hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大動脈解離における増殖応答の意義解明

ラパマイシンを予防投与するとマウス解離モデルの解離発症は完全に抑制された。DNAマイクロアレイの結果、解離発症前のマウス大動脈組織では増殖応答が亢進し、ラパマイシンによって特異的に抑制されることが明らかになった。蛍光免疫染色では平滑筋細胞、線維芽細胞、マクロファージで増殖応答が亢進していた。蛋白定量ではラパマイシン投与後のマウス大動脈組織で分化型平滑筋細胞のマーカーであるSM2の賛成が亢進していた。さらに解離発症後にラパマイシンを投与すると解離進展が有意に抑制された。以上の結果から、mTORが増殖応答を介して解離発症を促進し、また解離進展においても重要な役割を果たすことが明らかになった。大動脈解離は中高年に突然発症する致死性疾患であり、その病態が明らかでないために診断・治療法は確立していない。解離病態における増殖応答の重要性はこれまでにも示されているが、その詳細なメカニズムは依然不明である。本研究は増殖応答に着目し、解離病態の分子メカニズムを明らかにするものである。野生型マウスにコラーゲン架橋酵素阻害薬BAPNとアンジオテンシンIIを投与すると約2週間で解離を発症する(BAPN)。これに対してラパマイシンを投与すると解離発症は完全に抑制された。ラパマイシンの作用分子であるmTORは、増殖応答以外にも蛋白合成、血管新生、免疫応答などその機能は多岐にわたることから、解離病態において鍵となる機能を明らかにするため網羅的遺伝子解析を行った。その結果、増殖応答関連遺伝子のみで発現変動を認め、このことからmTORを介する解離病態において増殖応答が必須であることが示された。解離大動脈組織において増殖応答は主に外膜および外側中膜で起こっていることから、増殖応答が亢進している細胞を同定するため免疫組織染色を行った(計画2)。その結果、炎症細胞(CD45陽性細胞)において増殖応答が亢進していることが明らかになった。今後さらに同定を進める予定としている。また、解離発症におけるラパマイシンの抑制効果は明らかになったものの、解離進展に対する効果、すなわち解離進展におけるmTORの役割については明らかでないことから、現在モデルマウスの作成およびラパマイシン投与実験を行っている(計画1)。現時点では解離進展についても抑制傾向が示されている。本研究によりmTORを介する解離発症メカニズムが明らかになれば、診断マーカーの開発や、手術適応とならない症例に対する内科的な解離進展、再解離の予防治療など、新たな診断、治療法開発への発展が大いに期待される。当初申請した際の実験計画では実験3(ヒト組織培養)まで着手する予定であったが、当初の計画ではなかった遺伝子解析を行うことにより上述の通り大変意義のある成果が得られた。この結果は研究の実現性を高めるものであり、未着手の計画を補うものと考える。本研究は大動脈解離発症の分子病態解明を目的とする。マウス解離モデルにラパマイシンを予防投与すると、解離発症が完全に抑制された。蛋白定量およびDNAマイクロアレイの結果、マウス大動脈組織では増殖応答が亢進しており、ラパマイシンはこれを特異的に抑制することを明らかになった。この結果から、mTORが増殖応答を介して解離促進的に働くことが示唆された。また、大動脈組織の蛍光免疫染色により特に平滑筋細胞、マクロファージ、内皮細胞において特に増殖応答が盛んに起こっている事を明らかにした。続いてウェスタンブロット法を用いた蛋白定量を行い、ラパマイシンを投与したマウス大動脈組織において分化型平滑筋細胞のマーカーであるSM2が増加することを明らかにした。この結果から、平滑筋細胞の形質転換もしくは分化型平滑筋細胞の増殖が解離抑制的に働く可能性が考えられる。さらに研究者は臨床に即したラパマイシンの効果を検証するためラパマイシンの治療投与実験を行い、ラパマイシン投与により解離進展が有意に抑制されることを明らかにした。この結果は大動脈解離の発症病態を増殖応答という全く新しい側面から明らかにする大変意義のある研究成果であり、またラパマイシンによる解離進展抑制効果はStanford B型の解離のように積極的治療適応とならない症例に対する新たな治療法開発につながる重要な発見であると言える。今後も引き続き分子メカニズム解明に向けて研究を継続する。現在進行中の計画を継続するとともに、未着手である計画3、4(マウス細胞培養)にも着手する予定としている。

大動脈疾患実験に必要な機材、試薬、消耗品などについてすでに当研究所で有しているものを合わせて使用したため、費用削減につながり、次年度使用額が生じた。今後の実験や論文校閲に使用する。
社会科教育における認識過程と社会化過程の統一に関する研究

本研究は、社会科教育における社会認織過程と社会化過程を統一する理論及び授業理諭を構築するとともに、授業実践と直結する社会科の学習プログラムとそれに位置づく一連の教材を開発・作成し、そのモデルを提示しようとするものである。本研究実績の概要は、次の通りである。1.これからの社会科教育の在り方を展望しながら、社会科教育の目的・目標・内容・方法にわたって考察し、社会科教育の全体構造を明確にした。2.社会認識とは何かを明らかにするとともに、それを育成する社会認識過程を明らかにした。3.社会的資質とは何かを明らかにするとともに、それを育成する社会化過程を明らかにした。4.社会認識過程と社会化過程を統一する方法原理が「問題解決学習過程」であることを明らかにし、この過程を「集団思考・表現交流過程」として位置づかせていくことの必要性を明確にした。5.社会認識と社会的資質を統一的に育成するために、杜会認識過程と社会化過程を統一する授業理論を確立した。6.社会科教育における社会認識過程と社会化過程を統一する授業理論を踏まえ、熊本県の小学校・中学校教諭の研究協力を得て、小学校の第3学年から中学校の地理的・歴史的分野にわたる社会科の学習プログラム・教材を開発・作成した。それによって授業を実施し、社会認識と社会的資質を統一的に育成するための社会科の授業モデルを提示した。本研究は、社会科教育における認識過程と社会化過程を統一する理論及び授業理論を構築するとともに、授業実践と直結する社会科の学習プログラムとそれに位置づく一連の教材を開発・作成し、そのモデルを提示しようとするものである。今年度の本研究実績の概要は、次の通りである。1.社会科教育における認識過程と社会化過程の統一を図る理論を確立する前提を何よりもまず、確かにしておく必要があるということから、わが国の社会科の原点である初期社会科に立ち返り、捉え直し、これからの社会科教育の在り方を展望しながら、社会科教育の目的・目標・内容・方法にわたって考察し、社会科教育の全体構造を明確にした。2.社会科における認識過程と社会化過程の統一的授業過程と授業理論の骨子を確立した。3.認識過程と社会化過程の統一という視座からの学習指導要領の捉え直しと、現行の小学校・中学校社会科の教科書・指導書を分析した。4.認識過程と社会化過程の統一を目指す社会科の学習プログラム・教材の開発単元を確定し、熊本県の小学校・中学校教諭の研究協力を得て、小学校の第3学年から中学校の地理的・歴史的分野にわたって授業案を提示した。(以上の1.4.の成果は『科学研究成果報告書』に掲載)本研究は、社会化教育における社会認識過程と社会化課程を統一する理論及び授業理論を構築するとともに、授業実践と直結する社会科の学習プログラムとそれに位置づく一連の教材を開発・作成し、そのモデルを提示しようとするものである。1.これからの社会化教育の在り方を展望しながら、社会化教育の目的・目標・内容・方法にわたって考察し、社会化教育の全体構造を明確にした。5.社会認識と社会的資質を統一的に育成するために、社会認識過程と社会化過程を統一する授業理論を確立した。6.社会化教育における社会認識過程と社会化過程を統一する授業理論を踏まえ、熊本県の小学校・中学校教諭の研究協力を得て、小学校の3学年から中学校の地理的・歴史的分野にわたる社会科の学習プログラム・教材を開発・作成した。それによって授業を実施し、社会認識と社会的資質を統一的に教育するための社会科の授業モデルを提示した。
統合失調症のモデル動物におけるＢＤＮＦ－ＴｒｋＢシグナル系の役割

