hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CIS1ノックアウトマウスを用いた慢性骨髄性白血病の病態の分子機構の解析

Philadelphia転座t(9;22)(q34;q11)により形成される異常融合タンパクBCR-ABLは高いチロシンキナーゼ活性を有し、この増強されたキナーゼ活性が疾患の発症と深く関わっている。本来単量体であるABLがBCR付加によって四量体形成能を獲得し自己及び細胞内伝達分子のリン酸化を誘発する。BCR-ABLと分子間相互作用するタンパク群(Grb2、Shc、CrkL、SHP-1など)により活性化されたRasがBCR-ABLの腫瘍形成能に本質的な役割を果たしていると考えられる。一方でStat 3及びStat 5の活性化がBCR-ABL発現細胞においても誘導され、BCR-ABLから発するシグナルは造血因子受容体の刺激伝達と多くの点で類似していることが見い出され急速に理解が進んでいる。近年、Jak-Statシグナル伝達系に対し抑制的に働くCIS1がクローニングされ注目を集めている。CIS1はIL-2、IL-3、GM-CSF、EPOによって造血細胞における発現が誘導される細胞内情報伝達分子で、SH2ドメインを介してチロシンリン酸化されたEPOレセプター及びIL-3レセプターに結合する。BCR-ABL発現細胞株を用いた実験系において、CIS1がBCR-ABL融合タンパクと結合し、Stat 5の活性を抑制することにより腫瘍形成能を抑制することを見い出した(Experimental Hematology,2001,in press)。現在、CIS1ノックアウトマウスを作製中であり、ノックアウトマウス個体を用いることにより慢性骨髄性白血病の分子病態の解明を目指している。マウス個体における造腫瘍能の検討は単にBCR-ABLの発癌活性分子としての位置づけにとどまらず、慢性骨髄性白血病のより自然な病態に迫る分子機構を明らかにする上で極めて重要なアプローチといえる。一方でStat3及びStat5の活性化がBCR-ABL発現細胞においても誘導され、BCR-ABLから発するシグナルは造血因子受容体の刺激伝達と多くの点で類似していることが見い出され急速に理解が進んでいる。近年、Jak-Statシグナル伝達系に対し抑制的に働くClS1がクローニングされ注目を集めている。CIS1はIL-2、IL-3、GM-CSF、EPOによって造血細胞における発現が誘導される細胞内情報伝達分子で、SH2ドメインを介してチロシンリン酸化されたEPOレセプター及びlL-3レセプターに結合する。我々はCIS1がBCR-ABL融合タンパクと結合し、Stat5の活性を抑制することにより腫瘍形成能を抑制することを見い出した。現在、CIS1ノックアウトマウスを作製中であり、ノックアウトマウス個体を用いることにより慢性骨髄性白血病の分子病態の解明を目指す。マウス個体における造腫瘍能の検討は単にBCRーABLの発癌活性分子としての位置づけにとどまらず、慢性骨髄性白血病のより自然な病態に迫る分子機構を明らかにする上で極めて重要なアプローチといえる。
ヒト免疫系の進化と自己免疫疾患の関連の解析

理論的には免疫系はペプチド(タンパク質)のみならず糖鎖、塩基やその他の非自己化合物を全て認識できると考えられる。すなわちそれらの各種の分子を認識するレセプターが存在し、そのレセプターとリガンドの関係を解析することにより全物質的な自己と非自己の境界を明らかにすることができると考えられる。本年度、申請者は主にヒトとヒト感染ウイルスの共通ペプチドについて、その配列の特徴及び共通ペプチドを含むタンパク質の機能について解析した。特に、全身性の自己免疫疾患について顕著に共通ペプチドを含むことを示し、またこのような共通ペプチドは進化の過程でヒトからは通常無くなっていると考えられるデータも得た。さらに、これらの共通ペプチドを持つタンパク質は、機能的には一見して共通項は見られないものの、細胞内に存在しているcaspaseファミリーに属するプロテアーゼによって有意に切断され得るタンパク質であることを見出した。これらのプロテアーゼは細胞のアポトーシスの際に活性化されることが良く知られており、従って自己免疫疾患とアポトーシス、及び共通ペプチドが複雑なメカニズムで関連している可能性が示唆された。一つの可能性としては、これらのアポトーシスとウイルスの関係が挙げられる。ウイルスに感染した細胞はT細胞によって認識され、caspaseファミリーのプロテアーゼの一員であるグランザイムBによって破壊されるが、このグランザイムBはcaspaseと非常に良く似た配列モチーフを切断することから、このターゲットとして自己抗原とウイルス抗原が関連していると考えられる。以上の結果は、ウイルス感染と自己免疫疾患の関連を示すものであり、重要なものであると考えられる。本年度は主にヒトとヒト感染ウイルスの共通ペプチドについて、その配列の特徴及びタンパク質の機能について解析した。その結果、特に全身性の自己免疫疾患について顕著に共通ペブチドを含むことを示し、またこのような共通ペプチドは進化の過程でヒトからは通常無くなっていると考えられるデータも得た。すなわち、ウイルスと共通の配列が残っていると、疾患の原因となりうるが、それを進化の過程でなくすことで免疫反応が起こることを未然に防いでいるということが示唆される。また自己免疫疾患でターゲットとなる自己抗原について文献及びWEBからデータを収集した。現在で、組織特異的、及び全身性自己免疫疾患合わせて2500のタンパク質(ファミリーの数では約150)をデータとして集めた。またこれらのタンパク質で疾患の種類は約70種類をカバーしている。糖脂質抗原を提示するCD1分子については、その細胞内局在と、感染バクテリアのtropismについての関連性を明らかにした。ヒト細胞では抗原提示分子CD1は5つが知られている。これらのうち実際に抗原を提示するのは4種類で、いずれも細胞内での局在が異なっていることが知られていたが、これらの局在情報が、各分子が提示する糖脂質抗原を持つバクテリアの感染する細胞内小器官と一致していることを示した。またホスト・ウイルスの関係の解析の一環として、バクテリアとそのファージについても解析し、GC含量、及びアミノ酸組成についてホストとの関連性を解析した。現在までに全ゲノム配列が決定されているバクテリアは300を超えているが、それらのうち、感染するファージのゲノムも同様に明らかにされているものの数は約50である。今回はそれらのバクテリア50とファージを用い、全200ペアについてGC含量及びアミノ酸組成と配列類似性について解析した。その結果、ホストのGC含量はファージとほぼ完全に一致していること、またアミノ酸組成についてはホストと配列類似性が高い程、相関していることが分かった。本年度は主にヒトとヒト感染ウイルスの共通ペプチドについて、その配列の特徴及びタンパク質の機能、及び各生物種にユニークなペプチドとの関係について解析した。ヒトもしくはウイルスにユニークに現れるペプチドがどの程度、共通のペプチドに近いかということを調べるために、ベプチド間のマンハッタン距離を計算することで、その特徴を調べた。方法としては、各生物種にユニークなペプチド一つに対し、共通ベフチド全てとのマンハッタン距離を計算し、その最小値を共通ペプチド集団からの距離とした。その結果、ヒトにユニークなペプチドは共通ペプチドからの距離が遠くなるほど、すなわち配列が似ていないものほど数が多くなる分布を示し、それに対してウイルスにユニークなベフチドは距離が近い、すなわち共通ペプチドに配列が似いているものほど数が多いという分布を示した。このことからヒトにユニークなペプチド集合は共通ペプチドから離れていて、ウイルスにユニークなペプチド集合は共通ペプチドに近い、すなわちホスト側の配列はウイルスから逃げる方向に変化し、ウイルス側の配列はホストに近づくように変化していると考えられる結果が得られた。また共通ペプチドを持つタンパク質のオーソログ間のマルチプルアラインメントの結果から、この共通ペプチドはヒトになって新規にできた配列であるということを示した。

