hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宇宙X線観測用位置検出型蛍光比例計数管(ISPC)の開発

本研究ではX線天文衛星への搭載を目ざして、位置検出型蛍光比例計数管(ISPC)の開発を行った。2年間の研究で、以下の成果が得られた。(1)ISPCの概念設計。種々のシミュレーションや予備実験によりISPCの基本設計を固め、開発環境の整備を行った。(2)位置検出型フォトチューブ(PSPT)の評価試験。PSPTは、ISPCガスセルの発光の強度と位置を測定するもので、ISPC開発の鍵となる要素のひとつである。本研究ではPSPTの特性を実験により詳しく調べ、その動作を理解するとともに、既存のPSPTにより所期の性能をもったISPCが開発可能との評価に達した。またPSPTの改良への指針を得た。(3)ISPC実験室モデルの製作。ガラス製のガスセルとクォーツ窓のPSPTを用いることで、実験室レべルで安定して動作するISPCの開発に成功した。さまざまな改良の結果、広い入射範囲(直径40mm)にわたり良いエネルギー分解能(5.9keVで8%)と十分な位置分解能(1mm以下)を達成できた。またISPC内部の物理過程やバックグラウンド除去の方法について、多くの知見を蓄積した。(4)衛星搭載品開発の準備。電子回路部や高圧電源の設計、機上データ処理ロジックの開発、PSPTの耐振化、べリリウム窓材の検討なども行い、衛星搭載用ISPCを製作するための準備作業を行った。以上の成果により、3インチ径のPSPTを用いて、所期の性能をもつISPCを作る見通しを得ることができた。またISPC製作のノウハウを蓄積し、衛星搭載品を作る際に必要な基本技術を確立できた。よって本研究はその目的を十分に達成できたといえる。またこれは、わが国4機目のX線天文衛星として打上げが予定されている、ASTROーD衛星計画を支える、重要な成果と考えられる。本年度は研究実施計画にそってISPCの開発をスタートし,次のような結果が得られた.1.計算機シミュレーションにISPC特性の研究:ISPCの発光領域で作られた紫外線がphototubeに入射するプロセスを,計算機シミュレーションにより考察した.その結果phototube上のphoton分布は, FWHM23mmの極めてシャープなピークと広がった裾とを持つ事がわかった.従来はこの分布全体の重心で位置決定を行っていた為,十分な位置分解能が得られなかった.今回のsimulation結果から,例えばmultiーwire anodeによりphoton分布の形を取出せば,シャープなピーク部分だけを使って位置決定が行え,位置分解能を数倍改善できる見通しが得られた.この方法を採用すれば,一様性の向上とバックグランド除去の効率化も同時に達成できる為,来年度は実際のISPCに応用する予定である.2.ISPC発光部の開発:ISPC発光部の試作1号カウンターを製作しテストを行った.このカウンターは60mm径の標準的なものである.1号機の製作とテストを通じて,各種材料,クリーニングシステム,高真空排気装置,ガス詰め循環システム,テスト治具,高圧電源系,データ取得システム等が順次整備され,現在東大理学部の実験室にISPC開発の環境をフルに整える事ができた.1号カウンターは高電圧に対する耐圧が低く十分な特性試験を行えなかった.その原因として(1)材料(特に電極用メッシュとガラスチューブ)の高圧対策が不十分であった.(2)実験室の環境(湿度,クリーン度)が不適切であった,等が考えられ,現在小型のクリーンルームを設置し, 2号機を製作中である.

3.位置読出しシステムの開発:位置検出型phototubeの読出し回路, 2次元ADC装置, XYテーブル駆動システム等の製作と整備を行い,単体各システムの動作を試験した.全系を組合わせて,マイコンによる自動制御を進めつつある.本年度は、所期の性能をもったISPCの開発に成功し、それを用いてISPCの基本動作について多くの知見を蓄積した。その成果を以下で述べる。1.位置検出型フォトチューブ(PSPT)の評価試験:PSPTの有効径感度ムラ、チューブ内での電子雲の拡がり、電子増幅過程のゆらぎ、位置分解能、位置の線形性などを実験的に評価した。この結果PSPTの詳しい特性が解明され、またその改良の指針を得ることができた。2.ISPCの試作:昨年の試作機ガスセル部を改良し、広い入射範囲(直径40mm)にわたり良好なエネルギー分離能(5.9KeVで8%)と十分な位置分解能(1mm以下)をもつISPCを作りあげた。またこれを用いて、ガス蛍光の空間的拡がり、X線に対するゲインの一様性、ドリフト領域の電場の最適値、エネルギー分解能の場所依存性、位置決定特性を決める諸要因など、ISPCの基本特性を実験的に確立することができた。またバックグラウンド除去の方法についても検討を行った。3.衛星搭載品開発の準備:電子回路部や高圧電源の設計、機上データ処理ロジックの開発、フォトチューブの耐振化、ベリリウム窓材の検討など、衛星搭載品を作るのに必要なさまざまな予備作業を行なった。以上の成果により、3インチ径のPSPTを用いて、所期の性能をもつISPCを作る見通しを得ることができ、衛星搭載用ISPCを作るさいに必要な基本技術が確立された。よって2年度にわたる本研究は、その目的を十分に達成できたと言える。これはASTRO-D衛星計画を支える重要な成果と考えられる。
クラスター錯体によるエネルギーキャリアのテーラーメイド合成

