hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリアオートファジーの分子機構の解明

本研究では、ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)の分子機構について出芽酵母やヒト培養細胞を用いて解明することを目的とし研究を行った。その結果、ヒト培養細胞に於いて2つのMAPキナーゼErk2とp38のシグナル経路がマイトファジーに重要であること、出芽酵母では、マイトファジー必須因子であるAtg32の発現がTorの下流にあるSin3-Rpd3複合体によって制御さていることを明らかにした。また、隔離膜がミトコンドリアを包み込む過程でミトコンドリアを適切な大きさに千切りながらオートファゴソームを形成していることを明らかにした。ミトコンドリアオートファジー(略してマイトファジー)は、選択的なミトコンドリア分解機構である。マイトファジーは、ミトコンドリア品質管理に大きく貢献しており、様々な疾患にも関連する重要な現象であるが、ヒトを含む高等生物で、マイトファジーの分子機構はほとんど解明されていない。我々は、これまでに出芽酵母を用いた実験系において、マイトファジーに関連する遺伝子のスクリーニングを行い、マイトファジー関連因子の同定とその分子機構の解明を試みてきた。本研究では、これまでの研究を哺乳類まで発展させ、出芽酵母およびヒト細胞の実験系において、マイトファジーに関連する遺伝子の同定とその分子機構の解明を目的としている。平成26年度は、出芽酵母における研究では、マイトファジーに必須のミトコンドリア外膜タンパク質Atg32の発現を制御する機構に関して研究を進めた。Atg32の発現が、栄養飢餓やラパマイシン処理により大幅に増加することを見いだし、さらに、Atg32のプロモーター領域の詳細な研究を行った結果、Atg32の発現は、TORの下流でUme6-Sin3-Rpd3複合体により抑制されており、TORを抑制することでAtg32発現抑制が開放され、Atg32が発現するようになることを解明した。平成26年度は、同時にヒト培養細胞における研究を行い、種々のMAPキナーゼとマイトファジーの関連を検討した所、MAPキナーゼp38とErk2、及びその上流のシグナル経路がマイトファジー誘導に重要な役割を持つことを解明した。平成27年度は、出芽酵母における研究では、マイトファジーに必須なミトコンドリア外膜タンパク質Atg32のリン酸化制御に関する検討と行い、既に同定していたCK2によるAtg32のリン酸化を負に制御することでマイトファジーを抑制する機構が有ることを明らかにした。また、哺乳類における研究では、ミトコンドリアの形態とマイトファジーとの関係に付いて研究を進め、両者に需要な関連性が有ることを見出すことができた。また、研究をマウス動物モデルにまで発展させるための予備実験に成功している。本研究では、さらに線虫を用いた実験を推進しているが、線虫に関してはこれまでの所、特筆すべき研究成果は得られていない。本研究は、ミトコンドリアオートファジーの分子機構を出芽酵母、線虫、ヒト細胞を用いて解明しようとする研究であるが、平成27年度は、出芽酵母とヒト細胞を用いた研究で十分な成果が上がっており、当初の計画以上に進展していると判断した。また、研究をさらに発展させ、マウス実験も取り入れつつ有る。一方で、線虫の研究は、必ずしも予定通りに進展しているとは言えない。全体として考えると、おおむね順調に進展していると判断できる。ミトコンドリアオートファジー(略してマイトファジー)は、オートファジーによる選択的なミトコンドリア分解機構である。本研究では、これまでの出芽酵母での研究を発展させ、マイトファジーの分子機構の未解明な点を明らかにすると同時に、出芽酵母の研究をさらに哺乳類にまで発展させ、哺乳類でのマイトファジーの理解を進めることを目的としている。平成28年度は、隔離膜がミトコンドリアを選択し、包み込む過程の詳細な解析を行うことに成功した。ミトコンドリアは分裂と融合を繰り返し、その大きさを変化させるオルガネラである。このため、分裂が進むとミトコンドリアは直径が500nm程度の点状構造になるが、融合が進むと数千nmと棒状の形態を取るようになる。後者のミトコンドリアは、一般的なオートファゴソームの大きさを超えているため、これまでマイトファジーの前にミトコンドリア分裂が起こり、小さくなったミトコンドリアが分解されていると考えられてきた。本研究では、出芽酵母、哺乳類細胞を問わず、ミトコンドリア分裂因子破壊株でもマイトファジーが起こること示し、さらに、哺乳類細胞の詳細な蛍光顕微鏡解析により、隔離膜がミトコンドリアを包み込む過程で、ミトコンドリアを適切な大きさに千切り取っていることを明らかにした。

この研究成果は、従来の概念と大きく異なるもので、マイトファジーに限定すること無く、オートファジーが分解できる対象の大きさに制限がない可能性を示唆する初めての成果となった。本研究では、ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)の分子機構について出芽酵母やヒト培養細胞を用いて解明することを目的とし研究を行った。その結果、ヒト培養細胞に於いて2つのMAPキナーゼErk2とp38のシグナル経路がマイトファジーに重要であること、出芽酵母では、マイトファジー必須因子であるAtg32の発現がTorの下流にあるSin3-Rpd3複合体によって制御さていることを明らかにした。また、隔離膜がミトコンドリアを包み込む過程でミトコンドリアを適切な大きさに千切りながらオートファゴソームを形成していることを明らかにした。本研究は、ミトコンドリアオートファジーの分子機構を出芽酵母、線虫、ヒト細胞を用いて解明しようとする研究であるが、平成26年度では、既に出芽酵母とヒト細胞を用いた研究で成果が上がっており、当初の計画以上に進展していると判断した。一方で、線虫の研究は、マイトファジーの観察法の確立に時間を費やしており、必ずしも予定通りに進展しているとは言えない。全体として考えると、おおむね順調に進展していると判断できる。(1)出芽酵母においてミトコンドリア外膜タンパク質Atg32のリン酸化は、マイトファジーの最初のステップとして必須の修飾であることが判っている。これまでに、Atg32のリン酸化に関わるキナーゼとしてCK2を同定しているが、CK2によるAtg32のリン酸化がどのように制御されているかについては全く解明されていなかった。過去2年間でAtg32のリン酸化制御に関わる因子の探索により、リン酸化を制御する因子の候補がいくつか同定されている。今年度は、これらを詳細に確認し、Atg32リン酸化に強い影響を及ぼす因子を同定し、その機能解析を行う。(2)線虫を用いたマイトファジー研究は、マイトファジー観察法の樹立が困難であり、他の生物を用いた時ほど、スクリーニングに適した観察法が樹立できなかった。今年度は、これまでに得た線虫での研究成果を振り返り、何らか打開策を作っていく予定である。(3)ヒト培養細胞における研究は、順調に推移しており、過去2年間でミトコンドリア形態とマイトファジーとの関係などの解明に成功している。今年度は、これらの成果を論文として報告するとともに、マイトファジーとミトコンドリア恒常性に関する研究を進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学1,出芽酵母における研究では、予定通りにAtg32結合タンパク質の解析を行い、マイトファジー制御に関わる新規因子の同定を試みる。2,線虫における研究では、マイトファジー観察法の確立が遅れているため、平成27年度は本研究に力を入れ、観察法樹立に向けて研究を継続する。3,ヒト細胞を用いた研究では、これまでの研究をさらに発展させて、既に予備実験で同定している未発表因子とマイトファジーの関連を詳細に解析する。また、申請時には、遺伝子破壊をTALENを用いて行うことにしていたが、CRISPR-cas9という新たな遺伝子改変法を導入した所、非常に効率よく遺伝子破壊が可能であるため、本研究にもCRISPR-cas9を用いることとした。
非営利組織体の資源獲得と会計システム

