hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電場と音場を用いた水溶液中の生物由来物質の運動促進による氷成長の制御

その結果、不凍タンパク質と同様に氷結晶が微細化すること、繊維幅の小さいセルロースシングルナノファイバーおよびカルボキシメチルセルロースの場合に氷界面の温度低下が著しいことが明らかになった。2.氷成長抑制効果が得られたポリペプチドの希薄水溶液を用いて、1と同じ一方向凍結実験を行った。このとき液体中の18mm離れた微小電極間に直流電場を印加した。その結果、電極近傍において氷成長抑制効果が向上することがわかった。また,観察領域ごとに界面の形状と移動速度が場所により異なること、方形波状の電圧印加によりさらに氷成長を抑制できることがわかった。3.微細流路中の氷粒子・水混合体に冬カレイ由来不凍タンパク質を添加した場合について氷粒子の成長に関する測定を行い、以下の結果を得た。不凍タンパク質による氷粒子成長抑制効果は、水が流れている場合には静止水の場合と比較して低い。不凍タンパク質水溶液を短時間予熱すると、氷粒子成長抑制効果は低下した。この予熱した水溶液に、限外ろ過処理を施すことにより、氷成長抑制効果が向上する場合があった。1.不凍ポリペプチド水溶液の一方向凍結実験に関して、まず印加する直流の電圧、方形波の周期などの影響を調べた。電極における電気分解の影響も考慮して、交流の印加も行った。つぎに氷・水界面位置の形状と時間変化結果より、氷成長抑制効果が場所と時間によって異なることから、電極の位置と形状を変えて測定を行った。そのため、当初予定していた予熱後限外ろ過した不凍ポリペプチド水溶液の一方向凍結実験は2019年度に検討する。2.予定していたセルロースシングルナノファイバー、セルロースナノクリスタルあるいはカルボキシメチルセルロースを含む水の一方向凍結実験に関して、氷成長抑制効果が確認できたので、その効果を強める方法について検討した。他者の先行研究は、電場をかけることによりこれら細長い物質の方向が揃うことを示しているので、当面電場を用いることとした。3.動的光散乱法による不凍ポリペプチド凝集体とセルロースナノファイバー凝集体のサイズの分布の測定は、2019年度に検討する。4.計画では2019年度に実施予定の微細流路内の氷粒子・水混合体の氷粒子成長抑制に関しては、参照データとなる不凍タンパク質を添加した場合の測定を行った。その結果から、不凍ポリペプチド凝集体とセルロースナノファイバー凝集体の結果の予測が可能となり、今後の研究計画を効率的に行えることが予想される。5.計画では2019年度に実施予定のフェーズフィールド法を用いた凍結現象を予測する数値シミュレーションに関連して、凍結による体積増加を予測することに成功した。以上のことより、1,3は予定より遅れているものの、2は予定どおりであり、4、5は予定より進んでいることから、総合的に「おおむね順調に進展している」と判断した。当初計画および昨年度の進捗状況に鑑み、2019年度は当初計画を一部修正することとした。2019年度の推進方策について、その概要を以下に示す。
Circulating tumor DNA検査の臨床導入における課題点の克服

腫瘍細胞より血中に遊離したDNA (Circulating tumor DNA: ctDNA)は症例特異的バイオマーカーとして期待されているが、癌の種類や再発形式によるctDNAの陽性率の違いや、最適な解析のタイミング、陽性の判定基準など臨床検査としての妥当性・有用性は確定されていない。ctDNA高陽性率の食道癌、低陽性率の胃癌を対象とし、ctDNAモニタリングの臨床導入における課題点を明らかにする。Stage I症例、治療前ctDNA陰性進行癌、再発・再増大時のctDNA陰性維持例、腹膜播種症例など、ctDNA陰性例に焦点をあて、癌の状態により異なるctDNA放出のメカニズムを解明したい。
外科侵襲後の免疫不全の病態解明と腫瘍免疫に及ぼす影響に関する研究

消化器系悪性腫瘍において、術後感染性合併症を起こすと短期予後のみならず長期予後を増悪させるという報告が近年蓄積されてきた。しかし、この機序についての詳細な研究報告はほとんど皆無に等しい。そこでその機序を明らかにするために、マウスを用いて大腸癌株による肝転移モデルと腹膜炎の感染モデルを作成した。その結果、感染マウスでは肝転移巣が非感染マウスに比べ著明に増加していることが明らかになった。そこで肝臓の免疫機能を感染マウスと非感染マウスで比較したところ、感染マウスでは腫瘍免疫に重要なインターロイキン12やNK1細胞のIFN-γ産生能、抗腫瘍活性が有意に低下していることが明らかになった。今回は重症感染症の病態形成、特に免疫不全の病態を明らかにするため、CD4+T細胞、特に制御性T細胞:Treg (CD4+CD25+Foxp3+))などの獲得免疫能に注目し、それら免疫担当細胞の役割と敗血症性ショックの治療として行われているエンドトキシン吸着療法(PMX)による免疫不全への影響について検討した。「方法と結果」検討1:腹部外科感染症32症例を対象に、末梢血中白血球分画、CD4+T細胞、Treg細胞、CD8+T細胞、血中IL-6, IL-10, TGF-β濃度について測定した。その結果、septic shock症例では非shock症例に比べ、CD4+T細胞数が有意に少なくTreg細胞の割合(Treg/CD4+T)やIL-6, IL-10濃度は有意に高値であった。検討2.PMX(2時間)が施行されたseptic shock 13症例を対象にPMX終了直後、24時間後の上記マーカーについて検討した。その結果、PMX終了直後では開始前に比べ、Treg細胞数とIL-6、IL-10の有意な低下を認めた。さらに生存群(8例)と死亡群(5例)に分けPMX終了時、24時間後の変化について比較すると、終了時では両群間で差を認めなかったが、24時間後は生存群でCD4+T細胞数の有意な改善を認めたのに対し、死亡群では改善せずTregの割合とIL-10の有意な増加を認めた。したがって、腹部外科感染症が原因の敗血症の免疫不全の病態には、Treg細胞が重要な役割を果たし、PMX療法により、Treg細胞や血中IL-6, IL-10濃度の低下を認めた。尚、PMX終了24時間後のCD4+T細胞やTregの割合は敗血症性ショック症例の予後を反映し、24時間後のPMX再施行は予後不良例救命の一助になる可能性が示唆された。消化器系悪性腫瘍において、術後感染性合併症の発症が長期予後を増悪させるという臨床報告が最近蓄積されてきている。しかし、この観察事象を裏付ける実験的検討はない。そこでその機序解明のため、動物モデルの確立と感染性合併症発症時の宿主の免疫学的検討が不可欠であると考えられる。我々はマウス大腸癌細胞Colon-26を親株とする高肝転移マウスに、盲腸結紮穿刺法(cecal ligation and puncture model;以下CLP)による腹膜炎敗血症モデルを作成し、肝転移に及ぼす影響について検討した。その結果、敗血症マウスでは腫瘍接種後7日目に肝転移を認め、14日後には多数の肝転移が認められたのに対し、非敗血症マウスでは少数の肝転移のみであった。そこで肝臓でのinterleukin-12濃度や抗腫瘍活性を比較したところ、敗血症群では非敗血症群に比べ有意に低値で、さらに敗血症群では肝単核球数の有意な減少、特にnatural killer(NK)細胞の分画が著明に低下していることが明らかになった。そこでNK細胞のパーフォリン・グランザイム活性を検討したところ、やはり敗血症群で肝NK細胞におけるパーフォリン陽性細胞数が有意に低値であった。以上の結果から、敗血症時の肝内におけるIL-12p70産生能低下は、NK細胞やNKT細胞などを介したインターフェロンγの産生低下につながり、それがNK細胞の不活化につながっている可能性が考えられる。今回検討では、高肝転移+CLPモデルマウスを用いて、感染性侵襲が腫瘍の肝転移促進にどのように関与しているのかを、宿主側の肝におけるNK細胞数・機能低下という観点から明らかにすることができた。したがって、今後はNK細胞の賦活化が感染性侵襲をともなう担癌患者に対する抗腫瘍治療戦略の一手段となる可能性が示唆された。

