hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
侵略的外来種アライグマとマングースの新たな個体数抑制手法となる避妊ワクチン開発

その結果,合成ペプチド1および2投与後血清は全動物種の卵透明帯との反応が見られず,合成ペプチド3,4および5投与後血清はアライグマ卵透明帯とのみ反応が見られた。合成ペプチド3,4および5はワクチンの抗原候補として有力であることが示された。2)マングース本種の卵透明帯蛋白(ZPC)の精子卵結合部位の塩基配列を参考に合成した2種類のペプチド(A,B)の抗原性と免疫記憶について評価した。各ペプチドを各3頭(A群,B群)の雌マングースに4回投与して経時的に抗体価を測定したところ,両群とも有意な抗体価の上昇が認められた。各群1頭は継続飼育をして初回投与から約18月間抗体価の推移を評価した結果,A投与個体で約12ヶ月以上,B投与個体で約5ヶ月に満たない抗体価の持続性を示した。さらに,初回投与から19ヶ月後に追加接種したが,いずれのペプチド投与個体でも高度な免疫記憶は認められなかった。合成ペプチドAはBより免疫効率が高く有用性は高いものと推察されたが,免疫された雌マングース血清中抗体とマングース卵巣との免疫染色では特異的な反応は認められず,両ペプチドとも避妊ワクチンの有効性を担保するための高い抗原性と免疫記憶を持たせる改良が必要だと考えられた。本研究の最終目標である野生化アライグマとマングースに対する経口避妊ワクチンの実用化は、本申請研究期間で完了できるものではないが、今回得られた知見の概要は以下の通りである。アライグマでは、卵透明帯蛋白の塩基配列と立体構造を参考に合成した3種類のペプチドに対する抗ウサギ血清において、抗体産生誘導および誘導抗体の種特異性が確認され、これらがワクチンの抗原候補として有力であることが示された。マングースでも同様に、卵透明帯蛋白の塩基配列をもとに合成した2種類のペプチドに対する抗マングース血清において、抗体の持続期間や誘導抗体の生体抗原認識能が確認され、両ペプチドのワクチン抗原としての有用性が示された。マングースについては,飼育個体を用いた実験が順調に行えているが,アライグマについては飼育個体の確保および飼育実験に至っていない。これは,本種が特定外来生物であり,学術研究目的であっても捕獲や飼育に関する制限が大きいことにも起因している。また,本種に対する避妊ワクチン抗原候補の2種類の合成ペプチドについては,他種との免疫原性で交差性があることが判明し,種特異性が確保されていないため,再設計を余儀なくされている。今後,種特異性のある抗原候補を再検索して,飼育個体を用いた実験を行いたいと考えている。マングースについては,免疫した個体の卵巣の組織学的解析(免疫染色や電子顕微鏡による観察)を行う。また,注射による接種ではなく,経口で免疫賦与することが可能な抗原のデリバリーシステムについての評価を進める。一方,アライグマについては,ワクチン抗原候補の再設計をして新たな抗原候補となる合成ペプチドを作成し,これをウサギに免疫して抗体を得る。得られた抗体をアライグマと同所的に生息する他種の卵巣をもちいて免疫染色し,新たに設計した合成ペプチドの種特異性を評価する。種特異性が確認されれば,速やかに飼育アライグマを用いた免疫実験を行う。獣医学(野生動物医学)マングースについては,飼育個体を用いた実験を継続する。すなわち,経時的に採血を行い,免疫後の抗体価の推移を観察する。また,卵巣の組織学的解析では,免疫染色や電子顕微鏡による観察を行い,免疫効果の判定や免疫に伴う組織損傷の有無を詳細に検索する。
ネットワーク情報源符号化に基づく情報検索の性能限界の究明とその応用

本研究では、情報検索をネットワーク情報源符号化の観点からモデル化・定式化し、そのモデル・定式化に基づいて情報検索の性能限界をある情報源のクラスについて理論的に証明すると共に、その性能限界に漸近する性能を達成できる具体的な実現方法を示した。また、上記性能限界を理論的に証明できていないより広いクラスの情報源に対して、性能限界を近似的に導出できる数値計算のためのアルゴリズムを開発した。大容量ネットワークの普及、音楽・映像配信の一般化などにより、膨大な量のメディア情報を取得して保存する時代となっている。それに伴い、所望のメディア情報を高速かつ正確に探し出す技術の開発が各方面で進められており、検索性能は日々進化を遂げている。一方で、それらメディア情報検索技術の性能限界について、現実的な仮定の下で検討されている研究は少ない。本研究は、上記背景を踏まえ、以下の3項目について、理論と実装の両面から詳細に検討を進めることを目的とする。(1)情報検索を情報源符号化の観点からモデル化・定式化する。(2)上記モデル・定式化に基づいて情報検索性能の理論的限界を解明する。(3)上記理論限界に到達する情報検索アルゴリズムを構築する。平成20年度は、主に実証的解析に必要な理論基盤の整備を中心に下記成果を挙げた。1.情報検索の理論限界の究明及びその限界に漸近する具体的な符号化方法の提案:メディア情報検索における重要な基本技術であるインデックスを用いた検索(インデックス検索)を情報源符号化の枠組でモデル化し、その部分モデルについて理論限界を完全に解明すると共に、その限界に漸近する具体的な符号化方法を提案した。2.インデックス検索の理論限界の数値計算法の提案:成果1などによって導出される理論限界は、少数の特殊なデータ分布を除くと、解析的に導出することは不可能である。本成果では、事後確率の逐次推定で用いられる粒子フィルタの考え方を導入することで、これらの倫理限界を具体的に算出する数値計算法を提案した。大容量ネットワークの普及、音楽・映像配信の一般化などにより、膨大な量のメティア情報を取得し保存する時代となっている。平成21年度は、実証的解析への足がかりとなる基盤整備に関する下記の成果を挙げた。1.情報検索の理論限界に漸近する符号化方法の汎用的な作成方法の提案:情報検索における重要な基本技術であるインデックスを用いた検索(インデックス検索)は、情報源符号化の枠組でモデル化することにより、ある構造を持つ多端子情報源符号化問題として記述できる。そのモデルを含む広いクラスの多端子情報源符号化問題について、情報源に関する統計的性質が未知であっても、それが既知であるという条件の下で設計された具体的な符号化方法から、理論限界に漸近する符号化法方を作成できる手法を開発した。これにより、インデックス検索アルゴリズムとして、これまでに用いられてきたあらゆるタイプの情報源符号を用いることが可能になることが示された。
パーティクルボンバードメントによるシンビジウムの形質転換と糸状菌耐性の遺伝子工学

