hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性脳腫瘍におけるハイパーメタボリズムを標的にした新たな診断、治療戦略の考案

悪性脳腫瘍における新たな診断および治療標的を探索する目的で、中枢神経悪性リンパ腫の臨床サンプルを用いて、増殖、浸潤に関与するケモカイン(CXCL12/CXCL13)と受容体(CXCR4/CXCR5)およびそのシグナル分子の発現解析を行った。脳原発リンパ腫ではCXCL12およびその受容体であるCXCR4の発現も高く、CXCL12/CXCR4の増殖、浸潤への関与が示唆された。さらに下流のシグナル分子として、翻訳開始因子であるeIF4Eの活性型であるリン酸化eIF4Eの高発現がみられ、eIF4Eは細胞の代謝に関与する分子の発現調節にも関与しており、リンパ腫の新たな治療標的と考えられた。本研究では悪性脳腫瘍において亢進している代謝経路に着目し、関連分子の発現および機能を解析することで、治療抵抗性である悪性脳腫瘍に対して有効な新規治療法の開発を目的にしている。髄芽腫は、小児に発生する悪性脳腫瘍である。近年、摘出術後に放射線照射および多剤化学療法を併用することで、生存期間の延長がみられている。しかし中には各種治療に抵抗性で、予後不良な症例もある。この腫瘍に対して近年、網羅的な遺伝子解析が行われ、遺伝子発現に基づいたグループ分類がなされている。我々の施設で摘出術および後療法を行った22例に対して、各グループにおける代表的分子に対する抗体を用いて免疫組織染色を行い、日本脳腫瘍病理学会において発表した。今回用いた単一分子の発現だけでは、クリアーカットなグループ分類はできなかった。分子発現と治療反応性に関しての解析を進めている。脳原発悪性リンパ腫は、腫瘍細胞が脳深部に浸潤することで広範囲に脳を障害し、高度の認知障害等を生じる悪性脳腫瘍である。脳内に生じるケモカインは、腫瘍細胞の浸潤に関与し、細胞内のシグナル分子を活性化することが知られている。そこで我々は、中枢神経系リンパ腫組織において、B細胞リンパ球の遊走に関与するケモカインであるCXCL12およびCXCL13とその受容体の発現を解析した。中枢神経系リンパ腫では脳原発および二次性の脳内浸潤例共に、CXCL12とCXCL13は高発現し、また脳原発リンパ腫ではCXCL12受容体であるCXCR4の発現も高く、一方で脳浸潤を伴わない全身性リンパ腫ではCXCR4の発現がなく、CXCL12/CXCR4がリンパ腫の脳内浸潤に関与する可能性が示唆された。この結果は、日本脳腫瘍学会にて報告した。ケモカインシグナルは細胞内の代謝経路の活性化にも関与している可能性が高く、下流のシグナル分子の発現解析や機能解析を進めている。カテプシンSは、細胞内リソソームに局在するシステインプロテアーゼの一つであり、近年グリオーマ細胞の脳内浸潤や乳がんの脳転移に関与するとの報告がある。今回我々は、中枢神経系リンパ腫組織において、カテプシンSの発現を解析した。中枢神経系リンパ腫では脳原発および二次性の脳内浸潤例共に、カテプシンSは高発現していた。組織中の局在として、特に血管周囲に集蔟した細胞に強い発現があったことは、リンパ腫の血管周囲腔を介した脳内への浸潤に関与する可能性が示唆された。この結果は、日本脳腫瘍病理学会にて発表した。脳原発悪性リンパ腫に対しては、大量メソトレキセート療法と放射線照射の併用が標準的治療法として行われている。我々もこれまで行ってきた治療成績を解析し、転帰に関与する因子を検討した。その結果、化学療法を完遂できた症例の予後が良好であった。この結果は、日本脳神経外科学会学術総会にて報告した。また解析結果は、論文にもまとめて報告した(Makino et. al. International journal of clinical oncology 20, 2015)化学療法抵抗性には、代謝の亢進等リンパ腫細胞の生物学的特徴が関与している可能性が高く、蛋白発現および遺伝子発現解析を進めている。脳神経外科学、脳腫瘍学当初、代謝に関与する分子としてこれまで発現解析を進めてきたIDH1およびFASの機能解析を進める計画であった。機能解析に用いるIDH1変異型発現ベクターの作製等に時間を要しており計画の遅延が見られる。また摘出腫瘍(悪性髄膜腫、悪性リンパ腫など)から、悪性脳腫瘍初代培養細胞株を樹立中である。摘出腫瘍からのIDH

1遺伝子の変異を検出する目的で、これまでの変異型IDH1蛋白認識抗体による免疫組織染色に加えて、直接DNAの遺伝子変異を検出できるPCRを用いたパイロシークエンス法を立ち上げる。摘出脳腫瘍からの、初代培養細胞株の樹立に時間を要する場合には、悪性髄膜腫培養細胞株を購入し、阻害剤を用いたin vitroでの増殖抑制効果を検討する。さらに実験動物の皮膚に培養細胞株を移植した皮下移植モデルを作製し、in vivoでの増殖抑制効果を検討する。今年度の研究計画において、網羅的な遺伝子解析および実験動物を用いたin vivo解析まで遂行できなかったので、次年度への繰り越しになった。摘出サンプルを用いた網羅的な遺伝子または蛋白発現解析を行う。実験動物を用いたin bivoでの、機能解析または増殖抑制効果の検討を行う。
光ファイバ-による電波干渉計の位相同期法の研究

光ファイバ-は、同軸ケ-ブルに比べ伝送損失がきわめて小さいという利点を有するが、電気と光の変換過程で内部雑音が発生するという問題点がある。光ファイバ-を同期信号の伝送に用いたとき、この雑音は位相のゆらぎとなって位相の同期精度を劣化させる。電波干渉計の場合、最終的に感度を低下させる効果となる。本研究では、光ファイバ-を信号伝送に用いた場合に発生する雑音が電波干渉計に与える影響について定量的に解析し、光の強度が0dBm程度であれば発生する雑音の量が電波干渉計に与える影響は1%よりはるかに小さく、無視できるという結果を得た。光の強度を小さくしていくと、内部雑音の影響は相対的に大きくなる。我々は、光の強度の変化による位相同期回路の特性の変化を実験的に調べ、光の強度が-20dBm程度までは電波干渉計の感度を損なうことなく安定な位相同期を行うことが可能であることを確認した。これは、光ファイバ-の伝送損失を0.2dB/km0.4dB/kmとすると、50km100kmの伝送が可能であることに相当する。より高感度の受光素子を用いれば伝送距離は更に延ばすことが可能である。長距離伝送を行う場合、周囲温度の変化や局所的な屈曲などの外乱を受けることになる。このため、光ファイバ-の温度変化に対する伝送路長の変化特性、屈曲による伝送信号の位相変化特性、屈曲による損失の変化特性について実験的に調べた。特殊な加工を施した光ファイバ-ケ-ブルでは、温度変化に対し0.2ppm/°Cの伝送路長変化であり、高位相安定度の同軸ケ-ブルと同等かそれ以上の性能を有することがわかった。また、半径30mmまで曲げても位相変化は0.65度/GHz程度、損失は無視できるほど小さく、同軸ケ-ブルより屈曲を大きくすることが可能であるという結果が得られた。
普遍的な鉄硫黄クラスター生合成と根粒菌独自に進化した共生窒素固定との接点を解く

