hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
触媒的不斉ニトロマンニッヒ型反応の開発と高立体選択的な医薬合成への展開

本研究の最終年度にあたる本年度は、経済性と環境調和性にすぐれた反応系構築を目指し検討を重ねた結果以下の成果を得た。亜鉛触媒を活用したアンチ選択的な触媒的不斉マンニッヒ型反応の触媒量の低減化に関しては反応条件の詳細な検討により従来の他のグループの報告よりも500倍優れた触媒回転数を達成した。これは現時点で触媒的不斉マンニッヒ型反応に対して世界最高の回転数を示す触媒である。また、昨年度は芳香族アルドイミンからのアンチ選択的なマンニッヒ型反応のみを開発したが、本年度はさらにイミンの保護基を検討した結果、Boc-イミンを用いることで、シン選択的なマンニッヒ型反応の開発に成功した。さらに医薬合成への応用として、シン選択的な触媒的不斉マンニッヒ型反応を活用して抗腫瘍剤として有効なタキソテアの側鎖部の合成を達成した。またエステル等価体を求核剤とした反応開発にも着手し、新規に考案したN-アシルピロールを用いた反応を検討した。昨年度に用いた亜鉛のほかにインジウム金属がイミン活性化および系中でのエノラート生成に優れた性質を示すことを見い出した。配位子のチューニングに関しては、連結型ビナフトール不斉配位子を基軸としたスクリーニングを徹底して検討した。その結果、柔軟で自由度の高いビフェニル骨格を導入することで反応速度を大幅に向上することに成功した。これは従来の不斉配位子と比較して不斉源を半分にできたばかりでなく、高いエナンチオ選択性を維持したまま反応速度を向上させた点で価値が高い。14年度研究計画に基づきニトロマンニッヒ型反応の医薬合成への展開を検討した。アルミニウム-リチウム-ビナフトール触媒を用いた触媒的不斉ニトロマンニッヒ型反応の医薬品合成への展開としてサブスタンスP拮抗薬であるCP-99,994の全合成を達成した。従来問題であった触媒的不斉ニトロマンニッヒ型反応におけるジアステレオ選択性の問題に関して検討を重ねた結果、シリルニトロナートの高立体選択的なプロトン化反応による合成終盤におけるエピメリ化によって解決することができた。ニトロマンニッヒ型反応自体の立体選択性に関しては、反応温度、反応溶媒等の詳細な検討の結果不斉収率77%、ジアステレオ選択性6/1にまで改善することができた。さらに結晶化操作による精製のみで単離を行うことで不斉収率97%の生成物を得ることにも成功した。また、さらなる展開として1、2-ジアミン構造を有する医薬化合物ICI-199441の触媒的不斉合成も行った。ニトロメタンを求核剤として活用した場合には希土類-カリウム-ビナフトール錯体がもっとも良い結果を与えた。ニトロ基の還元と続く環化反応、脱保護、アミド化によりICI-199441の短工程触媒的不斉合成を達成した。さらに、鍵反応の革新的改良を目指し新規連結型ビナフトール型不斉配位子の合成と評価に着手した。リンカー部分に酸素原子、窒素原子、硫黄原子を導入した配位子について各種反応への適用を検討した結果、亜鉛錯体を活用したヒドロキシケトンのアルドール反応において含酸素型のものと含硫黄型のもので立体選択性が逆転するという現象を見い出した。現在、今年度に開発に成功した新規不斉配位子の応用として各種新規反応への展開を開始したところである。(726字)15年度研究計画に基づき特にsynおよびanti選択的な触媒的不斉マンニッヒ型反応の開発と医薬合成への展開を検討した。昨年度に着手した連結型ビナフトール不斉配位子を基軸とした触媒的不斉マンニッヒ型反応において特にEt_2Zn/linked-BINOL錯体が有効であることを見い出した。イミン上の置換基を検討することでsynおよびantiアミノアルコールを高い選択性(最高99% ee, dr>98/2)にて得ることに成功した。特に実用性を重視した検討から触媒量を0.25mol%にまで低減化することに成功した。これは従来法と比較して10倍以上の触媒効率である。さらに現在触媒量の低減化を進めており最高で0.02mol%にまで低減化できることもわかりつつある。また医薬合成への展開として免疫調整機能を有するサイトキサゾンの効率的な合成を達成した。さらに抗腫瘍剤タキソールの側鎖部の効率的合成も行った。医薬合成への展開と同時にsynおよびanti選択的な触媒的不斉マンニッヒ型反応のメカニズム解析も進めた結果:1、両反応において反応の律速段階が異なること:2、anti選択的な反応においては生成物による反応加速効果があることを明らかにした。また、連結型ビナフトール不斉配位子のリンカー部位のヘテロ元素に関しても系統的な検討を行った結果、酸素元素の場合が最も良好な結果を与えることを明らかとした。C2-対称性を崩した連結型ビナフトール不斉配位子に関しても徹底したチューニングを行い、従来の連結型ビナフトール不斉配位子に匹敵する選択性が得られることを見い出した。

これは現時点で触媒的不斉マンニッヒ型反応に対して世界最高の回転数を示す触媒である。また、昨年度は芳香族アルドイミンからのアンチ選択的なマンニッヒ型反応のみを開発したが、本年度はさらにイミンの保護基を検討した結果、Boc-イミンを用いることで、シン選択的なマンニッヒ型反応の開発に成功した。さらに医薬合成への応用として、シン選択的な触媒的不斉マンニッヒ型反応を活用して抗腫瘍剤として有効なタキソテアの側鎖部の合成を達成した。またエステル等価体を求核剤とした反応開発にも着手し、新規に考案したN-アシルピロールを用いた反応を検討した。昨年度に用いた亜鉛のほかにインジウム金属がイミン活性化および系中でのエノラート生成に優れた性質を示すことを見い出した。配位子のチューニングに関しては、連結型ビナフトール不斉配位子を基軸としたスクリーニングを徹底して検討した。その結果、柔軟で自由度の高いビフェニル骨格を導入することで反応速度を大幅に向上することに成功した。これは従来の不斉配位子と比較して不斉源を半分にできたばかりでなく、高いエナンチオ選択性を維持したまま反応速度を向上させた点で価値が高い。
細胞質分裂後の「細胞壁のゆるみ」制御に必須の細胞壁タンパク質の同定と分子機能解明

