hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写因子Sp1におけるトランス・スプライシングの分子メカニズムとその生物学的意味

我々は、同種のpre-mRNA間におけるトランス-スプライシングにより、多様なヒト転写因子Sp1のmRNAが生み出されているということをヒト培養細胞内を用いて示してきた。同種のpre-mRNA間のトランス-スプライシングが、最近、ほ乳類において相次いで発見されてきているがこのようなトランス-スプライシングの分子メカニズムは今だまったく不明である。そこで、本研究は、このトランス-スプライシングの分子メカニズムを明らかにすることを目的として行われた。また、このようなトランス-スプライシングの生物学的意義についても検討することを目的とした。まず、Sp1におけるトランス-スプライシングがさまざまの臓器の中でも起こっていることをラットを用いて確認した。一方で、転写とスプライシングは共役しているので、大きなイントロンが存在すると本来のacceptor部位が合成される前に、donor部位は別のPre-mRNAのイントロン中のacceptor部位とスプラシングを起こしているのではないかという仮説、すなわち、大きなイントロンが同種間のトランス-スプライシングを引き起こす大きな要因であるという仮説を立て検証した。Sp1においてトランス-スプライシングを引き起こしていると見られる大きなイントロン(イントロン3)を縮めたSp1遺伝子などを用いてヒト培養細胞を形質転換し、その形質転換体でのトランスースプライシングを調べた結果、配列ではなく長さそのものがトランス-スプライシングを引き起こしている要素であることが確認された。一方で、トランス-スプライシングとシスースプラシングの割合を調べたところ、トランス-スプライシングのは割合は1%であった。これらのことから、ほ乳類のスプライシング機構は本質的に副反応として同種間のトランス-スプライシングを引き起こす活性があり、大きなイントロンが存在するとその副産物のレベルが高く、検出されてきている可能性も考えられた。我々は、二つのmRNA前駆体間でのスプライシング(トランス-スプライシング)によりヒトの転写因子Sp1のmRNAの多様性が生み出されているということを示している。本研究は、このトランス-スプライシングの分子メカニズムを解明することと、Sp1 mRNAの生成にトランス-スプライシングが関わることの意味を調べることを目的としている。本年度は、まず、トランス-スプライシングにより生成されるヒトSp1 mRNAはエクソン3-2という構造体を有していることに着目して、Sp1遺伝子のイントロン1からエクソン2までの領域とエクソン3からイントロン3までの領域を独立したmRNA前駆体として同時にヒト培養細胞内で発現させたのち、トランス-スプライシングによる産物をRT-PCR法により検出するという系を確立した。驚くべきことに、この系においては、染色体上の遺伝子発現の場合には起らないトランス-スプライシングも起きることが示された。従って、染色体上の遺伝子の発現におけるスプライシングは、プラスミドに由来するmRNA前駆体間では影響しない何らかの要素により制御されているのではないかと考えられた。そのような要素として、スプライシングacceptor部位とdonor部位の物理的距離を推定した。すなわち、転写途上のmRNA前駆体上で、随時、スプライシングは行われることから、40kb以上という非常に大きなイントロン3が存在することにより、イントロン3上のacceptor部位と次に合成されつつあるmRNA前駆体上のdonor部位の間でスプライシングが起きているのではないかいう仮説を考えた。この仮説を検討するために、大きなイントロンを持ついくつかの遺伝子の発現においてトランス-スプライシングが起っているかを調べた。その結果、大きなイントロンの存在によりトランス-スプライシングが引き起こされる可能性が示唆れた。我々は、同種のpre-mRNA間におけるトランス-スプライシングにより、多様なヒト転写因子Sp1のmRNAが生み出されているということをしめしてきた。

そこで、本研究は、このトランス-スプライシングの分子メカニズムを明らかにすることを目的として行われた。また、このようなトランス-スプライシングの生物学的意義についても検討することを目的とした。昨年度までの解析から、大きなイントロンが同種間のトランス-スプライシングを引き起こす大きな要因であるという仮説を立てた。すなわち、転写とスプライシングは共役しているので、大きなイントロンが存在すると、本来のacceptor部位が合成される前に、donor部位は別のPre-mRNAのイントロン中のacceptor部位とスプラシングを起こしているのではないかと考えた。この仮説を検証するために、Sp1においてトランス-スプライシングを引き起こしていると見られる大きなイントロン(イントロン3)を縮めたSp1遺伝子などを用いてヒト培養細胞を形質転換し、その形質転換体でのトランス-スプライシングを調べた結果、配列ではなく長さそのものがトランス-スプライシングを引き起こしている要素であることが確認された。一方で、トランス-スプライシングとシス-スプラシングの割合を調べたところ、トランス-スプライシングのは割合は1%であった。これらのことから、ほ乳類のスプライシング機構は本質的に副反応として同種間のトランス-スプライシングを引き起こす活性があり、大きなイントロンが存在するとその副産物のレベルが高く、検出されてきている可能性も考えられた。
アデノウイルスベクターを用いた心筋イオンチャネル病の病態解明

アデノウイルスベクターを用いた心筋細胞へ遺伝子導入法の最適条件を決定するために、成熟モルモット単離心筋細胞にLacZ遺伝子を組み込んだアデノウイルスを感染させた。遺伝子発現効率は感染48時間後にピークとなり、10moiのウイルス力価により約50%の細胞が感染した。次に組換えアデノウイルスの作成を行った。正常型(WT)およびLQT3変異(ΔKPQ)心筋NaチャネルcDNAをアデノウイルスコスミドpAxCAwtにサブクローニングし、組換えコスミドDNAをHEK293細胞にトランスフェクションした。しかし、目的の遺伝子の導入は成功しなかった。原因としてNaチャネル遺伝子が大きすぎたためと考え、当初の実験計画を変更し遺伝子サイズの小さい、LQT1の原因遺伝子であるKvLQT1のcDNA(約2kb)を用いた。正常および2種類のLQT1変異KvLQT1(R555C,G314S)cDNAをコスミドベクター導入しサブクローニングした。しかし、この組み換えコスミドDNAの導入も成功しなかった。結局、失敗の原因は、導入する遺伝子よりも心筋細胞の状態によると考えられる。今回は確立したcell lineを用いたが、やはり非心筋細胞であることで、外来性の心筋細胞遺伝子を積極的に導入できないのかも知れない。今後は、未分化型で分裂能も有している培養心筋細胞や、心筋型のcell line等を用いて、イオンチャネル遺伝子の導入法確立などを経験した後、再検討する予定である。本年度はまず、アデノウイルスベクターを用いた心筋細胞へ遺伝子導入法の最適条件を決定するために、成熟モルモット単離心筋細胞にLacZ遺伝子を組み込んだアデノウイルスを感染させた。相同組換えにより組換えアデノウイルスゲノムが作成されれば、培養した細胞はウイルス増殖により通常1518日で死滅するが、われわれの実験では死滅細胞をみとめたクローンはごく少数で、増殖に成功したウイルス液も目的の組換えアデノウイルス遺伝子を持っていなかった。現在の段階では、残念ながら、組換えコスミドDNAは作成できたものの、組換えアデノウイルスの作成には至らなかった。その原因は、Naチャネル遺伝子が6kbと大きすぎて細胞内で組換えウイルス生成が困難であったためと考えられる。このため、当初の実験計画を変更し、LQT1の原因遺伝子であるKvLQT1のcDNA(約2kb)を用いていることを計画している。正常、および2種類のLQT1変異KvLQT1(臨床的に軽症型のR555C、重症型のG314S)cDNAをコスミドベクターへにサブクローニングはすでに終了し、現在、これらの組換えアデノウイルスの作成を行っている。
Indonesian Throughflow variability and its influence on global climatic events during the Pliocene and Pleistocene