風力や太陽光など,安定供給に難のある再生可能エネルギーを有効に利用するため,電気化学エネルギーを化学エネルギーに変換する多電子酸化還元触媒の開発が求められている。本研究では,生体酵素の活性中心をヒントに,(1)多電子プール能,(2)フレキシブル骨格,(3)配位不飽和サイト,という3つの特徴を併せ持つクラスター錯体を研究開発の中心に据え,触媒開発のための基礎研究を推進した。本年度も,昨年度までに引き続き,種々の新規クラスター錯体の合成ならびに触媒機能評価を行った。代表的な成果として,5つの鉄イオンを有するクラスター錯体に対し,配位子部位にメチル基もしくはブロモ基を導入した新規鉄五核クラスター錯体を導入し,置換基導入が電気化学的性質ならびに酸素発生触媒機能に対してどのような影響を及ぼすかについて検討を行った。新規クラスター錯体の同定は,単結晶X線構造解析,元素分析,ESI-TOF-MSにより行った。電気化学測定の結果から,電子供与性のメチル基を導入した場合には鉄中心の酸化還元電位が低電位側にシフトし,電子求引性のブロモ基を導入した場合には高電位側にシフトすることがわかった。次いで,酸素発生反応に対する触媒機能を評価したところ,電子供与性のメチル基ならびに電子求引性のブロモ基のどちらを導入した場合においても,酸素発生過電圧が無置換体に比べて低電位シフトすることが分かった。分光電気化学測定により電子移動機構の詳細について調査したところ,メチル基を導入した場合は無置換体と同様の機構で電子移動反応が進行していることが分かった。一方,ブロモ基を導入した場合では,全く異なった電子移動機構で反応が進んでいることが判明した。以上より,電子移動機構と触媒機能との間における興味深い相関が見出された。一部の化合物については,高純度の化合物を大量に合成することができず,電気化学測定を行うための十分な試料を得ることができなかった。結果として,当初の計画に比べ,部分的に遅延が生じた。今後は,種々の金属イオン(鉄,マンガン,コバルト,ニッケル,銅,ルテニウム等)から構成される多核クラスター錯体の合成を引き続き行い,電気化学的性質ならびに触媒機能について調査を行う。風力や太陽光など,安定供給に難のある再生可能エネルギーを有効に利用するため,電気化学エネルギーを化学エネルギーに効率よく変換できる多電子酸化還元触媒の開発が求められている。そこで本研究では,生体酵素の活性中心をヒントに,1多電子プール能,2フレキシブル骨格,3配位不飽和サイトの3つの特徴を併せ持つクラスター錯体を研究開発の中心に据え,触媒開発のための基礎研究を推進した。平成28年度は,鉄,マンガン,コバルト,ニッケル,銅,亜鉛,ルテニウム,オスミウムなどの金属イオンを含む多様なクラスター錯体の合成,電子状態評価ならびに触媒機能評価を試みた。合成したクラスター錯体の構造および電子状態の解明には,単結晶X線構造解析,ESI-TOF-MS,1H-ならびに13C-NMR,紫外可視吸収分光,電気化学測定,メスバウアー分光を用いた。また,触媒機能を評価するに当たっては,電気化学的手法による酸化還元もしくは化学試薬を用いた酸化還元を触媒反応の駆動力として用いた。また,上記の金属イオンの種類を変更する研究プロジェクトと並行し,配位子部位の化学修飾による触媒機能の向上を目指したプロジェクトにも取り組んだ。電子供与性や電子吸引性の置換基やプロトン解離サイトを導入した新規配位子を合成し,次いでその配位子を用いた鉄系クラスター錯体の合成を行った。とりわけ,プロトン解離サイトを導入した配位子を用いた鉄系クラスター錯体は,プロトン解離サイトを導入していない配位子を用いたクラスター錯体と比較して大幅な過電圧の低下がみられた。一部の化合物について,高純度の化合物を大量に合成することができず,電気化学測定を行うための十分な量の試料を得ることができなかった。結果として,当初の計画に比べ研究の遂行が遅れた。

一方,ブロモ基を導入した場合では,全く異なった電子移動機構で反応が進んでいることが判明した。以上より,電子移動機構と触媒機能との間における興味深い相関が見出された。一部の化合物については,高純度の化合物を大量に合成することができず,電気化学測定を行うための十分な試料を得ることができなかった。結果として,当初の計画に比べ,部分的に遅延が生じた。これまでに引き続き,多種のクラスター錯体の合成,結晶構造の解明,小分子の多電子酸化還元に対する触媒機能の評価を行う。また,研究の進捗に応じて,触媒構造の最適化を行う。今後は,種々の金属イオン(鉄,マンガン,コバルト,ニッケル,銅,ルテニウム等)から構成される多核クラスター錯体の合成を引き続き行い,電気化学的性質ならびに触媒機能について調査を行う。
高次脳中枢による嗅球神経回路調節の形態学的基盤

本研究は、嗅球シナプス神経回路の調節機構の解明を目的とし、一連の解析知見と予備的実験に基づき、神経回路の調節に密接に関わっていると考えられる遠心性入力の、シナプス結合を含めた詳細な微細構造解析を行なうものである。具体的には嗅球へ投射するセロトニンニューロン、アセチルコリンニューロン、ノルアドレナリンニューロンについて単一ニューロン標識と広範囲電子顕微鏡解析を組み合わせた統合解析を行った結果、3種のニューロンは嗅球各層で異なる線維分布を示し、そのシナプス標的ニューロンもそれぞれ異なっていることが分かった。精巧な嗅球シナプス回路は、他の脳領域から精緻な調節を受けていることが示唆された。嗅球神経回路は、匂い入力、介在ニューロンなどの調節を受けていることが知られている。この他に他の高次脳中枢からの遠心性ニューロン投射による調節が示唆されるが、その詳細は不明で、その詳細を解明することが本研究の目的である。嗅球へは、縫線核からのセロトニンニューロン、対角帯水平部からのアセチルコリンニューロン、青斑核からのノルアドレナリンニューロンが投射する。我々はまずセロトニンニューロンの解析結果を発表した(Suzuki 2015)。次にウイルスと遺伝子改変マウス(ChAT-Cre mouse)を用い、起始核(対角帯水平脚)から投射する単一アセチルコロンニューロン像を初めて明らかにした(Hamamoto 2016学会発表済、論文投稿中)。また起始核では、アセチルコリンの他にGABAニューロンが嗅球に投射しているのも確認された。更に投射先の嗅球では、主に糸球体層で複数の糸球体内部・周辺を横断している像が確認され、セロトニンニューロンとは線維分布が異なっていた。更にノルアドレナリンニューロンは嗅球内では、糸球体内部には分布せず、他の2種のニューロン群とは異なる分枝と線維分布を示した(Horie 2016学会発表済、論文準備中)。以上の結果から、遠心性投射する3種のニューロン群は異なる投射分布様式を示し、神経回路に対し異なる影響・効果を示すことが形態学的に示された。今後は更に解析を進め、高次脳中枢からの遠心性ニューロン投射の詳細と存在意義を明らかにしたいと考えている。他の脳領域(高次中枢)からの嗅球への遠心性投射で、これまで存在が分かっているセロトニンニューロン、アセチルコリンニューロン、ノルアドレナリンニューロンのうち、我々のこれまでの研究結果から、セロトニンニューロンについては既に論文発表し、アセチルコリンについても論文投稿してMinor Revision中で、平成28年6月には最終投稿予定である。またノルアドレナリンニューロンは当初2年目の平成28年度に行う予定であったが、平成27年度より解析を並行し、着実に知見を得て、3月の日本解剖学会に発表を行った。現在、速報として論文発表の準備をしている。このように研究は当初の研究計画に沿って概ね順調、もしくは計画以上に進捗している。嗅球神経回路における嗅覚情報は、匂い入力、介在ニューロンなどの調節を受けていることが知られている。この以外にも、他の高次脳中枢からの遠心性ニューロン投射による調節が示唆されるが、その詳細は不明である。本研究はこれら遠心性投射経路の全貌と詳細の解明を目的としたものである。嗅球へは、縫線核からのセロトニン、対角帯水平脚(HDB)からのアセチルコリン、青斑核(LC)からのノルアドレナリンの各ニューロンが投射する。我々はまずセロトニンニューロンを解析した(Suzuki 2015)。次にウイルスと遺伝子改変マウス(ChAT-Cre mouse)を用い、HDBからのアセチルコリン投射系について三次元的全体像からシナプス同定に至るまでの解析を論文発表した(Hamamoto 2017)。解析の過程でHDBには他にGABA系ニューロンの嗅球への投射が明らかになり、更にこのGABA系ニューロンには、parvalbumin(PV)含有及び非含有ニューロンのサブタイプがあることも分かり、現在、ステレオロジー法により空間的分布と細胞数について立体学的定量解析を、更にニューロルシダによる三次元構造解析を進め、論文発表の準備をしている。LCからのノルアドレナリンニューロンについては、既に免疫染色によって特徴的な線維分布様式が明らかとなり、現在、遺伝子改変マウス(DBH-Cre mouse)を導入して単一ニューロン標識を試みている。嗅球には同じチロシン代謝系のドーパミン系ニューロンが存在するが、これらとの関係についても解析が進め、ノルアドレナリンニューロンの全体像と共に論文発表を予定している。以上の結果から、3種の遠心性投射ニューロンについて、異なる投射分布様式を比較形態学的に明らかにした。今後は更に解析を進め、高次脳中枢から嗅球への遠心性ニューロン投射の詳細と存在意義を明らかにしたいと考えている。嗅球神経回路への他の高次脳中枢からの遠心性ニューロン投射系のうち、縫線核からのセロトニン、対角帯水平脚(HDB)からのアセチルコリンについては既に論文発表を終え、青斑核(LC)からのノルアドレナリンの各ニューロンについても順調に解析が進み、現在、解析データをまとめて論文投稿準備中である。これらは当初3年間の研究計画であったが、2年間で達成できている。

