hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨巨細胞腫の発現データベース構築に基づいた新規治療法開発

最終的にはタンパク質リスト統合的解析を進め、Denosumab奏効因子及び奏効遅延因子候補の同定に成功したが、(2)GCTBの悪性度及びDenosumab治療反応性に関わる機能解析・ネットワーク解析、(3)国内外大規模検証によるバイオマーカーの臨床応用を目的とした有用性の確認の遅延が生じた。本研究は、難治性かつ希少がんである骨巨細胞腫(Giant cell tumor of bone: GCTB)の治療成績の改善を目指し、その要となる腫瘍悪性度・治療抵抗性の機序について特定し、悪性度(再発・転移)・治療奏功性に関するバイオマーカーの同定及び、新規治療分子標的の開発を進めた。特に近年GCTBの新規治療薬であるDenosumab(RANKLを標的としたヒト型モノクローナル抗体製剤・分子標的治療薬)が開発され、作用機序(通常、receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)は破骨細胞の分化・成熟・機能および生存を制御して作用しているが、そのRANKLとDenosumabが結合することにより破骨細胞へのシグナル伝達を抑制し骨溶解を防ぐ)は骨巨細胞腫においてはまだ不明な部分も多い。そのため、(1) GCTBの悪性度及びDenosumab治療反応性に関わる発現データベースの構築(主にタンパク質発現)の基に、(2)それらで同定されたGCTBの悪性度及び治療反応性に関わる分子生物学的機能解析やネットワークの解明を進め、(3)バイオマーカーの同定や新規治療分子標的の開発を大規模検証の基に進めた。具体的には、GCTBの悪性度及びDenosumab治療反応性に関わる生物学的な特徴をプロファイリング・データベース構築を行うために、12ペアのDenosumab治療前・治療後凍結手術検体セット収集を行った。その手術検体を用いて網羅的なタンパク質発現をiTRAQ(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)の手法を用い研究を進め、特にDenosumab使用における、組織学的硬化(骨化)に関連するタンパク質発現データベース構築に成功した。それらデータベースはネットワーク解析も行い、RANKL経路との関係解明も行った。同定された因子は免疫化学染色を行い、GCTBのアーカイブ検証セットにて発現検証と臨床病理学的因子との相関を解析した。次年度は(1) GCTBの悪性度及びDenosumab治療反応性に関わる更なる発現データベースの構築(特にmRNA発現、遺伝子変異、代謝産物発現)を行い、(2)それらで同定されたGCTBの悪性度及び治療反応性に関わる分子生物学的機能解析やネットワークの解明を進める。また、(3)バイオマーカーの同定や新規治療分子標的の開発を大規模検証を行う予定である。
交流アークを用いた革新的長尺熱プラズマ流による大面積高速処理技術

革新的な長尺熱プラズマ場を構築し,基板表面の大面積処理技術を確立することを目的とする.熱プラズマは,1万度を超える高温などの特長を有するため,様々な材料プロセッシングへの応用が期待されている.しかし,従来の熱プラズマ発生手法は,数mmから数cm程度の小さな領域にしか発生できない点が問題であった.そこで本研究では,数百A級の電流をミリ秒オーダーで整流することで,新規な交流アーク発生手法を確立し,メートル級の長尺熱プラズマ流を得る.それにより,高速の大面積処理(酸化,窒化,ナノ結晶堆積)技術を確立する.革新的な長尺熱プラズマ場を構築し,基板表面の大面積処理技術を確立することを目的とする.熱プラズマは,1万度を超える高温などの特長を有するため,様々な材料プロセッシングへの応用が期待されている.しかし,従来の熱プラズマ発生手法は,数mmから数cm程度の小さな領域にしか発生できない点が問題であった.そこで本研究では,数百A級の電流をミリ秒オーダーで整流することで,新規な交流アーク発生手法を確立し,メートル級の長尺熱プラズマ流を得る.それにより,高速の大面積処理(酸化,窒化,ナノ結晶堆積)技術を確立する.
植物の光合成遺伝子システムに特有なコアプロモーター構成の起源と役割

植物の核遺伝子の多くはコアプロモーターの成分としてTATAボックスをもっているが、光合成遺伝子群にだけはTATAボックスがあまりみられない。光合成核遺伝子の大部分はもともとは原核型の葉緑体ゲノムにコードされていたものが、進化の過程で核ゲノムに転移し、そこで新たに真核型のプロモーターを獲得したと考えられている。本研究では、光合成遺伝子群が特有なコアプロモーター構成をもつ理由を、その起源と役割の二つの側面から検討する。本年度は、光合成遺伝子プロモーターについて、(1)構造的特徴の検討、(2)キメラプロモーターを用いた機能解析、(3)核ゲノム中でのプロモーター獲得過程を再現する実験系の確立、の3点を中心に研究を進めた。主な成果は以下のとおりである。(1)光合成膜タンパク質遺伝子のプロモーターをシロイヌナズナやイネを材料に詳細に解析した結果、光合成装置は、葉緑体ゲノムにコードされている反応中心サブユニットの周囲をTATA-less型核遺伝子の産物が取り囲み、さらにその周辺部にTATAボックス型核遺伝子の産物が位置している、という階層的な構造をもつことが明らかになった。(2)光合成遺伝子をはじめとする植物遺伝子群からコアプロモーター領域と調節プロモーター領域を取り出し、それらを組み合わせたキメラプロモーターの機能をタバコやイネで解析した。その結果、植物の核遺伝子のコアプロモーターと調節プロモーターの間には、少なくとも3種類の適合性群があり、その群を超えた組み合わせでは適切な転写調節が生じないことが明らかとなった。この知見は、コアプロモーターの類型は遺伝子の発現制御機構と深い関わりのあること示している。(3)シロイヌナズナの遺伝子トラッピング系統約350について外来遺伝子の挿入部位や発現の有無を解析し、核ゲノム中で偶発的に生じる新規プロモーターの構造的特徴を明らかにした。
膵β細胞Xaf-1が膵島機能および歯周組織に及ぼす影響の解明

