hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん抑制に関わる選択的スプライシング制御蛋白質の標的遺伝子の同定と認識機構の解明

特定のスプライシング制御蛋白質が,アポトーシス誘導に関わる遺伝子の選択的スプライシングを制御することで,がん化の抑制に寄与すると考えられている。しかし,実際に,この蛋白質が選択的スプライシングを制御する遺伝子の数や種類,標的配列とその認識機構は未知である。そこで,本研究では機能・構造解析によって,この蛋白質によるスプライシング制御メカニズムを明らかにすることを目的とする。この蛋白質にはN末端側にRNA結合ドメインが3つあり(以下トリプルドメイン),この部分がRNA結合を担うと考えられる。そこで,トリプルドメインと標的配列をもつRNA断片との共結晶を作製するため,トリプルドメインの調製を行った。まず大腸菌を宿主とした遺伝子組み換えで発現させ,付加しておいたタグの親和性により精製した後,タグを切断し,さらにゲルろ過によって精製した。しかし,このように調製したサンプルは,わずかに大腸菌由来のRNaseが混在しており,RNA断片を分解してしまった。これまでRNA結合蛋白質を調製してきた経験では,2段階目のクロマトグラフィーでイオン交換を用いると大腸菌由来のRNaseを除去できる。しかし,トリプルドメインは塩濃度を下げると沈殿してしまうためイオン交換を利用できず,ゲルろ過を用いた点が問題だと考えられる。そこで,RNaseを含まない無細胞蛋白質合成系を利用してトリプルドメインを合成して精製したところ,RNA断片の分解は抑制できた。しかし,無細胞蛋白質合成系で合成できたトリプルドメインのうち半分弱が不溶化してしまい,収量が低くなる点が問題となった。今後は,無細胞蛋白質合成系に界面活性剤等を添加して改善する予定である。培養細胞を用いた実験では,この蛋白質の発現を誘導もしくは抑制する準備を進めている。その一つとして,この蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行う予定である。大腸菌を宿主とした遺伝子組み換えで調製した蛋白質試料に,わずかに大腸菌由来のRNaseが混在してしまい,共結晶化させようとしているRNA断片を分解してしまうことがわかった。無細胞蛋白質合成系の利用により,この問題点は解決できることがわかったが,収量が低いため,今後,改善する必要があると考えている。無細胞蛋白質合成系を用いた場合に収量が悪くなってしまう主な原因は,合成された蛋白質のうち半分弱が不溶化してしまう点である。そこで,この合成系に界面活性剤等を添加することで可溶化させる予定である。本年度に結晶化スクリーニングを行う予定であったが,調製した試料に問題があったため,次年度に予定している。したがって,結晶化スクリーニングに必要な消耗品は,次年度に購入予定である。
再発悪性グリオーマ予後不良群に対するBNCTとベバシズマブ併用臨床試験

再発悪性グリオーマの予後は不良であり、標準治療は存在しない。ことに予後不良再発群(J Clin Oncol 25:2601-2606, 2007,以下JCO RPA 3+7群)は、再発後に何らかの補助治療を施行してもその治療以降の生存期間中央値が4.4ヶ月と極めて不良である。この予後不良再発悪性グリオーマに対象を絞って、その予後を改善するために、二つの治療、すなわちホウ素中性子捕捉療法およびベバシズマブ投与のコンビネーションによる臨床試験を行い、その治療効果を明らかにし、ひいては将来の加速器中性子源を用いた再発悪性グリオーマに対する標準治療への布石にすることが本研究の目的である。平成29,30年度とも以下のプロトコールに従い、再発悪性グリオーマ(MG)予後不良群(JCO,RPA 3+7群+Bev使用後再発群)に対して、原子炉BNCTを施行し、その2-4週後より、Bev10mg/kg, biweeklyの投与をRANOの診断基準での悪化まで継続し、全生存(OS)を主要評価項目として、single arm,第二相臨床試験を行う。以上の研究計画を実施予定としており、プロトコールの確立を医療イノベーション推進センター(旧称臨床研究情報センター)とともに行い、CRFも作成し、電子入力システムを構築した。平成29年8月に京都大学原子炉(KUR)が再開後、UMIN上にも本臨床試験を公開し、患者entryを開始したが、その直後からKURが施設上の不具合が発生し臨床試験を2ヶ月間休止せざるを得なかった。現在までに4例の症例のentryを行い、follow-up中である。平成29年度はプロトコールの確立を医療イノベーション推進センター(旧称臨床研究情報センター)とともに行い、CRFも作成し、電子入力システムを構築した。11月再開後4例をentryし、試験治療を行ない、現在follow-up中である。さらに数例の候補患者のscreeningを行ったが、臨床検査値が基準に達せず、また平成31年2月よりKURが保守点検期間に入り、平成31年8月から再開予定であり、その再開を待って臨床試験のentryを行なう予定である。各種学会で本臨床試験の発表を行い、その周知を心がけ、かつ当研究開発者が行なっている複数の臨床試験のアナウンスとともに、電子メールで発信し、本臨床試験の周知に努める。11月再開後1例をentryし、試験治療を行ない、現在follow-up中である。さらに数例の候補患者のscreeningを行ったが、臨床検査値が基準に達せず、また平成30年2月よりKURが保守点検期間に入り、平成30年7月から再開予定であり、その再開を待って臨床試験のentryを行なう予定である。

この予後不良再発悪性グリオーマに対象を絞って、その予後を改善するために、二つの治療、すなわちホウ素中性子捕捉療法およびベバシズマブ投与のコンビネーションによる臨床試験を行い、その治療効果を明らかにし、ひいては将来の加速器中性子源を用いた再発悪性グリオーマに対する標準治療への布石にすることが本研究の目的である。平成29,30年度とも以下のプロトコールに従い、再発悪性グリオーマ(MG)予後不良群(JCO,RPA 3+7群+Bev使用後再発群)に対して、原子炉BNCTを施行し、その2-4週後より、Bev10mg/kg, biweeklyの投与をRANOの診断基準での悪化まで継続し、全生存(OS)を主要評価項目として、single arm,第二相臨床試験を行う。以上の研究計画を実施予定としており、プロトコールの確立を医療イノベーション推進センター(旧称臨床研究情報センター)とともに行い、CRFも作成し、電子入力システムを構築した。平成29年8月に京都大学原子炉(KUR)が再開後、UMIN上にも本臨床試験を公開し、患者entryを開始したが、その直後からKURが施設上の不具合が発生し臨床試験を2ヶ月間休止せざるを得なかった。現在までに4例の症例のentryを行い、follow-up中である。平成29年度はプロトコールの確立を医療イノベーション推進センター(旧称臨床研究情報センター)とともに行い、CRFも作成し、電子入力システムを構築した。11月再開後4例をentryし、試験治療を行ない、現在follow-up中である。さらに数例の候補患者のscreeningを行ったが、臨床検査値が基準に達せず、また平成31年2月よりKURが保守点検期間に入り、平成31年8月から再開予定であり、その再開を待って臨床試験のentryを行なう予定である。各種学会で本臨床試験の発表を行い、その周知を心がけ、かつ当研究開発者が行なっている複数の臨床試験のアナウンスとともに、電子メールで発信し、本臨床試験の周知に努める。物品購入キャンセルが生じたため。次年度は、統計解析に使用予定。次年度は消耗品購入に充当する予定である。
発達障害における音声プロソディの解析的研究

