hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安全な自家造血幹細胞移植に向けたハイスルー・プット残存腫瘍細胞除去法の開発

白血病などの血液のガンにおける再発を伴わない自家造血幹細胞移植の実現に向けた、高精度で混入腫瘍細胞の除去を行うチップスケールのハイスループット混入細胞除去システムの基盤となる光学・マイクロ流体融合技術を開発した。具体的には、マイクロ流体チップ上に高速で流れる細胞を高速光学イメージング及び蛍光測定することにより、リアルタイムかつ高精度に膨大な数の細胞の分類を行う。この技術の開発は、研究代表者が推進中の内閣府革新的研究開発推進プログラム(ImPACT)の「セレンディピティの計画的創出による新価値創造」プロジェクトに吸収され、本研究で予定していたスペックを凌駕する技術を現在開発中である。自家造血幹細胞移植は白血病や多発性骨髄腫の治療に有効である。しかしながら自家造血幹細胞移植後のガンの再発など様々な問題が残されている。本研究では、ガン再発を伴わない自家造血幹細胞移植の実現を目指したハイスループット混入腫瘍細胞除去システム(Fluorescence-Activated Cell Purging)の開発を目的とする。平成25年度では当初の計画に従い光学実験系とマイクロ流体チップの開発と評価を行った。また、平成26年度開発予定であった測定機器による検出系の評価や電子回路のおおまかな作製も行った。平成25年度では、はじめに光学実験系とマイクロ流体チップ作製のために532nm連続波レーザー、ビームスプリッター、光電子増倍管、PDMSなどの備品・部品の購入を行った。備品・部品が到着後、光学実験系において前方散乱光と蛍光の検出用の系を設計・作製した。同時に細胞整列用マイクロ流体チップを作製・評価し細胞が一列に整列されることをハイスピードカメラによって確認した。そのマイクロ流体チップを光学実験系と組み合わせることで蛍光ビーズや染色されたマウス骨髄腫細胞の前方散乱光と蛍光をそれぞれ光検出器と光電子増倍管で検出・評価した。その後、細胞の前方散乱光・蛍光のそれぞれのシグナルを元に自作のアナライザを作製し、そのシグナルをフィルター、アンプ、ロジック回路にかけることで細胞破壊用の機械シャッターの駆動を可能にした。本研究の目的は、白血病などの血液のガンにおける再発を伴わない自家造血幹細胞移植の実現に向けた、高精度で混入腫瘍細胞の除去を行うチップスケールのハイスループット混入細胞除去技術システムの開発である。具体的には、このシステムは、注入された造血幹細胞グラフトの細胞一つ一つを蛍光測定し、獲得した信号に応じてレーザーによる目的腫瘍細胞の破壊を行う。具体的には、本研究期間中にこのシステムの大半の開発に成功した。システムの主要コンポーネントである光学実験系とマイクロ流体チップの開発と評価を行った。マウス骨髄腫細胞を実際の造血幹細胞および混入腫瘍細胞のモデルとして用い、検出系を評価した。また、測定機器と電子回路の開発とシステム全体の評価については、その一部であるアナライザーの作製・評価を行った。また、細胞を破壊する系の開発を行い、細胞破壊するための流速・レーザー強度などのパラメータの最適化を行った。同時に、作製したマイクロポストアレイのデバイスにサイズの異なったビーズを流すことで標的のサイズ別フィルタリングの性能の評価も行った。この装置の開発は、研究代表者が推進中の内閣府革新的研究開発推進プログラム(ImPACT)の「セレンディピティの計画的創出による新価値創造」プロジェクトに吸収され、本研究で予定していたスペックを凌駕する装置を現在開発中である。具体的には、レーザーで選択的破壊を行うのではなく、細胞ソーターを導入することで、非破壊で確実に目的の細胞を除去するための細胞同定情報処理チップの開発を行っている。非破壊で行うメリットは、細胞破壊の際にデブリが発生し、造血幹細胞ドラフトのコンタミを防ぐことである。本研究の成果に関しては、特許出願1件を行い、現在はジャーナル論文1本を準備中である。光科学研究計画において平成25年度で完了予定であった光学実験系とマイクロ流体チップの開発と評価は細胞を破壊する系以外はおおむね完了した。具体的には、マウス骨髄腫細胞を実際の造血幹細胞および混入腫瘍細胞のモデルとして用い、検出系を評価した。また平成26年度の計画である測定機器と電子回路の開発とシステム全体の評価については、その一部であるアナライザの作製・評価を行った。現在は細胞を破壊する系の開発につとめており、細胞破壊するための流速・レーザー強度などのパラメータの最適化を行っている。同時に、作製したマイクロポストアレイのデバイスにサイズの異なったビーズを流すことで標的のサイズ別フィルタリングの性能の評価を行っている。平成25年度に完了予定であった細胞破壊のパラメータ決定が完了していないものの平成26年度完成予定であったアナライザの開発がおおむね完了したので、細胞破壊のパラメータが決定されれば最終目標である細胞の選択的破壊・除去による装置全体としての評価が可能になるため、おおむね順調に進展していると判断した。

細胞破壊のための流速最適化などに向けてマイクロ流体チップの改良を行い、またレーザー強度調整に向けて光学実験系の改良を行っていく。同時に、細胞を効率よく破壊するために細胞に抗体を介して金ナノ粒子をドープすることも検討している。これらパラメータが決定した後には検出系と合わせて装置全体の評価に移行する。また、前方散乱光・蛍光のシグナルの検出を最適化するためにアナライザのさらなる改良も行っていく。装置全体の評価を7月中に終わらせ、その後に論文出版に移行する。研究費は、細胞培養などの生物実験系に必要な消耗品(フラスコ、ピペットなど)、自作アナライザ改良のための電子部品、マイクロ流体チップ作製に必要な消耗品(PDMSなど)に対して使用する。また共同研究者との打ち合わせや論文出版の経費も費用として計上する。
非極性溶媒中での静電反発を利用した螺旋状親油性高分子電解質の階層的構造制御

