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栄養素による時計遺伝子とメタボリック症候群の制御に関する研究

体内時計の制御機構をヒトで直接的に検討すべきであるが、ヒトでの検討には限界がある。実験動物であるマウスやラットの遺伝子配列は、ヒトと高い類似性があり、これらの実験動物で得られる実験結果は、ヒトの体内時計を解析する上で、非常に重要な知見になる。申請者は、遺伝的にメタボリック症候群を自然発症する実験動物より肝細胞を分離し、次いで、この肝細胞を多様な細胞外マトリックスを含むEHSゲル上で培養し、時計遺伝子のサーカディアンリズムを検討した。EHSゲルを培養デッシュにコーティングすると、肝細胞の基底膜に類似した環境を再構築でき、EHSゲルをコーティングしたデッシュ上で培養した初代培養肝細胞は、肝特異的遺伝子やタンパク質の発現、ホルモンによる酵素誘導を、in vivoに近い状態で再現できる特性を有する。その結果、時計遺伝子Cry1、Per2、Clockのサーカディアンリズムが、正常ラットとメタボリック症候群モデルラットで異なることを明らかにした。実験動物の脂質代謝関連遺伝子のサーカディアンリズムに対する摂取タンパク質の影響を検討したところ,肝臓・小腸・白色脂肪組織・褐色脂肪組織における脂質代謝関連遺伝子のサーカディアンリズムが摂取タンパク質の種類によって異なることを明らかにした。本研究では,メタボリック症候群を遺伝的に発症する実験動物を得られた初代培養肝細胞や株化線維芽細胞における時計遺伝子の発現リズムに異常があることを見いだした。ついで、動物性タンパク質と植物性タンパク質が、褐色脂肪のUCP1、UCP2遺伝子の発現量を亢進すること、肝臓のCyp7A1遺伝子のサーカディアンリズムに影響を与えることを明らかにした。以上のことより、メタボリック症候群モデル動物では、時計遺伝子の発現リズムに異常があること、摂取タンパク質は、脂質代謝のサーカディアンリズムに影響を与えることが示唆され、これらのことがメタボリック症候群の発症原因の一つであると考えられた。今後は,メタボリック症候群のモデル動物から樹立した株化繊維芽細胞を用いて時計遺伝子のサーカディアンリズムを検討すること,食品成分による制御を検討することが重要であると考えられる。申請者は、EHSゲルを用いた初代培養肝細胞が,in vivoサーカディアンリズムを再現できる可能性を示した。この実験系は、メタボリック症候群の発症に対する時計遺伝子の影響や、栄養素や食品成分による時計遺伝子やメタボリック症候群の制御機構を検討する上での有益な実験系になると期待できる。生体情報学購入した物品の物品費が,予定を下回ったために5,023円の残金が生じた。購入した物品の物品費が,予定を下回ったため残金が生じた。5,023円を次年度の物品費に使用する。次年度の物品費に使用する。
卵巣におけるキスペプチンネットワークの機能

視床下部で性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)神経の活動を調節するキスペプチンが、卵巣の顆粒層細胞にも発現し、排卵前のLHサージによって著しく発現の促進されることを発見・報告している(Laoharatchatathanin et. al., 2015)。本研究計画では、キスペプチンとGnRHを始めニューロキニンBやダイノルフィンなどの視床下部で関連の認められる神経ペプチドの卵巣での機能を明らかにする。初年度は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を投与して黄体化を誘起する幼若ラットモデルと顆粒層細胞の初代培養系を用いて、1)hCG投与によって、卵巣のGnRHとANXA5発現の増加することを明らかにした。2)初代培養顆粒層細胞で、hCGのプロジェステロン合成促進作用を、GnRHが抑制し、hCGとGnRHに相互作用のあることが明らかになった。3)hCGとGnRHは、相加的に顆粒層細胞のLH受容体発現を促進し、FSH受容体発現を有意に抑制した。4)黄体化に関与する遺伝子(p21、p27、FOXO1、プロラクチン受容体)の発現に対する作用もhCGとGnRHは相加的だった。これらの結果を受け、昨年度は、GnRHとキスペプチン、ダイノルフィン、ニューロキニンBの顆粒層細胞内での相互作用に着目した。これら全ての視床下部因子が顆粒層細胞に発現していること、hCGによって発現の増加することをインビボ、インビトロで観察した。更にGnRHがキスペプチン発現を促進すること、視床下部とは異なりキスペプチンはGnRH発現に影響しないことを明らかにした。GnRHはニューロキニンBとダイノルフィンの発現も促進した。これらの結果は、LHサージ後の顆粒層細胞黄体化の過程でこれら神経ホルモンが相互作用していることを示唆している。これらの成果を公表準備中である。本研究では、局所でのGnRHと顆粒層細胞に発現するキスペプチン、ニューロキニンBやダイノルフィンの関係を明らかにすることを目的とした。キスペプチンが、顆粒層細胞でもGnRH調節系として機能しているのかどうか調べたが、視床下部とは異なりキスペプチンにGnRH合成促進作用は認められず、逆にGnRHがキスペプチン合成を促進する結果が得られた。排卵前のLHサージによってキスペプチンやニューロキニンB、ダイノルフィンおよびGnRH合成が促進されるので、依然顆粒層細胞の黄体細胞への分化の過程に重要な役割を担っている可能性がある。次の諸問題が残されている。1)顆粒層細胞の黄体細胞への分化との関係黄体細胞への分化におけるGnRH、キスペプチン、ニューロキニンB、ダイノルフィン、ANXA5の働きを解明する。LHが細胞周期を停止し、分化を促進することが分かっているので、各ペプチドがLHの下流で作用する可能性を検討する。2)黄体細胞のステロイド産生能に対する影響ステロイド合成系への作用を解明する。分化の進んだ黄体では、旺盛なプロジェステロン合成が行われる。ステロイド産生酵素への影響だけで無く、コレステロール移送などを含めてそれぞれの影響を調べる。実験の進行に従って、継続実験を行う。卵巣での知見を他組織に当てはめられるかを検討する。LHによって顆粒層細胞で明確に発現の増加する神経ペプチドが、卵胞発育、排卵、黄体化(或いは卵胞閉鎖)に無関係とは考えにくいが、もしこれらと相関が無かった場合には、卵の成熟や受精能など他の排卵に伴う卵巣での現象との相関を調べる。最終年度は、2年目までに行ってきた実験の整理確認、補完実験を主に行うが、GnRH欠損マウス(hpg)とキスペプチンノックアウトラットの導入を試み、外部からのホルモン処置で卵胞の発育と排卵を誘起し、黄体化が起こるか、形態的に変化があるか、ダイノルフィン、ニューロキニンBを初めとして調べてきた遺伝子の発現変動に影響があるかなどを調べ、相互作用に加えて作用のヒエラルキーを明らかにすることを試みる。申請書には、3年目の研究を明治大学で行うと記したが、その後状況が変わり、岡山理科大学獣医学部に職を得、研究を継続している。共同研究者は北里大学にいて実験を継続している。岡山理科大では、細胞培養施設、レーザー顕微鏡(ZEISS LSM880)、その他必要な設備は整っている。性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)神経の活動を調節するキスペプチンが、卵巣の顆粒層細胞にも発現し、排卵前のLHサージによって著しく発現の促進されることを発見・報告している(Laoharatchatathanin et. al., 2015)。GnRHやキスペプチンが排卵前に急増する生理的意義が未解明である。円滑な周期的排卵には下垂体ホルモンに加えて卵巣局所の調節機構が必須と考えられる。本研究では、キスペプチンとGnRHを始めニューロキニンBやダイノルフィンによる視床下部で見られる神経ペプチドの機能を明らかにすることを目的としている。本年度の研究成果は次のようにまとめられる。未成熟雌ラット(25日齢)に妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)を投与して卵胞を発育させ、2日後に(hCG:ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン)を投与して黄体化を誘起するという幼若ラットモデルと顆粒層細胞の初代培養系を用いて実験を行った。