研究の目的は、膵β細胞におけるXaf1の役割を解明することである。先行研究の結果をふまえて作製済の膵β細胞特異的にXaf1を過剰発現させたマウス(Xaf1-βTgマウス)を用いて、1Xaf1が膵島機能・膵組織炎症および全身に及ぼす影響を明らかにする。さらに、2膵β細胞Xaf1によって引き起こされる病態(糖尿病など)が歯周組織に及ぼす影響を明らかにする。申請者らの先行研究結果よりマクロファージ由来インターフェロン(IFN) βは、膵β細胞のアポトーシスを誘導する事が示唆された。本研究ではXaf1が膵島機能に及ぼす影響、およびそれに伴う全身への影響について検証を行っている。現在までに、膵β細胞をIFNβで刺激した際のXaf1タンパク質の発現増大はsignal transducersand activator of transcription(STAT)1の阻害によって抑制される事を解明した。さらに、マクロファージを飽和脂肪酸(パルミチン酸)で刺激すると、マクロファージにおけるIFNβ遺伝子発現が増大する事を解明した。しかしながら、E.coli lipopolysaccharide (LPS)で刺激した場合に比べるとその発現レベルは低かった。同様にリコンビナントtumor necrosis factor-α、歯周病菌P.gingivalis LPSで刺激した場合にはIFNβ遺伝子発現の増大はほとんどなかった。これらの結果をふまえ、Xaf1発現が亢進した状態にある膵β細胞において、インスリン分泌や発現分子について検討する予定である。搬入予定としていた動物施設での飼育が困難となりマウスの飼育開始が遅れたため、膵β細胞特異的Xaf1過剰発現マウスを用いた検討については当初の計画より遅れている。飼育準備中に、膵β細胞を用いた検証を実施しXaf1発現に関与する分子機序について解析をすすめている。マウス膵β細胞および、膵β細胞特異的にXaf1を過剰発現させたマウスを用いて、以下の点について検討を行う。1膵β細胞Xaf1が糖尿病における歯周病態および歯周炎症下での糖尿病病態に及ぼす影響、2膵β細胞Xaf1が糖尿病発症に及ぼす影響を明らかにする。将来的にXaf1を標的とした革新的な糖尿病治療開の基盤とし、さらに、糖尿病を合併した歯周病患者における歯周病の病態改善につながる展開を目指す。
人工心肺施行中の遊離形セファゾリン濃度が著名に増加する原因究明と適正投与法

【研究目的】術中に人工心肺を用いる場合、体液量増加、血清アルブミン濃度低下など薬物体内動態に影響する多くの生理因子が変動するが、心臓手術で汎用されるセファゾリン(CEZ)に関して、生理因子変動を考慮した詳細な薬物動態の検討はなされていない。本研究では、人工心肺によるCEZ体内動態の変化を母集団薬物動態(PPK)の手法で検討した。【研究方法】東京医科歯科大学医学部附属病院で、人工心肺を実施した推算糸球体濾過量(eGFR)≧30ml min^<-1>の成人患者を対象とし、手術中経時的に複数回採血した。CEZ総濃度および遊離形濃度は、HPLC法により測定した。CEZ総濃度は非線形混合モデル法(NONMEM)を用いて解析し、PPKパラメーターと変動要因を解析した。PPKモデルにはCPB効果をコンパートメントのオン/オフで表現した1-コンパートメントモデルを採用し、個体内変動には比例誤差モデルを採用した。血漿CEZ蛋白結合の個体内変動は、血漿アルブミン濃度と相関する最大結合能(BMAX)を仮定したLangmuir式により解析した。本試験は、事前に東京医科歯科大学医学部倫理審査委員会の承認を受け(M2000-1895)、患者から文書同意を取得した後行った。【研究成果】27名から計199点の血中濃度データセットが得られた。最終PPKモデルの母集団CLとVdの推定値は人工心肺施行前後で異なり、それぞれ2.02および2.63(L h^<-1>)、9.9および12.6Lであった。また、CEZの血漿中遊離形分率は人工心肺中に増加したが、その変動はBMAX=150×(血清アルブミン値/3.07)0.94(mg L^<-1>)でモデル化できた。本研究で得られたPPKモデルは人工心肺を利用した心臓手術中の血漿中遊離形CEZ濃度を精度良く予測することが可能であり、今後のCEZ感染予防プロトコール策定に有用であると考えた。
次世代型多触媒動的光学分割法の開発とドミノ型不斉合成への応用

