hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二次代謝産物生合成において細胞質型と液胞型酵素はどのように使い分けられるのか？

高次に修飾されたポリアシル化アントシアニンを持つキンジソウ(Gynura bicolor)の葉から抽出した粗酵素液を用いて、基本骨格であるcyanidin(Cy)とcyanidin 3-glucoside(Cy3G)を基質として、UDP-glucoseとmalonyl-CoAを用いた糖転移(GT)反応と、アシル基転移(AT)反応を行ったところ、cyanidinに対する糖転移反応と、Cy3Gに対するマロン酸転移酵素活性が認められた。これらは反応条件から細胞質型の酵素であることが推察された。キンジソウの葉と根から抽出したRNAを用いてRNA-seq解析を行った。Trinityを用いたde novoアッセンブリによって得られた約11万contigについてBLAST検索を行ったところ、アントシアニンを蓄積する葉だけで発現しているacyl-CoA依存型のAT相同遺伝子を2種類獲得した。また、葉だけで発現していると思われるUDP-glucose依存型GTについて65 contigを獲得した。また、液胞型GTの相同遺伝子について41、液胞型ATの相同遺伝子については47 contigを獲得した。キンジソウと同時にポリアシル化アントシアニンをもつ紫キャベツ(Brassica oleracea var. capitata f. rubra)についても研究を進めた。紫キャベツ葉から抽出した粗酵素液を用いて、Cy, Cy3Gを基質として、UDP-glucoseを用いた糖転移反応について検討したところ、Cy3G→Cy3GG→Cy3GG,5Gの順番で糖転移反応が起こることが推定された。紫キャベツとアントシアニンを持たないキャベツの葉を用いてRNA-seq解析を行った。その結果、細胞質型GT:123、細胞質型AT:15、液胞型AT:149、液胞型AT:47のcontigを獲得した。本申請では、キンジソウや紫キャベツ等の高次に修飾されたアントシアニン分子のの生合成経路を解明し、それぞれの修飾反応を触媒している酵素が細胞質型のものであるか、液胞型のものであるかを明らかとすることが目的である。このため、まずは生合成の順序を決定するとともに、それらの反応がどのような基質を必要とするかを明らかとする必要がある。今年度は、キンジソウではアントシアニン基本骨格から2段階目まで、紫キャベツでは3段階目までの反応を検出することに成功し、これらが全て細胞質型の酵素によって触媒されることを推定した。また、これらの酵素をコードしている遺伝子を同定するために、RNA-seq解析を行い、候補遺伝子の絞り込みを行った。これらのことから概ね当初の予定通り研究は進行しているものと判断される。キンジソウについてはアントシアニン合成の3段階目以降の反応を検出するために、2段階目の反応を大量に行い、3段階目の反応の基質を用意する。具体的には、キンジソウ葉から抽出した粗酵素液を用いてmalonyl-CoAとCy3Gを基質として反応を行い、反応生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。精製したものを基質として、acyl-CoAやUDP-glucose、acyl-glucoseを用いて酵素反応を行い、3段階目以降の生合成経路の推定を行う。また、RNA-seq解析によって獲得した各種相同性遺伝子について、それらの発現量等を精査して、さらなる候補遺伝子の絞り込みを行った後に、クローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それらの酵素活性を評価することによって、各反応を触媒する酵素をコードするcDNAの単離を行う。紫キャベツについてはRNA-seqで獲得されているアントシアニン合成に関わる相同遺伝子のcontigについて、発現量解析や系統樹解析を行うことで、これまでに検出されている3段階目までの糖転移酵素をコードしていると思われる候補遺伝子の絞り込みを行う。選抜した候補遺伝子についてクローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それぞれの酵素活性について評価を行うことで、紫キャベツアントシアニン生合成に関与する遺伝子の同定を行う。

その結果、細胞質型GT:123、細胞質型AT:15、液胞型AT:149、液胞型AT:47のcontigを獲得した。本申請では、キンジソウや紫キャベツ等の高次に修飾されたアントシアニン分子のの生合成経路を解明し、それぞれの修飾反応を触媒している酵素が細胞質型のものであるか、液胞型のものであるかを明らかとすることが目的である。このため、まずは生合成の順序を決定するとともに、それらの反応がどのような基質を必要とするかを明らかとする必要がある。今年度は、キンジソウではアントシアニン基本骨格から2段階目まで、紫キャベツでは3段階目までの反応を検出することに成功し、これらが全て細胞質型の酵素によって触媒されることを推定した。また、これらの酵素をコードしている遺伝子を同定するために、RNA-seq解析を行い、候補遺伝子の絞り込みを行った。これらのことから概ね当初の予定通り研究は進行しているものと判断される。キンジソウについてはアントシアニン合成の3段階目以降の反応を検出するために、2段階目の反応を大量に行い、3段階目の反応の基質を用意する。具体的には、キンジソウ葉から抽出した粗酵素液を用いてmalonyl-CoAとCy3Gを基質として反応を行い、反応生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。精製したものを基質として、acyl-CoAやUDP-glucose、acyl-glucoseを用いて酵素反応を行い、3段階目以降の生合成経路の推定を行う。また、RNA-seq解析によって獲得した各種相同性遺伝子について、それらの発現量等を精査して、さらなる候補遺伝子の絞り込みを行った後に、クローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それらの酵素活性を評価することによって、各反応を触媒する酵素をコードするcDNAの単離を行う。紫キャベツについてはRNA-seqで獲得されているアントシアニン合成に関わる相同遺伝子のcontigについて、発現量解析や系統樹解析を行うことで、これまでに検出されている3段階目までの糖転移酵素をコードしていると思われる候補遺伝子の絞り込みを行う。選抜した候補遺伝子についてクローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それぞれの酵素活性について評価を行うことで、紫キャベツアントシアニン生合成に関与する遺伝子の同定を行う。オリゴ合成や分子生物学用酵素がキャンペーンにより当初の予定よりも低額に抑えられたため、若干の繰越が生じた。繰越分については次年度の分生生物学的酵素やキットの購入に充当する予定である。
深部静脈血栓症を予防するための CPM を駆使した椅子の開発

