hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類色素胞における運動制御の中枢機構

すでに先年発表した光吸収性と反射性の色素胞の反応を同時測定する装置(Oshima et al.,1984)の改良を試み, 2種の色素胞の中枢神経系による差動的制御の解明に便利に利用できるようにした.ついで,材料としてイズミダイ(tilapia)を選び,皮膚中の色素胞の分布を検索した.その結果,黒色素胞は鱗の真皮中に存在するもの,同じく真皮に存在するが,単離鱗には付着してこないものが存在し,中枢による制御方式も異なることを見出した.ナマズ,コイを使用し,末梢における色素胞の神経支配が交感神経のみであり,副交感神経の関与がないことを解剖学的に示し,従来の生理学的・薬理学知見を確証した.サカサナマズ(upside-down catfish)は腹部を上にして遊泳することで知られているが,通常の魚種には見られない腹部皮膚にも色素胞,特に黒色素胞が多数顕存在し,隠蔽色の発現に役立っていることを確認した.この魚種の背部・腹部の黒色素胞は薬理学的解析により,ともに交感神経節後繊維により細胞内色素凝集が制御されていることを明らかにした.この背部・腹部の黒色素胞は中枢神経系により差動的に制御されおり,したがって,背部,腹部の皮膚色の変化の過程,ことに速度が異なることを見出した.しかし,この差が効果器,すなわち色素胞自体の運動性の差に起因する可能性が残り,検討を進める予定である.ネオンテトラの体側の青紫色の縦縞が日周期的に変化し,夜間は青緑色になることが知られている.通常の魚類の体色の日周期的変化,特に夜間皮膚色が明化する現象は,松果体からのメラトニン分泌が低照度下で増加することによるが,ネオンテトラでは,縦縞内の運動性虹色素胞が直接に光を受容し,その結果,細胞内のグアニン小板重層の各小板の間隔を狭ばまり,より短波長側の光を反射するように変化するものと推論される.したがって,この反応には中枢神経系は直接に関与していないと結論された.すでに先年発表した光吸収性と反射性の色素胞の反応を同時測定する装置(Oshima et al.,1984)の改良を試み, 2種の色素胞の中枢神経系による差動的制御の解明に便利に利用できるようにした.ついで,材料としてイズミダイ(tilapia)を選び,皮膚中の色素胞の分布を検索した.その結果,黒色素胞は鱗の真皮中に存在するもの,同じく真皮に存在するが,単離鱗には付着してこないものが存在し,中枢による制御方式も異なることを見出した.ナマズ,コイを使用し,末梢における色素胞の神経支配が交感神経のみであり,副交感神経の関与がないことを解剖学的に示し,従来の生理学的・薬理学知見を確証した.サカサナマズ(upside-down catfish)は腹部を上にして遊泳することで知られているが,通常の魚種には見られない腹部皮膚にも色素胞,特に黒色素胞が多数顕存在し,隠蔽色の発現に役立っていることを確認した.この魚種の背部・腹部の黒色素胞は薬理学的解析により,ともに交感神経節後繊維により細胞内色素凝集が制御されていることを明らかにした.この背部・腹部の黒色素胞は中枢神経系により差動的に制御されおり,したがって,背部,腹部の皮膚色の変化の過程,ことに速度が異なることを見出した.しかし,この差が効果器,すなわち色素胞自体の運動性の差に起因する可能性が残り,検討を進める予定である.ネオンテトラの体側の青紫色の縦縞が日周期的に変化し,夜間は青緑色になることが知られている.通常の魚類の体色の日周期的変化,特に夜間皮膚色が明化する現象は,松果体からのメラトニン分泌が低照度下で増加することによるが,ネオンテトラでは,縦縞内の運動性虹色素胞が直接に光を受容し,その結果,細胞内のグアニン小板重層の各小板の間隔を狭ばまり,より短波長側の光を反射するように変化するものと推論される.したがって,この反応には中枢神経系は直接に関与していないと結論された.研究課題遂行のための適切な実験材料としてティラピアを選択した。まず皮膚での色素胞の分布から観察した結果、黒色素胞は(1)鱗に存在するもの、(2)鱗の黒色素胞と同じ層にあるが、単離鱗についてこないもの、(3)鱗の直下に存在するものに大別できることがわかった。このうち(1)は非常に細長い枝を有し、完全凝集に時間がかかるタイプであった。単位面積当りのこのタイプの黒色素胞の数は背側で多く、腹側で少なかった。(2)のタイプはかなり高密度に分布し、形態的には枝は太く、中心部の面積も大きく、積極的に体色変化に関与していると思われる。(3)は黒色素胞一虹色素胞複合体として存在していた。続いて、これら色素胞を支配する神経の走行を検索した。約30cm位のティラピアの背鰭にHRPを注射して13日後、最終ganglionを取り出し、固定,流水洗後、0.5%DAB(3,3 ́-ジアミノベンチジン)と1%【H_2】【O_2】水溶液中に30分つけてから、脱水,封入をした。また、鱗と鱗の間にHRPを注入し、17日後、ganglionを取り出した。その際、潅流水洗によって血液を流しておくと効果的な観察ができた。

このように、神経の走行の形態学レベルでの検索を経て、現在まで、電気生理学的実験の準備ならびに予備的な実験を積み重ね、より良い精度の結果を得られるようなシステムの改良や、方法の検討を進めている。まず交感神経節においてニューロンが実際に替力していることが確認され、神経支配が交感神経のみであることを示唆するデータが得られている。しかし、脳における体色変化の同定をはじめとする諸問題は、引き続いての検討課題として残された。
単語認知における表記差効果を規定する要因の分析

