hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コイルドコイル形成に基づく生細胞膜タンパク質ラベル法のクロスリンク化と小型化

標的のタンパク質分子を蛍光タンパク質と遺伝子融合して生細胞に発現させることで、標的タンパク質の挙動を追う技術は基礎生命科学研究で広く用いられています。この研究では、蛍光タンパク質融合体よりもサイズが小さく、利点の多い新規ラベル法である「コイルドコイルラベル法」をさらに強力な結合でラベルし、かつサイズを小さくする改良を行いました。これまでに用いてきたコイルドコイルプローブK3配列のコイルドコイル認識部位(残基番号1-21)に加えて、C末端側にリンカー(22-23)、プロテアーゼ認識・切断部位(24-27)、およびクロスリンク部位(28)を持つsmall coiled-coil用プローブの合成を行った。コイルドコイル認識部位のLysはArgに置換し、NH2基反応性試薬を用いて部位特異的に蛍光ラベルやクロスリンクを行えるようデザインした。相互認識に重要なプローブ配列のLysをArgに置換しても、元の配列と同様の結合力で特異的蛍光ラベルが行えることを確認済である。樹枝上でN末端に蛍光色素フルオレセインをラベルしたペプチドを脱保護、精製し、次にC末端アミノ基をテトラメチルローダミンSEでラベルすることを試みた。しかしながらペプチドとラベル試薬を混合すると非常に凝集しやすいことかわかった。色素がペプチド凝集を促進、またはシステインの酸化に伴うダイマー形成が原因だと考えられる。そこで、ラベル蛍光色素をより水溶性の高いCy5に変更してラベルを試みた。TFE,MeOH,HFIP等有機溶媒中での反応を試みたがいすれも精製物が見られなかった。そこで溶媒を100mMHEPESpH74に変更したところ反応は進行したが、アミノ基に加えてCys側鎖のチオール基にも蛍光色素の付加がみられた。Hydroxylamineを加えることでチオエステルを分解し、目的物を得た。その際、一部はダイマー化していたため、約100等量のDTTを加えて還元し、モノマーのプローブ(FL-probe-Cy5)を得た。これにクロスリンクを加えたところ最終目的プローブの精製が見られたが反応は完全には進行していなかった。FL-probe-Cy5はbufferに溶解しにくいため、完全に溶解してからクロスリンク試薬を加える必要がある。small oiledcoil用タグ配列については問題なく合成を完了した。2つの蛍光色素およびクロスリンカーを標識したプローブ(FL-probe(GMBS)-Cy5)の合成に関して、これまでに中間体の(FL-probe-Cy5)を得ることが出来ていたが、個々に約100当量のsulfo-GMBSを加え、pH6.5の50mMリン酸カリウム緩衝液中で,短時間(6分)反応させる事でプローブを得られることが明らかになった。精製したプローブをW-tag配列ペプチドと混合し、クロスリンク反応が起こるか確認を行ったところ、プローブの凝集または容器への吸着により、溶液からプローブが速やかに失われていることが明らかになった。そこで、プローブの水溶性を改善する為に、比較的水溶性が高いと考えられるATTO488およびATTO700を蛍光色素として用いたプローブ(ATTO700-probe(GMBS)-ATTO488)の合成を行った。これまでと同様の合成反応を行い約7nmolの精製プローブを得ることが出来た。このプローブを用いて、タグ配列(EIAAIER)3-GGIEGRKをN末端に付加したbeta2アドレナリン受容体をCHO細胞に一過性発現させ、染色を行ったところ、細胞膜上でATTO488、ATTO700両者の蛍光が見られる細胞が観測できた、100nMのプローブをPBS(+)中30分インキュベート後に、PBSでの洗浄を10回行ってから観察してもやはり蛍光は観察されたことから、タグとプローブ間にクロスリンク反応が起こっていることが示唆された。さらに、プロテアーゼfactorXaを加えて観察を続けたところ、ATTO700の蛍光が60分後には有意に減少したのに対し、ATTO488蛍光は大きくは減少しなかった。従って、プロテアーゼ処理により余分なタグープローブ配列を取り除くことができたと考えられる。以上、研究の目的であった新規小分子ラベル法のクロスリンク化と小型化を達成することができた。
キメラがんタンパクＴＬＳーＣＨＯＰによる多段階発がん機構の解明とその臨床応用

