hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
創傷治癒過程における上皮組織の化学伝達因子に関する分子生物学的研究

創傷治癒過程における種々の遺伝子の経時的な発現変化について,背部皮膚創傷モデルマウスを用いて明らかにするとともに,内毒素性リポ多糖(LPS)による創傷治癒遅延機序の一端を明らかにするために,LPSに対する表皮角化細胞の応答性について検討した.得られた結果は以下の通りである.1.マウス背部皮膚に創を作製後,再生上皮組織の遺伝子発現変化を検討した.IL-6,IFN-γならびにケラチン16(K16)mRNAは創形成後より発現が増強し,7日後まで発現がみられた.また,TNF-αmRNAは6時間後より発現が増強し,21日後まで発現がみられた.2.LPS投与マウスの創傷治癒は非投与対照群と比べて遅延し,再生上皮組織におけるIL-6 mRNA発現に差はみられなかったが,IFN-γおよびK16 mRNA発現については変化がみられなかった.3.ヒト表皮角化細胞株HaCaTはTNF受容体およびIFN-γ受容体mRNA発現を示したが,CD14およびTLR4発現はみられなかった.4.TNF-αは同細胞のIL-8およびMCP-1 mRNA発現ならびにIL-8産生を誘導し,他方,IFN-γはMCP-1 mRNA発現の増強ならびにIL-8 mRNA発現およびIL-8産生誘導を抑制した.5.LPSを添加したヒト末梢血単核球細胞(PBMC)培養上清は,HaCaT細胞のIL-8 mRNA発現を増強した.6.TNF-αおよびIFN-γやLPS添加PBMC培養上清はHaCaT細胞の増殖を抑制し,LPS添加PBMC培養上清によるHaCaT細胞の増殖抑制は抗TNF-αあるいは抗IFN-γ抗体により抑えられた.7.TNF-αおよびIFN-γは,HaCaT細胞に対してアポトーシスを誘導した.感染局所で細菌の病原因子により誘導される宿主細胞からの内因性因子は,表皮角化細胞に作用し,細菌の感染局所における創傷治癒の遅延を惹起することが考えられる.創傷治癒過程における種々の遺伝子の経時的な発現変化について,背部皮膚創傷モデルマウスを用いて明らかにするとともに,内毒素性リポ多糖(LPS)による創傷治癒遅延機序の一端を明らかにするために,LPSに対する表皮角化細胞の応答性について検討した.得られた結果は以下の通りである.1.マウス背部皮膚に創を作製後,再生上皮組織の遺伝子発現変化を検討した.IL-6,IFN-γならびにケラチン16(K16)mRNAは創形成後より発現が増強し,7日後まで発現がみられた.また,TNF-αmRNAは6時間後より発現が増強し,21日後まで発現がみられた.2.LPS投与マウスの創傷治癒は非投与対照群と比べて遅延し,再生上皮組織におけるIL-6 mRNA発現に差はみられなかったが,IFN-γおよびK16 mRNA発現については変化がみられなかった.3.ヒト表皮角化細胞株HaCaTはTNF受容体およびIFN-γ受容体mRNA発現を示したが,CD14およびTLR4発現はみられなかった.4.TNF-αは同細胞のIL-8およびMCP-1 mRNA発現ならびにIL-8産生を誘導し,他方,IFN-γはMCP-1 mRNA発現の増強ならびにIL-8 mRNA発現およびIL-8産生誘導を抑制した.5.LPSを添加したヒト末梢血単核球細胞(PBMC)培養上清は,HaCaT細胞のIL-8 mRNA発現を増強した.6.TNF-αおよびIFN-γやLPS添加PBMC培養上清はHaCaT細胞の増殖を抑制し,LPS添加PBMC培養上清によるHaCaT細胞の増殖抑制は抗TNF-αあるいは抗IFN-γ抗体により抑えられた.7.TNF-αおよびIFN-γは,HaCaT細胞に対してアポトーシスを誘導した.感染局所で細菌の病原因子により誘導される宿主細胞からの内因性因子は,表皮角化細胞に作用し,細菌の感染局所における創傷治癒の遅延を惹起することが考えられる.本研究は,創傷治癒過程における各種サイトカインならびに上皮骨格構成因子の再生上皮組織内における遺伝子発現レベルの経時的な発現変化について,背部皮膚創傷モデルマウスを用いて明らかにしようとするもめである.今年度は以下の結果が得られた.1.8週齢の雄性C3H/HeNマウスの背部皮膚に15×15mmの創を作製後,21日間治癒経過を観察し,その過程における再生上皮組織での各種遺伝子発現変化をRT-PCR法を用いて検討した.その結果,interleukin-6(IL-6),interferon-γ(IFN-γ)ならびにkeratin 16(K16)mRNAは,創形成後よりその発現が増強し,創形成後1週間までその発現がみられた.また,tumor necrosis factor-α(TNF-α)mRNAは,6時問後より発現が増強し,21日後までその発現がみられた.2.大腸菌由来リポ多糖体を腹腔内投与したエンドトキシン血症モデルマウスを作製し,創傷治癒経過について検討したところ、.無投与群と比べて治癒が遅延した.また,遺伝子発現変化については無投与群と比較して1L-6mRNAの差異はなかったが、IFN-γおよびK16 mRNAの発現は持続した.

次年度は,これら遺伝子産物の発現局在について組織学的な検討を行なうとともに,ヒト表皮角化細胞株を用いて創傷治癒過程において発現変化のみられた遺伝子産物と菌体表層成分に対する応答性の関係について明らかにすることを計画している.内毒素性リポ多糖(LPS)は,感染局所における創傷の治癒を遅延することが知られている.本研究はこれら創傷治癒遅延の機序の一端を明らかにするためにLPSに対する表皮角化細胞の応答性について検討した.その結果,下記のような知見が得られた.1.ヒト表皮角化細胞株であるHaCaTは,TNF受容体およびIFN-γ受容体mRNA発現を示したが,CD14およびTLR4発現はみられなかった.2.リコンビナントヒト(rh)TNF-αはHaCaT細胞のIL-8およびMCP-1 mRNA発現ならびにIL-8産生を誘導し,rhIFN-γはMCP-1 mRNA発現の増強ならびにIL-8 mRNA発現およびIL-8産生誘導の抑制を示した.3.大腸菌LPS添加ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)培養上清は,HaCaT細胞のIL-8 mRNA発現を増強した.4.rhTNF-αおよびrhIFN-γならびに大腸菌LPS添加PBMC培養上清は,HaCaT細胞の増殖を抑制した.また,大腸菌LPS添加PBMC培養上清によるHaCaT細胞の増殖抑制は,抗ヒトTNF-αあるいは抗ヒトIFN-γ抗体により抑えられた.5.rhTNF-αおよびrhIFN-γは,HaCaT細胞に対して明確なアポトーシスを誘導した.6.大腸菌LPS投与マウスは,背部皮膚の創傷治癒遅延がみられた.以上の結果から,感染局所で細菌の病原因子により誘導される宿主細胞からの内因性因子が表皮角化細胞に作用し,細菌の感染局所における創傷治癒の遅延を惹起することが考えられる.
位相解析による脳電気活動の時空ダイナミクスの研究