世界的に重要な花卉であり観賞植物である洋ランのシンビジウムにおいては,効果的で再現可能な組織培養手法と遺伝子工学プロトコルを開発する大きな必要性が依然として存在する.これまでに,シンビジウムの組織培養とマイクロプロパゲーションに関連した論文は多数報告されているが,シンビジウムの遺伝子工学について成功した論文は一つがあるのみである.この報告書において強調される結果は,過去2年間に達成された成功とともに,これらの結果がシンビジウムのバイオテクノロジーに関連した知見をいかに促進させ,あるいはいかに深めたかについて示すことになる.まず,ポジティブな結果は,以下の5つのカテゴリーにおいて成し遂げられた.すなわち,1)組織培養とマイクロプロパゲーション:プロトコーム状球体(PLB)とエンブリオジェニックカルス(EC)は,生物学的および非生物学的な要因に関するいくつかのテストから誘導することができた,2)人工種子技術と凍結保存:人工種子としてのPLBの短期,中期,長期の低温保存および凍結保存が達成できまた,3)体細胞変異の分析,フローサイトメトリーおよびRAPD分析:さまざまな処理から由来したすべての植物体は,体脂肪変異に関して上記の3つのテストにより確認された,4)DNA抽出プロトコルの改善と最適化:これまでに報告された最適と考えられているさまざまな手順は,本研究においてシンビジウムのために確立されたユニークなプロトコールと比較した,5)遺伝子工学と導入遺伝子分析:糸状菌の抵抗性遺伝子(エンドグルカナーゼとキチナーゼ)と同様に,選抜および標識遺伝子(uidA, nptII)は,パーティクルボンバードメント法によってPLBとECに対してうまく導入することができた.形質転換体は,PCR分析に加え,GUS分析および抗生物質分析によって選抜された.本研究によって得られた独創的な結果は,植物科学分野で評価の高い3つの国際雑誌に掲載されるとともに,シンガポール,南アフリカおよび米国の科学者との国際協力についても実現することができた.本研究では,まず,異なる植物生長調節物質(PGR),種々の添加物および培養条件によってシンビジウムのPLB切片からPLBおよびエンブリオジェニックカルス(EC)を誘導し,PLB切片から誘導されたPLB,PLBから発達したシュートや根,またPLB切片から誘導されたECについて,RAPD法およびフローサイトメトロリーを用いて細胞遺伝学的分析を行った.その結果,PGRの種類および組み合わせにかかわらず,PLB切片からPLB形成およびEC誘導が観察された.最高のPLB形成は0.1mgl^<-1> NAA+0.1mgl^<-1>kinetinまたは0.2mg^<-1> adenine添加培地で,また最高のEC形成は0.1mgl^<-1> NAA+0.01mgl^<-1> TDZまたは2mgl^<-1> BA+1mgl^<-1> NAA+1 gl^<-1>活性炭の添加培地でそれぞれ得られた.種々の添加物,支持体,ゲル化剤,および光条件は,PGRの有無にかかわらず,器官形成に影響を及ぼした.これらの効率的に誘導されたPLBやECは,パーティクルボンバードメントによる遺伝子導入のための有用な材料となろう.遺伝的変異については,まざまな核内倍数性がPLB(≦8C)およびEC(≦16C;16Cはtrace)で認められた.しかし,PLBから発達したシュート,およびシュートから分化した根では2Cと4Cのみが観察された.この細胞学的変異に加えて,RAPD分析を行ったところPLB,EC,シュートおよび根の間に遺伝的変異があることが明らかになった.A-18,B-10,C-2,LFY3およびtrnK2Rは単形性であったが,trnhおよび5SP3/4は器官特異的なマーカーを示す多形性であった.これらの細胞学的変異にかかわらず,再生した小植物体では形態的な変異はなかった.次に,このEC培養系を用いたマイクロプロパゲーション由来の培養体における遺伝的安定性については不明であることから,EC培養系および従来法のPLB培養系(対照)において得られるさまざまな培養体・器官について,フローサイトメトロリーを用いて細胞遺伝学的分析を行った.その結果,PLB培養系,EC培養系で得られた小植物体のいずれにおいても,葉の先端部・中央部および根の中央部・基部で細胞分裂は少なかった.一方,増殖PLB,誘導・増殖されたECおよびECから形成されたPLBでは活発な細胞分裂がみられた.また,小植物体の根の先端部および誘導・増殖されたECにおいては核内倍数性は高く(≧8C),ECから形成されたPLBでは核内倍数性は低かった.世界的に重要な花卉であり観賞植物である洋ランのシンビジウムにおいては,効果的で再現可能な組織培養手法と遺伝子工学プロトコルを開発する大きな必要性が依然として存在する.これまでに,シンビジウムの組織培養とマイクロプロパゲーションに関連した論文は多数報告されているが,シンビジウムの遺伝子工学について成功した論文は一つがあるのみである.この報告書において強調される結果は,過去2年間に達成された成功とともに,これらの結果がシンビジウムのバイオテクノロジーに関連した知見をいかに促進させ,あるいはいかに深めたかについて示すことになる.まず,ポジティブな結果は,以下の5つのカテゴリーにおいて成し遂げられた.すなわち,1)組織培養とマイクロプロパゲーション:プロトコーム状球体(PLB)とエンブリオジェニックカルス(EC)は,生物学的および非生物学的な要因に関するいくつかのテストから誘導することができた,

2)人工種子技術と凍結保存:人工種子としてのPLBの短期,中期,長期の低温保存および凍結保存が達成できまた,3)体細胞変異の分析,フローサイトメトリーおよびRAPD分析:さまざまな処理から由来したすべての植物体は,体脂肪変異に関して上記の3つのテストにより確認された,4)DNA抽出プロトコルの改善と最適化:これまでに報告された最適と考えられているさまざまな手順は,本研究においてシンビジウムのために確立されたユニークなプロトコールと比較した,5)遺伝子工学と導入遺伝子分析:糸状菌の抵抗性遺伝子(エンドグルカナーゼとキチナーゼ)と同様に,選抜および標識遺伝子(uidA, nptII)は,パーティクルボンバードメント法によってPLBとECに対してうまく導入することができた.形質転換体は,PCR分析に加え,GUS分析および抗生物質分析によって選抜された.本研究によって得られた独創的な結果は,植物科学分野で評価の高い3つの国際雑誌に掲載されるとともに,シンガポール,南アフリカおよび米国の科学者との国際協力についても実現することができた.
排尿機能評価に向けた、蓄排尿器官の生体モデル構築法の研究

