hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細菌、ウイルス感染による細胞極性の破綻と前立腺癌発生、進展機構の解明

本研究では前立腺癌の発生や進展に関与する細菌やウイルスの同定を試みた。また、感染による細胞極性の破綻と前立腺癌の発生や進展の関係について明らかとすることを目的とした検討を行った。その結果、前立腺癌に特異的に感染する細菌やウイルスの同定には至らなかった。一方、感染と慢性炎症という観点から、脂肪細胞由来のMCP-1が前立腺癌の進展に重要であることを見出した。さらに、炎症性サイトカインの産生や細胞極性にも重要な分子であるatypical protein kinase Cの高発現が正常前立腺細胞を癌化させる可能性を見出した。癌の発生や進展には様々な要因が重要であるが、慢性的な炎症による細胞内外の様々な異常も癌の発生や進展に深くかかわっている。炎症を引き起こす原因として細菌、ウイルスの感染が挙げられ、また細菌やウイルスの構成分子そのものも癌の発生や進展に重要であることが明らかとなりつつある。本研究では前立腺癌の発生や進展に関与する細菌・ウイルスの同定と前立腺癌への関与を明らかとすることを目的として、検討を行った。サンプルとして、研究の使用について十分な説明をおこない、研究使用の同意を得たヒト前立腺癌検体及び同一検体中に含まれている正常前立腺組織の各々より抽出したRNA及びDNAを使用した。抽出したRNAやDNAについて、PCR及びシークエンス解析、microarray等を用いて、前立腺癌組織中に含まれる細菌やウイルスの核酸検出を試みた。また、細菌やウイルスの感染によって、様々な細胞内シグナル伝達経路の活性化が起こることが知られている。その構成分子であり、極性関連分子であるaPKCの機能について、正常前立腺細胞株を用いた解析を行った。その結果、前立腺癌の発生や進展に関与すると考えられる細菌やウイルスの同定には至っていない。一方、正常前立腺細胞株を用いた解析からaPKCの発現や活性が前立腺癌の発生に関与することを示唆する結果が得られた。細菌やウイルスの感染が癌の発生や進展に関与することが知られている。一方で、前立腺癌の発生や進展と細菌やウイルスの感染の関係については不明である。そこで、本研究では、前立腺癌の発生や進展に関与する細菌やウイルスの同定を試みた。また、感染による細胞極性の破綻と前立腺癌の発生や進展の関係について、明らかとすることを目的とした検討を行った。研究使用の同意を得た前立腺組織よりRNAやDNAを抽出し、PCRやマイクロアレイを用いて、細菌やウイルスの同定を行った。その結果、前立腺癌組織や正常前立腺組織に特異的に感染することを示す細菌やウイルスは認められなかった。しかしながら、Epstein-Barr virus(EBV)は前立腺癌組織や正常前立腺組織で多くの感染を認めた。EBVはバーキットリンパ腫や胃癌との関係が明らかとなっていることから、前立腺癌の発生や進展にも何らかの関与がある可能性が示唆された。また、感染による慢性炎症やそれに伴う炎症性サイトカインの産生は前立腺癌の発生や進展に重要と考えられていることから、前立腺細胞以外に感染した場合を想定したパラクライン作用による前立腺癌の発生や進展の可能性についても検討を行った。その結果、脂肪細胞由来のMCP-1が前立腺癌の増殖や浸潤に関与していることを見出した。その他、細胞極性の維持や炎症性サイトカインの産生に重要な分子であるatypical protein kinase Cと前立腺癌の発生について、正常前立腺細胞を用いた検討を行い、aPKCが正常細胞で高発現や機能低下などの異常が起きることで、細胞極性が破綻することを見出した。さらに、aPKCが高発現することで、正常前立腺細胞が癌細胞へと変化する可能性を見出した。平成26年度は前立腺癌組織を用いて細菌及びウイルスの核酸の同定を進めてきたが、現在までのところ、前立腺癌組織に特異的に検出された細菌やウイルス検出は同定出来ていない。しかしながら、前立腺組織中に存在すると考えられるウイルスを検出出来ている。また、感染に密接な関係を持つケモカインであるMCP-1による前立腺癌進展機構について明らかとした。その他、前立腺癌の感染によって活性化する極性分子であるaPKCの機能解析から、正常前立腺細胞中でaPKCの活性が増加することで、細胞の極性が破たんし、また癌化へ進むことを示唆する多くのデータを取得している。これらのことから、研究全体としてはおおむね順調と評価した。分子腫瘍学今後の予定として、引き続き前立腺癌の発生や進展に関与すると思われる細菌やウイルスの同定を試みる。また、平成26年度に行ってきた組織中の細菌及びウイルス核酸の検出に加えて、免疫染色等の手法を用いて、前立腺組織中に含まれる細菌やウイルスのタンパクの検出を試みる。また、平成26年度の結果より、正常前立腺組織及び前立腺癌組織のどちらにも存在するウイルスが検出されている。

本検討で使用している正常前立腺組織は前立腺癌組織と対になっているものであることから、前立腺癌の発生や進展には前立腺組織全体に感染したウイルスによる炎症によって増加する炎症性サイトカインやケモカイン等が直接的もしくは間接的に前立腺細胞に作用することで、一部の前立腺細胞を癌化させている可能性が示唆される。そこで、前立腺組織中の細菌やウイルスの検出と同時に、感染によって増加する炎症性サイトカインやケモカインによる前立腺細胞の変化についても検討を行う。また、細胞株を用いた検討から、aPKCが前立腺癌の発生にも重要な機能を持つ可能性を示唆する結果を得ていることから、今年度もaPKCを中心とした前立腺癌の発生と進展機構について詳細な検討を進めて行く予定である。
癌におけるaPKCλ/ι-IL6経路の役割(乳癌、前立腺癌を中心に)

