hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス反復ストレスによる脳内プロスタグランジンE2産生誘導の分子機序

ストレスはうつ病など精神疾患のリスク因子であるが、ストレスを標的とした創薬は確立していない。我々は、マウスの反復ストレスによる情動変容に、生理活性脂質プロスタグランジンPGE2とその受容体EP1によるドパミン系制御が必須であること、ミクログリアに高発現するPG合成酵素COX-1が関与することを示してきた。本研究では、反復ストレスによる脳内のPGE2など生理活性脂質の変動とその分子基盤を調べた。反復ストレスによる情動変容における自然免疫分子の重要性を見出していることから、自然免疫分子との関連に着目して研究を進めた。本研究では、反復ストレスの有無によらず脳内のPGE2産生にはCOX-1が重要であること、自然免疫分子は反復ストレス後のPGE2産生にのみ関わることを示した。PGE2生合成酵素群と自然免疫分子はミクログリアに共発現しており、反復ストレスによる情動変化にはミクログリアの自然免疫分子が必須であることを示した。反復ストレスによるPGE2産生やミクログリア活性化には脳領域特異性があることを発見し、情動変化を促すミクログリアの存在する脳領域も特定しつつある。以上の結果から、反復ストレスは特定の脳領域のミクログリアで自然免疫分子を介してPGE2産生機構を増強することを示唆した。反復ストレスにより自然免疫分子依存的にミクログリアで誘導される遺伝子群を同定しており、今後PGE2生合成との関連を調べる。またCOX-1 floxマウスも作出しており、脳領域特異的なPG生合成の意義についても今後さらに検討する。並行してEP1受容体がGβγを介してアデニル酸シクラーゼを活性化してドパミンD1受容体によるcAMP産生を増強することも示した。本研究成果をもとに、今後、反復ストレスにおける炎症・自然免疫分子を介した神経ミクログリア相互作用の役割と分子実体が一層解明されることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、マウスの反復ストレスによる情動変容に、生理活性脂質プロスタグランジンPGE2とその受容体EP1によるドパミン系制御が必須であることを示し、ミクログリアに発現するPG合成酵素COX-1が関与することを示唆してきた。本研究では、反復ストレスによる脳内のPGE2など生理活性脂質の変動を調べ、その脂質変動を担う分子基盤を明らかにする。また、反復ストレスによる情動変容における自然免疫分子の関与を見出しており、反復ストレスによる脂質変動における自然免疫分子の役割と作用機序にも迫る。本年度は、反復ストレスによる情動変容が自然免疫分子Xとそのアダプター分子Yの遺伝子欠損マウスで消失することを確認した。ミクログリアを単離した定量的RT-PCR解析により、分子X、分子Yとアラキドン酸産生酵素cPLA2αのミクログリアに発現することを示した。反復ストレスによるPGE2産生は脳領域特異的に誘導されるが、COX-1欠損マウスでは脳内のPGE2産生はほぼ消失していた。一方、分子X欠損マウスではストレス暴露後に限り脳内のPGE2産生が部分的に抑制された。すなわち、分子Xはストレス暴露時に限りCOX-1依存的なPGE2産生を促進すると考えられた。COX-1の作用部位を同定するため、COX-1floxマウスの作出を継続している。また、脳領域かつミクログリア特異的に遺伝子発現を抑制する組換えウイルスも作出した。並行して、過剰発現系を用い、反復ストレスに関わるEP1がドパミンD1受容体と複合体を形成すること、EP1の活性化がGβγサブユニットとアデニル酸シクラーゼ7の活性増強を介してD1受容体によるcAMP産生を促進することを示した(Ehrlich et al. Mol Pharmacol, 2013)。

並行してEP1受容体がGβγを介してアデニル酸シクラーゼを活性化してドパミンD1受容体によるcAMP産生を増強することも示した。本研究成果をもとに、今後、反復ストレスにおける炎症・自然免疫分子を介した神経ミクログリア相互作用の役割と分子実体が一層解明されることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の本年度の研究計画では、反復ストレスによる情動変容におけるアラキドン酸産生酵素cPLA2と自然免疫分子の関与を検討し、脳内のPGE2など生理活性脂質の動態を計測し、その脂質動態へのCOX-1、cPLA2、自然免疫分子の関与を調べ、脳内でのcPLA2と自然免疫分子の発現を解析し、COX-1条件付け欠損マウスの作出を継続することを提案した。「研究実施の概要」に示した通り、反復ストレスによる情動変容における自然免疫分子Xとそのアダプター分子Yの関与を示し、脳内のPGE2産生におけるCOX-1と自然免疫分子Xの役割を解析し、COX-1 floxマウスの作出を継続している。加えて、ストレスによる情動変容を担うPGE受容体EP1とドパミン受容体のクロストークの分子機序も過剰発現系で明らかにしたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。今後は、自然免疫分子XによるCOX-1依存的なPGE2産生の促進機構を、ストレス暴露時のミクログリアでの自然免疫分子Xの作用機序の解析により明らかにする。具体的には、自然免疫分子Xの下流で働く情報伝達系の活性化を組織学的、生化学的に調べると共に、その情報伝達系をミクログリア特異的に阻害したときのPGE2産生を調べる。並行して、培養ミクログリアで自然免疫分子Xの活性化がCOX-1依存的なPGE2産生を促進するかを調べ、その分子機序を解析する。本研究で作出したCOX-1 floxマウスを用いて、COX-1の作用する脳領域と細胞種を同定する。
カリウムチャネル機能を制御する新規細胞内生理活性物質探索の新戦略

細胞内在性物質のファーマコフォアをインシリコで解析し、薬物と共通するファーマコフォアを有する新規生理活性物質の発見を目指した。スフィンゴシンのファーマコフォアは内向き整流性カリウム(Kir)チャネル阻害薬のファーマコフォアモデルの特徴に適合した。電気生理学的解析によりスフィンゴシンがKirチャネル阻害作用を持つことを実証した。さらに、細胞においてスフィンゴシンの生合成を刺激することでKirチャネル機能が抑制されることを示した。スフィンゴシンはカリウムチャネル機能を制御する生理活性物質である可能性がある。近年、内向き整流性カリウムチャネルに属するKir4.1チャネルのポア領域と結合し機能阻害する薬物の構造活性相関の研究が進められてきた。研究代表者は、これまでに得た複数の薬物の構造と作用のデータセットから阻害作用に関連するファーマコフォアモデルを作成している。本研究では、ファーマコフォアの類似性に基づいた薬理作用の予測とその実証研究を実施する。この方法論により、特にカリウムチャネル機能を制御する生理活性物質を新たに同定することを目的としている。本年度の研究開始後直ちに、Kir4.1阻害薬のファーマコフォアモデルを再利用し、薬物構造情報のデータベース(DB)からインシリコ探索によって新規阻害物質の同定が可能かまず検討した。結果として、多数のKirチャネル阻害物質が新たに見出されてきた。一方、構造的にはKirチャネルを阻害する可能性が示唆されるものの、実証研究で作用が認められなかった薬物も探索結果に含まれた。この研究から薬物構造と作用の関連に対する理解が更に進み、またファーマコフォアモデルの精緻化やインシリコ探索の手法などに関する情報を得ることが出来た。これらの結果は関連分野の学会で報告し、論文の投稿を準備している。基盤となる薬物作用の解析を実施した後に、インシリコ探索する対象を生体内物質に移した。Kir4.1チャネルポア阻害薬のファーマコフォアを用い、細胞内代謝物の構造情報の収容されたDBから薬物と類似のファーマコフォアを持つと見られる生体内物質をインシリコ探索した。