hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二次元ホウ素一炭素ネットワークを有する金属ボロカ-バイドの電子状態と物性

グラファイト及びその層間化合物は様々な機能性材料として有用であり、グラファイトにかわる新しい二次元pi電子系を創出することは新機能性材料開発において極めて重要である。本研究は、ホウ素と炭素からなるグラファイト類似二次元ネットワーク有する金属ボロカ-バイドRB_2C_2、RB_2C(R:アルカリ土類、希土類)を合成し、その電子状態を明らかにすることを目的とした。本年度はRB_2C_2のうち、R=Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tmの各化合物の多結晶体を合成し、その磁化率、磁化曲線、および熱容量の測定を行い、磁気相転移の性質を明らかにした。これらの化合物の磁気相転移温度はR=Gd(45.5K),Tb(23.5K),Dy(24.5K,15.0K),Ho(5.9K,5.1K),Er(14.6K,13.0K),Tm(15.5K)であった。GdB_2C_2およびTmB_2C_2は単純な反強磁性体であるがTbB_2C_2は面内容易軸のらせん磁性体であった。また残りの化合物ではそれぞれ二つの相転移が熱容量により認められ、磁場中熱容量測定の結果から、DyB_2C_2、HoB_2C_2の高温側の相転移は磁場にほとんど依存しない磁気四重極転移であり、低温部の相転移は弱い自発磁化を伴う反強磁性であること、またErB_2C_2の二つの相転移は反強磁性相間の逐次相転移であることを明らかにした。LaB_2C_2,CeB_2C_2の二つの化合物については本年度導入した単結晶育成用アーク溶解炉を用いて単結晶育成を試み、得られた結晶のラウエ写真により単結晶性を確認した。また、電気伝導測定を行い、いずれの結晶も残留抵抗比が約25、低温における残留抵抗率が0.7μΩcmとなり、低温高磁場でシュブニコフ・ドハース振動が観測されうる程度の良質な単結晶がえられた。これによりこの化合物群の電子状態の研究が大いに進むものと思われる。
植物青色光受容体の分子内・分子間光信号伝達機構の解明

植物の青色光受容体キナーゼであるフォトトロピンの分子内・分子間信号伝達機構の解明のために、大腸菌から調整したシロイヌナズナphotの解析を行った。phot1 LOV2-STKの変異体のリン酸化活性測定や分光解析から、リンカー領域にキナーゼ制御にかかわる複数のアミノ酸残基を見だした。また、LOV2のN末端領域の変異体(K475A)のX線小角散乱解析から、光依存的な凝集体形成と解消がみられた。アミノ酸変異によって、本来の構造変化ができず、凝集体を形成したと考えられる。LOV2のN末端領域やリンカーが分子内信号伝達にかかわっている。本研究は植物の光情報伝達機構の一つ、迅速な応答を可能にしているフォトトロピン(phot)リン酸化信号カスケードの初期課程の分子内、分子間信号伝達課程の分子機構を構造学的視点、および時間的視点から明らかにすることが狙いである。シロイヌナズナ(At)やクラミドモナス(Cr)のphot分子をin vitroで調製し、生物物理学的解析を行った。Cr_phot全長の単体での結晶化を目指し、約1000条件のスクリーニングを行った。複数条件から結晶形成がみられたため、結晶の最適化を試みた結果、微結晶を得ることが出来た。in houseの装置にて結晶の反射を測定した。しかし、結晶が小さいことと結晶性が低いことから構造解析が可能な散乱パターンの取得には至っていない。また、サンプルの分解も起きていることが確認されたため、調製方法の再検討を行っている。At_phot2全長についても、結晶化条件の検討を行っているが結晶は得られていない。At_phot2に関しては結晶化が困難なタンパク質である可能性もあり、結晶構造解析だけでなく、クライオ電子顕微鏡による構造解析を開始した。ネガティブ染色によるAt_phot2全長の観察を実施した。シロイヌナズナphot1_LOV2-STKの変異導入ペプチドに関して、SPring-8 BL45XUにてX線小角散乱(SAXS)実験を実施し、青色光依存的な構造変化の解析をおこなった。さらに、青色光・暗条件だけでなく青色光励起状態から暗状態への時間分解解析も行った。過渡的な構造変化を示すプロファイルを得た。Phot2のリン酸化実験における、non-RI実験系としてリン酸結合試薬を基盤にした抗体による検出法の検討を行ったが改良の必要がある。タンパク質相互作用解析として水晶振動子微量天稟(QCM)装置のセットアップを行った。計画していた、生化学解析、相互作用解析について進捗が遅れている。申請者の所属の移動(大阪府立大学から慶應義塾大学へ)により、RIの使用が容易でなくなり、生化学的解析にはnon-RIの実験系の構築が必要となった。また、当初予定であった大阪府立大学の機器の使用が困難になった為に、周波数カウンターを購入し、装置のセットアップが必要となった。phot単体での結晶化のスクリーニングを行ってきたが、構造解析に足る結晶を得られていない。本研究は植物の光情報伝達機構の一つであるフォトトロピン(phot)の光受容からリン酸化信号カスケードの初期過程の分子機構を解明することを目指している。昨年度に引きづづき、クラミドモナスphotとシロイヌナズナphot2全長タンパク質の結晶化スクリーニングを進めた。結晶化には至っておらず、調整したサンプルの分解も原因の一つの考えられた。シロイヌナズナphot2全長のクライオ電子顕微鏡による構造解析を行った。負染色観察でX線小角散乱(SAXS)で得られている構造と類似したものが見えたが、クライオ電子顕微鏡での像を得ることができなかった。サンプルの溶液条件の再検討が必要である。基質タンパク質であるBLUS1とのin vitroでの相互作用の解析を進めた。BLUS1単独での大腸菌での発現・精製系は構築できた。調整したBLUS1とphot2全長でのin vitorでの複合体形成を試みたが、確認はできなかった。大腸菌での共発現系も試みたが複合体の形成は確認できなかった。昨年度実施したphot1の最小機能領域(LOV2-キナーゼ)のSAXS解析によって以下のことが明らかになった。2量体を形成しており、青色光照射依存のLOV2とキナーゼドメイン間の配向の変化が確認された。キナーゼ活性の低下を示す変異体では、青色光照射依存的に分子の凝集と暗所での凝集の解消が観察された。リンカー領域にあるアミノ酸残基の置換が、本来の構造変化を起こせなくし、代わりに凝集が起こったと考えられる。こうしたことから、リンカー領域はLOV2での光受容の信号をキナーゼに伝える上で構造的にも重要な役割を担っていることが示された。また、最小機能領域でのドメイン配向がphot1とphot2とで異なることから、phot1, phot2の全長の構造が異なることが示唆された。

