hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノクラスタダイヤモンド-金属間のドライ低摩擦摺動機構の解明

研磨しやすい気相合成ダイヤモンド薄膜を成膜し,この膜を適度に研磨することにより得られる金属との間の低摩擦・低摩耗摺動について定量的に評価した。ダイヤモンド膜は研磨により、相手材金属と接触する平坦部と接触に寄与しない非周期的な溝構造が形成され、潤滑油がなくても相手材金属を摩耗しない摺動を実現することが明らかになった。また、研磨により得られた構造では摩擦係数がほとんど零になる摺動条件があることを計算機シミュレーションにより導き出した。接触面を半鏡面状に研磨したナノクラスタダイヤモンド膜と汎用構造金属材料の間の低摩擦摺動現象の動作環境依存性を評価した。研磨した膜の表面には不規則的な3次元的形状を有し、光学顕微鏡によるミクロスケール組織観察及び表面粗さ計によるマクロスケールの評価によって膜表面のうねりや凸凹形状の定式化などの微視的形状の特徴評価を行い、摩擦磨耗現象に直接的に影響を与える形状パラメータを抽出した。これらの膜表面の微細構造、表面の算術平均粗さを組織パラメータとして、膜の形状と摩擦係数との相関関係について、分子気体潤滑の観点からDirectSimulationMonteCarlo(DSMC)法を用いた数値シミュレーションを実施し、相対速度毎秒2m程度の摺動速度で研磨ダイヤモンド膜に希薄気体(この場合は空気)の散乱に起因する浮力が生じることを明らかにした。また、試験雰囲気における湿度を制御した環境下でピンオンディスク摩擦磨耗試験を行い、摺動性能の環境依存性を定量化した。その結果、表面粗さが小さい(平滑:算術平均粗さ0.2μm)ダイヤ面では低湿環境で摩擦係数0.8程度の低摩擦を示し、比較的表面粗さが大きい(算術平均粗さ0.8μm)ダイヤモンド面では相対湿度4060%の環境下において摩擦係数0.6以下の良好な低摩擦現象を示した。通常、この湿度範囲ではメニスカスの発生により摩擦係数が上昇するものであるが、液体架橋が局所的に潤滑膜として作用することにより摩擦係数が下がることが示された。1)研磨ダイヤモンドによる摺動及び摺動性能の環境依存性評価湿度の異なる環境下で表面粗さの異なる研磨ダイヤモンド膜と金属の間のピンオンディスク摩擦磨耗試験を行い、摺動性能の環境依存性を評価した。低湿度、高湿度の環境制御のもとで摩擦磨耗試験を行い、ダイヤモンド膜の組織パラメータと低摩擦現象の相関について定量化した。その結果、比較的研磨度の高い(鏡面粗さの小さい)膜面では湿度を低く設定することで、長時間安定した低摩擦摩耗状態が得られることが示されたが、研磨度の低い(表面粗さの大きい)膜面においても相対湿度4060%程度の環境下において、安定した摩擦摩耗状態が実現することが明らかになった。この2つの安定低摩擦状態は接触面の解析により、トライボフィルムの形態が異なることが示され、研磨ダイヤモンド膜の低摩擦低摩耗状態のメカニズムが明らかになった。2)低摩擦現象の現象論的数値解析モデルの構築1)によって明らかにされた物理的モデルに基づき、気体分子と固体壁面の形状と材質を取り込んだコンピュータシミュレーションを行った。ここでは、ナノレベルにおける低摩擦ダイヤモンド膜のミクロな時空間スケールにおけるエネルギーの伝搬現象とマクロな気体分子との相互作用によって決定されるメカニズムに基づくDSMC法(Direct Simulation Monte-CarloMethod)による数値シミュレーションにより解析を行った。DSMC法による解析の結果、研磨ダイヤモンド面と平板間の摺動においては、相対する2面間の間隙に希薄な気体が流れ込むことにより境界潤滑から流体潤滑状態に接触の状態が遷移することによって、摩擦係数が更に低く、ほとんどゼロになることが示された。実験的には2面間の相対速度が1m/s程度でこの効果が現れることが予想されたが、解析によってもその有効性が検証された。
特定酵素蛍光基質を用いた病原細菌および薬剤耐性細菌の簡易迅速定量法の開発

