hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジストロフィンの新しい心筋特異的分子種のクローニングとその病態的意義の解明

ジストロフィン遺伝子からは、多種のプロモーターと多様な選択的スプライシングにより多くのジストロフィンの分子種が産生されてきている。しかし、ジストロフィン遺伝子が極めて巨大な遺伝子であり、全構造が未だ解明されていないことから、さらに未知の分子種の存在が強く示唆されている。本研究では、ジストロフィン遺伝子の新しい分子種を解明するために、ジストロフィン遺伝子から転写されて産生されたmRNAを逆転写酵素(RT)PCR法を駆使して解析した。その結果、今までジストロフィン遺伝子の巨大なイントロンと考えられていた配列の中に新しいエクソン領域が存在することを見い出した。すなわち、イントロン2とイントロン3の配列の中にそれぞれエクソン配列が存在し、これが時に正規のジストロフィンmRNAに挿入されているのが発見された。イントロンの配列の中に存在するこの2つの配列は一次構造的にはエクソンの構造を保持しているにもかかわらず、正規のジストロフィンmRNAに組み込まれていることは稀であった。今後、今回クローニングできたエクソンにコードされている新しいジストロフィン分子種についてその病態的意義を明らかにする予定である。また、拡張型心筋症患者でジストロフィン遺伝子の異常が原因となっているか否かを検討した。しかし、今回の検討では拡張型心筋症患者の中にジストロフィン遺伝子のプロモーター領域に異常を有する例はなかった。このことは、ジストロフィンの分子種と心筋障害の関連に新たな視点の必要性を示唆したもので、今後の解決課題である。Duchenne型あるいはBecker型筋ジストロフィー(DMD/BMD)は最も頻度の高い遺伝性筋疾患である。DMD/BMDの分子病態は、ジストロフィン遺伝子およびその関連蛋白質の遺伝子の発見などにより急速に解明されている。ところが、DMD/BMDの患者の多くが拡張型心筋症で死亡しているにもかかわらず、その分子発生機序は依然として不明である。このため、現在DMD/BMDに合併する拡張型心筋症の発生機序を分子レベルで解明する研究が世界中の研究者の間で激しくしのぎを削って行なわれている。本研究では、研究者らがすでにその存在の手掛かりを得つつあるジストロフィンの新しい分子種の全塩基配列を世界で初めて決定するとともに、そのプロモーター領域のクローニングとプロモーター活性の解析等を行い、その生理学的意義を分子生物学的に解明するものである。ジストロフィンのエクソンの70と75の配列が直接連続した配列を有するmRNAが心筋特異的に発現する新しい分子種であることを、研究者らはすでにノーザンブロット解析等の結果から明らかにしている。ここでは、心筋cDNAライブラリーを作成し、そこに存在するエクソンの70と75の配列が直接つながった新しいジストロフィン分子種をクローニングするものである。このクローニングを開始するため、本年度においては、新しい分子種の基本的な配列となっているエクソンの70と75の配列が直結した部分の塩基配列を基点として5'RACE法を行った。5'RACEの増幅産物の塩基配列を決定し、現在まで一部の塩基配列を明らかにしてきた。今後、この作業を5'端方向へ順次繰り返し行い、ジストロフィンの新しい分子種の5'端の全塩基配列を明らかにする予定である。ジストロフィン遺伝子の異常から発症するジストロフィン異常症では、骨格筋の筋力低下に加え高頻度に拡張型心筋症を合併する。この拡張型心筋症が心筋特異的なジストロフィン分子種の異常から発症するとの仮説をたて、その原因となる新規の心筋特異的に発現するジストロフィンのアイソフォームの検索を行ってきている。そして、ジストロフィン遺伝子異常と拡張型心筋症を合併した症例の遺伝子の異常の分子発生機序の解明に着手した。この症例は、ジストロフィン遺伝子の5'端領域に遺伝子の欠失を有しており、この領域の欠失はしばしば拡張型心筋症を合併する。そこで、本症例の遺伝子の異常が強く拡張型と関連するものと考え、その異常の解明に着手した。

この例では、遺伝子の欠失はジストロフィン遺伝子のイントロンの1と7にそれぞれ断端が存在することを示唆する結果を得ている。現在、この断端を塩基配列を明らかにすべく、エクソン1から3'方向へ、あるいはエクソン8から5'方向へ、この患者のゲノムDNAを解析している。これには、現在までに知られているイントロン1と7の配列内にPCR増幅可能部位を見い出し、これをマーカーDNAとして順次マーカーDNAの患者由来のDNAを試料として増幅を行っている。その結果、欠失の断片をかなり狭い領域内に限定することが可能となった。現在、断端を含むDNA領域を一度にPCR増幅することを試みている。この増幅産物が得られれば、その塩基配列を決定し、断端の構造を明らかにする予定である。この結果は、心筋に特異的に発現するジストロフィンの新しいアイソフォームのクローニングを可能とするもので、大きく期待される。ジストロフィン遺伝子からは、多種のプロモーターと多様な選択的スプライシングにより多くのジストロフィンの分子種が産生されてきている。しかし、ジストロフィン遺伝子が極めて巨大な遺伝子であり、全構造が未だ解明されていないことから、さらに未知の分子種の存在が強く示唆されている。実際、Duchenne型筋ジストロフィーでは拡張型心筋症が高率に合併しているが、その発症機序は未だ解明されていない。本合併症の発症に未知の新しい分子種が関与している可能性が強い。本研究では、ジストロフィン遺伝子の新しい分子種を解明するために、ジストロフィン遺伝子から転写されて産生されたmRNAを逆転写酵素(RT)PCR法を駆使して解析した。その結果、今までジストロフィン遺伝子の巨大なイントロンと考えられていた配列の中に新しいエクソン領域が存在することを見い出した。すなわち、イントロン2とイントロン3の配列の中にそれぞれエクソン配列が存在し、これが時に正規のジストロフィンmRNAに挿入されているのが発見された。イントロンの配列の中に存在するこの2つの配列は一次構造的にはエクソンの構造を保持しているにもかかわらず、正規のジストロフィンmRNAに組み込まれていることは稀であった。今後、今回クローニングできたエクソンにコードされている新しいジストロフィン分子種についてその病態的意義を明らかにする予定である。
プロテインキナーゼのインタラクトーム解析

