hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糸状菌転写因子結合配列の網羅的解析とエンジニアリング

ビーズディスプレイ法は、DNAライブラリーをマイクロビーズ上に高集積に構築する手法である。この手法を用いてランダムDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いて糸状菌転写因子AmyRの結合配列の解析を行い、AmyR結合モチーフの抽出及び種々の新規AmyR結合配列の獲得に成功した。さらに、このビーズディスプレイ法とリガーゼリボザイムを用いたプロモーター活性ハイスループット解析法を確立した。本研究課題では、W/OエマルジョンPCRを利用したビーズディスプレイシステム用い、糸状菌由来の転写因子結合配列の大規模ライブラリースクリーニングを行い、糸状菌転写因子新規結合配列の獲得、改変プロモーターの創製を試み、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を目指す。まず、糸状菌、Aspergillus nidulans由来転写因子AmyRを用いたスクリーニング系の確立を行った。塩基配列をN(A,T,GもしくはC)x22としたランダムDNAライブラリーを作製し、上記W/OエマルジョンPCRを用いてランダムDNAビーズライブラリーを調製した。転写因子AmyR溶液及び蛍光標識抗体をこのビーズライブラリーに加え、転写因子を介した蛍光複合体[ビーズ-結合DNA-転写因子-蛍光標識抗体]を形成させ、高い蛍光強度を保持するビーズ複合体をセルソーターを用いて回収する操作を計5ラウンド行った。その結果、5ラウンド後においてAmyR結合コンセンサス配列、CGGN8CGGが多数(109クローン中19クローン)確認された。現在、これら獲得クローンの評価を行っている。また、酵母由来転写因子Gal4を用いて無細胞蛋白質合成系による転写因子結合部位スクリーニング系の確立を試み、ビーズ-Gal4結合DNA-in vitro発現Gal4-蛍光標識抗体の蛍光複合体形成に成功した。さらに、このビーズディスプレイ法を用いたプロモーター活性選別法の開発を行い、T7プロモーター活性を指標としたスクリーニング系の確立に成功した。今後、上記手法を組み合わせ、糸状菌ゲノムライブラリーもしくはランダムDNAライブラリーを用いた種々の転写因子結合配列のゲノムワイドスクリーニング、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を試みる。22年度に行った糸状菌Aspergll nidulans由来転写因子AmyRとランダムDNAライブラリーを用いたスクリーニングより得られた各クローンの評価を行った。その結果、AmyRに対し結合活性を示したクローンは強い結合親和性を示す5配列(グループI)と弱い結合親和性を示す10配列(グループII)に分類された。各グループに対しDNA配列アライメントを行ったところ、グループIにおいて結合モチーフ、(-5'-CGGNNNTTTNTCGG-3')が確認された。このモチーフは、2つのCGGトリプレット間にチミンが高頻度に保存されており、以前の研究において提起されていた新規AmyR結合モチーフと合致していた。グループIIにおいてはAmyRの結合に必須とされるCGGトリプレットモチーフが確認された。これらの結果をまとめてBiosci. Biotechnol. Biochem.に投稿し、掲載許可を得た。また、A.nidulansゲノムライブラリーを作製し、ビーズディスプレイ法によりA-nidulansゲノムライブラリーをマイクロビーズ上に構築することに成功した。このライブラリーを用いてAmyR結合部位のゲノムマッピングを行う。さらに、22年度に確立したビーズディスプレイ法を用いたプロモーター活性選別法に関する結果をまとめ、現在論文投稿中である。今後、上記手法及び得られる知見を組み合わせ、転写因子結合配列のゲノムワイドスクリーニング、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を試みる。本研究課題では、W/OエマルジョンPCRを利用したビーズディスプレイシステム用い、糸状菌由来の転写因子結合配列の大規模ライブラリースクリーニングを行い、糸状菌転写因子新規結合配列の獲得、改変プロモーターの創製を試み、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を目指した。22-23年度に行った糸状菌Aspergillus nidulans由来転写因子AmyRとランダムDNAライブラリーを用いたスクリーニングより確立したノウハウを基にA. nidulansゲノムライブラリーを用いたAmyR結合部位のゲノムワイドスクリーニングを行った。その結果、未知の結合部位を多数同定することに成功した。なかでも、UDP-グルコースピロホスホリラーゼプロモーター領域を含むクローンSL5は、AmyRに対して非常に高い結合活性を示した。そこで、このSL5についてさらに詳細な解析を行ったところ、このクローンは既知のAmyR結合モチーフCGGN8CGG及びCGGN8AGG配列を共に保有し、後者に優先的に結合することが確認された。さらにリアルタイムPCRを用いてUDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子の発現量を解析したところ、AmyR欠損株においてその発現量の減少が確認され、A. nidulans中でAmyRがこの遺伝子の発現を正に制御していたことが示唆された。これらの結果をまとめ、論文投稿を行う予定である。

今後、今回選択されたAmyR結合能を示すプロモーター配列のさらなる解析を行い、AmyRの転写制御機構の解明を試みるとともに、得られた知見を基にした改変プロモーターの構築を行い、糸状菌バイオプロセス改変による糖代謝能改良法の確立を行う。当初の実験計画ではモデル糸状菌をA. nidulans、モデル転写因子としてAmyRをそれぞれ用いて本系の確立を行った上で種々の転写因子、及び産業利用が期待される糸状菌A. oryzaeバイオプロセス改変を試みる予定であったが、現時点ではまだA. nidulans-AmyRでのみしか検討を行えていない。しかしながら、本研究は順調に推移しており、一層のスピードアップを図れば当初の目的を達成することは不可能ではないと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。・糸状菌A.nidulansゲノムライブラリーを用いた転写因子結合部位の同定既に構築が完了しているA.nidulansゲノムビーズライブラリーを用いてAmyRの結合DNAのスクリーニングを行う。獲得された配列解析を行い、得られた配列情報を基に用いたAmyRがどの遺伝子制御に関与しているか、特定する。また、AmyR以外の糸状菌転写因子を用いた糸状菌転写因子結合配列の解析を可能な限り行い、網羅的解析に基づいた転写因子-DNA相互作用ネットワークの構築を試みる。・無細胞蛋白質合成系を用いた糸状菌転写因子発現条件の検討本スクリーニング系の問題点として活性型転写因子の発現の難しさが挙げられる。そこで活性化型転写因子の高効率発現及びさらなるハイスループット化を目指すため、無細胞蛋白質合成系によるA.nidulans転写因子の活性型発現条件の最適化を試みる。具体的には、上記AmyRをモデル転写因子として、反応温度、フォールディングを促進する因子の付加などの検討を行う。・活性型プロモーターハイスループットスクリーニング法の確立と応用申請者らによって確立されたプロモーター活性スクリーニング法のさらなる効率化を試みる。具体的には本手法においてレポーターとして用いるリガーゼリボザイムの最適化を行い、プロモーターデザインの基盤技術確立を行う。・糸状菌バイオプロセスデザイン上記の検討より得られた知見、要素技術を基にA.nidulansゲノムに対してAmyRによる発現制御及びデンプン代謝に関与する遺伝子のプロモーター領域の改変を行う。具体的には、可溶性デンプンの分解能の向上を試みる。この一連の手法を確立することにより、転写因子結合部位の網羅的解析に基づいたバイオプロセスデザインが可能となる。
パラメータ化計算に関する未解決問題の調査と探求による計算複雑さ解明

