hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄幹細胞治療の特性を利用した脳動脈瘤に対する血管内治療

今回私が行った研究は、現在脳動脈瘤治療の最先端治療としてカテーテルを使用した血管内治療に、骨髄幹細胞研究を合わせた、未来への治療の第1歩となる研究を行った。実臨床の血管内治療で使用するステントにこの骨髄幹細胞を生着させ、ミニブタ脳動脈瘤モデルにおいて治療効果の判定を行った。結果的には優位な効果を認めることはできなかったが、今後の未来への治療としてきわめて重要な1歩を踏み出したと考えている。研究の目的近年、"脳梗塞患者に対する自己骨髄幹細胞の静脈内移植"の臨床研究を開始しており、新たな知見が刻々と得られている状況にある。本研究での脳動脈瘤治療における血管内治療においても同様のアプローチで、治療効果が十分期待できると予測している。本研究は、今後の血管内治療への発展という意味で、非常に有益な研究であり、今後脳動脈瘤治療の根幹をなすものと考えている。本年度の研究実施ミニブタ(体重30キロ前後)の総頚動脈分岐部に静脈にてパッチをあてた動脈瘤モデルを作製する。全身麻酔で脳動脈瘤モデルを作製し、大腿動脈経由でカテーテルを挿入し、作製した動脈瘤をプラチナコイルを用いて塞栓する。または動脈瘤頚部にステントを留置する。使用するデバイスや方法、器具などは実際の臨床治療で行うものと同様のものを用意する。生着させる細胞は、骨髄由来の骨髄間葉系幹細胞で、あらかじめコイルやステントに浸し、細胞を密着させる。1.ミニブタ動脈瘤モデルに対して、骨髄幹細胞コイルによる動脈瘤塞栓術の治療効果を検討:骨髄幹細胞コイルを用いて、血管内膜増殖効果の判定を通常のプラチナコイルと病理学的に比較検討し、内膜新生時期についても検討した。2.ミニブタ動脈瘤モデルに対して、骨髄幹細胞ステントによる動脈瘤頚部留置術の治療効果を検討:骨髄幹細胞ステントを用いて、血管内膜増殖効果の判定を通常のベアステントと病理学的に比較検討し、内膜新生時期についても検討。またステント単独治療群とコイル+ステント治療群でも比較検討し、血管内膜の状態を病理学的に検討した。3.骨髄幹細胞コイル、ステントの生着数の検討:細胞数、投与時期の検討を行い治療プロトコールの最適化を目指し、コイルやステントへ生着させる骨髄幹細胞の血管内膜増殖効果が期待できる最適な数や、時期を比較検討し、病理学的に検討した。骨髄幹細胞研究と脳動脈瘤に対する血管内治療を織り交ぜ、新しい治療方法を目指すこの研究は、今後の血管内治療への発展という意味で、非常に有益な研究であり、今後脳動脈瘤治療の根幹をなすものと考えている。また早期にこの研究結果を報告し、臨床応用することで、死亡率や後遺症を有する確率が極めて高い、クモ膜下出血患者の治療に一日でも早く、1人でも多く治療することが、社会的にも求められている。生着させる細胞は、骨髄由来の骨髄間葉系幹細胞で、あらかじめステントに浸し、細胞を密着させる。(1)ミニブタ動脈瘤モデルに対して、骨髄幹細胞ステントによる動脈瘤頚部留置術の治療効果を検討:骨髄幹細胞ステントと細胞のないステントを留置し治療効果を判定した。血管内膜増殖効果の判定を通常のベアステントと病理学的に比較、検討し、内膜新生時期についても検討する。またステント単独治療群とコイル+ステント治療群でも比較検討し、血管内膜の状態を、病理学的に検討した。(2)骨髄幹細胞ステントの効果を検討:骨髄幹細胞が血管内膜を新生し、脳動脈瘤の基部に内膜を形成しているか病理学的に検討した。ステントの有無で比較検討し、血管新生、血管内膜の増生に差があるか、病理学的に検討した。

生着させる細胞は、骨髄由来の骨髄間葉系幹細胞で、あらかじめステントに浸し、細胞を密着させる。(1)ミニブタ動脈瘤モデルに対して、骨髄幹細胞ステントによる動脈瘤頚部留置術の治療効果を検討:骨髄幹細胞ステントと細胞のないステントを留置し治療効果を判定した。血管内膜増殖効果の判定を通常のベアステントと病理学的に比較、検討し、内膜新生時期についても検討する。またステント単独治療群とコイル+ステント治療群でも比較検討し、血管内膜の状態を、病理学的に検討した。(2)骨髄幹細胞ステントの効果を検討:骨髄幹細胞が血管内膜を新生し、脳動脈瘤の基部に内膜を形成しているか病理学的に検討した。ステントの有無で比較検討し、血管新生、血管内膜の増生に差があるか病理学的に検討した。(3)骨髄幹細胞ステントによる脳動脈瘤破裂予防効果の検討:血管内膜を新生した脳動脈瘤は病理学的に破裂予防効果が本当にあるのか検討した。内弾性板の形成や動脈本来の構造と相違する部分があるか比較検討した。
北京市における歴史伝統保存型の商業街区開発にみる2類型

