hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腔腸動物から見た原始神経系の形成-機能と進化

本研究ではもっとも原始的であると考えられる刺胞動物ヒドラの神経系形成を解析し、神経系進化を考察することを目的とした。その結果以下の成果を得た。(1)ヒドラの神経系は神経ペプチド遺伝子の発現パターン解析からいくつもの小集団に分かれ、それらの小集団のいくつかは体軸に沿って顕著な区画を形成することを明らかにした。神経ペプチドHym-176を特異的に発現する神経集団は足部で区画を形成するが、その形成には2つの機構を併用していることが分かった。即ち、前駆体からの新たな分化と区画直上の他の区画の神経からの形質転換(phenotypic conversion)である。(2)区画の生成には位置情報が関わると結論した。位置情報を変化させることが知られている薬剤、alsterpaullone(ALP)とLiCl(ともにwntシグナルの一員であるGSK3βの阻害剤であることが知られている)処理個体で神経区画の著しい変化が見られた。このことから、ヒドラ神経の区画化には少なくともwntシグナル系が関与していると考えられる。(3)ヒドラ神経ペプチド遺伝子のプロモーターにドライブされたGFPを発現するトランスジェニックヒドラをはじめて作成した。このヒドラをALP処理すると、期待通り神経区画の変化がin vivoで見られた。(4)新規神経ペプチド及びその遺伝子の同定。ヒドラペプチドプロジェクトで得た2つのペプチドをコードする遺伝子を同定し、その発現が神経の小集団に限定されることを見出した。また、TOF-mass分析から2つの神経ペプチドともC-末端がアミド化されていることが分かり、それぞれFRamide A,FRamide Bと命名。前者はヒドラの外胚葉上皮筋を、後者は内胚葉上皮筋をそれぞれ収縮させる活性を示した。更に、RFamideをC-末端にもつ新たな神経ペプチド遺伝子を同定した。(1)ヒドラペプチド及びペプチド遺伝子の同定と発現解析(藤澤):現在進行中のペプチドプロジェクトとESTプロジェクトの併用で、新規神経ペプチド、Hym-65を同定し、且つその遺伝子をも同定した。この遺伝子には今ひとつのアミド化ペプチドがコードされていると推定された。発現は体中をほぼ均一に存在する神経小集団で見られた。Hym-65ペプチドは上皮ヒドラ(内外両上皮筋肉細胞のみからなるヒドラ)の体幹を収縮させることから神経-筋接合部位で作用する神経伝達物質と考えられた。(2)(2)神経小集団のコンパートメント維持機構の解析(藤澤):今年度はヒドラ足柄下半部に極在する神経ペプチドHym-176を発現する神経小集団の維持を抗BrdU/Hym-176遺伝子in situ hybridizationダブル染色法で調べた。その結果、Hym-176^+神経集団はすべて神経前駆体細胞からの分化で維持されており、既存の神経の分化転換はなかった。(3)コンパートメントとその中の神経機能との関係(清水):Hym-176を発現する細胞集団がなぜ足柄下半部に局在する必然性があるのかを、Hym-176ペプチドの機能を見ることで推察した。Hym-176は高濃度(10^<-5>M)で上皮ヒドラの体幹を著しく収縮させるが、10^<-6>Mでは足柄部のみの収縮を惹起した。このことからコンパートメントの機能は局部的に働く神経ペプチドを局在させるものであると結論した。(4)進行中の網羅的ペプチド同定を引き続き行い、約100個のペプチドを単離し、構造決定した。また、米国のカリフォルニア大学アーヴァイン校のBode教授と共同研究でヒドラ初期胚のcDNAライブラリー作製に協力した。ヒドラの神経系は単純な網目状構造であると考えられてきた。

しかし、最近の神経ペプチド遺伝子の発現解析からヒドラ神経系は多くの細胞小集団からなり、いくつかの小集団は体軸に沿って顕著な区画を形成することが分かった。本年度は以下の成果を得た。(1)ヒドラESTデータベースを利用し、ペプチドをコードする遺伝子を探索し、新規遺伝子1種を同定した。2種のペプチドをコードすると考えられ、神経細胞で特異的に発現することから、神経ペプチド遺伝子であると結論した。発現はヒドラ体幹全体で発現するがその数から見て一部の集団で発現すると考えられる。(2)足部で区画を形成する神経ペプチドHym-176の遺伝子およびその同族体遺伝子の発現解析から、Hym-176の区画は上下2つからなり、上部神経はHym-176およびHy176様遺伝子2種を発現し、それらは神経前駆体細胞からの新規分化すること、下部の神経はHy176様遺伝子の発現を失うことによりHym-176遺伝子のみを発現する集団からなることが明らかとなった。(3)区画の意義は特定の神経集団すなわちそれらが分泌する神経ペプチオをその領域に局在化することでその神経の局所的機能を実現させると考えた。足部のHym-176発現神経の区画は神経ペプチドHym-176を分泌するが、Hym-176は特異的に足部外胚葉筋の収縮を惹起した。このことから予想した区画の意義が証明された。ヒドラの神経系は神経ペプチド遺伝子の発現パターン解析からいくつもの小集団に分かれ、それらの小集団のいくつかは体軸に沿って顕著な区画を形成することを明らかにしてきた。(1)新規神経ペプチド及びその遺伝子の同定。ヒドラペプチドプロジェクトで新たに配列決定したものの中に、Hym-65ペプチド遺伝子中にコードされているものを見出し、C-末端構造からHym-65をFRamide A,新規ペプチドをFRamide Bと命名。前者はヒドラの外胚葉上皮筋を、後者は内胚葉上皮筋をそれぞれ収縮させる活性を示した。更に、RFamideをC-末端にもつ新たな神経ペプチド遺伝子を同定した。(2)神経ペプチドHym-176を特異的に発現する神経集団は足部で区画を形成することは既に報告したが、その形成には2つの機構を併用していることが明らかになってきた。成長期の若い固体ではこの区画内のHym-176+神経はその大部分が前駆体からの分化で補われていると報告してきたが、成熟固体では新たな分化だけではなく、区画直上の他の区画の神経からの形質転換(phenotypic conversion)でも補われることが分かった。昨年報告したように、Hym-176+神経の区画上半部から下半部への移行は形質転換を伴うことから、この機構も区画生成、維持に重要な働きを持つことが明らかとなった。(3)区画の生成には位置情報が関わると予測されたので、位置情報を変化させることが知られている薬剤をもちいて区画の変化を調べた。用いた薬剤はalsterpaullone (ALP)とLiCl,ともにwntシグナルの一員であるGSK3βの阻害剤であることが知られている。
ミオトニー症候群-Naチャネル病と筋強直性ジストロフィー症-の病態解明