本研究では、前立腺部尿道の前立腺部尿道における蓄排尿機能障害の評価法として、従来困難であった尿道内部、特に蓄排尿障害の原因疾患である、膀胱頚部や前立腺部における粘弾性や形状の性状変化が流体に与える影響を数値化することを目的として、患者の尿道形状取得と、尿道の尿輸送機能評価法の確立に取り組んできた。本年度においては、下部尿路形状構築における構築精度向上のためのアルゴリズムの開発と、臨床データを用いた提案手法における臨床的有用性についての検討を実施した。本手法における形状モデルの精度向上には、内視鏡画像における同一臓器の色彩情報を、臓器表面の血流量によって分別することが必要である。内視鏡から収集された下部尿路の色彩情報の分布をHSB色空間上に表現し、最尤法を用いて複合ガウス分布としてフィッティングすることで、収集した色情報を、低血流部位、高血流部位、非尿道臓器の3分布に分割できる手法を開発した。次に、臨床データを用いた、本研究の臨床的有用性について検討した。提案手法によって構築した、膀胱尿道鏡映像を基にした下部尿路の形状モデルを用いて、有限体積法による定常流解析を行い、尿道内における流れを可視化した。前立腺部尿道における圧力損失を、本手法における排尿症状の指標とし、従来の臨床検査におけるデータとの関連性を検討した。その結果、圧力損失量は前立腺体積に強い相関を示し、本研究が患者の尿道内腔の正常を適切に再現していることが示唆された。また、排尿症状の改善薬剤の投与により、臨床データと同様に、提案手法による圧力損失も改善傾向を示すことも確認された。また、本手法では、尿道内における詳細な流れの振る舞いを可視化できることから、尿道内における排尿症状の責任部位を同定し、より繊細な治療法を可能にすることが示唆された。今後、医学研究として大規模な症例数における本手法の評価や治療への応用を目指した検討が実施される見込みであり、現在、臨床現場での使用を想定したソフトウェアの開発を実施している。本年度までに本研究の主目的である排尿機能評価のための必要なソフトウェアの開発、ワークフローの確立、小規模な臨床データによる本研究の臨床的有用性の確認を完了している。今後臨床における大規模データを用いた検討などを含む、医療分野での本研究成果を用いた研究や技術応用等、発展と実用化が期待される。(抄録なし)本研究では蓄排尿機能障害の評価法として、従来困難であった尿道内部、特に蓄排尿障害の原因疾患である、膀胱頚部や前立腺部における粘弾性や形状の性状変化が流体に与える影響を数値化することを目的として、膀胱尿道鏡映像を用いた患者の尿道形状取得と、尿道の尿輸送機能評価法の確立に取り組んできた。当該年度においては、これまでに提案した尿道内腔形状取得法によって構築した尿道モデルを用いた尿道内流体解析によって得られる各種パラメータが、従来の臨床検査法によって得られる排尿機能指標とどのような関係を持つのかについて重点的に検討した。まず、投薬前後及び患者間のデータを適正に比較するため、生成した尿道パノラマ画像から、解剖学的特徴箇所を指定する事で、同一患者の投薬前後における解析領域が等価になるよう支援する、データアラインメントツールを開発した。さらに、本研究の尿道モデル生成手法は、臨床画像における様々なノイズに対するロバスト性が低いため、解析結果、構築した尿道モデル、内視鏡ビデオの時間及び位置関係を統合し、解析結果の妥当性に対する検証支援ツールを開発した。これらのツールを用いて、千葉大学附属病院泌尿器科の協力を得て、計17例の排尿障害に対する投薬治療前後の膀胱尿道鏡映像を用いた尿道内腔形状構築と、排尿流シミュレーションによる尿輸送機能の推定を行った。さらに膀胱尿道鏡映像取得時に得られた臨床における排尿機能指標との関連を検討した。シミュレーションの結果、提案手法により構築した前立腺部尿道モデル内腔での圧力損失は、薬物投与前に比べ薬物投与後に有意に減少した。この傾向は、現在臨床で排尿障害の代表的指標である、最大尿流量率における改善度合いと有意に相関することを確認した。これらは、提案手法における尿道モデル構築や、シミュレーションに用いている境界条件等の妥当性を示す上で、重要な知見となった。

前立腺部尿道における圧力損失を、本手法における排尿症状の指標とし、従来の臨床検査におけるデータとの関連性を検討した。その結果、圧力損失量は前立腺体積に強い相関を示し、本研究が患者の尿道内腔の正常を適切に再現していることが示唆された。また、排尿症状の改善薬剤の投与により、臨床データと同様に、提案手法による圧力損失も改善傾向を示すことも確認された。また、本手法では、尿道内における詳細な流れの振る舞いを可視化できることから、尿道内における排尿症状の責任部位を同定し、より繊細な治療法を可能にすることが示唆された。今後、医学研究として大規模な症例数における本手法の評価や治療への応用を目指した検討が実施される見込みであり、現在、臨床現場での使用を想定したソフトウェアの開発を実施している。当初計画における当該年度の目標の一つであり、排尿流シミュレーションによる診断及び治療支援への発展に重要な要素である、内視鏡による尿道形状取得法の精度向上を目標とした、尿道組織内の反射特性分布のクラスタリング手法の有用性に関する検討、及び反射特性のばらつきを考慮した補正手法が十分に検討されなかった。本年度までに本研究の主目的である排尿機能評価のための必要なソフトウェアの開発、ワークフローの確立、小規模な臨床データによる本研究の臨床的有用性の確認を完了している。今後臨床における大規模データを用いた検討などを含む、医療分野での本研究成果を用いた研究や技術応用等、発展と実用化が期待される。当該年度における検討では、本研究における排尿機能評価法と従来の臨床検査指標が有意に相関し、投薬による排尿機能の改善効果が測定できることを示した。今後、従来法では困難である、尿道内腔における排尿流の障害部位を、より細かに特定し、またそれらの知見を診断、及び治療時の支援材料とするためには、膀胱尿道鏡映像を用いた尿道内腔形状構築の高精度化と、ロバスト性の向上が必要である。当該年度に十分に取り組むことができなかった尿道内腔の分光反射特性分布による形状構築時の補正アルゴリズムに継続して取り組み、前立腺部尿道における疾患・治療による組織性状の変化を、より繊細に捉えることを目指す。(抄録なし)
乳児期早期の顔の動きの模倣の発生機序に関する研究

