hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
咀嚼による脳内神経伝達物質の活性化発現機序に関する神経内分泌学的研究

本研究によって得られた知見を以下に示す。咀嚼がラット学習能力に与える影響について実験を行い、考察を加えた。(1)通常の固形飼料で飼育したラット(以下、固形飼料ラット)、液体栄養で飼育したラット(以下、液体飼料ラット)、頚静脈にカニューレを挿入し頚静脈に高カロリー輸液を送り飼育したラット(以下、頚静脈ラット)および胃にカニューレを挿入し胃に液体栄養を送り飼育したラット(以下、胃ラット)でHebb and Williams迷路学習法を行ったところ、固形飼料ラットは液体飼料ラットより有意に錯誤回数が少なかった。また、液体飼料ラットは頚静脈ラット、胃ラットより有意に錯誤回数が少なかった。頚静脈ラットと胃ラットの錯誤回数に有意差はなかった。(2)上記と同様の4群のラット視床下部(室傍核、弓状核)のニューロペプタイドY(以下、NPY)濃度を測定したところ、固形飼料ラットは液体飼料ラットより有意にNPY濃度が高かった。また、液体飼料ラットは頚静脈ラット、胃ラットより有意にNPY濃度が高かった。頚静脈ラットと胃ラットのNPY濃度に有意差はなかった。以上(1)(2)の結果より、口腔から栄養を摂取することは、ラットの学習能力の発達にとって重要であり、さらに口腔から摂取する場合も、咀嚼の有無が学習能力にとって重要であることが示唆された。また、このメカニズムには脳内神経伝達物質NPYが関与していることが示唆された。現在までに得られた知見を以下に示す。(1)通常のラット(コントロール)・無歯顎ラットの2群に分け、迷路学習実験を行うことにより、咀嚼がラット学習能力に与える影響について調べたところ、コントロールに比較して、無歯顎ラットは有意に学習能力が劣っていた。(2)上記2群のラットに分け、視床下部のニューロベプタイドY濃度(記憶に関与することで知られる脳内神経伝達物質である。)を測定し、咀嚼が脳内神経伝達物質に与える影響について調べた。その結果、コントロールに比較して無歯顎ラットは有意に視床下部ニューロペプタイドY濃度が低かった。(3)直接餌を与えず、胃にカニューレを挿入し、高カロリー栄養輸液を与えたラットは、コントロールに比較して、迷路学習実験において有意に学習能力が劣っていた。しかし上記の実験を進めていくにあたり、以下の問題点が存在することがわかってきた。(1)迷路実験の再現性に疑問が残る。迷路実験の結果はその動物の性格・くせに大きく影響され、運動能力の高い動物は良い結果を出しやすい傾向がある。(2)通常のラットと無歯顎ラットでは栄養状態が異なり、その違いが運動能力の差を生じ、結果的に迷路実験で異なった成績を出す可能性があり、迷路実験の結果の解釈には注意を要する。(3)迷路実験では、学習後の記憶の強さ(どのくらい記憶が持続するか)を評価しにくい。以上の研究成果と問題点をふまえ、時間生物学を応用した新しい方法を次年度に開発したい。生体リズムにおける「同調」と「フリーラン」という概念はそれぞれ「学習」と「記憶」に対応する、という考え方は時間生物学において定説となっている。時間生物学的な考え方を学習・記憶効果の評価方法として応用することにより、上記3点の問題点を解消できると研究代表者は考えている。(1)通常の固形飼料で飼育したラット(以下、固形飼料ラット)、液体栄養で飼育したラット(以下,液体飼料ラット)、頚静脈にカニューレを挿入し頚静脈に高カロリー輪液を送り飼育したラット(以下頚静脈ラット)および胃にカニューレを挿入し胃に液体栄養を送り飼育したラット(以下、胃ラット)でHebb and Williams迷路学習法を行ったところ,固形飼料ラットは液体飼料ラットより有意に錯誤回数が少なかった。

2)上記と同様の4群のラット視床下部(室傍核、弓状核)のニューロペプタイドY(以下、NPY)濃度を測定したところ、固形飼料ラットは液体飼料ラットより有意にNPY濃度が高かった。また、液体飼料ラットは頚静脈ラット、胃ラットより有意にNPY濃度が高かった。頚静脈ラットと胃ラットのNPY濃度に有意差はなかった。以上(1)(2)の結果より、口腔から栄養を摂取することは、ラットの学習能力の発達にとって重要であり、さらに口腔から摂取する場合も、咀嚼の有無が学習能力にとって重要であることが示唆された。このメカニズムには脳内神経伝達物質NPYが関与していることが示唆された。
顎顔面形態形成における高分子非コードＲＮＡ：Ｅｖｆ２の機能とその分子基盤の解明

我々は、エンドセリン-1(ET-1)/ET-A受容体(ETAR/Ednra)シグナルが第1鰓弓では下顎のアイデンティティーを決定することを示してきたが、下顎の上顎化が見られるEdnra-/-にEvf2を発現させると、下顎歯槽骨遠位部と切歯の低形成が増強した。これは、Ednra-/-で僅かに残存していたHAND2の発現消失に起因していると考えられた。また、ET-1/ETARシグナルの主要な核転写因子でHAND2の発現に関わるDlx5/6、Dlx5/6のエンハンサー、Evf2は相互にポジティブフィードバックループを形成していることをin vivo, in vitroで示した。その作用メカニズムの一つとして、mI56iエンハンサーの一部のCpGのメチル化が関与している可能性が示唆された。さらに鰓弓のマイクロアレイの結果からパラスペックル蛋白のPSPC1に注目した。PSPC1はEvf2と複合体を形成することができ、in vitroではDlx5/6のエンハンサーを介して転写活性に作用し、強制発現系においてEvf2がパラスペックルの局在を変化させることを見いだした。これらによりEvf2が生体内でも、核内でパラスペックル蛋白に直接または間接的に結合して、転写調節などの機能に関与する可能性が示唆された。また、ETARevf2/-;Dlx5/6+/-のダブルへテロマウスが、予想に反して新生児期に呼吸不全にて死亡することを見いだした。病態的組織学的には新生児呼吸窮迫症候群様であり、サーファクタント蛋白やサーファクタント脂質の産生•分泌とETAR/Dlx5Dlx6/Evf2の関係を検索中である。Evf2は、生体においては正常発生•発達においては顕著な作用が見られないにもかかわらず、異常発生•病態時に作用が検出された。これはlong noncoding RNAの性質の一面を示唆するものと考えた。25年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまで、エンドセリン-1(ET-1)がET-A受容体(ETAR)を介して、頭頚部の形態形成において神経堤細胞の運命決定を制御する因子として働き、特に第1鰓弓では下顎のアイデンティティーを決定することを、マウス発生工学的研究によって示してきた。本研究課題では、noncoding RNAのEvf2が、ET-1/ETARシグナルに関わる分子基盤の解明を目的とした。核転写因子Dlx5,Dlx6は、顎顔面形成においてET-1/ETARシグナル下に存在するが、Evf2はこのDlx5,Dlx6のエンハンサーであるmI56i領域に作用して発現を亢進させることをEvf2ノックインマウスの鰓弓とP19細胞を用いて示すことができた。同様の系で、Evf2は核転写因子HAND2に対して抑制的に働くことを示したが、これはEvf2KIマウスで、ETARKOマウスに比べさらに下顎の切歯が低形成になった原因と考えられた。また、野生型(WT)、ETARKO、Evf2KIの鰓弓のマイクロアレイを用いてEvf2に関わる新たな因子をスクリーニングし、パラスペックル蛋白のPSPC1に着目した。過剰発現の細胞系で、PSPC1蛋白とEvf2 mRNAは核内で一部重なる、または接する状態を呈していたため、Evf2と複合体を形成していることが既に知られているDlx蛋白群とPSPC1との関係を免疫沈降法にて検討したところ、3者が複合体を形成している可能性が示唆された。

