hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
甲状腺ホルモンのノンゲノミック作用によるp27kip1の調節機序とその意義

本研究は、T3がp27^<Kip1>リン酸化を抑制し、p27^<Kip1>のUbiquitin化を減弱することによってp27^<Kip1>の蛋白レベルを増加することを明らかにした。このT3ノンゲノミク作用は細胞周期を制御することによって、細胞の分化を促進する一方、増殖を抑えた。T3よるp27^<Kip1>の調節分子機序を解明するために以下の実験を行った。1)まずは、pGL-IRES plasmidを作成し、N2aTRαとN2aTRβ細胞でReporter gene assayを行った。IRESはp27^<Kip1>mRNA上流にあるnon-coding sequenceであり、蛋白合成促進に関与する領域です。その結果、T3の添加はluciferase活性を増加しなかったため、p27^<Kip1>の蛋白合成効率に影響がないことを示唆した;2)次は、N2aTRαとN2aTRβ細胞を用いて、pulse-chase法で一定時間内に合成されたp27^<Kip1>蛋白を標識し、その後標識された蛋白がT3存在下、非存在下での経時的変化を追跡し、蛋白の安定性を検討した。その結果、N2aTRβ細胞で、T3はp27^<Kip1>蛋白安定性を促進したが、N2aTRα細胞では変化が認められなかった。また、N2aTRGS細胞でもN2aTRβと同じ結果を得られた。以上の結果から、T3はTRβのナンゲノミック作用を介して、p27^<Kip1>蛋白安定性を促進することを示唆した;3)さらに、N2aTRGS細胞をproteasome阻害剤LLnLやMG132で前処理し、p27^<Kip1>蛋白を免疫沈降後、抗ubiquitin抗体、抗p27^<Kip1>抗体を用いたWestern Blottingで、p27^<Kip1>のubiquitin化状態を検討した。その結果、T3はp27^<Kip1>のubiquitin化を抑制した;4)p27^<Kip1>のUbiquitin化はThr^<187>依存性と非依存性のメカニズムがあり、3)のように処理したN2aTRGS細胞のp27^<Kip1>のThr^<187>リン酸化を、Thr^<187>のリン酸化部位を特異的に認識できる抗体を用い、Western Blottingで検討した。その結果、T3がp27^<Kip1>のThr^<187>リン酸化を抑制した。以上の結果はT3がp27^<Kip1>のThr^<187>リン酸化を抑制し、p27^<Kip1>のUbiquitin化を減弱することによってp27^<Kip1>の蛋白レベルを増加することを明らかにした。ヒト肝細胞癌では、その70%以上がTRの変異を持つと言われている。これらの変異は主にTRのT3結合領域にあり、DNA結合領域だけの変異体はまだ報告が無い。T3の細胞分化作用がTRの変異で阻害されることが発癌の一つの原因だと考えられている。そこで、本研究は癌細胞におけるp27^<Kip1>のT3による調節とその意義を解明するために、ヒト肝細胞癌由来のHepG2細胞を用い、pcDNA3.1/TRGS(DNA結合能欠損)、pcDNA3.1/TRβ1-EとpcDNA3.1/TRβ1-J(両者はhepatocellular carcinoma患者に同定された変異体で、TRβ1-EはT3結合領域とDNA結合領域に変異を有し、TRβ1-JはT3結合領域だけに変異を有する)を導入し、これらのTRを恒常的に発現する細胞を樹立した。1)まず、これらの細胞にT3によるp27^<KiP1>の発現調節をWestern Blotting法で検討した。TRGS発現している細胞だけには、p27脇P1はT3により発現量が促進された。以上の結果から、T3はTRβと結合して、nongenomic作用を介して、P27^<Kip1>の発現量を調節することを強く示唆された。2)また、CK8 kitを用いて、癌細胞増殖に対するTR変異体の影響も検討した。その結果、TRGSではなく、TRβ1-EとTRβ1-Jを発現している細胞の増殖が促進された。この促進はp27^<Kio1>siRNAの導入することによって、抑えられた。以上の結果から、T3はTRβと結合して、新たなnongnomicメカニズムを介してp27照P1の発現を促進し、そして細胞周期を制御することによって、細胞の分化を促進する一方、増殖を抑えたことを強く示唆された。
ラクトフェリンの歯周治療への応用に関する基礎的研究

1.GCF,唾液中のヒトラクトフェリン(hLf)定量15人の被験者から採取したGCFおよび7人の被験者から採取した唾液についてhLf量を測定した結果,GCFでは平均226μg/ml,唾液では平均20μg/mlとGCF中のhLf量は有意に高かった。2.歯根面におけるhLf分布状態の観察ウサギ抗hLf IgGを使った免疫染色により,歯石が認められた部位には強い蛍光が認められた。被験歯の歯根を表層から歯髄腔までが3層となるように切削してhLf量を測定した結果,歯石が付着している部位では第1層から第3層に向かうにつれてhLf量が減少していた。また,歯石付着部位の第1層に含まれるhLf量は歯石非付着部位の第1層に比べて有意に高かった。さらに,歯石付着部位,歯石非付着部位とも第1層から第3層に向かうにつれてエンドトキシン活性が減少していた。3.歯肉縁上,縁下プラーク中のhLf定量19人の被験者から採取した歯肉縁上・縁下プラーク中のhLf量を測定した結果,縁上プラーク中hLf量の平均は3.27μg/ml,縁下プラーク中hLf量の平均は2.06μg/mlであり,対応のあるt検定で解析したところ統計学的な有意差は認められなかった。しかし,両者間には有意な相関関係が認められた(相関係数0.609,p<0.01)。4.hLfがA. actinomycetemcomitans感染ヒト単球系細胞の細胞死に与える影響THP-1細胞にA. actinomycetemcomitansを感染させ24時間後,感染群では対照群に比べてTNF-α産生量が有意に増加した。これにhLfを添加するとTNF-α産生量は有意に減少した。また,感染群では細胞内DNA断片化が対照群に比べて有意に亢進したが,hLf(100μg/ml)を感染操作前後に添加すると対照群と同程度まで断片化が抑制された。平成12年度では,(1)歯周炎患者の歯周組織におけるラクトフェリンの分布状態および(2)感染防御機構におけるラクトフェリンの役割,について検討する予定であった。(1)については,ELISA法によるラクトフェリン定量について再度,確認を行った。まず,1/1000希釈ウサギ抗ラクトフェリン抗体によってコーティングしたプレートを1%牛血清アルブミンによってブロッキングした。0.25ng/ml128ng/mlに希釈したヒトラクトフェリン溶液を標準血清とした。5名の健常者から採血した血清を希釈し,標準血清と共にプレートに加え室温で2時間インキューベートした。洗浄後,1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラクトフェリン抗体を加えて室温で2時間インキューベートした。プレートを洗浄後,基質溶液を加え発色させた。その結果,血清ラクトフェリン濃度は0.236μg/ml0.357μg/mlであった。これらの値は,これまで報告されている濃度と同様であった。歯肉溝滲出液についても,同様に健常者からのサンプルを用いて測定を行った。また,ポケット内縁上皮および抜去歯表面におけるラクトフェリンの分布については,現在,患者からのサンプルを収集中である。