これらのプロテアーゼは細胞のアポトーシスの際に活性化されることが良く知られており、従って自己免疫疾患とアポトーシス、及び共通ペプチドが複雑なメカニズムで関連している可能性が示唆された。一つの可能性としては、これらのアポトーシスとウイルスの関係が挙げられる。ウイルスに感染した細胞はT細胞によって認識され、caspaseファミリーのプロテアーゼの一員であるグランザイムBによって破壊されるが、このグランザイムBはcaspaseと非常に良く似た配列モチーフを切断することから、このターゲットとして自己抗原とウイルス抗原が関連していると考えられる。以上の結果は、ウイルス感染と自己免疫疾患の関連を示すものであり、重要なものであると考えられる。
免疫栄養が口腔癌化学療法に及ぼす影響についての基礎的研究

immunonutrientsを低濃度から高濃度に含有した培地と非含有培地(通常培地よりグルタミン・アルギニンを完全に取り除いた)を用い口腔癌樹立細胞株(HSC-4,SAS,SCC-25)の培養を行い,細胞増殖能の検討を行ってきた.さらにこれらの細胞株に5-FU系薬剤を作用させ,抗腫瘍効果と栄養素濃度との関係についての検討を行った。また、5-FUの代謝酵素のうち副作用の発現と関連するとされる酵素であるOPRT(オロテートホスホリボジルトランスフェラーゼ)、薬物代謝に強い関係のあるDPD(ジヒドロピリミジン脱水素酵素)の発現の有無と上記の実験における結果との関連についても検討を行った。これまでに,臨床の場において癌周術期における免疫栄養(グルタミンおよびアルギニン高含有栄養食品の使用による)の役割およびその効果について検討を重ねてきた.本年度は,がん治療時(化学療法・手術療法)における,免疫栄養が果たす役割・効果について明らかにするために口腔がん細胞株を用いた検討を開始した.現在,通常培地およびimmunonutrients(グルタミン・アルギニン)を含有(濃度各種)・非含有の培地を用い口腔癌樹立細胞株(HSC-2,HSC-3,HSC-4,SAS,SCC-25)の培養を行い,細胞増殖能の検討を行っている.並行してこれらの細胞株に5-FU系薬剤を作用させ,抗腫瘍効果と栄養素との関係についての検討を継続している.さらに,これまでの研究(平成16年度18年度若手研究B)と関連する内容として,5-FUの代謝酵素のうち副作用の発現と関連するとされる酵素であるDPD(ジヒドロピリミジン脱水素酵素)とOPRT(オロテートホスホリボジルトランスフェラーゼ)の発現の有無と上記の実験における結果との関連についても検討を行っている.また,癌細胞そのものの有害事象の発現に対する関与について検索し,特に起炎性という点から5-FU作用後の癌細胞株の上清における炎症性メディエーターを検索し各々の培地間での比較を行っている.これまでに,臨床の場において口腔癌周術期および化学療法・放射線療法時における免疫栄養(グルタミンおよびアルギニン高含有栄養食品の使用による)の役割およびその効果について検討を重ねてきた.本年度は,がん治療時(化学療法・手術療法)における,免疫栄養が果たす役割・効果について明らかにするために口腔がん細胞株を用いた検討を行っている.昨年より, immunonutrients(グルタミン・アルギニン)を低濃度から高濃度に含有した培地と非含有培地(通常培地よりグルタミン・アルギニンを完全に取り除いた)を用い口腔癌樹立細胞株(HSC-4, SAS, SCC-25)の培養を行い,細胞増殖能の検討を行っている.さらにこれらの細胞株に5-FU系薬剤を作用させ,抗腫瘍効果と栄養素濃度との関係についての検討を継続している.さらに,これまでの研究(平成16年度18年度若手研究B)と関連する内容として, 5-FUの代謝酵素のうち副作用の発現と関連するとされる酵素であるDPD(ジヒドロピリミジン脱水素酵素)とOPRT(オロテートホスホリボジルトランスフェラーゼ)の発現の有無と上記の実験における結果との関連についても検討を行っている.また,癌細胞そのものの有害事象の発現に対する関与について検索し,特に起炎性という点から5-FU作用後の癌細胞株の上清における炎症性メディエーターを検索し各々の培地間での比較を行っている.これまでに,臨床の場において口腔癌周術期および化学療法・放射線療法時における免疫栄養(グルタミンおよびアルギニン高含有栄養食品の使用による)の役割およびその効果について検討を重ねてきた.昨年度よりimmunonutrients(グルタミン・アルギニン)を低濃度から高濃度に含有した培地と非含有培地(通常培地よりグルタミン・アルギニンを完全に取り除いた)を用い口腔癌樹立細胞株(HSC-4, SAS, SCC-25)の培養を行い,細胞増殖能の検討を行っている.さらにこれらの細胞株に5-FU系薬剤を作用させ,抗腫瘍効果と栄養素濃度との関係についての検討を繰り返し行っている。また、これまでの研究(平成16年度18年度若手研究B)と関連する内容として,5-FUの代謝酵素のうち副作用の発現と関連するとされる酵素であるOPRT(オロテートホスホリボジルトランスフェラーゼ)、薬物代謝に強い関係のあるDPD(ジヒドロピリミジン脱水素酵素)の発現の有無と上記の実験における結果との関連についても検討を重ねている。あわせて、口腔癌の治療に多用されいている白金製剤であるCDDP(シスプラチン)も同様に作用させ、抗腫瘍効果と栄養素濃度との関連について検討を行っている。一方、昨年度より行っているがん細胞の有害事象の発現に関与する検索の中で起炎性について炎症性メディエーターを検索しているが、これについては、いまだ確かな結果を得られていない。
2価チタン錯体を用いる含窒素へテロ環化合物の効率的合成法の開発