本研究では、Kundu博士と赤井がこれまで個々に培った固定化触媒開発の知識と技術を融合し、リパーゼと固定化金属触媒を同時に使用し、各触媒による異なる反応が1つのフラスコ内で同時進行する多段階ワンポット合成法(ドミノ型不斉合成法)の開発を行うことを目的とした。本年度は以下の3つの成果を得た。1.リパーゼと固定化バナジウム触媒を併用して、プロパルギルアルコールの動的光学分割(DKR)を検討した。この際、同アルコールがバナジウム触媒と反応してアルコールの1、3-転位に基づく副反応を起こす問題に遭遇した。多様な反応条件を精査し、トリフルオロトルエンが特異的に副反応を抑えることを見出した。そこで、この条件下にDKRを実施し、対応する光学活性なエステル体を高収率で与える方法を創出した。2.リパーゼと固定化バナジウム触媒を筒状の反応容器内に充填し、基質の溶液を連続的に反応容器に流す「連続フロー合成」に成功した。さらに、フラスコのような容器内で反応を行う古典的なバッチ合成と比べてフロー合成では反応時間を約10分の1に短縮できることがわかった。現在、赤井研究室の大学院生がこのテーマを引き継ぎ、実用化を目指して検討中である。3固定化バナジウム触媒の担体であるメソポーラスシリカの細孔径によって、ラセミ化活性が大きく変わることが分かった。これら活性の違いが何に起因するのかを解明し、新たな機能を有する固定化触媒の開発に繋げたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、加水分解酵素リパーゼと金属触媒を同時に使用し、リパーゼによる速度論的光学分割と金属触媒反応が1つのフラスコ内で同時進行する多段階ワンポット合成法の開発を目標とする。この際、金属触媒を無機担体の細孔内部に固定化することで、リパーゼと金属触媒の共存性向上を図る。また、この概念をラセミ体アルコールの動的光学分割に応用する。また、開発した固定化触媒を充填したフロー合成装置を構築し、光学活性体の連続製造法の開発を目指す。本年度は以下の成果を得た。1研究代表者が最近作成した、細孔内径約4 nmのメソポーラスシリカの細孔内表面にオキソバナジウムを固定化したラセミ化触媒V-MPSと加水分解酵素リパーゼを同時に用いる動的光学分割(DKR)をラセミ体プロパルギルアルコールに適用した。オキソ金属種はプロパルギルアルコールと反応してMeyer-Schuster転位(プロパルギルアルコールの1,3-転位)を起こしてエノンを与えることがよく知られているが、上記DKRの反応条件を精査した結果、Meyer-Schuster転位が抑えられることがわかった。これによって、DKR生成物である光学活性エステルを収率良く与えることができた。現在、本法を種々のプロパルギルアルコールに適用し、一般化を検討している。2細孔内部を修飾したメソポーラスシリカの作成、ならびにメソポーラスシリカの細孔内部に種々の金属触媒を固定化した新触媒の作成を鋭意検討している。研究分担者のKundu Dhimanは昨年11月下旬に来日したので、今年度は4ヶ月しか研究期間がなかった。また、最初に、手慣らしのために手がけたラセミ体プロパルギルアルコールの動的光学分割(上記研究実績の概要1)において、オキソバナジウムによるMeyer-Schuster転位が反応条件を変えると抑えられることがわかった。その結果を受けて、反応条件の更なる改善に注力し、動的光学分割生成物の収率を大幅に改善することができた。この研究に予定以上の日数を費やしたため、2の検討が十分に出来ていない。現在、その遅れを取り戻すべく、鋭意努力している。本研究では、加水分解酵素リパーゼと金属触媒を同時に使用し、リパーゼによる速度論的光学分割と金属触媒反応が1つのフラスコ内で同時進行するドミノ合成法の開発を目標とする。更に、開発した固定化触媒を充填したフロー合成装置を構築し、光学活性体の連続製造法の開発を目指す。1細孔径が大きいメソポーラスシリカの細孔内部にオキソバナジウムを固定化した新触媒を作成した。次に、同触媒のICP、BET分析ならびに元素分析を行い、触媒中の金属含有量や結合状態を解析した。更に同触媒は、我々がこれまで汎用してきた細孔径2-4 nmのメソポーラスシリカの細孔内部に固定化した触媒よりもラセミ化能に優れていることが分かった。。2メソポーラスシリカの細孔内部に種々の金属触媒を固定化するためのリガンドを調製した。3昨年度に見出したプロパルギルアルコールのリパーゼ触媒動的光学分割法の基質適用性を拡張する研究を継続して実施中である。メソポーラスシリカの細孔内部に種々の金属触媒を固定化するためのリガンドを調製したが、金属の固定化、並びに、同固定化触媒を用いる動的光学分割の検討が遅れている。その他の計画は順調に進行している。

本研究では、Kundu博士と赤井がこれまで個々に培った固定化触媒開発の知識と技術を融合し、リパーゼと固定化金属触媒を同時に使用し、各触媒による異なる反応が1つのフラスコ内で同時進行する多段階ワンポット合成法(ドミノ型不斉合成法)の開発を行うことを目的とした。本年度は以下の3つの成果を得た。1.リパーゼと固定化バナジウム触媒を併用して、プロパルギルアルコールの動的光学分割(DKR)を検討した。この際、同アルコールがバナジウム触媒と反応してアルコールの1、3-転位に基づく副反応を起こす問題に遭遇した。多様な反応条件を精査し、トリフルオロトルエンが特異的に副反応を抑えることを見出した。そこで、この条件下にDKRを実施し、対応する光学活性なエステル体を高収率で与える方法を創出した。2.リパーゼと固定化バナジウム触媒を筒状の反応容器内に充填し、基質の溶液を連続的に反応容器に流す「連続フロー合成」に成功した。さらに、フラスコのような容器内で反応を行う古典的なバッチ合成と比べてフロー合成では反応時間を約10分の1に短縮できることがわかった。現在、赤井研究室の大学院生がこのテーマを引き継ぎ、実用化を目指して検討中である。3固定化バナジウム触媒の担体であるメソポーラスシリカの細孔径によって、ラセミ化活性が大きく変わることが分かった。これら活性の違いが何に起因するのかを解明し、新たな機能を有する固定化触媒の開発に繋げたい。予定通りに、細孔内部を修飾したメソポーラスシリカの作成、ならびにメソポーラスシリカの細孔内部に種々の金属触媒を固定化した新触媒の作成を推進する。また、調製した固体触媒を固体NMR, ICP, BETなどを用いて分析し、触媒中の金属含有量や結合状態を解明する。その後、これらの触媒をリパーゼ触媒動的光学分割に適用する。1細孔径が更に大きい(525nm)のメソポーラスシリカの細孔内部に種々の金属触媒を固定化した新触媒を作成する。2各種分析手法を用いて上記で調製した固体触媒を分析し、触媒中の金属含有量や結合状態を解明する。3上記の触媒を用いてラセミ化を行い、細孔サイズがラセミ化活性に及ぼす影響を解明する。更に、上記触媒をリパーゼ触媒動的光学分割に適用する。4金属固定化触媒と固定化リパーゼを混合充填したフローリアクターを構築し、連続フロー合成を検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
プロテアソームの動態と機能制御機構の解明