日本語の単語認知に関するこれまでの研究は、単語を表記する文字のタイプと単語の処理課題のタイプの間に交互作用が見られることを示してきた(表記差効果)。すなわち、読み上げのような音韻性の課題では、表音文字であるかなで書かれた単語の反応時間が、表語文字である漢字で書かれた単語の反応時間に比べて有意に速くなり、他方、範疇化課題のような意味性の課題ではそれが逆になると言うのである。この理由として、従来主張されてきたのは、各表記語の語彙接近過程において、音韻的符号化介在の必要性に違いがあるということであった。すなわち、かな表記語では、必ず音韻的符号化を経て語彙接近がおこるのに対して、漢字表記語では、音韻的符号化無しに語彙接近が可能であることを反映する結果だと解釈されてきたのである。しかし、他方では、日本語の特色である同音異義語の多さに起因する意味符号の特定性における両表記語の違いを反映していると解釈できる結果もある。本研究は、語彙接近過程での音韻符号化の必要性の非対称性が、単語の意味処理課題における表記差効果を説明するのに真に妥当であるのか否かを一連の8つの実験を通して検討することにした。その結果、まず意味処理課題での漢字表記語のかな表記語への優位性は、それが多義語である場合にのみ見られることが示された。また、この表記差効果も意味を特定するための文脈情報を事前に与えることで消失する事が示された。さらに音韻的符号化を妨害すると考えられる課題を同時に行わせても、意味処理課題に見られる表記差効果そのものには影響が無かった。これらの結果は、意味処理課題での表記差効果が、音韻的符号化の介在の有無で説明するよりも、意味的符号の操作における両表記語の違いという観点からの方がうまく説明できることを示していた。かな表記語と漢字表記語での語彙接近過程に質的な差異があるのか,もしあるとすれば,それはどのような機序に起困するのかを検討するため幾つかの実験を組織的に実施するのが本課題の目的である。本年度は2年計画の1年目に当たる。従行,かな表記語は,その語彙接近過程において音韻的媒介を必要とし,漢字表記語はその種の媒介無しに語彙表象へ直接接近できるとされてきた。これが音読課題でのかな表記語の,他方意味判断課題では漢字表記語の優位性をもたらすとされてきた。そこでまず最初に意味判断課題での漢字表記語の優位性を確認した上で,さらに音韻的符号化を妨害すると思われる構音抑制課題を実施し,これが漢字表記語のかな表記語に対する優位性をさらに拡大することにつながるのか否かを検討する実験を実施した。この結果,漢字表記記の優位性は構音抑制条件の有無に関わらず,その大きさに変化のないことが明らかにされた。このことは音韻的符号化に原因を求める考え方に否定的なものであった。そこで次に日本語での同音異気語の多さに着目し,これによるかな表記語の意味的あいまいさが,意味判断課題での漢字表記語の優位性の背景にあるのではないかという仮説をたて,これを検討するための実験を行なった。まず,実験に先だってかな表記した際に複数の意味を想記させる語(かな表記多義語)と単一の意味のみを想記させる新(かな表記一義語)を選択するための予備調査を実施した。これにもとづいて,これら各表記語間での意味判断がどのような関係になるのかを調べる実験を実施した。

この結果,漢字表記語,かな表記一義語間の意演判断時間には差がなく,かな表記多義語での判断が前者2タイプの語に比べ遅れることが示された。この結果は,従来の意味判断漢字表記優位説を否定するとともに,表記差効果の機序が語彙接近過程そのものというよりむしろ後語彙接近過程での問題といえることを示唆していた。単語認知過程の理解にとって表記の違いがその認知過程に差をもたらすのか否かということも重要な問題である。日本語では音節的表記である「かな」と語標的表記である「漢字」が使用されるので、この問題を明らかにするために都合が良い。従来、この点について取り組んだ研究から、漢字表記語は音韻的再符号化を経ずに直接意味情報に接近でき、より速い意味処理が可能だとされてきた。その結果、意味課題では漢字表記語の成績が、かな表記のそれにすぐれ、他方命名課題ではその逆の結果が現われるとされてきた。本研究ではこれを単語認知における表記差効果と称し、平成3,4年度の2年にわたってその生起機序を明らかにするための取り組みを行なってきた。その結果、表記差効果を生起させているのは従来言われていた両表記語間に音韻的再符号化の介在の有無があるからではなく、日本語の音韻特性に起因する同音異義語の多さ、換言すれば、意味的あいまいさに依ることが示唆された。本年度は、ローマ字表記語をマスキング及びプライミング刺激として使用した意味判断及び命名課題を用いた実験を4つ実施した。その結果、ターゲット刺激に先行あるいは直後に音韻情報の手がかりになるローマ字綴り語を与えても、意味判断そのものにおける表記差効果は影響を受けないことが示された。これは、漢字とかなの間に認められた認知成績の違いが、音韻的再符号化の介在の有無によるのではなく、同音異義語の存在による意味的あいまいさが主たる理由であるとする解釈を支持するものであった。
蛍光相関分光法による炎症関連転写因子活性定量プロファイル解析の臨床検査への展開

転写因子活性は、がんや炎症性疾患の病態に大きく関わっている。転写因子活性化定量解析に関して、ELISA法が研究レベルで利用されている。われわれは蛍光相関分光学(FCS)を基盤にした解析法を開発した。病態に関連する転写因子(NF-κB、AP1、NF-IL-6、SP1、NF-AT、OCT1)と特異的に結合する蛍光DNAプローブを作製し、TNF-α、LPS、PMA/Ionomycinで刺激したリンパ球において、NF-κBとAP1活性の1.5倍増加を確認した。FCS法は、ELISA法と比較して迅速、簡便、容易でハイスループットな転写因子活性定量検査利用に期待できる。本研究は、物質のブラウン運動が測定できる蛍光相関分光法(FCS法)を改良し、生体材料から転写因子を迅速に定量測定できる方法を開発し臨床応用することが目的である。そこで、細胞内転写因子定量測定をを確立しその測定精度を高めるための検討を行った。1)細胞(培養細胞、リンパ球)から核蛋白を抽出し、転写因子NF-κBの測定精度をための条件として、ヘパリン採血、EDTA採血とも問題にないこと、核蛋白保存条件は-80°C以下に保つ必要のあることを確認した。2)FCS測定は、MF20(オリンパス社)を利用した測定プロトコールを定めた。MF20の測定プログラムは1成分計算が搭載されているは、生体材料測定には2成分モデルへデータ計算を変更する必要がありそのプログラム変更を確定した。次に、細胞反応性は、複数の転写因子の活性調節により成り立っているため、転写因子活性化プロファイル解析が重要になってくる。転写因子発現プロファイルは、DNA-核蛋白アレイ(TF-activation profiling plate array 1, Signosis ,Inc)による48種類の転写因子発現プロファイル解析が研究室レベルで実施されている。しかし、アレイ解析は半定量結果しか得られず測定に時間を要するため、転写因子プロファイル発現の定量化にこのFCS応用を考え研究を進めている。平成27年度は、測定結果の検証を進める基盤となる転写因子NF-κBシグナル伝達系の異なる細胞株を樹立した。現在、この細胞株Fを用いた転写因子発現プロファイル解析を行っている。蛍光相関分光法(FCS法)は1分子計測技術であり、われわれはオリンパス社製MF20機器を利用している。測定には振動や埃の困窮を極力さける必要があるが、平成27年度は富山大学医学部全体が耐震工事と重なり、機器を装備している研究室は、耐震工事のため、機器測定が不能となり、工事終了後は機器調整に時間が長時間費やされた。そのため、MF20を用いた臨床検体の解析は遅れているが転写因子解析検証のための基盤に必要な細胞株準備や臨床検体処理を中心に研究をすすめてトータルとして平成28年度までに順調に進展していると評価した。本研究は、1分子レベルで高感度に物質量が定量できる蛍光相関分光法(FCS法)を基盤に、細胞内情報の集約機能を有する各転写因子活性量を定量化する検査法を確立し、本方法と細胞内分子を網羅的に解析する細胞発現アレイやCAGE法(CAP analysis gene expression)と比較検討することで遺伝子発現プロファイルの臨床応用開発を進めることである。本年度の実績は以下の通りである。1)転写因子NF-kappa BとAP-1活性化測定のためのプローブを選択し決定した。FCS測定は、MF20機器(オリンパス社)を利用し、定量化のための解析プログラムを開発した。2)NF-kappa Bに関する活性化プロファイル解析のために、IKK2ノックアウトマウスからIKK2欠損胎仔線維芽細胞(MEF)株を樹立した。3)この細胞株の特性は、IL-1,TNFで刺激してもIL-6発現が抑制されており、IKK2-NF-kappa Bシグナルがブロックされていることが確認できた。4)IKK2欠損MEFと対照IKK2発現MEFをIL-1βで刺激し、サイトカインアレイを用いたサイトカイン発現プロファイル解析を行った。その結果、IKK2欠損MEFは対照に比して、エオタキシン1、IL-10, MCP-1の発現が上昇しておりTh2優位になっていることが明らかなった。今後、この細胞株を用いてTh2優位になっている理由をFCS法とともにDNA/転写因子発現プロファイルをTF-activation profiling plate arrayを用いた網羅的解析とCAGE法による網羅的遺伝子発現プロファイルと各遺伝子発現に関する転写因子開始点解析など新しい転写因子解析法を組み合わせて明らかにしてゆく計画である。平成27年度はFCS測定機器であるMF20が施設耐震工事のため使用ができない状態であったが、平成28年度から順調に解析できる状態となり順調に解析が進められた。また本研究のテーマであるIKK-NF-κBシグナル系のプロファイル解析の精度向上のために利用する細胞としてIKK2ノックアウトマウスからIKK2遺伝子欠損細胞株を樹立できた。本細胞を利用してサイトカイン発現プロファイル解析による細胞特性が明らかになるなど臨床応用に向けて予定どおり順調に進展していると自己評価した。炎症性疾患、がん、生活習慣病等は組織間、細胞間のネットワークの異常が病因となる。さらにこの異常は、細胞内シグナル伝達の異常から生じる。細胞内情報は転写因子に集約されるため、転写因子活性化を病態解析に活用する検査法開発に取り組んできた。

