hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水産養殖環境における水中および土壌中のウイルス遺伝子量モニタリング法確立

昨年度の本研究において、甚大な被害を被ったIHHNV(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosisvirus)汚染も本年度に入ると落ち着き、昨年度新たに作成したMBV(Monodon Baculovirus)およびHPV(Hepatopancreatic parovirus)の各検出プライマーを用いた競合PCR条件を検討・確立した。6月より開始した集約型ウシエビ養殖2ターン(約3.5ヶ月×2)において、養殖されているウシエビ、ウシエビ養殖時に用いる海水、淡水および土壌、近隣の河川水のサンプリングを定期的に行い、現地にてDNA調製可能となるよう研究協力機関であるTOMSER., CO.LTDに依頼した。サンプル受け取りのため年度末に訪越し、現地TOMSER実験施設にてDNA抽出を行なった。また、検査機器の導入が難しい地域(南部メコンデルタ)で行なわれている粗放型ウシエビ養殖場にも赴き、集約型養殖との比較を目的としてサンプリングを行い、同様にDNA抽出し、一部PCR検出によりウイルスの存在を確認後、国内に持ち帰った。現在までのところ、これらサンプルからは対象としているエビ感染性ウイルス(WSSV : White Spot Syndromevirus, MBV, HPV, YHV : Yellow Headvirus, IHHNV)のうち新たにプライマーを設計したMBV遺伝子のみが検出された。また、ノロウイルス遺伝子も検出されており、今後、確立した競合PCR法を用いて経時的変動を追究する予定である。水産養殖環境水中のウイルスモニタリングを行うために,検査対象の拡大を試みることとし,糞便、下水・海水・淡水等の環境水および土壌の他,エビ幼生,プランクトン,植物およびバクテリアからの核酸抽出条件を検討した.サンプリングは静岡県の他,東京都および神奈川県の河川,沿岸部でも行い,環境水および土壌からの検出では,これまでに確立してしいるウイルス核酸抽出精製法の有用性が確認された.エビ幼生,プランクトンおよびバクテリアに陽性対照を混和したコントロール検体からもウイルス核酸の抽出が可能であったことから,これらも検査対象とすることとした.平成16年3月より養殖が開始されるエビ養殖池(ベトナム)においてこれらのサンプリングを開始できるよう現地において研修・指導し,経時的なサンプリングを行っている.植物については,植物細胞からの核酸抽出キットを用いてDNAおよびRNAの回収を試みたが,現在までにウイルス核酸の回収はできていない.試薬・方法を改良するなどして,引き続き検討している.HAV, WSSVおよびMBV検出を目的としたPCR法で用いるプライマーペアを対象として,1st PCRでも数コピーのウイルスDNAおよび数十コピーのウイルスRNAが検出できるPCR条件を確立した.これらについては競合DNAまたは競合RNAを作成し,競合PCRおよび競合RT-PCR条件を確立した.NVについては,ポリメラーゼ領域をターゲットとしたプライマーペアについて検討を行い,競合RT-PCR条件を確立したが,現在のNV検査はキャプシド領域をターゲットとしていることから,キャプシド領域のプライマーペアについて定性検出からあらためて検討することとし,今後競合RT-PCR条件の確立を目指す.ベトナム中部で平成16年3月より開始した集約型ウシエビ養殖1ターン(約3.5ヶ月)において、養殖されているウシエビ、ウシエビ養殖時に用いる海水、淡水および土壌、近隣の河川水のサンプリングを定期的に行い、収穫後(78月)に訪越してサンプル処理後に持ち帰る予定としていた.しかし、養殖開始4656日目を境に全ての養殖池でウシエビが壊滅したため、昨年度の指導に従って現地でDNA調製してもらい、また、周辺養殖場および親エビ購入地域付近の養殖ウシエビについても同様に処理してもらい、国内に持ち帰ってもらった。対象としているエビ感染性ウイルス(WSSV, MBV, HPV, YHV)は検出されず、河川水および養殖エビ背腸からヒト腸管感染性ウイルスが検出されただけであった。病死したエビの内臓をパラフィン包埋し、切片作成後HE染色によって検鏡したところ、肝膵に病変が認められたことから、エビ肝膵に感染するバナメイエビ感染ウイルスとして著名なTSVおよびIHHNVも検査対象とすることとし、プライマー作成、RT-PCRあるいはPCR検出条件の検討を行った。