hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アソーシエーション解析によるセイヨウナタネの窒素利用効率の遺伝子分析

174のセイヨウナタネ系統を用い、高窒素と低窒素条件で栽培し、本葉5枚程度の幼苗期に、葉の大きさ、地上部の乾物重やSPAD値(葉の緑色程度)の調査を行った。低窒素条件では植物体乾物重や葉の大きさが低下したが、セイヨウナタネの一部の系統はあまり低下せず、高NUE(窒素利用効率)系統の候補と考えられた。また、SPAD値の差異があった90系統を選び、窒素濃度、炭素濃度の測定を行った。C/N比は窒素利用効率に関する重要な形質であり、90系統において、低窒素下のC/N比は高窒素下より1.032.29倍に高くなることが示された。以上の調査により得られた形質データと先行研究で整備された19,945のSNPデータと組み合わせ、GWASを行った。低窒素下でのSPAD値、高窒素下でのC/N比、高窒素下と低窒素下での窒素濃度等の特性のGWASピークがA10の1315Mbの領域に集中しており、この領域はNUEの改良に重要であると考えられた。この領域の遺伝子の機能アノテーションを行い、窒素同化の主要な経路に関わる重要な遺伝子例えばグルタミンシンテターゼ遺伝子GS1、グルタミン酸シンターゼ遺伝子GOGAT、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子GDHを同定した。外国人特別研究員が8月1日に国立研究法人農業生物資源研究所に任期付研究員として就職したため、平成27年度は4ヶ月で研究を中断せざるを得なかった。半分以上のサンプル(1,800)の窒素含量を測定し、アソーシエーション解析を行い、候補遺伝子を推定したが、遺伝子の発現解析や遺伝子型分析は出来なかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。セイヨウナタネにおける窒素利用効率は植物体の構造との強い関連があり、草丈が低く、莢がつける枝が多いタイプは窒素をはじめとする養分の利用効率と収穫係数が向上し、多収化が実現したため、中国農業科学院油料作物から提供されたナタネ遺伝資源の472系統における3年間の草丈と枝の数の形質データとそれら系統の遺伝子型データと合わせて、アソーシエーション解析を行った。その結果、草丈と枝の数に関するQTL領域をそれぞれ7つと5つ見出した。A3に検出された草丈と枝の数のQTLは効果が高く、複数年にわたって検出された。シロイヌナズナなどの植物の草丈と枝の数に関する遺伝的基礎の情報に基き、QTL領域にある候補遺伝子を推測した。以上の結果をまとめた論文を投稿した。中国武漢の油糧作物研究所で調査した300系統の幼苗期における窒素吸収効率のデータを利用し、アソーシエーション解析し、2014年8月に公開されたセイヨウナタネのゲノム塩基配列を利用し、窒素吸収効率に関連するQTL領域にある候補遺伝子を推測した。低窒素下での乾物重に関連度が一番高いQTL領域にあるグルタミン合成酵素遺伝子GS2を候補遺伝子として注目し、系統間の塩基配列変異を明らかにした。以上の結果をまとめ、アメリカで行われたInternational Plant & Animal Genome XXIIIでポスター発表した。300系統の中から174系統を選び、東北大学農学研究科で窒素吸収効率を評価した。現在はデータを整理しているところである。26年度の研究実施計画は主に2つであった。一つは同じ300系統を用いて再度窒素吸収効率の評価を行い、反復データを取り、アソーシエーション解析を行うことである。スペースに限りがあるため、300系統の中の174系統を選び、東北大学農学研究科で窒素吸収効率を評価した。

現在はデータを整理しているところである。もう一つは候補遺伝子の変異を同定し、SNPマーカーを作成し、多数系統の遺伝子型分析を行うとともに、遺伝子発現解析を行うことである。26年度は低窒素下での乾物重に関連性が一番高いQTL領域にある候補遺伝子において、系統間の塩基配列変異を明らかにした。今はこの変異を検出するSNPマーカーを作成し、全系統の遺伝子型を分析しているところである。26年度の計画には書いていないが、ナタネにおける窒素利用効率に強い関連がある植物体の構造に関する形質のアソーシエーション解析を行い、結果をまとめ、論文を投稿した。27年度が最終年度であるため、記入しない。窒素吸収効率を2反復で評価したが、植物体窒素の含量はまだ測ってないため、本年度は全部のサンプル(約2,800)の窒素の含量を測る。その結果をもとに、アソーシエーション解析を行い、前年度と同じように候補遺伝子を推定し、変異を同定し、多数系統の遺伝子型分析を行うとともに、遺伝子発現解析を行う。また、グルタミン合成酵素遺伝子GS2について全系統の遺伝子型を分析し、発現解析を行い、窒素利用特性との関連を確認する。確認ができたら、その遺伝子を植物に導入し、高窒素利用効率に関わる候補遺伝子の機能を証明する。得られた成果を取りまとめ、学会発表を行いもとに論文を書く。
P/V比が2のバナジウムーリン系複合酸化物を用いた無水マレイン酸合成に関する研究

バナジウムーリン系複合酸化物のうちP/V比が2つのものに着目し、その結晶化過程やブタンからの無水マレイン酸(MA)合成能を明らかにするとともに、第3成分金属の添加効果について検討した。P/V=2の複合酸化物は、500600°Cでの焼成後はアモルファス状態であるが、さらに焼成温度を上げると(VO)2P4O12相が成長しはじめ750780°C焼成後は(VO)2P4O12相単相となった。また、800°C以上の焼成では(VO)2P4O12相以外に不明相が現れた。このような結晶化過程は赤外吸収スペクトルにおいても確認された。これら種々の焼成温度の触媒を用いてブタン酸化反応を行ったところ、780°C以下で焼成した触媒は50mol%程度のMA選択性を示した。一方、800°C以上で焼成した触媒ではMA選択性は35mol%以下に低下し、不明相の生成がMA合成を妨げていることがわかった。このようにP/V=2の(VO)2P4O12相あるいはこれとアモルファス相の混合相を有するV-P-O触媒は、従来から活性相といわれている(VO)2P2O7相(P/V=1)を含まないにもかかわらず、比較的高いMA合成能を有することがわかった。その一方で、P/V=2のV-P-O触媒は比表面積が23m^2/g程度であり、ブタン酸化活性はあまり高くない。これを改善するためにBi,Mg,Mn,Coなどの第3成分金属イオンの添加を試みた。その結果、500°C焼成後のアモルファス触媒において顕著な効果が見られた。特に、Co添加触媒においては、単独触媒の高いMA選択率を維持しつつブタン酸化活性が向上しており、単独触媒に比べてMA収率が増大した。しかし、780°C焼成により結晶化させると、すべての金属イオンの添加の場合についてMA収率は低下した。金属イオンは、アモルファス状態では触媒内部に取り込まれて特性を改質するのに対し、結晶状態では内部に入ることができず、MA合成を妨げるものと考えられる。
動き補償を利用した動画像の実時間背景・対象物分離アルゴリズムとハードウエアの開発

