hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スウェーデンのＳｏｃｉａｌｐｅｄａｇｏｇｉｋと社会教育者の専門性に関する研究

その際、「教育福祉」という概念を援用し、Social Pedagogyの理論と実践における教育と福祉の関係に焦点を当て、調査・分析を行った。本年度は、初年度の研究成果を踏まえ、(A)教育課程の調査、(B)2年間で得られたデータをもとに、ソスペッドによる実践の構造化を試みた。得られた知見としては、以下の通りである。(A)ソスペッド養成課程の考察:ソスペッドと同様の職種に就くことが多いソーシャルワーカーの養成課程と比較すると、ソスペッドは養成課程において教育学的観点を身につけていることが分かった。そのため、医療・社会福祉現場において、医療・福祉職ではなく教育者として実践に携わっている。日本においても、教育者が社会福祉現場等で教育の専門家として実践に携わる可能性が考えられる。(B)SP実践の構造:社会福祉実践現場における、ソスペッドの教育者としての人びととの関わり方について観察調査を実施した。その結果、「伴走者」として1関係性を築き、2ニーズを把握し、3挑戦するというプロセスを繰り返し、社会福祉対象者の自立に向けた教育支援を行うという実践の構造が仮説的に引き出された。この観点は、日本の社会教育主事の働き方とも類似性があると考えられ、今後の比較研究の可能性も見出された。2年次は主に、「教育福祉論」の再構築及び日本において教育福祉的実践を担う専門職の創生の可能性について言及することを目指す。そのため、これまで得られたデータを基に、ソスペッドの専門性及びその基盤を成す理論、すなわちSocial Pedagogy(=Socialpedagogik:SP)における教育と福祉の関係性を探り、現代的な「教育福祉論」の構築を目指す。具体的には、以下のことを行う。(方策A)データ整理及び分析:これまでスウェーデン現地で得られたデータ(特に参与観察調査から得たデータ)をカテゴリーごとにまとめ直し、実践現場における構造を分析する。その際、ソスペッドの教育学的視点あるいは教育者としての意義に着目し分析を進める(方策B)先行研究の再整理:データ分析で得られた知見を基に、先行研究の再整理を行う。具体的には、これまでの質的調査で得た新たな概念や、データ分析を行う過程で生まれた分析視点などに関する文献をまとめ、これまで行った文献調査と合わせて本研究の枠組みを修正する作業を行う。(方策C)「教育福祉論」の再構築:方策AとBを合わせ、現代的な「教育福祉論」の再構築を試みる。SPにおける理論とソスペッドの実践から、社会福祉領域で対象とされる人びとに対し、教育学的/教育的に関わることの重要性が見えてきた。すなわち、社会福祉領域で志向される対処療法的観点に加え、成長や発達/発展、計画という教育的な観点が専門職に備わることで、対象者が自らの人生を主体的に歩むことを可能にすると考えられる。
未来の存在論的身分に関する分析哲学的研究

未来という時間の存在論的身分を明らかにすることを目指して,「因果関係の本性」,「自然の斉一性」,「自然法則の身分」などの問題に取り組んだ。まず,不在因果の検討を通して因果関係の本性について考察した。出来事個体間の因果関係は出来事類型間の関連性を暗黙の前提とし,結果は原因だけでなく背景条件にも依存する。或る出来事が何であるかということの内に既に他の出来事類型との関連性が含まれている。要するに,因果関係とは世界と人間とが共同して作り出した秩序(出来事類型間の関連)である。次に,自然の斉一性(帰納法の正当化)の問題に取り組んだ。未来に関する斉一性は知識が成り立つための条件である。しかし,「既に過去になってしまった未来」の斉一性から「まだ過去になっていない未来」の斉一性を導くことは循環論証であり,未来が斉一的でなく知識が成り立たなくなる可能性は常にある。要するに,未来は或る意味で既知であり,別の意味でまったく未知である。さらに,研究の進展に伴ない,「過去の経験から得られた知識を未来へ投射し,かつ,自らの未来の行為を意図する主体」である「心」の存在について考察した。心を物質から独立させるデカルトの議論は妥当ではない。また,本研究全体の背景として,20世紀英米哲学における形而上学の盛衰(論理実証主義者や日常言語学派による形而上学批判から今日の分析形而上学への変化)およびカテゴリー論(自然法則や傾向性の分析を含む)について調査をおこなった。本研究の目的は,「自然の斉一性(帰納法の正当化)」,「自然法則の身分」,「因果関係の本性」,「未来時制命題の特質」という4つの具体的問題の検討を通して,未来という時間の存在論的身分を明らかにすることである。3年計画の1年目である本年度は,これらのうち,「因果関係の本性」と「自然の斉一性」の問題に取り組んだ。論文「不在因果について」では,不在因果(不作為や生起しなかった出来事を原因・結果とする因果関係)を対象に因果関係の本性について考察した。出来事個体間の因果関係は出来事類型間の関連性を暗黙の前提とする。結果は原因だけでなく背景条件(産出条件の現存と妨害条件の不在)にも依存する。不在因果とは妨害条件の不在が原因として際立った場合の因果関係である。因果関係とは世界と人間とが共同して作り出した秩序(出来事類型間の関連)である。論文「自然の斉一性について」では,未来と知識の関係について考察した。自然の斉一性とは場所の違い・経験の有無・時間の違いによらず同じ自然法則が成り立つことである。空間的斉一性・認識的斉一性・過去に関する斉一性は「説明の良さ」や「自然の認識からの独立性」によって正当化できる。しかし,未来に関する斉一性は正当化できない。「既に過去になってしまった未来」の斉一性から「まだ過去になっていない未来」の斉一性を導くことは循環論証である。経験が消滅的・時間的であるのに対し,知識は持続的であり時間を超えようとする。しかし,未来が斉一的でなく知識が成り立たなくなる可能性は常にある。それゆえ,未来は或る意味で既知であり,別の意味でまったく未知である。著書『哲学への誘い』では,出来事概念による時間様相(現在・過去・未来)の分析の概略を描いた。

