hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病Aβの脳内エコノミー破綻によるタウ依存的神経障害の分子基盤解明

本研究は脳内のAbetaエコノミー破綻により、Abetaが凝集性を獲得する分子機序、及びその下流でタウが病原性を獲得し、神経変性を引き起こす機序の解明を目的とする。1.脳内Abetaエコノミーに関わる分子基盤の検討。前年度APP tgマウス脳TBS可溶画分中に200kDa以上(peak 1)、50-70kDa (peak 2)、10-20kDa (peak 3)の3種類のAbetaが存在することを明らかにした。そこでpeak 1、2をAPP tgマウス脳に注入し、Abeta蓄積誘引能を検討したところ、peak 1に蓄積誘導脳があることを見出した。免疫除去法でpeak 1からAbetaを除いたところ、Abeta蓄積誘導脳が消失した。またpeak 2には蓄積誘導脳は認められなかった。また、アルツハイマー病患者脳TBS可溶画分を検討したところ、主にpeak 1、3が存在することが確かめられた。さらにAbetaオリゴマー特異ELISAを用いて検討し、peak 1にAbetaオリゴマーが存在していることが分かった。さらに、APP tgマウス脳peak 1中のAbeta量と、海馬Abeta蓄積面積を比較したところ、正の相関性があることが分かり、peak 1中のAbetaはアミロイド斑に結合している可能性が示唆された。2. Abetaの下流でタウが病原性を獲得する分子基盤の検討。前年度作出したAAV9-tauRDを用いてAPP tgマウス脳に注入したところ、タウのPHF1抗体陽性リン酸化を誘引し、さらに神経細胞死を引き起こすことを明らかにした。また分化させたヒト神経前駆細胞ReNcellにAPP tgマウス脳peak 1を投与したところ、リン酸化タウが神経突起内に出現することを見出し、peak1画分中のAbeta strainがタウ異常性獲得に重要であることを明らかにした。本研究は脳内Abetaエコノミーとその破綻、及びタウの異常性獲得の分子基盤解明を目指している。本年度、APP tgマウス脳中の可溶な200 kDa以上の高分子量Abeta oligomerにAbeta蓄積誘引脳があることをin vivoレベルで初めて明らかにし、さらにこのAbeta分子種はヒトアルツハイマー病患者脳にも存在すること、その量がアミロイド斑面積と性の相関性があることを見出した。これら結果は、新たなアルツハイマー病創薬標的を提供するものでもあり、順調に進行していると言える。また、タウの病原性獲得を引き起こすAbeta分子種を同定するため、新たにAAV9-tauRD誘導実験系を樹立し、APP tgマウス脳において、タウのリン酸化を誘引することに成功した。さらに、peak 1中のAbeta strainがタウ蓄積を誘導することを見出した。これらの結果から、研究は順調に進行していると言える。これらの結果を総合的に判断し、本研究はおおむね順調に進行していると評価される。脳内Abetaエコノミーの分子基盤解明のため、本年度作出したAAV-apoEを利用し、apoEがAbetaの凝集、蓄積に与える影響を解明する。また、peak 1 Abeta分子種がどのような機序でAbeta蓄積を誘引するか、生化学的解析を行い、またヒトアルツハイマー病脳由来のpeak 1 Abeta strainのAbeta蓄積誘引脳についても検討を行う。さらに、peak 1 Abeta strainの脳内からの除去がアルツハイマー病治療に寄与するか検討するため、peak 1を注入したAPP tgマウスに対し、Abeta抗体ワクチン療法を行い検討する。一方、タウの異常性獲得に寄与するAbeta分子種を同定するため、ReN cellを用いた実験系、及びAAV9-tauRDを用いたin vivo実験系を併用して詳細に解析し、その機序を明らかにする。本研究では脳内Abetaエコノミーの破綻により、Abetaが凝集性を獲得し、下流でタウが病原性を獲得し、神経細胞障害性を引き起こす分子基盤の解明を行なっている。脳内Abetaエコノミーに関わる分子基盤の検討。脳内Abetaエコノミー評価のため、APPトランスジェニックマウス(APP tg)脳においてin vivo microdialysis実験を行い、脳間質液(ISF)中のAbeta濃度を測定した。まず脳内AbetaエコノミーにapoEが関与するか検討するためapoEを欠損したAPP tg脳海馬のISFを3ヶ月齢において解析したところ、APP tgに比べ、Abeta濃度が約50%減少することが分かった。一方マウスapoEをヒトapoE2, E3, E4にノックインしたAPP tg脳海馬のISFを解析したところ、APP tgに比べ、Abeta濃度に変化は認められなかった。これらマウスを9ヶ月齢において免疫組織化学的に解析したところ、APP tgマウスに比べ、apoE欠損、あるいはapoE2, E3, E4ノックインAPP tgではいずれもアミロイド蓄積の著しい減少が認められた。これらの結果から、apoEはAbetaの脳内クリアランス、及び凝集性獲得に関わる可能性が考えられた。また、APP tgマウス脳TBS可溶画分をゲル濾過カラムで分離して解析したところ、200kDa以上、50-70kDa、10-20kDaの3種類のAbeta分子種が存在することが分かった。さらに、in vivo seeding実験により、Abeta蓄積誘引能を検討すると、200kDa以上の高分子量Abeta分子種がAbeta蓄積を誘引することを見出した。Abetaの下流でタウが病原性を獲得する分子基盤の検討。

タウ凝集性を誘導するため、予め凝集させたタウのリピート領域(RD)をタウtg脳に注入し、免疫組織化学的に検討したところ、タウRDはタウの過剰リン酸化を誘引することを明らかにした。また、アデノ随伴ウイルスを利用してタウRDを発現する実験系(AAV-RD)を作出した。本研究は脳内Abetaエコノミーの分子基盤解明、タウの病原性獲得を促すAbeta分子種の同定、そしてタウがAbeta依存的に病原性を獲得する機序の解明を目指している。まず脳内Abetaエコノミーの分子基盤解明のため、老人斑構成因子であり、またそのipsilon 4アレルがアルツハイマー病発症の危険因子でもあるapoEに注目して検討を行い、apoEの欠損によりISF中Abeta濃度が低下し、Abeta蓄積が減少することを見出した。これはapoEの存在が脳内Abetaエコノミーに重要な働きを担っていることを示唆している。またヒトapoE2、E3、E4ノックインマウスはISF中Abeta濃度が変化しないものの、Abeta蓄積が減少することを見出した。これらの結果は、ヒトapoEはマウスapoEと比べAbetaクリアランスに与える影響は同程度だが、Abeta凝集に抑制的に働き可能性を示唆している。これらの結果から当初の計画以上に進展していると考えられる。次にタウの病原性獲得を促すAbeta分子種の同定のため、APP tg脳の可溶画分をゲル濾過カラムで分離し、分子量の異なる3種のAbeta分子種を同定し、中でも200 kDa以上の高分子量Abeta分子種がAbeta蓄積を誘引しうることを見出した。今後これらのAbeta分子種に焦点を当てさらに研究を推進するため、順調に進行していると考えられる。さらにタウがAbeta依存的に病原性を獲得する機序解明のため、予め凝集させたタウRDの注入実験、あるいはAAV-RD実験系を樹立した。今後APP tg脳に予め凝集させたタウRDやAAV-RDの注入実験を行ない、Abeta依存的にタウが病原性を獲得するAbeta-タウカスケードモデルを作出するが、未だ完成に至っていないことから、やや遅れていると考えられる。これらの結果を総合的に判断し、本研究はおおむね順調に進行していると評価される。本研究は脳内のAbetaエコノミー破綻により、Abetaが凝集性を獲得する分子機序、及びその下流でタウが病原性を獲得し、神経変性を引き起こす機序の解明を目的とする。1.脳内Abetaエコノミーに関わる分子基盤の検討。前年度APP tgマウス脳TBS可溶画分中に200kDa以上(peak 1)、50-70kDa (peak 2)、10-20kDa (peak 3)の3種類のAbetaが存在することを明らかにした。そこでpeak 1、2をAPP tgマウス脳に注入し、Abeta蓄積誘引能を検討したところ、peak 1に蓄積誘導脳があることを見出した。免疫除去法でpeak 1からAbetaを除いたところ、Abeta蓄積誘導脳が消失した。またpeak 2には蓄積誘導脳は認められなかった。
非閉塞性胆汁うっ滞病変の機序解明と高圧酸素療法による改善効果