AtPME61はペクチンメチルエステラーゼ(PME)ファミリーの一つで,シロイヌナズナ花茎の基部で特異的に発現が高まるという特性を持つ。今年度の研究で, pro AtPME61 :: GUSは花茎の皮層の特定細胞列で特異的に発現すること,欠損変異体pme61では花茎組織内でのPME活性が有意に低下すること,花茎皮層の特定細胞壁内でペクチンのメチルエステル化度が高いこと,などを見いだした。更に興味深いことに, pme61では花茎伸長成長が促進され,花茎細胞壁の力学的な強度が低下することも見いだした。これらの結果は, PMEが細胞壁のゆるみ制御に関わることを示し,細胞壁のゆるみの研究に新たな視点を与えるもので,その意義は大きいと言える。ヒメツリガネゴケには32のXTH遺伝子(PpXTH)が存在し,その中にコケに固有のサブグループが存在することを明らかにした。その中で,コケに特徴的な遺伝子構造や発現特性を示す遺伝子種についてノックアウトラインとPro ;;XTH ::GUS融合体発現ラインを作成し,遺伝子機能とタンパク質の局在解析を進めた。その結果PpXTH32タンパク質は原糸体内に発現し,そのノックアウト体では原糸体の成長が抑制されることを見いだした。この研究により,原糸体の細胞伸長を細胞壁関連遺伝子の機能という視点から解析できるようになった。イネにおいて,キシログルカンが細胞壁のゆるみに関わるか否かは未だ結論の出ていない大きな問題である。この問題に答えるために,イネの茎葉部の伸長域で特異的に発現するOsXTH19の酵素反応特性を解析し,その基質がキシログルカンであることを実証した。この結果は,細胞伸長におけるキシログルカンの役割が被子植物に普遍的であることを示す点で重要な成果である。
Toll様受容体刺激によるシグナル伝達経路の阻害剤とその標的および阻害機構

Toll様受容体(TLR)はDrosophilaのTollに対する哺乳動物のホモログとして発見され、微生物細胞の構成成分を認識して自然免疫の中心的役割を果たす受容体分子として現在最も注目されている。我々はこれまでに、2-aminopurine(2-AP)がTLRシグナルによりMyD88非依存的に発現誘導されるIFN-βの産生を強く抑制することにより誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制することを見出している。本研究ではこの2-APによる阻害に関してさらに詳細に解析を行った。マクロファージ様細胞株RAW264において、2-APはLPSおよびpoly I:C刺激によるサイトカイン産生を調べたところ、LPS、poly I:C刺激によるIL-6産生は2-APにより強く抑制されたのに対し、TNF-α産生に対する抑制は部分的であった。LPSおよびpoly I:C刺激においてはNF-κB、IFN-βプロモーターおよびISREプロモーター配列が活性化されるが、2-AP添加により、NF-κBの活性化に関しては部分的に、IFN-βおよびISREに関してはほぼ完全に抑制された。さらにHEK293細胞にTBK1を過剰発現させた場合に起こるIFN-βプロモーター活性の上昇は2-AP添加により有意に抑制された。以上のことから、LPSおよびpoly I:C刺激において、2-APはTLRシグナル経路のうちTBK1の下流で阻害効果を示すことが明らかになった。2-APに類似の構造を有する化合物について、TLR刺激によるNO産生に対する効果について検討したところ、いくつかの9-banzyladenine誘導体が2-APよりも低濃度でLPS刺激によるNO産生を阻害することが明らかになり、2-AP同様、TLRシグナル阻害剤のリード化合物となる可能性が示唆された。我々はこれまでに、2-aminopurine (2-AP)がTLRシグナルによりMyD88非依存的に発現誘導されるIFN-βの産生を強く抑制することによりiNOSの発現を抑制することを見出している。マクロファージ様細胞株RAW264において、2-APはLPS、poly I:CおよびCpG DNA刺激によるサイトカイン産生を調べたところ、LPS、poly I:C刺激によるIL-6、GM-CSF産生は2-APにより強く抑制されたのに対し、TNF-α、IL-1β産生に対する抑制は部分的であった。CpG DNA刺激ではIL-6産生は誘導されなかったが、その他のサイトカイン産生については同様の結果であった。2-APに類似の構造を有する化合物についてTLR刺激によるNO産生に対する効果について検討したところ、2位にアルキルアミノ基を有する9-banzyladenine誘導体が2-APよりも低濃度でLPS刺激によるNO産生を阻害することが明らかになった。しかし、これらの化合物はさらに低濃度でIFNおよびNO産生誘導活性を示し、これらの化合物が両活性を示す作用点について、さらに検討が必要である。また、マクロファージ系細胞以外の細胞に対する2-APの作用解析の予備検討として、腸管上皮細胞株および間質細胞株を用いて、TLRリガンド刺激によるサイトカインおよびNO産生を調べたところ、両細胞ともNO産生は誘導されず、MCP-1およびIL-6が誘導さることがわかった。

我々はこれまでに、2-aminopurine(2-AP)がTLRシグナルによりMyD88非依存的に発現誘導されるIFN-βの産生を強く抑制することによりiNosの発現を抑制することを見出している。本研究では、この2-APによる阻害メカニズムについて、シグナル伝達経路を調べることにより解析を行った。まず、マクロファージ様細胞株RAW264をLPSおよびpoly I : Cにより刺激するとNF-κB、IFN-βプロモーターおよびISREプロモーター配列が活性化されるが、2-AP添加により、NF-κBの活性化に関しては部分的に、IFN-βおよびISREに関してはほぼ完全に抑制された。さらにHEK293細胞にTBK1を過剰発現させた場合に起こるIFN-βプロモーター活性の上昇は2-AP添加により有意に抑制された。昨年の結果からTLR刺激によるNO産生に対して阻害効果を示す2-AP類似の2-alkylamino-9-banzyladenine誘導体についてもほぼ同様の結果が得られ、2-AP同様、TLRシグナル阻害剤のリード化合物となる可能性が示唆された。また、昨年の結果から、腸管上皮細胞株および間質細胞株をTLRリガンド刺激によりサイトカイン産生が誘導されるシグナルについて検討を行ったところ、NF-κBの活性化が誘導されていることがわかった。
回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムの開発

