hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境R&D政策と内生的経済政長に関する分析

次に、第2の政策として、アイデアの価格に補助を与え、アイデアの創出を振興する政策が提示される。第3の政策としてR&D部門の費用の一部に補助を行なうことにより、アイデアの創出を振興する政策が展開される。さらに、大住は伊ヶ崎大理(院生)と環境政策を内生的経済成長の問題を検討し、日本経済学会で共同論文の報告を行なっている。片桐は、単独では、R&Dと内生的経済成長に関する論文を発表し、サイクルが生じる可能性に関する詳細な分析を開始している。大坂は、環境に関する論文を執筆するとともに、環境と成長に関する研究会に出席し、多数のデータを収集し、次年度以降の実証分析を行う準備を着々と整えている。さらに、共同研究を行ない、各自が得た知見について意見を交換した研究代表者である大住は,昨年に引き続いて,再生可能資源の動態的システムに関する数理的研究とR&Dと内生的経済成長の問題の理論的・実証的研究を行なった.再生可能資源の動態的システムの数理的研究については,生産を伴なうような一般的なシステムのもとで.大域的安定性を保証する充分条件を導出している.この件については,コロンビア大学のG.M.Heal教授と共同論文を執筆中である.R&Dと内生的経済成長の問題については,片桐氏と南氏と共同で研究を進めており,「内生的技術進歩に関する理論的,実証的分析」という論文を執筆し,学会で報告した.さらに,南氏と共同で,再生可能資源の動態的システムのもとで複数のOSS(optimal steady state)の存在の可能性も研究しており,それに関する論文も執筆中である.さらに,大坂は,トランスロガリズムによる全要素生産関数の生産性指数計測と,共和分分析(における生産性の擬似変数)や誤差修正モデルによる計量分析という異なる分析手法を用いて,アジア諸国における生産性向上に関する実証分析を行なっている.最後に,大住と大坂は,内生的経済成長に関するBarro,Determinants of Economic Growthを翻訳し,「経済成長の訳定要因-クロスカントリー実証研究」を九州大学出版会から出版する.今年度の研究に関しては、個別的あるいは共同で、環境R & Dと内生的成長の問題が取り組まれた。研究代表者である大住は次のような研究を行った。片桐氏、南氏と共同でR & Dの結果である内生的技術進歩に関する理論的・実証的研究を行った。ジョーンズ型の内生的成長モデルを実証可能なモデルに修正し、併せて、韓国と日本に関してR & Dが経済成長に及ぼす効果を分析した。さらに、池下(大学院生)、伊ヶ崎助手と共同で、再生可能資源の動態的システムと内生的経済成長モデルを統合し、長期的均衡成長経路を中心に分析を行った。このような研究は全く新しいものであり、今後の有望な研究領域になると思われる。さらに、野田(大学院生)と共同で、オーヴァーラッピング・ゼネレーションズ・モデルのフレームワークのもとで、人的資本の蓄積と長期均衡経路の関連について理論的研究を行い、さらに、東アジアの国を対象にして実証分析を行った。
生涯学習制度化の促進要因とプロセスに関する研究--欧州の事例を中心に

本研究においては、主に超国家的機関である欧州連合(EU)が,加盟各国とEUに加盟しない欧州経済地域(EEA)諸国とともに1996年をヨーロッパ生涯学習年に指定し,生涯学習の理念の普及に努め,参加各国がすべての市民に対する生涯学習の機会の保障を政策の重点課題としようとする動きに注目した。教育制度のみならず,公財政の配分,雇用制度,福祉制度の改革を含むこの「生涯学習制度化」を促進する要因として,1)地域統合によりもたらされた行政・財政の地方分権化の進展,2)人的移動の自由化,3)インターネットを含む情報メディアの普及,4)人々の学歴・学習経験の多様化/不均衡,5)雇用機会の不均衡等があることを解明し,EU及びOECDで収集されている既存のデータにより各国の特色を比較分析した。また,EUが生涯学習年事業において実施した加盟各国の国民に対する生涯学習に対する意識調査,学習への投資に対する見返りに関する標本調査等から,生涯学習制度化のプロセスに関する新たな分析の枠組みと調査研究の方法論を学んだ。この研究により,これまで「労働者の継続教育が中心」とみられていた西欧の生涯学習に,学習活動そのものから得られる喜び,人格の発達,余暇の充実,民主主義社会の市民としての自主性の伸長といった観点が付加されつつあることや,生涯学習の基盤としての就学前及び学校教育,学校外青少年教育の重要性が以前にも増して強調されるようになっていることが明らかになった。こうした動きの背景には,日本政府が生涯学習の振興に力を入れていることの影響が強く現われていた。今後は、我が国における生涯学習概念と「生涯学習制度化」の具体的施策のあり方を批判的に考察するためにも,引き続きヨーロッパ生涯学習年事業を題材とし,グローバルな視野から「生涯学習制度化」の方策を考える研究を継続したいと考える。
上演関連資料を通して見るルイ・ジュヴェの演劇

昨年度に引き続き、フランス国立図書館の演劇部門に出張し、ルイ・ジュヴェコレクションに収められた「演出ノート」の資料調査・研究を行った。平成14年度の研究内容を踏まえ、本研究の最終的な研究成果をより簡潔かつ明瞭にするには、ルイ・ジュヴェの晩年の作品を中心に研究を進めることが望ましいとの考えから、戦後から1951年に没するまでの数年間にジュヴェが演出を手がけた劇作品(ジャン・ジロドゥ『オンディーヌ』、モリエール『ドン・ジュアン』など)を対象に研究を進めた。具体的には、これらの作品の演出に係る演出メモを閲覧し、必要に応じその複製を発注した。また、それら演出作品に係る舞台写真も予算の範囲で新たに購入した。なお、本年度は、研究の最終年度にあたるため、より多くの識者等の意見を参考にし研究成果に反映させる必要から、2003年10月17日から早稲田大学演劇博物館にて開催された「劇場に生きる-舞台人・ルイ・ジュヴェ」展にあわせて、展示に係る図録の編集・出版を行った。また、本研究の成果の一部を、早稲田大学文学研究科紀要第49輯に発表予定の論文「ジャン・ジロドゥ『トロイ戦争は起こらない』試論-1935年の初演関連資料から-」にまとめた。日本にいながらにして.海外の図書館の所蔵する貴重資料を材料とした研究を進めるには、当該資料の目録の把握が不可欠であるが、本研究により、ルイ・ジュヴェ・コレクションの全貌をおおむね把握できたことで、ジュヴェに係るさまざまな研究の成立の余地が生まれたことも収穫の一つと言える。フランスに出張の上、フランス国立図書館(BNF)ルイ・ジュヴェ・コレクションの一部を閲覧し、研究対象に該当する「演出ノート」の絞込みならびに同資料のマイクロフィルムの発注を行った。発注した資料に係るジャン・ジロドゥの戯曲名は、『シャイヨの狂女』、『ベラックのアポロ』、『エレクトル』などである。また。ジロドゥ戯曲の演出コンセプ卜をより多角的に把握する必要から、やはりジュヴェが演出した。ジュール・ロマンの『クノック』のマイクロフィルムも併せて発注した。なお、研究対象資料の原本が、鉛筆での走り書きである場合が多いのに加え、資料形態が薄い紙の裏表にメモが書き込まれたかたちであるなどの理由により、マイクロフィルムでは解読が困難である場合も少なくないことなどから、資料解読のための補助資料として、各戯曲の初演時ならびに再演時に発表された新聞記事スクラップ集の複製も、同図書館が所蔵するものについては発注した。ジロドゥの『シャイヨの狂女』については、入手したマイクロフィルムの資料解読を概ね終了し、デジタル化できる部分についてはこれを行った。これを受けて、同図書館蔵の同戯曲に係る舞台写真アルバムを参照の上、「演出ノート」から読み取れる情報を視覚的に証明しうる写真の発注を行った。この調査の結果の一部は、早稲田大学坪内博士記念演劇博物館発行の「演劇研究:演劇博物館紀要』第26号に発表予定の論文「オーレリイに託されたもの-ジャン・ジロドゥ『シャイヨの狂女』を考える」の執筆のための資料として活用した。
情報爆発時代に対応する質問応答基盤技術に関する研究