in vivoキナーゼ・基質ペア予測のため、HeLa細胞抽出物を試料としたin vitroキナーゼ反応計測を行った。その結果、175, 574個のキナーゼ-基質ペアを同定し、303種のキナーゼに対する、のべ1, 525種のリン酸化モチーフを抽出することに成功した。これらの情報をもとにして、リン酸化プロテオミクス測定結果から細胞内における変動の責任キナーゼを予測するための2種類のツールを開発した。本研究の目的であるin vivoキナーゼ・基質ペア予測に必要な情報のプロテオーム規模での実測を達成するため、in vivoキナーゼ-基質連動性解析およびin vitroキナーゼアッセイを行った。in vivoキナーゼ-基質連動性解析については、ヒトガン細胞由来培養細胞株8種およびヒト白血病細胞由来培養細胞株10種について、リン酸化プロテオーム解析を行った。さらに12種類の異なる標的分子を持つキナーゼ阻害薬を様々な濃度で、様々な処理時間で反応させ、リン酸化プロテオーム解析を行い、in vivoキナーゼ-基質連動データを蓄積した。繰り返し実験を含むデータを多変量解析した結果、本手法は培養細胞間のリン酸化プロテオームの差を有意に検出できることがわかった。in vitroキナーゼアッセイについては、326種のリコンビナントキナーゼを入手し、HeLa細胞抽出物を試料としてキナーゼ反応を行い、リン酸化プロテオーム解析により基質となったリン酸化タンパク質およびそのリン酸化部位を同定した。HeLa細胞抽出物は温度感受性アルカリホスファターゼで脱リン酸化した後、高温処理にて不活性化する系を構築した。233種のセリン/スレオニンキナーゼおよび93種のチロシンキナーゼを反応させた結果、23561個のリン酸化部位が同定された。このうち8552個はin vivoでも同定されており、さらにこのうちの3468個は、1種類のキナーゼによってのみリン酸化が確認された部位であった。キナーゼ側からみると、260種のキナーゼはHeLa細胞発現タンパク質に対し、特異的なin vitro基質を有していることになる。予測ツール開発の前段階として、本年度は生データ解析ツールPhospep AnalyzerおよびデータベースPhospep DBを開発・整備した。本研究の目的であるin vivoキナーゼ・基質ペア予測に必要な情報のプロテオーム規模での実測を達成するため、LC-MS測定系にメートル長シリカモノリスカラムを用い、前分画なしで高効率にリン酸化ペプチドを同定・定量できる系を確立した。本システムを用いてin vivoキナーゼ-基質連動性解析およびin vitroキナーゼアッセイを行った。in vivoキナーゼ-基質連動性解析については、ヒトガン細胞由来培養細胞株を用いて、同一パスウェイ上の異なる標的分子を持つキナーゼ阻害薬を様々な濃度で、様々な処理時間で反応させ、リン酸化プロテオーム解析を行った。その結果、標的分子に関わらず共通してリン酸化が制御されている分子や標的分子に特異的に制御されている分子を同定でき、精密なパスウェイマップの作製が可能であることがわかった。またin vitroキナーゼアッセイについては、395種のリコンビナントキナーゼを用い、HeLa細胞抽出物を試料としてキナーゼ反応を行い、キナーゼ反応を行わなかった試料を参照にした定量的リン酸化プロテオーム解析により基質となったリン酸化ペプチドを同定・定量した。一義的に決定できたリン酸化部位は29,837個で、そのうちin vivoでも観測されているものは9,732個(33%)であった。基質ペプチドを用いて各キナーゼに対しモチーフ抽出を行った結果、既知のモチーフ配列に加え、未報告のものも大量に抽出可能であった。さらに基質ペプチドを元にキナーゼをクラスター解析したところ、キナーゼドメイン配列に基づくグルーピングと相同性の高いクラスターが形成されることを見出した。これらの情報をキナーゼ-基質ペアリングのための付加情報としてリン酸化ネットワーク解析データベースに登録した。本研究の目的である「in vivoキナーゼ・基質ペア予測」のため、高効率な定量的リン酸化プロテオミクス計測法の確立を行った。定量用化学的タグ法をリン酸化プロテオミクス用に改良し、リン酸化プロテオミクス自身を高性能化することに成功した。またLC-MS測定システムを最適化し、従来法と比べ約80倍感度を上昇させることにより、1万細胞(タンパク質1マイクログラム相当)からのリン酸化プロテオミクスを可能にした。本システムを用いて、385種のリコンビナントキナーゼに対するHeLa細胞抽出物を試料としたin vitroキナーゼ反応計測を行い、さらに計算科学的解析を行った。その結果、175,574個のキナーゼ-基質ペアを同定し、303種のキナーゼに対する、のべ1,525種のリン酸化モチーフを抽出することに成功した。これは既知モチーフ数の約10倍に相当するものであり、世界最大規模の情報を獲得できた。

これらの情報をもとにして、リン酸化プロテオミクス測定結果から、細胞内における変動パスウェイを予測するための2種類のツールを開発した。EGF刺激したPanc-1細胞における測定結果を用いて検証したところ、(1)1525種のモチーフとタンパク質相互作用マップを用いる方法、および(2)in vitro基質から責任キナーゼを推定する方法で、EGFRパスウェイの活性化およびEGFRパスウェイキナーゼの活性化を予測することに成功した。結論として、本研究の目的である「in vitrokinase-基質情報からプロテオーム規模でキナーゼ-基質ペアを予測すること」を達成することができた。本研究で得られた情報はすべてin-houseで開発した解析ツールであるPhosPepAnalyzerおよびそのデータベースであるPhosPepDBに登録済みである。
多数の微小粘性体から構成される複合系の変形プロセスに対する数値実験的研究

今年度は、昨年度までに作成された格子ボルツマン方による数値計算法を用いて、流れ場における流体相分離現象の成長速度の測定実験を行った。多成分粘性流体系の相分離の成長速度に対する流体運動の効果を調べることを目的とした。相分離で形成される構造の流さスケールRの時間tに対する成長速度は一般にR∝t^αの形がよく用いられる。よって成長率αを数値実験から見積もり、ずり応力場の影響を論議する。数値実験は、互いに不混和に調整された5つの流体成分が同じ体積割合でよく混合している状況を初期条件として、上下を2枚の平行平板で挟んだ2次元の系を用い、相分離による構造スケール(各領域の平均長径・平均短径)の時間発展を計測し、それぞれの成長率αを求めた。静止場およびずり応力場に対してこの計算を行った。推定されるレイノルズ数、キャピラリー数はそれぞれ0.28,0.0077であり、界面張力が効いた規模の小さい流れ場に相当する。結果として、静止場、ずり応力場ともに各成分がそれぞれ相分離によって成長していく様子が観察された。成長には、互いの成分の拡散による成長と、近距離にいる同じ成分相どうしの流体力学的な合体成長が認められた。拡散成長では、近距離にいる二つの同一成分相のうち小さい方が縮小しながら大きい方が増大することで合一していく粗大化も見られた。流体力学的合体は静止場にはほとんどみられず、ずり応力場において顕著であった。成長率αは、静止場では長軸短軸ともに約0.22、ずり応力場で長軸0.4、短軸0.3であった。これからずり応力が成長速度を増加させること、相分離の構造を時間とともに引き延ばしていくことが確認された。この計算における成長率が一般によく知られている拡散律則成長のα=1/2に比べて小さいのは、複数の異なる相の存在によって互いの相が他成分の拡散流速を疎外することに依っている。これは多成分多相系における相分離に特徴的な効果であるといえる。
トリプチセンキノン・ヒドロキノン系の特異なキンヒドロン型水素結合