ミオトニー症候群(骨格筋Naチャネル病および筋強直性ジストロフィー)の病態解明を行った。骨格筋Naチャネル病については、本邦の新規変異の機能解析を電気生理学的に行い、シミュレーションにて病態を明らかにした。また世界で初めて、イントロン領域の変異によるミオトニーを同定し、分子病態を解明したことも特筆される。mRNA病であると近年仮説されている筋強直性ジストロフィーについては、不整脈と関与する可能性のあるイオンチャネルのスプライシングの異常を心臓で見出すことができた。本研究はミオトニー症候群、とくに骨格筋Naチャネル病(先天性パラミオトニー、高カリウム性周期性四肢麻痺など)および筋強直性ジストロフィー症の病態を細胞・組織レベルで理解し、治療研究へ結びつけることを目的としている。本年度は首都大学および鹿児島大学の症例で見いだされた骨格筋Naチャネル病の新規変異Q1633EおよびP1158L変異について培養細胞を用いたパッチクランプ法にてチャネルのゲーティング機能の解析を行った。また本研究の最終目標のひとつは骨格筋のin silicoモデルを確立することであるが、まず変異Naチャネルのコンピューターシミュレーションを行なうためHodgkin-Huxleyモデルを主体にしたモデルをプログラミングした。上述のチャネル解析の実験データを使いモデルの検証を行い、病態を再現できることを確認した。いっぽう、筋強直性ジストロフィーにおけるチャネル発現・機能の解析も行い、まずモデルマウスを用いてカルシウム依存性カリウムチャネルの一種であるSKチャネルについて主に解析した。SK3チャネルmRNAの発現量やタンパク量を検討したところ、SK3チャネルmRNAが軽度増加していた。さらにこれまで骨格筋では注目されていなかったSK2チャネルについても解析を進めたところ、新たなスプライス変異体を同定することができた。この変異体チャネルの生理的意義などについてはまだ不明である。ミオトニー症状を増悪させる薬剤をモデルマウスに投与し組織を採取し、骨格筋組織内の種々のタンパクやそれらのmRNA発現量の変化を検討しているところである。計画にはなかったものの、本年度の特筆すべき成果は、世界で初めてイントロン領域の遺伝子変異によるミオトニーの症例を同定しえたことである。遺伝子異常の発見にとどまらず、生検筋mRNAの解析を行いスプライシング異常が生じること見出し、さらにスプライシング変異体チャネルの培養細胞を用いた発現・機能解析実験を行い、チャネルが実際に発現機能すること、また症状を説明しうる速い不活性化の異常を示すことまで明らかにした。さらに昨年度構築したHodgkin-Huxleyモデルを主体にしたプログラムでシミュレーションを行い、病態を再現できることを確認し、病態の全容を解明した。なお、変異が存在するイントロンはスプライシング制御機構がまだ未解明なAT-ACIIイントロンと呼ばれる特殊なイントロンであることから、スプライシング異常の分子メカニズムの解析を行い、AT-ACIIイントロンのスプライシング制御機構を解明しようと海外との共同研究を開始している。いっぽうで予定した計画も確実に進めている。コンピューターシミュレーションは、種々の実験データを適用し妥当性の検討を行うとともに、骨格筋のユニークな細胞膜構造であるT管の機能についてのシミュレーション研究も行った。筋強直性ジストロフィーにおけるチャネル発現・機能の解析も引き続き行い、昨年度見出したカルシウム依存性カリウムチャネルの一種であるSK2チャネルの新たなスプライシング変異についてもマウスでの解析を進め、正常マウスでも網膜・脳などに豊富に認められることなどを明らかにすることができた。本研究はミオトニー症候群、とくに骨格筋Naチャネル病(先天性パラミオトニー、高カリウム性周期性四肢麻痺など)および筋強直性ジストロフィー症の病態を分子・細胞レベルで解析し、シミュレーションなどを用いて組織レベルでの理解を行い、治療研究へ結びつけることを目的としている。まず、骨格筋Naチャネル病については、昨年同定した世界で初めてのイントロン領域の遺伝子変異によるミオトニーの症例について解析を行った。変異が存在するイントロンはスプライジング制御機構がまだ未解明なAT-ACIIイントロンと呼ばれる特殊なイントロンであることから、ミニジーンを用いた解析を海外との共同研究で行った。その結果、この変異はU1snRNPに加え、U6 snRNPの5'スプライス部位へのmRNA結合に異常をきたすことが判明し、両者がAT-ACIIイントロンの5'のスプライス部位の認識・決定に重要であることが明らかとなった。いっぽう筋強直性ジストロフィーは全身疾患であり、心伝導障害を中心とした不整脈を合併し、突然死にも関与している可能性が報告されている。計画にはなかったが本症の剖検心筋を入手できたため、mRNAのスプライシング異常を検討したところ、不整脈と密接に関連する可能性のあるイオンチャネルのmRNAスプライシングの異常を見出すことができた。さらにこの異常チャネルの電気生理学的機能解析の結果をコンピューターシミュレーションで検討し、実際に不整脈と関連する可能性が明らかになっている。
がん細胞のM期染色体分配制御異常発生機構に関する研究

M期進行制御の鍵カイネース群AIM/auroraファミリーの主要カイネースであるAIM-1は、我々が独自に発見した動物細胞におけるM期セリン・スレオニン型Aカイネースのサブファミリーで、そのメンバーの主要なカイネースであり、酵母Ipl1の機能的なホモローグであると考えられている。動物細胞で少なくとも3種類存在するこのクラスのカイネースの内、AIM-1はがん細胞で高発現が広く認められており、この高発現が、発がん過程での染色体量衡異常招来の要であろうと我々は考えている。すでに、我々は、AIM-1の過剰発現が、細胞の染色体量衡変化を招来すること、また、その結果として、細胞がん化を誘導し、AIM-1の過剰発現と相関して、がんの悪性化形質が増強されることを見出している。そこで、AIM-1過剰発現がM期進行制御に異常をもたらす機構を解析するために、その主要な基質であるH3ヒストンのリン酸化状態を解析した。その結果、M期特異的なH3ヒストン(Ser10)の過剰リン酸化がAIM-1発現量に依存して、強制発現細胞株ならびにがん細胞で認められた。また、Ser10をGlu10に置換した恒常的なリン酸化型H3ヒストンS10E変異体を強制発現したところ、AIM-1過剰発現で観察されるような染色体分配の異常が誘導された。すなわち、AIM-1過剰発現は、H3ヒストンのアンバランスなリン酸化を誘起し、染色体分配の異常を招来するものと考えられた。また、AIM-1のH3ヒストンへのターゲッティングには、INCENPのAIM-1によるリン酸化が必要であることも、同時に見出している。また、更には、SurvivinがAIM-1/INCENPの機能に深くかかわっていることも見出しつつあり、動物細胞のM期染色体分配と細胞質分離双方の進行制御機構の要となる分子群であることが明らかとなりつつある。
無細胞合成系によるフッ素１８新規ポジトロン標識蛋白質の開発