深部静脈血栓症(deep venous thrombosis: DVT)は同一姿勢の持続により局所の血液濃縮から発症する。間欠的空気圧迫法による予防が一般的であるが、効果が空気圧に依存するためコンプライアンは不良である。そこで足関節の連続受動運動(Continuouspassive motion: CPM)によるDVTの予防効果を検証した。膝窩静脈の血流量と血流速度は可度動角、背屈角度、角速度に応じて静脈血流を増加させることが可能である。CPM装置を開発するにあたり、予備実験を繰り返し行った。特にフットレストの作動による足関節の動きが有効であることが明らかとなった。最適なアクティブ・フットレストの作動様式として以下の5つの変量を決定した。初期角度が大きいと下肢血流速度が大きい傾向がある。フットレストの角度により血流速度増加効果が異なり初期角度が30度および45度では角速度が増加するにしたがい血流速度も増加した。初期角度は5560度を含む範囲でアクティブ・フットレストを作動させると最も効果的に血流速度を増加させることができる。作動量対効果の観点で最もコストパフォーマンスの高いストロークは5度であり更なる効果を期待する場合にはストロークを20度にして角速度を2030degree/秒にすればよい。動作頻度は20秒に1回程度のフットレスト作動で十分な効果が期待できる。作動方向は通常時には20秒に1回で55度から60度へ1020degree/秒の角速度で作動させる。装置に対する必要条件としてはヒトが足を乗せても耐えられるだけの耐久力(特に回転軸の部分)、足を持ち上げるだけの十分なトルク、さらに動作のプログラムが可能であることが想定されるため、ねじ送りリフト形式を採用する。動作の頻度、ストローク量、背屈・底屈の角速度をすべて独立してvolumeにより調節可能なものが理想的であり既にその設計を終了した。この設計をもとに次年度は下肢CPM装置を試作し、大腿静脈血流量をドップラーエコーにて評価する。深部静脈血栓症を予防するCPM装置開発のため予備実験を繰り返し行った。フットレストの作動による足関節の動きが有効であることを確認してきた。ねじ送りリフト形式を採用した足関節CPM装置を作成することに決定した。作動量対効果の観点で最もコストパフォーマンスの高いストロークは5度であり、フットレストの角度により血流速度増加効果が異なり初期角度が30度および45度では角速度が増加するにしたがい血流速度も増加する。初期角度は5560度を含む範囲でアクティブ・フットレストを作動させる更なる効果を期待する場合にはストロークを20度にして角速度を2030 degree/秒にする必要がある。初期角度が大きければ、動作頻度は20秒に1回程度のフットレスト作動で十分な血流に対する効果が期待できる。動作の頻度、ストローク量、背屈・底屈の角速度をすべて独立してvolumeにより調節可能で、かつ安価なものを設計した。この設計をもとに次年度は下肢CPM装置を試作し、健常人を対象に大腿静脈血流量をドップラーエコーにて評価する。持続する静止姿勢は深部静脈血栓症の危険因子である。特に航空機の搭乗では着座の持続により下肢静脈がうっ滞し発症する。従来型深部静脈血栓症予防機器である間欠的空気圧迫法は不快感が強く、睡眠の傷害となりコンプライアンスが不良である。我々の開発する血栓症予防機器は足関節CPM(連続受動運動)により下肢静脈環流増加させ、コンプライアンスを改善し航空機での着座など長時間着座においても就労や睡眠の妨げとならないものを開発しようとするものである。われわれが独自に設計したCPMはねじ送りリフト形式を採用し、動作の頻度、ストローク量、背屈・底屈の角速度をすべて独立してvolumeにより調節可能な装置であり、三宝精機工業(神奈川県横浜市)の協力のもと作成した。CPMの有効な作動条件を検証する目的で、健常人ボランティア7例(20-56、男6、女1名)を対象として大腿静脈血流量をドップラーエコーにて評価した。被験者の体位は座位とし、CPMの作動条件は自然下垂位から10度、10度から20度、20度から30度、25度から35度、25度から30度、10度から30度の6段階とし、角速度は3段階とした。変位角度および角速度に従量的に血流速度(Vmax、TaVmax)および流量は増加した。また初期足関節角度が背屈位のほうが効果は大きかった。最大の効果の得られた自然下垂位より10度背屈から30度まで背屈での連続受動運動、速度3000ではVmax = 60.1 cm/S, TaVmax=25.6 cm/S、流量=546 mL/minであり、強力な効果が確認された。

動作の頻度、ストローク量、背屈・底屈の角速度をすべて独立してvolumeにより調節可能なCPM装置が予想以上に高額となったため、より安価に作成するために、作動条件を制限し再度設計しなおす必要が生じたことが主たる理由である。24年度が最終年度であるため、記入しない。CPM装置の設計は済んでおり、24年度前期には装置が完成し年度内にはすべての実験は終了する予定である。
インスリンシグナル伝達における蛋白質高次構造認識機構

インスリンは代謝調節、細胞増殖因子として生体必須のホルモンであり、それは細胞膜に存在するインスリンレセプターと結合することにより作用を発現する。そのシグナルがどのようにして細胞内に伝達され、最終的なターゲットに到達するか、またその病態によってどのような異常が生ずるかを解析することは重要な課題である。我が国には約500万人のインスリン非依存性(成人型)糖尿病患者がおり、それは細胞のインスリンに対する応答障害に1つの主な原因があると考えられている。インスリンは細胞表面上にあるインスリンレセプターと結合し、レセプターチロシンキナーゼが活性化されインスリンシグナルを伝達する。糖尿病の病因を明らかにするためにはこのインスリンシグナル伝達の分子機構を解明する必要がある。インスリンがそのレセプターに結合するとレセプター細胞内ドメインにあるチロシンキナーゼが活性化され、Insulin receptor substrate-1がチロシンリン酸化され、そこにSH2ドメインを介してPI3-キナーゼやGRB2が結合する。PI3-キナーゼはその結合により活性化されるが、GRB2はRasの経路を介して最終的にはMAPキナーゼを活性化する。このシグナル伝達における最初のステップはレセプターαサブユニットへのインスリンの結合であるが、その結合部位及び、結合様式は明らかになっていない。この結合には糖鎖が関与し、またαサブユニット同志でS-S結合が形成されなくてはならないため、大腸菌、バキュオウィルスの発現系は使用できない。我々は以前インスリンレセプターのαサブユニットを細胞外へ放出するCHO細胞のクローンを確立した。無血清培地を用い培養液よりWGAカラム、ハイドロキシアパタイトカラムの2ステップによりαサブユニットを精製できたが、培地10ml当たり約1μgのαサブユニットしかとれなかったため、インスリンレセプターαサブユニットとインスリンとの結合を解析するためには大量高発現系を改良する必要がある。もっと強力な発現プロモーターを用い、ヒスチジンtagをつけて精製を1ステップにし、培地1ml当たり110μgのαサブユニットを精製し、高次構造解析に用いたい。
増幅遺伝子領域を標的とした革新的がん治療薬の開発

発がんの原因の一つにがん遺伝子の増幅が知られているが、増幅遺伝子産物を直接標的とする治療法の開発は困難なままである。研究代表者らが開発してきた増幅MYCN遺伝子をDNA配列特異的に認識しアルキル化する化合物MYCN-A3は、MYCN遺伝子を標的としたCRISPR/Cas9によるDNA傷害に類似した結果を示し、コピー数の減少を伴う細胞死を誘導したことから、遺伝子増幅ゲノム領域を直接標的とする治療戦略の可能性が示された。そこで、本研究課題では遺伝子増幅領域におけるDNA傷害がもたらすゲノム構造変化のメカニズムを明らかとするとともに、標的化可能な増幅遺伝子の同定および候補化合物の取得・評価を行う。
抗日戦争期、内戦期における中国人の社会的心性と中国共産党の政策に関する研究