選び出された候補物質は膜透過性の低さを考慮し、パッチクランプ法のインサイドアウトパッチ膜の細胞質側から投与するようにし、チャネルへの作用を解析した。系統的に解析する過程で、スフィンゴリン脂質のスフィンゴシンが細胞の内側からKir4.1チャネル機能を阻害することを新たに見出した。本研究は薬物のファーマコフォアモデルを利用し、カリウムチャネル機能を制御する新たな生理活性物質の同定を目指すものである。昨年度、Kir4.1チャネル阻害薬のファーマコフォアモデルに適合する物質の中から、スフィンゴ脂質のスフィンゴシンが細胞の内側からKir4.1チャネル機能を阻害すること見出した。本年度は引き続き、スフィンゴシンによるKirチャネル機能阻害の詳細を調べた。HEK細胞に発現させた各種Kirチャネルを流れる電流をパッチクランプ法により測定し、薬理学的な解析を実施した。まず、スフィンゴシンはKir4.1チャネルの他に、Kir2.1チャネルやKir1.1チャネルの機能も阻害することが分かった。また、これらの阻害に明確な電位依存性は見られなかった。スフィンゴシンによるKir2.1チャネル電流阻害のIC_<50>は1.2μMであり、他のKirチャネルも数μMのオーダーであった。次に、内因性のスフィンゴジンによるKirチャネル阻害がおこるか調べるために、スフィンゴシンの生合成を刺激する実験を行った。通常、細胞において最も豊富に存在するスフィンゴ脂質は細胞膜のスフィンゴミエリンであり、スフィンゴシンはスフィンゴミエリンからセラミドを介して代謝的に生合成される。スフィンゴミエリンの加水分解により、スフィンゴシンの直接投与と同様に、しかし数分間かけてゆっくりとKirチャネル電流は減少する。さらに、この電流減少はスフィンゴシンの生合成経路の薬理学的阻害により抑制された。つまり、Kir電流の減少は膜のスフィンゴミエリンの減少が直接的な原因ではなく、内因性スフィンゴシンの生合成が刺激されたため起こったと考えられた。今回の結果は、スフィンゴ脂質のシグナル伝達系の下流でカリウムチャネルが標的となる可能性を初めて示唆している。
交通シミュレーションのトータルプロセスの構築

交通シミュレーションに必要なデータの取得には多くの人手と時間を要するため,ある一日の調査に基づき施策を評価している.そのため,調査日以外の再現は難しく,シミュレーション結果について十分な信頼が生まれていない.本研究では,この問題に対応するため,近年取得が可能となってきた,交通に関連するビッグデータである日変動データに着目した.ある一日の交通調査の結果と,日変動データを用い,調査日の位置づけを明確にした上で,交通シミュレーション上で調査日以外の交通状況を再現する手法とその検証方法について提案した.近年,交通シミュレーションの活用が広がっているが,必要なデータの取得・整理に多くの人手・時間を要することや,ある一日の調査結果を基に作成されるため,施策の評価が過大あるいは過小評価になっているのでは,という不信感を払拭できていない問題がある.近年,情報通信技術の発達に伴い,ビッグデータが注目されているが,交通の分野では,日変動データとして,ビッグデータが注目される.これまで人手調査により取得されてきたデータも,こうしたビッグデータとして,365日の日変動を把握できる形で取得することが可能となってきている.本研究では,この日変動データを用いて,実際の交通で発生している日変動を交通シミュレーションで再現できるかを検証し,交通シミュレーションによる施策評価の信頼性の向上を目指す.また,日変動データが交通調査の代替となり得るか,その可能性と課題について考察を行った.ナンバープレート調査(NP調査)を主体とした交通調査,及び,日変動データとして,株式会社ナビタイムジャパンが取得・管理している携帯プローブデータ「NAVITIMEデータ」から旅行速度の日変動を,埼玉県警察が常時観測している「断面交通量データ」から断面交通量の日変動を把握し,調査日の位置づけと日変動の状況を明らかにした上で,日変動データから,対象地域の交通状況の変動を把握することができ,調査日の位置づけを明確にできた.また,日変動再現の手法を提案することができたが,手法の検証ができておらず,課題として残っている.また,現段階ではデータ量の不十分さから,少なくとも一日のNP調査は必要と言わざるを得ない.今後,利用者の増加や各社のデータを統合する仕組みづくりなどにより,日変動データの充実が求められる.近年,交通シミュレーションの活用が広がっているが,必要なデータの取得・整理に多くの人手・時間を要することや,ある一日の調査結果を基に作成されるため,施策の評価が過大あるいは過小評価になっているのでは,という不信感を払拭できていない問題がある.近年,情報通信技術の発達に伴い,ビッグデータが注目されているが,交通の分野では,日変動データとして,ビッグデータが注目される.これまで人手調査により取得されてきたデータも,こうしたビッグデータとして,365日の日変動を把握できる形で取得することが可能となってきている.本研究では,この日変動データを用いて,実際の交通で発生している日変動を交通シミュレーションで再現できるかを検証し,交通シミュレーションによる施策評価の信頼性の向上を目指す.また,日変動データが交通調査の代替となり得るか,その可能性と課題について考察を行った.本年度は,平成26年度にさいたま市大宮駅東口地区で実施した大規模ナンバープレート調査の結果から交通シミュレーションの構築を行うとともに,近年急速にその種類,及び個々のデータ量が増加するビッグデータについて,交通シミュレーションの信頼性向上への利用可能性がある交通量の日変動に関するビッグデータの検討を行った.さらに,ケーススタディ地区周辺における都市計画の動向に沿った枠組を考慮し,日変動データを利用した交通シミュレーションによるアウトプットの種類について検討を行った.ケーススタディ地区としているさいたま市大宮駅東口地区周辺で、新たな都市計画の動きが進んでおり、周辺交通流について新たなデータの提供の可能性があったことから、それらの動向を踏まえた上で、次年度に研究成果をまとめることが適切と考えたため,交通シミュレーションのアウトプットについて,評価指標に関する交通専門家及び一般市民の認識に関する調査が平成28年度に繰り越された。交通施策の評価等において,交通シミュレーションの利用が普及してきたが,予算や時間の制約から,多くの場合ある1日の調査データのみが用いられている.交通流は常に変動しており,1日のみのデータでは,対象地区の交通状況を十分に評価することができない.そこで本研究では,日変動再現手法の適用可能性を検討するため,埼玉県の大宮駅東口をケースに検討を行ってきた.平成27年度までの研究では,調査日に発生した渋滞が再現できていないという課題が残っており,最終年度は,渋滞再現ができなかった原因究明を行い,シミュレーション作成方法を明らかにすることを第一に研究を行った.シミュレーションの渋滞再現を行うことでボトルネック再現手法が確立し,交通シミュレーションを用いる今後の研究の再現性向上,既存研究の手法の整合性の確立を目的とした.日変動再現手法を検討する際に用いた交通シミュレーション「tiss-NET Cloud」において,内部機能,渋滞再現に必要なパラメータやその影響,ボトルネック特性を明確にし,ボトルネックによる渋滞再現に必要な「需要を増加させる方法」や「需要に対する処理機能を低下させる方法」を確立し,ボトルネックの再現可能性を検討した.本研究ではボトルネック現象の特徴である需要超過時間内に進入できなかった車両やダミー発終点の車両の組み込み等,需要を増加させるという新たな手段を取ってボトルネック再現手法の確立を行った.他の都市部や郊外部にもパラメータの調整を用いてボトルネックが十分に再現可能か,再現不可能な場合はシミュレーションの内部計算の方法を変更する必要がある.交通シミュレーションに必要なデータの取得には多くの人手と時間を要するため,ある一日の調査に基づき施策を評価している.

