hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラット炎症性大腸発癌モデルのβカテニン遺伝子変異とその病理組織学的形態への影響

本研究ではアゾキシメタンで誘発したラット大腸発癌モデルにおいて、大腸粘膜に生ずる変異陰窩巣(aberrant crypt foci;ACF)を指標とする520週間の短期および中期実験を行い、従来型のACFを検出するとともに、新規にβカテニン遺伝子変異を有する病巣について詳細な検討を行った。すなわち、ラット大腸粘膜はホルマリン固定後、メチレンブルー染色し、ACF総形成数を測定するとともに、パラフイン包埋標本を作製した。ACF部はマーキングして、粘膜に対して、水平方向からの薄切標本作製(H&E染色)を行い、βカテニンに対する免疫染色と細胞・形態学的異型度の検索を行った。また、同一材料より、レーザーによるLCM SYSTEM(オリンパス)を使用し、マーキングされたACF部および非ACF性の異型病変部をくり抜き、genomic DNA抽出を行い、βカテニン遺伝子のDNA配列について検討した。βカテニンの免疫染色では今まで検討されていた従来型のACFではβカテニンの核や細胞質への蓄積を示す陽性ははっきりしないものの、新規に見つけられた組織学的な異形成を有する病巣では陽性を示しており、βカテニン遺伝子変異を反映するものと考えられた。実際、ACF部では検討した20病変中3病変(15%)にβカテニン遺伝子エクソン3のコドン32と34に変異を見るに過ぎなかったが、非ACF性の異型病変では18病変の検索中13病変(72%)に同様にエクソン3のコドン32-41にかけて、点突然変異を伴っていた。加えて、核の極性および腺構造等を指標とする形態学的な異型度を検討した結果、形態的異型度は週令と共にこの新規βカテニン蓄積巣は異型度を増加するのに対し、従来のACFに異型度の増加は見られなかった。以上から、本研究で発見された新規のラット大腸粘膜異型病巣が、化学発癌における腫瘍性病変の芽であることが推定された。今年度、アゾキシメタンで誘発した大腸発癌モデルの実験系において、大腸粘膜に生ずる変異陰窩巣(aberrant crypt foci;ACF)を指標とする10週間の短期実験を行い型のごとくACFを検出し、βカテニン遺伝子変異を検討した。ラット大腸粘膜はホルマリン固定後、メチレンブルー染色し、ACF総形成数とそのACFを構成する変異陰窩巣を測定するとともに、パラフィン包理標本を作製した。特にACF部はマーキングして、粘膜に対して、垂直方向と水平方向の両方向からの薄切り標本(ヘマトキシリン・エオジン染色)を作製を行った。今回、水平方向に作製した標本から、従来、ACFと考えられている病変以外にも、組織学的に異型腺管病変を同定しうることを発見した。このため、これら病変から、LASER CAPTURE MICRODISSECTIONSYSTEM(オリンパス)を使用して、マーキングされたACF部および非ACF性の異型病変部をマイクロダイセクションし、genomicDNA抽出を行い、βカテニン遺伝子の増幅とそのDNA配列について検討した。ACF部では検討した20病変中3病変(15%)にβカテニン遺伝子エクソン3のコドン32と34に変異を見るに過ぎなかったが、非ACF性の異型病変では18病変の検索中13病変(72%)に同様のエクソン3のコドン32-41にかけて、点突然変異を伴い、ヒトで見られるセリン・スレオニン部にも多くの変異を認められた。

この頻度は既にラット大腸腫瘍で認められている(約60-80%)に一致し、この組織学的に同定される非ACF性の異型病変は、従来、前癌病変と考えられていたACF病変よりも腫瘍形成の芽としては重要に考えられた。現在、経時的観察や免疫組織学的検索を遂行中である。昨年度に続き、今年度もアゾキシメタンで誘発した大腸発癌モデルの実験系において、大腸粘膜に生ずる変異陰窩巣(aberrant crypt foci;ACF)を指標とする520週間の短期および中期実験を行い、従来型のACFを検出するとともに、昨年度に新規に検出したβカテニン遺伝子変異を有する病巣について詳細な検討を行った。すなわち、ラット大腸粘膜はホルマリン固定後、メチレンブルー染色し、ACF総形成数を測定するとともに、パラフイン包埋標本を作製した。特に昨年度と同様にACF部はマーキングして、粘膜に対して水平方向からの薄切標本作製(ヘマトキシリン・エオジン染色)を行うとともにβカテニンに対する免疫染色を行った。この水平方向の標本から見つけられた新規の病巣群に対し、細胞・形態学的異型度の検索を行った。今回、βカテニンの免疫染色では今まで検討されていた通常タイプのACFではβカテニンの核や細胞質への蓄積を示す陽性ははっきりしないものの、新規に見つけられた組織学的な異形成を有する病巣では陽性を示しており、βカテニン遺伝子変異を反映するものと考えられた。加えて、形態学的な異型度として核の極性や重層化および腺構造を検討した結果、形態的異型度は週令とともにこの新規βカテニン蓄積巣は異型度を増加するのに対し、従来のACFに異型度の増加は見られなかった。以上から、本研究で発見された新規のラット大腸粘膜異型病巣が、化学発癌における腫瘍性病変の芽であることが推定された。しかしながら、化学発癌剤の投与後、従来のACFが大腸粘膜全体で約100から200個見られるのに対し、この病巣は約半分程度でしか認められていないが、化学発癌剤での腫瘍の顕在化は通常1から2個であるため、今後、この病巣の顕在化に対する詳細な研究が必要である。
増殖因子レセプターによるシグナル伝達と複製開始の制御機構に関する共同研究