1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:新規に同定したNrf1プロセシング酵素DDI2の生理機能を明らかにするため、DDI2欠損マウスを作製した。DDI2欠損マウスは早期胎生致死となり、Nrf1欠損マウスよりも早期の致死であることから、Nrf1以外の標的分子が存在することが強く示唆された。そこで出芽酵母を用いた網羅的な遺伝学的解析を行い、DDI2がDNA-protein crosslinkの切断にはたらいている可能性を示唆する結果を得た。プロテアソームの基礎的発現制御因子の探索については、siRNAスクリーニングを実施し、有力な候補分子を服す得ることが出来た。これらの解析を進める一方、候補因子の中に明らかな転写因子が含まれていなかったため、siRNAによる不完全な遺伝子発現抑制が原因であると考え、CRISPR/Cas9によるsgRNAライブラリーを用いたノックアウトスクリーニング系を構築し、スクリーニングを実施した。2.プロテアソームの細胞内動態の解析:プロテアソームの局在を指標としたsiRNAスクリーニングを実施した結果、mTOR経路が細胞の栄養環境に応答してプロテアソームの核局在を制御する中心的な因子であることを明らかにした。3.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析:プロテアソーム阻害剤処理時の細胞死を指標としたsiRNAスクリーニングを実施した結果、O-GlcNAc化修飾経路がプロテアソーム機能低下時に細胞保護的に働くことを明らかにした。さらにO-GlcNAc化タンパク質の網羅的探索とRNA-Seq解析、siRNAスクリーニングの結果を統合することにより、O-GlcNAc化の標的となり、プロテアソーム機能低下時の細胞保護に重要な因子の同定に成功した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:最初に、プロテアソームサブユニットのプロモーターのどの領域が転写に重要であるかをmutantの作成により同定し、この領域にluciferaseをつないだコンストラクトを安定発現する細胞を樹立し、ゲノムワイドなsiRNAスクリーニングを実施した。その結果、プロテアソームサブユニットの転写に関与する複数の候補転写因子を得ることができた。2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解:プロテアソームの20S core particleの形成にTRC経路が、また19S RPの形成にBag6が関与する成果を発表した(Akahane et al. Nat Commun 4: 2234, 2013)。この成果を含んだプロテアソームの分子集合のメカニズムを包括した総説を執筆した(Sahara et al. Adv Biol Regul 54: 51-9, 2013)。3.プロテアソームの細胞内動態の解析:ゲノム編集の技術を用いて、プロテアソームのサブユニットに蛍光タンパク質を融合させることにより、内在性のプロテアソームの局在を観察可能な細胞株を多数樹立することができた。プロテアソーム機能阻害やレプトマイシンB処理によって、プロテアソームの局在が大きく変動することを見いだしている。4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析:プロテアソーム機能低下により細胞内の代謝が脂質合成にシフトすることから、AMPKの制御に着目した。その結果、プロテアソーム機能低下によりAMPKの活性が低下することを明らかにした。また精子ミトコンドリアのユビキチン化をin vitroで再構成する実験系を構築し、精子ミトコンドリアユビキチン化に関わるユビキチンリガーゼの候補を生化学的に同定することに成功した。下記1-4の項目について研究を行った。1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:プロテアソームサブユニットのプロモーターにluciferaseをつないだコンストラクトを用いてゲノムワイドなsiRNAスクリーニングを実施したが、二次・三次スクリーニングにより候補がすべて脱落した。そこで、酵母one-hybridアッセイのスクリーニング系(転写因子ライブラリーを米国の研究チームから供与)を立ち上げ、一次スクリーニングが完了した。また、出芽酵母におけるプロテアソームの転写制御因子Rpn4の結合コンセンサス配列について新しい提唱を行った(Shirozu R et al. FEBS Lett. 2015)。3.プロテアソームの細胞内動態の解析:ゲノム編集の技術を用いて、プロテアソームのサブユニットに蛍光タンパク質を融合させることにより、内在性のプロテアソームの局在を観察可能な細胞株を樹立し、ゲノムワイドなsiRNAスクリーニングを実施し、プロテアソームの細胞内動態に影響を与える候補因子約100を得た。4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析:プロテアソーム機能低下により細胞内の代謝が脂質合成にシフトする機構の解明に取り組んでおり、プロテアソームによる分解基質Xの蓄積が大きく寄与していることを見いだした。1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:出芽酵母プロテアソーム転写因子Rpn4の新たな認識コンセンサス配列の同定に成功した。またsiRNAスクリーニングにより哺乳類細胞におけるNrf1活性化に働くプロセシング酵素の同定に成功した。2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解:胸腺プロテアソームは他のプロテアソームには作り出せないユニークな特徴を持つペプチド断片を切り出してMHCクラスI上に提示させることにより、T細胞の正の選択に働くことを明らかにした。

3.プロテアソームの細胞内動態の解析:プロテアソームの2つのユビキチン鎖受容サブユニットRpn10とRpn13の単独および二重欠損マウスの解析により、両者が主に縮重的に働いているが、一部タンパク質については各受容体特異的に分解されており、各々マウスの発生に必須であることを明らかにした。プロテアソーム新規会合因子としてSirt1を同定し、タンパク質品質管理に働いていることを明らかにした。プロテアソーム会合因子Proteasome Inhibitor 31-kDa (PI31)がin vivoではプロテアソームによるタンパク質分解を正に制御することを明らかにした。4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析:ミトコンドリア機能異常による増殖遅延がプロテアソーム機能低下により回復すること、分解を免れ蓄積したMia40の作用によりミトコンドリアの融合と膜電位が改善する分子機構を明らかにした。当初の目標に向けて順調に研究が進展している。1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:出芽酵母プロテアソームの基礎発現・誘導性発現両者を制御する転写因子Rpn4の新たな認識配列および標的分子群を同定することが出来た。また、哺乳類細胞を用いたsiRNAライブラリースクリーニングにより、誘導性発現を担うNrf1の活性化因子を世界に先駆けて同定することに成功したことは目標の1つをクリアする進展といえる。2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解:分子多様性の病態生理的意義に関して、胸腺プロテアソームによる免疫制御分子機構の解明など、重要な成果をあげており、極めて順調に研究が進行している。これらの成果を受け、さらに一歩踏み込んだ「プロテアソームを自在にex vivoで再構成する」技術の開発にも取りかかったところである。3.プロテアソームの細胞内動態の解析:がん治療の標的として注目を浴びているユビキチン鎖受容体Rpn13の欠損マウスの解析により、生体におけるRpn13の役割を明らかにした。また機能未知であったプロテアソーム会合因子Sirt1とPI31がタンパク質分解に与える影響についての成果など、順調に研究が進展している。プロテアソームの局在制御については、siRNAスクリーニングの実施を完了し、有力候補を得ている段階であり、予定通りに研究が進展している。4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析:酵母遺伝学を用いてミトコンドリア機能とプロテアソーム機能の機能的相関の一端を明らかにすることが出来た。プロテアソーム機能低下時に発動する機構の解明のために、siRNAスクリーニングを実施済みであり、現在有力候補分子について分子機構を探索中であり、順調に研究が進展していると考えている。下記1-4の項目について研究を行った。1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明:ゲノムワイドsiRNA
ラット虚血-再循環肝障害に対する漢方薬の影響に関する薬理学的研究