そのため,調査日以外の再現は難しく,シミュレーション結果について十分な信頼が生まれていない.本研究では,この問題に対応するため,近年取得が可能となってきた,交通に関連するビッグデータである日変動データに着目した.ある一日の交通調査の結果と,日変動データを用い,調査日の位置づけを明確にした上で,交通シミュレーション上で調査日以外の交通状況を再現する手法とその検証方法について提案した.平成26年度は,交通シミュレーション,交通流に関する文献調査を行うとともに,NP調査を主体とした交通調査を実施し,日変動データとして,携帯プローブデータ「NAVITIMEデータ」から旅行速度の日変動を,埼玉県警察が常時観測している「断面交通量データ」から断面交通量の日変動を把握した.その上で,上記で得られたデータから,交通シミュレーションを構築し,調査日の交通状況の位置づけと日変動の状況を明らかにした.また,交通シミュレーションによる日変動再現の手法を提案することができた.一方,手法の検証については,課題として残っている.ある1日の調査のデータを用いた従来の交通シミュレーション,日変動がある中で調査日がどの位置づけになるか示した上での交通シミュレーション,調査日以外の日も再現した,本研究で提案した日変動を再現した交通シミュレーションを提示し,その信頼性について住民,及び専門家の意見を反映することが,交通シミュレーションの信頼性を考える上で必要である.日変動の考慮・再現の有無により,交通シミュレーションに対する感じ方にどのような変化が生じるかを分析することで,交通シミュレーションの信頼性の向上につなげる.さらに,交通シミュレーションで出力される結果としての交通状況を理解するための,評価指標を提案する.評価指標を提案評価指標の有効性については,住民やドライバーへのアンケート調査や,地元自治体や警察担当者へのヒアリングを実施して,日常感覚に合致した指標となり得ているかを検証する。都市交通計画ある1日の調査のデータを用いた従来の交通シミュレーション,日変動がある中で調査日がどの位置づけになるか示した上での交通シミュレーション,調査日以外の日も再現した,本研究で提案した日変動を再現した交通シミュレーションを提示し,その信頼性について住民,及び専門家の意見を反映することが,交通シミュレーションの信頼性を考える上で必要である.日変動の考慮・再現の有無により,交通シミュレーションに対する感じ方にどのような変化が生じるかを分析することで,交通シミュレーションの信頼性の向上につなげる.さらに,交通シミュレーションで出力される結果としての交通状況を理解するための,評価指標を提案する.評価指標を提案評価指標の有効性については,住民やドライバーへのアンケート調査や,地元自治体や警察担当者へのヒアリングを実施して,日常感覚に合致した指標となり得ているかを検証する。
閉鎖型核分裂をする細胞の分裂シグナルと二形成に伴う分裂パターンの制御

核ゲノムの伝承に必要な分子基盤は、何重ものバックアップ機構を備えている。細胞体を等分配する分裂シグナルの実体は、動物細胞ではよく解明されているが、閉鎖型の核分裂をする生物では不明である。そこで、分裂様式が異なる異種の分裂酵母を比較し、分裂シグナルの冗長性と種特異性の実体の解明を目指した。さらに、二形成では細胞質分裂パターンが切り替るため、この制御機構にも着目し、研究を進めた。本研究の結果、ゲノム組成が近縁な分裂酵母であっても、分裂シグナルのレパートリーは類似しているが、どの経路に依存しているか、その度合いはかなり違うことが判明した。また、二形成時の分裂に関与する可能性がある因子も同定した。本研究の第一の目的は、分裂様式の異なる分裂酵母を活用し、真核生物界における普遍的かつ根源的な分裂シグナルの実体の解明である。細胞質分裂の分子機構が最も良く理解されたSchizosaccharomyces pombeは、アニリン様蛋白質Mid1pが分裂期細胞の予定分裂面表層においてノードという分子複合体を組織化し、アクチン繊維とミオシンIIを統合することで収縮環が形成されることが判明している。本研究において昨年度までに、アニリン様蛋白質であるMid1pを主軸に分裂シグナルの機能の普遍性について調べた結果、異種の分裂酵母であるS. japonicusでは、複数の実験結果からMid1pの機能が細胞質分裂の制御にはあまり重要でないのが示唆されてきた。今年度はSj mid1遺伝子を機能破壊した結果、収縮環形成時にアクチン繊維の配向性が異常になる細胞が有為に認められたが、細胞質分裂の進行と完了には重篤な表現型は生じなかった(論文準備中)。そこで、S. pombeではMid1pの下流でアクチン繊維とミオシンIIを統合するRng2pについて、そのホモログの機能をS. japonicusにおいて調べた。その結果、Sj Rng2pの機能は、Sp Rng2pを代替できること、細胞内のノードと収縮環への挙動もほぼ同様であることが判明した。これより、Mid1pとは別の分裂シグナルをS. japonicusは利用しており、その作用点の最も上流部分がRng2pである可能性が示唆された。一方、Rng2pから下流のミオシンIIやアクチン繊維の収縮環への統合過程は2種類の分裂パターンが異なる酵母で保存されているらしい。一方、繊毛虫テトラヒメナを用いた新奇分裂機構の研究については論文2報を発表し、現在、そのアクチン非依存的な分子機構について研究を進めている。細胞質分裂は母細胞から娘細胞に確実にゲノムと細胞構造を伝承するプロセスである。それを実行する分子マシナリー「収縮環」の形成は分裂シグナルによって時空間的に制御される。その分裂シグナルの実体と発現機序については、発達した紡錘体をもつ動物細胞では理解が進んでいる。一方、閉鎖型の核分裂をする真菌や原生生物では、それらが真核生物の大部分を占めるにも拘らず、不明な点が多い。本研究では、分裂様式の異なる2種の分裂酵母を活用し、真核生物界における普遍的かつ根源的な分裂シグナルの実体の解明を目指している。本年度は、細胞質分裂の分子機構の解析が最も進んでいるSchizosaccharomyces pombeのMid1pを主体とした分裂シグナルの機能の普遍性について調べた。Mid1pは間期細胞では核質に収められており、分裂期に近づくと細胞質に排出されて細胞表層においてノードと呼ばれる分子複合体を組織化する。分裂期初期にノードは、アクチン重合因子とミオシンII、及びそれらの機能を統合する蛋白質が局在する。その結果、ノード同士がアクチン繊維のネットワークで結ばれ、最終的に収縮環構造が分裂期中期の細胞の中央領域に形成される。一方、異種の分裂酵母であるS. japonicusでは、細胞中央領域に収縮環が形成されるのは、分裂期後期に核分裂が生じた後である。この分裂酵母のMid1p様遺伝子をクローニングし、その機能を調べた。S. pombeのmid1遺伝子破壊株にSj mid1を発現させたが、細胞質分裂の異常を補うことができなかった。さらに、GFP融合型Sj Mid1pは、S. pombeのMid1pのような細胞内挙動を示すことは観察されなかった。これより、分裂酵母属の中でもMid1pによる分裂シグナルの重要性が異なることが示唆された。細胞の分裂様式は、細胞のサイズや形状と密接に関係し、また細胞の機能分化には分裂パターンの切替えが伴う。細胞の生存や運命を決定する細胞分裂の位置と方向性、そしてタイミングの制御が、どのような分子機構に基づいて実行されるのか、大変に興味深い。

