hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水圏での微生物食物連鎖における有機態コロイド粒子の代謝

本研究は主に海洋での有機物循環において重要な役割を果たしているコロイド態有機物の動態と微生物食物連鎖との関係に注目して実験室におけるモデル実験と海洋現場での観測との両面から研究を行っている。本年は2年度目であるが、サブミクロンサイズのコロイド粒子の生成機構について大きな研究の進展がみられた。比較的富栄養的な沿岸域から外洋までの測点での、サブミクロン粒子の濃度およびその粒径分布による観測から生物活動の高い沿岸表層では、高い粒子濃度に加えて粒径が0.6-0.7ミクロンに明らかなピークが検出された。このピークは外洋の表層および有光層以下では検出されず、その粒径分布は小さくなると単調に増加するパターンを示した。またこのピークは細菌群集などの生物粒子でないことが、実験的に確かめられた。一般に海洋での懸濁有機物の粒径分布は、凝集や吸着あるいは溶解などのプロセスが卓越すると指数関数的に粒径が小さいほうへ増加することが知られている。従ってこのことは、この粒径が0.6-0.7ミクロンの粒子は沿岸表層での活発なこのサイズのコロイドの生成が起こっていることを示している。一方実験室でのモデル系において海洋の微生物食物連鎖の中心である鞭毛虫類による細菌捕食によって、多量の0.6-0.7ミクロンサイズのコロイドが生成されることが明らかになった。このコロイド粒子の生成速度は、細菌濃度や鞭毛虫類の数に依存するが、沿岸現場での生成速度を見積もってみると、このプロセスだけで現場のサブミクロン粒子は2-20日で生成/分解されていることになる。これらの結果は微生物食物連鎖がコロイド有機物の動態に大きな役割を果たしていることを強く示唆する成果である。平成9年度は、生物群集の相互作用とそれと共役した炭素/窒素などの生元素循環という海洋表層生態系での基本的なプロセスの中で、有機デトリタスとしてのコロイド粒子が占める役割について現段階での研究のまとめを行った。1990年に研究代表者らによって発見されたサブミクロン粒子は、溶存有機物と懸濁有機物の境界上にあり、コロイド粒子の代表的なものであるが、これまでに、その主に外洋での鉛直あるいは水平分布、密度などの物理的性状、微生物食物連鎖による生成過程などが知られているのみであった。このコロイド粒子に関する総合的な本研究により、その性状や動態について次の様な知見が明らかにされた。1)このような非生物粒子は沿岸での詳細な分布の観測から、生物活性の高い水塊では、サイズが0.6-0.8ミクロンに分布のピークを持ち、生物活動により特定サイズの粒子が放出されることが示された。又人為的なブルーム実験でもこのことが確認された。2)生成過程としての微生物食物連鎖の内、従属鞭毛虫類による細菌捕食時にコロイドサイズの非生物粒子が放出される過程を顕微鏡下で始めて確認した等がこれまでの成果の一部であるが、本年度のハイライトとしては、YoProという高感度蛍光色素と高感度CCDカメラを用い、サブミクロン粒子のかなりの部分の光学的観察に成功したことである。これらは極めて不定形の希薄な有機物の塊からなっており、これまで得られていた物理的知見を裏付けるものである。さらにこれらのコロイド粒子が鞭毛虫類の働きによって大型のアグリゲートに凝集していく過程も発見された。
ヒト神経芽腫細胞分化におけるMycの機能を抑制するMxil遺伝子の関与

2、ヒト神経芽腫細胞NB69N、ヒト胎児繊維芽細胞TIG3、ヒト白血病細胞HL-60およびMOLT3由来のmxil cDNAの塩基配列決定により、Zervosらの報告したHeLa細胞のそれと比較して、3'側非翻訳領域に多型性を有する繰り返し配列を認めた。3、mxil mRNAの発現は、ヒト神経芽腫細胞NB69Nのレチノイン酸による分化誘導に伴い上昇した。さらに、種々の細胞株において、細胞密度の増加、血清飢餓のような静止期におけるmxil mRNAの上昇、反対に、血清刺激のような増殖期におけるmxil mRNAの下降が観察された。また、ヒト白血病細胞株HL60細胞およびMOLT3細胞由来のMxi1-cDNAの塩基配列決定を行ったところ、Zervosらの報告したHela細胞のMxi1に比較して、3'non-codingregionにおいて5塩基の欠失が存在した。Mxi1遺伝子の発現が、HL60細胞およびMOLT3細胞では、Hela細胞に比較して低いこととあわせて、今後さらに検討すべきであると考えられる。神経芽腫細胞株の分化に伴うMxi1遺伝子の発現の変化は、N-mycが増幅しているRT-BM-1細胞のレチノイン酸(RA)による分化誘導で、減少傾向が認められたが、N-mycが1コピーのNB69N細胞のRAによる分化誘導では、増加傾向が認められ、両細胞株間で異なる変化が観察された。今後は、Mxi1遺伝子の発現調節の機序を解明するために、他の細胞株での様々な培養条件での発現の変化を検討してゆきたい。
幼児の投球能力および投球動作における練習効果

5、6歳の幼児を対象として、10日間毎日「ボールを投げる、受ける」という練習を実施し、ボールを受ける能力の変化とあわせて投球能力の変化について調査した。保育園の年長児を対象とした。ボール投げの練習として毎日10分間自由な投げ合いを、またボール受けとして1日おきに10回づつ、自分で頭上に投げあげたボールを捕球するよう指導した。10日間の練習の前後で硬式テニスボール遠投、および硬式テニスボール捕球回数(5球のうち)を記録した。第1回測定時のボール投げの距離は、男子平均8.5m、女子平均5.5mであった。男子は練習以前において既に女子に比べ約3.0m優れた遠投能力を持っていた(P<0.01)。また捕球回数は、男子平均2.4回、女子平均2.8回であり、捕球能力における性差は統計的に有意なものではなかった。第2回の測定では、ボール投げ距離は、男子平均11.2m、女子平均5.6mであり、ボール受け回数は、男子平均4.0回、女子平均4.3回であった。第1回測定値に比較して.男子でボール投げ、ボール受けの両方に、また女子でボール受けに有意な練習効果が認められた(男子: P<0.01、女子: P<0.05)。捕球回数に見られる練習回数に見られる練習効果は男女間で差が見られなかったが、ボール投げ距離における練習効果に男女間で著しい差が存在した(P<0.01)。すなわち、5歳児を対象とした本研究においては、捕球能力およびその練習効果については男女間で差が見られなかったが、投球能力およびその練習効果については男子は女子より優れていた。身体的特性に男女間で差がなかったことから、本研究で見られた投能力およびその練習効果の性差は、男女間の生理的な差を示すものというより、スキルの学習に学習者自身の興味・意欲、あるいは学習以前の経験等が大きくかかわっていることを示すものと考えられた。本研究の目的は、3歳から6歳の男女幼児にオーバーハンドの投球練習を行なわせ、投球能力および投球動作における練習効果を、その発達過程および性差との関連から調べることであった。年少(34歳児)、年中(45歳児)、年長(56歳児)男女各5名、計30名の幼児に硬式テニスボール(周囲約20cm、重量約60g)の遠投を行なわせ投球距離を計測した。その投球動作を側方および後方の2方向から同時にビデオ撮影した。両方向から撮影されたビデオ画像から身体各部およびボールの座標解析を行った。このデータから、三次元画像解析法を用いて計算で各点の三次元座標値を求め、ボールおよび身体各部の速度変化、ボールスピードに対する手首(スナップ)の貢献度、体幹部のひねり、肩や前腕部の回旋動作などについて定量的に分析を行なっている。それによれば年長児で既に投球距離および投球動作の男女差が存在することが明らかになってきた。しかしながら保育園行事との関係で現在のところまだ練習を開始できないでいる。練習は週に3回、期間は4カ月間で約50回を予定していたが、練習計画の若干の変更を余儀なくされるかもしれない。練習には研究代表者または補助者が必ず立ち会い、ドッヂボール、玉入れ、鬼退治など幼児の興味が持続するよう工夫する予定である。5、6歳の幼児を対象として、10日間毎日「ホールを投げる、受ける」という練習を実施し、ボールを受ける能力の変化とあわせて投球能力の変化について調査した。