アミノ酸変異によって、本来の構造変化ができず、凝集体を形成したと考えられる。LOV2のN末端領域やリンカーが分子内信号伝達にかかわっている。本研究の目的を達成するためには、構造情報の取得が重要であり、本年度は構造解析を中心に解析を進め、その知見を元にシグナル伝達機構を解析すべく、変異体の作成、生化学的解析を進める。構造解析に関して、結晶化スクリーニングを引き続き行う。結晶が得られた場合、X線結晶構造解析を行う。phot-基質複合体でも同様に結晶化を検討する。構造情報が得られた場合は、変異導入したタンパク質を作成し、構造機能相関を検証する。さらに、高分解能での構造解析できた場合、時間分解SAXSの結果とあわせてMD-SAXS法によりダイナミクスの計算を試みる。光生物学消費税分の端数処理の不手際28年度分物品費として使用する
免震建物の終局挙動評価技術の高度化と合理的設計法への展開

本研究では画期的な耐震技術の一つである免震構造の一層の普及を目指して、免震装置の終局挙動評価手法と免震建物の地震時挙動解析技術を高度化し、それらの技術を免震構造の合理的設計法へ展開した。初めに、主要な免震装置である積層ゴムの極限挙動を追跡できる力学モデルを新たに開発した。続いて、この力学モデルを用いて、近い将来発生が懸念されている長周期地震動に対する免震建物の挙動を把握し、免震建物の安全性を検証した。本研究は平成20年度22年度の3年間の研究期間を設けており、初年度は主として免震建物の終局挙動評価技術構築の準備段階として、積層ゴムの加力試験を重点的に実施した。加力試験を実施した積層ゴムは、角型鉛プラグ入り積層ゴムと高減衰積層ゴムの2種類であり、大変形・高軸力という極限状態を想定した加力状態を作り出し、各積層ゴムの力学的特性に関する詳細なデータを取得した。この他に国内外の積層ゴムメーカーから、各種加力試験のデータを入手した。特に米国UC San Diego校で実施された実大積層ゴムの3軸動的加力試験結果は、この種の試験が国内では不可能であることから非常に貴重な試験データであり、来年度に詳細な分析を実施する予定である。本研究で実施した加力試験のうち、角型鉛プラグ入り積層ゴムについては、試験結果を再現するための力学モデルの構築を行い、角型断面に特有に見られる加力方向の違いによる力学的特性の変化を解析的に表現することが可能となった。この力学モデルは積層ゴムの3次元的挙動を再現できることから、建物の3次元的挙動をとらえるための振動解析システムへ直接組み込むことができる。さらに力学モデルの汎用性を検討するために、本研究で実施した積層ゴム以外の形状、種類の積層ゴムに対する適用を試みた。汎用性の検討からは、従来の力学モデルでは積層ゴム断面内で一律と仮定していた剛性に、ある分布形状を与えることで、サイズや形状の異なる積層ゴムへの適用性が高まることが判明した。この点については、新たな課題として次年度に検討を加える予定である。平成21年度は、免震積層ゴムの終局挙動評価技術の開発を行った。鉛プラグ入り積層ゴムに関しては、従来の力学モデルでは積層ゴム断面内で一律と仮定していた鉛直剛性に、ある分布形状を与えることで、実験結果の予測精度を大きく改善した。もう一種類の免震積層ゴムである高減衰積層ゴムについては、縮小試験体による加力試験を実施して終局状態の力学データを取得したとともに、シミュレーション解析により実験結果の再現を行った。高減衰積層ゴムでは、ゴム部が引張降伏した後に硬化する特性(引張硬化特性)を考慮することが、実験結果の予測精度向上にとって重要であることが明らかとなった。一方、多様な応力状態での免震積層ゴムの力学挙動を評価するために、昨年度開発した並列軸ばねモデルの軸ばね層を上端、下端に加えて要素中間にも設置するという3層モデルに拡張することで逆対称分布以外の曲げモーメントにも対応できるような改良を行った。免震積層ゴムの断面内の鉛直剛性分布、引張硬化特性の考慮、3層軸ばねモデル3つのアイディアは、免震積層ゴムの終局挙動予測精度を大きく改善する重要な知見であり、いずれも今年度中に査読論文として公表した。平成21年度後半は、免震積層ゴムの2方向加力状態における終局挙動の検討を新たに加えた。カリフォルニア大学サンディエゴ校の試験装置を用いて実大積層ゴムの動的2方向加力試験を行うとともに、平成21年度前半で開発した終局挙動評価モデルを2方向加力状態に対応できるような拡張を行った。以上のように、平成21年度中に免震積層ゴムの終局挙動評価技術の構築と、解析システムの開発を予定通り終了した。平成22年度は、前年度に開発した免震積層ゴムの終局挙動評価手法の改良と、合理的設計法への展開として水平2方向地震入力に対する免震建物の応答性状について検討を行った。前者に関しては、前年度に提案した並列軸ばねモデルに対して、積層ゴム断面内の鉛直剛性分布を考慮することによって終局挙動評価の精度を向上させた。具体的には、鉛プラグ入り積層ゴムを対象として、内部鋼板によるゴムの変形拘束が積層ゴム中心からの距離によって異なる効果を、円形断面ではベッセル関数、角型断面では2重フーリエ級数となる解析解によって評価する機能を並列軸ばねモデルに取り込んだ。これにより高軸力下での大変形時に見られる荷重変形関係の再現精度が大幅に向上した。続いて、水平2方向地震入力に対する免震建物の応答性状に関する検討では、高減衰積層ゴムを対象に水平2方向の連成効果を考慮して、2方向加力試験結果のシミュレーションおよび地震応答特性に関する検討を行った。これは、最近になって減衰性能を内包する積層ゴムが水平2方向に変形するとねじれ変形が生じて1方向変形時よりも限界性能が低下するという事実が発覚したため、2方向特性を考慮した限界特性の把握と設計法の確立が急務とされた研究課題である。

検討の結果、2方向に対する既往のモデル(MSSモデル)では高減衰積層ゴムの2方向特性を適切に評価できないことが明らかとなった、そこで、2方向連成効果を適切に評価できる力学モデル(山本モデル)を用いて検討を行い、山本モデルによる応答値を正とした場合に、従来のMSSモデルを用いた設計では2方向に対する余裕を1割程度見込む必要があると結論づけた。
上皮増殖因子阻害剤、リベロマイシンAの構造活性相関研究および標的分子の探索