まずinterleukin-8 (IL-8)に含まれるプロリンを非標識フルオロプロリンへと置換した[非標識F]IL-8の合成と評価を行った。その結果、純度の高い[非標識F]IL-8が十分量得られることが明らかとなった。またこの蛋白質のIL-8受容体への結合能は保たれていることを確認した。次に[18F]プロリンの合成に取り組み、問題なく合成できることを確認した。この[18F]プロリンを用いてIL-8の合成を行い、更に精製を行ったところ、放射化学純度が91%の[18F]IL-8が短時間で合成可能であることを明らかにできた。平成24年度に引き続き、無細胞蛋白質合成系を用いてインターロイキン8(IL-8)の合成を行った。平成25年度はポジトロン標識した[18F]IL-8の合成について検討した。従来の報告に従い[18F]プロリンを合成したところ、放射化学収率が30%で、問題なく[18F]プロリンを合成することができた。この[18F]プロリンを用いてIL-8の合成を行った。30分から120分まで反応時間を振って、合成量について検討したところ、時間依存的に[18F]IL-8が合成できることが明らかとなった。更にこの反応で得られた蛋白質溶液に対してイオン交換カラムを用いた精製を行い、極めて短時間でかつ夾雑物の少ない[18F]IL-8が精製可能であることを確認した。また得られた蛋白質は放射化学純度が91%であり、イメージングを実施するにあたり、十分な放射化学純度の[18F]IL-8が得られることが明らかとなった。次に、この[18F]IL-8を野生型マウスに投与し、PETイメージングを行った。体内動態を観察したところ、尿路系以外への特定の臓器に対する集積は認められなかった。CHO細胞にIL-8受容体を安定発現させた細胞を作製した。この細胞をnudeマウスへ移植したところ、CHO細胞の増殖が認められ、PETイメージングを行うための準備を整えることができた。今後、更にこの研究を発展させ、無細胞蛋白質合成法を用いたPETプローブ開発の基礎技術を確立していきたいと考えている。まずinterleukin-8(IL-8)に含まれるプロリンを非標識フルオロプロリンへと置換した[非標識F]IL-8の合成と評価を行った。再構成無細胞蛋白質合成反応液に含まれるプロリンを全て非標識フルオロプロリンへと置換した反応液を準備し、[非標識F]IL-8の合成を行った。この反応液をイオン交換クロマトグラフィーで精製して、収量および純度についてゲル電気泳動およびCBB染色・ウェスタンブロット法を用いて検討した。更にIL-8受容体への結合能がプロリンがフルオロプロリンに置換されたことにより変化するかどうかについて、[125I]IL-8を用いた競合阻害実験を行い評価した。そして、[非標識F]IL-8は通常のIL-8と同様の結合能を示すことを明らかにした。この後、[18F]プロリンを合成して実験を行う予定にしていたが、東北大学サイクロトロンRIセンターが修繕のため使用できない時期と重なってしまい、実験を十分に行うことができなかった。そのため平成25年度の予定していた抗HER2抗体の合成と評価を前倒しで進めることとした。これまでに、HER2に対する一本鎖抗体のcDNAを含むプラスミドを作製し、大腸菌にて抗HER2抗体を作製できることを確認した。またHER2を高発現したCHO細胞株も既に得ている。今後、再構成無細胞蛋白質合成法を用いて、プロリンをフルオロプロリンへと置換した[非標識F]抗HER2抗体を作製する準備を進めている。[非標識F]IL-8を問題なく合成することができ、またこの蛋白質の結合能についても確認をすませている。[18F]プロリンを用いた実験を行うことができなかったが、平成25年度に行う予定であったHER2の実験を前倒しで進めており、総合的に考えておおむね順調に進展していると考えている。平成25年度は東北大学サイクロトロンRIセンターを問題なく使用できる予定となっているので、[18F]プロリンを用いた[18F]IL-8の合成と評価を行うことができると考えている。また[18F}抗HER2抗体の合成と評価も併せて進めていく。該当無し
ペルシア語文化圏の成立と展開に関する総合的研究

1979年のイランにおけるイスラム革命の勃発と共に我が国ではイランについての関心が急速に高まり,東洋文庫をはじめとする図書館,研究所,大学等に大量のペルシア語文献が蒐集され,さらに,世界最初のペルシア語文献ユニオンカタログ(所在総目録)が編纂,出版されるに及び,ペルシア語原典資料からの研究が可能となった.イランを中心に,小アジア・中央アジア・西北インド・中国等・世界各地に成立,展開したペルシア語文化圏それぞれの共通点・相違点を明確にし,イスラム文化におけるペルシア文化の特質を解明していこうとする本研究もこうした一連の流れの中で企画され,実現したものであった.ペルシア語文化圏の「成立班」,「展開班」はそれぞれ小グループに分れ,各自の専門分野の代表的なペルシア語文献である『集史』,『五族譜』,『高貴系譜』,『学習の基礎』,『旋律の意図』等の中から,基本的重要事項と術語とを抜き出して整理し,これらの比較,検討を重ねた.可能なかぎり,本源資料である写本資料にまで溯って作業を進めたが,作業の過程で,あるいは研究成果の比較・検討の過程で,ペルシア語刊本と写本との字句の相違が当初の予想をはるかに上回る極めて著しいものであることが確認され,ペルシア語文化圏の諸地域を考察するにあたっては,ペルシア語写本資料の精査が不可欠であること,及び写本資料による研究体制確立が急務であることが痛感された.本研究においては,ペルシア語文化圏の貴重な成果を端的に示している『五族譜』その他諸写本の校訂を行い,これら写本資料を利用した多くの研究成果を挙げてきたが,本研究により,我が国におけるペルシア語写本資料による組織的研究の第一歩を踏み出すと共に,ペルシア語文化圏の諸問題解明についての第一歩を大きく踏み出すことができたと自負している.1979年のイランにおけるイスラム革命の勃発と共に我が国ではイランについての関心が急速に高まり,東洋文庫をはじめとする図書館,研究所,大学等に大量のペルシア語文献が蒐集され,さらに,世界最初のペルシア語文献ユニオンカタログ(所在総目録)が編纂,出版されるに及び,ペルシア語原典資料からの研究が可能となった.イランを中心に,小アジア・中央アジア・西北インド・中国等・世界各地に成立,展開したペルシア語文化圏それぞれの共通点・相違点を明確にし,イスラム文化におけるペルシア文化の特質を解明していこうとする本研究もこうした一連の流れの中で企画され,実現したものであった.ペルシア語文化圏の「成立班」,「展開班」はそれぞれ小グループに分れ,各自の専門分野の代表的なペルシア語文献である『集史』,『五族譜』,『高貴系譜』,『学習の基礎』,『旋律の意図』等の中から,基本的重要事項と術語とを抜き出して整理し,これらの比較,検討を重ねた.可能なかぎり,本源資料である写本資料にまで溯って作業を進めたが,作業の過程で,あるいは研究成果の比較・検討の過程で,ペルシア語刊本と写本との字句の相違が当初の予想をはるかに上回る極めて著しいものであることが確認され,ペルシア語文化圏の諸地域を考察するにあたっては,ペルシア語写本資料の精査が不可欠であること,及び写本資料による研究体制確立が急務であることが痛感された.本研究においては,ペルシア語文化圏の貴重な成果を端的に示している『五族譜』その他諸写本の校訂を行い,これら写本資料を利用した多くの研究成果を挙げてきたが,本研究により,我が国におけるペルシア語写本資料による組織的研究の第一歩を踏み出すと共に,ペルシア語文化圏の諸問題解明についての第一歩を大きく踏み出すことができたと自負している.1979年、イランにおけるイスラム革命の勃発と共に我が国では東洋文庫をはじめとする研究所,大学,図書館等に大量のペルシア語文献が菟集され、これらのペルシア語文献は直ちに整理されて目録が刊行された。さらに、これらの目録を基礎に、世界最初のペルシア語文献ユニオンカタログ(所在総目録)が作成されるに至り、ペルシア語原資料を用いての研究気運が急速に高まった。イランを中心とするペルシア語文化圏各地の共通点、相違点を明確にし、イスラム文化におけるペルシア文化の特質を解明しようとする本研究もこのような一連の流れの中で企画され、実現したものである。本年度、研究代表者、及び各研究分担者は各自の専門分野の代表的ペルシア語文献の中から可能な限り写本を用いて基本的重要事項と術語を抜き出し、整理して翻訳する作業を行った。志茂(『貴顕系譜』),本田(『集史』,『五族譜』),岩見(『学習の基礎』),関(『旋律の意図』),その他,岡崎,縄田,小山,加藤,中村,堀川,井谷等は小グループの共同作業を重ね、作業の過程で予期しなかった多くの貴重な発見をし、刊本に比して写本がいかに重要であるかを再確認させられた。これらの作業を通じての成果は、我が国におけるペルシア語写本による諸研究を可能ならしめ、我が国のペルシア語文化圏研究を世界のレベルに到達せしめ、やがてはこれを凌駕する第一歩を踏み出すことを成功させたことといえる。ペルシア語文献の大量菟集とユニオンカタログの作成という基礎作業の成果が研究面で大きく結実しつつあることを痛感するが、ペルシア語写本目録やペルシア語写本マイクロフィルムの菟集、及びマイクロフィルムのプリント化等の重要案件はほとんど手がつけられていない状態であり、これらを、ペルシア語刊本菟集の充実と共に、早急に実現していかなければならない。
不安における認知バイアスメカニズムに関する研究

