hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
泥質岩のBushveld複合岩体と塩基性シルによる接触変成作用の違いとその意義

本研究では、岩石学的記載及び岩石化学的調査にもとずいて、南アフリカ東トランスバール地域(Malipsdrift,Mafefe,Penge)に産する二つの火成岩体(Bushveld Complexと塩基性シル)の時期的関係を明かにし、併せて両火成岩体周辺に見られる岩石の変成時の物理化学的環境の違いを推定した。具体的には、変成度に敏感な泥質岩と縞状鉄鉱の顕微鏡,EPMA,X線解析用の試料を作成し、鉱物岩石の同定と化学分析を行い、岩石組織、鉱物組合せ(鉱物組成などを含む)を調べた。これらの結果をふまえ、各岩石系の鉱物共生と鉱物の化学組成を検討し、鉱物安定関係から、温度,圧力,流体組成,酸素分圧等を決定し、変成条件の違いを推定した。また、変成時の流体組成は相関係,温度,圧力などに著しく影響するので、その影響も検討した。こうして求められた変成条件の違いを基に、アモサイト(角閃石石綿)及び紅柱石鉱床の生成に、上記二つの火成岩体がどのように関連しているか考察を行なった。両火成岩体による接触変成作用によって生じた岩石組織と変成度に着目すると、当調査地域では、Bushveld Complexによる接触変成作用が広範囲に及んでおり、Pretoria層群からTransvaal層群へ向って、変成度が珪線石帯から緑泥石帯まで連続的に低下している。しかしながら、シルに接する部分では逆に変成度が高く(紅柱石-十字石帯)なっている。上記層群中の岩石の変成組織と鉱物組合せを詳しく調べた結果、少なくとも、当地域では、シルの貫入がBushveld Complexの前駆現象ではないとの結論を得た。これに基ずいて、アモサイトや紅柱石鉱床のこれまでの成因論を見直し、現在、その結果をまとめつつある。また、Bushveld Complexの火成活動史をも見直す必要があろう。
魚類好中球におけるNADPH酸化酵素の存在

ウナギ好中球のrespiratory burstにおいて、活性酸素スーパーオキシド産生量は酸素消費量とほぼ等しく、過酸化水素産生量はその約1/2であった。この量的関係は哺乳類貧食細胞のNADPH酸化酵素によって引き起こされる酸素代謝動態と化学量論的に一致し、魚類好中球でも哺乳類同様の酸素代謝機構の存在が証明され、魚類好中球においても酸素依存性殺菌が重要な働きをしているものと考えられた。異物で誘導されたウナギ好中球の活性酸素産生量は非誘導好中球より有意に高く、異物の侵入に対して、これを排除するために殺菌能の高い好中球が造血組織から放出されることが示された。ヒト好中球で報告されているNADPH酸化酵素の構成因子であるシトクロム-ムb558の大サブユニットを認識する抗体(抗原としてシトクロームb558アミノ酸残基550-569に相当する合成ペプチドを使用)を作成しドットプロット法により調べたところ、魚類好中球におけるNADPH酸化酵素の存在が証明された。さらに、ウエスタンプロット法を行ったところ、ヒト好中球と同様に分子量80-110kDaに特異的なバンドが検出された。さらに蛍光抗体法により、この抗体は界面活性剤で細胞膜の透過性を上げた後にのみウナギ好中球のエピトープを認識することが示された。これらの結果から、魚類好中球のシトクロームb558はヒト好中球と同様な分子量および存在形態をしているものと考えられ、NADPH酸化酵素が種を越えて保存されていることが示唆された。ウナギ好中球を利用し、まず、respiratory burst時に産生される活性酸素が実際に殺菌に利用されているかを調べた。各種の活性酸素消去剤による活性酸素の殺菌活性の低下により判定したところ、ウナギ好中球の酸素依存性殺菌活性には過酸化水素が重要であり、他の活性酸素種はほとんど役立っていないことが明らかとなった。さらに、サイトカラシンB処理により好中球の食胞形成を阻害すると、殺菌活性が低下し、またカタラーゼ(過酸化水素の消去剤)による阻害効果がみられないことから、好中球の酸素依存性殺菌活性には食胞の形成が必須であることが示された。以前の研究によりウナギ好中球のrespiratory burst時の過酸化水素産生量は平均12.45【plus-minus】0.85nM/10^7細胞/分であることが判っており、食胞内での過酸化水素濃度は数分以内に500μMに達すると計算され、過酸化水素だけで十分な殺菌があるものと考えられた。哺乳類で知られているシトクロームb558(NADPH酸化酸素の1要素)のアミノ酸配列の中から150172残基と550569残基を合成し抗体を作成した。この2つの抗ペプチド抗体のうち後者が特異的に反応することから、この抗体を使用して魚類好中球でのシトクロームb558をイムノブロットにより調べた。その結果、ウナギおよびコイの好中球では分子量910万の少々広い反応がみられ、これは対照として用いたヒト好中球とほぼ同じ分子量域であった。しかし、テラピアの好中球では他と異なり分子量15万の領域で反応が認められた。550596残基の部分は活性酸素産生にとって必須な部分であることが報告されており、魚類でも同様な部位が保存されいることが明らかとなった。しかし魚類によりNADPH酸化酵素全体の大きさが異なる可能性が示唆された。ウナギ好中球のrespiratory burstにおいて産生される活性酸素であるスーパーオキシドおよび過酸化水素の量比を正確に測定したところ、2:1であった。また、消費される酸素量とスーパーオキシド産生量との比は1:1であった。

この三者の量比は哺乳類好中球における報告と一致し、ウナギ好中球においてもNADPH酸化酵素が正確に機能していることが証明された。哺乳類の好中球に存在するNADPH酸化酵素の1要素であるシトクロームb558が、ウナギ好中球においても存在することが抗ペプチド抗体(ヒト好中球シトクロームb558アミノ酸残基550-569に相当する合成ペプチドを抗原として作成)から証明されたことから、ウエスタンプロット法によりさらに詳しくウナギ好中球シトクロムb558分子量を検討したところ、分子量80-110kDaに特異的なブロードバンドが検出された。この分子量領域は対照として用いたヒト好中球のシトクロームb558分子量領域と一致した。ブロードにバンドが検出されたのは、シトクロームb558に糖鎖が結合しているためと考えられた。次にこの抗体の結合部位を蛍光抗体法により検討した。この抗体は好中球の膜表面の物質とは反応せず、界面活性剤トリトンXで処理し膜透過性を高めることにより、陽性反応が認められたことから、抗体の結合部位は細胞室内に存在するものと考えられた。この存在様式はヒト好中球における報告と一致し、ウナギ好中球のシトクロームb558はその存在様式においても、哺乳類と非常に類似していることが明らかとなった。
精神障害当事者の語りの有効性に関する研究