ベトナム北部・中部および南部いずれの地域で生産されたウシエビからもIHHNV遺伝子が検出され、シークエンスによってその存在が確認された。また、養殖ウシエビのみならず、ベトナム近海に生育する天然ウシエビにも感染が広がっていることを確認した。平成16年10月より17年2月にかけて同様に養殖環境中からサンプリングを行い、養殖池のIHHNV汚染が経時的に減少傾向にあることを確認した。その間のPCR検査において、偽陽性を示す頻度の高かったMBVおよびHPVプライマーについて、再度プライマー作成、PCR検出条件の検討を行った。現在、ベトナム水産養殖試験場(No.2およびNo.3)において、ベトナム国内のPCR検出条件とIHHNV検査条件についで情報交換中である。

サンプル受け取りのため年度末に訪越し、現地TOMSER実験施設にてDNA抽出を行なった。また、検査機器の導入が難しい地域(南部メコンデルタ)で行なわれている粗放型ウシエビ養殖場にも赴き、集約型養殖との比較を目的としてサンプリングを行い、同様にDNA抽出し、一部PCR検出によりウイルスの存在を確認後、国内に持ち帰った。現在までのところ、これらサンプルからは対象としているエビ感染性ウイルス(WSSV : White Spot Syndromevirus, MBV, HPV, YHV : Yellow Headvirus, IHHNV)のうち新たにプライマーを設計したMBV遺伝子のみが検出された。また、ノロウイルス遺伝子も検出されており、今後、確立した競合PCR法を用いて経時的変動を追究する予定である。
新規不斉ラジカル反応の開発研究

本年度、私はベンジルアルコールのベンジル位C-H不斉アリール化反応の検討を行った。初期段階では、水素原子移動(HAT)部位としてベンジルチオールを有する触媒を用いて種々の検討を行ったが、目的物は低収率であった。この理由として、HATが効率的に進行していないのではないかと考えた。そこで、目的物の収率向上を目指し触媒内HAT部位のスクリーニングを行った。種々のチオールおよびその誘導体を検討した結果、チオカルボン酸を用いた時、高収率で目的のビアリールメタノールを合成する事に成功した。このスクリーニングの結果から、チオカルボン酸をHAT官能基として不斉触媒に導入する事とした。続いて、選択性の向上を目的としてビナフチル骨格の3,3'位の置換基効果の確認を行った。Ph基を用いた時、立体選択性は20%eeであったのに対して、2,6-ジフェニルフェニル基などの、より嵩高い置換基を導入した場合、反応は進行しなかった。嵩高い置換基は反応場を阻害すると考えている。現在は基質・求電子剤と二次的に相互作用しうる官能基の導入することで基質、および求電子剤を捕捉する検討を行っている。一方で、ベンジルアルコールの他にベンジルアミンに対して反応の試みたところ、極めて温和な反応条件にて目的の1,1-ビアリールアミンを高収率で得る事に成功した。本反応は様々なアミン基質に対して適用可能であり、クロピドグレルやドネペジルなどの医薬品を用いた場合でも目的物を良好な収率で得る事ができている。この結果を基にアミンを有する多くの強力な生物活性化合物に対しても本反応の適用を検討する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
中皮腫における胸腔内治療法の構築及び新規バイオマーカーの探索

胸膜中皮腫を極めて難治性の疾患から治療によって予後改善が期待できる疾患にするために、有効な胸腔内局所療法の開発及び、新しい中皮腫バイオマーカーの探索を目的とした基礎実験を行った。胸腔内局所療法の実験に関しては、マウス中皮腫胸腔内及び皮下モデルを作製し、これを使用し、抗癌剤(Gemcitabine)と免疫制御抗体である抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体との併用療法による腫瘍根治モデルを作製した。また、新しいバイオマーカーの探索実験では、2種類のプロテオーム解析法を用い、20種類の候補タンパク質を同定した。現在、その有効性を検討中である。中皮腫を極めて難治性の疾患から治療によって予後改善が期待できる疾患にするために、臨床的に解決すべき命題が2つある。一つは、中皮腫に対する有効な胸腔内局所療法の構築であり、二つ目は、中皮腫(難治性の組織型である二相型、肉腫型)に対するバイオマーカーの探索である。