた。今後は調査対象者を地域で生活する方全般に拡大し、地域の訪問看護ステーション所長に対象者のリクルートを依頼しているところである。本年度は研究を開始するにあたり改めて当初の研究計画書の見直しを行った。再度文献検討を行い、勉強会や研究会において関係者からの情報収集を行い、調査対象者の絞り込みと研究協力体制の整備を行った。結果、看護師と医師だけでなく、本研究に関与する薬剤師や行政職員等の関係者より研究への協力が得られる体制が整った。あわせて調査対象者の協力が得られる見通しがついた。本調査を進めるにあたり改めて文献検討と情報収集を行い、調査対象および研究協力体制の見直しを行った。さらに、平成26年度から実施している研究課題(基盤(C)課題番号26463411)を1年延長したため、その遂行に時間を要した。以上2点が本研究課題が遅れている理由である。今後の研究の推進方策としては、多職種(看護師、医師、薬剤師、行政職員等)より研究の協力が得られる体制が整い、調査対象者の確保についても見通しがついたため、本年度は研究計画書を大学の倫理審査委員会に提出し承認を得る予定である。その後、インタビュー調査を進めデータ収集を行う。今年度から次年度にかけてデータ分析とまとめを行う予定である。本年度は研究計画の見直しを行ったため研究の実施に至っていない。本年度に使用予定であったインタビュー調査に必要となる旅費や謝金などの使用を次年度以降に変更したため。研究の進捗状況が遅れているため、当初計画していた予算を使用しなかったことがその理由である。次年度使用額が生じた項目は、データ収集のための調査費用や謝金、成果発表のための参加費や旅費などである。今後の計画としては特にデータ収集のための調査費用、データをまとめるための物品購入等に使用する予定である。成果がまとまり次第、学会発表に参加する費用とする。
ショウジョウバエ精巣特異的細胞増殖因子の精子形成過程における機能解析

IDGF(insect-detrived growth factor)は、研究代表者らがこれまでに、センチニクバエ胚由来培養細胞であるNIH-Sape-4培養上清から、昆虫としては初めて単離、精製することに成功した細胞増殖因子である。cDNAクローニングの結果、IDGFが、既存のいかなる細胞増殖因子とも有意な相同性を示さない、構造的に全く新しいタイプの細胞増殖因子であることが明らかになっている。本研究では遺伝学的手法を導入できるショウジョウバエにおいて、そのホモローグ同定を試み、IDGFと全長に渡る相同性を示すものの、分泌タンパクであるIDGFとは異なり、膜貫通領域を有するタンパクをコードする新規のcDNAクローンを得た。遺伝子発現解析を行ったところ、この遺伝子(male-specific IDGF(ms-I)と命名)は、精巣特異的に発現していることを見出した。この結果からms-Iは、IDGFファミリーに属する膜結合型細胞増殖因子として、精子形成過程に特有の役割を担っていることが予想された。そこでその遺伝子発現細胞を調べたところ成熟一次精母細胞であり、またms-I蛋白は、分化段階のより進んだ細胞で検出されることがわかった。さらに4種類のオス不妊変異体におけるms-I遺伝子の発現を解析したところいずれの変異体でもms-I遺伝子の発現は見られなかった。これらの結果は、ms-Iが分化段階の進んだ精子形成過程で必須の役割を果たす遺伝子であることを示唆する。IDGF(insect-derived growth factor)は、研究代表者らがこれまでに、センチニクバエ胚由来培養細胞であるNIH-Sape-4培養上清から、昆虫としては初めて単離、精製することに成功した細胞増殖因子である。そこで、この因子の機能解析を進めるため、遺伝学的手法を導入できるショウジョウバエにおいて、そのホモローグ同定を試みた。その結果、IDGFと全長に渡る相同性を示すものの、分泌夕ンパクであるIDGFとは異なり、膜貫通領域を有するタンパクをコードする新規のcDNAクローンを得た。次に遺伝子発現解析を行ったところ、性差によらず恒常的に発現するIDGFとは異なり、この遺伝子は、蛹後期から成虫にかけてオス特異的に発現することが明らかとなったため、新たにmale-specific IDGF(ms-I)と命名した。