hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気分安定薬による臨床効果と細胞内イノシトール枯渇の関連性

気分安定薬、とりわけリチウムの作用機序と脳内細胞内イノシトールの枯渇の関連に注目し、主にモデルマウスを用いた解析を行った。具体的には、IMPase(myo-inositol monophosphatase)をコードする二つの遺伝子Impa1, Impa2の機能欠損マウスの表現型を観察した。IMPaseはリチウムの直接の標的であると想定されている酵素であり、実際in vitroでImpa1, Impa2タンパク質の酵素活性はリチウムにより阻害される(Ohnishi et al. JBC, 2007など)。Impa1機能欠損ホモマウスは、ほとんどが出産直前あるいは出産直後に死亡したが、下あごの形成不全や胸骨-肋骨接合部の非対称性、心臓の低形成といった極めて特徴的な表現型が現れ、少なくとも胎生期においてはImpa1によってイノシトールモノリン酸から供給されるイノシトールが、胎児の正常な発生に必須の役割を果たすことが証明された。一方、Impa2 KOマウスは一見正常に成育し、発生学上の異常を見いだすことは出来なかった。さらに、各種行動試験においても際だった異常を示さなかった。これらの結果やいくつかの状況証拠から、少なくとも発生期においてImpa2経路は主要なイノシトール合成経路ではなく, Impa1経路が重要であると予測された。Impa1機能欠損マウスに関しては、妊娠期に母親の飲み水にイノシトールを供給(離乳時まで)すれば、その致死性の大部分を回避できた。そこで、イノシトールレスキューマウスを用いて各種行動試験を行ったところ、ホモマウスは対照マウスと比較して顕著な過活動性を示した。このことは、脳内イノシトールの不足が躁様行動変化につながる事を示しており、さらにはリチウムの(抗躁ではなく)抗鬱作用には、Impa1の酵素活性抑制が関与している可能性が考えられた。細胞内のイノシトール枯渇は、気分安定薬、特にリチウム作用の生物学的基盤となっている可能性が指摘されている(イノシトール枯渇仮説)。細胞内でのイノシトールは、イノシトール1リン酸の脱リン酸化もしくは細胞外からのイノシトールの直接取り込みによって供給される。前者は、IMPase(inositol monophosphatase)によって媒介される反応であるが、この酵素はIMAL1,IMPA2の両遺伝子にコードされる。本研究では、両IMPaseの機能を欠損するマウスが、脳内のイノシトール含量にどのような影響を与えるか、行動にどのような影響を与えるかを評価することにより、上記の仮説の検証を目指すものである。今期は、MS/GC系により組織内イノシトールを定量する系を立ち上げること、Impa1,Impa2機能欠損マウスの基礎的表現型を解析することに注力し、イノシトール定量系を樹立することに成功した。Impa2遺伝子の欠損は、生存には影響を与えず、外形的な特徴、血液生化学的な各種の指標に関しても、野生型と際だった差異を認めなかった。FST,TST,LD boxtest,OF test,EPMなど各種の情動に関連する試験を行ったが、現在のところ際だった表現型は認めていない。現在、Impa1遺伝子欠損マウスに関しても、基礎的異常のスクリーニングを行っている段階であるが、少なくとも血液生化学的な各種の指標に関しては、野生型と際だった差異を認めない。今後、両系統の脳内イノシトール含量等を検討していく予定である。イノシトール濃度の低下が不十分な場合には、ダブルノックアウト系統の作出、イノシトール制限食の摂取等によって脳内イノシトール濃度の低下を達成できるか、行動との関連について検討する。

具体的には、細胞内でイノシトールを生成するための主要な経路である、イノシトールモノリン酸の脱リン酸化を触媒するIMPaseをコードする二つの遺伝子Impa1,Impa2の機能欠損マウスの表現型を観察した。IMPaseはリチウムの直接の標的であると想定されている酵素でもあり、実際in vitroでImpa1,Impa2タンパク質の酵素活性はリチウムにより阻害される(Ohnishi et al.JBC,2007など)。Impa1機能欠損マウスに関しては、ほとんどが出産直前あるいは出産直後に死亡したが、下あごの形成不全や胸骨-肋骨接合部の非対称性、心臓の低形成といった極めて特徴的な表現型をしめし、少なくとも胎生期においてはImpa1によってイノシトールモノリン酸から供給されるイノシトールが、正常な発生に必須の役割を果たすことが判明した。このことは、リチウムを服用した妊婦から、心奇形を持つ子供が高頻度で産まれるという報告との関連で興味深い。なおImpa2 KOマウスは一見正常に成育し、各種行動試験においても際だった異常を示さなかった。これらの結果やいくつかの状況証拠から、少なくとも脳内ではImpa2経路は主要なイノシトール合成経路ではなく,Impa1経路が重要であると予測された。Impa1機能欠損マウスに関しては、妊娠期に母親の飲み水にイノシトールを供給(離乳時まで)すれば、その致死性を回避できることが判明した。本マウスは、飲み水にイノシトールを混入するかどうかにより、ある程度自由に体内イノシトール濃度をコントロールでき、今後のイノシトール枯渇と行動の関連を研究するに当たって、重要なツールとなると期待される。これらの研究成果は、鋭意論文としてとりまとめ中である。
発生工学技術から展開するネコ胚性幹(ES)細胞株の樹立

