hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラマン分光法によるＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病凝集タンパク質の定量的測定技術の開発

4.培養細胞でのアミロイドβ凝集系の構築:高濃度Matrigelを用いて間質の拡散係数を下げ、培養細胞にアミロイド凝集体を作らせる系の構築を進めている。1.ラマン分光法を用いた振動スペクトル測定装置の構築(i).レーザー光源安定性の向上:本研究では、レーザーラマン分光顕微鏡の光源として、ECDL(external cavity diode laser)モジュールを自作し、レーザー発振を安定化させるために必要な定電流ドライバおよびレーザーダイオード温度コントローラを自作した。レーザーダイオード(LD)の温度を一定に保つことで、ラマンスペクトル測定の際の測定基準となる光源波長を固定することが可能である。今年度は温度安定化のためのPID制御機構を達成するマイコンプログラムの改良を進めており、±0.3°CであったLDの温度変動を±0.12°C程度まで安定化できるようになった。(ii).レーザーラマン分光顕微鏡の製作:可視光用の冷却CMOSを用いた昨年度までの検出系では、微量な生体サンプル・薄い病理切片の観測には測定感度が十分でないことが判明し、近赤外用の冷却CCDを新たに導入し、市販のレーザーラマン分光顕微鏡とほぼ同等のS/N比での測定が可能となりつつある。2.組織中での振動スペクトル測定技術の開発:ヒト剖検脳中での老人斑の振動スペクトル取得のためには、非染色試料で振動スペクトル画像取得後、免疫染色を行い老人斑を同定し、老人斑のある画素での振動スペクトルを同定する。振動スペクトル測定と免疫染色画像の撮影の間に、免疫染色操作が入るため、二つの測定を同じタイミングで連続して行うことはできない。この解決のためには、先に振動スペクトル測定した部位と同じ標本上の場所を、免疫染色後に定位するための位置あわせ技術が必要になる。本研究では、明視野画像から自動で検出した細胞の輪郭を免疫染色前後で比較し、互いにsuperimposeすることで、免疫染色後にはじめて確認できる老人斑の位置を、振動スペクトル画像上で特定する画像処理プログラムを製作した。アミロイドβのin vitroでのタンパク質凝集体について、非染色・非標識でのラマンスペクトル測定を成功させ、分子特異的な振動スペクトルのデータベースを構築した。新たに測定のための振動スペクトル測定装置開発を並行して進めているが、2014年3月時点では、稼動が少し遅れていた。アルツハイマー病剖検脳の組織中で老人斑の振動スペクトルを測定できる実験系を構築した。また免疫染色試料上の老人斑で、実際に振動スペクトルを測定し、先にin vitroで測定していたアミロイドβ凝集体の振動スペクトルとの比較・考察を行った。本来、振動スペクトル測定は非染色の試料を対象とする。組織中の振動スペクトルの空間分布を測定し、既存の染色方法を用いた標本の染色性との比較を行うためには、染色操作前後で撮影した顕微鏡画像を位置あわせする画像処理技術が必要になる。このためのプログラムも自作し、性能評価を行っている。培養細胞系でアミロイドβ凝集体の振動スペクトル測定を行う系は、構築中である。
クリニカル・クラークシップでの新たな診療現場指導・評価法導入による教育効果の研究

クリニカル・クラークシップの実習週数を増やした新しいカリキュラムを履修する医学生を対象として、診療現場での新しい指導・評価方法を導入するために、miniCEXや診療手技(採血、縫合・結紮、手術手洗い・清潔手袋装着、心電図記録)の評価表案を作成した。また、日々の実習記録、振り返り、指導医からのフィードバックで構成される実習ログ・ポートフォリオの様式を整え、学外ならびに選択臨床実習から導入した。また、旧カリキュラムでクリニカル・クラークシップの履修を修了した6年次を対象としてアンケート調査を実施し、担当患者数、単独で病歴を聴取した患者数、単独で身体診察した患者数、カルテ記載した患者数、カンファレンスで症例提示した患者数、病状説明に立ち会った患者数等の臨床実習実績、病歴聴取、身体診察、カルテ記載、症例提示、医療手技、診療参加についての自己評価、指導体制・指導状況についての学生の評価、学生の満足度、学生の自由記載意見等のデータを収集した。この結果、2006年度に医療面接、身体診察、カルテ記載、プレゼンテーションで構成される臨床推論課題による臨床実習後OSCEを導入した以降、2011年度までは臨床実習実績は経年的に増加したが、それ以降は減少しており、臨床実習後OSCEの改革によるクリニカル・クラークシップの改善効果には限界があることが示唆された。一方、主成分分析では、学生の満足度を規定する因子として、臨床医として模範的な指導医、適切な指導体制、指導医から適切な指導が抽出され、学生の経験症例数との関係は乏しかった。これらの結果から、クリニカル・クラークシップの評価を臨床実習後OSCE主体ではなく、指導と一体となった診療現場評価を重視する方向へシフトすることが、教育効果の向上に寄与すると考えられた。研究計画に従い、クリニカル・クラークシップにおける診療現場指導・評価表案の作成、実習ログ・ポートフォリオ様式の策定とその導入を実施した。また、旧カリキュラムでクリニカル・クラークシップの履修を修了した6年次を対象としてアンケート調査を実施し、担当患者数、単独で病歴を聴取した患者数、単独で身体診察した患者数、カルテ記載した患者数、カンファレンスで症例提示した患者数、病状説明に立ち会った患者数等の臨床実習実績、病歴聴取、身体診察、カルテ記載、症例提示、医療手技、診療参加についての自己評価、指導体制・指導状況についての学生の評価、学生の満足度、学生の自由記載意見等のデータを収集し、得られたデータを用いて、2006年以降の各項目の経年的変化を明らかにした。さらに、主成分分析等によって、満足度を規定する因子を明らかにした。これらによって、新たな診療現場指導・評価を導入することによって、クリニカル・クラークシップの教育効果が向上する可能性を示すことができ、今後の研究の方向性の適切さを確認できた。これらは、すべて当初の研究計画に基づいて計画通り実施されていることから、現在までの研究の進捗状況については、おおむね順調に進展していると判断した。2019年度は臨床実習週数を増やした新カリキュラムを履修する46年次に対して、miniCEX、実習ログ・ポートフォリオ、指導者との振り返りセッションの導入等の新しい指導・評価方法を本格的に導入する。履修を修了した6年次を対象としては、前年度までに実施した項目に加えて、実習週数の増加や新しい教育手法の導入についての学生による評価を調査項目に追加したアンケート調査を実施する。このデータを用いて、各項目の結果について前年度までとの比較検討を行う。さらに、多変量解析や主成分分析によって、満足度を規定する因子、学修成果を規定する因子を明らかにする。特に実習週数増加や新しい教育手法との関連性について検証を行う。また、自由記載によるテキストデータをもとに質的分析を行うことにより、学生の意見の傾向と特徴を明らかにする。これらによって、新しいカリキュラムや教育手法が、学生の満足度や学修成果に及ぼす影響を明らかにするとともに、これらの問題点や課題を抽出して、その改善策を作成し、次学年の指導・評価方法に新たに導入する。2020年度はクリニカル・クラークシップの週数を増やした新カリキュラムの履修を修了した6年次に対して、同様の履修修了後調査を継続し、前年度までと同様の分析を行うことにより、新たに導入した改善策が、学生の満足度や学修成果に及ぼす影響を明らかにする。これによって、課題の解決策の有効性を明らかにする。

