hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サルモネラのプラスミド性ビルレンス蛋白質の細胞局在性,精製および機能

培地で培養したE.coli JM109/pMKD601株(spvRABC遺伝子クローン化プラスミドを保持する大腸菌)、合成ペプチド抗体(一次抗体)および10nm金コロイド標識抗ウサギIgG抗体(二次抗体)を用いて免疫電顕によるSpvタンパク質の局在性を解析した。種々検討した条件の内で特記すべき点は、Spurr樹脂包理剤を用いることによってタンパク質の局在性の解像力が上昇したことである。SpvA合成ペプチド抗体を用いた解析によってSpvAタンパク質は細胞質に局在することが明かとなった(第71回日本細菌学会関東支部総会発表予定)。平成6年度は引き続き他のSpvタンパク質の細胞局在性について解析する。1.Spvタンパク質の機能:SpvR、SpvA、SpvB、SpvCタンパク質のうち、SpvRはspvABC遺伝子の発現を正に調節するポジテイブ調節因子であることを既に明らかにしている。本研究では、spvRの発現はSPVRによって正に調節され、SpvAまたはSpvBによって負に調節されていることが明らかになった。また、spvRの発現は培養の定常期に活性化すること、その発現はRpoSに依存していることが明らかになった。2.Spvタンパク質の分離と精製:S.Choleraesuis RF-1株(50kbビルレンスプラスミド保持株)の培養菌体をフレンチプレスで破壊して出発材料とした。種々のカラムを用いてSpvタンパク質の分離精製を試みた結果、SpvR、SpvA、SpvB、SpvCは他のSPVタンパク質から分離された。Spvタンパク質の分子量はSpvR;31kDa、SpvA;26kDa、SpvB;73kDa、SpvC;24kDaであった。(SDS-PAGEによる)。また、SpvBは疎水性に富み、SpvCは塩基性に富む蛋白質であることが明らかになった。3.Spvタンパク質の細胞局在性;最初に、大量発現系(spvRABC遺伝子クローン化プラスミドを保持する大腸菌株)を用いて免疫電顕の条件を検討した。次にこの条件を用いて親株(S.CholeraesuisRF-1株)のSpv蛋白質の細胞局在性を調べた。その結果、SpvCは細胞質および外膜に存在する蛋白質であることが明らかになった。今後は、この方法を用いて他のSpvタンパク質の局在を調べるつもりである。
ニコチン酸(ビタミンB3)の作用から脂肪肝治療の新たな標的分子を解明する

MSG投与による肥満・脂肪肝・脂肪肝炎モデルマウス(MSGマウス)に対してニコチン酸を投与したところ、脂肪肝の発症を完全に抑制し、完成した脂肪肝をほぼ正常な組織所見にまで改善させた。脂肪肝抑制のメカニズムとして、ニコチン酸の作用機序からは肝臓への脂肪酸動員と食後高脂血症の抑制が予測された。絶食・再摂食試験を行ったところ、ニコチン酸投与群では食後の遊離脂肪酸とTGが低下しており、少なくとも機序の一部であることが明らかになった。マイクロアレイ解析では、様々なパスウェイの関与が考えられたが、特にアポリポ蛋白A-IVと、PNPLA3がニコチン酸によって大きく変化していることが示された。計画書に記載した通り、我々は、ニコチン酸がMSG投与マウスの脂肪肝発症を抑制することを示しているが、ニコチン酸が完成した脂肪肝を"治療"する効果を有するかについても検討した。明らかな脂肪肝を呈することが既に確認されている12週齢のMSG投与マウスに対して、0.5%ニコチン酸またはvehicleを混餌投与して12週後に効果を確認したところ、ニコチン酸投与群では肝重量がvehecle群より明らかに少なく、組織所見でもNAFLD activity scoreが0点と、脂肪肝を全く認めないレベルにまで改善しており、治療効果を確認しえた。他の報告でも汎用されている肥満マウスへの効果を確認するため、高脂肪・高コレステロール食を負荷したC57BL/6マウスにvehicleまたは0.5%ニコチン酸を投与した結果では、脂肪肝の改善はわずかであり、ICR系統のMSG投与マウスで得られたような改善効果を認めなかった。次に、ニコチン酸の投与量を0.1%に減量し、MSG投与マウスで効果を確認したが、0.5%投与マウスと同等の脂肪肝改善効果を得られることを確認した。ニコチン酸投与による食後高血糖の上昇も、0.5%ニコチン酸と比較して軽度であった。上記の知見により、MSGマウスに対してはニコチン酸は確実な脂肪肝改善効果を有すると判断した。また、高脂肪・高コレステロール負荷食による別系統のマウスで同様の効果が得られなかったことから、MSGマウスが脂肪肝をきたすメカニズムとニコチン酸の作用が密接に関連していると考えられた。我々は、1) MSG非投与マウス(コントロール) 2) MSG投与、ニコチン酸非投与3) MSG投与、ニコチン酸投与の3群のプールサンプルについてマイクロアレイ解析を行った。結果について、現在解析を行っているところである。平成26年度までの検討で、ニコチン酸の投与は0.5%混餌投与でグルタミン酸ナトリウム(MSG)の新生児期投与でおこる脂肪肝の発症を抑制し、完成した脂肪肝を病理組織上正常にまで改善させること、0.1%混餌投与では、脂肪肝抑制効果は0.5%混餌投与と同等である上、0.5%混餌投与で認められた食後高血糖が軽度であることが確認できた。作用メカニズムの検討のため、1) MSGを投与しないコントロール群2) MSGを投与し、ニコチン酸を投与しない脂肪肝群3) MSGを投与し、ニコチン酸投与により脂肪肝が発症しなかった群の3群のプール検体を用いて肝臓での遺伝子発現をマイクロアレイ解析で検討した。1)と2)の比較により、MSG投与による肝臓での遺伝子発現の変化が、2)と3)により、ニコチン酸による治療効果が、1)と3)により、MSG投与によって変化するが、ニコチン酸による脂肪肝改善効果には関係のない遺伝子について検討できると考えられた。ニコチン酸の投与の有無では、炎症や脂肪酸合成アポトーシスなどと関連する遺伝子pathwayの変化が有意であった。ニコチン酸投与による変化が顕著であった遺伝子として、多くの遺伝子が挙がってきたが、脂質代謝に関係するものとしてはアポリポ蛋白A-IV、PNPLA3(patatin-like phospholipase domain containing 3)などが含まれていた。このうち、アポリポ蛋白A-IVは、肝臓からの中性脂肪分泌に関係することが報告されている。PNPLA3は、ヒトにおいて変異が脂肪肝と関係することが報告されているが、PNPLA3自体の発現レベルと脂肪肝との関係は明らかになっておらず、脂肪肝発症に関与するメカニズムも不明である。現在、これらの遺伝子発現と蛋白発現について解析を行っている。平成26年度にMSG投与マウス以外のマウス脂肪肝に対する検討を行い、高脂肪食負荷のC57BL6マウスでニコチン酸の治療効果が不十分であったため、MSGマウスに対する0.1%混餌投与を慎重に行った結果、マイクロアレイ解析を行うのが遅れ、結果の解析に本年度の半ばまでの期間を要した。マイクロアレイ解析により、既報にてニコチン酸と脂肪肝との関連すると示唆されていたDGAT2は、本モデルで検討している脂肪肝の改善効果とは関係が低いことが明らかとなった。従って、DGAT2に対するin vitroの解析は行っていない。代わりに、マイクロアレイ解析によって関与が示唆されたアポリポ蛋白A-IVおよびPNPLA3についての解析を進めている。また、培養β細胞に対する影響については、当施設の実験棟の改修に伴う機器整備のため、開始できず、平成28年度に実験を延期している。Monosodium glutamate(MSG)投与による肥満・脂肪肝マウスに対して、ニコチン酸の混餌投与を行ったところ、著明な脂肪肝抑制と、完成した脂肪肝の改善(治療)効果が得られるとともに、食後の高血糖を認めた。

