hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属人工超格子に関する共同研究

金属人工格子に関する研究は,当所の計画より広い展開を見ることとなり,予想した以上にさまざまな材料において有意義な成果を得ることができた。第1番目は,光磁気記録用の媒体に関するもので,Co/PtやCo/Pd人工格子膜は,大きな垂直磁気異方性を示し,かつ将来の短波長光磁気記録に必要な短い波長域における磁気カ-回転角が大きいことから非常に有望な材料と見られている。本研究では,これらの膜の垂直磁気異方性の起源が磁歪の逆効果である程度説明できるのではないかと考え,これまでほとんど知られていなかった磁歪定数について詳細な測定と検討を行った。その結果,コバルトパラジウム系は,磁歪定数が極めて大きく,磁歪の効果で垂直異方性の原因がかなり説明できることが分かった。一方,プラチナ系は,磁歪定数が小さく,垂直異方性へのその効果は微小なものに止まっている。また、Pd/Co人工格子膜の構造の様々なモデルについて計算機シュミレーションによって反射X線回折のパターンを計算し、実験の結果と比較検討したところ、界面において数原子層の拡散が起きている可能性が大きいことが分かった。第2番目に,コバルト超薄膜の磁気光学効果を調べる検討も行った。金で挟んだコバルト超薄膜は,コバルト層が0.8nm付近から垂直磁化状態となり垂直磁気異方性が誘導されることが分かった。その磁気光学カ-スペクトルは,2nm程度の膜では,ほとんどバルクの光学定数を用いて説明できたが,やはり0.6nm程度となるとバルクのものとはかなり異なったものとなる。これは,超薄膜状態のコバルトの電子状態がバルクのものとは,異なっているということを示唆している。第3番目は,希土類遷移金属系の光磁気記録媒体に関するものである。希土類遷移金属系については,ブルーレーザに対応できる短波長記録媒体という観点から,ネオジウムを含む系の検討を詳細に行った。ネオジウムと遷移金属のアモルファス合金薄膜は短波長において非常に大きなカ-回転角を示すが,飽和磁化が大きくなってしまうことから垂直磁化膜を得ることができなかった。本研究では,多層構造にすることで垂直異方性を誘導させるともに,ネオジウムにカドリニウムを添加することによって飽和磁化を低減して非常に角型比の良い垂直磁化膜を得ることに成功した。また,磁気光学効果を最大にするために遷移金属層は,鉄コバルト合金とした。膜厚比等を最適化した結果,短波長において従来材料に比べ2倍近い性能指数を示す材料を開発することができた。また,光磁気記録においては,局所的にレーザ照射して熱を加えるため,この人工格子膜の熱的安定性についても検討を行った。その結果,飽和磁化の値は,希土類成分が酸化され始める300度程度までは十分安定であるが,磁気異方性については,その起源が多層構造にあるため,その構造が崩れ始める200度程度から急激に低下することが分かった。しかし,実用上必要な寿命は確保しているものと考えられる。第4番目は,磁気ヘッド材料として重要な軟磁性膜に関するもので,Fe/FeCoZr人工格子膜が,等価的に非常に小さな結晶磁気異方性と磁歪定数を有し,その結果,非常に小さな保磁力と高い透磁率を示す材料の開発に成功した。また鉄系の材料を用いることでほとんど理論的に到達可能な範囲で最大の飽和磁束密度を持っている。多層構造としたことで周波数特性も非常に優れ,数メガヘルツ帯での使用が可能である。第5番目は,巨大磁気抵抗効果を示す人工格子膜に関するもので,非常に磁界感度の高い材料の開発に成功した。これは,磁性層に結晶磁気異方性が小さく,磁歪定数がほとんどゼロの組成のFeNiCo合金を用いることによって磁性層を非常にソフトな状態として磁界感度の向上させたものである。以上のように本研究では,日本側の研究分担者と連合王国・サルフォード大学グルンディ,ガーバー両教授と国際共同研究を行うことにより大きな成果が得られた。その磁気光学カ-

スペクトルは,2nm程度の膜では,ほとんどバルクの光学定数を用いて説明できたが,やはり0.6nm程度となるとバルクのものとはかなり異なったものとなる。これは,超薄膜状態のコバルトの電子状態がバルクのものとは,異なっているということを示唆している。第3番目は,希土類遷移金属系の光磁気記録媒体に関するものである。希土類遷移金属系については,ブルーレーザに対応できる短波長記録媒体という観点から,ネオジウムを含む系の検討を詳細に行った。ネオジウムと遷移金属のアモルファス合金薄膜は短波長において非常に大きなカ-回転角を示すが,飽和磁化が大きくなってしまうことから垂直磁化膜を得ることができなかった。本研究では,多層構造にすることで垂直異方性を誘導させるともに,ネオジウムにカドリニウムを添加することによって飽和磁化を低減して非常に角型比の良い垂直磁化膜を得ることに成功した。また,磁気光学効果を最大にするために遷移金属層は,鉄コバルト合金とした。膜厚比等を最適化した結果,短波長において従来材料に比べ2倍近い性能指数を示す材料を開発することができた。また,光磁気記録においては,局所的にレーザ照射して熱を加えるため,この人工格子膜の熱的安定性についても検討を行った。その結果,飽和磁化の値は,希土類成分が酸化され始める300度程度までは十分安定であるが,磁気異方性については,その起源が多層構造にあるため,その構造が崩れ始める200度程度から急激に低下することが分かった。しかし,実用上必要な寿命は確保しているものと考えられる。第4番目は,磁気ヘッド材料として重要な軟磁性膜に関するもので,Fe/FeCoZr人工格子膜が,等価的に非常に小さな結晶磁気異方性と磁歪定数を有し,その結果,非常に小さな保磁力と高い透磁率を示す材料の開発に成功した。また鉄系の材料を用いることでほとんど理論的に到達可能な範囲で最大の飽和磁束密度を持っている。多層構造としたことで周波数特性も非常に優れ,数メガヘルツ帯での使用が可能である。第5番目は,巨大磁気抵抗効果を示す人工格子膜に関するもので,非常に磁界感度の高い材料の開発に成功した。これは,磁性層に結晶磁気異方性が小さく,磁歪定数がほとんどゼロの組成のFeNiCo合金を用いることによって磁性層を非常にソフトな状態として磁界感度の向上させたものである。以上のように本研究では,日本側の研究分担者と連合王国・サルフォード大学グルンディ,ガーバー両教授と国際共同研究を行うことにより大きな成果が得られた。本国際共同研究の初年度にあたり、本年度は、とくに磁性に関する世界最大の国際会議ICM(IUPAC主催)と、そのサテライト会議である国際磁性薄膜・表面会議ICMFSが英国で開催されるところから、これらの会議において本研究分野の最先端の研究状況を調査するとともに、この会議の期間を利用して、9月3日、エジンバラ大学において本共同研究の主要メンバ-による研究打ち合わせ会議を実施した。研究代表者、内山、研究分担者、藤森、綱島、グルンディ-、ガ-バ-、研究協力者高橋(名古屋大学)、神保(大同工業大学)の出席のもとに、これまで研究分担者が独自に行ってきた研究の最新の成果を紹介し、意見交換を行うことを手初めとして、各分担者の研究課題について、具体的な研究実施計画を討議した。本年度の具体的な研究成果は以下の通りである。
アルカン炭素―水素結合活性化に有効な金属カルベン錯体の開発と新規合成反応の創出

