hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サンゴ共生生物群集の成立過程における共生種の多種共存機構とオニヒドデの役割

ハナヤサイサンゴ共生生物群集の成立過程に関与していると考えられるオニヒトデの役割について研究するために、一昨年オニヒトデが存在しない水域(熊本)での調査を実施した。本年度は先ずそのサンプルの解析をした結果、熊本では沖縄よりもサンゴガニ類の種数が少なく、抱卵数は大型個体ほど多いが沖縄のデータとは差が認められない、等の結果を得た。また数年来調査を継続している沖縄のサンゴ礁では、数年前と比較するとオニヒトデの個体数が激減しているので、この影響が共生種に出ているかどうかについて、サンゴのサイズと出現する共生種の関係に関する再調査を実施した。傾向は過去(オニヒトデが多数存在していた頃)と同じであり、大型サンゴほど多種のサンゴガニ類が確認されたが、特定種については明らかに個体数の減少がみられ、又小型化していた。サンゴに対する捕食者であるオニヒトデが存在しない事により、サンゴガニ類は攻撃行動をする必要がないので、その分のエネルギーを成長や繁殖に利用し得ていることはないであろうか?あるいは、サンゴガニの種間関係がより激しくなる結果、弱者が排斥され(途中で小型化する可能性もある)、種数が減少する事はないであろうか?後者の推測は、オニヒトデの個体数が少ない現在の沖縄において特定種の個体数が減少かつ小型化しているという事実により、強固なものとなるが、さらにこれを確かめるためには、オニヒトデの存在下及び非存在下における共生種の反応を観察する方法が考えられるので、現在、資源量(サンゴのサイズ)を考慮しながらの予備実験を実施している。より南方のタイにおいても過去に2カ所(シャム湾奥部のシーチャン島と比較的湾口に近いサムイ島)調査を実施した経験がある。そこではオニヒトデは観察されず、サンゴガニ類は1種類のみが採集された。今回の結果と比較検討した結果、同程度のサンゴに生息しているサンゴガニは明らかにタイノ方が沖縄の個体よりも大型であった。これは上記の推測を支持する結果である。サンゴガニ類の共存の機構には、オニヒトデの存在と関連した種間関係の程度とオニヒトデの撃退に要するエネルギーの差、及び資源としてのサンゴのサイズが重要な要因であることが示唆された。
器官情報と細胞極性を繋ぐ機構の数理モデル解析

組織を構成する細胞は、組織全体におよぶ位置情報を読み取ることにより、ある特定の軸に沿って極性化することが知られている。この現象は平面内細胞極性(planar cell polarity, PCP)と呼ばれ、上皮細胞の頂底軸(apico-basal軸)に直交する極性として定義される。ショウジョウバエの翅などを用いた研究から、PCPが形成される際、位置情報である非典型的カドヘリン分子Dachsous (Ds)の発現の濃度勾配が作られ、この情報に従って7回膜貫通型受容体Frizzled (Fz)などの偏在化が起きると考えられている。しかしながら、ショウジョウバエの翅と複眼でDsの濃度勾配とFzの非対称局在の関係が異なっており、PCP形成時における「器官の位置情報」と「個々の細胞の極性」を繋ぐ分子機構には不明な点が多い。これまでに我々は、PCP分子の一つであるSpiny-legs(Sple)が上述の謎を解く鍵となることを見出している。また、過剰発現系を利用したスクリーニングにより、Sple過剰発現によるPCP異常(翅毛の配向性の逆転)を抑圧する複数の遺伝子を同定している。本年度、その内の一つであるSpleアイソフォームのPrickle(Pk)に着目して研究を進めた。ショウジョウバエ翅と複眼におけるPkおよびSpleの発現量を定量的RT-PCR法により解析したところ、両遺伝子の発現比が翅と複眼で大きく異なることが明らかとなった。また、PkとSpleが異なる細胞内局在を示し、ホモまたはヘテロ複合体を形成することを明らかにした。PkとSpleの発現量、細胞内局在および複合体に関する実験結果を昨年度構築した数理モデル(北海道大学電子科学研究所の秋山正和博士と共同研究)に取り入れ、PCPのシミュレーションを行ったところ、翅型および複眼型のPCPを再現することに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。多細胞生物の器官は固有のパターンを有することが知られている。例えば、哺乳類の内耳においては、個々の有毛細胞が非対称な形態(極性)を有し、これらの細胞の極性の向きが器官の特定の軸に沿って揃っている。この現象は平面内細胞極性(Planar cell polarty,PCP)と呼ばれ、頂底軸方向の極性(apico-basal極性)に直交する組織平面内の極性として定義される。ショウジョウバエの翅などを用いた研究から、PCPが形成される際、位置情報である非典型的カドヘリン分子Dachsous(Ds)とゴルジ体キナーゼFour-jointed(Fj)の発現の濃度勾配が作られ、この情報に従って7回膜貫通型受容体Frizzled(Fz)などの偏在化が起きると考えられている。しかしながら、ショウジョウバエの組織毎に、DsとFjの濃度勾配とFzの非対称局在の関係が異なっており、PCP形成時における「器官の位置情報」と「個々の細胞の極性」を繋ぐ分子機構には不明な点が多い。これまでに我々は、PCP分子の一つであるSpiny-legs(Sple)がこの謎を解く鍵となることを見出している。我々はショウジョウバエを用いた遺伝学スクリーニングにより、Spleと遺伝学的に相互作用する分子の探索を行った。その結果、Spleの強制発現によるPCP異常(翅毛の配向性の逆転)を抑圧する複数の遺伝子を同定した。また、生化学的手法により、Spleとこれらの分子の相互作用を確認した。上述の結果ならびに同定した分子の発現解析の結果を基に、「器官の位置情報」と「個々の細胞の極性」を繋ぐ機構の数理モデルを構築した(九州大学マス・フォア。インダストリ研究所の秋山正和博士との共同研究)。今後、実験(遺伝学・生化学的解析)と数理モデルの双方向の検証を行うことにより、組織毎にPCPの機構が異なるロジックの解明を目指す。

また、PkとSpleが異なる細胞内局在を示し、ホモまたはヘテロ複合体を形成することを明らかにした。PkとSpleの発現量、細胞内局在および複合体に関する実験結果を昨年度構築した数理モデル(北海道大学電子科学研究所の秋山正和博士と共同研究)に取り入れ、PCPのシミュレーションを行ったところ、翅型および複眼型のPCPを再現することに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた通りに研究が進行し、研究目的を達成するに充分な研究成果を得ているため。予定通り研究が進行しているので、申請書の本年度の計画に従い、実験(遺伝学・生化学的解析)と数理モデルの双方向の検証を行うことにより、組織毎にPCPの機構が異なるロジックの解明を目指す。
膵管増生巣の細胞増殖能、核DNA量、遺伝子解析-膵癌の組織発生,病理診断への応用