(2)については,これまでマウスマクロファージで行ってきた感染実験をヒト由来の細胞(HL-60,U-937,THP-1)に細胞を換えて実験系を組み立てている途中である。実験系が確立次第,ヒトマクロファージのリポ多糖あるいは炎症性サイトカインに対する反応性にラクトフェリンがどの様に影響するか検討する予定である。平成13年度では,1.歯肉溝滲出液および唾液中のラクトフェリン量の定量,2.歯肉あるいは歯根面におけるラクトフェリンの分布について検討した。1.Ora flow社製ペリオペーパー(歯肉溝滲出液)あるいはサイアロペーパー(唾液)によって採取したサンプルについて,液量をペリオトロンにて計測した。その後,サンドイッチELISA法によりラクトフェリン量を定量した。現在,サンプル数を増やし,健常者と歯周病患者との間でラクトフェリン量に差が認められないか検討中である。2.歯周外科時に歯肉内縁上皮を含む試料を採取し,液体窒素中でO.C.Tコンパウンド(SAKURA社製)に包埋した。クライオスタットで超薄切片を作製し,ペルオキシダーゼ標識ウサギIgG(カッペル社製)を用いた免疫組織染色を行った。しかし,切片中にはラクトフェリン陽性の染色像は認められなかった。また,抜去歯をウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体(カッペル社製)およびアレキサ532標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(カッペル社製)にて蛍光染色し,モレキュラーイメージャー(バイオラッド社製)により観察した。抜去歯を撮影した画像と蛍光画像を比較したところ,強く蛍光を発する部位には歯石の付着が認められた。よって,ラクトフェリンは歯石が付着している部位に分布している可能性が示唆された。根面表層に分布するラクトフェリンが歯根全体に均一に分布しているかどうかを調べるために,根面を表層から歯髄腔まで一定量ずつ切削し,その中に含まれるラクトフェリン量を定量した。その結果,歯石付着の有無に関わらず,表層から歯髄腔に向かうにつれてラクトフェリン量は減少した。以上の結果から,ラクトフェリンは歯根表層,特に歯石が付着している部位に分布していることが明らかになった。平成14年度では,ラクトフェリンが歯周組織,特に歯肉上皮,歯肉線維芽細胞に与える影響について検討する予定である。平成14年度では,(1)歯肉縁上・縁下プラーク中のラクトフェリン定量,(2)歯根面にけるエンドトキシンとラクトフェリンの分布について検討した。(1)北海道医療大学歯学部附属病院にて歯周治療を行っている患者20名から,患者のプラークを実験に供するための承諾を得た。滅菌したスケーラーを使用して縁上・縁下のプラークを採取し,あらかじめ用意しておいたマイクロチューブ内のPBSに懸濁した。遠心操作後,上清を採取しタンパク定量,サンドイッチELISA法によるラクトフェリン定量を行った。サンプル中のタンパク量によってラクトフェリン量を標準化した後にデータを解析した結果,縁上プラーク量と縁下プラーク量との間に有意差は認められなかった。しかし,縁上プラーク中のラクトフェリン量と縁下プラーク中のラクトフェリン量が有意に相関するという結果が得られた。この結果から,患者毎にプラーク中に含まれるラクトフェリン量が異なる可能性が考えられた。(2)歯周治療において保存不可能と診断され抜歯された抜去歯について,根面表層に分布するラクトフェリンとエンドトキシンが歯根表層から深層までに均一に分布しているかどうかを調べるために,根面を表層から歯髄腔まで一定量ずつ切削し,その中に含まれるラクトフェリンとエンドトキシンを定量した。その結果,歯石付着部位では,表層から歯髄腔に向かうにつれてラクトフェリン量とエンドトキシン量は減少した。
無限次元多様体上の変分法の幾何学的研究

無限次元多様体上の幾何学について研究をすすめた.特に有限次元多様体上の関数空間として得られる多様体を研究し,その結果として元の多様体の研究に有用な知見を得た.より具体的には,有限次元多様体に関わる様々な汎関数を考察し,その変分を研究した.その根底にあるのは,良く研究されてきたモ-ス理論の拡張を目指すものである.モ-ス理論の研究は,その勾配ベクトル場を通じて力学系の研究に帰着させた.この視点にたって我々の研究は,無限次元力学系の研究にも貢献できた.これらの成果を通じて,下記に述べる無限次元及び有限次元多様体の位相・微分幾何学的性質をある程度明らかにできた.まず有限次元多様体上の計量全体のなす空間の位相を研究した.これを3つの観点から研究を進めた.第1に計量から定まる様々な(積分幾何的)不変量の変分を調べるものである.このような不変量の極値は,様々な偏微分方程式の解として与えられる.従って変分法と非線形偏微分方程式の観点で研究可能であった.第2にリーマン計量の曲率から定まる様々な不等式の極値を考察することである.多くのリーマン幾何学的な不変量の極値は偏微分方程式からは特徴つけられないが,それらに対してはより素朴で純リーマン幾何学的手法での研究が可能であった.第3に,この空間は多様体上の可微分同相写像のなす(無限次元)リー群の分類空間であることに着目する.従ってfoliated productの分類空間の研究の中で使われてきた方法がいろいろと使用できることが確認できた.さらに有限次元多様体上に与えられた構造のなすモジュライ空間や,2つの有限次元多様体の間の写像の族のなす空間の位相を研究した.この問題は部分多様体の研究を含んでいる.これらの問題についても多くの知られている汎関数の変分を調べることで研究をすすめた.無限次元多様体上の幾何学について研究をすすめた.特に有限次元多様体上の関数空間として得られる多様体を研究し,その結果として元の多様体の研究に有用な知見を得た.より具体的には,有限次元多様体に関わる様々な汎関数を考察し,その変分を研究した.