hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイルス感染に起因するエピジェネティック制御と個体発生への影響

パルボウイルスNSおよびEGFPを発現するレトロウイルスベクターをC57BL16マウス由来のES細胞に導入し、EGFPの発現量を指標にNS高発現クローン及び低発現クローンを得た。各細胞クローンについて、in vitro分化誘導により3胚葉への分化能力を比較検討したが、ES細胞の分化誘導は可能であったが、分化の程度を定量的に比較することが困難で再現性のある結果は、現在まで得られいない。一方、NSおよびEGFPを導入したTリンパ腫細胞(C57M(D)cell)では細胞のアポトーシス感受性の低下、細胞増殖性や腫瘍原性の低下が見られ、ES細胞の外胚葉系細胞の分化制御に関わる8MPのアンタゴニストとして作用するbmper遺伝子の制御領域でDNAメチル化が亢進し、それに伴うBMPERの発現抑制が認められた。しかし、bmperのノックダウンによりBMPERの発現を抑制した細胞クローンでは、C57NT(D)よりもアポトーシス感受性、細胞増殖性、腫瘍原性はいずれも亢進していた。今後、NSを導入したES細胞で、アポトーシス感受性、細胞増殖性、腫瘍原性の亢進の有無を検討するとともに、BMPERの発現とbmper遺伝子DNAのメチル化の状況についても検討し、BMPERを介したBMP下流のSmadあるいはMPKシグナル伝達系へのNSの関与を明らかにし、パルボウイルス感染における病因因子としてのNSの機能を解明したい。パルボウイルスNS遺伝子をマウスES細胞に導入するため、レトロウイルスベクター(pGCDNsam-IRES-EGFP/NS)を作製した。NSと選別マーカーおよびその後の解析用レポーター遺伝子としてEGFPを共発現できるようIRES配列をはさんで連結し、導入遺伝子の確実は発現のためにサイレンシングが起きないようprimer binding siteに変異を加えたMolony murine leukemia virus(MoMuLV)LTRを5'側に、negative controlregionを除いたPCMV-LTRを3'側に付加した。作製されたウイルスベクターは、一般的な株化細胞でNS及びGFPを発現することも確認した。また、マウスES細胞については、今後の解析を容易にするため、近交系であるC57BL/6マウス由来のES細胞を使用することとし、開発中のC57BL/6-ES細胞を用いて、キメラ形成能力や遺伝子ターゲティングの可否などの基礎的な特性解析を行った。次いで、作製したレトロウイルスベクターをマウスES細胞に導入し、EGFP及びNSの発現をFACS及びRT-PCRで確認した。さらに、NSにより宿主細胞のBmper(=Crossvein 2)のプロモーター領域の高度なメチル化が示唆されており、sh-RNAによるBmperの抑制が細胞の発生や分化、アポトーシス感受性等に変化をもたらすかどうかを検討中である。
悪性黒色腫細胞の生存、増殖、遊走、浸潤における脂肪組織の役割とその制御機構の解明

悪性黒色腫は最も悪性度の高い皮膚癌であり、進行すると有効な治療法がなく、致死的である。近年、悪性黒色腫の罹患率の増加と皮下、内臓脂肪組織の増加を基盤とする肥満との関連が疫学的に示唆されているが詳細は不明であった。我々が確立した脂肪組織のコラーゲン・ゲル器官培養系を用いた検討では、皮下脂肪組織が、悪性黒色腫細胞の増殖を高度に促進することを見出した。さらに、内臓脂肪組織は悪性黒色腫細胞の浸潤能とメラニン産生に寄与する可能性を見出した。本研究により、脂肪組織は悪性黒色腫の細胞動態に深く寄与することが明らかとなった。その制御機構の解明によって新規分子標的治療薬の開発が期待できる。本年度は、悪性黒色腫細胞株(B16細胞)とラット由来脂肪組織片を用いた3次元混合培養系を作成し、悪性黒色腫の増殖、浸潤、遊走能に関する検討を行った。【内容】皮膚培養に用いる2重皿培養法を改良し、皮下脂肪組織層を脂肪組織片で再現し、その上層に悪性黒色腫細胞を播種することで、三次元的な悪性黒色腫組織を再構築した。更に、悪性黒色腫細胞と脂肪組織をそれぞれコラーゲンゲルに包埋し、それぞれの組織discを作成し、その組織discを一部で物理的に接着させ、細胞間の距離が及ぼす影響を解析した。結果、悪性黒色腫細胞単独培養と比較し、皮下脂肪組織との3次元混合培養条件下ではBrdU labeling indexを用いた悪性黒色腫細胞の増殖能は有意に増加した。また、興味深い事に、脂肪細胞との混合培養系では悪性黒色腫細胞におけるメラニン含有細胞の割合が増加する傾向にあった。B16細胞では脂肪組織内への明瞭な浸潤像を同定し得なかった。【意義】臨床的には肥満と悪性黒色腫が示す悪性度の関連が示唆されているが、詳細は不明である。本研究では、in vitroで悪性黒色腫の増殖促進作用を脂肪組織が持つ事を明らかにした。興味深い事に、この増殖作用は脂肪組織と悪性黒色腫との細胞間距離に依存しており、距離の拡大と共に効果の減弱が見られ、サイトカインに依存するパラクライン作用と考えられた。一方、今回用いたモデルでは、悪性黒色腫の浸潤性を再現出来ず、評価系の改良を引き続き行っていく。悪性黒色腫(メラノーマ)は最も悪性度の高い皮膚癌であり、進行すると有効な治療法がなく、致死的である。近年、悪性黒色腫の罹患率の増加と皮下、内臓脂肪組織の増加を基盤とする肥満との関連が疫学的に示唆されているが、脂肪組織が悪性黒色腫にどのような影響を与えているか、その詳細は不明である。一般に、悪性黒色腫は皮膚表皮内で発生し、真皮→皮下脂肪組織へと浸潤し(図1)、全身諸臓器へ転移する。それ故に、脂肪組織が悪性黒色腫細胞の生存、増殖、遊走、浸潤、転移に活発に影響していると予想される。しかし、皮下及び内臓脂肪組織が悪性黒色腫細胞に与える直接的な影響を解析した研究は国内外にはなく、その詳細は不明である。本研究では、悪性黒色腫細胞の生存、増殖、遊走、浸潤における脂肪組織の役割とその制御機構を解明する。本年度は、脂肪組織による悪性黒色腫の増殖、遊走における影響を形態的および蛋白発現を中心に病理組織学的、Western blottingを用いて解析した。その結果、脂肪組織は悪性黒色腫細胞の細胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制する可能性があることを見出した。また、この現象にはMAPK系シグナルが関与するをことを見出した。本年度、新たに開発した生体の微小環境を模した器官培養系では、この脂肪組織が有するパラクライン効果は更に増強し、悪性黒色腫の細胞増殖を促進し、メラニン産生を含めた細胞機能の調節にも関与する可能性があるをことを見出した。悪性黒色腫(メラノーマ)は最も悪性度の高い皮膚癌である。進行すると有効な治療法はなく、致死的である。近年、悪性黒色腫の罹患率の増加と、皮下・内臓脂肪組織の増加を基盤とする肥満との関連が疫学的に示唆されているが、脂肪組織が悪性黒色腫にどのような影響を与えているか、その詳細は不明である。一般に、悪性黒色腫は皮膚表皮内で発生し、真皮→皮下組織へと浸潤した後、全身諸臓器へと転移する。しかし、皮下および内臓脂肪細胞が悪性黒色腫に与える直接的な影響を解析した研究は国内外になく、その詳細は明らかとなっていない。本年度は我々が開発した、新規3次元培養法を用いて脂肪組織が悪性黒色腫に与える影響を、初代培養脂肪組織および悪性黒色腫細胞株を用いて、MAPK系およびPI3L-AKT系を中心に解析した。また、脂肪組織存在下でMEK阻害薬を投与し、悪性黒色腫細胞の生存、増殖、遊走、浸潤に及ぼす影響を解析した。