今回の科学研究費ではこれらの問題解決のための基礎実験を計画した。本年度は、1マウス中皮腫の胸腔内モデルの作製、2ランダム免疫法及び二次元電気泳動法を用いた、中皮腫特異的タンパク質(腫瘍マーカー)の網羅的探索実験、3中皮腫臨床検体の集積を行った。マウス中皮腫の胸腔内及び皮下モデルの作製では、マウス中皮腫細胞株(AB12及びAE17)を購入し、皮下や胸腔内への移植、再培養を繰り返し、胸腔内に確実に生着する細胞株をクローニングした。結果、多様な実験に対応できるマウスでの中皮腫胸腔内、皮下モデルが完成した。ヒト中皮腫細胞株を免疫源とするランダム免疫法を用いて、網羅的に中皮腫に対する単クローン性抗体を作製した。ハイブリドーマのヒト中皮腫細胞株と中皮腫組織を用いたスクリーニングで最終的に6種類の抗体を選択した。今後は、これらの抗体の有用性を病理学的に詰めると同時に、その中でも有用と思われる抗体に関しては、認識する抗原を同定する予定である。二次元電気泳動法を用いた実験では、中皮腫の二相型と上皮型で発現量の異なるタンパク質(40種類)を選択した。現時点で9個のタンパク質名を決定した。最後に、臨床検体の集積においては、北里大学病院、横須賀共済病院、埼玉循環器呼吸器病センター、東京病院などから、現在までに、中皮腫15例(うち3例は疑いの段階)を集積しており、今後、二次元免疫ブロット法による患者血清中に存在する自己抗体の検出や上記実験で得られた腫瘍マーカー候補分子の病理組織学的、血清学的実験を行う予定である。中皮腫を極めて難治性の疾患から治療によって予後改善が期待できる疾患にするために、2つの問題を提起し、それぞれに対して基礎実験を行った。胸腔内局所療法の開発実験に関しては、2系統のマウス(BALB/c、C57BL/6J)においてこれまでに作製したマウス中皮腫胸腔内及び皮下モデルの内、皮下モデルを用いて、最終的に抗癌剤(Gemcitabine)と免疫制御抗体である抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体との併用療法(相乗効果を利用)による腫瘍根治モデルを作製した。現在、上記と同様の併用療法で、胸腔内モデルにおける腫瘍根治モデルを作製中である。今後はこれらのモデルを用いて、種々の抗癌剤、サイトカイン、免疫細胞療法の組み合わせで最も効果的な治療方法を探索する。また同時に、免疫学的及び病理学的手法を用い、腫瘍の根治及び再発に関するメカニズムの解析を行う。次に、難治性の組織型である二相型、肉腫型に対するバイオマーカーの探索実験では、まず、ヒト中皮腫細胞株を免疫源とするランダム免疫法を用いて、網羅的に中皮腫に対する単クローン性抗体を作製し、ハイブリドーマのヒト中皮腫細胞株と中皮腫組織を用いたスクリーニングを行った。最終的に6種類の抗体を選択し、ヒト中皮腫及び肺癌組織を免疫染色し抗体の特異性を検討した。結果、もっとも有望と思われる抗体に関して、中皮腫で高発現するも、肺癌でも細胞質の豊富な腫瘍細胞に低から中等度発現することが判明した。また、二次元電気泳動法を用いた実験では、ヒト中皮腫の二相型細胞株と上皮型細胞株で発現量の異なるタンパク質(40種類)を選択し、質量分析法を用いて20個を同定した。今後は、本結果を他のプロテオーム解析(並行して施行中のショットガンプロテオミックス法)の結果とも照らし合わせ、候補タンパク質を絞り、その有効性を検討する予定である。呼吸器外科胸腔内局所療法の開発実験では、生後68週のメスBALB/c及びC57BL/6Jのマウスにおいて、マウス中皮腫細胞株(AB12及びAE17)を用いたマウス中皮腫胸腔内及び皮下モデルを完成させた。

次の段階として、現在、ヒト非小細胞肺癌、悪性黒色腫,腎癌などで抗腫瘍効果が認められ注目されている免疫抑制性T細胞の作用を抑える抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体を用いた免疫療法の実験に、これらのマウスモデルが使えるかどうかを検討中である。ランダム免疫法を用いた中皮腫に対する網羅的な単クローン性抗体の作製では、ハイブリドーマのヒト中皮腫細胞株を用いたスクリーニング過程で20種類の候補抗体にしぼり、その後ヒト中皮腫組織を用いたスクリーニングで最終的に6種類の抗体を選択した。今後は、これらの抗体の有用性を病理学的に詰めると同時に、その中でも有用と思われる抗体に関しては、認識する抗原を同定する予定である。