また、Evf2によるエピジェネティック修飾に関しては、mI56iエンハンサーのDNAメチル化はWTとETARKOの鰓弓で変化がなかったため、ヒストン修飾を検討しているが、10.5日胚の鰓弓のみのChIP assayの系を立ち上げることができ、現在解析中である。下顎の形態形成に必要な因子に対するEvf2の調節に関しては、Evf2とDlx5、Dlx6、HAND2の関係をin vivo、in vitroでの検討し、最終的なデータをまとめることができ、現在投稿準備中である。また、Evf2による遺伝子発現調節の分子メカニズムにおいては、Dlx2のみならずDlx5,Dlx6とEvf2が協調してエンハンサーに作用している傍証が得られているので、次はRNA pull-downの系をさらに調整して非特異的な反応をできるだけ抑え、RNAと蛋白の直接結合の有無をはっきりさせる必要がある。Evf2によるエピジェネティック修飾に関しては、10.5日胚の鰓弓のみのChIP assayは、培養細胞と違い細胞数に限りがあるので困難を伴ったが、assay系を立ち上げることができ、現在解析中である。さらに、PSPC1蛋白とEvf2とのエンハンサーに対する協調作用が見られつつあるが、パラスペックルは転写やRNAプロセッシングに関わる蛋白が局在していると考えられるので、Evf2の作用機序として転写に関わる研究の一つの方向性を示すことができた。Evf2がDlx5やDlx6とエンハンサーを介して遺伝子発現調節に関わっていることが示されたので、PSPC1を含めたさらなる分子メカニズムを明らかにしていく。また、プロモーター領域に対する作用についても、詳細にLuciferase assayを重ねた上で、転写開始複合体の一部に組み込まれているか検討したい。一方、Evf2とDlx5,Dlx6の関係をin vivoで検討している中で、偶然にEvf2KIヘテロかつDlx5/6KOヘテロのマウスが生後1ー2日で肺の異常(または腸管の異常)で死亡することを見いだした。この要因として、Dlx5/6 +/-, ETAR+/-, Evf2異所性発現の3要因があるのでEvf2の貢献度を慎重に見極めつつ、Evf2の生体内での作用を検討していく。25年度が最終年度であるため、記入しない。
多機能計測と細胞機能操作による視交叉上核の光同調メカニズムの解明

哺乳類の概日リズムの中枢は脳の視床下部にある視交叉上核に存在し、網膜より直接の神経投射を受け、外界の光環境情報を統合し、最終的に睡眠/覚醒などの24時間の生理機能を制御する。概日リズム中枢は、自律振動と光同調の機能を持つ事が必須条件である。これ迄の申請者の光計測により、細胞内カルシウムや膜電位の概日リズムを可視化することで、神経回路レベルでの概日リズムの自律振動の仕組みを解明してきた。さらに本年度は、視交叉上核の主な出力投射先である室傍核と傍室傍核領域に細胞内カルシウムのウルトラディアンリズムを報告した。このように概日リズムおよびウルトラディアンの自律振動メカニズムが明らかになってきた一方で、生理機能を外界環境に同調させる光同調の仕組みの多くは未だ不明である。本研究課題では特に、光計測により神経活動や概日リズム変動を捉えつつ、視交叉上核の神経回路に摂動を与え、光同調の仕組みを解明することを目的に研究を行っている。本年度は特に、マウス生体内の脳深部からの光計測と細胞機能の操作を行うための要素技術の確立を目指して基礎的な条件検討を行った。まず成獣マウスの脳深部に遺伝子コード型カルシウムセンサーを組み込んだアデノ随伴ウイルスを感染・発現させる最適な方法(尾静脈注射と頭蓋内注射)を検討した。次にマウスの頭部に装着可能な小型LED、CMOSセンサー、GRINレンズなどからなる小型顕微鏡を作成して動作の確認を行った。また防音/遮光/換気の機能が備わった簡易型アイソレーションキャビネットを設計し、赤外線センサーによるマウス自発行動の自動測定システムを構築して動作確認を行った。前年度までに、培養スライスでの実験系において細胞種特異的に蛍光センサーおよび光遺伝学ツールを発現させ、光により細胞機能の計測/操作が可能な実験系を構築した。さらに本年度は、マウス成獣の生体内からの計測と制御を行うための基盤技術の確立を目指して実験条件の最適化を行った。構築した小型顕微鏡は正常に作動したものの、数日週に渡る長期計測を行うためには顕微鏡本体の耐久性や安定性の大幅な向上と、測定プログラムの改良が必要である。また脳深部の目的領域のみにアデノ随伴ウイルスを感染させる必要があるが、成功率が未だ低いために更なる実験技術の向上が必要である。生体内計測と細胞操作の研究は海外の有力ラボも精力的に進めていることから、戦略的に研究を進めて行く必要がある。in vitro、in vivoの実験条件をさらに最適化して、長期間の実験が可能な実験系の耐久性/安定性の向上を目指す。さらに本研究提案を基盤とした海外ラボとの共同研究提案(国際共同研究強化(A))とも連携して研究を戦略的に進めて行く。哺乳類の概日リズムの中枢は脳の視交叉上核に存在し、網膜より直接の神経投射を受け、外界の光環境情報を統合し、最終的に睡眠/覚醒などの24時間の生理機能を制御する。概日リズム中枢は[自律振動]と[光同調]の機能を持つ事が必須条件として知られる。これ迄の申請者の光計測により、時計遺伝子発現/細胞内カルシウム/膜電位の概日リズムを可視化することで、神経回路レベルでの[自律振動]の仕組みを解明してきた。しかし生理機能を外界環境に同調させる[光同調]の仕組みの多くは不明である。本研究課題では、光受容タンパク質を用いて細胞内機能を時空間的に自在に制御し、培養組織上で光入力を再現し、光計測により神経活動や概日リズム変動を捉え、視交叉上核の神経回路での光同調の仕組みを解明することを目的に研究を行っている。生後5日齢の仔マウスより視交叉上核スライス切片を作成し、培養後7日後にアデノ随伴ウイルス溶液をスライス上に添加し、遺伝子コード型カルシウムプローブおよび光受容タンパク質を感染発現させた。十分量のタンパク質の発現が見られる感染後10ー14日後より、ニポウディスク共焦点と高感度CCDカメラからなるタイムラプスシステムにて光計測を試みた。特にCre-LoxP細胞特異的遺伝子組み換え法を用いて、視交叉上核の神経回路の網膜投射領域に光受容タンパク質を感染発現させることを試み、細胞種限定的な発現が可能であること、また光照射により細胞内カルシウム濃度の制御が可能であることを確認した。アデノ随伴ウイルスによる光受容タンパク質の発現法を確立し、視交叉上核の神経回路の網膜投射領域に光受容タンパク質を発現させた。また光照射により細胞内カルシウム濃度の制御が可能であることを確認した。初年度の主たる目的を達成することが出来た為、概ね順調と判断した。