本研究では、ELISA法による転写因子活性解析と転写因子DNAアレイ法を超えるハイスループット転写因子活性化プロファイル検査法を探索し、蛍光相関分光法(FCS法)を転写因子活性化検査法を新たに構築した。FCS法は溶液中の分子間相互作用を1分子レベルで解析でき、生体内で生じる液相反応でかつホモジニアスアッセイ(洗浄工程不要)のため迅速性が確保できる特徴があるが臨床検査領域への応用例が少ない。本研究は1)NF-κB,NF-IL6(C/EBP)、ATF(C/EBP)、SP1、AP1、NF-ATに特異的に結合できるDNAプローブを作成した。2)患者血液からカラムを用いて迅速にリンパ球を分離し高品質な核蛋白を抽出し、蛍光標識転写因子結合DNAプローブと反応させた。オリンパス社MF20測定機器を用いた2成分解析プログラムによる各転写因子リコンビナント蛋白を基準にした検量線より定量化するFCS法転写因子活性測定プロトコールを策定した。3)添加回収試験にて種々の蛋白質が存在する核抽出液中の転写因子に対して特異的に検出するにはELISA法よりFCS法が優れていることを明らかにした。4)FCS法の転写因子活性化定量法の検証は、Jurkat cellに対してTNF-α、LPS、PMA+Ionomycinで刺激2時間すると、TNF-α刺激でNF-κB活性が1.27倍、PMA+Ionomycin刺激でNF-κBが1.49倍、AP-1が1.62倍、NF-ATが1.23倍の増加を認めた。以上より、FCS法の臨床応用に向けた基盤を確立することができた。転写因子活性は、がんや炎症性疾患の病態に大きく関わっている。転写因子活性化定量解析に関して、ELISA法が研究レベルで利用されている。われわれは蛍光相関分光学(FCS)を基盤にした解析法を開発した。病態に関連する転写因子(NF-κB、AP1、NF-IL-6、SP1、NF-AT、OCT1)と特異的に結合する蛍光DNAプローブを作製し、TNF-α、LPS、PMA/Ionomycinで刺激したリンパ球において、NF-κBとAP1活性の1.5倍増加を確認した。FCS法は、ELISA法と比較して迅速、簡便、容易でハイスループットな転写因子活性定量検査利用に期待できる。測定結果の検証のためとプロファイル解析へ展開するために、転写因子NF-κBシグナル伝達系の異なる細胞を利用して分析する必要がある。そこで、IKK2ノックアウトマウスのMEF(Mouse embryonic fibroblast:胎仔由来線維芽細胞)をSV40でトランスフォームさせた不死化細胞株を樹立した。対照としてIKK2f/fの不死化細胞を同じく樹立した。これらMEFを用い、NF-κB発現差をNF-κBp50,p65に対するELISAとFCS法による定量解析でデータ検討を行う。また、これらMEFを用いてIL-1刺激によるIL
アミノ酸代謝リモデリング分子をターゲットとした新たな膠芽腫治療の開発