二次元電気泳動法を用い、中皮腫の二相型と上皮型で発現の異なるタンパク質を探索する実験では、両者で発現に差のある40個のタンパク質Spotを選択し、そのうち9個は分子の同定が完了した。残りのSpotも同様に切り出し、質量分析を行い、タンパク質名を決定する予定である。中皮腫臨床検体の集積に関しては、4施設より1年間で中皮腫15例(疑いも含む)の中皮腫組織や血液を集積した。今後も症例集積を継続する予定であり、概ね実験計画通りに進んでいる。2系統のマウスで中皮腫胸腔内及び皮下モデルを作製したため、今後はこのモデルを用いて胸腔内治療実験を行う予定である。具体的には、免疫制御抗体療法(抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体など)、NKT細胞療法、免疫細胞療法、サイトカイン療法(IL-2など)、抗癌剤及びこれらの組み合わせである。現在、皮下モデルにおいて、免疫系を活性化すると考えられる抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体投与に対する腫瘍の反応を観察している。また、作製した単クローン性抗体による治療の可能性も考慮する。ランダム免疫法を用いた中皮腫に対する網羅的な単クローン抗体の作製では、選択した6種類の抗体に関して、これらの抗体の有用性を病理学的に詰めると同時に、その中でも有用と思われる抗体に関しては、認識する抗原を同定する予定である。二次元電気泳動法を用いた中皮腫の二相型と上皮型で発現の異なるタンパク質探索実験では、発現に差のある残り31個のタンパク質Spotを質量分析で同定する予定である。さらに、中皮腫組織型特異的タンパク質探索プロジェクトの一つとして、中皮腫患者血清中に存在する自己抗体の二次元免疫ブロット法による検出を開始する予定である。中皮腫臨床検体(中皮腫組織や血液)の集積に関しては、4施設より1年間で中皮腫15例(疑いも含む)を集積した。今後も集積を継続する予定である。初年度に購入予定であった胸腔内免疫治療実験用の各種抗体の購入が遅れたため。次年度(H26年度)は、初年度に続きさらに研究を進め、1マウス中皮腫胸腔内モデルを用いた種々の治療実験、2ランダム免疫法を用いた中皮腫に対する単クローン性抗体の同定、3二次元電気泳動法を用いた組織型特異的タンパク質の探索、4二次元免疫ブロット法による自己抗体の検出を開始する予定である。そのために、各種抗体やサイトカインの購入費用、タンパク同定実験にかかわる費用(Western blot法、免疫沈降法、その他)及び、各実験に必要な各種試薬費用(二次元電気泳動法、二次元免疫ブロット法、その他)などが必要である。
虚血性心不全の増悪および死亡リスク予測に有用なマイクロRNAの探索

世界に先駆けて超高齢化社会に突入した我が国に於いては近年、虚血性心不全患者が急増し、医療経済を圧迫している。本研究ではこのように現在社会問題となっている虚血性心不全症例の生活の質と生命予後改善のため、虚血性心不全の予後予測に有用なマイクロRNAの同定とその作用機序の解明を通じて治療への応用を検討した。具体的には虚血性心不全症例の血清を用い、種々の病態において遺伝子発現制御に関与することが明らかになり、また近年バイオマーカーとしても注目を集めている非コードRNAであるマイクロRNAの網羅的解析を行い、虚血性心不全症例の心不全増悪・および死亡リスク予測に有用なマイクロRNAを同定を試みた。第二次東北慢性心不全登録研究では先行の第一次東北慢性心不全登録研究の結果と比較して、近年我が国では虚血性心不全の増加が顕著であり、超高齢社会を迎えた我が国における心不全パンデミック対策として虚血性心不全の予防と治療が重要になっている。今回の研究により、その解決の糸口を見出すべく研究を行っている。さて本研究は研究計画に則り、研究は概ね順調に進行している。具体的には研究実施計画書が東北大学大学院医学系研究科倫理委員会により承認され、症例登録も順調に進み、解析も開始している。まず第二次東北慢性心不全登録研究における凍結保存血清を用いたマイクロRNAを用いた検討ではマイクロRNAのマイクロアレイを完了し、解析を進めている。現在虚血性心不全に特異的なマイクロRNAの同定に向けた多くの部分集団解析を行っており、今後各症例の臨床データ、具体的には身体所見、診察所見、血液データ、心エコーに基づく各種データ、画像データを考慮しつつ、3年間の経過観察中の心不全の増悪、心草履モデリングの進行、血液中のNTproBNP値の変化・推移と関連のあるマイクロRNAの同定を行っている。