hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放牧草地における窒素の流れ-特に排泄尿からの窒素の流れ-

放牧草地における窒素の流れを明らかにする一環として、放牧牛の排泄尿からの窒素の揮発を検討した。〔測定装置の検討〕これまでの方法は、排尿地点をプラスチックの容器で密閉したものを真空ポンプで吸引し、アンモニアガスを捕集するものであった。この方法では容器内の温度や風速を周囲の自然環境と合致させるのが困難であった。本研究では透明アクリル製の箱型風洞にファンを取り付け、ファンの回転数を変えることによって風速を制御し、周囲の風速と類似した値で測定出来る方法を検討した。風速が自然環境に近ければ風洞内の温度上昇を避けることが出来る。本装置を製作し、アンモニアガス捕集の精度を確認する実験を行ったところ、アンモニアガスの回収率は平均102.9%の値が得られ、本装置を用いて、アンモニアガスの揮発測定が可能なことが明らかとなった。〔排泄尿からの窒素の揮発の測定〕尿素と馬尿酸を窒素比で1:0.025に混合した水溶液(以下人工尿と称する)を、実験地に30g窒素/m^2施用し、揮発する窒素を風洞装置を用いて捕集した。その結果、尿施用後1日目に施用窒素の約0.72%が揮発したが、その後はほとんど揮発による損失は認められなかった。なお土壌表属より010cm層に大量のアンモニア態窒素の集積が認められ、地下80100cm層にも若干のアンモニア態窒素が存在した。
高速Ｘ線４Ｄイメージングによるパーキンソン病リハビリテーションの次世代モデル開発

2方向からX線を照射して撮影し、その画像を高速カメラで連続撮影して、3D動画として記録するシステムを製作した。同システムを用いて、パーキンソン病の4大症候(歩行・運動障害、寡動、筋固縮、安静時振戦)の他に、呼吸など自律神経機能、咀嚼/嚥下/発声などの様子を、X線ムービーとして記録し、解析した。従来は、遅れて発症するといわれていた呼吸運動の変調・障害が、パーキンソン病の4大症候とほぼ同時期の早い段階で発現することが、この3DX線動画システムによって初めて明らかになった。これらのパーキンソン病症状の早期発見により、早期のリハビリ開始が可能となり、症状進行の予防に役立つことが示された。パーキンソン病ラットモデルを用いて、高速X線4Dイメージングによって得られる神経変性マーカー分子の動態に関する情報と一般症状を包括した次世代型リハビリテーションの実験的開発を提案する。神経細胞ミトコンドリアの酵素障害によって変化した酸化還元状態を神経変性度に変換して可視化する高感度なX線4Dイメージング装置を製作し、パーキンソン病ラットモデルの大脳基底核での神経変性度をリアルタイムで精査する。その結果を活用してリハビリテーションのプログラムを最適化し、歩行や運動などの一連の機能障害に対する治療効果を確実に向上させる次世代モデルを構築する。研究戦略としては、高速X線4Dイメージング装置を開発し、パーキンソン病ラットモデルの大脳基底核の神経終末でのミトコンドリア酸化還元酵素の障害の動態を可視化し、神経変性度を精査する。従来の四大徴候(歩行・運動障害、寡動、筋固縮、安静時振戦)や、自律神経障害、高次脳機能障害、口腔機能障害などの症状の進行に関する情報と、神経変性に関する分子情報をもとに、パーキンソン病リハビリテーションの次世代モデルを作る。平成24年度はHX-4D装置開発のための理論解析を行い、1)高速X線3Dデュアルビーム撮影の硬軟両組織への対応、2)高速X線3Dデュアルビーム撮影と蛍光の同時撮影、の二つの要素技術を確立した。残る要素技術である3)多波長蛍光観察による神経変性部位の検出は平成25年度で完了する。高速X線3 Dイメージング装置を開発し、パーキンソン病ラットモデルについて、運動中枢である大脳基底核の神経活性状態をイメージングにより可視化する。平成24年度および25年度で、高精細マイクロ焦点X線ムービーシステムの製作に初めて成功し、米国重力物理生物学会等で発表した(Kumei et al.,2012, 2013)。パーキンソン病の代表的特長である歩行障害と姿勢制御異常について、マウスモデルを使用して、X線ムービー画像を撮影した。同X線ムービー動画像を20ミリ秒毎のビットマップX線静止画像に変換して時系列で連続解析を行い、さらに従来にはなかった物理指標の導入による斬新なアプローチによって、動物の歩行、姿勢制御について詳細な運動力学的解析を行うことに初めて成功した。その結果、従来の「重力加速度』ではなく、「躍度」または「加加速度」という概念が、極めて重要な意味をもつことを実験的に証明し、同内容を論文として国際雑誌で発表した(Hasegawa et al. Life 4;174-188, 2014)。さらに同X線ムービーを用いた解析により、パーキンソン病マウスでは、頭部、体幹部、尾部の骨格構成のリバランスが重要な意味をもつことがわかり、現在、詳細を解析中である。またこれらと並行して、脳内の運動中枢を非侵襲的に観察する方法として、当初はLED照明によって神経細胞のミトコンドリア酸化還元状態を可視化するという方向で作業をすすめていたが、脳内深部到達度が予想の精度が得られないため、現時点では、back upとして、近赤外光によるヘモグロビン酸素結合状態のリアルタイム可視化による中枢神経活動の非侵襲的観察を行う方式も視野に入れた検討を行っている。パーキンソン病ラットモデルを用いて、高速X線3Dイメージングによって得られる神経変性マーカー分子の動態に関する情報と一般症状を包括した次世代型リハビリテーションの実験的開発を提案する。高感度なX線3Dイメージング装置の活用によって、同疾患による中枢/末梢神経系の変性にともなう組織上あるいは機能上の微細な初期変化を可視化することで、早期発見に役立つことが期待され、それを活用してリハビリテーションのプログラムを最適化し、歩行や運動などの一連の機能障害に対するリハビリテーション治療効果を確実に向上させる次世代モデルとなる。平成26年度では、平成25年度で完成した高速X線3Dイメージングを用いて、パーキンソン病モデルマウスにおいてパーキンソン病の4大症候(歩行・運動障害、寡動、筋固縮、安静時振戦)と、自律神経系機能、咀嚼嚥下/発声などの口腔機能などの障害の進行と比較解析した。