脳神経回路網発達に非定型性があると考えられる発達障害(Neurodevelopmental disorders)児・者の社会的コミュニケーションを円滑にする方法を開発する目的で、非流暢性障害(吃音)や自閉症スペクトラム障害のある幼児・成人の自由発話の諸特性を解析した。今年度はまず非流暢性障害の中核症状である音の繰り返し、引き延ばし、ブロックなどの音声現象や心理的緊張などを記載できる音声ラベリング法を工夫し、非流暢性障害を持つ児童及び成人の発話特性を解析した。学齢期前後の児童の発話を解析した結果、発話文の複雑さと構音の難易度に関連する要因が吃音率や非流暢度など発話特性に有意な効果を示すこと、それらの効果は個人差が大きく発達的変化を示すことを明らかにした。さらに、非流暢性障害のある成人の緊張場面での自発発話を解析するために、心理的指標としてSTAIを、生理的指標として皮膚電導度(EDA)を使用して、吃音頻度・非流暢度やポーズなどの音声プロソディに関連する指標と緊張との関係を解析した。その結果,吃音群では対面場面より電話場面で吃音頻度とSTAIがともに上昇し、緊張の認知的制御特性と発話特性が有意に関連することが明らかになった。これらの結果は、非流暢性障害にはメッセージ生成にかかわる脳神経回路網と音声生成にかかわる脳神経回路網に不整合があり、緊張場面でそれが増大することを示唆する。今後さらに脳神経回路網の非定型性が非流暢性障害とは異なると考えられる自閉症スペクトラム障害の自発話解析を進めるために、ナラティブ題材を開発し音声の録音・解析を開始し、また発話の構文構造や言語運用上の特徴を記載する方法の検討を進めた。今年度は非流暢性障害の中核症状である音の繰り返し、引き延ばし、ブロックなどの音声現象と、心理的緊張など音声以外の付随事象との関係を記載できる音声ラベリング法の検討を進め、非流暢性障害を持つ児童及び成人の発話特性を解析することができ、有意義な成果を得ることができた。また、脳神経回路網の発達上の非定型性が非流暢性障害とは異なると考えられる自閉症スペクトラム障害の自発話解析を進めるためにナラティブ題材を開発し、音声録音と解析方法の検討を進めることができた。1)脳神経回路網の発達上の非定型性に差があると考えられる非流暢性障害や自閉症スペクトラム障害の自発話解析を進めるために、すでに開発したナラティブ題材をさらに改善し、自発話音声の録音と解析を進める。自発話音声の音韻とプロソディの特徴を記述する方法に加えて、文法的属性やコミュニケーション上の音声言語運用上の特性を解析できるラベリング法を開発する(今泉、青木)。2)臨床場面で活用できる使いやすい記述方法とするために、1)で示したラベリング特徴を組み込んで自動ラベリングが可能な手法の開発を検討する(籠宮、今泉)。3)開発した方法を活用して、神経発達障害に特異的な音声プロソディとコミュニケーションを阻害する音声的特徴を明らかにする(今泉、青木、籠宮)。

1)脳神経回路網の発達上の非定型性に差があると考えられる非流暢性障害や自閉症スペクトラム障害の自発話解析を進めるために、すでに開発したナラティブ題材をさらに改善し、自発話音声の録音と解析を進める。自発話音声の音韻とプロソディの特徴を記述する方法に加えて、文法的属性やコミュニケーション上の音声言語運用上の特性を解析できるラベリング法を開発する(今泉、青木)。2)臨床場面で活用できる使いやすい記述方法とするために、1)で示したラベリング特徴を組み込んで自動ラベリングが可能な手法の開発を検討する(籠宮、今泉)。3)開発した方法を活用して、神経発達障害に特異的な音声プロソディとコミュニケーションを阻害する音声的特徴を明らかにする(今泉、青木、籠宮)。自発話音声を録音するための素材つくりと発達障害の音声プロソディ解析に適した韻律ラベリング法の開発に十分な時間をかけたため、実際の音声ラベリング作業に使用予定であった謝金等の支出が予算より少なくなった。自発話音声の録音とラベリングにかける時間が増えるので、繰り越しとなった予算を今年度はその目的に使用する予定である。
肺病変修復過程促進に関する分子生物学的検索-肺胞上皮細胞増殖因子KGFおよびHGFによる肺障害予防効果

1.肺胞上皮細胞増殖因子による肺障害修復過程の促進-これまでの申請者らの研究で、FGFファミリー特にケラチノサイト増殖因子(KGF)が肺胞II型上皮細胞を特異的に増殖させ、かつ肺表面活性物質アポ蛋白遺伝子SP-A、SP-B mRNAsの発現を著明に増加させることが、培養細胞を用いた研究で証明されたことから、このKGFを用いてブレオマイシン肺線維症を軽減できないか検索した。臨床的には、体重減少が軽減、光顕的にも肺障害の抑制効果が観察され、アポ蛋白SP-A、SP-BおよびSP-C mRNAs発現を、in situ hybridization法により検索すると、肺線維化の強いところではこれらの発現が抑制されており、増殖因子KGFの前投与により臨床的、光顕的およびアポ蛋白質遺伝子発現からも障害の改善が観察された。I型およびIII型コラーゲンについて免疫組織学的に検索すると、ブレオマイシン投与によりコラーゲンが著明に染色され、in situ hybridization法によるそのmRNAの検索でも、肺障害部位(免疫染色部位)に一致して銀粒子の増加が観察された。これらの変化は、KGF前投与により軽減されることが証明された。しかし、ノーザン・ブロット法で肺表面活性物質アポ蛋白質およびコラーゲン遺伝子発現を検索すると、ブレオマイシン投与によるSP-A、SP-BやSP-C mRNAの発現抑制はみられなかったが、コラーゲン遺伝子の増加は証明された。このin situ hybridization法とノーザン・ブロット法によるmRNA発現の差異については、肺障害による上皮細胞の減少が関与していると考えられるが、今後さらに探究する計画である。現在、KGFによる肺障害抑制の機序解明のため、KGFによる転写因子(CEBP/α、β、γ、)や肝細胞増殖因子(HGF)などの遺伝子発現動態の検索を進めると共に、KGF後投与でもほかの人工サーファクタントやプロテアーゼ阻害薬との併用効果についても検索予定。2.エンドトキシン肺障害ラットについて、これまで光顕的、電顕的、免疫組織化学的およびin situ hybridization法による検索で肺胞上皮細胞の増殖とアポ蛋白遺伝子SP-A、SP-BおよびSP-C mRNAsの過剰発現を証明し、現在一酸化炭素(NO)遺伝子の発現動態の関与を検索している。3.肺胞上皮細胞のコラーゲン・ゲル内培養による肺胞構造の再構築および肺胞上皮細胞増殖因子によるその促進について検索を進めているが、肺胞様構造の観察およびその細胞に抗PCNA抗体による染色を証明している。現在、in situ hybridization法による遺伝子発現動態を検索中。
アルコール性精巣障害の発現機序に関する研究