本研究は,アルゴリズムの設計や解析,計算複雑さの理論などの分野で近年急速な進歩を見せるパラメータ化計算と,その枠組みのもとで,計算複雑さの上下界を明らかにする固定パラメータアルゴリズムやパラメータ化計算複雑さ理論を対象にしている.この際,歴史的にも未解決問題へのアプローチが分野発展の原動力となっている事実に鑑み,パラメータ化計算分野において提示される未解決問題に着目し,幅広い調査や整理とともに,過去の研究で自身が得た未解決問題との間に有機的な関連を見出し,そのような問題を解決することで,計算複雑さのクラスを分離する状況証拠を積み重ねて,困難さの原因に対する知見を獲得する.これらと並行し,さまざまな離散最適化問題に対する具体的な固定パラメータアルゴリズムや高速厳密アルゴリズムを設計することも同時に行う.これらを通じて,P=NP?問題の解決への側面からの貢献を目指す.このような目標のもとで,本研究計画申請期間を通して,平面的有向グラフにおける最長路問題に対する劣指数時間アルゴリズム,辺グラフ枝削除問題に対する高速固定パラメータアルゴリズム,PSPACE完全であることが知られている二人ゲームKaylesなどに対する未解決もんだいなどを幅広く調査した.それらの中で,部分問題としてグラフ描画を含む紙折り問題や,幾何学的な問題,あるいはグラフアルゴリズム分野で基礎的な問題である支配点集合問題などに対して効率的なアルゴリズムを設計することに成功した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,アルゴリズム設計・解析や計算複雑さの分野で近年急速な進展を見せるパラメータ化計算の枠組みのもとで,計算複雑さの上下界を明らかにする固定パラメータアルゴリズムやパラメータ化計算複雑さ理論を対象としている.この際,歴史的にも未解決問題へのアプローチが分野発展の原動力となっている事実に鑑み,パラメータ化計算分野において提示される未解決問題に着目し,幅広い調査や整理とともに過去の研究で自身が得た未解決問題との間に有機的な関連を見出し,そのような問題を解決することで計算複雑さを分離する状況証拠を積み重ねて困難さの原因に対する知見を獲得する.これらと並行し,さまざまな離散最適化問題に対する具体的な固定パラメータアルゴリズムや高速厳密アルトリズムを設計することも同時に行う.これらを通じて,P=NP?問題の解決への側面からの貢献を目指す.このような目標のもと初年度は,平面的有向グラフにおける最長路問題に対する劣指数時間アルゴリズム,編グラフ枝削除問題に対する高速固定パラメータアルゴリズム,PSPACE完全であることが知られている2人ゲームKaylesなどに対する未解決問題を幅広く調査した.一方,部分問題としてグラフ描画を含む紙折り問題や,幾何的な問題に対して具体的に効率的なアルゴリズムを設計することに成功した.本研究は,アルゴリズム設計・解析や計算複雑さの分野で近年急速な進展を見せるパラメータ化計算の枠組みのもとで,計算複雑さの上下界を明らかにする固定パラメータアルゴリズムやパラメータ化計算複雑さ理論を対象とし,当該分野で提示される未解決問題に着目し,幅広い調査や整理とともに過去の研究で自身が得た未解決問題との間に有機的な関連を見出し,そのような問題を解決することで計算複雑さを分離する状況証拠を積み重ねて困難さの原因に対する知見を獲得することや,さまざまな具体的な離散最適化問題に対する固定パラメータアルゴリズムや高速厳密アルトリズムを設計することを目標としているが,初年度はさまざま未解決問題に対する調査を行うことができたとともに,紙折り問題など具体的な問題に対して効率的なアルゴリズムを設計することに成功したため.本研究は,アルゴリズムの設計や解析,計算複雑さの理論などの分野で近年急速な進歩を見せるパラメータ化計算と,その枠組みのもとで,計算複雑さの上下界を明らかにする固定パラメータアルゴリズムやパラメータ化計算複雑さ理論を対象にしている.この際,歴史的にも未解決問題へのアプローチが分野発展の原動力となっている事実に鑑み,パラメータ化計算分野において提示される未解決問題に着目し,幅広い調査や整理とともに,過去の研究で自身が得た未解決問題との間に有機的な関連を見出し,そのような問題を解決することで,計算複雑さのクラスを分離する状況証拠を積み重ねて,困難さの原因に対する知見を獲得する.これらと並行し,さまざまな離散最適化問題に対する具体的な固定パラメータアルゴリズムや高速厳密アルゴリズムを設計することも同時に行う.これらを通じて,P=NP?問題の解決への側面からの貢献を目指す.このような目標のもとで,本研究計画申請期間を通して,平面的有向グラフにおける最長路問題に対する劣指数時間アルゴリズム,辺グラフ枝削除問題に対する高速固定パラメータアルゴリズム,PSPACE完全であることが知られている二人ゲームKaylesなどに対する未解決もんだいなどを幅広く調査した.それらの中で,部分問題としてグラフ描画を含む紙折り問題や,幾何学的な問題,あるいはグラフアルゴリズム分野で基礎的な問題である支配点集合問題などに対して効率的なアルゴリズムを設計することに成功した.最終年度である二年度目は,初年度に引き続き次々と生み出される未解決問題を精力的に調査し理解する.それとともに,これまでに調査した未解決問題の中からその重要さの観点から問題を厳選し,それらを具体的な対象として固定パラメータアルゴリズムや高速厳密アルトリズムを設計することを目標とする.これらの中には,グラフアルゴリズムの分野できわめて重要な問題であり,アルゴリズム設計・解析の画期的な新手法を次々と生み出す,この分野を牽引する原動力的な計算問題の一つとなっている,グラフにおける最長路やハミルトン性を扱う予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。
新規葉酸代謝拮抗薬における皮疹出現のリスク因子の解明と予防対策の検討