上皮増殖因子阻害剤として単離されたリベロマイシンA(1)は強い抗かび、抗腫瘍活性および真核細胞選択的なタンパク質合成阻害活性も有し、かつ低毒性なので新たな薬として期待されている化合物である。構造的特徴として1はaxial配置の18位三級水酸基にコハク酸が結合し、また19位にもaxial配置の不飽和カルボン酸を有する極めてユニークな構造を有している6,6-スピロケタールを骨核とするポリケチド系抗生物質である。我々はその構造と活性の相関研究に興味を持ち、新しい"薬"を創ることを最終目標とし研究を行った。天然品1の安定性および活性発現には5位水酸基と24位カルボキシル基の水素結合の寄与が考えられた。そのことはMM2計算からも指示され、またそれらの化学修飾および合成した種々の誘導体の生物活性試験(標的分子isoleucyl-tRNA synthetase阻害、in vitro蛋白質合成阻害およびsrc^<ts>-NRK細胞の形態正常化)より、活性発現には2個のカルボキシル基が必須であり、かつ強い活性を示すには24カルボキシル基および5位水酸基が重要であることを明らかにした。また、18位ヘミサクシニル基は活性発現に必須でないことも見いだした。さらに、5位TBS誘導体が成熟破骨細胞に選択的な細胞死を誘導することにより、高カルシウム血症および骨疾患治療剤として使用できることも見いだした。上皮増殖因子(EGF)阻害剤として単離されたリベロマイシンA(1)はまた抗真菌、抗腫瘍活性および真核細胞選択的なタンパク質合成阻害活性も有し、かつ低毒性なので新たな薬として期待されている。1はaxial配置の18位三級水酸基にコハク酸が結合し、また19位にもaxial配置の不飽和カルボン酸を有する極めてユニークな構造を有している6,6-スピロケタールを骨核とする新規なポリケチド系抗生物質である。我々は1の全合成を世界で初めて達成した後、構造活性相関研究-受容体機構解明により新しい"薬"を創ることを最終目標とした。本年度は、1の保護、脱保護等の化学修飾により種々の誘導体をデザイン、合成し、かつそれらの生物活性試験(isoleucyl-tRNA synthetase阻害、in vitro蛋白質合成阻害およびsrc^<ts>-NRK細胞の形態正常化)を行った。先ず、5位水酸基の活性への影響を調べるためそのメチルおよびシリルエーテルおよびエステルを合成した。また、1の3個のカルボキシル基の位置選択的メチル化を検討し、種々のモノエステルおよびジエステルを合成した。さらに、二重結合の活性への効果を調べるため1の還元体を合成した。また、18ヒドロキシ体およびそのメチルおよびMTMエーテルを合成した。それらの生物活性試験の結果、1の18位ヘミサクシニル基が活性発現に必須でないことおよび活性発現には2個のカルボキシル基が必須であり、かつ強い活性を示すには24カルボキシル基および5位水酸基が重要であることを明らかにした。構造的特徴として1はaxial配置の18位三級水酸基にコハク酸が結合し、また19位にもaxial配置の不飽和カルボン酸を有する極めてユニークな構造を有している6,6-スピロアセタールを骨核とするポリケチド系抗生物質である。天然物1の安定性および活性発現にはスピロアセタール構造のアノメリック効果に加えて5位水酸基と24位ウルボキシル基の水素結合の寄与が考えられた。水素結合による安定性はMM2計算からも支持された。

またそれらの化学修飾および合成した種々の誘導体の生物活性試験(標的分子isoleucyl-tRNA synthetase阻害活性、in vitro蛋白質合成阻害活性およびsrc^<ts>NRK細胞の形態正常化活性)より、活性発現には2個のカルボキシル基が必須であり、かつ強い活性を示すにはフリーの24カルボキシル基および5位水酸基が重要であることを明らかにした。また、18位ヘミサクシニル基に関しては、その誘導体も活性を示すことより、活性発現に必須でないことも見いだした。さらに、5位TBS誘導体が成熟破骨細胞に選択的な細胞死を誘導することにより、高カルシウム血症および骨疾患治療剤として使用できることも見いだした。
マイクロ波照射下新規アザ-6π電子系環状反応の開発と生理活性天然物合成への応用

マイクロ波(MW)照射下の有機合成反応の特徴は、反応速度の加速、収率の向上、あるいは無溶媒下でも進行することなど、反応系内を均一に加熱するため再現性が高い点などが挙げられる。その中で、ペリ環状反応への応用は、熱を利用するDiels-Alder反応、Claisen転位反応等への活用が当初から検討され、反応時間の短縮、あるいは収率の向上などその有用性を報告している。しかし、その一つである熱電子環状反応への応用例は、これまでに報告されていなかった。今回、1-アザヘキサトリエンに対する熱電子環状反応により構築できるイソキノリン骨格合成に新たにMWを利用し、有機合成の一手法として、MW照射下熱電子環状反応を確立することを目的に次の4項目の研究を実施した。(1)アザヘキサトリエン系の電子環状反応へのマイクロ波の影響について(3)抗腫瘍性bicolorlneの全合成研究(4)抗腫瘍性2一アザアントラキノン系アルカロイドscorpinoneの全合成研究本研究の結果よりMW照射下での熱電子環状反応を活用した新規イソキノリン合成法を確立することができた。その応用として、イソキノリン骨格を有する天然物の合成を行い、フロイソキノリンアルカロイドTMC-120AおよびB、フェナンスリジンアルカロイドtrispheridine、2-アザアントラキノンアルカロイドscorpinoneの合成を達成できた。よって、MW照射下での熱電子環状反応を活用したイソキノリン合成は有効な縮合複素環化合物の合成方法になるものと考えている。1.インターロイキン-5産生抑制作用をもつフロ[3,2-h]イソキノリン系天然物TMC-120A,B,Cの合成研究2-propenylbenzaldehyde oximeの熱電子環状反応によりイソキノリン合成後、フロ[3,2-h]イソキノリンへと誘導した。このフロ[3,2-h]イソキノリンより天然物TMC-120Bの最初の全合成を達成することができた。この2-propenylbenzaldehyde oximeの熱電子環状反応によるイソキノリン骨格合成に今回のテーマであるマイクロ波照射下での環化反応を種々条件検討した結果、反応時間の大幅な短縮とかなりの収率向上がみられ、新規な合成法の一手法になりうる可能性を示すことができた。天然物TMC-120Bの全合成に関しては、論文としてすでに発表した。マイクロ波照射下での環化反応については、結果をまとめ論文として発表する準備をしているところである。さらに合成した天然物を初めとする一連の化合物は生物活性試験を実施する予定である。2.1-アザヘキサトリエン系の電子環状反応へのマイクロ波の影響について上記の反応結果をもとに、種々の置換基をもつイソキノリン骨格合成にマイクロ波照射下1-アザヘキサトリエン電子環状反応を実施し、詳細な条件検討を行っているところである。1.1-アザヘキサトリエン系の電子環状反応へのマイクロ波の影響についてまず、環化反応に及ぼす置換基効果をみる目的で、ベンゼン環上に電子供与基としてはメトキシ基、電子吸引基としてはニトロ基を導入し、アルケン部分には電子供与基としてメチル基、電子吸引基としてエステルを導入した1-アザヘキサトリエン系となるアルドオキシム体を種々合成した。これら基質に対して、従来法とマイクロ波照射下での熱電子環状反応を実施し、比較検討した。更に、環化反応への反応溶媒(toluene, bromobenzene, o-dichlorobenzene, N,N-dimethylform amide)と反応温度(150°C,180°C,210°C)の影響についても検討した。その結果、反応溶媒はo-dichlorobenzene、反応温度は180°Cに設定する条件が最適条件であることがわかった。この条件を用いて、従来法とマイクロ波照射下での熱電子環状反応を比較したところ、基質によって差はあるものの、いずれも反応時間のかなりの短縮がみられた。さらに反応収率も、ほぼ同等かかなりの収率向上がみられた。

