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性的マイノリティの権利保障と労働法に関する研究

1.研究期間中の研究成果を日本労働法学会(2018年10月、早稲田大学)のワークショップにおいて「LGBTと労働法の理論的課題ートランスジェンダーを中心にー」をテーマにして以下の内容で発表した。1名古道功「趣旨説明」、2内藤忍「企業によるトランスジェンダーの外見・服装の制約」、3濱畑芳和「LGBTに対する合理的配慮を中心に」。労働法学会では、LGBTに関する報告は初めてであり、注目度が高かった。トランスジェンダーに関する事件は少なく、また企業での実情もそれほど解明されていない中、ワークショップではさまざまな意見が述べられ、提案された論点が深められた。トランスジェンダーを障害概念に含めるのか、それとも労働契約上の配慮義務に基づきその保護を図るのかには対立があり、また職場での取り扱いのむつかしさがあるが、今後、多様な人材の能力発揮が求められるダイバーシティマネジメントに鑑みると、働きやすい就労環境の構築は不可避であり、憲法13条に基づく人格権を尊重した方向で、立法を含めた考察が課題であることが明らかになった点が大きな成果である。2.ドイツにおけるLGBTの実情と研究状況を解明するために現地調査を実施した。成果は以下の通りである。1職場におけるLGBT当事者の状況に関する調査内容を把握し、その現状と課題が明らかになった。2LGの教員グループの活動状況、LGBTに関する学校教育の様子などのヒアリングを通じて、教育における積極的な取組みが重要である。3当事者団体の活動により、LGBTの人権保障が進み、関連法律の成立などの成果が得られた。4LGBTに対する法規制(男性のGのみに対する処罰規定など)の詳しい経緯が明らかになった。以上は、日本における課題を考えるにあたって有益な内容である。3.研究会を3回開催して、それぞれの研究成果の交流を行い、まとめの作業を行った。1実態調査3つの当事者団体及び1つの企業を調査した。【虹色ダイバーシティ】は、調査研究や企業研修などを行う団体である。学問的にも有益な調査を研究者と行っており、本研究にとっても有益な成果を上げている。【Rebit】は、LGBTの子供・若者を対象にした取り組みをしている唯一の団体であり、重視する事業は、1教育、2成人式、3就活・就労サポートである。若者が就労にあたって様々な困難に遭遇し、その解決のための取り組みの重要性が明らかになった。【LGBT法連合会】は、法制定との点で一致し、2015年4月に結成された。困難度リストを作成しているが、これは法案の根拠づけのためである。法連合会が作成した法案は2015年5月に発表されている。現在、国会には自民党案と野党案が提出されているが、法連合会の法案は、野党案に近い。【ドイツ証券】は、ドイツ銀行グループとして2010年から、ダイバーシティ施策の一環としてLGBTに関する先進的取り組みを行っている。具体的には、就業規則に1不利益取扱いの禁止、2慶弔休暇など同性パートナーへの付与、3応募書類での性別、写真、年齢記載なし、4研修の徹底、5相談窓口の設置などを定めて実施している。特徴的なのは、多様な人材が相互に競い合うとの視点を重視している点であり、「これが会社の強み」という。今回の調査で解明された点は以下の通りである。1多様な団体からの聞き取り調査の実施により多面的に実情が明らかになった。2それぞれ特徴ある取り組みを行っている。3LGBTに関する法律の必要性が確認できた。4東京と地方、また大企業と中小企業では状況が異なり、大都市における先進的企業の取り組みの普及が課題である。2研究会は2回開催した。3シンポ名古が研究の成果を「LGBTの権利保障と労働法総論」(2016年12月11日、学術会議)とのテーマで報告した。ほぼ予定通りに進展している。今年度予定していた企業調査は1か所のみであったが、次年度、実施するので支障はない。本年度は、企業調査と文献研究を中心とする研究、そして海外調査の一部(アメリカ)を実施した。企業調査では、渋谷区と共同して、性的少数者に対する施策が進んでいる10社のヒアリングを行った。ここで得られた成果は以下の通りである。第一に、ほとんどの企業において、すでにダイバーシティ施策に取り組まれており、性的少数者に対する施策はその一環であるので、スムーズに進められた点であり、「企業文化」が重要である。第二に、企業による施策では、就業規則に平等取扱いが規定され、また異性婚同様の福利厚生(慶弔祝い・見舞金、休暇など)や支援体制を充実させている。第三に、採用面接等で用いるエントリーシートには、男女記載欄を無くしている企業が見られ、人権に配慮されている。第四に、社長などのトップの支援がある企業では、積極的な取組みがなされており、その重要性が確認された。第五に、従業員だけではなく、顧客サービスでも性的少数者に配慮されており(例、同性パートナーにも異性パートナーと同じサービスを提供する)、注目される。他方、課題も提起された。第一に、企業施策を整えても、福利厚生などの利用者が少ない点である。先進的企業においてもカミングアウトには躊躇する状況にあるためといえ、これは、社会全体での理解促進と併せて検討しなければならない。第二に、企業独自には解決できない課題として、社会保険や相続が挙げられる。具体的には、労災での死亡による遺族補償金を同性パートナーは受領できない、また在職中の死亡による退職金の受領者をだれにするかなどであり、これは法的解決が求められる。

海外調査では、LGBT関係団体におけるヒアリング調査を実施し、先進的取組みの実情が解明された。このほか、それぞれの専門に基づき文献研究が行われ、研究会でその成果が報告された。本年度は企業調査を多く実施し、今後の研究遂行の当たって充実した成果を得られた。しかし、予定していた海外調査の一部は、諸事情から次年度に先送りすることになった。1.研究期間中の研究成果を日本労働法学会(2018年10月、早稲田大学)のワークショップにおいて「LGBTと労働法の理論的課題ートランスジェンダーを中心にー」をテーマにして以下の内容で発表した。1名古道功「趣旨説明」、2内藤忍「企業によるトランスジェンダーの外見・服装の制約」、3濱畑芳和「LGBTに対する合理的配慮を中心に」。労働法学会では、LGBTに関する報告は初めてであり、注目度が高かった。トランスジェンダーに関する事件は少なく、また企業での実情もそれほど解明されていない中、ワークショップではさまざまな意見が述べられ、提案された論点が深められた。トランスジェンダーを障害概念に含めるのか、それとも労働契約上の配慮義務に基づきその保護を図るのかには対立があり、また職場での取り扱いのむつかしさがあるが、今後、多様な人材の能力発揮が求められるダイバーシティマネジメントに鑑みると、働きやすい就労環境の構築は不可避であり、憲法13条に基づく人格権を尊重した方向で、立法を含めた考察が課題であることが明らかになった点が大きな成果である。2.ドイツにおけるLGBTの実情と研究状況を解明するために現地調査を実施した。成果は以下の通りである。1職場におけるLGBT当事者の状況に関する調査内容を把握し、その現状と課題が明らかになった。2LGの教員グループの活動状況、LGBTに関する学校教育の様子などのヒアリングを通じて、教育における積極的な取組みが重要である。3当事者団体の活動により、LGBTの人権保障が進み、関連法律の成立などの成果が得られた。4LGBTに対する法規制(男性のGのみに対する処罰規定など)の詳しい経緯が明らかになった。以上は、日本における課題を考えるにあたって有益な内容である。3.研究会を3回開催して、それぞれの研究成果の交流を行い、まとめの作業を行った。次年度は、海外調査と国内調査をメインとしつつ、各自の研究を進める。1.性的マイノリティの権利保障が進んでいるのはEUである。オランダは、法律で同性婚を承認するなどEUの中で先進的な国である。関係省庁において国内法制定の経緯・プロセス、立法内容、実務上の課題などを聴取する。また性的マイノリティの団体や企業を訪問して、実情や課題をインタービューする。次に、ドイツは、EU指令に基づき一般平等取扱い法を制定し、性的指向を理由とした差別を禁止するが、法律上の同性婚を認めない点でオランダとは異なる状況である。こうした点を踏まえて、同様の調査を行う。アメリカにおいて、6月にLGBTの当事者主催の大規模なシンポ等が開催されるので、これに参加して、意見交換や情報収集などを行う。
線虫C.elegansチロシンキナ-ゼ遺伝子ファミリ-の細胞特異的発現と転写因子

