hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳死肺移植における新規ドナー肺モニタリングシステムの開発

続いて、気道内より微量(0.5ml/kg以下)の肺胞被覆液(150mM Na+, 5.5mM K+, 1.9mM Ca2+, 28mM lactate-, 5,5mM glucose, 5g/dl Albumin, 315mOsm/L, PH6.8)を含むマイクロサンプリングプローブを同部位の選択した気管支末梢3ヶ所に接触させ、30分後、1時間後、マイクロサンプリングプローブを用いて気道上皮被覆液(ELF)回収し、データの解析を行なった。現在ブタの肺移植モデルを作成中であるが、手技が安定しないことなどから、その先のマイクロサンプリングによる肺移植モデルの解析には至っていない。但し、予備実験としてラット用のマイクロサンプリングプローブを作成して、ラット肺移植モデルを作成し、同様の評価を行なったところ肺胞水分吸収の評価は可能だった。引き続き、ブタを用いた移植モデルの安定した作成を行い、マイクロサンプリングによる気道上皮被覆液の解析を行う予定である。家畜ブタを用いた肺移植モデルを作成し、マイクロサンプリングによる肺胞水分吸収の評価を行う、これと並行して、クラウン系ミニブタまたは、ラット肺移植モデルを作成し、肺胞水分吸収量の測定を行う。更に肺胞水分吸収能がNa+channelを介した機能であることを証明するため、肺胞被覆液にNa+channel阻害剤アミロライド(10-4M)を添加した実験、βアゴニストによる肺胞水分吸収の効果を確認するためβ刺激剤テルブタリン(10-3M)を添加した実験、グルココルチコイドによる肺胞水分吸収の効果を検討するためデキサメタゾン(0.2mg/kg)を添加した実験を行う。また同時期のマイクロサンプリング部位と離れた部位の肺組織TBLBを行い、肺組織RNAのisolation及びRT-PCRからepithelial Na+channels (ENaC) mRNAlevel、αβγENaC mRNAlevelの測定を行う。予定である。24年度残額については、ブタ移植モデル作成に時間を費やしたため、本モデルを用いた研究に関わるマイクロサンプリングチューブ購入費これに伴う薬品が未購入であった。これに関しては翌年に繰り越して使用予定である。CLAWN系ミニブタは、近交系集団で、小型且つ6ヶ月齢(約15kg)で臓器が成熟するため、臓器移植実験に適合している。耳介が大きく、正確が温厚なため、頻回採血等も含めたモニタリングにも適している。但し、CLAWN系ミニブタは高価であるため、当面は、自家肺移植2例と通常の肺移植1例(ドナー1例、レシピエント1例)のみで合計4頭の実験を行う予定である。手技確立を主目的とした実験については、家畜豚を用いてさらに実験を行う予定である。検体採取に必要なマイクロサンプリングチューブについては、1頭あたり1回のサンプリング(最低3ヶ所のサンプリングをcontrolと対象部位)に合計6ヶ所のチューブが必要となる。これを時系列で移植前、摘出後、再還流後、移植後早期、移植後遠隔期にそれぞれサンプリングが必要と考えると、30本のサンプリングチューブが必要となる。従って、1箱(3本×10パック)が1頭当たり必要と考える。よって実験エラーも考慮し8箱必要である。更に肺組織RNAのisolation及びRT-PCRからepithelial Na+channels (ENaC) mRNAlevel、αβγENaC mRNAlevelの測定を行うため、これらの試薬が必要である。
原位置バイオレメディエーションにおける地下地盤環境の微生物群集の動態解析と制御

化学物質による地盤汚染に対し、微生物を用いた原位置バイオレメディエーション技術の開発が待望されている。しかし、原位置バイオレメディエーションで必要不可欠な、地下地盤における分解微生物の分布・移動・活性の把握とその制御に関する知見は非常に少なく、大きな研究課題となっている。そこで本研究では、1)深度数メートルまでの地盤微生物群集の解析、2)微生物移動性の解析法の確立を集中的に研究し、原位置バイオレメディエーション技術の基礎的知見を得ることを目指した。1)地下地盤の微生物群集解析昨年解析した黄色台地土に加え、河川土および海岸土でコアーをとり、その物理化学的環境、微生物群集構造、腐植、各種有機物の微生物分解活性、各種微生物群の分布を測定し、物理化学的パラメータと微生物群集の動態との相関関係を解析した。地下地盤環境の違いによらず微生物群構造が比較的似通っていることを明らかにした。2)ライシメータを用いた油汚染模擬試験野外ライシメータを利用して油汚染の自然減衰試験を行った。トルエン等の単環芳香族炭化水素を含むドデカン溶液を調合しモデル油とした。油の遺漏を想定し野外ライシメータで油汚染を起こし、その後の油の揮発、浸出から微生物分解を推定した。不飽和条件下では、比較的に分解速度は高いが、それでも濃度の非常に高い部位には1年以上油が残留した。油濃度変化と微生物群集構造変化の対応関係を調べたところ、油濃度の増加に伴い微生物量も増加し、分解菌と思われる微生物群集の特異的増加が観察された。油濃度の減少に伴い、もともとの微生物群集構造に戻った。3)微生物の移動性の解析法確立分解菌を導入するバイオオーギュメンテーションを想定し、分解微生物の地下地盤へ導入した際の移動性モデル試験を、川砂微生物を用いて行った。流速の高い時は、流出微生物数と土壌懸濁物量には正の相関が見られたが、低流速の場合は相関が見られなかった。このことから、流速によって流出する微生物の状態、即ち、土粒子に付着した微生物と浮遊した微生物の割合、が異なることが示唆された。微生物のサイズ分布が流速によって異なることも明らかとなった。しかし、原位置バイオレメディエーションで必要不可欠な、原位置(地下地盤)における分解微生物の分布・移動・活性の把握とその制御に関する知見は非常に少なく、今後の研究の大きな課題となっている。そこで、本研究では、地下地盤環境における分解微生物の分布・移動・活性の把握とその制御を目的とした。具体的には、1)深度数メートルまでの地盤における微生物群集の解析、2)微生物の移動性の解析法確立の2点を集中的に研究を進め、原位置バイオレメディエーション技術の基礎的知見を得ることを目指している。初年度である平成14年度は、地下地盤の実態調査を行い、その物理化学的環境、微生物群集構造を測定した。また微生物導入試験に関しては、地盤中の微生物移動性のモデル試験を行った。1)地下地金の微生物群集解析名古屋で特徴的な黄色土で覆われた台地でコアーをとり、その物理性、化学性および微生物性(分解微生物を含む)を測定した。物理性には、水分や間隙率の他、水分-水分エネルギー曲線を測定し、その空隙のサイズ分布を推定した。