本研究課題では特に、光計測により神経活動や概日リズム変動を捉えつつ、視交叉上核の神経回路に摂動を与え、光同調の仕組みを解明することを目的に研究を行っている。本年度は特に、マウス生体内の脳深部からの光計測と細胞機能の操作を行うための要素技術の確立を目指して基礎的な条件検討を行った。まず成獣マウスの脳深部に遺伝子コード型カルシウムセンサーを組み込んだアデノ随伴ウイルスを感染・発現させる最適な方法(尾静脈注射と頭蓋内注射)を検討した。次にマウスの頭部に装着可能な小型LED、CMOSセンサー、GRINレンズなどからなる小型顕微鏡を作成して動作の確認を行った。また防音/遮光/換気の機能が備わった簡易型アイソレーションキャビネットを設計し、赤外線センサーによるマウス自発行動の自動測定システムを構築して動作確認を行った。前年度までに、培養スライスでの実験系において細胞種特異的に蛍光センサーおよび光遺伝学ツールを発現させ、光により細胞機能の計測/操作が可能な実験系を構築した。さらに本年度は、マウス成獣の生体内からの計測と制御を行うための基盤技術の確立を目指して実験条件の最適化を行った。構築した小型顕微鏡は正常に作動したものの、数日週に渡る長期計測を行うためには顕微鏡本体の耐久性や安定性の大幅な向上と、測定プログラムの改良が必要である。また脳深部の目的領域のみにアデノ随伴ウイルスを感染させる必要があるが、成功率が未だ低いために更なる実験技術の向上が必要である。生体内計測と細胞操作の研究は海外の有力ラボも精力的に進めていることから、戦略的に研究を進めて行く必要がある。細胞内カルシウムの光イメージング計測により、網膜投射部位であるVIP細胞に光受容タンンパク質を発現させ、光照射によりカルシウム変化を捉え、他の領域の細胞への波及効果を観察する。特にVIP細胞は、視交叉上核神経回路内ではアルギニンバソプレッシン産生細胞[AVP細胞]に軸索投射を伸ばし、さらに視交叉上核の領域外[室傍核、傍室傍核]へと神経投射して、睡眠覚醒や体温調節などの中枢領域へと情報が伝搬すると考えられている。特に、視交叉上核神経回路内での情報伝搬の様子を詳細に捉えることを試みる。in vitro、in vivoの実験条件をさらに最適化して、長期間の実験が可能な実験系の耐久性/安定性の向上を目指す。さらに本研究提案を基盤とした海外ラボとの共同研究提案(国際共同研究強化(A))とも連携して研究を戦略的に進めて行く。経費節約により生じた未使用額は、研究を加速する為の動物購入経費、飼育経費、論文出版に関する費用に支出する。経費節約により未使用額が生じた。研究を加速する為の動物購入経費、飼育経費、論文出版に関する費用に支出する。
揮発性麻酔薬のターゲットとしてのカリウムチャネルとその分子機構

Kチャネルの共通部分のみを持つチャネルを対象とした。KcsAチャネル1分子電流記録から、酸性pHでほぼ100%の開口率であり、pKa5.2、Hill係数2.2であった。さらに、pH4.0,5.25,5.5の開時間と閉時間を解析した。開時間は1成分あり、pHによる変化はなかった。閉時間は3成分あり、pHが高くなるにつれて遅い成分が増えた。次に、揮発性麻酔薬を用いた脂質平面膜法の確立を試みた。脂質平面膜にKチャネルを埋め込み、電流記録を行った後、アクリル板で完全に密閉できた。1)揮発性麻酔薬を用いた脂質平面膜測定法の確立揮発性麻酔薬を使用する前に、2,2,2-トリフルオロエタノール(以下TFE)を投与し、その効果を明らかにした。TFEは、CF3基を有する最も単純なアルコールで、液体の状態で存在しており、揮発性麻酔薬の重要な原料である。揮発性麻酔薬を投与する前のカリウムチャネルの開口率は、1%以下であった。TFEを濃度依存性に投与していくと、1%TFE投与では、カリウムチャネルの開口率は1%以下であったが、2%TFE投与では、カリウムチャネルの開口率は約10%、3%TFE投与では、カリウムチャネルの開口率は約60%であった。この結果から、TFE濃度依存性にカリウムチャネルを活性化させることを明らかにした。これは、静止膜電位を安定化させ、麻酔作用を引き起こすことにつながる。さらにTFEはチャネル分子への直接作用ではなく、リン脂質に溶け込んでチャネルを開口させていることも分かった。この結果を基に、実際に脂質平面膜上で揮発性麻酔薬をカリウムチャネルに結合させる方法を試みた。まずは、脂質平面膜にカリウムチャネルを埋め込み、カリウムチャネルの電流記録ができることを確認した。テフロンチェンバーを覆うことができる、透明のアクリル板を作成し、それをかぶせた。あらかじめ穴をあけてホースを通したところから揮発性麻酔薬を投与した。水中ガス測定モニターを用いて、揮発性麻酔薬の濃度を測定できた。<脂質平面膜における単一チャネル電流記録と解析>カリウムチャネルには2種類のゲート(フィルタゲートとへリックスゲート)が直列に存在し、単一チャネル電流記録でみるゲーティング現象はどちらのゲートで起こっている現象かわからないため、片方のゲートを開放して、もう片方のゲートの開閉を観察するため、KcsAカリウムチャネルのフィルタゲートが開いたまま固定されている変異体であるE71AKcsAカリウムチャネルを作成した。E71A変異体では、フィルターが開いたままで固定されるため、ゲートのpHによる変化を電流記録し、解析した。酸性では(pH3-4)、開確率はほぼ100%であった。pHが5付近では開確率は50%となり、pH7.5では開確率は0%であった。(pKa=5.5,Hill係数2.2)単一チャネル電流記録から解析した開時間のヒストグラムと閉時間のヒストグラムから時定数を求めた。pH4.0では開時間は398ms、閉時間は0.3ms,1.78ms,31msであった。pH5.25では開時間は281ms、閉時間は0.16ms,50ms,562msであった。pH4.0では開時間は339ms、閉時間は0.25ms,15.8ms,1259msであった。これは、pHを上昇させていくと、開こうとする時間はゆっくりした成分が存在していることが分かった。変異体の作成と、その変異体を用いた単一チャネル電流記録とゲートの解析についてはほぼできている。今後は、この解析を基に、実際に麻酔薬を投与し、カリウムチャネルのゲートの挙動について検討したい。まずは、脂質平面膜に静脈麻酔薬を濃度を変化させて投与し、それらがゲートの挙動に影響するか観察する。そのためには、細胞外側からなのか、細胞質側からなのかを判断するためにも細胞外と細胞質側からそれぞれ麻酔薬を投与してみる。それから濃度を変化させて、ゲートの挙動を明らかにする。その後、揮発性麻酔薬を用いて、濃度を変化させてゲート挙動を明らかにする。脂質平面膜法で使用する、ガラス(50-100μmの穴を開けたもの)の購入や、カリウムチャンネルタンパク質を作成するための遺伝子工学試薬・培地類の購入に研究費を使用する予定である。
ウエルシュ菌産生壊死毒素（NetB）による鶏壊死性腸炎発症メカニズムの解明

