hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近傍植物への傷害刺激によるダイズ根粒着生数増加要因の解明と応用

雑草による根粒着生の促進は、雑草が生育する土壌浸出水(雑草水)が根粒菌の根粒形成関連遺伝子の発現に及ぼす影響と、ダイズが雑草水に反応した結果として根から放出されるイソフラボンによる根粒菌への影響の両者の介在がこれまでの研究から予想される。そこで、一般的な畑雑草であるホソアオゲイトウ、オオバコ、オオオナモミ、メヒシバ、ヒエを育苗コンテナに播種して栽培し、蒸留水に浸漬した雑草水を根粒菌液に添加培養後、逆転写反応を行い、real-timePCR法によってNodC遺伝子の発現解析を行った(実験1)。一方、根粒が着生するフクユタカとその根粒非着生系統の九系449をポット栽培し、実験1と同様に雑草を栽培した育苗コンテナを浸漬した雑草水をポットに常時供給して栽培した。ダイズ茎部のイソフラボン含量をLC/MSにより求めた(実験2)。その結果、NodC遺伝子の相対発現量を比較すると、オナモミは有意に発現が増加したのに対して、それ以外の雑草では有意差は認められなかった。一方、雑草水を常時供給したダイズの生育は、フクユタカではホソアオゲイトウで根粒数が多く全重に有意差が生じた。ダイズ茎中のゲニステイン減少量(対照に対する較差)と根粒着生数との間には有意な正の直線的関係が認められた。従って、ダイズが雑草水に反応した結果、茎から分解されたゲニステイン含量に差が生じ、それに応じて根粒形成が生じたものと考えられた。この間接的な作用は幅広い種で根粒着生の促進に働くしくみである可能性が考えられた。以上から、多くの雑草種では雑草によるダイズイソフラボンの放出量増加を介して根粒着生の促進が生じていた。ただし、オナモミの雑草水は根粒菌の根粒形成関連遺伝子に直接作用した。従って、雑草種による強弱があるものの、その産生物質は根粒菌に対する直接・間接の両方の働きかけにより根粒着生を促進するものと示唆された。雑草との混植によるダイズ根粒着生数の増加の原因を明らかにするため、2種のイネ科雑草の播種密度を3段階に変化させてプランター内で栽培し地上部を切除した。根を通さないメッシュクロス内で根粒菌接種土壌により栽培したダイズを雑草プランターの側面に移植し開花期まで栽培し、雑草現存量とダイズの根粒着生数とバイオマス量、植物体窒素含量との関係を求めた。根粒着生数は雑草現存量にともなって増加したが、種の違いが及ぼす影響は現存量によって説明された。一方、ダイズには品種間差が観察され、LOX欠失ダイズで感受性が高かった。活性炭により雑草土壌液を吸着させた場合は根粒着生数が著しく減少したことから、雑草根滲出液中に原因物質が含まれると見なされた。一方、ダイズの水耕栽培溶液に雑草土壌ガスをバブリングすると、対照との間に統計的有意差は認められないものの、草丈とバイオマス量が増加し、雑草が生育する土壌ガスになんらかの影響を受けている可能性が考えられた。根粒非着生系統ダイズにジャスモン酸類を処理した場合には、10μMでもダイズの生育が抑制された。以上から、ダイズの根粒着生数は地上部切除による傷害を受けたイネ科雑草の現存量にともなって増加し、その原因物質は根滲出液に含まれると示唆された。ただし、雑草土壌ガスの曝露によってもダイズの物質生産が増加する傾向が観察されたことから、気化した原因物質によっても根粒形成が影響されている可能性が考えられた。初年度の研究計画では、傷害植物根圏からのガス曝露と傷害植物土壌の浸透水がダイズの根粒着生に及ぼす影響の調査を計画した。土壌浸透水の影響については、ダイズの根粒着生数が地上部切除による傷害を受けたイネ科雑草の現存量にともなって増加し、活性炭による除去処理により、その原因物質が根滲出液に含まれるとことを明らかにできたことは顕著な研究の進展であると考えられる。一方、前者の雑草土壌ガスの影響については、実験条件の設定に問題があったために正確な影響評価が出来なかった。そのため、次年度に再実験を行う必要がある。根粒着生を評価するための給水マット水耕栽培方法を確立後、根粒着生促進効果の種間差を調査した.メヒシバ,オオバコ,オナモミ,ホソアオゲイトウを育苗箱内に播種し、地上部を切除後に育苗箱を水に浸漬し雑草土壌浸透水を回収した。根粒菌(USDA 110)を10^7cell /Lの菌密度となるよう各雑草土壌浸透水に添加混合した水耕液を供試し、ダイズを水耕栽培した.その結果、無雑草土壌水と比較してメヒシバで根粒着生数と根粒重が有意に増加した.そこで、メヒシバとオナモミの土壌浸透水とオナモミ茎葉浸漬水を用いて同様の比較実験を行うと、メヒシバとオナモミ茎葉浸漬水では有意な根粒着生の促進効果が認められるのに対し、オナモミ土壌浸透水では効果が見られなかった。すなわち、メヒシバでは根から、オナモミでは茎葉からの産生物質が根粒着生を促進していることが考えられた。