昨年までは,カメラを1次元的に左右に動かした場合のみを取り扱っていたが,より一般性を高めるために,カメラを上下左右にも動かした上での動き推定の効率化を行った.さらに,高速かつ高性能な動き推定アルゴリズムとして知られる共役法の初期探索ベクトルの推定に,ジャイロセンサからの情報を用いることで,共役法をさらに高速かつ高性能にすることを目指した.共役法は,全探索より画像品質を大きく落とさずに探索にかかる演算量を大幅に減らすことができる.通常共役法の初期探索ベクトルは,0付近,過去の履座,左と上のマクロブロックの動きベクトルの3つの候補のなかから選ばれる.ここでは,ジャイロセンサから求められた動きベクトルを共役法の初期探索ベクトルとした手法を新たに提案して,その演算量,画質の検討を行った.カメラの動く速度は,不均一であり,このようなカメラの動きに対して,共役法では画面の動きとは全く関係なく,0近傍の動きベクトルがもっとも多いことがわかった.共役法では,演算量は少ないが,全探索と比べて,SADの値が3%程度悪くなる.これに対して,提案手法では,共役法のみの場合に比べて演算量が30%になっているにも関わらず,SADは1.7%程度の劣化にとどまっていることがわかった.提案手法で求めた動きベクトルの中心値は,全探索で求めたものとほぼ同じ動きをする.ここでの撮影対象は,すべて静止物体である.提案手法の初期探索ベクトルは,すべてジャイロセンサから求めたものを用いている.実際には,被写体,背景,その他の3つに分類される.今後は,既存の共役法の初期ベクトルに,ジャイロセンサから得られたベクトルを加えることを検討したい.今年度は,まずジャイロセンサを用いてカメラの動きベクトルを抽出し,リアルタイムに動画像をカメラから計算機に取り込むための機構を構築した.次に,ジャイロセンサから得られた動きベクトルと画面の動きから得られた動きベクトルを比較し,ジャイロセンサからの情報から,正しく動きベクトルが求められることを証明した.誤差は,多くとも,数ピクセルであった.室内,屋外にて,構築したシステムにより動画像とジャイロセンサからの情報をリアルタイムに取り込み,そのサンプル画像を用いて,提案手法の有効性を評価した.提案手法は,被写体に対応した「中央領域」,背景に対応した「ジャイロ領域」,周辺からの予測に求める「予測領域」の3領域を適応的に探索することで,動きベクトルを求める.それぞれの領域を足しても,従来手法の探索範囲より大幅に狭くなる.ある程度良い動きベクトルが求まった時点で探索を中止することにより,さらに演算量を減らすことができ,サンプル画像では,演算量を全探索の1/3から1/5に減らすことができた.「ジャイロ領域」はカメラの動きが激しい場合,従来の全探索手法で探索する範囲を越えて探索することになり,画質の向上に寄与する.実際に,動きの激しい画像や,フレームレートが小さい画像で画質の向上を確認することができた.本研究の成果を積極的に発表し,日本工業新聞の記事として採用された.次年度は,動き補償だけではなく,動画像から背景をリアルタイムに抽出する個とも検討してみたい.昨年までは,カメラを1次元的に左右に動かした場合のみを取り扱っていたが,より一般性を高めるために,カメラを上下左右にも動かした上での動き推定の効率化を行った.さらに,高速かつ高性能な動き推定アルゴリズムとして知られる共役法の初期探索ベクトルの推定に,ジャイロセンサからの情報を用いることで,共役法をさらに高速かつ高性能にすることを目指した.共役法は,全探索より画像品質を大きく落とさずに探索にかかる演算量を大幅に減らすことができる.通常共役法の初期探索ベクトルは,0付近,過去の履座,左と上のマクロブロックの動きベクトルの3つの候補のなかから選ばれる.ここでは,ジャイロセンサから求められた動きベクトルを共役法の初期探索ベクトルとした手法を新たに提案して,その演算量,画質の検討を行った.カメラの動く速度は,不均一であり,このようなカメラの動きに対して,共役法では画面の動きとは全く関係なく,0近傍の動きベクトルがもっとも多いことがわかった.共役法では,演算量は少ないが,全探索と比べて,SADの値が3%程度悪くなる.これに対して,提案手法では,共役法のみの場合に比べて演算量が30%になっているにも関わらず,SADは1.7%程度の劣化にとどまっていることがわかった.提案手法で求めた動きベクトルの中心値は,全探索で求めたものとほぼ同じ動きをする.ここでの撮影対象は,すべて静止物体である.提案手法の初期探索ベクトルは,すべてジャイロセンサから求めたものを用いている.実際には,被写体,背景,その他の3つに分類される.今後は,既存の共役法の初期ベクトルに,ジャイロセンサから得られたベクトルを加えることを検討したい.
癌や生活習慣病の発症・進展に関与するANGPTL2発現のエピゲノム制御機構の解明