本研究の目的は、非営利組織(NPO)の資源獲得と会計システムについて検討することであった。昨年度は、内外の文献研究及び資料収集、各地のNPOへの訪問調査を実施し、研究のフレームワークを作成した。今年度は、これらの成果を踏まえ、茨城県のNPO及び水戸市の任意団体に対するアンケート調査を行った。この2年間の研究から得られた主要な到達点は以下のとおりである。1.多くの非営利組織は、種々の資源獲得の場面において困難に直面している。その問題を解決するために、情報公開、特に会計情報の公開が必要である。なぜならば、情報公開によって組織の透明性が高まり、その組織がどのような活動を行い、どのように社会に貢献しているのかが明らかとなるからである。また、情報公開によって、市民の監視を受けることともなる。これらのことにより、人々の支援を受けやすくなると考えられる。2.評価システムに関しては、第三者機関を設置しなければならないと思われる。第三者機関の評価を受けることによって、より組織の信頼性が高まり、人々の支持がより受けやすくなるからである。現時点では存在しない第三者機関による評価システムを早急に導入すべきであると思われる。3.資源提供者と非営利組織とのミスマッチ問題を解決するために、中間支援組織の拡充を図るべきである。一方に資金、労働力、その他の資源を提供したい人々がいる反面、他方には資金、労働力、その他の資源を必要とする非営利組織が存在する。両者の中間にあって、それぞれが望むことをマッチさせる中間支援組織を今以上に充実すべきであると思われる。今後上記の事柄について、さらに研究を深めていきたい。本研究は、NPO法人の財政的調査から研究を始める予定であった。しかしながら、本研究の開始が年度途中からの開始であったため、当初の予定を変更せざるを得なかった。そこで本研究においては、文献によるサーベイを最初に行うこととした。NPO法人は、会費、事業収入、補助金等ばかりでなく、労働力、知識等まで幅広い資源提供がなされる組織体である。これらの資源提供者が提供する諸資源を獲得するための基本的視座の分析を、まずサーベイすることとした。それと同時に、全国各地(札幌、東京、大阪、福岡等)のNPOサポートセンターに赴き、ヒアリング調査を行った。NPOサポートセンターにヒアリング調査を行ったのは、全国各地のNPOの立ち上げに協力するNPOサポートセンターで、実際のNPOが資源獲得に関して、どのような問題を感じているのかを調査するためである。また、このヒアリングは、来年度に予定しているアンケート調査の質問項目を構成するための意味合いも含まれている。会計システムに関するフレームワーク構築に関しても、上記と同様の理由により文献サーベイから開始した。すなわち、情報の目的適合性、信頼性、理解可能性を確保するためには、いかなる特質を備えるべきであるのかが、検討された。上記ヒアリング調査においても、アカウンタビリティに関する自覚の欠如は散見された。来年度において予定しているアンケート調査においては、資源提供者の情報ニーズを可能な限り特定する予定である。NPO法人の社会的使命の遂行状況を説明するためには、資源提供者の情報ニーズが特定されなければならないからである。そして、会計基準設定のためのフレームワーク構築がなされる予定である。本研究は、NPO法人に関する会計基準を、資金の調達から管理運営を貫く基軸として捉えてきた。なぜならば、財務情報の情報公開によって、当該組織体の活動の透明性が推進され、もって市民による支援や監督が可能となると考えられるからである。会計基準の構築に当たっては、同じく非営利組織体である政府会計の研究成果はもとより、営利企業に対する会計基準の研究成果を取り入れて検討してきた。非営利組織体においては、営利企業のような明確な所有主持分が存在せず、組織体外部の様々な利害関係者が当該組織体のガバナンスを行ってゆく必要がある。それゆえ、様々な組織における会計基準を検討する必要性が存在する。

そのような中、「公益法人会計基準」が公表された意義は大きいと言うことができよう。この基準は、わが国の非営利会計において統一的な会計基準が存在しないなか、統一基準として定着が期待されるものであるが、学会ではこの基準への批判も多く見られるところである。この基準は、企業会計の理論と手法を積極的に導入しようとしたものであるが、NPO法人をどの様に理解するのかといった根本的な問題が存在している。また、NPO法人の法人格取得に関しても、法制的な検討が現在進められている。公益法人改革と相俟って、非営利法人制度の大幅な見直しが進められている。このようにNPO法人を取り巻く環境は、変動の最中にあるといってよい。そのような中にあって、将来に向けた議論を実のあるものとするためには、諸論点を整理したフレームワークが必要である。本研究では、そのようなフレームワークを構築するために従前の理論において不足している部分、また今後確立していかなければならない部分を確認することができた。アンケート調査の結果等については、本研究を取り纏めた報告書を参照されたい。
小脳室頂核による急速眼球運動制御の神経機構