その結果、嚥下/発声などの微細な動的変化を可視化することに成功した。これらの動きをムービーとして捉えることは従来は困難であったが、我々が開発した高速X線3Dイメージング装置によって初めて可能となった。また、横隔膜の一連の動きの微細な変調を捉えることにも成功し、パーキンソン病発症の極めて早い段階での、呼吸機能の異常という現象をX線動画として観察記録することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。硬組織病態生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。2台のX線照射装置を同時に用いて、高速カメラ(高額のためデモ品を借用)で非侵襲・非拘束状態でのマウスの行動姿勢と、同時に横隔膜の動きや心臓拍動もX線動画像として取得することに成功した。各X線源の照射方向と同軸の可視光映像を撮影し、可視光観察とX線透過映像の観察データを互いに補完し、映像解析の精度を向上させた。成果を、中国で開催された国際シンポジウムで発表した。研究の本来の目的である、パーキンソン病などで特徴的に見られる歩行異常や、呼吸異常、姿勢制御の異常などを、今回開発した高精細マイクロ焦点X線ムービーによって詳細に解析し、動物の骨格、関節の広がり具合、姿勢バランスの異常などを、躍度という新しい物理指標によって原因分析することに世界で初めて成功した。今後は、この躍度をパラメータとする解析をさらにすすめ、パーキンソン病の早期に出現する異常を鋭敏に検出し、効果的なリハビリテーションに役立てることを視野に入れた研究を進める。in vitroのパーキンソン病モデルを使って、残る要素技術である多波長蛍光観察による神経変性部位の検出技術を確立する。パーキンソン病の四大徴候(歩行・運動障害、寡動、筋固縮、安静時振戦)や、自律神経障害、高次脳機能障害、口腔機能障害などの症状の進行に関する情報と、神経変性に関する分子情報をもとに、新しいパーキンソン病リハビリテーションの次世代モデルの基盤を構築する。1)パーキンソン病の症状と運動中枢における神経活動状態のリアルタイム可視化2)パーキンソン病モデル動物(ラットまたはマウス)の効果的リハビリテーションへの展開26年度が最終年度であるため、記入しない。遠隔操作移動制御システムを追加製作し、X線撮像の精度を高め、高速X線4Dイメージング装置を完成する。パーキンソン病モデルラット/マウスの発症の早期に、大脳基底核の神経変性マーカー分子のミクロ動態と動物マクロ行動異常をX線レベルで解析する。
卵胞発育とゴナドトロピンレセプター合成調節について

ゴナドトロピンレセプター(Gn-R)の発現調節については、その転写調節とmRNAの半減期について検討した。ゴナドトロピン自体は、Run on assay及びルシフェラーゼ法によりGn-Rの転写を促進することが示された。一方、ActivinはGn-Rの転写を促進し、半減期も延長する。IGF-IはActivinと異なり単独では何ら作用を示さないが、FSHと共同してGn-Rを増加させる。この機序を検討すると、転写には影響を与えず、半減期の延長を示した。顆粒膜細胞を用いた実験ではさらに培養液中のアクチビンの濃度を調べ、アクチビンはFSH添加により減少することが判明した。一方、IGF-IはFSHによりその発現が上昇する。これらの結果より、アクチビン、IGF-Iともにゴナドトロピンと共同してレセプター発現を増加させるが、その作用の時間と様式は異なっている。アクチビンは卵胞発育の初期に働き、FSHレセプターを増加し、FSHの作用を増強するが、FSHの作用によりアクチビンの産生は低下する。IGF-Iは単独では作用しないが、FSHと共同で作用し、FSHの存在下でさらにその作用が強まることが示された。黄体機能に対するPRLの作用については、ラットではPRLの作用がFSHレセプターではなくLHレセプターの発現に抑制的に働くことが判明した。この作用はIGF-Iとは逆にレセプターmRNAの安定性に障害を起こすことによると考えられた。今後もレセプター維持に対する検討が必要と考えられた。ラット顆粒膜細胞培養を用いてゴナドトロピンレセプターの発現調節の検討を行ってきたので、今回も同様の培養細胞を使用した。FSHレセプターに関して、cAMP-Aキナーゼ系は転写のレベルで、合成促進に働くという結果を得てきたが,Cキナーゼ系の刺激が、一時的にmRNAの減少をもたらし、その後上昇に転じる反応も存在することを観察した。LHレセプターについてはCキナーゼ系によっては恒常的にmRNAレベルの減少があらわれた。この結果を考慮して、FSHおよびLHレセプター遺伝子とルシフェラーゼリポーターを含むプラスミッドに接合し、この細胞に導入後FSH,LHを作用させた時のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はこの培養系を用いて観察されたので、PRLのレセプター発現に対する影響を検討しているが、現在まで一定した結果を得ていない。しかし、PRLはLHレセプターのmRNAの有意の減少をもたらすことが観察された。

黄体機能に対するPRLの作用については、ラットではPRLの作用がFSHレセプターではなくLHレセプターの発現に抑制的に働くことが判明した。この作用はIGF-Iとは逆にレセプターmRNAの安定性に障害を起こすことによると考えられた。今後もレセプター維持に対する検討が必要と考えられた。
直腸癌術前化学放射線治療における肛門括約筋障害と肛門機能温存に関する研究