これは、同種の他感作用物質の産生部位と一致するため、雑草のアレロパシーによりダイズがフラボノイド産生を高進させ、その結果、根粒形成が促進されていることが考えられた。雑草根圏ガスの根粒着生促進効果の有無を調査するため,8月初旬にヒエとメヒシバを育苗箱に播種し栽培し,ダイズを水耕栽培したコンテナを雑草の育苗箱で覆うことで雑草根圏ガスが水耕液に溶け込むようにし栽培した.また,雑草地上部を地際約3cmで切除する処理の有無を併せて比較し,傷害により発生する物質の効果をみた.雑草根圏ガスを水耕液に曝露させた場合,地上部切除により5%水準で有意に根粒着生数が増加し,雑草根から放出される気化物質が根粒着生に影響する可能性が示唆された。一方、寒地の北海道において、雑草管理方法を変えてダイズを栽培した場合の根粒着生数を比較すると、7月下旬では除草剤や手取除草に比較して、地上部刈取り、放置した場合に着生数が増加することが確認できた。土耕栽培ではさまざまな要因により栽培条件を一定にできず、雑草の産生物質の効果を評価することが難しい問題があったため、2年間をかけて、給水マットを用いた水耕栽培法を確立した。この実験方法の改良により、効果の比較が非常に容易になり、根粒着生促進効果の種間差を詳細に比較が可能となった。その結果、物理的傷害を与えない場合でも根粒着生促進には雑草種間差があること、この原因は、雑草のアレロパシーによりダイズがフラボノイド産生を高進させることで根粒着生数が増加していることが原因と考えられた。ただし、雑草に傷害を与えた場合にも有意に根粒着生が増加することから、雑草根から放出される気化物質が根粒着生に影響している可能性が考えられた。この物質は、傷害植物ホルモンであるジャスモン酸メチルだけでなく、揮発性のアレロパシー物質の両者が関与する可能性があり、さらに明らかにする必要がある。雑草による根粒着生の促進は、雑草が生育する土壌浸出水(雑草水)が根粒菌の根粒形成関連遺伝子の発現に及ぼす影響と、ダイズが雑草水に反応した結果として根から放出されるイソフラボンによる根粒菌への影響の両者の介在がこれまでの研究から予想される。そこで、一般的な畑雑草であるホソアオゲイトウ、オオバコ、オオオナモミ、メヒシバ、ヒエを育苗コンテナに播種して栽培し、蒸留水に浸漬した雑草水を根粒菌液に添加培養後、逆転写反応を行い、real-timePCR法によってNodC遺伝子の発現解析を行った(実験1)。一方、根粒が着生するフクユタカとその根粒非着生系統の九系449をポット栽培し、実験1と同様に雑草を栽培した育苗コンテナを浸漬した雑草水をポットに常時供給して栽培した。ダイズ茎部のイソフラボン含量をLC/MSにより求めた(実験2)。その結果、NodC遺伝子の相対発現量を比較すると、オナモミは有意に発現が増加したのに対して、それ以外の雑草では有意差は認められなかった。一方、雑草水を常時供給したダイズの生育は、フクユタカではホソアオゲイトウで根粒数が多く全重に有意差が生じた。ダイズ茎中のゲニステイン減少量(対照に対する較差)と根粒着生数との間には有意な正の直線的関係が認められた。従って、ダイズが雑草水に反応した結果、茎から分解されたゲニステイン含量に差が生じ、それに応じて根粒形成が生じたものと考えられた。この間接的な作用は幅広い種で根粒着生の促進に働くしくみである可能性が考えられた。以上から、多くの雑草種では雑草によるダイズイソフラボンの放出量増加を介して根粒着生の促進が生じていた。ただし、オナモミの雑草水は根粒菌の根粒形成関連遺伝子に直接作用した。従って、雑草種による強弱があるものの、その産生物質は根粒菌に対する直接・間接の両方の働きかけにより根粒着生を促進するものと示唆された。雑草土壌ガス処理と対照との間に有意差は認められないものの、草丈とバイオマス量が増加する傾向にあり、雑草土壌ガスになんらかの影響をダイズが受けている可能性が考えられた。
新規リウマチ関節炎抑制因子FRPのシグナル伝達と免疫システムに対する作用の解析

1.FRP受容体(A7)の解析:two-hybrid法でクローニングしたFRP受容体A7とCD14はじめ、activin A、follistatin、TGF-β1との親和性を解析した。それらのK_D値は以下のとおりであった。FRP対A7:4.20×10^<-6>M、FRP対CD14:1.72×10^<-4>M、FRP対activin A:1.43×10^<-6>M、FRP対follistatin:1.88×10^<-4>M、FRP対TGF-β1:1.28×10^<-8>M、FRPの結合様式は、結合速度が極めて速い一方、親和力は比較的低い特徴があった。ただしTGF-β1との結合速度はさほど速いものではなかった。activin AとCD14はA7と結合しないが、follistatinは弱い親和力で極めてゆっくりとA7と結合した。そしてactivin A、CD14、follistatinはFRPとA7の結合を阻害した。興味深いことに、TGF-β1もA7に比較的強い親和力で結合した。しかし、この結合はFRPにより阻害された。FRPはTGF-β1とその受容体TGF-β1sRIIの結合を阻害するが非常に軽度なため、FRPはTGF-βのシグナル伝達にほとんど影響しないと考えられた。以上からFRPはTGF-βファミリーを中心とした分子と相互作用し、免疫系のみならず組織の形成段階で大きな役割を演じていると結論した。2.セカンドメッセンジャーのクローニング:two-hybrid法にて得たクローン:SA240、SA263、SB224、SC21、SC23は、いずれもprey vectorを欠失していることがわかり、酵母を用いたtwo-hybrid法ではクローニングが不可能と結論した。解決法として、ほ乳類からみて酵母よりさらに種差の大きい大腸菌を用いたtwo-hybrid法を今後実施するか検討している。1.FRP受容体(A7)の解析:萌芽研究でクローニングに成功したFRP受容体(A7)のC末端に,FLAGタグをコードするA7cDNAをdoxycycline(Dox)制御発現ベクターに組み入れたpTRE-Tight-A7を構築した.これを制御ベクターpTet-Onと共に滑膜細胞株SFー1に導入しTetOn-SF-1/A7を樹立した.このTetOn-SF-1/A7にDox,FRPおよび抗FLAG抗体Fabを添加し,FRPのシグナル伝達の効果としてc-Fosの発現を定量した.TetOn-SF-1/A7にDoxを添加すると,誘導A7のためFRPのc-Fos抑制作用が増強され,この増強は抗FLAG抗体Fabで阻害された.よってFRPのc-Fos抑制シグナルは主としてA7によって伝達されると考えた(投稿準備中).

また、BIACOREを用いたA7とFRPの親和力解析では,Kd値が1-8×10-7Mと算出された.2.セカンドメッセンジャーのクローニングFRPのシグナル伝達系の解明のため,セカンドメッセンジャーのクローニングを試みた.方法はA7と同様で,A7の細胞内ドメインをコードするA7N386をbaitとし,ヒト心臓由来のcDNAライブラリーをpreyとして,酵母のtwo-hybhd法を用いて行った.現在5つのクローン:SA240,SA263,SB224,SC21,SC23にしぼり込み解析を進めている.今後これらのtwo-hybhd反応を確認した後,塩基配列およびアミノ酸配列ホモロジー検索による同定を行い,ノザンプロッティング・RT-PCR等での発現解析,BIACOREによるKd値解析を進めていく予定である.1.FRP受容体(A7)の解析: two-hybrid法でクローニングしたFRP受容体A7とCD14はじめ、activin A、follistatin、TGF-β1との親和性を解析した。それらのK_D値は以下のとおりであった。FRP対A7: 4.20×10^<-6>M、FRP対CDl4: 1.72×10^<-4>M、FRP対activinA: 1.43×10^<-6>M、FRP対follistatin: 1.88×10^<-4>M、FRP対TGF-β1: 1.28×10^<-8>M。FRPの結合様式は、結合速度が極めて速い一方、親和力は比較的低い特徴があった。ただしTGF-β1との結合速度はさほど速いものではなかった。activin AとCDl4はA7と結合しないが、follistatinは弱い親和力で極めてゆっくりとA7と結合した。そしてactivin A、CD14、follistatinはFRPとA7の結合を阻害した。興味深いことに、TGF-β1もA7に比較的強い親和力で結合した。しかし、この結合はFRPにより阻害された。FRPはTGF-β1とその受容体TGF-β1sRIIの結合を阻害するが非常に軽度なため、FRPはTGF-βのシグナル伝達にほとんど影響しないと考えられた。以上からFRPはTGF-βファミリーを中心とした分子と相互作用し、免疫系のみならず組織の形成段階で大きな役割を演じていると結論した。2.セカンドメッセンジャーのクローニング: two-hybrid法にて得たクローン:SA240、SA263、SB224、SC21、SC23は、いずれもprey vectorを欠失していることがわかり、酵母を用いたtwo-hybrid法ではクローニングが不可能と結論した。解決法として、ほ乳類からみて酵母よりさらに種差の大きい大腸菌を用いたtwo-hybrid法を今後実施するか検討している。
プロトポルフィリノーゲン酸化酵素阻害剤の分子化学的作用機構解析