本研究においては、経済的発展を続ける中国の首都北京市を対象として、そのなかでも特に什刹海地域と大柵欄地域という2つの著名な歴史伝統保存型の商業観光地を取り上げ、近年の文化的色彩の濃い商業街区開発について考察している。これまで中国の都市開発は現代化という目的を達成するために、かけがえのない多くの文化資源を都市開発の名のもとに、いとも簡単に撤去してきた。しかし、経済の発展は徐々に自らの持つ文化的資源への再注目となって表れている。本研究はこれらの点を現地での消費者調査や経営者調査を通して明らかにしようとしている。本年度は研究の初年度として、主として中国現地の実情を調査するとともに、各種資料の収集・分析を通して、その概要を把握し、かつ本研究の全体枠構築のための準備を行った。研究代表者ならびに分担者は、中国現地ならびに日本において、海外共同研究者である清華大学李強教授ら中国側研究者と3回(2005年9月北京、10月東京、2006年2月神戸)にわたり情報交換のための研究会を実施し、今後の現地調査を含む当該テーマに関する国際情報交換に努めた。本研究のテーマとして取り上げた中国における伝統保存型開発は、現在、中国における都市開発にとって無視できない潮流となりつつある。それはこれまでの開発手法がその成果を急ぐあまり都市破壊の批判を浴びてきたからである。とりわけ本研究の対象として取り上げた北京市什刹海ならびに北京市宣武区大柵欄地域の商業的な都市開発整備は、北京市のみならず中国における2つの注目すべきものといえる。什刹海は北京旧城内に位置し、周辺にはかつての貴族の住居であり、歴史的遺産でもある多くの王府や北京の住居の特性である胡同や四合院を有する。同時に、前海や后海と称される湖の存在など、豊かな自然環境に恵まれている。近年では、北京市民のみならず外国人の観光スポットとして、街区の変化が激しい。ただ、その変化は主として市民の経済的動機に基づくものであり、いわゆる消費動向を敏感に反映した開発が進んでいる。一方、宣武区大柵欄地域の場合は、2008年の北京オリンピック開催をにらんだ完全に国策型の都市開発整備であり、その開発は現代北京の最も重視される開発整備として、すべて政府の計画に基づき行政デベロッパーの手で進められている。本研究においては、今後、こうした全く異なった特性を有する2地域の現地状況を引き続き調査していくとともに、これらの開発の対比を通して、現代中国における都市開発整備の動向と市民意識の変遷を明らかにしたい。本年度は研究の第2年度として、中国現地の調査対象地である什刹海ならびに大柵欄地域の実情をさらに調査するとともに、具体的には什刹海の最も繁華な商業街区である煙袋斜街において来街調査を実施し、丈化保存型商業街区における動向把握に努めた。研究代表者ならびに分担者は、海外共同研究者清華大学李強教授と日頃から連携している。それゆえ、2006年7月から8月にかけて、李強研究室の研究者孟蕾を日本に招請し、調査の打ち合わせを行うとともに、10月の中国現地調査において、中国側研究者グループと来街調査実施に対する研究会を行い、中国における調査にあたっての注意点を学習した。来街調査は、2006年11月に行われた。現在、これら収集した調査結果を集計中である。本研究のテーマである中国における文化保存型の商業街区開発は、中国の経済発展とともに、各地で重視されるようになっている。とりわけ、北京オリンピックの開催というエポックが、これらの動きを助長している。それゆえ、研究グループは、北京市の2つの文化保存型商業街区開発の動きを追究するとともに、今回、中国各地で進められている同様の商業開発の動向を北京布の動きの参考資料として調査を実施した。2006年度においては、文化保存型商業開発において先進地域である杭州を訪問、清河坊商業街等を調査し、商業と観光の融合パターンを実見した。中国においては、我が国をはるかに超える外国人観光客を吸引しており、こうした商業と観光のシナジーによる充実がその魅力向上に大きく貢献していることが読み取れる。今後、本研究においても、こうした現実の調査研究はもとよりのこと、商業街区開発の波及効果についても分析する必要のあることを実感した。本年度は研究の第3年度として、中国現地の調査対象地である什刹海ならびに大柵欄地域の実情を調査するとともに、具体的には什刹海の商業的な中核である烟袋斜街において経営者調査を実施し、文化保存型商業街区における動向把握に努めた。経営者調査は、清華大学大学院院生の協力により実施され、現任翻訳作業を終えたところである。また、同じく文化保存型の街づくりを実施しているハルビンの中央大街商店街の現地調査を行い、その実情を調査すると同時に資料収集に努めた。

さらには、海外共同研究者李強清華大学教授との北京での打ち合わせを始め、最終年度の調査に向けて、平成20年2月に人民大学劉精明教授を招請し、打ち合わせを行うとともに、什刹海地区に関する最近の動向把握をおこなった。今回、北京オリンピックを目前に控え、大柵欄地域は再開発のまっただ中にあり、立ち入り禁止地区も多かったため、その代わりに隣接する崇門区において調査の比較的な視点を確立するために地域開発状況を調査した。同じ都市開発といっても、宣武区大柵欄地区と崇門区の開発は、全く形態が異なり、宣武区の文化保存型開発に対して、崇門区は完全なスクラップアンドビルド方式をとっている。確かに、オリンピックを控え、短期的には街を完全に改造する崇門区方式のほうが見た目には大きく変貌しているが、長期的にみれば、文化財を保存しつつ開発している宣武区の方式が評価されるであろうと思われる。今後、本研究においても、地域間の比較的な視点を明確にすることも必要となろう。本年は、研究期間の最終年度にあたるため、これまでの現地調査に続いて、洩れなく調査を行うとともに、報告書についての内容について精力的に討議を行った。まず、中国の現地調査においては、3ケ所目の事例調査として、アモイを訪問し、その商業開発の動向を詳しく調べた。アモイは立地的な制約から、中国には珍しい入り組んだ街並みとなっており、とりわけ「騎楼」といわれる、いわばゲタばきマンションのような形態により、特殊な街区を形成している。また現地調査においては、本年も北京の清華大学の全面的な協力を得て、新装なった大柵欄商店街で来街者調査を実施した。大柵欄商店街は、北京オリンピックをめざして工事がすすめられていたが、結局、隣接する前門商店街とともに、工期が大きくズレ込み間に合わなかった。ただ、大柵欄商店街は以前とは完全に様相を異にし、商業地として回復を果たしたようである。本年は、研究の最終期間として、現在、報告書作成に努力している。とくに、什刹海地区と大柵欄地区の2つを取り上げ、その地域の歴史的経緯ならびに現在の動向について、来街者調査結果の分析とともに、その問題の所在を明らかにすることを目指している。
河川における生態環境改善策としての凹み空間の流れ構造とその維持機構