マウスの肛門組織を評価対象にして、放射線照射実験と組織変性軽減治療モデルの開発を研究してきた。マウスの括約筋における組織障害は局所照射の10Gyから変性所見を認めることがわかり、14Gyを超えた照射になると、個体の死亡に繋がる重篤な障害が出てくることが明らかになった。また、再生医療の方法を用いて、治療による組織障害を軽減させるための治療モデルを作成する研究では、脂肪幹細胞と骨髄系幹細胞を用いたモデルを検討し、どちらのモデルにおいても、幹細胞投与による有害事象は無かったが、組織変性の改善は有意差をもって示すことはできなかった。14Gy以上を照射では肛門周辺部位の細菌感染巣をすべてに認めていた。本研究はラットの肛門括約筋を対象に、放射線と化学療法のそれぞれが肛門括約筋に与える障害を組織変成の程度を評価することで検討する。最終的に再生医療の手法を用いた、組織障害軽減モデルを作成することが目的である。直腸癌の切除献体における括約筋近傍の組織障害に関しては、放射線化学療法後の組織で有意に強いことを報告してきた(Dis Colon & Rectum,54(11) 1423-1429, 2011)。今回新たに、27例の直腸癌術前値量として単独化学療法を施行した症例の組織に関して、評価を施行した。単独化学療法後の組織はほとんど変性所見を認めず、組織変性スコアにおいても手術単独症例と同等であることがわかった。今後のラットにおける基礎研究で、放射線障害を中心とした組織障害を検討して、再生医療の導入を図り、組織障害の軽減に関する検討を進めていく上で、重要な知見となった。また、再生医療に利用する脂肪肝細胞に関しては、臨床使用を念頭において、脂肪肝細胞の細胞シートを作成する研究を開始した。細胞シートは、細胞と培養皿を接着させていた細胞外マトリックスを豊富に有しているので、短時間で患部に生着し一体化する。そのため、単純に局所注入するよりも効率良く細胞が患部に保持され、高い治癒効果が期待できる。脂肪由来幹細胞シートを作製し、肛門括約筋近傍の組織障害を予防、組織再生させる放射線照射モデルに脂肪由来幹細胞シートを移植することで、放射線による肛門括約筋障害の予防を証明する研究を進める予定である。直腸癌の術前化学放射線療法(CRT)は局所再発のリスクを軽減させるが、内肛門括約筋切除術(ISR)において術後肛門機能を低下させる最も大きな要因の一つであり、その理由としてCRTが残存する括約筋組織の組織変性を引き起こしていることを報告してきた。本研究の目的は、動物実験において肛門組織の放射線障害動物モデルを作成して、これを評価対象にした再生医療の手法を用いた、肛門組織障害を軽減させる治療モデルを作成することである。動物実験における放射線照射実験と照射後の動物管理を精度よく施行する目的にて、27年度より放射線総合医学センターから共同研究者に加わっていただき、実験のスピードアップを図る事ができた。本来、ラットの肛門組織を用いた放射線障害モデルを作成していたが、動物管理の観点からマウスの肛門を用いた方が実験数が増やせることと、マウスを用いた同様の肛門組織評価において、放射線障害の評価と肛門括約筋組織の認識が可能であったことから、マウスを用いた実験を施行している。マウスに放射線照射装置を用いて5Gy、10Gy、20Gyを照射するモデルをそれぞれn=5として3週まで、マウスの体重と肛門周囲の便付着に関して経過観察し、3週後に肛門組織を採取して組織障害を検討した。5Gyと10Gyでは観察中に死亡する個体はなかったが、20Gyでは1例が観察中に死亡した。また、組織障害を評価すると、5Gyでは組織障害の有無が評価できなかったが、10Gyと20Gyでは組織障害の所見を認め、特に20Gyでは粘膜下に感染巣を形成していることがわかった。10Gyと20Gyのモデルに関して骨髄間葉系幹細胞を静脈投与することで、個体の全身状態と組織障害について治療効果に関する検討を開始し、経過観察中である。最初はラットを対象とした、放射線照射実験を行っていたが、27年度より放射線総合医学センターから共同研究者に加わっていただき、実験のスピードアップを図るためにマウスを対象とした実験に移行した。これは、実験数の確保と動物管理の面で有用であり、今回の動物モデルの作成に関してはその種別で評価系に差異が生じないことがわかったことから、マウスを対象とした実験を施行することとした。放射線の照射量に関しては、20Gyでは個体死を招き、5Gyでは組織障害の所見が得られないことから、10Gy相当が望ましいことがわかった。ただ、マウスにとって数Gyの照射量の差が、大きな障害になり得ることから、現在8Gy,10Gy,12Gy,14Gyと細かく線量を区切った、照射実験を施行中である。この結果より、適切な照射線量が確定できると考えている。治療に関する、再生医療では放射線照射による、個体死などの全身状態に影響する変化を認めたことから、脂肪幹細胞の局所投与だけでは、治療につながらない可能性も考慮して、まず骨髄間葉系幹細胞の全身投与を施行して、治療効果を検討するところから着手した。

動物実験の種類を変更したこと、局所の放射線障害が全身状態に与える状況も加味する必要が出てきたことで、放射線障害モデルの作成に時間がかかっているが、これまでの実験結果で新たな放射線障害の知見も得られていることから、本研究の重要性はさらに増していると考えている。当初計画より、多少の遅れを認めているが、放射線総合医学センターの協力によって研究のスピードも速くなっているので、来年度の実績を着実に積み重ねていく予定である。マウスの括約筋における組織障害は局所照射の10Gyから変性所見を認めることがわかり、14Gyを超えた照射になると、個体の死亡に繋がる重篤な障害が出てくることが明らかになった。また、再生医療の方法を用いて、治療による組織障害を軽減させるための治療モデルを作成する研究では、脂肪幹細胞と骨髄系幹細胞を用いたモデルを検討し、どちらのモデルにおいても、幹細胞投与による有害事象は無かったが、組織変性の改善は有意差をもって示すことはできなかった。今までの研究における知見から、個体死となる14Gy以上を照射したモデルにおいては、肛門局所の障害のみならず、小腸障害が高度に起こっていることがわかった。また、肛門局所の組織所見では、肛門周辺部位の細菌感染巣をすべての個体で認めていた。追加で施行した実験において、マウスに放射線照射後、抗菌剤を投与するモデルを検討したが、中央値で3日の生存期間の延長を認めることがわかった。このことより、肛門周囲の感染と小腸障害の間に因果関係があり、この感染をコントロールする事で、個体の全身状態が改善できることが想定される。つまり、局所的な障害およびその治癒が腸管の微生物叢に影響を与えており、これが宿主の全身状態へ影響を与えている可能性がある。放射線治療前後においても、腸内細菌叢の変化が宿主の全身状態・免疫状態と関わりをもって、組織障害の程度、回復の状態や、治療予後に至るまで、関与している可能性がある。放射線局所照射マウスにおいて、腸内細菌叢の変化を解析し、肛門局所の組織障害の所見と小腸の絨毛障害の所見、また個体の生存期間や体重変化を含めた全身状態を包括的に解析することで、微生物叢の変化が治療や全身状態に与える影響を明らかにする事ができる可能性がある。マウスの肛門組織を評価対象にして、放射線照射実験と組織変性軽減治療モデルの開発を研究してきた。14Gy以上を照射では肛門周辺部位の細菌感染巣をすべてに認めていた。実臨床における、組織障害の所見を、化学療法単独症例に関して再評価することが、基礎実験を確実に推し進める根拠となり得ると判断したことで、病理学的検討を進める時間が必要となった点で、当初計画よりやや遅れているが、大変重要な知見が得られたことから、本研究自体は有意義なものになっていると考えられる。また、再生医療導入に関する検討も、時代背景に応じて研究を進めていることで、研究成果としては有意義であると考えられる。
自然科学に現れる時・空間パタ-ンの動画化処理