本研究では、情報爆発時代における人に優しい情報アクセスの一手法として質問応答技術を位置づけ、大量かつ多様な文書を知識源とする質問応答に関する基盤技術を確立する。さらに、人に優しいインタフェースという観点から一連の関連する質問文群を適切に解釈し、対話における質問応答処理を行う仕組みについても検討する。情報爆発の量・多様性の両側面に包括的に対応し、さらに、対話環境でも利用可能な質問応答システムを構築する点が本研究の特色である。本年度は、下記の知見を得た。1.任意の型の記述的回答が可能な日本語Web質問応答システム任意の型の記述的回答ができる質問応答の手法について検討をした。具体的には、Q&Aコミュニティサービスの質問・回答事例集合を用いることにより、質問の型分類を行なわない新しいアプローチを提案した。入力された質間文に対して、「記述スタイル」(ある質問の仕方に特有の回答の仕方)が類似する質問事例をコーパスから収集し、対応する回答文の事例集合から回答の記述スタイルに関する特徴表現を動的に取得する。評価実験により提案手法の有効性を示した。2.上記質問応答システムをエンジンとする記述的な回答な可能な英日言語横断質問応答言語の多様性の側面に対応するために、質問の言語とは異なる言語で記述された情報源から答を捜し出す言語横断質問応答(CLQA)について検討した。特に、上記1で構成した日本語質問応答システムを、昨年度提案した、Web文書を用いた名詞句の翻訳手法と機械翻訳とを併用する質問文翻訳方式と組み合わせることにより、英日CLQAシステムが構築できることを示した。3.機械学習を用いた二段階洗練化手法による人物説明記述の抽出質問応答の精度向上を目的として、定義型質問応答の核の一つとなる人物に関する説明記述を精度良く抽出する手法について検討し、同手法により高精度を実現できることを示した.本研究では、情報爆発時代における人に優しい情報アクセスの一手法として質問応答技術を位置づけ、大量かつ多様な文書を知識源とする質問応答に関する基盤技術を確立する。1.Web質問応答における複数検索エンジンの組合せによる精度向上複数の検索エンジンを組合せることにより、情報源の多様性を増す事ができると期待される。そこで検索結果を組み合わせるタイミングに注目し、3手法を比較検討した。その結果、各検索エンジンの出力を個別にQAエンジンで処理し、その解候補を後に併合する方法が効果的であることが分かった。2.Web文書を用いた名詞句の翻訳と機械翻訳とを併用した英日言語横断質問応答機械翻訳システムが持つ翻訳辞書に未収録の語句の翻訳に対応するために、次に示す、Web文書を用いた名詞句の翻訳手法3種を導入する方法を検討した:a)Wikipediaを用いた句の翻訳手法、b)Web検索の結果だけを用いた手法、c)Web検索結果と読みの情報を用いた句の翻訳手法。その有効性をNTCIR-6 CLQAにおいて示した。3.語彙統語パタンと語彙的連鎖によるパッセージ抽出に基づく記述的回答が可能な質問応答定義・理由等の記述的な回答をするnon-factoid型質問応答が期待されている。我々はHanらのモデルをnon-factoid型質問一般に拡張し、回答候補の適切性判定を、a)記述形式の適切さ、ならびに、b)質問内容との関連性の組み合わせにより測ることを検討している。その有効性をNTCIR-6 QACにおいて示した。3.機械学習を用いた二段階洗練化手法による人物説明記述の抽出質問応答の精度向上を目的として、定義型質問応答の核の一つとなる人物に関する説明記述を精度良く抽出する手法について検討し、同手法により高精度を実現できることを示した.
数値流体解析手法を用いたスラスタ性能向上に関する研究