粘液型脂肪肉腫特異的に見られるTLS-CHOPは、染色体転座に起因するキメラがん遺伝子である。この遺伝子産物は転写因子として機能し、粘液型脂肪肉腫の腫瘍発生や腫瘍増殖に関わると考えられているが、その分子メカニズムの詳細はまだ分かっていない。これまでの研究により、TLS-CHOPが、形質転換活性を持つDOL54の発現誘導や抗腫瘍活性を持つIL-24の発現抑制をすることなどが分かってきたが、本研究により、DOL54の高発現がIL-24の発現を抑制することにより腫瘍増殖を維持していることが判明した。さらに、新規に粘液型脂肪肉腫増殖に関わる分子群を同定しており、それらの分子機能を解析中である。粘液型脂肪肉腫の大多数には、染色体転座に起因するTLS-CHOPキメラ遺伝子が存在する。その遺伝子産物は新たな転写因子として機能し、腫瘍発生や腫瘍細胞増殖に重要な役割を担うと考えられている。これまでの研究により、TLS-CHOPは、トランスフォーム活性を持つDOL54の発現誘導、抗腫瘍活性を持つMDA-7の発現抑制、及び腫瘍細胞増殖と転移の促進因子であるPAI-1の発現誘導をすることが分かってきた。しかし、これらの分子の発現制御機構やDOL54による腫瘍化メカニズムの詳細については、まだ不明の点が多い。本研究は、これらの分子メカニズムを解明し、その知見の臨床応用を目指すものである。平成25年度は以下の項目で研究を行なった。1. DOL54の発現誘導を介した腫瘍化促進メカニズムの解明DOL54の発現誘導に至る分子パスウェイについては、そこへの介在が示唆されるタンパク群について、粘液型脂肪肉腫由来培養細胞のTLS-CHOPをノックダウンした際の発現量を検討し、期待される結果を得た。現在さらに、各介在候補タンパクを個別に着目して詳細な検討を行なっている。一方、DOL54によるがん化促進メカニズムについては、まずDOL54の数種のバリアントのcDNAの獲得を目指しているが、未だPCRエラーの無いcDNAが取得出来ておらず、引き続きクローニングの作業を継続している。2.がん抑制遺伝子MDA-7の発現抑制を制御する分子パスウェイの解明TLS-CHOPに発現誘導されMDA-7を標的とする可能性が示唆されるmiRNA群に対するanti-miRを粘液型脂肪肉腫由来培養細胞に導入したところ、増殖抑制が観察された例があった。この時、MDA-7の発現上昇が期待されるが、おそらく抗体の質の問題から未だMDA-7タンパクの発現の検出が出来ておらず、現在、鋭意努力中である。粘液型脂肪肉腫の大多数には染色体転座に起因するTLS-CHOPキメラ遺伝子が存在し、その遺伝子産物は腫瘍特異的な転写因子として重要な役割を担っていると考えられている。これまでの研究により、TLS-CHOPは、腫瘍化活性を持つDOL54と腫瘍の増殖・転移を促進するPAI-1の発現誘導、及び抗腫瘍活性を持つMDA-7の発現抑制に関与することが分かってきた。しかし、粘液型脂肪肉腫の発生・進展機構の詳細についてはまだ不明な点が多い。平成26年度は以下の項目で研究を行なった。1. DOL54の発現誘導を介した腫瘍化促進メカニズムの解明。DOL54の発現誘導分子経路において介在が示唆された分子群については、その関与を検証する実験を遂行中である。一方、DOL54による腫瘍化促進メカニズムについて、DOL54のノックダウンは粘液型脂肪肉腫細胞の増殖抑制を導くが、DOL54とMDA-7をダブルノックダウンするとその増殖抑制がなくなることを発見した。従って、DOL54ノックダウンによる増殖抑制にMDA-7の抗腫瘍活性が関与することが示唆され、TLS-CHOPによるMDA-7発現抑制にDOL54の発現誘導が必須であると想定された。現在、その確定作業と分子メカニズムの検討を行なっている。2.新規関連分子群のノックダウンや過剰発現による腫瘍抑制効果の検討。TLS-CHOPに発現抑制されるmicroRNA群の中でmiR-499-5pを粘液型脂肪肉腫細胞に導入すると細胞死を誘導することを見出した。また、miR-499-5pの標的遺伝子の候補の1つであるSOX11をノックダウンしても顕著な細胞死誘導が見られた。従って、粘液型脂肪肉腫の発生・進展機構の解明はもちろん、新規分子治療法の開発を考える上でもSOX11の粘液型脂肪肉腫における機能の詳細な検討が必要となってきた。染色体転座に起因するキメラタンパクTLS-CHOPは、粘液型脂肪肉腫の大多数で見られ、腫瘍特異的な転写因子として腫瘍発生や腫瘍増殖に関与すると考えられているが、その分子機能の詳細は不明である。これまでの研究により、TLS-CHOPが、腫瘍化活性を持つDOL54と腫瘍の増殖・転移を促進するPAI-1の発現誘導、及び抗腫瘍活性を持つMDA-7の発現抑制に関与することが分かってきた。本研究では、上記のTLS-CHOP下流分子群の分子機能の詳細と、新規関連分子群の腫瘍関連機能の検討を行なった。1. DOL54の発現誘導を介した腫瘍化促進メカニズムの解明TLS-CHOPのノックダウンが粘液型脂肪肉腫の増殖を抑制することは既に報告済みだが(Br. J. Cancer 2012)、本研究期間では、DOL54のノックダウンでも粘液型脂肪肉腫細胞の増殖が抑制され、その際にMDA-7の発現が顕著に増加することを発見した。

従って、TLS-CHOPがDOL54の発現誘導を介してMDA-7を抑制することで腫瘍細胞を維持することが示唆された。27年度は、この仮説を実験的に確定した(投稿準備中)。一方、複数の分子群が、DOL54を発現誘導する分子経路中に介在する可能性が示唆されていたが、これらについてはまだ確定的なデータが出ておらず、引き続き検討中である。また、PAI-1の発現誘導経路とDOL54&#8226;MDA-7の分子経路との相互作用に関しても、予備実験でその関連性を示唆する結果が散見されたものの、まだ詳細は不明で、さらに検討を進めている。2.新規関連分子群のノックダウンや過剰発現による腫瘍抑制効果の検討上記の分子とは別に、TLS-CHOPの影響で発現変動する分子群を特定し、その中から粘液型脂肪肉腫の増殖や転移に関与するものを同定した。27年度からは、その分子群の機能の解析を開始し、現在も継続中である。粘液型脂肪肉腫特異的に見られるTLS-CHOPは、染色体転座に起因するキメラがん遺伝子である。この遺伝子産物は転写因子として機能し、粘液型脂肪肉腫の腫瘍発生や腫瘍増殖に関わると考えられているが、その分子メカニズムの詳細はまだ分かっていない。これまでの研究により、TLS-CHOPが、形質転換活性を持つDOL54の発現誘導や抗腫瘍活性を持つIL-24の発現抑制をすることなどが分かってきたが、本研究により、DOL54の高発現がIL-24の発現を抑制することにより腫瘍増殖を維持していることが判明した。さらに、新規に粘液型脂肪肉腫増殖に関わる分子群を同定しており、それらの分子機能を解析中である。DOL54の発現誘導分子経路に介在する分子群の同定については、可能性のあるmicroRNA群やタンパク群が既に多く示唆されているが、未だに確定するには至っていない。これは技術的な問題や使用している抗体の質の問題などが考えられ、さらなる工夫が必要であると考える。一方、当初、DOL54による腫瘍化促進メカニズムとMDA-7発現抑制よる腫瘍細胞維持機構は、互いに何らかの相互作用がある可能性を考慮しつつも、TLS-CHOPの下流でそれぞれ独立した分子経路で制御されていると想定して研究を行なってきたが、26年度の研究結果により、DOL54がMDA-7の発現抑制に寄与していることが強く示唆された。また、TLS-CHOPに発現抑制を受けるmicroRNA群の中からmiR499-5pの発現抑制と、その標的分子の1つと予想されるSOX11の発現が、粘液型脂肪肉腫細胞の維持に必須であることを発見した。miR-499-5pやSOX11とDOL54、MDA-7の発現制御との関連性は今のところ見出されていない。これらの研究結果は、粘液型脂肪肉腫の腫瘍発生・進展機構の全貌を理解するために重要な新事実であると思われ、本研究の目的達成において大きな進展であると言える。従って、研究計画に比べて遅れている部分がある反面、当初の想定外の分子経路の存在を示唆する結果が得られたという進展が見られたことから、全体としては、まずまず順調に進展していると考える。医歯薬学平成27年度は本研究助成のプロジェクトの最終年度であるため、基本的に研究成果をまとめていく方向で遂行していく。
流れの方向性及び拍動性が培養血管内皮細胞の形態と機能に与える影響

