hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗Fas抗体眼内投与による実験的自己免疫性ぶどう膜炎の発症期における抑制

網膜特異抗原であるInterphotoreceptorretinoid-binding protein(IRBP)を完全フロインドアジュバンド(CFA)とともにB10.Aマウスに免疫するとT細胞を主体とした自己免疫性ぶどう膜網膜炎(Experimental autoimmune uveoretinitis;EAU)が発症する。EAUは、活性化したIRBP反応性T細胞の眼内浸潤により発症すると考えられるため、本研究で我々は、Fas receptorと結合して、Fas receptorを発現している細胞にアポトーシスを誘導する抗Fas抗体を眼の前房内に局所投与することにより眼内の活性化T細胞にアポトーシスを起こさせ、EAUをその発症期で抑制できるかどうかについて検討を行った。抗Fas抗体のアイソタイプコントロール抗体を前房投与されたマウス群と比較して、抗Fas抗体を投与されたマウス群では、EAUの重症度の抑制がみられ、免疫組織化学染色により、より多くの眼内浸潤リンパ球のアポトーシスが確認された。また、抗Fas抗体を投与されたマウス群においては、抗体投与を行っていない対側の眼においてもEAUの抑制がみられたことにより、その脾細胞のIRBPに対するT細胞増殖反応、IFN-γ合成能をさらに解析した。その結果、アイソタイプコントロール抗体を投与したコントロール群と比較して、IRBPに対するT細胞増殖反応に変化はみられなかったが、IFN-γ合成能は強く抑制されており、眼内に投与された抗Fas抗体が全身性にIRBP反応性IFN-γ合成T細胞のアポトーシスを誘導していたことが示唆された。網膜に存在する臓器特異的抗原、Interphotoreceptorretinoid-bindirlg protein(IRBP)を完全フロインドアジュバンド(CFA)とともにB10Aマウスに免疫すると、免疫後2週目より自己免疫性ぶどう膜網膜炎(Experimental autoimmune uveoretinitis;EAU)が発症する。今回我々は、Fas抗原を介して細胞死(apoptosis)を誘導する抗Fas抗体をIRBP免疫後3週目のB10Aマウスに投与し、そのIRBPに対するリンパ節T細胞増殖反応、lFN-γ合成能、およびEAU重症度について検討を行った。その結果、IRBP免疫後に抗Fas抗体を投与されたB10Aマウスでは、コントロール抗体を投与されたマウスに比べて、IRBPに対するT細胞増殖反応、およびlFN-γ合成能が著明に低下していることを認めた。また、組織学的検索により、EAUの重症度も明らかに軽症化していた。次に、IRBP免疫後5週目、抗体投与後2週目のB10Aマウスに、IRBPまたは卵白アルブミン(Ovalbumine;OVA)を再免疫し、その2週後にIRBPおよびOVAに対するT細胞増殖反応を検討したところ、OVAに対するT細胞増殖反応は、抗Fas抗体を投与されたマウス、コントロール抗体を投与されたマウス間で有意差はみられなかったが、IRBPに対するT細胞増殖反応は、コントロール抗体を投与されたマウスに比べて抗IRBP抗体を投与されたマウスにおいては有意に減弱していた。これらのことより、IRBP免疫後に活性化されたIRBP反応性T細胞が、抗Fas抗体投与により特異的にapoptosisに陥り、その結果EAUの抑制がみられたと考えられる。
ショウジョウバエ中枢ニューロンの性決定に果たす細胞間相互作用の役割の解明

本研究では、ニューロンの神経突起の形態的な性差の形成におけるニューロンを取り巻く「性環境」の果たす役割に着目して解析を進めた。平成27年度においては、前年度に引き続き、ニューロンが雌の投射様式を獲得するために周囲に「雌の環境」が必要である可能性を検討した。そのために周囲の脳細胞はそのままに、雌に性転換した状態にあたる、fruitless (fru)の機能を喪失した細胞クローンを雄の脳内にモザイク法によって作出する実験を行った。この雌に性転換されたmcALaニューロンの神経突起形態について詳細な観察を行ったところ、雄特異的な突起の形成は認められなかった。これは、周囲の細胞が雄のままであるならば、細胞クローンのみを雌化した場合でも、雄型の形態を維持しているという当初の予想に反する結果であった。同時に、この結果から、mcALaニューロンの雄特異的な神経突起の形成には、mcALaニューロン自身でFruが発現することが必要とされることが示唆された。これらの作業と並行して、引き続き細胞間相互作用に関与する脳細胞の解明を行った。脳細胞の解明においては、モザイク法によりtransformer (tra)の機能を雌の少数の脳細胞で喪失させることにより、その細胞だけを雄に性転換させた。これまでの実験においては、mcALa, mALニューロンといった個々のニューロンの形態に着目していたが、本年度では、一部のニューロン集団を雄化した際にそれに呼応してmcALa及びmALニューロンに雄特有の突起が形成されるかどうかということに重点をおいて解析を進めた。その結果、mcALaニューロンが他のfruitless(fru)発現ニューロンと同時に雄化された場合に、不完全な形態ではあるものの雄特異的な神経突起を形成することがあった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ショウジョウバエ中枢ニューロンの神経突起の形態的な性差の形成におけるニューロンを取り巻く「性環境」の果たす役割に着目して解析を進める。MARCM法によりtransformer (tra)の機能を選択的に雌の少数の脳細胞で喪失させることにより、その細胞だけを雄に性転換させた。それらの細胞をGFP標識し、抗GFP抗体とneuropile特異抗体を用いた二重蛍光染色をした後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。一部のニューロン集団を雄化した際にそれに呼応してmcALa及びmALニューロンに雄特有の突起が形成されるかどうかということに重点をおいて網羅的に解析を進めた。その結果、mcALaニューロンが同時に雄化された際に不完全な形態ではあるものの雄特異的な神経突起を形成する少なくとも3つのfruitless(fru)発現ニューロン群を同定した。また、mALニューロンについても、左右脳半球のmALニューロンが同時に雄化した場合、片側のみが雄化された場合と比べ、神経投射がより雄の様式に近づくことを明らかにした。これらの結果を受けて、相互作用するニューロン群の一方のみを雄化し、他方のニューロン群の投射パターンへの影響を検証するために、GAL4/UASシステムとは別の遺伝子強制発現系を用いたモザイク法を新規に確立した。この新規モザイク法を用いて脳内の一部のニューロン群をRFPで選択的に標識したところ、各脳に13つのニューロン群が形成された。26年度の研究においては、mcALaニューロンの雄特異的な神経突起の形成を誘導している可能性のあるfru発現ニューロン集団を数種同定できた。