アルコールによる種々の臓器障害の中でも、アルコールによる精巣障害に関する研究は精巣間質機能を中心に検討報告され、精巣のもうひとつの機能である造精機能(精細管機能)に対するアルコールによる障害の有無、その機序について検討した報告は殆ど認められない。そこでラットを用い、アルコール性造精機能障害のモデル実験を行った。当初精巣萎縮をきたす栄養条件が不明であったのでアルコール性肝障害を引き起こすとされるLieber処方にもとづいて36Cal%の炭水化物をエタノールで置換した合成液体飼料でモデル実験を行ったが、精巣萎縮は認められなかった。そこでアルコール性肝障害患者の栄養学的背景にもとづいた高脂肪、低蛋白食でエタノールを飼料総カロリーの46%含有する合成液体飼料を与えたところ精巣萎縮が発現した。萎縮精巣の生化学的、組織学的検討から精巣萎縮の実体は精細管内の精細胞の減少、精細管直径の減少として発現するものの、造精障害の主体はSertoli細胞と精細管壁であると考えられた。さらに精巣内アルコール脱水素酵素は精巣質でアルコール代謝に関係していることが示唆された。また6週間の処置後得られたラット血清テストステロン値はアルコール群で対照群より有意に低下していた。しかし6週間後の血清LH値は有意な変動を示さず、血清FSH値はアルコール群で有意な上昇を示した。以上からアルコール性精巣障害の機序には三大栄養素の組成とアルコール濃度が重要な要素であり、障害は精巣間質、精細管の両者で起こり、精細管障害の主体はSertoli細胞と精細管壁であると考えられた。三大栄養素の組成が精巣障害に及ぼす影響を検討する目的でアルコール含有液体飼料(エタノールを飼料総カロリーの46Cal%,蛋白8Cal%,脂肪20Cal%,炭水化物26Cal%含む)を30日齢雄性SDラットに6週間与え精巣障害を作成。これを以下の組成の液体飼料(エタノールは46Cal%含有)で飼育した4群のラットの精巣と比較検討した。1)高脂肪食;脂肪30Cal%,蛋白8Cal%,炭水化物16Cal%。2)低脂肪食;脂肪10Cal%,蛋白8Cal%,炭水化物36Cal%。3)高蛋白食;脂肪20Cal%,蛋白16Cal%,炭水化物18Cal%。4)低蛋白食;脂肪20Cal%,蛋白4Cal%,炭水化物30Cal%。5)ビタミンA大量食。その結果、対象群に較べアルコール含有液体飼料投与群は精巣が萎縮したが三大栄養素の組成が異なる各群間での精巣重量に差はなく組織学的にも光顕、電顕的観察で障害部位、程度の差は見い出せなかった。さらにSertoli cell tight junction(血液精巣関門)の障害はNeavesらの方法に準じたランタントレーサー法を用いて検討したがやはり対象群を除く各群間での差はなかった。当初、アルコール性精巣障害はアルコール精肝障害と同様に三大栄養素の組成がその発現に重要な要因で高脂肪低蛋白食でより発現しやすいと考えていた。しかし各実験群での精巣障害に差が見られず実験動物飼育の進行が遅れた。現在、精巣内ADHの局在を調べる目的で精巣内ADHの抽出を行っている。我々はすでに実験動物を用いたアルコール性造精機能障害のモデル実験を行った。即ちアルコールを46%含有する合成液体飼料でラットを飼育、実験的アルコール性精巣障害モデルを作成し、生化学的、形態学的に精細管、間質の両方に障害が起こることを報告した。今回はこの造精機能障害(精細管障害)が三大栄養素の組成で影響を受けるか、またこの精細管障害は他の実験的精巣障害で認められるセイトリ細胞の細胞間結合(Sertoli Cell tight junction)に影響を及ぼすかどうかを検討した。

アルコールを飼料総カロリーの46%含有する合成液体飼料でラットを飼育、この際基礎栄養素を高蛋白、低脂肪としたものと、低蛋白、高脂肪としたものの2種投与し光顕レベルで組織定量的に、造精機能障害の程度を評価した。アルコールを飼料総カロリーの46%含有する合成液体飼料でラットを飼育、精巣障害を作成。電顕的にセルトリ細胞を観察した。その結果高蛋白、低脂肪食でも、低蛋白、高脂肪食でもアルコール性造精機能障害の程度に差を認めないこと。またセルトリ細胞の微細構造の検討ではSertoli Cell tight junctionに異常を認めず、精巣血液関門の破綻がアルコール性造精機能障害の主因でないことが判明した。これまでのアルコール性精巣障害に関する研究は精巣間質機能を中心に検討報告され、造精機能(精細管機能)に対するアルコールによる障害の有無、その機序について検討した報告は殆ど認められない。そこで実験動物を用いたアルコール性造精機能障害のモデル実験を行った。即ちアルコールを飼料総カロリーの46%含有する合成液体飼料でラットを飼育、実験的アルコール性精巣障害モデルを作成した。その結果すでに、アルコール性精巣障害の成立には三大栄養素の組成とアルコールの濃度が重要な要素であることが明らかとなった。またその障害は精巣間質と精巣管の両方に起こること、さらに精細管障害の主体はSertoli細胞と精巣管壁であると考えられた。平成7年度での実験では、これらの精巣障害に伴う内分泌学的変動を観察し、精巣間質障害と造精機能障害(精細管障害)がどのように関連しているかを検討した。その結果6週間の処置後得られたラット血清テストステロン値はアルコール群で対照群より有意に低下していた。しかも6週間後の血清LH値は有意な変動を示さず、血清FSH値はアルコール群で有意な上昇を示した。これらの変動は精巣間質障害はアルコールによる直接的障害によるのと同様に精細管障害も下垂体を介するもの間接的なものでなく、また間質障害によるテストステロン低下が導く間接的障害でもないこと、すなわち精細管障害もまたアルコールによる直接的障害であることが示唆された。
軟骨・非軟骨細胞におけるマイナーコラーゲン分子の発現機構及び生物活性に関する研究