近年、我々はTi(O-i-Pr)_4と2等量のi-PrMgX(X=Cl,Br)の反応で得られる錯体η^2-propene)Ti(O-i-Pr)_2(1)が二価チタン反応剤として働き、オレフィンやアセチレンなどの不飽和炭化水素との反応でこれら炭素-炭素不飽和結合がチタンに配位した有機チタン化合物が得られること、そして生成した有機チタン化合物がそのまま、あるいは他の有機チタン化合物に分子内変換された後カルボアニオン種として作用する一連の反応を開発してきている。。この反応剤を用いて達成できる反応は4つに大別される。ひとつはアセチレンとの反応でアセチレン-チタン錯体を生成させ、それを1,2-ビスメタロアルケンとして用いるもので、ふたつめは、アリルアルコール誘導体と1からアリルチタン反応剤を、そしてプロパルギルアルコール誘導体と1からアレニルチタン反応剤を直接合成し、アリル化剤およびプロパルギル化剤(場合によってはアレニル化剤)として、それぞれ利用するものである。三つめは、1を用いる不飽和エステル類の分子内求核アシル置換反応である。四つめは、ジエン、エンイン、およびジインの分子内カップリング反応であり、生成したチタン化合物の反応性を利用した環状化合物の新規合成法である。これらの反応を利用して含窒素へテロ環化合物およびその前駆体の合成を行った結果、1)キノロン、ピロール、インドールの簡便合成、2)アミノ酸を原料とする光学活性含窒素化合物の合成、3)ピロール-2-オンの合成、4)光学活性ピペリジン、ピロリジンの合成、5)β-ラクタムの合成、6)α-ヒドラゾアルキンの合成、7)アミノ糖の合成、8)各種α-アミノカルボニル化合物の合成に成功した。1)アントラニル酸、ピロール-2-カルボン酸およびインドール-2-カルボン酸のN-不飽和アルキル誘導体とAの反応が容易に進行し、分子内求核アシル置換生成物を収率よく与えることを見出した。それゆえ、これまで例のない新しいキノロン、[1,2a]-ピロールおよび[1,2a]-インドール誘導体の合成法が確立できた。天然より入手容易なα-アミノ酸をN-アリルおよびN-プロパルギル化した後、2価チタン等価体Aとの分子内求核アシル置換反応させることにより5員環および6員環-ヘテロ環状化合物が合成できることを見出した。N-プロパルギル誘導体との反応ではTi-アセチレン錯体を経由して環状のエノン化合物がえられ、一方N-アリル誘導体との反応ではTi-オレフィン錯体より環化し、β-チタナケトンを経て分子内カルボニル付加してビシクロ骨格のシクロプロパノール化合物が得られた。。2価チタンの反応性を利用することにより、アミノ酸から種々の光学活性含窒素ヘテロ環化合物の合成をすでに成功している(J.Am.Chem.Soc.,119,6984(1997))。本年度は、得られたヘテロ環化合物に存在するエノン部位およびシクロプロパン部位の反応特性を活用し、アミノ糖類の合成を行った。特に医薬品として大きな可能性を持つ、1-デオキシアミノ糖の実用的合成法を開発することに成功した。すなわち、セリンより合成したシクロプロパノール骨格を有す、含窒素環状化合物にFeCl_3つづいてNaOAcを作用させることにより、含窒素シクロヘキセノンの光学活性体の合成に成功した。この化合物は2環性オキサゾリジニルピベリジンに2工程で変換できた。そして、このピペリジン誘導体より各種1-デオキシアミノ糖の合成に成功した。

一方、2価チタンとアミノ基を有するアリルアルコール誘導体の反応により、光学活性アリルチタン化合物を合成し、このものとアルデヒドとの付加反応を反応位置および立体選択的に行うことに成功し、得られた光学活性1,5-アミノアルコニルの光学活性ピペリジンへの変換を収率よく達成させる道を拓き、実用的な各種ピペリジンの新しい合成法を開発した。イミンへの炭素求核剤の反応は、アミンおよび各種含窒素へテロ環合成法として有用である。また現代の有機合成において不斉合成が重要であることに鑑み、イミンへの炭素求核剤の不斉付加は最も多くの関心を集めている分野である。しかしイミンはカルボニル基に比べて反応性が低いため、多くの努力にも関わらず解決すべき大きな問題点を残されている。たとえばカルボニルと反応するホモエノラートアニオン種は種々開発され、現在では光学活性ホモエノラートアニオン種の開発にも成功している状況であるのに対し、イミンと反応するホモエノラートアニオン種は、光学不活性なものでさえ全く報告されていないという段階にある。我々は近年、アリルチタンがイミンと高立体選択性で反応することを見出した。この知見を基にアクロレインの1,2-ジシクロヘキシルエチレンアセタールを合成し、このものに2価チタン反応剤を作用させ、対応する光学活性アリルチタン誘導体を得ることに成功した。このようにして得たアリルチタンはイミンとアリル基のα-位で位置選択的に、かつ立体選択的に進むことを見出した。しかも光学活性ホモエノラートアニオンすなわちイミンと反応する初めてのホモエノラートアニオンの開発に成功した。
化学修飾したヨウ素架橋一次元複核白金錯体の構造と原子価状態の解明