膵管上皮増生巣の前癌病変としての意義を検討する目的で,本研究は膵管上皮の特に異常を伴なう増殖性病変を中心に顕微蛍光測光法を用いて核DNA量の分析を行い,組織異型度と対比検討したので,以下のようにまとめた.切除膵(38例)から得られた膵管正常上皮(10)、膵管上皮増生巣(98)、湿潤癌巣(23)計131病巣について,細胞単離・顕微蛍光測光法により核DNA量を測定し,そのploidy patternを解析し各病変の組織異型度と対比検討した。その結果,正常膵管上皮と異型度I-II群の膵管上皮増生巣はほとんどdiploidyを示し,I-II群の異型上皮からpolyploidyが見られ,III群の異型上皮からploidyの増加とともにaneuploidyが出現増加し(p<0.01),湿潤癌巣では後者が73.9%を占めた。更らに,病変の増殖活性を表すS・G_2M期細胞とpolyploid cellの出現頻度は異型度に相関して増加した。以上のように膵管上皮増生巣は異型度の上昇とともにpolyploidy,aneuploidyの出現・増加,増殖活性の亢進を示し,膵の上皮内癌・湿潤癌巣へ連がる一連のsequenceにおける前癌性病変として位置付け得ることが裏付けられた。遺伝子としてRAS,p53,APCについて検索したが、十分な結果は得られなかった。膵管上皮に由来する膵管癌、嚢胞腺癌、粘液産生膵腫瘍には様々な異型度の膵管上皮が増生巣が高率に随伴し、前癌病変の候補とみなされる。申請者らは、膵管癌を主体とする切除材料を用いて、病理組織学的ならびに核DNA量の分析を行った結果、膵管上皮増生巣は、その病理組織学的異型度の増加につれて、diploid→polyplid→aneuploidと核DNA量の変化がみられることを認めた。さらに、それに伴う遺伝子レベルでの変化を検討するために、まず、膵管癌で高率に認められるK-ras遺伝子のcodon12における点突然変異について解析を始めた。K-ras遺伝子変異の検出法は、大腸腺腫における検討から、パラフィン切片からも確実に検出できる2-step-PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)を用いることとして、膵管上皮増生巣のパラフィン切片からDNAを抽出して解析を行った。しかし、半数の検体においてはPCRによるDNA量の増幅が認められず、K-ras変異を解析できなかった。この理由としては、膵管上皮増生巣は大腸腺腫と比較しても、あまりにも微小であるため抽出したDNA量が不十分であったためと考えられた。そこで現在は質の良いDNAを十分量とるための基礎的検討を行っている。また免疫染色によりPCNA、p53の異常についても検討中である。膵癌と乳頭部癌の前癌病変を明らかにする目的で、膵管上皮増生巣と乳頭部腺腫様組織、浸潤癌巣について、病巣の組織異型度を顕微蛍光測光法による核DNA量ヒストグラムの対比検討を行い、以下の結果を得た。1.正常膵管上皮巣を異型度12群ではすべてdiploidyを示し、3群から浸潤癌巣までpolyploidyとaneuploidyの増加傾向が認められ、浸潤癌巣ではすべてaneuploidyを示した。2.乳頭部の腺腫様組織と浸潤癌巣においても異型度に平行して、同様のploidy patternの変移傾向が認められた。3.以上の結果は、膵管上皮増生巣と乳頭部腺腫様組織の前癌病変をしての意義を支持するものと考えられた。さらに、膵癌に随伴する膵管上皮増生巣の発癌過程への関与、前癌病変としての意義を明確にすべく、これらの組織におけるK-ras遺伝子、p53遺伝子、APC遺伝子の変異、細胞増殖能の検討を行った。

まず、膵管癌を主体とする切片材料を用いて病理組織学的検索を行ったパラフィンブロックよりもDNA抽出を試みたが、PCRに必要な十分量のDNA抽出が困難であり、いまだその後の検索に至っていない。現在もパラフィンブロックよりのDNA抽出方法を検討し、継続中である。
肝循環調節に対する血液希釈と脈管作動性物質の相互作用に関する研究

肝臓の血行動態に関する生理学的検討は従来からなされてきている一方、肝実質内での血行調節に関する検討はいまだ充分といえない。本研究では今まで検討されることが少なかった肝類洞前後における血流調節機序を摘出灌流肝標本を用いて検討した。特に肝毛細血管圧(類洞圧)を求め、さらに血管床からの水分移動を濾過係数により求めながら、アナフィラキシ-反応時およびalpha受容体刺激剤投与時の肝内血管の反応部位(類洞前または類洞後か)を検討した。(1)成犬の肝臓を摘出し、自家血で門脈を定圧灌流した。(2)肝血流量、肝動脈圧、門脈圧、肝静脈圧ならびに肝重量を同時に測定した。(3)肝類洞圧は、肝流入、流出のカニュラを同時に閉塞したときに各々の圧が平衡に達する圧であるdouble occlusion pressureにより測定した。また肝血管床からの水分移動は、肝血管内圧を上昇させた際の肝重量の増加度filtration coefficientにより算出した。(4)ブタ回虫タンパク抗原によりIgE即時型アナフィラキシ-反応を惹起した時およびalpha受容体刺激剤であるフェニレフリンを投与した時について、その投与前後における(2)のモニターの変数および(3)の分析から肝内血管の反応局在を明らかにした。本研究で用いたdouble occlusion法およびfiltration coefficientによる肝血管床のの生理学的検討はこれまで行われていない方法である。結論として、アナフィラキシ-時における肝血管収縮反応は肝静脈側に優位であり、これが門脈圧亢進および肝うっ血の重要な成因となっていることが示唆された。一方、alpha受容体刺激剤投与時の肝血管収縮反応は門脈側に優位であり、肝血管の収縮反応はその原因によって局在が異なることが明らかになった。
ガレクチン-9 誘導能をもつ食品成分の探索とその機能性解析