本研究は、不安において認められる認知情報処理過程の歪みが引き起こされるメカニズムを検討することを目的とした。不安時には、周囲の脅威情報に対して選択的に注意を向ける注意バイアスや、想起意識を伴わず過去に体験した脅威情報が想起される潜在記憶バイアスは認められるが、想起意識を伴い脅威的出来事を想起する顕在記憶バイアスは認められにくいことが報告されている(認知バイアスの偏在性)。本研究で提案するモデルでは、注意処理に対して処理資源が配分され、顕在記憶処理に割かれる処理資源が不足するため、注意バイアスが認められ、顕在記憶バイアスが認められにくくなると想定した。本年度は、注意バイアスの処理段階を特定するための実験と、注意バイアスと顕在記憶バイアスに必要とされる処理資源が競合するかどうかを検討する実験の2つを行った。注意バイアスの処理段階を特定するために行った実験の結果、反応時間の結果からも事象関連電位(ERP)の結果からも、不安時の注意バイアスが情報処理の初期に引き起こされる現象ではなく、比較的後期に引き起こされる現象であり、少なくとも呈示される刺激の内容を認識して初めて生じることがわかった。このことは注意バイアスが自動的な処理ではなく、その生起に処理資源を必要とする処理であることを示唆する結果であった。また注意バイアスと顕在記憶バイアスの処理資源が競合するかどうかを検討するために行った実験の結果、注意バイアス検討課題中に顕在記憶に多くの処理資源を必要とするような課題を行ったところ、注意バイアスが消失したことから、注意バイアスと顕在記憶バイアスの処理資源が競合することがわかった。なおこれら研究成果は、2002年5月に開催された感情心理学会(於:宇都宮大学)、2002年9月に開催された日本心理学会のワークショップ(於:広島大学)、そして2002年11月に開催された行動療法学会(於:東京大学)等の諸学会で発表した。また学位請求論文の一部として、その内容を広島大学大学院生物圏科学研究科に提出した。
Lie群の表現と等質空間上の調和解析

DをC^n内の既約有界対称領域とすると, Dは単純Lie群Gとその極大コンパクト部分群Kを用いて, D=G/Kと表わされる. GのDでの作用はDのC^nでの閉包D^^ーに連続的に拡張され, Dの階数をrとするとDの境界はr個のG軌道B_1,...,B_rの交わりのない和となり,しかもBi〓Bi_<+1>(i=1,...,r-1)でBrはDのSilov境界となっている.さらに各Biは境界成分と呼ばれる階数がr-iである一つの有界対称領域に正則同相なC^n内の複素部分多様体の交わりのない和となり,その分割はG同変的になっている.この研究では1.各境界Biにはその境界成分に関連した自然なG準不変測度が定まる.2.D上の正則関数または調和関数に対して各境界Bi上での積分で与えられる積分公式を得た. Lie群Gのユニタリ表現とも密接な関連があるが,その解明は,今後の課題である.DをC^n内の既約有界対称領域とすると, Dは単純Lie群Gとその極大コンパクト部分群Kを用いて, D=G/Kと表わされる. GのDでの作用はDのC^nでの閉包D^^ーに連続的に拡張され, Dの階数をrとするとDの境界はr個のG軌道B_1,...,B_rの交わりのない和となり,しかもBi〓Bi_<+1>(i=1,...,r-1)でBrはDのSilov境界となっている.さらに各Biは境界成分と呼ばれる階数がr-iである一つの有界対称領域に正則同相なC^n内の複素部分多様体の交わりのない和となり,その分割はG同変的になっている.この研究では1.各境界Biにはその境界成分に関連した自然なG準不変測度が定まる.2.D上の正則関数または調和関数に対して各境界Bi上での積分で与えられる積分公式を得た. Lie群Gのユニタリ表現とも密接な関連があるが,その解明は,今後の課題である.
高濃度塩水栽培が可能な培地と培地内における根の機能