N-ヘテロ芳香環カルベンを配位子として有する新規ロジウム錯体を合成し,光照射条件下で芳香族化合物やアルカンの炭素ー水素結合の活性化における触媒活性を評価した.予想に反して,合成した錯体は,炭素ー水素結合の活性化反応に対する触媒活性はほとんどなかったが,反応にカルボニル化合物を添加すると,炭素ー水素結合のカルボニル化反応が促進効果されることを明らかにした.この検討を続けている過程で,パラジウム触媒による末端アルキンと末端アルケンの脱水素型カップリング反応,および光学活性ロジウム触媒によるシクロブタノールから光学活性シクロペンタノールの新規合成法の開発に成功した.遷移金属錯体を用いた炭素ー水素結合の選択的な活性化・官能基化反応の開発は、環境調和に優れた次世代型プロセスとして期待されている。本研究は、アルカン炭素ー水素結合の酸化的付加に高活性な金属カルベン錯体の合成と、これを利用した高効率・高選択的な触媒反応の開発を目的とするものである。今年度は前年度から引き続き、光照射下においてロジウム錯体による炭素ー水素結合の活性化を経た触媒反応の開発に取り組んだ。当初の研究計画では、水酸基を配向基と利用したアルコール類の反応を検討予定であったが、アミノ酸類の炭素ー水素結合の活性を検討した。アミノ酸類のα-位の炭素ー水素結合が、カルボニル化合物の共存下で光照射すると活性化されることが知られているためである。しかしながら、カルボニル化反応や不飽和化合物への付加反応は進行せず、複雑な混合物を与えるのみであった。当初の研究計画を達成するためには新たな触媒系の開発が必要であると考え、さまざまな触媒系の検討を行った。その過程で、末端アルキンと末端アルケンの脱水素型カップリング反応がパラジウム触媒の存在下で進行することを見出した。また、シクロブタノールとヒドラゾン化合物を光学活性ロジウム触媒の存在下で反応させると、シクロブタノールの炭素ー炭素結合にカルベンがエナンチオ選択的に挿入し、光学活性シクロペンタノールが得られることを見出した。本研究期間全体を通じて、当初の目的どおりの研究成果は必ずしも得られなかったが、その過程において末端アルケンと末端アルキンの新規脱水素型カップリング反応と、シクロブタノールの炭素ー炭素結合へのカルベンのエナンチオ選択的挿入反応を見出すことができた。これらの成果は、単純な分子から複雑な分子を簡便に合成できる新手法として極めて重要な結果であり、今後格段の進展が期待されるものである。芳香族炭素ー水素結合の活性化はよく研究されているものの、アルカンのそれは遅れた研究分野であり、効率的な反応の開発は急務である。今年度は交付申請書に記載したとおり、アルカン炭素ー水素結合の活性化に有効な金属カルベン錯体の調製とその反応性の検討について検討を行った。結果を以下に記す。まず二つのN-へテロ芳香環カルベン(NHC)配位子と一酸化炭素(CO)を有するさまざまなロジウムカルベン錯体を合成した。合成したロジウムカルベン錯体を触媒として用い、光照射下、アルカン炭素ー水素結合の活性化とつづくホルミル化およびオレフィン類への付加反応を検討した。基質としてアルキルベンゼンを用いたところ、芳香族の炭素ー水素結合の活性化された生成物が観測されるものの、アルカンの炭素ー水素結合が活性化された生成物は全く得られなかった。アルカン基質としてシクロヘキサンを用いた反応も検討したが、期待どおりの炭素ー水素結合の活性化した生成物は得られなかった。光照射下、RhCl(CO)(PMe3)2錯体を用いた反応では、ケトンやアルデヒドを少量添加すると、アルカン炭素ー水素結合がラジカル的に活性化され、反応が促進されることが知られている。そこで金属カルベン錯体を用いる反応においてもさまざまなケトンの添加を検討したところ、シクロヘキサンのホルミル化反応においてベンゾフェノンを添加すると、反応の促進効果が得られることを明らかにした。しかしながら、その活性はRhCl(CO)(PMe3)2錯体を用いる反応には及ばなかった。これまで、配位性官能基を用いた触媒的なアルカン炭素ー水素結合の活性化は数多く報告されているが、単純アルカンの炭素ー水素結合の触媒的活性化反応の例はほとんど知られていない。したがって、アルカン炭素ー水素結合の活性化に有効な高活性・高選択的な遷移金属錯体あるいは反応系の開発は、学術的に重要な研究課題である一方、非常に挑戦的な研究課題であるといえる。

本年度は交付申請書に記載した研究計画にしたがい、さまざまなNHC配位子を用いて、二つのNHC配位子と一酸化炭素COを有するロジウムカルベン錯体を合成し、アルカン炭素ー水素結合活性化能の評価を行うことができた。ロジウムカルベン錯体の反応性は既存のRhCl(CO)(PMe3)2錯体のそれには及ばないことがわかった一方、カルボニル化合物の添加がロジウムカルベン錯体によるアルカン炭素ー水素結合活性化反応においても有効であることを明らかにした。これらの知見は,次年度以降の本研究課題を推進する上で重要な結果であり、今後の研究の指針を与えるものであると考えられる。次年度も引き続き、アルカン炭素ー水素結合の活性化に有効な金属カルベン錯体の開発を行っていく予定であるが、研究開始当初に予定していた金属カルベン錯体の開発に限定せず、ホスフィン錯体やシクロペンタジエニル錯体など、さまざまな錯体を用いた反応を検討する予定である。特に近年,ロジウム3価やコバルト3価シクロペンタジエニル錯体が、芳香族炭素ー水素結合の活性化に非常に有効であることが報告されており、これらがアルカンの炭素ー水素結合の活性化にも有効であると期待している。平成25年度はまず、後半に検討を予定していたアルコール類の炭素ー水素結合の活性化・官能基化反応の開発を強く推進していく予定である。水酸基が配位性官能基として機能することで、炭素ー水素結合の活性化を効率的に行えるだけでなく、熱学的に安定なメタラサイクルの形成を駆動力とした、位置選択的な炭素ー水素結合の活性化が期待できるからである。本反応により単純なアルコール類を複雑分子へ効率的に変換できれば、工業的にも有用な反応となるうえ、医薬品合成への応用の可能性を秘めていることから、重要な研究課題であると考えている。さらに平成25年度後半には、末端イソプロピル基やtert-ブチル基上のメチル基選択的な炭素ー水素結合の活性化による複雑分子の構築手法の開発を予定している。配位性官能基を利用したアルカンの炭素ー水素結合の活性化は数多く報告されているが、それを用いないものはほとんどないことから、それを用いない反応の開発は非常に重要である。遷移金属錯体を用いて単純アルカンの結合を活性化すると、反応は末端選択的に進行することが知られているので、その知見をもとに、効率的な炭素ー水素結合の官能基化反応の開発を行う予定である。本年度は、本研究の推進に必要な消耗品や国内学会参加費用として研究費を使用したが、次年度、更なる研究の推進が予想されるので、300千円を次年度に使用できるように研究費を繰り越した。したがって次年度は、請求する研究費と繰越金の合計1,800千円を次のように使用する計画である。まず、設備備品は既設の設備で十分と判断し、設備備品費は予算に計上していない予定である。消耗品費は、反応基質や配位子、金属錯体、およびこれらを合成する際の原料となる有機化合物の購入(1,100千円/年)、汎用有機溶媒(300千円/年)、反応容器やピペット、サンプル瓶などのガラス器具(250千円/年)といった消耗品や、論文別刷代(50千円/年)に充てる。また旅費として、本研究の研究成果を発表したり、関連分野の情報を収集したりするために必要な国内学会の参加費用(100千円/年)を計上した。
40kDa-A型フィトクロム結合タンパク質と光シグナル伝達