高度手術侵襲症例や外科的感染症例を対象に、末梢血単核球(PBMC)でのIFN-γ産生能、NK細胞でのIL-18受容体発現、PBMCをIL-18で刺激した際のIFN-γ産生能、血中IL-18濃度について測定した。その結果、術後第5病日において、また外科的感染症症例においてもPBMCでのIFN-γ産生能が健常人に比べ有意に低下していた。そこで両群のPBMCをIL-18で刺激した際のIFN-γ産生能を比較したところ、術後症例では著明に増加するのに対し外科的感染症例では全く増加しなかった。尚、血中IL-18濃度は外科的感染症例で術後症例、健常人に比べ有意に高値であった。そこで両群のNK細胞でのIL-18レセプター発現を比較したところ、術後症例では健常人と差を認めなかったが外科的感染症例では有意に低下していた。したがって、外科的感染症例での免疫機能低下に関与しているPBMCのIFN-γ産生能低下は、NK細胞でのIL-18レセプター発現低下が関与していることが明らかになった。そこで臨床検討結果の機序を明らかにするため、マウスにsepsisモデルを作成し肝臓、脾臓から単核球を分離培養しサイトカイン産生能(IFN-γ、TNF-α)、CD56+, CD57+細胞でのIL-18レセプター発現、血中IL-10, TGF-β濃度を測定し検討している。外科的侵襲時、特に重症感染症時の免疫不全の病態と制御性T細胞との関連について、動物実験はもとより、臨床検体を用いた解析が順調に進みSurgeryにacceptされた。臨床検体を用いた検討は終了した。現在、動物モデルを用いて臨床結果の機序と対策について検討中である。外科侵襲後の免疫不全の病態が腫瘍免疫に及ぼす影響について、現在マウスを用いた肝転移モデルを用いて検討中である。外科侵襲後の腫瘍側の免疫機能の変化だけではなく肝臓の免疫機能についても解析中である。マウスにsepsisモデルを作成し肝臓、脾臓から単核球を分離培養しサイトカイン産生能(IFN-γ、TNF-α)、CD56+, CD57+細胞でのIL-18レセプター発現、血中IL-10, TGF-β濃度を測定し、IL-18レセプター発現とサイトカイン産生能低下の関連について明らかにし、その対策としての抗IL-10や抗TGF-β抗体の意義について検討する。外科侵襲後のマウス肝転移モデルにおける腫瘍免疫、肝免疫の解析に研究費を使用する。Sepsisの病態における免疫機能低下の機序について、CD4+T細胞、制御性T細胞に注目し検討する。またその対策としての血液浄化療法の意義について明らかにする。
ゲノムDNA型別における同一株の解釈に関する研究

平成10年度に引き続きMRSA菌株の変異とゲノム型別結果について,検討を行った。平成10年度の実験からは,尿および血清成分により培養を行った場合にゲノムの変化がみられることが確認された。また,平成10年度の実験からマウス尾静脈へのMRSA菌株の接種によりマウスの腎臓への定着の確認が行われたので,今年度は,MRSA菌株(臨床分離株)の株数を増やして実験を行った。具体的には,SPF ICRマウス尾静脈に,10^6CFU/マウスになるようにMRSA菌株の接種を行った。薬剤はCAZ(セフメタジジム)を用い,投与群と非投与群に分けて実験を行った。投与群については,CAZ(セフメタジジム)を1mg/mouse/dayを1日1回,実験開始とともに行い,7日間経口的に投与を行った。7日後腎臓を分離し,ホモジナイズを行い菌の回収を行った。回収した菌について,溶血性の違いを調べて変異が疑われた株について,ゲノム型別を行った。その結果,以下のことが示された。1,接種菌株によって腎臓への定着に差がみられた。(膿瘍の有無の違いおよび回収菌量の違い)2,薬剤投与群と非投与群の差によるゲノムDNAの変異の差は認められなかった。3,接種菌株によって回収された株に多いもので7バンド以上違うものもみられた(最多で16バンドの差がみられた)。4,回収された株のゲノムパターンに変化のないものもあった。以上のことからゲノムDNA型別における同一株と解釈されるバンドの差の数の範囲は接種(感染)した菌株によって異なることが示唆された。MRSA菌株の変異とゲノム型について、カジトン培地、カジトン培地にCAZ(セフタジジム)を添加した培地、カジトン培地に健常ヒトプール血清を添加した培地、カジトン培地に健常ヒトプール血清およびCAZを添加した培地、健常ヒト尿、および健常ヒト尿にCAZを添加した培地で、試験管内培養を行い、株の変化を溶血性の変化(不溶血株→溶血株)およびゲノム型別を行った。その結果、尿が含まれている培地では50%の株が溶血性株に転じており、その他の構成培地では、溶血性に転じた株は00.08%の割合であった。尿+CAZの培地構成で培養された株より得られた溶血性株に転じた9株のうち1株に2バンドのバンドパターン変化がみられた。また、カジトン培地、カジトン+血清の培地構成による培養で得られた溶血性株にも3バンドのバンドパターン変化がみられた。いずれも1個の遺伝的な変化により引き起こされると考えらた。また、不溶血性株にはバンドパターンの変化は見られなかった。おそらく変異はランダムに起こり、変異を起こした株の中に偶然溶血性を変化させる遺伝子部分が含まれていたもので制限酵素(SmaI)認識部位に変異が起こった株にバンドパターンの相違が見られたと想像された。一方、ICR系SPFマウスにMRSA株を感染させると腎内に定着することが確認できた。感染後腎内より回収を行ったところ溶血性に転じた株が見られなかった。現在、回収した菌株のゲノム分析を行っているが、今後薬剤の投与量や菌量を変えることも検討課題である。
アフリカマイマイ神経節からの神経作用性ペプタイドの分離・同定に関する研究

