hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性グリオーマに対する特異的養子免疫療法に関する研究

1) STT (specific targeting therapy)を行ったグリオーマ患者の血清中にマウスグロブリンに対する抗体が形成されているかを調べた。コントロールとして、STTを行っていないグリオーマ患者および正常被験者で行った。検査法としては、酵素抗体法を用いて調べたが、その結果いずれも有意差がないことがわかった。このことは、マウスF(ab)′2 BS抗体が抗原性の乏しい抗体であることを予想させるが、グリオーマ患者自体の免疫力低下による影響も懸念され、現在更なる検討を行っている最中である。2)患者血液中よりリンパ球を分離し、in vitroおいて、腫瘍細胞に対する細胞障害機能を調べたところ、リンパ球機能分子であるCD2およびLFA-1に対する抗体を投与したが、投与前と差異は認められなかった。また、それらのcouter partであるLFA-3およびICAM-1を投与したが、結果は同様であった。3) BS抗体を111Inでラベルし、髄腔内に投与した。コントロールとして、BS抗体と同様の方法でラベルした抗CD3抗体を用いた。その結果、BS抗体はコントロール場合よりも、より髄腔内に貯留し、その時間も長かった。このことより、BS抗体が腫瘍細胞と結合し、腫瘍細胞表面において効果的にリンパ球を刺激し得ることが明らかとなった。
頬粘膜圧痕の形成因子についての検索

臨床において頬粘膜に白い粘膜の隆起を認めることがある。この隆起は、Linea alba、buccal mucosa ridging、White line、頬粘膜圧痕などと呼ばれている。しかしその成因についての報告は、世界中で様々であり未だ一致した見解がないのが現状である。そこで、頬粘膜圧痕の成因について着目をし、立案した。文献検索によれば頬粘膜圧痕は、異常機能(parafunction)の1つであるブラキシズムによって発現すると考えられている。そこでまずは、頬粘膜圧痕の有無とブラキシズムとの関係について着目した。研究の概要としては、頬粘膜圧痕の有無の疫学調査を行い、過去の報告と比較し、さらに頬粘膜圧痕の人体解剖学的観察をした。(平成17年度)その調査結果を元に平成18年度は頬粘膜圧痕と就眠時ブラキシズムとの関係を明らかにすることを目的に、頬粘膜圧痕の有無とブラキシズム頻度との関係について詳細に検討を加えた。概要としては、調査対象者を欠如歯のない天然有歯顎者40名(男性25名女性15名平均年齢25±4歳)とし、就眠時ブラキシズム頻度の測定を行った。使用した機器は自宅で計測可能な歯ぎしりセンサー(Bite Strip, S.L.P Ltd,東機貿)とした。貼付部位は左側咬筋中央部とし、測定条件は6時間以上の就眠とした。測定日の翌朝に調査対象者の頬粘膜をデジタルスチルカメラにて撮影し頬粘膜圧痕の有無の判定を行った。結果として頬粘膜圧痕の有無と就眠時ブラキシズム頻度との間に関連は認められなかったことが判明した。この研究結果は、平成19年2月25日日本補綴歯科学会東関東支部にて報告した。頬粘膜圧痕は、異常機能(parafunction)の1つであるブラキシズム、特にクレンチングによって形成すると考えられている。しかしその科学的根拠となる報告はない。そこで本研究では、頬粘膜圧痕の成因に関与していると考えられている因子を検索することを目的に行う。平成17年度は、頬粘膜圧痕の実態調査および頬粘膜圧痕の人体解剖学的観察を行い、頬粘膜圧痕の実態調査では発現率、性差、年齢層などを明らかにした。また人体解剖学的観察では、当大学解剖学講座所蔵の日本人成人遺体の有歯顎の頭部を資料として用い、上顎第二大臼歯中央窩部における水平断および矢状断時における頬粘膜とクレンチング時に活動する咬筋との位置関係について詳細に検討した。平成18年度にはクレンチングによって咬筋が収縮し頬粘膜が歯を圧迫し形成されるという仮説をもとに、クレンチングを含めた生理的運動時における頬粘膜の圧力を圧力センサーおよび筋電計を用いて頬粘膜圧痕の認められる者と認められない者で比較検討する予定である。被験者の選択は、過去の報告を参考に20歳代の男女を選択する予定である。また、圧力センサーを設置可能な口腔内装置を開発および、本実験に先立ち予備実験等を行い、圧力センサーの設置部位の設定および筋活動採取における被験筋の選択を行う予定である。またこれらの実験結果については専門学会にて発表予定である。
火葬骨の高確度炭素14年代測定と食性解析のための基礎研究・考古資料への展開