植物は、外界の環境変化に適切に応答して、発芽・成長し、効率よく光合成を行い、開花・結実して子孫を残す。いずれの過程にも光による制御機構が働いており、これらの光形態形成反応の主要な光センサーであるフィトクロムは色素タンパク質で、可逆的な光スイッチとして働く。本研究は未解明である高等植物A型フィトクロム(phyA)の光シグナル伝達機構を、本研究開始以前にphyAをリガンドとするアフィニティーカラムを用いて見つけていたphyA結合タンパク質を手がかりにして、解明することを目指した。平成13年度はこれらBPの主要なものを同定した。その内の一つ、40kDa-BPはエンドキシグルカントランスフェラーゼ、45kDa-BPは仮想的β-ウレイドプロピオナーゼであることが解った。後者はもしそうで有ればニトリラーゼ活性を有しオーキシン生合成に関与している可能性が有る。両者共に光による脱黄化反応への関与が考えられる酵素である。平成14年度は、この二つのBPの1)cDNAのクローニングを行い、2)大腸菌などの発現系による調製を行い、in vitro系でのタンパク質間の結合、酵素活性解析、phyA複合体の酵素活性への光の効果などを調べることを目的とした。その結果クローニングしたcDNAを用いて酵素活性を持つ試料の調整に成功した。但し後者に関してはオーキシン生合成キーステップであらうインドール-3-アセトニトリルからインドール酢酸への過程を触媒するかどうかに関してはまだ確定的な結果が得られなかった。今後さらにこの点を含めphyA複合体の酵素活性への光の効果、トランスジェニック個体を用いてin vivo系でのphyA光シグナル伝達系へのこれらのBPの関与などを調べる必要が有る。移動能力を持たない植物は、外界の環境変化に適切に応答して、発芽・成長し、効率よく光合成を行い、開花・結実して子孫を残す。いずれの過程にも光による制御機構が働いており、これらの光形態形成反応の光センサーとして、赤色光領域に主要な吸収を持つフィトクロムと、青色光領域に吸収を持つ一群の青色光受容体が知られている。フィトクロムによる光情報受容の流れは、(1)発色団による光量子の吸収と光化学反応、(2)それにともなうタンパク質部分の構造変化、(3)相互作用タンパク質へのシグナル伝達、(4)シグナル伝達のカスケード、(5)目的遺伝子発現調節や酵素活性の調節、(6)生理反応の発現、と表せる。この(3)の分子機構を調べるべく、これまでフィトクロムをリガンドとするアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、複数のA型フィトクロム(PhyA)結合タンパク質(BP)を検出してきた。これらの部分アミノ酸配列から、光可逆的にPhyAに結合をする40kDa-BPを始めとする4つのBPを同定した。これらのBPは、オーキシンを介した細胞壁生合成の調節に関わっている可能性が有り、現在これらの点を明らかにすべく、BPの機能およびその機能制御機構へのフィトクロムの関与をin vitroおよびin vivoの系を用いて解析中であり、これらの結果からPhyAを介したシグナル伝達機構の解明に迫る予定である。

その内の一つ、40kDa-BPはエンドキシグルカントランスフェラーゼ、45kDa-BPは仮想的β-ウレイドプロピオナーゼであることが解った。後者はもしそうで有ればニトリラーゼ活性を有しオーキシン生合成に関与している可能性が有る。両者共に光による脱黄化反応への関与が考えられる酵素である。平成14年度は、この二つのBPの1)cDNAのクローニングを行い、2)大腸菌などの発現系による調製を行い、in vitro系でのタンパク質間の結合、酵素活性解析、phyA複合体の酵素活性への光の効果などを調べることを目的とした。その結果クローニングしたcDNAを用いて酵素活性を持つ試料の調製に成功した。但し後者に関してはオーキシン生合成キーステップであらうインドール-3-アセトニトリルからインドール酢酸への過程を触媒するかどうかに関してはまだ確定的な結果を得ていない。今後さらにこの点を含めPhyA複合体の酵素活性への光の効果、トランスジェニック個体を用いてin vivo系でのphyA光シグナル伝達系へのこれらのBPの関与などを調べる必要が有る。
小児急性骨髄性白血病における網羅的変異解析とプレシジョンメディスンへの応用