ニコチン酸の投与量を0.5%より0.1%混餌投与に減量したところ、脂肪肝に対する効果は同等であったが、食後高血糖はより軽度であることが確認されていた。平成28年度では、これらの遺伝子の発現がマウスの肝臓で変化しているかについて解析を開始した。アポA4、PNPLA3の発現については、ニコチン酸投与による発現の低下を示唆する結果を得ているが、再現性について、ニコチン酸の投与量を変えて確認しているところである。脂肪肝炎(NASH)においては、肝細胞への脂肪蓄積よりも、線維化が予後を規定するとの知見が広まってきており、collagen type Iや関連遺伝子の発現にも着目して解析を進めている。MSG投与による肥満・脂肪肝・脂肪肝炎モデルマウス(MSGマウス)に対してニコチン酸を投与したところ、脂肪肝の発症を完全に抑制し、完成した脂肪肝をほぼ正常な組織所見にまで改善させた。脂肪肝抑制のメカニズムとして、ニコチン酸の作用機序からは肝臓への脂肪酸動員と食後高脂血症の抑制が予測された。絶食・再摂食試験を行ったところ、ニコチン酸投与群では食後の遊離脂肪酸とTGが低下しており、少なくとも機序の一部であることが明らかになった。マイクロアレイ解析では、様々なパスウェイの関与が考えられたが、特にアポリポ蛋白A-IVと、PNPLA3がニコチン酸によって大きく変化していることが示された。平成26年度の研究実施計画に記した実験は、全て行うことができた。脂肪肝改善効果については、MSGマウスに対しては予想通りであった。一方、別系統の高脂肪食負荷マウスに対する効果が十分でなかったため、MSGマウスの結果を慎重に検討し、低濃度投与でのMSGマウスでの検討をとりわけ慎重に行い、十分な再現性があることを確認した。このため、進行がやや遅れ、マイクロアレイ解析の結果の分析を行っている段階で年度末を迎えてしまった。特に、PNPLA3は脂肪肝と関連して注目されている因子であり、作用機序が不明である点からも、今後解析をさらに進める予定である。ニコチン酸の0.5%混餌投与において、脂肪肝の著明な改善にも関わらず食後高血糖が認められた。これに対しては膵β細胞への直接の影響である可能性が高いと考えており、平成27年度に予定していた培養膵β細胞に対する添加実験を行う予定である。マイクロアレイ解析の予備検討では、MSG投与により変化し、ニコチン酸投与によってコントロールに近づいているいくつかの候補遺伝子が挙がってきている。特に、近年脂肪肝との関連が指摘されているPNPLA3が変化していることをつかんでいる。PNPLA3は、多型と脂肪肝の関連がしてきされているが、遺伝子そのものの意義や調節は十分に解明されていない。今後、RT-PCRなどで発現の変化を再確認し、意義を解析していく予定である。細胞実験室設備の改修に伴い、膵β細胞に対するニコチン酸の効果など、一部の実験の進行が遅延したため、試薬や細胞培地などの消耗品の購入が遅れ、経費を次年度に持ち越すこととなった。本年度報告書に記載したとおり、再現性の確認を行っていた結果、マイクロアレイ解析の検体提出が遅れたため、結果の解析が終了しないまま年度末を迎えた。
不随意的な刺激を利用した活動的で転倒しやすい高齢者のスクリーニング法の開発