1)hCG投与によって黄体化が起こり、ステロイド合成能の促進される時、卵巣のGnRH mRNA発現が有意に増加し、顆粒層細胞にANXA5の発現することが明らかになった。2)初代培養顆粒層細胞で、hCGのプロジェステロン合成促進作用を、GnRHおよびGnRHアゴニストが抑制し、hCGとGnRHに相互作用のあることが明らかになった。3)hCGとGnRHは、相加的に顆粒層細胞のLH受容体発現を促進し、FSH受容体発現を有意に抑制した。4)黄体化に関与する遺伝子(p21、p27、FOXO1、プロラクチン受容体)の発現に対する作用もhCGとGnRHは相加的だった。これらの結果から、LHによって顆粒層細胞から黄体細胞へ分化する多くの過程にGnRHの介在することが明らかになった。成果を公表した。卵巣に想定される、キスペプチン、GnRH、NKB、ダイノルフィンのネットワークについて解析中である。本年度はGnRHが卵巣局所の変化に下垂体の性腺刺激ホルモンと共に関与していることを明らかにできた。関連ペプチドであるNKB、ダイノルフィン、更にGnRHの機能に直接関わると推定しているアネキシンA5に関する研究を進めている。視床下部で性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)神経の活動を調節するキスペプチンが、卵巣の顆粒層細胞にも発現し、排卵前のLHサージによって著しく発現の促進されることを発見・報告している(Laoharatchatathanin et. al., 2015)。本研究計画では、キスペプチンとGnRHを始めニューロキニンBやダイノルフィンなどの視床下部で関連の認められる神経ペプチドの卵巣での機能を明らかにする。初年度は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を投与して黄体化を誘起する幼若ラットモデルと顆粒層細胞の初代培養系を用いて、1)hCG投与によって、卵巣のGnRHとANXA5発現の増加することを明らかにした。2)初代培養顆粒層細胞で、hCGのプロジェステロン合成促進作用を、GnRHが抑制し、hCGとGnRHに相互作用のあることが明らかになった。これらの結果を受け、昨年度は、GnRHとキスペプチン、ダイノルフィン、ニューロキニンBの顆粒層細胞内での相互作用に着目した。これら全ての視床下部因子が顆粒層細胞に発現していること、hCGによって発現の増加することをインビボ、インビトロで観察した。更にGnRHがキスペプチン発現を促進すること、視床下部とは異なりキスペプチンはGnRH発現に影響しないことを明らかにした。GnRHはニューロキニンBとダイノルフィンの発現も促進した。これらの結果は、LHサージ後の顆粒層細胞黄体化の過程でこれら神経ホルモンが相互作用していることを示唆している。これらの成果を公表準備中である。本研究では、局所でのGnRHと顆粒層細胞に発現するキスペプチン、ニューロキニンBやダイノルフィンの関係を明らかにすることを目的とした。キスペプチンが、顆粒層細胞でもGnRH調節系として機能しているのかどうか調べたが、視床下部とは異なりキスペプチンにGnRH合成促進作用は認められず、逆にGnRHがキスペプチン合成を促進する結果が得られた。
プロジェクトマネジメントにおける管理会計の役割の研究