二液式スラスタ内部の燃焼状態を化学反応を伴う3次元数値流体計算により高精度に推定して、解析結果が実際の燃焼試験結果と良く一致することを示し、その結果を用いて改良型噴射孔(インジェクタ)の設計計算を行った。次いで数値解析の演算時間を短縮する手法の開発を試み、上記インジェクタを用いたスラスタの燃焼試験結果と解析結果を比較することで、本手法によるスラスタ設計効率化を達成できる見通しを得た。まず,ヒドラジン(N2H4)と四酸化二窒素NTO(N2O4)の燃焼反応に関し,窒素,水素,酸素を含む既に検証された素反応を多く集めることにより,詳細反応モデルの構築を行った。この反応モデルは245反応式30科学種を含んでいる。従来の高々4反応程度を解析に組み込んだ所謂総括化学反応モデルでは燃焼室壁温やスラスタ性能が実験値と合わなかったのに較べ,1.燃焼ガス温度が断熱火炎温度に一致すること,2.着火遅れ時間が実験と合致すること,3.燃焼が平衡状態に達した後の化学組成が化学平衡計算によるものと合致すること,から妥当性を検証した。然しこの反応モデルは実際のスラスタの数値解析に適用するには大きすぎるため,O/F(酸化剤/燃料混合比)をパラメータとした時に上記3項目が詳細反応モデルと差を生じない範囲でモデルの縮小化を図り,61反応式23化学種からなる縮小反応モデルを構築した。このモデルを用いてフィルムクーリング型二液式スラスタの数値シミュレーションを実施し,1.燃焼室壁近傍ではヒドラジンが蒸発し徐々に燃焼ガスに取り込まれるため,境界層にはヒドラジン液滴とヒドラジンガスが混在した層を形成して,壁面冷却効果を高めていること,2.フィルムクーリング用ヒドラジンが全て燃焼ガスに取り込まれるドライアウト事象を明確に示すこと,また中心軸付近の火炎構造について,1.着火までにヒドラジンとNTOの蒸発による中間生成物が空間的に一様に分散するため温度的に均一な火炎を形成すること,2.高温の均一火炎が更にヒドラジン・NTOの蒸発を促進させるメカニズムを明らかにした。次に以上の結果を取り込んだ改良型インジェクタの設計計算を行い,噴射口部分の設計パラメーターを決定した。平成1417年度の科学研究費補助金(基盤研究A)による窒化珪素系セラミックススラスタに関する研究から得られた知見を基に、本研究は、スラスタ内部の燃焼状態を化学反応を伴う数値流体計算により推定することで、(従来は数多くの実験に基づく経験則に頼ってきた)燃料噴射口(インジェクタ)などの設計を効率化することを目的どした。平成19年度においてはヒドラジン(N2H4)と四酸化二窒素NTO(N2O4)の燃焼反応に関し61反応式23化学種からなる反応モデルを構築、このモデルを用いてフィルムクーリング型二液式スラスタの数値シミュレーションを実施、燃焼室壁温やスラスタ性能が実験値と良く合致することを示し、この結果を取り込んだ改良型インジェクタの設計計算を行って、噴射口部分の設計パラメーターを決定した。平成20年度においては、上記の3次元数値解析が未だ膨大な演算時間(1ケースの演算に数週間)を要するため、大幅な演算時間短縮を図り、スラスタ設計の実用ツールとしての有用性を増す事を目指した。計算負荷が大きい原因としては、詳細化学反応を数値的に取り扱う場合、反応速度の時間スケールが各反応で異なり演算が滑らかに進まないこと、解く化学種の保存式が増えること、が考えられた。そこで、1.反応機構、2.解析用計算機、3.流体計算中の反応機構解析手法の3点について見直しを行って計算負荷の低減を図り、得られた解析結果と19年度に設計したインジェクタを用いたスラスタの燃焼試験結果との一致の良好性を確認することとした。その結果、1.反応機構の見直し及び2.新たな計算機を用いてのベンチマークテストなどを実施して成果を上げた後、3.新たな手法の適用による解析が可能であることを示した。一方、上記スラスタの燃焼試験を成功裡に実施し、その結果と今後得られる解析結果を比較することで、本手法によるスラスタ設計の更なる効率化を達成する見通しが得られた。
酵母における細胞複製の制御

イノシトールりん脂質の細胞機能における役割,特に細胞複製における役割について研究を行った.イノシトールりん脂質に関与する突然変異株を分離するためにイノシトールりん脂質に対するモノクローナル抗体を作製し,その抗体を電気穿孔法を用いて細胞またはプロトプラスト化した細胞を処理することによって,その抗体に感受性株を単離する方法で開発した.イノシトールりん脂質の中でキーサブスタンスはPIP2であることから,まずPIP2に対する抗体を常法に従って作製した.そしてこの抗体で細胞を処理すると細胞は一時的に増殖を停止する.イノシトールりん脂質の哺乳動物の研究結果から類推すると,細胞周期のG1期に必要ではないかと考えられた.そこで温度感受性でG1期に停止する突然変異株を多数分離した.これらの株について抗体に対する感受性を調べた結果,感受性になった株が5種類と耐性になったが1種類単離することができた.感受性株の内2種類の株は制限温度下でPIP2を電気穿孔法により細胞に導入してやると細胞増殖が回復した.この結果はPIP2が細胞増殖に必要であることを示している.さらに哺乳動物ではイノシトールリン脂質代謝について解析が進みつつあるが不明な点が多い.酵母においてもその生化学的性状を明らかにする必要があるので, PIからPIPを合成するPItinose, PIPからPIP2を合成するPIPkniseの活性の測定法を確立した.またこの逆反応を行うホスファターゼについても同様に行った.さらに中間代謝産物の定量法をも確立し,イノシトールりん脂質の代謝を追究することが可能になった.イノシトールりん脂質の細胞機能における役割,特に細胞複製における役割について研究を行った.イノシトールりん脂質に関与する突然変異株を分離するためにイノシトールりん脂質に対するモノクローナル抗体を作製し,その抗体を電気穿孔法を用いて細胞またはプロトプラスト化した細胞を処理することによって,その抗体に感受性株を単離する方法で開発した.イノシトールりん脂質の中でキーサブスタンスはPIP2であることから,まずPIP2に対する抗体を常法に従って作製した.そしてこの抗体で細胞を処理すると細胞は一時的に増殖を停止する.イノシトールりん脂質の哺乳動物の研究結果から類推すると,細胞周期のG1期に必要ではないかと考えられた.そこで温度感受性でG1期に停止する突然変異株を多数分離した.これらの株について抗体に対する感受性を調べた結果,感受性になった株が5種類と耐性になったが1種類単離することができた.感受性株の内2種類の株は制限温度下でPIP2を電気穿孔法により細胞に導入してやると細胞増殖が回復した.この結果はPIP2が細胞増殖に必要であることを示している.さらに哺乳動物ではイノシトールリン脂質代謝について解析が進みつつあるが不明な点が多い.酵母においてもその生化学的性状を明らかにする必要があるので, PIからPIPを合成するPItinose, PIPからPIP2を合成するPIPkniseの活性の測定法を確立した.またこの逆反応を行うホスファターゼについても同様に行った.さらに中間代謝産物の定量法をも確立し,イノシトールりん脂質の代謝を追究することが可能になった.
ＧＰＣＲのシグナル伝達機構の構造生物学的解明

