hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓発生過程でおこる心外膜前駆細胞分化でのレチノイン酸の役割

心外膜前駆組織(proepicardium organ)は、胚心臓の静脈洞に形成され、発生の進行にともない胚心臓をおおい、成人心臓の心外膜や冠状血管になる。近年、心外膜前駆組織は冠状血管の平滑筋細胞・内皮細胞、心臓線維芽細胞、血球に分化するだけでなく、心筋細胞へ分化する可能性も示唆されている。しかしながら、「心外膜前駆組織の発生のしくみ」はほとんど分かっていない。心外膜前駆組織発生の仕組みを明らかにすることは「心臓の形づくり」の解明につながるばかりではなく、将来的な心外膜前駆組織を利用した疾病治療の開発に寄与すると考えている。研究代表者は、中胚葉から心外膜前駆組織への分化がこれまで報告されていたよりも早い発生段階で決定されること、そしてその分化にレチノイン酸が関係している可能性を見出した。本年度は神経胚期以前の中胚葉の分離法と培養法を検討しつつ、分化の仕組みの解明を試みた。中胚葉の分離はプロテアーゼの作用時間と濃度の条件を検討することで可能になった。分離した中胚葉の培養法に関しては、血清やITS(インスリン、トランスフェリン、セレン)の添加について条件検討を行った。その結果、神経胚期の中胚葉の培養は可能になったが、心外膜前駆組織が形成されない領域においても心外膜前駆組織のマーカー分子が誘導される問題が生じた。この結果は培養法のさらなる改善が必要なことを示している。一方、心外膜前駆組織は臓側中胚葉から形成される。しかしながら培養系で壁側中胚葉を培養したところ心外膜前駆組織のマーカー分子が誘導された。この結果は、壁側中胚葉も心外膜前駆組織への分化能を有していることを示している。このことは、中胚葉の心外膜前駆組織への分化決定は壁側中胚葉と臓側中胚葉の分離より早い段階で起こっている可能性を推測させた。心外膜前駆細胞は、胚心臓の静脈洞に形成され、発生の進行にともない胚心臓をおおい、成人心臓の心外膜や冠状血管になる。本研究では、心外膜前駆細胞の分化過程でのレチノイン酸の作用について調べた。心外膜原基形成過程において、マーカー分子のWT1とTBX18タンパク質は心外膜原基の隆起が形成される以前に局在が観察された。培養系を用いて調べたところ、ニワトリ胚ステージ14、15の臓側中胚葉の外植体は心外膜前駆細胞に分化したが、ステージ11-13の臓側中胚葉を培養したときには分化の低下が見られた。この培養系にレチノイン酸を加えたところ外植体のWT1とTBX18の発現は増加した。今後の研究計画の大きな変更は考えていない。しかしながらニワトリ原腸胚中胚葉の細胞系譜を容易に行えるようtol2 systemを用いた蛍光遺伝子導入による細胞系譜解析法の検討も行いたい。この方法を用いることにより生きたままの細胞系譜の解析が可能になると考えている。また、これまで行っていた時期よりもより早期の予定心外膜形成領域を含む中胚葉の培養系を早急に確立したい。早期の予定心外膜形成領域を含む中胚葉の培養の条件を検討するとともに、同時に心外膜前駆細胞形成領域でのレチノイン酸合成、分解、受容体に関する因子の局在などを培養系の実験と同時進行で明らかにする予定である。発生学細胞系譜を解析する実験方法の検討により、予定していた実験に使用する試薬・物品の購入ができなかったため。生物検定の培養条件検討により、予定していた実験に使用する試薬・物品の購入ができなかったため。27年度に予定していた実験を引き続き行うことから、これらの実験に使用する試薬・物品の購入をおこなう。ただし、新たに「tol2 systemを用いた蛍光遺伝子導入による細胞系譜解析の実験」を計画していることから、この実験に使用する試薬の購入も予定している。
シュワン細胞を介した末梢神経障害機構の解明

らい菌は、マクロファージおよび末梢神経シュワン細胞に対し親和性を示す細胞内寄生菌であり、末梢神経障害など特有な臨床症状をもたらす。そこで、ハンセン病における神経障害機構を解明するため、カニクイザルの新生児及び生体サルの後根神経節および座骨神経からシュワン細胞の分離培養を試み、細胞株の樹立に成功した。得られたシュワン細胞はS-100およびラミニン抗原陽性でありシュワン細胞であることが確認された。本シュワン細胞を使用し、以下の成果を得た。1.らい菌またはその菌体成分を用いて、サルのシュワン細胞を刺激すると、炎症性サイトカインIL-8が細胞上清中に産生された。菌体分画の中でも、膜蛋白がより多くサイトカインを産生し、濃度依存的にIL-8を産生した。2.CD40L存在下ではシュワン細胞から産生されるIL-8が増加した。さらに数種類のサイトカイン化でIL-8産生能に対する影響を調べたところ、IL-1αのみが、シュワン細胞のIL-8誘導能を有していた。これらのことから、IL-8及びIL-1αはらい菌感染後に神経障害に関与していると考えられた。3.増殖因子heregulin存在化で2-3週間培養後、シュワン細胞の株化を図ったが、シュワン細胞はpassageを25-30回以上するとサイトカイン産生誘導能が欠落した。従って、シュワン細胞は、in vitroでは初期の段階でのみらい菌感染をうけるとらい菌由来抗原を発現し、サイトカインを産生することが明らかとなった。以上のことから、ハンセン病における末梢神経障害の発生機構を解析する上で新たな知見を提供しうると想定された。ハンセン病における神経障害機構を解明するためのin vitroモデルを確立することを目的として以下の実験を展開した。1.末梢神経障害を発症することが知られているサルに着目し、カニクイザルの新生児および成体サルの後根神経節および坐骨神経をコラゲナーゼとトリプシンで処理した。細胞を分散させ初代培養を行いシュワシ細胞を得た。その後DNA合成阻害剤であるAra-C (cytosine-b-D-arabinofuranoside)を作用させて、シュワン細胞の増殖を妨げる繊維芽細胞を除去した。さらに、増殖因子heregulin存在化で2-3週間培養し、シュワン細胞の株化を図った。得られた細胞はS-100およびラミニン抗原陽性でありシュワン細胞であることが確認された。2.シュワン細胞の表面抗原を、FACS Caliburを用いて検索すると、MHCクラスI抗原は発現していたが、クラスII抗原は陰性であった。つぎに、らい菌に対するシュワン細胞の感受性を検索した。FITCラベルしたらい菌をシュワン細胞と混合培養すると、ジュワン細胞により容易に取り込まれた。シュワン細胞は、らい菌に対し高い親和性を有すると考えられた。3.らい菌の細胞膜蛋白に対するポリクローナル抗体で、らい菌感染シュワン細胞表面を検索すると陽性であった。従って、シュワン細胞は、らい菌感染をうけるとらい菌由来抗原をその表面に発現する可能性が示唆された。サル由来のシュワン細胞はらい菌感受性を有し、らい菌抗原をその表面に発現し、ハンセン病における末梢神経障害の発生機構を解析する上で有用な知見を提供しうると想定された。ハンセン病における神経障害機構を解明すること目的とし、カニクイザルの新生児および成体サルの後根神経節および坐骨神経由来シュワン細胞を株化した。らい菌感染またはその特異的抗原が及ぼす影響を検討するため以下の実験を展開した。1.樹状細胞は、らい菌抗原をプロセッシングしたのち細胞表面に抗原を提示し、T細胞を刺激することを報告した。そこで、らい菌をサル由来末梢神経シュワン細胞に感染させ、抗原提示能を調べた。らい菌感染後、抗原提示に関わる分子(MHC Class I,II,CD80,CD86)の発現をフローサイトメトリーで検出した結果、シュワン細胞の表面にClass I、CD86の発現が増強していた。このシュワン細胞を用いてT細胞と混合培養するとIFNγの産生量が若干上がることから、シュワン細胞はT細胞を活性化することが示唆された。2.らい菌のリボ蛋白の末梢神経シュワン細胞に対するアポトーシス活性について検討した。リボ蛋白刺激後、シュワン細胞の核染色による形態変化、FITC-Annexinを用いた細胞膜の反転について検討したが、顕著な変化は見られなかったことから、リボ蛋白は、シュワン細胞のアポトーシス誘導に関与していないことが示唆された。3.FITC標識らい菌をシュワン細胞に感染させたのち、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。Molecular Probe社のリソゾームマカーLysotracker Redを用いてらい菌のtraffickingをサルのシュワン細胞で観察した結果、らい菌はリソゾームと同時に存在する所と単独に存在する所もあった。サル由来のシュワン細胞はらい菌に易感染性であり、T細胞を活性化した。このことはハンセン病における末梢神経障害の発生機構を解析する上で有用な知見を提供しうる考えられる。