本研究は、企業組織のプログラム事業とプロジェクト間の実行メカニズムを管理会計的側面から明らかにしていくものである。その中で、企業のプロジェクト評価と事業プログラムの評価における業績評価尺度を仮説検証から明らかにし、関連マネジメントコントロールシステムの再構築を試みる。研究では、まず、関連する学際的文献調査を前提に、一連の関連する理論的貢献を収集分類する。そのうえ、関連する分野のフィールド調査をおこない、企業組織のプロジェクトを管理評価するための仮説モデルを検証することとその中での課題の抽出をおこなう。本研究では、これらの研究プロセスを通じて、企業組織における事業プログラムとプロジェクト間の一連のメカニズムを管理・評価するためのマネジメントコントロールシステムの構築を目指す。平成30年度においては、フィールド調査とアンケート調査の実施、そしてそれの関連研究成果をまとめることを重視して研究活動をおこなった。フィールド調査では、主に製造業を対象に企業を選定して、タイ王国(日本企業のグループ会社を含む4社)と、シンガポール(日本企業のグループ会社を含む5社)における企業の製品製造販売活動に関するヒアリング調査をおこなった。また、日本国内の公的組織と営利目的組織間でおこなったプロジェクト活動に関するヒアリング調査もおこなった。それと同時に当該研究期間中におこなった文献調査と専門家への意見収集、そしてフィールド調査から得られた知見をもとに、アンケート調査を実施、分析を行ったうえ、以上の活動に関する成果報告をおこなった。本研究は、企業組織の事業プログラムとプロジェクト間の実行メカニズムを管理会計的観点から明らかにするものである。具体的には、プロジェクト業績尺度と事業プログラムの業績尺度の関係を仮説検証から明らかにし、関連マネジメント・コントロールシステムの構築を試みる。平成27年度前半では、関連する学問研究分野の知見を収集、分類することを課題として、管理会計論、組織間管理論、プロジェクトマネジメント論、ネットワーク論などの、関連領域の国内外文献調査をおこなった。年度後半では、専門家への意見聴取を目的に、日本管理会計学会、国際戦略経営学会、国際プロジェクトプログラム(P2M)学会、日本会計研究学会等に出席し、関連研究分野の知見を収集することと、同時に、主な対象企業を選定して、韓国(韓国企業、1社)、ベトナム(ハノイ、ホーチミン市、日本企業のグループ会社、2社)、アメリカ(ニューヨーク市、日本企業のグループ会社2社を含む3社)において、企業活動について事前に調査質問状を送り、ヒアリング調査をおこなった。上記の活動以外に、国内外の学会報告で関連する研究内容について報告と議論をおこなった。当初、平成27年においては、関連研究文献調査、フィールド調査、そして、アンケート調査の実施を計画に研究をスタートしたが、結果的に、関連研究文献調査とフィールド調査、そして、それの関連研究実績の報告をおこなった。アンケート調査の実施は平成28年に予定している。関連研究領域の文献調査とフィールド調査を通して、一定の知見と仮説を立てることができた。得られた知見、理論から仮説を構築し、その理論と仮説をアンケートを設計し、理論検証していきたい。アンケート調査の実施においては、充分なデータの確保と回答率の向上に、いま以上の厳密さが要請されることから、先行研究からの調査項目の抽出からアンケートの設計までを、充分に検討して行いたい。本研究は、プロジェクトマネジメントにおける管理会計の役割を、企業組織の事業プログラムとプロジェクト間の実行メカニズムの観点から明らかにするものである。そこで、本研究では、プロジェクト業績尺度と事業プログラムの業績尺度の関係を仮説検証から明らかにし、関連マネジメント・コントロールシステムの構築を試みる。平成28年度においては、フィールド調査と文献サーベイから得られた知見の課題をしぼり、検討、総括することで研究をスタートした。平成28年度前半では、文献調査と企業での聞き取り調査などから企業における事業ビジネスとプロジェクトマネジメント成熟度モデル間の関連がある程度確認できた。これの成果をもとにして、国内外学会における論文の投稿・公開で、一定の成果を明らかにした。年度後半では、文献調査と専門家への意見収集、そして、それと同時に対象企業を選定して、海外(インドネシア)でのインタビュー調査を実施することで、アンケート調査のための仮説フレームワークを構築することができた。得られた知見と先行研究から調査項目を抽出、アンケートを設計していきたい。アンケート調査においては、充分な仮説検証のためには、データの確保と回答率の向上が要請される。さらに、内容の厳密さと正確さの面においても、アンケート設計には充分に検討をして行いたい。そのために、アンケート実施に時間がかかっている。本研究は、企業組織におけるプログラムとプロジェクトの実行メカニズムを管理会計的側面から明らかにしていくものである。その中、企業のプロジェクト評価と事業プログラムの評価における業績評価尺度を仮説検証から明らかにし、関連マネジメント・コントロールシステムの再構築を試みる。具体的な方法としては、関連する学際的文献サーベイを前提に、例えば、組織間管理論、プロジェクトマネジメント論、業績評価管理論の一連の理論的貢献を収集分類する。また、フィールド調査を踏まえて、プロジェクトを管理評価するための仮説モデルを設定、検証し、課題の抽出を行う。本研究では、これらを通して、企業組織における事業プログラムと製品開発プロジェクトまでの実行メカニズムを管理・評価するマネジメント・コントロールシステムの構築を目指す。平成29年度においては、関連する分野の学術文献のサーベイとフィールド調査を行い、得られた知見から課題をしぼり、検討、総括することができた。平成29年度前半では、文献調査と聞き取り調査などから企業組織間プロジェクトマネジメントにおける課題などについて確認することができた。これの成果をもとにして、国内研究会で報告を行い、一定の成果を明らかにした。平成29年度後半では、文献調査と専門家への意見収集、そしてフィールド調査から得られた知見をもとに、アンケート調査のための仮説

フレームワークの再構築と質問表、調査項目の精査に努め、一定の成果をあげることができた。アンケート調査の実施に時間がかかっている。アンケート調査手法による仮説検証型研究の際には、充分なデータの確保とそのための回答率、回収率の向上が必要不可欠である。調査の実施の際には、厳密な仮説フレームワークをもとに、質問表、調査項目の厳密さと正確さだけでなく、アンケート調査対象と実施時期なども充分に検討して行いたい。そのため、アンケート調査の実施に時間がかかっている。本研究は、企業組織のプログラム事業とプロジェクト間の実行メカニズムを管理会計的側面から明らかにしていくものである。その中で、企業のプロジェクト評価と事業プログラムの評価における業績評価尺度を仮説検証から明らかにし、関連マネジメントコントロールシステムの再構築を試みる。研究では、まず、関連する学際的文献調査を前提に、一連の関連する理論的貢献を収集分類する。そのうえ、関連する分野のフィールド調査をおこない、企業組織のプロジェクトを管理評価するための仮説モデルを検証することとその中での課題の抽出をおこなう。本研究では、これらの研究プロセスを通じて、企業組織における事業プログラムとプロジェクト間の一連のメカニズムを管理・評価するためのマネジメントコントロールシステムの構築を目指す。平成30年度においては、フィールド調査とアンケート調査の実施、そしてそれの関連研究成果をまとめることを重視して研究活動をおこなった。フィールド調査では、主に製造業を対象に企業を選定して、タイ王国(日本企業のグループ会社を含む4社)と、シンガポール(日本企業のグループ会社を含む5社)における企業の製品製造販売活動に関するヒアリング調査をおこなった。また、日本国内の公的組織と営利目的組織間でおこなったプロジェクト活動に関するヒアリング調査もおこなった。それと同時に当該研究期間中におこなった文献調査と専門家への意見収集、そしてフィールド調査から得られた知見をもとに、アンケート調査を実施、分析を行ったうえ、以上の活動に関する成果報告をおこなった。文献調査、フィールド調査から得られた知見の課題をしぼり、質問表を作成して、アンケート調査を実施、検証をおこなう。さらに業界毎に特徴のある企業をしぼり、フィードバック検証をおこなう。そして、分析結果の妥当性を固めて、より深い事例研究を行う予定である。
生物集団の運動の統一的模型と相転移としての群れ形成

