hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己会合によるアレスチンの活性調節機構の解明

視細胞で代表的な阻害蛋白質はアレスチンである。アレスチンはリン酸化したメタロドプシンIIに結合して、その活性を停止させる。われわれはX線溶液散乱法により、生理的濃度におけるアレスチンは、濃度依存的に自己会合(単量体⇔二量体⇔四量体)することを示した。さらに、アレスチンの四量体化は極めて協同性が高く、アレスチンの総濃度が増加した場合、四量体の濃度は急峻に増えるが、単量体濃度はあまり変化しないこと、また二量体の濃度は極めて低いことがわかった。昨年度はX線溶液散乱法により求められる見掛けの分子量を指標として、アレスチンの会合状態の塩濃度依存性を調べた。その結果、生理的条件よりも高塩濃度では、二量体が安定に存在することを示した。本年度は高塩濃度で生成する二量体の溶液構造を、散乱パターンから詳しく解析した。結晶構造解析で明らかにされている四量体から任意の組み合わせで二量体を抽出し、その溶液散乱パターンを計算した。これを実験から得られた二量体の散乱パターンと比較したところ、ABサブユニット、ACサブユニットの組み合わせとは明らかに異なっていた。しかしAAサブユニット、ADサブユニット、BDサブユニットの組み合わせと比較した中では、有意な差は見られなかった。今回の解析では、Q<0.2(Å^<-1>)のデータのみが使用できたが、計算の結果、これらのサブユニットの組み合わせの散乱パターンの違いは、0.2<Q<0.3(Å^<-1>)にあらわれることがわかった。そのため、広角側をさらに精度よく測定する必要があると考えられた。このことから、細胞内のアレスチン単量体の濃度は、自己会合によって一定に保たれているというモデルが推測される。アレスチンは単量体しか存在しないようなきわめて低い濃度でも活性を持つことから、単量体が活性型であると考えられているが、四量体の生理的役割については明らかな知見が得られていない。そこで本年度は、自己会合による四量体形成のメカニズムについて検討した。X線溶液散乱法による、濃度あたりの原点散乱強度(I(0)/conc)からみかけの分子量を求め、アレスチンの会合状態の指標とした。生理的塩濃度(100mM)では、アレスチン濃度を高めると単量体から四量体へと変化する。しかし、高塩濃度(500mM)では、緩やかに二量体が形成することがわかった。一方、高塩濃度中の2量体は、低アレスチン濃度でも安定であった。以上のことから、単量体から二量体を形成する時の相互作用と、二量体から四量体を形成する時の相互作用は異なっていることが示された。
認知的、構造的、統計的手法を導入した画像データベースの索引、検索法の基礎的研究

この研究では,画像(静止画像,映像を含む)の検索を「ことば」によって行うことを目的としている。例えば,絵画を例にとるなら,画家名や画題,時代から絵を探す検索システムは美術館には数多く存在している。ここでは,そうした固有名ではなく画像に描かれているものから検索できるデータベースを作ろうとしている。これには,大きな問題がありうる。画像に描かれた内容をことばで表す際には,主観に左右されるはずだという疑問が生じる。では,画像をみたら,それぞれの観察者が与える牽引語は千差万別で共通性はないのだろうか。そこで,画像に対する索引語付与実験を生み重ねてきた。この結果からは,被験者は大多数の画像において,共通性の高い牽引語を与える傾向がみられる。その際に,あらかじめ枠を設けておくとさらに共通性が高まることになる。すなわち,ただ,「主題」というのではなく,例えば「人物」「背景」「時間」というようなカテゴリを設定した方がよい。しかし,このカテゴリは多すぎると混乱を招くことになる。そこで,適当な枠を設けるために,被験者が与えた索引語を分析して,普通,人間が画像を見る時に,どのように視点を移動させていくかを調べている。こうした方法で,いくつかの索引法を用いて,西洋絵画とその索引語などを入力した250件からなるデータベースを構築した。一方,検索においては,現在,広く使われている論理型(ブール演算子を用いる)の検索手法よりも,類似した画像を順位付け出力ができる手法が,画像の検索では適していることを確かめた。
カイコ前胸腺刺激ホルモンの立体構造解析と機能相関

大腸菌で発現したPTTHの大規模精製系の確立-6xHis-tev-PTTHはPTTHの発現の場合と同じく封入体を形成した。従来法では、PTTHの封入体を8M尿素で可溶化した後、透析して巻き戻していたが、分子会合・沈殿を抑えるためにPTTH濃度を低くする必要があった(【less than or equal】30 μg/ml)。それゆえ、大容量の希薄タンパク質溶液を扱うこの方法は、大量調製には不向きであった。そこで、タンパク質間相互作用を抑えるために、6xHis-tev-PTTHをNi-NTA agaroseに結合させた状態で巻き戻したところ、6xHis-tev-PTTHが1mg/mlの高濃度であっても、会合・沈殿を抑えて、目的のホモダイマーを主産物として得ることができた。したがって従来法の1/30の液量で巻き戻しが可能になり、大腸菌で発現したPTTHの大量調製が効率的に行えるようになった。発現PTTHの大量調製法が確立したので、今後、結晶化条件の検討をPTTHの2D^1_-HNMR解析-NMR法による立体構造解析は、結晶化を必要とせず、さらに、比較的初期に二次構造を決定できるので、X線結晶構造解析と相補的な構造解析手段である。NMR法によるPTTHの立体構造解析を進めるために、H_2O(pH6.0、HCI添加によりpH調整)に溶解した2mMPTTHの2D^1_-HNMRを測定した。broadなNMRシグナルとsharpなものが混在することから、PTTH分子がrigidなコア構造とflexibleな周辺部からなることが明らかになった。スペクトルの質から、安定同位体(^<13>C,^<15>N,^2H)標識PTTHを用いることで、NMR法による構造決定が可能なことが示された。
アジアにおけるウエステルマン肺吸虫群の種分化に関する分子遺伝学的研究