申請者は、溶液中で動的ならせん反転現象を示すことが知られているポリ(p-フェニルアセチレン)誘導体に対してクロロホルムなどの非極性溶媒中でも解離可能な親油性イオンを修飾したらせん状親油性高分子電解質の調製と分子集合体形成に伴う階層的構造制御を目指し研究を行なっている。本年度は、らせん状親油性高分子電解質の調製と静電反発が非極性溶媒中でのらせん反転現象に及ぼす影響に関して検討を行った。フェニルアセチレンのパラ位に光学活性を有するL-アラニンと長鎖アルキル基、末端にアジド基を修飾したモノマーL2を合成した。L2を単独もしくはアジド基を持たないL1とランダム共重合することでらせん高分子polyL2もしくはpoly(L1-L2)を調製した。これらに対して親油性イオンをクリック反応によって導入することによって、全てのモノマーユニットにイオン性部位が導入されたpolymL2と5mol%導入されたpoly(L1-mL2)を得た。高分子反応の進行はIRスペクトル測定によりて追跡し、イオン導入量は^1HNMRスペクトルの積分比から見積もった。次に、溶媒の誘電率、共通塩添加、温度といった外的刺激によってイオンの解離度を変化させた場合のらせん構造の転移を円偏光二色性及び紫外可視吸収スペクトルによって主鎖のポリエンの共役長から評価した。その結果、溶媒の極性によって右巻きと左巻きが変化し、特にDMF中においては温度を変化させることによってらせん長を、高分子濃度と添加塩濃度によってらせんの巻方向の割合を可逆的に制御することに成功した。この変化はらせん高分子側鎖のイオン性部位の静電反発によって誘起されたと考えられ、有機溶媒中での静電斥力を制御することによってらせん構造転移を誘起させることに成功した。'今回申請者が得たらせん状親油性高分子電解質に関する基礎的知見は、本研究課題の最終目標である階層的構造制御を目指す上で極めて重要である。本研究課題は、1)らせん状親油性高分子電解質の調製と評価、2)両親媒性ジブロックコポリマーの調製と触媒反応場としての自己集合体形成、の二つに区分され初年度では前者の完遂を目指していた。今年度は実際にらせん状親油性高分子電解質の調製に成功し、光学スペクトル測定による評価を行うことができた。物性解析の面で当初計画していた原子間力顕微鏡観察までは踏み込めなかったものの、概ね順調に進展していると評価できる。研究計画通りにおおよそ進行しており、今後はまず、今年度遂行出来なかった原子間力顕微鏡観察をらせん状親油性高分子電解質の物性評価の続きとして進める。また、両親媒性ジブロックコポリマーの調製にとりかかり、それを用いた分子集合体評価、さらにカチオン性触媒の担持へと従来示した研究計画通りに遂行する予定である。

また、両親媒性ジブロックコポリマーの調製にとりかかり、それを用いた分子集合体評価、さらにカチオン性触媒の担持へと従来示した研究計画通りに遂行する予定である。
先天性脱髄モデルマウスの病態発生におけるMHC Class I分子の関与の解明

結果研究の解析に必要な基礎的データの蓄積のために以下の様な実験を行って成果を発表した。1) twitcherの脳において、脱髄の進行とともに、種々のミエリン蛋白の発現が減少していき、特にtwitcherの欠損酵素ガラクトシルセラミダーゼの基質であるガラクトシルセラミドの合成酵素であるUDP-ガラクトース:セラミドガラクトシルトランスフエラーゼの抑制が特異的であり、このため、twitcherにおいては酵素の欠損にも関わらず、基質ガラクトシルサラミドが蓄積しない可能性があることを示した。2) twitcherの脳において、中枢神経系のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイトの減少がアポトーシス死によることを示した。3)リポカリン型プロスタグランディンD合成酵素がマウスにおけるオリゴデンドログリア関連蛋白であることを証明し、その発現が、twitcher脳において脱髄の進行とともに増強することを見い出した。今後の研究の展開についてウィルス感染による脱髄モデルを用いたMayo ClinicのRodriguezらの研究により、MHC classI分子はウィルス感染に伴う脱髄の進行・神経的合併症の出現に関与していることが示唆されている。今後、上の1)3)に述べた様な新知見を元に、交配マウスF2の臨床症状・神経病理の解析を行い、MHC class I分子発現がtwitcherの脱髄に及ぼす影響を調べることは、脱髄症への治療の開発という面においても非常に大きいと考えられる。ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)欠損による先天性(非自己免疫性)脱髄症であるグロボイド・セル・白質ジストロフィー症のマウスモデルtwitcher(C57BL/6J-twi)のヘテロ接合体(galc^<twi/twi>)を同定し、β2-microglobulinノックアウトマウス(β2^<o/o>)と交配された。(MHC I分子の正常な発現にβ2-microglobulinは必須であるため、β2-microglobulinノックアウトマウスではMHC I分子の発現が認められない。)産出されたF1世代を生後7日にて断尾し、尾ホモジェネートより抽出したDNAを用いてgenotypeを決定した。galc遺伝子に関してはPCR-制限酵素切断断片パターンより、β2遺伝子に関してはgenome-specificなprobeを用いたsouthern blot hybridizationにてgenotypeを決定した。β2 locusに関しては全て+/0,galc locusに関してはtwi/+と+/+が同頻度で得られた。F1は全く無症状であり、生殖能力も正常であった。F1の中からβ2^<+/0>・galc^<twi/+>同士を選択的に交配させ、F2を作成した。F2世代のgenotypeはβ2 locusに関しては+/+,0/+0/0がgalc locusに関しては+/+,+/twi,twi/twiが予想される頻度にて出現している。現在、F2世代の神経症状をを含めた症状出現の有無に関して注意深く観察中である。結果twitcher(twi/twi)突然変異のへテロ接合体、(GALC^<twi/+>)を同定し、β2-microglobulinノックアウトマウス(β2^<>0/0)と交配させて、産出されたF1世代のgenotypeを決定し、F1の中からβ2^<+/0>・GALC^<twi/+>同士を選択的に交配させてF2を作成しているが、F2世代の繁殖力が低いという問題点のため、現時点では、F2世代におけるtwitchergenotypeに対するMHCclassIの影響が検討できていない。研究の解析に必要な基礎的データの蓄積のために以下の様な実験を行って成果を発表した。1) twitcherの脳において、脱髄の進行とともに、種々のミエリン蛋白の発現が減少していき、特にtwitcherの欠損酵素ガラクトシルセラミダーゼの基質であるガラクトシルセラミドの合成酵素であるUDP-ガラクトース:セラミドガラクトシルトランスフェラーゼの抑制が特異的であり、このため、twitcherにおいては酵素の欠損にも関わらず、基質ガラクトシルサラミドが蓄積しない可能性があることを示した。

2) twitcherの脳において、中枢神経系のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイトの減少がアポトーシス死によることを示した。3)リポカリン型プロスタグランディンD合成酵素がマウスにおけるオリゴデンドログリア関連蛋白であることを証明し、その発現が、twitcher脳において脱髄の進行とともに増強することを見い出した。今後の研究の展開についてウィルス感染による脱髄モデルを用いたMayoClinicのRodriguezらの研究により、MHCclassI分子はウィルス感染に伴う脱髄の進行・神経的合併症の出現に関与していることが示唆されている。今後、上の1)3)に述べた様な新知見を元に、交配マウスF2の臨床症状・神経病理の解析を行い、MHCclassI分子発現がtwitcherの脱髄に及ぼす影響を調べることは、脱髄症への治療の開発という面においても非常に大きいと考えられる。
5配位第二周期典型元素化合物の合成と単離を目指して