b2ARを、95 %以上の純度、80 %以上の活性割合。90%以上のメチオニン残基のメチル基の13C標識率で調製する手法を確立した。逆アゴニスト結合状態のb2ARのNMRスペクトルでは、概ね9個のメチオニン残基に対応するシグナルが観測された。一方、完全アゴニスト結合状態では、いくつかのシグナルが化学シフト変化および消失した。変異体を用いてシグナルを帰属した結果、リガンド依存的な変化を示したのは、M82、M215、M279であることがわかった。このうち、M82に関しては、逆アゴニスト結合状態で、2個のシグナルを与えていた。これらをM82DおよびM82Uと呼ぶ。一方、formoterol結合状態では、carazolol結合状態とは異なる化学シフトに、1個のシグナルが観測されていた。これをM82Aと呼ぶ。各シグナルの化学シフトと、既知の結晶構造におけるM82の環境に基いて、M82DおよびM82UはGタンパク質を活性化できない不活性化状態に、M82AはGタンパク質を活性化できる活性化状態に対応すると結論した。さらに、リガンドによりefficacyが異なる機構を明らかにするため、さらにアンタゴニスト、弱い部分アゴニスト、強い部分アゴニスト結合状態について、M82のシグナルの変化を解析した。その結果、これらの状態では、逆アゴニスト結合状態と完全アゴニスト結合状態の中間的な化学シフトを持つシグナルが観測され、efficacy依存的に連続的な変化を示した。また、これらのシグナルの化学シフトは、有意に測定温度依存的に変化した。以上のことから、各リガンド結合状態において、#61538;2ARは、M82D、M82Uに対応する不活性化状態と、M82Aに対応する活性化状態の間の平衡にあり、各リガンドのefficacyの違いは、活性化状態の割合の違いに起因することが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。SF-9昆虫細胞にCCR1を大量発現させた上で、膜画分を密度勾配遠心により精製した。CCR1をDDMで可溶化した上で、その直後にMSP1E3を使ってrHDL、に再構成した。得られたrHDLを、His-tagおよび1D4カラムで精製した。得られたCCR1の純度は80%以上、収量は40ugであった。得られたCCR1-rHDLに対して、Gタンパク質とMIP-1αのmonomeric mutantであるP8A/F13Y/E67Qを添加した試料を用いて、GDP-GTP交換アッセイを行った。その結果、MIP-1α濃度依存的にCCR1-rHDLに対する蛍光標識GTP結合量が増大した。したがって、CCR1-rHDLがシグナル伝達活性を保持することが示された。さらに、MIP-1α変異体とCCR1-rHDLの相互作用をSPRで調べた結果、解離定数が約2uMと算出された。次に、アミドプロトン検出型のTCS実験を行った。その結果、L3,A10,C11,C12,T16,F24,Y28,S32,Q34,I41,F42,S47,Q49,V50,C51にラジオ波照射に伴う有意な強度減少が観測された。本実験により得られたCCR1との結合界面と、CCR5との結合界面を比較すると、Q49の近傍は、両方の結合界面に含まれるのに対し、Q30を中心とした領域、およびV59を中心とした領域は、それぞれCCR1,CCR5との結合界面にのみ含まれていた。MIP-1αについて、E57やV63のSNPsが報告されている。これらの残基は、今回の研究で、CCR5特異的な結合部位に存在することが分かった。これらのSNPsが多発性硬化症の症状に与える影響を調べることにより、CCR5とMIP-1αの相互作用が病気の進行に果たす役割について、手掛かりが得られると考えた。

その結果、これらの状態では、逆アゴニスト結合状態と完全アゴニスト結合状態の中間的な化学シフトを持つシグナルが観測され、efficacy依存的に連続的な変化を示した。また、これらのシグナルの化学シフトは、有意に測定温度依存的に変化した。以上のことから、各リガンド結合状態において、#61538;2ARは、M82D、M82Uに対応する不活性化状態と、M82Aに対応する活性化状態の間の平衡にあり、各リガンドのefficacyの違いは、活性化状態の割合の違いに起因することが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。CCR1に関しては、当初の計画通り、試料調製法を確立した上で、TCS実験によりCCR1上のMIP-1□結合界面の同定に成功した。また、アドレナリン□2受容体に生じる構造変化をNMR解析する方法も確立した。これらに加えて、ヒト□オピオイド受容体についても、rHDL中の脂質二重膜に再構成する方法を確立し、SPR解析によりリガンド結合活性を保持していることを確認できた。今後、ヒト□オピオイド受容体の活性化に伴う構造変化もNMR解析することにより、オピオイドの薬理作用に関する重要な手掛かりが得られると考えている。以上より、当初の計画より進んでいると判断した。(1)CCR1やオピオイド受容体のNMR解析条件の確立CCR1やオピオイド受容体について、NMR解析に十分な純度、濃度、安定性の試料が調製できるようにする。活性を確認しながら、N末端やC末端の切除や熱安定変異の導入を行うことにより、収量や安定性の向上を試みる。また、リガンドアフィニティークロマトグラフィーにより、活性体のみを単離する方法も確立する。さらに、安定性が不十分な場合は、reconstituted high density lipoprotein(rHDL)中の脂質二重膜に再構成することも検討する。(2)膜貫通領域のシグナルの観測および帰属CCR1やオピオイド受容体について、膜貫通領域に存在するメチオニン残基のメチル基を選択的に13C標識した標識体を作製して、NMRシグナルの観測を試みる。観測できたら、変異体による帰属を行う。特に、リガンド結合部位近傍や、活性化に伴い大きく構造変化すると考えられるTM5,6の帰属を試みる。次に、アゴニスト結合時、アンタゴニスト結合時、非結合時のシグナルを比較することにより、活性化に伴う構造変化を検出する。さらに、NOEの検出や、13C核の化学シフトに基いて、構造変化の様式の手掛かりを得る。また、シグナルに多型が観測された場合は、機能と無関係な不均一性に由来するものでないことを十分確認した上で、線形解析やZZ-exchangeにより、量比や交換速度を決定する。以上の結果に基いて、細胞外領域へのアゴニストの結合により、CCR1やオピオイドの細胞内領域に生じる構造変化の様式および機構、ならびにG蛋白質やアレスチン等の細胞内エフェクター分子の活性制御の機構を考察する。
運動器障害で生じる広範囲慢性痛の病態解明：若齢期の特異性によるバイオマーカー探索