本年度は先ず染色体複製開始を制御するCdc7キナーゼ類似キナーゼの制御サブユニットの単離と機能解析をすすめた(Shlomai博士との共同研究)。その結果,1分裂酵母より、Cdc7-Dbf4キナーゼ複合体の機能的ホモログ(Hsk1-Him1)を単離し、両遺伝子とも分裂酵母の増殖に必須であり、染色体複製に要求されることが明らかとなった。2 him1+遺伝子の発現は細胞周期によりその発現は制御されて折G1後期からS期に最大になる。3 Himlタンパク質は、ヌクレオチドプールの枯渇によるS期停止のシグナルにより、過リン酸型になる。4動物細胞から、Cdd7類似キナーゼの制御サブユニット(H37)を単離しその機能解析を行った。その結果、H37タンパク質の機能がG1からS期への移行に必須であることが示された。また、動物細胞の染色体複製起点の活性化と転写活性化の共役機構を解析するためにヒト染色体5q上に存在するGM-CSF/IL3部位の全塩基配列を決定し、両遺伝子にはさまれる10kbの領域内に染色体複製起点が存在することを示唆するデータを得た(新井直子博士との共同研究)。また、GM-CSF受容体のシグナル伝達経路の解析をさらにすすめ、c-fos遺伝子発現活性化、MAPキナーゼカスケードの活性化、STAT5の活性化、DNA複製の誘導、アポプトーシス阻害等に必要な、受容体領域及びチロシン残基を同定した。また、DNA複製活性化に先立って誘導される種々のcDNAを単離しそのGM-CSF受容体によるシグナル伝達における機能解析を進めている。また、人為的にJak2キナーゼのニ量体化を誘導することにより、STAT5およびc-mycの活性化、さらに、サイトカイン非依存性の増殖が観察された。さらに、機能的なGM-CSF受容体を発現したトランスジェニックマウスに,ヒトGM-CSFを投与することにより、体内で、赤血球と巨核球の合成が誘導されることが明らかとなった。2ヒトNF-ATのアミノ酸配列に対応する3種のヒトcDNA(NF-ATp,c,x)とマウスNF-ATx cDNAを単離した。NF-ATxは新規の分子である。NF-ATxとc-fos/junの再構成によりIL-2遺伝子の転写は活性化される。更にThiとThzサブセット間ではNF-kBのp50/p65と(p50)2およびJunの存在状態に差異があることから、両者では、転写因子NF-kBとNF-AT/AP-1の活性化に至るシグナル伝達系に差異があることが強く示唆された。3 S期開始のマスタースイッチであると考えられている出芽酵母CDC7キナーゼのキナーゼ変異体を大量発現することにより、野性型出芽酵母の増殖は1CDNAで停止した。キナーゼ変異Cdc7はそのregulatory subunitであるDbf4を吸収することにより野性型Ccd7を不活化すると結論した。本年度は先ず染色体複製開始を制御するCdc7キナーゼ及びその類似キナーゼの機能の解析をすすめた(Shlomai博士との共同研究)。出芽酵母Cdc7キナーゼは、Dbf4と複合体を形成し、in vitroでCdc7、Dbf4およびDNApolαp180サブユニットをリン酸化する。Cdc7類似キナーゼをコードする全長cDNAをカエル、マウス、ヒトから単離した。

それらはそれぞれ574、531、483アミノ酸からなり、キナーゼ保存領域で出芽酵母Cdc7と約45%の同一性を示し、特徴的なキナーゼ挿入配列を有する。huCdc7は、核に存在し、その発現量は細胞周期で変動しない。一方、臓器においてはtestisにおける過剰発現と、C端領域を欠失した転写産物の存在が見い出された。種々の癌細胞系列でその発現を比較したが、これまでhuCdc7を異常発現したものは、見い出されていない。huCdc7は、in vitroでGST融合タンパク質として調製された、MCM2、MCM3およびMCM7タンパク質をリン酸化する。huCdc7遺伝子とmuCdc7はそれぞれ、ヒト1番染色体およびマウス5番染色体に存在する。muCdc7遺伝子は11個のイントロンからなる。動物細胞のCdc7類似キナーゼの発生分化あるいは、癌化における役割を理解するために現在ノックアウトマウスを作製している。また、染色体複製と転写活性化の共役機構を解析するために、ヒト5番染色体5q領域に着目し、IL-3/GM-CSFを含む20kbの塩基配列を決定し、現在competitive PCR法により、この領域に存在する複製起点の同定をすすめている(新井直子博士との共同研究)。また、GM-CSF受容体のシグナル伝達経路の解析をさらにすすめ、c-fos遺伝子発現活性化、MAPキナーゼカスケードの活性化、STAT5の活性化、DNA複製の誘導等に必要な、受容体領域及びチロシン残基を同定した。さらに、機能的なGM-CSF受容体を発現したトランスジェニックマウスの解析から、GM-CSFは、骨髄細胞の全ての細胞系列の増殖を誘導し、その分化経路については影響をあたえないが、胸腺細胞においては、特異的な細胞集団(DNとSP)の増殖を支持するが、DNからDPへの分化を時期特異的に阻害することを明らかにした(Yssell博士との共同研究)。このことは、胸腺細胞においては、分化の段階に応じて、細胞内のシグナル伝達装置の活性が修飾されることを示唆する。本年度は先ず染色体複製開始を制御するCdc7キナーゼ類似キナーゼの制御サブユニットの単離と機能解析をすすめた(Shlomai白紙との共同研究)。その結果、1分裂酵母より、Cdc7-Dbf4キナーゼ複合体の機能的ホモログ(Hsk1-Him1)を単離し、両遺伝子とも分裂酵母の増殖に必須であり、染色体複製に要求されることが明かとなった。2 him1+遺伝子の発現は細胞周期によりその発現を制御されておりG1後期からS期に最大になる。3 Him1タンパク質は、ヌクレオチドプールの枯渇によるS期停止のシグナルにより、過リン酸型になる。4動物細胞から、cDC類似キナ-エの制御サブユニット(H37)を単離しその機能解析を行った。その結果、H37タンパク質の機能がG1からS期への移行に必須でることが示された。また、動物細胞の染色体複製起点の活性化と転写活性化の共役機構を解析するためにヒト染色体5q上に存在するGM-CSF/IL3部位の全塩基配列を決定し、両遺伝子にはさまれる10kbの領域内に染色体複製起点が存在することを示唆するデータを得た(新井直子博士との共同研究)。
妊婦における睡眠呼吸障害の調査

研究目的閉塞型睡眠時無呼吸症候群(OSA)は,睡眠中に起こる上気道閉塞により低換気あるいは無呼吸となる疾患である。無呼吸発作による低酸素血症は高血圧,心血管疾患などの合併症を誘発する。近年,妊娠可能な年齢層の女性で肥満傾向がみられ,さらに妊娠経過中の生理的な体重増加はOSAを誘発する可能性を高めると考えられる。本研究では,妊婦の睡眠中の呼吸障害を評価するために,夜間睡眠中にパルスオキシメーターで低酸素状態を評価し,妊婦でのOSAの有病率を明らかにすることを目的とした。研究方法琉球大学医学部附属病院にて診療を受ける妊娠20週以降の妊婦を対象とし,パルスオキシメーターを用いて夜間睡眠中の連続した動脈血酸素飽和度(SpO2)を測定した。妊娠前後の睡眠の状況は自記式質問表により調査した。OSAの重症度は酸素飽和低下指数(3%ODI)を解析して評価し,OSAの有病率,妊娠週数,体重,肥満度指数(BMI)とODIとの関連を統計学的に解析した。研究成果と考察対象者とした20名の妊婦は,年齢32.7±5.4歳,妊娠週数29.1±45週(平均値±SD)であった。中央値(範囲)は,体重32.5(4295)kg,BMI 24.3(17.7385)kg/m2であった。ODIは軽度(5<3%ODI<10)が1名,正常(3%ODI 5未満)が19名であった。3%ODI値と妊娠週数や眠気指標との間に有意の相関は認められなかったが,SpO2測定時の体重,BMIとの間には正の相関(γ=0.52,p=0.019.γ=0.67,p=0.001)を認めた。3%ODIを基準とした場合,睡眠呼吸障害のあった妊婦は20名中1名のみで,今後,試験対象者と妊娠時期を考慮した検討が必要と考えられた。質問表の回答からは,妊娠中の睡眠の質の低下が明らかにみられたことから,妊娠の睡眠呼吸障害のさらなる検討が必要と考えた。
ABCトランスポーターの細胞内トラフィック機構の解明とその治療的応用