河川の生態環境を改善するための凹み空間として様々な形態を取り上げて,それらの境界条件が流れと土砂輸送及び水交換にどのような影響を与えるかについて,現地観測と実験及び数値計算によって検討した.河川側岸部の凹みであるわんどについては,その形成過程と流量特性に応じた流れ構造の特徴と土砂堆積機構が明らかにされ,透過水制や巨石を用いた淵の造成や河道多様性の創出において考慮すべき事項が示された.河川の生態環境を改善するための凹み空間として様々な形態を取り上げて,それらの境界条件が流れと土砂輸送及び水交換にどのような影響を与えるかについて,現地観測と実験及び数値計算によって検討した.河川側岸部の凹みであるわんどについては,その形成過程と流量特性に応じた流れ構造の特徴と土砂堆積機構が明らかにされ,透過水制や巨石を用いた淵の造成や河道多様性の創出において考慮すべき事項が示された.本年度は,主に3種類の凹部を対象とした研究を行った.第1は閉鎖的わんどであり,わんど開口部の形状がわんど内の渦の形成に与える影響を調べた.その結果,入口領域の奥行き・幅比が1.5以上で開口渦が形成され,これが間欠的にわんど内へ侵入することによって渦が形成されることがわかった.このような間接的に形成される渦の流速は直接形成される場合に比べて小さくなり,水交換速度はわんど内渦の流速におおむね比例するが,渦構造の形態により影響されることが示された.このことは水深平均の数値シミュレーションによりある程度までは再現できることが示されたが,精度の課題がありさらに非定常な組織渦構造の再現と3次元効果の組み込みが必要と考えられる.第2は複断面水路の高水敷に設置された水制により形成された凹部である.水制が水没しない条件と水没する条件について実験を行い,それぞれにおける流れ構造とこれに対応した砂堆積形状が明らかにされた.特に高水敷上の水制は低水路内の流れに大きな影響を与え3次元的な2次流を形成し,土砂の巻上げを活発にすることが示された.水制長さを短くした場合においても低水路への影響が認められ,この結果をもとに,現地河道に現れた旧水制群の撤去が行われた.第3は河床の片側に淵を有する流れの構造を検討した.水路片側の水深が深くなることにより,淵部分にはく離渦が生じ,直線水路にこのような淵を造成しても土砂堆積によって維持できない可能性が高いことが示され,淵内に透過水制を設置することによりはく離渦を消滅させ淵内流速を大きくすることができた.以上の結果は生態環境および土砂堆積の予測に貢献するものである.矢田川に設置された人工わんど周辺の河床変動メカニズムについて現地観測、実験室での模型実験および数値計算による解析を行った。まず現地で測量を行い土砂堆積形状と堆積量を明らかにし、出水との関係について考察した。この観測結果をもとに、数値シミュレーションと実験により流れ構造と土砂堆積の再現を行い、さらに土砂堆積抑制策について2粒径を用いた流砂実験によって検討した。その結果入口近傍の置き石工が重要な役割を果たすこと、いったん堆積すると埋没するまで進行すること、堆積を抑制するには開口部の境界をかさ上げすることが有効であることが示された。上記のわんどにおいては上流部の閉塞により水質の悪化が顕著となったことから、わんどの開口部形状がわんどの水交換に及ぼす影響について詳細に検討した。閉鎖性のわんどとして河川との境界部に堆積物を想定した障害物を設置し、その形状を変化させて、わんど内の流れ構造の変化および水交換効率の変化を検討した。この結果わんど開口部の閉塞状況に対応した流れパターンが明らかにされ、水交換にはレイノルズ応力とともに3次元的な移流機構が重要であることが示された。また庄内川のわんどでは浮遊砂の堆積が著しいところがあり、その凹みの形状から特殊な堆積形態を示していた。そこで、高水敷わんどの凹みの形状を種々変化させ、高水敷越流時の3次元的な流れ構造を明らかにするとともに、浮遊砂輸送実験を行い、わんどへの堆積特性を調べた。その結果、高水敷を横切る凹み境界線の角度が凹みに流れ込む流れの形態を大きく変化させ、土砂の堆積形状を支配することが明らかとなった。淵の造成方法については、巨石による洗掘促進について検討し、洗掘実験結果を再現できる数値計算法の検討を行った。その結果、構造物前面の横断方向の流砂量を大きく評価することで再現性が向上することが示された。2つの入口を持つ閉鎖的わんどの水交換機構,高水敷わんどの流れ構造及び土砂堆積機構,わんどの土砂堆積抑制方法及び水制,巨石を用いた河道多様性の創出について検討を行った.2つの入口を持つ閉鎖的わんどでは,開口部遮蔽物の長さ,奥行き,わんどのアスペクト比の影響を系統的に検討し,上流側開口部から流入する渦のスケールは開口幅に依存して形成され,わんど内に2次的な渦構造を誘起する.これに対し下流側開口部からの流入は側壁に沿ってわんど奥まで流入して大きな渦構造を形成する場合と,わんど奥まで流入できずに上流または下流の開口部から流出するパターンが現れる.高水敷わんどの流れ構造はわんど上流部の段落ち及び下流部の段上がりの設置角度の影響を大きく受けた3次元流れ構造に支配され,再付着流れと2次流構造によりわんど内の土砂堆積形態が変化することが示された.

このような流れ構造は3次元の乱流モデルを用いた数値計算によっておおよそ再現できることが示された.わんどの土砂堆積抑制に関して掃流砂の抑制にはわんど開口部のかさ上げが効果的であるが,平水時の水交換を維持するためには下流部を開放するかまたは杭群のような断続的開口部を有するものが効果的であった.後者の場合,比較的粗い杭密度の場合でもわんど内土砂堆積は抑制され,水交換も維持できることが示された.次に,巨石を用いた河道多様性の創出については,一様砂の上に置かれた球体は直径の65%から75%程度まで沈み込み,その前面に洗掘孔を形成して平衡状態に達することが明らかとなった.また,両岸に交互に透過水制群を適当な間隔で設置することによって,淵と瀬を有する蛇行形状が形成されることが示され,多様な河道形態の評価方法を示した.
ナノフォトニクス、画像認識技術、金属錯体の融合による菌類同定システム研究

菌類の同定は寒天培地などを用いて数日培養し増殖させるのが一般的である。もし1個体の菌を検出同定できれば、培養の手間と時間を大幅に短縮できることになり、食中毒の診断、初動を劇的に早くすることができる。本研究では菌類に選択的に結合する金属錯体を用いて、菌類の形状と発光を光記録技術により記録させた。記録させた情報をパターン認識技術により、様々な菌類の形状と発光特性を学習させ、1個体の菌でも同定を可能にした。光記録、錯体化学、パターン認識という3つの異分野を融合し、斬新な技術を開発することにより、菌類の迅速同定技術を開発するのみでなく、食中毒患者への迅速な治療を可能にする検出技術を提案するできた。■発光材料研究チーム; O-157、桿菌を識別して結合する金属錯体の合成を行った。金属錯体は、菌類捕獲部位と波長変換部位からできている。菌類捕獲部位を調整することにより、O-157、桿菌に特異的に結合できるように合成することが可能であり、一部の合成に成功した。Tb錯体、Eu錯体を反応させて可視化させる。O-157、桿菌により発光波長と発光寿命が異なることを利用して、菌の識別を行った。■光記録研究チーム;光ディスク上にO-157、桿菌、ごみが混入した汚染水をかけた後、乾燥させて測定を行った。まず、O-157、桿菌、ごみを識別して、ディスク上の数を計算科学を用いて計測した。また光学顕微鏡によっても観測を行い比較検討を行った。その結果、光ディスクで計測した場合と光学顕微鏡観察はほぼ一致した。測定時間は光ディスクの方が、110倍以上速いので光ディスクを用いた計測法の優位さも明確となった。金属錯体を用いた発光を光ディスクで検出する研究はH26年度に集中して研究を行う予定である。■パターン認識研究チーム;光記録波形データから2次元データとして再構築し、適応学習型汎用認識技術を適用して細菌の種類を特定するパターン認識技術の研究開発を行った。ノイズを除去したO-157、桿菌の電子顕微鏡画像から抽出したHLAC特徴を学習させ、テスト画像に含まれるこれら2種の細菌の種類と数を同定した。実験の結果、同形の桿菌であるにもかかわらず、正確に種類と数を同定可能であることが確認できた。なお、ノイズを除去しなくても、ほぼ計数が可能であることも確認できた。光ディスクチーム:光ディスク試料上に分散した菌(大腸菌等)を高速回転中に計測する手法において、取得する菌イメージの高精細化を行った。H25年度までは計測ピッチが0.74μm×0.125-0.5μm(半径方向×接線方向)、強度は256階調の条件でデータを取得していたが、H26年度は計測ピッチが0.4μm×0.125μm、強度は1024階調の条件で取得する変更を行い、各種菌の形状や光学特性に係わる情報量を増やした。金属錯体からの蛍光観察について大きさが数十μmの塊状であれば高速回転中に波長405 nm励起にて計測を行うことができたものの、菌個々の大きさである数ミクロン以下のときはこれまでに計測を行うことはできていなかった。発光材料研究チーム:発光測定系を製作し測定を行った。大腸菌、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌による発光波長、発光寿命を測定し、金属錯体合成にフィードバックさせた。大腸菌、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌による違いが発光波長、発光寿命として大きく現れる発光部位を工夫した金属錯体を見出し、菌種の相違の蛍光識別までを視野に入れた新規発光材料の開発を目指した。発光部位としてビピリジンヘキサトリエンを有する新規亜鉛錯体を作製した。パターン認識研究チーム:高精細化された菌イメージにより劇的に増大するデータ量に対応するためクラウドコンピューティングやデータマイニングなどの手法によりデータを効率的に収集および管理し、高速かつ高精度に処理可能な技術確立を目指して研究を行った。実際には光記録による読み取り信号(1次元)から適切にノイズを除去し、表面に付着した細菌の反射率変動から画像形式の2次元データとして再構築した。その際、ディスク毎に異なるノイズレベルや信号強度による推定結果への影響を抑制するため統計処理やフィルタ処理によるノイズ処理、バラツキを抑えるための正規化処理を行った。光ディスクチームでは、光ディスク面内での位置情報を高精度に決定する技術をベースに、光走査によって得られる菌イメージングの高精細化を検討した。また同種であっても菌形状は一様でないため、イメージングの数を大幅に増やすことで、パターン認識による菌同定の精度向上に寄与する。また蛍光検出のための光学系を高感度化する改善を行い、個々の菌からの蛍光計測を光ディスク回転中に行えるようにした。過去の実験結果から、蛍光剤(及び菌)は凝集する傾向があるが、より菌個々に分散するよう、乾燥方法を含む実験手順の見直しを図った。形状認識と蛍光計測の両結果を総合的に判断して菌の有無及び種類を適切に同定できる仕組みを構築した。発光材料研究チームでは大腸菌、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌に特異的に結合して発光する材料を製作し、発光波長や発光寿命等の特性解析を行った。これまでに上記菌類への認識能を有する新規発光材料(金属錯体)を開発している。

