hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質及び必須脂肪酸代謝に及ぼす各種食事**の調節機構

本研究は、必須脂肪酸の内、n-6系列のアラキドン酸(AA)、n-3系列のエイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)の代謝に対して、同時にゴマのリグナン化合物の1つであるセサミンとエピセサミンを等量投与することで、どのような代謝の調節作用が起き、その際のゴマリグナンの作用機構を解明することを目的とするものである。そのために、1).生体試料についてセサミンとエピセサミンの同時定量法を確立し、それらの体内動態を測定すること。2).AAまたはEPAを動物に投与した時に起きる代謝変動に対して、セサミンやエピセサミンがどのような影響を与えるか検討すること。3).DHA投与時の代謝変動へのセサミンの効果などを検討した。最初の検討項目であるセサミンとエピセサミンの代謝については、これらの化合物は容易に吸収されるが、24時間以内に、血液や臓器中から急速に消失することから、セサミンの必須脂肪酸代謝への効果は、それらの代謝物によることが判明した。また、エピセサミンよりも、セサミンの代謝がより速いことも確認された。次に、AAとEPA投与により、生体内の脂肪酸組成は大きく影響されることが明確にされた。特に、AAの大量投与により、肝臓はかなり強い影響を受け、正常状態でなくなるが、セサミンはこのような代謝変動を正常化し、各組織でのAA濃度を低下させる。同様に、EPA投与でも、急激な臓器でのEPA濃度の上昇をもたらすが、セサミンはこのような変動に対しても、生体の恒常性を保つように機能し、本来その動物がもっている正常範囲内にEPA濃度を維持するように機能した。従って、セサミンは両系列の必須脂肪酸の代謝を調節するように機能した。本年度は、2つの観点から研究を行った。1つはセサミンの脂肪酸代謝への影響を与える機構の解明のために、セサミンの生体内での代謝について検討した。本研究に用いているセサミンはセサミンとエピセサミンの等量混合物であるために、それぞれの同時定量法を行うために、HPLC法での定量法を確立した。そして、両セサミンを経口的に8週間連続投与した時の肝臓内でのセサミンの動態及び胃内に1回投与したセサミンの吸収をリンパカニュレーション法で調べると共に、1回投与後の各種臓器内でのセサミンの動態を経時的に検討した。その結果、吸収時にはセサミン、エピセサミン共に同様に吸収されるが、肝臓内ではエピセサミンに比べてセサミンの代謝がより速いことが示され、両セサミン共に24時間内に速やかに代謝されることが明らかになった。この結果より、セサミンの脂肪酸代謝への生理作用はセサミンの代謝物が行っている可能性が高いことが示唆された。次に、n-6系のアラキドン酸投与時におけるセサミンの効果についても検討を加えた。アラキドン酸(AA)を飼料中40%含むような高AA食をラットに投与すると、AAによる過剰の害が観察されたが、同時にセサミンを投与することで、このような害は防がれることが認められた。また、先に行ったn-6系の20:5(EPA)投与ではセサミンがEPA過剰投与によるn-6/n-3比の低下を改善したが、AA投与に際しても、AAの過剰摂取によるn-6/n-3比の大きな上昇を抑制した。これらの結果はセサミンが食事由来の必須脂肪酸、特にn-6、n-3両系列脂肪酸の代謝を調節し、生体が本来もっている適正なn-6/n-6比を保たせるように働くことが確認され、その機構は主にセサミンの代謝物が担っているものと推測された。これらの結果は本年の日本農芸化学会大会(4月,東京)で発表の予定である。

従って、セサミンは両系列の必須脂肪酸の代謝を調節するように機能した。昨年度までの研究成果に基づき、本年度は2つの視点からの研究を行った。1つはラットにn-3系列のドコサヘキサエン酸(DHA)を投与した時の効果を先に報告したアラキドン酸(AA)とエイコサペンタエン酸(EPA)投与の場合と比較し、その際のセサミンの効果を比べた。その結果、DHAの場合もEPAと同様に、セサミンを同時に投与する事で、DHA投与により低下したn-6/n-3比を上昇させることが確かめられた。また、このようなセサミンの生理作用はDHAから逆変換されてできるEPA量の減少に基づくものである事が認められた。次に、セサミンの生理作用がその代謝産物によることが昨年度の研究で明らかにされているが、その作用機作が脂肪酸のβ-酸化の促進によることが血液中のケトン体測定から推定されたので、EPAまたはAAを投与したラットの肝臓のミトコンドリア及びペルオキシソームのβ-酸化に関係する酸素活性を測定し、セサミンの代謝産物が脂肪酸のβ-酸化に関係する酵素活性を誘導するかどうかを調べた。その結果、EPA、AA投与の両群において、いずれもミトコンドリアとペルオキシソームでの関係酵素活性の有意な上昇が観測された。特にペルオキシソームでの酵素活性は3倍近くに上昇した。これは、セサミンによるβ-酸化の促進効果の主体はペルオキシソームであることを示唆するものであろう。このことは、セサミン投与による体内でのn-6/n/3比の変動は、過剰に投与した当該脂肪酸あるいはその代謝産物のβ-酸化による分解促進によることが確かめられた。これらの成果は、この4月に開催される日本農芸化学会の大会で発表する予定である。本年度は、本研究の最終年度に当たるため、セサミンの効果の1つであるβ-酸化の昂進機構の解明に焦点を置いた。この視点での研究に際して、投与した脂肪酸はn-3系列脂肪酸の最終産物であり、その生理機能が注目されているドコサヘキサエン酸(DHA)を用いた。そして、肝臓中の脂肪酸のβ-酸化系の酵素活性へのセサミンの影響を明らかにしようとして検討を行った。5週齢の雄のWistar系を用いて、対照群としてコーン油群、DHA群を設定し、それぞれにセサミン投与群を設けた。2週間の飼育期間後、ラットの肝臓のホモジェネートを分画し、ミトコンドリア画分とペルオキシソーム画分を得た。それぞれについて、β-酸化に関係する酵素活性の測定を行った。また、基質には、飽和脂肪酸とアラキドンなどのCoA誘導体を用いた。その結果、長鎖脂肪酸のβ-酸化において主体的に働くと考えられているペルオキシソームのアシルCoAオキシダーゼ活性はDHA投与又はセサミン投与で上昇すること、また、この2つのものを同時投与することで、その活性の増大はより高くなることが確認された。また、セサミンの作用を明確にするために、セサミンの体内での代謝をラットの血液についてHPLC法で調べた結果、セサミンの代謝は極めて速く、セサミン自身よりは、セサミンから誘導される代謝物がこれらの脂肪酸代謝調節を行う活性本体であることが明らかにされた。同様に、DHA自身もこれらの酵素活性を上昇させることから、アラキドン酸DHA.EPAのような長鎖の脂肪酸自身も、体内で燃焼され、エネルギーに変えられやすいこと、セサミンはそのような作用を昂進させることが明らかにされた。
働く新生鎖の生理機能と分子機構