さらに、in situ hybridization法により、ms-Iが精巣に発現していることを見出した。また、ショウジョウバエ胚由来培養細胞に遺伝子導入し、ms-Iが細胞膜上に発現されることを示した。これらの結果からms-Iは、IDGFのショウジョウバエホモローグそのものではないものの、IDGFファミリーに属する膜結合型細胞増殖因子として、精子形成過程に特異的な役割を担っていることが予想された。IDGF(insect-derived growth factor)は,研究代表者らがこれまでに、センチニクバエ胚由来培養細胞であるNIH-Sape-4培養上清から、昆虫としては初めて単離、精製することに成功した細胞増殖因子である。さらに4種類のオス不妊変異体におけるms-I遺伝子の発現を解析したところいずれの変異体でもms-

I遺伝子の発現は見られなかった。これらの結果は、ms-Iが分化段階の進んだ精子形成過程で必須の役割を果たす遺伝子であることを示唆する。
循環性癌細胞に対する新規治療の確立を目的としたCAST法による標的膜蛋白の探索

胃癌は、発生数が世界で第4位、死亡者数が第2位であり、その半数は日本をはじめとする東アジアで発生しており、わが国において胃癌の研究、解析を行うことは極めて重要である。胃癌の予後は、化学療法の進歩や内視鏡検査の普及による早期発見の増加などにより良好となってきているが、未だ満足できるものではない。よって、胃癌における新規治療標的の開発は急務と言える。また、循環性癌細胞は、遠隔転移や完全切除後の再発に密接に関与しており、乳癌、大腸癌、肺非小細胞癌、食道癌において、全生存期間や無再発期間が短いことと有意に相関する。循環性癌細胞は血液中に存在しているため、循環性癌細胞に特異的に発現している遺伝子を新規に同定し、これに対する治療法を確立することはきわめて有意義であると考えられる。そこで本研究では、胃癌における循環性癌細胞を材料として、CAST (Escherichia coli ampicillin secretion trap)法と呼ばれる網羅的遺伝子発現解析を行い、新たな治療標的の同定およびその機能解析を行うことを目的とした。まず、循環性癌細胞の性質を理解するために、ヒト胃印環細胞癌の細胞株であるHSC-44PEと、そこから派生させた高転移能細胞株HSC-44As3を材料に遺伝子発現解析を行い、遺伝子発現プロファイルの比較を行った。HSC-44PE、HSC-44As3から作製したCAST libraryからそれぞれ1,152クローンをシークエンスし、それぞれ275遺伝子、327遺伝子を同定した。そこから遺伝子発現プロファイルを比較し、高転移能株で発現の亢進していた15遺伝子に着目して胃癌における発現やその機能について解析を進めている。
臨海農業集落の存続基盤の明確化と類型化手法の確立

事例調査の深化の継続より、臨海農業集落の類型とそれぞれの存続要因の抽出を推進するとともに、臨海農業集落の類型化を実施した。事例調査については、松山市興居島では、新たに侵入したイノシシへの対策に係る地域住民の組織化を調査し、地域の危機対応能力の評価方法を検討した(武山担当)。岡山県奈義町では、農業用水路の維持管理、特に点検・機能診断に着目し、多面的機能支払18組織に聞き取りを行った(九鬼担当)。非農家や土木関係者が参加している組織のリーダー層は水路の維持管理に対する考え方が柔軟であり、このことから担い手に対する柔軟な考えの有無によって存続を推し量ることができると考えられる。大分県国東半島豊後高田市および国東市においては、集落単位の産業と生活に関する現地踏査と住民ヒアリングによる実態の確認を行った(清水担当)。臨海部よりも内陸部・市街地に位置する集落・世帯の住民の方が災害発生について生活・生産への影響が大きいと考えていることがわかった。また、各漁港の整備状況・規模・利用実態がコミュニティの構成人員や集落行事の活発度と関連性があることが推測された。愛媛県宇和島市・愛南町、長崎市においては、臨海農業集落における観光業の現状把握を行った(齋藤担当)。