これまでの研究で合成に成功した配位子1,8-ジメトキシ-9-ブロモアントラセンをn-BuLiと反応させて発生させた対応するリチオ体をそれぞれ種々のホウ素試剤と反応させて3種類のホウ素誘導体[B(OMe)2,BF2,BCl2]を合成し、その構造を明らかにすることができたB(OMe)2誘導体に関しては既に報告した超原子価5配位炭素のC-O距離[av.2.44(1)Å]と同様のB-O距離[av.2.44Å]を有しているほぼ対称な5配位構造であった。BF2誘導体はB(OMe)2誘導体と同様の対称な構造であったが、B-O距離[av.2.294Å]の明らかな短縮が観測でき、B(OMe)2誘導体に比べてtightな5配位構造であった。BC12誘導体はB(OMe)2誘導体、BF2誘導体とは大きく異なり、一つの酸素原子からのみ配位を受けた非対称な4配位ボラート構造であった。このようにホウ素に直接結合した置換基によりlooseな5配位、tightな5配位、4配位構造の間で変化が見られた。この実験結果は、永瀬先生によるDFT(B3PW91)計算によっても支持された。本研究では、9-位に臭素原子(または、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基)を有し、1,8-位に供与性配位原子(酸素、窒素、リン)を有する新規アントラセン骨格の合成に初めて成功し、OMe基を配位子とする5配位超原子価炭素化合物の合成に初めて成功した。X線解析の結果、それぞれのOMe基の酸素O1,O2のlone pairは中心炭素C19の空のp軌道に相互作用していると考えられ、C19周りのgeometryは少し歪んだ三方両錐(TBP)構造となっていることがわかった。2つのC-O(C19-O1,C19-O2)の距離はほぼ同じ(2.43(1)Å,2.45(1)Å)であり、C-O共有結合距離(1.43Å)より長いがvan der Waals半径の和(3.25Å)よりは短いことから、中心炭素と2つの酸素原子間には、明らかに求引的相互作用が存在すると結論できた。また、この相互作用の存在は、東京都立大の永瀬先生による密度汎関数法(DFT)のAIM解析により確認した。さらに中心にホウ素を導入した5配位ホウ素化合物の合成にも成功した。
アクティブネットワークコラボレーションに関する研究

本研究の目的は、長い間の夢であったマルチメディアコラボレーションを実現するためのネットワークサポート技術を開発することである。これに向けて、本年度は、階層型マルチキャストのためのネットワーク支援型レート制御、スパースモードルーティングに適した階層型マルチキャスト輻輳制御、アクティブリライアブルマルチキャストの再送フロー制御に関して検討を進めた。階層型マルチキャストのためのネットワーク支援型レート制御ネットワーク内に分散配置された階層型マルチキャスト対応ルータによるレート制御を行うことにより、階層型マルチキャストに要求される「パケットロスの防止」と「セッション間の公平な帯域割当の保証」を実現するネットワーク支援機構を構築した。具体的には、ルータにおいてシグナリングを行うと共に、ルータ間のシグナリングを行う手法について詳細な検討を進めた。スパースモードルーティングに適した階層型マルチキャスト輻輳制御スパースモードルーティングを行うネットワーク上で階層型マルチキャストを効率良く行うための輻輳制御手法を開発した。エンド・エンドの輻輳制御では階層毎に異なるルートを経由することを考慮する必要があることを明らかにし、パケットロスを最小限に抑制するために複数階層の受信を同時に中止するメカニズムを導入した輻輳制御手法について検討を行った。アクティブリライアブルマルチキャストの再送制御リライアブルマルチキャストを行う上で最も重要な課題とも言える再送の最適化を目的として開発したアクティブリライアブルマルチキャストにおいて、再送フローが受信性能に与える影響を明らかにした。さらに再送フローによる受信性能の低下を防止するために、再送を行う時間間隔をネットワーク状態に応じて適応的に変化させる再送フロー制御を開発した。これに向けて、本年度は、アクティブマルチキャストプロトコル、局所的適応型セッション管理手法、マルチキャストバッファ管理機構に関して検討を進めた。アクティブマルチキャストプロトコルの開発リライアブルマルチキャストを行う上で最も重要な課題とも言える再送の最適化について考察を進め、効率的に再送を行うためにはネットワークトポロジーの情報を用いるプロトコルの開発が必須であることを明らかにした。これに向けて、データパケットのキャッシング/再送を、データのキャッシングを輻輳状況に応じて適応的に、かつ複数のルータ間で分散的に行うアクティブマルチキャストプロトコルを開発した。局所的適応型セッション管理手法の検討複数のマルチキャストセッションを統合しユーザが柔軟に制御することのできる局所的セッション管理手法について検討を進めた。マルチキャストにおけるフロー制御機構を用いればネットワークトポロジーを大まかに把握できることに着目したエンドユーザ主導型のセッション管理手法を開発し、複数のセッション間での使用帯域を柔軟に変更することが可能であることを示した。マルチキャストバッファ管理機構の開発ネットワーク側にフロー同士の公平性を保証する輻輳制御機構を保持させることでスケーラビリティを持たせるマルチキャストバッファ管理機構を構築した。具体的には、ルータにおいてプライオリティドロップを行う手法に関して詳細な検討を進めるとともに、本手法を用いた階層化リライアブルマルチキャストプロトコルを開発した。来年度は本年度の成果を現実のネットワーク上に実装して検証を行う予定である。
統合ゲノム解析による難治性神経芽腫の病態関連遺伝子の探索