がん細胞は正常細胞とは異なり、特殊環境下で増殖や転移などの活発な活動を行うために、さまざまな代謝リプログラミングが起こっている。アミノ酸の中で,グルタミン,セリン,グリシン,トリプトファンの消費ががん細胞で共通して高く、これらのアミノ酸代謝のリプログラミングにより,がん細胞は過酷な環境での生存,増殖が可能となっている。栄養学的非必須アミノ酸の中でセリンは特殊な代謝様式を示し、3ステップの酵素反応[ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PHGDH),ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ1(PSAT1),ホスホセリンホスファターゼ(PSPH)]で3ホスホグリセリン酸(3PG)から合成されるが、グルタミンフリー培地で膠芽腫細胞を培養すると、細胞内セリンの著名な上昇が生じ、代謝酵素PSAT1が上昇し、さらにMTHFE2の発現も上昇していた。メタボローム解析を行うと、グルタミンフリーの培地ではセリンの炭素供給はグルコースからくるものと、それ以外からくるものとに二分され、グルコースからの供給はそれほど上昇してはいなかった。これはグルタミンからの炭素供給が遮断されることで他のアミノ酸から供給されることを意味した。グルタミンフリーによるセリンの上昇はグルコースからの炭素供給でない可能性が高いことから、現在代謝リモデリングについて解析中である。また、グルタミンフリー培地での培養ではMTHFFD2が上昇していたが、組織学的に膠芽腫では壊死周囲の細胞でMTHFD2の発現が高いことを確認した、また、膠芽腫の腫瘍中心部と辺縁部でグルタミン量をGC/MSおよびMRSで計測すると、腫瘍中心部ではグルタミン量が低く、栄養不良状態であることがわかり、中心部では辺縁部に比べセリンが有意に上昇していたことから、培養細胞と同様の機序が働いているものと考えられた。IDH変異のあるグリオーマでは2-ハイドロキシグルタレート(2HG)の産生が上昇するのみでなく、a-ケトグルタール酸(a-KG)補充のためにグルタミン酸代謝が亢進することを見出した。IDH変異のあるグリオーマの診断バイオマーカーとして有用であることを突き止めた。膠芽腫細胞の中では、糖代謝と関連の深いアミノ酸代謝で劇的なリプログラミングが生じているものと思われた。膠芽腫細胞内で、グルタミン,セリン,グリシン,トリプトファンの消費が共通して高い可能性が示唆された。栄養学的非必須アミノ酸の中でセリンは特殊な代謝様式を示し、3ステップの酵素反応[ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PHGDH),ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ1(PSAT1),ホスホセリンホスファターゼ(PSPH)]で3ホスホグリセリン酸(3PG)から合成されるが、グルタミンフリー培地で膠芽腫細胞を培養すると、細胞内セリンの著名な上昇が生じることを見出し、グルタミンフリーの状態ではPSAT1が著明に発現亢進していることを発見した。PSAT1はP-PyrをP-Serに変換するアミノトランスフェラーゼであるが、この酵素をノックダウンすると膠芽腫細胞の増殖は著明に抑制され、cell cyele arrestが起こり、アポトーシスが誘導されることが判明した。以上より、PSAT1はグルタミン不足環境下で非常に重要な酵素であると考えられる。グルタミンフリーの培養液で培養した時のアミノ酸の代謝変化を詳細に解析し、セリンの上昇の鍵となるのはPSAT1であり、その抑制で細胞がアポトーシスを起こし、セリンの生存に対する意義が確認されたため。膠芽腫(グリオーマ)におけるPSAT1の発現および悪性度との関係を解析する。また、PSAT1のノックダウンによる細胞増殖抑制効果およびアポトーシス誘導効果を詳細に検討する。マウス脳グリオーマ移植モデルを用い、PSAT1ノックダウンによる抗腫瘍効果を検討する。

そして、PSAT1のノックダウンとグルタミン合成阻害剤との併用による抗腫瘍効果を検討する。クロマトグラフィーカラム、ガラスバイアルなどが以前購入していたものを使用し、購入量が予定よりも少なく済んだため。また、メタボローム解析のサンプル数が少なく、解析費用が予定折も少なかったためである。これに関しては、次年度にノックダウン、阻害剤などを使用してメタボローム解析を多数行う予定である。
系列反応潜時課題学習に伴う脳機能地図の動態の解明

代表者は脳の前頭前野と呼ばれる領域の一部が、行動選択のルールが複数ある状況には活動する一方、単一のルールしかなければ不活性化されることを発見した。こうした状況依存的な脳領域の活性化は脳の機能地図が不変のものではなく、必要に応じて柔軟に構築・消去されることを示唆し、状来固定したものとして捉えられてきた脳機能地図についての概念の修正を促すものである。1).順序動作学習のモデルとして系列反応潜時課題を遂行するように二頭のアカゲザルを訓練した。次に、複数のキーを不特定順序で押す(Random)課題と、ルーチン化した一定の順序で押す(Sequence)課題をサルにさせながら一次運動野からニューロン活動を記録した。その結果、同じ要素動作(例.キー1→キー2の順に押す)でも動作がルーチン化した順序の一部として実行された時に特異的な活動を示すニューロンが一次運動野に多数(全課題関連細胞の40%)見つかった。又、RandomとSequenceにおけるこれらのニューロン活動の違いは運動速度や筋活動の違いでは説明できないことを統計的に明らかにした。従来、一次運動野は動作の順序制御より個々の要素運動の実行に関与しているとされてきたが、こうした所見は高度に運動学習が進んだ結果、一次運動野自体にも動作の順序制御に関与する神経ネットワークが構築されていることを示唆する。2).本計画とは別な研究によって前頭前野の内側部において上肢の運動に関連した領域が状況依存的に出現・消滅することを発見した。既にある上肢領域のニューロン活動が課題条件によって変わる現象はこれまでにも報告されているが、上肢領域自体が動的に再構成される現象はこれまでに報告された例がなく、大脳皮質機能地図の動態を考える上で重要な所見である。前年度の研究で前頭前野の後内側部(ブロードマンの8B野)において上肢の運動に関連した領域が状況依存的に出現・消滅することを発見した。既にある上肢領域のニューロン活動が課題条件によって変わる現象はこれまでにも報告されているが、上肢領域自体が動的に構築・消去される現象はこれまでに報告された例がなく、大脳皮質機能地図の動態を考える上で重要な所見と考え、更に詳細な解析を行った。まず、競合解決課題を遂行中のサルの本領野には運動に関連して活動するニューロンが多数存在することが明らかになった。ところが、課題から競合の要素を取り除いた条件で同じ運動をさせた場合には本領野からは運動に関連した細胞活動が消失することが分かった。更に、常に競合が発生する条件下で同じ運動課題をサルにさせた場合にも同様に運動関連ニューロンが消失した。このことから、本領野は競合の存在それ自体ではなく、競合が発生するかしないか予測不可能な状況下での運動行動の制御に関わっていると考えられる。なお、霊長類の8B野については大脳の高次運動領野との密な線維連絡がありながら、その行動制御における役割は従来知られていなかった。この領野の機能を明らかにしたのは、我々の研究成果が世界初である。又、本課題遂行中の8B野, pre-SMA, SMAのニューロン活動を同時に記録し、領野間の信号のやり取りを解析したところ、本課題遂行時には8B野とSMAとの間にLFPの相関があり、しかもその相関の因果関係はLFPの周波数帯域によって異なることを見出した。以上は計画書中の"多チャンネル信号記録及び多数の神経領域における神経活動の経時的解析"に従って実施したものである。競合解決課題を遂行しているサルのニューロン活動を記録する実験によって、前頭前野の後内側部(以下、pmPFCと略す)に上肢の運動に関連した領域が状況依存的に出現・消滅することを発見した。pmPFCのニューロン群は、競合・無競合試行が混在する条件下(mixed condition)では上肢の運動に関連して活動するが、課題の全試行を無競合試行だけにしても、競合試行だけにしても(single condition)活動しなくなる。こうしたことから、pmPFCは競合ありとなしの場合で異なる行動戦略を随時使い分けなくてはならない時に行動制御に参加すると考えられ、"反応選択の仕方を選択"するという、いわばメタなレベルでの行動制御に関与している事が窺われる。今年度は、こうした今までの所見の蓄積を踏まえて以下の3つの観点からデータの再解析、及び発展研究を実施した。(1).認知負荷依存的な神経回路網の最適化:上記の様にpmPFCは課題条件によって動的に活性化・不活性化する。そこで、そのpmPFCからの入力を受ける皮質運動野、具体的には前補足運動野、補足運動野(以下、それぞれpre-SMA,SMAと略す)の神経回路がどのように最適化されるか、neuron dropping analysisと呼ばれる手法によって解析した。その結果、SMAにおいては上記single conditionではmixed conditionに比べて、より少数のニューロン活動で正確に正解となる反応を表現できている事が明らかとなり、認知条件によって動的に神経回路網が最適化されている証拠が得られた。(2).カオス理論によるニューロン活動の解析・モデル化:東京大学・合原一幸教授らとの共同研究によりpmPFC