10週齢雄性ラットに小柴胡湯100mg/kgを4日間経口投与し、最終投与1時間後に肝臓の虚血を1時間行い、実験的肝障害の病態モデルを作製した。60分間の血液再循環後に血液を採取し、血清のGOT、GPTおよびLDHを測定した。肝ホモジネートより、マロンジアルデヒド量を指標として脂質過酸化物量を、またグルタチオン量、チトクロームP-450、チトクロームb_5、NADPHチトクロームC還元酵素活性を測定した。脂質過酸化物量は無処置群6.82±0.54に対し、小柴胡湯処置群5.11±0.15と減少した。しかしながら、グルタチオン量、チトクロームP-450、チトクロームb_5、NADPHチトクロームC還元酵素活性には変化はみられなかった。肝障害に対して小柴胡湯は有意な防御作用を示さなかった。つぎに、8周齢雄性ラットに大柴胡湯100,200および400mg/kgを、あるいは補中益気湯200および400mg/kgを4日間経口投与し、15分の虚血を行い軽症の実験的肝障害の病態モデルを作製した。60分間の血液再循環後に血液を採取し、血清のGOT,GPTおよびLDHを測定した。脂質過酸化物量は無処置群では7.06±0.67に対し、大柴胡湯200mg/kg処置群では6.58±0.33、400mg/kg処置群では6.33±0.55であり、大柴胡湯処置により減少の傾向を認めた。しかしながら、補中益気湯200mg/kg処置群では8.31±0.59、400mg/kg処置群では7.59±0.55であり、まったく減少しなかった。また肝障害に対しては大柴胡湯、補中益気湯とも軽度軽減する傾向を示した。以上のように小柴胡湯および大柴胡湯は脂質過酸化物を消去することにより肝障害を軽減すると考えられるが、補中益気湯では異なった機序によると考えられた。10週齢ラットに小柴胡湯100mg/kgを4日間経口投与し、最終投与1時間後に肝臓の左葉と中葉の虚血を1時間行い、腸管のうっ血を避けるために温存しておいた右葉と尾状葉を切除して、実験的肝障害の病態モデルを作製した。肝ホモジネートより、マロンジアルビテド量を指標として脂質過酸化物量を、またグルタチオン量、チトクロームP-450、チトクロームb_5、NADPHチトクロームC還元酵素活性を測定した。脂質過酸化物量は無処置群6.82±0.54に対し、小柴胡湯処置群5.11±0.15と有意に減少した。また、GOT,GPTおよびLDHは肝障害群ではそれぞれ、7368±262、5787±550、9837±4161と非常に高値を示し、小柴胡湯を処置しても有意な防御作用を示さなかった。

結論としては肝障害を引き起こすとされる脂質過酸化物生成量は減少したので肝障害防御作用があると考えられるので、より軽症の肝障害を得るべく、15分虚血、60分間再循環の肝障害を作製して現在検討中である。十分なデータがまだ得られていないので何とも言えないが、印象的には防御作用があると思っている。なお大柴胡湯についても検討を開始した。8週齢雄性ラットに大柴胡湯エキス細粒100,200および400mg/kgを4日間経口投与し、最終投与後1時間後に肝臓の左葉と中葉の虚血を15分間行い、腸管のうっ血を避けるために温存しておいた右葉と尾状葉を切除して、実験的肝機能障害の病態モデルを作製した。60分間の血液再循環後に血液を採取し、血清のGOT,GPTおよびLDHを測定した。肝ホモジネートより、マロンジアルデヒド量を指標として脂質過酸化物量を測定した。脂質過酸化物量は無処置群7.49【plus-minus】0.80ng/mg proteinに対し、大柴胡湯100mg/kg処置群では8.62【plus-minus】0.91ng/mg protein、200mg/kg処置群では6.58【plus-minus】0.33ng/mg protein、400mg/kg処置群では6.33【plus-minus】0.55ng/mg proteinであり、大柴胡湯処置により減少の傾向を認めた。また、GOT,GPTおよびLDH値も大柴胡湯処置により減少の傾向を認めた。しかしながら、偽手術群(非虚血群)に大柴胡湯を投与した場合にはこのような傾向は認められなかった。このように大柴胡湯は脂質過酸化物を消去することにより肝障害を軽減すると考えられるが、投与量による変化は小さかった。これは臨床応用の投与量による影響と類似していると思われた。なお、補中益気湯についても検討を加えたが、まだ成績の整理
電位依存性Ca^<2+>チャンネルの新規調節因子Centrinの分子機能の解明

ゾウリムシの繊毛の波打ち運動の方向は、繊毛膜上の電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化によって制御される。これまで、このチャンネルの必須制御因子としてCa^<2+>結合蛋白質Centrinを同定した。Centrinの機能部位の特定を分子遺伝学的手法で試みた結果、4つのCa^<2+>結合部位(EF-handl4)の内EF-hand4とN末の35アミノ酸が重要な役割を果たしていることを明らかにした。平成18年度は、これらの機能部位がCentrinの立体構造に与える影響を調べるために、野生型Centrinを大腸菌の系を用いて発現・精製した。精製した蛋白質をCentrinの突然変異株cnrCの細胞質内に顕微注入した結果、変異形質が治癒され電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化が見られた。このことは、リコンビナントCentrinが内在性のCentrinと同等の機能を持つことを示している。次に、リコンビナントCentrinをベースとして、N末の35アミノ酸を欠失させたCentrin(N末欠損型)とEF-hand4を含むC末側の28アミノ酸を欠失させたcnrCタイプのCentrin(cnrC型)を調製した。野生型、N未欠損型、cnrC型Centrinをそれぞれ0.1mM EGTA存在下もしくは0.1mM CaCl_2存在下で保温した後、それぞれのサンプルをSDS-PAGEとNative-PAGEで解析した。その結果、SDS-PAGEのパターンに違いは見られなかったが、野生型とcnrC型CentrinはNative-PAGEにおいて、Ca^<2+>存在下で見かけの分子量が大きくなっていた。一方、N末欠損型は、Native-PAGEにおいて、Ca^<2+>の有無での移動度の変化は他の2者に比べて僅かであった。N末欠損型は全てのEF-handが正常でCa^<2+>+の結合性には問題無いと考えられることからも、CentrinのCa^<2+>依存的な立体構造の変化にはN末部分が重要な役割をしていることが示唆された。また、野生型とcnrC型においてはCa^<2+>の存在下の方が見かけの分子量が大きくなっていることから、CentrinはCa^<2+>の依存的に構造が開いたような状況になることが推測された。CentrinにはCa^<2+>結合部位(EF-hand)が4箇所(EF-hand 14)存在する。またCentrinなどのCalmodulinファミリーはEF-hand 1と2およびEF-hand 3と4がペアとなって働くと考らえられている。そこでCentrinのCa^<2+>感受性とCa^<2+>チャンネルの関係を調べることを目的として、CentrinゲノムDNAに塩基置換を施し、各EF-hand 14のCa^<2+>結合能を損なわせた変異型遺伝子やEF-hand 1と2およびEF-hand 3と4のCa^<2+>結合能を同時に損なわせた変異型遺伝子を調製した。また、このCentrinは他のCentrinファミリーに比べN末部分に特徴的なアミノ酸配列を持つ。そこで上述の変異型遺伝子に加え、N末の2-35番目のアミノ酸を欠失させた遺伝子も調製した。そして、これらの変異型遺伝子をCentrinの突然変異体(cnrC)にInjectionして、変異部位が電位依存性Ca^<2+>チャンネルの機能回復効果に与える影響を検討した。その結果、EF-hand 3と4がCa^<2+>存在下で協調的に立体構造を変化させることが、電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性に必須であり、その際EF-hand 4はEF-hand 3に比べより機能的であることが分かった。また、N末部分もCa^<2+>チャンネルの活性に重要な働きをしていることが分かった。cnrCのCentrinは、突然変異によりEF-hand 4を含むC末側の28アミノ酸を失っている。この結果からもEF-hand 3と4の協調的なCa^<2+>感受性が電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性に重要であることが示唆された。

