hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
うつ病の病態と血小板放出因子との接点

脳由来神経栄養因子(BDNF)は末梢血中にも存在し、血清BDNF濃度の変化がうつ病の病態と関連することが知られている。今回、血液では血小板中に大部分のBDNFが貯蔵されていることに着目し、抗うつ薬が末梢血BDNFの濃度変化へ与える影響について解析・検討した。その結果、抗うつ薬の種類により血小板BDNF遊離量の変化時間や量に差が認められたとともに、同じ抗うつ薬でもBDNF量の反応に個体差を認め、臨床で経験する抗うつ薬効果の個人差について、血小板BDNF遊離変化が関係していると考えられた。今後は末梢、特に血小板BDNFの機能解析を中心とした検討が、うつ病の新たな病態解明につながる可能性が考えられた。脳由来神経栄養因子(BDNF)は神経栄養因子の1つであり、中枢神経系の成長、分化、維持、可塑性などにおいて重要な役割を持つ。我々はこれまでに、BDNF処置による神経幹細胞から神経細胞への分化促進を示し、抗うつ薬処置紀よる神経幹細胞のBDNF産生増加や神経細胞への分化促進を明らかにしてきた。すなわち、抗うつ薬はBDNFを介して脳の神経回路網の修復・形成促進能を有することが強く示唆され、BDNFはうつ病治療において重要な役割を果たしていると考えられる。BDNFは末梢血中にも存在することが知られ、血清BDNF濃度が低い未治療のうつ病患者を抗うつ薬で治療すると、臨床症状改善に伴い血清BDNF濃度が増加したとする報告がなされている。BDNFは血液脳関門(BBB)を通過できるとの報告がなされ、末梢血BDNF濃度はうつ病の病態を反映している可能性があるが、詳細は不明である。今回我々は、末梢血BDNFが特に血小板に多く存在することに注目し、抗うつ薬が血小板からのBDNF遊離変化へ与える影響について解析・検討した。ラットおよびヒト(健常者ボランティア)から血液を採取し、既存の方法を用いて血小板分画を得た。血小板に抗うつ薬を添加し、BDNFの遊離変化を調べた。その結果、抗うつ薬処置により血小板BDNF遊離変化が認められた。本研究から、抗うつ薬によって比較的早期に血小板BDNF遊離変化が起こることが示唆された。また、抗うつ薬の種類によりBDNF量の変化時間や量に差が認められたとともに、同じ抗うつ薬でもBDNF量の反応に個体差を認めたことから、臨床で経験する抗うつ薬効果の個人差には、血小板BDNF遊離変化が関連している可能性が示唆された。脳由来神経栄養因子(BDNF)は脳内だけではなく、末梢血中にも存在することが知られている。最近では、血清BDNF濃度が低い未治療のうつ病患者を抗うつ薬で治療すると、臨床症状改善に伴い血清BDNF濃度が増加したとする報告がなされている。また、BDNFは血液脳関門(BBB)を通過できるとの報告がなされ、末梢血BDNF濃度はうつ病の病態を反映している可能性があるが、詳細は不明である。我々はこれまでに、末梢血BDNFが特に血小板に多く存在することに注目し、抗うつ薬が血小板からのBDNF遊離変化へ与える影響について解析・検討してきた。今回、コルチコステロン慢性投与により作成したうつ病モデルラットから血小板を得て、うつ状態における血小板BDNF遊離の検討を行った。その結果、うつ病モデル群では正常群に比べて抗うつ薬によるBDNF遊離反応が低下しており、このことがうつ病での血清BDNF低下として表現されている可能性が考えられた。次に、血小板BDNF遊離の経路に関して、BDNFの受容体であるTrkB受容体に注目した研究を行った。その結果、TrkB阻害薬であるK252aにてBDNF遊離が抑制されたことから、血小板BDNF遊離にはTrkBが関与していることが示唆された。
細胞内シグナルトランスダクションを担うヘム関連タンパクの構造と機能

本研究ではヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼの研究を行った。まず高等動物由来の構成型ヘムオキシゲナーゼ(HO-2)の構造解析を行うために、大腸菌での大量発現系を利用してHO-2の高純度精製と結晶化条件のスクリーニングを実行した。その結果、これまでに知られている精製法ではHO-2の2量体などが含まれていることが明らかとなり、さまざまな改良を加えた精製法の開発により、現在考え得るレベルで最も純度の高い標品を得ることができるようになった。一方、バクテリア由来のヘムオキシゲナーゼ(HmuO)では大腸菌の大量発現系をもとに精製した試料を用いて結晶化することに成功していたので、HmuOの結晶構造解析に取り組むこととした。その実験に先立ち、可視吸収スペクトルや共鳴ラマンスペクトルなどの各種分光測定や、酵素反応解析などの基本的な酵素科学的性質をHO-2、HmuOについて調べた。それらの結果をもっともよく研究されている誘導型ヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の結果と比較し、これらのタンパク質間ではヘム近傍の構造や酵素反応スキームが細かい点では異なっているものの、基本的には同一であることが確認された。HmuOのX線結晶構造解析においては、酸化型酵素の構造を1.4Åの分解能で、酸化型酵素を一電子還元した最初の中間体である還元型酵素の構造を1.7Åの分解能で、それぞれ決定することに成功した。この結果、ヘムの酸化還元に伴ってヘム周辺の酵素の構造が大きく変化することが明らかとなり、この構造変化によって作られる立体効果が、引き続き起こる酵素の結合と、その部位特異的な酸化反応に重要な役割を果たすことを示せた。また、本構造解析により、反応に必要なプロトンの取り込み機構に関しても新たな知見を得ることが出来、重要な成果となった。高等動物のヘムオキシゲナーゼには誘導型と構成型の2種類が知られており、それぞれHO1、HO2と呼ばれている。本研究ではHO2の構造解析を実行するための高純度試料の調製を行った。ヘムオキシゲナーゼはC末端側に膜結合部位を持っているが、結晶化を容易に行なうためにこの部分を除いたものを大腸菌の大量発現系により調製した。精製した試料を用いていくつかの結晶化条件の検討を行なったが、全く結晶化しなかった。結晶化しない原因は試料の不均一性にあると考えられた。すなわち、かなりの割合で部分的に分解されていたり、変性したりしていることが等電点電気泳動や高速液体クロマトグラフィーによる精密な分析により判明した。そこで欠失させるC末端側のアミノ酸の数を増やしたものを新たに調製し、分解産物の混入を減らすことにより試料の均一性を向上させることを試みた。この場合も試料を結晶化することができなかったので、さらに高純度の精製法の開発を目指した。その結果従来のイオン交換カラム、ゲルろ過カラム、硫安分画による精製に加えてさらに、ハイドロキシアパタイトカラム、疎水クロマトカラム、色素カラムによる処理を行なうと、試料の均一性が著しく向上することが判明した。十分に精製した試料を用いて紫外可視吸収スペクトルおよび共鳴ラマンスぺクトルの測定を行なった。その結果、HO-2の一酸化炭素配位型におけるFe-CおよびC-O伸縮振動はHO-1のものとほぼおなじであったが、酸素化型の安定性はHO-1に比べて著しく低下していることが明らかとなった。本年度はまず高等動物由来の構成型ヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO-2)の高純度精製とX線結晶構造解析のための結晶化スクリーニングを行った。