類型化の実施については、昨年度から試行している愛媛県沿岸域では各類型の人口減少および耕作放棄地等土地利用変化を分析し、存続可能性の評価を行った(武山担当)。また、岩手県沿岸域でも農業と漁業に関する指標を中心とした類型化を実施し、東日本大震災の被災地である岩手県沿岸域においては震災前後で類型(地域構造)に変化が生じていること、類型の区分においては農業より漁業の影響が卓越していることが明らかになった(服部担当)。臨海農業集落の類型とそれぞれの存続要因の抽出が複数の事例地区で実施するとともに、類型化についても複数の事例の成果を取り込んだ実施がおこなわれた。ただし、類型手法の適用可能性の検証については不十分であるので、早急な実施を計画するところである。研究計画の最終段階である類型の適用可能性の検証を、山口県周南市大津島を事例に実施する。大津島ではこれまでと同様、各種統計資料等の収集とともに、行政や住民への聞き取り調査を実施する予定である。このことにより、これまでの研究成果の適用可能性を検証する。最後に、適用可能性の検証後、研究のまとめをおこなう。今年度は,岩手県広田半島,愛媛県宇和島市島嶼部,岡山県犬島でそれぞれ,農・漁業の兼営状況,離島における地域活性化イベントの影響,農地及び社会インフラ保全条件について調査した。岩手県広田半島では,地域の水田保有者に対するアンケート調査の分析と漁協組合員に対する聞き取り調査を実施した。いずれの調査からも,地域の生産者は農業・漁業のいずれかに特化する方向で経営内容を変化させている。漁業からの撤退は地域資源管理上の問題は生じないが,農業については集落営農で撤退された農地の管理を吸収することにより資源管理機能を維持していることが把握された。岡山県犬島では,離島において地域活性化イベントが与える影響を調べるため,瀬戸内国際芸術祭という3年に1度開かれるアートプロジェクトとの関わりに着目した。期間中の犬島の訪問者を把握するために現地調査を行い,島のキーパーソンにプロジェクトと島の関わりや島民の生活に関するインタビュー調査を行った。その結果島では二地域居住者が多いことから,分析視点の転換が必要と示唆された。愛媛県宇和島市の島嶼部においては,野生動物の侵入状況および組織的な対策実施状況について聞き取り調査を行い,島嶼部の農地および社会インフラを保全するための条件について整理した。その結果,これらの島嶼部では養殖漁業が盛んであり,島内に若い担い手も多く存在するが,地域との繋がりが薄く,野生動物対策の担い手になりづらい現状が把握された。以上より,臨海農業集落の存続基盤となる諸条件の把握を進めることができた。平成28年度は,それぞれの事例地区で臨海農業集落の存続基盤となる諸条件の把握を進め,農・漁業の兼営状況,離島における地域活性化イベントの影響,農地及び社会インフラ保全条件等の視点から明らかにしている。そして,これらを横断的にまとめるための議論を開始している。また,調査の過程では,分析の単位としての「島」の妥当性と「半島」の不安定性,交通アクセス評価における地域間接続関係の把握の仕方といった課題の抽出もあわせて行うことができた。平成29年度は,平成28年度に引き続き事例調査を深化させると共に,これまで収集した定性的・定量的なデータを搭載し,類型化を実施するための基礎となるプラットフォームの構築を実施した。事例調査については,岩手県陸前高田市広田半島,愛知県西尾市一色町佐久島,広島県竹原市大久野島,香川県男木島,愛媛県松山市島嶼部,大分県国東半島を対象に実施した。広田半島では,漁協組合員を対象としたアンケート調査を実施することにより,農業と漁業の兼営状況から存続可能性の高い経営形態を抽出した。佐久島では農地利用と観光の観点からクラインガルテンの実態について現地調査を行った。大久野島では,国立公園としての島の自然環境や観光資源であるうさぎの生息環境とそこに立ち入る人間との共生について検討するため調査を行った。男木島では,青壮年層の離島移住を取り上げ,移住者の特徴や移住の動機,移住までのプロセスを島への移住者8名へのインタビュー調査から明らかにするとともに先行研究の結果との比較を行った。

