hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
壮年性脱毛症における5alpha reductase(還元酵素)活性の検討

今回の研究では壮年性脱毛症者ならびに正常者から採取した血清における5alphareductase活性を測定することにより,壮年性脱毛症で肥大化した皮脂腺の男性ホルモン活性を比較検討した.【結果】壮年性脱毛症6名(A群)とコントロールとして正常者5名(B群)の血清を採取したA・B群それぞれの血清に対しグルクロニド抱合によりtestosteroneを,選択的硫酸アンモニウム沈殿法によりsex hormone binding-globulin binding capacityを,ジエチルエーテル・beta-グルクロニダーゼを加えた加水分解法を用い5alpha reductaseによる代謝産物である3alpha,17beta-androstanediol glucuronideおよびandrosterone glucuronideを測定した.今回の研究では壮年性脱毛症者ならびに正常者から採取した血清における5alphareductase活性を測定することにより,壮年性脱毛症で肥大化した皮脂腺の男性ホルモン活性を比較検討した.【結果】壮年性脱毛症6名(A群)とコントロールとして正常者5名(B群)の血清を採取したA・B群それぞれの血清に対しグルクロニド抱合によりtestosteroneを,選択的硫酸アンモニウム沈殿法によりsex hormone binding-globulin binding capacityを,ジエチルエーテル・beta-グルクロニダーゼを加えた加水分解法を用い5alpha reductaseによる代謝産物である3alpha,17beta-androstanediol glucuronideおよびandrosterone glucuronideを測定した.
学習者の主体性と深い学びを支える教師の授業遂行能力に関する実証的研究

学校教育において主体的で協働的かつ深い学びが求められる中、本研究では、学習者の思考を深める学習場面を生み出す教師の授業力の内実を明らかにする。そのために、教師の授業計画力と実践力との関係を明らかにし、授業の全過程の学習場面に応じて、両力量がどのように結実・往還しているのかを分析し、それを支える教師の見取りとインターベンションの内実を抽出する。そして、特に学習者の思考が深まる場面を詳細に分析した上で、小学校高等学校における教師の授業計画力と実践力が熟達するための具体的な方策を提案する。
網様体コリン作動性介在ニューロンによる運動ニューロン調節機構の形態学的解析

前年度から引き続いて,延髄の大細胞性網様体と神経連絡をもつ脳領域を明らかにする目的で,網様体に逆行性標識トレーサーを注入したマウスの脳の連続切片において,逆行性標識ニューロンの分布を解析した.逆行性標識の観察に用いた組織標本の隣接切片シリーズについて,ニッスル染色を行ったのち,脳アトラスにしたがって神経核の境界を決めた.その結果,逆行性標識ニューロンが存在する神経領域の正確な同定を進めることができた.次に,扁桃体に順行性トレーサーBDAを注入し,延髄網様体に対する投射を検討した.扁桃体は情動行動の制御に重要な役割をもつ神経核であり,威嚇など攻撃行動では口腔顔面筋の運動ニューロンを動員する必要があるため,網様体のプレモーターニューロンと直接連絡をもつ可能性が考えられる.上記の逆行性トレーサーの解析により,標識ニューロンが扁桃体中心核に存在したため,順行性トレーサーを用いて扁桃体と延髄との神経連絡を解析した.扁桃体中心核に順行性トレーサーBDAの注入がされた個体では,順行性標識された軸索と神経終末の投射が分界条床核などで豊富に見られ,先行研究との一致性が確認できた.続いて,脳幹における順行性標識を観察したところ,中脳水道周囲灰白質外側部,後赤核領域,脚橋被蓋核,結合腕傍核,青斑核,淡蒼縫線核,孤束核などに標識軸索と神経終末が存在したが,延髄大細胞性網様体への投射は少なかった.この結果は,扁桃体中心核と延髄網様体との神経連絡は扁桃体からの直接の投射よりも,脳幹の複数の神経核で中継されて,網様体のプレモーターニューロン(介在ニューロン)に伝達される可能性を示唆している.咀嚼・嚥下にはたらく口腔顔面筋を支配する運動ニューロンには,コリン作動性の神経終末C-terminalがシナプスを形成しており,運動ニューロンの興奮性調節に関与する.これらC-terminalを投射する起始細胞は,延髄の大細胞性網様体に分布するコリン作動性介在ニューロンであることが知られている.本年度は,C-terminal起始細胞と感覚性/運動性ネットワークとの神経連絡を解明する目的で,逆行性トレーサー(Fluoro-Gold)を延髄網様体に注入し,C-terminal起始細胞の存在領域に投射するニューロンの分布を検討した.逆行性標識されたニューロンは,脊髄後角,三叉神経脊髄路核,孤束核,最後野,小細胞性赤核,中脳中心灰白質,結合腕傍核,縫線核など脳幹の様々な神経核で観察された.また脳幹網様体においては,トレーサーを注入した延髄尾側部近くでは小細胞性網様体に標識ニューロンが多く分布したのに対して,延髄吻側部から中脳では外側巨大細胞傍網様核、外背側被蓋核など中間網様体に標識ニューロンが観察された.加えて,神経トレーシングに利用しているCre/lox誘導性ウイルスベクターの改良を行った.これまで使用していた膜移行シグナル付加GFP(myrGFP)発現アデノウイルスベクターは,ニューロンの樹状突起を精細に可視化できる一方で,軸索の可視化を苦手としていた.この問題点を解決するため,膜移行シグナル付加GFPとともに,シナプス局在分子と融合したGFPも発現するアデノ随伴ウイルスベクターを作製した.このベクターを利用することで,ニューロンの軸索分枝および神経終末部の標識効率について改善が期待される。当初計画では,1)網様体コリン作動性介在ニューロンに投射するニューロンの探索,2)コリン作動性ニューロン特異的標識法を用いた介在ニューロンの可視化と形態解析,について実施を計画していた.1)においては,逆行性トレーサーを用いた解析に取り組み,C-terminal起始細胞が存在する延髄網様体に投射するニューロンの分布を脳幹レベルで明らかにできた.2)においては,コリン作動性介在ニューロンの投射様式の再構築が可能となるよう,ウイルスベクターのコンストラクトの改良とベクター作製を終えることができた.当初計画したコリン作動性介在ニューロンの細胞形態の再構築まで進めていないが,解析に必要となるベクターが作製できたことから,研究全体はおおむね順調に進展していると評価した.コリン作動性介在ニューロン(C-terminal起始細胞)が分布する延髄大細胞性網様体に投射する神経領域を決定するため,トレーサーFluoro-Goldによる逆行性標識を用いて標識ニューロンの分布を調べた.前年度において脊髄・脳幹レベルの逆行性標識ニューロンの分布を解析したため,本年度は間脳より吻側レベルについて観察した.その結果,逆行性標識ニューロンは扁桃体中心核,不確帯核,側坐核,視床下部などに分布するとともに,皮質では体性感覚野,体性運動野,帯状回のそれぞれV層において対側優位に観察された.これらの脳領域は,口腔顔面筋の運動制御に関与する神経核にも投射することが報告されており,コリン作動性介在ニューロンが存在する大細胞性網様体も含めた運動調節回路が存在することを示唆している.マウス脊髄の前角運動核におけるC-terminalは,歩行開始時期に同期して成熟する.一方で,哺乳などに機能する口腔顔面筋運動核におけるC-terminalは,脊髄と異なる成熟過程を受けることが予想される.そこで口腔顔面筋運動核の生後発達と,コリン作動性シナプス機能分子の発現変化の関係性を免疫組織

