hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミロイド変性症(AD,FAP)の分子イメージング薬剤EMSBの臨床開発

平成28年度以前において、125I-EISBの標識率90%以上と放射化学的純度95%を精製分離した。正常マウスとアミロイド負荷マウスにそれぞれ1MBq約0.1mlを尾静脈より投与し、経時的に体内分布を測定した。体内分布から125IーEISBの有効性が確認された。さらに動物ののSPECT画像を得る目的で、123Iを同様に標識合成し、マウスとラットに投与、経時的な体内分布の画像を取得した。平成28年度では、123I標識の標識率を高め、SPECT/CT画像により薬剤EISBの有効性を確かめ、アミロイド診断薬剤として臨床応用する予定であったが、平成28年4月の熊本地震により、アイソトープ総合施設の被災で、閉鎖になりRI標識合成および動物実験が平成29年5月まで実験が一切できない状態である。標識合成については、臨時に黒髪RIセンターで、必要器具類を持ち込み実験を行った。上記の理由でほとんどの実験ができなかった。臨時の黒髪RIセンターでの実験は、不十分な実験装置、測定装置で合成技術を伝授するのみで、新しい結果は得られていない。アイソトープ総合施設が29年5月から使用予定であるので、再スタートする予定である。平成28年4月から、熊本地震によりアイソトープ総合施設の被災で、閉鎖になりRI標識合成および動物実験が平成29年5月まで実験が一切できない状態である。前期平成26年度での研究報告に引き続き、EMSBに125Iと18Fを、アミロイド診断薬である125I-EISBと18F-EFSBを標識合成した。今年度の本研究の目的は,1)標識合成する際の最適反応時間の決定すること,得られた1-(2-125I-ethoxy)-2,5bis (styryl)benzene (125I-EISB)の血液中での化学的安定性の評価を行うことである.他の2)は、安定同位体である19F-EFSBによる様々な病型の全身性アミロイドーシス患者のアミロイド集積を蛍光し薬剤として組織化学的分析を行った。1)前駆体EMSBのメシル基と125I-の求核置換反応により125I-EISBを得るための最適反応時間は10分であり,生理食塩水とヒト血清中における125I-EISBは精製後24時間までは安定であったことから,体内においても125I-EISBは化学的に安定であることが解った。2)18F-EFSBの安定同位体である19F-EFSBを用いて、アミロイドへの反応性を検討した。Fig. 2に示すように、全ての標本においてコンゴーレッド染色により橙赤色を示し、偏光顕微鏡下観察で緑色の複屈折を呈する箇所が存在したため、アミロイドの沈着が証明された。また[18F]EFSBの標識合成は、18Fは日本赤十字社熊本健康管理センターのサイクロトロン装置を用いて製造した。窒素ガス気流中で加熱した後、さらに無水アセトニトリル0.4mlを加えて共沸蒸留した。前駆体であるEMSB0.5mgをアセトニトリル2mLで溶解した溶液を加えて、200°C-5分間で合成した。固相抽出法により95.1%±3.4と高い放射化学的純度を獲得溶液は中性で、有害菌および異物の混入は無かった。全身性アミロイド検索剤前駆体EMSBに125Iと18Fを、標識しアミロイド診断薬である125I-EISBと18F-EFSBを標識合成し、臨床応用の基礎実験を行った。
生細胞内のmRNAと対応するタンパク質の同時定量による翻訳機構の解明

本研究の目的は、内在性mRNAやタンパク質を定量的にイメージングすることにより、細胞内における翻訳調節機構を解明することである。単一細胞内でGFP mRNAおよびGFPの同時定量を行ったところ、細胞ごとに翻訳の活性がばらついていることが分かった。さらにストレス時の細胞内において、内在性mRNAのダイナミクスを検討した結果、ストレスを受けた細胞内では翻訳中のmRNAを選択的にストレス依存的な顆粒内に閉じ込めることで翻訳を抑制していることを発見した。本研究の目的は、研究代表者がこれまでに開発した内在性mRNAのイメージング、定量法を応用して、生細胞内のmRNA・タンパク質同時定量法を確立することである。さらにこれを用いてmRNAの機能である翻訳の活性をリアルタイムに評価し、転写後調節におけるmRNAの機能を解明することを目指している。このため、標的遺伝子として緑色タンパク質(GFP)を選択し、そのmRNAとそれに対応するタンパク質(GFP)濃度を同一細胞内で定量を行うことで、単一細胞内の翻訳活性を評価出来ると考えた。平成21年度には、GFP mRNAとその翻訳産物GFPを、それぞれ蛍光顕微鏡を用いて定量することを目標とした。GFPm RNAに相補的な蛍光アンチセンスプローブを複数個設計し、一過的にGFPを発現させた生きたCOS7細胞内へ導入した。続いて蛍光褪色後回復法(FRAP)を用いて、細胞内におけるプローブの拡散速度を指標にプローブの細胞内でのmRNAとの結合能を評価した。この結果、GFP mRNAと結合できるプローブが確認された。続いて、このプロープを種々濃度で生細胞内へ導入し、それぞれの細胞内におけるプローブとmRNAとの結合比率を、蛍光相関分光法(FCS)を用いて測定した。この結合型・解離型濃度の比と、プローブの結合解離定数を用いて、個々の細胞に発現しているGFP mRNAの濃度を算出した。さらに、生細胞内GFPの濃度を定量するために、FCSを用いてGFP発現細胞内のGFPを定量的に解析した。GFPの発現量の多い細胞についてはFCSで正確な定量が行えなかったものの、細胞の蛍光強度とGFP濃度の校正曲線を作成することにより高発現の細胞内においてもGFP濃度を定量することが出来た。以上の検討により、単一細胞内においてGFP mRNA及びそれに対応するGFPの同時定量が可能となった。本研究の目的は、研究代表者がこれまでに開発した内在性mRNAのイメージング、定量法を応用して、生細胞内のmRNA・タンパク質同時定量法を確立し、さらにこれを用いてmRNAの機能である翻訳の活性をリアルタイムに評価することで転写後調節におけるmRNAの機能を解明することである。本年度は前年度に開発した単一細胞内GFPmRNAおよびGFPの同時定量法を行いて、mRNAと対応するタンパク質の同時定量を行った。まずCOS7細胞にGFP遺伝子を導入し、GFPを安定に発現する細胞株をクローニングしてGFP発現COS7細胞を作製した。この細胞内においてmRNAとGFPの同時定量を行い、個々の細胞で得られたGFP濃度をGFPmRNA濃度で除することにより、単一細胞内におけるmRNA一分子により翻訳されるタンパク質の平均分子数を算出した。さらに翻訳制御が起きていると報告されているストレス時の細胞内においてmRNAの動態(局在や発現量)と翻訳活性の関連を検討した。ヒ素を用いて酸化ストレス負荷をかけたCOS7細胞において、アンチセンスプローブを用いて内在性mRNAのタイムラプスイメージングを行い、内在性mRNAがストレス顆粒(stress granules, SG)へ局在する過程を可視化した。続いて、ストレス時にSGへ局在した内在性mRNAの翻訳活性を調べるため、mRNAダイナミクスを蛍光槌色後回復法(FRAP)を用いて検討した。その結果、SG内において内在性mRNAは抑留されている成分やSGとの結合・解離の平衡状態にある成分が検出された。一方、SG局在タンパク質は自由に拡散し、細胞質との間でシャトリングしていた。この結果はストレスを受けた細胞内では、翻訳中のmRNAを選択的にSG内に閉じ込めることで翻訳を抑制していることを示唆している。
堅牢なアーベル函数論の構築と精密化