本研究の目的は、ネコES細胞を樹立し、再生獣医療へ役立てることである。ネコにおける体外受精およびES細胞株の樹立について検討し、以下のことを明らかにした。(1)BCBによってネコ卵巣由来卵子を選別した結果、BCB(+)の卵子は、優位に体外成熟し、桑実胚/胚盤胞期胚へも優位に発育することがわかった。(2)ネコ精子では、パーコール法により質の良い卵子が選別できることがわかった。(3)ネコLIFの遺伝子配列を明らかにし、これはヒトやマウスLIFと高い相同性を示した。(5)体外受精卵から得られた胚盤胞期胚からネコES様細胞のコロニーが得られた。本年度の研究では、ネコES細胞株を樹立するために、去勢および避妊手術によって廃棄される精巣および卵巣から精子と未成熟卵子を回収し、これを体外受精によって胚盤胞期胚にまで成長させることを目的に、以下の項目を検討した。(1) Brilliant cresyl blue (BCB)によるネコ卵巣由来卵子の選別:避妊手術で得たネコ卵巣から未成熟卵子を回収し、卵丘細胞が付着しているGrade1,2群、卵丘細胞があまり付着していないGrade3,4群の2群に分けた。さらにBCB染色による卵子の染色の有無(+/-)によりGrade1,2+群、Grade1,2-群、Grade3,4+群、Grade3,4-群の4群に分けた。M-199培地で各群を24時間培養し、IVM卵子の核成熟率をHoechst染色により比較した。その結果、成熟(MII)卵子の割合は、他群と比較し、Grade1,2+群で有意に高値を示した。さらに、4群の卵子を各群IVM後、(2)で検討したパーコール洗浄済み凍結融解精液と共培養した後、6日間培養し、卵割率、桑実胚/胚盤胞率を比較した。その結果、卵割率、桑実胚/胚盤胞率は、他群と比較し、Grade1,2+群で有意に高値を示した。(2)ネコ精子の凍結保存とパーコール法による選別:去勢手術で得たネコ精巣上体から精子を回収し、凍結保存した。凍結精液を融解後パーコール洗浄したパーコール群と無洗浄のコントロール群に分け、先体を持つ精子の割合、精子生存指数をそれぞれ比較した。その結果、先体を持つ精子の割合は、コントロール群と比較し、パーコール群で有意に高値を示した。精子生存指数は、コントロール群と比較し、パーコール群で増加する傾向を示した。以上の結果から、(1)(2)より優良卵子・精子の選別が可能となった。また、これらの結果から胚盤胞期胚が作製され、ネコES細胞株樹立につながる研究成果が得られた。ネコ体外受精の効率をさらに上昇させるために、ヒトで用いられている培地を用いた培養法のうち、胚の発育に必要な成分を全て含んだ培地で培養する方法(one-step法)および胚の各発生段階に適した成分を含む培地で順次培養する方法(two-step法)によって、未成熟卵子から桑実胚および胚盤胞期胚への発生率について比較した。すなわち、避妊手術で得たネコ卵巣から未成熟卵子を回収し、卵丘細胞が付着しているGrade1,2と卵丘細胞があまり付着していないGraae3の2つに分類した。それぞれの卵子をM199培地で30時間体外成熟し、HTF培地に移して18時間体外受精を行った。その後の体外培養では、(1)0.3%BSA含有Only-one培地で6日間(one-step群)(2)0.3%BSA含有Only-one培地で2日間、5%FBS含有Only-one培地で4日間(one-step+FBS群)(3)0.3%BSA含有Early-Culture培地で2日間、0.3%BSA含有Blastocyst培地で4日間(two-step群)(4)0.3%BSA含有Early-Culture培地で2日間、5%FBS含有Blastocyst培地で4日間(two-step+FBS群)の4群に分けて培養した。その結果、すべての群で胚盤胞期胚への発生が認められ、特にone-step+FBS群において、胚盤胞期胚の発生率が有意に増加した。次に、胚盤胞期胚から内部細胞塊(ICM)を分離し、ES細胞様コロニーの作製について検討したところ、細胞間境界が明瞭で、核に対して細胞質が少なく核小体が明瞭な.ヒトES細胞に類似した形態を示すコロニーが観察された。さらに、ネコES細胞の培養に必要なサイトカインであるネコLIFのクローニングを試みた。すなわち、ネコ胎子線維芽

細胞からcDNAを作成し、ヒト、マウスなどで相同性が高い部分で作成したプライマーを用いてPCRによりネコLIFDNAを増幅した。増幅したDNAをシークエンスしネコLIFのアミノ酸配列を確認した。以上の結果から、ネコ体外受精系の確立に成功し胚盤胞期胚を多数供給した後、ネコES様細胞を培養することが可能となった。これらの結果は、ネコES細胞株樹立につながる研究成果である。
アルミニウム基アモルファス合金粉末の作成とそのバルク材の諸特性

前年度の研究において、Heガスを用いた超高圧ガス噴霧法により約25μm以下の粒径を持つAl-Y-Ni系のアモルファス粉末が8090%の高歩留りで作製できることを明らかにし、またこの粉末からのアモルファスバルク材への成型法を模索した。最終年度であるこの一年間では、主にアモルファス粉末の温間押出し法によるバルク成型化を試みると共にその特性の評価を行い、高強度軽合金の開発の可能性を調べた。Al-Y-Ni系のアモルファス合金は約10at%Y、510at%Niの組成域において、結晶化温度(Tx)直下でガラス遷移現象を示し、粘性が著しく低下することを見出した。そこで、ガラス遷移温度(Tg)域での温間押出しを試みた。その結果、553573Kの温度域では結晶相をほとんど含まれないアモルファスバルク材が、583603Kの温度域ではアモルファス相と結晶相が混在したバルク材が作製することが明らかになった。しかしながら、前者のアモルファス単相のバルク材では密度が約98%であり、さらに高密度化を計るための押出し条件の改善が必要である。一方、後者のアモルファス相と結晶相が混在したバルク材の密度は99%以上であり、バルク材のヤング率、圧縮強度、曲げ強度および引張強度はそれぞれ138GPa、1480MPa、1360MPa、940MPaであり、これらの値が結晶質Al基合金で最高値を示す超ジュラルミンの23倍も高い値であることが特筆できる。このようにアモルファスAl基合金を用いることにより高強度な軽合金を開発できる可能性が充分にあることが判明した。アルミニウムアモルファス合金粉末とその粉末からバルク材を作製するための最適組成を決めるために、アルミニウム基合金のアモルファス相の生成範囲と機械的性質や熱的安定性などの基本的性質の解明を前年度に引続き行なうとともに、23の合金系において超高圧ガス噴霧装置を用いてアルミニウムアモルファス粉末の作製を試みるとともに得られた粉末のバルク化とその基本的性質を調ベた。アモルファス相は、AlーSiーM(M=還移金属)やAlーGeーMの金属ー半金属系3元合金およびAlーMiーM_2(M_1=IV、V、VI族の還移金属、M_2=VII、VIII族の還移金属)の金属ー金属系3元合金の外に、AlーLn(Ln=希土類元素)系2元合金およびAlーLnーM系3元合金において生成することが判明した。特に、AlーLnーM系合金のアモルファス形成能は他のアルミニウム基合金の形成能よりも大きく、しかもその引張強さや硬さも高いことを見出した。また、AlーLnーNiやAlーLnーCo系合金では結晶化温度以下の温度域でガラス還移覘家が現われ、アモルファス粉末からアモルファスバルクを得るのに適した性質を有していることが明らかになった。これらの知見に基づいて、AlーYーNi系合金において超高圧ガス噴霧法によりアモルファス球状粉末の作製を試みた結果、Heガスを用いた場合に約25μm以下の粒形粉末がアモルファス相になること、および25μm以下のアモルファス粉末が8090%の高歩留で作製できることが明らかになった。現在、このアモルファス粉末を温間加圧焼結法や温間押出し法によりアモルファス相を保持した状態でバルク化するための諸条件を検討しており、小片ではあるがアモルファスバルクの作製に成功している。今後、より詳細に条件を検討することにより、高強度をもつアモルファスバルクへの成型法を確立できるものと考えている。