1)Kin7(=let-23)とlacZとの融合遺伝子の発現パタ-ンの解析を引続き行った。この融合遺伝子は、頭部、尾部の計30程度の細胞及び、腹部神経索に沿って並ぶ約12の細胞で発現することを昨年度観察した。この中にいくつかの陰門前駆細胞(VPC)が含まれると推定していた。細胞の同定を確実に行うため、XーgalによるlacZの活性染色のための個体試料の固定方法の改良を行った。その結果、融合遺伝子は、腹部において、神経索細胞では発現されているが、VPCで発現されていないことが明らかとなった。この結果は、本来のKinー7遺伝子もVPCで発現していないことを示唆する。2)更にこの点を明らかにするため、letー23遺伝子に陰門欠損変異をもつ(が致死でない)株に、野性型kinー7(=letー23)遺伝子とともに、マ-カ-としてhsp/lacZ融合遺伝子を染色体外にもつ形質転換体を作成し、陰門形成機能のキメラ解析を行った。その結果、陰門形成には、kinー7遺伝子のVPC(少なくともP5p,P6p,P7p)での発現は必要ないことがほぼ確実となった。3)kinー7遺伝子の上流にあるApal部位より上流を欠失したkinー7/lacZ融合遺伝子は、もとの融合遺伝子と異り、頭部先端に近いいくつかの細胞で発現が見られなくなることを確認した。更にいくつかの上流欠失変異を作成して、発現調節領域の同定を行っている。4)kinー7のC末端とlacZとの融合タンパクに対するウサギ抗体の精製はうまくいかなかった。現在kinー7のC末端等3ヶ所に対応する合成ペプチドを作成し、これらに対するウサギ抗体の作製を行っている。5)kinー8ゲノム遺伝子について、未定であった部分(N端側及び上流)約11kbの塩基配列をほぼ決定した。また、5'側のcDNAを単離し、全塩基配列を決定した。6)kinー8遺伝子のキナ-ゼ領域に、優性と予想される変異をin vitroで導入し、これを野性型の染色体外に導入したところ、unc表現型を示す個体がいくつか得られた。これがkinー8遺伝子の変異によるものであると確認している。
乳幼児をもつ世帯の家族生活・意識の変化にともなう住まい方の動向と住宅における課題

本研究では、乳幼児をもつ世帯に焦点をあて、家族構成・職業タイプ(労働実態)・家事育児分担の実態・夫婦観・家事育児観・社会との関係の持ち方等から家族生活意識における変化をいくつかの典型として整理し、家族観の変化にともなう住み方における動向を解明することを目的としていた。前年度においては、保育所を対象に乳幼児をもつ共働きの家族と住まいをとりあげ、当該年度においては、幼稚園を対象に乳幼児をもつ世帯の家族と住まいをとりあげた。研究方法としてはアンケ-調査を採用した。前年度で不十分だと感じた家族のライフスタイル志向や子育て観、住まい方のチェック項目を大きく追加した。そのため、単純に保育所と幼稚園の保護者比較はできなくなった。しかし、家族意識・生活意識の動向はより良く把握できたことによって、今後の研究の方向性は鮮明になったと思われる。女性の労働参加の意欲は高く、今後、乳幼児をもつ世帯の労働参加の意欲をどう支援するか、また夫の労働条件を変えることとどう連動させていくかはおおきな社会的課題となってこよう。家事・育児分担については、平等意識が増加しているが、現実は夫の協力をえられる状況にないとあきらめて肯定しているすがたが読み取れる。すみかたについては、乳幼児に目が行き届くということからくる暮らしが見受けられる。ひとつは、台所やD・Lで子どもが遊んだり着替えたりしていることや、家族そろって就寝するのがみられることなどである。部屋数にゆとりがある場合は子ども部屋が確保されているが、そこで寝たり、そこだけに子どもの衣類、玩具の収納が集中することはない。子どもは家族中心意識のなかで守られて生活するという姿が根づよいようである。本研究では、乳幼児をもつ世帯に焦点をあて、家族構成・職業タイプ(労働実態)・家事育児分担の実態・夫婦観・家事育児観・社会との関係の持ち方等から家族生活意識における変化を把握し、いくつかの典型として整理した。また、職業や住宅の移動などが以外に多くみられ、乳幼児の成育環境は安定したものではないことがわかった。研究方法として、最初はアンケート調査を予定していなかったが、保育者ヒアリングによって入所者の家族の生活変動が非常に大きい様に感じられ、その実態を把握する必要性を感じ、正規雇用の多い保育園、パート労働のおおい保育園、市街地内保育園とニュウタウン内保育園といった労働と居住地タイプから5ケ園を選定し、調査を実施した。あわせて、同じ保育園の保護者に対して許可をえた様々なタイプの家庭を訪問し、ヒアリングと、ぷらん採集をおこなった。被調査者の記入してくれた住み方プランの分析は未だ作業中であるが、こどもの生活にそったすみかたの工夫については今ひとつなされていないようすがうかがえる。乳幼児の減少と女性の労働参加の増加により、乳幼児をもつ共働きの支援をどのようにおこなうかは社会的課題といってよいが、とうの家族は、毎日の生活が忙しく住み方の工夫をこどもの成長と共におこなうことを意識する暇がないようである。ハッキリ課題として提起されればそのような傾向も減少すると思われる。
半導体トンネル磁気抵抗デバイスの基礎研究