本研究の目的は、精神障害者が教育機関に出向き、精神疾患の好発時期にある中学生・高校生に病いの体験を語る活動の有効性を明らかにすることである。その結果、精神障害当事者の語りを聞いた中学生・高校生は共生社会の実現に対する意識の向上がみられ、精神障害当事者自身にも「アウトカムとしてのリカバリー」「エンパワメント(自分の内側から回復する力)の育成」「社会改革への意識の覚醒」などがみられた。このことから、中学生・高校生の精神保健福祉教育では、精神障害当事者の病いの語りを取りいれたプログラムが有効的といえる。平成21年度は、当初、諸外国における早期精神保健教育の視察を計画していたが、インフルエンザが世界的に流行したため、今年度の研究は次の4点とした。(1)精神障害当事者の語り部研修の有効性の検証:研修の受講生に対して、質問紙票調査を実施した結果、研修をグループで行うことが効果的であることが示唆された。また、研修で自己の病いの体験を語りにすることで病いの客観化が図れ、社会改革の必要性を実感することが明らかになった。(2)精神障害当事者の語りが聞き手に及ぼす影響:精神障害当事者の語りの前後で聞き手である中学生・高校生に意識調査を行った結果、精神障害者に対する偏見の是正とともに、自己のメンタルヘルスに対する関心度が高まった。さらに、レクリエーションなどの良好接触体験が精神障害者との社会的距離の縮小に寄与することが明らかになった。(3)教育現場における教職員の「子どものメンタルヘルス」に関する意識の検証:中学校・高校の教職員を対象に質問紙票調査を実施した結果、教職員のメンタルヘルスリテラシーの程度があまり高くないものの、精神障害者に対する研修を強く望んでいることが明らかになった。そして、(4)精神障害当事者の語りに基づいた精神保健教育における補助教材の開発。これらの研究は、精神障害当事者の語りは中学生や高校生の精神障害者に対する偏見を是正し、自己のメンタルヘルスの関心度を高める効果を明らかにした点で有用といえる。今後、本年度に作成した補助教材の有効性についても検証する必要がある。尚、上記の研究のまとめとして、「精神障害当事者の『語り』の有効性に関する研究』と題する平成21年度研究成果報告書を作成した。2010年度は次の3つの研究実績が得られた。(1)昨年度は、精神障害当事者のリカバリーに向けたライフヒストリーを作成した。それをふまえて、精神の不調から医療機関を受診するまでの時期を「早期」と位置づけ、その「早期」における当事者が伝えたいことを検証することを目的として、グループインタビューを行った。その結果、精神病の理解よりも、個人の尊厳の尊重や共生社会の創生を伝えたいとしていることが明らかになった。(2)精神障害当事者の語りの聞き手に及ぼす影響を検証することを目的として、高校生、ホームヘルパー・地域ネットワーク委員を対象として、アンケート調査を行った。その結果、精神障害当事者の語りを聴いた後には好ましい態度変容がみられ、社会的距離が縮小されることが明らかになった。(3)昨年度作成した精神保健教育における補助教材を使用し、その有効性を検証するため、'中学生を対象として介入教育を行った。その結果、補助教材が書き込み式になっていることで自身のメンタルヘルスの状態を省察することがみられ、知識の伝授よりは自身のメンタルヘルスへの関心が高くなることが明らかになった。本研究の目的は、精神障害当事者が教育機関に出向き、精神疾患の好発時期にある中学生・高校生に自己の病いの体験を語る教育活動の有効性を図ることにある。平成23年度は、3年間の研究の成果を報告することを主として、(1)精神障害当事者による語りが聞き手に及ぼす影響、(2)精神障害当事者の中学生・高校生に対する語りによる自己変容(3)教育機関における教職員のメンタルヘルスリテラシー、に対する調査研究を行った。その結果、(1)精神障害当事者による語りが聞き手に及ぼす影響として、「精神障害(者)に関する知識の習得」「精神障害者の生活のしづらさに対する理解の促進」「自身のメンタルヘルスの関心の向上」「共生社会の実現に対する意識の向上」がみられた。(2)精神障害当事者の中学生・高校生に対する語りによる自己変容として、精神障害当事者は「前向き」「自分の内側から回復する力の育成」「生活の幅の拡大」「病いの肯定的変化」「自己効力感の向上」などの自己変容を認識していた。(3)教育機関における教職員のメンタルヘルスリテラシーとして、精神疾患に関する識別率はあまり高くはないものの、その対処方法としてカウンセリングや精神科医の受診を選定していることから、日頃より教育機関と精神保健福祉機関との情報交換の必要性を示唆できる。上記の研究結果に関して、学会発表(3演題)、論文発表(2本)を行った。
SLOSS問題の再検討：サンゴ礁魚類群集に影響する競争と分散の種間トレードオフ