1990年,1991年の両年度を通じて,私どもはこの国際学術研究(共同研究)により,先ずアフリカマイマイ(Achatina fulica Ferussac)の神経節より,Dーphenylalanineを含むtetrapeptide(GlyーDーPheーLーAlaーLーAsp)を分離・同定し,achatinーIと名付けた.さらにこのペプタイドの薬理学的性質について,かなり詳細に検討した.しかしながらachatinーI以外の神経作用性ペプタイドの分離・同定については,現在進行中であるが,まだその構造を確定していない.以下に上記両年度において得られた研究結果の主なものを,年度別に列挙する.(1990年度)1.AchatinーIのアミノ酸組成が,Gly,Phe,Lys,Aspであり,その配列がGlyーPheーLysーAspであることは,比較的容易に解析されたが,GlyーLーPheーLーLysーLーAspには,期待された興奮作用が見られず,GlyーLーPheーLーLysーAsp.amide,GlyーLーPheーLーLysーLーAsn,GlyーLーPheーLーLysーLーAsn.amideにも,この作用はなかった.しかしこの物質の機器分析(核磁気共鳴,質量分析,円二色性スペクトルなど)より,これのphenylalanine残基がD型ではないかと考えられ,GlyーDーPheーLーLysーLーAspを合成して,天然のものと比較したところ,総ての機器分析およびbioassayの結果が一致し,achatinーIの構造は,上記のものと結論された.2.AchatinーIの用量・作用曲線が求められた.Achatina神経細胞PON(periodically oscillating neurone)によって得られた結果を記せば,ED_<50>:2.0x10^<ー6> M(95%confidence limit:1.4ー2.6x10^<ー6> M),Hill coefficient:0.62,E_<max>:5.46±0.22nA(n=8)であった.このED_<50>値より,この物質はこれを神経伝達物質と考えるのに,充分な強い作用を有する.一方このペプタイドの興奮作用は,神経膜のNa+に対する透過性の上昇によるものであった.3.AchatinーIの立体異性体8種のなかで,強い作用を呈するものはachatinーIのみであり,これのレセプタ-はachatinーI識別のために,かなり明瞭な立体特異性を持つと結論された.4.竹内,山本,出浦,森,間野,関は,サントトマス大学(マニラ市)を訪れ,共同研究について討論するとともに,おのおの数回にわたって講演を行い,相互の友好を深めた.Kanapi,Dayao,Torralbaは,岐阜大学(岐阜市),(財)サントリ-生有研(大阪府),神奈川大学(平塚市)を訪問し,共同研究について討論したTorralbaは岐阜大学(岐阜市)で講演した.(1991年度)5.AchatinーIおのおののアミノ酸残基を他のもので置換した,achatinーI誘導体を20種あまりを合成しAchatina巨大神経細胞に対するその作用を検定したが,いずれの誘導体もほとんど作用を示さなかった.すなわちachatinーIの作用は,高い構造特異性を持つ.このペプタイドが作用を示すために,Nー端のアミノ基,Cー端の2つのカルボキシル基は必須であり,またachatinーI分子内におけるこれらの間の距離が重要であった.7.アフリカマイマイ神経節より,achatinーIの他に1つの神経作用性(神経抑制性)ペプタイドを分離されたが,これは多分APGWーamideであると思われた.しかしこれについては,さらに検討が必要である.フィリピン,ダバオ市で採取された淡水産カタツムリ(Pila luzonica)の神経節は極めて小さく,これは神経作用性ペプタイドを分離するために,適当な材料ではなかった.8.竹内はサントトマス大学とダバオ医科大学(ダバオ市)を,出浦と森はサントトマス大学を訪問した.共同研究について討論するとともに,先方の大学で3名とも数回にわたり講演した.Riveraは岐阜大学,藤田学園保健衛生大学(豊明市),(財)サントリ-生有研を訪れた.共同研究について討論するとともに,岐阜大学医学部で講演した。1990年,1991年の両年度を通じて,私どもはこの国際学術研究(共同研究)により,先ずアフリカマイマイ(Achatina fulica Ferussac)の神経節より,Dーphenylalanineを含むtetrapeptide(GlyーDーPheーLーAlaーLーAsp)を分離・同定し,achatinーIと名付けた.さらにこのペプタイドの薬理学的性質について,かなり詳細に検討した.しかしながらachatinーI以外の神経作用性ペプタイドの分離・同定については,現在進行中であるが,まだその構造を確定していない.以下に上記両年度において得られた研究結果の主なものを,年度別に列挙する.(1990年度)1.AchatinーIのアミノ酸組成が,Gly,Phe,Lys,Aspであり,その配列がGlyーPheーLysーAspであることは,比較的容易に解析されたが,GlyーLーPheーLーLysーLーAspには,期待された興奮作用が見られず,GlyーLーPheーLー

LysーAsp.amide,GlyーLーPheーLーLysーLーAsn,GlyーLーPheーLーLysーLーAsn.amideにも,この作用はなかった.しかしこの物質の機器分析(核磁気共鳴,質量分析,円二色性スペクトルなど)より,これのphenylalanine残基がD型ではないかと考えられ,GlyーDーPheーLーLysーLーAspを合成して,天然のものと比較したところ,総ての機器分析およびbioassayの結果が一致し,achatinーIの構造は,上記のものと結論された.2.AchatinーIの用量・作用曲線が求められた.Achatina神経細胞PON(periodically oscillating neurone)によって得られた結果を記せば,ED_<50>:2.0x10^<ー6> M(95%confidence limit:1.4ー2.6x10^<ー6> M),Hill coefficient:0.62,E_<max>:5.46±0.22nA(n=8)であった.このED_<50>値より,この物質はこれを神経伝達物質と考えるのに,充分な強い作用を有する.一方このペプタイドの興奮作用は,神経膜のNa+に対する透過性の上昇によるものであった.3.AchatinーIの立体異性体8種のなかで,強い作用を呈するものはachatinーIのみであり,これのレセプタ-はachatinーI識別のために,かなり明瞭な立体特異性を持つと結論された.4.竹内,山本,出浦,森,間野,関は,サントトマス大学(マニラ市)を訪れ,共同研究について討論するとともに,おのおの数回にわたって講演を行い,相互の友好を深めた.Kanapi,Dayao,Torralbaは,岐阜大学(岐阜市),(財)サントリ-生有研(大阪府),神奈川大学(平塚市)を訪問し,共同研究について討論したTorralbaは岐阜大学(岐阜市)で講演した.(1991年度)5.AchatinーIおのおののアミノ酸残基を他のもので置換した,achatinーI誘導体を20種あまりを合成しAchatina巨大神経細胞に対するその作用を検定したが,いずれの誘導体もほとんど作用を示さなかった.すなわちachatinーIの作用は,高い構造特異性を持つ.このペプタイドが作用を示すために,Nー端のアミノ基,Cー端の2つのカルボキシル基は必須であり,またachatinーI分子内におけるこれらの間の距離が重要であった.7.アフリカマイマイ神経節より,achatinーIの他に1つの神経作用性(神経抑制性)ペプタイドを分離されたが,これは多分APGWーamideであると思われた.しかしこれについては,さらに検討が必要である.フィリピン,ダバオ市で採取された淡水産カタツムリ(Pila luzonica)の神経節は極めて小さく,これは神経作用性ペプタイドを分離するために,適当な材料ではなかった.8.竹内はサントトマス大学とダバオ医科大学(ダバオ市)を,出浦と森はサントトマス大学を訪問した.共同研究について討論するとともに,先方の大学で3名とも数回にわたり講演した.Riveraは岐阜大学,藤田学園保健衛生大学(豊明市),(財)サントリ-生有研を訪れた.共同研究について討論するとともに,岐阜大学医学部で講演した。
t-PA受容体の分子クローニング、細胞内伝達系および生物学的意義の解析