抗日戦争期の山西省根拠地における中国共産党(中共)の新暦・農暦の記念日に関する政策,民俗利用政策の検討を行い、またその背景として、日本軍・傀儡政権の同様の政策の内実を検討した。その結果、以下のことが明らかになった。伝統文化、伝統的道徳によって中共を攻撃する。日本軍・傀儡政権の民俗利用の試みは、中共に一定の危機感をもたらした。中共が本来的には消滅させるべきものと考えていた農暦に関わる民俗を日本軍・傀儡政権は積極的に利用し、春節その他の節日における娯楽活動の組織化と政治宣伝、廟会の復活による集市活性化の試みとそこでの政治宣伝などは、占領開始後、早い時期に着手され、また、これらの民俗を破壊するものとして、中共を批判する宣伝がなされた。このことと前線の過酷な闘争の現実は、民衆との強固な結合の必要性を中共に認識させ、太岳区・太行区政府は、実践的には陜甘寧辺区に先行して、1939年には、廟会・集市利用による商取引の活性化,民俗様式を利用した宣伝など本格的な民俗利用政策に着手している。日本側の節日・廟会での施薬,廟会での生産展覧会、廟内での文化教育館設置という手法と、中共の労働英雄大会や廟会工作,日本の敬老会開催と延安の春節における祝寿運動などは、その形態が類似している上、抗日戦争期においては、いずれの項目についても日本側の着手の方が早く、両者の相互の影響を示唆する。この成果の一部は、「華北傀儡政権の記念日活動と民俗利用-山西省を中心に-」(曽田三郎編『近代中国と日本-提携と敵対の半世紀-』,御茶の水書房)に発表予定である。『史学研究』221号(1998年7月)に「陝甘寧辺区の記念日活動と新暦・農暦の時間」を発表した。革命運動と民衆の行動との関係については、従来様々な角度から議論されてきたが、民衆の道徳規範や民族、民間信仰との関わりについては、充分な検討がなされていない。小論は、中国共産党(中共)の根拠地である陝甘寧辺区における、抗日戦争期から延安撤退の時期(1937年7月47年3月)までの新暦の浸透政策と民衆の時間である農暦の民俗を利用した大衆動員政策との関わりを分析した。新暦の各記念日は、国内外の政治上の必要性の他に、民衆に中共の指導する革命の意義を浸透させるためにも重視された。新暦の生活リズムも、政治動員の効率上、民間への浸透が求められた。一方、農暦は農業、経済活動、信仰その他の活動の根拠となる民衆自身の生活リズムであり、彼らは、自らの生活規範、慣習に基づいて、ある共通の期待や願望を持って自発的に定められた行動を行う。民衆の自律的な行動と心性を把握して、行動が行われる場所と時間に対して適切な宣伝・動員を行うことができれば、多くの成果を期待できる。中共は、特に42年以降、積極的にこれらの農暦の時間(節句、廟会、集市など)と民間信仰を含む民衆の心性を利用し、政治動員上の一定の成果を上げることができた。一方、新暦を浸透させる方針は、放棄された訳ではなく、中共は民俗形式と農暦の時間を利用して、多くの新暦の記念日活動を組織し、また各種の組織と模範を通じて新暦の意義と生活リズムを貫徹させようとした。民間信仰に関しては、生産増強や政権の権威確立につながるものは利用され、また民衆の心性に訴える宣伝方式や、中共の基層幹部自身が民間信仰に生きる人々であるという状況は、民間信仰の政権への浸透を導くものであった。小論で得られた知見を基に現在、山西省における、中共、★錫山政権、日本軍の民俗利用政策について検討中であり、これまで発掘されていなかった地方レベルの新聞史料などを収集し近年のけ動向を整理した。研究動向整理の成果の一部は、「回顧と展望1998年の歴史学界中国現代」(『史学雑誌』、1999年5月出版予定、108巻5号)に示した。日本側の節日・廟

会での施薬,廟会での生産展覧会、廟内での文化教育館設置という手法と、中共の労働英雄大会や廟会工作,日本の敬老会開催と延安の春節における祝寿運動などは、その形態が類似している上、抗日戦争期においては、いずれの項目についても日本側の着手の方が早く、両者の相互の影響を示唆する。この成果の一部は、「華北傀儡政権の記念日活動と民俗利用-山西省を中心に-」(曽田三郎編『近代中国と日本-提携と敵対の半世紀-』,御茶の水書房)に発表予定である。
粉粒体の粒度分布を合理的に考慮できるコンクリートの調合設計法の確立