SLOSS問題(同一面積なら単一大リーフと中小リーフ群のどちらで生息種数が多くなるのか)について掘り下げるため,石垣島白保海岸の当初計画よりも狭い範囲の隣接4リーフにて,スズメダイ科魚類10種の個体追跡行動観察を行った。2015年9月の台風によって一部のリーフが移動し,市販の航空写真を地図としては利用不能となった。ドローンによる空撮を試み,空撮画像上に個体の行動圏を記録した。その結果,ニッチ分割は明確であるが「競争と分散の種間トレードオフ」が見られ,隣接する中小リーフ群で多種共存が成立しやすいことを見いだした。しかし,空撮に時間を要し,サンプル数が不十分となった。2018年に調査を完了したい。SLOSS問題(面積が同じなら、単一の大生息地と複数の小生息地群のどちらで生息種数や個体数が多くなるのか)について石垣島白保海岸においてスズメダイ科魚類を対象に調べてきた。その結果、総面積が同じなら中小リーフ群の方で生息種数が多くなること、サンゴ礁の礁池は水深が2m程度と浅いために中小リーフは底面積の増加に伴って体積が増加するが大リーフは底面積の割には体積が大きくないことを明らかにした。一般に、スズメダイ科魚類は、リーフを隠れ場所や採餌場所として利用している。したがって、リーフの総面積(底面積)が同じであれば、中小リーフ群で総体積が大きくなり、生息種数も多くなると予想される。今回、「リーフ底面積と生息種数の関係」と「リーフ体積と生息種数の関係」を整理・分析し、「底面積が同程度であれば、総体積が大きい中リーフ群で生息種数が多くなる」ことを確かめた。生息地を単純に平面と捉えたSLOSS問題に、立体的な視点を導入することにより、浅い海域では生息地の総面積だけでなく、リーフの立体的なサイズ分布が生息種数を左右することを示した。浅い海域は埋め立てられやすいため、保全対策時に役立てられる情報を提供できるので意義深い。また、スズメダイ科魚類の全種の種数・個体数を広大な地域で調べることは困難であるため、スズメダイ科魚類の生息種数の多い場所で個体数が多いと知られるハマクマノミに注目し、調査面積を3ヘクタールに拡大し、リーフ体積とリーフ底面積の関係を調べた。この結果、体積の大きな立体リーフが多い場所よりも、リーフの総底面積が多い場所において生息個体数が多くなることを明らかにした。浅い礁池では、リーフ底面積が大きくても高くはなれないため、リーフ体積はリーフ底面積から線形回帰による近似ができ、結果として航空写真画像に反映される総底面積データだけで、生息個体数の多い場所を予想できることがわかった。SLOSS問題の再検討として、サンゴ礁の浅い礁池においては、総底面積が同じであれば、なぜ大リーフ群よりも中小リーフ群で生息種数や個体数が多くなるのかについて調査を続けている。研究実績の前半に関しては、日本生態学会の国際誌に発表することができた。これまでの観察エリアは、0.3ヘクタール程度とそれほど広くは無かったため、一般化に近づけるためにはもう少し広い範囲で調査を行う必要があった。これまで調査を続けてきたスズメダイ科魚類の中で個体数の多い種類を対象に、観察エリアを3ヘクタールに広げ、リーフ底面積と生息種数や個体数の関係、リーフ間の移動などの追跡調査を行う計画であった。一部の種類については個体の移動が行動観察から予想していた範囲よりも広範囲におよび、追跡ができなかった。結果的には観察エリアをこれまでの広さの約10倍の3ヘクタールに拡大し、生息種数の多い場所で頻繁に観察されるハマクマノミに注目し、仮説の一部を検証できた。すなわち、立体的な大リーフ群の総面積よりも中小リーフ群を含めた総リーフ面積が生息個体数と高く相関することを確かめた。移動分散優位種に関しては、当初の計画よりも観察エリアを大幅に縮小した方が、成果を得やすいことがわかってきた。携帯GPSによる緯度経度計測を行い、GISソフトを使って航空写真画像の幾何補正を行ったが、たまたま対象エリアが画像中央部にあったため、補正の必要がない程度にしか歪曲していなかった。したがって、面積等のデータは以前のものを利用することにした。SLOSS問題(面積が同じなら単一の生息地と複数の生息地群のどちらで生息種数や個体数が多くなるのか)と競争と分散の種間トレードオフによる共存機構ついて、石垣島白保海岸で得られた結果が他の場所でも成立するのかどうかを知るために、瀬底島琉球大学熱帯生物圏研究センター前の海域において、石垣島白保海岸での調査と同じ方法を用いてスズメダイ科魚類を対象に調べた。その結果として、クロソラスズメダイ、ハマクマノミ、ハナビラクマノミは競争優位種と見なすことができ、クロスズメダイ、クマノミ、ミツボシクロスズメダイは移動分散優位種であると見なすことができた。しかし、白保海岸で確認できた「総面積が同程度であれば、大リーフよりも中リーフ群で生息種数や個体数が多くなる傾向」は瀬底島での調査では観察されず、同じ資源を利用する種間での競争戦略と分散戦略による共存機構の存在も確認できなかった。瀬底島の観察エリアでは、白保海岸と比較してサンゴ礁の発達程度が低く、礁池内に明確な立体構造を持つパッチリーフがなかったためであり、瀬底島でのパッチリーフは礁縁外側の水深3m前後の砂地にあり、白保の礁池よりも1m程度水深が大きく、大パッチリーフでもその高さは水面にまでは達していなかった。

「総面積が同程度であれば、大リーフよりも中リーフ群で生息種数が多くなる傾向」が見られなかった理由は、大パッチリーフが水面まで達していなかったことであると考えられた。底面積の大きい立体リーフでは、すみ分けによる共存が可能なためである。水深1m程度の違いが反映されるとは予想していなかったが、白保海岸での結果と矛盾はなかった。一昨年度の研究で得られた知見については、第13回国際サンゴ礁学会(ホノルル)において研究発表を行い、昨年度末に原著論文としてまとめ国際誌に投稿できた。SLOSS問題の再検討として、サンゴ礁の浅い礁池においては、パッチリーフの総面積が同じであれば、大リーフよりも中小リーフ群で生息種数や個体数が多くなるのかについて、一昨年度、観察範囲を3倍(3ha)に拡げても同様の現象が見られることを確認でき、さらに、昨年度、白保海岸での研究成果をより一般化するために、瀬底島で比較研究を行ったが、白保海岸で見られたような現象は瀬底島では観察できなかった。これは、瀬底島の観察エリアのサンゴ礁が白保海岸と比較して発達程度が低く、パッチリーフの基部の水深が1m程度深いことが関係していると考えられた。この点はこれまでの仮説と矛盾するものではなかったが、瀬底島では同じ面積の観察エリア内のパッチリーフの総数が少なく、地形的な特徴が異なるため、積極的に仮説を支持する結果とまでは言えない。ただし、「総面積が同程度であれば、大リーフよりも中リーフ群で生息種数が多くなる傾向」には浅い地形が大きく作用していることを明確にすることにはなった。一昨年度の調査により、白保海岸で確認した移動分散優位種のデータ整理を行うなかで、ミナミイソスズメダイとデバスズメダイは定住性が高いものの、移動分散優位種である可能性が生じてきた。個体識別移動調査の観察エリアを大幅に狭くして隣接する複数のパッチリーフ間で調査することが有効であることがわかった。特にミナミイソスズメダイはこれまでに生態調査がほとんどなされていな種であり、また、デバスズメダイは競争優位種と思われるミスジリュウキュウスズメダイと同じ生息地に共存して見えるため、競争と分散の種間トレードオフの詳細を観察するにはよい対象である。大面積の立体リーフによるすみ分けが十分にできない場合、中面積の立体リーフ群を利用した競争と分散の種間トレードオフによって共存が成立するのではないかと作業仮説をたてている。SLOSS問題(Single-Large-Or-Several Small problem,同一面積なら単一大リーフと小リーフ群のどちらで生息種数が多くなるのか)を掘り下げるため,個体追跡による行動観察を当初計画よりも狭い近接4リーフにて実施した。一部のリーフが2015年9月の台風によって移動していたため,市販の航空写真画像が地図として利用できず,ドローンによる空撮を試み,個体数が多いスズメダイ科魚類のクロソラスズメダイなど10種(以下「スズメダイ」を省略)を対象に空撮画像上に個体の行動圏を観察・記録した。藻食性で種間縄張りを持つことで知られる3種が競争優位種であること,ハナナガのみリーフ内滞在時間が長く,生息地に特化していること,ダンダラは砂地が主な生息地であることを確かめた。雑食性のミナミイソは,複数のリーフを利用する移動分散優位種であり,ダンダラとは避け合うが,種内縄張りを示した。
新規モデル系を用いた癌の神経浸潤における細胞間相互作用因子の探索