3年計画の2年目である本年度は,「過去の経験から得られた知識を未来へ投射し,かつ,自らの未来の行為を意図する主体」である「心」の存在について考察した。さらに,本研究の背景としての20世紀英米哲学における形而上学の盛衰について調査を行った。いずれも,本研究の深化にともなって生じた新しい課題である。まず,「心」の存在については,物質との関連性(心身問題)に焦点を絞り,デカルトの「物心二元論」について検討した。仮にデカルトが言うように「心の本質は『考えること』だけだ」としても,「この現実世界において私の心の存在がたまたま身体の存在に依存している」という可能性は排除できない。それゆえ,心を物質から独立させるデカルトの議論は妥当ではない。(この他,未来論および心身問題の一形態として「死後の生」について考察した。)次に,形而上学の盛衰についてだが,20世紀初頭の英米哲学において論理実証主義や日常言語分析学派から厳しく非難された形而上学は今日「分析形而上学」として復活した。なぜ復活できたのか。それは,「検証原理そのものの不備」や「クワインの全体論が検証原理から形而上学批判の力を奪ったこと」,「ストローソンの記述的形而上学が日常言語分析へ形而上学を持ち込んだこと」,「クリプキによって,様相概念(必然・偶然・可能)が認識論的概念(アプリオリ・アポステリオリ)や意味論的概念(分析的・総合的)に還元されないことが示されたこと」などのゆえである。(この他,代表的分析形而上学者の一人であるジョナサン・ロウの4カテゴリー論について調査し,「自然法則の身分」や「因果関係の本性」について考察した。)本研究の目的は,未来という時間の存在論的身分を明らかにすることである。本年度はこの問題設定の背景となる存在論的カテゴリーについて研究を行った。即ち,論文「ロウの4カテゴリー存在論(1)」において,現代の代表的な分析形而上学者であるジョナサン・ロウの4カテゴリー存在論について考察した。ロウは「個体/普遍」と「実体的/非実体的」という2つの区別を交差させることによって,対象(実体的個体)・モード(非実体的個体)・種(実体的普遍)・属性(非実体的普遍)という4つの根本的カテゴリーを立てる。(モードは「トロープ」とも呼ばれる。「個体としての性質」のことである。)これら4カテゴリーの間には「個体は普遍を実例化し,非実体は実体を特徴づける」という存在論的関係があり,かつ,(ロウによると)普遍は個体なしでは存在できない。ロウは,「根本的カテゴリーの種類が少ない節約的な他のカテゴリー論(キャンベル,アームストロング,マルティンなどのカテゴリー論)よりも,4カテゴリー存在論は説明力の点で優れている」と主張する。即ち,4カテゴリー存在論は1性質の知覚,2トロープの個別化,3自然法則の分析,4傾向性の分析などの問題をそれらのカテゴリー論よりも適切に解決する。即ち,1個体だけが因果関係に入りうるので,知覚はモードを必要とする。2モード(トロープ)は対象のあり方であって,その存在と同一性は対象に依存する。3自然法則とは,「種が属性によって特徴づけられる」ということである。4傾向性とは,「対象が,或る属性によって特徴づけられる種の実例である」ということであり,他方,生起状態とは,「対象が,或る属性の実例であるモードによって,特徴づけられる」ということである。このようにして,ロウは,対象・モード・種・属性の4つの根本的カテゴリーによって,知覚・トロープ・自然法則・傾向性を統一的に説明するのである。
ハマダラカのマラリア媒介能力に関わる抑制機構の解析

目的:プロフェノール酸化酵素活性化系の因子と考えられるマラリア媒介蚊ハマダラカ(Anopheles stephensi)の病原体認識分子(シアル酸特異的レクチン)を分子生物学的に解析するため、シアル酸特異的レクチンの遺伝子配列を決定し、アミノ酸配列を推定する。さらに、認識分子に相互作用するプロフェノール酸化酵素活性化系の因子を分子生物学的に解析する。マラリア原虫認識分子であるマラリア媒介蚊のシアル酸特異的レクチンおよびマラリア原虫認識分子相互作用因子を明らかにすることにより、蚊の段階でマラリア原虫を殺す機構の一つであるプロフェノールオキシダーゼ活性化系の最初の段階を明らかにする。そして、蚊における病原体媒介能を人為的にコントロールする可能性を探る。計画:マラリア非媒介蚊Armigeressubalbatus由来シアル酸特異的レクチンのアミノ酸配列を解析し、縮重プライマーを用いてPCRを行い、シアル酸特異的レクチンcDNAの遺伝子断片を得てプローブとして、Anopheles stephensi由来シアル酸特異的レクチンcDNAのクローニングをプラークハイブリダイゼーション法によって行う。ファーウエスタンブロット法あるいは、two-hybrid system法を用いて、レクチン相互作用蛋白質cDNAのクローニングを行う。成果:Armigeres subalbatusの蛹体液からホルマリン固定の赤血球を用いたバッチ法で得られた4つのポリペプチドをエドマン分解法やデノボシークエンシングにて解析し、多くのペプチドのアミノ酸配列を得ることができ、4つのポリペプチドに対してレクチンと類似性の配列を認めた。目的:プロフェノール酸化酵素活性化系の因子と考えられるマラリア媒介蚊ハマダラカ(Anopheles stephensi)の病原体認識分子(シアル酸特異的レクチン)を分子生物学的に解析し、シアル酸特異的レクチンの遺伝子配列を決定し、アミノ酸配列を推定する。マラリア媒介蚊のシアル酸特異的レクチンであるマラリア原虫認識分子をわかることにより、蚊の段階でマラリア原虫を殺す機構の一つであるプロフェノールオキシダーゼ活性化系の最初の段階を明らかにする。計画:マラリア媒介蚊Anopheles stephensiのcDNAライブラリーを作製し、シアル酸特異的レクチンの検出系を用いて、発現クローニングを行う。あるいは、マラリア非媒介蚊Armigers subalbatus由来シアル酸特異的レクチンcDNAの遺伝子断片をプローブとして、Anopheles stephensi由来シアル酸特異的レクチンcDNAのクローニングを行う。成果:マラリア媒介蚊Anopheles stephensi由来のcDNAライブラリーから、グライコホリンを用いた発現クローニング法によってシアル酸特異的レクチンのcDNAのクローニングを行った。その結果、7つのクローンを得ることができた。その中で、同じものが一組認められた。新規なものもあった。レクチンに相同性のものは、認められなかった。今後は、取れたクローンが、シアル酸特異的レクチンであるか確認を行う。また、新たな方向からシアル酸特異的レクチンのクローニングを行いたい。目的:マラリア媒介蚊ハマダラカ(Anopheles stephensi)のプロフェノール酸化酵素活性化系の因子と考えられる病原体認識分子(シアル酸特異的レクチン)を分子生物学的に解析し、シアル酸特異的レクチンの遺伝子配列を決定し、アミノ酸配列を推定する。マラリア媒介蚊のシアル酸特異的レクチンであるマラリア原虫認識分子を解析することにより、蚊の段階でマラリア原虫を殺す機構の一つであるプロフェノールオキシダーゼ活性化系の最初の段階を明らかにする。計画:マラリア媒介蚊Anopheles stephensiのcDNAライブラリーを作製し、シアル酸特異的レクチンのN末端アミノ酸配列に対するペプチド抗体を用いて、発現クローニングを行う。あるいは、マラリア非媒介蚊Armigeressubalbatus由来シアル酸特異的レクチンのアミノ酸配列を解析し、縮重プライマーを用いてPCRを行い、シアル酸特異的レクチンcDNAの遺伝子断片を得てプローブとして、Anopheles stephensi由来シアル酸特異的レクチンcDNAのクローニングをプラークハイブリダイゼーション法によって行う。成果:Armigeres subalbatus cDNAライブラリーからシアル酸特異的レクチンのN末端アミノ酸配列に対するペプチド抗体を用いて発現クローニングを行った。その結果、6つのクローンを得ることができた。現在、シアル酸特異的レクチンであるか確認中である。また、ホルマリン固定の赤血球を用いたバッチ法で得られた4つのポリペプチドをエドマン分解法やデノボシークエンシングにて解析し、多くのペプチドのアミノ酸配列を得ることができた。計画:マラリア非媒介蚊Armigeres