1.ウシおよびブタ大動脈由来の内皮細胞を使い,20dyn/cm^2のせん断応力を24時間負荷したとき,流れの方向性が細胞の形状と細胞骨格の成分であるF-アクチンフィラメントの形態に及ぼす効果を観察した.流れは一方向にのみ加えた場合(一方向流),30分および3分おきに対向的に切り替えた場合(対向流),30分おきに直交方向に切り替えた場合(直交流)とした.一方向流,対向流のいずれの場合も細胞は流れの向きに配向し形態も細長く伸長したが,その度合は一方向流を負荷した細胞のほうが顕著であった.直交流の場合,細胞の向きはランダムとなり,細胞の伸長の程度は対向流の場合とほぼ同程度であった.また,流れを負荷しない細胞ではF-アクチンフィラメントは主に細胞の周囲に存在していたが,流れを負荷するとストレスファイバーが多く観察されるようになった.ストレスファイバーの分布も一方向流では上流側に多く観察されるのに対して,対向流と直交流ではほぼ均一に分布しており,違いが見られた.これらの結果より,内皮細胞は流れの方向を感知し,その形態や機能を変化させている可能性があることが明らかとなった.2.ブタ大動脈由来の内皮細胞を用いてせん断応力による透過性を検討したところ,せん断応力負荷によって透過性が亢進していることがわかった.そこで,細胞の物質透過性と密接に関連している細胞間の接着蛋白であるプラコグロビンを蛍光抗体法により染色し,細胞周辺部における分布および接合状態を観察した.その結果,無負荷の状態では接着蛋白はほぼ均一な間隔で密に存在していたが,せん断応力の負荷によって接着蛋白の分布間隔が疎になり,透過性が亢進していることが予想された.1.ウシおよびブタ大動脈由来の内皮細胞を使い,20dyn/cm^2のせん断応力を24時間負荷したとき,流れの方向性が細胞の形状と細胞骨格の成分であるF-アクチンフィラメントの形態に及ぼす効果を観察した.流れは一方向にのみ加えた場合(一方向流),30分および3分おきに対向的に切り替えた場合(対向流),30分おきに直交方向に切り替えた場合(直交流)とした.一方向流,対向流のいずれの場合も細胞は流れの向きに配向し形態も細長く伸長したが,その度合は一方向流を負荷した細胞のほうが顕著であった.直交流の場合,細胞の向きはランダムとなり,細胞の伸長の程度は対向流の場合とほぼ同程度であった.また,流れを負荷しない細胞ではF-アクチンフィラメントは主に細胞の周囲に存在していたが,流れを負荷するとストレスファイバーが多く観察されるようになった.ストレスファイバーの分布も一方向流では上流側に多く観察されるのに対して,対向流と直交流ではほぼ均一に分布しており,違いが見られた.これらの結果より,内皮細胞は流れの方向を感知し,その形態や機能を変化させている可能性があることが明らかとなった.2.ブタ大動脈由来の内皮細胞を用いてせん断応力による透過性を検討したところ,せん断応力負荷によって透過性が亢進していることがわかった.そこで,細胞の物質透過性と密接に関連している細胞間の接着蛋白であるプラコグロビンを蛍光抗体法により染色し,細胞周辺部における分布および接合状態を観察した.その結果,無負荷の状態では接着蛋白はほぼ均一な間隔で密に存在していたが,せん断応力の負荷によって接着蛋白の分布間隔が疎になり,透過性が亢進していることが予想された.ブタ大動脈由来の血管内皮細胞をガラス板上で培養し、平行平板型のフローチャンバを用いて18dyn/cm^2のせん断応力を24時間にわたって負荷した。本研究では、血管内皮細胞に対する流れの方向性の影響を観察するため、一方向のみの流れ(一方向群)と、30分間隔(双方向群a)または3分間隔(双方向群b)で流れの向きを切り換えた双方向の流れを負荷した。この後、せん断応力を負荷した細胞のアクチンフィラメントをローダミンファロイジンにより染色した。細胞の形態変化を表す指標として従来から報告しているshape index(SI=4πA/P^2、A:細胞の面積、P:細胞の周長)の値についても蛍光顕微鏡写真から計測した。以上の実験の結果、流れを負荷しない細胞(静置群)では、比較的丸い細胞が多く認められるに対し、一方向群では細長い細胞が多く認められた。双方向群aおよびbでは、SIは静置群と一方向群でのそれの中間の分布を示したが、双方向群bの分布は、双方向群aに比べ、より静置群に近い分布を示した。細胞内におけるアクチンフィラメントの分布は、一方向群では細胞周辺部の流れの上流部分に多く観察されたが、双方向群aおよびbでは、上流側および下流側に均等に分散して観察された。これらの結果から、アクチンフィラメントの形成部位や細胞の形態の変化には、流れの方向性が強く影響すると考えられる。今年度の結果に基づき、来年度は流れの方向を直交させた場合および流れの方向性が細胞の機能としての物質透過性に及ぼす影響について検討する。また、物質透過性と関連して、細胞間の接着蛋白であるプラコグロビンの分布・接合状態と流れの関係についても蛍光抗体法により観察する予定である。培養した内皮細胞に平行平板型フローチャンバを用いてせん断応力負荷し,せん断応力が細胞の形態と機能に及ぼす影響を検討した.1.ウシ大動脈

由来の内皮細胞を使い,20dyn/cm^2のせん断応力を24時間負荷したとき,流れの方向性が細胞の形状と細胞骨格の成分であるF-アクチンフィラメントの形態に及ぼす効果を観察した.流れは一方向にのみ加えた場合(一方向流),30分おきに対向的に方向の切り替えた場合(対向流)とした.一方向流,対向流のいずれの場合も細胞は流れの向きに配向し形態も細長く伸長したが,その度合は一方向流を負荷した細胞のほうが顕著であった.また,流れを負荷しない細胞ではF-アクチンフィラメントは主に細胞の周囲に存在していたが,流れを負荷するとストレスファイバーが多く観察されるようになった.ストレスファイバーの分布も一方向流では上流測に多く観察されるのに対して,対向流ではほぼ均一に分布しており,違いが見られた.これらの結果より、内皮細胞は流れの方向を感知し,その形態や機能を変化させている可能性があることが明らかとなった.2.昨年度,ブタ大動脈由来の内皮細胞を用いてせん断応力による透過性を検討したところ,せん断応力負荷によって透過性が亢進していることがわかった.そこで,細胞の物質透過性と密接に関連している細胞間の接着蛋白であるプラコグロビンを蛍光抗体法により染色し,細胞周辺部における分布および接合状態を観察した.その結果,無負荷の状態では接着蛋白はほぼ均一な間隔で密に存在していたが,せん断応力の負荷によって接着蛋白の分布間隔が疎になり,透過性が亢進していることが予想された.
中出力・高クォリティ・サブミリ波ジャイロトロンの開発とプラズマ計測への応用