ヒト頭皮上より導出される脳波の内でも、基礎的な律動成分である脳波リズムについて、その位相・振幅の解析法を独自に開発し、時空動特性を解明することを目的として研究を執り行った。その結果、複素複調法による位相解析より、次のことが明らかになった。1.安静閉眼時にみられるアルファ波は、不安定かつ非定常な波である。アルファ波の位相・振幅は時間的にも空間的にも動的に揺らぐ(不安定性)。特に位相は、高々数秒間隔で振幅が極小値をとるときに大きくジャンプし、アルファ波のコヒーレンシーが長時間持続しないことを示す(非定常性)。2.シ-タ波、デルタ波等の脳波リズムはアルファ波に比べて単純な時間空間特性を示す。ヒトの睡眠に伴って観測されるシ-タ波、デルタ波および紡錘波の振幅・位相はアルファ波に比べて時間変動が小さく、空間的にもアルファ波のような複雑な構造は観測されなかった。また振幅、位相の分布から、アルファ波は少なくとも前頭部と後頭部に振動源を持ち、これらがお互いに作用しあう結合振動子系と解釈されるが、シ-タ波やデルタ波においては振動源が局在化した局所振動系と推定される。3.精神分裂病患者のアルファ波において、その揺らぎが健常者と異なる例を見出した。精神分裂病患者の安静時脳波を採取して位相・振幅の解析を行った結果、健常者と異なり時間空間分布が単純で変動が小さく、前頭部の振幅が最大となる例、健常者と同様な時空変動が観測されるものの中心部の振幅が最大となる例、および時間空間分布、変動共に健常者によく似た例の3つの代表例を見出した。各例の被験者は、それぞれ症状や年齢および服用薬物の量が異なっており、さらに多くの被験者について解析を続ける必要があるが、これまで明らかにされていなかった精神分裂病と脳波特性、あるいは向精神薬と脳波特性などの臨床応用に有用な知見が得られる可能性がある。なお、ファンデアポール振動子の結合系によるシミュレーションからはアルファ波のような複雑な時空動特性は得られなかった。選択する振動子のタイプ、結合の様式を含めて今後さらに検討する必要がある。また、現在当該年度に開発したウェーブレット解析による位相分析手法を脳波データに適用中であり、今後は複素複調法による結果との比較も含めて結果の集積および脳波特性に関する新規知見の獲得に努める。
インドネシアにおけるシティズンシップ教育の多元的・包括的研究

1.インドネシアの高等学校教育の国際化について、教育政策および教育課程の歴史的変遷を明らかにした。独立期からナショナルアイデンティティの醸成が第一であり続けており、教育の国際水準化は志向しているものの、国際バカロレアなどの国際教育課程は付加的に認める範囲に留まっている。2.前年度に実施していたジャカルタおよびジョグジャカルタでの国際教育実施高校に在籍する生徒および保護者へのインタビューより、今年度は国家アイデンティティや地域アイデンティティについては、愛着はあるものの貢献意識や貢献できるという自己効力観は低いことを分析した。3.また2018年度に実施したマルク州アンボン市の高等学校での調査では、宗教教育や公民教育の授業観察、生徒へのインタビューからは、グローバルシチズンシップの理解が表層的であること、華人系生徒は地域愛着や貢献意識が低いが、アンボン人生徒はそれらが高いことが分かった。ただし労働市場の問題から地域に住み続ける意志は弱いことがわかった。ローカル・ナショナル・グローバルコミュニティへのメンバーシップのバランスは、地域の政治経済状況に大きく左右されることが明らかになった。4.大学レベルにおけるシティズンシップ教育あるいは学生のシチズンシップの様相に関する調査として、東ジャワ州とマルク州の国立大学各1校において8人づつ、社会実践教育(Kuliah Kerja Nyata)に関するインタビューを行った。学生の学びとしては、地域開発の課題発見と解決に向けた試行錯誤や挫折の中で、市民、国民としての資質能力を向上させていることがわかった。また、宗教抗争を経験したマルク州の大学生は、異教徒の学生との長期にわたる協働が貴重な経験となり、地域によって異なる必要なシティズンシップ形成が行われていることがわかった。調査については順調に進んでいるが、当初予想していた地域科カリキュラムの各学校での取り組みが思ったほど進んでおらず、その点で研究計画の見直しが必要な状況となったため。地域科カリキュラムを積極的に実施している学校を探すことに力を入れるよりは、多くの学校での多次元のシティズンシップ教育状況を明らかにすることとする。ICT活用が多くなり、カリキュラムや教科書の利用が以前より教師によっては異なっていることが多いことも予想される。そのため授業観察や教員へのインタビューを増やす必要がある。昨年度実施したマルク州での授業観察、アンケート調査、生徒へのインタビューについて分析を進め、それをもとにアンケート調査は比較検討ができる範囲で修正を行う。その後、西カリマンタン州にて同様の調査を実施する。旅費や諸経費では調整できない程度の非常に小額の予算が残っているだけなので、次年度の旅費で使用することとする。
高齢者の安全・安心を守るリスク検出・評価システムに関する研究