本年度は,n-BuCS_2Hを配位子に用いてPt_2(n-BuCS_2)_4Iを合成し,示差走査熱量測定(DSC),結晶構造,電気伝導挙動,磁性について研究を行なった.DSC測定からPt_2(n-BuCS_2)_4Iは204212Kと318323Kの温度領域で相転移を起こすことがわかった.低温相(167K),中間層(298K),高温相(351K)の温度で結晶構造解析を行なった.いずれの場合も晶系は正方晶系であり,中性の一次元鎖-Pt_2(n-BuCS_2)_4-I-Pt_2(n-BuCS_2)_4-I-は結晶学的4回軸上に存在していた.相転移に伴い一次元鎖方向の周期は-Pt-Pt-I-の周期の2倍(低温相:P4/n),3倍(中間相:I4/m),1倍(高温相:I4/m)と変化することを明らかにした.低温相での白金-白金,白金-ヨウ素原子間距離からPt_2(n-BuCS_2)_4Iの原子価配列の様子を推定すると-Pt^<II>-Pt^<III>-I-Pt^<III>-Pt^<II>-I-(スピン-パイエルス状態)に近い状態であると考えられた.抵抗率の温度依存性を測定したところ,室温での電気伝導率は1743Scm^<-1>であり,DSCの結果と一致して,210Kと324K付近で抵抗率に跳びが認められた.低温相,中間相では,それぞれ活性化エネルギーが122meV,223meVの半導体的挙動を示した.熱電能の温度依存性から,高温相では金属的状態であることがわかった.磁化率測定から,低温側の転移点でスピンーパイエルス転移を起こしていることを明らかにした.このスピンーパイエルス転移はハロゲン架橋一次元複核白金錯体において最初に観測された例である.ヨウ素架橋一次元複核白金錯体Pt_2(MeCS_2)_4Iが示す興味深い金属的伝導挙動と構造相転移の相関を調べる目的から新規にPt_2(RCS_2)_4I(R=Et,n-Pr)を合成し,単結晶化に成功した.Pt_2(EtCS_2)_4Iの結晶構造の温度依存性を調べたが,硫黄原子の位置の乱れは認められなかった.輸送特性を調べたところ,高温側から204 Kまでは金属的状態が保持されることが明かとなった. Spring-8の放射光を用いて振動写真を撮影したところ,金属的状態では格子(周期:-Pt-Pt-I-)の2倍周期の散漫散乱が観測され,一次元鎖内で...pt^<2+>-Pt^<2+>...X-Pt^<3+>-Pt^<3+>-X...または...Pt^<2+>-Pt^<3+>-X-Pt^<3+>-Pt^<2+>...X...で表される周期配列の存在が示唆された.さらに,半導体状態にある低温では2倍周期のブラッグスポットへと変化した.これは金属状態では電子の非局在化により鎖間での相関がなかったものが,半導体では電子が局在化し鎖間での相関が生じたためと考えられる.一方,Pt_2(n-PrCS_2)_4Iは358 K付近で一次相転移を起こすことがDSCにより分った.輸送特性を調べたところ,低温側から330 Kまでは典型的な半導体であるが,これより高温側ではエネルギーギャップの小さい半導体挙動を示した.室温での振動写真では,-Pt-Pt-I-の周期の6倍周期に相当するブラッグスポットが観測されたが,330 Kから一次転移温度までは-pt--Pt-I-の3倍周期のブラッグスポットとこのときの格子の2倍周期に相当する散漫散乱が観測された.さらに高温側では-Pt-Pt-I-の周期に相当するブラッグスポットとこのときの格子の2倍周期に相当する散漫散乱が観測された.この錯体は温度変化とともに輸送特性と結晶構造が一致して変化することがわかった.本年度は,n-BuCS_2Hを配位子に用いてPt_2(n-BuCS_2)_4Iを合成し,示差走査熱量測定(DSC),結晶構造,電気伝導挙動,磁性について研究を行なった.DSC測定からPt_2(n-BuCS_2)_4Iは204212Kと318323Kの温度領域で相転移を起こすことがわかった.低温相(167K),中間層(298K),高温相(351K)の温度で結晶構造解析を行なった.いずれの場合も晶系は正方晶系であり,中性の一次元鎖-Pt_2(n-BuCS_2)_4-I-Pt_2(n-BuCS_2)_4-I-は結晶学的4回軸上に存在していた.相転移に伴い一次元鎖方向の周期は-Pt-Pt-I-の周期の2倍(低温相:P4/n),3倍(中間相:I4/m),1倍(高温相:I4/m)と変化することを明らかにした.

低温相での白金-白金,白金-ヨウ素原子間距離からPt_2(n-BuCS_2)_4Iの原子価配列の様子を推定すると-Pt^<II>-Pt^<III>-I-Pt^<III>-Pt^<II>-I-(スピン-パイエルス状態)に近い状態であると考えられた.抵抗率の温度依存性を測定したところ,室温での電気伝導率は1743Scm^<-1>であり,DSCの結果と一致して,210Kと324K付近で抵抗率に跳びが認められた.低温相,中間相では,それぞれ活性化エネルギーが122meV,223meVの半導体的挙動を示した.熱電能の温度依存性から,高温相では金属的状態であることがわかった.磁化率測定から,低温側の転移点でスピンーパイエルス転移を起こしていることを明らかにした.このスピンーパイエルス転移はハロゲン架橋一次元複核白金錯体において最初に観測された例である.
小児外科疾患に対する幹細胞とその微小環境制御を利用した再生医療

排便筋の発達の悪い鎖肛の患者の排便筋を再生させるために、骨格筋由来の筋芽細胞移植の有効性を検討し、さらに効率よく骨格筋の再生を起こさせるべく、gelatin hydrogel microsphereを用いたbFGFの徐放システムを併用して筋芽移植細胞の効率化を図ることを目指した研究を行った。徐放化bFGFによって、移植した筋芽細胞の生存率の向上効果とホストの骨格筋の再生促進効果がみとめられた。bFGFの徐放の効果は血管新生効果によるよりも、筋芽細胞の分化促進効果と筋繊維の再生促進効果によるものと考えられた。このように成長因子を併用した筋芽細胞移植は鎖肛患者の排便機能の改善に寄与することが期待される。1.小児外科疾患の代表である鎖肛の術後排便障害に対する再生医療の可能性について研究を行った。鎖肛における括約筋の低形成による排便機能障害を改善させる目的で、括約筋の再生による治療の可能性について検討した。ラット筋芽細胞を採取し、培養増幅してラットの下肢の筋欠損部に移植して筋肉の再生が起こるかどうかについて検討した。移植したGFPで標識した筋芽細胞はホストの筋の再生に関与することが確認された。ただし、生着した移植細胞の数はきわめて少なく、この効率を高めていくことが課題であると考えられた。そこで、in vitroで筋芽細胞に作用する成長因子について検討を行うとともに、現在、筋芽細胞の増殖促進作用を持つbFGFを用いて効率を上げられるかどうかについて検討中である。bFGFを含浸したgelatin microsphereをもちいた徐放化システムを用いてこの筋芽細胞の生着率を上げるべく研究を続けている。2.ラット羊膜細胞がin vitroで神経系の細胞に分化する可能性を示し論文にまとめた。これをラットの低酸素脳症モデルを用いてラベル化した羊膜細胞を脳内に移植する実験を行った。移植細胞は4週間後に脳内に生存していることが確認された。今後、神経細胞に分化するかについて検討する予定である。ラット筋芽細胞を採取し、培養増幅してラットの下肢の筋欠損部に移植して筋肉の再生が起こるかどうかについて検討し移植細胞の生着率を高めるために、筋芽細胞の増殖促進作用を持つbFGFを用いて効率を上げられるかどうかについて検討した。bFGFを含浸したgelatin microsphereをもちいた徐放化システムを用いて検討した結果、bFGFの徐放化システムを併用することで、細胞の生着率が上昇することが判明した。さらに、ホストの筋において再生状態を反映する核の中央化が著明に見られたことより、bFGFによってホストの筋組織そのものの再生を促進することが判明した。2.筋芽細胞から筋シートを作成する実験を行い、最適の条件について検討中である。今後、さらにこの研究を発展させ、筋シートの作成に成功すべく実験を行っていく予定である。3.気管再生についてPLGAとコラーゲンのハイブリッドscaffoldを用いた再生実験を行い、bFGFの存在下で軟骨再生が促進することを報告した。小児外科疾患の代表である鎖肛の術後排便障害に対する再生医療の可能性について研究を行った。鎖肛における括約筋の低形成による排便機能障害を改善させる目的で、骨格筋の再生による治療の可能性について検討した。これまでにEGFPラット筋芽細胞を採取し、培養増幅してラットの下肢の筋欠損部に移植して筋肉の再生が起こるかどうかについて検討し移植細胞の生着率が低いことが判明したため、生着率を高めるために、筋芽細胞の増殖促進作用を持つbFGFを用いて効率を上げられるかどうかについて検討した。京都大学との共同研究でbFGFを含浸したgelatin microsphereをもちいた徐放化システムを用いて検討した結果、bFGFの徐放化システムを併用することで、EGFPの発現量の計測から細胞の生着率が上昇することが判明した。さらにbFGFの効果について検討するめるために移植1か月後と10か月後の検体を用いて再生部の筋組織について、骨格筋関連遺伝子の発現に対するbFGFの影響について詳細に検討すると共に再生部位でのbFGFの血管新生の効果についても検討し、現在結果を解析中である。筋芽細胞から筋シートを作成することを目的に工学的手法を用いて骨格筋のin vitroでの構築実験を行い、骨格筋の再生に最適な足場の条件を検索し、構築した筋管細胞の太さや動態について検討した。現在、in vitroで収縮する筋組織の構築に成功しており、今後、さらにより効果的な骨格筋構築を目指して、この研究を発展させ、筋シートの作成に成功すべく実験を行っていく予定である。