subalbatus由来シアル酸特異的レクチンのアミノ酸配列を解析し、縮重プライマーを用いてPCRを行い、シアル酸特異的レクチンcDNAの遺伝子断片を得てプローブとして、Anopheles stephensi由来シアル酸特異的レクチンcDNAのクローニングをプラークハイブリダイゼーション法によって行う。ファーウエスタンブロット法あるいは、two-hybrid system法を用いて、レクチン相互作用蛋白質cDNAのクローニングを行う。成果:Armigeres subalbatusの蛹体液からホルマリン固定の赤血球を用いたバッチ法で得られた4つのポリペプチドをエドマン分解法やデノボシークエンシングにて解析し、多くのペプチドのアミノ酸配列を得ることができ、4つのポリペプチドに対してレクチンと類似性の配列を認めた。
「リポクオリティ」領域研究の推進

リポクオリティ領域全体の円滑な研究活動を支援するため、総括班として以下の活動を行った。(1)本領域のホームページ(https://sites.google.com/site/lipoqualityjpn/)において、研究成果や研究内容紹介などについて随時情報のアップデートを行った。16件の公募班を新たに加えた領域ホームページの整備および領域メイリングリストなど相互の連絡体制を整えた。また、本領域の最終年度に開催する第60回国際脂質生物学会議(ICBL2019)の事務局を立ち上げた。(2)研究支援センターの整備と利用:理研IMS内に設置した質量分析センターは、ノンターゲット解析の技術開発および従来のターゲット解析と組み合わせて領域内外との共同研究を展開し、リポクオリティ領域研究の進展に大きく貢献した。また、他の研究支援センターについてもそれぞれ整備を行ない、公募班員を含めたリポクオリティ領域研究を支援する運用を行った。(3)リポクオリティ・データベースの企画会議を月一回開催し、公開内容の検討、および海外の研究拠点や外部データベースとの連携方法について議論した。(4)第6回総括班会議を開催し、領域の運営方針について議論を重ねた。(5)「実験医学増刊:脂質クオリティ-生命機能と健康を支える脂質の多様性-」を羊土社から出版いただき、国内向けの総説集としてリポクオリティ領域研究の周知を図った。また、第60回日本脂質生化学会(東京)、9月に第91回日本生化学会大会(京都)にて共催シンポジウムを開催し、公知を図った。(6)2018年6月に第4回領域会議(淡路)を開催した。(7)2019年3月に第4回領域ニュースレターを発行した。各研究支援センターの運営状況は以下のように良好である。(1)質量分析センター:引き続きノンターゲット解析(Q-TOF)とターゲット解析(tripleQ)による脂質分析支援を領域内外の研究者に対して行った。また、得られた脂質分子の定量情報をリポクオリティ・データベースに登録する作業を進めた(有田班)主にイノシトールリン脂質測定支援を行った(佐々木班)(2)脂質イメージングセンター:イメージングデータの解析に機械学習による分子分布パターンの分類を行い、脳の白質、灰白質、小脳皮質など特異的な分布を示す脂質群を得る解析法を確立した(瀬藤班)ホスファチジルセリンおよびイノシトールリン脂質可視化解析法による共同研究を進めている(藤本班)(3)膜機能解析センター:筋小胞体膜に膜電位プローブをターゲットさせて膜電位の計測を行い、内膜からの蛍光シグナルをもちいて内膜電位の計測の可能性が見出された。またファゴソーム膜からの膜電位計測を行い、貪食にともなって膜電位が過分極することを見出された(岡村班)新規スフィンゴミエリンプローブの有用性および汎用性を高めるための材料を構築している。また、スフィンゴミエリンプローブ発現誘導型トランスジェニックマウスを作出した(反町班)(4)脂質データベース:45のグリセロ脂質とスフィンゴ脂質クラスに対し、鎖長や不飽和度を自由に設定して理論スペクトルを生成、ダウンロードできる機能を付与した(有田班)(5)臨床検体センター:倫理委員会の承認の下、血清、血漿、リポ蛋白、髄液、尿、ヒト組織検体などの臨床検体を収集し、領域内に提供した(矢冨班)(6)2018年6月17-19日に第4回領域会議を淡路夢舞台国際会議場にて開催した(横溝班)2019年2月に領域ニュースレター第4号を発行し、ホームページ上の業績を更新することにより、研究内容と成果の公知を図った(杉本班)。現時点では本総括班は極めて順調に稼働していると考えられるため、とくに問題点はない。今後も班員のサポートと、活発な班会議や情報発信を継続する。(1)質量分析センター:引き続きリポクオリティ分析支援センターとしての運用を行うと同時に、データベースや脂質スペクトルライブラリの構築を進める(有田班)位置異性体の個別解析法と集約解析法を領域内外の研究者に提供して、引き続きリポクオリティ分析支援センターとしての運用を行う(佐々木班)(2)脂質イメージングセンター:引き続き、組織分解能レベルから細胞分解能レベルでのマスイメージング解析を推進していくと共に、イメージング解析に機械学習を取り入れる事で効率化を推進していく(瀬藤班)進行中のイノシトール4リン酸、ホスファチジン酸の可視化解析法開発を推進するほか、リン脂質の脂肪酸鎖を解析する方法の開発に着手する(藤本班)(3)膜機能解析センター:膜電位プローブの分子の改変をさらに進め、蛍光シグナルの向上とフォトブリーチングの解消、計測希望部位での安定な集積効率を向上させ、多様な実験系での膜電位計測へと拡張させていく(岡村班)引き続き脂質可視化プローブの開発および管理配布体制を整備する(反町班)(4)脂質データベース:リポクオリティの成果を既存のデータベースと連携させ、領域終了後もその成果が継続して利用され続ける工夫をする(有田班)(5)臨床検体センター:引き続き臨床検体の提供を通じた領域内貢献を果たしていく(矢冨班)(6)2019年6月17日に第2回リポクオリティ国際シンポジウム、6月17-21日に国際脂質生物学会議(ICBL)を開催する(横溝班)リポクオリティニュースレターの編集・刊行や領域ホームページ更新を通じて、本領域内外の有機的な連携と国際交流活動を加速させる(杉本班)。

