hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セルセンサーの分子連関とモーダルシフト

3)平成19年8月に班員以外への研究領域の周知を目的として公開シンポジウムを開催した。4)情報発信のために解説した特定領域のホームページを利用して特定領域発足の意義,研究の進展状況の周知を行った。5)研究領域の若手研究者の鼓舞と情報交換を目的として,平成19年8月と平成20年2月に「若手の会」を開催した。6)関連学会においてセルセンサーをテーマとしたシンポジウムを開催するよう企画し,平成19年12月の日本生化学会日本分子生物学会合同大会,平成20年3月の日本生理学会大会において計画班員が中心となって「Cell Sensor」に関するシンポジウムを行った。平成20年度に開催される諸学会についても,セルセンサーシンポジウムの開催計画を立てた。5)特定領域「細胞感覚」の方針,目的,研究内容の周知を目的としてニユースレター誌「CELLSENSOR」2号,3号を作製した。総括班は、特定領域の研究推進のために、主に班会議等の会議の開催、班員への諸連絡、共同研究の推進、HPやニュースレターを通しての特定領域活動の宣伝の成果発信等を行った。具体的には、以下の活動を行った。1)総括班会議を複数回開催し、評価委員の参加も得た。そして、特定領域研究の推進方向、平成20年度、平成21年度の方針について議論し、具体的な活動計画を策定した。2)平成20年7月および12月に公募および計画班員による班会議を開催し、個々の班員の研究内容を発表して意見交換を行った。さらに、関連分野の研究者を招聘して特別講演を行った。3)情報発信のために解説した特定領域のホームページを利用して特定領域発足の意義、研究の進展状況の周知を行った。4)研究領域の若手研究者の鼓舞と情報交換を目的として、平成20年7月と12月に「若手の会」を開催した。5)関連学会においてセルセンサーをテーマとしたシンポジウムを開催するよう企画し、平成20年7月の日本神経科学会大会、平成20年8月の日本進化学会において計画班員が中心となって「Cell Sensor」に関するシンポジウムを行った。平成21年度に開催される諸学会についても、セルセンサーシンポジウムの開催計画を立てた。6)特定領域「細胞感覚」の方針、目的、研究内容の周知を目的としてニュースレター誌「CELLSENSOR」4号を作製した。1)総括斑会議を複数回開催し、評価委員の参加も得た。そして、特定領域研究の推進方向、平成21年度の方針について議論し、具体的な活動計画を策定した。2)平成21年6月および12月に公募および計画班員による班会議を開催し、個々の班員の研究内容を発表して意見交換を行った。3)平成21年8月に京都で行われた第36回国際生理学会でwhole-dayシンポジウム"Cell sensors : their sensing mechanisms and physiological significance"を開催した。
暑熱・寒冷順化の形成過程における体温調節および発熱反応解析

視床下部および視床下部外中枢温度感受性に立脚して暑熱・寒冷順化の形成過程における体温調節や発熱反応の解析を試み、温度順化の中枢性末梢性秩序を検索する目的をもって本研究課題実験が企画され、昭和62・63両年度に亘って所期の目的を達成したのでその概要を滋に報告する。昭和62年度内には動物(ナキウサギ)とヒト(暑熱-運動鍛練者)を用い年度当初の研究計画・方法に基づいて下記の実験が実施され所期の目的を達成し、一部は学会・専門雑誌に発表した。Iナキウサギ(Pika)による体温調節能・発熱特性の検索:(1)家ウサギ(アルビノ)と同一暑熱負荷条件下で熱放散能の出力を比較。(2)ナキウサギの発熱特性に関する研究、(a)無麻酔・無拘束のナキウサギに外因性発熱物質(LPS),(b)内因性発熱物質(ILa・IL_<1+>B)投与による実験。(3)(a)ヒトの対暑反応、特にスポーツ選手の対暑反応の順化獲得の有無の検索(b)高温低湿サウナによる暑熱-運動負荷の交又適応の解析実験を実施、昭和63年度は前年度の実験の補完に務めると共に、動物(ナキウサギ、家ウサギ)とヒト(対照被験者と暑熱-運動鍛練者)を用い熱放散能の反応指標として及層血管拡張、温熱パンティング、発汗反応の誘起・解析を実施し、初期の研究目的をほぼ達成し、下記の研究結果を学術雑誌にも順次発表した。II(1)ナキウサギの弱熱放散能立証とその原因の検索、(2)アルゴンレーザーによる家ウサギの中枢温度感受性組織の体温調節反応出力の解析、(3)温度順化形成過程における脳血流量の変化とそのHabituation Phenomenonの解析、(4)各種ホルモンと発汗機能との相関を求め、ホルモンと発汗量の経時的測定など、研究結果は既に発表済である。昭和62年度内には動物(ナキウサギ)とヒト(暑熱ー運動鍛練者)を用い年度当初の研究計画・方法に基ずいて実験が実施され所期の目的を達成し,一部は学会・専門雑誌に発表し,成果の大略は目下投稿準備中である.I,ナキウサギ(pika)による体温調節能・発熱特性の検索:私共は,ナキウサギは寒冷耐性,暑熱負荷に弱いと報告して来たが,今回,(1)家ウサギ(アルビノ)と同一暑熱負荷条件下で熱放散能の出力を比較,30-40°C,60%rhでウサギにみる浅速呼吸(パンティング)がナキウサギには欠落している亊,40°C,60%の条件でナキウサギは直腸温44°C,43.1°Cに上昇,生存出来ないが家ウサギは持続生存可能にて後遺症もない亊を観察,(2)ナキウサギの発熱特性に関する実験結果は(a)無麻酔・無拘束のナキウサギに外因性発熱物質(LPSーpyrogen)を3.8μg/kg静注し,直腸温上昇(ΔTre)0.73°Cおよび体温調節の熱産生反応を記録,ナキウサギの発熱特性を発熱曲線から解析に成功した.