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ヘテロ接触界面のイオン移動現象とその設計

高温へテロ接触界面におけるイオン移動現象を支配する因子を明らかにすることを目的とし、下記の成果を得た。・混合導電体電極/電解質へテロ接触界面における律速過程は、表面反応(吸着・解離)であり、急峻なポテンシャル勾配が気相/電極界面に存在することを初めて分光学的に明らかにすることに成功した。・高温ナノイオニクス現象を支配する因子として、構造変調が、非常に大きな影響を与えている。構造変調を制御することにより、高活性電極作製が可能であると考えられる。・量子ビームを用いた様々な最先端計測手段の確立に成功した。これは、今後のナノイオニクス研究の方法論として極めて有効であると考えられる。本研究の目標は、ヘテロ接触界面のイオン移動現象を支配する因子を明らかにし、ナノイオニクス現象の利用によるイオン移動速度を制御した高機能電極の構築とその設計指針を確立することである。ある相と別の相とのヘテロ接触界面におけるイオン移動は、種々の電気化学デバイスを含む化学反応の反応場であり、その現象解明が極めて重要であるにも関わらず、これまでほとんど明らかとなっていない。このヘテロ接触界面でのイオン移動を支配するのは表面からわずか数十nmの表面相であり、測定手段が限られていたこと、また界面に特異的な現象を抽出するのが困難であったことが一因である。酸化物イオン伝導体/金属電極/気相の界面における酸素交換および固体内の酸素移動挙動において、酸素交換反応定数が、わずか1%の水蒸気の存在により、数十倍数百倍に増大する特異的な現象を見出した。これは、ヘテロ接触界面において、反応サイトが不均一であることにより発生した局所的分極により、反応中間種である表面ラジカルが安定化していることによると考えられる。この系をプローブとし、中温-高温領域での気相/固相の接触界面でのイオン移動現象の解明を行い、さらにそれを発展させ、飛躍的に電荷分離反応速度を向上させた高機能電極作製の指針を得ることを目指した。ガス中の化学種特定と濃度分析、および安定な吸着化学種の推定のため、四重極質量分析装置と、温度・気体分圧が精密制御できる閉鎖系からなる気相交換実験装置を構築し、電解質の構造の影響を調べるため、ペロブスカイト構造をもつ酸化物イオン伝導体/金属/気相界面の酸素移動挙動について、同位体交換と二次イオン質量分析法(現有)を用いて界面および酸化物内の酸素移動挙動における水蒸気の影響を検討した。イオン移動現象は、様々なプロセスの中で極めて意有用な位置を占めている。しかし、ある相と別の相とのヘテロ接触界面におけるイオン移動は、種々の電気化学デバイスを含む化学反応の反応場であり、その現象解明が極めて重要であるにも関わらず、これまでほとんど明らかとなっていない。昨年度までの研究において、酸化物イオン伝導体/金属電極/気相の界面における酸素交換および固体内の酸素移動挙動における、酸素交換反応定数が、白金等の金属電極のみならず、希土類3d遷移金属酸化物電極においても水蒸気分圧に大きく依存することを見出した。本年度はこの系をプローブとし、中温-高温領域での気相/固相の接触界面でのイオン移動現象のさらなる解明を行った。静電噴霧蒸着法を用いて、希土類3d遷移金属酸化物電極を作製した。薄膜作製用の基板を焼結により作製する必要があり、静水圧プレス機を購入した。放射光を用いた軟X線を用いて、遷移金属のL吸収端と酸素のK吸収端を測定し、コバルトの系においては、電荷移動において酸素の2p軌道の寄与が大きいこと、Mnの系においてはMn 3d軌道の寄与が大きいことを明らかとした。また、ナノオーダーの局所における解析を可能にするために、ナノXAFSの手法の導入を行った。さらに、高温における電気化学反応場のその場分析手法として、高温におけるXAFS測定を行った。ランタンコバルト系酸化物おけるコバルトの電子構造が電位とともに大きく変化することを初めて見出した。ナノレベルの構造制御を行ったイオン伝導体と混合伝導体層の界面において、固気反応に及ぼす興味深い効果を解析・設計するためには、作動条件下における界面の局所構造、反応の律速過程とそれが生じる場所、界面における物質輸送などを含めた、ヘテロ接触界面におけるイオン伝導現象に寄与する諸性質の包括的理解が必要である。そこで本研究では、このヘテロ接触界面でのイオン伝導現象の、より直接的な評価手法の開発・確立を目指し、従来用いられてきた電気化学的な測定手法に加え、in situ X線吸収分光(in situ XAFS)、ナノX線吸収分光(nano-XAFS)、二次イオン質量分析(SIMS)による測定手法について検討した。