昭和63年度予算で映像作成、編集等にかかわる映像システムを購入し、広島大学理学部数学教室のミニス-パ-コンピュ-タ-、ワ-クステ-ション等から構成されているLANにそれを接続することから数値シミュレ-ション映像化システムが完成した。我々の最初の研究は燃焼現象に現われる炎面の時・空間パタ-ンを反応拡散方程式モデルで解析し、その結果の映像化である。我々は二つの異った状況下のシミュレ-ションを行った。一つは固形燃料の燃料面の伝播であり、両端の温度差を変えるとき、炎面の速度に分岐現象が現われ、炎面が振動しながら進むことが示された。このような現象は実験においても観察されている。もう一つは管状容器の内部から噴財する可燃性液体を外部から燃焼させたときに現われる2次元炎面の時間的発展である。このとき噴財させる速度を変えるとき炎面に軸対称分岐現象が現われ、炎面の形に興味深いパタ-ンが見られた。両者はともに分岐理論の範囲に入る現象であるが、まだ完全な理論解析は与えられていない。平成元年は二相合金の相分離現象をテ-マにした。これまで提出されている数値モデルに対して1次元、2次元空間場において相分離現象がどのように展開されるかが興味の対象である。得られた結果は我々が予想する以上に複雑で美しいもので、理論解析の困難さを示唆している。以上すべての結果はヴィデオテ-プ(VHS)で記録しており、それによって数学以外の他分野の人達の研究交流に十分に役立っている。63年度予算で映像生成、編集等にかかわる基本的機材(ビデオイメージ、コンポーザ、光動画ディスク、ビデオデッキ、モニタ、ビデオカメラ)が購入できたため、それらを機能的に利用するための基本レベルのソフト、すなわち数値計算用サブルーチンパッケージ、グラフィックサブルーチンパッケージを完成させた。さらに当教室に設置されているミニスーパーコンピュータ、ワークステーション等から構成されているLANに上記の数値データ映像システムを接続し、データ転送が非常に早く行われることになり、シミュレーション映像化システムが能率よく、スムースに行われるようになった。我々はこのシステムを用いた最初の研究として燃焼現象に現われる炎面の時・空間パターンの映像化に挑戦した。このような現象の数理モデルはすでに提出されていたが、炎面がどのようなパターンをとるかの理論的解析はほとんどなされていなかった。我々は2つの異った状況下での炎面パターンの数値シミュレーションを行いその動画化に成功した。内容はPart I:Propagation ofa reactingfrontin solidfuel combustion,Part II:Stability of cellular flame in gaseous fuel combustionの2つのパートに分かれている。前者は一定速度で進行する炎面がある状況下で不安定化し、炎面が振動しながら進行する様子を示し、後者は管状容器の内部から噴射する気体可燃性物質が外部から燃焼するときの2次元炎面の様子を示している。両者の結果はともに理論的な解析からは得られないもので、ここで用いた数値シミュレーションの映像化によって始めてその様相が明らかになったのである。前年度においてほとんど完成した動画化処理システムを用いて本年は界面パタ-ンの計算解析を行った。我々は二相合金においてしばしば観察される相分離、粗化(coarsening)現象の数理モデルとしていくつかの反応拡散方程式を提出し、その一次元、二次元空間上で界面パタ-ンを計算機シミュレ-ションで解析し、映像化することに成功した。このことから、モデルの比較が容易に行うことができ、さらに二次元空間場で理論からでは予想することのできないような複雑でかつ美しいパタ-ンを観察することができた。これらの結果は界面パタ-ンの解析手法の難しさと同時に今後の解析手法の発展にひとつの方向性を与えるものと思われる。以上の結果は「Phase dynamics in RD systems far from equilibrium」というタイトルで映画化されており、国際研究集会「非線形偏微分方程式とその応用」(京都)、「層転移、フロント、界面の連続モデル」(ソルトレイクシティ)で紹介し、多くの参加者から評価された。

一方、前年度に行った燃焼現象に現われる炎面パタ-ンのシミュレ-ションも続行しており、新しい結果として、一定速度で進行する炎面がある物理的パラメ-タ-(両端での温度差)を変えることから速度が倍周期カスケ-ドのもとで分岐現象を示し、さらにカオス的状況を示すことが確認された。この結果の理論的考察はまだ行われておらず、今後の問題として残されている。
潰瘍性大腸炎合併癌における粘膜付随細菌叢の網羅的解析

近年、潰瘍性大腸炎患者の急増とともに、潰瘍性大腸炎長期経過例に合併する大腸癌が増加傾向にあり、その対策が急務である。潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムはまだ不明だが、腸内細菌と粘膜免疫の相互作用が密接に関与している可能性が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。本研究では、潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムを明らかにする目的で、粘膜付随細菌叢とインターロイキン6トランスシグナリングとの関連について検討する。1年目である昨年度は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の2種類の手法を用いて、潰瘍性大腸炎の癌化に関与する粘膜付随細菌叢の検討を行った。その結果、潰瘍性大腸炎患者の腸粘膜には、多数の粘膜付随細菌叢が存在することを明らかにした。2年目である本年度は、大腸癌やクローン病での粘膜付随細菌叢を検討し潰瘍性大腸炎との比較を行うとともに、インターロイキン6トランスシグナリングの関連因子(IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素等)との関連を検討した。本研究によって、腸粘膜内に棲息する細菌による免疫細胞でのインターロイキン6トランスシグナリングの活性化が潰瘍性大腸炎の癌化に関与していることが明らかになれば、潰瘍性大腸炎の癌化予防や治療へとつながっていくことが期待される。潰瘍性大腸炎からの発癌には、腸内細菌と粘膜免疫との相互作用の関与が示唆されている。本研究では、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討を行う。粘膜付随細菌叢の解析は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の2種類の手法を用いて検討中である。まず、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を用いて、ヒト潰瘍性大腸炎およびクローン病、大腸癌のホルマリン固定パラフィン包埋標本を使用した検討を行った。その結果Eub338プローブ(全細菌を認識)を用いて粘膜付随細菌叢を検出することが可能となった。現在、LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いて凍結組織標本、ホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析を実施中である。インターロイキン6トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCRなどの手技を用いて、腸組織、血中でのIL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素などの発現を検討中である。本研究の最終目標は、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討することである。粘膜付随細菌叢に関しては、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の2種類の手法を用いた解析が確立しつつあるため、今後、通常大腸癌組織や、通常大腸癌の非癌部組織および潰瘍性大腸炎以外の腸炎(クローン病など)組織と、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌組織の粘膜付随細菌叢の比較解析を行っていく予定である。さらに糞便中の腸内細菌叢との比較も行う予定である。インターロイキン6トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCR、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法などの手技を用いて、腸組織のみならず血中でのインターロイキン6トランスシグナリングの関連因子(IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素等)の発現を検討中である。最終的には、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析結果と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析の解析結果の関連を比較することにより、潰瘍性大腸炎の癌化のメカニズムを解明していきたい。