本研究は、高齢者福祉分野のニーズを踏まえ、高齢者のリスクを検出・評価するシステムの構築する要素技術の研究と、住居や高齢者介護施設など屋内を対象とした試作システムの研究開発を行なった。また、介護度2、3レベルで自立歩行を行っている虚弱高齢者の日常生活の行動を携帯型身体活動センサーで観測し、屋内歩行速度の推定を行い、時間帯によって歩行率や歩行速度分布に大きく変化することを示した。本研究は,高齢者福祉分野のニーズを踏まえ,高齢者のリスクを検出・評価するシステムの構築を目的として,要素技術の研究と,住居や高齢者介護施設など屋内を対象としたプロトタイプシステムの研究開発を行なった.初年度は(1)高齢者のリスク行動パターンモデル開発.(2)屋内における位置同定手法/移動予測手法の調査検討,(3)高齢者リスクマイニング手法の開発,を行なった.(1)虚弱高齢者の健康を脅かす要因の上位には転倒がある.そこで老人ホーム入居者(女性157名,平均年齢83.4才)を対象に,過去1年間の転倒頻度と関連のある生活要因の調査を行った.転倒経験がない100名と転倒経験がある57名の比較を行った結果,年齢や体格や心血管疾患や高血圧,高脂血症,糖尿病などの有病率には差が無く,認知機能や抑うつ傾向にも差はなかったが,身のこなし検査(TUGT)は非転倒者の平均値は15.3±1.6秒であるのに対して転倒経験者では18.6±1.6秒,また2分間の行距離は非転倒者が70.6±26.7mに対して転倒経験者は58.5±25.0mであり,転倒経験者は歩行機能の低下がみられるほかにTUGTについても劣っていることがわかった.過去1年以内に2回以上転倒を経験している場合とそうでない場合にはさらにその差は大きかった.したがって歩行補助具の使用にかかわらず転倒リスクには歩行機能およびそれに関連する身のこなしが強く関連していることがわかった.(3)イベント系列から特徴的なパターンを発見する系列パターンマイニング,少ない教師データからの学習を可能とする学習法についての手法提案を行い,検討結果をまとめ論文投稿した.本研究では,高齢者福祉分野のニーズを踏まえ,高齢者のリスクを検出・評価するシステムの構築を目的として,要素技術の研究と,住居や介護施設など屋内を対象としたプロトタイプシステムの研究開発を行なった.今年度は,昨年度から引き継いで, (1)高齢者のリスク行動パターンモデル開発, (2)屋内における位置同定手法/移動予測手法の検討, (3)高齢者リスクマイニング手法の開発を行なうと共に,日常行動の履歴からリスク要因と推定される状況を抽出する,高齢者リスク検出・評価システムを試作した.(1)虚弱高齢者の体力テストは,認知機能の低下や抑うつにより,実施が容易ではない.そこで歩行状態のモニタリングから歩行機能や身のこなしに関連する事象を抽出し,転倒リスクの評価を行なうこととした.歩行機能が保たれていても,長時間の休息や起床後には骨格筋の短縮による筋機能の低下が起こるため,歩行機能の一時的な低下が生じる可能性がある.したがって同一個人においても転倒リスクが時間的に変化する可能性がある.そこで介護度2, 3レベルで自立歩行を行っている虚弱高齢者の日常生活の行動を,移動経路推定機能を有する携帯型身体活動センサーでモニタリングした.その結果,建物内の距離が確定している経路の移動時間を計測することにより歩行速度の推定が可能であること,また時間帯によって歩行率や歩行速度分布に大きく変化することが明らかになった.(2)自宅での高齢者介護サービスについての検討を行い,このためのシステム構成等をまとめて論文発表した.高齢者のリスク状態分類の学習を効率的に行うためのサポートベクトルマシンの研究,観察時系列から特徴的なパターンを発見する系列マイニング,学習プロセスを効率化するための半教師付き学習法,日常行動の観測時系列からのトレンド変化の検出などについて方式検討を行い,論文発表した.
「遺伝子関連発明のライセンス供与に関するOECDガイドライン」のインパクト評価

大手製薬企業ならびにバイオベンチャー企業の特許出願に発明者として掲載されている方々を対象とするアンケート調査を行った結果、企業の研究開発を阻害する要因として影響が最も大きいのは、他の企業が保有する特許権であることが明らかになった。また、大学の保有する特許・ノウハウ・マテリアルは、大手製薬企業よりもベンチャー企業の研究開発において、高い頻度で阻害要因となっていることも明らかになった。2003年5月からOECDで「遺伝子関連発明のライセンス供与に関するガイドライン」の策定作業が行われ、2006年2月に同ガイドラインが理事会で採択されることとなった。初年度は、次のような点を中心に、先行文献の調査、ならびに現地に赴いての調査研究を行った。・国内外において、現状で、ライセンス契約に関してどのような問題が生じているのか。・このような問題に対して、OECDガイドラインの存在がどのように寄与しているのか。・OECDガイドラインで解決しえない、ライセンス契約上の問題は何か・このガイドラインは、創薬プレイヤーの知的財産戦略ならびにライセンス契約の実態にどのようなインパクトをもたらしたのか。・OECDガイドラインの周知度国外に関しては、関連する研究会合に参加し、事例調査や先行文献調査の手がかりを得ると同時に、関連分野の専門家に対し、OECDガイドラインの評価をヒアリングした。初年度の調査研究によると、「遺伝子関連発明のライセンス供与に関するガイドライン」は、公共的研究開発成果の普及を目指すガイドラインとして、製薬・食品などの遺伝子関連の研究開発を行う業種にとどまらず、広範な技術分野の企業が注目するものとなっている。また、それと同時に、学術研究と商業的開発の両立を目指すガイドラインとして、バイオ・生命科学にとどまらず、広く大学・公的研究機関の研究者や研究管理担当者の関心を集めている。初年度の調査研究により、このガイドラインは、学術研究と商業的開発の両立を目指すガイドラインとして、バイオ・生命科学にとどまらず、広く大学・公的研究機関の研究者や研究管理担当者の関心を集めていることが明らかになった。2年目の本年は、調査の対象をバイオ・生命科学分野に限定せずに、このガイドラインの波及効果をヒアリング形式により明らかにすることを試みた。このための研究会を設置し、検討を行った。その結果、ライセンス・ガイドラインの次なる段階として、特許発明に対するアクセス性を高めるための仕組みが求められていることが明らかになった。特許発明に対するアクセス性を高めるための仕組みとして、モデル・ライセンス契約の策定、特許権を集合的管理するパテント・プールの構築、パテント・クリアリングハウスの構築などが挙げられる。これらの実例に関して、いくつかの国・プロジェクトにおける運用の実態を調査し、法的ならびに組織論的な課題を抽出した。このガイドラインは、学術研究と商業的開発の両立を目指すガイドラインとして、広く注目されている。本年は、企業の発明者がこの問題についてどの程度の認識を有しているのかを調べるため、アンケート調査を実施した。その調査内容は、以下のようなものである。特許権・ノウハウが存在していることや、契約がスムーズに行えないことが原因となって、研究開発が遅延したことや中止に追い込まれたことがあるか。特許権・ノウハウ・マテリアルのうちいずれが、そのような遅延や中止をもたらしたか。また、それは、大学・公的研究機関が保有するものであったか、企業が保有するものであったか。OECD「遺伝子関連発明のライセンス供与に関するガイドライン」をはじめとするいくつかのガイドラインに関する知識。本調査では、日本企業のうち、製薬企業(大手製薬企業とバイオベンチャー)に着目した。大手製薬企業に関しては、2008年の売上げ上位10社(IMS医薬品市場統計による。外国企業を除く。)をピックアップし、バイオベンチャーに関しては、2009年9月時点で株式上場している企業23社をピックアップした。ピックアップした企業の特許文献(2005年以降に出願したもの)に着目し、各社において特に重要度の高い特許の発明者となっている方々をリストアップした。計332名に対して個人名宛でアンケート質問表を送付したところ、回収率は約50%であった。
臨床的に用いられている植物性抗腫瘍性物質の生合成・生産の分子遺伝学的代謝工学