ラット小型肝細胞を用いた,病態解析モデルの確立<方法>(1)成熟ラット肝よりコラゲナーゼ潅流法により小型肝細胞を分離,培養を行いin vitroで類肝組織を構築した。(2)細胞膜トランスポーター(Oatpt,Ntcp,Mrpt,Mdr,Bsep,Bcrp)の遺伝子発現をRT-PCR法で定量化し,さらにそれらトランスポーター蛋白の細胞膜上への局在を免疫染色法で検討を行った。肝細胞トランスポーターの発現には,どのような核内転写因子(HNFt、C/EBPなど)あるいは,ホルモンレセプター(CAR,PXR,RXRなど)が関与し制御しているかをRT-PCR法によりその遺伝子発現の変化から検討した。(3)トランスポーターの安定発現した類肝組織において肝細胞におけるRI基質(Ettoron Sulfate,Estradiol glucronideなど)の細胞内への取り込み,細胞外への排泄を測定することにより輸送能を定量化し,in vitroにおける基質(胆汁)輸送を検討した。<結果>(1)小型肝細胞コロニカの経時的変化:肝細胞培養初期は,小型の実質細胞からなるコロニーを形成した。培養12日目に再播種後,細胞は成熟化し三次元構造をとり細胞間には毛細胆管構造を形成するようになった。(2)小型肝細胞成熟化に伴う肝細胞膜トランスポーターの発現:類洞側細胞膜上に発現する取り込み型有機アニオントランスポーター(Oatp1/2/4),毛細胆管側細胞膜上に発現する排泄型有機アニオントランスポーター(Mrp2)は,成熟肝細胞と比較し発現は低いが,成熟化するに従いその発現量は上昇した。また,これらの発現上昇には肝転写因子HNF4,ホルモンレセプターCARとの関連が示された。(3)小型肝細胞内への有機アニオン基質の取り込み,排泄:培養液中に投与された,Estoron Sulfateの細胞内への取り込み,およびEstradiol glucronideの毛細胆管への排泄は,培養日数が増し細胞が成熟化するに従い増加した。<考察>小型肝細胞の有機アニオントランスポーターの発現,有機アニオン輸送形態はin vitroにおける胆汁うっ滞病変解析モデルとして有用と考えられた。
炭酸固定酵素(PEPカルボキシラーゼ):遺伝子操作とX線結晶解析による機能解析

[目的]PEPカルボキシラーゼ(以下PEPCと略)は重要な炭酸固定酵素である、とくにC4植物では光合成的炭酸同化の初期反応を触媒する。我々はPEPCの立体構造を世界で初めて解明し、タンパク工学的な研究の基礎を築いた。本研究では、アロステリックな活性化因子および基質PEPと結合した複合体のX線結晶解析行い、さらに立体構造に基づく部位特異的変異導入による機能解析を行って炭素固定反応機構および活性調節機構を解明する。植物のPEPCはリン酸化による活性化を受けるので、この活性化の分子機構およびリン酸化に関与するプロテインキナーゼのPEPC認識機構について手がかりをえる。[研究経過および成果]1)PEPCとアロステリック阻害剤の複合体の構造から、阻害の機構としてループ競合モデルを提出、2)PEPの安定なアナログであるDCDPとの複合体の解析により触媒部位の位置を証明。3)トウモロコシのC4光合成に関与するPEPCの結晶解析に成功し、基本構造の大腸菌酵素との類似点と相違点を明らかにした。4)トウモロコシ酵素についてリン酸化部位に種々の変異を導入した。、このリン酸化に関与するプロテインキナーゼによる認識機構の解析を進めつつある。5)PEPCは糖リン酸化合物による活性化を受けるが、これに関与する残基を部位特異的変異導入により証明。6)PEPCの触媒部位を形成するフレキシブルループが基質の重炭酸イオンとの結合および糖リン酸化合物の活性化に重要であることを証明。7)PEPCの調節的リン酸化に関与するプロテインキナーゼのcDNAクローニングと性格づけに成功。[目的]PEPカルボキシラーゼ(以下PEPCと略)はホスホエノールピルビン酸(PEP)に二酸化炭素(真の基質は重炭酸イオン)を固定し炭素数4つのオキサロ酢酸を生成する反応を触媒する。PEPCは植物ではとくに多様な生理的役割をもち、中でもC4植物やCAM植物においては光合成的炭酸同化に直接関与することから、基礎・応用の両分野から多くの注目を集めている。我々は最近PEPCの立体構造を世界で初めて解明し、ようやくタンパク工学的な研究が可能になった。本研究では、アロステリックな活性化因子および基質PEPと結合した状態での結晶化条件の探索およびX線結晶解析行い、さらに部位特異的変異導入による機能解析を行って炭酸固定反応機構を解明する。[研究経過および成果]1)活性型PEPCの結晶化とX線結晶解析。大腸菌のPEPCはアロステリックな活性化因子であるアセチル-CoAやフルクトース1,6-ジリン酸の存在下においてはじめて基質と結合するため、化学的に不安定なこれらの調節因子と安定な基質アナログを準備して結晶化を試みたが、良好な結晶が得られなかった。アセチル-CoAのアナログで安定なものを探索中である。また、アセチル-CoAを必要としないトウモロコシのPEPCについても結晶化をこころみ若干の知見を得つつある。2)立体構造に基づく部位特異的変異の導入と機能解析。触媒部位に位置すると思われる2つの柔軟なループに注目し、それらの機能解析をおこなった。とくに702-708のGlyに富む領域についてその触媒における役割を解明し、さらに活性の高い酵素を作出することに成功した。[目的]PEPカルボキシラーゼ(以下PEPCと略)は重要な炭酸固定酵素であり、微生物および植物に広く分布する。基礎・応用の両分野から多くの注目を集めている。我々は最近PEPCの立体構造を世界で初めて解明し、ようやくタンパク工学的な研究を可能にした。本研究では、アロステリックな活性化因子および基礎PEPと結合した状態での結晶化条件の探索およびX線結晶解析を行い、さらに部位特異的変異導入による機能解析を行って炭酸固定反応機構および活性調節機構を解明する。[研究経過および成果]1)PEPの安定なアナログであるDCDPの結合した状態でのPEPC(大腸菌)の結晶化と解析に成功した。