本研究はアジアに広く分布するウエステルマン肺吸虫群Paragonimus westermani Complex(以下:ウ肺吸虫と略)の遺伝的変異、種分化の過程を明らかにする中で、1.本邦産ウ肺吸虫3倍体の起源を明らかにすること、2.ウ肺吸虫の原記載に一致する集団を特定することなどを主な目的とする。そのため平成7年度において以下の研究を行った。1.に関連しては、1995年8月7日から21日までの間、中国東北部・遼寧省寛旬県において調査研究を行った。採集したザリガニCambaroides dauricus約3、000個体から、約3、000個体の肺吸虫幼虫を得た。これらを幼虫の大きさから大型、中型および小型の3型に種別して、イヌ、ネコおよびラットに感染させ、現在までに約300個体の成虫を回収した。これらは総てウ肺吸虫と同定された。これまでの染色体の観察から、2倍体、3倍体のほか、少数ながら4倍体の虫が見いだされた。同地域産の3倍体は、動物に対する感染性や、アイソザイムパターンなどから見て、本邦産3倍体に酷似していた。しかし、同地域産の2倍体では、本邦産の2倍体が単一なアイソザイムパターンを示すのに対して、極めて多様性を示すばかりでなく、本邦産3倍体にみられる特有遺伝子が高率に見いだされた。この事実は、この地域産のウ肺吸虫にある集団が、本邦産同肺吸虫3倍体の形成に深く関与していることを示すものと考えられた。、また、4倍体に関する研究では、2倍体と3倍体との間で形成されたものと推定されたが、それが自然界で発育史をくりかえしているのか否か、また、4倍体感染の人体症例があるのかなどについては不明である。2.に関連しては、1995年10月15日から11月2日の間、インド東北部・マニプール州において調査研究を行った。採集したカニPotamiscus manipurensis239個体から、97個体の肺吸虫幼虫を得た。これらは、westermani(ウ肺吸虫)型、bangokokensis型、heterotremus型および従来記載のない型など4型に分類された。これらは、それぞれ類別して、イヌ、ネコ、ラットおよびフェレット(heterotremus型)に感染させ、その一部から成虫を得つつあるが、現在までのところ、ウ肺吸虫と同定出来るものは見いだされていない。総ての成虫が得られた段階において、詳細な研究を行うが、同地域で流行する肺吸虫症は複数種の病原虫が関与しているものと推定された。3.その他の地域としては、1996年2月6日から22日までの間、タイ南部ナコンシータマラート近辺の山中において調査研究を行った。採集したカニは、Demanietta manii,Salangathelphusa brevicarinataおよびPhricotelphusa aedesの3種であったが、第3種の約300個体から、約300個体の肺吸虫を得た。現在これらは、イヌ、ネコおよびラットに感染させ成虫成熟期まで観察中であるが、幼虫の形態からは、少数のウ肺吸虫型と多数のウ肺吸虫の変種と推定出来るのもが認められた。これまでの我々の研究を総合すると、アジアに広く分布し肺吸虫症の重要な病原虫と考えられるウ肺吸虫は単一なものでなく、極めて多様性に富むことが明らかとなった。本邦産の虫は、東アジア産、ことに中国東北部産の虫と遺伝的に見て極めて近い関係にあるが、東南アジア産のものとは極めて遠い関係にあることが判明した.今回、本研究が、単年度で採択されたため、本年度は、アジアの広域で、これまで調査が不十分であった地域、すなはち、中国、インドおよびタイ三国の、本研究で最も重要と考えられる地域を選び、集中的な調査研究と材料の収集に重点をおいた。これまで各地で、淡水産のカニ、またはザリガニから多数の肺吸虫幼虫を回収し、現在、実験動物に感染、観察中である。そのうち、得られた一部の成虫については、従来からの形態学的研究のほか、細胞遺伝学的集団遺伝学的研究を行い、上記のとおり極めて重要な知見を得たが、DNA分析など、さらに詳細な研究は、すべての成虫が得られた時点で開始するよう準備を進めているところである。

同地域産の3倍体は、動物に対する感染性や、アイソザイムパターンなどから見て、本邦産3倍体に酷似していた。しかし、同地域産の2倍体では、本邦産の2倍体が単一なアイソザイムパターンを示すのに対して、極めて多様性を示すばかりでなく、本邦産3倍体にみられる特有遺伝子が高率に見いだされた。この事実は、この地域産のウ肺吸虫にある集団が、本邦産同肺吸虫3倍体の形成に深く関与していることを示すものと考えられた。、また、4倍体に関する研究では、2倍体と3倍体との間で形成されたものと推定されたが、それが自然界で発育史をくりかえしているのか否か、また、4倍体感染の人体症例があるのかなどについては不明である。2.に関連しては、1995年10月15日から11月2日の間、インド東北部・マニプール州において調査研究を行った。採集したカニPotamiscus manipurensis239個体から、97個体の肺吸虫幼虫を得た。これらは、westermani(ウ肺吸虫)型、bangokokensis型、heterotremus型および従来記載のない型など4型に分類された。これらは、それぞれ類別して、イヌ、ネコ、ラットおよびフェレット(heterotremus型)に感染させ、その一部から成虫を得つつあるが、現在までのところ、ウ肺吸虫と同定出来るものは見いだされていない。総ての成虫が得られた段階において、詳細な研究を行うが、同地域で流行する肺吸虫症は複数種の病原虫が関与しているものと推定された。3.その他の地域としては、1996年2月6日から22日までの間、タイ南部ナコンシータマラート近辺の山中において調査研究を行った。採集したカニは、Demanietta manii,Salangathelphusa brevicarinataおよびPhricotelphusa aedesの3種であったが、第3種の約300個体から、約300個体の肺吸虫を得た。現在これらは、イヌ、ネコおよびラットに感染させ成虫成熟期まで観察中であるが、幼虫の形態からは、少数のウ肺吸虫型と多数のウ肺吸虫の変種と推定出来るのもが認められた。これまでの我々の研究を総合すると、アジアに広く分布し肺吸虫症の重要な病原虫と考えられるウ肺吸虫は単一なものでなく、極めて多様性に富むことが明らかとなった。本邦産の虫は、東アジア産、ことに中国東北部産の虫と遺伝的に見て極めて近い関係にあるが、東南アジア産のものとは極めて遠い関係にあることが判明した.今回、本研究が、単年度で採択されたため、本年度は、アジアの広域で、これまで調査が不十分であった地域、すなはち、中国、インドおよびタイ三国の、本研究で最も重要と考えられる地域を選び、集中的な調査研究と材料の収集に重点をおいた。これまで各地で、淡水産のカニ、またはザリガニから多数の肺吸虫幼虫を回収し、現在、実験動物に感染、観察中である。そのうち、得られた一部の成虫については、従来からの形態学的研究のほか、細胞遺伝学的集団遺伝学的研究を行い、上記のとおり極めて重要な知見を得たが、DNA分析など、さらに詳細な研究は、すべての成虫が得られた時点で開始するよう準備を進めているところである。
新合金理論に基づく遷移金属材料の耐熱・耐食機能評価