化学性として、pH、EC、全炭素量、全窒素量を測定した。生物性としては、全微生物群集構造と分解微生物群の解析をキノンプロファイル法を用いて行った。以上の調査より、この地盤の下層では孔隙径が小さく透水性が低いこと、またpHは5.0前後まで低下し有機物含量も殆ど無くなること、微生物量は表層土にくらべて数分の一から十分の一程度まで減少しており、また菌種も限られることが解った。下層の微生物の油分解活性は低いが、松の根などの周辺では高い活性が見られた。2)微生物の移動性の解析法確立地盤に分解菌を導入するバイオオーギュメンテーションを想定し、分解微生物の地下地盤へ導入した際の移動性モデル試験を、カオリン粒子を用いて行った。流速依存性の現象の現れ方が現れる場合と現れない場合があることが明らかになった。化学物質による地盤汚染に対し、微生物を用いた原位置バイオレメディエーション技術の開発が待望されている。しかし、原位置バイオレメディエーションで必要不可欠な、地下地盤における分解微生物の分布・移動・活性の把握とその制御に関する知見は非常に少なく、大きな研究課題となっている。そこで本研究では、1)深度数メートルまでの地盤微生物群集の解析、2)微生物移動性の解析法の確立を集中的に研究し、原位置バイオレメディエーション技術の基礎的知見を得ることを目指している。2年目にあたる平成15年度では、引き続き実態調査によって、地下地盤環境の微生物群の特性を明らかにするとともに、野外ライシメータを用いて微生物分解に伴う変動を明らかにした。また、微生物の移動性モデル試験を行った。1)地下地盤の微生物群集解析昨年解析した黄色台地土に加え、河川土および海岸土でコアーをとり、その物理化学的環境、微生物群集構造、腐植、各種有機物の微生物分解活性、各種微生物群の分布を測定し、物理化学的パラメータと微生物群集の動態との相関関係を解析した。地下地盤環境の違いによらず微生物群構造が比較的似通っていることを明らかにした。また、野外ライシメータを利用して化学物質の自然減衰試験を行った。トルエン等の単環芳香族炭化水素を含む油を調合し実験的に汚染土層を野外(ライシメータ内)で作製し、全微生物群の構造の変動と油の分解プロセスを調べた。全微生物群の増加と油の分解には高い相関が見られた。また、油の水溶解度および蒸気圧の違いによって、土層内での拡散の仕方が大きく異なることが明らかとなった。2)微生物の移動性の解析法確立分解菌を導入するバイオオーギュメンテーションを想定し、分解微生物の地下地盤へ導入した際の移動性モデル試験を,川砂微生物を用いて行った。微生物のサイズ分布が流速によって異なることが明らかとなった。そこで本研究では、1)深度数メートルまでの地盤微生物群集の解析、2)微生物移動性の解析法の確立を集中的に研究し、原位置バイオレメディエーション技術の基礎的知見を得ることを目指した。
パラミクソウイルスのRNA Editingの分子機構

ヒトパラインフルエンザウイルス-HPIV-2及びSV41-のP遺伝子に見い出されたRNA Editingの分子機構を解析する為に、ミニシストロンを構築した。このミニシストロンは両端にHPIV-2のリーダー配列(およびR1配列)とトレイラー配列、その中央にSV41のP遺伝子を組み込んであり、このcDNAをブルースクリプトIIベクターのT3プロモーターの下流に組み込みT3RNAポリメラーゼを用いてゲノムセンスRNA(VRNA)をオンオフ合成した。この合成RNAをHPIV-2感染HeLa細胞にtranfectして、2024時間後にこの細胞からRNAを分離精製し、リバースPCR法により、ゲノムセンスRNA(VRNA)あるいはmRNAセンスRNA(cRNA)の解析を行った。その結果,(1)R1配列を含むRNAの場合にはcRNAのみが検出され、SV41のP遺伝子がmRNAに転写されていることが示唆されたので、PCR産物をクローニングしてその塩基配列を調べたが、現在までのところ、edited RNAを検出できていない。(2)R1配列を含まないRNAの場合にはvRNAおよびcRNAの両センスのRNAが検出され、RNAのReplicationが起こっていることが示めされた。なおRNAを導入した細胞の上澄みを新たなHeLa細胞に接種したところ32代断代後の細胞内にもvRNAが検出されたので、P遺伝子のEncapsidationおよびPackagingが起こっていると考えられる。次にHPIV P遺伝子のcDNA(P蛋白をコードしている)をYM-1ベクターに組み込み、ReaeombinantのBaculovirusを作製して、P蛋白を発現させたところ、P蛋白とともにV蛋白も発現された。この機構を解析する為にmRNAを解析したところ、edited mRNAが見い出された。現在詳しい解析を行なっているところである。
「源氏物語」ハイパーテキストの作成と教育利用の為の基礎的研究

日本の代表的古典である「源氏物語」を題材に、海外での公開も含め、他の研究者にも利用可能なハイパー・テキストの開発を行った。今回のプロジェクトは既にオックスフォード大学と東京大学大型電算機センターで公開されている日英対照「源氏物語」テキスト・データベースを基礎にし、新たに現代語訳、注や画像をデータとして加えた。又レネ・シフェール訳のフランス語訳「源氏物語」の翻訳も発行されたので、実験的にテキスト・データベース化しシステムに組込んだ。フランスでも日本研究が盛んであり教育利用への需要も大きいことが予想されたからである。プログラムの対応機種は比較的安価に購入が可能であり、現在急速に普及が進んでいるWindowsマシンとした。大枠の古典、現代語訳、英語訳、仏語訳を対象に複数のテストを同時に相互参照しながら読み進むためのシステム開発には、Windows.3.0のMDI(Mult-iple Document Interface)機能を使いC言語で作成した。又画像との連結にもMDIを使った。そのほか注の参照にはメッセージ・ボックスを利用した。なお、今回対象としたテキストは源氏物語であるが、開発に当たっては他のテキストにも対応可能なよう、汎用性について十分に留意した。ユーザーは個々のテキストのみならず複数のテキストを読み込んで比較研究する事ができる。画像や注の参照もテキスト上の水色の部分とクリックすることにより可能である。海外からの要望で和歌の箇所をクリックすることにより古典語から現代語訳、仏訳、英訳に簡単にアクセスすることができるようにもなっている。1994年10月のFID国際会議と95年1月の情報処理学会(メディア情報研究会)の2回の亘って研究成果を発表した。特に前者では中世英語のハイパー・テキスト開発で高名なオックスフォード大学のディーガン博士より高い評価を受け、1995年7月にカリフオルニア大学サンタバ-バラ校で開催される、ACH/ALLC国際会議での発表に招待された。同会議では毎年"人文科学とコンピュータ"の分野の最高峰の発表が行われている。日本のハイパー・テキスト開発の現状を世界に知らせる上で大いに貢献できるのではないかと思っている。本研究の目的は日本の代表的古典である「源氏物語」のハイパーテキストを使いやすいパーソナル・コンピュータで開発し、それを教材として利用した場合の学習効果への影響を分析することにある。平成5年度は以下の作業を行なった。1.使用機器の導入と環境整備を行なった。それに伴い既に文字データとして機械可読になっている古典日本語版及びA.サイデンスティッカー訳の英語版「源氏物語」テキスト・データベースを変換し新しいマシンにインストールした。2.出来上がったハイパーテキストを国際的に通用させるため、SGMLやTEIといった汎用マークアップについて調査を行なった。実験的に第1章のヘッダーと内容のタッギングを行い、その成果を国文学研究資料館のシポジウム「国文学とコンピュータ」で発表した。3.「源氏物語」の現代語訳テキストのコンピュータ入力の許可を得るために出版社と交渉を行なった。4.最終的に研究利用への理解を得ることが出来たので、"文字データの入力作業を開始した。(研究補助を依頼した)5.一部入力された現代語訳をデータベース化し、既に作成された古典語と英訳のテキストと連動させるようなハイパーテキストシステムの開発を行った。(専門的知識の提供を受けた)パーソナル・コンピュータ市場は、新しいOSであるWindowsの台頭に伴う端境期にあり機種選定に苦慮した。又マルチ・メディアへの関心が高まったこともあり、著作権交渉に多大な時間と労力を必要とした。