これにより触媒部位がβ-バレルのC末端側に位置することがほぼ確実となった。2)マグネシウムイオンとの結合に関与する触媒部位の残基を推定した。3)トウモロコシのC4光合成に関与するPEPCの結晶解析に成功し、基本構造の大腸菌酵素との類似点と相違点を明らかにした。4)トウモロコシ酵素についてリン酸化部位に種々の変異を導入した。このリン酸化に関与するプロテインキナーゼによる認識機構の解析を進めつつある。5)PEPCは糖リン酸化合物による活性化を受けるが、これに関与する残基が推定されたので、これに変異を導入し、その性質を調べている。6)トウモロコシ酵素について触媒部位のループ構造に変異を導入した。大腸菌酵素の場合と同様に触媒機能の向上がみられるかどうかを検討している。[目的]PEPカルボキシラーゼ(以下PEPCと略)は重要な炭酸固定酵素であり、微生物および植物に広く分布する。基礎・応用の両分野から多くの注目を集めている。我々は最近PEPCの立体構造を世界で初めて解明し、ようやくタンパク工学的な研究を可能にした。本研究では、アロステリックな活性化因子および基質PEPと結合した状態での結晶化条件の探索およびX線結晶解析行い、さらに部位特異的変異導入による機能解析を行って炭酸固定反応機構および活性調節機構を解明する。[研究経過および成果]1.大腸菌由来のPEPCについて、PEPの安定なアナログであるDCDPとの複合体の構造解析に成功し、関与する残基の特定をおこなった。2.さらに、トウモロコシのC4光合成に関与するPEPCの構造解析の結果を解析し、本酵素の活性型と思われる構造状態を明らかにし、1.の知見と合わせて、PEPCの反応機構を分子論的に明らかにした。3.トウモロコシPEPCはグルコース6-リン酸によってアロステリックな活性化を受けるが、この活性化に関与するアミノ酸残基をX線構造解析の知見に基づいて推定し、実際に部位特異的変異の導入によって脱感作させることに成功した。4.トウモロコシ酵素について触媒部位のループ構造に変異を導入し、以前に大腸菌酵素の場合と同様に触媒機能の向上がみられるかどうかを検討したが、結果は否定的で一般化はできないようであった。5.好熱性ラン藻からPEPC遺伝子のクローニングをおこなうことに成功し、その組換え体酵素が非常に安定であること、および特有のアロステリックな調節能をもつこと、さらにフィードバック阻害因子であるアスパラギン酸に対する感受性を、部位特異的変異導入の手法によって失わせることに成功した。
iPSバンクにおける三座ホモ由来他家iPS細胞由来心筋細胞シートの有用性の検討

HLAホモ接合体を有するiPS細胞由来MHC適合移植ではMHC非適合移植と比較して有意な移植後の拒絶反応の軽減や移植細胞の生着延長を認めた。しかしMHC適合移植において免疫抑制剤なしまたは単剤では移植後の拒絶反応を十分に抑制することはできなかった。そのためMHC適合移植により移植細胞の免疫原性は軽減できるものの、より良い移植細胞の生着には免疫抑制剤が必要であることが示唆された。またMHC非適合移植においても移植後2ヶ月以降も非治療群と比較して有意な心機能改善効果を認めた。このことからMHC非適合移植も臨床における心不全治療となりうることが示唆された。本研究では、同種他家iPS細胞由来心筋細胞のMHC適合移植における心機能改善効果を検討した。方法としてiPS細胞はMHCハプロタイプがHT1のカニクイザルから樹立し、GFP遺伝子を導入したものを使用。心筋細胞へ分化誘導後、シート化(1.2×107 cells)し、MHCがHT1ヘテロ(n=2)とHT1非保有(n=2)の心筋梗塞モデルに移植しコントロール群(n=2)と比較した。移植群には免疫抑制剤を投与した。iPS細胞由来心筋細胞シート移植後、実態顕微鏡を用いてGFP蛍光強度にて生存を定量的に0週、12週、16週、24週で評価した。12週16週で、一部肉眼的に確認出来た移植iPS細胞を生検し組織学的評価としてHE染色、免疫染色(GFP抗体、CD3抗体、α-sarcomeric actin抗体)を行った。結果はiPS細胞由来心筋シート移植後1ヶ月で、コントロール群と比較し、MHC適合、非適合移植の両群で、LVEFとLVESVの改善を認め、その後も維持された。また、MHC非適合移植では、移植後3ヶ月あるいは4ヶ月の時点でTリンパ球の浸潤を認め、免疫拒絶反応が認められたが、MHC適合移植ではTリンパ球の浸潤は認められなかった。また、GFP蛍光強度は、MHC非適合移植群で3ヶ月から4ヶ月にかけて低下傾向であったが、MHC適合移植群では維持された(4ヶ月目;MHC適合群;34.9 vs MHC非適合群;21.7 vssham群;9.9)。現時点では、MHC適合移植群の方が、非適合移植群と比較し、iPS細胞由来心筋シートの生着が延長する傾向にあったが、心機能改善効果においては両群で明らかな差が認められなかった。本研究において、MHC適合/非適合移植の両群において臨床的有効性が示唆され、MHC適合移植の心機能改善効果に対する有用性はさらに長期間検討する必要がある。本研究において律速段階となる部分は、iPS細胞の準備と心筋梗塞モデルの作製である。iPS細胞の心筋細胞への分化に必要な試薬の供給が滞ったり、細胞の分化誘導がうまく行かない場合があり、実験が延期したことがある。また、iPS細胞を移植出来たとしても、術後に心不全があまりに重症で最後まで実験が遂行できない場合を経験し、計画通り進む訳ではないが、根気よく実験を継続することで概ね順調に進展していると考えられる。方法としてiPS細胞はMHCハプロタイプがHT1のカニクイザルから樹立しGFP遺伝子を導入したものを使用し心筋細胞への分化誘導後シート化しMHCがHT1へテロとHT1非保有個体の心筋梗塞モデルに移植し、コントロール群と比較。移植群には心臓移植に準じて免疫抑制剤を3剤を投与した。iPS細胞由来心筋細胞シート移植後、実態顕微鏡を用いてGFP蛍光強度にて生存を定量的に評価した。12週、16週で一部肉眼的に確認出来た移植iPS細胞を生検し、組織学的評価としてHE染色、免疫染色を行った。また、心筋血流の評価を行った結果、iPS細胞由来心筋シート移植後1ヶ月で、コントロール群と比較しMHC適合非適合移植の両群でLVEFとLVESVの改善を認め、その後も6ヶ月間維持された。MHC非適合移植群では、移植後3ヶ月あるいは4ヶ月の時点でTリンパ球の強い浸潤を認め、免疫拒絶反応が認められたが、MHC適合移植群では、Tリンパ球の浸潤は認められなかった。しかし、6ヶ月後の心筋組織ではMHC適合群でも移植細胞は消失しており、Tリンパ球の浸潤を認めた。また、GFP蛍光強度は、MHC非適合移植群で3ヶ月から4ヶ月にかけて低下傾向であったがMHC適合移植群では維持された。しかし、最終的にはMHC適合、非適合の両群において移植細胞は消失していた。現時点で、MHC適合移植群の方が、非適合移植群と比較し、iPS細胞由来心筋シートの生着が延長する傾向にあったが、心機能改善効果においては両群で明らかな差が認められなかった。本研究において、MHC適合/非適合移植の両群において臨床的有効性が示唆され、移植細胞の生着のさらなる延長に関しては、免疫抑制剤の強化や免疫寛容を起こす新たな細胞の同時移植などを検討する必要があると考えられた。概ね予定通りに実験は行えているが、iPS細胞由来心筋細胞が十分量出来ない場合や、移植したの心筋梗塞モデルが死亡するなどがあり、追加実験を余儀なくされることがあった。概ね、予定通りの頭数の実験が終わり、詳細な解析を含めた作業が残っている。