(b)更に0.52.0μg/kgの内因性発熱物質(インターロイキンl,rh ILー1α)を静注し,直腸温上昇(ΔTre)0.51.5°Cを認め,ナキウサギの発熱特性を立証した. (3)(a)ヒトの対暑反応,特に日本人スポーツマンと熱帯地住民の高温低湿サウナ反復負荷による実験結果では熱帯地住民は暑熱負荷(60%)の第一回目から対暑反応に順化獲得がみられたが日本人選手では5回の負荷を要した.また,両者間に核温上昇率や心拍・脈圧に軽度の暑熱適応変化があったが,結果として運動トレーニングが生体反応の季節変動の調整や暑熱順化の形成過程に大きな役割を果している亊,(b)高温低湿サウナによる暑熱ー運動負荷の交叉適応の解析に関する実験結果は熱帯地非スポーツマンの熱耐性は遺伝的に獲得されたものであるが日本人スポーツマンの熱耐性は暑熱と運動の協調による体温調節反応量の増加によると帰結出来る実験データを得ている.昭和63年度は前年度の実験の補完に努めると共に、動物(ナキウサギ、家ウサギ)とヒト(対照被験者と暑熱一運動鍛練者)を用い熱放散能の反応指標として皮膚血管拡張、温熱パンティング、発汗反応の誘起・解析を実施し、初期の研究目的をほぼ達成し、学術雑誌にも順次発表した。(1)ナキウサギ(pika)の弱熱放散能、ナキウサギの熱放散能の解析結果は、家ウサギは30°C33°C、60%rhの条件下でパンティングの誘起が可能であるのに反し、ナキウサギでは呼吸数の増加は皆無であり、40°C、60%rhでナキウサギの直腸温は急上昇し43.144°Cで死亡するが、この条件下で家ウサギの死亡例はなく、ナキウサギの弱熱放散能を裏付ける結果を得た。(2)アルゴンレーザーによる家ウサギPO/AHおよびRF加温による中枢性温度センサーの比較・解析:無麻酔ウサギのPO/AHを45mW、1Pmin加温して直腸温、耳介皮膚温、呼吸数、脳温を測定、脳幹網様体(RF)加温の結果と比較、さらにネンブタール麻酔による熱放散反応の抑制を記録解析し発表した。(3)温度順化形成過程における視床下部血流変化:温度順化と視床下部血流量の相関を求めて、水素クリアランス法のInitial slobe解析にて脳血流量(CBF)を測定し、CBFは外気温上昇および発熱物質(LPS3μg/kg)投与によって約20%、増加するが、30°C、4weeksの暑熱順化や10°Cの寒冷順化ウサギではこの増加を認めず、CBFのHabituation Phenamenonが観察された。(4)各種ホルモンの発汗への影響;容量式湿度計-発汗カプセル法を用いて甲状腺ホルモンの発汗への影響を検索、甲状腺亢進症では発汗潜時は10.6分、対照の(15.6分)に比し短く、発汗量は66mg/カプセルで対照の48mg/カプセルに比し多量、甲状腺低機能(橋本病)では潜時30分、発汗誘発なく、一例で56分、他の例で51分の温熱負荷による口腔温の十分の上昇にても発汗を認めず、甲状腺ホルモンの発汗機構に対する直接作用が示唆され、目下他の各種ホルモンと発汗の関係について検索中で、本研究課題の所期の目的を順次達成しつつある。
液状化による砂層の堆積構造の変化が強度特性に及ぼす影響に関する基礎的研究

1993年北海道南西沖地震と1995年兵庫県南部地震によって液状化した所で液状化によって引き起こされる一次的な堆積構造の変化や乱れ具合を地質学的・地盤工学的に検討するため、液状化層の開削調査を行った。(1)北海道南西沖地震の際、後志利別川は震源から遠くなるほど上流になるため、河川砂は粗くなる傾向にあるが、液状化砂は細かくなる傾向にあり、逆相関関係を示した。液状化によって生じた砂脈は表層の厚さ1.52.0mの砂質シルト層中に認められ、その下位の礫分を50%程度含む砂礫層中から立ち上がっていた。砂脈の下部は主として礫からなっており、偏平な礫粒子が立っていた。液状化層は完新世末期の河成砂礫層であると推定され、砂脈を充填している液状化砂は表層に向かって徐々に細粒化する傾向を示していた。(2)兵庫県南部地震で液状化したところを再調査した結果、徳島県鳴門市、兵庫県明石市、大阪市、大阪府貝塚市に囲まれた範囲で液状化したことが分かり、液状化地図を作成した。液状化層は埋立てマサ土であり、液状化が発生し砂脈を通じて上昇する過程で分級作用が生じていた。すなわち、下位から上位に向かって次第に埋立マサ土領域から細粒へとまた淘汰が進む方向に変化していた。噴砂や砂脈の中にはマサ土に多く含まれている粗礫やコブル粒子は認められず、大きな粒子の間を充填するマトリックス部が液状化して噴砂となったものと推定された。(3)室内繰返し三軸試験等を行った結果、繰返し載荷中に生じた過剰間隙水圧比に伴う強度比の変化には初期構造の差異はあまりみられず、液状化後の体積変化は供試体の初期堆積構造に影響を受けることを意味していた。以上のような、地震直後からの液状化災害調査、過去3年間にわたる地形解析、液状化砂層と砂脈の開削調査結果、室内土質試験結果を踏まえて解析したものを研究成果報告書として纏めた。液状化によって引き起こされる一次的な堆積構造の変化や乱れ具合を地質学的・地盤工学的に検討するため、1993年北海道南西沖地震および1995年兵庫県南部地震により液状化が発生した地域を対象として調査・分析を行った。(1)北海道南西沖地震の際、顕著な液状化災害が発生した後志利別川低地において、表層の砂層から試料を採取して粒度試験を行った。後志利別川は震源から遠くなるほど上流になるため、河川砂は粗くなる傾向にあるが、液状化砂は細かくなる傾向にあり、逆相関関係があることが分かった。また、この低地を構成する沖積層についてその形成過程と形成環境について検討した。(2)兵庫県南部地震で液状化したところを再調査した結果、徳島県鳴門市、兵庫県明石市、大阪市、大阪府貝塚市に囲まれた範囲で液状化したことが分かり、詳細な液状化地図を作成した。さらに、神戸市灘区において開削調査を実施した。トレンチ断面に現れた砂脈を詳細に観察し、砂脈と液状化層から試料を採取し、液状化層、砂脈、亀裂内堆積物、噴砂の示す特徴とその生成過程を検討した。液状化層は埋立てマサ