ヒト膀帯静脈血管より内皮細胞(HUVECs)を単離・培養し、HUVECs上に発現されるt-PAに特異的な受容体(t-PAR)の機能について解析した。さらにHUVECsの細胞溶解液より精製したt-PARの蛋白を解析し、その遺伝子についてもスクリーニングした。HUVECs上のt-PARにはt-PAは比較的高親和性結合するが、それ以外にt-PAはECM中のPAl-1と高親和性結合することが示された。細胞上のt-PARへの結合にはt-PA変異体を用いた検討から、t-PAのクリングル2領域のリジン結合部位が重要であることが示唆された。細胞上のt-PARに結合したt-PAはプラスミノゲンを効率的に活性化したが、これは精製したt-PARを固相化し、これに結合させたt-PAによるプラスミノゲン活性化能が90倍にも増加することからも裏付けられた。このようなt-PA活性調節による血管内皮細胞の線溶系制御は抗血栓性に大きく反映されると思われる。このt-PARは細胞上ではt-PA活性調節のほかに細胞内シグナル伝達も惹起した。すなわち、t-PAの活性部位依存的にHUVECぎはチロシンリン酸化反応が誘導され、プロテインキナーゼC経路を活性化した。しかしこのシグナルの下流においてはMAPK活性が減少しており、細胞の最終的な生物学的応答の解析は今後の課題である。t-PAR分子はその遺伝子から細胞内にも存在する分子の可能性があり、現在クローニングを進行中であるヒト膀帯静脈血管より内皮細胞(HUVECs)を単離・培養し、HUVECs上に発現されるt-PAに特異的な受容体(t-PAR)の機能について解析した。t-PAR分子はその遺伝子から細胞内にも存在する分子の可能性があり、現在クローニングを進行中であるヒト臍帯静脈より、酵素処理(0.25%トリプシン、0.05%EDTAを含む)によって血管内皮細胞(HUVECs)を単離し、培養を実施した。この方法では1本の臍帯(30-40cm前後)より最大200万個の細胞を得ることができた。この初代培養を繰り返し約1x10^9細胞数を集め、細胞を溶解し、ゲルろ過法によってすでに決定されているt-PARの分子量である約2万前後の蛋白画分を集めた。これをさらに逆相カラムによって精製し、t-PAと結合する単一分画を採取し、その一部を電気泳動によって単一バンドであることを確認した。t-PARの回収量は蛋白量で約2μgであった。この精製t-PARをアミノ酸配列分析によってN末端から20残基程度を同定し、この配列に相当するペプチドを合成した。さらにヒトヘモシアニンをコンジュゲートし、ウサギに免疫して抗血清を得た。IgG分画まで精製して以降のスクリーニングに抗t-PAR抗体として用いた。HUVECsのcDNAライブラリー(λgt11)を大腸菌(Y1090)で増幅させ、IPTGによってファージから蛋白を誘導させ、抗t-PAR抗体と反応するプラークをウサギ2次抗体/アビジン/ビオチン法で検出、選抜した。このプラークに含まれるファージをさらに増幅させ、再度同様のスクリーニングを実施し、最終的に単一のt-PAR陽性ファージを得た。またこの方法と平行して、放射性同位元素で標識した抗t-PAR抗体によっても同様にスクリーニングを行ない、t-PAR陽性ファージを得た。これらのファージを大腸菌で増幅後、ファージDNAとして塩基配列を解析した。さらにファージDNAをPCR法でさらに増幅後、大腸菌のプラズミドに組み込んで増幅させ、プラズミドDNAとしても塩基配列を解析した。これまでのところ数種類のcDNAが回収されており、最も信頼性の高いcDNAの塩基配列からはリボゾーム蛋白の1種であることが明らかになりつつある。現在その確認のための追試を実施中である。ヒト臍帯静脈血管より内皮細胞(HUVECs)を単離・培養し、HUVECs上に発現されるt-PAに特異的な受容体(t-PAR)の機能について解析した。

HUVECs上のt-PARにはt-PAは比較的高親和性結合するが、それ以外にt-PAはECM中のPAl-1と高親和性結合することが示された。細胞上のt-PARへの結合にはt-PA変異体を用いた検討から、t-PAのクリングル2領域のリジン結合部位が重要であることが示唆された。細胞上のt-PARに結合したt-PAはプラスミノゲンを効率的に活性化したが、これは精製したt-PARを固相化し、これに結合させたt-PAによるプラスミノゲン活性化能が90倍にも増加することからも裏付けられた。このようなt-PA活性調節による血管内皮細胞の線溶系制御は抗血栓性に大きく反映されると思われる。このt-PARは細胞上ではt-PA活性調節のほかに細胞内シグナル伝達も惹起した。すなわち、t-PAの活性部位依存的にHUVECsはチロシンリン酸化反応が誘導され、プロテインキナーゼC経路を活性化した。しかしこのシグナルの下流においてはMAPK活性が減少しており、細胞の最終的な生物学的応答の解析は今後の課題である。t-PAR分子はその遺伝子から細胞内にも存在する分子の可能性があり、現在クローニングを進行中である。
長期生存期にある再発がん患者の包括的看護ケアプログラムの開発