クロロフィル生合成の分子調節機構を調べるため、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素(Protox)阻害剤を用いた作用機構研究を行った。本研究では、葉緑体に存在するProtoxを阻害剤感受性Protox活性を指標として、直接精製・製造解析を行う方法と、阻害剤と特異的に結合するタンパク質を阻害剤との親和性を指標として精製・製造解析を行う方法の二つを試みた。Protoxの精製を行うにあたり、まず、Protoxの局在部位や性質を詳細に調べた。その結果、Protoxは葉緑体膜に存在しTritonX-100などの界面活性剤で容易に可溶化されること、また、可溶化されたProtoxは本除草剤と高い親和性で結合することを明らかにした。さらに、結合阻害実験やProtoxの動力学的解析により、除草剤が結合するタンパク質はProtoxであり、阻害様式は基質であるProtogenとの拮抗阻害であることも明らかにした。Protoxの精製は、20kgのホウレンソウから単離した葉緑体を出発材料とし、イオン交換、吸着、アフィニティークロマトグラフィーを始めとする各種カラムクロマトグラフィーを組み合わせて行った。その結果、葉緑体Protoxの候補として塩基性の58kDaのタンパク質を確認した。次に、結合活性を指標とした結合タンパク質の精製のため、まず、Protox阻害型除草剤であるアシフルオルフェンをリガンドとするアフィニティーゲルを作成した。葉緑体タンパク質を数段階のカラムクロマトグラフィーで部分精製した後、新しく作成したゲル担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。このアフィニティークロマトグラフィーを行うに当たり、過剰量のフリーのリガンドを同時にカラムに供したものをリファレンスとし、その差から特異的結合タンパク質を推定した。その結果、上記のProtoxとよく似た分子量を有するタンパク質を除草剤結合タンパク質の候補として更なる解析に供することができた。現在、二つの方法で精製してきたタンパク質が同一なものなのかどうかを構造解析を行うことにより解析している。
電気伝導特性解析プログラムの開発と核酸中の水和水が関与した電気伝導機構の解明

平成21年度、申請者は交付申請書に記載した「研究実施計画」に沿って人工核酸塩基から成るDNA二重鎖の電気伝導特性を解析した。DNA二重鎖は、次世代の電子ワイヤーとして利用することができると言われている。そして、最近の実験において、DNA二重鎖の電気伝導度を向上させる様々な人工核酸塩基が合成されている。本研究では、人工核酸塩基から成るDNA二重鎖における電気伝導特性を電子レベルで明らかにし、よりDNA二重鎖の電気伝導特性を向上させる新規の人工核酸塩基を提案することができる。この結果は、実用的なDNA電子ワイヤーを実現する上で重要であると考えられる。なお、本研究には、平成20年度の研究実施計画において、新規に開発した電気伝導特性解析プログラム(今年度業績(雑誌論文)(1))を用いた。今年度は、まず、実験により合成されている既存の人工核酸塩基BDA、MDA及びNDAから成るDNA二重鎖と金電極の複合体を作成し、その電気伝導特性を解析した。その結果、天然のDNA二重鎖及びこれらの人工DNA二重鎖の電気伝導度について実験結果を説明できる計算結果を得た。そして、既存の人工核酸塩基がDNA二重鎖の電気伝導度を向上させる要因が人工核酸塩基のイオン化ポテンシャルの小ささであることを明らかにした。これらの結果を2件の学会(今度業績(学会発表)(1)、(2))にて発表し、うち一件の学会で学生優秀発表賞を受賞した。さらに、本研究では、これらの結果を基に、DNA二重鎖の電気伝導度をより向上させる新規の人工核酸塩基を提案し、実際にこの新規人工核酸塩基から成るDNA二重鎖の電気伝導度が向上することを計算によって確認した。この結果を纏めた論文を現在作成中であり、今後、国際学術雑誌に投稿する予定である。本研究で得られた成果は、今後、より高性能なDNAワイヤーを実現する際に有益な情報となると考えている。電気伝導特性解析プログラムを新規に開発し、金電極間のDNAの電気伝導特性を解析した。まず、拡張ヒュッケル法と呼ばれる精度はあまり高くないがその計算コストの小ささから広く普及している手法を用い、1,000個程度の様々なDNAの電気伝導特性を解析し、その電気伝導特性に対する構造の依存性を統計的に解析した。その結果、DNAの電気伝導特性には、様々な環境要因の中でも金電極の表面の形状が最も大きく影響を与えることを明らかにした。また、拡張ヒュッケルを用いた電気伝導特性解析では、DNAの塩基のイオン化ポテンシャルを正確に計算することが難しく、電気伝導特性の塩基配列依存性を解析するためには、高精度な分子軌道法を用いる必要があることが明らかになった。次に、密度汎関数法(DFT法)と呼ばれる高精度な分子軌道法を用いた電気伝導特性解析プログラムを新規に開発し、DNAの電気伝導特性を経験的なパラメータを用いずに定量的に評価できるようにした。ここで、前述の拡張ヒュッケルを用いた電気伝導特性の解析結果から、実験と比較できる結果を得るためには、金電極のモデルは、表面の形状を実験とあわせ、又そのサイズも十分に大きいことが必要であることがわかっている。一方で、サイズの大きい金電極は、DFT法のような高精度な分子軌道法により計算することが非常に難しいことが知られており、これまでにその成功例は報告されていないといってよい。計画当初、DFT法には、フラグメント分子軌道法(FMO法)を利用することを考えていたが、金属クラスタはこの手法で扱うことが難しい。そこで、研究代表者は、固体物理の分野で金属の電子状態解析などに広く用いられているDFT法(SIESTA)を独自に電気伝導特性解析プログラムに導入し、十分なサイズの金電極に挟まれたDNAの電気伝導特性をDFT法レベルで解析することに初めて成功した。その結果、DNAの電気伝導特性の塩基配列依存性を解析し、実験結果と一致する結果を得ることに成功した。