細胞極性因子aPKCλ/ιは癌で高発現する。本研究では以下の3点を示した。1)aPKCλ/ιが子宮頸癌および前癌病変CINにおいて発現が亢進しており、進行にしたがって核内集積を示すこと、2)aPKCλ/ι遺伝子を移入した正常前立腺癌細胞は増殖能、運動能、浸潤性の亢進を示す。aPKCλ/ιが前立腺癌発生に寄与している可能性が示唆された。3)aPKCλ/ι-p62-GLOIの共発現乳癌が予後不良で、in vitroではaPKCλ/ι, p62, GLOIとの阻害剤併用は、共発現乳癌細胞株に強い増殖・生存抑制効果があった。乳癌におけるaPKCλ/ιシグナリングと糖代謝機構との関連性が示唆された。aPKCλ/ιは細胞極性を規定するとともに多くの癌での高発現する。本研究では1)細胞極性規定分子aPKCλ/ιおよびその下流分子IL6の各種難治癌における発現と、臨床病理学的因子との相関について調べる。2) aPKCに対する免疫細胞化学染色により、尿、体腔液中の癌細胞検出系を確立する。3)aPKCλ/ι阻害薬(aurothiomalate),IL6阻害薬(tocilizumab)がaPKCλ/ι, IL6高発現腫瘍細胞株に与える増殖抑制効果を検証し、治療標的としての可能性を検討する。LST 24例、平坦陥凹型病変13例、ポリープ状病変20例についてaPKCλ/ιの発現と局在を免疫組織化学的に検討した。LST-腺腫の86.6%とLST-癌の55.6%ではaPKC λ/ιは正常粘膜に比してやや高い発現を示した。これに対しポリープ状腺腫やポリープ内癌では高発現がみられた。このことからaPKCλ/ιは大腸腫瘍性病変の熱い区形式に影響を与えると考えられた。一方、子宮頸がんの前がん病変であるCINを検討したところ、CIN1→CIN2→CIN3と病態が進行するに従い、aPKCλ/ιの発現が増強すること、かつCIN1, CIN2においては経過観察中に進行した症例においてaPKCλ/ιが核に局在していた。このことはaPKCλ/ιがCINの程度の員団とともに信仰の予測に有用なマーカーであることを示す。われわれは、正常上皮で細胞極性を制御しているatypical protetein kinase λ/ιが各種癌(乳癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌など)で高発現をし、oncogenicに作用することを示してきた。本年度は,子宮頸癌の前駆病変であるCervical Intraepithelial neoplasm (CIN)におけるaPKCλ/ιの発現と細胞レベルでの局在を検討した。また、ヒトパピローマウイルス(HPV)との関係についても検討を行った。対象は192例のCIN、および13例の正常子宮頸部組織を用いた。aPKCλ/ιの過剰発現は正常上皮, 7.7%; CIN1, 41.7%; CIN2/3, 76.4%であった。aPKCλ/ιの核内局在は正常上皮, 0.0%; CIN1, 36.9%; CIN2/3, 78.7%であった。すなわちCINのグレードはaPKCλ/ι過剰発現と各局在に正相関していた。次に140例のCINを後方視的に検討し、4年間の累積進行率をCoxハザードモデルを用いて検討した。aPKCλ/ι過剰発現または各局在を伴ったCIN1は、正常発現または細胞質内局在症例よりも進行率が優位に高かった。多変量解析解析で、HPV16, 18感染, aPKCλ/ι過剰発現およびaPKCλ/ι各局在は独立したCIN1の進行危険因子であることがわかった。以上よりaPKCの過剰発現、核内局在がCIN病変の進行や予後を予測するマーカーとして有益であると示唆された。今後,本研究では,aPKCの過剰発現が発がん・がんの進展とどのように関連するか,その機序を明らかにすることを目的とし,将来的にCINおよび子宮頸癌に対する分子標的治療の標的となる分子を探索する.現在、他癌についても検討を加えている。現在、各癌におけるaPKCの発現の状況を検討中である。研究代表者の異動により予定がやや遅れているが、おおむね順調である。上皮細胞は、形態および機能的に極性の分化を示す。すなわち、上皮細胞においては隣接する細胞とのJCを境に細胞膜がapical面とbasolateral面に分けられ、細胞質内小器官も不均一な分布を示す。このように正常上皮細胞では、生理的機能を果たすための極性(非対称性)が生じており、隣接する細胞とともに秩序だった組織を形成している。細胞における極性の形成と維持は,生物のボディプランニングや細胞の正しい機能のために不可欠である.atypical Protein Kinase Cλ/ι(以下, aPKCλ/ι)はPAR3, PAR6などの蛋白と結合し細胞極性の形成,維持に重要な役割を果たしている(aPKC/PAR系)。これに対して癌組織では、秩序だった極性が失われ、不規則な組織構築が見られる。病理学では癌の組織診断に際し,構造異型、細胞異型を示標としてきたが、極性の異常は前者を反映している.

本研究で、われわれは免疫組織化学染色を用いて、膵癌、および子宮頸がん前癌病変であるcervical intraepithelail neoplasia (CIN)について検討した。膵臓癌の発生、進行過程でaPKCλ/ιが高発現すること、CINのグレードが高くなるほどaPKCλ/ιが発現が増強、核内に移行することを示した。これによって癌の発生進展にaPKCλ/ιが関与していることが知られた。今後は診断マーカーとしてのみならず、治療標的としての利用法を検討していく。すなわちaPKCλ/ι阻害剤による制癌効果を検討する。また他のがんにも検討を敷衍する。細胞極性因子aPKCλ/ιは癌で高発現する。本研究では以下の3点を示した。1)aPKCλ/ιが子宮頸癌および前癌病変CINにおいて発現が亢進しており、進行にしたがって核内集積を示すこと、2)aPKCλ/ι遺伝子を移入した正常前立腺癌細胞は増殖能、運動能、浸潤性の亢進を示す。aPKCλ/ιが前立腺癌発生に寄与している可能性が示唆された。3)aPKCλ/ι-p62-GLOIの共発現乳癌が予後不良で、in vitroではaPKCλ/ι, p62, GLOIとの阻害剤併用は、共発現乳癌細胞株に強い増殖・生存抑制効果があった。乳癌におけるaPKCλ/ιシグナリングと糖代謝機構との関連性が示唆された。代表研究者が所属機関を異動したことから、当初の目標に掲げた培養細胞を用いた実験の実行が、当面、困難となったため、臨床検体を用いての検討を主体に行わざるを得なかった。大腸LSTと子宮頸癌とその前駆病変であるCINを対象に知見が得られたにとどまっている。現在進行中の他癌(悪性黒色腫、子宮体癌など)についての知見を学会および論文発表を通じて発信する。人体病理学現在、分担研究者所属施設で細胞、動物実験の継続を計画している。すなわち主に乳癌、前立腺癌細胞株を用いてaPKCλ/ι-IL6経路の制御が癌の増殖抑制につながるかを検討する。我々は本研究期間中にaPKCλ/ι遺伝子を高発現している乳癌および前立腺癌細胞株に対し,aPKCλ/ι阻害薬(aurothiomalate)やIL6阻害薬(tocilizmab)を処理、あるいはRNA干渉法でaPKCλ/ι遺伝子をノックダウンすることにより増殖能、浸潤能抑制が得られるかを検討する。また阻害剤処理や遺伝子ノックダウンでヌードマウスでの造腫瘍性抑制が得られるかを検討する。これらを通じて分子標的治療確立の可能性を検討する。異動に伴い、研究部門から診療部門に移ったため、研究のための時間が作出できなかった。旧所属の施設を使用しているが時間的、距離的制約からなかなか進捗しない現状である。科学研究費交付決定後に、所属機関・部署の異動が決定し、新たな態勢での研究の計画通りの執行が困難であったため、助成金の使用が大幅に遅れた。次年度は現時点までに手元にあるデータをもとに、可及的に多くの学会、論文発表を行っていく。2015年度は研究態勢を見なおし、遅れを取り戻すため尽力したい。現所属は病院内の診断部門であるため、研究設備が皆無である。そのため助成金は試薬、消耗品費に充てることとする。現所属の基礎部門講座や客員教授としてのポジションを保持している前所属・横浜市立大学の設備を利用しての研究を推進する。
すべりなし境界条件付き熱対流力学モデルの基礎的研究

