hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌転移抑制分子Nm23-H1の分子間相互作用に基づく胃癌転移機構の解明とその制御

我々は癌転移抑制分子Nm23-H1の細胞内標的分子候補を見出してきた。Nm23-H1分子と標的分子の関わりを検討し、がん細胞がいかにして移動能を獲得し転移を可能にしたかを調べた。大腸がん、大腸腺腫症で発現しAPCにより活性化されるAsef2分子がNm23-H1の発現を認めない高転移性胃癌細胞株でその発現を認めた。Asef分子のGEF活性が優位になった結果がん細胞の運動能が亢進した。乳がん、膵臓がんの増殖・進展に関連するG3BP分子も結合標的分子であったが、結合強度に差があった。各G3BP分子は異なる機能を有することが知られ、共発現細胞では両分子が顆粒形成をして細胞質に共局在するのを認めた。今年度は、これまで申請者が準備段階でスキルス胃癌細胞株より見出した癌転移抑制分子Nm23-H1のパートナー分子のうちSPATA13(Asef2)分子とそのファミリー分子Asef1分子にについて物理的、生化学的性状における影響の解析を行った。標識付きNm23-H1およびAsef2, Asef1各遺伝子発現ベクターを用いて、in vitroおよびin vivoにおいて種々の検討を行い分子間の結合性、細胞内局在が一致することを確認した。また、高運動性を示す細胞へのAsef2, Asef1遺伝子の単独導入による運動能増強効果は弱く、一方でNm23-H1は強い運動抑制能を示した。Asef2-Nm23-H1, Asef1-Nm23-H1の組み合わせによる共発現では強い運動能抑制効果を認め、Nm23-H1の運動抑制能・癌転移抑制能を細胞レベルでの確認が得られた。しかし、Nm23-H1単独発現時と比べると運動能の回復を見たことから完全抑制ではなく、Asef2, Asef1の制御する他のシグナル経路の存在が示唆された。Asef2, Asef1の活性化因子であるAPC発現下では、Nm23-H1による細胞運動抑制からの強い回復を確認した。生化学的機能解析においてAsef2, Asef1はともに低分子G蛋白質Cdc42を活性化したが、Nm23-H1の共発現下ではCdc42の活性が抑えられた。内在性Asef2発現胃癌細胞株はCdc42が活性化されており、Nm23-H1の導入により活性が大きく抑制された。つまり、Nm23-H1によるAsef2細胞運動能の抑制・癌転移抑制の作用点は低分子G蛋白Cdc42の活性制御であると示唆された。現在これらの結果は論文投稿へ向け準備中である。高知大学から所属機関を異動することとなり、移動に関する時間がとられてしまったこと、投稿予定雑誌の規定の変更から修正等に時間がとられており若干の遅れを生じた。しかし、現段階での共著者間での話し合いで追加実験は済ませてあり、おおむね順調と考える。本研究は癌転移抑制蛋白質Nm23-H1の細胞内標的分子に対する相互作用および、その作用メカニズムの解明を目指している。今年度はNm23-H1の標的2分子との関係に関する投稿論文の修正及び評価者からの追加検証実験を実施した。検証実験は酵素蛋白質でもあるNm23-H1が及ぼす酵素活性について、1癌転移抑制蛋白質Nm23-H1による低分子Gタンパク質に与える影響、2標的分子の種々の細胞株における発現状況を検討、3Nm23-H1分子自身の酵素活性について検討を行った。細胞内においてNm23-H1分子との共発現により1は複数のGタンパク質分子が知られており、我々が以前より解析してきたCdc42に注目したところ、完全な変化を示すわけではなく、一部の変化に留まった。つまりNm23-H1が関わるシグナル経路は、我々が注目したCdc42以外の経路Rac1が並行して関わっていることを示唆すると結論付けた。2に関しては様々なタイプ、分化度の異なる胃がん細胞株のうち、入手できた細胞株に対して検討し、発現量の大小は認められたが、多くの細胞で標的分子の発現があることを確認した。3に関しては酵素活性レベルが安定せず、現在も検討中である。現在これら追加検討の結果を踏まえ論文修正を行っており、論文再投稿へ向け準備中である。胃がんは様々な分類・タイプがあり今後、分類別胃がん組織(病理検体標本を用いて)において両分子間の発現状況と特にがんの転移状況について検討してみたい。また、悪性度との相関関係、予後との相関関係などについても検討することを考えている。その他、本年度における研究業績は共同分担研究が主に発表成果となった。予備実験にて関連が示唆されていた、G3BP分子と癌転移抑制蛋白質Nm23-H1との相互作用及びその影響について解析を継続しており、予備実験結果通りこれら両分子は種々のin vitro, in vivo実験系において直接結合していることが各種結合確認実験にて証明できた。従って、両分子の物理的相互作用の証明は固まりつつある。しかし、1生化学的性状解析において、ファミリー分子間で細胞内発現量が一定せず、大きな差があることから、分解機構もしくは半減期に差があるのではないかと疑問に感じる結果となった。また。2分子機能解析において、G3BP分子や癌転移抑制蛋白質Nm23-