大腸菌は糞便汚染の指標であり,大腸菌群に変わる指標細菌として利用することが議論されている.現在の大腸菌数測定法は,培地の作製,希釈,18時間以上の培養,陽性の判定作業など多大な労力を要する.そこで本年度は,特定酵素基質培地法を液体培地に適用しこの課題を解決することとした.具体的には,マイクロプレートリーダー内で下水処理水を37°Cで培養しながら蛍光強度の経時変化を測定することにより,下水処理水中の大腸菌数を測定することを試みた.さらに測定時のDNAおよびmRNA量を定量し,測定時の酵素生成メカニズムを明らかにした.uidA遺伝子コピー数(すなわち大腸菌数)は4時間以降に対数増殖した.4時間以前はuidA量は検出限界(65 copies/μL)以下であった.mRNAも4時間以前は検出限界以下であった.MUの蛍光強度(すなわち酵素活性)は5.5時間から急激に増大した.これら3データを比べると,大腸菌対数増殖開始(5時間)とmRNA発現開始(6時間)には少しタイムラグがあるが,mRNA発現とMU生成(すなわちGUSとMUGの反応)にはタイムラグがない.よって,mRNA発現からGUSが生成され基質であるMUGと反応する一連の流れは短時間で起こることがわかった.ここで注目すべきは,uidAが検出限界以下である4時間以前でもMUの蛍光が検出されていることである.このことは,終沈水中(の大腸菌細胞内)に十分な量(マイクロプレートリーダーで検出可能な蛍光強度に達する量のMUGを分解できる量)のGUSがすでに(大腸菌を培養しなくても)存在していることを示している.蛍光強度の傾き(これは基質(MUG)分解速度に等しい)が直線であることは,酵素反応がゼロ次関数,すなわち酵素濃度が一定であることを示している.このように,大腸菌簡易測定法の開発に成功した。大腸菌は糞便汚染の指標であり,大腸菌群に変わる指標細菌として利用することが議論されている.現在の大腸菌数測定法は,培地の作製,希釈,18時間以上の培養,陽性の判定作業など多大な労力を要する.そこで本年度は,特定酵素基質培地法を液体培地に適用しこの課題を解決することとした.具体的には,マイクロプレートリーダー内で下水処理水を37°Cで培養しながら蛍光強度の経時変化を測定することにより,下水処理水中の大腸菌数を測定することを試みた.さらに年間を通じて3下水処理場の大腸菌数を測定し,本法の汎用性を検討することとした.3処理場のサンプルとも,蛍光強度は培養開始から約1時間は低下し,その後直線的に増化し,約6時間後から指数関数的に増大した.指数関数的に増大したのはこの時間に大腸菌が対数増殖しているためと考えられる.蛍光強度が直線的に増加した1時間から3時間の間の蛍光強度を一次式で近似し,サンプルの傾きとブランクサンプルの傾きの差を「蛍光強度増加速度」と定義した.蛍光強度増加速度は高濃度のサンプルほど大きくなった.この測定を平成29年5月から平成30年1月まで年間を通して行った.各処理場においてサンプリングの間隔は7日以上とした.3処理場とも大腸菌数が増大するのに伴い蛍光強度増加速度が増大する傾向が見られた.この結果を検量線として使い,一年間の大腸菌変動を解析した。大腸菌数をみると,3処理場ともに突発的に高い日があることがわかる.また,B処理場は9月以降に大腸菌数が上がるという季節変動が見られた.突発的に高い日は,A処理場では4日あり,このうち3日を本法は検出できた.B処理場には4日あり,このうち3日を本法は検出できた.C処理場にも4日あり,このうち3日を本法は検出できた.このように,大腸菌簡易測定法の開発に成功した。当初の計画では、一年目は技術を開発することが目的であったが、研究が予想以上に進展し、長期間実環境サンプルを測定することに成功したため、このように判断をした。大腸菌は糞便汚染の指標であり,大腸菌群に変わる指標細菌として利用することが議論されている.現在の大腸菌数測定法は,培地の作製,希釈,18時間以上の培養,陽性の判定作業など多大な労力を要する.そこで本年度は,特定酵素基質培地法を液体培地に適用しこの課題を解決することとした.具体的には,マイクロプレートリーダー内で下水処理水を37°Cで培養しながら蛍光強度の経時変化を測定することにより,下水処理水中の大腸菌数を測定することを試みた.さらに測定時のDNAおよびmRNA量を定量し,測定時の酵素生成メカニズムを明らかにした.uidA遺伝子コピー数(すなわち大腸菌数)は4時間以降に対数増殖した.4時間以前はuidA量は検出限界(65 copies/μL)以下であった.mRNAも4時間以前は検出限界以下であった.MUの蛍光強度(すなわち酵素活性)は5.5時間から急激に増大した.これら3データを比べると,大腸菌対数増殖開始(5時間)とmRNA発現開始(6時間)には少しタイムラグがあるが,mRNA発現とMU生成(すなわちGUSとMUGの反応)にはタイムラグがない.よって,mRNA発現からGUSが生成され基質であるMUGと反応する一連の流れは短時間で起こることがわかった.ここで注目すべきは,uidAが検出限界以下である4時間以前でもMUの蛍光が検出されていることである.

このことは,終沈水中(の大腸菌細胞内)に十分な量(マイクロプレートリーダーで検出可能な蛍光強度に達する量のMUGを分解できる量)のGUSがすでに(大腸菌を培養しなくても)存在していることを示している.蛍光強度の傾き(これは基質(MUG)分解速度に等しい)が直線であることは,酵素反応がゼロ次関数,すなわち酵素濃度が一定であることを示している.このように,大腸菌簡易測定法の開発に成功した。今後はさらに研究を進捗させ一日でも早く薬剤耐性細菌の簡易分析法を開発する。申請時には一年目研究費に公定法用試薬に70万円計上したが、研究計画を変ること無しに公定法による分析回数を削減することができたため、余剰研究費を次年度に繰り越すこととした。繰り越した研究費でさらに研究を進めるため、二年目はサンプル数を増やし公定法による分析回数も増やす。また、技術補助員を雇用する予定であったが十分なスキルを持った人材が見つからなかった。研究は本学大学院生が行ったため研究に進展に支障はなかった。
公共財供給等と新たなテクノロジーの活用に関する研究

人口減少・高齢化の進展が急速に進む中、社会保障費の膨張や恒常化する財政赤字により国の財政的な限界や、人口減少で地方も消滅の危機にあり、国や地方が担う公共サービスに様々な「綻び」が見え始めている。近年の技術革新で急速に普及が進む「暗号通貨」のブロックチェーン技術といった新たなテクノロジーを活用し、必要な公共財や公共サービス等を市場メカニズム等で供給する政策的手段を拡充できないか。本研究では、「公共財の供給等と新たなテクノロジーの活用」をテーマとして、新しいテクノロジーの枠組みが公共財や公共サービスの効率的な供給に活用できる可能性等を分析し、今後の政策立案の基礎となる有益な情報の提供を目指す。
集団検診のための新しい膵癌の血清学的診断法の開発

ヒト膵癌には、正常膵とは異なる膵癌特異的抗原、あるいはγ-GTPの存在することが判明しているが、これらの抗原に特異的なモノクロ-ナル抗体を作製し、それを血中レベルで測定するシステムを開発することによって、膵癌の集団検診に応用しようとするのが本研究の目的である。そこでまず、剖検により入手した正常膵、膵癌組織および我々が樹立したヒト膵癌株化細胞のホモジネ-トを37°C、1時間ブロメリンで処理し、10^5×g、30分遠心後の上清を粗γ-GTP分画として得た。これらから陰イオン交換体、ゲル濾過、分離用等零点カラムを用いてsialic acid-rich typeとsialic acidーpoor typeの2種類の正常膵γ-GTPと膵癌由来γーGTPを分離精製した。ついでBalb/cマウスにこれらのγーGTPを免疫し、血清中に抗γ-GTP抗体を確認してから細胞融合を行った。また一方、膵癌株化細胞のPanc-1を免疫源として上記と同様な方法でハイブリド-マを作成した。ハイブリド-マのスクリ-ニングは、最初はELISA法で行ったが、その後はPancー1とヒト膵癌組織に対する免疫組織化学により行った。現在、剖検により得られた正常膵組織、あるいは膵癌組織を用いて、モノクロ-ナル抗体の特異性を検討中である。また将来、地域における膵癌集団の実施を予定しているので、地域における成人病の集団検診の際に同時に血清を収集中である。そしてすでに実用化されている腫瘍マ-カ-であるCEA,Du-Pan2,NCC-ST439,KM01を成人2945人の血清を用いて検討した。その結果は、各項目間の相関は小さく、それぞれが独立した検査項目と考えられた。今後は、我々の作製したモノクロ-ナル抗体の既存の腫瘍マ-カ-の組合せにより膵癌の血清学的診断の確立を目指したいと考えられている。ヒト膵癌には、正常膵とは異なる膵癌特異抗原、あるいはγーGTPの存在することが判明しているが、これらの抗原に特異的なモノクローナル抗体を作製し、それを血中レベルで測定するシステムを開発して膵癌の集団検診に利用するのが本研究の目的である。そこで先ず、剖検により入手した正常膵、膵癌組織および教室にて樹立されたヒト膵癌株化細胞のホモジネートを37°C、1時間ブロメリンで処理し、10^5×g30分遠心後の上清を粗γーGTP分画として得る。これらから陰イオン交換体、ゲル濾過、分離用等電点カラムを用いてsialic acid-rich typeとsialic acid-poor typeの2種類の正常膵γーGTPと膵癌由来γーGTPを分離精製する。ついでBalb/cマウスにこれらのγーGTPを免疫し、血清中に抗γーGTP抗体が作られているのを確認してから、その脾細胞と骨髄腫株との細胞融合を行った。また一方、膵癌株化細胞をBalb/cマウスに免疫し、その脾細胞を用いてハイブリドーマの作製も行っている。また将来、地域における膵癌集団検診の実施を予定しているため、地域における成人病の集団検診の際に同時に血清を収集中である。そしてすでに実用化されている腫瘍マーカーであるCEA、DuーPan2、NCCーST439、KM01を成人2945人の血清を用いて測定した。