本研究は、いわゆるロ-レンツモデルとしてしらさている熱対流方程式が、上下の境界壁面上で渦度ゼロの「すべり」条件しか満たすことができないため数学モデルの意味しかもたないことに着目し、すべりなし条件を加味することによって一歩でも物理モデルに近づけようとした試みである。ロ-レンツが行ったのと同様の手順で基礎となる方程式(連続の式、渦度方程式およびエネルギ-方程式)の低次元モデル化をはかると、境界面上で渦度がゼロでないため壁面近傍に特異性が現れる。この難点を克服することが本研究の中心課題であり、線形安定理論との整合性に配慮しながら、固有関数の性質を利用して特異性の解消に成功した。結果として、(i)本モデルはきわめて弱い非線形作用の下で成立する。こと、(ii)ロ-レンツモデル(3元連立常微分方程式)と比べて、2箇所の係数が境界条件のみに依存して固有に決定できることを明らかにし、このモデルの適用限界および問題点を指摘した(飯田)。また、このモデルの力学系としての基本的な性質を明らかにする試みも幾つか行っており、(i)糸の分岐線図を求めてアトラクタの性質に本質的な相違が現れるかどうか(飯田)、(ii)この熱流体現象をカオス研究の立場からどのように理解すべきであるか、他の簡単な流れとの対比において検討を加えた(小河原)。これらの結果は2編の論文として日本機械学会へ発表の予定である。今後は、壁面で任意のせん断応力を付与できるより一般的なモデルを構築すると共に、モデルのカオス的挙動に見られる構造的な境界条件依存性とその原因および、より強い非線形作用への適用性の拡張などを考えて行きたい。
炎症・免疫反応による血栓凝固能の活性化と動脈硬化・循環器疾患発症への関与の分析

我が国では、欧米と比べ脳梗塞罹患率は高く、また今後増加が危惧されている虚血性心疾患も含めた循環器疾患予防対策が公衆衛生上急務である。本研究では、血液の機能的指標のうち特にIL-6受容体活性の亢進が、頸動脈超音波検査による動脈硬化度のうちプラーク指標と関連を認め、一方でMean-IMTとは有意な関連が認められなかったことから、生理的に近いと思われる内中膜肥厚からプラーク形成に至る過程へのIL-6受容体の関与が明らかとなった。既に報告されている実験病理的検討では、IL-6はプラーク巣内におけるMφ遊走等に関与するとされていることから、本研究におけるIL-6受容体活性の亢進は、これらの病理学的報告を裏付けるものである。また、この活性を亢進させる機序として、ズリ応力の亢進がplaqueの増加と関連していたことから、機械的作用も生体内で重要な役割を果たしていると考えられる。Case-control studyでは、日本人においても欧米と同様に、頸動脈超音波検査による動脈硬化度と脳梗塞有病との関連が認められた。しかし我が国に多い穿通枝系脳梗塞では、地域住民と比べても、その動脈壁肥厚は著しくなく、頸動脈超音波検査を穿通枝系脳梗塞のスクリーニング指標として単独で用いるには計測項目のさらなる検討が必要である。本研究結果からは、IL-6受容体活性を同時に測定することにより、特に動脈壁肥厚が中等度以下の場合の脳梗塞有病との識別が効果的に行える可能性が示唆された。このことは、同程度の動脈壁肥厚でも、動脈硬化がactiveに進行している最中であるかどうかを加味したスクリーニングとなると考えられる。日常生活習慣・体力に関する検討では、日常生活体力の低下と動脈硬化度が密接に関係していたことから、日常生活体力の維持が動脈硬化予防及びその後の循環器疾患予防にとって重要であることが明らかとなった。本疫学研究計画に基づき、E県Y市における満65歳の全住民(1054人)を対象に、ライフスタイル調査、頸動脈超音波検査、循環器検診、体力測定を施行した。そのうち、研究及び追跡に対しての書面による説明と同意を得られた者は、現時点(H14年1月末)までにライフスタイル調査は計564人(53.5%)、頸動脈超音波検査は計390名(37.0%)、循環器検診は計538人(51.0%)、体力測定は計314名(29.8%)となった。また、本研究のベースとなる循環器疾患コホートの追跡データとして、脳血管疾患及び虚血性心疾患に関する発症調査を行い脳血管疾患発症118例、虚血性心疾患発症30例の登録を完了した。研究初年度である本年は、基礎的解析を行った。その結果、頸動脈超音波所見のうち、機能的指標である頸動脈流速等から算出したズリ応力比と形態的指標であるPlaque Score(各々のプラークの厚み総和)との関連では、多因子調整後層別化解析にて血圧レベルが正常の群においてもズリ応力比の上昇に伴い動脈硬化の伸展を認め、一方、血圧レベルが高くてもズリ応力比が低い場合は動脈硬化の伸展が少なく、現在動脈硬化がactiveに進行している最中かどうかの有効な指標となる可能性が示唆された。また、ライフスタイルと動脈硬化度との関連についての断面解析では、生活体力に相当する筋力、柔軟性、俊敏性、平衡機能を合わせてスコア化した検討では、動脈硬化度の伸展に伴い男性では生活体力スコアが29.7%の低下を示した(p<0.05)。