(1)初年度には,本研究の現状の理解を交換し合うため,国際研究集会に出席し,講演および専門家との議論を行ひ,研究の方向付けを詳しく決めた.(2)海外研究者の招聘により,〓函数に関する新しい加法公式を発見した.(3)種数3のtrigonal曲線に付随するKummer多様体の定義方程式を具体的に決定した.(4)〓函数の原点における羃級数展開について種々の結果を得た.(1)初年度には,本研究の現状の理解を交換し合うため,国際研究集会に出席し,講演および専門家との議論を行ひ,研究の方向付けを詳しく決めた.(2)海外研究者の招聘により,〓函数に関する新しい加法公式を発見した.(3)種数3のtrigonal曲線に付随するKummer多様体の定義方程式を具体的に決定した.(4)〓函数の原点における羃級数展開について種々の結果を得た.本計画は,種数2以上の代数曲線に付随するAbel函数の代数的加法公式について,堅牢な理論を構築することを目的に3年間で遂行されるものです.本年度は,以下の様な2つの方向から研究を行ひ,結果を論文として公表いたしました.1.J.C.Eilbeck氏,松谷茂樹氏との共同研究であります.幾何学的な対称性を豊富に持つ曲線の場合のJacobi多様体上の函数(Abel函数)についての代数的加法公式にの具体形を得ました.これは古典的に楕円函数の場合にFrobenius-Stickelbergerの公式と呼ばれるものの一般化になつてゐます.もとの代数曲線の対称性を自然に反映した形の加法公式をいくつかの場合に完全に具体的に調べ上げました.結果をまとめて査読付きの学術誌に公表しました.2.次に,幾何学的な対称性を持たない一般の曲線について,Jacobi多様体に層化構造を加味した状況での代数的加法公式を与へました.これもFrobenius-Stickelbergerの公式の上記1とは別の観点からの自然な一般化となつてをります.理論的にはこちらを使ふと上記1で述べた公式を導くことができます.この結果は論文として査読付きの学術誌に掲載されることになりました.ただし,一般の場合の理論を完全に書き切るにはもう少し調べなければならない部分があるので,今回は5次式で定義されるtrigonal curve(種数は4)について結果を詳細に述べました.以上です.Weierstrassの楕円函数論に現れるsigma函数をできるだけ一般の楕円曲線から出発して再定義し,そこから構成される普遍的楕円函数(universal ellptic functsions)について研究した.特に下記の2つの結果を得た. 2については論文を執筆中である.1. ScotlandからJ.C. Eilbeck氏とMatthew England氏の2人を山梨大学に招聘して, 2週間に渡つて共同研究を行なつた.その結果,上記の普遍的楕円函数について, Hermite-Frobenius-Stickelbergerの加法公式に類似してゐるが,今までに知られてゐない型の加法公式を発見した.その公式は無限個の系列を持つのであるが,未解明な点もあるため,その一部に限り完全に具体的に書き下した.結果をまとめてarXiv.orgに公表した.2.上記の再構成したsigma函数の新しい構成法を発見した.基本的なideaはsigma函数の満たす平行移動公式(translational relation)に現れる調整因子を周期格子を走らせてすべての和を取る.但し,このままでは定数函数0になつてしまふので,少し工夫をして,自明でない平行移動公式を満たす函数を構成すると,平行移動公式の解の1次元性により,その無限和がsigma函数となる.まだ,非自明な函数であることの証明に少し問題があるが,概ね,この構成法ですべての種数のsigmaが構成できる.これはtheta函数を必要としないことと, modular不変性が明かになる点で有用である.幾何学的な自己同型を持たないd-gonalな(射影直線への全射の写像度の最小値がdであること)代数曲線Cで,従来とは異なる形の加法公式を導出した.通常,この種の公式は,素形式(prime form, Green函数に近いもの)をsigma函数と呼ばれる基本函数またはその導函数で書き下したものと,それの変数の定める点での曲線の代数的な座標の行列式とを結び付けるものである.しかし,本研究ではこれを一般化し,曲線Cの函数体に関する有理函数体上のGalois群の作用を組み込んで素形式を一般化したものと,それの変数の定める点での曲線の代数的な座標の行列式とを結び付ける公式に拡張したものを得た.また,楕円曲線についても次の様な結果を得た.楕円曲線は2-gonalであるが,射影直線への写像度3を持つ射も存在する.こちらを使ふことで,従来の加法公式と異なる形の加法公式が得られた.これはMatthew England, J. Chirs Eilbeck両氏を山梨大学に招聘して共同研究して得られたものである.これを論文にまとめて発表した.また,素形式をsigma函数の導函数で厳密に書き下すことができるであらうことはほぼ確からしいが,まだ完全に書き下す手順が解明されてゐない.そこで,松谷茂樹, John Gibbonsの両氏との共同研究として,いくつかの代数曲線について,具体的な記述を実行した.