ルシフェラーゼアッセイを用いて、プロモーター活性をみるとα1(XI)の発現細胞であるA204細胞では-199-65において、非発現細胞のHT1080細胞に比べ有意に上昇していた。この領域に結合する因子を検索する目的でゲルシフトアッセイを行った。その結果、-147-121に結合する因子が存在することがわかり、さらに変異を入れたコンストラクトを作製し解析を行った結果、-140-131の領域がこの因子の結合に重要であることがわかった。2.α1(V)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析マウスのプロモーター領域をルシフェラーゼアッセイを用いて解析した。α1(V)の産生細胞であるA204及びNIH3T3細胞においては-231+39の領域にプロモーター活性を認めた。一方、非産生細胞HT1080細胞においてはその活性が見られなかった。又、ゲルシフトを行い、-250-80の領域において三箇所のタンパクの結合する領域を同定した。そのうちの二箇所は同一又は類似の因子が結合してその活性を下げると思われ、残りの一箇所は逆に上げる因子の関与が考えられた。ヘパリンカラムを用いてリコンビナントのNppの溶出を調べると、このペプチドはヘパリンに対し有意に親和性が見られた。1.α1(XI)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析ルシフェラーゼアッセイを用いて、プロモーター活性をみるとα1(XI)の発現細胞であるA204細胞では-199-65において、非発現細胞のHT1080細胞に比べ有意に上昇していた。マウスα1(XI)鎖遺伝子の-536bp及び-5kbまでのDNA断片を血管平滑筋細胞及び軟骨肉腫細胞にトランスフェクションし、そのプロモーター活性を調べたところ、両細胞共に-536bpの断片にプロモーター活性を認めた。しかし、-5kbではその活性は減少した。さらにこれらのコンストラクトに第一イントロン5'側の10kbの断片を用いて、細胞特異的なエンハンサーあるいはサイレンサー活性を検索したが、明瞭な領域は認められなかった。一方、類似の機能をもつマウスα1(V)鎖遺伝子のプロモーターDNA断片を単離する為に、まずRACE法で5'側のcDNAを単離を試みた。その結果、現在まで単離していたcDNAよりも230bp上流まで伸びたクローンを得ることができた。現在これを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを始めている。2.α1(XI)鎖コラーゲンNプロペプチドの機能解析現在α1(XI)鎖cDNAの重複クローンを用いて、full lengthのcDNAを構築中である。又、スプライシングの多様性がみられる酸性領域及びPARP(プロリン・アルギニン・リッチ・ペプチド)領域のcDNAを用いてGST融合タンパクを作製中である。今後、このペプチドを用いて、軟骨細胞及び平滑筋細胞に対する接着能等の機能を見る予定である。3.α1(IX)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析α1(IX)鎖のプロモーター領域をカバーするDNA断片を単離する為に5'側のcDNA断片を用いて単離した。1.α1(XI)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析前回、報告したプロモーター領域(-541+251)を、ルシフェラーゼアッセイ法を用いてさらに限定した。-65+251までには発現細胞においてプロモーター活性は認められなかった。一方、5′欠失コンストラクトを用いた実験より-199より3′を欠失させると活性が起きることがわかった。この-199-65についてゲルシフトアッセイを行い、-100付近に結合タンパクがみられたが、このバンドは必ずしも発現細胞に特異的なものではない。現在、さらに発現細胞に特異的な結合タンパクの検索を行っている。2.α1(V)鎖コラーゲン遺伝子のプロモーター領域の同定マウスα1(V)の5′のcDNAを用いてプロモーターのDNA断片を単離した。RACE及びRNaseプロテクション法を用いて転写開始点を決定した。転写開始点は複数存在したが主要な開始点は第1メチオニンをコードするコドンの上流の361bpのところであった。発現細胞である横紋肉腫細胞A204を使って、ルシフェラーゼ活性を測定したところ-228+89にはプロモーター活性がみられた。

α1(XI)鎖Nプロペプチド(PARP:プロリン・アルギニン・リッチ・ペプチド)のGST融合タンパクを作製した。このペプチドの生物活性(特にヘパリンに対する親和性)を検討中である。1.α1(XI)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析ルシフェラーゼアッセイを用いて、プロモーター活性をみるとα1(XI)の発現細胞であるA204細胞では-199-65において、非発現細胞のHT1080細胞に比べ有意に上昇していた。この領域に結合する因子を検索する目的でゲルシフトアッセイを行った。その結果、-147-121に結合する因子が存在することがわかり、さらに変異を入れたコンストラクトを作製し解析を行った結果、-140-131の領域がこの因子の結合に重要であることがわかった。2.α1(V)鎖コラーゲン遺伝子の発現調節機構の解析マウスのプロモーター領域をルシフェラーゼアッセイを用いて解析した。α1(V)の産生細胞であるA204及びNIH3T3細胞においては-231+39の領域にプロモーター活性を認めた。一方、非産生細胞HT1080細胞においてはその活性が見られなかった。又、ゲルシフトを行い、-250-80の領域において三箇所のタンパクの結合する領域を同定した。そのうちの二箇所は同一又は類似の因子が結合してその活性を下げると思われ、残りの一箇所は逆に上げる因子の関与が考えられた。ヘパリンカラムを用いてリコンビナントのNPPの溶出を調べると、このペプチドはヘパリンに対し有意に親和性が見られた。
病態におけるロイコトリエン類の役割と5ーリポキシゲナーゼ阻害薬の治療への応用

ロイコトリエン(LT)類の病態における役割を知るために次のいくつかの実験を行い、生体内で重要な働きをしていることがわかった。1.LT類の簡便な抽出精製法の開発:ラジオイムノアッセイで測定するためには抽出精製が必須である。試料をpH3.5以下の酸性にし、すばやくSEPーPAKC_<18>カラムで抽出精製すると、90%以上の回収率でよい結果が得られた。2.ツベルクリンによるラット胸膜炎:結核死菌で感作し遅延型アレルギー胸膜炎をおこすと、血漿滲出は3,918,48時間にピークを示し、これにブラジキニン、プロスタグランジンの関与はあったがペプチドLTの関与はなかった。また好中球、単核球の浸潤について、LTB_4も補体も関与しなかった。3.ラット心筋梗塞:左主冠動脈を結紮すると左室の50%が虚血になるが、周囲より次第に血流が入り、48時間後には27%に縮小し、左心室の42%が12時間までに梗塞となった。好中球は12時間までの増加と1224時間までの著しい増加の二相性で心組織に浸潤した。LTB_4が心組織内で8時間をピークとして増量し、5ーリポキシゲナーゼ阻害薬(AAー861)を予め投与すると第一の好中球増加が著しく抑制された。1224時間の第二の増加は補体の活性化により起った。第一の好中球増加は34%の梗塞巣拡大に重要な役割を演じていた。4.エタノールによる胃粘膜障害:ラットの胃内腔に3分間30%エタノールを投与すると直ちに集合細静脈を中心に毛細血管にうっ血が生じ血流が停止した。この時胃壁内にはLTC_4が4.4ng/胃(6倍)に増大した。LTC_4により集合細静脈基部で収縮がおこるらしくAAー861で胃のうっ血が著しく抑制された。5.ハムスター頬袋の微小循環:LTB_4を微小血管表面に投与すると、細静脈内壁に好中球が転がり、粘着し、その数の90%以上が内皮細胞間を通過するが、内皮細胞と周細胞との間隙に停留し、30分以上たつと始めて周囲の組織に出現した。1.ロイコトリエン(LT)測定法の検討:80%エタノールで抽出した試料をPH3.5に調整しSep-pakC18で精製することにより、LTが効率よく分離出来,【LTB_4】をRIAで測定した。【LTC_4】の抗体は【LTD_4】と50%の交又反応性を示すので両者を区別する時にはHPLCにより分離後測定した。2.ラット遅延型アレルギー性胸膜炎の時間経過:結核死菌を抗原としてラットを感作し、3週間後に結核死菌を胸腔内に注射して胸膜炎を作成した。滲出液量は3時間に小さいピークを示した後,9時間で急に増加し18時間にピークを示す。その後30時間まで僅かに減少した。

