hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小音響圧による皮下組織3次元マッピング

世界数千万人の糖尿病者が毎日インスリン注射を行うが、皮膚より薬剤を投与するため吸収率が皮下組織に依存する。インスリン皮下注射を行っている糖尿病患者は同一部位への注射を繰り返すうちに皮下に結合組織の「偽性腫瘤:インスリンボールとも言う」を生じる。この腫瘤部位からのインスリン注射は、皮下吸収が妨げられ、インスリンの効果が十分に発揮されないケースが多く注射部位を変更するよう患者に指導している。また腫瘤部に合わせて薬剤量を設定すると健常部では薬効が強くなり低血糖となる。現在、ヒトを対象にしたインスリン皮下腫瘤の特性・存在範囲を定量化する方法はない。したがって皮下組織の腫瘤がどの程度、製剤の吸収率・血糖値に影響するかは不明である。見えない皮下組織を精緻に描出する方法が無い。我々は腹壁全体にわたり微小音響圧を利用した超音波装置(acoustic radiation force impulse: ARFI)で皮下組織の「3次元-地図」を作製する。1)腹部皮下の3次元-地図を作製し高度腫瘤部位を定量可視化する。2)腫瘤部と健常部の比較からインスリン吸収率、蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などを解析する。皮膚直下の3次元地図を利用し、安定したインスリン至適投与方法を確立することを研究の目的にしている。1)インスリン注射治療中で注射部位の皮下腫瘤を呈している糖尿病患者を対象に、表在超音波検査においてVTTQを用いた皮下腫瘤の硬度の測定を行い、定量化することを目的としている。現在、対象者の4名のエントリーが済み、順調に進んでいる。2)今後、特定されたインスリン誘導性皮下腫瘤部位と健常部位におけるインスリン製剤の吸収・力価に対する薬力学的評価を行う。腫瘤部位から得られたパンチバイオプシー検体からインスリン蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などの遺伝子発現はリアルタイムPCR法を用いて確認する予定である。腫瘤部と健常部の比較からインスリン吸収率、蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などを解析する。現在、対象者の絞り込みと試験測定を終了した。

1)インスリン注射治療中で注射部位の皮下腫瘤を呈している糖尿病患者を対象に、表在超音波検査においてVTTQを用いた皮下腫瘤の硬度の測定を行い、定量化することを目的としている。現在、対象者の4名のエントリーが済み、順調に進んでいる。2)今後、特定されたインスリン誘導性皮下腫瘤部位と健常部位におけるインスリン製剤の吸収・力価に対する薬力学的評価を行う。腫瘤部位から得られたパンチバイオプシー検体からインスリン蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などの遺伝子発現はリアルタイムPCR法を用いて確認する予定である。1)腹部皮下の3次元-地図を作製し高度腫瘤部位を定量可視化する。2)腫瘤部と健常部の比較からインスリン吸収率、蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などを解析する。皮膚直下の3次元地図を利用し、安定したインスリン至適投与方法を確立することを研究の目的にしている。腫瘤部と健常部の比較からインスリン吸収率、蛋白分解酵素、アミロイド蛋白などを解析する。理由:人件費、物品購入費が来年に繰り越された。使用計画:来年度以降には対象者エントリーが開始され、順次物品、謝金などが発生する。理由:物品購入費が来年に繰り越された。使用計画:来年度以降には残りの対象者エントリーが開始され、順次物品、謝礼品の支出などが発生する。
性別役割分業規範の健康影響とそのメカニズムに関する社会疫学研究

本研究は日本社会の特徴のひとつであり人々の家庭生活や仕事に様々な影響を与えといえる性別役割分業規範が人々の健康にどのような影響があるのかを検証することを目的として実施した。その結果、配偶者の喪失、家族形態、雇用形態、介護の有無など、家庭や仕事に関する様々な要因の健康影響が男女で異なりその背景に性別役割分業規範があることを把握した。加えて、その健康影響は社会経済状況によって異なることも改めて把握した。本研究により、性別役割分業規範が人の健康に間接的影響を与えていることが認められたことは、今後の公衆衛生対策において社会的性差(ジェンダー)に留意したアプローチが有用であることを示唆したといえる。【目的】本研究は、社会的役割、介護、家庭と仕事の対立、雇用形態と生活習慣、健康指標との関連を横断的に検証し、家庭や仕事に関連する要因と社会環境要因の健康影響とその生成メカニズムの解明を目的とする。【本年度の実績】平成26年度は、収集が終了したJPHC-NEXT研究(佐久地区)の個人データをデータクリーニングした。その後、居住地データを用いて地域環境要因の構築を実施した。テーマ3:家庭と仕事の対立と生活習慣、健康指標との関連完成した個人データを用い、家庭と仕事の対立、主観的健康感、抑うつ、肥満、高血圧などの身体的・精神的健康ならびに生活習慣(喫煙、飲酒、余暇の身体活動、睡眠など)との関連の横断的分析を開始した。テーマ4:雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連完成した個人データを用い、雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連の分析を開始した。加えて雇用形態と死亡リスクの関連を別データ(JACC Study)を用いて予備解析し、発表した。本研究は、社会的役割、介護、家庭と仕事の対立、雇用形態と生活習慣、健康指標との関連を横断的に検証し、家庭や仕事に関連する要因と社会環境要因の健康影響とその生成メカニズムの解明することを目的とする。平成27年度は、JPHC-NEXT研究(佐久地区)の個人データの収集・クリーニングを完了し、家庭と仕事の対立、介護、雇用形態、社会的役割数と健康(自覚的健康感、高血圧など)との関連に関する予備解析を進めた。また、地域環境要因構築のための居住地データの作成を完了した。社会的役割数と生活習慣、健康指標の関連に関する研究においては(テーマ1)、社会的役割数と、主観的健康感・高血圧等との関連に関する予備分析を行った。介護と生活習慣、健康指標の関連に関しては(テーマ2)、介護の有無と主観的健康感との関連に関する予備分析を行った。家庭と仕事の対立と生活習慣、健康指標との関連に関しては(テーマ3)、家庭と仕事の対立、主観的健康感、高血圧との関連の横断的分析を実施し、論文化を進めた。雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連に関しては(テーマ4)、雇用形態と死亡リスクの関連を別データを用いて(JACC Study)解析し、論文化した。また、JPHC-NEXT研究においても雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連の分析を開始した。当初の予定通り、JPHC-NEXT研究(佐久地区)のデータクリーニングは完了し個人データは完成している。また、地域環境要因構築のための居住地データの作成も完了した。実施した予備分析では仕事と家庭の対立、介護の有無、雇用形態と自覚的健康感の関連を示唆する知見が得られている。本研究は、社会的役割、介護、家庭と仕事の対立、雇用形態と生活習慣、健康指標との関連を検証し、家庭や仕事に関連する要因と社会環境要因の健康影響とその生成メカニズムの解明することを目的とする。平成28年度は、JPHC-NEXT研究の個人データの収集・クリーニングを完了し、家庭と仕事の対立、介護、雇用形態と健康(自覚的健康感など)との関連に関する解析を進めた。収集されたJPHC nextデータを用いて、仕事や家庭生活に係わると自覚的健康感の関連を横断的に分析し論文化した。その結果、家庭と仕事の葛藤が高い人の自覚的健康感が悪く、その関連は特に社会経済的に弱い群でより強い傾向がみられた。また、非正規雇用者や自営業者は正規雇用者と比較して、自覚的健康感が悪い人の割合が高いことも把握した。さらに、女性を対象に介護の有無の健康影響に関する記述分析の結果、介護のある女性において、ストレスが高く、抑うつ傾向が強く、望ましくない生活習慣を持つ人の割合が高い傾向がみとめられた。次に、家庭における役割の健康影響に関して、婚姻形態の変化、家族構成の変化と脳卒中リスクの関連について別データ(JPHCデータ)を用いて分析し論文化した。配偶者の喪失は家族構成の変化の中でも健康に最も影響が強いとされているが、本研究においても、男女ともに強い関連がみられ、男女差はなかった。しかし、その関連は家族形態や就労の有無といった背景による影響には男女差が顕著にみられた。親との同居がある男性では、配偶者の喪失によるリスクの上昇が見られないのに対し、女性ではそのリスクが加重されるという男女で異なる結果であった。また、別の研究では家族の喪失は男女共に脳卒中リスクの上昇がみられるが、家族の増加は女性においてのみリスク上昇がみられた。