塩水湛水栽培が成功するためには,培地の特徴として毛管上昇が起こりにくく,保水性が高い必要があり,培地内で根が生育するメカニズムは,湛水域に達した根がHydraulic liftにより情報の培地へ塩濃度の低い水を運搬し,培地上部に塩濃度が薄く根の生育しやすい領域ができるためであることを明らかにした.もみ殻培地を用い塩水湛水栽培を行ったコマツナは新葉を小さくして蒸散に対する水分損失を防ぎつつ,塩類を吸収し葉や葉柄に蓄積することで浸透圧を湛水養液の浸透圧よりも高くし,根からの塩水吸収を可能にしていることを解明した.まず,塩水湛水栽培が可能かどうかの調査において,水耕栽培や土壌培地に比べてもみ殻培地を用い,かつ,湛水面から培地表面までの距離が20cm以上ある場合にコマツナの生存率が高いことを明らかにした.この栽培法では3 %の塩濃度で湛水栽培しても生存可能であり,通常根腐れを起こすとして推奨されない湛水栽培が塩ストレス対策に有効だという点で実用上の価値が高い.続いて,塩水湛水栽培下では,コマツナは,葉の気孔を閉じることで新葉を小さくして蒸散などによる水分損失を防ぎつつ,塩類を吸収し葉や葉柄に蓄積することで浸透圧を湛水溶液の浸透圧よりも高くし,根からの塩水吸収を可能にすることが明らかになった.すなわち,塩水湛水栽培中に植物葉の水ポテンシャルが,湛水栽培に用いる塩水より高し変化し,培地-根への水の拡散ではなく,培地-根へのエネルギーを使った水のフローが暗示され,画期的な事象が見出された.根の役割分担を明らかにする調査では,培地底部を塩水に浸けた湛水栽培実験,毛管現象による培地内の水分上昇を排除した栽培実験を行った.その結果,コマツナの塩水湛水栽培においては,毛管上昇の起こりにくい培地を用いることにより,根系にかかる塩ストレスを軽減できることが示唆された.また,毛管現象を排除すると培地内の水分分布に勾配がみられ,根系自体にも水分を湿潤な場所から乾燥した場所へ輸送する働きがあることが確認された.すなわち,塩水湛水栽培をする際,培地としてもみ殻培地のような水分の毛管上昇が起こりにくい培地を選択することにより,根系にかかる塩ストレスや水ストレスを軽減できることが明らかになった.本結果は,これまで他の現象に隠されていた塩ストレスに対する植物応答のメカニズム,毛管現象を鍵とした土壌水分と根系の関係解明におけるブレークスルーに繋がる成果である.1.27年度に実施した研究成果:(1)塩水湛水栽培を行った葉の浸透ポテンシャル測定を行い,塩水区において豊浦砂でもみ殻培地区,粉砕もみ殻培地区より浸透圧が高いことを見出し,豊浦砂の根にはより塩ストレスがかかることを明らかにした.(2)塩水湛水栽培を行ったもみ殻培地,粉砕もみ殻培地,豊浦砂の水分特性曲線を求め,毛管上昇は豊浦砂で最も高く,もみ殻培地で最も低いこと,また,表面保水の能力は粉砕もみ殻で最も高く,豊浦砂で最も低いことを明らかにし,塩水湛水栽培に適した培地の土壌物理学的な条件を特定した.(3)塩水湛水栽培を行ったもみ殻培地,粉砕もみ殻培地,豊浦砂における根,含水率,ECの垂直分布を測定し,豊浦砂の根は培地下部にはほとんど分布していないが,もみ殻培地と粉砕もみ殻培地では培地下部まで根が発達していること,培地含水率,ECについては,豊浦砂は培地表面までほぼ一定であるが,もみ殻培地および粉砕もみ殻培地では培地底面から表面にかけて含水率が低下することを見出した.2.研究期間全体における研究成果:(1)塩水湛水栽培が成功するためには,培地の特徴として毛管上昇が起こりにくく,保水性が高い必要があり,培地内で根が生育するメカニズムは,湛水域に達した根がhydraulic liftにより上方の培地へ塩濃度の低い水を運搬し,培地上部に塩濃度が薄く根の生育しやすい領域ができるためであることを明らかにした.(2)もみ殻培地を用い塩水湛水栽培を行ったコマツナは新葉を小さくして蒸散による水分損失を防ぎつつ,塩類を吸収し葉や葉柄に集積することで浸透圧を湛水養液の浸透圧よりも高くし,根からの塩水吸収を可能にしていることを解明した.塩水湛水栽培が成功するためには,培地の特徴として毛管上昇が起こりにくく,保水性が高い必要があり,培地内で根が生育するメカニズムは,湛水域に達した根がHydraulic liftにより情報の培地へ塩濃度の低い水を運搬し,培地上部に塩濃度が薄く根の生育しやすい領域ができるためであることを明らかにした.もみ殻培地を用い塩水湛水栽培を行ったコマツナは新葉を小さくして蒸散に対する水分損失を防ぎつつ,塩類を吸収し葉や葉柄に蓄積することで浸透圧を湛水養液の浸透圧よりも高くし,根からの塩水吸収を可能にしていることを解明した.まず,塩水湛水栽培によってコマツナ葉の浸透圧が上昇し,根による吸水のドライビングフォースとなれるかを検証する課題については,コマツナ葉の水ポテンシャルが低下し,根が吸水するに十分な浸透圧となったことを明らかにし,当初目的を達成することができた.

「培地における毛管現象の起こりにくさ」が,高濃度塩水での湛水栽培を可能にするのか?の疑問を解く課題については,ポット中層に毛管現象が起きない空気層を置くことで根域を上部の非湛水域と下部の湛水域とに分ける方法(以下,半みず栽培法と呼ぶ)で,毛管上昇を削除した場合における水移動を調査し,毛管上昇により塩水が上昇しない層があることが塩水湛水栽培の成否に関わりが深いと推察され,課題の一部を達成し初年度として必要な知見を得た.塩水湛水栽培における植物の生存率と培地の水分・塩農度分布との関係を考察する課題は,研究実績の概要に記述したとおり達成することができた.塩水で湛水栽培した植物の根の形状を観察することで水中根や湿気中根の働きに相当する根が生じるか解明し,また,それらの機能について考察を行う課題は,栽培後における根系の写真を撮影し,培地下部と上部の形状の誓いについて観察を行い,来年度の調査にむけ一定の成果を得た.以上のことより,研究は当初の計画以上に推進していると自己評価する.農業環境・情報工学まず,各試験培地の毛管現象の程度は,培地の毛管力と相関がある水分保持曲線を求めて評価する.その上で,毛管現象の程度が異なる培地である,砂,もみ殻培地,粉砕もみ殻培地について,培地の水分および塩濃度マッピングを行い,毛管現象の程度と水分布および塩類集積の程度を調査する.NaCl 2%溶液およびNaCl 3%溶液,対照区として水でコマツナを湛水栽培する.NaCl溶液を与えてから3週間後に,培地を5つの水平な層に分割し,各区画の含水率および電気伝導度を測定しマッピングを行う.また,根の役割を明らかにするために,各層における根の分布を調査する.また,prit root法を改良し,植物の2つに分けられた根の片方を水耕栽培で,もう片方を培地栽培で育てる手法を確立する.試料植物は不定根が発生しやすく,比較的sprit root法に向いているトマトを用いる.sprit rootの方法はVierheiligらがキュウリに用いた方法をトマト用に調整して行う.
HTLV-1 bZIP factor による宿主機能撹乱メカニズムの解析