本研究では、根粒菌Sinorhizobium melilotiにおいて、マメ科植物との共生窒素固定系成立に必須の役割を有するヒートショックシグマ因子RpoH1によって発現制御される遺伝子群(レギュロン)の探索と、RpoH1レギュロン中に見出された新規共生必須遺伝子SMc00302 (sufTと命名)の機能解析を行ってきた。最終年度以前に、sufTが原核生物と真核生物の両方にわたって広く保存されるタンパク質ドメインDUF59から構成され、根粒菌においては、細胞内の鉄硫黄タンパク質レベルを維持する役割を果たし、またその役割は細胞内の鉄が正常な低レベルの場合にのみ必須であることなどを示した。これは、生命の根源的要素である鉄硫黄クラスターの生合成の調節機構が、根粒菌独自の共生窒素固定能に活用されていることを意味している。また、RpoH1はヒートショックの有無にかかわらず細胞内で一定のレベル存在するものの、その活性段階の調節により、ヒートショック条件下でレギュロンの発現を誘導していることを示した。最終年度には、宿主マメ科植物との相互作用の過程においてRpoH1が発現制御する遺伝子の探索に役立てるため、植物栽培温度と同じ25度で最小培地を用いた培養条件を採用して根粒菌のトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、以前の栄養培地条件での結果とは異なり、温度ストレスのない25度において、発現がRpoH1に依存する25遺伝子を同定するに至り、更に、そのうち7遺伝子は、野生型根粒菌においてヒートショックでは発現上昇しない、新たなタイプのRpoH1レギュロン遺伝子であることが判明した。この成果は、鉄硫黄タンパク質生合成の制御因子SufTを包含するRpoH1レギュロンが、根粒菌の共生窒素固定系成立にどのように寄与しているのか理解を進めるのに重要な知見となる。根粒菌は、マメ科植物との間で進化した共生窒素固定能が特徴的なグラム陰性細菌である。一方、真核生物と原核生物両方に分布する機能未知のDUF59ファミリータンパク質は、地球上の生物に普遍的に存在する鉄硫黄タンパク質の生合成に関与する可能性がある。根粒菌SinorhizobiummelilotiのDUF59タンパク質SufTが鉄硫黄タンパク質生合成と共生窒素固定の成立の両方にいかに組み込まれているかを探るために、そのsufT変異株を分離した。野生型と比べて、生育速度の低下、鉄飢餓に対する感受性増大、数種類の鉄硫黄酵素の活性低下、および共生窒素固定不全といった表現型を確認したことによって、SufTがSUFシステムを介した鉄硫黄タンパク質合成を促進し、そのことが共生窒素固定に重要であることが分かった。次に、S. melilotiのsufT変異株の生育速度が改善した自発的サプレッサー変異株を分離し、そのゲノム解析を行った。その結果、包括的鉄制御因子をコードするrirA遺伝子に欠失が見つかり、その後、その機能欠損がsufT変異に伴う全ての表現型(生育速度、鉄硫黄酵素の活性、共生窒素固定能)をサプレスすることを証明した。この結果は、rirA変異に伴う細胞内の鉄レベルの増加によって、鉄硫黄タンパク質生合成過程におけるSufT機能の欠損の影響を補われることを示唆している。SufTの機能が細胞内の個々の鉄硫黄タンパク質の生合成に及ぼす影響を解析するために、鉄硫黄タンパク質としてRirA、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アコニターゼを選び、それぞれのエピトープタグ付加タンパク質をコードする遺伝子をS.melilotiゲノムに組み込んだ。次年度に実施するそれらのタンパク質の鉄硫黄クラスター含有レベルの測定に役立てる。根粒菌のSufTの共生窒素固定における必須の役割、および鉄硫黄タンパク質生合成の効率に関する役割を明らかにすることに成功した。更に、その機能解明を深めるための実験準備も、おおむね順調に進めることができた。ただし、根粒菌の共生成立過程の時期特異的発現を誘導するプロモーターを用いた「sufT変異の影響を共生成立過程で一過的に顕在化させる」試みが、根粒菌ゲノム上の遺伝子でのプロモーター置換操作が難渋した結果、予定以上の時間を費やし、そのあおりで、計画していた酵母two-hybrid解析を次年度に回さざるを得なくなった。アルファプロテオバクテリアの代表種であるSinorhizobiummelilotiは、アルファルファ等のマメ科植物との共生窒素固定能を有し、この特徴はマメ科植物との共進化の結果である。このバクテリアの鉄硫黄クラスター生合成装置をコードするsuf遺伝子クラスターには、新規遺伝子sufTが含まれている。sufTは、広く原核生物と真核生物に保存されている機能不明ドメインDUF59からなり、その欠失変異株は、鉄飢餓条件への感受性増大や数種類の鉄硫黄酵素の活性低下といった生物に普遍的な性質への影響のみならず、根粒菌独自の性質である共生窒素固定能の欠損を示す。更に、包括的鉄制御因子RirAの欠損が、sufT欠失変異がもたらす多くの表現型をサプレスすることから、SufTは、S. meliloti細胞内の生理的な低鉄レベル条件下において、必要な鉄硫黄タンパク質を供給するのに必要な役割を果たしていると推定される。しかも、他のsuf遺伝子とは異なり、sufTの発現はヒートショックシグマ因子RpoH1による制御を受けることから、細胞がストレス環境に置かれる際に鉄硫黄タンパク質の生合成を補強する役割も考えられる。本研究では、原核生物と真核生物の両方にわたって保存されているDUF59の機能解明において、S. melilotiのsufTの解析が有効であると見なしている。