本シュワン細胞を使用し、以下の成果を得た。1.らい菌またはその菌体成分を用いて、サルのシュワン細胞を刺激すると、炎症性サイトカインIL-8が細胞上清中に産生された。菌体分画の中でも、膜蛋白がより多くサイトカインを産生し、濃度依存的にIL-8を産生した。2.CD40L存在下ではシュワン細胞から産生されるIL-8が増加した。さらに数種類のサイトカイン化でIL-8産生能に対する影響を調べたところ、IL-1αのみが、シュワン細胞のIL-8誘導能を有していた。これらのことから、IL-8及びIL-1αはらい菌感染後に神経障害に関与していると考えられた。3.増殖因子heregulin存在化で2-3週間培養後、シュワン細胞の株化を図ったが、シュワン細胞はpassageを25-30回以上するとサイトカイン産生誘導能が欠落した。従って、シュワン細胞は、in vitroでは初期の段階でのみらい菌感染をうけるとらい菌由来抗原を発現し、サイトカインを産生することが明らかとなった。以上のことから、ハンセン病における末梢神経障害の発生機構を解析する上で新たな知見を提供しうると想定された。
第一原理計算とモデル計算を併用した高効率光誘起相転移物質の理論的探索

北陸先端大山田助教(現東京農工大特任助教授)と共同で、シアノ架橋金属錯体ナノ粒子の磁性等の、表面配位子効果について研究を行った。これらの材料は光誘起磁性を示す物であるが、表面を修飾する長鎖アルキル鎖を持つ配位子の種類によって、磁化の大きさが異なることを山田助教が発見した。我々は、この理由が、配位子が結合する遷移金属が6配位高スピン構造から4配位低スピン構造に変化することを密度汎関数法の計算により明らかにした。具体的には、ニッケルにピリジン、エチルアミン、水が配位した場合の安定構造及びスピン状態をそれぞれ計算し、エネルギー比較から構造の安定性を議論した。磁化の変化は、配位子が結合する金属原子の比率が配位子の種類によって変化し、その結果、低スピンになる金属原子の比率が配位子に依存するためであると考えられる。この結果は、現在論文を執筆中である。また、錯体ナノ粒子を合成する際には、前述の通り、長鎖アルキル鎖を持つ配位子を使用するが、表面に長鎖アルキル鎖を持つ配位子が多数配位した場合に、その構造は明らかではない。我々は特に、金表面中にテルル末端配位子が吸着した際の構造について、半経験的分子軌道法により計算した。結果として、テルル末端配位子を利用した場合、配位子が高分子化し、硫黄末端配位子の場合と構造が大きく異なることを示した。この結果は、産総研中村徹主任研究員が実施した実験結果と一致する。光誘起相転移の定量的解析を目的として、理論中心の研究に加え、実験との協力も密接に行った。理論中心の研究では、光誘起相転移物質に不純物を入れた場合、相転移がより弱い光照射下でも、素早く実現することを、イジング模型のモンテカルロシミュレーションにより明らかにした。この結果は、分子磁性国際会議(ICMM04)で発表し、Polyhedronに論文掲載予定である。実験家との共同研究では、名古屋大学守友浩助教授との、光照射下の動的相転移の研究と、山形大学栗原正人助教授及び北陸先端大山田真実助手との、シアノ錯体ナノ微粒子に関する研究を行った。前者においては、スピンクロスオーバー型錯体に光照射した際に、光強度によって劇的に状態が変化する動的相転移について、理論的解析を行った。また、この実験解析を基にして、理論的に、どのような状況の場合に動的相転移が起こるかを明らかにした。この結果は、Journal of the Physical Society of Japan及び、Journal of Luminescenceに論文が掲載された。後者については、光誘起磁性を示す鉄コバルトシアノ架橋錯体のナノ微粒子を合成し、磁化測定(温度変化)等を行っている。光誘起相転移は、温度誘起相転移を示す物質で多数見つかっているため、まず温度変化に関して研究を進めている。これに関連して、ナノ微粒子における相転移挙動がバルクのそれとどのような違いがあるかを、イジング模型のモンテカルロシミュレーションによりしらべた。結果として、光誘起相転移の挙動は粒径及び形状に大きく依存し、球状微粒子と、立方体状微粒子では、温度相転移挙動の粒径依存性が異なることを明らかにした。この結果は日本物理学会で発表し、現在Chem.Comm.に論文投稿中である。本研究課題については、実験家との緊密な連携が必要であり、北陸先端大山田真実助手、山形大学栗原助教授と緊密な連携を確立できたシアノ錯体ナノ粒子の光誘起相転移に議論を特化した。本物質は、各種外的刺激による応答がナノ粒子の周りを覆う配位子に依存することが実験的に明らかとなった。我々は効率的に光誘起相転移を示すナノ粒子を探索するために第一原理計算とモデル計算を併用し、そのメカニズムを明らかにした。モデル計算ではイジング模型のモンテカルロシミュレーションを用いて非か利照射下での相転移特性を明確にした。結果として、ナノ粒子全体の光応答特性が粒子の表面の状態に大きく依存することを明らかにした。特に光誘起相転移を実現する光強度閾値が表面の状態に大きく依存することを明確にした。一方、第一原理計算では量子科学計算の手法を用いて、配位子の置換による、高スピン状態と低スピン状態の相対的安定性がどのように変化するかを計算した。実際に表面を保護する分子を置換することにより表面のスピン安定性が変化することを明確にした。この結果は実験で得られているものと一致しており、計算によって、スピン転移の挙動を予測できることが明らかになった。この結果はChemical Communications誌と、Journal of Physics : conference seriesに論文が掲載されたほか、文部科学省特定領域研究分子スピン主催の研究会で招待講演を行った。