bFGF徐放を利用した骨格筋再生実験gelatin hydrogel microsphereを用いたbFGFの徐放システムを併用して筋芽移植細胞の効率化を図ることを目的とした。EGFP発現ラットの大腿筋部骨格筋より筋芽細胞を採取し、野生型ラットの大腿筋の人為的筋欠損部に移植し、bFGFの徐放化群(Ex群)と筋芽細胞移植のみの群(C1群)および筋芽細胞とゼラチンハイドロゲルのみの群(C2群)の2つのコントロール群を作り、4週間後に移植組織における組織学的検討および定量RT-PCRによる遺伝子の発現について検討し比較を行った。結果、1EGFPの発現量はEx群で有意に高く、移植細胞の生存率が上昇していた。2Ex群では筋繊維の「核の中心化現象」が有意に多く観察され、ホストの筋繊維再生の促進効果が観察された。3CD31の発現はEx群でコントロール群に比べて高かったものの有意差は認められなかった。4Ex群においてMyogeninの高発現とMyoDの低発現が観察され、筋芽細胞から筋管細胞への分化促進が示唆された。本研究により、徐放化bFGFによって、移植した筋芽細胞の生存率の向上効果とホストの骨格筋の再生促進効果がが確認された。この効果はbFGFの徐放の効果は血管新生効果によるよりも、筋芽細胞の分化促進効果と筋繊維の再生促進効果によるものと考えられた。マイクロパターニング技術を用いた骨格筋の再生細かな溝を利用して細胞を整列させることによって、筋芽細胞から筋シートを作成することを目的に工学的手法を用いて骨格筋のin vitroでの構築実験を行い、骨格筋の再生に最適な足場の条件を検索し、構築した筋管細胞の太さや動態について検討した。in vitroで収縮する筋組織の構築に成功した。本研究により効果的な骨格筋構築に向けて大きな成果が上がった。現在データを解析中であり、今後、成果を発表していく予定24年度が最終年度であるため、記入しない。他施設との協力体制を強化し共同研究を推進していく予定24年度が最終年度であるため、記入しない。
流動要素法の基本的拡張と適用性に関する研究

FLEMの基本概念は既に構築済みで有るので,本研究では,拡張・適用を主目的として研究を進めた.FLEMは,updated Lagragianの定式化に沿っている.各増分過程でどのような応力速度を定義すれば妥当か検討した.連続体スピンに変えて,物質スピンを導入した解析を実施した.その結果,連続体スピンで見られた単純せん断下の応力の振動は解決することが出来た.b.間隙水の連成-液状化問題への適用飽和砂質地盤の液状化問題への解析手法の発展を行なった.双曲線モデルにダイレイタンシーを考慮した構成式を導入した.繰返し荷重下の有効応力と間隙水圧の変化を示した.c.線要素の導入構造物と地盤の応答解析への適用を目指して,梁要素の導入し,動的解析を行なった.固有振動数,共振現象など基本的事項について確認した.d.3次元解析へのFLEMの拡張3次元解析プログラムを開発し,トンネルの変形解析に適用した.中間主応力の大きさと方向の変化がどのように切羽近傍の変形に影響を及ぼすのか検討した.FLEMの基本概念は既に構築済みで有るので,本研究では,拡張・適用を主目的として研究を進めた.FLEMは,updated Lagragianの定式化に沿っている.各増分過程でどのような応力速度を定義すれば妥当か検討した.連続体スピンに変えて,物質スピンを導入した解析を実施した.その結果,連続体スピンで見られた単純せん断下の応力の振動は解決することが出来た.b.間隙水の連成-液状化問題への適用飽和砂質地盤の液状化問題への解析手法の発展を行なった.双曲線モデルにダイレイタンシーを考慮した構成式を導入した.繰返し荷重下の有効応力と間隙水圧の変化を示した.c.線要素の導入構造物と地盤の応答解析への適用を目指して,梁要素の導入し,動的解析を行なった.固有振動数,共振現象など基本的事項について確認した.d.3次元解析へのFLEMの拡張3次元解析プログラムを開発し,トンネルの変形解析に適用した.中間主応力の大きさと方向の変化がどのように切羽近傍の変形に影響を及ぼすのか検討した.
トランスグルタミナーゼの神経系における役割りについて-神経再生の分子機序解明-