非磁性半導体や強磁性半導体を量子井戸層として有する強磁性半導体GaMnAs二重障壁強磁性トンネル接合においては、量子サイズ効果とトンネル磁気抵抗効果(TMR)を組み合わせた新しい様々な機能が実現できると期待される。しかし、共鳴トンネル効果とTMR効果が同時に起こる現象は磁性半導体ヘテロ構造においては未だ明瞭に観測されていない。本研究では、In_<0.4>Ga_<0.6>Asの非磁性量子井戸層を有するGa_<0.94>Mn_<0.06>As(20nm)/AlAs(dnm)/In_<0.4>Ga_<0.6>As(0.42nm)/AlAs(dnm)/Ga_<0.94>Mn_<0.06>As(20nm)二重障壁強磁性トンネル接合を、p型GaAs(001)基板上に分子線エピタキシー法を用いて作製した。測定温度は7.0K、磁場は面内[100]方向に印加し、10mVのバイアス電圧を印加して測定を行ったところ、反平行磁化の時の抵抗が平行磁化の時の抵抗に対して低くなる負のTMRがAlAs膜厚(dnm)が2.07nmおよび1.24nmのときに観測された。さらに、TMR比のAlAs膜厚依存性を測定したところ、TMRがAlAsの膜厚に対して、0%を中心に振動することが分かった。振動の周期は約0.8nmである。このような負のTMRとTMR比の振動が観測されたのは、磁性半導体系では初めてである。この現象を理解するために、Luttinger Kohn k・pHamiltonianモデルおよびtransfer matrix法を用いてGaMnAs/AlAs/InGaAs/AlAs/GaMnAsRTDにおけるTMRの振る舞いに関する理論計算を行い、実験的に観測されたTMR振動がInGaAs量子井戸における量子サイズ効果に起因することを示唆した。トンネル確率のk_<//>依存性を計算・解析することにより、負のTMRは共鳴トンネル現象が起こるAlAs膜厚よりわずかに薄い膜厚で起こることがわかった。半導体をベースとしたエピタキシャル強磁性トンネル接合(MTJ)を、分子線エピタキシー法によって半導体基板上に作製し、そのトンネル磁気抵抗(TMR)効果を解明し、最適化し、制御することを目的とする。対象とする材料系は、(1)GaMnAs/AlAs/GaMnAs強磁性半導体ヘテロ構造と、(2)MnAs/AlAs/MnAs強磁性金属/半導体ヘテロ構造、の2種類である。さらに、(3)GaMnAs/AlAs/GaMnAs/AlAs/GaMnAs強磁性2重障壁構造などを作製し、量子効果デバイスを用いたTMRの増大とバイアス依存性の改善を狙う。本年度は、半導体をベースとした単結晶エピタキシャル強磁性トンネル接合の作製と材料科学的研究、トンネル磁気抵抗効果(TMR)の測定を行った。対象とする物質とデバイス構造は、(1)GaMnAs/AlAs/GaMnAs強磁性半導体ヘテロ構造と、(2)MnAs/AlAs/MnAs強磁性金属/半導体ヘテロ構造である。・分子線エピタキシー(MBE)によるウェッジ型試料を作製した。・磁化測定、TMR比および電流-電圧特性の基本特性測定を行い、(1)GaMnAs/AlAs/GaMnAs強磁性半導体ヘテロ構造と、(2)MnAs/AlAs/MnAs強磁性金属/半導体ヘテロ構造ともに、明瞭なTMRを観測した。・トンネル抵抗およびTMR比のAlAsトンネル障壁膜厚依存性とその物理的機構を明らかにした。半導体をベースとしたエピタキシャル強磁性トンネル接合(MTJ)を、分子線エピタキシー法によって半導体基板上に作製し、そのトンネル磁気抵抗(TMR)効果を解明し、最適化し、制御することを目的とする研究を行った。さらに、(3)GaMnAs/AlAs/GaMnAs/AlAs/GaMnAs強磁性2重障壁構造などを作製し、量子効果デバイスを用いたTMRの増大とバイアス依存性の改善を狙った。(1)エピタキシャルMnAs/III-V/MnAs強磁性トンネル接合デバイスにおけるトンネル磁気抵抗効果:エピタキシャル成長技術を駆使してすべて単結晶からなるMnAs/III-V/MnAs強磁性トンネル接合(MTJ)を作製し、強磁性金属/半導体からなる複合ヘテロ構造としては初めて明瞭なトンネル磁気抵抗効果(TMR)を観測した。そのTMR比は半導体(GaAs, AlAs)障壁層とその界面の品質に依存し、低温(10K)では最大30%以上に達した。(2)強磁性2重障壁構造などを作製し、量子効果デバイスを用いたTMRの増大とバイアス依存性の改善を試みた。実験的には大きなTMRには至らなかったが、GaMnAs/AlAs/InGaAs/AlAs/GaMnAs強磁性2重障壁構造において、負のTMRを観測した。また、AlAs障壁膜厚を変えるとTMRの値が振動的に変化することを見出した。この現象を説明するために、強結合近似を用いたTMRの理論計算を行いつつある。(3)新規なスピントロニクス・三端子デバイスの提案・解析と再構成可能な論理回路への応用:

将来のスピントロニクス・デバイスとして、スピンフィルタートランジスタやスピンMOSFETといったスピン依存電動を持つ新しい3端子デバイスの提案・理論解析も行い、その有用性を理論的に示した。またスピンMOSFETを用いた再構成可能な論理回路を設計した。非磁性半導体や強磁性半導体を量子井戸層として有する強磁性半導体GaMnAs二重障壁強磁性トンネル接合においては、量子サイズ効果とトンネル磁気抵抗効果(TMR)を組み合わせた新しい様々な機能が実現できると期待される。しかし、共鳴トンネル効果とTMR効果が同時に起こる現象は磁性半導体ヘテロ構造においては未だ明瞭に観測されていない。本研究では、In_<0.4>Ga_<0.6>Asの非磁性量子井戸層を有するGa_<0.94>Mn_<0.06>As(20nm)/AlAs(dnm)/In_<0.4>Ga_<0.6>As(0.42nm)/AlAs(dnm)/Ga_<0.94>Mn_<0.06>As(20nm)二重障壁強磁性トンネル接合を、p型GaAs(001)基板上に分子線エピタキシー法を用いて作製した。測定温度は7.0K、磁場は面内[100]方向に印加し、10mVのバイアス電圧を印加して測定を行ったところ、反平行磁化の時の抵抗が平行磁化の時の抵抗に対して低くなる負のTMRがAlAs膜厚(dnm)が2.07nmおよび1.24nmのときに観測された。さらに、TMR比のAlAs膜厚依存性を測定したところ、TMRがAlAsの膜厚に対して、0%を中心に振動することが分かった。振動の周期は約0.8nmである。このような負のTMRとTMR比の振動が観測されたのは、磁性半導体系では初めてである。この現象を理解するために、Luttinger Kohn k・pHamiltonianモデルおよびtransfer matrix法を用いてGaMnAs/AlAs/InGaAs/AlAs/GaMnAsRTDにおけるTMRの振る舞いに関する理論計算を行い、実験的に観測されたTMR振動がInGaAs量子井戸における量子サイズ効果に起因することを示唆した。トンネル確率のk_<//>依存性を計算・解析することにより、負のTMRは共鳴トンネル現象が起こるAlAs膜厚よりわずかに薄い膜厚で起こることがわかった。
ミトコンドリア－筋小胞体連関による心臓リズム・エネルギー代謝制御機構の解明