これは、ニューロンを特異的・個別に標識する方法を確立し(遺伝子改変マウスにウイルスベクターによる遺伝子導入)、更にレーザー顕微鏡と電子顕微鏡を直接組み合わせたVolume EM analysis及び電子線トモグラフィーによる統合的解析システムを構築できたことによることが大きい。この手法により、介在ニューロン(Kiyokage et al, J. Comp. Neurol. 2017)、投射ニューロン(Mastuno et al, J. Comp. Neurol. 2017)のシナプス解析が進み、介在ニューロンと投射ニューロンの面からも遠心性ニューロン投射系の解析が進んでおり、新たな解析の端緒が多く芽生えている。以上の進捗状況からも、当初の計画以上に進展をしており、今後も更に一層解析を進めて行く予定である。本研究は、嗅覚系一次中枢嗅球における嗅覚情報処理機構について、単一ニューロン標識、三次元構造解析、そしてシナプス結合の解析を行い、嗅球神経回路の調節機構の解明を目的とするものである。これまで、縫線核からのセロトニン5HTニューロン(Suzukiら2015)、対角帯水平脚HDBからのアセチルコリンAchニューロン(Hamamotoら2017)について解析し論文発表し、更に昨年度からは青斑核LCからのノルアドレナリンNAニューロンについて解析を始め、主に以下のような結果を得た。DBH-Creマウスにアデノ関連ウイルスを脳定位的にLCへ注入し、NAニューロンを蛍光標識した。その後ニューロルシダで単一NAニューロンのトレースを行い、中脳網様体→内側毛帯→黒質・線条体→脳弓上部→内側前脳束→前嗅索上方→嗅球という投射全経路を明らかにした。嗅球内では、細い線維が、特に顆粒細胞層、次いで外網状層に多く、糸球体層と僧帽細胞層は比較的少ない。突起は所々数珠構造varicosityを示し、その存在頻度は顆粒細胞層と外網状層に多かった。この数珠構造を抗Norepinephrine Transporter(NET)抗体を用いた免疫電顕で解析すると、球形小胞と数の少ない有芯性小胞を含み、シナプス結合を形成していた。シナプスは非対称性と考えられるが、シナプス後側の膜電子密度PSDが典型的な非対称性ほど顕著でなく、多様性に富んでいる。これらの所見は、5HTニューロンとAchニューロンとは異なり、他の脳領域からの嗅球への遠心性調節は、より精巧であることが推測される。以上の結果は、日本解剖学会(第123回全国学術集会)にて発表し、日本顕微鏡学会(第74回学術講演会)に発表予定で、現在論文を作成し、本年7月までに投稿予定である。これまで得た知見を基に、更に解析を進めている。本研究は、嗅球シナプス神経回路の調節機構の解明を目的とし、一連の解析知見と予備的実験に基づき、神経回路の調節に密接に関わっていると考えられる遠心性入力の、シナプス結合を含めた詳細な微細構造解析を行なうものである。具体的には嗅球へ投射するセロトニンニューロン、アセチルコリンニューロン、ノルアドレナリンニューロンについて単一ニューロン標識と広範囲電子顕微鏡解析を組み合わせた統合解析を行った結果、3種のニューロンは嗅球各層で異なる線維分布を示し、そのシナプス標的ニューロンもそれぞれ異なっていることが分かった。精巧な嗅球シナプス回路は、他の脳領域から精緻な調節を受けていることが示唆された。今後も引き続き解析を進め、アセチルコリンニューロンの論文の発表、ノルアドレナリンニューロンの論文投稿を当面の課題として取り組む。
中国の治安管理処罰法制の性格・機能・位相：制裁システムの動態構造の解明を目指して