枯草菌翻訳アレスト因子MifMは自身を合成するリボソームと相互作用することで翻訳アレストをひき起こす。この相互作用はアレストモチーフのN末端側からの引っ張り力によって解除される。この「引っ張り力感受性」を利用し、細胞内において新生鎖が翻訳途上で受ける引っ張り力を網羅的に調査する試みを進めている。MifMの翻訳アレストモチーフと枯草菌タンパク質の様々な領域を融合したライブラリを作成し、その中から翻訳アレストを解除するとおもわれるものを、lacZレポーターを用いた系で多数単離した。これらについて、アレスト解除が実際に起こっているかどうかの確認実験と、それが確認できたものの中から幾つかについて、翻訳アレスト解除のトリガーとなる動的挙動の同定を行った。中には、翻訳の途上で他の細胞質タンパク質と複合体形成を行う際に、アレスト解除をひき起こす引っ張り力を生み出していると思われるものも複数得られたことが示唆されつつある。バイオインフォマティクスを駆使した網羅的なゲノム解析から、新規翻訳アレスト因子の候補として三種類の因子を同定した。大腸菌、枯草菌のin vivoならびにin vitro翻訳系を用いた解析から、これらが、いずれも特定の生物種において翻訳アレストをひき起こすことが示唆された。これら新規翻訳アレスト因子のひき起こすアレストの分子機構について明らかにするため、各種変異解析を行った。その結果、翻訳アレストに重要と思われるアミノ酸残基が徐々に明らかになってきた。興味深いことに、これら三種類のアレスト因子のアレストに重要な役割を果たすと思われるアミノ酸残基の配列には一部類似性も見られた。今後、さらなる変異解析から、翻訳アレスト配列の収斂進化の可能性を検討する必要がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年から、新学術領域研究の補助を受け、「はたらく翻訳途上鎖の生理機能と分子機構」の解明を目指し、研究をスタートさせた。全てのタンパク質はリボソームで合成される。合成途上鎖(新生鎖)は、タンパク質の合成中間体であり、過渡的であり動的である。また、機能を持たない未成熟な存在であると見なされ、機能に着目した研究の対象外であった。我々は、翻訳の途上で自身の合成を一時停止(アレスト)させることで、新生鎖の状態で機能するタンパク質を過去に見出した。例えば、大腸菌SecMは、タンパク質の分泌装置をモニタリングして分泌モーターSecAの発現を調節する因子であり、枯草菌MifMは、タンパク質の膜組込のモニタリングを行う。本研究では、これらのアレスト因子のアレスト機構を明らかにすべく、その根幹である新生鎖-リボソーム相互作用を明らかにしようとしている。この相互作用はユニバーサルなものではなく、種によって固有であることが以前示唆された。遺伝学を駆使し、リボソームトンネル内のL4やL22が、種特異的な新生鎖-リボソーム相互作用に重要であることを見出した。特に、L22の90番目の残基の種特異性に対する重要性が明らかになった。共同研究により、MifM-リボソーム複合体の構造も解かれ、新生鎖-リボソーム相互作用の詳細な理解が進んだ。翻訳アレスト解除機構に関しては、SecMの翻訳アレストの解除に重要な領域として、分泌シグナル以外の領域が新たに同定された。その領域に相互作用する可能性のある因子の同定を、架橋実験を用いて進めている。本研究課題では、「はたらく新生鎖の生理機能と分子機構」の解明を目指している。以前、我々は、翻訳の途上でリボソームのトンネル内成分と相互作用することで、自身の翻訳伸長を一時停止(アレスト)させる因子を見出した。この翻訳アレストは、タンパク質の局在化装置の監視やその量的・質的制御に重要な役割を果たしていることがこれまでの我々の研究から明らかにされてきたが、その全貌は未だ未解明のままである。また、一般的なプロテオームメンバーが、翻訳途上鎖の状態で自律性を発揮し、自身の翻訳伸長速度を調節することで、その成熟や局在化に影響を与えるとの新たなパラダイムが生まれつつある。このような背景を受け、2015年度は、まず、枯草菌MifMとリボソームとの相互作用の全貌解明に向け、ドイツ・ミュンヘン大学のDaniel Wilson博士らとの共同研究で、MifMとリボソーム複合体の構造解析を行った。また、これまで解析がなされてこなかった、リボソームトンネル外でのリボソーム-MifM相互作用の解析を行った。その結果、MifMとリボソームのトンネル外領域成分との相互作用を含む多数の相互作用がMifMの翻訳アレストを安定化させていることを示唆する結果を得た。次に、東工大田口英樹教授らとの共同研究で、大腸菌プロテオームメンバーの網羅的な翻訳伸長プロファイルの解析を行ったところ、ほとんどのタンパク質は、合成途上の段階で翻訳伸長がポーズすることが明らかとなり、実際の翻訳において、翻訳伸長が一定速度で進行することはむしろまれであることが明らかとなった。京大森博幸准教授らとの共同研究においては、森らが海洋性ビブリオ菌で見出した新規翻訳アレスト因子VemPの分子機構を生化学的に解析し、森らによる結果と併せて、VemPが、リボソームのペプチジル転移反応を阻害することで翻訳アレストを引き起こしていることを示した。2014年度から2015年度にかけて、MifM-リボソーム複合体の構造解析が大きな進展を見せ、MifMの翻訳アレストの分子機構の詳細が明らかになりつつある。