運動器障害をはじめとした神経損傷以外の原因で発症する慢性痛は、病態が複雑で治療法、リハビリテーションが構築されておらず、ADL、QOLの低下を引き起こし、社会的に大きな問題となっている。また、臨床的に線維筋痛症、CRPS Iなどで小児の発症が少ないという報告があり、このような若齢期での発症率の低さは生後の発達過程における何らかの要因が発症に関与している可能性がある。そこで若齢期に着目し、我々の開発したモデルで若齢期処置を行い、行動学的・組織学的・分子生物学的検討を行った。筋損傷による慢性痛モデルにおいて、成熟(生後9週)処置で急性期の痛みの増強後に続く慢性痛がみられたのに対し、若齢(生後3週)処置では急性期の痛みの増強のみで慢性痛は発症しなかった。そこで、若齢と成熟処置での違いが発症要因と関連すると考えられる。そこで、末梢での違いとして障害筋の変化を検討した。組織学的検討において、急性期においては広範囲な筋細胞の壊死が観察された。成熟処置で慢性痛がみられ、若齢処置では慢性痛がみられない慢性期においては、ほぼ正常に近い筋組織像が成熟、若齢処置のどちらも同様にみられた。また、分子生物学的検討において、痛みに違いの出る慢性期においては成熟・若齢処置ともに処置前と同等であった。また、筋の分化・成熟に関与するmyogeninの発現は、処置前より成熟処置では減少、若齢処置ではほぼ同等であった。また、本モデルでは障害部から離れた足底部、さらに反対側まで両側性に痛みが拡がるため、脊髄における変化を分子生物学的に解析したところ、急性期において若齢でのMyogmRNA発現が成熟に比べやや多い傾向にあった。今後、筋の修復過程に注目していくことで、運動器慢性痛のメカニズムの解明と効果的な慢性痛リハビリテーションの基礎の構築につながることが期待される。運動器障害により広範囲に生じる慢性痛のメカニズム解明を進めるために、独自に開発した運動器慢性痛モデルを用いて、慢性痛の発症・維持要因を探る。特に、若齢期において慢性痛が発症しにくいことに注目し、生後の発達過程により変化する因子が関与している可能性を考えている。そこで、行動学的検討を踏まえ、障害部位である筋だけでなく、痛みが広範囲に拡がることから脊髄レベルおよび血液での解析を継時的に行うことにより、慢性痛発症・維持要因の新たなバイオマーカーを提案する。1末梢:筋組織における成熟および若齢期処置後の痛みの発症・拡大・維持の各時期におけるバイオマーカー解析2中枢:脊髄組織における成熟および若齢期処置後の痛みの発症・拡大・維持の各時期におけるバイオマーカー解析3全身性:血液成分における成熟および若齢期処置後の痛みの発症・拡大・維持の各時期におけるバイオマーカー解析上記の目的に対して、モデル作成を行い、そこからの下腿三頭筋筋組織・障害レベルでの脊髄、および、血液サンプルの採取を行い、筋組織で組織学的検討と生化学的検討を行っている。サイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質の解析として、TNFαをはじめとしてどの要因が関連物質として適切であるかをELISAおよびPCR法を用いて現在試行検討中である。これらの解析により、運動器慢性痛のメカニズムの解明と効果的な慢性痛リハビリテーションの基礎の構築につなげる。本モデルでは末梢筋損傷が長期痛み行動を引き起こすトリガーとなる可能性が考えられるため、障害筋である下腿三頭筋、また、脊髄サンプル・血液サンプルの凍結試料を作成し、サイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質として、ELISAおよびPCR法による解析を検討中であるが、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっており計画から遅れている。それにより、運動器慢性痛のメカニズムの解明と効果的な慢性痛リハビリテーションの基礎の構築につなげる。これまでに、筋損傷による運動器慢性痛モデルを9週齢(成熟)および3週齢(若齢)において作成し、末梢における筋損傷が長期痛み行動を引き起こすトリガーとなる可能性が考えられるため、障害筋である下腿三頭筋および反対側の下腿三頭筋の凍結試料を作成した。その凍結試料において、サイトカインであるTNFα、IL10や、MyoD、Myogeninといった筋特異的成長因子、抗酸化酵素(SOD)の解析を行った。また、本モデルでは障害部から離れた足底部、さらに反対側まで両側性に痛みが拡がるため、脊髄凍結試料を作成し、脊髄における可塑性発現の時間的・空間的な拡がりに注目し解析する。そのため、運動器慢性痛モデルを同様に作成し、9週齢(成熟)および3週齢(若齢)において脊髄組織および血液サンプルの採取を行った。これら脊髄組織で、神経栄養因子、サイトカイン、細胞内シグナル伝達系、また、血液サンプルにおいて上記に加えてバイオマーカーを検討中である。脊髄組織で、脊髄での感作や神経の成長に関与すると考えられる神経栄養因子、免疫系に関わるサイトカイン、細胞内シグナル伝達系や、血液サンプルにおいても筋損傷に関与するバイオマーカーを、免疫組織、PCRおよびELISA法により解析を検討中であるが、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっており計画から遅れている。

運動器障害をはじめとした神経損傷以外の原因で発症する慢性痛は、病態が複雑で治療法、リハビリテーションが構築されておらず、ADL、QOLの低下を引き起こし、社会的に大きな問題となっている。また、臨床的に線維筋痛症、CRPS Iなどで小児の発症が少ないという報告があり、このような若齢期での発症率の低さは生後の発達過程における何らかの要因が発症に関与している可能性がある。そこで若齢期に着目し、我々の開発したモデルで若齢期処置を行い、行動学的・組織学的・分子生物学的検討を行った。筋損傷による慢性痛モデルにおいて、成熟(生後9週)処置で急性期の痛みの増強後に続く慢性痛がみられたのに対し、若齢(生後3週)処置では急性期の痛みの増強のみで慢性痛は発症しなかった。そこで、若齢と成熟処置での違いが発症要因と関連すると考えられる。そこで、末梢での違いとして障害筋の変化を検討した。組織学的検討において、急性期においては広範囲な筋細胞の壊死が観察された。成熟処置で慢性痛がみられ、若齢処置では慢性痛がみられない慢性期においては、ほぼ正常に近い筋組織像が成熟、若齢処置のどちらも同様にみられた。また、分子生物学的検討において、痛みに違いの出る慢性期においては成熟・若齢処置ともに処置前と同等であった。また、筋の分化・成熟に関与するmyogeninの発現は、処置前より成熟処置では減少、若齢処置ではほぼ同等であった。また、本モデルでは障害部から離れた足底部、さらに反対側まで両側性に痛みが拡がるため、脊髄における変化を分子生物学的に解析したところ、急性期において若齢でのMyogmRNA発現が成熟に比べやや多い傾向にあった。今後、筋の修復過程に注目していくことで、運動器慢性痛のメカニズムの解明と効果的な慢性痛リハビリテーションの基礎の構築につながることが期待される。筋組織でのサイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質として、ELISAおよびPCR法を用いての検索を継続する。その際、さらに関連文献の検索、関連分野の研究者からの情報も含めて検索の効率を上げる。また、脊髄組織、血液サンプルでの物質の探索も同時にさらに進行させていく。脊髄組織で、脊髄での感作や神経の成長に関与すると考えられる神経栄養因子、免疫系に関わるサイトカイン、細胞内シグナル伝達系や、血液サンプルにおいても筋損傷に関与するバイオマーカーを、免疫組織、PCRおよびELISA法により解析を継続して行っていく。その際、さらに関連文献の検索、関連分野の研究者からの情報も含めて、最適な解析を検討していく。筋組織、脊髄組織、血液サンプルを用いて検索するサイトカイン、神経栄養因子などの関与する物質として、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっており、本格的な解析に着手できていないため。慢性痛の発症・維持要因を探る。
録音ろう管ネガティブのための光学的音声再生装置の開発