本研究は、有機成分のコラーゲンを用いて炭素14年代測定ができない火葬骨に対し、無機成分のバイオアパタイトを用いて炭素14年代測定を行うとともに、ストロンチウムSrとカルシウムCaの元素比、ならびにSrの三つの同位体(86Sr、87Sr、88Sr)の比を用いて生前の食性の情報を得る手法を確立することを目的としている。H30年度は、骨へのSrの取り込み過程解明のための予備実験と、いくつかの火葬骨試料に対して炭素14年代測定を行なった。予備実験では、現生イノシシの大腿骨をいくつかの小片に切り分け、異なる温度で加熱した後、粉砕し、84Srが濃縮した炭酸Sr溶液中に浸して、Sr交換の様子を調べた。その結果、300°C、600°Cで加熱した骨においては、1週間以内にSr同位体比の顕著な変化が起こり、Srの交換が起こっていることがわかった。一方、900°Cで加熱した骨においては、半年経っても、Srの交換が生じないことがわかった。本予備実験の結果から、実験に用いる骨片をあらかじめ粉砕し、均質化した後に、加熱した試料を用いる必要があることも明らかになった。考古試料を用いた検討においては、滋賀県多賀町の敏満寺遺跡石仏谷墓跡から出土した火葬人骨、アゼルバイジャンのギョイテペ遺跡から出土した被熱獣骨、奈良県唐招提寺西方院五輪塔地下から出土した證玄和尚とされる火葬骨の炭素14年代測定を行なった。その結果、石仏谷墓跡から出土した火葬人骨、證玄和尚とされる火葬骨は、いずれもアパタイトの結晶度が高く、得られた年代は推定年代と一致した。一方、ギョイテペ遺跡の獣骨は、アパタイトの結晶度が悪く、推定年代よりも数百年若い年代が得られた。アパタイトの結晶度が悪い骨は土壌からの汚染の影響を強く受ける可能性があり、炭素14年代測定を行う際、アパタイトの結晶度は、年代の信頼性の有効な指標となることがわかった。本研究は、1現生獣骨を用いた骨のSr・Cの取り込み過程解明実験、2さまざまな動植物のSr/Ca元素比・Srの三つの同位体(86Sr、87Sr、88Sr)の比の基礎データの集積、の2点の基礎研究、3考古遺跡から出土した火葬骨にこの手法を展開する応用研究、から構成される。H30年度当初は、1骨のアパタイトの結晶度がどの程度であれば、骨中に生体由来の情報が保持され得るのか、2火葬骨から食性情報を引き出す手段として、Sr/Ca元素比、Sr三同位体比指標が有効かどうか、の2点の基礎研究を主として進める予定であった。1に関しては、まず、現生イノシシ骨を用いて予備実験を行った。現在、予備実験で得られた知見をもとに、現生イノシシ骨を生のまま粉砕し、それを、加熱なし、300°C、450°C、600°C、750°C、900°C加熱用に6等分し、均質性を確保した上で、本実験を開始しようとしているところである。2に関しては、試料の入手に時間がかかり、あまり進めることができなかった。試料が揃い次第、分析に取りかかる計画を立てている。一方、当初の予定にはなかったが、3の応用研究に関して、考古骨試料が次々に入手できたこともあり、精力的に研究を進めることができた。その結果、日本の酸性土壌と、周辺に石灰岩が分布する地質をもつアゼルバイジャンのアルカリ性土壌では、火葬骨が埋没土壌から受ける汚染の影響が異なることが明らかになった。この結果は、高確度な炭素14年代を得るためには、骨のアパタイトの結晶度をチェックするほか、土壌の汚染の影響を見積もる指標が必要であることを示しており、今後の研究を進める上で鍵となる結果である。現在、骨試料の微量元素分析を行い、土壌の汚染の指標となり得る元素を探している。以上のように、本研究は、現在まで、おおむね順調に進展していると言える。1昨年度から準備を進めている骨のSr・Cの取り込み過程解明実験を本格的に開始する。本年度は、予備実験の結果に基づき、もっと詳細に骨中の同位体交換の様子を探るため、300°C、600°C、900°Cに加え、450°C、750°Cで加熱した骨粉ならびにアパタイト粉末を、均質性に十分に留意して調製し、84Srが濃縮した炭酸Sr溶液に浸す実験を行う。実験開始後、1日後、3日後、1週間後、2週間後、1ヶ月後、3ヶ月後、半年後、1年後に骨粉及びアパタイト粉を取り出し、84Sr/86Sr及び炭素14濃度、δ13Cを分析し、時間経過に伴ってSr及びCが取り込まれる速度を見積もる。さらに今後、骨片に対して、同様の実験を行い、骨表面からSr及びCが取り込まれる深さ、取り込む速度等について、詳細に追跡していき、骨のアパタイトの結晶度とSr・Cの取り込みの速度の関係を明らかにしていく。<淺原・南が主として実施>2いろいろな栄養段階の動物のSr/Ca、Sr三同位体比を測定するとともに、その動物の生育地周辺から採取した植物、土壌のSr/Ca、Srの三同位体比を測定し、それぞれの関係を明らかにする。様々な動植物のSr/Ca・Sr三同位体比の基礎データを蓄積する。<南・淺原・若木が分担して実施

>3昨年度炭素14年代測定を行なった敏満寺遺跡石仏谷墓跡から出土した火葬人骨、唐招提寺西方院五輪塔地下から出土した證玄和尚とされる火葬骨に対し、Sr/Caの元素比、Srの三同位体(86Sr、87Sr、88Sr)の比を測定し、得られた値を組み合わせて生前の食性の情報を得る試みを行う。新たに、大阪府松原市の立部遺跡から出土した火葬骨に対しても分析を行なっていく予定である。<若木・南が主として実施>得られた結果を、国内学会、国際学会で積極的に発表していく。関連分野の研究者と議論した内容を踏まえ、論文として公表していく。本研究は、有機成分のコラーゲンを用いて炭素14年代測定ができない火葬骨に対し、無機成分のバイオアパタイトを用いて炭素14年代測定を行うとともに、ストロンチウムSrとカルシウムCaの元素比、ならびにSrの三つの同位体(86Sr、87Sr、88Sr)の比を用いて生前の食性の情報を得る手法を確立することを目的としている。H30年度は、骨へのSrの取り込み過程解明のための予備実験と、いくつかの火葬骨試料に対して炭素14年代測定を行なった。予備実験では、現生イノシシの大腿骨をいくつかの小片に切り分け、異なる温度で加熱した後、粉砕し、84Srが濃縮した炭酸Sr溶液中に浸して、Sr交換の様子を調べた。その結果、300°C、600°Cで加熱した骨においては、1週間以内にSr同位体比の顕著な変化が起こり、Srの交換が起こっていることがわかった。一方、900°Cで加熱した骨においては、半年経っても、Srの交換が生じないことがわかった。本予備実験の結果から、実験に用いる骨片をあらかじめ粉砕し、均質化した後に、加熱した試料を用いる必要があることも明らかになった。考古試料を用いた検討においては、滋賀県多賀町の敏満寺遺跡石仏谷墓跡から出土した火葬人骨、アゼルバイジャンのギョイテペ遺跡から出土した被熱獣骨、奈良県唐招提寺西方院五輪塔地下から出土した證玄和尚とされる火葬骨の炭素14年代測定を行なった。その結果、石仏谷墓跡から出土した火葬人骨、證玄和尚とされる火葬骨は、いずれもアパタイトの結晶度が高く、得られた年代は推定年代と一致した。一方、ギョイテペ遺跡の獣骨は、アパタイトの結晶度が悪く、推定年代よりも数百年若い年代が得られた。アパタイトの結晶度が悪い骨は土壌からの汚染の影響を強く受ける可能性があり、炭素14年代測定を行う際、アパタイトの結晶度は、年代の信頼性の有効な指標となることがわかった。本研究は、1現生獣骨を用いた骨のSr・Cの取り込み過程解明実験、2さまざまな動植物のSr/Ca元素比・Srの三つの同位体(86Sr、87Sr、88Sr)の比の基礎データの集積、の2点の基礎研究、3考古遺跡から出土した火葬骨にこの手法を展開する応用研究、から構成される。H30年度当初は、1骨のアパタイトの結晶度がどの程度であれば、骨中に生体由来の情報が保持され得るのか、2火葬骨から食性情報を引き出す手段として、Sr/Ca元素比、Sr三同位体比指標が有効かどうか、の2点の基礎研究を主として進める予定であった。1に関しては、まず、現生イノシシ骨を用いて予備実験を行った。現在、予備実験で得られた知見をもとに、現生イノシシ骨を生のまま粉砕し、それを、加熱なし、300°C、450°C、600°C、750°C、900°C加熱用に6等分し、均質性を確保した上で、本実験を開始しようとしているところである。2に関しては、試料の入手に時間がかかり、あまり進めることができなかった。試料が揃い次第、分析に取りかかる計画を立てている。一方、当初の予定にはなかったが、3の応用研究に関して、考古骨試料が次々に入手できたこともあり、精力的に研究を進めることができた。
モンテーニュにおける宗教・哲学思想の変貌―トリエント公会議を背景に―