癌組織内の低酸素や低栄養といった環境変化により骨肉腫細胞におけるDNA脱メチル化関連酵素の発現が亢進し、ANGPTL2プロモーター領域のDNA脱メチル化が促進されることで、ANGPTL2の発現が誘導されることを見出した。ANGPTL2発現上昇に伴い骨肉腫細胞から分泌されたANGPTL2タンパク質は、骨肉腫細胞自身の浸潤能や腫瘍血管内侵入を亢進することで転移を促進することが明らかとなった。さらに、ANGPTL2がTLL1によって切断され、その転移促進能が不活性化されることが明らかとなり、TLL1によるANGPTL2の切断を促進することが、癌転移に対する新たな治療標的となる可能性が示唆された。本研究の実績として、DNAメチル化によってANGPTL2発現レベルの低い骨肉腫細胞をマウスの脛骨に移植すると、がん細胞におけるTETファミリーなどのDNA脱メチル化経路関連遺伝子の発現が誘導され、ANGPTL2プロモーター領域のDNA脱メチル化が引き起こされることで、ANGPTL2発現が誘導されることを見出した。さらに、がん細胞を低酸素・低栄養といったがんの微小環境下で培養したところ、移植モデルと同様に、DNA脱メチル化経路関連遺伝子の発現誘導を認めた。以上より、がん微小環境によって、がん細胞に置けるANGPTL2のプロモーター領域の脱メチル化が引き起こされ、ANGPTL2の発現が誘導されるといったエピジェネティックなANGPTL2発現調節機構が明らかとなった。また、新たなANGPTL2によるがん転移促進機構として、がん細胞から分泌されたANGPTL2がintegrin α5β1/p38 MAPK/MMP経路を活性化することで、がん細胞の浸潤能を促進することを明らかにした。さらに、分泌されたANGPTL2タンパク質に全長型だけでなく、プロセシングされた切断型が存在すること、切断型ANGPTL2はがん転移促進作用を失っていることを見出し、その切断に関わる切断酵素としてTLL1を同定している。さらに、TLL1の発現は、種々のがん細胞において発現が抑制されていることから、TLL1によるANGPTL2の切断を促進することが、がん転移に対する新たな治療標的となる可能性を見出している。本年度の研究成果として、ANGPTL2の発現制御に関わる新規転写調節領域を同定する目的で、ANGPTL2発現レベルが高く、プロモーター領域のDNAメチル化レベルが低いヒト膵癌細胞株とANGPTL2レベルが低くプロモーター領域のDNAメチル化レベルが高いヒト膵癌細胞株を用いてヒストンH3のK4メチル化(H3K4me1)やK27アセチル化(H3K27Ac)を指標にChIPアッセイによる解析を行った。その結果、ANGPTL2レベルが低くプロモーター領域のDNAメチル化レベルが高いヒト膵癌細胞株に比べ、ANGPTL2発現レベルが高く、プロモーター領域のDNAメチル化レベルが低いヒト膵癌細胞株において、ANGPTL2上流約10kbpの位置にH3K4me1やH3K27Acの高いシグナルが得られた。この領域はFAIRE法による解析から、オープンクロマチンの状態であることが示唆され、さらに、3Cアッセイによるクロマチン立体構造の解析を行ったところ、ANGPTL2プロモーター領域と上流の新規転写調節領域との相互作用が認められた。以上の結果から、当該領域がANGPTL2の転写調節領域として機能していることが示唆された。今後、プロモーター領域との相互作用に関わる因子を同定し、ANGPTL2発現制御における機能やANGPTL2の発現が誘導される病態との関連を明らかにする予定である。分子遺伝学平成25年度では、当該年度の研究項目であるDNAメチル化によるANGPTL2発現制御機構の解析において、がんの微小環境によって、がん細胞におけるANGPTL2プロモーター領域のDNA脱メチル化が引き起こされ、ANGPTL2発現が誘導されるといったエピジェネティックなANGPTL2発現調節機構、integrin α5β1/p38 MAPK/MMP経路を介したANGPTL2のがん転移促進機構を明らかにした。また、ANGPTL2プロモーター領域のDNAメチル化レベルとH3K9me3、H3K27meおよびH3K27Acレベルとの相関も見出している。がん細胞においてANGPTL2発現誘導に関与するヒストン修飾および新規転写調節領域の同定に向け、ANGPTL2の発現レベルが高い膵がん細胞株と発現レベルが低い膵がん細胞株を用いてH3K4me1およびH3K9Acに対するChIPアッセイを行い、ANGPTL2発現レベルの低いがん細胞株に比べ発現レベルの高いがん細胞株において、エンハンサーと考えられる複数の領域を見出した。さらに、これらの領域を対象に、プロモーター領域との相互作用を解析するため、3C法による解析準備を進めているところである。

以上より、本研究は当初の計画以上に進展しているものと考える。平成26年度では、ANGPTL2の発現レベルが高い膵がん細胞株と発現レベルが低い膵がん細胞株を用いてH3K4me1およびH3K9Acに対するChIP-seq解析を行い、より詳細にANGPTL2発現誘導に関与するヒストン修飾および新規転写調節領域の解析を行う。また、3C法によるプロモーターとエンハンサーの相互作用解析を行うとともに、相互作用に寄与する転写因子などの制御因子をChIPアッセイやゲルシフトアッセイを用いて同定する。さらに、同定した制御因子を過剰発現またはノックダウンしたがん細胞を樹立し、リアルタイムPCRによりANGPTL2の発現を評価するとともに、免疫不全マウスへの移植実験を行い、当該制御因子によるANGPTL2発現とがん転移との関連を解析する。
ラット水浸拘束ストレスモデルにおけるSSRI、SNRIの大腸運動への効果

拘束ストレス単独と比較して、水浸拘束ストレスでは有意に大腸内圧が亢進し、SSRI、SNRI投与にて、ストレス負荷による消化管運動の亢進は抑制され、慢性投与で効果の持続、作用の増強が確認できた。ストレスによる消化管運動亢進に対して、SSRI,SNRIの有効性が示唆された。過敏性腸症候群のような機能性消化管障害では、様々な刺激に対して消化管は過剰反応を示し、ストレスが加わると症状は増悪する。IBSの病態生理として研究されている消化管の運動異常および脳腸相関に着目し、ラットのストレスモデルを考案した。ストレス潰瘍の代表的なストレス負荷法である水浸拘束負荷は、ラットに十分なストレスを与えうる方法の一つであるが、水浸拘束負荷により大腸運動がどのように変化するかについては、検討が不十分である。圧トランスジューサーにより、腸管運動をリアルタイムに評価することで、水浸拘束負荷によるストレスが腸管運動にどのような影響を及ぼすか、評価を行った。SD系ラットを用い、24時間絶食後、エーテルにて吸入麻酔を行い、圧トランスデューサーを経肛門的に挿入し、先端の圧受容体の位置が肛門から3cmに固定した。ラットをネットでラッピングし拘束した状態で、室温にて1時間、大腸内圧を測定した。引き続き、拘束した状態のまま水温20°Cの水に剣状突起まで浸し、さらに1時間大腸内圧を測定した。大腸内圧曲線を記録し、得られた大腸内圧曲線から、15分間ごとにArea under curve(AUC)を求めて、運動係数(Motility Index : MI)を算出した。拘束負荷のみの場合と比較して、水温20°Cでは有意にMIの増加があり、ストレスにより大腸運動は亢進した。したがって、水浸拘束負荷はラットに十分なストレスを与えうる負荷であり、ストレスによる腸管運動の亢進をリアルタイムに評価できる有効な実験系であることが確認できた。さらにストレス条件下において、三環系抗うつ薬、SSRI、SNRI、マイナートランキライザー、ラモセトロン投与を行うことで、ストレスと腸管運動、薬剤の影響の評価を行うことが可能であることが確認できた。paroxetine 3mg/kg、fluvoxamine 30mg/kg、milnacipran 30mg/kgを蒸留水2mlに溶解し、胃管ゾンデを用いて強制経口投与し、薬剤投与後60分後に測定を開始した。投与初日、7日目、14日目に測定を行い、また、薬剤を投与しない群においては、蒸留水のみを強制経口投与した。ラットを拘束した状態で、室温にて1時間、大腸内圧を測定した。得られた大腸内圧曲線から、15分間のArea under curve(AUC)を求めて、運動係数(Motility Index:MI)を算出した。水浸拘束後にMIは有意に増加し、消化管運動の亢進を認めた。コントロール群と比較すると3剤ともに投与1日目から有意に腸管運動抑制効果が認められた。コントロール群、薬剤投与群とも投与初日と比較して日数が経つにつれてMIは減少したが、薬剤投与群で有意にMIは抑制された。SSRI、SNRI内服にてストレス負荷による消化管運動の亢進は抑制され、慢性投与でも効果の持続が確認できた。今後、各投与時期による薬剤間の比較検討を行うべく、データ解析を行っている。paroxetine3mg/kg、fluvoxamine30mg/kg、milnacipran30mg/kgを蒸留水2mlに溶解し、胃管ゾンデを用いて強制経口投与し、薬剤投与後60分後に測定を開始した。得られた大腸内圧曲線から、15分間のArea undercurve(AUC)を求めて、運動係数(Motihty Index:MI)を算出した。水浸拘束後にMIは有意に増加し、消化管運動の充進を認めた。コントロール群、薬剤投与群とも投与初日と比較して日数が経つにつれてMIは減少したが、コントロール群と比較して薬剤投与群で有意にMIは抑制された。薬剤間の比較では有意差がなかったが、投与初日でparoxetineのMIが低く、14日目ではmilnacipranが低くなる傾向があった。paroxetineの抗コリン作用による消化管運動抑制作用が投与初日から観察されたと考えられた。
肺構造モデル解析に基づく機能的残気量(FRC)測定のシステム同定