次に、リコンビナントCentrinをベースとして、N末の35アミノ酸を欠失させたCentrin(N末欠損型)とEF-hand4を含むC末側の28アミノ酸を欠失させたcnrCタイプのCentrin(cnrC型)を調製した。野生型、N未欠損型、cnrC型Centrinをそれぞれ0.1mM EGTA存在下もしくは0.1mM CaCl_2存在下で保温した後、それぞれのサンプルをSDS-PAGEとNative-PAGEで解析した。その結果、SDS-PAGEのパターンに違いは見られなかったが、野生型とcnrC型CentrinはNative-PAGEにおいて、Ca^<2+>存在下で見かけの分子量が大きくなっていた。一方、N末欠損型は、Native-PAGEにおいて、Ca^<2+>の有無での移動度の変化は他の2者に比べて僅かであった。N末欠損型は全てのEF-handが正常でCa^<2+>+の結合性には問題無いと考えられることからも、CentrinのCa^<2+>依存的な立体構造の変化にはN末部分が重要な役割をしていることが示唆された。また、野生型とcnrC型においてはCa^<2+>の存在下の方が見かけの分子量が大きくなっていることから、CentrinはCa^<2+>の依存的に構造が開いたような状況になることが推測された。
免疫性血小板減少性紫斑病に対するH.pylori除菌療法の効果発現機序の解明

免疫性血小板血小板減少性紫斑病(ITP)に対する新たな治療としてH.pylori除菌療法が注目されているが、ITPの病態におけるH.pyloriの役割について不明な点が多い。その効果発現機序を解明するためITP患者に対するH.pylori除菌療法を行い、前向き調査を行った。これまでの血小板数の推移や末梢血中のGP IIb/IIIa反応性B細胞頻度の測定から1)H.pylori除菌療法はH.pylori陽性患者にのみ効果がある。2)血小板増加反応の無かったH.pylori陽性患者でもGP IIb/IIIa反応性B細胞頻度は除菌前に比べて有意に低下するという結果が得られた。さらに患者末梢血を用いフローサイトメトリーを使用したマクロファージの貪食反応や末梢血単核球表面Fcgamma receptorの変化、特異抗原(GP IIb/IIIa)に対するT cell proliferationassayを施行し、H.pylori陽性反応群、H.pylori陽性不応群、H.pylori陰性群など群別に比較検討した結果、除菌療法後の血小板数の回復は、H.pyloriがそのものの消失より、血小板に対する免疫応答が選択的に抑制されるためであり、それゆえ2)のような結果が得られると考えられた。その病態における機序として、除菌療法直後から血小板増加反応が得られ、さらにその血小板数の維持ということから鑑みて、初期には抗血小板抗体産生抑制を介さない網内系機能の抑制(マクロファージの貪食能の低下など非特異的な反応)が働き、その後血小板に対する自己抗体産生の抑制(特異的反応)がかかる二段階の反応を推察した。免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)に対する新たな治療としてH.pylori除菌療法が注目されているが、ITPの病態におけるH.pyloriの役割について不明な点が多い。除菌療法の臨床効果とGPIIb/IIIaに対する抗血小板自己抗体産生に与える影響を前向きに検討した。血小板5万/μl以下の慢性ITP32例を対象とした。H.pylori感染は血中抗体価、尿素呼気試験、便中抗原(HpSA)により検索し、全てで陰性をH.pylori陰性とした。感染の有無にかかわらず全例で標準的な除菌療法を施行し、有効例は12週後の血小板が10万/μlを越えた例とした。H.pylori陽性21例(66%)と陰性11例の全例に除菌療法を行った。H.pylori陽性20例で除菌に成功し、残る1例もMTZを用いた再治療により除菌し得た。H.pylori陽性10例(48%)が有効例に分類されたが、陰性全例で血小板増加は全くみられなかった。有効例全例が24週、4例が48週時も血小板数10万/μl以上を維持し、再発例はない。H.pylori陽性有効群10例、陽性無効群11例、陰性群11例の3群間における治療前の血小板数、性、年齢、治療歴、抗GPIIb/IIIa抗体産生B細胞頻度に有意差はなかった。12週までの抗GPIIb/IIIa抗体産生B細胞頻度の変化は3群間で有意に異なり(P=0.002)、H.pylori陽性有効群のみならず陽性無効例でも減少したが、H.pylori陰性例では全く変化なかった。除菌療法による臨床効果はH.pylori感染例にのみ観察され、H.pyloriとITPの病態との直接的な関与が考えられた。また、H.pylori除菌による血小板増加は抗血小板自己抗体の産生抑制を介する可能性が示された。次年度はH.pylori除菌療法が血小板数を増やす機序について抗血小板抗体産生、網内系機能、血小板産生の3点に着目して検討を重ねる予定である。

その病態における機序として、除菌療法直後から血小板増加反応が得られ、さらにその血小板数の維持ということから鑑みて、初期には抗血小板抗体産生抑制を介さない網内系機能の抑制(マクロファージの貪食能の低下など非特異的な反応)が働き、その後血小板に対する自己抗体産生の抑制(特異的反応)がかかる二段階の反応を推察した。
多項式および超越整関数の複素力学系の多様性の研究