これも論文にまとめて発表した.当初の計画通りに想定した海外研究者との交流を果たしてゐる.やや方針の転換はあるものの,確実に成果がでてをり,論文にまとめる手順に入つてゐる.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度、招聘し共同研究をした研究者と連絡を密に取りながら、論文を完成させて適切な学術誌に投稿する。予算的に可能であれば、英国を訪問してさらなる共同研究を推進する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
アミノ酸代謝産物プロファイリングによる抑うつ症状の新規診断・治療法の探索

タバコの活性成分であるニコチンは主に喫煙によって摂取され、精神依存だけなく、多くの神経機能を増強する。特に、喫煙とうつ病の発症は高い相関関係を示す。うつ病の発症には、心身の安定や心に安らぎに関与するセロトニンが不足することが原因であると考えられている。一方、セロトニンは食事から摂取されるトリプトファン(TRP)から合成され、TRP欠乏がうつ病を悪化させると報告されている。本研究では、胎生期のニコチン摂取によって脳内のセロトニンが変化するだけでなく、TRP代謝も影響を受け、さらに出生後の慢性炎症により、うつ病を発症するリスクが高くなる可能性を示した。精神神経疾患の一つであるうつ病は、疫学的研究より喫煙と密接に関係のあることが指摘されている。タバコ中の生理活性成分であるニコチンは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)の強力な作動薬である。nAChRのアンタゴニストであるキヌレン酸(KA)は、トリプトファン(TRP)-キヌレニン(KYN)の代謝産物であり、TRP欠乏食によって、うつ病患者での情動が変化することが近年、報告されている。しかしニコチンがTRP-KYN代謝経路に与える影響は明らかにされていない。本研究は、ニコチンがTRP-KYN代謝経路に与える影響を明らかにし、nAChRを標的とした抑うつ病態の新たな診断・治療法の開発を主たる目的として行った。本年度の研究実績を下記に示す。1)ニコチンの慢性投与後のマウスにおける行動薬理学的解析とTRP代謝産物の動態(基礎データ)。マウスに生理的な条件でニコチンを摂取させた後、行動薬理学的解析と血中のTRP代謝産物を測定し、ニコチンによる影響を検討した。2)胎生期ニコチン投与が抑うつ様病態モデル動物に与える影響とTRP代産産物の動態。1)の結果を受け、ニコチン単独投与によって抑うつ病態を発症するモデルは解析が困難と考えらた。そこでニコチン単独投与モデルの解析ではなく、胎生期ニコチン投与(注意多動性障害モデル)と成長後の炎症が抑うつ病態に与える影響を検討した。本研究は、ニコチンがTRP-KYN代謝経路に与える影響を明らかにし、nAChRを標的とした抑うつ病態の新たな診断・治療法の開発を主たる目的とした。胎生期ニコチン投与が抑うつ様病態モデル動物に与える影響とTRP代謝産物の動態。胎生期ニコチン投与によって、生まれた仔マウスでニコチン依存による注意欠損多動性障害がみられるが、抑うつ様行動は見られない。そこで、このモデル動物を用いて、成長後の強い炎症による行動の変化と、TRP代謝産物、ならびにセロトニンをはじめとするモノアミン神経伝達物質の代謝について詳細に解析した。研究代表者の異動により、研究実施場所が変更となった。予定していた行動解析装置が新施設ではなく、新たな設置が必要となり、実験の進行が遅れた。さらに行動解析では環境変化等が実験結果に大きく影響することがあり、昨年度までに実施した実験結果と同様の結果が得られるかどうか再現性の確認が必要となったため、予定通りに進まなかった。本研究は、ニコチンがTRP-KYN代謝経路に与える影響を明らかにし、抑うつ病態の新たな診断・治療法の開発を主たる目的とした。本研究では、以下のことを明らかにした。1)ニコチン投与後のマウスにおける行動薬理学的解析とTRP代謝産物の動態(基礎データ)。マウスに生理的条件でニコチンを摂取させたのち、摂取中断後と中断して15日後に抑うつ様行動について、調べた。またニコチン投与によって、血中のTRP代謝産物が影響を受けるかを明らかにした。2)妊娠期ニコチン暴露ならびに成長後の慢性炎症による行動変容とTRP代謝産物の動態。成体へのニコチン単独投与だけでは、ヒトのニコチン依存状態を模倣することが困難であると考えられたため、ニコチン感受性がより高い神経発達期のニコチン暴露がTRP代謝に及ぼす影響を明らかにし、さらに成長したマウスで炎症が惹起された時、抑うつ様の行動障害が誘発されるのかを行動薬理学的手法を用いて検討した。

本研究では、ニコチン投与によって、TRP-KYN代謝が影響を受けること、さらに胎生期ニコチン暴露によって引き起こされる情動障害が成長後の炎症反応によって抑うつ病態へと発展する可能性を示した。さらにセロトニン経路とは独立した神経毒性を有するTRP代謝産物がうつ病の病態に関与している可能性を示唆した。タバコの活性成分であるニコチンは主に喫煙によって摂取され、精神依存だけなく、多くの神経機能を増強する。特に、喫煙とうつ病の発症は高い相関関係を示す。うつ病の発症には、心身の安定や心に安らぎに関与するセロトニンが不足することが原因であると考えられている。一方、セロトニンは食事から摂取されるトリプトファン(TRP)から合成され、TRP欠乏がうつ病を悪化させると報告されている。本研究では、胎生期のニコチン摂取によって脳内のセロトニンが変化するだけでなく、TRP代謝も影響を受け、さらに出生後の慢性炎症により、うつ病を発症するリスクが高くなる可能性を示した。基礎検討実験を受けて、交付申請書の記載にあった研究内容を若干修正したため、実験の進行がやや遅れている。これまで我々は、in vitroにおいて、ニコチン関連代謝産物がTRP代謝経路に及ぼす影響を明らかにしてきたが、今年度の基礎検討実験により、in vivoにおいてもTRP代謝経路に影響することを明らかにした。しかしながら、ニコチン単独投与ではTRP代謝産物への影響はマウス個体において十分に影響がみられたが、行動薬学的影響を及ぼすのに非常に時間がかかると思われた。そこで共同研究者らとより効率的な実験モデルを相談した上で、胎生期ニコチン暴露モデルに着目した。ニコチンの胎生期暴露で、出生後の仔マウスでは注意多動性障害がみられるが、抑うつ症状は見られない。このモデルに我々の研究室で保持している炎症モデルマウスのシステムを組み合わせることによって、ニコチン、TRP代謝経路ならびに抑うつ病態の関係を明らかにできると考え、軌道修正した上で実験を遂行中である。新施設での環境整備と行動解析装置の設置はほぼ完了したため、前施設で行っていた行動解析について、再現性が取れることを確認した上で実験を進める。昨年度までの研究実績により、ニコチン単独投与がTRP代謝へ及ぼす影響を明らかにした。さらにニコチン胎生期投与後、炎症を惹起した動物では、抑うつ行動が増悪することを明らかにした。TRP代謝の第二律速酵素であるKynurenine 3-monooxygenase(KMO)遺伝子欠損動物では、血清中ならびに組織中でニコチン性アセチルコリン受容体のアンタゴニストであるKAが高値を示す。そこで、最終年度はこの遺伝子欠損動物におけるニコチン投与の影響を明らかにすることで、ニコチンと抑うつの関係をより詳細に解析したいと考える。病態解析前年度までにニコチンの慢性投与によるTRP代謝への影響を検討した。また行動薬理学的解析を行った結果、ニコチンの単独投与では行動薬理学的影響を及ぼすのに非常に時間がかかると考えられた。そこでニコチンの胎生期投与後、炎症を惹起した抑うつモデル動物を作成し、この動物における血清、脳におけるTRP-KYN代謝産物の動態を明らかにした。また抑うつ行動、基本的な自発行動量や記憶障害について確認した。現在、セロトニンをはじめとするモノアミン系神経伝達物質の測定をHPLCにて行っている。
足湯および足湯と持久性運動の併用が高齢者の中心動脈伸展性に及ぼす効果