小児AML患者の30%以上が予後不良であるため、これまで申請者らは小児AMLの予後改善に寄与するべく、次世代シーケンサーで標的シーケンスを行うことで予後因子を同定してきた。今回我々はこれまでAMLを含む悪性疾患で報告のある遺伝子や、治療薬が開発されている遺伝子について網羅した343遺伝子パネルを用いて、次世代シーケンサーを使用したtargeted deep sequencingを立案した。解析の結果抽出された遺伝子変異について臨床データとの比較検討を行い、特定された遺伝子変異の変異頻度、臨床的特徴、予後との関係、その他の遺伝学的背景との相関関係を調べ、それらの遺伝子変異の重要性を決定する。小児急性骨髄性白血病(AML)は分子生物学的異常と治療反応に基づいたリスク層別化治療により、長期生存率は60-70%まで向上した。近年、次世代シークエンサーの登場によって、がん領域におけるクリニカルシーケンスが米国を中心に急速に普及している。治療決定に必要不可欠とされるクリニカルシーケンスは、研究論文で構築されたデータを基盤としており、小児AMLにおいても腫瘍の原因遺伝子となる、より多くのゲノム情報が必要とされている。申請者は、これまで本邦で行われたAML99研究及び日本小児白血病リンパ腫研究グループ(JPLSG)AML-05研究の検体を用い、RUNX1遺伝子変異が予後不良であり、第一寛解における造血幹細胞移植の必要性を報告してきた。今回、クリニカルシーケンスによるプレシジョンメディスンの根拠となるべく、小児AMLにおいて予後因子が同定できない正常核型や複雑核型症例を中心に343遺伝子のパネルシーケンス計画した。2018年度の研究では正常核型、複雑核型を中心とした小児AML約100症例に対してパネルシーケンスを行い、多数の遺伝子変異を複数の症例で同定している。同定された遺伝子変異について、これまでの遺伝子解析ツールを使用して有意な遺伝子変異のみを抽出し、臨床データとの比較検討を行った。現在予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異を同定し、過去の報告に関しての検討も行っている。これらの結果に関する一部について、昨年度の米国血液学会で発表を行っている。また、本年度の学会で報告をするべく、準備を進めている。正常核型、複雑核型を中心とした小児急性骨髄性白血病約100例を対象にして次世代シーケンサーを使用した343遺伝子パネルシーケンスを行い、多数の遺伝子変異を同定している。現在は同定された遺伝子変異について、これまでの遺伝子解析ツールを使用して有意な遺伝子変異の絞り込みを行い、臨床データとの比較検討を行っているところである。一部データがまとまったものに関しては昨年度の米国血液学会で報告もできており、研究進捗状況としては順調に進展していると考えられる。現在は絞り込まれた遺伝子変異の中から、予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異を同定し、既存の報告があるかの検討、および過去の報告があるものに関してはその傾向の比較検討を行っている。本年度は対象症例を更に増やしてパネルシーケンスを行い、小児急性骨髄性白血病における各遺伝子変異のより詳細な頻度や臨床データとの相関関係を解析する予定である。また、これまでのまとまったデータおよび今後解析予定のデータに関して、本年度の各学会(日本血液学会や日本小児血液がん学会、および米国血液学会を目標としている)で報告をするべく、準備を進めている。現在パネルシーケンスにてこれまで得られた遺伝子変異データから臨床データとの比較検討を行っているところである。予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異の候補選定を行っているが、本年度は対象症例を更に増やしてパネルシーケンスを行う予定であり、これらの新規のデータを追加した上で、より予後に関連した遺伝子変異の絞り込みを行う。これまでの解析で小児急性骨髄性白血病においてリカレントな遺伝子変異を複数同定できており、研究計画としては現在の方針のままで問題ないと思われる。本年度計画しているパネルシーケンスに加えて、今後は統計解析をメインに行い、各遺伝子変異の頻度に加えて性別や年齢、白血球数といった臨床データとの比較、これまでに得られた他の染色体異常や融合遺伝子、遺伝子変異や構造異常、遺伝子発現との相関関係、再発率、生存率との関係について解析していく。申請者は、これまで本邦で行われたAML99研究及び日本小児白血病リンパ腫研究グループ(JPLSG)AML-05研究の検体を用い、RUNX

1遺伝子変異が予後不良であり、第一寛解における造血幹細胞移植の必要性を報告してきた。今回、クリニカルシーケンスによるプレシジョンメディスンの根拠となるべく、小児AMLにおいて予後因子が同定できない正常核型や複雑核型症例を中心に343遺伝子のパネルシーケンス計画した。2018年度の研究では正常核型、複雑核型を中心とした小児AML約100症例に対してパネルシーケンスを行い、多数の遺伝子変異を複数の症例で同定している。同定された遺伝子変異について、これまでの遺伝子解析ツールを使用して有意な遺伝子変異のみを抽出し、臨床データとの比較検討を行った。現在予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異を同定し、過去の報告に関しての検討も行っている。これらの結果に関する一部について、昨年度の米国血液学会で発表を行っている。また、本年度の学会で報告をするべく、準備を進めている。正常核型、複雑核型を中心とした小児急性骨髄性白血病約100例を対象にして次世代シーケンサーを使用した343遺伝子パネルシーケンスを行い、多数の遺伝子変異を同定している。現在は同定された遺伝子変異について、これまでの遺伝子解析ツールを使用して有意な遺伝子変異の絞り込みを行い、臨床データとの比較検討を行っているところである。一部データがまとまったものに関しては昨年度の米国血液学会で報告もできており、研究進捗状況としては順調に進展していると考えられる。現在は絞り込まれた遺伝子変異の中から、予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異を同定し、既存の報告があるかの検討、および過去の報告があるものに関してはその傾向の比較検討を行っている。本年度は対象症例を更に増やしてパネルシーケンスを行い、小児急性骨髄性白血病における各遺伝子変異のより詳細な頻度や臨床データとの相関関係を解析する予定である。また、これまでのまとまったデータおよび今後解析予定のデータに関して、本年度の各学会(日本血液学会や日本小児血液がん学会、および米国血液学会を目標としている)で報告をするべく、準備を進めている。現在パネルシーケンスにてこれまで得られた遺伝子変異データから臨床データとの比較検討を行っているところである。予後不良因子となりうる可能性のある遺伝子変異の候補選定を行っているが、本年度は対象症例を更に増やしてパネルシーケンスを行う予定であり、これらの新規のデータを追加した上で、より予後に関連した遺伝子変異の絞り込みを行う。これまでの解析で小児急性骨髄性白血病においてリカレントな遺伝子変異を複数同定できており、研究計画としては現在の方針のままで問題ないと思われる。本年度計画しているパネルシーケンスに加えて、今後は統計解析をメインに行い、各遺伝子変異の頻度に加えて性別や年齢、白血球数といった臨床データとの比較、これまでに得られた他の染色体異常や融合遺伝子、遺伝子変異や構造異常、遺伝子発現との相関関係、再発率、生存率との関係について解析していく。
ヒト嗅覚受容体の新規リガンド同定法の確立