U937細胞およびヒトPBMCを用いて、ガレクチンファミリー分子の中で、特に多様な免疫調節作用をもつガレクチン9の発現調節活性を指標に、食品の機能性成分の探索を行った。結果、フコイダンは強い炎症性サイトカイン誘導活性と同時にガレクチン9発現抑制活性を有することがわかった。レイシ抽出液やカテキンにはガレクチン9発現調節活性は認められなかった。本研究により、フコイダンが、免疫抑制的機能をもつガレクチン9の発現を低下させることにより単球/マクロファージ系細胞を活性化へ誘導している可能性が示唆された。本研究は、ガレクチンファミリーという新しいレクチン分子群の発現誘導を指標に食品成分を解析し、新規機能性食品成分として研究開発するための基礎的知見を得ることを目的としている。特にガレクチン-9は,自己免疫疾患など免疫応答過剰状態では抑制的制御作用を示す一方,悪性腫瘍など免疫低下状態では免疫賦活作用を示すなど、生体を正常な状態に戻そうとするユニークな免疫調節機能をもつ分子である。本年度は、先ずin vitro系におけるガレクチン-9を含む8種類のガレクチンファミリー分子群の発現誘導検出系の確立を行った。ガレクチン-1,2,3,4,7,8,9,10に対してそれぞれのプライマーを作成し、β-アクチンをコントロールとしてRT-PCR法でそれぞれのmRNAの検出を試みた。ガレクチン-9は高分子と低分子の2種類が存在するが、本研究ではその両方が検出できる様、483/560bpのcDNA断片が増幅されるプライマーをデザインした。結果、ヒト末梢血単核球(PBMC)の未刺激PBMCでは、ガレクチン-1,2,3,8,9(低分子)が検出された。これに対し、10ng/mL PMA+0.5μg/mL ionomycinで24hr刺激したPBMCは、ガレクチン-1,3,8,9(高分子/低分子)を強く発現し、ガレクチン-2,4,7,10の発現は極弱くまたは全く検出されなかった。以上のことから、食品成分のガレクチンファミリー誘導能検出には、ガレクチン-1,3,8,9(高分子/低分子)を対象に、ヒト単球系癌細胞株(THP-1, U937)を用いた簡易スクリーニング法で行うことに決定した。本研究は、ガレクチンファミリーという新しいレクチン分子群の発現誘導/抑制を指標に食品成分を解析し、新規機能性食品成分として研究開発するための基礎的知見を得ることを目的としている。特にガレクチン-9は、自己免疫疾患など免疫応答過剰状態では抑制的制御作用を示す一方,悪性腫瘍など免疫低下状態では免疫賦活作用を示すなど、ユニークな免疫調節機能をもつ分子である。本年度は、ヒト単球系細胞株であるU937およびTHP-1を用いた簡易スクリーニング法を確立するために、先ずこれら細胞の刺激条件と炎症生サイトカイン産生について調べた。結果、U937細胞はPMA非存在下では10ug/mLLPS刺激でも僅かにIL-6(20pg/mL以下)が産生されるのみで、IL-1β、TNFα産生は全く認められないが、10ng/mL PMA,24hrプレ刺激により強い付着性を示すようなり、さらにLPS(0.1-10ug/mL)刺激.で濃度依存的にIL-1β(60-100pg/mL)、IL-6(70-90pg/mL),TNFα(35-70ng/mL)産生を誘導し、また同時に強いガレクチン-9のmRNA発現(RT-PCR法)を誘導することが分かった。一方THP-1細胞は、PMA非存在下で3種炎症生サイトカイン産生ならびにガレクチン-9 mRNA発現の誘導が認められたが、PMAプレ刺激U937細胞に較べてかなり低かった。以上のことから、食品群の広いスクリーニングにはより簡便なTHP-1細胞を、より精密な比較にはPMAプレ刺激U937細胞を用いることにした。これら簡易スクリーニング法で有用食品の探索を試みた結果、THP-1細胞を用いた系では、キノコ(アガリスク、シイタケ粉末)、海藻(コンブ,ワカメ)、緑茶の水溶性粗抽出液は、いずれも明らかなガレクチン-9誘導活性は認められなかった。一方、緑茶抽出液はPMAプレ刺激U937細胞系においてLPS刺激によるガレクチン-9発現と炎症生サイトカイン(IL-1β,IL-6,TNFα)産生の両方を強く阻害することが分かった。今後、探索対象食品群や機能性食品成分の種類を増やして、引続き検討を行う予定である。ガレクチン-9誘導あるいは抑制などガレクチン-9発現調節

能をもつ食品や食品成分を探索し、その成分の機能解析を行うために、免疫機構の中で貪食作用、抗原提示作用を有し、TNFα、IL-1β、IL-6などの炎症性サイトカインを産生して自然免疫と獲得免疫の両方で重要な役割を果たしている単球/マクロファージ系細胞を用いて、ガレクチン-9発現と炎症性サイトカイン産生に及ぼす食品の機能性成分の探索を行った。本年度は、海藻由来多糖類で免疫賦活作用が報告されているフコイダン、キノコ由来β-グルカンを有するレイシ抽出液、抗酸化能とともに抗炎症作用をもつ緑茶カテキンについて、U937細胞およびヒトPBMCを用いて炎症性サイトカイン産生とガレクチン-9発現に及ぼす影響について調べた。結果、β-グルカンを含むレイシ抽出液および抗酸化能・抗炎症作用もつカテキンは、RT-PCR(24cycle)におけるガレクチン9発現調節活性作用は認められなかった。一方、フコイダンはTNFα産生を約2.6倍、IL-1β産生を約1.3倍、IL-6産生を約1.3倍と増強し、強い炎症性サイトカイン誘導活性を有することがわかった。このときガレクチン9の発現は強く抑制されていた。ヒトPBMCを用いた実験でも同様に、フコイダンは強い炎症性サイトカイン誘導活性と同時にガレクチン9発現抑制活性を有することがわかった.本研究結果から、フコイダンが免疫抑制的機能をもつガレクチン9の発現を低下させることにより単球/マクロファージ系細胞を活性化へ誘導している可能性が示唆された。より最適な簡易スクリーニング法を確立することが今後種々の食品群の探索において重要と考え、2つのヒト単球系細胞株を用いたより簡便でより正確なスクリーニング法の条件決定に時間をかけた結果、有用食品群の探索を3種類しか行えなかったが、概ね順調に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。特に、方向性などの問題はない。本年度確立した簡易スクリーニング(2方法)を用い。多糖類、抗酸化食品/成分など、できるかぎり多くの種類の食品・成分を対象に探索する。
B-モノクロ-ナル抗体によるヒト黒色腫細胞の熱中性子捕促効果の解析