平成5年8年度に集積した模倣データを個別分析し、在胎週数、実験時の胎齢、生活齢により俯瞰した。1.在胎週数、実験時胎齢による模倣反応の生起状況:「人らしい」図版(正顔・目顔)のみに対する舌出し模倣の分布は、在胎週数が少なく(26週)ても実験時胎齢が36週以上になれば出現し、これは生下体重や、実験時の体重の影響を受けなかった。人らしさの認知は出生後の胎齢が33週になれば出現し、しかも同在胎週数群においては「人らしさ反応」の方がより早期に出現し、次に「乱顔反応」が出現した。人らしさを認知させる先天性機能は在胎30週前後の早産で生まれても、胎齢33週には発現する。胎児期の発達を系統発生上の進化になぞらえるなら胎齢33週すなわち妊娠8ヵ月には、種としてのヒトの認知・情動機能が備わることが示唆された。2.在胎週数、実験時生活週齢による模倣反応の生起状況:「人らしさ反応」の分布は、在胎週数が少ない場合は、実験時の生活週齢が高くなってから出現し(要経験)、在胎週数が十分な場合は、生活週齢が少なく出生直後でも出現した。「人らしさ反応」生起の生活週齢と在胎週数は負の相関を示した(p<.001)。胎内でも先天的に人らしさを認知させる脳の機能が造られる。胎内出の成熟が十分であれば、出生直後から人らしさを認知させる知的機能の発動する備えがある。これは今日の制約理論を支持する方向にある。「乱顔反応」生起も同様の相関を示した。人らしさ反応と乱顔反応の理論値の比較から、「人らしさ反応」の方がより早期から出現することが示唆された。理論値の係数の絶対値が大きいことから、実験時の胎齢よりも生活齢が、すなわち成熟よりも経験(外界との相互交渉)が、模倣反応の生起に寄与する要因であることが示唆された。3.実験時胎齢、実験時生活週齢による模倣反応の生起状況:模倣の発達過程は、正期産児ではその後、「人らしさ反応(生後1ヵ月)」→「乱顔反応(2ヵ月後半、刺激般化)」→「人らしさ反応(3・4ヵ月、刺激弁別)」へと進展する(池上,1984)、実験時胎齢36週以上では、各胎齢において生活週齢を追ってみると模倣反応の生起分布に正期産児と同様の発達パターンがみられた。この発達パターンは胎内成熟が十分であれば出生直後から発現する。実験時胎齢3335週に関しても同様のパターンの兆しがみえるが、その発現は、それに見合った生活週数が必要とされると想定される。この点については今後更なるデータの補完により明らかにされるところとなる。以上、顔の模倣を指標とした「認知・言語の成立」は、早産児であってもすでに胎齢33週において「種としてのヒトの」認知・前言語のパターンを有することが示された。種の自己(遺伝子)保存のためには、全く白紙であるよりも、学習についてある程度のフログラム(制約)のある方が環境への適応(生き残り)に有利であることが推察される。本結果は国内外において、未踏の領域である早産未熟児・正期産新生児の早期認知・言語の発生的機序について、未だ明らかにされたことのなかった貴重なPropositionを含んでいる。

理論値の係数の絶対値が大きいことから、実験時の胎齢よりも生活齢が、すなわち成熟よりも経験(外界との相互交渉)が、模倣反応の生起に寄与する要因であることが示唆された。3.実験時胎齢、実験時生活週齢による模倣反応の生起状況:模倣の発達過程は、正期産児ではその後、「人らしさ反応(生後1ヵ月)」→「乱顔反応(2ヵ月後半、刺激般化)」→「人らしさ反応(3・4ヵ月、刺激弁別)」へと進展する(池上,1984)、実験時胎齢36週以上では、各胎齢において生活週齢を追ってみると模倣反応の生起分布に正期産児と同様の発達パターンがみられた。この発達パターンは胎内成熟が十分であれば出生直後から発現する。実験時胎齢3335週に関しても同様のパターンの兆しがみえるが、その発現は、それに見合った生活週数が必要とされると想定される。この点については今後更なるデータの補完により明らかにされるところとなる。以上、顔の模倣を指標とした「認知・言語の成立」は、早産児であってもすでに胎齢33週において「種としてのヒトの」認知・前言語のパターンを有することが示された。種の自己(遺伝子)保存のためには、全く白紙であるよりも、学習についてある程度のフログラム(制約)のある方が環境への適応(生き残り)に有利であることが推察される。本結果は国内外において、未踏の領域である早産未熟児・正期産新生児の早期認知・言語の発生的機序について、未だ明らかにされたことのなかった貴重なPropositionを含んでいる。
機能不全リボソームRNAを選択的に認識する因子の同定

本研究課題では、出芽酵母において観察される「機能不全リボソームの選択的分解による品質管理」に着目し、どのような仕組みで数多くのリボソームの中から機能不全の分子だけを見分けることができるのか、細胞がとっている戦略を分子のレベルで理解することを目的に研究を行った。これまでにわれわれの研究から、機能不全リボソームがMms1/Rtt101という2つの因子に依存して選択的にユビキチン化を受けることが明らかになっていたが、本課題では生化学的な方法を用いて機能不全リボソームを精製し、解析するという手段を用いた。具体的には機能不全リボソームの25S rRNA上にMS2結合配列を繰り返し挿入し、MS2コートタンパクと融合したGSTたんぱく質を用いてリボソームをプルダウンするという新しい実験系を開発した。MS2タグ配列を持った25S rRNAの活性中心(PTC)に、機能を失わせるための点変異を導入することで、細胞の中から特定の変異25S rRNAのみを含む機能不全リボソームを回収することに成功した。MS2タグ配列を挿入したことが、リボソームの機能に影響を与えないこと、またこの配列が機能不全リボソームのMms1依存的なユビキチン化を阻害しないこともあわせて確認してある。このようにして得られた機能不全リボソームを詳細に解析することで、いくつかの新しい知見が明らかになった。まず第一に、本研究で扱っているPTCに変異を持つ機能不全リボソームが、A-siteに開始Met tRNAを持つことと、P-siteにさまざまなtRNAを一分子持つことが示唆された。このことは、ユビキチン化の標的になるリボソームは開始コドン上で80Sを形成し、しかも2つのtRNA結合部位の両方にtRNAを含んだ形で停止した分子であろうということを示す。さらに、機能不全リボソームに含まれるたんぱく質の質量分析による解析から、ユビキチン化の標的が明らかになり、機能不全リボソームの特異的認識がどのようになされるかについてのモデルが立てられる段階に研究が進展してきている。酵母リボソームの品質管理機構を明らかにするための研究基盤の整備を行った。具体的には、酵母リボソームRNAにMS2結合配列を6回並列に繰り返した配列を挿入し、この挿入がリボソームRNAの機能に影響を与えないことを確認した。この挿入を持つRNAも、通常の野生型と同様にin vivoでPol I温度感受性株を相補する活性を保持していた。活性中心(PTC)に点変異を導入することで活性は完全に失われ、これまでにわれわれが明らかにした品質管理経路(Mms1遺伝子に依存する経路)によって選択的な分解が行われた。Mms1を欠損した変異株においてはこの挿入を持つ機能不全変異RNAも完全な安定化が見られた。以上の性質は、このMS2配列の挿入を持たせたRNAを用いても、酵母リボソームの品質管理機構の研究が可能であることを示唆している。さらにこの挿入を利用して、成熟リボソームの撰択的沈降ができるかどうかを検証した。特定の(この場合にはPTCに点変異を持つ)RNAを含むリボソーム粒子のみを選択的に濃縮するためには、MS2配列に結合するMS2コートたんぱくを用いたアフィニティー精製ができなければならない。このRNAと同時に、GSTたんぱくを融合したMS2コートたんぱくを細胞内で発現させ、グルタチオンビーズによる変異リボソームのアフィニティー精製を試みた。ショ糖密度勾配遠心によりリボソーム粒子の大きさのフラクションを回収した上で、グルタチオンビーズによる精製を行い、変異リボソームの沈降を検証したところ、期待通りリボソームの沈降が見られることが分かった。MS2配列を持たないRNAを発現させた場合にはこれらのリボソームは沈降しないことから、こめ方法により特定の点変異をもつリボソームを選択的に濃縮することが可能となったことが分かった。