統合失調症の発症機序は未だ明らかでないが、妊娠期の感染や栄養状態が、統合失調症などの精神疾患のリスクを高めることが知られている。一方、脳由来神経栄養因子(BDNF: Brain-derived neurotrophic factor)およびその受容体TrkBシグナルは、精神疾患の病態に関わっていることが、多くの研究からわかっている。本研究の目的は、統合失調症のPoly(I:C)投与モデルを用いて、BDNF-TrkBシグナルの役割を調べ、妊娠マウスへのTrkB作動薬の投与が統合失調症の発症を予防できるかを明らかにすることである。妊娠マウスにPoly(I:C)(5 mg/kg for 6 days)を投与し、3週齢で離乳して飼育する。妊娠期から3週齢の離乳期まで、溶媒あるいはTrkB作動薬(7,8-DHF: 7,8-dihydroxyflavone)を妊娠マウスに飲み水として与えた。離乳後の通常の水を与え、10週齢以降に行動評価(運動量、認知機能障害)を実施した。さらに、マウス脳部位(前頭皮質、海馬、側坐核)を取り出し、BDNF-TrkB蛋白のウエスタンブロット解析を実施した。妊娠マウスに妊娠期から3週齢まで7,8-DHFを飲み水として与え、その後通常の水に戻し飼育し、10週齢以降に行動評価を行うと、Poly(I:C)の投与で引き起こされる認知機能障害、前頭皮質におけるBDNF-TrkBシグナルの低下が予防できることを見出した。以上の結果より、母親の栄養状態が、生まれてくる子供の精神病発症に大きく関わることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。
イオン結合による不斉有機分子触媒の高分子固定化法の開発

スルホン酸塩を有する高分子担体と塩構造を有する有機分子触媒のイオン交換反応により、有機分子触媒の簡便かつ効率的な高分子固定化法の開発に成功した。塩構造を有する種々の有機分子触媒が迅速かつ定量的に高分子上に固定化できたことから、不斉有機分子触媒の高分子固定化法の一つとして確立できた。イオン結合型高分子固定化不斉有機分子触媒による触媒的不斉反応では分子構造を最適化することで対応する低分子触媒よりも高い触媒性能を示すことが明らかとなった。アニオン性官能基を有する高分子担体と光学活性第四級アンモニウム塩構造を有する有機分子触媒のイオン交換反応により、有機分子触媒をイオン結合を介した高分子上への固定化を行い、有機分子触媒の簡便かつ効率的な高分子固定化法の開発を行った。スルホン酸塩やカルボン酸塩を有するモノマー、コモノマー、架橋モノマーに親水性、疎水性官能基を導入したスチレン誘導体、(メタ)アクリル酸エステル類、アクリルアミド類を用い、ラジカル溶液重合により、アニオン性官能基を有する固定化用高分子を合成した。ポリマー構造(直鎖型、架橋型)、親水性-疎水性バランス(疎水性、親水性、両親媒性)や架橋度、アニオン性官能基含有量を変えた固定化用高分子を合成し、シンコニジン四級塩、丸岡触媒、キラルイミダゾリジノン塩やチオウレア部位を有するイミニウム塩の反応を行った。反応は副反応無く、定量的に進行し、特にスルホン酸四級アンモニウム塩におけるイオン結合は酸性、塩基性、中性の幅広い範囲において安定なイオン結合を形成することを見出した。本研究より、カチオン性官能基を有する有機分子触媒がイオン結合を介して高分子上に簡便かつ定量的に固定化できることが見出された。また、アニオン性官能基を有する化合物はカチオン性官能基を有する固定化用高分子により、高分子上への固定化が可能であることを明らかとし、イオン性有機分子触媒の高分子固定化法の新たな方法の一つを確立した。イオン結合型高分子固定化不斉有機分子触媒による触媒的不斉反応を行い、その触媒性能(反応性、立体選択性、再使用性)を評価した。高分子固定化シンコニジンアンモニウム塩によるグリシンSchiff塩基の不斉ベンジル化反応は円滑に進行し、低分子触媒と同等の触媒性能を有することが明らかとなった。高分子に固定化するシンコニジン四級アンモニウム塩のキヌクリジン四級塩の置換基、二重結合や水酸基の修飾、ジスルホン酸塩の構造は容易に変更することが可能であり、これらの構造が不斉反応の転化率、収率、エナンチオ過剰率に大きく影響を与えることを見出した。それらの最適な組み合わせの検討を行った結果、低分子触媒を大きく上回る反応性やエナンチオ選択性を有するイオン結合型高分子固定化不斉有機分子触媒の開発に成功した。このイオン結合型高分子固定化不斉有機分子触媒は触媒活性を損ねることなく、数回の再使用が可能であった。イオン結合型高分子固定化MacMillan触媒によるシクロペンタジエンとケイ皮酸アルデヒドの不斉Diels-Alder反応では、親水性高分子を固定化用高分子に用いることにより、低分子触媒に匹敵する触媒性能の実現に成功した。また、新規に合成したMacMillan触媒二量体とジスルホン酸との反応は副反応なく円滑に進行し、MacMillan触媒を主鎖に含むイオン結合型キラル高分子の合成に成功した。MacMillan触媒二量体のリンカーやジスルホン酸の種類を種々検討して得られたMacMillan触媒を主鎖に含むイオン結合型キラル高分子を触媒とした不斉Diels-Alder反応では、キラル高分子触媒が対応する低分子触媒や二量体触媒よりも優れたエナンチオ選択性(endo体、>99% ee)を示すことを見出し、有機分子触媒を主鎖に含むイオン結合型キラル高分子が優れた高分子触媒として機能することを明らかにした。
冷却晶析操作の新規概念に基づく単分散結晶の製造