GDC上に作製したLa0.6Sr0.4Co03薄膜電極を用い、SOFC作動条件下におけるその場XAFS測定を行った。800°C、空気中において、-400+200mVの電圧を印加した際に得られたCo-K吸収端のX線吸収スペクトルを図2に示す。吸収端位置は、開回路状態に比べ、カソード分極させることにより低エネルギー側に、アノード分極させることにより高エネルギー側にシフトした。この結果は、電圧の印加によりLa0.6Sr0.4Co03薄膜中におけるCoの平均価数が変化していることを示している。一般に、酸化物イオン伝導体上の電極における過電圧は、電極における酸素ポテンシャルの平衡状態からの変分に対応すると考えられている。Co-K吸収端の位置から見積もったLa0.6Sr0.4Co03薄膜におけるCoの平均価数を、印加した過電圧量に相当する酸素分圧に対してプロットしたものを図3に示す。図3には、川田等によって報告されているLa0.6Sr0.4Co03薄膜における平衡酸素空孔濃度から算出したCoの平均価数も合わせて示した。両者の間には非常に良い一致が見られた。これにより、La0.6Sr0.4Co03薄膜電極における過電圧に伴う酸素ポテンシャル変化が、電極内部や電解質/電極界面ではなく、電極/気相界面において生じていること、すなわちLa0.6Sr0.4Co03薄膜電極におけるカソード反応が表面反応律速であることが明らかにされた。これは、高温ヘテロ接触界面はおける反応機構を電子分光によってin situ測定し、明らかにした初めての例である。本研究では、高温ヘテロ接触界面におけるイオン移動現象を支配する因子を明らかにし、ナノイオニクス現象を利用することにより、イオン移動速度を制御した高機能電極の構築とその設計指針を確立することを目的としている。このためには、電解質(イオン伝導体)と電極(電子伝導体あるいは混合伝導体)とのヘテロ接触界面近傍におけるイオン移動現象に寄与する諸性質の包括的理解が必要不可欠である。本年度は、下記の2つの課題について検討を行った。我々は、二次イオン質量分析装置(SIMS)を用いて同位体分布を三次元的に把握することで、酸化物イオン伝導体上に金属電極をつけた単純なヘテロ界面での酸素表面交換反応および電極反応における反応活性点の分布および拡散経路を明らかにする検討を続けてきた。今回は金(Au)/ガドリニウムドープセリア(GDC)界面における酸素交換反応の活性点分布について、温度の影響、電場の影響を検討し、これまでに報告しているAu/YSZ界面での結果と比較した。さらに、これまでに引き続き、電解質/電極ヘテロ接触界面におけるイオン移動現象を、直接的に評価することのできる分析・観察手法の開発・確立を行った。具体的には、これまでにも検討・開発を行ってきたin situ X線吸収分光(in situ XAFS)、in situナノXAFS、二次イオン質量分析(SIMS)を用いた評価手法をさらに発展・改良すると共に、固体酸化物形燃料電池(SOFC)のカソード反応を念頭に、これらの手法を用いて、酸化物イオン伝導体と3d遷移金属酸化物(ペロブスカイト型、層状ペロブスカイト型)あるいは金属(Au、Pt)とのヘテロ接触界面の評価を行った。
コラーゲン生体材料を用いた骨形成因子の臨床応用に関する研究

これまで、骨や骨肉腫組織には、間葉系細胞を刺激して骨誘導をもたらす物質が存在することが明らかにされ、骨形成因子(Bone morphogenic protein,BMP)と呼ばれている。我々は、このBMPの臨床応用を目的として、生体において低刺激かつ自己融解能を有するコラーゲン生体材料を基質とし、これにBMPを吸着せしめた移植実験を行った。1.研究方法1)牛骨ならびにハムスターOs515骨肉腫からのBMPの分離2) BMPを以下のコラーゲン生体材料(日本医用高分子材料研究所の提携)に吸着させ、BMP・コラーゲン複合体を作製(1)コラーゲンスポンジ(2) 2%コラーゲン溶液(3)荷電コラーゲン膜3)BMP・コラーゲン複合体をマウスの筋肉内、そして骨欠損部分に移植2.結果BMPをいずれの型のコラーゲン生体材料に吸着(混和)させても、生体内での骨誘導が観察させた。しかし、骨欠損部での骨形成能は、筋肉内でのそれに較べ劣ることがわかった。また、上記のコラーゲン生体材料のうちでは、コラーゲン溶液が骨誘導を引き起こすに最も有利であると思われた。3.結論これまで、BMP単独移植では生体内に確実に骨誘導を起こすことは困難であったが、BMP・コラーゲン複合体とすると極めて高率に豊所性の骨化を起こすことが可能であることが判明した。2牛の骨組織からのBMpの分離は,骨組織をEOTAにて脱灰後,上記の骨肉腫に対すると同様の方法で行った.ただし,骨組織からのBMpの収量は,骨肉腫の約1/10と低値を示した.3以上のようにして分離したBMpをコラーグレスポンジをもアリアーとしてマウスの筋肉内に移植した.コラーグレスポンジは,牛の皮膚のペプシン可溶化コラーゲンを用いて製造したもので,抗原性が低く,生体内に移植すると自己融解し,吸収される特徴を有するものである. BMp〓〓を行うと, 3週後には軟骨組織が出現し, 45週経過すると,骨組織が誘導されることが観察された.また,キカリアーであるコラーグレスポンジは,移植後, 4週間で殆んどが吸収された.4以上の結果から,コラーゲン生体材料を用いた骨形成因子の移植は,異所性に骨形成を引き起こす有効な方法であることが明らかにされた.昭和62年度には、ハムスターOs515骨肉腫ならびに牛骨から骨形成因子(Bone morphogenic protein,BMp)を分離した。得られた骨形成因子をコラーゲンスポンジに吸着させて、これせマウスの筋肉内に移植したところ、異所性の骨化が惹起されることが判明した。昭和63年度は、BMpをさらに異なったコラーゲン生体材料に結合させ、それらの骨誘導能につき検討した。1.コラーゲン生体材料(日本医用高分子材料研究所の提供)1)2%コラーゲン溶液2)コラーゲル膜2.BMpの移植方法1)2%コラーゲン溶液のBMpを混和し、これを経皮的にマウスの筋肉内あるいは骨欠損部に注入2)荷電コラーゲン膜にBMpを付着させ、マウスの筋肉内あるいは骨欠損部に移植3.結果2%コラーゲン溶液は粘性が高く、体温下では線維配列を形成することが観察されている。これにBMpを混和させて、注射器を用いて経皮的に生体に注入すると、筋肉組織内そして骨の欠損部分に効率よく骨形成が生じることがわかった。また、荷電コラーゲン膜にBMpを付着させて移植すると同様な骨形成が生じたが、その骨形成能はコラーゲン溶液混和群に比べてやや低いことが観察された。以上のことから、BMpとコラーゲン生体材料との複合体移植は、今後、臨床面で応用し得る可能性があるものと考える。
ヒト型骨髄性白血病マ-モセットモデル系の作製と白血病に対する遺伝子治療法の開発