さらに、本研究では、これらの結果を基に、DNA二重鎖の電気伝導度をより向上させる新規の人工核酸塩基を提案し、実際にこの新規人工核酸塩基から成るDNA二重鎖の電気伝導度が向上することを計算によって確認した。この結果を纏めた論文を現在作成中であり、今後、国際学術雑誌に投稿する予定である。本研究で得られた成果は、今後、より高性能なDNAワイヤーを実現する際に有益な情報となると考えている。
パッシブＲＦＩＤタグによるＭＥ機器の自動的な包括管理の研究

920MHz帯に代表されるUHF帯パッシブRFIDタグシステムは高機能である。これは認証域が大きく、医療環境の個体認証に適する。ここでは、ME機器の包括管理を目的としたUHF帯パッシブRFIDタグシステムの有用性を解析した。ME機器センター・病棟器材庫・病棟処置室の3カ所で現実的なタグの認証域を測定し、充分な認証域が得られた。本研究の範囲では、ヌル点の多くは建物の構造に依存して生じ、その位置は相当程度予測可能であることがわかった。病院ネットワークによるME機器所在管理システムも実現した。パッシブRFIDタグシステムの電磁的安全性についても解析し、様々なME機器に対して安全であることがわかった。平成24年度には、当初の予定であった「null点の影響の解析」「施設内遠隔認証」「小型ME機器所在管理ソフトウェアシステムの試作」に加え、「病院内認証に適したタグの最適化」と「最適化タグによる小型ME機器の認証特性評価」も実施した。タグの最適化は一部のタグメーカの協力の下で実施した。ここでは、小型ME機器の所在管理と共に、医療職者や患者などのヒトを対象とした認証にも有効なタグの実現を目指した。これと並行して、簡単なタグ所在管理ソフトウェアを試作した。このシステムにより、協力病院である札幌医科大学医学部附属病院の随所に設置したリーダとアンテナで小型ME機器などに添付したタグを検知し、その移動状況を同病院臨床工学技士室やME機器センターに設置した情報端末上で追跡可能とした。これらの最適化タグと所在管理システムを用いて、平成25年3月に、札幌医科大学医学部附属病院のME機器センター・循環器内科病棟・放射線部血管造影室を対象として、小型ME機器やワゴン類に添付されたタグを遠隔で検知した。平成23年度に実施したタグの認証特性測定では、それぞれの対象空間においての認証域を求めるに留まった。平成25年3月の実験では、実際の医療職者や患者の流れを想定して、対象となる小型ME機器やワゴン類を移動させ、各認証地点での認証の可否を判定した。これらは、同病院地下2階のME機器センターに設置したPC上の所在管理ソフトウェアで実施した。その結果、対象の各箇所において、リーダの出力の最適化を施すことで確実にタグを認証できることがわかった。またこれと併せてnull点も評価した。null点については、建物の構造的な特性に依存して生じることが多いことが推察された。以上の研究結果から、UHF帯のパッシブRFIDタグの医療環境における有用性が改めて確認された。平成25年度は、協力病院である札幌医科大学附属病院と湘南工科大学の間での小型ME機器「遠隔機認証実験」を予定していた。しかし協力病院のセキュリティシステム上これが困難となった。このため本年度は、UHF帯パッシブRFIDによる小型ME機器の包括的認証の際の「電磁的安全性の解析」を主軸として実施した。また小型ME機器が院内で搬送される際の「現実的な認証可能性」を、協力病院である札幌医科大学附属病院外来棟にて実験的に検証した。前者ではいくつかの安全ガイドラインが関係省庁から示されているが、その安全マージンが過大でUHF帯パッシブRFIDタグの応用を妨げている。ここではME機器の外来電磁波に対するイミュニティ試験値(JIS C61000-4-3)を根拠に、UHF帯パッシブRFIDシステムの現実的な危険度を評価した。一般ME機器では安全臨界値が3V/mであるため相当程度の配慮が必要だが、植え込み型ペースメーカなどの生命維持装置はその安全臨界値が10V/mと高く、外来電磁波に対して「強い」ことがわかった。検証実験でも、この安全臨界値を超えた電界強度を得るには、現実的な運用環境を度外視するほど近接させる必要があることがわかった。すなわち一般的な臨床現場でUHF帯パッシブRFIDを運用する場合、現実的なアンテナ設置位置や運用方法では障害が生じる可能性が低いことがわかった。後者では、札幌医科大学附属病院の放射線外来廊下にて、ステンレスワゴンと樹脂製ワゴンにより、小型ME機器の一般的な搬送状況の下での認証特性を評価した。その結果、金属製ワゴンを用いても必ずしも認証率低下が生じないことがわかった。認証率は主として小型ME機器へのタグの添付状況に依存し、ワゴンの材質による差異は僅少であった。平成25年度の研究により、UHF帯パッシブRFIDタグによる小型ME機器の包括的院内認証の実用性の高さと、一般ME機器・生命維持装置に対する電磁的な安全性が定量的に確認できた。平成23年度には、臨床現場でのUHF帯パッシブRFIDタグによるME機器所在管理の可能性を、実験的に検証した。実験は札幌医科大学附属病院で3回実施した。第1回目は、本実験の事前調査として8月1日から同3日に実施した。

ここでは、ME機器が置かれると考えられる同病院地下階のMEセンター、5階北病棟器材庫、同病棟ナースステーシヨン処置室で、電磁環境の状況を調査した。その結果、処置室のみ金属製物品棚が多く配されていることがわかった。第2回目は、本実験として9月4日から同9日に実施した。ここでは前述の3カ所で、ME機器に添付するUHF帯パッシブRFIDタグの認証範囲を調べた。実験には据置き型1Wのリーダを用いた。ハンディリーダも持参した。実験結果から、処置室以外では実用上十分な認証範囲が得られた。処置室では、物品棚など金属類の影響により小さめの認証範囲にとどまった。ただしリーダアンテナの配置を考慮すれば、相当程度の認証範囲が得られる見通しも得た。この実験と併せて、リーダから発せられる電磁波の電界強度を調べ、植込み型ペースメーカの脅威となる範囲も調べた。その結果、最大出力1Wで運用しても、リーダアンテナからおよそ350mm離れれば、脅威となる電界強度は観測されなかった。平成24年7月に、UHF帯RFIDの規格が改編されることがわかった。このため、新規格に準拠したリーダとタグを用いて、追加実験を実施した。これは1月30日から2月3日に実施した。その結果、全体的に認証範囲が拡大し、処置室にあっても十分な認証範囲が得られた。さらに、ME機器の所在管理をより簡単に実現するために、病棟入り口での認証範囲も調べた。その結果、ここを通過するタグを認証するのに十分な範囲が得られた。平成23年度に実施した検証により、UHF帯パッシブRFIDタグは、ME機器の院内所在管理に有効との結論に至った。本研究は、パッシブRFIDタグにより病院内で小型ME機器の自動探索を実現することが目的であった。その相当程度は、ハードウェア的にもソフトウェア的にも、平成23年度と平成24年度の研究で達成することができた。この2年間の研究を通じて、パッシブとくにUHF帯のRFIDタグを用いた自動認証システムが有用であることを示すことができた。具体的に平成24年度には、「null点の影響の解析」「施設内遠隔認証」「自動追跡システムの試作」が予定された課題であったが、実際にはさらに「タグの最適化」と「最適化タグによる認証特性の評価」まで、実施できた。これには、UHF帯RFIDの規格改編や、これに呼応したタグの高性能化も追い風となった。平成25年度には、かねてよりパッシブRFIDに求められている運用時の電磁的安全性についての解析を、継続して実施したい。研究途上において、UHF帯RFIDの規格改編が実施されることとなった。これを受けて平成23年度の研究では、当初の計画の範囲を大きく超えて、新規格に準拠したリーダとタグについても追加実験を行いそのパフォーマンスを評価した。その結果、新規格に準拠したリーダやタグならば性能の改善が著しく、多くの臨床現場にてほぼ確実に応用可能であることがわかった。
多重化隠蔽映像技術による新たな情報共有空間の創出のための映像制作手法の確立