新規葉酸代謝拮抗薬であるペメトレキセド(PEM)は肺癌や悪性胸膜中皮腫において主要な抗癌剤の一つであるが、PEM投与後に皮疹が高頻度に出現することが知られている。現在、皮疹予防として、デキサメタゾン(DEX)を1日8mg、3日間の高用量のステロイド投与が推奨されているが、高用量のステロイドは高血糖や精神障害など短期間でも様々な副作用を発現する。これまで皮疹発現のリスク因子や、ステロイドの予防効果を統計的に証明した報告はない。そこで、当院呼吸器・膠原病内科において2009年4月から2014年3月までの間に初回PEM治療が施行された患者を対象としてレトロスペクティブに調査を行った。対象患者134名中32名(23.9%)に皮疹が出現していた。皮疹予防効果を示すPEM投与後2日目、3日目(day2-3)のDEX量のカットオフ値は1.5mg/日であり、Day2-3に1.5mg/日以上のDEXが投与された患者では皮疹出現率が有意に減少していた(17.8% vs. 39.4%)。また、day2-3に1.5mg/日以上6mg/日未満のDEXが投与された患者と6mg/日以上の高用量のDEXが投与された患者の皮疹出現率は、それぞれ17.1%、16.7%と投与量依存のステロイドの皮疹予防効果は認めなかった。また、PEMの皮疹出現に関与する因子を検討した結果、患者背景などの関与は認められなかったが、皮疹が出現した患者群では好中球減少症の発現率が高いことが見出された。PEMによる皮疹の発現頻度は高いものの皮疹が出現しやすい患者を予測することは難しいため、PEM投与時には皮疹予防目的にステロイドの追加投与を検討する必要がある。その投与量として、day2-3に1.5mg/日以上が必要であるが、現在推奨されているほどの高用量は必要ないことが示唆された。
脳磁図によるヒト高次排尿調節機構の研究

脳磁図は、頭皮外から脳内磁界の3次元的局在を正確に推定できる非侵襲的検査法で、脳内電流変化の空間的分解能と時間的分解能に優れた非侵襲的検査法であるが、現在まで泌尿生殖器領域で脳磁図を応用した報告は見られない。今回、我々は排尿に関連する大脳皮質機能の解明を目的として、陰茎背神経(DPN)の電気刺激による体性感覚誘発磁界(SEF)を測定した。66チャンネルヘルメット型脳磁界計を用い、5例の健康成人男子ボランティアに対し、片側DPN電気刺激時のSEF記録し、正中神経(MN)、後脛骨神経(PTN)刺激時のSEFと比較検討した。さらに、各神経刺激時の頭皮上磁界分布の検討、信号源推定をおこない、各神経の大脳皮質における一次感覚野の局在について検討を加えた。DPN、MN、PTN、いずれのSEFにおいてもその磁気強度のピークを同定可能であった。各神経刺激時のSEFにおける頂点潜時を比較検討したところ、MN、PTNと比較してDPNの潜時が延長していた(p<0.001)。頂点潜時での振幅は、MN、PTNと比較してDPN-SEFが低値(p<0.001)であった。頂点潜時における頭皮上磁界分布は、DPNにおいてもMN、PTNと同様に、単一電流双極子パターンを認めた。さらに、DPN-SEFの頭皮上磁界分布の中心は、ほぼ正中に存在し、かつ陰茎の対側に偏位していた。これは、刺激側の対側の大脳皮質に神経細胞の興奮が起こっていることを示し、なおかつ、大脳半球間裂に面していることを示唆する。信号源推定では、DPN-SEFでは、刺激側と反対側の大脳半球で、MN、PTNよりも内側に信号源が推定された。本研究により、はじめてDPN-SEFが測定でき、一次感覚野の同定が可能であったことは、排尿機能や性機能に代表される、泌尿生殖器の大脳支配の解明への第一歩として、今後、脳磁図が有用な手段となりうることを示すものである。
認知・言語能力の発達におけるプロソディーの役割…神経心理学的研究…

1)幼児の認知・言語の獲得過程について。郵政省総合研究所関西先端センター知的機構研究室の協力を得て、神戸外大内に、C.T.Bestらのschemeに沿って、habituation/dishabituation procedureが実行できる装置を設置した。一方、神戸市須磨区・西区各保健所の協力を得て、約90人の生後612ヶ月の幼児を被験者として、1993年8月中旬から実験を開始した。a)現在は、実験方法の信憑性を検証しながら、/w//y/をcontrolとして使って/l/と/r/の弁別のパターンを追っている。これまでに次のような成果が得られた。イ)68ヶ月児は/l/と/r/の区別ができるのに、912ヶ月児になるとできなくなり、両音の知覚反応にいつて両者間に有意差が検出された。2)言語獲得の神経心理学的機序について何故1)のようなことが起こるのかについて神経心理学的にその原因を探ることは容易ではない。1)の/l/と/r/の弁別実験をやみくもに言語障害患者を対象に行うのは得策でない。そこで、研究者らのこれまでに蓄積された知見を整理し、音声言語認識と生成のメカニズムを、脳梁離断患者や純粋語〓患者のtiming controlのメカニズムを探ることによって、でき得る限り明らかにし、幼児の音声知覚の様態の変化を探る指標とした。ここで明らかとなったことは、1)聴解・発話単位の特定化性格、2)その生成の過程の明確化、3)リズム処理にはholisticとanalyticな2つの機構があり、これは神経心理学的に異なる処理機能を備えている、4)この2つの処理機構が音声言語処理に果たす役割、5)echoic memoryのメカニズムなどである。これは『話しことばの認識と生成』(神戸外大)やInternational Journal of Psycholinguisticsに発表された。
超機能性合成オリゴヌクレオチドによる特定遺伝子の転写制御法の開発