コンクリートのワーカビリティーを調整するための試し練りの省略を最終的な目的とし、セメント、細骨材および粗骨材の粒度分布を合理的に考慮できるコンクリートの調合設計法を確立するための検討を行った。その結果、セメントペースト、モルタルまたはコンクリートの流動性は、それらを構成する粉粒体(セメント、細骨材および粗骨材の混合物)粒子全体の粒度分布から求めた粒子分散距離によりある程度予測できることを明らかにした。昨年度の研究により、余剰水膜理論に基づく粒子分散距離(=粉体分散距離)を指標としてペーストの流動性を評価するためには、粉体の実積率の値を適切に測定する方法の開発が必要であることが明らかになった。そのため、本年度(2年目)の研究は、まず、各種の新しい実積率の測定方法を考案・試行し、その妥当性について検討した。そして、吸引法による粉体の実積率の測定値を用いると、ペーストの流動性を粒子分散距離により精度よく評価できることを明らかにした。さらに、粉体の実積率の測定値が得られない場合の粒子分散距離の計算方法を提案した。次に、研究の第2段階として、余剰水膜理論をモルタルに拡張して適用することを考えた。すなわち、モルタルを粉粒体(=粉体+細骨材)と水で構成される固液2相材料と見なし、その流動性をペーストの場合と同様に粒子分散距離により評価できるかを検討した。そして、拘束水比から求めた粒子分散距離により、モルタルの流動性を、粉粒体(=粉体+細骨材)の粒度分布や水粉粒体体積比にかかわらず、包括的に評価できることを明らかにした。さらに、本年度の研究では、分離の程度が構成材料間の相対速度により表示されるとの立場から、モルタルと粗骨材間の分離を定量評価するための検討を行った。また、インターロッキングや振動下の粗骨材沈降などの各種の分離現象が本質的に同一の現象であるかを検討した。そして、1鉄筋間通過時の粗骨材の分離と加振による粗骨材の沈降の2つの分離現象は同じ現象とはいえない、2既存の分離評価試験である円筒貫入試験は、主に、加振による粗骨材沈降のような分離現象の生じやすさを評価している、などの知見を得た。本年度(初年度)は、研究の第1段階として、セメント粒子の粒度分布とセメントペーストのワーカビリティーの関係について検討した。具体的には、セメントの代替材料として高炉スラグ微粉末などの粉体を用いた実験を行った。この実験では、粉体の粒度分布を変化させて、その比表面積、密度などを測定した。また、これらの粉体を用いて、水粉体比、高性能AE減水剤の添加率などを変化させた模擬セメントペーストを練り混ぜ、ペーストフロー試験やブリーディング試験などを行った。その結果、(1)高性能AE減水剤の添加率が同一の場合、ペーストの流動性に対する粉体の粒度分布や水粉体比の影響は、粉体分散距離(ペースト中におけるセメント粒子間の隙間の平均的な距離)により包括的に評価できる可能性が高い、(2)ブリーディング水がペーストの流動性に寄与する度合いは小さい、などの知見を得た。また、本年度の研究では、平成25年度の研究を一部先取りし、粉粒体(=セメント粒子+細骨材)の粒度分布とモルタルのワーカビリティーの関係を調べるための実験も予備的に行った。次年度に、この実験の結果を取りまとめ、次年度以降の研究に活用する予定である。昨年度までの研究で、余剰水膜理論をモルタルに拡張して用いた場合の適用性について検討し、粉粒体(=粉体+細骨材)の粒度分布や水粉粒体比にかかわらず、モルタルの流動性を、拘束水比から求めた粒子分散距離により包括的に評価できることを明らかにした。本年度の研究では、この結果を踏まえ、余剰水膜理論を、水と粉粒体(=粉体+細骨材+粗骨材)から成る2相材料と見なしたコンクリートにまでさらに拡張して適用することを試みた。その結果、コンクリートのスランプや降伏値は、単位水量(すなわち、粉粒体量)や細・粗骨材の粒度分布にかかわらず、粒子分散距離により包括的に評価できる可能性があるとの結果を得た。また、昨年度までの研究で、コンクリートの分離抵抗性に対しては、マトリックスモルタルの流動性が支配的な影響を及ぼすとの知見を得た。そこで、本年度の研究では、マトリックスモルタルの流動性を余剰水膜理論により予測し、その結果と対応させて、コンクリートの分離抵抗性を評価する方法についても併せて検討した。そして、コンクリートの分離抵抗性は、マトリックスモルタルの拘束水比に基づく粒子分散距離により評価できることを明らかにした。このほかに、本研究では、水セメント比や細骨材の粒度分布などがコンクリートの材料分離の度合いに及ぼす影響を検討し、1骨材量および細骨材率が一定の場合、水セメント比が高いほど、また、細骨材中の細粒の比率が低いほど、コンクリートの分離度合いは大きくなる、2水セメント比および細骨材中の細粒の比率が振動締固め時の粗骨材沈降に対する抵抗性に及ぼす影響は小さい、などの知見を得た。コンクリートおよびモルタルへの余剰水膜理論の適用に関する昨年度までの研究では、拘束水比から求めた粒子分散距離を利用するという限定的な形での理論の適用に留まっており、本研究で本来意図した形で余剰水膜理論を適用する段階までには至っていなかった。

これは、コンクリートやモルタルを構成する粉粒体(粉体粒子+細骨材+粗骨材)の実積率を十分な精度で測定できる試験方法を確立できていなかったことが原因である。本年度は、以上のような背景から、粉粒体の実積率を測定するための新たな試験方法(水浸脱気法)を考案し、その妥当性を検討した。また、この試験により得られた実積率の試験結果を基に粒子分散距離を計算した場合の余剰水膜理論のコンクリートやモルタルへの適用性についても検討した。そして、新たに考案した試験方法を用いれば、十分な精度とまではいえないものの、他の試験の場合よりは高い精度で実積率を測定可能であり、余剰水膜理論の適用性も向上するとの結論を得た。コンクリートのワーカビリティーを調整するための試し練りの省略を最終的な目的とし、セメント、細骨材および粗骨材の粒度分布を合理的に考慮できるコンクリートの調合設計法を確立するための検討を行った。その結果、セメントペースト、モルタルまたはコンクリートの流動性は、それらを構成する粉粒体(セメント、細骨材および粗骨材の混合物)粒子全体の粒度分布から求めた粒子分散距離によりある程度予測できることを明らかにした。研究申請時に予定していた主要な課題は、本年度までに一通り検討できたものと考えている。ただし、モルタルおよびコンクリートへの余剰水膜理論の適用に関する検討は、現時点では、拘束水比から求めた粒子分散距離を利用するという限定的な形での適用に留まっており、本研究で本来意図した形で余剰水膜理論を適用する所までは至っていない。これは、粉体や粉粒体の実積率を十分な精度で測定できる試験方法を確立できなかったことが原因であり、この点については、本年度までに達成できなかった課題として残された。工学研究の期間延長を申請して承認されたため、粉体や粉粒体の実積率をより高い精度で測定可能な試験方法に関する検討などの、本研究で残された課題については、平成27年度に引き続き検討を行っていく予定である。ペーストに対する余剰水膜理論の適用性に関する検討の過程で、ペーストの流動性に対する化学混和剤の影響を合理的に評価するためのアイデアを得たが、本年度は、このことに対して十分な検討を行う時間的余裕がなかった。また、モルタルに対する余剰水膜理論の適用性に関する検討では、本年度は、未だ限定的な条件の範囲でしか実験を行っておらず、より広範な条件下での実験が必要と考えられる。これらは、次年度への積み残し課題となる。ただし、全体としては、本年度の研究計画を、概ね予定通りに達成することができたものと考えられる。本年度の研究の過程で、粉体分散距離を求めるための重要な因子である、粉体の実積率の測定が非常に困難であることが判明し、この点は、本年度の研究における未解決な課題として残った。粉体の実積率測定手法については、次年度に改めて詳細な検討を行い、何らかの新しい手法を考案する必要があるものと考えられる。動ひずみ測定器の購入を予定していたが、研究の進展に伴い実験の内容を若干変更し、動ひずみ計の購入を取りやめたため、主にその分の未使用額が生じた。1粉粒体(=セメント粒子+細骨材+粗骨材)の粒度分布とコンクリートのワーカビリティーの関係の検討:研究の第3段階として、コンクリートへの余剰水膜理論の適用性を調べるための検討を行う。そして、粉粒体(=セメント粒子+細骨材+粗骨材)の粒度分布とコンクリートの流動性、レオロジー性質および分離抵抗性との関係について検討し、さらに、これらの関係のモデル化に関する考察を行う。
イオン液体と微生物をハイブリッド化した新規生体触媒材料の開発