磁化の変化は、配位子が結合する金属原子の比率が配位子の種類によって変化し、その結果、低スピンになる金属原子の比率が配位子に依存するためであると考えられる。この結果は、現在論文を執筆中である。また、錯体ナノ粒子を合成する際には、前述の通り、長鎖アルキル鎖を持つ配位子を使用するが、表面に長鎖アルキル鎖を持つ配位子が多数配位した場合に、その構造は明らかではない。我々は特に、金表面中にテルル末端配位子が吸着した際の構造について、半経験的分子軌道法により計算した。結果として、テルル末端配位子を利用した場合、配位子が高分子化し、硫黄末端配位子の場合と構造が大きく異なることを示した。この結果は、産総研中村徹主任研究員が実施した実験結果と一致する。
副交感神経による膵β細胞機能維持の解析

副交感神経の主要な伝達物質であるアセチルコリンが、膵β細胞機能維持にかかわる分子機構を明らかにすることを目的とした。培養膵β細胞とマウスを用い検討したところ、培養膵β細胞、マウスともにアセチルコリン投与により膵β細胞増殖が起きることが明らかとなった。アセチルコリンによる膵β細胞増殖機構として、阻害剤、欠損マウスの解析から今まで重要と考えられている分子(IRS-2、Akt、MAPkinase)とは異なった別の分子の関与が考えらた。マウスにコリン作動薬投与を行うと膵β細胞増加を起こすとされているGLP-1分泌の増加を認め、増殖に関与している可能性が考えられた。神経伝達物質(アセチルコリン)が膵β細胞機能維持(β細胞の生死、インスリン分泌、インスリンシグナル)に関わっているかを明らかにする目的で、まず無血清培養下MIN6細胞にアセチルコリンを添加し細胞数の変化を検討したところ細胞数が増加した。また、BrdU取り込みをフローサイトメトリーにて検討したところ、アセチルコリンによりBrdU取り込みが有意に増加した。アセチルコリンが膵β細胞の増殖を促すことが示唆された。ジアゾキシドにて、アセチルコリン刺激によるBrdU取り込みが部分的に抑制さておりインスリンレセプターを介した膵β細胞の増殖作用の経路が存在すると考えられる。インスリンシグナル活性化は膵β細胞の生死、複製に関わっており、インスリンシグナルの解析を行った。アセチルコリン刺激により、IRS-2とMAPkinase、CREBリン酸化が亢進していたが、Aktのリン酸化は認められなかった。MAPkinaseの阻害剤ではアセチルコリン刺激によるBrdU取り込みは抑制されず、MAPkinase経路、Akt経路とは異なった機序にて細胞増殖が起きていると考えられる。GLP-1作用の一部に自律神経が関わっているかを、マウスにGLP-1受容体作動薬であるliraglutideを投与し解析を行った。マウスにliraglutide投与を行うとインスリン分泌は増加するが、ムスカリニックレセプター阻害剤であるアトロピンを前投与するとliraglutideによるインスリン分泌は抑制されていた。またこの作用は糖尿病モデルマウスであるglucokinaseヘテロ欠損マウスでも同様の結果であった(Endocrinology, 153, 3066, 2012)。GLP-1によるインスリン分泌に自律神経経路の関与が考えられ、上記と同様にインスリンシグナルの活性化、膵β細胞の増殖作用に関し解析を進める。神経伝達物質(アセチルコリン)が膵β細胞機能維持(β細胞の生死、インスリン分泌、インスリンシグナル)に関わっているかを明らかにする事を目的とした。まずアセチルコリンのインスリン分泌への影響に関して、膵β細胞cell lineであるMIN6細胞とマウスを用い検討した。MIN6細胞では、アセチルコリン刺激により低濃度、高濃度ブドウ糖下ともにインスリン分泌の増加を認めた。マウスの検討では、アセチルコリン皮下投与により糖負荷後の血糖改善、インスリン分泌増加作用を認めた。この血糖改善効果は糖尿病モデルマウスであるIRS-2欠損マウスでも、同様に認められた。次にアセチルコリンの膵β細胞増殖能につき、同様にMIN6細胞とマウスを用い検討した。MIN6細胞の検討ではアセチルコリン添加により細胞数が増加し、BrdU取り込みも有意に増加していた。マウスにムスカリニックレプターアゴニストを経口投与し組織学的に膵β細胞へのBrdU取り込みを検討したところ、アゴニスト投与にてマウスの膵β細胞増殖が起きることを確認した。MIN6細胞で、アセチルコリン刺激によりIRS-2とMAPkinaseリン酸化が亢進していたが、Aktのリン酸化は認められなかった。MAPkinase阻害剤ではアセチルコリン刺激によるBrdU取り込みは抑制されなかった。IRS-2欠損マウスにおける組織学的解析で、ムスカリニックレプターアゴニスト投与による膵β細胞でのBrdU取り込みは抑制されなかった。以上から、アセチルコリンによる膵β細胞増殖機構として、IRS-2、Akt、MAPkinase非依存性の経路が関与していると考えられた。マウスにムスカリニックレプターアゴニスト投与を行うとGLP-1分泌の増加を認め、β細胞増殖に関与している可能性が考えられた。神経伝達物質(アセチルコリン)が膵β細胞機能維持(β細胞の生死、インスリン分泌、インスリンシグナル)に関わっているかを明らかにする目的で、まず無血清培養下MIN6細胞にアセチルコリンを添加し細胞数の変化を検討した。アセチルコリン添加によりMIN6細胞数が増加した。また、BrdU取り込みをFITC標識Anti-BrdU Antibodyを用いてフローサイトメトリーにて検討したところ、アセチルコリンによりBrdU取り込みが有意に増加した。これらの実験により、アセチルコリンが膵β細胞の増殖を促すことが示唆された。MIN6細胞をアセチルコリンにて刺激を行うと、高濃度ブドウ糖下で34倍のインスリン分泌増加がみられた。