しかし、当初予定していた周囲の脳細胞はそのままに、雌に性転換した状態にあたる、fruの機能を喪失した細胞クローンを雄の脳内にモザイク法によって作出する実験が、実験に用いる系統バエに不具合が生じたことにより思うように進めることができなかった。この実験は、本研究の重要な課題でもある、ショウジョウバエ中枢ニューロンの神経突起の形態的な性差の形成におけるニューロンを取り巻く「性環境」の果たす役割を解明する上で重要な実験であるので、優先的に進めていかなければならない。GAL4/UASシステムとは別の強制遺伝子発現系を用いたモザイク法を新規に確立することができたので、相互作用するニューロン群の一方のみを雄化し、他方のニューロン群の投射パターンへの影響を検証することが可能となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。26年度の研究により、mcALaニューロンの雄特異的な神経突起の形成を誘導している可能性のあるニューロン群が一部特定されてきているので、今後の方針として、新規のモザイク法を用いてこれらのニューロンが雄化した際にmcALaニューロンの形態に与える影響を解析していく。また、雄化された異なるニューロン群を異なる色で標識するために、これまでの手法にBrainbowを取り入れ、「作用する側」と「作用される側」のニューロンを明確に区別して形態を計測する。また、一連の相互作用する相手となる脳細胞を解明する実験と同時に、突起形成における細胞間相互作用を担う分子機構を解明するための実験を実施する。ショウジョウバエにおいては、シグナル分子やそれらのレセプターに関与する遺伝子は同定されており、その突然変異やRNAi発現により機能阻害が可能である。モザイク法とは異なる狙ったニューロン群のみを操作することのできる発現部位限定法を用いて同定されたシグナル分子やレセプターの機能阻害を引き起こし、mcALaニューロンの雄特異的な神経突起の形成に対する影響を検証していく。
未分化脂肪幹細胞の移植による軟骨内骨化を介した骨形成法と新しい骨再生療法への応用

従来の幹細胞を用いた骨再生療法は、血流不足に起因する移植組織の壊死を起こすことがあり、適用できる骨欠損の大きさに限界がある。そこで低酸素・低栄養環境に対して抵抗性をもつ軟骨を移植して軟骨内骨化を誘導する骨再生法が注目されている。しかしながら、移植に用いる軟骨を体外で作製するのには、多大なコストと労力がかかる。新しい骨再生法の開発を目指して本研究は、未分化脂肪幹細胞を移植することにより生体内での自発的な軟骨内骨化を誘導する方法の確立を目的とする。
各種水質汚染物質の魚類好中球に対する免疫毒性評価と分子生物学的解析

(1)ティラピアの鰾好中球に調整した塩化カドミウムを曝露し、ザイモサンを加えて貪食率を求めた。さらに好中球の活性酸素産生量についても測定した。また、メダカ、ゼブラフィッシュにおける暴露の影響を病原微生物を用いた感染実験で評価した。非曝露区では、3時間後の細胞生残率は98%であった。2x10^<-4>、2x10^<-5>、2x10^<-6>Mの濃度では86%、95%、96%であり、生残率の有意な低下が認められた。死細胞には核が断片化した像が多数認められた。貪食率は2x10^<-4>区で有意に低下した。また、活性酸素産生量は、非曝露区に対して3つの区いずれも10%ほど低下が認められたが、有意な差は認められなかった。メダカ、ゼブラフィッシュに対して1x10^<-4>Mの72時間曝露試験後にE. tardaによる感染実験を行ったが、非曝露区との間に有意な死亡率の低下は認められなかった。(2)孵化4日後のティラピア稚魚を排水基準および環境基準値の塩化カドミウムまたはクロム(III)に96時間曝露し、E. tardaに浸漬感染させ死亡する時間を調べた。カドミウムの環境基準区(0.01ppm)及びクロム(III)の排水基準(2.0ppm)と環境基準区(0.2ppm)において、対照区とほぼ同じ時間で死亡し、鰓上皮細胞の核濃縮の頻度、抗E. tarda免疫染色の陽性反応も同程度であった。カドミウムの排水基準においては、非感染区で試験水の影響と思われる死亡が見られた。これらのことから、カドミウムの環境基準及びクロム(III)の排水基準と環境基準は、免疫毒性が低いと評価された。本研究で化学物質のin vivo暴露による魚体への影響の評価にあたっての方向性を示せた。産業排水や地下水に含まれる化学物質は魚類の生存に与える影響要因として危惧されている。そこで、重金属(塩化カドミウム)のティラピア好中球に対する免疫毒性試験を行い、生存にあたえる影響をin vitroで調べた。さらに、メダカ、ゼブラフィッシュを用いてin vivoにおける影響を病原微生物を用いた感染実験で評価を試みた。ティラピア好中球は鰾から採取し、2x10^6細胞/mlに調整した。これに2x10^<-4>(-4区)、2x10^<-5>、(-5区)、2x10^<-6>M(-6区)に調整した塩化カドミウムをそれぞれ75μlずつ加えて3時間25°Cで曝露した。その後に生死細胞数を数え、塩化カドミウムの毒性について検討した。さらに0.25mg/mlに調整したザイモサンを加え、1時間後の貪食率を求めた。また、曝露後にPBSで洗浄した細胞の活性酸素産生量についても、CLA、PMA添加後に測定した。非曝露区では、3時間後の生残率は98%であったのに対し、-4区、-5区、-6区では86%、95%、96%であり、非曝露区と-4区の間には有意な生残率の低下が認められた。死細胞を顕微鏡観察したところ、核が断片化した像が多数認められた。