トリエント公会議にはじまるカトリックの改革運動は、16世紀後半のフランスにどのような反響をもたらし、モンテーニュの宗教・哲学思想にどのような影響を与えたのか。本研究ではまず、1660年代におけるカトリック陣営による論争文の出版や宗教戦争、さらにはピュロン的懐疑主義とキリスト教思想との融合について検討したうえで、そうした宗教的・政治的事象がモンテーニュの思想や作品形式にどのような変化をもたらしたのか考察した。平成24年度は、フランスにおけるトリエント公会議(対抗改革運動)の神学・哲学的影響を検討すべく、16世紀後半のフランス・カトリック陣営による宗教論争文集を調査し、そのうち(アウグスティヌス著『神の国』の訳者として名高い)ジャンシャン・エルヴェや(モンテーニュの友人でもあった)ジャン・マルドナをはじめとする、カトリック神学者たちの神学書や論争文について研究した。また、(16世紀フランスにおける対抗改革運動の重要人物とされている)ロレーヌ枢機卿に関する著書・参考文献についても、基本的な資料を中心に読解を進めた。これらの神学作品は、モンテーニュの宗教思想を形成した基盤のひとつである以上、今年度の調査は上記の資料を読み解きつつ、『エセー』に見られる宗教思想と照らし合わせて検討することに重点を置いた。さらには、研究課題の一次資料である『エセー』(1580年版、1582年版、1588年版、1595年版)についても、前年度から引き継ぐかたちで段階的読解を進めた。とりわけ今年度は、「祈りについて」(第一巻56章)と「レーモン・スボンの弁護」(第二巻12章)、および第一巻・第二巻の比較的短い章を中心に、加筆文や削除文について検討を行った。以上の研究成果については、所属研究機関内の紀要雑誌において、平成25年度に発表する所存である。なお、今年度の方策として掲げていた「(16世紀後半の一般信徒に向けた)教理問答に関する資料調査」については、予算および時間の制約上、作業を行うことはできなかった。当初、平成25年度の研究活動としては、16世紀後半のフランスにおける人文主義と宗教感情との関連性を明らかにすべく、懐疑主義思想とキリスト教思想との融合について調査・検討する予定であった。ところが、平成24年に行った研究(カトリック陣営によって出版された論争文集の調査)に関して、補足的な調査を行う必要が生じたため、当初予定していた今年度の研究内容を保留するとともに、前年度の内容をさらに掘り下げるかたちで研究を遂行した。補助事業期間の変更(1年度延長)を申請したのは、以上の理由からである。今年度の具体的な研究活動としては、16世紀後半におけるフランスの宗教的思潮と政治情勢との関連について書かれた二次的文献(論文や研究書)を読み解くことに重点を置いた。これらの二次的文献は、論争文集が出版された思想・社会的背景について理解を深めるうえで必要不可欠である以上、基本的な文献だけでも通読せざるを得なかった。これらの文献のいくつかは、モンテーニュの政治的主張や宗教・哲学的思想についても興味深い考察を行っており、今後の研究に関して重要な示唆を与えてくれた。以上の活動成果については、所属研究機関内の紀要雑誌において、平成26年に発表する所存である。なお、平成25年度(最終年度)の研究予定として当初に定めていた「16世紀における懐疑主義とキリスト教思想との融合」に関する調査については、平成26年度の研究目標として掲げたい。平成23年度は、モンテーニュにおける宗教・哲学思想の変貌を解き明かすべく、一次資料である『エセー』の諸版(1580年版、1582年版、1588年版)のリプリントを購入したうえで、諸版に見られる加筆文や削除文について検討を進めた。この読解作業をもとに、モンテーニュが宗教戦争を描出する際に用いた暗示的な表現技法と、『エセー』に見られる彼の宗教的寛容ないしは非暴力主義について、現時点での研究結果を発表した(『立教大学フランス文学』の論文を参照)。この研究結果では、宗教戦争(これはモンテーニュによると宗教的正当性から隔絶した「今・ここ」の世俗的な争いにすぎない)の利己性や残忍さを暗々裏に暴くと同時に、古代人の範例(exempla)を通して人間の残忍さを非難する、モンテーニュの(超時代的な)平和への意向を明らかにした。以上の指摘は、モンテーニュの宗教思想はもちろん、(古代と現代の個別的事象を識別せずに人間の本性を探求する)彼の人間観を研究するうえでも貴重な材料となるはずである。また、モンテーニュの宗教・哲学思想を解明するための重要な鍵ともいえる、トリエント公会議以降の神学的文脈についても考察を深めるべく、アウグスティヌス著『神の国』の仏語訳(1570年刊)に関する資料調査を行い、現時点での論考を纏めて公表した(筑波大学の電子ジャーナル論文を参照)。この論文では、ジャンシャン・エルヴェによる仏語訳『神の国』の序文を読み解いたうえで、16世紀後半のフランスにおけるアウグスティヌス作品の神学・哲学的受容が、カトリック側による対抗改革運動と密接な関係にあることが証明された。

なお、この論考はモンテーニュの思想を直接扱ったものではないが、『エセー』には『神の国』からの引用や翻案が数多く見られる以上、モンテーニュの思想形成を解き明かすにあたって重要な手がかりを与えてくれるはずである。本研究の主旨は、トリエント公会議が16世紀末のフランスにもたらした社会的・文化的問題を基軸に、モンテーニュにおける宗教的・哲学的変貌を解き明かしながら、『エセー』にみられる神学思想の独自性を指摘することにある。平成23年度は、一次資料となる『エセー』の加筆・削除文に着目しながら、モンテーニュの宗教思想に見られる変化について研究した。とりわけ、フランス宗教戦争をめぐる具体的言及や表現技法において、モンテーニュ独自の人間観や平和主義が見られたことは、特筆すべきである。また、トリエント公会議以降の神学的・哲学的思潮についても明るみにする必要があったため、平成24年度には、カトリック陣営の神学書や宗教論争文について調査を行った。さらには、公会議以降のカトリック思想とモンテーニュ自身の宗教思想との接点についても検討を試みた。これらの研究内容を補足すべく、平成25年度には、フランス16世紀後半の宗教的思潮および政治・社会的情勢に関する調査を進めた。平成26年度には、『エセー』で引用・借用されている懐疑思想家たちの著書を通して、懐疑思想が16世紀キリスト教思想でどのような位置を占めているのか考察した。以上の研究から、トリエント公会議はフランスの神学思想にもたらした影響力こそ決して多大ではないものの、宗教戦争という特殊な政治情勢と絡み合いながら、論争文の形式的発展や宗教感情の変化に寄与した、という点が理解できた。とりわけモンテーニュの場合は、「レーモン・スボンの弁護」での論述形式や、「祈りについて」または「ケア島の習慣」などの宗教的題材において、公会議の間接的影響が見てとれた。こうした宗教思想に正当性・普遍性を与えるべきものとして、懐疑思想が大いに援用されたという点が、今回の研究を通して明らかになったことであり、そこにモンテーニュの思想的独自性のひとつが見いだせるのである。人文学当初の段階では、1(16世紀後半の一般信徒に向けた)教理問答に関する資料調査を通して、トリエント公会議以降の宗教感情について究明すること、2前年度および今年度の資料調査と研究をふまえて、一つの論文を執筆すること、の二点が今年度の研究目標であった。そのうち、1については、予算および時間の制約上、達成することができなかった。というのも、16世紀後半に出版された教理問答については、フランス(とりわけモンテーニュの出生・生存地であるボルドー)の図書館において、数週間の資料調査を行う必要が生じるからである。とはいえ、現時点で読み進めた参考文献や資料についても、当時の教理問答に関する貴重な神学的情報が書かれていたので、1については、文献収集に余分な時間を費やす必要がないものと考えている。2についても、年度内に達成できなかったものの、所属研究機関内の紀要雑誌において次年度中に発表する予定で、現在のところ作業を進めている状態である。当初の段階では、16世紀後半における懐疑主義思想とキリスト教思想との関連性について調査・研究を行ったうえで、そのような文化・思想的背景がモンテーニュの宗教・哲学的思想に与えた影響について考察する予定であった。
遺伝子系統樹の重曹統合によるゲノム進化解析法と生物学的知識自動獲得システムの開発