その結果、配偶者の喪失、家族形態、雇用形態、介護の有無など、家庭や仕事に関する様々な要因の健康影響が男女で異なりその背景に性別役割分業規範があることを把握した。加えて、その健康影響は社会経済状況によって異なることも改めて把握した。本研究により、性別役割分業規範が人の健康に間接的影響を与えていることが認められたことは、今後の公衆衛生対策において社会的性差(ジェンダー)に留意したアプローチが有用であることを示唆したといえる。当初の予定通り、JPHC-NEXT研究(佐久地区)のデータクリーニングは完了し個人データは完成した。現在、地域環境要因構築のための居住地データの作成を実施している。今後、居住地データと個人データと突合し、データベースとする。データベース完了後、それぞれのテーマに関する個人要因・地域環境要因の影響分析を順次進め、国内外の学会発表、論文化を進める。社会疫学地域環境要因構築のための居住地データの作成が完了後、個人データと突合し、データベースとする。データベース完了後、それぞれのテーマに関する分析を進める。【平成27年度】テーマ3:家庭と仕事の対立と生活習慣、健康指標との関連データベース完成後、家庭と仕事の対立、主観的健康感、抑うつ、肥満、高血圧などの身体的・精神的健康ならびに生活習慣(喫煙、飲酒、余暇の身体活動、睡眠など)との関連の横断的分析を実施し、論文化する。また、作成された居住地データを用いて地域環境要因の影響に関する解析も開始する。テーマ4:雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連雇用形態と死亡リスクの関連を別データを用いて(JACC Study)予備解析し発表した。データベース完成後、雇用形態(正規雇用・非正規雇用)と生活習慣、健康指標との関連の分析を実施し、論文化する。テーマ1:社会的役割数と生活習慣、健康指標の関連データベース完成後、社会的役割数と、主観的健康感、抑うつ、肥満、高血圧などの身体的・精神的健康ならびに生活習慣(喫煙、飲酒、余暇の身体活動、睡眠など)との関連の横断的分析を開始する。テーマ2:介護と生活習慣、健康指標の関連データベース完成後、介護の有無と、主観的健康感、抑うつ、肥満、高血圧などの身体的・精神的健康ならびに生活習慣との関連の横断的分析を開始する。予定していた論文公表が次年度になったため予定額より少ない支出となり、その結果、残額が生じた。予定していた出張旅程が日程変更になったため予定額より少ない支出となり、その結果、残額が生じた。次年度に論文が出版費として使用する予定である。次年度に予定の海外出張が実施されるため、旅費として使用する予定である。
形状感インターフェイスの研究と開発:ダイナミックタッチによる知覚を通して

実験とデータ収集の結果から、当初の研究構想を実現することは非常に難しいことが明らかとなった。第一に、人間が形状感を検知するための閾値の問題が指摘できる。これによって、形状感を生成するハプティックデバイスを実現するためには、インターフェイスの物理的な大きさの点で大きな制約があると考えられた。また、実験では内観報告も得ているが、これを分析の対象とすると実験参加者の報告の多くは、刺激に対する確信の程度、もしくは、持ったときに連想されるイメージに関連するものが多かった。一方でしかし、こうした確信の強さやイメージの報告は、実際の刺激に関する弁別力とは独立で、感度の指標とは基本的に無関係であることも示された。以上、これらの問題点と限界を踏まえつつ、現在、形状感インターフェイスのモーメント変化を、検知しやすい人のタイプが存在する可能性が新たな研究領域のひとつとなった。人間の持つ感受性全般について広く扱うことを計画し、感受性の強さと気質との関連性の検討を視野に入れた検討が今後、求められるだろう。また、これらの課題と共に、ヒューマンインターフェイスの持つユーザビリディや利用可能性も今後の課題のひとつとなった。人間にとって利用しやすい情報として、感情は表現できるのだろうか。ヒューマンインターフェイス全般に対して、有用な情報提示ができる全く別の可能性についての問題提起を今後、おこなっていくことが期待される。ダイナミックタッチによる形状感インターフェイスの開発のため、各種モーメントを独立に制御可能ないくつかのプロトタイプの作成をおこなった。主に2つのモーメント(慣性テンソル中の第一固有値と静止モーメント)を制御することが目的であった。レゴ・マインドストームを用いてモータ駆動型のオブジェクトを数種類作成し、予備実験をおこなった結果、次の傾向が明らかとなった。ダイナミックタッチによる知覚は、変化の感受性が低い。つまり、閾値が高く、モーメントを独立に操作しても、相当な大きさで変化させなければ、知覚することができないと考えられた。この点はインターフェイス開発にとって大きな問題点となった。弁別における感受性この結果を踏まえ、小さな物体を材料として用い、第一固有値に対する感受性と知覚報告における誤差を評価するための簡易実験をおこなった。被験者24名を対象とし、それぞれ実験群(棒を振って長さを知覚する群)と統制群(棒を保持し、動きを止めたまま長さを報告する群)に無作為にわけた。実験材料は、プラスチックの棒と2つの錘を南いて、棒における錘の位置を制御し、第一固有値を独立に制御した材料4本を刺激として用意した。恒常法により48回の繰り返しをおこない、フィードバックは一切与えない。なお、長さの報告はマグニチュード推定法による。実験の結果、実験群では、長さ報告が第一固有値に対応し、統制群では対応しない傾向が確認された。ただし、群×棒の交互作用は有意でなかった。検出力分析によると、最小有意数は標本数2600となり、被験者がさらに20人以上必要ということがわかった。この埋由のひとつとして、測定誤差の大きさが考えられる。また、モーメントの丁度可知差異は相当に大きなことが予想された。現在、信号検出理論に基づいて、d'の測定をおこなう計画し、実験を続けている。実験では被験者10名を対象に実験群(ダイナミックタッチ)と統制群(静止保持)に分け、弁別の難易度によって感受性指標d'の値が変化することを確認し、丁度可知差異(JND)の測定をおこなう予定である。昨年度に引き続き、ダイナミックタッチによる形状感インターフェイスの開発のため、各種モーメントを独立に制御可能ないくつかのプロトタイプの作成をおこなった結果、ダイナミックタッチによる知覚は、変化の感受性が低いことが明らかとなった。つまり、閾値が高く、モーメントを独立に操作しても、相当な大きさで変化させなければ、知覚することができないのである。結論から述べると、形状感は生成されない、といえる。また、主慣性モーメントとしての第一慣性テンソルを変化させた場合であるが、これも長さの増減感覚をはっきりと生成させる結果は現在のところ得られていない。閾値との関係で考えると、インターフェイスに必要な大きさは、3メートルから5メートルであり、かつ主軸に取り付けた錘を瞬時に動かす必要が生じる。また、それを持った場合に疲労が出ないような軽さである必要もある。これは、本研究が持つ設計の構造上の問題と、物理的な制約によるひとつの限界であるだろう。なお、実験では内観報告も得ており、これを分析の対象とすると実験参加者の報告の多くは、刺激に対する確信の程度、もしくは、持ったときに連想されるイメージに関連するものが多かった。しかしながら、こうした確信やイメージは、実際の刺激に関する弁別力とは独立で、感度の指標とは基本的に無関係であることも示された。