リポクオリティ領域全体の円滑な研究活動を支援するため、総括班として以下の活動を行った。(1)領域事務局を理研IMS内に設置した。(2)本領域のホームページを開設し、領域概要、領域研究者紹介、研究内容紹介、研究成果、脂質研究実験法、脂質データベース、共有リソース、掲示板、などの項目を整備した。また、領域メイリングリストを整備し、班員間の連絡や共同研究に向けてのインフラを整備した。(3)研究支援センターの整備と利用:ノンターゲット解析用のQ-TOF型質量分析機器を理研IMS内に導入し、技術員の雇用とトレーニングを行うとともに、測定系の立ち上げと最適化を行った。また、他の研究支援センターについてもそれぞれ基盤整備を行ない、平成28年度から公募班員を含めたリポクオリティ領域研究を支援する準備体制を整えた。(4)リポクオリティデータベースの企画会議を3回開催し、領域内外の研究者に対して実用性の高いデータベースとして、早期の公開に向けた準備を行った。(5)第1回、第2回総括班会議を開催し、これからの総括班の運営方針について議論を重ねた。(6)2015年9月に一般公開のリポクオリティシンポジウム(三島)を開催した。(7)2016年2月に第1回領域会議(仙台)を開催した。(8)2016年3月に第1回領域ニュースレターを発行した。各研究支援センターの準備状況も以下のように良好であり、当初想定したより早い時点からの研究サポートを行うことができる体制が整った。(1)質量分析センター:新しいQ-TOF型質量分析機器を導入することで脂質ノンターゲット解析システムを確立し、支援センターとしての運用を開始した(有田班)リン脂質測定および技術指導について、既に2件実施した(佐々木班)(2)脂質イメージングセンター:支援センターとして、リゾリン脂質、エイコサノイド、コレステリルエステルなどのマスイメージング解析を行なった(瀬藤班)国際会議で電顕技術の研修を希望する研究者の受入が可能であることを広報し、既にチェコから研修生を受け入れている(藤本班)(3)膜機能解析センター:本格的なセンターの運用に向け、発現系細胞由来の膜断片からの急速還流によるパッチクランプ電流計測について、実践的なマニュアルを整備した(岡村班)PS結合プローブとしてevectin-2 PHドメインに2種類の蛍光タンパク質を融合させたプローブの配布準備が完了した。合わせてこれらの安定発現株の樹立を進め、配布が可能となるよう準備を進めている(反町班)(4)脂質データベース:スプレットシート形式で記録された脂質の生体サンプル、分子クラス情報、定量値を元データとし、これに対してウェブ上のインターフェースから検索をかけて結果をグラフィカルに表示するシステムを構築した(有田班)(5)臨床検体センター:研究倫理申請を進め、これまでに血清,血漿,髄液,眼房水を採取し,リゾリン脂質等の解析を開始した(矢冨班)皮膚炎症性疾患を中心とした種々の皮膚疾患の血清・病理組織を収集中である(本田班)(6)第1回領域会議を開催し(横溝班)、第1回領域ニュースレターを発行した(杉本班)リポクオリティ領域全体の円滑な研究活動を支援するため、総括班として以下の活動を行った。
内耳の受傷性に対する概日リズムの影響

蛍光免疫染色を用いて多点に設定(4時間毎に設定)したCTごとにサーカディアン関連タンパク質の発現を解析し、脳と蝸牛内での発現を確認、modified Sca/eSによる透明化手法においても蛍光輝度と分布が変化しないことを示した。一方、サーカディアンリズムを制御する遺伝子群(Per1,Per2,Cry,Bmal)は核内に存在する転写因子であることから、最適免疫染色の条件を見出すことが極めて困難であることが分かった。根拠として、同一臓器(脳もしくは蝸牛)での固定条件(4%パラホルムアルデヒド)によって蛍光輝度と分布が大きく変化したことが挙げられる。脳、蝸牛組織に関わらず緩い固定条件下では組織内全域で蛍光を確認できたが、強い固定条件下では皆無であった。これらの結果はCTを固定した条件下でも同様であり、同一CTでのサーカディアン関連遺伝子、タンパク質の発現が変わらないことを考えると固定条件のアーチファクトが原因と考えられた。また発現形態は各構成細胞体内に不均一に小胞様であることが明らかとなった。以上の結果から、蝸牛内サーカディアン関連タンパク質の定量解析にはCT条件だけでなく固定条件の検討が必要であり、解析の実現には安定したタンパク質発現かつ高解像度(S/N)での可視化できる条件を検討する必要がある。当初計画ではマウスの聴覚神経系解析のためにBrainbowマウスを輸入する計画であったが、海外からの手続き・検疫に時間がかかり、遅れたため。
無血・血管造影用器具(無血穿刺針・無血ストップコック)の開発