分裂酵母属のS. pombeとS. japonicusは、細胞分裂様式が異なる。両者は同様のゲノム構成のため、わずかな遺伝子機能の差が、分裂様式の差異をもたらすと推察される。本研究では、S. pombeの収縮環形成の時空間的制御に重要なMid1に着目し、両種間でその細胞機能の保存性を調べた。これまでの実験結果を整理し、今年度は論文作成を行い、H27年に学術誌に発表できる見込みである。Mid1の機能解析を進める過程で、S. japonicusのライブ観察し、偽菌糸形成時の細胞質分裂のパターンについて解析を進めている。一方、昨年度まで効率が悪かったS. japonicusの形質転換については、標準的なエレクトロポレーション法以外に、パーティクルガンや酢酸リチウム法など試みたが、改善には至らなかった。そのため、本研究に従事する学生2名と共に国立遺伝学研究所の仁木研究室を訪問し、指導を受け、ある程度まで効率が改善した。糸状菌や酵母でセプチンと相互作用し、細胞の極性伸長や隔壁分離にはたらくBud4/Mid2について、S. japonicusのホモログの機能解析を進めることができた。そして、隔壁分離にMid2が重要なことを明らかにした。Mid2は偽菌糸形成にも重要なことが期待される。また、Mid1と相互作用するRng2の機能を追求する過程で、その類似タンパク質Npg1が胞子形成に大切な役割を担うことを発見し、報告した。さらに、隔壁形成を制御するRho GTPaseの機能について、近畿大学の杉浦教授と論文発表した。分子細胞生物学Schizosaccharomyces japonicusの遺伝子組換えのための形質転換の効率が極めて低いため、実験に必要な遺伝子組換え体の作成に想定以上に時間と労力がかかっている。この効率の低さは、先行研究で報告されている状況からは全く予想がつかないものである。改善のため、現在2つの方策を試みている。ひとつは形質転換法そのものの見直しである。専攻研究では、酵母菌の形質転換に多用される酢酸リチウム法が働かないために、エレクトロポレーション法がよいとされていた。しかし、我々はエレクトロポレーション法の実験条件の検討を行ったが、大きく形質転換効率が良くなることはなかった。そのため、パーティクルガン法、およびプロトプラスト法について検討している次第である。2つ目は、エレクトロポレーション法で得られた形質転換クローンの多くが擬陽性であり、安定的に導入したい電子が細胞に保持されにくいことが判明した。これについては、導入遺伝子の品質とコンストラクトの見直し、形質転換体のスクリーニングに使用するマーカー(栄養マーカー、薬剤マーカー)の選別条件の再検討、そして外来遺伝子が導入され易い染色体上のローカースの探索などにより、改善を試みている。S. japonicusの実験系は、遺伝子導入ができるようになってから日が浅く、また研究者人口もまだ増えていないことから、実験系そのものの成熟化には時間がかかるかもしれないが、生物自体が有している学術研究におけるポテンシャルは高いため、上記の労力は必ず将来の役に立つと確信を持っている。目標としていたMid1の機能の理解を、異種の分裂酵母S. japonicusを利用することで深めることには成功した。
組織再生型人工神経を用いた横隔神経の再建と横隔膜機能回復の研究

本研究は切断された横隔神経に人工神経を移植し神経線維を再生させ、呼吸機能の回復を目的とする。これまでコラーゲン被覆したPGA織布管の中にコラーゲンスポンジを留置しラミニンコーティング・NGF徐放化を施した人工神経を開発し臨床応用されている。しかし人工神経の材料の最適化にはまだ改良の余地がある。そこでコラーゲンスポンジの架橋法、様々な徐放成長因子の組み合わせの検討を行い細胞培養で神経軸索再生の程度を比較した。PC12培養による軸索伸展の程度とコラーゲンスポンジ作製法ではグルタールアルデヒド(GA)架橋と乾熱架橋法を検討し、GA架橋では0%、乾熱架橋法では約10%のPC12細胞に放射状軸索伸長を認めた(平成15年度成果)。乾熱架橋法の凍結温度変化(-80°C、-20°C)によるスポンジの空隙の大きさはそれぞれ100500μm、5001000μmであった。PC12軸索伸長は100500μmで15%程度、5001000μmで15%程度であった。空隙の大きさによる軸索伸長に変わりはなかったがスポンジ表面に撒布したPC12細胞は5001000μmの空隙を持つ-20°Cスポンジで約1mmの深度まで細胞が確認できた(平成16年度成果)。生後ラット後根神経節細胞(DRG)の初代培養法を確立した(平成15年度成果)。頚部交感神経節細胞(SCG)初代培養法を確立した(平成16年度成果)。DRG・SCG共にGA架橋スポンジでは軸索伸長を認めず、乾熱架橋法で25%の軸索伸長を認めた。ついで-80°C凍結乾燥後の乾熱架橋コラーゲンスポンジ状で軸索伸長をPC12,DRG,SCGの培養を行い、NGF,BDNF, Bern University Prof.Weiss提供神経成長因子の添加の有無と軸索伸長を検討した。NGFは軸索伸長・細胞生存に必須であった。他の因子は軸索伸長には有意差を認めなかった。種々の人工神経の研究開発が進み臨床での末梢神経再生が可能となりつつある。なかでもコラーゲン・ラミニンスポンジを生体分解性のポリグリコール酸メッシュで被覆した人工神経は神経の再生に適した微小環境を移植部位に導入することで、基礎実験に引き続き臨床治験でも良好な結果を示している。しかし人工神経での臨床的再生は知覚神経が主となっている。なぜなら運動神経の臨床的再生は神経再生のみならず、脱神経後の筋肉萎縮を防がねば神経が再生しても有効な筋肉に収縮がおこらないからである。