我々が確立した脂肪組織のコラーゲン・ゲル器官培養系を用いた検討では、皮下脂肪組織が、悪性黒色腫細胞の増殖を高度に促進することを見出した。さらに、内臓脂肪組織は悪性黒色腫細胞の浸潤能とメラニン産生に寄与する可能性を見出した。本研究により、脂肪組織は悪性黒色腫の細胞動態に深く寄与することが明らかとなった。その制御機構の解明によって新規分子標的治療薬の開発が期待できる。昨年度の研究成果に引き続き、本年度においても悪性黒色腫と脂肪組織におけるパラクライン効果の一端(MAPK系)を解明することができた。しかし、一部で形態学的な解析結果と蛋白発現の解離がみられた。これは、形態的な解析には三次元培養を用い、蛋白解析には二次元培養という培養条件の違いが大きく寄与すると考えられる。混合培養系では免疫染色を用いるしか、個々の細胞での蛋白発現を解析する手段がない。この免疫染色は、蛋白質の定量は困難である。一方、二次元培養で単一細胞を培養し、western blotting等で蛋白の定量を行うが、この方法では複数の細胞種の混合培養は困難である。それぞれの実験系の限界が、形態学的解析結果と蛋白発現結果の解離を来したと考えられる。病理学本年度、我々は二次元培養と三次元培養の欠点を克服する新規三次元培養法を開発した。H27年度では、この新規三次元培養法を用いて、免疫組織化学、Western blot、real-time RT-PCR、ELISA等を用いて解析し、癌細胞の生存、増殖、遊走、浸潤における皮下、内臓脂肪組織の影響とその相違を明らかにする。さらに、cDNA microarrayによる網羅的遺伝子解析と癌細胞への候補遺伝子産物の蛋白やその阻害剤の投与実験により、脂肪組織誘導性の癌細胞の細胞動態の仲介因子を同定する。平成27年度は、これまでの実験から予想される癌細胞のアポトーシス、増殖、遊走や浸潤の促進因子や防御因子を癌細胞単独培養系、癌細胞ー脂肪組織混合培養系や癌細胞移植マウスに投与し、上記現象の促進及び阻害効果を比較検討し、悪性黒色腫の新規分子標的治療薬としての可能性を追求する。脂肪組織と悪性黒色腫細胞との密な細胞間相互作用の存在を確認出来た。一方、悪性黒色腫細胞の浸潤性に関する評価が不十分であり、更なる培養系の改良が必要である。本年度、生体の微小環境を再現する新規培養法を開発した。この培養を用いたサンプルを次年度にまとめて解析する為に、本年度の予算を次年度に繰り越した。本年度は、安定した培養が可能なラット由来脂肪組織を用いて解析を行った。但し、悪性黒色腫として用いたB16細胞株はマウス由来であり、種差の問題が存在する。次年度は、長期培養が困難であるがマウスの皮下脂肪組織を用いた相互作用の検討を行うと共に、培養系自体にも改良を加えていく。国際学会への出席を2回予定していたが、業務の都合にて参加出来なかったため。次年度に国際学会の参加を予定しており、その際に使用する。
抗原抗体反応における特異性・親和性創出と水分子との関連に関する実験的考察

本研究では、抗体への変異の導入が可能でかつ研究代表者らがその複合体の構造解析をすでに明らかにしている二つの抗原抗体相互作用(リゾチーム-HyHEL-10相互作用、低分子毒素シガトキシン-1C49相互作用)について、相互作用界面に存在し、水素結合を介して界面に存在するアミノ酸残基と結合している水分子の、相互作用における特異性・親和性に対する寄与を実験的に考察することにより、生命分子間相互作用に一般的に見られる、不完全な相補性を補う界面水分子が相互作用の特異性・親和性創出に果たす役割を明らかにすることを目的としている。本年度の成果は以下の通りである。1.リゾチーム-HyHEL-10相互作用:抗原と結合していない状態の可変領域断片の結晶構造を明らかにし、すでに明らかにしている複合体の結晶構造との比較により、抗原認識領域に見られる特徴的な水和構造と変異導入による相互作用の熱力学パラメーターの変化との対応を中心に議論を進めた。2.ヒト型化抗体-抗原相互作用:ヒト型化を施したHyHEL-10と抗原リゾチームの複合体構造を明らかにし、熱力学パラメーターとの対応について議論を進めた。熱力学的解析と構造解析から、可変領域間の構造の微調整が抗原抗体相互作用に重大な影響を与えることを示すと共に、抗体のヒト型化において可変領域間の適切な会合が重要であることを明らかにした。3.シガトキシンCTX3C-1C49相互作用:複合体構造に基づいて、抗原認識に関与するアミノ酸残基を中心に、Ala残基に置換した変異体を作製し、抗原との相互作用に関して、表面プラズモン共鳴法による解析を行い、抗体1C49の抗原結合部位に局在する芳香族アミノ酸残基の一部が、ポリエーテル化合物であるシガトキシンとの相互作用に重要であることを示し、芳香族性が重要であることを明らかにした。抗原と結合していない可変領域断片の結晶構造を明らかにし、抗原認識領域における特徴的な水和構造と変異導入による相互作用の熱力学的パラメーターの変化との対応の議論を進めた。本抗体をヒト型化した分子種、ならびにその変異体について相互作用を解析し、水分子の相補、構造変化を中心に各種パラメーターとの対応を考察した。現在、ヒト型化抗体-抗原複合体について、結晶構造解析を進めている。また、部位特異的飽和変異導入とファージ提示法を組み合わせた相互作用解析をスタートさせた。抗原認識に関与するアミノ酸残基を中心に、Ala置換した変異体を調製し、抗原との相互作用を、表面プラズモン共鳴法による解析を中心に行い、一つのTyrとTrpがEnergetic Hot Spotであることを明らかにした。水分子を介した水素結合は抗体側のTyrの水酸基によるものであり、水酸基を除去したPhe変異体、他のアミノ酸残基に置換した変異体についても現在解析を進めている。
大腸癌肝転移の基礎的臨床的研究ーアラキドン酸カスケ-ドからみた転移機講の解明とその臨床応用