前年度の研究において、Heガスを用いた超高圧ガス噴霧法により約25μm以下の粒径を持つAl-Y-Ni系のアモルファス粉末が8090%の高歩留りで作製できることを明らかにし、またこの粉末からのアモルファスバルク材への成型法を模索した。最終年度であるこの一年間では、主にアモルファス粉末の温間押出し法によるバルク成型化を試みると共にその特性の評価を行い、高強度軽合金の開発の可能性を調べた。Al-Y-Ni系のアモルファス合金は約10at%Y、510at%Niの組成域において、結晶化温度(Tx)直下でガラス遷移現象を示し、粘性が著しく低下することを見出した。そこで、ガラス遷移温度(Tg)域での温間押出しを試みた。その結果、553573Kの温度域では結晶相をほとんど含まれないアモルファスバルク材が、583603Kの温度域ではアモルファス相と結晶相が混在したバルク材が作製することが明らかになった。しかしながら、前者のアモルファス単相のバルク材では密度が約98%であり、さらに高密度化を計るための押出し条件の改善が必要である。一方、後者のアモルファス相と結晶相が混在したバルク材の密度は99%以上であり、バルク材のヤング率、圧縮強度、曲げ強度および引張強度はそれぞれ138GPa、1480MPa、1360MPa、940MPaであり、これらの値が結晶質Al基合金で最高値を示す超ジュラルミンの23倍も高い値であることが特筆できる。このようにアモルファスAl基合金を用いることにより高強度軽合金を開発できる可能性が充分にあることが判明した。
飲水中残留塩素による卵白アルブミン特異的免疫反応の誘導:塩素と食物アレルギー

飲水中の残留塩素が食物アレルギーの発症や進行に関与するかを明らかにすることを目的に、動物実験と調査研究を行った。マウスに長期間、0.1%塩素水または蒸留水を自由摂取させた後、卵白アルブミン(OVA)を用いて免疫し、OVA特異的なアレルギー反応について測定した。塩素水を摂取したマウスにおいては、OVA特異的な抗体価(III型アレルギー)、遅延型過敏反応(IV型アレルギー)、および小腸粘膜の細胞障害性T細胞の割合(IV型アレルギー)が、塩素を摂取しなかったマウスに比べて高い値であった。一方、浄水場からの距離が10km未満、10km以上20km未満、および20km以上の地域において、水道水を採水し、残留塩素濃度を測定した。その結果、浄水場に近いほど、水道水中の残留塩素濃度は高い傾向がみられた。更に、浄水場の付近および遠隔地域に在住する20歳代女性を対象に、アレルギーに関する質問調査を行ったところ、浄水場に近いほど食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の有病率が高かった。したがって今回、動物実験と調査研究により、飲水中の残留塩素は、アレルギー反応を亢進させ、アレルギー疾患の発症や進行に関与する可能性が示唆された。今年度は、塩素の経口摂取が卵白アルブミン(OVA)特異的免疫反応に及ぼす影響を、マウスを用いた実験で調べた。塩素を0%、0.1%または1%含んだ蒸留水0.5mlを5日間マウスに経口投与した後、OVAを水酸化アルミニウムアジュバントと共に2回腹腔に免疫した。その後、マウス血清中の抗OVA抗体価をELISA法により測定すると共に、OVA特異的な遅延型過敏反応(DTH)を測定した。塩素を投与したマウスの抗OVA IgG2aとIgG2b抗体価、およびDTHは、塩素を投与しなかったマウスに比べて高い値を示した。またこれら抗体価とDTHの上昇の度合いは、塩素の投与量に依存していた。一方、塩素を投与したマウスの抗OVA IgG1抗体は、塩素を投与しなかったマウスに比べて低い値であった。次に、OVAを腹腔でなく経口免疫した場合の、塩素の経口摂取の影響を調べた。塩素を0%または0.1%含んだ蒸留水を9週間マウスに自由摂取させた。その間、OVAをコレラトキシンアジュバントと共に3回経口免疫し、マウス血清中の抗OVA抗体価を測定した。OVAを経口免疫した場合でも、腹腔免疫した場合と同様な免疫反応を示し、塩素を経口投与したマウスの抗OVA IgG2aとIgG2b抗体価は、塩素を投与しなかったマウスに比べて高い値であった。また、塩素を投与したマウスの抗OVA IgG1抗体は、塩素を投与しなかったマウスに比べて低い値であった。以上より、塩素を高濃度に含む水を摂取した場合、Th2型の免疫反応よりも、むしろ、食物抗原に対するIgG2a抗体産生や遅延型過敏反応といったTh1型の免疫反応が優位に誘導される可能性が示唆された。今年度は、塩素の経口摂取がタンパク抗原特異的T細胞の反応に及ぼす影響を、昨年度に引き続きマウスを用いて研究した。また一方で、実際の浄水場からの距離と水道水中の残留塩素濃度およびpHとの相関を調べた。更に調査研究により、浄水場からの距離とアレルギー疾患の発症率を調べた。塩素を0%または0.1%含んだ蒸留水を8週間マウスに自由摂取させ、その間、卵白アルブミン(OVA)をコレラトキシンアジュバントと共に3回経口免疫した後、脾臓を摘出した。そしてこれら臓器から精製したT細胞におけるOVA特異的な増殖反応を、テトラゾリウム塩(MTT)法により測定した。塩素を投与したマウスの脾臓T細胞のOVA特異的な増殖反応は、塩素を投与しなかったマウスに比べて有意に高い値を示した。また、浄水場からの距離が長くなるにしたがって、水道水中の遊離残留塩素および結合残留塩素は低くなり、pHは高くなる傾向がみられた。次に、浄水場からの距離と食物アレルギーの関係を調べた。20代女性を対象にアンケート調査を行い、浄水場から10km未満、10km以上20km未満、および20km以上の地域に住んでいる女性における、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の発症率を調べた。