ニューロンのスパイク活動がカオス理論で説明できることを見出した。このことは初期状態の僅かな違いによって未来の状態が大きく変化することを意味し、一つのニューロンが多面的に情報を表現しうる可能性を理論的に示した。(3).冒頭の如くpmPFCは競合の有無によって反応選択の仕方を随時使い分けるプロセスに関与していると考えられる。そこで予め競合の有無をサルに告知しておけばpmPFCは活動しないだろうとの予測に基づいて追加実験を実施し、前期の仮説を補強する結果を得た。
胃食道接合部癌の幹細胞の同定と応用による治療法の開発

胃食道接合部は扁平上皮細胞と円柱上皮細胞が境界部を形成し悪性腫瘍の発生頻度が高いが、発生機序については不明である。我々は胃食道接合部に特異的に発癌するモデルを作成し、胃食道接合部癌の起源と発癌機序を検討した。胃粘膜特異的にKRAS遺伝子とTGFbR2遺伝子に変異を導入すると、約6週で扁平上皮円柱上皮接合部(SCJ)に浸潤性の腫瘍が発生し、扁平上皮、腺上皮、幹細胞の形質を示した。腫瘍細胞株からオルガノイドを作成し、検討したところ、Wntリガンド、EGF、Nogginなどから独立した生存条件を示した。KRT19陽性、Lgr5陰性の細胞が接合部癌の起源となっている可能性が示唆された。本研究では胃食道接合部癌の幹細胞の同定と治療法の開発を目標としている。H26年度は、K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスにタモキシフェンを投与し、経時的に胃食道接合部の組織を免疫染色と遺伝子発現解析を行った。腫瘍部ではKi67, PCNAの細胞増殖マーカー蛋白が高発現していた。また細胞形質マーカーでは扁平上皮のマーカーであるKRT1, KRT14の高発現に加えて腺上皮の形質マーカーとして用いられるKRT7, KRT8の発現がみられた。また遺伝子発現変化でも同様の変化がみられ、さらに幹細胞のマーカーとして知られるSOX2, SOX9, CD44などの分子の発現が著明に増加しており、本モデルの接合部癌が扁平上皮と腺上皮の形質、また幹細胞の形質を有することが示唆された。またこれらの接合部癌から二種類の癌細胞株の樹立に成功した。今後オルガノイドが作成できるか三次元培養を試み、種々のシグナル刺激により分化誘導が可能であるか検討する。接合部癌幹細胞の同定のためにRosa-EYFPおよびRosa-LacZ遺伝子を導入し、腫瘍細胞の系譜追跡を行った。腫瘍細胞はEYFPおよびb-galactosidase染色を行い、弱いながらもほぼすべての細胞がK19陽性細胞から発生していることが示された。H26年度は、K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスにタモキシフェンを投与し、胃食道接合部癌を作成した。腫瘍部では細胞増殖マーカーが高発現し、扁平上皮マーカーであるKRT1, KRT14、腺上皮の形質マーカーKRT7, KRT8の発現がみられた。さらに幹細胞のマーカーであるSOX2, SOX9, CD44などの分子の発現が増加しており、本モデルの接合部癌が扁平上皮と腺上皮、また幹細胞の形質を有することが示唆された。LacZ遺伝子を用いて腫瘍細胞の系譜追跡を行い腫瘍細胞はK19陽性細胞から発生していることを確認した。またこの接合部癌から二種類の癌細胞株を樹立した。H27年度は樹立した癌細胞株を用いてオルガノイドを作成した。いずれの細胞株でも三次元培養が可能であり、腺管様の出芽形態を示した。これらのオルガノイドは単層の細胞で形成される正常のオルガノイドと異なり、重層しており扁平上皮様の形質が認められた。よって本研究で樹立した接合部癌の癌細胞株は扁平上皮と腺上皮の双方の形質を有していると考えられた。またこのオルガノイドもSOX9, CD44の幹細胞マーカーを発現していた。さらに分化誘導因子についてこの培養細胞株を用いて検討した。Wntシグナルリガンド、EGF、TGFbシグナルのリガンド、またそのアンタゴニストであるNogginなどで刺激し、イムノブロットやq-PCRを施行したが、扁平上皮マーカーp63、腺上皮マーカーMUC4ともに有意な発現変化は見られず、接合部癌の分化誘導因子はこれらのリガンド以外のものである可能性が示唆された。またK19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/f; CDH1 f/fマウスを作成し、e-cadherin遺伝子の発癌への影響について検討した。このマウスにタモキシフェンを投与すると3w後にやはり接合部特異的に腫瘍が発生した。本腫瘍でも転移は認めず、組織型も同様であり、K19陽性細胞由来の接合部癌におけるe-cadherin遺伝子の影響は限定的であると考えられた。マウスの系統樹立、発癌モデルの解析はほぼ計画通りに進んでいる。また今年度は発生した癌細胞株からのオルガノイドの作成と解析を行った。現在までの刺激では特異的分化を促すシグナルを同定できていないため、今後さらなる薬剤をスクリーニングする予定である。本研究によってオルガノイドの標本を作り、その遺伝子発現を免疫染色で検討する実験系を確立した。一方で、接合部癌幹細胞の起源細胞については引き続き検討中であるが、未だに幹細胞の同定には至っていない。K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスを用いると接合部に限らず、胃粘膜全体が系譜追跡されてしまい、接合部特異的な幹細胞を指摘しえない。