H27年度は、発光材料の親水性の向上及び水系での凝集防止、菌類に結合時の発光強度の増大を目標に発光部位の改良を行った。パターン認識研究チームでは、菌イメージの計数・同定技術に関するこれまでの研究をさらに推し進めて高速化や高精度化を図るだけでなく、他2チームの新方式により得られる多くのイメージを用いて信頼性の検討も行った。すなわちH27年度は、引き続き光ディスクチームが収集する大規模な菌イメージデータに対する画像認識技術の精度向上を進めるとともに、新たに発光材料研究チームが取得した発光データに対する解析技術のフィージビリティスタディに着手した。菌類の同定は寒天培地などを用いて数日培養し増殖させるのが一般的である。もし1個体の菌を検出同定できれば、培養の手間と時間を大幅に短縮できることになり、食中毒の診断、初動を劇的に早くすることができる。本研究では菌類に選択的に結合する金属錯体を用いて、菌類の形状と発光を光記録技術により記録させた。記録させた情報をパターン認識技術により、様々な菌類の形状と発光特性を学習させ、1個体の菌でも同定を可能にした。光記録、錯体化学、パターン認識という3つの異分野を融合し、斬新な技術を開発することにより、菌類の迅速同定技術を開発するのみでなく、食中毒患者への迅速な治療を可能にする検出技術を提案するできた。光ディスクチームでは、H26年度はフォトンカウンティングなどの手法を検討し、蛍光検出の高感度化を図った。培地層について、培地の成分を含む樹脂をスピンコートする方法にて層形成する検討を進めた。光ディスク計測にとって好適な膜厚1μm程度にまで薄膜化することはできたものの、肝心の菌増殖性能が高温高湿下においても確認できなかった。通常の培地とは異なり薄膜にしたことが一因と推察されるが、今年度は培地と樹脂の混合比率や、培地の種類を変えるなどして、光ディスク計測に適用可能な薄膜培地層の実現を目指す。発光材料研究チームではこの錯体の光学特性として最大吸収波長377nm、最大発光波長464nm、発光量子収率2%、発光寿命0.034ns(いずれも50%エタノール中)を得た。更に405nm光励起により大腸菌に対する蛍光認識能を実証した。H26年度は、発光部位の化学的修飾による吸収の長波長化、発光量子収率の増大及び発光の長寿命化を行った。パターン認識研究チームでは、再構築した画像データから高次局所自己相関(HLAC)特徴にもとづくパターン認識と統計的機械学習処理に菌数を推定する処理においては、ノイズレベルによる影響を受けにくい特徴量を導入するなどして、推定精度の向上を図った。さらに、薄膜培地層がコーティングされた光ディスクからの菌イメージや、高感度化された蛍光観察像に対応する処理方式を検討および評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。無機材料工学光ディスクチームでは、光ディスク面内での位置情報を高精度に決定する技術をベースに、光走査によって得られる菌イメージングの高精細化を検討する。また同種であっても菌形状は一様でないため、イメージングの数を大幅に増やすことで、パターン認識による菌同定の精度向上に寄与する。また蛍光検出のための光学系を高感度化する改善を行い、個々の菌からの蛍光計測を光ディスク回転中に行えるようにする。過去の実験結果から、蛍光剤(及び菌)は凝集する傾向があるが、より菌個々に分散するよう、乾燥方法を含む実験手順の見直しを図る。形状認識と蛍光計測の両結果を総合的に判断して菌の有無及び種類を適切に同定できる仕組みを構築する。
固体表面に対する配向の精密制御されたタンパク質の創製