メラニン生成活性に依存することなく^<10>B元素を黒色腫細胞に集積させる目的で、黒色腫細胞関連抗原に対するモノクロ-ナル抗体(MoAb)に^<10>Bを結合させ、熱中性子照射で癌細胞を選択的に殺傷する研究を展開してきた。〈方法と成果〉1.抗体と細胞の選択:黒色腫細胞1個当り2×10^6分子の結合性が明らかにされている763.74抗体とヒト黒色腫細胞を結合させ、蛍光強度分析で本抗体を最も多く結合するP22細胞を得た。2.抗体1分子に約10^3個の^<10>B元素が結合すれば、癌細胞1個当り約10^9個の^<10>B元素が結合することとなり、本療法成功のための理論値となる。研究者らはアビディン・ビオチン法を応用した。このP22にヒオチン化763.74Tさらに^<125>Iでラベルされたアビディンを反応させ、その放射活性より細胞1個当りに集積されるアビディン数を算出すると3.84×10^6となり^<10>B元素数では1.6×10^8で目標とする1×10^9にかなり近付いていることがわかった。3.^<10>B-モノクロ-ナル抗体を用いた熱中性子照射による黒色腫細胞致死効果:P22に^<10>B-アビジン・ビオチン抗体処理後直径1cmのテフロンチュ-ブ数本に各々1.5×10^5個細胞を浮遊させ、コロニ-法で致死効果をみた。^<10>B-アビディン-ビオチン-MoAbが結合したP22細胞はコントロ-ル抗体で同操作を行ったものに比べ明らかな致死強大効果を認めた。〈反省と展望〉^<10>B-モノクロ-ナル抗体をアビディン・ビオチン法でヒト黒色腫細胞に集積できることが明らかであり、この成果に基き、ヒト黒色腫担癌ヌ-ドマウスで^<10>Bを集積させる条件を求め、ヒト治療への道を拓きたい。元素ボロン10(^<10>B)が熱中性子を吸収すると^<10>B(n,2)^7Li反応で高LET放射線が生じる。そのエネルギーで黒色腫細胞を選択的に殺傷する治療法を開発している。本療法の成否の1つは高濃度^<10>Bをいかなる方法で腫瘍細胞のみに選択的に集積させるかにかかっている。抗悪性黒色腫巣クローン抗体に^<10>Bを結合させる為、ビチオン化単クローン抗体を用いてin vitro熱中性子照射を行い以下の結果を得た。I.結果(1)ヒト黒色腫細胞にビオチン化抗体を結合させ、次いで^<10>B結合アビヂン(^<10>B-AV)を加え、反応後熱中性子(TN)を照射すると、TN照射のみの照射に比べ、有意に高い致死効果をコロニー法で得た。(2)ビオチン化単クローン抗体と^<10>B-ATを反応させた後、ヒト黒色腫とインクベートし、熱中性子照射後(1)と同様にコロニー法で致死効果をみたところ(1)よりも高い致死を得た。(3)ヒト黒色腫の抗原性の多様性を解決するため新しい抗ヒト黒色腫単クローン抗体と数種のヒト黒色腫細胞間で抗体結合性をFACSで検討したところ、親和性の高いものが数種得られた。II.今後の研究展開

実際にヒト黒色腫を治療する際の手順はI-(2)の方法であるが、今回高い致死効果を得たことは^<10>B-単クローン抗体法の応用実施へ一歩近づけたと考えられる。また、I-(1)より黒色腫の抗原に対する抗体を用意することにより、目的とする10^9個^<10>B元素/細胞を得る事が可能と考えられる。熱中性子照射の致死効果をコロニー法で測定するため、コロニー形成の良いヒト黒色腫株を樹立し応用する。また、1個の癌細胞当りの^<10>B結合数を明らかにするためアイソトープラベル法で解析する。メラニン生成活性に依存することなく^<10>B元素を黒色腫細胞に集積させる目的で、黒色腫細胞関連抗原に対するモノクロ-ナル抗体(MoAb)に^<10>Bを結合させ、熱中性子照射で癌細胞を選択的に殺傷する研究を展開してきた。癌細胞1個当り2×6^<10>個分子の抗体が結合する。熱中性子捕捉療法成功のために必要とされる1細胞当り10^9個の^<10>B元素と結合させるに必要な1抗体当りの^<10>B元素数は10^3個である。本研究ではヒト黒色腫細胞に対するモノクロ-ナル抗体763、74Tとヒト黒色腫細胞P22を用いて、以下の結果を得た。<方法と成果>1.細胞当りの^<10>B元素数:P22細胞にビオチン化763、74T、更に^<125>Iラベルアビディンを反応させ、放射活性より1細胞当りのアビディン数を求めると3.84×10^6個となり、細胞当りの^<10>B数では1.6×10^8個となった。まだ目標とする細胞当り10^9個には不足である。2.熱中性子照射による致死:^<10>Bーアビディンとビオチン化抗体を反応させた後、P22細胞をテフロンチュ-ブに入れ、異なる熱中性子量を照射し、コロニ-法で生存曲線を得た。^<10>B処理をしていない抗体を用いた対照に比べ、Do値は小さく明らかな致死増大を得た。<反省と今後の展望>前年度に得た細胞増殖曲線の結果を支持する結果であった。しかし、^<125>Iを用いた分析では1細胞当りの^<10>Bが1.610^8個とまだ少ない。従って今後は新たな抗体を見い出すこと、及び^<10>Bの定量を間接法でなく、より直接手法であるICPーMS法で行い、細胞当りの^<10>B元素数を求める。次にヒト黒色腫担癌ヌ-ドマウスに^<10>Bーアビディンービオチン抗体を投与し、腫瘍に集積する^<10>B元素量を実測し、さらに熱中性子照射で、腫瘍退縮効果を求めたい。
細胞質型チロシンホスファターゼの細胞外シグナルによる制御機構

細胞接着等のシグナル伝達過程にチロシンホスファターゼ(protein tyrosine phosphatase,PTP)が関与することが阻害剤による実験等で示されているが、その実体については不明な点が多い。PTP36は、我々が明らかにし、細胞接着の影響をうけることを見い出したホスファターゼ相同性分子で、ezrin,radixin,moesin等の細胞骨格蛋白にみられるバンド4.1相同性ドメインを持つことと合わせて細胞接着のシグナル伝達に関与すると推定された。我々は、シグナル伝達におけるPTP36の役割を検討し、本年度は以下に要約する様な結果を得た。1.バンド4.1相同性ドメインを持つチロシンホスファターゼ、PTP36は、セリンがリン酸化されており、細胞の剥離やv-srcの遺伝子導入によって、急速に脱リン酸化される。脱リン酸化はオカダ酸で完全に阻害されたことから、オカダ酸感受性のセリン/スレオニンホスファターゼが関与している。2.PTP36がセリン/スレオニンキナーゼと複合体を形成する事を明らかにした。このキナーゼはPTP36をin vitroでリン酸化し、またstaurospoine感受性であった。このキナーゼの候補分子は分子量約160kDaあるいは90kDaである。3.リン酸化がPTP36の細胞内局在を制御する事を明らかにした。PTP36は脱リン酸化されると細胞内での局在が変化した。このトランスロケーションは、脱リン酸化を阻害するオカダ酸で完全に制御された。4.テトラサイクリンで調節可能なプロモーターを利用して、PTP36の発現が調節可能な遺伝子導入細胞を樹立した。この細胞ではPTP36の過剰発現を誘導すると、形態変化と増殖性の低下が認められた。
ニューラルネットワークによる反射法地震探査データ処理