平成29年度は、sufTの発現制御を行うRpoH1の機能調節機構の解析を重点的に進めた。定量的Western blotting解析の結果、細胞内のRpoH1はヒートショック処理の間も一定レベルを維持することを見つけた。すなわち、RpoH1が誘導するストレス応答が、その活性の上昇が原因であることを示すことができた。Sinorhizobiummelilotiにおいて、sufT遺伝子の発現制御をつかさどるシグマ因子RpoH1の機能の制御機構について意義深い知見を得ることができた。一方、当初予定していた、細胞内の各種鉄硫黄タンパク質における鉄硫黄クラスター含有率に及ぼすsufT変異の影響の解析については、S.melilotiゲノム上の各遺伝子を、FLAGタグを付加した遺伝子に置換することができたが、それを用いた鉄硫黄クラスター含有率の解析は中途で終わった。細胞破砕の条件検討に時間を要したのが主な原因である。また、RpoH1が発現制御する、SufTと関連する他遺伝子の探索のために、RpoH1機能亢進変異株のRNA-seq解析を目論んでいたが、その変異株の作製が中途で終わった。次年度にそれぞれの解析を継続し、目的を達成したい。本研究では、根粒菌Sinorhizobium melilotiにおいて、マメ科植物との共生窒素固定系成立に必須の役割を有するヒートショックシグマ因子RpoH1によって発現制御される遺伝子群(レギュロン)の探索と、RpoH1レギュロン中に見出された新規共生必須遺伝子SMc00302 (sufTと命名)の機能解析を行ってきた。最終年度以前に、sufTが原核生物と真核生物の両方にわたって広く保存されるタンパク質ドメインDUF59から構成され、根粒菌においては、細胞内の鉄硫黄タンパク質レベルを維持する役割を果たし、またその役割は細胞内の鉄が正常な低レベルの場合にのみ必須であることなどを示した。これは、生命の根源的要素である鉄硫黄クラスターの生合成の調節機構が、根粒菌独自の共生窒素固定能に活用されていることを意味している。また、RpoH1はヒートショックの有無にかかわらず細胞内で一定のレベル存在するものの、その活性段階の調節により、ヒートショック条件下でレギュロンの発現を誘導していることを示した。最終年度には、宿主マメ科植物との相互作用の過程においてRpoH1が発現制御する遺伝子の探索に役立てるため、植物栽培温度と同じ25度で最小培地を用いた培養条件を採用して根粒菌のトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、以前の栄養培地条件での結果とは異なり、温度ストレスのない25度において、発現がRpoH1に依存する25遺伝子を同定するに至り、更に、そのうち7遺伝子は、野生型根粒菌においてヒートショックでは発現上昇しない、新たなタイプのRpoH1レギュロン遺伝子であることが判明した。この成果は、鉄硫黄タンパク質生合成の制御因子SufTを包含するRpoH1レギュロンが、根粒菌の共生窒素固定系成立にどのように寄与しているのか理解を進めるのに重要な知見となる。
C型肝炎ウイルス・ペプタイドワクチンの開発のための基礎的検討

6種類の純系マウスにHBV-HBcAgで免疫刺激を行った際は、すべてのマウスに早期より(2週)、高い抗体産生が見られたのに対し、HCVコア抗原は、きわめて免疫原性が弱く、1種類のマウス(B10M)にのみ、良好な抗体産生が見られたものの、他の5種類のマウスでは抗体産生は微弱であり、後期になって、さらに2種類のマウス(B10,B10S)に中等度の抗体産生が認められた。マウスのHCV抗体はpl-15,p11-25,p21-35,p51-65を認識していた。マウス・コア抗体のIgG subclassは、IgG2b>IgG2a>IgG1であった。また、B10MマウスのT細胞の認識エピトープであるp51-65ペプタイドでまず免疫刺激を行い、次にHCVコア抗原で追加免疫を行うと十分な抗体産生やT細胞の幼若化反応が見られた。従って、この領域ペプタイドはHCV感染の際のペプタイド・ワクチンとしての可能性を有している。また、今回の検討では、慢性C型肝炎患者では大多数の症例においてHCV抗体は、p1-15,p11-25,p21-35,p31-45に結合し、一部の症例のHCV抗体は、p41-55,p51-65に結合した。コア抗体のIgG subclassは、IgG1>IgG3であった。次にインターフェロン治療の前後の検体を用いて抗体価の変動を検討したところ、p11-25ペプタイド(P2)に対する抗体価がインターフェロンの治療効果を反映して、有効例では有意に低下していた。特にIgG1型P2抗体がインターフェロン有効例で著名に低下が認められた。現時点では、インターフェロン治療の有効例の判断の指標として、肝機能の持続的な正常化とHCV-RNAの持続陰性化が用いられているが、ペプタイド抗体低下例がインターフェロンの長期的な治療効果の指標となりうるかどうか今後検討を行っていく予定である。純系マウスにおけるC型肝炎ウイルス・コア抗原に対する免疫応答。MHC-H2領域のみ異なり、他はまったく同一の遺伝子を有する純系マウス(B10、B1、OS、B10M、B10D2、B10BR、B10P)にHCVコア抗原で免疫し、経時的(2-10週)な抗体価の推移を観察した。HCVコア抗原としては、全長を含むFLC抗原と2/3の領域を含むJCC(1-120)抗原の2種類の抗原を用いた。FLC抗原を4μg投与した際は、ほとんどのマウスに抗体産生が見られなかった。50μg投与では1種類のマウス(B10M)には、6週間から高い抗体産生が見られた。10週目の抗体価は高反応群(B10M)、中等度反応群(B10、B10S)、低反応群(B10D2、B10BR、B10P)の三群に分けられた。JCC抗原を用いて免疫刺激を行ったところ、FLC抗原の場合と同様であり、高反応群(B10M)、中等度反応群(B10、B10S)、低反応群(B10D2、B10BR、B10P)の三群に分けられた。