土である花崗岩ブロック間のマトリックス部にあり、液状化が発生し砂脈を通じて上昇する過程で分級作用が生じて、細礫粗砂を主体とする粗粒部、中砂細砂を主体とする中粒部、シルト粘土を主体とする細粒部がそれぞれ混在して砂脈内を充填していた。堆積構造の変化を室内三軸試験機内で再現した後、繰り返し三軸試験を行って、液状化強度に及ぼす影響について調べた結果、次のような知見が得られた。(1)自然堆積地盤を想定した水中落下によって作成された供試体は盛土のような締め固めによって作成された供試体よりも液状化強度は大きいが、再液状化しやすいことが分かった。(2)しかし、繰り返し強度比で表すと、堆積構造や細粒分含有量によらないユニークな強度曲線が得られた。液状化によって引き起こされる一次的な堆積構造の変化や乱れ具合を地質学的・地盤工学的に検討するため、1993年北海道南西沖地震および1995年兵庫県南部地震により液状化が発生した地域を対象として開削調査を行った。(1)北海道南西沖地震で液状化した地点での開削調査は、後志利別川にかかる真栄橋の上流0.2km付近の北檜山町内の左岸堤外地と豊田橋上流1.2km付近の今金町内の左岸堤外地で行った。地震直後の現地調査で確認した地点であり、噴砂を伴った亀裂を横切る多数のトレンチを掘削した。砂脈は表層の厚さ1.52.0mの砂質シルト層中に認められ、その下位の砂礫層中から立ち上がっていた。砂脈の下部は主として礫からなっており、偏平な礫粒子が立っていた。液状化層は完新世末期の河成砂礫層であると推定され、砂脈を充墳している液状化砂は表層に向かって徐々に細粒化する傾向を示していた。なお、液状化層から採取した乱さない土試料について土質力学的な試験を実施中である。(2)兵庫県南部地震で液状化した神戸市灘区において昨年度開削調査を実施した。そこでは、深度約1.8m以深で砂脈が不明瞭となっていたが、ここから土を採取して粒度分析を行ったところ埋立マサ土と類似していた。砂脈を充墳する堆積物の粒度組成は下位から上位に向かって次第に埋立マサ土領域から細粒へとまた淘汰が進む方向に変化していた。調査結果から地表下1.5約10m間に分布する埋立マサ土の上部が液状化したものと推定された。噴砂や砂脈の中に花崗岩の細中礫が含まれていたが、マサ土に多く含まれている粗礫やコブル粒子は認められなかった。このような大きな粒子はほとんど移動しなかったものと考えられ、大きな粒子の間を充墳するマトリックス部が液状化して噴砂となったものと推定された。液状化によって引き起こされる一次的な堆積構造の変化や乱れ具合を地質学的・地盤工学的に検討するため、豊田橋上流約1.2km付近の左岸堤外地で再び調査を行った。(1)砂脈及び液状化砂層の密度試験を深度80295cmまでの8つの水平断面で、堆積構造調査を垂直断面で実施した。砂脈は約250cmの深さまで認められた。その下位は礫分を50%程度含む砂礫層であり、この層で液状化が生じていた。砂脈の深度約80cmのところにシルトの薄層があり、液状化した水の沈殿物のようであった。その下の砂脈を充填している液状化砂はシルト質砂からなっており、深くなるに従って次第に平均粒径が大きくなり、分級していた。堆積時に形成された1次的構造は、液状化の発生・砂脈の形成と共に、周囲から砂脈基部へ、砂脈基部から砂脈上部へと向かう流れに対応して礫が再配列したものと考えた。下部は主として礫からなっており、偏平な礫粒子が立っていた。砂脈内を上昇する砂礫と水の流れは、45mmより細粒な粒子を運び上げることができたが、45mmより粗粒な粒子を運び上げるには充分な条件をそなえていなかったことを示唆していた。(2)砂質土の液状化後挙動(強度・変形・体積変化)に及ぼす堆積構造の影響を調べるため、非塑性のシルトに対して室内繰返し三軸試験を行った。
高温下の長時間運動中の飲水が心臓血管系の応答に及ぼす効果

本研究の目的は高温下(約35゚C)において軽運動をHeadーup及びーdowntiltingの異なった姿勢で行なった場合の心臓血管系の応答と飲水量の関係について検討した。初検者は10名の健康な女子であった。体位可変チエア-による自転車エルゴメ-タ-を内蔵した温度調節ボックス内で仰臥位で15分間の安静を保った後、70分間のペダリング運動を実施した。運動負荷は300kpm/min,約30ー40%UO_2maxの軽運動であった。飲水は運動開始50分時に約7ー8゚Cの冷水を被検者の欲するだけ与え、飲水量を測定した。測定項目は酸素摂取量、心拍数心拍出量、前腕血流量、平均動脈血圧、平均皮膚温、外耳温及び運動前後の体重であった。飲水量は14ー152CCの範囲であった。Headーdown tilting(HDT)時の方がHeadーup tilting(HUT)時より飲水量は少ない傾向にあった。体重減少量は300950gの範囲内にあり、HDT時の方がHUT時より多かった。発汗量を推定する体重減少量と飲水量及び平均皮膚温,平均体温を推定する外耳温と飲水量の関係においても飲水量への影響は少なかった。運動中の前腕血流量の変動はHDT時の方が高く、平均皮膚温には両者間に差のないことを考えるとこの増加は上半身に血液の移行のあったためと考えられる。平均血圧の変動は心拍数と同様な傾向を示し、両運動間に大きな差はみられなかった。一回拍出量はHDT時の方が高い傾向にあり、これは中心循環量が増加すると心房の受容器のみならず、胃、腸、門脈等の受容器が関与し、飲水欲を仰え、飲水量を少なくする。以上の結果から、高温下における軽度な運動とHeadーupとdown tiltingの2姿勢で行なった場合、皮膚温、外耳温による体温及び発汗等による飲水量への影響は小さかったと思われた。興味あることは一回拍出量に示唆される血液量の変化が心房等にある飲水欲の受容器を刺激し、その興奮が飲水量に影響するだろうことを示唆したことである。
Necdin/MAGEファミリーによるニューロンの分裂終了・分化・生存の制御機構

Necdinは最終分化したニューロンに発現して,細胞増殖と死を抑制する作用を持つ。Necdinと類似した配列をもつMAGEファミリー遺伝子はヒトでは30種類以上存在するが,ショウジョウバエには単一の相同遺伝子Drosophila MAGE(dMAGE)しか存在しない。ショウジョウバエの神経発生では神経芽細胞と呼ばれる神経幹細胞が,対称分裂により増殖するとともに,非対称分裂を行い神経芽細胞とより分化した神経母細胞を産生する。神経母細胞はさらに1回だけ分裂してニューロンを作る。胚期が終わると神経芽細胞は増殖を止めるため神経発生は静止期に入るが,1齢幼虫後期になると再び神経芽細胞は増殖を始めて成虫脳ニューロンを産生する(成体神経発生)。dMAGEは初期胚に高発現するとともに,成体神経発生期の神経芽細胞,神経母細胞とニューロンに発現し,成虫脳では学習記憶中枢であるキノコ体などのニューロンに発現していた。そこでMAGEファミリーの神経発生における役割を解明する目的で,RNA干渉法を用いてdMAGEを発現抑制することにより機能解析を行った。目的遺伝子の発現をコンディショナルに誘導するGAL4/UAS系を用いてdMAGERNA干渉を誘導した。4個のキノコ体神経芽細胞とそこから産生される神経母細胞を容易に同定できる蛹中期のキノコ体をモデル系として,神経芽細胞と神経母細胞でのdMAGE発現抑制の効果を解析した。キノコ体でdMAGEを発現抑制させて,蛹化42時間後に神経芽細胞,神経母細胞,およびニューロンの数を解析した。神経芽細胞は4個のままで変化は認められなかったが,1つの神経芽細胞に由来すると推定される神経母細胞の数が増え,ニューロン数も45%増加した。以上より,dMAGEはショウジョウバエ中枢神経系において神経芽細胞,神経母細胞の細胞周期制御に重要な役割を果たしていることが示された。
プレセニリン-1遺伝子の発現調節機構に関する研究

