hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属アルコキシドが触媒するヨードアミノ環化反応とその不斉触媒化に関する研究

今年度は、昨年度開発したヨードアミノ環化反応のエナンチオ選択的反応への展開と、これまで報告例のなかった3員環ヨードアミノ環化反応(ヨードアジリジン化反応)の開発について検討を行った。以下にその結果を述べる。1、N-アリルトシルアミド誘導体のヨードアジリジンハロ環化反応において、3員環形成反応はあまり一般的ではなく、特にヨードアジリジン化反応に関しては、全く報告がなされていない。申請者は、基質としてN-アリルトシルアミド誘導体を用い、tert-BuOKとヨウ素の存在下反応を行うことにより、ヨードアジリジン誘導体が良好な収率で得られることを見い出した。本反応は、アリル、クロチル、プレニル、メタリル、環状オレフィン等を有する種々のN-シルアミド誘導体に適用可能である。また、反応の3-exo環化選択性や立体特異性(trans-付加)もほぼ完全であり、アジリジン誘導体の有用な合成方法になり得ることも明かにした。2、エナンチオ選択的ヨードアミノ環化反応とその応用不飽和カルバメート、ウレア、アミド等の両性求核種を有する基質のハロ環化反応では、通常、o-環化生成物がN-環化生成物に優先して得られてくることが知られている。申請者は昨年度の研究で、上記基質のヨード環化反応をLiAl(Ot-Bu)_4とヨウ素の存在下行うことにより、いずれの基質においてもN-環化生成物のみが良好な収率で得られてくることを見い出した。この結果に着目し、キラル配位子(BINOL,TADDOL,酒石酸エステル等)で修飾したLiAl(OR^*)_4を用いて反応のエナンチオ選択性について検討を行ったが、得られるヨードアミノ環化生成物の不斉収率は10%以下であり、これについては現在鋭意検討中である。不飽和カルバメート、ウレア、アミドなど両性求核種を有する基質のヨード環化反応は、一般にO-環化体を優先して与えることが知られており、これらの基質に共通してN-環化生成物を得る方法は未だ確立されていなかった。申請者は、ヨウ素と種々の金属試薬の存在下、上記基質のヨードアミノ環化反応を検討したところ、金属試薬としてn-BuLiやLiAl(Ot-Bu)_4の様なLi系金属試薬を用いると、いずれの基質においても良好な収率でN-環化生成物のみが得られることを見い出した。このLi系金属試薬の効果は注目すべきものであり、例えばN-エトキシカルボニル基を有するN'-アリルウレアや4-ペンテン酸アミドの反応を他の金属試薬[NaH,t-BuOK,Ti(Ot-Bu)_4,Al(Ot-Bu)_3]存在下行っても、O-環化生成物かあるいはO-環化生成物とN-環化生成物の混合物を与えるのみである。本反応は5員環形成反応のみならず、6員環形成反応にも適用可能である。さらに、本ヨードアミノ環化反応のジアステレオ選択性について検討した結果、ホモアリル位に不斉中心を有するホモアリルカルバメートの反応では高い1,3-cis選択性が、またホモアリルウレアの反応では高いtrans-選択性が観察された。今後は、塩基性不斉金属触媒を用いるエナンチオ選択的ヨードアミノ環化反応や、塩基性金属試薬による求核部位の活性化を利用した3員環ヨードアミノ環化反応(ヨードアジリジン化反応)などについて検討する予定である。
エリスロポエチンとインスリン様成長因子1の脊髄保護効果の検討とシグナル伝達の解明

胸腹部大動脈瘤手術の重大な合併症の一つである下半身麻痺は、手術中の大動脈遮断に伴う脊髄虚血が原因と考えられている。しかし、脊髄虚血から脊髄を保護する方法は未だに確立されていない。多くの薬物による脊髄保護効果が動物実験で報告されているが、臨床応用するには、その薬物の安全性など詳細に検討すべき事柄が多い。本研究では、既に市販されているエリスロポエチン製剤とインスリン様成長因子1製剤の併用により、家兎一過性脊髄虚血モデルで保護効果があることを見出した。平成19年度はエリスロポエチン(EPO)とインスリン様成長因子1(IGF-1)の虚血前投与による脊髄保護効果を検討している。方法:家兎を用い、脊髄虚血30分前に以下の薬物を投与した。(1)生理食塩水(対照群)、(2)EPO 500 U/kg(EPO 500群)、(3)EPO 800 U/kg(EPO 800群)、(4)IGF-1 0.15mg/kg(IGF群)、(5)EPO 500 U/kg+IGF-1 0.15mg/kg(EPO 500+IGF群)脊髄虚血時間は13分間とし、再灌流後7日間後肢運動機能を観察した。後肢運動機能は5段階評価とした(4:正常、3:跳躍はできるが正常ではない、2:後肢はよく動くが跳躍できない、1:後肢がわずかに動く、0:後肢の完全麻痺)。その後、脊髄を灌流固定し、HE染色により腰部腹側脊髄の正常神経細胞数を計測した。結果:現在のところ、各群n=7まで行い、神経学的評価まで終了したところである。再灌流7日後の後肢運動機能スコアは、対照群4:0羽、3:2羽、2:2羽、1:0羽、0:3羽、EPO 500群で4:4羽、3:0羽、2:0羽、1:1羽、0:2羽、EPO 800群で4:2羽、3:3羽、2:2羽、1:0羽、0:0羽、IGF群で4:4羽、3:1羽、2:1羽、1:1羽、0:0羽、EPO 500+IGF群で4:1羽、3:0羽、2:5羽、1:0羽、0:1羽であった。現在、数を増やしながら、組織学的検討を行っているところである。平成20年度は、平成19年度の研究結果を基に、エリスロポエチン(EPO)とインスリン様成長因子1(IGF-1)の高用量とその併用の虚血前投与による脊髄保護効果を検討した。脊髄虚血時間は13分間とし、再灌流後7日間後肢運動機能を観察した。【結果】再灌流7日後の後肢運動機能スコアは、対照群で4:1羽、3:2羽、2:3羽、1:0羽、0:3羽、EPO群で4:3羽、3:3羽、2:3羽、1:0羽、0:0羽、IGF群で4:1羽、3:3羽、2:1羽、1:0羽、0:4羽、EPO+IGF群で4:5羽、3:4羽、2:0羽、1:0羽、0:0羽で、EPO+IGF群が有意に良好であった。正常神経細胞数(平均値)も、対照群27、EPO群51、IGF群29、EPO+IGF群70とEPO+IGF群が有意に良好であった。【考察・結語】過去の報告では、EPOとIGF-1には強い保護効果が観察されているが、本研究では、有意な保護効果は観察されなかった。しかし、両者の併用には強い保護効果が観察された。EPOとIGF-1はともにAktを活性化する作用があるが、両者の併用により、Aktの活性化が増強されたか否かを確認する必要がある。
転がり軸受の極微量油潤滑法開発を目指した油不足EHLの基礎研究