このタンパク質はいわゆる生化学研究のレベルでは、大腸菌の大量発現系を利用することにより、大量に精製することができた。しかし、精製の過程においてヘムオキシゲナーゼの末端アミノ酸が自発的もしくはタンパク質分解酵素によって分解されているために、試料の均一性が著しく失われるために、結晶化されることが非常に困難であることが判明した。そこで研究対象を少し変えて、バクテリアヘムオキシゲナーゼ(HmuO)の構造解析に取り組むことにした。HmuOはジフテリア菌のもつヘム分解酵素であり、HO-2と相同性の高いタンパク質である。HmuOについての構造解析は行われていなかったが、我々の研究はグループによって結晶化されることができていた。そこで結晶構造解析に平行してHmuOのキャラクタリゼーションを行うこととした。共鳴ラマン分光や可視吸収スペクトル測定などの各種分光測定により、HmuOのヘム近傍の構造はHO-2のものと類似していることが明らかとなった。さらに酵素反応解析やヘム近傍のアミノ酸変位体の作製を行い、酵素化学的な見地からHmuOとHO-2の違いについて議論した。HmuOの結晶は空間群P21で非対称単位あたり3つの分子を含むという複雑なものであったが、酸化型酵素と酸化型酵素のヘム鉄を還元剤で還元した還元型酵素について構造解析をすることができた。回折データ収集はSpring-8のBL45XUビームラインにおいて行い、酸化型酵素で1.4A、還元型酵素では1.7Aまでの回折データを収集することに成功した。
多民族都市レスターの多宗教統合とアイルランド系移民

(1)2018年度も、現代イギリスにおける多民族・多宗教都市レスターの「好評判」再考に向け、アイルランド系移民やイギリス生まれの移民二世について研究・調査を進めた。その内容は、彼らとのインタビュー、ローマ・カトリック教会やアイルランド系の「エメラルド・センター」訪問、イヴェント参加(聖パトリックの祝日のパレードや他のイヴェントなど)を含む現地調査である。とくにインタビューについては、高齢者を中心に「個人のライフ・ストーリー」を蓄積してきている。(2)2018年5月18日、レスター大学都市史センターで報告し、明治大学特定課題ユニットの「多宗教・多文化の歴史研究所」から刊行している『記憶と語りシリーズ』(英語版)全10冊の内容紹介を試みた(テーマ「第二次世界大戦後における多民族都市レスター住民の個人の語り」)。このシリーズも新たな学際的研究の試みの一つである。(3)2018年8月19日、アイルランド系の「エメラルド・センター」の新図書館のオープン・セレモニーに出席し、(2)に挙げた『記憶と語りシリーズ』10冊の展示を行った。(4)申請者がどうして第二次世界大戦後の多民族都市研究を始めたのか、また「個人の語り」を中心とした『記憶と語りシリーズ』をなぜ刊行し始めたのか、またそれらの冊子はどのような内容なのかを、「多民族都市レスター『記憶と語りシリーズ』を振り返ってー」と題して、歴史学雑誌『駿台史学』(第166号、2019年3月)に英文で掲載した。昨年度、『記憶と語りシリーズ』(英語版)の一冊としてインタビューをもとにしたアイルランド系移民2世のライフ・ストーリーを刊行する計画を進めていたが、それがインタビュイー(夫妻)の病気のため、その編集作業を先へ進めることができなかった。ただ、その後、二人の病気は順調に回復しているので、今年度にはそのブックレットを刊行できる予定である。2016年度、2017年度、2018年度の研究・調査を踏まえて、さらにインタビューを含む現地調査とその分析を進め、本研究テーマである「多民族都市レスターの多宗教統合とアイルランド系移民」をまとめる作業に繋げる。そのなかで、やや遅れている部分についても挽回し、順調に研究計画を進めていきたい。また、昨年度、刊行できなかった『記憶と語りシリーズ』の一冊としてアイルランド人夫妻のライフ・ストーリーなども今年度中に刊行できるよう作業を進める。これらに加え、昨年度インタビューのできなかった方たちについても、今年度の海外出張中に実施し、これまでの研究・調査を補いたい。(1)2016年度は、現代イギリスにおける多民族都市レスターの「好評判」再考に向け、アイルランド系移民について、彼らとのインタビュー、カトリック教会の訪問、イヴェントの参加(聖パトリックの祝日のパレードなど)を含む現地調査を実施した。とくにインタビューに関しては、「個人のライフ・ストーリー」を蓄積してきている。(2)明治大学特定課題研究ユニットの「多宗教・多文化の歴史研究所」から「記憶と語りシリーズ」(英語版)の9冊目として、1980年にレスターに来て、それ以後30年以上にわたりインド舞踊の普及に努めてきたインド系女性(ニリーマ・デイヴィ氏)とその夫メンスキー氏のライフストーリーを刊行した。また、そのシリーズIIの1冊目として、1954年にインドのパンジャーブ地方からコヴェントリーに渡って来て、そこに60年以上も住んでいるヒンドゥー教徒(ラム・クリシャン)とその妻ネスビット氏のライフ・ストーリーも刊行した。(3)1956年にインドのパンジャーブ地方からレスターに渡ってきて、50年以上もレスターに住み、現在、そこの市役所に勤務しているモヒンダー・シング氏に、本シリーズ8冊すべての「書評」を執筆してもらい、同研究所から『ディスカッション・ペーパー』の1冊として(第7号)として刊行した。また、その号には、地元のオーラル・ヒストリアンであるシンシア・ブラウン氏からの、その「書評」に対するコメントも掲載した。このシリーズは、新たな学際的国際交流の試みの一つである。(理由)海外出張のレスター滞在中に、インタビュイーの都合が悪くなり、インタビューのできない方がでて、予定の人数のインタビューを実施できなかったため。(1) 2017年度は、現代イギリスにおける多民族・多宗教都市レスターの「好評判」再考に向け、在英の南アジア系、ブラック系、ホワイト系(ユダヤ系・ラトビア系・ポーランド系)の研究を踏まえ、在英アイルランド系移民(イギリス生まれの二世も含む)に関する研究・調査を進めた。その主な内容は、彼らとのインタビュー、彼らの暮らしや宗教・文化・アイデンティティとも密接に関連するローマ・カトリック教会や「エメラルド・センター」(2000年代にアイルランド政府からも基金を得て創設された文化施設)の訪問、イヴェントへの参加(聖パトリックの祝日のパレードや結婚式など)を含む現地調査である。(2)明治大学特定課題ユニットの「多宗教・多文化の歴史研究所」から『ディスカッション・ペーパー』第8号(英語版)を刊行した。この冊子は、約20年にわたってレスター市役所の芸術・博物館部門の責任者として、実際にイギリスの多文化主義政策を都市レヴェルで実際に担ってきたセーラー・レヴットの作品である。本冊子は、同研究所刊行の『記憶と語りシリーズ』(英語版)10冊と『ディスカッション・ペーパー』第7号(モヒンダー・シング、英語版)の書評および彼女自身のライフ・ストーリー、レスターの祭りや彼女の家族の写真などを収録している。このシリーズも、新たな学際的国際交流の試みの一つである。