今後のデータベース開発は欧米のように個人に変わって学会等が代行する体制が急務であると感じた。昨年は基礎となるシステムの開発や各種データの入力実験が行なわれた。平成6年度は画像データや注などの各種データにタグを挿入し、それらをシステムへ組み込み、ハイパーテキストを完成させた。学会での発表や成果報告書の作成も行った。2)前年度購入したパソコン機器を使って絵本の画像を入力した。同時に挿入したタグ・コードをチェックし相互参照機能を完成させた。3)昨年度出来なかった「注」を入力し、上記で整備されたタグを挿入した。4)同様に古典語、英語、仏語のテキスト・データベースにタグを挿入した。5)入力された文字及び画像データの修正・加工作業を行った。6)総合的なシステムの運用実験を行うと共に、文字の検索実験を行った。7)画面操作の仕様を整備した。またシステムの汎用性を高めるために環境設定ファイルの作成を行った。8)システムの開発方法等、得られた成果の発表を行なった。システムの完成にあたっては、「源氏物語」以外のデータを使った場合のハイパー・テキスト開発にも利用できるよう汎用性に留意した。その結果、世界標準に近いCOCOA形式のタグ・コードでファイルが作成してあれば、簡単な環境設定でハイパー・テキストが作成出来るようになった。1994年10月のFID国際会議と95年1月の情報処理学会(メディア情報研究会)の2回に亘って研究成果を発表した。
分子夾雑系におけるタンパク質の動的挙動－揺らぎと反応ダイナミクス－

細胞環境を生体分子の反応場として理解するために、様々なクラウディング環境下でのタンパク質の反応・酵素活性を調べた。研究対象として光活性化型アデニル酸シクラーゼ(PAC)を取り上げた。PACは光依存的にATPからcAMPを合成する酵素である。cAMPは幅広い生物種が情報伝達物質として利用するため、PACはその細胞内濃度を光でコントロール可能な素子として応用面からも注目されている。クラウディング剤としてはFicoll 70, PEG 200, PEG 35000, Dextran, BSAを用いた。まずPACの光反応を希薄バッファー中で調べたところ、発色団の反応が1 ns以内に完了した後、タンパク質全体の構造変化が57 msで起こることを明らかにした。これは光センサードメインと酵素ドメイン間の配向変化を捉えたものと解釈された。次にクラウディング環境下で同様の測定を行うと、構造変化を表す信号強度が減少する様子が観測された。これは反応速度や反応収率の低下に由来する。一般にクラウディング環境では排除体積効果により分子がコンパクトになり、タンパク質構造の安定化が起こる。これに伴い揺らぎが抑えられたことが反応性低下の要因と予想される。続いて酵素活性をHPLCにより評価した。合成されるcAMP量を光照射前後で比較することで、酵素活性の上昇率が算出できる。希薄バッファー中に比べてクラウディング環境下では光依存的な活性の上昇率が低下することが明らかとなり、反応性の低下との相関が示された。その影響がクラウディング剤によって異なることも見出し、溶液の粘度や分子間相互作用など様々な因子が関わることが示された。計画通り、反応性・酵素活性に対するクラウディング効果の定量的解析を進め、分子反応と酵素活性の相関をクラウディング研究を通じて示すことに成功した。タンパク質は不安定な構造を持ち、熱的に絶えず揺らいでいる。この柔軟さにより高い反応性を有すると考えられる。したがって揺らぎの実観測を行い、クラウディング環境における反応性や酵素活性の低下の要因を、揺らぎという観点から明らかにする。また安定性と揺らぎのトレードオフの関係についてもクラウディング研究を通じて検討する。具体的には希薄バッファー中およびクラウディング環境下におけるPACの揺らぎや安定性を熱量計を用いて調べる。揺らぎと密接な関係がある熱容量や熱膨張係数を定量し、またタンパク質の変性温度から安定性の評価を行う。これらを比較することで、揺らぎと安定性の関係を明らかにする。続いて過渡回折格子法により反応に伴う熱放出や体積変化を時間分解で検出し、その信号強度から中間体のエンタルピーや部分モル体積を決定する。これらに対する温度依存性・圧力依存性を調べることで、反応中間体の揺らぎを熱力学的観点から捉える。これらの測定をクラウディング環境下で行い、反応速度や反応収率の低下の要因を、反応中間体の揺らぎの増減として明らかにする。

続いて過渡回折格子法により反応に伴う熱放出や体積変化を時間分解で検出し、その信号強度から中間体のエンタルピーや部分モル体積を決定する。これらに対する温度依存性・圧力依存性を調べることで、反応中間体の揺らぎを熱力学的観点から捉える。これらの測定をクラウディング環境下で行い、反応速度や反応収率の低下の要因を、反応中間体の揺らぎの増減として明らかにする。
遺伝カウンセリングにおけるマンガ冊子ツールを活用した家族歴聴取の質向上の検討