大腸癌の肝転移と原発巣局所の免疫能に対するPGE2の役割を大腸癌46例(非肝転移例32例:Group A;肝転移例14例:Group B)を対象に検索した。腫瘍潅流静脈血(V)、動脈血(A)、末梢血(PB)を採取し、血中PGE2値をRIA法にて測定した。その結果V中PGE2値(119.1pg/ml)はA(15.4pg/ml)およびPB(13.4pg/ml)に比較して明らかに高値を示した。PGE2V/A比(潅流静脈血PGE2値/動脈血PGE2値)を算出すると、Group A(13.3±2.4)ではGroup B(5.6±0.6)に比較して、有意に高値を示した。次に病理組織学的(炎症細胞浸潤の程度)、免疫組織学的(Tーcell subsets)、生化学的(PGE2局所不活化率)に局所免疫とPGE2との関係を検討した。肝転移群では細胞浸潤の程度、IL2ーreceptor陽性細胞数、PGE2不活化率いずれも低い値を示した。以上よりPGE2が局所免疫を低下させることにより、肝転移の成立しやすい原発巣局所の環境が作られていると考えられた。また、実験モデルの肝転移初期像の検討より、宿主炎症性細胞が転移形成に関与している可能性が示され、今後PGE2との関連での研究が期待される。本研究の初年度として免疫抑制作用をもつプロスタグランジン(E_2(PGE_2)と原発巣における局所免疫能との関係さらに局所免疫不全との関係について検討した。1)大腸癌患者46例に対し局所微小循環の観点から腫瘍の影響を最も強く受けていると考えられる腫瘍潅流静脈血(V)中PGE_2濃度と流入動脈(A)中PGE_2濃度を測定した。その結果腫瘍潅流静脈血中PGE_2濃度(119.1±14.3)pg/mlは流入動脈血中PGE_2濃度(15.4±2.3)pg/mlに比較して有意に高かった。肝転移の有無で検討するとPGE_2のV/A比は肝転移を有する症例においては肝移転を有しない症例に比較して有意に高値を示していた。その後の経過観察中に3例の異時性肝転移例を経験したが、いずれもPGE_2のV/A比は高値を示していた。2)免疫組織化学的手法を用いて癌増殖先進部の炎症性細胞浸潤を検討した。PGE_2のV/A比は癌増殖局所におけるIL-2リセプター陽性細胞数と負の相関を、サプレッサーT細胞数と正の相関関係をもつことが認められた。このことからPGE_2は癌増殖局所においてimmuno-suppressiveに作用していることが示唆された。3)腫瘍及びその非癌部粘膜のPGE_2代謝率(不活化率)を測定することより、以下の結果を得た。PGE_2の代謝率は個々の症例で検討すると全例において腫瘍組織では非癌部粘膜に比較して少なかった。また同時性肝転移を有する原発腫瘍組織の代謝率は肝転移を有しない原発腫瘍組織のそれに比較して有意に低値を示していた。以上よりPGE_2は癌増殖局所において免疫抑制的に働き、PGE_2のV/A比は局所免疫不全の指標と考えられた。さらにPGE_2V/A比は肝転移予知の指標としても有用と考えられた。免疫抑制作用をもつプロスタグランジンE_2(PGE_2)と大腸癌原発巣における免疫能との関係を肝転移の観点から検討した。1)PGE_2の灌流静脈血値/流入動脈血比(以下PGE_2V/A比)は、肝転移を有する症例13.3±2.4の方が肝転移を有しない症例(5.6±0.8)に比較して、有意に高かった。2)免疫組織化学的検討から、PGE_2V/A比が増加するにつれ、IL-2レセプタ-陽性細胞数は減少し、局所免疫能が抑制されていることが示唆された。3)PGE_2は組織で産生され、同時に不活化される。そこでPGE_2の組織不活化率を算出すると、腫瘍組織のPGE_2不活化率43.2±4.0%は、非癌部粘膜の不活化率65.2±3.0%より明らかに低値であった。同時性肝転移例の原発大腸腫瘍組織PGE_2不活化率は、29.9±5.1%と非肝転移例の51.3±4.0%に比較して低値であった。4)PGE_2V/A比はPGE_2腫瘍組織不活化率と負の相関を示したが、PGE_2組織産生量との間には相関がみられなかった。以上のことより、“PGE_2は、原発巣において、抗腫瘍効果をもつ細胞数を減少させることなどにより局所免疫能を低下させ、このため肝転移のおこりやすい局所の環境がつくられる。その局所免疫能低下はPGE_2の不活化の度合が低下することがその主因と考えられる。"との結論をえた。次に動物実験モデルにおいて、腫瘍細胞の標的臓器である肝において転移巣形成の初期段階には、免疫担当細胞として好中球が数多く存在することが明らかとなった。このことから、転移巣形成初期における好中球の役割が示唆された。大腸癌の肝転移と原発巣

局所の免疫能に対するPGE2の役割を大腸癌46例(非肝転移例32例:Group A;肝転移例14例:Group B)を対象に検索した。腫瘍潅流静脈血(V)、動脈血(A)、末梢血(PB)を採取し、血中PGE2値をRIA法にて測定した。その結果V中PGE2値(119.1pg/ml)はA(15.4pg/ml)およびPB(13.4pg/ml)に比較して明らかに高値を示した。PGE2V/A比(潅流静脈血PGE2値/動脈血PGE2値)を算出すると、Group A(13.3±2.4)ではGroup B(5.6±0.6)に比較して、有意に高値を示した。次に病理組織学的(炎症細胞浸潤の程度)、免疫組織学的(Tーcell subsets)、生化学的(PGE2局所不活化率)に局所免疫とPGE2との関係を検討した。肝転移群では細胞浸潤の程度、IL2ーreceptor陽性細胞数、PGE2不活化率いずれも低い値を示した。以上よりPGE2が局所免疫を低下させることにより、肝転移の成立しやすい原発巣局所の環境が作られていると考えられた。また、実験モデルの肝転移初期像の検討より、宿主炎症性細胞が転移形成に関与している可能性が示され、今後PGE2との関連での研究が期待される。
プロジェクト型授業支援のためのゲーミフィケーション理論の構築と実践適用