「高齢者における水中運動の中心動脈伸展性に対する効果」、平成21年度23年度科学研究費補助金、代表者:鰺坂隆一において、高齢者における中心動脈伸展性の改善には核心温が0.7度C以上上昇することが必要である可能性が示唆されたことから、全身体温が0.7度C以上上昇しうる足湯の条件を決定するための検討を行った。足湯における体温を測定している報告はごく少数であったが、43度Cで30分間の両下腿までの足湯によって鼓膜温が1度C程度上昇したとする報告があった(Eur J Appl Physiol,112:1261-1268,2012)。このため、この条件で予備実験を行ったところ、若年者においては、鼓膜温が1度C程度上昇することが確認できた。そこで、若年者においてはこの足湯の条件で測定を開始することとした。ただし、43度Cで30分間の両下腿までの足湯は、足の熱感が強くかつ下腿皮膚の発赤が高度であったので、高齢者においては、より安全かつ快適な条件を設定する必要があると考えられた。上記予備実験においては、新規に購入した鼓膜温計が正確に体温を評価しうるかの検討も行った。その結果、前述の文献で示された足湯直後の37度C38度Cの測定結果とほぼ一致した。今後、直腸温との同時評価を行って本鼓膜温計の信頼性を確立する必要がある。以上の予備実験の結果を得て、若年者に対する測定を開始した。3月末の時点で6名が被験者としての参加に同意し順次測定を行っている。現在、測定が完了しておらず被験者の追加も予定しているが、実施された結果によると、足湯に伴う体温の上昇により、血圧の低下および中心動脈伸展性の上昇が認められている。今後、高齢者も含めた被験者の参加を確保し、測定を進める予定である。
ツツジ類の遠縁交雑におけるアルビノ発現機構の解明

これまで常緑性黄色花ツツジの育成を目標として,落葉性のキレンゲツツジとさまざまな常緑性ツツジとの交配を行ってきたが,キレンゲツツジ×常緑性ツツジの交配では種子がまったく得られず,その逆交配では種子が得られる場合もあるが実生のほとんどはアルビノとなることを明らかにした.しかし,常緑性ツツジとキレンゲツツジとの交配を行う場合に,単交配(常緑性ツツジ×キレンゲツツジ)ではなく,三系交配(常緑性ツツジのF1×キレンゲツツジ)を行うことにより,数は少ないものの緑色の健全な雑種個体が得られることがわかった.ところが,低頻度ながら緑色個体が得られたミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配実生について,葉色と核および葉緑体ゲノム構成との関連を調査したところ,1個体だけ常緑性ツツジ由来の葉緑体DNAをもった三倍体であった.つまり,この個体はミヤマキリシマ由来の非還元性卵(2x)とキレンゲツツジ由来の花粉(x)との受精により生じたものと思われた.通常,ミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配では,得られる実生のほとんどはアルビノになるので,これらアルビノの出現はキレンゲツツジの核ゲノムとミヤマキリシマ由来の葉緑体ゲノムとの間の不和合性に起因するものと思われる.しかしながら,二倍性のミヤマキリシマ由来の核ゲノムと一倍性のキレンゲツツジ由来の核ゲノムをもつ三倍体実生では,葉緑体ゲノムがミヤマキリシマ由来であっても核と葉緑体ゲノムの間で不和合性が生じないことが示されたので,今後,四倍体常緑性ツツジ×二倍体キレンゲツツジの交配を行えば,三倍体で緑色の雑種実生が高い頻度で得られる可能性が示唆された.これまで常緑性黄色花ツツジの育成を目標として,落葉性のキレンゲツツジとさまざまな常緑性ツツジとの交配を行ってきたが,キレンゲツツジ×常緑性ツツジの交配では種子がまったく得られず,その逆交配では種子が得られる場合もあるが実生のほとんどはアルビノとなることを明らかにした.しかし,常緑性ツツジとキレンゲツツジとの交配を行う場合に,単交配(常緑性ツツジ×キレンゲツツジ)ではなく,三系交配(常緑性ツツジのF1×キレンゲツツジ)を行うことにより,数は少ないものの緑色の健全な雑種個体が得られることがわかった.ところが,低頻度ながら緑色個体が得られたミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配実生について,葉色と核および葉緑体ゲノム構成との関連を調査したところ,1個体だけ常緑性ツツジ由来の葉緑体DNAをもった三倍体であった.つまり,この個体はミヤマキリシマ由来の非還元性卵(2x)とキレンゲツツジ由来の花粉(x)との受精により生じたものと思われた.通常,ミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配では,得られる実生のほとんどはアルビノになるので,これらアルビノの出現はキレンゲツツジの核ゲノムとミヤマキリシマ由来の葉緑体ゲノムとの間の不和合性に起因するものと思われる.しかしながら,二倍性のミヤマキリシマ由来の核ゲノムと一倍性のキレンゲツツジ由来の核ゲノムをもつ三倍体実生では,葉緑体ゲノムがミヤマキリシマ由来であっても核と葉緑体ゲノムの間で不和合性が生じないことが示されたので,今後,四倍体常緑性ツツジ×二倍体キレンゲツツジの交配を行えば,三倍体で緑色の雑種実生が高い頻度で得られる可能性が示唆された.これまで申請者らは常緑性黄色花ツツジの育成を目標として,[常緑性ツツジ類の種間雑種(Fl)×キレンゲツツジ]の交配で緑色の健全な雑種個体を得ることに成功した.また,この交配によって得られたアルビノと緑色実生それぞれのプラスチドDNA(ptDNA)をPCR-RFLP法により調査したところ,アルビノのptDNAが種子親として用いた常緑性ツツジのFl由来(母性遺伝)であるのに対し,緑色実生のそれは花粉親に用いたキレンゲツツジ由来(父性遺伝)であることを見いだした.通常,ツツジ類のptDNAは母性遺伝するといわれているので,[キレンゲツツジ×常緑性ツツジ]のような交配が可能であれば,得られるほとんどの実生のptDNAは種子親であるキレンゲツツジ由来となり,理論上,多くの健全な緑色実生を得ることが可能となる.しかし,これまで[キレンゲツツジ×常緑性ツツジ]の交配で種子が得られたとの報告はない.本年度は[キレンゲツツジ×常緑性ツツジ]の交配における不親和性(一側交雑不親和性)の原因の解明を目的として,花柱内での花粉管行動の観察を行った.その結果,[キレンゲツツジ×常緑性ツツジ]の交配において,花粉は発芽するものの花粉管が異常な形態を示し,柱頭上もしくは花柱上部でその伸長が停止することが明らかとなった.従って,この交配における不親和性は花粉管の伸長停止により受精が起こらないこと(pre-fertilization crossincompatibility)に起因することがわかった.これまで常緑性黄色花ツツジの育成を目標として,落葉性のキレンゲツツジとさまざまな常緑性ツツジとの交配を行ってきたが,キレンゲツツジ×常緑性ツツジの交配では種子がまったく得られず,その逆交配では種子が得られる場合もあるが実生のほとんどはアルビノとなることを明らかにした.しかし,常緑性ツツジとキレンゲツツジとの交配を行う場合に,単交配(常緑性ツツジ×キレンゲツツジ)ではなく,三系交配(常緑性ツツジのF1×キレンゲツツジ)を行うことにより,数は少ないものの緑色の健全な雑種個体が得られることがわかった.