その根底にあるのは,良く研究されてきたモ-ス理論の拡張を目指すものである.モ-ス理論の研究は,その勾配ベクトル場を通じて力学系の研究に帰着させた.この視点にたって我々の研究は,無限次元力学系の研究にも貢献できた.これらの成果を通じて,下記に述べる無限次元及び有限次元多様体の位相・微分幾何学的性質をある程度明らかにできた.まず有限次元多様体上の計量全体のなす空間の位相を研究した.これを3つの観点から研究を進めた.第1に計量から定まる様々な(積分幾何的)不変量の変分を調べるものである.このような不変量の極値は,様々な偏微分方程式の解として与えられる.従って変分法と非線形偏微分方程式の観点で研究可能であった.第2にリーマン計量の曲率から定まる様々な不等式の極値を考察することである.多くのリーマン幾何学的な不変量の極値は偏微分方程式からは特徴つけられないが,それらに対してはより素朴で純リーマン幾何学的手法での研究が可能であった.第3に,この空間は多様体上の可微分同相写像のなす(無限次元)リー群の分類空間であることに着目する.従ってfoliated productの分類空間の研究の中で使われてきた方法がいろいろと使用できることが確認できた.さらに有限次元多様体上に与えられた構造のなすモジュライ空間や,2つの有限次元多様体の間の写像の族のなす空間の位相を研究した.この問題は部分多様体の研究を含んでいる.これらの問題についても多くの知られている汎関数の変分を調べることで研究をすすめた.松本はリーマン面の退化の位相的分類を写像類群の言葉で与えた。これはリーマン面の普遍族の完備化への応用を目指すものである。砂田は磁場のある場合の測地線の方程式にあたるものを研究した。たとえば負の定曲率空間の場合を具体的に調べ、磁場の強さによって出来る力学系がアノソフ系・ホロサイクル流・完全積分系と順に変わることを示した。これらの量子化についても研究を進めている。深谷はヤングミルズ方程式と概複素曲線の方程式の混合である方程式を研究した。すなわち曲面と二次元ユークリッド空間の直積である空間を考える。この空間の上のヤングミルズ方程式は曲面の表現空間への概複素曲線の方程式と近いことがドストグラウサラモン・吉田によって知られているが,この方程式を混合した方程式を考えそれに対して,解の滑らかさ,特異点除去定理,解のモデュライ空間のコンパクト化を論じた。これらは角付き多様体の上でゲージー理論を展開する基礎となるべきものであり,たとえば境界付き多様体のフレーア-ホモロジー理論の構成の解析の部分を正当化するものである。またラグランジアンの交点に対するフレーア-ホモロジーの研究におけるマスロフ指数の意味を明らかにした。すなわちこれらはノビコフによって多価関数のモース理論を展開するために導入されたローラン多項式環(ノビコフ環)とかかわる。またこのノビコフ環が量子コホモロージー環の係数環と自然に考えられることもわかった。さらにモース理論と位相的場の理論種々の低次元多様体の位相不変量の関係についての考察も進めた。無限次元多様体上の幾何学的手法でもって、有限次元多様体上の様々な汎関数の変分について研究を進めた。

得られた成果は下記の通りである。1.多様体上の幾何学的考察を元に様々な変分を考え、それらが共形不変性があるとき著しい性質を持ち、標準型を持つことを示した。(落合、大津)2.偏微分方程式論的考察を元に、様々な変分を考え、それらの危点の諸性質につき興味ある結果を得た。特に爆発を持つ危点につき知見を得た。(俣野、石村)3.有限次元多様体の微分同相の作る群およびその分類空間の位相につき成果を得た。(松本、坪井)4.Morse理論をシンプレクテイク幾何学の立場から再認識をし、物理幾何学への応用を発見した。(落合、坪井)5.多様体の写像に対する変分であるエネルギーとその危点を与える調和写像について、特に2変数の場合の研究を進めた。コントン数についての知見を得た。(落合、石村)6.部分多様体に対する変分である面積とその危点を与える極小曲面について、存在、滑らかさの研究をおこない、面積の増大度に関する知見を得た。
歯周病原細菌排除におけるカスパーゼの役割と炎症反応制御に関する研究

炎症性カスパーゼのカスパーゼ1、4、5はインターロイキン1βの産生やピロトーシスと呼ばれる細胞死を誘導することにより、炎症反応を惹起し、生体内に侵入した細菌の排除に関与していることが報告されている。そこで我々は歯周病炎症反応における炎症性カスパーゼの機能について実験を行った。ラットにおける実験的歯周炎モデルにおいて、カスパーゼ1の活性化に関与するNLRP3の抑制剤のグリブリドを投与したラットは、コントロールと比較して歯肉内の炎症性細胞数、破骨細胞数、歯槽骨吸収が抑制されていた。このことからカスパーゼ1は歯周炎症反応と歯槽骨吸収において重要な役割を演じていることが示唆された。病原性を示す細菌の特徴の一つとして細胞内侵入能および生存能があるが、細胞内に侵入した細菌がどのようにして排除されるかは明らかになっていない。近年、細胞質およびエンドソーム内の自然免疫受容体が細胞内細菌を検知し、カスパーゼ1,4,5を活性化し、ピロトーシスと呼ばれる形態の細胞死を誘導することで細胞内容物とともに細菌を細胞外に放出し、除菌する機序が報告された。しかし歯周病原細菌感染とカスパーゼ活性化との関連に関する研究はほとんど存在しない。そこで本研究では細胞内侵入歯周病原細菌のクリアランスにおけるカスパーゼ1,4, 5活性化とピロトーシスの役割について基礎研究を行う。病原性を示す細菌の特徴の一つとして細胞内侵入能および細胞内生存能があるが、細胞内に侵入した細菌がどのようにして排除されるかは明らかになっていない。近年、細胞質およびエンドソーム内の自然免疫受容体が細胞内細菌を検知し、カスパーゼ1、4、5を活性化し、ピロトーシスを呼ばれる形態の細胞死を誘導することで細胞内内容物とともに細菌を細胞外に放出し、除菌する機序が報告された。しかしながら歯周病原細菌とカスパーゼ活性化との関連に関する研究はほとんど存在しない。そこで本研究では細胞内侵入歯周病原細菌のクリアランスにおけるカスパーゼ1、4、5活性化とピロトーシスの役割に関して基礎研究を行う。前年度は歯肉上皮細胞株のHSC-2細胞を用いて歯周病原細菌(P. gingivalis, F. nucleatum)の細胞内侵入能について実験を行った結果、P.gingivalisは0.36%, F.nucleatumは0.14%であった。しかしながらHSC-2細胞でのカスパーゼ1、5の発現量が少なかったことから、今年度はヒトマクロファージ細胞株のTHP-1細胞を用い、実験を行った。THP-1細胞をP.gingivalis, F.nucleatumで刺激するとcaspase1 mRNAの発現はそれぞれ未刺激と比較して0.82と0.77で、コントロールのE.coliの1.89と比較して減少していた。