H1分子の発現遺伝子を導入したクローンを作成し、胃癌細胞の運動性確認実験の準備が整っていたが、研究施設の変更による培養環境の変化及び保存環境の変化、もしくは上記の遺伝子発現量の差に付随する細胞死のシグナル経路の活性化が起こったことによる細胞死により作成クローンが死滅してしまった。現在これら死滅したクローン細胞株の再作製中であり、発現量の差が生じる原因・メカニズムについて同時に検討している。また、旧所属機関に在籍する研究分担者からの協力がなくなったことから、新たな研究協力者を育成するとともに、新たな協力者を探し、機器使用によりデータ収集と解析を円滑に進める。さらに、現所属機関において協力研究員として協力可能研究者を見出しており、主に病理学的解析やデータ収集での協力を得る予定である。そのため病理標本における検討を今後加えていく予定にしている。我々はMALDI-TOF-MSを用いた先行解析研究においてNm23-H1の細胞内標的分子候補を検索し、種々の分子を見出してきた。本年度は標的分子のうちG3BP2及びG3BP1分子に焦点を絞りその詳細について解析を進めた。G3BP2及びG3BP1分子はこれまで、すい臓癌、乳癌の悪性度との関連が示唆されていたが我々は、柳原博士により樹立されたスキルスタイプ胃がん細胞株HSC39からNm23-H1の標的分子として見出した。このことから、G3BP1、G3BP2分子が胃がんにおいてもその発現が認められるかを、種々の胃がん細胞株と高転移性・高浸潤性を示すスキルスタイプ胃がん細胞株で比較検討した。その結果1G3BP2分子はスキルスタイプ胃がん細胞株(HSC39, 58)や高分化型腺癌細胞株(HSC57)において発現していることを確認した。これは先のマウスにおける転移・腹膜播種能確認実験の結果と一致していたことから、G3BP1, G3BP2分子が高浸潤・高転移性に関わっていることが示唆された。しかし、ヒトの臨床検体での確認・検討にまで至らず、本研究が残した今後への宿題である。さらに、両分子間相互作用について検討したところ、2in vitro , in vivoにおいてNm23-H1分子とG3BPの3つのファミリー分子各々は物理的な結合性を示し、3核移行ドメインを有する各G3BP分子と細胞質に優勢的に局在するNm23-H1の結合性が細胞内においては、細胞質に広く共局在していることを確認した。特筆すべき点はG3BPの3ファミリー分子(G3BP1, G#BP2a, G3BP2b)の各単独発現では大きな違いは認めなかったが、Nm23-H1との共発現細胞ではG3BP1だけが大小多くの粒子を形成し細胞質全体に広がり、G3BP2分子とは異なっていた。G3BP1がストレス顆粒形成と関連していることから、Nm23-H1との共発現がストレス刺激となって形成された可能性が考えられた。我々は癌転移抑制分子Nm23-H1の細胞内標的分子候補を見出してきた。Nm23-H1分子と標的分子の関わりを検討し、がん細胞がいかにして移動能を獲得し転移を可能にしたかを調べた。大腸がん、大腸腺腫症で発現しAPCにより活性化されるAsef2分子がNm23-H1の発現を認めない高転移性胃癌細胞株でその発現を認めた。Asef分子のGEF活性が優位になった結果がん細胞の運動能が亢進した。乳がん、膵臓がんの増殖・進展に関連するG3BP分子も結合標的分子であったが、結合強度に差があった。各G3BP分子は異なる機能を有することが知られ、共発現細胞では両分子が顆粒形成をして細胞質に共局在するのを認めた。
排尿障害を有する脳卒中患者における自立支援からみた排尿誘導法の有用性

回復期脳卒中患者に対する排尿援助の実態を明らかにするとともに、入院中の筋肉量の変化量の意義を示し、入院中の筋肉量の変化量を用いて、トイレ排尿誘導を行っていることの評価をした。入院中のADLの変化に入院中の筋肉量の変化量が関係していることが明らかとなり、看護援助の評価指標として筋肉量の変化量を用いることができると確認した。トイレ排尿誘導を実施しているか否かにより、入院中の筋肉量の変化量に有意な違いは認められなかった。少数での検討であったため、今後データ収集を重ねるとともに、より積極的に意図した能動的動作を取り入れた排尿誘導法の検討が課題であることが明らかとなった。本年度の研究では、多施設における排尿障害を有する回復期脳卒中患者に対する排尿援助についての実態調査を実施した。調査対象は、「2010年版近畿病院情報」(医事日報)をもとに近畿圏下の病院で、診療科にリハビリテーション科を有し、施設基準としてリハビリテーション(脳血管)のある病院のうち1/2等間隔抽出法により選定し、郵送許可の得られた病院に調査票を郵送した。267病院に調査票を郵送し、202病院(75.7%)から回収があった。排尿援助については、排尿日誌の活用が32.2%に止まる一方で、行動療法の実施は75.7%であり、多くの施設で導入されていた。中でも、時間排尿誘導法、パターン排尿誘導法が多く実施されていた。また、排尿援助を実施する職種として、看護師は99.0%と最高で、半数の施設では介護職者や看護補助者と協働して実施していた。以上の結果より、行動療法の実施割合にくらべ、排尿日誌の活用割合は半分以下であることが明らかになった。排尿日誌が用いられていない場合、排尿に関する情報を経時的に詳細に得ていないことが多く、患者の状態にあった行動療法の実施、実施による効果判定のためにも、排尿日誌の活用割合が、行動療法の実施割合により近づくことが望ましいと考えられた。また、排尿援助は、多職種と連携しながら実施に至っていることが示された。排尿行動が少しでも自立できるような排尿援助となるためにも、職種を問わず実施可能なエビデンスに基づいた共通のケア計画が必要であることが明らかになった。現在は、次ステップとして、排尿日誌の活用及び排尿誘導法のプログラムを作成中である。本研究は、自立支援、寝たきり予防の観点から排尿援助のあり方を示す研究として実施している。エビデンスに基づいた実践のためにも、本研究を続行する意義は大きいと考える。排尿障害のある脳卒中患者にとって、排尿の機会に、ベッド上でおむつ交換だけに終わることは、尿失禁の改善が得られにくいうえに、トイレに行くという生活上のリハビリテーションの機会を失うことになり、筋肉量やADL自立度の維持・向上を阻害する可能性があると考えられる。先行研究において、尿失禁のある患者に対して、排尿誘導法の実施が、尿失禁の改善につながることが示唆されている。また、研究代表者が行った研究において、自らの力で動作を行おうとする能動的動作を引き出す排尿援助をしている患者の方が、筋肉量が多い傾向にあった。そこで第一に、回復期脳卒中患者における入院中の筋肉量の変化量の意義を示すため、入院中の基本的ADL向上群と不変・低下群の間で、入院中の筋肉量の変化量に違いがあるか関係をみた。第二に、病棟で実施されている援助として、入院中の筋肉量の変化量を用いて、トイレ排尿誘導を行っていることの効果について検討した。1.入院中の筋肉量の変化量の意義入院中の基本的ADL向上群と不変・低下群の間で、入院中の非麻痺側下腿、および麻痺側下腿において筋肉量の変化量に有意差が認められ、基本的ADL向上群の方が低下群より、入院中の筋肉量の変化量が大きかった。また、非麻痺側下肢全体の筋肉量の変化量も同様に有意傾向を示した。入院中のADLの変化に入院中の筋肉量の変化量が関係していることが明らかとなり、回復期脳卒中患者における看護援助の評価指標として筋肉量の変化量を用いることができると確認した。2.入院中の筋肉量の変化量を用いたトイレでの排尿誘導病棟で実施されている援助として、トイレ排尿誘導を実施しているか否かにより、入院中の下肢筋肉量の変化量に有意な違いは認められなかった。少数例での検討のため、今後データ収集を重ねていく。また、より積極的に意図した能動的動作を取り入れた排尿誘導法の効果を検討していく必要がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。
骨髄幹細胞の肝細胞分化誘導における微小重力環境の影響

