hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造血幹細胞移殖後の肝中心静脈閉塞症(VOD)早期診断法の確立

これらの症例は、全身状態が不良で、皮下脂肪の厚い観察不良例であった。(6)HLA不一致の移植例に逆流の頻度が高かった。(考案)(1)門脈23次分枝の逆流所見はVODの初期の所見と考えられた。(2)逆流頻度は、HLA不一致の移植例で高かった。(3)High risk症例(再移植例、非寛解例)は門脈23次分枝の逆流所見があればVODに進展しやすいため、早期に抗血栓療法を開始すべきと考えられた。(4)体位変換(左側臥位)や深呼吸にて検出感度が上がった。(5)携帯用腹部Color DopplerUSは無菌室に安全にbedsideまで持ち運びできる有用な検査であった。(6)門脈23次分枝の逆流検出はVODの早期診断に必須であると考えられた。
細胞模倣膜2次元・3次元ダイナミクスの解析、設計と制御

細胞の信号伝達に関して、膜受容体やチャネルのみならず、膜のダイナミックな構造変化が重要であると指摘されている。我々は、膜ダイナミクスを、2次元ダイナミクス(相分離状態の変化)と3次元ダイナミクス(小胞形成を含む形態変化)に分類して研究を行っている。ここでは、DNAと膜の相互作用、そしてアミロイドと膜の相互作用について述べる。DNAはほどけたcoil状態と凝縮したglobule状態では、相分離構造との相互作用部位が異なる事を明らかにした。アミロイドβについては、酸化コレステロールの1種である、7-ケトコレステロールが、膜結合性に関わっている事をモデル膜で明らかにし、生細胞でもその結果を確認した。細胞膜は,様々な種類の脂質分子を含む二分子膜構造によって構成され,膜面には飽和脂質とコレステロールの多い領域(相分離ドメイン,ラフトドメイン)が存在するとされている.ラフトの性質や形成メカニズムに関する研究は中性脂質を中心に行われてきた.しかし,一般的に生体膜は多くの負に帯電したリン脂質を含んでおり,その静電的な効果が相分離に及ぼす影響は明らかになっていない.本研究では,不飽和脂質,飽和脂質,コレステロールの3成分[負荷電不飽和脂質(DOPG)/中性飽和脂質(DPPC)/コレステロール(Chol),中性不飽和脂質(DOPC)負荷電飽和脂質(DPPG)/Chol,DOPG/DPPG/Chol]を混合し,静置水和法を用いてサンプルを作成した.膜表面電荷を負荷電脂質の混合比で調節し,膜構造(膜表面の相分離ドメイン)を共焦点レーザー顕微鏡により観察した.このコレステロールの局在のし易さをLaurdanによる流動性測定,FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)による拡散係数測定により考察した【細胞系】細胞膜には、飽和脂質やコレステロールを豊富に含むラフト領域が存在し、信号伝達に重要であると考えられている。T細胞を活性化するレクチン(ConA)存在下では、ラフトが膜上で集積後、細胞骨格を介して内部へ集積することから、T細胞活性化には、ラフトと細胞骨格が重要と考えた。冷感剤メントールは、温度変化なしで冷感を引き起こす。そこでT細胞を例にラフト集積機構の温度依存性とメントールの影響について調べた。ラフトの細胞内部への集積が観察は、27°C以下ではラフトのみが集積し、27°C以上ではアクチンとラフトが細胞内部の同じ場所に集積した。メントール存在下では、27°C以上でラフトが集積し、アクチンとラフトは共存していた。低温(<27°C)でのラフトのみの安定性に依存した集積と、高温(≧27°C)でのアクチンも関与した集積の2種類があると考えられた。メントール存在下では、アクチンがラフトの安定性により低温でも関与いると考えられた。【人工細胞系】上述した細胞膜のダイナミクスに関して、2次元的(相分離構造)、3次元的(形態変化)ダイナミクスに分類して、研究を進めている。特にこれまでの人工細胞系では、2重膜の内外層の組成が同じ、対象膜を用いていたが、組成の異なる非対象膜を用いて、特に相分離構造の安定性について、検討を行った。対称組成リポソームと比べると相分離が起きにくいことから、外膜と内膜の相互作用が相分離形成を促していると考えられる結果が得られた。さらに脂質組成が非対称なリポソームの観察では、外膜が不飽和脂質よりも飽和脂質のときの方が,相分離がよく観察されることがわかった。内膜に形成される飽和脂質に富んだ領域が外膜に同じ飽和脂質が存在するときに安定化されること(chain interdigitation)を示している.細胞系、人工細胞系の双方について、着実に目標が達成できている。両者のデータを総合する事により、分子レベルでの相互作用に関する理解が深まりつつある。現在、電場を加えたエマルジョンやリポソームの移動、融合現象に関して、予備的な実験系の構築が進みつつある。これらの状況を勘案して、おおむね順調に進展していると判断した。【背景】細胞膜においてコレステロールと飽和脂質に富んだ相分離ドメインが形成され、脂質ラフトとして信号伝達に重要であると考えられている。実際の細胞膜では、負電荷脂質も多く含まれており、カチオンとの相互作用が、相分離に重要である可能性が高い。我々は、人工細胞膜を用いて、荷電脂質膜に金属イオンやポリアミンを加えた場合の相分離挙動を観察した。【方法】負電荷不飽和脂質(DOPG)と中性飽和脂質(DPPC)を混合し細胞サイズリポソームを作成した。このリポソームに、1価(NaCl)、2価(MgCl2)の金属イオン及び3価(Spermidine)、4価(Spermine)のポリアミンを加えた際の相分離構造の変化を、蛍光顕微鏡で観察した。【結果・考察】脂質が共に中性であるDOPC/DPPCの系と比較して、負の電荷を持つ不飽和脂質を含むDOPG/DPPCの系は、脂質頭部基の電荷による反発で相分離が起こりにくいことが分かった。室温で相分離しないDOPG/DPPCの系にカチオンを添加することによって、相分離が引き起こされた。また、多価のカチオンであるMgCl2やポリアミンを添加した際には、1価のNaClに比べて1万分の1以下の非常に低い濃度でも相分離を引き起こすことが観察された。価数が大きいほど低いカチオン濃度で相分離が誘起されるが、価数の増加と濃度の間に比例のような単純な関係は見られなかった。