車の流れでは、ある密度を境に突然状態が変わるという相転移の考え方を用いて、交通渋滞の性質を理解することができることが良く知られている。人の流れでも、密度が大きい時に狭い通路などで流れが詰まってしまう現象も、同様の考え方で理解できる。この研究は、車や人と同じ模型を用いて、生物の群れで起きる現象も統一的に説明しようとしたもので、その結果、生物の長い群れの隊列で発生する蛇行現象が同じ機構で説明できることがわかった。(1)1次元交通流の最適速度模型を基礎とした生物集団の運動の統一的な模型の構築(2)上記模型の安定性解析と数値計算による集団運動の性質の解析(3)上記模型の拡張の可能性の追求車の流れでは、ある密度を境に突然状態が変わるという相転移の考え方を用いて、交通渋滞の性質を理解することができることが良く知られている。本年度行なった研究の第一は、生物集団の統一模型の原型と想定している2次元最適速度模型において、一様な歩行者流の安定性の線形解析である。最適速度模型を歩行者に適用した場合、「歩行者は特定の方向に向かって進む」という性質が取り入れられる。その結果、空間軸の一つが特別な役割を果たすため、解析は簡単になる。昨年までの研究で、歩行者(以下粒子と略す)間の相互作用が斥力のみを含む場合については、一様流の安定性は明らかになっている。2次元では1次元の場合と異なり、高密度領域ではすべての感応度に対して不安定となる一方、低密度領域はほとんどすべての感応度に対して安定となっている。しかし今年度、引力も含めた場合に拡張して解析を行なった結果、引力がたとえ微小量でも存在すれば、低密度領域はすべての感応度に対して不安定となり、安定な領域は最適速度関数の勾配の大きい領域のみに限られることがわかった。最適速度模型では、粒子間に引力がある場合とない場合では1つのパラメタの値が異なっているに過ぎないにもかかわらず、得られる安定性が全く異なる物理的な機構についてはまだ不明である。この研究成果は2006年の国内および国際会議で発表を行ない(研究発表の1、3)、現在論文を執筆中である。上記の模型において、低密度で不安定な領域において数値シミュレーションを行なうと、粒子がいくつかのグループを形成し、各グループ間にはほとんど相互作用がない状態が最終状態として得られる。生物模型としては一つの方向を特別扱いしないようにする必要があると考えられるため、この状態が生物の群れ形成と見なせるかどうかについては、現在検討中である。本年度行なった研究の第一は、生物集団の模型の原型と想定している2次元最適速度模型において、引力がある場合の安定性の線形解析である。現在の2次元最適速度模型では「特定の方向に向かって進む」という性質が取り入れられているため、空間軸の一つが特別な役割を果たし、解析は簡単になる。その結果、引力が微小量でも存在すれば、低密度領域はすべての感応度に対して不安定となり、安定な領域は最適速度関数の勾配の大きい領域のみに限られることがわかった。この研究は論文1、2として発表した。続いて、生物運動に適用できる方向性のない模型についても研究中であるが、今年度の研究では数値シミュレーションによる結果しか得られていない。現在は解析的な研究の他、結果と対照できる実験的事実についても調査している。シミュレーションでは低密度で粒子(人、生物など)がいくつかのグループを形成することはわかっている。今年度では逆に高密度にした時に何が起こるかについても調べてみた。その結果、結晶に似た構造も現われ、物性系との関連の存在が期待できることがわかった。この成果は国際会議で発表を行なった(学会発表2)。本研究の目的は1次元交通流の模型である最適速度模型をべースに1次元から3次元までを統一的に扱う模型の構築である。そのため、模型の基礎になる交通流についても国内の研究者と共同で研究を行なっている。論文3はその実験的な研究の論文であり、国際的に高い評価を得た。学会発表1はその詳細を国際会議で行なったものである。この発表については現在論文を執筆中である。本年度の研究の第一目標は最適速度模型の線形解析であるが、これに関しては肯定的な結果はなく、向きのない場合や3次元への拡張の困難が明らかとなった。線形解析の代わりとして、数値シミュレーションによる研究を行ない、生物集団では一様な条件以外の設定が必要であることが認識された。そのため、プログラムの変更作業を実施している途中である。一方、生物模型の基礎となっている1次元最適速度模型についても、国内の研究者と共同で研究を行なっている。本年度はその実験的研究の詳細な解析の論文を執筆し、現在投稿中である。また、さらに次年度以降行なう予定の共同実験のための準備作業も本年度中に行なった。本実験は来年度実施予定である。また、生物の集団運動については、物理学的な研究に利用できるような公開データが少なく、各研究者が自分で用意する必要がある。本年度はそのような公開データ化を目指して、同期発光を行なう蛍の動画を撮影した。

そのようなものとして、東南アジアに生息する蛍が有名であるが、動画撮影が比較的容易に実行できるマレーシアを撮影地として選定した。現在は、動画を解析するソフトウェア開発を準備中である。本年度の研究としては、統一模型の原型と想定している2次元最適速度模型において、特定の方向へ進むという条件の下での安定性の解析を行なった。これまでの一様流の解析では、集団は空間全体を一様に埋め尽くすという条件の下で行なわれていたが、生物集団においては集団の大きさが空間内の有限の領域にのみ存在するという想定が必要である。本研究において、このような条件の下で安定性を調べると、これまでの一様流の状態では安定であったパラメタ領域においても、不安定になることがわかった。この不安定性の結果生じる運動は蛇行運動である。これは、魚などの群れが進行方向に長くなったときに現れる現象の力学的機構となる可能性がある。また、蛇行の不安定性はすべてのパラメタ領域で発生するため、一様かつ安定な状態は存在しない。即ち、2次元最適速度模型の範囲内での不安定性の議論としては本研究成果は最終的なものになる。以上の成果は年度当初の計画通りであった。この成果については現在論文執筆中であるほか、2010年度の国際会議で発表する予定である。これまでの成果をまとめると、1次元交通流における一様流の不安定性による渋滞機構、2次元歩行者流における詰まり現象などの力学的機構、2次元での生物集団の蛇行運動の3つが、一様流の不安定性という枠組みの中で統一的に理解できることになった。また、この枠組み内での不安定性による機構は以上の3つがすべてであり、これ以外の生物の集団運動に現れる現象の性質を調べるためには、模型の拡張が必要であると結論付けられる。
自己免疫性神経疾患のB細胞クロナリティーの検出とその病因的意義に関する研究