一方でK19-cre; TGFbR2 f/fマウス、K19-cre; Rosa-LacZマウスでは、接合部では系譜追跡される細胞が存在せず、KrasG12D+TGFbR2ノックアウトが腫瘍化には必要であると考えられた。K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/f(KRT)マウスにタモキシフェンを投与し、胃食道接合部(SCJ)特異的腫瘍は88%で見られた。病理学的には、扁平上皮癌と腺癌を混在したような腺扁平上皮癌と考えられ、著明な粘膜下層への浸潤を認め、扁平上皮マーカーであるKRT1, KRT14とともに腺上皮の形質マーカーKRT7, KRT8の発現がみられ、さらに幹細胞のマーカーであるSOX2, SOX9, CD44などの分子の発現が増加していた。接合部腫瘍を摘出、分離、培養し、接合部腫瘍細胞株(mJT1、mJT4細胞)を樹立した。三次元培養により、オルガノイドを作成した。培養条件によった有意な遺伝子発現変化はみられなかった。Wntシグナルリガンド、EGF、TGFbシグナルのリガンド、またそのアンタゴニストであるNogginなどで刺激したが、扁平上皮マーカーp63、腺上皮マーカーMUC4ともに有意な発現変化は見られなかった。KRTマウスにCDH1 f/fマウスを交配して胃食道接合部腫瘍について検討した。このマウスでも3w後接合部特異的に腫瘍が発生したが、転移は認めず、組織型も同様であり接合部癌におけるe-cadherin遺伝子の影響は限定的であった。KRTマウスにLacZ遺伝子を導入して染色によって追跡し、接合部に発生する腫瘍はK19陽性細胞が起源であることがわかった。また接合部深部腺管において6w後も染色されている細胞が残存し、CD44やSOX9などの幹細胞マーカーを強く発現しており腫瘍との類似性が示唆された。Lgr5-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスを作出したが、KRASとTGFbの遺伝子改変では腫瘍化をきたさなかった。すなわちK19陽性かつLgr5陰性細胞が起源になっている可能性が考えられた。胃食道接合部は扁平上皮細胞と円柱上皮細胞が境界部を形成し悪性腫瘍の発生頻度が高いが、発生機序については不明である。我々は胃食道接合部に特異的に発癌するモデルを作成し、胃食道接合部癌の起源と発癌機序を検討した。胃粘膜特異的にKRAS遺伝子とTGFbR2遺伝子に変異を導入すると、約6週で扁平上皮円柱上皮接合部(SCJ)に浸潤性の腫瘍が発生し、扁平上皮、腺上皮、幹細胞の形質を示した。腫瘍細胞株からオルガノイドを作成し、検討したところ、Wntリガンド、EGF、Nogginなどから独立した生存条件を示した。KRT19陽性、Lgr5陰性の細胞が接合部癌の起源となっている可能性が示唆された。マウスの系統樹立、維持が順調であり、計画通りにマウス発癌モデルを用いた癌発生の検討がすすんでいる。タモキシフェン投与による発癌も技術的に問題なく、解析できる発生率が得られている。免疫染色による表現系、細胞形態の解析はほぼ完了している。また癌の起源細胞の同定は、レポーター遺伝子の樹立と解析がはじまったところであるが、レポーターがうまく働いているのは確認できており、タモキシフェン投与からの期間を短く設定して、発生の起源に迫ることは可能と考えている。オルガノイドを用いた分化誘導法の検討は現在進行中である。接合部特異的な系譜追跡のモデルとしてK19-cre; KrasG12D; Rosa-LacZマウスを樹立し検討する。
新しい素材を用いた両親媒性クロマトグラフィー用充填剤の合成

グルタミン酸メチルやポリプロピレングリコールメタクリレートのような両親媒的なモノマーからクロマトグラフィー分離のための多孔質球状物を調製した。前者は独自に開発した懸濁蒸発法を用いて、後者はエチレングリコールジメタクリレートとの懸濁共重合によって達成された。1.ポリ(グルタミン酸メチル)、以下PMLG、から調製される球状体は希釈剤としてデカヒドロナフタレンやドデカン酸メチルを用いることによって容易に多孔度を調節できることが明らかになった。水溶性多糖類を用いたゲル浸透クロマトグラフィーでは排除限界分子量において200万,空孔率において95%が達成された。2.このPMLG球状粒子は水素だけでなく有機溶媒系で使用できることが確認された。水からメタノールあるいはテトラヒドロフランへの溶媒置換は容易であり、膨潤度や多孔度もこれらの溶媒においてあまり変化しない。3.PMLG球状粒子は極めて耐流速性にすぐれている。例えば排除限界分子量100万の粒子でさえ、容易に数ml/min(5mmI.D.)を達成することができる。これらの特性はPMLGがポリペプチド特有の高次構造を形成していることに由来する。4.ポリプロピレングリコールメタクリレートからの球状粒子は重合時に添加する希釈剤の極性および添加量によって疎水性が著しく異ることが見出された。粒子の疎水性は重合時に形成される希釈剤の相分離ドメインの極性と関係しているものと考えられる。一方、この疎水性は従来の逆相クロマトグラフィー用充填剤と比較して小さいために、比較的疎水性の小さい物質、例えば、生体関連物質の分離が有効であることが確認された。
特異体質性薬物性肝障害発症の個体差の決定因子の解明と予測試験系の開発

最近の薬物性肝障害(DILI)の予測研究は、特異体質性(idiosyncratic)に分類される発症頻度が極めて低く重篤なDILIに特徴的な「発症の大きな個人差」の原因解明が未だなされておらず、予測手段もない。本研究では、最新の知見や革新的技術を基に、(1)血漿及び肝臓エクソソームの解析、(2)肝非実質細胞の役割検討、(3)免疫因子の導入や欠失による検討、を主な課題として、特異体質性DILI発症の著しい個体差の原因を解明し、その予測試験系開発によって医薬品開発や臨床に資することを目的とする。
肺気腫進展様式から類推する肺胞破壊の原因