寸法や形状が一様に揃った結晶粒子群を単分散結晶といい、晶析工程後の固液分離および乾燥工程を含む粉体ハンドリング向上の面で有利となる。工業晶析操作の場合、製品結晶の純度に加えて、粒径分布が重要であり、均質な結晶粒子群を生産できることが望ましい。しかし、実際には操作中に新たな結晶核が自然発生することから、最終製品に微結晶が混入して結晶の寸法や形状が不揃いとなる。この点の解決を図った事例として、岩手大の研究グループが開発したシーディング法が有名であるが、本法の場合、種晶を大量に添加することから、種晶一粒あたりの成長量に限度があり、種晶の成長がそれほど見込めないこと、さらには種晶にもともと不純物が含まれていた場合、それを事前に検出して排除することが困難であることから、とりわけ医薬品や食品の分野では望まれないこともある。そこで本研究では、種晶を添加しない内部シーディング法に着目して検討を進めている。本法は、すでに既往実施例があるものの、操作理論の面で必ずしも確立されているとは言い難い状況にある。本研究課題においては、これまでに、高温の明礬飽和水を低温の明礬飽和水に添加することで結晶を析出させる「滴下冷却晶析法」について知見を深めてきた。そこで明らかにされたことは、冷却段を2段に分割することで結晶核の発生と成長の分離を図る手法が望ましいこと、さらにはそれぞれの冷却段で操作条件を結晶化現象に合わせて適宜調整することである。これらの知見は、国際学術雑誌であるJournal of Chemical Engineering of Japan誌に投稿され、公開されている。今年度は、前年度の計画にしたがい、原料添加用ノズルの材質と本数の増設に着目して検討を行った。その結果、材質の影響については現時点で明らかになっていないが、本数を増設することで製品結晶の均質性が有意に向上したことを見出している。これまでの進捗状況としては「やや遅れている」であったが、今年度は装置不具合の解消に加えて、原料供給用ノズルの増設や差し水添加操作など、新規なアプローチを積極的に取り入れた結果、製品結晶の均質性が大幅に改善され、一部の条件で本研究課題の目標値である変動係数(CV)20%台の製品結晶を得ることに成功した。このような進展が認められた理由としては、本研究課題におけるこれまでの積み重ねを通じて、滴下冷却法に対する知見が蓄積されたことで、本法に対する理解が深まってきていることが挙げられる。滴下冷却法は、高温の飽和水を低温の飽和水に添加する手法であり、操作技術の面でシンプルかつ取扱いが容易に思えるが、局所での冷却操作を伴うことから、晶析槽内部の液温がなかなか安定しないことに加えて、晶析現象を制御する必要があることから、当初想定された以上に難度の高い手法であることが分かってきた。前年度までは、技術上の基本課題の解消に研究従事時間の大半を要していたものの、積み重ねることで本法の知見が深まり、既往課題がおおむね解決された結果、晶析現象の操作制御がこれまで以上に効果的に行えるようになり、これまでの遅れが挽回されて、今年度の進捗に至ったと考えている。前年度に引き続いて、カリミョウバンー水系における滴下冷却晶析法を検討する。これまでの研究で、冷却段の分割やノズルの増設など、多角的なアプローチにより製品結晶の均質性向上を図ってきた。知見や経験の蓄積に伴い、本研究課題の数値目標である変動係数(CV)20%以下に着実に迫ってきているものの、いまだ決定打を欠いている感が否めない。目標を達成する上で重要なことは、最初の冷却段で生成させる種晶のもととなる結晶、すなわち内部シードの粒径分布であり、この段階で微小かつ均質性の高い結晶が求められる。本法の場合、前半の操作が上手くいかないと、後半の操作で挽回を図ることが困難であるため、前半の操作をいかに向上させるかが重要となる。これまでの経験より推察されることは、前半と後半の冷却段を中継する熟成工程において内部シードの品質低下が顕著となっており、本工程の改善を要することである。熟成工程は、最初の冷却段における結晶核の発生を確実に終了させて系全体をいったん安定化させる工程として位置づけており、原料の添加は行われず、液の撹拌のみが継続される。しかし、裏を返せば、熟成工程はたんに液体を撹拌するのみの工程であり、一切の結晶化制御がなされていない工程とも言える。恐らくは、最初の冷却段後に残存する過飽和度が大き過ぎることが問題となっており、それが内部シードの品質に悪影響を及ぼしているものと考えられた。この点において本手法の脆弱性が認められることから、今年度は、熟成工程の改善に重点を置いた検討を行う。具体的には、悪影響を及ぼす主な要因となっている残存過飽和を解消することを目的として、熟成操作中に差し水を添加することとし、最適な添加条件を模索する。差し水の添加量および添加速度、添加時の撹拌速度などが内部シードの品質に顕著な影響を及ぼすと推察されることから、これらの条件に焦点を当てて検討を進める。従来の冷却晶析法において、寸法や形状の均質な単分散結晶を製造するには、種結晶添加後の新たな核発生が十分に抑止される必要がある。この問題の解決策として、岩手大の晶析研究グループが開発した、種結晶を大量に添加する「シーディング法」が有用である。