最近、ニューラルネットワークを用いて、人間の神経細胞による優れた判断機能あるいはパターン認識機能を利用して、数式化が困難な各種制御、信号処理を行う計算機手法が多くの分野で盛んに行われている。一方、地下構造形態および構造内の媒質の物性値を調べる技術として反射法地震探査がある。反射法地震探査では、三次元調査の普遍化に伴い、大量のデータを迅速に処理するために専用のワークステーションと呼ばれる電子計算機を用いて解析者との会話形式によるデータ処理・解釈が一般化している。本研究では、教師信号付の階層型ネットワークを用い、誤差逆伝播のアルゴリズムにより学習を行い、反射法地震探査における各種データ処理を行うソフトウェアを開発した。開発したソフトウェアは初動波形の読取、反射波形の識別、速度解析結果の自動読取、物理検層解析における岩相判定である。教師信号付学習機能をもった階層型ニューラルネットワークによる処理における留意点として本研究の結果以下のことが明らかになった。1)高精度な処理結果を得るには、対象とする処理データに対して最適な階層のネットワークを構築する必要がある。2)ネットワーク間の荷重の初期値をできるだけランダムに設定する。3)限られた個数の学習データによる学習課程においては、学習するデータは用いる順序ができるだけランダムになるようにする。4)ネットワークの出力値が局所最小値に陥らないようにネットワーク間の荷重を修正する際に、モーメント法を用いるなどの工夫が必要である。今年度は「ニューラルネットワークによる反射法地震探査データ処理」の研究の一環として以下のことを実施した。1.ニューラルネットワークによるデータ処理ソフトウェアの作成2.合成データによるソフトウェアのテストランの実施3.計算結果の表示のためのソフトウェアの購入4.実際の現場データ取得のためのジォフォンの購入その結果、従来計算機が不得手とされていたパターン認識、各種判断に対して、ニューラルネットワークが有効であることが判明した。今後は、ニューラルネットワークの反射法地震探査への適用にとどまらず、物理検層などの他の物理探査データへの適用についても研究を進めていく。2)ネットワーク間の加重の初期値をできるだけランダムに設定する。
非線形弾性力により従来比1万倍の力を発生する静電マイクロアクチュエータ

電極間に発生する静電気力と非線形な特性を持つバネとを協働させる駆動方式を考案し、この方式により動く静電マイクロアクチュエータを提案した。有限要素法を用いた詳細なシミュレーションにより、以前よりも931倍も高出力な静電マイクロアクチュエータを設計した。更なる形状・寸法の改善や加工技術の高精度化ができれば、以前のものより1万倍以上高出力になることが分かり、新方式の優秀性を証明した。また、試作の実施により、実際に製作する上での問題点も実験的に明らかにした。アクチュエータの全体設計と製作プロセス設計を行い、一次設計自体は完了した。また、製作プロセス上必要な電極の絶縁膜形成プロセスとして、電着塗料の応用の実験的検討を行った。最適な条件を見付けることは出来なかったが試作に利用できる目処は付いた。FEM解析により水平面内、垂直面内で変形する非線形バネをそれぞれ設計した。水平面内で変形するバネについては、試作プロセスに従った材料や加工可能な寸法により詳細にシミュレーションし、予測される出力等も得ることが出来た。垂直面内で変形する非線形バネについては、静電引力と構造の連成解析が必要になってくるため、この手法の習得と簡単な構造の解析を行った。今後解析結果の妥当性について検証する予定である。製作プロセスについては厚膜レジスト(SU-8)の高アスペクト比加工や、前述の絶縁膜形成プロセスの検討を行った。厚膜レジストの加工条件などの条件出しはほぼ終了した。後は実際の製作プロセスを進めながら、条件を修正する必要がある。試作については、水平面内変形バネを有したアクチュエータにおいて設計したフルモデルの試作を進めた。プロセス途中で電極薄膜が剥離するなどの問題があり、工程を変更して試作を継続中である。厚膜レジストによる構造体までは問題なく製作できている。一方、垂直面内変形バネを有したアクチュエータに関しては、簡単なブリッジ構造のアクチュエータを設計し、試作を試みた。このアクチュエータに関しても別の薄膜の剥離や厚膜レジスト自体の剥離など予期しない問題が発生しており、プロセス条件を検討しながら試作を継続中である。水平面内変形バネを有した静電マイクロアクチュエータの製作条件の検討を昨年度から引き続き検討した。SU-8の残留ひずみが問題となったため、ポリイミドフィルムを素材とする構造に変更して、製作プロセスの検討を行った。ポリイミドフィルムのガラス基板への均一な接着技術を確立し、酸素RIEにより製作を進めている。RIEによるエッチング時のサイドエッチングが問題となったが、ほぼ解決する方法を見いだした。試作の継続により完成できると考えられる。まだ完成していないため、計画していたアクチュエータの駆動実験、評価を行うことは出来なかった。垂直面内変形バネを有した静電マイクロアクチュエータに関しては、概略的な構造を設計した。さらに接触型の3次元非線形バネのFEM解析手法を確立して、設計したアクチュエータ構造に使用する非線形バネの設計を行った。解析結果より非線形性を有し、静電引力にほぼ沿う特性を持った垂直面内変形バネを製作できること明らかにし、具体的な寸法例と発生力などを明らかにした。垂直面内変形バネを用いた簡単なアクチュエータであるブリッジ型アクチュエータの製作プロセスを確立して、試作、駆動実験、変形測定を行った。また、FEMを用いた静電-構造体連成解析手法により、アクチュエータの動作、変形シミュレーションを行った。現在、実験結果とシミュレーション結果の比較検討を行っている。さらに、垂直面内変形の非線形板バネを製作するため、グレイトーンリソグラフィを用いた湾曲板バネの製作プロセスを設計し、プロセス条件の検討とプロセスの妥当性を検証した。エマルジョンマスクを用いたグレイトーンリソグラフィ技術を確立することが出来たが、犠牲層剥離による板バネ自立工程において、バネの破壊や犠牲層の剥離不良の問題が生じている。現在、プロセスの最適化を検討中である。垂直方向に変形する非線形バネの製作プロセスを考慮して、基本的な動作を評価するための垂直方向に駆動するアクチュエータ構造を設計した。これに合わせて、摩擦などの実際に生じる現象を考慮に入れた有限要素法解析による非線形バネの詳細設計を行い、アクチュエータの性能予測を行った。また、これにより非線形バネの動作形態と形状も変更になったため、非線形バネの製作も含めたアクチュエータ全体の製作プロセスの設計も行った。昨年度に試作した簡便な構造を持った垂直方向に駆動するブリッジ型アクチュエータの動作については、有限要素法を用いた静電場-構造連成解析により詳細な動作解析を行った。その結果、シミュレーション結果と駆動実験結果がほぼ一致することが確認され、静電場-構造連成解析により妥当性のある設計が可能であることが確認できた。製作においては、引き続きグレイトーンリソグラフィ法を用いた垂直方向に変形する非線形バネの製作プロセスの開発を行った。

詳細なプロセス条件の検討により、昨年度までの問題を解決して非線形バネの自立構造を製作することが出来た。しかし、土台からの剥離後に残留応力の影響と思われる変形が非線形バネに発生し、設計通りの形状を得ることは出来なかった。原因を特定すべく検討を進めているが、本研究期間内では明らかにすることが出来なかった。これらと平行して、垂直方向に変形する非線形バネおよび垂直方向に駆動するアクチュエータの力学特性を評価するための評価装置を自作した。一方、酸素RIEを用いて水平方向に駆動するアクチュエータの試作を行った。ほぼ設計通りの可動なアクチュエータ構造体を試作できた。しかし、製作工程において配線の剥離が発生したため、完成には至らなかった。配線方法、プロセスの再検討を行っているが、本研究期間内には解決できなかった。以上のように、設計とシミュレーションによりアクチュエータの有用性、高出力化を確認できていることに加え、製作プロセスについても80%近くは確立できているが、製作工程で様々な問題が発生したため、計画通りにアクチュエータを完成させて駆動と特性評価を行うことは出来なかった。
新しい表面改質法を用いた操作性と強度を調和させたアパタイトセメントの調製