昨年度、金属材料の腐食特性を決める重要な因子のひとつである水素過電圧について、合金の電子構造との関連性を解明した。本年度はこの成果を基に、新しい構造材料として最近注目を集めている金属間化合物(TiAl,FeAl,NiAl)の水素過電圧と電子構造との関連を検討した。その結果、各種金属間化合物の水素過電圧におよぼす合金元素の影響は、遷移金属(Ti,Fe,Ni)合金における、それらと全く同じ振舞いをすることを明らかにした。すなわち、母金属(この場合、構成遷移金属元素、例えばFeAlにおけるFe)の周期表の位置より左側の元素を添加しても、水素過電圧は殆ど変化しないのに対し、右側の元素を添加すると大きく変化する。この場合の変化には、合金元素が純金属の場合に示す水素過電圧の特徴が現れる。このような合金元素による水素過電圧の変化は、やはり遷移金属合金の場合と同様、化合物と構成する金属元素間の電子の移行方向を考えることにより説明される。この場合、構成元素間での電子移行の結果、最も負のイオン性をもった元素が水素発生サイトとなり、その元素自身がもつ水素過電圧特性が化合物の水素過電圧となる。例えば、Ti,V,CrおよびMnを含んだFeAlではFeが最も負のイオン性をもつ。このため、これら元素を含むFeAlの水素過電圧は合金元素の影響を受けず、純鉄のそれと同じ値を示す。これに対してCo、NiおよびCuはFeAl中では最も負のイオン性をもつため、これら元素の特徴が化合物の水素過電圧に反映される。この他、化合物のフェルミ準位もその水素過電圧と相関のあることなどを明らかにした。本研究により、昨年度提唱した遷移金属合金の水素過電圧を理解するための合金理論が、金属間化合物の水素過電圧の理解にも適用できることが明らかとなった。
「根系ギャップ」に着目した永久凍土域亜寒帯針葉樹林における個体間競争過程の解明

アラスカ内陸部に生育するクロトウヒは地上部よりも地下部で競争を行っているという仮説を検証した。この仮説は3つの事実によって支持された。まず地上部が樹冠によって21%しか被覆されていないのに対し,地下部はその根系によって98%を占められていた。次に,各個体の根系は非対称な分布を示した。最後に,一般化線形モデルによる解析は,局所的な根長密度が他の個体の根長密度によって負の影響を与えていることを示した。これらの結果は,クロトウヒが地下部の競争を重視していることを表現している。この本研究の結論は,クロトウヒ林分では地上部よりも地下部への炭素分配が大きいというこれまでの研究を支持するものである。アラスカ内陸部では地形や斜面方位との関係で永久凍土の分布域が規定され,さらに植生の分布が関連づけられる。永久凍土があまり発達しない南斜面ではシロトウヒやカンバ類が,比較的発達し活動層が浅い山腹北斜面にはクロトウヒ林が成立する。クロトウヒの分布するところで土壌の分解も遅く有機物が堆積し,貧栄養であるため,根への分配が高いことが知られている。しかしながら,これらの少ない地下部資源の獲得競争の実態は不明であり,その一因として個体の根の分布状態が不明であることが挙げられる。そこでフェアバンクスのCPCRWサイトのクロトウヒ林に6m×6mのプロットを設置し,毎木調査,根系調査を行った。このクロトウヒ林は永久凍土の分布する北東向き斜面に成立し,活動層が浅いため根系はほぼ水平に発達する。個体間の根系の競合状態を精密に定量化するため,プロットを0.25mのグリッド576個に区切り,それぞれのグリッドにおいて2mm以上の太根の長さを個体識別しながら計測した。プロット内の個体は更新時期がほぼ同一か,それより若い個体から構成されていると考えられたが,地下部では,プロット内個体よりも古いプロット外の個体の根系が,プロット内個体よりも深い場所に張り巡らされており,新規参入個体は既存個体と地下資源の競合を強いられていることが示唆された。残念ながら,調査途中の降雪によりプロット外個体の根系の量的把握が中断されたので,次年度にこれを継続することとした。例年より早い降雪により作業を中断したこと,地下部という観測しえない対象において既存個体と新規参入個体の根系分布が想定しないものとなっていたことは計画を少々遅らせる要因といえる。しかしながら,前者は1日程度の遅れであり,次年度に向けての対処も行ってきたことから深刻な問題とはならなかった。また,後者については研究上むしろ新たな知見を得られる可能性が高く,好機ととらえて,慎重かつ丁寧にデータを積み上げることが重要となると考えられる。以上のことから,全体としてはおおむね順調と判断される。本研究は,アラスカ内陸部の丘陵地に生育するクロトウヒ個体群を対象に,根系の相互干渉の有無を明らかにすることを目的にする。この林分では地上部の林冠閉鎖が無いことから,光をめぐる競争は弱い。しかしながら,樹高約8m程度で樹冠衰退が認められ,クロトウヒは地上部の個体間競争を経験することなく一生を終えると考えられる。その生育過程において地下部での競争状態はどうなっているのか,という疑問に答えるため地下部の掘り取り調査を行った。仮説としては1)地上部と同じように地下部もギャップが多く個体間干渉はない,2)地下部のギャップはほとんどないが,個体間干渉があり根系の棲み分けが認められる,3)地下部のギャップはほとんどないが,個体間干渉はなく根系は絡み合っている,の3つである。アラスカ大学フェアバンクス校の長期生態系モニタリングサイト:CPCRWの北向き斜面に生育するクロトウヒ個体群を対象に,地下部掘り取り調査を行った。調査区は6m四方のプロットであり8mクラスの老齢個体に囲まれている。調査区内には樹高3m以下の若い個体が10個体分布している。このプロットを0.25mの256グリッドに細分し,グリッドごと,個体ごとに太根(直径1mm以上)の長さを計測した。同時に微地形や有機物層の影響を見るため,掘り取り前と鉱質土壌露出後の地表面の比高をレーザー墨出し器によって計測した。根系が観察されなかったグリッドは4つ(1.5%)に過ぎず,地下部にはギャップが存在しないことが明らかになった。一方,プロット内個体の各グリッドの根長は,個体サイズ(正),根元からの距離(負),有機物層の厚さ(正),プロット内の他個体の根長(負)の影響を受けた。このように地下部にギャップは存在せず,プロット内他個体から負の影響があることから,3つの仮説のうち二つ目の仮説が妥当であると考えられた。当初計画どおり平成28年度までにアラスカ現地での調査を完了し,目的としていたデータを全て収集した。6m四方のプロットを0.25m四方の576グリッドに分割し,立地条件や個体ごとの根の分布状況を調査したため,このデータは位置空間情報を含む巨大なものとなっている。プロット内全域にプロット内個体またはプロット外個体の根が分布しており,地下部では地上部のようなギャップが存在していないことが明らかにされた。このことは地下部の競争が苛烈であるため,地下部への物質分配が大きく,地上部への投資は後回しになっているという状況を示唆している。位置空間情報に関して個体をベースにした競争関係についてGLMを用いた解析が完了した。