昨年度から引き続き、ウエルシュ菌による鶏クロストリジウム・パーフリンゲンス感染症(鶏壊死性腸炎)の病原因子であるNetBの細胞致死活性に影響する感受性細胞側分子の特定を行った。NetBは鶏由来細胞にのみ毒性を発揮するため、NetB感受性細胞である鶏肝癌由来細胞(LMH)の細胞膜分子に対するモノクローナル抗体の作製およびLC-MS解析することにより、NetBの毒性発現に関わる感受性細胞側分子の特定を試みた。LMH細胞膜を免疫したマウス脾臓細胞を用いて常法によりハイブリドーマを作製した。NetBの細胞致死活性を抑制するモノクローナル抗体2株を得た。これらモノクローナル抗体とLMH細胞膜をウエスタンブロッティングにより反応させたところいずれも90 kDa付近に特異的なバンドが検出された。そこで、この分子をNetB細胞致死活性に関連する分子と判断し、外部機関のLC-MS/MSデータベースにより解析を行った。解析の結果、上位にヒットした分子より細胞膜上に存在すると考えられる分子を選別した。選別した分子は、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質大サブユニットおよびニワトリトランスフェリン受容体タンパク質の2分子であった。選択した2分子が鳥類細胞に特異的に発現する分子であるかを調べるため、ホモロジー検索により鳥類と哺乳動物間におけるアミノ酸配列の比較を行った。その結果、トランスフェリン受容体タンパク質において、鳥類と各種哺乳類間での相同性がより低い結果となった、トランスフェリン受容体は小腸で発現しており、NetBが病原性を発現する臓器であることから、鶏トランスフェリン受容体はNetBの細胞致死活性に関わる分子である可能性が示唆された。1.NetB受容体の特定NetBに対する唯一の感受性細胞であるニワトリ肝癌由来LMH細胞をマウスに免疫し、抗LMH細胞抗体を作製した。免疫蛍光染色により抗LMH細胞はLMH細胞膜との強い結合が確認されたが、非感受性細胞であるイヌ由来MDCK細胞およびサル由来Vero細胞に対する反応は確認されなかった。さらに、抗LMH細胞抗体はNetBのLMH細胞に対する細胞致死活性を有意に阻害した。以上の結果からNetBの毒素活性における種特異性は細胞への結合能に関連しており、ニワトリにおいて特異的に発現している細胞膜上の分子が受容体である可能性が示唆された。NetBに対する受容体を特定するためにNetBと反応させたLMH細胞を可溶化後、抗NetB抗体で免疫沈降した。可溶化分画を二次元電気泳動により展開後、銀染色しNetBと反応させていないLMH細胞の免疫沈降パターンと出現したスポットを比較した。複数のスポットがNetBと反応した場合にのみ検出された。そのスポットについて液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)を用いて解析し、分子の特定を試みた。解析データをデータベースと照合した結果、該当する分子は特定されなかった。2.オリゴマー形成から細胞致死に関わる細胞側分子の役割NetBの結合やオリゴマー形成への細胞膜上のコレステロールの関与を解析するため、LMH細胞をメチルーβーシクロデキストリンで処理し、細胞膜上のコレステロールを除去した。Triton X-114で可溶化し、ショ糖密度勾配超遠心にて分画後、抗NetB抗体を用いてイムノブロッティングを行った。その結果、NetBのモノマー分子とオリゴマー分子は同一画分に存在していた。結果、細胞膜上のコレステロールはNetBのオリゴマー形成には関与しないことが明らかとなった。ほ乳類由来細胞株に対してNetBの結合が確認されなかったことは、NetBの細胞致死活性や赤血球溶血活性でみられる結果と一致した。したがって、NetBの毒素活性が有する鳥類に限定した高い種特異性は細胞に結合する際の受容体分子に依存していることが明らかとなった。NetBと結合するLMH細胞上の分子は免疫沈降と二次元電気泳動により数種類の分子まで絞り込むことができたが、LC/MS解析では明らかにすることができなかった。この理由として、LC/MSのデータベースにおいて登録されている鳥類(ニワトリ)由来分子はヒトやマウスなどの実験動物由来分子に比べてかなり少ないのが現状であり、今回の解析結果がデータベース上に登録されていない分子のものである可能性が考えられる。孔形成毒素の中にはコレステロールを受容体とするものやコレステロールと相互作用してラフト領域でオリゴマーを形成する毒素が多数存在する。今回の研究において、NetBはコレステロールの関与なしに細胞に結合し、さらに非ラフト領域でオリゴマーを形成した。これらの結果からNetBは標的細胞への結合からオリゴマー形成までの一連の分子動態を細胞膜のコレステロールの関与なしに、一貫して非ラフト領域でたどることが明らかとなった。昨年度実施した二次元電気泳動およびLC-MSによるNetBの細胞致死活性に影響する感受性細胞側分子の特定においてLC-MSデータベース上に該当する分子が存在しなかった。この理由として、LC-MSデータベース上に鳥類とりわけニワトリに関するデータが非常に少ないことが考えられる。LMH細胞をマウスに免疫して得られた抗体がNetBの細胞致死活性を阻害することから、抗体中にはNetB受容体あるいはNetBの細胞致死作用を阻害する細胞側分子を認識する抗体が含まれていることを示している。そこで、今年度はLMC細胞あるいはLMH細胞膜をマウスに免疫することにより、NetBの細胞致死活性を阻害するモノクローナル抗体を作製し、その抗体を用いて特定分子を単離することを試みた。