ボール投げの練習として毎日10分間白由な投げ合いを、またボール受けとして1日おきに10回づつ、自分で頭上に投げあげたボールを捕球するよう指導した。10日間の練習の前後で硬式テニスボール遠投、および硬式テニスボール捕球回数(5球のうち)を記録した。第1回測定時のボール投げの距離は、男子平均8.5m、女子平均5.5mであった。男子は練習以前において既に女子に比べ約3.0m優れた遠投能力を持っていた(P<0.01)。また捕球回数は、男子平均2.4回、女子平均2.8回であり、捕球能力における性差は統計的に有意なものではなかった。第2回の測定では、ボール投げ距離は、男子平均11.2m、女子平均5.6mであり、ボール受け回数は、男子平均4.0回、女子平均4.3回であった。第1回測定値に比較して、男子でボール投げ、ボール受けの両方に、また女子でボール受けに有意な練習効果が認められた(男子:P<0.01、女子:P<0.05)。捕球回数に見られる練習効果は男女間で差が見られなかったが、ボール投げ距離における練習効果に男女間で著しい差が存在した(P<0.01)。すなわち、5歳児を対象とした本研究においては、捕球能力およびその練習効果については男女間で差が見られなかったが、投球能力およびその練習効果については男子は女子より優れていた。身体的特性に男女間で差がなかったことから、本研究で見られた投能力およびその練習効果の性差は、男女間の生理的な差を示すものというより、スキルの学習に学習者自身の興味・意欲、あるいは学習以前の経験等が大きくかかわっていることを示すものと考えられた。
Al-Ni-Ru系高品質準結晶の作製と準周期超格子の解析

1)基本の回折パターンをとる0.4nm周期の正10角形準結晶(Basic-structureと呼ぶ)は液体急冷した合金に存在し、高い規則性の準結晶である。2)規則格子反射をとる0.4nm周期の正10角形準結晶(CsCl-type structureと呼ぶ)は、Al_<70>Ni_<20>Ru_<10>合金のアーク溶解試料で見いだされた。高い規則性をとり、5回対称の2nm直径原子クラスターの規則配列として特徴づけられる。2方向の5回対称クラスターが菱形準周期格子中を規則的に配列し、CsCl-型超立方規則格子の投影で作られる準周期格子の特徴を示し、そのためCsCl-型正10角形規則準結晶と呼ばれている。3)基本の回折パターンをとる1.6nm周期の正10角形準結晶。Al_<75>Ni_<15>Ru_<10>合金の種々の熱処理条件に見いだされている。この構造は、正10角形対称のカラム状原子クラスターが2nmのボンドの長さの5角形タイリング配列をとっている。HAADF-STEM観察から、0.4nm周期の正10角形準結晶の2nm原子クラスターの原子配列において、NiとRu原子が規則配列をとっていることを見いだした。Al-Ni-Ru合金系で初めて正10角形準結晶を見いだし、種々の熱処理した合金から、その正10角形準結晶の安定領域を明らかにすることを行った。今回の研究において、3種類の正10角形準結晶の存在を明らかにした。1)基本の回折パターンをとる0.4nm周期の正10角形準結晶(Basic-structureと呼ぶ)、2)規則格子反射をとる0.4nm周期の正10角形準結晶(CsCl-type structureと呼ぶ)、3)基本の回折パターンをとる1.6nm周期の正10角形準結晶。Basic-structure Al-Ni-Ru正10角形準結晶は、急冷された合金で形成する。一方、CsCl-type structure Al-Ni-Ru正10角形準結晶は炉冷した合金で形成する。この正10角形準結晶は高温で焼鈍すると1.6nm周期の正10角形準結晶に変態する。CsCl-type structureAl-Ni-Ru正10角形準結晶の構造は、2方向の正五角形対称のカラム状原子クラスターが規則配列した構造として理解され、CsCl-typeの超立方格子の投影として理解される規則正10角形準結晶である。1.6nm周期の正10角形準結晶の構造は正10角形対称のカラム状原子クラスターが2nmのボンドの長さの5角形タイリング配列をとっていることがわかった。high-angle annular detectordark-field scannningtransmission electronmicroscopy(HAADF-STEM)および高分解能電子顕微鏡(HREM)観察から、それら正10角形準結晶のカラム状原子クラスターの原子配列を決定した。その原子配列において、NiとRu原子が規則配列をとっていることを見いだした。
金属錯体による異方性格子の構築と固体物性制御

2,1,3ーベンゾチアジアゾ-ル(btd)を用いて一次元および二次元ネットワ-ク構造を有するCu(I)およびAg(I)錯体ポリマ-の合成に成功した。(1)[Cu_2(btd)_2(CIO_4)]CIO_4.Cuにbtdのみで架橋された二次元ネットワ-クを有する錯体ポリマ-を合成することが出来た。対アニンのCIO_4^-は配位したものと配位しないものが1:1で存在しており、それに応じて4配位と3配位Cuが1:1で存在している。この二次元構造はほぼ同一平面上に存在する六員環Cu骨格を単位として構成されている。(2)[Cu(btd)(HPO_3F)].btdとさらにHPO_3F^-の二つがCuに架橋した二次元ネットワ-ク構造を有する錯体ポリマ-が合成できた。この二次元構造も六員環Cu骨格を単位として構成されている。btd架橋とHPO_3F^-の結合距離が少し異なるため六員環Cu骨格は同一平面になく僅かに厚みを有している。(3)[Ag(btd)(CIO_4)].Ag(I)のbtd錯体ではどのような構造をとるか興味がもたれる。Agにそれぞれ別のbtdのNが配位した一次元錯体ポリマ-であり、CIO_4^-がAgに弱く配位しているためNーAgーN角は166.6(4)°,144.3(4)°と大きく折れ曲がっている。ポリマ-鎖のbtdの間にπーπ相互作用(CーC=3.35A^^°)が存在する。しかし六員環Ag骨格を有する[Cu_2(btd)_2(CIO_4)]CIO_4しは全く異なる構造をとることがわかった。以上述べたようにbtdはCu(I)及びAg(I)錯体ポリマ-を構築する上で極めて有用な配位子であり、金属及びアニオンによて、構造制御できることを初めて明らかにした。これら錯体ポリマ-では420500nmに強度の大きい吸収が観測された。適当な酸化剤を用いて部分酸化することができれば、伝導性が飛躍的に増大することが期待される。
血管平滑筋・内皮における機械力受容の分子機構