一般に、三重鎖核酸の形成は標的二重鎖DNAがホモプリン-ホモピリミジン配列の場合に限定され、これがアンチジーン法の一般化・実用化を大きく妨げている.申請者らは、これまでにアンチジーン法によるDNAレベルでの遺伝子発現制御に向けた新しい核酸類縁体2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acid(2',4'-BNA)の合成に成功している。今回、このBNAの標的DNAに対する三重鎖形成能を詳細に評価したところ、BNAが極めて高い三重鎖形成能を有すること、その三重鎖形成は配列特異的であること等の興味深い知見が得られた。さらに、このBNAに新たな核酸塩基を導入し、これまでは極めて困難とされてきたCG塩基対をHoogsteen型水素結合にて認識可能かどうかという点について検討を進めた。合成した新規BNA類縁体については、各種スペクトル解析(NMR、X線結晶解析)によって、その糖部立体配座が厳密にN型に固定化されていることを確認した。さらに、これら新規BNA類はアミダイト化した後、DNA合成機を用いオリゴヌクレオチドへ導入した。新規BNAを含むオリゴヌクレオチド類について、その三重鎖形成能をTm測定により評価したところ、三重鎖形成が困難であるとされている中性条件下においても、CG塩基対を極めて効果的に認識し、安定な三重鎖核酸を形成し得ることを見出した。本結果は今後のアンチジーン法の開発研究にとって非常に重要な意味を持つものである。一般に、三重鎖核酸の形成は標的二重鎖DNAがホモプリン-ホモピリミジン配列の場合に限定され、これがアンチジーン法の一般化・実用化を大きく妨げている.現在世界中でこの問題を解決すべく様々なムクレオシド類縁体の開発が繰り広げられているがまだ決定打にかけているのが現状である.申請者らは、アンチジーン法によるDNAレベルでの遺伝子を任意に制御するための新しいヌクレオシド類縁体、すなわちこれまでは極めて困難とされてきたCG塩基対、TA塩基対をHoogsteen型水素結合にて認識可能なヌクレオシド類縁体の開発を目的とし、糖部立体配座を厳密にN型に固定化したC-ヌクレオシト類を各種設計した.リボース或いはグルコースを出発原料としこれらの合成を検討したところ、目的とするC-ヌクレオシド類の効率的合成経路の開拓に成功した.これらC-ヌクレオシド類の各種スペクトル解析(NMR、X線結晶解析等)によって、その糖部立体配座がN型に固定化されていることを確認した.さらに、得られたC-ヌクレオシド類はアミダイト化した後、DNA合成機を用いオリゴヌクレオチドへ導入可能であった.今回合成に成功した各種オリゴヌクレオチド類について、その三重鎖形成能をTm測定により評価したところ、3重鎖形成が困難であるとされている中性条件下においても、CG塩基対を効果的に認識し、安定な三重鎖核酸を形成しうることを見出した.本結果は今後のアンチジーン法に関する研究にとって大きな意義を有するものであると考えられる.一般に、三重鎖核酸の形成は標的二重鎖DNAがホモプリン-ホモピリミジン配列の場合に限定され、これがアンチジーン法の一般化・実用化を大きく妨げている.申請者らは、これまでにアンチジーン法によるDNAレベルでの遺伝子発現制御に向けた新しい核酸類縁体2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acid(2',4'-BNA)の合成に成功している。
水素修飾グラフェンにおける巨大スピン軌道相互作用の検証

グラフェンは水素で修飾して対称性を破ることで、素のグラフェンと比べて100倍以上もの巨大なスピン軌道相互作用が得られることが示唆されている。そこで本研究では水素化グラフェンにおける巨大なスピン軌道相互作用の検証とこれを用いたスピントロニクスデバイス実現を目指し、スピン注入素子の作成と逆スピンホール効果の検出を行った。その結果、水素化グラフェン素子の作成に成功し、その素子特性から先行研究よりは小さいものの水素化によって確かにスピン軌道相互作用が増大していることを確認した。グラフェンを水素で修飾することによってスピン軌道相互作用が増大することを明らかにするため、水素修飾グラフェンを用いてスピントロニクスデバイスを作成し、スピン軌道相互作用に起因したピンホール・逆スピンホール効果によるスピン流・電流変換現象の観測、およびスピン軌道相互作用によるShubnikov-de Haas振動の変調の観測を目指した。スピントロニクスデバイスは機械剥離グラフェンおよびCVDグラフェンを用いて作成し、グラフェンの水素修飾にはHSQを用いた。その結果、水素修飾グラフェンに強磁性体を用いて純スピン流を注入すると、それに直交する方向に起電力が生じており、さらに面内磁場を印加することで、その起電力がスピン歳差運動を反映した振動を示すことを発見した。このような起電力は水素修飾をしていないグラフェンを用いた素子では観測されなかったことから、水素修飾によってスピン軌道相互作用が増大し、逆スピンホール効果が生じた証拠であると考えることができる。一方、グラフェンへの水素修飾の量を変えることでスピン軌道相互作用の強度を変えることができるかどうかを調べたが、水素修飾量を増やすことでグラフェンの伝導度が急激に減少し、逆スピンホール効果は観測出来なかった。また水素修飾グラフェンではどのような水素修飾量においてもShubnikov-de Haas振動は観測できなかった。これはHSQを用いた水素修飾ではSiO2が表面に残留し、それがグラフェンの電子状態を変えたためではないかと考えられる。スピントロニクスデバイスを用いて逆スピンホール効果を観測し、スピン軌道相互作用が増大している証拠を得ることができた。一方で、水素修飾プロセスにおけるグラフェンの損傷が大きいため素子の歩留まりが極めて悪く、スピンホール角を含めた様々な物理量を算出する所までは至っていない。またHSQの塗布と残留するSiO2によるグラフェンの性能の劣化が大きくデバイス作成の障害となっている。グラフェンは軽元素である炭素のみで構成されており、さらにきわめて高い対称性を持つことからスピン軌道相互作用が小さい。しかしながら近年修飾によって電子構造を変化させたり、物理的な変形や積層によって対称性を破ることで、スピン軌道相互作用を導入できることが知られてきた。2013年には最も軽い元素である水素によってグラフェンの100倍以上のである2.5meVというという巨大なスピン軌道相互作用の導入に成功したという驚くべき報告がなされたが、これは電気伝導度のみでの検証であり、スピン軌道相互作用によるスピン変換現象や操作の報告されていなかった。そこで本研究では強磁性体を用いて水素修飾グラフェンにスピン注入を行い、スピン軌道相互作用によるスピン電流変換現象やスピン操作を通じて水素修飾グラフェン内のスピン軌道相互作用増大現象の実証とデバイス化に取り組んできた。その結果、グラフェン中を流れる純スピン流と直交する方向に有限の電圧が生じることを明らかにした。またこの電圧が外部磁場を印加することで振動し、その周期が伝播する電子スピンの歳差運動と対応することから、スピン流による起電力であることを示した。これによってグラフェン内で、増大したスピン軌道相互作用による逆スピンホール効果が生じていることを実証した。さらに解析から面直のラッシュバスピン軌道相互作用によって面内方向の有効磁場が生じていることも明らかにした。また、グラフェンに限らずいくつかの原子層では細孔によって強磁性になることが明らかとなってきており、細孔をあけることで生じるエッジ強磁性を利用して強磁性元素を使用しないスピン注入素子の作成に取り組んできた。特に黒リンでは細孔構造と酸素終端により水素終端グラフェンの100倍もの磁化が生じることが明らかになった。HSQによる水素修飾では残留するSiO2がグラフェンの性能の劣化の大きな要因であると考えられる。そのため、SiO2の影響を避ける方法としてHSQ濃度の調整し、さらに超薄膜によるグラフェンの表面保護や、化学薬品による残留物の除去することでグラフェンの性能を維持できるかを調べる。またHSQ以外の方法で水素修飾することでもスピン軌道相互作用が得られないかを調べ、十分なスピンコヒーレンス長を持つ水素修飾グラフェンを実現しスピン干渉素子を実現する。物性実験物品の納期が遅れたため納期の遅れた物品は4月購入予定
マトリックス中のナノ細孔設計による中空空間の高効率機能化