化学で検討した.三叉神経運動核,顔面神経核,疑核および舌下神経核のC-terminalについて,コリンアセチルトランスフェラーゼ,小胞性アセチルコリントランスポーターの発現を解析したところ,出生直後よりも生後4日齢で強い発現が見られた.また同一の運動神経核の中においても, C-terminalでの機能分子の発現変化が運動ニューロンプールごとに異なることが明らかになった.当初計画していた,1)脳幹網様体のコリン作動性ニューロンに対する神経連絡の解析,2)鰓弓性運動神経核のC-terminalで発現するシナプス機能分子の解析,の2点について解析を進めることができた.3)コリン作動性介在ニューロンの細胞形態の再構築,は前年度から解析を継続中であるが,研究全体はおおむね順調に進展している.前年度から引き続いて,延髄の大細胞性網様体と神経連絡をもつ脳領域を明らかにする目的で,網様体に逆行性標識トレーサーを注入したマウスの脳の連続切片において,逆行性標識ニューロンの分布を解析した.逆行性標識の観察に用いた組織標本の隣接切片シリーズについて,ニッスル染色を行ったのち,脳アトラスにしたがって神経核の境界を決めた.その結果,逆行性標識ニューロンが存在する神経領域の正確な同定を進めることができた.次に,扁桃体に順行性トレーサーBDAを注入し,延髄網様体に対する投射を検討した.扁桃体は情動行動の制御に重要な役割をもつ神経核であり,威嚇など攻撃行動では口腔顔面筋の運動ニューロンを動員する必要があるため,網様体のプレモーターニューロンと直接連絡をもつ可能性が考えられる.上記の逆行性トレーサーの解析により,標識ニューロンが扁桃体中心核に存在したため,順行性トレーサーを用いて扁桃体と延髄との神経連絡を解析した.扁桃体中心核に順行性トレーサーBDAの注入がされた個体では,順行性標識された軸索と神経終末の投射が分界条床核などで豊富に見られ,先行研究との一致性が確認できた.続いて,脳幹における順行性標識を観察したところ,中脳水道周囲灰白質外側部,後赤核領域,脚橋被蓋核,結合腕傍核,青斑核,淡蒼縫線核,孤束核などに標識軸索と神経終末が存在したが,延髄大細胞性網様体への投射は少なかった.この結果は,扁桃体中心核と延髄網様体との神経連絡は扁桃体からの直接の投射よりも,脳幹の複数の神経核で中継されて,網様体のプレモーターニューロン(介在ニューロン)に伝達される可能性を示唆している.平成29年度は,以下について研究を進める予定である.1.脳幹網様体のコリン作動性ニューロンに対する神経連絡の解析これまでの研究により,脳幹網様体におけるC-terminal起始細胞の存在領域は,脳幹に存在する感覚性中継核や自律神経系を含めた運動性中継核と神経連絡を持つ可能性が示された.一方で,前脳に存在する神経核からの投射については不明である.そこで,脳幹で解析を行った標本と同一個体の前脳領域についても組織標本を作製し,逆行性標識されたニューロンの存在する神経核を明らかにする予定である.2.鰓弓性運動神経核の運動ニューロンで発現するシナプス機能分子の解析哺乳・嚥下に機能する口腔顔面筋の運動ニューロンは出生直後から活発に活動する必要があり,脳幹の運動ニューロンとシナプスをつくるC-terminalは脊髄と異なる成熟過程をとる可能性が高い.そこで,脊髄のコリン作動性シナプスで発現する機能分子について,口腔顔面筋の運動ニューロンならびにC-terminalでの発現を免疫組織化学により検討する予定である.
景観遺伝学による新たな感染症対策評価方法の開発

倫理委員会の承認を得た後、中部ルソン地域内の狂犬病対策担当の獣医師らから、過去10年間の年間狂犬病動物報告数、ヒト狂犬病報告数、動物用狂犬病ワクチン接種数、登録イヌ頭数などについて情報を収集中である。また、中央ルソン地方動物衛生保健所において検査された動物狂犬病陽性検体について遺伝子解析を行う予定である。我々はこれまでにも同地域の地理的情報を用い、景観遺伝学の手法で狂犬病ウイルスの伝播の促進・抑制要素について検討を行ってきた。地理的勾配・人口密度・狂犬病対策活動のいずれが狂犬病ウイルスの伝播に関与しているかについて検討を行った結果、急勾配の坂がウイルスの伝播抑制に関与していることを見出した。後述のように、今回は動物実験倫理委員会からの許可が降りるのに時間がかかり、新規の研究としてはあまり進んでおらず、主に来年度から効率よくデータを収集するための討議をするにとどまった。カウンターパートであるRITM(研究協力機関であるフィリピン熱帯医学研究所)と討議した内容としては(1)来年度の研究計画についてのディスカッション(2)検体共有についてのディスカッション(3)過去のデータの整理であった。具体的には、(1)については、対象フィールドであるRegion 3における疫学データおよび狂犬病対策データの具体的な収集方法についての話し合いを行い、これまでのように自治体が収集した情報をそのまま使うのか、あるいはより精度の高いデータを得るために能動的にデータを収集するシステムを行う場合、どのようなことが可能かについて話し合った。(2)RITMが別の狂犬病研究において同じRegion 3で収集している検体の二次利用について話を進めた。別研究では動物狂犬病のウイルスの有無をPCRですでに確認しており、同じ個体の脳検体を本研究にも利用することが可能である。本研究ではその検体から狂犬病ウイルスの遺伝子配列の解読を行う予定である。該当個体の情報は、フィールドにおける同じカウンターパートであるRegion3の動物衛生研究所から共有される。(3)過去に我々がフィリピンで行なった狂犬病研究で用いた検体の収集場所と遺伝子解析結果についてデータベースのクリーニングを改めて行なった。これらの遺伝子情報は本研究でも利用予定である。研究プロトコルは、共同研究施設であるフィリピン熱帯医学研究所(RITM)倫理委員会で承認され進められている狂犬病分子疫学研究のプロトコルに変更を加えて申請していたが、本年度から動物に関する研究はRITM内の動物実験倫理委員会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)の担当となったのだが、その審査に時間がかかり承認がおりたのが2月であり、当初の予定より遅れてのスタートとなった。本研究ではまず初年度に、拠点となるフィリピン熱帯医学研究所(Research Institute for Tropical Medicine, RITM)における倫理委員会への変更申請を行い、次年度に変更承認が得られた。承認後は対象とする中部ルソン地方の地方動物衛生保健所において本研究に関する打ち合わせを数回行った。さらに、中部ルソン地方内の州レベル、市レベルの自治体で狂犬病対策を行っている獣医師らを招集しミーティングを行い、現状の共有を行うと共に、本研究に必要な情報提供の依頼を行った。過去10年間の年間狂犬病動物報告数、ヒト狂犬病報告数、動物用狂犬病ワクチン接種数、登録イヌ頭数などについての疫学情報を収集できた州または市において、さらにその中から町レベルで同様の情報を得られそうな都市を選び情報収集中である。また、中央ルソン地域地方動物衛生保健所において収集、検査された動物狂犬病陽性検体の収集も開始しており、RITMにおいて保存している。今後RT-PCRおよびシーケンスにより遺伝子情報を得る。なお我々はこれまでにも地理的情報を用い、景観遺伝学の手法でフィリピンにおける狂犬病の伝播の促進・抑制要素について中央ルソン地域におけるデータをもとに検討を行ってきた。今回、地理的勾配・人口密度・狂犬病対策活動(予算、および教育活動)のいずれが狂犬病ウイルスの伝播に関与しているかについて検討を行った結果、急勾配の坂のみが狂犬病ウイルスの抑制に関与していることを見出し、その知見について論文を投稿したがまだアクセプトまで至っていない。検体収集対象となっているRegion 3への訪問、追加検体および狂犬病に関する疫学情報収集を可及的速やかに開始する。ウイルス学倫理委員会からの承認がおりるまでに時間がかかり、実質的な研究があまり進められなかったため。年度始めから対象地域であるRegion3への出張、必要に応じて解析を行うのに必要なスタッフを雇用する。
バイオインフォマティクスによるがん化学療法の新規創薬ターゲット遺伝子の探索