最近,研究代表者らの調査により,録音ろう管からメッキを用いて型をとったネガティブあるいはガルバノと呼ばれる金属管がベルリンの国立民族学博物館に大量に保管されていることが明らかとなった.このネガティブには,19世紀末から20世紀半ばにかけて録音された世界の民族音楽が記録されているが,通常のろう管再生機(蓄音機)では再生が不可能であることから,これらの貴重な音声資料の利用が極めて困難な状態にある.本研究は,これらのネガティブから実時間で音声を再生するため,レーザーを用いた非接触式の光学的音声再生装置を開発することを目的としている.1.小型光学系の開発ネガティブ管は,金属管の内壁の凸状の部分に音声情報が記録されている.その凹凸変化をレーザービームの反射方向の変化として検出するため,半導体レーザー,小型のレンズ,ミラー,ビームスプリッタ,ビーム位置検出素子等を使用し,管の内部に挿入可能な小型の光学系を設計した.また,検出光学系には結像レンズとピンホールからなるリレー光学系を挿入し,不要な散乱光等を効率よく除去し,再生音声のSN比の向上を図った.2.駆動ユニットの開発内径58mmの保持筒にネガティブを挿入し,それを6本のネジにより周囲から固定してネガティブを保持し,この保持筒を直流モータにより回転駆動し,直流モータと保持筒全体を搭載したステージを円筒の軸方向にパルスモータを用いて直線駆動するシステムを開発した.保持筒にはロータリエンコーダを装着し,円筒の回転速度に対応してパルスモータによる直線移動を制御した.3.総合特性の確認と日本の音楽資料の再生以上の各システムを結合させ,光学的音声再生装置としての総合的な動作を確認した.さらに,試作した装置を使っていくつかのネガティブ管から音声の再生に成功した.その中には,1901年にベルリンで録音された新演劇俳優川上音二郎の一座による三味線や琴の演奏が含まれている.最近,研究代表者らの調査により,録音ろう管からメッキを用いて型をとったネガティブあるいはガルバノと呼ばれる金属管がベルリンの国立民族学博物館に大量に保管されていることが明らかとなった.このネガティブには,19世紀末から20世紀半ばにかけて録音された世界の民族音楽が記録されているが,通常のろう管再生機(蓄音機)では再生が不可能であることから,これらの貴重な音声資料の利用が極めて困難な状態にある.本研究は,これらのネガティブから実時間で音声を再生するため,レーザーを用いた非接触式の光学的音声再生装置を開発することを目的としている.1.小型光学系の開発ネガティブ管は,金属管の内壁の凸状の部分に音声情報が記録されている.その凹凸変化をレーザービームの反射方向の変化として検出するため,半導体レーザー,小型のレンズ,ミラー,ビームスプリッタ,ビーム位置検出素子等を使用し,管の内部に挿入可能な小型の光学系を設計した.また,検出光学系には結像レンズとピンホールからなるリレー光学系を挿入し,不要な散乱光等を効率よく除去し,再生音声のSN比の向上を図った.2.駆動ユニットの開発内径58mmの保持筒にネガティブを挿入し,それを6本のネジにより周囲から固定してネガティブを保持し,この保持筒を直流モータにより回転駆動し,直流モータと保持筒全体を搭載したステージを円筒の軸方向にパルスモータを用いて直線駆動するシステムを開発した.保持筒にはロータリエンコーダを装着し,円筒の回転速度に対応してパルスモータによる直線移動を制御した.3.総合特性の確認と日本の音楽資料の再生以上の各システムを結合させ,光学的音声再生装置としての総合的な動作を確認した.さらに,試作した装置を使っていくつかのネガティブ管から音声の再生に成功した.その中には,1901年にベルリンで録音された新演劇俳優川上音二郎の一座による三味線や琴の演奏が含まれている.最近,研究代表者らの調査により,録音ろう管から型を取ったネガティブあるいはガルバノスと呼ばれる金属管がベルリンの民族博物館に大量に保管されていることが明らかとなった.このネガティブには19世紀末から20世紀半ばにかけての世界各地の貴重な民族音楽が記録されているとされているが,通常のろう管再生機は使用できないため,音声再生が全くできない状態にある.本研究は,このろう管ネガティブに記録されている民族音楽を再生するため,レーザー光を用いた非接触式の音声再生装置を開発することを目的としている.1.小型光学系および信号処理システムの設計と試作本研究では,直径5cm程のネガティブ管の内壁に記録されている音声情報をレーザービームの反射方向の変化として検出する.そのために必要な,管の内部に挿入可能な小型の光学系を設計し,試作した.また,検出した反射ビームの方向信号から音声を再生するための信号処理システムを設計,試作した.2.ろう管ネガティブ駆動システムの設計と試作ネガティブの管の内面に接触することなしに,軸の周りに円筒を回転させ,同時に軸方向に一定速度で移動させるためのネガティブ保持機構,軸出し機構,駆動機構を組み合わせた駆動システムを設計し,試作した.3.再生装置の総合的性能評価と民族音楽資料の再生以上の各システムを結合させ,光学的再生装置としての総合的な動作を確認した.さらに,試作した装置を使って,1901年にベルリンで録音された新演劇俳優川上音二郎の一座の演奏する三味線や琴の演奏を含む幾つかのネガティブからの民族音楽の再生に成功した.本研究は,録音ろう管に金属メッキを施すことにより作成された金属製の型であるネガティブから,レーザー光を用いて非接触により音声を再生する手法および装置を開発することを目的としている.

19世紀末から20世紀半ばにかけて録音された世界の民族音楽を記録した貴重なネガティブ管がドイツに大量に保存されていることが最近明らかとなっており,本研究で開発する装置はそのような貴重な音声資料の活用に道を開くことを可能にする.今年度は,昨年度に試作した装置をさらに改良し,装置の特性の向上を行った.1.照射・検出光学系の小型化・高性能化光源に可視領域の半導体レーザーを用いることにより,ネガティブ管に挿入する光学ヘッドの小型化を行った.また,管内部での散乱光が光検出器に混入するのを防ぐため,レンズとピンホールからなるリレー光学系を挿入した.これにより,蛍光灯などの室内照明下でも安定した音声再生が可能となった.2.回転駆動システムの改良回転駆動系の材質および加工精度を改善し,昨年度作成したネガティブの回転駆動系に残っていた機械的な問題点を解決した.これにより,ネガティブ管を安定した速度で回転させることが可能となった.3.トラッキング法の改良レーザービームによる管内面の音声トラックの追尾法として,ネガティブを一定速度で軸方向に駆動する定速トラッキングに加えて,音声トラックからのレーザービームのずれ量を検出してそれを補正することによりトラックを行う自動トラッキングを導入した.これにより,より安定したトラッキングが可能となった.4.再生装置の総合特性の改良以上の改良した各システムを結合し,制御装置の回路パラメータを最適化することにより,全体の動作の安定化と再生音声の改善を図った.
ナノスペース中に束縛されたヘリウム4の超流動状態とその空間サイズ効果