コモンマーモセット末梢血造血幹細胞(PBSC)中へレトロウイルスベクターを用い、in vitroで多剤耐性遺伝子(MDR1)を高率に遺伝子導入できる系を確立した。この系を用い作製したMDR1遺伝子導入PBSCを、大量放射線照射後のマ-モセットに移植し、臨床経過を観察している。現在移植後約220日目であるが、末梢血好中球ならびにリンパ球中に導入されたMDR遺伝子を検出しており、将来的に目的遺伝子をin vivo選択マーカーとしてのMDR1遺伝子とともに長期にわたる血液再構築能を有する造血幹細胞中に導入し得ることが示唆された。この研究成果をもとに、BCR/ABLならびにPML/RARレトロウイルスベクターを用い、マ-モセットPBSC中への遺伝子導入を現在検討中である。なお現在の問題点は、これらの融合遺伝子はウイルス産生細胞に対して毒性を発揮するため、高力価ウイルス産生細胞が樹立できず、充分な遺伝子導入造血幹細胞が得れない点である。この問題を解決するために短期的ウイルス産生細胞株をφNX産生細胞をもとに樹立中である。これにより高力価の融合遺伝子導入用ベクターの作製とPBSCへの遺伝子導入が可能になるものと期待される。一方、白血病への遺伝子治療法の開発の為にマウス自家白血病・リンパ腫モデル系を用いて検討した。GM-CSF,B7-1遺伝子導入リンパ腫細胞の抗腫瘍ワクチン誘導効果には相加性があることが明らかとなった。また我々の自家肺がんマウスモデル系で、IL-12遺伝子導入腫瘍細胞の抗腫瘍ワクチン誘導効果ならびに既存腫瘍への治療への治療効果が明らかにされており、IL-12遺伝子導入白血病・リンパ腫細胞の抗腫瘍免疫誘導効果も期待され、現在検討中である。以上のように、今後の白血病・リンパ腫に対する免疫遺伝子治療法の基盤技術が確立されてきている。コモンマーモセット末梢血造血幹細胞(PBSC)中ヘレトロウイルスベクターを用い、in vitroで多剤耐性遺伝子(MDR1)を高率に遺伝子導入できる系を確立した。この系を用い作製したMDR1遺伝子導入PBSCを、大量放射照射後のマ-モセットに移植し、臨床経過を観察している。なお現在の問題点は、これらの融合遺伝子はウイルス産生細胞に対して毒性を発揮するため、高力価ウイルス産生細胞が樹立できず、充分な遺伝子導入造血幹細胞が得られない点である。また我々の自家肺がんマウスモデル系で、IL-12遺伝子導入腫瘍細胞の抗腫瘍ワクチン誘導効果ならびに既存腫瘍への治療効果が明らかにされており、IL-12遺伝子導入白血病・リンパ腫細胞の抗腫瘍免疫誘導効果も期待され、現在検討中である。
全身性エリテマトーデスの遺伝素因における荘型インターフェロン制御系分子群の役割

1.Type I interferon(IFN)pathway関連55遺伝子より選択した384tagSNPを搭載したマイクロアレイを作成し、全身性エリテマトーデス(SLE)105例、健常対照群102例の遺伝子型を決定し、関連解析を施行した。ヨーロッパ系集団において関連が報告されたSTAT4においてもっとも顕著な関連が検出され、STAT4が集団を超えたSLE関連遺伝子であることが強く示唆された。また、それ以外にも、過去に報告のない25遺伝子において、関連の可能性が示唆されるSNPが見出された。これらを有力な候補遺伝子として、今後、検体数を増やして関連を確認するとともに、高密度マッピングにより、機能的多聖部位を見出す計画である。2.ヨーロッパ系集団においてSLEとの関連が確立しているIRF5こ関して、日本人集団における関連解析を施行し、IRF5が集団を超えたSLE感受性遺伝子であることを見出した。しかしながら、そのハプロタイプ構造は、ヨーロッパ系集団と顕著に異なり、ヨーロッパ系集団においてリスクハプロタイプを構成するexon6の10アミノ酸挿入、polyAsignal部位多型は日本人では関連が見られず、逆に、ヨーロッパ系集団には見られないintron 1のSNPに有意な関連が検出された。3.HapMapドナーより樹立されたB細胞株のトランスクリプトームのデータベース(GENEVAR)を利用して、SNPとトランスクリプトームとの関連を解析する方法を確立した。この方法により、日本人集団においてSLEと関連するintron1多型が、IRF5自体およびIRF5によって誘導される遺伝子群のmRNA量と有意に関連することから、機能的多型と考えられることを示した。近年、ヨーロッパ系集団において、I型インターフェロンや炎症性サイトカイン産生経路において重要な転写因子であるinterferon regulatory factor 5 (IRF5)遺伝子に存在する、1)スプライス・アイソフォームの産生に関連する第1イントロン多型(rs2004640)、2)翻訳領域の10アミノ酸挿入、3)poly Aシグナルを改変する3'非翻訳領域(UTR)多型(rs10954213)の3個所すべてを含むハプロタイプが全身性エリテマトーデス(SLE)に関連することが報告された(Graham et al., PNAS 2007)。本年度、われわれは、日本人SLEにおけるIRF5多型の関連について検討し、以下の知見を得た。1.第1イントロンのSNP rs2004640については、日本人集団においても、関連が確認された(Tアリル陽性率SLE58.8%,健常者49.8%,OR1.44,P=0.048)。2.3'UTRのSNP(rs10954213)については、日本人集団では関連が検出されなかった。3.rs2004640下流に検出されたSNPにおいて、マイナーアリル頻度がSLEにおいて有意に減少していた。また、rs2004640の上流に検出された、1個の新規SNPを含む2個のSNPによるハプロタイプが、SLEに有意に増加していた。4.上記の計5SNPにより、5種類のハプロタイプ(ht1-5)が形成され、ht3がSLEにおいて有意に減少(P=0.0029)し、ht5が増加していること(P=0.026)が見出された。以上の結果、日本人集団においても、IRF5とSLEとの関連が確認された。さらに、ヨーロッパ系集団において原因的に寄与することが示唆されているrs2004640やrs10954213は、日本人では一義的な関連を示さず、むしろそれ以外の3個所のSNPの寄与が大きいことが示唆された。
成長期骨密度修飾因子と対策に関する研究

小児(3-20歳)の骨密度の正常値(平均±SD)を既報の報告(J Clin Endocrinol Metab81:1248-53,1996)並びにその後の健常人の検討をもとに設定した。この基準値は年齢のみならず身長・体重に応じた値で設定した。骨密度修飾因子として思春期遅発症・原発性無月型における低骨塩量、思春期早発傾向・女児の運動歴による骨密度増加をすでに明らかにしたが、その骨密度の修飾因子の可塑性に対する検討に着手した。(1)成長期の発来または骨年齢が2年以上遅れている思春期遅発症30名以上(2)思春期早発症で治療のため性腺抑制療法を行い人工的に女性ホルモン退縮状態を作った症例10例以上について対象の身長発育・骨密度・各代謝マーカー・遺伝子多型を検討した前方視的検討を行っている。私どもはすでにPeak bone massとビタミンD受容体のイントロン8のBsml遺伝子多型とは関係無い結果でビタミンD受容体遺伝子の転写開始点のAT/CG遺伝子型が骨成長と関係する結果なので、各遺伝子型に対応しEB transformed lymphoblastoid cell lineを作成しln vivoでのmRNAの各allele発現を知る系を作った。思春期遅発症群でのCa投与群では最終Peak bone massの改善をみる例とCa投与によりPeak bone massが改善されない例がありこの点に関してビタミンD受容体遺伝子のExon2転写開始点多型との関係で検討をすすめている。Western blot法によるVDR protein量との遺伝子型についての検討を加える予定である。
金属ナノチューブ電極の作製及び炭酸ガス還元への応用

