hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
種々の断面形状を有する表面欠陥の非破壊的検出

さらに、欠陥の高さが3mm以上になると、モード変換法も適用可能となることが明らかになった。断面形状が、矩形、二等辺三角形、直角三角形、円弧状及び階段状で、きずの高さを種々変化させたきずを作成し、これに対して放射能透過試験及び超音波探傷試験を適用し、断面形状・寸法を推定する方法について検討した。放射線透過試験においては、まず、一段形の正方形の階調計を評価の基準として採用し、一辺の長さ、厚さ及び配置を変化させた際の透過写真の濃度を求める計算式を導入した。ついで、階調計を試験体と同時に透過写真を撮影し、得られたきずの像の濃度分布を用いることにより、きずの高さをきずの断面形状に関係なく、ほぼ推定できることを明らかにした。この際、補正係数を導入する必要がある。この値は、試験体の厚さ、階調計の一辺の長さ及び階調計を線源側あるいはフィルム側に置くかにより変化するが、使用する線源の種類には影響されないことが明らかになった。超音波探傷試験においては、2振動子探触子を用いることにより、きずの形状・寸法をほぼ推定できることを明らかにした。この際、探触子の音響隔離面をきずの長さ方向に直角に配置して測定することによりきずからのエコーが得られやすくなる。また、試験体の材質が変化した場合には、それぞれの材料の音速の違いの補正を行えば十分推定が可能である。更に、水浸集束探触子を用いた自動探傷も試みた。この方法は分解能は優れているが、探触子の指向性が鋭いために、きずの先端が探傷面に対して傾いている場合には、エコー高さの低下が著しく、ほとんどエコーが識別できなくなることが明らかになった。
TACSTD2遺伝子による上皮タイトジャンクション機能制御機構の解明に関する研究

本研究では膠様滴状角膜変性症(GDLD)の原因遺伝子であるTACSTD2遺伝子がGDLDの病態にどのように関わっているかについて検討し、治療法の開発についても検討した。TACSTD2タンパクは1型膜タンパクであり、1個の膜貫通ドメインと短い細胞内領域を持っている。免疫沈降実験によってTACSTD2タンパクはタイトジャンクション関連タンパクの一つであるクローディン1および7と結合することが明らかとなった。またTACSTD2遺伝子に対するshRNAを用いて角膜上皮細胞においてノックダウンを行うとクローディン1, 7のみならず他のタイトジャンクション関連タンパクの細胞内局在が変化し、同時に上皮バリアー機能の低下を来たした。GDLDより手術時に得た角膜組織を用いてクローディン1、4、7タンパクの発現を免疫染色およびウエスタンブロットで検討したところ、GDLD患者角膜では正常角膜に比べこれらのタンパクの発現が著しく低下していた。レーザーマイクロキャプチャー法にて角膜上皮を組織切片より採取して定量PCRを行うと、mRNAレベルではクローディン1、4、7遺伝子の発現は変化していなかった。そこでHeLa細胞にTACSTD2およびクローディン1、4、7遺伝子を共導入したところ、TACSTD2と共導入している時にはクローディン1、7タンパクの発現が亢進した。またプロテアソーム阻害剤であるMG-132で処理した場合にもクローディン1、7タンパクの発現が亢進した。これらのことからTACSTD2タンパクはクローディン1、7タンパクのユビキチン・プロテアソーム経路によるタンパク分解を阻害してタイトジャンクション機能を正に制御しているものと推測された。そこで免疫沈降実験でクローディン1および7が実際にユビキチン化されているかどうかを検討したが、これらのタンパクはユビキチン化されていないことが明らかとなった。このことはGDLD患者由来の不死化角膜上皮細胞にMG-132を処理しても上皮バリア機能が改善しないことからも確からしい結果であると判断した。今年度はTACSTD2遺伝子の発現を様々の上皮組織にて検討した。TACSTD2遺伝子は重層扁平上皮の全層の細胞膜に発現していた。また角膜上皮細胞の不死化セルラインであるHCE-T細胞において抗TACSTD2抗体で免疫沈降実験を行ったところ、タイトジャンクション構成タンパクのうちクローディン1と7が共沈したが、HCE-T細胞で発現しているクローディン4は共沈せず、ZOI、オクルディンについても共沈は見られなかった。一方、分子間距離が近い場合にのみシグナルが見られるPLAアッセイにてTACSTD2タンパクとタイトジャンクション関連タンパクの分子間距離を検討したところ、クローディン1、4、7のすべてとZOIでシグナルが見られたがオクルディンについてはシグナルは認められなかった。そこでPLAアッセイによるシグナルの細胞内局剤をさらに詳細に検討する目的でPLAアッセイ後のサンプルをさらに蛍光標識抗デスモプラキンないし抗ゴルジン47抗体で2重染色し、PLAシグナルが細胞膜にあるのか、ゴルジ体に存在するのかを検討した。そり結果PLAシグナルは主に細胞膜上に存在し、わずかながら細胞内にも存在したもののゴルジ体には局在していなかった。次にTACSTD2遺伝子の機能喪失がタイトジャンクションタンパクの局在と機能にどのような影響を与えるかについて検討すべく、TACSTD2遺伝子に対するshRNA発現レンチウイルスベクターを構築した。現時点で作成した5つのレンチウイルスのうち2つのものについてRNA、タンパクの両レベルでの抑制を確認している。昨年度に同定したTACSTD

2遺伝子と結合するタンパクであるClaudin 1および7について、ユビキチン・プロテアソーム系路のタンパク分解が起こるかどうかを検討した。まず、HeLa細胞にレンチウイルスにてClaudin 1、4および7遺伝子を各々導入し、安定発現細胞とした。これをプロテアソーム阻害剤であるMG-132にて処理してClaudin 1および7に対する抗体で免疫沈降して抗ユビキチン抗体にてウエスタンブロットした。結果として、Claudin 1はMG-132処理によってユビキチンが結合したバンドが出現したが、Claudin 4については認められなかった。意外な事にClaudin 7についてはユビキチンが結合したバンドの出現が見られなかったが、これは用いたClaudin 7に対する抗体がユビキチン付加されると予測されるリジン残基を含む領域に対して作成されているために、ユビキチン化されたClaudin 7を認識できなかったためではないかと考えられた。またTACSTD2タンパクとClaudin 1および7の結合部位の同定を目的としてGST Pull-downアッセイを行ったが、全長TACSTD2および膜貫通領域までのTACSTD2タンパクを大腸菌発現系にて十分量得ることができなかった。そのため結合領域の同定には至っていない。これについては培養細胞にて行うことを検討している。TACSTD2タンパクに結合する因子の網羅的解析については、免疫沈降を行う抗体によりシグナルが隠れてしまうことが判明した。これについては抗体をProtein Aビーズにクロスリンカーにて共有結合させ、免疫沈降を行った後に二次元電気泳動、PMF解析を行うことを考えている。ミスセンス変異によって生じるGDLDの妥当性の検討ワイルドタイプおよびミスセンス変異をもつTACSTD2遺伝子を発現するレンチウイルスを作製した。またTACSTD2遺伝子の3'UTRをターゲットにしたshRNAレンチウイルスも作製した。shRNAウイルスをHCE-T細胞に感染させたところ、コントロールと比較して確かに上皮バリア機能は低下したが、野生型のTACSTD2遺伝子を供感染させても上皮バリア機能は回復せずさらにHCE-T細胞に野生型のTACSTD2遺伝子を感染させただけでも上皮バリア機能が低下した。このためこのシステムではミスセンス変異によって生じるGDLDの妥当性の検討は困難であると判断した。H23年度に患者由来の角膜上皮細胞の不死化を行ったので、その細胞に遺伝子導入する方法に切り替えることを考えている。プロテアソーム阻害剤によるGDLD治療の可能性の検討市販されているプロテアソーム阻害剤(MG-132,ラクタシスチン)の細胞毒性を培養角膜上皮細胞を用いて検討した。これらのプロテアソーム阻害剤は薬効濃度内で強い細胞毒性を示した。
Mgイオンによる致死性不整脈防止機序に関する研究