ゲノム編集技術を用いてNCLXノックアウトマウス作成に成功した。一部のホモNCLXノックアウトマウスは低体重、心臓異常、腎臓異常等の表現型が認められた。マウス心臓のランゲンドルフ灌流において、NCLX阻害剤(CGP-37157)は心拍数を減少させる傾向があった。CGP-37157は、マウス単離心室筋細胞の30%及び50%活動電位持続時間を延長し、Ca2+トランジエントを増加した。NCLX抑制により筋小胞体Ca2+含量が増加したためと考えられた。心臓ミトコンドリアの新しい包括的数理モデルを開発し論文発表した。また、ミトコンドリアー小胞体連関を考慮した新しい洞房結節細胞数理モデルを開発した。本研究においては、正常及び異常心臓リズム発生におけるミトコンドリアー筋小胞体連関のメカニズムと役割を解明することを目的に研究を行う。そのために、in vitro及びin situでの心筋細胞解析と心臓特異的NCLXノックアウトマウス解析を行う。さらに、数理モデル解析によりヒト心臓におけるミトコンドリアー筋小胞体連関の役割を演繹的に予測する。平成27年度は以下の研究を行った。1)全身NCLXノックアウトマウス、及びCre発現依存的な心臓特異的NCLXコンディショナルホモノックアウトマウスの作成に成功した。また、Creレコンビナーゼ活性化に必要なtamoxifen投与方法について検討した。2)マウスの心臓超音波解析法を確立した。全身NCLXヘテロノックアウトマウスにおいては、心臓超音波解析では有意な変化は見られなかった。また、心電図解析、心拍数測定のための実験装置の整備をした。単離ミトコンドリアを用いてミトコンドリアへのCa取り込みをマイクロプレートリーダで測定する装置及び実験プロトコールを確立した。3)マウス及びヒト心室筋細胞数理モデルの構築に取り組み、マウス心室筋細胞モデルがほぼ完成した。心臓ミトコンドリアの主要な代謝過程を組み込み、膜電位やイオン濃度など生物物理的要素を組み込み込んだ包括的心臓ミトコンドリアモデルが完成し、論文投稿を行った。4)マウス心臓洞房結節の電子顕微鏡解析を行い、洞房結節細胞におけるミトコンドリアと筋小胞体の位置関係、体積比などについて定量的なデータを得た。そして、既存のマウス洞房結節数理モデルに組み込み、ミトコンドリアー筋小胞体間のCaコミュニケーションが洞房結節の発火周期に与える影響を解析した(論文準備中)。NCLXコンディショナルホモノックアウトマウスの作成に成功し、解析を進めることができるようになったこと、及び数理モデル開発・解析が進んだことにより、おおむね順調に進展していると判断する。1)NCLXノックアウトマウスの作成・解析全身NCLXホモノックアウトマウスにおいては、NCLXmRNAの減少を確認した。しかしながらウェスタンブロットでは、NCLXタンパク発現の減少は確認できなかった。このマウスにおいては、全身状態、心臓超音波検査、心拍数において、野生型マウスとの間に著明な差異は認められなかった。タモキシフェンで誘導される心臓特異的NCLXコンディショナルノックアウトにおいては、タモキシフェン投与により、NCLXmRNAの減少を確認できた。しかし、ウェスタンブロットからは、NCLXタンパク発現の減少は確認できなかった。また、タモキシフェン投与量によっては、コントロールマウスにおいても、BNP,ANP等の心不全マーカーの増加や心臓超音波検査における駆出率低下が見られることが明らかになり、タモキシフェン投与プロトコールの検討を進めた。ウェスタンブロットの結果に関しては、用いた抗体の特異性に問題があるものと推測された。2)マウス及びヒト心筋細胞数理モデル構築・解析心臓ミトコンドリアのCa2+等のイオン動態、基質輸送体、エネルギー代謝を包括的に組み込んだ、数理モデルを開発し、論文発表した。数理モデル解析からは、ミトコンドリアNCLXが心筋細胞のミトコンドリアCa2+動態に重要であることが確認された。また、Ca2+によるミトコンドリアエネルギー代謝調節は、細胞質に存在するミトコンドリア代謝の基質に大きく依存することが明らかなった。また、マウス及びヒト心筋細胞(洞房結節細胞、心室筋細胞)の数理モデルの構築を進めた。上記の詳細な心臓ミトコンドリア数理モデルを、心室筋細胞の興奮ー収縮連関の数理モデルと統合した新しい心室筋細胞数理モデルの構築に成功した。ノックアウトマウスの解析は、若干計画よりも遅れている。数理モデル解析に関しては計画通りに進展している。全体としては、概ね順調に進展している。CRISPR-Cas9技術によるゲノム編集により、数種類のNCLXノックアウトマウス(ホモ及びヘテロノックアウト)の作成に成功した。一部のホモNCLXノックアウトマウスは低体重、心臓異常、腎臓異常等の表現型が見られ、NCLXの重要性が示唆された。詳細な解析を継続して行っている。新規にウサギ抗NCLX抗体を作成した。この抗体とマウス心室を用いたウエスタンブロットではNCLXがミトコンドリアに限局することが確認された。心室筋細胞の免疫細胞染色では、NCLXはミトコンドリア領域に存在するが局在性があり、T細管に近い領域に多く存在することが示唆された。心室筋細胞数理モデルに、ミトコンドリアー筋小胞体連関と詳細なミトコンドリア代謝を組み込んだ新しい数理モデルを作成した。また、ミトコンドリアと細胞質との間のH+輸送を組み込み、H+バランスを数値計算することに成功した。

この数理モデルを用いて、細胞質pH調節におけるミトコンドリア代謝とミトコンドリアNCLXの関与の解析を進めた。ゲノム編集技術を用いてNCLXノックアウトマウス作成に成功した。一部のホモNCLXノックアウトマウスは低体重、心臓異常、腎臓異常等の表現型が認められた。マウス心臓のランゲンドルフ灌流において、NCLX阻害剤(CGP-37157)は心拍数を減少させる傾向があった。CGP-37157は、マウス単離心室筋細胞の30%及び50%活動電位持続時間を延長し、Ca2+トランジエントを増加した。NCLX抑制により筋小胞体Ca2+含量が増加したためと考えられた。心臓ミトコンドリアの新しい包括的数理モデルを開発し論文発表した。また、ミトコンドリアー小胞体連関を考慮した新しい洞房結節細胞数理モデルを開発した。当初の計画通り遂行する。特に、全身NCLXノックアウトマウス、及びCre発現依存的な心臓特異的NCLXコンディショナルホモノックアウトマウスの解析を重点的に行う。1)NCLX抗体の特異性に問題があることが明らかになったため、新規にNCLX抗体の作成を行う。2)タモキシフェン投与プロトコールの確定を行う。3)数理モデル解析を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。生理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
未知のタンパク質TMEM135がシナプス小胞の機能制御に果たす役割の検討