一方、主成分分析では、学生の満足度を規定する因子として、臨床医として模範的な指導医、適切な指導体制、指導医から適切な指導が抽出され、学生の経験症例数との関係は乏しかった。これらの結果から、クリニカル・クラークシップの評価を臨床実習後OSCE主体ではなく、指導と一体となった診療現場評価を重視する方向へシフトすることが、教育効果の向上に寄与すると考えられた。研究計画に従い、クリニカル・クラークシップにおける診療現場指導・評価表案の作成、実習ログ・ポートフォリオ様式の策定とその導入を実施した。また、旧カリキュラムでクリニカル・クラークシップの履修を修了した6年次を対象としてアンケート調査を実施し、担当患者数、単独で病歴を聴取した患者数、単独で身体診察した患者数、カルテ記載した患者数、カンファレンスで症例提示した患者数、病状説明に立ち会った患者数等の臨床実習実績、病歴聴取、身体診察、カルテ記載、症例提示、医療手技、診療参加についての自己評価、指導体制・指導状況についての学生の評価、学生の満足度、学生の自由記載意見等のデータを収集し、得られたデータを用いて、2006年以降の各項目の経年的変化を明らかにした。さらに、主成分分析等によって、満足度を規定する因子を明らかにした。これらによって、新たな診療現場指導・評価を導入することによって、クリニカル・クラークシップの教育効果が向上する可能性を示すことができ、今後の研究の方向性の適切さを確認できた。これらは、すべて当初の研究計画に基づいて計画通り実施されていることから、現在までの研究の進捗状況については、おおむね順調に進展していると判断した。2019年度は臨床実習週数を増やした新カリキュラムを履修する46年次に対して、miniCEX、実習ログ・ポートフォリオ、指導者との振り返りセッションの導入等の新しい指導・評価方法を本格的に導入する。履修を修了した6年次を対象としては、前年度までに実施した項目に加えて、実習週数の増加や新しい教育手法の導入についての学生による評価を調査項目に追加したアンケート調査を実施する。このデータを用いて、各項目の結果について前年度までとの比較検討を行う。さらに、多変量解析や主成分分析によって、満足度を規定する因子、学修成果を規定する因子を明らかにする。特に実習週数増加や新しい教育手法との関連性について検証を行う。また、自由記載によるテキストデータをもとに質的分析を行うことにより、学生の意見の傾向と特徴を明らかにする。これらによって、新しいカリキュラムや教育手法が、学生の満足度や学修成果に及ぼす影響を明らかにするとともに、これらの問題点や課題を抽出して、その改善策を作成し、次学年の指導・評価方法に新たに導入する。2020年度はクリニカル・クラークシップの週数を増やした新カリキュラムの履修を修了した6年次に対して、同様の履修修了後調査を継続し、前年度までと同様の分析を行うことにより、新たに導入した改善策が、学生の満足度や学修成果に及ぼす影響を明らかにする。これによって、課題の解決策の有効性を明らかにする。
フグ毒テトロドトキシンの輸送・蓄積に関わる分子機構究明

まず、養殖トラフグにつき、稚魚、成魚、および性成熟が十分に進んだ個体の各組織からトータルタンパク質を抽出し、二次元電気泳動により分離後、抗Tr抗体を用いたウエスタンブロット法による候補タンパク質の選択とTOF-MSによるそれらの構造解析を行った。その結果、Tr群は、一部のアイソフォームで構造に個体差がみられるものの、その発現は成長/成熟段階には依存しないことが示唆された。一方、養殖トラフグ12ヶ月齢魚にテトロドトキシン(TTX)を経口経管投与し、各組織におけるTr群の発現状況をウエスタンブロット法で調べたところ、血漿中にみられるTr群のうち、Tr3と思われるアイソフォームが毒の投与により消失する現象が見出された。本アイソフォームについては、現在TOF-MSによる同定を進めており、今後は当該現象と毒輸送との関連について検討を行う予定である。遺伝子発現については、トラフグを対象として成長段階を比較するためのサンプルを追加し、これまでのサンプルと合わせて比較解析を行うとともに、ゲノム配列も合わせて総合的に解析を行っている。これまでにTr群は成長/成熟段階によらず肝臓のみで発現している可能性が示されているが、それに加えTr群のプロファイルもよく似ていることが示唆された。また、Tr2およびTr3が単一の遺伝子(scaffold_10076もしくはHE591872)にコードされていること、Tr3がコードされていると思われていた遺伝子(scaffold_3348もしくはHE593622)にはTr1-Tr4のいずれにも該当しないアイソフォームがコードされており、転写開始点が複数箇所あることなどもわかってきた。さらに、Tr群がゲノム上の複数箇所でかなり複雑にコードされていることも示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。各種フグにおけるテトロドトキシン(TTX)結合性タンパク質(PSTBP)アイソフォーム(Tr)群の組成や発現状況を明らかにするため、今年度は、有毒種としてコモンフグ、マフグ、ナシフグを、無毒種としてシロサバフグを用い、まず、RTーPCR法により肝臓における2ドメインタイプのTrの発現状況を調べた。次いで、RT-PCRと3'-RACE法により、各アイソフォームの部分配列を得た後、PSTBPとトラフグTr群の配列を加えて、Clustalで多重配列アライメントを、MEGA6でドメイン単位の系統樹を作成した。その結果、RT-PCR後の電気泳動において、有毒3種から目的サイズのバンドが得られた。これらにつき、部分配列取得後に作成した多重配列アライメントでは、N-グリカン推定結合部位(NXS/T配列)は7カ所において種間で保存されており、トラフグ以外ではさらに12カ所のNXS/T配列を有していた。また、N末端ドメインに比べ、C末端ドメインでアミノ酸の置換が高頻度に起きていた。系統樹は、N末端およびC末端ドメインでそれぞれクレードが構成され、N末端ドメインのクレードでは、トラフグのドメインのみ他種のフグから離れており、糖鎖推定結合部位の数も含めて、トラフグのTr群は他とは若干異なる特徴をもつことが示唆された。ウェスタンブロット法によりタンパク質レベルでの発現状況を調べたところ、Tr群はTakifugu属有毒フグに特異的であるが、その組成は種によって異なること、性成熟に伴って発現するアイソフォームが存在すること、などが示唆された。他方、トラフグ無毒個体に異なる用量でTTXを筋肉内投与し、皮と肝臓へのTTX移行様式を調べたところ、皮への移行率(投与毒量に対する移行毒量の割合)は投与毒量の増加に伴い有意に減少するのに対し、肝臓への移行率は投与毒量によらずほぼ一定であることがわかった。本年度は、数種フグの天然個体について、全長cDNAの網羅的解析を行う予定であったが、次世代シークエンサーの準備が遅れたため、年度末になってようやくトラフグを対象にcDNAライブラリーを作成し、それらの配列を取得することができた。現在その解析を進めている状況にある。今年度は、まず、トラフグTakifugu rubripesの各部位につき、テトロドトキシン(TTX)結合性タンパク質(PSTBP)アイソフォーム(Tr)群等、毒輸送関連遺伝子群の発現量を比較した。トラフグ試料より肝臓、卵巣、筋肉、皮を腑分けし、それぞれの部位から全RNAを抽出してcDNAライブリーの作製を行った。次世代シーケンサによって塩基配列を取得し、得られた配列のアセンブル、アノテーション、発現量の標準化を行い、部位毎で発現量を比較した。その結果、毒輸送関連遺伝子群には多くのアイソフォームが存在していることが明らかになった。また、これらの遺伝子群は特定の部位のみで発現していることが示されるとともに、その発現パターンには、生育段階や性別による違いが見られる可能性も考えられた。一方、部位毎に発現量が大きく異なる遺伝子群も明らかになりつつあり、発現量の再現性や生育段階による発現量の違い等を検証しつつ、今後は毒輸送関連遺伝子群と関係する他の遺伝子についても着目することで、毒輸送の分子機構の解明に繋がることが期待された。一方、天然ヒガンフグTakifugu pardalisにつき、性成熟に伴う体内TTX分布の変化を調査するとともに、同種養殖個体(12ヵ月齢)を用いてTTXと麻痺性貝毒(PST)の投与試験を行った。さらに、それら天然および養殖個体(毒投与および非投与個体)の血漿につき、PSTBPの発現状況を調べた。