本年度においては、まず、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞sphereと癌細胞株との共培養系を実施し、癌細胞が神経細胞の神経突起に沿って増殖・進展する現象の再現性確認を実施した。一方で、神経細胞や神経突起から離れた場所において、癌細胞株が向神経細胞性を示すか、あるいは反対に、神経突起伸長が向癌細胞株性を示すかの検討を行ったが、いずれも否定的な結果であった。このことから、癌細胞の神経浸潤は、癌細胞が神経細胞体もしくは神経突起に直接接触した後に加速する可能性が考えられた。あるいは、今回の実験系では、生体内組織と比較して関与する細胞種が少なく微小環境構造も単純なため、細胞同士の直接相互作用しか検出できない可能性も考えられた。今後は、本培養系で検出可能な、癌細胞株と神経細胞の直接相互作用に対象を絞って解析を進めることにした。また、癌細胞株が神経突起に沿った増殖・進展を行う際、足場となる神経細胞の種類に特徴があるか検討を行った。癌細胞と神経細胞の共培養を免疫染色したところ、癌細胞が神経突起と直接相互作用している領域では、Choline acetyltransferase陽性のコリン作動性神経細胞が多く、Tyrosine hydroxylase陽性のアドレナリン作動性神経細胞はほとんど見られなかった。また、Doublecortin陽性の神経細胞が多く見られ、主に比較的未成熟なコリン作動性神経細胞が癌細胞進展の足場となっている可能性が示唆された。感覚神経様細胞の関与に有無については、十分な結果が得られなかった。癌細胞株とヒトiPS細胞由来神経細胞の共培養系を用い、癌細胞が相互作用する神経細胞種を特定した。一方で、両細胞種に発現する分子レベルの解析については、まだ十分に検討できていない。未成熟なコリン作動性神経細胞が癌細胞の増殖・進展の足場となる可能性が示唆されたことから、今後は、コリン作動性神経細胞の神経伝達であるアセチルコリンや、同神経細胞で特異的に発現の見られる分泌・細胞表面タンパク質が、癌細胞の増殖・進展とどのように関連するかに解析対象を絞ることで、成果創出に結びつける。まず、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞より神経細胞を効率良く分化誘導する方法を検討した。当初は、培養中の神経堤細胞を酵素で剥離し、分散させた状態、もしくは、sphere形成させたのちに、マトリゲル±ポリリジンコーティングした培養皿上で培養する方法で培地組成等を検討したが、神経細胞以外の細胞も多く誘導される、もしくは、神経堤細胞が増殖するため、以後の解析には不適当と考えられた。そこで、神経堤細胞をsphere形成させた後に、マトリゲル包埋中での培養を検討したところ、長い神経突起進展が多く見られ、また、その他の細胞の増殖進展があまり認められなかったことから、神経細胞が効率良く誘導されたと考えられる。神経細胞の確認は、Tuj1等、免疫染色で実施した。次に、ヒトiPS細胞由来神経細胞と腫瘍細胞の共培養系の検討を実施した。上記と同様、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞をsphere形成させた後に、まず神経堤sphereをコーティングフリーな培養皿上で、マトリゲル中に包埋し、続いて膵癌細胞株を神経堤sphereから12 mm程度の距離を開けて播種した後に、上からマトリゲルを重層した。すなわち、マトリゲル包埋中での神経堤細胞と癌細胞株との共培養系を検討した。その結果、膵癌細胞株の存在下においても神経堤sphereから神経突起の伸長が多く観察された。一部では、癌細胞が神経突起に沿って増殖・進展する様子が観察された。また、神経突起を直接足場として移動する様子も観察された。一方、癌細胞増植が向神経性を示すか、神経突起伸長が向癌細胞性を示すかについては、明確な結論は得られなかった。また、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞よりシュワン細胞への分化誘導検討を実施した。これについては、さらなる検討を要する。当初の計画通り、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞より神経細胞を分化誘導する方法、および、神経細胞と腫瘍細胞との共培養系を確立した。また、神経堤細胞よりシュワン細胞への分化誘導系検討を実施した。神経細胞と腫瘍細胞との共培養系では、腫瘍細胞が神経突起に沿って移動する様子が確認でき、先行研究で報告されているDRGと癌細胞株との共培養系を模倣できたと考える。癌細胞と神経細胞の共

培養を免疫染色したところ、癌細胞が神経突起と直接相互作用している領域では、Choline acetyltransferase陽性のコリン作動性神経細胞が多く、Tyrosine hydroxylase陽性のアドレナリン作動性神経細胞はほとんど見られなかった。また、Doublecortin陽性の神経細胞が多く見られ、主に比較的未成熟なコリン作動性神経細胞が癌細胞進展の足場となっている可能性が示唆された。感覚神経様細胞の関与に有無については、十分な結果が得られなかった。癌細胞株とヒトiPS細胞由来神経細胞の共培養系を用い、癌細胞が相互作用する神経細胞種を特定した。一方で、両細胞種に発現する分子レベルの解析については、まだ十分に検討できていない。ヒトiPS細胞由来神経細胞と癌細胞株の共培養系において、DRG由来神経細胞と癌細胞との共培養系で見られた、癌細胞増植の向神経性増殖・進展、および、神経突起伸長の向癌細胞性は確認できなかった。このため、DRGと癌細胞との共培養系との比較を検討する必要があると考えられる。また、当初計画通り、ヒトiPS細胞由来神経細胞と腫瘍細胞が相互作用している領域での、膜タンパクやケモカイン/受容体、細胞接着性タンパク等の発現解析を実施する。未成熟なコリン作動性神経細胞が癌細胞の増殖・進展の足場となる可能性が示唆されたことから、今後は、コリン作動性神経細胞の神経伝達であるアセチルコリンや、同神経細胞で特異的に発現の見られる分泌・細胞表面タンパク質が、癌細胞の増殖・進展とどのように関連するかに解析対象を絞ることで、成果創出に結びつける。試薬・消耗品の販売キャンペーン適用等により、当初計画との差額が生じた。残余金は次年度に使用する計画であり、研究データの厚みを増すための追加実験に充足予定である。共培養系の再現性確認に時間を要したため、分子レベルの解析に十分手が回らなかった。その結果、研究費使用に当初計画との差が生じ、次年度に繰り越すことになった。本年度に未実施であった研究計画は次年度に実施する予定であり、繰り越した研究費はそのための費用に充てる。
キスペプチン・ＧｎＲＨ可視化ニューロンの受容体解析による生殖中枢制御機構の解明