(3)拙文としては、「多民族都市レスターに憑かれて」(『広島日英協会会報』no.113、2017年5月31日、4-8頁)や「多民族都市レスターのホワイト・ブリティッシュたち」(『明治大学人文科学研究所紀要』第82号、2018年3月、159-194頁)を刊行した。(2)おおむね順調に進展している。先の「研究実績の概要」の通りである。(1)2018年度も、現代イギリスにおける多民族・多宗教都市レスターの「好評判」再考に向け、アイルランド系移民やイギリス生まれの移民二世について研究・調査を進めた。その内容は、彼らとのインタビュー、ローマ・カトリック教会やアイルランド系の「エメラルド・センター」訪問、イヴェント参加(聖パトリックの祝日のパレードや他のイヴェントなど)を含む現地調査である。とくにインタビューについては、高齢者を中心に「個人のライフ・ストーリー」を蓄積してきている。(2)2018年5月18日、レスター大学都市史センターで報告し、明治大学特定課題ユニットの「多宗教・多文化の歴史研究所」から刊行している『記憶と語りシリーズ』(英語版)全10冊の内容紹介を試みた(テーマ「第二次世界大戦後における多民族都市レスター住民の個人の語り」)。このシリーズも新たな学際的研究の試みの一つである。(3)2018年8月19日、アイルランド系の「エメラルド・センター」の新図書館のオープン・セレモニーに出席し、(2)に挙げた『記憶と語りシリーズ』10冊の展示を行った。(4)申請者がどうして第二次世界大戦後の多民族都市研究を始めたのか、また「個人の語り」を中心とした『記憶と語りシリーズ』をなぜ刊行し始めたのか、またそれらの冊子はどのような内容なのかを、「多民族都市レスター『記憶と語りシリーズ』を振り返ってー」と題して、歴史学雑誌『駿台史学』(第166号、2019年3月)に英文で掲載した。昨年度、『記憶と語りシリーズ』(英語版)の一冊としてインタビューをもとにしたアイルランド系移民2世のライフ・ストーリーを刊行する計画を進めていたが、それがインタビュイー(夫妻)の病気のため、その編集作業を先へ進めることができなかった。ただ、その後、二人の病気は順調に回復しているので、今年度にはそのブックレットを刊行できる予定である。2017年度は、2016年度の研究・調査を踏まえ、さらにインタビューを含む現地調査とその分析をすすめ、次年度の「多民族都市レスターの多宗教統合とアイリッシュ移民」をまとめる作業につなげる。また、「記憶と語りシリーズ」の一冊としてアイランド人夫妻のライフ・ストーリーを次年度に刊行できるよう作業をすすめる。なお、2016年度にインタビューのできなかった方たちについては、今年度の海外出張中に実施し、これまでの研究・調査を補う。2018年度は、3年目の最終年度に当たるので、2016年度、2017年度の研究・調査結果を踏まえ、さらにインタビューを含む現地調査やその分析を進め、さらにそれらを本研究課題の「多民族都市レスターの多宗教統合とアイリッシュ移民」に繋げていく予定である。
チガヤ法を用いた半数体育種における染色体消失誘発のゲノム同定と遺伝的機構の解明

遠縁交雑において片方の染色体が消失することがあり、コムギでは半数体育種に利用されている。チガヤ花粉をかけた場合ムギ類における半数体制御機構に関わっているゲノムの探索と遺伝子群の座乗染色体を調べ、その染色体消失の原因について分子細胞遺伝学的に解明した。タルホコムギの2Dおよび7D染色体が染色体脱落およびその後の胚の成長に深く関与していることが明らかになった。本研究成果はダブルハプロイド法による品種改良に大きく貢献する。チガヤの花粉によるムギ類の半数体出現機構を制御するゲノムを探索した。2倍コムギ3種(ゲノム構成=AA : Triticum boeoticum、T.urartu、T.monococcum)、4倍性コムギ2種(AABB : T.dicoccoides、T.durum)、タルホコムギ(DD : Aegilops tauschii)、Ae.speltoides (SS)、ライムギ(RR)、オオムギ(HH)、カラスムギ、イネに対してチガヤの花粉をかけ、受粉後の半数性胚形成過程を観察すると共に、約2週間後の半数性胚の形成率を調べたところ、タルホコムギでは半数性胚が成長しており、胚救助により半数体植物が得られた。T.durumでは胚が形成されていたが、途中で成長が止まうていた。一方、T.dicoccoldesでは胚は全く見られなかった。それ以外の種では全く胚は形成されなかったことから、ムギ類ではチガヤとの交雑において、Dゲノム染色体が半数桂胚形成およびその胚の成長に深く関与しているごとが明らかになった。タルホコムギの半数体植物は世界で初めての報告である。半数体であることがはセントロメアプローブ等を用いたFISH法でした。染色体の消失は、受精後の第1分裂降で起こっており、染色体消失とセントロメア不活性化との関連を調べたが、チガヤCENH3の十分な抗体を作製するこどができなかったので、明瞭な結果を得るととができなかった。半数性胚に対してゴルヒチン直接処理による染色体倍加の実験では、交雑後4日目の穂に500ppmのゴルヒチンを処理することにより染色体の倍加が一例だけ見られたが、再現性を確認する必要がある。本研究は、チガヤ花粉をかけた場合、ムギ類における半数体制御機構に関わっているゲノムの探索と遺伝子群の座乗染色体を明らかにし、その染色体消失の原因について分子細胞遺伝学的に解明することを目的とする。昨年度の結果から、タルホコムギ(=Aegilops tausshii)(Dゲノム)で半数体が得られることがわかったので、Dゲノム染色体にはチガヤゲノムを速やかに排除する遺伝子と共に半数性胚を成長させる遺伝子が存在すると予測した。本年度は、これら遺伝子がDゲノムのどの染色体に存在するかを、マカロニコムギのAまたはBゲノム染色体をタルホコムギのDゲノムの同祖染色体と置換した11系統(染色体置換系統)にチガヤを交雑し、半数体が得られるかどうか調査した。受粉後一定時間ごとに子房を固定し、初期発生から2週間後までの半数性胚の形成率を解剖学的あるいは細胞組織学的に調べた。その結果、7D染色体には半数体制御に関する両遺伝子が座乗していることがわかった。また1D、2D、5D染色体も半数体形成に関与していることが明らかになった。7D染色体の半数体誘発遺伝子をマカロニコムギに導入することで、4倍性コムギや6倍性ライコムギにおいてもチガヤ法で半数体育種が可能となり、本研究成果はダブルハプロイド法による品種改良に大きく貢献すると思われる。チガヤ法による半数体育種の短縮化のために、未熟胚のときにコルヒチンによる染色体倍加処理をin plantaで行う方法について、処理時期やその濃度などを変えて条件検討を行った。しかし、染色体が倍加したと思われる胚は致死となり、倍加植物を得ることが出来なかった。また、各種抗体を使った免疫染色の実験から、コムギとの雑種胚におけるチガヤ染色体の消失は、チガヤ染色体のヘテロクロマチン化が原因ではないかと考えられた。23年度までの結果から、チガヤゲノムを速やかに排除する遺伝子または半数性胚を成長させる遺伝子が、Dゲノムの1D,2D,5D,7D染色体に存在することが示唆された。マカロニコムギのAまたはBゲノム染色体をタルホコムギのこれらのDゲノム染色体と置換した系統(染色体置換系統)にチガヤを交雑し、受粉後一定時間ごとに子房を固定し、初期発生から2週間後までの半数性胚の形成率を解剖学的あるいは細胞組織学的に調べた。