しかし、本法を用いる限り、種晶由来の不純物が製品に混入するリスクを払拭できない為、結晶純度の面で不都合となる場合がある。この点は、とくに医薬品や食品分野において重要となる。本研究では、種結晶を添加しない冷却晶析法として、「滴下冷却法」を提案した。本法は、高温の原料溶液に低温の原料溶液を外部から添加する方法であり、結晶化の推進力である過飽和度を、原料の供給方法を工夫することで、ある程度制御できる。本研究では、滴下冷却法を用いるとともに、原料溶液の冷却工程を核化工程(結晶の個数を増大させる工程)と成長工程(結晶の粒径を増大させる工程)の2工程に分割することで、単分散結晶製造の要件である「核化と成長の分離」の達成を目的とした。今年度は、1段目の核化工程に着目し、寸法や形状が均質な種結晶の作製に重点を置いた。具体的には、原料溶液の滴下量、滴下速度、温度を種々変更し、製品結晶の粒径や単分散性(粒径均質化の度合い)に及ぼす影響を調査した。また、従来法との比較を行い、新法である滴下冷却法の優位性を調査した。その結果、滴下冷却法を用いることで、単分散性が従来法よりも最大で40%程度改善され、滴下冷却法の優位性が示された。また、滴下冷却法において、原料溶液の滴下量および温度が過飽和度に顕著な影響を及ぼすことを見出した。これらの条件を最適化することで、単分散性の指標である変動係数(CV)を40%程度まで改善できている。本研究成果は、2016年度の化学工学会福島大会と化学工学会年会においてそれぞれ口頭発表がなされた。近く、海外学術論文誌に投稿を予定している。本研究課題では、単分散結晶が得られたことの数値目標として、変動係数(CV)20%以下を設定している。しかし、現状は高々CV40%程度であり、目標未達成の状況である。目標が達成されていない要因の一つに、装置仕様上の問題点が挙げられる。すなわち、高温溶液を低温溶液に滴下する際、低温溶液側の液温が数°C上昇するが、これが元の設定温度まで冷却されることで、意図しない結晶化が起こっていること、さらには、滴下された原料溶液が均一に混合されず、意図しない結晶化が局所で引き起こされていることが推察された。次年度は、現在問題となっている装置仕様上の修繕を図る一方、現状の成果をしのぐ良好な結果が予想されている手法(2段滴下冷却法)に着手する。当初の予定から、若干の計画変更の可能性があるが、基本路線は、当初の予定を継承する予定である。今後、研究を推進する上で、予期しない事態が起こった場合は、なるべく現在の手法での改善を試みる。ただし、同手法の継続が厳しいと判断された場合は、現在の手法(滴下冷却法)を中止し、代替の手法として貧溶媒添加晶析法を検討する。本法は、原料を含む溶液中に沈殿剤に相当する貧溶媒(原料にとって溶解しにくい溶媒)を添加することで結晶を析出させる手法であり、原料溶液を添加する点において、滴下冷却法と類似の手法である。検討されるべき事項についても、滴下冷却法と同様の視点に基づき、貧溶媒の添加量や添加速度が中心となる。本法は、本研究課題とは別に予備試験が進められている状況にあり、目的を達成するための操作条件に関して、数年程度の知見がすでに得られている。したがって、手法が変更された場合においても、これまでの進捗を引き継ぐことから、一からの検討とはならない。また、滴下冷却法と同様のアイデアに基づいて検討中であることから、手法が変更されても、本研究課題におけるアイデアの根幹部分は変わらない。
抗MHC classII抗体により誘導される新しい接着因子の同定

MHC classIIに対する抗体(TJA64)を10^7のLeukcyto adhesion deficiency sysndrome (LAD)より樹立された細胞株に作用させ、これを免疫源としてBalb/cマウスに免疫した。最終免疫後三日めにマウスミエローマcell line SP2/0と型のごとくfusionし、TJA64によりLAD lineに誘導された同種細胞接着(HA)を阻害する単クローン抗体をscreeningした。HAを一部阻害するクローン1D8,1H4を得、これのcharactrizationしたところそれぞれ抗CD11a,CD18抗体であることが判明した。より強力に阻害するRT22クローンは細胞株、組織切片等での反応性はLFA-1分子に対するものであることが推測されたが、その分子量はIgGより軽く、不完全抗体である可能性が考えられた。このcharactrizationは現在進行中である。またscreeningの第一段階としてLADにHAを誘導するものを同時に検索したが、その過程で得られた抗体TL-1はCD44分子を認識していた。この抗体で誘導されるHAはLFA-1,ICAM-1,alpha4-integrin,L-selectinに対する抗体では阻害されず、他のCD44抗体であるHermes 3,OS/37,BU52でblockされた。種々の代謝阻害剤を用いた検索ではこのHAはエネルギー依存性、温度依存性で細胞内シグナリングの関与が考えられ、また細胞内アクチンフィラメントも関わっていた。このようにCD44に対する抗体で引き起こされるHAが他のCD44抗体でblockされたことからCD44分子のconformatinal changeがHAを惹起したと考えられた。このような機序はLFA-1分子では報告されているがCD44分子では他に報告をみず、あらたな知見と考えられた。この現象については病理学会総会などで報告することとなっており、論文も準備中である。
植物の屈性運動に関わる生理活性物質を用いた作用機構の解明

植物の光屈性のメカニズムとして、Cholodny-Went説が良く知られており、光側と影側でオーキシンの横移動が起こり、光屈性が誘起されるとしている。一方で、オーキシンではなく、光誘導性成長抑制物質が光側で生成され、光側の成長が抑制されることによって引き起こされるという、Bruinsma-Hasegawa説が新たに提唱された。研究代表者らはこれまでにダイコン下胚軸の光屈性制御物質として、4-MTBIおよびRaphanusaninを見出し、また、重力屈性制御物質として、3,6'-disinapoylsucroseを見出してきた。また、トウモロコシからは光誘導性成長抑制物質としてDIMBOAやMBOAに着目し、それらの成長抑制作用と光屈性との関連性を明らかにしてきた。本研究では、まず、トウモロコシ芽生えにビーズをつけ、重力刺激を与えて上側組織と下側組織の成長率を調べた結果、屈曲の初期の段階で上側組織の成長が抑制されることを見出した。また、重力屈性刺激後、DIMBOAならびにMBOAの内生量をHPLCを用いて調べた結果、30分後にDIMBOAが増量し、60分後にMBOAが増量することを見出した。さらに、トウモロコシ芽生えの片側にDIMBOAおよびMBOAを投与した結果、いずれの場合も屈曲することが観測された。本研究結果は、これまでのダイコンでの研究成果と同様にBruinsma- Hasegawa説に基づく重力屈性メカニズムの証明に貢献するものと思われる。一方で、ダイコンを用いたオーキシン極性移動阻害活性試験法を用いて天然物からの極性移動阻害物質を探索した結果、ニガヨモギから、新規活性物質としてArtabolideを見出した。天然からのオーキシン極性移動阻害活性の単離報告は少なく、屈性運動に関わるオーキシンの極性移動を調べる重要なツールとなり得るものと思われる。25年度が最終年度であるため、記入しない。そこで本研究では、トウモロコシの重力屈性制御物質を探索擦ることを目的とした。トウモロコシ芽生えに重力屈性刺激与え、屈曲角およびH2O2の蓄積を比較検討した結果、上側と下側組織でのH2O2の偏差分布ならびに続くリグニンの偏差分布が観測された。一方で、ダイコンを用いたオーキシン極性移動阻害活性試験法を用いて天然物からの極性移動阻害物質を探索した結果、モッコウ、ゴボウ及びニガヨモギから、活性物質としてdehydrocostus lactone及び4-hydroxy-β-thujoneを見出した。

天然からのオーキシン極性移動阻害活性の単離報告は少なく、屈性運動に関わるオーキシンの極性移動を調べる重要なツールとなり得るものと思われる。当初はイメージングMSを用いての屈性現象に関わる生理活性物質の植物体内での分布を調べる計画であったが、機器の設定に時間を要してしまい行うことができなかったため、その計画が遅延している。イメージングMSが使用できるようになったので、屈性現象における生理活性物質の植物体内における分布を調べる研究を行う。また、生理活性物質の全合成ならびに蛍光ならびにアフィニティープローブ合成を行う予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
熱帯里山ガバナンスをめぐるステークホルダー間にみる利害関係とその背景