我々の成果は、グルタミン酸作動性シナプスにおけるPS-1遺伝子の発現制御機構のモデルと成り得る。またPS-1自体がシナプス機能に関与する可能性を示唆する。さらにPS-1遺伝子の発現制御により家族性アルツハイマー病の治療に応用できる可能性がある。
メッセンジャーRNAを標的としたジストロフィン異常の分子遺伝学的研究

Duchenne型筋ジストロフィーは最も頻度の高い遺伝性筋疾患で、出生3500人の男児に1人が発症する。Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)はジストロフィン遺伝子の異常により発症することが明らかにされたが、ジストロフィン遺伝子が、巨大なため、患者の約5割のみで、しかも比較的大きな遺伝子の異常しか明らかにされていない。本研究はジストロフィン遺伝子で微細な異常を効率よく解析するために、巨大な遺伝子そのものを解析試料とせず、サイズが100分の1以下になる転写産物(メッセンジャーRNA)を解析することにより効率よくし、しかも点突然変異等の微細な異常を明らかにしようとするものである。今回、従来の方法ではジストロフィン遺伝子に遺伝子異常が発見されなかったDMD患者を対象として、白血球中のジストロフィンメッセンジャーRNA(mRNA)のRT-PCR解析を行なった。方法は、まずジストロフィンmRNAを逆転写酵素によりcDNAに変換し、さらに重複PCR法を行なうものである。その結果、1例では遺伝子欠失のホットスポットとされる領域で正常より小さなサイズの増幅DNAを得た。この結果は、ジストロフィン遺伝子のスプライシングの異常を示唆するもので、現在その増幅断片の塩基配列を決定しつつある。また、他の1例ではシスチンリッチ領域でサイズの小さな増幅断片を得た。この増幅断片についても塩基配列を決定しつつある。これらの異常はいずれもmRNAを解析することのみにより発見が可能で、今回確立した方法がジストロフィン異常症において有効な遺伝子異常発見手段であることを示した。
細胞シートによる関節軟骨損傷治癒法の開発

【目的】我々は細胞シートによる関節軟骨の修復再生を目指している。今回、様々な酸素濃度環境下で軟骨細胞シートを作製しその特性を評価した。【方法】ヒト関節軟骨細胞およびヒト滑膜細胞を共培養し、酸素濃度2%下で培養する群、酸素濃度5%培養群、酸素濃度20%培養群の3群を作製し、培養14日まで経時的に各々の軟骨細胞増殖度を計測した。次に共培養積層化軟骨細胞シートを作製し、DMMB Assay、real time PCR法を用いて発現を検討した。【結果】他群と比較してより深層部に近い2%酸素濃度環境下では、より早く細胞外基質に富んだ積層化軟骨細胞シートを作製することが可能であった。【目的】培養期間を短縮することを目標とし培養方法の検討を行う。【方法】本学臨床研究審査委員会承認の下、患者同意のもと肩関節制動術の際時に得られたヒト関節軟骨細胞を単離後、滑膜細胞を1週間培養後採取した培地(20%FBS DMEM F12 1:1+アスコルビン酸(以下:AA)+抗生剤)に10%FBSを加えたコンディションメディウムで培養する群、通常培地(20%FBS DMEM F12 1:1+AA+抗生剤)で培養する群の2群を作製し、培養14日まで経時的に各々の軟骨細胞増殖度をMTT assayで計測した。また、初代培養時のAAの影響が示唆されたため、様々なAA濃度で初代軟骨細胞を培養し、プロテオグリカン量(以下PG量)をDMMB Assayを用いて測定し、real time PCR法を用いてCOL1、COL2等の軟骨形質維持に関する遺伝子発現を検討した。【結果】コンディションメディウムでは若干増殖能が高い傾向にあったものの、有意な差が認められなかった。よって共培養することによって何らかの因子が軟骨細胞の増殖に寄与することが示唆された。また、AA添加実験では、培養初期からAAを加えているものはデッシュへの付着が少なく、その後細胞死する傾向が観察された。MTT Assayの結果からも有意な結果が得られた。PCRの結果からは、インテグリンα10の値がAA濃度依存的に減少する傾向がみられた。【考察】今回の結果から、滑膜細胞と共培養することが軟骨細胞の増殖、適した培養環境であることが推察された。また、初代軟骨細胞を培養する際、AAが何らかの影響を及ぼし、細胞死を引き起こす原因となることが示唆された。よって、初代軟骨細胞を培養する際は少なくとも軟骨細胞がデッシュに接着するまでAAを添加しないほうが良いという事が示唆された。目的:本研究の目的は、ヒト軟骨細胞における増殖や分化のメカニズムを解明し、広範囲の関節軟骨損傷にも対応できうる【細胞シートによる関節軟骨損傷治癒法の開発】の確立である。研究の方法:関節内において、軟骨がおかれている環境の酸素濃度は、約2%4%とも言われている。また膝軟骨細胞の環境は、荷重というメカニカルストレスが特徴として挙げられ滑膜組織の提供する栄養素は、荷重によって軟骨内部にもたらされると推察される。軟骨細胞シート移植法の臨床応用へ向け、更なる培養期間短縮のために、培養環境を関節内での環境に近づけた培養法を検討する。本学臨床研究審査委員会承認の下、患者同意のもと肩関節制動術の際時に得られたヒト関節軟骨細胞およびACL再建術時に得られたヒト滑膜細胞(合計22例)を単離後24穴カルチャーインサート用プレートに滑膜細胞を、温度応答性インサート内に軟骨細胞を播種して共培養をし、酸素濃度2%で培養する群(2%群)、酸素濃度5%で培養する群(5%群)、酸素濃度20%で培養を行う群(20%群)の3群を作製し、培養14日まで経時的に各々の軟骨細胞増殖度をMTT assayで計測した。また、温度応答性インサートを用いて同様に培養を行い同条件下で、共培養積層化軟骨細胞シート(L-2%群、L-5%群、L-20%群)を作製し、プロテオグリカン量(以下PG量)をDMMB Assayを用いて測定し、real time PCR法を用いてCOL1、COL2等の軟骨形質維持に関する遺伝子発現を検討した。研究成果:生体内での軟骨表面の酸素濃度と同程度の5%群は、20%群と比べ有意な差はなかったが、深層部に近い2%下ではより早く細胞外基質に富んだ積層化軟骨細胞シートを作製することが可能であった。