致死性不整脈モデルとして早期後脱分極(EAD)によるTriggered activityを発生するアコニチン誘発性不整脈を用いてinvivo,invitroでMg^<2+>及び抗不整脈剤の効果を検討した。(1)家兎の心房、His束、心室より記録した局所心電図を下に、アコニチン灌流で発生した細動に対する除細動効果をみると3mM Mg^<2+>以下ではなく、5mM以上で認められ、しかもこの効果はTTXの場合に類似していた。一方、リドカイン、フレカイナイド、ベラパミルなどの抗不整脈薬には除細動効果は認められず、規則的な頻拍状態に戻すのみであった。さらに5mM Mg^<2+>には細動の予防効果を認めた。(2)invitroの単一心室筋でもアコニチンは活動電位再分極相を延長してEADを発生させた。5mM Mg^<2+>以上でEADを有意に抑制したが、抗不整脈薬はEADを抑制せず活動電位の回復も認めなかった。EADに対するMg^<2+>の抑制機序はアコニチンがもたらす内向きhump電流(window電流)を減少させることによった。抗不整脈薬にはその効果は弱くアコニチン不整脈に対しても同様であった。膜電位、膜電流に対するMg^<2+>イオンの効果は濃度によって異なり、3mM以下では活動電位持続時間(APD)は延長し、逆に3mM以上では短縮した。このAPDに対する2相性変化はK電流の抑制効果とCa電流のピーク値及びその不活性化過程への効果の差異によった。高マグネシウムがAPDを短縮することはアコニチン以外のEADによる致死的不整脈にも有効である。アコニチンの不整脈発生過程にプラトーの短縮を認めたが、これが細胞内Na負荷により活性化されるK電流の寄与が示唆された。(3)Naチャネル電流へのアコニチン効果はcell attach patchの方法では細胞膜の興奮状態を作成することが十分でなくデータを得るに至らなかった。以上の結果を国際心電学会、日本循環器学会、日本生理学会にて報告した。以上より高濃度Mg^<2+>が活動電位再分極相遅延により生じる重症不整脈の改善に有効であることを明らかにした。
ファジィ環境における大規模多目的多重レベルシステムに対する対話型意思決定

複雑に依存しあう実社会の様々な意思決定状況における最適化は,ファジィ情報のもとでの,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的を有する複数人の意思決定者の意向を考慮して行わなければならないことに着目して,大規模多目的多重レベル最適化問題を定式化するとともに,対話型ファジィ満足化手法を提案する.このように本研究では,(1)現実の意思決定状況のファジィモデリングによる多重レベル最適化問題を,線形のみならず線形分数,離散,および非線形性をも考慮した様々な観点からの定式化を進め,(2)ファジィ環境で定式化された多重レベル線形,線形分数,離散,および非線形計画問題に対する上位レベルと下位レベルの意思決定者の間の対話をも考慮した対話型ファジィ意思決定手法を確立し,(3)産業界における様々な状況での幅広い活用を試みる.本研究課題では,さまざまな意思決定状況に対して,意思決定者の選好情報を考慮した多目的およびファジィ環境における多重レベル意思決定問題に対する対話型意思決定手法の開発とその応用に焦点が当てられている.本研究課題における個別の研究は次の4種類のテーマに分類される.具体的には次の4つの段階で進めた.1.ファジィ環境における多重レベル線形計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究2.ファジィ環境における多重レベル線形分数計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究3.ファジィ環境における多重レベル0-1計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究4.ファジィ環境における多重レベル非線形計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究上記の研究のそれぞれについては,得られた成果は論文として学術雑誌に掲載されるとともに,いくつかの国際会議での研究発表を行った.また,以前から進めていた研究と関連するテーマは図書"Large Scale Interactive Fuzzy Multiobjective Programming"としてまとめた.複雑に依存しあう実社会の様々な意思決定状況における最適化は,ファジィ情報のもとでの,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的を有する複数人の意思決定者の意向を考慮して行わなければならないことに着目して,大規模多目的多重レベル最適化問題を定式化するとともに,対話型ファジィ満足化手法を提案する.このように本研究では,(1)現実の意思決定状況のファジィモデリングによる多重レベル最適化問題を,線形のみならず線形分数,離散,および非線形性をも考慮した様々な観点からの定式化を進め,(2)ファジィ環境で定式化された多重レベル線形,線形分数,離散,および非線形計画問題に対する上位レベルと下位レベルの意思決定者の間の対話をも考慮した対話型ファジィ意思決定手法を確立し,(3)産業界における様々な状況での幅広い活用を試みる.本研究課題では,さまざまな意思決定状況に対して,意思決定者の選好情報を考慮した多目的およびファジィ環境における多重レベル意思決定問題に対する対話型意思決定手法の開発とその応用に焦点が当てられている.本研究課題における個別の研究は次の4種類のテーマに分類される.具体的には次の4つの段階で進めた.1.ファジィ環境における多重レベル線形計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究2.ファジィ環境における多重レベル線形分数計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究3.ファジィ環境における多重レベル0-1計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究4.ファジィ環境における多重レベル非線形計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究上記の研究のそれぞれについては,得られた成果は論文として学術雑誌に掲載されるとともに,いくつかの国際会議での研究発表を行った.また,以前から進めていた研究と関連するテーマは図書"Large Scale Interactive Fuzzy Multiobjective Programming"としてまとめた.複雑に依存しあう現実の様々な社会システムにおける意思決定状況を,ファジィ情報のもとでの,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的をもつ上位レベルと下位レベルの意思決走者の存在を考慮して,大規模多目的多重レベル計画問題として定式化し,レベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するという対話型ファジィ計画法の開発を目指して,本年度は,ファジィパラメータを含む角型構造の大規模多目的線形計画問題の定式化を行なうとともに,問題特有の特殊構造を利用することにより,小規模の問題に分解して効果的に対処し得る分解原理に基づく対話型意思決定手法を提案して,小規模から中規模までの数多くの数値例によりその有効性を示した.さらに,上位レベルと下位レベルの意思決定者の存在を考慮したファジィパラメータを含む多重レベル線形,線形分数および非線形計画問題として定式化し,上位レベルの意思決定者と下位レベルの意思決定者がお互いの立場をわきまえて,可能な限りレベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するため,線形計画法や遺伝的アルゴリズムに基づく対話型ファジィ計画法を提案し,簡単な数値例によりその有効性を示した.また,今後,連続変数のみならず離散変数の大規模多目的ファジィ多重レベル計画問題にも対処し得るような対話型ファジィ計画法を開発するための準備として,2重構造文字列遺伝的アルゴリズムによる一般の0-1計画問題や整数計画問題に対する近似解法を提案して,数値例によりその有効性を検証した.しかも,提案した2重構造文字列遺伝的アルゴリズムを用いて,多目的0-1計画問題や多目的整数計画問題に対する意思快走者の満足解を導出するための対話型意思決定手法への拡張も試みた.複雑に依存しあう