2年目である本年度は、大腸癌やクローン病での粘膜付随細菌叢を検討し潰瘍性大腸炎との比較を行うとともに、インターロイキン6トランスシグナリングの関連因子(IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素等)との関連を検討した。本研究によって、腸粘膜内に棲息する細菌による免疫細胞でのインターロイキン6トランスシグナリングの活性化が潰瘍性大腸炎の癌化に関与していることが明らかになれば、潰瘍性大腸炎の癌化予防や治療へとつながっていくことが期待される。潰瘍性大腸炎からの発癌には、腸内細菌と粘膜免疫との相互作用の関与が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。本研究では、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討を行う。粘膜付随細菌叢の解析は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の2種類の手法を用いて検討中である。まず、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を用いて、ヒト潰瘍性大腸炎およびクローン病、大腸癌のホルマリン固定パラフィン包埋標本を使用した検討を行った。その結果Eub338プローブ(全細菌を認識)を用いて粘膜付随細菌叢を検出することが可能となった。現在、LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いて凍結組織標本、ホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析を実施中である。インターロイキン6トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCRなどの手技を用いて、腸組織、血中でのIL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素などの発現を検討中である。本研究の最終目標は、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討することである。粘膜付随細菌叢に関しては、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の2種類の手法を用いた解析が確立しつつあるため、今後、通常大腸癌組織や、通常大腸癌の非癌部組織および潰瘍性大腸炎以外の腸炎(クローン病など)組織と、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌組織の粘膜付随細菌叢の比較解析を行っていく予定である。さらに糞便中の腸内細菌叢との比較も行う予定である。インターロイキン6トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCR、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法などの手技を用いて、腸組織のみならず血中でのインターロイキン6トランスシグナリングの関連因子(IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素等)の発現を検討中である。最終的には、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析結果と、インターロイキン6トランスシグナリングの解析の解析結果の関連を比較することにより、潰瘍性大腸炎の癌化のメカニズムを解明していきたい。(理由)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を用いた検討は順調に進み、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜では多くの腸内細菌を認めることが明らかとなった。
仲買と農家をめぐる出荷流通の民俗誌

本研究は市場外流通において活動した仲買人と、彼らと交渉する農家をめぐる関係性を検証し、農作業に関わる計画および農家同士の協同労働についてその実態の考察を行った。対象とした地域は大阪府泉南地方(岸和田市、泉佐野市)で、おもにこの周辺で活動しているたまねぎ栽培農家を中心にした聞き取り調査を行った。また明治期から高度経済成長期における農作物流通の実態を把握するため、大阪府立中之島図書館、岸和田市立図書館などを中心に農業関係の行政資料の渉猟および分析を行った。上記調査資料から考察できた点は以下にあげられる。(1)明治期において大阪府泉南地方は北海道とならび西洋野菜栽培の先進地として開発が進み、特にたまねぎにおいてはオーストラリアへの輸出も視野に入れた大産地として発展していった。(2)その過程において、栽培農家と流通を束ねる仲買人による交渉関係は成熟し、仲買人は売れ筋に伴った農家への指導および先物買いを行うといったつきあいが成立していった。仲買人は青田師、ねぎ師と呼ばれ、大阪農業において農産物流通の中心的役割を果たしたといえる。(3)しかしながら戦後から高度経済成長下において、農協を単位とした市場流通が中心になったことや、泉南タマネギの生産力低下により、青田師の市場での役割は急激に低下していった。(4)現在では泉南タマネギ農家は専業による大型経営および極小規模の栽培に二極化している。しかしながら歴史的過程において蓄積されたつるしねぎなどの保存知識と技術は栽培農家において継承されていることが確認されている。上記観点に基づいて現在成果報告をまとめている途上である。本研究は市場外流通により成長してきた仲買人、通称青田師と蔬菜栽培農家との関わりについて、流通における双方の関係性がいかなるものであったかを検討するものである。本年度はたまねぎ栽培に関わる農家と青田師に関わる先行研究を中心に資料を渉猟し、かつ大阪府泉南地域を中心に聞き取り調査を行った。泉南地域におけるたまねぎ栽培の経緯であるが、明治17年(1885年)、坂口平三郎によって壬生村(現岸和田市)で栽培されたのが始まりで、その後田尻村(現田尻町)に伝わり秋まきたまねぎとよばれる従来の出荷時期をずらした栽培法を開発し、泉南地域全体の農産物へと成長した。その後「コレラに効く」といううわさ話が追い風となって、販売売り上げが急増し、大正15年(1926年)にはオーストラリアに輸出する作物にまで成長した。泉州たまねぎは特産品として成長したが、その要因は先にも述べたように流通をコントロールする青田師の存在が大きかった。青田師の役割は整理すると以下のように示される。2.品種の改良を行う手がかりとなる市場情報を取引農家に示すことにより、この当時としてはより先進的な情報を獲得することができた。現在のような情報社会ではネットを通じて情報を容易に獲得できるが、この当時は流通者の持つ情報が農家の生産サイクルを左右させうる大きな存在であったと指摘できる。上記に関わる史的事実について示された資料は原書、複本問わず収集することができた。来年度さらに聞き取り調査を進め詳細な検討を行うものである。
在宅医療介護サービス専門職間の連携がケア目標の達成度に与える影響とそのプロセス