穿刺針の構造:vascular entry needleは逆流止血弁を有しており、内筒針を抜き去った後、血液が穿刺針の近位端から噴出する事なく、止血弁の手前で拍動を保ったまま留まり、動脈拍動の確認が可能な構造である。更に、この逆流防止弁の特徴はガイドワイヤー挿入時にも、挿入されてガイドワイヤーに防止弁がまとわりついて血液の漏出を防止しえる。更に、内筒針の先端には誤穿刺防止用のスリーブが付いている。stopcockの構造:stopcockの基本構造はduck bill valveを内蔵した一方通行弁である。この一方通行弁はきわめて柔らかく、coaxialに挿入された子カテーテルに対しても血液漏れが生じない。なお、必要に応じて、この逆流防止弁を開放するノブスイッチが備えられている。本システムの基本性能を評価した後、In vivoによる評価を行った。結果:基礎実験において臨床応用可能な性能を有していることを確認しえた。臨床応用では血液漏れは極めて僅かであり、bloodless angiographic examinationとなり得た。結語:これらの器具を組み合わせた血管造影検査は血液の漏出がほとんど無く、術者感染の防止に対して有用なものと考えられた。無血穿刺針の開発:外套針の本体の血液の逆流が容易に観察可能な透明プラスチック製で、その近位端には血液の逆流防止弁と特殊な膜を張り付けた小孔が備え付けられている。このため、動脈に穿刺後、動脈血の噴出を見ることなくガイドワイヤーの挿入が可能となる。また、その際に危惧されるガイドワイヤーの挿入抵抗はきわめて少なくなる羊肉布がなされている。金属製の内筒針は外套針より抜き去った後、自動的にその先端がスリーブによってカバーされ、抜き去った内筒針の先端での誤穿刺が防止可能となっている。無血ストップコックの開発:ダックビルバルブとこれを任意に開放させるスライドノブが付いたもので、従来は薬液の注入後に活栓を閉じる操作が必要であったが、新しく開発された試作品では薬液の注入後に活栓を閉じる操作が不要であるばかりでなく、ガイドワイヤーや子カテーテルの挿入時にも血液漏れを起こさない工夫がなされている。更に、ガイドワイヤーの挿入はダックビルバルブを開放することなく、2方向から抵抗無く行える工夫がなされている。これら2つの試作品に対して、現在、基礎実験データの収集を行っており、今後、基礎動物実験ならびに臨床応用に向けて現在準備中である。1。無血・血管造影に必要な新たな動脈穿刺針と新たなストップコック/カテーテルハブをそれぞれ開発し、その基礎的な性能を評価するとともに、この両者を組み合わせて用いた血管造影検査を施行し、その臨床的有用性を検討し得た。2。穿刺針の構造概略と機能動脈穿刺針は逆流止血弁をその内部に有しており、内筒針を抜き去った後、血管が穿刺針の近位端から噴出する事なく、かつ、止血弁の手前で動脈拍動の確認が可能な構造となっている。この止血弁はガイドワイヤー挿入時にも、その隙間からの血液漏れを防止する。更に、抜き去られた内筒針の先端は自動的に誤穿刺防止用のスリーブに覆われるため、きわめて安全性の高い構造とした。3。ストップコックの構造概略と機能ストップコック/カテーテルハブはダックビルバルブを内蔵した一方通行弁を有している。このため、血液の逆流を起こす事なくガイドワイヤーや子カテーテルをストップコックの近位端から挿入する事が可能である。また、弁の開放と閉鎖はノブにて調節可能な構造となっている。4。これらの器具を組み合わせた無血血管造影検査は血液の漏出がほとんど無く、術者感染の防止上から有用なものと考えられた。
微小環境の変化によるHIV潜伏化機構の解明

リンパ組織を取り巻く様々な微小環境の変化がHIV潜伏化に関与すると推測されるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。また、潜伏細胞を体内から除去するためのいわゆるshock and kill療法における効率的なウイルス再活性化剤(latency-reversing agents; LRA)開発も近年重要視されている。本研究課題ではレポーター遺伝子を有するEnv欠損型HIV分子クローンを恒常的に発現する各種細胞株を構築し、ウイルスゲノムの潜伏化に関わる微小環境やウイルス再活性化能を有する新規LRAの開発を行ってきた。まず、これらの感染モデル細胞を様々な環境下で培養したところ、低酸素環境においてウイルスゲノムの転写を示すレポーター遺伝子活性の減少が見られ、HIV潜伏化の可能性が示唆された。エピジェネティック解析により、低酸素下ではHIVプロモーター領域のRNA PolII結合が低下し、且つヒストンメチル化が促進していたことから、低酸素シグナル惹起性のウイルス潜伏化が起こることが分かった。次に、ウイルスゲノムを効率的に活性化するLRAを探索するため、感染モデル細胞に作用点既知の低分子化合物およそ1,200種をそれぞれ添加し、レポーター遺伝子活性を指標としてHIV遺伝子発現に及ぼす影響について調べた。その結果、中枢神経系受容体に作用する化合物AがHIV遺伝子発現を有意に高めることが分かった。化合物Aはshockandkill療法で用いられるVorinostatと併用することで顕著なウイルスゲノム活性化能を有した。この活性は、通常Vorinostatの奏効率が低いとされるT細胞以外の潜伏感染細胞にも有用であった。総じて本研究では独自のレポーター細胞を駆使することで、HIV潜伏化および再活性化に関わる微小環境や化合物を効率的に見い出すことができた。HIV潜伏感染の成立には、リンパ組織を取り巻く様々な微小環境の変化が関わると推測されるが、その詳細な機構は依然不明である。本研究では、HIV潜伏・再活性化を容易に観察可能なモデル細胞を作成し、ウイルス潜伏・再活性化に関わる分子機序解明を行うことを目的とする。平成28年度は、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子をコードしたウイルスゲノムを安定発現したT細胞株および単球/マクロファージ株を多数樹立した。定常状態においても検出可能なルシフェラーゼ活性を示したクローンを複数選出し、ウイルスゲノムの転写活性化を観察するためのモデル細胞とした。これらのモデル細胞は平均12コピーのウイルスゲノムが挿入されており、SAHAやTNF-αなどの転写活性化剤の投与によってHIV産生が顕著に促進された。まず本モデル細胞を用いて、作用点既知の低分子化合物約1千種からHIV転写を促進もしくは抑制するものを探索した。その結果、既知の化合物を含む多くの化合物がT細胞および単球/マクロファージの両方でHIV遺伝子発現を上昇させることが分かったが、いくつかの化合物は単球/マクロファージのみでHIV遺伝子発現を促進させた。細胞種特有のHIV再活性化機構の存在が考えられ、現在その詳細な作用機序について解析中である。一方、本モデル細胞をさまざまな外的刺激に曝してHIV転写活性の増減を調べたところ、培養環境中の酸素濃度の低下に伴いHIV遺伝子発現の低下が観察された。この細胞を通常酸素濃度に戻すと再びHIV遺伝子発現が増加した。細胞の生存率には影響がなかった。これらの結果から酸素濃度依存的かつ可逆的なHIV潜伏・再活性化機構の存在が示唆され、現在その詳細な作用機序について解析中である。当初の計画通り、HIV潜伏・再活性化をモニター可能なモデル細胞を複数樹立し、それらの性状解析を終えた。また本モデル細胞を用いて、細胞種特有のHIV再活性化機構の存在、および酸素濃度依存的かつ可逆的なHIV潜伏・再活性化機構の存在をそれぞれ見いだした。研究計画はおおむね順調に進展していると考えられる。リンパ組織を取り巻く様々な微小環境の変化がHIV潜伏化・再活性化に関与すると推測されるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。本研究では前年度に樹立したHIV感染細胞株U2/U9(レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するHIVゲノムを恒常的に発現する単球由来細胞クローン)を用いた解析を行った。U2/U9細胞をさまざまな培養環境下で培養したところ、培養環境中の酸素濃度とウイルス遺伝子発現とに可逆的な相関性を見いだした。これらの細胞におけるウイルスプロモーター領域のエピジェネティクス解析により、低酸素培養下ではHIV潜伏化を示唆する特徴的なヒストン修飾が多数検出された。これらの結果から、低酸素環境はHIV潜伏化を促進させる可能性が示唆された。次に、HIV潜伏化に伴って発現上昇する宿主遺伝子の網羅的解析を行ったところ、約6,000遺伝子が抽出された。このうち、HIV潜伏化に関与する可能性のある因子群をバイオインフォマティクスで抽出した。これらの因子が潜伏化に関与する機構については現在解析中である。また、HIV潜伏・再活性化の作用機序解析および新規LRA(latency-reversing agents)開発のために、ケミカルバイオロジーを用いてHIV遺伝子発現を正もしくは負に制御する低分子化合物を探索したところ、中枢神経系受容体に作用する化合物のいくつかがU2/U9細胞におけるHIV遺伝子発現を顕著に高めることが分かった。現在その詳細な作用機序および新規LRAとしての有用性について解析中である。当初の計画通り、本年度までに独自のアッセイ系を用いてHIV潜伏化・再活性化に関わるシグナル経路や宿主因子候補をそれぞれ見いだした。また、従来と薬剤標的が異なると考えられる新規LRA候補を見いだした。研究計画はおおむね順調に推移していると考えられる。