これまでの研究から、コムギとの雑種胚におけるチガヤ染色体の消失は、ヘテロクロマチン化が原因ではないかと考えられるので、受精後の初期胚に対して既知のヒストン修飾(メチル化およびアセチル化)の抗体を用いて、免疫染色法により調べ、さらに、DNAのメチル化についても抗メチル化シトシン抗体を使ったFISH法で染色体上に可視化した。その結果、初期胚の細胞分裂においてチガヤ染色体は、ヘテロクロマチン化して凝縮するなど、エピジェネティックな変化がみられた。チガヤ法によりライコムギとパンコムギの雑種(AABBDR)後代から得られたダブルハプロイドの中で、病虫害抵抗性や乾燥耐性をもつ優良個体を選び、RおよびDゲノム染色体をFISH法で同定した。これらの系統はDゲノム染色体の一部がライムギ染色体と置換しており、しかもホモに固定されているので、チガヤ染色体脱落に関与するDゲノム染色体を推定することができた。いずれの系統も2Dおよび7D染色体をもっていたが、他のDゲノム染色体はライムギ染色体と置換することが可能であったことと、マカロニコムギのDゲノム染色体置換系統の解剖学的あるいは細胞組織学的から、2Dと7D染色体が染色体脱落およびその後の胚の成長に深く関与していることが明らかになった。本年度は、1)半数体形成に関与するDゲノム染色体の同定、2)染色体消失の分子的機構の解明、3)コルヒチン直接処理による半数性胚の染色体倍加の3つの課題からなり、全部の課題をこなすことができた。1)の課題で染色体の同定ができたのは大きな成果と考える。また、未熟胚にコルヒチン処理をすると胚が致死になるので、in plantaで染色体倍加は困難であることがわかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。チガヤゲノムを排除する遺伝子または半数性胚を成長させる遺伝子が、Dゲノムの1D、2D、5D、7D染色体に存在することがわかったので、次年度においてはそれぞれの染色体上の遺伝子がどのような役割をもつのか、またAまたはBゲノムの同祖染色体がどう影響するのか調べる予定である。チガヤ染色体消失の分子的機構について、DNAのメチル化、各種ヒストン修飾、CENH3の分子種の違いについての分子細胞学的研究が必要である。
分子レベルAMS^<14>C測定による大気エアロゾル中PAHsの起源推定と環境動態解析

本研究課題で目的とした、呼吸器内へ侵入可能な微細エアロゾル(粒径1.1μmおよび10μm以下)に含まれる微量なPAHの分子レベル14C測定を実現するために、極微量スケールでのAMS-14C測定の精度を検討し、想定されるエラーを回避するための技術的な提案を行った。この成果をもとに、以下の大気エアロゾル中の分子レベル14C測定を実施した。東京近郊(東京農工大学FM多摩丘陵)におけるエアロゾル中多環芳香族炭化水素(PAHs)の濃度、組成を詳細に分析した結果、マツ科植物樹脂の熱変性物が検出され、PAHの一部がバイオマス燃焼に由来する事が判明した。PAHの分子レベル14C測定の結果、Δ14Cは-514-787%♪%であった。これは、バイオマス燃焼の寄与率換算で1745%に相当し、エネルギー受給割合におけるバイオマス/化石燃料比(2%)に比べ著しく高い。調査地域における主要なバイオマス燃焼起源(ゴミ・下水汚泥の焼却)以外に未把握の燃焼起源があるか、個々の発生源の排出係数が高い可能性が示された。Δ14C-PAHの季節変動から、冬期における大気中PAH濃度の増大に対し、バイオマス燃焼が27%程度寄与していた事が判明した。PAHによる大気汚染レベルを制御するためには、各種のバイオマス燃焼起源からの放出抑制が重要であることが示された。山岳域(岐阜大学流域圏科学研究センター高山試験地)におけるエアロゾル中PAHは、極めて低濃度であったためΔ14C-PAHを測定できなかった。これらの試料については、現在、植物由来ワックスバイオマーカーの濃度、δ13C、Δ14Cの季節変動を測定し、冷温帯落葉広葉樹林の光合成炭素同位体分別値(Δ)を算出、有機エアロゾルによるNEP(生態系純生産)推定の可能性を検討中である。平成15年度は,エアロゾル試料の採取大気中PAHsの濃度を調べることを重点的に行なった。また,遠隔地域のデータを補完する目的から、山岳湖沼の表層堆積物についてもPAHsのAMS^<14>C分析を開始した。詳細は以下の通り。【エアロゾル試料採取】都市近郊として東京農工大学FM多摩丘陵および遠隔地域として岐阜大学流域圏科学研究センター高山試験地でエアロゾル試料を採取した。2004年2月現在までに,東京近郊で分級試料9,PM10試料29を,山岳地域でPM10試料8をそれぞれ採取した。このうち東京近郊試料はおよそ半数,山岳地域試料は全て,ASEによる溶媒抽出を完了した。【エアロゾル試料分析】2002年末から多摩丘陵で予備的に採取した試料を用いて、AMS^<14>C分析に必要な試料量を確認した。単一化合物での^<14>C分析を実現するために,東京近郊でおよそ12万立米の大気量が必要であると見積もられた。またPCGCによる化合物分取に必要な試料前処理方法を検討を行った。現時点で確定しているPCGCの前処理方法は:(1)ASE/toluene抽出,(2)0.5N KOH/MeOHによるアルカリ鹸化,(3)液液抽出による酸性化合物除去,(4)SiO_2、カラム分画,(5)GPCカラム分画,である。昨年9月以降,PCGCシステムおよびグラファイト化のための真空ラインの双方にトラブルがあった。このため,エアロゾル試料についてPCGC以降の試料精製を今年度は行うことができなかった。【山岳湖沼堆積物】