ところが,低頻度ながら緑色個体が得られたミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配実生について,葉色と核および葉緑体ゲノム構成との関連を調査したところ1個体だけ常緑性ツツジ由来の葉緑体DNAをもった三倍体であった.つまり,この個体はミヤマキリシマ由来の非還元性卵(2x)とキレンゲツツジ由来の花粉(x)との受精により生じたものと思われた.通常,ミヤマキリシマ×キレンゲツツジの交配では,得られる実生のほとんどはアルビノになるので,これらアルビノの出現はキレンゲツツジの核ゲノムとミヤマキリシマ由来の葉緑体ゲノムとの間の不和合性に起因するものと思われる.しかしながら,二倍性のミヤマキリシマ由来の核ゲノムと一倍性のキレンゲツツジ由来の核ゲノムをもつ三倍体実生では,葉緑体ゲノムがミヤマキリシマ由来であっても核と葉緑体ゲノムの間で不和合性が生じないことが示されたので,今後,四倍体常緑性ツツジ×二倍体キレンゲツツジの交配を行えば,三倍体で緑色の雑種実生が高い頻度で得られる可能性が示唆された.
線維芽細胞の酸性環境への耐性機構を標的にした肺線維症の治療法の開発

肺線維症における酸性環境に対する肺線維芽細胞の耐性機構を解明し、耐性因子と考えられる炭酸脱水素酵素(carbonic anhydrase: CA) IXの阻害薬を用いた治療法を開発することを目的として研究を行った。肺癌手術時に採取された特発性肺線維症(IPF)患者、COPD (気腫肺)患者および対照患者の肺組織から薄切切片を作成し、抗CA IX抗体との2重免疫組織染色を行い、IPFにおけるCA IXの発現細胞の同定を試みた。抗CA IX抗体との2重染色に用いる1次抗体として抗間葉系細胞マーカー(抗P4HB、抗S100A4、抗α-smooth muscle actin、抗vimentin)、抗細気管支上皮クララ細胞マーカー(抗CC10)、抗血管内皮細胞マーカー(抗CD31)、抗マクロファージマーカー(抗CD68)、抗汎白血球抗体(抗CD45)を用いた。CA IX陽性細胞はIPF患者肺の線維化組織に多数認められ、その陽性シグナルはCA IXブロッキングペプチドの添加により消失したことから特異的シグナルと考えられた。一方、健常肺組織やCOPD肺組織ではCA IX陽性細胞はほとんど認められなかった。そこでIPF肺組織を用いて抗CA IX抗体との2重染色を施したが、上記のいずれの抗体とも反応性が認められず、CA IX陽性細胞の細胞腫の同定には至らなかった。またブレオマイシン肺線維症マウスの肺組織を用いて抗CA IX抗体との2重染色を行ったが、CA IX陽性細胞を同定できる特異的染色が認められなかった。また肺線維芽細胞を低酸素(0.51%)条件下で培養したが、CA IXの発現やCA IX阻害薬による増殖抑制効果は明らかではなかった。当初の予想ではIPF患者肺の間葉肺組織にCA IX陽性細胞が多数認められたために、IPF肺組織の線維芽細胞がCA IXを発現して酸性微小環境に耐性化していると考えた。しかしながら間葉系細胞マーカー、炎症細胞マーカーなどのさまざまな細胞マーカーを用いて2重染色を行い、CA XI陽性細胞の同定を試みたが、これまでのところ細胞の同定には至っていない。マウスのブレオマイシン肺線維症モデルを用いた研究においても同様の結果であった。CA IXシグナルはブロッキングペプチドにより消失することから特異的シグナルと考えられる。抗CA IX染色を施した組織標本を観察する中で、線維化組織を被覆する上皮細胞にも陽性シグナルが認められることに気がついた。これまでの実験でCA IX阻害薬(U-104)の投与によりブレオマイシン肺線維症が抑制されたことから、CA IXが肺線維症の発症や進行に関わっていると考えられるが、間葉系細胞ではなく、上皮細胞におけるCA IXが肺線維症の病態に関わっている可能性が出てきた。そこで抗肺胞上皮細胞マーカー(抗SP-C、抗aquaporin-5、抗pan-cytokeratin、抗epithelial membrane antigen、抗CD44V、抗β4インテグリン)との2重染色を進めていきたい。

抗CA IX染色を施した組織標本を観察する中で、線維化組織を被覆する上皮細胞にも陽性シグナルが認められることに気がついた。これまでの実験でCA IX阻害薬(U-104)の投与によりブレオマイシン肺線維症が抑制されたことから、CA IXが肺線維症の発症や進行に関わっていると考えられるが、間葉系細胞ではなく、上皮細胞におけるCA IXが肺線維症の病態に関わっている可能性が出てきた。そこで抗肺胞上皮細胞マーカー(抗SP-C、抗aquaporin-5、抗pan-cytokeratin、抗epithelial membrane antigen、抗CD44V、抗β4インテグリン)との2重染色を進めていきたい。抗体などの購入にあたり、端数による次年度使用額が生じたが、次年度における抗体、試薬類と合わせて使用する予定である。
軽度認知機能障害の認知機能悪化速度を予測するバイオマーカーの探索研究