新たな溶媒であるイオン液体と微生物を複合化した新たなハイブリッド生体触媒を開発し、バイオ燃料の製造に応用した。まず、イオン液体の有用性を確認するために、リパーゼ発現細胞触媒を用いたバイオディーゼル燃料生産においてイオン液体の効果を調査したところ、イオン液体添加系では生産性が大きく増加した。また、重合基を導入したイオン液体を微生物固定化担体に修飾した細胞触媒ではバイオディーゼル燃料の生産性が向上した。イオン液体はカチオンとアニオンからなるデザイン可能な機能性溶媒であり、近年新たな非水系酵素反応溶媒としても注目を集めている。イオン液体は溶媒であるが、有機化学的手法を用いることでイオン液体自身に重合性官能基を導入することができる。本研究では、イオン液体に重合基を導入し、ラジカル重合を行うことポリマー化イオン液体を作製し、このポリマー化イオン液体に細胞触媒(微生物)を固定化した新たなバイオハイブリッド触媒材料を作製した。本研究で開発する新規材料は、イオン液体の「溶媒のデザインが可能」という特徴を利用した「微生物固定化担体のデザインと機能付加が可能」な新たなハイブリッド材料であり、バイオプロセスにおける新規生体触媒材料として非常に興味深い。平成21年度は、微生物を固定化するためのマトリックスであるポリマー化イオン液体の合成、およびそれを用いた微生物とのハイブリッド化について検討を行った。まず、ビニル基を導入した重合性イオン液体の合成を行い、目的化合物が合成されたことを確認した。合成した重合性イオン液体の重合性を架橋剤の共存下ラジカル重合を行うことで検討したところ、水溶液中でポリマーゲルが形成されイオン液体のポリマー化が示された。また、ポリマー化イオン液体への微生物固定化挙動を調査するため、多孔質担体へのポリマー化イオン液体の修飾を行った。ポリマー化イオン液体を修飾した多孔質担体の共存下で糸状菌Aspergillusoryzaeの培養を行ったところ、菌体は効率よく担体に固定化され、ポリマー化イオン液体が微生物固定化能を有することが明らかとなった。さらに、調製したリパーゼ生産性固定化菌体を用いてバイオディーゼル燃料(BDF)の生産を検討したところ、効率的なBDF生産が達成され、本研究で開発したバイオハイブリッド触媒材料がwhole-cell biocatalystとして有用であることが示された。平成22年度は、微生物固定化担体(BSPs)へのイオン液体ポリマーの修飾を検討し、糸状菌Aspergillusoryzaeの固定化とwhole-cell biocatalystの触媒特性について評価した。BSPsへのイオン液体ポリマー修飾法として(1)非共有結合的修飾(2)共有結合的修飾、について検討した。(1)では重合性イオン液体をBSPs共存下で重合する手法であり、イオン液体ポリマーが非共有結合的にBSPsを被覆すると考えられる。(2)では、まずBSPsの水酸基(OH基)に対して重合基を化学修飾し、それを起点として重合性イオン液体をポリマー化する手法で、共有結合的にイオン液体ポリマーが修飾されると考えられる。(1)の場合、疎水性のイオン液体ポリマーを修飾したBSPsにおいて固定化菌体量が増加し、バイオディーゼル生産性が向上するという結果が得られたが、(2)の手法で修飾した場合は、非修飾の方が活性が高くなるということが明らかとなった。
作用素ノルムTrotter-Kato積公式の更なる展開と経路積分の問題

Trotter-Kato積公式,または,Lie-Trotter-Kato積公式は,ふつうHilbert/Banach空間の強位相で収束するものであった.非自明なときに作用素ノルムでも成り立つ場合があることを知ったことが,本研究の動機であった.2.更に,一瀬は,H.Neidhardt及びV.A.Zagrebnovとの最近の共著論文(J.Functional Analysis 2004)において,1で確立した作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式を作用素和の場合から2次形式和の場合へ,一方の自己共役作用素が他方の自己共役作用素によって2次形式の意味でドミネイトされるとき,これらの作用素の定義域に関するある付帯条件の下に拡張し,最良の誤差評価と共に証明した.このドミネイションを仮定しないで証明できるかどうかは今後の問題であろう.Trotter-Kato積公式,または,Lie-Trotter-Kato積公式は,ふつうHilbert/Banach空間の強位相で収束するものであった.非自明なときに作用素ノルムでも成り立つ場合があることを知ったことが,本研究の動機であった.2.更に,一瀬は,H.Neidhardt及びV.A.Zagrebnovとの最近の共著論文(J.Functional Analysis 2004)において,1で確立した作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式を作用素和の場合から2次形式和の場合へ,一方の自己共役作用素が他方の自己共役作用素によって2次形式の意味でドミネイトされるとき,これらの作用素の定義域に関するある付帯条件の下に拡張し,最良の誤差評価と共に証明した.このドミネイションを仮定しないで証明できるかどうかは今後の問題であろう.本研究は,経路積分との関連を意識しつつ,シュレーディンガー作用素論における例を参考にしながら,作用素ノルムでの自己共役トロッター・加藤(Trotter-Kato)積公式に関する新しい一般的な結果が得られた.1.一瀬は,J. Korean Math. Soc.の論文で,2階以上の微分が有界なポテンシャルを持つ虚数時間シュレーディンガー方程式(熱方程式)の基本解が作用素ノルムでのトロッター・加藤積公式的方法による近似によって,藤原大輔(Duke Math. J. 1980)による実時間シュレーディンガー方程式に対するの基本解の経路積分的近似による構成と同じ誤差評価で得られることを注意した.高信敏も確率解析的方法でこのことを示した.2.一瀬,田村英男は,Commun. Math. Phys. 2001,の論文で自己共役トロッター・加藤積公式が,2つの非負自己共役作用素の作用素和が自己共役のときに,作用素ノルムで収束することを証明した.3. 2に続いて,一瀬,田村英男,田村博志,V. A. Zagrebnovは,Commun. Math. Phys. 2001,の第2論文で,2の結果が最良の作用素ノルム誤差評価O(1/n)で成立することを証明した.4.田村英男は伊藤宏と共に,磁場を持つシュレーディンガー作用素に対して,アハラノフ・ボーム効果の散乱振幅の漸近挙動の研究を更に深化させた.5.谷島賢二は,無限遠で空間変数の2乗を超えて増大するポテンシャルを持つシュレーディンガー方程式に対する解の平滑化効果に関する研究を更に深化させた.本年度の研究では,昨年に続いて,経路積分との関連を意識しつつ,シュレーディンガー作用素論における例を参考にしながら,作用素ノルムでの自己共役トロッター・加藤(Trotter-Kato)積公式に関して更に新しい結果が得られた.1.一瀬は,B.Jefferiesとの共著論文(J.Math.Phys.)において,極座標表示のDirac方程式に対してその基本解を構成することにより,解を経路積分表示する経路の空間上の測度が存在しないことを示した.2.一瀬は,田村英男との共著論文(J.Indian Acad.Sci.Math.Sci.)において,一瀬・田村英男,一瀬・田村英男・田村博志・V.A.Zagrebnovによる,2つの非負自己共役作用素の作用素和が自己共役のときの最良誤差評価O(1/n)付き作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式に関する最近の共同研究の総括を行った.3.2の研究に続いて,一瀬は,作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式に関する極く最近のH.Neidhardt, V.A.Zagrebnovとの共同研究で,作用素和を2次形式和の場合で,一方の自己共役作用素が他方の自己共役作用素を2次形式の意味でドミネイトする場合に拡張し,論文を執筆投稿中である.4.田村博志は,C.Gruber, V.A.Zagrebnovとの共同研究で2次元統計力学の問題を研究した.本年度は本研究の最終年度である.昨年度に続いて,経路積分との関連を意識しつつ,シュレーディンガー作用素論における例や応用を参考にしながら,作用素ノルムでの自己共役トロッター・加藤(Trotter-Kato)積公式及び関連する経路積分の問題に関して更に新たな成果が得られた.1.一瀬は,H.Neidhardt及びV.A.Zagrebnovとの共著論文(J.Functional Analysis 2004)において,平成15年度に田村英男,田村博志,V.A.Zagrebnovと共に確立した作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式を,作用素和の場合から2次形式和の場合へ,一方の自己共役作用素が他方の自己共役作用素によって2次形式の意味でドミネイトされるときに拡張し,最良の誤差評価と共に証明した.