貪食率は非曝露区、-4区、-5区、-6区で95%、20%、88%、95%であり、-4区で塩化カドミウムの曝露は有意に貪食率を低下させることが明らかとなった。また、活性酸素産生量は、非曝露区に対して3つの区いずれも10%ほど低下が認められたが、有意な差は認められなかった。メダカおよびゼブラフィッシュに対して塩化カドミウム(1x10^<-4>M)の72時間曝露試験後にEdwardsiella tardaによる感染実験を行ったが、非曝露区との間に有意な死亡率の低下は認められなかった。今後、感染手法の検討および強病原性株による感染実験を行い、最適な手法を確立する予定である。一般的に稚魚は化学物質に対して成魚よりも敏感であり、免疫毒性に対しても強い影響が見られることが予想される。そのため自然界に排出された化学物質は稚魚の資源に影響を与え、そのことが個体群の減少を招くことが考えられる。そこで、稚魚に対しカドミウムおよびクロム(III)を曝露させて、以下の実験を行った。孵化後4日のティラピア稚魚(約8mg)を排水基準および環境基準値のカドミウムまたはクロム(III)に96時間曝露し、その後E.tarda 1.0x10^6cfu/mlに調整した薄い培地(1%トリプトン、0.85%NaCl)に浸漬感染させ、死亡する時間を調べた。実験魚は死亡後直ちに固定し、HE染色、抗E.tarda免疫組織化学反応、アポトーシス検出のためのTUNEL染色を行った。カドミウムの環境基準区(0.01ppm)及びクロム(III)の排水基準(2.0ppm)と環境基準区(0.2ppm)において、対照区とほぼ同じ時間で死亡し、紙上皮細胞の核濃縮の頻度、抗E.tarda免疫組織化学染色の陽性反応も同程度であった。カドミウムの排水基準(0.1ppm)においては、E.tarda negtiveの試験区で、試験水の影響と思われる死亡が見られた。これらのことから、カドミウムの環境基準及びクロム(III)の排水基準と環境基準は、免疫毒性が低いと評価された。本研究では化学物質in vivo暴露による魚体への影響の評価にあたって研究の方向性を示せた。19年度は、非致死的な影響として食欲に注目し、食欲の変化から化学物質のコイに対する影響を評価できるかどうかを検討した。化学物質はカドミウムを用い、3つの試験区、対照区、1/10LC50区(10.54mg/L)、1/2LC50(5.27mg/L)を設定し、48時間暴露した。暴露前、暴露期間中と期間後における摂餌回数を比較して、カドミウムによる摂餌の影響を調べた。さらに、食欲に関係するホルモンNeuropeptide Y(NPY)、Leptinl,2のmRNAの発現量をリアルタイムPCRで定量し、カドミウム暴露の影響を考察した。また、鰓、味蕾の組織切片を作製して、暴露による組織学的な変化を観察した。3つの試験区いずれにおいても、暴露前、中、後における摂餌回数には、大きな増減は認められなかった。同様に、NPY、Leptinl,2のmRNA量にも目立った増減は認められなかった。病理組織学的検討を行ったところ、鰓には1/10LC50区、1/2LC50区で呼吸上皮の細胞核が崩壊する壊死と核の腫大が認められた。一方、味蕾は対照区との違いは認められなかった。コイでは、カドミウムの半数致死濃度の半分の濃度においてさえも、摂餌回数に変化が無かったこと、食欲に関係する遺伝子の発現量に変化が見られなかったこと、味蕾に病理組織学的な変化が認められなかったことから、影響はほとんど無いことが示唆された。自発摂餌を用いた毒性評価は、検討の余地があると考えられた。
神経と免疫応答に関する研究-リンパ節内神経線維の免疫応答における役割-

(1)Wistar rat顎下リンパ節は,片側各4個認められ,大きさや形態が異なっている.前回までは,神経染色および抗NEP抗体による免疫染色で門部に分布する神経束を報告した.今回4個のリンパ節の内,最も大きいリンパ節を用いてリンパ節内神経を電顕的に観察した.a.リンパ節門部,被膜部の神経門部において脈管系と同じ結合組織中に神経束が見られた.中枢側からの神経束で最大のものは,それぞれperineural sheathに囲まれた2つの束が隣接して走行していた.それらの束は各々6本の有髄線維と16本の無髄線維を含むシュワン細胞の単位が3個から成り立っていた.やがて分離して2つの神経束として走行した.異なる切片において観察される神経束での最多の有髄線維は6本がであったことから,このリンパ節に至る最大の神経束と考えられた.その他には有髄線維を4本,3本,2本,1本と無髄線維を含む神経束がはっきりとしたperineural sheathを持って認められた.大経のリンパ管周囲に近接した神経終末がラット腸間膜リンパ節で報告されているが,現在検索中である.b.髄質部,皮質部の神経髄索に分布する小動脈周囲に,無髄線維だけからなる神経束が認められた.血管壁との関係は,間に細網細胞の突起が見られ,近接したものはまだ見つかっていない.無髄線維のみの神経束はperineural sheathを欠き,基底膜様構造で包まれていた.これらは終末構造に至る部分と思われるが,有芯あるいは無芯小胞の識別可能な神経終末とはまだ言い切れない.もう少し追跡して観察したい.Wistar系ラット顎下リンパ節を用いて,リンパ節における神経分布についての検索をまず行った.1.成熟ラットにおける観察8-10週齢ラット下顎のリンパ節(Superficial cervical lymph nodes)は,左右の大唾液腺腺門近くに片側大小3-4個近接して間接される.いずれも二次小節胚中心であった.これらのリンパ節は,結合組織により緩く固定されていて,その結合組織に神経,血管,リンパ管などが分布している.神経線維は神経染色陽性,免疫組織染色一抗NFPおよび抗S-100蛋白共に陽性で,血管周囲や門部から髄質にかけての輸出管周囲結合組織に明瞭に認められた.またリンパ節は周囲を被膜で覆われていて,その被膜中にも細い神経束が認められた.(神経染色陽性,免疫組織染色一抗NFPおよび抗S-100蛋白共に陽性)リンパ節の門部から髄質部に分布する神経線維の微細構造は,リンパ節の横断面を用いて観察した.門部の横断面において観察された最大の神経束は,6本の有髄線維と,数本の無髄線維のみからなる2つの小区間からなるものであった.このほかの神経束は,有髄線維1-3本の他に無髄線維からなっていた.この無髄線維のみの小区間は多様で,十数本の大小さまざまな径からなるものや,数本の無髄線維のものなどがあった.これらの神経線維の機能的な面についてはまだ確認していない.2.リンパ節の神経の成長発育について」胎生14,16,18日目および生後1カ月までの標本製作を終了していて,現在神経染色や神経組織関連の抗体(抗NFP,抗NSE,抗S-100蛋白に加えて神経の成長発育関連に関わるGAP43など)による免疫組織化学を行っている.検索.1ラット成獣(10週齢、雄)において顎下腺・舌下腺周囲のリンパ節の解剖学的検索を行った。Superficialcervicallymph nodesは唾液腺の外側部から上部にかけて血管に沿って長径8mm前後のリンパ節が1個、他は5mmから2mmのものが3個、合計片側4個存在した。リンパ節周囲に到る神経線維は血管周囲から分岐していた。検索.2下顎リンパ節の個体発生は胎生14日、16日、18日、生後0日について検索した。ラット胎生期のリンパ組織の出現を検索するに当たって胸腺の出現と顎下腺の出現を目安にした。顎下腺原基となる上皮の陥入及び腺構造は胎生16日から観察された。胸腺は胎生16日に初めて観察された。胸腺は胸骨の上前面に紡錘形でかなり太い神経束と血管が隣接していた。胸腺を構成する細胞としてヘマトキシリンに濃染する円形の核を持つリンパ球と思われる細胞が主に存在した。胎生18日になると、顎下腺後外方部分にリンパ節が出現した。リンパ節は顎下腺や血管周囲の疎性結合組織にヘマトキシリン濃染の核をもつ細胞集団として観察され、動脈からの毛細血管が門部に入り、血液の供給も活発であった。NFP免疫染色によると、周囲の動脈と静脈の間の結合組織にNFP陽性神経束が検出された。また分岐した血管にそって細いNFP陽性線維が認められた。しかしこの腺維については非常に弱陽性であるため他の方法による検出を考えている。その他に胎生18日では前後の頚部に多数のリンパ節と思われる細胞集団が認められた。いずれも血管周囲にいくつか群をなして分布していた。生後0日では、胎生末期に比較してこれらのリンパ組織は容積が大きくなっていた。