炎症・免疫、血栓凝固系の測定について、フローサイトメーターによる多チャンネル同時測定を検討し、採血量の抑制及び安定化が達成できたため、次年度はこれらの指標を合わせて評価し、炎症・免疫等の血液レオロジーと動脈硬化・循環器疾患との関連、及びこれらを改善するための生活習慣について検討する予定である。本研究計画に基づき、平成13年度に引き続き、E県Y市における満65歳の全住民(1054人)を対象に、ライフスタイル調査、頸動脈超音波検査、循環器検診、体力測定を施行した。また市中脳外科病院を脳梗塞発症にて受診した連続症例についても引き続き地域における疫学調査と同一の手法を用い頸動脈超音波検査及び各血液生化学的指標の測定を施行した。その結果、これまでに調査を完了していた者を新たに追加し地域集団(1,064人)及び脳梗塞患者(599人)から調査資料の収集が完了した。また、本年度は研究最終年度であるため、これまでの調査に基づき解析・検討を行った。本研究で測定した血液の機能的指標のうち特にIL-6受容体活性の亢進が、頸動脈超音波検査による動脈硬化度のうちプラーク指標との関連を認めた。一方でMean-IMTとは有意な関連が認められなかったことから、生理的に近いと思われる内中膜肥厚からプラーク形成に至る過程へのIL-6受容体の関与が明らかとなった。また昨年度検討を行ったズリ応力の亢進がplaqueと正の相関を示していたことと合わせると、機械的作用がIL-6受容体活性の亢進と密接な関係を有していることが示唆された。case-control studyの手法を用いた検討では、日本人においても欧米と同様に、頸動脈超音波検査による動脈硬化度と脳梗塞有病との関連が認められた。しかし、我が国に多い穿通枝系脳梗塞では、地域住民と比べても、その動脈壁肥厚は著しく強くはなかった。尚、本研究結果からは、IL-6受容体活性を同時に測定することにより、特に動脈壁肥厚が中等度以下の場合の脳梗塞有病との識別が効果的に行える可能性が示唆され、このことは、同程度の動脈壁肥厚でも、動脈硬化がよりactiveに進行している最中であるかどうかを加味したスクリーニングとなると考えられた。
機能的電気刺激による麻痺肢の多関節制御及び機能代行システム

1コンピュ-タ制御による機能的電気刺激(FES)システムを用いて関節角度ならびに筋張力のフィ-ドバック制御を可能にしたが、さらに目標値フィルタ型2自由度PID制御器を用いた足関節と膝関節の関節角および節張力制御システム開発し、麻痺者を対象とした制御特性の改善をはかった。2負荷変動や筋疲労による特性変化の影響を検討し、これを補償するため適応制御器の導入を試み、制御対象の非線形性や時変性に対してより高い安定性補償能力を有するPI制御と適応制御を組み合わせた新しい筋・関節運動制御システムの実現をはかった。これと並行して膝関節と足関節の同時制御を行った際の相互影響を検討し、主働と拮抗筋の同時刺激収縮によって関節の運動インピ-ダンスを制御し、2関節間の相互影響を軽減する協調制御法を開発した。3筋電信号のARモデル解析にもとづくARパラメ-タ-からの発生筋張力の推定を行い、その推定筋張力によるフィ-ドバック制御を可能にした。また、各種動作に係わる主働筋の特性と筋疲労の特性を明らかにした。4歩行において重要な股関節の振り上げ動作のFES制御と起立姿勢保持制御の実現化をはかった。とくに起立動作および立位保持動作をFES単独使用で実現する場合、FESと長下肢装具の併用の場合、長下肢装具単独使用の場合について床反力を測定することによって比較検討した結果、起立動作ではFES単独、立位保持動作では併用型が望ましいことを明かにした。これよりFESの使用が有効であると結論づけられた。5脊随損傷による対麻痺者、脳卒中による片麻痺者に対する上記の臨床応用を行い、その一部は臨床的に導入可能であることを確認し、また臨床応用へ向けて改善をはかった。さらに四肢麻痺者にみられる痙性の定量化を行うと同時にその抑制と筋力強化にFESを利用する研究を行い、そのための簡易型FES装置を開発した。平成元年度の研究成果を以下に記す。1.コンピュ-タ制御FESシステムにより関節角度・筋張力のフィ-ドバック制御を可能にした。2.目標値フィルタ型2自由度PID制御器を用いた足関節膝関節の関節角および筋張力制御システムを開発し、麻痺者を対象とした制御特性の改善をはかった。3.負荷変動や筋疲労による特性変化の影響を検討し、これを補償するために適応制御器の導入を試み、制御対称の非線形性や時変性に対してより高い安定性補償能力を有するPI制御と適応制御を組み合わせた新しい筋・関節運動制御システムの実現をはかった。4.これと並行して膝関節と足関節の同時制御を行った際の相互影響を検討し、主働筋と拮抗筋の同時刺激収縮によって関節の運動インピ-ダンスを制御し、2関節間の相互影響を軽減する協調制御法を開発した。5.筋電信号のARモデル解析にもとずくARパラメ-タからの発生筋張力の推定を行い、その推定筋張力によるフィ-ドバック制御を可能にした。6.歩行において重要な股関節の振り上げ動作のFES制御を行い、各関節間の相互作用を検討した。また、起立姿勢保持制御の実現化をはかった。7.脊髄損傷による対麻痺者、脳卒中による片麻痺者に対する上記の臨床応用を行い、その一部は臨床的に導入可能であることを確認し、一部は臨床応用へ向けて改善をはかっている。四肢麻痺者にみられる痙性の定量化を行うと同時にその制御と筋力強化にFESを利用する研究を行い、そのための簡易型FES装置を開発した。(1)コンピユ-タ

制御による機能的電気刺激(FES)システムを用いて関節角度ならびに筋張力のフィ-ドバック制御を可能にしたが、さらに目標値フィルタ型2自由度PID制御器を用いた足関節と膝関節の関節角および筋張力制御システムを開発し、麻痺者を対象とした制御特性の改善をはかった。(2)負荷変動や筋疲労による特性変化の影響を検討し、これを補償するため適応制御器の導入を試み、制御対象の非線形性や時変性に対してより高い安定性補償能力を有するPI制御と適応制御を組み合わせた新しい筋・関節運動制御システムの実現をはかった。これと並行して膝関節と足関節の同時制御を行なった際の相互影響を検討し、主働筋と拮抗筋の同時刺激収縮によって関節の運動インピ-ダンスを制御し、2間節間の相互影響を軽減する協調制御法を開発した。(3)筋電信号のARモデル解析にもとづくARパラメ-タからの発生筋張力の推定を行い、その推定筋張力によるフィ-ドバック制御を可能にした。また、各種動作に係わる主働筋の特性と筋疲労の特性を明らかにした。(4)歩行において重要な股関節の振り上げ動作のFES制御と起立姿勢保持制御の実現化をはかった。とくに起立動作および立位保特動作をFES単独使用で実現する場合、FESと長下肢装具の併用の場合、長下肢装具単独使用の場合について床反力を測定することによって比較検討した結果、起立動作ではFES単独、立位保特動作では併用型が望ましいことを明かにした。これよりFESの使用が有効であると結論づけられた。(5)脊髄損傷による対麻痺者、脳卒中による片麻痺者に対する上記の臨床応用を行い、その一部は臨床的に導入可能であることを解認し、また臨床応用ヘ向けて改善をはかった。さらに四肢麻痺者にみられる痙性の定量化を行うと同時にその抑制と筋力強化にFESを利用する研究を行い、そのための簡易型FES装置を開発した。
クロスメディア状況下での広告効果伝達に関する構成的手法による研究

