hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
仮象の美学――ベンヤミンの仮象概念を軸に

また、多くの先行研究に当たることでベンヤミンの仮象概念の来歴を確認するとともに、幅広いジャンルの参考文献読解を通してその広範な適用可能性のための指針を得ることができた。ただ、当時の映画受容状況に関してはいまだ未解明な点も多い。この点については引き続き2014年度の研究課題としたい。2014年度は、これまでに得られた研究結果を綜合し、「仮象の美学」を構築することを目標とする。そのためには「仮象」の語が美学史においてどのように扱われてきたのかを検討すること、またそのような仮象のとらえられ方が具体的な芸術作品の上にどのように表されているのかを確認することが必要となる。このような作業を通して、従来の美学史を「仮象」の語を軸として再構成するとともに、人間がこれまで「見せかけ」という問題とどのように取り組んできたかを明らかにすることを目指す。こうしたかたちでの「仮象の美学」の構築は、コピーやまがいもののイメージがあふれる現代のメディア状況を考察する上でも重要なものとなると思われる。
日本列島海域テクトニクスの研究

本研究においては日本列島海域のテクトニクスの問題点を洗いだすとともに、重要な研究課題を取り上げそれらについての研究のアプローチの方法とくに研究体制と研究手法について検討を行なった。まず全体のテクトニックフレームワークについていくつかのモデルを研究した。その結果、1)日本列島の現在のテクトニクスは約200万年前から始まった。2)その要素として重要なのは日本海東縁の変形、東北日本の東西圧縮、西南日本の東西圧縮、中央構造線の右ずれ運動、沖縄トラフの拡大である。現在のテクトニクスの要因として最も重要なのは日本海東縁の圧縮テクトニクスおよび伊豆小笠原島弧の衝突テクトニクスと考えられる。したがって海域テクトニクスの主要課題として、1)日本海東縁の変形とはどのような性質のものか(本当にプレート境界か)。2)沖縄トラフはなぜ拡大を開始したのか。中央構造線と沖縄トラフの拡大テクトニクスの関係は。3)伊豆・銭州変形帯の性質は何か。新しいプレート境界は誕生しているのか。について研究すべきである。これらの課題アプローチとしては従来の海底探査(海底地形・地質・地殻構造・地球物理探査)に加えて次の手法の導入が必要である。1)海底地殻変動観測手法・海底活断層調査手法を確立する2)深部地殻の反射法探査手法を確立する3)海底地震観測を強化する4)陸上や離島GPS観測による地殻変動・プレート運動観測とタイアップするこれを効果的に実施するには大学における海底研究体制の大幅な強化が是非必要である。
ヘムシャペロンHRG-3による細胞間ヘム輸送の分子機構

ヘム(鉄ポルフィリン錯体)は、ほぼ全ての生物が生命維持に利用する化合物であるにも関わらず、その生体内輸送メカニズムは未解明であった。本研究では、線虫のヘム輸送に関わる新規な2種類のタンパク質HRG-3とHRG-4の調製法を確立し、各種分光測定や結晶化、ならびにヘム生合成欠損酵母を用いた機能解析を行うことにより、ヘム輸送メカニズムについて検討した。その結果、細胞間ヘムシャペロンと推定されたHRG-3は2量体あたり1分子のヘムを結合し6量体でヘムを輸送すること、腸管細胞の形質膜に局在するヘムトランスポーターHRG-4はポルフィリン環との相互作用によりヘムを輸送することなどを明らかにした。ヘム(鉄ポルフィリン錯体)は、微生物から動植物まで全ての生物において、様々な蛋白質の活性中心として存在し、重要な生理機能を担う生命維持に必須の生理活性物質である。近年、細胞内におけるヘム濃度の恒常性維持に関する研究は、微生物、酵母、哺乳類が有するシステムについて、国内のみならず海外からも幾つか報告例がある。しかし、細胞間や組織間におけるヘムの輸送や恒常性維持については、関連する分子が特定されておらず、全く未解明であった。本研究では、ヘム栄養要求生物である線虫C. elegansの遺伝子ノックアウト実験により近年同定された「細胞間ヘムシャペロンHRG-3」を研究対象とし、その構造機能解析により、細胞間ヘム輸送の分子機構解明を目的とした。本年度は、大腸菌を用いた組換えHRG-3の調製法確立とヘムの結合様式の検討を行った。HRG-3は低分子量の可溶性タンパク質である。この組換え体を大腸菌内で発現する際、タンパク質分解を受けたり、封入体として沈殿してしまう傾向が見られた。様々な発現系を構築し、タンパク質の発現条件を検討した結果、インテインタグを付加することにより、分解されず、かつ可溶性タンパク質として発現することができた。単離後、インテインタグを切断し、各種カラムクロマトグラフィーにより高純度な組換えHRG-3を調製する方法を確立した。精製標品にヘムは含まれていなかったが、ヘムを添加し、可視吸収スペクトルを測定すると、ヘムが結合した。そのスペクトルは、これまでのヘムタンパク質には見られない挙動を示した。今後は、共鳴ラマン分光法などによりヘムの配位環境を調べる。また、HRG-3は相同なタンパク質が存在せず、これまでにない立体構造を有する可能性がある。現在、X線結晶構造解析によりHRG-3の立体構造を解明するために、ヘム結合型/非結合型HRG-3の結晶化を行っている。ヘム(鉄ポルフィリン錯体)は、多くの重要な生理機能を担うタンパク質や酵素の補欠分子として機能するだけでなく、無機鉄よりも吸収率の高い鉄栄養源としてほぼ全ての生物の生命維持に不可欠な化合物である。しかし、食餌から摂取したヘムがどのようにして生体内で輸送されているのかは、関与する分子の同定やその構造機能相関の研究が遅れており不明瞭な点が多い。本研究では、ヒトにおけるヘム輸送タンパク質の良いモデルとされている線虫の細胞間ヘム輸送タンパク質HRG-3を研究対象とし、鉄栄養源として獲得したヘムの細胞間輸送の解明を目的とした。平成25年度に組換えHRG-3の調製方法を確立したので、平成26年度は生化学的手法や分光測定により、HRG-3のヘム結合に関する性質を調べた。HRG-3精製標品のヘミン滴定実験により、2分子のHRG-3に1分子のヘムが結合することを明らかにした。また、ヘム結合型および非結合型HRG-3のCDスペクトル測定により、HRG-3の二次構造はヘムの結合/非結合に関わらず、不規則構造をとることを明らかにした。さらに平成26年度は、HRG-3だけでなく、細胞外から細胞内へのヘム取り込むためのヘム輸送タンパク質HRG-4も研究対象とし、それらの構造機能解析により、鉄栄養源として獲得したヘムの生体内輸送メカニズムを詳細に解明することを目指した。HRG-4は、その一次構造から4回膜貫通型の膜タンパク質であることが推測されているが、既知の輸送体タンパク質とは異なる立体構造や機能メカニズムを有することが示唆されている。組換えHRG-4は、大腸菌など原核生物のタンパク質発現システムでは良質の試料が調製できなかったが、分裂酵母Pichia pastorisを用いて発現させることにより、構造解析に適した質と量の試料を調製できるようになった。ヘム(鉄ポルフィリン錯体)は、重要な生理機能を担うタンパク質や酵素の補欠分子として機能するだけでなく、無機鉄よりも吸収率の高い鉄栄養源として、ほぼ全ての生物の生命維持に不可欠な物質である。しかし、食餌から摂取したヘムがどのようにして生体内で輸送されているのかは、関与する分子の同定やその構造機能相関の研究が遅れており、不明瞭な点が多い。本研究では、後生動物が有するヘム輸送タンパク質として近年新たに同定された線虫由来HRGタンパク質を研究対象とし、鉄栄養源として獲得したヘムの輸送に関する分子機構の解明を目的とした。平成26年度までにHRG-3の調製法を確立し、生化学的ならびに分光学的キャラクタリゼーションはほぼ完了したので、平成27年度はHRG-3からヘムを受け取る可能性があるHRG-4を中心に研究を進めた。HRG-4は、腸管の細胞外から細胞内にヘムを取り込むために用いられる膜タンパク質である。