クラス内でグループ編成されるプロジェクト型授業では,プロジェクト活動が不得手や意欲的でない学生も含まれる.本研究ではこのようなプロジェクト型授業に対し,プロジェクト活動が成功し易くなるためのプロジェクト型学習(PBL)用のゲーミフィケーション法を開発し,実践適用することを目的とする.PBL用ゲーミフィケーションの開発ではPBLで必要となる「創造的問題解決,プロジェクト管理,協調学習」の活動に対し,ゲーム設計手法に基いた段階的な技術理解と動機付けを与えるような仕組みを設計し,システムに適用する.授業でのシステム運用を通し,提案方法の有効性を明らかにした.クラス内でグループ編成されるプロジェクト型授業では,プロジェクト活動が不得手や意欲的でない学生も含まれる.本研究ではこのようなプロジェクト型授業に対し,プロジェクト活動が成功し易くなるためのプロジェクト型学習(PBL)用のゲーミフィケーション理論を開発し,実践適用することを目的とする.平成27年度では,PBL活動基盤システムの構築とシステムの試行実験を行い,それに適用するゲーミフィケーションの設計を行った.PBL活動基盤システムでは授業カリキュラムで利用可能な,プロジェクト管理,コミュニケーション機能,ファイル共有機能を備えたWebアプリケーションを構築した.そして,それを実際のプロジェクト型授業で試用し,現状の問題を調査した.対象とするプロジェクト型授業のクラスは基礎的な専門知識を学んだ工学系の大学生が1回180分の4週分(約1ヵ月)に渡って,創造的問題解決を要するものづくりに関するチーム活動を実施する.授業内容は具体的には,「テーマ選定,アイデア創出,アイデア実装,成果発表」のプロセスに対し,45人で構成されるチームで話し合いながら遂行していくことを行った.そして,その授業にシステムを導入することで,基本的なプロジェクト管理機能がどの程度,どのように機能していたかをシステム履歴をもとに確認した.その結果,アクセスするものの各機能の利用意義や使い方の理解が不足している点,およびグループにシステムへアクセスしない学生がいる点が確認された.PBL活動基盤システムの構築とシステムの試行実験を行い,それに適用するゲーミフィケーションの設計を行った.基盤システムの運用により,今後の設計指針が確認できた点で,本研究はおおむね順調に進展している.クラス内でグループ編成されるプロジェクト型授業では,プロジェクト活動が不得手や意欲的でない学生も含まれる.本研究ではこのようなプロジェクト型授業に対し,プロジェクト活動が成功し易くなるためのプロジェクト型学習(PBL)用のゲーミフィケーション理論を開発し,実践適用することを目的とする.平成28年度では,プロジェクト型授業に実践適用可能な基盤システムの改善,および精緻に分析可能なシステム評価方法の検討を行った.平成27年度で構築し試用してきたプロジェクト型学習活動基盤システムでは,授業カリキュラムのなかで実際に運用可能であったものの,受講生たちが授業外の時間に行っているコミュニケーションの内容まで学習データとして取得することが難しかった.その原因として,受講生がその授業期間に普段使用しているコミュニケーションツールと本システムを併用していることがわかった.そこで本年度は,受講生たちが普段使用しているツールに対しアドオンしたシステムに作り変え,システムの統合化を行った.その際,学習データを蓄積可能にするために,データベースサーバーを構築し,アドオンシステムから常に受講者のツール上の振舞いを蓄積できるようにした.またプロジェクト型授業でのゲーミフィケーション効果を構造的に理解するために,それぞれのシステム機能と各受講者の行動の因果関係を統計的に表現できる構造化方程式モデリングを用いた場合の評価方法の検討も行った.PBL支援基盤システムの実装とその試行実験を行い,それに対するゲーミフィケーションの設計と評価方法の検討を行ってきた.しかし,研究代表者の所属の異動にともない,実験環境の変更を余儀なくされた.今年度はその準備のために時間を要した.クラス内でグループ編成されるプロジェクト型授業では,プロジェクト活動が不得手や意欲的でない学生も含まれる.本研究ではこのようなプロジェクト型授業に対し,プロジェクト活動が成功し易くなるためのプロジェクト型学習(PBL)用のゲーミフィケーション理論を開発し,実践適用することを目的とする.平成29年度では,プロジェクト型授業に実践的に適用可能な基盤システムを用いて,実際のPBL授業への適用とその評価を実施した.さらに,その研究成果をまとめて,学会で成果発表を行った.平成28年度で構築し利用してきたプロジェクト型学習活動基盤システムでは,対象としてきた代表者所属の情報環境のなかで授業内での運用が可能であったものの,平成29年度では新たな情報環境においてPBL授業を実施する環境が異なることを余儀されたため,改装する必要があった.そのため,本年度はこれまで開発してきたプロジェクト型学習活動の支援機能を,独自で開発してきたWebアプリケーションでなく,新たな情報環境のなかで使用されている一般的なラーニングマネージメントシステム上に機能を実装した.次に,大学院生39名が登録しているソフトウェア工学に関する科目のなかでPBL授業を実施し,開発システムを運用することで,アンケートと学生の活動データをもとに統計的手法を用いて,これまで開発してきたPBL用ゲーミフィケーションモデルの有効性を調査し,確認した.クラス内でグループ編成されるプロジェクト型授業では,プロジェクト活動が不得手や意欲的でない学生も含まれる.本研究ではこのようなプロジェクト型授業に対し,プロジェクト活動が成功し易くなるためのプロジェクト型学習(PBL)用のゲーミフィケーション法を開発し,実践適用することを目的とする.PBL用ゲーミフィケーションの開発ではPBLで必要となる「創造的問題解決,プロジェクト管理,協調学習」の活動に対し,ゲーム設計手法に基いた段階的な技術理解と動機付けを与えるような仕組みを設計し,システムに適用する.授業でのシステム運用を通し,提案方法の有効性を明らかにした.

これまで開発してきたプロトタイプシステムを導入し,調査した結果に基づきゲーミフィケーション機能の設計を行う.そして,それを取り入れたシステムを実装するとともに,実際のPBL授業のなかで運用しながらシステムの利用状況を観察するとともに,学習効果を確かめる.そのデータ分析により理論的な知見を得る.今後はこれまで実装してきたシステムを実際のプロジェクト型授業のなかに導入することで学習効果を確認する.また受講者の学習データを分析することで,統計データに裏付けられたゲーミフィケーション機能と学習効果との因果関係を明らかにする.学習支援システム,グループウェア研究計画書では次年度に実施する予定のすべての機材を計上していたが,今年度は試行システムのみの機材を購入したため次年度使用額が生じた.研究代表者の異動に伴い,実験環境を新たに設定する必要があった.そのため,実験実施にともなう機材分の額が次年度使用額として発生することになった.評価実験に必要とする機材を被験者人数分用意するために使用する.今年度の実験実施に伴いかかる機材や人件費などに支出する予定である.また研究成果を発表するうえでの費用にも使用する予定である.
再発口腔癌に誘導されるCD206+細胞の予後マーカーおよび治療標的としての可能性