本研究の目的は、生殖中枢におけるキスペプチンおよび性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンを制御するメカニズムの解明である。本年度は、以下の3点を実施した。(1)GnRH部分ペプチド受容体のキスペプチン-ニューロキニンB-ダイノルフィン(KNDy)ニューロンにおける発現解析(2)GnRH部分ペプチド中枢投与の黄体形成ホルモン(LH)分泌に対する効果の検討(3)キスペプチン欠損ラットにおけるGnRH部分ペプチドのLH分泌に対する効果の検討26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、生殖中枢であるキスペプチンおよびGnRHニューロンを制御するメカニズムの解明である。「キスペプチンニューロンのGPCR遺伝子発現を解析し、キスペプチンニューロンに入力する求心性神経伝達物質あるいは神経ペプチドを同定すること」および「GnRHニューロンに発現するオーファンGPCRの中から新規キスペプチン受容体を同定すること」を目指し、本年度は以下の3点を実施した。1.キスペプチンおよびGnRHニューロンにおける既知受容体の発現解析赤色蛍光タンパク質tdTomatoを指標にキスペプチンニューロンを、GFPを指標にGnRHニューロンをラット視床下部から採取し、逆転写PCRによって、キスペプチン受容体(GPR54)、NKB受容体およびダイノルフィン受容体の遺伝子発現を解析した。2.キスペプチンニューロンに発現する遺伝子の網羅的解析およびGPCR遺伝子の選出1.と同様に採取された、キスペプチンニューロン由来のcDNAを磁気ビーズにより精製し、次世代シーケンサによる網羅的遺伝子解析に供した。3. GnRHニューロンに発現するGPCR遺伝子強制発現細胞株の作成GPR54遺伝子をN7細胞(マウス視床下部由来細胞株)に導入してGPR54強制発現細胞を作成し、キスペプチンの部分ペプチドを投与して細胞内ルシフェラーゼ活性を測定し、GPCRシグナリングアッセイを確立した。以上より、本年度は、キスペプチン、NKB、ダイノルフィンの受容体局在を弓状核において明らかにした。また弓状核キスペプチンニューロンに発現するGPCR遺伝子を網羅的に解析した。さらに、オーファン受容体のリガンド探索を目的としたルシフェラーゼアッセイ系を確立した。以上の成果より、キスペプチンニューロンの活動を制御する新たなメカニズムの一部が明らかになりつつあり、新たな繁殖制御剤の開発に寄与することが期待される。また本研究の応用を目指し、性成熟期のブタにおけるキスペプチン遺伝子発現を解析した結果をまとめた論文の、学術誌への掲載が決定した。キスペプチン・GnRHニューロンの活動を制御する新たなメカニズムが、当初の年次計画通りに明らかになりつつあることに加え、本研究で得た知見を家畜に応用することを目指し、性成熟期のブタにおけるキスペプチン遺伝子発現に関する論文の学術誌への掲載が決定したため。今後は、キスペプチンニューロンに発現するGPCRの生理的機能を明らかにすることを目指す。専攻研究により、既にリガンドの明らかになっているGPCRに関しては、in vivoおよびキスペプチンニューロン培養系へのリガンド投与実験を行う。また、リガンド未知のオーファンGPCRに関しては、ノックアウトラジトの作出に着手し、繁殖機能に関する役割を明らかにすることを目指す。
楕円型線型偏微分方程式系(過剰決定系)のC∞解の存在

線型偏微分方程式系の楕円型過剰決定系に対する無限回微分可能解の存在問題が研究課題であったが,本研究で独立変数の個数が2のときには完全に解決することができた.即ち次の存在定理を確立した.定理.2独立変数に関する線型偏微分方程式系が包合的で楕円型であれば,局所無限回微分可能解を有する.楕円型過剰決定系の場合の無限回微分可能解の存在問題は,非常に微妙で難しい問題であり,一般には強い制約となる付加条件の下での結果しか未だ知られていない.上述の結果は,独立変数の個数が2の場合ではあるが,楕円型包合性の他には付加条件を一切課していない点で一般的なものである.証明の方法はL^2理論ではあるが,従来のもの(D-Neumann問題を扱う方法)とは異なる.一般に解の存在問題は,対応して構成される短い微分複体の完全性の問題として表現され,さらに後者はいわゆるSpencer列の対応する項における完全性と同値である.このSpencer列から定まる各近傍U上のL^2空間の間の微分複体を導入し,十分小さいUに対しこれが完全であることを示す.この証明が議論の要点であり2独立変数の場合にはSpencer列の微分作用素が単純で都合のよい局所表現を持つことにより,われわれの方法を適用することに成功した.この結果と楕円型微分方程式の解に関する正則性定理により元のSpencer列の完全性が導かれる.独立変数の個数が3以上のときの考察も行ったが, Spencer列における微分作用素の構造に決定的に異なる様相が生じる為,方法論と構造に関して手がかかりとなりうる知見を得てはいるが,問題の一般的解決へ至るには画期的な方法等の新たな発見が必要であり今後の研究課題である.線型偏微分方程式系における有名な未解決問題「包合的過剰決定系が楕円型であれば局所C^∞解を有するか?」に関連し,本年度においては主として2独立変数1未知関数に関する方程式系についての研究を行い,この場合には楕円型包合系は局所C^∞解を有するという存在定理を証明することができた,この未解決問題は一般の場合は非常に難しい問題でありいまだわずかな結果しかえられていない.例えば1970年頃にMackichanが与えた結果は「楕円型包合的偏微分方程式系がさらにδ-estimateを満たせば局所C^∞解を有する」というものである.この結果は重要で意義深いものであるが,δ-estimateを満たすと言う条件が非常に強い制約条件であり,一般の場合の解決と言うには程遠いものである.当研究で扱った偏微分方程式系のクラスは狭く特殊なものであるが新しい結果であり,また定理の証明方法も従来のものとは異なる.上述のMackichanの定理は,付随するD-Neumann問題をSweeneyが確立した方法で解くことにより証明されている.残念ながらSweeneyの方法は一般の場合にはうまくいかないことがSweeney自身が与えた具体例によって示されている.本研究でD-Neumann問題を扱わず異なる方法をもちいた一つの理由はこのためである.本研究の目的の一部は,未解決問題の困難さがどこにあるかをより深く考察し,一般的な場合の解決への手がかりをうることおよび新しい方法の有効性を験すことにあったが,この点においても当初の目的をほぼ果たすことができたと考えている.線型偏微分方程式系の楕円型過剰決定系に対する無限回微分可能解の存在問題が研究課題であったが,本研究で独立変数の個数が2のときには完全に解決することができた.即ち次の存在定理を確立した.定理.2独立変数に関する線型偏微分方程式系が包合的で楕円型であれば,局所無限回微分可能解を有する.楕円型過剰決定系の場合の無限回微分可能解の存在問題は,非常に微妙で難しい問題であり,一般には強い制約となる付加条件の下での結果しか未だ知られていない.上述の結果は,独立変数の個数が2の場合ではあるが,楕円型包合性の他には付加条件を一切課していない点で一般的なものである.証明の方法はL^2理論ではあるが,従来のもの(D-Neumann問題を扱う方法)とは異なる.一般に解の存在問題は,対応して構成される短い微分複体の完全性の問題として表現され,さらに後者はいわゆるSpencer列の対応する項における完全性と同値である.このSpencer列から定まる各近傍U上のL^2空間の間の微分複体を導入し,十分小さいUに対しこれが完全であることを示す.この証明が議論の要点であり2独立変数の場合にはSpencer列の微分作用素が単純で都合のよい局所表現を持つことにより,われわれの方法を適用することに成功した.この結果と楕円型微分方程式の解に関する正則性定理により元のSpencer列の完全性が導かれる.独立変数の個数が3以上のときの考察も行ったが, Spencer列における微分作用素の構造に決定的に異なる様相が生じる為,方法論と構造に関して手がかかりとなりうる知見を得てはいるが,問題の一般的解決へ至るには画期的な方法等の新たな発見が必要であり今後の研究課題である.線型偏微分方程式系の楕円型過剰決定系に対するC^∞解の存在問題は,楕円型決定系の場合と異なり,微妙で難しい問題であり,非常に強い制約条件のもとでの結果しか得られていない.前年度では最も構造が簡単である2独立変数1未知関数に関する過剰決定系に対し,新しい方法を試み,楕円型包合系は局所C^∞解を有するということを示すことができた.