HTLV-1のゲノムにコードされているHBZタンパク質は、HTLV-1関連疾患の発症に関与していると示唆されている。本研究では、宿主細胞内におけるHBZの機能を明らかにすることを目的として、Cullin 1 (CUL1)とHBZとの関係性に着目した。CUL1はタンパク質のポリユビキチン化を担う酵素Cullin型E3ユビキチンリガーゼの1つであり、Skp1/CUL1/F-box (SCF)複合体の構築に関わる因子である。我々のグループはHBZと相互作用する宿主因子としてCUL1を得ていたことから、HBZおよびCUL1それぞれの結合領域を検討した。その結果、HBZとCUL1はhead-to-tailの形で結合していることが明らかになった。SCF複合体は多くのタンパク質分解に関与することが報告されている。よって、HBZはSCF複合体の基質の安定化に影響を及ぼすと予想し、アポトーシス制御因子であるmyeloid cell leukemia-1 (MCL1)タンパク質量を測定した。その結果、HBZを過剰発現させた細胞株ではMCL1タンパク質の安定化が認められた。実際に、HBZが発現しているHTLV-1感染細胞株ではHTLV-1非感染細胞株と比較してMCL1タンパク質量が優位に増加していた。通常、アポトーシスのシグナルを受けた細胞ではチトクロムcがミトコンドリアから細胞質へと放出されるが、MCL1はその放出を抑制することにより、抗アポトーシス効果をもたらす。しかし、HBZの存在下ではMCL1タンパク質量の増加を介してチトクロムc量の制御を担っていることを見出した。最後に、HBZによるSCF複合体の機能抑制は如何にして引き起こされるのか検討した。SCF複合体は、CUL1を足場としてRbx1タンパク質とSkp1タンパク質が結合している。そこで、共免疫沈降法によってこれらの結合に影響を及ぼすか否か解析した結果、HBZはCUL1とSkp1の結合を阻害することを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)は、成人T細胞白血病(ATL)の原因となるレトロウイルスである。これまでに、ATL患者由来のT細胞に例外なく発現するウイルス由来タンパク質としてHTLV-1 bZIP factor (HBZ)が同定されており、HBZこそがATL発症に必要不可欠な因子であると示唆されている。本年度は、HBZの宿主細胞内での生理機能を明らかにすることを目的として2つの因子に着目し、研究を行なった。以前、酵母ツーハイブリッド法によってHBZと相互作用する因子としてcullin型E3ユビキチンリガーゼ複合体の構成因子であるCullin 1 (CUL1)を同定した。共免疫沈降法により、HBZとCUL1はhead-to-tailの形で相互作用することを見いだした。また、HBZを細胞内に過剰発現させるとCUL1が基質とする種々の宿主細胞内因子のユビキチン化を顕著に抑制することが示唆された。これは、HBZがE3リガーゼ複合体因子の中でもアダプタータンパク質として機能するSkp1のリクルートを顕著に妨げることによるものであった。これまでにHBZと相互作用する宿主因子として脱アセチル化酵素histone deacetylase-6 (HDAC6)を得ている。共免疫沈降法の結果、HDAC6タンパク質中に2つ存在する触媒領域のうちC末端領域に近い部位でHBZとの結合が認められた。HBZ側に関しては今回データが得られなかったため今後詳細を検討する必要がある。今回、CUL1を介したHBZの機能解析に関しては計画通り進展しているが、HDAC6とHBZの機能解析が思うように進展しなかった。特に、HBZ側の結合領域が絞りこめなかったためその後の解析に支障が出た。

最後に、HBZによるSCF複合体の機能抑制は如何にして引き起こされるのか検討した。SCF複合体は、CUL1を足場としてRbx1タンパク質とSkp1タンパク質が結合している。そこで、共免疫沈降法によってこれらの結合に影響を及ぼすか否か解析した結果、HBZはCUL1とSkp1の結合を阻害することを明らかにした。CUL1により調節される因子として、アポトーシス、オートファジー、細胞周期などを制御するものがある。そこでHBZを発現させた場合、それらの機能に影響を及ぼすか解析する。また、動物細胞中に一過性にHBZを過剰発現させた場合では観察されたCUL1の基質タンパク質の安定化が、HTLV-1感染細胞中でも認められるか解析する。HDAC6とHBZの関係性についてはまず、HBZの様々な部位欠損変異体を作成し、結合領域を解析する。その後、HBZによるαーチューブリンのアセチル化亢進能がHDAC6の機能阻害によるものか否か、先ほどの変異体を用い解析を行なう。これまでに、我々のグループはHBZが細胞質に輸送されることを見いだしている。HDAC6は細胞質に存在する因子であることから、HBZの核外輸送がHDAC6との相互作用に重要であるか検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
都市公共交通に対する複数の需要喚起策の適切な組み合わせとその効果計測