抗体の認識するcore領域内エピトープは、p11-25、p21-35、p51-65を認識するものが多かった。コア抗体のIgG subclassは、6種類のマウスとも同様で、IgG2b>IgG2a>IgG1であった。次にT細胞の認識するcore領域ペプタイドを調べるため、高い抗体産生が見られたマウス(B10、B10S、B10M)にFLC抗原50μgでfoot padに免疫刺激を行ったあと、所属リンパ節より得られたリンパ球をHCV-core peptideとともに培養し、リンパ球の幼若化反応を^3Hチミジンを用いて測定した。FLC抗原で免疫刺激を行った際のT細胞認識するエピトープはB10マウスはp11-25、B10Sマウスはp161-175、B10Mマウスはp51-65であった。純系マウスにおけるC型肝炎ウイルス・コア抗原に対する免疫応答.MHC-H2領域のみ異なり,他はまったく同一の遺伝子を有する純系マウス(B10,B10S,B10M,B10D2,B10BR,B10P)にHCVコア抗原で免疫し,経時的(2-10週)な抗体価の推移を観察した.HCVコア抗原としては,全長を含むFLC抗原と2/3の領域を含むJCC(1-120)抗原の2種類の抗原を用いた。10週目の抗体価は高反応群(B10M),中等度反応群(B10,B10S),低反応群(B10D2,B10BR,B10P)の三群に分けられた.JCC抗原を用いて免疫刺激を行ったところ,FLC抗原の場合と同様であり,高反応群(B10M),中等度反応群(B10,B10S),低反応群(B10D2,B10BR,B10P)の三群に分けられた.抗体の認識するcore領域内エピトープは,P11-25,p21-35,p51-65を認識するものが多かった.コア抗体のIgG subclassは,6種類のマウスとも同様で,IgG2b>IgG2a>IgGlであった.次にT細胞の認識するcore領域ペプタイドを調べるため、高い抗体産生が見られたマウス(B10,B10S,B10M)にFLC抗原50μgでfoot padに免疫刺激を行ったあと,所属リンパ節より得られたリンパ球をHCV-core peptideとともに培養し,リンパ球の幼若化反応を^3Hチミジンを用いて測定した.T細胞認識するエピトープはB10マウスはp11-25,B10Sマウスはp161-175,B10Mマウスはp51-65であった.2. C型肝炎患者のHCV抗体のコア領域内の認識エピトープ.急性および慢性C型肝炎患者血清を用いて,HCVコア抗体の認識エピトープを検索した.急性C型肝炎患者でのHCVコア抗体の認識エピトープは散在しているものの,1/3の症例ではp51-65を認識していた.一方.慢性C型肝炎患者でのHCVコア抗体の認識エピトープは大多数の症例において,pl-15,p11-25,p21-35,p31-45に結合し,一部の症例のHCV抗体は,p41-55,p51-65,p101-115に結合した.コア抗体のIgG subclassは,IgGl>IgG3であり,IgG2とIgG4は認められなかった.次にHCV-envelope antigen(El)構成ペプタイド内の認識エピトープを検索したところ,どの症例も,envelope(El)領域ペプタイドには,まったく結合しなかった.
日記史料からみた清末のモンゴル王公と清朝支配

本研究では、モンゴル王公が記した日記史料に注目した。清末に来京した乾清門行走バボードルジの日記などの分析から、北京での宮廷儀礼や乾清門行走の実態が明らかになった。さらにはこれら宮廷での活動や出来事、皇帝との接触などを通して、王公がいかなる対清認識・相互認識を形成していたかを分析し、清朝のモンゴル統治のメカニズムについて考察した。本研究は、清朝藩部統治の重要な政治アクターであるモンゴル王公および駐箚大臣等の清朝派遣官僚に注目し、特に、彼ら王公・官僚らが記したモンゴル語・満洲語・漢語の日記史料を中心に分析する。従来の研究が、主に行政文書を用い、清朝支配の貫徹か在地社会の自律性かという二元論的な課題設定をしていたのに対し、本研究では、統治者と被統治者が恒常的に接触する「場」(宮廷・駐箚地)において、実際にモンゴル王公が皇帝・清朝官僚をいかに認識し、いかなる関係を構築していたのかに注目し、清朝統治のメカニズムとそのモンゴル史上の意義を検討する。本年度は、研究初年度であるため、国内・海外での基本史料の調査・収集を通じて、史料状況の全体像把握につとめると同時に、既収集史料の分析を進め、研究全体を展望する論文を執筆するなど、国内外での成果発信につとめる計画であった。実際に、2013年8月に台湾で調査を行ったほか、国内では東京、仙台、大阪、札幌などの関係機関で調査を行った。対象は、出使あるいは駐箚した漢人・満人官僚の日記史料で、主に漢文で書かれた日記を中心に収集・整理を開始した。また本研究の核となるモンゴル語の日記史料や宮廷儀礼に関わる史料の収集・整理にも着手した。これらの成果として論文2編、学会発表1件がある。特に論文では、漠北モンゴルの閑散王公が、光緒9(1883)年末に北京・乾清門に行走した際のモンゴル語日記を分析し、作者バボードルジの出身・経歴、記述内容の特徴など史料の性格を明らかにし、序結において、先行研究の課題と今後の展望をまとめることができた。本年度は、中間年度にあたり、以下の二つを主な課題とした。まず、国内学会や国際シンポジウムで積極的に成果を発表することで、情報交換や議論の共有化に取り組むこと、そして、国内国外の各研究機関・図書館における史料調査および収集を集中的におこなうことである。これら研究活動や史料調査を通じて、埋もれている史料を発見し、それら新史料と、すでに収集したモンゴル王公バボードルジの光緒9(1883)年乾清門行走日記などを相互に比較検討することで、本研究の深化と体系化につとめる計画であった。史料調査については、夏期に台湾で調査を行ったほか、国内では東京、仙台、秋田、名古屋などの関係機関で調査を行った。それらの成果として、第一に、新たなモンゴル語日記史料を収集できた。その史料は、内モンゴルの王公が北京に値班した際の日記であり、上述のバボードルジの日記と比較検討する格好の材料を得た。現在、研究協力者と協同で、次年度の公開をめざし分析・整理中である。第二に、上述のバボードルジの日記について資料全体の公開に目途を付けた。日記中に出てくる儀礼こちらも刊行をめざし整理中である。その他、清朝宮廷文化に関わる史料を収集できた。成果公開については、国内での学会発表3回、研究会報告2回、国際シンポジウム報告1回と当初計画した以上の回数をこなすことができた。反面、新史料の発見とその整理に時間が取られ、論文の刊行については年度をまたぐこととなってしまった。次年度の最終年度に向けて鋭意成果の公開に力を注ぐこととしたい。本年度は、既収集史料の分析を進め研究全体を総括する予定であったが、昨年度に続いて、当初想定しなかった新たな史料を収集することができた。それらの漢文や満文で書かれた宮廷儀礼に関する新収集史料を組み合わせることで、宮廷儀礼とそこでのモンゴル王公の動きなどがより明らかになる可能性が出てきた。これらから得られた新たな知見は、今まで本研究で中心的に分析してきたバボードルジの日記だけでなく、昨年度に収集した内モンゴル王公の北京値班日記、ウリヤスタイ大臣の日記などを読解する上でも非常に重要であると言える。また本年度末には、日記史料や档案史料が出版されるとの情報を得て、一部は入手することができた。以上の事情から、当初予定していた計画を延長して、引き続き研究協力者などと連携しながら、成果の早期公開をめざす。年度当初に予定していた研究全体の総括や成果公開についてはやや遅れが生じているが、その理由は、当初想定していた以上に重要な史料が収集でき、その整理分析に時間を要しているからである。研究全体としては順調に進展していると言える。