現実の様々な社会システムにおける意思決定状況を,ファジィ情報のもとでの,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的をもつ上位レベルと下位レベルの意思決定者の存在を考慮して,大規模多目的多重レベル計画問題として定式化し,レベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するという対話型ファジィ計画法の開発を目指して,本年度は,ファジィ環境における角型構造の大規模多目的計画問題に対して,これまで研究代表者が遂行してきた研究成果がドイツのPhysica-Verlagより"Large Scale Interactive Fuzzy Multiobjective Programming"と題する200頁以上の研究書として出版されるとともに,研究代表者がこれまで提案してきた2重構造文字列遺伝的アルゴリズムに関する研究をも含む「離散システムの最適化<一目的から多目的へ>」と題する研究書が森北出版から刊行された.さらに,上位レベルと下位レベルの意思決定者の存在を考慮したファジィ環境での多重レベル線形分数,0-1および非凸計画問題を定式化し,上位レベルの意思決定者と下位レベルの意思決定者がお互いの立場をわきまえて,可能な限りレベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するため,線形計画法や遺伝的アルゴリズムに基づく対話型ファジィ計画法を提案し,数値例によりその有効性を示した.また,今後,ファジィ環境での離散変数の大規模多目的多重レベル計画問題にも対処し得るような対話型ファジィ計画法を開発するために,多次元整数ナップサック問題やより一般の整数計画問題に対する2重構造文字列遺伝的アルゴリズムによる近似解法を提案して,数値例により有効性を検証した.しかも,事例研究として,生産・人員割当2レベル線形分数計画問題を定式化して,提案した対話型ファジィ計画法を適用して,有効性を検証した.複雑に依存しあう現実の様々な社会システムにおける意思決定状況を,ファジィ情報のもとでの,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的をもつ上位レベルと下位レベルの意思決定者の存在を考慮して,大規模多目的多重レベル計画問題として定式化し,レベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するという対話型ファジィ計画法の開発を目指して,ファジィパラメータを含む多重レベル線形,線形分数および非線形計画問題として定式化し,上位レベルの意思決定者と下位レベルの意思決定者がお互いの立場をわきまえて,可能な限りレベル間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するため,線形計画法や遺伝的アルゴリズムに基づく対話型ファジィ計画法を提案した.しかも,現実問題への適用例として,建材企業とその協力会社の生産・人員割当問題を取り上げ,利益最大化と利益率最大化の観点から現実のデータを用いて2レベル線形および線形分数計画問題を定式化するとともに,対話型ファジィ計画法を適用することによって,建材企業を尊重すると同時に協力会社の満足度にも配慮した解を導出して,得られた解を比較・検討した.
連続式スチーム・インジェクション・プレスの開発

コンベヤの流れに沿って反復(ピストン)運動をする盤面800×1,200mmの蒸気噴射プレスを用いて、厚さ60mm及び100mm、比重0.4および0.6のパーティクルボードを連続的に製造した。接着剤にはイソシアネート樹脂を用い、パーティクルにはリングフレーカーで切削したラワンのセミストランドを用いた。製造されたボードの曲げ強度、剥離強度および厚さの膨潤率を測定した。その結果、厚さ100mm、比重0.6の場合でも、温度140°Cの蒸気を10秒噴射し、引き続き80秒間圧締する断続的なプレス・スケジュールで十分な接着剤の硬化をもたらし、ボードを成板することが可能であった。この熱圧サイクルは、従来の熱圧法に比べると約20倍の効率をもつものである。有限要素法による数値解析法を応用して、熱板表面からパーティクルマット内に高圧蒸気を噴射した場合のマット内の熱拡散を算出するための解析プログラムを作成した。このプログラムを用いて、種々の噴射蒸気圧、ボードの厚さと比重などについて、内部温度の時間的な変化を計算した結果、昨年度に実測されたものと良い一致を示した。このことからこの数値解析の方法がボード内の温度分布の予測、ひいてはプレスサイクルの予測に有効であることがわかった。さらに、数値解説の方法を、マットの側面から蒸気噴射する場合について適用した結果、盤面から噴射する場合に比べて著しく効率的であることが予測され、今後の課題として重要な示唆となった。熱板表面から高温(高圧)水蒸気を噴射することにより、パーティクルマット内の温度を急激に上昇させ、接着剤を硬化させ、ボードを短時間に熱圧成形する、いわゆる、蒸気噴射法をボードの連続成形と組み合わせて、効率の良い熱圧を連続的に行なうための装置の開発とその基礎原理について研究を行なった。結果の概要は以下の通りである:1高圧蒸気と液体窒素を用いる特殊な反応セル内で、高蒸気圧下の木材接着剤の反応挙動を調べた結果、縮合反応に続いて分解反応が起こり、接着剤の種類に固有の蒸気圧と適正硬化時間の関係が存在することを明らかにした。2有限要素法によるマット内の熱拡散に関する数値解析を行ない、蒸気噴射のタイミング、蒸気の圧力、ボードの比重、厚さなどが温度分布に及ぼす影響を算出し、その結果の精度を実験的に検証し、その計算方法が十分な実用性をもっていることを明らかにした。3コンベヤの流れに沿って反復(ピストン)運動をする盤面800×1,200mmの蒸気噴射プレスを設計、試作し、既設の高電圧配向マットフォーマーに連続的に設置し、その操作性能をテストした結果、目標に近い性能をもつことがわかった。4この連続式蒸気噴射プレスを用いて、厚さ60及び100mm、比重0.4および0.6のイソシアネート接着剤を用いたボードを連続成板し、その曲げ性能、剥離強度、厚さ膨張率などを調べた結果、例えば厚さ100mmのボードの場合、蒸気温度140°Cを10秒噴射すれば、全圧締時間は90秒で十分なことがわかった。この生産速度は從来の熱板プレス法のそれの約20倍である。この結果は2の数値解析による推定と一致した。5数値解析結果によればマット側面より蒸気噴射を行なうことがより有効である。また連続プレスへの適用性が高い。今後の課題である。
グループホーム型小規模高齢者居住施設における複数ユニットの機能分化と生活展開

