hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネいもち病抵抗性NLRタンパク質による病原菌エフェクター認識の分子機構の解明

いもち病を防除するアプローチとして、NLRs(Nucleotide-binding Leucine rich repeat Receptors)として知られる細胞内免疫受容体をコードするイネ抵抗性遺伝子を用いた抵抗性品種の利用が実施されている。植物のNLRsに組み込まれている特殊な領域(Integrated Domain: ID)は、病原体から分泌されたエフェクタータンパク質を直接認識し、免疫反応を誘導する。イネの免疫受容体ペアであるPik-1/Pik-2とRGA5/RGA4は、いずれもIDとしてHeavy Metal Associated(HMA)領域を持ち、このHMA領域でイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)エフェクターAVR-PikとAVR-Piaをそれぞれ認識する。AVR-PikとAVR-PiaはMAX(Magnaporthe Avrs and ToxB-like)エフェクターファミリーに属し、主要な立体構造は保存されている。どのようにしてIDが構造的に類似した異なるエフェクターを特異的に認識するのかを解明することにより、植物免疫受容体とエフェクターの共進化と機能の理解が導かれるであろう。本研究では、イネのNLRペアPikp-1/Pikp-2がミスマッチのエフェクターであるAVR-Piaに対してin plantaで免疫反応を誘導し、Pikp-HMA領域はin vitroでAVR-Piaと結合することを明らかにした。AVR-Piaと結合したPikp-HMAの結晶構造は、AVR-Pikエフェクターとの結合と比較して異なる結合接点を示し、この結果はID/エフェクター相互作用の適応性を示唆する。本研究では、一つのNLRがIDを介してどのように複数の病原体エフェクターを認識するのかを見出し、多様なエフェクターを認識できる免疫受容体の人工設計の可能性を示した。2「PikpのHMA領域はin vitroでAVR-Piaと結合する」初めにPik-HMA領域とAVR-Piaが複合体を形成するかどうかを定性的に確認するためにゲル濾過クロマトグラフィーを活用し、次に結合親和性を測定するために表面プラズモン共鳴を用いた。その結果、Pikm-HMAとAVR-Piaの間では結合が認められず、Pikp-HMAはAVR-Piaと結合し、in vitroでの相互作用がin plantaでの反応と相関することが確認された。3「Pikp-HMAはAVR-PikDとの結合とは異なる接点でAVR-Piaと結合する」Pikp-HMAとAVR-Piaの間で形成された結合接点を視覚化し、AVR-Pikとの結合接点と比較するために、これらのタンパク質間の複合体を精製し、X線結晶構造解析により1.9 Aの解像度で構造を決定した。その結果、驚いたことに、Pikp-HMA/AVR-Pia複合体とPikp-HMA/AVR-Pik複合体において主要な折りたたみ構造は同一であったが、Pikp-HMAとAVR-Piaの結合接点は、AVR-Pikエフェクターとの結合接点と完全に異なっていた。以上の結果を取りまとめてbioRxivに発表した。ペアで機能するNLR免疫受容体は、通常負の制御を通して働くと考えられている。すなわち、片方のNLRはもう一方のNLRの活性を抑制しており、この抑制は病原体エフェクターの探知によって解放され、シグナル伝達が誘導される。しかしながら、これが全てのNLRペアの機能による包括的な機構であるかどうかは分かっていない。そこで今後の研究では、Pikp-1/Pikp-2とAVR-PikDの関係において、NLRsとそのエフェクターの両方の協同作用によって細胞死が誘導されることを証明する。申請者らは、N. benthamiana葉においてPikp-1、Pikp-2、AVR-PikDエフェクターを単独でまたは組み合わせで発現させたところ、3者を共発現させた場合でのみHRが誘導されることを明らかにし、イネで見られる反応をN. benthamianaで再現できることを示した。そこで、共免疫沈降法によってin plantaでのこれらのタンパク質の相互作用を調べる。また、NLRの協同作用機構を解明するために、Pikp-1とPikp-2の欠失変異体シリーズをN. benthamiana葉で過剰発現させ、AVR-PikDの存在下でNLRのどの領域が細胞死をサポートするのかを調査する。NLRのNB-ARC領域には高度に保存されたP-loopおよびMHDモチーフがあり、これらのモチーフはNLR機能において重要な役割を果たすことで知られている。そこで、Pikp-1とPikp-2に存在するP-loopとMHDモチーフの突然変異体を各々作成し、免疫受容体としての機能に及ぼす両モチーフの役割を解明する。以上の研究を実施することで、既報のNLRペアによる免疫機構とは異なり、Pikp-1とPikp-2は協調的に働いてエフェクターを認識し、植物の免疫機構を誘導するという新奇の免疫シグナル伝達機構の存在を提唱する。イネの免疫受容体ペアであるPik-1/Pik-2とRGA5/RGA4は、いずれもIDとしてHeavy Metal Associated(HMA)領域を持ち、このHMA領域でイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)

エフェクターAVR-PikとAVR-Piaをそれぞれ認識する。AVR-PikとAVR-PiaはMAX(Magnaporthe Avrs and ToxB-like)エフェクターファミリーに属し、主要な立体構造は保存されている。どのようにしてIDが構造的に類似した異なるエフェクターを特異的に認識するのかを解明することにより、植物免疫受容体とエフェクターの共進化と機能の理解が導かれるであろう。本研究では、イネのNLRペアPikp-1/Pikp-2がミスマッチのエフェクターであるAVR-Piaに対してin plantaで免疫反応を誘導し、Pikp-HMA領域はin vitroでAVR-Piaと結合することを明らかにした。AVR-Piaと結合したPikp-HMAの結晶構造は、AVR-Pikエフェクターとの結合と比較して異なる結合接点を示し、この結果はID/エフェクター相互作用の適応性を示唆する。本研究では、一つのNLRがIDを介してどのように複数の病原体エフェクターを認識するのかを見出し、多様なエフェクターを認識できる免疫受容体の人工設計の可能性を示した。2「PikpのHMA領域はin vitroでAVR-Piaと結合する」初めにPik-HMA領域とAVR-Piaが複合体を形成するかどうかを定性的に確認するためにゲル濾過クロマトグラフィーを活用し、次に結合親和性を測定するために表面プラズモン共鳴を用いた。その結果、Pikm-HMAとAVR-Piaの間では結合が認められず、Pikp-HMAはAVR-Piaと結合し、in vitroでの相互作用がin plantaでの反応と相関することが確認された。3「Pikp-HMAはAVR-PikDとの結合とは異なる接点でAVR-Piaと結合する」Pikp-HMAとAVR-Piaの間で形成された結合接点を視覚化し、AVR-Pikとの結合接点と比較するために、これらのタンパク質間の複合体を精製し、X線結晶構造解析により1.9 Aの解像度で構造を決定した。その結果、驚いたことに、Pikp-HMA/AVR-Pia複合体とPikp-HMA/AVR-Pik複合体において主要な折りたたみ構造は同一であったが、Pikp-HMAとAVR-Piaの結合接点は、AVR-Pikエフェクターとの結合接点と完全に異なっていた。以上の結果を取りまとめてbioRxivに発表した。ペアで機能するNLR免疫受容体は、通常負の制御を通して働くと考えられている。すなわち、片方のNLRはもう一方のNLRの活性を抑制しており、この抑制は病原体エフェクターの探知によって解放され、シグナル伝達が誘導される。しかしながら、これが全てのNLRペアの機能による包括的な機構であるかどうかは分かっていない。そこで今後の研究では、Pikp-1/Pikp-2とAVR-PikDの関係において、NLRsとそのエフェクターの両方の協同作用によって細胞死が誘導されることを証明する。
室内隅角部の表面熱伝達特性に関する実験的研究