(1)遺伝子系統樹の重層による筋肉組織の進化的関係の推定筋肉組織に発現するタンパク質の遺伝子の系統樹を推定し,これらを重ね合わせることで,組織の系統樹を推定した。用いたタンパク質は,ミオシン重鎖,ミオシン必須軽鎖,ミオシン調節軽鎖,トロポニンC,筋発生調節因子,アクチンである。PIRデータベースからこれらのタンパク質のアミノ酸配列を相同性検索を用いて抽出し,分子系統樹を作成した。またそれらのタンパク質がからだのどの組織で発現しているかについての記述を抽出し,組織の進化系統樹を推定した。そのあと,これら全体がもっとも矛盾なくあてはまる組織系統樹を,開発したプログラムSuperを用いて選んだ。その結果,脊椎動物の筋肉組織の進化的な関係は,(平滑筋,((心筋,遅筋),速筋))と推定された。無脊椎動物のデータも加えて解析したところ,無脊椎動物の筋肉組織は,脊椎動物の骨格筋(速筋,遅筋,心筋)と起源を共通とするが,脊椎動物の平滑筋はそれらとは独立に生じたと推定された。(2)分子進化解析システムDeepForestの開発DeepForestは,分子進化学研究を支援するために,HTMLで書かれたドキュメントから呼び出されるCGIプログラムである。ユーザーがスクリプトを書き込むとインタープリターがそれを解釈して述語を呼び出す。また,塩基配列やアミノ酸配列の進化のシミュレーションのようなアプリケーション・プログラムも,CGIを用いたインターフェースによって使うことができる。DeepForestは,以下のWWWで公開している:(1)遺伝子系統樹の重層による筋肉組織の進化的関係の推定筋肉組織に発現するタンパク質の遺伝子の系統樹を推定し,これらを重ね合わせることで,組織の系統樹を推定した。DeepForestは,以下のWWWで公開している:
プロティノスのアイステーシス論における像と痕跡の機能

プラトンの対話篇の独自な読解に依拠して美学思想を展開した新プラトン主義哲学者プロティノスにおける〈アイステーシス〉の機能の理解を踏まえた上で、〈像〉などの現象様態や〈痕跡〉の位置づけとそれを把握する魂の働きについて明確化し、感覚とそれに触発された知的機能の働きの諸局面における現れの受容をめぐる議論に関して、プロティノスがいかに独自の思索展開をしているかについて、テクスト批判を遂行して見極めることが本研究の目的である。そのために、本年度においては、プロティノス『エンネアデス』における美についての理論の中で、〈形〉が知性的なレヴェルから感性的なレヴェルに介入してくる能動性の記述を分析して、この活動性が、知性的なものと感性的なものとの間の分有関係を基礎づけ、魂の浄化の問題に関係していることについて考察し、イタリアでの国際学会において発表した。プロティノスにおいて〈形〉の活動性と魂の働きが重複して捉えられている点についてさらに考察した。また、近年多数公刊されている各論文ごとの注釈書等を参考としつつ、プロティノスにおける哲学的営みに組み込まれている〈アイステーシス〉の機能に関して、肉体性や情動に結びつく受動面と、知性的働きに発展的に通じていく動態面とを区別し、かつそれらの連動性を説いている箇所に着目し、とりわけ〈痕跡〉や〈刻印〉などが、知性で捉えられる存在の想起や観照へと通じていく役割を果たしていることを明確にすることに努めた。この考察を、フランスのエクス・マルセイユ大学の古代思想研究所で発表した。プロティノスの美の理論における痕跡および刻印の機能を分析・検討し、国際学会で1回研究発表し、海外の研究所で1回研究講演をして、研究内容について他の研究者との議論を通じてより考察を深めることができた。痕跡および刻印と魂の働きの関係について、プロティノスの他の論文の中での用例についても検討を加えていき、感覚の機能の動態をより明確にしていく。
う蝕・歯周病原菌の口腔内定着機構の解明

口腔内常在細菌の多くはバクテリオシン、過酸化水素等の抗菌性因子を産生する。う蝕・歯周病原因菌の口腔内定着機構を解明するため、ミュータンスレンサ球菌(Sm)を中心にレンサ球菌の抗菌性因子抵抗性について検討し、バクテリオシン耐性に関与する新規二成分制御系因子(Sm:2つ、化膿レンサ球菌1つ)を同定した。平成25年度においては口腔内細菌の産生するペプチドを解析するため、まず最初に歯周病原因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)におけるペプチドをコードするsmall RNAの解析を行うこととした。Aa菌の産生するペプチドおよび発現調整性RNAの解析のために、網羅的にsmall RNAの同定を、ゲノム情報解析およびRNA解析により試みた。Small RNAの解析のためには遺伝子間領域に置いて詳細な情報が必要となる。しかし、Aa HK1651株の公開されているゲノム情報においては不明瞭な点もも認められたため、in silico Molecular Cloningソフトウェアを用い正確な遺伝子化領域の決定を行った。今後、RNA-seqを行うことによりAa HK1651の全転写産物の発現性を解析し、遺伝子間やアンチセンス鎖に発現が見られる領域を新規small RNAの候補として解析する予定である。これまでに、RNA-seqのために必要なtotal RNAの精製を種々の方法を用いて行い、最適な方法(酸性フェノール法)を確立した。以後、rRNAの除去を行い、MiSeqにて解析予定である。RNAの解析と並行して、乳酸菌の産生するバクテリオシンに対するレンサ球菌、特に化膿性レンサ球菌への感受性について検討を行った。乳酸菌の産生するナイシン(Nisin A)およびナイシン産生菌を用いて、感受性試験を行った結果、感受性に違いが認められたもののいずれも感受性を示した。また、化膿性レンサ球菌におけるナイシン感受性に影響を及ぼす因子を同定した。現在、ナイシン産生菌と口腔内レンサ球菌との共培養試験法の確立のための実験を開始した。平成26年は以下の点について検討を行った。1A. actinomycetemcomitansのsmall RNA解析:昨年度からの継続研究であり、本年度はRNA-seq解析を行った。解析の結果、十数個のsmall RNAをコードする遺伝子領域を検出できた。検出された遺伝子はこれまでに報告されているものと一部一致した。これらの遺伝子を定量性PCR法によりさらに発現の有無について検討を行い、数種のsmall RNAを推定した。しかし、RNA-seq解析においてrRNAの検出量が低いことから、全てのsmall RNAの解析が行えていない可能性が示された。2化膿レンサ球菌のバクテリオシン感受性に関与する二成分制御系因子の解析:昨年度からの継続研究であり、乳酸菌の産生するナイシンの感受性に関与する二成分制御系因子(TCS)の解析を行った。TCSの制御下にあるナイシン耐性因子の本体を検討するため、TCS周辺領域の遺伝子発現、変異株の作製を行い、ナイシン耐性にトランスポーターが関与していることを明らかにした。また、このトランスポーターの抗体を作製し、タンパクレベルにおいてもナイシン作用時に発現増大が認められた。3ミュータンス菌の糖代謝に関与する遺伝子発現解析:S. mutansの細胞壁合成と解糖系に糖を分配する因子について解析を行った。糖分配に関与する因子であるNagBの調節性因子のNagRを同定した。もう一つの分配に関与する因子であるGlmSの調節性因子について検討中である。平成27年度はAggregatibacter actinomycetemcomitansのsmall RNAの解析を行った。最終的にsmall RNAを120程度同定することができた。これらの因子の中には血清や唾液中で発現量が変化するものもあった。本解析に伴い、抗菌性ペプチドをコードするRNAについても検討を行ったが抗菌性因子は同定されなかった。また、本年度は口腔から種々のレンサ球菌を分離し、性状解析を行った。その中で、黄色ブドウ球菌や他のレンサ球菌に強い抗菌力を有するバクテリオシンを産生するミュータンス菌を分離した。性状解析の結果、本菌がmutasinIIIを産生することが明らかにした。また、過酸化水素産生能が強いS.sanguinis, S.parasanguinisも分離し、他菌種に対して抗菌力を示した。さらに、黄色ブドウ球菌のS.sanguinisの産生する過酸化水素に抵抗性を示す因子を明らかにした。種々の口腔レンサ球菌種を用いた共培養実験を行い、バクテリオシン産生菌の各菌種の割合に影響を及ぼすことを明らかにした。う蝕・歯周病原因菌をコントロールする目的で甘草由来のグリチルレチン酸の抗菌性について検討し、う蝕原因菌に対して抗菌力が認められた。3年間の研究期間を通して、1)A. actinomycetemcomitansのsmall RNAおよびペプチド解析、2)口腔レンサ球菌の産生するバクテリオシンの同定、3)レンサ球菌の外環境適応因子である2成分制御系因子のバクテリオシン感受性との関連性、4)口腔レンサ球菌の共培養時におけるバクテリオシンの細菌叢形成に及ぼす影響などについて主に研究を行い、いくつかの知見を明らかにした。本研究を通して、種々の細菌は抗菌性因子を産生し、細菌叢形成に影響を及ぼしていることが明らかとなった。本研究は口腔内細菌叢形成の解明に繋がることと考える。