タンパク質(酵素)の固体表面に対する付着は、分析、反応、生体材料設計など生物生体工学の多岐の分野においてみられれ現象であり、それぞれの応用を考える際には付着に対する親和性と配向の制御が重要な鍵となる。そこで、本研究では、タンパク質の固体表面に対する相互作用と直接付着に関与する部位の解明を行うと共に固体表面に対する親和性と配向の制御されたタンパク質の創製を最終目的としている。タンパク質として分子量が小さく、性質や立体構造が明らかにされているウシ膵臓ribonucleaseA(RNaseA)に着目して、固体表面に直接相互作用するタンパク質分子内ペプチド部位の解明と固体表面に対する親和性及び配向の制御された酵素の創製を行うために、変異RNaseAの調製法を確立すると共にその付着挙動を調べた。変異RNaseAとしては、ステンレス表面に対する付着部位と推定されている、^<47>His-Glu-Ser-Leu-Ala-Asp-Val^<57>中のAlaをAspに置換したAla55Asp変異RNaseAとGluとAspのそれぞれあるいは両方をAlaに置換した、Glu55Ala変異RNaseAとAsp55Ala変異RNaseA、及びPS Latexに対し強い付着を示す^<117>Pro-Val-His-Phe-Asp-Ala-Ser-Val^<124>中のPheをAlaに置換したPhe120Ala変異RNaseAを調製した。いずれの場合も変異RNaseA遺伝子をプラスミドpBXRに組み込んだ発現プラスミドを作成し、大腸菌(BL21)内で発現させた。培養大腸菌を回収後に超音波破砕を行い、封入体を回収した。回収した封入体を変性・再生後にイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過により精製した。精製酵素はSDS-PAGE上で均一であることを確認した、精製酵素の収率は10%前後であった。精製酵素のステンレス粒子及びPS Latexに対する付着特性を調べた。予備的検討の結果、予想した通りにAla55Asp変異RNaseAはステンレス粒子に対して野生型RNaseAよりも強い付着力を示したが、Phe120Ala変異RnaseAでは変化がみられなかった。
内毒素や抗菌ペプチドなどの生物間の攻撃と防御の物質を利用した感染症創薬シーズ研究

生物は他の生物と互いに影響を与えあいながら進化を遂げてきた。その過程で、他の生物を攻撃する物質、他の生物からの攻撃を防御する物質、お互いの生存を助け合う物質が発達した。これらの生物間の攻撃と防御、あるいは助け合いを担う物質は自然が長い時間をかけて作りあげてきた貴重な創薬資源として捉えることができる。このうち、微生物と動物との間で攻撃・防御に関わる物質から有用な創薬シーズを作り出す。本研究では特に内毒素(エンドトキシン)やアミノ酸含有脂質などの細菌に由来する免疫刺激物質と、動物(特に昆虫)の抗菌ペプチドに焦点を当てている。前年度までの研究を踏まえて今年度は特に抗菌ペプチドの哺乳動物免疫系に対する作用について解析を行った。抗菌ペプチドが哺乳動物免疫系に対して作用するとの報告はこれまでに多数されているが、その仕組みはよくわかっておらず、またその作用も抗菌ペプチドそのものが活性化するとの報告や、アジュバントとしての作用、あるいは微生物成分由来の免疫賦活物質の作用を増強する作用など多彩である。そこで、これまでの研究で用いてきたハエの抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドとサソリ毒に含まれる抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドを用いて、免疫系に対する効果を調べた。免疫系に対する効果はマウスマクロファージ由来細胞株に対するサイトカインの分泌促進、あるいは分泌抑制を測定する実験系を確立して調べた。抗菌ペプチド単独では免疫刺激活性を認めなかった。一方、リポ多糖や細菌由来DNAの刺激効果に対して、阻害的に働く場合と増強する場合とがあり、その効果はリガンドと抗菌ペプチドの組み合わせで異なった。この作用機構を明らかにしていくことが今後の課題の一つである。抗菌ペプチド単独では免疫刺激活性を認なかった。このように研究の方向性が定まり、解析を進めていくべき現象が見いだせている。このことからおおむね順調と判断できる今年度までに、これまでの研究で用いてきたハエの抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドとサソリ毒に含まれる抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドを用いて、免疫系に対する効果を調べた。そのために抗菌ペプチドの配列の改変、リガンドの変更、リガンドや抗菌ペプチドの細胞への処理方法の変更、などを通じて研究を進めていく。本研究では特に内毒素(エンドトキシン)やアミノ酸含有脂質などの細菌に由来する免疫刺激物質と、動物(特に昆虫)の抗菌ペプチドに焦点を当てる。このうち特に以下に焦点を当てた。抗菌ペプチドをD-アミノ酸で合成するとプロテアーゼによる分解を受けにくいために安定化するとされている。また、活性領域を全てD-アミノ酸で合成したD-抗菌ペプチドは抗菌活性そのものがL-抗菌ペプチドよりも高くなる場合がある。このほか環状化によりペプチド構造が安定化すると活性が強くなる可能性がある。これらのことを前提として抗菌ペプチドの断片ペプチドを合成して活性領域を同定したのちに、これをリード化合物としてアミノ酸配列の改変や安定化の工夫により、有用抗菌ペプチドの作出を行うことを計画している。また、抗菌ペプチドは感染応答において、殺菌だけではなく宿主側に免疫刺激や創傷治癒などの働きをする可能性がある。宿主に対する生理活性についても活性測定系を確立した上で検討する。これらのことの事前準備を本年度は行った。また、内毒素の免疫刺激の応用は本研究の課題であるが、内毒素を阻害するイミダゾリン化合物の作用について発展的に検討を行った。特定の抗菌ペプチドの活性領域を全てD-アミノ酸で合成したD-抗菌ペプチドは抗菌活性そのものがL-抗菌ペプチドよりも高くなるこれまでの結果があるが、この結果を確認できた。また抗菌ペプチドの宿主に対する生理活性について活性測定系の構築ができつつある。

その過程で、他の生物を攻撃する物質、他の生物からの攻撃を防御する物質、お互いの生存を助け合う物質が発達した。これらの生物間の攻撃と防御、あるいは助け合いを担う物質は自然が長い時間をかけて作りあげてきた貴重な創薬資源として捉えることができる。このうち、微生物と動物との間で攻撃・防御に関わる物質から有用な創薬シーズを作り出す。本研究では特に内毒素(エンドトキシン)やアミノ酸含有脂質などの細菌に由来する免疫刺激物質と、動物(特に昆虫)の抗菌ペプチドに焦点を当てている。前年度までの研究を踏まえて今年度は特に抗菌ペプチドの哺乳動物免疫系に対する作用について解析を行った。抗菌ペプチドが哺乳動物免疫系に対して作用するとの報告はこれまでに多数されているが、その仕組みはよくわかっておらず、またその作用も抗菌ペプチドそのものが活性化するとの報告や、アジュバントとしての作用、あるいは微生物成分由来の免疫賦活物質の作用を増強する作用など多彩である。そこで、これまでの研究で用いてきたハエの抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドとサソリ毒に含まれる抗菌ペプチドに由来する合成部分ペプチドを用いて、免疫系に対する効果を調べた。免疫系に対する効果はマウスマクロファージ由来細胞株に対するサイトカインの分泌促進、あるいは分泌抑制を測定する実験系を確立して調べた。抗菌ペプチド単独では免疫刺激活性を認めなかった。一方、リポ多糖や細菌由来DNAの刺激効果に対して、阻害的に働く場合と増強する場合とがあり、その効果はリガンドと抗菌ペプチドの組み合わせで異なった。この作用機構を明らかにしていくことが今後の課題の一つである。抗菌ペプチド単独では免疫刺激活性を認なかった。このように研究の方向性が定まり、解析を進めていくべき現象が見いだせている。
テロメア機能から読み解く遺伝性乳癌におけるゲノム不安定化のメカニズム