「多重化隠蔽映像技術による新たな情報共有空間の創出のための映像制作手法の確立」は立体映像技術と互換の映像ディスプレイ技術として、偏光フィルタを用いたExPixel方式の多重化技術における画質向上技術について詳細は「多重化不可視映像技術(第3報) 普及型ディスプレイにおける視聴特性評価ー」において報告している。またFPGAによるハードウェア化に加え、偏光フィルタ等が必要ない方式についての実験的成功に至った。これらの基礎技術は次世代の多重化映像技術となる裸眼視聴可能な多重化映像技術「ExField」のベースとなっており、今後も幅広い研究応用性が期待できる。本研究「多重化隠蔽映像技術による新たな情報共有空間の創出のための映像制作手法の確立」は、現在急速に普及しつつある立体ディスプレイをベースに、「奥行き・飛び出し」以外の新しい付加価値を与えることを研究の目的としている。本提案では特に、技術的な基盤が完成しつつある多重化隠蔽映像を、幅広いコンテンツ開発者と協力しながら、「多重化」と「隠蔽」を利用した情報デザイン上の付加価値の提案、およびそれを実現する具体的な映像表現手法を確立し、デモコンテンツを広く発信することで評価することにより、新しい映像表現を社会に浸透させることを目的としている。「多重化・隠蔽映像」が一般化すれば、複数人がひとつの大画面を視聴する環境(リビングルーム、教室、会議室、ミュージアム、パブリックビジョン等)において、大画面を共同視聴し、複数のチャンネルを「ゆるく共有」し、選択的に異なる情報を見ることができる。これにより映像メディアの可能性を大きく広げることができる。このような背景において、本年度は既存の3Dディスプレイと互換方式である複数プロジェクタを使った映像多重化手法について、1.画質・色彩向上,2.ストーリー手法,3.インタラクティブ性,4.教育・理解向上,5.ユーザ間の関係デザインという要素について研究を続けてきた。従来不可能と考えられていたフラットパネルディスプレイでの多重化隠蔽映像の実現に成功した。当該年度の成果として主要なものは,右のとおりである。(1)ニコニコ超会議2にて「ニコニコメガネ」を招待展示,(2)経産省Innovative Technologiesに採択,DCEXPO2013にて「2x3D」を展示,(3)研究成果2作品が先端技術館@tepiaで常設展示化,(4)テレビの多重化を可能にする汎用ソフトウェア「ExPixel」の開発に成功,(5)裸眼とメガネ装着で全く異なる映像を見せられる「ExPixel」技術2年目となる平成26年度においては、3Dフラットパネルにおける多重化技術を「ExPixel」として一般理論化し,ニーズ収集,ハードウェア化,普及展開を中心に、科学的視点において研究を推進した。(1)画質・色彩向上について、標準的撮影機材の整備および、業務用映像機器の色調整に使用されるディスプレイ較正器Datacolor社製「Spyder HD」を導入した。(2)ストーリー手法、(3)インタラクティブ性、(4)教育・理解向上、(5)ユーザ間の関係デザインについては、国内でのユーザーテスト、展示発表、ヒアリングで調査を行った。本研究の基盤となる多重化隠蔽映像技術は文字メッセージ以外にも、応用の幅が広く、また具体的に本研究成果を活用して製品・サービスに組み込みたいとの企業からの問い合わせも多くあり、科学的な研究成果を整理して実験的プロトタイプから、研究開発基盤の構築や技術をツールに落とし込む整理が必要であることがわかった。また世界の研究ステージ、特に米国における先進的な多重化ディスプレイ研究者やコンテンツ制作、開発面において、研究者と交流することで今後進めるべき方向性を確認できた点が意義深い。新しい情報メディアおよび情報デザインにおいて、(1)(5)の各要素は複雑かつ密接に絡み合っており、実験方法を確立することが難しい。本研究の成果として、研究者が提案する「動的複合ペルソナ手法」により、ミュージアムを使ったフィールドテストを通して自然な体験状態を維持しながら観測し、体験者の状態を物理的なパラメータにおいて評価することが可能になった点が重要な進歩であるといえる。また開発者に向けた「多重化クリエイソン」を2回実施することにより、開発者が実際に検討するプロセスや、ソフトウェアやツールにおける現状の課題が明らかになった。これらの成果により、研究要素(2),(3),(4),(5)を向上させるための、特色ある方法が整理できた。平成26年度末に,MIT Media LabおよびCMUを訪問し,理論の検証および普及展開のための意見交流を行った.そのディスカッションから,最終年度となる平成27年度は,3Dフラットパネルにおける多重化技術「ExPixel」の普及展開を中心にアプリケーション開発に力を入れた.PC不要で多重化不可視映像を生成可能とするFPGAハードウェア化を行い「ExPixel FPGA」としてコンテンツ開発者側で評価可能にするための多重化映像試験キットを作成し,データ取得した.(1)画質・色彩向上について:タイChulalongkorn Universityと鈴木久貴を中心に,実用的な様々な角度における特性について,画質改善を確立した.(2)ストーリー手法:Top-Bottom方式をサポート,既存のMPEG等のコンテンツを映像編集ツールを使い自由に再生可能に.(3)インタラクティブ性:複数のPCやハードディスクレコーダー,ゲームコンソール等のSet-top-boxから,自由に多重化不可視映像可能に.これにより既存のVRエンタテイメントシステムとデジタルサイネージを融合させた「MGV」を開発することが可能になり,DCEXPO 2015, SIGGRAPH ASIA 2015,「科学と技術のひろば」等の一般公開テストにおいて良好な結果を得た.(4)教育・理解向上:合理的配慮と健常者のための不要な情報の非表示を同時に達成する教育ユニバーサルデザインを開発.(5)ユーザ間の関係