がん領域におけるゲノム医療は著しく変化している状況である.2018年度には「がんゲノム医療」が先進医療として開始し,がん患者における最適な治療を検討するために,ゲノム情報を用いた医療の提供がなされている.そして2種類のがん関連遺伝子のゲノムプロファイリング検査が製造販売承認を取得し,今後,保険適用での開始が見込まれている.一方,がんゲノムプロファイリング検査により,二次的に遺伝性腫瘍の病的バリアントが認められる,もしくは疑われるケースが出てくる可能性がある.さらに,生殖細胞系列の病的バリアントの有無から治療適応を決めるコンパニオン診断も2018年度に承認され,保険適用となっている.つまり,これまで遺伝性腫瘍の患者はその臨床情報,家族歴から遺伝性が疑われ,診断に至るケースが中心であったが,がんゲノムプロファイリング検査や生殖細胞系列の遺伝子を調べるコンパニオン診断により,遺伝性腫瘍の患者が"拾いあがってくる"時代へと突入している.当研究者は,二次的に遺伝性腫瘍の診断がついた場合でも,患者が理解し,自ら考えられる状況を医療者は提供する必要があると考える.もしくは,がんゲノムプロファイリング検査やコンパニオン診断を受ける以前に患者自ら遺伝性腫瘍の可能性に気づき,がんの早期発見・早期治療へ歩む道をサポートしていく医療サービスが必要だと考えている.当該研究で開発を目指している冊子ツールは,患者やそのご家族が遺伝性腫瘍やがんゲノム医療の理解を深める補助的な役割となること,患者やそのご家族が自律的に意思決定を行えることを期待しており,2018年度は国内の遺伝カウンセラーや遺伝医療に関わる医療者などから意見を伺ってきた.それらを踏まえ、現在,開発するマンガ冊子ツールの内容再検討ならびに研究計画の再構築を研究協力者と共に行っている.ここ1年だけでもがんのゲノム医療領域が大きく進化している.適したタイミングで,適したツールを開発したいと考えており,これまで冊子ツールの作画担当者ならびに研究協力者との協議を行い,それらの協議内容を踏まえて,研究計画の再検討を行っている.特に,変化が大きい領域という点において,なるべく長く使える内容を,もしくは容易に改定を行いやすい方法を冊子ツールの作画担当者と慎重に模索している.また,院内のがんゲノム医療体制構築ならびに遺伝性腫瘍のチーム医療体制の再整備を実施している.今後,開発したツールを用いた院内調査を行うにあたり,院内体制に即した調査方法を検討している.今後のがんのゲノム医療やコンパニオン診断の進展と動向を伺いながら,研究計画の再検討を進めていく.同時に冊子ツールの開発に取り掛かり,2019年度中に研究倫理審査委員会にて研究計画の実施承認ならびに冊子ツールドラフト版の使用承認を得たい予定である.その後,冊子ツールの完成と印刷完了を目指す.冊子ツールの開発には3-4か月かかる見込みである.また,開発する冊子ツールは海外でも活用してもらえるように,海外の学術集会等に出席し,国外の遺伝カウンセラーより意見を得る予定である.がん領域におけるゲノム医療は著しく変化している状況である.2018年度には「がんゲノム医療」が先進医療として開始し,がん患者における最適な治療を検討するために,ゲノム情報を用いた医療の提供がなされている.そして2種類のがん関連遺伝子のゲノムプロファイリング検査が製造販売承認を取得し,今後,保険適用での開始が見込まれている.一方,がんゲノムプロファイリング検査により,二次的に遺伝性腫瘍の病的バリアントが認められる,もしくは疑われるケースが出てくる可能性がある.さらに,生殖細胞系列の病的バリアントの有無から治療適応を決めるコンパニオン診断も2018年度に承認され,保険適用となっている.つまり,これまで遺伝性腫瘍の患者はその臨床情報,家族歴から遺伝性が疑われ,診断に至るケースが中心であったが,がんゲノムプロファイリング検査や生殖細胞系列の遺伝子を調べるコンパニオン診断により,遺伝性腫瘍の患者が"拾いあがってくる"時代へと突入している.当研究者は,二次的に遺伝性腫瘍の診断がついた場合でも,患者が理解し,自ら考えられる状況を医療者は提供する必要があると考える.もしくは,がんゲノムプロファイリング検査やコンパニオン診断を受ける以前に患者自ら遺伝性腫瘍の可能性に気づき,がんの早期発見・早期治療へ歩む道をサポートしていく医療サービスが必要だと考えている.当該研究で開発を目指している冊子ツールは,患者やそのご家族が遺伝性腫瘍やがんゲノム医療の理解を深める補助的な役割となること,患者やそのご家族が自律的に意思決定を行えることを期待しており,2018年度は国内の遺伝カウンセラーや遺伝医療に関わる医療者などから意見を伺ってきた.それらを踏まえ、現在,開発するマンガ冊子ツールの内容再検討ならびに研究計画の再構築を研究協力者と共に行っている.ここ1年だけでもがんのゲノム医療領域が大きく進化している.適したタイミングで,適したツールを開発したいと考えており,これまで冊子ツールの作画担当者ならびに研究協力者との協議を行い,それらの協議内容を踏まえて,研究計画の再検討を行っている.特に,変化が大きい領域という点において,なるべく長く使える内容を,もしくは容易に改定を行いやすい方法を冊子ツールの作画担当者と慎重に模索している.また,院内のがんゲノム医療体制構築ならびに遺伝性腫瘍のチーム医療体制の再整備を実施している.今後,開発したツールを用いた院内調査を行うにあたり,院内体制に即した調査方法を検討している.今後のがんのゲノム医療やコンパニオン診断の進展と動向を伺いながら,研究計画の再検討を進めていく.同時に冊子ツールの開発に取り掛かり,2019年度中に研究倫理審査委員会にて研究計画の実施承認ならびに冊子ツールドラフト版の使用承認を得たい予定である.その後,冊子ツールの完成と印刷完了を目指す

.冊子ツールの開発には3-4か月かかる見込みである.また,開発する冊子ツールは海外でも活用してもらえるように,海外の学術集会等に出席し,国外の遺伝カウンセラーより意見を得る予定である.冊子ツールの開発ならびに作成費用が,当初2018年度の支払い予定であったが,次年度以降の支払い予定となったため次年度使用額が生じた.冊子ツールの開発・作成費用には,マンガ作画担当者との打ち合わせに纏わる移動および会場費用,開発作成費用,印刷費用等が含まれる.現在冊子ツールの内容を再構築している段階であり,2019年度以降のマンガ冊子ツール完成時に開発作成費用の支払い予定となる.
神経芽細胞腫における自然退縮の分子機構とその治療への応用