メカトロ機器において回転伝達機構の角度伝達誤差やバックラッシ,あるいは剛性などがサーボの特性に大いに影響する.本研究は回転伝達機構の特性と制御特性の関係を定量的に明らかにすることを目的とし,汎用的な回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムの開発を行い,開発したしシステムの性能の評価と代表的な回転伝達機構の回転特性の計測実験を行った.1)開発した計測システムは,各種回転伝達機構(歯車減速機,摩擦伝動装置,タイミングベルト装置など)を対象にした汎用的で,負荷イナーシャ,負荷トルク,入力速度パターンなどの試験条件を簡単に設定できるシステムである.本装置を用いて,回転伝達機構の回転伝達誤差,バックラッシュ量,ねじり剛性と制御特性(速度制御誤差,位置決め誤差,ステップ応答,安定性など)を計測でき,コンピュータ上の表示やプリンタへの出力が簡単にできる.2)剛性直結カップリング,バックラッシを有するカップリングと歯車減速機を用いて,静的な回転伝達特性の計測実験を行い,従来の歯車かみ合い試験機の性能を実現できたとともに,従来できないバックラッシの連続的な測定を高精度に測定できたことがわかった.また歯車について,歯面仕上げ方法による伝達精度への影響まで調べられることが実験により確認された.3)バックラッシを有するカップリングと平歯車減速機の動的な計測実験を行い,バックラッシに起因する駆動側と受動側の接触,衝突(片面,両面),非接触からなる複雑な振動現象を観測することができた.4)本システムの力学系と制御系のモデルを作成し,回転伝達の運動シミュレーションを行い,実験で観察した現象を定量的に再現することができた.これらのモデルに基づき,バックラッシを有する制御系をより適切に設計することが可能である.メカトロ機器において回転伝達機構の角度伝達誤差やバックラッシ,あるいは剛性などがサーボの特性に大いに影響する.本研究は回転伝達機構の特性と制御特性の関係を定量的に明らかにすることを目的とし,汎用的な回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムの開発を行い,開発したしシステムの性能の評価と代表的な回転伝達機構の回転特性の計測実験を行った.1)開発した計測システムは,各種回転伝達機構(歯車減速機,摩擦伝動装置,タイミングベルト装置など)を対象にした汎用的で,負荷イナーシャ,負荷トルク,入力速度パターンなどの試験条件を簡単に設定できるシステムである.本装置を用いて,回転伝達機構の回転伝達誤差,バックラッシュ量,ねじり剛性と制御特性(速度制御誤差,位置決め誤差,ステップ応答,安定性など)を計測でき,コンピュータ上の表示やプリンタへの出力が簡単にできる.2)剛性直結カップリング,バックラッシを有するカップリングと歯車減速機を用いて,静的な回転伝達特性の計測実験を行い,従来の歯車かみ合い試験機の性能を実現できたとともに,従来できないバックラッシの連続的な測定を高精度に測定できたことがわかった.また歯車について,歯面仕上げ方法による伝達精度への影響まで調べられることが実験により確認された.3)バックラッシを有するカップリングと平歯車減速機の動的な計測実験を行い,バックラッシに起因する駆動側と受動側の接触,衝突(片面,両面),非接触からなる複雑な振動現象を観測することができた.4)本システムの力学系と制御系のモデルを作成し,回転伝達の運動シミュレーションを行い,実験で観察した現象を定量的に再現することができた.これらのモデルに基づき,バックラッシを有する制御系をより適切に設計することが可能である.本年度は、汎用的な回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムの開発を行い、開発したシステムの基本性能の確認と簡単な回転伝達機構の回転特性の計測実験に関する研究を行った。その結果、(1)各種回転伝達機構(歯車減速機、摩擦伝動装置、タイミングベルト装置など)を対象にできる汎用的な構造、負荷イナーシャ、負荷トルク、負荷ダンピングなどの試験条件を変更できる装置を設計し、製作した。本装置は、ACサーボモータで駆動する駆動軸ユニット、負荷条件などを設定する従動軸ユニットとさまざまな回転伝達機構に合わせるための両軸の精密移動テーブルから構成されている。(2)回転角度、回転速度、回転加速度などの試験条件を制御し、かつ回転伝達誤差、バックラッシ量、ねじり剛性と制御特性(速度制御誤差、位置きめ誤差、ステップ応答、安定性など)を計測する制御・計測システムを設計、製作した。駆動軸の運動制御、制御特性の計測と表示などは2台のコンピュータによって行われる。(3)計測システム自身の精度、剛性、共振周波数などを実験的に調べ、設計仕様を達成できたことを確認した。(4)バックラッシを有する簡単な回転伝達機構について、バックラッシ量、ねじり剛性と制御特性の計測を行い、本計測システムの有効性を確認できた。また同回転伝達機構を用いて、いろいろな加減速のパターンによる正逆回転実験を行い、その伝達状態は接触、衝突(片面、両面)、非接触からなっていることが計測結果よりわかった。本年度は,前年度で開発した回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムを用いて,バックラッシを有するカップリングと平歯車の伝達特性の計測実験,及びバックラッシを有するカップリングの動的な伝達特性に関するシミュレーションを行った.その結果,1)バックラッシを有するカップリングについて,バックラッシ量や最大回転速度などの実験条件を変えて実験した結果,速度が変化するときバックラッシにより回転伝達誤差が大きく変化し,加速度が負に変わるとき低速時に片面衝突,高速時に両面衝突が起きることを見出した.2)平歯車(JIS1級とJIS0級)について,上記と同様な実験条件において同じような現象が観測され,バックラッシ量が小さい場合両面衝突が起きやすいことがわかった.

3)バックラッシを有するカップリング,サーボ系を含んだ計測システムのモデルを作製し,接触,非接触と衝突現象を考慮して回転伝達のシミュレーションを行い,計測実験で観測された現象を定性的に確認することができた.本年度は,先に開発した回転伝達機構の総合角度伝達特性計測システムを用いて,ブレーキとフライホイールなどの負荷条件におけるバックラッシを有するカップリングと平歯車の伝達特生の計頼り実験,及びバックラッシを有するカップリングのシミュレーションモデルの改善を行った.その結果,1)バックラッシを有するカップリングについて,ブレーキトルク,フライホイール(慣性負荷),バックラッシ量と回転速度の実験条件を変えて実験した結果,負荷によりバックラッシに起因する接触面の移動のタイミングが大きく変化し,また接触面の一時離れが起きる複雑な挙動を示していることがわかった.2)平歯車(歯切り仕上げ歯車と歯研磨歯車)について,上記と同様な実験条件においてバックラッシ量に起因する同じような現象が観測され,それに加えて偏心量による歯あたり衝突が現れていることがわかった.また,本装置を用いると,歯面加工法によるかみ合い伝達誤差への影響を細かく調べることが可能であることも実験により確かめられた.3)前年度で作成したシミュレーションモデルについて,偏心要素や飽和要素などを追加してより実験条件に近いモデルで回転伝達のシミュレーションを行い,計測実験で観測された現象を定量的に確認することができた.
哺乳動物neuronal identity決定の機構