その結果、食物アレルギーの症状を呈したことがあると答えた女性は、浄水場から近い順に、11.1%、5.6%、0%であり、一方、アトピー性皮膚炎の症状を呈したことがあるであると答えた女性は、30.6%、11.1%、0%であった。従って、浄水場に近い程、食物アレルギーとアトピー性皮膚炎の発症が高くなることが示唆された。花粉症とぜんそくにおいても同様な傾向がみられた。以上より、動物実験においては、塩素の経口摂取により抗原特異的T細胞の反応が有意に高くなること、また調査研究においては、浄水場に近く、水道水中の塩素濃度が高くなるに従って、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の発症率が高い傾向が示された。今年度は、塩素の経口摂取が消化管粘膜におけるタンパク質特異的細胞障害性T細胞の誘導に与える影響、およびそれらT細胞反応を誘導する樹状細胞に与える影響を、TM反応に傾きやすいC57BL/6マウスを用いて研究した。また一方で昨年に引き続き調査研究を行い、浄水場からの距離とアレルギー疾患の発症率を調べた。塩素を0%または0.1%含んだ蒸留水を3ヶ月間マウスに自由摂取させた後、卵白アルブミン(OVA)をコレラトキシンアジュバントと共に2回経口免疫し、脾臓細胞と小腸上皮間リンパ球を採取して、これらの細胞におけるOVA特異的細胞障害性T細胞(CTL)をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、塩素を投与したマウスの小腸粘膜のT細胞は、塩素を投与しなかったマウスに比べて、OVA特異的細胞障害活性が高かった。一方、脾臓T細胞においては、塩素投与による影響はみられなかった。次に、塩素を投与、非投与したマウスの脾臓と小腸粘膜の樹状細胞(DC)を採取し、そのサブタイプについて調べたところ、塩素投与したマウスの小腸粘膜においては、Th2反応を誘導する33D1陽性DCが著しく減少していた。これらより、塩素の経口摂取はC57BL/6マウスの小腸粘膜のTh2誘導性DCを減少させ、結果的にCTLや遅延型過敏反応およびIgG2a抗体産生といった、Th1優位な免疫反応を誘導する可能性が示唆された。一方、昨年に引き続いた調査研究において、浄水場に近く、水道水中の塩素濃度が高くなるに従って、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の発症率が高い傾向が示された。以上より、飲水中の塩素は、C57BL/6マウスの消化管粘膜のTh2誘導性抗原提示DCを減少させ、消化管粘膜および全身のTh1免疫反応を過剰に誘導する可能性が示唆された。しかし、ヒトの場合は塩素摂取によりTh1のみならずTh2反応の過剰反応も誘導される可能性があるため、塩素投与がTh2優位なマウスストレインの消化管粘膜のDCに与える影響も今後調べる必要があると考える。
siRNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの視神経変性疾患への適応

エンドセリン誘発網膜視神経障害でリン酸化ERKは網膜で一過性に上昇し、視神経では遅れて上昇することが確認され、この上昇は保護的に働いていることが確認された。またsiRNAの浸透度に関して、硝子体注射で網膜神経節細胞の中に入ることを確認した。CRE decoyオリゴヌクレオチドにより、TNF-αによる内因性のBDNF上昇は有意に抑制され、その上昇は内因性の保護機構であることが示唆された。siRNAおよびオリゴヌクレオチドが視神経変性疾患モデルにある程度有用であることが示唆された。TNF-α誘発視神経障害、エンドセリン誘発網膜視神経障害、NMDA誘発網膜障害に関わる分子生物学的出来事を視神経、網膜別に検討してきた。TNF-α、NMDA硝子体注射後の形態学的変化は現在までに検討していたため、今年度はエンドセリン硝子体注射後の網膜神経節細胞および視神経障害を時間的に検討した。硝子体注射後28日での網膜垂直切片の結果をもとにエンドセリンの量を0.2nmolに決定し、硝子体注射後1、7、14、28日後の網膜及び視神経をサンプルにウェスタンブロットでextracellular signal-regulated kinase(ERK)の蛋白を検討した。ERKはいずれも変化を認めなかったが、リン酸化ERKは網膜で一過性に上昇し、視神経では遅れて上昇することが確認された。またリン酸化ERKは網膜でも視神経においても、アストロサイトのマーカーであるGFAPと共存していることが確認された。ERKの阻害剤であるU0126を用いた研究によりp-ERKの上昇は網膜にも視神経にも保護的に働いていることが確認され、現在すでに臨床で使用されているウノプロストンにp-ERKを上昇される効果があることが確認され、視神経の保護の観点からも期待がもたれた(Vis Neurosci,in press)。またsiRNAの浸透度に関して、まず硝子体注射で検討し、網膜神経節細胞の中に入ることを確認した(Brain Res,2007)。現在様々なsiRNAの効果について検討中である。昨年度はsiRNAの浸透度に関して、まず硝子体注射で検討し、網膜神経節細胞の中に入ることを確認した(BrainRes,2007)。更にこれまでにsiRNAを球後注射して、視神経への浸透度を評価してきた。アテロコラーゲン等を用いていろいろ試みたが、やはり球後注射されたcy3-labeled siRNAを視神経内で検出することが困難であった。そこで硝子体注射で視神経に存在する因子に影響を与えることができるかどうかを検討した。TNF-α誘発視神経障害においてデコイオリゴヌクレオチドを用いてその効果を検討した。まずTNF-α硝子体注射により、視神経において内因性のp-CREBとBDNFが一過性に上昇することを確認した。CRE decoyオリゴヌクレオチドはp-CREBがCRE領域に結合するのを阻害する。このオリゴヌクレオチドにより、TNF-αによる内因性のBDNF上昇は有意に抑制された。オリゴヌクレオチド単独では視神経軸索に変化は認めなかったが、TNF-αと組み合わせることで、TNF-αによる軸索数減少は有意に増強された。このことより一過性内因性p-CREBおよびBDNFの上昇は、内因性の保護機構であることが示唆された。p-CREBもBDNFもその局在は、視神経軸索ではなく、むしろオリゴデンドロサイトであったため、硝子体注射されたオリゴヌクレオチドが視神経に働きかけていることが考えられた。
照射下における可動欠陥クラスタの実証と特性評価に関する理論的・実験的研究