本研究は特に刑事制裁との動態的関係に着目し、中国の治安管理処罰法制の法的性格および現実的機能を解明した上で、制裁システムにおいてそれを位置づけることを目指した。その結果、1治安管理処罰法違反と犯罪の違いは程度の差であり、両者は人為的(政策的)な区別である(が、交錯する局面もある)こと、2本制度は犯罪として刑罰を科すに至らない軽微事件を効率的に処理する受皿であること、3両者はスティグマの点で大きな隔たりがあることを明らかにした。中国の制裁システムの動態構造の解明を目指す第一歩として、本研究は治安管理処罰法制(刑罰を科すには至らない軽微な違法行為を処罰する行政処罰)と他の法的制裁(特に刑事)との動態的関係に着目し、その実体的・手続的法制を考察し、それらとの関係における1本制度の法的性格、および2現実的機能を解明した上で、3制裁システムにおいて本制度を位置づけることを目指す。初年度である本年度は、1本制度の法的性格の解明に重点を置き、主に次の3点の作業を進めた。1.下位法令の整理と公表関連下位法令を整理した上で、公安機関による行政事件の処罰・処理手続(治安管理処罰も含む)の一般規定となる公安部「公安機関行政事件手続規定」(2012年12月3日採択、2013年1月1日施行。計240ヶ条)の邦訳を進めた。2.文献調査治安管理処罰および刑事制裁に関する実体法および手続法に関する文献を収集・読解し、刑事制裁との関係における本制度の法的性格を理論的に考察した。具体的には、主に犯罪行為と治安管理処罰行為共通の本質的特徴とされる「社会危害性」に着目して、両行為の違いが理論的に如何に説明されているかを検討した(通説は両行為の差を「社会危害性」の質的違いに求めるが、今日、量的違いにすぎないとする批判説も有力に主張されている)。3.第1次現地調査2013年12月に、北京に赴き第1次現地調査を実施した。中国人民公安大学を訪問し、同治安学院の教員・学生と座談会を行い、情報を収集した。また研究協力者を訪問し、情報を収集するとともに、次年度の訪問先を協議した。2年目である本年度は、2本制度の現実的機能の実証的解明に重点を置き、主に次の4点の作業を進めた。1.関連法令翻訳の公表公安機関による行政事件の処罰・処理手続(治安管理処罰も含む)の一般規定となる公安部「公安機関行政事件手続規定」(2012年12月3日採択、2013年1月1日施行。計240ヶ条)の邦訳を、若干の解説を付して、『阪大法学』第64巻第6号(2015年)に公表した。2.文献調査刑事制度との関係に留意しつつ(また初年度のテーマである1本制度の法的性格と照らし合わせつつ)、主に本制度の運用に関する実証研究を収集・読解した。また『中国法律年鑑』等に掲載されている各種統計を整理・分析した。3.第2次現地調査2014年12月に、四川・北京に赴き第2次現地調査を実施した。四川大学法学院および北京師範大学法学院を訪問し、主に刑事訴訟法の専門家と面談し、情報を収集した。4.中間的発表成果の取りまとめに向けて、研究会において中間的発表を行った。最終年度(3年目)である本年度は、既存の成果を振り返りつつ、他の法的制裁との動態的関係・位相を解明し、3制裁システムにおいて本制度を位置づけることを目指した。具体的には次の3点の作業を進めた。1.文献調査これまでの知見(1本制度の法的性格および2現実的機能)を振り返りつつ、主に制裁システムにおける本制度の位置づけに関する議論を収集・読解した。2.中間的発表成果の最終的取りまとめに向けて、それまでの知見を整理し、比較法学会社会主義法・アジア法部会(於中央大学、2015年6月6日)にて「中国の制裁システムにおける治安管理処罰制度の位置づけと機能ー刑事制度との関係・比較からー」と題して報告を行った。その後、その要旨を坂口一成「中国の制裁システムにおける治安管理処罰制度の位置づけと機能ー刑事制度との関係・比較からー」比較法研究77号(2015年)243243頁として公表した。3.論文公表準備学会報告後、質疑応答等を踏まえて、成果論文の執筆を進めている。

その結果、1治安管理処罰法違反と犯罪の違いは程度の差であり、両者は人為的(政策的)な区別である(が、交錯する局面もある)こと、2本制度は犯罪として刑罰を科すに至らない軽微事件を効率的に処理する受皿であること、3両者はスティグマの点で大きな隔たりがあることを明らかにした。1関連翻訳の公表初年度に達成する予定であったが、本年度にその遅れを取り戻すことができた。2文献調査おおむね順調に進んでいる。3第2次現地調査文献読解過程で生じた問題について、情報を得ることができた。4中間的発表順調である。中国法基本的には研究計画書に沿って進める。2015年6月の比較法学会社会主義法・アジア法部会で本研究の成果を報告する。そこでの批判・教示を元にブラッシュアップし、論文にまとめて公表する。1下位法令の整理と公表公安部「公安機関行政事件手続規定」を翻訳して公表する予定であったが、まだ完成には至っておらず、若干遅れている。3第1次現地調査想定以上の成果を得たと考える。特に中国人民公安大学での座談会の参加者との交流を通じて、本制度の法的性格に関する理論的問題(研究実績の概要1参照)のみならず、他の法的制裁との連関も含めた本制度の実務・運用全般についても貴重な知見を得ることができた。基本的には研究計画書に沿って進める。なお、今年度公表できなかった公安部「公安機関行政事件手続規定」の翻訳を、早期に完成させ、公表する。また夏に第2次現地調査を行い、主に実務家(公安、弁護士等)を訪問する予定である。
酸応答性センサーの活性化機構の解析

大腸菌の酸応答性センサーであるEvgSは多くの酸耐性遺伝子群の発現を誘導して菌に酸耐性能を付与するが、その活性化機構の詳細は解明されていない。本研究は、細胞内外のpHとEvgSの活性化に着目し、種々の培養条件下での両者の関係を検討することでEvgSの活性化機構の解明を当初の目的とした。EvgS活性化条件であるpH5.7を酢酸で調整するとEvgSが不活化して細胞内pHが低下したこと、嫌気条件で培養したときもEvgSが不活化して細胞内pHが低下したことから、細胞外がpH5.7で細胞内がpH7以下になるとEvgSが不活化することが示唆された。そこで培地中に添加する安息香酸濃度を変化させることで細胞内pHを7.6 - 6.5に段階的に調節してEvgS活性化を検討した。その結果、少量の安息香酸の添加によってEvgSは不活化したが、その時の細胞内はpH7.5であり、細胞内外にpHの差が存在していてもEvgSは不活化されることが判明した。今後、安息香酸によるEvgSの不活化機構を明らかにすることで、EvgSの酸性pHによる活性化機構を解明したい。さらに、本研究では、EvgS活性に影響を及ぼす新たなシグナルとして、酸化還元状態を見出した。EvgSの活性化には、酸性pHとアルカリ金属イオンに加えて好気条件も必要である。好気条件の感知にはEvgSの細胞質側に位置するPASドメイン内の2つのシステイン残基(C671, C683)が関与し、細胞膜中の酸化型ユビキノンによって生じたS-S結合が活性化に必要であるというモデルが示唆された。今後、このモデルをin vitroの系において検証し、EvgSにおける酸性pHの感知と酸化還元状態の感知との関連をさらに検討したい。大腸菌が宿主の口から侵入し腸に到達するには強酸性の胃を通過する必要がある。そのため、酸耐性能は大腸菌にとって非常に重要な機能である。大腸菌の酸応答性センサーであるEvgSは活性化すると多くの酸耐性遺伝子群の発現を誘導して菌に酸耐性能を付与するが、その活性化機構は未だ解明されていない。本研究では、細胞内外のpHとEvgSの活性化に着目し、種々の培養条件下での両者の関係を検討することで、EvgSの活性化機構の解明を目的としている。当該年度では、大腸菌細胞内pHを測定するために、細胞内で発現させた変異型pHluorin(M153R)の蛍光強度を種々のpH下で測定して検量線を作成した。作成した検量線をもとに細胞内pHを測定したところ、EvgSを活性化させるM9, pH 6の培地のpHを塩酸で合わせた場合にはEvgSは活性化したが、酢酸でpHを合わせた場合にはEvgSは活性化しなかった。このとき、細胞内pHを測定すると、塩酸の場合は細胞の恒常性が働き中性に近いpHであったが、酢酸の場合はpH 6以下に低下していた。また、酸素濃度を減らした微好気培養を行った場合もEvgSの活性化が抑えられ、細胞内pHが低下した。以上の結果より、酸性pHによってEvgSが活性化するには細胞膜をはさんだプロトン勾配が関与していることが示唆された。細胞内外のpHとEvgSの活性化との関連を残りの2年間でさらに詳細に検討する。また、EvgSの活性化に関わる大腸菌内因子の探索として、異なる二成分制御系であるRcsC/RcsD/RcsB系のレスポンスレギュレーターであるRcsBを欠失させた株とEnvZ/OmpR系のレスポンスレギュレーターであるOmpRを欠失させた株で、EvgS/EvgA系の活性化が起きないことを確認した。これらの二成分制御系がEvgS/EvgA系にどのように関連しているかを今後検討する。本研究の目的であるEvgS活性化測定と大腸菌細胞内pHの測定系の構築が終了し、培地に強酸を添加した場合と弱酸を添加した場合でのEvgSの活性と細胞内pHが測定できるようになった。この測定系の構築および測定機器の準備に想定以上の時間がかかってしまい、当該年度に計画していたEvgS付近の局所pHの測定およびEvgSの活性を制御する因子の探索が実施できなかった。これらに関しては、すでに実験の予備検討を行っており、平成29年度に精力的に進める予定である。大腸菌の酸応答性センサーであるEvgSは活性化すると多くの酸耐性遺伝子群の発現を誘導して菌に酸耐性能を付与するが、その活性化機構の詳細は解明されていない。本研究は、細胞内外のpHとEvgSの活性化に着目し、種々の培養条件下での両者の関係を検討することでEvgSの活性化機構の解明を目的としている。前年度は細胞内pHの測定条件を確定し、酸素濃度を減らした微好気培養を行うとEvgSの活性化が抑制されることを見出した。当該年度では、振とう(好気)、静置(微好気)、嫌気培養に対するEvgSの活性化を検討し、微好気培養よりさらに酸素濃度の低い嫌気培養下でEvgSが全く活性化しなくなることを見出した。