1)サイクロトロン2次及び3次高調波動作を用いたジャイロトロンの超高周波化福井大学とシドニー大学の双方で,各々のグループで有する12T超伝導マグネットを用いて,ジャイロトロンの超高周波化の研究を行った。福井大学では,Demountable型ジャイロトロン(GYROTRON FU III)を設計・試作し,サイクロトロン2次及び3次高調波動作を用いた研究を行なった。2次高調波動作で,最高周波数636GHz(波長472μm)まで,3次高調波動作で最高周波数444GHz(波長676μm)まで周波数可変のジャイロトロンが実現した。このジャイロトロンは,モード競合を抑制するため空洞共振器の半径を小さくしてあるので,上記の2次及び3次高調波動作は,単独動作が可能でその出力を直ちに光源として用いることができる。出力電力は,いずれも100700Wであり,ジャイロトロンとしては中出力であるが,プラズマ計測及び物性研究のための光源としては十分の出力である。一方,シドニー大学では,福井大学で開発した高調波ジャイロトロンの原理を導入して,高周波化の研究を行い,サイクロトロン基本波と2次高調波における動作を併用して,周波数範囲150615GHzを覆うジャイロトロンを実現した。出力は,10mW20Wであり,ジャイロトロンとしては小出力であるが,連続動作が可能であり,周波数及び出力電力の安定性に優れたジャイロトロンである。2)ジャイロトロンの長パルス動作サブミリ波ジャイロトロンをプラズマ散乱計測の光源として用いるためには,連続動作または長パルス動作の達成が必要である。福井大学のGYROTRON FU IIを用いて,2次高調波動作による352GHz(TE_<161>モード)での発振を0.6secにわたって継続することに成功した。出力電力150Wが得られ,この出力を核融合科学研究所のヘリカル装置CHSのサブミリ波散乱計測のために用いている。3)サブミリ波ジャイロトロンの振幅変調及び周波数変調ジャイロトロン出力の振幅変調及び周波数変調は,ジャイロトロンを広範囲の研究のために,光源として用いる際に重要である。福井大学では,シドニー大学との共同研究として電子銃の陽極変調による出力の振幅変調と陰極変調による周波数変調の研究を行った。4)基本波動作と高調波動作のモード競合及びモード協力の研究ジャイロトロンの高周波化のためには,高調波動作を用いることによる磁場の軽減が不可欠であり,また,基本波動作との競合を避けて高調波動作のよる出力を純粋に取り出す必要がある。このため,シミュレーションによって基本波動作との競合を調べ,高調波動作が単独で起きる条件を見いだし,実験を行うことによって,2次及び3次高調波での単独発振を達成した。また,2次高調波動作が基本波動作をトリガーすることにより,基本波動作の開始ビームを低下させ,ビームエネルギーを高効率で引き出して,電磁波エネルギーに変換する機構があることを見いだし,実験的にも証明することができた。この現象は,一種のモード協力であり,ジャイロトロンの高効率動作を可能にする。5)ジャイロトロン出力を光源とするプラズマ散乱計測開発したミリ波ジャイロトロンを光源とするプラズマ散乱計測装置を試作し,シドニー大学のトカマク装置TORTUSのアルフェン波加熱時の入射波の検出に成功した。また,福井大学のGYROTRON IIを光源とするサブミリ波散乱計測装置を製作し,核融合科学研究所のCHS装置に設置して,プラズマ中に自然励起されるドリフト波の測定を行い,その検出に成功した。ドリフト波はプラズマ閉じ込めに悪影響を与える波動であるので,その制御が必要であり,本測定はそのための情報をえるために必要である。

3)サブミリ波ジャイロトロンの振幅変調及び周波数変調ジャイロトロン出力の振幅変調及び周波数変調は,ジャイロトロンを広範囲の研究のために,光源として用いる際に重要である。福井大学では,シドニー大学との共同研究として電子銃の陽極変調による出力の振幅変調と陰極変調による周波数変調の研究を行った。4)基本波動作と高調波動作のモード競合及びモード協力の研究ジャイロトロンの高周波化のためには,高調波動作を用いることによる磁場の軽減が不可欠であり,また,基本波動作との競合を避けて高調波動作のよる出力を純粋に取り出す必要がある。このため,シミュレーションによって基本波動作との競合を調べ,高調波動作が単独で起きる条件を見いだし,実験を行うことによって,2次及び3次高調波での単独発振を達成した。また,2次高調波動作が基本波動作をトリガーすることにより,基本波動作の開始ビームを低下させ,ビームエネルギーを高効率で引き出して,電磁波エネルギーに変換する機構があることを見いだし,実験的にも証明することができた。この現象は,一種のモード協力であり,ジャイロトロンの高効率動作を可能にする。5)ジャイロトロン出力を光源とするプラズマ散乱計測開発したミリ波ジャイロトロンを光源とするプラズマ散乱計測装置を試作し,シドニー大学のトカマク装置TORTUSのアルフェン波加熱時の入射波の検出に成功した。また,福井大学のGYROTRON IIを光源とするサブミリ波散乱計測装置を製作し,核融合科学研究所のCHS装置に設置して,プラズマ中に自然励起されるドリフト波の測定を行い,その検出に成功した。ドリフト波はプラズマ閉じ込めに悪影響を与える波動であるので,その制御が必要であり,本測定はそのための情報をえるために必要である。1.3次サイクロトロン高調波単独動作によるジャイロトロンの高周波化と高出力化(パルス動作)福井大学において,現有のジャイロトロン管を8テスラの超伝導マグネットに設置して,サイクロトロン3次高調波で単独動作させる実験を行い,ジャイロトロン管と超伝導マグネットの中心軸の配置を正確に合わせることと磁場の空間分布を最適条件に合わせることにより,周波数354GHz,出力25Wの3次高調波単独動作による発振に成功した。この結果に基ずき,12テスラの超伝導マグネットを用いたテラヘルツ・ジャイロトロンの設計を行い、装置を完成した。(この研究を行うために,シドニ-大学から1名の研究者を招へいした。)2.シドニ-大学におけるサブミリ波ジャイロトロンの連続動作と周波数可変機構の研究シドニ-大学においては,現有のGyrotron IVA装置を用いて,サイクロトロン2次高調波動作させることにより,600GHzまでの高周波化を達成した。また,連続動作で,比較的小出力(<1W)の発振を行い,階段的に周波数可変のジャイロトロンを実現した。(この研究を行うために、福井大学から1名の研究者を派遣した。)この成果を生かして,福井大学のサブミリ波ジャイロトロンの連続動作にも成功した。3.シドニ-大学TORTUSトカマク装置及び核融合科学研究所CHSヘリカル装置のサブミリ波散乱計測
睡眠時呼吸障害(いびき)の身体に与える影響について