本年度は,昨年度作成した壁面近傍気温測定装置の一部を改善し,恒温室内に設置した模型壁面ならびに実際の室内壁面を対象に測定し,検討した. 1.壁面近傍気温測定装置の改善;この研究では,対流熱伝達率は,壁面近傍の気温勾配と空気の熱コンダクタンスより伝達熱量を求め,この値を壁面温度と壁面から10cmの位置の気温との差で除して求めている.本研究では, 1)表面温度は壁面近傍気温勾配より推定する.2)実際の室内の壁面測定対象にするため,従前に比べ,センサーの測定壁面への速やか,かつ正確な移動および設置ができるよう改善した.2.模型壁面(平面壁,取合い部分)の対流熱伝達率の測定:平面壁では,熱伝達率は床から25cmの位置において最小値, 50cmで最大値をとり,更に上方になるに従い漸減する傾向を明らかにした.また取合い部分については,その近傍では,壁面中央部に比べ熱伝達率は小さくなる傾向を確認した.3.実際の室内壁面の対流熱伝達率の測定:暖房時の対流熱伝達率について測定した.対流熱伝達率特性については現在解析中であるが,熱伝達率の値は模型壁面と略同様23kcal/m^2h°Cである.4.今後の研究計画について:(1)今回の測定方法によって,実際の室内壁面を対象とした対流熱伝達率測定が可能であることは確認したが,暖冷房時は吹き出し気流に起因する室内気流があるため,対流熱伝達率の定量化に当っては,この室内気流の把握方法を確立する必要があると考える.(2)本研究では実際の室内壁面を対象としたため,壁面から0.53mmまでの気温勾配より熱伝達率を求めてきたが,模型壁面における結果からみると壁面上方ならびに取合い部分については,更に基礎的な研究が必要と考える.上記の室内気流等の問題点を解明した後,室内側熱伝達率値を提案したいと考える.本年度は,昨年度作成した壁面近傍気温測定装置の一部を改善し,恒温室内に設置した模型壁面ならびに実際の室内壁面を対象に測定し,検討した.1.壁面近傍気温測定装置の改善;この研究では,対流熱伝達率は,壁面近傍の気温勾配と空気の熱コンダクタンスより伝達熱量を求め,この値を壁面温度と壁面から10cmの位置の気温との差で除して求めている.本研究では, 1)表面温度は壁面近傍気温勾配より推定する.2)実際の室内の壁面測定対象にするため,従前に比べ,センサーの測定壁面への速やか,かつ正確な移動および設置ができるよう改善した.2.模型壁面(平面壁,取合い部分)の対流熱伝達率の測定:平面壁では,熱伝達率は床から25cmの位置において最小値, 50cmで最大値をとり,更に上方になるに従い漸減する傾向を明らかにした.また取合い部分については,その近傍では,壁面中央部に比べ熱伝達率は小さくなる傾向を確認した.3.実際の室内壁面の対流熱伝達率の測定:暖房時の対流熱伝達率について測定した.対流熱伝達率特性については現在解析中であるが,熱伝達率の値は模型壁面と略同様23kcal/m^2h°Cである.4.今後の研究計画について:(1)今回の測定方法によって,実際の室内壁面を対象とした対流熱伝達率測定が可能であることは確認したが,暖冷房時は吹き出し気流に起因する室内気流があるため,対流熱伝達率の定量化に当っては,この室内気流の把握方法を確立する必要があると考える.(2)本研究では実際の室内壁面を対象としたため,壁面から0.53mmまでの気温勾配より熱伝達率を求めてきたが,模型壁面における結果からみると壁面上方ならびに取合い部分については,更に基礎的な研究が必要と考える.上記の室内気流等の問題点を解明した後,室内側熱伝達率値を提案したいと考える.本年度は、室内表面の対流熱伝達率を測定するための装置を作成し、恒温室においてその装置の測定精度ならびに測定方法について実験・検討した。1壁面近傍気温測定装置の作成:この研究では、対流熱伝達量を壁面近傍の気温勾配と空気の熱コンダクタンスより算出する方法を採っている。そのため、隅角部における壁面近傍の気温を正確かつ容易に測定できる気温測定装置ならびにそのセンサー部を任意の位置に移動することができる装置を大型のカメラスタンドの一部を改良して作成した。2対流熱伝達率の測定方法と測定精度に関する検討:現在までに非恒温室において、測定所要時間内の気温変動に伴い生ずる測定誤差について実験・検討を行なってきた。本年度は、測定装置自身による誤差について考察するため、恒温室内において、単一板の模型壁面を対象に実験し、センサーとセンサーホルダの位置関係を正確に測定できれば、壁面近傍気温より表面温度を推定すること、壁面近傍02mmの範囲で45点測定すれば熱伝達量を求めることが可能であることを得た。3実大壁模型装置の作成:模型壁面の熱源には面状発熱体を用い、それを比例制御装置でコントロールし、隅角部の対流熱伝達率を求めたが、その際に用いる気温については定説もないため、今後の研究課題の一つとなった。以上の実験研究より、室内中央部ならびに隅角部の局所熱伝達率の測定方法とその問題点が明らかになったので、来年度以降は、出来る限り多くの建築物の室内壁面を対象に測定し、種々の壁面・隔角部の類別化を計り、その結果を恒温実験室の模型壁面において検討し、設計値としての対流熱伝達率と対流熱伝達率の測定方法を提案したいと考えている。
ゲノム情報解析のためのUNIXシェルの開発