このことは、ユビキチン化の標的になるリボソームは開始コドン上で80Sを形成し、しかも2つのtRNA結合部位の両方にtRNAを含んだ形で停止した分子であろうということを示す。さらに、機能不全リボソームに含まれるたんぱく質の質量分析による解析から、ユビキチン化の標的が明らかになり、機能不全リボソームの特異的認識がどのようになされるかについてのモデルが立てられる段階に研究が進展してきている。
Ⅰ型肺胞上皮由来物質RAGEを用いた特発性肺線維症の病態解明の試み

特発性肺線維症患者の血清中のRAGEリガンドHMGB1の検討をおこない、安定期の特発性肺線維症患者では健常者と比較して血中HMGB1が高値であり急性増悪症例では更に顕著な上昇を認めた。安定期のHMGB1高値は急性増悪の予測因子であり、急性増悪症例においてはHMGB1高値は予後不良因子であった。これらの結果からHMGB1が特発性肺線維症患者の急性増悪の病態に関与していることが示唆され第59回日本呼吸器学会総会にて学会発表をおこなった(論文投稿中)。特発性肺線維症患者の気管支肺胞洗浄液中のesRAGEと予後、急性増悪についても詳細な検討をおこない学会発表をおこなった。ブレオマイシンの経気道投与を行ったC57BL/6マウスによるブレオマイシン肺傷害モデルマウスを作成し、RAGE阻害薬(FPS-ZM1、TTP488)による治療実験、条件検討を継続している。さらにRAGEリガンドの中で線維化に関連している分子(S100A9)についてその阻害によるブレオマイシン肺傷害モデルの治療実験を開始している。臨床検体によるHMGB1の特発性肺線維症における体内動態の特徴、急性増悪に関わることを明らかにした。動物実験、基礎実験ともにRAGE-RAGEリガンド経路の阻害による治療効果の検証を行っている。特発性肺線維症患者におけるRAGE,RAGEリガンドのバイオマーカーとしての意義について総括し論文発表を行う。動物実験、細胞実験ともに治療効果の検証を行うとともに、病態に関与する機序について明らかにしてゆく予定である。特発性肺線維症患者の血清および気管支肺胞洗浄液中の内在性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE, esRAGE)の測定結果について、可溶性RAGE(soluble RAGE, sRAGE)との相違を含めた詳細な検討をおこない、esRAGEが予後および急性増悪に関して密接に関連していることを見出し、第58回日本呼吸器学会総会にて学会発表をおこなった。ブレオマイシンの経気道投与を行ったC57BL/6マウスによるブレオマイシン肺傷害モデルマウスを作成し、RAGE阻害薬(FPS-ZM1、TTP488)による治療実験、条件検討を開始している。肺癌あるいは肺胞上皮細胞株として用いられるA549細胞についてウェスタンブロット法でRAGEの発現を確認した。今後RAGEの抑制により増殖能の抑制効果について検証する予定である。臨床検体によるsRAGE、esRAGEの特発性肺線維症における体内動態の特徴を明らかにし、動物実験、基礎実験ともにRAGE-RAGEリガンド経路の阻害による治療効果の検証を開始している。
神経軸索伸長阻害因子による自己免疫疾患の新たな制御機構の解明

本研究において,抗体産生細胞であるB細胞の寛容維持における免疫制御受容体ーリガンドによる新規制御ネットワーク機構の解明を目的とし,神経軸索伸長阻害因子NogoおよびNogo受容体(NgR1)のB細胞活性化制御における役割を検討した.Nogoが骨髄B細胞や腹腔B-1細胞の分化・生存,さらに脾臓の胚中心B細胞の活性化を負に制御していること,in vitroの解析において,NogoがTLRシグナル伝達に必要であることを示した.このようにNogoがB細胞寛容誘導に寄与している可能性が示唆された.抗体産生細胞であるB細胞の自己寛容機構が破綻すると病原性自己抗体の産生が誘導され,全身性エリテマトーデスなど様々な自己免疫疾患の発症につながる.自己のMHC class Iを認識する免疫制御受容体PirBは自己抗体の産生を制御することで自己免疫疾患の発症を抑制し,B細胞の自己寛容の成立・維持に必須の役割を果たしているが,PirBの新規なリガンドとして神経軸索伸長阻害因子であるNogo/MAG/OMgpが報告されるなど,これら受容体ーリガンドによる新規な免疫制御ネットワークが興味深い.本研究では,これら分子群によるB細胞の自己寛容の制御機構を明らかにするため,各種遺伝子欠損マウスを用いてB細胞の分化・機能における役割を解析した.その結果,Nogoが骨髄B細胞や腹腔B-1細胞の分化・生存,さらに胚中心B細胞の活性化を負に制御している可能性を明らかにした.さらにNogo/MAG/OMgpの受容体であるNgR1の免疫細胞での発現を確認し,PirB非依存的なB細胞寛容誘導機構の存在を調査するためNgR1遺伝子欠損マウスにおけるB細胞の機能解析を行ったが,野生型マウスと比較して骨髄や脾臓,腹腔B細胞の分化・生存に有意な違いを認めることはできなかった.このように,NogoはNgR1ではなくPirBを介してB細胞寛容誘導に寄与している可能性が考えられる.自己免疫疾患の発症制御における役割は依然明らかではないが,NogoはB細胞による抗体産生を負に調節することが示唆された.本研究において,抗体産生細胞であるB細胞の寛容維持における免疫制御受容体ーリガンドによる新規制御ネットワーク機構の解明を目的とし,神経軸索伸長阻害因子NogoおよびNogo受容体(NgR1)のB細胞活性化制御における役割を検討した.Nogoが骨髄B細胞や腹腔B-1細胞の分化・生存,さらに脾臓の胚中心B細胞の活性化を負に制御していること,in vitroの解析において,NogoがTLRシグナル伝達に必要であることを示した.このようにNogoがB細胞寛容誘導に寄与している可能性が示唆された.Nogo/MAG/OMgpは神経系細胞に発現し,NgRやPirBを認識することにより神経軸索の伸張阻害を担う分子であるが,免疫担当細胞における機能は明らかになっていない.申請者は免疫応答,特にB細胞の分化や自己寛容の成立・維持における役割について検討するため,骨髄や脾臓,腹腔B細胞の分化・成熟,抗体産生に与える影響,in vitroでの抗原刺激に対する応答能など各種遺伝子欠損マウスを用いて解析した.骨髄におけるB細胞の分化において,Nogo遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較して未成熟B細胞および成熟B細胞割合が増加することが観察された.さらに,自然抗体産生細胞である腹腔B-1細胞数の増加を認めた.Nogo遺伝子欠損マウスは無刺激状態において亢進したIgG抗体産生を認め,胚中心(GC)形成が亢進していることが示された.T細胞依存性抗原に対する免疫応答について確認したところ,Nogo遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較してGCB細胞数,形質細胞数,IgG抗体の産生量が増加することを確認した.しかしながら,in vitroで単離されたB細胞のLPS, CpG, anti-CD40抗体刺激における細胞増殖能について有意な差は見い出せていない.また自己免疫疾患の発症におけるNogoの役割を明らかにするため,加齢したNogo遺伝子欠損マウスの臓器を採取し病理組織学的解析を行ったが,明らかな異常は観察されていない.このように,自己免疫疾患の発症制御における役割は依然明らかではないが,NogoはB細胞による抗体産生を負に調節することが示唆された.抗体産生細胞であるB細胞の自己寛容機構が破綻すると病原性自己抗体の産生が誘導され,全身性エリテマトーデスなど様々な自己免疫疾患の発症につながる.自己のMHC class Iを認識する免疫制御受容体PirBは自己抗体の産生を制御することで自己免疫疾患の発症を抑制し,B細胞の自己寛容の成立・維持に必須の役割を果たしているが,PirBの新規なリガンドとして神経軸索伸長阻害因子であるNogo/MAG/OMgpが報告されるなど,これら受容体ーリガンドによる新規な免疫制御ネットワークが興味深い.昨年度,Nogoが骨髄B細胞や腹腔B-1細胞の分化・生存,さらに胚中心B細胞の活性化を負に制御している可能性を明らかにした.一方,Nogo/MAG/OMgpの受容体であるNgR1のB細胞での発現を確認し,NgR1遺伝子欠損マウスにおけるB細胞の機能解析を行ったが,野生型マウスと比較して骨髄や脾臓,腹腔B細胞の分化・生存に有意な違いを認めることはできなかった.今回,さらにB細胞の自己寛容の制御機構を明らかにするため,TLRシグナルのB細胞分化・機能におけるNogoの役割を解析した.その結果,LPS刺激により産生されるIL-