油不足EHLにおける中心部油膜厚さ,最小油膜厚さ,前方メニスカスおよび側方メニスカス距離を,転がり接触部へ流入する付着油膜厚さの関数として算出できる回帰式をElrodのアルゴリズムを用いたEHL数値解析の結果から導出した.最小部油膜厚さは,油不足が厳しいとき,すなわち流入付着油膜厚さが薄い場合は,中心部油膜厚さとの比が一定となることが見出された.したがって,最小部油膜厚さは流入油膜厚さが0の近傍における中心部膜厚変化との微係数の比として与えられる.これらの式の妥当性と,実際の転がり軸受で必要な連続転走の影響を確かめるために,光干渉法を用いた油膜厚さ測定装置を作成した.連続転走の影響はガラスディスク上の同一転走軌道上に鋼球を3つ配置し,それぞれの油膜厚さを光学干渉により測定することで調べた.また,最初の転動体の前方にはころを配することで,一様流入油膜を作り出した.入り口流入油膜は転がり接触部を通過した後,転動体に付着し再度,入り口に流入するため,中心部油騰卓さは,ガラスに付着した油膜厚さと中心部油膜厚さそれ自身の1/2の和とにより決まる.この関係と本研究で得た回帰式,およびHamrock-Dowsonの油膜厚さ式を連立させて解くことで推定された中心部油膜厚さは,光干渉法で測定された中心部油膜厚さと10%以内の誤差で一致した.また,3個の転動体の連続転走による油膜の減少についても,前述の方法を繰り返して行うことで,推定が可能となり,測定結果とおおよそ一致した.また,側方への流出によるサイドバンドの影響がメニスカスサイズに現われ始めるのは,入り口流入油膜が十分潤滑時の油膜厚さ程度になったときであり,特に側方メニスカス距離は計算値と大きく相違する.しかしながら,側方メニスカスが油膜厚さに与える影響は非常に小さい.油不足EHLにおける中心部油膜厚さ,最小油膜厚さ,前方メニスカスおよび側方メニスカス距離を,転がり接触部へ流入する付着油膜厚さの関数として算出できる回帰式をElrodのアルゴリズムを用いたEHL数値解析の結果から導出した.最小部油膜厚さは,油不足が厳しいとき,すなわち流入付着油膜厚さが薄い場合は,中心部油膜厚さとの比が一定となることが見出された.したがって,最小部油膜厚さは流入油膜厚さが0の近傍における中心部膜厚変化との微係数の比として与えられる.これらの式の妥当性と,実際の転がり軸受で必要な連続転走の影響を確かめるために,光干渉法を用いた油膜厚さ測定装置を作成した.連続転走の影響はガラスディスク上の同一転走軌道上に鋼球を3つ配置し,それぞれの油膜厚さを光学干渉により測定することで調べた.また,最初の転動体の前方にはころを配することで,一様流入油膜を作り出した.入り口流入油膜は転がり接触部を通過した後,転動体に付着し再度,入り口に流入するため,中心部油騰卓さは,ガラスに付着した油膜厚さと中心部油膜厚さそれ自身の1/2の和とにより決まる.この関係と本研究で得た回帰式,およびHamrock-Dowsonの油膜厚さ式を連立させて解くことで推定された中心部油膜厚さは,光干渉法で測定された中心部油膜厚さと10%以内の誤差で一致した.また,3個の転動体の連続転走による油膜の減少についても,前述の方法を繰り返して行うことで,推定が可能となり,測定結果とおおよそ一致した.また,側方への流出によるサイドバンドの影響がメニスカスサイズに現われ始めるのは,入り口流入油膜が十分潤滑時の油膜厚さ程度になったときであり,特に側方メニスカス距離は計算値と大きく相違する.しかしながら,側方メニスカスが油膜厚さに与える影響は非常に小さい.まず,点接触転がり接触部へ流入する油膜厚さ(以下,入り口油膜厚さ)をパラメータとして,中心部油膜厚さに関するスタベーションファクターを算出する回帰式を数値計算結果より得た.ここで提案する回帰式は,入り口油膜厚さの減少に対するスタベーションファクターの減少の程度を示す指数が運転条件,すなわちHamrock-Dowsonの無次元パラメータU, W, Gの関数として与えられる.提案する回帰式の妥当性について製作した光学観察装置により確認した結果,誤差10%以下でスタベーションファクターが推定できることがわかった.さらに,最小部膜厚,入り口メニスカス長さ,および側方メニスカス長さを算出する回帰式の定式化を行った.最小部膜厚は中心部膜厚を推定する回帰式とまったく同じ形の式で,単に入り口油膜厚さにHamrock-Dowsonの無次元パラメータU, W, Gの関数として与えられる係数を乗ずればよいことが示された.入りロメニスカス長さ,および側方メニスカス長さは,入り口油膜厚さとほぼ線形関係にあり,その係数が運転条件,すなわちHamrock-Dowsonの無次元パラメータU, W, Gの関数として与えられる.これら数値計算から算出した回帰式を実際の転がり軸受に適用するため,連続転走する転動体における膜厚の測定ができるよう既存装置に新たに球状ローラーを2つ追加した.合計3つの転動体が連続転走する系で中心部膜厚の観察を行った.この系での入り口油膜厚さを前方の中心部膜厚と自身の中心部膜厚の平均であると仮定し,提案する回帰式との連立方程式とみなし解くことで,連続転走による中心部膜厚の減少を推定した結果と観察結果は概ね一致した.

ElrodのアルゴリズムをEHL数値計算に適用し,油膜厚さ,油膜圧力とメニスカス位置を自動決定するプログラムを作成した.これより油不足を考慮した数値計算による転がり軸受運転条件(荷重,速度,材料物性および平均供給油量)をパラメーターとしたパラメータースタディを行い中心部油膜厚さ,最小油膜厚さおよび前方・側方メニスカス距離を算出する回帰式を,油膜厚さに対してはHamrock-Dowsonの油膜回帰式に対するスタベーションファクターとして,メニスカス距離に対しては無次元長さとして導出した.並行して連続転走状態が実現できる光学干渉装置を作成し油膜厚さとメニスカス距離の実測を行った.その結果から3%8%程度の誤差で既述の油膜厚さとメニスカス距離が推定できることを確認した.ただし,メニスカス距離については,供給油量が多い場合は側方の油溜まりによる影響が大きく,数値計算による推定値から大きく外れる.しかし,この状態であっても中心部油膜厚さにはほとんど影響しないことがわかった.実際の高速転がり軸受での油不足状態で必要となる動的な効果についても検証した.一つは,遠心力による内外輪転走面のずれによる油剤の再流入効果であり,これについて光学干渉試験機を改変して簡単なモデル試験を行った.このモデル試験結果を導出した回帰式を用いて推定することができるかを平均流量の考え方を導入して検証した.一様厚さの油膜が流入する場合の推定誤差に比較すると誤差は大きくなるが,側方の油溜まりを含めた平均油量を用いた流量バランスと回帰式のみで,ある程度の見積りが可能であることが示された.もう一つは,油剤の軸受内からの散逸と供給のバランスによる軸受内での平均油量の見積りであり,これは既存の実機相当スピンドル装置での定量油剤潤滑試験から得られる摩擦係数変化と膜厚推定値の変化の関係から類推した.この場合,摩擦係数変化はEHL油膜厚さの変化よりも,発熱による油剤および周囲温度の影響が顕著であることがわかった.
科学技術計算に有用な高速4倍長演算に関する研究