熱帯雨林の劣化・減少が進む中、その保全の核として先住民が長年暮らしに利用してきた熱帯里山に着目し、ガバナンスの鍵となるステークホルダーの利害関係について、インドネシアおよびマレーシアの3つの主研究サイトにおいて調査した。その結果、各研究サイトの調査結果より、熱帯里山のガバナンスについては、熱帯里山の「内」の内発的意向を基盤とした「外」とのつながりの構築が重要になってくること、およびその際の鍵として、「内」の有する知識、知恵などの「知」と外の「知」との融合による高度化を指摘した。本研究では、熱帯雨林保全の重要な鍵として、森やその周辺に住む先住民が長い時間をかけて暮らしのために創りあげてきた「熱帯里山」に注目する。熱帯里山の管理をめぐっては、先住民、政府、開発企業、NGOなどさまざまなステークホルダーがみられる。インドネシアおよびマレーシアの4つの調査サイトにおいて、ステークホルダー間の利害関係について比較研究をおこない、熱帯里山のガバナンスに必要な条件について導き出すことを目指している。平成20年度の研究目的および内容は、調査サイトにおいて各担当者が具体的で詳細な研究テーマを設定することであった。調査サイトとしては当初予定していた4か所にくわえ、インドネシア・ランプン州を新たに加えた。各調査サイトにおける研究実績の概要は下記のとおりである。マレーシア・ヌグリスンビラン州:先住民オランアスリのいくつかの村落において、森林利用と森林資源を利用した村落開発に焦点を当てた調査を行った。エコツーリズムの取り組みを行っている村、おもに出稼ぎによって生計を立てている村があり、その概要の聞き取りを行った。21年度以降比較調査をする予定である。マレーシア・サラワク州:サラワクでは全般に農村の過疎化が急速進んでいる。その状況をバラム川の中上流村落において広域調査をおこない実施した。最上流では廃村もみられた。中には活気のある村もみられ、21年度以降はいくつかの村間での比較調査をおこなう。インドネシア・東カリマンタン州:インドネシアでは2000年の地方分権化以降、多くの村でプランテーションの開発が進んでいる。21年度は開発に関わるステークホルダー各々についてインタビューなどによって詳細に調査する。インドネシア・中スラウェシ州:伝統的な儀礼や慣習が残る焼き畑を実施している村において、村の歴史を調べ、なぜ伝統的なやり方が残っているのかを調査した。来年度はさらに詳細に調査し、稲作法や儀礼について映像による記録も行う。インドネシア・ランプン州:ジャワからの移民が創った果樹・有用樹混合林を対象とし、その所有が村人と国家との間で揺れ動く様を調査した。21年度は外からのNGOが果たした役割に着目し研究を継続する。20年度から引き続き調査しているマレーシアのサラワク州および半島部、インドネシアの東カリマンタン州および中部スラウェシ州での調査に加え、熱帯里山との比較のために日本国内の里山利用についての調査を実施した。サラワク州においては、バラム川流域において進行しつつある、企業によるプランテーション開発、都市への人口流出に伴う過疎・高齢化、村人自身による村落開発の進展について調査し、プランテーションをめぐって企業と村の間で土地争いがみられること、村によって過疎化の状況が大きく異なることが分かった。半島部では、これまでの調査結果を分析・考察、さらに世界各地の「里山」との比較検討により、都市と農村あるいは生産地と消費地をつなぐ新たな関係のあり方「関係価値」という概念を提唱した。東カリマンタン州では、地方分権化・民主化の動きの伴い、村の人々が企業と組んでアブラヤシプランテーションの開発を進めている。熱帯里山の維持者であったはずの人々をアブラヤシ農園開発の拡大に駆り立て、熱帯里山を消失へと導く結果となっていることが明らかになった。中スラウェシ州では、ドンガラ県トンプ集落において、焼畑を軸とした人と森の関わりに関する調査を、現地NGOと連携する形で実施し、森の伐開の儀礼、穂刈、種まきのプロセスを参与観察し、その意味内容を聞き取った。日本の里山における比較は、高知県大豊町においておこなった。過去からの里山利用、現在の過疎高齢化問題について調査した。熱帯里山と共通してみられる問題もあり、将来的な比較研究の可能性がみえてきた。20年度から引き続き調査しているマレーシアのサラワク州、インドネシアの東カリマンタン州および中部スラウェシ州での調査および21年度から開始した熱帯里山との比較のために日本国内の里山利用についての調査を実施した。サラワク州においては、バラム川流域において進行しつつある、企業によるプランテーション開発、都市への人口流出に伴う過疎・高齢化、村人自身による村落開発の進展についてさらに上流部の状況を調査し、プランテーションをめぐって企業と村の間でみられる土地争いの状況を詳細に記述した。調査結果は、Borneo Research Bulletin誌に投稿中である。

東カリマンタン州では、これまでの研究成果より、企業の直営農園による大規模な土地の収用と森林破壊を伴うPIR制度によるアブラヤシ農園開発の代替案として、企業を伴わないUPP制度により小規模分散型で高生産量のゴム園を造成し地域経済の向上を図りつつ、土地の収用と大規模な熱帯林の破壊の回避する「緩やかな産業化」による地域発展戦略を提言した。中スラウェシ州では、引き続きドンガラ県トンプ集落において、村人と周囲の森・自然との関係が顕著に顕れる儀礼や神話・民話の聞き取りをすすめた。その聞き取りと記録の成果を村人と共有するとともに、地元政府の政策(特に郷土教育のカリキュラム)に活かす方途について、調査を共同で進めた関係者と話し合った。日本の里山における比較は、高知県大豊町の一集落において全戸の大半を訪問し、これまでの暮らしの状況、今後の集落の将来についてのインフォーマルなインタビューを実施した。最終年度にあたり、国際会議「文化と歴史そして生態を重視したもう一つの草の根の農村開発に関する国際会議」(山口県)を京都大学および山口大学と共催し、熱帯里山における今後の持続的な開発についての議論をおこなった。調査対象地においては、20年度から引き続き調査しているマレーシアのサラワク州、インドネシアの東カリマンタン州および中部スラウェシ州での調査、および21年度から開始した熱帯里山との比較のために日本国内の里山利用についての調査に関し、まとめをおこなった。サラワク州の結果については、都市への人口流出に伴う過疎・高齢化、村人自身による村落開発の進展について補足調査を実施し、その結果、論文がBorneo Research Bulletin誌に掲載決定となった。東カリマンタンについては、農園開発にともなう土地所有権の取り扱いについて、文献調査および法令を検討した。35年間の農園事業権終了後は、対象土地は国家に返還され、非林業用地である農園跡地は、地方自治体(Kabupaten)に管理が委譲される。したがって、住民の慣習的権利の取り扱いは地方自治体に委ねられることがわかった。中スラウェシ州では、最終成果のアウトプットのために、調査村での焼畑作業・儀礼に関わる映像の再編集、文章や絵での成果ドラフトの内容をトンプ村関係者と確認し、加筆修正作業をおこなった。高知大学の「中山間」プロジェクトと共同で、今後の農山村の里山管理に関する比較調査を実施し、「地元民の内発性」を核とした発展形態のあり方が議論された。その成果は、上の国際会議において発表・議論され、報告書を出版した。
アミノ酸Ｌ－リジンによるｕｒｅｍｉｃ　ｍｅｍｏｒｙ解除の試み