このことから、価数だけではなく、カチオンの電荷密度や水との親和性が、相挙動の決定に大きく影響していると考えられた。細胞の信号伝達に関して、膜受容体やチャネルのみならず、膜のダイナミックな構造変化が重要であると指摘されている。我々は、膜ダイナミクスを、2次元ダイナミクス(相分離状態の変化)と3次元ダイナミクス(小胞形成を含む形態変化)に分類して研究を行っている。ここでは、DNAと膜の相互作用、そしてアミロイドと膜の相互作用について述べる。DNAはほどけたcoil状態と凝縮したglobule状態では、相分離構造との相互作用部位が異なる事を明らかにした。アミロイドβについては、酸化コレステロールの1種である、7-ケトコレステロールが、膜結合性に関わっている事をモデル膜で明らかにし、生細胞でもその結果を確認した。荷電脂質に関する相分離構造の情報は、きわめて限られており、新しい知見が得られている。海外の一流雑誌にも論文が掲載され、学会発表等も積極的に行っており、予定通りに進んでいると言ってよいと判断した。細胞の信号伝達に目を向けると、神経細胞におけるシナプス小胞に代表されるような、小胞輸送を基盤としたミクロ空間外への物質輸送が、情報伝達において重要な役割を担っていることが理解できる。アミロイドペプチド等の小胞輸送メカニズムを解析し、神経細胞毒性の発現機構を理解すると同時に、小胞形成に必要な脂質組成について、考察を実行細胞系からの結果を参考に行う。また、「ラフト仮説」は、極めて魅力的であり、多くの膜受容体やイオンチャネルが、ラフトを介して信号伝達を行っているという研究例が報告されている。人工細胞系の相分離構造を調べると、5種類(Spinodal(縞状), Rough(歪形), Smooth(円形), Reverse(反転), No domain(一様))の相分離構造に大別できる。しかし、細胞生理学的には「ラフト」は1種類のみが想定されている。この細胞系と人工細胞系における、相分離構造に関する理解のギャップを埋めるべく、生きた細胞の相分離構造について、精査する。28年度が最終年度であるため、記入しない。生物機能工学次の2点について、重点的に研究を行う。(1)細胞の信号伝達に目を向けると、神経細胞におけるシナプス小胞に代表されるような、小胞輸送を基盤としたミクロ空間外への物質輸送が、情報伝達において重要な役割を担っていることが理解できる。我々は既に、空間内部に向けての小胞形成について報告している(J.Phys.Chem.B 2007)。膜脂質の電荷やタンパク質との相互作用によって、小胞形成の方向を空間外へと操れる可能性についても検討を続行し、アミロイドペプチド等の小胞輸送メカニズムを解析している。そこで、空間相互の情報交換を小胞輸送を介して可能とするような、「ミクロ空間・情伝達システム」の基盤技術を開発する。(2)蛍光観察や原子間力顕微鏡(AFM)、さらにはその組み合わせにより、モデル膜系の研究から提案された生細胞膜における相分離構造について検証する。既に予備的な実験は行っている。
虚血性脳障害におけるシグナル伝達セラピーの創薬科学研究

本研究では新規脳保護薬として開発きれだカルモデュリン阻害剤、DY-9760eの虚血に伴う脳浮腫の抑制効果とそのメカニズムと脳保護薬として開発中の新規バナジル誘導体の治療有効時間域を明らかにすることを目的とする。虚血、頭部外傷、種々の神経変性疾患に伴う神経細胞死には過剰の細胞内カルシウムの上昇、それに伴う一酸化窒素(NO)の産生とカルシウム依存性プロテアーゼ(カルパイン)の活性化反応が関わっている。DY-9760eは虚血に伴うNO産生とカルパイン/カスパーゼの活性化反応を抑制して神経細胞を保護した。さらに、DY-9760eは虚血に伴う血液脳関門の破綻と脳浮腫を抑制した。脳浮腫は再灌流に伴う血管内皮障害の結果もたらされ、脳虚血亜急性期に見られる最も重篤な症状である。しかし、脳浮腫に有効な薬剤はない。DY-9760eの血管内皮細胞保護作用と脳浮腫抑制作用に焦点を絞って、抗脳浮腫薬として臨床開発へと進める。一方、バナジウムとその誘導体は非選択的なチロシンホスファターゼ阻害剤である。オルトバナジウム酸はインスリン様成長因子(IGF-1)と同様に脳においてPI3キナーゼ/AktとMAPキナーゼを活性化した。その結果、バナジウム酸とIGF-1は砂ネズミの一過性脳虚血とラット中大脳動脈閉塞モデルにおいて強力な脳保護作用を示した。Aktによる脳保護作用には細胞死を誘導するフォークヘッド転写因子(FOXO)、Badおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)の抑制作用が関わっていた。虚血性の細胞障害は脳以外に心臓、腎臓などの組織においても見られる。オルトバナジウム酸の心筋保護効果は虚血再灌流による心筋細胞障害に対しても認められた。この心筋保護作用にもAktの活性化反応が関与していた。砂ネズミ海馬神経細胞における一過性前脳虚血に伴う遅発性神経細胞死にはprotein kinase B (Akt)の不活性化反応が関与している。私達はホスホチロシンホスファターゼ阻害剤であるバナジウム酸ナトリウムが虚血直後に起こるAktの不活性化反応を抑制することによって、神経保護効果を示すことを報告した。本研究ではAktの不活性化反応に伴ってForkhead transcription factorファミリーの一つであるFKHRの脱燐酸化反応がin vivoで起こることを見出した。FKHRはSer-256がAktによりリン酸化されることによって、転写活性が抑制されている。FKHRの脱燐酸化反応によって、核内に移行して、その後標的遺伝子であるFasリガンドが誘導されことを砂ネズミ海馬で確認した。このFasリガンドの誘導は遅発性神経細胞死に関わっていると考えられる。これらのアポトーシスシグナルの活性化反応はバナジウム酸ナトリウムの投与で完全に抑制された。次に新規脳保護薬であるカルモデュリン阻害剤DY-9760eの作用機構について解析した。マイクロダイアリシス法で海馬内一酸化窒素(NO)濃度を虚血再灌流後にリアルタイムで測定したところ、海馬においてNOが持続的に上昇することが解った。DY-9760eの前投与はNO上昇を完全に抑制した。NOと活性酸素種との反応で産生されるパーオキシナイトライトの作用である、蛋白質のニトロチロシン化が虚血後、著しく上昇した。この蛋白質のニトロチロシン化もDY-9760e投与によって完全に抑制された。ニトロチロシン化が神経細胞障害にどのように関わるのか今後さらに追究する。