ヒトB細胞を細胞株した後、RT-PCR法により免疫グロブリン遺伝子重鎖の可変領域を形成する部分の塩基配列を決定する方法を確立した。自己抗体産生細胞として、慢性関節リウマチの滑膜組織由来のリウマチ因子産生B細胞を対象に免疫グロブリン遺伝子重鎖の可変領域の塩基配列を決定した。その結果、それらの可変部領域、特にCDR3(complement dtermining region 3)領域には多くの体細胞突然変異が導入され、自己抗体であるリウマチ因子の産生機転には免疫複合体など自己抗原による刺激が重要な役割を果たすことが明らかにされた。一方、免疫グロブリン遺伝子の産生制御機構のひとつに活性酸素の関与が示唆されている。またアポトーシスは変性疾患特に神経変性疾患で重要な役割を果たすと考えられている。L-DOPAは難治性神経疾患であるパーキンソン病の治療薬であるが、L-DOPAには自己酸化或いは細胞内での代謝過程で生じる活性酸素により、アポトーシスを誘導する可能性がる。今回私は、L-DOPAは主に自己酸化の過程における活性酸素の産生を介して、神経細胞株であるPC12細胞にアポトーシスを誘導することを、カタラーゼやsuperoxide dismutaseなど抗酸化物質によるアポトーシスの抑制実験や細胞死の過程における細胞内活性酸素量の変化を直接経時的に測定することで明らかにした。さらに免疫調節剤であるブシラミンにも銅イオン存在下でアポトーシスを誘導する活性があることを同様の方法により明らかにした。本研究の目的は、自己免疫性神経疾患における免疫グロブリン遺伝子の可変領域(VH)に関するB細胞レパートリーを解明することにある。本研究における到達目標の第1点は、VH(各1-6)ごとのB細胞レパートリーをPCR-SSCP法またはCDR3-length法により明らかにするアッセイ方法を確立することであり,第2点は、自己免疫性神経疾患を対象に末梢血及び髄液中のB細胞レパートリーを検討することである。平成7年度の研究により、まずlgM・lgG・lgAの各クラスの免疫グロブリン重鎖遺伝子をPCR法により増幅単離する条件を決定することができた。具体的には、まず末梢血より全RNAを抽出し、lgG・lgA・lgMのそれぞれのFc部分に特異的な下流プライマーを用いてcDNAを合成し、PCR法による増幅には、VH1-6に特異的な上流プライマーとFc部分のプライマー(特異性を上げるために、cDNA合成に用いた部分より内側のFc部分に設定)とを用いた。更に、ポリアクリルアミドゲル及び自動シークエンス機により、得られたバンドを展開することで、免疫グロブリン重鎖遺伝子のCDR3長を決定できることが判明した。平成8年度は、CDR3長の解析法を完成させ、当初の計画に沿い、炎症性あるいはB細胞腫瘍性の神経疾患患者を対象にして、病変部位(髄液あるいは生検部位)と末梢血とで、免疫グロブリン重鎖のCDR3長を比較検討する予定である。L-DOPAは難治性神経疾患であるパーキンソン病の治療薬であるが、L-DOPAには自己酸化或いは細胞内での代謝過程で生じる活性酸素により、アポトーシスを誘導する可能性がある。

今回私は、L-DOPAは主に自己酸化の過程における活性酸素の産生を介して、神経細胞株であるPC12細胞にアポトーシスを誘導することを、カタラーゼやsuperoxide dismutaseなど抗酸化物質によるアポトーシスの抑制実験や細胞死の過程における細胞内活性酸素量の変化を直接経時的に推定することで明らかにした。さらに免疫調節剤であるブシラミンにも銅イオン存在下でアポトーシスを誘導する活性があることを同様の方法により明らかにした。
低温域における加熱媒体としての氷スラリーの凝固挙動および凝固熱伝達特性の解明

本研究では,微細な氷と液体の固液二相混合物である氷スラリーを対象とし,氷スラリーの凝固特性および凝固を伴う熱伝達特性の解明を目的としている.研究第一段階では,氷スラリーを冷却した際の凝固挙動の観察を行い,氷スラリーが冷却面に固着しない条件等の提案を行う.具体的には,氷スラリーを生成する際の水溶液の種類,伝熱板の材質が凝固過程に及ぼす影響について検討する.研究の第二段階では,固着しない条件にて液相の凝固を伴った熱伝達率の計測を行う.本研究では,微細な氷と液体の固液二相混合物である氷スラリーを対象とし,氷スラリーの凝固特性および凝固を伴う熱伝達特性の解明を目的としている.研究第一段階では,氷スラリーを冷却した際の凝固挙動の観察を行い,氷スラリーが冷却面に固着しない条件等の提案を行う.具体的には,氷スラリーを生成する際の水溶液の種類,伝熱板の材質が凝固過程に及ぼす影響について検討する.研究の第二段階では,固着しない条件にて液相の凝固を伴った熱伝達率の計測を行う.
糖尿病網膜症における可溶型VAP-1/SSAOの産生機構

糖尿病網膜症は糖尿病罹病期間にともなってその発症率が急増する細小血管障害であり、世界的な高齢化にともなって糖尿病網膜症患者数も今後増加すると推測されている。Vascular adhesion protein (VAP)-1/semicarb azide-sensitive amine oxidase (SSAO)は、生体内に存在する一級アミンを酸化してアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を産生する酵素である。先行研究で、抗血管内皮増殖因子(VEGF)製剤を投与した増殖糖尿病網膜症患者の硝子体中の可溶型VAP-1/SSAO濃度は低下することが明らかとなっており、VEGFが可溶型VAP-1産生経路の上流にあることが示唆されている。本研究の目的は、「糖尿病網膜症眼内における可溶型VAP-1/SSAOの産生メカニズムと同疾患の病態責任分子VEGFの関連」について検討することである。本年度は昨年度のヒト硝子体検体およびラット網膜血管内皮細胞(TR-iBRB2)を用いた検討結果を踏まえ、VEGFが糖負荷条件下において網膜血管内皮細胞からのVAP-1/SSAO分泌を亢進させる機序を検討した。網膜血管内皮細胞において腫瘍壊死因子TNF-αやインターロイキン1β(IL-1β)などの炎症性サイトカインがマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)を誘導し、膜型VAP-1切断によって可溶型VAP-1/SSAOを同細胞から遊離させることを我々は先行研究で明らかとしている。そのため、MMPsがVAP-1/SSAO分泌に関与しているとの仮説を立て、その検証をおこなった。ゼラチンザイモグラフィー法を用いて、MMP-2とMMP-9活性化率がVEGF刺激によって増加すること、またMMP阻害剤Batimastatによって膜型VAP-1切断が抑制されることが明らかとなった。平成30年度交付申請書に記載した研究計画のうち、膜型VAP-1の切断によって可溶型VAP-1/SSAOを産生する酵素としてMMPsを特定したことから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。先行研究で、抗VEGF製剤を投与した増殖糖尿病網膜症患者の硝子体中の可溶型VAP-1/SSAO濃度は低下することが明らかとなっており、VEGFが可溶型VAP-1産生経路の上流にあることが示唆されている。本年度の研究により、抗VEGF製剤を投与した増殖糖尿病網膜症患者の硝子体中の可溶型VAP-1/SSAO濃度、および酸化ストレスマーカーであるヘキサノイルリジン(N epsilon-(hexanoyl)lysine、HEL)が有意に低下するという結果が得られた。抗VEGF製剤を投与しない増殖糖尿病網膜症患者の硝子体中では可溶型VAP-1/SSAO濃度とHEL濃度に正の相関がみられたが、抗VEGF製剤を投与した群では両者の相関は失われていた。さらに、ラット網膜血管内皮細胞(TR-iBRB2)を用いて糖尿病を模した25 mMの糖負荷条件でのin vitro解析をおこない、同条件下でVEGF(1-100 ng/ml)刺激をすると、培養上清中のVAP-1/SSAO濃度および、SSAO酵素活性が有意に増加するという結果を得た。VAP-1 mRNAの発現量はVEGF刺激により変化しなかった。これらの結果から、VEGFが糖負荷条件下において網膜血管内皮細胞からのVAP-1/SSAO分泌を亢進させることが示唆された。平成29年度交付申請書に記載した研究計画のうち、可溶型VAP-1/SSAOの産生メカニズムにおけるVEGFの関与については検討により学術的意義のある結果を得ていることから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。