今年度、我々は骨髄幹細胞から微小重力環境下に肝臓を分化誘導するための準備実験として、以前から行なっているhanging drop culture培養系でのembryoidbody(EB)を用いた、多能性を有する胚性幹(ES)細胞から肝細胞への分化誘導に関する研究を行った。hanging dropにて5日間培養してEBを作製した後、ES細胞の分化誘導を試み、肝細胞特異的に取り込まれるindocyanine green(ICG)試薬がES細胞由来の肝細胞の同定に有用であるかどうかを検討した。ICG陽性細胞は免疫組織化学染色でalbumin陽性を示す三次元構築をもつ細胞群として分化することを突き止めた。この細胞群をRT-PCRで解析したところ、肝細胞markerであるalbumin, α-fetoprotein, transthyretin, α-1-antitrypsin, glucose-6-phosphatase,および内胚葉マーカーであるHNF-3βの発現を認めた。さらに、電子顕微鏡を用いた形態学的解析では、細胞質内に多数のER, lysosomes, Golgiの存在が明らかとなったほか、cell-cell contact(desmosomes)およびbile canaliculusも確認された。さらに我々は、EBの培養日数を6日間に延長した実験系によりES細胞から蠕動運動能を有する腸管の分化誘導にも成功した。電気生理学的にも解剖学的にも(粘膜上皮、平滑筋、ICC、神経細胞)腸管特異的な特徴を有していた。発生学的に肝臓が原腸から分化することを考えると、これらの結果は今後、骨髄幹細胞から微小重力環境下に肝臓つくるという命題にとって大変重要かつ画期的な発見であると考えられる。現在、骨髄幹細胞を角いた実験の前に、マウスから分離した肝細胞を用いてSpheroidを作製し、微小重力環境における形態変化を分析中である。今後実験計画申請書に記したように、微小重力環境下に骨髄幹細胞からの肝臓の分化誘導を行い、重力が臓器分化誘導に及ぼす影響を検討したいと考えます。
新光延試薬を用いたsp^3炭素上での効率的炭素-炭素結合形成反応の開発

光延型反応に利用されている従来試薬(DEAD-Ph_3P)では反応しない,あるいは反応しにくいとされていた炭素求核種を活性化できる新試薬として,安定型ホスホランCMBP, CMMPを開発した.以下に,その研究結果を列挙する.1.CMBP, CMMPの合成法を確立するとともに,それらの特性を正確に評価した.その結果,pK_a値が23程度の求核剤も反応することを見いだした.2.新試薬を用いて,従来試薬では不可能だった(アリールメチル)フェニルスルホン類及び,(アリルメチル)フェニルスルホン類のアルコールとの縮合反応に成功した.3.本反応に際し,アルコール側の立体化学は完全にWalden反転した.4.本反応を用いピリジンアルカロイドやフェロモン誘導体の立体選択的合成法を開発した.光延型反応に利用されている従来試薬(DEAD-Ph_3P)では反応しない,あるいは反応しにくいとされていた炭素求核種を活性化できる新試薬として,安定型ホスホランCMBP, CMMPを開発した.以下に,その研究結果を列挙する.1.CMBP, CMMPの合成法を確立するとともに,それらの特性を正確に評価した.その結果,pK_a値が23程度の求核剤も反応することを見いだした.2.新試薬を用いて,従来試薬では不可能だった(アリールメチル)フェニルスルホン類及び,(アリルメチル)フェニルスルホン類のアルコールとの縮合反応に成功した.3.本反応に際し,アルコール側の立体化学は完全にWalden反転した.4.本反応を用いピリジンアルカロイドやフェロモン誘導体の立体選択的合成法を開発した.光延型反応に利用されている従来試薬(DEAD-Ph_3P)では反応しない,あるいは反応しにくいとされていた炭素求核種を活性化できる新試薬として,安定型ホスホランCMBP, CMMPを開発した.以下に,その研究結果を列挙する.1.CMBP, CMMPの合成法を確立するとともに,それらの特性を正確に評価した.その結果,pK_a値が23程度の求核剤も反応することを見いだした.2.新試薬を用いて,従来試薬では不可能だった(アリールメチル)フェニルスルホン類及び,(アリルメチル)フェニルスルホン類のアルコールとの縮合反応に成功した.3.本反応を用いピリジンアルカロイドやフェロモン誘導体の立体選択的合成法を開発した.光延型反応に利用されている従来試薬(DEAD-Ph_3P)では反応しない,あるいは反応しにくいとされていた炭素求核種を活性化できる新試薬として安定型ホスホランCMBP, CMMPを開発した.以下に,その研究結果を列挙する.1.CMBP, CMMPの合成法を確立するとともに,それらの特性を正確に評価した.その結果,pK_a値が23程度の求核剤も反応することを見いだした.2.新試薬を用いて,従来試薬では不可能だった(アリールメチル)フェニルスルホン類及び,(アリルメチル)フェニルスルホン類のアルコールとの縮合反応に成功した.3.本反応に際し,アルコール側の立体化学は完全にWalden反転した.4.本反応を用いピリジンアルカロイドやフェロモン誘導体の立体選択的合成法を開発した.
2001年インド西部大地震の総合的調査研究

地表地震断層調査班は震源域に分布する推定活断層沿いの地表地震断層の有無に重点をおいた航空機による観察と、変動地形の地上調査、および地震に伴って発生した亀裂についてのトレンチ調査を行った。その結果、地表地震断層は確認できず、Budarmora村北の活断層の延長上で発見されたプレッシュア・リッジは地盤の液状化を伴う亀裂と連動して発生した地滑りによって説明できることが明らかになった。余震観測班は2月27日3月6日までBhachauからRaparにかけての地域に8観測点を設置し、余震の観測を行なった。震源決定された余震はほとんどが1035kmの深さに分布し、本震の断層が地殻下部に達し、地表には突き抜けなかったことが強く示唆された。余震は全体的に南傾斜の面に分布しており、メカニズム解の二つの節面のうち、南傾斜の節面が断層面であることを示している。GPS観測班は2月中旬から3月上旬にかけて、14観測点で余効地殻変動の観測を行なった。5月中旬に実施された第2回目の観測との比較からは数cm程度の上下変動が認められた。被害調査班は3月413日にかけて、建物種別の被災度簡易評価によるMSK震度分布の推定、アンケート震度調査、Gandhidhamにおける建物の詳細被災度調査、組積造及びRC構造物の微動測定による振動特性評価、地盤・土木構造物の被害調査、人的被害と緊急対策の調査を実施した。その結果、Bhachauを中心に東西50kmの範囲で最大MSK震度10、震度分布は東西に長い楕円状となり、震央距離210kmのAhmedabadで震度6と推定された。死亡率はBhachau郡で6.5%、Bhuj郡では1.6%に達し、組積造住宅倒壊の影響が大きいこと、組積造の破壊パターン・周期等について知見が得られた。RC造の被害原因として壁率の少ない一階、不適切な補強筋量と施工が指摘され、1956年Anjar地震後に建設されたGandhidhamのRC造は設計施工が良好で被害小とわかった。現地における観測調査は2月18日3月13日にかけて行われ、現在資料の解析を行なっている段階であるが、現時点における各班の観測調査の概要は下記のとおりである。GPS観測班は2月18日に現地入りし、全14観測点(インド側受信機7台と日本側受信機7台を使用)の設置を21日までに完了した。引き続き観測網に対する24時間連続観測(30秒サンプリング)のメンテナンスを行い、連続観測は3月4日まで続けられた。その結果、地表地震断層は認定できなかったが、Budarmora村北で活断層上に位置する地盤の液状化を伴う亀裂についてはトレンチ調査を行なうことにより、主要な変形は地滑りよって説明されることが明らかになった。予備的な結果によれば、余震の震源のほとんどが1030kmの深さに分布し、本震の断層がかなり深いことを示唆している。また、余震は全体的に南傾斜の面に分布しており、メカニズム解の二つの節面のうち、南傾斜の節面が断層面である可能性が高い。被害調査班は3月413日の10日間、現地において、町村の建物種別の被災度簡易評価によるMSK震度分布の推定、アンケート震度調査、Gandhidhamにおける建物の詳細被災度調査、組積造及びRC構造物の微動測定による振動特性評価、地盤及び土木構造物の被害調査、人的被害と緊急対策の実施状況に関する調査などを実施した。また、インド側の研究協力者と調査結果のとりまとめ及び今後の情報交換について協議するとともに、デリーの科学技術省、国立災害対策研究所、日本大使館を訪問し、調査結果の報告および研究交流のニーズについて意見交換を行なった。