我々はこれまでの人工神経を改良しさらに短時間で神経線維切断端の再結合・刺激伝道系の再開を試みるとともに、電気信号を効果器へ伝えることの可能な電気伝導性の高い材料を使用した人工神経を作成することで神経再生までの効果器である筋肉の萎縮を最小限にとどめ、神経再生と同時に筋肉の運動も回復するような人工神経の開発を目指している。臨床使用対象は肺癌手術際、切断を余儀なくされることがあり、さらに再生が可能となった暁には残存肺機能の効果的温存が得られるという利点のある横隔神経を念頭においている。今年度は神経細胞類似の細胞系として知られるPC12細胞および後根神経節を用い、組織再生の足場としてのコラーゲンの形状・および徐放させる成長因子の検討を行っている。PC12細胞を用いた種々のポアサイズのグルタールアルデヒド架橋コラーゲンスポンジ上で神経突起培養実験では、ポアサイズの変化によらず神経突起の再生は通常の硝子板上の培養での神経突起再生と比べても著しく劣った結果となっている。さらにラット後根神経節細胞の同様の実験でもコラーゲンスポンジ上での神経突起再生は不良である結果を得つつある。今後はコラーゲンスポンジ作成法を乾熱架橋へ変更し架橋程度を弱め同様の実験を行い、In vitroで得られた結果のIn vivoでの再現性を検討する予定である。末梢神経が再生することは近年の研究で明らかにされ、人工神経の研究も緒に付いた。本研究は横隔神経を再生させ、組織学的・電気生理学的な再生のみならず横隔膜運動ひいては呼吸機能という生体機能の回復を目的とするものである。我々はこれまでコラーゲンコーティングしたPGA織布管の中にコラーゲンスポンジあるいはコラーゲン繊維を留置しこれにラミニンコーティングあるいはNGF浸漬徐放化を施した人工神経を開発した。坐骨神経を再建し組織学的あるいは電気生理学的な神経再生に成功しその歩行機能も回復したことを報告している。これらの研究で以下の問題点が明らかになった。神経軸索の再生の足場としての材料の最適化、軸索再生の速度の促進、除神経の間に起こる当該神経支配筋肉の萎縮の軽減である。そこでコラーゲンスポンジの架橋法および徐放成長因子の組み合わせと神経軸索再生の程度を比較した。グルタルアルデヒド架橋コラーゲンスポンジ上でPC12細胞を培養し軸索成長を顕微鏡的に観察した。ついでこの化学架橋コラーゲンスポンジのポアサイズを変更し同様の観察を行った。PC12細胞は化学架橋スポンジ状では軸索突起を成長させずポアの中で球状の細胞として観察された。乾熱架橋コラーゲンスポンジ上で同様の実験を行った。播種したPC12細胞の約10%程度が軸索突起を伸展したが、コラーゲン基質が予定の観察期間内に溶解してしまい、不充分な観察結果となった。

この結果より本研究のコラーゲン基質はグルタルアルデヒド架橋では架橋の程度が強力すぎるかごく微量の残存グルタルアルデヒドのため軸索伸展ができなかった可能性を示唆した。ついで乾熱架橋コラーゲンスポンジ上でマウス後根神経節細胞を培養した。コラーゲンコーティングガラス板上での軸索伸展には及ばないものの約10%の細胞で軸索伸展を認めた。全ての実験でNGFが軸索伸展と細胞形態維持には必要であった。本研究は切断された横隔神経に人工神経を移植し神経線維を再生させ、呼吸機能の回復を目的とする。これまでコラーゲン被覆したPGA織布管の中にコラーゲンスポンジを留置しラミニンコーティング・NGF徐放化を施した人工神経を開発し臨床応用されている。しかし人工神経の材料の最適化にはまだ改良の余地がある。そこでコラーゲンスポンジの架橋法、様々な徐放成長因子の組み合わせの検討を行い細胞培養で神経軸索再生の程度を比較した。PC12培養による軸索伸展の程度とコラーゲンスポンジ作製法ではグルタールアルデヒド(GA)架橋と乾熱架橋法を検討し、GA架橋では0%、乾熱架橋法では約10%のPC12細胞に放射状軸索伸長を認めた(平成15年度成果)。乾熱架橋法の凍結温度変化(-80°C、-20°C)によるスポンジの空隙の大きさはそれぞれ100500μm、5001000μmであった。PC12軸索伸長は100500μmで15%程度、5001000μmで15%程度であった。空隙の大きさによる軸索伸長に変わりはなかったがスポンジ表面に撒布したPC12細胞は5001000μmの空隙を持つ-20°Cスポンジで約1mmの深度まで細胞が確認できた(平成16年度成果)。生後ラット後根神経節細胞(DRG)の初代培養法を確立した(平成15年度成果)。頚部交感神経節細胞(SCG)初代培養法を確立した(平成16年度成果)。DRG・SCG共にGA架橋スポンジでは軸索伸長を認めず、乾熱架橋法で25%の軸索伸長を認めた。ついで-80°C凍結乾燥後の乾熱架橋コラーゲンスポンジ状で軸索伸長をPC12,DRG,SCGの培養を行い、NGF,BDNF, Bern University Prof.Weiss提供神経成長因子の添加の有無と軸索伸長を検討した。NGFは軸索伸長・細胞生存に必須であった。他の因子は軸索伸長には有意差を認めなかった。
政党再編期の参議院における多数派形成と議員行動

本年度は2年間にわたる科学研究費補助金の第2年度に当たる。前年度の成果を受けて、当初からの研究課題と今年度の研究計画に沿った成果を出すことが目指された。具体的には、政党再編期における参議院について、会派変動と議員行動の因果連関を解明するという観点から、計量データに依拠した実証分析を行うという試みであるこの試みは、2つの成果となってあらわれた。1つは研究論文「参議院自民党と政党再編」である。ここでは、従来ほとんど分析がなされていなかった自民党参議院議員の離党及び会派残留行動について、衆議院自民党の分裂を説明するための諸モデルよりも、参議院自民党において歴史的に形成された文脈を重視したモデルの方が、よりよく説明できることを明らかにした。すなわち、参議院自民党では長らく佐藤派-田中派-竹下派の圧倒的優位が続いていたが、それが少なくとも一時的に弱まったのが、1989年選挙による大幅な議席減から93年の分裂にかけての時期であった。他派閥の所属議員は、竹下派優位が弱まった状況の下では、以前に比べて党内昇進などで有利になっていたと考えられるが、分裂に際して、そのことが明らかに離党を抑止する要因として作用したのである。もう1つの成果としては、参議院議員の総合的データベース構築に着手できたことである。上に挙げた論文の中では1993年分のデータの一部しか利用しておらず、現時点でもデータベースとしては未完成の段階である。