多数存在する類似形態の組織がすべてリンパ組織であるかどうか、現在リンパ球(T cell抗体による免疫染色など)の同定を行っている。(1)Wistar rat顎下リンパ節は,片側各4個認められ,大きさや形態が異なっている.前回までは,神経染色および抗NEP抗体による免疫染色で門部に分布する神経束を報告した.今回4個のリンパ節の内,最も大きいリンパ節を用いてリンパ節内神経を電顕的に観察した.a.リンパ節門部,被膜部の神経門部において脈管系と同じ結合組織中に神経束が見られた.中枢側からの神経束で最大のものは,それぞれperineural sheathに囲まれた2つの束が隣接して走行していた.それらの束は各々6本の有髄線維と16本の無髄線維を含むシュワン細胞の単位が3個から成り立っていた.やがて分離して2つの神経束として走行した.異なる切片において観察される神経束での最多の有髄線維は6本がであったことから,このリンパ節に至る最大の神経束と考えられた.その他には有髄線維を4本,3本,2本,1本と無髄線維を含む神経束がはっきりとしたperineural sheathを持って認められた.大経のリンパ管周囲に近接した神経終末がラット腸間膜リンパ節で報告されているが,現在検索中である.b.髄質部,皮質部の神経髄索に分布する小動脈周囲に,無髄線維だけからなる神経束が認められた.血管壁との関係は,間に細網細胞の突起が見られ,近接したものはまだ見つかっていない.無髄線維のみの神経束はperineural sheathを欠き,基底膜様構造で包まれていた.これらは終末構造に至る部分と思われるが,有芯あるいは無芯小胞の識別可能な神経終末とはまだ言い切れない.もう少し追跡して観察したい.
共生微生物によるガソリン様燃料の生産

沖縄の土壌から低炭素数のものを含む炭化水素類を生産する真菌(酵母F-6株、カビK-38株)を分離した。F-6株とK-38株の育種、培養条件の検討を行った後、食品廃棄物を利用して3Lジャーファーメンターで共生させて連続培養を行ったところ、炭化水素類を1.3g/Lのレベルで回収できた。生産された炭化水素は、トリオレイン、オレイン酸並びに炭素数15程度の炭化水素等であった。得られた炭化水素類は、そのまま又はメチル化して燃焼できバイオ燃料としての利用が可能であった。炭化水素類を生成する微生物として分離した赤色の酵母Rhodosporidium属(F-6株)と白色のカビMortierella属(K-38株)について液体振とう培養(30°C、135rpm、7日間)を行い、菌体内の脂質の生産量と培養液中(菌体外)への炭化水素類の生産量の比較を行った。F-6株では、培養液250ml中の湿潤状態の菌体重量は31.9g、凍結乾燥後の菌体重量は1.4gであり、クロロホルム:メタノール=2:1で2回抽出した炭化水素類量は、乾燥菌体内で25.6mg/g、培養液上清中(菌体外)で0.03mg/mlであった。また、K-38株では、培養液250ml中の湿潤状態の菌体重量は21.5g、凍結乾燥後の菌体重量は2.6gであり、抽出した炭化水素類量は、乾燥菌体内で62.4mg/g、培養液上清中(菌体外)で0.41mg/mlであった。これにより、菌体内への炭化水素類の蓄積が主体であることが判明した。3Lジャーファーメンターにて、F-6株とK-38株を同時に混合通気培養したところ、乾燥菌体内炭化水素類量を80.9mg/gまで向上させることができた。新規スクリーニングでは、乾燥菌体当たり72.0mg/gの炭化水素類を生産する細菌Y-99株を得た。また、衝撃波を用いたF-6株とK-38株の炭化水素類の抽出法を検討した結果、衝撃波処理(3.1kv)を10回行うことで、無処理の1.4倍まで抽出量を向上できた。食品廃棄物を利用した場合の炭化水素類の生産をF-6株とK38株を用いて検討した。ご飯5%および合挽きミンチ1%を添加した培地にF-6株とK38株を接種したが発酵は進まなかった。3Lジャーファーメンターに培地を入れ、黒麹菌を3日間1vvmで通気して糖化を行った後にF-6株とK38株を混合培養した結果、良好な発酵が認められた。発酵液の90%を採取し、残りにご飯および合挽きミンチの黒麹菌による糖化液を再度添加することを3回まで繰り返し、連続培養が出来ることが確認できた。連続培養で総計480gの湿潤菌体が得られた。湿潤菌体を爆破レンジ(3500V)で爆破した後に凍結乾燥したところ、乾燥菌体32.1gが得られた。クロロホルム-メタノール液で乾燥菌体から抽出することで炭化水素類10.7gを回収することができた。得られた炭化水素類をNaOH飽和メタノールでメチル化したものは着火すると燃焼しバイオ燃料として利用が可能と判断された。炭化水素類を生成する微生物として分離した細菌(F-6株)とカビ(K-38株)について培養条件を検討した結果、F-6株は酵母エキスを含む培地(pH5、30°C)で、K-38株はポテト抽出液を含む培地(pH7、30°C)で良好に増殖することが確認された。これらの菌株の菌体RNAを用い同定した結果、F-6株はRhodosporidium属、K-38株はMortierella属と推定された。これらを2週間振とう培養(30°C、135rpm)した結果、F-6株は赤色に懸濁し、K-38株は液体培地内で球状菌体を多数形成した。これらの培養液を遠心分離して菌体と上清に分離した。この時の培養液100ml中の菌体重量(湿潤状態)は、F-6株は4.41g、K-38株は6.09gであった。炭化水素類の抽出方法としては、分離した菌体を凍結乾燥させ、超音波破砕機により菌体を破壊し、エーテルを用いて菌体から油分を抽出した。エバポレーターを用いてエーテルを蒸発させて油分を得た。同様に上清を濃縮して、上清に含まれる油分を抽出した。その後、TLC(Silica gel 60 F254)を用いて、それぞれの油分の種類を確認した。

これらの油分の収率は、F-6株乾燥菌体量0.49gからは12mg(対乾燥菌体収量2.4%)、固化培養液0.76gからは9mgの油分が抽出された。一方、K-38株乾燥菌体量0.56gからは70mg(対乾燥菌体収量12.5%)、固化培養液0.82gからは32mgの油分が抽出された。これらの油分についてTLC分析した結果、ステロール類、複数の脂肪酸、炭化水素類が確認された。現在、F-6株とK-38株との混合培養、精度を上げたTLC分析、ガスクロ分析を進めている。中規模培養まで実施できたが、時間的な制約で廃棄物の利用の検討ができなかった。培養条件の検討に時間を取り、油分の分析がTLC分析までとなった。生産性の向上については、時間的な制約により実施が遅れた。微生物の炭化水素類の種類確認とその生産性向上を図り、廃棄物を利用した連続培養法の確立を行う。生産された炭化水素類の簡易精製法を検討する。さらに、燃焼の予備実験として化学修飾法の検討を行い、燃焼を確認し、本研究の実用性を評価する。炭化水素類の生産性の向上を図り、また、混合培養についても検討を進める。また、新たなスクリーニング株についても炭化水素類の生産性を測定する。微生物が利用できる産業廃棄物について検討を進める。さらに、微生物が生産した炭化水素類の分析をGCMSを用いて推進する。研究に用いる物品費35万円、学会参加費10万円、文献図書費5万円を予定している。次年度への研究費約17万円のうち約10万円は3月末の農芸化学会大会参加で使用し年度末時点で未清算となっており、7万円は培地等が未購入となっていた。今後、研究に用いる物品費として37万円、学会参加など旅費として15万円、文献図書費として5万円を計画している。
リアルタイムストロンチウム90検出器の開発