その結果、Bhachauを中心に東西50kmの範囲で最大MSK震度10、震度分布は東西に長い楕円状となり、震央距離210kmのAhmedabadで震度6と推定された。死亡率はBhachau郡で6.5%、Bhuj郡では1.6%に達し、組積造住宅倒壊の影響が大きいこと、組積造の破壊パターン・周期等について知見が得られた。RC造の被害原因として壁率の少ない一階、不適切な補強筋量と施工が指摘され、1956年Anjar地震後に建設されたGandhidhamのRC造は設計施工が良好で被害小とわかった。
食物繊維に対する消化管細胞応答の解明

腸管の絨毛を構成する上皮細胞は,タイトジャンクション近傍に存在するフィブロネクチンを介して水溶性食物繊維のペクチンの化学構造を認識すること,またその結果,α5β1インテグリンを介して細胞内に情報を伝達し,細胞表面に存在するヘパラン硫酸糖鎖の硫酸化構造を変化させていることを明らかにした。これは,食物繊維の機能性が,従来知られている分子のかさ高さによって発揮される物理化学的性質や,大腸における腸内細菌を介した二次代謝産物に起因するものに加え,直接的な細胞応答に起因する可能性を新たに示したものである。昨年度までに,フィブロネクチンがペクチンを認識する腸管上皮細胞局在タンパク質であること,さらにフィブロネクチンは食物繊維の化学構造を識別して特異的に結合していることを明らかにした。そこで今年度は,フィブロネクチンを介して細胞内に伝えられる情報を解析するため,腸管上皮細胞様モデル細胞としてCaco-2細胞を用い,ペクチンに対するCaco-2細胞応答の解析を行った。まず,Caco-2細胞にペクチンを与えた際の細胞内代謝産物の変化をメタボローム解析によって調べたところ,細胞内のポリアミン量が減少していることが示されたことから,ペクチンに誘導されるポリアミン代謝関連遺伝子の発現量の変化をリアルタイムRT-PCRを用いて解析した。ポリアミン合成に関与するODC遺伝子,ポリアミン合成を調節するOAZ遺伝子,ポリアミン分泌に関与するSSAT遺伝子,ポリアミン再合成に関与するPAO遺伝子にそれぞれ注目し,ペクチンを細胞に添加6時間後のトータルRNAを回収した後に解析した。その結果,ペクチンを添加すると,ODCとSSATの遺伝子発現量が増加し,PAO遺伝子の発現量が減少することから,ペクチンによってCaco-2細胞のポリアミン合成が誘導され,さらにポリアミンが細胞外に分泌されていることが示唆された。そこで次に,ポリアミンがペクチンの添加により細胞外に放出されているかを確かめるため,トランスウェルを用いた細胞培養によって培養上清を回収した後,塩化ダンシルを用いてポリアミンをダンシル化して標識し,HPLCによって分析した。その結果,ペクチン添加によって細胞外にポリアミンの一種であるスペルミジンが分泌されていることが示された。動物細胞表面に普遍的に存在するヘパラン硫酸(HS)が,さまざまな生理機能に関与することに着目し,腸管上皮細胞様モデルとしてCaco-2細胞を用い,ペクチン添加による細胞表面HS構造への影響を調べたところ,HSの硫酸化構造の大きな変化が認められた。さらに,この構造変化に影響を与える脱硫酸化酵素HS 6-O-endosulfatase(HSulf)に注目し,ペクチン添加時のCaco-2細胞内発現をリアルタイムRT-PCRにより確認したところ,Caco-2において発現するHSulf-2の発現が増加していた。そこで,Caco-2細胞におけるHSulf-2の発現誘導を指標として,ペクチンと相互作用する細胞外マトリクスタンパク質のフィブロネクチンとその受容体であるα5β1インテグリンが,ペクチンによる細胞応答に関与しているか検討した。すなわち,フィブロネクチンのペクチンとの結合部位であるIII1Cペプチドやフィブロネクチンのインテグリンとの結合部位であるRGDペプチドをペクチンと同時に添加すると,ペクチンによるHSulf-2の発現誘導に対して,それぞれのペプチドが抑制的に影響することが明らかとなり,ペクチンはこれらのタンパク質を介してHSulf-2の発現を制御し,ヘパラン硫酸の構造変化をもたらしていることが示唆された。さらに,小腸陰窩細胞のIEC-6細胞とCaco-2細胞とを用いて複合培養系を構築し,トランスウェルの分化Caco-2細胞のアピカル側にペクチンを添加すると,アウターウェルのIEC-6細胞の生育数が,ペクチンの濃度依存的に増加することを見出した。また,ペクチン添加時にCaco-2細胞内Wnt3aタンパク質の発現量が上昇すること,さらに,ペクチン添加によりCaco-2細胞表面のヘパラン硫酸の硫酸化構造は,Wntタンパク質に対して結合力を著しく減少させることを明らかにした。今年度は,食物繊維を認識する腸管上皮細胞局在タンパク質の候補となるフィブロネクチンが,ペクチンと生理的条件下で相互作用するかを検討した。まず,ヒト小腸由来cDNAライブラリーを導入したファージディスプレイ法によって,プルーン由来ペクチンと相互作用することが明らかになったペプチドとの相同性にしたがい,フィブロネクチン・フラグメントIII領域を候補タンパク質とし,ペクチンとの相互作用を表面プラズモン共鳴法により解析した。タンパク質をセンサーチップに固定し,プルーン由来ペクチン,レモン由来ペクチン,ポリガラクツロン酸をそれぞれアナライトとして実験を行った。その結果,プルーン由来ペクチンとフィブロネクチンの解離定数は0.0006 mMと非常に強い相互作用を示すことが分かった。