研究目的本研究は、機能的残気量(FRC)測定値の決定因子および検査結果に影響を及ぼす要因を明らかにするために、健常症例を対象にしたFRC測定のモデル解析を行った。また、生理的な肺内不均等分布の関与について調べFRC測定のシステム同定を試みた。研究方法肺機能検査のすべての項目の基準範囲を満たす症例200例(男性92例、女性108例)を無作為に抽出し対象とした。また、FRC値による細分類によりサブ解析を行った。FRCは、ヘリウム(He)ガス閉鎖回路法によって測定した。肺の構造モデル解析は、コンパートメントモデル解析を行った。また、He濃度平衡曲線から、0.25分間(15秒間)ごとの時限変化量を求め、それぞれの区間の変化量を要素とした単変量解析および重回帰分析を行った。研究成果コンパートメントモデル解析では、He濃度平衡動態から、肺は、比較的単純な構造の一つの混合室であり、肺末梢の生理学的な気流の肺内不均等分布を検出できないことが明らかになった。He濃度平衡曲線の解析では、検査開始直後のHe濃度の時限変化量(単変量)では、FRC測定値を十分に説明できなかった。検査開始初期の要素と中盤の要素をそれぞれ統合した0.25-0.75分間と1.00-1.50分間の2要素を説明変数とすることで、重相関係数0.949、決定係数0.899と良好な適合度を示した。回帰分析の結果は、肺末梢の構造によってモデルの完全性が失われたと考えることで説明できた。記録中間の変化量因子は、肺末梢の構造に由来する不完全混合室に適応するための修正項とみなされた。Heガス閉鎖回路法によるFRC測定は、生理的な肺内不均等分布の関与しない比較的簡単な肺構造でのガス拡散を反映していた。FRC測定は、一つの不完全混合室へのHeガスの拡散モデルとしてシステム同定された。肺末梢の微細な構造による換気不均等を反映しない反面、検査開始初期と中間の濃度変化量を規定因子とした重回帰式で良好なFRCの推定値の算出が可能であった。
戦後日本の社会像の検討-「子ども」と「社会」の関係性イメージを切り口にして

本研究は、「子ども」と「大人」双方の子ども観や社会像を表す言説を収集・分析することで、「社会」を一枚岩で実体的なものとみなし、「子ども」を「社会」の存続の鍵と見る社会観を再考し、新たな戦後日本社会の理論化を目指すものである。1.(1)戦前を含む現代までの子どもの言説資料の収集中でも中学校の生徒会誌の近年分が当初予定より多く収集でき、分析済み部分との比較や、同時代の毎日中学生新聞の投書欄との比較を厚みを持って行えた。成果として、「社会化の揺らぎ」「子ども期の消滅」などと言われる近年の子どもの変化について、「子ども」概念のずれとして描き直した(元森2005)。1.(2)子ども言説の位相に関する方法論的な検討女性研究やマイノリティ研究の理論、読者共同体や書くことについての理論を収集、検討すると同時に、(1)にあげた独自に収集した子どもの作文資料において多領域の文書の比較や戦前からの作文の変容を実証的に分析し、「子ども」を自由でかつ大人の理想の枠内に留まるべきものと見なすという、教育的想像力の誕生と変遷の記述作業を行っている。その一部は、第57回日本教育社会学会(2005年9月、幕張)で報告すると同時に、現在論文投稿を準備している。2.近年の「子どもの権利」「子どもの自由」などに関する言説の収集とフィールドワーク旧来型の「教え込み」による「子どもの社会化」へのオルターナティブとして提起されている、上記の概念に注目し、「権利」を語る言説のバリエーションを整理した。また、東京都世田谷区を中心とするプレーパーク活動へのフィールドワークを行い、「子ども」と「大人(社会化エージェント)」の非権力的な関係性の(不)可能性について分析を行った。成果は、現在論文として投稿中の他、現実的な子ども施策に反映させるべく同活動に関する調査プロジェクトと共同し、実態調査を行った。本研究は、「子ども」と「大人」双方の子ども観や社会像を表す言説を収集・分析することで、「社会」の存続の鍵に「子ども」を見る社会観を問い直すものである。本年度は、補助金を受けて、効率的な資料収集・分析を行うことができた。第1に、子どもの言説資料の収集を集中的に行った。以前より収集していた中学校の生徒会誌を追加収集した他、毎日中学生新聞の投書欄を1983年から最新のものまですべて網羅的に収集・分析した。20年分の学校、友人、自分に関する投書の量と内容の変遷を分析することで、「社会化の揺らぎ」「子ども期の消滅」などと言われる近年の子どもの変化について、「子ども」概念のずれとして描き直し、同時に「自分らしさ」の論理が教育(社会化)の領域に入ってきたことの意味を検討した。成果は、第11回日本子ども社会学会(2004,6、博多)で報告した他、元森(2005)として発表予定である。なお、当初の見込みより都内で入手可能な資料が多かったので、旅費の予定分を複写費や文献購入費、記録・整理用のOA機器購入に当て、より効率的な分析が行えた。第2に、公的教育(社会化)へのアンチテーゼとも見られがちな市民活動の資料収集を行った。中でも、東京都世田谷区を中心とするプレーパーク活動を集中的に検討し、一方で、近代社会の持つ大人と子どもの権力性の究極的な回避しがたさ、社会化図式の否定しがたさと、他方で、それが極小化する瞬間の存在を記述する試みを行っている。成果は、第77回日本社会学会(2004,11、熊本)で報告した他、論文として執筆中である。第3に、社会化論に関する理論的検討のための文献収集を行った。古典的な理論的文献の他、国内で社会化論が受容され批判された過程を分析するために、社会化に言及した書籍・論文を網羅的に収集、分析した。資料のリストアップと収集は、謝金を支出し人員を雇うことで効率的に行うことができた。