本研究で開発・評価・性能向上を行った4倍精度数演算ルーチンの数学研究の応用として、Brun定数の高精度計算に適応を行い、論文を作成し投稿を行った。また本研究成果を基に、博士論文執筆中である。なおBrun定数とは、p(>=2)を素数としたときp+2も素数となる全てのpについての(1/p+1/(p+2))の総和の値を言う。これまでに知られていたBrun定数は小数点以下9桁目まで正しく求まっていたが、本研究で10桁目を正しく求める事が出来た。並列計算機の性能向上や数値計算法の進展は大規模科学技術計算の大きな鍵となっている。浮動小数点演算において計算規模が増すに従って多くの計算を必要とし、計算誤差が増大する。その解決策の1つとして倍精度数より有効桁数の多い倍精度を2つ用いて表。される'double-double'精度のデーター型の4倍長精度数がある。しかし4倍長精度演算はソフトウェアによって実現されているため、倍精度演算に比べ多くの計算時間を必要とする。本年度は4倍精度数学関数の高速化を目指し、特に4倍長精度平方根関数の高速化を試みるとともに、理論的な誤差解析を行った。作成したアルゴリズムは3種類で、アルゴリズムAとBの共に演算数は少ないが、gccより精度を確保できなかった。ところがアルゴリズムCは'double-double'精度で表現できる最大精度の解を算出することはできないが、その精度は計算機実験上gccよりはるかに精度が良く、10^7回の実験で全て正しい解を算出することができたことに加え、理論的な解析でさらに精度を高めたい場合の対策方法が判明した。またgccで採用されているアルゴリズムでは、今回の計算機実験では最大5ビットの誤差が発生し、正規化処理がされていないことがわかった。今後の展開としてはアルゴリズムCの問題点を改善したアルゴリズムの作成と計算機実験。さらに並列性を考慮したアルゴリズムの改良が考えられる。その解決策の1つとして倍精度数より有効桁数の多い倍精度を2つ用いて表される'double-double'精度のデーター型の4倍長精度数がある。この'double-double'精度の4倍長精度数は通常の計算機上で高速に計算をエミュレートできる特徴を持つ。その代償として4倍長精度演算はソフトウェアによって実現(エミュレート)されるため、倍精度演算に比べ多くの計算時間を必要とする。(4倍精度数の加減乗算で、ハードウェアで実現している倍精度数演算の1/10程度、除算で1/3程度の演算速度。)本年度はこれまでに開発・評価・性能向上を行った4倍精度数演算ルーチンの数学研究の応用として、Brun定数の高精度計算に適応を行い、論文を作成し投稿を行った。ここで言うBrun定数とは、p(>=2)を素数としたときp+2も素数となる全てのpについての(1/p+1/(p+2))の総和の値を言う。(この時のpを双子素数、Twin prime、と呼ぶ。)昨年度末までに知られていたBrun定数は小数点以下9桁目まで正しく求まつていたが、今回10桁目を正しく求める事が出来た。(現在までに得られているBrun定数の値は1.902160583...であり、今回最後の数値である3を確定した。)近年疎結合並列環境を用いた将棋プレーヤーの判断決定の方法として合議が注目されている。合議とは複数の将棋プレーヤーの判断を統合することによって最終的な指し手を決定する枠組みのことである。合議は比較的単純な実装方法で並列化を実現でき、多数決により判断ミスの少ない強い将棋プレーヤーを生成できるという利点がある。小幡らは将棋プログラムBonanzaに乱数合議と呼ばれる手法を用いることによって、従来のBonanzaに有意に勝ち越すプレーヤーを生成することに成功した(http://homepage1.nifty.com/ta_ito/ito-lab/gougi/gougi.html)。なお乱数合議とは、将棋プレーヤーが持つ評価関数の評価値を乱数により変化させることで複数の判断を生成し、それらを用いた多数決などで最終的な指し手を決定する手法をいう。科学技術計算における研究における4倍長精度計算の応用可能性の一例としての本研究で、プレーヤーの多様性に着目し特別な目的関数を用いつつ将棋プレーヤーの学習に集団学習手法を適用し、合議プレーヤーを生成する手法の提案をおこなった。実験でははじめにBaggingを将棋プログラムの学習に対し適用して合議プレーヤーを生成し、既存のボナンザメソッドによる学習によって生成された単一プレーヤーや乱数合議との比較を対戦実験によりおこなった。

さらにNegative Correlation Learningの考え方をBaggingによる将棋の集団学習に導入することによって生成された合議プレーヤーを対戦実験によって既存手法と比較した。実験の結果よく調整されたBaggingによる合議は乱数合議と同等の強さを持つこと、Baggingによる集団学習にさらにNegative Correlation Learningの考え方を用いて調整した合議は単一プレーヤーと乱数合議の双方に有意に勝ち越すことを確認した。本稿の結果は集団学習により強い合議プレーヤーを生成できることを意味し、今後様々な集団学習を用いた評価関数の学習が期待される。
新奇な硫黄-窒素三重結合を活用する合成反応と新規機能性分子の創製