COPD臨床検討では、82名を前向き観察研究に登録し、観察期間終了である2016年6月末日以降に最終解析予定である。血清中の抵抗力を司る物質が多いと、COPDの増悪が少なくなる傾向を見出しており、観察期間終了後に解析予定である。タンパク分解酵素を気道内に投与することにより、肺気腫のモデルマウスを作成し、弾性線維合成関連蛋白によって、肺気腫の発症・進行が抑制できるか検討した。現時点では、劇的な肺気腫形成の抑制は確立出来なかったが、肺の一部に傷害が修復しているように見られる箇所があり、修復・再生過程をさらに詳しく解析し、治療方法確立を目指す予定である。ヒトCOPDにおける臨床検討平成26年4月の報告書作成時点で当院外来通院中の安定期COPD患者78名が前向き観察研究に参加されている。臨床検討に際してCOPD患者の横断的検討ならびに経年変化評価のため前向き臨床データの蓄積を採取しているほか、それと併せて血中全長DANCEと切断型DANCEの解析、in vitroでリンパ球の自己免疫反応や炎症抑制能を評価するため、血清、血漿、末梢血単核球を単離・凍結保存を行っている。また、COPD増悪時には炎症プロファイル、血中DANCE量が変化していることが予想されるため、臨床研究参加者のCOPD増悪時にも上記評価を行っている(平成26年4月時点で5例)。動物実験平成25年度は野生型マウスのエラスターゼ経気道投与肺気腫モデルを用い、以前に実施したDANCE投与による治療効果の再現実験を行ったが、再現性に乏したった。この点についてはエラスターゼにより誘導される気腫が高度なため、DANCEによる治療効果が得られない可能性が考えられた。現在エラスターゼ投与量の確立や投与手技の標準化を目標としたエラスターゼ経気道投与肺気腫モデルの検証を行っており、それと併せてDANCE投与スケジュールの検討を行っている。モデル内、モデル間の生理学的評価を目的として小動物用肺機能測定装置を用いた評価を行っているほか、マウス飼育・実験室を開室し同室に小動物用CT(Latheta LCT-200,日立アロカメディカル)を導入し、新たな評価ツールとして応用を開始している。「ヒトCOPDにおける臨床検討」平成27年4月の報告書作成時点で、同意取得者は82名(のべ94検体)が前向き観察研究に参加されている。対照として、健常者3名からの検体も収集済みである。外来にて前向きの観察を継続しており、1年目、2年目の観察が終了するごとに増悪の有無や、呼吸機能の推移などの臨床データを収集している。「動物実験」昨年度、エラスターゼ経気道投与気腫マウスにおけるDANCEの治療効果が得られなかったことを報告した。その後、オリジナルの4分の1まで減量することによって、安定した気腫モデルを作成することができるようになった。小動物用CT(Lantheta LCT-200)が稼働開始し、エラスターゼ投与後2週間の時点ではDANCE経気道投与により、画像上の気腫化が抑制できるpreliminary dataが出始めている。COPD臨床検討では、82名が前向き観察研究に参加され、対照として、健常者3名からの検体も収集済みである。外来にて前向きの観察を継続しており、呼吸機能の推移などの臨床データを収集中で、採集観察期間終了である2016年6月末日以降に最終解析予定である。予備検討にて、健常若年者と比して、COPD患者ではToll-like receptor ligandsによる刺激後に細胞内IFN-γ陽性細胞の増加と抑制性サイトカイン陽性細胞の減少が示唆されたが、症例数を増加させるにつれ、ばらつきが多く、一定の傾向が得られなくなった。一方で血清中の液性因子が増悪予測因子となる傾向を見出しており、観察期間終了後に論文作成予定である。エラスターゼ経気道投与気腫マウスでは、オリジナルの4分の1まで減量することによって、安定した気腫モデルを作成することができるようになった。小動物用CT(Lantheta LCT-200)が稼働開始し、エラスターゼ投与後2週間の時点ではDANCE経気道投与により、画像上の気腫化が抑制できるpreliminary dataがみられたが、同時に施行した病理学的検討でリンパ球浸潤を認めた。このリンパ球浸潤はヒト重症COPDで見られるリンパ濾胞と相同性があるのか、あるいは、本モデルは、肺気腫以外の病態が関与しているのか、さらなる検討が必要であると考えられた。また、マウスを低用量エラスターゼで前処理後に長期喫煙すると、微細なエラスターゼ傷害部位が著しく顕在化した。さらに、lineage trace modelで一部GFP陽性II型肺胞上皮由来の扁平上皮が見られた。このことは、II型からI型肺胞上皮への分化による修復機転や、あるいはII型肺胞上細胞の分化障害が肺気腫病変の形成に関与している可能性を示唆するものと考え、引き続き細胞外マトリックスとの関連を検討していく予定である。

現時点では、劇的な肺気腫形成の抑制は確立出来なかったが、肺の一部に傷害が修復しているように見られる箇所があり、修復・再生過程をさらに詳しく解析し、治療方法確立を目指す予定である。ヒト研究におけるエントリーは順調である。昨年度は予備検討にて、健常若年者と比して、COPD患者ではToll-like receptor ligandsによる刺激後に細胞内IFN-γ陽性細胞の増加と抑制性サイトカイン陽性細胞の減少が示唆されたが、症例数を増加させるにつれ、ばらつきが多く、一定の傾向がえら得るかどうかが今度の検討課題である。しかしながら、手技自体は確立しており、観察終了時には何らかの知見が得られるものと考える。動物実験概要に記載したとおり、仮説の検証にはいたっていないが、エラスターゼ投与量・DANCE投与量・タイミングなどの予備的検討が順調に進行しており、小動物CTなど評価系も確立した。呼吸器内科臨床検討では、引き続き、連携研究者において血中全長DANCEと切断型DANCEの解析を行う。末梢血リンパ球における表面抗原発現型・特に記憶B細胞の多寡と、現在蓄積が進んでいる胸部CT画像や生理学的データなど前向き観察研究の臨床データとの関連を評価し、COPD患者における新たなPhenotypeの分別やそれに基づいた疾患管理、治療応用の可能性を探る。動物実験では、新たに確立したエラスターゼ少量投与モデル(野生型)を用い、気腫形成の時間経過とDANCE発現などの細胞マトリックス発現・障害の時間経過、リンパ球応答の時間経過などを評価する。小動物用CTが安定稼働するようになったので、途中経過は生体での画像的評価を時系列で成功し、サクリファイスする最終日(21日目)には、小動物用肺機能測定装置を用いた生理学的評価と病理学的変化など多角的評価を行うことで肺気腫進展様式の差異を同定し、それに基づき生化学的、免疫学的差異の評価を行い、平行して、DANCE投与による治療効果の評価実験を行う。可能であれば、さらに、連携研究者が作成したDANCEを過剰発現するノックインマウスなどを用いて慢性喫煙刺激に対する気腫感受性・自己免疫応答の有無の評価を行う。最終的にDANCEの喫煙感受性予測マーカーとしての応用、治療への応用を目標とする。ヒト研究においては、エントリーが順調であり、平成25年度にはToll-like receptor ligandsを用いたin vitroでのリンパ球刺激系を用い、マルチカラーフローサイトメーター(BD LSRFortessaTM)を用いた細胞内サイトカインの評価を行う予備検討を行うことも可能であった。若年健常者と比較してCOPD患者において、IFNγなど炎症性サイトカイン産生細胞は上昇し、抑制性サイトカイン産生細胞は低下していた。この結果は健常者と比較したCOPD患者におけるリンパ球の反応性の差を支持するものであった。また、頻回にCOPD増悪を呈する症例においては特徴的な反応を示す可能性が示唆された。動物実験では予備検討の再現には至っていないが、野生型マウスを用い、これまでに確立されている6か月間の慢性喫煙鼻部暴露肺気腫モデルに加え、タバコ煙抽出物を用いた新規喫煙関連肺気腫モデルの確立を行っている。
日本における楽器卸商と特約店団体の歴史的考察