2.近年の「子どもの権利」「子どもの自由」などに関する言説の収集とフィールドワーク旧来型の「教え込み」による「子どもの社会化」へのオルターナティブとして提起されている、上記の概念に注目し、「権利」を語る言説のバリエーションを整理した。また、東京都世田谷区を中心とするプレーパーク活動へのフィールドワークを行い、「子ども」と「大人(社会化エージェント)」の非権力的な関係性の(不)可能性について分析を行った。成果は、現在論文として投稿中の他、現実的な子ども施策に反映させるべく同活動に関する調査プロジェクトと共同し、実態調査を行った。
海洋性珪藻の二酸化炭素応答分子モデルを用いた海洋一次生産変動予測に関する基礎研究

海洋性珪藻の炭酸脱水酵素が葉緑体内で顆粒状に複合体を形成する機構を決定した。また、遺伝子発現レベルでのCO_2応答に必須な新規分子スイッチを見出し、このCO_2依存的な制御にサイクリックAMPと呼ばれる2次情報伝達分子が関わることを明らかにした。これらの結果は海洋性珪藻の効率的なCO_2固定と、その環境CO_2依存的調節の分子機構解明に寄与する結果であり、海洋表層に於ける主要なCO_2固定系を制御する分子機構の理解に資するものである。表記課題を遂行するためのサブプロジェクトとして平成18年度は3項目について研究を実施し、以下に述べる成果を得た。(1)無機炭素濃縮機構(CCM)の中心となる分子機構の解明のために、海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutum葉緑体カーボニックアンヒドラーゼ(PtCA1)の局在を決定する機構を調べたところ、PtCA1が葉緑体ガードルラメラ上に顆粒を形成する分子機構としてPtCA1のC末端ヘリックスに存在する疎水性クラスターが必須の働きを持つことが明らかとなった。この局在特性のCCMとの生理的つながりをさらに調べるために、CO_2固定酵素であるRubiscoとの局在比較を行った。現在Rubisco小サブユニット遺伝子(rbcS)をクローニングし、egfpあるいはcfpで蛍光標識後、P.tricornutum内で発現させることにより、CO_2流路調節系であるPtCA1とCO_2固定系であるRubiscoとの機能的連携を調べている。(2)海洋表層のCO_2濃度に応答して一次生産効率を制御するための分子機構を探るため、典型的なCO_2応答性を示す、ptca1プロモーター領域内の機能配列を塩基削除および塩基置換により精査した。その結果、ptca1プロモーターの転写開始点から上流70塩基までに存在する、cAMP応答配列CRE1およびそれに隣接するp300結合配列が高CO_2環境下および光の非存在下における転写抑制に必須の働きを持っことが明らかとなった。この結果はPlant Physiol.(2006)142巻に掲載済みである。(3)今世紀半ばまでの間に予想される海洋表層の環境変動のうち、CO_2濃度および塩濃度の変動に対して細胞が示す挙動を遺伝子発現レベルで追跡するためにAmplified fragment length polymorphism(AFLP)法を用い、発現変動遺伝子群をP.tricornutumで半網羅的にスクリーニングした。現在、塩およびCO_2応答性を確認した遺伝子それぞれ14および30を単離した。表記課題を遂行する為に設定したサブプロジェクトとして、平成19年度は3項目について、研究を実施し、以下に述べる成果を得た。1.無機炭素濃縮機構(CCM)の中心となる分子機構解明のために、葉緑体型カーボニッグアンヒドラーゼPtCA1がチラコイド上に顆粒を形成する時に共局在し、高効率なCO_2固定に資するタンパク質因子を探索した。その結果、Rubiscoは共局在因子では無い可能性が高かった。一方、低CO_2環境下で重要と考えられている緑藻の機能未知タンパク質、Lci遺伝子のホモログ4種を海洋性珪藻で見出し、この発現量を分析したところ、3種が低CO_2誘導性であり、1種が定常的な発現を示した。現在、Lciタンパクの葉緑体内での局在を調べている。2.CCMを海洋表層のCO_2濃度変化に応じて転写レベルで調節する分子機構を詳細に解析した。その結果、昨年度まで考えられていた遺伝子プロモーター領域の配列内に更に新たなシス領域枠を見出した。この配列は互いに逆方向に3回並ぶ6塩基の相同配列を中心としており、研究からこのうちの2つのエレメントが存在していればCO_2応答をプロモーター領域に与えることが分かった。さらにこの配列がcAMP応答領域であることがわかり、CO_2応答性の新たなプロモーター構造の同定に至った。3.21世紀半ばまでに予測される環境変動の海洋一次生産に及ぼす影響を珪藻細胞内の分子レベルから予測することを目的とし、CO_2応答性のみならず、海洋の塩分濃度および鉄濃度に応答する遺伝子をcDNA-AFLP法で探索した。ここで捕らえた応答性遺伝子は数十種にのぼった。この遺伝子発現を実際の海洋環境で追跡する為の実験系を構築する為に、平成19年度は親潮域の海洋調査船に乗船し、海水からのmRNA抽出とこれを用いた遺伝子発現解析を試みた。表記課題を遂行する為に設定したサブプロジェクトとして、平成20年度は3項目について、研究を実施し、以下に述べる成果を得た。1.無機炭素濃縮機構(CCM)の中心となる分子機構解明のために、ゲノム上にコードされる8種のカーボニックアンヒドラーゼ(CA)の局在解析、およびこれまで解析が進んでいる葉緑体型CAであるPtCA1の活性調節機構を調べた。

その結果、これまで葉緑体内に局在が確認されているPtCA1,2以外の6種のCA候補はすべて、葉緑体辺縁部の2次共生藻特有の4重胞膜系に存在し、葉緑体周辺部の複雑な膜系がCAの働きで無機炭素流路の制御ポイントとなっていることが強く示唆され、珪藻におけるCO_2獲得機構の重要な過程が明らかになりつつある。一方、PtCA1を精製し、活性調節機構を調べたところ、ホウレンソウ由来チオレドキシンおよびDTT存在下で活性が2倍程度上昇することが分かった。2.CCMを海洋表層のCO_2濃度変化に応じて、サイクリックAMPを二次メッセンジャーとしながら、転写レベル調節する分子機構を詳細に解析した。平成19年度に決定した新規CO_2応答性プロモーター構造の核になるシス領域配列をCCRE1-3と名づけ、ここに相互作用する転写因子をゲルシフト法により探索した。その結果、ヒトendoplasmic reticulum (ER) stress-regulated transmembranetranscription factor 6(ATF6)の珪藻ホモログのうち少なくとも3種(PtbZIP2, 3, 7)がCCRE配列をターゲットとすることが明らかとなった。このことは珪藻のCO_2応答が、哺乳類のシグナル伝達系に類似した系を利用していることを示唆している。3.変化しつつある海洋環境因子として、海洋の塩分濃度低下に応答する遺伝子を探索した。その結果、塩濃度が低くなると酸化ストレスが高まりアスコルビン酸の生合成系が活性化されることが分かった。
選択用薬剤に依存しない遺伝子高発現細胞取得に基づく異種移植用クローンブタの作製