しかしながらタンパク発現量は、P.gingivalisではcaspase1の発現は変わらなかったが、F.nucleatum, E.coliでは増加していた。またピロトーシスは3菌種でそれぞれ差は認められなかった。これらの結果から歯周病原細菌のcaspase1のタンパク発現には、さまざまな機序があることが考えられた。所属研究機関が長崎大学より福岡歯科大学に変更になり、研究環境の整備や研究条件の設定に時間を要したために研究の進捗状況はやや遅れている。HSC-2細胞ではカスパーゼ1のタンパク発現の検出は困難であったため、THP-1細胞でも実験を並行して行っている。病原性を示す細菌の特徴の一つとして宿主細胞内への侵入能および生存能があるが、細胞内に侵入した細菌の排除メカニズムは明らかになっていない。近年、細胞質内およびエンドソーム内の自然免疫受容体が細胞内細菌を検知し、インフラマソームを介したカスパーゼ1、4、5を活性化し、ピロトーシスを呼ばれる形態の細胞死を誘導することにより、細胞内容物とともに細菌を細胞外に排出し、除菌するメカニズムが報告された。一方これらのカスパーゼはIL-1βやIL-18などの炎症性サイトカインのプロセッシングと活性化にも関与しているため、炎症の誘導にも関与している。しかしながら歯周病原細菌感染とカスパーゼ活性化に関する研究は少ない。そこで我々は歯周病原細菌によるインフラマソーム活性化を介した、カスパーセの活性化とピロトーシス、IL-1βの誘導に関して基礎実験を行った。Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans刺激によりTHP-1細胞はIL-1βを培養液中に放出した。IL-1βの放出はNLRP3インフラマソームインヒビターのMCC950とカスパーゼ1インヒビターのz-YVAD-fmkにより抑制されたが、IL-8の放出は影響を受けなかった。また細菌刺激によるTHP-1細胞からのLDHの放出は誘導されなかった。このことは歯周病原性細菌刺激により、カスパーゼ1の活性化とIL-1βの活性化は誘導されるが、ピロトーシスは誘導されないことを示唆している。またこれらの細菌によるラット歯周炎モデルにおいて、NLRP3を抑制する作用を有する糖尿病治療薬グリブリドを投与したラットの歯周組織は炎症性細胞浸潤と歯槽骨吸収が減少していた。このことからNLRP3活性化が歯周炎の発症、進展に関与することが示唆された。研究期間中に長崎大学から福岡歯科大学へ研究期間の移動したために、研究の進捗状況に遅延が生じた主な理由である。さらに細胞培養液中のカスパーゼ

1のプロセッシングをimmunoblottingで確認しているが、適切な抗体がないためにうまく検出できていない。病原性を示す細菌の特徴の一つとして宿主細胞内への侵入能および生存能があるが、細胞内に侵入した細菌の排除メカニズムは明らかになっていない。近年、細胞質内およびエンドソーム内の自然免疫受容体が細胞内細菌を検知し、インフラマソームを介したカスパーゼ1、4、5を活性化し、ピロトーシスを呼ばれる形態の細胞死を誘導することにより、細胞内容物とともに細菌を細胞外に排出し、除菌するメカニズムが報告された。またピロトーシスによって放出された細胞内容物はDangerシグナルとして近接する細胞に作用して、炎症応答を誘導することが知られている。本年度はカスパーゼ4,5によるピロトーシスの誘導に関して研究を行った。ヒトマクロファージ細胞株のTHP-1とU937のカスパーゼ4、5の遺伝子発現をRT-PCR法によって調べたところ、これらの細胞はカスパーゼ4のみを発現しており、カスパーゼ5の発現は認められなかった。さらにカスパーゼ4のタンパク発現はWB法によって確認した。近年カスパーゼ4は細胞内LPS受容体として作用し、ピロトーシスを誘導することから、E.coliのLPSをTHP-1細胞にトランスフェクションし、細胞死を培養液中のLDH酵素活性を指標としてLPSのカスパーゼ活性化を検討した。E.coliLPSを24時間トランスフェクションすると40%の細胞が細胞死を起こした。この活性はpan-caspase抑制剤のz-VAD-fmk,カスパーゼ4抑制剤のz-LEVD-fmkによって抑制された。これらのことからマクロファージ内に侵入したグラム陰性細菌のLPSは、カスパーゼ4によって認識され、ピロトーシスを誘導することが示唆された。炎症性カスパーゼのカスパーゼ1、4、5はインターロイキン1βの産生やピロトーシスと呼ばれる細胞死を誘導することにより、炎症反応を惹起し、生体内に侵入した細菌の排除に関与していることが報告されている。そこで我々は歯周病炎症反応における炎症性カスパーゼの機能について実験を行った。ラットにおける実験的歯周炎モデルにおいて、カスパーゼ1の活性化に関与するNLRP3の抑制剤のグリブリドを投与したラットは、コントロールと比較して歯肉内の炎症性細胞数、破骨細胞数、歯槽骨吸収が抑制されていた。このことからカスパーゼ1は歯周炎症反応と歯槽骨吸収において重要な役割を演じていることが示唆された。今年度は所属研究所属機関が長崎大学より福岡歯科大学に変更になり、研究環境の整備や研究条件の設定に時間を要したために研究の進捗状況はやや遅れている。研究備品を整備しつつ、研究計画に従い実験を遂行する。実験の遅れを取り戻すべく、THP-1細胞を用いてカスパーゼ4、5についても解析を進めていく。カスパーゼ1の活性化について新しい抗体でImmunoblottingを行う予定である。Immunoblottingがうまくいかない場合においては、カスパーゼ1の酵素活性を測定する予定である。またカスパーゼ4、5のIL-1β活性化への関与も検討する。
日本の鉱山技術資料の総合的研究と総合目録の作成