1.CFTR生合成および形質膜発現における分子シャペロンの機能解析生化学的または細胞生物学的手法を用いて検討した結果,小胞体分子シャペロンであるカルネキシンは未成熟なCFTRのユビキチン化および細胞質への逆輸送を抑制することにより,CFTRのフォールディングを促進することが明らかとなった(Okiyoneda T. et al.,Mol Biol Cell 15:563-74,2004).また,カルネキシンのホモログであるカルレティキュリンは形質膜に発現しているCFTRのエンドサイトーシスを促進し,細胞膜へのリサイクリングを抑制することにより,形質膜のCFTR発現量を負に制御していることを明らかにした(Harada K. and Okiyoneda T. et al. J Biol Chem 2006,in Press).2.CFTR変異体(ΔF508)の小胞体局在化におけるカルネキシンの機能解析様々な細胞生物学的検討の結果,カルネキシン過剰発現はCFTR変異体(ΔF508)の小胞体局在化を増強させた.本作用はΔF508の細胞質への逆輸送およびユビキチン化を抑制することにより,小胞体関連分解を抑制することに起因することを明らかにした(Okiyoneda T. et al.,Mol Biol Cell 15:563-74,2004).さらに,カルネキシン欠損細胞を用いた検討の結果,ΔF508の小胞体局在化にカルネキシンは必須ではないことを明らかにした(Okiyoneda T. et al.,投稿中).3.CFTRの細胞内輸送経路および成熟化機構の解析1.CFTR生合成および形質膜発現における分子シャペロンの機能解析生化学的または細胞生物学的手法を用いて検討した結果,小胞体分子シャペロンであるカルネキシンは未成熟なCFTRのユビキチン化および細胞質への逆輸送を抑制することにより,CFTRのフォールディングを促進することが明らかとなった(Okiyoneda T. et al.,Mol Biol Cell 15:563-74,2004).また,カルネキシンのホモログであるカルレティキュリンは形質膜に発現しているCFTRのエンドサイトーシスを促進し,細胞膜へのリサイクリングを抑制することにより,形質膜のCFTR発現量を負に制御していることを明らかにした(Harada K. and Okiyoneda T. et al. J Biol Chem 2006,in Press).2.CFTR変異体(ΔF508)の小胞体局在化におけるカルネキシンの機能解析様々な細胞生物学的検討の結果,カルネキシン過剰発現はCFTR変異体(ΔF508)の小胞体局在化を増強させた.本作用はΔF508の細胞質への逆輸送およびユビキチン化を抑制することにより,小胞体関連分解を抑制することに起因することを明らかにした(Okiyoneda T. et al.,Mol Biol Cell 15:563-74,2004).さらに,カルネキシン欠損細胞を用いた検討の結果,ΔF508の小胞体局在化にカルネキシンは必須ではないことを明らかにした(Okiyoneda T. et al.,投稿中).3.CFTRの細胞内輸送経路および成熟化機構の解析
ズリ応力誘発血小板凝集における細胞内二次伝達物質の検討

1.ズリ応力負荷時の血小板内カルシウムイオン濃度の変化2.少量エピネフリンの効果(1)高ズリ応力負荷時ズリ応力負荷に先立ち、血小板浮遊液に、終濃度が10ng/mlとなるように少量のエピネフリンを添加した。高ズリ応力負荷による血小板の凝集は添加前の49±10%から、エピネフリン添加後には70±7%に増加した。250±49nMであったズリ応力負荷後の細胞内カルシウムイオン濃度上昇も、エピネフリン添加後には404±134nMに増加した。ズリ応力による凝集、細胞内カルシウムイオン濃度変化ともにalpha2受容体阻害薬であるヨヒンビンにより用量依存性に抑制された。またvon Willebrand factor(vWF)と血小板膜糖蛋白GPIbの結合を抑制する抗体(nmc-4またはGVR20-5)により凝集、カルシウム濃度変化ともに完全に抑制された。(2)低ズリ応力負荷時エピネフリン添加前にはズリ応力負荷による凝集、細胞内カルシウムイオン濃度変化ともに認められなかったが、エピネフリン添加後には66±17%の血小板凝集を認めた。この際細胞内カルシウムイオン濃度も50±17nM上昇した。エピネフリン存在下の、低ズリ応力誘発血小板凝集、細胞内カルシウムイオン濃度変化ともにヨヒンビンにより用量依存性に抑制された。またvWFとGPIbの結合を抑制する抗体により、凝集、カルシウムイオン濃度変化ともにほぼ完全に抑制されたことから、エピネフリン存在下では、低ズリ応力負荷時にも、vWFとGPIbのinteractionにより仲介される血小板の活性化、血小板凝集が起こることが示唆された。エピネフリン刺激によりGPIbの高次構造が変化し、ズリ応力に対する感受性が高くなることがその原因と推論された(Goto S,et al.Am Heart J投稿中)。
光散乱に現れるゆらぎの量子性と古典性の研究