癌組織において、がん細胞に分化し未分化性を維持する癌幹細胞の存在が明らかにされつつある。正常組織の幹細胞が特定の微小環境下で幹細胞性を維持するのと同様に、がん幹細胞にもがん微小環境というニッチが存在し、がんの治療抵抗性や転移などの悪性化、免疫寛容などに貢献していることがわかりつつある。申請者は最近の研究で、脳腫瘍や口腔がんにおいて放射線照射によって局所血管からの血管新生が抑制された際に、骨髄由来細胞、特にCD11bを発現する単球系細胞が腫瘍内へ誘導され、その後M2マクロファージに分化し脈管形成が起こることを見出した。本研究では口腔がんにおいてそのM2マクロファージが再発の予後マーカーとなりうるか、またどのようにがん細胞とかかわっているのか、特にがん幹細胞による悪性化への関わりについて解析を行い、これらを標的とする新規治療戦略の可能性を探る。本年度は昨年度に引き続いて次のテーマに沿って実験を行なった。1)M2マクロファージが口腔がんの化学放射線療法後の予後マーカーとなりうるか?当科で化学放射線治療を行う口腔癌患者の末梢血液から単核球を分離し、蛍光標識したM2マクロファージの抗体と反応させフローサイトメトリーを用いて検出を行った。治療前後の変動が再発に関連するかどうか統計学的解析を行った。化学放射線治療を行なっている口腔がん患者の血液よりM2マクロファージのマーカータンパクとして数種類の抗体を用いてフローサイトメトリーを行なっているが、予想よりも発現量が少なく、また現在までに治療前後での優位な変化は見られていない。人の細胞を用いた研究では今後症例数を増やして同細胞群のマーカー解析を行う予定である。一方担がんマウスモデルでは有意な変化が見られており、今後の結果が期待される。申請者は最近の研究で、放射線照射によって局所血管からの血管新生が抑制された際に、骨髄由来細胞、特にCD11bを発現する単球系細胞が腫瘍内へ誘導され、その後M2マクロファージに分化し脈管形成が起こることを見出した。本研究ではそのM2マクロファージが再発の予後マーカーとなりうるか、またどのようにがん細胞とかかわっているのかを特にがん幹細胞による悪性化への関わりについて解析を行い、これらを標的とする新規治療戦略の可能性を探る。本年度は次のテーマに沿って実験を行なった。1)M2マクロファージが放射線化学療法後の予後マーカーとなりうるか?当科で放射線治療を行う口腔癌患者の末梢血液を、蛍光標識した細胞の抗体と反応させフローサイトメトリー、ELISAを用いて検出を行った。血液中の予後予測マーカーの探索として数種類の抗体を用いてフローサイトメトリーを行なったが、現在までに優位な変化は見られていない。今後症例数を増やして同細胞群のマーカー解析を行う予定である。放射線治療後の腫瘍残存・再発予防を目指したM2マクロファージを標的とする治療の開発として、同細胞の誘導、分化に関わる因子の探索とその阻害剤によって再発や血管形成が抑制されるかどうかを解析する予定である。
正四面体用構造を有するマクロモノマーからなる 高強度ハイドロゲルの創製

これまでに、我々は四官能性ポリエチレングリコール(PEG)をプレポリマーとした高分子反応により、均一網目構造を有する新規なハイドロゲル(Tetra-PEGゲル)を創製した。このゲルは均一構造に由来する高い力学強度を有しており、また二液混合によりon-siteで作成することができる。このゲルは高い均一性、力学物性、生体適合性、操作性を有しており、医療材料への応用だけにとどまらず、学術的な意味でも興味深い研究対象であると考えられる。[研究の目的と20年度の成果]我々は四官能性ポリエチレングリコール(PEG)をプレポリマーとした高分子反応により、均一網目構造を有する新規なハドロゲル(Tetra-PEGゲル)を創製した。このゲは均一構造に由来する高い力学強度を有しており、また二液混合によりon-siteで作成することができる。20年度の実験結果より、もっとも高い強度を得ることのできるマクロマーの分子量や、組み合わせには最適値があることが明らかとなってきた。今年度は、さらなる最適化と共に、これまでに得られた結果を一般化し、理論的な解釈を付けることを目的とする。[21年度の研究計画]20年度の研究結果より、分子量20,000Daのポリマーより作成されたハイドロゲルは他の分子量のポリマーから得られたものよりも高い力学強度を有していることが明らかになった。今年度は、力学的強度、動的光散乱、小角中性子散乱を用いて、反応に用いるポリマーの形状が反応に及ぼす効果についてさらに検討する。また、20年度に確立された合成技術、設計指針を元に微細網目構造を設計し、さらなる物性の向上を目指す。さらには、構造解析、シミュレーションによるモデル作成も継続して行い、ゲル微細網目の力学物性に及ぼす効果について明らかにする。20年度の実験結果より、最も高い強度を得ることのできるマクロマーの分子量や、組み合わせには最適値があることが明らかとなってきた。具体的には、分子量20,000Daのポリマーより作成されたハイドロゲルは他の分子量のポリマーから得られたものよりも高い力学強度を有していることが明らかになった。また、異なる分子量のポリマーから作成されたゲルは、同分子量のポリマーから得られたものと比較して、反応効率が低いことも明らかになった。21年度は、反応に用いるモジュールのサイズが力学特性に及ぼす影響について調べるために、小角中性子散乱を用いた構造解析を行った。その結果、モジュールサイズがあまりに小さい場合には、網目構造に不均一性が導入されることが明らかとなった。また、分子量10,000以上のモジュールを用いた場合には均一な網目構造が形成され、それらは類似の構造を有していることも明らかになった。ゲル化反応を制御するために、ゲル化の反応機構について明らかにすべく様々な条件下においてゲル化反応の解析を行った。その結果、モジュール末端の官能基の反応性を考慮することにより、ゲル化反応の予測が可能であることが明らかになった。この結果は、今後のゲル化条件の策定のための指針となると考えられる。
悉皆的二次代謝経路推定に向けたデータベースおよび要素技術の研究開発

遺伝子情報からの代謝物の推定法を活用し、実験により得られた新規化合物について部分構造に基づいた類似化合物の生合成経路から出発物質と代謝経路を予測する、あるいは、逆方向に類似の生産物質から出発物質の予測をする。また、遺伝子のアミノ酸配列情報と候補となる二次代謝物の部分構造情報を活用した酵素遺伝子のアノーテーションづけを行うことを目標としたデータベース構築が本研究の課題である。そこで、生合成マシナリー・データベースの構築に向けた情報収集ならびに生物種-代謝物-酵素の関係を体系化するためのデータベースを設計を行った。具体的には、フラボノイド、テルペノイド、ポリケタイド、ペプチドなど生物種を考慮に入れた既知生合成酵素についてアミノ酸配列、反応様式、ドメインに関する情報および二次代謝物の反応情報の蓄積を進めるに至っている。また、二次代謝物を生合成する生物を分類体系に従って検索できるDBの公開を行った。データベースにおける登録形式は、反応番号、酵素名、反応式、生物種、遺伝子名、文献から構成され、この形式に従ってデータを蓄積し、プロトタイプデータベースの運用を検討する。本形式においては、最低限度の代謝反応から遺伝子へのリンク情報を得ることができる。
セントロメア領域を含む広域DNAの分離とクロ-ン化