その結果,特定の個体のあるグリッドにおける根長は,その個体のサイズ,根元からの距離,グリッドの有機物層の厚さ,そしてそのグリッドに分布するプロット内他個体の根長が影響していた。すなわちプロット内の小さな個体同士は競争関係にあり,棲み分けているといえる。以上のように,地下部に「根系ギャップ」が存在するかどうか,地下部では棲み分けが生じているか,という2点が明確になり,新しい知見が得られたことから概ね順調に進展していると判断した。本研究は,アラスカ内陸部に成立するクロトウヒ個体群を対象に,根系の相互干渉の有無を明らかにすることで,地下部への物質分配の重要性を検証するものである。この林分では林冠の閉鎖が20%程度と小さく,地上部の個体間競争は緩やかである。地下部での競争状態を明らかにするため,6m四方のプロットを576個の25cmグリッドに分割し,各グリッドにおける根長分布を個体ごとに計測した。地上部との比較を行うと,地上部の占有面積が20%程度であったのに対して,地下部の占有は98%とほぼ全域を占めていた。このことから,地下部の個体間競争は,地上部からは予測ができないほどシビアであるといえる。得られたデータを複数の視点から解析することで,地下部の競争状態を評価した。まず,個々の個体の根系の分布が対称であれば,個体間の競合状態は弱いとされる。ここでは非対称な分布示したことから何らかの競合が生じていることが示唆された。次に,根系分布が個体間でオーバーラップしていれば,個体間の競合状態は弱いとされる。ここでは比較的多くの領域がオーバーラップしており,必ずしも排他的ではないことが示された。最後に,個体のサイズ,根元からの距離,有機物層の厚み,地形の凹凸,他個体の根長を説明変数にした一般化線形モデルをあてはめた。このモデルでは他個体の根長が負に影響していた。すなわち,根域同士のオーバーラップはあるものの,他個体が占有するグリッドでは,根長を増大させることはできない。このように,クロトウヒ地下部の個体間競争は全体としては緩やかだが,局所的には排他的な傾向を持つ。1個体が広く根系の領域を広げることがあっても,その領域を全て埋め尽くすわけではない。以上からクロトウヒ個体群の地下部における競争は熾烈であり,同個体群における地下部への同化物分配は量的にも質的にも極めて重要であると結論された。アラスカ内陸部に生育するクロトウヒは地上部よりも地下部で競争を行っているという仮説を検証した。この仮説は3つの事実によって支持された。まず地上部が樹冠によって21%しか被覆されていないのに対し,地下部はその根系によって98%を占められていた。次に,各個体の根系は非対称な分布を示した。最後に,一般化線形モデルによる解析は,局所的な根長密度が他の個体の根長密度によって負の影響を与えていることを示した。これらの結果は,クロトウヒが地下部の競争を重視していることを表現している。この本研究の結論は,クロトウヒ林分では地上部よりも地下部への炭素分配が大きいというこれまでの研究を支持するものである。当初,プロット数を増大,もしくはプロット面積を拡大する予定であったが,現在のプロットのみを詳細かつ丁寧に調査することとする。
分子系統解析によるカンアオイ属タイリンアオイ節植物の分類地理学的考察

カンアオイ属タイリンアオイ節植物は,九州南部に分布するサツマアオイ,九州北部から中国地方西部に分布するタイリンアオイ,東海地方のカギガタアオイ,伊豆半島のアマギカンアオイ,そして関東地方南部の多摩丘陵に分布するタマノカンアオイからなる一群である.これらは,日本列島の東西に隔離分布するにもかかわらず,萼筒の形態や内壁の襞紋様,舷部の形態などによる類似性から,一つの分類群(節)にまとめられている.また,この節内の分化については,九州地方産種から関東地方産種へ萼筒の形や柱頭の形に勾配的な変異が認められるとして,西から東への分布拡大の過程で分化したのではないかと考えられている(前川,1953).しかし,二地域間には地理的距離の大きな隔たりがあり,また,花形質で指摘されてきた変異は必ずしも勾配的変異とはいえない.そこで,本研究では,分子系統学的解析に基づいて,タイリンアオイ節の単系統性と同節種間の系統関係を明らかにし,地理的分布との関連について考察することを目的とした.カンアオイ属植物についての分子系統学的解析は,これまでにKelly (1998)による核DNAのITS領域の解析による報告があるが,この一群についての解析はない.葉緑体DNAのtrnL遺伝子間領域の塩基配列,そして核DNAのITS-1領域の塩基配列の比較による系統解析を進めた.その結果,葉緑体DNAについては,系統解析を進める上で有効な情報を得ることはできなかったが,ITS領域については多くの変異がみられ,系統推定のための情報を得ることができた.ITS領域に基づく分子系統解析の結果,タイリンアオイ節の九州産2種と東海・関東産の3種は,それぞれ別のクレードに属し,単系統性は認められないという結果が得られた.これは,タイリンアオイ節諸種が西から東への分布拡大の過程で分化したものではないことを示唆している.カンアオイ属タイリンアオイ節植物は,九州南部に分布するサツマアオイ,九州北部から中国地方西部に分布するタイリンアオイ,東海地方のカギガタアオイ,伊豆半島のアマギカンアオイ,そして関東地方南部の多摩丘陵に分布するタマノカンアオイからなる一群である.これらは,日本列島の東西に隔離分布するにもかかわらず,萼筒の形態や内壁の襞紋様,舷部の形態などによる類似性から,一つの分類群(節)にまとめられている.また,この節内の分化については,九州地方産種から関東地方産種へ萼筒の形や柱頭の形に勾配的な変異が認められるとして,西から東への分布拡大の過程で分化したのではないかと考えられている(前川,1953).しかし,二地域間には地理的距離の大きな隔たりがあり,また,花形質で指摘されてきた変異は必ずしも勾配的変異とはいえない.そこで,本研究では,分子系統学的解析に基づいて,タイリンアオイ節の単系統性と同節種間の系統関係を明らかにし,地理的分布との関連について考察することを目的とした.カンアオイ属植物についての分子系統学的解析は,これまでにKelly (1998)による核DNAのITS領域の解析による報告があるが,この一群についての解析はない.葉緑体DNAのtrnL遺伝子間領域の塩基配列,そして核DNAのITS-1領域の塩基配列の比較による系統解析を進めた.その結果,葉緑体DNAについては,系統解析を進める上で有効な情報を得ることはできなかったが,ITS領域については多くの変異がみられ,系統推定のための情報を得ることができた.ITS領域に基づく分子系統解析の結果,タイリンアオイ節の九州産2種と東海・関東産の3種は,それぞれ別のクレードに属し,単系統性は認められないという結果が得られた.これは,タイリンアオイ節諸種が西から東への分布拡大の過程で分化したものではないことを示唆している.本研究は、台湾、九州、東海地方から関東南部にかけて分布するタイリンアオイ節6種の種分化と形質進化の方向性、そして地理的分布との関わりについて考察することを目的としている。これら6種は日本列島の西から東への分布拡大というイベントの過程で種分化したと考えられている。その根拠には萼筒形態に認められる共通性と雌蘂形態における西から東へのクライン的変化が挙げられている。この研究は、これら6種について形態の再検討を行い、そして最近の分子系統学的解析手法を取り入れて、関連植物の進化的分化の方向性を明らかにし、その結果に基づいて上記の仮説を検討するものである。今年度はまず研究対まであるタイリンアオイ節6種それぞれの分布地(九州南部、九州北部、東海、伊豆半島、関東南部)数集団から分子系統解析に使用するための試料の採取を積極的に進めてきた。またタイリンアオイ節の外群に使用するためにミヤコアオイ節植物種ついても近畿地方での試料の採取を行い、これまで台湾産の一部を除き、試料をほぼ揃えることができた。採取した試料は、その一部を形態観察用に栽培して維持し、葉はシリカゲルで乾燥し、DNA抽出のための試料として保存した。その後、乾燥した葉の試料よりCTAB法で全DNAを抽出し、PCR法で葉緑体DNAのmatK遺伝子を含むtrnT-trnF領域を増幅した後、DNAオートシークエンサーを用いて塩基配列の決定を進めている。これまでに採取した試料からのDNA抽出は比較的スムーズに進んでいるが、増幅の段階で難点もあったが、現在はそれも克服しつつある。