方法としてiPS細胞はMHCハプロタイプがHT1のカニクイザルから樹立しGFP遺伝子を導入したものを使用し心筋細胞への分化誘導後シート化しMHCがHT1へテロとHT1非保有個体の心筋梗塞モデルに移植し、コントロール群と比較。移植群には心臓移植に準じて免疫抑制剤を3剤を投与した。iPS細胞由来心筋細胞シート移植後、実態顕微鏡を用いてGFP蛍光強度にて生存を定量的に評価した。12週、16週で一部肉眼的に確認出来た移植iPS細胞を生検し、組織学的評価としてHE染色、免疫染色を行った。また、心筋血流の評価を行った結果、iPS細胞由来心筋シート移植後1ヶ月で、コントロール群と比較しMHC適合非適合移植の両群でLVEFとLVESVの改善を認め、その後も6ヶ月間維持された。MHC非適合移植群では、移植後3ヶ月あるいは4ヶ月の時点でTリンパ球の強い浸潤を認め、免疫拒絶反応が認められたが、MHC適合移植群では、Tリンパ球の浸潤は認められなかった。しかし、6ヶ月後の心筋組織ではMHC適合群でも移植細胞は消失していた。また、GFP蛍光強度は、MHC非適合移植群で3ヶ月から4ヶ月にかけて低下傾向であったがMHC適合移植群では維持された。MHC適合移植群の方が、非適合移植群と比較し、iPS細胞由来心筋シートの生着が延長する傾向にあったが、心機能改善効果においては両群で明らかな差が認められなかった。さらに移植部位の遺伝子発現を解析したところ、MHC適合非適合移植の両群においてNK細胞の移植部位への浸潤を示唆する所見を認めた。そのためNK細胞を中心とする自然免疫系による拒絶反応がMHC適合群でも起こっている可能性が示唆された。そのため今後はMHC適合移植モデルにおける自然免疫応答による移植細胞生着への影響を検討する必要がある。HLAホモ接合体を有するiPS細胞由来MHC適合移植ではMHC非適合移植と比較して有意な移植後の拒絶反応の軽減や移植細胞の生着延長を認めた。しかしMHC適合移植において免疫抑制剤なしまたは単剤では移植後の拒絶反応を十分に抑制することはできなかった。そのためMHC適合移植により移植細胞の免疫原性は軽減できるものの、より良い移植細胞の生着には免疫抑制剤が必要であることが示唆された。またMHC非適合移植においても移植後2ヶ月以降も非治療群と比較して有意な心機能改善効果を認めた。このことからMHC非適合移植も臨床における心不全治療となりうることが示唆された。今後は、心機能評価としてPET画像を加えることを検討している。また、得られた心筋組織の蛋白の遺伝子発現や染色による評価を行い、iPS細胞の生着と心機能の評価を詳細に行っていく方針である。実験より得られたデータから解析を行い、論文作成を行う。心臓血管外科iPS細胞から心筋細胞への分化誘導に使用する消耗品費用を予定より抑えることが出来た予定より、組織の染色やデータの解析にかかる費用等を節約することができたためiPS細胞の培養に必要な試薬類PCRや染色に必要な試薬類に使用する予定である次年度は、これまでに繰り越してきた費用を用いて、データの解析あるいはin vitroの追加実験を行う予定である
TOR複合体が刺激に応答して細胞増殖を制御する仕組みの解明