眼球運動制御に関与する室頂核領域(oFN)への入力、及びそこからの脳幹への出力について、電気生理学的及び解剖学的方法を用いて解析を行った。oFNから脳幹への投射は外転神経核より尾側領域に終末は多く密に存在していたが、頭側の領域には密に存在せず、対側優位であった。この部位の網様体細胞(NRG)にはoFNから強い興奮性入力があるのに対し、頭側部の網様体細胞(NRPc)には余り入力がなかった。NRG細胞は、頚部運動細胞に投射し、眼球と頭部の共同運動(視線制御)に関わると考えられた。実際、NRG細胞は、視線運動中枢の対側上丘から強い興奮性の単シナプス入力と同側上丘からの2シナプス性入力を受けていた。平成23年度に、室頂核の眼球運動関連領域への入力を神経解剖学的方法を用いて解析を行い、主に上丘からの入力に関してまとめた。24年度は引き続き、その解析を室頂核からの出力について行った。上丘の微小電流刺激を行い、眼球運動を誘発する部位を同定した後、ガラス電極を介して微量のデキストランビオチン又はホースラディシュペルオキシデース)を眼球運動が誘発される上丘深層に圧注入した。一定の生存期間の後、切片標本を作製し、逆行性にラベルされる細胞体の分布を小脳核でマッピングを行なった。細胞は両側性に分布していたが、対側優位であった。前後軸方向の分布を見ると、尾側の背側部に分布しており、頭側腹側の室頂核には存在しなかった。この領域は、四肢・体幹を支配する室頂核領域と考えられてきた部位に相当する。一方、細胞が分布していた尾側背側の領域が、眼球運動領域であるかを確認するため、前もって小脳の微小電流刺激を行って眼球運動が誘発される領域を同定した動物で、同様の注入実験を行ったが、室頂核尾側の眼球運動誘発領域の中に、標識細胞は分布していた。電気刺激で眼球運動が誘発される領域は、逆行性標識細胞の分布領域より広範囲にわたっていたが、それは尾側の細胞からの出力の軸索の走行に一致していた。両側性室頂核以外に、それに比べて大型の細胞が多数近接する中位核に分布していた。これらの細胞は、いずれも反対側にしか存在しなかった。前者は、小脳皮質のlobule VIIのPurkinje細胞からの投射を受けており、後者は、小脳皮質中間部にある、ManoやHikosakaらによって見いだされた眼球運動関連領域のPurkinje細胞から抑制性の入力を受けている部位であることが明らかになった。上丘注入部位の検討では、頭側部位のtracer注入による逆行性標識が多く見られたが、尾側部の注入では標識される細胞数は遥かに少数であった。平成25年度は、室頂核の眼球運動関連領域から脳幹の標的細胞への投射経路を解明するため、電気生理学的及び解剖学的方法を用いて神経回路の解析を行った。小脳室頂核尾側部及び上丘を微小電流刺激し、網様体脊髄路細胞より細胞内記録を行い、シナプス入力のパターンを解析した。まず解剖学的に室頂核尾側部から脳幹への投射を調べる目的で、室頂核尾側部にデキストランビオチンを微量注入し、脳幹における軸索終末の分布をプロットし解析したところ、外転神経核より尾側の領域に終末は多く密に存在していたが、頭側の領域には終末は密には存在せず、この投射は対側優位であった。これらの解剖学的実験結果を基に、その投射部位に相当すると思われる脳幹網様体から細胞内記録を行い、網様体細胞を外転神経核よりも頭側にあるか尾側にあるかで分類してシナプス入力の性質を解析した。尾側の網様体細胞(NRG)には室頂核尾側部から非常に強い興奮性入力(EPSP)があるのに対し、頭側部の網様体細胞(NRPc)にはあまり入力はないことがわかった。このEPSPはその潜時から単シナプス性であると判定された。すでにItoらにより室頂核から網様体細胞への入力は報告されているが、それらは延髄に位置し四肢に投射する網様体脊髄路細胞であり、刺激部位が室頂核頭側部からであった。本実験の対象は、室頂核尾側部からの投射であり、より頭側脳幹の橋ー延髄境界部にある網様体脊髄細胞である。これらの細胞は、頸部運動細胞に投射し頭部の運動に関係しており、眼球運動と共同して視線制御に関わると考えられた。実際、これらの位置に存在する網様体脊髄細胞は、対側上丘から強い興奮性の単シナプス入力があるのみならず、同側上丘から2シナプス性の興奮性入力があることが明らかになった。以上を論文としてまとめJournal of Neurophysiologyに投稿し掲載された(Takahashi et al. 2014)。

NRG細胞は、頚部運動細胞に投射し、眼球と頭部の共同運動(視線制御)に関わると考えられた。実際、NRG細胞は、視線運動中枢の対側上丘から強い興奮性の単シナプス入力と同側上丘からの2シナプス性入力を受けていた。平成23年度:室頂核への上丘からの入力系についての解析を行い、それを基に室頂核の眼球運動関連領域から脳幹の標的細胞への投射経路の解析を行う。上丘-室頂核間の入出力関係を明らかにするため、解剖学的解析を行った。上丘の最前部(固視領域)、前部(眼球運動領域)、後部(頚運動領域)にtracerを注入し、室頂核に逆行性に染色される細胞の分布を解析した。その結果、tracerを上丘の前半部に注入した場合、室頂核に両側性に細胞が逆行性染色されたが、後半部の注入では染色される細胞はほとんどなかった。同側より対側に染色される細胞が多かった。次に、室頂核で微小電流刺激を用いsystematic mappingを行って、眼球運動を誘発する室頂核の部位とその誘発される眼球運動の性質を解析した。この結果を基に、室頂核の異なる部位に限局して順行性tracerを注入した実験を行った。現在、脳幹へ投射する神経終末の分布を詳しく解析し、各核内部位からの投射領域の同定を行っている。また、電気生理学的解析を行い、上丘から室頂核のうち上記で同定した眼球運動関連領域と、そこへ投射することが明らかとなった小脳虫部の部位(主にlobule VI, VII)のPurkinje細胞から神経活動及び電場電位を記録し、上丘からの入力について、苔状線維入力と登上線維入力の分布を調べた。上記の眼球運動関連領域の室頂核後部の腹側部とlobuleVIIに主に対側下オリーブ核を介して強い登上線維入力とそれより弱い苔状線維入力の入力パターンを明らかにした。それを基に、現在さらにそれぞれの入力を伝達する脳幹の中継核の同定を行っている。実験は計画通り順調に進展し、確実に次のステップへ進んでいる。上丘から小脳虫部や室頂核への入力経路、室頂核から脳幹への出力経路を、電気生理学的および解剖学的手法を用いて、詳細に解析し、小脳が眼球運動系においてシステムとしてどのように機能しているかを明らかにする。上丘から小脳虫部(lobule VI,VII)や室頂核への入力経路の中継核の同定を、電気生理学的および解剖学的手法を用いて、進めていく。研究費は主に、実験に用いる動物代、動物飼育料、手術関連薬品、染色用試薬などに用いる。
基礎地盤の液状化を考慮した液状化に伴う盛土の被害スクリーニング手法の開発