その結果、ヒガンフグは食物からTTXを特異的に吸収し、普段は主に皮に蓄積するが、成熟に伴いTTXは卵巣に輸送・蓄積されるようになること、その際、卵母細胞内の毒の微細分布も次第に変化すること、PSTBPは毒の有無に関わらず構成的に発現していること、などが示された。研究実績の概要に記載のとおり、トラフグを対象に、次世代シーケンサによる全長cDNAの網羅的解析を行うことができた。しかしながら、性成熟が十分に進んだ雌個体を入手することができず、また、タンパク質レベルでの解析も若干遅れているため、成長段階や成熟段階によるTr群の発現プロファイルの相違を明らかにするには至らなかった。まず、成長/成熟段階の異なるトラフグの各部位について、PCRによりTr群遺伝子の発現プロファイルを調べた。その結果、いずれの段階においても、肝臓にのみTr1、Tr2、およびTr3の発現が確認された。次いで、二次元電気泳動によって各部位のトータルタンパク質を分離し、抗Tr抗体を用いたウェイスタンブロット法によりTr群と推定される複数のタンパク質を選択した。これらにつき、現在、TOF-MSによる構造解析とPro-Q Emeraldキットによる糖鎖修飾の解析を並行して進めている。一方、成熟段階の異なるトラフグ試料につき、次世代シーケンサを用いた遺伝子発現解析を引き続き行っている。今回、部位毎にcDNAライブリーを構築して発現遺伝子の同定と定量化を行う従来の方法とともに、転写開始点から確実に配列を解読する新たな方法(CAGE法)による解析も追加して行った。従来の方法では、Trのように類似の配列がタンデムに連結されているような場合に発現量の定量化やアイソフォームの同定が困難であるという欠点があったが、転写開始点からの解析を追加することで、より高精度な発現プロファイルが得られつつある。他方、淡水フグPao suvattiiの人工飼育個体から肝臓、皮、および消化管の組織切片を作成し、テトロドトキシン(TTX)またはサキシトキシン(STX)を含む培地で一定時間培養後、各切片の毒取り込み量を測定した。その結果、いずれの組織もSTXの取り込み量がTTXを上回った。特に消化管ではTTXはほとんど取り込まれず、STX取り込み量との差が最も顕著となった。現在、このような毒選択の分子機構について検討中である。研究実績の概要に記載のとおり、CAGE法とPro-Q Emeraldキットの導入により、より高精度なcDNA発現プロファイの解析や糖鎖修飾の解析が可能となりつつある。しかしながら、依然として性成熟が十分に進んだ雌個体の入手が困難であったことに加え、タンパク質レベルでの解析が遅れているため、成長段階や成熟段階によるTr群発現プロファイルの相違を明らかにするには至っていない。まず、養殖トラフグにつき、稚魚、成魚、および性成熟が十分に進んだ個体の各組織からトータルタンパク質を抽出し、二次元電気泳動により分離後、抗Tr抗体を用いたウエスタンブロット法による候補タンパク質の選択とTOF-MSによるそれらの構造解析を行った。その結果、Tr群は、一部のアイソフォームで構造に個体差がみられるものの、その発現は成長/成熟段階には依存しないことが示唆された。一方、養殖トラフグ12ヶ月齢
非切断型DNA損傷を契機とする放射線誘発遺伝的不安定性の染色体移入法による解析