現在、このタイリンアオイ節植物の分子系統解析にどの領域がもっとも適切かを検討している段階であるが、次年度早々には特定の領域に絞った解析を進めたいと考えている。カンアオイ属タイリンアオイ節植物は,九州南部に分布するサツマアオイ,九州北部から中国地方西部に分布するタイリンアオイ,東海地方のカギガタアオイ,伊豆半島のアマギカンアオイ,そして関東地方南部の多摩丘陵に分布するタマノカンアオイからなる一群である.これらは,日本列島の東西に隔離分布するにもかかわらず,萼筒の形態や内壁の襞紋様,舷部の形態などによる類似性から,一つの分類群(節)にまとめられている.また,この節内の分化については,九州地方産種から関東地方産種へ萼筒の形や柱頭の形に勾配的な変異が認められるとして,西から東への分布拡大の過程で分化したのではないかと考えられている(前川,1953).しかし,二地域間には地理的距離の大きな隔たりがあり,また,花形質で指摘されてきた変異は必ずしも勾配的変異とはいえない.そこで,本研究では,分子系統学的解析に基づいて,タイリンアオイ節の単系統性と同節種間の系統関係を明らかにし,地理的分布との関連について考察することを目的とした.カンアオイ属植物についての分子系統学的解析は,これまでにKelly(1998)による核DNAのITS領域の解析による報告があるが,この一群についての解析はない.葉緑体DNAのtrnL遺伝子間領域の塩基配列,そして核DNAのITS-1領域の塩基配列の比較による系統解析を進めた.その結果,葉緑体DNAについては,系統解析を進める上で有効な情報を得ることはできなかったが,ITS領域については多くの変異がみられ,系統推定のための情報を得ることができた.ITS領域に基づく分子系統解析の結果,タイリンアオイ節の九州産2種と東海・関東産の3種は,それぞれ別のクレードに属し,単系統性は認められないという結果が得られた.これは,タイリンアオイ節諸種が西から東への分布拡大の過程で分化したものではないことを示唆している.
進化分子工学によるDNA鋳型を用いた新しい分子センサーの設計と合成

進化分子工学を天然型DNAと非天然修飾核酸を用いて行い、新しい分子センサー構築概念を確立した。1.天然型DNAの進化分子工学は、ゲスト分子として葉酸を選んで行った。葉酸をアガロースゲルに固定化し、カラムに充填した。ここにランダム配列を有するDNA集団を添加し、葉酸に結合するDNAを分離した。1回めのこのアフィニチィクロマトでは、結合するDNAは微量で検出できなかったが、分離したDNAをPCRで増幅しては、カラムに添加するという操作を繰り返すことにより、より結合性の高いDNAが選別されるようになってきた。このように選別されてきたDNAをホスト分子として、葉酸を選択的に染色できるかを検討した。まずDNAを蛍光ラベル化プライマーを用いて蛍光標識した。これを、葉酸をパターン状に固定化した膜に添加したところ、選択的に葉酸が固定化されている部位にだけレーザー顕微鏡で蛍光が観察された。2.非天然型核酸がPCRによって増幅可能か、あるいは転写・逆転写によって天然DNAへ変換可能かを検討した。まず、DNA塩基部位を蛍光ラベル化した3リン酸化物が市販されているので、これを基質としてPCRによる増幅を行った。しかしながら、単独では基質として働かなかった。次に、RNA塩基部位を蛍光ラベル化した3リン酸化物を用い、転写反応を行ったところ、蛍光ラベル化転写産物が得られた。さらにこの転写産物を逆転写したところ、もとのDNAが得られた。これにより非天然核酸を用いた進化分子工学の可能性が示された。
逆流性食道炎による食道発癌過程での炎症性微小環境の解明とその抑制

胃食道逆流症(GERD)に代表される消化液の逆流による慢性炎症が食道癌発生の大きな原因の一つである。発癌機序に関しては組織学的にInflammation-Metaplasia-Adenocarcinoma sequenceによることが解明されているが、本研究では腫瘍微小環境の変化を浸潤細胞の観点から検討した。GERDにより炎症初期には食道粘膜にpStat3の活性化と汎マクロファージが誘導される。炎症の持続とともに腫瘍関連(M2型)マクロファージや調節性T細胞が誘導され、癌の微小環境が形成される。以上より発癌の抑制あるいは癌治療にはこれら癌微小環境を改変させる工夫が重要である。申請者らはラットを用いて発癌剤を使用せず十二指腸液の食道逆流手術モデルによる自然食道発癌に成功し、その発癌機序が組織学的にInflammation-Metaplasia-Adenocarcinoma sequenceによることを証明してきた。しかしこの炎症反応がどのようなプロセスを経て発癌に至るか詳細は明らかになっていない。近年、HDAC阻害薬であるValpronic acid (VPA)がStat3のリン酸化を阻害することやTGF-β阻害を介して免疫寛容を誘導することが報告されている。そこで申請者らは食道発癌の各段階においてTumor-associated macrophage(TAM)を中心とした癌組織の微小環境形成に関与する炎症・免疫反応を検討することを第一の目的に、続いてこの逆流モデルにVPAを投与し、抗腫瘍免疫誘導による炎症性微小環境に対する効果を検討することを第二の目的として実験を計画した。初年度である当該年度は十二指腸食道逆流ラットモデルの標本を用いてCD68(汎マクロファージ(M1型macrophage))、pStat3(TAMへの分化に関与)、CD163(TAM (M2型macrophage))、Foxp3(制御性Tリンパ球(Treg))の発現を検討した。その結果、炎症性微小環境の変化はまず十二指腸液逆流による炎症により、CD68のM1型macrophageが浸潤し、間質細胞および近傍上皮のpStat3の発現が増強し、続いてCD163のM2型macrophage、さらにTregが誘導され、癌の微小環境が形成されることが示された。来年度は十二指腸胃食道モデルを作製し、VPA投与による発癌の予防と微小環境の変化を病理組織学的に詳細に検討する予定である。胃食道逆流症(GERD)に代表される消化液の逆流による慢性炎症が食道癌発生の大きな原因の一つとされている。申請者らはラットを用いて十二指腸液を食道に逆流させる手術を行い約40週間観察すると発癌剤を使用せずに食道癌が発生し、その発癌機序が組織学的にInflammation-Metaplasia-Adenocarcinoma sequenceによることを世界に先駆けて報告してきた。しかしこの惹起された炎症がどのようなプロセスを経て発癌に至るのか詳細は明らかになっていない。近年、腫瘍周囲の微小環境が癌の形成に大きな役割を果たしていることが示唆されている。その中でもStat3のリン酸化やTGF-βが免疫寛容を誘導し、免疫抑制性の微小環境を形成することが大きな要因と考えられている。HDAC阻害薬であるValpronic acid(VPA)はこれらの因子を抑制することが示唆されており、発癌抑制が期待される。そこで申請者らは食道発癌の各段階においてStat3のリン酸化やTGF-βによって誘導sされるTumor-associated macrophage(TAM)が癌組織の微小環境形成に関与することを第一の目的に、続いてこの逆流モデルにVPAを投与し、抗腫瘍免疫誘導による免疫抑制性微小環境に対する効果を検討することを第二の目的として実験を計画した。2年目である当該年度には40週に達した十二指腸胃食道モデルラットを順次屠殺し、標本の採取と評価を行った。個体数が少なかったために、モデルの作製を追加している。来年度は、屠殺したモデルの食道および全身臓器の検索を行い、特に食道では粘膜および間質に浸潤した細胞をCD68(汎マクロファージ(M1型macrophage))、pStat3(TAMへの分化に関与)、CD163(TAM (M2型macrophage))、Foxp3(制御性Tリンパ球(Treg))などの免疫染色を行って発癌過程の解明と抑制効果を検討する予定としている。申請者らはラットを用いて十二指腸液と胃液の混合液を食道に逆流させる手術を施行し、約40週間観察すると発癌剤を使用せずに食道癌が発生し、その発癌機序が組織学的にInflammation-Metaplasia-Adenocarcinoma sequenceによることを世界に先駆けて報告してきた。