小児の代表的な腹部固形腫瘍である神経芽腫には、しばしば自然退縮を起こす予後良好タイプがある一方で、1歳以降に生じ、非常に予後不良な難治例も存在する。本研究では、多様な臨床像を示す神経芽腫について最適な治療戦略を構築することを目的に、腫瘍のゲノムコピー数異常、エピゲノム異常、マイクロRNAを含む遺伝子発現パターンなどの分子プロファイル解析を行い、悪性化腫瘍に強く関連する分子的特徴を探索した。進行神経芽腫の予後に強く相関するマーカーの候補が複数見いだされ、これらは今後難治性神経芽腫の早期診断、治療法開発のための標的遺伝子の同定につながると期待される。小児の代表的な腹部固形腫瘍である神経芽腫は、自然退縮する予後良好タイプから予後不良な難治性タイプまで、臨床経過が異なるサブセットが存在する。進行神経芽腫については5年生存率は約30%と依然として予後不良である。本研究ではこのように多様な臨床像を示す各サブセットの神経芽腫について最適な治療戦略をたてることを目的に、ゲノム異常と遺伝子発現の観点から悪性化腫瘍に強く関連する分子的特徴を明らかにする。これまでに行ってきた網羅的ゲノムコピー数異常解析および遺伝子発現解析の結果に対して、エピゲノム解析とマイクロRNA発現解析を組み合わせることによりさらに発展させ、新規治療標的遺伝子の同定とその解析を目的とする。平成24年度は以下を実施した。1. MYCN増幅群の高密度ゲノムおよび発現アレイ解析:典型的難治性タイプのMYCN増幅群30例(長期生存例20、死亡例10)について、解像度244KのアレイCGHと13000遺伝子の小児癌由来DNAチップを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。2群間で有意に差のある複数箇所のゲノム領域と遺伝子発現データを抽出し共通性を検討したところ、両者に強い相関は見られなかったものの、特定のゲノムパターンに関しては本症例群において有意に予後に相関していることが示された。2.予後関連エピゲノム変化の検索:昨年度に引き続きBisulfate処理細胞株を用いたメチル化特異的PCRとBisulfite sequenceを行い、予後に相関するエピゲノム変化の絞り込みを進めた。プライマリー腫瘍50例を用いたパイロシーケンサーによる定量Bisulfite-PCRの系を立ち上げ、検証を開始した。3.予後関連マイクロRNAの抽出と絞り込み:昨年度絞り込んだ予後に相関する80種類のマイクロRNAのうち上位4種類について定量PCRを行い、独立症例における再現性を確認した。多様な予後臨床像を示す神経芽腫の各サブセットについて最適な治療戦略をたてることを目的に、ゲノム異常と遺伝子発現の観点から悪性化腫瘍に強く関連する分子的特徴を明らかにする。これまでに蓄積してきた神経芽腫組織バンクを解析対象とし、網羅的ゲノムコピー数解析、遺伝子発現解析、エピゲノム解析、マイクロRNA発現解析を組み合わせることにより、新規予後マーカーや治療標的遺伝子の同定を目的とする。平成25年度はこれまでに同定された候補遺伝子について、結果の検証を進め、その結果について学会等で報告した。1. MYCN増幅群のゲノムおよび発現アレイ解析:典型的難治性タイプのMYCN増幅群30例について取得したアレイCGHデータと、患者予後との相関解析を行ったところ、ゲノムコピー数の特定のパターンと死亡群との相関がえられたため、検証用の症例を300例追加し、予後因子としての評価を行った。網羅的遺伝子発現を用いた予後マーカーとの比較から、このゲノムパターンがより高精度に予後不良群を予測することが再現性をもって示された。2.予後関連マイクロRNAの検証:本研究で抽出した予後に相関する80種類のマイクロRNAのうち、最も相関の高かった2種類について120症例の独立検体を用いて定量PCRを行い、再現性をもって新規予後因子として利用できることを確認した。3.予後関連エピゲノム変化の検索:神経芽腫細胞株を用いたBisulfite sequenceから絞り込んだ候補遺伝子のうち、予後不良群で発現低下が見られる一つについて、2種類のプライマーセットを作製し、パイロシーケンサーによる定量Bisulfite-PCRを50例の独立症例について行った。本エピゲノムマーカーは上記のゲノムあるいはマイクロRNAマーカーに比して予後との相関はやや低く、リスク分類の構築には後者2つのマーカーが有効であることが示唆された。小児の代表的な腹部固形腫瘍である神経芽腫には、自然退縮を起こす予後良好タイプがある一方で、1歳以降に生じ、非常に予後不良な難治例も存在する。近年のがん治療法の進展により、小児癌の治癒率は目覚ましく向上したが、進行神経芽腫については5年生存率は約30%と依然として予後不良である。

これまでに蓄積してきた神経芽腫組織バンクを解析対象とした網羅的ゲノムコピー数異常解析および遺伝子発現解析の結果を、エピゲノム解析とマイクロRNA発現解析を組み合わせることによりさらに発展させ、新規治療標的遺伝子の同定とその解析を目的とする。平成23年度は以下を実施した。1.予後関連マイクロRNAの抽出約700種類のマイクロRNAを搭載したmiRNAチップを用いて40症例(予後良好群20症例、予後不良群20例)の発現プロファイルを行い、同症例のゲノム異常パターンとの相関を解析した。予後不良な神経芽腫の高頻度欠失領域に存在し発現が低下しているがん抑制遺伝子様マイクロRNA、または、高頻度増加領域に存在し発現が高いがん遺伝子様マイクロRNAの候補を合計80種類抽出した。相関があるマイクロRNAの予想標的遺伝子の情報をTargetScanデータベースで検索し、遺伝子発現データと比較した。2.予後関連エピゲノム変化の抽出神経芽腫細胞株12種類を脱メチル化剤存在下で培養してDNAの脱メチル化を行い、RNAを調製した。未処理細胞のRNAとともにDNAチップを用いた遺伝子発現解析を行い、各遺伝子の発現レベルを比較した。メチル化による発現抑制が進行例に特異的に起こっているものを絞り込むため、メチル化特異的PCR法のパネルを作製した。1. MYCN増幅群の高密度ゲノムおよび発現アレイ解析典型的な難治性タイプのMYCN増幅群30例について、計画通り網羅的ゲノム解析を行った。独立症例を用いた検証は引き続き必要であるが、ゲノムコピー数の特定のパターンの予後への強い相関が見いだされ、今後の腫瘍リスク分類への適用の可能性が期待される。2.予後関連エピゲノム変化の検索計画通り予後に相関するエピゲノム変化の絞り込みが進んでいると言える。パイロシーケンサーによる定量Bisulfite-PCRの導入により、プライマリー腫瘍を用いての検証がスムーズに行える環境が整った。3.予後関連マイクロRNAの抽出と絞り込み候補となるマイクロRNAがターゲットする遺伝子の候補はデータベース検索から多数挙がっており、標的遺伝子の絞り込みは容易ではないが、今後神経芽腫細胞株を用いた導入実験を行い、遺伝子発現解析を組み合わせることで効率よく候補の絞り込みを計画している。1.予後関連マイクロRNAの抽出計画通り40例のマイクロRNA網羅的発現解析を行い、統計解析により予後に強く相関するマイクロRNAの候補を80種類抽出した。これらのマイクロRNAのゲノム情報と予想標的遺伝子のデータベースからの取得に時間を要したが、ほぼ予定通り遺伝子発現データとの比較も開始できた。2.予後関連エピゲノム変化の抽出計画通り神経芽腫細胞株の脱メチル化剤存在下での培養、脱メチル化DNAとRNAの抽出を行った。DNAチップを用いた遺伝子発現解析を行い、各遺伝子の発現データを取得した。メチル化による発現抑制の検証を行うため、細胞株のBisulfate法-メチル化特異的PCR法のパネルも作製したので、抽出した遺伝子について今後順次検証を行うことが可能である。
LB法による水溶性タンパク・単分子膜の調製法開発－無機ナノシートとES法の活用