9,10-dihydro-9,10-[1,2]benzenoanthracene-1,4-dione(トリプチセンキノン、TPQ)と9,10-dihydro一9,10-[1,2]benzenoanthracene-1,4-diol(トリプチセンヒドロキノン、TPHQ)をドナー(D)、アクセプター(A)とする二成分系結晶(TPQ_X,TPHQ_<1-X>、x>ca.0.8)を得た。結晶の色はxに依存して変わる。褐色の結晶(TPQ_<0.8>TPHQ_<0.2>)はTPQと同形であり、これは特有のディスオーダー構造を持ったTPQとTPHQの混晶であった。TPQの結晶中にはベンゼン環(D)とキノン環(A)の平行配列が存在し、ここには弱い分子間π-π相互作用(A..D相互作用)が認められた。この相互作用の存在は2種類のTPQメチル誘導体の結晶構造によっても支持された。混晶の場合、ディスオーダーのために、キノン環(A)とヒドロキノン環(D)の平行配列が一定の確率で生じ、この部分で強いA..D相互作用が起こり、これが混晶特有の色の原因と推察された。また、このD..A相互作用の強さには水素結合の関与している可能性が高い。高圧赤外スペクトル(OH伸縮振動、C=O伸縮振動、六員環のC=C伸縮振動領域)から、TPQ_XTPHQ_<1-X>(x=ca.0.8)は40kb以上では電子移動とプロトン移動の連動現象を示す可能性の高いことが分かった。TPHQ(六方晶)とTPQ(斜方晶)の単位格子間には簡単な幾何学関係があり両者の結晶構造は類似性が高い。TPHQ(極性結晶)には興味ある誘電性質の発現が期待される六員環水素結合が見出された。
超音波周波数分析・赤外分光制御による深部臓器癌の非手術的治療装置の試作

本研究は、超音波周波数分析及び近赤外スペクトル分析の両法によるモニタリングのもとに深部臓器癌のハイパーサーミア加温による非外科的治療を安全かつ効果的に行える機器を試作することにある。高周波型のハイパーサーミア器を導入し、熱電対による深部温度の計測を行いつつ、40-44度に加温するシステムと光ファイバーで任意の部位の近赤外域の分光分析を行う機器の製作、及び肝組織構築の変化及び肝癌の存在を超音波周波数解析装置の製作を行い、これらを組み合せ用いた。近赤外分光光度計は900nmまでの波長を分光分析し、微弱光用にスペクトルを蓄積、加減算等により目的臓器の分光分析を行った。これは腹壁を差し引いた肝臓等の分光分析により局所の酸素化の推測・局所の非侵襲的機能診断に有用と考えられた。また、ケプストラム解析は肝臓を超音波の微小散乱体の集合体とし、散乱体間距離を超音波後方散乱の周波数解析に基ずいたケプストラムより算出したが、肝硬変に肝癌が合併している場合に、その平均的散乱体距離の分布が癌部では広がりを示すことが判明し、これは肝癌構築の不均一性のためと考えられ、ケプストラム解析により肝癌の存在診断が可能であることが示唆された。犬家兎の肝、脾などの臓器におけるハイパーサーミア器による加温、組織壊死と近赤外分光スペクトル分析及び超音波周波数分析結果との基礎的関係を調べた結果、正常組織では加温により血流の増大がほぼ均一に生じるのに対し、障害肝などはその増大が不均一で、局所の酸素化が低下する部位が出現し、その結果、肝小葉構築異常をきたすと超音波周波数分析により客観的評価が可能となることが判明した。これらの組み合せにより今後、非手術癌治療がより安全確実に施行できると考えられた。本研究は、超音波周波数分析及び近赤外スペクトル分析の両法によるモニタリングのもとに深部臓器癌のハイパーサーミア加温による非外科学的治療を安全かつ効果的に行える機器を試作することにある。昨年度までにハイパーサーミア器、温度測定装置及び近赤外分光分析器、超音波周波数ーケプストラム解析装置を組合せ、その基礎的検討を行った。今年度は、犬、家兎、ラットの肝臓などの腹部臓器における加温と組織変化の関係、近赤外光分析による臓器内血液量、血液ヘモグロビン酸素飽和度、血流速度、さらに超音波周波数ーケプストラム分析により肝の脂肪浸潤のみならず線維化の程度、肝小葉構築の異常、肝硬変と肝癌の質的差異について調べた。その結果、ハイパーサーミア効果は温度の測定のみならず臓器の機能評価を局所で行うことが重要であり、加温についてはいかに深部の目的部位に焦点を合わすか、他の正常部位の温度上昇を防ぐかが問題であり、加温法の改良の必要性が臓器機能の評価面からも明かとなった。一方、超音波周波数ーケプストラム解析を臨床に応用し、慢性肝炎、肝硬変、肝癌について解析を行ったところ求めた平均の散乱体間距離は正常肝、慢性肝炎、肝硬変へと病変の進展とともに増大し、肝小葉構造が拡大し、不均一化を生じ原発性肝癌ではこれが一層顕著になることが明かとなった。さらに熱性変性による肝小葉体間距離の変化を現在検討中である。また、近赤外分光分析により肝臓局所の血流と酸素化の解析を行ったところ、組織血流が変動し、これには正常肝と障害肝で著しい差があることが判明した。例えば、アルコール負荷による癌部血流の変動を加温治療に応用できる可能性が考えられた。加温器、温度測定技術、癌の機能変化の連続的評価のより一層の進歩が望まれた。
フォーテスキュー国制論の歴史的位置