低侵襲のためにアパタイトセメントをシリンジで導入する場合には混水比を増大させており、機械的強さが低下するため、混水比増大以外の手法でセメントの流動性を確保する手法の開発が望まれていた。本研究では、アパタイトセメントの粉体を気相でオゾン処理することにより、ぬれ性の著しい向上が確認された。その結果オゾン処理粉末試料の圧縮強度は未処理粉末に対して約200%向上したアパタイトセメントの調製が可能になった。本研究の目的は、セメント粉末のオゾン処理により粉末表面の水酸基を増大させることによってセメントペーストの練和性を損なうことなく練和液の減水を行い、セメント硬化体のミクロ気孔を低減化させることによって圧縮強さを150%に増大した高強度アパタイトセメントを創製することである。しかしながら、オゾンは強い酸化力で最近細胞膜を破壊し殺菌性を有することが知られている。本年度の実験では、前年度に確立したアパタイトセメント粉末のオゾン処理法が細胞に与える影響を評価した。前年度に確立したオゾン処理法で処理したアパタイトセメント硬化体に細胞実験を行い初期接着性。細胞増殖性等の検討を行った。アパタイトセメントの粉末部としてはリン酸四カルシウム(TTCP:太平化学産業)とリン酸水素カルシウム(DCPA:J.T.Baker)等モル混合タイプを選択した。上記市販粉末を遊星式ボールミルにて3時間粉砕し、TTCPは平均粒径10μm、DCPAは平均粒径1.4μmとなるように調製した。得られたTTCP,DCPAを充填したカラムにオゾンを4 L/minで4時間通気させ、粉末のオゾン処理を行った。また、あらかじめ等モル混合した粉末の処理も同様に行った。得られた粉末を滅菌水にて練和し、滅菌した10mm径の円形試料作成テフロンモールドに充填し、37°C相対湿度100%で24時間養生させ試料を作成した。骨芽細胞の細胞接着性、細胞増殖能を測定した。その結果、オゾンによる表面改質を受けた試料はその流動性や機械的性質が著しく向上するのに対して、細胞接着性、増殖性に全く影響を与えないことが明らかになった。また、著しい初期炎症等の発生がないことを組織学的に確認した。以上により、本研究により開発された粉末オゾン処理方法を用いることにより、減水材を使用することなく、流動性を最大2倍、機械的強さを最大200%向上させた。アパタイトセメントの粉末部としてはリン酸四カルシウムとリン酸水素カルシウムの等モルタイプを選択した。市販粉末を遊星式ボールミルにて粉砕し、TTCPは平均粒径10μm、DCPAは平均粒径1.4μmに調製した。TTCP,DCPAおよびTTCPとDCPAを等モルで混合した粉末を充填したカラムにオゾンを4 L/minで4時間通気させ、粉末のオゾン処理を行った。粉末に対するオゾン処理効果およびオゾン処理がセメントペーストの練和性に及ぼす影響を検討した。セメント広がり面積によるぬれ性の検討を中心に行った。その結果、さらに必要に応じて粉末X線回折、SEM等の分析も行った。オゾン処理後の濡れ性の評価にはL/P比0.3、0.4、0.5に調製したオゾン処理・未処理セメント粉末スラリーを用いた。測定は0.2mLのセメントペーストをシリンジからガラス板の上に出し、ガラス板と重りで圧接して広がった面積の測定によって行い、その面積をNIH Image Jを用いて測定した。また、オゾン処理の計時的安定性も検討した。L/P比一定試料での比較では未処理粉末に対してオゾン処理粉末は有意にセメント広がり面積が大きく、さらに処理後2週間の粉末は処理直後と比較して有意差が認められなかった。これによりオゾン処理は粉体の濡れ性向上に有効な手段であり、処理後も安定してその効果が持続することが明らかになった。オゾン処理前後の粉末X線測定結果からはオゾン処理によるセメント粉末の相変化は認められなかった。さらにオゾン処理が機械的特性に与える影響をダイアメトラル引張強さ試験により検討したところ、処理群・未処理群に有意差は認められなかった。これによりアパタイトセメント粉末のオゾン処理は粉末の濡れのみに効果があり、その他の機械的特性には影響を全く与えない理想的な処理方法であることが明らかになった。本研究においてはセメント粉末表面の水酸基を増大させることによってセメントペーストの練和性を損なうことなく練和液の減水を行い、セメント硬化体のミクロ気孔を低減化させることによって圧縮強さを150%に増大した高強度アパタイトセメントを創製することを目的としている。本年度の研究結果より、オゾン処理が粉体に与える影響が減水硬化のみである事が明らかになった。申請書で計画した3つの検討(1)アパタイトセメント粉末のオゾン処理(2)オゾン処理粉末の分析およびペースト練和性の評価(3)オゾン処理がアパタイトセメントの基本特性に及ぼす影響の検討はすべて完了しており進捗状態に問題はない。

また、得られた結果についても当初の計画通りであり新たに研究計画を変更する必要性は生じていない。平成24年度は次の研究を行う。1.アパタイトセメント硬化体の細胞接着・増殖・分化実験(細胞への影響を検討)アパタイトセメント硬化体に骨芽細胞様細胞を播種し、10%牛血清を含むαMEM中で一定期間培養します。骨芽細胞の細胞接着性、細胞増殖(MTT法)および分化能(アルカリフォスフォターゼ活性の測定、ELISA法によるTypeIコラーゲンおよびオステオカルシン発現量の定量化)を検討します。対照試料としてはオゾン処理を伴わないTTCP-DCPA系アパタイトセメント(平成23年度に調整法を確立した粉末でオゾン処理を行わないもの)を用いる。2.アパタイトセメント硬化体の実験動物を用いた組織学的初期評価実験動物(ラット)の頭蓋骨にクリティカルサイズ以上の骨欠損を形成する。実験動物の骨欠損部にてオゾン処理アパタイトセメントを硬化させ、骨欠損部を再建する。移植後2、4週目に試料を周囲組織と一塊に摘出し、アルカリフォスフォターゼ活性、オステオカルシン産生をタンパクレベルにて評価するとともに、骨の形成をと骨梁構造解析装置(現有設備:X線CTスキャナSkyScan)を用いて定量的に解析する。動物実験に関しては所属機関付属施設である福岡歯科大学アニマルセンター規定に従い行う。動物細胞実験用試料作成のためモールド(テフロン・ステンレス製)、細胞実験用試薬(MTT、アルカリフォスファターゼ測定用キット、ELISAキット等)、動物実験用器具、病理組織標本作製にかかる薬品を購入する。また、実験動物の飼育費(所属機関付属施設である福岡歯科大学アニマルセンター規定に従う)。また、成果発表用英文校正費用、成果発表用旅費を申請する。なお、1品50万円を超える機器の購入予定はない。
ポルフィリン症モデルマウスを用いた病態発症機序の解明