認知症の最大の原因疾患であるアルツハイマー病(AD)を、初期段階の軽度認知障害(MCI)で検出することは臨床上有用である。MCI患者のADへの移行(認知機能低下の進行)を予測する事は困難であるが、その予測手段の候補として、血漿中マイクロRNA(miRNA)が挙げられる。本研究では、血漿中miRNAによりMCI患者の将来の認知機能低下を予測することが可能かについて検討を行った。同一年齢の高齢者を対象とした疫学研究を用いた検討の結果、3年後の認知機能が低下した群で19中2種類のmiRNAが有意に低下している事が明らかになった。診断マーカーとしての有用性を明らかにするためには更なる検討が必要である。関西健康長寿(SONIC)研究では開始時70歳、80歳、90歳の各500人について3年ごとに認知機能評価テストであるMoca-Jテストを含めた精神、身体機能検査を施行している。2015年には全ての年代の3年後までの継続調査が終了した。本研究ではまず開始時80歳を対象にMoca-JスコアがMCIに分類される19点以上25点以下の参加者を抽出した。開始時に認知症、がん、脳卒中、甲状腺疾患、パーキンソン病関連疾患と診断されている参加者は対象から除外し計114人をmiRNA測定の対象とした。3年後のMoca-Jスコアと比較したところ維持・上昇群は65人低下群を49人であり、来年度にTaqMan Array MicroRNA 384well Cardを用いた検討を行う予定である。測定するmiRNAに関しては過去の文献より血漿(清)中濃度と認知症との関連が報告されているものの中から、中枢神経系での役割が確認されている22種類を選択し、コントロールとして我々が健常者サンプルで安定した発現を確認したmiRNA2種類を用いる予定である。尚、70歳、90歳のサンプルに関しては80歳のサンプルで同定した候補miRNAを用いて検証を行う。また大阪大学医学部付属病院の患者においては血液検査、頭部MRIや各種認知機能検査、脳血流SPECT、髄液検査を施行しMCIや認知症の病型分類を行い、血漿サンプルを蓄積している。今後、大阪大学医学部付属病院のサンプルに関しても候補miRNAを用いた検証を行う予定である。当初の計画では平成27年度中にSONIC研究の血漿サンプルからのmiRNA抽出とreal time PCRを行う予定であったが、血漿サンプルからのmiRNA抽出に遅延が生じている。これは、MOCA-Jスコアのデータクリーニングに時間を要したためであり、現在データクリーニングは完了しており正確なMOCA-Jスコアデータを用いた解析が可能となっている。2016年には70歳患者の二回目の調査(76歳時)を施行し2017年度には80歳患者の二回目の調査を開始する予定になっている。。開始時に認知症、がん、脳卒中、甲状腺疾患、パーキンソン病関連疾患と診断されている参加者は対象から除外し計113人をmiRNA測定の対象とした。3年後のMoca-Jスコアと比較したところ維持・上昇群は65人低下群を49人であった。また、維持・上昇群間で性別、生活習慣病(高血圧、脂質異常症、糖尿病)の有無等の背景因子に大きな違いを認めなかった。Custom miRNAカードを用いて行うmiRNAの検討項目は最終的にmiRNAに関しては過去の文献より血漿(清)中濃度と認知症との関連が報告されているものの中から、中枢神経系での役割が確認されている17種類を選択し、コントロールのhousekeeping遺伝子4種類と溶血マーカー1種類、補正用のspike inを1種類選択した。現在、real time PCRによる解析を進めている。また大阪大学医学部付属病院のアルツハイマー病患者に関してはMRIやSPECTによる画像検査に加え、脳脊髄液のAβやTau濃度の測定も行っており、今後SONIC検査で変化を認めた血漿中miRNAの有用性について検証を行う事が可能となっている。SONIC研究の血漿サンプルからのmiRNA抽出とreal time PCR実施完了に遅延が生じている。当初予定の方法で行ったreal time PCRでは検出感度以下のサンプルが多かったため、中断したためである。そのためreal time PCR前にあらかじめ増幅する方法に切り替え検出効率の上昇を認めた。その解決のため時間を要したが、現在は改変した方法を用いた検討を進めている。2017年度には80歳患者の二回目の調査を開始した。

また、維持・上昇群間で性別、生活習慣病(高血圧、脂質異常症、糖尿病)の有無等の背景因子に大きな違いを認めなかった。Custom miRNAカードを用いて行うmiRNAの検討項目は最終的にmiRNAに関しては過去の文献より血漿(清)中濃度と認知症との関連が報告されているものの中から、中枢神経系での役割が確認されている17種類を選択し、コントロールのhousekeeping遺伝子4種類と溶血マーカー1種類、補正用のspike inを1種類選択した。その結果、維持上昇群と、低下群の間で発現に差を認める血漿中miRNAは17種類中2種類であった。2017年度に施行した6年後のMoca-Jスコアに関してはデータのクリーンアップを行っている。完了後に同データとmiRNAの関連についても解析し論文化する予定である。認知症の最大の原因疾患であるアルツハイマー病(AD)を、初期段階の軽度認知障害(MCI)で検出することは臨床上有用である。MCI患者のADへの移行(認知機能低下の進行)を予測する事は困難であるが、その予測手段の候補として、血漿中マイクロRNA(miRNA)が挙げられる。本研究では、血漿中miRNAによりMCI患者の将来の認知機能低下を予測することが可能かについて検討を行った。同一年齢の高齢者を対象とした疫学研究を用いた検討の結果、3年後の認知機能が低下した群で19中2種類のmiRNAが有意に低下している事が明らかになった。診断マーカーとしての有用性を明らかにするためには更なる検討が必要である。現在、血漿サンプルからのmiRNA抽出を開始しており、今後も引き続き行っていく。抽出したmiRNAによるreal time PCRは短期間で完了するため結果が出次第論文化を進めていく。大阪大学付属病院患者のデータ収集に関しては引き続き継続する。研究に必要な人員や機器は準備できている。上述の方法によりSONIC検体を用いたRealtime PCRを開始しており、解析可能なデータを得ている。終了次第データを解析し早期に論文化を進めていく。またSONICでは2017年に80歳の二回目の調査が行われる予定であり、同調査で認めたMoca-J検査の結果についても解析し報告する予定にしている。当初の予定では70歳のサンプルを用いた検証を行う予定であったが、血漿サンプルの質の不良を認めたため解析困難と判断し検討を中止する。一方、大阪大学付属病院アルツハイマー病患者のデータ収集に関しては症例が大幅に蓄積されており、SONIC検体を用いた検討で認知機能低下との関連が明らかになったmiRNAを用いて有用な検討を行う事が可能である。老年医学現在までの進捗状況に記した通り、H27年度に完了予定であったSONICサンプルからのmiRNA抽出やreal time PCRが完了していない。当該実験にかかる経費の大半を次年度に持ち越すこととなった。現在までの進捗状況に記した通り、H28年度に完了予定であったSONICサンプルからのmiRNA抽出やreal time PCRが完了していない。当該実験にかかる経費を次年度に持ち越すこととなった。上述の通り、miRNA抽出やreal time PCRに関しては準備が整っており、順次試行していく。
ＴＲＩＣチャネルと小胞体カルシウム放出