柔軟性・拡張性に富むユーザ志向型のゲノム情報解析の環境をUNIX上で構築するひとつの方法は、ゲノム情報解析のためのツール群をディスク上のコマンドファイルとして作成することである。しかし、このような方法で構築された環境では、柔軟性を実現するために解析ツール・コマンドの再利用性・汎用性を高めると、プロセス間通信によるツール・プロセス間のデータの受渡しが増加するために、解析の処理速度が大幅に低下する問題がある。さらに、ネットワークへの対応も困難である。本研究で開発を行なったgshでは、これらの問題を解決するためにクライアント/サーバ・モデルを採用し、データの受渡しの多い解析ツールをひとつのサーバプロセスのサービスとして提供するようにした。さらに、サーバ上にUNIX型のファイルシステムを構築し、解析にもちいるデータの管理も同時にできるようにした。サーバ上に実現した、標準入出力機能、リダイレクション機能、パイプライン機能、ファイルシステムを利用すれば、サーバがサポートする解析ツール間のデータの受渡しを同一のプロセス内で行なうことができる。したがって、単純な解析ツールを組み合わせて複雑な解析を行なう場合でも、プロセス間通信により繰り返しデータの受渡しを行なうことがないので、高速な処理が可能である。本年度は、ゲノムのマッピング解析の研究の中でこの環境を実際に使用し、ゲノムの情報解析で広く利用できるシステムとして完成させた。
イチジクコバチにおける寄主植物への適応の遺伝的基盤の解明

イチジク属植物と絶対共生関係にあるイチジクコバチを対象に、寄主利用を決定づけるゲノム領域の探索を行なった。利用する寄主植物種が異なるイヌビワコバチとその近縁種の比較により、種間で遺伝的分化の特に大きい領域が複数見出された。これらの領域の近傍には、イチジクコバチの寄主利用を決定づけるゲノム領域が位置している可能性がある。本研究では、イチジクコバチの種群を材料に、次世代シークエンサーを用いた解析により点突然変異をマーカーにしたゲノム規模の相関解析を行う。そして寄主植物の異なる種間・集団間の比較により、種ごとに特定の寄主植物の利用を可能にするゲノム領域を明らかにする。新たに解読するイヌビワコバチのゲノムや他種のゲノムを参照配列として、寄主であるイチジク属植物への適応に関わる遺伝子群の探索を行う。一連の解析結果により、イチジクコバチにおける寄主利用の遺伝的基盤を明らかにすることを目指す。本年度は日本・台湾で採集したイチジクコバチ(イヌビワコバチBlastophaga nipponicaとその近縁種3種)を用いて、種ごとに特定の寄主植物の利用を可能にするゲノム領域の解明に取り組んだ。合計130個体の次世代シークエンサーを用いたddRAD-seq解析により得られている99,424遺伝子座の種間・集団間の遺伝的分化の程度を調べた。その結果、ミトコンドリアDNAや核DNA(マイクロサテライトマーカー)と同様に、台湾に分布するイヌビワコバチを含む3種のほとんどの遺伝子座では寄主植物の違いに対応した遺伝的分化が見られないことが明らかになった。台湾の3種は、比較的最近の絶滅と寄主転換により、現在の「1種コバチ:多種イチジク」の関係になった可能性が示唆された。さらにこれら3種間で遺伝的分化の大きな(種特異的な対立遺伝子を持つ)遺伝子座の探索を行った。これらの遺伝子座は、寄主植物への適応に関わるゲノム領域のマーカーとして利用できる可能性がある。予備的ではあるが、種間で特に遺伝的分化の大きな遺伝子座(FST=1)として合計46領域が見出された。見出されたマーカーの周辺の塩基配列の決定・ゲノム上での位置の特定のためにイヌビワコバチのゲノム配列の解読に着手し、配列情報の取得を行った。当初の計画通りに解析に必要な種群を選定することができ、参照配列に用いるイヌビワコバチのゲノムの解読に必要な配列情報の取得を行い、解析に必要な基盤が整ったため。一方で、種間で遺伝的分化の大きな領域をマーカーとして見出すための解析は予備的なものしかできていないため次年度以降に検討する必要がある。本研究では、イチジクコバチの種群を材料に、次世代シークエンサーを用いた解析により検出した点突然変異をマーカーにゲノム規模の相関解析を行う。本年度はイヌビワコバチBlastophaga nipponica(日本集団32個体・台湾集団33個体)とその近縁種B. taiwanensis(台湾集団30個体)を材料に、ゲノム規模の情報を用いた比較により寄主適応の遺伝的基盤を明らかにしようとした。他の近縁種B. tannoensis・B. yeniを合わせたddRAD-seq法による解析でこれまで得られた99,424遺伝子座のうち、欠測値50%未満のもの・2対立遺伝子のものを選抜した結果、3,323遺伝子座が得られた。これらの遺伝子座の配列情報を用いて種間・集団間での遺伝的分化の程度を調べた。その結果、中立な条件のもとで期待される遺伝的分化とは異なり、種間で特に大きな遺伝的分化を示す領域が複数見出された。昨年度に引き続き、見出されたマーカーの周辺配列の決定・ゲノム上での位置の特定のためにイヌビワコバチのゲノム配列情報の取得を行った。年度の途中(10月)に所属機関(生命誌研究館・奨励研究員から大阪府立環境農林水産総合研究所・任期付研究員)の変更があり、当初の計画通りにエフォートを割くことが難しくなったため。最終年度である本年度は、イヌビワコバチBlastophaga nipponica(日本集団32個体・台湾集団33個体)とその近縁種B. taiwanensis(台湾集団30個体)を材料に、ゲノム規模の情報を用いた比較を行った。その結果、両種の台湾集団間の遺伝的分化の程度は小さいことが明らかになった(FST=0.026)。

さらに、この傾向とは異なり、種間で特に大きな遺伝的分化を示す領域が10領域見出された。これらの領域のうち、寄主植物の違いに対応した分化の傾向を示す領域(3領域)について、新規に配列を取得したイヌビワコバチのドラフトゲノムを元に周辺に位置する遺伝子の特定を試みた。ゲノム上の位置が推定できた領域は全て遺伝子間領域に位置していた。当初の予想とは異なり、周辺に位置する遺伝子に共通した機能を見いだすことはできなかった。イチジク属植物と絶対共生関係にあるイチジクコバチを対象に、寄主利用を決定づけるゲノム領域の探索を行なった。利用する寄主植物種が異なるイヌビワコバチとその近縁種の比較により、種間で遺伝的分化の特に大きい領域が複数見出された。これらの領域の近傍には、イチジクコバチの寄主利用を決定づけるゲノム領域が位置している可能性がある。寄主植物の違いと相関のあるゲノム領域を検出するため、集団史を考慮したシミュレーションにより得られた塩基配列情報と比較する等、種間の遺伝的分化についての解析方法の改良を検討する。マーカー周辺の塩基配列の決定と候補領域のゲノム上での位置の特定のためにイヌビワコバチを用いてドラフトゲノム配列を構築する。種間比較により見出されたマーカー周辺の塩基配列の決定とゲノム上での位置の特定のために、これまでに取得した配列情報をもとにイヌビワコバチのドラフトゲノム配列の構築を試みる。所属機関に当該研究の実施環境がほとんど整備されておらず、その整備に時間を要するため、必要があれば共同研究や外注により解析を行うことを検討する。分子生態学・集団遺伝学・昆虫分類学複数の業者から見積もりを取る等、消耗品の調達方法の工夫により当初計画と比べ経費の節約が出来たため。年度の途中(10月)に所属機関(生命誌研究館・奨励研究員から大阪府立環境農林水産総合研究所・任期付研究員)の変更があり、当初の予定通りの予算執行が出来なかったため。次年度の消耗品費として使用する予定である。
サツマイモおよびキャッサバの耐旱性評価に関する共同研究