本研究は「制限君主制論」あるいは「混合政体論」の基礎を提供する理論として注目されている15世紀イングランドの法律家サー・ジョン・フォーテスキューの国制論の歴史的位置を明らかにする試みである。そのために、フォーテスキューの主要な3作品である『自然法論』、『イングランド法の礼賛について』、『イングランドの統治』の写本および刊本を可能な限り調査した。また、フォーテスキューの蔵書であったと考えられるオクスフォード大学ボドリ図書館蔵のRawlinson, C 398写本も検討した。その結果、「政治権力かつ王権に基づく支配」という概念はフォーテスキューに独自のものである可能性が高いことが判明した。写本については、すでにコピーの形で入手済みであったランべス写本(Lambeth 262)と8月にイングランドに出張した際に新たに写真撮影の形で入手したケンブリッジ大学図書館蔵の写本(Cambridge University Library Ll, III, 11)の比較検討を始めた。この他、英国図書館蔵の2写本(Cotton Claudius A VIIIとHarley 1757)も部分的に比較参照した。他方、刊本については、同じくケンブリッジ大学図書館蔵の初版(1714年)と立教大学図書館蔵の第2版(1719年)の「序文」「献呈の辞」等を比較検討した。また、フォーテスキューの小作品『ランカスター家の権利の弁護』(Defensio Juris Domus Lancastriae)を解説付きで邦訳し、『法政研究』第80巻第4号に「資料」として掲載した。本作品は直接国制論に関係するものではなく、王位継承権について論じたものであるが、本作品からは、ヘンリ1世の死亡(1135年)後の王位継承時にすでに議会が存在していたとフォーテスキューが論じていることが明らかになった。本研究の目的は、「制限君主制論」あるいは「混合政体論」の基礎を提供する理論として注目されている15世紀イングランドの法律家ジョン・フォーテスキューの国制論(統治形態論)の歴史的位置を明らかにすることにある。本年度は、当初の実施計画によれば、彼の思考の展開過程を跡づけると共に、彼の国制論の思想的淵源を明らかにすることを具体的な課題としていた。このうち、重点的に研究を進めたのは、1215年に成立したマグナ・カルタとフォーテスキューの国制論の関係である。マグナ・カルタは、後世(とくに17世紀以降)その「神話」化を通して、国王権力を制限すると共に、臣民の諸権利を保障し、法の支配を宣言した最初の文書と評価されるようになる。そうであるならば、フォーテスキューの国制論にも何らかの影響を与えているのではないかと推定されるところ、彼の諸著作を通観してみてもマグナ・カルタへの言及は一切見当たらない。この事実はどのように説明されるのか。この点については、従来、中世末にはマグナ・カルタは現実政治の世界から消えていたのだと指摘されてきた。確かに、ジョン王のマグナ・カルタ(1215年)は同年中に無効とされたが故に、フォーテスキューにとっても、その存在自体が知られていなかったということも考えられなくはない。しかし、注目されるのは、フォーテスキューの王位継承論との関係である。彼は、自らが仕えるランカスター朝の正統性を主張するために、一般論として、王が死去した場合には王の弟が王位を継承すべきことを論じている。しかるに、ジョン王は正にリチャード一世の弟として王位に就いたのであるから、そのような正当な権原をもつジョン王から獲得した文書であるマグナ・カルタに論究することは、むしろ自らの主張にとってマイナスになると考えたのではないか。これは仮説であって、さらに検証を要するが、本年度の研究のさしあたりの成果である。本研究の目的は「制限君主制論」あるいは「混合政体論」の基礎を提供する理論として注目されている15世紀イングランドの法律家ジョン・フォーテスキューの国制論の歴史的位置を明らかにすることにある。最終年度にあたる本年度は、主として以下の2点について研究を進めた。第1に、トマス・アクィナスからの影響について。フォーテスキューは、その初期の著作『自然法論』において、トマスの『君公統治論』(Ad Regem Cypri de Regimine Principum)に言及し、同書の中でトマスが「王権に基づく統治」と「政治権力に基づく統治」について論じていることを指摘している。これらの概念は、フォーテスキューの理論の特徴である「王権かつ政治権力に基づく支配」にとって真に権威となるものではないが、フォーテスキューはトマスの用語を基に独自の思考を展開していったのではないかと考えられる。第2にフォーテスキューの蔵書について。オクスフォード大学ボドリ図書館蔵の分類記号Rawlinson,C.398を付された写本(2015年9月に実際に閲覧)は、フォーテスキューの蔵書の1つであったことが明らかであり、そこに含まれた2つの作品、すなわちRichard Rede著『新年代記』とボヴェーのウィンケンチウス著『君公の道徳的教育について』の内容を検討した結果、前者からは、フォーテスキューが、「王権かつ政治権力に基づく支配」の古さを強調するに際して依拠した「ブルータス伝説」が当該『年代記』に書かれており、また力による支配権の交替を意味した「ノルマン征服」の効果を否定しようとしていたことが判明した。

また後者については、フォーテスキューがその王権論においてウィンケンチウスから大きな影響を受けていること、しかしウィンケンチウスの著作は「混合政体論」の典拠とは言えないことが明らかになった。本研究は「制限君主制論」あるいは「混合政体論」の基礎を提供する理論として注目されている15世紀イングランドの法律家サー・ジョン・フォーテスキューの国制論の歴史的位置を明らかにする試みである。そのために、フォーテスキューの主要な3作品である『自然法論』、『イングランド法の礼賛について』、『イングランドの統治』の写本および刊本を可能な限り調査した。また、フォーテスキューの蔵書であったと考えられるオクスフォード大学ボドリ図書館蔵のRawlinson, C 398写本も検討した。その結果、「政治権力かつ王権に基づく支配」という概念はフォーテスキューに独自のものである可能性が高いことが判明した。2015年はマグナ・カルタ成立800年にあたるため、我が国の法制史学会においても6月の総会で「マグナ・カルタの800年ーマグナ・カルタ神話論を越えてー」と題するシンポジウムが開催されることとなり、本年度はじめに、研究代表者も報告をおこなうよう主催者から依頼された。その準備に相当の時間をとられたため、本研究の達成度は「やや遅れている」と評価せざるを得ない。イングランド法制史次年度はフォーテスキューの主著の1つである『イングランドの統治』について、残存写本および刊本を比較対照しながら、解読を進め、その独自の国制論の歴史的位置について一定程度の見通しを得るようにする。本研究の目的は、第一に、「政治権力かつ王権に基づく統治」(dominium politicum et regale)というフォーテスキュー独自の国制論を15世紀後半イングランドの歴史的文脈において的確に位置付けることであり、また第二に、それが後代絶対王政期にいかなる意義を付与されたかを明らかにすることである。今年度は第一の目的を達成するために、『イングランドの統治』を刊本と残存写本の綿密な校合を踏まえて解読し、さらにフォーテスキューの国制論の思想的淵源を解明することを計画していたが、検討対象とすることのできた写本は3写本にとどまり、また思想的淵源の解明についても不十分であり、達成度は「やや遅れている」と評価される。当初の計画通り、フォーテスキューの統治形態論の集大成と考えられる『イングランドの統治』の解読を進め、先行する著作である『自然法論』および『イングランド法の礼讃について』における議論と比較することによって、フォーテスキューの思考の展開過程を跡付ける。また、彼の国制論の思想的淵源を明らかにするために、トマス・アクィナスの『君公統治論』(De regimine principum)と比較する作業を進める。
上衣腫におけるDNAチップを用いた網羅的遺伝子解析