都市公共交通という市民の資産を活かすためには、長期的かつ安定的な需要を確保する必要があり、時間軸を意識した需要喚起策が重要である。財政学の分野で発達した世代会計および世代勘定表は、長期にわたる事業の各時期における費用と便益をとりまとめることによって総合的に判断できる手法であり、各政策の組み合わせを評価することによって、適切な政策実施体系のための有効な情報を提供できる。本研究は、このような観点から、世代会計手法を援用した複数政策の長期的な効果計測の可能な評価モデルの構築を目的とした。本研究では、まず、自動車の保有をダミー変数として取り込んだ通勤交通機関選択モデルを作成し、一旦自動車を保有すると、たとえ鉄軌道のような公共交通機関が整備されても、公共交通機関への機関選択を行わない傾向が見られることを示し、都市公共交通の需要喚起に関して不可逆性があることを確認した。一方で、都市公共交通事業を評価できる世代会計および世代勘定表について、世代重複モデルを用いた理論的な整理を行った。これによって、この手法が示す数値が、真値と比較して税徴収による所得変化分と価格変化分だけ異なるものの、実用的には大きな差を与えないことを示した。その上で、いくつかの政策の組み合わせについて世代勘定表を作成し、同じ投資額の政策組み合わせであっても、各世代の生涯純便益の合計で示される総便益においても、また、世代間の公平性指標においても、必ずしも同じ結果を与えないことを示した。この手法により、適切な政策の組み合わせが存在することがわかった。ただし、税および債券をともに考慮した予算制約や政策財源のポートフォリオが、どのような影響を与えるかについては不明な点が多く、今後の課題として残った。地方中枢都市における地下鉄や新交通システムなどの都市公共交通機関の需要喚起策は,大きな効果をあげているとは言えない.その大きな要因の1つとして,各政策が独立に,かつ,できるところから行われている場合が多いため,全体の整合性がとれていないという点があげられる.施策実行には,適切な組み合わせと順序が必要である.それらが行われないことによって失われた便益が明確でないために,全体の整合性が保たれない政策実行が放置されていると考えられる.このような背景から,複数の施策に対する適切な組み合わせと順序を明確に評価でき,その効果を計測して明示できる手法の開発を,本研究の目的とした.本研究では,まず,都市公共交通の需要喚起策の総合性と不可逆性の整理を行った.一旦,自動車を保有,利用した主体が公共交通に転換しにくい点や,郊外の戸建て住宅に居住し始めた主体が集約的な需要を必要とする大量公共交通になじまず自動車利用に依存していく点をとりまとめた.その上で,これまで,研究者が開発してきた世代会計モデルをベースに,各世代別に当該事業によって享受できる便益と負担している費用の差である純便益を集計して,市民全体の便益を計算できる考え方を整理した.この都市交通基盤型世代会計モデルは,その評価段階での完全予見性を仮定しているものの,将来の毎年の損益計算書と貸借対照表を作成することから,逐年的な評価を可能にする.また,世代会計モデルから作られる世代勘定表は,単なる財務分析部分だけでなく,経済分析として得られる便益をも導入できるので,準動学的な便益計測結果を明示的に表現できるものとなっている.今後は,土地利用・交通変化を簡便な形で取り入れたモデルを組み合わせ,具体的な政策の組み合わせや順序の違いによって,世代勘定表によって集計できる純便益総和が異なることを示すような枠組みを構築していく必要がある.都市公共交通という市民の資産を活かすためには、長期的かつ安定的な需要を確保する必要があり、時間軸を意識した需要喚起策が重要である。
バイオミメティックな受容体とＨＰＬＣによる化学物質の環境リスク初期評価手法の構築

ヒト健康や生態系に及ぼす化学物質の影響を評価する際に利用されるエストロゲン活性値を,既存の高速液体クロマトグラフィーと人工的に作製できる疑似受容体分子インプリントポリマーを組み合わせて,スクリーニング的に予測する手法を確立した。確立したエストロゲン活性予測手法で得られた活性値は既存のバイオアッセイ法によるそれらと概ね同様の傾向を示した。すなわち,スクリーニング的にエストロゲン活性を予測する手法としては妥当であると結論できた。17βーエストラジオール(E2)を鋳型分子に用いて作製した分子インプリントポリマー(MIP)をHPLCカラム化して,エストロゲン活性予測システムを構築した。エストロゲン活性を有するE2,エストリオール(E3),エストロンならびにエチニルエストラジオール(EE2)を本システムに注入し,それぞれの保持時間からE2の保持時間に対する相対値,すなわち,次式に従って,相対的なエストロゲン活性値を求めた。相対的なエストロゲン活性値(%)=被検物質の保持時間/E2の保持時間×100相対的なエストロゲン活性値は,E3が65%,エストロンが31%,EE2が72%であった。本研究課題の中核であるエストロゲン活性予測システムの構築のための基盤となる分子インプリントポリマー(MIP)を,17β-エストラジオール(E2)を鋳型分子に用い,沈殿重合法により作製した。作製したE2ーMIPの分子認識能について,エストリオール,エストロン,エチニルエストラジオールなどのエストロゲン類を用いて評価した。その結果,供試物質に対して,ポリマーの認識能にある程度の差が確認されたことから,平成25年度から着手する予測システム構築のためのエストロゲン様物質の吸脱着材料としての活用が見込める特性を有していると判断した。17β-エストラジオール(E2)およびE2と化学構造が類似した化合物を認識する分子インプリントポリマー(MIP)を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のカラムに充填して確立したエストロゲン活性予測システムを用いて,数種類の化合物のエストロゲン活性値(E2の相対値(%))を求めた。次に,提案予測手法で得られた活性値の妥当性を,既存のバイオアッセイ法(酵母ツーハイブリッドアッセイ法)で得られた活性値(国立環境研究所のデータベースを利用)との比較により評価した。提案予測手法で得られたエストロゲン活性値は,エチニルエストラジオール72%,エストロン31%,エストリオール64%であった。既存のバイオアッセイ法による,これらの化合物のエストロゲン活性値は,それぞれ56%,16%,0.45%であり,両者を比較すると,エストリオールでは乖離が認められたものの,他の被検化合物の活性値は概ね同様に活性値の低下が認められた。一方,ビスフェノールAやノニルフェノールなど,エストロゲン活性を有すると報告されている内分泌攪乱化学物質については,提案予測手法における保持時間がボイドマーカー(アセトン)よりも早く,E2-MIP充填カラムに保持されないと判断した。すなわち,当該化合物のエストロゲン活性は陰性であると判定した。以上の結果から,抗体などの機能性タンパク質に比べて容易に調製が可能な人工分子認識素子MIPと汎用性に優れたHPLCを組み合わせることで,オンラインで種々の化合物のエストロゲン活性をスクリーニング的に予測できることが示唆された。ヒト健康や生態系に及ぼす化学物質の影響を解明するための初期リスク評価では,エストロゲン活性が重要な指標の一つとして位置づけられると考えられるため,本研究で確立した手法は学術的に意義があると結論できる。分析化学本申請課題の中核と位置づけているエストロゲン活性予測システム構築を達成しており,現在のところ概ね順調に進んでいると判断した。平成24年度はエストロゲン活性予測システムの構築のための基盤を成すエストロゲン類を認識する分子インプリントポリマー(MIP)の調製を目的とした。先の研究実績概要に記したとおり,研究実施前に想定した分子認識能(選択性)を有するMIPの作製を達成しており,現在のところ本研究課題は概ね順調に進んでいると判断した。これまで通り当初の研究計画に則しつつ,必要の応じて関連分野の研究者からの技術的助言等を受けながら課題を遂行する。今年度は本申請課題の中核を成すことから,当初の研究計画に則しつつ,適宜,関連分野の研究者からの技術的助言等を受けながら,着実に課題を遂行する。試薬類(移動相用有機溶媒など)や高速液体クロマトグラフの消耗品類の購入に必要な経費が当初の積算額を下回ったため。システム構築に必須なE2認識MIPのロット間差を検証するなど,期待される研究成果に厚みを持たせると同時に,平成26年度は最終年度となることから,研究成果の公表を視野に入れる。いずれにせよ,これまでの2ヶ年と同様に,着実な課題遂行のために,適正かつ効率的な予算執行に努める。高速液体クロマトグラフ(HPLC)を活用する試験が主体になるため,それに必要な移動相用有機溶媒,また,平成24年度に作製したE2ーMIPを充填カラム化するために必要な機材の購入が中心となる。
ロリクリントランスジエニックマウスによる皮膚角化異常症モデルマウスの作製