慢性炎症によりIL-10, PGE2, TGF-β等が恒常的に産生される結果、Stat3の活性化が持続し、抑制性免疫担当細胞(調節性T細胞(Treg)、骨髄由来抑制細胞および腫瘍関連(M2型)マクロファージ(TAM)が優勢な免疫寛容状態に陥っていることが問題であると考えられる。申請者らは第一に食道発癌のどの段階においてpStat3の活性化が惹起され、TAMやTregが誘導され、癌組織の微小環境が形成されるのかを検討した。次に、pStat3やTGF-β抑制作用を持つHDAC阻害薬であるValpronic acid(VPA)をこの逆流モデルに投与し免疫抑制性微小環境の改変効果を検討した。最終年である当該年度は40週に達した十二指腸胃食道モデルラットを屠殺し、採取された標本の解析を行った。逆流による慢性炎症により炎症初期の術後20週目よりpStat3の活性化および汎マクロファージ(M1型)の誘導が認められ、週数を経た扁平上皮過形成、Barrett上皮、癌発生時期にも発現が継続していた。TAMは術後30週目以降でBarrett上皮および癌部周囲に少数ながら誘導されていた。Tregは癌部周囲の一部に発現しているのみであった。またVPA投与群ではコントロール群に比べて癌発生率が低率である傾向を認めた。胃食道逆流症(GERD)に代表される消化液の逆流による慢性炎症が食道癌発生の大きな原因の一つである。発癌機序に関しては組織学的にInflammation-Metaplasia-Adenocarcinoma sequenceによることが解明されているが、本研究では腫瘍微小環境の変化を浸潤細胞の観点から検討した。GERDにより炎症初期には食道粘膜にpStat3の活性化と汎マクロファージが誘導される。炎症の持続とともに腫瘍関連(M2型)マクロファージや調節性T細胞が誘導され、癌の微小環境が形成される。以上より発癌の抑制あるいは癌治療にはこれら癌微小環境を改変させる工夫が重要である。2年目である当該年度は計画したラットモデルに加え、追加してモデルを作製している。その一部は屠殺し、現在は病理学的・分子生物学的に検討を行っている。消化器外科術後40週に達したラットを順次屠殺し、食道および全身臓器の検索を行い、病理組織学的・分子生物学的に検討を行う。さらにVPA投与による発癌抑制効果とその機序を検討する。初年度である当該年度は計画したラットモデルの作製に成功している。分子生物学的検討のために購入予定であった試薬の一部の購入を来年度に先送りしたため術後40週に達したラットを順次屠殺し、食道および全身臓器の検索を行い、病理組織学的・分子生物学的に検討を行う。来年度に飼育期間を終了し、切除組織の分子生物学的検討を行う。次年度使用額はその際の試薬購入に使用する
1770年代から1830年代におけるガイスト概念の変遷―ゲーテを中心に