リンパ組織を取り巻く様々な微小環境の変化がHIV潜伏化に関与すると推測されるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。また、潜伏細胞を体内から除去するためのいわゆるshock and kill療法における効率的なウイルス再活性化剤(latency-reversing agents; LRA)開発も近年重要視されている。本研究課題ではレポーター遺伝子を有するEnv欠損型HIV分子クローンを恒常的に発現する各種細胞株を構築し、ウイルスゲノムの潜伏化に関わる微小環境やウイルス再活性化能を有する新規LRAの開発を行ってきた。まず、これらの感染モデル細胞を様々な環境下で培養したところ、低酸素環境においてウイルスゲノムの転写を示すレポーター遺伝子活性の減少が見られ、HIV潜伏化の可能性が示唆された。エピジェネティック解析により、低酸素下ではHIVプロモーター領域のRNA PolII結合が低下し、且つヒストンメチル化が促進していたことから、低酸素シグナル惹起性のウイルス潜伏化が起こることが分かった。次に、ウイルスゲノムを効率的に活性化するLRAを探索するため、感染モデル細胞に作用点既知の低分子化合物およそ1,200種をそれぞれ添加し、レポーター遺伝子活性を指標としてHIV遺伝子発現に及ぼす影響について調べた。その結果、中枢神経系受容体に作用する化合物AがHIV遺伝子発現を有意に高めることが分かった。化合物Aはshockandkill療法で用いられるVorinostatと併用することで顕著なウイルスゲノム活性化能を有した。この活性は、通常Vorinostatの奏効率が低いとされるT細胞以外の潜伏感染細胞にも有用であった。総じて本研究では独自のレポーター細胞を駆使することで、HIV潜伏化および再活性化に関わる微小環境や化合物を効率的に見い出すことができた。前年度までに見いだしたHIV潜伏・再活性化機構のより詳細な分子機序解析を進める。とくに単球/マクロファージのみでHIV遺伝子発現を促進させた化合物については、薬剤作用点に対するさまざまな阻害剤を用いてパスウェイ解析を行い、新規latency-reversing agent(LRA)としての有用性について検討する。酸素濃度依存的な機構については、さまざまな酸素濃度下で培養したモデル細胞のトランスクリプトーム解析、エピジェネティクス解析などを行い、責任因子の同定を行う予定である。低酸素シグナル経路が惹起するHIV潜伏化、および中枢神経系シグナル経路が惹起するHIV再活性化にそれぞれ関わる責任因子を同定し、その分子機構について解明する。実際の感染細胞を用いた検証を行う。また、現在までに見いだした新規LRA候補の有用性について検討する。
ナノ粒子型MRI造影剤におけるプロトン緩和機構の解明と深化

申請者らが開発した生体適合性ナノ粒子型Gd-MRI造影剤について、その性能の深化を目指し、種々の粒径・表面修飾および組成におけるプロトン緩和機構をNMRおよびMRIを用いて詳細に解析する。得られた知見とこれまでの報告を比較することで、ナノ粒子型Gd-MRI造影剤のプロトン緩和能について、高性能化への新たな指針を見出すとともに、動物実験によってその効果を検証する。最終的には、細胞単位でのMRI検出を可能にする新規造影剤を創製し、細胞の動きや病態メカニズム解明へ向けたツールとしての利用を目指す。
不完全知識を操作し高次知能機能を実現する知識ベ-スに関する研究

演繹的推論機能を越える高次人工知能機能を導入することによって、現在の知識ベ-ス・システムの能力の幅を拡大するため、不完全な知識の操作を基底技術と考える観点から研究、開発を行った。具体的には、不完全な知識を仮説として扱う論理に基づく仮説推論システムを出発点に設定して研究を遂行した。仮説推論はその理論的な基盤性と、診断や設計といった問題に適用できるといった実用性の両面で今後の知識処理の有力な枠組みであるが、不完全な知識に起因して非単調推論が必要となり、低い推論速度の克服が最大の課題である。そこで、仮説推論の高速化を重点課題にして研究を行い、次の成果を得た。第1は推論パスネットワ-クによる高速仮説推論法であり、仮説間の矛盾によって生じるバックトラックを回避することにより大幅な速度向上を達成している。また変数を含む述語論理表現の仮説推論に適用できる同様な高速推論法も開発した。仮説推論を始めとする非単調推論の計算複雑度はNPー完全であり、最悪値で指数オ-ダとなる推論時間の壁は、通常の採索による求解の範囲に留まっていたのでは克服できない。本研究ではこの指数オ-ダの壁を克服する手法として、類推による高速仮説推論法、経験に基づく学習による仮説推論の高速化法、発想的知識生成のための論理知識ベ-スのコンパイル法、0ー1整数計画法の利用による高速最適解計算の仮説推論法を考案し、具体化した。類推は過去の類似する求解の成功例を利用する。経験に基づく学習は、推論の経験を知識として定着させ以後の推論の高速化に活用する。知識ベ-ス・コンパイルの基本的考え方は、通常の推論はゴ-ルが与えられてから開始されるのに対し、ゴ-ルが与えられる以前に可能な推論は行ってしまうものであり、ここでは論理知識表現のPrime Implicateへの高速変換法を与えている。整数計画法の利用では近似解法の有効性を明らかにしている。知識ベ-スの能力を拡大するためには、今後、類推、学習、発想といった高次人工知能機能を解明して、広く利用できるようにすることが大きな課題である。そのような知識ベ-スの実現へ向けてのアプロ-チとして、「不完全な知識を含む知識ベ-スとこれを操作する高速高次推論」が重要な視点であるとし、「論理に基づく仮説推論システム」を具体的な枠組みに設定して研究を推進した。仮説推論は診断や設計問題に直接的に適用できるという実用性も備えた重要な枠組みなのであるが、非単調推論となるため、推論速度が十分でないことが最も大きな問題点である。そこで、仮説推論の高速化メカニズムを最重点課題として研究を進め、次のような幾つかの有用な手法を考案、開発した。1)推論パスネットワ-クによる高速仮説推論法(仮説の矛盾によって生ずるバックトラックを回避する推論法により、Prologに基づくシステムと比較すると、1000倍以上の高速化を達成する。)2)類推の利用による高速仮説推論法(過去の推論で成功した類似事例を利用することにより高速化を図り、平均値として可能仮説数に対して指数オ-ダ以下の推論時間を達成できることを示した。)3)発想的仮説生成の効率化のための知識ベ-ス・コンパイル法(問題が与えられる前に推論できる部分は行って知識を変形してしまうコンパイル法の研究を行い、命題論理節集合を高速にPrime Implicant節にコンパイルする手法を開発した。)4)重み付け制約の制御による仮説推論システムとその回路ブロック設計への応用(仮説推論が設計問題にも有効であることを具体的に示した。