LMH細胞単体またはLMH細胞膜を免疫原としてマウスに56回免疫後、脾臓細胞から抽出したリンパ球を用いて常法によりハイブリドーマを作製した。スクリーニングはLMH細胞膜を固相化したELISA法および単層培養したLMH細胞にハイブリドーマ培養上清を反応後、NetBを添加し、致死活性をMTT法により測定した。LMH細胞膜と反応し、さらにNetBの細胞致死活性が減少したクローンを選別した。3回限界希釈法によるクローニングが終了した6クローンについてウエスタンブロッティングにより細胞膜上の反応分子を調べた結果、1クローンについて特異的分子を検出することができた。さらに、現在、陽性ハイブリドーマを作製している。細胞膜上のセラミドはスフィンゴミエリナーゼの代謝更新によって細胞膜上に蓄積する脂質である。スフィンゴミエリナーゼの作用を阻害する阻害剤であるGW4869を用いてセラミドのNetB細胞致死活性への関与について解析した。その結果、阻害剤添加によりNetBの細胞致死活性の減少が確認された。NetBの細胞致死活性を抑制するモノクローナル抗体を得るために3回細胞融合を実施し、3回目にようやく陽性クローンを得ることができた。分子の特定については現在、ウエスタンブロッティングによりバンドの検出が可能なモノクローナル抗体は1クローンに限られている。ウエスタンブロッティングにより特異分子と反応する複数のモノクローナル抗体を得なければ目的の分子特定には至らないと考えている。したがって、さらに陽性クローンを得る必要がある。オリゴマー形成から細胞致死に関わる細胞側分子の役割については、LMH細胞膜上のセラミドがNetBの細胞致死作用に関与していることを証明したが、どのように関与しているのかを証明するまでに至らなかった。オリゴマー形成あるいは孔形成のいずれの段階にセラミドが関与しているのかを解析する必要がある。昨年度から引き続き、ウエルシュ菌による鶏クロストリジウム・パーフリンゲンス感染症(鶏壊死性腸炎)の病原因子であるNetBの細胞致死活性に影響する感受性細胞側分子の特定を行った。NetBは鶏由来細胞にのみ毒性を発揮するため、NetB感受性細胞である鶏肝癌由来細胞(LMH)の細胞膜分子に対するモノクローナル抗体の作製およびLC-MS解析することにより、NetBの毒性発現に関わる感受性細胞側分子の特定を試みた。LMH細胞膜を免疫したマウス脾臓細胞を用いて常法によりハイブリドーマを作製した。NetBの細胞致死活性を抑制するモノクローナル抗体2株を得た。これらモノクローナル抗体とLMH細胞膜をウエスタンブロッティングにより反応させたところいずれも90 kDa付近に特異的なバンドが検出された。そこで、この分子をNetB細胞致死活性に関連する分子と判断し、外部機関のLC-MS/MSデータベースにより解析を行った。解析の結果、上位にヒットした分子より細胞膜上に存在すると考えられる分子を選別した。選別した分子は、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質大サブユニットおよびニワトリトランスフェリン受容体タンパク質の2分子であった。選択した
自治体会計への企業会計的手法の導入の実態調査研究

近年、各自治体への企業会計手法の導入が進んでいるが、その実効性が疑問視される背景を、自治体による会計情報の公開の意義や、公開のインセンティブという観点から考察した。その結果、自治体会計改革の後発事例(他の先駆的自治体の後追い的に改革を行ったもの)は、自治体としての正当性確保のための同型化と解釈でき、先駆的事例では、よくいわれるような財政危機はなく、首長のリーダーシップが大きく影響していたことが明らかとなった近年、各自治体への企業会計手法の導入が進んでいるが、その実効性が疑問視される背景を、自治体による会計情報の公開の意義や、公開のインセンティブという観点から考察した。その結果、自治体会計改革の後発事例(他の先駆的自治体の後追い的に改革を行ったもの)は、自治体としての正当性確保のための同型化と解釈でき、先駆的事例では、よくいわれるような財政危機はなく、首長のリーダーシップが大きく影響していたことが明らかとなった近年、地方自治体の財政改革の一環として,企業会計方式の導入が数々の自治体において検討および実施されてきていることは周知のとおりである。国の内外を問わず、地方自治体が開示する財務情報の利用者として、市民や国民が想定されており、財務報告の目的として公的説明責任(につながる受託責任の明確化)が掲げられている。自治体が公的説明責任をはたすことによって、行政担当者に対する規律づけが期待されているのである。ところが、アメリカのように市民や国民が納税者としての立場を明確に意識して行政サービスの善し悪しに常に高い関心を寄せているような状況がないわが国においては、そのような規律づけが期待通りになされるとは考えにくいといわざるをえない。すなわち、行政担当者によるモラル・ハザードをコントロールする手段として、とりわけモニタリングの手段として自治体の財務報告が想定されているのであるが、わが国には納税者として声を上げるということが通常おこなわれていないために、財務報告がモニタリングのために用いられないという問題点をはらんでいるのである。このような納税者の意識を急激に変革することは容易ではないため、財務報告を用いたインセンティブ契約をおこないモラル・ハザードをコントロールすることを模索するほうがよいと考えられる。たとえば財務報告を用いたインセンティブ契約の例として、行政サービスの成果に連動した報酬制度・昇進制度を設計することがあげられる。総務省によれば,地方自治体による財務報告の目的として,意思決定に有用な情報の提供と公的説明責任とが措定されている。まず意思決定に有用な情報の提供について,第1の利用者として想定されている市民が投票の際に自治体の財務報告にもとづいて意思決定をおこなうという前提に問題なしとしない。まな,納税をもって,市民による資金提供とみなす点にも無理がある。また公的説明責任についても,総務省が想定するような行政コスト計算書では,コスト(インプット)情報を明らかにするにすぎず,説明の責任は果たしているものの受託した資源の効率的な利用についての説明は十分であるとは言い難い。さらには,市民は地方自治体に委託した資金の使途についてほとんど無関心であり,その使途について自治体にクレームをつけるということは通常考えにくく,たんに財務情報を公表するだけではパブリック・ガバナンスは期待できない。上述の問題にもかかわらず,近年,自治体において会計改革が積極的に進められてきている意義は何なのであろうか。この点を考察するのに有効な視点を与えてくれるのが,制度化パースペクティブである。すなわち,企業会計手法の導入は地方自治体にとって正当性の確保のための1つの手段なのである。会計手法を改革することによって,地方自治体は財政再建に積極的な姿勢を示し,健全な組織であると見なされようと努力しているのである。さらに,地方自治体の会計改革は強制的同型化とみなすことができる。多くの報告書や基準は総務省や内閣といった権威から分表されたものであり,地方自治体における会計改革は,これらの報告書や基準によって方向づけられているためである。そして,自治体が参考にすべきモデルとして公表された総務省方式は,企業会計手法の導入という方向性とは裏腹に複式簿記の導入を強制するものではなく,「分離」とみなすことが可能である。自治体会計改革の契機について, 1つの特徴として,自治体の長による強力なリーダーシップがあったことがあげられる。中には,営利企業での勤務経験のある者や,あるいは公認会計士試験の受験をめざした経験のある者が自治体の長となり,自治体会計の改革を強力に指示したという背景が伺える。もう1つ先駆的自治体に共通する特徴として,近年の多くの自治体における会計改革の背景には自治体の財政危機があるといわれているが,先駆的な自治体はむしろ財政の危機的な状況はなく,財政危機の打開が動機とはなっていなかったことがあげられる。また,誰に対する公開なのかという点では,意見が分かれたが,議会あるいは市民一般という意見が比較的多かった。ただし,議会に対する公開であっても市民一般に対する公開であっても,会計情報は多くの資料のなかの1つに過ぎず,会計情報が取り立てて注目されることはないようである。先駆的な自治体において企業会計手法を導入することによって,自治体経営にどのような変化が生じたかという点について,際立った変化を見出すことはできなかった。担当部署の職員は会計改革に積極的であっても,それが他の部署の職員にまで大きな変化を及ぼしたとか,あるいは市民(や県民)の関心をひきつけたといった事例は見られなかった。なかには担当部署の職員のコスト意識の改善に役立っているというところもあった。
視細胞死の機構の詳細な解明とその阻止