本研究課題は,硫黄-窒素(S-N)三重結合を活用する新規機能性材料の創製を目的に,1)(S^<VI>-N)_n結合を主鎖にもつ化合物の合成とその特殊機能の開拓および,2)λ^6-スルファンニトリル類から誘導した新規ヘテロクムレン化合物(RN=S^<VI>=C=S^<VI>=NR)の結合特性の開拓を行なった。本年度の研究計画に基づき実施した研究成果を以下に述べる。平成16度の研究により,ジフェニルスルフィミド(Ph_2S=NH)と5当量のフルオロスルファンニトリル1(Ph2FS≡N)との反応から,両末端にS-N三重結合を持つ化合物2(Ph2(N≡)S-N=(Ph_2)S=N-(Ph_2)S≡N)をほぼ定量的に得られたことを見出した。本年度は,S^<VI>-Nがさらに拡張した化合物の構築を目的に化合物1と2との反応を種々試みたところ,活性化剤として,トリフルオロメタンスルホン酸(TMSOTf)を加えた系において,化合物3([Ph_2(N≡)S-N=(Ph_2)S=N-(Ph_2)S=N-(Ph_2)S≡N][TfO])を得ることに成功した。また,化合物2の両端窒素原子の反応性を利用して,ジブチルスズジクロリドとの反応を行ったところ,スズ原子を含む8員環化合物4の合成に成功した。この化合物4は,化合物2と反応し,さらに主鎖が拡大した化合物5([(Ph_2(N≡)S-N=(Ph_2)S=N-(Ph_2)S≡N)_2-SnBu_2][2Cl])を得ることが出来た。2)新規ヘテロクムレン化合物の結合特性の開拓本年度は,両端の窒素原子間を典型元素や遷移金属で架橋した新規環状化合物の合成を目的に,化合物6(Ph_2(HN=)S=CH-(Ph_2)S≡N)を塩基で処理した後,ジフェニルスズジクロリドと反応させたところ,スズ原子を含む新規環状化合物の合成に成功した。本研究課題は,硫黄-窒素(S-N)三重結合を活用する新規有機合成試剤および,新規機能性材料の創製を目的に,1)S-N三重結合の窒素原子の塩基性を活用する非イオン性強塩基試剤の設計・合成と種々の合成反応への利用,2)(S^<VI>-N)_n結合を主鎖にもつ化合物の合成とその特殊機能の開拓および,3)λ^6-スルファンニトリル類から誘導した新規ヘテロクムレン化合物(RN=S^<VI>=C=S^<VI>=HR)の結合特性の開拓を行う。最近研究代表者らは,フルオロスルファンニトリル1(Ph_2FS≡N)が(S^<VI>N)n結合を主鎖にもつ化合物のビルディングブロック剤として利用できることを見出している。そこで今回,既に合成に成功したPh_2(HN)=S=N-(Ph_2)S≡Nと化合物1との反応を行ったところ,さらにS^<VI>-Nが拡大したPh_2(N≡)S-N=(Ph_2)S=N-(Ph_2)S≡N2を得ることに成功した。また化合物2を効率良く得る合成法を種々検討したところ,ジフェニルスルフィミド(Ph_2S=NH)と5当量の化合物1とを塩基存在化で反応させた系において,化合物2をほぼ定量的に得ることに成功した。2,新規ヘテロクムレン化合物の結合特性の開拓申請者は、メチル-λ^6-スルファンニトリル(Ph_2MeS≡N)を出発物質として新規ヘテロクムレン化合物((MeN)Ph_2S=C=SPh_2(NMe))をはじめて合成することに成功した。今回は,S^<VI>=C=S^<VI>結合のさらなる特徴を探索するため,種々の官能基を有する化合物の合成について検討した結果,電子吸引基を持つN-アシルヘテロクムレン誘導体の合成に成功し,さらにその分子・電子構造についても明らかとした。

また,化合物2の両端窒素原子の反応性を利用して,ジブチルスズジクロリドとの反応を行ったところ,スズ原子を含む8員環化合物4の合成に成功した。この化合物4は,化合物2と反応し,さらに主鎖が拡大した化合物5([(Ph_2(N≡)S-N=(Ph_2)S=N-(Ph_2)S≡N)_2-SnBu_2][2Cl])を得ることが出来た。2)新規ヘテロクムレン化合物の結合特性の開拓本年度は,両端の窒素原子間を典型元素や遷移金属で架橋した新規環状化合物の合成を目的に,化合物6(Ph_2(HN=)S=CH-(Ph_2)S≡N)を塩基で処理した後,ジフェニルスズジクロリドと反応させたところ,スズ原子を含む新規環状化合物の合成に成功した。
メタボリックシンドロームにおける尿路結石促進機序の解明と分子標的治療への応用

尿路結石はメタボリックシンドローム(MetS)の一病態であると、私たちは報告してきた。本研究では、MetS環境における結石形成機序と結石マトリックスオステオポンチン(OPN)との関連を解明するため、以下の研究を行った。[1]脂肪細胞・マクロファージ・尿細管細胞の共培養系を確立し、尿細管細胞単独よりも、3細胞の共存環境でもっともシュウ酸カルシウム一水和物結晶の付着能が亢進した。[2]抗MetS作用を有するベージュ細胞を誘導するβ3作動薬を投与し、結石形成を有意に抑制した。[3] MetSモデルマウスに対し、抗OPN抗体を投与することで尿路結石と動脈硬化を有意に抑制した。1.脂肪細胞・Mφ・尿細管細胞の共培養系を用いたMetS環境での新規結石形成因子の同定・MetS環境モデル共培養系の確立:マウス腎尿細管細胞(M-1)・脂肪細胞(3T3-L1)・Mφ(LAW264.7)を用いた共培養系を確立し、M-1単独環境よりも、3細胞が共存環境下でもっともシュウ酸カルシウム一水和物(COM)結晶の尿細管細胞への付着能が有意に更新した。当年度の予定としては、脂肪細胞の濃度勾配を配した共培養系を確立し、分離細胞毎の遺伝子変異、培養液の因子解析を行う予定であったが、予想よりも脂肪細胞の分化プロセスの安定化、共培養系の確立が困難であった。このため、脂肪濃度勾配によって、COM結晶の付着能の亢進、および関連遺伝子(Spp1, Ccl2, Il6, Tnf, Sod1)の発現亢進を同定する段階までは計画通り進んだ。2. MetSモデルマウスを用いたゲノムワイド解析による結石形成責任遺伝子OPNの機能分析・本年度は、OPN欠損MetSモデルマウスを産出し、Genotyping用プライマーの確立と、繁殖を行う予定であった。Genotyping用プライマーは、Leptin遺伝子に関しては設計が完了した。しかし、OPN欠損MetSモデルマウスの産出は、MetSモデルマウス(ob/ob)の形質としての出産率の低さが問題となり、頭数がまったく増えなかった。このため、現在までOPN欠損マウスの頭数を十分に増加させ、今後、Leptinヘテロ欠損マウスとの交配を通じて、目的マウスが産出できるよう飼育を続けている。1.脂肪細胞・Mφ・尿細管細胞の共培養系を用いたMetS環境での新規結石形成因子の同定予想よりも脂肪細胞の分化プロセスの安定化、共培養系の確立が予想を遙かに超えて困難であったことが主要因である。2. MetSモデルマウスを用いたゲノムワイド解析による結石形成責任遺伝子OPNの機能分析OPN欠損MetSモデルマウスの産出は、MetSモデルマウス(ob/ob)の形質としての出産率の低さが問題となり、頭数がまったく増えなかったことが主要因である。本研究は、メタボリックシンドローム(MetS)による尿路結石形成が促進する機序の主体が「腎尿細管細胞・脂肪細胞・マクロファージとの共存環境におけるオステオポンチン(OPN)発現の亢進」であると位置付け、動脈硬化も標的とした新たな結石予防因子として抗OPN抗体を用いることが目的であり、共培養システム、動物モデルを用いて以下の3つの研究を行うものである。1.脂肪細胞・Mφ・尿細管細胞の共培養系を用いたMetS環境での新規結石促進因子の同定:本年度は、Mφのクラスタリング解析とマルチプレックス解析によるパラクライン因子同定を行う予定であったが、脂肪細胞に関わる新知見として、UCP-1発現を有するベージュ細胞の存在が明らかとなり、まずは3T3L-1脂肪細胞の分化モデルにベージュ細胞分化因子であるCLを投与することによって、ベージュ細胞モデルの確立を行った。2.MetSモデルマウスを用いたゲノムワイド解析による結石形成責任遺伝子OPNの機能分析:1.に順じ、新たな知見としてベージュ細胞活性を促進することによる尿路結石形成研究を行った。具体的には、結石モデルマウスに予め1週間PBS、CL0.1、CL1.0を投与し、結石形成モデルを作らせた、その結果、CL投与群において脂肪細胞の脂肪滴が細径化したベージュ細胞が分化し、PBS投与群と比較して腎結石形成が有意に少なくなった。3.抗OPN抗体によるMetS環境での尿路結石予防効果の解析と分子標的治療の開発:MetSモデルマウス(ob/ob)に対し、予定通り抗活性型OPN抗体を投与した。結果として尿路結石の形成は一部の投与濃度で抑制された。今後細胞培養モデルを用いた研究を行っていく。本年度は、Mφのクラスタリング解析とマルチプレックス解析によるパラクライン因子同定を行う予定であったが、脂肪細胞に関わる新知見として、UCP-1発現を有するベージュ細胞の存在が明らかとなり、まずは3T3L-1脂肪細胞の分化モデルにベージュ細胞分化因子であるCLを投与することによって、ベージュ細胞モデルの確立を行った。またベージュ細胞促進因子CL投与を行うことによる腎結石形成予防効果が認められたため、本来の白色脂肪細胞研究と併行してベージュ細胞研究も行ったため、発現解析が予定通りには行う事ができなかった。[1]本年は白色脂肪細胞(3T3-L1)の単独培養が不調で、諸条件の見直しで予想通りの分化が得られるまでに約半年かかった。