電離放射線照射によって引き起こされる様々な影響の中でも、遺伝的不安定性は放射線発がんにも関係すると考えられており、その誘発機構の解明は放射線の生物影響だけでなく発がん過程を解明する上でも重要である。本研究では、遺伝的不安定性の誘発原因の一つとして非切断型のDNA損傷に着目し、その損傷の種類の違いによって誘発される遺伝的不安定性の違いを明らかにする為、染色体や細胞の核型を指標とした解析を行った。電離放射線により誘発される遺伝的不安定性は、放射線の被ばくにおいて深刻な問題である放射線発癌等の長期的な影響に関与するが、その誘発気候は解明されていない。申請者はこれまでに、DNA二重鎖切断(DNA Double-strand breaks;DSBs)修復機構の欠損によって生成する不完全なDSBs修復産物を有する細胞において、遺伝的不安定性の誘発が亢進されたことから、非DSBs型DNA損傷による細胞の不安定化の可能性を調べる為、非DSBs型DNA損傷を細胞に導入した。その結果、非DSBs型DNA損傷の導入は、細胞に対して染色体異常や核型の異常といった遺伝的不安定性が誘発する事を明らかにした。しかし、非DSBs型DNA損傷によって遺伝的不安定性が誘発される事は示されたものの、その誘発過程は未だ不明である。本研究は、癌細胞の悪性度にも県警する染色体の数的な異常である核型異常に着目し、非DSBs型クラスターDNA損傷によって誘発される核型異常の誘発機構解明を目的とする。本研究は、放射線いよる生物影響の中でも、高感度の検出が可能な染色体異常に着目し、非DSBs型クラスターDNA損傷によって遅延性染色体異常の生成及び、細胞分裂制御機構の破綻の解明を目的とする。すなわち、非DSBs型クラスターDNA損傷の細胞への導入により、引き起こされる染色体数の異数化と多倍数体化の誘発機構の解明に重点を置き。染色体の異数体化を起こしている癌細胞との関係を明らかにする事を目指す。そのために、非DSBs型クラスターDNA損傷の残存が核型異常の原因となるのか、あるいは細胞内の修復機構を始めとする各種細胞応答の異常が原因なのかを明らかにし、非DSBs型DNA損傷による細胞分悦制御や細胞周期の制御への影響の詳細を解明する。電離放射線により引き起こされる様々な影響の中でも遺伝的不安定性は放射線の長期的な影響であり、放射線発がんの要因となりうるものである。しかし、その誘発機構の解明は未だなされていない。申請者はこれまでに、DNA二重鎖切断(DNA Double-strand breaks; DSBs)修復機構の欠損した細胞では遺伝的不安定性が高くなることから、DSBs修復欠損により生じる不完全なDSBs修復産物が遺伝的不安定性の因子と成り得ると考えた。そこで、非DSBs型DNA損傷を細胞内に導入することによって、損傷を導入された細胞が不安定性を誘発するかを調べた結果、非DSBs型DNA損傷の導入は細胞に対して核型異常、染色体異常を誘発することを明らかにした。しかし、それら各種異常の誘発機構の全容は未だ不明である。そこで本研究は、がん細胞の悪性度にも関係する染色体の数的な異常である核型異常の非DSBs型クラスターDNA損傷による誘発機構解明を目的とする。UV-Aの照射によって生じさせた非DSBs型DNA損傷は、微小核細胞融合法によって未照射の細胞に移入する。その後、損傷導入細胞を選択的に培養し、核型異常等を調べる。本研究では、導入によって細胞周期にどのような影響を及ぼすのか、すなわち、細胞分裂制御への影響があるのかを調べる。通常、DNA損傷が生じると細胞周期には修復のための遅延等が見られる。そこで核型異常の形成の原因として、細胞分裂の制御に異常が生じるのではないかと考え、非DSBsクラスターDNA損傷の導入が細胞分裂制御へ及ぼす影響を解明する。電離放射線により引き起こされる様々な影響の中でも、遺伝的不安定性は放射線の長期定期な影響であり放射線発がんの要因となりうるものである。申請者は、DNA二重鎖切断(DNA double-strand breaks ; DSBs)修復機構の欠損した細胞では遺伝的不安定性の誘発頻度が高くなることから、DSBs修復欠損により生じる不完全なDSBs修復産物が遺伝的不安定性の因子と成り得ると考えた。そこで、非DSBs型DNA損傷を不完全なDSBs修復産物と想定し、これを細胞内に導入し、損傷を導入された細胞が遺伝的不安定性をを誘発するかを調べた結果、非DSBs型DNA損傷の導入は細胞に対して核型異常、染色体異常を誘発することを明らかにした。しかし、それらの各種異常の誘発機構の全容は未だ不明である。そこで本研究では、がん細胞の悪性度にも関係する染色体の数的な異常である核型異常の非DSBs型クラスターDNA損傷による誘発機構解明を目的とする。UV-Aの照射によって生じさせた非DSBs型DNA損傷は、微小核細胞融合法によって未照射の細胞に導入する。そこで、核型異常の形成の原因として、細胞分裂の制御に異常が生じるのではないかと考え、非DSBs型クラスターDNA損傷の導入が細胞分裂制御へ及ぼす影響を解明する。

電離放射線照射によって引き起こされる様々な影響の中でも、遺伝的不安定性は放射線発がんにも関係すると考えられており、その誘発機構の解明は放射線の生物影響だけでなく発がん過程を解明する上でも重要である。本研究では、遺伝的不安定性の誘発原因の一つとして非切断型のDNA損傷に着目し、その損傷の種類の違いによって誘発される遺伝的不安定性の違いを明らかにする為、染色体や細胞の核型を指標とした解析を行った。平成26年度は客員研究員として研究活動を行っているものの、研究時間の確保が当初計画していたより少なくなってしまった。また、紫外線照射染色体の移入効率の大幅な低下により、予定していた研究に着手することが出来ず、研究計画に遅れが生じた。放射線生物学平成26年度に行った非DSBs型クラスターDNA損傷の移入では、紫外線の照射線量を増加させることで移入する損傷を増やすことを検討したが、その結果移入効率の大幅な低下を引き起こした。そこで、損傷量を増やすことよりも影響の解析に重点を置き、移入後の細胞の細胞内酸化度の変化、および、細胞分裂時における中心体や紡錘糸形成の異常、移入染色体の細胞内での修復過程におけるDNA切断の生成の有無を調べることとする。また、損傷の移入により移入後の細胞でDNA修復機構が活性化されるかどうかを調べることにより、紫外線照射染色体を導入した細胞が、細胞全体への紫外線照射では見られなかった大きな影響を受けた原因を調べる。平成25年度の途中で前所属研究機関を退職したことにより、現在の所属先に研究拠点を移した。これによって、研究環境等を含む実験結果の再現性の確認等を行う必要が生じた。そのため、当初の研究計画には含まれていなかった研究拠点の移動とそれに伴う再現実験等により、研究計画に遅れが生じた。研究の進捗状況の遅れに伴い、本来当該年度に行う予定であった研究に必要であった物品等の購入を行わなかった為に物品費の残額が生じた。平成25年度に引き続き、非DSBs型クラスターDNA損傷が細胞内環境に及ぼす影響の解析を行う。DNA損傷修復機構の存在が、UV-A照射染色体の移入により誘発される遺伝的不安定性に対して及ぼす影響を調べる。UV-A照射染色体を移入した修復機構欠損細胞に対して、遺伝的不安定性の誘発を調べる。解析は、染色体異常、及び核型の異常を指標として行う。また、非DSBs型クラスターDNA損傷による細胞分裂制御機構への影響を調べる。染色体の増減による異数体化は、細胞分裂時の染色体の不均一な分配、あるいは、多倍数体化した細胞から染色体が欠落して起こるため、染色体の欠落や不均一な分配には、中心体の機能異常や染色体の動原体の異常・不活化による紡錘糸形成異常や、中心体複製異常による多極分配等が関与していると考えられる。そこで、非DSBs型クラスターDNA損傷が細胞分裂の制御機構に及ぼす影響を調べる。解析は、蛍光免疫染色法によって、中心体の複製及びその機能、あるいは紡錘糸の形成等について正常に行われているのかを調べる。当該年度に行うことのできなかった研究に関しては、平成27年度に行うものとする。また、研究計画に大幅な遅れが生じているため、アプローチ方法を大きく見直し、より効率的に行う。所属研究機関が日本原子力研究開発機構から大阪府立大学に移った事に伴い、研究計画に遅れが生じた。
全部材の最大荷重効果を同時に再現するユニバーサルな風荷重分布算定法の開発