鉱山開発は日本の近代化と資本の蓄積を支えてきた重要な産業であり、江戸時代においても様々な技術を集結した総合技術であった。本研究では、国内の江戸時代の鉱山技術に関する器物資料および文献史料のリストアップとデータベース化を目的に研究を行ってきた。これまでに全国の博物館・大学・資料館約50ヶ所を訪れ、収蔵資料の調査を行った。また主要鉱山約30ヶ所で現地調査を行った。大学関連の文書史料に関しては九大、東大で調査を行った他、東北、近畿、中国、九州地方の大学の研究者の協力によりリスト化を進めた。この内、九州大学所蔵の鉱山・製錬関連の古文書・絵図等については、随時デジタル化を行い、Web上(http://database.museum.kyushu-u.ac.jp/kouzan/およびhttp://record.museum.kyushu-u.ac.jp/search/)に公開し、研究者に限らず一般の人々による画像の閲覧と目録の検索を可能にした。鉱山の現地調査は、金・銀・銅・鉛・錫等を対象とした奈良時代江戸時代末の主要鉱山について実施した。調査では当時の山師が採掘の対象とした鉱石の採取や採掘エリアを把握する事に重点を置いた。特に製錬跡を伴う場合は製錬澤や製錬炉の炉材を採取し、鉱石と併せて分析を行うことで、採掘対象の鉱石を推定し、当時の製錬技術の検証を行った。江戸時代の鉱山技術としては、鉱山における採鉱では、坑内掘りの技術が普及し、様々な坑内燈が用いられた。また、坑内採掘では湧水対策が必須であり、桶のほか樋の使用が一般化した。水抜き坑道は近世初期から掘られていたが、測量術の進歩と普及により、元禄以後には大規模な疎水坑道の掘削が行われるようになった。鉱石を処理する選鉱技術としては、鉱石の粉砕にリンズを用いた石臼が定型となった。また、ねこ流しによる比重選鉱が行われた。鉱石から金属を取出す製錬技術では、中世末に石見銀山へ導入された灰吹法が全国に普及し、大阪銅吹所では南蛮吹が導入され、各地の鉱山や製錬所への技術移転が進められた。平成17年度には、中世ヨーロッパの鉱山技術との対比のためスウェーデン・ドイツ・スロバキアにおいて現地調査を行った。今後は、日本の主要鉱山に関する器物・文献の現状や鉱石・製錬澤の分析値等を統合した総合データベースを構築することによって、多方面から幅広く鉱山技術を研究・検証できる環境を整えてゆく。本年度の研究では、江戸時代の非鉄金属(金・銀・銅・鉛・錫)鉱山、鉄山、石炭鉱山に関する技術資料を対象に予備的な所在調査を行った。まず、各地の博物館等の機関に所蔵される器物資料・文献資料の調査を行い、資料の保管状況と目録作成の現状を調査した。非鉄金属鉱山については、生野銀山(資料館)、佐渡金山(博物館、資料館)、尾去沢銅山(資料館)、大葛金山、石見銀山(資料館)について調査した。

このほか、各地域の研究者、関係者との連携をはかり、岩手県金沢金山、大分県木浦鉱山(錫)の鉱山資料の一部について現状を把握した。目録作成については、まず、九州大学工学部資源工学科所蔵の古文書資料(内田家文書、荒木文書)を対象として、資料のマイクロフィルム化を完了し古文書資料の一部について、研究分担者のホームページ上で公開を実施した。また、鉱山絵巻についてデジタル化の準備を開始した。さらに、同学部列品室の鉱山技術関連標本・器物資料のリスト化を進めた。金属鉱山鉱石試料の重要コレクションについては、産総研地質票本館所蔵の木下標本等、合同資源産業(株)所蔵の磯部標本の所在調査を行うと共に、データベース化を検討した。さらに、鉱山技術の鉱床学的背景を明らかにする目的で、地質調査、試料の採取・分析等を行った。非鉄金属鉱山に関しては、佐渡の新穂金山、島根県石見銀山、丸山銅山(大年ノ元製錬遺跡)、福岡県星野金山について、鉄山に関しては、古代の元岡遺跡(福岡県)と幕末の大日向鉄山(長野県)、犬鳴鉄山(福岡県)、富山海岸の砂鉄産地等について調査を行った。その他、目録作成を行う上で必要となる日本の鉱山リストの作成に着手した。まず、日本鉱産誌に採録されている金・銀鉱山、銅・鉛・亜鉛鉱山、錫鉱山、水銀鉱山のリストのデジタル化を完了した。また、石炭鉱山のリスト作成に関する文献資料の調査を行った。平成15年度は国内主要鉱山の現地調査として、秋田県阿仁銅山、大葛金山、尾去沢銅山、山口県長登銅山、島根県石見銀山、都茂丸山銅山、宮崎県木浦鉱山(錫)の調査を行った。資料館・博物館関連の施設としては、小坂町立総合博物館郷土館、阿仁町郷土文化保存伝承館、秋田県立博物館、秋田大学工学資源学部付属鉱業博物館、秋田県立図書館、東京大学総合博物館、東京大学工学部、湯ノ奥金山博物館、石見銀山資料館、住友史料館、大阪歴史博物館、宇部市石炭資料館等において文献・器物の所在調査を行った。特に、山口県長登銅山では、周辺地質の調査、鉱石・からみ(製錬滓)試料の分析等を行い、銅の製錬技術の古代から近世にいたる時代的変遷を検証するための基礎データの収集を行った。また、文献試料については東北地方の鉱山史料について82点を目録化した。昨年度目録化を行った九州大学旧採鉱学科所蔵鉱山関連古文書については、テキストデータベースの作成を完了し、絵図等についても随時デジタル化、HP上での公開を進めてきた。本年度の研究の過程で得られた知見として、鉱山技術を探査・採掘・選鉱・製錬のプロセスに分けた場合、鉱山技術を読み解く材料として、1)鉱山技術が人(山師)の移動を伴って広がること、2)当時の技術レベルに応じた採掘対象(鉱石)の選択、3)石臼等選鉱用の道具の変遷、4)新しい製錬技術の伝播、5)製錬技術の科学的検証等が挙げられる。特に、5)の製錬技術の検証については、長登銅山の鉱石・からみの分析の結果、当時の製錬技術や採掘の対象となった鉱石、あるいは製錬の過程で添加された溶融剤等を推定する事が可能である事が判明した。また本特定領域の他の研究班との連携として、製錬技術についてはA03班「生産遺跡出土資料研究に基づく近世科学技術の比較研究の総合化」と協調して鉱山遺跡関連のシンポジウムに参加を行った他、A01班「石黒信由以下4代の編著書・作成地図・考案測量器具に関する調査・研究と日本近代化論」と共同で鉱山で使用された測量器具についての調査をおこなった。
唱導文献に基づく法会の綜合的研究―寺院聖教調査の統合と復元的研究への展開―

調査フィールドの基盤調査・研究に据えている各寺院・文庫調査については、研究成果の統合に向けて、以下のような研究実績と成果を得た。〔金剛寺調査・研究〕『天野山金剛寺善本叢刊』第1期・第2期の公刊(平成28年度・29年度)を経て、調査データの綿密化・高度化を図った。さらに、他の寺院とのネットワークを解明するフォーラムを国内(名古屋大学)および海外(ハンブルク大学)において開催した。〔金沢文庫調査・研究〕神祇関係のテクストを中心とする展示を金沢文庫にて開催し、併せて研究成果を公表する研究集会を国内(横浜市立大学)および海外(エクス・マルセイユ大学)で開催した。〔真福寺調査・研究〕昨年度中に目録の入力作業・電子化の第一段階を予定通りに終了し、本年度からはデータの確認作業を進めた。また、金剛寺・東大寺等との寺院ネットワーク解明に向けた研究と、その成果報告の場を設けた(上述、名古屋大学・ハンブルク大学)。〔勧修寺調査・研究〕引き続き、重要文化財指定に連動した調査聖教・経典類の全貌解明に向けての研究を展開した。法会・唱導学創成に向けて、本研究が積極的に展開している統合的・復元的研究においては、法会の実態を灌頂に着目して解明するフォーラムを海外(UCサンタバーバラ)において開催した。東アジアにおける唱導の比較対照研究においては、あらたに文文化遺産と交流史に着目するプロジェクトを立ち上げ、学内のプロジェクト経費に採択された。