網膜血管内皮細胞において腫瘍壊死因子TNF-αやインターロイキン1β(IL-1β)などの炎症性サイトカインがマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)を誘導し、膜型VAP-1切断によって可溶型VAP-1/SSAOを同細胞から遊離させることを我々は先行研究で明らかとしている。そのため、MMPsがVAP-1/SSAO分泌に関与しているとの仮説を立て、その検証をおこなった。ゼラチンザイモグラフィー法を用いて、MMP-2とMMP-9活性化率がVEGF刺激によって増加すること、またMMP阻害剤Batimastatによって膜型VAP-1切断が抑制されることが明らかとなった。平成30年度交付申請書に記載した研究計画のうち、膜型VAP-1の切断によって可溶型VAP-1/SSAOを産生する酵素としてMMPsを特定したことから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。平成30年度は、VEGFによる可溶型VAP-1/SSAO産生増加の機序を検討する。近年、可溶型VAP-1/SSAOは膜型VAP-1が蛋白切断を受けて生じる遊離型フォームであることが構造解析によって明らかとなった。しかしながら、可溶型VAP-1/SSAOを遊離させる蛋白分解酵素については不明な点が多い。VEGF添加により発現および活性に変化を生じる蛋白分解酵素をreal-time PCR法、ウェスタンブロット法、ELISA法、ゼラチンザイモグラフィーなどにより探索する。また、発現および活性の増加が認められた蛋白分解酵素に対する阻害剤あるいはsiRNAによって可溶型VAP-1/SSAO産生が抑制されるかを検討する。理由:平成29年度の研究計画は可溶型VAP-1/SSAOの産生メカニズムにおけるVEGFの関与の検討であったが、順調に研究が行われ、予定よりも低額の研究費で計画遂行が可能であったため。使用計画:平成30年度に計画している、VEGFによる可溶型VAP-1/SSAO産生増加の機序の検討において、real-time PCR、ウェスタンブロット、ELISA、ゼラチンザイモグラフィーなど実験に用いる試薬・抗体および蛋白分解酵素阻害剤やsiRNAの購入に使用する予定である。理由:平成30年度の研究計画は可溶型VAP-1/SSAOの産生機序の検討であったが、順調に研究が行われ、予定よりも低額の研究費で計画遂行が可能であったため。使用計画:令和元年度に計画している実験に用いる試薬・抗体および蛋白分解酵素阻害剤やsiRNAの購入に使用する予定である。
マウス生殖細胞で発現するsmall RNAとエピジェネティクス

胎児精巣よりsmall RNAを単離し、超高速シークェンサーを用いて網羅的にシークエンス・解析をおこなった。その結果、胎児精巣にはレトロトランスポゾンの配列をもったpiRNAが大量に存在することが明らかとがらが。またこのレトロトランスポゾンの配列をもつpiRNAが、レトロトランスポゾンのsilencingにはたらいていることが明らかとなった。また、piRNAができないようなmutantでは、レトロトランスポゾンのDNAメチル化も減少すろことから、piRNAがDNAメチル化を介してレトロランスポゾンの抑制に働いている可能性が示唆され、論文にまとめた。また、成長期卵母細胞からも、small RNAを単離し、超高速シークエンサーを用いて綱羅的に、シークエンス・解析をおこなった。その結果、卵母細胞で発現するsiRNAを大量に同定するとともに、siRNAが卵母細胞でレトロトランスポゾンのsilencingとmRNAの発現調節にはたらくことが明らかとなった。siRNAの前駆体となる二本鎖RNAが、RdRPによる酵素の作用ではなく、sense RNAとantisense RNAによって自然に形成されていることも、配列解析によって明らかとなった。また、多くのsiRNAが偽遺伝子領域に由来し、その偽遺伝子のもととなった遺伝子の発現制御にはたらいていることがわかった。このことから、今まで機能のわからなかった偽遺伝子が、機能的な遣伝子の抑制を担うことが明らかとなり、これらの結果を論文としてまとあた。マウスの胎生期のオスの生殖細胞および卵子より、RNAを回収し、small RNA libraryを作製し、シークエンスをおこなった。オスの生殖細胞にはレトロトランスポゾンの配列をもったpiRNAがあることがわかった。このpiRNAはDNAのメチル化を介して、レトロトランスポゾンの抑制にはたらいてることを共同研究で明らかとし、論文にまとめた。卵には、大量のsiRNAがあることを明らかにし、レトロトランスポゾンの抑制と遺伝子発現制御に働くことがわかった。これらのsiRNAがどのようにできるかを調べたところ、偽遺伝子から生成していることがわかった。これらの偽遺伝子から生成したsiRNAは、配列上類似性をもつ遺伝子から転写されてできるmRNAの分解にはたらいている。今まで、機能のわからなかった偽遺伝子が、機能的な遺伝子の抑制をになうことが明らかとなった。現在、論文を投稿中である。
統合失調症動物モデルにおける認知障害発現に関わる神経機構の解明