世界規模の遺伝子解析により、ヒト、マウスなどの遺伝子の塩基配列が決定された。その結果、未だに機能が明らかとされていない遺伝子およびタンパク質が存在しているが明らかとなっている。本研究は未だにその機能が明らかとなっていないTmem135遺伝子が神経細胞間の神経伝達に大きな役割を担っているシナプス小胞における機能を検討した。その結果TMEM135タンパク質は海馬神経細胞に存在していることが明らかとなった。またシナプス小胞におけるグルタミン酸の取り込み能に関与している可能性が示唆された。申請者の研究協力者である米国ウイスコンシン州立大学マディソン校のDr.Ikedaの研究グループは,機能未知タンパク質の一つであるTransmembrane135(Tmem135)の遺伝子変異マウスの視覚ならびに聴覚神経系に,神経変性を伴う早期老化が起きることを見いだし,さらにこのTMEM135が網膜のシナプス小胞に存在することを突き止めた。このTMEM135は現時点でその機能は全く明らかとなっていないが,その遺伝子変異マウスが神経変性を伴う早期老化を引き起こすことから,本タンパク質が神経,特にシナプス小胞おいて何らかの機能を持ち,老化のプロセスに関与しているものと考えられる。そこで本研究課題はTMEM135のシナプス小胞における機能を明らかにし,本遺伝子と老化に伴う神経変性との関わりを調べることが目的である。申請者の研究協力者である米国ウィスコンシン州立大学マディソン校のDr. Ikedaの研究グループは,Transmembrane135(Tmem135)の変異マウスの視覚ならびに聴覚神経系に神経変性を伴う早期老化が起きることを見いだし,さらにこのTMEM135タンパク質(TMEM135)が網膜のシナプス小胞に存在する可能性を突き止めた。このTMEM135は現時点でその機能は全く明らかとなっていないが,TMEM135が神経,特にシナプス小胞おいて何らかの機能を持ち,老化のプロセスに関与していると考えられる。本研究課題はTMEM135のシナプス小胞における機能を明らかにし,本遺伝子と老化に伴う神経変性との関わりを調べることが目的である。平成27年度は,平成26年度に計画していたが整備および培養条件の設定に難渋し,計画通りに実験が遂行出来ていなかった培養神経細胞を用いてのTMEM135の細胞局在を引き続き検討した。大脳皮質神経細胞,海馬神経細胞の初代培養細胞の培養を試み,海馬神経細胞については培養に成功した。そこで海馬神経細胞においてTMEM135とMicrotubule-associated protein 2(MAP-2,神経細胞マーカー) ,シナプス小胞のマーカーであるVesicular glutamatetransport protein 1(VGLUT1),Vesicular GABAtransporter(VGAT)との局在関係を検討するために,細胞免疫化学染色法による二重染色を行った。その結果,TMEM135はMAP-2で染め出された神経細胞に広く発現をしていたが,当初の予測とは異なり,VGLUT1とVGATとは共局在を示さなかった。これらの結果,TMEM135は海馬の神経細胞には発現しているが,シナプス小胞には存在していない可能性が示唆された。培養細胞を用いた細胞免疫化学染色法によるTMEM135の細胞局在の検討は平成26年度より計画していたが,培養環境設備の立ち上げ,整備および培養条件の設定に難渋し,当初の実験計画が全体的に遅れている。平成27年度の免疫染色の実験結果より, TMEM135は海馬神経細胞には存在していたが,当初の予測とは異なりシナプス小胞への局在は証明出来なかった。そこで平成28年度はTMEM135のシナプス小胞における機能的関与をさらに検証するため,TMEM135がグルタミン酸のシナプス小胞への取り込み能に及ぼす影響を検証した。Tmem135変異マウスおよび野生型マウスの脳よりシナプス小胞を単離し,3Hでラベルしたグルタミン酸を用いて、それぞれのマウスより単離したシナプス小胞へのグルタミン酸の取り込み能を検討した。その結果、Tmem135変異マウスではグルタミン酸の取り込み能の低下が見られた(Tmem135変異マウス: 36.5 ±4.0 pmol/mg protein/10min,野生型マウス: 39.9±7.9 pmol/mg protein/10min)。これらの結果よりTMEM135はシナプス小胞へのグルタミン酸の取り込みに関与している可能性があるが、さらなる検討が必要であると思われた。

本研究は未だにその機能が明らかとなっていないTmem135遺伝子が神経細胞間の神経伝達に大きな役割を担っているシナプス小胞における機能を検討した。その結果TMEM135タンパク質は海馬神経細胞に存在していることが明らかとなった。またシナプス小胞におけるグルタミン酸の取り込み能に関与している可能性が示唆された。培養環境設備の立ち上げ,整備および培養条件の設定に難渋しており,計画通りに実験が遂行出来ていない。平成27年度の研究成果より,当初の予測とは異なりTMEM135は海馬神経細胞おいてグルタミン酸およびGABAのシナプス小胞には存在していない可能性が示唆された。平成28年度はこれらの知見をさらに機能面でも検証するため,野生型およびTmem135変異マウスの脳よりシナプス小胞を単離し,シナプス小胞におけるグルタミン酸およびGABAの再取り込みを比較し,Tmem135変異マウスのシナプス小胞の機能を検討する。また今後の研究の推進方策について,研究協力者である米国ウィスコンシン州立大学マディソン校のDr. Ikedaとも再検討する。歯科麻酔学細胞培養に精通した研究者に助言および援助を受けつつ,引き続き培養神経細胞を用いてTMEM135タンパク質の神経細胞における局在を,免疫細胞化学法を用いて検討を進める。さらに上記研究の進展状況を踏まえて,平成27年度の計画計画にあげているツーハイブリッド法を用いたTMEM135のタンパク質-タンパク質間相互作用の検討の準備を行っていく予定である。極めて少額の次年度使用額で、ほぼ予定通りの使用であった。H28年度の研究の消耗品に使用する。
大環状環拡張ポルフィリン化学の開拓