以上、これらの問題点と限界を踏まえつつ、現在、形状感インターフェイスのモーメント変化を、検知しやすい人のタイプが存在する可能性が新たな研究領域のひとつとなった。人間の持つ感受性全般について広く扱うことを計画し、感受性の強さと気質との関連性の検討を視野に入れた検討が今後、求められるだろう。また、これらの課題と共に、ヒューマンインターフェイスの持つユーザビリディや利用可能性も今後の課題のひとつとなった。人間にとって利用しやすい情報として、感情は表現できるのだろうか。ヒューマンインターフェイス全般に対して、有用な情報提示ができる全く別の可能性についての問題提起を今後、おこなっていくことが期待される。
ファブリー病における腎不全発症進展と接着分子

ファブリー病はα-ガラクトシダーゼの遺伝的欠損による先天性代謝疾患で、多彩な臨床症状を呈する。本症における腎不全は、患者の生命予後に直接影響を及ぼす重要な症状の一つである。しかし、その発症進展は、グロボトリアオシルセラミドなどの基質の蓄積が原因であると考えられているが、詳細な機構は不明である。病態解明のためには、細胞レベルでの解析が重要であるが、ファブリー病患者由来の腎細胞の入手は現実には、非常に困難である。そこで、アンチセンスオリゴDNAを用いて、ヒト腎由来の培養細胞でのα-ガラクトシダーゼの選択的な遺伝子発現阻害系の構築を検討し、人工的なファブリー病のモデル作製を試みた。α-ガラクトシダーゼmRNAの翻訳開始コドン(AUG)領域付近の塩基配列に相補的なホスホロチオエートオリゴDNA(SオリゴDNA)を、ヒト腎由来の正常メサンギウム細胞に継続的に投与することにより、α-ガラクトシダーゼ活性を選択的に低下させるアンチセンスオリゴDNAの配列が確認された。さらに、α-ガラクトシダーゼ活性をより効率良く低下させるために、まずバフィロマイシンを投与し、次にα-ガラクトシダーゼを選択的に低下させる配列を持つホスホロチオエートオリゴDNA(SオリゴDNA)を、継続的に投与した。その結果、投与による細胞内酵素活性の低下は、対照の正常メサンギウム細胞の25-30%程度であり、良好と考えられた。また、投与による、他のリソソーム酵素の活性や細胞には影響を与えなかった。しかしながら、リソソーム病の発症を考えた場合、残存酵素活性は、正常の10%以下と想定されているので、今後さらに効率の良い投与法の検討をすすめたい。ファブリー病患者23例の尿を試料として、ビトロネクチンレセプター(VNR、インテグリンαvβ3)の尿中排泄量に関して、ウエスタンブロツテイング法により解析をした。VNRの尿中排泄量は、古典型ファブリー病ヘミ接合体、亜型ヘミ接合体、古典型ヘテロ接合体の順に多く、これらの値は、正常コントロールに比べて有意に増加していた。腎機能や尿所見に異常を認めない段階のファブリー病患者においても、尿中へのVNRの排泄が認められ、その排泄量は、顕性蛋白尿のみられる各種腎疾患患者の排泄量と同程度かそれ以上であった。尿中VNRの排泄量と患者の年齢、尿蛋白量、血尿の程度についての相関はみられなかった。ELISA法による尿中VNRの排泄量の解析でも同様の結果が得られたが、その感度はウエスタンブロツテイング法の方が優れていた。VNRの主なリガンドであるビトロネクチン(VN)の尿中排泄量をELISA法により測定したが、ファブリー病患者と正常コントロール間に差は認められなかった。古典型ファブリー病ヘミ接合体患者より得られた尿沈さ及び生検腎組織を試料として、免疫組織化学的解析を行った。患者尿沈さは、抗VNR抗体及び抗グロボトリアオシルセラミド(CTH)抗体で、陽性に染色された。患者腎組織は、抗VNR抗体で、糸球体上皮、ボ-マン嚢上皮及び遠位尿細管が陽性に染色され、また抗VN抗体では、糸球体メサンギウム領域で陽性に染色された。ファブリー病患者の腎組織上でのVNR、VNの発現の増加が認められた。以上のことよりVNR-VNが、ファブリー病における腎機能障害の発症進展に関連している可能性が考えられた。今後、細胞レベルでの糖脂質蓄積とVNR-VNとの関連について解析するため、ヒト腎臓由来の培養細胞を用いて、α-ガラクトシダーゼに対するアンチセンスSオリゴDNAを投与することにより、人工的なファブリー病のモデルの確立をめざす。さらにこの系で基質の蓄積とVNRの発現の増加の有無について検討を行う予定である。
腸内細菌回復メカニズム：多変量解析を用いた攪乱とプロバイオティクス投与の機構解明