金魚の視神経は哺乳類と異なり再生し、46ヵ月で視覚機能も完全に回復する。この長い再生過程(46ヵ月)で働く分子を同定しその機能を追求することはきわめて重要である。本研究では特に視神経切断後早期に切断端からの再生神経線維の伸長に働く分子の同定を目指した。視神経切断後5日目の網膜からmRNAを抽出しcDNAを合成しcDNAライブラリーを作製した。ディファレンシャルハイブリ法で対照(無処置)と比べて視神経切断5日目に発現が増加(upregulation)するcDNAクローンをスクリーニングした。そのクローンの塩基配列を決定しDNA data baseの検索から、トランスグルタミネース(TG)やNa, K-ATPase α3サブユニットをコードする遺伝子が捕捉された。ISH法や免疫組織化学法によりTGやNa, K-ATPase α3の視神経切断後の経時変化を調べた所、網膜神経節細胞にのみ切断早期に発現が上昇し、Na, K-ATPase α3は10日目、TGは20日でピークとなりその後徐々に対照群のそれに復した。また、成熟金魚の視神経をあらかじめ切っておき(57日前)、網膜片を作製し培養すると神経節細胞から神経突起が伸長(神経再生のin vitro系の確立)する。この培養系にTG抗体やNa, K-ATPase α3の特異的阻害剤ウアバインを添加すると、神経突起の伸長が完全に抑えられた。このことからTGやNa, K-ATPase α3は視神経再生初期の再生線維の伸長に重要な役割を果たしていることがわかる。今後この遺伝子クローニング法を駆使して再生各時期に働く遺伝子を見つけたいと思っている。また、遺伝子改変動物を作製し、その遺伝子の機能も明らかにしたい。タンパク質架橋酵素トランスグルタミネース(TG)は、血液凝固や皮膚の角質化、神経細胞の凝集など種々の機能や疾患に関連していることが報告されている。今回我々は特に神経再生過程における役割を探る目的で金魚視神経切断後5日目の網膜cDNAライブラリーを作製し網膜TG cDNAをクローニングした。TGの翻訳領域全長の塩基配列及び推測される678個のアミノ酸を決定した。この塩基配列中にはTG酵素活性部位やCa^<2+>結合部位が存在していた。更にTG mRNAの発現量を調べるため視神経切断後の各時期での網膜および視神経の標的器官である視蓋での発現をノーザン法で調べた。その結果、TGmRNAは、視神経切断後早期(57日目)に上昇し約10日で7倍とピークを示しその後減少した。このmRNAの時間経過は、酵素活性の時間経過よりやや先行していた。この早い時期でのTGの誘導は再生軸索が伸長する前であることより、TGの役割としては何かclean upの様な機能を想定できる。現在mRNAの局在部位をin situハイブリダイゼーション法にて検索中である。また、このTG cDNAクローンの翻訳領域全長をプラスミドDNAに挿入し大腸菌にて増やしたところ、約75kdのTG蛋白のバンドが回収できた。この合成蛋白は有意のTG酵素活性を有していた。今後このリコンビナント蛋白を用い、抗体を作製し、TGの局在を調べたい。更に神経損傷部位にこのリコンビナントTGを注入添加したり、抗体を注入することで神経再生へのTGの役割を明らかにする予定である。神経再生時に誘導のかかる酵素の一つにトランスグルタミネース(TG)がある。TGはタンパク質架橋酵素であり上皮細胞型、組織型、神経型等が知られている。しかし本酵素の神経系における役割や細胞局在に関しては不明なことが多い。特に中枢神経系の軸索再生時については殆ど報告がない。そこで我々は金魚視覚神経を神経再生のモデルとしてTGの役割を検索した。まず、金魚網膜TGcDNAをクローニングし全塩基配列を決定した。

更にこのcDNAを大腸菌DNAに挿入しTGの融合タンパク(分子量約75kD)を作成し活性のあるリコンビナントTGタンパクを入手した。次いでウサギにリコンビナントTGタンパクを注射し、抗TG抗体を作製した。この抗体やmRNA(cDNA)をプローブとして視神経切断後の網膜を経時的に免疫組織化学やin situハイブリ法で比較検討した。その結果、視神経切断後TG発現が510日から有意に上昇し、2030日でピークとなりその後5060日で正常に復した。この発現上昇の局在は網膜神経節細胞に限局していた。金魚の視神経線維の再生は切断710日位で開始されるので、この時期と一致する。TGの誘導は金魚の視神経再生線維の伸長に何らかの役割を演じていると考えられる。更に抗血清を精製しTGの中和抗体による再生伸長の抑制の実験を試みたところ、成熟網膜培養系において網膜片からの神経突起の伸長をこのTG抗体が濃度依存的に抑制したことにより、TGの神経突起伸長作用がより明瞭に証明された。現在その内在性の基質を探索しているところである。
東北アジアにおける定着的食料採集社会の形成および変容過程の研究