がん細胞の抗がん剤感受性を規定する遺伝子群を同定する目的で、39種類のヒトがん細胞株について約65種類の抗がん剤に対する感受性と約1万種類の遺伝子発現を測定し、バイオインフォマティクス的手法により各々の抗がん剤感受性と統計学的に有意な相関が認められた遺伝子群を抽出した。ここで認められた抗がん剤-遺伝子の間の関連性を一般化するためには、39細胞株とは違ったセットを用いて検証をおこなう必要がある。本研究では、関連性の検証のために米国国立がん研究所(NCI)が公開している60種類のヒトがん細胞についての薬剤感受性・遺伝子発現データベースを利用した。その結果、39細胞株での解析で有意な相関が認められた遺伝子-抗がん剤の組み合わせ3,267組のうち、617組(19%、268遺伝子)についてNCIのデータを用いても同様な相関が認められた(P<0.05)。このことから、これらの遺伝子は、相関が認められた抗がん剤の感受性への機能的な関与が期待された。そこで、RNA干渉法を利用してこれらの遺伝子発現が高い細胞株で発現をノックダウンさせ抗がん剤感受性が変化するかを検討し、これまでに発現ノックダウンによりDNAトポイソメラーゼ(トポ)阻害剤の感受性が大きく低下した遺伝子を同定した。このことから、この遺伝子はトポ阻害剤による抗がん作用に機能的な関与があることが示唆された。現在、他の遺伝子についても順次検討を進めている。抗がん剤感受性に大きな影響を与える遺伝子はがん化学療法・抗がん剤耐性克服の新たな創薬ターゲットとしての可能性が期待される。
非対称化を活用した含窒素連続不斉炭素構築法の開発とパクタマイシン類の合成研究

「連続する含窒素・酸素四置換炭素」の高エナンチオ・ジアステレオ選択的な構築法の開発は,現在でも非常に挑戦的な研究課題であり,それらを応用した天然物の全合成や生物活性評価にも興味が持たれる.本研究課題では,これら合成法の開発を基盤とした天然物の骨格構築法を開発し,全合成及び生物活性評価への展開を目的とする.まず,非対称化反応を用いたパクタマイシン類のラセミ全合経路を確立する.さらに,不斉非対称化を伴うアジリジン化反応及び[4+2]環化付加反応を応用したパクタマイシン,パクタマイケートのエナンチオ選択的全合成を達成する.「連続する含窒素・酸素四置換炭素」の高エナンチオ・ジアステレオ選択的な構築法の開発は,現在でも非常に挑戦的な研究課題であり,それらを応用した天然物の全合成や生物活性評価にも興味が持たれる.本研究課題では,これら合成法の開発を基盤とした天然物の骨格構築法を開発し,全合成及び生物活性評価への展開を目的とする.まず,非対称化反応を用いたパクタマイシン類のラセミ全合経路を確立する.さらに,不斉非対称化を伴うアジリジン化反応及び[4+2]環化付加反応を応用したパクタマイシン,パクタマイケートのエナンチオ選択的全合成を達成する.
血液細胞-血管内皮相互反応制御による網脈絡膜疾患の病態解明と新治療法の開発