また東北大学病院に入院し、心臓カテーテル検査を受ける虚血性心不全症例に関しても症例登録を進めており、冠循環の入り口である大動脈起始部とその出口である冠静脈洞、そして大体静脈から血漿を採取し、マイクロRNAそしてメタボロームの網羅的解析に向けたサンプルのストックを行っている。研究計画に則り、研究は概ね順調に進行している。第二次東北慢性心不全登録研究における凍結保存血清を用いたマイクロRNA解析はほぼ完了しており、現在は冠循環におけるマイクロRNA解析、メタボローム解析の進行を研究の中心としている。慢性心不全症例において症例背景を完全にマッチさせた心不全増悪イベント発症群10例と非発症群10例を抽出し、約700のマイクロRNAを搭載したマイクロアレイを用いての網羅的解析を行った。検定としてはWelch's t-testとWilcoxon rank sum test(ノンパラメトリック検定)を用いた二標本検定を行った(心不全発症群vs非発症群)。また各Probeごとに、心不全発症群vs非発症群の検定を行い、性別、年齢65歳以上、虚血性心疾患、心筋症、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、の共変量の有無によるサブグループごとに、二標本検定を行った。また、Two-wayANOVAとして心不全増悪イベント発症群と非発症群の2群と上記の共変量を用いた二元配置分散分析を行い、交互作用項を持った二元配置分散分析と交互作用項が有意でない場合に限り、交互作用項を持たない二元配置分散解析を行った。二標本検定の結果、データ全体に対してグループ間で有意差のあるProbeは存在しなかった。サブグループ解析の結果、有意差のあったProbeと共変量の組み合わせを10通り検出した。しかしながらTwo-wayANOVAにおいて主効果あるいは交互作用項が有意となった場合の、発現量をboxplotを用いて表し、イベントの有無と共変量の有無により、以下の4通りに場合分消して検討した結果、虚血性心不全、あるいはその他の基礎疾患に基づく心不全の診断、増悪イベント予測に有用なマイクロRNAは現時点では見いだせなかった。マイクロRNAの網羅的解析により、虚血性心不全に特徴的な挙動を示すマイクロRNAの絞り込みに難渋しているため。本研究ではこのように現在社会問題となっている虚血性心不全症例の生活の質と生命予後改善のため、虚血性心不全の予後予測に有用なマイクロRNAを同定し、その作用機序の解明を通じて治療への応用を検討した。具体的には虚血性心不全症例の血清を用い、種々の病態において遺伝子発現制御に関与することが明らかになり、また近年バイオマーカーとしても注目を集めている非コードRNAであるマイクロRNAの網羅的解析を行い、虚血性心不全症例の心不全増悪・および死亡リスク予測に有用なマイクロRNAを同定し、心不全症例の治療・予後改善に役立てることを目的とした。本研究では第二次東北慢性心不全登録研究(CHART-2)研究に登録された慢性心不全およびそのハイリスク症例を対象にその凍結保存血清を用いてマイクロRNAの網羅的解析を行い、虚血性心不全に特異的なマイクロRNAを複数同定した。現在本研究計画に則った内容をさらに発展させるべく、現在その増加がわが国で顕著である、左室駆出率の保持された虚血性心不全の病態解明と予後予測マーカーの開発に向けて、同定したマイクロRNAの機能解析を行うともに、メタボローム解析結果と合わせた統合解析を行っている。また冠循環におけるマイクロRNAに関しても同じくメタボローム解析結果と合わせた統合解析を行っている。

世界に先駆けて超高齢化社会に突入した我が国に於いては近年、虚血性心不全患者が急増し、医療経済を圧迫している。本研究ではこのように現在社会問題となっている虚血性心不全症例の生活の質と生命予後改善のため、虚血性心不全の予後予測に有用なマイクロRNAの同定とその作用機序の解明を通じて治療への応用を検討した。具体的には虚血性心不全症例の血清を用い、種々の病態において遺伝子発現制御に関与することが明らかになり、また近年バイオマーカーとしても注目を集めている非コードRNAであるマイクロRNAの網羅的解析を行い、虚血性心不全症例の心不全増悪・および死亡リスク予測に有用なマイクロRNAを同定を試みた。研究計画書の通り。