この3種の培養条件における菌の細胞内pHを測定すると、好気、微好気培養では培養開始2時間以降に細胞内pHが7以下に低下するのに対し、嫌気培養では1時間後にすでに7以下に低下しており、pHが7以下になると活性化が停止するのではないかと考えられた。しかし、細胞内pHの差は小さく、pH以外に酸化還元状態がEvgSの活性化に関与するのではないかと思われた。膜タンパクであるEvgSの細胞質側にはPASドメインが存在する。PASドメイン内の3つのCysをそれぞれAlaに置換して測定したところ、C671AとC683Aにおいて嫌気状態での活性化抑制が緩和された。還元状態でPASドメイン内のS-S結合が切断されてヒスチジンキナーゼ活性が変化する報告例があり、EvgSにおいてもPASドメイン内のS-S結合が活性調節に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、異なる二成分制御系であるEnvZ/OmpR系を詳細に検討したところ、EvgS/EvgA系に関連がないことが判明し、EnvZ/OmpR系の検討は中断した。次にRcs系の検討に移る。当該年度に明らかになった還元状態とEvgSの活性化抑制は、細胞質内領域のPASドメインの重要性を示しており、本研究の目的であるEvgSの酸による活性化機構の解明につながるものではないかと考えている。今後の研究計画に変更は生じるが、前向きの変更であると捉えている。一方、他の二成分制御系との関連に関しては、有力な候補として考えていたEnvZ/OmpR系の検討を中断し、本年度はRcs系の検討に重点を置く予定である。このため、ネットワークの解明の部分が遅れていることから、総合して「やや遅れている」と判断した。大腸菌の酸応答性センサーであるEvgSは多くの酸耐性遺伝子群の発現を誘導して菌に酸耐性能を付与するが、その活性化機構の詳細は解明されていない。本研究は、細胞内外のpHとEvgSの活性化に着目し、種々の培養条件下での両者の関係を検討することでEvgSの活性化機構の解明を当初の目的とした。EvgS活性化条件であるpH5.7を酢酸で調整するとEvgSが不活化して細胞内pHが低下したこと、嫌気条件で培養したときもEvgSが不活化して細胞内pHが低下したことから、細胞外がpH5.7で細胞内がpH7以下になるとEvgSが不活化することが示唆された。そこで培地中に添加する安息香酸濃度を変化させることで細胞内pHを7.6 - 6.5に段階的に調節してEvgS活性化を検討した。その結果、少量の安息香酸の添加によってEvgSは不活化したが、その時の細胞内はpH7.5であり、細胞内外にpHの差が存在していてもEvgSは不活化されることが判明した。今後、安息香酸によるEvgSの不活化機構を明らかにすることで、EvgSの酸性pHによる活性化機構を解明したい。さらに、本研究では、EvgS活性に影響を及ぼす新たなシグナルとして、酸化還元状態を見出した。EvgSの活性化には、酸性pHとアルカリ金属イオンに加えて好気条件も必要である。好気条件の感知にはEvgSの細胞質側に位置するPASドメイン内の2つのシステイン残基(C671, C683)が関与し、細胞膜中の酸化型ユビキノンによって生じたS-S結合が活性化に必要であるというモデルが示唆された。今後、このモデルをin vitroの系において検証し、EvgSにおける酸性pHの感知と酸化還元状態の感知との関連をさらに検討したい。当該年度に明らかになった還元状態EvgSの活性化抑制についてさらに検討を進める。EvgSの活性を測定するのに、レポーターアッセイだけではなく、細胞内でのリン酸化状態の測定を試みる。また、抑制機構へのユビキノン、メナキノンなどの因子の関与も検討する。一方、EvgSの酸による活性化においてPASドメインの果たす役割を明らかにしたい。また、Rcs系とEvgS/EvgA系との関わりを検討する。
蛋白質の分子進化に基づく眞核化構築機構の解析

「ホモロガスな蛋白質は、ホモロガスな高次構造を持つ」ことを指標に高次構造相似度検索電算機プログラムを用いて比較蛋白質間の全アミノ酸対の相関度を数値化したマトリックスを解析することによってシクエンスホモロジーを導く調査が続けられ、本プロジェクトに供された。1.眞正細菌、クロロプラスト、"古細菌"、二種酵母の大亜粒子rRNA結合リボソーム蛋白相同種が調査され、その相同ヶ所の配列から、核移入シグナルを伴った眞核化構築への分子上の変遷を明示した。2.細菌型フェドキシン27種の調査では、3アミノ酸からなる連結配列の存在を導き、これが26アミノ酸配列の倍増幅の中央に位置する分子構造を明示したが、植物型フェレドキシン34種との総合的解析によると植物型フェレドキシンは、連結配列部位等の高度保存部位が指標となって、細菌型分子の培増副の進化的事象によって生じた事を導いた。3.リボソーム蛋白質EL7/12相当種は眞正細菌、"古細菌"、眞核生物を通して多くの配列報告が有り、本解析方の素材として早くから取り上げられてきたが、この一二年で有効な生物種の配列報告が急増した為、更に調査が進められたところ、蛋白質固有の"保存単位"の存在を示すところとなったが、EL7の球状と一端フラグメントの結〓解析の詳細と照らすと、構造、機能単位に相当することが分った。蛋白進化の過程では構造、機能単位が保存されやすいとの一般概念が初めて具体的に裏付けされたものである。この保守性に対照的に、眞核化に当っては積極的進化的飛躍を必要とした。即ち必須であったトランスポジション事象は上の保守的一般ルールに抗したドラスチックな事象であったことを導いた。4.酵母及びH.halobiumのリボソーム蛋白質遺伝子解析が行われ、その遺伝子構成及び相同蛋白種との比較本解析の所見が進化的に考察され本プロジェクトに資料を提供した。
細胞膜ー核内シャトル分子Ｈｉｃー５の皮膚創傷治癒における役割の解明