地震による盛土の被害形態は、(1)基礎地盤の液状化による被害、(2)慣性力による盛土本体の被害に大別できる。本研究では、(1)の基礎地盤の液状化による被害を対象として、基礎地盤条件に着目した被害スクリーニング手法を提案することを目的とした。動的遠心模型実験ならびに過去の地震被害の分析により、微地形区分に応じて、単純に液状化層と表層の非液状化層の厚さをパラメータとすることで、基礎地盤の液状化による盛土の被害をスクリーニングできることが分かった。道路・鉄道盛土や河川堤防などの盛土構造物は一般に延長が長い。このため、耐震診断や補強の優先順位の設定にあたり、比較的簡易な手法で地震による被害をスクリーニングする手法を構築することは重要である。本研究は盛土、堤防などの土構造物の耐震診断・設計・補強の合理化に資することを意図して、盛土の液状化による被害スクリーニング手法の開発を目的とする。H22年度は、過去の被害・無被害事例に着目した事例分析と、表層非液状化層に着目した動的遠心模型実験を行った.河川堤防の地震時被害事例に関する事例分析ならびに文献収集の結果、河川堤防の場合、地震による沈下の程度は地形区分に加えて、基礎地盤の土層構成にも強く依存し、本年度の文献調査の範囲では、液状花層厘が25mの範囲では、表層に5m以上の非液状化層が存在する場合には、堤防に有意な沈下が生じた事例はなかった。このととは、表層非液状化層の厚さがスクリーニングを行うための有用な指標であることを示唆している。これを実験的に検証するため、液状化層15mの上に高き6mの盛土が築造されている状況を想定した動的遠心模型実験を実施した。実験では、全層厚は一定としつつ、水位を低下させて表層非液状化層および液状化層の厚さを変化させた。表層非液状化層の厚さは0m、3m、6m、15mの4通りで、加振は1.5Hz20波の正弦波で行い、最大加速は約600galである。実験の結果、表層非液状化層の増大とともに盛土の沈下量は減少した。また、表層非液状化層厚が6mのケースでの盛土の沈下量は、表層非液状化層厚が15m、すなわち液状化層が無い場合とほぼ同程度だった。この結果は、事例分析の結果と定性的に対応しており、今後はさらなる事例収集とともに、数値解析にようて盛土高さ、液状化層厚、液状化層の液状化強度に関するパラメータスタディを行い、表層の非液状化層厚を指標とした盛土の地震被害スクリーニング手法を提案する。本検討では、(1)の基礎地盤の液状化による被害を対象として、基礎地盤条件に着目した被害スクリーニング手法を提案することを目的とした。一方で、平成23年3月11日に発生した東北地方太平洋沖地震においては、軟弱な粘性土地盤上に築堤された砂質土河川堤防の提体が粘性土の基礎地盤の圧密沈下によってめり込み、その結果地下水以深となった堤体部が液状化する被害形態が多く見られた。以上の背景を踏まえつつ、研究最終年度の今年度は、過去に実施した動的遠心模型実験の再現解析およびパラメータスタディを実施し、液状化強度・液状化層、非液状化層および堤防高さを指標とした堤防沈下量のノモグラムを作成し、過去の地震被害事例との照合を行った。その結果、微地形区分に応じて、単純に液状化層と表層の非液状化層の厚さをパラメータとすることで、本研究で対象とした基礎地盤の液状化による盛土の被害を概ねスクリーニングできることが分かった。具体的には、微地形区分と液状化層の厚さに応じて、液状化による盛土の被害が生じない非液状化層の最低厚さの目安を提示した。しかしながら、東北地方太平洋沖地震で多く確認されたような軟弱粘性土地盤にめり込んだ提体部分が液状化する被害形態については、提案するパラメータのみでは被害形態として抽出できないため、別途考慮しなければならないことも明らかとなった。このため、基礎地盤への提体のめり込み(圧密沈下)が認められない条件であることも、併せて付記しつつ基礎地盤条件によるスクリーニング法を提案することとした。
二重トンネル障壁におけるスピン偏極電子の輸送現象

本研究では,トンネルデバイスを作製するための装置の開発を行うとともに,トンネル素子の実現に必要な強磁性と反強磁性膜の交換結合などの要素技術についても詳細な検討を行った。また,トンネル接合の形成プロセスについても検討した。(1)二重トンネル接合は,4から5種類の金属を積層することによって構成される。また,マスクパターンの用いたプロセスが必要となる。このため,5元のマグネトロンスパッタリング装置に,超高真空中で交換可能なメタルマスク交換機構を取り付け,5層構成のトンネル素子の試作が可能なシステムを作製した。(2)Gaイオンをベースとした集束イオンビーム加工装置を用いて,CoFeB薄膜の微細加工を行い,1×1μm^2から0.2×0.2μm^2の磁性ドットを作製してその磁区パターンを走査型磁気力顕微鏡により観察した。(3)安定な反強磁性/強磁性交換結合二層膜の作製プロセスを検討するために,NiFe/MnIr2層膜を作製し,その交換異方性を測定した。その結果,交換異方性は,基板-ターゲット間距離に大きく依存しており,この距離を120mmとすることによって,MnIr層厚を4nm程度まで薄膜化できることが分かった。(4)NiFe/Al_2O_3/NiFe/MnIrという構成のトンネル素子をメタルマスクを用いて作製した。Al層の酸化方法をいろいろ試みたところ,Alターゲットを酸素中で順方向スパッタしたプラズマ中にAl層を配置する方法でトンネル接合が形成できることが分かった。ただ,トンネル抵抗変化率としては,0.3%程度の小さな値しか得られず・接合の形成方法を今後さらに改善する必要がある。本研究では,二重トンネル接合の作製を行う計画であるが,本年度は,トンネルデバイスを作製するための装置の開発とトンネル素子の実現に必要な強磁性と反強磁性膜の交換結合二層膜についていろいろな角度から検討を行った。このため,5元のマグネトロンスパッタリング装置に,超高真空中で交換可能なメタルマスク交換機構を取り付けた。これでスピンバルブ膜のラインを作製したところ,100μmのパターンが形成でき,磁気抵抗変化も得られた。(2) Gaイオンをベースとした集束イオンビーム加工装置を用いて,100μmのスピンバルブのラインを幅1μmの細線まで加工した。加工後の磁気抵抗効果は,加工前から大幅に変化し,零磁界近傍の急激な抵抗変化は見られなくなった。これは,反強磁性層の一方向異方性の細線化による変化と考えられる。(3)微細な素子において,良好な磁気抵抗特性を得るためには,安定な反強磁性/強磁性交換結合二層膜の作製プロセスが重要である。そこで,反強磁性体としてIrMn,強磁性層としてFeCoBを用いた交換結合二層膜を5元スパッタリング装置で作製し,その構造と磁気特性を系統的に調べた。その結果,IrMnの組成に関しては,Ir組成30から35%において交換結合磁界が極大値を示すことが分かった。また,成膜時のスパッタ圧に関しては,0.4から4Paまで変化させて結合磁界を調べたが,スパッタ圧の高いほうが大きな値を示した。これは,XRDの解析から,IrMnのγ相の(111)配向性が高まったためと考えられる。さらに,交換結合磁界のIrMn層厚依存性を調べたところ,交換結合磁界は,ある臨界膜厚で急激に立ち上がること,スパッタ圧が高いほどこの臨界膜厚が薄いことが分かった。