軽いヒュ-リスティックとして制約知識に重みを付け、これによって推論動作を制御する実用的な高速仮説推論機構を開発することによって実現した。)演繹的推論機能を越える高次人工知能機能を導入することによって、現在の知識ベ-ス・システムの能力の幅を拡大するため、不完全な知識の操作を基底技術と考える観点から研究、開発を行った。具体的には、不完全な知識を仮説として扱う論理に基づく仮説推論システムを出発点に設定して研究を遂行した。仮説推論はその理論的な基盤性と、診断や設計といった問題に適用できるといった実用性の両面で今後の知識処理の有力な枠組みであるが、不完全な知識に起因して非単調推論が必要となり、低い推論速度の克服が最大の課題である。そこで、仮説推論の高速化を重点課題にして研究を行い、次に成果を得た。第1は推論パスネットワ-クによる高速仮説推論法であり、仮説間の矛盾によって生じるバックトラックを回避することにより大幅な速度向上を達成している。また変数を含む述語論理表現の仮説推論に適用できる同様な高速推論法も開発した。仮説推論を始めようとする非単調推論の計算複雑度はNPー完全であり、最悪値で指数オ-ダとなる推論時間の壁は、通常の探索による求解の範囲に留まっていたのでは克服できない。本研究ではこの指数オ-ダの壁を克服する手法として、類推による高速仮説推論法、経験に基づく学習による仮説推論の高速化法、発想的知識生成のための論理知識ベ-スのコンピイル法、0ー1整数計画法の利用による高速最適解計算の仮条推論法を考察し、具体化した。類推は過去の類似する求解の成功例を利用する。経験に基づく学習は、推論の経験を知識として定着させ以後の推論の高速化に活用する。知識ベ-ス・コンパイルの基本的考え方は、通常の推論はゴ-ルが与えられてから開始されるのに対し、ゴ-ルが与えられる以前に可能な推論は行ってしまうものであり、ここでは論理知識表現のPrime Implicateへの高速変換法を与えている。整数計画法の利用では近似解法の有効性を明らかにしている。
口唇口蓋裂患者における哺乳時咀嚼筋活動パターンの経時的変化に関する研究

口唇口蓋裂患者は出生直後より,健常乳児と異なる哺乳様式を取らざるを得ないが,乳児期の哺乳様式の差異がその後の咀嚼器官の発達に影響を及ぼすことが基礎研究や健常児では明らかになってきている。一方,口唇口蓋裂児ではその影響について今だ検討されていない。今回我々は,当科受診し保護者の了承の得られた口唇口蓋裂児に対して、当科所有のポリグラフシステムRM-6000を用いて,今後の研究のデータ収集のための予備実験をおこなった。実験方法は,当科受診した口唇口蓋裂児に対し,当科で使用している口蓋裂用乳首を用いて哺乳指導を行ったあと,一週間後に再診させ、保護者に実験の内容について説明し了承を得た上で,保護者に抱負された状態での哺乳時の筋電図を採取した。筋電図を採取する部位は,咬筋,側頭筋,顎舌骨筋群とした。貼付部位は初回計測時に触診にて決定し,後日同部位で計測可能なように耳珠,外眼角,口角等の基準店を設定し,各点からの距離を計測した。筋電図採取のための電極は皿電極,日本光電社製ビトロード(P-150,A-150)の3種類を用い比較した。なお,筋電図採取前には患児の皮膚を皮膚前処理用スキンピュアにて清拭し日本光電社製ホルターバンにて固定した。筋電図の基線が安定した後,前回受診時に指導した乳首を用いて自由に哺乳を行わせた。各電極とも開始直後は良好な記録が得られたが,皿電極は時間の経過とともに顎舌骨筋群測定部位の接触が不良となり,安定した記録が得られなかった。一方ビトロード2種については概ね安定した記録が得られた。同患児について日を改めて再度記録を行ったが,初回と同じ結果であった。今後はビトロードを用いて咀嚼筋筋電図を採取し,あわせてHotz床装着時の口唇圧を測定する方法を確立していく予定である。
単純ヘルペスウイルスと宿主細胞間の分子攻防の網羅的解析