イオンや中性子による照射を被ると材料中には多量の格子欠陥が導入され、材料は劣化に至る。最近の理論的研究ならびに我々の実験的研究では、はじき出しカスケード(点欠陥の密集領域)の形成過程において新しい型の欠陥(クラウディオン型クラスタ)が予測されている。この欠陥は非常に可動性が高いと予測され、例えば結晶粒界などにおける欠陥蓄積が促進され、材料劣化が加速試験の予測よりも早く進行する可能性がある。そこで本研究ではこれらの機構解明に関して実験的、理論的研究を展開する。特に以下の三点について検討した。(1)クラウディオン型クラスタの直接観察十分に焼鈍した高純度の銅と金において400600°Cにてイオン照射その場電顕観察実験を行い、100nmオーダーの長距離可動な欠陥を観測した。これらの寿命、移動の異方性、照射線量依存性などから格子間原子型欠陥でありかつクラウディオン型であることを明らかにした。(2)クラウディオン型クラスタの安定性に関する分子動力学計算実験分子動力学計算により純銅中のクラウディオン型クラスタの安定性を調べた。そしてこの欠陥が非クラウディオン型に変化する過程、熱的安定性、およびその後の可動性についてシミュレーションを行った。(3)イオン照射したCu-Co合金析出物の断面電顕観察実験時効析出型合金であるCu-Co中の整合析出粒子周辺の弾性歪場が格子欠陥に影響されて不整合化する現象を利用し、クラウディオン型クラスタの計測法を確立した。そしてイオン照射した試料の断面電顕観察により飛程よりも1μ程度深部においても整合性が低下することを確認した。照射線量、線量率、照射温度依存性などからクラウディオン型クラスタの拡散によるものであることを明らかにした。今年度の成果は、投稿論文(4件)および国内学会(2件)にて発表された。特に以下の三点にっいて検討した。(1)加速器結合型電子顕微鏡によるクラウディオン型クラスタの直接観察十分に焼鈍した高純度の銅と金において400600°Cの比較的高温でのイオン照射その場電顕観察実験からクラウディオン型クラスタを実験的に捉えることに世界で初めて成功した。そして100nmオーダーの可動性やその形成頻度に及ぼす照射環境の影響などを明らかにした。(2)CBの安定性に関する分子動力学計算実験その場観察実験の結果から、クラウディオン型クラスタが移動し点欠陥と相互作用してフランク・ループに変化する、というモデルを構築し、その検証のため分子動力学計算を行った。熱的安定性や空孔どの相互作用から、80K以上での可動性や空孔との相互作用などを明らかにした。(3)イオン照射したCu-Co合金析出物の断面観察実験時効析出型合金であるCu-Co中の整合析出粒子周辺の弾性歪場を利用し、クラウディオン型クラタの計測法を確立した。そしてイオン照射後の断面観察により飛程よりも深部で整合性低下を確認し、照射環境依存性からクラウディオン型クラスタの拡散によるものであることを明らかにした。

今年度の成果は、投稿論文1件、修士論文1件、および国際学会1件、国内学会3件として発表された。イオンや中性子による照射を被ると材料中には多量の格子欠陥が導入され、材料は劣化に至る。最近の理論的研究ならびに我々の実験的研究では、はじき出しカスケード(点欠陥の密集領域)の形成過程において新しい型の欠陥(クラウディオン型クラスタ)が予測されている。この欠陥は非常に可動性が高いと予測され、例えば結晶粒界などにおける欠陥蓄積が促進され、材料劣化が加速試験の予測よりも早く進行する可能性がある。そこで本研究ではこれらの機構解明に関して実験的、理論的研究を展開する。特に以下の三点について検討した。(1)クラウディオン型クラスタの直接観察十分に焼鈍した高純度の銅と金において400600°Cにてイオン照射その場電顕観察実験を行い、100nmオーダーの長距離可動な欠陥を観測した。これらの寿命、移動の異方性、照射線量依存性などから格子間原子型欠陥でありかつクラウディオン型であることを明らかにした。(2)クラウディオン型クラスタの安定性に関する分子動力学計算実験分子動力学計算により純銅中のクラウディオン型クラスタの安定性を調べた。そしてこの欠陥が非クラウディオン型に変化する過程、熱的安定性、およびその後の可動性についてシミュレーションを行った。(3)イオン照射したCu-Co合金析出物の断面電顕観察実験時効析出型合金であるCu-Co中の整合析出粒子周辺の弾性歪場が格子欠陥に影響されて不整合化する現象を利用し、クラウディオン型クラスタの計測法を確立した。そしてイオン照射した試料の断面電顕観察により飛程よりも1μ程度深部においても整合性が低下することを確認した。照射線量、線量率、照射温度依存性などからクラウディオン型クラスタの拡散によるものであることを明らかにした。今年度の成果は、投稿論文(4件)および国内学会(2件)にて発表された。
幅拘束大圧下制御圧延による易成形高強度バイモーダル薄鋼板の製造基盤研究

本研究の最終目的は,強度1GPa伸び20%以上である高強度・易成形バイモーダル薄鋼板を製造し,高強度・易成形バイモーダル鋼材を自動車部品に適用することで,車体の部材使用量の減少および燃費效率を向上させ,自然環境の毀損の最小化,省エネルギー化することにある.(2年目)幅拘束大圧下制御圧延機を用い,易成形高強度バイモーダル薄鋼板の製造および塑性加工特性の把握(1)幅拘束大圧下制御圧延機を用い,バイモーダル組織の製造条件におけるデータの定量化:熱間加工シミュレーター試験により得られたデータを基にして,幅拘束大圧下制御圧延を実施し,理想的なバイモーダル組織を形成する圧延条件を定量化する.(2)多様な加工条件により作られた試料の塑性加工特性の把握:幅拘束大圧下制御圧延により製造された幅100mm高さ13mmの薄鋼板を用い,深絞り,穴広げ,エリクセン実験を行うことでバイモーダル組織の成形性を調査する.○研究の状況幅拘束大圧下制御圧延機により加熱温度・冷却手法・圧下率など多様なパラメーターを変化させて圧延した低炭素鋼(S20C・S25C)の内部組織を検討した結果から,目指しているサブミクロンサイズ(<1um )の基地(マトリックス)組織に2ー4umサイズの結晶粒が混合を有するバイモーダル組織を創成する最適な条件は,圧延後ミスト冷却・加熱温度900°C近傍・圧下率70%(相当ひずみ=1.39)以上が必要となると判断される(指導原理の定量化).この結果はS20Cを用いて平面ひずみ圧縮試験を行った時の結果と良く一致した.また,エリクセン・深絞り試験により圧延材の成形性を調査した結果,バイモーダル組織を持つことで均一伸びが高く,優れた成形性を示したと判断する.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の最終目的は,強度1GPa伸び20%以上である高強度・易成形バイモーダル薄i鋼板を製造し,高強度・易成形バイモーダル鋼材を自動車部品に適用することで,車体の部材使用量の減少および燃費效率を向上させ,自然環境の毀損の最小化,省エネルギー化することにある.具体的に説明すると, 1.熱間加工シミュレーターにより最適加工条件の把握, 2.熱間加工シミュレーターのデータを基にして幅拘束大圧下制御圧延機を用いて高強度・高延性を持つバイモーダル薄鋼板の製造, 3.バイモーダル薄鋼板の塑性加工特性の取得を行う.これらを調査することで,実際に高強度・高延性の二つの性質を適切に組み合わせるバイモーダル鉄鋼材料を製造し,それらを産業に適用するための基盤研究を行う.平成25年度1.熱間加工シミュレーター試験により最適加工条件の把握(1)バイモーダル組織を形成する最適加工条件の探索材料は主に低炭素鋼を用い,熱間加エシミュレータ(熱間圧縮)を利用して種々の加工温度,加工速度,冷却速度などのパラメータを調整しながら実験を行い,バイモーダル組織を形成する最適加工条件を調査する.組織の評価は結晶方位,ミスオリエンテーション,集合組織などを組み合わせて金属組織学的に深く検討し,低炭素鋼でのバイモーダル混合組織の形成機構について解明する.(2)内部組織の変化による機械的特性の調査(1)の試験を用いて製造された試料の機械的特性を調査するため,硬度試験及び引張試験を実施する.硬度試験を通じて,内部組織の変化に対する硬度変化を観察し,引張試験施行の前に最大引張強度を予想する.その後,引張試験を行い,降伏強度,最大引張強度,均一伸び,延伸率を調査する.本研究の最終目的は,強度1GPa伸び20%以上である高強度・易成形バイモーダル薄鋼板を製造し,高強度・易成形バイモーダル鋼材を自動車部品に適用することで,車体の部材使用量の減少および燃費效率を向上させ,自然環境の毀損の最小化,省エネルギー化することにある.(2年目)幅拘束大圧下制御圧延機を用い,易成形高強度バイモーダル薄鋼板の製造および塑性加工特性の把握(1)幅拘束大圧下制御圧延機を用い,バイモーダル組織の製造条件におけるデータの定量化:熱間加工シミュレーター試験により得られたデータを基にして,幅拘束大圧下制御圧延を実施し,理想的なバイモーダル組織を形成する圧延条件を定量化する.(2)多様な加工条件により作られた試料の塑性加工特性の把握:幅拘束大圧下制御圧延により製造された幅100mm高さ13mmの薄鋼板を用い,深絞り,穴広げ,エリクセン実験を行うことでバイモーダル組織の成形性を調査する.○研究の状況幅拘束大圧下制御圧延機により加熱温度・冷却手法・圧下率など多様なパラメーターを変化させて圧延した低炭素鋼(S20C・S25C)の内部組織を検討した結果から,目指しているサブミクロンサイズ(<1um )の基地(マトリックス)組織に2ー4umサイズの結晶粒が混合を有するバイモーダル組織を創成する最適な条件は,圧延後ミスト冷却・加熱温度900°C近傍・圧下率70%(相当ひずみ=1.39)以上が必要となると判断される(指導原理の定量化).この結果はS20Cを用いて平面ひずみ圧縮試験を行った時の結果と良く一致した.