本研究では、第一に、培養ラット大動脈平滑筋細胞に周期的な伸展刺激を加えた際(イワキガラス・FLX-SYSTEM細胞伸展装置使用)、(1)細胞内にストレス応答蛋白キナーゼの一つ、Jun-N末端キナーゼ(JNK)の活性化がひきおこされること、(2)これは、伸展刺激により平滑筋からATPが放出され、これがオートクリンのメカニズムにより平滑筋自身の細胞膜上のP_2プリン受容体を活性化することにより生ずること、を見い出した。JNK活性測定は、免疫沈降-in vitroキナーゼ測定(恒温振とうかくはん機、タイテックPR12使用)ならびに抗活性化型JNK抗体によるウエスタンブロット(電気泳動用電源、アトークロスパワー1000使用)の両方により行なった。さらに、伸展刺激によるATP放出とJNK活性化は、いずれも、細胞内サイクリックAMP(cAMP)上昇により完全に抑制された。外来性のATP添加によるJNK活性化も細胞内cAMP上昇により強力に抑制されたことから、cAMPは(1)伸展刺激によるATP放出と(2)P_2受容体を介するシグナリングの少なくとも2つの部位で機械力受容機構に調節作用を及ぼしていることが明らかとなった。上記から、伸展刺激によるATP放出反応が機械力受容において重要な役割を担っていることが明らかとなった。現在、ATP放出の阻害薬をスクリーニングしている。この結果に基づき、ATPトランスポーターの実体を解明したい。また、JNK活性化をメディエイ卜するP_2受容体のさらなる理解のため、我々のクローニングした新規P_2受容体(P_<2Y6>)発現細胞株を樹立し、アゴニスト・アンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングしている。現在までのところ、2種類のアゴニストを見い出しているが、アンタゴニストは見い出せていない。本年度は、血管平滑筋に発現するABCファミリートランスポーターcDNAのクローニングを完了した。単離したcDNAは、約5kbのオープンリーディングフレームを有し、約180kDaの分子量を有するタンパクをコードすると想定された。このタンパクの機能解析を目的として,このcDNAを発現ベクターに組み込んだ。現在、この発現ベクターを培養細胞に遺伝子導入し、タンパクの発現の有無を確認中である。機械的伸展による血管平滑筋細胞からのATP放出が、種々の細胞内情報伝達系によって修飾を受ける可能性について検討した。細胞内サイクリックAMPを増加させるホルスコリンで細胞を前処理すると、平滑筋からのATP放出はほぼ完全に抑制された。これと一致して,放出されたATPによって媒介されるJunN末端キナーゼ(JNK)の活性化も、ほぼ完全に抑制された。JNKと同様に、Extracellularsignal-regulated kianse(ERK)の活性化も抑制された。細胞膜透過性のサイクリックAMP誘導体にも同様の抑制作用があった。一方、ホルスコリンはATPによるJNK活性化も強く抑制した。以上の結果から、サイクリックAMPは機械力によるJNK活性化を少なくとも二つの部位、すなわちATP放出とP2受容体を介するシグナリングの両部位において抑制することが明らかとなった。P2受容体に対する特異的遮断薬は未だ見い出されていない。そこで、我々のクローニングした新規P2受容体(P2Y6)を発現する細胞株を樹立し、細胞内Ca^<2+>増加シグナルを指標として、約2000種の化合物のアンタゴニスト活性を検討した。しかし、現在までのところ有効なアンタゴニストは見い出せていない。本研究では、第一に、培養ラット大動脈

平滑筋細胞に周期的な伸展刺激を加えた際(イワキガラス・FLX-SYSTEM細胞伸展装置使用)、(1)細胞内にストレス応答蛋白キナーゼの一つ、Jun-N末端キナーゼ(JNK)の活性化がひきおこされること、(2)これは、伸展刺激により平滑筋からATPが放出され、これがオートクリンのメカニズムにより平滑筋自身の細胞膜上のP_2プリン受容体を活性化することにより生ずること、を見い出した。JNK活性測定は、免疫沈降-in vitroキナーゼ測定(恒温振どうかくはん機、タイテックPR12使用)ならびに抗活性化型JNK抗体によるウエスタンブロット(電気泳動用電源、アトークロスパワー1000使用)の両方により行なった。さらに、伸展刺激によるATP放出とJNK活性化は、いずれも、細胞内サイクリックAMP(cAMP)上昇により完全に抑制された。外来性のATP添加によるJNK活性化も細胞内cAMP上昇により強力に抑制されたことから、cAMPは(1)伸展刺激によるATP放出と(2)P_2受容体を介するシグナリングの少なくとも2つの部位で機械力受容機構に調節作用を及ぼしていることが明らかとなった。上記から、伸展刺激によるATP放出反応が機械力受容において重要な役割を担っていることが明らかとなった。現在、ATP放出の阻害薬をスクリーニングしている。この結果に基づき、ATPトランスポーターの実体を解明したい。また、JNK活性化をメディエイ卜するP_2受容体のさらなる理解のため、我々のクローニングした新規P_2受容体(P_<2Y6>)発現細胞株を樹立し、アゴニスト・アンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングしている。現在までのところ、2種類のアゴニストを見い出しているが、アンタゴニストは見い出せていない。
3-NP局所投与ラットの内耳障害発生機序及び薬剤投与効果に関する検討