37例の上衣腫に見られる染色体、遺伝子異常についてFISH(Fluorescence in situ hybridzation)、マイクロアレイ法にて網羅的に解析した。その結果、(1)22例のgrade2の上衣腫のうち、11例(50%)で第5染色体の増幅が腫瘍の存在部位と無関係に見られた。NF2遺伝子の欠失は22例の頭蓋内上衣腫の3例(14%)で、15例の脊髄上衣腫の8例(53%)で検出された。退形成性上衣腫における染色体17p13.3の欠失頻度はgrade2上衣腫のそれと比べて有意に高かった。以上の結果は第5染色体増幅は上衣腫の発生に、また、特にNF2遺伝子欠失は脊髄上衣腫の発生に深く関わっている可能性を示唆している。また、第17染色体の欠失(この染色体上の癌抑制遺伝子)は上衣腫の悪性化に関与していると推測された。(3)発現アレイ解析で第5染色体で有意に増幅している遺伝子は460485個であった。このなかで細胞周期や細胞増殖と関連している遺伝子を検索中である。また、第17染色体において有意に欠失している遺伝子も120-150個あり、同様な検索を行っている。さらに、各症例の臨床データ(生存期間、無再発期間、治療反応性など)との関連も調べる。(3)発現アレイ解析で第5染色体で有意に増幅している遺伝子は460-485個であった。このなかで細胞周期や細胞増殖と関連している遺伝子を検索した。また、第17染色体において有意に欠失している遺伝子も120-150個あった.ゲノムデータベースから各遺伝子が上衣腫の発生や進展とどういった関連があるかを見た.
網羅的RNAシークエンス解析を活用した卵黄抗体の輸送を担うIgY受容体の同定

母ドリ卵黄へのIgY抗体の輸送を担う受容体の同定を目指し、ニワトリ卵胞の最内層で発現する全RNA配列を網羅的に獲得した。配列解析により9,848の既知遺伝子の転写産物の発現が確認された。この中に3種類の既知IgY受容体の転写産物が含まれていたが、それらの発現は低レベルであった。配列解析結果からのIgY受容体候補の選抜を効率化するために、IgY輸送能に特徴があるトリ集団の発掘を試みた。抗体産生能を消失したIgY欠損鶏では卵黄へのIgY輸送能が最大で3倍に亢進し、網羅的発現解析でのIgY欠損鶏の有用性が判明した。閉鎖系集団で維持されたウズラ6系統の卵黄輸送能に顕著な差は見られなかった。母ドリの体内では、IgY抗体が血液から卵黄へ移行し、胚やヒナへ免疫機能を付与する。このIgYの輸送は、卵胞内層に存在するIgY受容体により行われていると考えられているが、そのような機能を持つ受容体は同定されていない。我々は、独自に作出したIgYの変異体が、卵黄へのIgY輸送の鍵となる卵胞の最内層を通過できないことを発見し、「IgY受容体」がこの最内層に存在することを突き止めた。本研究ではIgYを卵黄へ輸送する受容体候補遺伝子の探索を目的として、次世代シークエンサーを用いて卵胞内層における遺伝子発現の網羅的な解析を行った。得られた結果の概要は以下の通りである。1)産卵期の採卵鶏(Julia Light®)から卵胞の最内層(顆粒膜細胞層と卵母細胞を含む)の組織層を採取し、総RNAを抽出した。これを鋳型にしてcDNAを調製し、次世代シークエンサーを用いて、この組織層で発現するRNAの塩基配列データを取得した。2)データベース上に登録されたニワトリゲノム配列に、取得したRNA配列をマッピングした。また、マッピングされたRNAの発現量を数値化した。3)ニワトリゲノム配列にマッピングされなかった塩基配列を連結して、RNA配列を再構築した。4)BLAST検索により、再構築したRNA配列に類似する既知遺伝子の情報を網羅的に収集した。5)これらの解析から、候補IgY受容体遺伝子を抽出するには至っていない。本研究ではIgYを卵黄へ輸送する受容体候補遺伝子の探索を目的として、卵胞組織での網羅的発現解析により判明した遺伝子群の中から、有望な候補受容体遺伝子の選抜に取り組んだ。1)全16,000の転写産物の中から、BLAST解析により、既知IgY受容体遺伝子であるCHIR-AB1に類似した配列を持つ転写産物の探索を試みた。2)CHIR-AB1、CHIR-B3を含む13の転写産物が抽出された。しかしながら、既知のCHIRファミリーの遺伝子発現レベルは全て低値であった。3)CHIR-AB1に類似したアミノ酸配列を有し、発現レベルが高値を示した未知転写産物を抽出した。4)この転写産物の遺伝子配列をデータベース上で確認し、ニワトリ卵胞mRNAを鋳型にした逆転写PCRによるクローニングを行った。4)推定上のアミノ酸配列部位にプライマーを設定した場合に、遺伝子断片は増幅できなかった。5)この未知転写産物は非翻訳領域が大量に転写されていることが判明し、タンパク質そのものは発現していないと判断された。以上の解析から、候補IgY受容体遺伝子を抽出するには至らなかった。本研究は網羅的RNA解析を活用して、母ドリの卵黄への抗体輸送を担うIgY受容体を同定することを目的とした。これまでに、ニワトリ卵胞の最内層で発現する遺伝子の配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に判読した。その中から既知IgY受容体の配列に類似する候補遺伝子を抽出したが、この遺伝子からはタンパク質への翻訳が生じていないことが判明した。さらに解析によって得られた膨大のRNA配列の中から候補遺伝子を抽出することが困難であることが判明した。そこで、最終年度はIgYの卵黄輸送能に差がある2群以上のニワトリおよびウズラ集団を発掘し、網羅的解析による候補遺伝子の抽出を容易にするためのモデル動物の確立を目指した。・閉鎖系集団で維持された5系統の雌ウズラ(AWE, DB, L, Pansy, WE)と市販の雌ウズラに標識IgYを翼下静脈に投与した。産卵された卵の卵黄に取り込まれた標識IgY量を測定し、これを各系統の卵黄輸送能の指標とした。系統間で標識IgYの卵黄への取り込み量に差は見られず、IgY輸送能に差があるウズラ集団を見つけ出すことはできなかった。・孵卵18日目の鶏胚からファブリキウス嚢を外科的に除去し、IgY欠損鶏を作出した。産卵開始まで育成し、翼下静脈に投与した標識IgYの卵黄への取り込み量を測定した。産卵された卵の卵黄に取り込まれた標識IgY量は、通常鶏よりもIgY欠損鶏で約3倍高くなった。