本研究は、企業が展開する宣伝広告活動に関して、既存マス媒体(新聞、雑誌、ラジオ、テレビの四大媒体)による広告効果が、インターネット広告やブログやSNSといった新しいコミュニケーション手段を含むクロスメディア状況下でどのような影響を受けているかについて焦点を当て、そのメカニズムを構成的手法(エージェント・ベース・アプローチ)によって解明することを目的としている。本研究は、企業が展開する宣伝広告活動に関して、既存マスコミ媒体(新聞、雑誌、ラジオ、テレビの四大媒体)による広告効果が、インターネット広告やブログやSNSといった新しいコミュニケーション手段を含むクロスメディア状況下でどのような影響を受けているかについて焦点を当て、そのメカニズムを構成的手法(エージェント・ベース・アプローチ)によって解明することを目的としている。研究初年度である昨年度(平成21年度)の活動実績はとしては、関連領域の先行研究の網羅的なレビューを行い、モデル構築の際の理論的な裏付けと基礎的知識の整理をおこなった点である。特に、広告効果測定に関する先行研究、ならびに、複雑ネットワークに関する最新の研究動向については念入りなレビューをおこなった。さらに、株式会社ビデオリサーチより、同社が取り扱っている既存マスコミ媒体の視聴率調査ならびにメディア環境調査(MCR)データの提供を受け、それらのデータを用いて次年度(平成22年度)以降に本格化する予定のシミュレーション・モデル構築に向けて、プロトタイプモデルを設計・作成をおこなった。また、次年度(平成22年度)中に実証的に収集することが必要とされる、パラメータについての洗い出しを行った。なお、同プロトタイプモデルを用いたシミュレーション結果について、国内外の学会において今年度の研究成果として発表した。本研究は、企業が展開する宣伝広告活動に関して、既存マスコミ媒体(新聞、雑誌、ラジオ、テレビの四大媒体)による広告効果が、インターネット広告やプログやSNSといった新しいコミュニケーション手段を含むクロスメディア状況下でどのような影響を受けているかについて焦点を当て、そのメカニズムを構成的手法(エージェント・ベース・アプローチ)によって解明することを目的としている。研究第二年度の昨年度の活動実績は、シミュレーション・モデルの構築と出来上がったシミュレーション・モデルを実行し、現実データとのマッチング処理によるパラメータ・チューニングを重点的におこなった。本研究で用いた現実データは、株式会社ビデオリサーチより、同社が実施している既存マスコミ媒体の視聴率調査ならびにメディア環境調査(MCR)データの提供を受けた。また、シミュレーション・モデルの妥当性の検証は研究計画全般の成否に大きく関わるために、特に慎重に検討をおこなった。その際に、第三者の視点からのフィードバックが重要な役割を占めるとの認識から、前述の株式会社ビデオリサーチの担当者との間で、研究期間中に定期的な情報交換の場を設定し、実務的な視点からのシミュレーション・モデルの妥当性に対する意見等を聴取して、シミュレーション・モデル構築に反映させた。昨年度の研究活動の過程における研究成果については、国内外の学会を通じて、としての発表をおこなった。昨年度の発表実績は、国外の研究大会で2回(ドイツ・ケルンと米国・サンディエゴ)と国内の研究大会で3回であった。最後に、研究成果の公表のためのプラットフォームとしてWebサイトを立ち上げることを計画していたが、昨年度後半にWebサイト構築を外部業者に委託し、基本的な枠組みについて完成させた。それと平行して、インターネットを通じた情報発信の仕組みについての検討をおこなった。研究最終年度にあたる今年度の活動は、シミュレーション・モデルの完成を最優先課題として取り組んだ。昨年度までに行った現実データとのマッチング処理によるパラメータ・チューニングの精度を上げることや、シミュレーション・モデルの妥当性の検証等の結果を踏まえて、シミュレーション・モデルを構築した。シミュレーション・モデル構築に際しては、株式会社ビデオリサーチより本研究に対するデータ提供を受け、同社との間で定期的な情報交換の場を設定し、そこでの議論を通じてシミュレーション・モデルの精緻化を図った。研究成果の公表に関しては、研究初年度の後半より国内外の学会を通じて、研究成果を発表してきたが、昨年度に関しては、国外の研究大会で1回(米国・ボストン)と国内の研究大会で3回、研究成果の発表を行った。また、今年度後半には、研究期間満了に伴い過去3年間の本研究の活動を振り返り、研究成果のとりまとめをおこなった。
ミトコンドリアゲノムによる核遺伝子のエピジェネティック制御機構の解明

連続戻し交配によって近縁野生種Aegilops geniculata細胞質(ミトコンドリアゲノム)を導入した細胞質置換コムギ系統は、生育不良を引き起こすことなく、花成(栄養成長から生殖成長への移行)が遅延する。コムギの花成では、AP1/FUL-like MADSボックス転写因子をコードするVRN1遺伝子が中心的な役割を担う。花成促進遺伝子であるVRN1は、その発現をエピジェネティックに抑制されており、低温にあうことによってエピジェネティック状態が変化し、発現レベルが上昇する(春化現象)。本研究では、Ae. geniculata細胞質置換系統において、ミトコンドリア原因遺伝子がVRN1のエピジェネティック発現制御にどのように影響するかを明らかにし、その分子機構に迫る。<VRN1遺伝子発現およびエピジェネティックス解析>プロモーター領域のDNAメチル化解析、およびヒストン修飾の免疫沈降法(ChIP法)解析により、ミトコンドリアからのMRSにより、春化によるVRN1遺伝子のエピジェネティック抑制の解除が阻止されることが証明された。<ミトコンドリア原因遺伝子の探索>RNA-seq解析の結果、正常細胞質ミトコンドリアゲノムで春化処理した植物で特異的に発現するミトコンドリア遺伝子(新規orf)を4つ同定した。これらのorfと相同な領域を持つorfが、細胞質置換系統のミトコンドリアゲノムにも見出された。現在私たちは、春化における低温センサーがミトコンドリアに存在し、ミトコンドリアから特異的な遺伝子発現とMRSが生じ、VRN1のエピジェネティック制御に影響を及ぼすとする「ミトコンドリア春化センサー仮説」を提唱している。この仮説は、核と細胞質の不調和によるVRN1のエピジェネティック抑制解除の阻止をうまく説明できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。連続戻し交配により、近縁野生種Aegilops geniculataの細胞質(ミトコンドリアゲノム)を導入した細胞質置換コムギ系統では、花成促進遺伝子VRN1の発現パターンが変化するために、花成(栄養成長から生殖成長への移行)が遅延することを見出した。VRN1遺伝子は、その発現をエピジェネティックに抑制されており、冬季の低温によってその抑制が解除され、花成が進行する。細胞質置換系統では、ミトコンドリア遺伝子のなんらかの作用によって、低温によるVRN1遺伝子のエピジェネティック状態の変化が抑制されていると考えられる。本研究では、Ae. geniculata細胞質ミトコンドリアゲノム(遺伝子)がVRN1のエピジェネティック発現制御に影響を及ぼす機構を解明する。1.細胞質置換系統および正常細胞質系統における表現型解析人工気象器を用いて、詳細な表現型解析を行った。その結果、低温処理(春化処理)をしない場合、細胞質置換系統は正常細胞質系統より出穂期が約40日遅延した。42日間の春化処理を行った場合でも、細胞質置換系統は約20日出穂が遅延した。春化処理を行った場合、正常細胞質系統は第7葉が止葉となり出穂するが、細胞質置換系統では、第11葉が止葉であった。また、細胞質置換系統では、葉間期も増大していた。2. VRN1遺伝子のエピジェネティックス解析バイサルファイト・シークエンス法により、VRN1遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化レベルを調べた。正常細胞質系統では、春化処理前はメチル化レベルが高く、春化処理によって一様にメチル化レベルが低下するが、細胞質置換系統では、TATAボックスの上流で、春化処理後もメチル化レベルが低下しない領域が見出された。さらに、ChIP解析によって、細胞質置換系統では、春化処理後も、ヒストン修飾の抑制状態が保持されることが明らかとなった。