海外研究協力者Gustafssonと共同し,山岳湖沼表層堆積物中のPAHsを抽出,精製した。これは,遠隔地域における試料量が十分でない可能性を考慮したための措置である。山岳湖沼堆積物中のPAHsの大部分は大気降下物に由来するので,堆積物中PAHsの^<14>C分析結果を「大気中PAHsの積算」として評価に用いる予定である。平成16年度の研究実績詳細は以下の通り。【エアロゾル試料採取】都市近郊として東京農工大学FM多摩丘陵および遠隔地域として岐阜大学流域圏科学研究センター高山試験地でエアロゾル試料を採取した。本研究開始以降2004年12月末までに,東京近郊で分級試料41,PM10試料38,山岳地域でPM10試料26をそれぞれ採取した。これら全てについて,ASEによる溶媒抽出を完了した。【エアロゾル試料分析】前年度に引き続きPCGCによる化合物分取に必要な試料前処理方法を検討した。最終的に確定した前処理方法は:(1)ASEによるMeOH/toluene抽出,(2)KOH/MeOHによるアルカリ鹸化,(3)液液抽出による酸性化合物除去,(4)SiO_2カラム分画,(5)DMFによる芳香族成分抽出である。現時点で東京近郊では2004年6月まで、山岳地域では2004年8月までに採取した試料について精製/PAHs分析を完了している。異性体同士をコンポジットすることで東京近郊では夏、冬の2試料、山岳大気では全期間を通じて1試料、AMS分析を実施できる試料量を確保できた。H15年9月以降,グラファイト化のための真空ラインの回収率が低下しており現時点で未解決である。回収率低下の影響は、20μgC未満の極微量試料において顕著であったため,1試料あたりの化合物量を当初の予定よりも増やす必要が出てきた。このような事情から,エアロゾル試料についてPCGC以降の試料精製を今年度は行うことができなかった。【山岳湖沼堆積物】H15年度に海外研究協力者Gustafssonと共同し,山岳湖沼表層堆積物中のPAHsを抽出,精製したものをPCGCで分取し,AMS測定に供した。しかしAMS測定実施機関であるアメリカウッズホール海洋研究所においてPAHsのグラファイト化処理の際に試料が^<14>C汚染され、測定を実施できなかった。最終年度の研究成果は以下の通り。H17年度までに東京近郊(東京農工大学FM多摩丘陵:東京都八王子市)で採取されたエアロゾル試料から多環芳香族炭化水素(PAHs)を抽出・精製し、その濃度、組成を詳細に分析した結果、マツ科植物樹脂の熱変性物であるレテン、1,7-ジメチルフェナンスレンが検出され、この地域の大気エアロゾル中PAHの一部がバイオマス燃焼に由来する事が判明した。そこで、エアロゾル試料から特に高濃度で検出されたPAHを単離し、国立環境研究所の加速器質量分析計を用いた高精度放射性炭素同位体比測定法により分析したところΔ^<14>Cが-514-787‰、現世炭素(1950年当時の植物由来シュウ酸と同等の^<14>C含有量をもつ炭素)の含有率(pMC、% of modern carbon)が2146%の範囲であることが明らかとなった。これは、バイオマス燃焼の寄与率に換算すると1745%に相当し、エネルギー受給割合におけるバイオマス/化石燃料比(2%)に比べて著しく高い数値である。
科学技術日本語教材の開発

本年度は当課研究の最終年度で成果のまとめに向けて研究をすすめた次の項目を中心に行った。(1)ニーズ分析調査のまとめ=本年度は米国ワシントン大学工学部、中国清華大学日本語科、フランスCNRSなど海外の理工系大学および大学院生のための日本語教育の担当者と本研究課題の内容に関する意見交換を行うことができた。ワシントン大学とは漢字頻度の分析と教材の開発、清華大学とは理工系教科書の作成に関する協力をした。CNRSからはリュカ研究員が来日し、当研究で収集したテキストのディスコースを共同で行い論文作成および教材作成に至った。(2)テキストデータベースの補充と語彙・テキスト分析のまとめ=前年度までに入力したテキストデータベースの不備箇所の補充と訂正、校正を行った。その結果16冊分のテキスト約文字がデータベースとして完成した。また、テキスト分析では(a)文字レベル=漢字の頻度分析(b)語レベル=助詞相当句の頻度分析をし、日本語教育学会大会、日本科学教育学会などで口頭発表し、さらに東工大人文論叢に論文として発表した。(c)構文レベル=結合価からみた述語用言の分析と頻度分析、自動形態素解析プログラムで解析後、分析したものをまとめ、計量国語学会などで発表した。(d)ディスコースレベル=16冊の教科書のディスコース構造の分析を行い、各教科書の構造の傾向をみた。その方法としてキーワードの出現分布のマトリックスをコンピュータプログラムによって出すこと、各テキストの章、節、バラグラフに見える、ディスコースに関わる表現を抽出することなどを試み、成果発表を予定。(3)教材の作成完成=(A)「科学技術文章読解入門」テキストの執筆本研究の成果をもとに、専門書を読むために必要な基礎知識とテクニックを示し、その例題や練習問題として本研究のデータベースを使用している。(B)「専門教官によるやさしい科学技術日本語講義」テキスト編集専門教官の留学生に対する特別講義の講義録に、語彙表解説をつけて編集した。本年度の研究は大きく5項目に分けてそれぞれ下記のように行った。(1)教材作成のための基礎調査(A)ニ-ズアナリシス=理工系大学院専門教官および留学生を対象に日本語能力と専門教育に焦点をおいた質問を用意したアンケ-ト調査および面接調査を行い集計整理した。(B)学習行動分析=日本語初級後半・中級前期の学生が専門書を読むとこにどのようにして理解を可能にして行くかを観察するために、課題を与えそれを解読する過程をVTRに記録し分析した。(2)理工系大学テキスト語彙調査=東工大で使用されている理工系テキストを52冊を収集し、そのうち「回路理論基礎」「物理A」「回路理論基礎」「基礎化学実験」「生物学」「解析入門」をコンピュ-タに入力しテキストデ-タベ-スとした。態素解析はテキストを人手で形態素解析し、それを頻度解析プログラムによって漢字・語彙の頻度を出した。(次年度からは形態素解析プログラムで自動的に行う予定である。)構文レベルでは複合助辞、副詞の呼応、文末表現の分析法を考察した。文型の抽出法については次年度にさらに検討を要するが、今年度は現在の分析の段階でその様相と頻度を出してみた。この結果は、「科学技術日本語の文型抽出」として計量国語学会第34大会で発開した。(3)教科書作成=上記(1)(B)で述べたような学習プロセスの観察に基づいて専門日本語のテキストを作成した。このテキストは今年度末の報告書に収録する。このテキストを用いて行った講義をVTRに収録した。(4)CAI試作品作成=専門教科テキスト「回路理論基礎」をコンピュ-タによる読解学習プログラム