複数の慢性疾患を有する在宅療養者には,そのケアニーズの複雑性から複数の専門職による総合的なケアが必要である.そのため,多職種連携の充実を主軸とした在宅医療介護サービスの質の確保方策が検討され,日本では在宅医療と介護の連携推進事業が多数展開されている.一方,多職種連携を充実させることは,望ましいアウトカムを得るための方策として必ずしも有用でないことが複数の研究で報告されており,多職種連携がどのような場合に利用者のアウトカムの向上により効果的であるのかを詳細に検討した報告や研究はない.そこで,本研究は,多職種連携において中心的な役割を果たす訪問看護師からみた連携に着目し,訪問看護師と訪問看護師以外の専門職との連携しやすさが利用者へのケアにおける目標達成度を高めるのは,目標達成に向けて行うケアがどのような特徴を有する場合であるのかを明らかにすることを目的とした.質問紙調査とインタビュー調査の結果を得た.1)受け持ち訪問看護師が利用者に立案する目標には,【生活支援】を行う目標と【処置観察】を行う目標があった.2)【生活支援】の目標では,受け持ち訪問看護師が連携しやすいと感じているほど,利用者の目標が達成されている傾向がある一方で,【処置観察】の目標では,連携のしやすさと目標達成度に関連がなかった.3)その理由として,【処置観察】の目標には,連携しにくい場合でも訪問看護師のみで対応でき達成される目標があることや,連携しやすい場合でも利用者に避けられない状態の悪化があり達成されなかった目標があることが影響していると考えられた.本研究は,訪問看護師が訪問看護師以外の専門職と連携しやすいことが具体的にどのような場合に目標達成度を高めるのかを明らかにすると共に,訪問看護師によるケア介入方策を具体的に提示するものであり,これらの知見は今後の訪問看護の発展に資するものであると期待された.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
近世城下町の設計原理に関する研究

本研究は近世城下町の設計原理の解明を目的として次の3課題を明らかにすることを目標とした。(1)城郭の位置決定法(2)城郭・城下町の主要施設の配置法(3)町割・街路の線引きの方法である。以上の研究課題に対して次の4仮説をたててこれを実証する方法とした。(1)城郭の中心天守の位置決めは城主崇敬の古社古刹と視軸を用いて決定されたのでは、(2)天守の位置決めは城主崇敬の古社古刹とα三角形60間モデュールを用いて決定されたのでは、(3)城郭・城下町の主要施設(軍事施設と社寺)の配置は視軸とα三角形60間モデュールを関連づけて配置されたのでは、(4)町割を決定づけた街路の線引きは天守など主要施設を基点としたヴィスタ並びに視軸とα三角形60間モデュールを関連づけて計画されたのでは。以上、独創的な仮説をたててこれを実証した。その研究結果の概要を次に列挙する。(1)視軸によって天守位置が決定されたのは長浜や中津等織豊系の城下町に際立っており、α三角形60間モデュールによって天守位置が決ったのは篠山や伊賀上野など藤堂高虎の設計に際立ち、慶長14(1609)年以後この方法が主流になった。(2)天守を基点に視軸によって軍需施設(門櫓)が配置され、一方、城主崇敬の社寺は天守を基点にα三角形60間モデュールによって配置する方法が特徴的にみられた。(3)町割は天守からのヴィスタで本町などの基軸が設定された場合(長浜等天正慶長初期)と、主要施設からのヴィスタによって町割の基軸が設定された場合(伊賀上野・明石等慶長14年以後)、α三角形60間モデュールの適用(中津、府内)に類型化される。(4)築城期における設計技法の考察からダイナミックな変化が明らかになり、また原町割からの変容過程の考察からその変容の法則性を解明しえた。一応の研究成果は得られたが、200余の城下町で史料収集と調査はできたもののここに収めることが出来たのは管見に触れた27城下町に止まっており、以後の課題として残された。本研究はその近世城郭・城下町の設計原理の解明に主目的を置き、次の4課題を設定してその縄張の理念を明らかにする。(1)城郭の位置決定法(2)城郭・城下町の主要施設の配置法(3)町割・街路の線引き方法(4)街区割の基本形。以上の研究課題に対して、これまでの本研究の成果を踏まえて、それぞれの課題に対応して、次の4仮説をたてて実証する。(1)城郭の中心天守は藩主崇敬の古社古刹と視軸ならびにα三角形の60間モデュールと関係したのでは。(2)門・櫓・番所ならびに古社古刹の配置は視軸とα三角形の60間モデュールを重ねてレイアウトしたのでは。3)町割を決定づけた濠と街路の線引きは主要施設や周辺の山頂、古社古刹を基点とするヴィスタでは。(4)曲尺の表目と裏目でつくるα三角形が設計施工の全般を通して関連していたのでは。以上の独創的仮説を置き、実証している。

本年度は本研究助成の初年度でもあり、基礎資料収集を主とし、以下の基礎調査を実行した。(1)城郭・城下町建設に関する史資料の収集と基礎調査(市史・県史・絵図)、(2)復原図作成資料(1/2500、1/10000、1/50000地形図、復原図、遺構調査図)(3)古社・古刹の史資料(神社誌、仏閣誌)ならびに古社・古刹の向きの調査である。本年度は5月に甲信越地方(長野・山梨・新潟)、8月に近畿地方(兵庫・京都・和歌山)、9月に中部地方(愛知・岐阜・三重)の基礎調査を実施した。また、分析段階、例えば復原図作成、仮説の実証作業の段階で不明な点の補足調査が必要となる。また、仮説の論拠となる文献や事実の確認作業が生じる。このような補足調査として、本年度は大分県の日出城下町や宮崎県の高鍋、山口県の津和野等に出かけた。研究成果の発表については次頁に示した通りである。本年度は助成金交付初年度であり、以上に記載したように史資料収集を主とする基礎調査に重点を置いた。分析や論文の発表は次年度以降に重点を置いている。本研究は近世城下町の設計原理の解明を目的とする。その設計理念を明らかにするために、次の4課題に焦点を絞り込んで考察する。(1)城郭の位置決定法(2)城郭・城下町の主要施設の配置法(3)町割・街路の線引きの方法(4)街区割の基本形。以上の研究課題に対して、これまでの本研究の成果を踏まえ、次の4仮説をたててこれを実証する。(1)城郭の中心天守の位置決めは、藩主崇敬の古社古刹と視軸ならびにα三角形60間モデュールを用いて決定したのでは。(2)天守以外の門・櫓・番所ならびに古社古刹の配置は視軸とα三角形の60間モデュールを用いてレイアウトしたのでは。(3)町割を決定づけた濠と街路の線引きは主要施設や周辺の山頂、古社古刹を基点とするヴィスタでは。(4)曲尺の表目と裏目でつくるα三角形が設計施工の全般を通して関連していたのでは。以上の独創的な仮説を置き、これの実証を試みる。本年度は本研究助成の2年目であり、昨年に引き続き基礎資料収集を主とし、以下の基礎調査を実施した。(1)城郭・城下町建設に関する史資料の収集と基礎調査(市史、県史、絵図)、(2)復原図作成資料(1/2500、1/10000、1/50000地形図、復原図、遺構調査図)(3)古社・古刹の史資料(神社誌、仏閣誌)ならびに古社・古刹の向きの調査である。本年度は5月に北関東地方(栃木・茨城)、8月に東海地方(静岡・神奈川)、9月に東北・北海道地方(青森・秋田・岩手・北海道)の基礎調査を実施した。このような補足調査として、本年度は8月に福山城下町、龍野城下町、篠山城下町に、また、比叡山や高野山、久能山や日光の調査に出かけた。本年度は助成金交付2年目であり、以上に記載したように史資料収集・基礎調査に重点を置いた。その設計原理を解明するために、次の4課題に焦点を絞り込み考察する。以上の研究課題に対して、従前の研究成果を踏まえ、次の4仮説をたてこれを実証する。
マウス個体発生におけるTead/Yap依存的細胞競合に関する研究