異種移植を可能とする遺伝子改変クローンブタを独自の手法を用いて作製することを目指し、移植関連遺伝子としてα-GalT、DAFやTMなどがあるが、α-GalTは発現が無い方が望ましく、後者2つは過剰発現が望ましい。α-GalTについては、α-GalT遺伝子をKOしたブタ細胞株CRISPR-2-1(2-1)の作製に成功した。DAFやTMの過剰発現系については、独自に考案した選択用薬剤に依存しないpiggyBacを基本とした多遺伝子遺伝子導入系を用い、2-1に遺伝子導入を進めている。2-1の核移植によるブタ胚盤胞作製に成功しているので、遺伝子改変クローンブタ作製には後一歩のところまで来ている。ブタからヒトへの異種移植には、超急性移植拒絶(HAR)を招く特定の糖鎖α-Gal epitopeをブタ細胞表面から除く必要がある。しかし、それだけでは足りず、急性、慢性移植拒絶を抑えるための多遺伝子導入クローンブタの開発が求められる。今回、独自に考案した選択用薬剤に依存しない多遺伝子発現細胞の取得法と体細胞核移植法(SCNT)を駆使することにより、上記目標を達成することを目指す。これまで、IB4SAP(毒素結合α-Gal epitope特異的レクチン)を用いて薬剤不在下遺伝子高発現ブタ細胞の単離が可能かどうかを検討し、実際、それが可能であることを報告した(Sato et al., Biology 2, 341-355, 2013)。即ち、まず、α-Gal epitopeを消化するEndoGalCをコードする遺伝子と緑蛍光タンパク(EGFP)をコードするcDNAを同時発現するプラスミドpCEIEndを作成し、これをブタ細胞に遺伝子導入する。導入後4-5日目(導入遺伝子の一部は宿主ゲノムに挿入され、残りは細胞質から消滅)に細胞を回収し、IB4SAPに短時間作用させ、その後、新鮮培地にて10日間ほど培養する。この過程で、α-Gal epitopeを発現する細胞はIB4SAPと結合するため死滅する。その結果、外来性遺伝子であるEndoGalCとEGFPを組み込んだ細胞(いわゆる遺伝子同時高発現細胞)は、α-Gal epitopeを発現せず、IB4SAP処理後も生存することが判った。平成25年度は外来性遺伝子の導入効率が頗る高いとされるトランスポゾン系の一つpiggyBac(PB)を上述の系に絡め、効率性が高く、且つ選択用薬剤に依存しない多遺伝子同時高発現細胞の取得法を考案し、その有効性を検討した。その結果、期待通り、効率良く、多遺伝子同時高発現細胞株取得に成功した(論文投稿中)。ブタからヒトへの異種移植には、移植時、超急性移植拒絶(HAR)を招く特定の糖鎖α-Gal(αガラクトース)エピトープをブタ細胞表面から除く必要がある。しかし、それだけでは足りず、HAR後に起こる急性、慢性移植拒絶を抑えるため、多遺伝子が導入された異種移植用多遺伝子導入クローンブタの開発が求められる。今回、独自に考案した選択用薬剤に依存しない多遺伝子同時高発現細胞の取得法と体細胞核移植法(SCNT)を駆使することにより、SCNT率を高め、その結果として、繁殖性の良好な極力移植拒絶を抑えた上記クローンブタの開発を目指す。平成24年度は、IB4-SAP(α-Galエピトープを特異的に識別、結合するレクチンであるIB4にサポリン毒素が結合したもの)を用いて薬剤耐性遺伝子不在下で遺伝子高発現ブタ細胞の単離が可能かどうかについて検討した。先ず、α-Galエピトープを消化できるEndoGalCをコードする遺伝子と緑蛍光タンパクをコードするEGFP cDNAを同時発現できるプラスミドベクターpCEIEndを構築する。このベクターをブタ胎仔性繊維芽細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入後4-5日目(ベクターが細胞ゲノムに挿入された時期)細胞をトリプシン処理で回収する。次いで、これら細胞をIB4-SAPを含む液に懸濁し、3 h, 37°Cにて加温する。その後、細胞懸濁液をそのまま新鮮培地を含む培養皿に入れ、10日間ほど培養する。この過程で、IB4-SAPと結合した細胞(α-Galエピトープを発現)は死滅し、結合しなかった細胞(α-Galエピトープを発現しない;EndoGalC、EGFPが過剰に発現されていると目される)は生存し、強い緑蛍光を示すコロニーとなって増殖する。この実験を通し、EndoGalC/EGFP高発現とα-Galエピトープ発現減退という逆相関性を明らかにする。異種移植には超急性移植拒絶を招く特定の糖鎖α-Gal epitope(α-Gal)をブタ細胞表面から除く必要があるが、更に、急性・慢性移植拒絶を抑える幾つかの移植拒絶抑制因子を導入された、いわゆる「多遺伝子導入クローンブタ」の開発が求められる。