静注色素量からみた血漿蛋白質滲出量は3時間と915時間にピークがあり、その後漸次減少した。滲出液中の多核白血球数は3時間でプラトーに達し、単核球は18時間から48時間まで徐々に増加した。予備実験では3.9時間に【LTC_4】,【LTB_4】はほとんど検出されなかった。5-リポキシゲナーゼ阻害薬(AA-861,80mg/kg.P.O.)投与により15時間のみ抑制された。血漿キニン系の関与は認められていない。3.微小循環レベルでの多核白血球(PMNL)游走:ハムスター頬袋を用い【LTB_4】によるPMNLの細静脈内壁粘着を昭和61年度に購入した超高感度カメラ(C2400-08)によりVTRに記録することが出来た。細静脈内壁粘着後,PMNLは流れに逆って立ち上り、45分間そのままの状態に留った後30秒位で急速に内皮細胞間を通過し結合組織間を游走するのが記録された。今後PMNLをacridine-orangeで染色し蛍光標識して、連続記録,定量化する予定である。4.ラット心筋梗塞モデル:左主冠動脈を結紮し48時間まで、心虚血巣への血液の再流入,梗塞巣の大きさの拡大,PMNL数をそれぞれ特殊染色後に定量化した。PMNL数のピーク(24時間)より前の8時間に心組織内【LTB_4】がピークを示し、AA-861で、【LTB_4】,PMNL,梗塞巣が抑制された。1.ラット遅延型アレルギー性胸膜炎の解析:結核死菌をラットに皮下注射し3週間後に右胸腔内に結核死菌を注射して遅延型アレルギー胸膜炎を作った. 20分間の血漿滲出量を静注色素の漏出量として測定すると,抗原投与3時間に小さいピークがみられるが918時間に大きなピークがあり, 96時間まで次第にこの血漿滲出速度は減少し,確かに遅延型アレルギー反応がおこっていることがわかった.滲出液量は6時間から著しく貯留し始め18時間でピークとなった.浸潤細胞数は多核白血球が9時間まで増加し以後漸減した.単核球数は9時間より48時間まで除々に増加した.滲出液中の血漿カリクレインーキニン系の前駆体量が血漿より減少し消費がおこったと推測された.またブロメライン静注により血漿カリクレインーキニン系前駆体を枯〓させたラットで胸膜炎をおこしてみると, 3,9,15,18時間の血漿滲出が抑制され血漿キニンが血漿滲出に関与すると思われた.アスピリンを血漿滲出1時間前に投与すると9,15,18時間の血漿滲出が抑制されこの時間帯にプロスタグランジンが関与すると予測された.5ーリポキシゲナーゼ阻害薬のAAー861投与では各時間とも有意な抑制はみられなかった.2.微小循環レベルにおける多核白血球血管外游走の解析:ハムスター頬袋の微小循環を用いLTB_4で局出潅流すると多核白血球が細静脈内壁に粘着するが,これらはやがて内壁に向って立上り,内腔から急速に消失した.平均消失時間は7分で, 14分位たって周囲の組織間隙に認められることもあった.用量に拘らず粘着した白血球の90%以上が内腔より消失し,粘着が浸潤に重要なステップであることが確認された.cyclic AMP Phosphodiesterase阻害薬のDNー9693を投与すると粘着した多核白血球が再び内壁から血流にもどることが明らかとなった.1.ラット・ツベルクリンによる遅延型アレルギー性胸膜炎:ウシ結核死菌で感作後,再び結核死菌をラット胸膣内に投与しておこす胸膜炎は,3,12,48,時間をピークとする血漿滲出があり、第一のピークはヒスタミンセロトニン、第二のピークは血漿キニン,プロスタグランジンと考えられた。好中球は9時間でピークとなり、単核球は48時間まで徐々に増大した。両者の炎症巣への動員につき、LTB_4、補体の関与は9,18,48時間の時点で全く認められず、現在新しい走化因子の単離を始めている。2.微小循環レベルにおける多形核白血球血管外遊走機序の解析:LTB_4により血管外遊走には(1)血管内皮細胞内壁への粘着,(2)内皮細胞間通過,
ナノメートルオーダー分子膜のレオロジー特性と油膜温度分布の関係