一方,レモン由来ペクチンとの解離定数は2 mM,ポリガラクツロン酸との解離定数は38 mMと非常に弱いものであり,フィブロネクチンはプルーン由来ペクチンが有する特異的な構造に選択的に結合することが推察された。次に,フィブロネクチンどうしが結合することを利用し,固定されたフィブロネクチンに対して,ペクチンとフィブロネクチンを同時に添加することによる競合阻害実験を行った。その結果,プルーン由来ペクチンが最も強くフィブロネクチンどうしの結合を阻害し,レモン由来ペクチンやポリガラクツロン酸は高濃度でのみ阻害作用をすることが分かった。これにより,フィブロネクチンがプルーン由来ペクチンが特徴的に有する化学構造を認識していることが確認された。さらに,小腸上皮様モデル細胞のCaco-2細胞を用いて,フィブロネクチンの局在を調べたところ,基底膜側の主要な存在部以外にタイトジャンクションに一部局在しており,腸管に到達したペクチンは,タイトジャンクションに存在するフィブロネクチンと相互作用する可能性が示唆された。フィブロネクチンのレセプターとして知られている細胞表面のインテグリンが,ペクチンによる細胞応答に関与しているかについて今年度内に明らかにすることは出来なかったものの,ペクチンによる細胞応答としてポリアミン代謝関連遺伝子の発現量が変化すること,その発現量の変化から細胞外にポリアミン放出量が増加していることが示唆されること,そして実際に細胞外にポリアミンの一種であるスペルミジンの分泌量が増加していることを明らかにしたことは,Caco-2細胞においてペクチンを添加することで応答する代謝経路を解明するという研究の目的を達成したことにあたる。これは,本年度の当初の目標を十分に達成する結果が得られたと考えている。本研究は,健康食品素材として注目されている「食物繊維」が示す生理機能のうち,腸管上皮細胞への直接的な作用の結果もたらされる生体への影響を明らかにし,高齢化社会を脅かすさまざまな現代病から健康を守るための食材として,食物繊維が有効であるかを検証する科学的基盤の確立を目指している。本年度は,食物繊維(ペクチン)を認識する腸管上皮細胞局在タンパク質を同定するために,ヒト小腸由来cDNAライブラリーを導入したファージディスプレイ法によって同定されたペプチドに相同性のあるフィブロネクチンを候補タンパク質として,表面プラズモン共鳴法を利用し,まず食物繊維と相互作用するタンパク質の存在の検証を行った。その結果,生理的な条件下で,フィブロネクチンとプルーン由来ペクチンが相互作用する可能性が示唆されたこと,由来の異なるペクチンによってフィブロネクチンとの結合力が異なることから,細胞外マトリクスに存在するフィブロネクチンは,腸管内に摂取されたペクチンと構造特異的に相互作用する可能性が強く示された。これまでに,ペクチンとフィブロネクチンが構造特異的に相互作用することを示し,またCaco-2細胞を用いてペクチンによるポリアミン分泌が誘導されることを明らかにしてきた。そこで今後は,フィブロネクチンの細胞表面レセプターとして知られているインテグリンが,ペクチンに対する応答においても機能しているかについて,阻害剤を用いた実験等によって解明する。
授業の省察過程と教師の専門的成長に関する研究

本研究課題の第1の目的である「教師の省察」に関する研究に関して、1985年から近年での国内外での動向について、約110本の研究をレビューした。そこで明らかになった点の一つは、省察の概念の展開に伴う多義性の問題であり、特に国内での省察研究では技術的知に関する省察、省察の方法論は検討されているが、省察の認識過程自体や批判的省察の視点による研究がみられない点、また近年の米国での動向の一つに、フェミニズム教育学の視点から教師-生徒間の関係性やケアの視点からの省察の必要性が指摘されていること、また第2に初期の研究が教師個人の自己省察に焦点をあてた研究が多かったのに対し、近年はアクションリサーチによる研究がとりいれられ、学校-大学・教育委員会の連携により、個としての省察だけではなく、メンタリングやカンファレンスなど同僚生を軸にした省察過程の検討がなされていること、かつトップダウンではなく教師自らの声による省察の重視がなされていること、また第3に海外での省察研究では実習生や新任教員の省察を促す開発プログラムが進められているがわが国の実態を考えるならば中堅、熟練教員の省察を考えていく必要性を指摘した。また第2の目的としての教師の専門的成長に関しては、実践知としてのイメージに焦点をあて、第1研究では学生から熟練教師までを対象にし、教職経験年数とともに授業イメージが変容すること、第2に学生を対象に授業一般の授業イメージのみならず教科固有のイメージを検討し、その間には時には非一貫性が認められること、第3に教師間の授業カンファレンスにおける談話の分析からイメージが専門的な実践知の共有のための重要な役割を担っており、それが一つの教師文化を形成していることを明らかにした。本研究課題の第1の目的である「授業に関する省察と教師の成長の文献研究」に関しては、特に省察に関しては、1985年以降の文献、特に1990年以降の近年の欧米における動向を、本年度は主に検討した。そして、省察研究の教師教育への導入が、主に初任期の教育のあり方として検討されており、熟練教師のためにもこの概念をさらに検討することが必要である点、また実際の教育研究においてはVan Manen(1977)が指摘する省察の3レベルのうち、経験主義的・分析的視点からの研究が主となっており、解釈学的・現象学的水準、批判的・弁証法的水準からの研究が少ないこと、またShonの指摘する“reflection after action"の研究は多いが、“reflection in action"の研究が少ないことを明らかにし、現在この点を展望論文として整理し、執筆中である。さらに、わが国で行われてきている授業実践報告や研究紀要をこの概念枠組みから検討するため、現在文献の収集と分析を行っているところである。また、教師の専門的成長に関してはライフコース、生涯発達という視点から、教師の危機の問題を捉え、「学習評価研究」に執筆し発表した。第2の目的である「省察過程に関する実証研究」については、予備調査を行った。1人の熟練教師の授業を継続的にビデオ撮影し、授業後にそのビデオを再生しながら、筆者との面接を通して省察を行ってもらうことを2つの小学校2年生の国語の授業に関して行い、現在その授業ならびに省察の会話を言語資料として書き起こし、分析を行っており、本年度末までには、1論文として整理し発表する予定である。また教師の成長に伴う信念の変容に関する実証研究をまとめて「教育心理学研究」に執筆し、現在印刷中である。以上のように、おおむね順調に研究は進められている。本研究の第1目的である「授業に関する省察と教師の成長の文献研究」に関しては、近年の省察研究の動向をまとめ、「教育学年報第5巻」に発表した。また省察に関して、この発表論文よりもさらに、考えを深め、省察の内容枠組み、修辞枠組み、主体枠組みからなる筆者なりのモデルをまとめ、「児童心理」で、現在印刷中である。