植物性アルカロイドであるカンプトテシンは、キノリン骨格を有する変形モノテルペノイドインドールアルカロイドであり、トポイソメラーゼIを特異的に阻害するため臨床において抗癌薬として広く世界的に用いられている。そこでこの植物性抗腫瘍性アルカロイド物質であるカンプトテシンの効率的な生産を目的とした研究を行った。まず、チャボイナモリ(Ophiorrhiza pumila)の毛状根培養によるカンプトテシンの効率的な生産システムを確立した。次に、液体培地で培養した毛状根がCPTを生産、培地中に放出していることをしていることを見いだした。さらに、3L容のジャーファーメンターを用いた毛状根の培養を行い大量培養条件を確立した。次に、チャボイナモリ毛状根からカンプトテシン生合成に関わる4つの酵素をコードするcDNAを単離し、各種ストレス条件下におけるこれらの発現解析を行った。さらに、カンプトテシン生合成経路中の鍵酵素であるストリクトシジン合成酵素について、部位特異的変異導入した組み換えタンパク質を用いて、その機能に重要なアミノ酸残基を同定した。また、イソプレノイドから誘導されるカンプトテシン骨格中のセコロガニン部分の生合成起源について、[1-^<13>C]グルコースの取り込み実験および特異的生合成経路阻害剤を用い,た研究を行い、セコロガニン部分はいわゆる非メバロン酸経路によることを解明した。最後に、高速液体クロマトグラフィー-フォトダイオードアレー検出-質量分析を用いたハイスループットメタボローム解析により、各種カンプトテシン生産植物や培養体の植物化学的性格付けを行い、チャボイナモリの薬用遺伝子資源としての有用性を明らかにした。チャボイナモリ(Ophiorrhiza pumila)は、琉球列島特産のアカネ科多年性草本植物で、その全草に抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシン(CPT)を含有している。我々は、これまでにチャボイナモリを材料としてその無菌植物から毛状根を誘導し、液体培地で培養した毛状根がCPTを生産、培地中に放出していることをしていることを確認した。今回、大量培養条件を確立するために、3L容のジャーファーメンターを用いて毛状根の培養を行った。また、CPTの放出を促進させるために、添加するエリシター等の種類と濃度、添加後の処理日数について検討した。(1)ジャーファーメンターによる大量培養:ジャーファーメンターの底部には毛状根保持用のステンレスメッシュを取り付けた。培養槽に、2.5LのB5液体培地(2%Sucrose)を入れ、これに100ml三角フラスコで液体振とう培養した毛状根約10gF.W.を植え付けた。通気量2.5L/min.、培地温度28°Cで培養し、培地の撹拌は培養槽底部の6枚羽撹拌器(60rpm)で行った。(2)CPT放出促進条件の検討:培養開始3週目の培地に、メチルジャスモン酸(MJA)、サリチル酸(SA)、イーストエキス(YE)を添加し、CPT放出量のタイムコースを測定した。培養は50ml培地/100ml三角フラスコによる液体振とう培養とした。ジャーファーメンター培養では、7週間培養で192gF.W.、8週間培養で240gF.W.の毛状根が得られ、100ml三角フラスコでの培養とほぼ同等の増殖倍率を示した。スケールアップに伴う増殖倍率の低下は見られなかった。CPT放出促進条件の検討では、MJA500μMまたはYE500μg/mlの添加後6時間目より放出促進がみられ、2448時間後に最大となった。一方、SA(100μM)では、添加後1週間目で放出促進がみられた。

臨床的に用いられる植物由来抗癌物質であるカンプトテシンの効率的かつ安定な生産技術の確立を目的として、チャボイナモリ(Ophiorrhiza pumila)の組織培養による生産について検討した。ジャーファーメンター(培地量2.5L)を用いて、毛状根の大量培養を行った。ジャーファーメンターにステンレス製メッシュを培養槽底部に設置することにより培地撹拌による毛状根の機械的損傷を軽減した。その生産量は8週間で約22mgであった。さらに、植物内でのカンプトテシンの生合成の場を明らかにするために植物器官、組織および細胞内における局在性に関する解析を行った。チャボイナモリ植物体中のカンプトテシン含有率は、細胞分裂の活発な部位で多かった。また、落射型蛍光顕微鏡(励起波長360-370nm、観察波長420-460nm)を用いた組織化学的観察を行ったところ、葉や茎および毛状根の横断切片においては、カンプトテシンに由来する強い青色蛍光が、表皮、トライコーム(毛)および導管において観察された。毛状根では、部位により青色蛍光の存在部分が異なり、根端部分(生長点近傍)では液胞内で、細胞伸長が終わった部分では細胞壁に沿った部分で強い蛍光が観察された。これらの結果から、カンプトテシンは根の生長点付近の細胞液胞内で生産された後、細胞間隙、表皮へと能動的或いは受動的に輸送されることが示唆された。また、カンプトテシン生産植物としてのOphiorrhiza属植物についてRAPD法による類縁関係の解明および成分分析を行った。臨床的に用いられている植物性抗腫瘍性アルカロイド物質であるカンプトテシンの効率的な生産を目的とした生合成研究を行った。昨年までの本研究成果で、チャボイナモリ(Ophiorrhiza pumila)の毛状根培養とカンプトテシン生産に成功している。本年度はチャボイナモリ毛状根におけるカンプトテシンの生合成に関する研究の一環として、イソペンテニルピロリン酸から誘導されるセコロガニン部分の由来にっいて[1-^<13>C]グルコースおよび阻害剤を用いて検討した。B5液体培地で培養してきたチャボイナモリ毛状根を、[1-^<13>C]グルコースを含むB5液体培地に継代した。4週間後に毛状根を収穫し、メタノール抽出後、クロロホルム画分を精製しカンプトテシンを得た。カンプトテシンの^<13>C-NMRを測定し取り込みパターンを解析した。また、B5培地で培養してきた毛状根に培養開始3週目にメバロン酸経路の阻害剤であるフォスフィドマイシン、ロバスタチン、および非メバロン酸経路の阻害剤であるクロマゾンを添加し、カンプトテシン産出量を測定した。その結果、[1-^<13>C]グルコース投与実験は、カンプトテシンのセコロガニン部分は非メバロン酸経路由来であることを示唆した。また、ロバスタチンはカンプトテシン産出量に影響を与えなかった。一方、フォスフィドマイシン、ロバスタチンではカンプトテシン産出量が減少した。以上より、カンプトテシンのセコロガニン部分は非メバロン酸経路由来であることが結論された、さらに、カンプトテシン含有植物と培養組織についてその網羅的二次代謝産物プロファイリング(メタボローム解析)を行った。
ムコン酸類の嫌気的生分解の評価とエタノール発酵技術の検討