本年度は,トンネルデバイスを作製するための装置の開発を行うとともに,トンネル素子の実現に必要な強磁性と反強磁性膜の交換結合などの要素技術の開発,トンネル接合の形成方法などについて検討を行った。(1)二重トンネル接合は,4から5種類の金属を積層することによって構成される。また,マスクパターンの用いたプロセスが必要となる。このため,5元のマグネトロンスパッタリング装置に,超高真空中で交換可能なメタルマスク交換機構を取り付け,5層構成のトンネル素子の試作が可能なシステムを作製した。(2)Gaイオンをベースとした集束イオンビーム加工装置を用いて,CoFeB薄膜の微細加工を行い,1×1μm^2から0.2×0.2μm^2の磁性ドットを作製してその磁区パターンを走査型磁気力顕微鏡により観察した。(3)安定な反強磁性/強磁性交換結合二層膜の作製プロセスを検討するために,NiFe/MnIr2層膜を作製し,その交換異方性を測定した。その結果,交換異方性は,基板-ターゲット間距離に大きく依存しており,この距離を120mmとすることによって,MnIr層厚を4nm程度まで薄膜化できることが分かった。(4)NiFe/Al_2O_3/NiFe/MnIrという構成のトンネル素子をメタルマスクを用いて作製した。Al層の酸化方法をいろいろ試みたところ,Alターゲットを酸素中で順方向スパッタしたプラズマ中にAl層を配置する方法でトンネル接合が形成できることが分かった。ただ,トンネル抵抗変化率としては,0.3%程度の小さな値しか得られず,接合の形成方法を今後さらに改善する必要がある。
骨形成蛋白(BMP)による内分泌調節作用機序の解明とその臨床応用のための基礎研究

平成17年度における研究として、ヒト卵巣顆粒膜由来の細胞(KGN)を用いて下垂体ゴナドトロピンFSHと卵巣におけるBMPの機能連携についてさらに検討を深めた。KGN細胞にはBMP I型・II型受容体・Smadが発現し、BMPの添加によりFSH受容体発現は減弱した。FSHはALK-3・ActRII・BMPRII・Smad1/5の発現を増強し、抑制型Smad6/7の発現を減弱した。さらにFSHはBMPリガンド依存的にBMP-6,-7によるSmad1/5/8のリン酸化とDNA合成を促進した。Smad過剰発現モデルを用いた検討ではSmad1,5によるBMPシグナルの増強を認めた。I型受容体の過剰発現モデルではALK-3/ALK-6の過剰発現下においてBMP-6,-7作用の増強が見られ、FSHによるBMP作用の増強はI型受容体の発現亢進による可能性が示唆された。またBMPはKGN細胞のステロイド合成に作用し、特にプロゲステロンの合成を抑制した。BMPはforskolinによるcAMP合成には影響しないが、forskolinやcAMPによって刺激されたステロイド合成の律速段階であるStAR転写活性を抑制した。このようにBMPが顆粒膜細胞でのステロイド合成を抑制する一方で、FSHはBMP活性を増強する新しい「FSHとBMPの相互作用」の存在が見いだされた。また、卵母細胞に強い発現を認めるBMP-15を卵母細胞機能の診断ツールとして利用するためのアッセイ系の設立への基礎研究も進行中である。さらに性腺外の重要な内分泌系として、1)副腎髄質におけるBMPの影響についても評価した結果、副腎髄質細胞に対してBMPがカテコラミン分泌を抑制すること、2)卵巣同様のステロイド産生系をもつ副腎皮質においては、アルドステロン合成系においてBMP-6分子がアンギオテンシンIIによる副腎作用と協調的に作用することが証明された。このように、BMP分子が自己分泌・傍分泌機構により卵巣・副腎皮質・副腎髄質における内分泌調整機構を発揮することが新たに示された。今回の研究では、まずヒト卵巣顆粒膜由来の細胞株としてヒトKGN細胞を用い、下垂体から分泌されるゴナドトロピンFSHと卵巣におけるBMPの機能連携について検討した。顆粒膜初代培養細胞と同様に、KGN細胞にもBMPシステムの作動環境としてBMPのI型・II型受容体およびシグナル伝達因子Smadが発現しており、FSHの存在下ではFSH受容体を介してステロイド合成能を発揮できる。興味深いことにcDNAアレイを用いた検討では、FSHの存在下でこの細胞のBMP受容体やシグナル伝達系Smadの発現が増強された。現在、BMP応答レポーター遺伝子活性をもとに、この細胞における種々のBMP受容体サブユニットの過剰発現の影響と、FSHによるBMPシステムの活性化作用について比較検討中である。さらに、卵母細胞に強い発現を認めるBMP-15を卵母細胞機能の診断ツールとして利用するため、BMPアッセイ系の設立への基礎研究も進行中である。またBMPを生体内投与した場合に考慮すべき作用として、BMPが卵巣ステロイド合成に作用することから、生体内の他のステロイド合成系への干渉作用の存在が想定される。性腺外のステロイド合成系として、副腎皮質ステロイド合成におけるBMPの影響についても評価した。その結果として、ヒト副腎皮質培養細胞H295Rに発現するBMP-6が、副腎皮質刺激因子のなかでもアンギオテンシンIIと協調して副腎皮質ステロイドであるアルドステロンの産生・分泌を促進することが明らかとなり、BMPは卵巣のみならず卵巣外のステロイド合成系にも影響することが証明された。また、他の主な内分泌腺として、甲状腺でのBMP作用について検討したところ、甲状腺刺激ホルモンTSH作用への抑制作用が明らかとなった。このようにBMPは、自己分泌・傍分泌機構により卵巣・副腎皮質・甲状腺における内分泌調整機構を発揮することが明らかとなってきた。

さらに性腺外の重要な内分泌系として、1)副腎髄質におけるBMPの影響についても評価した結果、副腎髄質細胞に対してBMPがカテコラミン分泌を抑制すること、2)卵巣同様のステロイド産生系をもつ副腎皮質においては、アルドステロン合成系においてBMP-6分子がアンギオテンシンIIによる副腎作用と協調的に作用することが証明された。このように、BMP分子が自己分泌・傍分泌機構により卵巣・副腎皮質・副腎髄質における内分泌調整機構を発揮することが新たに示された。
消化器癌腹膜播種性転移細胞の生物学的活性度に及ぼす腹膜内温熱化学療法の影響