松山市島嶼部では,柑橘栽培地域における土地利用の変遷と野生動物対策の現状を調査し,イノシシの生息拡大プロセスと地域での被害対策体制の構築プロセスを明らかにし,島嶼部を存続させるために必要な条件を整理した。大分県国東半島では,既存の統計情報を照合・整理し,基礎データの作成を継続するとともに,孤立性指標(公共交通の利便性,頻度,欠航頻度,他の集落へのアクセス道路,災害時の孤立経験)を自治体ヒアリングおよび地図により把握した。プラットフォームの構築については,事例調査から抽出された存続要因をまとめた。そのうえで,愛媛県沿岸域を対象に,沿岸農業集落の特徴を明らかにするとともに,各産業分野の就業者人口割合を指標として,沿岸農業集落の類型化を試行し,類型化手法の検証を行った。事例調査については地区により若干の違いがあるものの,いずれも着実に進展しいている。プラットフォームの構築についても,愛媛県沿岸域を対象に類型化を試行し,類型化手法の検証を実施できているから。事例調査の深化の継続より、臨海農業集落の類型とそれぞれの存続要因の抽出を推進するとともに、臨海農業集落の類型化を実施した。事例調査については、松山市興居島では、新たに侵入したイノシシへの対策に係る地域住民の組織化を調査し、地域の危機対応能力の評価方法を検討した(武山担当)。岡山県奈義町では、農業用水路の維持管理、特に点検・機能診断に着目し、多面的機能支払18組織に聞き取りを行った(九鬼担当)。非農家や土木関係者が参加している組織のリーダー層は水路の維持管理に対する考え方が柔軟であり、このことから担い手に対する柔軟な考えの有無によって存続を推し量ることができると考えられる。大分県国東半島豊後高田市および国東市においては、集落単位の産業と生活に関する現地踏査と住民ヒアリングによる実態の確認を行った(清水担当)。臨海部よりも内陸部・市街地に位置する集落・世帯の住民の方が災害発生について生活・生産への影響が大きいと考えていることがわかった。また、各漁港の整備状況・規模・利用実態がコミュニティの構成人員や集落行事の活発度と関連性があることが推測された。愛媛県宇和島市・愛南町、長崎市においては、臨海農業集落における観光業の現状把握を行った(齋藤担当)。類型化の実施については、昨年度から試行している愛媛県沿岸域では各類型の人口減少および耕作放棄地等土地利用変化を分析し、存続可能性の評価を行った(武山担当)。また、岩手県沿岸域でも農業と漁業に関する指標を中心とした類型化を実施し、東日本大震災の被災地である岩手県沿岸域においては震災前後で類型(地域構造)に変化が生じていること、類型の区分においては農業より漁業の影響が卓越していることが明らかになった(服部担当)。臨海農業集落の類型とそれぞれの存続要因の抽出が複数の事例地区で実施するとともに、類型化についても複数の事例の成果を取り込んだ実施がおこなわれた。ただし、類型手法の適用可能性の検証については不十分であるので、早急な実施を計画するところである。まず,これまで個別に検討してきた臨海農業集落の存続基盤となる諸条件について,横断的に比較検討するための共通プラットフォームを構築する。
糖輸送タンパク質を分子標的とした新規抗がん治療薬の探索研究

癌化に伴う糖輸送の増加は早期診断法としてPET(陽電子放射線断層診断)にも応用されているが、分子標的治療薬は未開発である。我々はヒト腫瘍細胞を用いた選択的な薬剤スクリーニングより、GSK3β阻害薬(タンパク質リン酸化阻害薬)を見出し、腫瘍特異的な糖輸送タンパク質の発現阻害も明らかにした。GSK3β阻害薬はヒト大腸がん細胞に対しても有効性を示し、ヌードマウスを用いた動物実験でも抗腫瘍効果が確認された。以上の結果より、GSK3β阻害薬はヒト腫瘍に対する新しい分子標的薬となる可能性が示唆された。(特許公開2013)癌化に伴う糖輸送の増加は早期診断法としてPET(陽電子放射線断層診断)にも応用されているが、分子標的治療薬は未開発である。(特許公開2013)<目的>細胞がん化に伴う糖輸送代謝の亢進は古くより報告され、近年は早期診断法としてPET(陽電子放射線断層診断)にも応用されているが、がんの進展・転移との関連は未解明である。