近年、活動的な高齢者の平衡能力を評価するために、不安定板上での姿勢保持テストが用いられている。このテストは、身体の重心位置により不安定板が変動するため、成就するためには、不安定な状況下で姿勢を保持し続ける必要がある。しかし、加齢に伴う体力低下により前述の成就度も低下する傾向にあるが、どの体力要因が影響しているかは明らかでない。本研究の目的は、不安定板上での姿勢保持の成就度と各種体力の変化を縦断的に検討することであった。左右に揺れる不安定板上で20秒間の両脚立ちが成就可能な高齢者52名を対象とし、1年後も成就可能な35名を成就群、1年後に成就不可能になった17名を非成就群に分類した。前述の測定には、ディジョックボードを用いた。評価変数には、身長、体重、股関節屈曲筋力、膝関節伸展筋力、片脚立ち支持時間、FR、10m歩行時間、敏捷性ステップ時間、及び股関節移動距離を選択した。2要因分散分析(成就×時期)の結果、身長のみ有意な交互作用が認められ、非成就群は身長が低下した。片脚立ち支持時間、10m歩行時間、敏捷性ステップ時間、及び股関節移動距離の成就要因に有意な主効果が認められ、いずれの時期においても非成就群は成就群よりも劣った。以上、不安定板上での姿勢保持が成就不可能になった高齢者は、身長の低下、つまり姿勢変化の影響が大きいと考えられる。高齢期におけるバランス能力は、歩行能力や転倒リスクと密接な関係があることから、バランステストは転倒リスクのスクリーニングに利用されている。バランス能力は、「外乱に対して身体重心位置を留める能力」と定義されており、身体アライメントや筋力、柔軟性などが関与する。転倒回避能力に関連したバランス能力を評価するために、ファンクショナルリーチテストやLimits of stabilityテストなどが開発されている。これらのテストは随意的に身体を動かした時のバランス能力を評価する。しかしながら、一般的に、転倒は偶発的に生じるため、身体が不随意的な刺激を受ける時に安定姿勢を保持するバランス能力の評価も重要と考えられる。前述のバランス能力を評価するため、近年、不安定板上での姿勢保持テストが開発されている。不安定板上では、支持基底面が随時変動するため、重心位置が常に変動する不安定な状況下で立位姿勢を保持し続ける必要がある。このテストの成就度が劣る者は、バランス能力を含んだ各種身体機能に劣り、転倒リスクが高いと仮定される。本年度は、60歳以上の女性高齢者137名(年齢76.6±6.2歳、身長147.8±5.4cm、体重49.3±7.5kg)を対象に、不安定板上での姿勢保持能力と下肢筋力(股関節屈曲筋力、膝伸展筋力、および足趾把持力)およびバランス能力(開眼片脚立ちおよびファンクショナルリーチ)の関係、ならびに転倒との関連性を検討することを目的とした。その結果、不安定板上での姿勢保持能力は、下肢筋力およびバランス能力との間に顕著な関係はないが、転倒経験を有する高齢者の多くは、不安定板上での姿勢保持の成就自体が困難であることが明らかにされた。前述の高齢者の中には、体力水準の高い者も含まれることから、今後、さらに解析を進める必要がある。本年度の計画どおり研究を遂行し、国内学会発表、国際誌への投稿、大学紀要への投稿を行い、成果を報告した。また、次年度に実施する「不安定な歩行路上での歩行の成就度の検討」について、歩行路の開発を連携企業と進めることができた。転倒リスクの評価の一つにバランステストが用いられている。多くのバランステストでは、直立姿勢の状態で、身体を不安定にさせる。しかし、転倒は歩行中に発生するため、移動動作を伴うテストによりバランス能力や易転倒性を評価することも重要である。そこで我々は、弾力性のある素材を用いたバランスバーを利用し、徐々に狭くなる直線の歩行路を歩くバランスバーテストを開発した。本年度の研究目的は、バランスバーテストと下肢筋力(股関節屈曲筋力および膝伸展筋力)、バランス能力(開眼片脚立ちおよびファンクショナルリーチ)、および歩行能力との関係性、ならびに転倒との関連性を検討することであった。対象者は、60歳以上の高齢者169名(年齢78.8±7.2歳、身長149.8±7.2cm、体重49.9±8.2kg)であり、内訳は、過去1年間の複数(2回以上)転倒経験者が24名(年齢80.8±5.7歳、身長148.1±7.2cm、体重52.1±7.0kg)、および非転倒経験者が145名(年齢78.5±6.3歳、身長150.0±7.2cm、体重49.5±8.4kg)であった。バランスバーテストには、不安定バーセットを用いた。各バーは、特殊配合ポリエチレン製であり、5種の幅で構成されている(全長500×厚み60×幅150、130、110、90、70mm)。本研究では、各バーを幅の広い順に2つずつ直線に並べ(計10枚)、被験者はその上を1枚ずつ30bpmのテンポで歩いた。評価変数は、バーから逸脱せずに歩行できた枚数(成就枚数)とした。代表値は2試行目の値とした。

解析の結果、バランスバーテストは、開眼片脚立ちや歩行テストとの間に中程度の関係(r=0.41,-0.47)があったが、等尺性下肢筋力との関係は殆どなかった。また、過去1年間に複数回の転倒経験を有している者は本テストの成就度が劣ることが明らかにされた。本年度の計画どおり研究を遂行し、3編の報告を国内学会にて発表した。また、研究論文についてもほぼ目途が立っている。平成30年度の測定も計画通りに実施できる予定である。近年、活動的な高齢者の平衡能力を評価するために、不安定板上での姿勢保持テストが用いられている。このテストは、身体の重心位置により不安定板が変動するため、成就するためには、不安定な状況下で姿勢を保持し続ける必要がある。しかし、加齢に伴う体力低下により前述の成就度も低下する傾向にあるが、どの体力要因が影響しているかは明らかでない。本研究の目的は、不安定板上での姿勢保持の成就度と各種体力の変化を縦断的に検討することであった。左右に揺れる不安定板上で20秒間の両脚立ちが成就可能な高齢者52名を対象とし、1年後も成就可能な35名を成就群、1年後に成就不可能になった17名を非成就群に分類した。前述の測定には、ディジョックボードを用いた。評価変数には、身長、体重、股関節屈曲筋力、膝関節伸展筋力、片脚立ち支持時間、FR、10m歩行時間、敏捷性ステップ時間、及び股関節移動距離を選択した。2要因分散分析(成就×時期)の結果、身長のみ有意な交互作用が認められ、非成就群は身長が低下した。片脚立ち支持時間、10m歩行時間、敏捷性ステップ時間、及び股関節移動距離の成就要因に有意な主効果が認められ、いずれの時期においても非成就群は成就群よりも劣った。以上、不安定板上での姿勢保持が成就不可能になった高齢者は、身長の低下、つまり姿勢変化の影響が大きいと考えられる。昨年度に収集したデータ分析を進めるとともに、制作した道具を利用し、不安定な状況下での歩行能力と転倒の関連について明らかにしていく。そのため、今年度も介護一次・二次予防対象高齢者100名程度に調査および測定を実施する。不安定板上での姿勢保持および不安定な歩行路での歩行の成就度、ならびに転倒経験について、経年変化を検討していく。そのため、本年度および昨年度の各測定に参加した被験者(介護一次・二次予防対象の高齢者)を対象に、同様の調査および測定を実施する。次年度使用額が生じた理由として、平成29年度計画の「不安定な歩行路上での歩行の成就度」の検討について、歩行路の製作費が安価であったことが挙げられる。測定を公民館等の施設で実施するため、運搬が楽であること、準備に時間を要さないことを考慮して開発を進めた結果、既存の製品を改良することで対応可能となった。本年度は、各種体力を測定する機器を購入し、より詳細に「不随意的な刺激」との関係を検討していく予定であった。しかし、特注の測定機器の開発が遅れ、年度内に購入することができなかった。測定器は既に完成しているため、平成30年度にそれを購入する。これらの金額と次年度以降に請求する研究費を合わせた使用計画として、各種体力を測定する機器を購入し、より詳細に「不随意的な刺激」との関係を検討していく。また、それに伴い測定項目が増えるため、人件費および謝金としても使用していく。
生体認識分子を融合したナノ粒子による全く新しい生体内ピンポイント遺伝子導入法