光散乱におけるストークス・反ストークス成分の強度比を精密に測定し、光散乱の基礎表式から期待されるボルツマン因子との精密な比較を行った。酸化チタン結晶のEgフォノンモードにおいて、散乱強度比がボルツマン因子からずれ、モードのピークにおける値に近づく傾向を示すという結果が得られた。このずれは、通常は現象論的に取り入れられる不可逆的な緩和過程を考慮することが、光散乱におけるスペクトル拡がりを考える上で本質的に重要であることを示している。本研究の目的は、量子論的な揺動散逸定理に基づく光散乱スペクトルの基礎表式の適用限界を実験的に明確にするとともに、適用できなくなる起源を明らかにすることである。散逸性の大きい緩和モードが現れる典型的な系を対象として、そのストークス散乱と反ストークス散乱の強度比を精密に測定し、光散乱の基礎表式から期待されるボルツマン因子との精密な比較を行い、この関係を満たさない振動数領域を明確にするとともに、ボルツマン因子からのずれの程度を定量化する。その結果から、光散乱スペクトルにおいて物質中のゆらぎが量子性を失い、古典的なゆらぎとして観測される起源を明らかにする。今年度は、まず、ゆらぎの起源が明確な系における散逸現象を調べるために、酸化チタン(TiO_2)結晶のフォノンラマン散乱スペクトルの測定を行い、そのストークス・反ストークス散乱強度比(I_s/I_<AS>)を詳細に解析した。その結果、200Kにおいて、フォノンの中心振動数ω=450cm^<-1>付近で強度比l_s/I_<AS>がボルツマン因子からずれて、ローレンツ型のスペクトルで期待される値に近づく傾向を示すことが明らかとなった。一方300Kにおいては、ω=150から450cm^<-1>の広い領域でボルツマン因子より数%程度小さい値を示すことが分かった。ラマン散乱スペクトルと量子論的揺動散逸定理とが対応する限り、強度比I_S/I_ASはボルツマン因子と一致することが期待される。今後、温度変化の詳細な解析を行い、ボルツマン因子からのずれとフォノンの非調和性や緩和現象との関連を明らかにする。散逸過程との関係を探るために、スペクトル拡がりの大きいモードをもつ系を対象としてストークス散乱と反ストークス散乱の強度比を精密に測定し、光散乱の基礎表式から期待されるボルツマン因子との精密な比較を行う。今年度は、比較的広いスペクトル拡がりをもつ酸化チタン結晶におけるフォノンラマン散乱(Egモード)について、その温度依存性に関する詳細な測定を行い、ストークス・反ストークス散乱強度比を解析した。その結果、約150Kから250K程度までの温度において、モードの中心振動数から半値幅程度の周波数領域で、強度比が各振動数におけるボルツマン因子からずれ、モードの中心振動数におけるボルツマン因子の値に近づくことが明らかとなった。そのずれの大きさは最大で約5パーセントであった。フォノンモードのスペクトル拡がりの起源によらず、光散乱が系の定常状態間の遷移に対応し、時間反転対称性と系のカノニカル分布が成り立つならば、強度比とボルツマン因子との関係は常に満足されるはずである。今回観測されたボルツマン因子からのずれは、通常は現象論的に(単に近似として)取り入れられる不可逆的な緩和過程を考慮することが、光散乱のスペクトル拡がりを考える上で本質的に重要であることを示している。そのために、拡がりの大きいモードをもつ系を対象としてストークス散乱と反ストークス散乱の強度比を精密に測定し、光散乱の基礎表式から期待されるボルツマン因子との精密な比較を行った。これまでに、液体の緩和モード、KDP結晶の分極緩和モード、酸化チタン結晶のEgフォノンモードのラマン散乱スペクトルにおいて、ストークス・反ストークス散乱比がボルツマン因子からずれ、モードのピークにおける値に近づく傾向を示すという結果が得られた。これらの観測されたボルツマン因子からのずれは、定常状態に対するカノニカル分布を基礎におく光散乱の理論からは説明することができず、通常考慮されていない緩和過程の重要性を示している。系のコヒーレンスに不可逆な緩和が起こるとすると(位相緩和時間τc)、エネルギーに不確定さ△E=h/τcが生じるため、この範囲内では各エネルギー値Eに対してカノニカル分布を適用することはできない。その結果、強度比が△Eの範囲内でボルツマン因子からずれ、一定の値をとることが期待される。

光散乱のスペクトル形状の解析において、位相や分布数の不可逆な緩和を取り入れる場合、それは近似的解析であると通常は理解されている。しかし、観測された強度比のボルツマン因子からのずれは、不可逆な緩和過程を考慮することが、近似としてではなく、本質的に重要であることを示している。今後、この不可逆な緩和過程の本質を明らかとすることが課題である。
心筋興奮収縮連関における小胞体Ca放出機構の薬理学的再検討

心筋の興奮収縮連関は、興奮時の細胞外からの流入Ca^<[2+]>が小胞体のCa^<[2+]>放出チャネルを開口し、その結果の小胞体からの放出Ca^<[2+]>が収縮を惹起すると考えられている。しかし、小胞体のCa^<[2+]>によるCa^<[2+]>放出(CICR)抑制する薬物が必ずしも心筋の興奮収縮連関を抑制しないという予備的結果が得られていたので、本研究で詳しく検討した。本研究により得られた新たな知見は以下の通りである。(1)アデニンは心筋においても骨格筋同様ATP存在下に小胞体のCICRを抑制する。(2)充分量のアデニン存在下においても、心筋の電気刺激による収縮は全く抑制を受けず、むしろ増大する。(3)電気刺激による収縮時の細胞内Ca^<[2+]>濃度の一過性増加(Ca^<[2+]> transient)に対するアデニンの効果は二相性で、適応直後には減少し、その後時間とともにゆっくりと増大した。アデニンを洗滌したときには、逆に洗滌開始直後にCa^<[2+]> transientは増大し、時間とともに徐々に減少した。(4)CICRを抑制するプロカインは、心筋の脱分極による収縮(K収縮)を抑制する。上記(1),(2)は、心筋の興奮収縮関連がCICRを介するという一般的な考えと一見矛盾するが、(3)のアデニン適用、洗滌直後の結果は、やはり心筋興奮収縮連関はCICRを介することを示している。アデニンにはCICR抑制作用の他に、小胞体Ca^<[2+]>ポンプ抑制作用((3)の緩徐な効果)及び収縮蛋白系のCa^<[2+]>感受性を増大させる作用があるので、これらが重なってCICR抑制による収縮抑制作用が覆い隠されて、(1),(2)の一見矛盾と見える結果が得られたものと結論される。(4)の結果はこれを支持する。以上、心筋興奮収縮連関はやはりCICRを介すると考えて矛盾はないことが分かった。心筋の興奮収縮連関は、興奮時の細胞外からの流入Ca^<2+>が小胞体のCa^<2+>放出チャネルを開口し、その結果小胞体から放出されるCa^<2+>が収縮を惹起すると一般的に考えられている。そうであれば、小胞体のCa^<2+>によるCa^<2+>放出(CICR)の抑制薬は心筋の興奮収縮連関を抑制するはずなので、本研究ではその点を検討することを目的とした。まず、アデニンがATP存在下の骨格筋小胞体のCICR抑制薬として作用することを以前我々は示したが、心筋でも同様であることを確認した。すなわち、アデニンは0.1mM以上で、ラット心室乳頭筋skinnedfiberの小胞体においても、それ自身ではCICRを促進したが、同種の促進作用をずっと強力に有するATPの存在下ではアデニンを共存させるとCICRはむしろ抑制された。ATPの強い促進作用がアデニンの弱い促進作用で置き換えられるためと解釈される。