また,エリクセン・深絞り試験により圧延材の成形性を調査した結果,バイモーダル組織を持つことで均一伸びが高く,優れた成形性を示したと判断する.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。S20Cについては,高ひずみ速度付与試験設備での試験が終了した.圧下率に対応した圧縮率は70%,加熱温度は700°C900°Cの間について実験を行った.この試験によって, 800°Cを上回る温度でバイモーダル組織の形成が始まり, 850°Cの温度で数ミクロンの微細粒とサブミクロンの超微細粒からなるバイモーダル組織(平均粒径1.4ミクロン)が得られた.平成26年には幅拘束大圧下制御圧延機を用い,易成形高強度バイモーダル薄鋼板の製造および塑性加工特性の把握する.先に熱間加工シミュレーター試験により得られたデータを基にして,幅拘束大圧下制御圧延を実施し,理想的なバイモーダル組織を形成する圧延条件を定量化する.また,バイモーダル組織の持つ機械的特性(高強度・高延性)を把握するため,引張試験,ビッカース硬度試験などを実施する.これらの実験から得たデータを解析することでバイモーダル混合組織が持つ特異な特性を探求する.その上,多様な加工条件により作られた試料の塑性加工特性の把握する.幅拘束大圧下制御圧延により製造された幅100mm高さ13mmの薄鋼板を用い,深絞り,エリクセン実験を行うことでバイモーダル組織の成形性を調査する.また,実験された試料の組織と成形性の関係について定性・定量的な評価をすることで産業界にバイモーダル組織の薄板鋼板の適用可能性を見極める.
質量分析イメージング法による線虫C.エレガンスのシングルセルレベル脂質マッピング

本研究はすべての細胞の位置と形が特定されているモデル生物線虫C.エレガンスを用いて,これまで不可能であったシングルセルレベルで生体分子の発現マッピングを行い,これまでほとんどわかっていない脂質などの生体分子の局在とその成立メカニズムを明らかにする.またその研究成果を発展させて,将来のヒトを用いた医学応用のための基礎技術の確立を目指す.本年度は研究の最終年度として,本研究の結果確定した固定法(30分程度のパラホルムアルデヒド(PFA)固定)で処理した線虫の凍結切片を用いて,TOF-SIMS法で線虫のイメージング解析を行った.10 keV Ar1000+をスパッタリングイオンビーム(TOF.SIMS5, ION-TOF GmbH)として、表面をクリーニングしたのち,60 keVのBi3++を一次イオンとして測定した.また,昨年度開発した測定データを主成分分析(PCA)で解析し,二次イオン像を融合させる方法によって,空間分解能の向上したイメージを得た.その結果,いくつかのアミノ酸由来と想定されるフラグメンイオンが,腸など特定の組織(細胞)に偏在していることが示された.このように本研究で当初予定していた通りシングルセルレベルでの生体分子イオン局在解析が可能になった.一方で,線虫は微細であるため,生体分子が局在する細胞・組織の解剖学的位置をより明確にかつ迅速に確定するための基礎的な技術開発が必要であることも明らかになった.本研究の成果をもとに今後そのような方向に研究を発展させる予定である.線虫C.エレガンスは成虫でも体長1ミリ前後と,質量分析イメージング法(IMS)で解析されてきた材料としては非常に小さく,これまで我々が行ってきたマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法によるイメージングでは解像度が十分ではなく,発現細胞・組織の特定が困難であった.そこで本研究では高解像度での解析が可能な飛行時間型二次イオン質量分析(TOF-SIMS)法によるイメージングの導入を行う.TOF-SIMS法は特に解像度に優れており,1μm以下の解像度で生体分子の局在情報が得られる.本研究ではすべての細胞の位置と形が特定されている線虫C.エレガンスを用いてこれまで不可能であったシングルセルレベルで脂質の発現マッピングを行い,その環境変異と遺伝学的変異による変化プロファイルを明らかにすることで,これまでほとんどわかっていない脂質の局在の機能とその成立メカニズムを明らかにし,将来のヒトを用いた医学応用のための基礎技術の確立を目指す.本年度は研究の初年度として,新たに成蹊大学理工学部青柳里果教授との共同研究を開始した.解析機器はアルバックファイ社のシステムに加えて新たにION-TOF社のTOF-SIMSシステムを用いた.予備的なサンプル準備法の条件決定の結果,軽度(30分程度)のパラホルムアルデヒド(PFA)固定が,脂肪酸などの生体分子検出に最適であることがわかった.線虫をPFA固定後,凍結切片を作製して,計測を行うことで,生体由来の脂肪酸を効率よく検出することができた.今後は変異体や培養条件の変化における生体分子の発現量や発現パターンの変化を観察するとともにより細かい発現細胞・組織の特定を試みる予定である.ナノメーターレベルの高解像度を実現するTOF-SIMSを線虫に導入し,細胞ごとの生体分子の分布を解析することを目指し,サンプルの準備法の検討をおこなった.安定度の高いパラホルムアルデヒド(PFA)固定後の凍結切片法の条件を検討し,最適な条件を決定することができた.またこれまでのアルバックファイ社のシステムに加えてION-TOF社のシステムを導入しより感度の高い解析ができるようになった.本研究ではすべての細胞の位置と形が特定されている線虫C.エレガンスを用いてこれまで不可能であったシングルセルレベルで脂質の発現マッピングを行い,その環境変異と遺伝学的変異による変化プロファイルを明らかにすることで,これまでほとんどわかっていない脂質の局在の機能とその成立メカニズムを明らかにし,将来のヒトを用いた医学応用のための基礎技術の確立を目指す本年度は研究の2年度目として,昨年度確定した軽度(30分程度)のパラホルムアルデヒド(PFA)固定後の凍結切片を用いて,TOF-SIMS法で線虫のイメージング解析を行った.野生型(N2)とω3脂肪酸デサチュラーゼが欠損し、エイコサペンタエン酸(20:5 n-3)などω3脂肪酸が合成出来ない線虫fat-1変異体の2種を比較解析した.試料は、10 keV Ar1000+をスパッタリングイオンビーム(TOF.SIMS5, ION-TOF GmbH)として、表面をクリーニングしたのち,60 keVのBi3++を一次イオンとして測定した結果,N2とfat-1の間で二次イオン強度に差がある二次イオンピークが見つかった.また,いくつかのアミノ酸由来フラグメンイオンが,ある特定の組織に同様に偏在していることが分かった.また,新たなデータ解析法として,TOF-SIMSデータに関しては各ピクセルにおける各二次イオン強度を,光学顕微鏡イメージ像に関しては画像データの各ピクセルにおける強度を変数とし,測定データを主成分分析(PCA)で解析し,元のTOF-SIMSデータよりも空間分解能の向上したイメージを得ることができた.また,解像度の異なる二次イオン像を融合させることで,高い空間分解能も維持できることが示された.昨年度,安定度の高いパラホルムアルデヒド(PFA)固定後の凍結切片法の条件を検討し,最適な条件を決定することができたので,本年度は,この条件で作成した,線虫サンプルを用いて,ION-TOF社のシステムでイメージング解析を行った.