1、家兎移植可能固形腫瘍(VX2)を用いた癌性腹膜炎モデル動物の作製検討項目:1)VX2細胞浮遊液の作製方法、2)VX2細胞浮遊液の冷凍保存方法、3)腹腔内に注入するVX2細胞浮遊液の注入細胞量、4)腹腔内への注入方法、5)注入後の再開腹温熱療法施行時期の決定検討結果:1)MEM-Hunks液内での細切と極細網の金属メッシュ濾過操作に加え、0.25%トリプシン処理を行うことにより、良好な状態のVX2単離細胞浮遊液の作製が可能となった。(n=6)2)同一腫瘍による実験系の確立のため、VX2単離細胞に95%FCS+5%DMSO溶液を混入し、Slow-freezing Methodを用いて生存状態での冷凍保存に成功した。(n=1)3)温熱療法施行時にほぼ均一な癌性腹膜炎状態が得られることを目標に家兎16羽に対しVX2細胞浮遊液を、細胞数1×10^7個(n=3)、5×10^6個(n=3)、1×10^6個(n=10)腹腔内投与した。それぞれ1、2、3、4週間後に再開腹して、腹腔内へのVX2による腫瘍結節の播種状況を比較したところ、1×10^6個投与群で、3週間後にP_3と判定しうる結節径35mmの播種性転移が成立し、しかも個体差の少ない播種による癌性腹膜炎状態を得た。2、温熱療法至適温度の検討家兎の本術に対する耐術能の検討として健常家兎8羽に、開腹下温熱療法を43°C、45°Cで30分間行った。43°C温熱群は4羽中3羽が生存したが、45°C温熱群は4羽全例が死亡した。よって耐術上の温熱可能温度は43°Cと判明した。3、家兎癌性腹膜炎モデルに対する温熱療法単独での効果の検討(方法)VX2細胞浮遊液1×10^6個腹腔内注入3週間後の癌性腹膜炎モデルに対して43°C、30分間の開腹下温熱療法を行い(n=9)、本療法施行後5日目に再開腹を行い肉眼的評価及び、BrdU染色、PCNA染色による免疫組織化学的に増殖能の評価を行った。(結果)肉眼的評価は8羽中7羽がPD、1羽がNCで、BrdU染色による評価は細胞核内取り込みが悪く8羽全例が評価不能であった。PCNA labelingindexでは、温熱施行前のPCNA L.I.(n=4)は、63.3±8.3(Mean±SD)、施行後のPCNA L.I.(n=9)は、55.9±6.7(Mean±SD)と有意差は認めないものの、温熱療法により増殖能低下の傾向をうかがわせた.1、家兎移植可能固形腫瘍(VX2)を用いた癌性腹膜炎モデル動物の作製検討項目:1)VX2細胞浮遊液の作製方法、2)VX2細胞浮遊液の冷凍保存方法、3)腹腔内に注入するVX2細胞浮遊液の注入細胞量、4)腹腔内への注入方法、5)注入後の再開腹温熱療法施行時期の決定検討結果:1)MEM-Hunks液内での細切と極細網の金属メッシュ濾過操作に加え、0.25%トリプシン処理を行うことにより、良好な状態のVX2単離細胞浮遊液の作製が可能となった。(結果)

肉眼的評価は8羽中7羽がPD、1羽がNCで、BrdU染色による評価は細胞核内取り込みが悪く8羽全例が評価不能であった。PCNA labelingindexでは、温熱施行前のPCNA L.I.(n=4)は、63.3±8.3(Mean±SD)、施行後のPCNA L.I.(n=9)は、55.9±6.7(Mean±SD)と有意差は認めないものの、温熱療法により増殖能低下の傾向をうかがわせた.
CDH23遺伝子の大規模スクリーニングと難聴発症のメカニズムに関する研究

CDH23遺伝子変異は、遺伝子変異の種類によって臨床像が異なる事が報告されており、過去の報告では、ナンセンス変異やフレームシフト変異では、両側感音難聴と網膜色素変性症を合併するUsher症候群を呈するが、ミスセンス変異の場合には感音難聴のみを呈することが報告されている。本研究では、日本人感音難聴患者を対象にCDH23遺伝子解析を行い、遺伝子変異の種類と頻度を明らかにするとともに、その臨床像のとりまとめを行った。その結果26種類の新規遺伝子変異を見出すとともに、その臨床的特徴を明らかにした。CDH23遺伝子は、10q21-q22に位置し69個のexonから構成されている。コーディングされる蛋白質は、10065塩基・3354アミノ酸からなる27個のextracellular domainにより構成されており、細胞膜を1回貫通する膜蛋白質で細胞間接着因子の働きをしている。内耳の有毛細胞上に存在しPCDH15と共結合し動毛・不動毛間を架橋し、音刺激や前庭刺激を有毛細胞内に伝えイオンチャネルの開閉を制御している聴覚にとっては大変重要な分子である。deletionやNonsense mutation等蛋白質が大きく変化する場合は網膜色素変性症を併発するアッシャー症候群タイプ1Dを発症し、missense mutation等蛋白質が大きく変化しない場合は、常染色体劣性遺伝形式をとる非症候群性難聴(DFN12)を発症することが、過去の報告で明らかとなっている。当研究施設で以前64家系の日本人非症候群性難聴患者に対してCDH23遺伝子変異解析を実施したところ、17種類の新しいmisssense mutationを発見した。このうち4種類のmisssense mutationに関しては家系調査等で難聴の原因遺伝子であると判明し、論文で報告を行っている。今回、当施設で管理保存されている難聴患者DNA 1845検体に対し、インベーダー法を用い4種類の変異解析を実施したところ、52検体(2.8%)で変異が認められた。現在、臨床症状および家系調査を実施し総合的に評価を行っている。コーディングされる蛋白質は10065塩基・3354アミノ酸からなる。27個のextracellular domainにより構成されており、細胞膜を1回貫通する膜蛋白質で細胞間接着因子の働きをしている。過去の報告では、DeletionやNonsense mutation等蛋白質が大きく変化する場合は網膜色素変性症を併発するアッシャー症候群タイプ1Dを発症し、Missense mutation等蛋白質が大きく変化しない場合は、常染色体劣性遺伝形式をとる非症候群性難聴(DFN12)を発症することが、過去の報告で明らかとなっている。本年度は前年度までに、当施設で管理保存されている難聴患者DNA 1845検体に対し、インベーダー法を用い4種類の変異解析を実施し、変異が認められた52症例を対象に直接シークエンス法による解析を実施し、新規変異の候補16種類を見出した。本年度は、当研究施設で日本人非症候群性難聴患者1845検体に対してCDH23遺伝子変異解析を実施したところ、17種類の新しいmisssense mutationを発見した。また、見出された変異に関して臨床像のとりまとめを行ったところ、多くのケースで低音部に残存聴力を有する高音漸傾型の難聴を呈すること、また進行性の難聴となることを明らかにした。また、見出された変異のうちR2099

W変異のホモ接合体変異では発症年齢が50歳代と非常に遅く、遅発性あるいは緩やかな進行性の経緯をとることが明らかと成った。このことはC57BL6Jマウスが加齢性難聴の表現型を呈する原因遺伝子変異がCDH23に見つかるという過去の報告と一致する興味深いものであった。また、結果を論文として取りまとめた。
腸粘膜組織セロトニン量とトリプトファン可用性に着目した犬の炎症性腸疾患の病態解析