ヒト染色体のセントロメア領域の構造と機能を明らかにするために、セントロメア領域を長いDNA断片としてクロ-ン化することを主な方針として研究を進めてきた。長い断片のクロ-ニングはまだ進行中であるが、セントロメア領域におけるDNA-蛋白質相互作用など、新たな知見が得られたことを以下に述べる。1.セントロメア領域のクロ-ニング:ヒト染色体のセントロメア領域には、基本単位が170bpのアルフォイド反復配列が数百-数千kbにわたって存在している。これらを制限控訴BglIIによって約200kbの断片とし、より細かい他のDNA断片からショ糖密度勾配遠心法により分離、濃縮することができた。この長いDNA断片を酵母にクロ-ニングし、さらにその生物活性を検出することを念頭において、pYACプラスミドにHygromycine耐性遺伝子と、DNA複製に必要なARS(Autonomously Replicating Sequences)を組み込んだ誘導株を作成した。これらの改良したベクタ-に長いDNA断片を挿入し酵母に形質導入した後、Pulse-fieldゲル電気泳動法とSouthern Hybridization法を用いて、アルフォイド配列を持つクロ-ンを検索中である。2.セントロメア領域でのDNA-蛋白質相互作用:染色体のセントロメア部位に存在する分子量80kDのCENP-B蛋白がアルフォイド配列中の17bpの特異的配列に直接結合することを、セントロメア抗原を認識する自己免疫患者血清中のセントロメア抗体を用いてのImmunoprecipitation法、及びgel-shift法により示した。現在までクロ-ン化されたアルフォイド配列の解析により、この17bp配列(CENP-B box)がY染色体を除くすべての染色体のセントロメア領域に見出されることから、このCENP-B蛋白とCENP-B boxの結合反応がセントロメア機能において何らかの役割を担うものと示唆された。1.セントロメア領域DNAのクローン化Raji細胞DNAを制限酵素PvuII及びBglIIで分解した産物をパルスフィールド電気泳動で分離し、セントロメア領域に特異的なアルフォイド配列をプローブとして用いることにより、セントロメア領域は約150kbのDNA断片として、得られることがわかった。現在、出芽酵母を宿主とするYACプラスミドを用いて、これらのDNA断片のクローン化を行いつつある。2.アルフォイドDNAとセントロメア抗原蛋白質の相互作用HeLa細胞の核抽出液を用いたIn Vitroの実験から、セントロメアを構成するアルフォイドDNAの繰り返し配列の中に、セントロメア抗原蛋白質と特異的相互作用をする領域がある頻度で存在することを示した。この相互作用によって生ずるDNAー蛋白質複合体には、少なくとも、80kDaの抗原蛋白質が含まれる。また、この複合体形成には、アルフォイド配列中の17bpからなる領域(hCEN-1 box)が必要である。hCEN-1 boxは、Y染色体を除く、すべてのヒト染色体に存在することから、この相互作用のセントロメア機能における重要性が示唆される。今後、突然変異導入を用いて、hCEN-1 box内の必須塩基を決定し、又、DNAとの相互作用を利用して、関与する蛋白質因子の精製を行なう。1.クロ-ニングベクタ-の改変:酵母を用いて長いDNA断片をクロ-ニングするためのpYACベクタ-を、BglII断片をクロ-ン化するために改変した。さらに、クロ-ン化したDNAを動物細胞に戻して解析することを念頭において、Hygromycine耐性遺伝子を導入し、またDNA複製に必要なARS(Autonomously Replicating Sequence)を組み込んだ誘導株を作成した。

2.長いDNA断片の分離とクロ-ニング:ヒト培養細胞293S DNAを制限酵素BglIIで分解することにより、アルフォイド反復配列のためにBglII切断部位が希であるセントロメア領域を約200kbの断片として得ることができる。これをショ糖密度勾配遠心法により、より細かい他の染色断片から分離することができた。この濃縮されたセントロメア断片を、改変したpYAC誘導株にクロ-ン化し、アルフォイド配列をもつものを検索中である。3.ヒト培養細胞へのDNA導入効率の改善:ヒト培養細胞293S株を用いることにより、外来DNAの導入効率を、リン酸カルシウム法では用いた細胞の50%以上、Electropration法では約40%の高頻度に行う条件を得た。4.セントロメア領域でのDNA-蛋白質相互作用:染色体のセントロメア部位に存在する分子量80kDのCENP-B蛋白がアルフォイド配列中の17bpの特異的配列に直接結合することを、セントロメア抗原を認識する自己免疫患者血清中のセントロメア抗体を用いてのImmunoprecipitation法、及びgel-shift法により示した。現在までクロ-ン化されたアルフォイド配列の解析により、この17bp配列(CENP-B box)が、Y染色体を除くすべての染色体のセントロメア領域に見出されることから、このCENP-B蛋白とCENP-B boxの結合反応がセントロメア機能において何らかの役割を担うものと示唆された。
Max-Plus代数を用いた期待効用最大化問題の最適戦略の数値解析

無限時間範囲べき型期待効用最大化問題を、取引費用を考慮に入れて考察した。取引費用としては、総資産に対する一定比率の部分と取引量に比例した部分の双方を含む場合を包含する一般的な取引費用の下で考察し、対応する、"エルゴード型"リスク鋭感的準変分不等式を導いた。その解の存在を一定比率コストの場合に対応する変分不等式との比較から、逐次的に構成する方法を開発することによって示した。"エルゴード型"リスク鋭感的準変分不等式の解は、ある関数と定数の組からなるが、その関数を用いて最適三略の構成を行い、また、その定数が最適値を与えることを示した。また、一定比率コストで対数効用最大化問題の場合には"エルゴード型"変分不等式の解の存在と一意性を示すことで得られていたが、その解から決まる自由境界の数値解析の研究をマルコフ連鎖の確率制御問題により近似することにより行った。ファクター過程が有限状態マルコフ連鎖であるファクターモデルに対して無限時間範囲期待効用最大化問題を考察し、そのマルコフ連鎖がエルゴード的である場合には、Wonhamフィルターの収束する不偏測度を用いて最適値が表現されることを示した。格子気体モデルの性質、特に流体力学極限で得られる拡散係数について研究を行ない、昨年までに得られた「拡散係数の滑らかさ(Lipshitz連続性)」の結果およびその証明から得られた系と、非対称な格子気体の不変測度に関する結果を用いることにより統計物理学において成立することが予想されている「Einstein Relation」が、ある条件の下では成立することが証明でき、またこの条件を満たさない場合には反例を得ることができた。・ファクター過程が有限状態マルコフ連鎖であるファクターモデルに対して、べき型期待効用最大化問題を論じ、証券価格の情報のみを用いて投資戦略を構成する部分情報下の問題を定式化し、その最適戦略を偏微分方程式の解を用いて構成した。その際まず、フィルタリングの問題を考察し、問題を完全情報下のリスク鋭感的確立制御問題に問題を帰着した。さらに、そのベルマン方程式を導出、そして、その方程式を線形の偏微分方程式に変換した後、その解を用いて最適戦略の表示を得た。・また、取引費用を考慮したべき型期待効用最大化問題を考察した。問題を危険証券への投資比率過程のリスク鋭感的衝撃制御問題として定式化し、その最適戦略の構成を論じた。一定比率の取引コストを持つ場合で、問題は乗法的汎関数の最適停止問題に帰着される。その最適停止問題に対応する変分不等式を考察するにあたって、係数の退化性を排除するために、座標変換の方法を用いて、問題の全空間上のものに変換し、さらに、ゲージ変換を通じて、変分不等式を変換し、可解性、一意性、解の滑らかさを示した。その解を用いて最適戦略の構成を行った。・ベッセル過程に類似したずれの係数をもつ確率過程をファクター過程とする、ファクターモデルに対して、長期間最適投資問題(大偏差確率最大化、および関連するリスク鋭感的制御)を考察し、最適戦略の明示的な表示を得た。このモデルは1次元ではあるが、ヘストン型やCIR型のファクターモデルを含むものである。
ACPに基づく意思決定支援のための地域医療・介護多職種対象教育プログラムの開発