研究目的:ミトコンドリアトキシンを用いた永久的聴力閾値上昇モデル(PTSモデル)に対しその長期経過を観察し、アポトーシス阻害剤を用いた場合と比較しその効果を検討する研究成果:8kHzでは閾値変化が投与直後よりスケールアウトで固定され、僅かに回復するものがあった。20kHzでは聴力はスケールアウトのままであった。組織学的には外側壁線維細胞の障害は中回転では回復をみとめたが、基底回転では高度に障害が残存した。考察:蝸牛外側壁線維細胞は再生能を有するため長期観察により障害が回復する可能性が考えられるが、今回の実験では外側壁の障害は中回転では回復したが基底回転においては残存した。これまでの当研究室の報告では3-NPの投与後に中回転・基底回転ともに外側壁線維細胞が障害されることから線維細胞は再生能を有するものの限界があることが判明した。また昨年の報告でアポトーシス阻害剤の投与により基底回転においても細胞障害が抑制されたことから、本難聴モデルにおいて、組織障害の抑制のためにもアポトーシス阻害剤を早期に投与する必要性があることが判明した。急性感音難聴の中には内耳エネルギー不全が存在する可能性が考えられており、急性感音難聴の治療にアポトーシス阻害剤の治療が有効である可能性が示された。研究目的:3-NP(3-nitropropionic acid)はTCA cycleのsuccinate dehydrogenaseの作用を阻害するミトコンドリアトキシンである。今回我々はミトコンドリアトキシン3-NPを正円窓に投与することにより蝸牛ミトコンドリア障害モデルを作成した。このモデルはその濃度に応じてTTS及びPTSが生じることが明らかになった。このモデルはTCA cycleを障害することにより代謝障害が生じていることが内耳障害発生機序の一つと考えられる。今回難聴を生じない30mM投与群に対し騒音負荷を行い内耳障害の病態解明を行い、内耳障害の予防法を検討する。研究方法:実験動物として体重180-200gのS-D系Ratを用いた。3-NPの投与方法はそれぞれのラットの左耳後部を切開し骨包を開放して正円窓を明視下におき正円窓を損傷しないように3-NP 30mM(3-NP群)及び生理食塩水(control群)をそれぞれマイクロチューブ付きのシリンジポンプにて1.5μl/minで計3.0μl注入した。騒音付加は、投与2日目に115dB 2kHz OBNを1時間負荷した。騒音負荷前後、負荷1日目、3日目、7日目、14日目にABR(8kHz,20kHz)を測定した。研究目的:ミトコンドリアトキシンを用いた永久的聴力閾値上昇モデル(PTSモデル)に対しアポトーシス阻害剤を、内耳障害後に経静脈的に全身投与しその効果を検討する。研究成果:8kHzでは閾値変化が40dB程度にまで回復し有意に改善を認めた。20kHzでは聴力の改善はみとめなかった。組織学的には外側壁線維細胞の障害は顕著に抑制されたが、基底回転基底側では障害が残存した。考察:アポトーシス阻害剤の投与により病理学的には蝸牛外側壁線維細胞の障害の顕著な改善をみとめたが、聴力障害は軽度の改善を認めたにすぎなかった。このことから永続性高度難聴の発症に線維細胞の果たす役割が大きいことが考えられる。またアポトーシス阻害剤の投与により細胞障害が抑制されたことから、本モデルにおいても線維細胞障害発現のメカニズムとしてアポトーシスの関与が考えられ本モデルでの永続性難聴の発症にアポトーシスが関与していることが示された。今回アポトーシス阻害剤をモデル作成直後に投与して聴力の改善が得られたことから急性高度感音難聴の一部でアポトーシス阻害剤の治療が有効である可能性が示された。
カーボンナノチューブの特異な一次元電子状態とその光学応答に関する研究

1.種々の平均直径を持つ単層カーボンナノチューブを用いて、薄膜試料を作成して、その吸収スペクトルを測定した。単層カーボンナノチューブに起因する吸収帯が、試料の平均直径に依存して近赤外可視領域に観測され、平均直径の減少とともにそのピークエネルギーは高エネルギー側に観測された。2.半導体的なバンド構造を持つナノチューブによる基礎吸収帯は、クーロン効果により、単純なバンド計算に比べて高エネルギー側に現れることを明らかにした。さらに、チューブの直径が小さいほど、この高エネルギーシフトが大きくなることがわかった。このことは、直径の小さなチューブほど、一次元性が高いことを示している。3.高分子ポリマー中に、単層カーボンナノチューブを分散させ、ポリマーごと伸張させることにより、配向したナノチューブ試料を作製した。偏光吸収スペクトルでは、伸長軸と光の電場が平行のときにはナノチューブによる吸収帯が現れるが、垂直の場合にはその遷移は押さえられることが分かった。これは、理論的な予測と一致している。4.フェムト秒パルスレーザー光を用いて、過渡吸収分光を行い、ナノチューブの一次元バンド中に光励起されたキャリアーの緩和ダイナミクスを調べた。半導体チューブでは、約10psと1ps以下の緩和時間をもつ2成分の緩和挙動を示した。このうち、速い成分はチューブ直径に依存して変化し、小さな直径を持つチューブほど、速い緩和を示した。実験結果は、電子-格子相互作用が直径に依存していることを示唆している。5.カーボンナノチューブと同じ炭素クラスターであり、その最小単位でもあるフラーレンについて、その結晶状態の重合過程について調べた。C_<60>結晶では光照射により重合反応が進行するが、その過程をラマンスペクトルの測定により詳細に調べた。重合体の生成には中間状態として2量体が存在していることがわかった。圧力印加により光重合反応を制御することが出来ることがわかった。また、C_<70>結晶の高温高圧重合反応について、その重合条件を明らかにした。その結果、従来報告されていたよりも低温・低圧でも重合が起こりうることがわかった。本年度は、種々の平均直径をもつ単層カーボンナノチューブの薄膜試料の光学吸収スペクトルを測定し、単層カーボンナノチューブにおけるクーロン効果の直径依存性を調べた。また、ポリマー中に配向させた単層カーボンナノチューブ試料を作製し、光学スペクトルの異方性を調べた。主な結果は以下のとおりである。1.三重大学斎藤弥八教授、東京都立大阿知波洋次教授らのグループにより合成された、種々の平均直径を持つ単層カーボンナノチューブを用いて、薄膜試料を作成して、その吸収スペクトルを測定した。2.半導体的なバンド構造を持つナノチューブによる基礎吸収帯は、クーロン効果により、単純なバンド計算に比べて高エネルギー側に現れることを、我々はこれまでの研究で明らかにしているが、チューブの直径が小さいほど、この高エネルギーシフトが大きくなることがわかった。3.高分子ポリマー(ポリスチレン)中に、単層カーボンナノチューブを分散させ、ポリマーごと伸張させることにより、配向したナノチューブ試料を作製した。