電荷を有する無機ナノシートの水分散液上へ両親媒性イオンの溶液を滴下すると、気-液界面上でナノシートとイオンが会合して有機/無機複合単分子膜が形成される。従来法ではマイクロシリンジを用いて手で溶液を滴下していた。本研究ではエレクトロ・スプレー(ES)法を利用して溶液を霧状に分散液上に吹き付け、どのような複合薄膜が調製されるのかを調べている。霧状にして撒くことにより、薄膜調製における個人差がなくなり、また溶解性の高い両親媒性イオンでも単分子膜が調製されると期待される。実際の実験ではナノシートとして、陰電荷をもつ粘土ナノシートを用いている。研究計画に従い平成30年度には、水に対する溶解度が低くないために水上では単分子膜を形成しない物質(4級アルキルアンモニウムイオンおよびアミノ酸)を粘土分散液上にES法で噴霧し、複合薄膜形成について調べた。トリメチルオクタデシルアンモニウムイオン(TMODA+)を用いて薄膜を調製し、これまで調べてきたオクタデシルアンモニウムイオン(ODAH+、1級アンモニウムイオン)を用いたときの結果と比較した。表面圧-分子面積等温曲線の結果は両者でほぼ同様の挙動を示した。一方、基板上に移しとられた薄膜の赤外吸収から、ODAH+薄膜に比べてTMODA+薄膜の方がアンモニウムイオンの膜中密度が低く、薄膜調製時に分散液中へTMODA+が多く溶解していることが分かった。TMODA+よりも炭素鎖が短くより溶解性の高いトリメチルヘキサデシルアンモニウムイオンを用いると、表面圧-分子面積曲線においてTMODA+と異なる挙動がみられた。今後、炭素鎖の長さを変えて、系統的に調べる必要がある。アミノ酸であるL-チロシンとL-ロイシン塩酸塩を用いて複合薄膜の調製を試みた。分散液の濃度やpHを変えたり、イオン交換性の異なる数種の粘土鉱物を用いたが、複合薄膜は形成されなかった。研究計画通り、水溶性アルキルアンモニウムイオンを用いた薄膜系について調べた。ただし、これまで得られた結果が興味深くさらに系統的な研究を進める必要があると判断している。一方で、次年度に計画していた光学活性なアミノ酸を用いた薄膜調製についてはすでに着手した。上記のように、水溶性アルキルアンモニウムイオンを用いた薄膜系について継続して研究する。加えて、研究計画に従い、タンパクや多糖類を用いた複合薄膜調製を試みる。無機ナノシートの分散液上に両親媒性分子を展開して有機/無機複合薄膜を調製するのに、従来法では両親媒性分子の溶液をマイクロシリンジから手で滴下していたが、本研究においてはエレクトロ・スプレー(ES)法を活用して高品質な薄膜、すなわち実験者の滴下条件に依存せず、かつ水溶性分子でも単分子膜化できる技術の開発を目指している。平成28年度には、1.ES法を利用して溶液を展開できる装置の組み立て、および2.水への溶解度が低い両親媒性アルキルアンモニウム陽イオンを用いた薄膜調製を行った。1.について、まずシャーレに水をはり、水中の電極とマイクロシリンジとの間に電圧をかけてスプレーの状態を観察した。シリンジ先端からの噴射状態をビデオに撮って観察したり、水面にグラファイト粉をまいて粉の動きをみたりした。その結果、水面ーシリンジ間距離を15mm、電圧は10kVに決定した。次にLBトラフにおいて下層液中の電極を固定し、シリンジ先端を水面間距離を保ちながら水平に移動できるように装置を組み立てた。実際に10kVの電圧をかけると配線から放電したり、トラフの水がこぼれたりするなど、数々の不都合が生じたが1つ1つ解決していき、現在はほぼ安定して実験を行うことができるようになった。2.について、塩化オクタデシルアンモニウムの溶液を用いて実験を行った。水上では手で展開した場合とES法で展開した場合とで表面圧ー分子面積(πーA)曲線に違いはなかったが、無機ナノシートである粘土ナノシートの水分散液上では明らかな差が見られた。噴射速度によるπーA曲線の変化を調べたところ、噴射速度が遅くなるに従い曲線は大面積側へシフトし、ある速度で折り返して小面積側へシフトすることが分かった。基板上に移しとった薄膜について、IR分光法、XRD、XPS、AFMを用いて解析し、πーA曲線の挙動について説明できるモデルをたてた。初年度は、ほぼ当初の計画通りに進んだ。すなわち、1.エレクトロ・スプレー(ES)法を活用できる装置の組み立て、2.従来法である「手まき」とES法との比較、および3.わずかに水溶性であるアルキルアンモニウムイオンと粘土ナノシートを用いたときの薄膜形成過程の解析が行われた。ただし、3.についてはサポート・データの収集が完了せず、次年度に残ってしまった。無機ナノシートの分散液上に両親媒性陽イオンを展開して有機/無機複合薄膜を調製できる。従来法では両親媒性イオンの溶液をマイクロシリンジから手で滴下していたが、本研究においてはエレクトロスプレー(ES)法を活用して品質にばらつきの少ない薄膜を調製することを目的としている。さらに、水に対して易溶な分子の単分子膜を無機ナノシートとの複合化により調製することに挑戦する。2年目となる平成29年度には、1薄膜形成メカニズムの解明、2やや水溶性の高い両親媒性イオンを用いた薄膜形成挙動の解明、および3印可電圧を逆転したときの挙動解明を中心に研究を進めた。

1について、昨年度から引き続きデータを収集し、薄膜形成メカニズムを解明した。ES法で両親媒性イオン溶液を噴霧するときの速度が遅いと、霧状に噴霧された溶液の一部が蒸発・乾固(結晶化)して分散液上に到達する。このため無機ナノシート(粘土ナノシート)との静電的相互補作用が弱く、下層液中に溶解する両親媒性イオン(結晶)の割合も無視できなくなる。その結果、複合薄膜中における両親媒性イオンの密度は低くなり、また両親媒性陽イオンの対イオンである塩化物イオンが薄膜中に含有される。一方、噴霧速度が速いと大粒の溶液が分散液表面に衝突するため液面が乱され、液面上で両親媒性陽イオン/無機ナノシート複合体が多層構造となる。2について、両親媒性陽イオンとしてトリメチルオクタデシルアンモニウム陽イオンを用いてデータを収集している。これまでのデータから、先のオクタデシルアンモニウム陽イオンを用いたときと類似の挙動をとるようである。3について、マイクロシリンジと分散液間に印可する電圧を逆転(-10 kV)して薄膜の形成挙動を調べているが、今までのところデータのばらつきが大きく議論するには至っていない。当初の計画通り、2年目には水溶性アルキルアンモニウム陽イオンを用いた複合薄膜形成の研究を行った。ただし、1年目に行う予定であった薄膜形成メカニズムのモデル化に手間取り、また原稿執筆にもそれなりの時間を要した。さらに当初計画になかった印可電圧を逆転したときの挙動についても実験を行った。それらのため、計画よりやや遅れ気味である。電荷を有する無機ナノシートの水分散液上へ両親媒性イオンの溶液を滴下すると、気-液界面上でナノシートとイオンが会合して有機/無機複合単分子膜が形成される。従来法ではマイクロシリンジを用いて手で溶液を滴下していた。本研究ではエレクトロ・スプレー(ES)法を利用して溶液を霧状に分散液上に吹き付け、どのような複合薄膜が調製されるのかを調べている。霧状にして撒くことにより、薄膜調製における個人差がなくなり、また溶解性の高い両親媒性イオンでも単分子膜が調製されると期待される。実際の実験ではナノシートとして、陰電荷をもつ粘土ナノシートを用いている。研究計画に従い平成30年度には、水に対する溶解度が低くないために水上では単分子膜を形成しない物質(4級アルキルアンモニウムイオンおよびアミノ酸)を粘土分散液上にES法で噴霧し、複合薄膜形成について調べた。トリメチルオクタデシルアンモニウムイオン(TMODA+)を用いて薄膜を調製し、これまで調べてきたオクタデシルアンモニウムイオン(ODAH+、1級アンモニウムイオン)を用いたときの結果と比較した。表面圧-分子面積等温曲線の結果は両者でほぼ同様の挙動を示した。一方、基板上に移しとられた薄膜の赤外吸収から、ODAH+薄膜に比べてTMODA+薄膜の方がアンモニウムイオンの膜中密度が低く、薄膜調製時に分散液中へTMODA+が多く溶解していることが分かった。TMODA+よりも炭素鎖が短くより溶解性の高いトリメチルヘキサデシルアンモニウムイオンを用いると、表面圧-分子面積曲線においてTMODA+と異なる挙動がみられた。今後、炭素鎖の長さを変えて、系統的に調べる必要がある。アミノ酸であるL-チロシンとL-ロイシン塩酸塩を用いて複合薄膜の調製を試みた。
SLEモデル動物でのEtretinateによる抗核抗体産生の抑制についての研究