このドミネイシヨンを仮定しないで証明できるかどうかは今後の問題であろう.2.藤原大輔は,以前シュレーディンガー方程式の基本解を経路積分法を基に区分的古典軌道を用いて大変良い近似で構成したが,最近熊ノ郷直人と共に,時間分割折れ線近似の場合にも良い近似で得る研究やウィーナー空間上の振動積分の漸近解析の研究を行った。3.田村英男は,伊藤宏との共同研究で,磁場を持つシュレーディンガー作用素及びディラック作用素について,アハラノフ・ボーム効果がどのような形で現出しているかについて数学的厳密な結果を得た.4.谷島賢二は,A.Galtbayer,A.Jensenとの共同研究で,場の量子論のネルソン模型や時間周期的ポテンシャルを持つシュレーディンガー方程式の解の局所時間減衰について研究した.3,4は本研究の今後の参考になる.5.一瀬は,本研究から明らかになった作用素ノルム自己共役トロッター・加藤積公式の近似の良さから,この近似の積分核も同じ誤差評価で収束しているのではないかという問題を,新たな田村英男との共同研究で検討中である.
高官能基選択的な有機還元剤の開発とそれを用いる還元的分子変換反応の開発

種々のビオロゲン誘導体(1,1'-ジ置換4,4'-ビピリジニウム,V^<2+>)を合成し,これらの酸化還元挙動について精査し,V^<2+>が二段階の可逆的な一電子還元(V^<2+>→V^<+・>,V+^・→V^0)を受けること,V^0が亜鉛に匹敵する還元力を持つことを明らかにした。ビオロゲンを電解還元して生じるV^0を有機還元剤とする,パラジウム触媒によるハロゲン化アリールの還元的カップリング反応(2Ar-X→Ar-Ar)を開発した。ビオロゲンのN上の置換基を適宜選択して,有機溶媒,イオン性液体,水などさまざまな媒体中で機能する有機還元剤を開発した。さらに,N-置換ピリジニウム塩を電解還元して生じる有機還元剤が同様の反応を進行させることを見つけた。1.(拡張)ビオロゲン誘導体の合成とその物性・電気化学特性評価4,4'-ビピリジルのN上にポリ(エチレンオキシ)基および芳香環を導入したビオロゲン誘導体を合成し,その酸化還元電位をサイクリックボルタンメトリーで測定した。ポリ(エチレンオキシ)基を導入した場合は通常のアルキル基を導入した場合に比べて還元力は変わらなかったが,芳香環を導入するとその還元力は低下した。ビオロゲン誘導体の溶解度は対アニオンによってかなり影響を受けることがわかった。たとえば,ビス(トリフルイミド)[NTf2-]を対アニオンに有するビオロゲンは極性の高い有機溶媒には溶解するが,ヘキサンなどの非極性溶媒もしくは水には溶解しないことがわかった。このことは,ビオロゲン誘導体の回収・再利用に当たって重要な知見となる。2.還元型ビオロゲン誘導体(VO)を用いる分子変換反応の開発マグネシウム陽極・白金陰極を付した非分離型電解セルを用いてビオロゲン誘導体をテトラヒドロフラン中で電解還元すると,還元型ビオロゲン誘導体(VO)が発生した。これを用いてパラジウム触媒存在下,芳香族ハロゲン化物の還元的二量化が進行し,相当するビフェニル体が得られた。同反応は水やイオン液体を溶媒に用いても進行することが明らかになった。現在,この成果について論文を作成中である。有機還元剤の前駆体として4,4' -ジビピリジニウム化合物を設定し、その合成と電解還元による有機還元剤の発生について検討した。モデル反応としては、パラジウム触媒を用いる芳香族ハロゲン化物の還元的カップリング反応を取り上げ、本系で発生する有機還元剤の効率・反応性について検討した。その結果、1)4,4' -ジ置換ビピリジニウム化合物を電解還元すると、還元性を示す有機反応剤(有機還元剤)を発生することができる。その際、4,4' -ジ置換ビピリジニウム化合物を適切に設計することにより、溶媒として有機溶媒・イオン性液体・水など、さまざまなものが使用できる。サイクリックボルタンメトリーによる電気化学的解析から、この還元剤はその構造にも依存するが、亜鉛に匹敵する還元力を示すことがわかった。2)4,4' -ジ置換ビピリジニウム化合物を電解還元して発生する有機還元剤とパラジウム触媒とを組み合わせて用いることにより、芳香族ハロゲン化物の還元的カップリングが起こり、相当するビアリール化合物が得られることがわかった。特に、水を溶媒に用いた場合にも、4,4' -ジ置換ビピリジニウム化合物に両親媒性基(ポリエチレンオキシ基)を導入することにより、目的とする還元的カップリング反応が効率よく進行することを見つけた。3)4-置換ピリジニウム塩型の反応剤を設計・調製し、これが4,4' -ジ置換ビピリジニウム化合物と同様に有機還元剤の前駆体として機能することを予備的に明らかにしており、現在その分子設計・反応設計を行っている。種々のビオロゲン誘導体(1,1'-ジ置換4,4'-ビピリジニウム,V2+)を合成し,これらの酸化還元挙動について精査し,V2+が二段階の可逆的な一電子還元(V2+→V+.,V+・→V0)を受けること,V0が亜鉛に匹敵する還元力を持っことを明らかにした。ビオロゲンを電解還元して生じるV0を有機還元剤とする,パラジウム触媒によるハロゲン化アリールの還元的カップリング反応(2Ar-X→Ar-Ar)を開発した。
EHL潤滑における潤滑油の固化特性と潤滑性能に関する研究