ヒトの過敏性腸症候群および炎症性腸疾患(IBD)では腸におけるセロトニン(5-HT)の産生ないし除去機構の異常が知られている。我々は以前,IBDの犬では腸の5-HT産生細胞数が多いことや,5-HT産生酵素や除去機構に関わる遺伝子転写量が健常犬群と異なる症例がいることを発見した。本研究では,血中と腸組織中5-HT濃度を健常群とIBD群とで比較した。5-HTおよび材料であるトリプトファンの炎症細胞への影響を培養条件下で調べ,それぞれ異なる結果を得た。そして炎症時に活発化すると言われるトリプトファン代謝経路の酵素IDO1の腸における遺伝子転写量を,他の5-HT関連遺伝子や臨床所見と比較解析した。消化管粘膜組織におけるセロトニン(5-HT)の産生および除去機構の変化は,ヒトの過敏性腸症候群(IBS)および炎症性腸疾患(IBD)の病態に深く関与している。筆者らは過去にIBDの犬で検討したところ,症例群では健常群に比べて消化管粘膜組織中の5-HT陽性細胞数が多く,5-HT産生に働く酵素TPH1の遺伝子mRNA量が少ないことを発見した。また組織中の5-HT除去機構であるセロトニントランスポーター(SERT)とTPH1をコードする各遺伝子のmRNA発現パターンが,症例犬群において健常犬群から逸脱する2パターン存在することを発見した。しかしその結果として実際の組織中ないし血中5-HT濃度に変化が生じているか否かは明らかでなかったことから,初年度に健常犬および症例犬でこれらを測定することを計画した。5-HT濃度の測定に最も多く用いられている手法は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)であるものの,これを直ちに利用できる環境になく,ヒトやマウスではELISA法によって消化管粘膜組織中5-HTを測定した報告があることから,市販の犬5-HT測定用ELISAキットを用いた。血中5-HT濃度もELISA法を用いて測定した。測定値自体は得られたものの,犬5-HTが測定できている確からしさを現在も検討中でると同時に,その結果として必要性が高ければ主要な測定手法であるHPLCに移行することの可能性も検討中である。初年度に併せて計画していた,疾患犬の検体の収集,それらの5-HT陽性細胞数,SERT遺伝子・TPH1遺伝子mRNA量の定量も予定通り続けている。筆者らは過去に犬において,IBD症例群では健常犬群に比べて消化管粘膜組織中の5-HTを産生するEC細胞に相当する5-HT陽性細胞の数が多く,5-HT産生に必要な酵素TPH1の遺伝子mRNA量が少ないことを発見した。また組織中の5-HT除去機構であるセロトニントランスポーター(SERT)とTPH1をコードする各遺伝子のmRNA発現パターンが,健常犬群と比較して逸脱する2パターンが症例犬群に存在することを発見した。上記の結果として実際の組織中ないし血中5-HT濃度に変化が生じているか否かは明らかでなかったことから,初年度に健常犬および症例犬でこれらを測定することを計画した。5-HT濃度を測定するには一般的に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が用いられるものの,これを直ちに利用できる環境になく,二次案としてヒトやマウスで消化管粘膜組織中5-HTを測定した報告のあるELISA法を用いて検討した。血中5-HT濃度は,食後の推移から,採用したELISA測定系で測定できている可能性が高いことが分かった。一方,組織中濃度は,犬用として市販されているELISAキットを使用し測定値自体は得られたものの,正確に測定できている確からしさが不十分であり,代替手法について検討を要すると考えている。また,犬の十二指腸粘膜生検組織からのリンパ球分離法は,参考にしたSoneaらの報告(Vet Immunol Immunopathol, 2000)に改変を加えた手技を確立した。なお,対象疾患群の検体収集や被検組織における5-HT陽性細胞数,SERT遺伝子・TPH1遺伝子mRNA量の定量も予定通り継続しており症例のデータを蓄積中である。【健常犬および症例犬の消化管粘膜組織中および血中セロトニンの定量・比較】「研究実績の概要」に記載したとおり,消化管粘膜組織中のセロトニン濃度については,当初予定していたELISA法を用いた測定が正確でない可能性が考えられ,高速液体クロマトグラフィー含め別の手段への変更も検討しなければならないと考えている。血中のセロトニン濃度は,採用したELISA測定系の確からしさを確認したため,これを用いることとした。【トリプトファン可用性によるリンパ球の反応生の検討】犬の消化管粘膜生検組織からリンパ球を分離する手法については,「研究実績の概要」に記載したとおり,確立することができ,当初の予定通りである。IBDは犬でも発生が多いものの,重症度や標準的な治療への反応生が症例ごとに様座万であることが小動物臨床における問題となっている。申請者は先行研究において,犬IBDで初めて,消化管の「5-HT環境」に着目した病態解析を行った。

5-HTは,アミノ酸であるトリプトファンが材料となりTPH1という酵素の働きによってEC細胞から産生されるが,先行研究の結果,症例犬群では健常犬群に比べて消化管粘膜組織中の5-HT陽性細胞(EC細胞に相当)の数が多く,5-HT産生に働く酵素TPH1の遺伝子mRNA量が少ないことを発見した。これをヒントに平成28年度は,TPH1発現低下によって生じていると考えられるトリプトファン余剰状態が炎症の主役である組織中リンパ球の反応生に与える影響を解析することを計画した。本試験では,前年度の計画通り確立した手法を用いて犬の十二指腸粘膜組織から分離したリンパ球を用いるが,トリプトファンを添加した条件で犬のリンパ球を初めて培養するにあたり,細胞毒性をはじめとした問題が生じる可能性もあるため,まずは採取が簡単で比較的消化管粘膜組織中リンパ球とポピュレーションが似ている犬の末梢血由来リンパ球を用いて予備実験を行っている。検討項目の1つであるリアルタイムPCR法を用いた各種サイトカインmRNA量の解析に必要な条件検討においては,標的サイトカインに対する既報のプライマー配列に問題を見つけたため,改良作業が必要であった(予想以上に時間がかかったため期間延長承認申請書を提出し,認められた)。この問題は解決できたため,今後,一部終了している予備実験を完了させたのち,本試験へと移行する予定である。【トリプトファン可用性によるリンパ球の反応生の検討】犬の消化管粘膜生検組織からリンパ球を分離する手法については,すでに前年度に確立している。しかし「研究実績の概要」に記載したとおり,測定系の予備実験および条件検討に時間を要したため,予定よりも進捗が遅れている。代表者らの先行研究で,犬炎症性腸疾患(以下cIBD)の消化管粘膜組織のセロトニン(以下5HT)環境は健常犬群と異なり,トリプトファン(以下Trp)を5HTに変換する酵素TPH1の遺伝子mRNA量が少ないことが明らかとなった。これに加えて,局所におけるTPH1の欠乏とそれによるTrpの余剰状態が免疫寛容の破綻や過剰な炎症反応の一因となるというマウスの報告をヒントに,cIBDの病態とTrp代謝に着目した解析を計画した。H2829年度,Trpを添加して犬のリンパ球を初めて培養するにあたり細胞毒性などの問題が生じる可能性を考慮し,まずは犬の末梢血由来リンパ球を用いて予備実験を行った。Trp非添加,5,50,500μg/mlの条件下で培養し,生細胞数およびサイトカイン遺伝子mRNA量(IL-17, IL-21, IFN-γ)を定量した。その結果,全項目で培養液中のTrp濃度による違いは認められなかった。一方,分離した腸粘膜由来リンパ球はどのような条件下であっても培養に耐えられず早期に死滅してしまうことが判明した。細胞を得る際に避けられない物理的および化学的な処理が細胞にダメージを加えている可能性が考えられた。細胞培養によるTrp余剰状態の再現実験が技術的に困難であると判断し,Trp代謝と腸炎の関係性を別の角度から検討した。特に腸ではIDO1という酵素を介するTrp代謝経路が知られている。IDO1は局所のトリプトファンを減らし,活性化したT細胞の鎮静化や制御生T細胞の促進を介して,炎症に対する負のフィードバック機構として働いていると言われている。ヒトのIBD患者や腸炎モデル動物におけるIDO1の発現増加や,IDO1インヒビターがマウスの腸炎を悪化させた報告がある。
無機系先端材料の組織制御と塑性加工性,表面加工性およびトライボロジ-