次いで、β3刺激薬投与によるベージュ細胞分化を試みたが、条件を変えても形質変化が見られず断念した。こおため褐色脂肪細胞モデルC3H10t1/2細胞の単独培養に着手した。この手法で褐色脂肪細胞の分化成熟が確認できれば、共培養系の実験に進む。[2]前年度のwild-typeの採取組織(腎+脂肪)の評価を行い、脂肪細胞内の脂肪滴縮小を認めた。また、β3投与により脂肪組織内のUCP-1とアディポネクチン発現量がそれぞれ8.1倍、4.2倍に増加し(P<0.01、P=0.01)、IL-6の発現量が0.3倍に低下した(P=0.02)。一方腎組織内のSOD発現量は2.3倍に増加した(P=0.04)。本知見をもって、ob/obマウスを使用することなく、マウスの褐色脂肪組織を除去・移植することが、本研究テーマに最も相応しい結果に繋がると判断し、現在研究を進めている。[3] 8週齢雄ob/obの結石モデル作成系に対し、Day 0, 3, 6にコントロールとしてIgG抗体500μgを腹腔内投与した群(n=4)、OPN抗体250μgを投与した群(n=4)、OPN抗体500μgを投与した群(n=4)に分けた。Day1, 4, 7に麻酔下に解剖し、血液、腎、大動脈を採取した。血液尿生化学を測定した。また摘出腎の結石形成量と結石関連因子発現、動脈硬化を観察した。OPN抗体500μg投与群は、Day4では有意に結石形成量が少なかったが、Day7では少ない傾向にあったが有意差を認めなかった。尿生化学では各群の有意差を認めず、血液生化学ではOPN抗体500μg投与群のday4でのみAdiponectinが有意に高かった。大動脈硬化像も同群で有意に抑制された。尿路結石はメタボリックシンドローム(MetS)の一病態であると、私たちは報告してきた。本研究では、MetS環境における結石形成機序と結石マトリックスオステオポンチン(OPN)との関連を解明するため、以下の研究を行った。[1]脂肪細胞・マクロファージ・尿細管細胞の共培養系を確立し、尿細管細胞単独よりも、3細胞の共存環境でもっともシュウ酸カルシウム一水和物結晶の付着能が亢進した。[2]抗MetS作用を有するベージュ細胞を誘導するβ3作動薬を投与し、結石形成を有意に抑制した。[3] MetSモデルマウスに対し、抗OPN抗体を投与することで尿路結石と動脈硬化を有意に抑制した。1.脂肪細胞・Mφ・尿細管細胞の共培養系を用いたMetS環境での新規結石形成因子の同定:脂肪濃度勾配によって、COM結晶の付着能の亢進、および関連遺伝子(Spp1, Ccl2, Il6, Tnf, Sod1)の発現亢進を同定する段階までは計画通り進んだため、引き続き1autoMACSを用いた細胞分離による細胞腫毎の発現解析、2マルチプレックス解析による培養液内の可溶性因子の定量、4マイクロアレイ解析による定量を進める。2. MetSモデルマウスを用いたゲノムワイド解析による結石形成責任遺伝子OPNの機能分析:Leptinヘテロ欠損マウスとの交配を通じて、目的マウスが産出できるよう飼育を続け、予定数に達したところで、結石形成実験を行う。3.抗OPN抗体によるMetS環境での尿路結石予防効果の解析と分子標的治療の開発:抗OPN抗体をMetSモデルマウスに投与し、尿路結石・動脈硬化の防御硬化を確認する研究である。現在、抗OPN抗体に関する薬剤譲渡契約を協議中のため、抗体を入手次第、MetSモデルマウスに対する投与を開始する。
ストレス蛋白質と外膜蛋白質からなる二成分型シグナル伝達機構に関する研究

アブラムシ細胞内共生体が合成するストレス・タンパク質シンビオニンはヒスチジンタンパク質キナーゼ活性を有することから、共生体におけるエネルギー転換系の中心的役割を担うとともに、細胞内情報伝達機構に関与すると考えられる。本研究では、シンビオニンが二成分型機構における"センサー分子"として機能する可能性を立証するための解析を行い以下の成果を得た。1.新たに開発した制御分子検出法により、共生体にはシンビオニンから高エネルギーリン酸基を受容するタンパク質(制御分子)が8種類存在することを見出した。また、これらすべてのタンパク質を電気泳動的に分離・精製し、その部分アミノ酸配列分析を行い、既知タンパク質との相同性を検索した結果、4種類の制御分子(DnaK、SymL、OmpF、HistoneH1)を同定した。2.免疫染色法および免疫沈降法により、42-kDa制御分子は大腸菌の外膜構成タンパク質(ポリン)OmpFと免疫化学的特性を共有することを見出した。3.電子顕微鏡を用いた免疫組織化学法によりセンサー分子および制御分子の共生体内局在性を調べた結果、シンビオニンは細胞質に、OmpF相同分子は主として外膜画分に(一部は細胞質)に局在することを明らかにした。4.大腸菌の外膜単離法に準じて、共生体から外膜を単離する方法を確立した。さらに、シンビオニンと共生体外膜からなるリン酸基転移解析系を再構築し、そのキネティックスを詳細に解析した。5.本研究により得られた結果に基づき、アブラムシ細胞内共生系における情報伝達機構のモデルを提唱した。アブラムシの細胞内共生微生物(共生体)が合成するストレスタンパク質・シンビオニンは、分子シャペロンとして機能するばかりでなく、ヒスチジン・タンパク質キナーゼ(HPK)として、共生体におけるエネルギー転換系の中心的役割を果たすとともに、共生体と宿主の間の情報伝達にも関与すると考えられる。本年度は主に、シンビオニンが2成分型シグナル伝達機構における′′センサー分子′′として機能しうる可能性を立証するための解析を行い、以下の成果を得た。1.シンビオニンが共生体内でセンサー分子として機能するためには、′′制御分子′′すなわち、リン酸化シンビオニンから高エネルギーリン酸基を受容するタンパク質が必要である。本研究者はすでに、8種類のリン酸基受容タンパク質の存在を見出しているが、本年度は、これら全てのタンパク質を分離・精製し、精製標品の部分アミノ線配列分析を行い、さらにデータベースを用いて既知のタンパク質との一次構造上の相同性を検索した。その結果、4種類の受容タンパク質の同定に成功した。残りの4種類のタンパク質については現在分析中である。2.リン酸基受容タンパク質の1つ(分子量42,000)は、大腸菌の外膜を構成するタンパク質(OmpF、OmpC、PhoE)と高い相同性を示し、かつ抗原性も共有することをすでに見出している。そこで本年度は、アブラムシ共生体の外膜単離法ならびに外膜タンパク質の部分精製法を確立し、シンビオニン/外膜(あるいは外膜タンパク質)から成る2成分機構におけるリン酸基転移反応のキネティックスを詳細に解析した。我々は、アブラムシの細胞内共生体が合成するストレスタンパク質・シンビオニンは、分子シャペロンとして機能するばかりでなく、2成分系センサー分子として共生体と宿主間の情報伝達機構に関与すると考えている。この仮設を立証するために、センサー分子・シンビオニンから高エネルギーリン酸基を受容する制御分子の検索を行い、これまでに4種類の制御分子(DnaK,SymL,OmpF,HistoneHl)を同定した。本年度は主にOmpF-相同分子に焦点を絞り解析を進め以下の成果を得た。1.抗ー大腸菌OmpF抗体を用いた電子顕微鏡免疫組織化学法により、OmpFー相同分子は主に共生体の外膜画分に局在し、一部は細胞質中にも存在することを明らかにした。又、シンビオニンは、共生体の細胞質にのみ存在することを明らかにした。2.OmpF