本研究は、新しい治療を繰り返し受けることによって経過がより慢性的にたどり長期生存期にある再発がん患者の心理社会面を明らかにし、患者に包括的看護ケアを提供するためのケアプログラムを開発することを目的とする。本研究は、ナラティヴ(Narrative)の概念を用いた質的帰納的研究デザインの研究であり、ナラティヴ・アプローチを用いたフィールドワークを行い、患者の生活世界に即した声から体験の意味づけを明らかにする。それらを基礎資料とし、ケアプログラム開発に取り組み、患者への適切な生活支援をめざす。そのために初年度である平成17年度は、以下の2点に取り組んだ。(1)看護学におけるナラティヴの概念の整理近年、ナラティヴ(物語・語り)の概念を用いた対人援助への接近方法が注目されている。看護学領域においてもその有用性が報告されている(吉村,2005,松原,2005)。一方でナラティヴ論の看護学領域への導入は、社会学、医療人類学、臨床心理学、医学、教育学など多領域から影響をうけ混乱が生じている。そこで、ナラティヴ論に精通している研究協力者とともにまず看護学におけるナラティヴの概念の整理に取り組んだ。具体的には、2000年から2005年の間で我が国において刊行され看護学領域で参考にできると考えた4領域の文献から、ナラティヴ概念に関する記述を抽出し、共通点相違点を明らかにし、看護学におけるナラティヴ概念の今後の展望について考察した(研究発表1)。引き続き、我が国の看護学領域においてナラティヴ論がどのように導入され、活用されているのか実態を把握するために文献研究を行った(研究発表2)。本研究のフィールド調査に取り組むにあたり、ナラティヴの概念を整理にできたことは、今後の研究の進行にも大きな成果であった。また、これらの成果は、看護学分野でナラティヴ論に取り組む人たちにとっても有用な結果であると考える。(2)研究フィールドに入る準備本研究のフィールド調査の計画について、研究協力者であるがん専門看護師から定期的に実践的知識の提供を受けた。調査方法や対象に関する示唆だけでなく、がん看護実践が抱える現実的な多くの課題についての議論も活発であった。このことは、本研究の目的をより明確にすることに非常に役立った。がん看護学領域における研究では、より実用的な見地から看護研究者と実践者との共同研究が推奨されている(真壁,2003)。このような意味でも臨床に密着した問題改善に非常に意義深いと考える。
大型モザイクCCDカメラの試作と画像再構成の研究

2000×8144画素をもったモザイクCCDカメラを完成した。このカメラは1000×1018画素をもった日本TIのCCDチップを2×8の格子に並べたものである。このカメラは現時点で世界最大級のものとなった。現在、木曽観測所のシュミット望遠鏡につけて、サ-ベイ観測に使用されている。大型カメラを製作する上での問題点は前年度にほぼ調べられており、本年度は実際にカメラを設計、整作し、天体の像をとれるようにする事に努力が注れた。これらの過程で、(1)シュミット望遠鏡の焦点面の曲率に合わせてCCDを実装する技術を修得した,(2)多くのCCDを一つづつ遂次的に読出す回路、方法を確立した、(3)大型の冷却部(21×20cm)を冷却し保持する技術を修得し、そして(4)大型の真空マド(10×20cm)を使うことができた。この過程で当初の設計が必ずしも最良ではないという事がわかった点は、(1)現在のカメラでは、CCDを8個単位に一列にしているが、機械的にはこの必要はなく、一つ一つを主プレ-ト上に実装した方が良い、(2)冷却用の液体チッ素タンクは容量が不足で満タンで5時間程度しかもたず、冷凍機を使用した方が良いということがわかった。完成したカメラの主要な性能は次の通りである。X素子はフォ-カス方向には平均で10μm,最悪で40μmの精度で実装されており、XY方向には平均で3μm,最悪で10μmの精度で実装されている。これらは観測に支障のない精度である。望遠鏡に取りつけた状態での、読出しノイズは1218エレクトロン相当であった。暗電流は20分露出で2e以下、バイアスの変動は一晩で±5e以下であった。天体観測用として十分な性能を持っていることが、確認された。第一段階としてモザイクCCDを設計するための基礎的な実験を行った。これには(1)低温での電子部品の動作テスト,(2)温度サイクルに耐え得る接着剤(導電性及び紫外硬化)の選定・テスト,(3)モザイク取付け基盤用に使うセラミック材量の温度サイクルテスト等が含まれる。これらのテストをふまえて,CCDデュワ-に使用できる接着剤・材量が決定し,実際に使用するデュワ-の設計を行った。CCDチップを取り付けるためには精密なXYステ-ジと顕微鏡が必要だが,これは写真乾板の側定に使用されていものを改造し,使用した。さらにXY位置の読出し精度を改善するために最新のレ-ザ-スケ-ルを取り付けた。CCDチップを微小に移動させるためのマニュピレ-タを小型のXYステ-ジ・回転スケ-ジで自作し,テストのためICを取り付けてみた。これによって得られた位置精度は最悪で±5μmであった。さらに赤外線観測に使用されていた大型デュワ-を使用し,モザイク基盤を冷却した時の温度の一様性をテストした。基盤上の温度差は通常1度以内,10Wの熱を片側から投入した場合でも5度で,非常に一様である事がわかった。8ケのCCDを並列に読み出す回路を設計し,基板化してテストし,うまり動く事がわかった。アナログ部分のノイズも十分無視できる事がわかった。他に,CCDデュワ-のマド材として化学強化したガラスが十分な強度を持っている事がわかった。大型のモザイクCCDを作るノウハウはいままで未知であったが、この年度の基礎実験でほとんどすべての問題点が解決し,ノウハウを修得することが出来た。これをふまえて現在,実際に観測に使用できる8000×2000画素のモザイクCCDカメラの製作が行われている。主要な部品はそろい,各部の組立を行っている。平成3年夏期より実際の観測を行い,天文学的成果が出てくると思われる。X素子はフォ-

カス方向には平均で10μm,最悪で40μmの精度で実装されており、XY方向には平均で3μm,最悪で10μmの精度で実装されている。これらは観測に支障のない精度である。望遠鏡に取りつけた状態での、読出しノイズは1218エレクトロン相当であった。暗電流は20分露出で2e以下、バイアスの変動は一晩で±5e以下であった。天体観測用として十分な性能を持っていることが、確認された。
安全で高品質な食品の創製を目指した微生物制御