本研究は、清朝藩部統治の重要な政治アクターであるモンゴル王公および駐箚大臣等の清朝派遣官僚に注目し、特に、彼ら王公・官僚らが記したモンゴル語・満洲語・漢語の日記史料を中心に分析する。従来の研究が、主に行政文書を用い、清朝支配の貫徹か在地社会の自律性かという二元論的な課題設定をしていたのに対し、本研究では、統治者と被統治者が恒常的に接触する「場」において、実際にモンゴル王公が皇帝・清朝官僚をいかに認識し、いかなる関係を構築していたのかに注目し、清朝統治のメカニズムとそのモンゴル史上の意義を検討する。本年度は最終年度に当たり、新たに収集した史料の分析を進め、既収集史料との比較参照を行い、研究全体を総括することを目指した。また昨年度から継続して、日記史料や宮廷儀礼に関する史料の収集も積極的に行った。結果として、主に漢文・漢語で書かれた宮廷儀礼に関する史料、漢人・日本人が清末から民国期に書き残した回想録等を収集することができ、北京の宮廷や都市空間、モンゴルの各駐箚地における人的交流について、さらに多角的・通時代的に分析するための材料を揃えることができた。成果として、当初から中心的な分析対象としてきたバボードルジの日記の出版に目処が立ったほか、本研究期間中に収集した日記史料も基礎的な整理・分析を終えることができた。ただし、分析対象やテーマが計画当初よりも広がったため、期間中に公開を終えることができなかった成果もある。今後も順次本研究成果を公開していく予定である。本研究では、モンゴル王公が記した日記史料に注目した。清末に来京した乾清門行走バボードルジの日記などの分析から、北京での宮廷儀礼や乾清門行走の実態が明らかになった。さらにはこれら宮廷での活動や出来事、皇帝との接触などを通して、王公がいかなる対清認識・相互認識を形成していたかを分析し、清朝のモンゴル統治のメカニズムについて考察した。本研究の特徴のひとつは、モンゴル語や漢語、満洲語などの多言語で書かれた史料、特に刊行・研究が進む行政文書とは異なる、個人の日記史料を扱うことにある。従来、未刊行・未調査の史料を収集するために、広汎な史料調査が不可欠である。本年度では、引き続き国内・海外での史料収集および従来知られていなかった(利用されてこなかった)関連史料の発見と収集につとめる計画であった。実際には、上述の如く、モンゴル王公が北京宮廷に参内した際のモンゴル語日記を新たに収集することができたほか、すでに収集した日記史料の公開など、学会全体に裨益するような史料の共有化に目途が立った。また国内外の所蔵機関にアクセスし、漢文で書かれた日記史料や宮廷儀礼に関する史料を収集したほか、宮廷文化に関連する史料も収集することができ、最終年度の円滑な調査・研究が進められる環境が整った。当初予定してなかった新出の日記史料の分析を急ぐとともに、本年度および次年度に刊行されるとの情報を得た中国所在の重要史料などの収集を急ぐ。その分析と収集の状況を見て、必要であれば海外での補足的な史料調査を行う予定である。以上の新たに収集した史料を積極的に利用することで、国内外での史料調査を効率化し、既収集史料を分析し直し、最終的な成果公開に結び付ける予定である。人文学東洋史次年度は最終年度に当たるため、研究成果のとりまとめ、および成果の公開に注力する。史料分析の主たる対象は、引き続きモンゴル王公バボードルジの光緒9(1883)年乾清門行走日記であり、史料の公開に向けて分析・整理を進める。また内モンゴル王公の日記についても、分析・整理を行い、公開する予定である。
ベクターの生態特性が病原体動態と進化に与える影響の理論的研究

本年度は昨年度に引き続き家畜を用いたマラリア防除について研究を行った。マラリア防除戦略のほとんどは殺虫剤を用いて媒介蚊をコントロールするようにデザインされてきた。しかし、殺虫剤抵抗性蚊の出現により防除戦略は失敗に終わっている。本研究では,媒介蚊をマラリアに感染しない家畜に集中させることによって、マラリア感染蚊の人への吸血頻度を減少させ、殺虫剤抵抗性蚊の進化を許さずにマラリアを防除できることを理論的に示した。さらにこのような防除方法は、家畜を1箇所に集め、居住区から隔離することでさらに有効であることがわかった。また並行して疫学パラメーターが病原体系統樹に与える影響について研究を行った。現在得られる病原体系統樹は病原体の疫学パラメーターなどの疫学動態を反映しているが、疫学パラメーターと病原体系統樹の関係について調べた研究はない。本研究では、多重感染および交差免疫を考慮した多抗原SIR個体ベースモデルを構築し、徹底的なシミュレーションにより、疫学パラメーターと病原体系統樹の関係について解析を行った。結果は疫学パラメーターの中で、病気による死亡率の変化がもっとも系統樹の形に影響を与えるということがわかった。これはインフルエンザのような一本の枝から抗原型が毎年供給されるような系統樹は、ワクチン等の摂取による回復率の上昇によるものではなく、系統間の干渉作用による重感染個体の減少が重要であるということを示す。年度の後半よりこれらの研究成果をまとめて、学術雑誌に投稿中である。
脱細胞血管を素材とする小口径血管グラフトの開発