・IgY欠損鶏では、内因性IgYの欠損により代償的に卵黄へのIgY輸送能が亢進したと推察された。よって、IgY欠損鶏は網羅的解析による候補遺伝子の抽出を容易にするためのモデル動物として有用であることが判明した。母ドリ卵黄へのIgY抗体の輸送を担う受容体の同定を目指し、ニワトリ卵胞の最内層で発現する全RNA配列を網羅的に獲得した。配列解析により9,848の既知遺伝子の転写産物の発現が確認された。この中に3種類の既知IgY受容体の転写産物が含まれていたが、それらの発現は低レベルであった。配列解析結果からのIgY受容体候補の選抜を効率化するために、IgY輸送能に特徴があるトリ集団の発掘を試みた。抗体産生能を消失したIgY欠損鶏では卵黄へのIgY輸送能が最大で3倍に亢進し、網羅的発現解析でのIgY欠損鶏の有用性が判明した。閉鎖系集団で維持されたウズラ6系統の卵黄輸送能に顕著な差は見られなかった。・当初の予定通り、ニワトリ卵胞の最内層で発現する遺伝子の配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に判読することができた。・解読された遺伝子の中から既知IgY受容体の配列に類似する候補遺伝子を抽出したものの、この遺伝子は実際にはタンパク質としての発現が見られず、目的とするIgY受容体の遺伝子断片ではないと判断された。・昨年度中にIgY受容体の候補遺伝子を抽出する予定であったが達成することができなかった。・よって、当初の予定よりも研究の進展が遅れているのが現状である。動物栄養生理学・次世代シークエンサーでの解析によって得られた膨大なRNA配列の中から、目的とするIgY受容体の候補遺伝子を抽出することが極めて困難であることが判明した。・網羅的解析に供試したサンプルは通常ニワトリ単独のものであったことから、候補遺伝子を絞り込めない点が問題であった。・網羅的解析によりIgY受容体の候補遺伝子を探索する場合、IgYの卵黄輸送能に差がある複数の群を準備する必要があると考えられた。・特徴的なIgY卵嚢輸送能を持つトリ個体を見出すために、1)様々なウズラ系統でのIgYの卵黄輸送能を調査する。2)鳥類特有の免疫器官であるファブリキウス嚢を外科的に除去することでIgY欠損ニワトリを作出し、このニワトリのIgY卵黄輸送能を調査し、IgY輸送能の変動を調査する。・IgYの卵黄輸送能が特徴的なトリ個体が得られた場合、再度、この個体と通常ニワトリの2つのサンプルを網羅的解析に供試し、両者で発現レベルに差がある遺伝子群の中から候補遺伝子を抽出し、IgY受容体遺伝子の同定を目指す。・当初の予定通り、ニワトリの卵胞の最内層で発現する遺伝子の配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に判読した。・解読作業によって得られた膨大な数量のフラグメントの塩基配列をニワトリのゲノムリファレンス配列にマッピングするとともに、de novo配列解析によって、未知の転写産物の配列をつなぎあわせることに成功した。この点についても当初の予定通り進めることができた。・解読された遺伝子の中から卵黄輸送を担うIgY受容体候補遺伝子を抽出することはできていない。当初から、この作業には時間がかかると予想しており、この点においては研究の進展がやや遅れている。・次世代シークエンサーでの解析によって得られた膨大なRNA配列の中には、これまでに機能が判明していない未知遺伝子と類推される断片の配列が大量に含まれている。この中から、卵胞の内層で高レベルに発現し、なおかつ既知の抗体受容体と類似する配列を選抜する。
超低エネルギー中性子発生法開発とその発生機構の解明・それによる中性子特性の研究

中性子電気双極能率測定に関し、研究代表者が5月、8月に行ったガチナ、ILLの視察結果に基き、これらの研究所で行はれている測定限界と本研究との関連について分析が行はれた。測定には極めて安定した微小磁場が必要であるが従来の磁場遮蔽は常温で行はれている。このため四重のμメタルに拘らず磁場の安定性は0.1μガウスに過ぎない。計算の結果、本研究に於いては1nガウスまで安定になりうることを示すことが出来た。これによって測定装置設計の基礎が確立した。電気双極能率測定時には超冷中性子は偏極している必要があるが、冷中性子を偏極しそれを超流動ヘリウムと反応させることにより発生する超冷中性子の偏極度を求める実験が進行中である。電気双極能率を超冷中性子により測定する場合、極低温中での超冷中性子の檢出が不可能となる。このためには極低温環境に於いても十分作動する檢出器の開発が急務である。この点について東北学院大が先ず液体窒素の温度での研究を進め、フォトダイオードが液体窒素温度で作動することを示した。これに関連して超冷中性子の吸収確率が高いLi^6やB^<10>をドープしたシリコン檢出器の製作の可能性について檢討がなされた。若しこれが完成すれば中性子電氣双極能率の測定に画期的な進歩がもたらされることになる。超流動ヘリウム全立体角法による超冷中性子発生に於いては当該超流動ヘリウムの温度を少しでも低く保つことが肝要であるが、これは冷媒である液体ヘリウム3の熱伝導メカニズムに密接に結びついて居り、液体ヘリウムからの核沸騰熱伝達についての研究が行はれた。また超流動状態のヘリウム4それ自体の熱伝導度が容器の直径によってどの様な値を示すかについても測定が行はれ、これらの結果は電気双極能率測定装置の基本設計に多大の指針を与えた。
音声対話形式による日本語教育支援(CAI)システムの研究

平成7年度は音声対話形式によるCAIシステムの構築の実現を目指して以下の様な研究を推進した。実際に語学教育の現場において音声情報処理技術を応用したソフトウェアをインストールしたパーソナル・コンピュータを導入した特別教室で、音声対話主体の語学教育を試み、学生の評価も求めた。従来のモノローグ主体の語学授業から音声対話主体に切り換えたことに対する学生の満足度は非常に高かった。これは一方通行の語学教育よりも音声対話主体の教育の方が言語の本質であるコミュニケーションの成立をより実感できたことにも起因すると思われる。また、これと平行して、学生の学習意欲を高めるために、目的指向のタスクを設定して、実際に会話が行なわれる場面状況を設定して、役割分担を行ない、書き言葉ではなく、日常会話で使われる音声言語の習得を目的とした語学教育を試みた。この点に関する学生の評価も高かった。学生は抽象的な状況よりも自分が実際に体験可能な実場面の具体的な状況設定に学習意欲をそそられたものと思われる。学生の各ペア-の音声対話の発話はコンピュータに入力を指定することが可能で、ネイティブの発話との比較をコンピュータの画面上で各自が確認することができるような仕組みになっている。スペクトログラム機能を利用した分析では、各音声の継続が時間上でのパタンの変化やフォルマント(ホルマント)構造の変化等を視認することができる。これによって、子音連続への不要な母音の挿入や/r/と/l/の誤りなどを自分の目で確認することができるようになり、発話矯正が容易になった。基本周波数分析機能の利用では、ネイティヴの発話のイントネーションとの比較によって、自分の発話の欠点を認識し、自然なイントネーションやリズムの習得が従来に比べてずっと容易になった。
喉頭反射の神経機構