変動風力を受ける構造物の全ての部材に生ずる最大荷重効果を,一つの荷重分布で同時に再現するユニバーサルな等価静的風荷重の算定手法について研究した。先ず,大スパン片持ち屋根,高層建築物,ドーム屋根など,種々の建物モデルの多点変動風圧実験を行い,得られた変動風圧力を構造物のFEMモデルに作用させ,時刻歴応答解析によって全部材の最大荷重効果を求めた。ついで,変動風圧力のPOD規準モードおよび特異値分解を用いることによって,時刻歴応答解析で得られた全部材の最大荷重効果と同じ静的荷重効果をもたらすユニバーサルな等価静的風荷重が合理的に算定できることを明らかにした。さらには,様々な構造形式に対応するユニバーサルな等価静的風荷重の算定を行い,影響関数とともにデータベース化するとともに,準静的成分のみならず,最大荷重効果に共振成分をも含む場合に対しても,ユニバーサルな等価静的風荷重の算定が可能であることも示した。大スパン片持ち屋根に関しては,構造モデルの違い,風向角の違い,気流の違いによるユニバーサルな等価静的風荷重分布の変化も検討した。得られたユニバーサルな等価静的風荷重により再現される全部材の最大荷重効果を,従来からのガスト影響係数法や,準静的成分に対するLRC法による結果と比較検討し,どのような条件下においても,ユニバーサルな等価静的風荷重の方が高い精度で真の最大荷重効果を再現できることを示した。なお,ユニバーサルな等価静的風荷重の算定では,最大荷重効果の正負の組み合わせ方は自由であり,場合によっては,非常に不自然な分布が得られることがある。この問題に対しては,各部材の荷重効果の時刻歴波形のPOD解析を行い,その規準座標に基づいて,最大荷重効果の正負の組み合わせを合理的に定める画期的な手法を開発した。・本研究は,全部材の最大荷重効果を同時に再現するユニバーサルな等価静的風荷重分布を算出する手法を提案するものである。データベースとしての汎用性を備えるため,まず,高層建築物および低層建築物に典型的な長方形平面の建物モデルを対象として,アスペクト比や辺長比を変化させた風圧模型を用い,多点同時風圧測定システムにより変動風圧の測定を行った。実験では,東京工芸大学・風工学研究センターに現有するエッフェル型境界層風洞を使用した。実験気流は,郊外および高層建築物の多い地域を想定し,実験風向を変化させて風圧測定を行った。・最大荷重効果の評価方法に関する情報を整理し,極値解析による手法で合理的な最大荷重効果算定法の提案を行った。・いくつかの建物形状の構造パラメータを仮定し,FEMモデルを作成した。ユニバーサルな等価静的風荷重の解析では,影響関数が必要となる。そこで,建物FEMモデルより,軸力,曲げモーメントおよびせん断力などの応力や,変位に関する影響関数を抽出し,影響関数マトリクスのデータベースを構築した。・風洞実験により得られた変動風圧データと,FEMモデルを用い,準静的な時刻歴応答解析を行った。・準静的な最大荷重効果を対象としたユニバーサルな等価静的風荷重は,POD解析による規準座標の線形結合により,最適な近似解として一義的に求め,かつ等価静的風荷重に対する規準座標の寄与率等を検討した。また,合理的な規準座標の組合せの検討のため,POD解析による規準座標のデータベースを構築し,解析の効率化を計った。本研究では,構造物のすべての部材の最大荷重効果を同時に再現するユニバーサルな等価静的風荷重という新しい概念を提案し,その算定手法の開発を行ってきた。平成18年度は,先ず,風洞実験による多点同時風圧データの蓄積を行うとともに,大スパン片持ち屋根を対象として,異なる3つの構造モデルを想定し,ユニバーサルな等価静的風荷重の検証を行なった。

屋根フレームをFEMモデルに置換し,風洞実験により得られた変動風力を作用させ,時刻歴解析によりすべての部材の真の最大応力を求めた。それらの結果をもとに,前年度までに提案された手法を用いて,ユニバーサルな等価静的風荷重を算定した。得られたユニバーサルな等価静的風荷重により再現される荷重効果と,時刻歴解析により求めた真の最大荷重効果を比較した結果,両者は非常に高い相関関係にあることが明らかにされ,種々のケースに対して,その精度の検証がなされた。更に,平成18年度に特に検討したのは,部材の最大荷重効果の正負の組み合わせ方によっては,得られるユニバーサルな等価静的風荷重分布が不自然な分布になる問題である。ユニバーサルな等価静的風荷重の算定では,条件として与える最大荷重効果の組み合わせば自由であり,任意に定めることができ,部材数が増えるに従い最大荷重効果の組み合わせば指数関数的に増加してしまう。これに対して,荷重効果の時刻歴に対してPOD解析を行い,この荷重効果のPOD規準モードに基づいて,最大荷重効果の組み合わせを一義的に決定する方法を考案した。その結果,ユニバーサルな等価静的風荷重として自然な分布が得られることが分かった。最大荷重効果に共振成分を含むケースの取り扱い,ドーム屋根などの種々の構造形態に対するユニバーサルな等価静的風荷重分布の検討などを行った。
地域依存性を考慮した製品ライフサイクルプランニング方法論の研究