その一次構造からは4回膜貫通型タンパク質であることが推測されているが、既知の輸送体タンパク質とは異なる立体構造を有することが示唆されていた。本研究では、HRG-4の立体構造を明らかにしてヘム輸送の分子機構について議論するために、組換えHRG-4の高純度調製法を確立し、X線結晶構造解析による構造決定に向けて結晶化に取り組み、単結晶を得た。さらに、輸送基質の特異性を検討するために、ヘム生合成系遺伝子を欠損した酵母を用いた機能解析も行った。その結果、ヘムだけでなく亜鉛ポルフィリンなどの中心金属が異なるポルフィリン化合物も輸送できることを明らかにした。この結果から、HRG-4はヘムに含まれる中心鉄ではなくポルフィリン環を認識することによりヘムを輸送するという分子機構を提案した。ヘム(鉄ポルフィリン錯体)は、ほぼ全ての生物が生命維持に利用する化合物であるにも関わらず、その生体内輸送メカニズムは未解明であった。本研究では、線虫のヘム輸送に関わる新規な2種類のタンパク質HRG-3とHRG-4の調製法を確立し、各種分光測定や結晶化、ならびにヘム生合成欠損酵母を用いた機能解析を行うことにより、ヘム輸送メカニズムについて検討した。その結果、細胞間ヘムシャペロンと推定されたHRG-3は2量体あたり1分子のヘムを結合し6量体でヘムを輸送すること、腸管細胞の形質膜に局在するヘムトランスポーターHRG-4はポルフィリン環との相互作用によりヘムを輸送することなどを明らかにした。平成26年度以降、生化学的手法や分光法による細胞間ヘム輸送タンパク質HRG-3の構造機能解析の他に、食餌から獲得したヘムを腸管細胞内に輸送するヘム取り込み輸送体HRG-4の調製を計画していた。いずれも計画通り順調に進められている。生物無機化学組換えHRG-4の調製方法も確立できたので、高純度に精製する方法を検討し、X線結晶構造解析による立体構造解析のための結晶化を行う。また、生化学的手法によりヘムの授受に伴うHRG-3とHRG-4の相互作用について検討する。平成25年度の研究計画として、研究対象タンパク質HRG-3の調製、ヘムの結合評価、立体構造解明をあげていた。研究実績概要のとおり、大腸菌組換えと各種カラムクロマトグラフィーにより、HRG-3の調製方法を確立できた。また、精製標品がヘムを結合できることも確認し、ヘム結合型/非結合型での結晶化に向けて研究を進められているため、すべて順調に行うことができたと考えている。平成26年度は、HRG-3の構造解析を中心に研究を進める。X線結晶構造解析に適した単結晶を調製できなかった場合は、NMRなど別の手法による構造解析を行う。その後、HRG-3のヘムシャペロンとしての機能を調べるために、HRG-3からヘムを受け取るタンパク質を調製する。HRG-3とそのタンパク質間でのヘムの授受機構について、生化学的手法や分光法により検討していく予定である。
骨髄並びに血液中からの再生医療用細胞分離膜の調製と幹細胞分離

幹細胞は成体の組織に存在しており、組織の再生修復に関与している。このうち、造血幹細胞は自己複製能をもち、全ての血球の母細胞である。現在、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植と多様な幹細胞源を用いた造血幹細胞移植が可能となり、白血病などの難病に対する治療法となってきている。そのために、臍帯血、末梢血中に含有するより未分化の造血幹細胞を純化・分離する細胞分離用機能性膜の調製が必要不可欠となってきている。本研究では、再生医療用細胞分離膜に臍帯血並びに末梢血を透過させて、造血幹細胞並びに間葉系幹細胞の透過率並びに回収率を解析した。有用細胞純化・分離用の細胞分離膜の調製と探索を行った。エポキシ化発泡ポリウレタン膜と共に、エポキシ化不織布を調製した。これらの膜表面に、化学表面反応を用いて、a)アミノ基、b)カルボキシル基、c)スルホン酸基、d)水酸基、e)インテグリンレセプターを認識するRGDS配列のペプチド、f)非インテグリンレセプターを認識するREDV配列のペプチド、g)コラーゲン、h)フィブロネクチン、i)ラミニン、j)ヴィトロネクチン、を共有結合を用いて固定化した。ペプチド並びに細胞外マトリックス等たんぱく質の細胞分離用機能性膜上への固定化量は、たんぱく質定量キット(マイクロBCA法)を用いて、導入量を定量するとともに、反応条件を変化させて導入量が制御された細胞分離用機能性膜を調製した。さらに、末梢血、臍帯血に加えてマウス骨髄からの間葉系幹細胞の純化・濃縮法の開発を行い、間葉系幹細胞の純化は表面修飾ナイロンメッシュ膜を用いることにより成功した。成体の組織には、組織の再生修復に関与している幹細胞が存在している。その中で、造血幹細胞は自己複製能をもち、全ての血球の母細胞である。本研究では、未分化な造血幹細胞の表面マーカーとしてCD34のみならずCD133に着目してポリウレタン発泡体膜に臍帯血並びに末梢血を透過させて、造血幹細胞の透過率並びに回収率を解析した。未修飾PU発泡体膜(孔径5μm)並びにプルロニックF127コートしたプポリウレタン発泡体膜(孔径5μm)による臍帯血・末梢血の膜透過実験の回収率を検討した。CD34^+CD45^+細胞は未修飾PU膜と比較して、プルロニックコートしたプポリウレタン膜に末梢血並びに臍帯血を透過させ、その後、回収液を透過させた時の回収率が高いことが観察された。また、末梢血中のCD34^+CD45^+細胞は、臍帯血中のCD133^+CD34^+細胞と比較して高い回収率を得ることが可能であることが明らかとなった。以上より、プルロニックコートしたプポリウレタン膜に末梢血を透過させることにより、末梢血中の造血幹細胞の純化並びに単離が可能であることが明らかとなった。