ヒト嗅覚受容体のリガンドを同定することは、ヒトの匂い受容の理解にとって必須である。本申請課題では、ヒト嗅覚受容体のリガンドを同定するアッセイ系の確立するため、ヒト嗅神経をin vitroで作出する方法を計画した。発生期の嗅覚神経細胞の遺伝子発現プロファイルデータから候補となる転写因子を絞り込んだ。現在、レンチウイルスを用いてヒト線維芽細胞に遺伝子導入し、嗅覚神経細胞への分化誘導を試みている。匂いの知覚は、匂い分子が鼻腔奥にある嗅覚受容体に結合することによって生じる。嗅覚受容体遺伝子は生物種ごとにレパートリーが大きく異なっていることから、特定の動物の匂い認識機構を理解するためには、その動物が持つ嗅覚受容体遺伝子の機能を解析することが不可欠である。ヒトゲノムには、全遺伝子の1%強に相当する約400個もの嗅覚受容体遺伝子が存在するが、技術的な制約によりそれらの殆どは未だリガンドが明らかとされていない。この状況を打破するべく、本申請課題では我々が作製した変異マウスを用いたヒト嗅覚受容体の新しいリガンドスクリーニング法を確立する。これにより、ヒトの匂い認識の理解に新しい道を拓く。これまでヒト嗅覚受容体のリガンドが同定されてこなかった理由として、従来の培養細胞を用いたin vitroアッセイ系では機能的な嗅覚受容体が発現しないことが原因と考えられている。この問題を解決するには、ヒト嗅覚受容体を内在性の状態に近い環境、すなわちヒト以外の嗅細胞を用いた実験系を構築することが妥当な方策であると考えられる。そこで本研究課題では、マウスの嗅細胞にウイルスインジェクション、遺伝子改変動物の作製という2つの方法でマウス嗅細胞へのヒト嗅覚受容体遺伝子の導入を試みる。これらの手法と、嗅覚組織の急性スライスを用いたカルシウムイメージングを組み合わせ、ヒト嗅覚受容体のリガンド同定に向けたスクリーニング法を確立する。本研究に関しては、今年度他の研究費との兼ね合い上途中で研究費を繰り越さねばならず殆ど研究を実施できなかった。研究課題の遂行の途中で、他の研究費との兼ね合い上研究を来年度に繰り越すことになった。匂いの知覚は、匂い分子が嗅覚受容体に結合することによって生じる。嗅覚受容体遺伝子は生物種ごとにレパートリーが大きく異なっており、ヒトの匂い受容のメカニズムを理解するには、ヒト嗅覚受容体の機能を解析することが不可欠である。ヒトゲノムには、約400個もの嗅覚受容体遺伝子が存在するが、技術的な制約によりそれらの殆どは未だリガンドが明らかとされていない。本申請課題では、この状況を打破するべく、ヒト嗅覚受容体の新しいリガンドスクリーニング法の確立を目指した。これまでヒト嗅覚受容体のリガンドが同定されてこなかった理由として、従来の培養細胞を用いたアッセイ系では機能的な嗅覚受容体が発現しないということが原因となっていた。これに対して本申請課題では、【1】ヒト嗅覚受容体を内在性の状態に近い環境、すなわちマウス嗅細胞に発現させる、【2】ヒト嗅細胞自体をin vitroで作出するという二つの方法を提案した。【1】に関して、マウス嗅細胞にウイルスインジェクション、遺伝子改変動物の作製という2つの方法を試みた。ウイルスには、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスの三種類を試したが、どれも細胞毒性、感染細胞数の少なさ、ウイルス由来の遺伝子の発現レベルの問題によりリガンドスクリーニングを実施するには至らなかった。また、遺伝子改変動物に関しても、トランスジーン由来の嗅覚受容体遺伝子を発現する細胞が、週齢を追うにつれ減少していくという現象によりリガンドアッセイの実験には至らなかった。【2】に関して、直接変換法に習ってヒト由来の線維芽細胞にレンチウイルスを用いて複数の転写因子を同時に導入することで嗅細胞を作出することを目指した。マイクロアレイ解析を行い嗅細胞の遺伝子発現プロファイルから候補となる転写因子を約20種類同定し、どの遺伝子の組み合わせが嗅細胞の誘導に必要であるかを現在検証している。本研究課題では、マウスの嗅覚神経細胞に異所的にヒト嗅覚受容体を発現させることによってヒト嗅覚受容体のリガンド同定を試みることを目的としている。その方法として、遺伝子改変動物の作製及びウイルスによる遺伝子導入を計画している。2年計画のうち前半の1年間は他の研究費との兼ね合い上殆ど実施することができなかったため、来年度にすべてを完了させる。そのため当初ウイルスを用いた遺伝子導入の結果をみてから遺伝子改変動物の作製を遂行する予定だったが、来年度は両方の実験を同時に開始することで遅れている分を取り戻す。神経発生学次年度の額を使用してません。次年度の額を使用してません。
高等植物のDNA型移転調節因子の転移機構と遺伝子発現調節

高等植物のDNA型転移調節因子(トランスポゾン)は染色体上を転移し、種々のDNA再編成を引き起こして遺伝子の発現制御にも様々な影響を与え得る遺伝因子で、Ac/Ds系、En/Spm系Mu系などに大別できる。本研究の目的はアサガオやマルバアサガオの易変性変異を含む自然突然変異の同定や易変性変異の花の絞り模様形成機構を、DNA型転移調節因子の転移と遺伝子発現調節の両面から解析することである。また、後半の2年間は寺田博士を共同研究者に迎えイネの相同組換えも行い、以下の結果を得た。1718世紀(江戸時代)に日本で花卉園芸化されたアサガオの自然突然変異は、En/Spm系のTpn1ファミリーと名付けた一群の非自律性転移調節因子の関わる変異で、白花や絞り花の変異体はアントシアニン色素生合成系のCHS,CHI,DFR,ANSの各遺伝子内にTpn1類縁因子が挿入した変異体であり、紫地に青色のセクターを生じる易変性「紫」変異の解析から、液胞のNa^+/H^+交換輸送体が花弁液胞のpHを上げて青花化させることを明らかにした。1718世紀に欧米で花卉園芸化されたマルバアサガオの易変性「条斑」変異に関わるCHS-D遺伝子内に挿入されていたAc/Ds系の転移調節因子Tip100は自律性因子であり、赤色化を咲かせるpink変異はAc/Ds系の新規の非自律性のDNA型転移調節因子Tip201がF3'H遺伝子に挿入した変異であることを明らかにした。イネにおける相同組換えによる遺伝子ターゲティングのために、高頻度形質転換、強力なPositive-negative選抜、PCR法を用いた導入遺伝子のゲノム挿入部位の確認など高効率で相同組換体を分離するための諸条件を検討し、世界で最初にイネのWaxy遺伝子をターゲティングしたトランスジェニックイネの作出に成功した。江戸時代に自然突然変異体として分離されたアサガオの変異の大部分は、我々が既に単離したEn/Spm系のTpn1類縁の非自律性転移調節因子の挿入による変異であり、易変性の変異形質を示さずに安定な変異であると考えられる変異の中にも、対応する自律性因子がジーンサイレンシングによりその活性が抑えられ、その結果挿入されたTpn1類縁の非自律性因子の転移脱離できなくなったために、一見安定な変異であると従来考えられていた変異もあることを強く示唆する結果を得た。事実、極く最近になって、安定な白色花を咲かせると考えられていたr-1変異は、アントシアニン色素生合成に関わる遺伝子内にTpn1類縁の非自律性因子が挿入した変異であり、その転移脱離能が抑えられるため白色花となることも明らかにすることができた。それ故、本研究では自律性因子のジーンサイレンシングによる不活性化機構の解明を目指して、まずTpn1類縁の自律性転移調節因子の同定を試みている。アルバアサガノの花の絞り模様を賦与する易変性「条斑」変異は、アントシアニン生合成系ののCHS-D遺伝子内にAc/Ds系の転移調節因子Tip100が挿入した構造であることも明らかにした。このTip100の転移能に影響を与える他の遺伝因子の存在が示唆されているので、Tip100が非自立性因子であり、類縁の自立性因子の活性により転移の頻度とタイミングが決められているのか否かを検討するため、まずTip100を導入した異種トランスジェニック植物における転移能を検討中である。