デザイン:本来1名同時プレイ可能なゲームシステムを,2名同時に同一ディスプレイにて体験できる関係デザインを提案,ニコニコ超会議2015「第8回ニコニコ学会βシンポジウム」(来場者15万人)にて展示発表を行い,会場投票で1位となる金賞を授与された.研究成果社会周知として,テレビ番組協力及びシンポジウムを2件開催した.「多重化隠蔽映像技術による新たな情報共有空間の創出のための映像制作手法の確立」は立体映像技術と互換の映像ディスプレイ技術として、偏光フィルタを用いたExPixel方式の多重化技術における画質向上技術について詳細は「多重化不可視映像技術(第3報) 普及型ディスプレイにおける視聴特性評価ー」において報告している。またFPGAによるハードウェア化に加え、偏光フィルタ等が必要ない方式についての実験的成功に至った。これらの基礎技術は次世代の多重化映像技術となる裸眼視聴可能な多重化映像技術「ExField」のベースとなっており、今後も幅広い研究応用性が期待できる。本研究「多重化隠蔽映像技術による新たな情報共有空間の創出のための映像制作手法の確立」は、現在急速に普及しつつある立体ディスプレイをベースに、「奥行き・飛び出し」以外の新しい付加価値を与えることを研究の目的としている。3ヵ年の研究計画は5つの要素、(1)画質・色彩向上(2)ストーリー手法(3)インタラクティブ性(4)教育・理解向上(5)ユーザ間の関係デザインについて、複合的にデモコンテンツ制作を行い、Webを用いた発信や体験可能な公開展示などの社会周知機会を設けながら遂行する計画として提案された。体制としてコンテンツ制作者や国内外の専門家といった非研究者とのコラボレーションを積極的に行い、所属機関である情報メディア学科の学生、大学院生、他教員、国内外のコンテンツ制作の専門家らと協働しながら研究を遂行していく点が特徴的である。平成26年度は既存の3Dディスプレイと互換方式である複数プロジェクタを使った映像多重化手法について、(1)画質・色彩向上,(2)ストーリー手法,(3)インタラクティブ性,(4)教育・理解向上,(5)ユーザ間の関係デザインという要素について、当初計画では(1)(3)について中心的に研究を進める計画であったが、実験システム開発面では学部生(鈴木久貴,田口裕起,鈴木百合彩,津田良太郎,田口裕起,安藤歩美,岡本遼,中澤遥)および、コンテンツ制作面では阿部章仁氏(写真家)による協力により、急速に開発・検証面をすすめることができた。エンタテイメントシステム研究成果の需要から、3Dフラットパネルでの研究を中心的に進めていくべきと考える。
脂肪酸結合タンパク質による細胞内薬物輸送の分子メカニズム解析

脂肪酸結合タンパク質(fatty acid-binding protein, FABP)は細胞内に豊富に存在し、脂肪酸のみならず疎水性薬物の細胞内輸送も担うと考えられている。しかしながら、FABPに結合する薬物種やその結合メカニズム、薬物動態に及ぼす影響はほとんど研究されていない。本研究では、大腸菌発現系により調製したFABPを用いて様々な薬物との結合メカニズムを解明すること、培養細胞を用いてFABPが薬物動態に与える影響を解明することを目的としている。今年度は、細胞に取り込ませたフェノフィブラートのアッセイ系を構築した。まず、COS7細胞にフェノフィブラートを添加しインキュベートした後、洗浄およびメタノール抽出により細胞抽出液を得た。これをHPLCに供し、検討の結果10ng1ugまで定量的に測定できる系を確立した。次いで、Lipofection法によりhuman FABP1を過剰発現させた細胞にフェノフィブラートを添加した結果、controlの細胞よりも1.3倍の薬物取込量の増加が認められた。また、大腸菌発現系により精製したFABPのリコンビナントタンパク質を用いて、様々な薬物との結合実験を行った。薬物結合能をFABPアイソフォーム間で比較した結果、FABP35は比較的相同性が高いにも関わらず、結合親和性が異なる薬物を複数見出した。そこで、FABP5のT85S、Q96H、S105T変異体を作製し、薬物結合実験を行った。その結果、これらの変異体では野生型FABP5の薬物結合能と大きな違いは認められなかった。初年度は、大腸菌発現系により精製した肝臓型FABP(FABP1)を用いてFABPに結合する薬物のスクリーニング解析を行った。FABPと結合すると蛍光を示す化合物1-anilinonaphtalen-8-sulfonate(ANS)と薬物との競合反応を指標とすることで、多くの薬物について効率的にアッセイを行った。これまでにFABPに結合することが報告されている薬物を含め約50種の様々な薬物について解析を行った結果、ロサルタン、バルサルタンなどのアンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)やニフェジピン、ニカルジピンなどのCa拮抗薬(CCB)、スタチン系薬物フルバスタチンなどFABP1に結合する薬物を新たに複数同定できた。さらに、ARBやCCBそれぞれのアナログについて親和性解析を行い、FABPに結合する薬物の構造的特徴について検討した結果、FABPとの薬物結合には1)分子内に含まれる酸性基は1つが好ましいこと、2)構造が類似した化合物では分子の疎水性度が重要であること、が考えられた。また、解析の中でFABPに対して脂肪酸に匹敵する極めて高い親和性を示す薬物を見出すことができ、FABP研究のリード化合物として有用であると期待された。初年度の計画では、1)FABPに結合する薬物のスクリーニング解析、2)FABPアイソフォーム間における薬物結合の違いを予定していた。1)については、FABPに結合する薬物を新たに複数同定でき、さらにFABPとの薬物結合に重要と考えられる因子を推定することができた。2)については、他のFABPアイソフォームについても大腸菌発現系による精製を終えており、様々な薬物との親和性の比較を検討中であることから、概ね順調に進行していると評価した。脂肪酸結合タンパク質(fatty acid-binding protein, FABP)は細胞内に豊富に存在し、脂肪酸のみならず疎水性薬物の細胞内輸送を担うと考えられている。しかしながら、FABPに結合する薬物種や、薬物動態への影響についてはほとんど研究されていない。本研究では、大腸菌発現系により調製したFABPを用いて様々な薬物との結合様式の解明すること、培養細胞を用いてFABPが薬物動態に与える影響を解明することを目的としている。平成29年度は、10種のFABPアイソフォームのうちFABP15について大腸菌発現系を用いてリコンビナントタンパク質を調製し、蛍光物質ANSとの置換反応を利用した薬物結合能の比較解析を行った。その結果、FABP1, 5には高い親和性を示すが、FABP4に対して低い親和性を示す薬物を複数見出した。特にFABP4と5は53%と比較的高い相同性を示すにも関わらず、薬物結合能に違いが認められた。この結果は、組織ごとの薬物動態を理解する上で重要な知見になるとともに、薬物結合に重要なアミノ酸残基の特定に有用であり、アイソフォーム特異的な阻害剤の創製にも応用できると期待できる。また、培養細胞実験にも着手しCOS7細胞およびHEK293細胞にLipofection法を用いてFABP1を強制発現させWestern blottingにより発現を確認した。今後は、FABP1を強制発現させた細胞を用いて薬物取り込み能への影響を解析し、変異体との違いや薬効発現への影響についても解析していく予定である。当初の計画通り、平成29年度では培養細胞を用いた実験に着手し、細胞用FABP1発現ベクターの構築、発現の確認まで終えている。さらに、FABP1を強制発現させた細胞へのフェノフィブラートの添加実験を進めている。添加した薬物の取込量を評価する必要があると考え、HPLCを用いた薬物取込量の評価系を確立した。さらに、FABPアイソフォームの構造が非常に類似しているのも関わらずアイソフォーム特異的に結合する薬物を見出せたことから、薬物結合に重要と考えられるアミノ酸残基を絞ることができた。以上の結果から概ね順調に進展していると判断した。