哺乳動物の多様な神経細胞の各々に特徴的な性質(neuronal identity)が、神経発生から神経回路網の構築・発達に至る過程でいかに決定されるのかを分子レベルで明らかにするため、主にBar型ホメオボックス遺伝子MBH1の解析を行った。MBH1は、脊髄の交連神経細胞が分化する時、一過的に発現する。この発現制御機構を詳細に解析するため、MBH1ゲノムの転写制御領域とレポーター遺伝子のlacZを持つトランスジェニックマクスを多種類作製した。その結果、MBH1の発現は、MBH1遺伝子の下流に存在するE-boxで制御され、その制御には、ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子のMath1が関与することを示した。一方、Math1やMBH1の下流で発現する遺伝子を解析するため、マイクロアレイ法を用い解析を行った。Math1とMBH1遺伝子を電気穿孔法で発生過程の脊髄で強制発現させた後、脊髄よりRNAを抽出し、発現量が変化する遺伝子を検索した。その結果、わずかの遺伝子のみで発現量が変化し、その発現量の増減の程度はMath1やMBH1の強制発現の間でほぼ同一であった。この事は、Math1の強制発現でMBH1が誘導される事と合致する。以上の結果、Math1とMBH1遺伝子が同一のカスケード上に存在し、共通の下流遺伝子を制御することにより、交連神経細胞の分化を制御することが明らかとなった。
ヘパラナーゼの機能解析-分化誘導機能と血管新生作用の解析と制御による癌治療開発

癌の浸潤・転移過程は分子レベルでの解明が世界レベルで進められているが、その過程は大別して3つの重要な機構が一連の過程の中で効率良く且つ複雑に構成されている。それらは1)癌細胞の遊走・接着、2)細胞外マトリックス分解、3)血管新生であるが、我々は細胞外マトリックス分解と血管新生に深く関わる分子であるヘパラナーゼ(Heparanase: HPA)について、本科学研究費を用いて、研究している。先ず、ペパラナーゼが分化誘導刺激によってシャペロン(HSP90)と結合し核内に移行し細胞に分化を誘導することを明らかにしてAACR,Cancer Scienceにおいて発表した。また、血管新生については昨年度に既に下記論文において、ペパラナーゼがCOX-2を介して血管新生をもたらすことを明らかにした。すなわち、これまでの論文とあわせて胃、大腸、食道、乳腺においてペパラナーゼが発癌、進展過程に強く関わり、COX-2を介して血管新生をもたらすことがin vitroならびにヒトがんにおいて、明らかとなった。以上のことから、我々は癌の浸潤転移過程を系統的に理解する上でHPAとFAKを軸としたシグナル分子生物学的相互作用及びシグナル伝達系の網羅的解析と、これらの分子を標的とした新既治療戦略の確立及び集学的治療の相乗効果の基礎的検討を開始している。こういった研究を通じて分化誘導の仕組み、特異的な分子標的薬剤の開発につながり、将来の臨床への貢献が期待されるものと考えられた。研究の進捗は順調で、ごの期間にわれわれの樹立した食道扁平上皮細胞を用いて、ヘパラナーゼの核内移行が核内のマトリックスを分解し、さらにそれが細胞の分化を誘導することを明らかにし、論文として発表した。このことはこれまで明らかでなかった細胞分化の機序を解析したことで今後の同分野における研究に大きく責献する特筆すべき成果である。ヘパラナーゼはこれまでは癌の浸潤・転移に関わり、癌の悪性度を規定するものと考えられてきた。この機構についても、われわれは下記のことを明らかにした。すなわち、ヘパラナーゼがCOX-2を誘導し、さらに下流のVEGFなどの誘導を介して血管新生を誘導して癌の進展に寄与することを食道癌、胃癌、大腸癌、乳癌組織において見出した。このことはヘパラナーゼの悪性度を規定する機構として、新たな血管新生シグナルを通じて癌の進展に寄与することが明らかにされたことになる。さらに、驚くことにヘパラナーゼが核内に移行することで、上皮細胞の分化が惹起されることがin vitrにおいて明らかにされた。また、癌組織内のヘパラナーゼの核内移行の見られる部分において、分化度が高い傾向が見られin vitroでの研究結果と実際の癌組織の分化傾向が一致していたことになる。このことは、主に食道の正常上皮と食道癌組織を用いて研究された。本研究期間における成果は、ヘパラナーゼによる血管新生の研究においても、乳がんならびに胃印鑑細胞がんの進展にCOX-2を介した血管新生機構が明らかとなったこと、そして、ヘパラナーゼの核内移行が、細胞の分化を司っていることであり、これらにより今後の研究成果が期待される。それらは1)癌細胞の遊走・接着、2)細胞外マトリックス分解、3)血管新生であるが、我々は細胞外マトリックス分解と血管新生に深く関わる分子であるヘパラナーゼ(Heparanase:HPA)について、本科学研究費を用いて、研究している。

すなわち、これまでの論文とあわせて胃、大腸、食道、乳腺においてペパラナーゼが発癌、進展過程に強く関わり、COX-2を介して血管新生をもたらすことがin vitroならびにヒトがんにおいて、明らかとなった。以上のことから、我々は癌の浸潤転移過程を系統的に理解する上でHPAとFAKを軸としたシグナル分子生物学的相互作用及びシグナル伝達系の網羅的解析と、これらの分子を標的とした新既治療戦略の確立及び集学的治療の相乗効果の基礎的検討を開始している。こういった研究を通じて分化誘導の仕組み、特異的な分子標的薬剤の開発につながり、将来の臨床への貢献が期待されるものと考えられた。
体内時計中枢における分子神経メカニズムの決定