(1)神経芽細胞腫新鮮組織材料を用いた解析(2)神経芽細胞腫細胞株を用いた神経細胞死の分子機構の解析神経芽腫培養細胞CHP134を用いて、GDNF/Retシグナルによって抑制されるレチノイン酸誘導神経細胞死のin vivoシステムを確立し、その分子機構を解析した。その結果、1)Caspaseファミリー分子では、Caspaseー1,3,9の発現誘導と活性化が見られたが、その他のCaspaseは変化しなかった。5つのIAPファミリー遺伝子の中では、Survivinのみが強く発現抑制された。2)p53の経路では、p21^<WAF1>の一過性誘導がみられたが、Bax,PIG3,Mdm2などの誘導はみられなかった。3)ミトコンドリアの膜電位の低下が見られた。4)この細胞死は、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはニュールチュリン(NTN)の存在下で抑制することができた。したがって、レチノイン酸誘導神経細胞死は、ミトコンドリア=>Caspase-9,3の死シグナル経路の活性化が中心となっているものと思われた。しかしながら、GDNF/NTNによる神経細胞死抑制の分子機構については今後さらに解析する必要がある。(3)新規細胞死抑制分子、Survivinの機能解析近年、進行神経細胞腫において高頻度に17qゲインが見られることが明らかになってきたが、我々はSurvivin(-α)がその原因遺伝子のひとつである可能性を示した。さらに活性領域であるBIRドメインにインサートの入った新規スプライスバリアント(Survivin-βと命名)を見出し、βが機能消失型であることを示し、αとβがmicrotubuleへの結合において競合することを明らかにした。したがって、Survivinは神経芽細胞腫の生存と細胞死を制御する重要な分子であることが強く示唆された。(4)発生過程における神経細胞死の制御に重要な役割を果たしているp73の機能について解析した。その結果、p53には存在しないp73のCOOH-末端領域が転写活性化能を負に、アポトーシス誘導能を正に制御していることを見いだした。(1)神経芽細胞腫新鮮組織材料を用いた解析(2)神経芽細胞腫纒胞株を用いた神経細胞死の分子機構の解析神経芽腫培養細胞においてはTrkAの発現が抑制され、その細胞内シグナル伝達機構も障害されているが、GDNF/Retシグナル伝達機構は正常である。そこで、神経芽腫培養細胞CHPl34を用いた神経細胞死の誘導とそのGDNF/Retシグナルによる抑制系を確立し、神経細胞死の分子機構を検索した。神経芽腫培養株であるCHPl34細胞は、レチノイン酸処理または血清除去によりアポトーシスに陥った。しかし、レチノイン酸は本細胞のRet遺伝子発現を誘導し、GDNFまたはNTN存在下においてはその細胞死が抑制された。この細胞死誘導の際には、l)細胞質p53の核移行とp21^<WAF1>の誘導、2)Caspase-3の発現誘導と活性化、3) Survivinの発現低下、が見られ、GDNF/Retの存在下ではこれらが抑制された。ところが、血清除去によるアポトーシスの場合には、Retが誘導されず、因子の添加による細胞死の抑制は見られなかった。

したがって、本システムはGDNFによる神経細胞死抑制の分子機構の解明と、その臨床への応用を目的とした研究に有用と思われた。(3)新規細胞死抑制分子、survivinの機能解析Survivin(SVV)cDNAをクローニングし、神経芽細胞腫における発現と細胞死抑制機構について解析した。その結果、sVV mRNAは進行病期の腫瘍に有意に高く発現しており、神経芽細胞腫細胞株におけるアポトーシスの誘導に伴って発現が著しく低下した。SVV遺伝子を細胞内に導入したところ、そのアポトーシスはほぼ完全に抑制された。したがって、SVVは神経芽細胞腫の細胞死制御において重要な働きをしていることが示唆された。(1)神経芽細胞腫新鮮組織材料を用いた解析(2)神経芽細胞腫細胞株を用いた神経細胞死の分子機構の解析神経芽腫培養細胞CHP134を用いて、GDNF/Retシグナルによって抑制されるレチノイン酸誘導神経細胞死のin vitroシステムを確立し、その分子機構を解析した。その結果、1)Caspaseファミリー分子では、Caspase-1,3,9の発現誘導と活性化が見られたが、その他のCaspasesは変化しなかった。5つのIAPファミリー遺伝子の中では、Survivinのみが強く発現抑制された。2)p53の経路では、p21^<WAF1>の一過性誘導がみられたが、Bax,PIG3,Mdm2などの誘導は見られなかった。3)ミトコンドリアの膜電位の低下が見られた。4)この細胞死は、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはニュールチュリン(NTN)の存在下で抑制することができた。したがって、レチノイン酸誘導神経細胞死は、ミトコンドリア=>Caspase-9,3の死シグナル経路の活性化が中心となっているものと思われた。しかしながら、GDNF/NTNによる神経細胞死抑制の分子機構については今後さらに解析する必要がある。(3)新規細胞死抑制分子、Survivinの機能解析近年、進行神経芽細胞腫において高頻度に17qゲインが見られることが明らかになってきたが、我々はSurvivin(-α)がその原因遺伝子のひとつである可能性を示した。さらに、活性領域であるBIRドメインにインサートの入った新規スプライスバリアント(Survivin-βと命名)を見出し、βが機能消失型であることを示し、αとβがmicrotubuleへの結合において競合することを明らかにした。したがって、Survivinは神経芽細胞腫の生存と細胞死を制御する重要な分子であることが強く示唆された。(4)発生過程における神経細胞死の制御に重要な役割を果たしているp73の機能について解析した。その結果、p53には存在しないp73のCOOH-末端領域が転写活性化能を負に、アポトーシス誘導能を正に制御していることを見出した。
行政が担う不妊専門相談センターを活用した不妊支援システムの構築