網脈絡膜疾患の病態形成に、血液細胞と血管内皮の相互反応が重要な役割を果たしていることを示し、その相互反応を制御することで、病態の引き起こす組織障害を軽減させることができることを明らかにした。具体的には、抗血小板薬であるシロスタゾールが網膜虚血再灌流後の網膜における白血球および血小板と血管内皮の相互反応を減弱させ、引き続いて生じる組織障害を抑制すること、誘導型一酸化窒素合成酵素の機能抑制が、眼炎症における白血球-血管内皮相互反応の減弱をもたらすことなどを示した。我々は以前、血中の血小板数を減少させることが、網膜虚血再灌流障害の軽減をもたらすことを報告し(Nishijima K, et al.Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 977,2004)、血小板が、白血球一血管内皮相互反応を修飾することで網膜虚血再灌流障害の病態形成に一役買っている可能性を明らかにした。血小板の機能を抑制することで、疑似血小板減少状態を作ることは可能と考え、ホスホジエステラーゼ3(PDE3)活性を特異的に阻害する抗血小板剤であるシロスタソールに注目した。シロスタソールには、白血球と血小板、血管内皮相互反応の減弱効果があるとされており(Ito H, et al. Platelets 15: 293,2004)、シロスタゾールの網膜虚血再灌流障害に対する神経保護作用について、白血球一血管内皮相互反応に着目して検討した。有色ラットを用いて、その視神経を露出、結紮し、60分間網膜中心動脈を閉塞させ網膜虚血を作製した後、視神経を解放し再灌流させることで網膜虚血再灌流障害モデルを作製した。網膜虚血再灌流障害の急性期には、白血球が血管内皮細胞上を転がるローリング現象や白血球の血管内皮への強固な接着、白血球の血管外への遊走など、ダイナミックな白血球-血管内皮相互反応が生じるが、シロスタソールの経口投与(100mgkg^<-1>day^<-1>)により、ローリング現象は最大77.6%(P<0.01)、白血球の血管内皮への接着は36.1%(P<0.01)、白血球の網膜毛細血管床への集積は20.4%(P<0.01)の抑制がみられた。また、網膜虚血再灌流障害においては、白血球ローリングを司る細胞接着分子であるP-selectin、および白血球と血管内皮との強固な接着に関与する細胞接着分予てあるICAM-1の網膜での遺伝子発現が亢進するが、シロスタゾールの投与によりともに有意に抑制された(P<0.05)。さらに、血小板と血管内皮との相互反応について検討したところ、血小板も白血球と同様に、網膜虚血再灌流障害の急性期には、ローリングや血管内皮への接着といった血管内皮との相互反応を生じるが、シロスタゾールの投与により、ローリングは32.0%(P<0.01)、血管内皮への接着は42.4%(P<0.01)の抑制がみられた。網膜虚血作製後2週間後に網膜組織障害について検討したところ、網膜虚血再灌流によって非薄化した網膜厚が、シロスタゾールの投与により有意に改善した(P<0.0001)。以上の結果によりシロスタゾールは、網膜虚血再灌流後の網膜における細胞接着分子の発現を抑制することで、白血球および血小板と血管内皮との相互反応を減弱させ、引き続いて生じる組織障害を抑制すると考えられた。白血球-血管内皮相互反応は、炎症の病態形成において重要な役割を果たしている。また炎症時には、誘導型-酸化窒素合成酵素(inducible NO synthase; iNOS)の発現が亢進し、iNOS由来のNOが、白血球-血管内皮相互反応における白血球と血管内皮細胞の接着を司る細胞接着分子であるICAM-1やP-selectinなどの発現を制御することで、炎症の病態形成に深く関わっていることが報告されている。今回我々は、iNOSノックアウトマウスを用いて、眼炎症モデルであるエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(Endotoxin-induced uveitis; EIU)の病態形成過程におけるiNOSの果たす役割について検討した。iNOSノックアウトマウスおよびC57BL/6マウス(正常対照マウス)の足蹄部に1ipopolysaccharideを注射することでEIUモデルを作製した。EIUを誘発後、アクリジンオレンジ白血球蛍光造影法を用いて、網膜循環における白血球-血管内皮相互反応を経時的に観察した。また、網膜血管外に遊走した白血球については、網膜をflat-mountに展開した後、蛍光顕微鏡下にて評価した。

EIU発症の急性期には、網膜主幹動静脈の拡張、白血球が血管内皮細胞上を転がるローリング現象や白血球の血管内皮への強固な接着、白血球の血管外への遊走など、ダイナミックな白血球-血管内皮相互反応が生じるが、iNOSノックアウトマウス群では、C57BL/6マウス群に比べて、白血球のローリング現象は最大98.2%(P〈0.0001)、遊走白血球数は最大74.0%(P〈0.0001)の抑制がみられた。また、iNOSノックアウトマウス群において主要網膜静脈径の拡張がC57BL/6マウス群に比べて有意に減弱していた(P〈0.0001、最大76.4%)。以上から、iNOSノックアウトマウスでは、EIUの網膜循環において白血球-血管内皮相互反応が著明に減弱し、網膜の血管拡張も抑制されることが分かった。このことからiNOSは、眼炎症に対して促進的に働き、その病態形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。iNOSノックアウトマウスを用いて、眼炎症モデルであるエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(Endotoxin-induced uveitis; EIU)の病態形成過程におけるiNOSの果たす役割について、白血球-血管内皮相互反応の観点から検討した。EIU発症の急性期には、網膜主幹動静脈の拡張、白血球が血管内皮細胞上を転がるローリング現象や白血球の血管内皮への強固な接着、白血球の血管外への遊走など、ダイナミックな白血球-血管内皮相互反応が生じるが、iNOSノックアウトマウス群では、対照マウス群に比べて、白血球のローリング現象は最大98.2%、遊走白血球数は最大74.0%の有意な抑制がみられた。また、iNOSノックアウトマウス群において主要網膜静脈径の拡張が対照マウス群に比べて有意に減弱していた。網膜循環障害である網膜静脈閉塞症(Retinal vein occlusion; RVO)は、黄斑部に浮腫を生じることによって重篤な視機能障害をもたらす疾患である。この黄斑浮腫の形態と網膜層構造の変化が、RVOの視機能予後にどのような影響をもたらすかについて、3次元光干渉断層計(Three-dimensional optical coherence tomography; 3D-OCT)を用いて検討した。3D-OCTを用いると、従来の方法では十分に描出できなかった網膜層構造を、高解像度で詳細に観察することが可能であった。外境界膜と視細胞層の層構造と視力について検討した結果、外境界膜及び視細胞層の層構造が保たれていることと視力との間には正の相関がみられた。これにより、RVO発症後の視力改善に網膜層構造の保持が重要であることが示唆された。
絶縁体/半導体異種材料単結晶超格子を用いたサブバンド間遷移レーザの研究