人生の最終段階における医療・ケアに関して、患者本人・家族・医療者が話し合うプロセス「アドバンス・ケア・プランニング(ACP)」の普及には、地域で医療・介護に携わる多職種が連携して取り組む必要がある。その実践のための課題を明らかにし、多職種がACPに基づいた意思決定支援のために必要な知識・スキルを身につける教育プログラムを開発する。模擬患者・家族との実践演習を含む予定である。
縄文・弥生時代における磨石・敲石の研究

北海道地方・中部地方・南西諸島の縄文時代の磨石・敲石の調査を行ったほか、近畿地方・中国地方・九州地方の資料調査を補った。この結果、北海道地方から南西諸島にいたる磨石・敲石の地域性の概略を把握することができた。また、前年に概要を把握した近畿地方以西における磨石・敲石の形態分類と各形態の時間的・空間的分布の細部を検証する作業を行った。縄文文化における磨石の地域性については特徴的な地域は3つある。北海道西部は北海道式石冠やそれに類する磨石があり、叩き潰すような製粉が想定される。中部地方は球面状磨面が多用され、球状礫の選択傾向が強い。微粉化を志向している。九州地方は反対に平坦面状磨面が多用され、円盤状礫が選択されやすい。これらの境界は必ずしも明確でなく、中間の地域では漸次的に変わるが、東北・関東地方に再考の余地がある。この背景には植物食の比重と植生、それに基づく植物質食料加工技術があると思われる。しかし中部地方の球状礫の選択傾向は単にそれに留まらず、独自の粉食文化の発達が予想される。近畿以西の磨石・敲石の形態分類とその時間的・空間的分布について成果の一つが滋賀県竜ヶ崎A遺跡の磨石・敲石の考察である。磨面については基本的に平坦面状磨面と凸面状磨面で構成され、凸面状磨面において外湾曲面状から球面状への時期的変化が認められた。アバタ状敲打痕のある石器について、軟質石材で直方体状礫の正面や側面を使用するものは弥生時代以降に出現するようである。この背景に弥生時代における新たな生産技術の出現が想定できた。剥離痕のある棒状礫について、軽いもののみ出土する遺跡、重いものから軽いものまでそろう遺跡など、いくつかのヴァリエーションがあることを指摘できた。これについて石器製作における剥片や原石の問題とあわせて検討すれば、石器石材流通の実態に迫ることができる可能性を示唆した。九州地方・東海地方の縄文・弥生時代の磨石・敲石の調査を行い。これまでの調査の蓄積とあわせて検討した。この結果、近畿地方以西の西日本については形態分類と各形態の時間的・空間的分布の概要を把握することができた。そして西日本における磨石・敲石のおおよその変遷を描くことができた。また、東日本についても磨石・敲石の変遷と地域性について一定の見通しが持てるようになった。磨石については磨面の形状について平坦面状と凸面状に大別し、凸面状磨面をさらに外湾曲面状、球面状、長球面状などに細分した。また、これを重量分布やセットとして推定される石皿の形態、その遺跡ごとの様相を比較検討した。その結果、平坦面状磨面の磨石と凸面状磨面の磨石ではそれぞれ特有の重量分布・形態変化が認められ、機能的な差違と考えることができた。これらとセットになる石皿は基本的には使用面が平坦面状の石皿であるが、これに加えて深いくぼみのある石皿がある。この石皿には凸面状磨面の磨石がセットとなり、微粉化に特化した形態と考えられた。そして縄文後期の磨石・石皿のセットについて中四国・近畿地方では特に微粉化を志向しているのに対し、九州地方では殻割り・粗挽きを志向しているといえ、地域性を指摘することができた。この背景には植生とそれに基づく食料加工技術の差異と考えられた。ただし、文化的系譜の側面や社会的側面の検討が課題として残っている。敲石については敲打痕に伴う摩耗痕の有無から敲打対象の硬質か軟質かを区別する見通しを立てた。そして石器製作にかかわる敲石について縄文後期には棒状礫を使用する九州・東日本と円礫・亜円礫を使用する中四国近畿という地域性を指摘することができた。この背景には石器石材の種類とその形態が要因とみられる。

磨面については基本的に平坦面状磨面と凸面状磨面で構成され、凸面状磨面において外湾曲面状から球面状への時期的変化が認められた。アバタ状敲打痕のある石器について、軟質石材で直方体状礫の正面や側面を使用するものは弥生時代以降に出現するようである。この背景に弥生時代における新たな生産技術の出現が想定できた。剥離痕のある棒状礫について、軽いもののみ出土する遺跡、重いものから軽いものまでそろう遺跡など、いくつかのヴァリエーションがあることを指摘できた。これについて石器製作における剥片や原石の問題とあわせて検討すれば、石器石材流通の実態に迫ることができる可能性を示唆した。
歯周病細菌性因子の解明を目指したプラーク由来臨床株の分離とそのゲノム解析