本研究では、高い細胞及び組織特異性を有し、極めて高い遺伝子導入効率を有するウイルス感染機構を応用し、かつ、ウイルスゲノムを完全に排除した副作用の危険性が低い遺伝子導入法を開発することを目的としている。(1)組換え酵母によるHBsAg (B型肝炎ウイルス(HBV)表面抗原(HBsAg)粒子)の大量生産:ヒト肝臓に対する特異的レセプターを有するHBsAg Lタンパク質粒子を酵母で大量に生産する方法を確立した。(2)同粒子を用いるヒト肝臓癌由来培養細胞への遺伝子導入:エレクトロポレーション法により粒子内部にGFP(緑色蛍光タンパク質)発現遺伝子を封入し、ヒト肝癌由来細胞HepG2に添加したところ、リポフェクタミン法よりも百倍以上高い効率で、ほぼ全ての細胞に遺伝子を導入した。(3)同粒子を用いるヒト肝臓癌を接種したヌードマウスへの遺伝子導入:ヒト肝臓癌由来細胞HuH-7とヒト大腸癌由来細胞WiDrを接種したヌードマウスにGFP発現ベクターを含む同粒子を腹腔内投与したところ、ヒト肝臓癌由来固形癌部にGFPによる蛍光が認められた。一方、マウスの通常臓器、及びヒト大腸癌由来固形癌部には全く蛍光は認められなかった。(4)同粒子を用いるヒト肝臓癌を接種したヌードマウスにおける遺伝子治療:最近では、本粒子内部にHSV由来チミジンキナーゼ遺伝子を包含し、ヒト肝臓癌を移植したヌードマウスに静脈注射し、ガンシクロビルを経口投与することで、移植ヒト肝癌特異的な増殖抑制効果を観察することができた。以上の結果から、本粒子を用いた遺伝子導入方法は、高い細胞及び組織特異性を有し、極めて高い遺伝子導入効率を有するウイルス感染機構を応用し、かつ、ウイルスゲノムを完全に排除した副作用の危険性が低いと考えられた。
単極紡錘体を誘導する小分子の作用機構解析

ピレノシンAは子宮頸がん細胞に対して単極紡錘体を誘導する。本研究では、ピレノシンAの作用メカニズムの解明を目的として研究を行った。ピレノシンAのアルキン誘導体を用いて細胞内の局在を解析した結果、ピレノシンAは中心体に局在していることが示唆された。このことからピレノシンAは中心体に存在するタンパク質に作用することが示唆された。さらに、ピレノシンAのアルキン誘導体を用いて、ピレノシンA結合タンパク質の探索を行った。その結果、enolase 1, elongation factor1-alpha 1などのタンパク質が同定された。単極紡錘体は、細胞分裂期に通常二極となる紡錘体が一つの極になる現象である。単極紡錘体を引き起こす化合物としては、微小管モータータンパク質であるEg5の阻害剤が知られている。我々は単極紡錘体を誘導する化合物としてピレノシンAを見出している。この化合物はEg5の酵素活性を阻害しないことから、新規な作用機構により単極紡錘体を引き起こすと考えられる。そこで本研究では、ピレノシンAの標的タンパク質の同定及び細胞内での作用機構解明を目的とした。まずピレノシンAのプローブとして、アルキン誘導体及びビオチン誘導体を合成した。アルキン誘導体処理したHeLa細胞を抗αチューブリン抗体により免疫染色し、単極紡錘体を誘導することを確認した。次にピレノシンAアルキン誘導体を用いて細胞内の局在を解析した。アルキン誘導体でHeLa細胞を処理し、固定化後、クリックケミストリーにより蛍光色素であるAlexaを導入した。その後、共焦点顕微鏡により観察し、細胞内の局在を解析した。その結果、ピレノシンAアルキン誘導体は、リング状に観察される染色体の中心にドット状に集積することが示唆された。さらに、中心体に存在するγチューブリンの抗体で免疫染色した結果、ピレノシンAアルキン体の局在と重なることが明らかになった。以上の結果から、ピレノシンAは中心体に作用していることが示唆された。現在ビオチン誘導体を用いて、ピレノシンA結合タンパク質の同定を試みている。申請者らは単極紡錘体を誘導する化合物としてピレノシンAを見出している。アルキン誘導体でHeLa細胞を処理した後、フイスゲン反応により蛍光色素であるAlexaを導入し、細胞内の局在を解析した。その結果、ピレノシンAは中心体に作用していることが示唆された。さらに、アルキン誘導体を用いて、ピレノシンA結合タンパク質の同定を行った。HeLa細胞をアルキン誘導体で処理し、その細胞破砕液中のピレノシンAのアルキン部位に、フイスゲン反応によりアジド基が結合したビオチンを導入した。ビオチン化タンパク質をNeutrAvidinビーズに用いて精製した。精製したタンパク質をSDS-PAGEにより分離後、Streptavidin-HRPによりビオチン化タンパク質を検出した。その結果、複数のタンパク質がアルキン誘導体と共有結合していることが示唆された。さらにLC-MS/MSにより、タンパク質を同定した結果、enolase 1, elongation factor1-alpha1, actinなどであることがわかった。ケミカルバイオロジー研究計画ではファージディスプレイ法によるピレノシンAの標的タンパク質の同定を予定していた。ピレノシンAのビオチン誘導体を用いてこの方法を試みた結果、いくつかの結合タンパク質が得られたが、未だ有力な候補は得られていない。一方、アルキン誘導体を用いた細胞内局在の解析により、ピレノシンAの中心体への局在を明らかにした。この局在はこの化合物に特徴的であり、細胞分裂期では中心体は紡錘体極となるため、関連性が強く示唆される。このため、今後の標的タンパク質同定及び作用機構解析は容易になると期待される。現在は研究計画に基づきアフィニティーラベル法による標的タンパク質同定を遂行しており、標的タンパク質とピレノシンAの結合を確認している。

今後はアフィニティーラベル法による標的タンパク質同定を中心に行う。この際、中心体及び中心体近傍に存在するタンパク質に絞り解析を進める。さらに、研究計画に基づき作用機構の解析を進めていく。一方、同時にピレノシンAが抗がん効果をもつかどうかを、動物実験により検証する。当初購入を予定していた消耗品を次年度に繰り越したため。消耗品費として使用する予定。
ニンニク抽出物の食品衛生微生物に及ぼす抗菌作用について