異常者は4項目とも約3%の頻度で、4項目のうち1項目以上異常者は全体の約10%、複数項目の異常者は1.36%であり、各項目間の相関は小さくそれぞれが独立した検査項目と考えられた。今後、膵癌の集団検診にこれら腫瘍マーカーを応用するには、要精検率が高くならない程度に複数のマーカーを組み合わせて測定する必要があると思われた。ヒト膵癌には、正常膵とは異なる膵癌特異抗原、あるいは膵癌由来α-GTPの存在することが判明しているが、これらの抗原に特異的なモノクロ-ナル抗体の作製を試みた。すなわち剖検により入手した膵癌より得られたα-GTPでBalb/cマウスを免疫した。方法としては、sialic acid-rich typeとSialic acid-poor typeの2種類の正常膵α-GTPと膵癌由来α-GTPでBalb/Cマウスを3回免疫し、その後血清中にα-GTPに対する抗体の産生を確認した。そしてα-GTPに対する抗血清の存在が確認されてから、免疫Balb/cマウス脾細胞とX-63骨髄腫株との間で細胞融合を行った。ハイブリド-マのスクリ-ニングは、最初はELISA法で行ったが、その後はヒト膵癌組織と膵癌株化細胞に対する免疫組織化学により行った。以上のα-GTPに対するモノクロ-ナル抗体の作製法と全く同一の方法により、ヒト膵癌株化細胞であるParc-1を免疫源としてモノクロ-ナル抗体の作製も行った。現在は、上記の方法により得られた膵癌特異的α-GTPあるいはParc-1に対するモノクロ-ナル抗体で正常膵組織とは反応しない膵癌特異的ハイブリド-マをスクリ-ニングしている最中である。また将来的に膵癌の血清学的診断を行うために、関連病院より膵癌患者の血清を収集中である。地域における成人病検診において、膵癌の集団検診を予定しているので、各種の成人病検診に際しても血清を収集中である。したがって今後は、上記の方法により得られたモノクロ-ナル抗体を用いて、より感度、特異性の高い膵癌の血清学的診断を目指したいと考えている。
幼児教育における環境教育の実践的指導内容の検討について

幼児教育における環境教育の実践的指導内容の充実、および幼児教育課程への確立を目的として、3年間にわたり行った調査、実践結果から、次のような将来への指針が導き出された。幼児期の環境教育とは、まさに自然教育であるといってよく、ワクワクするような自然体験をたくさんさせることである。環境問題の理論や実践を知識として学ぶのではなく、あそびを中心とした直接体験の中で、「自然への感性」を豊かに育むことである。自然を回復・保全しつつ、現環境を子どもの体験の場としてより多く与えること、また、子どもが体験している時に、豊かな自然体験を持ち子どもを導いてやることのできる大人が、理解者、助言者としてそばにいてやることが大切である。親とともに、幼児教育現場における保育者の環境教育の視点での役割は実に大きい。しかしながら、本研究結果から、親への啓発が必要であり、また、保育現場での現保育環境の整備や保育内容の充実、保育者の資質の向上などの必要性が指摘できた。さらに、保育内容については、従来から行われている保育内容に、環境教育視点での明確な意義を持たせること、その上に、五感をフルに使って遊ぶ自然活動を新たに開発し、より多く年間指導計画へ位置づけることなどが指摘できた。以上のことは保育者の保育実践力や感性に左右されことが多いと思われるがるが、保育者養成課程での環境教育カリキュラムは不十分で、その充実や保育者の再教育が必要であることがわかった。そこで、「幼児自然教育研修会」を試行し、この中で、保育者が理論と実践を学ぶとともに、自ら楽しみながらの自然体験を通して、幼児教育における環境教育の実践的指導内容を模索した。保育者の意識を高め、実践力を向上させるための再教育の場として、あるいは保育者養成課程の学生への指導内容として、このような研修プログラムの開発・実施の必要性が指摘できた。平成4年度は、子どもの環境認識形成に大きな影響を与える人的要因である親、保育者の環境保全に対する考えや行動についての調査、また、保育現場の環境教育に関する保育内容の実態についての調査や事例収集などを主な研究内容とした。子供は、日々の生活の中でかかわるすべてのものから影響を受けながら成長していき、しかも、直接体験を通して獲得していく。特に人的環境の影響は大きいと思われるので、その実態を知り、しかもよりよい方向性を考えることによって、幼児期の環境教育を考える際の第一歩とする。また、保育現場の実態を知り、問題点を明らかにすることは、幼児教育における環境教育の実践的指導内容の検討を行う際の一助となると思われる。これらの研究からわかった知見については、1992年環境科学シンポジウムにおいて口頭発表し、平成5年度の保育学会においても口頭発表の予定である。研究結果の概要は次の通りである。親の環境認識を決定する要因は相互に関連がみられ、複雑に作用しあいながらある一定の方向に親の環境認識を決定していくと思われる。その要因の柱は(1)深い環境認識の形成(価格より、安全性を重要だと考えるなど)が必要で、これらの意識は実際の行動と強く関連する。(2)親の自然への親しみ行動・態度は、子どもの自然や小動物への親しみ行動とよく関連しており、親の影響が大きいことが言える。(3)親は、社会への帰属意識が強いほど社会に関わりを多く持とうとしたり、社会問題に関心を強く持っていたりする。環境保全のための行動とこのことは深い関連がある。などであるが、詳しくは平成5年度に環境教育学会で論文発表を行う。保育者の環境教育に対する考えや保育内容の実態については、平成5年度に報告する。また、本研究に先立って、一般住民の環境保全行動・態度について調査したので、本学紀要に発表した。