本研究の目的は、喉頭反射の神経回路を解明し、さらにこの喉頭反射神経回路に対する上位中枢の制御機構を解明することにある。これまでに、成ラットの上喉頭神経に刺激電極を留置し、内喉頭筋に留置した記録電極から再現性のある喉頭反射の筋活動を記録することが可能となった。また、実験動物を脳定位固定装置に固定し、ガラス電極を用いて脳幹ニューロンの記録が可能となった。上喉頭神経刺激に応答するニューロンの記緑から、上喉頭神経刺激による喉頭反射が多シナプス性の反射であり、この反射を中継するニューロンが延髄の小細胞性網様体核に存在することが明らかとなった。今後はさらに研究をすすめ、順行性神経標識物質を用いて喉頭反射の反射弓を構成する神経細胞の標織をおこない、これらの神経細胞の投射領域を明らかにすることで、喉頭反射回路を構築する神経細胞の解剖学的な接続様式を解明したいと考えている。また、喉頭反射の神経回路に対する上位中枢からの影響についても検討を加えたいと考えている。また、実験動物を脳定位固定装置に固定し、ガラス電極を用いて脳幹ニューロンの記録も可能となった。しかし、上喉頭神経刺激に応答するニューロンの記録個数が十分でないため、その電気生理学的特性や分布様式を検討するまでには至っていない。今後はさらに研究をすすめ、上喉頭神経刺激に応答するニューロンの電気生理学的特性や分布様式を検討したい。さらに記録に用いたガラス電極から神経標識物質を注入することによって、記録されたニューロンの投射領域を明らかにし、喉頭反射回路を構築するニューロンの電気生理学的特徴のみならず、解剖学的な接続様式についても検討をしたいと考えている。
癌化における低分子量GTP結合蛋白質Ralの役割

低分子量GTP結合蛋白質Rasは多くの細胞成長因子の下流で働くシグナルのスイッチである。その活性は、活性化因子GEF(GDP/GTP交換因子)と不活性化因子GAP(GTPase活性化因子)のバランスによって制御されている。ヒトの多くの癌で変異を来しているRasは、Raf、PI3キナーゼおよびRalGEF(低分子量GTP結合蛋白質Ralの活性化因子)を直接のエフェクターとする。RalGEFを介したRalの活性化がヒトの癌で重要であるという報告が相次いでいる。Ralの抑制性制御因子(GAP)はこれまで不明であったが、最近、我々は世界に先駆けてRalGAPを同定した(JBC,2009)。そして、膀胱癌悪性化におけるRalGAPの役割を重点的に解析し、膀胱組織の主要なRalGAP活性サブユニットはRalGAPα2だが、浸潤性膀胱癌細胞でRalGAPα2の発現が著しく低下し、そのため、Ralの活性が上昇していていることを見いだした。そして、浸潤性膀胱癌細胞へのRalGAPα2の強制発現はマウスで肺転移を抑制すること、化学膀胱発癌を誘導すると野生型では認めなかった浸潤性膀胱癌がRalGAPα2遺伝子KOマウスでは42%に生じたこと、癌組織でRalGAPα2が発現低下したヒト膀胱癌患者の生命予後は不良であることを見いだし、論文発表した。このようにRalGAPα2の発現低下は膀胱癌悪性化に深く関わっている。低分子量GTP結合蛋白質Ralは多くの細胞成長因子の下流で働くシグナルのスイッチである。その活性は、活性化因子(GDP/GTP交換因子、GEF)と不活性化因子(GTPase活性化蛋白質、GAP)のバランスにより制御されている。RalGEFの多くはRas癌遺伝子の下流で活性化されることが知られている。RalGAPの分子実体はこれまで不明であったが、最近、我々は世界に先駆けて報告した(JBC,2009)。本研究では癌化におけるRal/RalGAPの役割について明らかにすることを目的とした。平成22年度はヒト癌細胞株、癌組織でのRalGAPの発現を解析し、浸潤性膀胱癌においてRalGAPの発現が喪失していることを見いだした。免疫染色による検討では膀胱癌の進展に伴いRalGAPの発現が減少していた。また、浸潤性膀胱癌では良性の表在性膀胱癌に比べGTP型Ralの量が増加していた。RalGAP陰性の浸潤性膀胱癌細胞株にRalGAPを再導入することで、膀胱癌細胞の浸潤、転移が抑制された。現在、既に作成したRalGAP遺伝子改変マウスを用いて、BBN投与による化学膀胱発癌を解析中である。RalGAPの活性制御機構は不明であるが、RalGAPがAktによりリン酸化されることを見いだし、リン酸化による活性制御機構を解析した。また、ラット脳細胞質より新規RalAエフェクター分子を見いだすことに成功した。最近、RalGEFを介したRalの活性化がヒトの癌で重要であるという報告が相次いでいる。Ralの抑制性制御因子(GAP)はこれまで不明であったが、最近、我々は世界に先駆けてRalGAPを同定し(JBC,2009)、さらにその遺伝子改変マウスを作成した(未発表)。本年度は、膀胱癌悪性化におけるRalGAPの役割を重点的に解析し、膀胱組織の主要なRalGAP活性サブユニットはRalGAPα2だが、浸潤性膀胱癌細胞でRalGAPα2の発現が著しく低下し、そのため、Ralの活性が上昇していた。

そして、浸潤性膀胱癌細胞へのRalGAPα2の強制発現はマウスで肺転移を抑制すること、化学膀胱発癌を誘導すると野生型では認めなかった浸潤性膀胱癌がRalGAPα2遺伝子KOマウスでは42%に生じたこと、癌組織でRalGAPα2が発現低下したヒト膀胱癌患者の生命予後は不良であることを見いだし、論文発表した。このようにRalGAPα2の発現低下は膀胱癌悪性化に深く関わっている。低分子量GTP結合蛋白質Rasは多くの細胞成長因子の下流で働くシグナルのスイッチである。その活性は、活性化因子GEF(GDP/GTP交換因子)と不活性化因子GAP(GTPase活性化因子)のバランスによって制御されている。ヒトの多くの癌で変異を来しているRasは、Raf、PI3キナーゼおよびRalGEF(低分子量GTP結合蛋白質Ralの活性化因子)を直接のエフェクターとする。最近、RalGEFを介したRalの活性化がヒトの癌で重要であるという報告が相次いでいる。Ralの抑制性制御因子(GAP)はこれまで不明であったが、最近、我々は世界に先駆けてRalGAPを同定した(JBC, 2009)。本年度は、膀胱癌悪性化におけるRalGAPの役割を重点的に解析し、膀胱組織の主要なRalGAP活性サブユニットはRalGAPα2で、浸潤性膀胱癌細胞でRalGAPα2の発現が著しく低下し、そのため、Ralの活性が上昇していた。そして、浸潤性膀胱癌細胞へのRalGAPα2の強制発現はマウスで肺転移を抑制すること、化学膀胱発癌を誘導すると野生型では認めなかった浸潤性膀胱癌がRalGAPα2遺伝子KOマウスでは42%に生じたこと、癌組織でRalGAPα2が発現低下したヒト膀胱癌患者の生命予後は不良であることを見いだし、論文発表した(Oncogene, 2013)。さらに、悪性化に伴う種々の膀胱癌細胞株RalGAPα2の発現低下のメカニズムを解析し、CpGアイランドのDNAメチル化および、ヒストンアセチル化が深く関与していることを見いだした(発表準備中)。本年度、膀胱癌におけるRalGAPの機能解析に重点をおいて研究を進め、細胞、遺伝子改変マウス、膀胱癌症例での検討をすべて併せ、Oncogene誌に論文を発表する事ができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、当初予定していた残りのテーマに集中する。(1)RalGAP活性を制御するシグナリングを解明すること(2)未だ同定されていない細胞癌化を担うRalの直接のエフェクターを同定すること。
皮膚血管拡張機構の血流マッピングによる解析