8つのピロールからなるオクタフィリンの金属錯体の合成と物性究明についての研究を行った。これまでに、銅二核錯体が熱により定量的に二等量の銅ポルフィリンへと変換される事を見出しているが、その反応機構は明らかになっていなかった。そこで、他の金属についても錯体を合成し、反応性の違いを検討する事にした。亜鉛との錯化からは、定量的に亜鉛二核錯体を得た。この錯体は構造的には銅二核錯体とほぼ同じであるが、熱による変換反応は全く起こらない事を見出した。この反応性の違いについて知見を得るために、分子軌道計算によって反応の中間状態の構造を見積もった。その結果、8の字型構造の交差する部分で渡環相互作用が働き、橋掛けが起こった中間状態が示唆された。橋掛けが起こる二つの炭素原子間の距離は、銅錯体よりも亜鉛錯体の方が遠くなっていることがX線結晶構造解析の結果から分かっており、亜鉛錯体で骨格変換反応が進行しない理由であると考えられる。次に、コバルトとの錯化からは、コバルト単核錯体を定量的に得た。この単核錯体は熱による変換を起こさなかったが、更に酢酸銅と反応させる事によって得られたコバルト銅ヘテロ二核錯体において、熱によるポルフィリンへの変換反応が進行する事を見出し、実験的に反応の活性化パラメーターを得た。これを銅二核錯体の場合と比べる事で、反応がエントロピー支配的に進行する事を確認した。この結果は軌道計算の結果と矛盾しない。一方、トリフルオロエタノールを溶媒として用いたパラジウム錯化から得られた錯体が、軌道計算から示唆された反応の中間状態に類似した構造を有する事を、X線結晶構造解析から確認した。以上の結果より、軌道計算から示唆された反応機構の妥当性を示す事が出来たと言える。この他に、プロトン化による[36]オクタフィリンのメビウス芳香族性の誘起や、前例のない二価二配位銅錯体についての検討も行った。環拡張ポルフィリンのうち、8つのピロールからなるオクタフィリンの金属錯体についての研究を中心に行った。これまでに、銅二核錯体が熱により定量的に、2等量の銅ポルフィリンへと変換される事を見出しているが、その反応機構は明らかではなかった。そこで、上記の変換反応の中間状態を計算により見積もったところ、反応の途中段階で、銅の価数が2価から1価及び3価へと不均化している事を示唆する結果が得られた。すなわち、この反応には1価から3価の原子価を安定に取り得る銅の存在が不可欠である事を示唆している。そこで、他の金属についても錯体を合成し、比較検討した。亜鉛との錯化においては、定量的に亜鉛二核錯体を得たが、構造的には銅二核錯体とほぼ同じであるにもかかわらず、熱による変換反応は全く起こらなかった。これは、亜鉛が2価以外の価数を取り得ないために、上記の反応機構を進行できないためであると考えられる。コバルトとの錯化においては、コバルト単核錯体を定量的に得た。この単核錯体は熱による変換を起こさなかったが、更に銅塩と反応させる事で得たコバルト銅二核錯体において、ポルフィリンへの変換反応が進行する事を見出した。コバルトも複数の原子価を安定に取りうるので、上記の反応機構の裏付けとなるものと考えている。ニッケルやパラジウムとの錯化においてはいずれも、錯形成の段階で新たな骨格変換が起こった構造を含む複数の種類の錯体が得られた。パラジウム錯体のうち一つは、炭素パラジウム結合を3つ持ち、メビウスの輪のようにねじれた構造を有する事をX線結晶構造解析により明らかにした。この錯体は、ヒュッケル則を満たさない36π電子系であるにも関わらず、1H MWRスペクトルにおいてシグナルの大きな高磁場シフトが見られ、強い芳香族性の存在を示唆している。現在までに合成例が1例しかない「メビウス芳香族性」を示す分子であると考えられ、現在その物性の検証を急いでいる。まず、従来の環拡張ポルフィリンの合成法を見直し、より高濃度の条件下で反応を行なう事で、最高でピロール18個からなるオクタデカフィリンまでの、種々の環サイズからなる環拡張ポルフィリンを単離同定した。10個のピロールからなるデカフィリンについてはX線結晶構造解析によってその構造を明らかにした。次に、この合成法から比較的収率よく得られる、8個のピロールからなる非芳香族化合物である[36]オクタフィリンについて、金属錯化に伴う構造と芳香族性の変化を検討した。[36]オクタフィリンに対し酢酸パラジウムを用いて錯化を行なうと、2種類のパラジウム二核錯体が、51%、20%の収率で得られた。前者は[36]オクタフィリンと同様のヒュッケルトポロジーからなる8の字型構造を有するが、8つのピロールのうち2つが反転し、そのベータ位でパラジウムと結合を形成していた。一方後者は、ピロールを3つ反転させ、共役面は嚢表のないメビウスの輪のようなトポロジーを有しており、やはり反転したピロールとパラジウムが結合を形成していた。興味深い事に、ヒュッケル型パラジウム錯体は、非平面構造にもかかわらずNMRスペクトルにおいて大きな反遮蔽効果が観測され、反芳香族性を示す事を確認した。

一方メビウス型パラジウム錯体は、NMRスペクトルにおいて明らかな遮蔽効果が観測され、ヒュッケル則を満たさない36π電子系にもかかわらず強い芳香族性を示す事を確認した。メビウストポロジーを持つ共役系は4n個のπ電子を有する場合に芳香族性を示しうると言う理論的予測は「メビウス芳香族性」として古くからなされていたが、分子内にかかる歪みが大きいために、そのような分子を合成する事は非常に困難であった。今回、パラジウムの配位によってメビウス型のトポロジーを固定する事によって、初めて明確なメビウス勢香族性を示す分子の合成に成功したと言える。8つのピロールからなるオクタフィリンの金属錯体の合成と物性究明についての研究を行った。これまでに、銅二核錯体が熱により定量的に二等量の銅ポルフィリンへと変換される事を見出しているが、その反応機構は明らかになっていなかった。そこで、他の金属についても錯体を合成し、反応性の違いを検討する事にした。亜鉛との錯化からは、定量的に亜鉛二核錯体を得た。この錯体は構造的には銅二核錯体とほぼ同じであるが、熱による変換反応は全く起こらない事を見出した。この反応性の違いについて知見を得るために、分子軌道計算によって反応の中間状態の構造を見積もった。その結果、8の字型構造の交差する部分で渡環相互作用が働き、橋掛けが起こった中間状態が示唆された。橋掛けが起こる二つの炭素原子間の距離は、銅錯体よりも亜鉛錯体の方が遠くなっていることがX線結晶構造解析の結果から分かっており、亜鉛錯体で骨格変換反応が進行しない理由であると考えられる。次に、コバルトとの錯化からは、コバルト単核錯体を定量的に得た。この単核錯体は熱による変換を起こさなかったが、更に酢酸銅と反応させる事によって得られたコバルト銅ヘテロ二核錯体において、熱によるポルフィリンへの変換反応が進行する事を見出し、実験的に反応の活性化パラメーターを得た。これを銅二核錯体の場合と比べる事で、反応がエントロピー支配的に進行する事を確認した。この結果は軌道計算の結果と矛盾しない。一方、トリフルオロエタノールを溶媒として用いたパラジウム錯化から得られた錯体が、軌道計算から示唆された反応の中間状態に類似した構造を有する事を、X線結晶構造解析から確認した。以上の結果より、軌道計算から示唆された反応機構の妥当性を示す事が出来たと言える。この他に、プロトン化による[36]オクタフィリンのメビウス芳香族性の誘起や、前例のない二価二配位銅錯体についての検討も行った。
都市化過程における青少年の生活構造の変容に関する研究