6産生はNogo遺伝子欠損マウスにおいて減弱することが示され,TLRシグナルにNogoが必要であることを明らかにした.このようにNogoはB細胞寛容誘導に寄与している可能性が示唆された.免疫学免疫制御機構,特に自己抗体の産生と自己免疫疾患の発症機序に着目し, Nogo/MAG/OMgpおよびその受容体であるPirBやNgR1のB細胞の自己寛容の成立・維持における役割の検討を行った.Nogo遺伝子欠損マウスの解析において,Nogoが胚中心の形成制御に重要な役割を果たすこと,さらにB細胞による抗体産生を負に調節する可能性を明らかにした.一方,NgR1遺伝子欠損マウスのB細胞分化・生存に明らかな異常は観察されず,これら受容体ーリガンドを介する免疫制御ネットワークによる自己寛容維持機構についてさらなる解析が必要である.免疫制御機構,特に自己抗体の産生と自己免疫疾患の発症機序に着目し, Nogo/MAG/OMgpのB細胞の自己寛容の成立・維持における役割の検討を行った.Nogo遺伝子欠損マウスの解析において,Nogoが胚中心の形成制御に重要な役割を果たすこと,さらにB細胞による抗体産生を負に調節することを明らかにした.一方,病理組織学的解析においてNogo遺伝子欠損マウスに明らかな異常は観察されておらず,Nogoの自己寛容維持機構における役割についてさらなる解析が必要である.Nogo遺伝子欠損マウスの解析よりNogoが胚中心形成や抗体産生を負に制御することが示唆された.しかしNogo単独の異常では明らかな自己免疫疾患の症状を呈さないことから,現在,自己免疫疾患自然発症モデルマウスと交配中であり,自己免疫疾患に及ぼす影響を明らかにする.さらに,Nogo/MAG/OMgpやNgR1, PirBによるB細胞制御の分子機序を解明する.Nogo遺伝子欠損マウスの解析よりNogoが胚中心形成や抗体産生を負に制御することが示唆された.しかしNogo単独の異常では明らかな自己免疫疾患の症状を呈さないことから,自己免疫疾患を自然発症するマウスと交配することにより自己免疫疾患に及ぼす影響を明らかにする.さらに,Nogo/MAG/OMgpやNgR1, PirBによるB細胞制御の分子機序を解明する.該当なし
北琉球方言の調査研究-与路島方言・請島方言・喜界島方言を中心に-

琉球方言区画上、北琉球奄美方言に属する与路(よろ)島方言、請(うけ)島方言、喜界島花良治(けらじ)方言を取り上げ、国際音声字母表記(I.P.A)を用いた臨地調査をおこなった。これらの地域は比較的方言資料が少なく、早急な調査が必要とされている。今回、与路島方言、請島方言については、記述的研究として音韻体系、中央語との音韻対応、動詞、形容詞の活用、助詞の用法を明らかにし、喜界島花良治方言については音韻体系、中央語との音韻対応を明らかにした。まず、本研究の目的を示すと次のとおりである。1).方言資料の乏しい地域を選択し、高齢話者の琉球方言の記述的研究を行い、琉球方言資料の増幅に努める。これは、次世代に方言が継承されていない現状では、急務である。地域としては、琉球方言区画上、北琉球奄美方言に属する鹿児島県大島郡瀬戸内町与路島方言、鹿児島県大島郡瀬戸内町請島方言、鹿児島県大島郡喜界町花良治方言とする。これらの地域は琉球方言の中でも調査資料が少ない地域であり、中本正智(1976)『琉球方言音韻の研究』等に断片的な資料がみられる程度である。従って、音韻、文法、語彙の体系的な調査を行いその実態を明らかにし、基礎資料の充実をはかる必要がある。2).今回対象とする地域は、琉球方言の中でも特にバラエティに富んだ音声が多く観察される。これらの特徴的な現象の中には報告はされていてもその要因及び成立について明らかにされていないものが多い。例えば、喜界島の/〓/の音素は、琉球方言の中では、他に与那国島でしかみられない音素である。平成17年度の科研費で調査した与那国方言の調査資料とも比較考察したいと考えている。以上の目的を達成すべく、平成20年度は与路島方言の調査研究を以下のとおり行った。1.音韻体系の調査2.動詞・形容詞の活用体系の調査音韻調査については、ほぼ完了し音韻体系を明らかにした。大きな特徴としては、例えば、[k〓it(傷)[t〓〓i〓](血)のように無気喉頭化音がみられることや、[kawa](鎌)のようにマ行のW音化(破裂が弱まり鼻音が残る)等が、あげられる。動詞・形容詞の活用については、引き続き補足調査が必要である。これらの調査資料はI.P.A(国際音声字母)表記で記述し、多くの研究者が利用できるように整備している。これらの地域は琉球方言の中でも調査資料が少ない地域である。2).今回、対象とする地域は、琉球方言の中でも特にバラエティに富んだ音声が多く観察される。これらの特徴的な現象の中には、報告はされていてもその要因及び成立について明らかにされていないものもある。例えば、与路方言でみられた[kawa](鎌)のようなマ行のw音化(破裂が弱まり鼻音が残る)の現象は、他に佐仁方言でしかみられないようであり、比較考察したいと考えている。以上の目的を達成すべく、平成21年度は請島方言の調査研究、及び与路島方言の補足調査を以下のとおり行った。1.請島方言の音韻体系の調査2.請島方言の動詞の調査3.与路島方言の動詞・形容詞の補足調査請島方言の音韻調査については、ほぼ完了し音韻体系を明らかにした。大きな特徴としては、例えば、[k〓umo:](雲)[ts〓no:](角)のように無気喉頭化音がみられることや、[ku:r](これ)[t〓ukajum](使う)のように子音単独で拍をあらわす例がみられる等があげられる。請島方言の動詞・形容詞の調査については、引き続き補足調査が必要である。