本研究では、マウスおよびキイロショウジョウバエの体内時計細胞の長期安定培養を行い、時計遺伝子転写リズムと細胞内H+/Ca2+濃度リズムの相関を解析した。その結果、ハエの前胸腺細胞では、時計遺伝子PeriodとTimlessの挙動が乖離しうることや、哺乳動物の中枢ニューロンの場合とは異なり、神経系に依存的したCa2+スパイクリズムが存在することが明らかとなった。これらのことは、細胞種に依存した時計遺伝子や細胞内Ca2+濃度の振動が存在することを意味している。多くの生物の生理活動にみられる約24時間の周期性は、脳内の特定の神経細胞(群)によって支配されている。本研究では、こうした体内時計ニューロンに普遍的な仕組みを明らかにするために、マウスとショウジョウバエの体内時計ニューロンに共通する細胞内イオン振動機構を明らかにすることを目的としている。計4年のプロジェクトの初年度にあたる本年度では、マウスにおいてすでに報告している細胞内カルシウム濃度リズムに対する時計遺伝子の関与を明らかにするために、以下の実験をおこなった。まず、視交叉上核(SCN)ニューロンに蛍光Ca^<2+>センサーであるYC2.1と時計遺伝子Bmal1のshRNAの共発現を行い、SCNニューロンの生理活動リズムにどのような乱れが生じるのかを検討した。その結果、shRNAを導入されたSCNニューロンでは、概日細胞内カルシウム濃度リズムに見られる周期が延長し、また振幅が有意に減少することが明らかになった。また、BMAL1モノクロナール抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、ノックダウンの成否を検討した結果、shRNAを導入されたニューロンでのみ、Bmal1タンパク質の発現が抑制されていることが明らかになった。本年度はさらに、ショウジョウバエの体内時計細胞(LNs)に蛍光pHセンサー(deGFP4)を発現させた系統の作出に成功した。deGFP4をLNsに強制発現させたショウジョウバエの個体行動リズムを解析したところ、明暗サイクルおよび恒暗条件下において、野生型と差異はなかった。よって、作出したハエの体内時計は正常に動作しているものと推定された。そこで、この系統のハエの脳を、顕微鏡ステージ上で培養し、細胞内H^+濃度をバイオイメージング法により解析した。その結果、振幅がpH0.5程度の概日pH振動が3日間にわたり観察された。本研究では、体内時計中枢であるマウス視床下部視交叉上核(SCN)とキイロショウジョウバエ(LNs)ニューロンを様々なバイオイメージング技法を用いて解析・比較することにより、時計遺伝子転写リズム、細胞内Ca2+/H+濃度リズム、および活動電位発火頻度リズムの因果関係を明らかにすることにチャレンジする。これらにより、体内時計中枢に共通する分子神経メカニズムを決定することを目的としている。本年度は、これまでに分かってきたキイロショウジョウバエの前胸腺細胞の振動と、LNsの振動との仕組みの違いを、特に光情報入力による時計遺伝子の発現リズムの差として明確に捉えることに成功し、この結果を、Nature Communications誌に投稿し、衰終稿に至るまでのリバイズ実験をすべて完了した。ショウジョウバエを用いた実験においては、さらに、LNsの細胞内pHに劇的な概目リズムが存在すること、及び、pHホメオスタシスに異常をきたす変異個体において、歩行活動リズムの遅延を観察するなど、新たな発見もあった。マウスのSCNニューロンの細胞内Ca2+濃度リズムについての研究も進展し、SCN特異的にBma11をノックダウンすることにより、細胞内Ca2+濃度リズムが減衰することなども明らかになった。これらの背景を基に、今後、Perルシフェラーゼ発光と細胞内Ca2+濃度(Yellow Cameleon蛍光レシオ)の交互測定を行う予定である。これらの研究成果に加え、本年度は、睡眠覚醒リズム制御におけるヒスタミン神経系の役割を、幾つかのH1受容体アンタゴニストを用いて調べ、現在、入眠導入薬として使われているジフェンヒドラミンやクロロフェニラミンにあまり大きな作用が認められないこと、及び、第二世代H1アンタゴニストであるケトチフェンに強い睡眠促進作用があることを明らかにし、2報の論文発表を行っている。地球の自転周期で変動する数多くの生命現象は、体内に存在する自律的な振動機構により調節されている。そうした体内時計の研究領域では、約1日の周期で転写・翻訳が繰り返される「時計遺伝子」の同定や機能解析が、研究主軸として位置づけられている。時計遺伝子の転写リズムは、自己の遺伝子産物による転写フィードバック制御や、他の時計遺伝子産物とのタンパク質間相互作用において形成されることが示唆されており、また近年では、体内時計細胞に固有なCa2+濃度リズムなど「生理学的なファクター」が、そうした分子フィードバックループと相互作用することが提唱されている。そこで本研究では、マウスおよびキイロショウジョウバエの体内時計細胞の長期安定培養を行い、これら培養モデルにおける時計遺伝子転写リズムと細胞内Ca2+濃度リズムの相関を解析した。本年度は、研究期間の最終年にあたり、研究成果をまとめ、幾つかの論文を発表した。

具体的には、蛍光Ca2+センサーを安定発現させたSCNプロジェニター細胞(SCN2.2YC細胞)を作成し、これを材料に時計遺伝子転写リズムとCa2+濃度リズムを解析し、この細胞には弱い時計遺伝子転写リズムのみが存在し、概日Ca2+濃度リズムが存在しないことを報告した(Scientific Reports 2014)。成熟したSCNニューロンにみられる概日Ca2+濃度リズムの分子制御機構については、昨年度の北米神経科学学会のシンポジウムで講演し、現在その内容をJournal of Neuroscienceに投稿・リバイズ中である。また、これとは別に、キイロショウジョウバエの中枢ペースメーカーニューロンの細胞内プロトン濃度リズムの解析も完了した。特に、Lateral neuronの活動電位発火頻度に対し、プロトン濃度が大きく影響した結果は興味深く、この結果については論文投稿を準備中である。本研究では、体内時計中枢であるマウス視床下部視交叉上核(SCN)とキイロショウジョウバエ(LNs)ニューロンを様々なバイオイメージング技法を用いて解析・比較することにより、時計遺伝子転写リズム、細胞内Ca2+/H+濃度リズム、および活動電位発火頻度リズムの因果関係を明らかにすることにチャレンジする。これらにより、体内時計中枢に共通する分子神経メカニズムを決定することを目的としている。本年度は、これまでに分かってきたキイロショウジョウバエの前胸腺細胞の振動と、LNsの振動との仕組みの違いを、特に光情報入力による時計遺伝子の発現リズムの差として明確に捉えることに成功し、この結果を、Nature Communications誌に発表した。ショウジョウバエを用いた実験においては、さらに、LNsの細胞内pHに劇的な概日リズムが存在すること、及び、LNs特異的なミトコンドリアH+トランスポーターの欠損により細胞内pHリズムが消失することを突き止めた。マウスのSCNニューロンの細胞内Ca2+濃度リズムについての研究も進展し、SCN特異的にBmal1をノックダウンすることにより、細胞内Ca2+濃度リズムが減衰することや、このリズム減衰は細胞間コミュニケーションに依存しないことも明らかにした。これらの研究成果に加え、本年度は、SCNの出力系としての室房核ニューロンの役割や摂食行動リズムについての論文をJ Biol Chem及びJ Physiol (Lond)に論文発表するなど多数の研究成果を得た。ショウジョウバエの体内時計細胞の振動機構についての論文が、2012年5月にNature Communications誌に受理された。哺乳動物の視交叉上核リズムについての研究もまとめに入っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。ショウジョウバエの体内時計ペースメーカニューロンに大きな細胞内pH振動が観察されたため、pH感受性の少ないルシフェラーゼレポーター(Per-eLuc)の発現するトランスジェニックバエの作出を行う予定である。
集落営農の地域類型とその展望