このうち、造血幹細胞は自己複製能をもち、全ての血球の母細胞である。現在、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植と多様な幹細胞源を用いた造血幹細胞移植が可能となり、白血病などの難病に対する治療法となってきている。そのために、臍帯血、末梢血中に含有するより未分化の造血幹細胞を純化・分離する細胞分離用機能性膜の調製が必要不可欠となってきている。本研究では、再生医療用細胞分離膜に臍帯血並びに末梢血を透過させて、造血幹細胞並びに間葉系幹細胞の透過率並びに回収率を解析した。再生医療用細胞分離膜のベース膜として、前年度の研究成果より発泡ポリウレタン膜並びにナイロンフィルター(メッシュ状孔))に焦点を当てて研究行った。このベース膜にプラズマ処理を行い、グリシジルメタクリレート等モノマーを導入した。さらに、膜表面に、表面反応によりa)アミノ基、b)カルボキシル基、c)スルホン酸基、d)水酸基、e)細胞認識ペプチド、を共有結合により固定化した。末梢血のみならず、臍帯血中からの造血幹細胞の分離実験を行なった。末梢血中からの造血幹細胞の濃縮は、高い分離率を示していたが、臍帯血中からの造血幹細胞の分離率は、30%前後と低かった。この原因として、臍帯血固有のタンパク質成分並びに高タンパク質濃度に起因すると考察した。造血幹細胞を回収する時の回収液(血清アルブミン、デキストラン)の濃度が高いほど造血幹細胞の純度は高かった。この原因は、高濃度の回収液は、より高い界面活性効果を示すためであると考察した。臍帯血中から細胞分離膜を用いて造血幹細胞を純化した後に、この造血幹細胞の培養を行ったところ、得られた造血幹細胞は増殖することが確認された。幹細胞は成体の組織に存在しており、組織の再生修復に関与している。本研究では、再生医療用細胞分離膜に臍帯血並びに末梢血を透過させて、造血幹細胞並びに間葉系幹細胞の透過率並びに間葉系幹細胞の透過率並びに回収率を解析した。有用細胞純化・分離用の細胞分離膜の調製と探索を行った。エポキシ化発泡ポリウレタン膜と共に、エポキシ化不織布を調製した。これらの膜表面に、化学表面反応を用いて、a)アミノ基、b)カルボキシル基、c)スルホン酸基、d)水酸基、e)インテグリンレセプターを認識するRGDS配列のペプチド、f)非インテグリンレセプターを認識するREDV配列のペプチド、g)コラーゲン、h)フィプロネクチン、i)ラミニン、j)ヴィトロネクチン、を共有結合を用いて固定化した。ペプチド並びに細胞外マトリックス等たんぱく質の細胞分離用機能性膜上への固定化量は、たんぱく質定量キット(マイクロBCA法)を用いて、導入量を定量するとともに、反応条件を変化させて導入量が制御された細胞分離用機能性膜を調製した。さらに、末梢血、臍帯血に加えてマウス骨髓からの間葉系斡細胞の純化・濃縮法の開発行い、間葉系翰細胞の純化は表面修飾ナイロンメッシュ膜を用いることにより成功した。
低エネルギ-領域におけるDーD核融合反応断面積の測定

従来のDーD核融合反応断面積のデ-タは重心系のエネルギ-で、6KeV以上の高エネルギ-領域に限られており、これより低いエネルギ-領域の核融合反応率の評価は高エネルギ-領域から外挿された断面積の値を用いて行なわれている。しかし最近、DーD核融合反応断面積やD(d,p)T反応とD(d,n) ^3He反応の分岐比が高エネルギ-領域からの外挿値と大きく異なる可能性を示唆する研究結果が報告されている。我々は、TiD_<0.192>薄膜(厚さ0.020.5mm)タ-ゲットに、コルトロンイオン銃からの0.5KeVー10KeVまでのD^+イオンを入射して、核融合反応により生成するP(3.02KeV)、t(1.01MeV)および^3He(0.82MeV)の収率を表面障壁型半導体検出器で測定することにより、重水素の核融合反応率のエネルギ-依存性を評価した。測定された核融合反応の反応率はガモフの理論式を低エネルギ-領域に外挿した値よりも若干高い(約10%)ほど大きい値が得られた。t+p反応と^3He+n反応の分岐比に関しては、t+p反応の方が低エネルギ-領域で若干高くなる傾向はあるものの顕著な差は認められなかった。実測された核融合反応率より核融合反応断面積を求めるためには、重水素イオンのTiD_<1.93>タ-ゲット内における阻止能デ-タが必要-不可欠である。残念なことに、重水素化物中における数KeVの重水素イオンの阻止能について信頼のおけるデ-タはないので、反応率のエネルギ-依存性の形でのみ報告せざるを得なかった。從来のDーD核融合反応断面積のデ-タ-は重心系のエネルギ-で,6kev以上の高エネルギ-領域に限られており,これよりも低いエネルギ-領域の核融合反応率の評価は高エネルギ-領域から外挿された断面積の値を用いて行なわれている。最近,低エネルギ-領域のD( ^3He,p) ^4He反応の断面積が電子のしゃへい効果によって増大すること,および低温核融合においてはD(d,p)T反応が,D(d,n) ^3He反応よりも強く起こることが報告されている。これらの結果は,DーD核融合反応の断面積や分岐比が高エネルギ-領域からの外挿値と大きく異なる可能性があることを示唆している。我々は,これらの可能性の有無を明らかにするために,重心系のエネルギ-で,5keV以下の低エネルギ-領域における核融合反応断面積と分岐比の測定を目的とする研究を行った。DーD核融合反応の反応率は重陽子エネルギ-の低下に伴い指数関数的に減少するので,核融合反応生成作を高い効率で計測する必要がある。そこで,TiDタ-ゲット薄膜(Ti/D=0、92,厚さ約200nm)の背後に半導体検出器を置き計数効率を高めた。この方法により,3.0MeVのp,1.0MeVのt及び0.8MeVの^3Heを完全に分離して計数できることが確認され,各反応生成物の入射重陽子当りの収率測定を行なうことができた。現在迄に,入射重陽子のエネルギ-が10KeVから2、5KeV迄の範囲の測定結果が得られている。