具体的な研究推進は、次年度に引き継がれ、後継の共同研究へと引き継いでいく計画を立案中である。統合的研究成果への展開の一環として、前近代の日本における信仰を正統と異端の観点から、キリスト教との相対化をも意図して分析するフォーラム(ヌーシャテル大学)を開催した。また、絵画資料等を含む宗教テクストの世界を身体や芸能の視点からとらえなおすフォーラム(コロンビア大学)を開催した。成果の報告・公刊の点では、本研究の中核的課題とする、唱導文献に基づく法会の統合的・復元的研究において、一部に顕著な業績を上げることができている。金剛寺に関する研究では、予定を前倒しするかたちで『天野山金剛寺善本叢刊』第1期・第2期を刊行できたことは、特筆すべき成果である。このことにより、研究期間後半を、調査研究の綿密化に宛てることができている。さらに、寺院間ネットワークを探求する課題に向けて研究体制を整え、学会を名古屋大学に招致して、金剛寺・真福寺をめぐる聖教類のネットワーク解明の成果を得た。もちろん、調査研究対象の中核に置いている金剛寺・真福寺に関しても、今後に向けて多大な作業が残されている。両寺院聖教の悉皆目録完成は、将来的に完遂させなければならない重要な点である。この点については、本研究課題の後半に作業を進めると共に、次の共同研究の中核に据える計画を立案済みである。復元的研究について、本年度は研究分担者との共同研究体制を活かし、灌頂儀礼とのかかわりから法会の実態を復元的に探究するプロジェクトを進め、UCサンタバーバラにおいて成果報告の国際研究集会を開催することができた。これは、昨年度の論義を中心とする復元的研究と対をなすものであり、これを研究期間最終年度を待たずに行えた点は、当初の研究計画以上の進展を示すものである。これらの共同研究の成果の公刊についても、各々進行中であり、研究期間最終年度およびその翌年に二つの出版物が公刊される予定である。もちろん、これらの研究についても、今後に向けての課題は残されている。たとえば、院政期から鎌倉時代初期にかけての法会の復元的研究については、さらに多くの時間を要することが明らかになりつつある。この点については、本研究期間中に最大限の努力を進めると共に、不十分な点は後継の共同研究で、更に進展させることを計画済みである。調査フィールドと位置づける部分については、本研究の課題解明に直結する点を進めると同時に、後継課題につなげる準備段階として、金剛寺・真福寺聖教の悉皆目録完成を見据えた作業を同時に展開する。復元的研究においては、後白河院を中核に据えた研究を進めるが、本研究期間中に完遂できるわけではないので、最大限の成果報告を行うと共に、今後に向けての展開方法を策定する。研究成果の発表を行った国内外のフォーラム・学会から得られた成果については、それらのうちのいくつかを出版物として公刊する計画が進展中である。最終年度に間に合わせるものは確実に実現させると共に、研究期間終了後2年のあいだに公刊する計画で進めているものについては、内容をさらに充実させつつ実現させる。〇本研究は、近年飛躍的に進みつつある寺院聖教調査の成果を踏まえ、特に唱導文献に着目して、法会の綜合的理解へと研究を深めることを構想するものである。これを推進するため、調査・研究の継続と成果報告を推進した。以下、基盤調査と各研究・分析プロジェクトに沿って概要を示す。[基盤調査]〔金剛寺調査・研究〕においては、前年度に完成済みの目録に依拠して聖教分析を進め、日本学術振興会より出版助成を得て、「天野山金剛寺善本叢刊第1期」2冊を刊行した。〔真福寺調査・研究〕においては、真福寺大須文庫聖教典籍悉皆調査の礎となる「黒板目録」のデータ入力作業を推進し、分析の基礎的作業を終了した。〔神奈川県立金沢文庫調査・研究〕においては、分析対象となる聖教・唱導文献におけるアーカイヴ化の視点による調査を推進し、次年度以降の成果報告および連携展示のための準備を整えた。

[寺院聖教調査の統合的研究]関連唱導文献の注釈・分析作業を推進した。研究代表者の在外研究に伴って、これを海外においても研究グループによって進めた。成果報告の場を翌年度に確保しつつ、その準備を進めている。[復元的研究・東アジア宗教文献比較対照研究]復元的研究については、連携研究者が学会発表による成果報告を行った。また、後述の海外展開フィールドにおいても、院政期の諸宗派における法会の実態を解明する事例について、学会・フォーラムによる成果報告を複数行った。東アジア宗教文献に関する研究については、先行する研究期間に実施したシンポジウム・フォーラムの出版による成果報告の準備を整えた。いずれも、次年度に刊行予定である。[海外展開・連携フィールド]ハーバード大学において、ハーバード大学他の研究者および国内の研究者との共同研究による国際ワークショップを開催した。また、次年度に開催されるEAJS(欧州日本研究協会)の大会におけるフォーラムの準備を進めた。〇成果報告については、当初の計画以上の出版実績とそのための準備を整えることができた。天野山金剛寺善本叢刊に関しては、第1期の刊行に続いて、次年度に刊行を継続するめどがたった。東アジア宗教文献比較対照研究の領域においても、先行研究期間中から推進してきた国際シンポジウム等の成果を刊行する計画が複数実現し、それぞれ校正・入稿段階に入っている。学会等における発表の分野においても、複数の研究メンバーが参加したハーバード大学における国際ワークショップをはじめ、欧米の研究集会での成果発表を進めることができた。研究成果報告の場については、次年度以降にも継続・分散するかたちで、ほぼその内容を整えるに至っている。〇基盤調査においては、真福寺大須文庫の今後の調査・分析に必須となる目録の入力作業が、当初の計画以上に進展した。この結果、次年度からの効率的な分析作業が可能となり、合わせて平成30年度に予定している連携展示企画による成果報告への道筋についても大きな前進となった。真福寺と金剛寺との統合的調査については、両寺院における調査・研究・成果報告が順調に進んでいることで、今後に向けての相乗的効果が期待される状況である。〇研究期間開始後に、研究代表者の所属先変更と在外研究が惹起したが、この当初予期していなかった状況に関しても、研究分担者・連携研究者との協力的関係によって大きな問題は生じなかった。むしろ、海外における展開フィールドにおいては、研究代表者の在外研究先であるハーバード大学との連携関係の強化および成果報告に結実する結果となった。国内寺院・文庫における調査機会が当初の計画通りに確保できなかったが、これについては、次年度に補って実施する計画を策定済みである。また、復元的研究の成果の学会等への発信は十分に推進することができたが、研究組織内での問題の共有機会は、次年度に確保する必要があると考えている。研究計画のうち、調査フィールドと位置づける基盤調査については、以下のように研究を推進した。〔金剛寺調査・研究〕平成28年度に、科学研究費補助金出版助成金の支援を得て刊行した金剛寺善本叢刊第一期に続き、平成29年度出版助成金により善本叢刊第二期を刊行した。〔金沢文庫調査・研究〕唱導