さらに、Tip100の転移と頻度とタイミングが異なる変異体も分離できたので、この変異体のTip100の構造と機能も解析中である。江戸時代に自然突然変異体として分離されたアサガオの変異の大部分は、我々が既に単離したEn/Spm系のTpn1類縁の非自律性転移調節因子の挿入による変異であり、易変性の変異形質を示さずに安定な変異であると考えられる変異の中にも、対応する自律性因子がジーンサイレンシングによりその活性が抑えられ、その結果挿入されたTpn1類縁の非自律性因子が転移脱離できなくなり、一見安定な変異の様にふるまう変異もあることを明らかにしてきた。極く最近になって、紫地に青色の絞りの花を咲かせる易変性変異にもTpn1の類縁因子が関与していると思われる結果も得られた。それ故、本年度も絞り模様の激しさを決める分子機構の解明を目指して、Tnp1類縁の自律性転移調節因子の同定を多面的に試みている。En/Spm系の自律性転移調節因子は2種の転移酵素遺伝子をコードしていることが知られているが、その内の1つの配列を含むと思われるDNA断片の分離に成功したので、その機能を解析中である。マルバアサガオの花に絞り模様を賦与する易変性「条斑」変異は、アントシアニン生合成系のCHS-D遺伝子内にAc/Ds系の転移調節因子Tip100が挿入した構造であることを既に明らかにしてきた。このTip100の転移能に影響を与える他の遺伝因子の存在が示唆されていたので、先ずTip100が自律性因子であるのか否かを検討するため、Tip100を導入したトランスジェニックタバコ植物における転移能を検討した。その結果、Tip100は自律性因子であること強く示唆する結果が得られた。現存するアサガオの多様な変異体は全て自然突然変異体であると考えられるので、そのほとんどがTpn1類縁の挿入変異体と推定できる。このTpn1類縁因子の挿入によりタグされた未知有用遺伝子を簡単に同定できる簡易トランスポゾンディスプレイ(Simplified Transposon Display)法を我々は開発し、紫地に青色の絞り花を咲かせる易変性「紫」変異purple-mutableに応用した。その結果、この易変性「紫」変異は、花弁表層の液胞の膜タンパクで、液胞型Na+/H+交換輸送体をコードしている遺伝子内に、Tpn4と名付けたTpn1類縁因子が挿入した変異であることを明らかにできた。アサガオゲノム中には約800コピーのTpn1類縁因子が散在しているにもかかわらず、易変性「紫」変異の同定に成功したことから、本法が極く最近相次いで発表された類似の諸手法と比較して、簡便かつ有効的な方法であると思われる。また、花色発現に花弁液胞内のpHが重要なことは従来から論議されてはいたが、花弁液胞のpHを上昇させて花色を青色化させるタンパクの実体は、本研究によりその一端が初めて明らかにされた。
DNA上の極性を有したスライディングとカップルした塩基変換酵素反応の解析

ヒトのAPOBEC3G(以下A3G)タンパク質は、HIVのDNAに作用して、シトシンをデアミネーションしてウラシルに変換する酵素である。これによりHIVのゲノム情報は破壊され、A3Gは抗HIV活性を有する。我々はNMRシグナルを用いる事で、A3Gによるデアミネーション反応をリアルタイムでモニタリングできる事を、これまでに報告してきた。今回デアミネーション反応のホットスポットを2つ有する1本鎖DNA及び同ホットスポットを3つ有する2つ有する1本鎖DNAを調製した。この際、特定のシトシンに13C安定同位体標識を施した。この標識により、どのシトシンがデアミネーションを受けたのかを一義的に帰属・同定する事が可能となった。標識によって、これまでより長鎖のDNAにおけるデアミネーションも比較的容易に追跡できる事が実証された。DNAにA3Gを作用させ、各ホットスポットおけるデアミネーションの進行を、申請者等が確立したリアルタイムモニタリングの手法で追跡した。その結果我々の予想通り5'端近くのホットスポットの方が、3'端近くのホットスポットより、デアミネーションを受ける頻度が高い事が実証された。またホットスポット間に2本鎖を形成させ、想定されているA3Gのスライディングを阻害した系では、ホットスポット間におけるデアミネーション頻度の差が消失する事が確認された。デアミネーション効率に関して各ホットスポットにおいて得られた実験データを、カイネティックモデルを構築して再現する事を試みた。その結果、A3GはDNA鎖上をスライディングすると考えられる事、そしてスライディングの方向によってホットスポットにおける触媒活性が異なると考えられる事が示唆された。HIVのゲノムDNAの広い範囲に渡ってA3Gが効率的に変異を導入する上で、この事は有利に働いていると考えられる。ヒトのAPOBEC3G(以下A3G)タンパク質は、HIVのマイナス鎖DNAに作用して、シトシンをデアミネーションしてウラシルに変換する酵素である。我々はNMRシグナルを用いる事で、A3Gによるデアミネーション反応をリアルタイムでモニタリングする事に世界で初めて成功した。本研究ではデアミネーションのホットスポット(CCC)を、鎖の5'端近くと3'端近くに計2つ配した1本鎖DNAを調製し、A3Gを作用させ上記の手法で反応を追跡した。仮にA3GがDNA鎖上を3'→5'の方向性を持ってスライディングしながらデアミネーションを行う場合、3'端近くのホットスポットにおけるデアミネーションを終えたA3Gは、スライディングして5'端近くのホットスポットに到達し、そこで引き続きデアミネーションを行う。この場合確率論的に、5'端近くのホットスポットにおけるデアミネーションの方が、他方より早く進行するはずである。実際にそのようになっている事が、今回実験によって検証できた。次に2つのホットスポットの間のDNAに相補的なDNAを加えて2本鎖を形成させ、スライディングができない状況を作る。この際には2つのホットスポットの反応性には差がなくなる事が予想されるが、実際にそのようになる事が実験的に確認できた。これらからA3Gによるデアミネーションは、3'→5'の極性を有したスライディングとカップルして生じている事が示された。また残基特異的に13C安定同位体標識を施したDNAも調製し、これを用いた反応のモニタリングも行った。その結果同位体標識をすれば、100残基程度のDNA鎖(分子量35000)中におけるデアミネーションも比較的容易に追跡できる事が示された。13C安定同位体標識によってもたらされるこのような高い空間分解能を生かせば、過渡的複合体の挙動が明らかになり、HIVのゲノムDNAの広い範囲に渡ってA3Gが効率的に変異を導入するメカニズムに迫れると考えられる。
中枢神経系発生に関与する遺伝子の単離、機能解析