正常ヒトケラチノサイトの分化過程でHic-5はケラチノサイト内での局在が細胞質からFocal adhesionに変化し、内因性のHic-5はケラチノサイトの増殖、早期分化、接着能に正の影響を、運動能には負の影響及ぼしていることが示唆された。正常メラノサイトのモデル細胞として用いたB16-F1マウスメラノーマ細胞で、内因性のHic-5は増殖、遊走、浸潤能について正の影響を及ぼしていることがわかった。Hic-5はRho依存的なメラノーマの運動能調節経路を介してメラノーマの転移能に影響を与えた。これらのHic-5の役割は創傷治癒過程では上皮化過程および表皮の色素回復に関与していると考えられる。マウス皮膚創傷治癒の組織サンプルを抗Hic-5抗体で免疫染色を行ったところ、創傷治癒後期の一部の線維芽細胞に陽性像を認めた。ヒトの創傷治癒部で同様の実験を行ったとこと、その陽性像は明確ではなかった。ところが創傷治癒後のケロイド部では抗Hic-5抗体による染色で明確な陽性像が得られた。したがって、マウスの場合は創傷治癒過程の後期から、ヒトの場合は創傷治癒後の線維化の段階でHic-5が発現してくると考えられた。そこでHic-5発現ベクターをトランスフェクトしたヒト線維芽細胞におけるコラーゲン合成を調べたところ、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞よりもコラーゲン合成は上昇していた。また、同時にこれらの細胞間での種々の細胞増殖因子の産生量を比較したが、有意な差はなかった。以上のことから、真皮線維芽細胞においては早期の創傷治癒過程にはHic-5は大きな働きをしていないことが推測された。しかしながら、後期の創傷治癒過程において線維芽細胞がコラーゲンなどマトリックス産生がはじまる時にその合成を上昇させることで、治癒後の組織をより強固にすることに働いているものと考えられる。さらには過剰な線維化には病因学的な役割をしていることが示唆された。一方、種々の細胞増殖因子はHic-5の過剰発現によっては誘導されないことからHic-5は表皮においてはケラチノサイトの増殖、遊走、接着、分化を調節することによって創傷治癒に重要な役割を果たしているが、真皮においては創傷治癒そのものよりもむしろその完成後に重要となると考えられる。皮膚の構成細胞としてメラノサイトにおけるHic-5の役割について研究した。モデル細胞としてマウスメラノーマ細胞株B16-F1細胞を用いた。まずB16-F1細胞におけるHic-5の発現を免疫染色およびウエスタンブロット法で確認した。次にsh-RNA発現ベクターを用いてB16-F1細胞におけるHic-5のノックダウンを試みた。その結果、2つの細胞株を得た。これらHic-5ノックダウン細胞株では細胞の運動能が減弱しており、ボイデンチャンバーによる浸潤能の測定によってもその浸潤能の減弱がみられた。さらにHic-5のノックダウンによって細胞の増殖能も低下しており、Hic-5がメラノサイトの運動および増殖のいずれにおいても重要な因子であることがわかった。さらにHic-5のノックダウによりRhoAが活性化されており、細胞形態がアメーバ様に変化することもあわせて明らかにした。したがって、皮膚創傷治癒において色素の回復においてHic-5はメラノサイトにおいて重要な働きをしていると思われた。細胞膜ー核内シャトル分子Hic-5の創傷治癒における役割を検索する目的で、表皮を主に構成し、創傷治癒に重要な働きをする細胞であるケラチノサイトに注目し研究を進めた。ヒトケラチノサイトの分化過程におけるHic-5の細胞内局在を検討した結果、核辺縁から細胞膜への移動がみられた。このことから、Hic-5がケラチノサイトにおいて何らかの生理学的役割を果たしている可能性が示唆されたので、ヒトケラチノサイト細胞株Hacat細胞を用いてHic-5ノックダウン細胞を作成した。その結果、Hic-5ノックダウン細胞ではコントロール細胞に比べて、IdU取り込みによってアッセイされた増殖活性が抑制された。次に試験管内で細胞培養面に人工的創傷を加え、かつ、マイトマイシンC処理を行い増殖を阻害した上で、Hic-5ノックダウン細胞の細胞遊走能をアッセイしたところ、コントロール細胞に比べて遊走が亢進していた。また、コラーゲンタイプIVに対する接着能について検討したところ、Hic-5ノックダウン細胞はコントロール細胞に比べて接着が抑制されていた。マウス皮膚の免疫組織学的染色の結果では、創傷治癒過程において急性期ではHic-5の発現は低かったものの、ヒト組織の検討ではケロイド部では表皮に発現が強く認められ、創傷治癒の早期では発現を低下させ、慢性期では上昇している可能性が考えられた。

以上から、細胞膜ー核内シャトル分子Hic-5は増殖と細胞接着には促進的に、逆に細胞遊走、早期分化には抑制的に働き、むしろその発現を低下させることで創傷治癒を促進する可能性が示唆された。Hic-5の皮膚と創傷治癒における役割について、表皮ケラチノサイトと真皮線維芽細胞という主要な構成細胞について調べることができた。また、その2種の細胞について異なった役割をHic-5は果たしていることが明らかになった。また、創傷治癒促進のターゲット分子としてのHic-5は表皮でより重要であることがわかった。このことはより治療アプローチが表面に近く、行いやすいことを示しており、創傷治癒を促進するための治療開発へのヒントを与えている。皮膚創傷治癒において重要な役割を果たす表皮ケラチノサイトについて、細胞膜ー核内シャトル分子Hic-5に発現および分化過程における細胞内局在の変化を明らかにできた。さらにHic-5ノックダウン細胞を用いた実験から、この分子が有する、表皮ケラチノサイトの増殖、遊走、接着における役割について新しい知見を得ることができた。さらには、急性期創傷治癒過程では発現は低く、慢性期に入ったケロイド部の表皮では発現が高いことから、急性期においてはその発現量を低下させることで創傷治癒に促進的役割を果たしうるものと考えられ、創傷治癒においてその役割を合理的に説明することができた。皮膚における構成細胞として表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞についてHic-5の創傷治癒過程における役割を調べてきたので、今後もうひとつの重要な構成細胞であるメラノサイトにおける役割を調べたい。培養メラノサイトを用いてHic-5の発現およびノックダウンの影響を調べていきたいと考える。今後は皮膚におけるHic-5の免疫染色を行い、この過程で表皮でだけでなく、真皮内の発現についても研究を進めていく。特に創傷部位についてはマウスの創傷治癒過程の組織とヒトの創傷部の組織を用いて検討して行きたい。また、皮膚の構成細胞であるメラノサイトについてもその発現を検討し、発展的研究を行って行きたい。メラノサイトの細胞株の取得および細胞培養のために研究費を使用したい。さらに細胞株を用いたノックダウンのための分子生物学的手法を行うため、研究費を用いる予定である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
経済成長・不平等・貧困における因果関係及びその経路に関する研究