幼稚園、保育園の保育者自身が環境教育を行う上で、課題と思うことについて調査した結果、現環境を生かし、あるいは改善しながら保育内容の充実をはかる必要性が指摘でき、保育者は知識だけでなく、保育に生かしていけるような感性や、専門性といった資質が求められていることが分かった。また、そのためには保育者自身の豊かな「自然への感性」や自然体験」が望まれ、保育者の成育歴における環境教育や、保育者養成課程における環境教育の重要性が指摘できた。保育者養成課程における環境教育の実態を知るために保育者養成系短期大学の教育内容や教員の意識について調査した。教員は、学生の「自然への感性」や「自然体験」がやや乏しいと感じており、こういった指導の必要性を強く感じているのが分かった。また、幼児期における環境教育の必要性についても、非常に肯定的であった。環境問題を取り扱う教科は、内容や量については明確ではないが、約8割の短大で実践されているようである。しかし、現況では不十分であり、学生自身の「自然への感性」を豊かにするような、あるいは、「自然体験」ができるような教科を充実させることや環境教育関連科目の教育課程における必須化が望まれる。保育現場に資料の協力を依頼し、環境教育に関連した保育内容について、指導計画や、実践記録を収集した。しかし、日常の保育とは、様々な目的、目標を持って計画され、総合的にその達成を願うもので、特に環境教育として取り上げて特別な実践が行われることは少ないという結果であった。今ある環境を極力生かしながら、子どもの「自然への感性」を豊かにしたり、たくさんの「自然体験」の機会を与えるなどの保育内容の充実が必要で、早急に幼児教育体系に位置づくことが望ましい。これまでの研究結果から、現保育環境の整備や、実践的指導内容の充実と確立を可能にしていくためには、保育者の資質の向上を必要とし、また、現時点での保育者養成課程の環境教育では不十分で、その充実や保育者の再教育の必要性が示唆できた。そこで、今回、保育者の意識を高め具体的指導内容を模索するための研修プログラム開発を試みた。実際に自然の中で2泊3日で行う宿泊研修で、講習内容の概要は次の通りであった。(1)幼児期の環境教育を考える・・(1)自然を伝える者としての大人の役割(2)自然教育におけるプログラムの必要性(3)発達段階と自然教育(2)自然への感性をみがく体験学習・・・五感を使うゲームなどの自然体験や、野外炊飯等の生活体験など。この「幼児自然教育研修会」において、保育者は理論と実践を学ぶとともに、楽しみながらの自然体験を通して、幼児教育における環境教育の実践的指導内容を模索した。幼児期の環境教育とは、まさに自然教育であるといってよく、ワクワクするような自然体験をたくさんさせることである。小学校以上のように環境問題を知識として学ぶのではなく、あそびの中で「自然への感性」を豊かに育むことである。子どもを取り巻く現環境を体験の場としてより多く与えてやること、また、豊かな自然体験を持ち子どもを導いてやることのできる大人が、一人でも多く理解者、助言者としてそばにいることが大切である。
基底状態および励起状態における選択的電子移動複合体を経る反応の開発と応用

ドナ-・アクセプタ-としての分子の適当な組合せの基底状態および励起状態における選択的電子移動による複合体形成を利用し、新しい高選択的な官能基変換および骨格合成反応などを開発し、これを医薬・農薬などとしての有用性が期待される、複雑な構造を有する天然有機化合物などの合成に応用することにより、現代精密有機合成化学の進歩に寄与するとともに21世紀の創薬への合成化学的基盤の飛躍的向上に資することを目的に本研究が行われた。具体的成果の上がったのはマクロライド、ポリエ-テル抗生物質の合成研究であり、その報告を行う。1.マクロライドの合成:セコ酸及びマクロ環のコンホメ-ションをNMR、MMP2計算により予測し、保護基によって制御することにより反応の選択性を極限まで向上させることによりマクロライドの高効率で完全選択的合成の一般法を確立した。これによりエリスロノリド、マリドノリドなどの超効率合成が達成され、ランカノリド、オレアンドノリドなどはその途上にある。2.ポリエ-テルの合成:特異な構造を持ち懸案であったリソセリンの全合成が完成した。即ち、C_1ーC_9およびC_<10>ーC_<23>フラグメントをD-グルコ-ス、D-マンニト-ルを出発原料として完全立体選択的に合成し、最後に両者のアルド-ル縮合によってリソセリンがはじめて合成された。
植物ホルモン応答の細胞選択的な制御システムの構築