アムール川下流域においてロシア人研究者と共に国際共同発調査を実施した。その結果、層位と放射性炭素年代測定によりアムール川下流域における新石器時代の編年(コンドン文化→マルィシェヴォ文化→ヴォズネセノフカ文化)を確立することが出来た。そして、コンドン文化の文化内容を明らかにすることが出来た。これらの成果によりアムール川下流域における新石器時代の文化変遷をより具体的に捉えられるようになった。新石器時代における東シベリア地域との交渉関係も明らかにすることが出来た。(1)アムール川下流域は極東平底土器の一角を占めており重要な地域であるが、いまだ研究の遅れた地域でもある。日本の縄文時代に対応するアムール川下流域の新石器時代はその最も基本となる編年すら不明確である。そのため、当該地域の新石器時代から初期金属器時代にかけての編年を確立する。明らかにする点は、アムール川下流域の新石器時代から初期金属器時代における食料採集民の生業活動と集落形態の変遷である。(2)北日本とアムール川下流域との関わりを明らかにする。北海道東部の縄文時代早期やサハリン南部の新石器時代には、石刃鏃文化と呼ばれる、大陸との関連が考えられている段階がある。ところが、それに対応と考えられているものは、アムール川中流域や沿海州の新石器時代遺物群であり、もっとも肝心のアムール川下流域の対応する段階は分かっていない。これを明らかにする。(3)アムール川下流域にはときにシベリア地域のより北方の文化が波及することが知られている。アムール川下流域は、極東地域と東シベリア地域の接点であり、東シベリア系の文化がアムール川下流域でどのような動きをしたのかを、具体的な発掘資料をもとに把握する。この三つが本研究課題の大きな柱である。アムール川下流域の新石器時代多層位遺跡として著名なマラヤ・ガバニ遺跡の発掘調査をロシア側の共同研究者とともに夏季8月に実施した。かつてロシアの研究者によって調査された際の発掘区に隣接する地点に発掘区を調査することにより、かつての調査の成果は簡単な報告しかないためその内容を明らかにすることに努めた。発掘調査では最上層から鉄器時代の遺物が出土したが、主体となる層ではアムール川下流域の新石器時代を代表する三つの文化、コンドン、マルイシェヴオ、ヴォズネセノフ文化の遺物、遺物を検出し、それらの間の相対的な序列をほぼ確定することができた。またそれぞれ各文化期の細別を考えるための良好な資料を得ることができた。また、これらのアムール川下流域に典型的な土器群の他に、シベリアのベリカチ文化の土器も多く出土し、このアムール川の最下流地域が新石器時代に極東とシベリアの接点となっていたことが確かめられた。これらの発掘した調査資料は、冬季の12月にハバロフスクを訪れて、夏季発掘資料の整理作業をロシア側共同研究者とともに実施した。出土した土器の図面作成、拓本作成、写真撮影を行った。また、出土した石器についても図面作成、写真撮影を行った。これに併行して、国内では土器付着炭化物の年代測定を実施したが、さらに次年度以降測定数を増やす予定である。次年度繰越分の作業として、翌年に継続して出土した遺物の図面整理をおこなった。昨年度に引き続きアムール川下流域の多層位遺跡であるマラヤ・ガバニ遺跡の発掘調査をロシア側の共同研究者とともに夏季8月に実施した。昨年度の発掘区に隣接する地点に発掘区を二カ所設定し調査することにより、変遷過程の実態をより明らかにすることに努めた。発掘調査では最上層から鉄器時代の遺物が出土したが、主体となる層ではアムール川下流域の新石器時代を代表する三つの文化、コンドン、マルイシェヴォ、ヴォズネセノブ文化の遺物、遺物を検出し、それらの間の相対的な序列を今回もほぼ確定することができた。また、これらのアムール川下流域に典型的な土器群の他に、シベリア尖底土器系のベリカチ文化はこのアムール川の最下流地域の新石器文化の中ではマルイシェヴォ文化との関係が深いことが確かめられたが、両者の具体的な関係はまだ分析を必要としている。これらの発掘した調査資料は日本に持ち帰ることはできないため、今回も冬季の12月にハバロフスクの博物館を訪れて、夏季発掘資料の整理作業をロシア側共同研究者とともに実施した。また、この間にロシア側共同研究者と夏奉の調査成果について討議を行った。昨年度及び今年夏季の発掘調の際に現地で作成した図面や撮影した写真の整理を国内で実施した。これに併行して、国内では周辺地域との比較研究を推進するため資料収集をおこなった。

今年度は昨年度までの遺跡とは異なり、より上流のハバロフスク周辺に位置する遺跡(クニャーゼ・ヴォルコンスコエ1)を選定し、夏8月約2週間にわたって日露共同で発掘調査をおこなった。大きな発掘区を二つ設置し地山まで掘り下げた。アムール川下流域の新石器時代を代表する文化であるコンドン文化の年代的位置、およびその文化内容の実態が従来不明なままであったが、この遺跡はコンドン文化の単純遺跡であり、コンドン文化の解明のために調査した。冬にこの夏季発掘資料を整理するためにハバロフスクの博物館に赴き、出土遺物の図面作成、写真撮影などの資料整理を行った。そして、発掘調査時に採取した資料から年代測定を実施した。まだ分析は完全には終了していないが、コンドン文化期の土器の実態が明らかとなり、後続するマルイシェヴォ文化との分離が可能となり、また石器組成では石刃が主要な素材となっていること、それを用いた石刃鏃の存在がより確実となった。年代測定も未だ途中であるが、確実な年代測定値が従来ほとんど無かったコンドン文化期の年代測定値の数が増したことでほぼ年代を特定することができるようになった。また、代表者は従来コンドン文化に代表されるアムール編目文土器諸文化を三段階に分けているが、この遺跡の資料はコンドン文化期の土器の年代的細別を考える上で重要な資料となるであろう。石刃鏃も東北アジアの新石器時代前半に広域に分布した特徴的な石器であり、周辺地域の諸文化との比較を可能とする重要な石器である。昨年度までの層位的に出土したマラヤ・ガバン遺跡での発掘資料と今回の単純遺跡での調査成果を総合することにより、アムール川下流域の新石器文化の変遷をかなり解明することができた。本年度は、研究計画通り、夏季にアムール川下流域のキジ湖周辺の分布調査、冬季にロシア・ハバロフスク市およびマガダン市の所蔵資料の調査を実施した。キジ湖は間宮海峡と近接しており、大陸-サハリン間の文化交流論のなかで注目される地域である。しかし、先史時代遺跡の調査はほとんど実施されておらず、過去に於いて当地域の果たした役割は解明されていない。そこで、本年度はキジ湖畔周辺で日露共同遺跡踏査を行い、その実態解明を目指した。本調査では、近隣地域における先史遺跡の立地条件を参考とし、主要な岬周辺と小高い台地上で試掘を行った。その結果、キジ湖北東部および中央部の試掘坑(チルバ1遺跡、サンニキ1遺跡)において遺物を確認した。両試掘孔の遺物は古金属器時代以降のものと考えられるが、今のところ詳細な時期を特定できていない。ほかの地点では、遺跡の存在を確認していない。現状において、キジ湖畔の遺跡群をアムール川に面した遺跡群と連続的に捉えることは困難である。キジ湖畔の遺跡踏査と並行して、ハバロフスク地方郷土誌博物館で、ダリジャ湖畔のダリジャ13遺跡とウディリ湖畔のロガチョフスキー島(カリチョーム7)遺跡の出土遺物を調査した。ダリジャ2遺跡出土資料には、東シベリア系のスィアラフ文化(新石器時代前期)、ベリカチ文化(同中期)に関係する土器片が確認され、アムール下流域と東シベリアの文化交流を考える上で重要な所見を得た。マガダン市では、北東国立大学・ロシア科学アカデミー極東支部北東地域複合科学研究所において、カムチャッカ半島やコリマ川流域に所在する新石器時代遺跡群の出土遺物を調査した。
急性心筋梗塞患者の階段歩行労作時における循環動態と看護援助法に関する検討