平成19年度の活動は引き続き、集落営農の集中している地域である富山県、島根県の補足調査をするとともに、以前から集落営農の先進地である滋賀県の組織についても調査する機会を得た。得られた知見を、島根県の集落営農メールマガジンにて発表し、島根県の「次世代の集落営農の在り方研究会」、全国農業協同組合中央会の「集落営農組織支援方策研究会」、富山県、滋賀県と学識経験者による「次世代の集落営農研究会」にメンバーとして参加し、具体的な支援方策の議論に活かすことができた。また、組織育成の担当者との議論からも、各地域の集落営農の相違点や政策への対応方針を学ぶことができた。各県ともに農政の品目横断的経営安定対策の下で、政策要件に適合した組織づくりと、推進してきた組織の発展方向を合わせて考える中から、将来の集落営農の像を考える必要がある。また、研究成果の取りまとめ、発表を行った。具体的には、農家壮年人口の違いによる集落営農の地域類型について論文にまとめて投稿中(3度目)であり、年度内に発表できることを目指している。また、昨年度末の3月の日本農業経済学会にて報告した複数集落にまたがって展開する大規模な集落営農についても、報告した内容をもとに2007年度日本農業経済学会論文集に投稿し、掲載された。いずれも、これまで集落営農の展開してきた地域において、集落の農家壮年人口(人数)による地域類型があることを具体的に述べている。また、後者の論文においては、それとともに集落を越えた新たな集落営農組織の展開に言及し、その中での地域性を述べるとともに、大規模な組織であっても集落の範囲にとどまる活動があること、その要因について言及した。口頭報告では、6月に開催された全国担い手協議会主催の「集落営農組織リーダー・担当者交流会」にて「集落営農組織の現状と課題」という研究成果を踏まえた報告を行った。平成17年度は、特定農業法人の集中している地域における集落営農分析を行った。統計分析には、富山県の農業生産組織調査、島根県の集落営農実態調査(ともに個票データ)、2000年世界農林業センサス集落カードを利用した。それによって集落営農の担い手不足の差異、とくに集落の壮年人口の格差による組織の違いを析出した。壮年人口の少ない地域(島根県)では、壮年人口が少ない集落ほど、そこで設立された集落営農の機械のオペレーターの人数が少ないという傾向がみられた。また、壮年の多い地域(富山県)ではそのような傾向が見られなかった。それには非農家層の厚みの違いや、地域労働市場の展開度の違いに起因するオペレーター労働の位置づけの違いも影響していると考えられる。この結果を中心に7月に行われた日本農業経済学会にて個別報告を行った。また、実態調査としては特定農業法人を中心とし、とくに広島県、島根県の壮年の少ない地域の集落営農の実態を調査した。その際に、壮年人口規模とオペレーターの人数に着目するとともに、新たな方向性として営農だけでなく、加工事業に取り組む組織の調査も行った。営農以外の事業に取り組む組織は集落営農の先進地域においても未だに数が少ないが、その中においても多様な取り組みがみられる。また、広島県の安芸高田市の地域の自治組織についてもヒアリングを行う中で、地域自治の取り組みから生まれる集落営農組織が存在することを知った。営農以外の集落営農の特徴や、集落営農の設立の仕方による組織の差異などについては研究の主たる課題ではないが、次年度以降の研究の中で解明していきたい。平成18年度も引き続き、特定農業法人の集中している地域における集落営農分析を行った。それとともに、農政上の担い手として集落営農が位置づけられる中で集落営農の設立を推進する自治体や、設立したばかりの法人以外の組織の調査も行った。統計分析については、引き続き集落営農のある集落における農家壮年人口による組織の違いを明確化する分析を行った。さらに、新たな全国統計(『集落営農実態調査報告書』農林水産省より)が整備される中で、各地の組織の特徴を大きく把握できるようになり、その集計を試みた。新しい全国統計の詳細な分析は来年度に持ち越している。平成18年度の具体的な活動について次に報告する。特定農業法人の集中している以前からの集落営農の先進地域においては、農政の展開にも対応しながら集落を超える大規模な組織が生まれつつある。その実態の調査と内容の解明に努めた。壮年人口の多い地域である富山県、福井県にて複数集落(旧村範囲)の100haを大きく超える組織の調査を行い、そこでの組織の体制を学んだ。そして、それを壮年人口の少ない地域である山口県の事例であり、かつ複数集落で活動している事例と比較して、相違点についてまとめた。この成果を、日本農業経済学会の春季大会において報告している。また、新たな取組として集落営農間のネットワークの実態や、多角化に取り組む事例についても調査を行った。さらに、平成18年度は農政に対応して全国各地で集落営農の設立が展開する中で、これまでの組織の実態と政策への対応について講演という形で報告する機会を度々得ることができた。その際に、報告した地域にて、組織化に取り組みつつある組織の事例を調査し、その実態と特徴についても報告している。(たとえばJA経営実務2月号に佐賀県の任意組織の対応と特徴についてまとめた。)これらの実態を踏まえて、続く平成19年度において集落営農の地域類型を明らかにしていきたい。

平成19年度の活動は引き続き、集落営農の集中している地域である富山県、島根県の補足調査をするとともに、以前から集落営農の先進地である滋賀県の組織についても調査する機会を得た。得られた知見を、島根県の集落営農メールマガジンにて発表し、島根県の「次世代の集落営農の在り方研究会」、全国農業協同組合中央会の「集落営農組織支援方策研究会」、富山県、滋賀県と学識経験者による「次世代の集落営農研究会」にメンバーとして参加し、具体的な支援方策の議論に活かすことができた。また、組織育成の担当者との議論からも、各地域の集落営農の相違点や政策への対応方針を学ぶことができた。各県ともに農政の品目横断的経営安定対策の下で、政策要件に適合した組織づくりと、推進してきた組織の発展方向を合わせて考える中から、将来の集落営農の像を考える必要がある。また、研究成果の取りまとめ、発表を行った。具体的には、農家壮年人口の違いによる集落営農の地域類型について論文にまとめて投稿中(3度目)であり、年度内に発表できることを目指している。また、昨年度末の3月の日本農業経済学会にて報告した複数集落にまたがって展開する大規模な集落営農についても、報告した内容をもとに2007年度日本農業経済学会論文集に投稿し、掲載された。いずれも、これまで集落営農の展開してきた地域において、集落の農家壮年人口(人数)による地域類型があることを具体的に述べている。また、後者の論文においては、それとともに集落を越えた新たな集落営農組織の展開に言及し、その中での地域性を述べるとともに、大規模な組織であっても集落の範囲にとどまる活動があること、その要因について言及した。口頭報告では、6月に開催された全国担い手協議会主催の「集落営農組織リーダー・担当者交流会」にて「集落営農組織の現状と課題」という研究成果を踏まえた報告を行った。
イネ-マメ科作付体系における窒素利用効率に関する研究