SLEモデル動物であるMRL/lマウスにEtretinateを長期間経口投与し、血清中抗核抗体の発現と皮膚および腎病変の発生とに対する影響をしらべた。1.材料と方法:(1)生後5週、雌のMRL/lマウスを4群に分けて飼育した。A群:Etretinate5mg/kg/日投与、B群:25mg/kg/日投与、C群:50mg/kg/日投与およびD群:非投与対照。Etretinateはピーナッツ油に溶解し週3回経口投与した。D群ではピーナッツ油のみ投与した。(2)投与前、投与7週後および13週後に、ラット肝を基質とした蛍光抗体間接法で血清中の抗核抗体をしらべた。(3)投与13週後に皮膚および腎を採取し、組織学的変化をHE染色、PAS染色および蛍光抗体直接法でしらべた。2.結果:(1)Etretinate投与13週後のマウス生存率は、A群12/15、B群10/10、C群9/10およびD群14/25であり、Etretinate投与が生存率を高くする傾向がみられた。(2)抗核抗体の陽性率は投与7週後でA群13/15、B群7/10、C群8/9およびD群18/22であった。投与13週後ではA群10/12、B群8/10、C群7/9およびD群12/14であった。いずれの時点でも各群間で陽性率の有意差はなかった。また核の染色パターンについても全群でspeckled型が主体であり、各群間の差はみられなかった。(3)投与13週後の皮膚および腎の組織学的変化については各群間で差がなかった。(4)皮膚基底膜部および腎糸球体でのIgGの沈着は、その程度および頻度において各群間で差がなかった。3.考案:今回の実験条件下では、Etretinateの経口投与はMRL/lマウスにおける抗核抗体の発現あるいは皮膚・腎糸球体病変の発生を抑制しなかった。しかし紫外線治療中の乾癬患者にみられる抗核抗体の発現をEtretinateが抑制することはわかっているので、今後はMRL/lマウスに紫外線を照射しながらEtretinateを投与する実験系で再検討する予定である。
協調学習マネジメント能力の向上を目指した教育プログラムの開発

深い思考力と高い問題解決能力,他者との協働に優れた人材育成を行うための学習環境をデザインする要件を見いだすことを目的として,大学生対象の2つの科目開発を行い,デザイン要件の効果を検証した.基礎的科目はPBL中に行う活動の形成的評価に重点を置き,自分や属するグループの活動の質に意識的になることを,発展的科目は協調的かつ創造的な問題解決に取り組むドラマを分析・議論することで,より深く活動を分析する視点を身につけることを狙った学習環境をデザインした.学習の成果物や活動の観察記録を質的に分析した結果,両開発科目とも導入したデザインの効果が見いだされた.本研究の目的は,協調学習のマネジメント能力を向上させるための教育プログラムを開発することである.社会的構成主義の立場から学習環境構築の理念として知識構築コミュニティに基づき,深い思考力と高い問題解決能力,他者との協働に優れた人材育成のためのカリキュラムを構成する.このことにより,通常の教育では埋もれがちな学生の資質を伸ばし,将来リーダー的役割を果たせる優秀な人材として社会に輩出するシステムを整えることが最終目標である.このような目標をふまえ,平成24年度は,これまで継続して行っている大学初年次科目(基礎的内容)などからデータを収集し,そこで導入している種々の学習環境デザインのための要素技術について,問題点の洗い出しと,それを踏まえたデザインの改良を行い,さらに実際の学習場面に適用することでデータ収集を行い,効果の検証を行った.先行研究から継続しての授業デザインのPDCAサイクルを回すことで,形成的評価指標の最適化と学習環境のデザイン原則の明確化,要素技術の確立を目指している.さらに,発展科目の学習環境デザインの要件定義と具体的な要素技術の確立のために,教材の開発に着手した.具体的には,活動理論を理解させるための学習活動として,テレビドラマ分析を核とした学習環境をデザインし,その効果と問題点の検証を行った.そして,前年度の試行を踏まえてプロトタイプを作成,再実施し,デザイン要件の再定義に向けて検討を行った(継続中).本研究の目的は,大学教育において,協調学習のマネジメント能力を向上させるための教育プログラムを開発することである.平成25年度には,前年度に収集したデータ分析をもとにした学習環境デザインの検討と,それをふまえ2科目の授業開発・改良に取り組んだ.学習環境デザインの検討については,主に次のようなことを実施した.基礎科目のデザイン要素技術について,1)学習者が必然性のもと主体的に活動に取り組み,またその過程で遭遇する種々の問題を解決しようとするような状況設定,2)学習者自身が自分やグループの活動を適切に振り返ることのできる機会提供,という2側面から検討を行った.その結果,学習者が自己調整や共同調整を行いやすくするための課題提示の仕方と,振り返りを行いやすくするための学習支援システムのデザイン要件が見いだされた.発展科目のデザイン要素技術については,内容理解をより深めるための検討を行った.その結果,1)理論として得た知識を応用するための課題提示方法と,2)多視点から対象を捉えるための議論の用い方についてのデザイン要件が見いだされた.これらの知見をふまえ,改良した2科目を実施しデータ収集をすることで,新たなデザイン変更が2つの科目で扱う知識の理解深化に寄与したかどうかの検討を行った.その結果,デザイン変更は概ね有効であることが示されたとともに,個人差への対応や更なる理解深化を目指すためのデザイン指針が見いだされた.深い思考力と高い問題解決能力,他者との協働に優れた人材育成を行うための学習環境をデザインする要件を見いだすことを目的として,大学生対象の2つの科目開発を行い,デザイン要件の効果を検証した.基礎的科目はPBL中に行う活動の形成的評価に重点を置き,自分や属するグループの活動の質に意識的になることを,発展的科目は協調的かつ創造的な問題解決に取り組むドラマを分析・議論することで,より深く活動を分析する視点を身につけることを狙った学習環境をデザインした.学習の成果物や活動の観察記録を質的に分析した結果,両開発科目とも導入したデザインの効果が見いだされた.本研究の目的は,協調学習のマネジメント能力を向上させるための教育プログラムを開発することである.平成23年度は,先行研究を引き継ぐ形で開発中の初年次科目(基礎的内容)の授業デザインの改良に取り組み,学習者に提供する形成的評価指標の改良と,学習環境のデザイン原則を導き出すことに取り組んだ.具体的には,大学初年次科目として「学習マネジメント」の授業デザイン改良を行った.具体的にはブレンディング型の実施形態で,対象学習者数は大学1年生の2クラス約100名であった.少人数のグループでプロジェクト・ベースの課題に取り組むというもので,協調学習支援システムを導入し,学習活動の軌跡とそれに対する学習者自身の形成的評価の記録が俯瞰的に把握できるような仕組みを整えた.開発科目は10月から1月の期間で実施した.協調学習支援システム上の記録や授業観察記録,学習者に課したレポートなどのデータ収集を行った.収集データは現在分析を行っている途中である.また,学習支援方略を検討する際に必要となる,学習活動時のマネジメント能力を同定するために,大学3年生を対象とした授業をターゲットとしたデータ収集を行った.