シリコン基板上に積層エピタキシャル成長可能な弗化物系絶縁体弗化カルシウム(CaF_2)と弗化カドミウム(CdF_2)を用いたヘテロ接合は、その接合界面に大きな(2.9eV)の伝導帯バンド不連続を有するため、これらの材料で構成した薄膜超格子を用いると、室温においても極めて顕著な微分負性抵抗を示す共鳴トンネルデバイスやサブバンド間遷移レーザの実現が期待される。特にサブバンド間遷移レーザの実現には、多層積層薄膜の精密構造制御による量子井戸サブバンドの制御が必要不可欠であり、本年度の研究により以下の成果を得た。1)CdF_2/CaF_2ヘテロ構造の結晶成長を原子層厚レベルで制御するため、結晶成長領域を100nm程度の微細な領域に限定するナノ領域ローカルエピタキシー法を提案し、CdF_2-CaF_2二重及び三重障壁共鳴トンネルダイオードの微分負性抵抗特性評価を行った。その結果、室温で再現性の良い微分負性抵抗特性を得るとともに、三重障壁,二重障壁双方の場合において,CdF_2量子井戸層の層厚制御により、微分負性抵抗のピーク位置を制御することにはじめて成功した。2)シリコン(100)基板表面を2原子層(=1結晶周期)ステップが支配的になるように構造を制御することにより、その上にCdF_2/CaF_2RTD構造の積層エピタキシャル成長に成功するとともに,その構造においてはじめて室温微分負性抵抗特性を観測した。これはシリコン(100)基板上の反位相境界による結晶欠陥の生成を抑制し、位相がそろったエピタキシャル平坦膜の形成に成功したものであり、大規模LSIのプラットフォームと弗化物系量子ヘテロ構造の形成プラットフォームを共通化することが可能となるため、応用上極めて大きな波及効果を有する成果である。1)CdF_2/CaF_2ヘテロ構造の結晶成長を原子層厚レベルで制御するため、結晶成長領域を100nm程度の微細な領域に限定するナノ領域ローカルエピタキシー法を提案し、CdF_2-CaF_2二重障壁共鳴トンネルダイオード(DBRTD)の微分負性抵抗特性評価を行った。その結果、室温で再現性の良い微分負性抵抗特性を得るとともに、CdF_2量子井戸層の層厚制御により、微分負性抵抗のピーク位置を制御することにはじめて成功した。2)ナノ領域ローカルエピタキシー法を適用してシリコン(100)基板上に作成したCdF_2/CaF_2RTDにおいて、はじめて室温微分負性抵抗特性を観測した。これはシリコン(100)基板上最表面原子の再配列による異方的マイグレーションを抑制し、エピタキシャル平坦膜の形成に成功したものであり、大規模LSIのプラットフォームと弗化物系量子ヘテロ構造の形成プラットフォームを共通化することが可能となるため、応用上極めて大きな波及効果を有する。
肝免疫担当細胞(Kupffer細胞、Pit細胞)による肝細胞癌の増殖抑制機序:NOおよびTNF-αの関与

本研究では、肝免疫担当細胞の一つであるKupffer細胞によるNOおよびTNF-αの放出動態の解明を行った.またさらに、これらによる肝癌細胞障害や肝癌細胞内DNA断片化(アボトーシス)との時間的空間的相関およびその制御機構の解明を行った.まずKupffer細胞と肝癌細胞の共培養系におけるNO・TNF-α産生の定量と、転写因子活性化ならびにアボトーシスを蛍光を用いて可視化、定量するシステムを確立した。この結果、Kupffer細胞と肝癌細胞を共培養することにより、接着因子CD18/ICAM-1を介した肝癌細胞との接着反応からKupffer細胞の転写因子NF-κBが活性化され、iNos・TNF-αのmRNAの転写が促進されることが明らかとなった.これにより、Kupffer細胞から放出されたNo・TNF-αが相乗効果的に肝癌細胞に対してアボトーシスを引き起こすことが明らかとなった.近年、NK(Natural Killer)細胞を初めとするリンパ球系細胞から放出されるオステオボンチンというペプチドがマクロファージ等のiNOS誘導を阻害することが報告され、新たな免疫・抗癌活性調節機序として注目を集めている.このNK活性を有するPit細胞とKupffer細胞を共培養することにより、Kupffer細胞由来NOによるPit細胞のオステオボンチンや抗肝癌活性に対する影響を、またPit細胞由来オステオボンチンによるKupffer細胞のNO・TNF-α産生および抗肝癌活性に及ぼす検討を行っている。
氷床コア分析による過去の温室効果気体濃度の研究

南極及びグリーンランドで掘削された氷床コアを分析することによって過去の温室効果気体の変動を推定するために、コアから効率よく空気を抽出する装置と試料気気中に含まれるCO_2,CH_4,N_2C,CO_2のδ^<13>Cを高精度で定量する装置を開発した。総合分析精度はそれぞれ、1ppmv,10ppbv,2ppbv,0.05%以内であった。これらの装置を用いて南極みずほコア,南やまとコア,グリーンランドSiteJコアを分析した結果、以下のことが明らかとなった。1.9000-250年前の後氷期におけるCO_2,CH_4,N_2O濃度は280.9±4.6ppmv,729±30ppbv,265±8ppbvとほぼ一定であった。しかし、何れの気体の濃度も、人間活動の影響によってこの250年の間に急速に増加し、現在のレベるに達した。2.南やまとコアを分析することによって得られたCO_2,CH_4,N_2O濃度は213.3±4.6ppmv,484±44ppbv,243±10ppbvであり、後氷期の値よりかなり低く、このコアは氷河期のものであることが示唆された。また、δ13CはCO_2濃度の変動とほぼ逆相関となっており、このことから、氷河期の大気中のCO_2濃度の変動は海洋生物活動に帰依されると考えられる。3.みずほコア及びSite Jコアから得られた250年以前のCH_4濃度はそれぞれ701±10ppbv,756±10ppbvであり、工業化以前でも自然的発生源の強度の違いを反映して、南半球高緯度よりも北半球高緯度において濃度が高かったことを意味している。また、現在の南北両半球の濃度差は本研究で得られた値の役3倍であり、CH_4の濃度増加の原因は北半球における人間活動による発生源の強まり、あるいは消滅源の弱まりによるものと考えられる。過去における大気中の微量気体濃度の変遷を推定するために、切削法と融解法によって氷床コアから空気を抽出する装置を製作し、高精度でCO_2とCH_4濃度を定量する技術を確立した。また、これらの技術を用いて、過去におけるCO_2とCH_4濃度の変動を明らかにするために南極みずほコア、やまとコア及び北極サイトJコアの分析に着手した。本年度の結果をまとめると以下のようになる。(1)開発した融解装置は1kgのコアを約15分で融解させ、放出された空気を完全に回収できる。また、切削装置の空気抽出効率は98%であり、1kgのコアを約2分で切削する能力を有する。(2)抽出した空気はガスクロマトグラフィ-を分析部とした測定システムによって分析され、濃度の定量精度はCO_2について±1.0ppmv以内、CH_4について±10ppbv以内であり、氷床コア分析を行うには十分な精度である。(3)コアの空気含有量の深度分布から推定されたみずほコアの気泡の年代はコアより364年ほど若く、年代幅は約106年であることが推定された。(4)人間活動の影響を受ける以前の南半球のCO_2とCH_4のバックグラウンド濃度はそれぞれ279287ppmvと690750ppbvであった。(5)CO_2とCH_4の濃度は18世紀後半以降より人間活動の影響をうけて著しい増加傾向を示した。(6)やまとコアの気泡