京都大学大学院農学研究科附属農場(高槻市)の水田二毛作長期試験圃場においてマメ科作物を組み入れた水田二毛作の窒素の動態を研究した。20012002年の冬作では、メインプロット(4区)における冬作物の収量調査およびマメ科作物のすき込み処理を行った。2002年の稲作では、それぞれのメインプロットにマイクロプロット(3反復)を設け、^<15>N標識硫安をレベル施用(0,40,80,120kg ha^<-1>)してイネ-マメ科作付体系における収量ならびに窒素の利用効率を調査した。20022003年の冬作では、^<15>N標識硫安を施用し、大麦をレファレンスクロップとしてマメ科作物の生物的窒素固定、肥料由来の窒素量をそれぞれ推定するとともにマメ科作物をすき込み処理した。2003年の稲作ではマメ科作物の生物的窒素固定由来の窒素がイネの収量にどの程度貢献するかを検討した。以上の実験結果を要約すると次のとおりである。イネ-ソラマメ、イネ-ヘアリベッチではha当たり131352kgの窒素を吸収して335010820kgの乾物生産を示した。吸収窒素の4178%が生物的窒素固定によるものであった。それらのマメ科作物のすき込みはイネの収量を低下させることなく施肥窒素の利用効率を高めた。施肥窒素の回収率はイネ-ソラマメでとくに高かった。イネ-ソラマメではha当たり80kg、イネ-ヘアリベッチでは40kgの窒素がマメ科作物のすき込みによって供給されており、稲作における窒素の必要量を基本的にまかなえる量であることを明らかにした。化学肥料による施肥量はマメ科作物からの供給量にあわせて調整されるべきであると結論した。マメ科作物を組み入れた水田2毛作の窒素利用効率を解明することを目的とし、京都大学農学研究科付属農場の水田2毛作長試験期圃場において研究を行なった。本年度は上記試験圃場の8つのメインプロット(各250m^2、2反復)のうち(1)ソラマメ(すき込み)-イネ(窒素無施用)区、(2)ヘアリーベッチ(すき込み)-イネ(窒素無施用)区、(3)ハダカムギ(地上部持ち出し)-イネ(窒素無施用)区、(4)休閑-イネ(化学肥料施用)区を対象として、それぞれに窒素施肥に関して4水準(ON,40kgNha^<-1>,80kgNha^<-1>,120kgNha^<-1>)のサブプロットを設けた(各1m^2、3反復)。窒素施肥は^<15>N標識硫安を用いた。現在、^<15>N atom % excessを計測している最中である。分析機器にトラブルが頻発して作業が遅延しがちであるが、4月中には完了見込みである。すでに調査を完了したイネの生育、収量の調査から次のような知見を得ている。ソラマメ-イネ体系は他の作付体系に比べて栄養生長期、生殖生長期ともに高いSPAD値、高い個葉光合成速度を示し、生育期間をとおして十分な窒素が供給されていることが考えられた。ソラマメ-イネ体系においてより多くの有効分げつが確保された。ソラマメ-イネ体系の収量はNレベルに関わらず収量は高く(688-778g籾m^<-2>)、ヘアリーベッチ-イネ体系の40kgNha^<-1>,80kgNha^<-1>,120kgNha^<-1>区、ハダカムギ-イネ体系の80kgNha^<-1>,120kgNha^<-1>区、休閑-イネ体系の120kgNha^<-1>区の収量に相当した。Agronomic efficiency(AE)はマイナスであった。ソラマメ-イネ体系によって収量を低下させることなく化学肥料の施用量を減らすことが可能であること(施肥窒素の利用効率の向上の可能性)が示唆された。ソラマメ-イネ体系の高収性には大きい乾物生産と籾への乾物分配の高い特性が密接に関係していることが推察された。

イネ-ソラマメ、イネ-ヘアリベッチではha当たり131352kgの窒素を吸収して335010820kgの乾物生産を示した。吸収窒素の4178%が生物的窒素固定によるものであった。それらのマメ科作物のすき込みはイネの収量を低下させることなく施肥窒素の利用効率を高めた。施肥窒素の回収率はイネ-ソラマメでとくに高かった。イネ-ソラマメではha当たり80kg、イネ-ヘアリベッチでは40kgの窒素がマメ科作物のすき込みによって供給されており、稲作における窒素の必要量を基本的にまかなえる量であることを明らかにした。化学肥料による施肥量はマメ科作物からの供給量にあわせて調整されるべきであると結論した。
体節内のボディープランと感覚器特異化の遺伝解析

ショウジョウバエ胚の末梢神経系の感覚器には代表的な2種類の感覚器である機械刺激受容器と伸展受容器があり、各体節に複数ずつ存在する。ホメオボックス型転写因子をコードするcut(ct)遺伝子の突然変異体では、機械刺激受容器と伸展受容器間の形質転換を示す。ct遺伝子の発現調節には体節内の位置情報が重要な役割を果たしている可能性が示唆され、ct遺伝子のcis制御領域がどのような体節内の位置情報支配下にあるかを明らかにすることにより、体節内位置情報と感覚器の特異化の関係の理解を深めると考えられた。ct遺伝子の機械刺激受容器前駆細胞の発現に十分なcis制御領域は、転写開始点から-30kbに存在する2.8kbのゲノム領域(A3)に存在しており、今年度はこのA3領域をより細分化しct遺伝子の発現に必要十分な細小ゲノム断片を同定することを目標とした。A3領域を細分化してlacZレポーターと融合させたDNAコンストラクトを構築し、遺伝子組換えショウジョウバエの作成を行い、ct遺伝子の発現に十分なcis調節領域を狭めることを試みた。その結果、ct遺伝子の発現にはA3領域内の127bpのゲノム断片で十分であることが明らかとなった。この127bp内には上流因子の一つと考えているAS-Cの結合配列であるE-boxが2ケ所存在した。一方で127bpゲノム断片内の3ユ側端の28bpを削ったコンストラクトは、E-boxを削らないにも関わらず、機械刺激受容器前駆細胞における発現に十分ではなかった。そこでこの28bpにAS-CのようなbHLH型転写因子とは異なる上流因子が作用する可能性を考えた。28bpを3領域に分割し、それぞれに塩基置換を施したDNAコンストラクトを持った遺伝子組換えショウジョウバエを作成し、この28bp内の必要な塩基配列を明らかにした。その結果、127bpの内、3ユ端の19bpの塩基配列が必要であることが明らかとなった。
閉鎖生態系循環式養殖システムにおける環境制御技術の確立とその応用に関する研究