TOR複合体(TORC1とTORC2)はTORキナーゼを中心とするタンパク質複合体で、栄養や成長因子に応答して細胞の増殖や代謝などを制御する。分裂酵母を用いた因子探索により、TORC経路の上流からTORCの活性を調節する因子と、下流でTORCによる増殖制御を担う因子の候補を複数同定してきた。本研究では、これら因子群の機能と制御を明らかにし、TORCの「刺激に応じた活性調節機構」と「増殖制御の機序」を分子レベルで理解することを目的とする。H30年度は、分裂酵母TORC1を負に調節するGATOR1複合体をベイトに、作用する因子の同定を試みた。免疫沈降によりGATOR1複合体を精製して結合因子を解析し、Seh1、Sea2、Sea3、Sea4、Sec13を同定した。これらのタンパク質は、哺乳類GATOR2複合体の構成因子に相当するものであった。したがって、分裂酵母にもGATOR2が保存されていることが明らかになった。GATOR2は、TORC1の活性制御因子であるRag二量体を介してTORC1を正に調節する。分裂酵母のSeh1、Sea2、Sea4の遺伝子破壊株を作製して表現型を解析したところ、野生株と同程度の増殖を示した。これまでの成果から、Rag二量体によるTORC1の活性化は分裂酵母の増殖に必須でなく、むしろGATOR1とRag二量体がTORC1を抑制することでTORC1活性を増殖に適切な水準に保つ、というモデルを提唱している。GATOR2の欠損が増殖を阻害しないことは、このモデルに矛盾しない。一方で、Sea3の遺伝子破壊株は増殖遅延を示した。二重変異株を用いた遺伝学的解析から、Sea3はGATOR1の構成因子と同経路でRag二量体を介してTORC1を負に制御することが見出された。以上から、分裂酵母ではSea3がGATOR1に組み込まれてその働きを補助している可能性が示された。当初の予定通り因子探索に成功し、因子探索で同定したタンパク質の特徴付けを行うことができた。特に、これまでGATOR2の構成因子として知られていたSea3タンパク質が、GATOR1の構成因子のようにも振る舞うという知見は、哺乳類の相同タンパク質WDR59の研究への展開も含め、今後の研究展開につながる成果が得られたといえる。TORC1の負の調節因子として働くことが示唆されたSea3について詳細な解析を進める。Sea3と、GATOR1やGATOR2の各構成因子との相互作用、Sea3の欠損が各構成因子の発現や局在に与える影響、あるいは各構成因子の欠損がSea3の発現や局在に与える影響について検証する。また、GATOR1やRag二量体とは独立にTORC1の活性を制御する可能性がある因子を複数取得しており、これらの因子の特徴付けも同時に行う。さらに、TORC1の下流で機能することが示唆される因子についても解析を行い、TORC1経路が細胞増殖をどのようにコントロールしているのかを明らかにする。真核生物間で高度に保存された2種のTOR複合体(TORC1とTORC2)はTORキナーゼを中心とするタンパク質複合体で、栄養や成長因子に応答して細胞の増殖や代謝などをコントロールする。これまでに分裂酵母を用いた因子探索を行い、TORC経路の上流からTORCの活性を調節する因子と、下流でTORCによる増殖制御を担う候補因子とを複数同定してきた。本研究では、これら新規因子のTORC経路における機能と制御を明らかにし、TORCの「刺激に応じた活性調節機構」と「増殖制御の機序」を分子レベルで理解することを目的とする。H29年度は、TORC1の活性制御に関わるRag二量体Gtr1-Gtr2(哺乳類のRagA/B-RagC/D二量体に相当)と結合する因子として同定した4つのタンパク質が構成する複合体について、詳細な解析を行った。4つのタンパク質のうちの1つが、哺乳類のRag二量体の制御因子であるRagulator複合体の構成因子Lamtor2と配列上の相同性を示すため、4つのタンパク質をそれぞれLam1からLam4と名付け、同定した複合体が分裂酵母のRagulatorに相当する可能性を検証した。その結果、Lamタンパク質の遺伝子破壊株ではいずれもRag二量体の液胞局在が欠損しており、哺乳類のRagulatorと同様にLamタンパク質もRag二量体を液胞にアンカリングしていることが明らかになった。一方で、Lamタンパク質やRag二量体の欠損株ではTORC1の活性が過度に上昇するため、哺乳類とは異なり、分裂酵母のRag二量体とRagulatorはTORC1を負に制御していることが示唆された。これを支持するように、分裂酵母のTORC1はRag二量体やLamタンパク質の欠損株でも液胞に局在していた。したがって、TORC1の局在を介さない経路でTORC1活性を制御する機構が存在しているといえる。当初の予定通り、因子探索で得られたタンパク質の特徴付けを行うことができた。Ragulatorに相当するタンパク質複合体を分裂酵母で見出すことに成功し、この複合体が新規の機構でTORC1の活性を負に制御していることが明らかになったため、今後の研究展開につながる成果が得られたといえる。さらに、成果の一部を論文発表することもできた。

分裂酵母を用いた因子探索により、TORC経路の上流からTORCの活性を調節する因子と、下流でTORCによる増殖制御を担う因子の候補を複数同定してきた。本研究では、これら因子群の機能と制御を明らかにし、TORCの「刺激に応じた活性調節機構」と「増殖制御の機序」を分子レベルで理解することを目的とする。H30年度は、分裂酵母TORC1を負に調節するGATOR1複合体をベイトに、作用する因子の同定を試みた。免疫沈降によりGATOR1複合体を精製して結合因子を解析し、Seh1、Sea2、Sea3、Sea4、Sec13を同定した。これらのタンパク質は、哺乳類GATOR2複合体の構成因子に相当するものであった。したがって、分裂酵母にもGATOR2が保存されていることが明らかになった。GATOR2は、TORC1の活性制御因子であるRag二量体を介してTORC1を正に調節する。分裂酵母のSeh1、Sea2、Sea4の遺伝子破壊株を作製して表現型を解析したところ、野生株と同程度の増殖を示した。これまでの成果から、Rag二量体によるTORC1の活性化は分裂酵母の増殖に必須でなく、むしろGATOR1とRag二量体がTORC1を抑制することでTORC1活性を増殖に適切な水準に保つ、というモデルを提唱している。GATOR2の欠損が増殖を阻害しないことは、このモデルに矛盾しない。一方で、Sea3の遺伝子破壊株は増殖遅延を示した。二重変異株を用いた遺伝学的解析から、Sea3はGATOR1の構成因子と同経路でRag二量体を介してTORC1を負に制御することが見出された。以上から、分裂酵母ではSea3がGATOR1に組み込まれてその働きを補助している可能性が示された。当初の予定通り因子探索に成功し、因子探索で同定したタンパク質の特徴付けを行うことができた。特に、これまでGATOR2の構成因子として知られていたSea3タンパク質が、GATOR1の構成因子のようにも振る舞うという知見は、哺乳類の相同タンパク質WDR59の研究への展開も含め、今後の研究展開につながる成果が得られたといえる。引き続きLamタンパク質に関する詳細な解析を行うとともに、TORC1の上流から活性を調節する因子の候補として得られているGATOR複合体の分裂酵母ホモログについても同様に解析を行い、TORC1を負に制御する機構についてさらなる検証を進める。TORC1の負の調節因子として働くことが示唆されたSea3について詳細な解析を進める。Sea3と、GATOR1やGATOR2の各構成因子との相互作用、Sea3の欠損が各構成因子の発現や局在に与える影響、あるいは各構成因子の欠損がSea3の発現や局在に与える影響について検証する。また、GATOR1やRag二量体とは独立にTORC1の活性を制御する可能性がある因子を複数取得しており、これらの因子の特徴付けも同時に行う。さらに、TORC1の下流で機能することが示唆される因子についても解析を行い、TORC1経路が細胞増殖をどのようにコントロールしているのかを明らかにする。研究の進捗に応じて当初想定していた予算執行計画の一部を変更したため、未使用額が生じた。これは主に、想定していたよりも早くまとまったデータセットが得られたため、成果を論文発表することに尽力したことによる。H30年度はTORC
同質的な組織のマネジメント・コントロール：数理モデル分析による研究