当初の予定であった、滑膜細胞を培養したコンディションメディウムでの細胞増殖活性の実験に使用するためのコンディションメディウムを準備するために時間を要したため、次に行う予定であった、Hypoxiaの実験の順番の入れ替え実験を行った。【方法】本学臨床研究審査委員会承認の下、患者同意のもと肩関節制動術の際時に得られたヒト関節軟骨細胞およびACL再建術時に得られたヒト滑膜細胞(合計22例)を単離後24穴カルチャーインサート用プレートに滑膜細胞を、温度応答性インサート内に軟骨細胞を播種して共培養をし、酸素濃度2%で培養する群(2%群)、酸素濃度5%で培養する群(5%群)、酸素濃度20%で培養を行う群(20%群)の3群を作製し、培養14日まで経時的に各々の軟骨細胞増殖度をMTT assayで計測した。また、温度応答性インサートを用いて同様に培養を行い同条件下で、共培養積層化軟骨細胞シート(L-2%群、L-5%群、L-20%群)を作製し、プロテオグリカン量(以下PG量)をDMMB Assayを用いて測定し、real time PCR法を用いてCOL1、COL2等の軟骨形質維持に関する遺伝子発現を検討した。【結果】5%群、20%群と比較して2%群は有意に細胞増殖活性が高かった。(p<0.05)PG量は5%群、20%群間では有意な差は得られなかったが、2%群、20%群間では、約1.1倍2%群のPG量が多い結果となった。PCRの結果からは、どの群もCOL2などの軟骨細胞特異的遺伝子の高発現が見られ、COL1などのカタボリックファクターの値は低値に抑えられた。【考察】今回の結果から、より低酸素濃度環境が軟骨細胞の増殖、細胞外基質産生に適した培養環境であることが推察された。今回の研究の目的である、移植可能な組織の作製までに期間をより短縮する培養方法の検討において、コンディションメディウム、AA添加検討を行った。コンディションメディウムに関しては、メディウムだけでは有意な結果が得られなかった。そのため、細胞を共培養することによって、何らかの細胞増殖因子が細胞から培地中に放出されるのではないか。と推察された。次に影響が示唆されたAA添加実験においては、初代軟骨細胞の増殖能は濃度が高くなるほど低くなる傾向があり、LIVE/DEAD染色の結果からは、AA 0.56mM添加群では、死細胞率は51%と非添加群の13%に比べ、多くの細胞が播種後細胞死へと向かっていることがわかった。そのため、コンフルエントまでの時間は濃度依存的に長くなる傾向となった。しかしながら、培養4日目からAAを添加する0+0.14mM、0+0.28mM、0+0.56mM群に関しては非添加群と比べ、細胞外基質量の産生量、増殖能ともに有意な結果となった。これらの結果から、軟骨初代培養初期にはAAを添加せずに培養を行ってものちの細胞外基質の産生量を上げることができ、かつ、より短い期間で組織を作製することが可能であった。また、real-time PCRの結果からインテグリンα10の発現が濃度依存的に低くなるという結果が得られた。インテグリンα10は細胞接着、増殖に重要な因子であることから、初代軟骨細胞のインテグリンα10の発現をAAが阻害し、その結果軟骨細胞がディシュへ接着する能力が低下し、細胞死へとつながったのではないかと考察された。
イオンペア超分子構造の２次元化とその機能発掘

イオン性の相互作用を利用した2次元自己組織化構造構築の可能性を見出すために,イオン化可能なヘプタジン環誘導体の水溶液ー電極界面挙動評価を実施し,2次元自己組織化する条件を見出した.特にメレムにおいてはモノカチオンであってもハニカムネットワーク構造を構築可能であることを見出した.さらにシアメルル酸はトリアニオンの状態であっても金電極に強く吸着し,ランダム構造であるものの電気化学的には構造変化は全く見られず,修飾電極としての応用の可能性を見出した.イオン性の相互作用を利用した2次元自己組織化構造構築の可能性を見出すために,イオン化可能なヘプタジン環誘導体の水溶液ー電極界面挙動評価を実施し,2次元自己組織化する条件を見出した.特にメレムにおいてはモノカチオンであってもハニカムネットワーク構造を構築可能であることを見出した.さらにシアメルル酸はトリアニオンの状態であっても金電極に強く吸着し,ランダム構造であるものの電気化学的には構造変化は全く見られず,修飾電極としての応用の可能性を見出した.本研究課題は,2次元イオンペア超分子構造体の創製を目指し,平成23年度はグラファイト型窒化炭素のユニット分子であるメレム,メロン及びシアメルル酸の合成と,メレムをメインビルディセグブロックとした自己組織化挙動を,各pH下における電解質水溶液/電極界面でのSTM観察を実施した.メレム,メロン及びシアメルル酸は,メラミンを出発物質として熱分解反応などから合成した.それぞれの合成条件を制御することにより,メレム,メロン(メレムオリゴマー)及びシアメルル酸の合成に成功し,TOF-MS及びIRなどの構造同定,さらには吸収スペクトルから,ターゲット分子の同定ができた.また走査型トンネル顕微鏡(STM)観察では,メレムが中性状態であるアルカリ性水溶液弱酸性水溶液存在下,ハニカム構造⇔最密充填構⇔ランダム構造という電気化学的なorder-order-disorder相転移を見出すことに成功した.さらに低pH領域の酸性水溶液下では,2次元ハニカムネットワーク構造は構築するものの,それ以上の高密度な構造(充填構造など)は構築されなかった.これは,低pH領域ではメレムがプロトン化したことが考えられ,充填構造など高密度な配列では静電的に反発することから,ハニカムネットワークのような低表面密度な構造のみが構築可能であると考えられるしかしながら,静電的な反発を考えると,ハニヵムネットワークにおいて溶液中に存在するオキソアニオンとイオンペアを形成したことが示唆された.本研究課題は,ヘプタジン誘導体の超分子ビルディングブロックへの利用を志向した2次元での自己組織化構造の構築と,静電的な相互作用を利用したヘプタジン環誘導体のイオンペアの2次元自己組織化を目標とした.本年度においては,ヘプタジン環誘導体の1つであるシアメルル酸の2次元自己組織化およびメレム・シアメルル酸イオンペア2次元自己組織化に関して重点的に行った.シアメルル酸はどのような水溶液条件下においても,Au(111)上でランダムな吸着構造が構築されていたため,シアメルル酸ー金の相互作用が極めて強いことが推測された.そこで,使用する基板として,有機分子が比較的弱く吸着するヨウ素修飾Au(111)を選択,電気化学走査型トンネル顕微鏡にて吸着挙動を観察した.その結果,シアメルル酸は配列構造を自己組織的に構築したことを確認した.配列構造は水素結合性の2量体が密に配列した構造であり,メレムの配列構造(ハニカムおよび充填構造)とは異なる構造であった.さらに,電気化学的に脱離可能なヨウ素の特性を利用し,配列構造観察後に,その場で電気化学的にヨウ素の脱離を行ったところ,配列構造は消失,直接Au(111)上で確認されたランダム構造が構築された.さらにメレムとの混合溶液を作製,イオンペアの構築とその自己組織化を試みた.その結果,ランダム構造を構築した.ランダム構造中で分子構造を観察するまでには至らず,イオンペアの状態で配列したことがランダム構造構築の原因なのか,シアメルル酸が優先的に配列しているのかの判別には至らなかった.官能基がわずかに異なるヘプタジン誘導体であったが,吸着特性などが大幅に異なっており,これら2つの分子を静電的に配列するには,溶液条件,基板の選定,電位など外的環境制御が極めて難しいことが明らかとなった.水溶性のメレムのpKbから,各pHにおける水溶液ー電極界面における自己組織化挙動,及びメレムと同類のヘプタジン環誘導体であるシアメルル酸の合成及びその界面自己組織化挙動を走査型トンネル顕微鏡(STM)及び電気化学測定により評価した.メレムに関しては,pKb1が12であり,弱アルカリ性及び中性中においては,メレムが基板に対して平行に横になった状態で形成するハニカム構造と充填構造,そして,メレムが垂直に立ち上がった状態で集合したと推測されるファイバー構造が構築された.しかし,カチオン化するpH1などの酸性条件下ではファイバー構造は構築されなかった.このことから,最もメレムが密に集合化しているファイバー構造では,カチオン化に伴う静電的反発から構築されなかった,と推測される.前年度合成したシアメルル酸のSTM観察では,メレムと異なる挙動を示した.