連携研究者たちの協力の下,本年度に得た主な成果は次のとおりである:超越整関数fのジュリア集合がシェルピンスキーカーペット(即ち,全疎である連結かつ局所連結なコンパクト集合で,その補集合の各成分の境界が互いに交わらないジョルダン閉曲線になるもの)となるための1つの十分条件(即ち,(1) fのファトウ集合の各連結成分は有界であり,その境界はfの特異点の軌道を含まない,(2)fのファトウ集合には遊走領域は存在しない,(3) fのファトウ集合の各連結成分のうち周期的なものは,有限個の吸引領域だけから成り,しかもそれらの境界は互いに交わらない,(4)ファトウ集合内の特異点の軌道は全て(3)の有限個の吸引領域に含まれる)を得た.またこの条件を満たす具体例が存在することを次のようにして示した:双曲型である多項式Pで,そのファトウ集合の有界な連結成分がいくつかの吸引領域とその逆像だけから成り,それらが互いに交わらない,という条件を満たすものを与えると,それに対して,超越整関数fでPの力学系を部分力学系として含み(即ち,適当な円板へのfの制限がある擬等角写像によってPと共役となる),しかもfのジュリア集合がシェルピンスキーカーペットとなるようなものが存在することを示した.更にこのような超越整関数fを関数の増大度の観点からは,ある意味で多項式にいくらでも近いようなものとして構成することもできることを示した.2次多項式族に関する研究については,予定ではMandelbrot集合に関する前年度の成果に続く結果を得ようとしたが,目立った結果は今のところまだ得られていない.また超越整関数のJulia集合の位相的性質に関する研究については,過去に得た成果からの多少の進展はあったものの,満足のいく結果までは得られていない.今後は2次多項式族に関する研究は依然継続しつつ,超越整関数の力学系の研究,特にJulia集合の位相的性質の研究も引き続き行う.また課題解決の考察をしているうちに他のおもしろい現象や新たな問題を発見することも十分考えられる.当初の実施計画にあるもののみを考察するようなことはせず,このような発見があった場合は臨機応変に対応する予定である.連携研究者の協力の下,本年度得た主な成果は次のとおりである:(1) Mandelbrot集合において,一般の放物型周期点を持つ2次多項式に対応するパラメータの近傍を拡大していくと,対応するJulia集合を摂動して得られるCantor型のJulia集合に似た構造とそれによる入れ子構造(「decoration」と呼ぶ)が見られ,最終的には「小さいMandelbrot集合」が出現する.この現象は,入れ構造に対するモデル集合を定義し,ある擬等角写像によるその集合の像として現れる,という定式化で説明できる.(2)同様の入れ子構造がMisiurewicz点(=2次多項式のの臨界点0がpreperiodic,即ち,1回以上写像で動かすと周期点に落ち着くようなパラメータ値)の近傍の拡大についても現れる.(3)(1)にある「小さいMandelbrot集合」に属するパラメータに対するJulia集合には(1)に現れたのと同様の入れ子構造が存在する.(4)(2)のMisiurewicz点をうまく選ぶと,現れる入れ子構造は歪曲度が1にいくらでも近いような擬等角写像による像になっている.(5)(1)や(2)で得られる「decoration」に属するパラメータに対する力学系はsemihyperbolicという性質を持つ.またこれからsemihyperbolicだがMisiurewiczやhyperbolicでないパラメータがMandelbrot集合の境界に稠密に存在することがわかる.(6)(4)と(6)の結果を組合わせることによって,「Mandelbrot集合の境界のHausdorff次元は2である」という宍倉による有名な結果に対して「Mandelbrot集合の境界にはCantor型のJulia集合の擬等角写像による像で,Hausdorff次元が2にいくらでも近いようなものが見えるから」という,非常にわかりやすい説明をつけることができるようになった.紆余曲折はあったが,1年前に「研究実施計画」に述べていた「目標」のかなりの部分を達成できたと言えると思う.連携研究者たちの協力の下,本年度に得た主な成果は次のとおりである:超越整関数fのジュリア集合がシェルピンスキーカーペット(即ち,全疎である連結かつ局所連結なコンパクト集合で,その補集合の各成分の境界が互いに交わらないジョルダン閉曲線になるもの)となるための1つの十分条件(即ち,(1) fのファトウ集合の各連結成分は有界であり,その境界はfの特異点の軌道を含まない,(2)fのファトウ集合には遊走領域は存在しない,(3) fのファトウ集合の各連結成分のうち周期的なものは,有限個の吸引領域だけから成り,しかもそれらの境界は互いに交わらない,(4)ファトウ集合内の特異点の軌道は全て(3)の有限個の吸引領域に含まれる)を得た.またこの条件を満たす具体例が存在することを次のようにして示した:双曲型である多項式Pで,そのファトウ集合の有界な連結成分がいくつかの吸引領域とその逆像だけから成り,それらが互いに交わらない,という条件を満たすものを与えると,それに対して,超越整関数fでPの力学系を部分力学系として含み(即ち,適当な円板へのfの制限がある擬等角写像によってPと共役となる),しかもfのジュリア集合がシェルピンスキーカーペットとなるようなものが存在することを示した.

更にこのような超越整関数fを関数の増大度の観点からは,ある意味で多項式にいくらでも近いようなものとして構成することもできることを示した.2次多項式族に関する研究については,予定ではMandelbrot集合に関する前年度の成果に続く結果を得ようとしたが,目立った結果は今のところまだ得られていない.また超越整関数のJulia集合の位相的性質に関する研究については,過去に得た成果からの多少の進展はあったものの,満足のいく結果までは得られていない.今後は2次多項式族に関する研究は継続しつつ,超越整関数の力学系の研究,特にJulia集合の位相的性質の研究への取り組みも開始する.2次多項式族に関する研究については例えば,上記(1),(2)の現象は考えているパラメータの近傍で列を成して無限個現れるが,その現れ方やスケールの漸近的性質の考察を行う.コンピュータグラフィックスによる実験で予想を立てるところから始めたいと考えている.また課題解決の考察をしているうちに他のおもしろい現象や新たな問題を発見することも十分考えられる.当初の実施計画にあるもののみを考察するようなことはせず,このような発見があった場合は臨機応変に対応する予定.今後は2次多項式族に関する研究は依然継続しつつ,超越整関数の力学系の研究,特にJulia集合の位相的性質の研究も引き続き行う.また課題解決の考察をしているうちに他のおもしろい現象や新たな問題を発見することも十分考えられる.当初の実施計画にあるもののみを考察するようなことはせず,このような発見があった場合は臨機応変に対応する予定である.次年度繰越ができない校費があり,それを優先して使った結果である.繰り越した助成金は次年度の助成金と共に,旅費は前年度と同程度かそれ以上に,また物品費は前年度よりかなり多く使用する予定である.
プリオン蛋白構造変化における脾臓の役割解明