Subtraction法によって選択され、胚発生において興味ある発現様式を示した新規遺伝子(約30種)のうち、特に数種について解析を進めた。1)lefty:新しいTGFβ-superfamilyである。驚くべき事に、嚢胚形成時において左右非対称に発現する(左側の中胚葉のみ)。発現の非対称性・時期・部位から判断して、左右軸を決定しているMorphogenだと予想される。2)P450RA:Brn-2の下流に位置された、構造上新しいP450である。その酵素活性や生物学的活性を調べたところ、レチノイン酸を不活性化する酵素であった。胚発生においては、神経冠や神経板の一部に特異的に発現されていた。胚におけるレチノイン酸の不均一な分布を作り出していると予想された。3)もう1つは、構造上Deltaに関連している新規遺伝子である。神経誘導の起こっている部位・時期に対応して発現されており、Notch/Deltaの系で見られるような細胞間相互作用を介して、神経細胞の誘導に関与している分子と考えられる。以上の3つの遺伝子について、Targetingによる機能解析を準備した。leftyについては、期待どうりにTargetされたES細胞株を数種類得て、ヘテロのマウスを作製できた。
多眼カメラを用いた高精細画像撮像のための信号処理方式の基礎的研究

研究代表者らは先に信号処理手法によって更なる高解像度化と低雑音化とをはかった新たな撮像方式として、平面の被写体に焦点を合わせた複数の固体撮像素子で撮像した多眼画像を信号処理手法により統合化することによってより解像度の高い画像を生成する撮像方式を提案した。本研究はこの[多眼撮像方式]を平面はかりでなく種々な立体形状ゐ有する撮像対象の撮像が可能な方式へと発展させるために、新たな撮像方式および統合方式を提案し、この方式の性能評価を行なった。研究代表者らが先に提案した多眼撮像方式では、撮像対象が平面かつカメラに輻輳を付けない場合にのみ撮像が可能であた。この原因は、画像統合による解像度の改善がカメラ配置に依存していたためである。そこで本研究では以下の項目について検討し、立体形状を有する対象をも撮像可能な撮像方式を開発した。(1)CCD撮像素子のアパーチャ(受光面)形状の検討画像統合による解像度の改善をカメラ配置に依存せずに得るためには個々の撮像素子が互いに異なるアパーチャを有する必要がある。即ち、個々のかめらでアパーチャ形状が異なれば、標本化位置が一致しても、撮像領域が異なるため統合化により解像度の改善が得られる。2眼カメラの場合のアパーチャについて計算機シミュレーションを行ない比率1:2の縦長・横長のアパーチャ形状の撮像素子の組合わせの統合波数応答を導出した。(2)異なるアパーチャで撮像された画像の統合法の開発撮像素子のアパーチャが異なると、個々の画像で解像度が異なり、画像間の対応関係の推定が困難となる。そこで、本研究では、解像度の異なる画像に対しても対応関係の推定が可能な信号処理方式を開発した。開発した信号処理方式は対応関係の推定処理と統合処理とを繰り返すもので、計算機シュミレーションによりこの方式の評価を行なったところ繰り返しのたびに対応関係の推定精度が改善された。
椎間板性腰痛に対する早期診断・治療システムの開発

国民の多くの愁訴である腰痛に対して、早期診断・治療システムの開発の研究を行った。腰痛の主たる原因となる椎間板に着目し研究した。MRIT2マッピング法というヒトに侵襲の少ない検査方法を応用し、変性が少ない椎間板では荷重負荷によりT2値が回復することから椎間板変性の早期診断に応用できることを報告した。椎間板再生医療による治療は未だ動物実験の域をでないが、現在施行されている最小侵襲腰椎固定術では、固定によるADL障害と隣接椎間障害が問題であることが判明し、今後は固定を用いない治療法の開発が必要であることを明確した。腰痛の原因となる椎間板変性の機序を解明し、椎間板変性を早期に診断するために腰椎MRIを撮像し、T2マッピング法にて極早期の軟骨変性を解析した。健常人40名(男性26名、女性14名、平均年齢25.6歳)を対象とした。腰椎の負荷前に撮影し、ROI(関心領域)を髄核、前方・後方線維輪に設定し、T2値を各椎間レベルで評価した。負荷前のT2値は髄核が有意に高く、髄核ではL3/4で148と最も高く、L5/S1では112と有意に低値であった。髄核の変性グレードによる評価では、各々のT2値は、138, 122, 92, 60msecと変性度とT2値は強い相関が認められ、椎間板変性の早期診断に応用できることが示唆された。一方、前方、後方線維輪では変性度が進んでもT2値には有意な変化がなく、早期の椎間板変性が髄核から発生することも明らかになった。一方、ラット尾椎椎間板モデルについては、岩手医科大学では未だ確立できておらず、過去の報告に追随した。椎間板の圧迫による変性モデルを作成し、変性による1型コラーゲンの上昇やアグリカン、2型コラーゲンの低下を報告した。本モデルでの圧迫群では、椎間板での蛋白及びmRNAレベルでのMMP群やADAMST群の経時的な進行性の発現上昇が確認され、異化遺伝子の発現上昇が椎間板変性の初期の変性機序であることを明らかにした。これらの点から機械的因子が椎間板変性の引き金になることが推測され、MRIによる評価と合わせて動的因子が変性に与える影響について研究を進めていく予定である。動的負荷が椎間板組織に与える生物学的影響については、神戸大学での研究を継続した。組織培養した椎間板に動的負荷をかけることにより髄核を中心として椎間板変性が誘導されることを明らかにした。さらに動的負荷により椎間板が変性していく過程でIntegrinが関与していることを示唆した。平成27年度の研究実施計画において1)椎間板変性の病態解明の研究と2)T2マッピング法MRIの撮像をテーマとして研究を行った。椎間板変性の初期変化をとらえその病態を解明するために健常人ボランティア40名のMRIを撮影しT2値を計測した。T2値が椎間板変性の早期診断に応用できることが明らかになったので今後は腰椎の前屈・後屈動作後も同様に測定し、椎間板変性の病態と早期診断法についてさらに研究を進める。一方、ラットを用いた病態研究では、岩手医科大学の施設の問題もあり、研究モデルの作成が困難である。従って、この分野においては、情報を共有して神戸大学の研究グループと共同で研究を進めていく予定である。腰椎MRIを撮像し水分含有量を示唆するT2マッピング法にて腰椎に対する運動負荷が椎間板に及ぼす影響を検討した。椎間板変性の原因になりうる椎間関節の軟骨変性についても同様の方法にて解析した。45度屈曲、30度伸展、40度の回旋運動を15回施行し、運動前、運動直後、30分間安静後の3回のMRIを撮像し、T2マッピング法にて比較検討した。髄核においては、運動負荷後にはT2は有意に低下するが、安静により元の値に回復することが明らかになった。線維輪では運動負荷によってもT2値に有意な変化はなかった。変性の分類によるとグレード1と2の椎間板変性のないか軽度の群では、運動負荷によりT2値は有意に低下し、安静により有意に増加した。グレード3と4の変性の進んだ群では、運動負荷前後のT2値の変化は認めなかった。椎間板変性に影響を及ぼすと考えられる椎間関節軟骨についてもT2マッピング法を用いて同様の解析を行った。椎間関節のT2値も運動負荷後には有意に低下し、変性の初期変化に関与していることが明らかになった。以上の研究から変性変化の少ない髄核では、運動負荷によりT2値は低下し安静により回復するが変性が進行するとこの変化が非可逆的になり変性が進行していくことが示唆された。腰痛の治療システムを評価するために固定術前と術後の血液検査を施行し、血清中フッ素イオン濃度や微量金属濃度を測定した。血中フッ素イオン濃度は、脊椎固定術術後の骨代謝に影響を及ぼすことが判明し、今後骨癒合判定に利用が可能であることが示唆された。ラット尾椎椎間板モデルについては、椎間板の圧迫による変性モデルを作成し、継続して椎間板変性の病態について神戸大学と共同研究を行った。圧迫により椎間板の変性が進行し、その過程で細胞のオートファジーを誘導しうる因子が、脊索由来細胞に多く出現し、これが椎間板変性に関与していることが示唆された。