インスリンシグナル活性化は膵β細胞の生死、複製に関わっており、アセチルコリンで強いインスリン分泌が確認できたことから、次にインスリンシグナルの解析を行った。アセチルコリン刺激により、IRS-2のリン酸化亢進がみられるが、IRS-1のリン酸化は変化しなかった。また、MAP kinaseのリン酸化が亢進していたが、Aktのリン酸化は認められなかった。また、アセチルコリン刺激によりCREBのリン酸化も確認した。以上の結果から、アセチルコリンが膵β細胞増殖に働き、その経路としては分泌されたインスリンが働きインスリンレセプターを介しIRS-2-MAP kinaseを活性化する経路や、インスリンレセプターを介さないCREBを介する経路などの存在が示唆された。MIN6細胞において神経伝達物質の細胞増殖機構に関しほぼ計画通りに研究を進めた。マウスにおける解析では、迷走神経遮断の解析が手技的に確立しなかったが、代わりにムスカリニックアゴニスト投与を行うことで、神経伝達物質のβ細胞への役割に関しin vivoでの解析が可能となった。IRS2欠損マウスでのインスリン分泌に関し下記の推進方策に記載した通り新たな知見を得ている。インクレチン製剤の神経調節の関与についても、マウスにliraglutide投与を行い解析を進めた。おおむね研究計画に沿って、実験をすすめている。神経伝達物質、アセチルコリンの膵β細胞増殖作用の機序解明を引き続き行う。マウスにムスカリニックレセプターアゴニストを投与すると、血糖改善、インスリン分泌増加作用を認めており、現在、アゴニスト投与にてマウスの膵β細胞増殖が起きるかを組織学的に解析している。マウスでのβ細胞増殖が確認できれば、IRS-1、IRS-2、glucokinase、PI3-kinase欠損マウスを用い増殖作用を解析することで、β細胞増殖経路を明らかにすることができる。またインスリン分泌に関して、IRS-2欠損マウスにムスカリニックレセプターアゴニスト投与を行うと、野生型マウスに比して血糖がより改善し著明なインスリン分泌増加を認めた。ムスカリニック刺激によるインスリン分泌に対しIRS-2は抑制的に働いていることが明らかとなり、機序に関し解析をすすめる。MIN6細胞でliraglutideによる膵β細胞増殖作用がカルバコールにより増強されるかをBrdU取り込みにて解析を行う。その増殖経路に関しインスリンシグナルを含め解析を行い、GLP-1と神経伝達物質の相互関係に関して解析を行う。また、マウスにおいても上記で使用したムスカリニックレセプターアゴニストとGLP-1受容体作動薬liraglutideを同時に投与し膵β細胞量がさらに増加するかを解析する。各種欠損マウスを用い、その増殖経路に関してどの分子が関わっているかを検討する。アセチルコリンの膵β細胞増殖作用の機序を明らかにする。
末梢神経障害におけるカリウムチャネル異常に関する研究

本年度は筋痙彎,ミオキミアを主徴とする21症例で,患者血清中の免疫グロブリンを用い,PC12,NB1などの培養細胞のK電流を抑制の有無,Western blot,二抗体免疫沈降法での抗VGKC抗体の有無を測定し,臨床症状との関連を検討した。その結果,(1)Isaacs症候群と診断された7例中3例でWB陽性であったが,全例でK電流の抑制が認められた.(2)Isaacs症候群以外の14例中6例(43%)でWB陽性であり,全例でK電流の抑制が認められた.(3)臨床症状,筋電図所見との関連では,筋電図上のmyokymiaがK電流の抑制の頻度が高い傾向が認められた.(4)MGで筋痙彎,またはmyokymiaを有する患者(3例)は全例でWB陽性で,かつK電流の抑制も認められた.(5)二抗体免疫沈降法では,検討した14例中4例(29%)でのみ陽性であった.(6)これらの血清ではNa電流の抑制は認められなかった.以上の結果から,抗VGKC抗体はIsaacs症候群にのみ特異的ではなく,特発性の筋痙彎,ミオキミアを主徴とする末梢神経障害に高率見られた.また抗VGKCの抗体のアッセイ系としてはpatch clamp法が最も鋭敏であり,WBがその次に有用であった.一方,Lambert-Eaton症候群,MGなどで用いられている二抗体免疫沈降法は感度の点で問題が多いことが明らかとなった.また抗ガングリオシド抗体が陽性のGBS4例の血清でNaチャネルの抑制の有無を検討したが,抑制は認められなかった.この事から,CBSにおける伝導ブロックには抗ガングリオシド抗体によるNaチャネルの抑制は関与しないと考えられた.昨年度の研究と併せて,本研究により筋痙彎,ミオキミアなどの末梢神経の興奮性を主徴とする末梢神経障害においては抗VGKC抗体が高率に陽性であり,その病態と密接に関連することが明らかとなった.今後より簡便かつ鋭敏な抗VGKC抗体のアッセイ系の確立が必要である.本年度は筋痙彎,ミオキミアを主徴とする21症例で,患者血清中の免疫グロブリンを用い,PC12,NB1などの培養細胞のK電流を抑制の有無,Western blot,二抗体免疫沈降法での抗VGKC抗体の有無を測定し,臨床症状との関連を検討した。その結果,(1)Isaacs症候群と診断された7例中3例でWB陽性であったが,全例でK電流の抑制が認められた.(2)Isaacs症候群以外の14例中6例(43%)でWB陽性であり,全例でK電流の抑制が認められた.(3)臨床症状,筋電図所見との関連では,筋電図上のmyokymiaがK電流の抑制の頻度が高い傾向が認められた.(4)MGで筋痙彎,またはmyokymiaを有する患者(3例)は全例でWB陽性で,かつK電流の抑制も認められた.(5)二抗体免疫沈降法では,検討した14例中4例(29%)でのみ陽性であった.(6)これらの血清ではNa電流の抑制は認められなかった.以上の結果から,抗VGKC抗体はIsaacs症候群にのみ特異的ではなく,特発性の筋痙彎,ミオキミアを主徴とする末梢神経障害に高率見られた.また抗VGKCの抗体のアッセイ系としてはpatch clamp法が最も鋭敏であり,WBがその次に有用であった.一方,Lambert-Eaton症候群,MGなどで用いられている二抗体免疫沈降法は感度の点で問題が多いことが明らかとなった.また抗ガングリオシド抗体が陽性のGBS4例の血清でNaチャネルの抑制の有無を検討したが,抑制は認められなかった.この事から,CBSにおける伝導ブロックには抗ガングリオシド抗体によるNaチャネルの抑制は関与しないと考えられた.昨年度の研究と併せて,本研究により筋痙彎,ミオキミアなどの末梢神経の興奮性を主徴とする末梢神経障害においては抗VGKC抗体が高率に陽性であり,その病態と密接に関連することが明らかとなった.今後より簡便かつ鋭敏な抗VGKC抗体のアッセイ系の確立が必要である.本年度は末梢神経障害における電位依存性Kチャネルに対する抗体の測定およびその障害機序についてpatch-clamp法を用いて行った。1.電位依存性Kチャネル(VGKC)に対する自己抗体の測定。Human neuroblastoma cell lineであるNB1細胞の培養液中に、患者血清から分離した免疫グロブリン分画5ul/mlを添加し3日間培養した後、whole cell clampでNB1細胞のK電流の抑制を指標として、抗体の有無を測定した。対象は臨床的に筋けいれんやミオキミアなどの末梢神経興奮性亢進症状を認めるIsaacs症候群4例、GBS7例、Idiopathic generalized myokymia(IGM)3例、MMN2例で、対照として末梢神経興奮性亢進症状を有さない疾患対象群(CIDP、HAM)4例を用いた。その結果、対照群血清に比較して、Isaacs症候群、GBS、IGMの血清でVGKCn有意の抑制が認められた。これらの疾患はいずれも自己免疫疾患の側面を有しており、末梢神経の興奮性亢進症状がVGKC抗体によるものと考えられた。