低エネルギ-領域の実験値は外挿による予想よりも10%ほど,大きい値であるが,pを生成する反応がnを生成する反応よりも増大する傾向は認められない。核融合反応断面積を求めるため,重陽子のTiDタ-ゲットに対する阻止能デ-タが必要であり,次年度は阻止能の測定を行なう予定である。從来のDーD核融合反応断面積のデ-タは重心系のエネルギ-で、6kgV以上の高エネルギ-領域に限られており、これよりも低いエネルギ-領域の核融合反応率の評価は高エネルギ-領域から外挿された断面積の値を用いて行なわれている。最近、低エネルギ-領域のD(^3He,P)^4He反応の断面積が電子のしゃへい効果によって増大すること、低温核融合においてはD(d,p)T反応がD(d,n)^3He反応よりも強く起こることが報告されている。これらの結果は、DーD核融合反応断面積や分岐比が高エネルギ-領域からの外挿値と大きく異なる可能性があることを示唆している。我々は、これらの可能性の有無を調べるために、重心系のエネルギ-で、5keV以下の低エネルギ-領域における核融合反応断面積と分岐比の測定を目的とする研究を行った。重陽子の入射はコルトロンイオン銃を用いて行った。タ-ゲット試料には厚さ0.5mmの重水素を吸蔵させたTi薄膜(組成:Ti/D=0.92)を用いた。核融合反応生成物であるP,tおよび^3Heの検出は表面障壁型半導体検出器を用いて行った。DーD核融合反応の反応率は重陽子エネルギ-の低下に伴い指数関数的に減少するので、重心系のエネルギ-で2.5keV以下の測定には非常な労力を必要とした。低エネルギ-領域の反応率は外挿による予想値よりも10%ほど大きい値が得られたが、Pを生成する反応がnを生成する反応よりも増大する傾向は認められなかった。
嫌気性消化の相分離による効率化と基質合解の挙動および嫌気性菌群相互作用に関する研究

本研究では,嫌気性消化における各種類の基質の分解挙動および嫌気性細菌群の相互作用を解明することに加え、嫌気性流動床を組み入れた二相嫌気性消化プロセスによる効率化を検討した。本研究より得られた主な結果は次のようにまとめられている。(1)、セルロ-ス単一基質および混合汚泥と比較して余剰活性汚泥は分解しにくい。混合汚泥からのメタン生成量およびメタン含有率は汚泥の組成によって大きく影響される。セルロ-スと余剰活性汚泥の混合汚泥の嫌気性消化において,その混合割合にかかわらず,加水分解反応が全プロセスの律速段階である。また,加水分解段階の反応速度は残存固形有機物濃度に関して一次反応式で表わすことができる。(2)、前熱処理を加えた結果、余剰活性汚泥の分解率およびメタン生成量は著しく向上された。余剰活性汚泥の嫌気的分解率を向上させるための最適前熱処理の条件は処理温度が170°Cで,処理時間が60分である。この条件において,滞留時間510日の消化を通して、COD除去率および消化ガス生成量はそれぞれ60%および230ml・gCOD^<-1>に達しており,その値はコントロ-ル系の約2倍である。(3)、HRTを0.25日,0.5日,1.0日および2.0日に設定し、実験温度を10°Cから30°Cまで変化させて可溶性デンプンを基質とした連続実験を行った結果,基質の分解率、酸生成菌とメタン生成菌の菌数分布はHRTおよび温度により大きく影響されることが分かった。(4)、嫌気性流動床を二相消化のメタン生成相に用いて基質除去および生物膜形成特性に及ぼす基質組成および負荷の影響を検討した結果、有機酸基質に少量のグルコ-スおよび酵母エキスを添加することによって基質除去率および生物膜の形成が促進される、COD負荷3DugーCOD/m^3・dまで上げても基質除去率が98.8%以上であった。1.単相消化と二相消化の性能比較内容積1lの酸生成槽および5lのメタン生成槽を組み合わせてケモスタット型二相嫌気性消化実験装置により、35°Cの恒温槽で可溶性デンプンを基質とした消化実験を行った。また、これと並行して単相消化槽を二相消化と同一のHRTで操作し、HRTを変化させて単相と二相消化法の効率的の相違を検討した結果、pHの安定特性においては二相消化の方は単相消化より優れており、COD除去率およびメタン生成率については、HRT5日以下の場合二相消化の方が単相消化より高いが、HRT10日の条件ではほぼ同じ効率が得られている。2.嫌気性消化における余剰活性汚泥の分解特性35°Cの温度で回分および連続実験を行い、嫌気性消化における余剰活性汚泥の分解挙動について検討した。回分実験において余剰活性汚泥のCODの57%が分解され、その内約80%が30日間で分解される。連続実験においてHRTを0.5日から5日まで変化させ、有機物の分解速度とCOD物質収支を解析した結果、余剰活性汚泥の嫌気性消化において固形物の加水分解反応はプロセス全体の律速段階であること、また加水分解速度は一次反応式で表れることが明らかになった。余剰活性汚泥中の難分解性有機物の含有率は約5075%であり、汚泥の採取時期によって異り、夏期のものは特に分解しにくいことも知られた。

さらに、余剰活性汚泥の組成は炭水化物が710%で、タンパク質が4958%で、脂質が69%で粗繊維が2835%であるが、それぞれの分解可能の比率は脂質48%>タンパク質43%>炭水化物37%の順となっている。3.嫌気性細菌群の分類定量Hungate嫌気的操作法を導入してMPN法による嫌気性細菌群の分類定量を試みた。今年度はメタン生成菌とホモ酢酸生成菌を中心に検討した結果、MPN法による分類定量法は有効であること、培養時間は4週間を必要とすることが知られた。1.タンパク質の二相消化について内容積3lの酸生成槽および6lのメタン生成槽を組み合わせたケモスタット型二相嫌気性消化の実験装置により、35°Cの温度条件でアルブミンの単一基質およびタンパク質を主成分とする混合基質について二相消化を行った結果、以下のことが明らかになった。(1)酸生成相におけるタンパク質の分解率はHRT2日以上の条件では80%以上であったが、HRT1.5日の条件ではアルブミン単一基質の場合約、70%だったのに対して、タンパク質を主成分とする混合基質の場合には80%と高くなっている。このことから、混合基質を用いた場合はタンパク質の分解が促進されると考えられる。(2)HRT1.5日の条件では、タンパク質の酸発酵が十分に行われたこと、メタン発酵がほとんど進んでいないこと、またタンパク質分解菌とメタン生成菌の菌数の比はおよそ100:1だったことから、タンパク系廃水の二相嫌気性消化も可能と考えられる。2.嫌気性消化におけるセルロ-スと余剰活性汚泥の分解特性の比較35°Cの温度で回分実験および連続実験を行い、嫌気性消化におけるセルロ-ス、余剰活性汚泥およびその成分の混合汚泥の分解特性について比較検討を行った。セルロ-スと比較して余剰活性汚泥の方が分解されにくく、30日間の嫌気性消化を通してセルロ-スの約90%が分解されたの対して、余剰活性汚泥は50%しか分解されず、特に余剰活性汚泥に含まれる炭水化物はわずか20%しか分解されなかった。また、セルロ-スと余剰活性汚泥を混合して処理する場合はセルロ-ス単一基質の場合よりセルロ-スの分解が促進される。セルロ-スと余剰活性汚泥との混合汚泥の嫌気性消化においても加水分解段階がプロセス全体の律速段階である。余剩活性汚泥の嫌気性分解特性に及ぼす前熱処理の促進効果の解明およびTP/ADプロセスの最適化を図るために,62175°Cでの熱処理実験と35±1°Cでの回分および連続式嫌気性消化実験を通して,余剩活性汚泥の嫌気的分解に及ぼす熱処理条件と消化時間の影響を検討した。その結果,以下のことが明らかとなった。1)熱処理に伴う活泥の可溶化、低分子化および固形有機物の熱変性によって,余剩活性汚泥の嫌気的分解率と消化ガス生量が向上されただけでなく,消化時間も10日以下に短縮できる。2)嫌気性消化の効率化ための最適熱処理条件には温度170°C。時間60分程度である。この条件では消化時間510日におけるCOD除去率およびガス生成量はそれぞれ60%および223235ml/gー10Dであり,対価系より倍増した。3)滞留時間1.5日10日の汚泥消化槽におけるメタン生成菌の菌数は10^710^8MPN/mlの範囲にある。低温域における酸発酵特性に及ぼす温度とHRTの影響を検討するために,HRTを0.25日,0.5日,1.0日および2.0日に設定し,実験温度を10°Cから30°Cまで変化させて可溶性デンプンを基質とした連続実験を行った。その結果,以上のことが明らかとなった。1)炭水化物の分解率は温度とHRTにより大きく影響される。
尿毒症症状改善に向けたインドール吸着合成ナノ粒子の開発