我々はゼブラフィッシュ視細胞変異体ovlを用いて、この変異体における視細胞死がフォトトランスダクションと関連すること、視細胞死のシグナルはトランデューシンの位置でアデニリルシクラーゼと連結し、下流の視細胞死のシグナルに伝播されることを示した。また、ヒトロドプシン変異体モデルを作成し、この系や色素変性モデルマウスにおいても同系が視細胞死に関連していることをしめし、この系が新たな治療ターゲットになることを示した。計画に基づき我々が開発した視細胞の強制発現系を用いて、ヒトロドプシンの各変異体、Q344X、P23H、G106R、G188R、K296E、T4R、N15S、L88P、S334Xのトランスジェニックゼブラフィッシュを得ている。このうちG106R以下は本邦において現有する網膜色素変性患者に認められる変異である(パーソナルコミュニケーション)これらの変異体の表現型を解析するとその重症度に差はあるものの、基本的には視細胞死を引き起こしていると考えられた。つまり、ヒト網膜色素変性のモデルとして来年度以降の研究に使用できると考えられた。またQ344Xに関しては、視細胞死が光感受性を示すこと、トランスデューシンの発現を抑制すると視細胞死を抑制できるが、ホスホジエステラーゼの発現を阻害しても視細胞死を抑制できないことより、以前より我々が検討してきた変異体ovlと同様の視細胞死のメカニズムが働いていると考えられた。現在、他の変異体でのこの系の関与を検討している。我々は視細胞死に小胞体ストレスが関与しているとの予想の元に小胞体ストレスを生体でモニターできる魚を開発した。これはXBP-1のスプライシングを利用し、小胞体ストレスがかかると上記スプライシングによりVenusの読み枠がずれVenusが発現されるというものである。これと開発したロドプシンQ344X、さらに、ENU誘導し細胞変異体であるovlを掛け合わせたが、残念ながらこれら変異体の視細胞において有意に小胞体ストレスが上昇しているという知見は得られなかった。これは、RT-PCRを用いたSite-Specifcスプライシングのモニターでも同様の結果であった。ヒトロドプシン変異体、Q344X, P23H, G106R, K296E, T4R, N15S, S344Xについて、ラインを得たうえ、その表現型解析を行った。まず、Rh1:EGFPトランスジェニックを掛け合わすことにより、桿体細胞を可視化し、その数を検討した。これにおいて、受精後二週間において視細胞の数は野生型にに比べ有意に減少していた。また、ヒト表現型において重症であるといわれているQ344X, S344Xにおいては他のラインに比して減少率が高く、ヒト表現型を良く再現していると考えられた(Q344Xにて64.9%の減少、p<0.01)。また、この現象はTUNEL解析によってアポトーシスによるものであることを確認している。つまり、これらトランスジェニックは野生型に比してTUNEL陽性細胞が外顆粒層のみで増加していた。また、ヒト野生型ロドプシンのトランスジェニック体ではこのような視細胞の数の減少や、TUNEL陽性細胞の増加は認めなかった。また、Q344Xにおいて、野生型において視細胞死を引き起こさない通常の光刺激を遮断すると、視細胞死は有意に減少した。また、フォトトランスダクションの構成分子であるトランスデューシンを発現抑制すると視細胞死は抑制されたが、次の段階のフォスフォジエステラーゼを発現抑制しても視細胞死は抑制されず、むしろ増強した。したがって、この視細胞死のシグナルがトランスデューシンの位置を通過していることが示された本年度においては昨年度において作成したヒトロドプシン変異体トランスジェニック魚、Q344X,P23H、K296E,T4R,N15S,S344Xについて詳細な表現型解析を行った。これによれば、これらの魚は誕生後早いものでは5日目ごろより視細胞の減少を認め、これはTUNEL解析よりアポトーシスによるものであった。これより、これらのトランスジェニック体はヒト網膜色素変性のモデルとして使用できると考えられる。また、ヒト表現型と同じくQ344X,S344XなどClass Iに属する変異では表現型が深刻で、欧米に多いClass IIに属する。P23Hでは表現型が軽いことが確認できた。また、S344X,Q344XをもちいてTcris薬剤セットをもちいてスクリーニングを行っている。また、これらの魚においては臨床的にも効果が議論されているビタミンA,Eなどの薬剤は視細胞死の阻止に影響を与えなかった。計画書に記載している新たなレポーターについてはロッド細胞に強制発現させたが、残念ながら、容易に検出できる系では検出限界以下でハイスループットスクリーニングには使用できないと判断した。また、これらの強制発現型の開発により、視細胞において容易に外来遺伝子を発現させることが可能となり、この系をもちいて、異所性フォトトランスダクションと視細胞死の関連について検討を行った。