この結果より、電子環状反応に対するマイクロ波照射の効果は、反応時間、収率の面で有効に機能していることがわかり、新しい有機合成反応の一手法を提供することができた。特に、ベンゼン環上に電子吸引基(ニトロ基)がある場合環化反応の反応性が低下することが予想されたが、それに反し、短時間かつ良好な収率でイソキノリン誘導体を与え、ある程度の量産が可能であった。更に、このニトロイソキノリン誘導体は、イソキノリンからのニトロ化では合成できないものもあり、医薬品素材としての供給も可能であると考える。2.抗腫瘍性bicolorineの全合成研究上述の確立した条件を活用し、本化合物のbenzo[c]isoquinoline骨格合成に成功している。最終工程のメチル化を現在検討しているところである。以上の内容について、現在論文作成中である。6π電子系電子環状反応へのマイクロ波の有効性を検討し、よりクリーンで効率の良い反応系の開発を目的とした。更に、その応用として生理活性天然物を標的化合物として設定し、その全合成研究を実施することで、その有用性を実証しつつ医薬素材の発見につなげたいと考え、次の研究課題を実施した。1.抗腫瘍性bicolorineの全合成研究:アルドオキシムを基質として設定し、マイクロ波照射下1-アザヘキサトリエン電子環状反応によりbenzo[c]isoquinoline骨格合成を行いbicolorineの全合成を達成した。この方法は4工程と比較的短工程での骨格合成が可能であるため、一連の化合物合成に有効であると考えている。この究成成果については、すでに公表している。2.抗腫瘍性2-アザアントラキノン系アルカロイド類の合成研究:まず、出発原料となる多置換ナフトキノンの合成ルートの開発を行った。そのナフトキノンより1-アザヘキサトリエンに誘導後、マイクロ波照射下での電子環状反応を実施し、抗腫瘍活性をもつscorpinoneおよび6-O-demethyl-5-deoxybostrycoidinの全合成を達成できた。その研究成果をまとめ、公表準備をしているところである。3.ヘキサトリエン系および2-アザヘキサトリエン系電子環状反応へのマイクロ波の影響について:様々なヘキサトリエンあるいは2-アザヘキサトリエンを基質として設定し、マイクロ波照射下での電子環状反応を実施した。しかし現在のところ研究成果をまとめる段階まで来ておらず、研究を継続中である。
硝子体上での細胞培養の試み

【目的】増殖糖尿病網膜症(PDR)では、硝子体上に新生血管が伸展するために増殖膜と呼ばれる繊維性の組織が形成されるが、昨年度の検討では、生理的条件下での硝子体への細胞の接着、増殖は硝子体前部に限局していることを明らかにした。しかし、糖尿病網膜症の新生血管は、網膜から後部硝子体へと伸展するため、後部硝子体への血管新生には硝子体の生理的性質の変化が影響すると考えられる。本年度の研究では、この硝子体後部の細胞接着性の変化の原因として、糖尿病による血管透過性亢進による血液成分の漏出を仮定し、鶏胚硝子体を血漿と一定時間作用させた時の変化を解析した。【方法】血漿と一定時間反応させた18日齢鶏胚硝子体に、ウシ血管内皮細胞株ECV304を加え、37°Cで3時間、穏やかに回転培養を行い、硝子体表面に細胞を付着させた。細胞の付着した硝子体を取り出し、硝子体に付着していない細胞を洗い流した後、一定時間培養した。培養後、硝子体の重量を測定し、^3H-チミジンの取り込みによる細胞増殖能および可溶性ホルマザンを用いた吸光度法により細胞数の算定を試みた。また、顕微鏡下で細胞の接着状態を観察した。更に、血漿成分と反応させた硝子体を低分子へパリンと作用させた後、同様に細胞を付着させ、培養した。【結果】血漿処理した硝子体に細胞を付着させた後、顕微鏡的観察および培養した硝子体を前部と後部に二分し、吸光旋法で細胞数を測定したところ、硝子体前部だけでなく、未処理の硝子体では観察されなかった硝子体後部へも多量の細胞が付着していた。ウエスタンブロッティングにより、血漿処理硝子体にはフィブロネクチンが検出された。また、低分子へパリンを作用させたところ、硝子体への細胞接着はほぼ完全に抑制された。【考察】後部硝子体上への血管内皮細胞の接着、伸展は、血漿成分に含まれる接着因子であるフィブロネクチンを介して硝子体後部表面の接着性が増加することが原因で起こることが明らかとなった。また、この接着性の増加は、低分子へパリンを作用させることにより抑制されることから、本実験系は、硝子体への細胞接着抑制物質のスクリーニングに応用できると考えられる。【目的】増殖糖尿病網膜症(PDR)では、硝子体に増殖膜と呼ばれる繊維性の組織が形成され、これを足場として硝子体上に新生血管が伸長してゆく。増殖膜は硝子体を収縮させるため、失明の引き金となる硝子体牽引の原因の一つと考えられているが、硝子体上での増殖膜の形成過程や、血管内皮細胞の増殖状態を再現できるモデルは現時点では知られていない。本研究ではPDRにおける増殖膜形成や硝子体牽引の機構を解明するための実験系を開発するため、新鮮で形態が整っており、取扱いの容易な鶏胚硝子体を用い、培養ウシ血管内皮細胞株ECV304を硝子体上で培養することを試み、その際、硝子体にどのような変化が観察されるかを検討した。【方法】18日齢鶏胚から得られた硝子体に細胞を加えた後、37°Cで3時間、穏やかに回転培養を行い、硝子体表面に細胞を付着させた。これら細胞の付着した硝子体を取り出し、硝子体から付着していない細胞を洗い流した後、一定時間培養した。【結果】硝子体に細胞を付着後、90時間まで培養したところ、作用させた細胞数が多いほど硝子体体積が減少した。しかし、顕微鏡的観察および培養した硝子体を前部と後部に二分し、吸光度法で細胞数を測定したところ、細胞の接着、増殖部は硝子体前部に限局していた。【考察】鶏胚の硝子体上で血管内皮細胞株を培養することができた。この際、観察される硝子体の体積減少は、硝子体上で細胞が増殖した結果と考えている。硝子体表面の細胞接着性は前部と後部で異なり、後部に比べ、前部の方が細胞接着性が強いことが明らかとなった。PDRと関連する硝子体後部への細胞接着は、正常な硝子体では起こらないことから、来年度は血管透過性の亢進などによる影響を考慮した実験系の開発を行う。【方法】血漿と一定時間反応させた18日齢鶏胚硝子体に、ウシ血管内皮細胞株