アルツハイマー病の個別化医療を目指したサブグループ特異的なバイオマーカーの同定

アルツハイマー病(Alzheimer's disease, AD)のサブタイプ特異的バイオマーカーを同定するため、細胞内または細胞外にアミロイドβを蓄積するAD患者由来のiPS細胞を神経細胞に分化誘導しその培養上清を網羅的・定量的に解析した。その結果細胞内型AD、細胞外型AD、そして両ADのバイオマーカー候補をそれぞれ複数個同定した。multiplexed-MRM (multiple reaction monitoring)法でiPS細胞由来神経細胞の培養上清の候補タンパク質を定量した結果、現在までのところ3種類の候補タンパク質がLC-MSMS解析と一致する結果が得られた。対照者と細胞内にアミロイドベータタンパク質を蓄積するアルツハイマー病患者(細胞内タイプ)のiPS細胞をそれぞれ3クローンずつ培養し、Kondoらの方法(Cell Stem Cell 2013)で神経細胞に分化誘導した。分化後の神経細胞を2日間培養し培養上清を回収した。その培養上清からアルツハイマー病のバイオマーカーを精製するため、まず培地中に大量に含まれるBSAの除去を行った。具体的には、培養上清を抗BSA抗体をプロテインGマグネットビーズにクロスリンクさせたものとインキュベートすることによりBSAを吸収除去した。さらにBSAを除去した培養上清を3 kDa以下の分子を除去するフィルターを用いて濃縮した。そのサンプルをトリプシン消化後、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)により定量的・網羅的解析を行ったところ、両群間で有意に差のあるタンパク質を59個同定した。同定された分子を大まかに分類するとプロテアーゼが7個、プロテアーゼ阻害分子、糖転移酵素が各5個、糖異性化酵素、細胞接着分子、酸化還元酵素が各3個、その他となった。これらの分子が細胞内タイプのADバイオマーカー候補になると考えられるが、今後脳脊髄液等の臨床検体で確認していく必要がある。また当初の計画どおりに、培養上清の糖タンパク質をレクチンによる部分精製したサンプルを用いてバイオマーカー候補を同定する試みも実行中である。昨年度は対照者と細胞内にアミロイドベータタンパク質を蓄積する家族性アルツハイマー病患者(細胞内タイプ)のiPS細胞由来神経細胞の培養上清から培地成分のBSAを除去し、LC-MSMSでバイオマーカー候補分子を59個同定した。本年度はさらに候補分子を絞るため孤発性の細胞内タイプアルツハイマー病患者のサンプルをLC-MSMSで分析し、前述の59個の中から3個を家族性と孤発性アルツハイマー病に共通した細胞内タイプのバイオマーカー候補として抽出した。一方、家族性および孤発性アルツハイマー病の細胞外にアミロイドベータタンパク質を蓄積する細胞外タイプのiPS細胞から神経細胞の培養上清を調製し、これまでと同法でLC-MSMSで分析した。その結果家族性と孤発性アルツハイマー病に共通した細胞外タイプのバイオマーカー候補として3個を、全アルツハイマー病共通のバイオマーカー候補として1個を抽出した。これら7個の抽出したバイオマーカー候補が確かにiPS細胞由来神経細胞の培養上清中で量的に変化しているかを確かめるため各抗体を用いてウエスタンブロット法もしくは免疫沈降とウエスタンブロット法を組み合わせた方法により検出を試みた。その結果1個の候補分子を検出することができた。しかしながら他の6個は検出できなかった。上記の分析とは別にiPS細胞由来神経細胞の培養上清からレクチンカラムにより糖タンパク質を精製し、タンパク質がどの程度同定できるかの予備検討を行った。iPS細胞から分化させた神経細胞の培養上清をMAH、WGA、PNAの3種類のレクチンカラムにアプライし、糖タンパク質をそれぞれ溶出した。各レクチンカラムの溶出画分には糖タンパク質の量が少なかったので3つの溶出画分をひとまとめにしLC-MSMS分析した。その結果総計で430分子を同定することができた。これによりレクチンカラム3つを組み合わせた精製法によりバイオマーカー候補の同定が可能であることが分かった。細胞内および細胞外にアミロイドベータを蓄積するタイプのiPS細胞を神経細胞に分化させた後の培養上清を部分精製し、質量分析計を用いた網羅的解析を行い、バイオマーカー候補を複数個同定しているため。またレクチンカラムを用いた新規方法でもタンパク質の同定が可能であることが明らかになったから。平成27年度までにiPS細胞由来神経細胞の培養上清からBSAを除去したサンプルをLC-MSMS分析しバイオマーカー候補を7個に絞っていた。これら7個の分子が確かにアルツハイマー病(AD: Alzheimer's disease)患者のiPS細胞由来神経細胞の培養上清中で増減しているかを調べるため免疫沈降後ウエスタンブロット法で検出したが、1つしかバンドとして検出できなかった。他の6個の分子は存在量が少ないため、あるいは抗体の感度が低いため検出されなかったと考えられる。そこでより感度が高く、かつ抗体に依存しない定量法(mlutiplexed-multiple reaction monitoring (MRM)法)を用いて定量した。その際に候補分子選定の基準を複数通りに増やすことにより、候補分子を7個から19個(バイオマーカーの内訳は細胞内型ADが10個、細胞外型が3個、全AD共通が6個)にした。各分子の同位体ペプチドを合成しMRM法の標準物質とし、iPS細胞由来神経細胞の培養上清をトリプシン消化後MRM法で分析した結果、3個の分子については最初のLC-MSMSでの定量結果が再現された。