特に本来外節に発現のないアデニルシクラーゼを視細胞において外節に強制発現させることによりアデニルシクラーゼの異所性発現が視細胞死を促進することを証明し、学術雑誌に掲載された。
分子集合体の高次組織と機能の研究とその推進

物質としての最少単位である分子の集合状態に着目して、そこに全く新しい構造・物性・更に反応特性を見出さんとして計画立案し、3ヶ年にわたって実行した特定研究である。その成果は、本特定研究を実行したものとして満足すべき成果をあげ得た。多くのすぐれた業績の中から代表例を選び、各班について列挙すれば下記の通りである。(1)第一班に於ては、(BEDT-TTF)に代表される電子供与体の利用によって、有機超伝導体が確立され、その研究の中心に日本の研究集団を位置づけることが出来た。また、その構造の多様性から取扱いのむつかしいポリアセチレンの配向性向上の研究(液晶利用による)も次々世代に発展することを期待し得る。(2)第二班では、黒燐の層間化合物の作成の成功は特記に値し、また、グラファイト層間化合物(【KC_8】;Tc=0.151K,Rb【C_8】;Tc=0.026K)の正確な超伝導性の発見は、新しい超伝導体理論の出現を導くことが期待されるのみでなく、超低温(mK)化学の道を開くものと期待している。(3)第三班の包接化合物については、シクロデキストリン(CD)を中核とし、その化学修飾分子による各種包接化合物がつくられ、その包接空間の変化に応じて、その機能を調節できる正に分子設計のモデルを組あげ、この分野の世界の中心となる所まで成長させることが出来た。(4)第四班のミセル、累積膜層の研究は目をみはるものがある。中でも逆ミセル中の可溶化水中での酵素の活性を、その高次構造に結びつけて理解している研究、更に化学反応によってつくり出される磁性体(【Fe_3】【O_4】)の超微粒子は、磁性流体の出現を導いている。(5)第五班では理論、実験の合体をめざす本班に於ては、やはり"有機強磁性体への接近"を主張しなくてはならない。そして、その最も実現の可能性の高い研究とされてい。これらはいづれも、これから発展の道を加速されつつ進むと信じる。
アンダーソン型ヘテロポリ酸を用いたMo-V-M複合酸化物触媒の水熱合成と物質形成

アンダーソン型ヘテロポリモリブデン酸および硫酸バナジルを水熱合成して得られる結晶性Mo-V-M-O系複合酸化物触媒としてMo-V-Al-O、Mo-V-Ga-O、Mo-V-Sb-O、Mo-V-Te-Oが得られた。これらの触媒はいずれも針状結晶であるが、粉末X線回折の結果、針状結晶の軸方向には非常に類似した構造である一方、断面の結晶構造がAl,Ga型とSb,Te型の2つに大別できることが分かった。1.種々の試行によりAl,Ga型の構造をもつ触媒ではトリエチルアミン塩酸塩を水熱合成溶液に添加することにより、触媒結晶の結晶化を促進できることが見出された。2.低級アルカンの酸化反応これら各種Mo-V-M-O触媒についてエタンの酸化反応試みたところ、いずれの触媒も高活性を示したが、粉砕処理を施すことによりさらにエタン転化率が増加し、CO_x選択率の減少することが分かった。これは針状結晶断面が低級アルカンの部分酸化に有効な活性面であるためと考えられる。一方Al,Ga型とSb,Te型の2つのグループで比較すると、生成物分布に違いが見られた。反応温度340°においてMo-V-Al-O,Mo-V-Ga-Oでは7080%のエチレン選択率、410%の酢酸選択率を与えたのに対し、Mo-V-Sb-O,Mo-V-Te-Oでは約90%のエチレン選択率を示し、酢酸はほとんど得られなかった。このことから針状結晶断面の構造がエタン酸化反応に大きく影響していることが分かった。またトリエチルアミン塩酸塩の添加効果についてMo-V-Al-O触媒についてエタン酸化反応を行なったところ、更に酢酸選択率、エチレン選択率が向上することが分かり、針状結晶断面の結晶化により部分酸化に適した表面構造が形成されたと考えられる。ヘテロ元素としてAl,Cr,Fe,Co,Ni,Cu,Znなどを含んだAnderson型ヘテロポリ酸とVOSO_4の混合溶液を水熱合成することにより各種Mo-V-M複合酸化物を得た。さらにGa,Sb,Teを酸化物あるいは硫酸塩の形で(NH_4)_6Mo_7O_<24>溶液に反応させ、Anderson型ヘテロポリ酸を経由せずに、VOSO_4の混合溶液を加えて水熱合成し、Mo-V-M複合酸化物を得た。これらはいずれも暗紫色の固体であり、XRD分析により2θ=22°に鋭いピークを持つ結晶であった。ヘテロ元素あるいは添加金属元素Mについて、それ以外にシャープなピークを持つサンプルはまだ得られていないが、Al,Ga,Sb,Teについてはシャープなピークが現れるものを得ることが出来た。Al,Ga系では2θ=4.8,8.9°に特徴的な2本のピーク、そしてSb,Te系では2θ=6.5,7.8,9.0°に特徴的な3本のピークが現れ、ピークパターンとしては2種類に分類することが出来た。そこでMo-V-Al複合酸化物及びMo-V-Sb複合酸化物について、それぞれSEMを用いて分析したところ、いずれも針状結晶であり、これらの針状結晶を細かく見るといずれも更に細い針状結晶を束ねたような構造であることが分かった。これらの相違点としては、Mo-V-Al複合酸化物の針状結晶の側面は比較的凹凸の少ない曲面であるのに対し、Mo-V-Sb複合酸化物では、側面方向に板状結晶が張り出したような構造で、断面としてはかなり凹凸の大きな不定形となっていた。これらのことからMo-V-Al複合酸化物とMo-V-Sb複合酸化物は針状結晶の軸方向には類似した結晶性を持つが、軸に垂直な方向については異なる結晶性を持つと推測される。

またトリエチルアミン塩酸塩の添加効果についてMo-V-Al-O触媒についてエタン酸化反応を行なったところ、更に酢酸選択率、エチレン選択率が向上することが分かり、針状結晶断面の結晶化により部分酸化に適した表面構造が形成されたと考えられる。
縁起・地誌・俳書をめぐる天狗説話の享受と展開