1.発汗量と皮膚血流の二次元的な分布を検討することにより能動性皮膚血管拡張の神経機構を検討した。2.レーザードップラー血流計のプローブを1mmの間隔で10×5点のポイントをメッシュ状に移動させながら皮膚血流量を記録し,各点で皮膚血流反応に部位差が生じるか否かを検討した。その結果,発汗波と同期した血管拡張反応はどの部位でも認められ、部位差がなかった。3.着色法により個々の能動汗腺の位置を同定し、汗腺部位とその周辺部位について皮膚血流反応に差があるか否かを検討した。その結果、汗腺部位もその周辺部も一律に血管拡張反応が認められた。4.やや広い皮膚面(背部の20×20cm)に対して、着色法と、換気カプセルを用いた多点の同時定量法により作成したマップの2つの方法により発汗活動の二次元的分布を求めその各々について、レーザードップラー法による血流スキャンニング装置(Moor, LDI)により得た皮膚血流のマッピング画像と対比した。その結果、多くの例では発汗の多い部位と血流の多い部位は一致しなかった。若干の例では発汗の多い部位では血流が少ないという逆の関係が認められた。5.以上の結果は、能動性皮膚血管拡張は皮膚の全面に同期性に発現することを示している。したがって,皮膚血管拡張の神経機序として,従来推測されている発汗神経による機序(ペプチドを介する機序)も否定できないものの,皮膚血管拡張神経を介する機序の重要性が高まった。6.血流測定(レーザードプラー法)における分解能の向上や、発汗量のマッピング精度の改善など技術的な問題点を解決する必要があるが、今後は血管拡張神経の存在も重要視した皮膚血管調節機構の検討が迫られる。能動性皮膚血管拡張が発汗神経により仲介されるか否かを,皮膚面における血流と発汗量の二次元的な分布を解析することにより解明を試みるのが本研究の目的である。研究I:報告者らは以前に,発汗神経活動に同期して一過性に皮膚の血管拡張が生じることを証明した。この血管拡張が汗腺部分に限局するかどうかを追究するため,レーザードップラー血流計を用いそのプローブを細かい間隔で走査して,血管拡張が汗腺に一致して生じるか否かを検討することを目的とした。本年度は,特殊プローブを試作し同時に4カ所から皮膚血流を記録しながら手動でプローブを任意の位置を移動させて,個々の部位で血管拡張反応が出現するか否かを観察した。主として前腕で測定したが,どの箇所にプローブを移動させても同様な皮膚血管拡張反応が観察され,限局的な1点で血管拡張が認められるとの結果は得られなかった。この結果は,発汗神経活動と同期性の血管拡張反応は汗腺周囲に限局したものではないことを示唆する。次年度は,汗腺の密度の低い部分を選び,実体顕微鏡を用いて個々の能動汗腺の位置を確認し,汗孔部とそこから離れた皮膚との間で血流反応が異なるか否かを検討する。研究II:皮膚血流の多寡と発汗活動の多寡とが空間的に関連するか否かを広い皮膚面内において検討するのが目的である。マッピング手法により発汗量の空間的分布を調べ,血流画像化装置により皮膚血流を走査して両者の類似性を調査した。今年度は7チャンネルの発汗同時記録装置を試作し,皮膚面の36または72点の発汗量を求めて皮膚面の発汗量地図を構築した。試作されたの地図は著しい個人差を示した。同時に記録した皮膚血流走査画像から血流の多い部位と比較すると,数例において発汗量の多い部位と一致していたが一致しない例もあった。

来年度は,発汗量地図の精度を向上させて信頼性の高い分析を行うとともに,下肢陰圧負荷(LBNP)により発汗分布や皮膚血流分布が暑熱負荷時と異なるか否かを検討して皮膚の血管拡張と発汗活動との間に機能の解離が生じるか否かを検討する。皮膚血管拡張機構のうち能動性血管拡張と呼ばれる機構が発汗神経を介して生じるか、血管拡張神経を介して起こるかについては永く論議されている。発汗神経が関わるとすれば血管拡張は汗腺周囲に限局することが予測される。本研究では、2種類の実験によって汗腺活動と皮膚血流の二次元的な分布を検討することによりこの仮説を検証した。1)着色法(和田・高垣法)により限局皮膚面で個々の能動汗腺の位置を同定し、汗腺部とその周辺部について皮膚血流反応に差が生じるか否かをレーザードップラー血流計(LDF)のマイクロスキャニングにより検討した。高温環境下で前腕、背部、大腿部を対象とし、4チャネルLDFプローブの1チャネルの受光部を汗腺の位置に、他のチャネルを無汗腺部に当てて同時記録を行った。その結果、汗腺部もその他の部位もまったく同じ血流レベルを示し、また一過性に現れる血管拡張反応もすべての部位で同期した。この結果は、皮膚血管拡張反応は能動汗腺に一致したものではく、汗腺以外にも均一に分布することを示唆する。ただし、血流測定の分解能に限界(1mm程度)があることや、非能動汗腺を同定できないことなどは未解決の問題として残る。2)広い皮膚面に対して発汗量のマッピングを行い、LDFスキャニングによる血流画像化装置により得た皮膚血流のマッピング画像と対比した。発汗量のマッピングは、多チャンネル(5、6チャンネル)の換気カプセルを用いて(3036点)等発汗量曲線を描く方法と、着色法(ミノール法)を用いて写真撮影する方法を用いた。換気カプセル法による方法は着色法によるものより解像度が劣った。しかし、いずれの方法でも若干の例において発汗活動が高い部位と皮膚血流が多い部位が一致したものの、多くの例では一定の関連が認められなかった。以上、方法論の問題は残るが、二次元的に見て皮膚血管拡張と汗腺活動は必ずしも一致しないことから、皮膚には血管拡張神経が存在することが示唆される。