アデニン誘導性腎不全ラットモデルを用いた検討により、アミノ酸L-リジンの経口投与が、腎不全合併症である血管石灰化を抑制することが明らかとなった。アミノ酸L-リジン経口投与は、腸管におけるカルシウム吸収調節を介して、腎不全合併症である二次性副甲状腺機能亢進症を抑制し、適切な骨血管相関を保つのに貢献した。また、L-リジン経口投与にて血漿濃度が上昇したアラニン・プロリンは血管平滑筋細胞のアポトーシスを抑制し、同じく血漿濃度が上昇したアルギニン・ホモアルギニンはカルシウム・リン酸の沈殿形成を抑制することが明らかになった。本研究では、血中の尿素が著明に上昇し血管石灰化・骨粗鬆症を生じる腎不全動物モデル(アデニン腎症ラット)を作成した。雄性Sprague-Dawleyラットを1)正常コントロール(Cont)群、2)アデニン誘導性腎不全(Ade)群、3)アデニン腎不全+グリシン投与(Gly)群、4)アデニン腎不全+L-リジン投与(Lys)群の4群に無作為に分け、実験を行った。なお、グリシンは最も単純な構造のアミノ酸であることから、本実験ではアミノ酸コントロールとして用いた。Cont群に比べAde群・Gly群・Lys群では同程度に血清尿素窒素が上昇した。また血清クレアチニン濃度上昇もAde群・Gly群・Lys群間で同程度であり、グリシンやL-リジンは腎機能を改善しないことが明らかになった。しかし、リジンのカルバミル化修飾体であるホモシトルリンの血漿濃度を測定したところ、Cont群に比べAde群・Gly群で上昇し、Lys群で抑制される傾向にあり、L-リジン投与によりカルバミル化修飾(uremic memory)が抑制されうることが明らかになった。また、Ade群・Gly群で認められていた著明な血管石灰化病変は、Lys群でほぼ完全に抑制された。さらに、Ade群・Gly群で認められた著明な骨粗鬆症様の骨病変も、L-Lys投与によりほぼ完全に抑制された。これらの結果から、L-Lys投与によりuremic memoryが解除され、骨・血管病変が改善される可能性があることが明らかとなった。また、L-Lys投与は、血漿Ala, Pro, Arg, Homo-Arg濃度の上昇を引き起こし、Ala, Proの上昇は血管平滑筋細胞のアポトーシス抑制、Arg, Homo-Argの上昇はカルシウム・リンの沈着抑制性に作用することが明らかとなった。本研究の目的は、1)蛋白質リジン残基εアミノ基に対して、尿素がカルバミル化修飾を引き起こし、本修飾がuremic memoryとして作用すること、および2)アミノ酸L-リジン投与によりuremic memoryが解除できること、の2点を証明することにある。本年度の研究では先ず、血中の尿素が著明に上昇し血管石灰化・骨粗鬆症を生じる腎不全動物モデル(アデニン腎症ラット)を作成した。Cont群に比べAde群・Gly群・Lys群では同程度に血清尿素窒素が上昇していた。また血清クレアチニン濃度もAde群・Gly群・Lys群間で同程度であり、グリシンやL-リジンは腎機能を改善しないことが明らかになった。しかし、リジンのカルバミル化修飾体であるホモシトルリンの血漿濃度を測定したところ、Cont群に比べAde群・Gly群で上昇し、Lys群で抑制される傾向にあることが明らかになった。つまり、L-リジン投与によりカルバミル化修飾(uremic memory)が抑制されうることを明らかにした。さらに、Ade群・Gly群で認められた著明な骨粗しょう症様の骨病変も、L-Lys投与によりほぼ完全に抑制された。アミノ酸L-リジンの経口投与だけで、腎不全モデル動物の血管石灰化・骨粗鬆症病変をほぼ完全に抑制できることを明らかにした点は、非常に大きな進展であると考えられる。

なぜなら、腎不全患者における骨・血管病変の進展は、同患者における心血管疾患発症・進展の危険因子であると考えられており、単純なアミノ酸投与でそれらの病変を抑制できるなら、これまでの治療戦略を大きく変える可能性があるからである。当初の予想通り、L-リジン経口投与によりリジンのカルバミル化修飾(ホモシトルリン)が抑制されることも明らかにした。L-リジンによるカルバミル化修飾抑制は腎機能の改善(つまり尿素の低下)には依存しておらず、L-リジン投与による蛋白代謝促進、あるいはカルバミル化decoyとしての遊離アミノ酸L-リジンの作用に依存していることが示唆された。カルバミル化エリスロポエチンは造血能を失い、カルバミル化低密度リポタンパク質が動脈硬化を促進することなどから、カルバミル化は蛋白質の機能不全を起こす修飾であると考えられている。我々の実験結果は、L-リジン経口投与により、カルバミル化修飾による蛋白機能不全を抑制できる可能性があることを示しており、非常に有用な知見であると考えられる。(1) L-リジンによるuremic memory解除機序の詳細な検討・・・アデニンラットではL-リジン投与にて血漿ホモシトルリン濃度が低下することを確認したが、生体を構成する蛋白質のリジン残基εアミノ基に対するカルバミル化を抑制するか否かについては、未検討である。エピジェネティクスの本体であるヒストンのリジン残基修飾はカルバミル化と同じεアミノ基に生じるため、ヒストン蛋白質の修飾に着目しつつ、L-リジンによるuremic memory解除の分子メカニズムの解明を試みる。(2)培養細胞を用いた、カルバミル化がヒストン修飾に与える影響の検討・・・我々は計46種類の抗ヒストン修飾特異的モノクローナル抗体を保有しており、一連の抗体を用いて、尿素によるカルバミル化がヒストン修飾にどのような影響を与えるのか、培養細胞系を用いて評価する。また、各修飾変化と遺伝子発現変化の関係を明らかにするため、抗ヒストン修飾特異的モノクローナル抗体を用いてChIP-sequenceおよびiTRAQ標識質量分析を行う。(3)尿素負荷モデルにおける、L-リジンによるuremic memory解除の試み・・・アデニンラットモデルは血清尿素窒素が著明に上昇するモデルであるが、体内の尿素だけが上昇しているモデルではないため、本年度の結果のみで「L-リジンが尿素によるuremic memoryを解除した」と断言することはできない。このため、J Am Soc Nephrol. 2010;21(11):1852 -1857の方法に従い、片腎摘ラットに2%尿素水を飲水させることで血清尿素濃度上昇モデルを作成し、L-リジン投与によって、本当にuremic memoryが解除できるか否か、また腎・心血管病変の進行を抑制出来るか否か、組織学的・生化学的手法を用いて検討する。上記実験を遂行するために必要な動物購入費・動物維持管理費・試薬購入費・プラスチックおよびガラス器具類購入費として使用する。
形態形成過程における細胞極性制御機構に関わる下流因子の網羅的解析