本研究の目的は、行政の支援である不妊専門相談センターの活用を視野に入れた不妊支援システムを構築することである。本研究の目的を達成するために、研究初年度から2018年度にかけて、【基礎的研究】として、不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)の現状、連携の実際、および課題を明らかにすることとした。1.文献レビュー:不妊専門相談センターの成り立ちと現状、厚生労働省の報告書から見えた事業の課題、不妊専門相談センターの研究動向を整理分析した。不妊専門相談センターの論文報告はセンター利用者を対象としたものがほとんどである。全国の不妊専門相談センターを対象とした文献からは、不妊専門相談センター事業の内容の基準が曖昧であるために、不妊専門相談センターによって事業内容が異なり、センター間に差があることが指摘されている。2.行政が担う不妊支援事業のうち、特定不妊治療支援事業に携わる看護職者の実践と課題をインタビューにより明らかにした。行政が担う不妊支援は大きく不妊専門相談センター事業と特定不妊治療支援事業があるが、今回は基礎調査として特定不妊治療支援事業に携わる看護職者のインタビューを行った。その結果、申請の対応で見える不妊当事者の苦悩、個別対応の配慮、申請の際に心理状況に気づきながらも寄り添うことへの限界、医学的・専門的な相談に対処できない葛藤などが明らかになった。これをもとにインタビューガイド作成、および所属機関における倫理審査申請に向けて準備を続けている。2018年度は、基礎的研究として、不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)の現状、連携の実際、および課題を明らかにすることを目的としていたが、情報収集、計画立案に時間を要した。そのため2019年度は、速やかに実施し、研究の遅れを取り戻す予定にしている。不妊専門相談センターおよび医療機関にて不妊支援に携わる医療者への調査を早急に進めるべく準備は整っている。2019年度:不妊専門相談センターおよび医療機関において不妊支援に携わる看護職者の体験より、不妊専門相談センターと医療機関との連携の現状と課題を明らかにする。不妊専門相談センターにおいて不妊支援に3年以上携わる看護職者10名および、医療機関において不妊支援に3年以上携わる看護職者10名の合計20名を対象とした半構造化面接による質的記述的研究を実施する。また不妊当事者のおしゃべり会を開催し、フォーカスグループインタビューにより不妊当事者が求める支援および行政が担う不妊専門相談センターの活用を明らかにする予定である。本研究の目的を達成するために、研究初年度である2017年度は、【基礎的研究】として、不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)の現状、連携の実際、および課題を明らかにすることとした。これをもとにインタビューガイド作成に向けて検討を続けている。2.情報収集:今年度は主に国内外の学会参加を重ね、不妊支援に関する情報を広く収集した。ICM(カナダ)にて世界の不妊看護研究の動向を探ったが、不妊に関する研究は、少なかった。ポスター研究「The role midwives in European fertility clinics」というヨーロッパの不妊クリニックにおける助産師の役割に関する研究報告では、ヨーロッパの10か国中2か国で助産師が不妊専門看護師と同じ業務を担っていた。業務の割合は10か国間で違いがあった。ベルギーとフランス以外の国全てで、不妊に関わる仕事の拡張が熱望されていた。また産後うつなどの原因としての不妊の報告はほとんど挙がってこなかった。国内の学会では「不妊専門相談センターの認知と利用の実態」というテーマで発表した。認知度、利用度の低い不妊専門相談センターの実態を明らかにすることで、本研究の意義を明らかにした。3.基礎的研究の準備:支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)を対象とした調査を実施するための情報収集・整理およびインタビューガイドの作成に取りかかった。初年度の2017年は、基礎的研究として、不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)の現状、連携の実際、および課題を明らかにすることを目的としていた。文献検討、インターネット上で得られる不妊支援情報の整理、学会参加による国内外の情報収集、そして不妊支援を提供する側に無記名自記式質問紙調査および面接調査を行い、課題を明らかにする予定であった。しかし、不妊支援情報の収集と整理に時間を要し、無記名自記式質問紙調査および面接調査を行うための準備の着手が遅れた。

行政が担う不妊支援は大きく不妊専門相談センター事業と特定不妊治療支援事業があるが、今回は基礎調査として特定不妊治療支援事業に携わる看護職者のインタビューを行った。その結果、申請の対応で見える不妊当事者の苦悩、個別対応の配慮、申請の際に心理状況に気づきながらも寄り添うことへの限界、医学的・専門的な相談に対処できない葛藤などが明らかになった。これをもとにインタビューガイド作成、および所属機関における倫理審査申請に向けて準備を続けている。2018年度は、基礎的研究として、不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)の現状、連携の実際、および課題を明らかにすることを目的としていたが、情報収集、計画立案に時間を要した。そのため2019年度は、速やかに実施し、研究の遅れを取り戻す予定にしている。不妊専門相談センターおよび医療機関にて不妊支援に携わる医療者への調査を早急に進めるべく準備は整っている。2018年度は、初年度に得た情報および文献検討結果から、行政が行う不妊専門相談センターの活用に関する課題を明確にする。その上で着手が遅れていた不妊支援に携わる行政、医療機関を対象とした面接調査を実施する。速やかに実施するため研究倫理審査部会への申請やインタビューガイドの作成を急ぐ。分析の結果、無記名自記式質問紙調査の検討や、今後の研究計画の検討を行う。2019年度:不妊専門相談センターおよび医療機関において不妊支援に携わる看護職者の体験より、不妊専門相談センターと医療機関との連携の現状と課題を明らかにする。不妊専門相談センターにおいて不妊支援に3年以上携わる看護職者10名および、医療機関において不妊支援に3年以上携わる看護職者10名の合計20名を対象とした半構造化面接による質的記述的研究を実施する。また不妊当事者のおしゃべり会を開催し、フォーカスグループインタビューにより不妊当事者が求める支援および行政が担う不妊専門相談センターの活用を明らかにする予定である。【次年度使用額が生じた理由】2017年度は不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)対象に無記名自記式質問紙調査および面接調査を実施する予定だった。しかし不妊支援情報の収集と整理に時間を要し、無記名自記式質問紙調査および面接調査実施に至らなかった。そのため無記名自記式質問紙調査および面接調査に必要な研究協力者への謝金、郵送代、交通費、テープ起こし代などを使用せず、次年度の使用となった。【次年度使用額の使用計画】2018年度は、2017年度に実施できなかった面接調査を優先的に実施する予定である。不妊支援を提供する側(不妊専門相談センター、医療、不妊自助グループ)対象に面接調査を実施し、課題を明確にし、それを踏まえて無記名自記式質問紙調査を行う。
トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子コピー数の測定法の開発と応用