Cpox遺伝子変異に起因するポルフィリン症を自然発症するミュータントマウスを用いて、各臓器のトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、エピゲノム修飾解析を網羅的に行い、「ポルフィリン症の多彩な病態の発現はポルフィリン中間体によるグアニン四重鎖構造への干渉を介した遺伝子発現制御の乱れに起因する」という仮説を検証し、ポルフィリン症の病態発症機序・経路を標的とした治療法開発へと繋げる。
ヒト細胞における複製開始制御とエピゲノム維持機構との連携の解明

細胞の正常な増殖において、核内に納められているDNAを正確に複製することは必要不可欠である。ORC(Origin Recognition Complx)は、DNAの複製開始点を認識するタンパク質として、1992年に出芽酵母において発見され、ヒトまで広く保存されていることが知られている。近年、ヒトORC構成因子の一つを用いた実験から新規ORC結合タンパク質として、LRWD1(Leucine-rich Repeats and WD repeat domain cantaining1)/ORCAが発見された。報告者の所属する研究室でも独自にLRWD1を同定しており、LRWD1をRNA干渉法により機能阻害すると、G1期が延長することやORCの可溶性が上昇すること、ヒストン修飾酵素G9aと相互作用することを独自に明らかにしており、LRWD1はヒストン修飾酵素と連携することで、DNAの複製開始に重要な役割を果たしているものと考えられる。当該年度ではLRWD1がDNA複製開始でどのような機能を果たしているかを解き明かすため、DNAヘリカーゼの一つであるMCM3にGFPタグを付加し、生細胞中で動態を観察できる系を樹立した。この系と昨年度までに樹立していた、mCherryタグを付加したPCNAによる細胞周期観察系を組み合わせることにより、細胞周期の時期を特定しながら、LRWD1の有無によるMCM3の動態を観察した。その結果、MCM3はLRWD1が存在する状態ではG1期の終わりから、PCNAの集積に先立って点状の局在を示し、LRWD1をノックダウンするとその集積がみられなくなることがわかった。このことから、LRWD1はMCM3が集積するのに必須な複製開始点の構築に関わっていることが生細胞観察で示唆された。以上の結果はG9aのノックダウンでも同様であった。これらの結果からLRWD1はG9aとともに複製開始点の構築に深く関わり、LRWD1-G9a複合体の機能を詳細に解析することで、今まで知られていなかったヒトにおけるDNA複製開始点の構築、また制御への新たな知見を与えるものと期待される。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。ORC(Origin recognition complex)は、DNAの複製開始点を認識するタンパク質として、1992年に出芽酵母において発見され、ORC1-6からなる6つのタンパク質からなる複合体である。最近、ヒトORC2の免疫沈降産物に含まれる新規ORC結合タンパク質として、LRWD1(leucine-rich repeats and WD repeat domain containing 1)/ORCAが同定された。LRWD1をRNA干渉法により機能阻害すると、G1期が延長することから、LRWD1はDNAの複製開始にORCと共に極めて重要な役割を果たしていると考えられる。さらに報告者の所属する研究室において、ORCと相互作用する因子としてLRWD1を独自に同定していた。報告者の解析からLRWD1とヒストンメチル化酵素G9aは相互作用し、LRWD1上のG9aはH3K9me2及びH3K9me3を導入する酵素活性があること、またLRWD1はG1期からS期への移行に重要でかつ、ORCがクロマチンへの結合に重要であることが分かっており、LRWD1はG9aと連携しヘテロクロマチックなヒストン修飾をクロマチンへと導入することで、ORCを複製開始点上に安定に存在させ、複製開始の制御に関与することが考えられる。ヒトを含めた後生動物では、出芽酵母で発見されているような複製開始点に特有のDNA配列は見つかっておらず、複製開始点が決定される機構の実態は明らかとはなっていない。このことは、ヒストン修飾やクロマチン構造など、DNA配列だけでなくエピジェネティカルに制御される仕組みによって複製開始点が制御されていることを示唆している。LRWD1はORC構成因子と異なり後生動物にのみ存在することから、LRWD1の機能を明らかにすることは、ヒトにおけるDNA複製開始機構を理解する新たな知見を与えると期待される。採用第1年度の研究年次計画では、(I)LRWD1の複製開始装置形成への影響の検討、(II)LRWD1変異体を用いたLRWD1-G9a結合意義の検討、(III)G9aが複製開始に関与するかの検討を行うと計画していた。以下にそれらの実験で得られた結果を説明する。(I)LRWD1をノックダウンし、ORC及びMCMがクロマチンから脱離しやすくなるのかの検討を行った。塩濃度を変化させ、その濃度依存的な可溶性の検討をウェスタン・ブロットにより行ったところ、LRWD1ノックダウンによりORC2及びMCM3の可溶性の変化が見られた。このことから、LRWD1はORC及びMCMを含めた、複製開始複合体の安定なクロマチンへの結合に関与していることが考えられた。(II)LRWD1のG9aとの結合能を欠損させた変異体をRNAi耐性として、安定発現する細胞株を樹立し、この細胞と野生型を安定発現する細胞を用いた生細胞観察を行った。野生型を発現する細胞に対してLRWD1のノックダウンを行うと、親株では遅延していたG1期の長さの回復が見られた。一方で、変異体を発現する細胞に対してLRWD1のノックダウンを行うと、G1期の長さの回復が見られたなかった。これらのことから、LRWD1はG1期の進行に重要で、さらにその機能を果たすにはLRWD1とG9aの相互作用が極めて重要であることが示唆された。(III)