空気を分析した結果はCO_2、CH_4濃度がそれぞれ230240ppmvと530580ppbvであることを示し、分析したコアが氷期のものであることを示唆した。(7)産業革命前の北半球のCH_4濃度は約750ppbvであり、南半球より約50ppbv程高かったことから、CH_4の自然発生源が北半球に多いということが示唆された。(8)また、現在の南北両半球のCH_4濃度差が125ppbvであることを考慮すると、CH_4の人為発生源も北半球に多いということが予想される。南極及びグリーンランドで掘削された氷床コアを分析することによって過去の温室効果気体の変動を推定するために,コアから効率よく空気を抽出する装置と試料空気中に含まれるCO_2,CH_4,N_2O,CO_2,のδ^<13>Cを高精度で定量する装置を開発した。総合分析精度はそれぞれ,1ppmv,10ppbv,2ppbv,0.05%以内であった。これらの装置を用いて南極みずほコア,南やまとコア,グリーンランドsiteJコアを分析した結果,以下のことが明らかとなった。1.9000-250年前の後氷期におけるCO_2,CH_4,N_2O濃度は2809±4.6ppmv,729±30ppbv,265±8ppbvとほぼ一定であった。しかし,何れの気体の濃度も,人間活動の影響によってこの250年の間に急速に増加し,現在のレベルに達した。2.南やまとコアを分析することによって得られたCO_2,CH_4,N_2O濃度は213.3±4.6ppmv,484±44ppbv,243±10ppbvであり,後氷期の値よりかなり低く,このコアは氷河期のものであることが示唆された。また,δ^<13>CはCO_2濃度の変動とほぼ逆相関となっており,このことから,氷河期の大気中のCO_2濃度の変動は海洋生物活動に帰依されると考えられる。3.みずほコア及びsiteJコアから得られた250年以前のCH_4濃度はそれぞれ701±10ppbv,756±ppbvであり,工業化以前でも自然的発生源の強度の違いを反映して,南半球高緯度よりも北半球高緯度において濃度が高かったことを意味している。また,現在の南北両半球の濃度差は本研究で得られた値の約3倍であり,CH_4の濃度増加の原因は北半球における人間活動による発生源の強まり,あるいは消滅源の弱まりによるものと考えられる。
遺伝性赤血球膜異常症の病因・病態に関する生化学的・分子遺伝学的研究

平成6・7年度を通じて次の4大主題について共同研究、情報交換、相互討議を行い、次の如き成果が得られた(論文1-32:業績目録添付)。1.わが国における遺伝性赤血球膜異常症の疫学頻度に関する研究:2.遺伝性球状赤血球症(HS)の病態・病因解析:(1)疫学的特徴:蛋白生化学の立場から、本症のphenotypeの同定を行い、わが国のHSの特徴を解析した。その結果、諸外国では、本症の病因がankyrin単独またはankyrin (Ank)+spectrin (Sp)の複合異常が全症例の約2/3であり、band3 (B3)あるいはband4.2(B4.2)異常症が約1/3であるのに対して、わが国では、Ank/Sp系の異常は極めて稀で、むしろB3/B4.2異常が主体であることを明らかにした(論文5)。3.わが国に特有なband4.2異常症の病因・病態の解明:(3)B4.2異常症の病態研究:B4.2完全欠損症における膜間粒子(IMP)としてのB3、および細胞骨格蛋白網の病態を電顕学的および膜物性学的に検索し、B4.2がB3のみならず、Spにも結合していることを明らかにした(論文11、18、20、22)。(4)赤血球膜形態形成(morphogenesis)におけるB4.2の役割:膜形態形成過程においては、まずSp、B3が発現し、次いでAnk、B4.1が、最後にB4.2が発現し、赤血球膜形成が完成することを見出した(論文9、17、22、23、27、31)。(1)わが国におけるHEの疫学的特徴:膜蛋白生化学的検索により、α-Sp異常症は極めて稀(α^<1/74>異常症1家系のみ)(論文3)であるのに対して、β-Sp異常症は全世界8家系のうち、3家系を報告した。(3)α-Spectrin genepolymorphism :日仏共同研究の一環として、α-Sp gene異常としてのallele α^<LELY>の頻度を日本人、仏白人、黒人、中国人について検索し、わが国ではその頻度は他民族とほど同様であった(論文14)。B4.1完全欠損症(B4.1 Madrid)の分子病態:細胞骨格蛋白網を構成するB4.1の完全欠失状態においては、IMP(B3)と細胞骨格蛋白網の著しい異常が生じていることを膜生化学的、分子電子顕学的に明らかにした(論文29)。以上、従来からの研究背景と日仏共同研究の成果によって、平成6・7年度において、わが国の赤血球膜異常症の特徴と明らかにしえたが、さらに平成8年度のおいても本国際学術研究共同研究として同一共同研究計画名の下に未解決の諸項目について検索を進める予定である。

以上、従来からの研究背景と日仏共同研究の成果によって、平成6・7年度において、わが国の赤血球膜異常症の特徴と明らかにしえたが、さらに平成8年度のおいても本国際学術研究共同研究として同一共同研究計画名の下に未解決の諸項目について検索を進める予定である。(1)わが国における赤血球膜異常症症例の集積とその疫学的特性の解明:赤血球膜異常症自験610症例を検索し、わが国におけるその疫学的特徴を明らかにしえた。その結果、遺伝性球状赤血球症(HS)が最も高頻度であり、ついで遺伝性楕円赤血球症(HE)、遺伝性有口赤血球症(HSt)となり、これらの主体は赤血球膜蛋白異常症であり、膜脂質異常症は数%と判明した。この膜蛋白異常症のうち、わが国のHSでは、欧米(spectrin・ankyrin異常が主要因)とは異なり、band 3・band 4.2異常症が主体であることを明らかにした。また本年度の研究対象として特にband 4.2異常症とspectrin異常症を取りあげた。
HTLV-1 Taxによる細胞性初期遺伝子の発現誘導機講とウイルス複製への役割

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)の転写制御因子Taxはウイルス遺伝子だけでなくさまざまな細胞性遺伝子を転写レベルで活性化することが知られており,このことによって感染細胞の異常増殖を誘発し白血病化に関与すると考えられている。我々はTaxによって誘導される核内原癌遺伝子群として(c-fos,egr-1,egr-2)を既に同定し,報告している。本研究ではこれらの遺伝子のTaxによる転写誘導機構を明かにすることを試みた。これらの遺伝子の転写制御領域で,Tax応答性に必要な領域を欠失変異を導入して調べたところCArG配列を同定することが出来た。そこに結合する転写因子としてSRF(serum responsive fator)が3つの遺伝子に共通な因子として同定できた。試験官内でTaxとSRFを作らせて両者の結合能を調べたところ特異的な結合が観察された。SRFと異種の転写因子に由来するDNA結合領域(GAL4)のキメラ蛋白質を細胞内に発現されるとTaxはGAL4結合配列を介した転写をも活性化することを示した。SRFはもともと細胞内に存在した増殖刺激が細胞に加わると核内でそのシグナルを受けとる最終標的と成る転写因子の一つであり,このことによって細胞を増殖相に向かわせるための最初の遺伝子発現が起こる。我々の実験結果から,TaxがHTLV-1感染細胞の中で発現したときには増殖刺激なしにTaxがSRFを介した核内原癌遺伝子の発現を誘導し,その結果細胞増殖機構の少なくとも一部が異常に働き始めると考えられる。以上の結果から,我々の今回の研究によってHTLV-1Taxが白血病発症を誘導するときの最初の出来事の分子機構を明かにすることが出来たと考える。
特異な化学構造と強力な抗癌作用を有する糖・脂質複合型希少天然物の合成化学的研究