福島第一原発事故では90Srを含んだ汚染水の漏出が続いている。90Srは高エネルギーβ線を出し、生体内でCaのように骨に沈着する。γ線を放出しないため測定が困難で、JIS規格の計測法では4週間程度必要である。我々は屈折率1.05のシリカエアロゲルを使ったチェレンコフカウンターで、1.2MeV以上のβ線に反応し低エネルギーβ線やγ線にほとんど反応しない90Sr測定器を開発した。有効面積300平方cmの試作品は1分の計測時間で表面汚染密度を0.1Bq/平方cmの精度で測定できる。この測定器は大型化が容易で、1平方mの装置なら10分の計測で排水の体積汚染密度を10Bq/リットルで測定できる。福島第一原子力発電所事故では大量の放射性物質が環境中に放出し、汚染水の漏洩の形で現在も放出が続いている。事故当初は131Iによる被爆が、現在は137Csと134Csからのγ線による外部被爆が問題となっているが、今後は海産物中の90Srからの内部被爆が問題となるかもしれない。90Srはγ線を放出しないため通常のサーベイメーターなどでは測定できない。JIS規格の計測法では標準1ヶ月必要で、事故現場での復旧作業の安全確保のための汚染濃度測定や現在自粛が続いている福島県沖漁業の再開に不可欠な食品中の汚染検査には使えない。本研究では1.2MeV以下のβ線やγ線には感度がなく1.2MeV以上のβ線のみに感度がある放射線計数装置として、屈折率1.048のシリカエアロゲル、直径0.2mmの波長変換ファイバーのシート、小型高性能の光電子増倍管を用いたしきい値型チェレンコフカウンターを開発した。本研究で製作した検出器は有効面積が10cm×30cmで、90Srの感度が0.12%、137Csに対する感度が0.00013%、雑音頻度が0.012Hzであった。この検出器で一様な汚染のある表面汚染濃度の測定下限は、137Csが90Srの100倍の濃度で存在するような過酷な環境でも、わずか1分間の計測時間で0,1Bq/平方cmである。またこの検出器は大面積化が容易な構造をしており、もし1平方m程度のものを製作すれば、食品や排水中の90Sr検出下限は、137Cs濃度が90Srの10倍の環境で、10分程度の計測時間で10Bq/リットルが推定できる。さらに宇宙線μ粒子事象を除去するためのシンチレーションカウンターを加えたり、試料をあらかじめ100°C以上に加熱して計測の邪魔になる水分を除去するなどの対策を加えれば、測定下限0.1Bq/リットルにも到達できる可能性がある。
Naチャネルの細胞膜発現調節:サブユニットmRNA変動と細胞内輸送・局在化機構

Naチャネルの細胞膜発現の調節機構を解明するために、発生学的に神経堤に由来するウシ副腎髄質クロマフィン細胞を用いて、(i)細胞膜Naチャネル量を変動させる細胞内外の因子を同定し、さらに、(ii)その際のNaチャネルのサブユニットmRNAレベルの変動と細胞内輸送・局在化機構を解析し以下の結果を得た。1.Protein kinase C(PKC)による調節:(1)PKC-αの活性化は、Naチャネルの細胞膜表面からのインターナリゼーションを促進することにより、細胞膜Naチャネル量を低下させた。(2)PKC-εの活性化は、Naチャネルα-サブユニットmRNAレベルを低下させ、β_1-サブユニットmRNAレベルを上昇させた。(3)α-サブユニットmRNAレベルの低下は、その遺伝子転写率の低下によるものではなく、mRNA崩壊率の亢進に由来した。(4)PKC-αおよび-εの効果は、蛋白合成に依存していた。2.Mitogen-activated protein kinase(MAPK)による調節:培養ウシ副腎髄質クロマフィン細胞では、恒常的にMAPK(ERK1,ERK2)が活性化されており、PD98059(MAPKKの阻害剤)によってその活性化を抑制すると、細胞膜Naチャネル量が著しく増加した(12時間で、約1.5倍)。この時、Naチャネルのα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルは不変であった。3.神経保護薬による変動:リルゾール、NS-7[4-(4-fluorophenyl)-2-methyl-6-(5-piperidinopentyloxy)pyrimidine hydrochloride]は、Naチャネルα-サブユニットのドメインIトランスメンブレン・セグメント6に結合し,Naチャネル開孔を阻害し、その結果、Caチャネル開孔、カテコールアミン分泌を低下させた。長期処置によって、リルゾールはNaチャネル量を変動させないが、NS-7は増加させた。4.イムノフィリンリガンドによる変動:免疫抑制薬であるサイクロスポリンAおよびFK506は、イムノフィリンを介して、Naチャネルのインターナリゼーションを抑制することにより、細胞膜Naチャネル量を増加させた。1. Protein kinase C(PKC)による調節:チメレアトキシン(conventional PKCの活性薬)、Go6976(conventional PKCの阻害薬)、フォルボールエステル、ブレフエルジンA(ADP ribosylation factor-1阻害薬)などを用いた。(1)PKC-αの活性化は、Naチャネルの細胞膜表面からのendocytosisを促進した。(2)PKC-εの活性化は、Naチャネルα-サブユニットmRNAレベルを低下させ、β_I-サブユニットmRNAレベルを上昇させた。2. Mitogen-activated protein kinase(MAPK)による調節:培養ウシ副腎髄質クロマフィン細胞では、恒常的にMAPK(ERK1,ERK2)が活性化されており、PD98059(MAPKKの阻害剤)によってその活性化を抑制すると、細胞膜Naチャネル量が著しく増加した(12時間で、約1.5倍)。この時、Naチャネルのα-および、β_I-サブユニットmRNAレベルは不変であった。3.細胞内[Ca]_iによる調節:A23187(Caイオノフォア)および、タプシガルギン(小胞体Ca-ATPase阻害薬)による[Ca]_iの持続的上昇は、細胞膜Naチャネル量、α-およびβ_I-サブユニットmRNAレベルを低下させた。2,5-di-(t-busyl)-1,4-benzohydroquinone(DBHQ)による一過性[Ca]_i上昇は、効果がなかった。4.神経保護薬による調節:リルゾール、NS-7[4(4-fluorophenyl)-2-methyl-6-(5-piperidinpentyloxy)pyrimidine hydrochloride]は、Naチャネルα-サブユニットのドメインIトランスメンブレン・セグメント6に結合し,Naチャネル開孔を阻害し、その結果、Caチャネル開孔、カテコールアミン分泌を低下させた。