途上国で持続可能な消費と生産を実現するには、製品ライフサイクルを通じた環境負荷と製品ユーザの生活の質を設計初期段階で考慮する必要がある。本研究では、人間の基本ニーズと製品開発プロセスを体系的に接続する生活圏アプローチを提案した。本アプローチでは、製品の存在理由と機能・構造を視覚的に表現するバリューグラフと、普遍的な基本ニーズの充足要因とが接続される。次に、製品機能・構造に地域情報を対応付ける拡張機能構造マップを提案し、設計情報可視化システム上に試作実装した。途上国の調査や製品分解、ライフサイクルアセスメントから得た情報を試作システム上で可視化し、その有効性を検証した。1)文献調査:関連研究の把握と,本研究の位置づけ明確化を行った.本研究をテアダウンを核とするリバースエンジニアリングと,現地観察を組み合わせて,設計支援に有効な形で地域制約情報を構造化する研究と位置付けた.特に,関連する既存研究は,適正技術に関するものであり,これについては国内第一人者のヒアリングを実施した.2)現地調査:ベトナムの都市部と農村部で家庭内工業製品の使い方や選定条件などを調査した.その結果,日本製品と比較して実現手段や構造が大きく異なる製品として,炊飯器,洗濯機,電気給湯器を抽出した.そして,それらの製品について,価格差以外の差異にも注目し,地域制約に関する複数の仮説を導いた.それらは,製品属性と,生活の価値観,住居,社会インフラ,気候などの属性との相互関係を意味する.3)テアダウンの実施:当初研究計画では,対象製品の使用環境において関連するすべての人工物を対象にテアダウンする計画だったが,現地調査の結果,これを変更した.すなわち,テアダウン対象は,対象製品のみとした.4)拡張機能構造分析手法の枠組み提案:設計情報としては対象製品を含む関連人工物を対象とし,地域制約を含む設計情報構造化の枠組みを「拡張機能構造分析手法」として提案した.以上がH27年度の成果である.地域特性と製品ライフサイクルの関係性可視化モデルの提案,という最終目標に向けて,これまでのところほぼ計画通りに推移している.一部テアダウンの対象範囲を変更したが,扱う情報の範囲は変えていないので,計画全体への影響は小さいと見積もっている.途上国で持続可能な消費と生産パターンを実現するには、製品ライフサイクルを通じた環境負荷と製品ユーザの生活の質を設計初期段階で考慮する必要がある。本研究では、まず人間の基本ニーズと製品開発プロセスを体系的に接続する生活圏アプローチを提案した。途上国の現地調査や製品分解情報、ライフサイクルアセスメントから得た情報を試作システム上で可視化して、その有効性を検証した。H27年度で地域制約情報を製品の機能・構造に関係づける情報モデルのコンセプトを拡張機能構造分析手法として固めたので,H28年度は,それを計算機上に実装する.さらに,ライフサイクルオプションに関係する地域制約を抽出し、地域制約とライフサイクルオプションの関係を定量把握するための分析手法を考案する。事例研究を通じて有効性を検証するとともに,既存のライフサイクルプランニング・プロセスに組み込む提案を行う.上記事例研究については、現地関係者に手法開発者とは異なる角度からレビューしていただき、研究をまとめる。また、今後の課題と展望を明らかにして、先進国製品への地域依存性の反映などの発展を目指す.28年度が最終年度であるため、記入しない。ライフサイクル工学28年度が最終年度であるため、記入しない。
日本最初期の点字雑誌「六星の光」の墨訳と戦前の盲人の教育・生活論

本研究は、筑波大学障害学系の研究者と附属視覚特別支援学校の資料室担当教員・同窓会・後援会関係者などの共同研究として進められている。今年度だけで、延べ60人ほどが参加している。作業としては、全盲のアルバイト2名が週に23日原典(点字)のテープ録音を行っていて、全473号(欠本が100号以上ある)のうち340号まで完了した。この中で古い点字の特質などが明らかになり、各地の盲学校成立や当時活躍した盲人の資料等が発見されている。このテープを「日本盲人職能開発センター」および卒業生のグループへ送り、テープ反訳を行っているが、今年度は20号分が反訳された。この後を、月一回の共同の作業日に、全盲と晴眼者の2人一組で何組かに別れ、校正して、一次完成校にする。ここは大変手数がかかるため、約40号分の一次完成であった。人名・地名・鍼灸の用語など難解な漢字への変換が課題になっているので、厳密な完成はもう少し作業が進まないとむずかしい。また、製本されていないものの調査、欠本の調査もあわせて行ってきた。こうした中で、2009年は点字の発明者ルイ・ブライユの生誕200年、および日本点字をつくった石川倉次生誕150年にあたり、各地で記念する点字の歴史展が企画されてきた。「六星の光」は、日本で最初期の点字雑誌であるので、こうした展示へは、本研究の紹介と共に作成した点字の復刻版と墨訳したものを出品して、多くの関心を集めている。今年度は、視覚障害者向けのイベント「サイト・ワールド2008」において、ルイ・ブライユ生誕200年記念の「点字以前と点字の歴史」展を本校の資料を展示して行った。なお、大塚美紀は引き続きルイ・ブライユ関連の資料紹介を準備し、青松利明も「附属視覚特別支援学校研究紀要」に本研究の概要を執筆中である。本研究からの資料提供により、「東奥日報」に青森盲創設者の紹介がなされ、エロシェンコ関係者の研究発表も準備されている。また、墨訳後の出版も検討が進んでいる。
歯の上皮ー間葉相互作用の人工構築とシグナル伝達のイメージング解析