-相同分子の全アミノ酸配列を明らかにするために、OmpF遺伝子のクローニングを開始し、これまでに、OmpF遺伝子の一部(約700bp)をクローニングした。3.アブラムシ共生体から外膜を単離する方法を確立し、シンビオニン/単離外膜から成るin vitroの2成分型情報機構解析系を確立し、リン酸基転移反応のキネティックスを詳細に解析した。
膵ランゲルハンス島移植生着延長に及ぼすクッパー細胞及びマクロファージ除去効果

膵ラ島移植における最も大きな問題として、移植片が早期に機能不全となる現象(PNF)があげられる。その原因として移植片周囲のマクロファージや肝内ではクッパー細胞の活性化に伴った非特異的炎症反応が推察されているが、未だ確定されていない。そこで、ラットを用いて膵内および膵ラ島内マクロファージのsubpopulationの局在を免疫染色にて検索し、LE-C12MDPによるマクロファージ除去膵ラ島を用いてPNFへの関与を検討し、膵ラ島移植生着延長に及ぼすクッパー細胞、マイクロファージ除去効果を明らかにすることを目的とした。膵ラ島は雄性Wisterラットからコラゲナーゼ注入消化法、デキストラン不連続濃度匂配法により採取し、レシピエントにSTZ静注により作成した雄性Lewisラットを使用して腎被膜下に移植した。マクロファージED1、ED2免疫染色は、凍結切片にて直接法で行った。LE-C12MDP作成はVan Rooijenらの方法によった。分離膵ラ島のマクロファージ除去はLE-C12MDPとの混合培養にて行った。レシピエントマクロファージおよびクッパー細胞除去はLE-C12MDP腹腔内投与により行った。ED1+は外分泌組織内および膵島周囲に認められ、また膵島内にも確認されたが、ED2+は外分泌組織および膵島内にほとんど認められなかった。膵島1000個の同系移植(Wister-Wister)においては全例血糖は低下し、PNFの発生は認められなかった。同種移植においてはマクロファージ除去膵島移植+レシピエントマクロファージ除去の系においてPNF発生を抑制しえた。血清TNFα値は有意な差を認めなかった。膵ラ島同種腎被膜下移植におけるPNF発生は,同種移植免疫学的機序が関与しており、この反応には膵島内ED1陽性細胞およびレシピエントマクロファージが関わっていることが示された。平成11年度は、ラット膵ラ島分離については、DAラットを用いてkaufmanの方法に準じて行い、viabilityの良好なラ島が充分な収量得られた.しかし、LEC12MDP作成担当である赤松順寛が米国留学となり、安定したLE-C12MDPが作成できず、膵ラ島中のマクロファージ除去効果の判定が行われずにいた.ようやく最近になりLE-C12MDP作成技術に習熟し、来年度は今年度に予定していたvitroの系による評価とともにvivoによる検討を行い、研究を完遂する.1.ラット膵ラ島の分離純化:WisterおよびLewisラットを用いてコラゲナーゼ膵管内注入法にてラ島分離、純化を行い、Wisterでは1匹当たり200IEQのラ島を安定して採取し、static incubation法で良好なvaiabilityであることを確認した。2.分離ラ島の同系ラット移植:ストレプトゾトシン静注により作成した糖尿病Wisterに同系Wister無処理ラ島800IEQを腎被膜下および門脈内注入し、耐糖能の改善を確認した。この系ではPNFの現象は認められなかった。3.LE-Cl2MDP作成とマクロファージ除去:作成したLE-Cl2MDPをWisterラットに静注および分離ラ島混合培養によりマクロファージ除去操作を行った。マクロファージ除去の確認は、ED1およびED2抗体を用いた凍結切片による免疫染色を行い、静注では膵臓中ED2陽性細胞は除去されないが、分離後のラ島はED2陰性となる現象が認められた。

分離ラ島とLE-Cl2MDPとの混合培養ではED1陰性でとなり、LE-Cl2MDP静注後分離ラ島と混合培養ラ島ではラ島内マクロファージ除去に差が認められた。これらはパラフィン包埋切片でも確認された。分離ラ島とLE-Cl2MDPの混合培養による毒性試験はインスリン分泌能により検討を加え、問題がなかった。5.無処置ラ島800IEQのWister-Lewis同種腎被膜下移植ではRNF高率に認められ、この系でLE-Cl2MDP静注処理ラ島、混合培養処理ラ島の移植実験を行った。
作物培養細胞の分化及び器官形成過程の遺伝子活性