本研究の目的は,睡眠時呼吸障害の病的境界がどこにあるかということと鼾の医学的意義を明らかにすることである.鼾は睡眠時呼吸障害においては必発する症状であるが,本当に大きな鼾は上気道狭窄の指標として用いられるべきものであるかという疑問の解答はなされてはいない.そこで睡眠時無呼吸をもたない単純鼾症患者6名を対象として終夜睡眠ポリグラフ検査を施行し,鼾の強さとして鼾の音圧,上気道狭窄度として食道内圧変動値を測定し,その関係を検討した.結果であるが,睡眠深度が深くなるにつれて食道内圧変動値は大きくなる傾向にあったが,鼾の音圧は必ずしも大きくなる傾向は示さなかった.そしてそれぞれの食道内圧変動値とそれに一致する鼾の音圧の相関関係を求めたところ,相関係数は各症例で0.3370.724であり,高い相関とはいえなかった.この結果からいえることは,鼾の音圧は上気道狭窄を予測する補助的な指標とはなるうるかもしれないが,十分な指標とはなりえないということである.上気道狭窄が高度になれば上気道を通過する呼吸量が制限され,鼾として生じる音が大きくない場合があるということが推測された.上気道の呼吸通過障害をきたす睡眠時無呼吸症候群では,鼾の強さは必ずしも上気道狭窄の強さを表す十分な指標とはなりえないと考えられる.今後は,食道内圧変動値,音圧,呼吸量の同時測定を行い,それぞれの変動を検討し,鼾,低換気,無呼吸に至る過程を観察し,鼾の医学的意義を明らかにしてゆく.本研究の目的は,睡眠時呼吸障害の病的境界がどこにあるかということと鼾の医学的意義を明らかにすることである.鼾は睡眠時呼吸障害においては必発する症状であるが,本当に大きな鼾は上気道狭窄の指標として用いられるべきものであるかという疑問の解答はなされてはいない.そこで睡眠時無呼吸をもたない単純鼾症患者6名を対象として終夜睡眠ポリグラフ検査を施行し,鼾の強さとして鼾の音圧,上気道狭窄度として食道内圧変動値を測定し,その関係を検討した.結果であるが,睡眠深度が深くなるにつれて食道内圧変動値は大きくなる傾向にあったが,鼾の音圧は必ずしも大きくなる傾向は示さなかった.そしてそれぞれの食道内圧変動値とそれに一致する鼾の音圧の相関関係を求めたところ,相関係数は各症例で0.3370.724であり,高い相関とはいえなかった.この結果からいえることは,鼾の音圧は上気道狭窄を予測する補助的な指標とはなるうるかもしれないが,十分な指標とはなりえないということである.上気道狭窄が高度になれば上気道を通過する呼吸量が制限され,鼾として生じる音が大きくない場合があるということが推測された.上気道の呼吸通過障害をきたす睡眠時無呼吸症候群では,鼾の強さは必ずしも上気道狭窄の強さを表す十分な指標とはなりえないと考えられる.今後は,食道内圧変動値,音圧,呼吸量の同時測定を行い,それぞれの変動を検討し,鼾,低換気,無呼吸に至る過程を観察し,鼾の医学的意義を明らかにしてゆく.
ＴＯＲ複合体の構成因子の機能解析から植物細胞の増殖制御を紐解く

植物にとって、窒素はその生長を決定付ける重要な栄養元素である。それにもかかわらず、植物の窒素代謝制御については不明な点が多く残されている。一方、酵母と動物においては窒素代謝制御についての詳細が調べられている。その制御における窒素量の感知とシグナル伝達の中心因子は、TORキナーゼ複合体である。植物のTORキナーゼの機能については殆ど不明であり、TOR複合体に関して言えば、酵母や動物の相同タンパク質が植物では見出されないことから、"植物特異的"な複合体構成因子が想定される。本研究では、TOR複合体構成因子の情報を手がかりに、窒素などの栄養源を感知するシグナル受容因子や、TORの活性を調節する因子を同定する。すなわち、TOR複合体構成因子の機能解析を通じて、植物細胞の増殖制御を理解することを本研究の目的としている。今年度は、TOR複合体を精製するための実験基盤をまず整えた。始めに、TORの複合体であることがゲノム比較情報から確認できる、RAPTORとLST8にタグを付加した株の構築を行なった。酵母などでProteinA融合RAPTORもしくはLST8を用いることでTOR複合体の精製に成功していることから、まずはじめにProteinA融合タンパク質として発現する株の構築を行った。目的のコンストラクトがゲノム上に挿入されていることは確認されたが、タンパク質の発現を確認することはできなかった。ProteinAの存在が悪影響していると考え、FLAGもしくはMycタグ融合タンパク質として発現する株の構築を目指した。現在までに、FLAGもしくはMycタグ融合タンパク質として発現する株の取得に成功し、RAPTORもしくはLST8複合体の精製に成功している。複合体精製のための株の取得や免疫沈降実験に成功しており、概ね計画通りに進展している。複合体を窒素源の有無などの各種生理条件から精製し、複合体構成成分の同定とその役割を明らかにする。また、複合体の細胞内局在を解析することで、各因子の機能解明における基盤情報を合わせて取得する。
圧縮性流体計算におけるGodunov型有限体積法開発のパラダイムシフト