オーキシンの偏差濃度分布の調節は、植物の成長制御に重要である。オーキシンの濃度分布を自在に制御する目的で,新しいホルモンデリバリーシステムの開発に挑んだ。本課題では,不活性型オーキシンアナログを代謝活性化する微生物酵素を探索し,植物に酵素遺伝子を形質転換することで特定の細胞で活性化酵素を発現させることに成功した。本システムはオーキシンの濃度分布を人為的に制御する技術として,オーキシンの生理応答の時空間的な解析に活用されることが期待される。オーキシンは植物ホルモンの中で中心となって,植物の成長制御を司る。このオーキシンの分化・成長に対するホルモン作用は,植物内の組織・細胞での濃度分布によって調節されている。例えば,屈性応答や側根形成などは,オーキシンの不等分布によって引き起こされると考えられている。このオーキシンの濃度分布を自在に制御する技術が待望されており,本課題では植物バイオテクノロジーとケミカルツールを融合させた全く新しいタイプのホルモンデリバリーシステムの開発に挑んだ。オーキシンを各種アミノ化合物と縮合させて不活性化したプロドラッグ(代謝活性型ホルモンアナログ)を合成し,植物体内では,代謝を受けず数日間は安定であるプロドラッグを合成・探索した。その結果,オーキシンであるIAAにある種のアミノ酸を結合させたプロドラッグ体では,植物体内できわめて安定であり,植物体内では加水分解を受けてオーキシンを遊離しないことがわかった。また,合成したプロドラッグ体は,植物に対して毒性は示さなかった。本オーキシンプロドラッグを炭素源として生育できる微生物のスクリーニングと,その同定に成功した。現在,酵素遺伝子のクローニングを実施中である。平成27年度に計画していたプロドラッグ体の分子設計と合成は初期の目標を達成した。微生物由来の代謝活性化酵素の探索に向けた予備実験も完了し,微生物スクリーニングでは,おおむね良好な結果を得ている。酵素遺伝子のクローニングは,現在解析中であるが、現時点では良好な結果が得られており,酵素遺伝子の同定に向けて,順調に進展している。している。一方,オーキシン以外の植物ホルモンの代謝活性化酵素の探索の予備実験は,植物体内で安定性の高いプロドラッグの分子設計に問題が生じているが、現在新たな保護基(代謝活性化基)の設計と導入に向けて動き出したところである。スクリーニングした微生物のゲノムシーケンスは平成28年度に持ち越しとはなったが、全体としておおむね順調に進展していると評価した。植物の分化成長の制御の中心となっているオーキシンのホルモン作用には,植物内の器官・組織内での濃度分布の調節が非常に重要となっている。この濃度分布は,主としてオーキシンの生合成・輸送・代謝による3段階で制御されている。植物の重要な環境応答である屈性応答や頂芽優勢は,オーキシンの濃度分布の差が形成されことにより調節されると考えられている。すなわちオーキシンの不等分布による各組織,細胞間のオーキシン応答の差により,屈性応答などが引き起こされる。このようにオーキシンの濃度分布の情報は非常に重要であることから,これまで,オーキシン濃度分布の可視化手法などが精力的に研究されてきたが,逆のアプローチであるオーキシンの濃度分布を人為的に制御する確実な手法は報告されていない。本研究では,新しいオーキシンの濃度分布の制御手法の開発に着手した。平成27年度はオーキシンに各種アミノ化合物を結合させたプロドラッグを合成し,植物体内で代謝安定性を示したオーキシンプロドラッグを見出し,このプロドラッグを分解してオーキシンを遊離する微生物酵素の同定に成功した。平成28年度はこの酵素遺伝子のクローニングと組換え酵素の発現に着手した。ホモログ検索による候補となる微生物の酵素遺伝子をクローニングし,このプロドラッグ遊離酵素遺伝子を,大腸菌においてGFP融合タンパクとして,活性を維持したまま発現させることに成功した。この組換え体酵素を用いてカイネティックスを測定し,プロドラッグに対するKm値やVmaxなどから,酵素の基質特異性や合成したプロドラッグに対する親和性を検討した。また酵素のGFP融合たんぱく質を過剰発現するシロイヌナズナ形質転換体の作成を実施して,融合タンパク質の植物体の成長に対する影響を検討した。平成28年度に計画していた微生物由来のプロドラッグ代謝活性化酵素の探索に成功し,その酵素遺伝子のクローニング,大腸菌での組み換えタンパクの大量発現と精製に成功した。また,得られた組み換え酵素を用いて,プロドラックに対する親和性や速度定数などを測定した。組み換え酵素はGFP融合タンパクとして発現させた場合においても活性を示し,過剰発現した場合においても,大腸菌やシロイヌナズナに対する顕著な毒性は示さなかった。以上,研究全体としておおむね順調に進展していると評価できる。オーキシンは,環境応答や形態形成の制御を担う極めて重要な植物ホルモンである。オーキシンの分布と内生濃度は輸送とともにオーキシンの代謝不活性化や生合成,前駆体からの代謝活性化などにより調節を受ける。したがって,環境応答や形態形成の制御には,オーキシンの信号伝達系の制御とともに極性輸送や生合成・代謝不活性化によって調節される植物体内のオーキシン濃度勾配の形成が重要である。オーキシンは,オーキシン排出輸送タンパクであるPINやABCBトランスポーターにより極性輸送される。それら輸送タンパクが協調して細胞内のオーキシン濃度を制御することにより,植物体内でのオーキシン濃度の偏差分布が形成される。本研究課題では,オーキシンの濃度分布を人為的に制御する技術の開発を目指して,研究を推進した。

植物体内でオーキシン濃度を自在に制御する技術を創出するため,全く新しいタイプのホルモンデリバリーシステムの開発に挑んだ。すなわちオーキシンプロドラッグ(代謝活性型ホルモンアナログ)と,それに特異的に作用し,オーキシンを遊離する微生物由来の酵素を用いたオーキシンデリバリーシステムの構築である。最終年度までに,合成したオーキシン-アミノ酸複合体であるオーキシンプロドラッグを特異的に分解するペプチダーゼを土壌細菌より分離・クローニングした。そして大腸菌でGFP融合タンパクとして発現させた酵素について,カイネテックの解析に成功した。最終年度は,シロイヌナズナの各種細胞・組織特異的プロモーターの制御化で, GFP融合ペプチダーゼを発現させて,特定の細胞のみでオーキシンプロドラッグからオーキシンを遊離させることによって,自在に細胞内のオーキシン濃度分布を制御することに成功した。これらの成果は,国際学会にて成果発表した。オーキシンの偏差濃度分布の調節は、植物の成長制御に重要である。オーキシンの濃度分布を自在に制御する目的で,新しいホルモンデリバリーシステムの開発に挑んだ。本課題では,不活性型オーキシンアナログを代謝活性化する微生物酵素を探索し,植物に酵素遺伝子を形質転換することで特定の細胞で活性化酵素を発現させることに成功した。本システムはオーキシンの濃度分布を人為的に制御する技術として,オーキシンの生理応答の時空間的な解析に活用されることが期待される。平成28年度は,オーキシンののみならず,オーキシン受容体阻害剤や輸送阻害剤のプロドラッグ化を実施するとともに,進展が遅れているサリチル酸,ジャスモン酸,アブシジン酸のプロドラッグ化を推進する。また,活性化酵素のクローニングを行い,同定された酵素遺伝子を用いて,植物での発現コンストラクトの作成を行い,植物体でのホルモンプロドラック体の代謝活性化制御を実証する。さらに,各組織特異的プロモーターの制御下で代謝活性化酵素を発現する形質転換体を構築し,ホルモン分子の精密投与を試みる。平成29年度の最終年には,同定したプロドラッグ活性化酵素とGFPの融合遺伝子を,植物の組織特異的なプロモーターの制御下で発現する形質転換植物を作成し,オーキシンの精密制御を実施し,オーキシン応答性のレポーターラインなどを同時に導入し,細胞特異的にオーキシン濃度の制御が達成されたかどうかを検討する生物有機化学平成27年度予定していた微生物ゲノムの配列決定にかかるシーケンス実験の費用を予定していたが,別の手法でクローニングが可能であると推定された。しかしながら,しかしホモロジーに基づくPCRクローニングなどで解析が困難な場合は,ゲノムシーケンスによる受託解析を平成28年度に実施するためと,組み換え植物体を作成する費用のため,次年度の使用額が生じた。
好中球によるマクロファージ変容機序の解明～癌と結核の共通分子基盤を切り口にして～