口腔内常在細菌の多くはバクテリオシン、過酸化水素等の抗菌性因子を産生する。う蝕・歯周病原因菌の口腔内定着機構を解明するため、ミュータンスレンサ球菌(Sm)を中心にレンサ球菌の抗菌性因子抵抗性について検討し、バクテリオシン耐性に関与する新規二成分制御系因子(Sm:2つ、化膿レンサ球菌1つ)を同定した。RNA-seqの解析も本年度に行い、今後の検討課題も明確化されてきている。レンサ球菌の研究についても、化膿レンサ球菌については一区切りの段階に来ている。ミュータンス菌についてはさらに検討の余地はあると考えるが、全体としてはおおむね順調である。しかし、様々な菌を用いた検討がなされていない点が課題である。口腔細菌学1A. actinomycetemcomitansについては平成27年度の研究でsmall RNAについては全容を明らかにするため、再度サンプル調整について検討後、RNA-seq解析を行う予定である。最終的には種々の培養条件での各small RNAの発現を解析する。また、RNA-seqの結果からペプチドの発現が認められるものについては、抗菌性の有無について検討を行う。2化膿レンサ球菌については、論文作成に向けての最終的なデータ出しを行う。3ミュータンス菌についてはGlmSの発現性調節性因子の同定および解析を行う。特にリボザイムとしての活性の有無について明らかにし、発現調節がRNAレベルかタンパクレベルであるのかを明らかにしていく。う蝕原因菌および歯周病原因菌の産生する実際のペプチドの解析の進捗が悪い。これは、RNAの解析が予想以上に困難で、ゲノム情報を用いた解析を自身でする必要が生じたためにやや進捗が遅れた。しかし、RNAseqの準備はすでに完了しており、次年度には結果が出ると期待している。また、化膿性レンサ球菌のバクテリオシン感受性に関する検証を先に進めたために、種々の口腔内細菌の産生するペプチドの網羅解析の遅れが生じた。1)RNAの解析:RNAseqより得られた情報をもとにAa菌の産生するペプチドの網羅的解析を行う。必要に応じて定量性PCR、ノーザン解析などにより詳細な検証を行う。Aa菌が平成26年度で完結した場合には他の歯周病原因菌について解析を行っていく。2)Aa菌の産生するペプチドについて高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて同定を行い、RNA解析の結果と照合する。3)ミュータンス菌および歯周病原因菌の産生するペプチドの解析・同定をHPLCを用いて行う。主要なペプチドは精製を行い、性状について検討する。
同種分子間で顕著な電荷移動相互作用を示す有機化合物の探索とその電子状態の解析

電子供与体と電子受容体を直接化学結合でつないだ様々な分子を合成し、新たに次の2系列の分子群が、同種分子間で強い電荷移動相互作用を示す分子内電荷移動型化合物であることを見いだした。まず、1ーアリ-ルー2ー(pーニトロフェニル)ー2ーシアノエチレン類(I)。フェニル、ナフチル、アントリル、ピレニル、アニシル、フェロセニルなど、14種類のアリ-ル基をもつ分子を合成し、その電子状態を調べたところ、溶液の第1吸収帯のエネルギ-が、対応するアリ-ル基が水素原子と結合した芳香族分子の垂直イオン化エネルギ-とよい直線関係にあり、しかもその傾きが他の典型的な分子内電荷移動型化合物のそれとほぼ等しいことから、Iのグル-プの化合物も分子内電荷移動型化合物であると認定した。AM1分子軌道計算もこの解釈を支持する。固体の拡散反射スペクトルから吸収スペクトルを求めたところ、これらの化合物の固体は溶体液よりも長波長に強い吸収帯を示し、同種分子間で電荷移動遷移を起こすことが分かった。大部分の化合物の溶液と固体は蛍光性である。固体の蛍光スペクトルが狭いバンド幅を持つことから、対応する分子間電荷移動遷移のバンドも狭いものと推定される。溶液スペクトルの濃度依存性はなく、溶液では二量体は形成しない。次に、5ーアリ-ルメチレンヒダントイン類(II)。芳香族アルデヒドとヒダントインの脱水縮合による合成はかなり困難で、8種類のアリ-ル基を持つ分子しか合成できなかった。AM1の計算によると、ヒダントインの電子受容能は小さく、比較的大きなイオン化エネルギ-のアリ-ル基をもつ分子では分子内電荷移動型分子の特徴を示さなかったが、固相の吸収スペクトルが強い分子間相互作用を示すことなどより、IIのグル-プの化合物も分子内電荷移動型化合物と見なした。溶液での二量体形成は見られなかった。
ヒグマは良い種子散布者か？ヒグマ生息地内外におけるヤマブドウ、サルナシの種子散布