本研究は、細胞極性に関わるaPKC遺伝子と細胞集団の極性制御に関わるWnt-PCPシグナルの構成因子Daam1遺伝子に着目した一連の実験生物学的検討である。一連の解析により、1細胞を制御する極性シグナルと多細胞を制御する極性シグナルの関連性を明らかにする。本研究では上皮細胞内でのaPKCとDaam1の相互作用によりリン酸化が変動する分子が、上流因子か下流因子か、2次性変動遺伝子かどうかを生化学的、細胞生物学的、分子生物学的に検証している。上皮細胞での機能解析を目的として、遺伝子ノックアウト上皮細胞株の樹立を試み、aPKCとDaam1の相互作用が具体的な表現形として得られるかを、実験技術も含めて検討した。作製した細胞株を用いて、2次元、2.5次元、3次元の培養条件での細胞の挙動をLive cell imagingシステムを用いて経時観察している。また、経時観察と全く同様のタイムコース・同条件で培養したサンプルを用いて、細胞極性マーカー、細胞骨格、細胞内小器官、平面極性関連因子に対する特異抗体で免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察している。さらに、バイオ・インフォマティクス・データベースに蓄積されている情報と照らし合わせて、細胞極性病を定義する病態の探索と検証をリン酸化プロテオミクス解析において同定された遺伝子群との関連性を検討し、樹立した上皮細胞株を用いて生化学的、細胞生物学的な検討を行っている。これらの一連の研究成果により、上皮細胞の極性を維持する分子メカニムが、1細胞内では共通であるが;、その下流の分子群の組成を代えることにより平面極性をも制御することが明らかとなりつつある。本研究は、細胞極性制御という3次元での形態形成過程に必須である生命現象の根幹メカニズムに着目し、さらに1細胞と細胞集団に細分化して細胞極性の制御機構を明らかにすることを目的とする。具体的には、形態形成過程における、3次元細胞極性制御に関わる具体的な分子ターゲットを同定し、それらの機能を解析する。本研究の遂行のために、これまで独自に構築してきた薬剤誘導性遺伝子ノックアウトシステムを用いて、オミックス解析により遺伝学的相互作用の本態をタンパク質の活性調節レベルで明らかにしてきた。これらの分子ターゲットと既知の細胞極性制御因子との相互作用を具体的に解析することにより、細胞極性制御の本態を明らかにする。細胞極性制御因子aPKCの下流因子を、リン酸化プロテオミクス解析により同定する事を目的とした。aPKCには分子亜種としてlambda分子腫とzeta分子腫があるが、胎生致死であるaPKClambda単独KO上皮細胞株、aPKClambda/zetaダブルKO上皮細胞株をコンディショナル・ノックアウトマウスから樹立し、同様の方法で樹立した正常上皮細胞株との比較をすることで、網羅的に解析した。全遺伝子を解析対象としたが、約10の有力な候補分子を同定した。有力な下流候補分子に対して具体的な関わりを解析する実験系として、3次元培養法による生細胞観察、細胞極性マーカーでの免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡観察で行う方法を確立した。今後、細胞極性制御に関わるaPKCの下流遺伝子候補との具体的な関わりを、確立した3次元培養法と分子細胞生物学的方法により解析する。予定していたaPKCのノックアウト細胞株は全て樹立する事に成功し、リン酸化プロテオミクス解析を行った。有力な下流候補分子が同定されたので、具体的な関わりを解析する実験系として、3次元培養法による生細胞観察、細胞極性マーカーでの免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡観察でを行う方法を確立した。本研究課題の進行にあたり、以下の点について検討した。形態形成過程を時間的、空間的に解析することを目的として、細胞極性制御に関わるaPKCとDaam1遺伝子に着目して、野生型、薬剤誘導性遺伝子ノックアウトaPKCλ腎尿細管上皮細胞株、aPKC λ/ζダブルノックアウト腎尿細管上皮細胞株、aPKC λ/ Daam1ダブルノックアウト腎尿細管上皮細胞株および、Daam1ノックアウト腎尿細管上皮細胞株を作成した。作製した細胞株を用いて2次元、2.5次元、3次元の培養系を確立し、タイムラプス顕微鏡観察が可能な実験系を構築した。経時観察後のサンプルを用いた免疫蛍光染色による実験的解析系の確立も行った。研究課題に示した、細胞極性制御機構における下流因子の網羅的解析の目的で、リン酸化プロテオミクス解析を行った。その結果、20種程度の解析が可能な数の候補分子を同定した。現在は、パスウェイ解析を中心とした既知の細胞内経路シグナルとの関わりを検討する一方で、新規の細胞極性制御シグナル機構の発見に繋がる実験結果の解析と必要十分性を満たす論理的構築を行っている。今後は、細胞極性異常に基づく疾患群の検索と、現在治療に用いられている薬剤の効果を検証して、新たな疾患概念に基づく新規治療薬の開発を検討する。また本研究の網羅的解析系の構築の一環として、プロテオミクス解析を用いたサプリメント食品の体内動向、培養細胞株を用いて他生物種における腫瘍ウイルスの細胞生物学的検索に共同研究者として参画して論文発表に至った。本研究課題は以下の点のように進行している。形態形成過程を時間的、空間的に解析することを目的として、細胞極性制御に関わるaPKCとDaam1遺伝子に着目して、野生型、薬剤誘導性遺伝子ノックアウトaPKCλ腎尿細管上皮細胞株、aPKC λ/ζダブルノックアウト腎尿細管上皮細胞株、aPKC λ/ Daam1ダブルノックアウト腎尿細