研究代表者は、慢性炎症病態の成立基盤に関する研究を展開していたところ、結核持続感染で生じる肉芽腫においてS100A9陽性の好中球サブセットが、マクロファージの持続的活性化を引き起こす鍵細胞である可能性を見出した。そこで本研究では、以下2点を目的として研究を実施している。<I>好中球又はS100A9に依存したマクロファージM2誘導の分子機序解明<II>上記<I>で得られた分子機序が、ヒト癌悪性化又は慢性炎症疾患において適用される可能性を検討し、好中球による疾患悪化の分子基盤の解明につなげる。<I>に関しては、モルモットを基盤にした上述の研究成果を、ヒト・マウスに発展させるために、1ヒト好中球を高純度に分離するラットモノクローナル抗体の作製、そして、マウス研究基盤の先駆けとして、2S100A9遺伝子欠損マウスの作製、3マウスBCG炎症モデルの樹立を行った。各項目の実施状況概要を下記に示す。1ヒト末梢血好中球を抗原とした抗体スクリーニングを実施することで、pan好中球抗体及びそのハイブリドーマ株の樹立に至った。2CRISPR/Cas9システムを活用し、タンパク発現欠損が予測されるin/del変異導入ライン(合計5ライン)のF0世代樹立に成功し、実際にS100A9タンパク質が欠失した3ラインの確立に成功した。3モルモットを利用した結核持続感染を反映する動物モデルとして、マウスBCG投与個体を検討中である。1ヒト好中球を利用した好中球特異的抗体の作出健常人末梢血を用いた密度勾配遠心法から好中球をエンリッチし、CFAとのエマルジョンを作製しラットに免疫し、3週後の免疫ラットの腸骨リンパ節細胞とSP2/0をfusionすることで、ヒト好中球抗体を産生するハイブリドーマクローンを多数樹立した。それらのうち、単球やリンパ球を認識せず、末梢血好中球に対する特異的認識抗体(HG147)を単離した。HG147は、いくつかのpan好中球抗体と競合することが明らかとなったが、抗原同定に至っていない。今後、抗原同定やブロッキング活性に関する実験を進めながら、ヒト好中球:マクロファージ共培養実験の整備を進める。マウスS100A9遺伝子を標的としたgRNAを数種類設計し、詳細な活性評価を経て得られたgRNAを用いてC57/BL6マウス受精卵へインジェクションした。結果として、8種類の異なるin/del変異導入マウス(F0)を得た。そのうち、S100A9タンパク発現が完全に欠失した5ラインのF0マウスを樹立し、うち3ラインについて繁殖作業を継続している。3マウスBCG炎症モデルの構築C57/BL6マウスに対するBCG投与ルートとして、静脈、皮内、皮下、腹腔投与を試みて、それらの組織応答をHE染色やフローサイトメトリーを用いて解析した。特に、標的組織に浸潤する好中球及びマクロファージの極性評価について、時空間的解析を実施している。平成30年度は、S100A9遺伝子欠損マウスを活用したマウス研究を主体として、以下の課題に着手する。1S100A9遺伝子欠損マウスを活用したマクロファージの持続的活性化を制御するS100A9新機能の同定2好中球・S100A9に依存したマクロファージの持続的活性化を検証するマウス慢性炎症モデルの確立1S100A9分子は、好中球に高発現する分子でありながら、好中球における生理機能が明確ではない。S100A9遺伝子欠損マウスにおいて、好中球分化は野生型と変わらない。マクロファージの持続的活性化に影響する遺伝子発現にS100A9が関与する可能性について、オミクス解析を糸口にするなどして、S100A9新機能の同定を試みる。2マウスBCG投与モデルの組織解析を進めるとともに、担癌モデルなど他の慢性疾患モデルに関する構築準備を進める。炎症組織における好中球の浸潤、マクロファージの極性等を経時的に定量するための組織学解析を確立する。立した適当なモデル系におけるS100A9遺伝子欠損マウスの表現型を検証することで、S100A9に依存したマクロファージの持続的活性化を生体レベルで実証する。

2CRISPR/Cas9システムを活用し、タンパク発現欠損が予測されるin/del変異導入ライン(合計5ライン)のF0世代樹立に成功し、実際にS100A9タンパク質が欠失した3ラインの確立に成功した。3モルモットを利用した結核持続感染を反映する動物モデルとして、マウスBCG投与個体を検討中である。1ヒト好中球を利用した好中球特異的抗体の作出健常人末梢血を用いた密度勾配遠心法から好中球をエンリッチし、CFAとのエマルジョンを作製しラットに免疫し、3週後の免疫ラットの腸骨リンパ節細胞とSP2/0をfusionすることで、ヒト好中球抗体を産生するハイブリドーマクローンを多数樹立した。それらのうち、単球やリンパ球を認識せず、末梢血好中球に対する特異的認識抗体(HG147)を単離した。HG147は、いくつかのpan好中球抗体と競合することが明らかとなったが、抗原同定に至っていない。今後、抗原同定やブロッキング活性に関する実験を進めながら、ヒト好中球:マクロファージ共培養実験の整備を進める。マウスS100A9遺伝子を標的としたgRNAを数種類設計し、詳細な活性評価を経て得られたgRNAを用いてC57/BL6マウス受精卵へインジェクションした。結果として、8種類の異なるin/del変異導入マウス(F0)を得た。そのうち、S100A9タンパク発現が完全に欠失した5ラインのF0マウスを樹立し、うち3ラインについて繁殖作業を継続している。3マウスBCG炎症モデルの構築C57/BL6マウスに対するBCG投与ルートとして、静脈、皮内、皮下、腹腔投与を試みて、それらの組織応答をHE染色やフローサイトメトリーを用いて解析した。特に、標的組織に浸潤する好中球及びマクロファージの極性評価について、時空間的解析を実施している。平成30年度は、S100A9遺伝子欠損マウスを活用したマウス研究を主体として、以下の課題に着手する。1S100A9遺伝子欠損マウスを活用したマクロファージの持続的活性化を制御するS100A9新機能の同定2好中球・S100A9に依存したマクロファージの持続的活性化を検証するマウス慢性炎症モデルの確立1S100A9分子は、好中球に高発現する分子でありながら、好中球における生理機能が明確ではない。S100A9遺伝子欠損マウスにおいて、好中球分化は野生型と変わらない。マクロファージの持続的活性化に影響する遺伝子発現にS100A9が関与する可能性について、オミクス解析を糸口にするなどして、S100A9新機能の同定を試みる。2マウスBCG投与モデルの組織解析を進めるとともに、担癌モデルなど他の慢性疾患モデルに関する構築準備を進める。炎症組織における好中球の浸潤、マクロファージの極性等を経時的に定量するための組織学解析を確立する。立した適当なモデル系におけるS100A9遺伝子欠損マウスの表現型を検証することで、S100A9に依存したマクロファージの持続的活性化を生体レベルで実証する。
ＬＭＯ関手の拡張を用いた境界付き曲面とコボルディズムの研究