(4)PKC-αおよび-εの効果は、蛋白合成に依存していた。2.Mitogen-activated protein kinase(MAPK)による調節:培養ウシ副腎髄質クロマフィン細胞では、恒常的にMAPK(ERK1,ERK2)が活性化されており、PD98059(MAPKKの阻害剤)によってその活性化を抑制すると、細胞膜Naチャネル量が著しく増加した(12時間で、約1.5倍)。この時、Naチャネルのα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルは不変であった。3.神経保護薬による変動:リルゾール、NS-7[4-(4-fluorophenyl)-2-methyl-6-(5-piperidinopentyloxy)pyrimidine hydrochloride]は、Naチャネルα-サブユニットのドメインIトランスメンブレン・セグメント6に結合し,Naチャネル開孔を阻害し、その結果、Caチャネル開孔、カテコールアミン分泌を低下させた。長期処置によって、リルゾールはNaチャネル量を変動させないが、NS-7は増加させた。4.イムノフィリンリガンドによる変動:免疫抑制薬であるサイクロスポリンAおよびFK506は、イムノフィリンを介して、Naチャネルのインターナリゼーションを抑制することにより、細胞膜Naチャネル量を増加させた。
ダイアンソウイルスのRNA複製機構

本研究では、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)の翻訳、複製および感染機構を解析し、以下の研究成果を得た。1)RCNMVのゲノムRNA1とRNA2の5'末端にはキャップ構造が存在せず、ウイルスタンパク質はキャップ非依存的に翻訳された。RNA1のキャップ非依存性翻訳には3'非翻訳領域(3'-UTR)に存在するステムループ(SL)構造が重要であった。一方、RNA2の翻訳機構はRNA1と異なり、翻訳にはRNA1のコードする複製酵素成分タンパク質(p27とp88)を必要とし、RNA2の複製とリンクしていた。2)RNA2の複製には5'-UTRと3'-UTR以外に、RNA2のORF内に存在するSL構造が重要であった。また、このSLは、RNA1にコードされる外被タンパク質の発現でも重要な役割を果たし、それにはループの配列以外に構造そのものが重要であることが分かった。3)RNA1は、RNAサイレンシング抑制活性を持ち、その活性には複製酵素成分タンパク質(p27とp88)とマイナス鎖合成の鋳型となりえるRCNMV RNAを必要とした。このことから、RCNMV RNA合成機構とRNAサイレンシング機構に関連性が示唆され、これらの機構に共通因子を利用している可能性が強く示唆された。RCNMVRNA複製酵素複合体の宿主因子およびRNAサイレンシング装置構成因子の同定が期待される。以上のように、RCNMVは翻訳、RNA複製、RNAサイレンシングに関わる宿主因子を巧みに利用して遺伝子発現制御を行うとともに、植物のウイルス抵抗性を抑制していることが明らかとなった。また、これらの結果は、真核生物の新たな翻訳制御機構の解明にもつながると考えられる。レッドクローバーネクロティックモザイクダイアンソウイルス(RCNMV)は、2分節のプラスセンスRNAをゲノムとする植物ウイルスである。本研究では、1)RCNMV RNA1の翻訳・複製に関与するRNAシス因子(塩基配列と構造)の解析、2)RCNMV RNA2の複製に関与するORF内に存在するシス因子(塩基配列と構造)の解析、3)ゲノムRNA、のin vitro複製系の構築、4)ウイルスタンパク質27kDと88kDタンパク質の複製における機能解析を行っている。成果の概要:1)RCNMV-カナダ株の温度感受性(17°Cでは宿主植物に全身感染できるが、22°Cでは接種葉にも感染できない)が一細胞レベルでのRNA複製過程にあることを明らかにした。温度感受性を示さないオーストラリア株とカナダ株の間で作成したリコンビナントウイルス及びキメラウイルスの解析から、カナダ株の温度感受性は、ゲノムRNA1の3'非翻訳領域が関与していること、また、温度感受性は一塩基の違いによっても変化することを明らかにした。さらに、RCNMVRNA1の3'UTRはポリAに比べmRNAの翻訳活性を数十倍高めること、また、キャップ要求性を著しく低下させることを明らかにした。2)RNA2ORFの3端側領域にRNA2の複製に必要なシス配列が存在することを明らかにした。3)ウイルス感染葉から鋳型依存性で、かつ高い活性を持つ感染特異的可溶性:RNA合成酵素を得ることに成功した。特に注目すべき成果は、RCNMVがキャップ非依存性の翻訳機構を持ち、翻訳過程が温度感受性に関与する要因の1つである可能性を示したことである。平成14年度の成果概要:以下のことを明らかにした。1)RCNMVのゲノムRNA1と2いずれの5'末端にもキャップ構造が存在しないこと、そして、RNA1の3'非翻訳領域(3'-UTR)、その中の66塩基中含まれるステムループ領域がキャップ非依存性の翻訳に重要である。2)RNA2のキャップ非依存性の翻訳はRNA2とRNA1の複製とリンクしている。

3)RNA2の複製には5'-UTRと3'-UTR以外に、RNA2に存在するORFの3端側領域33塩基のシス配列が必要である。又、この領域は、RNA1からのサブゲノムRNAの転写には影響しないが、サプゲノムRNAからのタンパク質翻訳に影響する。4)BY2培養細胞から液胞を除いた細胞抽出液(北大の石川らの方法)を用い、RCNMVのタンパク質とRNAが合成されることを確認した。5)RCNMV感染ササゲプロトプラストでp27を特異的に検出できる抗体を作製した。特に注目すべき成果は、RCNMV RNA2キャップ非依存性の翻訳活性が、RNA2と物理的に相互作用することが分かっているRNA1の複製と関係していることを示したこと、また、RNA2の複製に必要な因子がサブゲノムRNAの翻訳活性と関係していることを明らかにしたことである。これらの結果は、RNA-RNA分子間相互作用が翻訳に重要な役割を果たしていることを示唆するものであり、真核生物新たな翻訳制御機構の解明につながると考えられる。これらの結果は、J. Virol.に投稿中である。平成15年度の成果の概要:(1)RCNMVRNA2は、複製に必要なシス因子をタンパク質コード領域に持ち、その領域のステムループ構造(SL)が不可欠であることを明らかにした。また、本SLは、RNA1との相互作用を介して外被タンパク質発現に関与するSLであったが、RNA2の複製とRNA分子間相互作用はお互いに独立していた。(2)RNA2のキャップ非依存性翻訳は、RNA1のコードする複製酵素成分タンパク質を必要とし、同時にRNA2自身がプラス鎖RNA合成に必要なシス因子を備えていることが重要であることを明らかにした。(3)RCNMVのRNA1がRNAサイレンシングサプレッサーをコードしていること、さらに、サプレッサーである複製酵素成分タンパク質は、タンパク質として存在するだけではサプレッサー機能を持たないが、機能発現には複製酵素複合体を形成する必要があることが示唆された。成果で特に注目すべき点:(1)複製酵素成分タンパク質のサイレンシングサプレッサーとしての機能発現には複製酵素複合体形成の必要性が示唆されたことから、RNA複製装置とRNAサイレンシング装置成分との間に何らかの関係がある可能性が強く示唆された。(2)RNA2の翻訳機構解析からウイルスRNA複製機構と翻訳機構が密接に関連していることが分かった。これらの結果は、一細胞でのRNAウイルスの翻訳・複製機構のさらなる進展に繋がるとともに、ウイルスの植物体での全身感染機構および植物のウイルス抵抗性機構の研究にも重要な情報を提示し、その解明の糸口なると考えられる。
原爆被爆者における緑内障と網膜細動脈硬化との関連