平成30年度において,以下の研究成果が得られた。1セル境界における不連続(変差)を最小化する原理,すなわちBVD原理に基づき,再構築関数を選択する複数のBVDアグロリズムを提案した。そのうち,セルの各境界セグメントにおける総変差を指標とするBVD法の定式化について実証を行い,実用性が高く非構造格子に適用し易い方法を見出した。2多段階BVDアグロリズムを提案し,WENOのような非線形重み係数を用いる多項式を用いず,常係数多項式とTHINC関数のみを許容関数としたBVD解法の開発に成功した。この解は既存の非線形リミター(あるいは非線形重み係数)に基づく高解像度解法と根本的に異なり,連続と不連続解の両方に対して数値散逸が極めて少ない高精度な数値解が得られる。3THINC法を許容再構築関数として用いたBVD法を反応性圧縮性流れ及び自由界面多相圧縮性流れの数値解析に適用し,反応面及び多相間の移動境界面における数値散逸誤差を解消した。長年既存の数値解法が解決できなかった難問を解決した。4BVDの概念をHLLリーマンソルバーに適用し,その接触不連続における過剰な数値散逸誤差を大きく改良した。改良したHLLリーマンソルバーは,他の既存HLL系手法に比べ,計算精度とロバスト性の両面において優位性を示している。本研究計画は平成2930年度において,現行の有限体積法の空間再構築法を根本的に見直し,数値解法設計の新しい指針としてセル境界変差値の最小化原理(BVD原理)を確立させるとともに,それに基づく新型解法の開発を中心に研究を取り組んできた。当初の計画より上回る研究成果があげられた。本研究構想は,数値流体力学研究の長年抱えていた難問を解決し,新しい方向性を示す成果をあげ,関連分野の新しい理論体系の形成と応用問題の解決にも大きく資するものであろう。平成29年度において,以下二つの方面において重点的に研究を行った。・メッシュセル境界において物理量が不連続である前提をなくし,その不連続(変差)を最小化する新たな空間再構築の原理,すなわちBoundary Variation Diminishing (BVD)原理は計算手法の数値粘性の削減に非常に有効であることについて,リーマンソルバーの性質分析と数値実験の両面から検討を行った。さらに,BVD原理の応用において数値計算手法の設計指針を提案した。対象セルにおいて単一境界における変差や複数の境界における総変差などを指標とするBVD法の定式化を考案し,実証を行った。・本研究グループで提案したTHINC法をBVD法の許容再構築関数として用い,連続解と不連続解をともに精度よく計算できる数値解法の提案に成功した。さらにTHINCのみによるBVD法を提案し,オイラー方程式だけではなくデトネーションなど反応を伴う高マッハ流れの計算にもWENO法など従来手法の問題を回避し,優れた計算結果を示した。当初の計画では,平成29年度中に以下の研究内容を実施する予定だった。・有限体積法の枠組におけるBVD原理の理論分析および数値実験による検証を行い,BVD法は連続解と不連続解を同時に捉える高解像度数値解法を根本的に改良する原理としての有用性を検証する・BVD型新しい数値解法を設計するときの指針を提示し,計算精度と計算効率の両面において非構造格子にも対応できるような優れたBVD定式化を考案するとともに,BVD原理に基づく再構築関数類を検討する研究期間において上記の研究目標を達成した上,さらに,提案したBVD型解法を用い,オイラー方程式だけではなく,デトネーションを伴う反応ガスの数値解析にも成功した。従来のWENO法が解決できない反応面位置のずれなどの問題点を完全に解決した。この成果は関連分野において大きな影響を与えることになる。

今後は,BVD解法は連続解と不連続解を同時に解像できる革新的高性能数値解法として確立させるとともに,その実用展開に向けて以下の方向に研究を展開していく予定である。・BVD原理に基づき,構造格子及び非構造格子における新たな有限体積法の定式化および数値計算モデルを開発する。・BVD原理とMOODを組み合わせた高解像度数値解法の研究開発を行う。・BVD法が不連続解を精度よく計算できることから,それに基づく圧縮性自由界面多相流の高性能数値計算モデルの構築に大きな期待を寄せており,今後さらに研究を推進する。本研究企画(萌芽)の採択はやや遅れていた(今年度の7月)ため,当初計画していた物品購入などの支出は他の研究費で充当したので,残額が生じた。次年度の研究内容を踏まえ,計算サーバーの購入などを含めて研究費の執行計画を検討する。
心血管障害におけるアンジオテンシンIIの役割に関する分子薬理学的研究

本研究では、各種心血管障害モデルラットでのアンジオテンシンIIタイプI(AT1)受容体拮抗薬の効果を分子薬理学手法を用いて検討することにより、心血管障害におけるアンジオテンシンIIの役割を検討した。高血圧ラットに、アンジオテンシンIIタイプ(AT1)受容体拮抗薬、α-交感神経受容体遮断薬、β-交感神経受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬をそれぞれ、同等な降圧効果を示す用量を投与し、心肥大退縮効果、心筋細胞の形質変換さらに遺伝子発現に対する効果を比較検討したところ、AT1受容体拮抗薬は他の降圧薬よりも有意に、心肥大退縮効果、心筋の形質変換抑制効果さらにコラーゲン等の細胞外マトリックスの遺伝子発現抑制効果が強かった。さらに、心筋梗塞モデルラットでの検討から、AT1受容体拮抗薬により、心筋梗塞による心肥大並びに心不全の発症は著明に抑制された。さらに、心筋細胞の胎児型への形質変換や、コラーゲン遺伝子の発現増加を抑制し、心不全の発症に重要とされるCa-ATPase遺伝子発現の低下を抑制することがわかった。このように、アンジオテンシンIIは、AT1受容体を介して、心筋肥大のみならず、心室リモデリングや心不全の発症にも重要な役割を演じている。血管肥厚におけるアンジオテンシンの役割を解明するために、ラットの頚動脈をバルーンカテーテルを用いて内膜剥離することにより血管肥厚モデルを作製し、遺伝子発現の変動を調べた。さらに、AT1受容体拮抗薬の遺伝子発現への効果を調べた。AT1受容体拮抗薬は、c-fos、c-junの発現を抑制し、さらにフィブロネクチンの発現も特異的に抑制し、血管の肥厚を抑制した。すなわち、バルーン障害血管において、AngIIは平滑筋細胞でのAP-1の活性化を介して、フィブロネクチンの遺伝子発現を誘導し、平滑筋の増殖や遊走を促進すると考えられる。今回の研究では、心肥大、心室リモデリング、心不全におけるアンジオテンシンIIの役割を分子レベルで検討した。1,22週令の脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)に、アンジオテンシンIIタイプ(AT1)受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬、α-交感神経受容体遮断薬、β-交感神経受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬をそれぞれ、同等な降圧効果を示す用量を10週間経口投与し、心肥大退縮効果、心筋細胞の形質変換さらに遺伝子発現に対する効果を比較検討した。そして、同等な降圧効果にもかかわらず、AT1受容体拮抗薬とACE阻害薬は他の降圧薬よりも有意に、SHRSPにおける心肥大退縮効果、心筋の形質変換抑制効果さらにコラーゲン等の細胞外マトリックスの遺伝子発現抑制効果が強かった。2,左冠状動脈結紮により心筋梗塞を作製したラットを、AT1受容体拮抗薬投与群、ACE阻害薬投与群、及びコントロール群の3群に分けた。AT1受容体拮抗薬あるいはACE阻害薬投与により、心筋梗塞による心肥大並びに心不全の発症は著明に抑制されることがわかった。また、これらの薬剤は、著明な降圧をきたさない用量で、心筋細胞の胎児型への形質変換を抑制するだけでなく、コラーゲン遺伝子の発現増加を抑制し、さらには心不全の発症に重要とされるCa-ATPase遺伝子発現の低下を抑制することを証明した。このように、アンジオテンシンIIは、AT1受容体を介して、高血圧や心筋梗塞によって生じる心筋肥大に関与するだけでなく、心筋細胞の形質変換や、間質の線維化にも関与する。また、Ca-ATPase遺伝子発現の低下にも関与し、心不全の発症にも重要な役割を演じていると考えられる。