上記の研究課題に関して2つの異なる研究を遂行し、それらの研究結果を2編の研究論文として出版した。(1)経済成長が乳児死亡率に与える影響を、発展途上国83カ国の過去40年間のデータに基づき、計量経済学的に分析した。推計結果によれば、全体としては経済成長が乳児死亡率を引き下げるが、経済成長が乳児死亡率に与える影響は、好況期と不況期において、非対称である。(2)女性の学校教育および女性の社会的地位が経済発展に与える影響について、計量経済学的に分析し、それら3変数間のメカニズムを解明した。3年間研究期間の1年目として、以下の2本の研究論文に取り組み完成させた。学会および他大学研究会において、合計7回の研究成果報告を行い、知の共有を通じた社会貢献を試みた。また、それら2本の研究論文を、欧米の査読つきジャ-ナルに出版することを予定している。1)単著、英語論文、"When Does Growth Save the Poor?"(欧米の査読つきジャ-ナルに投稿中。)「経済成長が貧困問題を解消するのか」という問いに対して、研究者の間で大きく意見は分かれる。正しい答えは何であるのか。またなぜそのような意見の下一致が生まれるのかを解明することを目的として、実証分析を行った。最大83カ国の発展途上国のパネルデ-タを用いて。経済成長と貧困解消との間のマクロ経済関係を分析した。経済成長期には、経済成長が貧困問題を解消するかどうかは明らかではない一方で、経済停滞期には経済成長の欠如が貧困を著しく悪化させることが明らかとなった。そのため、経済成長と貧困解消に関する意見の不一致の原因は、経済成長と停滞期の非対称性に求められる。つまり、経済成長期にある地域を分析するか、経済停滞する地域を分析するによって、経済成長が貧困解消に及ぼす影響についての見識は異なる、と説明可能である。低所得国において、女性の学校教育の修得が貧困問題解決につながるであろうことは、広く認識されている。だが、それとは対照的に、実証分析においては、女性の学校教育が経済成長や貧困解消に影響を与えないという結果を示す文献が多い。このような「女性の学校教育のパラドックス(逆説)」に注目し、クロスカウントリー・パネルデ-タによる回帰分析をおこなった。女性の学校教育が幼児死亡率低下に与える影響は限定的であるが、女性の社会的地位の向上が貧困削減に大きく貢献することを示す推計結果を得た。3年間の研究期間の2年目として、これまでの研究成果を深化・洗練させながら、以下の2編の研究論文を加筆修正した。それら2編の研究論文は、欧米の査読つきジャーナルに投稿中であり、現在審査結果を待っている段階である。1)単著、英語論文、"Asymmetrieal Impact of Economic Growth on Infact Mortality in Developing Countries"本論文では、1962年から2002年の発展途上83力国のパネルデータを用いて、一人当たりGDPが幼児死亡率に与える影響を回帰分析した。所得の変化が幼児死亡率に与える影響は、好況期と不況期では、非対称であることを統計的に明らかにした。所得の上昇が幼児死亡率を減少させる効果は統計学的に頑健(robust)ではないが、所得の下落は幼児死亡率を引き上げる。経済成長と貧困削減の関係についての既存の実証研究においては、その関係の有無について対立しあう証拠が提示されてきており、いまだにコンセンサスが得られていない。この既存研究間の矛盾が、その分析対象となる地域や期間が経済成長期であったか経済停滞期であったかによって説明できることを、本研究は示唆している。このような「女性の学校教育のパラドックス」に注目し、クロスカウントリー・パネルデータによる回帰分析をおこなった。本研究の研究業績として、2編の研究論文を英語論文として完成させた。大幅な加筆修正を繰り返してクオリティを引き上げ、2009年11月に、湘南藤沢学会ディスカッションペーパーとして発表した。同時に、それら2編の論文は、すでに欧米の査読つき学術ジャーナルに投稿済みであり、現在それらの結果を待っている段階である。1人当たりGDPが乳児死亡率に与える影響を、発展途上国83カ国の過去40年間のデータに基づき、計量経済学的に分析した。経済成長率が正である期間(好況期)においては、経済成長は乳児死亡率にあまり影響を与えない。

しかし、経済成長が負の期間(不況期)においては、経済状況の悪化は、乳児死亡率に甚大な悪影響を与える。これらの計量経済学的証拠は、既存の文献における経済成長と貧困削減についての見解の相違が、それらの文献が分析する期間や地域が経験してきた経済成長が正か負であるかの違いによって生み出されてきている可能性を示唆している。既存のクロスカウントリー分析の中では、女性の学校教育と経済発展の間に弱い関係しか存在しないことが示されてきている。この不可思議な証拠は、開発経済学者を悩ませてきた。パネルデータ分析を用いる本研究が明らかにしたのは、女性の学校教育が経済発展に弱い効果しか持たないという既存の統計学的証拠が、女性の学校教育特有のものではなく、学校教育そのものが経済発展に大きな効果を持たないという側面を映し出しているということである。同時に、女性の学校教育によってもたらされるであろう女性の社会的地位の向上が、乳児死亡率低下に貢献することも、重要な結論の一つである。
新規抗インフルエンザ薬開発に向けた構造生物学的研究