G9aをRNAiにより機能阻害した細胞を、mCherryタグを付加したPCNAを用いた生細胞観察により、各細胞周期に分け、その時間の測定を行なった。その結果、G9aのノックダウンによりG1期、S期、G2期のいずれの細胞周期も延長する結果が得られ、G9aはLRWD1と相互作用し、G1期の進行に必須な役割を果たすのみならず、各細胞周期においても重要な役割を担っていることが示唆された。細胞の正常な増殖において、核内に納められているDNAを正確に複製することは必要不可欠である。ORC(Origin Recognition Complx)は、DNAの複製開始点を認識するタンパク質として、1992年に出芽酵母において発見され、ヒトまで広く保存されていることが知られている。近年、ヒトORC構成因子の一つを用いた実験から新規ORC結合タンパク質として、LRWD1(Leucine-rich Repeats and WD repeat domain cantaining1)/ORCAが発見された。報告者の所属する研究室でも独自にLRWD1を同定しており、LRWD1をRNA干渉法により機能阻害すると、G1期が延長することやORCの可溶性が上昇すること、ヒストン修飾酵素G9aと相互作用することを独自に明らかにしており、LRWD1はヒストン修飾酵素と連携することで、DNAの複製開始に重要な役割を果たしているものと考えられる。当該年度ではLRWD1がDNA複製開始でどのような機能を果たしているかを解き明かすため、DNAヘリカーゼの一つであるMCM3にGFPタグを付加し、生細胞中で動態を観察できる系を樹立した。この系と昨年度までに樹立していた、mCherryタグを付加したPCNAによる細胞周期観察系を組み合わせることにより、細胞周期の時期を特定しながら、LRWD1の有無によるMCM3の動態を観察した。その結果、MCM3はLRWD1が存在する状態ではG1期の終わりから、PCNAの集積に先立って点状の局在を示し、LRWD1をノックダウンするとその集積がみられなくなることがわかった。このことから、LRWD1はMCM3が集積するのに必須な複製開始点の構築に関わっていることが生細胞観察で示唆された。以上の結果はG9aのノックダウンでも同様であった。これらの結果からLRWD1はG9aとともに複製開始点の構築に深く関わり、LRWD1-G9a複合体の機能を詳細に解析することで、今まで知られていなかったヒトにおけるDNA複製開始点の構築、また制御への新たな知見を与えるものと期待される。今後の研究の推進方策として、次年度では以下の3つの実験を行おうと計画している。(I)LRWD1と結合したG9a依存的なヒストン修飾がクロマチン全体に対してどのように導入されているか検討を行う。RNA干渉法によりLRWD1を機能阻害した細胞に対して、抗ヒストン修飾抗体を用いた免疫染色や細胞抽出液に対するウェスタン・ブロットを行う。この染色の輝度値及びウェスタン・ブロットのバンド輝度値を定量解析し、LRWD1が核全体のヒストン修飾にどのように影響を及ぼすかを明らかにする。
レーザースペックルフローグラフィーを用いた電子眼底血管造影装置

眼底血流画像化装置は当研究室においてこれまで長年に渡って研究開発が進められ、大学発ベンチャー企業によって製品化が進められてきたが、今回測定視野を大幅に広げ、操作性を向上させ、臨床で利用できる医療機器としての製品化に成功した。また血流解析ソフトに多数の改良を加え、血流波形など新しい情報を提供できるようになった。これらにより従来の蛍光眼底造影法で得られる血流マップとほぼ同等の画像が、造影剤を用いずに得られるようになった。従来まで我々は、既存の眼底カメラに血流画像化機能を組み込む方式の眼底血流画像化システムを開発してきたが、これでは測定画角が狭く、十分な機能を発揮できなかったため、本研究では専用の眼底血流画像化装置の研究開発に取り組んだ。先ずレーザースポットを縦長にし、眼底に2面隣接して投影する光学系を開発し、1回の照射で画角約30度の範囲にレーザーを照射できるようになった。しかし試作装置では左右のレーザースポットの光量バランスが悪く、血流マップの特性が左右で若干ずれることが分かったため、次年度における課題とした。次に広い面積の血流分布を画像化する際に不可欠の、眼底移動に対するトラッキング手法の改良を行った。レーザー光による血流マップの移動情報を基にした従来の方法では、トラッキング精度に限界があったため、補助光として黄色LEDを眼底に照射し、インコヒーレント画像を用いたトラッキング技術を開発した。これによってトラッキング精度は向上したが、可視光のため被験者にとってはかなり眩しく、このストレスによって血流が変化する可能性も考えられた。そこで今年度は実用化の第一段階として、画角をやや絞り、無散瞳で手軽に測定できることに主眼をおいた装置の開発に切り替えた。その結果、画角が横20度×縦12度で、画素数は横700ドット×縦360ドット、測定時間最長10秒の試作機が完成した。この装置は眼底カメラ部、顎台、XYZステージ、PCにより構成され、既存の眼底カメラと似た外観となっている。また内部固視標により視線を誘導し、視神経乳頭部から黄斑部までの広い範囲を一回の測定で画像化できる。九州大学眼科などで、本試作装置の評価実験を開始している。今年度は画角を横20度×縦12度と当初の計画よりやや絞り、無散瞳で手軽に測定できることに主眼をおいた装置を開発した。高感度CCDカメラを新規に採用したため、眼底を照射するレーザーレベルを抑えられ、眼に対する安全性を確保できた。画像をPCのメモリーに取り込むための専用フレームバッファメモリーボードを開発し、最長8秒間の連続画像を取りこぼしなく転送できるようになった。また眼底カメラ部の内部に固視標を設置し、視線を誘導することにより、眼底の目的部位の血流を確実に画像化できるようにした。内部固指標はLEDマトリクスを用いているが、これを十字型に点灯することにより、中心視力の悪い黄斑変性症の患者もある程度の固視が得られるようになった。本装置により、視神経乳頭部から黄斑部までの広い範囲を、一回の測定で画像化できるようになった。当研究室発のベンチャー企業では、これを原型とした臨床用医療機器の開発と製品化を開始し、平成20年1月に製造承認を得た(医療機器認証番号:220AGBZX00001000)。平成20年4月4日付けではあるが、本装置の基本特許である「広視野型眼底血流画像化装置」が国内特許第4102888号として確定し、九州工業大学の新たな知的財産となった。次年度に開発する装置では、画角切替機構やスプリットイメージによる合焦判定機能を取り入れて操作性の向上を図り、より完成度の高い電子眼底血管造影装置の完成を目指す。今年度は前年度に製品化した眼底血流画像化装置に以下の改良を加え、性能向上に取り組んだ。当初の計画通りレーザースポットを眼底に2個並べて照射できるようにレーザー照射光学系を変更した。観察光学系を全面的に見直し、作動距離を広げて欧米人のように眼球が顔面より奥にある場合も測定できるようにした。レーザー光束が瞳孔を通過する位置を正確に設定できるよう、瞳孔を観測するカメラと赤外照明光を組み込んだ。また従来機で最も難しかった眼底画像のピント合わせを補助するために、上記の2個のスポットが合焦位置で接する機構を組み込んだ。これによりスポットの間隔を見ながら正確にピントを合わせられるようになった。またこれらの機構により、将来画角の拡大も可能になった。測定ソフト、解析ソフトの改良もユーザーの意見に従って精力的に進められた。心拍に同期して血流が変化する様子を波形として捉え、これを特徴づける物理量を研究した結果、波形の歪度が有効であることが解った。

脈絡膜の血流波形の歪度が年齢と共に増加し、末梢血管抵抗の増加との関係が示唆された。網膜血管と背景血流を分離する技術も進歩し、別々に血流値や波形を数値で読み出せるようになった。トラッキングのアルゴリズムも改良され、平均血流マップは蛍光眼底造影によって得られる画像により近くなった。従来までは矩形のラバーバンドしか描けなかったが、楕円形やその内部を4分割するなど、視神経乳頭部の血流分布の解析に有効な機能も追加し、臨床に利用しやすくなった。