上記の事実から、ATPを含有する生きた心筋細胞においてはアデニンはCICR抑制薬として作用するはずである。これを確かめるために、生きたラット心室乳頭筋においては、アデニンはCICR促進薬であるカフェインの作用に拮抗するかどうかを調べた。カフェインは約0.5mM以上で心筋の電気刺激による収縮を増大させ、5mM以上の高濃度では拘縮を起こすが、それらの効果はいずれもアデニンによって濃度依存的に抑制された。依存して抑制される。したがって、確かにアデニンはCICRを抑制していると考えられる。しかし生きた心筋のCICRを強く抑制する10mMアデニン存在下においても、ラット心室乳頭筋の電気刺激による正常な収縮は全く抑制を受けず、むしろ収縮は増大した。この結果が、心筋の生理的な興奮収縮連関はCICRを介するものであるという一般的な考えとどう折り合いがつけられるのか、さらに検討する予定である。心筋の興奮収縮連関は、興奮時の細胞外からの流入Ca^<2+>が小胞体のCa^<2+>放出チャネルを開口し、その結果小胞体から放出されるCa^<2+>が収縮を惹起すると一般的に考えられている。しかし、小胞体のCa^<2+>によるCa^<2+>放出(CICR)の抑制薬は必ずしも心筋の興奮収縮連関を抑制しない結果が得られているので、本研究でその点を検討した。昨年度我々は、アデニンがラット心筋においてATP存在下に小胞体のCICRを抑制することを確認したが、他方、10mMアデニン存在下においても、ラット心筋の電気刺激による正常な収縮は全く抑制を受けず、むしろ収縮は増大し、心筋の生理的な興奮収縮連関がCICRを介するものであるという一般的な考えと矛盾する結果を得た。本年度は、この矛盾点を解明するため、電気刺激による収縮時の細胞内Ca^<2+>濃度の一過性の増加の程度(Ca^<2+> transient)を、山形大学医学部薬理学教室の遠藤政夫教授の協力を得て、aequorinを用いて測定し、それに対するアデニンの効果を調べた。その結果、アデニンのCa^<2+>transientに対する作用は二相性で、適用直後には減少効果を示し、その後時間とともにゆっくりと増大した。アデニンを洗滌により除去したときには、逆に洗滌開始直後にCa^<2+> transientは増大し、時間とともに徐々に減少した。アデニン適用、洗滌直後の変化は、心筋興奮収縮連関はCICRを介しているという解釈に合致している。他方、アデニンのゆっくりした作用は、すでに我々が報告したアデニンの小胞体Ca^<2+>ポンプ抑制作用の結果と考えられる。アデニンはもう一つの作用として収縮蛋白系のCa^<2+>感受性を増大させるので、この効果が重なって、アデニンの適用または洗滌直後の速いCa^<2+>transient変化時には、収縮は必ずしもそれに対応した変化をせず、CICR抑制作用が一見覆い隠されて見えたものと考えられることが明らかになった。
イチョウイモのムカゴと新芋の発達に関する研究

本実験では,培養系で試験するための基礎的知見を得るため,昨年までの結果より,ムカゴの発育を促進するウニコナゾールと,新芋の発育を促進するジベレリンの効果の再確認を行った.さらに,塊茎形成に作用すると言われているジャスモン酸がジベレリンとの混合処理によって,相乗効果が報告されているので,ジャスモン酸の単独処理と,ジベレリンとの混合処理を行った.1.主枝の発育ジベレリン(GA)処理区、ウニコナゾール(Uni)処理区,ジャスモン酸誘導体(PDJ)処理区,およびPDJ+GAとも,対照区を比較して,著しく主枝の伸長を促進する効果は認められなかったが,Uniによって,主枝の伸長は著しく抑制された.主枝の葉数に関しては,いずれの処理区とも,大きな差は認められなかった.2.ムカゴと新芋の発育8月5日,9月26日,および主枝の枯れ上がり後の3回掘り取り調査を行った.新芋の発育は,いずれの掘り取り時期においても,GA処理区が大きく,Uni区では最も小さかった,PDJ処理区は新芋の発育を促進せず,GAとの組み合わせによっても,相乗効果は認められなかった.ムカゴの発育は,新芋の発育とは逆にUni処理によって著しく促進され,GA処理によってほとんど認められなかった.PDJは単独,GA混合処理によっても,ムカゴの発育を促進しなかった.以上の結果より,ジベレリンが新芋の発育を促進し,ムカゴの発育を抑制すること,ウニコナゾールは新芋の発育を抑制し,ムカゴの発育を促進すること,PDJは単独,混合処理区とも,ムカゴと新芋の発育を促進しないことが明らかになった.本研究は,イチョウイモの新芋とムカゴの発育に関する研究を行った.特に本年度は培養に応用するための基礎的知見として,植物成長調整物質と日長の組み合わせ処理を行って,新芋とムカゴの発育に及ぼす影響を調べた.植物成長調整物質として,対照区(展着剤を含む蒸留水)ジベレリンA_3(100ppmと200ppm),ウニコナゾールP(25ppm),サリチル酸(1000ppm),n-propyl dihydrojasmonate(PDJ:ジャスモン酸誘導体,5ppmと50ppm)の7区と,8時間日長と24時間日長の2区を組み合わせた合計14処理区を設けた.新芋とムカゴの発育はこれまでの報告と同様に8時間日長区で促進され,24時間日長区て抑制されたが,ジベレリンA_3とウニコナゾールPもまた特異的に反応し,ジベレリンA_3は漣度による大きな差はなく,ムカゴの発育を著しく抑制したが,新芋の発育は促進した.逆にウニコナゾールPはムカゴの発育を著しく促進するものの,新芋の発育を抑制した.ジベレリニA_3による新芋の発育とウニコナゾールPによるムカゴの発育はそれぞれ,8時間日長と24時間日長によって強められる傾向が認められた.サリチル酸とPDJに関しては顕著な傾向が認められなかった.今後この知見を利用して,培地の組成にジベレリンA_3もしくはウニコナゾールPの添加することや外植体の育成期にジベレリンA_3もしくはウニコナゾールPを前処理することで,新芋とムカゴの発育を培養系で効率良く制御出来るかを検討したいと考えている.本実験では,培養系で試験するための基礎的知見を得るため,昨年までの結果より,ムカゴの発育を促進するウニコナゾールと,新芋の発育を促進するジベレリンの効果の再確認を行った.さらに,塊茎形成に作用すると言われているジャスモン酸がジベレリンとの混合処理によって,相乗効果が報告されているので,ジャスモン酸の単独処理と,ジベレリンとの混合処理を行った.1.主枝の発育ジベレリン(GA)処理区、ウニコナゾール(Uni)処理区,ジャスモン酸誘導体(PDJ)処理区,およびPDJ+GAとも,対照区を比較して,著しく主枝の伸長を促進する効果は認められなかったが,Uniによって,主枝の伸長は著しく抑制された.主枝の葉数に関しては,いずれの処理区とも,大きな差は認められなかった.2.ムカゴと新芋の発育8月5日,9月26日,および主枝の枯れ上がり後の3回掘り取り調査を行った.新芋の発育は,いずれの掘り取り時期においても,GA処理区が大きく,Uni区では最も小さかった,PDJ処理区は新芋の発育を促進せず,GAとの組み合わせによっても,相乗効果は認められなかった.ムカゴの発育は,新芋の発育とは逆にUni処理によって著しく促進され,GA処理によってほとんど認められなかった.PDJは単独,GA混合処理によっても,ムカゴの発育を促進しなかった.以上の結果より,ジベレリンが新芋の発育を促進し,ムカゴの発育を抑制すること,ウニコナゾールは新芋の発育を抑制し,ムカゴの発育を促進すること,PDJは単独,混合処理区とも,ムカゴと新芋の発育を促進しないことが明らかになった.
嗅覚連合学習を支える神経回路機能同定のためのキノコ体細胞集団活動解析