本研究では、数理的なマネジメント・コントロール研究で用いられるLENフレームワークにおいて、プリンシパル=エージェント間で経営環境に関する主観的信念が異なる場合に、最適なマネジメント・コントロールの設計にいかなる影響が及ぼされるかを検討した。本研究で用いたモデルでは、経営環境に関して、より良好な環境にあると信じている場合は楽観的、劣悪な環境にあると信じている場合は悲観的だと定義する。分析の結果、楽観的なエージェントと契約した方が、均衡でのインセンティブ・レートや努力水準が高くなる一方、エージェントが楽観的すぎる場合にはプリンシパルから契約が提示されなくなる条件が存在することが明らかとなった。本研究で扱おうとしている数理モデルと特に親和性の高いVan den Steen(2010)やKim(2015)では,何らかのプロジェクトの主観的な確率に影響を与える,たとえば経営環境のような観察不可能な変数について,プリンシパルとエージェントの間で主観的信念が異なると仮定していた。さらに,仮に一方のプレイヤーがもう一方のプレイヤーの主観的信念を観察したとしても,自分の信念こそ正しいのであり,相手の信念は間違っているのだと考え,信念の改訂は行なわれないという仮定も置かれている。こうした仮定の背後は,まったく同じ知性を持った人間でも,同じ事象に対して異なる主観的確率をつけるはずであるという考え方(たとえばHarsanyi 1968)があることがわかった。これらの先行研究は,マネジメント・コントロール研究でよく用いられる,いわゆるLENモデルを用いていないため,今後はLENモデルにおいてこうした仮定を置くと,どのようなマネジメント・コントロールの設計が最適になるのかを検討する.本年度中に信念の異質性の表現方法を確定する予定であったが,先行研究の検討に予想以上に時間を要したため,確定には至らなかった。前年度では、組織成員間の信念の異質性に関する理論研究のレビューを実施し,以下にマネジメント・コントロール領域の数理モデルに落とし込むかを検討した。本年度においても,引き続き組織成員間の信念の異質性をいかにモデル化し,マネジメント・コントロール研究の文脈でいかに解釈するかを検討した。プリンシパル1人,エージェント1人のシンプルなモラル・ハザードのモデル(線形報酬,負の指数関数型の効用関数,誤差項の正規分布を仮定)において,エージェントの生産性がプリンシパルにもエージェントにも観察不可能であるケースを考えた。このとき,プリンシパルとエージェントはそれぞれ独立に生産性に関する主観的な信念を形成するが,その信念は必ずしも一致しない。こうしたある変数についての主観的信念がプレイヤー間でずれることを指して,信念の異質性と捉えている。このとき,プリンシパルの信念に較べてエージェントの信念の方が大きければエージェントは(自身の)生産性について楽観的であり,反対にエージェントの信念の方が小さければ悲観的であると解釈することができる。分析の結果,プリンシパルは,エージェントがより楽観的である場合に,より高いインセンティブ・レートを提示し,エージェントはその高いインセンティブ・レートに反応してより高い水準の努力を投下することがわかった。一方で,エージェントがプリンシパルと比べて楽観的すぎる場合には,プリンシパルがエージェントの楽観的な主観的信念を受け入れられず,契約を提示しなくなる条件が存在することが明らかとなった。なるべく早い段階で信念の異質性の表現方法を確定させ,具体的なマネジメント・コントロールの文脈での分析に移行する。分析は,マネジメント・コントロール研究に対する含意を意識しながら行なう。29年度が最終年度であるため、記入しない。マネジメント・コントロール29年度が最終年度であるため、記入しない。
大脳新皮質第Ⅴ層微小カラムの機能解析

大脳新皮質が機能単位の繰り返しで構成されているか不明である。我々は、大脳新皮質第5層に位置し皮質外への出力を担う皮質下投射細胞が微小なカラム状に並んでいることを発見した。これらの微小カラムは周期的に配置され、皮質に沿って6角形の格子状のパターンをつくっていた。同一微小カラム内の細胞は発生期にはギャップ結合によって結合し、後に共通なシナプス入力を受けることがわかった。視覚野、体性感覚野、運動野のいずれでも、同一微小カラム内の細胞はよく似た活動パターンを示した。以上より微小カラムは大脳新皮質の機能単位であり、多数の微小カラムによる並列処理が大脳新皮質の基本的な計算様式であることが示唆された。哺乳類の大脳新皮質は複雑な内部回路をもち、その機能解析は困難である。しかしこの困難は、大脳新皮質を基本単位の繰り返し構造に還元できれば大きく軽減される。申請者らは,多数の分子マーカーを用いた検索により、マウス新皮質第5層において、主要な錐体細胞である皮質下投射細胞(SCPNs)が細いカラム状(微小カラムと名付けた)に配置していることを発見した。この微小カラムは30-35μm程度の周期で周期的に配置しており、古典的な皮質カラム(幅200-500μm)に比してはるかに微細な構造である。さらに,視覚野において,個々の微小カラムが異なる脳機能に対応するという予備的結果を得ている。以上の結果は、この微小カラムが大脳新皮質の基本的な単位である可能性を示唆しており、この単位とそれに結合するメゾ回路を解析することにより,新皮質全体への理解が促進されると期待される。本年度は、(1)微小カラムが機能単位として動作するか、および(2)微小カラムに内部構造があるかを明らかにすることを目的とした研究を行った。(1)を明らかにするために、微小カラムのin vivoでの活動を遺伝子発現を指標として解析し、微小カラム内の細胞の活動に強い相関があることを示した。さらに、スライス上で光刺激を用いて局所回路を解析する実験系を作成し、予備実験をすすめた。(2)を明らかにするために、微小カラム内の細胞の多様性を遺伝子発現や神経結合パターンを指標として解析し、微小カラムが正確な内部構造を持つことを示した。これらの結果の一部は論文審査中および論文作成中である。大脳新皮質は脳の大きな部分を占め、感覚、運動、記憶、行動計画など様々な高次精神機能を担う。大脳新皮質の回路は極めて複雑であり、このことが理解の大きな障害になっている。当研究室では、大脳新皮質神経回路の微細秩序構造を探るために、マウス大脳新皮質第5層の微細構造の解析を行っている。まず第5層の主要なタイプの神経細胞の一種である皮質下投射細胞が、id2遺伝子の特異的発現によって良くラベルできることを示した。さらに、皮質下投射細胞が第5層内で層に垂直な方向に並ぶ傾向を持ち、微小なカラムを作っていることが分かった。このような微小カラムは多数周期的に並んでいた。また、特定の視覚刺激を与えた時、微小カラムの中の神経細胞が類似した反応を示すことを活動依存的な遺伝子発現を用いて見いだした。以上から、マウス大脳新皮質第5層には、皮質下投射細胞からなる微小なカラム状の機能的な単位が存在し、このような単位が多数平行に配置していることを示唆している。さらにこのような微小カラムは発生上近縁でない細胞によって形成されていることを示し、論文として発表した。この結果は、大脳新皮質の局所回路にはこれまで知られていなかった微細な秩序構造があることを示している。また小さな単位が繰り返していることから、大脳新皮質回路の少なくとも一部の成分は繰り返し構造を持つ可能性を示唆している。これまでの研究をさらに発展させるため、微小カラムの2次元配置、微小カラム中の神経細胞の多様性、スライス電気生理学実験による神経結合解析などに着手した。またin vivoで神経活動を観察するためのイメージング法をほぼ確立した。大脳皮質第5層の皮質下投射細胞(SCPN)が形成する微小カラムに関する以下の研究を行った。発生期の大脳皮質では、SCPNとCPN (対側投射細胞)はそれぞれ特異的にギャップ結合によって電気的に結合し、特にSCPNは微小カラムと同様な構造のネットワークをつくっていることを昨年度までに見出した。ギャップ結合が神経活動の増幅と同期をもたらすことを確認し、論文を投稿した。