1.実質的な種子散布距離(定着した実生と母個体間の距離)の推定:ヒグマの生息していない奥尻島と利尻島、ヒグマの生息地である浦幌町において道沿いを20-40kmにわたりヤマブドウを探索し、各地150個体以上について葉の採取と位置情報・開花の有無と性別の記録を行なった。奥尻島、利尻島、浦幌町の葉サンプルの一部(奥尻174個体、利尻島489個体、浦幌町192個体)からDNAを抽出し、5つのSSR遺伝子座の遺伝子型を調べた。SSRデータをもとにベイズ理論による親子解析を行なったところ、採取した雌個体を母樹とする若齢個体を検出されなかった。これは採取できた雌個体の数が少なかったこと、遺伝子型を決定できなかった遺伝子座を含む個体が多かったことが一因だと考えられた。SSRデータをもとに近交係数(Kinship, Loiselle et al. 1995)を算出し、位置情報をもとに空間遺伝構造を比較したところ、浦幌町でのみ5-10km離れた個体間で有意な正の近交係数を示した。これはヒグマの生息していない地域とヒグマの生息している地域との間で実質的な種子散布距離には差があるという予測を否定しない結果であった。2.見かけの種子散布距離(定着した実生と母個体間の距離)の推定:浦幌町、利尻島でヒグマおよび中型哺乳類の糞を探索、採取した。浦幌町では新たに36個の糞を採取し、そのうち1つからヤマブドウ、4つからサルナシが検出された。中型哺乳類の糞は15個採取され、そのうち7つからサルナシが検出された。利尻島では中型哺乳類の糞12個を採取したが、糞の中にはヤマブドウは含まれていなかった。利尻島の中型哺乳類の糞はノネコまたはイタチのものと見られ、これらは利尻島では中型哺乳類がヤマブドウの種子散布を担っていないことを示唆した。1.実質的な種子散布距離の推定:実質的な種子散布距離の推定では、サンプル採取は概ね順調に進んでいるが、遺伝子型分析の結果が期待に反しており、やや遅れている。利尻島、奥尻島、浦幌町でヤマブドウのサンプルを多数(合計1720個体)採取し、そのうち847個体について5つのSSR遺伝子座の遺伝子型を決定した。しかし、親子と推定される個体のペアは検出されず、実質的な種子散布距離を得られなかった。雌個体のサンプルを追加することと、一部のサンプルについて遺伝子型の再分析が必要である。ヒグマの生息している天塩町でヤマブドウのサンプル採取を予定していたが、2018年度には実施できなかった。2019年度にサルナシのサンプル採取と合わせて行う必要がある。2.見かけの種子散布距離の推定:見かけの種子散布距離推定のためのサンプル採取は概ね順調に進んでいる。浦幌町、利尻島でヒグマ、中型動物の糞を採取することができ、そのうちいくつかからヤマブドウ、サルナシが検出された。2019年度には奥尻島、天塩町でも実施する。鳥類の糞の採取は2019年度以降に実施する予定である。1.実質的な種子散布距離の推定:ヤマブドウについては、2018年度実施できなかった天塩町での葉サンプル採取を行うとともに、利尻島、奥尻島、浦幌町でも雌個体のサンプルを追加する。また、解析に用いるSSR遺伝子座を6-8座増やし、親子の検出感度を高める。これにより、親子関係のある個体を検出する。サルナシの葉サンプルの採取を利尻島、奥尻島、天塩町、浦幌町で行う。SSR遺伝子型決定のためのマーカーを選定し、遺伝子型決定を行う。2.見かけの種子散布距離の推定:各調査地でヒグマ、中型哺乳類、鳥類の糞の採取を行う。すでに採取・保存されている浦幌町の過去のヒグマの糞、ならびに、2018年度に採取した糞に含まれていたヤマブドウ、サルナシからDNAを抽出し、SSR遺伝子型を決定する。

浦幌町では新たに36個の糞を採取し、そのうち1つからヤマブドウ、4つからサルナシが検出された。中型哺乳類の糞は15個採取され、そのうち7つからサルナシが検出された。利尻島では中型哺乳類の糞12個を採取したが、糞の中にはヤマブドウは含まれていなかった。利尻島の中型哺乳類の糞はノネコまたはイタチのものと見られ、これらは利尻島では中型哺乳類がヤマブドウの種子散布を担っていないことを示唆した。1.実質的な種子散布距離の推定:実質的な種子散布距離の推定では、サンプル採取は概ね順調に進んでいるが、遺伝子型分析の結果が期待に反しており、やや遅れている。利尻島、奥尻島、浦幌町でヤマブドウのサンプルを多数(合計1720個体)採取し、そのうち847個体について5つのSSR遺伝子座の遺伝子型を決定した。しかし、親子と推定される個体のペアは検出されず、実質的な種子散布距離を得られなかった。雌個体のサンプルを追加することと、一部のサンプルについて遺伝子型の再分析が必要である。ヒグマの生息している天塩町でヤマブドウのサンプル採取を予定していたが、2018年度には実施できなかった。2019年度にサルナシのサンプル採取と合わせて行う必要がある。2.見かけの種子散布距離の推定:見かけの種子散布距離推定のためのサンプル採取は概ね順調に進んでいる。浦幌町、利尻島でヒグマ、中型動物の糞を採取することができ、そのうちいくつかからヤマブドウ、サルナシが検出された。2019年度には奥尻島、天塩町でも実施する。鳥類の糞の採取は2019年度以降に実施する予定である。1.実質的な種子散布距離の推定:ヤマブドウについては、2018年度実施できなかった天塩町での葉サンプル採取を行うとともに、利尻島、奥尻島、浦幌町でも雌個体のサンプルを追加する。また、解析に用いるSSR遺伝子座を6-8座増やし、親子の検出感度を高める。これにより、親子関係のある個体を検出する。サルナシの葉サンプルの採取を利尻島、奥尻島、天塩町、浦幌町で行う。SSR遺伝子型決定のためのマーカーを選定し、遺伝子型決定を行う。2.見かけの種子散布距離の推定:各調査地でヒグマ、中型哺乳類、鳥類の糞の採取を行う。すでに採取・保存されている浦幌町の過去のヒグマの糞、ならびに、2018年度に採取した糞に含まれていたヤマブドウ、サルナシからDNAを抽出し、SSR遺伝子型を決定する。2018年度は、天塩町でのサンプル採取を開始できなかったことに加え、利尻島、奥尻島、浦幌町でサルナシのサンプル採取を開始しなかったため、旅費と人件費の支出が減り、使用総額が予定よりも772,326円少なくなった。2019年度にはこれらサンプル採取と分析を行うため、残額は次年度予算と合わせて使用する。
弾性領域内の応力による軟質磁性材料の磁化過程に及ぼす効果に関する研究