ショウジョウバエの嗅覚関連学習をなす神経回路を同定するために、学習が行なわれている最中の脳の神経活動を蛍光カルシウムセンサーで記録し、記憶に必要な神経細胞の同定を目的とした。約2000個のキノコ体細胞のうち、CREB活性化神経細胞(CRE-p細胞)に注目した。1)CRE-p細胞へ入力するドーパミン神経の応答パターン記録・解析、2)CRE-p細胞から出力する神経MBONsの応答パターン記録・解析、3)2)の出力神経のうち、2つの神経においてトレーニング依存的な可塑的なカルシウム応答を確認した、4)2つの出力神経のは、忌避学習後にそれぞれ応答性の増強と減少という相反する可塑性を示すことを確認した学習・記憶のメカニズムを知るためには、どの神経細胞が記憶の形成・維持・読み出しに関わるかを知ることが不可欠である。記憶獲得の前後では条件付けに使われた刺激に対する応答が特定の神経細胞で変化することが予想され、それらが学習・記憶に必要な神経細胞の有力候補となる。学習が行われている最中の脳の神経活動をモニターし、その解析から匂い「学習・記憶細胞」を同定することを主な目的としている。本年度は、比較的短い時間で起こる学習初期(短期記憶)に関わる神経細胞群の同定を試みた。ショウジョウバエの嗅覚関連学習においてキノコ体の入出力に関わる神経群が重要だと言われていたが、学習によってそれらの可塑性を生理学的に示すことが課題であった。そのため顕微鏡下で学習を行わせながら、キノコ体の出力神経群のカルシウムイメージングを行った。約2000のキノコ体神経から30個の出力神経へ接続しているうち、そのうち少なくとも1つの神経において学習前後において条件付けされた匂い刺激への応答が変化することを確認できた。条件付けしていない匂い刺激では変化が見られないこと、異なる匂いを用いても同様の変化が見られることから、この可塑性は条件付け特異的なものだと考えられる。興味深いことに可塑性の増減が、報酬学習と嫌悪学習とで逆になることがわかった。これは最近、イギリスの研究グループからの報告と同様の傾向があった。報酬・嫌悪学習それぞれに独自の機構を備えるのではなく、キノコ体からの出力の総体としてある一定の価値を線形的に抽出していることを示唆している。今後は(1)その他の出力神経の可塑性の確認、(2)条件刺激入力と可塑性の度合いを比較することによって学習効率の定量化を試みていきたい。学習記憶のメカニズムを知るためには脳のどの細胞が記憶の形成・維持・読み出しに関わるかを知ることが不可欠である。本研究では学習が行われている最中の個体の脳の神経集団活動をライブでモニターし、記憶細胞を同定することを目的とした。長期記憶の中心的役割を担う転写因子CREB活性細胞との関連について解析することで、短期記憶から安定した長期記憶を形成する遷移を、生理学的な解析を行った。(1)嗅覚記憶中枢での報酬刺激・忌避刺激に対する応答これまで学習初期フェーズにおこる神経活動変化として、キノコ体垂直出力部(α/α' lobe)での条件刺激に対するCa応答上昇が挙げられていた。報酬・忌避情報の入力がドーパミン神経を介してキノコ体へ入力している部位は、別の部位(γ/β/β')にも及んでいることが、行動実験による先行研究で明らかになっていた。本研究のライブイメージングの結果、忌避情報である電気ショックがキノコ体へ入力される部位を比較した。結果、キノコ体には電気ショックに対する応答性が異なるグループが存在し、それぞれ異なるダイナミクスで応答していることが明らかになった。これは、電気ショックの情報がキノコ体において、複数回異なる神経を通して処理されていることを示唆する。それぞれのグループの発火ピーク間の時間は少なくとも数百1ミリ秒あることから、キノコ体へ入出力を繰り返す情報の「リカレント」があることを示唆する。(2)電気ショックに対する応答性によってキノコ体の神経群をグループ分けすると、CREB陽性・陰性神経と関連性があることがわかった。CREB陽性神経を得意的に標識する系統は、当研究室によって作成されたものを用いた。現在は、電気ショック情報のCREB陽性・陰性神経への入力経路、また出力経路をカルシウムイメージングによって、解析を行っているところである。1)CRE-p細胞へ入力するドーパミン神経の応答パターン記録・解析、2)CRE-p細胞から出力する神経MBONsの応答パターン記録・解析、3)2)の出力神経のうち、2つの神経においてトレーニング依存的な可塑的なカルシウム応答を確認した、4)2つの出力神経のは、忌避学習後にそれぞれ応答性の増強と減少という相反する可塑性を示すことを確認した短期記憶に関わる神経細胞群の同定に関して、条件付け特異的な可塑性を示す神経細胞を少なくとも1種類確認することができた。顕微鏡下でカルシウムイメージングを行いながら学習させる実験系を確立できたことが重要な結果となる。一方で、キノコ体自身の可塑性の有無は完了していないため、匂い入力から可塑性の定量的解析は喫緊の課題である。蛍光波長の異なる2種類のカルシウムセンサーをキノコ体神経とその出力神経それぞれに発言させ、可塑性を観察する実験は現在進行中で、データを貯めている過程である。神経生物学キノコ体

出力神経の可塑性の程度による入力刺激による学習効率の定量化を試みる。匂い刺激に対するカルシウム応答は個体ごとに大きく異なるため、定量化には解析上の工夫が必要になってくると予想される。数学的なモデルを仮定することによって多変量解析を効率的に行えないか共同研究を含めて検索中である。また今回以外のキノコ体出力神経の学習による可塑性の有無はまだ完了していないので、引き続き短期学習に関わる神経細胞を探索する。現在、神経のカルシウム応答の増減を指標として生理学的な解析を行っているが、学習に関わる変化を分子レベルでも調べるために、長期記憶形成に重要とされているCREBタンパクを手掛かりに実験を行っていく予定である。当研究室で作成されたCREB応答性神経を可視化できる系統を用い、短期記憶から長期記憶への記憶の遷移(固定化)回路を同定する。基金の一部の範囲内で研究を遂行したたため。CREB応答性神経と平成26年度で同定した短期記憶神経の回路関係を明らかにするために、26年度の経費と合わせて、様々な変異系統の作成、維持、増殖に用いる試薬、培地を購入する。また、これらの分子生物学、神経生物学研究用試薬、実験器具を購入する。
軽度認知低下の早期発見にむけた簡易生化学マーカーの開発

【目的】高齢者の軽度認知機能低下を早期に発見するための再現性、客観性に優れた生化学マーカーが求められている。本研究では脳に豊富に含まれる血清プラスマローゲン(Pls)と尿ミオイノシトール(MI)に着目した。前者はグリセロリン脂質のサブクラスの一つであり、後者は糖アルコールの一種でありPlsを主要構成脂質とするミエリン形成に深く関わると推測される。本研究の目的は、この2つの物質を用いて地域保健医療の現場において認知機能が低下した高齢者をスクリーニングするための簡便かつ侵襲性の低い生化学的検査を開発することである。【方法】東京都健康長寿医療センターもの忘れ外来等の受診中の患者56人と地域在宅の研究協力ボランティア(健常高齢者)68人を対象にCDR(Clinical Dementia Rating)を用いて重症度判定した。CDR0.5群24人、CDR1群17人、CDR2群4人、CDR0群(健常者)55人を対象にコリン型(CP)とエタノールアミン型(EP)血清Plsの分別定量を行なった。また,空腹時二番尿を検体として尿MIを測定した。解析は年齢と教育年数を共変量として分散分析を行った。【結果】EPはCDR02群で順に69.3±2.2μM、62.2±3.1μM、52.0±3.9μM、44.2±7.9μMであり、CDR0群と1群、2群間で有意差が見られた。同様にMini-Mental State Examination(MMSE)により分類すると高得点群(28点以上:68人)、中得点群(24-27点:23人)、低得点群(23点以下:23人)で順に67.1±2.0μM、57.1±3.3μM、54.1±3.7μMであり、高得点群と中および低得点群間に有意差が見られた。一方、CPおよび尿MIについてはCDR、MMSEいずれの群間でも有意差は見られなかった。【結論】PlsのEPは健常高齢者から軽度認知症高齢者をスクリーニングできる可能性が示唆された。
除去修復エンドヌクレアーゼ機能とその欠損による原子病態の生化学的解析