冠動脈バイパス術などのために自分の血管になれる高機能小口径血管移植片の開発を試みった。ラットの大腿動脈から血管を採集し、洗剤(SDS)で細胞を徐去し、リン脂質ポリマー(MPC)を抗血液凝固のために塗布した。細胞除去の効率を上げるため、超音波洗浄と循環系を利用した全身潅流も試した。SDSと超音波洗浄の併用が有効な小口径血管脱細胞法だと確認した。しかし、処理したサンプルをラットの大動脈に移植すると術後4週で栓塞した。MPC塗布が組織吸収反応を惹き起すため、他の抗凝固措置が必要だと判断した。遂行した実験:1)脱細胞化血管移植片の作製及び最適化:SDラットの大腿動脈を20mmの長さで採取し、室温でPBSで15分洗浄、1%SDSで24時間洗浄、純水で30分洗浄、1% Triton-X100で60分洗浄、抗生剤入りPBSで6日間洗浄、純水で1時間洗浄後、凍結乾燥する。脱細胞効率を上げるため、二種類の方法を試す:a)SDS洗浄とTriton-X100洗浄後超音波洗浄を20分間加える。b)左心室に針を挿入、右心房を開き、左心室から試薬を導入、全身潅流を行う。内膜抗凝固措置として、MPC塗布を行う。2)脱細胞化血管組織片の分子構造評価:作製された試料を臨界点乾燥とイオンコーティング処理を施し、走査電子顕微鏡(SEM)で立体構造を観察する。3)血管移植及び機能評価:Wistarラットの大腿動脈に10mmの欠損を作製し、異体脱細胞化血管移植片を10-0ナイロン糸で端端吻合する(各群N=5)。術後4週目にサンプルを採取し、血管の開存を確認する。4)組織学的評価:移植部位を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋の後に縦方向に薄切切片を切り出し、免疫蛍光染色で膠原線維、弾性線維、基底膜の変化と、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞の形態を観察する。結果:超音波処理による脱細胞効率の上昇を確認した。全身潅流は腹腔内臓器には有効だが、下肢の動脈には無効だった。術後4週でラット大腿動脈に移植されたサンプルが栓塞した。MPC塗布群は血管自身が吸収された。結論:SDSと超音波洗浄は有効な小動脈脱細胞処理法だと確認できた。径0.81mmの血管では脱細胞血管移植は開存しない。MPC塗布は組織吸収反応を惹起するため、脱細胞血管に不適切だと考える。遂行した実験:1)異種脱細胞化血管移植片の作製:日本白色家兎の上腕動脈を20mmの長さで採取し、外部撹拌浸漬と管腔内潅流法により、室温にPBSで15分洗浄、1%SDSで24時間洗浄、純水で30分洗浄、1% Triton-X100で60分洗浄、抗生剤入りPBSで6日間洗浄する。一方、ホルマリン固定、パラフィン包埋の後に薄切切片を切り出し、免疫蛍光染色でCollagen 1, Collagen 4, Fibronectin, Lamininなどの細胞外マトリックス構造と細胞核を観察する。3)血管移植及び機能評価:Wistarラットの大腿動脈に20mmの欠損を作製し、異種脱細胞化血管移植片(各10例)を10-0ナイロン糸で端端吻合する。術後3週目にサンプルを採取し、血管の開存を確認する。結果:上記の脱細胞法が血管全層の細胞を溶解除去できることを免染で確認した。SEMで滑らかな内膜基底膜構造を確認した。しかし、内膜と中膜の間に核残骸の沈着も観察された。術後3週でラット大腿動脈に移植されたサンプルがすべて栓塞した(3/3)。脱細胞法のさらなる効率向上が望ましい。血管内膜に抗凝固加工が不可欠だと示された。計画:脱細胞処理の効率を上げるために、SDS処理後超音波洗浄を加えると全身潅流脱細胞処理を試す。移植血管内膜にヘパリン塗布、MPC塗布を試す。予定通りに研究を遂行した。今後の計画:1)脱細胞処理の効率を上げるために、SDS処理後超音波洗浄を加えると全身潅流脱細胞処理を試したい。

2)処理した移植血管内膜にヘパリン塗布、MPC塗布など抗凝固方法を試す。最善の抗凝固措置を探りたい。実験消耗品の購入(50万)と研究成果の発表(20万)に使用するつもりだ。
核局在性非コードRNAの高効率ノックダウンに向けたAgo2の核移行メカニズム解明

本研究では、RNA干渉に必須の分子であるArgonaute (Ago)2の核移行メカニズムの解明を試みた。その結果、Ago2のある部位に変異を導入することで核移行が抑制されることが明らかとなった。さらに、その部位はあるタンパク質(タンパク質X)との結合に重要な領域であった。そこでタンパク質Xとの結合を免疫沈降法により検討したところ、タンパク質Xとの結合性を欠失した変異型Ago2は核への移行性を消失していた。またタンパク質Xをノックダウンすることで、Ago2の核移行が減弱した。従って、Ago2はタンパク質Xとともに核に移行していることが示唆された。近年、核内にタンパク質をコードしない多くの長鎖非コードRNAが存在し、クロマチン修飾因子などと複合体を形成して遺伝子発現を制御するとともに、その発現が疾患とも大きく関連することが明らかとなってきた。従って核局在性の長鎖非コードRNAも重要な創薬ターゲットであり、その制御には標的RNAを分解するsiRNAが有用と期待される。しかし、核局在性RNAをsiRNAで分解するには、siRNAとともに標的RNAを切断するArgonaute 2 (Ago2)が核に局在する必要がある。申請者は既にAgo2の一部が核に局在することを見出しているが、Ago2は分子量約100kDaであることから能動輸送により核移行していると予想される。しかしAgo2には既知の核移行シグナルが無く、その核移行メカニズムは不明である。そこで本研究では、核局在性RNAの高効率ノックダウンやAgo2の核での機能解明に向けて、Ago2の核移行メカニズムを明らかにすることを試みた。まず、Ago2の各機能ドメイン(RNA結合ドメインやRNA切断活性ドメイン)に変異を加えた変異型Ago発現プラスミドを作成した。それらのプラスミドをHeLa細胞にTransfectionしたのち、核及び細胞質画分に分離したところ、TNRCファミリー蛋白質とのに変異を加えたAgo2では、核への局在が大きく抑制されていた。そこで、TNRC6AおよびTNRC6Bをノックダウンしたところ、TNRC6Aをノックダウンした場合に、Ago2の核移行が大きく阻害された。Argonaute 2 (Ago2)は、RNA-induced silencing complex (RISC)の主要構成成分であり、Post-transcriptional Gene Silencingを担う最も重要な因子である。これまでにAgo2が細胞質のみならず核にも局在することが報告されているが、Ago2の核移行メカニズムは明らかとなっていない。そこで、Ago2の核移行メカニズムの解明を試みた。まずAgo2のアミノ酸配列から核移行シグナルとして予想される配列を、in silico解析により同定し、その部位にアミノ酸変異を導入し核移行を検討したが、Ago2の細胞内局在に大きな違いは観察されなかった。次にAgo2の各機能ドメインにアミノ酸変異を導入し、その変異体の核移行について検討したところ、ある変異体においてAgo2の核移行が大きく抑制された。その核移行が抑制された変異体では、あるタンパク質の結合に重要な領域にアミノ酸置換が導入されていた。さらにそのタンパク質には核移行シグナルが存在していることから、Ago2はそのタンパク質とともに核に移行していることが予想された。Argonaute 2 (Ago2)は、RNA-induced silencing complex (RISC)の主要構成成分であり、Post-transcriptional Gene silencingを担う最も重要な因子である。これまでにAgo2が細胞質のみならず核にも局在することが報告されているが、Ago2の核移行メカニズムは明らかとなっていないことから、Ago2の核移行メカニズムを解明することを試みた。昨年度までにAgo2のなかで、あるタンパク質(タンパク質Xとする)との結合に重要な領域に変異を導入することによりAgo2の核移行が抑制されることを見出している。そこで本年度は、核に移行しない変異型Ago2とタンパク質Xとの相互作用について検討した。免疫沈降方により野生型および変異型Ago2とタンパク質Xとの相互作用について検討したところ、核に移行する変異型Ago2はタンパク質Xと結合していたのに対し、核に移行しない変異型Ago2はタンパク質Xとの結合が減弱していた。さらにタンパク質Xをノックダウンすることで、Ago2の核移行が大きく減弱した。また共焦点レーザー顕微鏡および免疫染色法を用いてAgo2の細胞内局在を検討したところ、Western blottingの結果を支持する結果が得られた。以上の結果より、タンパク質XによってAgo2が核に移行していることが示唆された。上記に加えて、トランスクリプトーム解析によりAgo2に結合し核移行に関与するタンパク質を探索している。Ago2の核移行を担うタンパク質の同定に成功しており、またAgo2内の核移行に重要なドメインの同定も終了している。現在、最終的な再現性の確認とAgo2と核移行を担うタンパク質の結合を免疫沈降により検討している。