高根域温度条件がサツマイモとキャッサバの根系および地上部の発育に及ぼす影響の評価人工気象室内において気温25°C、根域温度25°C、40°Cを設定し、両種の地上部の成育反応、根系については、構成要素レベルでの発生・伸長反応を精査した。実験と採取した試料の解析・分析の一部は昨年度中に行ない、その残りを本年度行なった。両種とも、地上部で認められた高根域温度に対する反応は促進的であり、これまで報告した、イネ科作物の場合とは対照的であった。根系反応では、根系全体でみた場合、サツマイモでは促進的、キャッサバでは抑制的であったが、根系要素別にみると、両種ともとくに高次側根の発育が促進されることを見いだした。なお、この概要は第2回アジア作物学会議(1995年8月21日25日)において発表し(様式5、10研究発表参照)、現在投稿論文を取りまとめ中である。2.キャッサバの活着期の根系発達に及ぼす土壌乾燥の影響の評価活着期、すなわち植え付けから約3ケ月後までのキャッサバに対する、乾燥の時期および期間の及ぼす影響を、とくに根系発達に注目して検討した。植え付け後944日に乾燥処理を与えた場合(前期乾燥処理)、4482日に同処理を与えた場合(後期乾燥処理)、いずれも土壌を湿潤に保った対照区と比べて葉数、地上部乾物重が有意に減少した。また、植え付け後982日目まで乾燥処理を与えた区(全期乾燥処理)では、後期乾燥処理区と類似の地上部生長の減少傾向が認められた。根系発達についてみると、前期乾燥処理区では、不定根数・長、第1次・2次・3次側根数、乾物重が減少した。しかし再灌水後、これらの値は増加する傾向を示した。一方、後期乾燥処理区では、同様の不定根数・長、第1次、第2次側根数は乾燥によって減少したが、第3次側根数は促進される傾向を認めた。また、不定根が太くなることによって、根系乾物重も増加した。全体として、これらの結果はキャッサバは活着期においては乾燥に対して感受性が高いことを示している。なお、この結果は原著論文として日本作物学会紀事に公表した(様式5、10研究発表参照)。つづいて、この成果をさらに発展させるために、サツマイモを加え、対象品種、乾燥処理時間・方法を増やした、いくつかのポット実験を昨年度から開始している。現在、順次、採取した試料の解析、分析を進めている。また、この成果が出た段階で、これらの種・品種の水分生理を含めた耐旱性と根系発達・機能を、圃場試験によって評価することを計画している。現在実験圃場にそのための雨よけシェルターを作成中である。3.農家圃場におけるサツマイモ根系発達の調査フィリピン国レイテ州の、4農家のサツマイモ圃場(Abuyog,Salvacion,Calipayan,San Austin)において、土壌の性質、およびサツマイモ根系の土壌深度別分布を調査した。その結果、土性はすべてシルト質壌土であった。また、4調査地間では、表層5cmまでの土壌水分は、1321%、有機物含有量は1.761.86%、リン含有量は30.243.4ppm、カリウム含有量は13.733.8%、pHは、5.035.19の範囲にあった。また、根長密度・根重密度および土壌貫入抵抗値の土層別分布についての結果を現在解析中である。今後もこの調査を継続し、ポット・圃場試験の結果と比較する予定である。以上のように、本研究は、これまでほとんど未解明であったこれらの作物の根系発達と、その土壌温度・水分に対する反応性を明らかにしつつある。得られた成果の一部は、すでに公表済みか、あるいはその直前の段階に至っているが、他の多くの部分は実験・調査が継続中であり、それらはすべて、現段階ではフィリピン側の研究所において行なわれている。したがって、今後は、実験が終了したものから共同でデータを取りまとめ、これらの作物の根系発達・機能が、それらの耐旱性において果たす役割の実態を明らかにし、論文として公表していく予定である。また、新たな研究のための予算を申請する計画を立案中である。2.キャッサバの活着期の根系発達に及ぼす土壌乾燥の影響の評価