この共同研究により得られた知見の幾つかは、申請当初予想していなかった重要なものであり、共同研究を介した構造解析以外の手法からたどり着くのはおそらく困難な知見であったため、当初の計画以上の進展といえる。また、2015年度は、東工大田口英樹教授らとの共同研究や、京大森博幸准教授らとの共同研究が大きな進展を見せた。いずれも、新学術領域の班員間での共同研究であり、各研究室がおのおの得意な技術を提供し合った結果、申請当初の予想以上に研究がスムーズに進行し、大腸菌プロテオームメンバーのほとんどが翻訳伸長時にポーズを経験するというインパクトのある知見や、新規アレスト因子の発見とその分子機構の理解の進展という、それぞれに重要な結果が得られた。新学術領域の班員同士の共同研究が生み出した成果という点でも意義深い。我々は、翻訳の途上で生理機能を発揮する新生鎖である枯草菌MifMや大腸菌SecMを発見し、以来、新生鎖の生理機能と分子機構の解明を目指して研究を行ってきた。枯草菌MifMは、そのC末端付近の特定のアミノ酸配列(アレストモチーフ)を介して自身を合成するリボソームに働きかけ、そのPTC付近やペプチド鎖排出トンネルにあるリボソーム成分と相互作用することで自身の翻訳伸長をアレストする。また、N末端にある膜挿入シグナルがYidC依存的に膜挿入されると、おそらくそれに伴う「引っ張り力」によって、翻訳アレストが解除される。前年度に行った研究から、MifMが、これまで見出されていなかった新たな相互作用を介して翻訳アレストを安定化させていることが示唆された。この相互作用は、アレストモチーフよりもさらにN末端側にある領域とリボソームの表面との相互作用を含むものであることが示唆された。網羅的な変異解析から、この相互作用が比較的弱い相互作用の集合によって補完されているものであることも示唆されつつある。SecMやMifMのアレスト解除はそれぞれの持つN末端領域が細胞装置に引っ張られることで引き起こされることが示唆されている。N末端領域の改変により、アレストモチーフを力学センサーとして利用することが可能であると考え、その領域のシステマティックな改変を行っている。トランスポゾンを利用した方法が有効であるとの予備的結果が得られつつある。SecMのアレストモチーフとN末端シグナル配列との間に、アレスト解除に必要なエレメントが存在することを以前見出した。その領域と相互作用する因子をin vivoならびにin vitroの架橋実験から探索しており、現在、ターゲット候補が絞られてきた状況である。MifMの翻訳アレストに必要な領域の全体像を解明する試みから、MifMの翻訳アレストの安定化に寄与する新たな相互作用の存在が明らかになりつつある。網羅的な変異解析から、この相互作用の持つ性質も分かりつつあり、リボソームと新生鎖の相互作用が広範囲にわたるものであることが見えてきた。これまでほとんど注目されてこなかった、翻訳伸長速度の制御における新生鎖とリボソーム表面成分との相互作用がこれらの解析から浮かび上がってきたことは意義深い。
太陽周期活動の予測とその地球環境影響の解明

太陽磁場精密観測グループは、衛星・地上の先端的観測データの高度処理を進めるとともに、ベルギー王立天文台による黒点相対数の大改訂を受けて、我が国のアーカイブデータとの比較検証を行った。また、太陽周期予測数値計算グループは、太陽極域磁場と次の太陽周期活動との非常に高い相関関係に基づいて、表面磁束輸送モデルで次期太陽極域磁場を推定し更に太陽周期活動予測をする手法を確立した。そして次期サイクルの活動が現在のサイクル24の70%程度の低さになるという予測結果を得た。この結果を論文発表するとともに、名古屋大で国際ワークショップを主催して、次期周期予測の国際相互比較を行い、予測手法の精緻化に向けて議論した。太陽放射変動グループは、乾板太陽画像データのデジタル化・較正処理を行い、20世紀半ばの太陽活動変動のデータ解析を行って、導出したプラージュ・インデックスは電波放射変動と相関が高いことを明らかにした。また、宇宙線変動グループは、マウンダー極小期に発生した宇宙線強度異常増加イベントを高精度かつ絶対年代で決定するため、樹木年輪中の炭素14の高精度分析を行った。さらに、国際共同研究でトラバーチン堆積物中の宇宙線生成核種・ベリリウム10による宇宙線強度変動の復元を開始した。地球システムモデル計算グループは、MRI地球システムモデルを用いて産業革命前と完新世中期の古気候再現実験を行い、ミランコビッチ周期による日射量変動に起因した気候変化を定量的に評価した。成層圏オゾン化学過程の扱いに依存して、南極域地上気温変化に最大1.7度の差が生じることを発見し、成層圏化学過程の重要性を初めて指摘した。次期大気海洋結合モデル相互比較プロジェクトCMIP6のための計算も順調に進んでいる。また、高エネルギー粒子降下による中層大気化学過程等への影響についても、素過程モデル開発と化学-気候モデルへの導入を進めた。次期太陽周期予測関係では、次期太陽活動極大の予測の準備段階として、国立天文台で長期継続観測している各種データの整備が進み、「ひので」衛星等の磁場データを用いた主要パラメータを求めるツールが完成した。また、太陽全球表面磁場の時間発展を解く表面磁束輸送計算コード開発が終わり、観測結果から太陽極小期の極域磁場を予測し更に次のサイクルの太陽活動度の予測する手法を確立できた。これで、次期サイクルの予測に関する基本目標はすでにほぼ達成しており、当初の計画を上回る成果を得ることができた。太陽放射変動・宇宙線変動関係では、太陽彩層画像の乾板データを較正し、プラージュ・インデックスと呼ばれる太陽紫外線強度の指標を導出できるようになった。また、樹木年輪よび氷床コアの宇宙線生成核種の単年分解能での精密測定が進んだ。太陽活動変動気候影響関係では、MRI地球システムモデルの性能検証のため古気候再現計算を行い、ミランコビッチ・サイクルによる日射量変動に起因した気候の変化を定量的に調べ、地表の気候変化に対して成層圏オゾン化学過程の重要性を初めて指摘することができた。また、高エネルギー粒子降下に伴う化学効果を導入し、過去事例で感度実験を行って、本格実験を開始できる段階となった。次期太陽周期予測関係では、太陽磁場観測データ等を用いて主要パラメータの10年スケール時間変動の解析を進め、開発してきた表面磁束輸送モデルをさらに改良し、太陽全球表面磁場の時間発展を解いて、予測した極小期の極域磁場をもとに第25太陽周期の予測を行う。太陽放射変動・宇宙線変動関係では、較正済み太陽彩層画像乾板データアーカイブから太陽紫外線強度を推定し、地球高層大気応答との対応調査を進める。また、樹木年輪、氷床コアの宇宙線生成核種を単年分解能で精密分析して、小氷期における太陽活動周期及び宇宙線強度変動の詳細解析を進める。太陽活動変動気候影響関係では、太陽高エネルギー粒子によるNOx, HOx生成過程を導入したMRI地球システムモデルを用いて、次期大気海洋結合モデル相互比較プロジェクトCMIP6に準拠した実験を進める。また、775年の三宅イベントを事例として、14C、10Beの移流実験を行い、地質学的試料分析研究との共同研究を推進する。さらに、上記基本目標に加えて、マウンダーミニマムのような極端な状況を作り出す原因を、観測データ解析、試料分析、数値実験から探り、発展目標の達成をめざす。国立天文台(三鷹)の赤外スペクトロポラリメータを運用し、次期太陽サイクルの予測に用いる太陽磁場精密データの観測を継続した。また、紫外線放射量の指標となるカルシウムK線画像のデジタル化や、国内観測による黒点相対数、プロミネンスの緯度分布、大気光強度などのスキャン作業も実施した。太陽周期予測数値計算グループは、サイクル24の極域磁場をもとに次期太陽サイクルの活動度を予測する5年前予測を試みた。表面磁束輸送モデルの数値計算コードを開発し、ひので、SDO、地上観測データを入力して、太陽極小期の極域磁場を予測し、従来よりも早い段階での次期太陽サイクル予測手法を開発中である。太陽放射変動グループは、飛騨天文台フレア監視望遠鏡によるHα線画像を用いて、19922012年の彩層画像からプラージュ・インデックスの導出を行った。また、データの較正処理や再スキャンの作業を行って、特に、分光スリット幅のムラや、スリットスキャン中の天候変化などによる、筋状模様の除去プログラムを開発して、較正を行った。宇宙線変動グループは、マウンダー極小期周辺に発生した宇宙線強度異常増加イベントの年代を決定するため、加速器質量分析計で炭素14濃度の高精度分析を行った。