前年度は、阪神大震災の被災者対策として設置され、異なる社会福祉法人に運営委託されたケア付き仮設住宅2棟を対象として、介助行為および入居者-職員間の会話から、両ケア付き仮設住宅において入居者-職員の関係性や雰囲気に違いが見られること、またそうした差異が職員のシフトやケアスタンスの相違に依ることを示し、同一設置形態のグループリビングユニット間に見られる差異を画タイ的に示したが、本年度は、引き続き両ケア付き仮設住宅がグループハウスに統合される過程を中心に調査を行い、小規模グループリビングにおけるケアの継続性と入居者の適応過程について、行動観察と入居者-職員間の会話内容に基づき考察し、小規模グループリビングの施設転居直後、居室滞在率が高まり「閉じこもり傾向」が見られること、入居者による自発的な会話が減少するだけではなく、その内容も介助に関連する割合が増え、より多くのサポートを必要とする受け身の状態となることから、平常時に増してケアが必要となること、また、適応過程全般にける入居者による自発的会話と日常会話の割合の時系列的変化から、入居者-職員の関係性が構築される過程を示した。また、ケアスタッフが変化しないグループとケアスタッフが新しくなるグループを比較し、施設転居に伴う影響がケアスタッフの変化したグループに強く現れることから、小規模グループリビングにおいて、ケア環境の継続性が物理的環境と同様に重要であることなどを、高齢者グループリビングの統合過程から示した平成11年度は、特別養護老人ホームの建て替えに際して、同一入居者・職員・敷地において、小規模処遇の導入を客観的に検証するため、複数ユニットを全国に先駆けて導入する、岐阜県立特別養護老人ホーム「飛騨寿楽苑(飛騨古川町)」を対象として、ユニットケア導入前の入居者の生活展開(居室の使い方、施設内での生活、生活の質)からケア(介助の内容、介助の質、スタッフのストレス)に関して調査を行った(平成11年9月)。ここで得られたデータは、本年度得られるユニットケアの導入後のデータと比較し、その効果を検証する予定である。また、老人保健施設に全国で始めて本格的なユニットケアを導入した「ケアタウンたかのす(秋田県鷹巣町)」を対象として、平成12年3月、入居者の生活展開(ユニット内での生活展開、ユニット外での生活展開、痴呆棟ユニットでの生活展開)からケア(介助の内容、介助の質、スタッフの移動距離)に関して調査を行った。調査時期が年度末に差し迫った時期であり、得られたデータの詳細については、十分な分析ができていないが、1)ユニットに最低一人の職員が配置されている時間帯は、職員の移動距離が短縮されていること、2)移動距離が短くなることにより、職員にゆとりが生じ、声かけをする回数や、ケアに関連しない会話を行う回数が増えていること、3)ただし、夜勤など、複数ユニットを一人の職員が担当している時間帯は、職員の移動距離は逆にユニット化していない施設よりも多くなる傾向が見られた。以上、ユニットケアの導入は、入居者の生活の質を高めることが確認されたが、そのためには十分な職員配置が不可欠であることが確認された。また、ケアスタッフが変化しないグループとケアスタッフが新しくなるグループを比較し、施設転居に伴う影響がケアスタッフの変化したグループに強く現れることから、小規模グループリビングにおいて、ケア環境の継続性が物理的環境と同様に重要であることなどを、高齢者グループリビングの統合過程から示した
腎細胞癌特異抗原に対し単離した完全ヒト型抗体の機能解析と治療効果の研究

ファージ・デイスプレイ法を用い、ICOS法(J Immunol Methods. 351 : 1-12、2009)によりAIMS-5ライブラリーより2種類のヒト腎細胞癌細胞特異的抗体(062-130 & 059-152)を選択した。これら抗体が認識する腎がん細胞膜上の抗原はEGFRであった。これら抗体をIgG化し抗腫瘍効果を検討した。in vitroではヒト腎癌細胞株であるCCF-RC1に対し、062-130では濃度依存性に細胞増殖を抑制し、抗体濃度10μg/mlにてコントロールに比べ59.4%、059-152では34.8%の細胞増殖抑制効果が得られた。これら腫瘍増殖抑制の機序として、各抗体ともCCF-RC1およびACHNに対し35-40%程度の腫瘍細胞に対するADCC活性を認めたがCaki-1に対しては全くADCC活性を呈さなかった。また、062-130はCCF-RC1およびACHNに対しリン酸化阻害活性を示し、これらはEGFR阻害薬であるCetuximabより強力であった。一方、059-152は如何なるリン酸化阻害活性も示さなかった。ヒト腎癌坦癌SCIDマウスに対し投与した実験では、コントロールに比べ有為な腫瘍増殖抑制を認めた。抗腫瘍効果は、各抗体において投与スケジュールや投与量、投与方法により増殖抑制に差がみられた。また、抗がん剤等との併用により相乗効果も認められたが、一方で抗がん化学療法剤との併用では宿主の体重減少等が認められ、副作用に対する検討が必要と考えられた。しかし、私どもの腎細胞癌治療用抗体作製のストラテジーは本来ヒト抗体ファージ・ライブラリーより産製される抗体を用いることから交差反応の可能性も少ないため、将来的にも治療の有効性と安全性を充分に諮れるもので、ヒト腎細胞癌に対する臨床応用が期待できると考えられた。現在までに我々が単離した2種類の腎癌特異的抗体をIgG化しin vitroにおいて培養樹立腎癌細胞株を用いた細胞増殖抑制を測定した。ヒト腎癌細胞株であるCCF-RC1をターゲットとした場合、コントロールに比べ062-130では濃度依存性に細胞増殖が抑制された。抗体濃度10μg/mlにて59.4%の増殖抑制効果が認められた。059-152では34.8%の細胞増殖抑制作用が得られた。また、ヒト腎癌を坦癌させたSCIDマウスに対し投与した場合では、腫瘍容積の縮小効果コントロールに比べある程度の腫瘍増殖抑制を認めた。これら腫瘍増殖抑制の機序として腫瘍細胞に対するADCC、リン酸化阻害などがあり、これらに関し検討した。ヒト腎細胞癌を担癌したSCIDマウスでの抗腫瘍効果は、各抗体において投与スケジュールや投与量、投与方法により増殖抑制に差がみられ、至適条件の設定が必要である。また、抗がん剤等との併用作用についても検討中である。In vivoにおける全身的な副作用の有無も検索する必要もある。私どもの腎細胞癌治療用抗体作製のストラテジーは、本来ヒト抗体ファージ・ライブラリーより産製される抗体を用いることで将来的にも治療の有効性と安全性を充分に諮れるものと考えられる。今回腎癌細胞株から単離された2種類の抗EGFR抗体059-152、062-130はヒト腎細胞癌に対する有効性が期待できると考えられる。