その結果野生型とfat-1変異体で異なるピークを得ることができた.また,測定データを主成分分析(PCA)で解析することで,元のTOF-SIMSデータよりも空間分解能の向上したイメージを得ることができた.また,解像度の異なる二次イオン像を融合させることで,高い空間分解能も維持できることが示された.以上の結果から,本研究の目的とする細胞レベルでのイメージングに必要な条件が揃った.本研究はすべての細胞の位置と形が特定されているモデル生物線虫C.エレガンスを用いて,これまで不可能であったシングルセルレベルで生体分子の発現マッピングを行い,これまでほとんどわかっていない脂質などの生体分子の局在とその成立メカニズムを明らかにする.またその研究成果を発展させて,将来のヒトを用いた医学応用のための基礎技術の確立を目指す.本年度は研究の最終年度として,本研究の結果確定した固定法(30分程度のパラホルムアルデヒド(PFA)固定)で処理した線虫の凍結切片を用いて,TOF-SIMS法で線虫のイメージング解析を行った.10 keV Ar1000+をスパッタリングイオンビーム(TOF.SIMS5, ION-TOF GmbH)として、表面をクリーニングしたのち,60 keVのBi3++を一次イオンとして測定した.また,昨年度開発した測定データを主成分分析(PCA)で解析し,二次イオン像を融合させる方法によって,空間分解能の向上したイメージを得た.その結果,いくつかのアミノ酸由来と想定されるフラグメンイオンが,腸など特定の組織(細胞)に偏在していることが示された.このように本研究で当初予定していた通りシングルセルレベルでの生体分子イオン局在解析が可能になった.一方で,線虫は微細であるため,生体分子が局在する細胞・組織の解剖学的位置をより明確にかつ迅速に確定するための基礎的な技術開発が必要であることも明らかになった.本研究の成果をもとに今後そのような方向に研究を発展させる予定である.PFA固定と凍結切片法を組み合わせた方法でTOF-SIMSに適したサンプルを作成し,アルバックファイ社,ION-TOF社のシステムに加えて最近英国NPLで開発されたOrbiSIMSのイメージングシステムを用いて,より精細な解析を行う.野生型と脂質合成変異体の比較,温度などの環境条件の変化を検討することで脂質の細胞内局在の生物学的役割を明らかにする.個々の脂質の分布パターンを炭素鎖の長さと二重結合の数まで区別して解析することはIMSでのみ可能な技術である.具体的には以下の順序でTOF-SIMSの高解像度イメージング解析を行う.a)生体膜の脂質の分布図を器官ごとまた可能であれば細胞ごとに比較する.b)脂質の構成要素である脂肪酸合成の変異体(fat遺伝子)での発現パターンの変化を解析し, LC-MSなど他の方法で得られたデータと比較検討する.PFA固定と凍結切片法を組み合わせた方法でTOF-SIMSに適したサンプルを作成し,アルバックファイ社,ION-TOF社のシステムに加えてOrbiSIMSのイメージングシステムを用いて,より精細な解析を行う.野生型と脂質合成変異体の比較,温度などの環境条件の変化を検討することで脂質の細胞内局在の生物学的役割を明らかにする.
ヒトのミトコンドリア蛋白質の転写の協調性を支配する転写調節因子の精製とクローニング