同一の微小カラム内の細胞は強い共通入力をうける傾向が高いことを昨年度までに示した。さらに精密な解析によってこれを確認し、また弱い入力は非選択的であることを示し、論文を作成した。In vivoでのCaイメージング技術の改良を継続し、多数の細胞から良好なシグナルが得られるようになった。この技術を用いて微小カラム内の細胞の応答特性の検討を継続した。SCPNは第5層の上部と下部では異なる遺伝子発現を示すことを昨年度までに見出した。このように制御された遺伝子発現は、微小カラムの内部構造を形成していると考えられる。この遺伝子発現制御の精密な定量解析および発生過程の検討を行い、論文を作成した。CPNや抑制性神経細胞など、SCPN以外の細胞タイプについて3次元配置解析を行った。マウス以外の哺乳類脳サンプルを用いて、微小カラムの存在を検討する実験を開始した。これまで得られた微小カラムの解剖学的・生理学的特徴にもとづき、視覚情報の並列処理を行う神経回路モデルを作成した。これを用いて微小カラム内の細胞の受容野などについての予言を得た。微小カラムの配置を詳細に決定するため、微小カラムの細胞を高密度で染色しその座標取得を行う技術を開発した。この技術で得られたデータから、微小カラムがマウスの視覚野、体性感覚野および運動野を含む広い範囲に存在し、ほぼ同一の構造をとっていることが確認された。さらに、微小カラムは皮質に沿って周期的に配置しており、近似的に6角形の格子状の構造をとっていることが明らかとなった。またこの構造は細胞タイプ特異的であり、微小カラムからは他のタイプの興奮性細胞は排除されていることも分かった。微小カラムがin vivoで機能単位として振る舞うかを調べるため、カルシウムイメージングを行った。実験系の改良により、多数の微小カラム細胞から良好な信号を取得することが可能となった。無刺激下での自発活動を測定したところ、微小カラム内の細胞が類似した時間パターンで活動していることが明らかとなった。この類似性は視覚野、体性感覚野および運動野で共通してみられた。また視覚刺激に対する応答性も微小カラム内で類似していることが明らかとなった。これらの結果より微小カラムが機能単位として振る舞うことが示された。以上より、微小カラムが大脳新皮質の機能単位であることが明らかとなった。この結果は、多数の微小カラムによる並列処理が大脳新皮質の基本的な計算様式であることを示唆する。微小カラムは周期的に配置されているため、その並列処理は規則的かつ組織化された構造を持つ可能性がある。微小カラムさまざまな領野で共通であるため、感覚処理、運動制御、言語機能などの幅広い情報処理が微小カラムに依存した共通な処理基盤を持つと予想される。細胞の3次元分布を脳全体から取得する方法を確立し、微小カラムの三次元分布と脳領野間での分布の詳細を解析した。この解析の結果、微小カラムが大脳新皮質に沿った特異的な2次元配置をとっていることがわかった。生きたマウスの大脳新皮質第5層の細胞のCa信号を画像化する手法の効率化を行い、微小カラムに含まれる細胞の活動計測を進めた。大脳皮質のギャップジャンクションの解析をスライスパッチ法を用いて行った。マウス大脳皮質第5層の興奮性細胞の間には、細胞タイプ特異性と空間配置特異性とを持ち微小カラムに関連した精密なギャップジャンクションネットワークがあることを発見した。このネットワークは発生期に特異的であり、微小カラムの神経回路の形成に関与している可能性がある。
子宮内膜症・腺筋症における幹細胞の役割の解明

本研究では、子宮内膜症および子宮腺筋症の発生・進展における幹細胞の役割を明らかにするために、ヒト内膜細胞を用いた腹膜内膜症モデルマウスの開発を行い、磁性体により内膜症様病変をマウス壁側腹膜の任意の位置に局在させ得る戦略が可能で有ることを示した。同時に、新たに幹細胞標識追跡法を開発することで、組織(病変)再構成過程における幹細胞の振る舞いを検証できるin vivoシステムを構築し得た。さらに、子宮腺筋症の類縁疾患である子宮平滑筋腫の病因メカニズムに幹細胞とWNT/β-Catenin経路が関与することを明らかにした。磁性体の使用と宿主環境への介入による新しい子宮内膜症・腺筋症モデルマウスの確立に向けて研究を行った結果、以下の成果を得た。A.磁性体標識発光内膜細胞の作製非機能膜型受容体(membrane X receptor,mXR)、発光蛋白CBR、および蛍光蛋白GFPの3つを同時に発現することが可能なレンチウイルスを初代培養細胞に感染させて、3つのそれぞれが十分に発現するか否かを検討したが、様々な条件下においても感染効率が低いため、それぞれの発現量も目標には十分に達し無かった。そこで、戦略を軌道修正し、子宮内膜由来の不死化細胞および癌細胞株にまず感染させて、導入された少数の細胞をセルソーターで分取して、それを増殖させることにした結果、得られた細胞はmXR、CBR、GFPとも十分に発現していた。また、これらの細胞は、mXRに対する抗体と磁性体を用いたmaglleticcell sorting(MACS)によってもさらに選別・濃縮することが可能であった。B.磁性体による標識発光内膜細胞のin vivo集積とその生物発光イメージング重度免疫不全マウスNOGの腹腔内に、選別・濃縮された上記の細胞を移植し、同時に「ネオジム磁石丸型」といった複数個のミニ磁石を体外あるいは体内に留置させることにより、任意の場所に標識細胞を集積させて、異所性病変の作成を試みた。Xenogen社IVISの発光イメージングを用いることで、目標とする場所への集積が示唆された個体もあったが、コントロール群との差異が明確でない個体もあり、ミニ磁石の磁力強化や留置場所・時間の条件設定など今後検討すべき課題があることも判明した。内膜の初代培養細胞および幹細胞は、感染効率(遺伝子導入率)が低いうえに、手術検体からの入手や取扱いが容易でないため、それらに代えて、内膜由来の不死化細胞株および癌細胞を用いて、磁性体を用いた内膜症・腺筋症モデルマウスの開発とその検証を行った。さらに、磁性体を用いて目的とする細胞を選別し集積させる至適条件を設定するためには、標識蛋白を安定的に発現する細胞株が必要となる。そこで、上記の2種類の細胞株それぞれに、非機能膜型受容体(membrane X receptor, mXR)、発光蛋白CBR、および蛍光蛋白GFPの3つを同時に発現することが可能なレンチウイルスを感染させた。その後に、GFPを高発現する細胞をセルソーターで2回選別し、GFP高発現細胞を分取してフローサイトメーターで解析したところ、標識蛋白全てを安定的に発現することが判明し、これらを大量に培養して細胞株のストックを確保した。これらをそれぞれ免疫不全マウスの腹腔内に注入するとともに、「ネオジム磁石丸型」などの複数個のミニ磁石を体外あるいは体内に留置させることにより、任意の場所に標識細胞を集積させて、異所性病変の作成を試みた。長期間に亘る移植細胞の振る舞いをbioluminescence imaging(BLI)を用いて非侵襲的且つリアルタイムに観察したが、内膜癌細胞株は増殖速度が速く長期の観察では予定期間内に移植マウスが癌死してしまった。一方、内膜不死化細胞株では、通常移植だけでは生着しないが、このシステムを用いると、磁石留置場所の近傍に集中して生着した病変が確認された。本年度は、子宮内膜症および子宮腺筋症モデルを作成するため、これまで用いていた不死化子宮内膜腺上皮細胞だけでなく不死化子宮内膜間質細胞を入手し、両者を混合して免疫不全マウスに移植することで、より確実により内膜構造に近い内膜症様組織を腹膜に発生させることを試みた。既に作成した発光および蛍光シグナルを発し且つ非機能膜受容体を発現する不死化子宮内膜腺上皮細胞と入手した不死化子宮内膜間質細胞を混合し、膜受容体に対する磁気ビーズを標識した抗体と反応させて、両側の卵巣を摘出した免疫不全マウスの腹腔内に移植した後、ネオジムミニ磁石を腹壁に留置して、壁側腹膜への移植細胞の集積と生着を図った。免疫不全マウスにはエストロゲンを投与して410週間の間、移植した細胞の振る舞いを発光イメージングを用いて非侵襲的、リアルタイムおよび定量的にモニタリングした。結果は、移植細胞は磁石留置場所の直下・近傍に一致して生着したことを発光シグナルにより確認した。