平成28年度は、初年度の研究成果と研究目標を元に研究を継続遂行した。昨年度に腰椎MRIを撮像し、T2マッピング法によるT2値を求めることにより椎間板変性の早期診断に応用できることが明らかにした。本年度は、腰椎の運動負荷前と負荷後、安静後にMRIを撮像し、椎間板変性がないか軽度の髄核では、運動負荷後にT2値が低下し安静にて回復するが、変性が進んだ椎間板ではこの変化が起こらないことを明らかにした。椎間板髄核の初期の変性変化を診断することは可能になったが、これが腰痛の早期診断に結び付けていく必要がある。また、非特異的腰痛には、椎間板変性だけでなく椎間関節の変性も関与している可能性があり、これについても研究を進めていく必要がある。腰痛の早期治療に結び付けていく研究に関しては、進行しておらず課題である。腰痛の原因となる因子の早期診断においては、脊椎固定手術前と後の血清中のフッ素イオン濃度や微量金属濃度を測定することにより診断するシステムの開発中であり、この分野の研究は本年度から開始したところである。ラットを用いた椎間板変性モデルを用いた椎間板変性を解明する研究は、従来通り神戸大学と共同研究を進めており、この分野での進展はやや計画より遅れている。MRIT2マッピングによる一連の研究からグレード1または2の椎間板変性がないか、軽度の変性にとどまる椎間板では、運動負荷を行ってもT2値が回復することが判明し、逆にT2値が回復しない椎間板は変性に陥っていることが明らかになった。このことからMRIは椎間板変性の初期早期診断に有用である。また、同様の結果は、椎間関節にも合致し、病理学的にも証明が可能であった。一方、腰痛の早期診断として骨に注目し、腰椎固定術前後の血中フッ素濃度を経時的に測定した。フッ素濃度は術後1周で一旦低下するが、徐々に上昇し、術後1と3ヶ月では有意な上昇がみられ、骨形成能が向上していることが示唆された。従って、フッ素濃度の測定により骨代謝の状態が診断できることを明らかにした。ラットの創外固定による椎間板圧迫変性モデルを用いた研究では、椎間板変性の進行とともにオートファジー活性の高い脊索由来細胞の減少と非脊索由来細胞における死細胞の増加を認め、オートファジーが椎間板の恒常性維持に重要な役割を果たしている可能性を明らかにした。これらの研究結果を踏まえ、最少侵襲治療法について研究した。椎間板変性の進行を予防することが、腰痛治療につながることは明らかである。しかし、現時点は、変性進行を遅らせる有用な治療法の開発の臨床応用には至っていまし。従って、側方侵入による椎体間固定では、腰痛の原因である椎間板を切除し、その機能を消失させることが可能である。従来の後方侵入固定法との比較においても出血量などの手術侵襲が小さく、同様の腰痛軽快効果が得られており、最少侵襲治療法として有用であることが判明した。本研究において、低侵襲腰痛治療の方法のひとつになりうることを明らかにした。国民の多くの愁訴である腰痛に対して、早期診断・治療システムの開発の研究を行った。腰痛の主たる原因となる椎間板に着目し研究した。MRIT2マッピング法というヒトに侵襲の少ない検査方法を応用し、変性が少ない椎間板では荷重負荷によりT2値が回復することから椎間板変性の早期診断に応用できることを報告した。椎間板再生医療による治療は未だ動物実験の域をでないが、現在施行されている最小侵襲腰椎固定術では、固定によるADL障害と隣接椎間障害が問題であることが判明し、今後は固定を用いない治療法の開発が必要であることを明確した。
唾液腺外分泌細胞におけるCa依存性Kチャネルの細胞内調節機構

ラット顎下腺からコラゲナーゼとデイスパーゼにより単一腺房細胞を調整し、それにパッチクランプ法を適用し以下の実験を行った。ホールセルパッチクランプ法を適用することにより単一細胞細胞膜全体のCa依存性Kチャネル電流を測定した。ピペット内溶液はG-glutamateを基本した溶液を用いた。溶液中の遊離Ca濃度は基本的に1uMとする。細胞外液はNMDG-glutamateを基本した溶液として膜電位固定により惹起されるK電流が得られるか否かを検討した。このような実験条件下で得られた電流の大部分は10mMTEAにより抑制されなく、このTEA非感受性の電流を電気生理学的に検討した。TEA10mM存在下で見られた電流の逆転電位は細胞外K濃度を変化させるとほぼK選択的電極のような振舞をしたことから、K電流であることが明らかになった。このK電流がK選択的イオンチャネルを介しているか否かを調べるために、ピペット内溶液のK-glutamateをCs-、Na-、Rb-glutamateで置換して同様な実験を行った結果、CsおよびNa置換では外向き電流は膜電位過分極側では観察できなく、逆転電位は約0mVにシフトした。一方Rb置換ではKと同様な外向き電流が観察され、逆転電位もKとほぼ同様であったことから、この電流は非選択的カチオンチャネルを介したものでないことが、明らかになった。この電流はピペット内溶液の遊離Ca濃度は100nM以下にすると完全に抑制されたことから、Ca依存性Kチャネル電流であることが明らかになった。さらにこのK電流は細胞外にBa(5mM)やquinine(1mM)を投与することに抑制された。これらの研究により明らかになったTEA非感受性、Ca依存性K電流の電気生理的性質は以前報告したラット顎下腺を用いた血管側外向きKイオン輸送の性質とよく類似していることから、本研究で示されたKチャネルが生理学的に重要な役割を果たしている事が示唆される。