まず,シアメルル酸の状態では極めて溶解度が低いことから,前駆体のシアメルル酸カリウムにより実施した.現在までの結果,電気化学的及びpH変化ではランダムな吸着構造が確認されたが,明確なシアメルル酸の分子像観察に成功した.また,分光学的手法によるシアメルル酸同定では,高い純度と考えられていたが,STM観察ではごくまれにメラムが観察された.このことから,シアメルル酸誘導体は金基板への吸着力がメレムよりも強いこと,不純物の存在が自己組織化に影響を及ぼしていたことが推測される.これら自己組織化に関しては,イオンペアや水素結合による相互作用以外にも,イオン化したハロゲンも利用可能なハロゲン結合に関しても,検討を行い,配列構造構築に成功した.またメロンを物理修飾した電極による電気化学では,触媒作用を見出すことに成功した.申請書記載通りに,オリゴマー及びメレム誘導体の合成に成功し,且つイオンペア構造体の構造観察に成功したと考えられる.また新しの知見として,メレムとメラミンなど異種分子間で水素結合可能な分子を2次元で交互に配列することにも成功しており,純度の問題はあるが,順調に研究展開している.25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度においては,メレム及びシアメルル酸の2次元イオンペア構造をめざし,単体・混在系における自己組織化挙動評価,及びメロン分散溶液によるメロン薄膜の作製と電気化学的評価が目標であった.予定通り,各分子のpH依存性とメレム-シアメルル酸混合系の自己組織化,メロン薄膜の電気化学に関して実施した.特にメレムのpH依存性では,メレムのサイドでの相互作用はカチオン化または対アニオンの影響は見受けられず,高度に配列することが確認され,過塩素酸(無機)アニオンとメレムカチオンが存在する配列であることが示唆された.しかしながら,分光学的に高純度のシアメルル酸であったが,分子レベルでの解像度を有するSTMでは,ごくわずかに含まれている不純物が単体での自己組織化に影響を及ぼしていることが確認された.これにより,現在混合系における自己組織化挙動が不明確であることが認識され,現在高純度精製を実施している.また,近年ハロゲンイオンを導入した場合,ハロゲン結合も相互作用の一つであることが示唆されており,ハロゲン結合とイオンペアとの相違をするため,ハロゲン結合に関しても合わせて自己組織化挙動を評価した.その結果,ハロゲン結合においては水素結合と同程度の強さを有した状態では十分に2次元自己組織化構造を構築することが可能であり,現状の分子ではハロゲン結合の可能性はないと考えられる.このように,イオンペアの自己組織化構造の構造構築には至ってないものの,それを解決すべく問題点は確認されており,ほぼ純情に進展していると考えられる.合成したシアメルル酸及びメレムオリゴマー(メロン)の純度は低いものの,分光学的に合成物がターゲット分子であることを同定した.またイオンペア2次元超分子構造に関する知見は得られたものの,イオンの同定には至っていない.次年度以降は,合成物に精製による高純度化及びその水溶液中での挙動評価(高解像度観察)を行う.特にイオンペア構造体であるこどを視覚的に評価することを目指し,メレムとその誘導体との混合下での自己組織化挙動及びその電気化学的特性評価などを実施する.25年度が最終年度であるため、記入しない。イオンペア構造体の構築のためには,より高純度化のためのシアメルル酸の再精製,または加圧による規則性の高いメロンの合成による高純度シアメルル酸の合成を実施する必要性がある.
有機農産物の市場浸透における信頼の役割

本研究では、日本とドイツで実施したアンケート調査に基づき、有機農産物市場の流通構造が日本とドイツで異なる要因について、消費者の心理面に焦点を当てて分析した。その結果、日本では量販店等の「開かれた」チャネルを選択する消費者の一般的信頼度が比較的高めであり、有機農産物の市場浸透を図るには人々の信頼力を高めることが有効であると考えられた。しかし、ドイツの調査では異なる傾向が見られ、明確な結果は得られなかった。平成22年度は文献調査と聞き取り調査により、有機農産物の生産・流通現場における信頼形成のあり方を整理した。また、有機野菜の価格の水準や変動の整理を行い、慣行栽培および特別栽培のものと比較した。聞き取り調査は量販店を含む多様な小売り形態へ向けて有機農産物を出荷する流通業者2社、農業生産法人2社を選定した。聞き取り調査の結果、有機農産物の生産者と流通業者の関係性は近年変化しつつあることが確認できた。第一に、これまで有機農産物の主要な小売媒体であった宅配等の「閉鎖的な」チャネルにおける売上が停滞し、従来取引のなかった「外部」への販売が重要性を増している点である。第二に、従来のように生産・販売予想に基づく作付段階での契約で生じる需給のミスマッチが増大し、フードチェーンの川上においてより大きなリスク分担が求められるようになってきている点である。第三に、量販店における有機農産物の販売は、その取扱い姿勢により販売量の動向に差異が生じつつある点である。第一と第二の点は、有機農産物の流通において、取引当事者間で確実に売買が行われるという従来の安心感が部分的に崩壊しつつある中で、双方の信頼関係をより強固なものにする必要性に駆られている事を示している。第三の点は、販売現場における明確な差別化や量的な安定性が有機農産物の売上動向に影響を与える可能性を示唆していた。農林水産省の生鮮食料品価格・販売動向調査の結果を用いて有機野菜の価格水準・変動幅を整理し、慣行栽培品と比較した結果、有機野菜の価格は平均して70%高く、変動幅も30%程度大きいことがわかった。販売数量を従属変数、価格・所得を説明変数とした重回帰分析では十分な説明力が観察されなかったが、概して高い価格弾力性を示していた。また、金融危機後の経済の停滞を表わすダミー変数を用いたところ、数量の減少に有意に作用していることが確認できた。平成23年度は有機農産物の市場浸透における信頼の役割を、国内外で実施したアンケートの比較を通じて検証した。比較対象国として、有機食品が近年主流化を遂げたと言われるドイツを選定した。調査の結果、ドイツは日本と比べて有機野菜の購買層が厚く(日本の16.8%に対し46.3%)、9割の回答者が普段利用している小売店で購入することができると回答していた。このことから、ドイツは日本よりも有機野菜の市場浸透が進んでいることが確認された。有機野菜を購入する際に最もよく利用する購買チャネルとして量販店を挙げた回答者は日独両国ともに約60%であったが、日本では宅配利用者が多く(ドイツが0.6%であるのに対し日本は13.7%)、ファーマーズマーケットでの利用者が少ない(ドイツが13.0%であるのに対し日本は3.4%)。このことから、日本はドイツと比較してより閉鎖的な購買チャネルが選択される傾向にあることが確認できた。量販店のような「開かれた」チャネルにおいて有機農産物の流通が成功するには、それが真に有機栽培されたものであるか否か、外部不経済の緩和のために他の消費者も進んで購入するか否かといった、有機農産物を巡る様々な不確実性に対し、消費者の一般的信頼が強固に形成されている必要がある。そこで有機野菜の購買チャネルと消費者の一般的信頼度との関係を分析した結果、有機野菜の購買頻度と一般的信頼度との間に関連性が認められ、高信頼者ほど有機野菜を購入していることが明らかになった。また、国内の調査では量販店を主要な購買チャネルとして選択している購買層に高信頼者が多いという傾向も観察されたが、ドイツの調査では高信頼者ほど一般の量販店よりも自然食品店などの専門的小売店を利用する傾向がみられた。日独両国では表示への信頼性も異なると考えられることから、今後さらなる比較検討が必要である。
「気になる」外国人幼児の把握と支援に関する比較教育学的研究