以上の結果から、新しい作用メカニズムを有する脳保護薬としてバナジウム酸ナトリウムとDY-9760eが有効であることが示唆された。私達は蛋白質チロシンホスファターゼ阻害剤であるバナジウム酸ナトリウムがAkt/protein kinase Bを活性化して虚血性脳障害に対して神経細胞保護作用を示すことを見いだした。しかしこれまでの、研究は虚血前投与での成績であり、臨床においては梗塞発症後投与の有効性が重要である。本研究ではよりヒトの脳梗塞モデルに近い、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用いて、虚血後の末梢投与による神経保護作用を検討した。虚血後、および末梢投与で虚血周囲領域(ペナンブラ)で有意な梗塞サイズ縮小効果を示した。この脳保護作用にもAkt/protein kinase Bの活性化反応が関与していた。さらに、虚血後の血糖値の急激な上昇も抑制することが解った。これらの脳保護作用は梗塞後7日目のみならず、28日目においても同様の縮小効果が確認できた。神経細胞に対して致死的な虚血負荷を与える前に軽度の虚血を行うと神経細胞は虚血耐性を獲得する。私達はPI3キナーゼを介するAktシグナルがこの虚血耐性現象にも関わることをこれまでに明らかにした。本研究ではこれらのシグナルの下流標的蛋白質についてさらに検討した。その結果、この虚血耐性現象にはPI3キナーゼ系を介する内皮由来一酸化窒素合成酵素(eNOS)の誘導が関わっていることを明らかになった。以上の結果は、Aktシグナルを活性化するバナジウム酸ナトリウムが脳梗塞急性期治療薬として有効であることを示唆している。本研究では新規脳保護薬として開発されたDY-9760eの虚血に伴う脳浮腫の抑制効果とそのメカニズム、同様に脳保護薬として開発中の新規バナジル誘導体の治療有効時間域を明らかにすることを目的として、次のような新しい知見を得た.マイクロスフェア脳塞栓モデルラットの脳内で虚血後24-48時間において内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)が誘導されることを見出した。eNOSの発現は脳毛細血管内皮細胞において顕著であり、その発現の増大は障害のマーカーである蛋白質ニトロチロシン化反応の上昇と一致していた。さらに、蛋白質ニトロチロシン化反応の上昇は活性型カスパーゼの発現と一致しており、eNOSの発現によって、脳毛細血管内皮細胞が障害されることを示唆していた。DY-9760e(25mg/kg)の投与はeNOSの発現は抑制しないにも関わらず、血管内皮における蛋白質ニトロチロシン化反応を完全に抑制した。同じ投与量において虚血に伴う脳浮腫を著しく改善したことから、DY-9760eは血管内皮細胞でのNO産生とそれに伴う蛋白質ニトロチロシン化反応抑制することにより、血液脳関門の破綻を抑制して、脳浮腫を改善することが示された。次に、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用いて新規バナジウム化合物(VO(OPT))の治療有効時間域について検討した。虚血・再灌流後30分までの末梢投与で有効であることが確認できた。また、プロテインキナーゼであるAktを活性化することによってアポトーシス実行因子であるFasリガンドの発現を抑制することがVO(OPT)の脳保護作用のメカニズムのひとつであることが確認できた。
In vitro受精法を用いた胚発生第一分裂における極性決定の分子機構

トウモロコシの卵細胞、in vitro受精法で作製した2細胞胚、その胚から単離した頂端細胞および基部細胞からcDNAを合成し、これら4種のcDNAをテンプレートとしてRAPD-PCRを行った。その結果、受精後に新たに発現する遺伝子もしくは発現が抑制される遺伝子が同定され、それらの発現パターンから1)頂端細胞においてのみ発現する遺伝子、2)基部細胞においてのみ発現する遺伝子、3)頂端および基部細胞の双方の細胞で発現する遺伝子、4)頂端細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、5)基部細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、6)恒常的に発現している遺伝子、の6つのグループに分類した。さらに、受精により発現が誘導される遺伝子の発現を受精卵から2細胞胚までの受精卵発達過程で調べたところ、胚発生の第一細胞分裂以前に受精卵細胞中においてそれら遺伝子が既に発現していることが明らかになった。このことから、グループ1または2の遺伝子転写産物が受精卵中の頂端または基部領域に局在していることを示唆された。トウモロコシ卵細胞タンパク質をSDS-または2D-PAGEで展開後、ゲル中の主要タンパク質バンド/スポットをLC-MS/MSにより解析した。その結果、卵細胞主要タンパク質として、3種の解糖系酵素、2種のミトコンドリアタンパク質およびアネキシンp35を同定した。未開花のイネ花より卵細胞と精細胞をおのおの単離する系を確立し、イネin vitro受精系の確立に向けて研究を進めている。また、16個のイネ卵細胞からのcDNA合成に成功した。受精卵や2細胞胚など極微量試料からのRNAを出発材料にしてマイクロアレイ解析を行う予定であるが、このような微量のRNAをアレイ解析用のプローブ作製に用いた際のデータの信頼性を検証する研究も進行させている。受精卵の胚発生第一分裂により細胞質に富んだ小さな頂端細胞(apical cell)と液胞が発達した大きな基部細胞(basal cell)からなる2細胞胚へと発達する。本年度は、受精卵、頂端細胞および基部細胞中で発現が誘導または抑制される遺伝子をRAPD-PCR法により、また、受精卵中で新規合成または分解されるタンパク質をマススペクトル法により同定することを目的として研究を行った。単離した卵細胞、頂端細胞、基部細胞、2細胞胚および多細胞胚からそれぞれのcDNAを合成し、これをテンプレートとしてRAPD-PCRを行った。増幅されたDNAのバンドパターンを5種の細胞・胚の間で比較し、1)受精後に頂端細胞でのみ発現する遺伝子2)基部細胞でのみ発現する遺伝子3)頂端・基部の双方の細胞で発現する遺伝子4)受精後に頂端細胞でのみ発現が抑制されている遺伝子5)基部細胞でのみ発現が抑制されている遺伝子6)恒常的に発現している遺伝子、の6つのカテゴリーに分類した。また、これら増幅DNAの塩基配列決定後、内部プライマーを作製し、PCR法によりその発現パターンを追認した。さらに、受精後に新たに発現する遺伝子の受精後の発現開始時間を調べたところ、それらの発現は受精後0.5時間から12時間の間に始まることが示された。2.マススペクトル法による解析卵細胞75個および180個分のタンパク質をそれぞれSDSおよび2D-PAGEで展開後、主要なタンパク質バンド/スポットについてマススペクトル解析を行い、一次構造を決定した。さらに、卵細胞および受精卵タンパク質をそれぞれ2D-PAGEで展開後、スポットのパターンを比較し、受精後に新たに合成されると考えられるタンパク質(6スポット)および受精後に速やかに分解されると推定されるタンパク質(8スポット)を同定した。
歯周病関連細菌の異種菌体間相互作用に関する研究