2018年度:(1)昨年度に引き続きゲーテ晩年の詩「一と全」に見られる「世界ゼーレ」と「世界ガイスト」という両概念を検討し、それらが意味論的な空所となっていると解釈する論文を完成させた(Goethe-Jahrbuch Bd.135掲載決定済)。(2)ゲーテ形態学におけるガイスト概念は一部でI・P・V・トロクスラーを典拠とするが、ゲーテとトロクスラーの思想的差異を指摘した論文を執筆した(論文集Natur und Geist所収決定済)。(3)「ガイスト的形相」をめぐるゲーテの新プラトン主義批判の核心が世界の脱ヒエラルキー化にあったことを示し、そこからゲーテ色彩論とアリストテレス思想の近縁性が導出できることを論文で主張した(『モルフォロギア』第40号掲載)。研究期間全体:交付申請の時点では、1770年代から1830年代までの時期にガイスト概念の雰囲気的・感性的・具体的な意味内容が内面的・知性的・抽象的になっていく中で、ゲーテは時流に逆らい概念の原義を守ろうとしたという仮説を立てていた。しかし本研究を通じてゲーテはむしろ近代的思想文脈に応じてガイスト概念を「時」との関わりから再解釈していたことが明らかになった。18世紀後半からの世界観の時間化(ラヴジョイ、フーコー)に並行してゲーテのガイスト概念も時間化した。そこには全体性の理想と結び付いた過去や未来の表象が、時間的なずれによって直接的に知覚されないがために、かえって「現在」の深層=表層において知覚されるようになるという逆説構造を確認できる。この構造はゲーテ形態学思想の核心をなすと同時に文学作品にも反映しているが、晩年のゲーテ作品はこの構造そのものが幾重もの自己批判という戯れのなかで語るようになった。なお、ここに見られる「時」のイメージについては「根源」概念および「雰囲気」現象との関わりからさらなる研究が必要である。主にゲーテの諸作品におけるガイスト概念の含意を解明しようとする本研究計画において、平成27年度には以下の4点について研究を進めた。1)平成27年5月にドイツのダルムシュタット・ゲーテ協会において『ヴィルヘルム・マイスターの遍歴時代』に登場する聖女マカーリエについての研究発表を行った。ここでは彼女が病身としてかつ鏡の比喩を用いて描写される理由をゲーテの宇宙論から導出し、マカーリエの「精神的・霊的」なあり方は、本来調和してあるべき宇宙と人間の関係が崩壊した時代としての近代を体現すると結論付けた。この発表は論文化され、ダルムシュタット・ゲーテ協会論集第六巻で発表された。2)平成27年8月に中国の上海で開催された第13回国際独文学会において『ファウスト第二部』で「ガイスト」として描き出されるヘレナについての研究発表を行った。ここでは映像性こそヘレナの本質をなすと捉えた上で、その演出が当時の最新技術であるファンタスマゴリアを用いて効果的になされていたことを実証的に示した。この発表も論文化し学会の論文集に投稿した。3)平成27年11月に発行された学術雑誌『モルフォロギア』に「モナド・エンテレケイア・マカーリエーゲーテにおける「個の不滅」の問題」と題する論文を発表した。ここでは、ガイスト概念とも密接に関係するモナド概念とエンテケレケイア概念のゲーテによる用法を整理し、「エンテレケイア」の語を使って描き出されるマカーリエの描写が「真摯な冗談」というゲーテ晩年の文学創作原理を反映している可能性を指摘した。4)平成28年3月に発行されたドイツ文学論文雑誌『DA』に「薔薇十字的世界史の挫折ーゲーテの『秘密』と1780年代』と題する論文を発表した。ここではメシア的形象と理解できるフマヌスを登場させる未完の作品『秘密』が、普遍と個別をめぐるゲーテの「挫折」の本質を示していると主張した。上記のように平成27年度にはゲーテ作品におけるガイスト概念の解明について具体的な研究実績をあげることができた。ただし研究計画にはもう一点、日本独文学会秋季大会でのゲーテ最晩年の詩に関する発表を盛り込んでいたが、これは実現できなかった。それには以下のふたつの理由があった。第一に平成27年6月にドイツ・ベルリンで行われたプネウマ概念に関するコロキウムに参加したこと、第二に平成27年10月に出版された集英社文庫『ゲーテ』(ポケットマスターピース・シリーズ第二巻)にゲーテ年譜などを執筆をしたことである。これら予期せぬ仕事によって時間的経済的な余裕がなくなり秋季大会での発表は断念した。しかし前者の学会参加によって、ガイスト概念の一源泉であるプネウマ概念について今後の研究推進に欠かせない知識と人的ネットワークを得ることができたし、また後者の原稿執筆も、専門的な研究成果の一端を一般社会へと還元できたという観点からは非常に有意義であったと考える。計画されていた研究内容は平成28年度に延期し実行する予定にしている。さらに本年度には、当初の研究計画には盛り込んでいなかったゲーテの未完作品『秘密』についての論文を発表することもできた。以上を総合して、計画通りではなかったものの、質と量の双方の観点からして研究はおおむね順調にすすんでいると判断する。主にゲーテのガイスト概念を究明しようとする本研究課題において、平成28年度には以下の3点について研究を進めた。

1)平成28年4月に神戸大学で開催された阪神ドイツ文学会研究発表会において、ゲーテの「現在」(Gegenwart)概念について口頭発表を行った。ゲーテにおいて「現在」概念はガイスト概念と複雑に連関しながら用いられており、この研究発表によって本研究課題の新しい切り口を得ることができた。この発表はさらに『ファウスト第二部』ヘレナ劇の解釈に重点をおきつつ論文化され『ドイツ文学論攷』第58号(2016)に所収された。2)平成28年7月に「形態学と想像力ーゲーテのナマケモノ論における「詩的表現」の意味」と題した口頭発表を、名古屋大学で開催された日本独文学会東海支部の研究発表会で行った(招待講演)。この発表原稿を改稿して、同年11月に発行された学術雑誌『モルフォロギア』第38号に同題名の論文を発表した。ここではゲーテ形態学において想像力が占める重要な位置を確認した後、その想像力観が拠っているガイスト概念の性格を、ゲーテによるスイスの思想家トロクスラーの引用から紐解いた。結論として、ゲーテ形態学の基底には主体と客体に共通して「プネウマ」のはたらきを認める古代ギリシア的な生命観があることを示した。3)上記二点に加えて、ゲーテ晩年の詩「一と全」においてみられる「世界ガイスト」と「世界ゼーレ」の概念について研究を進め、この両概念が従来言われてきたように互いに対立するのではなく、むしろ同じ系列に属するものとして考えられていた可能性を、19世紀初頭のドイツ語圏における古代哲学の受容の観点から明らかにしつつある。この研究成果は平成29年6月にドイツのヴァイマルで開催される国際ゲーテ協会で発表する予定である。(すでに発表申込を行い受理された。)上記のように平成28年度にはほぼ計画どおりの研究を遂行し、具体的な実績をあげることができた。なかでも、ゲーテの「現在」概念の解明に取り組むことで、『ファウスト第二部』におけるヘレナ劇との関連から新しい研究の切り口が見出せたことは特筆に価する。平成27年度に計画していたゲーテ晩年の詩「一と全」研究については、当該年度に具体的な業績をあげることができなかったが、その後も研究を継続し内容を高度化させて、ゲーテ研究の世界最高峰である国際ゲーテ協会での発表を申し込み受理された。以上の経緯から、「一と全」についても、発表時期こそずれ込んだものの、研究自体は順調に進展していると判断する。ゲーテを中心に、近代ドイツ思想史におけるガイスト概念の内実を究明しようとする本研究課題について、平成29年度は以下の2点について研究を進めた。1)ゲーテ晩年の重要な思想詩「一と全」で使われる「世界魂(Weltseele)」および「世界ガイスト(Weltgeist)」概念について考察した。従来の研究ではこれらの意味内容に諸説あったが、本研究では、そもそもこれらの語は意図的に明確な意味内容を担わされてはおらず、言語の地平を超越したものを指し示すだけの象徴的空白として機能しているという解釈を示した。この内容は昨年から継続して取り組んできた研究の成果であり、平成29年6月のドイツ出張に際し、ダルムシュタット・ゲーテ協会(講演会)および国際(ヴァイマル)ゲーテ協会(若手ゲーテ研究者シンポジウム)において発表を行った(双方とも招待講演)。現在ドイツ語論文としての発表を準備中である(国際ゲーテ協会の年鑑Goethe-Jahrbuchに掲載決定済だが、平成30年度の研究実績として記載予定)。2)若きゲーテの神学論文「聖書の二問題」にみられるプネウマ(聖霊)論が、のちのゲーテ自然科学の背景をなしている可能性があることを論証した。
アモルファス半導体の電子-ボンド相互作用のボンド選択励起法による研究