トランスジェニックマウス(Tgマウス)において、より正確かつ簡便な導入遺伝子量の測定をリアルタイムPCR法により行うための研究・開発を実施した。実験材料となるTgマウスについては、ヘミ接合体として系統維持を行った。ホモ接合体を得るためには、ヘミ接合体同士の交雑を行い、試料DNAの絶対量を基準値として導入遺伝子数をリアルタイムPCR法により測定する方法(1)によって、ホモ・ヘミ接合体および野生型マウスの鑑定法を用いて3者を区別した。測定の対象となる導入遺伝子については、リアルタイムPCRに最適なプライマーを設計し、反応効率等の最適化を実施した。測定法としては、解析のために内在性コントロールを基準として対象となる遺伝子量を算出する相対的定量法(ΔΔCt法)および人工的に合成したDNAを用いた絶対定量法について検討を行った。相対定量法の検討を行う過程において、ΔΔCt法によるホモ・ヘミ接合体の判別法(2)を構築し、先の(1)の方法との有用性における比較検討を行った。ΔΔCt法のために、導入遺伝子のほかに内在性遺伝子に特異的なプライマーを設計し、両者の増幅効率を予備検討し、比較Ct法に適用できることを確認した。これらの条件検討をもと、実際に幾つかのTg系統におけるホモ・ヘミ接合体の判別を行った。(2)の方法は(1)と比較した場合、2種類のプライマーセットをデザインしそれぞれのPCR反応効率がほぼ同等となるように条件設定を行うため、より厳密な予備検討とそのための複雑な作業を要した。しかし条件設定後は比較的容易に作業できることから、比較Ct法による判別はより多数の個体を処理するのに適した方法と考えられる。現在、これらの方法によるTgマウスにの接合性判定の技術提供のために、基盤整備(Web上にての公開等)を行っている。一方、絶対定量法による導入遺伝子コピー数の測定についても検討中である。実験材料となるTgマウスとして、すでに系統の樹立されたmtGFP-,mtDsRed2-Tg系統を用いた。それぞれの系統については、ヘミ接合体として系統維持されている。ホモ接合体を得るために、ヘミ接合体同士の交雑を行い、ホモ・ヘミ接合体および野生型マウスの鑑定法を用いて3者を区別した。必要とする数のホモ・ヘミ接合体を得るために、体外受精等の発生工学的手法および前述鑑定法を用いて産仔数を整えた。得られたホモ・ヘミ接合体より尾を採取し、総DNAを調整することでリアルタイムモニタリングPCR法による解析時の試料とする。測定の対象となる導入遺伝子として、上記Tg系統のEGFPおよびDsRed2を標的遺伝子とした。測定法として、TaqManプローブまたはSYBR-Greenを用いたリアルタイムモニタリングPCR法と、その解析のために内在性コントロールを基準として対象となる遺伝子量を算出する相対的定量法(ΔΔCt法)を採用した。標的遺伝子(EGFPおよびDsRed2)と内在性コントロール用遺伝子のそれぞれのプライマー・プローブセットによるPCR効率がほぼ100%となるように、試料DNAの希釈系列を作製および標準曲線による解析等により、条件の最適化を行った。また、標的遺伝子と内在性コントロール用遺伝子のそれぞれの反応効率がほぼ等しく、ΔΔCt法による測定が可能か否かを検討するために、近似曲線を用いた解析を行い、構築した測定条件による解析が有効であることを確認した。
尿中カテコールアミン:微小炭素電極によるマススクリーニング

ヒト尿中には沢山の神経伝達物質およびその代謝物が存在する.神経芽細胞腫並びに褐色細胞腫において尿中カテコールアミン関連物質が上昇するといわれており,本研究は,こらの臨床診断に役立つ測定法を開発することが目的である.尿中カテコールアミン代謝物ホモバニリン酸やバニルマンデル酸は高速液体クロマトー電気化学検出器により定量することができる.私共は,これらをボルタメトリーにより測定することができることを既に報告している.今回は,同様なボルタメトリー法によりカテコールアミンを定量する方法を検討した.尿中にはドーパミンの他に尿素,カテコールアミンの代謝物であるDOPAC,ホモバニリン酸等が多く存在する.ドーパミンを他の物質から区別するため,コンピュータコントロールできるボルタメトリーのプログラムを作製し,試験管内での実験を行った.この方法により,ドーパミンは10-7Mまで測定でき, DOPACとアスコルビン酸が共存しても測定が可能であった.次に,正常尿中のカテコールアミンを測定したところドーパミンは殆ど検出できなかった.正常尿におけるドーパミン量は10^-8M程度とされており,今回用いた方法の検出感度の限界より劣いためであった.私共は,高速液体クロマトー電気化学検出器により,尿中カテコールアミンを測定してきたが,この高速液体クロマトを用いる方法は, 1検体を測定するためには20分以上かかり,尿中カテコールアミンのマススクリーニングとしては不適当である.今回,開発したコンピュータコントロールボルタメトリーは〓度がまだ良くないが,尿中カテコールアミンを濃縮して測定すれば,臨床検査に有用な手段となると思っている.ヒト尿中には沢山の神経伝達物質およびその代謝物が存在する.神経芽細胞腫並びに褐色細胞腫において尿中カテコールアミン関連物質が上昇するといわれており,本研究は,こらの臨床診断に役立つ測定法を開発することが目的である.尿中カテコールアミン代謝物ホモバニリン酸やバニルマンデル酸は高速液体クロマトー電気化学検出器により定量することができる.私共は,これらをボルタメトリーにより測定することができることを既に報告している.今回は,同様なボルタメトリー法によりカテコールアミンを定量する方法を検討した.尿中にはドーパミンの他に尿素,カテコールアミンの代謝物であるDOPAC,ホモバニリン酸等が多く存在する.ドーパミンを他の物質から区別するため,コンピュータコントロールできるボルタメトリーのプログラムを作製し,試験管内での実験を行った.この方法により,ドーパミンは10-7Mまで測定でき, DOPACとアスコルビン酸が共存しても測定が可能であった.次に,正常尿中のカテコールアミンを測定したところドーパミンは殆ど検出できなかった.正常尿におけるドーパミン量は10^-8M程度とされており,今回用いた方法の検出感度の限界より劣いためであった.私共は,高速液体クロマトー電気化学検出器により,尿中カテコールアミンを測定してきたが,この高速液体クロマトを用いる方法は, 1検体を測定するためには20分以上かかり,尿中カテコールアミンのマススクリーニングとしては不適当である.今回,開発したコンピュータコントロールボルタメトリーは〓度がまだ良くないが,尿中カテコールアミンを濃縮して測定すれば,臨床検査に有用な手段となると思っている.微小炭素電極を用い、カテコールアミンの高感度な測定システムの開発を行った。その結果、炭素繊維の種類によってカテコールアミンに対する検出感度が異なるばかりでなく、電極のコンピュータによる活性化状態によっても大きく左右されることが判明した。高弾性をもつ東レのM-40や東邦のMH-45はカテコールアミンの検出感度が高張力性のT-300やHTA-7に比べて10倍も高いことが分った。この事は炭素繊維内における結晶の度合と相関性があるものと思われる。このような観点から信州大学の遠藤氏らが開発したウイスカータイプのグラファイト繊維を用いた所、伝導度が高すぎるため、クーロン電流の測定には適さないことが判明した。また、M-40やHM-45はコンピュータによる活性化時に安定したデータが得られず、現段階ではHTA-7が使用可能な電極として得られている。HTA-7を用いた電極でドーパミンとセロトニンの分離を行ったところ、ドーパミンは150mVセロトニンは250mV付近に印加電圧を持ち、双方を分別できた。一方、代謝物であるジヒドロキシ酢酸(DCPAC)と5-ヒドロキシインドール酢酸(5HIAA)について検討したところ、DOPACはドーパミンの1/501/100の検出感度であるのに対し、5HIAAはセロトニンに比べて1/10であった。これらの結果からドーパミンはその代謝物から分別できるが、セロトニンについては現在のところ不完全であるとの結論を得た。神経芽細胞腫(ニユーロブラストーマ)など各種神経疾患は幼若期に早期発見することが必要である。ニューロブラストーマの最も信頼できる診断法として、数年前から私が提晶しているホモバニリン酸の高速液体クロマトグラフィー電気化学検出法と微小炭素電極法がある。しかし、夾雑物による防害など、いろいろな問題からホモバニリン酸の測定よりも尿中に比較的多く存在するドーパミンをモニターするほうが、より迅速に診断できることに気ずいた。尿中のドーパミンは血中の濃度に比べて百倍以上も濃く、尿中カテコラミンの内でもノルエピネフリンの十倍も多いことが高速液体クロマトグラフィー電気化学検出器による測定から判明した。