ニンニク抽出液(以下抽出液)の抗菌作用を食中毒の予防に応用出来るかどうかを検討するため,その基礎研究として主要な食中毒菌の抗菌作用を検討した。その結果,多くの食中毒菌に対し強い抗菌作用を有することを認め,既に報告を行った。今年度は、魚の生食により多発する食中毒の代表的な原因菌である腸炎ビブリオ及び食品との関連で注目されているヒトのリステリア症の原因菌であるリステリア菌を供試し,これらの菌に対する抽出液の抗菌作用をin vitro及びin vivoで検討し,次の結果を得た。1.腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用(1)抽出液の抗菌活性:最小発育阻止濃度と殺菌濃度は同値で,強い抗菌活性が認められた。(2)培地中の腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用:抽出液の濃度が10、5及び2.5%の培地に供試菌を10^4/g個接種した場合,それぞれ15分,30分及び1時間以内にすべての菌は死滅した。(3)魚肉中の腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用:抽出液の濃度が10,5及び2.5%のアジの生魚肉に供試菌を10^5/g個接種した場合,1時間後の生存率はそれぞれ0.3,1及び7.6%で,加熱した魚肉を用いた場合もほぼ同様であった。2.リステリア菌に及ぼす抽出液の抗菌作用(1)培地中のリステリア菌に及ぼす抗菌作用:抽出液の濃度が10及び5%の培地に供試菌10^4/g個接種した場合,1時間後の生存率は共に10%以下であった。(2)鶏肉中のリステリア菌に及ぼす抽出液の抗菌作用:培地によるin vitroの場合とほぼ同様の傾向を示した。以上の結果から,抽出液は腸炎ビブリオ及びリステリア菌に対し,in vitro及びin vivoのいずれの場合も強い抗菌作用を示した。実際の食生活に於いて,ニンニクは魚介類や食肉等に香辛料として用いられているが,食中毒予防の面からもその使用は意義があると考えられた。本研究は、おもな食中毒菌および腐敗細菌など広範囲にわたる食品衛店微生物について、それぞれの標準株および食品由来株等25株を供試し、ニンニク抽出液の抗菌作用とその安定性について検討し、つぎの結果を得た。1.ニンニク抽出液の抗菌作用ニンニク抽出液は、供試した食品衛微生物に対し、かなり広し抗菌域と強い抗菌力を示すことが認められた。その最小発育阻止濃度は、数株の腐敗細菌が52.5%を示すほか、大多数の菌株は1.250.63%で、菌種間における顕著な差は認められなかった。2.抗菌作用に及ぼす加熱処理の影響抗生剤の検定菌を用いカップ法により抽出液の抗菌作用を検討した。伝出液を100°C20分加熱した場合、抗菌作用は失活した。処理時間を20分とし、37°、55°、70°、85°Cの加熱処理後の抗菌作用を調べた結果、70°C以上の加熱温度により急速に減弱することが認められた。3.抗菌作用に及ぼすpHの影響ニンニク抽出液が6.0および7.0の場合は、抗菌作用に影響はみられなかった。pH5.0および8.0以上で抗菌作用は次第に減弱し、pHの変化により影響を受けることが認められた。なお、本研究に用いてニンニク抽出液および供試菌株は、超低温フリーザー(-80°C)で保存し、必要に応じて使用した。昨年度、ニンニク浸出液は、食中毒菌及び腐敗菌に対し強い抗菌作用を有することを報告した。今年度は、その実際的応用の可能性を検討するため、食肉中のサルモネラ菌に及ぼすニンニク浸出液(以下浸出液)の抗菌作用を検討した。実験材料は市販の食肉を用い、サルモネラ菌はS.typhimuriumを供試した。市販の食肉には細菌汚染が認められるため、食肉汚染菌に及ぼす浸出液の抗菌作用の検討も行った。また、サルモネラ菌の殺菌濃度も測定した。ついで、無処理および120°C15分加熱滅菌した食肉に、浸出液を5、10および20%した後、サルモネラ菌を接種し、経時的に接種菌の生存率を検討し、次の結果を得た。1.食肉汚染菌に及ぼす浸出液の抗菌作用浸出液は食肉汚染菌の発育を阻止し、増殖を遅延させることが認められた。浸出液を高濃度に添加した場合、その傾向が顕著であった。2.サルモネラ菌に及ぼす浸出液の抗菌作用浸出液のMICと殺菌濃度の差は小さく、強い抗菌作用が認められた。3.食肉中のサルモネラ菌に及ぼす浸出液の抗菌作用無処理の食肉に浸出液を5%添加し供試菌を接種した場合、1時間後の生存率は54%で、3時間後には40%に減少した。加熱滅菌した食肉に浸出液を5%添加した場合、接種菌の1時間後の生存率は57%、3時間後には12%に減少した。いずれの場合も浸出液が高濃度になると、さらに強い抗菌活性が認められた。以上の結果から、ニンニクの抗菌作用の実際的応用の可能性が確認された。調味料添加の場合も検討したい。今年度計画していた魚肉中の腸炎ビブリオおよび鶏肉中のカンピロバクタ-等に及ぼす抗菌作用についても鋭意検討する予定である。

ニンニク抽出液(以下抽出液)の抗菌作用を食中毒の予防に応用出来るかどうかを検討するため,その基礎研究として主要な食中毒菌の抗菌作用を検討した。その結果,多くの食中毒菌に対し強い抗菌作用を有することを認め,既に報告を行った。今年度は、魚の生食により多発する食中毒の代表的な原因菌である腸炎ビブリオ及び食品との関連で注目されているヒトのリステリア症の原因菌であるリステリア菌を供試し,これらの菌に対する抽出液の抗菌作用をin vitro及びin vivoで検討し,次の結果を得た。1.腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用(1)抽出液の抗菌活性:最小発育阻止濃度と殺菌濃度は同値で,強い抗菌活性が認められた。(2)培地中の腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用:抽出液の濃度が10、5及び2.5%の培地に供試菌を10^4/g個接種した場合,それぞれ15分,30分及び1時間以内にすべての菌は死滅した。(3)魚肉中の腸炎ビブリオに及ぼす抽出液の抗菌作用:抽出液の濃度が10,5及び2.5%のアジの生魚肉に供試菌を10^5/g個接種した場合,1時間後の生存率はそれぞれ0.3,1及び7.6%で,加熱した魚肉を用いた場合もほぼ同様であった。2.リステリア菌に及ぼす抽出液の抗菌作用(1)培地中のリステリア菌に及ぼす抗菌作用:抽出液の濃度が10及び5%の培地に供試菌10^4/g個接種した場合,1時間後の生存率は共に10%以下であった。(2)鶏肉中のリステリア菌に及ぼす抽出液の抗菌作用:培地によるin vitroの場合とほぼ同様の傾向を示した。以上の結果から,抽出液は腸炎ビブリオ及びリステリア菌に対し,in vitro及びin vivoのいずれの場合も強い抗菌作用を示した。実際の食生活に於いて,ニンニクは魚介類や食肉等に香辛料として用いられているが,食中毒予防の面からもその使用は意義があると考えられた。
振動に対する人間の機械的応答及び心理的応答に見る非線形特性の解明