本研究では、TRICチャネル両サブタイプとRyR、IP3Rのいずれもが発現している平滑筋を用いて以下の3点について明らかにした。1TRIC-A過剰発現によりCa2+スパークの発生を発端とした過分極シグナルが亢進し、恒常的な血管弛緩により低血圧を示すこと、2血管平滑筋におけるTRIC-Aの発現量が血圧を制御する可能性を示唆、3血管平滑筋におけるTRIC-Aの発現量変化は小胞体内のCa2+分布、つまりRyRやIP3Rを有する小胞体内のCa2+貯蔵量に影響を与える可能性を示唆。申請者のグループにて見出された小胞体TRICチャネルサブタイプは、カルシウム放出と連動して機能するカウンターイオンチャネルである。本申請研究では、(1)TRICチャネルとカルシウム放出チャネルであるリアノジン受容体及びイノシトール3リン酸受容体が選択的に連動して機能する(選択的機能協調性を有する)こと、及び(2)TRICチャネルの能動的カルシウム放出制御というまったく新しい2つの機構について解明を目指した。具体的には、TRICチャネル両サブタイプとリアノジン受容体、イノシトール3リン酸受容体のいずれもが発現している平滑筋を実験材料とし、細胞内カルシウム動態の詳細な薬理学的解析を行い、またそれに付随した細胞・組織機能を評価することで2つの機構を解明する。計画では平成24年度に平滑筋特異的TRIC-B欠損マウス及び平滑筋特異的TRIC-Bトランスジェニックマウスを作製し、機能解析を行う予定であった。しかしながら実際には、平滑筋特異的TRIC-Aトランスジェニックマウスの血管平滑筋細胞の解析により、TRICチャネルがカルシウム放出チャネルと選択的に機能協調すること、及びTRICチャネルの能動的カルシウム放出制御に関して研究が大きく進展した。具体的にはTRIC-Aを過剰発現した血管平滑筋細胞において、カルシウムスパーク頻度が顕著に上昇したこと、さらにはカフェインにより刺激した際、TRIC-A過剰発現血管平滑筋細胞において顕著な反応の増強が観察されたことからTRIC-Aとリアノジン受容体が選択的に機能協調している可能性が示唆された。また、カルシウムスパーク頻度が上昇したことから、TRIC-Aが積極的にカルシウム放出を亢進させていることが有力だと考えられる。これらの結果は、平成24年度の成果発表として記載した(雑誌論文の5番目)。平成24年度の成果として、平滑筋特異的にTRIC-Aを過剰発現させたマウスの血管平滑筋においてTRIC-Aがリアノジン受容体と機能的に共役しCa2+放出を支え、血管平滑筋におけるTRIC-Aの発現密度が血圧調節に重要であることを示した。これを受けて、平成25年度は平滑筋特異的TRIC-B過剰発現マウスの血管平滑筋における小胞体Ca2+動態について検討した。その結果、TRIC-B過剰発現平滑筋細胞において定常状態Ca2+レベルの上昇、小胞体Ca2+総量の増加、ストア枯渇Ca2+流入の増加及び受容体刺激によるIP3受容体を介したCa2+放出量の減少が観察された。申請者の研究グループにて見出された小胞体TRICチャネルサブタイプは、カルシウム放出と連動して機能するカウンターイオンチャネルである。本申請研究では、(1)TRICチャネルとカルシウム放出チャネルであるリアノジン受容体及びイノシトール三リン酸受容体が選択的に連動して機能する(選択的機能協調性を有する)こと、及び(2)TRICチャネルの能動的カルシウム放出制御というまったく新しい2つの機構について解明を目指した。具体的には、TRICチャネル両サブタイプ(TRIC-A及び-B)とリアノジン受容体、イノシトール三リン酸受容体のいずれもが発現している平滑筋を実験材料とし、細胞内カルシウム動態の詳細な薬理学的解析を行い、またそれに付随した細胞・組織機能を評価することで2つの機構を解明する。本年度は、平成25年度に作製した平滑筋特異的TRIC-B過剰発現マウスより血管平滑筋を単離し、血管平滑筋における小胞体カルシウム動態について詳細に検討した。

平成25年度に結果が得られていた小胞体Ca2+貯蔵量の増加について、細胞質中のカルシウム濃度を測定する従来の蛍光指示薬ではなく、小胞体のカルシウム濃度を検出可能な蛍光指示薬に変更して行ったところ、TRIC-B過剰発現平滑筋において同様に小胞体Ca2+貯蔵量が増加していることを確認した。また、カフェインによるCa2+放出量が同程度であること、イノシトール三リン酸受容体刺激後にカフェインでの刺激を行うとTRIC-B過剰発現平滑筋でのCa2+反応が増強することを見出した。プレリミナリーな結果として、単離TRIC-B過剰発現平滑筋細胞におけるCa2+スパーク頻度の増加が観察されていることから、TRIC-A過剰発現細胞と同様の現象が起こっていることが予想される。これはテールカフ法による血圧測定からも低血圧であるため矛盾しない結果である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生理学・薬理学26年度が最終年度であるため、記入しない。平滑筋特異的TRIC-Aトランスジェニックマウスの血管平滑筋細胞の解析により、予想以上に2つの機構についての理解が深まった。また、現在作製中の平滑筋特異的TRIC-Bトランスジェニックマウスは2つの機構を証明するための有用なモデル系となると考えられ、実験系はすでに確立しているものばかりであるため、全体としては当初計画した通りに進んでいると考えられる。作製していた2ラインの平滑筋特異的TRIC-B過剰発現マウスのうち、1ラインでTRIC-Bの発現量が減少するという事態が発生し、再度作製し直したため解析を開始するのが遅れたため。上述のように平滑筋特異的TRIC-Bトランスジェニックマウスがまもなく作製され、すぐに解析に取りかかる準備はできている。ただし、細胞内環境を制御できる条件下ではないため、サポニン処置などにより細胞外環境をコントロールすることで、カルシウム放出チャネル機能を正確に制御し、活性を測定する必要があると考えられる。この実験系については、平行して条件検討を進める予定である。現在得られている結果から、小胞体Ca2+放出における異常の存在は明らかでありリアノジン受容体やIP3受容体からのCa2+放出に関して、高時空間分解能を有する装置でのCa2+動態解析が必要であると考えられる。また、Ca2+放出が細胞膜上のK+チャネル活性や静止膜電位に影響を及ぼすことも考えられるため、ホールセルパッチクランプ法や微小電極法などの電気生理学的実験により検討を行うことを予定している。平成25年度は、特に設備備品の購入を予定していない。従って、研究費はほぼ消耗品費として使用する予定である。平成24年度には、自身で所有する他の研究費も潤沢にあり、年度をまたいでの繰越し使用が可能だったため次年度に使用することとした。平滑筋特異的TRIC-B過剰発現マウスの2ラインのうち1ラインでTRIC-Bの発現量が減少するという事態が生じたため、トランスジェニックマウスを再度作製しなければならず、解析の開始が遅れたため、次年度使用額が生じた。すでに平滑筋特異的TRIC-B過剰発現マウスの2ラインが準備でき、解析を本格化している。
頭頚部における、Ｈｏｘ遺伝子による領域決定の分子メカニズムの解析