20072008年に広島・長崎放射線影響研究所において行った、原爆被爆者の緑内障調査の全データを解析した結果、原爆被爆者において、正常眼圧緑内障と被爆線量には有意な正の相関を認めることがわかった。正常眼圧緑内障の発症メカニズムはいまだ不明であるが、循環障害の関与が疑われている。そこで、眼局所の循環障害に関連すると考えられる網膜細動脈硬化と、被爆線量との関連を調べたが、有意な相関を認めなかった。平成1920年に、広島・長崎放射線影響研究所において原爆被爆者の緑内障調査を行ったが、平成19年4月の時点で診断が終了した対象者の予備的解析において、正常眼圧緑内障と被爆線量に有意な相関が見られることが判明した。正常眼圧緑内障は、発症因子として、循環障害など眼圧非依存因子が関与している可能性が多く報告されているが、現時点では発症メカニズムの完全な解明には至っていない。我々は、過去の調査において、眼局所の循環障害に関運すると考えられる網膜細動脈硬化が、原爆被爆者において、被爆線量との有意な相関を認めた点に注目し、原爆被爆者の緑内障と網膜細動脈硬化との関連を調べることとした。まず,被爆者の緑内障調査は平成20年に終了したため、全対象者の解析をすすめた結果、やはり正常眼圧緑内障と被爆線量には有意な相関を認めることがわかった。この結果は、放射線被爆と緑内障発症との関連を検討する上では、今後非常に重要な意味をもつ結果であると考える。次に網膜細動脈硬化の判定を行うことになったが、検者間での相違をなくすため、調査時に撮影した全ての眼底写真を、1名の連携研究者が,1999年にHubbardらが報告した判定方法にもとづいて判定を行うこととした。この判定万法は、眼底写真解析用ソフトを用いて非常に細かい変化を判定する必要があるため、連携研究者は、過去にこの方法を用いて数々の大規模疫学調査を行ってきたFundus Photograph Reading Centerで、全写真の判定を行う準備をすすめていった。平成21年度は、平成1920年に広島・長崎放射線影響研究所において行った、原爆被爆者の緑内障調査の全てのデータ解析をすすめていった結果、予備的解析の結果と同様、正常眼圧緑内障と被爆線量には有意な正の相関を認めることがわかった。このような結果は、今までにまったく報告が無く、放射線被爆が緑内障の発症に関連があるかもしれないという意味で、世界的にも非常に注目すべき結果であると考える。正常眼圧緑内障は、発症因子として、循環障害など眼圧非依存因子が関与している可能性が従来報告されているが、現時点では発症メカニズムの完全な解明には至っていない。我々は、過去の原爆被爆者調査において、眼局所の循環障害に関連すると考えられる網膜細動脈硬化が、被爆線量との有意な相関を認めた点に注目し、原爆被爆者の緑内障と網膜細動脈硬化との関連を調べることとした。検者間での相違をなくすため、調査時に撮影した全ての眼底写真を、1名の連携研究者が、1999年にHubbardらが報告した判定方法にもとづいて判定を行うこととした。連携研究者は、過去にこの方法を用いて数々の大規模疫学調査を行ってきたFundus PhotographReading Centerに、眼底写真データを持ち込み、全写真の判定を行いながらデータのまとめに取り組んでいるところである。全ての写真の判定が終了した時点で、データを解析し、結果を発表予定にしたいと考えている。
成層圏の大気の運動をシミュレーションする回転円筒水槽実験

成層圏の大気現象は理論的に又は数値シミュレーションで調べられてきたが、より具体的にこれらの基礎となる力学的構造を知るには実験室での再現実験も有効である。本研究の目的は、従来の大気大循環を再現する回転円筒水槽実験において、回転円筒水槽の下層で対流圏に当たる波動流を生成し上層で成層圏に当たる安定成層を作り、波動流の上方への伝播を調べたり、成層圏周極渦に当たる密閉性の強い渦の生成を試みることである。我々は円筒水槽(水深1315cm)の底の厚さ3cmの層に半径方向の温度差を与えて波動流を生成し、水面を暖めることにより5cm以上の上層は温度が高さとともに上昇する安定成層を作ることに成功した。今回の科学研究費補助金による研究では、(1)下層の対流層で生成された傾圧波動の渦度は、準地衡風的渦度方程式に従い、上層の成層に指数的に減衰しながら浸透すること、(2)下層の対流層で安定した軸対称流や傾圧波動が生成されるためには、上層が強い成層状態になっていることが必要であることが示された。特に(2)の成果を実際の大気に適用すると、オゾン層が紫外線を吸収して上層の大気が成層圏を作っていることが、対流圏に安定した大気循環が生成するために不可欠であることを意味する。本研究課題の成果(1)については論文にまとめられ、Experiments in Fluidsに掲載決定され、成果(2)については、Journal of Atmospheric Scienceに投稿中である。中緯度対流圏のロスビー波を円現する従来の回転円筒水槽実験で、底から水深の20%にあたる高さにのみ半径方向に温度差を与え、さらに観測水の水面を暖めることで下層に対流圏にあたるロスビー波の流れ、上層に成層圏にあたるハドレー流の流れを作ることに成功した。本年度は、ドリフトする対流圏波動が成層圏への浸透によりどのような影響をもたらすかを基礎的に調べる実験をした。成層圏における流れの解析には、準地衡風的渦度方程式が使われるが、この方程式によれば、成層への波動の浸透は指数的に減衰し、減衰の速さは波数が大きいほど早い。第一に、これを検証する実験をし、極めて良い精度でこのことが成り立つことを確かめた(Tajima et al.,Exp. Fluidsに発表予定)。第二に、波数4について流速、内外壁の温度差などの詳細な観測をした。その結果、(1)成層へ浸透した波動流は、極側にあたる内壁が外壁よりも暖かくなるように半径方向の温度差を生成すること、(2)波動流の位相速度が平均水平流と一致する臨界層付近では、平均水平流の減衰が弱まること、(3)臨界層のすぐ上には回転方向と逆に流れ、臨界層の下の波動とは位置が半波長ずれた波動が表れること等を発見した(Tajima et al.,J.Atmos. Sci.に投稿中)。特に、(1)の結果は、結果的には、成層圏突然昇温と似た現象と言える。これらの実験は、テキサス大学Center for Nonlinear Dynamicsの回転水槽実験グループを10日間訪問し、我々の実験について講演・議論し、準地衡風的渦度方程式に基づく数値解析をした。オックスフォード大学のRead教授を20日間訪問し、我々の実験に重要なベータ効果を取り入れた実験について議論すると共に、波動流の成層への浸透における臨界層での現象について議論し、上記(3)の結論を得た。韓国公州大学校自然科学大学大気科学科の蘇教授のグループを4日間訪間して、我々が計画している実験について講演し、共同実験を進める議論をした。