無菌培養したバレイショ植物の塊茎のcDNAライブラリーをディファレンシャルスクリニング法により選抜し、pT1cDNAクローンを得た。本研究では、新たな塊茎形成指標蛋白質PKPIの遺伝子構造および発現特性を明らかにした。塊茎誘導に影響する低温、ジャスモン酸およびショ糖が、PKPI遺伝子の発現誘導に密接に関係する事実は、両者に共通に制御機構を示唆する。イネ種子カルスを誘導して180210日間培養後のカルスはアブサイシン酸(ABA)添加培養により,ABAが不定胚の形成を誘起し、不定胚前段階の分化を完成することを組織切片で観察発見し、ABAの不定胚由来の再分化植物体の比率を増加し、茎葉分化由来の再分化植物体形成の抑制抑効果を観察した。ABA添加培養は、カルスに45kD、24.5kD、18.5kD及び14kDの新生蛋白質を誘導した。それぞれの同一分子量の蛋白質は成熟種子胚にも見られ、植物体再分化及び種子発芽時に消失することを観察した。培養カルスのABA誘導蛋白質が種子形成と成熟段階に、内生ABAによるABA特異的発現蛋白質と類似した性質、あるいは相同アミノ酸配列を持っている可能性を示唆した。バレイショ葉肉プロトプラスト、タバコ葉肉プロトプラスト、ダイズ培養細胞プロトプラスト、ニンジン培養細胞プロトプラストを用いて、電気容量125μF電圧600Vの条件で遺伝子を導入し、プロモーターの発現量を比較したところ、GUS活性の高かった順にNOS、35S、PKPI、Act-1、Controlとなった。一方イネ培養細胞プロトプラストでは、Act-1、35S、NOS、PKPI、Controlの順を示した。イネ培養細胞プロトプラストで発現量の多かったAct-1は、単子葉植物のイネ由来のプロモーターであるため、同じ単子葉植物であるイネにのみ、高い発現量を示したものと考えられる。NOSはアグロバクテリウム由来の、35Sはカリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーターであり、どちらも双子葉植物を宿主とする病原菌由来のプロモーターである。また、PKPIは、双子葉植物であるバレイショ由来のプロモーターである。このため、イネ以外のプロトプラストでは、これらの発現量が多かったと考えられる。バレイショ植物の培養および塊茎形成誘導を組織培養の手法を用いておこなった。塊茎の生重は誘導後2週間の間に急増し、可溶性蛋白質の電気泳動法による分析では、塊茎特異的蛋白質が40、24、23、22kDaに存在した。無菌培養した塊茎のcDNAライブラリーをディファレンシャルスクリーニング法により選抜し、pT1cDNAクローンを得た。pT1の塊茎特異的発現が塊茎形成誘導後5日目から確認され、塊茎の肥大に伴い増加した。このcDNAは796塩基で、222残基のアミノ酸配列から成る24.7kDa蛋白質を完全にコードする領域を含み、アミノ酸配列はバレイショのKunitz型プロテアーゼインヒビター(PKPI)のN末端配列と一致した。PKPIcDNAをプローブとして検索した結果次の事柄を明らかにした。PKPIは塊茎主要貯蔵蛋白質の10%を構成する。

低温貯蔵塊茎は塊茎形成の誘導過程での生合成活性を維持している。さらに、塊茎形成過程の貯蔵蛋白質の蓄積は低温からの温度上昇時、つまり夜間から日中へかけての温度較差が大きい時に促進されると考えられる。PKPIとパタチンmRNA蓄積に及ぼす生長調節物質の影響を検討した。供試化合物中、塊茎切片にPKPI mRNAを誘導したのはジャスモン酸だけであった。トランスジェニックタバコ植物でのPKPIプロモーターの発現は維管束組織に特異的で、葉身組織切片での発現はショ糖濃度に依存した。本研究では、新たな塊茎指標蛋白質PKPIの遺伝子構造および発現特性を明らかにした。塊茎誘導に影響する低温、ジャスモン酸およびショ糖が、PKPI遺伝子の発現誘導に密接に関係する事実は、両者に共通に制御機構を示唆する。イネ種子カルスを誘導して180210日間培養後のカルスはアブサイシン酸(ABA)添加培養により、白色コンパクト化し、生長が顕著に抑えられ、乾物含量と可溶性蛋白質含量が増加される。植物体の再分化率がABA添加前培養により増加し、緑色植物体の出現期間も一週間以上短縮することを観察した。本研究ではABAが不定胚の形成を誘起し、不定胚前段階の分化を完成することを組織切片で観察発見し、ABAの不定胚由来の再分化植物体の比率を増加し、茎葉分化由来の再分化植物体形成の抑制抑効果を観察した。ABAは培養カルス細胞のサッカロース吸収と蓄積及び澱粉の合成と蓄積を促進し、還元糖の著しい変動を抑え、フラクトースの含量を減少し、グルコース含量を増加することを確認した。またABAはインヴェルターゼ及びフォスフォグルコイソメラーゼの活性を抑制し、フォスフォグルコムターゼとフォスフォリラーゼ及び硝酸還元酵素の活性を促進する効果を認めた。糖類、澱粉及び酵素活性の消長により、ABAが細胞生理活性の助長を促すと推測できる。412mg/LABA添加培養は、カルスに45kD、24.5kD、18.5kD及び14kDの新生蛋白質を誘導した。それぞれの同一分子量の蛋白質は成熟種子胚にも見られ、植物体再分化及び種子発芽時に消失することを観察した。そのうち、24.5kD ABA誘導蛋白質をN末端解読や単一蛋白質精製や抗体作成等を行った。N末端からそれぞれ解読した20個(pI6.1蛋白質)と30個(pI6.9蛋白質)のアミノ酸残基のうち、60%が相同であった。その抗体は、ABA誘導の24.5kD蛋白質及び成熟種子胚の24.5kD蛋白質との特異的反応を確認したが、ABA処理区由来の再分化植物体及び成熟種子由来の幼植物体の可溶性蛋白質との抗体反応は認めなかった。これはカルスの植物体再分化後あるいは種子の発芽後に、24.5kD蛋白質が完全に消失したことを裏付ける。培養カルスのABA誘導蛋白質が種子形成との成熟段階に、内生ABAによるABA特異的発現蛋白質と類似した性質、あるいは相同アミノ酸配列を持っている可能性を示唆した。現代の作物研究において最重要課題は器官特異的発現を誘導するプロモーターの解析である。本研究では、エレクトロポレーションによってプロトプラストに遺伝子を導入し一過的発現を調査し、植物の種や組織による、いくつかのプロモーターの発現能力の特性について検討した。
交通流記録システムを活用した環境外乱による地盤震動特性のマスキング現象の解明