また、小氷期について屋久杉、伊勢スギの酸素同位体比の測定を行い、中部日本および屋久島での降水環境の復元を行った。さらに、中国華東師範大学と、トラバーチン堆積物中の宇宙線生成核種・ベリリウム10による宇宙線強度変動の復元に向けての共同研究を開始した。地球システムモデル計算グループでは、気象研究所地球システムモデルの大気化学過程に高エネルギー粒子降下に伴うHOx、NOx生成を行うパラメタリゼーションを導入し、化学気候モデル相互比較実験にてソーラープロトンの効果に関する再現実験を行った。高精度雲モデルの高度化として太陽高エネルギー粒子の影響を取り込むための取り組みを開始した。太陽磁場精密観測グループの研究計画はおおむね順調に進展している。磁場観測装置の較正を扱った論文はSolar Physics誌に投稿し改訂中であるが、カルシウムK線画像のデジタル化などは予定より早く完了した。太陽周期予測数値計算グループでは、表面磁束輸送モデルの数値計算コードを開発し、テストをおこなった。本格的な研究は2016年度に行う。また、観測データから計算に必要な物理量(差動回転、子午面循環流など)を導出する基本的なツールの作成・整備をおこなった。太陽放射変動グループは、データの較正処理や再スキャンなど、乾板データからプラージュ・インデックスを導出するのに必要な作業を予定通り推進している。また、宇宙線変動グループも計画どおりに進捗している。地球システムモデル計算グループは、気象研究所地球システムモデルに高エネルギー粒子に伴うNOx、HOx生成過程を導入して、標準的な化学気候モデル相互比較実験で、ソーラープロトンの効果を取り込んだ過去再現実験を行った。また、高精度雲モデルに雲電荷過程の効果を取り込むための取り組みを開始した。太陽磁場精密観測:ひので衛星の可視光望遠鏡複数スキャンから広領域磁場データを得るモザイク観測を実施し、ひので国際会議で発表した。国立天文台と、中国科学院北京天文台が運用する磁場観測装置とのデータの相互比較論文を発表した。また、2015年の黒点相対数の大改訂を受けて、国立天文台等の1930年代からのデータとの比較検証を行った。太陽周期予測数値計算:次太陽周期活動と前サイクルの太陽極域磁場との非常に良い相関関係に基づいて、表面時速輸送モデルで次期太陽極域磁場を推定する研究を進めた。すでにモデル開発は完了し、実際に次期太陽サイクル活動の予測を行って、次期サイクルは現在のサイクル24の70%程度の活動サイクルになるという結果を得た。太陽放射変動:新たな較正方法の確立により、京大乾板データを科学的解析に耐えうる品質にまで向上させ、公開した。また、これを用いて、過去の太陽面におけるプラージュ領域の長期変動について解析を行った。宇宙線変動:太陽活動極小期における宇宙線変動を復元するため、樹木年輪中の炭素14濃度の高精度分析、及び、湖底堆積物中のベリリウム10の分析を開始した。また、宇宙線変動の気候影響解明のため、古気候データと気象データにより太陽周期への依存性等を検証した。
戦中・戦後の数学教育における進歩主義と本質主義の対立と共存に関する研究

戦中の数学教育を特徴づける数学教育再構成運動を中心に、数学教育における目標論、カリキュラム構成について、資料収集、分析を行った。数学教育再構成運動において作られた教授要目案とこれ以前の教科書を検討することによって、数学教育再構成運動における新たな視点や、そのもとにあった数学教育論を検討した。再構成運動の中心となった日本中等教育数学会において設置された数学教育再構成研究会が3地区で作った教授要目案には、指導内容に共通点が見られる事や、教授要目案の特徴として、具体的な事象との関連で数学の内容を取り上げることや、数学的な内容の繋がりが重視されていたことを明らかにした。また、数学と文化や数学とは何かという学習する対象である数学の意味や意義に対する考察が取り上げられていた事が、数学教育再構成運動の特徴であることを指摘した。この成果については、日本数学教育学会における研究大会において、研究論文「数学教育再構成運動における五種検定教科書から『数学第一類・第二類』への転換」として掲載および発表している。数学教育の歴史的変遷に見られる思想的対立や、そこにおける議論の成果をまとめる。数学教育再構成運動については、各地区の活動を具体的に分析する。この研究の方策については、日本数学教育学会の数学教育研究の展開を基に、他大学の研究者と意見交換をしながら進める。進歩主義と本質主義の対立を、1920年代1930年代の米国の数学教育に遡り、主な主張を調査した。その対立が日本の数学教育における目標論やカリキュラム論にどのように反映してきたかという視点で研究を進めた。このため、当時のNational Council of Teachers of Mathematics(全米数学教師協議会)やAmerican Mathematics Association(アメリカ数学会)、Progressive Education Association(進歩主義教育協会)における活動や主張を、当時の報告書や学会誌などを収集し、分類、整理している。また、分析の方法として、数学教育における戦前から戦後に至る論争史をレビューすることで、異なる数学教育に対する主張を特徴的に捉えるとともに、それらが主張された時代背景や教育会全体の動向から思想的な対立構造を捉えている。戦中の教授要目や戦後の学習指導要領および国定教科書『高等小学算術書』『尋常小学算術』『カズノホン』『初等科算数』『数学』や五種検定教科書、一種検定教科書、文部省著作教科書、戦後の検定教科書から,戦中・戦後の数学教育の変遷を整理する。特に、教授要目の改正や国定教科書の編纂においては、数学教育再構成運動の研究会記録などから、海外の数学教育の影響がどのようにあったかを分析する。この研究の方策については、日本数学教育学会の数学教育研究の展開を基に、他大学の研究者とも意見交換をしながら進めている。
ポリピロール・マイクロチューブの合成と特性評価