本年度9月まではフランス共和国INSA deLyonで,ガラス・鋼球間での滑り接触時に発生する特異油膜形状(ディンプル)のレオロジー特性を調べることを目的とし,圧力及び油膜厚さの測定を行った.圧力分布の測定は,Raman分光装置によって測定されるスペクトルの圧力依存性を利用して行った.油膜厚さの計測は,前年度に測定油膜厚さ領域の拡大を行った二色光干渉法に基づいた計測システムを用いた.その結果,滑り率が高くなると出現する特異油膜形状内では,局所的に圧力が上昇し,純転がり条件と比較して最高圧力が2倍近くにまで上昇することがわかった。帰国後は,INSA deLyon所有の実験装置で設定可能な運転条件より,さらに広い範囲での実験が可能となるよう,実験装置を設計,製作した.この実験装置は,ディスク,オールともに個々独立に回転制御できるようにし,実験温度も高精度に制御できる構造とした.油膜厚さの計測は顕微鏡を用いた光干渉法により行い,昨年度行ったアルコール潤滑下での実験で示したようなIN以下の微小摩擦力も測定可能とした.今後の課題としては,本年度の研究対象としたガラス・鋼球間で発生するディンプルのような熱的な要因で発生するものについては「温度および圧力と固化・壁面滑りとの関係の解明」を行い,弾性流体潤滑条件での詳細なレオロジーマップを作成することが最初にあげられる.そして,ナノメートルオーダー厚さでの潤滑膜のようなせん断率が極めて高い条件でのレオロジー特性を測定し,ナノメートルスケールの現象である油膜破断などのメカニズム解明に役立てることが最終的な目標であると考えられる。平成17年度はフランス共和国INSA deLyonのPhilippe Vergne主任研究員の下で定常条件での弾性流体潤滑膜(EHL)のレオロジー特性を調べるための実験を行った.実験には,既存のボールオンディスク型の実験装置を用い,油膜厚さ分布,油膜内の圧力分布,トラクション係数の測定を行った.圧力分布の測定は,Raman分光装置によって測定されるスペクトルの圧力依存性を利用して行い,油膜厚さの計測は,数nmまで測定可能な光干渉法に基づいた計測システムを用いて行った.実験は,大きく分けて二種類の条件を設定して行った.一つは,単純な分子構造を持ち,表面との反応性の高い潤滑油としてアルコールの一種であるDodecanolを用い,ガラス・鋼球間での油膜厚さの計測を行った.その結果,以下のことが明らかとなった.純転がり条件では通常の油膜形状と同一のものであったが,二面間の滑りの増加にともない,油膜厚さが変化し,純転がり条件と比較して油膜が厚くなることが明らかとなった,また,その形状もこれまで計測されてきたものとは大きく異なることを明らかにした.もう一方の実験ではこれまで発見されてきたdimple内の圧力分布の測定をRaman分光測定機で行うため,その準備段階として,純転がり条件での圧力分布の測定を行った.その結果,EHL油膜内の圧力分布が平均圧力1GPa程度の圧力分布を分解能30MPa以下と高精度に計測できることが確認できた.また,dimple内の圧力分布は,純転がり条件よりも最高圧力が高く,圧力勾配も急となるので,最適な空間分解能の検討を行った.本年度9月まではフランス共和国INSA deLyonで,ガラス・鋼球間での滑り接触時に発生する特異油膜形状(ディンプル)のレオロジー特性を調べることを目的とし,圧力及び油膜厚さの測定を行った.圧力分布の測定は,Raman分光装置によって測定されるスペクトルの圧力依存性を利用して行った.油膜厚さの計測は,前年度に測定油膜厚さ領域の拡大を行った二色光干渉法に基づいた計測システムを用いた.その結果,滑り率が高くなると出現する特異油膜形状内では,局所的に圧力が上昇し,純転がり条件と比較して最高圧力が2倍近くにまで上昇することがわかった。
鑑賞体験を重視したアニメーション・インスタレーションの研究

本年度は身体感覚と連動するアニメーションを制作し、展示した。鑑賞者の姿勢をカメラから入力し、姿勢判断システムによって立っている状態や座っている状態、下を向いている状態などを判断し、それに合わせてキャラクターがポーズを取る。このインスタレーションを発達障がいワークショップで使ったところ、キャラクターと熱心に遊ぶ様子が見られた。特に自分と同じポーズをとらせることに面白さを感じる子供が多く、キャラクターが自分を真似するまで自分でポーズをとり続けるなどの関わり方をする様子が見られた。特にリアプロジェクションによって等身大のキャラクターと直接向き合えるようにした状態で、鑑賞者と同じ姿勢をとったり挙動に反応したりすることが有効であった。また複数のキャラクターが独立に動いている時に人間が来ると止まって見つめるインタラクションを組み込んだアニメーション・インスタレーションを展示し、それに基づいて時間軸要素について検討を行った。このインスタレーションでは複数のキャラクターが独立に動くことで多様なパタンの組み合わせが出来るので、キャラクターが一つだけのときよりも見ていて飽きない効果があった。一方で、複数キャラクターの状態遷移を表すのには複数の時間軸が必要になり、状態遷移の扱いが複雑になる。そのため各状態と、状態間での可能な遷移とをあらかじめ定義してプログラムの中から参照する実装方法を作り出した。これにより複雑な状態遷移を明示的に記述できるようになった。およびプロジェクションを使ったアニメーション・インスタレーションの実践と、それにもとづく複数の時間軸の分析、および状態遷移の実装方法について研究を進めることができたため、当初計画通り進展している。最終年度にあたって、パブリックな場所でのアニメーション・インスタレーションの展開と、それを実現する過程で状態遷移の実現方法について研究を進化させたい。2017年4月には、南カリフォルニア大学(USC)映画芸術学部で行われたRhythms + Visions / Expanded + Live 3に上平晃代が「オオカミのゆりかご」を出展した。この展示会は一晩だけの短時間であったが、数千人の来場者がUSCのキャンパスを訪れ、アニメーション・インスタレーションの鑑賞の様子を観察するのに適した機会であった。これまで同作品はフロントプロジェクションで展示していたが、今回リアプロジェクションで展示することにより、鑑賞者がアニメーションのすぐ正面の触れるような位置に立てるようになった。実際にプロジェクションされている映像を触りにくる来場者も多く、映像でありながら触覚を通したインタラクションが自然に起こる状況を観察することができた。映像と触覚との連動の必要性が明確になったことは、本年度予定していた研究計画(1)アニメーション・インスタレーションの要素分析の成果である。また2017年9月には、メディアアート分野で世界最大の展示会であるアルスエレクトロニカ・フェスティバルにおいて、ユークリッド(佐藤雅彦、桐山孝司)として「指紋の池」を展示した。同フェスティバルも数万人の来場者があり、多数の鑑賞者がインスタレーションを体験した。この作品では、一度スキャンした指紋がディスプレイの中に入り、もう一度スキャンすると自分のところに戻ってくる。指紋が戻ってくるアニメーションを見ることで、鑑賞者が指紋に対して特別な感情を持つようになる様子が観察された。また同時に、指紋が帰ってくるときの動きのバリエーションを増やすことでより自分の指紋と感じられるアニメーションにすることが有用であるとの知見が得られた。大規模なイベントでの展示を2回にわたり行なったことで、多くの鑑賞者を観察することができた。そのため本年度の計画(1)アニメーション・インスタレーションの要素分析、を大きく進めることができた。本年度の計画(2)制作支援環境の構築、についてはまだ着手したばかりであり、今後の継続的な研究が必要であるが、具体的な作業は見えており、概ね順調な進行状況である。来年度も引き続き、アニメーション・インスタレーションに有用な要素をさらに分析するとともに、それを展示に反映して実際の場で観察することを行なっていく。さらに状態遷移を容易に組み込めるようなプログラミング環境や、映像とセンサーの融合など、アニメーション・インスタレーションの実現環境や技術課題を整備していく予定である。

最終年度にあたって、パブリックな場所でのアニメーション・インスタレーションの展開と、それを実現する過程で状態遷移の実現方法について研究を進化させたい。予定よりも物品費を節約できたため次年度の物品費として繰り越す。物品費に使用する予定であったが互換性の確認から延期になったため。
生体機能分子の創製の研究統括