この結果は抗VGKC抗体がIsaacs症候群にのみ特異的なものではなく、末梢神経興奮性亢進という病態と関連していることを示すもので、この様な疾患の治療という観点から重要であると考えられた。2.電位依存性Kチャネル(VGKC)の障害機序についての検討。今回のpatch-clampを用いた実験系で、VGKCが抑制されるのには少なくとも2日以上を要した。この事は以前PC12を用いた実験で、同様にVGKCが抑制されるのに3日以上要し、かつ潅流実験では抑制が見られなかった結果を再確認するものであった。今年度はさらにsinle channelレベルで検討を行ったが、その結果個々のチャネルのactivation、inactivationは血清添加前と後(whole cell clampではVGKCが抑制)で差を認めなかった。この事は抗VGKC抗体は直接チャネル機能に影響を及ぼすのではなく、チャネルの発現の抑制や崩壊の促進に関与していることが考えられた。この様な機序はLEMSなどの抗体依存性のチャネル障害を起こす疾患においても報告されており、免疫グロブリンにチャネル蛋白に対する架橋形成、崩壊の機序が想定されている。抗VGKC抗体も同様のVGKCに障害を及ぼしている可能性が考えられた。本年度は筋痙彎,ミオキミアを主徴とする21症例で,患者血清中の免疫グロブリンを用い,PC12,NB1などの培養細胞のK電流を抑制の有無,Western blot,二抗体免疫沈降法での抗VGKC抗体の有無を測定し,臨床症状との関連を検討した.その結果,(1)Isaacs症候群と診断された7例中3例でWB陽性であったが,全例でK電流の抑制が認められた.(2)Isaacs症候群以外の14例中6例(43%)でWB陽性であり,全例でK電流の抑制が認められた.(3)臨床症状,筋電図所見との関連では,筋電図上のmyokymiaがK電流の抑制の頻度が高い傾向が認められた.(4)MGで筋痙彎,またはmyokymiaを有する患者(3例)は全例でWB陽注で,かつK電流の抑制も認められた.(5)二抗体免疫沈降法では,検討した14例中4例(29%)でのみ陽性であった,(6)これらの血清ではNa電流の抑制は認められなかった.以上の結果から,抗VGKC抗体はIsaacs症候群にのみ特異的ではなく,特発性の筋痙彎,ミオキミアを主徴とする末梢神経障害に高率見られた.また抗VGKCの抗体のアッセイ系としてはpatch clamp法が最も鋭敏であり,WBがその次に有用であった.一方,Lambert-Eaton症候群,MGなどで用いられている二抗体免疫沈降法は感度の点で問題が多いことが明らかとなった.また抗ガングリオシド抗体が陽性のGBS4例の血清でNaチャネルの抑制の有無を検討したが,抑制は認められなかった.この事から,CBSにおける伝導ブロックには抗ガングリオシド抗体によるNaチャネルの抑制は関与しないと考えられた.昨年度の研究と併せて,本研究により筋痙攣,ミオキミアなどの末梢神経の興奮性を主徴とする末梢神経障害においては抗VGKC抗体が高率に陽性であり,その病態と密接に関連することが明らかとなった.今後より簡便かつ鋭敏な抗VGKC抗体のアッセイ系の確立が必要である.
異常ヘモグロビン症診断のルーチン化のための新技術の開発

最新の質量分析(MS)法、等電点電気泳動法及び遺伝子解析法を組み合わせ、迅速・正確な実用的診断法を確立した。本システムを用い、学内外より依頼のあった異常ヘモグロビン(Hb)症疑いの16検体を分析した結果、以下の異常ヘモグロビン5種15症例を同定した。また、逆相カラムRP-300とPartisil(ODS)による異常鎖の分離法を加え、さらに多種の変異の同定に対応できるようにした。本システムを用い、学内外より依頼のあった異常ヘモグロビン(Hb)症疑いの16検体を分析した結果、異常ヘモグロビン9種11症例を同定した。その内、2種(*印)は新規変異であった。その一つHbSazamiは、日本人に特有のプロモーター領域のTATAボックスに変異(-31A->G)が存在するβサラセミア症が合併していることをDNA解析の手法を用いて証明した。また、日常検査法としての簡便さと迅速性を追求するため、律速段階である酵素消化を従来法に代えて、ビーズに酵素を固定化させたボロスザイムを使用し、行程の短縮化を検討した。トリブシンの場合、酵素反応時間は20分で定量的に消化ペプチドが検出できた(通常12時間)。一方、V8プロテアーゼの場合、10分より、消化ペプチドが検出し得たが、再現性等を考慮して反応時間は2時間とした(従来は12時間)。更に、自家製の逆相樹脂を充填したナノスプレーチップ(内径200mm)をオンラインでMSに連結すれば、微量のナンプルで変異部位の同定が可能であることを、実証した(HbHamadan:2例、HbMasuda:1例)。
ナメクジ嗅覚中枢の振動ネットワークの再編成能力を用いて脳波の仕組みを解明する