多細胞生物の発生では、ゆらぎにより個々の細胞の分化状態などに一時的にばらつきが生じる。正確な発生を遂行するためには不適合な細胞を排除することが必要であり、その様な排除を行う仕組みの一つに細胞競合がある。しかし細胞競合研究の多くはハエの組織や培養細胞に人為的に導入した前がん状態の異常細胞の排除の研究であり、哺乳類の正常発生で生じる細胞状態のばらつきに関する研究は少ない。特に隣接細胞の状態を認識するメカニズムについては全くわかっていない。本研究では申請者が見出した、着床前マウス胚の多能性細胞(エピブラスト)の形成時に起こる細胞競合による品質管理機構に着目し、不適合な細胞を認識するしくみを解明する。
正常および赤血球膜異常症における遺伝子発現の制御機序と病態発症機構の研究

(I)膜蛋白関連遺伝子の発現に関するgenemethylationの研究:(II)我が国における赤血球膜異常症,特に遺伝性球状赤血球症(HS)の病態発生機構の研究:(I)膜蛋白関連遺伝子の発現に関するgene methylationの研究:(II)我が国における赤血球膜異常症,特に遺伝性球状赤血球症(HS)の病態発生機構の研究:(I)膜蛋白関連遺伝子の発現に関するgene methylationの研究:(II)我が国における赤血球膜異常症,特に遺伝性球状赤血球症(HS)の病態発生機構の研究:
神経伝導路の機能的同定・可視化を目指す新規手法の開発

哺乳類をはじめとする不透明で大型の個体において、個体活動に関連する神経伝導路の同定する普遍的な手法を確立することを目的として、遺伝子にコードされたプローブの開発を進めている。このプローブは神経活動の脱分極の有無を直接的に測定する設計になっており、複数のコンポーネントにより構成される。前年度の実験結果を引き継ぐ形で、その内の一つであるプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を進めている。プロテアーゼの発現の有無を制御する為、形質導入する菌株のとしてBL21(DE3)を使用し、本年度、新規に導入した大腸菌の電気穿孔装置を使用して条件検討を続行している。また、もう一つのコンポーネントの膜電位感受性プロテアーゼの開発に関し、刺激時の分子の構造変化が小さいことから、この変化を拡大することを目的として、constrained labelingと呼ばれる別途の標識技術を援用して分子デザインを行ってきた。この工夫を追加しても切れ味よく活性を制御することは困難と考えられたため、更にこのデザインに加えて新たにTEVプロテアーゼの阻害配列を利用してプロテアーゼの活性制御を行うアイデアを追加し、プロテアーゼ、阻害配列のスクリーニングを進めることとした。具体的にはTEVプロテアーゼとその近縁のプロテアーゼの双方について検討を進め、必要に応じてアミノ酸変異を入れて改変することにより、至適のプロテアーゼ改変体を作成するためのスクリーニングを行っている。神経伝導路の同定を目的とする遺伝子にコードされたプローブのコンポーネントの内、プロテアーゼコンポーネントの作成について特に進捗が遅れている。使用する分子の刺激時の構造変化がプロテアーゼの酵素活性を制御する為には小さく、別途独自の工夫を加える必要があることから、前年度より施行しているconstrained labelingと呼ばれる標識技術を援用した分子デザインに加えて、更にTEVプロテアーゼの阻害配列を利用したスクリーニングが必要となっているため。引き続きプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を続行すると共に、プロテアーゼコンポーネントの開発について、constrained labelingに加えてTEVプロテアーゼの阻害配列を利用した分子デザインによるスクリーニングを遂行したい。TEVプロテアーゼとその近縁のプロテアーゼの双方で、同様の検討を予定している。プロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の軸索移行を促進させるための、抗体様小分子の実験系についても、引き続きファージディスプレイによるスクリーニングにつき検討を進めたい。哺乳類をはじめとする不透明で大型の個体において、個体活動に関連する神経伝導路の同定する普遍的な手法を確立することを目的として、遺伝子にコードされたプローブの開発に着手した。このプローブは神経活動を脱分極の有無を直接的に測定する設計になっており、複数のコンポーネントにより構成されるが、その内の一つであるプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を行った。当初は緑色蛍光タンパク質を使用していたが、大腸菌のコロニー単位でスクリーニングを予定している為、コロニーの色の識別しやすい赤色蛍光タンパク質に変更して作成している。具体的にはプロテアーゼ認識部位前後のリンカーについて、その長さや配列が異なるプライマーを設計し、SLiCE法によりスクリーニング用のライブラリ構築を終了している。大腸菌株XL10-Goldに形質転換したところ、1000以上のコロニーが得られたが、プロテアーゼの発現の有無を別途制御する為、XL10-Gold以外の菌株への形質導入を予定している。菌株の候補としBL21(DE3)を予定しているが、通常のケミカルコンピテント細胞法では導入効率が極めて低い為、電気穿孔法用のコンピテント細胞作成を行っている。またこの電気穿孔法による実験の為、大腸菌の電気穿孔法実験用機器を導入した。また、プロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の軸索移行を促進させる工夫の一つとして、抗体様小分子の実験系の立ち上げを行い、ファージディスプレイ用のライブラリの構築を終了し、スクリーニングの条件について検討を開始した。神経伝導路の同定を目的とする遺伝子にコードされたプローブのコンポーネントの内、プロテアーゼコンポーネントの作成についてやや進捗が遅れている。(使用する分子の刺激時の構造変化がプロテアーゼの酵素活性を制御する為には小さく、別途独自の工夫を加える必要があることが判明してきている。)哺乳類をはじめとする不透明で大型の個体において、個体活動に関連する神経伝導路の同定する普遍的な手法を確立することを目的として、遺伝子にコードされたプローブの開発を進めている。