本研究はメーカーによる流通支配が徹底できない、日本の固有の状況は何なのかを解明することであり、楽器産業における卸商と特約店団体の役割を検討し、日本の楽器産業に関する研究を深めることである。意義は、日本の流通経済の中で発生した「関係的契約」を歴史資料から詳細に分析することで、卸商の存在理由、小売店の自立性の意味を明らかにすることである。日本の流通はアメリカと比較して、複雑で、流通経路が長いことが指摘されているが、これは歴史的な背景をもとに成立っているのであって、日本の流通機構が遅れているためではない。本研究によって、日本の流通機構の成り立ちの一端を示し、今後の流通システムの在り方を提示する。
イオン能動輸送機構の結晶学的研究

本研究の目標は筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造をまずは、既に薄いながらもX線レベルの三次元結晶が得られていたカルシウム結合状態(ElCa^<2+>)の結晶を用いて、原子分解能で決定し、さらに他の生理的状態に関しても結晶化を進めることであった。本研究は我々の期待を上回る速度で進行し、3つの状態について原子モデルを構築でき、さらに他の2つのカルシウム結合状態(E1ATPとE1Pのアナログ)についても結晶化に成功している。この結果、カルシウムと燐酸の離脱に伴う構造変化を明らかにすることが出来た。すなわち、カルシウムの離脱に伴い10本ある膜貫通ヘリックスのうち、6本が大きな再配置を起こし、カルシウム結合時には大きく離れていた三つの細胞質ドメインはコンパクトに集合することが判明した。膜貫通ヘリックスのうち2本は、膜に対し垂直方向の運動成分を持ち、カルシウムの離脱・結合に伴って、ピストンのように運動すること、すなわちP型イオンポンプは原子サイズの手押しポンプのような機構を持っていることが明らかとなった。その成果の一部は2000年6月と2002年8月にNatureに、2002年12月にPNASに発表することが出来た。以上の成果は世界的注目を集め、NatureやNature Structure BiologyのNew & Views、ScienceのEditor's choiceで詳しく紹介された他、世界標準の生化学、分子生物学の教科書に最近の大きな成果として紹介されている。本研究では、特定研究で進行中である筋小胞体カルシウムATPaseのカルシウム存在下における結晶構造の解析と並行して他の生理的状態の構造を明らかにし、イオン能動輸送機構の構造的解明を目指している。そのために、まずATP結合部位の検討を行い、カルシウム存在下で得られた構造モデルを電子顕微鏡法によって得られたカルシウム非存在下のマップにフィットすることを試みた。ATP結合部位を決定するために、蛍光アナログであり、親和性が最も高いTNP-AMPを用い、可視化を試みた。蛍光強度の増大が観察できたので、結合が期待されたが、実際、差フーリエ法でその位置を決定することが出来た。結合に直接関与している残基はPhe487であり、部位特異的変異の結果とよく一致するものであった。この結果、リン酸化部位とアデノシン結合部位は別のドメインにあり、25Å以上離れていることから、能動輸送中には大きなドメイン運動が起こることが判明した。この結果はさらに原子モデルをカルシウム非存在下のマップにフィットすることで確認された。このマップはデカバナジン酸で誘導されるチューブ状結晶から電子顕微鏡によって得られたものであり、低分解能(8Å)ではあるが明らかに異なった生理的状態に対応している。フィッティングは非常にうまく行き、細胞質ドメインのみならず,分子全体にわたる大規模な構造変化を起こしていることが明らかになった。この状態の構造はもっと追求する価値が十分にある。本研究の目的は、筋小胞体カルシウムATPaseに関し、すでに得られていたカルシウムを結合した状態の三次元結晶に加えて、本酵素の異なった生理的状態での結晶を作製し、その三次元構造を高分解能で解くことである。特に目指したことは、カルシウム非存在下の結晶を得ることである。本酵素は、可溶化した場合カルシウム非存在下においては急速に失活してしまう。安定化の為には強力な阻害剤であるタプシガーギンを用いることが考えられた。カルシウム存在下で可溶化・精製した標品にタプシガーギンを加えて透析すれば、非常に安定であり、三次元結晶も十分な大きさのものが得られることが判った。一応3.5Å分解能までのデータ収集にも成功し、現在解析を進めている。さらに、燐酸化状態の構造を得るべく検討を進めた。その結果、マグネシウムとフッ素を結合した状態は極めて安定であり、タプシガーギンを必要としないことも判った。問題は、精製であったが、これも、これまでと同様の色素カラムによる精製方法が使えることが判った。三次元結晶化にも成功し、小さいながらも3.3Å分解能までの反射を与える結晶が得られた。

スプリング8でデータを収集し、デカバナジン酸存在下で得られるチューブ状結晶の電子顕微鏡法によって得た密度図に基づいて得たモデルを用いて、分子置換法による解析を試みている。まだ未完成であるが、解析は順調に進行しており、能動輸送の本質が本研究によって解明されると期待される。本研究ではイオン能動輸送のメカニズムを高分解能結晶構造解析によって明らかにすることを目標とし、特に筋小胞体カルシウムATPaseの構造解析を行ってきた。このイオンポンプに関しては、既にカルシウム結合時(E1Ca)の構造を2.6Å分解能で決定することに成功した。従って、カルシウム非存在下(E2)、カルシウム非存在下のリン酸化状態(E2P)での構造決定を次の目標とした。研究は極めて順調に進行し、E2に関しては強力なる阻害剤であるthapsigargin存在下で2種の結晶を作成することに成功した。そのうちP4_1対称性を持つ結晶は一軸が600Å近くあり、データ収集は困難であったが、SPring-8BL44XU(阪大・蛋白研ビームライン)で3.1Åまでのデータ収集に成功し、分子置換法によって構造を決定できた。ElCa^<2+>の構造とは大きく違っており、Ca^<2+>の輸送に関する重要な知見が得られた。また、E2Pに関してはMg/F複合体の結晶化に成功し3.2Å分解能での一応の構造モデルは得られた。しかるに、最近になって結晶の改良によって2.9Å分解能でのデータが得られた。