脳のニューロンが同期活動する仕組みと意義を知りたい。ナメクジ嗅覚中枢のニューロンを一度バラバラにしてもin vitroで(培養皿上で)再び同期的振動ネットワークが再形成されることをみつけたので、ネットワークが一から作られる様子を薬理学的に調べた。グルタミン酸およびアセチルコリンが同期的振動の発生に必須なのに対し、ドーパミン、セロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン、オクトパミンなど多くの生体アミンたちは必須ではないことが分かった。これはin vivo(実際の脳内)で生体アミンたちが外因性の調節因子として重要な働をしていることと一致する。脳波の仕組みと役割を考える上での新しい基礎的知見を得た。ナメクジの脳にある嗅覚中枢は、ヒトと同じように、規則正しく整列して層構造を形成すニューロンたちの同期的振動活動(いわゆる脳波)を利用してにおいを嗅ぎ分けたり記憶したりする。さらに、ヒトを上回る再生能力をもち、切除された触角や破壊された脳を数週間ののちに回復させ再び機能させることができる。研究代表者らは、一度バラバラにした嗅覚中枢・前脳葉のニューロンたちを生理的食塩水中で培養するだけで振動活動を発生するネットワークを再形成すること、この前脳葉培養ニューロンによる振動ネットワークの再形成が細胞体の凝集を伴うこと、細胞体の凝集には前脳葉内における領域差があることを見出した。目下のところ、前脳葉ニューロンの自発的神経活動に影響を与えるさまざま調節因子について調べており、特にアセチルコリンが同期的振動活動の駆動に重要な役割を果たしていることわ分かってきている。振動ネットワークが一からつくられる様子を観察しながら脳波の仕組みと意義について明らかにしてゆきたい。ナメクジの脳にある嗅覚中枢「前脳葉」では、ヒトと同じように、ニューロンが規則正しく整列して層構造を形成している。ニューロンたちは満遍なく手を繋ぎ、電気シグナルを同期させながら振動活動(すなわち脳波)を発生させることにより「においの嗅ぎ分け」や「記憶」を行うと考えられている。さらに、ヒトを上回る再生能力をもち、切除された触角や破壊された前脳葉を数週間ののちに回復させ再び機能させることができる。研究代表者らは、一度バラバラにした前脳葉ニューロンたちが培養皿の上で再び同期的な振動ネットワークを形成することを見つけた。脳における振動活動「脳波」のしくみと役割を調べる目的で、神経振動ネットワークが出来上がってゆく様子を調べている。目下のところ、ナメクジの神経振動ネットワークの再形成がニューロンの凝集を伴うこと、その凝集には前脳葉内における領域差(均一だと考えられていた前脳葉ニューロンの性質に領域依存的な差異)があること、そして同期的振動活動の駆動には神経伝達物質であるアセチルコリンの放出が重要な役割を果たしていることを見出してJ Comp Neurol誌等に発表した。さらに、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン等のカテコールアミンや、セロトニン、ヒスタミン、オクトパミンを含む生体アミンらにも注目している。In vivoではこれら生体アミンによる前脳葉の振動活動の変調が観察されるが、in vitroの培養ニューロン・ネットワークでは見られない。前脳葉内には上記のアミン作動性ニューロンが見つからないという組織学的根拠から、前脳葉外からのアミン作動性入力が重要であることを改めて示そうとしている。そして、振動ネットワークがつくられる様子を順次観察しながらブラックボックスであった前脳葉ネットワークを明らかにしてゆく。研究代表者らは、分散培養によって一度バラバラにした前脳葉ニューロンが再び同期性を持ち振動活動を発生するまでの様子を調べてきた。特に、このin vitro振動ネットワークにおける様々な神経伝達物質および調節因子の作用と役割について注目している。近年、アセチルコリンの合成酵素およびニコチン性受容体がクローニングされたことで、前脳葉におけるコリナージックシステムの分布と役割が分かってきた。同様に、さまざまな生体アミンの合成酵素についてもクローニングが進み、それぞれの分布と役割が明らかになりつつある。前脳葉ニューロンのin vitro振動ネットワークにおける生体アミンたち、具体的にはヒスタミン、セロトニン、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、オクトパミン等の作用について調べた結果、各アミン作動性ニューロンの分布と役割について次第に考察できるようになってきている。これらの結果については動物学、生理学、神経科学等のさまざまな分野の学会で報告し、議論を重ねた上で論文として発表している。また、前脳葉内の領域差についても注目しており、前脳葉ニューロンのin vitro振動ネットワークが出来上がって行く様子を丹念に調べながら明らかにして行きたい。研究代表者らは、同期的振動ネットワークの仕組みと意義について調べている。ナメクジの脳は哺乳類に比べて少数のニューロンで構成される比較的シンプルなシステムだが、嗅覚中枢である前脳葉はおよそ10万個のニューロンが規則正しく整列して層構造を形成し、同期的振動活動(いわゆる脳波)を発生している。ナメクジはこの同期的振動ネットワークを利用してにおいを嗅ぎ分けたり記憶したりする。さらに、ナメクジは素晴らしい再生能力をもっている。例えば、物理的に破壊した嗅覚中枢は数週間すれば層構造を回復させて同期的振動を発生するし、再びにおいの嗅ぎ分けや記憶をすることができるようになる。また、切除した触角は数週間すれば回復し、その先端部には元通りに眼と嗅上皮が形成されて、再び視覚および嗅覚情報を感受することができるようになる。研究代表者らは、一度バラバラにした嗅覚中枢のニューロンたちを生理食塩水中に静置するだけで、同期的振動ネットワークを再形成することを見出した。

このin vitro同期的振動ネットワークにおける前脳葉ニューロンの自発的活動に影響を与えるさまざまな因子について調べた結果、特にコリナージックシステムが同期的振動の駆動に重要な働きをしていることが分かってきた。一方で多くの生体アミンは同期的振動に必須ではなく、ネットワークの外から影響を与える調節因子であることが分かってきた。これらの結果の一部は原著論文として(J Comp Neurol誌2014, 2016a, b)、または国内外の学会にてすでに発表済みである。目下のところ、同期的振動ネットワークが一からつくられる様子を調べながら、脳波の仕組みと意義について考察している。研究代表者らは、分散培養した前脳葉ニューロンたちがin vitro同期的振動ネットワークを形成して行く様子を調べた。その結果、グルタミン酸およびアセチルコリンを神経伝達物質とするシステム(glutamatergic systemおよびcholinergic system)がin vitroネットワークにおける前脳葉ニューロンの自発的活動を調節し得ることが示された。一方で、ドーパミン、セロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン、オクトパミンなど多くの生体アミンはin vitroネットワークにおける前脳葉ニューロンの自発的活動に影響を及ぼさなかった。すなわち、in vivoの前脳葉ネットワーク内に含まれる(内在性の)グルタミン酸とアセチルコリンは同期的振動活動の発生に重要であるが、in vivoの前脳葉ネットワークの外に存在する生体アミンたちは同期的振動活動の発生には必須ではなく、外からの調節因子として働くことが分かってきた。以上の中でも特にコリナージックシステムは重要である。十分に成熟したin vitro培養ネットワークでは、コリンエステラーゼ(アセチルコリン分解酵素)の抑制薬であるフィゾスチグミンまたはニコチンの投与により同期的振動活動が発生することが確認されているからである。研究代表者らは、動物の中枢神経系ではたらく同期的振動ネットワークの仕組みと意義について調べている。ナメクジの中枢神経系は哺乳類に比べて少数のニューロンで構成される比較的シンプルなシステム(脳)である。一方で嗅覚中枢である前脳葉は、およそ10万個のニューロンが規則正しく整列して層構造を形成し哺乳類に似たような同期的振動活動(いわゆる脳波)を発生している特異的な脳領域である。ナメクジはこの同期的振動ネットワークを利用してにおいを嗅ぎ分けたり記憶したりする上に、素晴らしい再生能力で物理的破壊後の前脳葉や触角器官を再生回復させて、再びにおい情報処理能力を取り戻す。研究代表者らは、分散培養した前脳葉ニューロンが生理食塩水中で同期的振動ネットワークを再形成することを見出した。このin vitro同期的振動ネットワークにおける前脳葉ニューロンの自発的活動に影響を与えるさまざまな因子について調べた結果、特にコリン作動性シナプス伝達が同期的振動の駆動に重要な働きをしていることが分かってきた。
X線自由電子レーザ絶対強度計測のためのマイクロカロリメータ