真核生物の細胞内には、核ゲノムに加えてミトコンドリアゲノムが存在する。生物体内で起こる高次元の複雑な生命現象は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの複雑に絡み合う遺伝子産物の組合せによる相互作用(ゲノム・遺伝子相関)を通じて決定されているに違いない。近縁野生種Aegilops geniculata細胞質(ミトコンドリアゲノム)を導入した細胞質置換コムギ系統は、花成(栄養成長から生殖成長への移行)が遅延する。コムギの花成では、VRN1遺伝子が中心的な役割を担う。花成促進遺伝子であるVRN1は、その発現をエピジェネティックに抑制されており、低温にあうことによってエピジェネティック状態が変化し、発現レベルが上昇する(春化現象)。本年度の研究では、Ae. geniculata細胞質置換系統において、ミトコンドリア原因遺伝子の何らかの作用により、VRN1のエピジェネティック発現制御が変化する証拠をつかむことができた。1.ミトコンドリア原因遺伝子および核関連遺伝子の同定コムギ品種「Chinese Spring」(CS)およびAe. geniculata細胞質を導入した細胞質置換コムギ系統((gen)-CS)を、42日間低温処理した後、20°C長日16時間日長で栽培し、第2葉期の葉をサンプリングする。葉からRNAを単離し、次世代シークエンサーによって網羅的に転写産物の比較を行う(RNA-seq解析)。次世代シークエンサーによって解読された塩基配列(リード)は、まず、コムギの完全長cDNAデータにあて、CSと(gen)-CSでどのようなクローンにヒットするか明らかにする。この結果から、(gen)-CSで特異的に発現する核遺伝子を同定する。また、cDNAデータにヒットしなかった配列は、ミトコンドリアゲノム由来であると想定し、CSのミトコンドリアゲノム配列データにあて、ゲノムのどの領域にヒットするか明らかにする(現在、一部進行中)。さらに、リアルタイムPCRによる発現解析により花成遅延に関連するミトコンドリア候補遺伝子を特定する。2. VRN1をターゲットとするsmall RNAの同定ミトコンドリア原因遺伝子からの何らかのシグナルにより、VRN1遺伝子のエピジェネティック制御を行っていると考えられる、VRN1遺伝子特異的なsmall RNAを単離し、次世代シークエンサーによる網羅的塩基配列解析あるいはアフィニティー沈降法により、VRN1遺伝子をターゲットとるすsmall RNAを同定する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
界面活性剤の棒状ミセルによる乱流制御機能の発現機構の解明

ごく少量の陽イオン界面活性剤と適当な対イオンを添加することにより乱流管内流において顕著な抵抗低減効果を引き起こすことが可能である。この界面活性剤による抵抗低減技術は大口径の管でも効果があることが実験的に確かめられている。適当に高いせん断速度域における界面活性剤水溶液のレオロジー特性が抵抗低減系の乱流制御機構の解明における重要な鍵である。せん断誘起状態(SIS)はせん断流れ場において棒状ミセルが整列し互いに集合した状態であると考えられている。本研究においてはSISが十分高いせん断速度条件下で達成され、その後せん断速度が線形に減少された。このようなせん断履歴におけるせん断応力の応答が測定され、Maxwellモデルの緩和関数を持ちいて解析された。その結果非常に大きい緩和時間が得られ、この緩和時間はせん断速度の微分値で相関された。この緩和時間が管内流における抵抗低減効果を予測するのに用いられた。先に報告者により提案されていた粘弾性減衰関数モデルが乱流モデルとして用いられ、SISの条件下で決定されたせん断粘度がモデル計算に用いられた。本モデルにより異なった管径における抵抗低減効果が正確に予測できることが明らかにされた。上述の乱流モデルが大口径のパイプラインシステムにおける抵抗低減効果を予測するために用いられた。予測結果は直径1,000mmの管においても80%以上の抵抗低減効果が得られることを示した。本研究の重要な結論は界面活性剤による抵抗低減技術が実用規模の地域冷暖房システムに適用可能であること、また抵抗低減効果が本研究で提案されたモデルで定量的に予測可能なことである。本研究の最終目的は乱流抵抗低減効果の機構を究明することである。この機構を完全に理解することは現段階では困難であり、過去の研究でも解明されていない。今後、更にこの減少の原因究明を続けて行く計画である。陽イオン界面活性剤としてオレイルビスヒドロキシエチルメチルアンモニウムクロライド(商品名Ethoquad 0/12)を500-1000ppm水中に溶解し、モル比で1:1.5のサリチル酸ナトリウムを添加することにより、顕著な粘弾性を発現することを確認した。特に溶液の長時間緩和現象をレオメータにより測定し、緩和時定数が剪断速度の変化率の関数であることを明らかにした。この関係を使って粘弾性流体の乱流減衰モデルを提案し、スケールアップ則の検討を行った。その結果、モデル予測値は本研究で得た1050mmの管径の抵抗低減効果は勿論、他の研究者が得た80150mmの管径のデータをもよく説明できることが明らかになった。これより実用規模の地域冷暖房システムにおける大口径管(例として1,000mm)の抵抗低減効果を予測した。これらの結果は日本レオロジー学会誌及びRheolgica Actaに投稿し、現在印刷中である。熱交換器における伝熱係数の低下が界面活性剤の添加により、抵抗低減効果と同時に起こるとプロセスの設計上問題になると予想される。超音波破砕機によって界面活性剤のミセル構造を破壊しその回復時定数を測定した。その結果、回復に要する時間は1秒程度であり、熱交換器の入り口でミセル構造を破壊してもすぐ回復するため伝熱係数の上昇を維持することが困難であることが明らかになった。そこで、管内面を加工した内部溝付き粗面管の抵抗低減効果を測定し、粗面管による抵抗の増大と界面活性剤による抵抗低減効果の複合系における総括の効果を評価することとした。この実験は現在進行中であり、平成10年度に結果を得る予定である。