ECV304を加え、37°Cで3時間、穏やかに回転培養を行い、硝子体表面に細胞を付着させた。細胞の付着した硝子体を取り出し、硝子体に付着していない細胞を洗い流した後、一定時間培養した。培養後、硝子体の重量を測定し、^3H-チミジンの取り込みによる細胞増殖能および可溶性ホルマザンを用いた吸光度法により細胞数の算定を試みた。また、顕微鏡下で細胞の接着状態を観察した。更に、血漿成分と反応させた硝子体を低分子へパリンと作用させた後、同様に細胞を付着させ、培養した。【結果】血漿処理した硝子体に細胞を付着させた後、顕微鏡的観察および培養した硝子体を前部と後部に二分し、吸光旋法で細胞数を測定したところ、硝子体前部だけでなく、未処理の硝子体では観察されなかった硝子体後部へも多量の細胞が付着していた。ウエスタンブロッティングにより、血漿処理硝子体にはフィブロネクチンが検出された。また、低分子へパリンを作用させたところ、硝子体への細胞接着はほぼ完全に抑制された。【考察】後部硝子体上への血管内皮細胞の接着、伸展は、血漿成分に含まれる接着因子であるフィブロネクチンを介して硝子体後部表面の接着性が増加することが原因で起こることが明らかとなった。また、この接着性の増加は、低分子へパリンを作用させることにより抑制されることから、本実験系は、硝子体への細胞接着抑制物質のスクリーニングに応用できると考えられる。
インジウム新素材におけるインジウム肺発症の実験的研究

種々のインジウム化合物の肺障害について、実験動物を用いた気管内投与による評価を行った。インジウム化合物の中で、肺障害の発現の程度は水酸化インジウムが最も重度であり、次いでインジウム・スズ酸化物(ITO)超微粉、ITOターゲット研削粉、酸化インジウムの順であった。さらにインジウムを含む太陽電池である銅-インジウム-ガリウム-セレン(CIGS)の気管内投与によって肺障害が惹起されることが初めて認められた。今年度はITO、酸化インジウム(In_2O_3)、水酸化インジウム(In(OH)_3)をラットの気管内に2週間にわたって反復投与し、投与終了後12週間後までの各インジウム化合物の肺への影響について評価した。【実験方法】被験粒子にはITO、In_2O_3、In(OH)_3を用いた。1回投与量は10mg In/kgである。各インジウム化合物は、ラットの気管内に週2回、計5回、2週間にわたって反復投与した。各群最終投与日の翌日(0週)、1週、2週、3週、4週(水酸化インジウム群のみ)、12週目(水酸化インジウム群を除く3群)に肺障害の進展について検討した。【結果および考察】体重の推移に関し、In(OH)_3群では投与期間中から観察期間中体重増加が著しく抑制され、ITO群、In_2O_3群および対照群に比べて有意に減少した。In(OH)_3群では重度の衰弱のため、観察は4週間で終了した。各時点の各インジウム投与群で対照群と比べて有意に増加した。各時点のITO群およびIn_2O_3群の相対肺重量は、対照群の約2倍で推移した。一方、In(OH)_3群では、ITO群およびIn_2O_3群に比べて有意に増加し、経時的に増加していた。肺の病理学的評価では、各ITO群、In_2O_3群、In(OH)_3群で肺の炎症性変化を主体とする病変が観察され、特に、In(OH)_3群では肺病変の程度がITO群およびIn_2O_3群に比べて重度であった。以上の結果から、水酸化インジウム粒子の反復経気道投与によって、ITO粒子やIn_2O_3粒子に比べて肺障害は顕著に発現した。ITOやIn_2O_3粒子だけでなく、水酸化インジウム粒子の投与によっても肺障害が引き起こされることが明らかになった。今年度は、粒子径の異なるITO研削粉とITO超微粉をラットの気管内に2週間にわたって反復投与し、投与終了2週後までの各ITO粒子の肺への影響、生体内動態について評価した。【実験方法】実験群は3群設定し、ITO研削粉群、ITO超微粉群および対照群である。各ITO粒子は滅菌蒸留水に懸濁し、1回投与量はITOとして10mg/kgであり、対照群は滅菌蒸留水のみ1ml/kgを投与した。各ITO粒子は、Wistar rat(SLC,メス,8週齢)の気管内に週2回、計5回、2週間にわたって反復投与した。各群最終投与日の翌日(0週)、1週、2週に血清中インジウム濃度および肺障害の進展について検討した。各時点のラットの血清中の金属濃度について血清を酸で灰化後、ICP-MSを用いて測定した。肺の病理評価は2週目でのみ行った。【結果】体重の推移に関し、各ITO群で投与期間および観察期間で対照群と同様の推移を示し、有意な差は観察されなかった。各時点でのITO研削粉群およびITO超微粉群の相対肺重量は、対照群に比べて有意に上昇し、さらに、ITO超微粉群はITO研削粉群に比べて、有意に上昇していた。血清中のインジウム濃度に関し、各時点でITC超微粉群はITO研削粉群の約10倍の濃度を示した。両ITO群とも経時的に血清中インジウム濃度は上昇した。肺の病理学的評価では各ITO群で肺の炎症性変化を主体とする病変が観察され、ITO超微粉群はITO研削粉群に比べて肺病変の程度は強く発現した。【考察】今回、同用量の2種類のITOを気管内に反復投与を行い、その結果、粒子径が小さいITO超微粉がITO研削粉に比べて血清中インジウム濃度が高く、さらに肺病変が強く発現した。ITOの粒子径の違いにより血清中インジウム濃度や肺病変の発現に違いが観察されたことはインジウムによる生体影響には化学形態に加えて、粒子径についても留意する必要があると考えられた。次世代太陽電池の新素材である銅-インジウム-ガリウム-セレン(Cu-In-Ga-Se : CIGS)のヒトへの健康影響に関する知見が見当たらず、早急に健康リスクについて評価する必要があると考える。そこで、CIGS粒子をラットの気管内に投与し、CIGSの経気道性曝露による呼吸器影響を中心とした評価を行った。【実験方法】