1.現有の連続モード同期Nd:YAGレーザーの共振器内にQスイッチ素子(NEOS社製)を取り付け、モード同期とQスイッチの併用動作をさせて、パルス幅100ピコ秒、パルス間隔12ナノ秒の約30本のパルス列(最大パルスエネルギー30μJ、パルス列の繰り返し1kHz)を発生させた。このパルス列をKTP結晶に入れ第2高調波光(532nm)を発生させた。2.θ=43°、φ=0°でカットした5x3x10mm^3のKTP結晶と4枚のミラーを用いた単一共振型パラメトリック発振器を組み立てた。当初AgGaS_2結晶を使用する計画であったが、メーカーの生産休止のため、発振波長は約4μm程度と短くなるがパラメトリック発振の報告例もあるKTP結晶を用いることにした。共振器の調整にはHe-Neレーザーを用いた。3.このパラメトリック発振器のKTP結晶に1で得た532nm光を円筒面凸レンズで集光し、発振を試みた。しかし、発振に到る前に結晶に損傷が生じた。用いた結晶の品質に問題があったようである。現在、第二の結晶を用意しているところである。早急に発振を行い、得られた赤外光をアモルファスC:H膜に照射し、当初の計画を実行する予定である。4.空気中紫外光照射によるアモルファスC:H膜の膜厚減少効率の照射紫外光波長依存性を測定し、低エネルギーしきい値が約3.1eVであることが分かった。光生成された電子正孔対のエネルギー移動による結合解離の可能性が高い。
前立腺癌および腎癌に対するアポトーシス抑制因子、サバイビンの効果に関する研究

前立腺癌及び腎癌におけるSurvivinの発現を調べ、Survivinの抑制による抗腫瘍効果つき検討した。臨床前立腺組織におけるSurvivinのmRNA発現を定量し、前立腺肥大症に比し、前立腺癌で有意に過剰発現していた(Pca:BPH=8.86:1)。前立腺癌ホルモン療法後では発現量が有意に少なかった。前立腺癌細胞LNCaP, PC-3において、survivin遺伝子に対するsiRNA導入による細胞増殖への影響につきMTS assayにて検討し、細胞増殖が有意に抑制された(96時間後,LNCaP:31%分減,PC-3:25%分減)。また、survivinのspliced isoformsであるSurvivin-2α,-2B,-ΔEx3の発現につき検討した。LNCaP, PC-3において、Survivin-2α,-2B,-ΔEx3の発現がみられたが、-ΔEx3の発現は少なかった。-2α,-2Bにつき臨床前立腺組織にてmRNA発現の発現を調べたが、-2α,-2Bともに前立腺癌、前立腺癌ホルモン療法後、および前立腺肥大症の間で発現量に有意差はなく、Gleason score7,8,および9の間でも有意差を認めなかった。一方、臨床腎組織におけるsurvivinとsplice variantsのmRNA発現をrealtime PCRにて定量し、survivinの発現量はM1でM0と比し有意に過剰発現しており(P<0.05)、survivin2BはT3がT1+T2に比し過剰発現していた(P<0.05)。正常腎組織では癌に比し、survivin2αが相対的に有意に多く発現していた。腎癌細胞caki1において、survivin遺伝子に対するsiRNA導入による細胞増殖への影響につきMTS assayにて検討し、細胞増殖が有意に抑制された(96時間後,36%分減)。以上より、前立腺癌および腎癌の増殖には、survivinおよびsplice variantsが関与している可能性が考えられ、survivinの抑制は今後の腎癌治療手段の一つになりうる可能性が示唆された。
低酸素応答における転写因子の核輸送制御機構の解明－水酸化酵素PHDの新しい機能－

これまでにプロテオミクス的手法を用いて網羅的に同定したプロリン水酸化酵素PHD3と結合するタンパク質群の解析を進めた。このアプローチにより得られた核輸送因子AはPHD3と細胞内で結合することが確認された。さらに、同じ質量分析のデータからPHD3は別な酵素Bとも相互作用することが判明したため、分子AとBの間での結合を検証したところ、両者の間にも結合が存在することが明らかになり、PHD3-A-Bの三者で複合体が形成されていることが示唆された。核輸送因子Aが酵素Bと結合することによりその細胞内局在を制御している可能性が考えられたことから、酵素Bの細胞内局在を細胞分画実験により検討したところ、通常は核内に存在する酵素Bが、この複合体が効率的に形成される低酸素環境では有意に減少することが明らかになった。さらに、PHD3と酵素Bの相互作用により、Bが水酸化修飾を受ける可能性を質量分析を用いて検証したところ、水酸化される可能性のある複数の部位の同定に成功した。また、これらの水酸化候補部位に変異を導入した変異体を作製し、解析を進めたところ、いくつかの変異体ではその安定性が著明に低下することが明らかになった。今後は、ここまでの研究成果をまとめるとともに、核輸送因子Aおよび酵素BがPHD3により水酸化を受けることを実証し、その部位を、質量分析を用いて精確に同定したい。また、この水酸化がどのような低酸素条件(酸素濃度、時間)によって変化するのかについても検証したい。最終的に、代表的な低酸素性がんのマウスモデルを用いて、これらの水酸化変異体の解析を実施することで、低酸素性の疾患の発症・発展におけるこれらの分子の生理的意義を明確にしたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、慢性期の低酸素環境で活性化される転写因子CREBの活性制御機構を明らかにするために、CREBをノックダウンした細胞を作製した。この細胞を用いた解析から、新たにCREBはERストレス刺激により活性化されることを見出した。また、がん細胞を長期的な低酸素環境で培養することにより、ERストレス経路とCREB経路が協調的に活性化されることが判明した。したがって、両者がクロストークしながらCREBの活性化状態を維持して、慢性的な低酸素応答に寄与していることが考えられた。この成果は論文として報告した。次に、これまでにプロテオミクス的手法を用いて網羅的に同定してきた、プロリン水酸化酵素PHD3と結合するタンパク質群の解析を進めた。また、質量分析のデータを精査することでAは細胞内で水酸化修飾を受ける可能性が示唆された。そこで、AとPHD3の相互作用を低酸素環境で検討したところ、両者の間の相互作用は変化しなかったものの、Aがさらに別な酵素Bと結合することが判明した。現在、PHD3-A、B間の相互作用がBの細胞内局在にどのように作用するのか、解析を進めている。慢性期の低酸素環境でCREBの活性を制御する分子機構として、CREB経路がERストレス経路とクロストークしながら、活性化状態を維持することを明らかにした。この成果を論文として発表した。また、プロリン水酸化酵素PHD3の新たな水酸化標的タンパク質の候補として、核輸送因子Aを同定した。さらに、PHD3はAに加えて、酵素Bとも結合して、これらの分子は複合体を形成することで、Bの細胞内局在を変化させることが示唆された。これらを達成したことで、本研究計画中の慢性期低酸素下での転写因子の活性制御機構の解析、PHD3とその結合タンパク質の相互作用の分子機序の解析、ならびに、その相互作用を介した細胞内局在変化の解析までを順調に進めることができた。