研究課題「LMO関手の拡張を用いた境界付き曲面とコボルディズムの研究」における境界付き曲面とコボルディズムについて、そのホモロジー類似であるホモロジーコボルディズムを通して研究を行った。ホモロジーコボルディズムとは、ホモロジー的に「境界付き曲面と閉区間の直積」であるような、ある種の境界付き3次元多様体である。ホモロジーコボルディズムの境界を適切に貼り合わせることにより、閉3次元多様体が得られる。逆に任意の閉3次元多様体Xはそのようにして得られることが知られており、Xの位相不変量hc(X)を定義することができる。今年度の主な研究成果は、Xに「円周と球面の直積S^1xS^2」を連結和した際にhcがどのように変化するかを表す次の等式を証明したことである:hc(X#2S^1xS^2)=hc(X)+1。この等式と逆井氏の先行研究を合わせることで、hc(X)の計算は有理ホモロジー3球面Yに対してhc(Y)及びhc(Y#S^1xS^2)を計算することに帰着される。有理ホモロジー3球面の中で最も基本的なものはレンズ空間L(p,q)であり、昨年度の研究において等式hc(L(p,q))=1を証明し、その系としてhc(L(p,q)#S^1xS^2)の計算も完了している。これらと今年度の成果を合わせることで、1次ホモロジー群のねじれ部分群が巡回群の場合にhc(X)を完全に決定することに成功した。hc(X)の計算に関して、ねじれを持つ場合を含む広いクラスに対する計算結果は知られておらず、大きな前進となった。またhc(X)と深く関係するホモロジーファイバー結び目についても研究し、有理ホモロジー3球面内のヌルホモロガスな結び目がホモロジーファイバー結び目であるための必要十分条件をAlexander多項式を用いて与えた。29年度が最終年度であるため、記入しない。研究課題に含まれる「境界付き曲面とコボルディズム」の研究に際して、特にホモロジーコボルディズムに着目して研究を行った。ここでホモロジーコボルディズムとは、ホモロジー的に「境界付き曲面と閉区間の直積」であるようなコボルディズムである。このようなコボルディズムに着目した理由を説明する。一般に、曲面と区間の直積であるようなコボルディズムにおいて、上下の曲面を合わせることにより閉3次元多様体が得られる。逆に任意の(連結で向き付けられた)閉3次元多様体は、そのようなコボルディズムから得られることが知られている。このときの曲面の種数の最小値op(X)は3次元多様体Xの基本的な不変量であり、基本群やホモロジー群の生成元の最小数さらにHeegaard種数などと関係がある。(なおopという記号はオープンブック分解に由来する。実際、連結なバインディングを持つXのオープンブック分解におけるページの種数の最小値がop(X)に他ならない。)しかしop(X)を決定することは一般に困難である。そこでホモロジー的に直積であるコボルディズム(ホモロジーコボルディズム)まで範囲を広げることにして、類似の不変量hc(X)に着目した。hc(X)は比較的計算しやすい不変量である。実際、整係数1次ホモロジー群が自由Abel群の場合は逆井によって決定されていた。しかし1次ホモロジー群がトーションを持つ場合には限定的な結果しか知られておらず、新しい発想が求められていた。申請者はトーションを持つ場合で最も基本的なレンズ空間に着目し、「任意のレンズ空間L(p,q)に対して、hc(L(p,q))=1が成り立つこと」を証明した。コボルディズムへの幾何的操作を導入し、Lagrangian q-コボルディズムの成すモノイダル圏の代数構造について理解を深める計画だったが、この点についてはやや遅れている。一方、「研究実績の概要」で述べたホモロジーコボルディズムに関する研究では大きな成果が得られた。特に主結果「任意のレンズ空間L(p,q)に対して、hc(L(p,q))=1が成り立つ」は,一般の閉3次元多様体Xに対するhc(X)そしてop(X)を決定する上で重要なステップとなる。なお、1次ホモロジー群は同型だがhcは異なるような例が知られており、したがってこの結果は非自明なものである。また主定理の証明で鍵となったのは、整数論におけるChebotarevの密度定理であり、独自性の高い証明手法となっている。具体的には、ある連立不定方程式に整数解が存在することを密度定理から導き、その解を用いて全てのL(p,q)内に種数1の「良い」曲面が存在することを証明した。ここで良い曲面とは、その曲面に沿ってL(p、q)を切り開くと補空間がホモロジーコボルディズムとなるような曲面である。このようにホモロジーコボルディズムに関する上述の研究については、当初の計画以上に進展していると言える。

逆に任意の閉3次元多様体Xはそのようにして得られることが知られており、Xの位相不変量hc(X)を定義することができる。今年度の主な研究成果は、Xに「円周と球面の直積S^1xS^2」を連結和した際にhcがどのように変化するかを表す次の等式を証明したことである:hc(X#2S^1xS^2)=hc(X)+1。この等式と逆井氏の先行研究を合わせることで、hc(X)の計算は有理ホモロジー3球面Yに対してhc(Y)及びhc(Y#S^1xS^2)を計算することに帰着される。有理ホモロジー3球面の中で最も基本的なものはレンズ空間L(p,q)であり、昨年度の研究において等式hc(L(p,q))=1を証明し、その系としてhc(L(p,q)#S^1xS^2)の計算も完了している。これらと今年度の成果を合わせることで、1次ホモロジー群のねじれ部分群が巡回群の場合にhc(X)を完全に決定することに成功した。hc(X)の計算に関して、ねじれを持つ場合を含む広いクラスに対する計算結果は知られておらず、大きな前進となった。またhc(X)と深く関係するホモロジーファイバー結び目についても研究し、有理ホモロジー3球面内のヌルホモロガスな結び目がホモロジーファイバー結び目であるための必要十分条件をAlexander多項式を用いて与えた。「現在までの進捗状況」で述べたChebotarevの密度定理とは、数体の有限次元Galois拡大においてArtin記号がDirichlet密度に関して均等に分布していることを主張する定理である。例えばDirichletの算術級数定理は密度定理の特別な場合である。またArtin記号とはLegendre記号(平方剰余記号)の一般化であり、Galois群の元として定義される。「研究実績の概要」で述べた主結果の証明において、整係数2次形式とその判別式に関する古典的な事実も重要な役割を果たしている。このようにホモロジーコボルディズムの研究に対して、整数論が有効な手段を提供してくれることがわかった。そこで今後は整数論との関係に着目して「境界付き曲面とコボルディズム」について研究を遂行し、hc(X)及びop(X)の理解につなげたい。また以上の研究を通して今年度に得た知識や経験を生かして、「Lagrangian q-コボルディズムの成すモノイダル圏」の代数構造に関する理解を深めることができると考えている。そしてこの圏を始域とするLMO関手(の拡張)の研究を進めたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
四肢再生と皮膚の完全再生を可能にしている共通原理の解明