活着期、すなわち植え付けから約3ケ月後までのキャッサバに対する、乾燥の時期および期間の及ぼす影響を、とくに根系発達に注目して検討した。植え付け後944日に乾燥処理を与えた場合(前期乾燥処理)、4482日に同処理を与えた場合(後期乾燥処理)、いずれも土壌を湿潤に保った対照区と比べて葉数、地上部乾物重が有意に減少した。また、植え付け後982日目まで乾燥処理を与えた区(全期乾燥処理)では、後期乾燥処理区と類似の地上部生長の減少傾向が認められた。根系発達についてみると、前期乾燥処理区では、不定根数・長、第1次・2次・3次側根数、乾物重が減少した。しかし再灌水後、これらの値は増加する傾向を示した。一方、後期乾燥処理区では、同様の不定根数・長、第1次、第2次側根数は乾燥によって減少したが、第3次側根数は促進される傾向を認めた。また、不定根が太くなることによって、根系乾物重も増加した。全体として、これらの結果はキャッサバは活着期においては乾燥に対して感受性が高いことを示している。なお、この結果は原著論文として日本作物学会紀事に公表した(様式5、10研究発表参照)。つづいて、この成果をさらに発展させるために、サツマイモを加え、対象品種、乾燥処理時間・方法を増やした、いくつかのポット実験を昨年度から開始している。現在、順次、採取した試料の解析、分析を進めている。また、この成果が出た段階で、これらの種・品種の水分生理を含めた耐旱性と根系発達・機能を、圃場試験によって評価することを計画している。現在実験圃場にそのための雨よけシェルターを作成中である。3.農家圃場におけるサツマイモ根系発達の調査フィリピン国レイテ州の、4農家のサツマイモ圃場(Abuyog,Salvacion,Calipayan,San Austin)において、土壌の性質、およびサツマイモ根系の土壌深度別分布を調査した。その結果、土性はすべてシルト質壌土であった。また、4調査地間では、表層5cmまでの土壌水分は、1321%、有機物含有量は1.761.86%、リン含有量は30.243.4ppm、カリウム含有量は13.733.8%、pHは、5.035.19の範囲にあった。また、根長密度・根重密度および土壌貫入抵抗値の土層別分布についての結果を現在解析中である。今後もこの調査を継続し、ポット・圃場試験の結果と比較する予定である。以上のように、本研究は、これまでほとんど未解明であったこれらの作物の根系発達と、その土壌温度・水分に対する反応性を明らかにしつつある。得られた成果の一部は、すでに公表済みか、あるいはその直前の段階に至っているが、他の多くの部分は実験・調査が継続中であり、それらはすべて、現段階ではフィリピン側の研究所において行なわれている。したがって、今後は、実験が終了したものから共同でデータを取りまとめ、これらの作物の根系発達・機能が、それらの耐旱性において果たす役割の実態を明らかにし、論文として公表していく予定である。また、新たな研究のための予算を申請する計画を立案中である。相手側の大学がこれまでに収集したサツマイモ54品種、キャッサバ38品種の中から、採取地域のとくに水文学的環境、および栽培上の経験から判断して、耐旱性において異なると考えられるものを各種14品種選定した。そしてこれらをビニールポットト内で約2ヵ月間生育させ、その結果、これらの品種間で、不定根の長さ・走行角・発生数、側根の発達程度、それに伴う根系の土層別分布において明瞭な差異が認められた。そこでこられの根系写真を撮影し、採取した根系について、さらに詳しい調査を始めた。
量子ホール系における非対角長距離秩序と複合粒子対の対称性

量子ホール系は典型的な強相関電子系であり,内部自由度の存在は電子相関に大きな影響を及ぼす.特に,層自由度を持つ二層量子ホール系においては,相関の様子を決めるパラメータ(層間トンネルの振幅や層間隔の大きさ)を制御できるため,多彩な状態が実現される.この層自由度は擬スピンを用いてよく記述されるが,ランダウ準位占有率がν=1/(奇数)の場合には,基底状態に擬スピン強磁性秩序が形成される.なかでも,最も基本的なν=1の擬スピン強磁性相に対しては,基底状態波動関数が一般化されたコヒーレント状態で表されることを乱雑位相近似で示した.この結果は,量子ホール系における電子・正孔対をポゾンとして近似することに基づいているが,今年度はこのアプローチをさらに進めた.つまり,Quantum Hall Ferromagnetと呼ばれるν=1/(奇数)のスピン自由度を持つ量子ホール系に対し,そのフェルミ多体系ゆえの非線形性をボゾン化法に基づいて解析した(その成果の一部は来年度前半に「物性研究」に発表される予定).現在もこのアプローチから研究を継続中であり,ボーズ凝縮との関連も追究する予定である.また,最近は複合粒子の対形成の可能性や非対角長距離秩序の存在が指摘されているが,それらに関しても理論的考察を進め,その内容の一部を1999年3月10日配本の著書の中で報告した.この教科書は,分数量子ホール効果の研究の最近の進展をまとめたもので,青木秀夫教授(東大理)をその共著者とする.量子ホール系は強相関電子系の典型例であり、内部自由度の存在は電子相関に大きな影響を及ぼす。なかでも、層自由度を持つ二層量子ホール系は、相関のようすを決めるパラメータ(層間トンネルの振幅や層間隔の大きさ)を制御できるため、多彩な状態が実現される点で興味深い。層自由度はしばしば擬スピンを用いて記述されるが、この擬スピンが強磁性秩序を形成するランダウ準位占有率ν=1/(奇数)の場合に今年度は注目した。複合フェルミオン描像を用いることにより、基底状態を論ずる際にはν=1の場合のみを考えれば十分であるため、まずν=1の擬スピン強磁性相における基底状態波動関数を乱雑位相近似の範囲内で解析的に求めた。この結果として、擬スピン強磁性相に属する一般のパラメータに対し、基底状態は擬マグノンのスクイーズド真空にほかならないことがわかった。スクイーズド状態とは一般化されたコヒーレント状態で、相関効果を反映して量子揺らぎ異方的になった状態である。特に、層間トンネル振幅が小さくなるにつれて、基底状態がスピーン・コヒーレント状態(電子・正孔系のBCS状態)からずれてゆき(スクイーズの度合いが強くなり)、北川・上田らにより提案されていたスピン・スクイーズド状態がこの現実の系において実現されることが明らかになった。また、この強磁性相における電子(あるいは、複合フェルミオン)間の対相関は、スピン3重項のp波ペアリングであると予想されるが、系のパラメータの変化による対相関の変化を追求するために、非対角長距離秩序相関関数も含めて理論的定式化を継続中である。量子ホール系は典型的な強相関電子系であり,内部自由度の存在は電子相関に大きな影響を及ぼす.特に,層自由度を持つ二層量子ホール系においては,相関の様子を決めるパラメータ(層間トンネルの振幅や層間隔の大きさ)を制御できるため,多彩な状態が実現される.この層自由度は擬スピンを用いてよく記述されるが,ランダウ準位占有率がν=1/(奇数)の場合には,基底状態に擬スピン強磁性秩序が形成される.なかでも,最も基本的なν=1の擬スピン強磁性相に対しては,基底状態波動関数が一般化されたコヒーレント状態で表されることを乱雑位相近似で示した.この結果は,量子ホール系における電子・正孔対をポゾンとして近似することに基づいているが,今年度はこのアプローチをさらに進めた.つまり,Quantum Hall Ferromagnetと呼ばれるν=1/(奇数)のスピン自由度を持つ量子ホール系に対し,そのフェルミ多体系ゆえの非線形性をボゾン化法に基づいて解析した(その成果の一部は来年度前半に「物性研究」に発表される予定).現在もこのアプローチから研究を継続中であり,ボーズ凝縮との関連も追究する予定である.また,最近は複合粒子の対形成の可能性や非対角長距離秩序の存在が指摘されているが,それらに関しても理論的考察を進め,その内容の一部を1999年3月10日配本の著書の中で報告した.この教科書は,分数量子ホール効果の研究の最近の進展をまとめたもので,青木秀夫教授(東大理)をその共著者とする.
視覚的分析技術を使ったビッグデータからの偏微分方程式の導出