ミニチュア版を試作をし、学生による試行学習の後改訂を行った。以上の成果を平成2年度科学研究費補助金報告書「科学技術日本語教材の開発」(約150頁)として2年度末に出版する。本年度の研究実績は大きく下記の5項目に分けられる。(1)教材作成のための基礎調査=「理工系留学生の日本語学習および能力に関する実態調査報告」(研究成果中間報告書)を発表後、これをもとに文化庁国語課主催平成3年度日本語教育研究協議会東日本地区および西日本地区に招かれ、調査内容について講演討議に参加(仁科)。(2)理工系大学テキスト語彙調査=東工大で使用されている理工系テキストを57冊を収集し、今回は「解析概論I」「図学」「化学I物理の状態と化学熱力学」「生物学上下」「理工系の微分積分学」「流体力学」「建築環境設備学」「細胞生化学の進め」「地球科学入門」「都市計画」「数学」(計9冊)をコンピュ-タに入力しテキストデ-タベ-スとした。形態素解析はテキストを人手で形態素解析し、それを頻度解析プログラムによって漢字・語彙の頻度を出した。また今年度はNTTが開発した自動形態素解析プログラムを用いて分析を行った。前年度計量国語学会で発表した「科学技術日本語の文型抽出」に続いて、同学会第35会大会で「科学技術日本語の構文解析-助詞相当句を中心に-」を発表した(仁科・武田)。今回は構文レベルで特に助詞相当句の分析に焦点を合わせ、分析法の考察と集計頻度を出した。(3)教科書作成=(2)に基づいて専門日本語のテキスト試作版を作成した。このテキストは平成4年度末の報告書に収録する。本年度は当課題研究の最終年度で成果のまとめに向けて研究をすすめた次の項目を中心に行った。(1)ニーズ分析調査のまとめ=本年度は米国ワシントン大学工学部、中国清華大学日本語科、フランスCNRSなど海外の理工系大学および大学院生のための日本語教育の担当者と本研究課題の内容に関する意見交換を行うことができた。ワシントン大学とは漢字頻度の分析と教材の開発、清華大学とは理工系教科書の作成に関する協力をした。CNRSからはリュカ研究員が来日し、当研究で収集したテキストのディスコースを共同で行い論文作成および教材作成に至った。(2)テキストデータベースの補充と語彙・テキスト分析のまとめ=前年度までに入力したテキストデータベースの不備箇所の補充と訂正、校正を行った。その結果16冊分のテキスト約文字がデータベースとした完成した。また、テキスト分析では(a)文字レベル=漢字の頻度分析(b)語レベル=助詞相当句の頻度分析をし、日本語教育学会大会、日本科学教育学会などで口頭発表し、さらに東工大人文論叢に論文として発表した。(c)構文レベル=結合価からみた述語用言の分析と頻度分析、自動形態素解析プログラムで解析後、分析したものをまとめ、計量国語学会などで発表した。
拮抗微生物の機能利用による微生物制御法の開発と機能発現を阻害する環境要因の解明

前年度に収集した約2,500株の蛍光Pseudomonas属細菌株から選抜された抗生物質2,4-diacetylphloroglucinol(DAPG)産生菌株約30株の、DAPG生合成に対する植物病原菌代謝物の影響を調査した。その結果、植物病原菌であるFusarium属菌が産生するフザリン酸(FA)、Rhizoctonia属菌等が産生するフェニル酢酸(PAA)、イネいもち病菌等が産生するピコリン酸等の物質が蛍光pseudomonadsの一部の菌株のDAPG生合成を阻害した。また全ての植物病原菌代謝物が蛍光pseudomonadsのDAPG生合成を抑制したわけではなく、カビ毒として著名な糸状菌代謝物デオキシニバレノールやゼアラレノン等はFA/PAA感受性株に対してもDAPG生合成を阻害しなかった。一方で、蛍光pseudomonadsのその他の菌株は上記の阻害物質の影響を受けないことも確認された。そこで植物病原菌由来のDAPG生合成阻害物質の影響を受けなかった一菌株、LRB3W1株の植物病害防除効果を調査し、キャベツ苗立枯病、萎黄病およびトマト萎凋病に対する一定の防除効果を確認した。またLRB3W1菌株の病害抑制効果が、植物病原菌の細胞壁を構成するキチンを加水分解する酵素、キチナーゼを産生する細菌株と併接種することによってその防除効果が増強されることを確認した。さらに収集された蛍光pseudomonadsの16SrRNA遺伝子配列を決定し、各特性と遺伝的背景との関連性を調査した。その結果、上記阻害物質の影響を受けた蛍光pseudomonads菌株は遺伝学的な相同性が高いことが確認された。各種植物根圏から分離した約2,500株の蛍光Pseudomonas属細菌株の抗生物質生産能、特に2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG)生合成能をDAPG生合成遺伝子の一つphlDの特異的配列情報をもとにPCRスクリーニングを行い、約30株のポジティブ株を得た。そしてまず、DAPG生産性Pseudomonas属細菌の一株、P.fluorescens LRB3W1株の植物病原性糸状菌に対する抗菌活性を検定し、さらにキャベツおよびトマト植物の重要土壌伝染病害に対する病害抑制効果を調査した。その結果、LRB3W1株はキャベツ苗立枯病、萎黄病およびトマト萎凋病等の土壌伝染性病害に対して顕著な防除効果を示した。また抗生物質DAPG生産性Pseudomonas属細菌、LRB3W1株の病害抑止効果は糸状菌細胞壁分解酵素生産性細菌の存在下において増強されることを確認した。続いてLRB3W1株を含むDAPG生産性Pseudomonas属細菌のDAPG生合成に対する植物病原菌代謝産物フザリン酸(FA)およびフェニル酢酸(PA)の影響を調査するため、両物質を含む培地上で供試菌株を培養後、DAPG産生を検出した。本予備実験の結果、菌株ごとにDAPG生合成におけるFAもしくはPAに対する感受性が異なることが確認された。本結果は植物病原菌に対する拮抗微生物株の主要作用機構である抗生物質生産性が植物病原菌代謝産物の影響を受けることを示し、生物防除資材として利用する際の菌株選抜の重要性を示唆した。
礫間接触酸化方式による河川水の直接浄化実験