ロリクリンは皮膚のcell envelope(CE)の主成分であり、恐らくCEのうち約75%位はロリクリンであると考えられている。我々はこれまでにヒトのロリクリン遺伝子をクリーニングし,その遺伝子を用いてトランスジエニックマウスを作成した。トランスジエニックマウス作成を用いられたDNA断片は全長20kbであった。このトランスジエニックマウスは全く正常なphenotypeを持ち,このマウスで発現されたヒトのロリクリンは内在性のマウスロリクリンと全く同様に皮膚のケラトヒアリン顆粒及びCEに出現した。皮膚の角化異常性疾患は遺伝性角化症と非遺伝性角化症に大別されるが遺伝性角化症に属する疾患のうち現在遺伝子レベルでの異常が解明されているのは,水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症と葉状魚鱗癬および掌蹠角化症の一部のみである。他の遺伝性角化異常症においては,遺伝子レベルでの異常は全く解っていない。ロリクリンはそCE主要成分であるので,ロリクリンの遺伝子異常(即ちポイントミューテーション)が,ある種の角化異常症の原因遺伝子である可能性は非常に高いと考えられる。我々の研究目的はロリクリンのミュータント遺伝子を用いてトランスジエニックマウスを作成し,角化異常症の動物モデルを作成することである。平成6年度はマイクロインジェクション用のミュータントコンストラクトの作成を行った。ロリクリンはアミノ酸配列上、3ケ所のグリシンに富む領域が存在するがN端からC端にかけて第1、第2、第3グリシンループと名付けられている。今回我々は、第2グリシンループが欠損したコンストラクトと第3グリシンループが欠損したコンストラクトを遺伝子工学的手法を用いて作成した。今後コンストラクトをマウスの受精卵にマイクロインジェクションすることによりトランスジェニックマウスを作成し表皮にどのような変化が生じるかを観察する予定である。
栄養素による時計遺伝子とメタボリック症候群の制御に関する研究

本研究では,メタボリック症候群を遺伝的に発症する実験動物を得られた初代培養肝細胞や株化線維芽細胞における時計遺伝子の発現リズムに異常があることを見いだした。ついで、動物性タンパク質と植物性タンパク質が、褐色脂肪のUCP1、UCP2遺伝子の発現量を亢進すること、肝臓のCyp7A1遺伝子のサーカディアンリズムに影響を与えることを明らかにした。以上のことより、メタボリック症候群モデル動物では、時計遺伝子の発現リズムに異常があること、摂取タンパク質は、脂質代謝のサーカディアンリズムに影響を与えることが示唆され、これらのことがメタボリック症候群の発症原因の一つであると考えられた。体内時計は、睡眠・覚醒、血圧、体温、免疫という広範囲の生理現象を制御し、体内時計の破綻はメタボリック症候群を発症させる。体内時計に関する研究は、遺伝学、生理学、細胞生物学、行動学の各分野で精力的に進められ、最もホットな研究テーマとして注目されている。体内時計のうち中枢時計は視交叉上核に、抹消時計は全身組織に存在する。中枢時計と抹消時計のクロストークによって体内時計は制御され、一方の制御機構が破綻すると、他方が代償的に働いていることが予想させる。体内時計の制御機構をヒトで直接的に検討すべきであるが、ヒトでの解析には限界がある。実験動物マウス・ラットとヒトの遺伝子配列には相同性があり、実験動物で得られる研究成果はヒトでの重要な基礎的知見になると期待できる。メタボリック症候群の発症に対する体内時計の関与を詳細に検討するには,メタボリック症候群由来の培養細胞を用いてin vitroで検討すべきであると考えられる。しかし,そのような培養細胞は存在しないことから,本研究では,肥満・2型糖尿病・脂質代謝異常症・高血圧を遺伝的に合併して発症するメタボリック症候群のモデル動物の胎児から繊維芽細胞を分離・培養してクローン化し,メタボリック症候群を発症する遺伝的素因を有する株化繊維芽細胞を樹立した。メタボリック症候群の発症に対する体内時計の関与を詳細に検討するには,メタボリック症候群由来の培養細胞を用いてin vitroで検討すべきであるが,そのような培養細胞は存在しない。本研究では,肥満・2型糖尿病・脂質代謝異常症・高血圧を遺伝的に合併して発症するメタボリック症候群のモデル動物の胎児から繊維芽細胞を分離・培養してクローン化し,メタボリック症候群を発症する遺伝的素因を有する株化繊維芽細胞を樹立した。これにより,今後,in vitroで詳細な検討が期待される。体内時計は、睡眠、覚醒、血圧、体温、免疫という広範囲の生理現象を制御し、体内時計の破綻はメタボリック症候群を発症させる要因となる。体内時計に関与する研究は、遺伝学、生理学、細胞生物学などの分野で精力的に進められ、最もホットな研究分野の一つとなっている。体内時計のうち、中枢時計は視交叉上核に、末梢時計は全身組織に存在している。体内時計は、中枢時計と末梢時計のクロストークによって制御され、一方が破綻すると、もう一方が代償的に機能し、結果として体内時計の恒常性が保たれている可能性がある。体内時計の制御機構をヒトで直接的に検討すべきであるが、ヒトでの検討には限界がある。実験動物であるマウスやラットの遺伝子配列は、ヒトと高い類似性があり、これらの実験動物で得られる実験結果は、ヒトの体内時計を解析する上で、非常に重要な知見になる。申請者は、遺伝的にメタボリック症候群を自然発症する実験動物より肝細胞を分離し、次いで、この肝細胞を多様な細胞外マトリックスを含むEHSゲル上で培養し、時計遺伝子のサーカディアンリズムを検討した。EHSゲルを培養デッシュにコーティングすると、肝細胞の基底膜に類似した環境を再構築でき、EHSゲルをコーティングしたデッシュ上で培養した初代培養肝細胞は、肝特異的遺伝子やタンパク質の発現、ホルモンによる酵素誘導を、in vivoに近い状態で再現できる特性を有する。その結果、時計遺伝子Cry1、Per2、Clockのサーカディアンリズムが、正常ラットとメタボリック症候群モデルラットとで異なっていることが明らかになった。このことより、EHSゲルを用いた初代培養肝細胞は,in vivoサーカディアンリズムを再現できる有益な実験系となる可能性が示唆された。マウスのEHS肉腫から得られるEHSゲルは,ラミニン、エンタクチン、へパラン硫酸プロテオグリカン、タイプIVコラーゲンなどの多様な細胞外マトリックス蛋白質を含んでいる。このEHSゲルを培養デッシュにコーティングすることにより、肝細胞の基底膜に類似した環境を再構築できると期待される。