中空空間をもつ新規ナノ材料の開発として、分子鋳型法や有機・無機ナノ複合化、ゾルゲル法などの技術を融合した物質の移動や伝達の可能な中空マトリックスの合成を試みた。一般に中空空間は固いマトリックスによって外部との接触が遮断された非効率的空間であり、識別や運送可能なマトリックスの設計は、中空材料の新しい可能性を生み出す鍵となる。平成18年度においては、マトリックス中へのホスト化合物を用いた分子認識サイトの導入と分子認識機能の検討を行った。具体的には、まず、鋳型となる有機分子をシクロデキストリン(CD)ホストとともに錯体を形成し、この錯体を金属アルコキシドと交互に積層化し、薄膜を作成した。次いでこの鋳型分子を除去することで金属酸化物マトリックス中に特定のボスト分子をアンカーとした鋳型分子の形を作成した(Biosens. Bioelectron.,22,388,2006)。この方法の特徴は、ホスト化合物をナノレベルのマトリックス中に導入でき、従って拡散性と分子認識能力の高い製膜プロセスが達成できることである。しかしながら、この製膜プロセスの短所として、マトリックスとなる金属アルコキシドの吸着に有機溶剤を用いるため、CD中に導入された鋳型分子の脱離の恐れがある。このような問題を解決するために、金属マトリックスの作成プロセスに気相表面ゾルゲル法を導入することを検討した。その他生体分子による製膜プロセスを試み、安定・均一な製膜や薄膜の機能化に有効であることが実証された(Chem. Lett.,35,990,2006)。さらに本研究では、抗アドレナリン薬として用いられているpropranololの光学異性体を持ち、スピンコーティングによる分子鋳型法を検討した。また、膜厚の制御や加熱処理を検討し、鋳型分子の吸着特性を調べたところ、ほぼ100%に近いキラル認識が可能であることが確認された(Proceedings of IEEE Sensors2006,1249,2006)。現在、これらの技術を利用した機能性中空粒子の合成を進行中である。中空構造を材料とする一番大きな魅力は、その空間であるが、一般にその空間は固いマトリックスによって外部との接触が遮断された非効率的空間という欠点をもつ。本研究では、その3次元空間を化学反応の新しい場として用いるための手法として、物質の移動や伝達の可能な中空マトリックスの開発を目的とした。まず、平成17年度においては、マトリックス中のナノ細孔のサイズ制御に関する最適条件を検討した。具体的には、ナノ細孔の作成法として、(1)鋳型となる有機分子を金属アルコキシドモノマーと適切な比率で複合化し、その混合物を用いて薄膜を作成した後、次いでこの鋳型分子を除去することで金属酸化物マトリックス中に鋳型分子の形を作る(Chem.Lett.,34(12),1686,2005)、(2)表面ゾル-ゲル法により金属酸化物/ポリマー複合薄膜を形成し、プラズマ法を用いて鋳型となるポリマー分子を除去することで金属酸化物マトリックス中にナノ細孔を作成する方法を試みた。方法(1)の特徴として、マトリックスとなる金属アルコキシドと鋳型分子の濃度比を変えることで鋳型分子の細孔を精密に制御することができ、場合によってはタンパク質などの巨大分子の固定化にも応用可能である。方法(2)は、小分子を鋳型とする方法(1)に比べ、正確な分子細孔を作ることはできないが、ポリマー自身の慣性半径によって異なったナノ細孔を作成することができる。ポリアクリル酸(PAA)を用いた場合とポリビニルアルコール(PVA)を用いた場合の膜厚に関連した吸着挙動について調べたところ、PVA膜ではフラーレン(直径:1nm)、cyt.c(直径:約3nm)などに対して吸着量の定量的増加を示すが、PAA膜ではそのような相関が得られないことが分かった。このような吸着挙動は、本研究で用いたポリマーの慣性半径に由来するものであることが実測のポリマーのサイズから明らかとなった。平成18年度においては、平成17年度において検討した実験条件をベースに多孔性中空粒子の合成およびその機能化に取り組む。

このような問題を解決するために、金属マトリックスの作成プロセスに気相表面ゾルゲル法を導入することを検討した。その他生体分子による製膜プロセスを試み、安定・均一な製膜や薄膜の機能化に有効であることが実証された(Chem. Lett.,35,990,2006)。さらに本研究では、抗アドレナリン薬として用いられているpropranololの光学異性体を持ち、スピンコーティングによる分子鋳型法を検討した。また、膜厚の制御や加熱処理を検討し、鋳型分子の吸着特性を調べたところ、ほぼ100%に近いキラル認識が可能であることが確認された(Proceedings of IEEE Sensors2006,1249,2006)。現在、これらの技術を利用した機能性中空粒子の合成を進行中である。
授業可視化プラットフォームの構築