ごく少量の陽イオン界面活性剤と適当な対イオンを添加することにより乱流管内流において顕著な抵抗低減効果を引き起こすことが可能である。この界面活性剤による抵抗低減技術は大口径の管でも効果があることが実験的に確かめられている。適当に高いせん断速度域における界面活性剤水溶液のレオロジー特性が抵抗低減系の乱流制御機構の解明における重要な鍵であり、せん断誘起状態(SIS)はせん断流れ場において棒状ミセルが整列し互いに集合した状態であると考えられている。本研究においてはSISが十分高いせん断速度条件下で達成され、その後せん断速度が線形に減少された。このようなせん断履歴におけるせん断応力の応答が測定され、MaxweIIモデルの緩和関数を持ちいて解析された。その結果非常に大きい緩和時間が得られ、この緩和時間はせん断速度の微分値で相関された。この緩和時間が管内流における抵抗低減効果を予測するのに用いられた。先に報告者により提案されていた粘弾性減衰関数モデルが乱流モデルとして用いられ、SISの条件下で決定されたせん断粘度がモデル計算に用いられた。本モデルにより異なった管径における抵抗低減効果が正確に予測できることが明らかにされた。上述の乱流モデルが大口径のパイプラインシステムにおける抵抗低減効果を予測するために用いられた。本研究の重要な結論は界面活性剤による抵抗低減技術が実用規模の地域冷暖房システムに適用可能であること、また抵抗低減効果が本研究で提案されたモデルで定量的に予測可能なことである。抵抗低減効果に付随しておきる伝熱減少に関する実際的な対策として、内部溝付き組面管による実験結果は現在学会誌に投稿して印刷待ちの状態である。この研究により熱交換器の性能低下に対する対応策が示された。本研究の最終目的は乱流抵抗低減効果の機構を究明することである。この機構を完全に理解することは現段階では困難であり、過去の研究でも解明されていない。今後、更にこの減少の原因究明を続けて行く計画である。
中枢神経障害ラットの排尿障害からの回復に寄与する中枢神経細胞の分子生物学的研究

1.腰仙髄アドレナリン受容体の排尿における役割を検討するため、正常ラットと胸髄を損傷した慢性脊損ラットの腰仙髄領域の脊髄髄腔内にアドレナリンα1A受容体遮断薬のタムスロシンとα1D受容体遮断薬のナフトビジルを投与し、等容量性膀胱内圧測定に及ぼす効果を検討した。その結果、脊髄損傷の有無に無関係に、両薬剤とも投与後の膀胱収縮の発現を遅らせ、投与量を増やすとナフトビジル投与で膀胱収縮圧が低下した。α1D受容体のmRNAの半定量では、脊損後も腰仙髄内のα1D受容体mRNA量に変化はなかった。したがって、排尿反射の求心路と遠心路の両方にアドレナリンα1D受容体が関与していることが判明し、血中のカテコラミンも脊髄に作用して排尿反射促進に働くことが考えられた。2.副腎髄質を仙髄に自家移植した慢性脊損ネコとシャム手術脊損ネコで経時的に膀胱内圧測定と外尿道括約筋筋電図測定を行ったところ、自家移植ネコで膀胱収縮時に外尿道括約筋が収縮する膀胱尿道協調不全状態が改善した。移植した仙髄中にはチロシン水酸化酵素に対する抗体陽性反応細胞が確認された。したがって、腰仙髄に投射するカテコラミンは尿道弛緩の点からも排尿促進に働くことが判明した。3.脳梗塞ラットの等容量性膀胱内圧測定と中枢神経系各所のグルタミン酸とグリシン濃度を経時的に測定した。正常ラットをコントロールとすると、脳梗塞後にラットは頻尿となったが、2週後にはコントロールレベルに回復した。大脳では脳梗塞1日後から8週までグルタミン酸が低下し、脳幹と頚胸髄ではグリシンが低下した。腰仙髄では脳便塞1日後から1週後までグリシンが低下したが、その後グリシンは徐々に増加しコントロールレベルに回復した.したがって、脳梗塞後の頻尿とその後の回復は腰仙髄中のグリシン濃度に依存する可能性が考えられた。中枢神経障害のモデルとして胸髄での脊髄損傷ラットと脳梗塞ラットを用いて脳脊髄内アミノ酸系神経伝達物質濃度と血清アミノ酸濃度をキャピラリー電気泳動装置で経時的に測定し,障害からの回復とアミノ酸濃度との関係を検討した。脊髄損傷ラットでは脊髄損傷直後の弛緩性麻痺による尿閉状態では腰仙髄内グリシンが増加したが、痙性麻痺による排尿筋過反射ではグリシンが減少した。腰仙髄内グルタミン酸濃度に変化はなかった。胸髄損傷ラットの腰仙髄のグリシンの低下は数週遅れて血清グリシン濃度に反映された。脳梗塞急性期ラットの頻尿状態では脳脊髄のグルタミン酸が増加し,脳内グリシンが低下したが,慢性期の頻尿正常化状態では脳脊髄のグルタミン酸も低下した。脳梗塞ラットの経時的な血清グルタミン酸濃度に大きな変化はなかったが,血清グリシン濃度は慢性期に低下した。仙髄髄腔内への薬剤投与実験では,グルタミン酸投与は腰仙髄内グリシンを増加させ,グルタミン酸受容体遮断薬の投与はグルタミン酸とグリシンを減少させた。グリシンの投与はグルタミン酸を減少させた。したがって,脳脊髄のグルタミン酸ニューロンはグリシンニューロンを活性化し,グリシンニューロンはグルタミン酸ニューロンを抑制している。