偏光吸収スペクトルでは、伸長軸と光の電場が平行のときにはナノチューブによる吸収帯が現れるが、垂直の場合にはその遷移は押さえられることが分かった。これは、理論的な予測と一致している。4.偏光吸収スペクトルの角度依存性の解析から、試料中でのナノチューブの配向分布を求めたところ、この試料では、56%のナノチューブが伸長軸に対して±15°の範囲に分布していることが分かった。5.配向試料の偏光ラマンスペクトルを測定したところ、入射光の波長に依存した、ラマンスペクトルの偏光角度依存性が現れた。金属チューブと半導体チューブのバンド構造と共鳴条件を考慮した結果、これらのチューブで、共鳴ラマン散乱の角度依存性に違いがあることが分かった。本年度は、種々の平均直径をもつ単層カーボンナノチューブの薄膜試料の光学吸収スペクトルを測定し、単層カーボンナノチューブにおけるクーロン効果の直径依存性を調べた。また、ポリマー中に配向させた単層カーボンナノチューブ試料を作製し、光学スペクトルの異方性を調べた。主な結果は以下のとおりである。1.三重大学斎藤弥八教授、東京都立大阿知波洋次教授らのグループにより合成された、種々の平均直径を持つ単層カーボンナノチューブを用いて、薄膜試料を作成して、その吸収スペクトルを測定した。半導体的なバンド構造を持つナノチューブによる基礎吸収帯は、クーロン効果により、単純なバンド計算に比べて高エネルギー側に現れることを、我々はこれまでの研究で明らかにしているが、チューブの直径が小さいほど、この高エネルギーシフトが大きくなることがわかった。このことは、直径の小さなチューブほど、一次元性が高いことを示している。2.高分子ポリマー(ポリスチレン)中に、単層カーボンナノチューブを分散させ、ポリマーごと伸張させることにより、配向したナノチューブ試料を作製した。3.フェムト秒パルスレーザー光を用いて、過渡吸収分光を行い、ナノチューブの一次元バンド中に光励起されたキャリアーの緩和ダイナミクスを調べた。半導体チューブでは、約10psと1ps以下の緩和時間をもつ2成分の緩和挙動を示した。このうち、速い成分はチューブ直径に依存して変化し、小さな直径を持つチューブほど、速い緩和を示した。この系では発光は観測されないので、観測された緩和は主に無輻射過程によるものであると考えられる。この無輻射過程がマルチフォノン放出過程であるならば、実験結果は、電子-格子相互作用が直径に依存していることを示唆している。
遷移金属錯体におけるりん光状態の熱失活経路の解明

d6およびd8型遷移金属錯体のリン光量子収率の低下をもたらしている熱失活過程について、活性化エネルギーや活性化体積などの速度論的パラメータを決定し、その値を指標として量子化学計算で得られた反応経路を検証することによって、代表的なRu(II)錯体とPt(II)錯体における熱失活経路とその律速段階を明らかにした。今年度は、高圧下で発光測定を行うための高圧分光セルを開発した。特に微弱発光測定に適するように、サファイア光学窓を3面とし、観測方向には大きな窓としたことが技術的に難しかった点であった。このセルは、-20200°Cの広い温度範囲において、0.1400MPaの圧力範囲の発光寿命やスペクトルを高い精度で観測することが可能である。開発したセルの性能を検討するために、ルテニウム(II)トリスビピリジン錯体のリン光状態について、dd状態を経由した熱的失活の活性化体積を150°Cにおいて決定したところ、文献値と同一の値が得られた。本セルではこれまでよりも、より高い温度域での圧力変化の測定が可能であるため、活性化体積を求めるための複雑な補正を省くことができる。今後、この特長を活かして様々な遷移金属錯体のリン光状態の熱失活の活性化体積を決定する。青色リン光性の錯体であるイリジウム(III)トリスピラゾール錯体について、dd状態を経由した熱的失活過程のマトリックス依存性を検討した。Facial体とmeridional体とでは、全く異なる速度論パラメータを有することが分かった。発光強度に対する溶媒効果はほとんど観測されなかったが、剛性マトリックスである有機ポリマー中では、イリジウム錯体の発光強度が著しく高くなることを見出した。減衰速度の温度依存性より、剛性マトリックス中では、頻度因子が小さくなることが明らかになった。光学活性な配位子をもつルテニウム(II)オキサゾリン錯体のリン光寿命について検討したところ、Δ体とΛ体とでは発光寿命が大きく異なっていることを見出した。DFT計算の結果、Δ体とΛ体とで、リン光状態に関与する分子軌道が異なっており、Δ体はΛ体よりもリン光状態で大きく構造が変形することが、寿命の違いの原因であることが判った。1.時間相関単一光子計数システムの光検出器を、高速応答のMCP付光電子増倍管に人れ替えた。これにより本測定システムで決定できる発光寿命が40ピコ秒までとなり、大幅に性能向上した。2.この発光寿命測定システムと前年度の研究で開発した高圧分光セルを用いて、さまざまなルテニウム(II)ポリピリジン錯体について、リン光状態がdd状態を経由して熱的失活する過程の活性化体積を決定した。その結果、ビピリジンなどのこ座配位子のトリス錯体は、ターピリジンなどの三座配位子のビス錯体に比べて、大きな活性化体積を示すことが明らかになった。この活性化体積は、熱的失活過程に関わるdd状態の分子構造についての情報を含んでいると考えられる。前者の錯体では、大きな距離の変化を伴うような四配位型構造のdd状態を経由し、後者では、コンパクトな三角両錐型構造のdd状態を経由して失活することを強く示唆している。これらの考察は、量子化学計算によるリン光状態の熱的失活過程の経路計算結果と一致している。3.大きな活性化体積を伴うルテニウム(II)トリスビピリジン錯体の熱失活は、ゼオライトのようなかご分子の中に錯体を閉じこめることで、熱失活を抑制できることが知られているが、活性化体積の小さなターピリジン三座配位子の錯体に対しては有効ではない。量子化学計算による反応経路探査の結果、ビスターピリジン錯体の場合には、配位子のロッキングを防ぐような置換基を入れることによって、三角両錐型構造のdd状態の生成を抑えることができると予想した。実際にフィルムマトリックス中で、置換ビスターピリジン錯体の発光寿命を測定したところ、二桁程度も長寿命化することを見出した。4.ユーロピウム(III)錯体が励起状態でアミノ酸と結合することで、錯体の構造が歪むことを、円偏光の測定により明らかにした。一般に、リン光性遷移金属錯体の発光量子収率が低下する原因は、大きく構造が歪んだ金属中心の励起状態であるdd状態を経由して速やかに失活する熱的失活過程の存在である。この金属中心の励起状態を経由した熱失活が起きやすいと、室温でリン光寿命が著しく短くなり、量子収率の低下が起きる。本研究では、非制限ハイブリッドDFTレベルの理論計算で励起状態のポテンシャルエネルギー曲面(PES)を計算し、それに基づき熱失活経路を探査することで、熱失活に伴う詳細な構造変化の解明を行った。さらに、リン光の熱失活の活性化体積を測定し、量子化学計算で得られた構造変化の大きさと比較検討することで、量子化学計算を検証する方法を確立した。

この手法に基づき、d6型遷移金属錯体として代表的な[Ru(bpy)3]2+ (bpy=2,2'-bipyridine)について、リン光状態と分子体積の大きな四面体構造のddとが熱的平衡状態にありdd→GSが律速であることを、活性化体積の大きさから明らかにした。また、d8型のリン光性遷移金属錯体であるシクロメタレート白金(II)錯体のリン光状態が、4配位シーソー型dd状態を経由して失活することを明らかにした。白金(I)ジアセチル錯体について、極低温分光によりリン光状態の精密な電子状態を明らかにした。さらに、この錯体をクロモフォアとした光誘起電子移動系を合成し、それを光増感色素とした太陽電池を製作して、光電変換性能を評価した。また、ジシアノ金(I)錯体を光励起した際に生じる金属中心の励起状態の失活過程について、超高速過渡吸収分光測定と非制限ハイブリッドDFTレベルで計算した励起状態のポテンシャルエネルギー曲面(PES)に基づき、励起多量体の形成と構造緩和の詳細なメカニズムを初めて明らかにした。高圧を発生するための高圧ポンプにリークが発生したが、その修理はスイスのメーカしかできないため修理に時間がかかった。そのため高圧分光測定ができない期間が生じ、測定法の確立が遅れてしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。熱失活の速度論的パラメータの解析法は確立したので、比較的合成の容易な発光性のルテニウム、白金、パラジウム錯体について、測定・解析を行う。高圧ポンプは半期に一度程度、高圧シールの入れ替え修理が必要なので、修理が国内で迅速にできるように、代理店に技術者の養成をお願いしている。
破局的状況を回避するインターネットルーティングプロトコル