現在までに我々はファージ・デイスプレイ法を用い、ICOS法(J Immunol Methods. 351 : 1-12、2009)によりAIMS-5ライブラリーより単離した2種類のヒト腎細胞癌細胞特異的抗体(062-130 & 059-152)をIgG化した。in vitroではヒト腎癌細胞株であるCCF-RC1に対し、062-130では濃度依存性に細胞増殖を抑制し、抗体濃度10μg/mlにてコントロールに比べ59.4%、059-152では34.8%の細胞増殖抑制効果が得られた。これら腫瘍増殖抑制の機序として、ADCCおよびEGFRのTKリン酸化阻害の有無に付き検討した。両抗体ともCCF-RC1およびACHNに対し35-40%程度の腫瘍細胞に対するADCC活性を認めたがCaki-1に対しては全くADCC活性を呈さなかった。また、062-130はCCF-RC1およびACHNに対しリン酸化阻害活性を示し、これらはEGFR阻害薬であるCetuximabより強力であった。一方、059-152は如何なるリン酸化阻害活性も示さなかった。また、ヒト腎癌を坦癌させたSCIDマウスに対し投与した場合ではコントロールに比べ、ある程度の腫瘍増殖抑制を認めた。ヒト腎細胞癌を担癌したSCIDマウスでの抗腫瘍効果は、各抗体において投与スケジュールや投与量、投与方法により増殖抑制に差がみられ、至適条件の設定が必要である。また、抗がん剤等との併用作用についても検討中である。In vivoにおける全身的な副作用の有無も検索する必要もある。私どもの腎細胞癌治療用抗体作製のストラテジーは、本来ヒト抗体ファージ・ライブラリーより産製される抗体を用いることで将来的にも治療の有効性と安全性を充分に諮れるものと考えられる。ヒト腎細胞癌に対する有効性が期待できると考えられる。現在までにファージ・ディスプレイ法を用い、ICOS法(J Immunol Methods.351:1-12、2009)によりAIMS-5ライブラリーより単離した2種類のヒト腎細胞癌細胞特異的抗体(062-130&059-152)を選択しIgG化した。これら腫瘍増殖抑制の機序として、両抗体ともCCF-RC1およびACHNに対し35-40%程度の腫瘍細胞に対するADCC活性を認めたがCaki-1に対しては全くADCC活性を呈さなかった。また、ヒト腎癌を坦癌させたSCIDマウスに対し投与した場合では、コントロールに比べある程度の腫瘍増殖抑制を認めた。ヒト腎細胞癌を担癌したSCIDマウスでの抗腫瘍効果は、各抗体において投与スケジュールや投与量、投与方法により増殖抑制に差がみられた。また、抗がん剤等との併用により相乗効果も認められた。一方、抗がん化学療法剤との併用では宿主の体重減少等が認められ、今後も副作用に対する検討が必要と考えられた。しかし、私どもの腎細胞癌治療用抗体作製のストラテジーは、本来ヒト抗体ファージ・ライブラリーより産製される抗体を用いることで将来的にも治療の有効性と安全性を充分に諮れるものと考えられる。
ヒト鼻粘膜上皮M細胞の機能解析および分化誘導:鼻粘膜DDSを介する新しい治療戦略

鼻咽腔・鼻粘膜は,外来病原体に対する生体防御の最前線に位置し,その粘膜は,自然免疫,獲得免疫において重要な役割を担っている.われわれは,感染アレルギーの免疫機構解明のため,ヒト鼻咽腔粘膜上皮・鼻粘膜上皮における抗原提示機構と上皮バリア機能を解析する研究をおこなった.鼻咽腔・鼻粘膜は,外来病原体に対する生体防御の最前線に位置し,その粘膜は,自然免疫,獲得免疫において重要な役割を担っている.われわれは,感染アレルギーの免疫機構解明のため,ヒト鼻咽腔粘膜上皮・鼻粘膜上皮における抗原提示機構と上皮バリア機能を解析する研究をおこなった.鼻咽喉腔は,外来病原体に対する生体防御の最前線に位置し,その粘膜は,自然免疫,獲得免疫において重要な役割を担っている.ヒト鼻粘膜上皮は,発達したタイト結合による上皮バリア機能を有し,抗原取り込み機構については,鼻咽腔リンパ装置(NALT)同様,抗原提示細胞である樹状細胞およびM細胞の関与が考えられている.我々は,以前アレルギー性鼻炎において,抗原提示細胞であるCD11c陽性樹状細胞が上皮と同様のタイト結合分子を発現し内腔に樹状突起を伸ばしていることを報告した.しかし,鼻粘膜上皮の抗原取り込み能を有するM細胞については,未だ不明である.消化管においては,樹状細胞が上皮と同様のタイト結合分子を発現し内腔に樹状突起を伸ばしバリアを維持したまま抗原を取り込むことが世界で初めて報告され,さらに最近,消化管粘膜関連リンパ装置(GALT)同様に,腸絨毛上皮中にも,M細胞が散見されることが明らかとなった.このことからも,鼻咽腔リンパ装置(咽頭扁桃)だけでなく,鼻粘膜上皮中にもM細胞が存在する可能性が十分考えられる.本研究では,咽頭扁桃のM細胞を指標にして,鼻粘膜組織および培養鼻粘膜上皮細胞を用いて,鼻粘膜上皮のM細胞の同定,分離および分化誘導を行い,鼻粘膜上皮のM細胞の特異的タイト結合蛋白の発現を検索し,最終的にはヒト鼻粘膜上皮における抗原提示機構(M細胞,樹状細胞)と上皮のバリア機能との関係を明らかにする.これらの研究成果は,ヒト鼻粘膜のタイト結合による上皮バリアを維持したままM細胞に特異的に抗原を取り込ませるdrug deliverysystemにつながると考えられる.さらにM細胞をターゲットとしたDNAワクチン療法にもつながると考えられる.外来病原体に対する生体防御の最前線に位置する鼻粘膜・口腔咽頭粘膜は,自然免疫,獲得免疫において重要な役割を担っている.なかでもヒト鼻粘膜上皮は,解剖学的に防御機構としての発達したタイト結合による上皮バリアを有していることが知られている.近年タイト結合は前述の防御・バリアとしての機能に加え,免疫応答の第一歩である抗原取り込み機構にかかわっていることが示されており,我々は,以前アレルギー性鼻炎において,抗原提示細胞であるCDllc陽性樹状細胞が上皮と同様のタイト結合分子を発現し内腔に樹状突起を伸ばしていることを報告した.本研究では,咽頭扁桃のM細胞を指標にして,鼻粘膜組織および培養鼻粘膜上皮細胞を用いて,鼻粘膜上皮のM細胞の同定,分離および分化誘導を行い,鼻粘膜上皮のM細胞の特異的タイト結合蛋白の発現を検索し,ヒト鼻粘膜上皮における抗原提示機構(M細胞,樹状細胞)と上皮のバリア機能との関係を明らかにすることを目的としてきた.我々はcytokeratin 20 (Ck20)をマーカーにし透過型電子顕微鏡を用いてヒト咽頭扁桃(adenoid)組織を観察すると,短い微絨毛をもったM細胞様の細胞内にCk20で標識された金粒子が同定され,さらにポケット様構造の内部にはリンパ球を取り込んでいる像が確認された.また,ヒト咽頭扁桃組織および培養細胞におけるCk20陽性細胞は,周囲の上皮同様,特定のタイト結合蛋白を細胞境界領域に発現していることを観察した,これらのヒト咽頭扁桃のCk20陽性のM細胞を指標にして,今後ヒト鼻粘膜組織および培養鼻粘膜上皮細胞を用いて,TSLPおよびPPAR-γリガンドなどによるタイト結合のバリア機能調節をターゲットとして,樹状細胞の抗原提示と上皮のバリア機能との関係も踏まえて,アレルギー性鼻炎の新しい治療のための基礎研究を行う予定である.
臨床検査値の個体差の遺伝学的・中毒学的研究