本年度、正則化回帰を適用して、本質的な偏微分項を絞り、効果的に偏微分方程式の導出する手法を開発した。具体的には、時系列データが定義される離散点毎に、できるだけ多くの偏微分項から構成される線形偏微分方程式として、時間偏微分項を表現した。本研究では、疑似計測データを使って、もとの偏微分方程式の偏微分項を含む複数の偏微分項を計算し、変数削減を使った重回帰や正則化回帰を適用し、各偏微分項に対する係数を計算する。変数削減には、各係数に対するP値を閾値として、そして、正則化には、一般的なLpノルム正則化を用いる。非ゼロの係数に対する偏微分項がもとの偏微分項を含んでいるかどうかを確認する。回帰分析を適用して,本質的な偏微分項を絞ることができるかどうかを確認するために。一次元の反応拡散方程式,バーガース方程式,KdV方程式に関して導出実験を行った。空間領域における時系列測定から偏微分方程式を導出するために,境界条件や初期条件を変えることで,4種類のデータをそれぞれの偏微分方程式について生成し,これを疑似時計測データとした.そのデータから,最大500タイムステップ分の時系列データを取り出して,それに対して回帰分析を適用することにより,その有効性を検証した.偏微分項データは,疑似計測データを用いて基本的には差分法で計算した.ここで,三階偏微分項と四階偏微分項に関しては,差分法での導出の際の誤差があまりにも大きいと考えられるために,三次スプライン補間を用いて偏微分項を導出した.この結果、正則化回帰よりも変数削減法を使った重回帰の方が導出精度が高いこと、そして、多様な初期条件・境界条件で計算された結果を使い、条件の網羅性を高めると、偏微分方程式の導出におけるノイズ耐性が大きくなることが明らかになった。申請時には、仮説「正則化回帰を適用すれば、重要な偏微分項を絞ることができ、効果的な偏微分方程式の導出を可能にする。」を検証するための計画を記載していた。この仮説を検証するために、時系列データが定義される離散点毎に、できるだけ多くの偏微分項から構成される線形システムとして、時間偏微分項を表現する。解析解または数値解の存在する偏微分方程式において、時空間であらかじめ求解しておき、もとの偏微分方程式の偏微分項を含む複数の偏微分項を計算し、正則化回帰を適用し、各偏微分項に対する係数を計算する。非ゼロの係数に対する偏微分項がもとの偏微分項を含んでいるかどうかを確認することができた。また、変数削減法を使った重回帰分析の適用も行い、両者の比較も行うことができたからである。今年度は、仮説「収束的交差写像法を適用すれば、時間偏微分に影響を及ぼす偏微分項を選択することができ、効果的に偏微分方程式の導出を可能にする。」を検証するための実験を行う予定である。今年度中には、偏微分項の各ペアに対して、時系列データが定義される離散点毎に因果関係を評価し、その強度をスカラデータとして可視化し、因果強度の空間分布を俯瞰的に理解することを期待する。具体的には、解析解または数値解の存在する偏微分方程式において、時空間であらかじめ求解しておき、もとの偏微分方程式の偏微分項を含む複数の偏微分項ペアに対する複数スカラデータを俯瞰可視化し、もとの偏微分項を選択できるかどうかを確認する。具体的には、複数の偏微分項ペアに対する因果強度スカラデータに対して個別の色付けを行い、俯瞰的可視化手法としてボリュームレンダリング手法を用いて、複数スカラデータの融合的可視化を行う。具体的には、ある偏微分項に対しては、同一の色相で、その値に対して、彩度・値を変化させるような色付けを行う。また、不透明度については、スカラデータの値が不透明度と正の相関を持つように変化させる。また、可視化手法を半透明等値面表示に変更したときと比較を行い、ボリュームレンダリング法の優位性を確認する。さらに、数値解法で利用した格子の解像度がどの程度、偏微分項の特定に影響するかを評価する予定である。空間領域における時系列測定から偏微分方程式を導出するために,境界条件や初期条件を変えることで,4種類のデータをそれぞれの偏微分方程式について生成し,これを疑似時計測データとした.そのデータから,最大500タイムステップ分の時系列データを取り出して,それに対して回帰分析を適用することにより,その有効性を検証した.偏微分項データは,疑似計測データを用いて基本的には差分法で計算した.

ここで,三階偏微分項と四階偏微分項に関しては,差分法での導出の際の誤差があまりにも大きいと考えられるために,三次スプライン補間を用いて偏微分項を導出した.この結果、正則化回帰よりも変数削減法を使った重回帰の方が導出精度が高いこと、そして、多様な初期条件・境界条件で計算された結果を使い、条件の網羅性を高めると、偏微分方程式の導出におけるノイズ耐性が大きくなることが明らかになった。申請時には、仮説「正則化回帰を適用すれば、重要な偏微分項を絞ることができ、効果的な偏微分方程式の導出を可能にする。」を検証するための計画を記載していた。この仮説を検証するために、時系列データが定義される離散点毎に、できるだけ多くの偏微分項から構成される線形システムとして、時間偏微分項を表現する。解析解または数値解の存在する偏微分方程式において、時空間であらかじめ求解しておき、もとの偏微分方程式の偏微分項を含む複数の偏微分項を計算し、正則化回帰を適用し、各偏微分項に対する係数を計算する。非ゼロの係数に対する偏微分項がもとの偏微分項を含んでいるかどうかを確認することができた。また、変数削減法を使った重回帰分析の適用も行い、両者の比較も行うことができたからである。今年度は、仮説「収束的交差写像法を適用すれば、時間偏微分に影響を及ぼす偏微分項を選択することができ、効果的に偏微分方程式の導出を可能にする。」を検証するための実験を行う予定である。今年度中には、偏微分項の各ペアに対して、時系列データが定義される離散点毎に因果関係を評価し、その強度をスカラデータとして可視化し、因果強度の空間分布を俯瞰的に理解することを期待する。具体的には、解析解または数値解の存在する偏微分方程式において、時空間であらかじめ求解しておき、もとの偏微分方程式の偏微分項を含む複数の偏微分項ペアに対する複数スカラデータを俯瞰可視化し、もとの偏微分項を選択できるかどうかを確認する。具体的には、複数の偏微分項ペアに対する因果強度スカラデータに対して個別の色付けを行い、俯瞰的可視化手法としてボリュームレンダリング手法を用いて、複数スカラデータの融合的可視化を行う。具体的には、ある偏微分項に対しては、同一の色相で、その値に対して、彩度・値を変化させるような色付けを行う。また、不透明度については、スカラデータの値が不透明度と正の相関を持つように変化させる。また、可視化手法を半透明等値面表示に変更したときと比較を行い、ボリュームレンダリング法の優位性を確認する。さらに、数値解法で利用した格子の解像度がどの程度、偏微分項の特定に影響するかを評価する予定である。
ヒト消化器癌において化学療法感受性を規定する遺伝学的諸因子の同定