協同問題解決時における学習者の発話について,shared epistemic agencyという観点から分析を行った.分析結果の一部は日本認知科学会第28回大会にて発表を行った(協調学習におけるEpistemic Agentの活動についての考察).さらに,平成24年度から開発を着手する予定である新規開発科目(発展的内容)に用いる理論や教材について検討を行うために,試験的な授業パッケージを開発し,数名に対して実施した.収集データは現在分析中である.開発する2つの科目の開発,実施とデータ収集については,予定通り行えているためおおむね順調に進展していると考えられる.ただし,詳細な分析に想定以上の時間がかかっていること,また,デザインの要素技術について新たに検討するべき点が見つかったことから,全体的にデータ収集と分析に想定以上の時間を要している点が課題として残る.平成23年度の目標である大学初年時科目の授業デザイン改良は,予定通りに進んでいるが,データ分析に要する時間が膨大であるため,今後の進捗に影響を及ぼす懸念がある.一方で,平成24年度より着手する予定の新規開発科目について,試験的なデータ収集が出来たことは,研究全体の進捗の上でプラスになると考えられる.基礎的科目,発展科目と合わせて要素技術確立のために他校・他科目で,授業デザインと実施,分析を行い,さらに学習環境デザインの要件と要素技術の確立をめざす.特に,発展科目については,教材としてのテレビドラマが持つべき条件を定義するために,種々のドラマを対象として分析を実施する予定である.ドラマ分析を強固なものにするためにNHKアーカイブスの学術利用トライアル研究IIに応募し,採択されているため(http://www.nhk.or.jp/archives/academic/result/result2-2.html参照),この機会を利用し集中して分析を行うことで,ドラマの持つべき仕様を明らかにする.また,国内外の学会に参加し情報収集を行うことで,関連の深い研究からの知見を得,本研究の質を向上させることを目指す.さらに,これまで得られた研究の成果を,国内外の学会発表や研究論文の投稿を通じて,広く公表していく予定であるとともに,確立されたデザイン要件や要素技術は,カリキュラムをパッケージ化することで,他大学の教員が実施できるような仕組みを整える予定である.次年度使用の費用が発生した理由については,主に1.諸事情により,データのバックアップ環境の構築方法を変更したこと,2.授業デザイン検討の過程で,課題内容の大きな見直しを行い,準備する教材を変更したこと,3.データ分析に想定より時間がかかっていること,によるものである.今後については,特に3.に関して分析をスピードアップさせるための人的資源の確保などを検討している.平成25年度は,授業実施とデータ収集のために,次のような9項目について研究費使用を計画している:1.研究対象授業実施に係る資料作成,2.教材類の作成,3.データ収集のために用いるシステムの管理・運用費用,4.データの保管用メディア類,5.授業支援者やデータ整理,データ分析に関わる謝金,6.5の作業に係る業者委託費用,7.情報収集や研究発表として,国内外への学会参加に関わる費用,8.研究成果の発表に関わる費用,9.パッケージ化補助者の謝金.次年度については,平成23年度に遅れた部分について取り戻すこと,そして,前倒しで試験的に実施した新規科目開発に関連して,当初の予定よりも教材費用がかかる可能性が明らかになったため,次年度使用の費用をこれに回すことを検討している.
木材腐朽菌類によるダイオキシン類の分解および処理に関する研究