本研究は、BOD、T-N、T-Pなどの濃度が環境基準値を大きく超えた強汚濁河川と判定される高屋川を対象河川とし、河道内に建設された導水流下式の大型実験開水路(60^m×1^m×1^m)3本を用い、礫間接触酸化方式による水質浄化効果を定量的に考察評価したものである。1)各種水質項目について河川原水濃度に対し、各接触酸化水路における空間的、経時的浄化効果を除去率として定量評価した。2)接触材付着生物および動物プランクトンの種と個体数を計量し、水質浄化に及ぼす生物化学的評価を試みた。3)接触水路内の堆積汚泥量の場所的分析を定量的に分析し、強熱減量、酸素消費速度を計測して水質浄化効果との関連を評価した。礫間接触酸化法は、微生物活性(酸化作用)に期待する水質浄化法であるから、水温、降水量、DO(溶存酸素量)、SS(濁度)の関係について分析した。BOD、D-BOD、CODについては有機物特性を考察した。付着藻類についてはPantle・Buck法に基づき水質判定を行った。その結果、以下のような知見を得た。1)季節的な水質浄化効果(除去率)について、有機物汚濁指標(BOD)と栄養塩類指標(T-N)については冬期に低下する傾向がある。すなわち水温との相関関係は高い。T-Pについては季節的な関係はほとんどなく負荷量が高くなるにつれ浄化効果も高くなる。2)付着藻類について、各接触材ブロックの出現種数、個体数、密度ともに珪藻類の占める割合が高く、中でもNitzdschia属、Achnantes属の珪藻綱が優占している。3)Pantle・Buck法による指標種の珪藻による水質汚濁評価の結果はβ-中腐水性であった。4)付着藻類の密度は、いずれも通水時間経過とともに増加する傾向を示した。このことは微生物の増殖、すなわち水質浄化効果が高なることになる。既設の大型実験水路(60m×1m×1m)3本を使用して、接触材として脱油石炭、サンゴ石を用いた。中央の水路2は接触材を敷かず、架台のみ設置したコントロール水路とした。その両側の水路1と3の上流側接触材ブロックI,II(各10m)には石炭を、下流側接触材ブロックIII,IV(各10m)にはサンゴ石を30cm厚で敷き詰めた。各接触材ブロックの底部は堆積汚泥溜めとして高さ20cmのメッシュ架台を設けて2段構えとしている。この実験で解明すべき目的は、1)浄化効果に及ぼす気象・水文条件の影響、2)水質浄化効果の絶対評価、3)付着生物活性と浄化効果との関係、4)接触材の繰り返し利用の限界である。したがって、実験工程は、1)河川水の連続通水(3ヶ月)における各水路測点における水質調査分析、2)堆積汚泥及び付着生物調査、3)水路洗浄である。実験ケースは、第一季(8月18日11月11日)、第二季(11月15日2月5日)の2ケースである。水質指標としては、COD、BOD、SS、T-N、T-P、pH、DO、TURB、CONDについて毎週一回、計12回の観測分析を行った。堆積汚泥については各季の終回に各ブロックから全量を回収し、重量、含水率、強熱減量を定量分析した。

付着生物についても各季の初回と終回の観測日に各接触材ブロックから基材を採取し、生物種、密度、酸素消費速度を定量分析した。それらの成果は学会において発表される。本研究は、BOD、T-N、T-Pなどの濃度が環境基準値を大きく超えた強汚濁河川と判定される高屋川を対象河川とし、河道内に建設された導水流下式の大型実験開水路(60^m×1^m×1^m)3本を用い、礫間接触酸化方式による水質浄化効果を定量的に考察評価したものである。1)各種水質項目について河川原水濃度に対し、各接触酸化水路における空間的、経時的浄化効果を除去率として定量評価した。2)接触材付着生物および動物プランクトンの種と個体数を計量し、水質浄化に及ぼす生物化学的評価を試みた。3)接触水路内の堆積汚泥量の場所的分析を定量的に分析し、強熱減量、酸素消費速度を計測して水質浄化効果との関連を評価した。礫間接触酸化法は、微生物活性(酸化作用)に期待する水質浄化法であるから、水温、降水量、DO(溶存酸素量)、SS(濁度)の関係について分析した。BOD、D-BOD、CODについては有機物特性を考察した。付着藻類についてはPantle・Buck法に基づき水質判定を行った。その結果、以下のような知見を得た。1)季節的な水質浄化効果(除去率)について、有機物汚濁指標(BOD)と栄養塩類指標(T-N)については冬期に低下する傾向がある。すなわち水温との相関関係は高い。T-Pについては季節的な関係はほとんどなく負荷量が高くなるにつれ浄化効果も高くなる。2)付着藻類について、各接触材ブロックの出現種数、個体数、密度ともに珪藻類の占める割合が高く、中でもNitzdschia属、Achnantes属の珪藻綱が優占している。3)Pantle・Buck法による指標種の珪藻による水質汚濁評価の結果はβ-中腐水性であった。4)付着藻類の密度は、いずれも通水時間経過とともに増加する傾向を示した。このことは微生物の増殖、すなわち水質浄化効果が高なることになる。
GPCRシグナル調節因子スピノフィリンとGPCRとの相互作用の構造生物学的解析

全長400残基のスピノフィリン(SPL)のうち71残基のfragmentが(以下SPL-f71),α2Aアドレナリンレセプター(α2A-AR)の細胞内第三ループの19残基のfragment(α2A-AR-f19)と結合することを見いだしていたので,その2つのfragment間の相互作用をNMRで解析する事を試み,以下の成果を得た.(1) 15NラベルしたSPL-f71,および,そのα2A-AR-f19複合体のHSQCスペクトルの温度変化を比較することにより,SPL-f71のうち20残基がα2A-AR-f19と相互作用していることが,更に強く示唆された.(2) α2A-AR-f19は細胞毒性があるので,GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質は大腸菌では殆ど発現できなかった.そこで,不溶性の融合タンパク質を与えるketosteroid isomerase (KSI)との融合体のコンストラクトを作成した.(3) 13C-HSQCの感度が低いことが「複合体形成に伴う側鎖のシグナル変化の追跡」を困難にしていたが,感度良く測定できる条件を見出した.SPL-f71とα2A-AR-f19との複合体の構造をNMRで決定するためには両方のfragmentの安定同位体ラベルが必要である.しかし,GSTとの融合タンパク質として発現させたα2A-AR-f19は,様々な培養条件の検討にもかかわらず,収率を上げることができなかった.そこで,GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質としての発現を諦め,不溶性の融合タンパク質を与えるKSIとの融合タンパク質のコンストラクトを作成した.また,α2A-AR-f19の添加に伴うSPL-f71のNHシグナルの変化が小さいことがα2A-AR-f19とSPL-f71との複合体のストイキオメトリーや結合定数の決定を困難にしていた.α2A-AR-f19は塩基性であるのに対し,SPL-f71は酸性であるので,側鎖の解離基どうしの相互作用が重要で,側鎖のCHは複合体形成に伴って大きく変化すると期待していた.しかし,13C-HSQCの感度が低かったことから複合体形成を13C-HSQCでモニターすることができなかった.年度末に13C-HSQCを高感度に測定する条件を見出したので,今後は13C-HSQCで複合体のストイキオメトリーと結合定数を正確に決定できると期待される.従来の融合タンパク質発現系では細胞毒性の強いα2A-AR-f19を効率的に発現できなかったので,化学合成したペプチドを使わざるを得ず,安定同位体ラベルによる詳細な解析ができなかった.不溶性画分として発現するKSI融合タンパク質のコンストラクトを作成したので,今後は不溶性タンパク質として発現させ,安定同位体ラベルして,SPL-f71との結合を解析する.α2A-AR-f19のどの残基がSPL-f71と結合するのか,結合に伴い,どのような構造変化を起こすのかが決定できると期待される.13C-HSQCスペクトルが感度良く測定できるようになったので,SPL-f71の側鎖CHシグナルの変化を指標として「SPL-f71のどの残基がα2A-AR-f19と相互作用するのか」の情報を得る.また,熱分析によりSPL-f71とα2A-AR-f19との相互作用のストイキオメトリーと結合定数を決定する.全長400残基のスピノフィリン(SPL)のうち71残基のfragmentが(以下SPL-f71),α2Aアドレナリンレセプター(α2A-AR)の細胞内第三ループの19残基のfragment(α2A-AR-f19)と結合することを見いだしていたので,その2つのfragment間の相互作用をNMRで解析する事を試み,以下の知見を得た.(1) 15NラベルしたSPL-f71のHSQCスペクトルのα2A-AR-f19 titrationと温度変化測定により,SPL-f71のうち20残基がα2A-AR-f19と相互作用していることが,強く示唆された.(2) SPL-f71の主鎖の構造はα2A-AR-f19との結合により大きくは変化しないことが示唆された.(3) SPL-f71とα2A-AR-f19との結合は1:1ではない可能性が示唆された.SPL-f71とα2A-AR-f19との複合体の構造をNMRで決定するためには両方のfragmentの安定同位体ラベルが必要である.しかし,GSTとの融合タンパク質として発現させたα2A-AR-f19は,様々な培養条件の検討にもかかわらず,収率を上げることができなかった.そこで,発現を諦め,α2A-AR-f19は化学合成品の使用に切り替えた.発現条件の検討で時間がかかったのが,遅れの1つの原因である.また,SPL-f71とα2A-AR-f19とを混合すると凝集体ができた.この凝集体ができにくい条件を探すのに時間がかかったのが,遅れのもう1つの原因である.全長400残基のスピノフィリン(SPL)のうち71残基のfragmentが(以下SPL-f71),α2Aアドレナリンレセプター(α2A-AR)の細胞内