歯の発生は上皮間葉相互作用により進行するため、由来の異なる2つの細胞をin vitroで長期的に同時に観察できる系が望まれる。本研究はこれを実現するための基礎研究として、歯胚より分離した細胞の未分化性を維持する分子の検索と培養条件の検索を行った。その結果、上皮細胞が発現するFgf9が歯の間葉細胞の増殖に働くと共に間葉側での持続的なFgf10の発現に働くことで細胞の未分化性を維持することが明らかになった。平成19年度は切歯の幹細胞の増殖・維持に働く成長因子を検討する為に、マウス切歯の形成端部で発現する成長因子の網羅的解析実験を行った。さらにin vitroにおける歯の上皮系幹細胞と間葉系幹細胞の共培養条件を検討する為に、培養液の最適化条件とコラーゲンを使用した場合の培地と歯の幹細胞の適合性について検討を行った。1.SuperArray社のRT2Profiler PCR Array Sytemの製品の中からMouse Growth factors(PAMM-041C)を使用して解析を行ったところ、これまで報告されているFgf,Bmpシグナルの他、歯での解析が行われていない数種類の分子が侯補として挙げられた。特に発現が高かったFgf9について組織化学的実験を行ったところ、切歯歯胚形成端部の上皮組織に局所的に分布することが見いだされた。さらにFgf9タンパクを加えて培養を行った歯胚ではFgf10の発現が維持されたことから、Fgf9はFgf10とともに幹細胞nicheを構成する分子であることが示唆された。この結果は現在論文にまとめ受理されている。また、近年骨髄などの造血組織において特定のケモカインが幹細胞nicheを構成する為の重要なファクターであることが、CXCL12のトランスジェニックマウスを使用した実験により示されている。同様のケモカインがPCRアレイの結果から歯でも表現しており、重要な機能を持ちうることが考えられたため現在これらの分子についても詳細を検索している。2.コラーゲンを数種類の異なった濃度で培地に加え、間葉細胞をコラーゲンの中で培養し、上皮細胞と間葉細胞の分布,細胞数の変化について数日培養を行い検討した。現在最適なコラーゲンの濃度と細胞の播種法について引き続き検討中である。歯の発生は上皮間葉相互作用によって調節されているため、より詳細な観察を行うには由来の異なる2つの細胞をin vitroで同時に観察できる系が望まれる。本研究ではこれを実現するための基礎研究として歯胚由来の細胞の長期培養条件と未分化性を維持するためのシグナル分子の解析を行った。平成20年度では前年度に行ったDNAアレイの結果をふまえた解析とコラーゲンを用いた培養条件について引き続き検討を行った。1.歯の未分化領域においてFgf9の発現が上昇していたことから、Fgf9タンパクを加えた状態で歯胚由来の間葉細胞の培養を行ったところ細胞の増殖率が向上しな。2.切歯歯胚の未分化領域から分離した一次培養上皮細胞にFgf2とEGFタンパクを加えた状態で長期間培養した後、幹細胞マーカー遺伝子数種類の発現を確認した。3.コラーゲンコートを行った培養皿によって歯胚由来の一次培養細胞の接着効率が上昇した結果、細胞の増殖速度が向上した。4.コラーゲン上に上皮細胞を培養した結果、シート様に配列した上皮細胞が回収できた。また以上の研究過程において新たに特定のケモカインの発現が上昇していたため、現在これに注目しその機能について検討している。本研究課題で得られたin vitroでの歯の培養条件を使用した解析方法の確立についても今後の課題としたい。
腸内細菌による中枢神経系炎症制御メカニズムの解析

多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスを用いて、中枢神経系炎症の発症に寄与する腸内細菌の探索を行った。その結果、EAEが抑制されたマウスの小腸においてErysipelotrichaceae科の菌株が減少することを見出した。本菌株をマウスから単離培養し、無菌マウスに定着させたところ、EAE症状が悪化することを確認した。本菌株は小腸においてバイオフィルムを形成し、小腸上皮に付着することで炎症反応を促進し、さらにはEAEにおける自己抗原特異的T細胞の病原性を高める可能性が示された。各種抗生物質を投与したマウスの小腸内容物の16S rRNAメタシーケンシングを行った結果、ampicillin投与によりErysipelotrichaceae科の菌株が有意に減少することが明らかとなった。そこで同菌株を単離培養し無菌マウスに定着させたところ、無菌マウスに比べEAE症状が悪化することを確認した。また、小腸粘膜固有層においてTh17の活性化が誘導されたこと、さらには小腸でのserum amyloid A発現およびIL-23発現が有意に増加したことから、本菌株はSegmented filamentous bacteria(SFB)と同様のメカニズムでTh17細胞の分化を誘導することが示唆された。また、Th17はEAE発症において中心的な役割を果たしていることから、今回単離した菌株はMOG特異的なTh17細胞を小腸で活性化することによりEAE病態悪化を促進することが示唆された。今回単離した菌株のゲノムシーケンシングを行った結果、本菌株は細胞外多糖を高産生することでバイオフィルムを形成し、宿主腸管上皮細胞に定着することが示唆された。現在、Th17細胞の活性化に寄与する因子を探索中である。多発性硬化症モデル(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)における腸内細菌の影響を検討した結果、Erysipelotrichaceae科の菌株が小腸において抗原特異的T細胞を活性化し、中枢神経系の炎症を促進することが示唆された。これらの結果は、マウス小腸から単離したErysipelotrichaceae科菌株のみを有するモノアソシエイトマウスにおいて確認できた。一方、マウス小腸で優性なLactobacillus属菌株は、中枢神経系の炎症に影響を及ぼすことは無かった。Erysipelotrichaceae科菌株が抗原特異的T細胞を活性化するメカニズムを解析した結果、本菌株は小腸においてserum amyloid A(SAA)およびIL-23発現を誘導することで、抗原特異的Th17細胞のpathogenicityを高めることが示唆された。本菌株は小腸粘膜においてバイオフィルムを形成することで上皮細胞に接着することを確認しているが、このことが上記の炎症促進反応に寄与すると予想される。一方、Erysipelotrichaceae科菌株のみが腸管に定着したモノアソシエイトマウスは、通常の腸内細菌を有するマウス(SPF)に比べ、EAEの重篤度は低い。このことは、Erysipelotrichaceae科菌株だけでなく、他の腸内細菌も複合的に中枢神経系の炎症促進に関与していると考えられる。今後更なる研究で腸内細菌-中枢神経系炎症の関係を紐解くことにより、腸内細菌をターゲットとした多発性硬化症の治療戦略を確立できると期待される。当初の予定どおり、中枢神経系炎症に関与する菌株の同定、単離培養、さらにはモノアソシエイトマウスの作製を行うことができた。また、本菌株の宿主への影響(小腸粘膜固有層におけるTh17細胞の活性化)を確認することができた。これは、平成27年度実施予定である「中枢神経系炎症に関与する菌活性成分の作用メカニズムの解明」を行うあたって、非常に重要な結果である。また、本年度の予定であった関与菌株のゲノムシーケンスを完了した。得られたシーケンスのde novoアセンブリおよびアノテーションを行ったが、complete配列を得るには至っていない。しかし、draftゲノム配列をvirulence factor databaseに対してBLASTを行い、宿主に影響を及ぼす可能性のある遺伝子群の抽出を完了している。現在、さらなる解析を行うことにより、平成27年度実施予定の遺伝子欠損株作製の準備を進めている。また、モノアソシエイトマウスの小腸内容物から菌トランスクリプトーム解析を行う予定であったが、今年度はシーケンシングデータを得るまでに留まっており、来年度に詳細な解析を行う予定である。以上のように、当初予定していた計画どおりに進展しており、来年度実施予定の実験準備も順調に行うことができた。農学今回単離した中枢神経系炎症に関与する菌株からゲノムシーケンスおよびトランスクリプトーム(RNA-seq)データをすでに取得している。