しかし、幸いにも衆議院に関して同様のデータベース構築を進めている研究者(建林正彦・関西大学助教授、エリス・クラウス・カリフォルニア大学サンディエゴ校教授)や国会の計量分析に実績のある研究者(川人貞史・東北大学教授、増山幹高・成蹊大学助教授、福元健太郎・学習院大学助教授)との共同研究にも見通しが立っているので、今後とも作業を継続する予定である。本年度は初年度であったため、研究課題である政党再編期の参議院についての実証分析を加えるための前提的な作業から着手した。具体的には、政党再編期以前の参議院、とくに自民党における派閥化の進行とキャリア・パスの確立時期についての検討、および広く国会に関する近年の研究が持つ特徴の把握である。その際、他国の議会研究や現代政治分析の成果が広く参照されたことはいうまでもない。これら二つの作業は、いずれも研究論文に結実した。まず前者については、参議院におけるキャリア・パス確立の出発点となった1971年議長選挙について分析を加えた論文「参議院自民党における閣僚ポスト配分ルールの形成」である。同論文は、参議院自民党においても、重宗議長という特異な指導者がいなくなったとき、衆議院と同様の制度化が進行し始めたことを指摘したもので、本補助金による研究課題の前史をなす時期を扱っている。また後者に関しては、レヴュー論文「国会研究の新展開」を著した。この小論では、1990年代後半以降の国会研究には、緻密な因果関係の把握と研究対象の拡大という2つの大きな特徴があることを指摘し、今後の課題についてもあわせて論じた。いずれの論文も、レフェリー・ジャーナルに投稿し査読を経て掲載されており、本研究課題の意義が評価されていることを示すものと考えられる。来年度は2年目に当たるため、本年度の成果を踏まえつつ、中心的課題としての政党再編期に関する研究を行う予定である。本年度の研究により、類似したテーマに関心を持つ研究者が少なくないことも分かったので、こうした方々との協力も含め、より大きな成果を挙げられるよう努力したい。
ゼニゴケを用いた新しい相互作用タンパク質探索技術の開発

本技術で用いる、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼNanoLucのPCA法であるNanoBitのゼニゴケでの機能を確認するため、ポジティブコントロールのモデル実験としてホモダイマーを形成するMXMTタンパク質、ゼニゴケ由来青色光受容体フォトトロピン(MpPHOT)相互作用を用いて検証を行った。それぞれのタンパク質とLgBitまたはSmBitが融合するようなコンストラクトを作成し、形質転換ゼニゴケを作出、発光解析を行ったところ、非常に弱い発光しか検出できなかった。このことから、ルシフェラーゼを用いたPCA法は適さないと考えられ、GFPを用いたPCA法であるBiFC法に切り替えることとした。蛍光タンパク質は植物で有効であるsfGFPを用い、NanoBitの場合と同様に、MXMT、MpPHOTタンパク質を用い、それぞれのタンパク質とNGFPまたはCGFPが融合するようなコンストラクトを作成し、無性芽を用いたアガートラップ法により同時に二重形質転換した。作出した形質転換ゼニゴケを蛍光顕微鏡で観察したところ、GFP蛍光を持つ細胞を観察できた。そのため、スクリーニングにはsfGFPを用いたBiFC法が有効であると考えられる。ゼニゴケの形質転換法(アガートラップ法)の改良では、形質転換体の選抜に用いる抗生物質の比較を行った。BC3-38株由来無性芽を用いたアガートラップ法では、ハイグロマイシンおよびクロルスルフロンが効率的に選抜可能な抗生物質であることがわかった。また、無性芽を用いたアガートラップ法で有効であった共存培養時のパラフィルムの使用と暗処理を胞子、葉状体切片を材料にしたアガートラップ法に応用させた。胞子を用いた場合、パラフィルムが有効であったが、葉状体切片を用いた場合では、どちらの改良点も適さないことがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度では、本技術に用いるためのBaitである青色光受容体フォトトロピンとウミシイタケルシフェラーゼのN末端断片を融合させたタンパク質(PHOT-NLuc)を発現する形質転換ゼニゴケの作成と、Preyに用いるゼニゴケcDNAライブラリーの構築を行う予定であった。本年度は、ゼニゴケにおけるルシフェラーゼの機能を確認するために、まず、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ(Rluc)の全長を発現する形質転換ゼニゴケを作出し、その発光強度を検証した。しかし、発光が確認されないか、非常に弱い発光のみが確認されたため、他の生物由来のルシフェラーゼに変更することにした。次に、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ(Nluc)の全長を発現する形質転換ゼニゴケを作出したところ、強い発光が確認されたため、本技術の開発には、Nlucを用いることにした。また、本技術は、新規タンパク質のスクリーニングへの利用を目的としているため、高効率な形質転換法は必須である。そのため、本年度は報告者が開発したゼニゴケの簡便な形質転換法であるアガートラップ法の改良を行い、さらなる高効率化を目指した。アガートラップ法の改良では、アグロバクテリウム株の菌株による形質転換効率の差を比較した。さらに、アグロバクテリウムとの共存培養時に、シャーレをパラフィルムで巻くことで、培養室内が乾燥していても、効率的な形質転換を行えるようになった。これらの改良で、これまで約50%であった形質転換効率を90%以上に上げることに成功し、スクリーニングに用いる為に、充分な効率の形質転換系を確立出来たと考えられる。本年度は年度途中からの採用再開だったため、平成28年10月から平成29年3月までの半年間の研究進歩状況を報告する。当初の計画では、本技術に用いるためのBaitと、Preyに用いるゼニゴケcDNAライブラリーの構築を行う予定であった。本技術の開発には、当初ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ(Rluc)を用いる予定であったが、予備実験であるゼニゴケにおけるルシフェラーゼの機能の確認において、Rlucでは弱い発光しか確認されなかったため、本技術の開発には適さないと考えられた。次に、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ(Nluc)を用いたところ、強い発光が確認されたため、本技術の開発にはNlucを用いることに変更した。