1)ポリピロール・マイクロチューブの自己生成条件の検討ピロールの電解の際、初期段階に導電性の膜が生成するが、電解時間を長くすると直径数十mm、長さ1^-数十mmの突起物が再現性よく膜に垂直な方向に自己生成する。この現象はp-トルエンスルホン酸ナトリウム以外の有機スルホン酸塩を電解質に用いた場合でも、また作用電極をITOガラスから白金箔に変えた場合でも観察される。この突起物を液体窒素で急速冷凍後切断して、SEMで観察すると、中は空洞でマイクロチューブであり、元素分析とラマンスペクトルの測定結果よりこのマイクロチューブが確かにポリピロールよりなることを明かにした。2)ポリピロール・マイクロチューブの白熱発光自己生成ポリピロール・マイクロチューブは、その両端に電流を流すと白熱発光する。この発光によってマイクロチューブの骨格のC/N比は、3.5から発光1分後に7.4に、10分後に14.2に変化する。ラマンスペクトルでは、ポリピロールの分子構造に由来するラマンバンドが消える一方、炭素材料に典型的なラマンバンドが現れる。一方、低温領域で電気抵抗の温度依存性を調べると、ポリピロール・マイクロチューブでは、測定した広い温度範囲でT^<1/3>の温度依存性を示し、発光したマイクロチューブでは、T^<1/20>の温度依存性を示した。3)ポリピロール・マイクロチューブの黒鉛化白熱発光中に黒鉛化が進行するかを確認するために、ポリピロール・マイクロチューブをアルゴン雰囲気中2500°Cで熱処理した。その結果、処理後のマイクロチューブの元素分析とラマンスペクトルの結果は黒鉛自身のものと一致した。また、黒鉛化したマイクロチューブは黒鉛と同様の温度依存性を示した。
手足口病ウイルスの白血球侵入機構に関する研究

エンテロウイルス71(EV71)は、主に乳幼児にみられる一般的な発熱性疾患である手足口病の主要な原因となる病原体である。本研究では、白血球に発現するシアロムチン膜蛋白質であり、炎症の初期段階できわめて重要な役割を果たすPセレクチン糖蛋白質リガンド1(PSGL-1)を、EV71の機能的受容体として同定した。PSGL-1のアミノ末端領域は、EV71と特異的に結合した。非感受性マウスL929細胞にPSGL-1を発現させると、EV71が侵入・増殖し、細胞変性効果を示すようになった。EV71分離株8株のうち5株は可溶性PSGL-1に結合し、PSGL-1はJurkat T細胞への感染のための主要な受容体として機能していた。他の3株のEV71分離株はPSGL-1を使用せず、白血球における分離株特異的EV71増殖機構の存在が示唆された。非白血球細胞ではEV71がPSGL-1非依存的に増殖し、EV71に対する別の受容体が存在することが示唆された。PSGL-1とEV71の相互作用の分子基盤を解明するため、PSGL-1変異体を作製し、EV71との結合に重要な翻訳後修飾を同定した。PSGL-1アミノ末端領域のチロシン硫酸化部位に変異を導入すると、PSGL-1とEV71の結合は阻害された。さらに、硫酸化阻害剤であるsodium chlorateはPSGL-1とEV71の相互作用を阻害し、Jurkat細胞におけるEV71増殖を阻害した。これらの実験から、PSGL-1アミノ末端領域のチロシン硫酸化が、白血球細胞におけるEV71の複製を促進することが示された。EV71受容体としてのPSGL-1の同定は、手足口病およびEV71が関連する他の疾患での細胞指向性や病態形成におけるPSGL-1陽性白血球の役割に新たな光を当てるものである。本研究の目的は、エンテロウイルス71(EV71)が白血球系細胞に感染する際に使用するレセプターを同定することである。本年度は、研究代表者が既にEV71レセプター候補として絞り込んでいたP-selectin glycoprotein ligand-1(PSGL-1)について、EV71レセプターの機能をもつかどうかを検討した。PSGL-1は主に白血球表面に発現するシアロムチンファミリー蛋白質で、セレクチンやケモカインとの結合により、初期炎症反応で重要な機能をはたす分子である。まず、EV71とPSGL-1との特異的結合をフローサイトメトリーで検討した。PSGL-1を細胞表面に発現していない細胞にPSGL-1を発現させたところ、細胞表面にEV71が結合するようになった。その結合は抗PSGL-1抗体で阻害された。さらに免疫沈降法にて、PSGL-1の細胞外領域からなる可溶性PSGL-1(PSGL-1-Fc)とEV71が共沈することを確認した。このように、EV71とPSGL-1が特異的に結合することを明らかにした。次に、EV71感染におけるPSGL-1の役割を検討した。EV71が感染しないマウス細胞にPSGL-1を発現させると、PSGL-1依存性にEV71が感染するようになった。さらに、PSGL-1陽性のヒトTリンパ

球細胞株におけるEV71感染は、抗PSGL-1抗体で阻害された。っまり、PSGL-1は、EV71と結合するのみならず、感染にもかかわる機能的レセプターであることを示した。以上のように、EV71の白血球系細胞におけるレセプターとして、PSGL-1を同定した。本研究成果は世界で初めてのEV71レセプター同定であり、Nature Medicine誌に発表した。手足口病を起こすエンテロウイルスの中でも特に重篤な症状を示すエンテロウイルス71型(EV71)に対する抗ウイルス薬・ワクチンは未だに開発されていない。その理由の一つは、EV71の細胞侵入機構(レセプター)が未知ということにあった。昨年度、EV71の白血球系細胞のレセプターとして、PSGL-1を同定し、PSGL-1アミノ末端領域にEV71が結合することを明らかにした。本年度はPSGL-1とEV71の結合機構を解明するために、PSGL-1側の結合領域をより詳細に解析した。PSGL-1と、本来のリガンドであるP-selectinとの結合には、PSGL-1アミノ末端領域のチロシン硫酸化およびO型糖鎖付加が必要である。これらの修飾の、EV71との相互作用における役割を解明した。具体的には、PSGL-1を発現していない細胞(293T細胞)にPSGL-1変異体を発現させ、EV71との結合をフローサイトメトリーで検出した。1)O型糖鎖付加部位に変異を導入し、糖鎖付加を阻害したPSGL-1変異体には、EV71が結合した。2)チロシン硫酸化部位に変異を導入し、チロシン硫酸化を阻害したPSGL-1変異体には、EV71が結合しなかった。3)チロシン硫酸化阻害剤存在下で培養した、野生型PSGL-1を発現する293T細胞には、EV71が結合しなかった。4)チロシン硫酸化阻害剤存在下で培養したJurkat細胞では、EV71増殖が阻害された。以上のように、PSGL-1とEV71の結合、およびPSGL-1依存性EV71増殖には、PSGL-1のチロシン硫酸化が必須であることを解明した。PSGL-1のチロシン硫酸化に依存するEV71感染機構の解析は、手足口病や中枢神経疾患等、EV71感染症の病原性発現の分子的基盤の解明に役立つことが期待される。
根端メリステムのパターン形成シグナリング