1回投与量は粒子量として0.5mg/kg(Inとして0.09mg/kg)、5mg/kg(Inとして0.9mg/kg)、50mg/kg(Inとして9mg/kg)とし、実験群として各CIGS投与量群は3群、ITO投与群1回投与量12mg/kg(Inとして9mg/kg)と対照群を加えた5群、1群15匹17匹で構成した。ラットは8週齢より投与を初め、週2回、3回にわたって気管内投与を行い、最終投与日の翌日(0週)、1週、3週目に各群5匹6匹ずつ安楽死させた。健康影響について評価を行った。【結果および考察】投与期間および観察期間中の体重変化に関し、各投与群は対照群と同様の体重推移を示した。肺重量に関し、CIGS 0.5mg投与群では0週、1週目では対照群と比べて有意な増加は観察されなかったが、3週目では有意に増加した。CIGS 5mgおよび50mg投与群およびITO投与群では各評価時点の肺重量が対照群に比べて有意に増加していた。3週目ではCIGS投与群においては量依存性に肺重量が増加し、CIGS 50mg群はITO群に比べ肺重量が有意に増加した。肺の病理変化に関し、肺炎、肺胞上皮細胞の増生、肺胞マクロファージによるCIGSやITO粒子の貪食、肺胞腔内に細胞壊死片の沈着が観察された。これらの肺病変は経時的に進展し、肺病変の程度は量-依存性に増悪した。以上の結果より、CIGSの気管内投与により肺障害が引き起こされ、急性毒性の発現を認めた。
統合オミクス解析を応用した骨格形成における包括的転写制御システムの解明

顎顔面を含むヒトの骨格の大部分は、内軟骨性骨化と呼ばれる軟骨細胞が主体の骨化様式により形成される。そのため、骨格形成およびその疾患メカニズムの解明には、軟骨細胞の遺伝子発現を担う転写因子を同定しその制御機構を理解することが重要となる。本研究では、次世代シークエンサーを応用したゲノムワイド解析を駆使し、遺伝子発現の初期段階であるヒストン修飾からmRNA発現に至る階層的な統合オミクス解析を実施し、内軟骨性骨化に重要な新規転写因子とその遺伝子制御ネットワークを全ゲノムレベルで解明することに挑戦する。
炎症性腸疾患における癌化マーカーの遺伝子学的検討ー血液・糞便の臨床応用

炎症性腸疾患(IBD)長期経過例では大腸癌リスクが増加する。本研究では、患者血液、糞便あるいは生検組織といった新たな材料を対象とし大腸癌検出の可能性に関する検討を行った。対象遺伝子変化として、LINE1 global hypomethylationの程度(LHI)に注目した。大腸癌患者の血漿LHIは健常人より有意な上昇を示し、癌患者スクリーニング検査としての有用性が示唆された。生検組織では、大腸組織においては、前癌状態で既にLHIの有意な上昇を認めた。糞便での遺伝子検出の可能性の検討ではLHIの検討は可能であったが、その臨床応用の可能性に関しては対象遺伝子のより詳細な検討が必要と考えられた。大腸癌の発生は炎症性腸疾患長期経過症例における重大な問題となっている。そのサーベイランスは、現状では大腸内視鏡でのみ可能であるが、識別困難なケースも多い。そのため前癌病変であるDysplasiaの指摘がサーベイランスの目標とされているが、その方法は現状では内視鏡に限られている。IBDサーベイランスには分子生物学的アプローチを背景とする新たな展開が必須である。サーベイランスとしての臨床応用において重要なことは、低侵襲、繰り返し採取可能であることであるが、候補は、生検材料、新規材料として糞便、血液であり、その際特に微量DNAであることを意識した検討が重要である。まず、IBD患者のサーベイランスにおける内視鏡生検材料にてER, MINTs, P16, RUNX3等のメチル化およびLINE1のメチル化の定量を行い、癌化リスクとの検討を行うために、生検材料における上記測定の最適化を行った。癌化症例の解析により、サーベイランスの応用可能性を検討した。次いで、新規材料として糞便、血液での検討に備え、現在資料収集を行っているが、微量で質のよくない検体であるため、その再現性、安定した定量性を追求することが必要である。炎症性腸疾患(IBD)長期経過例では大腸癌発生リスクの増加するためサーベイランスの重要性が強調されている。本研究では、患者血液、糞便あるいは生検組織といった低侵襲で繰り返し使用可能な材料を対象とし、その対象に適した方法や遺伝子変化を探索する。生検組織における大腸癌検出の可能性に関しては、Laser Capture Microdissectionの手技を用いて、正常組織、前癌病変、癌間質組織、癌組織の極小標本より正確でコンタミの少ない抽出を実行し、LHIを検討した。大腸組織においては、前癌状態で既にLHIの有意な上昇を認めた(正常組織: 0.38,前癌病変: 0.49, p<0.05)。組織中のLine1 hypomethylationは腫瘍発生のきわめて早期より生じることが示された。その他の対象となる材料として糞便における遺伝子検出の可能性の検討を行った。糞便を用いたLHIの検討は可能であったが、その臨床応用の可能性に関してはさらなる症例の集積や対象遺伝子のより広範囲な検討が必要と考えられた。LHIの検討は組織や血液におけるスクリーニングでの有用性が期待される。IBD癌化患者20名の生検材料(病変部に限定せずにstep biopsyが施行されているため、非癌部の生検材料も同時に利用可能。)を収集した。健常人正常粘膜生検組織、IBD非癌患者生検組織(同一患者の経時的生検材料を含める)、IBD癌化患者(以前よりのサーベイランスにより経時的に収集された腫瘍部と非腫瘍部の生検材料)を対象として、メチル化定量の対象遺伝子としては、これまでIBD癌化のマーカーとなり得る異常メチル化の報告されているp16, RUNX3, MINTs, HPP, ESR1, COX2, E-cadherinに加え、大腸癌発癌の早期より非メチル化の認められるLINE1を選択し検討を行った。糞便・血液サンプルの収集、遊離DNA抽出を行う。健常者30名、潰瘍性大腸炎非癌患者50名、潰瘍性大腸炎癌化患者20名程度を対象とすべく収集している。血液中遊離DNAの抽出対象は過去の検討に基づき血清とし、具体的には、血液採取後早期に遠心後、フィルターをかけ血球(細胞)成分を除去し凍結保存している。糞便からの遊離DNAの収集方法としては、主として大腸内視鏡時の残留液を回収することで行う。遊離DNAの抽出は上記に準じ、得られた血液中および糞便中遊離DNAに関して再現性定量性を確保すべく予備検討を行っている。大腸がん以上の検討で、糞便や血液中遊離DNA総量(遊離DNA濃度)が、有用であるかが判明するが、更に各種サイズのLINE1遺伝子に関する量的検討を行うことで、DNA integrityが有用であるかどうかが判断される。それと同時に今回の検討の中心であるLINE1methylation定量に際し使用するアンプリコンサイズの目標値が決定される。