ヒトの腸内に生息する約100兆個の菌(腸内細菌)は、薬や食生活の変化などで頻繁に、かつ、継続的に攪乱を経験し、細菌叢の乱れ(ディスバイオシス)は肥満や炎症性腸疾患などの身体へ悪影響を及ぼすことが報告されている。先行研究ではビフィズス菌のようなプロバイオティクスなどの微生物投与がディスバイオシスからの回復に効果的であると報告されている。しかし、回復のメカニズムを解明する研究は少ない。本研究ではマウスを用いて、様々な抗生物質を与えディスバイオシスを引き起こし、ビフィズス菌などのプロバイオティックスを与え、腸内細菌叢の回復と宿主への長期的な影響、及び回復メカニズムを解明すべく、研究を行う。
情動に関与する神経の可塑的変化とモノアミン神経伝達の分子機構

コカインの報酬効果は、いずれかのモノアミントランスポーターが欠損しても他のものが補うと考えられ、複雑な分子機構が予想された。我々はコカインの報酬効果におけるドーパミンとセロトニン神経伝達の相互作用を検討するために、ドーパミントランスポーター(DAT)/セロトニントランスポーター(SERT)ダブルKOマウスを作製した。DAT完全欠損にSERT部分あるいは完全欠損が加わることによりコカインの報酬は消失した結果は、コカイン報酬にはDATとSERTが共に関与し、同族トランスポーターの補完作用が働いていることを示唆している。脳内微少透析法を用いて、モノアミントランスポーターKOマウスにおいてドーパミン、セロトニンの基礎値およびコカイン投与時の変化を計測したところ、線条体ではDATシングルKOマウスにおいてコカイン投与によりドーパミンが上昇したが、DAT/SERTダブルKOマウスでは、その上昇が観察されなかったことから、線条体におけるドーパミンの上昇がコカインの報酬効果と相関し、SERTがドーパミン再取り込みを補完したと考えられた。前頭前野皮質では、DAT/SERTダブルKOマウスにおいてもコカイン投与によりドーパミンが上昇したことから、残存するNETがドーパミン再取り込みを補完したと考えられた。エタノールの報酬効果におけるモノアミンの役割について、細胞膜トランスポーターであるDATおよびシナプス小胞モノアミントランスポーター(VMAT)欠損マウスモデルを用いて検討した。DAT欠損マウス、VMAT欠損マウスのいずれにおいても雄マウスはエタノール消費量が上昇している結果は、ドーパミン神経伝達がエタノールの報酬効果に関与することを示唆している。
転写因子による神経上皮領域化と神経細胞多様化の分子戦略

PtflaアリルにMath1を、あるいはMath1アリルにPtflaをノックインしたマウスの両者がついに完成した。前者については精力的に解析したが、Math1はたとえ異所性に発現されたとしてもその部位の神経上皮を菱脳唇の形質へと転換することができること、つまりMath1が神経上皮の空間アイデンティティの決定因子であることが明らかになった。後者のマウスについては現在精力的に解析しているところであるが、子宮内電気穿孔法による異所性遺伝子発現によって、Ptflaも小脳脳室帯の空間アイデンティティの決定因子であることが示唆されている。また、小脳で見られたこれらの転写因子の働きが、さらに吻側の後脳領域でも見られることが明らかになった。中央部後脳では、Ptfla神経上皮ドメインおよびMath1ドメインからそれぞれ蝸牛神経核の抑制性および興奮性神経細胞が、吻側後脳ではそれぞれのドメインから登上線維神経細胞と苔上線維神経細胞が生み出されることを明らかにした。また、PtflaローカスにYFPをノックインしたマウスを用いて、小脳神経上皮細胞を特異的にセルソーターで集めてきて、それぞれ発生段階特異的な発現をする遺伝子群をマイクロアレイ解析で集めている。さらに、PtflaおよびMath1の結合分子をアフィニティクロマトグラフィとLC-MSIMを用いて多数同定した。今後は、これらの分子の機能解析から時間アイデンティティ決定因子を同定していく。本年度も、実験を遂行するための道具・基盤作り、そして実験系の構築に力を注いだ。具体杓には、転写因子をコードするPtf1aアリルにMath1を、あるいはMath1アリルにPtf1aをノックインしたマウスを作成した。前者は現在精力的にその表現型を解析している。後者もようやくヘテロマウスが得られたので、平成21年夏くらいからは、本格的な表現型の解析が開始できるはずである。また、Math1アリルにCreERという誘導型のCreリコンビナーゼcDNAをノックインするマウスも完成し、このマウスを用いて聴覚系の蝸牛神経核の発生機構を明らかにし論文が受理された(Development, in press)。また、Ptf1aローカスにYFPをノックインしたマウスを用いて、小脳神経上皮細胞を特異的にセルソーターで集めてきて、それぞれ発生段階特異的な発現をする遺伝子群をマイクロアレイ解析で集めている。これらの「時間アイデンティティ決定遺伝子・分子」の候補に関して、子宮内エレクトロポレーション法によるそれぞれの分子の活性の検証を行っているところである。今後は、さらに実験を遂行するための基盤作りにつとめ、さらにそれを用いて研究目的を達成していきたいPtflaアリルにMath1を、あるいはMath1アリルにPtflaをノックインしたマウスの両者がついに完成した。
虚血性脳傷害におけるエストロゲンと低体温の併用効果