しかしながらこのクラスは余りにも狭くまた技術的にもその構造の特殊性を使う為,この実績のみを踏まえて直ちに一般の場合を研究するには飛躍がありすぎるので,本年度はまず独立変数の個数は2だが未知関数の個数には制限を設けない場合を考察することから始めた.一般に局所C^∞解の存在問題は,対応するある短い微分複体の完全性の問題として表現され,さらに後者はいわゆるSpencer列の第一項における完全性と同値であることが知られている.2独立変数の場合にこのSpencer列を調べると,単純で都合のよい局所表現を持つことが分かり,その結果前年度試みた方法をこの列に修正を施しつつ適用して,その完全性を示すことができた.かくして2独立変数に関する楕円型包合系は局所C^∞解を有するという定理を得た.これにより2独立変数の楕円型線型過剰決定系に対する局所C^∞解の存在問題は完全に解決されたことになる.引き続いて独立変数の個数が3以上の場合の考察にはいったが,微分方程式系の構造において2独立変数の場合とは決定的に異なる様相が生じる為,結果を得るには未だ不十分な段階に留まっている.
地域金融機関の利益の質とガバナンス構造

本研究の目的は、信用金庫と信用組合の利益について研究することにある。とくに、非営利協同組織である信用金庫や信用組合は、普通銀行とは経営目的が異なり、利潤最大化ではなく、地域の会員・組合員のために経営している。そのような行動原理の違いを明らかにするために、信用金庫や信用組合の利益をどのようにコントロールしているかをガバナンス変数を用いて実証的に分析することにある。今年度は、論文を完成させる機関であったが、研究代表者が本務校において学科長を務めたために時間的な余裕がなく、完成には至らなかった。今年度は、研究最終年であり、論文を完成させる予定であったが、それには至らなかった。現在、共同研究者と論文作成に当たっており、今年度中に完成させ、学会等で報告する予定である。研究課題は、地域金融機関の利益の質とガバナンス構造との関連性の有無、またその程度を明らかにすることにある。とくに、株式会社ではない信用金庫や信用組合は、地方銀行や第二地方銀行とはその存在意義・目的が会員や組合員の利便性を重視するといった意味で異なっており、また、経営範囲などの制約も厳しい状況にある。それゆえ、経営に関するガバナンスの在り方も異なっていると考えられる。本研究の目的は、もともと規模の小さな地域金融機関である信用金庫や信用組合がどのようなガバナンス構造を保有しており、ガバナンスが経営にどの程度影響しているかを実証的に明らかにすることにある。研究補助を受けた研究課題について、本年度(H28年度)の計画は、(1)関連研究の文献サーベイ、(2)具体的なリサーチデザインの策定、(3)必要なデータベースの作成であった。(1)については、日本の地域金融機関の経営に関する図書・論文を15本ほど読み、まとめた。また、海外における金融機関や一般事業会社の利益調整に関する論文とガバナンス構造と利益調整に関する論武運を10本ほどまとめた。(2)については、地域経済を専門とする先生、経済理論を専門とする先生、計量経済学を専門とする先生方に本研究の目的等をお話しし、来年度(H29年度、30年度)の研究計画のめどがついた。(3)については、10月に『日本金融名鑑』の最新版まで購入し、アルバイトを雇用してデータ入力を行った(現在も進行中)。上記、【研究実績の概要】でも述べたが、データ入力が遅れている。信用金庫や信用組合は機関数が多いうえに、ガバナンスの電子データが存在しないため、すべて手入力になる。そのため、当初の予定では、本年度中にデータベースの作成が終了する予定であったが、現在も進行中である。2017年度は、まず、昨年度から引き続き、信用金庫および信用組合のガバナンス関連・データの入力を進めた。年度末までに2000年度2014年度までの入力が完了した。さらに、関連既存研究のサーベイを進め、今年度より共同研究者になっていただいた福重元嗣大阪大学教授との研究打ち合わせを数回行い、また地域経済学の研究者である三井栄岐阜大学地域科学部教授とも議論することによって、本研究課題である地域金融機関の利益とガバナンスの関係について、データを用いて実証研究する準備が整いつつある。分析準備までの議論となったのは、信用金庫や信用組合は、利益追求型の金融機関ではなく、同じ預金取扱機関である銀行とは経営戦略が異なるため、利益についてどのように判断基準を設けるかが難しい問題であることが挙げられる。また、ガバナンスについても、理事や監事などが会員または組合員の中から互選されるため(公表データからは確認できないが、特に非常勤の理事・監事はその傾向にあるようである。)、ガバナンスと利益について関係をどのようにとらえるかが問題となる。後述するように、その論点を詰めるのに時間がかかった。また、データを用いた実証分析を行った結果から、説得的な解釈ができないこととが判明したため、それを補うために必要なデータを再入力した。現在、2015年度、2016年度のガバナンスデータを入力しており、6月末までには入力が完了する予定で、現時点で必要だと思われるデータの整備ができると考えられるので、実証分析を進めていく予定である。2017年度は、実証研究を行い、その成果をペーパーにする予定であったが、ガバナンスに関するデータ入力に時間がかかったことと、取得データで実証分析をしてみた結果、詳細な解釈をするために、必要なデータが不足していることに気付いたため、データ再入力に時間がかかったのが原因である。H29年度は、現在データ入力が終了している年度について単年度で信用金庫、信用組合の経営状況(利益など)とガバナンス構造の関係性を統計的にを実証分析していく予定である。H30年度には、全期間ので他をそろえ、単年度で得られた結果をもとにして実証分析を実施し、学会等で発表する予定である。また、H29年度より、大阪大学の福重元嗣先生を共同研究者として参加していただき(申請済み)、より深み胃のある研究にする計画である。