メタノール溶媒に炭酸ガスを吸収させ、銅電極を用いて高い電流効率でメタンを生成させることが可能となりつつあるためが、エチレンやエタンなどのさらなる高次炭化水素を得るためには、電極設計が重要な鍵となる。本研究では、各種金属によるナノチューブ電極を作製し、その電極を用いてメタノール溶媒中での電気化学的還元特性の検討を試みた。金属ナノチューブ電極の作製方法として、様々な手法が提案されているが、簡便性と再現性を考慮して、平成18年度では陽極酸化法による酸化チタンナノチューブを作製し、その表面に金属を蒸着することにより金属ナノチューブを作製することを検討した。続いて、平成19年度では、まず、ベースとなる酸化チタンナノチューブの作製のために、チタン板をフッ酸イオン存在中において水溶液中で陽極酸化を行い、印加電圧、印加時間、電流値、水溶液の組成などを細かく制御・最適化することにより、チタン板上に酸化チタンナノチューブを生成することができた。陽極酸化条件を検討し、ナノチューブの直径、長さを制御できる条件をある程度見出すことができ、作製した酸化チタンナノチューブとテンプレートとして、イオンコーターを用いて、金属ナノチューブを作製することができた。さらに、この酸化チタンナノチューブ上に金や銅をスパッタリングによりコーティングし、金や銅のナノチューブを作製することができた。その金属ナノチューブを用いて炭酸ガスの電気化学的還元を試みた。本研究では、各種金属によるナノチューブ電極を作製し、その電極を用いてメタノール溶媒中での電気化学的還元特性を検討する。本実験計画では、まず金属ナノチューブの作製法を詳細に検討し、銅、金、亜鉛、鉛などの金属ナノチューブを作製し、そのメタノール溶媒中でのCO_2の電気化学的還元特性を調べる。電極活性や電流効率に関するデータを得た後、プラント化を念頭に置いて、開発した電極に最適なメタノールの純度、安価な支持塩等検討し、システムの最適化を図る予定である。まず、ベースとなる酸化チタンナノチューブの作製のために、チタン板をフッ酸イオン存在中において水溶液中で陽極酸化を行い、印加電圧、印加時間、電流値、水溶液の組成などを細かく制御・最適化することにより、チタン板上に酸化チタンナノチューブを生成することができた。平成19年度では、この電極を炭酸ガス還元に応用する計画である。
明治期における一斉教授法成立史の研究

本年度は、明治初期にアメリカから移入された日本の一斉教授法が、どのような教育状況に対応して生み出されたものであるのか、その起源をより明確にすべく、サンフランシスコ市とセントルイス市において一等級一教師の等級制一斉教授法が成立する過程を検討した。研究成果は、1.「1870年前後におけるサンフランシスコ市の初等教育-『東京師範学校附属小学教則』(1873年)の背景にある教育状況-」(日本比較教育学会第39回大会、2003年6月)、2.「ミズーリ州セントルイス市における一斉教授法の成立過程-等級制学校への移行とSchool Tacticsの採用を中心に-」(『アメリカ教育学会紀要』第14号、2003年11月)において報告した。1.では、1870年頃のサンフランシスコ市では、オスウィーゴー運動の本来の理念が伝わらず、カルキン(Calkins, N.A.)の形式的な授業法の影響のみを受けており、一斉復唱は注意深く行われなければ有害であると教育委員会が認識するようになっていた事実を明らかにした。しかし、明治初期日本には、必ずしもその見解が伝わらず、お雇いアメリカ人教師スコット(Scott, M.M.)は、カルキンの書を参考に形式化したサンフランシスコの教育方法を忠実に伝え、それが明治初期の復唱を重んじる一斉教授法の受容に影響を与えたのではないか、と指摘した。2.では、1857年以降のセントルイス市においては、産業化に力を注ぐ中で、管理と教授の効率性に優れ、経済性の高い学校教育を展開しようとした結果、等級制一斉教授が成立し、こうした一斉教授を効率よく進める必要からSchool Tacticsが採用されていた事実を明らかにした。School Tacticsは、明治初期日本に「教場指令法」として移入され、日本の「教場指令法」は、教師による号令中心の画一的、形式的な一斉教授法のありようを規定する情報源であり続けたことを指摘した。この他、昨年度と本年度の研究成果をまとめ、博士論文「明治前期おける一斉教授法の受容過程」の作成に従事した。本研究は、明治初期に移入された一斉教授法の背景に、アメリカのいかなる学校管理思想があり、それがどのような教育状況に対応して生み出されたものであるか、またこのようなアメリカの教育情報を受け、日本の小学校教育においてどのように一斉教授法が成立したかその経緯を解明することを目的とする。本年度は、アメリカのセントルイス市で採用されたSchool Tacticsなる一斉教授法を成り立たせるための方法が、19世紀後半のアメリカと日本でそれぞれどのように導入され、定着していったのかに焦点を当て、文献調査を中心に比較教育史的視点から研究を進めた。研究の結果、1.セントルイスでは、管理と教授の効率性や経済性の高い等級制学校システムを導入し、等級制の大規模学級において一斉教授を効率よく進める必要から、School Tacticsを採用していたこと。2.セントルイスではSchool Tacticsの中に、生徒に「意見」や「批判」を問う指令や、生徒に互いに発問させ、回答させる指令を組み込み、生徒を授業に積極的に参加させる工夫が加えられていったこと。3.SchoolTacticsは、明治初期日本に「教場指令法」として移入され、平章学校(現山形県長井市立長井小学校)、土浦小学校、藤沢小学校などの等級制大規模学校において導入されたが、教師からの一方向的な号令だけが浸透し、教師中心の画一的な一斉授業を成り立たせる情報源となったこと。4.明治20年代の開智学校、開明学校などでは、学級制導入後も「教場指令法」が学校管理規則の一部としてさらに詳細に規定され、一斉授業場面において生徒の行動を一斉に統制し、訓育の役割も果たすようになっていたことを明らかにした。このうち、1.3.に関しては、平成14年6月の日本比較教育学会において「ミズーリ州セントルイス市における一斉教授法の成立過程」と題する研究成果の報告を行った。