本研究においては,青少年の生活構造を社会化の視点から,生活関係を基軸として,生活行動とその関連諸要因-生活目標,生活手段,生活時間,生活空間-の全体関連的な組み合わせの一定のパターンと規定し,その現代的様相および都市化との関連における変容過程を明らかにしようとした.そこで,都市化が急激に進展しつつある地域社会として瀬戸大橋の架橋地である香川県坂出市とその周辺地域を調査地として選定し,都市部,都市近郊,島嶼部の三つの地域類型を設定して,比較しつつ課題にアプローチすることとした.そして,それぞれの地域に居住する小学校2年生, 4年生, 6年生および中学校2年生,高校2年生(都市部のみ)を対象に集合調査・留置調査による質問紙調査を実施した.また,これとは別に青少年の育成活動に携わる各種の関係団体の代表者を対象にした聴取調査を行ない,青少年の生活構造に関する各種の資料および意見を収集した.調査の結果,大要つぎの諸点が明らかになった.1.青少年の生活構造の様相は各地域類型によって異なること,つまり都市化によって変容していくこと.2.青少年の生活構造の様相は青少年の年齢の上昇とともに変化していくこと.特に中学生以降の生活構造のパターンは多様化すること.3.しかし,年齢による生活構造の変化の様相のパターンは各地域類型ともに近似的なパターンを示していること.4.家族・学校・地域とに区分した青少年の生活領域における生活関係のそれぞれの様相は相互関連的な関係にあること.本研究においては,青少年の生活構造を社会化の視点から,生活関係を基軸として,生活行動とその関連諸要因-生活目標,生活手段,生活時間,生活空間-の全体関連的な組み合わせの一定のパターンと規定し,その現代的様相および都市化との関連における変容過程を明らかにしようとした.そこで,都市化が急激に進展しつつある地域社会として瀬戸大橋の架橋地である香川県坂出市とその周辺地域を調査地として選定し,都市部,都市近郊,島嶼部の三つの地域類型を設定して,比較しつつ課題にアプローチすることとした.そして,それぞれの地域に居住する小学校2年生, 4年生, 6年生および中学校2年生,高校2年生(都市部のみ)を対象に集合調査・留置調査による質問紙調査を実施した.また,これとは別に青少年の育成活動に携わる各種の関係団体の代表者を対象にした聴取調査を行ない,青少年の生活構造に関する各種の資料および意見を収集した.調査の結果,大要つぎの諸点が明らかになった.1.青少年の生活構造の様相は各地域類型によって異なること,つまり都市化によって変容していくこと.2.青少年の生活構造の様相は青少年の年齢の上昇とともに変化していくこと.特に中学生以降の生活構造のパターンは多様化すること.3.しかし,年齢による生活構造の変化の様相のパターンは各地域類型ともに近似的なパターンを示していること.4.家族・学校・地域とに区分した青少年の生活領域における生活関係のそれぞれの様相は相互関連的な関係にあること.本研究においては、青少年の生活構造を社会化の視点から、生活関係を基軸として、生活行動とその関連諸要因-生活目標,生活手段,生活時間,生活空間-の全体関連的な組み合わせの一定のパターンと規定し、その現代的様相および都市化との関連における変容過程を明らかにしようとした。そこで、都市化が急激に進展しつつある地域社会として瀬戸大橋の架橋地である香川県坂出市とその周辺地域を調査地として選定し、都市部,農村部島嶼部の三つの地域類型を設定して、比較しつつ課題にアプローチすることとした。そして、それぞれの地域に居住する小学校2年生,4年生,6年生および中学校2年生,高校2年生(都市部のみ)を対象に集合調査・留置調査による質問紙調査を実施した。また、これとは別に青少年の育成活動に携わる各種の関係団体の代表者を対象にした聴取調査を行ない、青少年の生活構造に関する各種の資料および意見を収集した。調査の結果、大要つぎの諸点が明らかになった。1.青少年の生活構造の様相は各地域類型によって異なること、つまり都市化によって変容していくこと。2.青少年の生活構造の様相は青少年の年齢の上昇とともに変化していくこと。特に中学生以降の生活構造のパターンは多様化すること。3.しかし、年齢による生活構造の変化の様相パターンは各地域類型ともに近似的なパターンを示すこと。4.家族・学校・地域とに区分した青少年の生活領域における生活関係のそれぞれの様相は相互関連的な関係にあること。今後は、調査結果をさらに詳細に分析して、青少年の生活構造を構成する諸要因の相互関連性を明らかにするとともに、事例調査を実施して青少年の生活構造を総合的に把握することとする。
乳幼児の呼吸器・消化管感染症に対する次世代型舌下粘膜ワクチンの開発

バキュロウイルス発現系を用いてVP5、OVA、VP5+OVA、α2β1インテグリン(ヒト、マウス2種類)、NSP4の合成を行った。VP5、OVA、VP5+OVA、α2β1インテグリン(ヒト、マウス2種類)の発現は良好なことが確認されたが、NSP4の発現は確認できなかった。α2β1インテグリンに対するVP5、OVA、VP5+OVAの結合力をELISAを用いて分析した結果、OVAはα2β1インテグリンに結合しないが、VP5とVP5+OVAはα2β1インテグリンへの高い結合性が認められた。α2β1インテグリンは舌下粘膜にも発現することをマイクロアレイ解析によって確認しており、VP5を輸送担体としたワクチンが次世代粘膜ワクチンとして有用である可能性が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
再生医療用ナノ・マイクロプラットフォームの創製