(1)ミスマッチ修復活性を正確に評価できる系の開発種々のDNA修復系のなかでもミスマッチ修復系は抗癌剤がもたらすDNA障害に深く関与していると考えられる。これまで、遺伝子の変異が未知である細胞や組織検体のミスマッチ修復活性を評価する方法としてはマイクロサテライト不安定性解析があったが、従来法は方法論的に問題の多いものであった。われわれは近年著しい発達を見せている蛍光標識による核酸泳動技術を導入して、正確で客観的な新しいマイクロサテライト不安定性解析法を構築し、既に発表した(Nucleic Acids Res.25:3415-3420,1997)。この系の完成により、ミスマッチ修復遺伝子の変異が知られていないものについても正確にミスマッチ修復異常が検索できるようになり、この研究計画において重要な進歩となった。(2)ミスマッチ修復異常と抗癌剤感受性について1)の研究を受けて、7種のヒト大腸癌細胞細胞株のマイクロサテライト不安定性をサブクローン同志を比較することで解析、ミスマッチ修復能を評価した(投稿中)。現在、同じ細胞株において各種抗癌剤の感受性を検討中である。また、多くの臨床検体においてもマイクロサテライト不安定性解析によりミスマッチ修復異常の検索を開始した。II.in vivoにおけるp53遺伝子変異と抗癌剤感受性p53遺伝子の変異の有無が知られている腫瘍細胞株をヌードマウスに移植し抗癌剤、特に5FUの感受性を細胞生物学的に評価したところ、遺伝子型により特異な反応をみせた。とくに抗癌剤が誘導するアポトーシスは細胞種により著しく異なり、p53やその他の細胞死にかかわる遺伝子を評価し抗癌剤感受性を予測することの意義が示された(BritJ Cancer.in press)。
受容体型癌遺伝子c-erbB-2を指標とした診断と治療

1.血清c-erbB-2の測定系を確立し、その応用をこころみて次の成果をえた。a)EIAによる測定系を、健康人346例をもとに作成し13.0%、再発乳癌の陽性率51.2%との値をえた。b)RIAによる測定系では、同じく13.0%、47.9%であった。c)乳癌組織抽出液では過剰発現例は39.3%であった。このテストは以上の結果より、実用化の域に入ったと考えられる。現在、健康保険適用の可能性について厚生省で審議されている。2.その他ErbB-2蛋白、遺伝子および関連遺伝子についての研究を行い、次の成果をえた。a)ErbB-2のリガンドとしてエストラデオールが機能しうることを示した。b)新しい受容体型チロシンキナーゼbrtを同定した。c)新しいチロシンキナーゼを含むキメラ蛋白P80を同定した。1.乳癌におけるc-erbB-2の診断上の有用性についての検討。国立がんセンター、民間企業ニチレイ、栄研とともに、外科、病院検査部を中心とする研究グループを組織し、乳癌診断、および病状のモニターに際しての血清erbB-2価測定の有用性について検討中である。すでに2回会合を開き、約200例の乳癌症例についての結果を得ている。現在結果の解析が進行しており、1993年秋にこのまとめの論文を発刊することを予定している。2.erbB-2リガンドの決定。erbB-2は受容体型細胞膜蛋白であり、特定のリガンドと結合して機能することが予想されている。このリガンドの同定を進め、ステロイドホルモンE2(17b-estradiol)がerbB-2蛋白に直接結合してそのキナーゼ活性を高進させること、また、erbB-2発現NIH3T3細胞をE2処理することにより、細胞表面からerbB-2蛋白がダウンレギユレートすることや、この細胞がトランスホーム細胞のように形態変化をおこすことを見いだした。これらの知見に立脚して、修飾E2を利用してerbB-2過剰発現癌細胞の増殖を選択的に抑性する方法を検討している。3.膀胱癌における臨床病理学的検討以前から我々はerbB-2蛋白が、乳癌のみならず膀胱癌においても高頻度に発現高進を示すことを報告してきたが、本年度は多数症例をもとにして、その発現高進と患者の臨床経過との相関をもとめ、両者がよく相関すること、従ってerbB-2が膀胱癌の有力な予後因子として使用できることをしめした。1.乳がん診断における血清ErbB-2蛋白値測定の有用性:全国8施設の外科、検査部の参加する研究会を組織して、乳癌の診断におけるErbB-2蛋白の有用性について検討した。400例をこえる症例の血清、組織片、組織抽出液、コントロール血清などを、EIA,RIAをもちいて検索した。以下に主要なデータを示す。2)ErbB-2蛋白測定に際してのEIA法とRIA法の値はほぼ完全に相関した。3)遺伝子の増幅のみられた症例は有意に高い抽出液中のErbB-2蛋白値を示した。4)乳癌のうち免疫染色が陽性であった症例は46/117例、39.3%であった。5)同じく遺伝子の増幅がみられた症例は14/56例、25.0%であった。6)他の腫瘍マーカーとの組み合わせでは、CA15-3,ST439との組み合わせが特に良好であった。そのほか多角的にデータを解析し、EIAおよびRIAによる本検索が、診断にきわめて有効であり、実用化が可能であることを示した。この結果は現在投稿中であり、また診断薬として健康保険適用を申請中である。2.ErbB-2を同定する単クローン抗体を新たに数種、共同研究によって開発した。3.本研究の過程で、特殊な悪性リンパ腫の発生にかかわる新しいキナーゼ蛋白を発見した。現在投稿中である。1.血清ErbB-2の測定系を確立し、その臨床応用をこころみ、成果を得た。a)EIAによる測定系を、健常人364例をもとに作成し、原発乳癌の陽性率13.0%((24)/(185)),再発乳癌陽性率51.2%((62)/(121))との値を得た。

b)RIAによる測定系では同じく原発13.0%((24)/(185)),再発47.9%((58)/(121))との値を得た。c)乳癌組織抽出液では過剰発現例は39.3%((46)/(117))であった。本試験は以上より実用化の域に入った。現在健康保健適用について厚生省で審議されている。2.その他ErbB-2蛋白、遺伝子および関連遺伝子について以下の諸点を解明した。a)ErbB-2のリガンドとしてエストラジオールが機能しうることを示した。b)新しい受容体型チロシンキナーゼbrtを同定した。c)新しいチロシンキナーゼを含むキメラ蛋白p80を同定した。
ＭａｓｓＡＲＲＡＹを用いたマウス腫瘍特異的遺伝子のヒト神経芽腫における網羅的解析