本年度は平成15年度で得られた微細藻類のバイオマス生産、微細藻類-動物プランクトン間および動物プランクトン-魚類仔稚魚間のバイオマス変換効率やガス交換実験を基に閉鎖生態系循環式養殖システム全体の物質収支の算出を行った。試算は本システムの人工的な食物連鎖を利用したティラピア仔魚の飼育を想定し、それに必要なタマミジンコおよびクロレラのバイオマスを推定し、それぞれの生物における窒素およびリンの含量から物質の再循環を行わなかった際の魚体蓄積率を算出した。クロレラ-タマミジンコ-ティラピアの一連の食物連鎖から得られる魚類のバイオマスはクロレラのバイオマスの5.17%であり、窒素およびリンについてはティラピア排泄物のそれぞれ5.12%および5.54%が回収可能であると算出された。さらに酸素収支についてはクロレラのバイオマス生産時に生じる酸素量およびタマミジンコおよびティラピアの飼育に必要な酸素量を個別に算出し、比較を行った。その結果、クロレラの酸素量再生量がティラピアおよびタマミジンコの酸素消費量の2倍以上と推定され、十分な酸素供給が可能であると推定された。さらに、昨年度製作したCERAS小型実験装置の試作装置の各水生生物を用いた動作確認実験を行い、24時間程度の生命維持は十分に可能であると確認した。一方、上記の試算により、酸素収支において余剰が発生すると推察されたことから、ガス交換以外の食物連鎖物質循環系を本装置に組み込む改良を行い、包括的な物質循環型の装置を構築した。今後は実際に装置の運用を行って生命維持の確認および物質循環を把握し、酸素および窒素、リン等の栄養塩の動態について調査する必要がある。また、魚類飼育の際に蓄積された堆積物の可溶化実験を行い、淡水魚および海水魚の排泄物中の窒素を過酸化水素およびマイクロウェーブ分解装置を用いることで70%程度回収することが出来た。本年度は微細藻類-動物プランクトン間の栄養塩フィードバック実験をクロレラ、Chlorella vulgarisとタマミジンコMoina macrocopaを用いて行ったが、微細藻類の十分な増殖を得ることができず、十分なタマミジンコの培養ができなかった。この主な原因としてはタマミジンコ排水によるコンタミネーションが考えられ、排水の滅菌が必要であることがわかった。また、タマミジンコの酸素消費量の測定を行った結果、飼育水温依存的な値が得られ、2530°Cでは約2mgO_2/g湿重量/hであり、飼育水中の溶存酸素量の低下に伴い、酸素消費量も減少することもわかった。次に魚類-微細藻類間のガス交換を目的として再生循環型魚類飼育実験装置の実験を行い、その結果を基に本装置の小型実験装置の設計・製作を行った。再生循環型魚類飼育実験装置のガス交換実験ではクロレラおよびティラピアOreochromis niloticus幼魚を用いて実験を行い、2週間の生命維持に成功した。また、安定したティラピアへの酸素供給にはクロレラの増殖、すなわち、バイオマス生産量が一定以上であることが重要であり、クロレラの培養段階を多段階にすることでこの系を定常的に維持できることも実証した。次に本装置の実験結果を踏まえて小型実験装置の設計・製作を行った。小型実験装置は魚類飼育槽(約1.5L)、沈殿槽(約0.8L)、濾過槽(約0.8L)、気液混合槽(約0.5L)、動物プランクトン培養槽(約1L)、微細藻類培養槽(約2.5L)、配管類、循環水ポンプおよび送気ポンプからなり、総容積10L以下である。本年度は循環水および送気の物理的な性能を調査し、正常に動作することを確認した。また、本年度は装置の製作に期間を要したため、実際に本装置による生物を用いたガス交換生命維持実験を行うことが不可能であった。実験については来年度行う予定である。

今後は実際に装置の運用を行って生命維持の確認および物質循環を把握し、酸素および窒素、リン等の栄養塩の動態について調査する必要がある。また、魚類飼育の際に蓄積された堆積物の可溶化実験を行い、淡水魚および海水魚の排泄物中の窒素を過酸化水素およびマイクロウェーブ分解装置を用いることで70%程度回収することが出来た。
主要臓器における死後変化の組織学的検討ならびに死因との関連

ラット(雄)を頚椎脱臼又は失血により屠殺し,一定時間室温に放置した後,腎臓・肝臓・膵臓・心臓・骨格筋の各組織を摘出した。摘出した組織はパラフィン又はエポキシ樹脂包埋を行い,死後24時間までの組織学的変化を光学顕微鏡で観察した。また透過型電子顕微鏡を用いて超微形態学的変化についても検討を行った。1.頚椎脱臼群においてパラフィン包埋法とエポキシ樹脂包埋法を比較検討したところ,エポキシ樹脂包埋法は固定完了までの死後変化が最少限に抑えられることから,死後の組織学的変化を光学顕微鏡的に検討する目的に適していた。更に,死後24時間までの核クロマチンの凝集や細胞質内の空胞の出現等の経時的な差異が見られた。2.頚椎脱臼群および失血群における超微形態学的変化を比較したところ,死後変化は頚椎脱臼群に比べて失血群で遅延する傾向があった。すなわち,頚椎脱臼群では膵臓のアシナル細胞におけるミトコンドリア内の高電子密度無構造沈澱物は1時間後にすでに出現し,10時間後にはミトコンドリアの無構造化が著しかったのに対し,失血群では高電子密度無構造沈澱物は3時間後には殆ど見られず,10時間後にも一部のミトコンドリア内に見られるのみであった。また心筋細胞では頚椎脱臼群で3時間後に筋弛緩像を示し,10時間後に収縮像を示し,15時間後には弛緩像を示していたが,失血群では10時間後には収縮像と弛緩像が混在していた。これらの差異は,死後の体温降下が失血群で急速であったことが大きく影響したと考えられた。3.頚椎脱臼群における超微形態学的検討から,核クロマチンの凝集・ミトコンドリア内の高電子密度の無構造沈澱物の出現等,各組織における微細構造の変化を死後経過時間推定の指標の一つとして用いることが可能と考えられた。死後の組織学的変化に関する研究は臓器移植の視点からの報告は多いが,法医学的視点に立ったものはほとんど見られない。また,組織学的検索は法医実務上重要な位置を占めているが,光学顕微鏡的観察に通常用いられるホルマリン固定法は,その固定能力が低い為に固定完了までに死後変化が進むことが知られている。各種死因に特徴的な組織学的変化が死後変化によりいかに修飾されるかを明らかにするために,本年度はラットを頸椎脱臼にて屠殺し,その直後および室温放置1,3,5,10,15,24時間後に解剖し,腎臓・肝臓・膵臓・心臓・骨格筋・脳および肺臓を摘出し,ホルマリン固定後パラフィン包埋してHE染色した標本および,グルタールアルデヒド・四酸化オスミウム固定後エポキシ樹脂包埋してトルイジンブルー染色した標本について比較検討を行い,以下の結果を得た。1.パラフィン包埋法ではその固定能力が低いために,死後変化の指標となるミトコンドリアの膨化変性・核クロマチンの凝集等が組織固定中にも進行し,臓器によって多少の差はあるものの,死後5から10時間までの経過時間推定は難しいことが明らかとなった。2.エポキシ樹脂包埋法では死後変化の指標となるミトコンドリアの膨化変性・各クロマチンの凝集等が経時的変化として認められ,その出現時期が各臓器に特異的なことから,これらを組み合わせる事により早期の死後経過時間の指標の1つとして利用できるものと思われた。