地域としては、琉球方言区画上、北琉球奄美方言に属する鹿児島県大島郡瀬戸内町与路島方言、鹿児島県大島郡瀬戸内町請島方言、鹿児島県大島郡喜界町花良治方言とする。これらの地域は琉球方言の中でも調査資料が少ない地域である。従って、音韻、文法、語彙の体系的な調査を行いその実態を明らかにし、基礎資料の充実をはかる必要がある。2).今回、対象とする地域は、琉球方言の中でも特にバラエティに富んだ音声が多く観察される。これらの特徴的な現象の中には、報告はされていてもその要因及び成立について明らかにされていないものもある。例えば、与路方言でみられた[kawa](鎌)のようなマ行のW音化(破裂が弱まり鼻音が残る)の現象は、他に佐仁方言でしかみられないようである。以上の目的を達成すべく、平成22年度は喜界島方言の調査研究、及び請島方言の補足調査を以下のとおり行った。1.喜界島方言の音韻調査2.請島方言の助詞の調査3.請島方言の動詞の補足調査喜界島花良治方言の音韻調査については、ほぼ完了し音韻体系を明らかにした。大きな特徴としては、例えば、[gutti:](一昨日)[gutu](夫)のようにワ行のヲに対応するgの例がみられることや、[Φana](花)[Φani](羽)のようにハ行子音はΦに対応する等があげられる。これらの調査資料はI.P.A(国際音声字母)表記で記述し、多くの研究者が利用できるように整備している。
IVR等における医療被曝局所皮膚累積線量の正確な測定法,記録法の開発研究

研究の概要(1)放射線皮膚障害を惹起するレベルの線量に反応するシートタイプのフィルム3種類を選定し検討した。(2)ファントム実験で候補フィルムの基礎的性能を検討し,局所皮膚累積線量の正確な測定が可能かどうかを既存の皮膚線量計などと比較したが、測定値は一致し,いずれのフィルム法も正確な線量を得ることができた。(3)臨床例の検討では,フィルム法が安定した計測値を示すのに対し,面積線量計やSDM (Skin Dose Monitor)の値は測定環境により著しく異なった値を示した。フィルム法でも反射型線量測定用フィルムが銀塩塗布の透過型フィルムに比べて,自動現像機の条件変動,機種による違いを較正しないだけ容易に安定した測定が可能であった。(4)安定して正確な線量測定を行うため,被曝したフィルムの情報をデジタル画像データとして収集し解析を行う汎用性の高いシステムを開発した。(5)繰り返して検査が行われることが多いので,局所ごとの皮膚被曝累積総線量を一定精度誤差範囲内で身体マップ上に表示でいる共通利用可能な方法を開発した。患者が診療のために受ける医療被曝については,法律上線量限度は定められていないが,最近長時間のX線透視による放射線皮膚障害の症例報告があいついでおり,正確な局所被曝線量の測定とその記録が重要な課題となっている。本研究では,X線に感受性のあるシートタイプフィルムをセンサとして局所皮膚累積被曝線量の正確な測定法の開発を行った。(1)放射線皮膚障害を惹起する1グレイから10グレイのレベルの線量に反応するフィルムとして,X線を照射することにより発色する反射型フィルム(GAFCHROMIC XR TYPE R)ならびに自動現像機で処理が可能な特殊低感度フィルムの2種類を選択し基礎実験を行い,臨床例で測定を試みた。(2)ファントム実験で候補フィルムの線量特性,線質特性,線量率特性,方向特性,後方散乱の影響,患者皮膚面とフィルムの密着性の影響,照射後のフィルム濃度の経時変化(反射型フィルムのみ),可視光線の影響(反射型フィルムのみ),などを検討したが,全てにおいて大変有効である結果が得られた。各種線量計との線量比較においても,フィルム法は正確な測定値を示した。(3)安定して正確な線量測定を行うため,被曝したフィルムの情報をデジタル画像データとして収集し解析を行う汎用性の高いシステムを開発した。(4)実際のIVR症例について,フィルムの最大濃度値を測定し最大皮膚面吸収線量を測定することができることを確認した。(2)ファントム実験で候補フィルムの基礎的性能を検討し,局所皮膚累積線量の正確な測定が可能かどうかを既存の皮膚線量計などと比較したが,測定値は一致し,いずれのフィルム法も正確な線量を得ることができた。(3)臨床例の検討では,フィルム法が安定した計測値を示すのに対し,面積線量計やSDM(Skin Dose Monitor)の値は測定環境により著しく異なった値を示した。
焦点距離可変液晶レンズの実用化に関する研究