神経伝導路の同定を目的とする遺伝子にコードされたプローブのコンポーネントの内、プロテアーゼコンポーネントの作成について特に進捗が遅れている。使用する分子の刺激時の構造変化がプロテアーゼの酵素活性を制御する為には小さく、別途独自の工夫を加える必要があることから、前年度より施行しているconstrained labelingと呼ばれる標識技術を援用した分子デザインに加えて、更にTEVプロテアーゼの阻害配列を利用したスクリーニングが必要となっているため。引き続きプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を続行すると共に、プロテアーゼコンポーネントの開発を加速させたい。後者については従来の設計方針を改変し、constrained labelingと呼ばれる別途標識技術を援用して分子デザインを行っている。引き続きプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を続行すると共に、プロテアーゼコンポーネントの開発について、constrained labelingに加えてTEVプロテアーゼの阻害配列を利用した分子デザインによるスクリーニングを遂行したい。TEVプロテアーゼとその近縁のプロテアーゼの双方で、同様の検討を予定している。プロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の軸索移行を促進させるための、抗体様小分子の実験系についても、引き続きファージディスプレイによるスクリーニングにつき検討を進めたい。研究計画当初予定していたサーマルサイクラーの導入は中止し、電気穿孔法装置導入へ変更したが、これは別の研究計画と共用とすることとし、本研究計画からは支出しなかった。また、抗体様小分子のスクリーニングの為のライブラリ作成等は共同研究先の費用負担によった為、基金運用として次年度以降の各種スクリーニングの為の費用として繰り越した。膜電位感受性プロテアーゼの作成に難渋しており、本格的なスクリーニング開始が遅れているため。
KATPチャネル欠損マウスにおけるアルツハイマー病中核・周辺症状の病態機能解析

本研究では、KATPチャネル欠損マウスの表現型(Kir6.2チャネル欠損マウス:認知機能障害ならびに攻撃性症状、Kir6.1チャネル欠損マウス:うつ・不安症状ならびに攻撃性症状)に関する脳部位の同定、ならびに細胞内機序について明らかにし、ADの中核・周辺症状におけるKATPチャネルの病態生理学的役割について検討した。「研究課題1」: Kir6.2欠損マウスにおける認知機能障害の細胞内機序の解析、申請者は、記憶学習関連の行動解析によりKir6.2欠損マウスにおいて認知機能障害を見出しており、本研究では認知機能障害の標的部位である海馬における細胞内機序について明らかにした。特に、細胞内カルシウムシグナルに注目し、Kir6.2欠損マウスにおける細胞内カルシウムシグナル異常について同定した。「研究課題2」:Kir6.1欠損マウスにおけるうつ・不安症状の細胞内機序の解析、申請者は、うつ・不安症状関連の行動解析によりKir6.1欠損マウスにおいてうつ・不安症状を見出しており、本研究では海馬歯状回(うつ症状の標的部位)ならびに海馬および外側扁桃体(不安症状の標的部位)における細胞内機序について明らかにした。特に、Kir6.1欠損マウスにおける不安症状の細胞内機序を同定し、現在、論文投稿中である。「研究課題3」: Kir6.1/Kir6.2欠損マウスにおける攻撃性症状の細胞内機序の解析、申請者は、攻撃性行動関連の行動解析によりKir6.1/Kir6.2欠損マウスにおいて攻撃性行動異常を見出しており、本研究では大脳皮質(内側前頭前皮質)における細胞内機序について明らかにした。その結果、大脳皮質におけるセロトニン神経系に関与を示唆しており、今後、論文として報告する予定である。本研究により、Kir6.1/Kir6.2欠損マウスにおける不安症状に関しては、既にデータがまとまり、論文投稿中である。また、Kir6.1/Kir6.2欠損マウスにおける攻撃性症状についても、論文投稿に必要なデータの最終段階まで来ていることから、当初計画以上に進展していると考える。Kir6.1/Kir6.2欠損マウスにおける表現型解析は、引き続き、認知・精神機能に注目して取り組む予定でおり、Kir6.1/Kir6.2チャネルが中枢機能において必須の分子であることを同定し、中枢疾患治療への応用を目指したいと考える。今後の計画として、攻撃性行動関連の行動解析によりKir6.1/Kir6.2欠損マウスにおいて攻撃性行動異常を見出しており、本研究では大脳皮質(内側前頭前皮質)における細胞内機序について明らかにする。1.マイクロダイアリシス法を用いて、Kir6.1/Kir6.2欠損マウスの攻撃性行動誘発時における大脳皮質におけるカテコルアミン量について測定する。2.カテコルアミントランスポーター阻害薬の適応によりKir6.1/Kir6.2欠損マウスの攻撃性行動と大脳皮質におけるカテコルアミントランスポーターとの関連性について免疫ブロット法ならびに免疫組織化学的手法により検討する。3.電気生理学的手法により、大脳皮質スライス切片を用いてKir6.1/Kir6.2欠損マウスにおけるシナプス伝達効率ならびにシナプスの可塑的変化について検討する。さらに、海馬歯状回(うつ症状の標的部位)における細胞内機序について明らかにする。1.海馬歯状回におけるBrud/NeuN陽性細胞数について検討し、うつ症状と神経新生の関連性について検討する。2.神経新生と関連する分子であるAkt、ERK、CREB等のリン酸化レベルならびにBDNFの発現量について免疫ブロット法により検討する。また、BDNFのmRNA量についてもReal-time PCR法により検討する。3.電気生理学的手法により、海馬歯状回スライス切片を用いてKir6.1欠損マウスにおけるシナプス伝達効率ならびにシナプスの可塑的変化について検討する。