植物抽出液と複数の微生物制御因子を併用したハードルテクノロジーを用いて安全で高品質な食品の創製を試みた。レモンユーカリ,カレープランツ,甘草の各エタノール抽出液が高い抗菌性を示し,0.05-0.025%濃度でグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌,リステリア,バシラス属の増殖を完全阻止した。これらはウェルシュ菌や好熱性好酸性菌の栄養細胞,芽胞ともに効果があった。一方,大腸菌等のグラム陰性菌にはクローブ,ローズマリー抽出液の殺菌作用を除き全般的に効果は低かった。植物抽出液の抗菌性は低酸性(pH 5.5-6.0)やグリシン,酢酸ナトリウムの微量添加で高まることを食品モデル培地への接種保存試験で証明した。本研究は、微生物学的に安全でかつ高品質な食品の創製を目指し、抗菌性を有する植物抽出液とその他の増殖制御因子を組み合わせたハードルテクノロジーによる微生物制御法の確立を目的としている。自然界には病原微生物が常在しており、食中毒や食品媒介感染症の予防において、食品の洗浄殺菌や流通、保存中の病原菌増殖コントロールは非常に重要である。ところが単独因子での制御では、耐性を有する菌の増殖を許すリスクがあり、また近年の消費者の高い嗜好性を満たす高品質な食品の製造は困難である。本研究室では抗菌性を有する植物抽出液のスクリーニングを行い、食中毒菌に対する静菌作用や殺菌作用について検討してきた。今年度は、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス、バチルス属細菌、ボツリヌス菌、グラム陰性菌の大腸菌(腸管出血性大腸菌など)、サルモネラを試験対象微生物とし、植物抽出液としてカレープランツなどのハーブ類、クローブなどのスパイス類、甘草などの漢方食材の各エタノール抽出液について、他の制御因子存在下(低pH,グリシン等の静菌剤)で培地における静菌作用について評価した。グラム陰性菌は細胞表層に外膜を有しており、植物抗菌成分の細胞内への透過障害となることからキレート作用を有するカプリル酸やEDTAの効果についても調べた。その結果、高い抗菌性を有する抽出液、菌種ごとの感受性、ハードル因子との組み合わせで増殖抑制効果が上昇することを明らかにすることができた。本研究は植物抽出液を始めとする微生物増殖制御因子を複数組み合わせて、より効果的な食品中での微生物制御を目指している。今年度は主としてNutrient agarなど寒天平板培地を用いて評価した。今年度の研究で菌種あるいは菌株それぞれの植物抽出液抽出液や各制御因子に対するMIC (最小発育阻止濃度)を明らかにし、例えば、カレープランツやレモンユーカリは極微量の0.025%濃度でブドウ球菌やバチルス属細菌の増殖を完全に阻止することがわかった。また、pH 6の条件やグリシンの添加でさらに抗菌性が高まる場合が多いことがわかった。一方、大腸菌に対するローズマリー抽出液が殺菌的に働くグリシンやEDTAの濃度を明らかにした。これら今年度の成果は、さらなる環境要因との組み合わせやストレスを与えた菌の挙動、さらに食品中でのこれらの効果の検証に有用なデータを提供することになり、当研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究は、安全かつ高品質な食品の創製を目指し、抗菌性植物抽出液と他の増殖制御因子を組み合わせたハードルテクノロジーを用いた微生物制御法を開発することにより食の安全基盤の確立を目的としている。環境中には病原微生物が広く分布して食材が汚染を受ける機会が多いため、食中毒や食品媒介感染症の予防において、原材料の除菌、食品の殺菌や病原菌増殖コントロールは非常に重要である。ところが単独因子のみによる制御では、耐性を有する菌の増殖を許すリスクがある。また近年の消費者の高い嗜好性を満たす高品質な食品の需要が高まっており、安全な食品との両立が困難になっている。本研究では抗菌性を有する植物抽出液のスクリーニングを行い、食中毒菌や腐敗菌に対する静菌作用や殺菌作用について検討している。平成28年度は、食品の一般的な加熱条件で残存して問題となる芽胞形成菌のBacillus属とClostridium属を主たる試験対象とし、植物抽出液として27年度の研究で明らかにしたカレープランツ、レモンユーカリなどのハーブ類、メース、クローブなどのスパイス類、甘草などの漢方食材のエタノール抽出液について、ハードル存在下(低pH,グリシン,酢酸ナトリウム等の静菌剤)で寒天培地および液体培地における静菌作用の評価を行った。その結果、pH 5.5-6.0、0.25-0.4%酢酸Na、0.5%グリシン条件下で、0.0125-0.025%の植物抽出液がBacillus属の増殖を完全に阻止することを明らかにした。また、食品中で同様の保存試験を行った結果、クリームソースのように効果が低下する例があり食品成分が影響していると推察された。一方、ボツリヌス菌等のClostridium属に対する植物抽出液の抗菌性はBacillus同様に高くpH 5.8では効果が高まったものの、グリシン等との相加・相乗効果はほとんどみられなかった。本研究は植物抽出液を主として複数の微生物増殖制御因子を組み合わせて、より効果的な食品中での微生物制御を目指している。28年度は、食品の微生物制御でしばしば問題になる芽胞形成菌をターゲットにして培地や食品モデルを用いて評価した。その結果、レモンユーカリ、カレープランツ、甘草等のエタノール抽出液が微量(0.025-0.0125%)で効果を示すpH条件やグリシン、酢酸ナトリウムの添加濃度を明らかにできた。

また、それらの条件で液体培地での接種保存試験を行い、12週目までBacillus属細菌を完全発育阻止できることを証明した。同じく芽胞形成菌であるボツリヌス菌に対してもBacillus属に効果のあった抽出液が同様に効果的であることもわかった。食品中での評価では増殖遅延効果を示すものがある一方、効果が低下する例がみられ課題が残った。また、大腸菌等のグラム陰性菌に対する試験を継続して行ったが、かなり高濃度の抽出液とキレート物質が必要で実用的に使える条件をみつけることはできなかった。植物抽出液を加えた培地や食品中で各ハードル条件下での芽胞菌の挙動に関する数々の知見は、食品の微生物制御に関わる有用なデータを提供しており、当研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究は、安全かつ高品質な食品の創製を目指し、抗菌性植物抽出液と他の増殖制御因子を組み合わせたハードルテクノロジーを用いた微生物制御法を開発することにより食の安全基盤の確立を目的としている。環境中には病原微生物が広く分布して食材が汚染を受ける機会が多いため、食中毒や食品媒介感染症の予防において、原材料の除菌、食品の殺菌や病原菌増殖コントロールは非常に重要である。ところが単独因子のみによる制御では、耐性を有する菌の増殖を許すリスクがある。また近年の消費者の高い嗜好性を満たす高品質な食品の需要が高まっており、安全な食品との両立が困難になっている。本研究では抗菌性を有する植物抽出液のスクリーニングを行い、食中毒菌や腐敗菌に対する静菌作用や殺菌作用について検討している。平成29年度は、前年度の研究で明らかにした抗菌性を有する植物抽出液、静菌剤、低pHを併用し,新たに加熱食品・飲料の腐敗を引き起こして問題となる好熱性芽胞形成菌のGeobacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, Alicyclobacillus acidoterrestrisおよび嫌気性の食中毒細菌であるウェルシュ菌(Clostridium perfringens)の増殖制御について平板希釈法により検討した。その結果、レモンユーカリ、カレープランツ、甘草のエタノール抽出物のMICが0.025-0.1%で高い抗菌性を示し、メース、ナツメグ、クローブなどのスパイスやローズマリーなどのハーブにも抗菌性がみられた。これらの植物抽出液の抗菌性は,単独では抑制効果を示さない程度の低pHあるいはグリシンの添加でさらに高まった。例えばMICが0.1%のローズマリー抽出液は、pH 5.5 /グリシン0.2%の条件下ではGeobacillusの増殖を完全に抑制することを示した。植物抽出液と複数の微生物制御因子を併用したハードルテクノロジーを用いて安全で高品質な食品の創製を試みた。レモンユーカリ,カレープランツ,甘草の各エタノール抽出液が高い抗菌性を示し,0.05-0.025%濃度でグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌,リステリア,バシラス属の増殖を完全阻止した。これらはウェルシュ菌や好熱性好酸性菌の栄養細胞,芽胞ともに効果があった。一方,大腸菌等のグラム陰性菌にはクローブ,ローズマリー抽出液の殺菌作用を除き全般的に効果は低かった。植物抽出液の抗菌性は低酸性(pH 5.5-6.0)やグリシン,酢酸ナトリウムの微量添加で高まることを食品モデル培地への接種保存試験で証明した。
大容量RNA配列の情報解析による中心体非翻訳型RNAの網羅的同定