保育施設に在籍する発達障害が疑われる「気になる」幼児の中には外国にルーツをもつ幼児(以下、便宜上「外国人幼児」とする)がいる。本研究では今後の支援体制の在り方を問う上で必要な彼らの在籍状況の実態把握を目的としている。2017年度に行った愛知県東部・静岡県西部の認可園(幼稚園・保育園・認定こども園)の実態調査に引き続き、最終年度である2018年度は、愛知・静岡両県全域の(旧制度上の)認可外保育施設の、35歳児クラスの外国にルーツをもつ発達の気になる幼児の在園状況調査を行った。愛知県・静岡県の自治体が発表している認可外保育施設一覧に掲載されている施設の中で、2歳児以下だけが在籍すると把握できた施設と外国人専用保育施設を除く全431施設に質問紙を郵送し、有効回答は42園であった。その調査の結果、1認可外保育施設にも外国人幼児が一定数在籍している、2特定の園に偏って在籍している(外国人の受入れに積極的な園、他園での入園を断られた外国人幼児の受け皿になっている園がある)、3対象地域の父母の出身国はブラジルが最も多いが、国籍が多様である、4認可外保育施設における障害診断ありの幼児の割合は、日本人2.0%、外国人2.2%と差が少ないが、発達の気になる子の割合は日本人(5.5%)に対し外国人(11.2%)と外国人幼児のほうが二倍高く、この傾向は2017年実施の認可園の結果と同様であった、5外国語対応保育者の人数割合は、認可保育施設よりも認可外保育施設の方が高い、などが明らかとなった。保育の質の向上のためには、認可施設だけでなく認可外施設も含めた行政の支援体制の構築の必要性が浮かび上がる結果となった。3年間の研究の初年度である2016年度は、発達の気になる外国人幼児の就園状況の把握の一環として、「各自治体が把握できる範囲での外国人幼児の就園状況を明らかにすること」と、「発達が気になる外国人幼児に関する事例を収集すること」を目的に、調査を行った。愛知県東部(西三河・東三河)および静岡県西部地域の計27市町村の保育主管課に対して、2016年6月から7月にかけて、当該市町内の外国人幼児の在籍総数と、発達の「気になる」外国人幼児の人数について書面で調査を依頼し、24市町村から回答を得ることができた。また、2016年8月から2017年1月の間に、個別調査の同意を得られた各園に赴き、発達の気になる外国人幼児の状態について、担任教師や園長からの聞き取りを行い、「気になる行動・態度」の要因を容易には判別できない事例があることを確認した。回答の得られた24市町村のうち、外国人幼児の在籍者のいるのが19市町、いないのが5市町村であった。総園児数における外国人園児の割合を見ると、高いところでは9.3%、低いところでは0.6%と地域によって状況が大きく異なることが分かった。また、発達の気になる外国人幼児数の回答のあった16市町のうち、発達が気になる外国人園児がいたのは14市、いないのは2市町であった。総外国人園児数における気になる外国人園児の割合は、高い市で32%、低い市で5%であった。この「気になる子の割合」の大きな差については、園あたりの在籍人数の違いなどのほかに、「気になる」という保育現場の担当者の判断基準の違いや、支援体制の違いが影響していると考えられ、次年度により詳しく調査することとした。当初は、平成28年度から愛知県東部・静岡県西部の外国人幼児の就園調査と、ブラジルでの発達障害・多文化保育に関する文献資料の収集を行う予定で、前者を主に研究分担者が、後者を主に研究代表者が行う予定であった。しかし、実際調査を始めたところ、外国人幼児の就園調査を充実させることがブラジルでの子育て・園文化比較のためにも必要であることがわかり、研究代表者と研究分担者が共に個別の園での聞き取り調査を行うこととした。その結果、ブラジルでの文献資料収集は次年度に先送りになったものの、愛知県東部・静岡県西部での実態調査に総力体制で臨むことができ、実態把握の問題点や現場での対応の違いとその要因等について分析することができ、日本乳幼児教育学会での研究発表や協力自治体への調査報告の配布などを行うことができた。外国にルーツをもつ子ども(本研究では便宜上、外国人幼児とする)の就園状況に関しては、健常児も含めたすべての外国人幼児についても、十分な把握はされていない。発達の気になる外国人幼児ともなれば、信頼できる統計データは会見の限りないのが実情であり、本研究はタイトルにある通り、「気になる」外国人幼児の把握の必要があるという認識の下で進めてきた。具体的には愛知県東部と静岡県西部の保育施設に在籍する発達の気になる外国人幼児の就園状況や支援体制、保育者の気になっている点を把握するため、全26市町村の保育行政とその地域内のすべての認可保育施設(保育所・幼稚園・認定こども園)を対象に質問紙調査(郵送)を平成29年67月に行い、25市町村と430園(回答率50.6%)から回答を得た。行政調査・園調査から、主に以下の4点が明らかとなった。第1に発達の気になる外国人幼児に対する支援体制は自治体によって異なる。