1.根端メリステムにおけるmiRNAの細胞非自律性センサーコンストラクトを持つ植物を用い、様々なマイクロRNA分子種について根端メリステム領域で細胞非自律的な機能をもつかどうか調べた。その結果、miR166,miR171,miR319,miR391など、対象としたすべてのmiRNAが細胞非自律的に機能し得ることが明らかとなった。2.胚発生におけるMIR165/166遺伝子の発現パターンと細胞非自律的機能シロイヌナズナのゲノムには、miR165/166を産生する遺伝子が9つ存在する。これらの遺伝子の胚発生における発現パターンを解析した結果、5つが胚柄と胚の下部-周縁部で共通した発現パターンを示すことが分かった。標的遺伝子であるPHBは、胚の頂端-中心領域で特異的に発現していたのに対し、miR165/166に抑制されない変異型PHBは胚全体で発現していた。これらのことから胚においてもPHBの発現領域がmiRNA165/166による転写後抑制で規定されていることが明らかとなった。また、胚においてもmiR165/166が細胞非自律的に機能していることが明らかとなった。根冠細胞の初期分化には、miR160によるARF10/16の転写後抑制が重要な機能を果たしている。miR160を産生する3遺伝子(MIR160A-C)の根端メリステムにおける発現を調べたところ、すべてが内皮より内側で発現していた。これに対し、miR160の活性領域は、内皮の外側にまで拡大していた。一方、ARF10/16は根冠細胞と表皮細胞で強く発現していた。この結果から、中心柱や内皮に由来するmiR160がARF10/16の発現を細胞非自律的に制御することで、根冠の分化を制御していることが示唆された。本研究課題では、様々な形質転換ラインを用いて、マイクロRNA(miRNA)の細胞非自律性の発現機構や発生生物学的な意義を多角的に解析した。miRNAが細胞非自律的に機能するメカニズムとして、原形質連絡(PD)を介したsymplasmic経路の関与が考えられる。最近の研究により、PDの透過性がcalloseの蓄積量で制御されることが明らかになりつつある。そこで変異型callose合成酵素遺伝子を根の内皮細胞で誘導的に発現させることでPDの透過性を阻害したところ、内皮由来のmiR165による中心柱での発現抑制機能が低下することが明らかとなった。この結果は、miR165自体がPDを通って細胞間移行していることを強く示唆している。また、miR165を根の細胞層特異的かつDEX依存的に誘導発現させる系を用いて、miR165の細胞非自律性に組織特異性が見られるかを調べた。その結果、miR165は根の内皮のみならず、中心柱や根冠などで特異的に発現させた場合でも、周囲の細胞に対して細胞非自律的に機能することが明らかとなった。この結果は、miR165の細胞間移行には内皮細胞に特異的な因子は関与しないことを示している。さらにMIR165/166ファミリーの全9遺伝子と、他のMIR遺伝子についても内皮細胞特異的な誘導発現システムを用いて細胞非自律性を解析した。その結果、MIR165/166のみならず、MIR319AやMIR171Aも根端メリステムにおいて細胞非自律的に機能することが明らかとなった。

根端メリステムや胚において、miRNA165/16が原形質連絡を通って、自由に細胞間を移行し得ることが明らかになった。またmiRNAの細胞間移行は、miRNA165/166に限らず、他のmiRNA分子でも普遍的にみられることが明らかとなった。これは、植物の発生制御におけるmiRNAの機能についてのこれまでの考え方を大きく改訂する重要な発見である。今年度の研究成果から、シロイヌナズナの根や胚において、様々なマイクロRNAが原形質連絡を通って比較的自由に細胞間移行していることが強く示唆される。これらの結果は、マイクロRNAを介した植物の発生制御についての従来の考え方を大きく転換するものであり、マイクロRNAの細胞非自律性が器官分化や組織パターンの形成に機能している事例が他にも存在する可能性を検証する必要がある。
気管支喘息モデルにおけるshRNA導入樹状細胞を用いた免疫療法の開発

骨髄由来樹状細胞にshRNAを導入する効率が極めて悪く、樹状細胞のcell lineであるDC2.4を使って、shRNAの導入した。導入効率は低かったが、骨髄由来樹状細胞よりも良好であった。さらにDC2.4の抗原提示能をin vitroで解析したが、T細胞の活性化やサイトカイン産生上昇が認められなかった。抗原刺激をしたDC2.4を使って、喘息モデルを作成を試みたが、メサコリンに対する気道過敏性亢進、好酸球性気道炎症、BALF中の2型サイトカインの上昇は認められなかった。以上より、この実験系で仮説を証明することは難しいとの結論に至った。実験動物としてC57Bl6マウスを使用し、抗原として卵白アルブミン(OVA)を使用している。骨髄由来樹状細胞の作成は、我々の以前の報告(Koya T et al. 2006, 2007, 2009)をもとに行った。shRNAはSanta Cruz biotechnology社のshRNAレンチウィルス発現システムを使用し、copGFP control plasmidをコントロールに用いた。shRNAの導入は樹状細胞培養過程で添加するだけで可能であるが、最適導入効率を探求するためにはさまざまな条件で行った。またshRNA導入された樹状細胞をpuromycinで選択する方法を用いて行った。しかし導入効率が極めて不良であり、また長期間の培養にも困難であることも判明した。Sorting技術を用いて、selectionする方法もあるが、Santa Cruz biotechnology社のshRNAレンチウィルス発現システムでは、標的shRNAにはGFPが付加されていないため、sortingを使用することはできない。また実際にCD86 shRNAを導入したが、発現の抑制は軽度で、骨髄由来の樹状細胞を使用する系では困難と判明した。そこでDC2.4というC57Bl6由来の樹状細胞cell lineを使用し、遺伝子導入を行っている。このcell lineはもともとco-stimulatory moleculeの発現が低く、抗原提示能も若干低いため、shRNAを使うよりも、遺伝子導入をし、強制発現させる系を作成中である。実験を手伝う大学院生の異動があり、実験のスケジュールが遅延したことが一つの原因である。しかし4月より新しい大学院生が実験を継続しており、人員的な要素は解消されている。その他に当初は骨髄由来樹状細胞を使用して、shRNA導入を試みていたが、いろいろ条件を設定したものの、導入効率が悪く、抗原提示機能を保持した状態で実験に使用することが困難なため、断念している。そのためcell lineを使って、一から実験を再開しているため、その条件設定に時間を費やしている。当初は3つの実験計画の柱を立て、推進する計画であった。1.骨髄由来の樹状細胞へのshRNAの導入→当初はマウスより骨髄細胞を採取し、GM-CSFとIL-4を使って、樹状細胞を作成し、shRNA (Santa Cruz biotechnology社のshRNAレンチウィルス発現システム)をトランスフェクションする予定であったが、遺伝子の導入効率は10%程度であり、トランスフェクションされた細胞をセレクションしている段階で骨髄樹状細胞の増殖が止まるため、shRNAの導入は成功しなかった。次に樹状細胞株DC2.4を使ってshRNAの導入を試みた。幾つかの条件を設定したのち、GFPを使った導入は効率良くトランスフェクションが可能となった。しかしcd80や86をターゲットにした場合には明らかなCD80, 86発現の低下を認めることはなかった。これはもともとDC2.4のCD80, 86の発現が低発現であることが考えられる。DC2.4自体は抗原提示能は存在しており、ナイーブCD4 T細胞との共培養で、抗原特異的Th2細胞を作成することができる。現在はCD80, 86よりPD-L1, PD-L2をターゲットにし、これらをDC2.4にトランスフェクションすることにより、よりtoleragicな樹状細胞を作成し、Tregを有意に誘導できるシステムを目標にしている。2. shRNA導入した樹状細胞とT細胞のin vitroでの培養とその解析→上述したように目的する分子を標的とした樹状細胞を作成できていないので、トランスフェクションによって機能改変できた樹状細胞との比較はできていない。今後の研究によりその部分を解析する予定である。3.導入した樹状細胞を使って喘息モデルへの応用、免疫療法への誘導→この部分に関しては進んでいない。まず実験系の確立に時間を要した。骨髄樹状細胞を使用した実験系からcell lineを使用した実験系に移行がスムーズでなく、培養に手間取った。実験を専属に行う大学院生、実験補助員の確保もままならない時期もあり、人的要素もあったが、これに関しては解消されてきている。当初の予定では、骨髄由来樹状細胞にshRNAを導入するよていであったが、予想されていたとおり、shRNA導入効率が極めて悪く、導入細胞は1%程度であった。なんとか条件を変えて、CD86に対するshRNAを入れたが、コントロールと比較して抑制効果は極めて、微弱で有り、このシステムではこれ以上の結果を期待することは無理と考えた。続いて、樹状細胞のcell lineであるDC2.4を使って、shRNAの導入した。さらにDC2.4の抗原提示能、すなわち抗原特異的CD4T細胞産生能が備わっているか、in vitroにてDC2.4とnaive CD4 T細胞を共培養し、抗原の有無によるCD4 T細胞の変化を解析した。