CMS/ LMS(授業支援ツール)の学生活動ログを可視化、分析するためのシステムについて、必要な機能を検討し、「授業可視化プラットフォームVisP」として提案した。提案したシステムについて、オープンソースLMSのMoodleのブロックモジュールとして実装した。可視化手法を、統計解析ソフトRのスクリプトで記述し、システムにモジュールとして組み込む手法を提案した。また、授業可視化の手法について実際の授業データやSNSデータに基づいて開発を行った。本年度は、授業可視化プラットフォームの完成をめざして仕様の検討と実装を行なった。検討のなかで、セキュリティに関する問題があきらかになった。可視化モジュールは本システムの利用者が自由に作成してインストールする事ができるものである。セキュリティの問題とは、可視化モジュールの作成者が、モジュール内に組み込むPHPスクリプトを通してシステムが持つすべてのデータにアクセスできてしまう事である。当初の設計では、PHPで記述するものになっていたたえ、データベースのアクセスに可視化プラットフォーム管理者と同等の権限を持って行なうことになってしまう。これを回避するため、テータベースにアクセスしてデータを抽出する部分は授業可視化プラットフォームが行い、可視化モジュールの中からは行なえなくする必要がある。検討の結果、オープンソースのデータ解析言語であるRと組み合わせて、可視化モジュール部分をRのスクリプトとして作成する方針でシステムの再設計を行なった。これにより、データ抽出部分とはまったく独立の形で可視化モジュールを作成する事が可能となる。また、モジュール開発の際にも手元のRでデバッグを行なえるようになり簡便に開発環境が構築できる。それに加えてRの豊富なグラフイックライブラリおよびグラフィックAPIが利用できるようになり、さまざまな可視化モジュールの開発がより少ない手順で行なえるようになる。この方針に従い、システムの再設計を行なった。再設計の詳細について国際学会で発表し平成21年度末現在実装を進行中である。昨年度セキュリティ問題が発覚したことを受け、慎重に再設計ならびに実装をすすめている。実装にはオープンソースのコース管理システムMoodle1.9ならびに統計パッケージのRを利用し、Moodle 1.9のモジュールとして、本システム(授業可視化システム)の開発をしている。本システムの実装は大きくデータベースモジュール、可視化モジュールのハンドリング、ならびに可視化モジュールそのものにわけられる。データベースモジュールに関しては、コース管理システムのBlackboard Learning System CE8とMooldeのデータベースに対応する形で実装をした。現在、可視化モジュールのハンドリング部分を作成している。まだ完成には至っていないが、内部的な動作の検証をおこない、ユーザインタフェースの詳細な部分を作り込んで行く段階である。可視化モジュール、すなわち授業の可視化そのものに関しては、アイデア段階のものもふくめていくつかのものを試験的に作成している。コース管理システムへのログイン情報、オンラインテストの点数を主な素材としていくつかの可視化を試すと同時に、文献、他の研究者の活用状況を調査している段階である。この部分に関し、特に掲示板データ等のネットワークを使った可視化に関して共同研究者が成果発表を行った。これらの研究ではコース管理システムの掲示板データだけでなく、SNS(ソーシャルネットワークシステム)の交友関係を元にしたネットワークの分析も行っており、本研究課題で開発するシステムのSNSへの拡張のための準備になっている。本研究の目的は、CMS(コース・マネージメント・システム/授業運営支援システム)から発生する大量の学習データの可視化を日常の授業で利用可能とするための授業可視化プラットフォームを構築し、プラットフォームを共有する教員間の情報共有を促進することである。そのため、オープンソースのコース管理システムであるmoodleのブロックモジュールとして、本可視化プラットフォームを作成した。可視化のエンジンとしてはこれもオープンソースのデータ解析言語であるRを用いた。本システムの主な開発部分は、LMSからのデータ輸入を行うデータベースモジュールと、可視化モジュールを管理する部分である。可視化モジュールは、Rのスクリプトとして作成するが、本システムでは、Moodleのデータベースに蓄積した学習データを、セキュリティを考慮してアクセス可能な部分だけを抽出、Rスクリプトで取り扱える形に変換して可視化モジュールへ渡す部分を作成した。教員間の情報共有を促進するためのコミュニティ作りに関しては、まだシステムが公開できる段階に至っていないために、大きくは進んでいないが、教育データ分析に関する研究会の開催などが共同研究者を中心として進みつつある。可視化モジュール、すなわち授業の可視化そのものに関しては、いくつかのものを作成した。コース管理システムへのログイン情報、オンラインテストの点数、掲示板データ可視化のモジュールを作成した。また、SNS(ソーシャル・ネットワーク・サービス)の交友関係を元にしたネットワークの分析も行った。
AED普及にともなう学校救急の変貌と体制作り

AED普及による校内研修体制構築の必要条件を探り、今後の教職員の救急救命処置対応における研修の方向性を見出すため実態調査及び実技研修を行った。その結果、効果が得られる研修方法は(1)定期的に繰り返し行う実技の練習、(2)AED・CPRの仕組みを理解できる教材、(3)自分自身の技量が把握できる教材の活用であった。その上で最新の医学情報に基づくあらゆる場面を想定した実践的研修が重要であることがわかった。したがって、今後これらの内容を組み入れた実践力をつける研修プログラムを構築することが急務であることが明らかになった。1AEDの普及による校内研修体制の現状を把握し、救急処置技能研修の方向性の基礎データを得る目的で、A県に勤務する小・中学校の養護教諭を対象に調査を行った。その結果、以下の知見が得られた。(1)実際にAEDを使用したことがあると答えた者は、2.0%であった。(2)研修を設定している学校は、79.7%であり、内容は心肺蘇生法が95.0%・AED92.9%であった。(3)開催頻度は、定期的に年1回が72.7%、指導者は消防士(82.7%)が一番多かった。(4)今迄受けた研修会の方法は、実技の研修が一番多く99.3%を占めていた。(5)救急処置研修において効果がある研修内容は、実技の練習(98.0%)が多く、次いで何回も練習(77,7%)、講義(75.1%)、少人数での研修(71.4%)であった。(6)研修の実施により効果が見られる(教職員の救急体制への意識の変化)理由は、職員の積極的態度や危機管理意識の高まり、水泳学習時における実践化、また、技術の定着、校内協力体制の構築が挙げられた。(6)AEDを含む研修に望むことは、内容については実践場面を想定した演習、方法は専門家による反復練習、目標としては教職員自身の実践化、また、基礎・最新理論の習得、対象の拡大、AEDの貸し出し等であった。2教育学部学生を対象に救急処置研修会を実施した。今回の調査・研修会で、研修の実態を把握することができた。次年度は得られた結果を活かし、具体的に救急処置技能研修プログラムを作成していきたい。AEDの普及により、救急処置に関する校内研修や指導者研修の内容も変化してきている。昨年度の実態調査の結果において、研修内容の希望は、実践面を想定した演習や基礎・最新理論の習得であった。そこで、「CPR・AED学習キット」による実践、また、現在救急処置研修では音声による指示操作が中心であるが、今回の研修では、心電図の波形(心室細動・心停止等)がコントロールでき、それに対応できるAED操作を実習できる「ミニアンとレサシアンモジュラーシステムCPR-モデル」を教材として使用した研修プログラムを企画し、研修を行った。研修対象は、現職養護教諭124名養成機関教員5名その他4名また、中学生25名(総合的な学習)である。参加者の研修への評価では、「波形が出るAEDは、AEDの意味が理解できた」「学習キット」を実際に扱いパットの貼り方や部位が確認できた」「児童生徒の教材として学習キットは適している」「実際体験したことで、自分自身を振り返ることができ、また、繰り返し行う研修が重要であることが確認できた」等の意見を得た。また、中学生の認識では、心停止の状態でもAEDは有効であると理解していた生徒もおり、今回使用した学習教材は、有効であったことが窺えた。AEDの普及に伴う研修の啓発活動が目覚しい現状において、救急処置研修の意味や根拠そして学習教材についても検討し、開発していくことの必要性が示唆された。AEDの普及により、救急救命処置に対する研修はその内容も変化し、また啓発活動も目覚しい。本研究の実態調査より研修内容は、実践面を想定した演習や最新の理論の習得を希望する者が多数を占めている。また、対象別(中学生・現職養護教諭・養成に関わる教員)に実技を中心に行った研修においても、繰り返し学び習得する意義が得られた。そこで、今年度は学校現場において救急救命処置の中心となる役割を担う教育学部養護教諭養成課程の学生(1年生・4年生)を対象に実際に「CPR・AED学習キット」を用いた演習「レサシアン/モジュラーシステム/CPR-Dモデル」を用いた学習を行った。その結果、今迄救急救命の学習を受けているものは、高校の保健体育の授業で受けている者が多く、運転免許証取得時、また、4年生は大学の研修で学んだものが多数占めた。その内容は、1年生は、レサシアンを活用しての学習内容であり、実際にAEDの操作を学んだ者は数名であったが、4年生はAEDの操作も含めての学習内容であった。