Nigricanoside Aジメチルエステル体の分子北西部位の調製を行った。前年度に採用していた経路では全合成が困難であるため、合成経路の抜本的見直しを行った。ジヒドロキシアセトンのアセトナイド保護体をRAMPヒドラジンと縮合させてヒドラゾンを調製し、アリルブロミドとの間でEndersアルキル化を行った後に、酸処理してRAMPを除去した光学活性なケトンを得た。続いて得られたケトンのジアステレオ選択的な還元の検討を行った。所望のanti還元体のみを得ることは出来なかったものの、嵩高い還元剤を用いることでsyn還元体を単一物として得ることに成功した。次に生じた水酸基の立体反転を行い、水酸基の立体化学を所望のものに整え、ブロモ酢酸誘導体とのエーテル化を行うことでαーβ鎖間の連結に成功した。続いてオキサゾリジノンとの縮合を経てアルキル化前駆体を得た。これよりアルキル化、オレフィン化を経て分子北西部位の合成が完了でき次第、分子南東部位との連結を行う。また、エーテル結合を構築する別法として、二つの脂肪酸鎖の直接的な連結を視野に入れている。これまで関連研究では不斉補助基を利用したアルキル化を報告してきたが、新たな戦略として1不斉補助基を利用した不斉酸化、2キラルプールへの求核付加反応による所望の不斉炭素原子部位の構築を考案した。その一環としてnigricanoside類のα,β鎖に類似する構造を有するsacrolide Aおよび三重結合を有するオキシリピンの合成研究に取り組み、前者では戦略1を、後者では戦略2を駆使してこれら二つの化合物の全合成を達成した。さらに後者では提唱構造の誤りを発見し、天然物の真の構造を解明する成果を挙げた。このモデル研究で得られた知見は、nigricanoside類の合成研究を加速させるうえで重要であると考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。前例の無い構造様式で連結したNigricanoside Aジメチルエステル体の全合成研究を行った。今年度は主に、Nigricanoside Aの立体構造の分子北西部位の調製を追究した。アリルハライドとプロパルギルアルコールを塩基性条件下反応させ、中程度の収率で連結体を得ることが出来た。得られたプロパルギルアルコールの三重結合をトランス二重結合へ還元し、不斉エポキシ化に付すことで光学純粋なエポキシアルコールを調製した。一方、カルボン酸フラグメントはオキサゾリジノン誘導体を用いた不斉アルキル化を行い、不斉補助基を加水分解することで調製した。得られたエポキシアルコールフラグメントとカルボン酸フラグメントを縮合させたところ、反応は円滑に進行し分子内エーテル環化前駆体を得た。現在環化反応の検討を行っている。また、Nigricanoside Aの特異なエーテル結合を構築する別法として2つの脂肪酸鎖の直接的な連結も引き続き検討している。今年度は2つの脂肪酸鎖の関連構造を有する、酸化型不飽和脂肪酸(オキシリピン)の合成を1つ達成したが、脂肪酸鎖のさらなる効率的な合成法を確立するため、オキシリピン型化合物であるSacrolide Aの合成も同時に行っている。文献を精査したところ、従来用いていたオキサゾリジノンよりも反応性に富むことに加え、その後の官能基変換も容易に行うことが可能な不斉補助基を見出した。この不斉補助基を用いることにより、水酸基を有する不斉炭素を構築する予定である。nigricanoside Aの合成において分子北西フラグメントの調製に検討を要した。具体的にはエポキシアルコールを調製する際に二重結合の異性化や酸化反応で予期せぬ反応が起こったため反応条件を精査する必要があった。Nigricanoside Aジメチルエステル体の分子北西部位の調製を行っている。エーテル環化前駆体に対し、まずは酸を触媒として水酸基からの環化反応を試みたが、解析困難な混合物を与えた。次に塩基またはルイス酸による検討を試みたが望む反応は進行せず、原料の分解を起こすのみとなった。以上の結果よりエポキシドへの分子内6-exo-環化反応は困難だと考え、別法として金属を用いた二重結合への環化反応を試みたが反応は進行しなかった。以上第二級水酸基からの分子内エーテル環化反応は困難だと判明したため、合成経路の抜本的見直しを行った。また、Nigricanoside類のエーテル結合を構築する別法として、2つの脂肪酸鎖の直接的な連結を視野に入れている。その際、水酸基を有する不斉炭素をいかにして構築するかが鍵となる。新たに不斉補助基としてDaviesの不斉補助基に着目し、モデル研究としてオキシリピン型天然物の合成に取り組み、アルキル化条件の最適化を試みた。しかし、文献の方法に則りDaviesの不斉補助基を合成してアルキル化を行ったところ、収率が非常に低い結果を与えた。溶媒や添加剤の検討を行ったが収率の改善には至らなかったため、Daviesの不斉補助基の実用性は低いと判断した。そのため新たな水酸基導入法としてDavis酸化を用いた合成経路を立案した。この合成経路に基づきsacrolide Aの合成を進め、効率的に不斉第二級水酸基を構築して右側フラグメントを合成し、別途調製した左側フラグメントとのオレフィン化に付すことで全炭素骨格を構築した。

現在脱保護とラクトン化を試みており、このモデル研究で得られた知見は、nigricanoside類の合成研究を加速させるうえで重要であると考えている。Nigricanoside Aジメチルエステル体の分子北西部位の調製に検討を要している。当初予定していたエポキシドへの分子内6-exo-環化反応が困難であることが判明し、新たな合成経路を練る必要があった。Nigricanoside Aジメチルエステル体の分子北西部位の調製を行った。前年度に採用していた経路では全合成が困難であるため、合成経路の抜本的見直しを行った。ジヒドロキシアセトンのアセトナイド保護体をRAMPヒドラジンと縮合させてヒドラゾンを調製し、アリルブロミドとの間でEndersアルキル化を行った後に、酸処理してRAMPを除去した光学活性なケトンを得た。続いて得られたケトンのジアステレオ選択的な還元の検討を行った。所望のanti還元体のみを得ることは出来なかったものの、嵩高い還元剤を用いることでsyn還元体を単一物として得ることに成功した。次に生じた水酸基の立体反転を行い、水酸基の立体化学を所望のものに整え、ブロモ酢酸誘導体とのエーテル化を行うことでαーβ鎖間の連結に成功した。続いてオキサゾリジノンとの縮合を経てアルキル化前駆体を得た。これよりアルキル化、オレフィン化を経て分子北西部位の合成が完了でき次第、分子南東部位との連結を行う。また、エーテル結合を構築する別法として、二つの脂肪酸鎖の直接的な連結を視野に入れている。これまで関連研究では不斉補助基を利用したアルキル化を報告してきたが、新たな戦略として1不斉補助基を利用した不斉酸化、2キラルプールへの求核付加反応による所望の不斉炭素原子部位の構築を考案した。その一環としてnigricanoside類のα,β鎖に類似する構造を有するsacrolide Aおよび三重結合を有するオキシリピンの合成研究に取り組み、前者では戦略1を、後者では戦略2を駆使してこれら二つの化合物の全合成を達成した。さらに後者では提唱構造の誤りを発見し、天然物の真の構造を解明する成果を挙げた。このモデル研究で得られた知見は、nigricanoside類の合成研究を加速させるうえで重要であると考えている。nigricanoside Aの分子北西部位の完成を急ぐ。加えて2つの脂肪酸鎖の関連構造を有する化合物を合成し、エーテル結合で連結する条件を見出す。nigricanoside Aの分子北西部位の調製を急ぐ。モデル研究で得られた知見を基にして効率的な不斉炭素構築法およびエーテル結合の構築条件を追究する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
銀杏中毒原因物質の食品加工過程における配糖体化メカニズムの解明と毒性評価