第2に、調査地域には発達の気になる外国人幼児が就園しており、保育者の「気になる」割合は、外国人幼児に対するほうが、日本人幼児に対するよりも高い。第3に発達の気になる外国人幼児の場合、日本語でのコミュニケーションが十分にとれないことから生じる「気になる」行動・態度と、先天的に有している発達上の特性からくる「気になる」行動の部分のどちらにも保育者は気になっている。第4に、どの項目も日本語が理解できないことで生じる行動である可能性は否定できないものの、言語能力が直接反映する項目(「話が通じているかわからない」や「発音が不明瞭」など)は、就園期間が長くなるほど保育者の気になる割合が減少した。このことから、就園期間の長さを把握することは、幼児理解に欠かせないと指摘できる。平成29年度は、当初の予定よりも大幅に規模を拡大した行政調査・園調査に着手し、貴重なデータを収集するとができた。外国人幼児と日本人幼児の文化背景の違いや、また外国人幼児同士でもルーツとなる国の違いが習慣・考え方の違いとなり、日本人保育者にとって「気になる存在」となりうることが分かった。また、保育者の、幼児理解・家庭理解の度合いも併せて質問紙で調査するなど、多層な面から保育者の「気になる」点の解明を図った。しかし、一方で国籍による違い・文化差の具体については十分検討できなかったため、次年度において補いたい。保育施設に在籍する発達障害が疑われる「気になる」幼児の中には外国にルーツをもつ幼児(以下、便宜上「外国人幼児」とする)がいる。本研究では今後の支援体制の在り方を問う上で必要な彼らの在籍状況の実態把握を目的としている。2017年度に行った愛知県東部・静岡県西部の認可園(幼稚園・保育園・認定こども園)の実態調査に引き続き、最終年度である2018年度は、愛知・静岡両県全域の(旧制度上の)認可外保育施設の、35歳児クラスの外国にルーツをもつ発達の気になる幼児の在園状況調査を行った。愛知県・静岡県の自治体が発表している認可外保育施設一覧に掲載されている施設の中で、2歳児以下だけが在籍すると把握できた施設と外国人専用保育施設を除く全431施設に質問紙を郵送し、有効回答は42園であった。その調査の結果、1認可外保育施設にも外国人幼児が一定数在籍している、2特定の園に偏って在籍している(外国人の受入れに積極的な園、他園での入園を断られた外国人幼児の受け皿になっている園がある)、3対象地域の父母の出身国はブラジルが最も多いが、国籍が多様である、4認可外保育施設における障害診断ありの幼児の割合は、日本人2.0%、外国人2.2%と差が少ないが、発達の気になる子の割合は日本人(5.5%)に対し外国人(11.2%)と外国人幼児のほうが二倍高く、この傾向は2017年実施の認可園の結果と同様であった、5外国語対応保育者の人数割合は、認可保育施設よりも認可外保育施設の方が高い、などが明らかとなった。保育の質の向上のためには、認可施設だけでなく認可外施設も含めた行政の支援体制の構築の必要性が浮かび上がる結果となった。平成28年度に行った気になる外国人幼児の就園状況調査の結果から、さらに詳細を調査する必要があることが分かったため、調査項目を修正した上で平成29年度も愛知県東部・静岡県西部の市町村を対象にアンケート調査を実施する。また、愛知県東部・静岡県西部にはブラジル人が多く在住することから、日本とブラジルの園文化の違いを分析するために、ブラジルで発達障害や多文化保育に関する文献資料の収集や関係者からの聞き取りなどを行う。平成29年度は、外国人集住率の高い愛知県東部・静岡県西部地域を調査地に選び、すべての認可保育施設(公立私立の保育所・幼稚園・認定こども園)を調査対象とし、貴重なデータを得ることができた。しかし、このような認可保育施設に通わない(通えない)幼児については、情報を得ることはできなかった。
多次元蛍光イメージングによる下垂体後葉ホルモン分泌・局所神経回路の可視化と光制御

バゾプレッシン-eGFPトランスジェニックラットとオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットを交配することによりバゾプレッシン-eGFP×オキシトシン-mRFP1ダブルトランスジェニックラットが得られた。このダブルトランスジェニックラットの視床下部視索上核から大細胞性神経分泌ニューロンを酵素処理後、機械的に急性単離した。蛍光顕微鏡下でeGFP緑色蛍光およびmRFP1赤色蛍光を指標にバゾプレッシンニューロンおよびオキシトシンニューロンを同定し、ホールセルパッチクランプ法により膜電位および膜電流記録を行い、酸感受性について検討した。その結果、バゾプレッシンニューロンの方がオキシトシンニューロンよりも極めて酸感受性が高いことが明らかとなった。光興奮性タンパク(チャネルロドプシン2(ChR2))-eGFP遺伝子をc-fos遺伝子に挿入した融合遺伝子を用いて作出したトランスジェニックラットに浸透圧負荷(2日間脱水、高張食塩水腹腔内投与)後、視床下部室傍核および視索上核の一部のニューロンにChR2の発現を示すeGFP緑色蛍光陽性のニューロンが観察されたが、機能的な解析(光感受性の検討)までには至らなかった。また、バゾプレッシン-ChR2-eGFPトランスジェニックラットでは、2%食塩水飲水負荷後に視床下部室傍核、視索上核および下垂体後葉において著明なeGFP緑色蛍光の増加が観察された。さらに共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、eGFP緑色蛍光は大細胞性神経分泌ニューロンの細胞膜に主に限局して発現していた。このラットの視索上核から単離した大細胞性神経分泌ニューロンおよび視索上核を含む脳スライス標本を用いてeGFP緑色蛍光陽性ニューロンからホールセルパッチクランプ法により膜電位もしくは膜電流を記録しながら青色光照射したところ、再現性よく活動電位および内向き電流が記録できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度(平成25年度)に得られた成果は以下の通りである。(1)バゾプレッシン-eGFP、オキシトシン-mRFP1、c-fos-eGFPおよびc-fos-mRFP1トランスジェニックラットの脳内に発現した蛍光タンパクを蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡を用いて詳細に観察した。その結果、バゾプレッシンおよびオキシトシンの細胞質内での局在を小胞レベルで観察でき、さらに立体的に再構築することができた。c-fos-eGFPおよびc-fos-mRFP1トランスジェニックラットを用いて適刺激(例えば、浸透圧刺激)後のc-fos遺伝子発現を単一細胞の核内にeGFP蛍光もしくはmRFP1蛍光で観察することができた。(2)オキシトシン-mRFP1×c-fos-eGFPダブルトランスジェニックラットを交配により作出し、そのラットの腹腔内にオキシトシンニューロンを特異的に活性化するためにCCK-8を投与した。その結果、mRFP1蛍光で同定したオキシトシンニューロンの細胞核内にニューロンの活性化の指標となるc-fos遺伝子の発現を示すeGFP蛍光を観察することができた。(3)バゾプレッシン-eGFP×オキシトシン-mRFP1ダブルトランスジェニックラットを交配により作出し、そのラットの視床下部視索上核を含む脳スライス標本を作製した。その結果、生細胞の状態でeGFP蛍光もしくはmRFP1蛍光を同一スライス標本で同定することができ、かつ比較的長時間にわたりその蛍光を観察することができた。(4)光興奮タンパク(チャネルロドプシン2)をc-fos遺伝子に挿入した融合遺伝子を作製し、トランスジェニック動物を作出するための準備が整った。このラットの視索上核から単離した大細胞性神経分泌ニューロンおよび視索