X線自由電子レーザのパルスエネルギーを測定できる常温マイクロカロリメータの設計・製作を行った。これまで用いてきたカロリメータの大きさは、およそ、直径10cm×長さ20cm程度の円筒形大きさであるのに対して、製作したマイクロカロリメータのサイズは、直径2.2cm×長さ2.1cmである。性能評価は、3keV5keVのシンクロトロン放射光を用いて行った。マイクロカロリメータのバラツキは、極低温放射計と同等の±1μW程度であることを確認した。マイクロカロリメータによる放射光強度の絶対値は、極低温放射計と約5%以内で一致することを確認した。平成26年度は、X線自由電子レーザのパルスエネルギーを測定できるマイクロカロリメータ本体を設計・製作を行い、現在所有している極低温カロリメータ用の制御装置を用いて動作テストを行った。現在用いている極低温カロリメータ本体の大きさは、およそ、直径10cm×長さ20cm程度の円筒形大きさであるのに対して、製作したマイクロカロリメータ本体サイズは、直径2.2cm×長さ2.1cmである。体積にして、およそ200分の1の大きさになった。マイクロ化したため、ICF70のフランジに取り付けることができるようになり、フォトダイオードのようにどこにでも取り付けうる使い勝手の良い検出器となった。マイクロカロリメータ本体の構造は、小さくても、極低温カロリメータと同様に受光部と2重のシールド部で構成されている。受光部には、サーミスタ温度センサと温度制御用ヒータを3セット接着させている。シールド部には、サーミスタ温度センサと温度制御用ヒータをそれぞれ1セットを接着させた。これらのサーミスタ温度センサと温度制御用ヒータによって、マイクロカロリメータの温度制御と熱量測定を行う。製作したマイクロカロリメータの動作確認を行うため、既設の真空容器内にマイクロカロリメータを取り付け、電気ヒータによるオフラインテストを行い、問題なく動作することを確認した。受光部が小さくなり軽くなった結果、感度が数十倍に向上した。一方、感度が良くなったために、外部の温度変化の影響を受けやすくなり、その方策をとる必要があることが分かった。今後は、シンクロトロン光を用いて、動作テストをするとともに、外部の温度変化の影響を取り除くことに取り組む。平成27年度は、計画通り、昨年度開発したマイクロカロリメータの性能評価を中心に行った。性能評価は、X線領域のシンクロトロン放射光を使って行った。具体的には、3keV5keVの放射光の絶対強度をマイクロカロリメータで測定し、国家標準器である極低温放射計による絶対強度と比較し、性能評価を行った。放射光ビームラインに設置した条件下でのマイクロカロリメータのバラツキは、極低温放射計と同等の±1μW程度であることを確認した。このバラツキは、X線自由電子レーザの10分の1程度の強度(約100μW)である放射光の絶対強度を高精度に測定できる性能である。マイクロカロリメータによる放射光強度の絶対値は、極低温放射計と比べて約5%以内で一致することを確認した。しかし、この比較を3keVから5keVの範囲の様々なエネルギーの放射光に対して行った結果、マイクロカロリメータの測定値が極低温放射計と比べて一律に約3%高いことが明らかとなった。この原因として、小型化に伴う受光部内部の温度分布の影響が考えられ、受光部内部の温度センサとヒータの配置を見直し、改造を行った。受光部のセンサは温度分布の影響が少ない場所に再配置し、制御・加熱用ヒータは、光強度測定の状態をより忠実に模擬できる配置へと変更した。以上の改造を行い、平成27年度後半にシンクロトロン放射光での再評価実験を実施した。その結果、マイクロカロリメータの測定値が約3%高く、改善が見られなかった。しかし、3%高く測定される結果は再現しているため、この効果を補正項および誤差として考慮することによってマイクロカロリメータを絶対測定器として使用できると考えられる。また、X線自由電子レーザの強度には10%程度の強度変動があることから、このマイクロカロリメータはX線自由電子レーザの絶対強度測定器として十分な精度があると考えられる。平成26年度の計画は、X線自由電子レーザのパルスエネルギーを測定するマイクロカロリメータの受光部を開発、製作を行うとともに、動作テストを行うことであった。実際に、マイクロカロリメータの受光部を製作し、動作テストを行ったので、計画通りに進んだ。マイクロカロリメータは予定通り、受光部と2重のシールド部の3重構造とし、ICF70のフランジに挿入できる大きさにすることを実現した。また、動作テストでは、0.1μWの熱量でも測定が可能となる感度を得ることができた。

以上のことより、全体として概ねに順調に進展していると考える。放射線計測感度が良くなったために、外部の温度変化の影響を受けやすくなり、その方策をとる。具体的には、マイクロカロリメータと光源の間に、温度コントロールが可能なアパーチャーを設置し、外部からの温度変化が受光部に入らないように工夫する。次に、シンクロトロン放射光のX線を用いて、極低温放射計と比較を行い、性能評価を行う。また、パルス光の測定が可能かどうか、パルス電源と交流ブリッジ回路・ロックインアンプを用いて、パルス特性を調べる。マイクロカロリメータの動作確認のための測定システムを既存の装置を利用したため、予算を節約できた。翌年度は、次年度使用額と合わせて、パルス光測定システムを製作する。
多重ドメイン蛋白によるユビキチンシグナルの選択性と疾患