今回、独自に考案した選択用薬剤に依存しないpiggyBac(PB)を基本とした多遺伝子導入細胞の取得法、新しい方法を用いたα-Galを完全に発現しないKOブタ細胞の作製、体細胞核移植法(SCNT)などを用いて上記目標を達成することを目指す。α-Galはα-GalTにより合成される。従って、α-Galをブタ細胞から無くすには、α-GalT遺伝子をKOするか、α-Galを消化するEndoGalCを細胞内で発現させればよい。前者は、最近開発された次世代型KO系と呼ばれるCRISPR/Cas9を用いてα-GalT遺伝子をKOしたα-Galを完全に無くしたブタ細胞株CRISPR-2-1の作製に成功した(Sato et al., 2014)。後者では、毒素結合α-Gal特異的レクチンを用いて薬剤不在下EndoGalCを導入されたブタ細胞株(α-Gal陰性)を得た(Sato et al., 2013)。更に、PBを基本とした遺伝子導入系により、α-Gal発現陰性ブタ細胞を効率良く取得できることを示した(Sato et al., 2015)。従って、in vitroでブタ細胞への異種移植に伴う様々な拒絶を抑える因子(遺伝子)を導入する系は確立したといえる。一方、上述のCRISPR-2-1をドナーとするSCNTを用いて得たクローン胚盤胞にα-Gal発現が不在なことを確認した(Sato et al., 2014)。現在、最終的に多遺伝子発現クローンブタ作製を目指し、CRISPR-2-1にDAFやTMなどの拒絶を抑える因子をPB経由で導入している。発生工学、分子生物学分野上述のように、PBとEndoGalCを組み合わせることにより、効率的な多遺伝子発現細胞株の取得を狙った。先ず、PB transposase遺伝子とEndoGalC遺伝子を同時に発現できるプラスミドpTransIEndを作成し、これをEGFPなどのマーカーを取り入れたトランスポゾン系ベクターと共にブタ細胞に遺伝子導入する。導入後2日目(まだ、多くのプラスミドが宿主細胞ゲノムに挿入されないまま細胞質に存在)に細胞を回収し、IB4SAPで処理し、その後、通常培地で培養した。生じたコロニーを調べると、EndoGalC遺伝子はなく、α-Galエピトープの発現も回復していた。一方、目的遺伝子であるEGFPも発現していた。また、この系を用いて赤蛍光遺伝子とEGFPの2個のマーカーを一つの細胞に発現させることにも成功した。このことは、この系を用いれば、一回の遺伝子導入処置で多遺伝子高発現細胞の取得が可能であることを示すもの。現在、異種移植関連遺伝子をトランスポゾン系ベクターに導入し、これら遺伝子をもつベクターとpTransIEndとを共遺伝子導入し、遺伝子導入後2日目で細胞をIB4SAPで処理することにより、「薬剤耐性遺伝子不在下で複数個の異種移植関連遺伝子を高発現するブタ細胞の取得」を試みている。次に、「異種移植関連遺伝子を複数個内蔵する発現ベクターの構築と同ベクターとIB4-SAPとを用いて薬剤耐性遺伝子不在下で複数個の遺伝子の高発現がブタ細胞で可能かどうかについての検討」を行なうため、現在、異種移植関連遺伝子を内蔵したベクター系を構築している。異種移植関連遺伝子としてCD47抗原遺伝子(急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード)、DAF遺伝子(急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード)、
生体分子ナノ組織体の構築と機能発現

DNAオリガミ法により新たに設計したDNAフレームを用いて、様々な酵素の反応の制御及びその一分子観察を行った。まず、DNAメチル化酵素がDNA鎖を折り曲げることに着目し、異なるテンションのDNA鎖をDNAフレームに導入するこ、とで、DNAのメチル化反応が基質となるDNAの張力に依存していることを実験的に示すことに成功した。さらにDNAの修復酵素についても同様の観察を行い、DNA修復酵素がDNA鎖を修復する過程を動的に捉えることにも成功した。また、グアニンの繰り返し配列がNaイオンやKイオンの存在により、四重鎖構造を形成することを利用して、DNAフレームに導入したDNA鎖そのものの構造変化を動的に捉える検討にも成功した。この構造変化は数nmの範囲で起こっている事象であるため、今までにこのようなスケールの動的観察は報告されておらず、DNAフレームと高速原子間力顕微鏡を組み合わせることの有用性を示す結果となった。上記結果より、DNAフレームを用いれば、酵素の反応を一分子観察でき、更にはDNA鎖の構造変化を動的に捉えることができるということが明らかになったことから、DNAフレームに異なるtopologyのDNA鎖を導入し、DNA組み換え酵素であるCreの反応機構を詳細に検討した。その結果、Creがどのような過程を経て四量体を形成するかということが明らかなり、現在論文の作成段階にある。他にも、DNAディバイスとして最近注目されているDNAモーターの動きについてもDNAオリガミ法と高速原子間力顕微鏡を用いることによってその直接観察に成功した。また、DNAモーターにとってレールの役割を果たすstatorに分岐点を設け、シグナルによって最終到着珍点をコントロールする検討に成功し、ナノレベルでのDNAの多様性を多分に示す結果となった。いずれの検討においても蛍光基などによる修飾を一切行わずに直接一分子観察するということを報告したものであり、今までなかった手法であることから非常に意義を持ったものとなった。研究目的及び研究実施計画においてはDNAを用いて酵素反応の機能評価を行うことを予定しており、複数の酵素評価の検討がいずれも終了していることから順調に研究が進行されたと考えている。DNAオリガミ法により新たに設計したDNAフレームを用いて、DNAメチル化酵素反応を検討した。これにより反応が基質となるDNAの張力に依存していることを実験的に示すことに世界に先駆けて成功した。さらにDNA修復酵素についてもDNAフレームを用いることによって反応の詳細な解析が可能であることを示した。また、DNAフレームを用いて、グアニン4重鎖構造の動的な構造変化を一分子レベルで実時間観察し、DNAそのものの動的な挙動を捉えることに成功している。このようにDNAの構造変化を一分子観察で捉えた系は今まで報告されておらず、このDNAフレームが非常に有用であることを示唆している。いずれの検討においても、修飾基を導入することなく動画を捉えることに成功しており、新規性に富んだ検討となった。これらの結果については、いずれも蛍光基などによる修飾を一切行わずに直接一分子観察するということを報告したものであり、今までなかった手法であることから非常に意義を持ったものとなった。研究目的及び研究実施計画においては1年目でDNAフレームに任意の配列のDNAを架橋させ、それぞれの機能評価を行うことを予定しており、これらの検討がいずれも終了していることから順調に研究が進行していると考えている。
細胞染色体ネットワークとEBウイルスゲノムの複製・分配