本課題ではリグニンを始めとする芳香族化合物からの新規発酵技術の可能性を探ることを目的とし、芳香族化合物の代謝中間体であるムコン酸類の嫌気的条件における資化微生物の探索を検討した。代表的なムコン酸類であるcis,cis-muconic acidを単一炭素源とした集積培養により、嫌気的条件においてムコン酸類を資化可能な微生物を4菌株単離した。また、同様にムコン酸類の一種である2-hydroxymuconic semialdehydeの調製を検討し、その前駆物質の合成を達成した。平成25年度は24年度に引き続き、ムコン酸資化微生物スクリーニング基質となる2-hidroxymuconic semialdehydeの合成について検討を行った。合成過程において、当初計画していた酒石酸エステルを用いた系では目的とするC2セグメントの合成が効率的に進行しなかったため、新たに保護したhydroxyacetaldehydeを用いた系を採用することとした。また、C4セグメントとのカップリングについても種々検討を行った。これまで用いていたGirignard型の反応の代わりとしてBrbier型の反応を用いることで収率の改善を達成したが、未だアレンの生成が低収率の原因となっており、さらなる検討を必要としている。構築したC6骨格について、還元、脱保護を達成しており、標的化合物の前駆体を合成しつつある。また、ムコン酸資化微生物スクリーニング系についても嫌気的な培養系を立ち上げており、カテコール分解系のもう一方の基質であるムコン酸を用いて嫌気的資化菌のスクリーニングにとりかかっている。現在、複数のサンプルより嫌気的資化菌と思われる株を発見している。本研究課題遂行の第一歩として、嫌気的条件においてムコン酸ならびにヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの資化菌を探索するため、土壌サンプルの採集を行った。当初計画の通り、低酸素条件でリター分解を行っているという条件を下に、サンプリングサイトを選択した。2月期の北海道名寄市雨竜郡の2メートル深積雪下の土壌や、3月期北海道大学内実験苗畑の1.5メートル深の土壌を始めとして、合計10箇所の土壌から微生物ストックを調製した。また、ムコン酸を単一炭素源とした培地の調製法について検討するとともに、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの取得法についても見直しを行った。当初計画においてヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを微生物代謝により調製する計画であったが、今後検討するラベル化実験、誘導体実験を考慮し、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを有機合成することとした。合成に当たってC6骨格をC2セグメントとC4セグメントへ分割し、それぞれを酒石酸エステルならびに1,4-but-2-enediolから調製することとした。現在、それぞれのセグメントの構築と、C6骨格へのカップリングを達成している。今回立案した合成計画ではスケールアップ可能な戦略を選択しているため、今後集積培養を行うのに十分量のヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを合成出来ると考えられる。リグニンを始めとする芳香族の化合物の生分解鍵中間体であるムコン酸類に着目し、その嫌気的条件における資化の可能性について検討した。北海道内33地点から採取した土壌サンプルについて、cis,cis-ムコン酸を単一炭素源とした培地にて嫌気的条件下、集積培養を行った。検討したサンプルのうち、6サンプルについて優位な生育が確認された。また、生育が示されたサンプルをtrans,trans-ムコン酸を単一炭素源とする液体培地で同様に培養した際、生育がほとんど見られなかったことから、これら微生物はcis,cis-ムコン酸を選択的に資化していることが示された。集積培養物をcis,cis-ムコン酸を単一炭素源とする寒天培地に画線培養したところ、6サンプルのうち4菌株のみが嫌気的条件で生育した。嫌気的培養においては生育が目視で確認できる濁度を示すまで概ね30日以上を要したが、単離した4菌株のうち1菌株については数日で優位な生育を示した。また、cis,cis-ムコン酸と同様、単一炭素源として用いられるべき代表的なムコン酸類である2-hydroxymuconic semialdehydeの化学合成について検討した。2-Butene-1,4-diolから保護、オゾン分解を経て合成したC2ユニットと、2-butyne-1,4-diolから調製したC4ユニットとのBarbier反応によるカップリングにより、C6骨格を構築した。アルキンの還元と続く脱保護を行った後、酸化反応の条件検討を重ねることにより、最終生成物を導く酸化反応前駆体の合成を達成した。森林科学当初計画においては、2-hidroxymuconic semialdehydeならびにムコン酸の嫌気的資化菌を発見し、その同定、活性評価を達成している段階であるが、未だ到っていない。これは2-hidroxymuconic semialdehydeの合成が遅れているためである。当初計画では微生物のスクリーニングまでを達成する予定であったが、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの取得法について見直しを行ったため、スクリーニングまでを達成できていない。

しかしながら、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの有機合成による調製は、今後本課題を円滑に進める上で重要なステップであること、スクリーニング自体は時間を要しないことなどから、この遅れは全体の遂行において問題とならないものであると考えている。現在、2-hidroxymuconic semialdehydeの合成においては概ね最終段階に差し掛かっており、目標へ到達しつつある。この基質の調製は本課題達成における鍵段階である。今後はさらに本基質の合成を進め、達成することでムコン酸類資化菌の発見とその資化過程の解明を目指す。現在行っているヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの合成を速やかに達成する。また、その後ムコン酸、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを単一炭素源に用いた集積培養、微生物スクリーニングを行う。スクリーニングの後に種同定、エタノールを始めとする代謝産物の同定を行う。2-Hidroxymuconic semialdehyde合成研究における遅れによるもの。未使用額は概ね菌株のスクリーニングならびに種同定、分解機構解析への使用を予定していた額である。2-Hidroxymuconic semialdehydeの合成、ならびにその大量合成と、菌株のスクリーニングならびに種同定、分解機構解析への使用を予定している。次年度の研究の推進方策に従い、ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの合成材料の購入ならびに集積培養の培地とその他消耗品の購入、スクリーニング後に用いるエタノール生成評価のキット購入に研究費を使用する計画である。
MELKを介した肝細胞癌の増殖のメカニズムと制御

肝細胞癌の治療成績の改善を行うためには、外科的治療に加え、新しい肝細胞癌の制御理論が必要であると思われる。今回、我々は、肝細胞癌の発育進展における新しい分子標的として、Embryonic leucine zipperkinase(MELK)に着目し、臨床病理学的、分子生物学的に癌の細胞増殖におけるMELKの役割を検討した(当研究は香川大学医学部倫理審査委員会の承認済み)。1,マウスを用いたMELK発現の特性の検討:マウス正常組織を用いて、RT-PCRによりMELKについて各臓器ごとの発現様式を検討する。【結果】胸腺、脾臓、小腸、精巣での発現が著しく亢進していた。2,ヒト肝細胞癌におけるRT-PCRを用いた発現の病理学的比較検討:当科で凍結保存してきたヒト肝細胞癌の生材を用い、正常部と癌部でのMELKの発現の違いを検討する。【結果】肝細胞癌(n=10)では、正常部0.063±0.01(mRNA/18S rRNA)、癌部0.66±0.83、転移性肝癌(N=6)では正常部0.061±0.080、癌部1.09±1.27など、癌部においては正常部に比べ約10倍に発現が亢進していることがわかった。3,ヒトにおけるMELK発現の変化について:平成22年度検討項目であった、ホルマリン固定したヒト手術材料をもちいたMELKの免疫染色を繰り上げて行い、癌における発現様式の違いを検討した。【結果】発売されている抗体の2種類を用い免疫染色を試みたが、染色することができなかった。今後、条件を変えて染色することが必要と思われた。【本研究の意義・重要性】MELKが癌部で発現が亢進していることを見出した。これは胎生期に発現するタンパクが癌化することで再度、発現が亢進することを示し、今後、癌治療の新しいターゲットとして研究を進めて生きたい。
科学の頑健性の分析による科学的実在論の擁護の可能性についての研究