エストロゲンが脳虚血後の組織傷害を軽減する可能性が示唆されている。一方、低体温療法は多くの動物モデルで脳虚血後の組織傷害を軽減することが示されている。本研究ではラット一過性前脳虚血モデルを用いて虚血性脳傷害におけるエストロゲン虚血後投与と低体温療法の併用効果を検討した。その結果、虚血28日後においてエストロゲン虚血後投与と低体温療法の併用は、エストロゲン単独または低体温単独と比較して、組織学的な脳保護効果を増強しなかった。【目的】ラット一過性前脳虚血モデルを用い、エストロゲン虚血後投与の長期的な脳保護効果を調べた。【方法】雄SDラット32匹をハロタンで麻酔導入後、気管挿管と人工呼吸を行い、カテーテルを尾動脈、頚静脈に留置し、側頭温を37.5°Cに維持した。ラットをC7群とC28群(シクロデキストリン5mg/kg投与)、およびE7群とE28群(17β-エストラジオール200μg/kg投与)の4群(各n=8)に分けた。観察期間は、C7群とE7群では7日間、C28群とE28群では28日間とした。脱血による低血圧(平均血圧40mmHg)と両側頚動脈閉塞により前脳虚血状態とし、10分後に頚動脈閉塞解除と返血により再灌流を行った。再灌流と同時にシクロデキストリンまたは17β-エストラジオールを静脈内に投与した。虚血7日後または28日後に神経学的評価とY字型迷路試験(5分間)を行い、その後、脳の灌流固定、H-E染色を行い、海馬CA1領域から1mm当りの残存細胞数を計測した。統計解析は二元配置分散分析で行った。【結果】海馬CA1領域における残存細胞数は、E7群においてC7群よりも有意に多く残存していたが、E28群とC28群に差は認められなかった。神経学的評価において群間に有意差はなかった。Y字型迷路試験では、C7群とE7群ともに虚血7日後の短期記憶が障害されていた。【結論】今回の実験モデルにおいて、エストロゲンの虚血後投与は虚血7日後の海馬CA1細胞の保護効果を有するが、その効果は28日後に消失していた。エストロゲンは、海馬CA1細胞の細胞死を遅らせている可能性がある。【目的】ラットー過性前脳虚血モデルを用い、エストロゲン虚血後投与の長期的な脳保護効果を調べた。【方法】雄SDラット32匹をハロセンで麻酔導入後、気管挿管と人工呼吸を行い、カテーテルを尾動脈、頚静脈に留置し、側頭温を37.5°Cに維持した。ラットをC7群、C28群(シクロデキストリン5mg/kg)、E7群、E28群(17β・エストラジオール5mg/kg)の4群(各n=8)に分けた。C7群とE7群は観察期間を7日間、C28群とE28群は28日間とした。虚血7日後または28日後に神経学的評価とY字型迷路試験(5分間)を行い、その後、脳の灌流固定、H-E染色を行い、海馬CA1領域から1mm当りの残存細胞数を計測した.統計解析は二元配置分散分析で行った。神経学的評価において群間に有意差は認められなかった。Y字型迷路試験では、両群ともに虚血7日後の短期記憶が障害されていた。【目的】ラット一過性前脳虚血モデルを用い、虚血性脳傷害におけるエストロゲン虚血後投与と低体温法の併用効果を検討した。【方法】雄SDラット40匹をハロタンで麻酔導入後、気管挿管と人工呼吸を行い、カテーテルを尾動脈、頚静脈に留置し、側頭温を37.5°Cに維持した。

ラットを対照群(側頭温37.5°C)、エストロゲン群(17β-エストラジオール200μg/kg投与)、低体温群(側頭温35°C)、エストロゲン+低体温群、シャム群の5群(各n=8)とした。脱血による低血圧(平均血圧40mmHg)と両側頚動脈閉塞により前脳虚血状態とし、10分後に頚動脈閉塞解除と返血により再灌流を行った。エストロゲン投与群では再液流と同時に17β-エストラジオールを静脈内に投与し、低体温群では再潅流と同時に1時間、側頭温を35°Cに低下させた。虚血再灌流の28日後に神経学的評価(neurolgic deficit score)を行い、さらに脳の潅流固定、H-E染色により、海馬CA1領域から1mm当りの正常細胞数を計測した。統計解析は分散分析とscheffeテスト、Steel-Dwassテストで行った。【結果】海馬CA1領域における正常細胞数は、対照群(5±2mm:平均±標準偏差)と比べてエストロゲン群(5±3mm)、低体温群19±24/mm)、エストロゲン+低体温群(21±28/mm)において有意差は認められなかった。シャム群(132±22/mm)では他の4群と比較して海馬CA1領域の正常細胞数が有意に多く観察された。神経学的評価において5群悶に有意差は認められなかった。1結論1今回の研究では、虚血後エストロゲン投与、虚血後低体温、虚血後エストロゲンと低体温の併用の全てにおいてラット一過性前脳虚血モデルにおける脳保護効果を示さなかった。
腫瘍血管新生阻害作用を有する樹状細胞を用いた肺癌に対する新規治療法の開発

血管内皮増殖促進因子(VEGF)には樹状細胞の成熟を阻害する作用がある。そこで本研究では最初に樹状細胞に可溶型VEGF受容体遺伝子を導入し、腫瘍が産生するVEGFに拮抗する樹状細胞の作成を試みた。遺伝子導入にはアデノウィルスベクターを使用した。樹状細胞はマウス骨髄細胞よりGM-CSFおよびIL-4を用いて分化誘導した。可溶型VEGF受容体遺伝子は野生型VEGF受容体の細胞外領域を単離して作成した。アデノウィルスを用いた実験では樹状細胞への遺伝子導入効率は感染ウィルス濃度に相関して上昇し、十分な可溶型VEGF受容体の産生が確認された。感染細胞の培養上清はヒトVEGFによる血管内皮細胞のDNA合成を阻害した。コントロールの樹状細胞はVEGFの存在下では成熟化が阻害され、B7分子およびMHC分子の発現はともに抑制され、T細胞の増殖能も低下した。一方、可溶型VEGF受容体遺伝子を導入した樹状細胞はVEGF添加培地においてもB7、MHC分子の発現を認め、T細胞の増殖能も維持された。これらの結果より、可溶型VEGF受容体遺伝子導入樹状細胞は腫瘍が産生するVEGFに拮抗し、細胞障害性T細胞の誘導を介して抗腫瘍活性を発揮できる可能性が示された。次に樹状細胞の抗腫瘍活性を高める方法としてalpha-galactosylceralnide(α-GalCer)を使用した。α-GalCerは抗腫瘍活性を有するアゲラスフィンをもとに開発された化合物であり、樹状細胞上に発現されたMHCクラスI様分子、CDldを介してNKT細胞に提示される。そこで、未熟樹状細胞および成熟樹状細胞にα-GalCerを投与し、MHCクラスI,II,CD86の発現について検討した。その結果、今回の実験条件下ではα-GalCerでパルスしたDCを用いるとコントロールに比べて腫瘍の縮小および生存期間の延長効果がみられた。マウス骨髄細胞からサイトカインを用いて分化させた樹状細胞に可溶性VEGF受容体遺伝子を導入した結果、樹状細胞単独と比べてVEGF添加培地における樹状細胞のアポトーシスが有意に減少する結果となった(AnnexinV-FACs assay)(21% vs. 56%)。よって、腫瘍組織内において可溶性VEGF受容体遺伝子導入樹状細胞は腫瘍細胞から分泌されるVEGFのアポトーシス作用を阻害しうる可能性が示唆された。また、樹状細胞に生理活性物質であるα-GalCerを添加した結果、細胞状の表面マーカーはMHC class I, II・B7-1,2ともに変化を認めず、樹状細胞自体の成熟度には影響を及ぼさない結果となった(FACs assay)。さらに貪食能(Latex-Beads assay)・抗原提示能(HEL-protein assay)・T細胞増殖能(MTT-assay)についても検討したが、α-GalCerによる変化を認めなかった。一方でCD1dは活性化することより、α-GalCerと接触した樹状細胞はT細胞・B細胞を刺激するのではなくてNKT細胞を活性化することが確認された。さらに担癌マウスモデルを作成し、予めin vitroでα-GalCerを添加した樹状細胞を注入すると、無治療群や樹状細胞単独投与群及びα-GalCerと樹状細胞を同時に投与した群と比較して有意に腫瘍重量の縮小効果を認めた(0.24g vs. 4.65g vs. 0.95g vs. 1.06g)。