必要なデータ入力はほぼ完了したので、実証分析を行い、論文を作成する。時間的に間に合えば、所属学会である日本金融学会や日本経済学会での発表も予定している。また、共同研究者とともに毎年開催している研究会(現代経済学研究会)での報告をする。現在、共同研究者と論文作成に当たっており、今年度中に完成させ、学会等で報告する予定である。アルバイト謝金の見積もりが甘かったこととアルバイトによるデータ入力が思ったほど進まなかったため、支出が減少したため。データ入力の謝金分が余った。今年度は、その資金を含めてデータ購入に充てる予定である。データ入力のアルバイト謝金が利用できなかった。残金は、共同研究者との打ち合わせの旅費として使用する予定。繰り越し分は、H29年度のアルバイト謝金に使用する予定である。また、余剰が出た場合には、信用組合の財務データ購入代金に充てる(単年度分16万円程度の見積もり)。
アンジオテンシンII受容体過剰発現による腎炎増悪機構解析

AT1a受容体過剰発現マウスは塩分負荷により糸球体内の細胞数が増加し、細胞外基質や線維化促進サイトカイン(CTGF)陽性領域の増加が野生型マウスよりも顕著であった。IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)に対してグラム陰性細菌の細胞壁成分であるリポポリサッカライドを投与したところ、凝固系の活性化とともに細胞増殖反応が見られ、第Xa因子阻害剤によって抑制が見られた。さらにAT1a受容体過剰発現マウスとHIGAマウスの交配により生まれた個体では、収縮期血圧は野生型と比べヘテロ接合型で31週以降では常に上回るとともに線維化促進、増殖因子の発現促進が観察された。これらのことから、慢性期における糸球体腎炎の進展に対して塩分負荷の軽減やアンジオテンシン受容体拮抗薬、利尿薬(サイアザイド類似薬)の有用性や、急性増悪時の抗Xa阻害剤の有用性が示唆された。本研究では、新規レニンアンジオテンシン系亢進AT_<1A>受容体過剰発現マウスとIgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)を交配することにより、血管障害と糸球体硬化の進行する系を開発し、その機構を解析することを目的として研究を行った。AT_<1A>受容体過剰発現マウスの遺伝子型の判定法として、3プライマーを用いたPCR法を確立した。そしてHIGAマウスとAT_<1A>受容体過剰発現マウスの交配により,両者の遺伝的性質を有する個体を作製した。アンジオテンシンII受容体に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、受容体過剰発現マウスの腎組織では小動脈血管平滑筋細胞と糸球体メサンギウム細胞に強く発現が認められた。さらに高齢の受容体過剰発現マウスでは、糸球体の硬化や小動脈には線維化と血管構築像の崩壊所見が認められた。野生型では老齢になっても糸球体硬化像は乏しく、血管構築像の変性所見は乏しかった。HIGAマウスの凝固系活性化の特徴を検討するために、同マウスにリポポリサッカライド(LPS)を投与し、炎症を惹起させた。その結果、メサンギウム領域におけるフィブリンの沈着および、tissue factor, Factor V, Factor X, PAR1,2の発現とともに、同領域における細胞増殖とマクロファージの浸潤がみられた。さらにこれらの所見はコントロールマウスとしてのBalb/cマウスにくらべ、HIGAマウスのほうが顕著にみられた(論文投稿・改訂中)。本研究では、新規レニンアンジオテンシン系亢進AT_1a受容体過剩発現マウスとIgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)を交配することより、血管障害と糸球体硬化の進行する系を開発し、その機構を解析することを目的として研究を継続実施した。塩分負荷による糸球体肥大に関する検討により、PAS染色の所見から塩分負荷後、ホモ接合型、野生型ともに糸球体の肥大、細胞増殖が観察された。その際、ホモ接合型、野生型を比べた時に糸球体の面積は、ホモ接合型マウスにおいてより増加がみられた。また糸球体内の細胞数は、ホモ接合型マウスは有意に細胞数の増加がみられた。また抗CTGF染色、抗fibronect血染色おいて、PAS染色の所見と同様にホモ接合型、野生型に塩分負荷を行うことでそれぞれの陽性面積率が増加していた。そこで塩分負荷が線維化の悪化機序に関係していることが考えられた。次にIgA腎症におけるAT1a受容体刺激の役割を明らかにするため、PCR法を用いて雄性のAT_1a受容体過剰発現ヘテロ接合型マウスと雌性のHIGAマウスの交配により生まれた個体の遺伝子型の判定を行い、AT_1a受容体過剰発現遺伝子に関してヘテロ接合型マウス及び野生型マウスに群分けした。IgAの蓄積はAT_1a受容体野生型とヘテロ接合型で有意な変化は認めなかった。収縮期血圧は野生型と比べヘテロ接合型で約5mmHgと軽度な上昇が見られ、31週以降では常に上回っていた。PAS染色では、糸球体面積は野生型に比べヘテロ接合型の方が大きく、メサンギウム細胞の増殖も観察された。また、尿細管上皮細胞では空胞変性を認めた。マツソン・トリクローム染色、fibronec血免疫染色、CTGF免疫染色では、陽性面積が野生型に比べヘテロ接合型の方が有意に増加していたことから、AT_1a受容体を介した線維化促進、増殖因子の発現促進が起ったと考えられた。
中国先秦時代における領域支配の展開―「郡県制」形成前夜の地方統治制度をめぐって―