また、本年度は本技術に用いる形質転換法の改良に成功し、非常に高効率なゼニゴケ形質転換が可能になった。本技術に用いるルシフェラーゼの変更はあったが、本技術の基盤技術である高効率なゼニゴケ形質転換法の確立には成功したため、本技術の開発はおおむね順調に進展していると考えられる。本技術で用いる、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼNanoLucのPCA (Protein-fragment Complementation Assay)法であるNanoBitがゼニゴケにおいて機能するかを確認する必要があるため、ポジティブコントロールのモデル実験としてホモダイマーを形成するMXMTタンパク質、ゼニゴケ由来青色光受容体フォトトロピン(MpPHOT)およびヘテロダイマーを形成するFKBP-FRB相互作用を用いて検証を行う予定であった。そのため、それぞれのタンパク質とLgBitまたはSmBitが融合するようなコンストラクトを作成し、形質転換ゼニゴケを作出した。同様に、ネガティブコントロールのモデル実験としてLgBit, SmBitのみを発現させるようなコンストラクトを作成し、形質転換ゼニゴケを作出した。

形質転換ゼニゴケを作成後、発光検出器を用い、MXMTとNanoBit融合タンパク質を発現する形質転換体で発光を確認できた。今後は引き続きモデル実験の検証を進め、その後スクリーニングに向けたBaitとPreyの作成を行う。また、本技術はスクリーニングに用いるため、高効率な形質転換技術が求められる。そのため、昨年度に引き続き形質転換法の改良を行った。アグロバクテリウムとの共存培養期間に着目し、改良を加えたところ、ゼニゴケ株BC3-38, Tak-2由来無性芽でほぼ100%の形質転換効率を達成した。今回の改良で、スクリーニングに用いるために充分に高効率な形質転換系の確立が完了したと考えられる。また、本技術では高効率な形質転換が必須であり、昨年度から形質転換法の改良を行っている。改良ではゼニゴケ株BC3-38由来無性芽を用いて、共存培養時の1湿度条件、2アグロバクテリウムの菌株、3界面活性剤の添加、4明暗条件の検討を行った。これらの改良点を他のゼニゴケ株Tak-1, Tak-2由来無性芽に応用し、1アグロバクテリウムの菌株、2前培養の再検討を行った。これらの最適化により形質転換効率はTak-1由来無性芽で約30%から約60%に改善し、BC3-38由来無性芽、Tak-2由来無性芽ではほぼ100%の形質転換効率を達成した。本技術で用いる、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼNanoLucのPCA法であるNanoBitのゼニゴケでの機能を確認するため、ポジティブコントロールのモデル実験としてホモダイマーを形成するMXMTタンパク質、ゼニゴケ由来青色光受容体フォトトロピン(MpPHOT)相互作用を用いて検証を行った。それぞれのタンパク質とLgBitまたはSmBitが融合するようなコンストラクトを作成し、形質転換ゼニゴケを作出、発光解析を行ったところ、非常に弱い発光しか検出できなかった。このことから、ルシフェラーゼを用いたPCA法は適さないと考えられ、GFPを用いたPCA法であるBiFC法に切り替えることとした。蛍光タンパク質は植物で有効であるsfGFPを用い、NanoBitの場合と同様に、MXMT、MpPHOTタンパク質を用い、それぞれのタンパク質とNGFPまたはCGFPが融合するようなコンストラクトを作成し、無性芽を用いたアガートラップ法により同時に二重形質転換した。作出した形質転換ゼニゴケを蛍光顕微鏡で観察したところ、GFP蛍光を持つ細胞を観察できた。そのため、スクリーニングにはsfGFPを用いたBiFC法が有効であると考えられる。ゼニゴケの形質転換法(アガートラップ法)の改良では、形質転換体の選抜に用いる抗生物質の比較を行った。BC3-38株由来無性芽を用いたアガートラップ法では、ハイグロマイシンおよびクロルスルフロンが効率的に選抜可能な抗生物質であることがわかった。また、無性芽を用いたアガートラップ法で有効であった共存培養時のパラフィルムの使用と暗処理を胞子、葉状体切片を材料にしたアガートラップ法に応用させた。胞子を用いた場合、パラフィルムが有効であったが、葉状体切片を用いた場合では、どちらの改良点も適さないことがわかった。
カチオン性ナノバブルとキャビテーションを利用した新規バイオフィルム除去法の開発

深い歯周ポケット内や根分岐部などの“狭く"“深い"部位に形成されたバイオフィルムを効率的に除去することは、歯周病の予防・治療・再発防止のために非常に重要な戦略である。本研究では、超音波によるキャビテーション現象を応用した非接触型の新しいバイオフィルム除去法の開発に向けて、カチオン性ナノバブルを併用する。カチオン性ナノバブルは負電荷を示す細菌表面に対して静電的親和性を有し、バイオフィルム近傍でより効率的にキャビテーションを誘導する事が可能であると考えられる。昨年度までに、カチオン性脂質であるDSDAPを含むリン脂質を用いて調製したリポソームが、平均粒径180 nm、ζ電位が+1020 mVのカチオン性を示すことを示した。このリポソームにパーフルオロプロパンを内封して、平均粒径600 nmのカチオン性ナノバブルを作製することができた。今年度は、Storeptococcus mutans (S.mutans)に対するカチオン性ナノバブルの相互作用について、フルーサイトメトリーと生体分子相互作用解析装置(Biacore)を用いて解析した。カチオン性ナノバブルは、S.mutansの浮遊菌およびバイオフィルムの両方に対し、DSDAPを含まない従来型ナノバブルに比べて強く相互作用することが確認された。また、蛍光標識させたナノバブル溶液をS.mutansのバイオフィルムに添加し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてバイオフィルムに対するカチオン性ナノバブルの挙動を評価したところ、カチオン性ナノバブルを示す赤色蛍光がバイオフィルム表面および内部で強発現している様子が観察され、カチオン性ナノバブルとバイオフィルムとの静電的相互作用が増強していることが示された。さらに、超音波照射とカチオン性ナノバブルを併用すると、S.mutansバイオフィルムの剥離効果が増強する傾向が認められた。26年度が最終年度であるため、記入しない。深い歯周ポケット内や根分岐部などの"狭く""深い"部位に形成されたバイオフィルムを効率的に除去することは、歯周病の予防・治療・再発防止のために非常に重要な戦略である。