モニタリング後に発光部位およびその周辺組織を採取して、HE染色および免疫組織化学により生着組織の構成細胞の検討を行ったところ、明らかな腺管構造は認めなかったがヒトビメンチン陽性であり、ヒト由来組織であることを確認した。また、内膜細胞と子宮平滑筋細胞で構成される子宮腺筋症モデルの作成のため、レンチウイルスでGFPを導入した初代子宮平滑筋細胞の不死化を検討していたところ、長期生存可能で増殖能の極めて高い細胞集団が自然に発生したため、その細胞特性の解析を行うとともに、その集団の中から表面マーカーを用いて幹細胞様集団の単離を試みたが、幹細胞様集団の比率は極めて低いことが判明した。26年度が最終年度であるため、記入しない。産婦人科学、生殖生理学、幹細胞学、再生医学26年度が最終年度であるため、記入しない。発現細胞が得られてin vitroでのMACS選別は可能になった点は当初の目標の大部分は達成し得た。しかし、レンチウイルスの細胞への感染効率が十分でないことや、マウスに装着するサイズのミニ磁石では十分な磁力が得られないことなどがあり、条件設定や戦略の変更などに時間を要したため、病変を有する宿主の介入実験までには至っていない点で、「やや遅れている」とした。また、平成24年4月7月にかけて研究室が移転したことも研究が当初の予定から遅れた一要因となった。細胞の種類を代えることで、磁性体を用いた内膜症・腺筋症モデルマウスの開発戦略が妥当で実行可能であることが判明したが、その基盤知見や技術を本来の目的とする細胞にはまだフィードバック出来ていない点で、「(3)やや遅れている。」とした。ミニ磁石の磁力強化や留置場所・時間の条件設定を今後さらに重点的に行うとともに、初代培養細胞や幹細胞にこだわらず、前述の方法で得られた3者発現の不死化細胞や癌細胞を積極的に活用することで、レンチウイルスの感染効率の低さを今後は克服する。すなわち、先ず病変形成を目標にして、次に安定的に出来た病変に幹細胞をもぐり込ませて幹細胞の振る舞いを追跡する戦略を取る。これまでに引き続いて、磁性体を用いた子宮内膜症・腺筋症モデルマウスの開発および確立とその疾患モデルにおける幹細胞の修飾とその影響に関する検討を行う。すなわち、1)磁性体標識発光内膜細胞の作製、2)磁性体による標識発光内膜細胞のin vivo集積と病変作成、3)生物発光イメージング、4)マウス宿主への免疫学的介入、などの諸点について、これまでに引き続いて内膜症・腺筋症モデルを更にブラッシュアップする。さらに、この系に標識した幹細胞を混在させて、病変形成における幹細胞の振る舞いを検討する。特に、内膜だけでなく子宮筋成分を幹細胞候補集団に混在させることにより、それぞれがニッチとして幹細胞の振る舞いをどのように規定するのかを調べる。これらをふまえたうえで、この幹細胞に既報の内膜症誘導・促進因子の候補遺伝子(PTEN、RAS、CDNK2BASあるいはWNT4)について機能変異を導入することで、病変形成にどのような影響が及ぶかについても病理組織学的ならびに生化学的に検討する。またそれぞれのステージで標識細胞を分取しオミックス解析に供するなどして、各ステップにおいて、どのような遺伝子あるいはその産物がどのような発現ならびに役割を果たすのかについても調べる。以上については、丸山が主に研究の企画と統括を行う。
ランダム突然変異を用いた酵素配列空間の統計的解析

酵素の進化はその配列空間上の運動におきかえられる。活性や安定性などの性質は、進化過程で最適化されてきた、つまりそれぞれの空間上の山を登ってきたのたろうか。本研究では、この質問に答えるために、現在の酵素の配列空間上の位置、及びまわりの地形の情報を得た。方法としては、亜硝酸法を用いて、現在の酵素遺伝子にランダムに突然変異を導入した。そして、与えられた変異型酵素を統計的集団として解析し、地形や、天然酵素の最適化度を知った。天然酵素はB.stearothermophilusの耐熱性カタラーゼを用いた調べる性質は、熱安定性、カタラーゼ活性とペルオキシダーゼ活性とした。その結果、配列空間上の地形として、現在の天然酵素は、熱安定性に関しては、山の上部(1.95delta)に存在していた。しかし、カタラーゼ活性では中上部(0.56delta)、ペルオキシダーゼ活性では中部(-0.06delta)であった。言い換えると、熱安定性は進化的によく最適化されているが、酵素活性は、ほとんど最適化されていないことがわかった。このことは、熱安定性は、アミノ酸置換では、これ以上改変することが難しいが、酵素活性に関しては容易であることを示していた。実際、酵素活性に関しては、10倍ほどにその活性が上昇した変異型酵素が取得された。さらに、得られたアミノ酸配列空間上の地形の情報を使って、2回目の変異操作での改変するターゲットとしてペルオキシダーゼ活性を選ぶことができた。