ヒト神経芽腫の新規腫瘍関連遺伝子同定を目的として、皮膚腫瘍モデルマウスを用いたスクリーニングから絞り込んだ腫瘍関連遺伝子についてヒト神経芽腫における変異を解析し、さらに、それらの変異と臨床データとの関連を調べた。DNAメチル化解析および遺伝子発現解析の結果、TFAP2Eが腫瘍組織で高発現・低メチル化を示し、その遺伝子発現はCpG island-1のメチル化により制御されている可能性が示唆された。また、生存解析からTFAP2E CpGi-1の低メチル化は予後不良因子であることが示された。本研究結果より、TFAP2Eがヒト神経芽腫の新規腫瘍関連遺伝子である可能性が強く示唆された。DNAメチル化は胚発生・分化に重要なDNA修飾機構のひとつであるが、近年DNAメチル化の異常が様々な腫瘍の発生に関与していることが報告されている。我々は皮膚腫瘍モデルマウスを作製し、その正常皮膚と皮膚腫瘍を用いてDNAメチル化解析と遺伝子発現解析を網羅的に行った。その結果、腫瘍組織で高メチル化・低発現を示した遺伝子が1個、逆に腫瘍組織で低メチル化・高発現を示した遺伝子が39個あった。これらはDNAメチル化変化と遺伝子発現変化を伴うことから腫瘍の発生・進展に関与する可能性が高く、腫瘍関連遺伝子である可能性が示唆された。今回これらの遺伝子をヒト神経芽腫で解析した。目的はヒト神経芽腫の新規腫瘍関連遺伝子を同定し、その遺伝子の治療標的としての可能性を検討することである。前年度の解析から絞り込まれた7個の遺伝子につきヒト神経芽腫細胞株を用いてDNAメチル化解析を行った。その結果EPHB2遺伝子とTFAP2E遺伝子が正常組織と細胞株とでDNAメチル化レベルに有意差を認めた。これらを対象に神経芽腫臨床検体を用いてDNAメチル化解析と遺伝子発現解析を行ったところ、TFAP2E遺伝子が腫瘍組織で高発現・低メチル化を示した。強力な脱メチル化剤である5-aza-2 deoxycytidineをヒト神経芽腫細胞株に作用させTFAP2E遺伝子の遺伝子発現制御機構を解析したところ、コントロール群と比較し5-aza-2 deoxycytidine投与群で低メチル化・高発現を示した。神経芽腫臨床検体のDNAメチル化レベルと生存月数をもとに行った生存分析では、TFAP2E遺伝子CpGi-1において高メチル化群より低メチル化群が予後不良であった。以上よりTFAP2E遺伝子はヒト神経芽腫の新規腫瘍関連遺伝子である可能性があり、その発現はCpGi-1のDNAメチル化の制御を受けている可能性が示唆された。1.新規腫瘍特異的メチル化変異領域のヒト相同領域の検索我々は既にマウスにおいてMeDIP法とMicroarrayを組み合わせた手法によりDNAメチル化状態と遺伝子発現状態の網羅的解析を行っている。これによりマウス腫瘍特異的DNAメチル化変化領域を特定し、その近傍で遺伝子発現が亢進している20領域と遺伝子発現が低下している1領域を確認している。これは前者が癌遺伝子、後者が癌抑制遺伝子の候補遺伝子であると考えられる。これらの遺伝子のヒト相同領域をUCSC Genome Bioinformatics Website(http://genome.ucsc.edu/index.html)で検索した。その結果、21の遺伝子のうち相同領域がないものが4つ、既にヒト神経芽腫で遺伝子発現解析の報告があるものが1つあり、これらを解析対象から除外した。2.神経芽腫細胞株を用いた遺伝子発現解析とDNAメチル化解析細胞培養の際にコンタミ等の大きな問題なく順調に培養できた。培養した細胞からのRNA抽出やcDNAへの変換にあたってはキットを利用し時間短縮を図った。また、作製したプライマーは数が多かったが、おおむね一度で問題なく働くことが確認できた。そのプライマーを用いたリアルタイムRT-PCRも安定して結果を得られた。絞り込まれた7つの遺伝子においてMassARRAY Epityper法にて定量的メチル化変化解析を行う。有意差を認めた遺伝子に対してWestern Blotting法にてタンパク発現解析を行う。その後、その遺伝子の定常発現株を作製し、PIポリアミド、siRNAを用いて機能解析を行う予定である。該当なし。
3次元微細構造体を利用した超高感度ELISA環境分析システムに関する研究

本年度は、昨年度開発した3次元流路ネットワーク内での分析操作の検討に取り組んできた。開発した測定系としては、主なELISAの手法であるサンドイッチELISAと競合的ELISA系であり、抗原としてはマウスIgGおよびポリ塩化ビフェニル(PCB)の測定系を開発した。バイオデバイス性能としては、マウスIgGの測定系では数10ng/ml以下の感度、PCBの測定感度としては0.1ng/ml以下の感度を有すると期待できる結果であった。また、今年度新たに得られた重要な成果として、垂直型キャピラリー固相の加工精度が検体間誤差に大きな影響を及ぼすことがわかった。これはキャピラリー加工精度を向上したデバイスにより実験を行ったところ、PCB測定系のB0値検体間誤差が数10%から5%以下にまで改善したことから得られた知見である。一方で、昨年度開発した3次元流路ネットワークの改良にも取り組んできた。改良点としては流体シークエンシング精度の向上、デバイス耐久性の向上であり、デバイス構造の見直しや材質を見直してきた。この中では達成できた業績としては従来数10%程度あったシークエンシング誤差を数%程度にまで低減できた。よって、この改良により一度に数十検体以上のマイクロリアクターを動作可能な精度にまで改善できた。また永久構造を形成可能なSU8レジストを用いたデバイスの作製プロセス検討を行った。作製プロセスとしては、紫外線リソグラフィーにより作製したSU8垂直流路構造にドライフィルムレジストを張り合わせ、その上にマスクをアライメントおよびリソグラフィーを行い、これを2回行うことで、垂直流路お上側と下側に平面流路を接着した構造を形成するプロセスを開発した。本年度の取り組みは以下の観点から進めた。(1)CD型マイクロ流体デバイス内における、垂直送液の実現性の検証→機械加工により作製した垂直流路内での挙動検証を行い、3次源流路ネットワーク内での遠心力による流体制御を実証した。(2)3次源流路ネットワーク内における流体挙動観察技術の確立→光センサーと高速ストロボ発光システムを併用することにより、回転ディスク上での流体挙動を観察可能なシステムを構築した。(3)テフロンマイクロ構造を用いた環境分析系の検討→テフロンマイクロ構造に抗体を固定化することにより競合法による抗原の定量に成功し、低分子量化合物の定量が必要な環境分析への適用の可能性を示した。