本研究では、超音波によるキャビテーション現象を応用した非接触型の新しいバイオフィルム除去法の開発を目指す。初年度にあたる本年はまず、キャビテーション効果を増強させるためのカチオン性ナノバブルの開発に着手した。カチオン性ナノバブルは負電荷を示すバイオフィルムに対して静電的親和性を有し、バイオフィルム近傍でより効率的にキャビテーションを誘導する事が可能であると考えられる。カチオン性脂質であるDSDAPを用いて逆相蒸発法にてリポソームを調製し、その物性を評価した。緩衝液の種類および構成脂質の含有比率について検討を重ねた結果、平均粒径180nm、+1020mVのζ電位を示すカチオン性リポソームを調製することができた。このリポソームにパーフルオロプロパンを内封してカチオン性ナノバブルとし、ガスの保持能について検討したところ、中性ナノバブルに比べてガスの保持能が短い傾向が見られた。次に、生体分子相互作用解析装置(Biacore)を用いて、負電荷表面およびStoreptococcus mutans (S. mutans)バイオフィルム表面とカチオン性リポソームとの相互作用を解析したところ、中性リポソームに比べていずれの表面においてもResponse Unit (RU)の上昇が認められた。また、蛍光標識させたリポソーム溶液をS. mutansバイオフィルムに添加し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてバイオフィルムに対するカチオン性リポソームの挙動を評価したところ、カチオン性リポソームを示す赤色蛍光がバイオフィルム表面および内部で強発現している様子が観察され、カチオン性リポソームとバイオフィルムとの静電的相互作用の増強効果が示唆された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。適当なナノバブルの調製方法の検討とその評価に予想以上の時間を要したため。特に、調製に使用する緩衝液の種類やリポソームの構成脂質の選択および含有比については、度重なる試行錯誤が必要であった。また、その後の評価方法についても、当初想定していた手法では測定できない場合があり、代替法の検討と新たなプロトコールの確立のために当初の計画通りの進展は達成できなかった。本年は静電的相互作用解析のプロトコールを確立するために安定して供給可能なリポソームを用いて基礎的検討を行ったが、今後はナノバブルを用いて同様の解析を行う。その際、ナノバブルの安定性を向上させるために構成脂質や含有比を変えるなど調製方法の改良をさらに進めるとともに、実際に超音波を照射してキャビテーション誘導能について評価する。また、ヒト口腔上皮細胞に対する生体適合性と障害性を評価し、超音波照射条件について最適化を行う。
小動物呼吸器疾患モデルにおける呼吸機能の解析

ラットのフローボリューム(FV)曲線とボディプチスモグラフ(BPG)測定を行った。BPGは熱交換能力強化で飛躍的に精度が向上し、メサコリン吸入時の肺気量増加を確認した(論文済)。FV曲線では測定方法の検証を行い、さらに、FVCとピークフローが良い指標であること、曲線の下行脚が3相に分かれることを見出した(投稿中)。これらの装置で喘息モデルの肺機能を6週間測定したところ、第2週で強い閉塞性変化と肺気量の増加が得られた後、反応は徐々に消失した(執筆中)。今年度はラットの適正なフローボリューム(FV)曲線を得るためには、挿管チューブを特別注文の13ゲージ針とする必要のあることが判明した。13ゲージ針の使用と装置の改良により、ヒトと類似した形状のFV曲線を安定して得られるようになったが、下行脚後半相の再現性は不十分であり、解析にはさらなる検討が必要である。メサコリン吸入(04.0mg/ml)による検討で、ピークフローの低下と努力肺活量(FVC)の減少が気道収縮の評価には適するが、0.05秒率と0.1秒率は不適なことが明らかとなった。ボディプレチスモグラフによる追加測定で、FVCの低下は気道収縮に伴う肺の過膨張が原因と考えられた。これらの結果は臨床結果と類似する点と異なる点があり、臨床肺機能検査と小動物検査の比較検討を行う基本資料となるため、2008年度欧州呼吸器学会で発表するとともに論文作成中である。このように測定値の安定と基礎データが確立したため、次いで、Norway Brownラットを卵白アルブミン(OVA)で感作して気管支喘息の実験モデルを作成して、長期経過の観察を開始した。測定にはスパイロメトリーとボディプレチスモグラフを用いた。現在は中途経過であるが、感作後の第2週目にOVA負荷で実験的喘息発作を誘発すると、ピークフローとFVCは対照群と比較して低下し、機能的残気量は増加している。この結果はメサコリン吸入負荷による気道収縮と類似している。今後は観察期間を延長して反応の増減を追跡するともに、実験個体数を増加させて結論を導く予定である。今年度は、計画に従って喫煙によるラットの慢性閉塞性肺疾患モデル作成を試みたが、予備実験の段階で8週間の煙草煙曝露によっても、フローボリューム(FV)曲線と機能的残気量等での明らかな肺機能変化が得られなかった。この理由として、昨年度の実験においても、わが国で入手したNorway Brownラットの気道反応性が極めて低かったことが関係していると推測された。そこで、今年度は気道反応性が高いとの情報を得たモルモットを対象として、昨年類似の実験を行い、研究の推進を期した。モルモットは大型かっ体型が大きく異なるため、装置は再製作の必要があったが、年度半ばにFV曲線測定機は完成した。測定を行うと、モルモットのメサコリン、ロイコトリエンD4に対する急性反応はラットより遥かに高かったが、FV曲線はラットと異なり下行脚領域が狭いことが判明したため、まず、基本波形の取得を行った。次いで、吸入と静脈投与薬剤による気道収縮に対するFV曲線の下行脚形状が異なることが判明し、臨床で推測されている「吸入投与は大中径気道に主として作用し、経口薬は末梢気道に強く作用する」仮説の傍証が得られた。さらに、卵白アルブミン感作による喘息モデルの作成もラットよりは遥かに容易であり、気道反応も極めて高かったため、FV曲線は喘息モデルでのアレルギー性収縮と薬剤投与での急性気道収縮と異なることに言及できた。これらの結果は、平成21年の日本呼吸器学会と国際生理学会にて発表予定である。機能的残気量測定に関しては、現在は装置の作製中であり、平成21年夏頃完成する予定である。なお、成果の一部はJ Phsyiol Sciに投稿、revise後の再投稿が終了している。