実習後の評価の問いである「学生の間に身につけておきたい救急処置能力」では、初めて学ぶ者が多い1年生は"正しく行える""正しい知識""状況に応じた対応"、4年生では"状況を判断し、迅速に冷静に動ける""正しく使える"であった。養成の教育では、医学面のカリキュラムと整合させた系統的な学習を行うことが重要であることが示唆された。
特異的ヘテロ原子サイトを有する革新的ゼオライトの計算機支援合成

ゼオライトは結晶性多孔質アルミノケイ酸塩であり、その高い比表面積、水熱安定性、固体酸性などの特性から、触媒、吸着剤、イオン交換剤として広く用いられている。骨格構造中における、AlやZnなどのヘテロ原子の位置は、ゼオライトの物理化学的特性の根幹であり、その制御はゼオライト合成の究極の目標の1つと言える。本研究では、計算機化学により設計した有機構造規定剤を用いることで、Al原子を有するゼオライトの結晶化経路をエンジニアし、Al原子位置の制御されたゼオライトを合成した。また、Alだけでなく、新規ジンコシリケートゼオライトの合成にも成功した。材料化学、化学工学
若手小学校教師の熟達への学習プロセスの分析と実践への応用

教師の熟達化に関する研究は,昨今の社会的背景や要請から鑑みても,意義があり時宜を得た研究であると言える。本研究では,小学校教師の経験からの学習に着目し,インタビュー調査,質問紙調査,授業分析,授業研究会の分析を行った。本研究では,単なる人と人,人とモノとの相互行為を経験とすることを越えて,活動がどのように変容しネットワークとして組織されていくか、その道筋を経験と定義した。そして経験学習を捉える枠組みとして,経験を観想的経験と活動的経験に二分し,認知的痕跡論(Cussins,1992,1993)に基づき分析を行った。調査対象校(横浜市立小学校)1校の担任教師全員に依頼し実施したインタビュー調査,質問紙調査の言説分析,ネットワーク分析を行った。さらに初任・若手小学校教師を中心に1年間授業を観察し,認知的痕跡として教授手法の一つであるリボイシングを含むやり取りを抽出し,教師段階の特徴を描き出し比較した。また,対象校の重点研究会の研究授業と授業研究会を観察し,分析を行った。授業研究会は,議論の主要なテーマと頻出する言葉を認知的痕跡とし,カテゴリ化し,その変遷を追跡することで痕跡のネットワークを描き出した。同時に研究会の参加構造についても分析し,それがとのような経験を象らせることになるか考察した。また,これは観察した授業のビデオを見せながら筆者が意見を述べる形式で参加する,デザイン実践であった。その結果,都合の良い関係の切り結び方だけでなく,役職・役割を媒介として職員間のネットワークが形成されていた。また,授業研究会は義務的参加といった硬く構造化きれているが故に,表面的で浅い経験としかなり得ない一方で,参加者全員に共通の経験を象らせることができるという特徴があった。今後,それぞれの研究を再編成し,国外を含めたジャーナルなどを通して研究成果を公表したり,実践への参加を通して改善に活用したりしていく予定である。対象フィールドである横浜市内の小学校ヘボランティアとして実践に参加することを通し、定期的(週23日)にフィールド・ワークを行った。具体的な調査方法は、新任教師2名を中心に授業を観察・ビデオ録画した。また、夏期休業中には自由記述式質問紙調査とインタビュー調査を了解いただいた担任教師全員に実施した。フィールド・ワークと並行して、経験および経験からの学習概念について文献調査を進めた。研究会などを関催して、経験概念の精緻化と分析枠組みとしての有用性を検対した。経験からの学習は従来、回顧的(語りや省察等)に扱われ、学習は経験がトリガーとなり引き起こされるという意味で、経験と学習は相互に不可分であるとされてきた。つまり、経験が学習に先んじて存在し、学習が後続するという固定的で文脈独立的な見方がされてきた。そして経験と学習(event and lesson)構造のセットを抽出することが目指されてきた(たとえば、松尾,2006;金井,2002;金井・古野,2001;Kolb,1984;Kolb&Kolb,2005:谷口;2006など)。しかし分析の結果、経験が所与で固定的に学習に先んじて存在するのではなく(したがって経験が学習を先導するのではなく)、経験と学習は相互に構成し合い、経験と学習は実践を語る、省察するという実践の中でその都度的に相互に(再)構成し合っていると考えられた。また、Cussins(1992)の認知的形跡(cognitive trails)論とこの経験概念を融合することで、実践語りの形跡を同定し追跡することで経験および経験からの学習を詳らかにできる分析装置となると考えられた。
隕石の超高精度Mo同位体分析による地球の水の起源に関する研究