本研究では,再生医療の実用化を目指し,3次元組織を低コストかつ省スペースで培養し,個別操作できるマイクロデバイスの開発に取組んだ.微細加工に適し,かつ細胞培養への適性を併せ持つ,新たな素材や,新規の単一細胞ハンドリング技術,新たなマイクロ流路作製技術等の要素技術を開発し,最終的には,それらを統合したオンチップ自動培養システムの実証機を完成させた.実証機では,1センチ角に100個の独立したマイクロウェルを配置し,人手を介することなく,組織体の形成から,分化誘導,ソーティングまで,個別に操作することに成功した.本研究では,再生医療の実用化を目指し,3次元組織を低コストかつ省スペースで培養し,個別操作できるマイクロデバイスの開発に取組んだ.微細加工に適し,かつ細胞培養への適性を併せ持つ,新たな素材や,新規の単一細胞ハンドリング技術,新たなマイクロ流路作製技術等の要素技術を開発し,最終的には,それらを統合したオンチップ自動培養システムの実証機を完成させた.実証機では,1センチ角に100個の独立したマイクロウェルを配置し,人手を介することなく,組織体の形成から,分化誘導,ソーティングまで,個別に操作することに成功した.(1)培養チャンバーユニット:マウス・ラット幹細胞の組織培養できるように、10mm角程度の空間を有する培養チャンバーユニットを、マイクロ光造形と、新開発の生体適合化プロセスにより作製した。チャンバーには、培地循環用の流路と、温度制御モジュールが接続され、自動制御することにより、幹細胞培養の大幅な省力化を達成した。(2)膜マイクロ流路ネットワーク:培養チャンバー内部で、3次元組織内の物質交換、および分化誘導剤のピンポイント投入を行うための、膜マイクロ流路ネットワークを開発した。膜マイクロ流路は多孔生体適合性ポリマーで作製され、流路内外の物質透過が可能である。(3)ナノファイバースキャフォールド:培養チャンバー内の、膜マイクロ流路以外の空間に、幹細胞が接着・増殖できるように、ナノファイバーカプセルを用いた新構造スキャフォールドを開発した。ナノファイバーカプセルは、生体適合性ポリマーからなり、100nm程度の不織布状表面形態と、φ数μmの中空カプセル構造を有し、細胞の接着と、空隙を利用した培地・薬剤の導入が効率的に行える。(4)細胞操作ナノアクチュエータシステム:チャンバー内でナノアクチュエータを自由自在に駆動し、単一細胞レベルの操作・刺激を行うため、ナノ光造形により、光トラップによる液中駆動可能なアクチュエータを開発した。さらに、これまで2次元に限られていた操作・観察系を、3次元で可能にするため、新たな光学系とソフトウェアの統合システムを完成させた。我々は、工学分野から、再生医療へ貢献することを目指し、独自に開発してきた3次元ナノ加工プロセス、マイクロアクチュエータ、微小力センシング、ナノ機能材料等の要素技術を統合し、細胞に生化学的および機械的刺激をピンポイントで与え、分化誘導を制御することのできる再生医療用プラットフォームの開発を進めている。我々が細胞の足場材料として、独自に発見した「ナノメッシュカプセル」は、1表面が微細な多孔質で覆われていること、2中空構造であること、3生分解性であること、という特徴を持つ。従来、足場材料として用いられてきたナノファイバーと比して、連続的な繊維ではなく粒子であるため、微細な3次元パターニングができる。また、ナノファイバーと異なり、球状の中空構造を持つため、高い空孔度を持った厚みのあるスキャフォールドが作製できる。本年度は、微細加工した導電性鋳型を対電極とすることで、立体スキャフォールドの作製を実証した。さらに、予めポリマー溶液に薬剤を混合することで、薬剤徐放性ナノメッシュカプセルの生成にも成功した。また、プラットフォーム内で細胞を操作するため、共焦点顕微鏡と光トラップ光学系を干渉せずに統合した新光学系を考案した。顕微鏡の対物レンズを動かす代わりに、共役位置においたレンズペアを駆動して、共焦点3次元像を取得する。光トラップによって駆動する細胞操作ナノロボットを3次元空間で自由に操作しながら、ロボット及び細胞の位置や変形を、任意の方向から、リアルタイムで3次元操作・観察・録画できるハードウェア及び専用ソフトウェアを開発した.本研究課題では,生体外で3次元的な組織を再生することを目指し,幹細胞に生化学的および機械的刺激をピンポイントで与え,分化誘導を制御することのできる再生医療用プラットフォームの開発を進めている.本年度は,個々の細胞上の局所に刺激を与えて分化誘導するため,リアルタイム3次元観察下で,光駆動マイクロロボットを操作できるシステムの高速化に取り組んだ.高速化には,構成するすべての要素の高速化が必要であるが,前年度までのシステムでは,光学系の効率が悪く,観察対象からイメージング素子に届く光量の低さがボトルネックとなっていた.そこで,可変焦点レンズを用いる方式を新たに考案し,プロトタイプを構築して,従来比2倍の高速化を実証した.また,胚様体形成プラットフォームについては,温度制御,湿潤環境維持,二酸化炭素濃度維持機能を追加し,手のひらサイズのシステムに全機能を集積した.これを用いてiPS細胞からの胚様体形成とタイムラプス観察を実証した。再生医療が臨床で役立つものとなるには,細胞レベルではなく,組織・臓器レベルの再生技術の開発が必要不可欠である.

我々は,独自に開発してきた3次元ナノ加工プロセス,マイクロアクチュエータ等の要素技術を応用し,再生医療用プラットフォームを開発することを目的としている.本年度は,幹細胞培養・分化誘導プロトコールの中で最も煩雑な工程の一つである,胚様体形成を効率化することを優先し,胚様体形成に特化したプラットフォームの開発を進めた.幹細胞の分化誘導では,3次元細胞凝集塊である胚様体を作製し,細胞間相互作用により分化を促進させる.胚様体の作製手法としては,浮遊培養法,ハンギングドロップ法などが知られているが,胚様体の作製,分化誘導,解析,回収の全ての工程をシームレスに行う装置は存在せず,分化誘導や組織形成を高効率・低コストで行うことを困難にしていた.我々が開発したプラットフォームは,手の平サイズの自動培養装置で,大量の胚様体の形成,分化誘導,観察が可能である.また,均一なサイズの胚様体を,多数一括形成した後,複数の系列に分化誘導することが可能であり,さらに,大量に形成・分化誘導された胚様体から,個々の胚様体を選択的に回収する機能を持つ.細胞培養部分は、PDMS製の柔軟な薄膜と空気圧駆動ラインから成る.PDMS薄膜の上部には流路が取り付けられている.空気圧伝達ラインには正方形の開放部を備えており,負圧を印加することで上部のPDMS薄膜が開放部に沿って凹み,胚様体を培養するためのマイクロウェルを形成する.空気圧駆動ラインと送液ラインは垂直に配置されているため,アレイ上の任意の胚様体を選択的に回収することができる.各々10本の圧力駆動ライン,及びマイクロ流路からなる合計100個の培養用マイクロウェルを備えたプロトタイプを作製し,ヒトiPS細胞を用いて胚様体形成を実証した.本研究課題では,生体外で3次元的な組織を再生することを目指し,幹細胞に生化学的および機械的刺激をピンポイントで与え,分化誘導を制御することのできる再生医療用プラットフォームの開発を進めている.これまでに,単一細胞や組織上の局所に刺激を与えて分化誘導するため,光駆動マイクロロボットを三次元的に操作し,リアルタイムで三次元観察できる高速共焦点顕微鏡システムを開発してきた.しかし,画像の更新速度を上げると,画像の光量が不足するというトレードオフ関係のために,力計測に必要なフレームレートを共焦点顕微鏡システムのみで実現することは困難であった.そこで,本年度は,光駆動マイクロロボット上に位置検出用のマーカを配置し、平面画像から光駆動マイクロロボットの位置と姿勢を3次元で高速に取得できる手法を開発した。これにより,力計測のデータ更新周期は,従来の10倍以上に向上した.また、光駆動マイクロロボットの局所に,非加熱,中性条件で金属コーティングを行う手法を開発した.この技術を用いて,ニードル状の光駆動マイクロロボットの先端に金属コーティングを施し,外部からのレーザ光照射により,細胞膜に微細穿孔する技術も開発した.これにより,培養中の細胞群の中で,特定の細胞のみに遺伝子操作や薬剤刺激を行うことが可能となった.26年度が最終年度であるため、記入しない。医用マイクロ・ナノマシン26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、工学分野から、再生医療へ貢献することを目指し、独自に開発してきた