Pg409単体でのtrypsin-like enzymcについては、菌体の処理を嫌気で行った方は217U(1U=ΔA_<405>0.001/min)であったのに対して、好気的に処理したものは147Uと32%減少した。一方、Av81と共凝集したPg409の酵素活性は嫌気では184Uであったのに対して好気では108Uと41.2%もの減少を示した。また、これらの測定値は、Pg409は好気においてはAv81と共凝集することにより単独の時より26.6%酵素量が減少し、嫌気においては15.2%の減少幅に留まることも示している。さらに、それぞれの菌の培養液をあらかじめ嫌気状態にしておいたPBSで希釈したものを試料として、嫌気条件下で同様に測定したところ、Pg409単独の酵素活性は224Uであったのに対して、Pg409とAv81とを混合した場合は両細菌の共凝集は起こらず、酵素量は212Uと僅か5%の減少幅に留まった。これらのことから、Pg409のtrypsin-like enzymeの一部はde novoで合成される可能性があること、また、Av81との共凝集によりPg409の酵素量は減少することが示された。
プラットホームスイッチングにおけるインプラント周囲粘膜の分子生物学的解明

歯科インプラントのプラットホーム部分をくびれさせることをプラットホームスイッチングといい、インプラント周囲の経年的な歯槽骨吸収を防ぐ方法として知られているが、生物学的メカニズムはほとんど解っていない。本研究の目的は、歯科インプラントにおけるプラットホームスイッチングの分子生物学的メカニズムを解明することである。我々は直径1mm、長さ4.7mmのプラットホームスイッチングインプラント(PSi)を製作し、ラットの口蓋に埋入して周囲組織を採取した。ノーマルプラットホームインプラント(NPi)において、骨縁に近い部分にインプラントを囲むように横走するコラーゲン線維が観察された。(Psi)においても、この輪走線維はくびれ部分に観察された。これはXavierらの報告した輪走線維に相当するものと思われた。この輪走線維に存在する線維芽細胞周囲にtype XII collagenの強いシグナルが観察された。また、sham群に比べてPSi群でtype XII collagen、TGF-b1、Integrin mRNAの有意な発現上昇が認められた。一方で、骨芽細胞の分化マーカーmRNAに変化は見られなかった。type XII collagenは線維結合型コラーゲンに分類される細胞外基質タンパクで、生体内では腱や靭帯、角膜、歯根膜など、機械的刺激を受容する部位に局在が認められ、コラーゲンネットワークの組織安定性の役割を持つことが示唆されている。PSインプラント周囲において、輪走線維を保持、安定化させるシステムが存在する可能性が示唆された。
流動場における自発的な光学分割に関する研究

本年度はアキラルバナナ型分子における選択的キラリティの発生について主に研究を行った。バナナ型分子はその長軸を層法線方向から傾けることによって系にキラリティを発生させる。すでにNMR測定から分子は非対称にねじれた構造をとっていることが予想されている。このことを確認するために、偏光赤外吸収スペクトルを測定した。その結果分子の主たる双極子の起源である2つのカルボニル基の吸収は分子長軸に対して垂直方向には向いていないことが明らかになった。このことは分子がねじれておりいることを意味する。もともとキラルで、らせん構造を持つ液晶である、コレステリック液晶、キラルスメクチック液晶をホストにし、アキラルバナナ型分子の添加を行い、興味ある現象を発見した。すなわち、アキラル分子の添加にも係わらず、ホスト液晶のらせんピッチは短くなった。このことはアキラル分子がキラルな場において一方のねじれたコンフォメーションをとり、これがホストのらせんのねじれ力を増加させると考えられる。また、キラル末端鎖を持つバナナ型液晶を合成したところ、強誘電的配列をとり、一方、層のキラリティは一層、一層変化するラセミ体であることを見いだした。本研究では結晶と液体の中間相であるスメクティック液晶における自発的光学分割について次の2つの液晶系で研究した。(1)アキラルバナナ型分子における選択的キラリティの発生バナナ型分子はその長軸を層法線方向から傾けることによって系にキラリティを発生させる。このことは分子がねじれており、その一方のねじれ構造のみが実現しており、かつ分子の長軸周りの回転は強く束縛されていることを意味する。このようなバナナ型分子を強誘電性液晶にドープすることにより、反強誘電相が発現することも見いだした。この時のバナナ型分子もホストのキラル場の影響を受け、キラリティを発現させることが分かった。(2)ジアステレオマー型反強誘電性液晶のラセミ体における自発的光学分割ラセミ体液晶が強誘電的スイッチングを示すことからこの液晶系では自発的な光学分割が起こっていることが予想されていた。我々は、この液晶に関して、ホメオトロピック配向セルの偏光顕微鏡観察を行った。観察された縞構造が2種類あることから右旋性、左旋性のドメインの存在が示唆された。これらのドメインに対して、顕微鏡下での円二色性測定を行い、それぞれのドメインから正負の二色性を得た。それにより、右旋性、左旋性のドメインの存在が明らかになった。これは流動性のある系で見いだされた初めての光学分割である。
察するインタフェースに関する研究