抗原刺激に伴い、CD25の発現は明らかに上昇しており、刺激が伝達されていると考えられる。しかしサイトカイン産生は低く、抗原刺激ののち、PMAとIonomycinの刺激を行った細胞内サイトカイン像であるが、サイトカインの検出は微弱であった。抗原刺激をしたDC2.4をナイーブマウスに気管より移入し、喘息モデルの作成を試みたが、メサコリンに対する気道過敏性亢進、好酸球性気道炎症、BALF中の2型サイトカインの上昇は認められなかった。DC2.4にCD80, CD86に対するshRNAも導入したが、元々発現量が高くないためか、ほとんど変化無く、明らかに差を見いだすことはできなかった。以上より、この実験系で仮説を証明することは難しいとの結論に至った。骨髄由来樹状細胞にshRNAを導入する効率が極めて悪く、樹状細胞のcell lineであるDC2.4を使って、shRNAの導入した。導入効率は低かったが、骨髄由来樹状細胞よりも良好であった。さらにDC2.4の抗原提示能をin vitroで解析したが、T細胞の活性化やサイトカイン産生上昇が認められなかった。抗原刺激をしたDC2.4を使って、喘息モデルを作成を試みたが、メサコリンに対する気道過敏性亢進、好酸球性気道炎症、BALF中の2型サイトカインの上昇は認められなかった。上述したように、樹状細胞のcell lineを使って実験系を作成しており、基礎的データはそろってきている。次の段階として遺伝子導入を予定しており、秋前までに遺伝子改変樹状細胞を作成する予定である。動物モデルはすでに完成されており、樹状細胞の調整ができしだい、in vivoの実験系に移行可能であるため、条件設定にしっかり時間をかけたい.まずcell line (DC2.4)を使用した機能改変樹状細胞を作成することが急務であるが、これに関しては作成目処が立っており、計画に沿って進める。その樹状細胞とのin vitroの培養実験と喘息モデルマウスへの移入実験は同時進行で行う予定である。マウスモデルはすでに確立されたモデルがいくつかあるため、一番適したモデルを使って、治療モデルを作成する予定です。最終年度になるので、結果を得るために、実験スケジュールを詰める必要があり、若干予算的に困窮する可能性があるが、試薬の共用したり、実験動物の適正使用を遵守することにより、進めて行く予定である。アレルギー学実験用途で使用したが、小額の残余がでたため、翌年に繰り越した。実験用途で使用したが、少額の残余がでたため、翌年に繰り越した。本年度と合わせて、実験消耗品および旅費に使用する。本年度と合わせて、実験消耗品として使用する予定である。
外的刺激に対する皮膚免疫応答における補体系の機能解析

病原体などの外的刺激に対する自然免疫応答は、宿主の生体防御機構として重要である。皮膚では外的刺激を受け上皮傷害を来すと、好中球や単球/マクロファージが浸潤して病原体の貪食や組織修復を行う。しかし、表皮由来因子の放出から炎症細胞浸潤へ至る真皮内の応答経路は不明である。補体系は、病原体の排除や貪食の補助機構と考えられてきたが、近年では様々な免疫調節作用が報告されている。申請者は、刺激因子であるドデシル硫酸ナトリウムの反復塗布で誘導される炎症細胞浸潤が、補体欠損マウスでは減弱することを見出した。本研究では、補体システムに着目し、上皮傷害によって誘導される皮膚免疫応答カスケードの解明を目指す。外的刺激に対する皮膚の免疫応答における補体系の関与を評価するため、代表的な刺激因子であるSDSを各種補体欠損マウスの皮膚に反復塗布した。まず、SDS塗布によって皮膚における補体C3の沈着を免疫染色によって確認した。次に、C3欠損マウスではSDS塗布による耳介腫脹に加えて、表皮肥厚ならびに好中球、単球といった皮膚への炎症細胞浸潤が減弱することを確認した。次に、近年免疫調整作用が報告されている補体成分C5aに着目し、C5a-C5aR1経路がSDSに対する皮膚免疫応答に関与するかどうかを検証した。SDSを塗布した皮膚においてC5aが産生されていることをELISA法により確認し、SDSを塗布した皮膚における補体の活性化が示唆された。さらに、C5aの特異的受容体であるC5aR1が欠損したマウスにおいてSDSに対する応答を評価した。その結果、C5aR1欠損マウスでは、C3欠損マウスと同様に、SDSによる耳介腫脹ならびに好中球、単球といった皮膚への炎症細胞浸潤が減弱することを見出した。一方で、われわれはSDS刺激による耳介腫脹や炎症細胞浸潤は好塩基球を除去することで顕著に減弱することを確認しており、SDS塗布に対する免疫応答が好塩基球に依存することが示唆された。C3欠損マウスやC5aR欠損マウスではSDS塗布による好塩基球浸潤も減弱していたことから、現在われわれはSDS刺激による皮膚への好塩基球浸潤に対して補体系か関与するのではないかという問を立て、検証を進める予定としている。現在われわれは、SDSに対する皮膚免疫応答に対する補体系の役割として、特にC5a-C5aR1経路に着目して研究をすすめているが、欠損マウスの繁殖に時間を要しており、十分な個体数を確保してのキメラマウス作製が想定よりも遅れている。今後は、どの細胞におけるC5a-C5aR1経路が重要であるかを明らかにするため、以下の方法でマウス実験を進める予定としている。1)まず、定常状態ならびに炎症時の皮膚におけるC5aR発現細胞をフローサイトメトリーで確認する。2)3)次に、放射線照射後の骨髄移植によって、野生型マウスあるいはC5aR1欠損マウスを各々ドナーあるいはレシピエントとして骨髄キメラマウスを作製し、C5a-C5aR1経路が放射線感受性の高い骨髄由来細胞で重要か、放射線耐性の間葉系細胞で重要かを確認する。1)のC5aR1の発現結果と、2)の骨髄キメラマウスの実験で候補となるターゲット細胞を絞り、ターゲット細胞の除去によってSDSに対する免疫応答が減弱するかどうかを確認する。最終的には野生型マウスから候補とした細胞をソーティングし、C5aR1欠損マウスへ移入することで、外的刺激に対する応答が回復するかどうかを確認する予定である。