第三ループの19残基のfragment(α2A-AR-f19)と結合することを見いだしていたので,その2つのfragment間の相互作用をNMRで解析する事を試み,以下の成果を得た.(1) 15NラベルしたSPL-f71,および,そのα2A-AR-f19複合体のHSQCスペクトルの温度変化を比較することにより,SPL-f71のうち20残基がα2A-AR-f19と相互作用していることが,更に強く示唆された.(2) α2A-AR-f19は細胞毒性があるので,GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質は大腸菌では殆ど発現できなかった.そこで,不溶性の融合タンパク質を与えるketosteroid isomerase (KSI)との融合体のコンストラクトを作成した.(3) 13C-HSQCの感度が低いことが「複合体形成に伴う側鎖のシグナル変化の追跡」を困難にしていたが,感度良く測定できる条件を見出した.SPL-f71とα2A-AR-f19との複合体の構造をNMRで決定するためには両方のfragmentの安定同位体ラベルが必要である.しかし,GSTとの融合タンパク質として発現させたα2A-AR-f19は,様々な培養条件の検討にもかかわらず,収率を上げることができなかった.そこで,GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質としての発現を諦め,不溶性の融合タンパク質を与えるKSIとの融合タンパク質のコンストラクトを作成した.また,α2A-AR-f19の添加に伴うSPL-f71のNHシグナルの変化が小さいことがα2A-AR-f19とSPL-f71との複合体のストイキオメトリーや結合定数の決定を困難にしていた.α2A-AR-f19は塩基性であるのに対し,SPL-f71は酸性であるので,側鎖の解離基どうしの相互作用が重要で,側鎖のCHは複合体形成に伴って大きく変化すると期待していた.しかし,13C-HSQCの感度が低かったことから複合体形成を13C-HSQCでモニターすることができなかった.年度末に13C-HSQCを高感度に測定する条件を見出したので,今後は13C-HSQCで複合体のストイキオメトリーと結合定数を正確に決定できると期待される.α2A-AR-f19は塩基性アミノ酸残基が多いので大腸菌にストレスを与え,発現効率が低いと考えられる.そこで,大腸菌にストレスを与えにくい発現系へ変更して,調製する予定である.SPL-f71とα2A-AR-f19との混合時に生じる凝集体はcholine-O-sulfateの添加である程度防止できるが,完全には防止できていない.申請者の研究室では新規の凝集防止剤を合成しているので,それらも利用して凝集を防止する予定である.従来の融合タンパク質発現系では細胞毒性の強いα2A-AR-f19を効率的に発現できなかったので,化学合成したペプチドを使わざるを得ず,安定同位体ラベルによる詳細な解析ができなかった.不溶性画分として発現するKSI融合タンパク質のコンストラクトを作成したので,今後は不溶性タンパク質として発現させ,安定同位体ラベルして,SPL-f71との結合を解析する.α2A-AR-f19のどの残基がSPL-f71と結合するのか,結合に伴い,どのような構造変化を起こすのかが決定できると期待される.また,熱分析によりSPL-f71とα2A-AR-f19との相互作用のストイキオメトリーと結合定数を決定する.安定同位体試薬の購入を急ぐ必要がなくなったので,繰り越すことにした.次年度の予算に繰越金を合わせて,安定同位体試薬を購入し,ラベルサンプルを調製する予定である.安定同位体試薬の購入を急ぐ必要がなくなったので,繰り越すことにした.次年度の予算に繰越金を合わせて,安定同位体試薬を購入し,ラベルサンプルを調製する予定である.
無機炭素輸送濃縮機構の環境応答

本研究では、無機炭素輸送濃縮機構の環境応答機構を明らかにするためにクラミドモナス、ラン藻に加えて、高等植物アラビドプシスを実験材料として、以下の実験を行った。(1)CA遺伝子上流域とレポーター遺伝子(nit1硝酸還元酵素の構造遺伝子)を融合させたキメラ遺伝子をもつプラスミドを作製し、選抜用プラスミドpMN24とともにクラミドモナス宿主株(nit1-305)により形質転換をおこなった。形質転換株の約20%がキメラ遺伝子をゲノムに保持していた。CA遺伝子の約1.4kb上流域までを含むプラスミドを形質転換した場合、二酸化炭素の低下に伴うレポーター遺伝子の発現誘導は認められなかったことから、CA遺伝子の二酸化炭素濃度低下による発現誘導には、さらに上流の領域が必要であると考えられた。(2)ラン藻CA遺伝子(icfA)と炭酸固定酵素RubisCO遺伝子の間約20kbについてDNA塩基配列を決定した。この領域に挿入変異を導入して、得られたカナマイシン耐性株のCO_2要求性を調べたが、高CO_2要求株は得られなかった。(3)アラビドブシスからCAをコードするcDNAを単離し、これをCaMV35Sプロモーターの下流にセンス・アンチセンス両方向に挿入した形質転換用ベクターを作製した。これをTi-プラスミドバイナリー系を用いてアラビドプシスに再導入して形質転換アラビドプシス個体を得た。CA活性の低下した形質転換植物体について、空気レベルでの二酸化炭素濃度では野生型と生育・光合成活性の大きな差は認められなかった。