慢性腎臓病(CKD)は、慢性的に腎臓の機能が低下する病態の総称である。近年、尿毒素であるインドキシル硫酸(IS)が、活性酸素種の産生により腎傷害を引き起こし、CKDを進行させることが報告された。ISはタンパク質由来のインドールが吸収・代謝を受けることで生じるため、インドールの消化管吸収阻害はCKDの進行抑制につながる。インドール吸着NPsの開発に向け、インドールの高い疎水性と香族性に着目し、ナノ粒子の構成成分には、疎水性モノマーとしてN-tert-butyl acrylamide、N-phenyl acrylamide、そして2,3,4,5,6-pentafluorophenyl acrylamideの3種類を用いて検討を行った。NPsは各疎水性モノマーに、N-isopropyl acrylamide(NIPAm)と、架橋剤を加え、ランダムラジカル共重合法により合成した。そして、合成したNPsとインドールインキュベートした後に、NPsに吸着されたインドールの量を算出することによりNPsのスクリーニングを行った。その結果、NPsとインドールとの相互作用は、NPsに組み込む疎水性モノマーの構造と配合比によって大きく変化した。次に、NPsの吸着選択性を、インドール類似低分子化合物であるインドール酢酸、トリプタミン、トリプトファンおよびビタミンB12のNPsへの吸着量を測定することで評価した。すると、NPsのインドール類似化合物吸着量は、インドール吸着量と比較して有意に低いことが明らかになり、NPsはインドールを特異的に吸着することが示された。さらに、in vitroでのNPsのインドール消化管吸収抑制効果を、小腸上皮様細胞株Caco-2細胞を用いて検討したところ、NPsはインドールのCaco-2細胞単層膜のapical側からbasal側への透過量を有意に減少させた。タンパク質ータンパク質間の強い結合は、それらを構成するアミノ酸の性質により水素結合、疎水性相互作用、静電的相互作用などの多種多様な結合が広範囲に渡って組み合わさることで生み出されている。我々は、これらの相互作用を生み出す機能性モノマーを用い、抗体のように標的生体高分子に対して強く結合する多官能性ポリマーナノ粒子(NPs)の合成・開発を試みてきた。しかしながら、非分解性であるNPsは、実用化(臨床応用)という観点から考えると静脈内投与剤として用いるよりも、経口投与剤として用いるほうが適している。そこで本研究では、消化管でインドールを吸着して体外へ排泄させる経口投与型のナノ粒子開発を行い、腎不全治療への応用を試みた。インドールを吸着するナノ粒子開発に向けて、ナノ粒子は2%架橋したpoly N-isopropyl acrylamide (pNIPAm)に、数種類の疎水性モノマーを組み込み合成した。合成したNPsとインドールを室温にてインキュベートした後に超遠心分離を行い、インドール吸着率を算出した。NPsとインドールとの相互作用は、ナノ粒子に組み込む疎水性モノマー構造と配合比によって大きく変化することが明らかになった。また。NPsの吸着選択性を明らかにするため、カルボキシ基をもつインドール酢酸、アミノ基をもつトリプタミン、両基をもつトリプトファンの3つの化合物をインドール類似低分子化合物として、シアノコバラミン(ビタミンB12)を腸内に存在する高分子化合物として用いた。その結果、インドール誘導体であるインドール酢酸、トリプタミン、トリプトファン、シアノコバラミンの吸着量は、インドールの吸着量と比較して有意に低いことが明らかになった。以上より、NPsは消化管でインドールを素早く選択的に吸着し、体外への排泄を促すことで、腎不全の悪化を抑制できる可能性が示された。インドールの高い疎水性と芳香族性に着目し、ナノ粒子はN-Isopropyl acrylamide (NIPAm)、N,N'-Methylenebisacrylamideに加えて疎水性モノマーであるN-tert-Butyl acrylamide (TBAm)、芳香環を持つN-Phenyl acrylamide (PAA)、もしくはPAAの環炭素原子に結合している5個の水素原子をフッ素で置換した2,3,4,5,6-Pentafluolophenyl acrylamide (FluoroPAA)を用いて合成した。合成したNPsのインドール吸着率は、インドールと10秒間インキュベート後に超遠心分離を行い算出した。その結果、疎水性モノマーを組み込まないで合成したナノ粒子は、殆どインドールを吸着しなかった。疎水性モノマーの組み込み率を20%から80%に増やすことで、インドールの吸着率も増大した。また、各疎水性モノマーを比較すると、TBAmもしくはFluoroPAAを含有したナノ粒子はPAAを含有したナノ粒子と比較して顕著にインドールを吸着した。しかし、TBAmとFluoroPAA含有ナノ粒子を比較すると、顕著な差はみられなかった。FluoroPAAを含有したナノ粒子はインドールの構造類似化合物(トリプタミン、インドール酢酸、トリプトファン、ビタミンB12)と3時間混合しても、ほとんど吸着しなかった。