近年、非コードRNA(lncRNA)が様々な生理現象に関与していることが明らかにされてきた。過去の知見から中心体-分裂期紡錘体の形成に関与するlncRNAの存在は実験的に示唆されていたが、その同定には至っていなかった。本研究では、中心体-分裂期紡錘体系に局在するlncRNAを生化学的手法と次世代シークエンスを融合することで網羅的に同定することを試みた。結果として、分裂期紡錘体形成に関与するlncRNAを一つと中心小体先端部の形成に関与するlncRNAを一つ同定することに成功した。現在は、lncRNAが中心体機能をどのように制御することで紡錘体形成に関与しているか解析を進めている。1.ヒト培養細胞から中心体の生化学的精製法の確立及びRNAの抽出:ヒト培養細胞であるHeLa細胞、HEK293T細胞から中心体画分を生化学的に粗精製した。主には、ショ糖密度勾配液を利用した超遠心により、中心体を含んだ細胞質画分からの精製を行った。また、RNA精製後のサンプルに関しても精製度や濃度の測定を行った。2.次世代シークエンシングによるRNA配列の同定及びヒトゲノムへのマッピンング:遺伝研が所有する次世代シークエンサーHiseq2000を利用し、サンプル中のmRNA及びncRNAを網羅的且つ定量的にシークエンスし、検出した配列をヒトゲノム上にマッピングした。3.統計学上有為差のある(中心体特異的な)ncRNA群の同定とサンプル間比較の情報解析:全ヒトゲノ領域を100bpごとに区切り、リード数でネガティブコントロールと比較して2倍以上、4倍以上の値を示すゲノム領域を選別した。また、サンプル種間(異なる培養細胞、異なる実験条件、異なる実験)で比較した場合、共通して中心体画分に見出されるものに関しても選別し検証を行った。以上の解析から、ヒト培養細胞から粗精製した中心体画分に含まれる特異的ncRNAを約50同定した。そのほとんどがこれまで解析されていない、機能未知のlncRNAである。lncRNAは進化速度が非常に速いことから、他種における一次配列上の保存性に関しては多くの場合が不明であったが、ヒト培養細胞における機能スクリーニングにおいて今後各々の細胞分裂過程における機能を明らかにしたい。初年度に関しては、主に中心体に特異的に局在しうるlncRNA候補群の同定を予定しており、それを達成している点では概ね順調に研究は進展している。細胞内における候補lncRNA各々の機能解析においても、初年度に、今後使用するsiRNAの選定や、局在解析に行うFISH法の条件検討などを行い、以前よりも効率化することに成功している。今年度においては、中心体構成因子の免疫沈降分画もしくは中心体粗精製分画に特異的に濃縮されたlncRNA群のフェノーム解析を行い、細胞分裂期に機能する新規のlncRNA二つを同定することに成功した。両方とも機能未知のlncRNAであるが、片方はRNAiを介した発現抑制により、分裂期紡錘体の形成異常を示す極めて興味深い表現型を示した。中心小体及びそれを取り囲むPCMマトリックスの形成においては、顕著な異常は見られなかったが、紡錘体を形成する微小管の濃度が著しく低下し、その結果染色体分配エラーが観察された。この結果は、中心体の微小管形成活性が部分的に失われている可能性を示唆するものである。特筆すべきは、この表現型は細胞特異性を有することである。これまでの解析から、どのヒトがん化細胞でもある頻度で表現型は観察されるものの、U2OS細胞やPANC1細胞など表現型が顕著な細胞種が存在することが確認された。細胞分裂という極めて基礎的なプロセスにおいて、このように多様な表現型が観察される例はタンパク質ではあまりなく、このlncRNAが組織特異的な機能を有することが予測された。現在はこの表現型の詳細な解析、分子機構に関するデータ取得を進めている。一方、もう一つのlncRNAはその発現抑制により、中心小体の先端部分の構造が一部欠損するという、極めて特異的な表現型を示した。中心小体複製や中心体の機能に直接的な影響は見られないものの、繊毛形成への関与が推測されることから、現在その可能性を実験的に検証している段階である。同定された中心体で機能しうるlncRNAの機能解析を精力的に進める。このステップを迅速に行い、表現型の観察から有望な候補群が得られない場合においては、条件変更も検討し、再度候補lncRNA群の選定を行う。機能スクリーニングや局在解析の条件検討は十分になされているので、この過程は円滑に遂行されることが期待できる。

細胞生物学次世代シークエンス解析により、今後解析するべき中心体に特異的に局在するlncRNAの候補群の選定は完了した。しかし、ヒト培養細胞におけるRNAiを用いた各々の因子の機能解析や局在解析は今年度着手できなかった。次年度においてはwet系の実験、すなわち機能スクリーニングを精力的に推進する必要があり、当該研究課題における全体的な経費もここにかかる予定である。次年度においては、今年度からの持ち越し分と、次年度分として請求した助成金の合算を、主にwet系の実験、すなわち、遺伝子実験関連試薬、タンパク質実験関連試薬、培養細胞関連試薬等の消耗品費として大部分を使用し、一部、成果発表のための国内学会参加費、論文掲載費に使用する計画である。
タンパク質工学の応用へ向けての多角的アプローチ