以上の結果より、体内より採取した樹状細胞とα-GalCerを共培養すると腫瘍縮小効果が得られることが確認され、さらに可溶性VEGF受容体遺伝子を導入することにより更なる抗腫瘍作用が期待される。マウス骨髄細胞から培養して分化させた樹状細胞に、分泌型VEGF受容体遺伝子及び特異的生理活性物質であるα-ガラクトシルセラミドを細胞内に導入した。導入された樹状細胞は活性化し、成熟型へと変化を認め、細胞表面上に共刺激分子を強発現するようになった。また異系リンパ球に対する増殖刺激能も亢進し、抗原提示能も増強した。VEGFを樹状細胞に添加すると、樹状細胞はアポトーシスが生じて不活性化するが、分泌型VEGF受容体遺伝子を導入した樹状細胞は、VEGF存在下においても抑制されることなく免疫活性を保持しえた。また、α-ガラクトシルセラミドを細胞内に導入した樹状細胞は、NKT活性が著明に増強された。実際に、マウスに肺癌細胞株及び悪性黒色腫細胞株を生着させ、両者を導入した樹状細胞を担癌マウス体内へ再投与すると、樹状細胞は腫瘍組織内へ遊走し抗腫瘍活性を示した。腫瘍量も無治療群及び樹状細胞単独群と比較して、導入済み樹状細胞を投与した群で有意に抑制された。さらに、樹状細胞に抗癌剤を投与すると、DNA合成能は低下するものの樹状細胞の抗原提示能は比較的保たれていた。分泌型VEGF受容体遺伝子及びα-ガラクトシルセラミドを導入した樹状細胞においても同様の結果であった。担癌マウスへ樹状細胞並びに抗癌剤を同時投与すると、両者併用群では単独群より強い腫瘍抑制効果が得られた。一方、抗癌剤と併用する樹状細胞に対して、導入による追加効果を検討したが、導入の有無と抗腫瘍効果に有意差は認められなかったものの、樹状細胞にα-ガラクトシルセラミドを導入した群では、未導入群と比較して腫瘍縮小効果が大きい傾向が認められた。
初期設計段階での不確定性を考慮した有限要素法の開発

形状と物性の不確定性を有する初期設計段階でトラス構造を有限要素法(FEM)解析する方法の提案とプログラム開発を目的とした。要素の断面積、ヤング率、節点座標という設計変数(入力変数)と変位や応力という出力要求性能との関係が単調、あるいは非単調である場合に、それらの不確定性を範囲で表現し、範囲で与えられた要求性能を満足する設計変数の範囲をFEMで求めるために、Finchの範囲伝播理論、遺伝的アルゴリズム等の局所解探索法、あるいは領域分割法をセットベース設計手法に組み合わせて解析する手法である。例題としては、タワー構造、ドーム構造、変形片持ち梁構造などに適用し、その有効性を確認した。構造解析対象の形状と物性の不確定性を有する初期設計段階での有限要素法(FEM)解析に関する新たな手法を提案した。具体的には、節点位置(座標)と要素物性(ヤング率)の不確定性をそれらの変動幅(集合)として与え、構造の応答出力(変位と応力)を変動幅(集合)として求めるために、今回は計算量の少なさと計算効率を重視して、Finchの集合演算理論を採用し、具体的解析対象構造をトラス構造とした場合の解析アルゴリズムの定式化を行った。そのアルゴリズムでは、変動幅とともに、その範囲内において設計者が規定する選好度([0,1]の間の数値で定義)を入力変数である節点位置と要素物性の範囲に与えて、出力性能である応力と変位の選好度付き範囲を求める定式化を実施した。トラス構造を選択したのは、FEMとしては初歩的であるが、これを用いて提案手法の正しさを示すためであった。このようなアルゴリズムを具体化するために、トラス構造の2次元弾性解析プログラムを、購入したパソコン上で開発して複数の例題について解析を実行し提案手法の正しさを示し、それらの結果を国際会議と国内研究講演会で発表した。以上の提案、解析結果により、一般に形状や物性が確定的でない構造への有限要素法の適用が可能となり、本研究は有限要素法としての新たな展開として意義の大きい提案となっている。また、製品や構造のライフサイクル設計という観点での初期設計の重要性について鑑みると、本研究はライフサイクル全体を考慮する初期設計における構造解析の観点での支援手法となっていて、この点でも本研究の有用性が示された。節点座標や材料定数といった入力情報と変位や応力といった出力情報との関係が非単調の場合に対処し、入力の範囲情報から出力の範囲情報を求めるために、新たに局所探索法の導入を提案した。具体的には、その手法として遺伝的アルゴリズム(GA)を利用するものとした。これは特に形状情報に関係する節点座標が変動する場合に特に考慮すべきことがらである。しかし節点座標は、一般的には[0.1]の範囲を越える実数値であり、遺伝的アルゴリズムにおける遺伝子表現0と1の組み合わせとの関係が必要になるが、この関係性表現も新たに提案した。この提案に基づくGAを構築した。また形状変更に伴う計算の非効率化を防ぐために、領域分割法の導入も図った。領域分割法により,形状に対応する節点座標の変動がある領域とそうでない領域に分割する手法である。そうすることにより,非変動領域は1回の有限要素法解析(剛性マトリックスを1回作成)で済むので、全体としての解析効率が大きく向上することになった。これらにより、初期設計段階において形状検討を実施するときの不確定性が一般的に処理可能となった。今回の提案の有用性を確認するために、3次元トラス構造の解析にセットベースのアルゴリズムおよび遺伝的アルゴリズムを導入した解析プログラムの開発を行った。解析精度、解析時間、設計上の有用性などに関する計算結果からも、今回の提案内容の有効性を示すことが出来た。以上より、初期設計への支援手法として位置づけることができた。申請書に記載した研究目的は「構造解析対象の形状と物性の不確定性を有する初期設計段階でFEM(有限要素法)解析を計算機のパワーによらずに実施する」方法の提案とそのためのプログラム開発であった。その実施計画のひとつとして、節点座標や材料定数といった入力情報と変位や応力といった出力情報との関係が非単調の場合に対処し、入力の範囲情報から出力の範囲情報を求めるために、前年度は局所探索法として遺伝的アルゴリズム(GA)を導入した。今年度は局所探索法としての効率化を一層図るために、GAに代えて多段階連結法とParticle Swarm Optimization(PSO)法を導入した。また最終年度であるので、基本としてのトラス構造解析(2次元と3次元の両方を解析する機能)に、領域分割法、局所解探索機能を持つ選好度付きセットベース設計手法を統合し、ひとつのプログラムとして完成させた。例題としては、スカイツリーを模擬した構造、ドーム構造、曲弦トラス構造橋などを採用した。