インドール吸着NPsの開発に向け、インドールの高い疎水性と香族性に着目し、ナノ粒子の構成成分には、疎水性モノマーとしてN-tert-butyl acrylamide、N-phenyl acrylamide、そして2,3,4,5,6-pentafluorophenyl acrylamideの3種類を用いて検討を行った。NPsは各疎水性モノマーに、N-isopropyl acrylamide(NIPAm)と、架橋剤を加え、ランダムラジカル共重合法により合成した。そして、合成したNPsとインドールインキュベートした後に、NPsに吸着されたインドールの量を算出することによりNPsのスクリーニングを行った。その結果、NPsとインドールとの相互作用は、NPsに組み込む疎水性モノマーの構造と配合比によって大きく変化した。次に、NPsの吸着選択性を、インドール類似低分子化合物であるインドール酢酸、トリプタミン、トリプトファンおよびビタミンB12のNPsへの吸着量を測定することで評価した。すると、NPsのインドール類似化合物吸着量は、インドール吸着量と比較して有意に低いことが明らかになり、NPsはインドールを特異的に吸着することが示された。さらに、in vitroでのNPsのインドール消化管吸収抑制効果を、小腸上皮様細胞株Caco-2細胞を用いて検討したところ、NPsはインドールのCaco-2細胞単層膜のapical側からbasal側への透過量を有意に減少させた。申請者らは、静脈内に投与されたナノ粒子が、30分後に血液中に5%以下の残存量で、多くは肝臓に蓄積することや、4週間後には95%以上は体内から消失することを明らかにしてきた。しかし、経口投与後の体内動態は明らかではない。そこで、今後の方針としては、経口投与したナノ粒子の血中以降量、時間依存的な腸内残存量、糞への排泄量の解析を行なっていく。経口投与後の体内動態の解析は、経口製剤の開発に向けて非常に重要である。経口投与後のナノ粒子の体内動態を決定する要因としては、ナノ粒子の電荷(正、負電荷)、疎水性度、サイズ、架橋剤の割合があげられる。そこで、これらの性質の異なるナノ粒子ライブラリーを合成し、体内動態を測定する。そして、血中に移行せず、腸内に蓄積せず速やかに体内から排泄されるナノ粒子の組成を明らかにする。体内動態研究の後、実際にナノ粒子の消化管でのインドール吸着能と吸収阻害効果を検討する。まず、放射標識インドールとナノ粒子を経口投与し、排泄量、血液中への移行量、腎臓での蓄積量を検討する。また、インドールは経口摂取されたトリプトファンから生合成される。そこで、トリプトファンの放射標識体を経口投与した後にナノ粒子を経口投与し、血液、腎臓、肝臓、消化管、消化管内の放射活性を測定し、消化管でのインドール吸収阻害効果を明らかにする。また、本検討を絶食時と通常食時に行うことで、食事の影響を明らかにする。本検討を通して、ナノ粒子の経口投与剤としての有用性を明らかにする。
環境調和型共有結合生成反応-超臨界流体およびKを溶媒とする新規反応場の開発

1.超臨界二酸化炭素中での電解カルボキシル化白金陰極、マグネシウム陽極を取り付けた高圧反応容器に支持電解質としてBu_4NBF_4、共溶媒として少量のアセトニトリル(10ml:155mlの反応容器に対して6vol%)を加え、二酸化炭素の臨界点以上の反応条件(40°C,80Kg/cm^2)で電解することによって、電解力ルボキシル化が可能となることを見出した。超臨界二酸化炭素中での電解によるカルボン酸の合成は本研究が世界で最初の例である。さまざまな置換ハロゲン化アリールを電解すると相当するアレーンカルボン酸が高収率で得られた。例えば、1-および2-クロロナフタレンからナフタレン手およびナフタレン-2-カルボン酸をそれぞれ92%および83%の収率で得ることができた。また、ハロゲン化ベンジル類を同様な条件下電解することによって置換フェニル酢酸を高収率で合成することができた。現在、さらにさまざまな基質を用いて電解カルボキシル化を検討している。2.超臨界二酸化炭素を用いる抗炎症剤の合成1-クロロ-1-(4-イソブチルフェニル)エタンおよび1-クロロ-(6-メトキシナフチル)エタンを超臨界二酸化炭素中上記の条件で電解することによって、抗炎症剤であるイブプロフェンおよびナプロキセンをそれぞれ79%および74%の収率で合成することに成功した。3.電子移動反応における超臨界流体の特性に関する研究超臨界エタン中ビフェニルアニオンからピレンへの電子移動反応をパルスラジオリシスを用いて検討し、溶媒の再配向エネルギーの圧力依存性を明らかにした。すなわち、臨界圧近傍では再配向エネルギーがかなり増大することを見出した。
安全性や旅行時間を考慮した地方部の高速道路整備のあり方に関する基礎的研究