染色体末端に存在するテロメアはゲノム安定性の維持に非常に重要であり、テロメア機能の破綻は染色体末端の融合を誘導し、癌細胞で高頻度に見られる染色体の欠損・転座を引き起こす。我々は、染色体末端融合が遺伝性乳癌原因遺伝子であるBRCA1によって制御されていることを見出した。乳癌は女性で最も多い癌であり、その約10%がBRCA遺伝子の異常によって起こる遺伝性乳癌である。本研究は、テロメア機能に着目して遺伝性乳癌におけるゲノム不安定化機構を明らかにし、癌抑制のための基盤技術の開発を目指している。我々は、これまでにテロメア機能破綻時に起こる染色体融合が特定の細胞周期でのみ起こることを見出している。染色体融合にはテロメアクロマチンのユビキチン化が重要なステップとなっているが、平成30年度はテロメア機能不全時の細胞周期依存的なテロメアクロマチンのユビキチン化制御を中心に解析を進めた。その結果、ユビキチン化酵素は細胞周期を通じてテロメアに局在してくるのに対して、家族性乳ガン遺伝子であるBRCA1複合体がこのユビキチン化酵素の機能をS/G2細胞周期特異的に抑制していることが明らかになった。BRCA1複合体の発現をRNAi法によって抑制すると、S/G2細胞周期でのテロメアクロマチンのユビキチン化抑制が解除された。さらに、細胞周期キナーゼCDKによりリン酸化されるBRCA1複合体因子に着目して、CDKによるリン酸化部位に変異を導入してリン酸化が起こらないような変異体を樹立した。この変異体を細胞に導入すると、RNAi法によるノックダウンと同様にテロメア機能不全時に起こるテロメアクロマチンユビキチン化の細胞周期依存性が消失した。以上の結果は、BRCA1複合体因子が染色体融合に関与するクロマチンユビキチン化制御に強く関与していることを示している。研究成果について国内学会で4回の発表を行った。平成30年度において、BRCA1複合体によるテロメア機能破綻時の染色体融合に強く関与するテロメアクロマチンユビキチン化の制御機構を明らかにすることができた。当初の研究計画通りの進捗である。平成31年はテロメア機能不全時に起こるテロメアクロマチンユビキチン化・染色体末端融合に関与するBRCA1複合体因子を中心に機能解析を行い、家族性乳癌におけるゲノム不安定化への寄与について研究を進める予定である。研究成果は速やかに国際学術雑誌、学会等で発表するとともに、インターネット等を通じて社会に向けて広く発信していく予定である。染色体末端に存在するテロメアはゲノム安定性の維持に非常に重要であり、テロメアによる染色体末端保護機能が破綻すると染色体末端部にDNA損傷反応が誘導される結果、染色体末端同士が融合し、癌細胞で高頻度に見られる染色体の欠損・転座を引き起こす。我々は、最近、染色体末端融合が遺伝性乳癌原因遺伝子であるBRCA1によって制御されていることを見出した。本研究では、テロメア機能に着目した解析から遺伝性乳癌におけるゲノム不安定化のメカニズムを明らかにし、癌抑制のための基盤技術の開発を目指している。我々は、テロメア機能破綻時に起こる染色体融合が特定の細胞周期でのみ起こることを見出しているが、平成29年度は染色体融合が細胞周期依存的に起こる分子メカニズムを中心に解析した。その結果、細胞周期制御キナーゼであるCDK1/2の活性によって染色体融合を制御する因子を同定した。この因子の発現をRNAi法によって抑制すると、染色体末端融合でのDNA損傷応答の細胞周期依存性が消失した。さらに、この因子におけるCDK1/2によるリン酸化部位を同定した。リン酸化が起こらないような変異体を細胞に導入すると、RNAiによるノックダウンと同様にテロメア機能破綻時の染色体末端に起こるDNA損傷応答の細胞周期依存性が消失した。以上の結果は、テロメア機能破綻時の染色体融合に本因子が強く関与していることを示している。研究成果は、国際学術誌1報、国内学会3回で発表を行った。平成29年度において、テロメア機能破綻時の染色体融合に関与する分子を同定し、CDK1/2によるリン酸化による制御メカニズムを明らかにすることができた。BRCA

1複合体の発現をRNAi法によって抑制すると、S/G2細胞周期でのテロメアクロマチンのユビキチン化抑制が解除された。さらに、細胞周期キナーゼCDKによりリン酸化されるBRCA1複合体因子に着目して、CDKによるリン酸化部位に変異を導入してリン酸化が起こらないような変異体を樹立した。この変異体を細胞に導入すると、RNAi法によるノックダウンと同様にテロメア機能不全時に起こるテロメアクロマチンユビキチン化の細胞周期依存性が消失した。以上の結果は、BRCA1複合体因子が染色体融合に関与するクロマチンユビキチン化制御に強く関与していることを示している。研究成果について国内学会で4回の発表を行った。平成30年度において、BRCA1複合体によるテロメア機能破綻時の染色体融合に強く関与するテロメアクロマチンユビキチン化の制御機構を明らかにすることができた。当初の研究計画通りの進捗である。平成29年度に明らかにした染色体末端融合制御因子の機能解析を進め、テロメア機能破綻時の染色体融合の詳細な制御メカニズムと、遺伝性乳癌におけるゲノム不安定性との関連を明らかにしていく。研究成果は速やかに国際学術雑誌、学会等で発表するとともに、インターネット等を通じて社会に向けて広く発信していく。平成31年はテロメア機能不全時に起こるテロメアクロマチンユビキチン化・染色体末端融合に関与するBRCA1複合体因子を中心に機能解析を行い、家族性乳癌におけるゲノム不安定化への寄与について研究を進める予定である。研究成果は速やかに国際学術雑誌、学会等で発表するとともに、インターネット等を通じて社会に向けて広く発信していく予定である。
脂質非対称を感知して伝達する分子機構の解明