本年は、これまで行ってきた中世期の天狗説話研究をふまえ、中世から近世へ展開する過渡期へ焦点をあて、ひろく怪異説話の展開に焦点をあてた基礎的研究を行った。愛宕山の寺社縁起とかかわって作られた古浄瑠璃「あたごの本地」本文の注釈を進め、考察を行った。本文は『古浄瑠璃正本集』所収本文を利用した。また戦国期の逸話とともに怪異譚を収録した『義残後覚』を対象とした研究会も発足し、中心的に活動した。天狗説話の受容、展開について、国立民族学博物館『月刊みんぱく』(2018年4月)に文章を発表、京阪神エルマガジン社『関西の神社をめぐる本』(2018年12月)に取材協力した。東アジア恠異学会第120回定例研究会(2018年11月10日)において口頭発表を行った。その他、同志社大学良心館コモンズカフェ(2019年1月16日)において講演を行った。古代、中世の怪異説話について「妖怪・怪異・異界ー中世説話集を事例にー」東アジア恠異学会編『怪異学の地平』(臨川書店、2018年12月)を発表した。また怪異説話と近世期の地誌、俳諧書との関連について「狐火伝承と誹諧」『朱』62(伏見稲荷大社宣揚部、2019年3月)を発表した。怪異説話にもとづいた絵巻の受容、展開について、2018年4月21日に国際日本文化研究センターにおいて、2019年3月6日から8日までチェスター・ビーティー・ライブラリィ(アイルランド、ダブリン)において、『大江山絵巻』その他の調査を行った。その成果として、2019年3月7日にチェスター・ビーティー・ライブラリィにおいて口頭発表を行った。また、「まんが訳酒天童子繪巻」「まんが訳道成寺縁起」の古典監修を担当し、現代語訳、解説を担当した。この成果はKADOKAWA運営のウェブ漫画コンテンツ『ComicWalker』に無料公開され、メディアにも多く取り上げられた。受け入れ機関である京都精華大学堤研究室を中心に研究会を開催し、芸能文化や宗教民族にかかわる様々な知見を得ることができた。またアイルランド・チェスター・ビーティー・ライブラリィへの調査研究など海外に所蔵される絵巻資料を視野に入れたひろい知見から研究を進めた。国際日本文化研究センターによる機関拠点型研究プロジェクト「大衆文化の通時的・国際的研究による新しい日本像の創出」にかかわり、研究成果を一般に公開した。今年度は近世期における天狗説話研究の基礎として、中世との過渡期に注目し、問題点を整理することができた。また天狗説話以外の怪異伝承、説話に注目することで、誹諧や絵巻などに展開する問題意識をひろく持ち、今後の研究計画に大きな指針を持った。地誌、俳諧書を用いた具体的な作業は今後も行う必要があり、次年度以降に継続する。今年度予定していたホノルルアカデミー・オブ・アーツ(アメリカ、ハワイ州)への調査は、日程調整のため実施できなかったため、次年度以降に計画したい。

国際日本文化研究センターによる機関拠点型研究プロジェクト「大衆文化の通時的・国際的研究による新しい日本像の創出」にかかわり、研究成果を一般に公開した。今年度は近世期における天狗説話研究の基礎として、中世との過渡期に注目し、問題点を整理することができた。また天狗説話以外の怪異伝承、説話に注目することで、誹諧や絵巻などに展開する問題意識をひろく持ち、今後の研究計画に大きな指針を持った。地誌、俳諧書を用いた具体的な作業は今後も行う必要があり、次年度以降に継続する。今年度予定していたホノルルアカデミー・オブ・アーツ(アメリカ、ハワイ州)への調査は、日程調整のため実施できなかったため、次年度以降に計画したい。古典監修、現代語訳を担当。
現職教員再教育における批判的読解力(及びその指導力)速成のためのカリキュラム開発

本研究の主要な成果は、以下の二点に分けられる。1)上記研究課題に係る教員講習用テキストの作成。これは、教員自身の批判的読解力を訓練するためのものと、生徒の批判的読解力を訓練するためのものとの二種類を準備した。2)研究成果を広く社会に発信するため、研究内容を平易に書き直し、一般書(新書)としてまとめた。(現在、刊行準備中である。)本研究の主要な成果は、以下の二点に分けられる。)本研究は、平成19、20年度の2年計画で、現職教員及び教員志望者(主として国語)の批判的読解力(及びその指導力)を速成するための方法を開発し、それにもとづくカリキュラム・教材資料集を作成することを目的とする。具体的手段としては、Informal Logic(非形式論理学)のNegative Approach(否定的方法)を援用し発展させ、主として現職教員再教育の場で、また従として教員養成の場で、(国語)教員に必要な批判的読解力(及びその指導力)を短期間で効率よく育成するための理論・方法として構築する。平成19年度の実績としては、1)アメリカの高等教育でもっとも利用されているDouglas WaltonのInformal Logicでの枠組みを基本とし、非形式論理学の教科書・研究書約70種類を比較検討して、6課程のカリキュラムモデルを暫定的に設定(カリキュラムは教員研修・教員養成用のテキスト〈取捨選択により、10・15・30時間の訓練が可能〉のかたちで具体化する)。2)各課程の理論的構築及び理論を説明するための具体的例文の採取と作成。(理論編の原稿は現在第3課程まで終了)3)研究協力者(現職教員10名)とともに、上記理論の教材化の検討(課程ごとに、「初等1」「初等2」「中等1」「中等2」の4種類の教材と解説書を作成する)。4)勤務校での演習、現職教員向けのサマー・セミナー、放送大学での対面授業で、暫定的に作成した教材を用いて試行的トレーニングを実施。等の成果が得られた。本研究は、平成19、20年度の2年計画で、現職教員及び教員志望者(主として国語)の批判的読解力(及びその指導力)を速成するための方法を開発し、それにもとづくカリキュラム・教材資料集を作成することを目的とする。平成20年度の実績としては、1)教員研修用テキストの原稿完成。以下の生徒指導用ワークシートと合わせ、21年度の教員免許状更新講習テキストとして冊子化予定。2)研究協力者(現職教員)による、生徒指導用のためのワークシートと指導者用の解説原稿完成。3)研究成果を社会に発信するため、上記(1)テキストの内容から材料を借り、一般向け図書(新書・光文社・7月刊行予定)の原稿完成。4)上記(2)のワークシートにもとづき、研究協力者の勤務校で実験授業の実施(DVD撮影)。5)上記成果にもとづく、教員免許状更新講習予備講習、各種団体の依頼による講演・講話等の実施。等の成果が得られた。