グルタミン酸ニューロンとグリシンニューロンの活動性のバランスの乱れが運動障害や排尿障害と関連しているが,障害からの回復にはグルタミン酸とグリシンニューロンの活動性のバランスまが重要である可能性が考えられた。また,脳脊髄中のグリシン濃度は血清グリシン濃度に反映された。現在,in situ hybridzation法によるグルタミン酸産生酵素やグリシン産生酵素のmRNA発現実験で,これらアミノ酸系ニューロンの増減や活動性の状態を検討中である。これまでの本研究では、脳梗塞ラットや脊髄損傷ラットにおいて興奮性伝達物質のグルタミン酸や抑制性伝達物質のグリシンの脳脊髄内各部位での増減は障害とその後の機能回復に一致していた。特に、脊髄損傷ラットでは損傷直後に損傷部位以下の脊髄中グリシンが増加し、弛緩性麻痺及び尿閉となったが、慢性期には損傷部位以下の脊髄中グリシンが低下して痙性麻痺及び頻尿となった。この脊髄中のグリシン濃度の変化は血清中グリシン濃度にも反映されていた。しかし、脳梗塞ラットの脳脊髄内アミノ酸濃度の変化は血清中アミノ酸濃度に反映されなかった。前立腺肥大症のモデルとしての尿道部分閉塞ラットや糖尿病ラットでも脊髄内グリシン濃度が低下する傾向があったが、血清グリシン濃度に変化はなかった。したがって、血清グリシン濃度を測定することにより、脊髄障害の有無を推察可能と考えられた。次に、脊髄中でのグリシン産生状況をグリシン産生に関わる酵素のメッセンジャーRNA(mRNA)の発現程度から検討した。グリシンはグリオキシル酸からアラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(AGT)を介して産生される経路とセリンからセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)を介して産生される経路があるが、中枢神経系内でのグリシン産生は主にSHMTを介した経路で、脊髄にSHMTm RNAの発現が多かった。脊髄損傷後は損傷部位以下の脊髄内のSHMTmRNAの発現が低下していた。肝ではAGTを介してグリシンが産生されるが、AGTmRNAの肝での発現は脊髄損傷後にも変化がなかった。したがって、脊髄損傷後の血清中グリシンの増減は脊髄中のグリシン産生量に依存していることが考えられた。1.腰仙髄アドレナリン受容体の排尿における役割を検討するため、正常ラットと胸髄を損傷した慢性脊損ラットの腰仙髄領域の脊髄髄腔内にアドレナリンα1A受容体遮断薬のタムスロシンとα1D受容体遮断薬のナフトピジルを投与し、等容量性膀胱内圧浸旋に及ぼす効果を検討した。その結果、脊髄損傷の有無に無関係に、両薬剤とも投与後の膀胱収縮の発現を遅らせ、投与量を増やすとナフトピジル投与で膀胱収縮圧が低下した。α1D受容体のmRNAの半定量では、脊損後も腰仙髄内のα1D受容体mRNA量に変化はなかった。したがって、排尿反射の求心路と遠心路の両方にアドレナリンα1D受容体が関与していることが判明し、血中のカテコラミンも脊髄に作用して排尿反射促進に働くことが考えられた。2.副腎髄質を仙髄に自家移植した慢性脊損ネコとシャム手術脊損ネコで経時的に膀胱内圧測定と外尿道括約筋筋電図測定を行ったところ、自家移植ネコで膀胱収縮時に外尿道括約筋が収縮する膀胱尿道協調不全状態が改善した。移植した仙髄中にはチロシン水酸化酵素に対する抗体陽性反応細胞が確認された。したがって、腰仙髄に投射するカテコラミンは尿道弛緩の点からも排尿促進に働くことが判明した。3.脳梗塞ラットの等容量性膀胱内圧測定と中枢神経系各所のグルタミン酸とグリシン濃度を経時的に測定した。正常ラットをコントロールとすると、脳梗塞後にラットは頻尿となったが、2週後にはコントロールレベルに回復した。大脳では脳梗塞1日後から8週までグルタミン酸が低下し、脳幹と頚胸髄ではグリシンが低下した。
イネにおける耐病性と細胞死のシグナル伝達

植物の耐病性反応において、細胞死が病原体の感染細胞で誘導される。この細胞死は、病原体の増殖抑制および抵抗性誘導において重要な役割を果たしていることが知られている。しかし、その分子機構についてはほとんどわかっていない。そこで、本研究では、細胞死と耐病性の関連を調べるために、いもち病感染に伴って疑似病斑(細胞死)を誘導するイネの関口朝日変異体(Sekiguchi-lesion ; sl)を解析している。この変異体では病斑形成に伴って防御遺伝子の発現や抗菌性物質の蓄積を含む一連の抵抗性反応が誘導されることから、SL遺伝子は耐病性反応のネガテイブ・レギュレーターとして機能していると考えられる。前年度までの解析により、マップペースドクローニングによりSL遺伝子の候補遺伝子を特定した。今年度、複数のsl変異体で候補遺伝子の塩基配列を解析したところ、塩基置換の変異が生じていることがわかった。また、候補遺伝子のcDNAをユビキチンプロモーターの下流に連結しsl変異体で過剰発現させたところ、候補遺伝子はsl変異を相補することが明らかとなり、候補遺伝子がSL遺伝子であると確定した。SL遺伝子の機能解析を行うために、SLタンパク質の一部をGST融合タンパク質として大腸菌の系を用いて発現させ、それを抗原としてSLタンパク質に対する抗体を作成した。ウエスタン解析により、作成した抗体がSLタンパク質に特異的に反応することを確認した。また、全長のSLタンパク質を酵母と大腸菌の系を用いて発現させ、特異的抗体を用いたウエスタン解析で目的のタンパク質が出来ていることを確認した。今後は、このSLタンパク質を用いて酵素活性および基質について解析を行い、耐病性誘導におけるSL遺伝子の役割を明らかにしていく予定である。植物の耐病性反応において細胞死はしばしば観察され、重要な反応であることはよく知られているが、その分子機構についてはほとんど分かっていない。そこで、耐病性反応における細胞死の意義と分子機構を理解するため、現在までによく研究されているイネ関口朝日変異体(Sekiguchi-lesion ; sl)の解析を行なった。sl変異体では、いもち病菌などの感染により葉に疑似病斑を誘導する。この病斑形成に伴い、様々な抵抗性関連遺伝子の発現や抗菌性物質の蓄積が誘導される。したがって、SL遺伝子は抵抗性誘導のネガテイブレギュレーターとして機能していることが示唆される。マップベースクローニング法により、SL遺伝子の絞込みを行なったところ、候補となる遺伝子を単離することができた。まず、候補遺伝子を用いてsl変異の相補実験を行なうため、候補遺伝子のcDNAを単離した。このcDNAをユビキチンプロモーターの下流に連結し、過剰発現させるためのコンストラクトを作成した。このコンストラクトをアグロバクテリウム法を用いて、sl変異体に導入した。現在、形質転換植物の作成中であり、これらの植物体を用いて候補遺伝子がSL遺伝子であるかどうかを確認する予定である。また、GSTやMBPなどのタグをSLタンパク質の部分配列と結合させたコンストラクトを作成した。大腸菌の系を用いて、タグをもつSLタンパク質を大量発現させ、抗体作成の抗原として使用する予定である。また、SLタンパク質の生化学的な機能解析を行なうため、全長のSLタンパク質を発現させるための実験系を構築中である。さらに、SL遺伝子の発現制御について解析しており、SL遺伝子の解析を通じて細胞死の誘導機構および抵抗性シグナルの伝達機構について明らかにしていく予定である。