しかしながら、FABPに結合する薬物種やその結合メカニズム、薬物動態に及ぼす影響はほとんど研究されていない。本研究では、大腸菌発現系により調製したFABPを用いて様々な薬物との結合メカニズムを解明すること、培養細胞を用いてFABPが薬物動態に与える影響を解明することを目的としている。今年度は、細胞に取り込ませたフェノフィブラートのアッセイ系を構築した。まず、COS7細胞にフェノフィブラートを添加しインキュベートした後、洗浄およびメタノール抽出により細胞抽出液を得た。これをHPLCに供し、検討の結果10ng1ugまで定量的に測定できる系を確立した。次いで、Lipofection法によりhuman FABP1を過剰発現させた細胞にフェノフィブラートを添加した結果、controlの細胞よりも1.3倍の薬物取込量の増加が認められた。また、大腸菌発現系により精製したFABPのリコンビナントタンパク質を用いて、様々な薬物との結合実験を行った。薬物結合能をFABPアイソフォーム間で比較した結果、FABP35は比較的相同性が高いにも関わらず、結合親和性が異なる薬物を複数見出した。そこで、FABP5のT85S、Q96H、S105T変異体を作製し、薬物結合実験を行った。その結果、これらの変異体では野生型FABP5の薬物結合能と大きな違いは認められなかった。次年度は培養細胞を用いた実験を予定しており、1)FABP1が核内へ薬物を送達するメカニズムの解析、2)FABPアイソフォームが薬効発現に及ぼす影響の解析を計画している。1)に関しては、蛍光緑色タンパク質GFPを融合したキメラFABPの発現プラスミドを初年度のうちに構築しているため、細胞内局在解析にスムーズに取り掛かれると考えている。2)に関しては、発現プラスミドの構築および薬物取り込み量の評価系の構築を終えているため、培養細胞にFABPを強制発現させた後、薬物取り込み量や薬効発現に与える影響について解析を進めていく予定である。FABP1の強制発現系が構築できたため、平成30年度では培養細胞を用いてFABPの発現に伴う薬物取り込み能、薬効発現に与える影響を解析する。細胞にFABP1を強制発現させた後、フェノフィブラート等の薬物を添加し、薬物取り込み量をHPLCで、遺伝子発現変化をリアルタイムPCRで解析する。また、FABPの細胞内局在解析にも着手する。FABP1の推定核移行シグナル配列をAlanineに置換し、GFPを融合したキメラ変異体を作製する。現在、野生型の発現プラスミドは構築済みのため、局在解析と同時に変異体作製に取り掛かる。さらに、大腸菌発現系の実験ではFABPアイソフォーム間で薬物結合能に違いが見出されたため、その原因となるアミノ酸残基を推定し、アミノ酸変異体を作製することで検証実験を行う。平成30年3月末に注文した品が、4月納品となったため繰越金が生じた。
被爆地の写真から作るバーチャル空間と平和学習の実践

被爆地の写真から作るバーチャル空間と平和学習の実践本研究の成果は、(1)原爆写真から作る平和教育のためのコンテンツ(3D教材)の完成であり、(2)開発コンテンツによる平和教育の実践から得られた教育的視点の再考にある。科学的視点に立ち、光の痕跡として残された写真情報から教材を作成することは、確かな事実に基づく教材作りが可能で、子どもたちに訴える力が大きい。しかし、開発コンテンツによる実践には学校の諸事情に合わせる調整が必要である、結果となった。本研究の目的は、(1)事実を記録として残した「写真」から、(2)バーチャル空間の3次元を作り上げ、(3)エクスポージャーの教育実践を行うこととである。人類の過ち(科学技術の負の遺産)から未来志向の科学技術を学びつつ、平和を学ぶ教育の新しい形を試みる、本研究で掲げた重要な意義を、バーチャルゼネレーション(現代の子どもたち)に効果的に伝習するため、平成22年度はアメリカの国立公文書館を訪問し資料を収集するとともに、長崎平和推進協会の写真部会が所有している写真と照らし合わせながら、バーチャル空間のための資料(写真)を選別し、データベースの基本を構築した。また、バーチャルジェネレーションの慣れ親しんだ携帯端末からのバーチャル空間の表示実験を開始した。利用した携帯端末はGoogleが提案したAndroid-OSを利用したVer.2.2のDesire(端末はHTC社製造)及びVer.2.3のNexus-s(端末はSamsung社製造)であり、IPod Touch(端末はMAC社製造)による次年度からの教育現場での実験のための機材を用意した。平成23年度は学校現場での利用と評価を目的に、長崎の平和団体(NPO法人)と協力しながら市内所在の小学校での平和教育に取り組むとともに、これらの教材の有効性を確認する予定である。小学校での平和教育実習に用いられる素材は、アメリカ国立公文書館から入手した写真と長崎平和推進協会の写真部会が管理する写真から作成したバーチャルデータであり、教師側で作成した授業案等がある。人類の過ち(科学技術の負の遺産)から未来志向の科学技術を学びつつ、平和を学ぶ教育の新しい形を試みる、本研究で掲げた重要な意義を、バーチャルゼネレーション現代の子どもたち)に効果的に伝習するために以下の予定で研究が進められた。平成22年度はアメリカの国立公文書館を訪問し資料を収集するとともに、長崎平和推進協会の写真部会が所有している写真と照らし合わせながら、バーチャル空間のための資料(写真)を選別し、データベースの基本を構築した。また、バーチャルジェネレーションの慣れ親しんだパーソナルコンピュータや携帯端末からのバーチャル空間の表示実験を開始した。なお、バーチャル空間は平成22年度の研究により完成した。平成23年度は学校現場での利用と評価を目的に、長崎の平和団体(NPO法人)と協力しながら市内所在の小学校(長崎市立城山小学校、長崎市立小榊小学校、雲仙市立西郷小学校)での平和教育に取り組んだ。また、平成22年度に実施した内容により開発された平和教育教材の有効性を確認することができた。小学校での平和教育実習に用いられる教材は、アメリカ国立公文書館から入手した写真と長崎平和推進協会の写真部会が管理する写真から作成したバーチャルデータであり、教師側で作成した授業案等が用いられ、本研究を持って「平和教育教材」の完成ができ、実践をもって有用性を確認した。
光熱変換光位相差検出法によるマイクロ分光光度計の実現と一細胞スペクトル計測