本年度前半は、前年度に引き続き、台湾・中央研究院歴史語言研究所に訪問学員として滞在した。その間の成果としては、論文(1)「先秦期における「郡」の形成とその契機」を執筆、これを『古代文化』に投稿し、査読の結果当該誌61-4号(2010年)に掲載された。本論文は従来研究の手薄であった先秦時代の「郡」を正面から論じるものであり、近年の出土資料による研究成果に鑑みつつ、文献史料の再検討を通じて、「郡」が形成されてゆく過程およびその契機を明らかにした。また翻訳を担当した張文昌著「中国中古における書儀の発展と『温公書儀』-『朱子家礼』の前奏」は、『高知大学学術研究報告人文科学編』58(2009年)に掲載された。2009年8月27日に帰国したのちは包山楚簡の研究に専念し、博士論文の一部となる論文(2)「包山楚簡の[宀邑]と[宀邑]大夫-戦国楚の行政単位と「郡県」」(『史林』に投稿予定)を執筆した。本論文は、包山楚簡に見える地方行政単位に関する先行研究を整理し、特に「[宀邑]」に焦点をあて、従来「郡県制」の観点から規定されてきたその性格の捉え直しを図るものである。2009年12月3日、以上の成果にもとづく博士論文『先秦時代の領域支配』を京都大学に提出、口頭試問を経て、2010年3月23日に京都大学博士(文学)の学位を授与された。本年の研究成果である上記の論文(1)は第四章に、論文(2)は第三章に相当する。本年度は論文「「県」の系譜-「商鞅県制」成立の前提として-」を執筆、日本秦漢史学会に投稿した(審査中)。従来の研究が中心課題としてきたのは先秦期における「県」制の展開であるが、春秋期についてはその特殊性解明が、戦国期についてはその軍事性の解明が、それぞれ研究の焦点となっており、両者の間を見通した研究はほぼ皆無であった。この問題に鑑み、春秋戦国中期までの「県」制の発展過程を明らかにした点に本論文の意義かおる。具体的な内容は次の通り。また本年度後半より、研究指導委託により台湾・中央研究院歴史語言研究所に訪問学員として滞在している。本所では充実した世界各国の研究書や期刊雑誌、最新のデータベースが日常的に使用でき、研究環境は極めて快適である。本所研究員の紹介により本年末に中国湖北省の博物館(湖北省博物館・荊門博物館等)を調査する機会を得たことは特に大きな収穫となった。
急速凍結分光法を使った金属酵素およびセンサー蛋白質の反応機構の研究

本研究課題で得られた成果は以下のとおりである.1.P450酵素における活性阻害剤の結合様式の検討ヘム酵素であるP450はバクテリアから高等動物まで広く分布し,種々の薬物の代謝において重要な役割を担っている.したがって,感染症の原因となる真菌類のP450の機能を選択的に阻害できれば抗菌剤として有望な薬剤の開発が期待できる.そこで本研究課題では結核菌とヒトのP450(CYP51)に対する活性阻害剤であるいくつかのアゾール化合物について,その活性阻害様式を共鳴ラマンスペクトルやEPRを用いることで,構造化学的に検討した.その結果,アゾール環の置換基の立体障害とその疎水性度を制御することによって結核菌のP450のみ選択的に結合するアゾール化合物の分子設計が可能であることを示した.2.ヘム酸化酵素中間体におけるラジカル位置の制御ヘムを含む酸化酵素であるペルオキシターゼ類は多くの動植物に存在し,種々の酸化反応を触媒している.これらの酵素はその反応中間体としてラジカル種を形成するが,そのラジカルの位置については基質の大きさに依存して異なることが知られている.つまり,小さな基質の場合は蛋白質に埋め込まれたポルフィリン環上に,大きな基質の場合は蛋白質表面に露出したアミノ酸上に形成される.われわれは既に小さな基質に対する酸化酵素である西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)について,蛋白質表面に芳香族アミノ酸を導入することで、ラジカル位置をポルフィリン環上から導入した芳香族アミノ酸に移動できることを報告してきた.今回,その移動したラジカル種による活性を検証するために,野生型のHRPでは反応性が低い立体障害の大きな基質を用いて検討したところ,蛋白質表面にラジカル種を有する変異体ではその活性が数十倍に増大し,ラジカル位置の制御によってヘム酵素の基質特異性が制御できることが示された.本年度に得られた研究成果は以下の通りである.1.プロリン水酸化酵素の発現と精製.高等動物における酸素濃度センサーと想定されている4-プロリン水酸化酵素に急速凍結分光法を応用するため,その大量発現系と精製手法の確立を試みた.発現系としては大腸菌を用い,His-tag融合蛋白質で精製した後,TEVプロテアーゼでHis-tag部分を切断することで,tagのないP4Hを精製することに成功した.蛋白質の純度としてはSDS電気泳動から90%程度,収量は培地1リットルあたり0.21mgであった.収量についてはまだ改善する必要はあるが,通常の分光法であれば測定可能であるので,本年度は過渡的な分光情報の基礎となる定常状態での分光学的性質を検討することとした.2.銅イオン置換プロリン水酸化酵素の金属イオン周辺構造4-プロリン水酸化酵素への金属イオンの配位を確認するため,アポ蛋白質に銅イオンを加え,そのEPRシグナルを測定した.その結果,g_⊥=2.05と考えられるシグナルとg_<//>=2.21と考えられるシグナルが観測され,これは銅イオンに窒素原子が2個配位した典型的なEPRスペクトルパターンであった.このEPRシグナルの解析からA_<//>=14mT,が求められ,プロリン水酸化酵素の鉄イオンの配位環境は,従来報告されているタウリン水酸化酵素の場合と類似であることが明らかになった.また,タウリン水酸化酵素の場合に補欠分子として必要なα-ケトグルタル酸を4-プロリン水酸化酵素へ添加したところ,このESRシグナルに変化がみられ,タウリン水酸化酵素同様,4-プロリン水酸化酵素においてもα-ケトグルタル酸が鉄イオンに配位することが示された.本研究課題で得られた成果は以下のとおりである.1.P450酵素における活性阻害剤の結合様式の検討ヘム酵素であるP450はバクテリアから高等動物まで広く分布し,種々の薬物の代謝において重要な役割を担っている.したがって,感染症の原因となる真菌類のP450の機能を選択的に阻害できれば抗菌剤として有望な薬剤の開発が期待できる.そこで本研究課題では結核菌とヒトのP450(CYP51)に対する活性阻害剤であるいくつかのアゾール化合物について,その活性阻害様式を共鳴ラマンスペクトルやEPRを用いることで,構造化学的に検討した.その結果,アゾール環の置換基の立体障害とその疎水性度を制御することによって結核菌のP450のみ選択的に結合するアゾール化合物の分子設計が可能であることを示した.2.ヘム酸化酵素中間体におけるラジカル位置の制御ヘムを含む酸化酵素であるペルオキシターゼ類は多くの動植物に存在し,種々の酸化反応を触媒している.これらの酵素はその反応中間体としてラジカル種を形成するが,そのラジカルの位置については基質の大きさに依存して異なることが知られている.つまり,小さな基質の場合は蛋白質に埋め込まれたポルフィリン環上に,大きな基質の場合は蛋白質表面に露出したアミノ酸上に形成される.われわれは既に小さな基質に対する酸化酵素である西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)について,蛋白質表面に芳香族アミノ酸を導入することで、ラジカル位置をポルフィリン環上から導入した芳香族アミノ酸に移動できることを報告してきた.今回,その移動したラジカル種による活性を検証するために,野生型のHRPでは反応性が低い立体障害の大きな基質を用いて検討したところ,蛋白質表面にラジカル種を有する変異体ではその活性が数十倍に増大し,ラジカル位置の制御によってヘム酵素の基質特異性が制御できることが示された.