細胞膜の脂質組成は外層と内層で異なっており,脂質非対称を生じている。脂質非対称は様々な生命現象に重要であるため,脂質非対称を維持する機構が存在する。我々はこれまでにRim101経路が脂質非対称変化に応答し,Rim21がセンサーとして機能することを見出していた。本申請において,我々はRim21からのシグナル伝達がESCRT IIIに至るまで細胞膜で起こることを明らかにした。また,このシグナル伝達経路にユビキチン化が重要であることを見出した。さらに,脂質非対称変化によってRim21依存的に発現誘導される新規タンパク質Opt2を同定し,脂質非対称応答において重要であることを明らかにした。細胞膜二重層では外層と内層の脂質組成が異なる(脂質非対称)。我々はこれまでに脂質非対称を感知してシグナルを伝える経路としてRim101経路を同定してきた。Rim101経路は外界のアルカリ化に応答する経路としても知られる。従来のモデルでは外界のアルカリ化が起こるとまずセンサータンパク質Rim21がエンドサイトーシスし,その後エンドソーム上で下流因子を集積させて転写因子Rim101を切断・活性化するというものであった。しかし我々は今回,従来のモデルとは異なり,これらのRim101経路の因子群(Rim8,Rim13,Rim20,Snf7)が細胞膜上にパッチ状に集積してシグナルを伝えることを明らかにした。また,ユビキチンリガーゼRSP5の変異体を用いた解析から,この過程にはユビキチン化が関与することも見いだした。マイクロアレイを用いた解析から,脂質非対称が乱れた際にRim101経路依存的に誘導される遺伝子群を抽出し,機能未知のOpt2を同定した。ホスファチジルエタノールアミン(PE)のフリップに関わるLEM3欠損株ではPEが外層に露出しており,外層のPEに結合して毒性を示す薬剤Duramycinに対して感受性を示す。一方,OPT2とLEM3の二重欠損株は耐性を示した。また,PEに結合するRoペプチドにより外層に露出したPEの可視化を行ったところ,LEM3欠損株よりもOPT2とLEM3の二重欠損株ではPEの露出が低下していた。さらに,Opt2を過剰発現させると蛍光標識したPEの取り込み量が減少した。これらのことから,Opt2がこれまでに報告されているフロッパーゼのファミリーには属さない新しいタイプのフロッパーゼであることが示唆された。細胞膜脂質二重層の内層と外層の脂質組成が異なっていることを脂質非対称と呼ぶ。脂質非対称の維持は膜電位の形成,細胞膜の安定化に重要であるため,脂質非対称に変化が生じるとその変化を認識し,元に戻そうとする機構が存在すると予測された。実際我々は,そのような機構の存在を見出し,Rim101経路が関わることを明らかにしてきた。Rim101経路の最上流では細胞膜に局在するRim21が脂質非対称のセンサーとして働くことも見出している。本年度,我々はRim21のどの領域がどのようにして脂質非対称を認識するのかについて解析を行った。Rim21は複数膜貫通タンパク質であるが,細胞質に存在するC末端に比較的大きな親水性領域(Rim21C)を持ち,この領域には多数の荷電アミノ酸クラスターが存在する。Rim21CをGFPへ融合させ,細胞内局在を観察したところ,細胞膜とバッドネックに局在が見られた。一方,脂質非対称に変化が生じた変異株中ではそのような局在が失われた。このことから,Rim21C内に脂質非対称を認識するモチーフがあることが明らかとなった。また,我々はRim21Cに存在する荷電アミノ酸クラスターそれぞれの変異体を作成し,脂質非対称変化に対する応答能を調べた。その結果,353から355番目のグルタミン酸(EEEモチーフ)をアラニンに置換した変異体で活性が失われていた。これらの結果から我々は脂質非対称認識に関して以下のような仮説を提唱した。正常な脂質非対称の状態では細胞膜内層に負電荷を持つリン脂質が多く存在し,Rim21CのEEEモチーフと反発しあっている。しかし,脂質非対称が乱れると負電荷のリン脂質が減少し,Rim21Cとの反発力が軽減し,Rim21C末端の膜との相互作用や構造変化が引き起こされる。その結果,Rim101経路の下流因子がリクルートされて,Rim101経路の活性化が引き起こされる。脂質生化学交付申請書に記載の項目については研究実施の概要に示した通り,殆ど全て達成することができた。脂質非対称シグナルを下流に伝える分子機構の解明及び,Opt2の機能解明のどちらについても現在論文を投稿中である。Rim21のC末端側の荷電アミノ酸の役割については現在解析中である。

脂質非対称シグナルを下流に伝える分子機構の解明については現在の知見を精製タンパク質を用いたin vitroの解析に発展させる。また,脂質組成に影響を与える変異株中でのRim21の挙動を調べることで,脂質非対称を感知する分子メカニズムを明らかにする。Opt2については欠損株を用いた解析により生理的役割について明らかにする。また,フロッパーゼとしての特性評価を生化学的な解析により行う。Rim21のC末端親水性領域に存在する荷電残基クラスターの役割解明において,この配列とGSTとの融合タンパク質の大腸菌の発現量が低く,精製に時間がかかっているためである。Rim21のC末端荷電残基のGST融合タンパク質の大量発現,精製,脂質との結合アッセイに必要な試薬の購入に用いる。
蛋白質相互作用解析による癌抑制遺伝子BRCA1の細胞周期制御分子機構の研究

細胞周期を通して、BRCA1の蛋白複合体を網羅的に解析した。HERC2がS期特異的にBRCA1と結合し、分裂期ではBRCA1から迅速解離する現象を見出した。HERC2はBRCA1のユビキチンリガーゼで、BARD1から離脱したBRCA1を不安定させると同時に、pre-RC複合体のMCM蛋白質の活性化を誘発し、異常複製開始点を発火させる。HERC2はClaspinとともに複製フォークの進行や安定を制御し、最終的にG2/Mチェックポイント応答に機能する。HERC2はBRCA1が司っている細胞周期のG2/Mチェックポイント制御機構には重要な役割を担い、BRCA1の細胞周期調節機構には必須因子であることを明らかにした。本年度の研究内容1.各細胞周期におけるBRCA1の結合蛋白質の検索した。2.合成期にBRCA1と特異的結合するHERC2蛋白はBRCA1のユビキチンリガーゼであることを同定した。3.さらに、HERC2とBRCA1の結合の生物学的機能解析を行った。本年度の研究結果細胞周期を通して、BRCA1の蛋白複合体を網羅的に解析した。そこでHERC2がS期特異的にBRCA1と結合し、分裂期ではBRCA1から迅速解離する現象を見出した。HERC2はHECTとRLDドメインを持ち、ユビキチンリガーゼの構造特性を有する。その構造特性から、HERC2はユビキチンリガーゼE3活性を有すること、核と細胞質間のシャトルタンパク質であることを明らかにした。HERC2のHECTドメインはBRCA1の分解領城とダイレクトで結合し、BRCA1をユビキチン化する。HBRC2はBRCA1のユビキチンリガーゼであることを明らかにした。BRCA1はS期foci形成する。BARD1から離脱するとなると、HERC2と結合して、ユビキチン化を受け、分解される。ただし、BARD1から離脱するBRCA1の量が少なく、S期ではHERC2が正常な細胞周期の進行に顕著な影響を与えない。HERC2はBARD1から離脱したBRCA1を不安定させて、G2/Mチェックポイント機構を機能停止状態にする役割を果たしている。HERC2はBRCA1が司っている細胞周期のG2/Mチェックポイント制御機構には重要な役割は担い、BRCA1の細胞周期調節機構には必須因子であることを明らかにした。研究結果の意義癌細胞のDNA修復機構はG2/Mチェックポイントしかを持ってない場合がほとんどで、G2/Mチェックポイント機構をターゲットした抗がん剤であれば、癌細胞唯一のDNA修復機構が破壊され、DNA傷害剤と併用すれば、低用量でも十分な抗がん効果が期待できる。BRCA1はG2/Mチェックポイントの主な役割を担っているが、その分子機構はまだ解明されていない。この研究により、BRCA1のG2/Mチェックポイント制御分子機構がより明白となり、これをターゲットとする新規抗癌剤開発に新しいアプローチするのに理論的根拠を提供できる。本年度の研究内容2.HERC2蛋白がBRCA1のユビキチンリガーゼ活性に与える影響を解析した。本年度の研究結果前年度において、HERC2はBRCA1のユビキチンリガーゼであることを明らかにした上で、BRCA1が司っている細胞周期のG2/Mチェックポイント制御機構に機能していることを明らかにした。本年度では、その制御メカニズムの解析を行った。Claspinの不安定化でBARD1のリン酸化が誘導される現象が起きた。BARD1がリン酸化されることによって、BRCA1のユビキチンリガーゼ活性が抑制された。HERC2蛋白を除却することにより、Claspinの不安定化によるBARD1のリン酸化誘導が解除され、BRCA1のユビキチンリガーゼ活性が保たれた。よって、HERC2蛋白はClaspin分解機構を制御している同時に、BARD1のリン酸化レベルをコントロールし、BRCA1のユビキチンリガーゼ活性を制御していると考えられる。研究結果の意義本年度の研究結果で、BRCA1のG2/Mチェックポイント制御分子機構に新たな見解を見出した。これをターゲットとする新規抗癌剤開発に新しいアプローチするのに理論的根拠を提供できる。本年度の研究内容本年度の研究結果平成21年度において、BRCA1の機能不全がClaspinの蛋白質分解を誘導し、G2/Mチェックポイント応答不能が引き起こすことに対して、HERC2蛋白を除却することによって、Claspinが安定され、G2/Mチェックポイント応答が回復するとの結果が得られた。本年度では、Claspinが複製フォークの安定因子であることから、HERC2蛋白が複製フォークの進行および安定に与える影響に着目して、その制御メカニズムの解析を行った。