今年度はこれらのデータを詳細に解析することにより、中枢神経系炎症に関与する活性成分候補遺伝子の探索を行う。また当初の予定どおり、上記解析により短鎖脂肪酸を始めとする代謝物の関与が疑われた場合、腸管内容物のメタボローム解析を行う。現在、核磁気共鳴装置(NMR)に加えLS-MS/MSによるメタボローム解析条件を検討中であり、これらの手法を組み合わせることにより低濃度代謝物の変動も解析することを目指す。上記の解析による菌活性成分の同定を行うとともに、作用メカニズムの解析を行う。今回単離した菌株の作用機序として、小腸粘膜固有層のTh17細胞の活性化が関与することをすでに確認している。また、本作用にはserum amyloid Aを介したIL-23発現亢進が関与することを示唆するデータを得ている。これらの情報をもとに、腸内細菌によるMOG特異的Th17細胞の活性化メカニズムの解明を試みる。具体的には、単離精製した菌活性成分を無菌マウスに投与し、腸管上皮細胞のメタトランスクリプトーム解析を実施する。これにより、腸管上皮細胞からのserum amyloid A産生促進に寄与する細胞内シグナル経路を解析する。また、小腸粘膜固有層で活性化したMOG特異的Th17細胞が中枢神経系炎症促進に関与するのか、本細胞を単離精製後、adoptive transfer EAEモデルを用いて確認を行う。当初予定していた旅費を今年度は使用しなかった。招待講演(広島)では旅費等を主催者から負担して頂いた。また、一般発表を行った日本分子生物学会年会は横浜開催であったため、宿泊費等が不要となった。その他、日本免疫学会学術集会で発表予定であったが、実験の進捗の理由により今年度は発表を控えた。今年度発表予定であった日本免疫学会学術集会で発表を行う。また、日本分子生物学会年会および日本農芸化学会など、当初の予定より多くの学会発表を行う予定である。
運動器損傷に対する血管新生および組織特異的マイクロRNAによる新規治療開発

脊髄損傷モデルに対するmiR-210の投与では、損傷後早期の損傷部での血管新生が促進され、それに引き続いておこるグリオーシスも促進されて、運動機能の回復が改善した。また同モデルに対するmiR-145の投与では、運動機能が改善し、ターゲット遺伝子候補の一つであるセマフォリン3Aの発現が抑制されていた。半月板損傷モデルに対するmiR-210投与では損傷半月板にmiR-210が取り込まれ、半月板の修復が促進されていた。ラットアキレス腱損傷モデルに対するmiR-210の投与では、最終の腱の修復にコントロール群との差はなかったが、miR-210投与群では早期にアキレス腱が修復されていた。各種運動器損傷モデルに対して血管新生マイクロRNA投与実験を行い、その中で半月板損傷モデル、腱損傷モデル、脊髄損傷モデルにおいて血管新生促進作用を持つmiR-210の投与で組織修復促進効果が確認できた。半月板損傷モデルではコントロール群(無機能siRNA投与群)に比べて、miR-210投与群で局所での血管新生が促進し、半月板欠損部が早期に線維性組織にて架橋された。アキレス腱損傷モデルに対するmiR-210投与ではコントロール群に比べて、腱断裂部での瘢痕形成が少なく、良好な腱組織で修復された。脊髄損傷モデルに対するmiR-210投与では、コントロール群に比べて損傷後早期のアストログリオーシスが促進され、F4/80陽性のマクロファージが集積している面積が小さく、血管新生、軸索伸長および髄鞘形成も促進され、後肢運動機能の回復が促進された。損創部におけるmiR-210の発現は投与後7日までコントロール群に比べて有意に高く、投与したmiR-210が十分に細胞内に取り込まれている可能性があり、in situハイブリダイゼーションによる評価でもmiR-210投与群では損傷部とその周囲においてmiR-210の高発現を認めた。ターゲット遺伝子ではPTP1BやEFNA3の発現が有意に低下していた。TUNEL染色やCaspase3の発現評価から損傷部におけるアポトーシスが抑制されており、miR-210投与によるPTP1BやEFNA3の発現抑制による血管新生促進や神経保護作用が脊髄修復に促進的に働いた可能性が考えられた。各種運動器損傷モデルに対する血管新生マイクロRNAとしてmiR-210の投与を行った。昨年度までに行っていた脊髄損傷に対する投与の内容については雑誌Spineでpublishされた。半月板損傷モデルに対する投与では昨年度までの結果に加えて、損傷部へのmiR-210の取り込みが確認され、miR-210投与により局所でのI型およびII型コラーゲン、VEGF、FGF2などの発現が上昇し、損傷部での血管新生や細胞増殖が促進されることが明らかとなった。これらの結果については雑誌Arthritis Research & Therapyにpublishされた。また、アキレス腱損傷モデルに対する投与では、昨年度までの結果に加えて、miR-210投与による局所での血管新生促進効果やI型コラーゲン、VEGF、FGF2などの発現が上昇について明らかにした。これらの内容については雑誌Journal of Orthopaedic Scienceに投稿し、acceptされた。さらに組織特異性マイクロRNAとして脊髄損傷モデルに対するmiR-145の投与実験を行った。脊髄損傷後の投与時期の違いでのmiR-145の局所への取り込みや脊髄機能改善の程度の違いを検討したところ、損傷後3日以降での投与でmiR-145の取り込みが上昇することが分かり、損傷3日後の投与が最も脊髄機能を改善させた。Targetgene候補にSemaphorinやEphrinなど軸索伸長抑制因子を複数含むmiR-145の投与が脊髄損傷後の修復促進効果について検討した。前年度の研究で、脊髄損傷部へmiR-145を投与するタイミングとして、損傷後3日以降での投与でmiR-145の取り込みが上昇し、脊髄機能回復が改善されることが分かったため、本年度の研究は損傷後3日以降の投与での実験を行った。損傷後42日において経頭蓋電気刺激による後肢筋電位を測定し、振幅を評価したところ、損傷後7日の投与群において特に筋電位の振幅が高く、コントロールとの有意差を認めた。Dynamic Plantar Aesthesiometerを用いた感覚機能の評価では、損傷後3日での投与群において反応時間の延長を認めたが、他の群との有意差は認めなかった。脊髄損傷部でのmiR-145のtarget geneを明らかにするためにmiR-145投与翌日の損傷部組織で候補遺伝子についてreal-time PCRやWestern blottingによる発現レベルの評価を行った。Real-time PCRでは、Sema-3A, Sema-6A, ROCK1, Ephrin-B3, Plexin-A2, Netrin-4,GAP1, GAP2, GAP3の発現レベルの評価を行ったが、miR-145投与群とコントロール群との間に有意差は認められなかった。一方、Western blottingによる発現レベルの評価では、miR-145投与によってSema-3Aの発現が著明に抑制されていた。また脊髄損傷部におけるEphrin-B3およびSema-3Aの免疫染色を行うと、miR-145投与群ではコントロール群に比べて、これらの因子の陽性面積が小さかった。これらのことから、miR-145の投与はmRNAレベルではなく、タンパクレベルにおけるEphrin-B3およびSema-3Aの発現を抑制していると考えられた。