当研究室では、すでに銀杏中毒の原因物質が4'-O-メチルピリドキシン(MPN)であることを明らかにしている。本研究では、新たに銀杏を摂取する際には、MPNの配糖体の形で摂取していることを示した。さらに、MPNの配糖体はMPN同様、痙攣誘発作用を有すること、摂取したMPN配糖体は小腸において一部はそのままの形で吸収され、また一部はMPNに変換されることが示された。本研究は、銀杏中毒の毒性発現機構の第一段階として小腸におけるMPN配糖体の吸収機構と加水分解機構の関与を示した最初の研究である。1、MPNの配糖体化工程の同定:銀杏製品の加工工程におけるMPNならびにMPN配糖体量を測定するため、熱処理の影響を中心に検討した。その結果、生の銀杏を茄でた時と電子レンジで加熱した時、ならびに炒った時いずれの条件でもMPNが減少し、MPN配糖体が増加した。以上の結果より熱処理が配糖体化に寄与していると考えられた。また、銀杏を摂取する際には、MPN配糖体の形で摂取していることが明らかとなった。2、MPNの配糖体化条件の検討:銀杏は薄皮とさらにその周りを固い殻に包まれているが、殻または薄皮の有無に関わらず、すべての条件でMPN配糖体の増加が観察され、熱処理によるMPN配糖体の増加には殻または薄皮は影響しないことが明らかとなった。また、温度条件について検討すると、茹でることによる配糖体の増加は、37度以下の水中では観察されず、高温条件での処理が必要であることが明らかとなった。3、血中および尿MPNおよびMPN配糖体の測定法の開発:当研究で確立したMPNおよびMPN配糖体量の測定に用いたHPLC法(Yoshimura et al.,2005)に加えて、内因性のビタミンB_6も含めた同時定量法を確立し、現在論文投稿準備中である。4、MPNの配糖体の体内動態:MPN配糖体を経口投与後のラットの尿中にMPN配糖体やMPNよりもMPNの代謝物が多く存在することを発見し、MPN配糖体は生体内でMPNに変換しさらに代謝を受けることが明らかとなった。今後は、代謝物も含めた分析を行う予定である。1) MPN配糖体の生成機構平成20年度における研究により、生の銀杏ではMPNが多く存在し、熱処理を行った銀杏ではMPN配糖体が多く存在したことから、熱処理によりMPNがMPN配糖体に変化したと考えていた。しかし、平成21年度における研究により測定前処理時に行った乾燥処理により、生の銀杏ではMPN配糖体が減少しMPNが増加するが、熱処理した銀杏では、MPN配糖体量の変化が観察されなかった。つまり、生の銀杏では、MPN配糖体が乾燥処理中にMPNに加水分解されMPNが多く検出されたが、熱処理をした銀杏では、乾燥処理によるMPNの加水分解が起こりにくく、MPN配糖体が主に検出されたと考えられた。2)ヒトにおけるMPN配糖体の加水分解平成20年度における研究により、ラットの生体内でMPN配糖体は、MPNに変換され、さらに代謝を受けることが明らかとなった。平成21年度における研究では、銀杏中に含まれるMPN配糖体を摂取したと考えられる銀杏中毒患者でも、血清中にMPNならびにMPNの代謝物が検出され、ヒトにおいても、MPN配糖体がMPNに変換され、さらに代謝を受けることが明らかとなった。また、銀杏中毒患者では血清中ピリドキサールリン酸濃度が低値でありビタミンB6欠乏状態であることも明らかとなった。3) MPNの代謝反応銀杏中毒患者ならびにMPN配糖体を投与したラットにおいて検出されたMPNの水酸化体が、ラット、マウス、モルモットおよびヒトの肝ミクロソームで生成することを明らかにした。この代謝物はどの動物種でも生成する代謝物として今後、代謝に関与する酵素の同定等を行う予定である。平成21年度までの研究により、MPN配糖体投与後のラットと銀杏中毒患者の血中からMPNならびにMPNの代謝物が検出され、生体内ではMPN配糖体からMPNが生成することが明らかとなった。平成22年度の成果を以下に示す。1)MPN配糖体経口投与(1mg/kg)後のラット尿中にMPN配糖体が排泄され、投与されたMPN配糖体の約30%がMPN配糖体として吸収されそのまま排泄されることが明らかとなった。2)MPN配糖体を経口投与後のラットにおけるMPN代謝物の排泄率は、MPN投与後のMPN代謝物の排泄率の50%程度であり、MPN配糖体投与後にMPNに変換された割合は、MPN投与後に吸収された割合の約半分であると推測された。

3)MPNによる痙攣を引き起こし易いマウスを用いて、MPN配糖体とMPNの痙攣誘発作用を比較した。MPN配糖体は、MPNよりも毒性が低く、毒性が現れるまでに時間がかかることから、MPN配糖体は生体内でMPNに変換されて毒性を示すと考えられた。4)小腸粘膜においてMPN配糖体からMPNが生成するか、MPN配糖体が小腸粘膜を透過するかを同時に検討するために、平成21年度に購入したチャンバーシステムを用いた検討を行った。MPN配糖体の一部が小腸粘膜においてMPNに変換されること、また残りの一部はそのままの形で小腸粘膜を透過することが明らかとなった。本研究により、銀杏に多く含まれているMPN配糖体は小腸で一部がMPNに変換され、銀杏中毒を引き起こしていると考えられ、小腸におけるMPN配糖体からMPNへの変換が銀杏中毒の発症の個体差原因と成り得ることが明らかとなった。