School Tacticsは、明治初期日本に「教場指令法」として移入され、日本の「教場指令法」は、教師による号令中心の画一的、形式的な一斉教授法のありようを規定する情報源であり続けたことを指摘した。この他、昨年度と本年度の研究成果をまとめ、博士論文「明治前期おける一斉教授法の受容過程」の作成に従事した。
分子進化の中立仮説の統計的検定法に関する研究

分子レベルの進化機構として、分子進化の中立説は、種内変異と種間変異を統一的に説明する有力な仮説である。分子進化の中立説を帰無仮説として、種内変異のデータと種間変異のデータを用いた統計的検定法が、Hudson,Kreitman and AguadeとFu and Liにより考案されている。これらの方法では、集団が平衡状態にあること、集団に地理的構造が無いことを仮定している。しかし、現実の生物集団がこの仮定を満たしているとは、必ずしも限らない。そこで、集団が平衡状態にない場合と地理的構造がある場合に、これら2つの方法で中立仮説の統計的検定に用いられる統計量がどのような影響を受けるかについて、コンピュータ・シミュレーションを用いて研究を行った。コンピュータ・シミュレーションでは、中立モデルを仮定した。Island modelを用いて、集団構造がHudson,Kreitman and Aguadeの方法とFu and Liの方法で用いられる統計量に与える影響について調べた。どちらの方法についても、サンプリングが重要であるが、特に、Hudson,Kreitman and Aguadeの方法については、1つの遺伝子座については全集団からサンプルし、もう1つの遺伝子座についてはある1つの分集団からサンプルした場合に、中立仮説の棄却率が高くなる。集団のサイズが変化した場合場合について、Hudson,Kreitman and Aguadeの方法とFu and Liの方法で用いられる統計量がどのような影響について調べた。集団のサイズ変化が起こった時期が中立仮説の棄却率に大きく影響する。
宇宙における大規模運動の観測をめざしたマイクロカロリメータの開発

昨年度までに、単一ピクセルのTES(超伝導遷移端検出器)型カロリメータを用いて世界レベルの優れたエネルギー分解能達成できたので、今年度はさらに多素子化に向けてマッシュルーム形状の吸収体をつけた素子について性能評価を行った。その結果、精密な形状の吸収体形成に成功し、カロリメータとしての性能は吸収体の材質などに大きく影響を受けることがわかった。これらの結果を7月にイタリアで行われた第10回低温検出器国際学会(LTH-10)で発表を行い、論文として出版した。またTES感度の磁場依存性を調べることで、カロリメータ性能が超伝導臨界電流の大きさで制限されることを明らかにし、3月にフロリダで開催されたTES国際Workshopで発表を行った。カロリメータを冷却するための断熱消磁冷凍機(ADR)の開発も行っており、共同研究を行っている理化学研究所宇宙放射線研究室の三原によって設計・製作されたADRを整備・改良することにより、100mK以下で8μK程度の優れた精度で温度コントロールできるシステムを構築し、X線発生装置と組み合わせて動作させることに成功した。2005年度打ち上げ予定のX線天文衛星Astro-E2に搭載されるカロリメータ検出器XRSのNASAゴダード研究所での地上較正実験にも参加し、期待通りの優れたエネルギー分解能を発揮することを確認、ピクセルごとの性能の違いやエネルギー依存性などを調べた。これらのデータ解析用のコンピュータおよび、TESの製膜用にスパッタターゲット(チタンと金の2種類)を購入した。Chandra衛星の高分散回折格子を使った観測により、X線連星GX301-2の鉄輝線から初めてコンプトンショルダを分離し、投稿論文としてまとめた。本年度は、単一ピクセルのTES(超伝導遷移端検出器)型カロリメータを用いてエネルギー分解能を追求することに力点をおき、研究・開発を行った。共同研究を行っている早稲田大学理工学部庄子研究室およびセイコーインスツルメンツ(株)で製作したカロリメータ素子を数種類、東京都立大学の希釈冷凍機をもちいて冷却、X線照射をして評価を行った結果、現段階で18eV(@5.9keV)程度のエネルギー分解能を実現することができた。昨年までは99eVのエネルギー分解能が最高であり、1年間で着実な進展があったといえよう。また、多ピクセル化に関しても、世界で初めてスズめっきを利用して形成したX線吸収体をつけたカロリメータでX線の検出を行うなど今後の発展が期待できる。これらの研究開発に関しては、2001年の7月にアメリカ合衆国ウィスコンシン大学で行われたLow Temperature Detectorの第9回国際会議(通称LTD-9)において発表を行い、その内容は論文として出版されている。カロリメータの開発と併せて、それを冷却するための断熱消磁冷凍機(ADR)の開発も行っており、共同研究を行っている理化学研究所宇宙放射線研究室の三原によって設計・製作されたADRを整備・改良することにより、100mK以下までの冷却が行えることを確認した。また、特に「あすか」衛星の観測データを用いて、宇宙における大スケール構造に関して解析・研究を行い、将来的にカロリメータを用いて行える物理について検討した。また、解析の結果についても重要なものは投稿論文としてまとめられ出版されている。本年度は、単一ピクセルのTES(超伝導遷移端検出器)型カロリメータを用いてエネルギー分解能を追究することを力点におき、研究・開発を行った。

昨年までは99eVのエネルギー分解能が最高であり、1年間で着実な進展があったといえよう。また、多ピクセル化に関しても、世界で初めてスズめっきを利用して形成したX線吸収体をつけたカロリメータでX線の検出を行うなど今後の発展が期待できる。これらの研究開発に関しては、2001年の7月にアメリカ合衆国ウィスコンシン大学で行われたLow Temperature Detectorの第9回国際会議(通称LTD-9)において発表を行い、その内容は論文として出版されている。カロリメータの開発と併せて、それを冷却するための断熱消磁冷凍機(ADR)の開発も行っており、共同研究を行っている理化学研究所宇宙放射線研究室の三原によって設計・製作されたADRを整備・改良することにより、100mK以下までの冷却が行えることを確認した。また、特に「あすか」衛星の観測データを用いて、宇宙における大スケール構造に関して解析・研究を行い、将来的にカロリメータを用いて行える物理について検討した。また、解析の結果についても重要なものは投稿論文としてまとめられ出版されている。昨年度までに、単一ピクセルのTES(超伝導遷移端検出器)型カロリメータを用いて世界レベルの優れたエネルギー分解能達成できたので、今年度はさらに多素子化に向けてマッシュルーム形状の吸収体をつけた素子について性能評価を行った。その結果、精密な形状の吸収体形成に成功し、カロリメータとしての性能は吸収体の材質などに大きく影響を受けることがわかった。これらの結果を7月にイタリアで行われた第10回低温検出器国際学会(LTD-10)で発表を行い、論文として出版した。またTES感度の磁場依存性を調べることで、カロリメータ性能が超伝導臨界電流の大きさで制限されることを明らかにし、3月にフロリダで開催されたTES国際Workshopで発表を行った。カロリメータを冷却するための断熱消磁冷凍機(ADR)の開発も行っており、共同研究を行っている理化学研究所宇宙放射線研究室の三原によって設計・製作されたADRを整備・改良することにより、100mK以下で8μK程度の優れた精度で温度コントロールできるシステムを構築し、X線発生装置と組み合わせて動作させることに成功した。2005年度打ち上げ予定のX線天文衛星Astro-E2に搭載されるカロリメータ検出器XRSのNASAゴダード研究所での地上較正実験にも参加し、期待通りの優れたエネルギー分解能を発揮することを確認、ピクセルごとの性能の違いやエネルギー依存性などを調べた。これらのデータ解析用のコンピュータおよび、TESの製膜用にスパッタターゲット(チタンと金の2種類)を購入した。Chandra衛星の高分散回折格子を使った観測により、X線連星GX301-2の鉄輝線から初めてコンプトンショルダを分離し、投稿論文としてまとめた。
16SrRNA特異領域を利用した遺伝子組換えルーメン細菌の追跡