研究初年度はMo同位体分析法の開発を行った。まず、プレソーラー粒子を含む隕石を完全分解する手法の開発を行った。研究代表者はこれまで、隕石を完全分解する手法として、試料にフッ化水素酸・硝酸・硫酸を加え、高圧分解装置(DAB-2)で250 °Cに加熱する手法を開発し、NdやSrの同位体分析に適用してきた。本手法の問題点は、DABの耐圧容器(SUS316Ti)にMoが23%程度含まれているため、分解時に試料がMo汚染を受けてしまうことである。そこで、耐圧容器内にセットする試料容器(テフロン製)を二重にすることで、問題解決を試みた。その結果、Mo汚染の程度は軽減されたが、依然数10 ngのMoが混入し、本分解法がMo同位体分析には適さないことが判明した。一方、TIMSを用いたMo同位体分析法に関しては、従来のStatic法ではなく、検出器の経年劣化をキャンセル可能なDynamic法による測定法を開発した。Dynamic法を適用した結果、Mo同位体比の精度が数倍向上した。例えば95Mo/96Mo比に関し、Static法では繰り返し再現性50 ppm程度であったものが、Dynamic法では12 ppmとなった。これにより、隕石に見られるごくわずかなMo同位体比の変動を検出することが可能となった。分析技術の開発においては、若干の遅れが生じている。これは、試料の分解に高圧分解法が適用できないとの結論に至るまで、数多くの実験を試みたためである。また、連携研究者が一般企業に就職し、研究上の協力が得られなくなったことも遅延の原因の一つである。様々な工夫を凝らしたが、最終的にどうしても容器からのMo混入を防ぐことができなかった。一方、TIMSによるMo同位体分析法に関しては、Dynamic法を用いることにより、予想以上の精度向上を達成することができた。今後、試料分解法の開発がすすめば、隕石の高精度Mo同位体比データを逐次獲得することが可能になる。研究2年次は、隕石の完全分解法として、アルカリ融解法を適用する。アルカリ融解法では使用する融剤から微量元素が汚染するため、分解した試料のSrやBa同位体分析は不可能となるが、Mo, Ru, REEなどの同位体分析を実施する上では問題ない。同時に、Mo化学分離法の確立を行う。Moの化学分離はイオン交換法により行う。基本的な分離法は既に確立済みだが、隕石の完全分解でアルカリ融剤を用いるため、それらを除去するための新たな分離工程を確立する必要がある。分離には陰イオン交換樹脂を用いる予定である。一方、隕石試料の分析では炭素質コンドライト、および分化隕石、特に小惑星ベスタ由来のHED隕石の分析を行う。HED隕石はプレソーラー粒子を含まないため、完全分解法を適用する必要はない。なお、連携研究者が不在である点に関しては、Mo同位体分析を研究テーマとする研究室の学生と協力しながら補う。隕石のMo同位体組成を基に、研究計画班と議論を行い、原始地球への小天体の衝突と元素供給プロセス、およびレイトベニア仮説を検証する。

同時に、Mo化学分離法の確立を行う。Moの化学分離はイオン交換法により行う。基本的な分離法は既に確立済みだが、隕石の完全分解でアルカリ融剤を用いるため、それらを除去するための新たな分離工程を確立する必要がある。分離には陰イオン交換樹脂を用いる予定である。一方、隕石試料の分析では炭素質コンドライト、および分化隕石、特に小惑星ベスタ由来のHED隕石の分析を行う。HED隕石はプレソーラー粒子を含まないため、完全分解法を適用する必要はない。なお、連携研究者が不在である点に関しては、Mo同位体分析を研究テーマとする研究室の学生と協力しながら補う。隕石のMo同位体組成を基に、研究計画班と議論を行い、原始地球への小天体の衝突と元素供給プロセス、およびレイトベニア仮説を検証する。
オートファジーにおける膜の起源：オルガネラバイオジェネシスの解明

細胞内の分解システムであるオートファジーは、発生・分化から、発がん・神経変性疾患・感染症等の抑制まで多岐に亘る機能を持つ。オートファジーを遂行する膜で出来た構造体オートファゴソームがどこで作られているのかが、40年来論争の的となってきた。今回我々は、オートファゴソームがミトコンドリアと小胞体の接触点で形成されることを発見した。永年の謎が解けると共に、オートファジーを制御して疾患を治療する方法の開発に役立つ情報が得られたことになる。オートファジーを遂行する膜オルガネラであるオートファゴソームは、他のオルガネラとは異なり常に新たに形成されるが、どこからそれが現れるのか40年来論争の的となってきた。本研究計画では、応募者が最近見いだした小胞体のオートファゴソーム形成への関与を手がかりに集中的かつ統合的な解析を展開し、オートファジー分野における最大の謎「膜の起源」問題について最終的な決着をつけることを目的としている。初年度である平成23年度は、交付申請書に記載の2つの計画を実施し各々について以下の成果を得た。1)Atg14Lの小胞体上での点状集合に必要な分子としてSyntaxin17を同定した(大阪大学歯学部天野敦雄教授らとの共同研究)。Syntaxin17は小胞体に局在するSNAREfamilyの膜タンパク質で、これまで機能ははっきりしていなかった。我々は、Syntaxin17がAtg14Lの上流に位置し、Atg14Lの点状集合に必須であることを見出した。またSyntaxin17もオートファジー誘導時に、Atg14Lと同じ場所に集合することを明らかにした。また、電子線トモグラフィーによる揺りかご構造の詳細な検討を行い、構造の近傍にミトコンドリアが存在することを突き止めた。2)上記Syntaxin17が、Atg14Lと共にミトコンドリア・小胞体接触サイトに点状集合することが判明した。さらに、接触サイトの形成に必要なPACS2のノックダウンによって、両者の点状集合が阻害され、かつオートファゴソームも形成されなくなることを示した。以上の知見から、Syntaxin17と共にAtg14Lがミトコンドリア・小胞体接触サイトに集合するとそこでオートファゴソームが形成されるというモデルを考えている。細胞内大規模分解システム・オートファジーは、発生・分化から、がん・神経変性・感染症等の抑制まで多岐に亘る機能を持つ。本研究では、応募者が最近見いだした小胞体のオートファゴソーム形成への関与を手がかりに集中的かつ統合的な解析を展開し、オートファジー分野における最大の謎「膜の起源」問題について最終的な決着をつけることを目的とした。平成24年度に、オートファゴソームが小胞体ーミトコンドリア接触点で形成されているという決定的な証拠を得て目的をほぼ達成したので、平成25年度はさらなる解析を行った。その結果、以下の成果を得た。オートファゴソーム形成に必要な膜タンパク質Atg9は、普段はゴルジ体に局在し必要に応じて一過性にオートファゴソーム膜に現れるので、輸送小胞により何かを運んでいる可能性がある。輸送シグナルと思われる配列に変異を導入してAtg9-KO細胞に発現させると、野生型のようにオートファジーを回復できないことが判明したので、その変異Atg9を用いて詳細な解析を行った結果、Atg9が再循環エンドソームを経由することがオートファゴソーム形成に必要であることが判明した。本研究の全ての結果を総合すると、オートファゴソーム形成には、少なくとも3つのオルガネラ、小胞体、ミトコンドリア、再循環エンドソームが関わることが結論される。今年度は以下の如く分野のブレイクスルーとなる画期的な成果を得ることができた。1)これまで世界的にも前例が無いレーザー蛍光顕微鏡による3色同時撮影システムを構築し、小胞体とミトコンドリアがダイナミックに接触する様子をライブ観察で捉え、その接触点でオートファゴソームが形成される様子を動画撮影することに成功した。オートファゴソームの生成と接触点の関係を直接観察した画期的な成果である。さらには画像のデジタル処理により形成を定量化し、また形成途上のオートファゴソームが常に小胞体上にあるのに対し、ミトコンドリアに対しては接触と僅かな解離を繰り返していることも明らかにした。