本研究は、電気生理学的測定に適した注意セット転換(ASS)機能検査システムの開発と、それを用いた健常動物および統合失調症モデル動物における注意セット転換機能に関与するニューロン群の応答特性解明を目的として実施された。ニューロンのユニット活動と時間的同期が容易な視覚および聴覚刺激を弁別刺激とするASS機能検査システムを開発し、ラットを被験体として課題遂行中の内側前頭前皮質(mPFC)ニューロンのユニット活動を記録した。その結果、記録されたmPFCニューロンの約27%が注意転換に関連した発火活動変化を示し、さらにこの注意転換関連性応答には10タイプの活動パターンがあることを明らかにした。25年度は、ニューロンのユニット活動記録に適した注意方略転換(ASS)能力検査システムの開発と、正常動物の本検査課題における基準的ニューロン応答パターンを同定することに注力した。光刺激と音刺激を同時提示し、一方の感覚モダリティのみが報酬獲得行動において弁別刺激となるようなASS課題を設定し、報酬刺激を脳内快領域(内側前脳束)に対する通電刺激とすることにより、弁別刺激の呈示タイミングとオペラント行動反応タイミングが正確に把握でき、多数試行の遂行が可能な課題状況を実現した。しかしながら、ASS課題自体がラットにとって非常に難しい課題であるため、当初、訓練開始から課題学習完成までに50日程度要したが、最終的に10日以内に課題習得可能な強化スケジュールを確立した。課題遂行中の単一ユニット活動記録により、内側前頭前皮質(mPFC)ニューロンの活動には以下の6種類の応答パターンが存在することを見出した。1)個別の弁別刺激には応答しないが、方略転換(set shifting)後に一過的な自発発火頻度の低下を示す2)個別の弁別刺激には応答しないが、方略転換後に一過的な自発発火頻度の増加を示す3)弁別刺激呈示直前の2秒前から発火頻度が漸次的に増大し、弁別刺激の定時後、発火頻度が1秒以内にベースラインレベルに戻る(方略転換後、一過的に増強)4)弁別刺激呈示0.1秒前くらいから発火頻度が低下し、弁別刺激呈示期間中、発火頻度低下が維持される5)弁別刺激呈示0.1秒前くらいから発火頻度が増加し、弁別刺激呈示期間中、発火頻度増加が維持される6)個別の弁別刺激に対しても、また、方略転換の前後でも発火頻度の変化を示さない。この内、13が方略転換に関連するニューロン応答と推定され、記録したmPFCニューロンの21%がこのタイプの応答特性を示した。特に12タイプの応答パターンは従来のASS課題を用いた研究で報告されておらず、本研究での新知見といえる。26年度は前年度開発した電気生理学的ニューロン活動記録に適した注意セット転換(attention set-shifting; ASS)機能計測システムをさらに改良することと、このシステムを利用して、統合失調症の代表的な薬理学的動物モデルであるフェンサイクリジン(PCP)慢性投与ラットにおける注意転換障害に関わる神経機構の検討を研究目標とした。ASS計測システムの改良については、ラットの行動における個体差に応じた細かな強化スケジュール管理を可能にする制御ソフトウエア開発を行い、この結果、注意転換時の初回記録が訓練開始から安定して10日以内で実施できるようになった。今回の技術的改良で従来の方法より短期間で計測可能なシステムを完成させることができた。しかしながら、PCP慢性投与ラットにおける計測においては、少なくとも今回のPCP投与法(10mg/kg, i.p., 10回)で疾患モデルラットにおいて一貫した注意転換障害が認められなかった。そこで、今回の投与法によるPCP慢性投与ラットの全般的な前頭前皮質活動レベルを検証するため、[18F]FDG-PETを用いて前頭前皮質における糖代謝を測定した。この結果、PCP慢性投与ラットの前頭前皮質糖代謝レベルは統制群である生理食塩水投与ラットの糖代謝レベルと有意な差異が認められなかった。今回用いたPCP慢性投与法は統合失調症動物モデルを作成する際によく用いられる方法であるが、安定した統合失調症様の認知障害を引き起こす手法としては不適切と考えられる。よって、より信頼性の高いPCP慢性投与モデル作成法を開発することが急務である。本研究で開発した注意構え転換(ASS)課題の遂行成績が、PCP反復投与により顕著な低下を示すようなPCP投与プロトコルを研究期間内に確立することが困難であったため、PCP反復投与動物での記録を断念し、最終年度は統制群となる生食投与ラットにおける前頭前皮質(PFC)ニューロン活動のデータ記録に専念した。ASS課題遂行中に、総計127個のPFCニューロンから単一ユニット活動を記録した。記録された127ニューロンのうち、53個(41.7%)のニューロンが課題関連性の応答を示し、その内、34個(26.8%;課題関連性応答するニューロンの64.2%)のニューロンが注意転換に関連する応答変化を示した。課題関連性応答するニューロンのうち、条件刺激(光または音)に対して興奮性ないし抑制性応答するものが各々約20%、脳内報酬刺激に対して興奮性ないし抑制性応答するものが各20%であった。注意転換前後で応答特性が変化するニューロンは、条件刺激に対する応答が注意転換前後で無応答から抑制性応答に変化するものが一番多く(11個;注意関連応答するニューロンの32.4%)、続いて脳内報酬刺激に対する応答が興奮性応答から無応答に変化する(8個;23.5%)ものが多かった。

ユニット記録部位のフィールド電位に関して時間周波数解析も実施したが、各周波数帯域の振幅、試行間位相同期性において、注意転換前後で有意な変化が認められなかった。本研究では、健常ラットにおけるASS課題時のニューロン活動特性を明らかにすることができたが、当初予定していた統合失調症モデル動物におけるPFCニューロン活動異常を検証することができなかった。今後、PCP反復投与モデル以外の統合失調症動物モデルにおいて同様の記録を試みる予定である。本研究は、電気生理学的測定に適した注意セット転換(ASS)機能検査システムの開発と、それを用いた健常動物および統合失調症モデル動物における注意セット転換機能に関与するニューロン群の応答特性解明を目的として実施された。ニューロンのユニット活動と時間的同期が容易な視覚および聴覚刺激を弁別刺激とするASS機能検査システムを開発し、ラットを被験体として課題遂行中の内側前頭前皮質(mPFC)ニューロンのユニット活動を記録した。その結果、記録されたmPFCニューロンの約27%が注意転換に関連した発火活動変化を示し、さらにこの注意転換関連性応答には10タイプの活動パターンがあることを明らかにした。平成26年度の研究で、我々は従来の研究でしばしば用いられてきたPCP慢性投与法を用いて、統合失調症モデルラットの作成を試みたが、統合失調症患者で障害が認められている注意構え転換(ASS)課題で一貫した障害を再現することができなかった。PETを用いた前頭前皮質の糖代謝レベル測定においても、PCP慢性投与群に有意な代謝レベルの変化が認められず、少なくとも今回用いた慢性投与モデル作成法が、安定した注意転換障害を引き起こすモデル動物作成法として不適切なものと考えられる。ASS課題で注意転換障害が安定して生じる統合失調症モデル動物を用いて電気生理学的計測を実施するというのが、本研究計画の大前提であるが、残念ながらこの前提を確立できていない。神経生理学新たなPCP反復投与法を開発し、注意転換障害が安定して生じるような信頼性の高いPCP慢性投与動物モデルを確立することが、今年度研究の第1優先課題である。これに関しては、投与量、投与回数、断薬期間等の改良で改善される可能性が高いことを予備実験で把握しているので、今期の前半で解決できそうである。信頼性の高い認知障害モデルラットの確立と並行して、モデル動物における電気生理学的ニューロン活動記録を実施し、可能な限り研究の遅れを挽回したい。注意方略転換(ASS)課題は、一般に齧歯類動物にとって非常に難しい課題であるため、課題習熟に長い訓練期間を必要とする。本研究で開発したASS課題においても、通常の強化訓練スケジュールでは習熟するのに1ヶ月以上の日数が必要であった。脳内刺激を報酬刺激としている関係上、訓練開始前に電極埋め込み手術をしなければならないので、課題習熟までに長期間を要するのは、埋め込み電極の耐久性を考慮すると実用性の面で非常に好ましくない。そこで、課題習熟に要する期間を大幅に短縮できるような強化スケジュールを新たに開発する必要に迫られた。この最適強化スケジュールの開発に多くの期間を要してしまい、年度内に当初予定していた統合失調症モデル動物における記録まで至らなかった。26年度に実施した注意転換
細胞内栄養センサーとしてのリボソームの翻訳伸長停止メカニズムの解明