本提案手法では不確定な性能範囲を満足する設計変数(トラス要素のヤング率、断面積、節点位置)の範囲を求めることを可能とし、初期設計段階でのひとつの設計支援手法として、例題検証も含めてまとめることができた。さらに以上と基本的に同じコンセプトにより、2次元の弾性構造設計問題に関しても設計変数範囲解を求めるプログラム開発を行った。
マイクロ二次流れ指標を用いた新たな抗血栓性評価用ＣＦＤ解析手法の確立

当研究では,血液ポンプ開発における抗血栓性評価にむけて,材料表面粗さ・主流のせん断速度など独立したパラメータのみでなく,材料表面マイクロ幾何学形状近傍に発生するマイクロ二次流れのパラメータを加えた複合的要因による血球付着現象への影響を明らかにする.さらに,血栓形成度と血液性状・表面材料物性・せん断流れ・材料表面近傍のマイクロ二次流れの関係を定式化,血液ポンプ開発のための新たな流体工学的抗血栓評価法(抗血栓性評価用CFD解析)を確立することを目的とする.マイクロ幾何学構造を有する試料片への血液成分付着現象の定量化のために,血液性状,表面材料物性,せん断流れをコントロールする必要がある.せん断流れおよび表面材料物性に関しては,エンジニア的コントロールが容易であるが,血液性状に関しては各血液の個体差があるためコントロールが難しい.今年度は,血栓形成の要となる全血血小板凝集能をコントロールする方法について集中的に検討を行った.当研究では全血血小板凝集能を用いてコントロールする手法をとった.10,000s-1以上の高せん断領域においては,クエン酸による抗凝固状態にも関わらず,30,000s-1,5分以上のせん断負荷条件下において血小板凝集能が顕著に向上することが判明した.以上によりIn Vitroの抗血栓試験において,生理的状態に近づけるための薬剤コントロールの他,血液成分付着実験前全血にせん断負荷を与えることで全血血小板凝集能をコントロールできることがわかった.500s-1以下の低せん断領域においてはせん断負荷による全血血小板凝集能コントロールよりも凝固剤等の薬剤を用いた方が有用である.また,この結果と並行して,本題となるIn vitroによる血液成分付着現象・血栓形成の定量化のための試料片設置チャンバを設計製作した.本研究の計画は平成30年度に(1)マイクロPIV法によるマイクロ二次流れの可視化,(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)付着調査,令和元年度に(3)ex vivo評価:動物実験による血栓形成評価,令和2年度に(4)抗血栓性評価用CFD解析手法の確立とアプリケーションソフト開発を計画している.本年度の(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)付着調査において,複合的パラメータを組み合わせた血液成分付着評価のためには,血液性状,表面材料物性,せん断流れ等の各性状をコントロールできる必要がある.しかしながら,血液性状に関しては各血液の個体差があるためコントロールや取扱が難しい.血小板の活性化特性,およびフォン・ヴィレブランド因子の破損特性などとせん断応力の関係性を明らかにした従来研究は見られるが,全血血小板凝集能とせん断の関係性を明らかにした従来研究はほとんどなく,全血血小板凝固能を用いて血液性状を表すことは新規性の高いテーマである.それゆえ,実験精度や従来研究との関連性を明確に示すことが要求されており,繰り返しの実験と条件探索が必要となるため,全体の計画より「やや遅れている」と考える.昨年度に計画していた(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)付着調査,および本年度に計画している(3)exvivo評価:動物実験による血栓形成評価については,評価用チャンバが完成しているので連続して実験可能である.したがって昨年度遂行できなかった実験については今年遂行予定である.当研究では,血液ポンプ開発における抗血栓性評価にむけて,材料表面粗さ・主流のせん断速度など独立したパラメータのみでなく,材料表面マイクロ幾何学形状近傍に発生するマイクロ二次流れのパラメータを加えた複合的要因による血球付着現象への影響を明らかにする.さらに,血栓形成度と血液性状・表面材料物性・せん断流れ・材料表面近傍のマイクロ二次流れの関係を定式化,血液ポンプ開発のための新たな流体工学的抗血栓評価法(抗血栓性評価用CFD解析)を確立することを目的とする.マイクロ幾何学構造を有する試料片への血液成分付着現象の定量化のために,血液性状,表面材料物性,せん断流れをコントロールする必要がある.せん断流れおよび表面材料物性に関しては,エンジニア的コントロールが容易であるが,血液性状に関しては各血液の個体差があるためコントロールが難しい.今年度は,血栓形成の要となる全血血小板凝集能をコントロールする方法について集中的に検討を行った.当研究では全血血小板凝集能を用いてコントロールする手法をとった.10,000s-1以上の高せん断領域においては,クエン酸による抗凝固状態にも関わらず,30,000s-1,5分以上のせん断負荷条件下において血小板凝集能が顕著に向上することが判明した.以上によりIn Vitroの抗血栓試験において,生理的状態に近づけるための薬剤コントロールの他,血液成分付着実験前全血にせん断負荷を与えることで全血血小板凝集能をコントロールできることがわかった.500s-1以下の低せん断領域においてはせん断負荷による全血血小板凝集能コントロールよりも凝固剤等の薬剤を用いた方が有用である.また,この結果と並行して,本題となるIn vitroによる血液成分付着現象・血栓形成の定量化のための試料片設置チャンバを設計製作した.本研究の計画は平成30年度に(1)マイクロPIV法によるマイクロ二次流れの可視化,(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)付着調査,令和元年度に(3)ex vivo評価:動物実験による血栓形成評価,令和2年度に(4)抗血栓性評価用CFD解析手法の確立とアプリケーションソフト開発を計画している.本年度の(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)

付着調査において,複合的パラメータを組み合わせた血液成分付着評価のためには,血液性状,表面材料物性,せん断流れ等の各性状をコントロールできる必要がある.しかしながら,血液性状に関しては各血液の個体差があるためコントロールや取扱が難しい.血小板の活性化特性,およびフォン・ヴィレブランド因子の破損特性などとせん断応力の関係性を明らかにした従来研究は見られるが,全血血小板凝集能とせん断の関係性を明らかにした従来研究はほとんどなく,全血血小板凝固能を用いて血液性状を表すことは新規性の高いテーマである.それゆえ,実験精度や従来研究との関連性を明確に示すことが要求されており,繰り返しの実験と条件探索が必要となるため,全体の計画より「やや遅れている」と考える.昨年度に計画していた(2)in vitro評価:リアルタイム血液成分(血球等)付着調査,および本年度に計画している(3)exvivo評価:動物実験による血栓形成評価については,評価用チャンバが完成しているので連続して実験可能である.したがって昨年度遂行できなかった実験については今年遂行予定である.
感染性口腔疾患における臨床応用を目指した新たな口腔微生物即時検出システムの確立