尿中にはいろいろな夾雑物があり、高速液体クロマトグラフィーのみでモニターするのは時間的に不利であり、定性的な微小炭素電極法を用いることが重要である。微小炭素電極を用いるためのプログラミングをパーソナルコンピューターで作り、電極の活性化,測定,データ解析などをすべてコントロールできるようにした。この方法を用いることにより、ドーパミンを10【^-8】Mまでボルタモグラム上で検出することが可能になった。ドーパミンの主な代謝物であるジヒドロキシ酢酸(DOPAC)は、これまでの研究では分離できないとされていたが、今回の方法で分離することが可能になった。また、ホモバニリン酸によるドーパミン検出に対する防害はこの方法で容易に除くことができる。今後は、尿の前処理あるいは無処理検体中のドーパミンのモニターとそのデータ解析の方法などについて検討し、マススクリーニングのための基礎的検討を行う計画である。
インスリンシグナルとカルシウムシグナルのクロストークについての分子遺伝学的研究

1).インスリンシグナルの下流において、イノシトールリン脂質代謝或いはその中心の酵素であるホスホリパーゼC(PLC1)が働いていることが示唆されているが、分子レベルのメカニズムには不明の点が多い。我々は,分裂酵母モデル系を用いてホスホイノシチドによるシグナル伝達を研究している。PIP_2は主要なホスホイノシチドであり,phospholipase Cにより分解されて、二つの主要なセカンドメッセンジャーであるIP_3とジアシルグリセロールを生じる。哺乳動物細胞では、IP_3は特異的受容体に結合し細胞内ストアからのカルシウムの遊離を引き起こす。一方ジアシルグリセロールはプロテインキナーゼC(PKC)の活性化を引き起こす。我々は免疫抑制薬であるFK506を用いた遺伝学的スクリーニングにより,免疫抑制薬感受性と温度感受性を同時に示すPhosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase(PIP5K)をコードするits3^+遺伝子を単離した。its3-1変異体は細胞内PIP_2量が極めて低い。Its3 PIP5Kの細胞機能をさらに明らかにするために我々は,its3-1変異体の新たな表現型を解析し,micafunginに超感受性を示すことを明らかにし,細胞統合性に障害があることを示唆した。本研究において,我々はphospholipase Cをコードするplc1^+遺伝子の過剰発現が,its3-1変異体の種々の表現型を相補するが,他のPIP5K下流因子の遺伝子発現では相補しないことを明らかにした。本研究によりIts3 PIP5KがPlcl1介するが,Rho/PKCとは独立の経路により細胞統合性を制御することを明らかにした。2).Rabファミーリータンパク質は小胞輸送に関与し,ヒトでは60以上の遺伝子でコードされている。分裂酵母ゲノムはこれまで報告された真核細胞の中で最も少ない9個のRabファミリータンパク質をコードしており,Rabの機能解析に最適のモデル生物である。我々は,免疫抑制薬を用いた遺伝学的スクリーニングにより、輸送小胞をエンドソームからリサイクルするRab6ホモログのRyh1をコードする遺伝子を単離,解析した。さらに,Ryh1は別のRabをコードするYpt3変異体と遺伝学的関係を示し、機能的関係も示すことから,これら2つのRabタンパク質が共同的に働くこと,さらにカルシニューリンを介する細胞内シグナル伝達により制御されることを明らかにした。インスリンシグナルの下流において、イノシトールリン脂質代謝回転あるいはその中心的酵素であるホスホリパーゼC(PLC)が働いていることは、これまでの研究で示唆されているが、その分子レベルのメカニズムは不明である。我々は分裂酵母を用いてインスリンの増殖シグナルとマップキナーゼ系の関係や、インスリンシグナルとカルシウムシグナルのクロストークについて研究を進めている。研究成果は、以下のとおりである。1)ホスファチジルイノシトール4燐酸5キナーゼ(PIP5K)はプロテインキナーゼC(PKC)非依存的にPLCを介する経路により細胞統合性を制御するPIP5KはPI(4)Pをリン酸化して、PIP2を産生する。PIP2はPLCによって分解され、さらにジアシルグリセロール(DG)とIP3になる。本研究では、PLCの過剰発現によって、PIP5K変異体の細胞統合性欠損が相補できることがわかった。この効果はPLCの酵素活性に依存し、IP3ではなく、DGが主役として活躍している。さらに、deletion mutantの解析によって、PLCのPH like domainはPLCの局在や、酵素活性に重要な役割を果たしていることも示唆された。一方、哺乳動物細胞ではDGによって活性化されるPKCはこの現象に関与しないことも明らかになった。我々の研究により、初めて分裂酵母のPKCはRhoにより活性化される哺乳動物のPKNと似ていることも示唆された。2)細胞内輸送に働くアダプチン遺伝子の同定カルシニューリンと遺伝学的に関連する分裂酵母変異体を単離し,その遺伝子を決定した。その結果,ゴルジ・エンドソームからの小胞輸送を担うことが知られているアダプチンをコードしていることが明らかになった。また,アダプチン遺伝子ノックアウトでも同様の表現型が認められることも確認した。

本研究において,我々はphospholipase Cをコードするplc1^+遺伝子の過剰発現が,its3-1変異体の種々の表現型を相補するが,他のPIP5K下流因子の遺伝子発現では相補しないことを明らかにした。本研究によりIts3 PIP5KがPlcl1介するが,Rho/PKCとは独立の経路により細胞統合性を制御することを明らかにした。2).Rabファミーリータンパク質は小胞輸送に関与し,ヒトでは60以上の遺伝子でコードされている。分裂酵母ゲノムはこれまで報告された真核細胞の中で最も少ない9個のRabファミリータンパク質をコードしており,Rabの機能解析に最適のモデル生物である。我々は,免疫抑制薬を用いた遺伝学的スクリーニングにより、輸送小胞をエンドソームからリサイクルするRab6ホモログのRyh1をコードする遺伝子を単離,解析した。さらに,Ryh1は別のRabをコードするYpt3変異体と遺伝学的関係を示し、機能的関係も示すことから,これら2つのRabタンパク質が共同的に働くこと,さらにカルシニューリンを介する細胞内シグナル伝達により制御されることを明らかにした。