歯周病細菌性因子の全容解明の為には歯垢細菌叢の網羅的研究が求められるが、リファレンス情報の充実は不可欠である。本研究では、歯周病患者の歯垢から新菌種を含む臨床株を分離し、そのゲノム解析を行うこととした。既知菌種との16S相同性が98.7%以下の株を17株分離し、特に相同性の低かった3株については新菌種候補としてゲノムのドラフト配列の決定を行った。平行して、齲蝕病巣由来の既知菌種(B. dentium JCM 1195, S. inopinata JCM 12537, P. denticolens JCM 12538)について全ゲノム配列の決定を行い、公的データベースに登録した。本研究は、歯周病をはじめとする口腔の疾患に対し、デンタルプラーク(以下プラーク)中の細菌が大きく影響していることから、700種以上と言われる複雑な口腔細菌叢のデータベース構築の際のリファレンス情報の充実を念頭におき、未分離の新菌種候補を新たに生菌分離し、その性状を解析しようとするものである。平成24年度は、歯周病患者よりプラークを採取し、生菌の分離を行ったところ、60株の分離株を得た。これらの株について、16SリボソームRNA遺伝子配列の決定による系統解析を行った。既知の菌株との相同性が98.7%以下のもの、配列の登録はあるが、菌種の特定ができていないものとの相同性が高いものについて、それらを新菌種候補として検討を行ったところ、17株が該当した。平成25年度は、前年度に引き続き歯周病患者よりプラークのサンプリングを行った。新たに5名の患者よりプラークを採取し、20%グリセロールにて凍結保存した。順次分離作業を進める。前年度に分離した17株の内、3株については、特に相同性が低く、新菌種である可能性が高いため、再度16S遺伝子のシークエンスを行い、より正確な塩基配列を調査した。また、これらの生物学的性状についての検討を開始した。さらに、これらの株は、全ゲノムのドラフトシークエンスを実施する予定であったが、25年度中に開始することはできなかった。本研究では、歯周病の病因解明と口腔細菌のリファレンス情報の充実を目的として、歯周病患者のプラークから、新菌種候補を含む臨床株を網羅的に生菌分離し、16SリボソームRNA遺伝子(16S)配列決定による系統解析、全ゲノム解析あるいはドラフト配列決定を計画している。24年度は、4名の歯周炎患者より、デンタルプラークを採取し、生菌の分離を行った。サンプリングを行ったプラークは、分離作業実施までの間、20%グリセロールにて凍結保存を行った。分離作業は、BL寒天培地にて37度で48時間、嫌気培養し、形成したコロニーについて順次、釣菌を行った。新たな培地にて培養し純化を行い、継代可能な菌株について凍結保存した。これまでに60株の分離、純化を行った。次に、これらの60株について16S解析を行った。BL寒天培地にて継代したコロニーに対し、コロニーPCRを行い、16S遺伝子を増幅した。増幅したDNAを鋳型DNAとして、BigDyeTerminatorV3.1CycleSequencingKit(Applied Biosystems)を用いたシークエンス反応を行い、ABI3730シークエンサー(Applied Biosystems)によって、塩基配列を決定をした。それらの配列データをもとに、相同性解析を行った。既知の菌株との16Sの相同性98.7%未満の菌株、配列の登録はあるが、菌種の特定ができていないものとが相同性が高いものについて、それらを新菌種候補とした。その結果、これまでに分離行った60株のうち、うち17株が新菌種候補であることが判明した。現在、これらの菌について、詳細な性状試験を行っている。本研究では、デンタルプラーク細菌叢から新菌種の臨床株を分離し、ゲノム解析を行うことで、口腔細菌のリファレンス情報の充実を図った。あわせて、既知菌種についてもいくつかの臨床分離株のゲノム解析を実施し、口腔細菌叢と歯周病との関連性を考える上での基盤とした。平成25年度までに、新菌種候補株として17株を分離し、それらのうち特に相同性が低い3株についてはより正確な16S遺伝子の塩基配列を決定した。2株はStreptococcus属、1株はVeillonela属の近縁種と推定された。平成26年度はこの3株について全ゲノムの塩基配列の決定を行い、ドラフト配列を得た。

また、既知のう蝕病巣由来の細菌株Bifidobacterium dentium JCM1995株、Parascardovia denticolens JCM12538株、Scardovia inopinata JCM12537株について全ゲノム解析を平行して実施した。これらの3株はかつてBifidobacterium属に分類されていた近縁種である。ゲノム配列の決定は、ショットガン方式によるサンガー法にて行った。B. dentium JCM1995株のゲノムはプラスミドを含まない2635669bpの染色体DNAのみで構成され、2141のタンパクをコードする予測遺伝子が認められた。P. denticolens JCM12538株、S. inopinata JCM12537株のゲノムも同様にプラスミドを含まず、それぞれの染色体DNAは、長さが1890857bp、1797862bpで、他のBifidobacterium属の菌種よりも1.9から2.8Mbp短かった。これらの配列情報は、DDBJ/GenBank/EMBLの公的データベースに登録した。(accession no. AP012326、AP012333、AP012334)歯周病学24年度は、サンプリングした被験者の数は少なかったものの、採取したサンプルから17株の新菌種候補を得ることができ、順調に経過していた。25年度に入り、17株の中でも、特に既知の菌種と相同性の低い3株を選び、より詳細な16S遺伝子のシークエンスを行った。それらの分離株について、性状試験やDNA-DNAハイブリダイゼーション等により、細菌学的な特徴についての検討を開始したが、それらの解析についての作業について遅延が生じており、解析可能な結果には至っていない。また、全ゲノムのドラフトシークエンスについても、開始しておらず、これまでの研究の達成度としては、やや遅れていると考える。当初の予定では、24年度は、10から15名の被験者からデンタルプラークのサンプリングを行い、採取したサンプルから生菌を分離し、純化、16S解析を実施することとなっていた。25年度以降も同様の作業を継続し、新菌種候補が得られた場合、生物学的な性状分析とゲノムのドラフトシークエンスを行い、新菌種であることを確認する予定であった。24年度に実施したサンプリングは、被験者4名にとどまっている。しかしながら、採取したサンプルからは、60の株を分離し、それらについて16S解析を実施したところ、17株の新菌種候補を得ることができた。これは、当初、24年度に予定していた数よりも多いものであった。サンプリング数は少なかったものの、経過としては概ね順調であると考える。25年度中に得たサンプルからも、同様に生菌分離を行う予定です。既知の菌種と特に相同性の低かった3株については、性状分析を進め、生物学的な特徴を明らかにするとともに、全ゲノムのドラフトシークエンスを実施する予定である。ドラフトシークエンスは、パイロシークエンス法を応用した次世代シークエンサーを用いてショットガン方式にて行う予定である。全ゲノムの詳細なシークエンスの決定は困難であるため、可能な限りのアッセンブリを行う。得られたデータは公的データベースに登録し、リファレンス情報として利用できるようにする予定である。25年度は、継続してサンプリングを行い、さらなる新菌種候補を分離する予定である。同時に、25年度中に分離された17の臨床分離株について、性状試験やDNA-DNAハイブリダイゼーション等により、細菌学的な特徴について検討を行い、新菌種の提唱を目指す。
ジャズと文学：日米文学研究とインプロヴィゼーション・スタディーズの視点から

その誕生から100年を迎えたジャズは、多くの日本文学・アメリカ文学作品に描かれ続けている。本研究は日米のジャズをめぐる文学作品を、文学研究およびインプロヴィゼーション・スタディーズの研究手法を併せた学際的な視点にて再検証する。日米におけるジャズ文学史を、特に即興実践の表象に着目しながら分析することで、ジャズを描いた文学作品の特性と魅力を明らかにしたい。