人間共存型ロボットにおける「察するインタフェース」の実現に向けて、対人行動や対面動作における「察する」振舞、社会性を持った振舞について以下の成果を得た。まず、ユーザとロボット相互の動きを把握しながら、ロボットがユーザの期待(意図)に合せた対人行動を行う場合として、狭い通路でのすれ違い、障害物がある様な通路での並走と縦走の自律的切替えを可能とした。音情報に基づく出会い頭での衝突防止方法を開発した。また、実演販売や演説などの聴衆の立ち位置を調整するロボット、室内の任意の位置に着席した複数人からの挙手動作認識手法の開発を行った。1.ユーザや周囲環境に関するマルチモーダル情報の処理手法に関して、下記の研究を行った。(1)マイクロホンアレーにより取得した多チャネルの音情報から遅延時間マップを用いて3次元音源位置を推定する手法を考案した。音源の尤度を時間方向で加算処理することで、複数の音源に対応できるようにした。また、割り込み音について、周波数情報と音圧情報、及び画像情報との統合を行い音源種別の識別を可能にした。(2)ロボットと複数の人間とのコミュニケーションを円滑に行えるようにするため、複数人が重なり合って見える環境においても、挙手認識を行い、更に挙手した人物の顔位置を探し、どのユーザが挙手しているかを認識できる手法を開発した。実空間内の点に対するX-Zプロット画像を作成し、また、腕により連結している手と顔のペアを探していく手法により、手前の人物に隠されて顔や腕領域が見えない場合にも、見えている手と腕の領域から顔位置を推定できるようにした。(3)HSV色空間に対するセグメンテーション結果と距離情報を統合することで周囲環境のモデルを動的に生成し、歩行者の検出並びに追跡を行う手法を考案した。この結果に基づき、室内環境下で、ロボットが歩行者との衝突を回避して自律移動することができるようにした。2.察するインタフェースの具体的アプリケーションとして、廊下をロボットが人間と並走の形態で移動していて複数の対向歩行者とすれ違う場合に、ステレオカメラ及び全方位カメラで周囲を観測しながら、これらの人間の動きに合わせて並走と縦走の形態を自律的に切替えながら移動する方法を開発した。また、ロボットが人間と同じ生活空間内を移動する際の障害物への対応について、回避だけではなく、周囲環境への配慮を行いつつ働きかけを行う方法について基礎的検討を行った。察するインタフェースに関して、下記の研究を行った。(1)対人行動における「察する」振舞ロボットの自律移動を実現するための基礎技術として、動的環境下において、観測領域が動的か静的かの度合を確率的にマッピングすることにより、動物体に影響されることなく室内形状を把握し、ロボットの自己位置推定をロバストに行う方法を考案した。複数の歩行人物及び障害物が存在する廊下において、ロボットがユーザと連れ立って並走・縦走を自律的に切り替えながら移動する方法を検討した。ステレオカメラによりロボット前方の距離情報を取得し、廊下の壁、対向人物、障害物、ロボット各々の位置をx-z平面画像上で認識する。また、ロボットと同行ユーザとの位置関係を全方位カメラ画像から取得する。廊下を幅方向に複数のレーンに分割し、ロボット、対向人物、同行者の各々が位置するレーンを把握し、ロボットが同一レーン内で対向人物や障害物と衝突することがないように、同行者との並走、縦走を自律的に切り替えられるようにした。更に、曲がり角もある廊下において、複数歩行者及び障害物どの衝突を回避しながら、ロボットが目的地まで自律的に移動する方法を考案した。カルマンフィルタを用いた歩行者位置の推定手法、歩行者の位置と歩行速度を考慮したポテンシャルフィールド法、目的地が視野外にある場合のサブゴール設定法等の導入により、ロボットの自然な自律移動を実現した。(2)対面動作における「察する」振舞コンピュータ/ロボットとユーザとのインタラクションにおいて、ユーザの首振り動作、視線の動き、反応のタイミングを観測し、これらの情報からユーザの内部状態・意思を推定し、推定結果に応じた反応を返すようにした。ユーザが明示的に指示をしなくても、システム側がユーザの状況に合せて(希望・意思を察して)反応するような新たなインタフェース形態である。1.対人行動における「察する」振舞廊下や室内などの日常環境下において、ロボットが周囲環境(障害物や複数の歩行者)の状況に合わせて、同行者と並走する、後方を追従する、前に位置するなど同行者との相対的位置関係を臨機応変に変化させながら安全に移動する手法を考案した。レーザレンジファインダにより取得した距離情報に基づいて作成したX-Z平面画像を用いて、同行者の向きや同行者との位置関係、周辺人物の存在や速度を認識する。人工ポテンシャル法を使用して、引力と斥力の計算結果から移動方向の決定を動的に行えるようにした。

廊下の曲り角や部屋の出入口における出会い頭での衝突を防ぐために、マイクロホンアレーで受信した音のマイクロホン間音圧差の変化から、視覚では捉えられない物陰の状況をロボットに予測させる手法を考案した。音源尤度マップや視覚情報と組合せることで、状況に応じた適切な動作を選択できるようにした。2.社会性を持った振舞実演販売や演説などにおける複数人の聞き手の立ち位置を、頭上カメラによって撮影した画像を用いて把握し、より多くの聞き手が見易い位置関係となるようにロボットに自律的に聞き手の立ち位置を調整させる方法を考案した。ロボットは聞き手のパーソナルスペースに留意してより良い陣形のシミュレーションを行い、発話と音声認識によるインタラクションを通じて相手の反応に応じた立ち位置の誘導を行う。複数のテーブルが配置された室内の任意の席に着席した複数人のユーザを対象にした挙手動作認識手法を考案した。個々のユーザの特定のために入室する人物をカメラで撮影し、服の色情報を取得する。ステレオカメラ及びレーザレンジファインダから得られる色情報と距離情報を用いて、入室してきた人物との対応付け、及び、胴体、頭部、腕の位置関係の検出に基づく挙手動作認識を行えるようにした。
ジェンダーに注目する沖縄の米軍基地と地域社会との重層的関係

本研究の目的は、米軍兵士と現地人女性との関係に注目するジェンダーの視点から、沖縄の米軍基地と地域社会との重層的関係について考察することである。本研究での米軍とは米海兵隊を意味する。その際に、1)交際・結婚、2)基地内就労、3)「基地の街」の3領域に焦点を当てる。以上の研究目的にもとづいて、本年度はこれまで収集したデータの資料整理と分析を行い、博士論文の執筆を中心に研究を進めた。また、その成果は2009年3月末に、博士論文として提出することができた。現地調査の大部分は昨年度実施したが、必要に応じてフォローアップ調査も実施した。以下、具体的な研究実績である。1.昨年に引き続き、随時、ジェンダー研究、軍隊と女性や沖縄の歴史と民俗などのテーマを中心に関連文献の収集と読解に努め、研究動向や必要な知識の習得を目指した。2.インタビューのテープおこしを行い、これまで収集したデータを整理・分析した。必要に応じてフォローアップ調査も実施した。3.大学のゼミで博士論文の構成を発表し、意見交換を行った。そこで得られた指摘に基づき、博士論文の構成を修正し引き続き博士論文の執筆を進めた。4.博士論文の執筆を行なう傍ら、学会誌『文化人類学』へ論文を投稿、採択が決定され論文が刊行された。5.本年度の最も大きな研究成果は、これまで行なってきた調査結果を博士論文としてまとめ、大学院に提出することができた点である。博士論文では、沖縄における米軍兵士と日本人女性との結婚と家族生活を男女双方の視点から捉え、そこに見られる軍隊と沖縄との間にある緊張関係や、その間で揺れ動く夫婦の姿を明らかにした。また。軍隊と地域社会との間に形成される重層的な関係にも着目し、軍隊を社会・文化的な文脈から捉え、そこで生きる人々の経験を某地内外から記述・分析した。本研究の目的は、米軍男性と現地人性との関係に注目するジェンダーの視点から、沖縄の米軍基地と地域社会との重層的関係について考察することである。今年度は現地調査を中心に主として1)と3)についての基礎的な資料収集を行った。1.軍人・軍属やその家族を支援するPersonal Services Center(PSC)を中心に、米海兵隊基地内での現地調査を開始した。PSCの主催するクラスの参加により米軍基地関係者の沖縄での生活が明らかとなった。さらに、PSCのフロント・デスクでの参与観察により、PSCの組織や海兵隊の理解が深まった。また、PSCによるPremarital Seminarに参加し、軍人男性と結婚予定である日本人女性とインタビューを行った。セミナーでは、軍人男性と国際結婚するために必要となる手続きの説明のほか、文化、食生活や言葉の違いから生じる問題が話し合われた。2.日本人軍人妻を対象としたJapanese Spouses Orientationに毎月参加し、日本人軍人妻の抱く疑問や問題点が明らかとなった。また、日本人軍人妻と個別に後でインタビューを行い、軍人男性との結婚・家族生活についてさらなる理解を深めた。インタビューでは、なれそめ、交際期間、親からの反対、アメリカや沖縄での生活について聞いた。また、日本人女性のアメリカ人夫とのインタビューから、男性側の視点を聞き、より深く結婚・家族生活ついて知ることができた。だが、アメリカ人男性側の視点については、今後さらなるインタビューが必要である。3.嘉手納米空軍基地の前で、米軍関係者を対象に戦後から今日まで商売を営む人からの聞き取りを行い、戦後から今日までの「基地の街」の歴史的変遷が明らかになった。本研究の目的は、米軍男性と現地人女性との関係に注目するジェンダーの視点から、沖縄の米軍地と地域社会との重層的関係について考察することである。本研究での米軍とは米国海兵隊を意味する。以上の研究目的にもとづいて、本年度は主に1)と2)を中心に現地調査を行った。また、本年度後半からは博士論文執筆にむけて資料整理を行った。1.米軍基地内の施設であるPersonal Services Center (PSC)を中心に、海兵隊基地内での現地調査を昨年度から引き続き行った。2.基地内施設であるMarine Corps Family Team Building(MCFTB)によるセミナーへ参加した。参加したセミナーは、Japanese Spouse Orientation( JSO)、L.I.N.K.S.、Japanese L.I.N.K.S.とKey Volunteerである。これらのクラスの参加から、日本人妻やアメリカ人妻の抱える疑問や問題点が明らかとなった。また、海兵隊の部隊と軍人家族の架け橋となる軍人妻であるKey Volunteerを育成するクラスへの参加により、いかに海兵隊の軍人家族の支援制度が形成されており、機能しているのかを学んだ。3.米兵と結婚した日本人妻、その夫とのインタビューを行った。インタビューから、本土出身の日本人妻と沖縄出身の妻たちの間に見られる相違や緊張関係を見ることができた。また、アメリカ人夫は、退役後や除隊後の就労や不安定な収入、また退役後の定住場所について悩んでいた。また、基地内で働く日本人従業員とのインタビューから、基地、軍隊やアメリカ合衆国に対する複雑な思いや葛藤が明らかになった。