本研究は新たに開発した競合PCRによる特定ルーメン菌のDNA定量法を利用することで、ルーメンへ移植した遺伝子組み換え菌の精度高い追跡をはかろうとするものである。以下のような成果が得られた。1.組み換え用ホスト菌株の16SrRNA遺伝子の特異領域を利用して、定量性の高い競合PCR系を確立した。定量下限は100-200菌細胞であった。2. in vitro培養実験によると、新鮮ルーメン液に移植された組み換え体は、生菌数で追うと3時間以降急減するが、DNAで追うとやはり急減するものの少し減少が遅れる傾向があった。これは死菌由来のDNAも定量してしまうためと思われた。ルーメン混合菌のみの培養液に組み換え体を移植した場合、生菌数はやはり低下したが、DNAで追うと48時間目でも移植直後と同じレベルの組み換え体DNAが定量された。このことは、飼料粒子やプロトゾアを含まない洗浄ルーメン菌液中では死滅した組み換え体およびそのDNAの分解が極めて緩慢なことを示している。3.次に実際のヒツジのルーメン内へ大量の組み換え体を移植し、その経時的追跡を試みた(in vivo実験)ところ、組み換え体は、移植後急激にルーメン内密度を減らした。生菌数で追うと72時間目まで計数可能であったが、144時間目以降は検出できなくなった。競合PCR法でも、標的DNA領域の定量値の経時変化はほぼ同様であった。4.以上のことから、競合PCRによるDNAレベルでの組み換え体追跡は、実際のルーメン内でも十分に応用可能であり、死菌由来のDNAは迅速に分解されるため、大きな誤差要因にはならないことが示唆された。一方、組み換え体のルーメン内高密度定着には強い制限要因があり、今後それらを明らかにしていく必要があると思われた。本研究は新たに開発した競合PCRによる特定ルーメン菌のDNA定量法を利用することで、ルーメンへ移植された遺伝子組み換え菌のより精度の高い追跡をはかろうとするものである。平成9年度の研究成果は以下のとおりである。1.標的とする組み換え体の16SrDNA特定領域とホモロガスなものをもつ近縁菌株を有しないルーメン液供与ヒツジを選抜できた。このヒツジのルーメン液を使用し、そこへ移植した組み換え体の高精度な追跡が可能となった。2.in vitro培養実験によると、新鮮ルーメン液に移植された組み換え体は、生菌数で追うと3時間以降急減するが、DNAで追うとやはり急減するものの少し減少が遅れる傾向があった。ルーメン混合菌のみの培養液に組み換え体を移植した場合、生菌数は48時間で10^6/mlから10^3/mlのレベルへ低下したが、DNAで追うと48時間目でも移植直後と同じレベルの組み換え体DNAが定量された。このことは、ルーメン混合菌の培養液(飼料粒子やプロトゾアを含まない)では死滅した組み換え体およびそのDNAの分解が極めて緩慢なことを示している。3.以上のことから、競合PCRによるDNAレベルでの組み換え体追跡には実際のルーメン液中でも十分に応用可能だが、菌体分解やDNase活性の強い条件下でのみ適応可能なことが明らかになった。平成10年度の研究成果は以下のとおりである。

1.標的とする組み換え体の16SrDNA特定領域とホモロガスなものをもつ近縁ルーメン菌株を有しないヒツジを選抜し、このヒツジのルーメン内へ大量の組み換え体(×10^<12>細胞相当)を移植した。その後、組み換え体の経時的追跡を試みた。なお追跡には、高濃度の抗生物質を含有する選択培地による培養計数法と、本研究で新たに開発した競合PCR法(非培養法)を併用した。2.ヒツジルーメン内に移植された組み換え体は、移植後急激にルーメン内密度を減らした(×10^7/mlが24時間で×10^2/mlへ低下)。生菌数(培養法)で追うと72時間目まで計数可能であったが、144時間目以降は検出できなくなった。非培養の競合PCR法でも、標的DNA領域の定量値はほぼ同様の推移を示した。3.以上のことから、競合PCRによるDNAレベルでの組み換え体追跡は、実際のルーメン内でも十分に応用可能であり、死菌由来のDNAは迅速に分解されるため、誤差要因にはならないことが示唆された。一方、組み換え体のルーメン内高密度定着には強い制限要因があり、それらを明らかにしていく必要があると思われる。
走化性因子受容体の新たな制御因子の機能とその免疫系における役割