1)低温度せん断試験試作した同心2重円筒試験機を用いて低温度条件下での潤滑油せん断特性を調べた。粘性流体および粘弾性体と挙動する温度領域では、潤滑油のせん断応力はせん断速度の増加とともに高くなる。しかし、潤滑油のガラス転移温度以下になると、せん断滑りは内筒表面またはごく近傍の狭い層内でのみ生じ,滑り速度に応じた限界せん断応力が存在する。限界せん断応力は潤滑油の分子構造により異なり、トラクション係数の高い潤滑油の方が限界せん断応力も大きい。2.4球滑り接触試験当初のチムケン試験機をより基礎的デ-タが得やすい4球試験機に変更して実験を行った。固化膜形成を含めた油膜形成状態は潤滑油構造の影響を著しく受け、最も固化しやすい多縮合ナフテン環が最も厚い油膜を形成する。また,高滑り速度条件下で固化膜ないしは流動性をほとんど示さない油膜を一旦形成すると、滑り速度を低下し油膜形成条件を悪化させても高滑り速度条件下で形成された厚い油膜を保持し,摩耗等の表面損傷を軽減する。3.2円筒試験,4円筒試験分子構造の異なる潤滑油を用いて,転がり滑り試験を実施した結果を要約する。(1)接触域において潤滑油が固化または弾塑性体として挙動する条件では,粘性流体とは逆にせん断速度の増加に伴い,トラクション係数は低下する。(2)潤滑油が固体的挙動をする領域でのトラクション係数は潤滑油の種類,滑り速度,接触圧力,潤滑油温度等の作動条件に拘らず潤滑油の粘度ー圧力係数αと平均ヘルツ圧力pとの積,αp,によってほぼ決定できる。ここでαpは接触域での潤滑分子のパッキング状態の尺度と考えられる。1.2重円筒型回転粘度計を試作し、低温度域での潤滑油のせん断特性を調べた。粘性流体および粘弾性体と挙動する温度領域では、せん断応力はせん断速度の増加とともに高くなるが、潤滑油の静的な固化(ガラス転移)温度以下になると(限界)せん断応力はせん断速度が低い方が高くなる。また、せん断応力は潤滑油分子構造により異なり、いずれの領域においてもトラクション係数の高い潤滑油の方がせん断応力が大きくなる。すなわち、せん断応力はポリフェニルエ-テルである5P4E、縮合ナフテン環炭化水素のタ-ル水添油、ナフテン鉱油、パラフィン鉱油、パラフィン系合成炭化水素PAOの順に小さくなる。2.2円筒転がり滑り試験において、接触域において潤滑油が固化または弾塑性体として挙動する条件では、粘性流体とは逆にせん断速度の増加に伴い、トラクション係数は低下する。また潤滑油が固体的挙動をする領域では、潤滑油の粘度-圧力係数αと平均ヘルツ圧力pとの積、αp、は潤滑分子の接触域でのパッキング状態の尺度であり、トラクション係数は潤滑油の種類、滑り速度、接触圧力、潤滑油温度等の作動条件に拘らずαpの値によってほぼ決定できる。3.完全EHL条件下で接触域に一旦形成された潤滑油固化膜は、潤滑条件が劣化し十分な潤滑油膜の形成が期待できない条件下でも維持され、摩擦面の保護、摩擦摩耗特性の劣化を防止する。1)低温度せん断試験試作した同心2重円筒試験機を用いて低温度条件下での潤滑油せん断特性を調べた.

粘性流体および粘弾性体と挙動する温度領域では,潤滑油のせん断応力はせん断速度の増加とともに高くなる.しかし,潤滑油のガラス転移温度以下になると,せん断滑りは内筒表面またはごく近傍の狭い層内でのみ生じ,滑り速度に応じた限界せん断応力が存在する.限界せん断応力は潤滑油の分子構造により異なり,トラクション係数の高い潤滑油の方が限界せん断応力も大きい.2.4球滑り接触試験当初のチムケン試験機をより基礎的デ-タが得やすい4球試験機に変更して実験を行った.固化膜形成を含めた油膜形成状態は潤滑油構造の影響を著しく受け,最も固化しやすい多縮合ナフテン環が最も厚い油膜を形成する.また,高滑り速度条件下で固化膜ないしは流動性をほとんど示さない油膜を一旦形成すると,滑り速度を低下し油膜形成条件を悪化させても高滑り速度条件下で形成された厚い油膜を保持し,摩耗等の表面損傷を軽減する.3.2円筒試験,4円筒試験分子構造の異なる潤滑油を用いて,転がり滑り試験を実施した結果を要約する.(1)接触域において潤滑油が固化または弾塑性体として挙動する条件では,粘性流体とは逆にせん断速度の増加に伴い,トラクション係数は低下する.(2)潤滑油が固体的挙動をする領域でのトラクション係数は潤滑油の種類,滑り速度,接触圧力,潤滑油温度等の作動条件に拘らず潤滑油の粘度ー圧力係数αと平均ヘルツ圧力pとの積,αp,によってほぼ決定できる.ここでαpは接触域での潤滑分子のパッキング状態の尺度と考えられる.
B細胞におけるSTIM1依存的カルシウム流入機構の解析

STIM1ノックアウトマウスを作製し、本マウス由来胎仔肝細胞から分化させたSTIM1欠損肥満細胞を用いる事により、STIM1がIgE依存的な抗原刺激によるカルシウム流入に必須であることを明らかにした。さらに、STIM1が肥満細胞の脱顆粒、サイトカイン産生、そしてアナフィラキシー反応において重要な役割を果すことを見出しました。B細胞特異的STIM1ノックアウトマウスの樹立に成功し、解析の準備が整った。また、STIM1に結合するタンパク質の同定に成功した。免疫細胞におけるカルシウムシグナルは、免疫反応の重要な誘因として知られており、持続的なカルシウムシグナルは細胞内カルシウムストアである小胞体からのカルシウム放出が引き金となって引き起こされる細胞外からのカルシウム流入(ストア作動性カルシウム流入:SOC)が主要なソースとなるが、そのメカニズムは不明であった。申請者はSOC活性化機構の解明を目的とし、これら成果が免疫不全症、自己免疫疾患、アレルギーといった免疫病の理解、さらには免疫系をコントロールするための新規薬剤の創製にもつながるものと期待して研究を進めている。当該年度は、特に肥満細胞に注目して解析を進めた。肥満細胞はアレルギー反応を引き起こすためのエフェクター細胞であり、アレルゲンの刺激によって脱顆粒を起こすと、ヒスタミン等のメディエーターが放出され、血管拡張、血管透過性の充進などの即時型反応が起こり、さらに、サイトカインなどの作用で炎症を主体とする遅発型反応が起こる。これらの現象にカルシウムが関与する事が知られているが、SOCチャネルを介するようなカルシウム流入および持続的カルシウムシグナルの役割は不明である。そこで我々はこの疑問にアプローチするため、小胞体カルシウムセンサーであり、SOC流入に必須の分子であるSTIM1を欠失させたノックアウトマウスを作製した。胎仔肝細胞から分化させたSTIM1欠損肥満細胞を用いる事により、STIM1がIgE依存的な抗原刺激によるカルシウム流入に必須であることを明らかにした。さらに、STIM1が肥満細胞の脱顆粒、サイトカイン産生、そしてアナフィラキシー反応において重要な役割を果すことを見出した。本研究内容は、STIM1が誘導する肥満細胞内へのカルシウム流入がアレルギー反応に必須であることを示しており、STIM1が抗アレルギー薬の標的となり得る可能性を示唆した重要な結果である。免疫細胞におけるカルシウムシグナルは、免疫反応の重要な誘因として知られており、持続的なカルシウムシグナルは細胞内カルシウムストアである小胞体からのカルシウム放出が引き金となって引き起こされる細胞外からのカルシウム流入(ストア作動性カルシウム流入:SOC)が腫瘍なソースとなるが、その詳細なメカニズムは不明であった。当該年度は、STIM1のホモログであるSTIM2の欠損DT40B細胞株を樹立し、その機能解析から、STIM2はSTIM1と違ったタンパク質翻訳後修飾を受けることを見出した。STIM1との機能ドメインのキメラ体を構築し、安定発現細胞株を樹立、解析することにより、STIM1との機能的差異に言及できた。これら現象がいかにストア作動性カルシウム流入に関与するのかを検討しているところである。また、生理的意義の解析のため、STIM2ノックアウトマウスを作製したところ、約4週から5週ごろに致死となることが判明し、STIM2がなんらかの生命維持機能に必須であることがわかった。また、B細胞におけるSTIM2の機能を知るため、mb-1creマウスとfloxマウスを掛け合わせたB細胞特異的ノックアウトマウスの樹立にも成功した。
熱ショック蛋白質の細胞内寄生性原虫によるアポトーシスの抑制機能