本研究では先行研究および科学研究の実態調査により、科学の営みとその知識産出過程をモデル化・検証し、科学的実在論(特にチャクラバティの半実在論)を擁護するための議論に適用した。具体的な事例を元にして検討した結果、次の結論に至った。1)頑健性は、科学者が実在性を判断するための一つの基準になりうる。2)しかし頑健性だけを元にして科学的実在論を擁護することは困難である。とりわけ、科学的実在論を支持する重要な論拠である奇跡論法を頑健性モデルによって擁護することが困難であることが分かった。これらの先行研究の分析により、科学的実在論の奇跡論法について、既存の議論とは違う形での擁護が可能かどうかを検討中である。特に(3)においては、科学哲学者が頑健性を過剰に評価しているという考察が提示されており、本研究を進めていく上での重要な示唆が得られた。今年度は採択時期の都合で半年分しか研究期間がなかったが、本研究における基本文献の収集および検討を中心に研究を進めた。本来、頑健性という概念の議論は、科学的実在論論争とは別の独立した文脈で論じられることが多く、両者の関連付けに注意しつつ検討を重ねた。具体的には、「研究実績の概要」でも述べたHudsonの先行研究は、科学における頑健性という概念の役割についてむしろ否定的な立場から、頑健性に頼らない形での実在論擁護を試みている。ただし、Hudsonの考察では科学的実在論論争において重要な論点であった、「新奇な予言の導出による経験的成功」という観点が抜け落ちている。この観点からHudsonの考察を検討し直し、その成果を来年度の学会で発表すべく、準備を進めている。平成28年度は、前年度に実施した文献調査にもとに、頑健性概念の分析と科学の営みのモデル化を行ない、頑健性モデルによって科学的実在論を擁護することを試みた。その際、科学研究の個別ケースとして分子生物学の事例(メソソームの実在)を中心的に検討し、奇跡論法という科学的実在論の道具立てが頑健性によって擁護できるかを分析・考察した。メソソームの事例は文献調査を通じて着想を得たものであり、以下の点で重要な成果があった。1)当該論争では物理学の事例がこれまで多く取り上げているが、本研究によって分野間での比較検討が可能となった。2)電子顕微鏡による細胞観察という容易に実行可能な研究に基づく事例であって、多くの科学者がメソソームの実在に関する議論に参加しているため、科学コミュニティにおける科学的知識の浸透過程の分析という課題を十分に実行することが可能となった。これらの成果は科学基礎論学会と、科学的実在論論争の国際ワークショップにおける講演という形で発表した。上記の研究を通して、頑健性という側面から科学的実在論の擁護を検討したが、必ずしも科学的実在論にとって肯定的な結論には至らなかった。例えば、科学的実在論では、理論や観察の収束が科学的知識の信頼性を保証するという見解を採用するが、メソソームの事例では、観察の収束とその頑健性は観察対象の実在性を担保しないことが分かった。もちろん、最終的にはメソソームの実在性を否定する結論の「収束」が見られており、頑健性は科学的知識の受容と浸透に際して重要な指標となっていることは確かである。そのため、科学的実在論を擁護するためには、このような科学研究の動的発展の理解を組み込んだ形での方策を探る必要があるという結論が得られた。上位の結論は論文としてまとめ、科学哲学系学術誌への投稿準備を進めている。申請時においては、「実際の科学の現場への参与観察を通した頑健性概念の検討」を予定していた。しかし先行研究との関連性、そして参与観察予定であった研究グループの事情を考慮した結果、次年度は当該研究グループをリアルタイムに追うのではなく、関連する領域のこれまでの研究成果を通して、本研究の目的をフォローする。この路線変更については研究費申請の当初から考慮に入れており、本研究の遂行にあたって、別段の影響はないと考えている。また、次年度は学会等での成果発表を念頭に置きつつ、研究を進める予定である。ただし、申請時に予定していた国際学会(The Philosophy of science Association Biennial Meeting)での研究発表は困難となってしまった。当該学会へは、海外の最新の研究動向の調査という形での参加を計画している。一方、国際的な情報発信としては、7月に京都大学で開催が計画されている科学的実在論の国際ワークショップにおいて研究発表する予定がある。28年度が最終年度であるため、記入しない。科学哲学28年度が最終年度であるため、記入しない。
患者-医療者関係の再構築に向けた患者参加の概念の体系化と推進方策に関する研究

患者参加の概念整理および研究動向の把握のため、関連する国内外の先行研究の収集を行い、患者参加の概念の用いられ方と構成要素、医療の場における患者参加の具体例を検討した。患者参加は、医療の過程や結果に患者のニードを反映させることを目的とした、医療者ー患者間のコミュニケーション特性あるいは関係特性と暫定的に定義した。その構成要素は、医療者-患者間の共同の意思決定(Shared decision-making)が中核概念であり、共同の意思決定に加え、患者が自己に関する識者として位置づけられていること、患者の自律とセルフケアが促進されていることなども包含されている。国内文献では、患者参加の具体的な展開例として、患者参加型看護計画や医療安全、症状モニタリングへの参加の促進に向けた取組みの報告が多く得られ、ケア計画の話し合いや情報、目標の共有などが重視されていることが明らかになった。しかし、国内文献では患者参加の意味内容が明確でないものも多く、構成要素を明確にした実証研究も少ないことも明らかになった。これらの抽出された構成概念及び既存の尺度の内容、国内の取組みの具体例を整理して、今後予定している調査で患者参加の程度を測定するためのアイテムプール案の作成を進めている。また、国内外の学会に参加し、研究者、実践者および患者会との交流をはかり、研究テーマや参加の概念、質問項目案について意見交換を行った。文献数が想定よりも多く、収集・整理に予定より時間を要し、概念の整理をもう少し行う必要がある。また、それにより訪問や有識者インタビューを一部しか行えていない点でやや遅れが生じている。関連領域での研究実績のある研究分担者を追加する予定であり、構成概念の整理を進め、調査票の作成を行う。文献収集、整理に時間を要し、訪問調査やインタビュー調査に使用する予定であった旅費、謝金への支出が生じなかった。次年度、情報収集、調査打ち合わせのための旅費や謝金として使用する予定である。
プロポフォールによる静脈内鎮静法の研究-嚥下機能、BIS、血中濃度を中心に-