トリプシンインヒビターの単体と酵素との複合体及びリパーゼA2の立体構造をX線結晶解析により解明した(芦田)。タンパク質工学的手法によりリゾチームの高温失活機構及び構造形成過程を解析し、また、酵素反応機構の変換に成功した(井本)。血液凝固系のvlla因子結合部位の解析を行い、またカブトガニ体液の凝固に関与するプロテアーゼの活性化機構を解明した(岩永)。タンパク質工学的手法によりヘビ毒腺ホスホリパーゼA2の構造と機能を解析し、また、11種のアイソザイム遺伝子の塩基配列を解明した(大野)。X線結晶解析により、グルタチオン合成酵素並びにアスパラギン酸合成酵素の立体構造を明らかにし、反応機構を解析した(小田)。臨床治療への利用を目的として、グルタチオン合成酵素のPEGによる化学修飾の効果を解析し、また、プリンヌクレオシド代謝系酵素の遺伝子の塩基配列を解明した(木村)。1本鎖モネリンの溶液構造を多次元NMR法により解析した(小林)。Achromobacterプロテアーゼlのリジン残基に対する高い基質特異性の原因をタンパク質工学的に改変した酵素を用いて解明いた(崎山)。耐熱性菌のオリゴ-1,6-グルコシダーゼを対象として、プロリン残基の多重置換導入による酵素の遺積的耐熱化をタンパク質工学的手法により実証した(鈴木)。好熱菌のリジルtRNA合成酵素遺伝子の塩基配列を解明し、また、基質L-リジンとATRの結合を平衡論及び速度論的に解析した(外村)。基質特異性の異なる2種のジオキシゲナーゼ間のハイブリッド酵素を作成し基質特異性の拡大に成功した(古川)。新規デキストラン誘導体及びPEG誘導体によるリゾチームの化学修飾による酵素の安定性と反応性の増大を見出した(山崎)。プロリン残基に特異性を有する微生物由来の6種のペプチダーゼを単離精製し、酵素遺伝子のクローン化、塩基配列の決定、過剰発現並びに酵素の結晶化を行った(芳本)。蛋白質性インヒビターとプロテアーゼとの複合体及びリパーゼA2のX線結晶構造解析により、詳細な構造情報を得た(芦田)。酵素の耐熱化を目指して、リゾチームの高温不可逆失活の機構および還元条件からの構造形成の過程を解析した(井本)。血液凝固系において、組織因子(TF)上のVIIa因子結合部位の解析を行い、TFのLys-17の結合への関与を明らかにした(岩永)。ヘビ毒腺ホスホリパーゼA2の59位及び31位のアミノ酸を置換し、それが基質との相互作用や四次構造に及ぼす効果を解析した(大野)。大腸菌由来グルタチオン合成酵素のATP結合部位の17残基からなるループ構造が担う機能を、ループ欠損変異体酵素を作成して解析した(小田)。グルタチオン合成酵素のポリエチレングリコールによる化学修飾により、安定性増大とアナフィラキシーショック低減がもたらされた(木村)。^<15>Nラベルの1本鎖モネリンの構造を多次元NMR法により解析し、詳細な構造情報を得た(小林)。アクロモバクター・プロテアーゼの部位特異的変異酵素を用いて、活性および基質特異性への水素結合の寄与を評価した(山崎)。Bacillus由来オリゴ-1,6-グルコシダーゼにプロリン残基9個を導入し、酵素の耐熱性の累積的増大を明らかにし、耐熱性プロリン説の直接証明に成功した(鈴木)。Bacillus由来リジルtRNA

合成酵素の遺伝子の塩基配列を解析し、また酵素のリジン基質認識機構を検討した(外村)。2種類の芳香族化合物酸素添加酵素の各サブユニットを交換したハイブリッド酵素を構築し、環境汚染物質であるトリクロロエチレンをも速やかに分解する酵素を得た(古川)。蛋白質安定化のための修飾剤として新規なデキストラン誘導体を開発し、その有効性を示した(山崎)。4種のプロリルアミノペプチダーゼの遺伝子クローニング、塩基配列解析、酵素過剰発現、及び結晶化に成功した。本酵素がセリン酵素であることを解明した(芳本)。小麦胚芽トリプシンインヒビターの単体とトリプシンの複合体の立体構造をX線結晶構造解析により解明した(芦田)。組換え型ニワトリ卵白リゾチームを用いて酵素反応機構をカルボニウムイオン中間体安定化機構からグリコシル中間体経由機構への変換に成功した(井本)。カブトガニ体液の凝固に関与するセリンプロテアーゼの前駆体の1,3-β-D-グルカンによる活性化機構を解明した(岩永)。ハブ属毒腺ホスホリパーゼA2の11種のアイソザイムを単離し一次構造と各遺伝子の塩素配列を解明し進化論的考察を加えた(大野)。グルタチオン合成酵素と遷移状態アナログとの複合体並びにアスパラギンの酸合成酵素の立体構造をX線結晶解析により明らかにした(小田)。臨床治療への利用を目的として、微生物由来のプリンヌクレオシド代謝系酵素の生化学性質並びに酵素遺伝子の塩基配列を解明した(木村)。1本鎖モネリンの溶液構造を多次元NMR法により詳細に解析した(小林)。Achromobacterプロテアーゼ1のリジン残基に対する高い基質特異性の原因をタンパク質工学的に改変した酵素を用いて解明した(崎山)。耐熱性菌のオリゴ-1,6-グルコシダーゼを対象として、プロリン残基の多重置換導入による酵素の累積的耐熱化をタンパク質工学的手法により実験的に証明した(鈴木)。B. stearothermophilusのリジルtRNA合成酵素と基質し-リジンとATPの結合を平衡論的及び速度論的に解析し酵素遺伝子の塩基配列を解明した(外村)。基質特異性の異なる2種のジオキシゲナーゼ間のハイブリッド酵素を作成し芳香族基質に対する特異性の拡大を証明した(古川)。メトキシPEG誘導体によるリゾチームの修飾により酵素の安定性とグラム陰性菌に対する反応性の増大を見出した(山崎)。プロリン残基に特異性を有する微生物由来のアミノペプチダーゼPを単離精製し、酵素遺伝子のクローン化、塩基配列の決定、過剰発現並びに酵素の結晶化を行った(芳本)。
鉄代謝異常に着目した新たな神経変性疾患モデルマウスの確立とその解析

本研究では鉄代謝異常と神経変性疾患の因果関係の解明を目指し、神経細胞特異的に反応性に富んだ鉄を増加させたトランスジェニックマウス(IRP2 Tg)を作製し、神経変性疾患のモデルマウスとの交配実験を行うことで、鉄代謝異常が神経変性の増悪因子となることを示すとともに、発症および病態形成機構の経時的観察を目的としている。H22年度はパーキンソン病に焦点を絞り、培養細胞レベルおよび変異マウスの解析を行った。近年、ダメージを受けたミトコンドリアにparkinが局在化し、ミトコンドリアをミトファジーによる分解に導くことでミトコンドリアの品質管理を行っていることを示唆する報告が数多くなされている。そこで、SH-SY5Y細胞にparkinとIRP2を過剰発現し、培養上清に鉄を添加して観察を行ったところ、対照群と比較し、細胞内における反応性に富んだ鉄量の増加、ミトコンドリアの形態変化、膜電位の低下が認められ、さらにparkinの局在化が観察された。この観察結果はparkin KOマウスが目立った表現型を示さないのに対し、IRP2 Tg parkin KO二重変異マウスが寡動の症状を呈する理由になるのではないかと考えている。また、IRP2 Tgマウスの脳における反応性に富んだ鉄量の増加を定量的に確認することにも成功し、さらに、蛍光免疫染色によりIRP2 Tgや二重変異マウスの神経細胞ではミトコンドリアにおける酸化ストレスの増大が認められるのではないかと考えられる観察結果が得られ、今後詳細な解析を行う予定である。
諮問機関の比較政治制度分析：審議会と連邦諮問委員会の比較研究

行政に国民の声が反映されることは民主主義の観点から重要であるが、どのような手段によってそれは可能となるのだろうか。本研究は、行政の民主化を図る手段として審議会やパブリックコメントなどの「市民の行政参加」の仕組みに注目し、それがいかに機能しているのかを明らかにする。審議会やパブリックコメントは市民の意見を取り入れるという役割を十分果たしていないと評されることが多いが、本研究は理論とデータに基づいてこれに反論を試みる。