本研究では,新生ポリペプチド鎖に依存したリボソーム停滞機構の解明を目指し,特にリボソームタンパク質uL4に着目して以下の研究を進めた.(1)新生ポリペプチド鎖依存的なリボソーム停滞へのuL4の関与リボソームタンパク質uL4はループ構造を有し,新生ポリペプチド鎖の通り道(出口トンネル)を形成する.リボソームの活性中心から出口に1/3程度(10アミノ酸程度)進んだところに,uL22とともにuL4のループ構造が突き出し,狭窄部位が形成される.本研究では,uL4のループ領域にさまざまな変異をもつuL4-FLAG遺伝子を発現するシロイヌナズナ株を材料とした.これらの株から無細胞翻訳系を作製し,複数の制御性ポリペプチド鎖に依存したリボソーム停滞への狭窄部位の関与を評価した.その結果,uL4のループ領域への変異は対象となる配列により異なる結果を示した.また,短いポリペプチド鎖に依存したリボソーム停滞には影響を与えなかった.新生ポリペプチド鎖に依存したリボソーム停滞にリボソーム狭窄部位が関与する生化学的証拠を示しただけでなく,多様な配列をもつ制御性ポリペプチド鎖が狭窄部位に異なる形で作用し,リボソーム停滞を誘導することを見出した.(2)機能不全リボソームタンパク質によるリボソームストレス応答前年度の解析から,ループ領域の大部分を欠く改変型uL4-FLAGを発現するシロイヌナズナ株では,葉の形態異常が見られた.生化学的解析により改変型リボソームタンパク質の機能を評価したところ,遊離のリボソームタンパク質でなく,リボソームサブユニットへの結合が示唆されたが,いまだ機能不全かどうかを示す結果は得ていない.また,RNA-seq解析の結果,コントロール株に比べて改変型uL4-FLAGを発現するシロイヌナズナ株ではいくつかの転写因子の発現が上昇しており,リボソームストレス応答が示唆された.本年度は,リボソーム停滞を誘導する制御性ポリペプチド鎖の中でも,リボソーム内部で狭窄部位と相互作用できないほどに短い配列(10アミノ酸以下)を新たに解析対象に加えた.その結果,これらの制御では,uL4のループ領域の変異に依存せず,野生型リボソームと同様にリボソーム停滞が誘導されることを示すことができた.前年度に明らかとなった機能不全と考えられる改変型リボソームタンパク質の機能解析を進め,興味深いことにリボソームサブユニットへの結合を示唆する結果を得た.また,葉の形態異常に加え,改変型リボソームタンパク質を発現するシロイヌナズナ株では,他の段階でさらなる異常を示すデータも得られた.ただ,今年度に予定したリボソームタンパク質uL22変異体を用いた解析が進まず,次年度へ繰り越しとなった.次年度は,リボソームタンパク質uL22に着目し,新生ポリペプチド鎖に依存したリボソームの停滞への関与を検証し,学術論文の投稿準備を進める.また,ループ領域を大きく欠いた改変型uL4を用いた解析を進め,リボソームタンパク質の機能異常が発生・発達段階へ及ぼす影響を検証する.uL4のループ領域に小さな変異をもつシロイヌナズナ株を材料としたリボソームプロファイリング解析を行い,リボソーム狭窄部位を介して発現制御される遺伝子を同定し,生理学的意義を考察する.本年度は,翻訳途上の新生ポリペプチド鎖がリボソームの翻訳停止を誘導する機構の解明を目指して研究を進めた.リボソームタンパク質uL4はループ構造を有し,リボソームタンパク質uL22とrRNAとともに新生ポリペプチド鎖の通り道(出口トンネル)を形成する.本研究では,uL4のループ領域に変異導入された変異型uL4-FLAG遺伝子を発現するシロイヌナズナ株を材料とした.はじめに,これらの形質転換株を用いた生理学・生化学的解析を行い,ループ領域に変異をもつuL4を取り込んだ変異型リボソームの植物体内での機能性を確認した.次に,これらの形質転換株からシロイヌナズナ細胞抽出液を作製し,複数の新生ポリペプチド鎖に依存したリボソームの停滞への出口トンネルの関与を評価した.その結果,uL4のループ領域に欠失変異をもつ形質転換株由来の細胞抽出液では,変異型リボソームに依存してリボソームの停滞効率が減少した.一方,uL4のループ領域頂点にアミノ酸置換をもつ変異型リボソームでは,リボソームの停滞効率に影響が見られなかった.これらの結果は,リボソーム停滞効率の変化が出口トンネルと新生ポリペプチド鎖との相互作用の変化に起因することを示唆する.また,特定の小分子が新生ポリペプチド鎖に作用し,出口トンネル内部で新生ポリペプチド鎖のコンホメーション変化を誘導する例が報告されている. uL4のループ領域への欠失変異の導入は新生ポリペプチド鎖のコンホメーション変化だけでなく,リボソームの停滞も抑制した.これらの結果は,翻訳途上の新生ポリペプチド鎖が細胞質中の小分子を感知してコンホメーションを変化させ,リボソーム出口トンネルとの相互作用を介してリボソームの翻訳停止に寄与することを示す重要な知見である.本年度に得られた成果は国際学会を含む複数の学会で報告し,国際学術論文として投稿準備中である.本年度は,リボソームの停滞を誘導する複数の遺伝子に対し,リボソームタンパク質uL4が翻訳途上の新生ポリペプチド鎖との相互作用を介してリボソームの停滞に寄与することを生化学的に示した.その過程で,ループ領域の大部分を欠く変異型uL4を発現する形質転換株では,葉の形態異常が見られることが明らかとなった.