本研究は,弾性領域の応力印加が軟質磁性材料の磁化特性に及ぼす効果のうち,その発生機構が十分には明らかとされていない応力効果について実験的に検討し,その非可逆的な変化の発生機構を明確化することを目的としている。本年度は消磁応力効果についての検討およびその取りまとめを行うと共に,磁界応力効果について検討を行った。消磁応力効果について,けい素鋼板を用いて消磁後の応力印加によって生ずる磁化特性変化の測定と,それに対応する磁区構造変化を観察することで検討した。その結果,消磁応力効果は試料内の磁区構造と深く関連しており,特にスパイク磁区およびそのピニングサイトと密接に関連があることが明らかとなった。また,この応力効果は消磁周波数によっても変化し,それは180°磁壁間隔が消磁周波数に依存して変化することに起因していることを明らかとすることができた。すなわち,この応力効果は180°磁壁とその周辺のスパイク磁区とが密接に関連しながら移動することで磁化が進行していることと密接に関連していることを明らかとすることができた。一方,磁界中応力効果については応力印加によって磁区構造を制御し易いアモルファス薄帯を用いて検討した。ここでは,試料内の磁区構造を整理するために,正の飽和磁気ひずみ定数を持つ試料に予め100MPaの張力を印加し,それを初期状態として実験検討した。その結果,可逆成分が少なくなり,非可逆成分が主な磁化変化として観察された。しかしながら,完全には180°磁壁のみとすることができず,可逆成分を完全に零とすることはできなかった。そのため,この応力効果についての定量的な考察には至らなかった。今後は,試料を磁界中で熱処理することによって更に大きな磁気異方性を誘導し,検討を進める必要があると考えられる。本研究は,軟質磁性材料の磁化特性が弾性領域の応力によって受ける効果のうち,十分にはその発生機構が明らかでない応力効果について実験的に検討し,その発生機構を明確化することを目的としている。本年度は実験装置の作製を行い,対象とする応力効果のうち実用的にも重要な材料と考えられ,未だ検討されていない方向性けい素鋼板における消磁応力効果について検討を行った。ここでは特に,方向性けい素鋼板の圧延方向および直角方向に切り出した試料について検討した。この試料における応力効果についてはあまり検討されておらず,消磁応力効果の特性およびその磁化機構については不明確な状態であった。圧延方向に切り出した試料では,消磁応力効果が明確に観察された。一方,圧延方向直角方向に切り出した試料では消磁応力効果は観察されなかった。しかしながら,その試料に10MPaの張力を常に印加した状態で応力を変化させた場合には,絶対量は圧延方向の特性に比べて小さいものの消磁応力効果が明確に観察された。以上の結果において消磁応力効果が観察されたケースでは応力変化や磁界印加を通じて,磁区構造がドラスティックには変化せず,消磁の際に得られた基本的な磁区構造を保ちつつ磁化が進行する試料について消磁応力効果が観察されていた。一方,消磁応力効果が観察されなかった圧延方向に対して直角方向に切り出した試料では,消磁で得られた磁区構造は張力印加および磁界印加によって大きく異なるものとなっていた。これらのことから,消磁応力効果は消磁後の応力変化および磁界印加によって磁区構造が大きくは変化しない場合に限り観察される効果であることが明らかとなった。本検討によって,消磁応力効果の磁化機構を理解する上で重要な知見を得るとともに,材料応用の際に消磁応力効果を避けたい場合に選択すべき材料の具備すべき特性を明確化することができたと考えられる。
脳特異的なアロマターゼ遺伝子発現を制御する転写因子の機能解析

ステロイドホルモンは発生過程のあらゆる段階において、可逆的あるいは不可逆的に作用する。その作用は個体の生物学的環境適応化を考える上で、興味深い現象のひとつである。ステロイドホルモンは中枢神経系の機能発現にも重要な役割を担っている。げっ歯類において、脳の機能的な性差は周生期にエストロゲンが働くことにより行われる。一方、アロマターゼの発現も周生期に一過性に増加し、その発現調節のプログラムは脳の性分化と深く関わっていると考えられる。今回の研究では脳の性分化のメカニズム解明の一環として、アロマターゼ遺伝子の脳特異的発現制御に関与する転写因子の解析を行った。アロマターゼ遺伝子の脳特異的プロモーターに存在するaro-Bサイトに結合するLhx2は、Deaf-1と相互作用して高い転写活性化を示す。培養細胞におけるレポーターアッセイにおいて、Deaf-1のみでは転写活性化は生じない。また、胎仔間脳部の初代神経細胞を用いたsiRNA実験においてLhx2をノックダウンすると、内因性のアロマターゼの発現が抑えられることより、Deaf-1による転写増強はLhx2を介して行われると考えられる。さらに、脳特異的なアロマターゼの転写制御メカニズムを解析するためDeaf-1タンパク質に注目し、様々な変異体を作成して転写活性化能の測定による機能ドメインの同定を行った。種々のDeaf-1のミュータントをのなかで、Deaf1-mutBC(アミノ酸残基150-471)は野生型と同程度にLhx2の転写活性化を増強した。Deaf1-mutBCから、さらに150-234のアミノ酸領域を欠損させると転写活性増強能が減少することから、この領域がLhx2を介した転写活性増強に関わっていると考えられた。また、Deaf-1の転写活性化領域を同定するために、GAL4/UASシステムを用いて様々なDeaf1断片の転写活性化能を調べた結果、アミノ酸残基1-149や374-450などの複数の領域に、転写活性化能が存在することが明らかとなった。しかしながら、Lhx2を介した転写活性の増強を認めるmutBCフラグメント(GAL4DBD-mutBC)には、GAL4/UASシステムでは転写活性化が認められなかった。さらに、GAL4DBD-mutBCと同時にLhx2をコトランスフェクトすると転写活性化が認められるようになった。これらのことよりDeaf-1とLhx2のタンパク質間相互作用によって引き起こされる変化が、転写活性化に必要である事が推測される。マウスにおける脳でのアロマターゼの発現は、性分化の臨界期に一過性のピークを示し、脳の性分化と密接に関連すると考えられている。本遺伝子の脳特異的プロモーターに存在する複数の異なるシスエレメントのうち、aroBサイトに結合する転写因子のひとつとしてLhx2があり、Lhx2と結合する因子としてDeaf1が単離された。現在までの研究により、Deaf1はaroBサイトへ結合したLhx2と相互作用することで、協同的に転写制御を行うことが明らかとなっている。今年度の研究では、Deaf1によるアロマターゼ遺伝子の脳特異的転写制御メカニズムを解明するため、Deaf1タンパクの様々な内部欠損変異体の特性を解析することにより、詳細なDeaf1の機能ドメインの同定を行った。Deaf1変異体の発現プラスミドは、PCR法を用いて作成した。Deaf1とLhx2の相互作用は免疫沈降法により解析した。また、Deaf1変異体によるLhx2を介したアロマターゼ脳特異的プロモーター活性への影響は、COS7細胞を用いたレポーターアッセイにより調べた。Deaf1タンパク質のN末からアミノ酸を順次欠損させた変異体において、N末150から234番目まで欠損すると、Deaf1とLhx2の相互作用も消失することから、2つの因子のタンパク質間相互作用に必要な部位は、アミノ酸領域150234にあると考えられた。一方、アミノ酸148234、189234、および235292番目の領域が欠損した内部欠損変異体において、転写活性化能の低下が見られたことより、Deaf1による転写活性増強には、189292の領域が必要であると考えられた。このように、Lhx2との相互作用や転写制御に必要なDeaf1の機能ドメインは、アミノ酸189292番目の領域に集まって存在していることが示唆された。脳で周生期に発現するアロマターゼは、精巣から分泌されたアンドロゲンを脳内でエストロゲンに変換する。この時期にエストロゲンが働くことで脳の神経回路は不可逆的に雄型に構築される。本遺伝子の脳特異的プロモーターに存在するシスエレメントのうち、aro-Bサイトに結合する核内因子として単離したLhx2は、limドメインと、DNA結合活性を持つホメオドメインの2つの特徴的なドメインから成る転写因子である。