口腔感染症に関連する微生物の種類や量を正確に簡便に測定することは、その診断や治療効果、予後の判定に重要である。本研究では、キャピラリー電気泳動を利用した検出器を有する微生物検出システムを構築し、その検出感度や定量性を検討した。その結果、開発した検出システムはリアルタイムPCR法とほぼ同等の感度や定量性が得られた。臨床サンプルを用いて有効性を検討した結果、高感度で簡便に歯周病細菌の検出や定量ができ、Porphyromonas gingivalisに関しては、線毛型も識別することができた。う蝕や歯周病などの口腔微生物が原因となる口腔感染症の診断や治療効果の判定、予後の判定には、口腔微生物の検査が有効である。しかし、これまでの口腔微生物検出法は、検出感度や定量性、検出時間等に問題があった。本課題は、チェアーサイドで臨床応用可能な口腔微生物検出システムを確立することを目的とする。本年度の研究では、まず、インフルエンザウイルス検出用に開発されたシステムを改良し、チップ部、サンプル注入部、遺伝子増幅部および検出部からなる歯周病細菌検出システムを構築した。小型チップはPCRが行えるように設計し、検出にはキャピラリー電気泳動を利用した。本システムを用いて、歯周病細菌のなかでも特に病原性が高いとされているred complex構成菌(Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola)の連続希釈懸濁液を作製し、検量線を作成した。ヒトから採取した唾液と歯肉縁下プラークを用いて、それに含まれるred complex構成菌の菌数を本システムを用いて算定した結果、リアルタイムPCR法を用いて測定した結果とほぼ一致した。P. gingivalisはその線毛型により6型に分類されており、歯周病患者ではII型線毛を有するP. gingivalisが高頻度で検出されることが報告されている。そこで、次に、異なる線毛型を有するP. gingivalis株を用いて本検出システムの有効性を検討したところ、本システムはP. gingivalisの線毛型を識別できることが明らかとなった。う蝕や歯周病は口腔細菌が原因となる細菌感染症である。したがって、う蝕や歯周病をはじめとする口腔の微生物が原因となる感染症の診断や治療効果の判定、予後の判定には、口腔微生物検査が有効である。これまでにも、口腔微生物を測定する検査は存在するが、検出感度や定量性、検出にかかる時間等に問題があった。本研究課題は、チェアーサイドで臨床応用できる口腔微生物検出システムを確立することを目的とする。これまでの研究で、インフルエンザウイルス検出用に開発されたシステムを改良してキャピラリー電気泳動を利用した検出器をもつ歯周病細菌検出システムを構築した。本システムを用いて種々の歯周病細菌の定量性について検討したところ、既存のリアルタイムPCR法とほぼ同等の感度や定量性が得られた。また、有力な歯周病細菌であるPorphyromonas gingivalisは有する線毛型により6型に分類され、それぞれ病原性が異なる。本システムは、P. gingivalisの線毛型も識別できることを明らかにした。本年度は、本システムにより、実際に臨床サンプルを用いて、唾液や歯垢中に含まれる歯周病細菌やP. gingivalisの線毛型を識別できるかどうかを検討した。その結果、臨床サンプルでも、本システムにより歯周病細菌の有無や菌数、P. gingivalisの線毛型を識別できることがわかり、本システムの臨床応用への可能性が示された。研究期間中に、研究代表者1名が応募資格を喪失したため、研究組織から削除した。当初は、削除した研究分担者の役割を、研究代表者および他の研究分担者が補い、期間中に研究を完遂させる計画であったが、研究代表者の体調不良や、研究代表者の母の緊急入院や介護のため、当初計画の遅延を生じた。口腔の2大疾患であるう蝕と歯周病は、いずれも口腔細菌が原因となる口腔感染症である。また、口腔細菌は口腔疾患のみならず、誤嚥性肺炎をはじめとする全身疾患にも関連することが報告されている。したがって、口腔に存在する微生物の種類や量を正確に簡便に測定することは、口腔微生物が引き起こす感染症の診断、治療効果や予後の判定に有効である。これまでにも、口腔微生物を同定する検査法は報告されているが、検出感度や定量性、判定時間等に問題があった。本研究課題では、これらの問題点を改善したチェアーサイドで利用できる口腔微生物検出システムを構築することを目的とした。これまでの研究で、インフルエンザウイルス検出用に開発されたシステムを改良して、キャピラリー電気泳動を利用した検出器を持つ歯周病細菌検出システムを構築し、その検出感度や定量性を検討した。このシステムを用いて、Porphyromonas gingivalisをはじめ、種々の歯周病細菌について調べた結果、リアルタイムPCR法とほぼ同等の感度や定量性が得られた。また、慢性歯周炎の主要な原因菌であるP. gingivalisは、線毛型により歯周病原性が異なる可能性が報告されている。本研究課題で構築したシステムは、P. gingivalisの線毛型を識別することができた。本年度の研究では、唾液やプラークなどの臨床サンプルの数を増やし、臨床応用における本システムの有効性について検討した。その結果、本システムは、臨床サンプルにおいても高感度で短時間で歯周病細菌の検出や定量ができることが示された。この結果は、本システムの臨床応用への可能性を示唆している。

口腔感染症に関連する微生物の種類や量を正確に簡便に測定することは、その診断や治療効果、予後の判定に重要である。本研究では、キャピラリー電気泳動を利用した検出器を有する微生物検出システムを構築し、その検出感度や定量性を検討した。その結果、開発した検出システムはリアルタイムPCR法とほぼ同等の感度や定量性が得られた。臨床サンプルを用いて有効性を検討した結果、高感度で簡便に歯周病細菌の検出や定量ができ、Porphyromonas gingivalisに関しては、線毛型も識別することができた。本年度の研究により、本課題で構築したシステムが有力な歯周病細菌の検出に有効であることを示した。このことより、研究はおおむね順調に進展していると考える。上記の理由で補助事業期間の延長が認められたため、研究計画のうち、完遂できなかった部分を平成28年度で完遂させる予定である。研究代表者の体調も回復したため、現在の研究体制で遂行可能であると考える。平成28年度は、臨床サンプルの数を増やし、システムの有効性を確かめるとともに、検出器等、システムの改良を行う予定である。予防歯科学次年度は、臨床サンプルを用いて本課題で構築した口腔微生物検出システムの有効性の検討を行う予定である。研究分担者の応募資資格の喪失等により研究に遅滞が生じたため次年度使用額が生じた。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。次年度に試薬の購入や成果発表に使用する。次年度に試薬の購入に使用する。