ナイミーヘン症候群の蛋白NBS1はそのC末側の約100aaの狭い領域にDNA修復を協調的に行うための、RAD18,RNF20,ATM,MRE1の4種類の蛋白との結合ドメインが存在し、それにより損傷乗り越えDNA合成、クロマチン・リモデリング、チェックポイント、相同組み換え修復を制御する。本研究では、これら拮抗する制御系がNBS1を介したユビキチン化が「選択的に基質タンパク質を識別」する機構を解析する。RNF20をノックダウンするとRAD18によるPCNAユビキチン化能も低下した。このことはRNF20によるユビキチン化シグナルとRAF18によるユビキチンシグナル経路が重複している可能性を示唆する。そこで、RNF20のシグナル経路をさらに解析した結果、RNF20はヒストンシャペロンFACTと結合して、DNA二重鎖切断部位に集結することが判明した。これに対してRAD18の集結には少なくとも二種類の蛋白が必要であることがマススペクトルを用いた実験による明らかとなった。また、この二種類の蛋白はDNA二重鎖切断には反応せずに、専ら紫外線損傷だけに反応したことから、RNF20とRAD18のユビキチンシグナル経路は全く独立したものである。両ユビキチンシグナルが交差する原因は、RNF20によるクロマチンリモデリングが紫外線損傷応答にも必要と思われる。一方、RAD18結合ドメイン欠損のNBS1ノックインマウスを作製してその性質を解析した結果、ナイミーヘン症候群の特徴である小頭症は観察されなかった。また、免疫グロブリンのサブセットにはわずかに異常が見られたものの、顕著な違いではなかった。このことから、ナイミーヘン症候群の患者に見られる臨床症状の多くは相同組換えなど他のNBS1機能の喪失に由来すると思われる。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内に数多く存在する蛋白制御系の中でユビキチン化が「時を得て選択的に基質タンパク質を識別」するためには、拮抗する制御系から適正なタイミングで選択される必要がある。ナイミーヘン症候群の蛋白NBS1はそのC末側の約100aaの狭い領域にDNA修復を協調的に行うための、ユビキチン化呼応素を含む5種類の蛋白との結合ドメインが存在する。本研究では、この中で損傷乗り越えDNA合成(RAD18によるPCNAユビキチン化)がクロマチン・リモデリング(RNF20によるH2Bユビキチン化)が選択的に開始する機構を解析する。さらにRAD18結合ドメイン欠損のNBS1ノックインマウスの解析により、ユビキチン蛋白制御異常が原因のナイミーヘン症候群の分子病態を明らかにすることを目的とする。RNF20によるヒストンH2Bユビキチン化がクロマチン・リモデリングを行ってRAD51などのDNA修復蛋白がDNA損傷部位に近づけるようになることを我々は以前に報告した。堅いクロマチンにRNF20が近づけるのは,既にクロマチン内に存在する蛋白による促進が起こるだろうと思われるので、ヒストンシャペロンFACTとRNF20との関係を検討した。その結果、FACTの構成因子SUPT16hのC末側でDNA損傷依存的にRNF20が結合することが判明した。この結合が出来ない変異体では、RNF20の放射線フォーカス形成、クロマチン・リモデリングが起こらず、結果として放射線高感受性となった。一方、RAD18がNBS1と結合するためには、NBS1の他のドメインが必要であることがわかり、現在そこに結合する蛋白の同定を行っている。また、ユビキチン結合ドメインをノックインしたNBS1マウスは生存可能であり(ノックアウトは胎生致死)、ナイミーヘン症候群の特徴である免疫組換えに異常を呈することが明らかとなった。

26年度が最終年度であるため、記入しない。研究は2年計画で進めていたが、今年度はRNF20経路の解析が予定通り進行した。もう一方のRAD18経路についても、手がかりが得られたので、ほぼ順調に進行していると判断した。DNA損傷後にRAD18がNBS1に結合するためにNBS1の未知のドメインが必須であることが判明した。現在、マススペクトルを用いたプロテオミックスにより結合蛋白の同定を進めている。この蛋白の機能解析により、DNA損傷からNBS1、そしてRAD18を介したPCNAユビキチン化の経路が明らかになる。また、本年度明らかにしたFACTからRNF20の経路との比較により、DNA修復ネットワークにおけるユビキチン化の選別とタイミングの全体機序を明らかにすると期待される。我々が作製したNBS1ユビキチン結合ドメインのノックインマウスは、ナイミーヘン症候群患者と同じく免疫不全を呈した。この原因として、VDJ組換え、クラススイッチ組換え、hypermutationの3種類の経路が考えられるので、その機構も明らかにする予定である。
黄色ブドウ球菌2成分溶血毒素の形成するヘテロヘプタマー膜孔超分子の構造解析

黄色ブドウ球菌γヘモリジンはHlg1(34kDa)とHlg2(32kDa)から成る二成分性溶血毒素である。我々は、γヘモリジンの二成分がヒト赤血球膜上で外径9nm、内径3nmのリング状複合体を形成し、この複合体が実効内径2nmの膜孔として作動して溶血を起こすことを示した。さらに、電子顕微鏡および化学的架橋剤を使用した研究により、膜孔複合体はヘプタマーであり、二成分はモル比3:4または4:3で交互に配列していると推定した。本研究では、(1)nanogoldでラベルしたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を融合したGST融合Hlg1(またはGST融合Hlg2)とwild typeのHlg2(またはwild typeのHlg1)から膜孔複合体を形成させ、電子顕微鏡を使用して膜孔複合体中のナノゴールドを観察することで毒素2成分の分子配列の可視化、(2)電子顕微鏡による立体構造の解析を試みた。(1)GST1分子当たり1個のナノゴールドを結合した融合毒素を作製するために、GSTに含まれる4個のシステインの内(138番目のシステインを除く残り)3個をアラニンに置換した組換え体GSTを作製した。現在、ナノゴールドによってラベルした融合毒素と未結合のナノゴールドを分離する方法について検討中である。また、(2)本毒素複合体は2成分を3:4または4:3で含むために、X線結晶回折による3次元構造の解明は困難であると予測されるために、ヒト赤血球膜から単離した膜孔複合体をネガテイブ染色して透過型電子顕微鏡によって立体構造の解析をおこなった。その結果、膜孔複合体は直径約3nmの細長いモノマー分子が平行に並び、高さ約10nm、横幅約9nmの構造であることが明らかになった。様々な角度から撮影した像から、γヘモリジンの膜孔複合体は、黄色ブドウ球菌の1成分溶血毒素αヘモリジンの立体構造に類似したマッシュルーム状の形態を有することが示された。我々は、γヘモリジンの二成分がヒト赤血球膜上で内径3nm、外径9nmのリング状毒素複合体を形成し、この毒素複合体が実効内径約2nmの膜孔として作動し、溶血を引き起こすことを明らかとした。さらに、高精細なネガテイブ電子顕微鏡像および生化学的な解析結果から、膜孔複合体はヘテロヘプタマーであり、二成分はモル比3:4および4:3で交互に配列していると推定した。本研究では、膜孔複合体中の分子配列を可視化するために、nanogoldでラベルしたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を融合させたGST融合Hlg1(またはGST融合Hlg2)とwild typeのHlg2(またはwild typeのHlg1)から成る膜孔複合体を赤血球膜上で形成させ、電子顕微鏡で観察する。現在、GST分子内の4個のシステイン残基のうち3個をアラニンに置換し、1分子につき1個のnanogold粒子でラベルしたGST融合毒素を作成中である。また、本毒素複合体は2成分を3:4、4:3で含むために、X線結晶回折による3次構造の解明は困難であると予測されるため、電子顕微鏡によるリング状構造体の3次構造の解明を試みた。