本論文では十分に書ききれなかった部分をさらに深め、別論文として執筆を計画中である。また教師の成長モデルに関しては、新任期、初任期、中年期、熟練期各段階の特徴と発達課題を同じく、「児童心理」(印刷中)の3回の連載論文にまとめて発表した。本論文では省察主体として主に個人の教師が論じられているため、集団としての省察の必要性を論じた論文を「教育と医学」にその案を発表した。さらにこの点については来年度検討する予定である。また第2の目的である「省察過程に関する研究」に関しては昨年度収録したデータに関しては論文として執筆発表する準備段階にあり、またさらに1単元を通して一人の教師の省察過程を追うデータを収録し、そちらは現在整理中である。また実証データの一部に関しては日本心理学会の「熟達化研究の現在とこれから」というシンポジウムにおいて話題提供者としてその一部を公開発表した。以上のようにおおむね順調に研究は進められており、来年度には本年度までの実証研究を論文化し、まとめていく予定である。本研究の第1目的である「授業に関する省察と教師の成長の文献研究」に関しては、既に「教育学年報」、「児童心理」の連載論文でまとめたものをさらに整理することによって、「省察の内容枠組」をモデルとしてさらに精緻化し、教師の発達を職人モデルではなく、コミュニテティにおける同僚性モデルで考えることを提案し、コミュニティと教師文化が教師の成長を支えるという視点を「実践の創造と同僚関係」「教員としての成長を支援するために必要な視点とシステム」(いずれも印刷中)の2論文に執筆しまとめた。ただし両論文では紙数の制限から当該領域の近年の研究を網羅することができなかったため、90年代の実証的な省察研究を網羅して収集し方法論を軸に現在レビュー論文としてまとめており、投稿予定である。また第2の目的である「省察に関する研究」に関しては、実際に授業検討カンファレンスのデータを収集分析し、その結果の一部は「実践の創造と同僚関係」「授業をイメージする」(印刷中)の両論文に発表した。また98年7月開催予定の教育心理学会第40回総会において「教師の成長を考える」と題するシンポジウムを企画し、「教師の成長を支える同僚性」と題して具体的な分析結果を発表報告する予定となっている。当初に予定された研究のうち、教師と実習生の会話分析、教師達が行っている授業研究会の談話の収集分析に関しては予定通り進められた。ただし当初予定されていた教師の成長に関する質問紙研究に関しては、まだ実施することができなかった。報告書には含めることができないが、今後この研究を契機に実施する予定にはしている。
ジチオカルボン酸塩およびエステルを用いる大環状化合物の合成研究

これまで、ジチオカルボン酸誘導体の合成研究を行って来たが、本研究ではこれらの合成方法を応用して、特異性のある大環状化合物を得ることを目的とした。活性メチレン化合物あるいはスルホンアミド類に,アルカリ存在下で二硫化炭素を作用させて、ジチオカルボン酸の塩,およびジチオカルボン酸ジメチルエステル,を得た。これら各々に,ジハロゲン化ポリエーテルおよびジアミノポリエーテルを高希釈下で反応させて,チアクラウンエーテル類およびアザクラウンエーテル類を合成した。また,ジチオカルボン酸ジメチルエステルとジアミンとの2:1反応では,2:1反応生成物を得ることが出来,さらにあらたにジアミンと反応させて大環状化合物(2:2)を得た。以上合成した大環状化合物の各種金属イオンとの錯形成についての研究は,現在,進行中である。
左右決定が99.99%のキャナリゼーションを達成するしくみ

現在までに、マウス胚ノード中に存在する左右非対称な水の流れが、ノード脇で発現するCerberus like 2 mRNAの不安定化を引き起こし、Cerberus like 2 mRNAの発現パターンを左右非対称に変化させる事を解明した。本研究は、物理的な水の力を遺伝子発現の左右非対称性へと変化させる機構であると考えられr、非常に興味深いものである。私達はさらに理解を深めるため、アクチノマイシンDを使用して遺伝子発現におけるmRNAの転写をストップさせ、さらにWntシグナルの促進剤であるBIOを添加して、マウス胚を培養した。その結果、Cerberus like 2 mRNAの量は減少しており、この結果はWntシグナルがCerberus like 2 mRNAの分解に影響している事を示している。従来までの結果から、Cerberus like 2 mRNAとWntシグナルは、連結したフィードバック機構を持つ事を明らかにしており、本研究はそのフィードバックメカニズムの実体を解明する物となった。またWntシグナルがCerberus like 2 mRNAのどの部位に作用するのかを理解するため、Cerberus like 2 mRNAの欠失解析をおこない、3'側のUn-translatedregionがその機構に極めて重要である事を明らかにした。さらに、解明したフィードバックメカニズムを用いて、数理モデルを作成したところ、連結したフィードバック機構はノイズに対して極めて安定で、確実に左右を決定するために重要である事がわかった。脊椎動物の心臓、胃、肺、腸等の内臓臓器の形態は左右非対称である。内臓臓器の左右非対称性は、高度に保存された遺伝子カスケードで正確に決められており、マウスでは左右決定を間違う確率が1万匹に1匹、つまりCanalizationの値は99.99%と非常に高い。マウス胚の左右決定では、まず体の中心に位置するノードで右から左への水流が起こる。その結果、ノードの左右両脇に存在する約30個ずつのcrown cellと呼ばれる細胞で、Cerberus/DANファミリーに属する分泌因子Cerl2のmRNAが、右側で左側よりも多く発現する。現在までの研究から、crown cell内のCerl2 mRNAの局在を観察すると、細胞膜に強く局在している事が明らかになった。さらにノード流を受けた部分の膜に存在するCerl2 mRNAの量が減少している事を明らかにした。そこで、300bpの短い特殊な配列を挿入した改変Cerl2遺伝子を作成した。このレポーター遺伝子をBACのCerl2遺伝子領域と置き換えて、マウス受精卵にインジェクションし、胚を回収して300bpに対する蛍光In situ hybridizationを行って局在を観察した。同時に上記のBACコンストラクションからCerl2のイントロン又はUTRを欠失させ、膜のテンショ変化を感知し細胞内局在に重要な部位を同定した。Cerl2のmRNAのdeletion解析を行ったところ、Cerl2の3'UTRとintron領域が、Cerl2のmRNAの安定性をコントロールする事で、Cerl2 mRNAの量を変化させている事がわかった。さらにCerl2の3'UTRを欠いたトランスジェニックマウスでは、Cerl2の膜付近の局在が左右ともに強くなっていた。現在、3'UTRに結合する蛋白を同定中であり、候補蛋白を2つに絞った。Cerl2 RNAの安定性をコントロールする部位を、トランスジェニックマウスの解析から同定した。さらに、同定した部位に結合する蛋白質をほぼ同定しており、目的であるCerl2の安定性コントロールを行うメカニズムはほぼ明らかになりつつある。超高感度センサーの仕組みと振る舞い、センサーが間違う確率を解析するために、センサーの動作を直接観察する。BAC(Bacterial Artificial Chromosome)を利用したトランスジェニックマウスで、Cerl2の転写量をLuciferaseを用いて、Cerl2 mRNAの細胞内での振る舞いをMS2-GFP蛋白を用いてリアルタイムに定量する。これよりセンサーへの入力値、揺らぎ、誤動作する確率を解析する。その後、ノイズを含むダイナミックシミュレーションと実験から揺らぎの原因を解明する。また、ノード流が細胞膜に与える張力と膜付近でのRNA分解機構を、PIV解析とmRNAのイメージングで明らかにし、センサーへの入力を解明する。
女性の肥痩意識と皮下脂肪厚ー大学生と40歳代の比較ー