本研究では,振動に対する人間の応答特性にみる非線形性の解明を目的としている.ここで言う非線形性とは,入力振動の大きさに依存して振動数依存性などの応答特性が変化する性質のことを指している.昨年度までの実験で,非線形性が不快感においても認められることを確認し,さらにこの非線形性が,身体の揺れで見られるものと同様の傾向であることが分かった.本年度は,昨年度実施した実験で測定した,振動を受けた際の身体の揺れ方の特性を解明するため,数理モデルを構築し検討した.前後方向,左右方向のそれぞれについて,様々な自由度を持つモデルを構築し実験結果と比較することで,実験結果を適切に解釈しうる最適なモデルを選定した.その結果,実験で対象とした周波数領域において,水平方向の振動を受けた際の身体の揺れとしては,骨格系の曲げ変形および回転運動が支配的となることが明らかとなった.また,臀部や大腿部の皮下組織が変形することによる,身体の水平方向の揺れも生じていることが示された.本研究で得られた成果は,人の不快感の度合いに着目した振動環境の評価に応用できる.すなわち,まず,振動に対する身体の揺れに関する実験データをもとに,力学に基づく人体の数理モデルを構築する.これにより,様々な振動環境に対する身体の揺れを予測することが可能となる.つぎに,この予測した身体の揺れに基づき,その振動環境に対する不快感を予測する.これは,本研究で得られたような身体の揺れと不快感の関係を用いることで可能となる.本研究の成果は,適用可能な周波数領域などが限られるものの,このようなことを一部可能としたものである.人の主観的な評価である不快感のような心理的応答を,身体の揺れのような客観的指標により評価できることは,様々な応用面で意義のあることと言える.本研究では,振動に対する人間の応答特性にみる非線形性の解明を目的としている.ここで言う非線形性とは,入力振動の大きさに依存して振動数依存性などの応答特性が変化する性質のことを指している.本研究では,振動に対する人間の応答として,人体の機械的な応答及び心理的応答としての振動不快感に着目している.本年度は,非線形性に着目した機械的応答と心理的応答との関連性に関する実験を行った.実験は,座位被験者を用いた振動実験であり,全身振動に対する人体の機械的応答及び心理的応答を,異なる大きさの振動に対して測定した.入力振動としては人体に対する前後方向の振動を用い,正弦振動の振動数および振幅を変化させ,応答の振動数依存性および振幅依存性について検討した.振動数は人体前後方向の低次の固有モードが励起される15Hz,振幅は0.251m/s^2 r.m.s.とした.実験では,機械的応答として座面(駆動面)における動質量および機械インピーダンスを,また心理的応答としてマグニチュード推定法により不快感を測定した.その結果,動質量(機械インピーダンス)および不快感の振動数依存性が,振動の大きさにより変化することが確認された.また,それらの変化はある程度の対応が認められ,機械的応答と心理的応答との因果関係が示唆される結果が得られた.次年度以降も,異なる条件で実験室における被験者実験を継続するとともに,その数理モデルの構築などを行い,非線形性発現のメカニズムの解明を目指す.なお,本年度は研究期間の最初の6ヶ月であったため,研究発表などを行うまでには至っていない.本研究では,振動に対する人間の応答特性にみる非線形性の解明を目的としている.ここで言う非線形性とは,入力振動の大きさに依存して振動数依存性などの応答特性が変化する性質のことを指している.本研究では,振動に対する人間の応答として,人体の機械的な応答及び心理的応答としての振動不快感に着目している.本年度は,非線形性に着目した機械的応答と心理的応答との関連性に関する実験を行った.これは,昨年度実施した予備実験の結果に基づき,計画されたものである.実験は,座位被験者を用いた振動実験であり,全身振動に対する人体の機械的応答及び心理的応答を,異なる大きさの振動に対して測定した.入力振動としては人体に対する前後および左右方向の振動を用い,正弦振動の振動数および振幅を変化させ,応答の振動数依存性および振幅依存性について検討した.振動数は前後および水平方向において人体の低次の固有振動モードが励起される1.610Hz,振幅は0.1251m/s^2r.m.s.とした.実験では,機械的応答として座面(駆動面)における動質量および機械インピーダンスを,また心理的応答としてマグニチュード推定法により不快感を測定した.その結果,動質量および不快感の振動数依存性が,振動の大きさにより変化することが確認された.また,それらの変化はある程度の対応が認められ,機械的応答と心理的応答との因果関係が示唆される結果が得られた.次年度は,被験者実験の結果に基づき,その数理モデルの構築を行い,非線形性発現のメカニズムの解明を目指す.なお,これまでの研究結果については,次年度中の学会での研究発表および論文投稿を予定している.本研究では,振動に対する人間の応答特性にみる非線形性の解明を目的としている.ここで言う非線形性とは,入力振動の大きさに依存して振動数依存性などの応答特性が変化する性質のことを指している.昨年度までの実験で,非線形性が不快感においても認められることを確認し,さらにこの非線形性が,身体の揺れで見られるものと同様の傾向であることが分かった.

本年度は,昨年度実施した実験で測定した,振動を受けた際の身体の揺れ方の特性を解明するため,数理モデルを構築し検討した.前後方向,左右方向のそれぞれについて,様々な自由度を持つモデルを構築し実験結果と比較することで,実験結果を適切に解釈しうる最適なモデルを選定した.その結果,実験で対象とした周波数領域において,水平方向の振動を受けた際の身体の揺れとしては,骨格系の曲げ変形および回転運動が支配的となることが明らかとなった.また,臀部や大腿部の皮下組織が変形することによる,身体の水平方向の揺れも生じていることが示された.本研究で得られた成果は,人の不快感の度合いに着目した振動環境の評価に応用できる.すなわち,まず,振動に対する身体の揺れに関する実験データをもとに,力学に基づく人体の数理モデルを構築する.これにより,様々な振動環境に対する身体の揺れを予測することが可能となる.つぎに,この予測した身体の揺れに基づき,その振動環境に対する不快感を予測する.これは,本研究で得られたような身体の揺れと不快感の関係を用いることで可能となる.本研究の成果は,適用可能な周波数領域などが限られるものの,このようなことを一部可能としたものである.人の主観的な評価である不快感のような心理的応答を,身体の揺れのような客観的指標により評価できることは,様々な応用面で意義のあることと言える.
Exploration of facile synthesis for functional porphyrinoids and investigation of their applications

我々が合成に成功したNiNCは、従来の反芳香族化合物とは異なった高い安定性を示す興味深い化合物である。今回、NiNCを用いて反芳香族化合物を積層させると芳香族性が発現することを世界で初めて実証した。様々な機能性化合物の合成にも成功し、その成果を報告した。具体的にはbodipyとヘキサフィリンのハイブリッド化合物を用いたアンテナシステムや、反芳香族性NiNCを電極として用いた有機リチウム電池及び全有機化合物電池の開発にも取り組んだ。その結果、高い安定性や優れた電池性能を達成し、新たな有機電池としての可能性を示した。有機化学
高密度ポリマーブラシ/無機微粒子複合系(準ソフト系)コロイド結晶の科学