低塩素置換されたダイオキシン類(ダイベンゾ-p-ジオキシン、ダイベンゾフラン等)およびクロロナフタレンなどの多環式芳香族化合物を分解可能な白色腐朽菌Phlebia lindtneriを、これまでの研究でダイオキシン類処理に有望な菌株として見いだしている。この分解反応はシトクロムp-450(CYP)モノオキシゲナーゼによる酸化反応であると予想しているが、酸素付加の位置選択性が高く塩素置換位置、および塩素置換度によりその分解性が大きく損なわれること予想された。そこで、実際に2-4塩素置換ダイオキシン類の分解実験を行ったところ、塩素置換度が増えるに従い分解力が著しく低下していくことが明らかになった。この様な問題点を克服する為の情報を得るために、まずCYPモノオキシゲナーゼの遺伝子情報を得ることにした。保存領域であるヘム結合サイトとpolyA配列間でRT-PCRを行った。この結果、350bpと370bp付近に二つのバンドが確認され配列を決定したところ二つのアイソザイムを発現しているようであった。そこでそのアイソザイムそれぞれについて5'-RACE法により完全長の決定を試みたが、現在のところ完全長を得るに至っていない。しかしながら、部分配列をBlastサーチにかけたところカワラタケ由来のCYPと相同性が高く同じファミリーに属する可能性が高かった。故にこのCYP遺伝子が白色腐朽菌類に広く分布した代謝経路上の酵素(たとえば、芳香族代謝経路)であることが推定される。幾つかの塩素化ダイオキシシ(2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin)を無機化可能である木材腐朽菌を得ているが、この中で、無塩素置換体である、dibenzo-p-dioxin及びdibenzofuranに対し特に高い分解力を示したPhlebia lindtneriのダイオキシン類及び塩素化ナフタレン、多環式芳香族化合物類に対する分解挙動について検討を行なった。その結果、ダイオキシン類(dibenzo-p-dioxin、dibenzofuran、2,7-dibenzo-p-dioxin、2,8-dibenzofuran)はP.lindtnerilによって、モノ水酸化体(モノオール)へと代謝されるのに対し、ナフタレン、フェナンスレンはジハイドロジオール、ジオール等の代謝物へも変換されていた。また、塩素化ナフタレンでも同様な分解代謝物が検出された。さちに、このような分解反応はシトクロムp-450モノオキシゲナーゼの関与が阻害剤添加実験から推察された。以上のことから、多環式芳香族化合物に対してP.lindtneriはダイオキシン類の酸化時とは異なるアイソザイムで酸化反応を触媒していることが予想される結果となった。低塩素置換のダイオキシンを分解可能な菌株について分解機構解明等について検討を行ってきたが、高塩素置換体の反応経路については不明である。ダイオキシン類は水溶性が低く、生物による分解を受けにくいが、塩素置換数が増えるに従ってその傾向は大幅に増大する。この様な特性や毒性を考慮すると、高塩素置換ダイオキシンを分解試験に大量に用いることは現実的ではないと考えられる。そこでダイオキシン類とよく類似した毒性、物性を持ちながら、より水溶性が高く、毒性も低い塩素化ナフタレン類を塩素化ダイオキシン類のモデル化合物として実験に用いることにした。ダイオキシン分解菌である、Phlebia lindtneriおよびPhanerochaete chrysosporiumを実験に供した。P.lindtneriに関しては一塩素化ナフタレンを水酸化分解することは既に報告している。両菌株により二塩素置換ナフタレン類は複数のモノオール、ジハイドロジオールへと分解された。P.lindtneriにおいては、水酸化反応によって塩素転移反応が一部起こっていた。四塩素化ナフタレンも同様にP.lindtneriにより水酸化物へと代謝されたが、P.chrysosporiumでは代謝産物は確認できなかった。P.lindtneriによる塩素化ナフタレンの水酸化反応は、チトクロムP-450(CYP)の特異的阻害剤により阻害されたことからCYPモノオキシゲナーゼによる反応であると推察された。
血液細胞におけるSykの生理的機能の解析；活性化機構と標的分子の同定

平成9年度は以下のことを明らかにした。(1)血小板を用いてSykの会合分子としてFakを同定し、Actin細胞骨格に移行したSykは細胞骨格の再重合時にFakと会合することを明らかにした。その機構について明らかにする目的で、1997年のFEBS Special Meetingにて「血液細胞におけるSykの生理的機能の解析」に関し、他のチロシンキナーゼとの相互作用やチロシンリン酸化の意義についてレビューを受けた。その結果、両者の会合がSykチロシンリン酸化の程度に応ずることが明らかとなったがSykが直接Fakを基質としてリン酸化するか否かは否定的であり、この過程におけるSrcキナーゼの役割については不明である。(2)細胞骨格を構成する他の分子について解析したところ、膜の裏打ち蛋白質のひとつであるPaxillinが凝集させたSykによりチロシンリン酸化されることを見出し、インテグリンからのシグナル伝達経路において細胞骨格に作用するSykの役割を明らかにした。正常細胞におけるPaxillinの機能はまだ不明な点が多く、私は血球細胞に加えて胎児臍帯内皮細胞や皮膚角化細胞といった正常組織の初代培養細胞を用いてその解析を行った。その結果これらの細胞ではin vitroでの分化過程においてそれぞれ発現量が変化し、チロシンリン酸化を受けていることや3つのisoformが存在していることが明らかとなった。チロシンキナーゼとこれらの関わりについては今後の研究対象とする予定である。
ヒューマノイドロボットのバイオメカニカルコントロール

研究計画に基づき、前半の6ケ月間に完了した研究に引き続き、生物力学的研究に基づく数理モデルのヒューマノイドロボットへの実装を本格的に実行するという後半に計画された研究活動を全て完了した。この後半6ケ月間に行われた研究の主な成果は、フルサイズのヒューマノイドロボットへのダイナミックシミュレーターを用いた研究成果の適用である。我々が設計した適応型モーションコントローラを使用してヒューマノイドロボットへの人間対象からの動作の移行を効果的に行った。適応型モーションコントローラの設計の為に、我々は半径基礎機能ネットワークと呼ばれる効果的な機械の学習能力技術を使用した。半径基礎機能ネットワークへの入力はキャプチャーされた人間の動作、ロボットの動作そして、ヒューマノイドロボットの安定したパラメータである。ヒューマノイドロボットの必要な動作において、相反する有効な技術が半径基礎機能のパラメータ値を決定するのに使われた。機械の学習技術を使用して適応型モーションコントローラで、ヒューマノイドロボットの任意の動作をコントロールする事ができ、同時にヒューマノイドロボット自身がバランスをとる状況で、人間対象と同じ動作を適応することができる。研究の最終部分において、我々は実験結果を評価し、人間対象のオリジナルの動作とヒューマノイドロボットの動作の比較分析をした。評価と分析の結果は論文として、学会及びロボット工学雑誌に投稿、発表する。研究計画通りに全ての予定されていた研究活動を終了。最初に計画された実験研究の詳細な方法論を特定。リアルタイムモーションキャプチャー、コンピューターのデータ処理ソフトウェア、ヒューマノイドロボットの動作及びロボット自身のシミュレーションのためのダイナミックシミュレーションシステムを含む実験環境を整えた。片側にモーションキャプチャーシステム、そして反対側にダイナミックシミュレーターやヒューマノイドロボットのデータ処理ソフトウェアを接続するためのソフトウェアモジュールを設計した。研究の主たるアイデアはヒューマノイドロボットの安定性についてのフィードバック情報を対象の人間に提供する事である。従って、我々はグラフィックな面でヒューマノイドロボットの安定性についての情報を示す特別なグラフィックインターフェイスを設計した。このグラフィックインターフェイスは、対象の人間が、ヒューマノイドロボットが要求された動作をする間バランスを保つ事を可能にすることができる。その後、人間の動きに関するいくつかの例のモーションキャプチャーを実行。ダイナミックな一貫性と安定性を達成するために、キャプチャーされた人間の動きをヒューマノイドロボットにとって可能な動きに変える適応型モーションコントローラを製作した。これらの機械の学習能力技術へのインプットはキャプチャーされた人間の動作、ロボットの動作、ヒューマノイドロボットの安定性のパラメータである。これらの機械の学習能力技術を使う事によって適応型モーションコントローラはヒューマノイドロボットが人間の動きと同じような動作をするようにコントロールし、同時にヒューマノイドロボットがバランスをとれている状況に適応させる。適応型モーションコントローラのパラメータを最適化するために、ベイズ流学習や人工的神経ネットワークのような機械の学習の技術を検討することを始めた。