本研究の目的は、従来の大気大循環を再現する回転円筒水槽実験において、回転円筒水槽の下層で対流圏に当たる波動流を生成し上層で成層圏に当たる安定成層を作り、波動流の上方への伝播を調べたり、成層圏周極渦に当たる密閉性の強い渦の生成を試みることである。我々は円筒水槽(水深1315cm)の底の厚さ3cmの層に半径方向の温度差を与えて波動流を生成し、水面を暖めることにより5cm以上の上層は温度が高さとともに上昇する安定成層を作ることに成功した。本年度は、上層における半径方向の内外壁の温度差、子午面の温度分布、円周方向の流速を測定した。その結果、半径方向の内外壁の温度差は下層で対流を生成するために加えた温度差とは反対で、温度は内壁で高く外壁で低い。円周方向の流速は上層で高さとともに減衰する。温度差と流速の高さ変化は温度風の関係にあることを、子午面の温度分布の測定によって正確に示した。また、水面を暖めないで上層を成層状態にしないと、下層の対流層には安定した軸対称流や波動流が生じないことを示した。これらの結果を総合すると、上層で半径方向の温度差が下層と反対になっているのは、温度風の関係から上層での流れが高さとともに減衰していることを示し、そのために下層の対流層で安定した軸対称流や傾圧波動が生成される。従って、下層の対流層で安定した軸対称流や傾注波動が生成されるためには、上層が強い成層状態になっていることが必要であることが示された。この結論を実際の大気に適用すると、オゾン層が紫外線を吸収して上層の大気が成層圏を作っていることが、対流圏に安定した大気循環が生成するために不可欠であることを意味する。成果は論文にまとめ、Journal of Atmospheric Scienceに投稿中である。
輸血製剤への応用を目指したネコ多能性幹細胞の培養および血液分化技術の開発

ES細胞とiPS細胞をネコで作製し、それを血液細胞へ分化させることを目的として、以下の成果を得た。1ピエゾマイクロマニピュレーターを用いた顕微授精でネコ胚盤胞期胚を作製し、ネコES細胞コロニーの作製に成功した。2ネコLIFを大腸菌で作製し、その機能を確認した。3ネコ胎子線維芽細胞にレトロウイルスを用いてOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycの4遺伝子を導入し、ネコiPS様細胞株の樹立に成功した。4ネコ体細胞にセンダイウイルスを用いて初期化遺伝子を導入し、ネコiPS様細胞株コロニーの作製に成功した。5ネコiPS様細胞からマクロファージと赤芽球系の血液細胞へ分化させることができた。ES細胞(胚性幹細胞)とiPS細胞(人工多能性幹細胞)をネコで作製し、これらを血液細胞に分化させるために、本年度は以下の研究成果を得た。1.顕微授精からのネコES細胞株の樹立ネコ未成熟卵子と精子を用いてピエゾマイクロマニピュレーターで顕微授精を行った。各種条件を検討することで、ピエゾマイクロマニピュレーターを用いた顕微授精によって、効率的に胚盤胞期胚を作成することに成功した。さらに、胚盤胞期胚からネコES細胞の初代コロニーを得ることに成功している。2.ネコiPS細胞から血液前駆細胞の分化誘導昨年度に樹立に成功したネコiPS細胞株を用いて、血液細胞への分化を試みた。すなわち、ネコiPS細胞を浮遊培養し、これらの細胞を分化させることで胚様の形態をした細胞塊(胚様体)を作製した。次に胚様体を各種サイトカインを用いて培養したところ、コロニーアッセイ法において赤芽球性前駆細胞であるBFU-Eに形態が類似したコロニーが確認された。以上のことから、作製したネコiPS細胞が血液系細胞に分化することを証明した。ES細胞(胚性幹細胞)とiPS細胞(人工多能性幹細胞)をネコで作製するために、本年度は以下の研究成果を得た。1.顕微授精からのネコES細胞株の樹立未受精卵子と精子を用いて体外受精を行った。培養時の酸素濃度を20%と5%に調節して、体外成熟、体外培養を行い比較検討を行った。その結果、体外成熟では20%、体外培養では5%の酸素濃度が適した培養環境であることがわかり、胚盤胞期胚が多く得られた。次に、ピエゾマイクロマニピュレーターを用いた顕微授精を行ったところ、顕微授精を用いても胚盤胞期胚まで成長することが明らかとなった。これらの結果より、ES細胞株樹立に必要な受精卵を大量に作製する準備が整った。2.ネコiPS細胞株の樹立ネコ胎子線維芽細胞にレトロウイルスを用いてマウスOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycの4遺伝子を導入した。その後、ウシ胎子血清(FBS)添加ヒトES培地で培養したところ、45継代以上維持が可能なネコiPS様細胞株が得られた。樹立した細胞株はヒトiPS細胞と類似した形態を示した。また、未分化マーカーを発現し、継代数の多いものでは導入遺伝子は検出されず、すべての継代数でNanog遺伝子は検出された。さらに各胚葉のマーカーに陽性を示す細胞へ分化した。核型は2n=38 XY型を示し、長期継代後も正常であった。3.ネコLIFの作製:クローニングにより609 bpのcDNAを得た。成熟タンパク質に相当する配列は540 bpであり、ヒトLIFアミノ酸配列と90%が一致した。SDS-PAGEにより目的タンパク質の予想分子量である70 kDa付近にバンドを確認した。さらにThrombinによりタグ配列を除去し、ネコLIFの予想分子量である20 kDaのタンパク質を分離した。作製したネコLIFはマウスES細胞の未分化性を維持し、TF-1細胞の増殖を促進した。ES細胞(胚性幹細胞)とiPS細胞(人工多能性幹細胞)をネコで作製し、これらを血液細胞へ分化誘導させるために、本年度は以下の研究成果を得た。1.顕微授精からのネコES細胞株の樹立:本研究室で作製したネコ組換LIFを用いてネコ未成熟卵子を培養したとろ、成熟率が増加することが分かった。また、前年度までにネコ未成熟卵子と精巣上体精子を用いてピエゾマイクロマニピュレーターで顕微授精を行い、胚盤胞期胚を効率的に作製できることが確認されたため、本年度はより未成熟な精子細胞である精巣内精子および伸長精子細胞を用いた顕微授精を行った。