平成20年6月に、取りまとめの公開シンポジウムをタワーホール船堀(東京)にて実施した。このとき代表的な研究成果を中心に公開し、成果を社会に対して発信した。これらの研究成果は、生命現象の化学的解明に飛躍的な進展や新戦略による創薬にも直結するため、製薬に代表される産業界においても有用であり、公開シンポジウムでは企業の研究者も幅広く参加した。また、本特定領域研究では、各研究項目の計画研究班員と公募班員の間での緊密な共同研究体制を構築することを重要課題として掲げた。これまで、公開シンポジウムやHPにより研究者の相互の理解を深め、有機的連携と緊密な共同研究体制を構築した。現在までに、30組以上の領域内共同研究が進行中であり、成果があがりつつある。また、最終報告も平成21年3月に作成した。この最終報告書にはおのずと解決された問題と、さらに解決されなかった問題(既存の学術誌等には投稿できない)が例示されることとなるため、この方面の研究者にとって研究課題が容易に見つけ出せるバイブル的な存在になるように留意し整理した。また、班員、研究協力者、班友の業績を中心としたテキスト「天然物の全合成: 20012008」の編纂を行った。現在最終校正の段階にあり、平成21年中に発売可能な状態にある。本特定領域ではすでに50を超える生理活性天然物(生体機能分子)の全合成を達成している。それらを網羅する本書は、インパクトが大きい。本研究では、特異で重要な機能を持った稀少活性天然物質とその各種標識分子や設計分子などの「生体機能分子」を高効率的かつ独創的に創造する合成プロセスの確立とそのための革新的合成反応の開発、これら生体機能分子をプローブとして分子レベルでの生命機能の解明を総合的に推進することを目指している。この問題の解決には、有機合成化学の力を結集するとともに、分子生物学、生物有機化学に精通した研究者を所属機関の枠を越えて結集し、各研究者の間での緊密な情報交換に基づく共同研究の促進が不可欠である。総括班では、本特定領域研究の円滑な遂行のため、全体計画の運営と取りまとめを行っている。本年度は、研究の遂行に必須となる大型機器(NMRとMass)の導入を行い、共同利用に活用する準備を達成した。また、それぞれの研究項目における計画研究も開始し、これらの各班員の研究の進行状況の迅速な公開と情報交換のためにホームページの充実も行った。また、ホームページでは本研究分野を一般の方に啓蒙するためコーナーの設立も検討した。さらに、有機合成化学を専門とする班員を中心として、有機反応論の反応機構の問題集作成に協力した。これらは研究の推進だけでなく、本研究分野の一般社会における底辺拡大に貢献していると考えている。また、次年度から始まる全体シンポジウムにおいて、領域研究の評価グループからの意見を全体計画に円滑の反映させるための内容の検討を行った。さらにシンポジウムでは、討議を充実させるために各班員全員のポスター発表を行なうことを計画しており、その準備も整えた。さらに、ポスターの内容をショートレポートとして班員専用のサイトに掲載することも計画した。本特定領域研究では、学術的かつ社会的に価値ある優れた生体機能分子の探索、それらを自在に合成する独創的合成設計の確立と革新的合成反応の開発、さらに高機能化した分子プローブを用いた分子レベルでの生命現象の解明を総合的に推進することを目的としている。このように総合的な研究課題である本特定領域研究「生体機能分子の創製」を強力かつ円滑に推進するためには、各研究項目の計画研究班員と公募班員の間での緊密な共同研究体制を構築することが重要である。本年度、本総括班では25名の計画研究と105名の公募研究の採択を行い、これら研究の情報交換の場としてホームページを開設するとともに、研究題目と研究概要を含めた班員名簿の作成を行った。さらに、6月には東京大学薬学部で第1回全体会議を開催し、計画班員による研究概要紹介と研究成果報告を行った。「新たな生体機能分子のシーズとなる活性天然物質の探索および生物活性評価系の構築」を主目的とする4班については、公募班員全員の研究概要紹介を実施することにより、研究者相互の有機的連携を図るとともに緊密な共同研究体制を構築した。また、11月には京都薬科大学にて、第一回公開シンポジウムを開催した。本シンポジウムでは、12名の口頭発表に加えて計画および公募班員全員によるポスター発表を行った。本ポスター発表では活発な議論が交わされ、その結果としていくつかの共同研究が開始されている。12月のホノルルのPACIFICHEM 2005の際には、福山代表が主催した「Total Synthesis of Natural Products」シンポジウムのスピーカーと本特定領域研究の研究員による、意見交換会を開催した。本年度、本総括班では23名の計画研究と85名の公募研究の採択を行い、研究題目と研究概要を含めた班員名簿の作成を行った。

これまで公開しているホームページに、班員専用ではあるが掲示板を作成し、班員相互間の情報交換を密に行える環境を整備した。さらに、6月には仙台国際センターで、また12月には東京大学弥生講堂にて、第2回および第3回公開シンポジウムを開催し、口頭発表を主とした研究成果報告を行った。また、第3回公開シンポジウムでは、口頭発表に加えて計画および公募班員全員によるポスター発表を行った。それぞれ200名近い研究者が参加し、活発な議論が行われた。さらに第3回公開シンポジウムの終了後、評価者会議を開催し、本特定領域の現状および今後について議論を行った。評価者からはより広くシンポジウムを周知すべき等、数多くの意見が出された。今後の領域運営に活用していく予定である。本特定領域研究では、学術的かつ社会的に価値ある優れた生体機能分子の探索、それらを自在に合成する独創的合成設計の確立と革新的合成反応の開発、さらに高機能化した分子プローブを用いた分子レベルでの生命現象の解明を総合的に推進することを目的としている。このように総合的な研究課題である本特定領域研究「生体機能分子の創製」を強力かつ円滑に推進するためには、各研究項目の計画研究班員と公募班員の間での緊密な共同研究体制を構築することが重要である。本年度、本総括班では23名の計画研究と85名の公募研究各班員の、研究題目と研究概要を含めた班員名簿の作成を行った。またこれまで公開しているホームページへのアップロードし随時行い、情報の公開に務めた。さらに、6月には北海道大学学術交流会館で、また12月には千里ライフサイエンスセンタービル・ライフホールにて、第4回および第5回公開シンポジウムを開催し、口頭発表を主とした研究成果報告を行った。また講演要旨集を作成した。昨年度の評価者会議で出された意見をもとに、公開シンポジウムの宣伝活動にも力をいれ、製薬企業をはじめとする多数の企業研究者の参加があった。さらに第5回公開シンポジウムの終了後、評価者会議を開催し、本特定領域の現状および今後について議論を行った。評価者から本研究領域の今後の展望を含め、数多くの意見が出された。平成20年6月に、取りまとめの公開シンポジウムをタワーホール船堀(東京)にて実施した。このとき代表的な研究成果を中心に公開し、成果を社会に対して発信した。これらの研究成果は、生命現象の化学的解明に飛躍的な進展や新戦略による創薬にも直結するため、製薬に代表される産業界においても有用であり、公開シンポジウムでは企業の研究者も幅広く参加した。また、本特定領域研究では、各研究項目の計画研究班員と公募班員の間での緊密な共同研究体制を構築することを重要課題として掲げた。これまで、公開シンポジウムやHPにより研究者の相互の理解を深め、有機的連携と緊密な共同研究体制を構築した。現在までに、30組以上の領域内共同研究が進行中であり、成果があがりつつある。また、最終報告も平成21年3月に作成した。
扁形動物プラナリアを用いた脳障害モデルの作成およびその修復・再生機構の解析