遺伝子治療学現在、Ago2とAgo2の核移行を担うタンパク質の細胞内における結合を免疫沈降により検討している。また、これまで得られたデータの最終的な再現性を確認しており、それが終了次第、論文投稿する予定である。既にAgo2の核移行に重要なドメインを同定することに成功するとともに、Ago2の核移行に重要となるタンパク質の同定にも成功している。本成果は4回の学会(うち1回は国際学会)で発表した。一部、予想とは異なる実験結果が得られたため、追加実験を行う必要が生じた。また結論を得るために実施しなければならない実験が生じた。Ago2の核移行に関与するImportinファミリーの同定を試みるとともに、Ago2の核移行を阻害した場合に、核局在性の非コードRNAのノックダウンが阻害されるか検討する。またAgo1の核移行メカニズムについても、Ago2と同様の機構により核移行しているのか検討する。実験試薬の購入に使用する予定である。
高速高分解能PIXE分析システムの開発と化学状態分析への応用

波長分散方式による粒子線励起X線分光(PIXE : Particle Induced X-ray Emission Spectroscopy)を行うため分光結晶とカーボンファイバーアノードを持つ電荷分割型位置敏感比例計数管(PSPC : Position Sensitive Proportional Counter)を組み合わせた結晶分光PIXEシステムを自作により構築し、信頼性の向上と高速高分解能化のための検討を行った。まず理研を中心として大気中での高速高分解能な結晶分光PIXEシステムの開発を行い、法政大学における真空中でのそれに応用する方針で行った。その結果いくつかの問題点と解決方針が明らかとなった。1)イオンビーム照射しながら大気中から真空中の試料位置を監視するためレーザ変位計を導入し試料位置の変化をスペクトルの変化として換算し,ケミカルシフトの信頼性向上を図った。2)レーザ変位計の計測システムが安定するために90分間のウォーミングアップが必要である。3)ビームスリットを試料側に近くに(試料前10cm)設置し加速器のビーム状態の変化に対する影響を低減させた。4)カーボンファイバーの接着法式を銀ペーストから、半田付けに変更しアノードの電気的接触の不安定性を低減した。5)PSPC内を係数ガスで十分置換する事が測定の精度向上に重要である事を明らかにした。6)アノード電圧と係数ガス圧の変動がスペクトルに及ぼす影響を検討した。以上の事項を考慮し、αアルミナのケミカルシフトを測定し従来の誤差範囲内で実験データと一致したので真空中での結晶分光PIXEの信頼性は保証されているとの結論を得た。湾曲の分光結晶と単一のPSPCとを組み合わせたvon Hamosu方式の結晶分光PIXEシステムを構築し硫黄の化合物のケミカルシフトを測定した。その結果、平板結晶とPSPCの組み合わせに比べ約10倍の感度向上が実現した。また平板結晶と多層PSPCの組み合わせによる結晶分光PIXEに比べSN比が5倍向上した。平成13年度は真空外からレーザー変位計を導入し、イオンビームを照射中の試料位置を非接触で常時監視できるシステムの設計と予備測定を実施した。この場合、レーザー光をイオンビームと平行に照射するにはイオンビーム通路にセンサーを入れなければならずこの手法は原理的に不可能であった。光路追跡の検討を行った結果、イオンビームと垂直に導入することとした。具体的には真空チャンバーの上部から光学窓を通してセンサーヘッド(キーエンス社製KL080)からのレーザー光を導入し、ミーラーで一旦反射させ真空中の試料に照射し、照射光は再びミーラーに反射し、センサーヘッドの受光部に入るようにした。これはメーカーで保証しない新しい手法であるため、実際にどの程度の精度で測定できるか改めて検討する必要があった。それ以外に、真空パッキンの弾力性によりセンサーが動く可能性もあったが、測定中センサーの分解能(3ミクロン)以内で安定していた。ただし問題点として、センサーの表示が安定するのに電源投入後1時間程度かかり測定上十分注意しなければならないことが挙げられる。ミーラーの角度を水平に対し25度としたとき、試料へのレーザー光の入射角度は法線に対し40度であった。従って光路長ΔS(mm)と試料変位ΔD(mm)とにはΔS=1.31ΔDの関係が成立した。

位置検出比例計数管(PSPC)上の位置変位ΔPとチャンネルナンバーΔCとの間にはΔP/ΔC=0.132mm/channelの関係があり、試料からPSPCまでの光路長L=40cmを考慮すると,1eVの変化は分光結晶としてEDDT(d=4.404Å)を用いた場合、回折角の変化Δθは0.0113度となった。以上のような条件設定のもとでPIXEの測定実験(バンデグラフ加速器、1.5MeV,プロトンビーム)を行ったところ金属アルミニウムに対する酸化アルミニウムのエネルギーシフト量は0.44eVとなり従来のケミカルシフトとほぼ等しい結果が得られた。従来より高精度な状態分析をするため結晶分光PIXEシステム全体の安定性等について大々的に見直しを行った。従来試料表面でのイオンビームは左右にほとんど動かないとしていたが、試料前のスリットは1m離れており、厳密には疑わしくなった。そこで試料前10cmの位置に幅0.5mm厚み1mmのカーボン製のスリットを設置し、試料中心から反れたビームで照射しないようにした。従来、PSPCのアノード(7ミクロンカーボンワイヤー)を導電性接着材で固定していたが電気的接触が不安定になるとの指摘があり、念のためハンダで固定し直した。さらにシステム全体の安定性を見るため、アイソトープ(Fe55、5.9keV)を用いて0.2mmのスリットを通して長時間の時分割測定を実施した。40分ずつ20回測定しピーク位置がどの程度変化するか調べた。また、エレクトロニクスの安定性は発信機から0.02-0.2Hzのパルス信号をプリアンプから入れて調べた。その結果パルス信号のピーク位置の変化は±0.1チャンネル程度で極めて安定していた。ところが、アイソトープによるピーク位置は0.5チャンネル程のばらつきを持ちながら2チャンネルほど徐々に高チャンネル側にシフトした。思考錯誤の結果、PSPC内に流すPRガスが空気と全て置換するのに10cc/minの場合6時間以上かかっている疑いがでてきた。そこで50cc/minの流量で1時間流してから測定したところピークシフトは無くなり、ばらつきは±0.5チャンネルになった。さらにレーザ位置センサーの安定性について調べた結果、意外にも2時間は安定しない事が分かった。以上の実験の結果を踏まえ2種類の黒雲母中のアルミニウムの状態を比較検討した。
株式会社経営における権限委譲の法的分析