特に、健常人あるいはIBD非癌患者とIBD癌化患者の差の大きいアンプリコンサイズを目安にLINE1 MSP用のprimerをデザインする。LINE1のメチル化に加えてp16, RUNX3, MINTs, HPP, ESR1, COX2, E-cadherinメチル化定量も行うこれらのメチル化異常に関しては、頻度、程度等比較的高率ではないことが予想されるため、サーベイランスとしての有用性の向上のためにマルチマーカー化することを検討する。
移動カメラ映像データベース/マイニングによるアウェアネス提供システム

スマートフォンやタブレットPC等モバイルディバイスの普及とWi-Fi等の高速無線通信網の発達により,移動カメラで撮影された映像を共有するサービスが提供されるようになってきた.本研究ではこれらのサービスを,より高品位の親密なコンテキストとして提供するための技術を開発することを目的とした.UGC(User Generated Contents)形態で集積される映像データを高速にデータベース化し,時空間条件からコンテキストとして提供するまでのシステムを実現するために,次のような課題の検討を行った.(1)時空間条件検索に適合したデータベース構造,(2)ストリームデータ処理系の導入による映像データベースの高速構築方式,(3)プライバシー保護コンテキストサービスのための画像処理方式,(4)通信環境に依存したスケーラブルな映像配信方式.そして,これらの技術を統合した新たなコンテキストサービスシステムを開発し,その有効性を確認した.スマートフォンやタブレットPC等モバイルディバイスの普及とWi-Fi等の高速無線通信網の発達により,移動カメラで撮影された映像を共有するサービスが提供されるようになってきた.本研究ではこれらのサービスを,より高品位の親密なコンテキストとして提供するための技術を開発することを目的とした.UGC(User Generated Contents)形態で集積される映像データを高速にデータベース化し,時空間条件からコンテキストとして提供するまでのシステムを実現するために,次のような課題の検討を行った.(1)時空間条件検索に適合したデータベース構造,(2)ストリームデータ処理系の導入による映像データベースの高速構築方式,(3)プライバシー保護コンテキストサービスのための画像処理方式,(4)通信環境に依存したスケーラブルな映像配信方式.そして,これらの技術を統合した新たなコンテキストサービスシステムを開発し,その有効性を確認した.・アウェアネス提供サービスをITS分野で活用する場合のサービスシナリオを検討。そのサンプルとして、駅前に家族を迎えに行くシナリオ・駐車場入場への待ち行列探索シナリオ・交差点事故の映像解析シナリオの3つを対象にして、想定される駐車車両や通過車両の配置状況の把握方法について検討。・今年度の目標であるデータベース化の対象とする移動カメラからの映像ストリーム収集に関して:複数台のドライブレコーダからの映像ストリームが得られたのと同じ効果が得られる360度サラウンドカメラを搭載した車両を用意して、それらをサービスシナリオに基づき複数台連動して撮影する実験を実施。これによって得られた映像ストリームのデータ容量は全体で126Gbyte、総フレーム数50万フレームに及んだ。・映像データベースの構築に関して:映像ストリームのデータベース構築方法として、(1)ある程度の時系列を持った連続ストリームの塊単位にレコード化するストリーム塊単位の管理方法と、(2)映像ストリームを構成する各フレームをそれぞれ個別に管理するフレーム単位の管理方法との2方式を比較・検討。画像特徴量の多様性をきめ細かく関係付ける観点から、(2)の方式を採用し、Webデータベース化を図った。そして、画像特徴量の抽出タイミングの順序を自由にし、しかもそれらの関係付けを多重に記述可能な、リスト型タグ付け方式とそのプロフィールを効率的に反映可能なメタデータ化方式を検討。・アウェアネスを、ユーザに最も興味のある映像ストリームとして配信するサービスをシステム運用の観点から検討。各車両で撮影され蓄積されている映像ストリームのメタデータだけをセンターサーバでアーカイブ管理して検索に対応させ、適合した映像データは各車両から直接転送される分散配信方式を検討。・これら一連の検討により、実用的なアウェアネス提供サービスシステムの方式検討が進展したと判断される。・前年度に引き続き、アウェアネス提供サービスをITS分野で活用する場合のサービスシナリオを検討。従来のドライブレコーダが、一般ドライバの車両に普及しない(装着率0.1%以下)問題を分析。その原因として、事故時以外の通常時に何の役にも立っていないことから、この通常時に役立つコンテキストアウェネスサービス機能を策定。・アウェアネス提供サービスをより広く普及させるため、ドライブレコーダ専用のハードウエア構成からより汎用的なスマートフォン構成に切り替えて検討、映像のアーカイブサーバもクラウド構成に変更。条件指定からの映像ストリームの検索メカニズムの開発関係:・スマートフォンを用いたUGC(User Generated Contents)形式でアーカイブされる映像+位置データを用いてデータベース化を行い、従来の事故時の映像サービス(事故解析モード)の他に、通常時にも任意の位置・時間指定から該当映像を提供するサービス(Context Awarenessモード)を行うことが可能なシステムを開発アウェアネス条件指定から映像ストリーム検索の高速化関係:・MPeg映像をJPeg静止画列に分解して時空間属性を付与し、それに時空間インデックスを張ることにより空間近傍演算を高速化させ、条件検索後の静止画列をMPeg化して映像提供するような映像データベースの構築方式を開発・時空間の条件設定には、映像アーカイブサーバに接続したスマートフォンの画面に空間情報を表示させ、例示ベースの簡単な操作から映像を検索できるようなGUIを開発アウェアネス検索のための映像データマイニング関係:・アウェアネスサービスの一例として、一時停車のリコメンド位置の状況を映像で確認できるサービスを検討。・一時停車のリコメンド位置を自動抽出する技術として、車両のハザードランプの点灯位置を画像マイニングにより自動認識する方式を開発。認識率は、晴天昼間の条件で約70%程度。・検索された映像の公開にあたり,映像内に含まれる不適切シーン抽出のために,例示型パターン学習とBoosting学習関数による不適切オブジェクトの認識を行うような画像マイニング方式を開発.その応用として,UGC映像データベースに含まれるプライバシー対象オブジェクトの抽出と保護方式を検討.・アウェアネス条件指定からの映像ストリーム検索時間性能測定と妥当性の評価を行い,それらの成果を学会での発表やITS標準化委員会への提案等を実施