扁形動物プラナリアは、最初に「脳」と呼べる集中神経系を獲得した生物である。また、プラナリアの神経には哺乳動物と同様、各種神経伝達物質を産生していることが知られている。ヒトを含め哺乳動物は多様に進化し、脳も複雑に構築され、機能・調節されている。このため、これらを直接解析すると本質がどこにあるのか区別できなくなることがある。本年度は、最近、ヒトにパーキンソン病の原因環境因子として注目された農薬のロテノンについて検討した。ヒト神経芽細胞SH-SY5Y細胞およびプラナリアにおける障害を比較検討した。ヒトSH-SY5Y細胞においてロテノンによる細胞死にはカスパーゼ9および3の活性化が関与していた。また、この細胞死は非選択的カスパーゼ抑制薬およびBcl-2蛋白質により阻害された。プラナリアは1μMロテノン処置すると数日後に、個体が溶解し、死に至った。この時、DNA分解が観察された。この個体死は、非選択的カスパーゼ抑制薬およびパーキンソン病治療薬の高濃度タリペキソール、プラミペキソールにより抑制された。また、DNA分解もカスパーゼ抑制薬により抑制された。以上のことから、下等なプラナリアからヒトまで、ドパミン神経の細胞死に共通の機構が存在することが示唆された。一方、in vitro実験系で、α-シヌクレイン蛋白質は過酸化水素およびチトクロムcにより凝集した。この凝集は、高濃度タリペキソールおよびプラミペキソールにより抑制された。これらの結果から、扁形動物プラナリアからヒトまで、基本的なドパミン神経機能および細胞死メカニズムが保存されていること、つまりプラナリアはラットなどを用いた実験動物モデルの代替モデルとして有用であること、これを用いた薬物のスクリーニングが可能なことが示唆された。そこで本年度は、ヒトにパーキンソン病様症状を引き起こすドパミン神経毒素MPTPを用い、プラナリアおよびマウス、さらにヒト神経芽細胞SH-SY5Y細胞における障害を比較検討した。マウスにMPTPを投与すると、黒質のチロシン水酸化酵素(TH)陽性神経細胞が脱落した。また、この時、α-シヌクレインおよびparkin陽性神経細胞も脱落することを見出した。プラナリアに1mMMPTPを投与すると数日後に、個体が溶解し、死に至った。一方、低濃度では個体の一部が溶解されるが、その後もとの正常個体に修復・再生された。MPTPによるプラナリアの個体死は、D2-ドパミン受容体アゴニストのタリペキソールおよびプラミペキソールにより完全に抑制された。また、カスパーゼ抑制薬によっても個体死は抑制された。ヒトSH-SY5Y細胞においてMPTP代謝産物のMPP^+による細胞死はDNA断片化を伴うアポトーシスであるが、この細胞死もタリペキソールおよびプラミペキソールにより部分的に抑制された。今後、その詳細なメカニズムを解析していく予定である。

また、プラナリアの神経には哺乳動物と同様、各種神経伝達物質を産生していることが知られている。ヒトを含め哺乳動物は多様に進化し、脳も複雑に構築され、機能・調節されている。このため、これらを直接解析すると本質がどこにあるのか区別できなくなることがある。本年度は、最近、ヒトにパーキンソン病の原因環境因子として注目された農薬のロテノンについて検討した。ヒト神経芽細胞SH-SY5Y細胞およびプラナリアにおける障害を比較検討した。ヒトSH-SY5Y細胞においてロテノンによる細胞死にはカスパーゼ9および3の活性化が関与していた。また、この細胞死は非選択的カスパーゼ抑制薬およびBcl-2蛋白質により阻害された。プラナリアは1μMロテノン処置すると数日後に、個体が溶解し、死に至った。この時、DNA分解が観察された。この個体死は、非選択的カスパーゼ抑制薬およびパーキンソン病治療薬の高濃度タリペキソール、プラミペキソールにより抑制された。また、DNA分解もカスパーゼ抑制薬により抑制された。以上のことから、下等なプラナリアからヒトまで、ドパミン神経の細胞死に共通の機構が存在することが示唆された。一方、in vitro実験系で、α-シヌクレイン蛋白質は過酸化水素およびチトクロムcにより凝集した。この凝集は、高濃度タリペキソールおよびプラミペキソールにより抑制された。
フェムト秒時間分解X線吸収分光法による核波束振動の構造追跡

フェムト秒の時間幅を持つX線自由電子レーザーは、フェムト秒化学に新たな進化をもたらすツールである。特に時間分解X線吸収分光において元素選択的に局所構造の超高速変化の追跡が可能となり、化学反応中の分子構造について全く新しい知見をもたらすことが期待されている。本研究では、溶液中で光励起された金属錯体が緩和する際に起こる核波束振動の局所的な構造変化を原子分解能で観測する。申請者が確立したタイミング揺らぎの補正技術を用いることにより、世界最高の時間分解能の50フェムト秒で分子構造のリアルタイム動画を実現する。
北大西洋18・1.9世紀の人口移動における移民貿易業界の役割について

研究者は、世界的規模の移民史考察のフレームワーク、人口移動・労働力移動のフレームワークを提示する第1段階として、北大西洋18・19世紀に存在した移民貿易業界のネットワークの実態を検証しようとしている。単に移民を押し出すプッシュ側の移出要因と、移民受け入れのプル側の要因の考察に終始する均衡論方法だけでは、移出と移入の相互の関係が解明できず、中間に存在するメディアである移民業界の考察が必須だと考えたからである。また、、世界的規模の移民考察のフレームワークというとき、様々な人口移動・労働力移動のキーになるのは、様々な個々の研究を括ることのできる移民業界の存在ではないかといえるからでもある。こうした見地から、昨年度は、船会社の文献研究と移民史の学説整理をしたが、本年度は、そうした研究をさらに重ねたほか、アメリカとイギリスの移民関連法についてもさらに検証を加えた。また、「移民書簡」「移民文学」などにも研究を進めた。さらに、ドイツからの移出についても、リバプールからの移民を補完するために、移民形態を研究し始めた。今後は、スカンディナビアからの移出についても同様に、考察する必要があるので、来年度はそれに終始するつもりである。平成3年度・4年度の研究成果は、今後、数編の論文にまとめて順次公表するつもりであるが、今回はその第1として、「大西洋航路の開設と移民業界について」まとめた論文を、この研究報告書に添付する。1817年に始まったパケット便により定期航路の開設に意味を分析し、移民貿易の実態を浮き彫りにしようとするものであるが、航行途上の問題だけでなく、大西洋両岸での船会社、船長、移民代理業者、旅館業、鉄道業、金融業などによるネットワークの存在を解明しようとするものである。