新型インフルエンザウイルス出現の脅威への対策の一つとして、新規抗インフルエンザ薬開発に向けた研究を行った。インフルエンザウイルスの複製に中心的な役割を果たしているRNAポリメラーゼの働きを阻害する薬剤が効果的な抗ウイルス薬になるため、そのような薬剤を設計するために、RNAポリメラーゼの立体構造を解明した。また、本研究で使用したRNAポリメラーゼを基に、RNAポリメラーゼの働きを抑制する抗体の作成にも成功した。今後、本成果を基にした薬剤開発が期待される。インフルエンザは、日本でも毎年冬になると決まって流行する病気として広く知られている。近年では、豚由来新型インフルエンザウイルスによる世界的大流行が起こり、その脅威に対して日本でもタミフルなどの備蓄に大変な金額が注がれている。しかし、既にタミフル耐性型のインフルエンザウイルスが発見されるなど、ウイルスの変異は頻繁に起こりうるため、このような新型ウイルスに対するワクチンや新薬の開発が世界中で積極的に行われている。本研究では、新規抗インフルエンザウイルス薬ターゲットとして、ウイルスの複製(増殖)に中心的な役割を担っているインフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ(vRNAP)に注目し、このvRNAPの構造生物学的研究を行う。具体的には、vRNAPを精製・結晶化し、X線結晶構造解析によりその立体構造情報を得ることを目的とする。vRNAPはPA、PB1とPB2の3つのサブユニットからなる250kDaと比較的大きな蛋白質であり、構造解析を行うのに十分な量を得るのは非常に困難である。本研究でも、その全ての構造解析を目指しつつも、薬剤ターゲットになりうる部位の部分的な構造解析を行ってきた。これまでに申請者は多くの部位のvRNAP発現系構築を試み、そのいくつかに成功した。本研究では特にサブユニット間結合に注目し、今回新たにPB2-PB1サブユニット結合部位の構造を明らかにした(Sugiyama et al. 2009)。今後は、これまでに明らかにしてきたvRNAPの部分的な構造を基にした新規薬剤候補を探索していくだけでなく、より詳細なvRNAPの反応メカニズムに迫るため、3つのサブユニットからなるvRNAP全体の立体構造解析に挑戦していく予定である。2009年に発生した豚由来新型インフルエンザによる世界的大流行は、一時的に世界中を混乱に陥れたものの、その毒性は季節性の亜型と同じで弱く、死者数は予想されたものよりもずいぶん少なかった。しかし、今後鳥インフルエンザのような強毒型による世界的大流行が起こりうると懸念されており、その対策は世界中の国々にとって非常に深刻な問題である。本研究ではその対策の一つとして、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ(vRNAP)をターゲットとした新規抗インフルエンザ薬開発を目指し、その構造生物学的研究を進め、これまでにvRNAPを構成する三つのサブユニット間のそれぞれの結合部位の立体構造を解明してきた。平成22年度には、完全な形でのvRNAPの立体構造解析を目指し、三つのサブユニットのタンパク質発現系構築を試みた。その結果、酵母を用いた発現系により、PAサブユニット全長の発現に成功したが、PB1及びPB2全長の発現は、大腸菌・酵母どちらを用いた場合にも確認できなかった。そこで、これまでの本研究により既にその発現に成功しているPA-PB1サブユニット複合体を用いて、新規抗インフルエンザ薬開発を目指した。まず始めに、複合体の立体構造を基にin silicoによるサブユニット間結合阻害剤を探索し、導き出された化合物と複合体の結合を生化学的に解析した。その結果、数種類の結合阻害剤が見つかった。また、PA-PB1複合体に結合するモノクローナル抗体を調製したところ、ウイルス複製を抑制する抗体の調製に成功した。これらは新薬開発に向けて非常に重要な成果であり、特許申請も視野に入れさらなる研究を進めている。今後は、これら候補化合物及び抗体との結合型の立体構造解析を行い、抗インフルエンザ薬開発に向けたさらなる情報を引き出していく。
脳血管障害超急性期における細胞膜機能障害に関する研究

Nitroglycerinは、nitricoxide(NO)を介して平滑筋細胞膜を過分極させることにより弛援反応を引き起こすことが知られている。猿クモ膜下出血モデルにおいてnitroglycerinの全身投与による脳血菅攣縮に対する治療効果を検討した。12頭の日本猿を用いてクモ膜下出血モデルを作製した。出血後7日目に脳血管撮影を施行すると、全例に脳血菅攣縮を認めた。大脳皮質脳血流量(rCBF)は、血腫側で有意に低下した。また、cGMP量は血腫側中大脳動脈および両側頭頂葉で有意に低下した。Nitroglycerinを静脈内投与すると脳血菅攣縮は有意に改善し、rCBFも上昇したが、脳血菅におけるcGMP量は上昇しなかった。したがって、nitroglycerinの脳血菅攣縮改善効果はNOによるcGMPの上昇によるものではなく細胞膜過分極によるものであることが示唆された。細胞膜過分極は、クモ膜下出血においても影響されず、脳血菅攣縮治療の有用な手段であるものと考えられた。Protein CおよびProtein Sは、血菅内皮細胞膜上に存在するthrombomodulinによって活性化され抗凝固作用を発揮する。34例のクモ膜下出血患者において、末梢静脈血中のProteinC, ProteinSおよびAntithrombinIIIを経時的に測定した。その結果、これらの3因子は同様な変化をとり、急激な低下は症候性脳血菅攣縮を引き起こし、持続的な低下は脳虚血による神経症状の悪化を招くことが判明した。3因子の減少の原因は、クモ膜下出血により炎症反応が引き起こされることによってcoagulation cascadeが活性化されるためと推測された。これらの実験結果より、クモ膜下出血おいては血管内皮細胞および平滑筋細胞ともに細胞膜機能障害が神経症状発生に重要な役割を果たしていることが推測された。正中縫線核神経細胞と網膜神経節細胞においてpatch clamp法を用いてcalciumおよびpotassium channelを解析した。2)正中縫線核神経細胞におけるwhole-cell voltage clamp法による実験;TEAにより阻害される外向きのイオン流は脱分極性のステップ電圧によって低下せず、また過分極性のprepulseによってもこのイオン流は不変であった。したがって、TEAにより阻害される外向きイオン流は不活性化機構の働きが弱いことが示唆された。一方、4-APにより阻害されるA電流は持続時間が短く、過分極性のprepulseによって著しく増加した。このことより、A電流には強力な不活性化機構が存在することが示唆された。3)網膜神経節細胞におけるwhole-cell voltage clamp法による実験;酵素的に単離した網膜神経節細胞を用いて、Naイオン流を選択的に測定した。この細胞におけるNaイオン流は一過性で、haloperidolによって可逆的に阻害された。今後は脳血管平滑細胞においてpatch clamp法を用いて、calciumおよびpotassium currentを測定する。今年度は、クモ膜下出血後脳血管攣縮における細胞膜機能障害とその治療法の可能性について検討した。猿のクモ膜下出血モデルを作製し、血管撮影によって脳血管攣縮を確認した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて、細胞膜リン脂質過酸化物を測定した。細胞膜リン脂質は、phosphatidylcholine hydroperoxide(PCOOH)とphosphatidylethanolamine hydroperoxide(PEOOH)を脳血管、クモ膜下血腫、脳組織において測定した。

その結果、PEOOHはいづれの験体においても不変であったが、PCOOHは血管攣縮の見られた血管壁に有意に高く検出され、攣縮の程度と関連していた。脂質の酸化を抑制するtirilazadは、脳血管攣縮と血管壁におけるPCOOHの生成の両者を抑制した。このことより、クモ膜下出血においては、出血近傍の脳血管壁に脂質過酸化反応が発生することにより、血管攣縮が引き起こされることが明らかとなった。さらに、細胞膜に過分極とcGMPの上昇の両者を惹起するnitroglycerinは、猿クモ膜下出血モデルにおいて、脳血管攣縮を抑制し、脳血流量を増加させたが、血管壁cGMPを上昇させなかった。したがって、nitroglycerineは脳血管平滑筋に過分極を引き起こすことにより、血管攣縮を改善することが示唆された。現在、パッチクランプ法により、ラット脳血管平滑筋細胞においてnitroglycerineの各種イオン流におよぼす影響を検討中である。