今回は、Lhx2の転写活性化機能を詳細に調べる目的で、Lhx2の欠損変異体を用いて実験を行った。。Lhx2の発現プラスミドとして野生型(pCI-Lhx2)、アミノ酸234-380を欠失した変異体(pCI-Lhx2-lim)、およびホメオドメインを含むアミノ酸148-406の変異体(pCI-Lhx2-homeo)を作製した。アロマターゼ脳特異的プロモーターの上流を含むレポータープラスミド(pGL4-AR- N1-Luc)と発現プラスミドをCOS-7細胞にリポソーム法にてコトランスフェクトして、ルシフェラーゼアッセイを行った。pCI-Lhx2はpGL4-AR-N1-Lucからのルシフェラーゼ活性を用量依存的に増加させた。この活性はプロモーター内に存在するaro-Bサイトに変異を導入したレポーターでは認められないため、野生型Lhx2の転写活性化はaro-Bサイトを介して行われることが確認された。また、pGL4-AR-N1-LucをpCI-Lhx2-lim、またはpCI-Lhx2-homeoと共にコトランスフェクトした結果、pCI-Lhx2-limでは転写活性化は認められなかったが、pCI-Lhx2-homeoでは野生型と同様の転写活性化を認めた。ホメオドメイン近くに転写活性化ドメインも存在しており、limドメインは転写活性化に必要でないことが明らかとなった。内因性アロマターゼを発現する細胞モデルとして、すでに確立されている胎仔間脳部の初代神経細胞を用いる方針に定めたため、転写因子の機能解析を有効に進めることができた。初年度の計画のうち、中枢神経においてアロマターゼを発現する神経細胞の株細胞化を試みる実験は実行しなかった。その理由は、視床下部の株化培養細胞において、アロマターゼの発現が認められるものが報告された事による。現在までに株化された視床下部細胞では、アロマターゼを発現しているという明確な報告が存在しなかったが、もしもこの視床下部由来の株化培養細胞がアロマターゼを発現しており、生理的状態を再現できるとすると、新たなアロマターゼ発現神経細胞の株細胞化は必ずしも必要ではないことになる。報告された株化神経培養細胞は、最近市販されたので、一般に入手可能である。今後はこの細胞が本研究計画に使用できるものかどうかを調査した上で、今年度以降の細かな方向転換も含めて検討するものとする。予定していた大学院生の補充の欠員等の理由により、初年度に計画されていたsiRNAを利用した転写因子の機能抑制が脳アロマターゼ遺伝子発現に及ぼす影響に関しては、翌年度に実行することとなった。本年度に引き続き、Deaf1の機能に焦点を当て、脳特異的アロマターゼ遺伝子の発現制御を軸として研究を進める。特にDeaf1の翻訳後修飾による機能制御の可能性を検討する。申請者は、Deaf1がSUMO化修飾因子の1つであるUbc9と相互作用することを現在までの研究にて確認している。SUMO化は様々な細胞内イベントに関与することが知られている。一次構造の解析により、Deaf1にもSUMO化される可能性のあるコンセンサス配列が3カ所存在していた。
Tissue engineeringによる骨・軟骨複合組織の作成 ―臼蓋形成不全に対する応用―

再生医工学で再生した軟骨を下肢荷重関節の軟骨移植に応用するためには、移植片の再生軟骨が高度に分化していること、荷重に耐える軟骨下骨が存在することが必要である。これらの条件を満たす骨軟骨片を作るために、ポリグリコール酸(PGA)不織布を鋳型として再生医工学で作製した軟骨組織を骨組織とともに臼蓋に移植し経時的変化を組織学的に検討した。ビーグル犬(1才8.513.1kg)の右側膝蓋大腿関節軟骨を採取、軟骨細胞を分離(1.8×10^6個)し3週間の単層培養を行った。脛骨近位より採取した510mm四方の骨膜の片面に同サイズのPGA不織布を縫着し、骨膜-PGA接合体を作製した。培養した軟骨細胞(5.5×10^7個)を骨膜-PGA接合体に播種し、三次元培養を行った。8週間の培養後、腸骨より採取した自家骨にこの組織片を縫着、左側臼蓋上方にこの骨軟骨複合体を軟骨組織が関節面を向くように移植、固定した。移植後12週における移植骨軟骨片の生着状態、肉眼、組織所見を評価した。三次元培養後PGA不織布を足場として骨膜上に軟骨組織の形成を認めた。自家移植後12週の時点では、移植骨の骨癒合は良好に得られていたが、移植片と大腿骨頭間には瘢痕様組織が充満しており組織学的にも軟骨基質の乏しい線維軟骨をわずかに認めるのみであった。この原因として瘢痕形成により培養軟骨組織が障害された可能性が高く、関節包の再建やフィブリン糊の使用等により瘢痕を防止することが必要である。関節軟骨細胞の採取ならびに単層培養骨膜付き3次元軟骨培養Polyglycolic acid(PGA)メッシュは大きさ1×1cm,厚さ0.15mm、気孔率85%のものを使用し、これを2枚重ね、脛骨全面より採取した骨膜のcambium layerをメッシュ側に向けて逢着した。メッシュ内に単層培養で得た軟骨細胞を播種したのち上述の培養環境で3次元培養を4、8、12週間行った。組織学的検討培養期間に関わらず再分化した軟骨細胞のメッシュ内での分布を認め、サフラニン0ならびにコラーゲンII型抗体による軟骨基質の染色性は良好であった。骨膜と培養軟骨組織との癒合も全面で認められた。小沢田らの開発したvibratorによる軟骨組織の硬度測定では12週群が最も硬く、正常軟骨の約50%の硬度が得られた。これらの条件を満たす骨軟骨片を作るために、ポリグリコール酸(PGA)不織布を鋳型として再生医工学で作製した軟骨組織を臼蓋に移植し経時的変化を組織学的に検討した。脛骨近位より採取した510mm四方の骨膜の片面に同サイズのPGA不織布を縫着し骨膜-PGA接合体を作製。培養した軟骨細胞5.5×10^7個)を骨膜-PGA接合体に播種し、三次元培養を行った。三次元培養後PGA不織布を足場として骨膜上に軟骨組織の形成は見られた。

自家移植後12週の時点では、移椎骨の骨癒合は良好に得られていたが、移植片と大腿骨頭間には瘢痕様組織が充満しており組織学的にも軟骨基質の乏しい線維軟骨をわずかに認めるのみであった。この原因として瘢痕形成により培養軟骨組織が障害された可能性が高く、今後関節包の再建やフィブリン糊の使用等防止策を講じる予定である。