本研究は、質量解析計を駆使し、単純ヘルペスウイルス(HSV)がコードするウイルス因子と宿主因子の相互作用に基づく、ウイルス病態発現機構および宿主細胞制御機構を解明することを目標とした。我々は、リン酸化ペプチドの特異的濃縮方法を利用したリン酸化プロテオーム解析により、HSV感染細胞における607種類のリン酸化部位を同定した(J. Virol. 88: 655-666. [2014])。本解析で同定されたウイルス因子vdUTPaseSer-187のリン酸化は、マウス病態モデルにおいて、HSVの効率的な中枢神経破壊能に必要である一方、抹消組織における病態発現能(ヘルペス性角膜炎等)には影響が認められなかった(J. Virol. 88: 2775-2785. [2014])。本表現系の分子機構を探索した結果、Ser-187のリン酸化は、vdUTPaseの酵素活性を促進することで、宿主細胞がコードするdUTPaseの酵素活性が低い環境下(Ex.脳)においても、十分なdUTPase活性を供給し、HSVゲノムの変異率を低下させ、HSVの中枢神経破壊能を高めることが明らかとなった(J. Virol. 88: 7776-7785. [2014], J Virol. 89:241-8. [2015],下図参照)。本知見は、HSVの遺伝子治療用ベクター開発や腫瘍溶解治療法等の医学応用上、重要な基礎的知見となりうると考えられる。次に、定量的リン酸化プロテオーム解析により、HSVがコードするウイルス特異的なプロテインキナーゼであるUs3が司る宿主細胞因子のリン酸化部位を包括的に探索した。一連の解析から、我々はUs3がEndosomal sorting protein SNX3 Ser-72のリン酸化を介して、逆行性小胞輸送経路を活性化することで、ウイルス因子のLysosomal Degradationを阻害し、効率的な子孫ウイルスの産生を促進することを明らかにしつつある。我々は、本研究で解明された包括的なリン酸化情報を基盤し、今後も精力的にHSV研究を展開する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、高感度質量解析計を駆使し、単純ヘルペスウイルス(HSV)感染細胞におけるウイルス因子と宿主因子の相互作用がもたらす宿主細胞制御機構およびウイルス病態発現機構を解明することを目標としている。今期は、(i)インターラクトーム解析により明らかとなったウイルス因子ICP22と宿主転写因子p53の相互作用のHSV増殖における役割の解明および(ii)定量的リン酸化プロテオーム解析によるウイルスPKの宿主細胞基質の網羅的探索を試みた。(i)の解析の結果、p53はHSV-1の最初期必須遺伝子の一つであるICP27の効率的な発現に必要であるという正の影響に加え、他の病態発現関連ウイルス遺伝子であるICP0の不安定化という負の影響を併せ持ち、本研究において、p53の相互作用因子であることが明らかとされたICP22が後者の負の作用のみを中和することで、HSV-1はp53の正の影響のみを享受していることが示唆された。本結果は、国際学術誌であるJ Virol. 87:9323-32(2013)に掲載された。(ii)の解析の結果、Sorting Nexin 3(SNX3)が、HSV-1ウイルスPKの標的基質であることが明らかとなった。また、SNX3発現抑制細胞を用いた解析より、SNX3は、HSV-1ウイルスPK活性依存的に、HSV-1の増殖を司ることも明らかとなった。本結果は、第38回国際ヘルペスウイルスワークショップサテライトミーティングおよび第61回日本ウイルス学会学術集会にて、口頭発表演題に採択された。次に、定量的リン酸化プロテオーム解析により、HSVがコードするウイルス

特異的なプロテインキナーゼであるUs3が司る宿主細胞因子のリン酸化部位を包括的に探索した。一連の解析から、我々はUs3がEndosomal sorting protein SNX3 Ser-72のリン酸化を介して、逆行性小胞輸送経路を活性化することで、ウイルス因子のLysosomal Degradationを阻害し、効率的な子孫ウイルスの産生を促進することを明らかにしつつある。我々は、本研究で解明された包括的なリン酸化情報を基盤し、今後も精力的にHSV研究を展開する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要に記載した通り、本研究は一定の成果(学術論文、学会発表等)を得ていること、高感度質量解析計を駆使したウイルス因子と宿主因子の相互作用に関する網羅的なスクリーニングも順次、進展していることから、おおむね順調に進展していると考えられる。インタラクトーム解析では、従来は可溶化試薬の悪影響により解析が困難であったウイルスタンパク質に関しても、Filter Aided Sample Prep (FASP)法を導入することで、むしろより高感度な解析が可能となった点など当初の計画以上に進展した点もあった。一方、リン酸化プロテオーム解析では、SNX3以外の有力な宿主細胞基質の候補分子の同定には至っておらず、さらなる解析が必要である。東京大学医科学研究所感染・免疫部門ウイルス病態制御分野(川口研究室)ホームページ(今後の研究の推進方策)インターラクトーム解析に関しては、申請時の計画通り、以下の(i)(iv)を推進する。(i)ウイルス増殖に重要なウイルス因子より順次、ウイルス因子と宿主因子の複合体を精製し、高感度質量分析計により相互作用因子を包括的に同定する。(ii) (i)により得られた知見を、データベース化する。(iii)Pull down法により、宿主因子とウイルス因子の相互作用に、必要な最小アミノ酸を同定する。(iv) (iii)で同定したアミノ酸特異的組換えウイルスをBACシステムにより作製し、マウス病態モデルに供し、病態発現への関与を解析する。定量的リン酸化プロテオームに関しては、ウイルスPKが司る宿主細胞改変機構の内、主要なものの一つと考えられるSNX3を介した細胞内輸送の攪乱に関して、より詳細な解析を試みる。
超レパートリーを有するヒト型一本鎖抗体ライブラリを用いた抗ペプチド抗体の整列化

本研究の目的は、すでに所属研究室で独自に作製したヒト型一本鎖抗体ライブラリを用い、多数の抗原ペプチドに対するアフィニティーの高い抗体を単離し整列化する方法論を確立することである。具体的には、ビーズ上に8,000種のペプチドが結合した抗原ペプチドライブラリを作製し、我々が独自に作製した10^<11>以上という膨大なレパートリーを有する抗体ライブラリを用いてスクリーニングを行っている。最終的にはファージ抗体と抗原ペプチドの配列を対応させたデータベース化を目指している。これにより、抗原のスクリーニングが容易になるだけなく、各種特異抗体のスクリーニングも不要になる可能性もあると考えている。今年度は、多数の抗原に対する抗体ファージを網羅的に短期間でスクリーニングするシステムの改良を行った。培養温度や発現誘導条件、菌株、ブロッキング剤などのスクリーニング諸条件を検討し、効率的なスクリーニング法を確立した。またビーズ上のペプチドに結合するファージ抗体を単離し、それぞれの抗体遺伝子配列を確認するとともに、ファージ抗体を整列化するための条件検討を行っている。この結果、一本鎖抗体の精製をハイスループットで行うために、精製用タグの改良が必要であると判断した。現在、新しい抗体ライブラリの作製を計画中である。我々の抗体ライブラリは短期間(23週間)で作製できるため、ライブラリの改良が容易であるという点で非常に有利である。今後、このシステムを発展させ、整列化抗体による網羅的解析を行うためのシステムを構築する予定である。これまでに抗体の整列化に関する報告はほとんどないことから、本研究の成果は疾患の診断や治療に役立つ抗体を迅速かつ大量に得られる有用な手段となるであろう。また、機能ゲノム解析の一環としてのタンパク質大規模研究(プロテオミクス)にも大いに貢献できるものと期待される。