本研究では、既存の研究において構築された暫定2車線区間道路における追越挙動モデルを基にし、暫定2車線高速道路を走行する各車両の希望走行速度による所要時間からの遅れ時間を短縮させるためにより効果的な,追い越しを行うための付加車線の長さおよび,その設置位置を検討した.暫定2車線高速道路の実態調査・分析では,暫定2車線高速道路の実態を調査し.車両の発生時刻分布,車両走行速度,車両走行速度の標準偏差,車線長の実態を調査し,シミュレーションに使用した.車両の発生時刻分布については,ビデオ撮影したデータを観測し,分布の適合度検定を行った.分布の適合度検定を行った結果,暫定2車線高速道路(磐越自動車道)における車両の発生時刻はポアソン分布に従っていることが分かった.本研究における車両発生時刻にはポアソン分布に従う乱数を採用した.付加車線長の検討では,暫定2車線区間内に設置する付加車線長を検討しし,追い越し挙動モデルについての説明と本研究における付加車線長の評価方法について述べた.付加車線の評価方法としては,所要時間比を用いた.付加車線設置位置の検討では,暫定2車線区間内における付加車線の設置位置の検討を行った.付加車線長を固定し,位置を5パターンに分けてシミュレーションを行った.所要時間比が最も小さくなった設置位置はどの交通量においても,区間の先頭に設置するパターンであった.また,所要時間比が最も大きくなった設置位置は区間の後方側に設置するパターンであった.また,シミュレーションで得られた結果を用いて,区間前方内および区間前後でt検定を行ったところ,区間前方側での設置間での所要時間には有意な差が得られなかったが,区間前後においては有意差が確認できた.よって暫定2車線道路区間の前方側に設置するほうが,後方に設置するよりも所要時間の短縮に対して効果の可能性があることが分かった.●交通事故要因の分析:平成12年から16年の5年間に,暫定2車線区間で発生した「はみだし事故」件数を高速道路路線別に集計すると,1位は磐越自動車道で,2位が上信越自動車道である.まず,上位の2つの路線を持つ新潟県の高速道路で発生した交通事故データをもとに,暫定2車線区間と4車線区間別に,事故内容(軽傷,重傷,死亡)と,道路線形(直線,緩和曲線A,円曲線R),勾配,路面状態(乾燥,湿潤,積雪,凍結),天候,車両速度等の中から,交通事故を誘発する要因を特定した.●交通事故率の推計:4車線区間と暫定2車線区間は,平面線形と縦断線形が大きく異なり,同じ事故率を使うことは不適切であると考えられる.そこで,上記で抽出された要因を変数とした交通事故率推計式を暫定2車線区間と4車線区間別に作成し,それぞれの交通事故率を推計した.●ビデオ調査:暫定2車線区間2カ所とそれらに挟まれた付加車線区間の複数の測定地点において,車両の通過時刻を測定する.1カ所に40m間隔に2台のビデオカメラを設置し,その区間速度も同時に求める.後述の車両挙動モデルは勾配の影響も考慮できるものとし,モデルの移転性を確認するために2カ所以上の付加車線区間で,車両走行データを取得した.●タイムスペース図での車両走行軌跡(trajectory)の作成:ビデオ画像から各撮影地点での車両通過時刻と速度を求める.ビデオ撮影地点間の車両の挙動は,その地点での速度も考慮した上で補間して,任意の時刻における各車両の位置,速度,加速度を推計した.また,追い越し車両の挙動を分析することにより,後述の追い越し時の加速度,追い越し時の速度等の値を推定した.また,暫定2車線区間で単独で走行している車種別の車両速度を計測し,これから車種別の希望速度分布を求めた.概ね順調に進展している本年度は,暫定車線高速道路に設置されている付加車線における追越挙動モデルを構築した。まず、暫定2車線開通区間を持つ磐越自動車道において、複数の地点で地点速度をビデオ撮影により計測した後に、スプライン関数を用いて走行車両のTime-Space図を作成し、付加車線設置区間における車両挙動を明らかにした。次に、追従していない場合は各車固有の希望速度で走行し、追越区間では前車の走行速度と自車の希望速度との速度差や付加車線終了地点までの距離を考慮して追越を実施すると仮定してモデルを構築した。車群が付加車線設置区間へ流入した後は原則として、走行車線を希望速度で移動させる。ただし、前方車両を走行する低速車両と追越車両との車頭時間が走行車線に形成される車群中の車頭時間以下となる状況では、追越の可否を判定する。当該車両を追越後に、その追越車両の前方に車両が存在しない場合は、付加車線区間内において走行車線を走行している先行車両の前方に位置することが可能な場合は、1台目を追越した際の加速度を保ちつつ追越を継続するものとする。3台目以降も同様に判定を行い、追越しの判断を行う。追越が完了し、追越を行うことのできる車両が前方に存在しなくなれば、走行車線へと進路を変更し、自車の希望速度に従い走行する。付加車線終了時の車群内での順位が実測データと最も合致するようにモデルのパラメータを推定したところ、追越対象車両を前車1台のみではなく、2台目以降の車両も追越対象とすることによって、既往モデルよりも高い再現性を有することを確認した。おおむね順調に進展している.

本研究では、既存の研究において構築された暫定2車線区間道路における追越挙動モデルを基にし、暫定2車線高速道路を走行する各車両の希望走行速度による所要時間からの遅れ時間を短縮させるためにより効果的な,追い越しを行うための付加車線の長さおよび,その設置位置を検討した.暫定2車線高速道路の実態調査・分析では,暫定2車線高速道路の実態を調査し.車両の発生時刻分布,車両走行速度,車両走行速度の標準偏差,車線長の実態を調査し,シミュレーションに使用した.車両の発生時刻分布については,ビデオ撮影したデータを観測し,分布の適合度検定を行った.分布の適合度検定を行った結果,暫定2車線高速道路(磐越自動車道)における車両の発生時刻はポアソン分布に従っていることが分かった.本研究における車両発生時刻にはポアソン分布に従う乱数を採用した.付加車線長の検討では,暫定2車線区間内に設置する付加車線長を検討しし,追い越し挙動モデルについての説明と本研究における付加車線長の評価方法について述べた.付加車線の評価方法としては,所要時間比を用いた.付加車線設置位置の検討では,暫定2車線区間内における付加車線の設置位置の検討を行った.付加車線長を固定し,位置を5パターンに分けてシミュレーションを行った.所要時間比が最も小さくなった設置位置はどの交通量においても,区間の先頭に設置するパターンであった.また,所要時間比が最も大きくなった設置位置は区間の後方側に設置するパターンであった.また,シミュレーションで得られた結果を用いて,区間前方内および区間前後でt検定を行ったところ,区間前方側での設置間での所要時間には有意な差が得られなかったが,区間前後においては有意差が確認できた.よって暫定2車線道路区間の前方側に設置するほうが,後方に設置するよりも所要時間の短縮に対して効果の可能性があることが分かった.●暫定2車線区間における車両挙動:暫定2車線区間においては,低速車両による車群が形成される場合がある.その先頭となる車両は,他車の速度に関係なく自分の希望速度で走行(自由走行)すると仮定する.前車よりも希望速度が速く前車に追いついた車両は,前車と同じスピードで,車頭時間2秒で追従走行する.ただし,大型車と小型車の速度は,それぞれ異なった正規分布に従うものと仮定する.●付加車線区間における車両挙動:(a)追い越し判断:車群が付加車線設置区間へ流入した後は原則として,走行車線を希望速度で移動させる.(b)追い越し挙動:追い越し可能と判断した車両は,追い越し車線のクリアランスを確認した場合は,一定の加速度で加速すると同時に車線変更を行う.本モデルでは車線変更に掛かる時間はないものとする.追い越し不可能と判断した車両は,前車に追従走行する.(c)追い越し後の車両挙動:追い越しを開始した車両は,希望速度にある一定の速度を加えた速度まで加速して前車を追い越す.場合によっては,2台以上まとめて追い越すことも可能であり,走行車線に戻った追い越し車両を追い越すことも可能なモデルとする.●適切な付加車線長や設置間隔の検討:上記モデルを用いて,与件のルートに対し,複数の交通量と大型車混入率のパターンごとに,適切な付加車線長やその設置間隔を検討する.上りと下りの付加車線が交互に出現する「2+1車線」道路の線形に応じて,交通量や大型車混入率を考慮した最適な付加車線長も計算する.今後は新たな暫定2車線高速道路を対象に現地調査を行うことでモデルの移転性を高める予定である。また交通量に応じた最適な付加車線の設置方法について本モデルを用いて検討する。
循環不全モデルにおける脳幹前庭神経細胞の発火特性変化の解明