XPGとXPE-ERCC1タンパクは、ヌクレオチド除去修復(NER)機構においてそれぞれ3′,5′切断酵素として働くが、本来はバブルやループなどの特殊なDNA構造を基質とするエンドヌクレアーゼである。これらの遺伝子(XPGあるいはERCC1)を欠損したマウスはいづれも成長阻害を示し、離乳前にすべて死亡する。本研究では、この両エンドヌクレアーゼのNER機構以外での機能に着目し、その本体を明らかにすることを目的とした。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。1.バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いてXPGタンパクを高発現させ、3種のカラムステップにより精製した。様々なDNA基質を用いて切断活性を調べたところ、1-3ntのバブル(塩基ミスマッチ)型DNA基質に対しても切断活性を示すことが明らかとなった。また、3ntのループ(IDミスマッチ)型DNA基質に対する切断活性も認められ、酵素活性的にはDNA中に生じたミスマッチ部分に対してXPGが働き得る可能性が示唆された。2.放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス胎児由来細胞を継代培養したところ、最初は正常あるいはヘテロ細胞より増殖率が低かったものの、途中から急激に増殖率が上昇し、正常やヘテロ由来細胞よりも早く株化した。4継代ごとに細胞よりDNAを抽出して、マイクロサテライト解析を行ったところ、調べた8種類のプライマーのうち2種類で継代に伴ったバンドパターンの変化が観察された。3.酵母のTwo-hybridシステムを用いてXPGタンパクと相互作用する可能性のある4つのクローンを分離した。現在、塩基配列の決定、ならびに各相互作用についてのin vitroでの確認を行っている。4.MBP-XPG、あるいはMBP-ERCC1を抗原としてマウスに免疫を行い、これまでにXPGタンパクに対するモノクローナル抗体を4種類樹立した。
「子育ての社会化」による公私領域と親役割の再編―ひろば型・預かり型支援に着目して

平成29年度は、前年度に乳幼児の保護者を対象に実施した質問紙調査のデータから、地域子育て支援拠点事業などの「ひろば型支援」と一時預かり事業などの「預かり型支援」の利用者と非利用者の特徴を分析し、これらの子育て支援の利用状況が、乳幼児の母親の属性や育児ネットワーク、規範意識等とどのように関連しているか考察した。「ひろば型支援」については、分析対象者を支援の利用状況別に5つのグループに分け、クロス集計や対応分析で各グループの特徴を比較した。その結果、母親の就労状況に加えて学歴や世帯所得と、育児ネットワークの種類及びフォーマルな育児資源の利用状況との関連が示され、「ひろば型支援」の利用者と非利用者の社会階層的差異が明らかになった。「預かり型支援」については、特に母親規範意識との関連に注目しながら、一時保育の利用経験の規定要因をロジスティック回帰分析等により検討した。その結果、親族サポートの状況、育児ストレス、世帯所得、母親規範意識といった変数で有意な効果が示された。また、「子育ての社会化」施策として「専業母」も利用できる一時保育制度の拡充が図られている中で、本分析結果からは、「三歳児神話」を支持する意識は現在も母親たちの間で根強い一方、親の都合で子どもを預けることを肯定する意識も広くみられるという母親規範意識の複層性が明らかになった。以上の内容は、国内外で開催された学会・研究集会での研究発表、学術雑誌の査読論文(2本)のほか、調査報告書としてもまとめ、研究成果を公表した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、日本における「子育ての社会化」施策の拡充が、乳幼児ケアの実態や子育てをめぐる親の規範意識等に与える影響を明らかにすることにある。平成28年度は、地域子育て支援拠点事業などの「ひろば型支援」と一時預かり事業などの「預かり型支援」に着目し、これらの支援の利用状況が、主に母親の育児ネットワークや規範意識等とどのように関連しているかを検討するため、A市において乳幼児の保護者を対象とした質問紙調査とインタビュー調査を実施した。質問紙調査は、平成28年9月11月の期間に、A市内10ヶ所の保健センターを計20回訪問し、乳幼児健康診査のために来館した保護者を対象に実施した。835票の調査票を配布し、同12月末時点で522票を回収した。調査項目は、ひろば型支援および預かり型支援の利用経験や支援に対する評価、育児ネットワークや配偶者・親族等の育児関与の状況、自身の子育てに対する評価や認識、親役割や子育て支援の利用に対する規範意識、対象者の属性等に関する項目を設定した。また質問紙調査の回答者の中から承諾を得られた保護者を対象に、特に母親役割や子育て支援の利用をめぐる規範意識について掘り下げる半構造化インタビュー調査を計画し、平成29年3月末時点で5名を対象に実施した。本研究は、近年の日本における「子育ての社会化」施策の具体的制度に着目し、「子育ての社会化」は子育ての実態・規範レベルではどのように進展しているのか、子育て支援の利用者と非利用者の双方を対象とした質的・量的調査から検討している点に特色がある。数百人規模で実施した質問紙調査からは、現行の子育て支援制度の課題把握にとっても重要なデータが収集できた。今後は、質問紙調査の結果を統計的・計量的手法により分析するとともに、引き続きインタビュー調査によるデータ収集も進め、研究課題に関する詳細な考察・検討を行っていきたい。平成28年度は、乳幼児の保護者を対象とした質問紙調査およびインタビュー調査の実施、また国内外の研究集会での研究報告と論文執筆など、概ね研究実施計画に記載した通りの進捗があった。特に質問紙調査の実施にあたっては、行政機関の協力を得て、乳幼児の保護者を対象に数百人規模の調査を行うことができ、調査課題であった子育て支援の利用者と非利用者の比較分析が可能なデータを収集することができた。また、年度末には当該調査の単純集計結果報告書を作成し、関連機関に対して調査結果の中間報告を行った。上記の調査活動と並行して、日本における近年の子育て支援の政策動向やひろば型支援の利用状況に関する研究内容を、7月にオーストリアで開催された国際社会学会の研究集会にて英語で発表し、その内容を英語論文にまとめて機関誌へ投稿した。また、子育て支援関連の研究集会で、預かり型支援の歴史的発展に関する研究成果の報告を行った。その他、日本国内で開催された社会学の研究集会に参加し、研究テーマに関連する情報収集を行うとともに、国公立図書館や大学図書館、子育て・女性関連の情報機関等において文献・資料の収集を行った。以上のように行政機関からの協力も得て当初の予定よりも大規模な調査が可能になったことや国際学会での研究発表と英語論文の執筆ができたことは大きな進展であった。一方で調査の大規模化により必要な準備や手続きが増え、調査の実施時期が予定よりも遅れたことや、質問紙調査の集計作業や報告書の修正作業に想定より時間がかかり、インタビュー調査の実施スケジュールに影響がでたことを鑑みて、評価区分は(1)ではなく(2)とした。