1.静脈内鎮静法による嚥下機能への影響を検討するために、舌圧・咽頭圧が同時に測定できるシステムの開発を行った。2.対象:研究内容に同意を得た嚥下障害のない健康成人を対象とした。3.方法:被験者の鼻腔より測定用カテーテルを挿入し圧波形により食道入口部の圧測定点を確定した。空嚥下と水3ml嚥下時の舌圧、咽頭内圧、食道入口部圧を測定した。圧測定には多目的圧測定システムを用いた。また、舌圧測定のため被験物固有の口蓋床を作成し装着した。4.測定項目(1)舌圧、咽頭内圧波形(2)最大舌圧、最大咽頭内圧および各々平均値(3)パターン分類5.結果(1)食道入口部圧は通常用圧を示し、嚥下に伴い2峰性を示し安定した波形を得ることができた。(2)大部分の被験物で最大咽頭内圧平均値が舌圧に対して高い値を示した。また、空嚥下時と水嚥下時では平均値はほぼ同様の値を示した。(3)舌圧4点と咽頭内圧の最大平均値を大小関係から分類すると4つの代表的パターンが得られた。6.考察(1)舌圧測定に関しては、繊細な測定が可能で設置部位の制約も少なく衛生面で優れていた。(2)咽頭内圧に関しては、他の研究者の報告と一致しており測定方法は妥当であった。(3)食道入口部の嚥下圧測定に関しては、中咽頭での波形が得られない場合があり検討が必要である。7.まとめ本研究で開発された舌圧・咽頭内圧同時測定システムは嚥下機能評価に有用であり、静脈内鎮静法時における嚥下機能解析にも測定可能であることが示された。1.研究システムの整備本年度は静脈内鎮静法による嚥下機能への影響について測定することを前提に、実験システムの整備を行った。新規購入した機器は摂食・嚥下時の舌圧、咽頭内圧の測定が可能なマルチパラメータ消化管運動機能測定システム(日本メドトロニック)で、実験手技の確立を目差した。測定は舌圧と咽頭内圧の同時測定とし、静脈内鎮静法など被験者の状態が変化した時にも安定したデータが得られるよう工夫した。特に舌圧については、先行研究として嚥下時口蓋と舌との接触圧が安定して得られる領域をあらかじめ同定する必要があった。同定結果から最も再現性が高いと考えられる口蓋の4点を舌圧測定部位とした。一方、咽頭圧は経鼻カテーテルタイプの内圧測定カテーテルを使用した。食道入口部(UES)圧は再現性が高いためリファレンスとし、その上部に位置する中咽頭と下咽頭の嚥下時内圧を測定部位とした。舌圧、咽頭圧はポリグラフで1画面表示されるため、双方の圧変化測定が可能となった。尚、摂食・嚥下のモニタリング用として、咬筋と舌骨上筋群に対し表面筋電図も同時測定、ポリグラフ上に表示させた。咽頭圧測定用カテーテルは姿勢変化や嚥下の反復により位置が不安定となるため、安定したデータ獲得が難しい。当面は内視鏡ファイバースコープ(現有)を咽頭部位に挿入し、視覚的なモニタを併用することとした。

2.倫理委員会申請当大学院医歯学総合研究科倫理委員会に、上記システムによる研究の倫理審査を申請した。その結果、条件付きであるが、承認を得た。本年度は1.の研究システムにより、若干名であるが健康成人に対し無鎮静下で摂食・嚥下時の測定を行った。その結果、異なる食形態、舌位の違い、顎位の違いにより咽頭圧にも影響が出ていることを確認した。1.嚥下機能評価準備期/口腔期評価にはエレクトロパラトグラムを、咽頭期、食道期評価にはインフュージョン内圧カテーテルによる嚥下圧測定を適用した(昨年度購入済み)。エレクトロパラトグラムは、口蓋部分に複数の圧センサを埋め込んだプレートを被験者に装着し、舌-口蓋接触の状態を明示した。嚥下圧測定用内圧カテーテルは被験者の鼻腔より挿入し、多目的内圧測定システム(昨年度購入済み)を介して嚥下圧を測定した。双方はデジタイズにより同一時間軸にて評価が可能となるよう、システム構築を前提とした。研究分担者が嚥下機能評価を行った。2.本研究に関しては,岡山大学大学院医歯学総合研究科倫理委員会(平成17年2月22日)で審査され承認を得ている。健康成人ボランティアに対し,上記実験システムを用いて嚥下機能評価を行った。研究に際し被験者への安全性,利益/不利益などは最大限配慮し,研究内容を十分説明して同意を得て行った。3.摂食・嚥下機能障害のない健康成人(若干名)に対し無鎮静下で摂食・嚥下時の測定を行った。その結果,カテーテルを鼻孔付近で固定することで嚥下前後のカテーテルの位置移動,回転を抑えることが可能であった。従って圧測定中,随時画像による位置確認の必要性はないと考えられた。4.本測定装置を用い,下咽頭から中咽頭の各部位で,咽頭測定部位,咽頭内圧測定値の再現性が得られた。さらに,咽頭内圧測定にふさわしい部位の決定が得られた。
細胞接着阻害因子を標的として新規癌治療薬の開発