本研究の目的は、自分の身体に対する自己評価をさせ、あわせて脂肪量を実測することによって、自己評価と現実との差異を明らかにしていくことである。研究対象としては、東京及びその周辺のテニススク-ルに参加している中高年男女を選び、合計84人のデ-タを収集した。肥痩の自己評価は質問紙法によって行うと同時に、脂肪量の実測を体脂肪率計測器(栄研式キャリパ-など)を用いて行い、数値は直ちにフィ-ドバックした。肥痩自己評価(5段階:痩せている、どちらかといえば痩せている、普通、どちらかといえば肥っている、肥っている)と体脂肪率との間の相関を男女別に調べてみたところ、男女ともこの両者の間には正の相関があることが示され、対象者全体としてみると、自己評価には信頼性があると考えられたが、個人別にみると回帰直線から大きくはずれた値を示すものも多く、全員が正しい評価をしているとはいえない、ということが明らかになった。その原因については、現在検討中である。なお、実際に調査・測定を行っていく際には、不正確な判定をしたものに対しては、得られた体脂肪率をもとに、正しい肥痩度というものを認識させ、「余分な脂肪を減少させる」という、健康的に減量するためのアドバイスを行った。今回は、この脂肪量の測定に加え、膝関節の伸展力の測定、障害の調査等も実施し、この年代の体力を総合的に判定することも、試みているところである。このように、多角的にデ-タを収集することは、測定評価の分野の研究を運動生理学やスポ-ツ医学につなげるという意味でも、重要であると思われる。
平城京木簡と飛鳥藤原京木簡の字形比較

平城京木簡の字形についてのデータと、それより以前の藤原宮木簡にみえる字形を比較することによって両木簡における字形の特徴を把握することを目的とし、字例を収集し、整理する基礎作業および成果発表に取り組んだ。研究対象(調査範囲)は、平城京および藤原京出土木簡で、奈良文化財研究所が調査にあたりすでに報告されている木簡に限定して対象とした。具体的には、次の報告書所収のものに限定する。『平城宮木簡』17、『平城京木簡』13、『平城宮発掘調査出土木簡概報』141、『藤原宮木簡』13、『飛鳥藤原京木簡』1・2、『飛鳥藤原宮発掘調査出土木簡概報』122。基礎作業を行いながら、まず、一定の基準に照らすべく、中国の『干禄字書』の字体注記(正字・俗字・通字)のいずれに相当するかを調査した。対象とする文字は『干禄字書』所収文字に限定されるが、両木簡群ともに、『干禄字書』の正字に該当するものより、俗字・通字に該当するものが多かったことが明らかになった。これは、以前行った、木簡とほぼ同時期の、正倉院文書等との比較における傾向とも一致した。この結果を論文にまとめた。また、飛鳥藤原京木簡では、平城京木簡の場合と比べは字の大部分を省略する場合が多いことに注目し、口頭発表を行った。これらのうち、中国の敦煌木簡にみられる類似した形も取り上げた。両木簡群の字形の比較には、まだ様々な観点からの分析が必要であり、本調査はごく一部の観点にすぎないが、上記の調査から、特に、筆画の省略に対する意識について、さらに深める必要があると考えた。また、中国において口頭発表および資料収集を行った際、中国文字学関連の情報を入手することができたが、中国の文字資料との対照については、どの時期の、どの範囲の資料と対照させていくか、さらに多くの資料にあたるとともに、文化的背景も考慮しながら、絞っていきたいと考えている。
バイオオルガノメタリクス研究戦略に基づく内皮細胞メタロチオネイン誘導機構の解析