前庭系中枢の神経細胞において、一過性虚血性がどのような変化を生じるのかを解明するため、本研究ではラット脳幹スライス切片において無酸素無グルコース細胞外液を還流し、モデル条件とした。神経細胞の膜特性の変化はパッチクランプ方を用いて観察した。まず、前庭神経核神経細胞をホールセル記録し、膜電流固定下に自発発火を記録した。無酸素無グルコース細胞外液還流により、前庭神経核神経細胞の自発発火は消失あるいは低下した。このことから、一過性虚血刺激により、細胞膜に対する過分極刺激が生じたことが示唆された。機序として、シナプス前細胞からの抑制性刺激が増加するや細胞膜のイオン透過性の変化が示唆された。前庭神経核を含む脳幹のスライス切片をラットを用いて作成し、パッチクランプ法にて前庭神経核および小脳皮質の神経細胞より膜電位変化を記録した。虚血条件として、低酸素低グルコース(OGD)細胞外液の還流を行った。前庭神経核の神経細胞では、10分程度のOGD還流で発火頻度の低下が観察された。この現象は、前庭神経核神経細胞における抑制性入力の上昇で生じうる。従って、前庭神経核に対する重抑制性入力である前庭小脳プルキンエ細胞からのGABA作動性入力に注目し、前庭小脳領域で実験を進めた。ラット小脳虫部のスライス切片を作成し、前庭小脳領域のプルキンエ細胞を-70mVに膜電位固定し、自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)を記録した。sEPSCは短時間のOGD刺激により顕著な増加を示し、細胞外液を生理的な外液に変更すると、ほぼベースラインの状態に回復した。このことから、ODG外液還流によりsEPSCは顕著に増加するが、これは一過性で可逆性の変化であることが分かった。次に、このOGD刺激による反応が、前庭小脳特異的であるのか、あるいは小脳全体の共通した現象であるのかを調べるため、前庭小脳以外の小脳領域で同様の実験を行った。前庭小脳以外のプルキンエ細胞におけるsEPSCは、OGD刺激で若干の頻度の上昇を認めたが、前庭小脳領域の反応に比べ有意に小さかった。次に、sEPSCの増加はプルキンエ細胞の興奮性シナプス前神経細胞の顆粒細胞の自発発火の増加に起因すると考えられたため、そのメカニズムを解明するために前庭小脳顆粒細胞に注目し、パッチクランプ記録を行った。このとき、顆粒細胞における興奮性介在ニューロンであるunipolar brush cellに関しても同様に電気記録を行った。これまでと同様、実験系として、前庭神経核を含む脳幹のスライス切片を、ラットを用いて作成し、パッチクランプ法にて前庭神経核および小脳皮質の神経細胞より膜電位変化を記録した。虚血条件として、低酸素低グルコース(Oxygen-Glucose Deprivation; OGD)細胞外液の還流を行った。ODG刺激中に観察された発火頻度の低下は、前庭神経核神経細胞における抑制性入力の上昇で生じうる。従って、次に前庭神経核に対する重要な抑制性入力として、前庭小脳プルキンエ細胞からのGABA作動性入力に注目した。前庭小脳を含む小脳スライス切片を作成し、実験を進めた。パッチクランプ法にて前庭小脳領域のプルキンエ細胞より電気記録を行った。前庭小脳領域のプルキンエ細胞では、低酸素低グルコース(Oxygen-Glucose Deprivation; OGD)細胞外液を還流により、自発性興奮性シナプス後電流(spontaneous excitatory postsynaptic current: sEPSC)の増加が観察された。このOGD刺激による反応は、前庭小脳領域のプルキンエ細胞で顕著であり、その他の領域では明確ではなかった。従って、そのメカニズムとして前庭小脳特異的な分布を示す興奮性介在ニューロンであるunipolar brush cell (UBC)による興奮性変化が想定された。UBCは外部入力がない条件下でも自発発火をしている興奮性介在ニューロンである。今後の展開として、小脳スライス切片を作成し、このUBCを電流固定し、OGD外液を還流させ、自発発火の変化を観察する予定である。これは、プルキンエ細胞におけるsEPSC増加の直接的な要因としての解明に寄与すると考える。前庭神経核を含む脳幹のスライス切片をラットを用いて作成し、パッチクランプ法にて前庭神経核の神経細胞の膜電位変化を記録した。

電流固定化に自発発火を記録しながら、これが虚血条件として、低酸素低グルコース(Oxygen-Glucose Deprivation; OGD)細胞外液の還流を行った。10分程度のOGD還流で発火頻度の低下が観察された。OGD刺激後、発火頻度は回復を示し、このときの発火特性は刺激前と変化を認めなかった。一方、ODG刺激中に観察された発火頻度の低下は、前庭神経核神経細胞における抑制性入力の上昇で生じうる。前庭神経核に対する重要な抑制性入力は、対側前庭神経核からの交連線維と、前庭小脳プルキンエ細胞からのGABA作動性入力である。従って、次に、ラット小脳虫部のスライス切片を作成し、前庭小脳領域のプルキンエ細胞にパッチクランプを行い、同様にOGD細胞外液を還流させた。まず、プルキンエ細胞を-70mVに膜電位固定し、自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)を記録した。プルキンエ細胞における抑制性入力を抑制するためGABAチャネルブロッカーを常時使用した。sEPSCは短時間のOGD刺激により顕著な増加を示し、細胞外液を生理的な外液に変更すると、ほぼベースラインの状態に回復した。このことから、ODG外液還流によりsEPSCは顕著に増加するが、これは一過性で可逆性の変化であることが分かった。次に、このOGD刺激による反応が、前庭小脳特異的であるのか、あるいは小脳全体の共通した現象であるのかを調べるため、前庭小脳以外の小脳領域で同様の実験を行った。前庭小脳以外のプルキンエ細胞におけるsEPSCは、OGD刺激で若干の頻度の上昇を認めたが、前庭小脳領域の反応に比べ有意に小さかった。椎骨脳底動脈循環不全による眼振を含めた中枢性めまい症状の発生から自然経過での改善に関する病態生理を明らかにすることが本研究の主題である。実験計画では、ラットの脳幹前庭神経細胞において、虚血刺激として低酸素低グルコース(Oxygen-Glucose Deprivation; OGD)細胞外液の還流を行い、これにより生じる一過性の発火特性変化を明らかにし、次にこれが発生するメカニズムを解析する方針である。これまでの実験で、虚血刺激により前庭神経核神経細胞における自発発火の停止が確認された。さらに、前庭神経核における抑制性制御系として、前庭小脳に注目し、前庭小脳から前庭神経核への抑制性出力細胞であるプルキンエ細胞における一過性虚血における変化をとらえることに主眼を置いた。前庭小脳プルキンエ細胞では、ODG刺激により自発性興奮性シナプス後電流の顕著な増加が確認できた。さらに、その原因となりプルキンエ細胞の興奮性シナプス前細胞である小脳顆粒細胞より電気記録行い、OGD刺激による一過性の自発発火の増加を確認した。OGD刺激による前庭小脳の興奮性の増加は、プルキンエ細胞の興奮増加を介して、その軸索出力であるGABA作動性の抑制性出力の増加となって、前庭神経核における抑制性の増加に寄与する重要なメカニズムとして解釈できる。以上より、今年度の実験計画目標である、前庭神経核神経細胞における一過性虚血時の発火特性の変化のメカニズムの主要部分を小脳領域において明らかにすることが出来ており、目標は十分に達成できていると考える。