EBウイルス(EBV)潜伏感染細胞におけるウイルスゲノムの複製・分配において中心的な働きをするウイルス蛋白質EBNA1は、細胞性因子と相互作用することでその機能を発揮すると考えられているが、その実体は明らかではない。そこで平成19年度の研究において作製したhemagglutinin(HA)エピトープタグを付加したEBNA1蛋白質を発現する組換えEBV、および新たに作製したFLAGエピトープを付加したEBNA1蛋白質を発現する組換えEBVを用いて、これらを末梢血Bリンパ球へと感染させることで、リンパ芽球様細胞株(lymphoblastoid cell line, LCL)を樹立した。これらのLCLより細胞抽出液を調製し、抗エピトープ抗体で免疫沈降を行い、EBNA1蛋白質が潜伏感染細胞内で形成する蛋白質複合体の精製を試みた。抗HA抗体を用いた場合は、全細胞から調製した細胞粗抽出液を用いて良好な免疫沈降が可能であった一方で、抗FLAG抗体を用いた場合は、核抽出液を用いた場合にのみ免疫沈降が可能であり、免疫沈降物の収量という点で前者が優れていた。そこで野生型EBVで樹立したLCL(コントロールLCL)、およびHAタグ付加EBNA1発現LCLの細胞粗抽出液を材料として、抗HA抗体による免疫沈降を行い、得られた免疫沈降物をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により解析した。その結果、コントロールLCLからの免疫沈降物には認められず、エピトープタグ付加EBNA1発現LCLからの免疫沈降物にのみ認められる複数の蛋白質バンドを同定した。以上の結果より、EBV潜伏感染細胞内において、ウイルス蛋白質EBNA1はいくつかの細胞性因子と複合体を形成することにより、ウイルスエピゾームの複製・分配における機能を発揮していることが示唆された。EBウイルス(EBV)感染細胞におけるEBNA1蛋白質の局在の解析、および生化学的解析を目的として、hemagglutinin(HA)エピトープタグを付加したEBNA1蛋白質を発現する組換えEBVゲノムをBAC(bacterial artificial chromosome)システムにより作製した。これをもとにHAタグ付きEBNA1蛋白質を発現する組換えEBVを産生し、この組換えEBVのみがエピゾームとして感染する細胞を樹立した。この細胞におけるEBVゲノムの局在、およびEBNA1蛋白質の局在を、それぞれFISH法および抗HA抗体を用いた蛍光免疫染色法により解析したところ、タグ付きEBNA1蛋白質は、核内においてEBVゲノムの存在部位に集積してドット状に局在していた。同調培養細胞を用いた実験において、タグ付きEBNA1蛋白質は細胞周期のG2期間期核内において頻繁にダブルドットとして観察され、さらにG2期未成熟凝縮染色体の姉妹染色体上に頻繁に対称性に局在することを見出した。FISH法と蛍光免疫染色法を同時施行して、EBNA1のダブルドットとEBVゲノムの相対的位置関係を調べたところ、EBVゲノムのシグナルがEBNA1のダブルドットにはさまれた形のダンベル様構造物が多数観察された。したがって、EBNA1蛋白質の姉妹染色体上への分配は、EBVゲノムの分配より先行することが明らかになった。以上の結果より、EBNA1蛋白質は、細胞DNA複製の際に姉妹染色体上へ分配され、また分配されたEBNA1蛋白質に導かれる形で、複製したEBVゲノムの姉妹染色体上への均等分配が起きるというモデルが考えられた。
細胞老化の不可逆性とその生体内における役割の解明

細胞老化の不可逆性は異常細胞の増殖を永久に阻止するために必要であり、この不可逆性が癌抑制機構として重要な役割を果たしていると考えられる。しかし、この不可逆性の分子機構や細胞老化の生体内における役割については不明な点が多い。本研究では、細胞老化における不可逆的増殖停止機構の詳細を明らかにすることを目的として以下の研究を行った。1.細胞老化における不可逆的増殖停止の誘導に関与する因子及びシグナル経路の同定。温度依存的に細胞老化を誘導出来る細胞株を用いることで、p16-RB経路が十分に活性化されると、ROS-PKCδシグナルが不可逆的に活性化され細胞質分裂が抑制されることを明らかにした。また、この時、細胞質分裂の正常な進行に必要なWARTS/LATS1キナーゼの発現が抑制されることが主な原因の一つであることを見出した。更に様々なシグナル伝達経路の阻害剤と、RNAiによる遺伝子機能の抑制を行った結果、PI3-kinaseの下流因子であるAKTがROS-PKCδシグナルの不可逆的活性化に関与していることを明らかにした。2.遺伝子改変マウスを用いた細胞老化のリアルタイムin vivoイメージング細胞老化において発現の上昇が認められるCDKインヒビター遺伝子の発現をマウスの生体内でリアルタイムに観察するために、それら遺伝子の発現をルシフェラーゼ活性としてモニター出来るトランスジェニックマウスを作成した。これらのマウスを用いて細胞老化誘導シグナルの生体内ダイナミクスの可視化が可能になった。細胞老化の不可逆的増殖停止メカニズムの詳細を明らかにするために、ヒト正常2倍体線維芽細胞であるTIG-3細胞に温度感受性型のSimian Virus 40 large T抗原(LT)を発現させることにより不死化させた細胞株(SVts8細胞)を用いて実験を行った。この細胞はテロメラーゼの発現レベルが亢進しており、更に許容温度(34°C)ではLTがpRBとp53に結合しそれらの機能を阻害するために、永久に分裂増殖可能である(不死化している)。しかし、非許容温度(38.5°C)で培養すると、LTが失活性し、pRBとp53が復活するために急速に細胞老化様の増殖停止を起こす。この状態で5日間培養した後に、これらの細胞を再び許容温度に戻してpRBとp53を失活させると細胞のDNAの合成は再開するが細胞増殖は停止したままであった。しかし興味深いことに非許容温度で培養する際に低血清培地(0.2%の血清濃度)で培養した場合には、その後再び許容温度で培養することにより、細胞増殖が再開した。これらの結果より、細胞老化における不可的増殖停止の誘導にはpRBとp53の活性化だけでは不十分であり、更に血清刺激(増殖シグナル)が加わることが必須であることが示唆された。次に血清刺激が如何にしてpRB及びp53と協調して働くのかについて検討した結果、活性酸素種(ROS)が重要な役割を果たしていることを突き止めた。p16^<INK4a>-RB経路の活性化は増殖シグナルと協調してROSの産生を促進し、PKCδの不可逆的な活性化を引き起こす。PKCδの不可逆的な活性化は、WARTS(LATS1)などの細胞質分裂に必要な蛋白質の発現を低下させるために細胞質分裂の進行が不可逆的に阻害されることを明らかにした。細胞老化の不可逆性は異常細胞の増殖を永久に阻止するために必要であり、この不可逆性が癌抑制機構としての必須要因であると考えられる。しかし、細胞老化の分子機構や細胞老化の生体内における役割については不明な点が多い。昨年度の研究で明らかにした細胞老化で起こるROS-PKCδシグナルの不可逆的活性化のメカニズムを解明するために、老化細胞において様々なシグナル伝達経路の阻害剤と、RNAiによる遺伝子機能の抑制を行った。

その結果、PI3-kinaseの下流因子であるAKTがROS-PKCδシグナルの不可逆的活性化に関与していることを様々な癌細胞株やヒト正常2倍体線維芽細胞も用いて明らかにした。2.遺伝子改変マウスを用いた細胞老化のリアルタイムin vivoイメージング細胞老化において発現の上昇が認められるCDKインヒビター遺伝子の発現をマウスの生体内でリアルタイムに観察するために、それら遺伝子の発現をルシフェラーゼ活性としてモニター出来るトランスジェニックマウスを作成した。これらのマウスを用いてCDKインヒビターの生体内での発現動態を調べた結果、CDKインヒビターの一つであるp21が皮膚発癌に対して細胞老化誘導することで癌抑制に効いていることと、加齢の過程で腎臓において発現が上昇することで細胞老化を誘導していることを明らかにした。本研究により、細胞老化誘導シグナルの生体内ダイナミクスの可視化が可能になった。