我々はヒトHeLa融合がん細胞株を用いた研究を基盤として、腫瘍性細胞の選択毒性と糖輸送タンパク質GLUT3の発現阻害を指標とした新規分子標的薬の探索を行い、GSK3βリン酸化阻害剤を見出した。本研究では、新規がん分子標的薬としての応用性を検討した。<結果・成果>約300種の化学ライブラリーより探索したGSK3βリン酸化阻害剤は、腫瘍性HeLa融合がん細胞と共に、GLUT3を高発現する大腸がん細胞のCaco2細胞に対しても有効性を示し、強い細胞増殖阻害とGLUT3発現の阻害作用を示した。阻害作用におけるシグナル伝達においてβ-カテニン経路の非依存性が確認された。また、ヌードマウスを用いたin vivo抗腫瘍効果についても条件検討を開始した。がん・免疫細胞由来の膜小胞エキソソームについて、簡便な分離法や構成分子の生化学的解析、並びに免疫刺激に伴う生理薬学的変化を解析し、転移・浸潤への関連に活用する予定である。<目的>癌化に伴う糖輸送の亢進は古くより報告され、近年は早期診断法としてPET(陽電子放射線断層診断)にも応用されているが、その分子的基盤や分子標的治療薬は未解明である。我々はヒトHeLa融合がん細胞株を用いた研究より、「糖輸送タンパク質を分子標的とする新規抗がん治療薬の探索研究」を行い、腫瘍特異的なGLUT3発現抑制作用を持つGSK3阻害薬(セリンプロテインキナーゼ阻害薬)を見出し、その作用をin vitro, in vivo系で解析した(特許公開2014)。本年度は、これまでの研究基盤に基づき、1)ヌードマウスを用いた抗腫瘍効果、2)GLUT3発現の高いことが予想されるヒト患者由来の大腸がん細胞株について検討した。<結果・成果>我々はHeLa融合細胞株を用いた腫瘍細胞選択的な薬剤スクリーニングより、GSK3阻害薬を見出し、GLUT3発現抑制効果を明らかにした。本年度の検討により、1)GSK3阻害薬は、ヌードマウスを用いたHeLa融合細胞移植腫瘍に対しても部分的な抗腫瘍効果を示し、奏効腫瘍ではGLUT3発現抑制も確認された。2)GSK3阻害薬はGLUT3発現の高いヒト大腸がん細胞に対して、増殖抑制効果とGLUT3発現抑制効果があることが確認された。以上の結果より、GSK3阻害薬はGLUT3発現の高いヒト腫瘍に対する新しい分子標的薬となる可能性が示唆された。今後は、GSK3阻害剤の抗腫瘍分子メカニズム及び標的とするヒト腫瘍について検討を行う予定である。腫瘍生物学腫瘍性の異なるHeLa融合細胞株の選択毒性を指標として化学ライブラリーより探索したGSK3βリン酸化阻害剤は、GLUT3を高発現するHeLa融合細胞と共に、ヒト大腸がん細胞のCaco2細胞に対しても増殖阻害とGLUT3発現阻害作用を示すことが確認された。更に、GLUT3発現量の異なる数種のヒト大腸がん細胞を用いて、増殖阻害とGLUT3発現の相関性について検討中である。また、RNAiを用いて、増殖阻害に及ぼすGLUT3並びにシグナル分子の解析も進行中である。また、ヌードマウスを用いたin vivo抗腫瘍効果については、腫瘍性HeLa融合細胞を皮下移植し、GSK3β阻害剤を皮下および腹腔に520 mg/kgで週3回連続投与により腫瘍体積の変化を指標として検討中であるが、まだ十分な抗腫瘍効果は得られていない。問題点として、腫瘍形成の不均一性があり、抗腫瘍効果の統計的処理が困難な点があげられる。投与条件や他の抗がん剤との併用効果を検討中である。1標的がん細胞については、GLUT3発現量の異なるヒト大腸がん細胞株を用いて、増殖阻害とGLUT3発現の相関性について更に検討する予定である。また、GSK3β阻害剤のシグナル伝達機構の解析を更に進めるとともに、他の抗がん剤との併用効果を検討する。

2ヌードマウスを用いたin vivo抗腫瘍効果については、形成する腫瘍サイズの均一集団化を図りながら、抗腫瘍効果の統計的な解析を試みるとともに、投与条件や他の抗がん剤との併用効果などを検討し、新規抗がん治療薬の開発への応用性を研究する予定である。また、がん細胞や免疫細胞から分泌されるエキソソームのがんの進展・転移に及ぼす役割についても検討する予定である。