ヒトを含め全ての真核生物にミトコンドリアは存在し、その発現が転写レベルで厳密に調節されていることを明らかにした。まず、ヒトのATP合成酵素のalphaサブユニット遺伝子の構造を決定し、その転写の組織特異性を示し、さらに同酵素betaサブユニットの遺伝子のPboxおよびSboxと相同な配列が存在し、協調的な発現に関与している転写調節因子が存在する可能性を明らかにした(論文2)。次に、核におけるrRNAのプロセシングとミトコンドリアにおけるゲノム複製にかかわるRNA(MRP RNA)の遺伝子の転写調節領域(Box I)を決定した(投稿中)。ミトコンドリアは卵形成初期に爆発的に増加するが、このとき、MRP RNAは高レベルで転写されており、その転写調節領域への核タンパク質の結合はこの転写量に対するように変動した。また、MRP RNA遺伝子には未知のCキナーゼ遺伝子が隣接している。報告者は既にシロイヌナズナの葉緑体H^+輸送性ATPase遺伝子atpC2が液胞H^+輸送性ATPase遺伝子に近接していることに加えて、本年度は同種小胞体局在性オーキシン結合タンパク質遺伝子が小胞体で機能するSRPの7SLRNA遺伝子と近接していることを明らかにしており(論文1)、これらのことから、MRPRNA遺伝子と近接するCキナーゼ遺伝子も卵形成またミトコンドリア増殖になんらかの役割を担っているらしいことを明らかにした。
アシドーシスが未熟な血管の機能にあたえる影響に関する基礎的研究

平成6年度は直径100-200uの微小な抵抗血管を用いて研究をおこなった.実験動物:胎生28日の胎仔家兎(妊娠満期は31日),生後3日の新生仔,生後6カ月の成獣家兎を用いた。実験標本:腸間膜動脈(直径100-200uの小血管)を摘出し、1-2mmの長さに切断しリング状の標本を作製した.血管に直径20uのタングステン線を通し左右からひっぱって張力をかけた.実験装置:血管標本を倒立顕微鏡のステージに作ったバスの上におき、灌液を灌流した。血管の収縮力を張力トランスジューサ-で測定した.細胞内pHは水素イオン感受性色素BCECFを、細胞内Ca濃度はCa感受性色素fura-2を用い測定した.実験計画:コントロールの液は5%CO2で飽和しpH7.4とし、アシドーシスは20%CO2で飽和しpH6.8とした.研究成果:成獣ではアシドーシスにより血管収縮は70%ofCに低下し、その後95±5%ofCに回復した。一方新生仔ではアシドーシスで68±3%ofCに低下したままで回復しなかった.細胞内pHは成獣、新生仔ともにコントロールの7.1からアシドーシスで6.9に低下し両年齢群で差はなかった.細胞内Ca濃度の指標であるfura-2の螢光比は成獣ではアシドーシスで1.40から1.30に一過性に低下しその後1.42に上昇した.新生仔ではアシドーシスで1.80から1.75に一過性の低下の後、1.82にまで回復した.アシドーシスによる螢光比の低下幅,上昇幅は両年齢群で差はなかった.以上の結果より未熟な血管ではアシドーシスによる血管弛緩作用がよりおおきいこと、その差は細胞内pHやCaの変化では説明できないことが分かった.平成6年度は直径100-200uの微小な抵抗血管を用いて研究をおこなった.実験動物:胎生28日の胎仔家兎(妊娠満期は31日),生後3日の新生仔,生後6カ月の成獣家兎を用いた。一方新生仔ではアシドーシスで68±3%ofCに低下したままで回復しなかった.細胞内pHは成獣、新生仔ともにコントロールの7.1からアシドーシスで6.9に低下し両年齢群で差はなかった.細胞内Ca濃度の指標であるfura-2の螢光比は成獣ではアシドーシスで1.40から1.30に一過性に低下しその後1.42に上昇した.新生仔ではアシドーシスで1.80から1.75に一過性の低下の後、1.82にまで回復した.アシドーシスによる螢光比の低下幅,上昇幅は両年齢群で差はなかった.以上の結果より未熟な血管ではアシドーシスによる血管弛緩作用がよりおおきいこと、その差は細胞内pHやCaの変化では説明できないことが分かった.肺動脈と体動脈(大動脈など)の未熟な血管を用い、1)アシドーシスが血管収縮に与える影響、2)細胞内pH調節、3)アシドーシス下での細胞内Ca濃度調節について研究した.実験動物:胎生28日の胎仔家兎(妊娠満期は31日),生後3日の新生仔,生後6カ月の成獣家兎を用いた。実験標本:下行大動脈、左右肺動脈を摘出し、1-2mmの長さに切断しリング状の標本を作製した.実験装置:血管標本を倒立顕微鏡のステージに作ったバスの上におき、灌流液を灌流した。血管の収縮力を張力トランスジューサーで測定し、細胞内pHは水素イオン感受性色素BCECFを、細胞内Ca濃度はCa感受性色素fura-2を用い測定した.実験結果:コントロールの液は5%CO2で飽和しpH7.4とし、アシドーシスは20%CO2で飽和しpH6.8とした.1)50mM KClを含む液で灌流し血管の中等度収縮を起こさせた後、アシドーシスにすると、成獣大動脈では収縮は一過性に経度低下した後コントロールに戻ったが、未熟大動脈では大きく弛緩したままであった.成獣肺動脈は一過性に弛緩した後、むしろ収縮した.未熟肺動脈では大きく弛緩した.2)アシドーシス時の細胞内pHは未熟血管、成獣血管ともに同程度に低下した.3)アシドーシス時の細胞内Caは両年齢群でともに同程度上昇した.結論:アシドーシスが血管収縮に与える弛緩作用は未熟血管でより大きいがその機序は細胞内pHやCa濃度の変化では説明できず、筋肉固有の性質に起因するのかもしれない.

本研究では大動脈と腸間膜細動脈の未熟な血管を用い、1)アシドーシスが血管収縮に与える影響、2)細胞内pH調節、3)アシドーシス下での細胞内Ca濃度調節について研究した.平成5年度は大動脈など大きな血管で、6年度は直径100-200uの微小な抵抗血管を用いて研究をおこなった.実験動物:胎生28日の胎仔家兎(妊娠満期は31日),生後3日の新生仔,生後6ヵ月の成獣家兎を用いた。実験標本:大動脈、肺動脈、腸間膜動脈(直径100-200uの小血管)を摘出し、1-2mmの長さに切断しリング状の標本を作製した.血管に直径20uのタングステン線を通し左右からひっぱって張力をかけた.研究成果:コントロールの液は5%CO2で飽和しpH7.4とし、アシドーシスは20%CO2で飽和しpH6.8とした.1)50mM KClを含む液で灌流し血管の中等度収縮を起こさせた後、アシドーシスにすると、成獣大動脈では収縮は一過性に経度低下した後コントロールに戻ったが、未熟大動脈では大きく弛緩したままであった.成獣肺動脈は一過性に弛緩した後、むしろ収縮した.未熟肺動脈では大きく弛緩した.2)アシドーシス時の細胞内pHは未熟血管、成獣血管ともに同程度に低下した.3)アシドーシス時の細胞内Caは両年齢群でともに同程度上昇した.結論:アシドーシスが血管収縮に与える弛緩作用は未熟血管でより大きいがその機序は細胞内pHやCa濃度の変化では説明できず、筋肉固有の性質に起因するのかもしれない.