急性心筋梗塞患者の階段歩行労作時における看護援助法の確立をめざし、血行力学的観点から検討を行った。対象および方法:急性心筋梗塞患者73例、健常者31例を対象とし、階段歩行労作に関し、臥位3分、立位3分、廊下歩行50m、2階段下り、2階段上り、廊下歩行50m、および臥位時における収縮期血圧、拡張期血圧、心拍数、PRPおよび心電図の変化を1分毎に観察し、病態との関連を吟味した。結果:1)急性心筋梗塞患者の階段歩行労作においては、これまでに提示したいずれの日常生活労作よりも、コントロ-ル値に比べPRPの著明な増大が示されたが、ST偏位の異常は認められなかった。また、健常者では、これらとほぼ同様な変化であったが、階段上り直後においては、心筋梗塞患者に比べ、PRPの有意な増大が示された(P<0.025)。2)階段歩行労作後の回復時間は、健常者では、平均1.19分で回復したのに比べ、心筋梗塞患者では、1.87分に延長した。3)60才以上の高令患者では、60才未満群に比べ、PRPの増大は有意に軽度であった(P<0.025)。4)EF、梗塞部位、病日との関連は認められなかった。5)心室性期外収縮の散発例が1例示された。考察:階段歩行労作時においては、心筋酸素消費量の著しい増大が示されたが、急性心筋梗塞患者は、健常者に比べ、PRPの増大は、有意に軽度であった。また、労作後の回復過程においても有意な延長が示され、心機能の低下が示唆された。さらに、高令の心筋梗塞患者においては、加令による心機能および末梢循環機能の不安定性が認められた。したがって、階段歩行労作時の看護援助に際しては、高令者、および回復時間の延長が著しい事例に注目する必要があると思われる。
心筋ミオグロビンの新しい機能

今回の研究では、過去に科学研究費補助金を用い開発した細胞内酸素濃度およびミトコンドリア代謝の超高解像度画像化システムを用い(1)果たして心筋細胞内部の酸素拡散がミトコンドリアの好気的代謝を制限する要因となり得るか、(2)もしそうならばミトコンドリアのエネルギー産生は、どのようにして拡散性酸素供給の不足に適応するのか、(3)そのとき細胞質に存在するミオグロビンはどのような生理的機能を果たすのか、を追求した。その結果、ラット心室筋細胞内部では、酸素拡散はミオグロビンにより加速されるものの、その速度は当初予想されていたよりはるかに緩慢で、細胞(ミトコンドリア)の酸素需要が中等度増加した際には、拡散による酸素供給が追いつかなくなり、細胞の中心部分に酸素不足領域(hypoxic core)が形成されることを画像化することができた。このhypoxic coreは、ミトコンドリアの好気的代謝を抑制し、細胞中心部に代謝制限領域(anoxic core)を形成するおそれがあるが、正常なミトコンドリアにおいては、その内因性制御機構(呼吸調節)により、anoxic coreの形成が回避され得ることを明らかにした。これらの結果は、特に心肥大が心不全の転帰をたどるメカニズムを理解する上で意義深い。すなわち種々の容積あるいは圧負荷に対する生理的代償として心筋細胞の肥大がおこるが、これは毛細血管から細胞中心部までの酸素拡散距離を拡大し、細胞中心部にhypoxic coreを形成する。これは細胞のエネルギー産生に対し潜在的な脅威となる。このことに加え、肥大心筋で報告されているミトコンドリア呼吸調節の異常により、正常心筋では回避され得るanoxic coreの形成が加速され、最終的には、心筋に不可逆的なエネルギー不足が生じるものと予想される。以上のメカニズムの実験的検証が今後の課題である。本研究は、心筋組織中に比較的多量に含まれるミオグロビンが、従来考えられてきた(1)短時間の酸素貯蔵、(2)細胞内酸素拡散を増強する促進拡散担体、という機能に加えて、(3)心筋組織中で発生した活性酸素種(ROS)の消去作用をもつ、という仮説を検討しようというものである。この目的のため、今年度は、単離心筋細胞を用い、細胞内の活性酸素の量を蛍光法で定量し、つづいて内因性に活性酸素を生成することが可能かどうかを検討した。単離心筋細胞を細胞膜透過型の活性酸素(おもにH_2O_2)指示蛍光試薬であるH_2DCF/DA(5μM)またはcarboxyH_2DCF/DA(10μM)と35°Cで30分間インキュベートをした後、細胞をHEPESバッファにて洗浄、実験に供した。細胞外に50ないし100μMのH_2O_2を加えると、DCF蛍光強度はベースラインの約5倍に増加し、本法で細胞内のROSレベルを推定できることがわかった。次に、単離心筋細胞を気密キュベットにいれ、細胞外を10%酸素で表面灌流した後、細胞外酸素濃度を1%に低下させ30分間灌流を行ったところ、DCF蛍光は低酸素灌流と共に低下した。この結果は、培養心筋細胞に低酸素負荷を与えるとDCF蛍光が大きく増加するとしたSchumackerらの報告(JAP88:1880-1889,2000)と異なるものである。外因性H_2O_2に対するDCF蛍光の増加は、5mM NaNO_2を用い予めミオグロビンを不活化した細胞において、増加傾向を示した。これは、本研究の仮説を支持する結果である。

最近、本研究と同様の目的を持った研究の成果が出版された(PNAS98:735-740,2001)ため、本研究をより迅速に遂行する必要がある。今回の研究では、過去に科学研究費補助金を用い開発した細胞内酸素濃度およびミトコンドリア代謝の超高解像度画像化システムを用い(1)果たして心筋細胞内部の酸素拡散がミトコンドリアの好気的代謝を制限する要因となり得るか、(2)もしそうならばミトコンドリアのエネルギー産生は、どのようにして拡散性酸素供給の不足に適応するのか、(3)そのとき細胞質に存在するミオグロビンはどのような生理的機能を果たすのか、を追求した。その結果、ラット心室筋細胞内部では、酸素拡散はミオグロビンにより加速されるものの、その速度は当初予想されていたよりはるかに緩慢で、細胞(ミトコンドリア)の酸素需要が中等度増加した際には、拡散による酸素供給が追いつかなくなり、細胞の中心部分に酸素不足領域(hypoxic core)が形成されることを画像化することができた。このhypoxic coreは、ミトコンドリアの好気的代謝を抑制し、細胞中心部に代謝制限領域(anoxic core)を形成するおそれがあるが、正常なミトコンドリアにおいては、その内因性制御機構(呼吸調節)により、anoxic coreの形成が回避され得ることを明らかにした。これらの結果は、特に心肥大が心不全の転帰をたどるメカニズムを理解する上で意義深い。すなわち種々の容積あるいは圧負荷に対する生理的代償として心筋細胞の肥大がおこるが、これは毛細血管から細胞中心部までの酸素拡散距離を拡大し、細胞中心部にhypoxic coreを形成する。これは細胞のエネルギー産生に対し潜在的な脅威となる。このことに加え、肥大心筋で報告されているミトコンドリア呼吸調節の異常により、正常心筋では回避され得るanoxic coreの形成が加速され、最終的には、心筋に不可逆的なエネルギー不足が生じるものと予想される。以上のメカニズムの実験的検証が今後の課題である。