本研究では、各種心血管障害モデルラットでのアンジオテンシンIIタイプ(AT1)受容体拮抗薬の効果を分子薬理学手法を用いて検討することにより、心血管障害におけるアンジオテンシンIIの役割を検討した。高血圧ラットに、アンジオテンシンIIタイプI (AT1)受容体拮抗薬、α-交感神経受容体遮断薬、β-交感神経受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬をそれぞれ、同等な降圧効果を示す用量を投与し、心肥大退縮効果、心筋細胞の形質変換さらに遺伝子発現に対する効果を比較検討したところ、AT1受容体拮抗薬は他の降圧薬よりも有意に、心肥大退縮効果、心筋の形質変換抑制効果さらにコラーゲン等の細胞外マトリックスの遺伝子発現抑制効果が強かった。さらに、心筋梗塞モデルラットでの検討から、AT1受容体拮抗薬により、心筋梗塞による心肥大並びに心不全の発症は著明に抑制された。さらに、心筋細胞の胎児型への形質変換や、コラーゲン遺伝子の発現増加を抑制し、心不全の発症に重要とされるCa-ATPase遺伝子発現の低下を抑制することがわかった。このように、アンジオテンシンIIは、AT1受容体を介して、心筋肥大のみならず、心室リモデリングや心不全の発症にも重要な役割を演じている。血管肥厚におけるアンジオテンシンの役割を解明するために、ラットの頸静脈をバルーンカテーテルを用いて内膜剥離することにより血管肥厚モデルを作製し、遺伝子発現の変動を調べた。さらに、AT1受容体拮抗薬の遺伝子発現への効果を調べた。AT1受容体拮抗薬は、c-fos、c-junの発現を抑制し、さらにフィブロネクチンの発現も特異的に抑制し、血管の肥厚を抑制した。すなわち、バルーン障害血管において、AngIIは平滑筋細胞でのAP-1の活性化を介して、フィブロネクチンの遺伝子発現を誘導し、平滑筋の増殖や遊走を促進すると考えられる。
肺線維化病変成立過程に及ぼすサイトカイン・成長因子の影響に関する分子生物学的研究

間質性肺疾患の病因・病態を解明する目的で、ヒト肺線維症のモデルであるブレオマイシン投与による肺線維症マウスにおける肺胞マクロファージのサイトカイン発現、および、サルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄液(BAL)細胞におけるサイトカインおよび未知遺伝子の発現を、Reverse transcription-polymerase chainreaction(RT-PCR)法およびDifferential display(DD)法を用いて検討した。ブレオマイシンを10日間腹腔内投与をおこなったマウス30匹と生食を投与したコントロールマウス30匹の比較検討により、ブレオマイシン肺線維症マウスでは肺胞マクロファージにおけるPDGF-A,IGF-Iの発現を有意に増加しており、これらのサイトカインが、肺線維化過程において重要な役割を果たしている可能性が示唆された(投稿中)。サイコイドーシス患者19例と健常者8例のBAL細胞におけるサイトカインの発現をRT-PCRで比較検討した結果、TNF-α、PDGF-B、GM-CSF、IL-6の発現量がサイコイドーシス患者で有意に増加しており、またこれらサイトカインの発現量には正の相関が見られ、病変局所で活性化された肺胞マクロファージが一連の炎症過程の中であるモノカインを産生し、これに呼応して他のサイトカインの発現が誘導され、肺病変の進行がおこる可能性が示された(投稿中)。さらに、サルコイドーシス患者および他の間質性肺疾患の肺胞マクロファージからmRNAを抽出しDD法を行った結果、サイコイドーシス患者に特異的に発現増加している遺伝子の断片が得られた。そのシークエンスをDNAデータベースで検索したが有意なホモロジーはなく、未知遺伝子と考えられた(投稿準備中)。
低温熱量を用いた温熱処置後の腫瘍内静止期細胞分画における再酸素化現象の分析

まず、C3H/Heマウスに移植された直径1cm大のSCC VII腫瘍の全腫瘍細胞(P+Q細胞)と静止期細胞(Q細胞)の低酸素細胞分画は、各々14.3±0.9%,59.6±4.4%である事を明らかにした。次に、SCC VII腫瘍を移植したC3H/Heマウスに、固形腫瘍内の急性低酸素細胞を酸素化するとされるニコチンアミド投与や慢性低酸素細胞を酸素化するとされるカーボジェンガス処置に低温度(=低温熱量)温熱処置を組み合わせた処置によって、低温度温熱処理が主として固形腫瘍内の慢性低酸素細胞分画を解除し酸素化することを明らかにした。さらに、低温度温熱処理後の低酸素細胞分画を求めるための放射線照射のタイミングを様々に変化させて、P+Q細胞及びQ細胞における低酸素細胞分画の時間的変化をC3H/Heマウスに移植されたSCC VII腫瘍について検出した。その結果、低温度温熱処置によって、Q細胞の低酸素細胞分画は(P+Q)細胞の低酸素細胞分画より著しく低下し、低温度温熱処置による低酸素細胞分画の低下は、低温度温熱処置後2-3日後にはほぼ消失する事が明らかになった。以上の事実は、低温度温熱処置はカーボジェン処置と同様に、慢性低酸素細胞分画を多く含むQ細胞分画の低酸素細胞分画をより顕著に低下させ、その効果は2-3日維持される事を示した。ここまでの結果は、当初、直接的な殺細胞効果や放射線増感作用を期待して施行されている放射線治療直後の温熱治療であっても、さまざまな臨床的な理由によって、これらの効果がほとんど期待できなて様な低温度までしか加熱し得なかった症例に対しては、放射線照射と温熱治療の順序を逆転させ、腫瘍の酸素化現象を促すための低温度温熱治療をまず施行し、しかる後に放射線を照射し増感効果をねらうという臨床的な可能性をも示唆した。
癌の体細胞変異の高感度検出法(AL-COLD-PCR-SSCP)の開発と臨床応用