さらに、アメリカ人軍入妻とのインタビューから、彼女たちが抱える就労に対する不満も明らかとなった。本研究の目的は、米軍兵士と現地人女性との関係に注目するジェンダーの視点から、沖縄の米軍基地と地域社会との重層的関係について考察することである。本研究での米軍とは米海兵隊を意味する。その際に、1)交際・結婚、2)基地内就労、3)「基地の街」の3領域に焦点を当てる。以上の研究目的にもとづいて、本年度はこれまで収集したデータの資料整理と分析を行い、博士論文の執筆を中心に研究を進めた。また、その成果は2009年3月末に、博士論文として提出することができた。現地調査の大部分は昨年度実施したが、必要に応じてフォローアップ調査も実施した。以下、具体的な研究実績である。1.昨年に引き続き、随時、ジェンダー研究、軍隊と女性や沖縄の歴史と民俗などのテーマを中心に関連文献の収集と読解に努め、研究動向や必要な知識の習得を目指した。2.インタビューのテープおこしを行い、これまで収集したデータを整理・分析した。必要に応じてフォローアップ調査も実施した。3.大学のゼミで博士論文の構成を発表し、意見交換を行った。そこで得られた指摘に基づき、博士論文の構成を修正し引き続き博士論文の執筆を進めた。4.博士論文の執筆を行なう傍ら、学会誌『文化人類学』へ論文を投稿、採択が決定され論文が刊行された。5.本年度の最も大きな研究成果は、これまで行なってきた調査結果を博士論文としてまとめ、大学院に提出することができた点である。博士論文では、沖縄における米軍兵士と日本人女性との結婚と家族生活を男女双方の視点から捉え、そこに見られる軍隊と沖縄との間にある緊張関係や、その間で揺れ動く夫婦の姿を明らかにした。また。軍隊と地域社会との間に形成される重層的な関係にも着目し、軍隊を社会・文化的な文脈から捉え、そこで生きる人々の経験を某地内外から記述・分析した。
手話言語の語順処理にかかわる脳内処理基盤の研究

日本手話の語順は自由度が高く、SOV語順だけではなくOSV語順も許される。そこで、日本手話における文処理メカニズムを解明するため、手話母語話者を対象にSOV語順とOSV語順の文理解(処理)時の脳活動を機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて測定を行った。その結果、OSV語順文とSOV語順文の直接比較で、OSV語順文の文理解(処理)時のほうがSOV語順文の文理解時に比べ、左脳の言語野の活動が有意に上昇することが確認できた。この結果は、手話の統語構造の複雑さを反映しているものとみられる。本研究では、手話言語の統語(語順)処理にかかわる大脳皮質の経時的な変化をfMRI(機能的磁気共鳴画像法)を用いて調べることで、言語(統語)処理の機能局在の解明と手話学習の到達度の変化が脳内処理に与える影響の究明に貢献する。日本語他動詞文の文理解(処理)時の脳活動を計測した結果、「基本語順文(SOV語順)」と「かき混ぜ文(OSV語順)」の文理解時に、左脳の下前頭回(ブローカ野)やウェルニッケ野など主に言語処理に固有に関与する言語中枢領域に賦活が観察され、このことから2つの語順の理解(処理)時に関わる認知処理はかなりの程度共通していることが示唆された。また、「かき混ぜ文」の文理解時に有意に働く賦活領域を特定するために行った「基本語順文」との直接比較では、左脳の下前頭回(BA44/45)に脳活動の上昇が観察された。この結果は、移動操作による統語構造の複雑さと下前頭回を含むブローカ野活動の上昇は、英語やドイツ語などの個別言語特有のものではなく、移動の統語現象を持つ言語において普遍的なものであることを示唆するものである。日本手話の場合も日本語と同様、その語順における自由度はかなり高く、二項動詞の場合、「主語<目的語<動詞(SOV)」の語順(基本語順)だけではなく、「目的語<主語<動詞(OSV)」の語順も「目的語<動詞<主語(OVS)」の語順も許される。本研究で予想される結果と意義は以下の2点である。(1)手話母語話者(L1)が移動操作を含む二項動詞文の文理解(処理)時にかかわる言語中枢領域を特定できる。(2)手話母語話者(L1)における統語移動の処理を司る脳部位と手話学習者(L2)における移動を司る脳の部位との対応関係が明らかになる。機能的磁気共鳴画像法(fMRI)による日本語他動詞文の文理解(処理)時の脳活動計測の結果、「基本語順文(SOV語順)」と「かき混ぜ文(OSV語順)」の文理解時に、左脳の下前頭回(ブローカ野)やウェルニッケ野など主に言語処理に固有に関与する言語中枢領域に賦活が観察され、このことから2つの語順の理解(処理)時に関わる認知処理はかなりの程度共通していることが示唆された。一方、日本手話は音声として話される日本語と異なる文法をもつ言語で、単語は主に手指動作で、文法情報(語順も含む)の多くは手以外の動き(非手指動作、例えば、視線、表情、頭部動作など)で表現するが、日本語と同様、その語順における自由度は高く、二項動詞の場合、「主語<目的語<動詞(SOV)」の語順(基本語順)だけではなく、「目的語<主語<動詞(OSV)」の語順も「目的語<動詞<主語(OVS)」の語順も許される(ただし、下記の語順は非手指要素に着目した場合の語順である)。本研究は、手話母語話者が移動操作を含む二項動詞文の文理解(処理)時にかかわる脳内処理基盤のモジュールの解明を目的とする。本年度はその検証のため、日本手話を現場で指導している専門家と日本手話の語順と文法規則などについて十分議論を行い、実験に使用する刺激文を完成した。研究機関の変更により、刺激文完成後すぐにfMRI実験の日程調整ができず、当初のスケジュールよりやや遅れている。日本手話は音声として話される日本語と異なる文法をもつ言語で、単語は主に手指動作で、文法情報(語順も含む)の多くは非手指動作(手以外の動き)で表現する。日本手話の場合、日本語と同様、その語順における自由度はかなり高く、二項動詞の場合、「主語<目的語<動詞(SOV、1)」の語順(基本語順)だけではなく、「目的語<主語<動詞(OSV、2)」の語順(かき混ぜ語順)も「目的語<動詞<主語(OVS)」の語順も許される。以下の語順は、日本語文と同様、目的語の「弁当」が主語の「田中」の前へ移動することで産まれる話題化構文(2)の一種とみられる(1田中弁当作る(SOV語順)【田中さんが弁当を作る】、2弁当(固定+頷き)田中作る(OSV語順)【弁当は、田中さんが作る】)。