活性炭素繊維(Activated Carbon Fiber ; ACF)は面内サイズ約30Åのナノグラファイトの乱れた3次元ネットワークからなり,ナノポアと呼ばれる内径数数十オングストロームのナノスペースが発達したマイクロポーラスな物質である.そのため3000m^2g^<-1>にも及ぶ非常に大きな比表面積を持ち,様々な物質をそのナノポア中に吸蔵することができる.本研究では,ねじれ振り子法を用いることでACFのナノポア中に吸着した^4Heの超流動密度を測定し,超流動^4Heの空間サイズ効果について検討することを目的とする.平成15年度においては前年度作成・開発を行った高感度のねじれ振り子を用い,ACFに吸着した^4Heの,超流動密度の吸着量依存性の測定を行った.試料であるACFが繊維状の物質であるため,20mKにおけるQ値は62万程度と比較的小さく,ねじれ振り子への試料の固定方法には改善の余地があると思われる.吸着量23.7μmolm^<-2>以下では20mKまでの範囲では超流動は観測されなかった.これはグラファイト上への^4Heの吸着に換算すると1.1層吸着に相当し,グラファイトの場合と同様,第1層吸着は基盤との相互作用のため固相として存在していると考えられる.吸着量23.7μmolm^<-2>において約500mKにナノポア中に吸着した^4Heの超流動転移と思われる周波数シフトが観測された.この超流動転移点は吸着量を増加させても変化せず,30μmolm^<-2>以上の吸着量ではバルクの^4Heの超流動転移が観測されるようになる.ナノポア中の^4Heの超流動転移点が吸着量依存性を示さず,それ以上の吸着量においてバルクの^4Heの超流動転移が観測されることから,吸着量23.7μmolm^<-2>において既にナノポアが^4Heで完全に埋められていると考えられるが,ACFのナノポアの構造モデルとあわせ,より詳細な検討が必要と考えられる.活性炭素繊維(Activated Carbon Fiber ; ACF)は面内サイズ約30Åのナノグラファイトの乱れた3次元ネットワークからなり,ナノポアと呼ばれる内径数十数オングストロームのナノスペースが発達したマイクロポーラスな物質である.そのため3000m^2g^<-1>にも及ぶ非常に大きな比表面積を持ち,様々な物質をそのナノポア中に吸蔵することができる.本研究では,ねじれ振り子法を用いることでACFのナノポア中に吸着した^4Heの超流動状態を測定し,超流動^4Heの空間サイズ効果について検討することを目的とする.平成14年度においては^4Heガスハンドリングシステム,高感度のねじれ振り子,およびその周辺エレクトロニクスの作製・開発を行った.開発したねじれ振り子の4.2Kにおける共鳴周波数,Q値はそれぞれ1214.91615Hz±0.00005Hz,1.6×10^6で,4HeをACFのナノポア表面に1原子層吸着させることで約0.7Hzの周波数変化を観測できた.これは本研究を遂行するのにおいて十分な基本性能を持っているといえる.また,ACFと同程度の,約25Aのナノしペースを持つ多孔質ガラスを用いた研究も開始した.1気圧の下では約1Kで超流動転移が観測された.圧力を加えるにつれ超流動転移温度は減少していくが,バルクの^4Heが固化する領域においても超流動転移と思われる周波数変化が観測された.これはナノスペース中に束縛された^4Heによる超流動と考えられ,ナノスペース中で特異な超流動状態が実現していると考えられる.活性炭素繊維(Activated Carbon Fiber ; ACF)は面内サイズ約30Åのナノグラファイトの乱れた3次元ネットワークからなり,ナノポアと呼ばれる内径数数十オングストロームのナノスペースが発達したマイクロポーラスな物質である.そのため3000m^2g^<-1>にも及ぶ非常に大きな比表面積を持ち,様々な物質をそのナノポア中に吸蔵することができる.本研究では,ねじれ振り子法を用いることでACFのナノポア中に吸着した^4Heの超流動密度を測定し,超流動^4Heの空間サイズ効果について検討することを目的とする.平成15年度においては前年度作成・開発を行った高感度のねじれ振り子を用い,ACFに吸着した^4Heの,超流動密度の吸着量依存性の測定を行った.試料であるACFが繊維状の物質であるため,20mKにおけるQ値は62万程度と比較的小さく,ねじれ振り子への試料の固定方法には改善の余地があると思われる.吸着量23.7μmolm^<-2>以下では20mKまでの範囲では超流動は観測されなかった.これはグラファイト上への^4Heの吸着に換算すると1.1層吸着に相当し,グラファイトの場合と同様,第1層吸着は基盤との相互作用のため固相として存在していると考えられる.吸着量23.7μmolm^<-2>において約500mKにナノポア中に吸着した^4Heの超流動転移と思われる周波数シフトが観測された.この超流動転移点は吸着量を増加させても変化せず,30μmolm^<-2>以上の吸着量ではバルクの^4Heの超流動転移が観測されるようになる.

ナノポア中の^4Heの超流動転移点が吸着量依存性を示さず,それ以上の吸着量においてバルクの^4Heの超流動転移が観測されることから,吸着量23.7μmolm^<-2>において既にナノポアが^4Heで完全に埋められていると考えられるが,ACFのナノポアの構造モデルとあわせ,より詳細な検討が必要と考えられる.
新しい超音波造影剤ヘリウムガスの基礎的研究と臨床応用

原発性肝癌の診断として超音波検査は重要な役割を果たしてきたが、CT、MRIに比べて造影剤が存在しないという欠点をもっていた。しかし、1984年頃より経動脈的な二酸化炭素を用いた造影エコーが徐々に行われるようになってきたが、二酸化炭素の溶解度が高いため、短時間しか検査できないという欠点をもっていた。そこで我々は、潜函病の治療に用いられ、二酸化炭素より溶解度の低いヘリウムガスを用いて造影エコーができないかと考え、この研究を開始した。ニュージーランドホワイトラビット30尾を使用しその有用性と安全性のを検討した。具体的には、透視下で実験動物の肝臓にヘリウムガスを注入しその安全性を確認した後VX2等の移植腫瘍を使用し、腫瘍の内部にどのくらいの時間ヘリウムガスがとどまるか検討した。その結果ヘリウムガスは0.1ml/kgまでは胃、肝臓、膵臓に組織学的は変化は認められず、またヘリウムガスは二酸化炭素に比べ腫瘍に約4倍長くとどまることがわかった。その為結果を熊大倫理委員会に提出し、使用許可を得たため臨床例への使用を検討中である。
熱力学的解析に基づいた競合状態におけるDNA間結合の特異性に関する研究