平成14年商法改正によって、会社の機関は選択的に委員会等設置会社が設けられた。新制度の構造であれば、会社法上の機関としての取締役会の性格はより経営者としての性格を失うことになる。歴史的発展の経緯から見ても、法が予定する「取締役」は、株主から委任を受けて会社の維持・運営に責任を持つものであって、経営を自己執行することまでは本来的に含まれていない。その意味からすれば、取締役会の決議事項を法定して、何を取締役会および取締役が自己執行しなければならないか、という点を法が押しつける根拠は見いだすことができない。しかし「取締役」を責任のみの担い手とするならば、経営陣の中に責任だけを負うスケープゴートを作るだけであって、経営の執行と責任とが対応していなければ、エージェンシー・コストが高くなるだけである。責任と権限の問題は、そのまま権限委譲の形態の問題と直結する。すなわち、権限委譲には対外的な責任についても含めてすべての決定権限を授権するもの(代理権型)と、対外的な責任は上位の者に残したまま、情報の偏在や分業等の理由で下位に委譲される形式のもの(使者型)とに分類される。会社内部の授権システムでは基本的に後者の形が多用されており、それぞれ権限には「権威」となる源泉があり、会社の組織の形にもよるが、この者が株主に対して経営責任を負うべきであろう。問題は、以上の経営責任を、取締役として株主から任用を受けたという「機関責任」と見ていたことに起因する。しかし実態としては「機関責任」のドグマにこだわる必要はなく、株主および株主総会との権限分配から得られた取締役および経営陣の権限に即した責任を問えばよいのであり、それにより柔軟な解決が可能であると思われる。株式会社における権限委譲の分析の手掛かりなる概念として、まず代理権の側面から分析を始めた。すなわち商法総則中の「商業使用人」規定の分析である。その結果、対外的に包括的権限を付与する権限授与行為の側面こそ、本来の商業使用人制度の存在意義であり、現に外務的権限が存在したか否かを裁判で争う場合には、後付的公平性の観点の方を多用するため、表見法理と限りなく接近していることが指摘できた。以上を中間的結論としつつ、次に権限委譲と会社法との関係を模索した。特にドイツで問題となっている場面を分析し、第三者に経営を任せる経営管理契約の場合と、特に事業部制化にともなって組織構造を変化させる場合とを取り上げ、それぞれの場合につき、取締役会のもとにある業務執行権をどの程度他人に委譲してよいか、法定される権限との関係を考えた。その過程で、取締役会の機能として、会社の機関、特に株主総会との関係という視点と、取締役会の会議体・合議制としての視点を区別する必要性を指摘した。そして研究をとりわけ前者の視点から行うこととした。この点は現在も継続中であるが、あるべき会社の形を押しつける形ではなく、ありうべき選択肢の範囲を呈示することを課題としたい。研究の実施は、主として文献・資料購読とその分析を通じて行ったが、経済学の研究者の助力を得て、企業の境界と法の役割について研究する機会を得た。また、2度ほどではあるが上場企業の経営担当者にインタビューする機会にも恵まれた。
原発性胆汁性肝硬変における免免応答機序の解明と診断・治療法の確立

3年間の研究にて、以下の点を明らかにした。1.原発性胆汁性肝硬変(PBC)の病態に関与するT細胞の機能解析では、(1)ミトコンドリア抗原反応性T細胞クローンを用いて、ミトコンドリア抗原と核膜抗原(gp210)との間に分子相同性のあること、(2)PBC患者由来細胞と健常者由来のT細胞の間には、T細胞の活性化における側副刺激分子への依存性の相違のあることを示した。2.PBCに対する免疫療法の開発を目的とした自己抗原特異的T細胞の誘導実験では、(1)自己抗原特異的CD8陽性T細胞の誘導に成功した。4.PBC発症における胆管上皮細胞Toll-like Receptors (TLRs)の関与の解析では、(1)TLR-4はPBC肝組織に発現し、PBCの進行とともに胆管・肝細胞の発現が増加していること、(2)BECはLPSなどの細菌成分の刺激によりTLR4-NF-kBとMAPK経路を介してIL-6、IL-8、MCP-1を分泌すること、(3)PBCの初期病変では病変局所のTLR-3-type1 IFN系が活性化していることを示し、TLRsおよびそのシグナル伝達系の異常で、慢性の胆管炎が生じている可能性を示した。5.我核膜孔蛋白gp210に対する免疫応答と予後との相関解析では、(1)gP210蛋白のB細胞エピトープの同定、(2)ELISAによる抗体の定量系の確立、(3)抗gP210抗体価が肝不全への進展の予測マーカーと有用であることの証明を行い、抗gp210抗体を血清マーカーとして新レい治療研究が可能となつた。また、(4)PBCにおける小葉間胆管細胞でに、gp210抗原の発現が増加していることから、(5)gp210抗原は炎症に伴う何らかの機構により高発現しgp210抗体の産生と関連していることが示唆された。1.原発性胆汁性肝硬変(PB)の病態に関与するT細胞の機能解析を行なった。その結果、(1)gp210抗原の一部にPDC-E2 163-176反応性T細胞クローンが交差反応性を示すこと、(2)PBC患者由来のPDC-E2反応性T細胞は側副刺激分子非依存性であり健常者由来のPDC-E2反応性T細胞は側副刺激分子依存性であること、(3)側副刺激分子依存性T細胞はanergy状態になりやすいこと、(4)PBC患者からは側副刺激分子非依存性のPDC-E2反応性T細胞が多く同定され、健常者からは側副刺激分子依存性のPDC-E2反応性T細胞が多く同定されることを明らかにした。2.我々が提唱してきたPBCの発症と進展に関する作業仮説"分子相同性とepitope spreading"にもとづき、核膜孔蛋白gp210に着目し、gp210に対する免疫応答と予後との相関について解析した。まず、gp210蛋白の中で、最も抗原性が強いB細胞エピトープを同定した後、その部位を含む抗原を用いて、ELISAによる抗体の定量系を確立した。この系を用いて、PBC71症例の抗gp210抗体を経時的に定量した。その結果、抗gp210抗体価が、肝不全への進展の独立した予後因子であり、抗gp210抗体はよい予後予測マーカーとなることが明らかとなった。