.時空間条件検索に適合したデータベース構造関係.・映像フレーム実体(実際には画像実体)と,時空間属性実体及びタグ情報実体とを関係付けるような永続化スキーマの正規化設計を行い、ユーザ指定のタグ入力を効率化させた.ストリームデータ処理系の導入による映像データベースの高速構築方式関係データベース構成として,最新映像DB・公開可能履歴DB・公開不可履歴DBの3種類とし,ストリームデータ処理(SDP)で各データベースへの振り分け制御を高速化した新たなデータベース管理方式を開発.プライバシー保護コンテキストサービスのための画像処理方式関係:サンプル提示からの機械学習によるパターン分類方式を採用、これらの画像処理をストリームデータ処理と同期させて実行させるための,SDPへの組み込み方式を検討し,実用化の評価を行実施.通信環境に依存したスケーラブルな映像配信方式関係SDPと外部データベースの間にキャッシュを介在させ,その間で非同期レプリケーションを行う構成を開発.これを用いたサービスシステムとしての実装を実施.
化合物アレイを用いた拮抗作用を示さない植物ホルモン受容体結合化合物の探索

植物は周りの環境からの刺激に応答して植物ホルモンを生合成し、様々なストレスに対する防御機構を発現させる。植物ホルモンはその受容体と相互作用することにより、受容体とタンパク質の相互作用を変化させ、下流のシグナル伝達を開始させる。植物ホルモン受容体には複数のホモログが存在することが多く、各々の機能分化について未だ不明瞭な点が多い。また植物ホルモンのシグナル伝達は互いにクロストークすることもわかっているが、その詳細な分子機構は未だ明らかになっていない。そこで、ケミカルバイオロジーの手法を用いて植物ホルモン受容体に結合する化合物をバイオプローブとして用いることにより受容体機能の解明を目指す。当研究グループではケミカルアレイを用いたスクリーニングによりアブシジン酸受容体のアンタゴニストRK460を単離し(Ito et al., 2015)これらの立体異性体を合成した。また、シロイヌナズナの14種のアブシジン酸受容体のうち、11種類の組換えタンパク質を精製することができたため、RK460関連化合物の受容体特異性を評価し、立体異性体による受容体特異性の違いを明らかにした。このような受容体選択性のあるアンタゴニストは植物ホルモンシグナル伝達系の解析のための有用なバイオプローブとなることが期待されたため、強い活性の見られた化合物について構造展開を行った。また理研NPDepoライブラリーのスクリーニングによりアブシジン酸受容体と結合するPP2Cタンパク質の活性を阻害する化合物が新たに見いだされ、これがアブシジン酸だけでなくジャスモン酸応答遺伝子にも影響を与えることが遺伝子発現評価により明らかとなった。この化合物が両植物ホルモンシグナル伝達系を活性化する可能性がある。アブシジン酸受容体を用いたケミカルアレイスクリーニングにより単離されたRK460について、新たに精製に成功した2種の受容体と合わせて11種のアブシジン酸受容体を使用した詳細な特異性試験を実施し、RK460の立体構造活性相関が明らかとなった。これよりさらなる構造展開へと研究を発展させている。一方、アブシジン酸シグナル伝達系の負の制御因子であるタンパク質脱リン酸化酵素(PP2C)のひとつであるHAB1活性を指標としたスクリーニングにおいて理研NPDepoライブラリーより、活性を示す化合物を得た。この化合物をシロイヌナズナに処理したところ一部のアブシジン酸関連遺伝子に加えて、ジャスモン酸応答性遺伝子の発現が上昇する事を見出した。この化合物はアブシジン酸、ジャスモン酸の両ストレス応答ホルモンシグナル伝達に影響を及ぼすことが期待され、さらに調査を進めている。他の植物ホルモン受容体の解析に関し、組換えタンパク質が不溶ないしは収量が少ないため、発現誘導条件と精製方法に関して課題が残る。RK460の立体異性体に関して、植物に処理したときの安定性ないしは受容体特異性を考慮した構造展開を進める。合成化合物の受容体特異性に関しても試験を実施し、アブシジン酸アンタゴニストの構造活性相関の知見を蓄積する。同時に植物体への影響についても調査する。植物ホルモンシグナル伝達活性化の評価系について、ストレス応答性プロモーター:レポーター遺伝子の形質転換植物の利用に加えて、より広い範囲での遺伝子発現調査ができるようにRT-qPCRによる評価も導入する。可溶化困難または収量の低い受容体組換えタンパク質に関しては、精製用タグの検討または、解析する受容体の数を限定して無細胞発現系の利用を検討する。植物は乾燥、温度変化、菌感染、傷害など周りの環境からのストレスに応じて種々の植物ホルモンを合成し、ストレス応答を発現する。植物ホルモンはそれぞれの受容体と相互作用することによりタンパク質間相互作用を制御し、下流のシグナル伝達を開始させる。植物ホルモン受容体には複数のホモログが存在し、各々の機能分化について未だ不明瞭な点が多い。また植物ホルモンのシグナルは互いにクロストークしているが、その詳細は明らかになっていない。そこで、ケミカルバイオロジーの手法を用いて植物ホルモン受容体に結合する化合物をバイオプローブとして受容体機能の解明を目指している。当研究グループではケミカルアレイを用いた化合物スクリーニングにより、アブシジン酸(ABA)受容体のアンタゴニストRK460を単離した(Ito et al ., 2015)。今回新たにRK460の立体異性体を合成し、複数存在するABA受容体への選択性を試験したところ、一部の立体異性体のみに活性があり、また選択性が異なることがわかった。このような選択性のある植物ホルモンアンタゴニストは、植物ホルモンシグナル伝達系の解析のための有用なツールとなると考え、RK460とその異性体についてさらに解析を進めている。またABAとの拮抗作用が報告されているサリチル酸(SA)、ジャスモン酸(JA)のシグナル伝達とのクロストークに関しての知見を得るために、SA、JAそれぞれによって発現が誘導される遺伝子プロモーター領域をレポーター遺伝子に連結したコンストラクトを作製し、シロイヌナズナへの形質転換を行った。またSA、JA受容体に関して、シロイヌナズナより各受容体遺伝子を大腸菌タンパク質発現系ベクターにクローニングした。これらの異種発現・精製を試みたところ、一部の受容体で組換えタンパク質の誘導が見られなかったため、別の発現ベクターへの導入を行っている。ABA受容体を用いたケミカルアレイスクリーニングより単離されたRK460の立体構造と活性、受容体選択性の相関に関する知見が得られたことから、ABA受容体機能の解明および植物ホルモンシグナル伝達へのアプローチにRK460が有用なツールとなることが期待された。RK460異性体の合成、光学分割、また9種類のABA受容体組換えタンパク質の精製に成功したため、生化学実験をスムーズに行うことができた。