トキソプラズマの強毒株(RH株)、弱毒株(Beverley株)を用いたマウス感染モデルで宿主の感染抵抗性とHSP65の発現には密接な相関があることを報告した。すなわち、弱毒株感染では腹腔マクロファージにHSP65が発現するが強毒株感染ではその発現は見られない。この発現にγδT細胞が深く関与していることも明らかにした。弱毒株感染でHSP65が腹腔マクロファージの細胞膜上、細胞質内に発現されるが、あらかじめ抗TcR-γδ抗体でγδT細胞を除去するとHSP65の発現は著しく抑制される。また、これらのマウスでは感染抵抗性が有意に低下していた。本研究では発現したHSP65の感染抵抗性への貢献について、トキソプラズマによって誘導されるマクロファージのアポトーシスとの関連性を検討した。強毒株を感染させたマウスのマクロファージは多くがアポトーシスを起こしていたが、弱毒株を感染させたマウスではアポトーシスを起こしたものは少数であった。γδT細胞除去マウスへの弱毒株感染では、マウスの、マクロファージの多くがアポトーシスを起こしていた。このようにHSP65を発現がないマウスではアポトーシスが誘導されやすくなっていた。試験管内での実験においてもHSP65をあらかじめ発現させたマクロファージでは非処置のマクロファージに比べ、アポトーシスの頻度が減少していた。また、HSP65のアンチセンスオリゴヌクレオチドでHSP65の発現を特異的に抑制すると、アポトーシスが起こりやすくなった。以上の結果から、HSP65は原虫感染によるマクロファージのアポトーシスを抑制することによって抵抗性に役立っていることを明らかにした。
新しい栄養化学的方法論を用いる、ビタミンC、Eの機能に関する体系的研究

1)生体内の酸化的ストレスを評価する有効な化学的指標として、臓器中の脂質ヒドロペルオキシドの特異的・高感度測定法を確立した。2)上記の方法を用いて老化による臓器中のヒドロペルオキシドレベルの変化をマウスで実測し、老化ラジカル説の実験的証拠を提出した。3)ビタミンCの機能を検討するため、遺伝的にビタミンCを合成できないODSラットをビタミンC欠乏食で飼育し、各種臓器におけるビタミンCの減少を我々が開発した特異的・高感度測定法で追跡した。この結果、12臓器はビタミンC減少速度様式から4種類に分類された。脂質ヒドロペルオキシドは、脳において対照群より有意に増加していることが明らかになった。4)ビタミンE欠乏4週間でラット心臓、肺、腎臓の脂質ヒドロペルオキシドが有意に増加した。通常ビタミンE欠乏の症状を見いだすには何か月もの時間がかかることを考えると、脂質ヒドロペルオキシドは生体内ラジカル反応の指標として極めて有効であると結論できる。5)生体内(in vivo)におけるビタミンCとEの間の相互作用を検討した結果、両ビタミンは生体内で緊密な相互作用を行なっていることが判明した。6)ラジカル反応、即ち、ビタミンC、Eと関連深い動脈硬化について検討した。LDLの酸化において、シアル酸残基が酸化的修飾を受けて減少していくことを明らかにした。これは動脈硬化の発症に重要であるマクロファージの認識との関連で興味深い。以上、特異的・高感度分析法の開発と動物実験への応用により、抗酸化系ビタミンC、Eの生体内での機能を体系的に解説することができることを示した。抗酸化系ビタミンC、Eの機能を解析するためには、まず、生体内のラジカル反応の評価法の確立する必要がある。この為、光学顕微鏡による組織像と臓器中の脂質ヒドロペルオキシドのレベルを高感度・特異的に測定する方法を開発した。後者についてはクロロホルム-メタノール抽出した脂質画分をナフチルジフェニルホスフィンと反応させ、生成するNDPPオキシドを高速液体クロマトグラフで定量するという方法により、ヒドロペルオキシドの回収率85%以上で、検出限界1pmol、相関係数0.99で定量可能であることが分かった。さらに化学発光検出器を用いる方法も検討中である。本法をまず、老化の問題に適用した。ここ半世紀に渡り、老化はラジカル反応によって起こるという説があり、その化学的検証を行なうためである。マウスを自然に老化させ、肝臓、心臓、腎臓におけるとヒドロペルオキシドレベルを測定した。これらの臓器においては、5週令と20週令の間で有意にヒドロペルオキシドレベルが上昇し、その後は、80週令に至るまで上昇したままであることが判明した。マウスの寿命は約100週なので、人の1年がマウスの1週に対応する。上記の結果は、臓器ヒドロペルオキシドは成長期に増加しそのままのレベルを維持することを示している。またその上昇率が2倍以内であるので、老化と共に、急速にヒドロペルオキシドが蓄積するというものではなく、長い間一定濃度のヒドロペルオキシドに晒されていることが老化を進めていくことが分かる。一方、脳では老化によるヒドロペルオキシドの増加はないが、脳は成長期以後、細胞分裂しないので酸化的障害が蓄積していくと考えられ、やはり時間項が重要であることを示している。抗酸化系ビタミンCの機能を検討するため、遺伝的にビタミンCを合成できないODSラットをビタミンC欠乏食で飼育し、各種臓器におけるビタミンCの減少を我々が開発した特異的・高感度測定方法(Anal.Chem.,64,1505-1507(1992))で追跡した。この結果、12臓器はビタミンC減少速度様式から4種類に分類されることが明らかになった。この中で脳はビタミンC減少速度が最も遅いことが判明した。