本研究ではI.形態再生に関わる遺伝子群の特定II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証の3つの研究をツメガエルを対象にして行う。項目「I」「II」においてRNA-seqによってそれぞれ目的とする遺伝子群を特定した上で、項目「III」では局所的な遺伝子発現の操作技術を駆使して、特定の遺伝子群を成体の四肢や皮膚で発現させ、その再生能力を回復させることによって機能を実証する。I.形態再生に関わる遺伝子の特定ネッタイツメガエルの四肢サンプルでRNA-seqを行い、そのデータを解析することで、再生能力の高い幼生の四肢再生で特異的に発現量の多い遺伝子をリストアップした。そのうちのいくつかについてはin situハイブリダイゼーションにより発現パターンを確認した。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定アフリカツメガエルの皮膚と四肢の再生サンプルからtotal RNAを抽出した。さらに皮膚創傷後に発現量が増加することが分かっているPrx1遺伝子について定量的PCRを行って発現量増加をチェックすることでtotal RNAの品質を確認した。また以前にマウスのゲノム配列を用いた遺伝子組換え個体で報告された、アフリカツメガエルの皮膚の再生過程でみられるPrx1遺伝子の四肢エンハンサーの活性化は、ツメガエルのゲノム配列を用いた遺伝子組換え個体でも再現できることを確認した。III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証前年度に引き続き四肢再生への機能が予想されているshh, lmx1などの遺伝子操作を行った。shhについては四肢のパターン形成に関わる下流遺伝子への影響を確認した。lmx1については遺伝子操作のための組換え体を作製した上で、まず四肢の発生に対する影響を観察した。I.形態再生に関わる遺伝子群の特定では実際に発現量に差がある遺伝子のリストアップを行うことができた。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定ではRNA-seqを実施するためのtotal RNAの準備までは完了した。次世代シークエンサーでのシークエンス作業までは行えなかったが、適切にサンプルを回収できていることをPrx1の定量的PCRによって確認することができた。III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証ではI, IIで特定した遺伝子の機能解析には至っていないが、既知の遺伝子についての操作は行えるようになり、その影響を下流遺伝子の発現から確認することができた。以上のような状況を総合して、研究はおおむね順調に進展していると判断した。I.形態再生に関わる遺伝子群の特定ではすでに発現量に差がある遺伝子をリストアップしたが、解析のベースになったゲノム情報のバージョンが更新されているため、確認のために最新バージョンのゲノム情報を用いて、遺伝子のリストアップ作業をもう一度行い結果を確認する。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定では調整したtotal RNAを用いたRNA-seqを実施するが、それと並行してPrx1以外に皮膚と四肢の再生での共通した発現が予想されるいくつかの既知遺伝子についてin situハイブリダイゼーションでの発現観察を行う。III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証についてはレーザーによる発現誘導の技術を積極的に活用することで、局所的に発現誘導する精度をさらに高めることを試みる。項目「I」「II」においてRNA-seqによってそれぞれ目的とする遺伝子群を特定したうえで、項目「III」(実施は次年度以降)ではIR-LEGOなどの局所的な遺伝子発現の操作技術を駆使して、特定した遺伝子群を成体の四肢や皮膚で発現させ、その再生能力を回復させることによって機能を実証する。I.形態再生に関わる遺伝子群の特定ネッタイツメガエルの四肢の再生芽を対象にしてRNA-seqに必要な量のtotal RNAを回収するための実験条件を検討した。その上で幼生と成体のそれぞれについて、四肢の切断前と切断後について独立に3つずつのreplicateを取ってtotal RNAを回収した。その上で次世代シークエンサー(NextSeq PE75)によるRNA-seqを実施した。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定当初の予定ではネッタイツメガエルの皮膚を材料としてRNA-seqを行う予定であったが、連携研究者の内山郁夫氏らとの議論の結果、体サイズが大きくて皮膚創傷実験が行いやすいアフリカツメガエルを材料としてRNA-seqを行っても当初の目的を達成できることが分かったので、アフリカツメガエルで実験を実施することにした。大量のtotal RNAを回収するのに適した皮膚創傷実験の方法を検討し、最適な方法を明らかにした。四肢の再生に関して、十分な品質のtotal RNAを回収して予定していたRNA-seqを実施することができた。また皮膚の再生に関しても、創傷の与え方について複数の方法を検討して、最適な方法を明らかにすることができた。以上の点から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。項目「I」「II」においてRNA-seqによってそれぞれ目的とする遺伝子群を特定したうえで、項目「III」ではIR-LEGOなどの局所的な遺伝子発現の操作技術を駆使して、特定した遺伝子群を成体の四肢や皮膚で発現させ、その再生能力を回復させることによって機能を実証する。

I.形態再生に関わる遺伝子群の特定RNA-seqの実施のためにネッタイツメガエルの幼生と成体の四肢サンプルからtotal RNAを抽出するのと並行して、ネッタイツメガエルの四肢再生の能力を再度確認し、アフリカツメガエルと同じステージで再生能力が低下することを確かめた。さらに代表的な遺伝子に対して、in situハイブリダイゼーションによる発現解析が問題なく実施できることを確認した。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定アフリカツメガエルの再生中の皮膚からRNA-seqのためのtotal RNAを抽出する実験の条件検討を行った。さらに皮膚再生と四肢再生の共通性を裏付けるために、皮膚再生と四肢再生のそれぞれにおいてTGF-βシグナル経路を薬剤で阻害する実験を行い、どちらの再生も阻害されることを明らかにした。III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証遺伝子発現の精密な操作の準備として、アフリカツメガエルにおける1細胞レベルでの発現誘導の実験条件を詳細に検討した。さらにshhをアフリカツメガエルの肢芽の前側で局所的に発現させることで過剰肢が形成されることを明らかにした。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定で予定していた皮膚再生を対象にしたRNA-seqの実施がやや遅れているが、III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証では予想以上に精密な局所的な遺伝子発現操作ができるようになり、1細胞レベルでの発現操作の条件を論文として発表することができた。以上のような状況を総合して、研究はおおむね順調に進展していると判断した。本研究ではI.形態再生に関わる遺伝子群の特定II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定III.器官再生を制御する遺伝子群の機能の実証の3つの研究をツメガエルを対象にして行う。項目「I」「II」においてRNA-seqによってそれぞれ目的とする遺伝子群を特定した上で、項目「III」では局所的な遺伝子発現の操作技術を駆使して、特定の遺伝子群を成体の四肢や皮膚で発現させ、その再生能力を回復させることによって機能を実証する。I.形態再生に関わる遺伝子の特定ネッタイツメガエルの四肢サンプルでRNA-seqを行い、そのデータを解析することで、再生能力の高い幼生の四肢再生で特異的に発現量の多い遺伝子をリストアップした。そのうちのいくつかについてはin situハイブリダイゼーションにより発現パターンを確認した。II.再生芽細胞の形成に関わる遺伝子群の特定アフリカツメガエルの皮膚と四肢の再生サンプルからtotal RNAを抽出した。さらに皮膚創傷後に発現量が増加することが分かっているPrx1遺伝子について定量的PCRを行って発現量増加をチェックすることでtotal RNAの品質を確認した。