我々は個人差のモデルとして実験動物の系統差について検討し、これまでに2系統のラットで血清ロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)活性が有意に異なることを見出した。さらに、これら2系統及びそれらのF_1及びF_2、さらにF_1と親系統との戻し交配したラットにより血清LAP活性の違いが遺伝的に制御されていることを明らかにした。LAPは部分精製されたタンパク質を用いてN末端から20アミノ酸の配列が種、臓器間で保存されていることが知られていた。そこでここに相当するDNA配列とmRNA3、末端のpolyA配列を利用してラット肝cDNAライブラリーを鋳型にPCRを行い、LAP遺伝子の単離を試みた。PCRにより予想される長さのDNA断片が増幅されたため、クローン化して塩基配列を決定したが、プライマーに用いた配列を除いて全く一致する配列が見出せなかった。今後プライマー並びにcDNAライブラリーを作り直し、再度LAP遺伝子の単離を試みる予定である。また、LAP活性はある種の癌細胞で高値であり、活性に亜鉛を必要とすることから、癌化とメタロチオネイン(MT)の関係についても検討した。MTはその発現が転写レベルで制御されていることからMTIプロモーターの下流にレポーター遺伝子を接続したプラスミドを導入した細胞を用い種々の癌遺伝子による形質転換の影響を調べた。その結果、ras及びsis癌遺伝子は金属及びグルココルチコイドによるMTIプロモーターの活性化を促進したが、neu癌遺伝子は正常細胞の場合よりも抑制した。MTの関与が知られている制癌剤シスプラチン耐性はいずれの癌遺伝子で形質転換した細胞においても正常細胞より耐性が増加していたことから、MTの合成は金属やグルココルチコイド以外にも複数の因子が関与し、さらに、MTI単独ではなく、MTIIのプロモーターにも作用することにより誘導され、シスプラチン耐性も獲得していると考えられた。我々はこれまでに、2系統のラット間で血清アルカリフォスファターゼ(ALP)、ロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)、クレアチンフォスフォキナーゼ(CPK)活性が有意に異なることを見い出している。そこでこの2系統のラットを用いて種々の交配実験を行った結果、これら活性の違いは遺伝的な背景の違いに起因する可能性が示唆された。特にLAPは両系統での活性の違いがラットの全週令を通じて顕著であることからさらに両系統の遺伝的背景について解析を進める予定である。またLAPは数種のアイソザイムが存在し、眼のレンズ由来のものは部分的なアミノ酸配列が明らかにされているのでこの配列を基にいくつかのプライマーを作成し、PCR法によりLAP遺伝子の単離を試み、両系統でのLAP遺伝子の違いについても検討を加える予定である。さらに両系統のラットの各臓器中のLAP活性を測定し、血清LAP活性の違いに影響するアイソザイムの特定についても着手したい。またLAPの活性はある種の癌細胞で高い値を示すこと、さらにその活性には亜鉛を必要とすることから、細胞の癌化及び亜鉛の代謝がLAPの活性に影響を及ぼす可能性が考えられる。そこで亜鉛代謝に関与することが知られているメタロチオネインの発現調節について基礎的な検討を行った。メタロチオネインプロモーター下流にリポーター遺伝子(beta-ガラクトシダーゼ)を接続したプラスミドを作製し、これを単一の癌遺伝子(sis,neu,ras)で形質転換した培養細胞へ導入し、beta-ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、メタロチオネインプロモーター活性のカドミウムや亜鉛による活性化はある種の癌遺伝子(sis neu)の発現により増大する結果が得られた現在細胞癌化と金属によるメタロチオネインプロモーター活性化の機構について検討している。
かたちから探る聴覚情報表現