「ひろば型支援」については、分析対象者を支援の利用状況別に5つのグループに分け、クロス集計や対応分析で各グループの特徴を比較した。その結果、母親の就労状況に加えて学歴や世帯所得と、育児ネットワークの種類及びフォーマルな育児資源の利用状況との関連が示され、「ひろば型支援」の利用者と非利用者の社会階層的差異が明らかになった。「預かり型支援」については、特に母親規範意識との関連に注目しながら、一時保育の利用経験の規定要因をロジスティック回帰分析等により検討した。その結果、親族サポートの状況、育児ストレス、世帯所得、母親規範意識といった変数で有意な効果が示された。また、「子育ての社会化」施策として「専業母」も利用できる一時保育制度の拡充が図られている中で、本分析結果からは、「三歳児神話」を支持する意識は現在も母親たちの間で根強い一方、親の都合で子どもを預けることを肯定する意識も広くみられるという母親規範意識の複層性が明らかになった。以上の内容は、国内外で開催された学会・研究集会での研究発表、学術雑誌の査読論文(2本)のほか、調査報告書としてもまとめ、研究成果を公表した。平成29年度も引き続き、質問紙調査のデータ分析、インタビュー調査の実施とデータの入力・分析、学会や研究集会での成果報告、学会誌への投稿や調査報告書の作成等に取り組む予定である。平成28年度に実施した質問紙調査のデータの入力と集計作業は、一通り完了している。したがって今後は、このデータを統計的・計量的な手法によりさらに詳細に分析し、子育て支援の利用者と非利用者の特徴の比較や、支援の利用意識と子育ての実態・規範意識との関連等について考察を進める。インタビュー調査については、まだ分析データが不十分であるため、平成29年度も引き続き調査の実施とデータ収集に取り組んでいきたい。なお、インタビューの録音データは対象者一人あたり2時間以上の長さがあるため、テープ起こし作業にはその数倍の時間を要する。したがって、今後は調査対象者の承諾を得た上で、可能な部分についてはテープ起こし作業を調査協力者などと分担し、データ入力作業のスピードアップを図り、インタビューの実施やデータの分析により注力していきたいと考えている。以上の調査結果をふまえて、平成29年度は研究課題を中心テーマに博士論文の執筆に取り組みたい。また、国内学会と国際学会での研究報告という形で積極的に研究成果の発表に取り組むとともに、投稿論文や最終調査報告書等の形でも成果公表を行っていきたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
残響下で高齢者や非母語話者に明瞭な録音音声・肉声による拡声音声の調査

雑音下で発話の特性が変化することを応用し、駅など残響がある公共空間で高齢者や非母語話者に聞きやすい音声案内の作成を目的とした。若年者と高齢者に対する聴取実験の結果、白色雑音/残響を聞きながら発話した音声は、静かな環境で発話した音声(現在の音声案内)よりも、雑音/残響下(信号対雑音比=-2, 0 dB、残響時間1.43.6 s)で明瞭度が有意に上昇した。これらの音声を公共空間に拡声することで明瞭な音声案内を提供し、「音声によるバリアフリー」を実現できる可能性を示した。本研究の最終目的は、駅などの公共空間で雑音や残響の影響を受けにくい音声案内を拡声することで、高齢者や非母語話者などの利用者が音声案内を聞きやすくする「音声によるバリアフリー」の実現である。本研究では、人が発話をする際に周囲の音環境によって発話方法やその明瞭度が変化する現象を応用し、公共空間の音声案内の多くで使われる静かな環境で録音した音声を拡声する方法(発話時と案内を聞く音環境が異なる)よりも、公共空間に存在する雑音や残響下で発話された音声を拡声する方法(発話時と案内を聞く音環境が同じ)の方が、音声案内が聞きやすくなる可能性を提案する。今年度は、上記の両方法において、発話をする環境と利用者が聞き取る環境を模擬し、発話側として音声の録音と音響分析、聞き取り側として若年者に対する聴取実験を以下のように行った。1)発話:静かな環境での発話、雑音/残響音をヘッドホンから聞きながらの発話を6名分録音した。録音音声の音響分析の結果から、ピッチやフォルマントなどの周波数情報、単語の長さなどの時間情報、子音対母音のインテンシティ比などの振幅情報が、雑音/残響下の発話の方が静かな場所での発話と比べて変化した(振幅情報以外は増加)。2)聞き取り:上記の録音音声に雑音/残響を加えた音声を用い、若年者32名に対して聴取実験を行った。その結果、雑音や残響下の発話の方が、静かな環境での発話よりも単語の正解率が上昇した(雑音下で約12%、残響下で約15%上昇)。以上より、音声案内を拡声する空間の雑音や残響を聞きながら発話をした方が、空間の情報が与えられない場合よりも音声明瞭度が上昇することが示された。またその明瞭度の増加は、周波数・時間・振幅の特徴が雑音/残響下で変化する事と相関が得られた。以上の結果を公共空間における音声案内の録音に応用することで、より明瞭な音声案内を提供できる可能性が示された。本研究の目的は、駅や空港などの残響がある公共空間において聞き取りやすい音声案内を作成することである。一般的に音声案内は静かな環境で録音・合成されているが、人は周囲の環境に応じて発話を変化させることから、本研究では雑音や残響下で発話した音声案内の方が、公共空間で聞き取りやすくなることを仮定した。昨年度は、静かな環境で発話した音声と比べて、雑音や残響下で発話した音声の周波数・時間・振幅などの音響的な特徴量が有意に変化し、音声生成の面で発話の適応が示された。今年度は、その発話の変化炉聞き取りやすさへどのように寄与しているかを調査した。2名の発話者に対し、雑音/残響音を公共空間で聞く平均的なレベルで提示して録音を再度行った。録音音声に雑音/残響を加えた音声を、若年者と高齢者各32名が聴取する実験を行った。若年者に対する実験結果から、雑音/残響下で発話した音声の方が、静かな環境で発話した音声よりも、雑音/残響下での単語了解度が有意に高くなった。聴取する残響条件が発話者と聴取者で同じ場合・異なる場合共に、残響下で発話した音声の方が明瞭になった。また、明瞭度が高くなる雑音/残響条件は、発話者によって異なった。高齢者に対する予備実験からも、同様の傾向がみられた。以上より、静かな環境で録音・合成した音声案内を拡声する従来の方法よりも、公共空間に存在する雑音や残響を聞きながら発話された音声を拡声する方法の方が、音声案内が聞きやすくなる可能性が示された。録音に使用する残響条件は、拡声先の残響条件と必ずしも同じである必要はなく、残響の選定としては実用的であることも示された。本研究のゴールは、駅や空港などの残響がある公共空間で聞き取りやすい音声案内を作成することである。