レクチンカラムを用いてアルツハイマー病のバイオマーカーの候補分子を同定する方法では、iPS細胞由来神経細胞の培養上清をMAH、WGA、PNAの3種類のレクチンカラムにアプライし、糖タンパク質をそれぞれ溶出した。各レクチンカラムの溶出画分には糖タンパク質の量が少なかったため3つの溶出画分をひとまとめにしLC-MSMS分析した。データは対照者とアルツハイマー病患者間で定量比較した。その結果細胞内型ADのバイオマーカー候補として31個が得られた。今後はMRM法を用いて候補タンパク質を定量し、LC-MSMS分析と同様の増減を示すかを確かめる。アルツハイマー病(Alzheimer's disease, AD)のサブタイプ特異的バイオマーカーを同定するため、細胞内または細胞外にアミロイドβを蓄積するAD患者由来のiPS細胞を神経細胞に分化誘導しその培養上清を網羅的・定量的に解析した。その結果細胞内型AD、細胞外型AD、そして両ADのバイオマーカー候補をそれぞれ複数個同定した。multiplexed-MRM (multiple reaction monitoring)法でiPS細胞由来神経細胞の培養上清の候補タンパク質を定量した結果、現在までのところ3種類の候補タンパク質がLC-MSMS解析と一致する結果が得られた。細胞内にアミロイドベータを蓄積するタイプのiPS細胞を神経細胞に分化させた後の培養上清を部分精製し、質量分析計を用いた定量的網羅的解析を行い、バイオマーカー候補を複数個同定しているため。既に同定した7個のバイオマーカー候補分子については、感度の高いELISA法もしくは質量分析法でiPS細胞由来神経細胞の培養上清中の量を定量し、確かに量的変動が起こっているかを調べ、患者の脳脊髄液でも量的変動があるかを調べる。レクチンカラムを用いて、iPS細胞由来神経細胞の培養上清から糖タンパク質を精製しLC-MSMSにてアルツハイマー病のバイオマーカーの候補分子を同定する。同定後は、上記と同じように培養上清での量的変動の確認後、患者の脳脊髄液で量的変動を調べる。神経疾患の生化学レクチンカラムや糖鎖抗体カラムを用いてiPS細胞から分化させた神経細胞の培養上清から糖タンパク質を部分精製し質量分析し、アルツハイマー病のバイオマーカーの候補分子を絞り込む。細胞外にアミロイドベータを蓄積するタイプについても同様に分析していく。
時間分解蛍光測定を軸とする蛋白質水和と機能発現の相関解析

時間分解蛍光和周波測定装置について、光学系の高度化を行った。特に、非線形光学結晶下流でのバックグラウンド光を除去のために新たに設置したレンズ・スリット光学系が威力を発揮し、生体試料からの微弱な和周波光を定常的に測定可能となり、とリゾチームからの和周波測定に成功した。320370 nmにおける1500 psの蛍光強度測定から、トリプトファン蛍光の動的ストークスシフトを再構成できた。さらに、量子化学計算から励起状態にあるトリプトファンの電荷分布を推定し、の蛍光強度への静電相互作用の影響を検討した。水中リゾチームの分子動力学計算トラジェクトリーから、水分子の双極子とトリプトファンの双極子の相互作用が、動的ストークスシフトの主要因となっていることを、初めて明らかにすることができた。これまでに構築した経験的水和分布関数を、通常の分子動力学計算で使用されている分子力場で再現できるのか?どの水分子モデルがこの関数を再現できるのかを、短いペプチドの分子動力学計算によって検討した。その結果、sp2混成軌道を有する脱プロトン化した酸素原子と窒素原子においては、それらの孤立電子対を考慮することが、水和分布関数の際現に不可欠であることが明らかとなった。また、水分子モデルでは、TIP3PとTIP4Pモデルが、水和分布関数を良く再現できることも明らかとなった。この研究結果は、従来の分子動力学計算による蛋白質の動的構造研究や、創薬における分子結合シミュレーションの再考を促す衝撃的なものであった。結晶構造解析による植物青色光受容蛋白質の立体構造解明を目指してきたが、良質な結晶が作出できないため、電子顕微鏡による単粒子解析によるアプローチを行っている。また、電子顕微鏡による蛋白質の構造解析の応用として、ドメイン運動を行う蛋白質の構造多形を可視化することを試みた。28年度が最終年度であるため、記入しない。1.蛋白質水和の研究これまでに開発してきた時間分解蛍光和周波測定装置について、光学系の高度化を行い、トリプトファン溶液について和周波測定を行った。また、トリプトファンの蛍光を正しく見積もるために、電子密度分布を量子化学計算によって推定した。分子動力学計算によってグルタミン酸脱水素酵素のドメイン運動に関わる水和構造変化の詳細を明らかにし、同酵素の親水性ポケットへの水和水分子の段階的な吸着脱離過程と、疎水性ポケットへの水和水分子の周辺水素結合ネットワークに応じた吸着脱離過程の協奏によってドメイン運動が制御されている可能性を指摘した。2.植物青色光受容蛋白質フォトトロピンの構造研究シロイヌナズナphototropin1について、光受容LOV2ドメインとキナーゼドメインで構成された最小機能単位の立体構造をSPring-8 BL45XUでのX線小角散乱実験によって解析し、暗中、青色光照射下での立体構造モデルを得た。モデル形状推定に関わる画像解析問題を検討して新しい解析法を提案し、同アルゴリズムの概要を報告した。光照射によってLOV2ドメインに内に生じる微小構造変化がLOV2とキナーゼの連結部分によって伝達され、キナーゼドメインのLOV2ドメインに対する相対位置が変化することが見出された。伝達にかかわる連結部分の点変異体を測定し、部位特異的な構造変化の役割を検討した。シロイヌナズナphototropin2全長のX線小角散乱実験から、全体構造、青色光照射下での構造変化を明らかにした。phototropin1と同様に、青色光照射によってLOV2-キナーゼの相対配置変化が生じることが明らかとなった。さらに、同分子の高分解能構造解析をめざし、電子顕微鏡観察と結晶化を試みた。クラミドモナスphototropinについては、全長の結晶化を試み、結晶を得てSPring-8のBL32XUにて回折強度測定を行ったが、解析が困難な多結晶であった。1.蛋白質水和の研究これまでに開発してきた時間分解蛍光和周波測定装置の高度化を行い、トリプトファン蛍光の和周波を得つつあり、さらに、それを正しく解釈するべく、トリプトファンの電子密度分布を量子化学計算によって推定している。分子動力学計算によってグルタミン酸脱水素酵素のドメイン運動に関わる水和構造変化に関する研究は、当該分野における水和の重要性認識の向上に貢献している。2.植物青色光受容蛋白質フォトトロピンの構造研究シロイヌナズナphototropin1光受容LOV2ドメインとキナーゼドメインで構成された最小機能単位やシロイヌナズナphototropin2全長について、分子の形状と青色光受容によって書汁立体構造変化を観測できた。その結果から、光照射によってLOV2ドメインに内に生じる微小構造変化がLOV2とキナーゼの連結部分によって伝達され、キナーゼドメインのLOV2ドメインに対する相対位置が変化することが見いだされた。モデル形状推定に関わる画像解析問題を新しい考えで解決し、同アルゴリズムの概要を報告できた。シロイヌナズナphototropin2全長については、さらに高分解能構造解析をめざし、電子顕微鏡観察と結晶化を試みており、クラミドモナスphototropinについては、全長の結晶化を試み、解析が困難な多結晶であったものの結晶を得てSPring-8にて回折強度測定を行を実施することができた。このように、本申請の研究課題はおおむね順調に進んでいると考えられる。