メタクリル酸メチルの表面開始リビングラジカル重合により構造の明確な濃厚ポリマーブラシを有する単分散シリカ微粒子を合成することを引き続き行った。特に本年度は、逆ミセル法またはリシン添加法を用いることによりシリカコア粒子を数ナノメートル程度まで小さくすることに成功した。また、グラフト鎖の高分子量化のために高圧下での重合に取り組み、5000気圧において分子量約1000万程度の高分子をグラフトする技術もほぼ確立した。蛍光色素を内含した単分散性シリカ微粒子表面へのポリメタクリル酸メチルのグラフト化と、得られた複合微粒子からのコロイド結晶作成法を確立した。その構造解析を共焦点レーザースキャン顕微鏡により行い、画像解析ソフトウェアのイマリスを用い三次元画像構築また特殊スライス画像の構築を行い、コロイド結晶の構造を詳細に解析した結果、グラフト鎖長により粒子間距離のみならず、結晶構造そのものも制御できることが判明した。本年度、新たに合成に成功した超高分子量PMMA付与シリカ微粒子から成るコロイド結晶においては、これまで本系では観られなかった結晶構造の出現が期待でることから、現在検討中である。さらに、ビニル基を側鎖に有するポリマーをシリカ微粒子にグラフトし、コロイド結晶を構築し、それを光開始剤存在下で光照射することによりコロイド結晶の固定化を行うことに成功した。また、濃厚ブラシ付与単分散性ZnS微粒子および濃厚ブラシ付与中空微粒子を用いてコロイド結晶を創製することにも成功した。高密度ポリマーブラシを有する微粒子の構造・物性科学的解析を行い、さらに、準ソフト系コロイド結晶を構築するための基礎技術の確立を目指すことを目的とした。ポリメタクリル酸メチル(PMMA)の濃厚ブラシを付与した単分散1生球状シリカ微粒子(PMMA-SiP)の動的光散乱測定により、そのPMMA鎖はコアの曲率の影響があるにも関わらず、オールトランス構造の完全伸びきり鎖に対して約50%も伸張していることが判明した。同様の分散液において、微粒子濃度の増加に伴い、分散液は、(無秩序)流体相から、結晶/流体2相共存領域を経て結晶相に転移した。これは、結晶を定義するための重要な規範の一つであるアルダー転移と呼ばれる現象が準ソフト系コロイド結晶にも存在することを示している。また、臨界結晶化濃度(φ_m)は、既知のソフト系(φ_m0.01)とハード系(φ_m0.5)コロイド結晶の中間値を示した。結晶を共焦点レーザースキャン顕微鏡(CLSM)観察したところPMMA-SiPが規則正しく結晶状に配列しており、粒子間距離は、グラフトポリマーの分子量によってnmからμmオーダーに達するまで制御できることが明らかとなった。CLSMを用いた3次元観察により、結晶構造はほぼ面心立方格子であることがわかった。今後は、結晶化におけるグラフト鎖長、グラフト密度、粒径の影響を検討するともに、各種スペクトル測定、顕微鏡観察を行い結晶化過程の速度論的解析を行う。各種モノマーへの応用性を検討するとともに、架橋性モノマーの重合にも取り組みコロイド結晶を固定化することを試みる。濃厚ポリメタクリル酸(PMMA)ブラシを付与したシリカ微粒子のグラフト膜厚とグラフト鎖形態との関係を明らかにすることを中心課題とした。シリカ微粒子(直径130nm)にほぼ一定のグラフト密度(0.7chains/nm^2)で鎖長を異にするPMMAブラシを付与し一連の複合微粒子を調製した。それら試料の流体力学的グラフト膜厚(h)を動的光散乱測定により決定し、調べたPMMAの分子量域において、hはM^<0.83>_w(M_wは重量平均分子量)に比例することが明らかとなった。hと分子量指数の関係を理解するためにDaoud-Cottonのスケーリング模型を考えた。結果を要約すると、ブラシ膜は半径r_cを境界とし、これより内部を濃厚ブラシ層、外部を準希薄ブラシ層に二分される。濃厚ブラシ層では排除体積効果が遮断され、ブラシ膜厚は非摂動状態のブロブ鎖の半径方向への積層で表現される。準希薄ブラシでは、膨潤したブロブ鎖がこれに換わる。ここで使われた試料においては、PMMA分子量(M_w)が188,000付近で排除体積効果が顕著に現れ始めこのあたりがr_cとなる。これより大きい分子量域では、準希薄ブラシ領域へと移行していく。グラフト鎖の形態が複合微粒子表面のポテンシャルに大きく影響を与えることが予想され、グラフト鎖の形態と複合微粒子から成るコロイド結晶構造の相関を明らかにすることが今後の重要課題となる。また、濃厚ブラシ付与微粒子を水面上に結晶状に配列させる手法を確立し、二次元コロイド結晶を作成することに成功した。さらに、濃厚ブラシを有する単分散中空微粒子の創製法を確立するとともにこの高次構造制御にも取り組んだ。

蛍光色素を内含した単分散性シリカ微粒子表面へのポリメタクリル酸メチルのグラフト化と、得られた複合微粒子からのコロイド結晶作成法を確立した。その構造解析を共焦点レーザースキャン顕微鏡により行い、画像解析ソフトウェアのイマリスを用い三次元画像構築また特殊スライス画像の構築を行い、コロイド結晶の構造を詳細に解析した結果、グラフト鎖長により粒子間距離のみならず、結晶構造そのものも制御できることが判明した。本年度、新たに合成に成功した超高分子量PMMA付与シリカ微粒子から成るコロイド結晶においては、これまで本系では観られなかった結晶構造の出現が期待でることから、現在検討中である。さらに、ビニル基を側鎖に有するポリマーをシリカ微粒子にグラフトし、コロイド結晶を構築し、それを光開始剤存在下で光照射することによりコロイド結晶の固定化を行うことに成功した。また、濃厚ブラシ付与単分散性ZnS微粒子および濃厚ブラシ付与中空微粒子を用いてコロイド結晶を創製することにも成功した。
逆転の発想による脳動脈瘤塞栓治療用カバードステントの開発