乳癌はわが国及び世界において女性の中で最も頻発する癌であり、世界的な問題である。特に、プロゲステロン、エストロゲン、HER2という標的受容体を持たない乳癌がトリプルネガティブ乳癌(TNBC)と呼ばれており、現在その治療法はない。我々はTNBCがペリオスチン(PN)遺伝子が過剰発現することを見出し、この中和抗体を独自に作製して原発巣および肺転移巣への転移を抑制することを確認した。PNの乳癌転移の機序として網羅的な共役蛋白質の解析を行い、PN蛋白質がWnt蛋白質と結合しWntシグナルを増強させることを見出した。ペリオスチンの乳癌への転移に関して他のラボより、臨床の乳癌サンプルより乳癌幹細胞を抽出したところ乳癌幹細胞にペリオスチンが強発現いること、1000人以上の乳癌症例の解析にてリンパ節転移症例でペリオスチンは発現が強く、トリプルネガティブ乳癌でペリオスチンの発現が極めて高いことが報告されている。そこで、我々が典型的なトリプルネガティブ・ヒト乳癌細胞であるMDA-MB231細胞を重症免疫不全マウスに移植するモデルを構築した。その系で我々が独自に開発したペリオスチン中和抗体を投与したところ、乳腺部の原発層は有意に増殖能が抑制され、肺転移は著明に抑制することを確認した。また、マウス体重においても有意に体重減少を抑制することが可能であった。一方、Nature誌によって、ペリオスチンがマウス乳癌幹細胞のニッチで強発現されておりペリオスチンKOマウスを用いてペリオスチンを抑制するとマウス乳癌肺転移が著明に抑制されることが報告され、ペリオスチン中和抗体が同じマウス乳癌幹細胞の転移を抑制することを確認していたが、その機序としてWnt3aとペリオスチンが結合し幹細胞の未分化能を維持させているとされていた。我々はビアコアを用いて各種蛋白質とペリオスチンの結合を網羅的に解析しているがWnt3aとペリオスチンの結合が我々の中和抗体で阻害可能であることを確認した。これによって、我々のもつペリオスチン中和抗体がペリオスチンのWnt3aに対する作用を阻害していることが考えられた。悪性新生物に対する治療法は様々に開発されてきたが、依然として我が国死因の1位であり、新規治療法の開発が求められている。これまで癌治療薬は癌の増殖力を抑える治療法が様々に考えられ原発巣の増殖はある程度抑制できるようになってきたが、転移を十分に抑制することはできず結果的に予後を改善するに至っていない。一方、臨床症例において乳癌や悪性黒色腫の転移症例でぺリオスチン(PN)が上昇していることが報告され注目されている。我々が独自に作成したPN1中和抗体を用いてマウスF10悪性黒色腫細胞の肺転移モデルで効果を検討したところ、4T1乳癌細胞と同様に、原発巣の抑制とともに、肺転移巣の著明な抑制効果を確認することができた。一方、すでに作成終了しているPNKOマウスを用いてF10悪性黒色腫での効果を検討した。結果は意外にも、PNKOマウスにはF10悪性黒色腫での原発巣抑制効果や、肺転移抑制効果は確認できなかった。この原因として、癌細胞周辺の線維芽細胞から発現されるPNを抑制しても、F10自体がPNを過剰に発現するために癌抑制効果がでないことが考察された。そこで、癌細胞自体へのPNKOも行うため、シグマアルドリッチ・ジャパンの契約し日本では初のCompoZr Zinc Finger Nuclease Technologyを用いたPNKO細胞の作製を予定していたが最後になってシグマアルドリッチより、成功する保証はできないとの連絡があり実験遂行できなかった。一方、H24年12月にNature誌に乳癌幹細胞のニッチ形成にPNが重要でありPNの抑制が乳癌幹細胞の肺転移抑制につながるとの論文が報告され、現在PN中和抗体による乳癌幹細胞の転移抑制効果を検討中である。トリプルネガティブ乳癌(TNBC)は年々増加傾向の乳癌の中でもエストロゲン、プロゲステロン、HER2などの治療標的が存在しない乳癌であり現在のところ治療標的がないアンメットニーズの高い疾患である。一方、1086人の乳癌症例にてペリオスチン(PN)の発現の強い症例が独立した予後規定因子であること、TNBCで特にPNが過剰発現していることが報告されている。そこで我々はPN中和抗体を独自に作成し、TNBCの1つであるヒト・MDA-MB-231細胞と重症免疫不全マウス(NOGマウス)を用いたTNBC肺転移モデルを構築し、PN中和固体の効果を検討した。PN中和抗体は原発巣を有意に抑制しただけでなく肺転移巣を著明に抑制することを確認した。また、この機序を解明するためにPN蛋白質がWnt3a蛋白質と強固に結合することを確認した。

さらに、臨床サンプルを用いてPN中和抗体を用いて乳癌症例の原発巣を免疫染色すると、PN発現症例で転移する傾向であることが観察された。以上より、PN中和抗体のTNBCへの治療薬としての可能性が示唆された。癌転移乳癌幹細胞へのペリオスチンの影響および、その阻害作用の解析を現在の研究の方向にしており、ペリオスチン中和抗体の作用機序が癌幹細胞の未分可能の抑制をWnt3aの抑制を介しておこなっていることが明らかとなったことは意義深いと考えている。ペリオスチンのKO細胞は技術的問題のため現在成功しておらず改変を重ねている。また、特許作成のため学会、論文などはあえて控えております。ご了承ください。我々はすでに4T1マウス乳癌細胞の肺転移モデルでのPN中和抗体による癌発巣の抑制及び、肺転移抑制効果を確認していたが、今回F10マウス悪性黒色腫モデルにおいてもPN中和抗体による、原発巣の抑制や肺転移の著明な抑制を詳細に証明することができた。さらに、4T1モデルは背景がバルブCのマウスを使う必要があり、現在PNKOマウスのバッククロスを掛けている。一方、F10マウス悪性黒色腫モデルにおいては背景がC57BL6であったので現在のまま使えるために先にF10悪性黒色腫モデルでの作用を検討した。意外にも効果を証明できず、やはり癌周辺の線維芽細胞のPNを抑制する必要があると考えられた。さらに、シグマアルドリッチ・ジャパンによってPNKOの癌細胞を作る予定で契約を交わしていたが、最後になってシグマアルドリッチ・ジャパンが成功の保障はできないとの連絡をしてきたため頓挫した。癌のペリオスチンKO細胞が完成すれば、すでにペリオスチンKOマウスは作成済みであるのでそれを組み合わせて乳癌の転移への影響をクリアーに評価することが可能となる。さらには、各種バリアントのレンチウイルスベクターが構築できれば各々の機能を評価することが可能となる。F10マウス悪性黒色腫モデルでの原発巣の抑制や、肺転移の著明な抑制作用の機序を検討する必要がある。具体的にはPN中和抗体による癌抑制効果を遺伝子アレイ、あるいは蛋白アレイを掛けていくことによってその機序を明らかにする。また、我々の中和抗体が入ることによってPN蛋白質がどのような蛋白質と結合を阻害されるかを詳細に検討する予定である。また、悪性黒色腫や乳癌症例に外科切除例の臨床サンプルを用いて一方、マウス乳癌幹細胞の肺転移がPNKOマウスで著明に抑制されていることがH24年末のNature誌に掲載された。乳癌幹細胞自体はマウス4T1乳癌細胞とちがってPNを発現していないが、乳癌幹細胞の周辺のニッチを形成する線維芽細胞がPNを発現させており、このPNが乳癌幹細胞のWnt3aを活性化させて転移をさせていると報告されている。そこで、我々も同じ系を構築して、PN中和抗体がマウス乳癌幹細胞の転移に抑制効果があるかを検討する予定である。レンチウイルスを用いた実験を考えていたが、なんらかの問題が生じてペリオスチン遺伝子の導入ができなかった。そのため、方針を変更してペリオスチンによる癌幹細胞の転移の機序の解明にしたため。MDA-MB231細胞より癌幹細胞をFACSにて取り出し、スフェアーを作成してペリオスチン抗体の癌幹細胞への影響を解析する予定。Wnt3a以外の蛋白質との相互作用も解析していく予定。1、PN中和抗体による悪性黒色腫の原発巣の抑制及び肺転移抑制の機序の解明を予定している。