癌の体液診断を行う上で重要なことは、多量の正常細胞のDNAに隠れて癌細胞由来のDNAが検出しづらくなっていることをいかに回避して高感度な検出ができるかである。微量の遺伝子変異を検出する新規の方法として、Adapter Ligation COLD-PCR (AL-COLD-PCR)を考案し、その確立を目指したが成功しなかった。そこで、COLD-PCR-HRM(high resolution melting)法について検討した。K-rasコドン12, 13に変異をもつ癌細胞株のDNAと変異を持たないDNAとを割合をかえて混合し、COLD-PCR-HRMで解析した結果、0.51%の変異の混入を検出できることが判明した。Full COLD-PCRの方がnested PCRよりも効率よく検出できた。大腸癌と肺癌の臨床材料から抽出したDNAを試料として、同様にHRM解析を行ったところ、変異型をほぼ全例変異型として判定できた。COLD-PCR-HRM法は、癌の体細胞変異の高感度検出法として有用であると考えられた。癌の体液診断を行う上で重要なことの一つとして、多量の正常細胞由来のDNAに埋もれた少量の癌細胞由来の遺伝子異常を生じたDNAを高感度にとらえる方法の開発があげられる。そこで、本研究では2008年に発表されたCOLD-PCRを改良して、短い断片にしか対応できなかった欠点を克服し、長い断片も一度に扱える方法を確立し、方法論の検証、臨床的評価、さらに臨床検査への適用について検討することを目的として研究を始めた。パイロット的に、K-ras遺伝子の変異があることが判明している箇所を含んだ断片をPCR増幅し、制限酵素処理後、アダプターをライゲーションし、そのアダプター配列を認識するプライマーでPCR増幅した。制限酵素処理によって短い断片とすることにより、COLD-PCRで変異部位をエンリッチすることができる目論見であったが、うまく均等にアダプターPCRで増幅されていない。現在、条件を再検討している。もう一つの長い断片を一度に扱う方法として、COLD-PCR-HRM (high resolution melting)法を試みることにした。これは、PCRは複数行わなければならないが、一度にまとめてPCRで増やしておいて、ABI社の7500リアルタイムPCRシステムを活用しHRM解析を行うものである。本研究で取り上げた方法とは異なるが、効率よくCOLD-PCRを用いた少量の癌細胞の遺伝子変異を捉える方法としては十分に実用性のある方法と考える。実際、通常のPCRよりもCOLD-PCRによって遺伝子増幅することで、K-rasの遺伝子変異の検出率は向上していることをつきとめた。アダプターをライゲーションし、そのアダプター配列を認識するプライマーでPCR増幅して、それをCOLD-PCRで変異部位をエンリッチし、さらにそのSSCP解析は困難であることが判明した。そこで、昨年度のCO:LD-PCR-HRM (high resolution melting)法の条件をさらに検討した。K rasコドン12,13に変異をもつ癌細胞株のDNAと変異を持たないDNAとを割合をかえて混合し、COLID-PCR-HRMで解析した。その結果、0.51%の変異の混入を検出できることが判明した。これは、通常のnested-PCR-HRM解析よりも感度が高かったので、COLD-PCRの優位性によるものと判断できた。大腸癌と肺癌の臨床材料から抽出したDNAを対象として検討した結果、遺伝型の同定はできないが、変異の存在をスクリーニングするには有用であることが判明した。さらに、別の遺伝子解析法として、GENECUBE(東洋紡)のK-ras変異用の試薬を作成し、検出効率について検討を始めている。

そこで、本研究では2008年に発表されたCOLD-PCRを改良して、短い断片にしか対応できなかった欠点を克服し、長い断片も一度に扱える方法を確立し、方法論の検証、臨床的評価、さらに臨床検査への適用について検討することを目的として研究を始めた。ただ、昨年度の研究結果からアダプターをライゲーションし、そのアダプター配列を認識するプライマーでPCR増幅して、それをCOLD-PCRで変異部位をエンリッチし、さらにそのSSCP解析は困難であることが判明した。そこで、COLD-PCR-HRM (high resolution melting)法の条件をさらに検討し、K-rasコドン12, 13の変異をもつアレルを0.51%まで検出できる系を確立することができた。これは、通常のnested-PCR-HRM解析よりも感度が高く、市販のキットよりも高いものであった。癌細胞自身が得られない場合でも、癌細胞または癌細胞由来のDNAが混入した試料が得られれば、遺伝子変異の有無を推定することができ、治療法の選択につなげることができ、いわゆるコンパニオン診断が安価に可能となった。一方、未知の遺伝子変異の有無がCOLD-PCR-HRM法で検出できるかどうかを、ミトコンドリアDNAを標的として調べた。その結果、微量の遺伝子変異を有するアレルによる軽度なHRM曲線の変化をつかまえることは容易ではないと考えられた。すなわち、K-rasのように変異部位が絞られるものはよいが、どこにあるか予測できない変異アレルを明解に判定することはCOLD-PCR-HRM法では困難であるという結論に達した。当初予定していたアダプターライゲーションでの方法には限界があることが判明したので、別の方法としてHRM法に迅速に切り換え、細胞株、臨床材料での検討をした。技術革新は予測以上に早く、ステップの多い方法よりも自動化しやすい方法が実地上でのメリットが多いため、目先を変えて検討を進めたことによって順調に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子検査の自動化、簡便化を図るため、自動分析機で遺伝子解析を行うための環境作りに取り組む。市販の機器であるGENECUBEを活用する際に、COLD-PCRを取り込み、その応用性について検討する。高感度な自動化された遺伝子変異の検出方法が確立されることを目標とする。
生体透過snake photon検出のための基礎研究

未だ未知の点の多いsnake photonに対し、その基礎的な特性を明らかにすること、またその生体透視への応用ひいては光CT実現へ向けたbreakthroughの可能性を拓くことをめざし、次の研究を行った。1.高濃度散乱体におけるsnake photonの理論的解析モンテカルロシミュレーションにより、snake photonのふるまいを調べた。2.生体に近い散乱体溶液を用いたsnake photonの実験的解析試料には、散乱吸収特性が既知で、生体組織の光学パラメータとの関係が明らかなIntralipid水溶液を用いた。高出力レーザ、高感度受光器、分光系を中心とする実験システムを設計・製作し、snake photonの特性を実験的に解析した。これらの結果、次の成果が得られた。1.生体組織のような高濃度散乱体を透過した光の中にsnake photonが、既存技術で十分検出可能なレベル含まれることが明らかとなった。これらの結果は、snake photonを有効に分離抽出することができれば、生体の光透視イメージングにおける新たな散乱抑制法が得られる可能性を示唆するものと考えられる。