組織制御と塑性加工関係では:1.強度3000MPa以上のものの開發よりも,3000MPaのものをうるためのプロセシングの安定性の向上の研究に重点をおいた。1つの結論として,スリップ・キャスチング成形法は一軸加圧成形法にくらべて有利であると判断された。2.強度3000MPaの發現機構については,焼結体に存在する残留応力,ZrO_2部分の転位による変形,ZrO_2ーAl_2C_3間の相互拡散,その他こうあれば強くなるであろうと考えられる多くの条件の重畳がもたらしたものであると考えられた。3.10%程度のZrO_2を含むMgO焼結体においては,MgOの粒成長が抑制され,予期した通り,このMgOーZrO_2系の焼結体で超塑性的挙動が確認された。4.SiC/MgO複合焼結体で,ナノ分散したSiC微粒子は,MgOの拡散や,転位の移動を抑制し,MgO焼結体の耐クリ-プ特性をいちじるしく向上させることを明らかにした。5.TiーAl2元素TiAl基合金は,加工熱処理によって(α+γ)2相層状構造から(α+γ)微細等軸粒組織に変えることができた。またこの微細等軸粒組織では数100%におよぶ超塑性を發現した。表面加工,トライボロジ-関係では:1.酸化物セラミックスにたいするAg,Pt,Cuなどの金属の摩耗摩擦について,環境雰囲気との関係をしらべ,新しい多くの知見をえた。2.非酸化物セラミックスについても,トライボロジ-的な多くの知見をえた。3.ZrO_2・Al_2O_3系複合セラミックスの表面加工後に残る残留応力について,ZrO_2,Al_2O_3それぞれについて詳細な新しいデ-タを提出した。
ハニカム状フィルムを支持体とした多細胞型人工脂質膜の創製

多細胞型人工脂質膜の支持体の作製を目的として、移流集積法を用いてポリスチレンビーズを銅板メッシュ内の50μmの矩形領域にほぼ規則的に集積させる手法を確立した。そのビーズ配列を鋳型とした無電解金属電鋳と鋳型の溶解除去によって球殻構造体を得て、FIB加工とSEM観察で開口部の径や内部構造を明らかにした。この構造体にペインティング法等を用いて脂質膜を展開し、孔内が外部環境と区画されていることを蛍光観察にて確認した。また、脂質膜に膜融合性リポソームを用いてイオノフォアを導入し脂質膜中のイオン透過現象を蛍光観察にて追跡した。今年度は主に以下の3点の研究課題に取り組んだ1.多細胞型人工脂質膜の支持体である高分子ハニカムフィルムを直径4mmの銅板メッシュと一体形成する手法を確立した。これは高分子ハニカム自身に対する更なる支持体として系の機械的強度を上げる事と、メッシュにてハニカム構造を区画化することで物質移動や観察対象の単位として用いる事を狙ったものである。メッシュ上に高分子溶液をキャストしハニカムを自己組織的に生成させた後に余分な部分を剥離除去することで目的の構造体を得ることが出来た。さらに1MeVのプロトンビームを照射することにより二次加工も可能であることが確認された。2.多細胞型脂質膜中に導入したグラミシジン(イオノフォアの一種)のイオン透過能を追跡する手法に発展させるために、まず単独のリポソームに導入したグラミシジンのイオン透過能を定量する手法を開発した。リポソーム内包部に導入したpH指示薬であるピラニンを用いて評価するという手法自体は既報のものであるが、回帰分析によって速度因子を良好に定量することができた。測定はリポソームに対して非破壊的であり、3回程度の繰返し性を持つ。3.リン脂質膜の蛍光修飾手段として新たに長鎖アルキル基を導入した希土類錯体を分子設計・合成し、リポソーム導入効率を測定した。合成は長鎖アルデヒドから得たジアミン経て鋳型縮合をすることで達成された。長鎖アルキル基を持たない類似体に比べ高いリポソーム導入効率を持つことも確認された。概要で説明した課題1は最終目標である多細胞型人工脂質膜の作成・観察を容易にし、本研究課題全体の進捗を前進させるものと考えている。ただし、ハニカム上に形成した脂質膜の膜容量を測定して二分子膜形成を確認するという段階には至らず、期待通りの進捗が得られない部分も存在している。今年度は主に以下の3点の研究課題を取り組んだ1.移流集積法を用いてポリスチレンビーズを直径4mmの銅板メッシュ内にほぼ規則的に集積させる手法を確立した。その後さらに無電解金属電鋳とビーズの溶解除去を施すことで、多細胞型人工脂質膜の支持体となる球殻構造体を得た。本法で得られる構造体は区画されているため、従来の一様に充填された球殻構造体に比べ人工膜の観察・操作において利点を持つ。また階層的な生体組織を模倣したモデルとなり得る構造である。本構造対に対してペンティング法を用いることで部分的に脂質二重膜が形成されていることが示唆された。2.多細胞型脂質膜を作製するために従来のリポソーム作製方法を改良した。まず、導電性基板(ITO膜)上にPDMSスタンプを用いて脂質膜パターンを作製した後にエレクトロフォーメーション法(EF法)にて多細胞型ベシクルを作製した。生成したベシクルの多くは基板から遊離しないために倒立顕微鏡での観察が容易であり、グラミシジン導入膜のイオン透過現象の蛍光顕微観察などにも成功した。この手法を1.で得られた球殻構造体に適用することで機械的強度に富んだ人工脂質膜を作製することが可能になると考えている。3.人工脂質膜への膜タンパク質導入に資する脂質ナノディスクの作製方法を検討した。従来用いられている膜骨格タンパク質よりも調製の容易な20量体程度のペプチドでのナノディスクの形成をQCM・DLS等で追跡し、最適なアミノ酸配列や二次構造について知見を得た。ハニカムフィルム内への人工脂質膜の作成手法をより洗練させる事、今年度不首尾に終わったハニカム内脂質膜の電気的測定手法を改善する事、酵素固定化したビーズを利用して局所的な小胞内酵素反応を実行・確認する事などを行うことで研究全体を推進させていきたい。生体関連化学今年度と次年度にまたがって使用するクロマトグラフィーの部品を更新しようとしたが、今年度の残額では費用がまかなえないため、次年度分と合算して購入することにした。上記の部品を購入するために消耗品費として予算執行する予定である。