一方で、われわれはSDS刺激による耳介腫脹や炎症細胞浸潤は好塩基球を除去することで顕著に減弱することを確認しており、SDS塗布に対する免疫応答が好塩基球に依存することが示唆された。C3欠損マウスやC5aR欠損マウスではSDS塗布による好塩基球浸潤も減弱していたことから、現在われわれはSDS刺激による皮膚への好塩基球浸潤に対して補体系か関与するのではないかという問を立て、検証を進める予定としている。現在われわれは、SDSに対する皮膚免疫応答に対する補体系の役割として、特にC5a-C5aR1経路に着目して研究をすすめているが、欠損マウスの繁殖に時間を要しており、十分な個体数を確保してのキメラマウス作製が想定よりも遅れている。今後は、どの細胞におけるC5a-C5aR1経路が重要であるかを明らかにするため、以下の方法でマウス実験を進める予定としている。1)まず、定常状態ならびに炎症時の皮膚におけるC5aR発現細胞をフローサイトメトリーで確認する。2)3)次に、放射線照射後の骨髄移植によって、野生型マウスあるいはC5aR1欠損マウスを各々ドナーあるいはレシピエントとして骨髄キメラマウスを作製し、C5a-C5aR1経路が放射線感受性の高い骨髄由来細胞で重要か、放射線耐性の間葉系細胞で重要かを確認する。1)のC5aR1の発現結果と、2)の骨髄キメラマウスの実験で候補となるターゲット細胞を絞り、ターゲット細胞の除去によってSDSに対する免疫応答が減弱するかどうかを確認する。最終的には野生型マウスから候補とした細胞をソーティングし、C5aR1欠損マウスへ移入することで、外的刺激に対する応答が回復するかどうかを確認する予定である。
タンパク質の配列アライメント法の改良とゲノム機能予測への適用

昨年度は、アミノ酸配列のアライメント法の改良を行った。改良したアライメント法の精度を評価したところ、既存の方法と比べて、アミノ酸配列の一致度が低い場合(30%未満)に、より正確なアライメントを得られることがわかった。本年度は、この改良したアライメント法をホモロジーモデリング法と組み合わせることで、タンパク質の機能部位の予測を行った。具体的には、らん藻の概日時計の中心的役割を果たしているKaiCに適用した。KaiCは、ATP依存的に6量体を形成し、自己リン酸化することがこれまでに明らかとなっている。6量体形成および自己リン酸化は、概日時計の振動に重要であると考えられているが、リン酸化されるアミノ酸残基およびリン酸化のメカニズムは明らかとなっておらず、またKaiCの立体構造も決定されていない。そこでKaiCのリン酸化部位を予測する為に、KaiCとアミノ酸配列の類似性があるDNAヘリカーゼの立体構造を基にして、KaiCの6量体構造をホモロジーモデリング法によって構築した。KaiCとDNAヘリカーゼのアミノ酸配列の一致度は30%を下回っている為、改良したアライメント法を用いることで、既存の方法よりも精度よいアライメントが得られることが期待された。構築したKaiCの6量体構造に基づき、リン酸化部位の予測を行った。名古屋大学の近藤孝男グループらが実験によって自己リン酸化部位を同定したところ、予測したアミノ酸残基が確かにリン酸化されることが明らかとなった。同定されたリン酸化部位は、6量体構造のサブユニット接触部位に存在しており、自己リン酸化が起こる為には6量体が形成される必要があること、および隣のサブユニットが結合するATPの加水分解によってリン酸基が転移されることがはじめて示唆された。ホモロジーモデリング法は、ゲノムにコードされた立体構造未知タンパク質の立体構造情報を得る有効な手段であるが、鋳型タンパク質と標的タンパク質のアミノ酸配列の一致度が低い(30%未満)場合、アライメントの挿入/欠失の位置を決めるのが難しいため、得られるモデルの精度が低くなるという問題点がある。本年度は、アミノ酸配列の一致度が30%未満である場合に、正確なアライメントが得られるように、研究代表者らが開発したギャップペナルティに溶媒露出度を取入れたアライメント法の改良を行った。まず、立体構造既知であるホモロガスなタンパク質のうち、アミノ酸配列の一致度が30%未満であるタンパク質ペアを収集し、ペアどうしの立体構造を重ね合わせて得られた構造アライメントを正解とした。次に、約2500通りのギャップペナルティパラメータで配列アライメントを生成した。これらのデータは磁気媒体に保存した。各配列アライメントを正解と比較し、最も正解に近い配列アライメントが得られるギャップペナルティパラメータを得た。この改良したアライメント法の精度を、既存の方法のうち最も精度の良い方法と比較したところ、挿入/欠失の位置を決定する精度が約11%向上していることがわかった。さらに、このアライメント法をホモロジーモデリングプログラムFAMS(Ogata, et al.(2000),J.Mol.Graph.Model.18,258-272.)と組み合わせ、国際立体構造予測コンテスト(CASP 5)の全自動ホモロジーモデリング部門に参加した。その結果、9サーバ中4位という成績であり、このアライメント法が他の方法と比べて遜色ないことがわかった。現在、このアライメント法をホモロジーモデリングに適用し、様々なタンパク質の機能部位の推定を進めている。
業務地区における必要歩行者空間の算出方法に関する基礎的研究

本研究では,都心の業務地区を利用する歩行者に必要な空間を確保するための調査・解析を行なった。調査は,業務地区での地上と地下の連絡路(段階)における歩行者流動の実態調査,業務地区での交差点における歩行者流動の実態調査を行なった。また,それぞれについて解析を行ない,地上と地下の連絡路における平均歩行速度,密度等の算出,ならびに交差点における平均歩行速度,待時間,密度等を解析した。また,地上と地下の連絡路における歩行者流動の実態調査では,階段だけしか扱えなかったので,地上と地下の連絡路の変わりに階段とエスカレーターが並列に設置されている地点として地上とスカイウエイの連絡路における歩行者流動の実態調査を行い,利用状況の変化を捉らた。しかしながら,実際に調査した結果は,数量的なものであるため,今後は,利用者の意識調査を行なうことにより,歩行者空間の必要性を明確なものに位置づける必要があると考えられる。