ステント外周に対して、微細な孔を多数開けた薄膜で一体化させた微細孔化カバードステントを開発し、脳動脈瘤治療への有効性を示してきた。一般に、瘤口を塞ぐためには孔は小さい必要があり、逆に孔を大きく多くすると側枝の開存や内膜肥厚の抑制には有利であるが、瘤内への血流速度が早くなるため塞栓できずにカバー材の意味が無くなるとのジレンマが生じていた。しかし孔をある程度の大きさにすることで、瘤内の血流を停滞させることが可能であることを可視化回路での実験で見いだした。大きな孔が瘤内の流れを止めるという新しい発見し、動物で検証した。これまで我々は、ステント外周に対して、微細な孔(マイクロ孔)を多数開けた薄膜で一体化させた微細孔化カバードステントを開発し、動脈瘤治療への有効性を示してきた。一般に、瘤口を塞ぐためには孔は小さい必要があり、逆に孔を大きく多くすると側枝の残存や内膜肥厚の抑制には有利であるが、瘤内への血流速度が早くなるため塞栓できずにカバー材の意味が無くなるとのジレンマが生じていた。しかし不思議な事に、孔をある程度の大きさにすることで、瘤内の血流を停滞させることが可能であることを可視化回路での実験で見いだした。大きな孔が瘤内の流れを止めるという常識を打ち破る新しい発見に基づいて、本研究では流体力学的拍動流回路にてカバーフィルムに開ける孔の大きさ、形、面積の最適設計を行い、動物を用いて実験的に作製した動脈瘤にて検証を行うことを目的とした。本年度では、作製したカバードステントを用いて動物実験による検証を行った。犬や兎に実験的に動脈瘤を作製し、ステント留置による血流の変化をアンギオ上で確かめた。短期観察によって血栓性と塞栓性を確かめ、長期観察によって組織化することを確認した。大きな孔が瘤内の流れを止めるという常識を打ち破る新しい発見に基づいて、本研究では流体力学的拍動流回路にてカバーフィルムに開ける孔の大きさ、形、面積の最適設計を行い、動物を用いて実験的に作製した動脈瘤にて検証を行う事を目的とする。本年度の研究成果を以下に記載する。1)流体力学的機能評価アクリル立方体を切削加工することで、瘤形状を内部に有する動脈瘤モデル模型を作製した。多孔質フィルムの作製は、現有のエキシマレーザーを用いて行った。拍動流ポンプをつなげた流体回路を設計し、モデルを装着し、回路内に蛍光微粒子を流すことで、動脈瘤内の流れの可視化を行い、孔の大きさ、面積、形状と瘤内の流れの関係を明らかにした。2))カバードステントの作製/物性評価ステントのカバー化はこれまで開発したディッピング法によって行った。カバー化後は先のレーザー加工装置にて多孔化を行った。ステントに柔軟性を持たせるための1つの方法として、短いユニット構造の連結が行った。そこでカバー材によって連結させることで、柔軟性と拡張性が両立された。当初予定していた研究実施計画に添って、研究は順調に進行し、期待された研究成果が得られ、論文発表並びに特許申請が行えたため。主に動物実験評価に取り組む。これまで犬ならびに兎で作製してきた動脈瘤モデルを用いて、動物実験評価を行う。基本的に体内への導入は大腿動脈のカットダウンによって行う。アンギオ室内にて血管造影しながら頚部及び頭部へ誘導させる。動脈瘤のエントリー部にてステントを留置させる。瘤内への親血管の血流の流入阻止は血管造影によって調べる。一定期間留置させた後に、瘤の封鎖ならびに内膜肥厚の程度を血管造影によって調べる。また、周囲の組織とともに留置したステントを摘出し、組織切片を作製して、内膜肥厚の程度を定量解析すると同時に、組織形態学ならびに免疫学的な評価を行う。留置実験は国立循環器病研究センター研究所内の動物実験施設内にて、外科医と共同して行う。物品費の購入を主とし、研究成果の発表のための旅費や論文の投稿料などを計画している。
石塔と金石文を素材とする思想史研究の新たな領域と方法の開拓

本研究においては、石塔や金石文を資料として、普遍的で民族固有の感覚とみなされがちな遺骨の重視が、実はこの列島で展開した長い歴史の中でしだいに形成されたものであったことを明らかにした。遺骨に対してまったく関心を払うことがなく、遺骸を放置して省みなかった古代の人々。火葬骨を大切に霊場まで運んだ中世の人々。家の墓を作って骨を収め、定期的に墓参を繰り返した近世以降の人々。この三者に、死者や霊魂についての共通する観念を見出すことはきわめて困難である。それは、「日本人の死生観」という形で総括されてきたこれまでの通説が、根本的に見直される必要性があることを示すものにほかならないのである。現存する中世の石塔のデータを網羅的に収集すると同時に、その銘文に関するデータベースを作成した。また石塔に関連する資料とその分析に必要な参考文献・図書・報告書の収集を行った。あわせて、研究の鍵となる主要な石塔群については、実物について実地調査を行うとともに、それを写真撮影して記録した。実地調査は、六郷満山(大分県)、慈恩寺とその周辺(山形県)、朝熊山(三重県伊勢市)、善光寺(長野県)、松島(宮城県)において実施した。本研究は、石塔に加え、聖地を構成する経塚、木像・絵像、文献史料などを博捜して当該フィールドの宗教空間をトータルに解明し、歴史的・思想的なコンテクストに位置づけることを目指すものであった。その目的を実現すべく、本年度は収集した石塔のデータについて本格的な分析を行い、背景にあるコスモロジー及び死生観の解明を試みた。その結果、実地調査を行った各地域について、空間構造のおおまかなモデルを構築することに成功した。また、日本の中世は不可視の彼岸世界のイメージが肥大化する時代であったが、その理想世界と被救済者をつなぐ聖地・霊場の立地上の特質と、その役割の重要性を明らかにすることができた。その成果は、数多くの論文として刊行された。また、本研究の成果を広く海外に発信するとともに、海外をフィールドとする宗教的空間研究と擦り合わせを行うために、韓国・台湾・アメリカに出張し、現地での研究者との打ち合わせ、研究発表、現地調査などを実施し、今後の研究に向けての人的なネットワークを構築した。墓碑・五輪塔・板碑など、この日本列島にはほとんど無数といってよい石塔類が存在する。その数量は文献史料を圧倒するものがあり、そこに刻まれた銘文とともに、ある時代の世界観や時代思潮を捉えようとする際の好個の資料となりうるものと考えられる。しかし、従来、思想史や精神史の資料として石塔とその銘文を用いようとする試みはほとんど皆無だった。本研究はそうした研究の現状に鑑み、(1)日本の中世に焦点を絞り、大量に残存する五輪塔・板碑などの石塔群を素材として取り上げ、その配置状況や銘文の分析を通じて当時の人々が共有するコスモロジーと死生観を解明し、古代・近世と比較しつつ、その独自性を明らかにすること、(2)以上の考察から明らかにされた中世固有の時代思潮を背景に置くことによって、従来の思想史研究の大半を占めていた、いわゆる鎌倉仏教、神道思想、本覚思想といった体系的思想に、新たな角度から意義と意味を見出すことを目指すこと、(3)本研究を日本中世という特定領域の研究にとどめることなく、石塔などの非文字資料や金石文などの体系化されないテキストを用いていかに時代思潮を再構成していくかという、思想史一般の方法論の問題として深化させ、その成果を国内外に発信すること、の3点を基本目的としてなされた。所期の目的はほぼ達成することができたと考えている。同じ石塔であっても、中世においては死者を浄土に送り出す供養塔の役割を果たしていたのに対し、近世になると死者の霊魂の依り代としての墓標の機能を担ったことを、中世から近世へのコスモロジーの転換に位置づけて明らかにしたことは、本研究の最大の成果である。また、法然流の専修念仏が中世社会においていかに異質な存在であったかという点や、近世における幽霊の大量発生の原因を、金石文を資料として広いコンテクストのなかで明らかにしたことも、重要な成果であると考えている。現存する中世の石塔のデータを網羅的に収集すると同時に、その銘文に関するデータベースの作成を進めた。また石塔に関連する資料とその分析に必要な参考文献・図書・報告書を収集した。東北・関東・長野・岐阜・京都などで実地調査を行い、主要な石塔群のデータを収集するとともに、それを写真撮影して記録した。また、そこで収集した資料を整理し、データベース化した。