マイクロ流路中で溶液の吸収スペクトルを測定するデバイスの開発に向け、光ファイバを用いた干渉計を構築し原理を検証した。平成29年度は可視光レーザーを用いて干渉計の構築を試みたが、コヒーレンス長が短く干渉させることは困難であった。そこで平成30年度に新たに赤外レーザーを購入して干渉を試みたところ、干渉させることはできたものの、光ファイバの微小振動の影響で極めて不安定な干渉しか得られなかった。そこで、光ファイバを短く切り詰める、風よけを設置するなどの工夫を施した結果、安定した干渉が得られるようになった。更に原理検証のため、励起レーザーを用いて試料を加熱しその屈折率変化を干渉計で検出することを試みた。この際、マイクロ流路を有するデバイスは作製せず、バルク空間で試料液滴を用いることによって信号の取得を試みた。その結果、試料が励起レーザーを吸収することによって発した熱に由来する信号を検出することに初めて成功した。この結果を、これまでに開発してきた導波路を用いたデバイスと比較した。導波路を用いたデバイスの場合、試料溶液中で発生した熱が熱拡散によってガラスに伝達したものを検出していたため感度が低かった。一方、本実験で得られた信号の強度は導波路デバイスと比較して1桁向上していた。このことから、溶液中に発生した熱を直接検出することにより感度を向上するという本研究の基本戦略を実証することに成功したと結論づけた。当初予定していた可視光レーザーでの干渉計構築が困難であったことおよび、ファイバの微小振動が干渉に与える影響が予想よりもはるかに大きかったことなどから、研究に遅れが生じている。これまで、デバイスを作製せずにバルク空間での原理検証に留まっていたが、ファイバの微小振動を排除するためにはファイバを精密固定可能なデバイスを作製することが必要不可欠である。今後は、デバイスの試作を繰り返しながら安定性や感度を向上させる方法を検討していく。
細胞周期に依存したWntシグナル制御機構と発がん制御機構

Wntシグナル経路の破綻は細胞のがん化を引き起こすことが知られている。本研究は、細胞周期におけるWntシグナル経路の役割とがん化の連関を理解することを目的とし、「Wntシグナル経路が有糸分裂期において機能するか」という点に焦点を絞り、研究を遂行した。本研究により、異なったWntシグナル経路がそれぞれ、分裂中期や分裂終期に機能し、有糸分裂期におけるWntシグナル経路の多様な機能を明らかにすることができた。Wntシグナル経路には大きく、β-catenin依存性経路と非依存性経路の二つが存在し、細胞外分泌蛋白質であるWntとその受容体であるFrizzled(Fz)、LRP5/6、Ror1/2などの組み合わせにより下流のシグナル経路を決定する。本研究は、Wntシグナル経路の有糸分裂期における機能と細胞周期に依存したWntリガンドの発現調節機構を明らかにすることを目的としている。本研究を開始するにあたり、Wntシグナル経路の構成因子のひとつであるDv12が紡錘体軸の制御に関与すること、及び、紡錘体チェックポイントに関与することを明らかにしていたが、本年度はさらに以下の知見が得られた。(1)Plk1によるDv12のリン酸化部位T206に対する非リン酸化型変異体T206Aを作成し、Dv12による紡錘体軸の制御において、Plk1によるDv12のリン酸化が必要であることを明らかにした。(2)紡錘体軸の制御に加えて、Dv12がリン酸化に依存して微小管一動原体結合を制御することを明らかにした。(3)Dv12がリン酸化非依存的に紡錘体チェックポイントを活性化し、さらに、紡錘体チェックポイントキナーゼのひとつであるMps1の活性化、及び、Bub1とBubR1の動原体集積に関与することを明らかにした。(4)Wntの受容体であるFz2とβ-catenin依存性経路の共役受容体のひとつであるLRP6が、Dv12と共に紡錘体軸の制御に関与することを明らかにした。以上の研究成果は、EMBO J.誌において公表した。さらに、上記の研究成果に加えて、β-catenin非依存性経路のWntリガンドであるWnt5a、及び、その共役受容体Ror2のノックダウン細胞において多核細胞が有意に増加したことから、Wnt5a-Ror2経路が細胞質分裂に関与することが示唆された。来年度は細胞質分裂におけるWnt5a-Ror2経路の分子機構を詳細に解析する予定である。前年度までに、Wntシグナル経路の構成因子であるDvl1/2/3のトリプルノックダウン細胞(以降、Dvlノックダウン細胞とする)において、それぞれのシングルノックダウン細胞と同等に細胞質分裂異常の指標となる多核細胞が増加すること、さらに、βicatenin非依存性経路のWntリガンドであるWnt5a、及び、その共役受容体Ror2のノックダウン細胞においても多核細胞が有意に増加することを見出し、Wnt5aシグナル経路が細胞質分裂に関与することが示唆されたことから、本年度はその詳細な分子機構を明らかにするべく解析を行い、以下の知見が得られた。(1)Dvl2、及び、Wntシグナル経路の受容体であるFz2が細胞質分裂時に中央体に局在した。また、Fz2は分裂前期から後期までは細胞膜全周に局在するが、分裂終期移行後、Rabl1依存的にリサイクリングエンドソームを介して中央体に集積することが明らかになった。(2)Dvl2はWnt5aシグナル経路依存的に中央体に集積することが明らかになった。(3)Dvlノックダウン細胞、及び、Wnt5aノックダウン細胞では細胞間橋を構成する微小管の安定性が低下し、ESCRT-IIIのサブユニットのひとつであるCHMP4B(細胞質分裂終了時における膜器官分離に必要)の中央体における局在に異常がみられた。(4)Wnt5aシグナル依存的にFz2とCHMP4Bが複合体を形成することを明らかにした。以上のことから、Wnt5aシグナル経路が細胞間橋の微小管安定性に寄与し、さらに、Wnt5aシグナル依存的にFz2を介してCHMP4Bの局在を調節することで、細胞質分裂終了時の膜器官分離に関与することが明らかになった。本研究成果は、Journal of Cell Scienceに投稿し、査読審査中である。