免疫沈降により、HERC2蛋白質がClaspinと複合体を形成していることを確認した上で、HERC2がPCNA、TopBp1およびMCM7などの複製因子とも共局在することを免疫蛍光染色にて確認した。HERC2は複製フォークに局在し、複製複製フォークの進行に影響を与えていると考えた。Claspinの機能不全時、複製フォークが不安定化となり、複製も停止状態に陥ることがすでに報告されている。siRNA技術を用いて解析した結果、HERC2蛋白はClaspinの複製フォーク進行障害誘発や複製フォークの不安定化誘導に働いていることを見出した。この過程では、HERC2がpre-RC複合体のMCM蛋白質の活性化を制御することによって、異常複製開始点の発火制御に機能していることを明らかにした。研究結果の意義本年度の研究結果で、BRCA1/HERC2は複製フォーク複合体との相関性を検討することにより、BRCA1の細胞周期制御ならび癌抑制機構を含めた新規な生命現象を探り理解して、これらを標的とする新規抗癌剤開発のアプローチに理論的根拠を提供する。
合成ペプチドをもチいるインスリン受容体機能発現の分子機構の解析

1.ヒト胎盤性インスリン受容体タンパク質(HIRP)のペプチドフラグメントの化学合成:昭和62年度において計画したHIRP関連ペプチドの固相法による化学合成を完了し、その純度と構造を確認、抗原としてもちいうることを証明した。2.合成ペプチドに対する抗血清の作製:上記1で得た各合成ペプチドを抗原として抗血清の作製を試み、現在までに、本研究の目的に使用し得るものを17種類得た。3.抗合成ペプチド血清をもちいるHIRP特異RIAの確立:抗合成ペブチド血清および抗原ペプチドをもちい。HIRP部位特異RIA系を確立しこれにより、HIRPを定量すのことをはじめて可能にした。4.抗合成ペプチド血清をもちいる免疫組織化学的研究:抗合成ペプチド血清をもちい、ヒト胎盤組織を免疫染色し、いずれの抗血清も合胞体栄養細胞膜に特異的に反応することを確認することによりこれら抗血清の有効性と有用性を証明した。5.抗合成ペプチド血清をもちいる生化学的研究:(a)胎盤性HIRPの2種の分子種を分別証明するともに、それらのインスリン結合能に対するpHならびに塩濃度の影響の特異性を明らかにした。(b)ヒト肝ガン由来培養細胞にHIRPの存在を証明するとともに、そのインスリン結合能を免疫化学的に解析した。(c)胎盤性HIRPのαサブユニットN端部がインスリン結合に関与していることを明らかにした。(d)胎盤性HIRPαサブユニットのC端領域およびβサブユニットの膜直下領域にαβ型、α_2β_2型においてともに分子表面に露出した構造をとっていることを明らかにした。(e)ヒト単核球HIRPが本研究の抗血清をもちいて解析しうることを証明し、その分子型が胎盤性HIRPα_2β_2型に一致することを明らかにした。1.ヒト胎盤性インスリン受容体タンパク貭(HIRP)のペプチドフラグメントの化学合成:HIRPαーサブユニット(9ー154)領域について6画分, (314ー731)領域は16画分,またβーサブユニット(736ー929)領域は8画分に分割し,それぞれに相当するアミノ酸2030残基よりなるペプチドフラグメント計30種を化学合成した.合成は固相法によっておこない,最終生成物はHPLCにより高純度に精製した.2.合成ペプチドフラグメントに対する抗血清の作製:上記1で得た各合成ペプチドは,順次,ポリビニルピロリドンに吸着した形のものを抗原として家兎に免疫注射し抗血清を作製した.現在までに, HIRP(30ー61),(48ー77)および(736ー760)を抗原として作製した抗血清は特に高い抗体価を示し,本研究の目的の為に十分使用しうるものであった.3.抗合成ペプチド血清をもちいる免疫組織化学的研究:上記2で得たregion-specific抗インスリン受容体血清をもちいてヒト胎盤組織を免疫染色したところ,いずれも合胞体栄養細胞膜と特異的に反応した.HIRPの互に〓れた部位を認識するこれら抗血清が同じ細胞膜を免疫染色することを明らかにした本研究の結果は,ここに作製した抗合成ペプチド血清の有効性を証明するものである.なお,ラット肝臓にもこれら抗血清と反応する膜成分を認めた.4.抗合成ペプチド血清をもちいるインスリン結合部位の解析:ヒト胎盤可溶性膜標品をもちい,インスリン結合反応に対する各抗血清の阻害効果を検討した結果,抗HIRP(30ー61)および(48ー77)が明らかに阻害活性を示し,これによりαーサブユニットN端部がインスリン結合に関与していることを示した.一方, βーサブユニットN端部は関係していなかった.以上本年度研究実施計画の全てを完了した.(1)ヒト