血管内皮細胞におけるメタロチオネイン(MT)誘導を介在する細胞内シグナル経路を有機-無機ハイブリッド分子を活用して解析し,MTアイソフォームのうち,MT-1の誘導にはMTF-1-MRE経路とNrf2-ARE経路の両方が必要なのに対し,MT-2の誘導にはMTF-1-MRE経路のみが関与することを明らかにした。さらに,MT-1AおよびMT-2の誘導は,ALK5-Smad2/Smad4-Sp1経路およびALK5-Smad2-Sp1経路によって介在されることも明らかにした。MTアイソフォームには機能上の違いはないと考えられてきたが,実際には機能分化が存在することが示唆された。zinc(II)bis(diethyldithiocarbamate)の銅置換体copper(II)bis(diethyldithiocarbamate)も内皮細胞のMTを誘導することを明らかにした。この銅錯体がユビキチンプロテアソーム系の阻害を通じてNrf2を活性化することも明らかにした。この銅錯体を活用し,MT-1A/Eの誘導にはMTF-1-MRA経路およびNrf2-ARE経路の両方の活性化が必要であるが,MT-2Aの誘導にはNrf2-ARE経路は関与しないことを示唆する結果を得た。有機アンチモン化合物ライブラリーから,MT-1AおよびMT-2Aの転写誘導を行う化合物tris(pentafluorophenyl)stibaneを得た。この化合物を用いた検討の結果,やはりMT-1A/Eの誘導にはMTF-1-MRA経路およびNrf2-ARE経路の両方の活性化が必要であるが,MT-2Aの誘導にはNrf2-ARE経路は関与しないことが示された。以上の結果は,MT-1の本来の役割が解毒機構にあり,一方,MT-2の本来の役割は亜鉛代謝にあることを示唆している。申請者らは,有機ー無機ハイブリッド分子のバイオロジーをバイオオルガノメタリクスと名付け,その研究を展開している。血管内皮細胞は血液と直接接している唯一のcell typeであり,血管病変の防御に重要な役割を果たしている。メタロチオネイン(MT)は亜鉛代謝制御に寄与するだけでなく,重金属の毒性軽減作用,抗酸化作用,炎症反応の抑制作用などを有する生体防御タンパク質である。本研究の目的は,有機ー無機ハイブリッド分子を生体機能解析のツールとして活用し,MTアイソフォームの機能分化に重要な血管内皮細胞におけるMTアイソフォームの発現誘導に介在する細胞内シグナル伝達を解析し,エピジェネティックなMTアイソフォーム発現誘導制御機構についても検討を加えることである。そこで平成28年度に予定していた有機ー無機ハイブリッド分子によるMTアイソフォームの誘導を介在する細胞内シグナル伝達経路を解析する研究に取り組み,内皮細胞のMTの誘導が無機亜鉛では起こらないこと,MTF-1-MRE経路の活性化だけでも起こらないことを明らかにするとともに,MT-1A/Eの誘導にはMTF-1-MRE経路およびNrf2-ARE経路の両方の活性化が必要であるが,MT-2Aの誘導にはNrf2-ARE経路は関与しないことを明らかにした。これらの新知見は4報の国際学術論文として公表され,目標を超過達成できた。内皮細胞をCu10で処理したとき,ZIP7 mRNAの発現上昇が認められた。そこで,ZIP7 siRNAを導入しZIP7をノックダウンしたところ,Cu1024時間処理ではMT誘導に変化は認められなかったが,48時間後においてCu10によるMT誘導の抑制が認められた。同様に,Cu10処理後8および16時間後にはZIP7のノックダウンによるMT-1A/1E/2A mRNA発現の抑制は認められなかったが,24時間後にはMT-2A mRNAの発現上昇が抑制された。他のZIPファミリーをそれぞれノックダウンしたときには,このようなCu10によるMT誘導の抑制は認められなかった。これらの結果から,ZIP7の発現上昇は小胞体から細胞質への亜鉛イオンの流出を促進し,この亜鉛イオンによるMTF-1の活性化がCu10によるMT誘導に寄与すると推察された。今年度の結果は,MT誘導を介在するMTF-1の活性化に必要な亜鉛イオンが小胞体からZIP7を介して供給されるという新しいMT誘導機構を示唆するものである。また,ほとんど不明であった亜鉛輸送体ZIP7の機能に新しい視点を与えるものである。メタロチオネイン(MT)の誘導機構については不明な点が多く残されているが,特に血管内皮細胞は無機亜鉛が誘導能を示さないという特殊な細胞である。この特殊性のため無機亜鉛は内皮細胞のMT誘導機構解析ツールとしては用いることはできない。そこで有機-無機ハイブリッド分子ライブラリーを活用し,有用なツールとして銅錯体Copper(II) bis(diethyldithiocarbamate)(Cu10)を見出したのが平成27年度の研究である。しかしながら,MT誘導に不可欠な転写因子MTF-1の活性化には亜鉛イオンの存在が必要である。その由来は不明であったが,平成28年度に亜鉛輸送体ZIP7がCu10による内皮細胞のMT誘導に関与していることを突き止めることに成功した。これは小胞体にプールされている亜鉛イオンがCu10によるMTF-1の活性化に関与していることを示唆するものであり,MTの新しい誘導機構を提示する結果であった。亜鉛イオンの動態を直接計測するに至っていないが,ZIP7の新機能を示唆する結果でもあり,順調な進展と言って良い。

MTF-1/MRE経路はSb35,As35およびP35によって活性化されたが,MTアイソフォームプロモーターへのMTF-1の結合を増強したのはSb35およびAs35であった。いずれの化合物もNrf2/ARE経路を活性化し,MT-2A遺伝子より約3 kb上流にあるAREへのNrf2の結合を増加させた。一方,P35のMT-2A転写誘導におけるMTF-1/MRE経路の関与が部分的であること,Nrf2/ARE経路がMT-2A転写誘導には関与しないことが示されたことから,MTF-1やNrf2を介さない転写誘導機構の存在が示唆された。そこで細胞増殖因子/サイトカインについて検討し,TGF-βシグナル経路が内皮細胞MTを誘導することが分かった。すなわちALK5-Smad2経路が内皮細胞MTを誘導し,MT-1Aの誘導にはSmad2と協調してSmad4およびSp1が関与すること,このうちSp1はMT-2Aの転写誘導にも関与することが示された。血管内皮細胞におけるメタロチオネイン(MT)誘導を介在する細胞内シグナル経路を有機-無機ハイブリッド分子を活用して解析し,MTアイソフォームのうち,MT-1の誘導にはMTF-1-MRE経路とNrf2-ARE経路の両方が必要なのに対し,MT-2の誘導にはMTF-1-MRE経路のみが関与することを明らかにした。さらに,MT-1AおよびMT-2の誘導は,ALK5-Smad2/Smad4-Sp1経路およびALK5-Smad2-Sp1経路によって介在されることも明らかにした。MTアイソフォームには機能上の違いはないと考えられてきたが,実際には機能分化が存在することが示唆された。平成27年に研究が順調に進展し,エピジェネティックなMTアイソフォーム発現誘導制御機構が残っている。重要な問題は2つあると思われる。第一は,銅錯体copper(II) bis(diethyldithiocarbamate)によるMT誘導においてMTF-1活性化に必要な亜鉛イオンはどこから供給されたのかという問題である。我々は,この銅錯体が小胞体から細胞質に亜鉛イオンを輸送する金属輸送体SLC39A7の発現を上昇させることを予備的に見出している。そこで,平成28年度は,copper(II) bis(diethyldithiocarbamate)による血管内皮細胞のMT誘導にこの亜鉛輸送体が関与する可能性を検討し明らかにする。また,この銅錯体によるSLC39A7の発現誘導を介在する細胞内シグナル経路についても検討する。第二は,ヒストンのアセチル化によるエピジェネティックな制御の可能性である。MTF-1はp300と呼ばれるヒストンアセチル転移酵素活性を有するタンパク質と複合体を形成することが報告されている。そこで,ハイブリッド分子によるMTアイソフォームの誘導にMTF-1ーp300複合体形成とヒストンのアセチル化や他のエピジェネティックな調節が関与するかどうかを検討する。これについては平成29年度での実施を計画するが,MTF-1活性化機構が順調に解明された場合には,前倒しして実施する。内皮細胞のメタロチオネイン(MT)誘導の機構にはMTF-1-MRE経路およびNrf2-ARE経路の活性化だけでなく,エピジェネティックな調節も含まれている。