3種類のプリオン蛋白構成部分ペプチド(PrP101-130,141-170,171-200)のマウス体内動態を検討し、PrP101-130が最もプロテアーゼK抵抗性を示す凝集性蛋白として、脾臓へ蓄積することを解明した。更に、PrP101-130とその他の脳内異常凝集性蛋白であるA-beta42,Stefan B蛋白とのアミノ酸残基相同性を比較することで、ヒスチジン(PrP111),バリン(PrP120),グリシン(PrP131)が、PrPの異常凝集性に関与する鍵となるアミノ酸残基であることを示唆した。次に、PrP同様A-beta蛋白は、モルテングロビュールと考えられ、A-beta42をモデルとして、その凝集性に影響を与える蛋白環境因を検討したところ、水素イオン濃度(pH4.6),金属イオン(Cu2+,Zn2+)の関与が明らかになった。これらの研究成果に基づき、マウス由来培養神経細胞(N2a)を対象として、PrP breaker peptidesの検索を行った。即ち、PrP(101-130)添加培養後N2a細胞内でのPK抵抗性蛋白に対するPrP breaker peptidesを検索する目的で10残基より構成されるPrP101-109,PrP103-112,PrP115-124,PrP115-124,PrP128-PrP137の5種類のペプチドを添加し、PK処理後、残存するPK抵抗性蛋白量の変化をCell Western Dot Blotにて検討したが著しい変化は認められなかった。次に、培養グリア細胞を用いた系でも同様の検討を行ったが、著しい変化は認められなかった。今後、breaker peptidesに関しては、更にアミノ酸残鎖数をはじめ、PrP101-130内の他のペプチド作成部位などの検討が必要であると考えられた。マウス脾臓より分離した単核球は、さらに抗CD11c,抗CD80抗体を用いて、Folicullar dendritic cells (FDCs)にまで精製分離することに成功した。精製したFDCsは、最終的には、マウス由来神経芽細胞N2aと細胞融合させる予定であるが、今回我々は、このマウスFDCsにプリオンタンパクの立体構造変化の鍵を握ると考えられる部分的なプリオンペプチドフラグメントを添加し数日間、試験管内で培養後^<51>Crでラベルし、マウス尾静脈より移入後、その体内分布を調べた。プリオン蛋白も一種のアミロイドであり、アルツハイマー病におけるベータアミロイドやステブァンBとの共通点が多く、いずれも脳内で異常凝集を惹起しうる。本年度我々は、これらの蛋白間の相同性が高いシークエンスをCLUSTAL Xを用いて解析し同定した。即ち、プリオン蛋白では90-144のフラグメントは、アミロイドベータ1-42、ステファンB13-60のフラグメントと高い相同性を示すことを明らかにした。この知見に基き今回添加するプリオンフラグメンントは、90-144のシークエンス内に含まれる部分鎖とした。結果として細胞移入数日後、これらの細胞は脾臓に集積し所謂FDCsのホーミング現象を示した。この結果より、融合細胞が確立されれば、神経芽細胞の性質を兼ね備えたFDCsが脾臓で観察でき、脾臓で正常プリオンタンパクが異常

プリオンタンパクに立体構造変化する過程の解析が可能となる。さらに、一度体外へ取り出し様々な処理を加えた神経細胞を用いて、体外からの異常プリオンタンパクを選択的に捉脱でき、新たな治療法の開発を示唆するものと考えられる。昨年度までの研究成果を基に、マウス脾臓より分離、精製したFolicullar dendritic cells(FDCs)を、マウス由来神経芽細胞N2aと細胞融合させる試みを継続中であるが、現在のところ、未だ融合細胞を得るには到ってはいない。しかしながら、本年度我々は異常凝集性プリオン蛋白の神経細胞毒性に関与する部位を決定する目的で、数種類のペプチド鎖を新たに合成した。即ち、他の脳内異常凝集蛋白質であるベータアミロイドやステファンBとの相同性が高いシークエンス(CLUSTAL Xにて解析、同定)である、プリオン蛋白(PrP)90-144のフラグメントを更に細分割しPrP90-110,PrP107-124,PrP120-140の3種類を作成し、神経細胞への添加培養でその細胞毒性を検討中である。これと平行して、アルツハイマー病におけるベータアミロイド1-42(Aβ42)についても同様に細分割化したペプチドであるAβ1-16,Aβ17-42を作成し細胞毒性を比較検討し、Aβ17-42がAβ42の細胞毒性の大部分を担うことを明らかにした。これら両者に共通として含まれる神経細胞毒性に必須なペプチドモチーフを決定、合成後、その細胞毒性を確認する予定である。これらの知見は、現在遂行中の神経細胞・FDCs融合細胞の確立後、添加培養にてその細胞毒性を検討する予定である。更に我々は、その毒性を阻止できる短鎖ペプチドのモチーフも現在作成し既にAβ42に対する毒性阻止効果を確認している(Exp.Neurol.Matsunaga Y. et al.,2005,196,282-289)。これらより、脾臓にホーミングした神経芽細胞-FDCs融合細胞が、摂取された異常プリオンタンパクにより受ける細胞毒性の解析が可能となり、更に毒性阻止可能なペプチドのスクリーニングに応用可能と考えられる。即ち、他の脳内異常凝集蛋白質であるベータアミロイドやステファンBとの相同性が高いシークエンス(CLUSTALXにて解析、同定)である、プリオン蛋白(PrP)90-144のフラグメントを更に細分割しPrP90-110,PrP107-124,PrP120-140の3種類を作成し、神経細胞への添加培養でその細胞毒性を検討中である。これらの知見は、現在遂行中の神経細胞-FDCs融合細胞の確立後、添加培養にてその細胞毒性を検討する予定である。更に我々は、その毒性を阻止できる短鎖ペプチドのモチーフも現在作成し既にAβ42に対する毒性阻止効果を確認している(Exp.Neurol.Matsunaga Y.et al.,2005,196,282-289)。これらより、脾臓にホーミングした神経芽細胞-FDCs