前年度までの研究で、傍細胞記録・染色法によって標識された下丘細胞65個の形態学的特徴、生理学特性、空間配置についての生データの収集が完了した。推測のとおり、下丘に存在する大型抑制性細胞、小型抑制性細胞、興奮性細胞は異なる形態学的性質をもち、それに対応するように生理学特性にも違いが見られた。しかしながら、特に興奮性細胞は非常に多様な生理学特性を示していたことから、単に形態と生理の関連を見るだけでは片手落ちなのではないか、と考え、最終年度は標識細胞の分布と生理学特性との関連を更に詳しく調べることとした。サンプル数の多い大型抑制性細胞と興奮性細胞について、各々の細胞の生理学特性と空間座標をプロットし、同一細胞種および異なる細胞種について、生理学特性の相違度の細胞間距離に関する関数(dissimilar index)を算出し、この関数と、細胞がランダムに分布していた場合の関数を5000回算出することによって求めた95%信頼区間を比較した。すると、いくつかの生理学特性について、近隣の細胞がより類似した性質を有する、すなわち地図表現が存在することと、この地図表現が大型抑制性細胞と興奮性細胞で異なることが明らかとなった。近隣の細胞は視床の同じ領域に投射することから、異なる生理学特性をもった興奮性細胞と大型抑制性細胞からの出力が視床で収束することで新たなる情報表現が生まれることを示唆している。本内容を追加して、論文を執筆しているところである。実験1:機能イメージングによる聴覚機能構築の詳細の検討/脳の機能地図の形態学的基盤を明らかにする技法を開発すべく、下丘スライスに色素を詰めた電極を刺し、電位イメージングを行いながら軸索の標識を行なった。すると、神経活動伝搬様式と標識軸索終末の空間分布につよい相関が見られた。現在論文投稿中である。この技法をin vivoに応用するための条件を現在検討している。実験2:c-fos分子発現を用いた音刺激依存的な活動ニューロンの下丘内分布の解明/c-fos分子の音刺激に対する発現パターンは個体差が大きいことが問題であった。そこで、本年度はc-fosの以外の活動依存性分子の発現についても検討を行った。リン酸化Erkは下丘皮質で強く免疫反応性が見られた。これはc-fosが下丘皮質で強い発現を示すこととよく対応していた。一方で下丘中心核でこの分子の発現は見られず、この分子は音刺激による神経可塑性に関係すると推測された。実験3:下丘単一ニューロンの機能形態学/今年度は65例のラット下丘中心核ニューロンについて、細胞種、樹状突起形態、入力終末の空間分布と音刺激に対する応答性の関連について検討した。大型抑制性細胞はスウィープ音に対する選好性が確認された。この選好性がどのような形態学的パラメータと相関が強いのか解析したところ、樹状突起の展開も重要ではあるが、最も強い要因は興奮性や抑制性の入力終末の密度であることが判明した。一方、小型抑制性細胞は素早く変化する正弦変調FM音の変調位相によく追従することが判明した。この選好性と相関のある形態学的パラメータは樹状突起の広がりや抑制性の入力終末の密度であったが、何れも弱い相関に留まったことから、この選択性は膜特性のような細胞内部の特性によって主に生み出されると考えられた。本年度は大学のカリキュラムの変更に伴い教育業務が通常の2倍(6ヶ月)になった上、1月に代表者の移籍が決まったため、予定していた実験の多くが実施できなかった。なお、過去に行った実験の解析については予定通り実施し、それをもとに日本解剖学会総会・学術集会で新知見を報告できたことから、「やや遅れている」と判定した。本年度は、傍細胞記録・染色によって標識された下丘細胞の形態学的分析と、生理学的性質の関連について解析を行った。67個の下丘中心核神経細胞(大型抑制性細胞13個、小型抑制性細胞5個、興奮性細胞49個)の樹状突起形態をNeurolucidaを用いて定量化したところ、抑制性細胞と興奮性細胞の間で様々な形態学的特徴に違いが見られることが明らかになった。さらに、細胞体周囲のコンフォーカルZスタック画像から、細胞体及び樹状突起に接触する興奮性及び抑制性終末の密度を定量化した。すると、大型抑制性細胞は樹状突起、細胞体両者の部位で他の細胞種に比べ有意に多い入力を受けることも明らかになった。一部の生理学的性質はこのような樹状突起形態や終末密度といった形態学的パラメータと相関を示した。NEURONシミュレータを用いて、大型抑制性細胞と小型抑制性細胞をシミュレーションしたところ、実際の音刺激応答性に類似した発火様式を再現することに成功した。生理学的性質と細胞の空間分布を定量化する解析法を開発した。この方法によって、興奮性細胞について、一部の生理学的性質が細胞体の位置と関連がある、すなわち地図表現があることについても明らかになった。以上のことから、下丘中心核において、ある種の生理学的性質は細胞種による情報表現と、空間分布による情報表現の2重表現がされていることが示唆された。これらの研究内容は2018年3月に行われた日本解剖学会のシンポジウムで発表した。現在内容をまとめて論文を作成している。本研究で一番労働集約的な側面が強かった、樹状突起形態および軸索形態の3次元再構築をすべて終わらせることができた。このため、全ての解析をおおむね完了させることができた。これによって最終年度は論文執筆、国際学会発表と一部の追加実験に専念することが可能になった。

前年度までの研究で、傍細胞記録・染色法によって標識された下丘細胞65個の形態学的特徴、生理学特性、空間配置についての生データの収集が完了した。推測のとおり、下丘に存在する大型抑制性細胞、小型抑制性細胞、興奮性細胞は異なる形態学的性質をもち、それに対応するように生理学特性にも違いが見られた。しかしながら、特に興奮性細胞は非常に多様な生理学特性を示していたことから、単に形態と生理の関連を見るだけでは片手落ちなのではないか、と考え、最終年度は標識細胞の分布と生理学特性との関連を更に詳しく調べることとした。サンプル数の多い大型抑制性細胞と興奮性細胞について、各々の細胞の生理学特性と空間座標をプロットし、同一細胞種および異なる細胞種について、生理学特性の相違度の細胞間距離に関する関数(dissimilar index)を算出し、この関数と、細胞がランダムに分布していた場合の関数を5000回算出することによって求めた95%信頼区間を比較した。すると、いくつかの生理学特性について、近隣の細胞がより類似した性質を有する、すなわち地図表現が存在することと、この地図表現が大型抑制性細胞と興奮性細胞で異なることが明らかとなった。近隣の細胞は視床の同じ領域に投射することから、異なる生理学特性をもった興奮性細胞と大型抑制性細胞からの出力が視床で収束することで新たなる情報表現が生まれることを示唆している。本内容を追加して、論文を執筆しているところである。4月から代表者の所属が変更になったので、まずは実験環境の整備を行う。実験3を行うのに必要な実験室が存在しないので、間接経費ないし教室費を利用して実験室の整備を行う。イメージング設備は共同研究先の金沢医科大学生理学I講座に設置する手はずとなっており、共同研究者の村瀬博士に5月に設営をお願いする段取りである。46月は研究代表者は教育業務が重いので、この時期に実験環境整備を完了させることで、29年度の研究を円滑に開始できると考えている。まず、解析結果を速やかに論文にまとめ、投稿を行う。それと並行して、明らかになった細胞種表現・地図表現がさらに上位の中枢でどのようになるか調べるため、内側膝状体で生理学的記録を行い、逆行性標識を行うことを検討している。本年度は大学のカリキュラムの変更に伴い教育業務が通常の2倍(6ヶ月)になった上、1月に代表者の移籍が決まり、予定していた実験の多くが実施できなかったため。最終年度は成果発表が予定より多くなる事になりそうであり、論文校正費を多めに確保するため繰越を行った。次年度以降、試薬・消耗品の購入に使用。発表論文2件は何れも研究代表者がco-1st authorである。
Ｔ型電位依存性カルシウムチャネル賦活化を標的としたアルツハイマー病創薬研究