従来のIP(インターネットプロトコル)では、ベストエフォートと呼ばれる単一のサービスのみをサポートしており、QoS(Quality of Service)保証をサポートしていない。そのため、インターネットにQoS保証を導入する有力なフレームワークとして、IntServやDiffServが着目されている。DiffServでは、自ドメインの境界部分でパケットをクラス分けし、ドメイン内ではクラス別に異なるPHB(Per-Hop Behavior)を適用することでサービスの差別化を行なう。現在提案されているPHBはキューイングに基づくものだけである。これに対し本研究では、優先度の低いトラフィックについても可能ならば「迂回」させることで性能劣化を防ぐことを考え、そのために通信状況に応じた適応ルーティングをDiffServのPHBとして実現する方法を提案した。提案に基づきDiffServのフレームワークで適応ルーティングを行なうシステムを設計し、PCプラットフォーム上に実装した。さらに、上記の提案を、RSVPのようなフロー単位の資源予約を行うIntServの枠組において応用することを考えた。すなわち、QoSフローにより帯域が消費されたリンクは、低優先度のトラフィックができるだけ迂回するようにコスト値を調整する。この際、コスト値を一時に大きく変化させると遷移状態においてパケットループが生じうる。本研究では、ループを生じさせないように段階的にコスト値を変更する手順をグラフ理論的に求めるアルゴリズムを示した。そのため、インターネットにQoS保証を導入する有力なフレームワークの一つとして,DiffServが着目されている。これに対し本研究では、優先度の低いトラフィックについても可能ならば「迂回」させることで性能劣化を防ぐことを考え、そのために通信状況に応じた適応ルーティングをDiffServのPHBとして実現させる方法を提案した。提案する方式では、通信状況に応じてOSPFのコスト値を動的に変更し経路を切り替える点で適用可能な状況が広い。一般にこのような通信状況に応じた適応ルーティングでは、パケットループおよび経路の発振という二つの深刻な問題が生じうる。本論文では、前者についてはループを生じさせない安全な変更コスト値の範囲をグラフ理論的に求めるアルゴリズムを示すことで解決した。後者については、経路の切り替えの対象を優先度の低いトラフィッククラスに限定し、かつ経路切り替えが緩やかに行われるようにすることで回避する。現在、提案に基づきDiffServのフレームワークで適応ルーティングを行なうシステムを設計し、PCプラットフォーム上に実装中である。
胃癌深達度とリンパ節転移、動注化学療法の効果判定に関する病理組織学的研究

われわれの施設では胃癌の術前進行程度の診断の一つとして4年6カ月前より超音波内視鏡(GF-UM2,3)が導入され、深達度、リンパ節転移の有無を検討している。すでに超音波内視鏡検査を施行した症例は過去4年間に約500例余となっている。これらの手術摘出標本を詳細に検討するため、さらに多数の連続切片を作成して、病理学者の指導を受けつつ病巣の範囲と深達度、リンパ節転移について再検討し、それらを再構築すると共に、各々の症例の術前診断(上部消化管内視鏡所見、超音波内視鏡所見)と対比し、いかなる所見が病理組織学的所見と一致するかなどを詳細、厳密に検討した。さらに、胃癌の術前動注化学療法の効果判定に関しても、治療前後で上部消化管内視鏡、超音波内視鏡を施行し、同様に術後の摘出標本とを詳細に対比検討した。その結果、深達度診断に関しては、早期癌・進行癌の鑑別は約90%、全体の正診率は約65%であり、潰瘍(線維化)を伴った症例や深達度mの症例の診断率は低かった。リンパ節転移診断は正診率約75%であり、内部エコーは超音波画像からの詳細な描出・解析は難しいものの、リンパ節の大きさ・形態・性状より病理組織学的所見の対比から転移陽性の傾向が得られた。動注化学療法の効果判定に関しては、現在まだ検討中であるが、上部消化管内視鏡所見、超音波内視鏡所見、病理組織学的所見の各々に偏りが見られ、単独での判定よりも総合的に判定した方が良い傾向であった。
がんの間質細胞遺伝子依存性を制御する転写因子網の解明

がんの形成には間質細胞とのシグナル相互作用が重要であり、間質細胞側の機能変化や遺伝的変化もがん進展に重要と予想される。本研究では間質細胞側の機能を転写因子Bach1が制御する可能性に着目し、Bach1の発がんモデルにおける機能、Bach1の下流標的遺伝子群の探索、ヒト細胞におけるBACH1機能の制御機構の解明を進めた。Bach1の間質細胞における重要性が明らかとなり、今後、がん組織におけるBach1の機能を追求する基盤を構築することができた。しかし、間質細胞側の制御システムには不明な点が多い。本研究では、がん細胞が微小環境中の間質細胞の「特定の機能に強く依存する」(stroma gene addiction)というアイデアに基づき、stroma addictionをマウスモデルで評価する実験系を開発し、stroma gene addictionに関わる遺伝子・分子の候補を網羅的に調べる。前年度までの研究から、転写因子Bach1ノックアウト線維芽細胞は、がん細胞との共培養系でがん細胞の増殖を強く促進することを見いだし、さらにヒトBACH1に対するモノクローナル抗体を作成した。本年度の研究により、ヌードマウス移植の系を用いて、Bach1ノックアウト線維芽細胞が野生型細胞よりも高率にヒト乳癌細胞株MCF7による腫瘍形成を支持することが判明した。この作用は、NF-kB経路の活性化が関わること、Bach1はNF-kBの上流制御キナーゼの調節因子NEMOの発現を直接抑制することを証明した。また、BACH1モノクローナル抗体を用いた細胞染色やヒト癌組織染色の検討を行い、条件を決定できた。BACH1は細胞質と核をシャトリングしているという過剰発現を用いた以前の報告結果が、内在性タンパク質についても成り立つことを証明できた。細胞環境に応じてBACH1の局在が制御され、間質細胞の機能が変化する可能性が考えられる。今年度は、転写因子Bach1に着目し、Bach1ノックアウト線維芽細胞のがん間質細胞としての性状を野生型線維芽細胞と詳細に比較した。サイトカインやケモカイン分泌能、がん細胞増殖刺激能、酸化ストレス防御能に大きな差をみとめた。Bach1ノックアウト細胞は酸化ストレスに応答してp53が活性化し、細胞老化の状態を発現しやすい。すなわち、Bach1はp53を抑制していることを報告している。しかし、このサイトカインやケモカイン分泌能は細胞老化やp53とは関係ない変化であった。すなわち、Bach1は細胞老化とは独立して分泌能を制御することが考えられた。Bach1の作用点候補(抑制対象経路)として、NF-kB転写因子経路が浮かび上がってきた。個体レベルでも検証するために、野生型マウスおよびBach1ノックアウトマウスにマウスがん細胞を移植し、その増殖や転移能を比較した。さらに、ヒトがん組織におけるBach1の変動を検出するために、組織染色に使えるモノクローナル抗体の作成をすすめた。これまでヒトがんにおけるBach1の機能は、GWAS解析などから想定されてきたものの、分子機能解析レベルではほとんど進んでいなかった。その大きな理由は、病理組織解析に用いることのできるヒトBach1抗体が世の中に存在しないことであった。私たちは、この点を大きな問題と考え、モノクローナル抗体作成に挑戦してきた。少なくともヒトがん細胞を染色できそうな抗体クローンを複数えており、大きな進展といえる。間質細胞におけるBach1の機能も明確になった。基本的には計画調書に記述した内容に沿って進める。しかし、モノクローナル抗体作成に成功したことから、ヒトがん組織の解析を追加する。コンディショナルノックアウトマウス作製については難航しており、解決策を再検討する必要がある。基本的にはマウス実験、細胞培養実験の消耗品に充当する。特に、培養用血清、遺伝子発現プロファイリング用アレイ試薬などを多めに購入する。
発生工学を用いた虚血部血管新生誘導におけるケモカイン・サイトカイン作用の解明