申請者はCOMMD8が同じタンパクファミリーに属するCOMMD3と会合し、COMMD3/8複合体を形成することを見出した。COMMD3およびCOMMD8は互いの非存在下ではユビキチン化が亢進し、プロテアソームを介して分解されることから、COMMD3/8複合体の安定性が両タンパク間の会合に依存することが分かった。また、COMMD3/8複合体は液性免疫応答に重要な複数の走化性因子受容体の正の制御因子であることが分かった。GPCRのC末端領域は複数のGRKによってそれぞれ異なる部位がリン酸化され、その部位に応じて下流のシグナル伝達のアウトカムが決定する。COMMD3/8複合体によるGPCRシグナル伝達の制御メカニズムを検討したところ、COMMD3/8複合体はGPCRに会合し、特定のGRKをGPCRに動員するアダプター分子として機能して、細胞遊走を促進することが明らかになった。さらに、B細胞を介した免疫応答におけるCOMMD3/8複合体の役割を検討したところ、B細胞特異的にCOMMD3/8複合体を欠損するマウスでは、免疫後の抗体価産生が低下し、これに伴って抗原特異的胚中心B細胞および形質芽細胞の産生も減少することが分かった。以上のことから、COMMD3およびCOMMD8が液性免疫応答に重要であることが明らかになった。走化性因子受容体の新たなシグナル伝達制御機構を解明する過程で、我々は走化性因子受容体に会合する機能未知のタンパクXを同定した。本研究の目的は、タンパクXの走化性因子受容体のシグナル伝達、およびB細胞を介した免疫応答における役割を明らかにすることである。これまでに我々は、タンパクXを欠損するB細胞においてCXCR4をはじめとする複数のケモカイン受容体の反応性が低下することを見出している。我々はCXCR4をモデルとしてタンパクXの作用機序を解析した。CXCR4のC末端領域はG protein-coupled receptor kinase(GRK)ファミリーに属するGRK2とGRK6によってそれぞれ異なる部位がリン酸化される。タンパクXはGRK6と会合し、GRK6によるCXCR4のリン酸化を促進することが明らかになった。一方で、GRK2によるリン酸化へのタンパクXの関与は認められなかった。また、GRK6の下流のシグナル伝達分子であるERK1/2およびp38の活性化がタンパクXを欠損することにより減少した。以上のことから、タンパクXがGRK6によるCXCR4のリン酸化を促進することで下流のシグナル伝達分子が活性化し、細胞遊走が亢進すると考えられる。B細胞特異的にタンパクXを欠損するマウスをモデル抗原で免疫したところ、抗原特異的な血清抗体価が野生型マウスに比べて大きく減少した。このことから、タンパクXはB細胞の免疫応答に重要であることが分かった。これまでの研究において、タンパクXがGRK6によるCXCR4のリン酸化を促進することで、下流のシグナル伝達分子が活性化することが明らかになった。また、タンパクXはB細胞の免疫応答に重要であることが確かめられた。以上のことから、走化性因子受容体のシグナル伝達機構についての解析、およびB細胞を介した免疫応答についての解析ともに、おおむね順調に進展していると言える。GPCRである走化性因子受容体の新たなシグナル伝達制御機構を解明する過程で、我々は走化性因子受容体に会合する機能未知のタンパクXを同定した。これまでに我々は、走化性因子受容体CXCR4をモデルとした解析を行い、タンパクXはGRK6をCXCR4へ動員するアダプター分子として機能し、GRK6によるリン酸化を誘導して、b-arrestin2を介したMAPKの活性化と細胞遊走を促進することを明らかにした。続いて我々は、CXCR4以外の走化性因子受容体についてタンパクXの役割を解析することにした。その結果、CXCR4と同様にオキシステロール受容体であるEBI2のシグナル伝達においても、タンパクXが受容体へのb-arrestin2の動員とMAPKの活性化を促進することが分かった。さらに、走化性因子受容体以外のGPCRへのタンパクXの関与を検討するため、b2アドレナリン受容体のシグナル伝達におけるタンパクXの役割を解析した。その結果、タンパクXはGRK6によるb2アドレナリン受容体のリン酸化とb2アドレナリン受容体へのb-arrestin2の動員を促進することが分かった。以上のことから、タンパクXが複数のGPCRのシグナル伝達において、特定のGRKをGPCRに動員するアダプター分子として機能すること明らかになった。これまでに我々は、B細胞特異的にタンパクXを欠損するマウスでは、抗原特異的な血清抗体価が野生型マウスに比べて大きく減少することを見出している。さらに、B細胞特異的にタンパクXを欠損するマウスの解析を進めたところ、同マウスにおいて抗原特異的胚中心B細胞および形質芽細胞の産生も低下することが分かった。これまでの研究から、タンパクXがCXCR4以外のGPCRのシグナル伝達においても、特定のGRKをGPCRに動員するアダプター分子として機能することが明らかになった。また、タンパクXが抗原特異的胚中心B細胞および形質芽細胞の産生に重要であることが分かった。

申請者はCOMMD8が同じタンパクファミリーに属するCOMMD3と会合し、COMMD3/8複合体を形成することを見出した。COMMD3およびCOMMD8は互いの非存在下ではユビキチン化が亢進し、プロテアソームを介して分解されることから、COMMD3/8複合体の安定性が両タンパク間の会合に依存することが分かった。また、COMMD3/8複合体は液性免疫応答に重要な複数の走化性因子受容体の正の制御因子であることが分かった。GPCRのC末端領域は複数のGRKによってそれぞれ異なる部位がリン酸化され、その部位に応じて下流のシグナル伝達のアウトカムが決定する。COMMD3/8複合体によるGPCRシグナル伝達の制御メカニズムを検討したところ、COMMD3/8複合体はGPCRに会合し、特定のGRKをGPCRに動員するアダプター分子として機能して、細胞遊走を促進することが明らかになった。さらに、B細胞を介した免疫応答におけるCOMMD3/8複合体の役割を検討したところ、B細胞特異的にCOMMD3/8複合体を欠損するマウスでは、免疫後の抗体価産生が低下し、これに伴って抗原特異的胚中心B細胞および形質芽細胞の産生も減少することが分かった。以上のことから、COMMD3およびCOMMD8が液性免疫応答に重要であることが明らかになった。タンパクXが欠損するB細胞では、CXCR4の他にもCCR7やCXCR5の反応性が低下することが分かっている。そこでCXCR4以外の走化性因子受容体についてもGRK6に着目した解析を行い、走化性因子受容体のシグナル伝達制御におけるタンパクXの役割を一般化する。また、新規分子のB細胞を介した免疫応答における役割を解明するために、胚中心B細胞の数や形質細胞の数を調べるなど、B細胞特異的にタンパクXを欠損するマウスの解析をより詳細に行う。走化性因子受容体のシグナル伝達におけるタンパクXの機能を解析する過程で、タンパクXに会合する分子を探索したところ、我々は新たに機能未知のタンパクYを同定した。そこで今後は、タンパクYがタンパクXの機能にどのように関与するか検討する。CXCR5、CCR7およびEBI2はB細胞を介した免疫応答の誘導に重要な役割を果たし、タンパクXを欠損するB細胞ではこれらの走化性因子受容体の反応性が低下する。そこで、モデル抗原でマウスを免疫し、免疫したマウスの脾臓やリンパ節におけるタンパクX欠損B細胞の局在が、野生型B細胞の局在とどのように異なるか検討して、より詳細にB細胞を介した免疫応答におけるタンパクXの機能を解析する。当初の計画では、BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer)を用いた実験を行い、タンパクXが走化性因子受容体のシグナル伝達にどのように関わっているか検討する予定であった。しかし、BRET測定用のプレートリーダーの納入が遅れたため、年内に購入するBRET測定用試薬が少なかったため。タンパクXのCXCR4以外の走化性因子受容体におけるシグナル伝達制御機構の役割を明らかにするために、BRETを用いたアッセイを利用して、より幅広い解析を行う予定である。その際に必要な実験試薬の購入に繰越金を用いる。