そこで、日本手話における文処理メカニズムを解明するため、東北地方(仙台と山形周辺)に在住している手話母語話者を対象に「基本語順文(SOV語順)」と「かき混ぜ語順文(OSV語順)」の文理解(処理)時の脳活動を機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて測定を行った。まず、文理解(処理)の際の大脳皮質の活動領域を特定するために基本語順文条件とベースラインの安静条件を比較した。その結果、左右両側の上前頭回と中前頭回、左脳の中側頭回、下前頭回などに有意な賦活が見られた。この結果は、語順の違いにかかわらず認知処理がかなりの程度共通していることを示唆するものである。次に、「かき混ぜ語順文」と「基本語順文」の直接比較では、「かき混ぜ語順文」の文理解(処理)時のほうが「基本語順文」の文理解時に比べ、左脳の言語野の活動が有意に上昇することが確認できた。この結果は、手話の二つの語順における統語構造の複雑さを反映しているものとみられる。日本手話の語順は自由度が高く、SOV語順だけではなくOSV語順も許される。そこで、日本手話における文処理メカニズムを解明するため、手話母語話者を対象にSOV語順とOSV語順の文理解(処理)時の脳活動を機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて測定を行った。その結果、OSV語順文とSOV語順文の直接比較で、OSV語順文の文理解(処理)時のほうがSOV語順文の文理解時に比べ、左脳の言語野の活動が有意に上昇することが確認できた。この結果は、手話の統語構造の複雑さを反映しているものとみられる。刺激文作成に必要な基本動詞の数に限りがあり、思った以上に時間がかかってしまったため、当初のスケジュールよりやや遅れている。手話の専門家と十分に議論し、すでに刺激文が出来上がっているので今後はfMRI実験とデータ分析を行う。また、実験参加者(手話話者)も手配済みなので出来るだけ早い段階で実験を開始する。言語学本年度に作成した刺激文が自然な文になっているかどうかを手話話者に確認してもらい、問題がある刺激文に対しては修正を行う。また、行動実験を実施し誤答率が高い刺激文についても再度調整を行う。研究機関の変更により、予定していた実験を実施できず実験参加者に支払う予定だった謝金分の経費が残る状況に至った。刺激文の見直しが必要だったため、行動実験の参加者に支払う予定だった謝金分の経費が残る状況に至った。実験参加者への謝金とfMRI使用料に使用する。行動実験とfMRI実験の謝金として使用する。
新規シアロ糖鎖固相合成法の開発と応用

当初の研究計画に準拠して、研究初年度では糖鎖固相合成法に適したシアル酸糖残基ユニットの高効率的導入法の検討を行った。固相反応を用いる糖鎖合成では、固相担体に固定化された糖鎖基質の反応性が著しく低下し、固相合成の全体としての効率を減ずる原因となる場合が多い。従って、比較的基質の反応性が高く発揮される液相環境で用いられてきた糖ユニットを固相環境に適した形へと変形する必要がある。そこで初年度では、特に最も反応性の低いシアル酸供与体の反応性改善に着手した。この結果、従来型で汎用されたシアル酸5位アセトアミド基を他の官能基へと変換すると、供与体の反応性に影響することが明らかとなった。例えば、トリフルオロアセトアミド基、ジアセチルイミド基、トリクロロエトキシカーバメイト(NTroc)基への変換は反応性を向上させ、その中でもNTrocが最も反応性を上昇させることを発見した。本年度上半期では、上記の発見を受け、前年度からの新規のNTocシアル酸供与体の反応性の検証実験を継続し、また供与体糖鎖合成における汎用性を検討した。この結果、新規シアル酸ユニットは、既知のシアル酸供与体と比して卓抜した反応性と汎用性を有することを証明することができ、この知見を速報として論文発表した。続いて、この新規シアル酸ユニットを合成ブロック構築に利用し、その合成ブロックを用いる複雑なオリゴ糖鎖の合成に着手している。現段階では、NTrocシアル酸を種々の類緑体(5-NH_2,5-NHGc,5-NHAc,8-OSO_3H,1,5-Lactam)へと変換する方法を開発し、多種のシアル酸含有合成ブロックを効果的に構築することが可能となった。また、合成が難易とされる8-OMe体の合成法も合わせて確立することが出来た。また、下半期では、さらN-Trocシアル酸供与体の応用性を拡大する目的で、シアル酸のα(2-4)及びα(2-8)結合型二量体の化学合成に応用し、各種新規シアル酸二量体合成法を確立するにいたった。本年度は、本研究で確立を目指している新規シアロ糖鎖固相合成法の基盤となる、シアル酸供与体の開発に重点を据えて研究を行った。一般に、固相担体上でのグリコシル化反応は、担体に固定化した基質の反応性の低下に起因して、高水準の効率性を達成することが難しいとされている。その為、固相反応を基盤とする方法論の有用性は、必然的に、グリコシル化の効率に大きく影響を受けることとなる。そこで、本研究で提唱した方法論を、実際性、信頼性の高いものとして実現する為に、グリコシル化反応の中で、もっとも効率の低いものであるシアリル化を改善することに着手した。シアル酸供与体の反応性は、C5位のアミノ基の保護基によって大きく変化することが、最近知られるようになった。天然に広く分布しているシアル酸はC5位にアセトアミド基を有していることから、元来の供与体もアセチル基をC5位アミノ基の保護基として採用していた。しかし、それをN,N-ジアセチル、N-トリフルオロアセチルなどの電子吸引性の高い官能基に置換すると、供与体の反応性が飛躍的に向上する。そこで、本研究では、トリクロロエトキシカルボニル基をアミノ基の保護基として導入した、C5-カーバメート型のドナーを開発し、その供与体としての反応性を評価した。上述のN,N-ジアセチル、N-トリフルオロアセチル型のシアル酸供与体との、競合的グリコシル化実験を行なった結果、本研究で開発したN-トリクロロエトキシカルボニル型の供与体が、もっとも反応性が高いことが明らかとなり、この知見をさらに、ワンポット連続グリコシル化によるシアル酸2量体グリコシドの合成にも応用発展させている。この知見については、近日諭文発表する予定である。また、今後、この新規シアル酸供与体に、分離子候補分子を導入し、異性体分割の有効性を検証する予定である。