ケモカイン(MCP-1)は単球集積効果だけでなくアポプトーシス抑制・内皮NO遊離作用を介して内皮保護に働くことが知られている。我々はラット微少冠動脈内皮細胞にはVEGF・VEGF受容体が発現し、周囲の心筋細胞はVEGFを合成することを見いだし、L1-βは非常に強くこれらVEGF・VEGF受容体遺伝子発現を亢進させることを報告した。このようにサイトカイン・ケモカインは虚血部位での血管再生メカニズムの重要な要因のひとつと考えられるがその詳細は明らかでない。今回我々はMCP-1受容体であるCCR2欠損マウス、IL1-β欠損マウス虚血下肢での血管新生効果を検討した。CCR2欠損マウス、IL1-β欠損マウスいずれにおいてもレーザードップラーで評価っされる虚血下肢での血流量の回復は著明に減弱していた(3週後には40%減弱)。免疫組織染色では新生毛細血数は減少していた。MCP-1およびIL1-βの投与にて、虚血下肢での血流量減少は回復した。虚血部に集積する単球・リンパ球数も減少しており、末梢血のFACSではCCR2欠損マウス、IL1-β欠損マウスいずれにおいてもCD34-,FLK+hematopoietic cellの骨髄からの動員が減少していた。これらの結果はケモカイン(MCP-1)・炎症性サイトカインL1-βは骨髄からの血管芽細胞の動員、局所での血管新生因子の供給の減弱を介して血管新生に関与することが示唆された。
中枢神経細胞のイオンチャンネル動態に及ぼす吸入麻酔薬の作用

ヤツメウナギにおけるハロセンのAC50、AC95は単一Giant internenron-Axonのシナプス伝達を各々25%、50%抑制した。シナプス伝達の抑制は、シナプス後膜のグルタミン酸に対する応答の感受性低下が主な機序であることが推察された。臨床濃度に相当する範囲では、細胞膜の興奮性と膜電位依存性のNaチャンネルには影響を及ぼさなかった。成績は、麻酔状態が興奮性シナプス伝達の部分的抑制によってもたらされることを示唆した。これらの成績はAnesth.Analg.76巻2号、342-347、1993.に掲載された。2.ラット青班核ニューロンを用いて、麻酔薬がセロトニン受容体およびalpha2アドレナリン受容体の感受性に及ぼす作用について解析した。臨床濃度の麻酔薬がこれらの受容体応答性を低下させることによって中枢性痛覚抑制系を賦活する可能性を示唆した。成績はJ.Neurosurgical Anesthesiaに投稿中である。3.アフリカツメガエル卵母細胞の受容体発現モデルを作製し、細胞内情報伝達系に与える吸入麻酔薬の作用を解析した。5-HTで誘発されるC1-電流はメトキシフルレン0.5,1,3mMで各々対照値の80,60,20%に抑制された。イノシトール3リン酸、Ca^<2+>の注入で誘発されるC1-電流には影響が認められなかったのでこの系における麻酔薬の作用点は膜結合型酵素系にあると推測された。1.ヤツメウナギ脊髄の軸索ニュ-ロンモデルにおいて,シナプス伝達機構におよぼすハロセンの抑制作用を定量的に解析した。抑制作用の主要機序はグルタミン酸受容体を介する興奮性シナプス後電位(EPSP)の抑制で,行動学的麻酔濃度のAD_<50>,AD_<95>は各々,EPSP抑制のED_<25>,ED5_<50>に相当した。膜電位依存性のナトリウムチャンネル,シナプス前膜からの伝達物質の放出機序などは臨床濃度の麻酔作用には関与しないと推測された。これらの知見は発表論文3で報告する。2.ラット脳スライス標本を用いた実験では,縫線核と青斑核ニュ-ロンから自発活動を記録した。NMDA25μMによって自発発射頻度は各々1.4±0.5Hz(N=24),1.2±0.6Hz(N=19)であった。吸入麻酔薬ハロセン,イソフルレン0.21.5mMの間で自発発射頻度は濃度依存性に抑制された。この抑制過程はグルタミン酸受容体に対する吸入麻酔薬の直接的抑制効果と推測された。これらの知見は発表論文4、5で報告する。3.海馬スライスおよび新生ラットの摘出脊髄標本を用いてpropofolの作用機序については解析した。グルタミン酸受容体拮抗薬であるDNQX,APVおよび,GABA阻害薬であるピクロトキシンなどを用いた実験成績から,GABAを介する抑制機構の選択的増強が主要機序であり,興奮性伝達の抑制は関与しないと推測された。この知見は発表論文1,2,6で報告した。1.ヤツメウナギにおけるハロセンのAC_<50>、AC_<95>は単一Giant internenron-Axonのシナプス伝達を各々25%、50%抑制した。これらの成績はAnesth.Analg.76巻2号、342-347、1993に掲載された。

2.ラット青斑核ニューロンを用いて、麻酔薬がセロトニン受容体およびα_2アドレナリン受容体の感受性に及ぼす作用について解析した。臨床濃度の麻酔薬がこれらの受容体応答性を低下させることによって中枢性痛覚抑制系を賦活する可能性を示唆した。成績はJ.Neurosurgical Anesthesiaに投稿中である。3.アフリカツメガエル卵母細胞の受容体発現モデルを作製し、細胞内情報伝達系に与える吸入麻酔薬の作用を解析中である。麻酔薬は主に膜結合型酵素系に作用する知見が得られ、現在投稿準備中である。
新規二種ミクログリア分化増殖因子の脳・アストロサイト・ニューロンに於ける産生機構