我々は、認知機能改善薬であるST101のT型カルシウムチャネル賦活作用に注目したアルツハイマー病創薬研究に従事し、海馬におけるST101のT型カルシウムチャネル賦活作用には、Achの遊離促進が関与していることを明らかにした。ST101(1mg/kg)の慢性適応により、嗅球摘出マウス(OBXマウス)における認知機能障害は、有意な改善効果を示し、T型カルシウムチャネル阻害薬であるmebefradi(1mg/kg)の前処置によりこの改善作用は阻害された。また、ST101による認知機能改善作用は、CaMKIIalpha, PKCおよびERKのリン酸化反応の促進効果が関与していることも明らかにした。本研究は、T型カルシウムチャネル(T-type VGCC)の賦活化によるアルツハイマー病(AD)の創薬研究である。本研究では、AD治療候補薬としてST101/ZSET1446に注目し、ST101の認知機能改善作用の細胞内機序について検討した。さらに、申請者は、大脳皮質神経細胞においてST101によるCaMキナーゼIIの活性化の亢進は、T-type VGCCの賦活化を介して認知機能を改善することを世界で初めて明らかにした(Moriguchi et al., J. Neurochem. 2012)。これまでT-type VGCCが認知機能調節に関与する報告は皆無であり、本研究ではST101の細胞内機序としてT-type VGCCに注目し認知機能調節との関連性について詳細に検討し、以下の結果を得た。(1)OBXマウスを用いてT-typeVGCC阻害薬MibefradilおよびNNC55-0396処置の記憶学習行動を検討した結果、ST101による認知機能障害の改善効果は、上記の阻害薬処置により有意な改善阻害効果が確認された。(2)海馬におけるACh遊離に対するST101の効果ならびにT-typeVGCC阻害薬MibefradilおよびNNC55-0396の阻害効果について検討した結果、ST101は海馬におけるACh遊離を介してT型カルシウムチャネルを賦活化することを明らかにした。(3)海馬における長期増強現象に対するT-typeVGCC阻害薬MibefradilおよびNNC55-0396の阻害効果について検討した結果、ST101による海馬および大脳皮質におけるLTPの増強効果は、阻害薬により有意に抑制された。これらの研究により、ST101によるT-type VGCCの賦活化による認知機能改善効果について、詳細な作用機序を明らかにした。ST101は低濃度(0.1-1.0 nM)においてラットの体性感覚皮質のCaMキナーゼIIの自己リン酸化の亢進を介して、認知機能調節の指標であるLTPを有意に増強することを見出した。一方、海馬CA1領域においても、有意なCaMキナーゼIIの自己リン酸化の亢進が認められるが、体性感覚皮質と比較して微弱なものであった。さらに、CaMキナーゼIIのpre-terminalの基質であるシナプシンIならびにpost-synapticな基質であるGluR1のリン酸化を検討したところ、GluR1のリン酸化の亢進が認められた。本結果より、CaMキナーゼIIの自己リン酸化の亢進はpost-synapticな影響によるものが推察される。体性感覚皮質において記憶学習の指標である長期増強現象(LTP)を用いてST101の影響について電気生理学的解析により検討した。ST101による体性感覚皮質のLTPの増強およびCaMキナーゼIIの自己リン酸化の亢進は、T型VGCCの阻害薬であるmibefradil(1μM)により有意に抑制されることが明らかになった。この結果、ST101は体性感覚皮質においてT型VGCCの賦活化を介してカルシウムの細胞内への流入を促進し、CaMキナーゼIIの活性化を誘導することが推察される。さらに、whole-cell patch-clamp法によりT型VGCCのサブユニットであるCav3.1(α1G)チャネルを過剰発現させたNeuro2A細胞において、ST101は有意にT型VGCC内向き電流を増強し、カルシウムイメージング法においても細胞内カルシウム濃度を有意に増強させた。本調査研究により明らかにしたT型VGCCの賦活化が認知機能調節に関与する結果は、世界で始めての報告であり、認知機能調節における細胞内カルシウムの制御にT型VGCCの賦活化が重要でることを明らかにした。申請者は進行性神経変性疾患の動物モデルとして嗅球摘出(OBX)

マウスを用い、OBXマウスにおける認知機能障害、特に海馬CA1領域におけるLTPの減弱とCaMキナーゼIIの活性低下の知見を電気理学的解析、生化学的解析により見出しており(Moriguchi et al., J. Neurochem. 2006)、OBXマウスにおける認知機能障害に対してST101の慢性処置により有意な改善効果を得られた。さらに、ST101による改善効果は、T-type VGCC阻害薬により有意に消失した。また、マイクロダイアリシス法を用いた研究により、OBXマウスの海馬において有意なAch量の減少が確認され、ST101はAch量を有意に改善した。このように、T-type VGCCの賦活化は、in vivoにおいても有意な認知機能改善効果を明らかにした。申請者は、ST101より強力な薬効を有する化合物SAK3に関する研究に従事した。これまでの研究より、SAK3は、ST101と異なり、記憶形成に重要な海馬において、T-type VGCCを介したCaMキナーゼII賦活作用を有することが明らかとなった。また、ADの原因物質として考えられているβ-amyloidの凝集には、β-secretaseおよびγ-secretaseによるAPPの切断が問題視され、現在、β-amyloidの凝集阻害薬の開発が進められている。ST101には、カルシウムシグナル賦活化作用だけでなく、β-amyloidの凝集阻害効果も有することを明らかにした。本研究により、T-type VGCC賦活化によるカルシウムシグナルを介した新しいアルツハイマー病創薬の治療戦略を確立した。薬理学、電気生理学ST101のT-type VGCCを介した認知機能改善効果の作用機序に関しては、当初の研究計画の通り、明らかにできている。T型VGCCの認知機能調節への関与という本結果は、世界で初めての報告である(Moriguchi et al., J. Neurochem., 2012)。現在、in vivoにおけるマイクロダイアリシス法を用いた海馬におけるアセチルコリンの遊離作用がT型VGCCを介していることも見出しており、本結果は、当初の計画以上に進展していると言える。また、ST101の誘導体であるSAK1-5の5種類の誘導体より、申請者はSAK3にST101より強力なT型VGCC作用を見出しており、その点でも当初の計画以上に進展していると言える。新規認知機能改善薬であるST101は、現在、アルツハイマー病治療薬の候補化合物として米国において臨床試験(Phase II)を行っている。これまでの基礎研究の報告では、ST101の繰り返し投与によりニコチン刺激によるアセチルコリン放出がamyloid-β(Αβ)注入ラットにおいて増強する。ST101は嗅球摘出マウスにおいて海馬の長期増強現象(LTP)をCaMキナーゼIIおよびプロテインキナーゼCの活性化を介して改善する、ST101はΑβの過剰発現型マウス(3×Tg-ADマウス)においてα-secretaseおよびβ-secretase経路以外の新しいAPPプロセッシング経路を誘導することで、Αβの凝集を抑制することが報告されている。これらの報告からも、T型VGCCの新たな認知機能改善作用が期待できる。本研究は新規AD治療薬ST101の細胞内機序の解明を目的としており、申請者の発見したT-type VGCCの賦活化による認知機能調節は世界初の報告であると共に申請者のオリジナルな研究である。