平成12年度は、環境外乱による地盤震動特性のマスキング現象の解明に向け、実験的・解析的双方の側面からの検討を行った。実験的検討としては、平成11年度に構築したリアルタイムの交通流記録システム(池上通信機(株)・ZPC-104他)と、既存の地盤振動モニタリング・収録システムを連動させ、道路交通に起因する地盤振動と交通流との相関の抽出を試みた。その際に、補助的に騒音も計測するのが良いと考え、新たに積分形普通騒音計(リオン(株)・NL-06)を購入した。当初の研究計画では、数パターンの敷地と道路との取り合いをフィールド調査の上選択して、地盤振動・交通流同時計測を実施する予定であったが、振動・映像・騒音同時計測手法の工夫・習得にじっくりと時間を費やしたため、千葉市内の計155箇所においてフィールド調査は行ったものの、同時計測としては、今年度の段階では、千葉大学西千葉キャンパス南門付近の平面道路と敷地境界における検討のみとなった。交通外乱による地盤振動を適切に説明するためは振動源特性(走行速度・積載状況・車種・路面凹凸等)まで遡って一台一台の車両走行状況を精度良く把握することが鍵となるため、現在、同時刻における敷地境界での振動・騒音と映像のパターン分類と、波形・スペクトルの定常的、非定常的特性の考察を進めており、今後に繋がる成果が出つつ有る。解析的検討としては、平成11年度に地盤振動計測を実施した東京都墨田区鐘ヶ淵周辺の敷地の1つである、高架道路に面した公園について、既存の動的相互作用解析コードSASSIを使用し、高架道路の複数橋脚による伝播波動の重ね合わせに関する検討を行った。推定加振力による平行成層地盤上の複数橋脚基礎同時加振の結果は、橋軸直交測線上の地盤振動観測記録を定性的・定量的に説明しており、環境外乱による地盤震動特性のマスキング現象の一端を解明することができた。平成11年度は、本研究の核となるリアルタイムの交通流記録システムを構築した。交通外乱による地盤振動を説明するためは振動源特性(道路種別・車種・走行速度・積載状況・路面凹凸等)まで遡って一台一台の車両走行状況を精度良く把握することが鍵となるため、振動観測を行う敷地に対して支配的な影響を及ぼすと考えられる複数(実際には2本)の道路を選択し、それぞれの道路脇に監視カメラを取り付け、振動計測中の全てのカメラからの映像を計測ステーションで遠隔操作により同時に確認・収録できる仕様とし、適切なデータ処理を行うことによって地盤上各地点における振動特性と交通振動源特性との相関を整理することができるものを目指した。そのため、池上通信機(株)のICD-47モノクロカメラ、ZPC-104パンチルトコントローラー他を購入した。業者サイドのカメラの立ち上げの遅れによりシステム納入時期が年度末までずれ込んでしまい、当初計画していた地盤振動モニタリング・収録システムとの連動(地盤振動・交通流同時計測)の実施には到らなかったが、システム立ち上げに先行して地盤振動計測のみによるプレスタディを実施した。具体的には、24時間道路交通外乱にさらされている地域(東京都墨田区鐘ヶ淵周辺の3つの敷地を選択)において日時を変えて複数回振動計測を行い、交通流(時間帯別)および振動源特性(道路種別)、各道路と敷地との取合い(各道路からの距離)による地盤振動特性の差異を振動方向別に調査した。その結果、昼間と夜間、あるいは平日昼間と祝日昼間の交通量・交通流の違いは当該地盤振動性状に明らかに反映されていること、また、高架道路が振動源の場合と平面道路が振動源の場合とでは、振動方向による振幅レベル差の度合いが大きく異なること等、環境外乱による地盤震動特性のマスキング現象解明へのベースとなる有用な知見が得られた。

推定加振力による平行成層地盤上の複数橋脚基礎同時加振の結果は、橋軸直交測線上の地盤振動観測記録を定性的・定量的に説明しており、環境外乱による地盤震動特性のマスキング現象の一端を解明することができた。
膵島移植における脂肪由来幹細胞を用いたIBMIR制御に関する研究

当研究において、ADSCと膵島共培養によってVEGFを介する細胞保護効果が実証された。全身投与されたADSCは傷害膵に集積せず、網内系にトラップされた。IBMIR制御の検討のためにADSC投与によるマウスの凝固系変化およびブタを用いた膵島と全血の混合培養を行い、サイトカイン分析を行った。結果としては凝固系およびサイトカイン変化に与えるADSCの影響は極めて小さくかつ極めて多量の細胞数を必要とした。当研究においては、実験計画に基づき、まずin vitroでADSCの傷害膵島保護作用について実証し、次いでin vitroでに報告のあるclosed circulation systemを用いてADSCのIBMIRの制御効果について詳細な検討を行うこととしている。平成25年度は「研究実施計画」に照らすと、(研究1-1)ADSCと膵島共培養による細胞保護効果の実証(in vitro)のためにADSCおよび膵島1.0x105をTranswellTM kitを用いて両者を隔絶膜あり/なしの条件下で培養し、細胞のquality(純度、viability、recovery rate)を評価した。その結果は以下の通りである。膵島recovery率、viabilityは共培養群で有意に良好であり(P<0.05)、上清中のインスリン、IL-6、IL-8、VEGFが共培養群で高値(P<0.01)であった。VEGFを抗VEG薬添加によって阻害すると、viability・インスリン濃度は低下した。現在、(研究1-2)ADSCの凝固系・免疫担当細胞に対する反応に関する検討(in vitro)のためにマウス脾臓よりMagneticcell sortingの手法を用いて表面マーカーによりT細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞に分離を行い、各々の細胞について上記の隔絶膜を用いた培養系を用いて、細胞接触あり/なしで混合培養を行い、同様にサイトカイン分析を行い、その結果を解析中である。平成26年度は「研究実施計画」に照らすと、これまでに得られた結果(ADSCと膵島共培養による細胞保護効果の実証:膵島recovery率、viabilityはADSC共培養群で有意に良好であり(P<0.05)、上清中のインスリン、IL-6、IL-8、VEGFが共培養群で高値(P<0.01)であった。VEGFを抗VEG薬添加によって阻害すると、viability・インスリン濃度は低下した)を用いてin vivoの実験を進めるにあたり、ADSCの投与経路につき検証を行った。その結果は尾静脈から注入されたADSCは膵にほとんど集積せず、網内系(脾臓、肝)にトラップされることが判明した(蛍光発色による細胞追跡)。平成27年度は(研究2-2)異系膵島移植モデルを用いたADSCによるIBMIR制御に関する検討(in vivo)のために膵島およびADSCの経門脈的移植の系を確立するとともに、ADSC投与によるレシピエントマウスの凝固系の変化(TF,C3a)につき検討を行った。同時に27年度施行予定の大動物(ブタ)を用いた予備実験としてブタ膵島とブタ全血の混合培養を行い、サイトカイン分析(IL-6,IL-8,IP-10,IL-4,TGF-β,MCP-1)を行った。結果としては凝固系の変化に与えるADSCの影響は極めて小さく、多量の細胞数(ADSC)を必要とした。同様に、サイトカイン分泌に与える影響も、ADSCの濃度依存性とはいえ、多量の細胞数(ADSC)を添加することでのみ得られた。消化器外科「研究の目的」に照らして、現在、研究1-2)ADSCの凝固系・免疫担当細胞に対する反応に関する検討(in vitro)が終了しているところであるが、マウス脾臓よりMagneticcell sortingの手法を用いて表面マーカーによりT細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞に分離の過程において、共培養に十分な細胞数(特にマクロファージ、樹状細胞)が得られなかったため、一時的に進捗が遅れている。今後の推進方策:一応in vitroに関してはデータが得られたので、実験計画に基づき、平成26年度以降はin vivoの検討を行う。ただし、マウス同種膵島移植IBMIRに関するモデルは未だ確立されていないため、実験計画に明記されたマウス実験系を早急に確立し、補体系の評価を行ってIBMIRの検討に耐えうるかを判断する。不能であれば、すでに確立されている通常のマウス同種膵島移植モデルを用いて、経時的に肝を摘出し免疫組織学的検討を行い、次年度の大動物実験に備える。計画書作成時に購入予定であった消耗品の価格変動のため次年度への繰越額は消耗品に使用予定である