胸腺筋様細胞は脊椎動物の発生初期から出現し、ヒトでは重症筋無力症との関連が示唆されてきた細胞であるところから、我々はこれらの細胞は生理的に重要な機能をもつ細胞と考え、ラットからクローン化し、多種のサイトカインとともに新規80-kDa、100-kDa造血因子をも産生していることを見いだした。大量培養により、アミノ酸配列決定し、両者とも新規な造血因子であることを確認した。両因子はこれまでのところほとんど同一細胞により、同時に産生されることが判明している。胸腺では筋様細胞から、脳では免疫組織化学法により、神経細胞やグリアから産生されていることが判明した。特に、ヒト重症筋無力症者胸腺では筋様細胞の異常増加が認められ、原因抗原であるアセチルコリンレセプターと同時に多量の二因子を過剰に産生し、これが胸腺での、抗アセチルコリンレセプター抗体産生B-細胞の特異的増加の一因になっていることをつきとめ、重症筋無力症における胸腺摘出の有効性が論理的にはじめて証明できた。一方、脳内での、両因子の作用を調べるため、これまで、ラット、ヒトの神経系の細胞を使い、両因子をこれらの培養系から直接精製し脳内細胞への作用を調べたところ、ミクログリアの増殖因子として、既存のマクロファージコロニー刺激因子やグラニュロサイト・マクロファージコロニー刺激因子などとともに作用する事も判明した。従って、両因子はマクロファージ系細胞に多様性を起こす分化増殖因子であると考えられる。さらに当該二因子は神経細胞のMAPKの活性を高め、神経の生存や生理機能にとっても、重要な因子であることが判明した。この様に新規二因子は他のサイトカインと同様多機能性があり、今後様々な機能が見いだされることが期待される。さらに我々はリコンビナント製品を得ることに成功し、量産化と具体的な胸腺筋様細胞は脊椎動物の発生初期から出現し、ヒトでは重症筋無力症との関連が示唆されてきた細胞であるところから、我々はこれらの細胞は生理的に重要な機能をもつ細胞と考え、ラットからクローン化し、多種のサイトカインとともに新規80-kDa、100-kDa造血因子をも産生していることを見いだした。さらに我々はリコンビナント製品を得ることに成功し、量産化と具体的な我々はこれまで、ラット胸腺より筋様細胞の前駆細胞と思われる細胞をクローン化し、この細胞が既存のサイトカインばかりでなく新規造血因子80-kDa,100-kDa因子二種を産生することを見いだし、遺伝子クローニングに成功し、リコンビナント製品を得ている。最近本二因子は胸腺筋様細胞ばかりでなく、ラットの脳内グリア細胞からも産生されていることをノーザン、ウエスターン解析で見いだした。精製品はミクログリアの分化増殖に作用することから、ミクログリアの分化増殖因子の一つと考えられる。ミクログリアは近年、他のモノサイト系細胞と同様、多様性を示すことから、他の造血因子と共に、ミクログリアの分化増殖にも作用すると考えられる。多くのサイトカインは多機能性があるところから、本二因子に関してもその可能性が考えられるので、ラット脳を用いて、両因子に対する特異抗体で、免疫組織染色をしたところ、多くの神経系細胞や軸策が特異的に染色されることを見いだした。このことは当該二因子はミクログリアの分化増殖因子としてばかりでなく、神経細胞の生存維持等にも深く関与した因子であることが判明した。さらにヒトアストロサイト細胞株もラットと同様本二因子を産生していることが判明した。今後の研究課題として、両因子と神経細胞との関係を重点的に研究していく新規80-kDaと100-kDa因子の研究80-kDaと100-kDa新規二種の因子は両者とも胸腺の筋様細胞細胞の生理機能研究を通して見い出された新規因子で、両者とも骨随細胞に作用し、モノサイト系の造血分化増殖を特異的に誘導する因子である。さらに両因子は腹腔浸出細胞や、脳ミクログリアの分化増殖を誘導する。モノサイト系細胞の分化誘導に必須とされる。GM-CSFとM-

CSFの遺伝子が欠損するマウスでも血流にモノサイト系細胞が出現することから、これら以外の造血因子の存在が指摘された。我々の二因子はこれに相当し、モノサイト系細胞の臓器特異性や多様性に関与する因子と考えられる。最近我々は数種の脳内細胞がこれら二因子を活発に産生し、ミクログリアの分化増殖ばかりでなく、神経細胞の生存維持にも重要な作用をすることをみいだした。二因子の多様な作用はさらに、免疫反応の場でも見い出された。両因子はIL-2と相乗的に作用し、抗原特異的B-細胞の増加を著しく促進した。このような多岐に渡る生理機能を持つ二つのサイトカインは常に同時産生されていることから、その生理的意義を追求している。本研究では、特に、脳内における生理作用を追求し、培養細胞を用いて解析し、その生産細胞の特定化、生理査証の解析を行った。私たちが樹立したラット由来クローン化胸腺筋様細胞の培養情勢中に見出した二種の新規分化増殖因子、80-kDa因子と100-kDa因子は、共にモノサイト系細胞に対してそれぞれ特異的な刺激活性を有する。両者は互いに、分子サイズが異なるだけでなく、特徴ある細胞刺激効果を示し、免疫学的交差性は認められない、また共に既存のモノサイト系細胞刺激因子と異なる分子である。このような細胞刺激活性を指標として物質の分離精製を行い、そのアミノ酸分析結果をもとに、産生細胞のmRNAからcDNAを獲得、また因子タンパクに対する特異的モノクローナル抗体および合成ペプタイドを抗原としたウサギ抗血清のアフニティカラム精製標品を作成した。これらを研究探索子として脳内のモノサイト系細胞であるミクログリアに対する細胞刺激活性を見出すことが出来た。培養アストロサイトによる両因子生産能をマウス・ラット・ヒトと種をこえて認めた。筋様細胞由来の同因子、またその遺伝子組み換え体由来同因子は、免疫学的にも、生理活性に上でも同一の因子と認められた。特異抗体を用いた組織化学的検討により、生体脳ではニューロンが陽性反応を示した。そこで培養ニューロンを標的にMAPキナーゼ活性を検じ、活性を認めた。脳内の陽性部位の局在に関しては、大脳皮質や海馬における所見からは脳の成長発達との関係が窺われ、特に臭球から海馬に至る神経走向に関連する結果を得て、その機能解析を終えた。ところで、二因子は、私たちがこれまでヒト重症筋無力症の発症と胸腺摘出術による同症の鍵となると考えてきた胸腺筋様細胞で、同細胞はB細胞にも分化する非常にユニークな、多機能な細胞で、非常に豊富な細胞刺激因子を生産する能力を有する。本因子が脳にあってもグリア・ニューロンの相互関係を解き明かす研究素子となると考え今後も詳細に検討したい。