Hox遺伝子とDlx遺伝子による頭頸部の領域決定の解析を行った。Creレコンビナーゼ依存的にタグ付きHoxa2を過剰発現させるノックインマウスを用いた解析を進めた。神経堤細胞をマークするWnt1Creと掛け合わせて、マウス胎仔の咽頭弓を集めてChIP-seqを行うことに成功した。これにより、Hox遺伝子がマスターレギュレーターとして哺乳類の頭頸部神経堤細胞に領域特異的な位置情報を与える際に、直接的にどのようなゲノムの領域を支配しているかが明らかになった。また、ポリコーム複合体が胚発生において重要な働きをしていることは既知のことであるが、今回特に神経堤細胞特異的なH3K27Me3(ポリコームマーカー)やH3K4Me2などのヒストンマークの解析を野生型とPRC2ノックアウトマウスにおいて解析することで、神経堤細胞の前駆細胞においてH3K4Me2とH3K27Me3の両方で同時にマークされるbivalentなゲノム領域が、神経堤細胞が咽頭弓に遊走後、その咽頭弓の位置特異的に遺伝子制御を変化させることを明らかにした。さらに、近年報告されたクロマチンアクセシビリティをゲノムワイドに検出するATAC-seqの系を導入することに成功した。この手法は、これまでに主流であったDNaseHS-seqに比較して少数の細胞で高いクオリティのデータを獲得することを可能にするものであり、今までにマウスの神経堤細胞と神経細胞における解析をin vivoで行った。これにより生体内でのクロマチン制御のダイナミクスを高い時間・空間解像度で解析することが可能になった。これらの成果の一部はScience誌に報告した。28年度が最終年度であるため、記入しない。マウス胎児組織のエピジェネティックな解析を行うにあたり、少ない細胞数からの効率的なChIP-seqを可能にすることは研究計画を遂行する上で大変なスピードアップにつながる。そこで、既に咽頭弓組織を用いたChIP-seqの実験系を立ち上げていた共同研究者であるFilippo Rijli博士の研究室に赴き技術を習得・改良して、実際それをもちいて胎児組織のゲノムワイドなヒストン修飾を解析できた。具体的には、最近報告されたライブラリー作成においてトランスポゼースを活用したChIPmentationという方法を導入することで、通常なら100万から1000万細胞が必要なところを、抗H3K4Me2抗体とH3K4Me3抗体ならば5万細胞、抗H3K27Me3抗体と抗H3K27Ac抗体であれば20万細胞と、総じて1/10以下の細胞数で解析が可能になった。現在この解析手法をホメオボックス遺伝子を含む転写因子にまで拡張しているところである。昨年度はChIP-seqの進捗状況に若干の遅れが生じて一部予算を繰り越すことになったが、今回の新たな技術の取得でその遅れを補って余りあるほどのアドバンテージを得ることができたと考えている。小細胞数からのChIP-seqプロトコルを習得したことで、胎児組織からのエピジェネティック解析が大幅に効率化したため。咽頭弓におけるHox遺伝子とDlx遺伝子の機能解析を行った。Hox遺伝子群は咽頭弓の前後軸に沿った位置情報を規定することがよく知られており、実際マウスにおいてHoxa2を本来Hox遺伝子ネガティブである第1咽頭弓に過剰発現させると、第1咽頭弓由来の骨格が第2咽頭弓様にホメオティックトランスフォーメションすることを昨年度までに確認してあるが、ここで顎近位部の表現型に着目するとメッケル軟骨(第1咽頭弓由来)が茎状突起(第2咽頭弓由来)の遠位部にホメオティックトランスフォーメションしている様子が観察された。これは、メッケル軟骨が明らかに第1咽頭弓の腹側由来の構造であるということを考慮すると、茎状突起の発生が第2咽頭弓背側由来(進化的には舌顎軟骨由来)であるという従来仮説に反する。茎状突起の発生学的由来をより詳細に明らかにするために、咽頭弓の背腹の情報を規定するDlx遺伝子群の変異マウスを解析したところ、茎状突起の遠位部がやはり第2咽頭弓の腹側、近位部が背側に由来することが明らかになった。以上のことは茎状突起は従来言われていた通りの舌顎軟骨のみならず、角舌軟骨からの寄与があることを強く示唆する結果となった。これは哺乳類における咽頭弓骨格の進化・発生学的理解を深めることになるとともに、咽頭弓の形態形成においてHox・Dlx遺伝子群が協調的に働いていることを明確に示唆する結果ともなった。以上の結果はDevelopmental Biologyに発表した。HoxとDlx遺伝子群が咽頭弓において協調的に形態形成プログラムを動かしていることが明らかになった。

また、ポリコーム複合体が胚発生において重要な働きをしていることは既知のことであるが、今回特に神経堤細胞特異的なH3K27Me3(ポリコームマーカー)やH3K4Me2などのヒストンマークの解析を野生型とPRC2ノックアウトマウスにおいて解析することで、神経堤細胞の前駆細胞においてH3K4Me2とH3K27Me3の両方で同時にマークされるbivalentなゲノム領域が、神経堤細胞が咽頭弓に遊走後、その咽頭弓の位置特異的に遺伝子制御を変化させることを明らかにした。さらに、近年報告されたクロマチンアクセシビリティをゲノムワイドに検出するATAC-seqの系を導入することに成功した。この手法は、これまでに主流であったDNaseHS-seqに比較して少数の細胞で高いクオリティのデータを獲得することを可能にするものであり、今までにマウスの神経堤細胞と神経細胞における解析をin vivoで行った。これにより生体内でのクロマチン制御のダイナミクスを高い時間・空間解像度で解析することが可能になった。これらの成果の一部はScience誌に報告した。今回習得したChIP-seq技術を転写因子に適応することで、発生期における遺伝子の制御の全体像に迫る。Hox遺伝子群とDlx遺伝子群が形態形成プログラムを動かしている際、分子レベルでどのようにクロストークがあるのかを明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。