上皮細胞株および、Daam1ノックアウト腎尿細管上皮細胞株を作成した。これらの細胞株の作製にあたっては、不死化遺伝子であるSV40Ttsのゲノムへの導入、初代培養技術による腎尿細管細胞の分離、薬剤・蛍光マーカー・形態による選択、50回以上の継代による細胞株の安定化が必要であったが、いずれにおいても数回の試行のみで順調に進行した。細胞増殖曲線の作成、ゲノム解析とタンパク質解析により、細胞株が目的通りに作製できている事を確認した。さらに各細胞間の質的な違いの有無を把握し、詳細な培養条件を設定した。研究課題に示した、細胞極性制御機構における下流因子の網羅的解析の目的で、リン酸化プロテオミクス解析を行った。その結果、20種程度の解析が可能な数の候補分子を同定した。作製した細胞株を用いて2次元、2.5次元、3次元の培養系を確立し、タイムラプス顕微鏡観察が可能な実験系を構築した。経時観察後のサンプルを用いた免疫蛍光染色・共焦点顕微鏡観察による実験的解析系の確立も行った。その結果、解析に耐える抗体の選択・入手、観察条件の設定を行う事が出来た。リン酸化プロテオミクス解析の結果として同定した、20種程度候補分子のうちの抗体や阻害剤などが容易に可能入手であった数種類については、確立した細胞生物学的、生化学的解析系を用いて実際に評価を行い、評価が可能である事が判明した。本研究は、細胞極性に関わるaPKC遺伝子と細胞集団の極性制御に関わるWnt-PCPシグナルの構成因子Daam1遺伝子に着目した一連の実験生物学的検討である。一連の解析により、1細胞を制御する極性シグナルと多細胞を制御する極性シグナルの関連性を明らかにする。本研究では上皮細胞内でのaPKCとDaam1の相互作用によりリン酸化が変動する分子が、上流因子か下流因子か、2次性変動遺伝子かどうかを生化学的、細胞生物学的、分子生物学的に検証している。上皮細胞での機能解析を目的として、遺伝子ノックアウト上皮細胞株の樹立を試み、aPKCとDaam1の相互作用が具体的な表現形として得られるかを、実験技術も含めて検討した。作製した細胞株を用いて、2次元(on plate)、2.5次元(on gel)、3次元(in gel)の培養条件での細胞の挙動をLive cell imagingシステムを用いて経時観察している。また、経時観察と全く同様のタイムコース・同条件で培養したサンプルを用いて、細胞極性マーカー、細胞骨格、細胞内小器官、平面極性関連因子に対する特異抗体で免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察している。さらに、バイオ・インフォマティクス・データベースに蓄積されている膨大な情報と照らし合わせて、細胞極性病を定義する病態の探索と検証をリン酸化プロテオミクス解析において同定された遺伝子群との関連性を検討し、樹立した上皮細胞株を用いて生化学的、細胞生物学的な検討を行っている。これらの一連の研究成果により、上皮細胞の極性を維持する分子メカニズムが、1細胞内では共通であるが、その下流の分子群の組成を代えることにより平面極性をも制御することが明らかとなりつつある。
ヌクレオシドトランスポーターを介したアデノシン取込みによるニューロン新生調節機構

ヌクレオシドトランスポーターENT1を介したアデノシン取込みが神経幹細胞の機能においてどのような役割を果たしているのかを明らかにし、その作用機構を解明した。ENT1は未分化な神経幹細胞に高発現し、細胞内に取り込まれたアデノシンはAMPおよびADPに代謝され、ピリミジン生合成経路を阻害してその増殖を抑制した。このENT1を介したアデノシン取り込みによる増殖抑制は睡眠剥奪による海馬歯状回のニューロン新生低下に関与している可能性が明らかになった。我々は神経幹細胞の増殖がアデノシンによって抑制され、これはアデノシントランスポーターの一種である受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター1(ENT1)を介したアデノシン細胞内取込みによってもたらされることを見出した。本研究では、ENT1を介したアデノシン取込みによる神経幹細胞の増殖抑制の分子基盤を明らかにするとともに、ENT1を介したアデノシンの細胞内取込みと増殖抑制が、脳内のニューロン新生においてどのような役割を果たしているのかを探ることを目的とした。平成22年度は次の2つの項目について検討を行い、下記のような成果を得た。1)マウス海馬由来の神経幹細胞におけるENT1の発現解析および活性調節機構の解析マウス海馬から神経幹細胞を調整し、増殖条件および分化条件下におけるENT1ならびにENT2、ENT3、ENT4のmRNA発現を解析したところ、ENT1は未分化状態で多く発現し、分化に伴い、その発現は低下した。一方、ENT2-4は未分化状態ではほとんど発現せず、分化に伴い、その発現が上昇した。^3H-アデノシン取込みを指標にしてトランスポーター活性を調べたところ、未分化な神経幹細胞におけるENT1特異的なアデノシン取込みが明らかになった。2)ENT1を介したアデノシン取込みによる神経幹細胞増殖抑制の分子機構の解明野生型およびENT1遺伝子欠損マウスより神経幹細胞を培養し、アデノシンの増殖抑制効果を調べたところ、アデノシン取込み活性は欠損マウスで弱く、またENT1(-/-)神経幹細胞はアデノシンによる増殖抑制に耐性を示した。また、薬理学的・生化学的解析により細胞内に取り込まれたアデノシンは、アデノシンキナーゼによってアデノシン-1-リン酸(AMP)に代謝された後、ピリミジンde novo合成経路を抑制して増殖を阻害していることが明らかとなった。我々はニューロン新生を担う神経幹細胞の増殖能がアデノシンによって抑制的に調節され、これはアデノシントランスポーターの一種である受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター1(Equilibrative nucleoside transporter 1; ENT1)を介したアデノシン細胞内取込みによってもたらされることを見出した。そこで本研究では、ENT1を介したアデノシン取込みによる神経幹細胞の増殖抑制の分子基盤を明らかにするとともに、ENT1を介したアデノシンの細胞内取込みと増殖抑制が、脳内のニューロン新生において生理的および病態生理的にどのような役割を果たしているのかをENT1遺伝子欠損マウスを用いて探ることを目的とした。この目的を達成するために次の3つの項目について検討を行い、次のような成果を得た。1)マウス海馬由来の神経幹細胞におけるENT1の発現解析および活性調節機構の解析マウス海馬から神経幹細胞を調整し、増殖条件および分化条件下におけるENT1ならびにENT2、ENT3、ENT4のmRNA発現を解析したところ、ENT2-4は未分化状態ではほとんど発現せず、分化に伴い、その発現が上昇するのに対し、ENT1は未分化状態で多く発現し、分化に伴い、その発現は低下した。さらに、ENT1欠損マウス由来の神経幹細胞において、アデノシンの増殖阻害曲線は右方シフトしており、アデノシン耐性であることがわかった。さらに、^3H-アデノシン取込みを指標にしてトランスポーター活性を調べたところ、未分化な神経幹細胞におけるENT1特異的なアデノシン取込みが明らかになった。2)ENT1を介したアデノシン取込みによる神経幹細胞増殖抑制の分子機構の解明薬理学的・生化学的解析により細胞内に取り込まれたアデノシンは、アデノシンキナーゼによってアデノシン-1-リン酸(AMP)に代謝された後、ピリミジンde novo合成経路を抑制して増殖を阻害していることが明らかとなった。一方、高い細胞内AMP/ATP比で活性化されるAMP依存性キナーゼはアデノシン処理で活性化されるもののアデノシンによる増殖抑制には関与していないことが明らかになった。3)生体内のニューロン新生におけるENT1を介した増殖抑制の役割の解明脳内でアデノシンレベルの上昇する睡眠剥奪はマウスの海馬神経幹細胞の増殖を阻害することがBrdU免疫染色法によって観察された。