続いて、この新規シアル酸ユニットを合成ブロック構築に利用し、その合成ブロックを用いる複雑なオリゴ糖鎖の合成に着手している。現段階では、NTrocシアル酸を種々の類緑体(5-NH_2,5-NHGc,5-NHAc,8-OSO_3H,1,5-Lactam)へと変換する方法を開発し、多種のシアル酸含有合成ブロックを効果的に構築することが可能となった。また、合成が難易とされる8-OMe体の合成法も合わせて確立することが出来た。また、下半期では、さらN-Trocシアル酸供与体の応用性を拡大する目的で、シアル酸のα(2-4)及びα(2-8)結合型二量体の化学合成に応用し、各種新規シアル酸二量体合成法を確立するにいたった。
蚊の発育濾胞をアポトーシスにより退化させるoostatic hormoneの解析

2.まず、in vitroでの実験条件を確立するため、培養液や容器について調べたところ、アカイエカ濾胞を少なくとも2日間正常に保つためには、TC100 mediumを用い、Iwaki Glass Bottom中で培養することが最も良いと判断された。3.羽化直後の雌より取り出した卵巣を2の条件で2日間培養し濾胞の成長を見たところ、培養液に1μgのJHを含んだ条件で、濾胞の若干の成長が見られた。4.3の培養で、羽化直後の雌の卵巣を、oostatic hormoneを分泌していると想定される成熟卵巣といっしょに培養したが、コントロールと比べ、特に成長の遅れあるいは退化は見られなかった。5.in vivoでは、羽化直後の雌を断頭あるいは腹部を分離し、その体腔内に成熟卵巣を57時間培養した後の培養液を注入したところ濾胞の発育が若干押さえられた。6.上の、in vitro, in vivoの結果から、oostatic hormoneのbioassayとしては、in vivoで、分離腹部に成熟卵あるいは吸血後の成長卵巣を培養し、その培養液を注射する方法が適当と判断された。現在、このbioassay法で、培養液に分泌されたoostatic hormoneの分離・生成を進めている。1.雌アカイエカで、吸血後発育を始めた濾胞を退化させるoostatic hormoneについてin vivo、in vitroの両条件で調べた。2.まず、in vitroで実験条件を確立するためには、培養液や容器について調べたところ、アカイエカ濾胞を少なくとも2日間正常に保つためには、TC100mediumを用い、Iwaki Glass Bottom中で培養することが最も良いと判断された。3.羽化直後の雌より取り出した卵巣を2の条件で2日間培養し濾胞の成長を見たところ、培養液に1μgのJHを含んだ条件で、濾胞に若干の成長が見られた。6.上のin vitro、in vivoの結果から、oostatic hormoneのbioassayとしては、in vivoで、分離腹部に成熟卵あるいは吸血後の成長卵巣を培養し、その培養液を注射する方法が適当と判断された。現在、このbioassy法で、培養液に分泌されたoostatic hormoneの分離・生成をすすめている。1.まず、本研究の目的であるoostatic hormoneを成熟卵巣から抽出する方法を検討した。滅菌シャーレに1mlのAedes saline(10mM Hepes)を入れ、そこに吸血5日経た雌アカイエカより摘出した卵巣を入れて2時間穏やかに振とうし、その培養液を採取した後、新たに1mlのAedes salineを入れてさらに2時間培養を行い、その培養液も採取した。この状態では、濾胞の分解も起こらず、卵巣から分泌されるoostatic作用を持つ物質の分離が非常にやりやすいと考えられた。2. oostatic hormoneのbioasssayとして、吸血3日後の卵巣をAedes saline中で短時間培養し、そこに1の培養液からの抽出物質を加え、退化がコントロールに比べ早い時期に引き起こされるか見ることを考えた。そのため、まず吸血3日後の卵巣が、Aedes saline中でどの程度正常な形態を保てるか調べたところ、摘出卵巣は、saline中で約24hは、摘出時の形態を保つことがわかった。<今後の研究計画>1.まず、oostatic hormone様物質のHPLC等の分離抽出を行う前に、発育中の卵巣(吸血3日後)を直接上の1で集めた成熟卵の培養液に入れて510時間ほど培養し、コントロールとの差を見て、oostatic作用を持つ物質の有無を確かめ、それから分離・抽出の作業に入る。2.培養によるassayと同時に、吸血した雌の体腔にoostatic作用を持つ物質を注射し、コントロールと比べて濾胞の発育がどうなるかを見る。3. 12)のassay法を用い、卵巣より放出させ、他の濾胞をアポトーシスにより死滅させるoostatichormoneの分離・精製を、セントリコン分離チューブ、HPLCを駆使して行う。

1.羽化後4日経過した雌より、静止期に達した卵巣(濾胞長径約80-90μm)を取り出し、Gracels medium,Schnelderis medium,TC100の3種のmedium中で2448時間培養し、濾胞の変化を見たが、TC100で培養された濾胞が形態的に最も正常に近かった。2.吸血後5日以上経たアカイエカ雌より成熟に達した卵巣を摘出し、1の静止期の卵巣とともにTC100 medium中で培養し、成熟卵巣をmedium中に含まないコントロールと比較したが、はっきりとした差は認められなかった。3.吸血後5日以上経たアカイエカ雌より成熟卵巣を摘出し、TC100 mediumで5時間培養した後、培養液をサンプルとして集め、これを羽化直後のアカイエカに注射したところ、コントロールと比べ、濾胞の発育に若干の遅れが生じた。これらのことから、成熟卵巣から濾胞の発達を抑制するoostatic hormoneが分泌され、また3のin vivo methodがこのホルモンのbioassaryに適していることが確認できた。