本年度の研究は,複数のDNAが溶液中に存在してハイブリダイゼーションするような競合状態の解析を主眼として進めてきた.成果としては,(1)競合状態を解析する実験手法の確立,(2)競合状態において二本鎖の生成割合を予測するモデルの提案の二つに要約できる.まず(1)であるが,競合状態の解析においては,複数種類生成される二本鎖の割合を実験的に計測する必要がある.そこで,FAMという蛍光物質とDabcylと呼ばれるクエンチャー物質を利用することにより,ある特定の二本鎖の生成割合を計測する手法を確立した.次に,上記の実験手法を用いて,二本鎖の生成割合を予測するモデルの提案・検証を行った.予備実験の結果から,二本鎖の安定性の尺度であるTmやΔGminの差が生成割合に寄与していることが分かった.そこで,「生成割合=f(Tm(ΔGmin)の差)」という関数を用いて予測が可能かどうかを検証した.尚,関数fは,熱力学的な考察に基づき,シグモイド関数を変形した関数として定義した.このように定義したモデルを実測値にフィッティングさせ,χ二乗検定によりモデルの当てはまりを計算した結果,30mer以下の比較的短い配列であれば,二本鎖の生成割合を精確に予測できることが示された.また,40mer以上の長い配列であっても,Tmが10°C以上異なっていれば,安定な二本鎖がほぼ100%生成されることが示された.これらの結果は,DNAコンピューティングにおいて熱力学的なシミュレーションを行う際や塩基配列を設計する際に有用なデータとなる.特に,自身の相補配列とのみ結合する特異的な配列を設計する際の指針として上記の結果を用いることが可能であり,DNAコンピューティングにおけるシステマティックな設計論の確立に寄与すると考えられる.本年度の研究業績は以下の二点にまとめられる.1化学実験により,二本のDNAが結合するためのΔGの閾値ΔG^*を明らかにした2全ての塩基配列の組についてΔG>ΔG^*を満たすような塩基配列集合の設計プログラムの実装・公開まず,上記1に関して説明する.当初は,三本のDNAが競合して結合する際に,結合の特異性を満たすΔGの条件も併せて調査する予定であった.しかしながら,科学研究費が申請額の150万円より50万円少ない100万円であったため,二本のDNAが結合する場合のみ調査を行っている.具体的な実験方法に関しては,計画時に述べた通り電気泳動による手法を採用した.これは,当初危惧していた識別能が予想よりも高く,DNA間結合の判定が十分可能だったためである.実験の結果,ΔGによって二本のDNAが結合するか否かを精度よく判定できることが確認された.さらに,バッファの塩濃度が1M,DNAの濃度が1uMという基準的な条件下において,ΔG^*=-14.0kcal/molを閾値として,これを下回った場合に二本のDNAが結合することが明らかとなった.次に,上記2に関して説明する.上記の結果より,お互いに結合しない,つまり結合の特異性を満たす塩基配列を設計する場合,ΔG>ΔG^*という条件を満たす必要があることがわかった.そこで,全ての塩基配列の組についてΔG>ΔG^*を満たすような塩基配列集合を設計するプログラムの実装を行った.PCの環境に出来るだけ依存せずに実行可能なように,Javaアプリケーションとして実装を行い,現在,Web上で公開している本年度の研究は,複数のDNAが溶液中に存在してハイブリダイゼーションするような競合状態の解析を主眼として進めてきた.成果としては,(1)競合状態を解析する実験手法の確立,(2)競合状態において二本鎖の生成割合を予測するモデルの提案の二つに要約できる.まず(1)であるが,競合状態の解析においては,複数種類生成される二本鎖の割合を実験的に計測する必要がある.そこで,FAMという蛍光物質とDabcylと呼ばれるクエンチャー物質を利用することにより,ある特定の二本鎖の生成割合を計測する手法を確立した.次に,上記の実験手法を用いて,二本鎖の生成割合を予測するモデルの提案・検証を行った.予備実験の結果から,二本鎖の安定性の尺度であるTmやΔGminの差が生成割合に寄与していることが分かった.そこで,「生成割合=f(Tm(ΔGmin)の差)」という関数を用いて予測が可能かどうかを検証した.尚,関数fは,熱力学的な考察に基づき,シグモイド関数を変形した関数として定義した.このように定義したモデルを実測値にフィッティングさせ,χ二乗検定によりモデルの当てはまりを計算した結果,30mer以下の比較的短い配列であれば,二本鎖の生成割合を精確に予測できることが示された.また,40mer以上の長い配列であっても,Tmが10°C以上異なっていれば,安定な二本鎖がほぼ100%生成されることが示された.これらの結果は,DNAコンピューティングにおいて熱力学的なシミュレーションを行う際や塩基配列を設計する際に有用なデータとなる.特に,自身の相補配列とのみ結合する特異的な配列を設計する際の指針として上記の結果を用いることが可能であり,DNAコンピューティングにおけるシステマティックな設計論の確立に寄与すると考えられる.
次世代シークエンサーを用いた難聴遺伝子の網羅的解析

難聴の原因遺伝子はおおよそ100種類ぐらい存在すると考えられているが、従来の直接シークエンス法ではスループットが低いため、数遺伝子を解析するのが限界であり、遺伝子変異を検出できない例が多く認められる状況であった。本研究では、次世代シークエンサーを用いることで、難聴の原因候補遺伝子の全塩基配列を決定し、網羅的に解析を行うことで、より診断率を向上させることを計画した。信州大学が従来より管理する日本人難聴遺伝子データベースに登録されている難聴患者216名を対象に、難聴との関連が報告されている112遺伝子のエクソン領域の網羅的解析を行った。その結果、効果的に遺伝子解析が実施され、複数の難聴の原因遺伝子変異を同定することができた。本研究では、次世代シークエンサー(ゲノムシークエンサー)を用いることで、難聴の原因候補遺伝子の全塩基配列を決定し、網羅的に解析を行うことで、より診断率を向上させることを計画した。平成22年度は、難聴患者約200名を対象に、コバリスを用いてDNAをおおよそ200塩基に断片化した後に、Agilent社のSureselectを用いた選別法により、候補遺伝子領域を含むDNA断片の濃縮を行う。濃縮後はシークエンス用のアダプターを付加した後に、ブリッジPCRを用いてDNAの増幅を行ない、次世代シークエンサーにより全塩基配列の決定を行なった。Agilent社のSureselect等を用いた候補遺伝子領域の選択的濃縮に際しては、海外の文献や、Hereditary Hearing loss Homepageを参考に、既に報告されている難聴の原因遺伝子や、まだ遺伝子までは明らかになっていない原因座位に対するビオチン化オリゴをカスタム合成し、pull down法により選別した。次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析の結果、複数の難聴の原因遺伝子変異を同定しており、現在サンガーシークエンスを用いた確認作業を進めている状況であり、十分な成果が得られており、次年度以降に向けて順調に解析を実施できた。難聴の原因遺伝子はおおよそ100種類ぐらい存在すると考えられているが、従来の直接シークエンス法ではスループットが低いため、数個の遺伝子を解析するのが限界であり、遺伝子変異を検出できない例が多く認められる状況であった。平成23年度は、前年度までに引き続き、難聴患者約200名を対象に、コバリスを用いてDNAをおおよそ200塩基に断片化した後に、Agilent社のSureselectを用いた選別法により、候補遺伝子領域を含むDNA断片の濃縮を行った。現在サンガーシークエンスを用いた確認作業を進めている状況であるが、200名の難聴患者の解析により、既に230カ所以上の新規ミスセンス変異、17種類のスプライシング変異、5種類のナンセンス変異を同定した。十分な成果が得られており、次年度以降に向けて順調に解析を実施できた。平成24年度は、前年度までに引き続き、難聴患者約200名を対象に難聴の原因遺伝子54遺伝子を含む112遺伝子の全エクソン領域をAgilent社のSureselectを用い候補遺伝子領域を含むDNA断片の濃縮を行い、シークエンス用のアダプターを付加した後に、次世代シークエンサーにより全塩基配列の決定を行なった。検出された遺伝子変異にお関してはサンガーシークエンスを用いた確認作業を行うとともに家系サンプルを用いた解析を行い、病的変異を多数同定した。