1.着用が可能な焦点距離可変眼鏡をレンズとして、眼鏡試験枠に装着できる構造寸法のもの、すなわち直径3.7cmのアクリル製のフレネルレンズおよび同じ直径の透明導電膜をコートしたガラス板により円形の液晶レンズを試作した。アクリル製レンズの曲率半径を3cm(焦点距離f=-6.01cm)とした場合には11.967cm(1.58.4ジオプター)の焦点距離可変範囲が得られた。このレンズを眼疾患(白内障)患者に対して試用した場合の視力の変化を測定した。近方視における視力の低下の割合は少なく、ある程度評価できる結果が得られた。また、健常者の調節近点変化の測定も行った。2.液晶による焦点距離可変のレンズにおいて、異方性を有する液晶固有の特性に基づく収差を補償する方法として、液晶分子を一方向に配向させたいわゆるホモジニアス配向ではなく軸対称的な分子配向特性を有する液晶レンズを堤案し、同心円状あるいは放射状の液晶分子配向法を開発し、液晶レンズを試作した。その結果、このような液晶分子の配向特性に起因する光学的異方性に基づく収差を軽減することができた。また、可変焦点液晶レンズにおける非線形特性を補償する方法として、ゲスト・ホスト液晶セルにおける印加電圧に対する透過光強度特性の逆関数電圧を作り、液晶レンズを駆動することで液晶レンズの非線形特性をほぼ補償することができた。3.焦点距離可変眼鏡レンズの試用範囲を白内障患者から一般の老眼鏡着用者に広げた場合について検討を行い、凸レンズ状の焦点距離可変液晶レンズと凹レンズとを組み合わせた構造のレンズを構成することにより、正の焦点距離をもつ凸レンズから負の焦点距離をもつ凹レンズまで連続的にその焦点距離を変化させることができる遠近両用のレンズを試作し、その基本動作を確認した。4.研究成果の取りまとめを行った。1.昭和59年度で得られた研究成果、すなわちくさび形構造液晶セルやフレネル構造のプリズム液晶セルにおける液晶分子の配向と電圧印加時の光学的特性の測定結果、並びにフレネル構造の液晶レンズにおける可変焦点効果等の研究成果に基づき、着用が可能な焦点距離可変の眼鏡の設計及び試作を行なった。すなわち、直径が37mmの円形フレネルレンズ及び透明導電膜を有するガラス板を用いて、眼科検査用の試験枠に插入できるような構造の液晶による可変焦点レンズを作成した。2.前記第1項で述べた焦点距離可変眼鏡において、温度変化による特性の変化の補償法及び電圧印加による応答並びに回復特性の改善法など、実用化を行なう場合において重要となることが予想される種々の問題点を取り上げて検討を加え、これらの諸特性の改善法として複屈折バイアス法を考案し、駆動装置の試作を行ない、その動作特性を測定した。3.焦点距離可変眼鏡において予想される種々の光学収差、特に液晶における光学的異方性及び液晶分子の配向特性に基づく収差について実験的検討を加え、その原因並びに解決法について考察を行なった。4.距離センサとして超音波送波器及び受波器を用い、焦点距離可変眼鏡と組み合わせることにより、機械的可動部分を持たずに全自動的に焦点距離を可変できる眼鏡を設計し、試作を行ない、その動作特性を測定した。5.試作した焦点距離可変の眼鏡における各種の特性の測定を行ない種々の問題点等を明らかにするとともに、また解決すべき点について検討を加えた結果、焦点距離可変眼鏡の特性をより一層向上させるための指針が得られた。
c-Srcと脳機能障害:新規生体機能モニターマウスによる解析

脳神経系で機能調節に重要な働きをすると予想されるc-Srcの機能を生体レベルで検証するため、新たにc-Srcのリン酸化部位遺伝子改変マウスを作製し、これらのマウスがエタノールの脳機能障害のモデルとなり得るのか検討した。変異マウスはエタノール消費量が野生型より少なく、エタノール嗜好性も弱かった。これらの結果から、c-Srcがエタノール欲求行動に関与することが明らかになり、アルコール依存症の治療創薬や節制予防法の手掛かりとなる可能性が示された。c-SrcはSrc型チロシンリン酸化酵素群の一つであり、脳神経系で発現が高く、脳のアスパラギン酸受容体(NMDAR)の制御因子としてなど様々な機能に関与していると推定される。しかし、他のSrc型酵素の相補機能により、生体レベルでc-Srcのみの脳神経の機能の全容を検証できる遺伝子改変動物が得られていない。そこで、神経細胞で機能制御に関わり、他のSrc型酵素にはないc-Srcのリン酸化部位セリン75に、リン酸化の阻害変異(SA)及び擬似変異(SD)を各々導入した新規c-Srcノックインマウスを作製した。エタノールの脳機能障害は現代の医学的社会的に重大な課題の一つである。エタノールの脳神経系に及ぼす影響は、多様な神経伝達物質系への作用の結果、生体行動レベルに表れると考えられる。本研究ではこれらのマウスが、生体行動に及ぼすエタノール効果の生体モデルとなり得るのかを検討した。行動の評価はエタノールの摂取(消費及び嗜好)についてtwo-bottle選択試験により解析を行い、急性のエタノールの脳に及ぼす効果(催眠効果)の相異は正立反射消失時間の測定により解析した。また、エタノール長期投与後の離脱による効果をRitzmann and Tabakoffの評価基準で観察した。SD/SDホモ接合体マウスはエタノール消費量が野生型より少なく、エタノール嗜好性も弱かった。一方、SA/SAマウスは調べた限りにおいて、エタノール消費量が野生型より多く、エタノール嗜好性も強かった。なお、正立反射消失時間はSD/SD及びSA/SAとも有意な差が認められなかった。また、Ritzmann and Tabakoffの評価も差がなかった。これらの結果から、c-Srcがエタノール欲求行動に関与することが明らかになり、アルコール依存症の治療創薬や予防法の開発の手掛かりとなる可能性が示された。Srcセリン75にリン酸化の阻害変異(SA)及び擬似変異(SD)を各々導入したSD及びSAマウスを用いて、野生型、SD変異型、SA変異型各マウスにおける急性のエタノールの脳に及ぼす効果(催眠効果)の相異を正立反射消失時間の測定により評価した。1.測定系の確立。(1)測定槽。アクリル製のV字型の測定槽。(2)測定マウスの性別。オスマウスのみ。(3)投与エタノール量。20%エタノール生理的食塩水液を用い、3mg/g体重のエタノールを投与。(4)マウスの月齢。月齢が高いほど正立反射消失時間の個体間差が大きく、3カ月齢に限定。(5)消失時間の決定。5回連続して30秒以内に起立した時間を正立反射回復時間と定義。(6)エタノール投与後の生体行動反応。投与後の酩酊状態の一定化、また、出血(血尿)、死亡、催眠効果の未発現等の抑止、投与後3分経過後測定開始。(7)その他。ナイーヴマウスの使用、測定時間帯の設定。上記のように各要因を検討した結果、SD及びSA各点変異の導入の正立反射消失時間への影響を再現性よく評価できるシステムが確立された。これは今後の展開に道を開く重要な成果である。2.NMDARのエタノール感受性に果たすc-Srcの役割:SD及びSAマウスと正立反射消失時間測定系を用いた解析。SA変異型では、野生型とヘテロ変異型、或いはホモ変異型との間に消失時間の差がなかった。一方SD変異型では、野生型に比べてヘテロ及びホモ変異型の消失時間が短縮する傾向が見られた。これらの結果は、測定サンプル数がまだ、充分ではないので断定することはできないが、NMDARの上方制御分子であるSrcのセリン75の燐酸化が脳NMDARのエタノール感受性を制御しているというこれまで未解明の重要な発見につながる可能性を示している。3.血中エタノール濃度の測定、Harrisらの方法に準拠し測定系を構築した。Src独自の機能を生体レベルで、とりわけSrcの発現が高い脳神経系における生体機能は、Src完全欠損(ノックアウト)マウスでは他の類縁酵素の機能相補により検討できないと考えられる。そこで、私共が作製したSrcのユニーク領域内のセリン75にリン酸化の阻害変異(SA)及び擬似変異(SD)を各々導入した新規の遺伝子改変マウスを用いて、脳NMDARのアルコール感受性がSrcに特異的なチロシンリン酸化により制御されているのかを生体レベルで明らかにしようとしている。