現在行っているマイクロRNAアレイの解析を進め、冠循環におけるマイクロRNA解析、メタボライト解析に向けたサンプルのストックを継続し、研究を進める。網羅的解析に用いるサンプルを変えて検討を行う。同時に、マイクロRNAによる網羅的解析以外の手法を検討する。循環器内科自身の学会出張に係る経費を削減することができたため。研究代表者および研究協力者の海外学会への参加を予定していたが、研究協力者のみが参加することとなり、当初予定していたよりも旅費を削減することができたため。平成28年度は、国内および海外学会への参加を計画しており、平成27年度分と併せて執行する。国内および海外学会へ積極的に参加して研究発表を行う予定であり、繰り越し分と併せて執行をする。
海藻アラメからエタノールと食品機能成分を生産する新技術開発と海藻産業への応用研究

褐藻類からエタノール生産とポリフェノールであるフロロタンニンの分離、応用を組み合わせた海藻利用技術を開発し、海藻を使った新産業の育成に貢献することを目的として、褐藻類の効率的な糖化条件、アメフラシ消化液に存在するフロロタンニン結合タンパク質、EHEPの性質、アメフラシセルラーゼの作用機構、フロロタンニンの生理作用について検討した。特に、GHF45に属する21kDaセルラーゼの作用機構について解析し、本酵素がセロビオハドロラーゼと同様にセルロース繊維に強固に結合し、セロビオースを遊離すること、他のbeta1,4-エンドグルカナーゼと強いシナジー効果を示し、アメフラシ消化液のセルロース分解システムにおいて非常に重要な酵素であることを証明した。さらに、廃棄物であるワカメ茎、メカブの有効利用を開発するため、海藻糖化のための前処理方法、アミエビ酵素の利用について検討し、アミエビ抽出液の併用によって、産業用セルラーゼの必要量を20分の1に減少させ、コストダウンできる方法を開発した。EHEPとフロロタンニンの作用機構は、EHEPの結晶構造解析とEHEP変異体の機能解析により分子レベルで明らかにした。EHEPの108番目のアスパラギン残基がフロロタンニンの結合に最も重要であることが判明した。また、フロロタンニンとEHEPの結合は弱酸性が至適pHであるが、pH7.5以上ではフロロタンニンが遊離し、EHEPとフロロタンニンの結合は可逆反応であることがわかった。フロロタンニンは培養小腸上皮細胞と反応させると、特にシグナル伝達を制御する遺伝子の発現が変動することが、マイクロアレイ法によって証明された。以上の結果より、アラメ等の褐藻類に含まれるフロロタンニンは、有用な食品機能成分として活用できる可能性が示された。本研究の目的は、褐藻類からエタノール生産とポリフェノールであるフロロタンニンの分離、応用を組み合わせた、海藻利用技術を開発し、海藻を使った新産業の育成に貢献することである。平成29年度の計画は、1アメフラシ110kDa BGL、EHEPの大量発現系の構築、2アミエビ由来糖化酵素の開発により、効率的な褐藻類の糖化機構を開発すること、さらに、褐藻類に含まれる機能成分であるフロロタンニンと特異的に結合するアメフラシフロロタンニン結合タンパク質(EHEP)の応用を図るための3EHEPのフロロタンニン結合機構の解析である。平成29年度は、計画に従って以下の研究を進めた。アメフラシ110K BGL, EHEPの大量発現系の構築については、110K-BGLは酵母による発現、EHEPは糖鎖を含まないので大腸菌による発現を試みた。110K BGLは酵母による発現には成功しなかった。EHEPは、GST融合タンパク質として超音波処理した大腸菌の不溶性画分に回収されたが、8M尿素液で可溶化後、透析操作で徐々に尿素濃度を下げることにより、最終的に活性のあるEHEPを得ることができた。また、アメフラシ消化液に含まれる21Kセルラーゼのセルロースのセロビオハドロラーゼ非依存性のセルロース分解機構における役割について明らかにした。アミエビ由来糖化酵素に関しては、酸処理したアミエビ抽出液をメイセラーゼ(トリコデルマ由来セルラーゼカクテル)と併用することにより、ワカメめかぶの効率的な糖化反応条件の検討を行った。アラメ等褐藻類に含まれる海藻ポリフェノールを容易に褐藻類から分離し、機能成分として利用できるように、EHEPとフロロタンニンとの結合解離機構について解析した。さらに、EHEPの結晶構造解析より予想されたフロロタンニン結合部位の変異体を大腸菌発現系で作成し、結合様式について解析した。EHEPの大腸菌発現系を以下に示すように構築した。EHEPをGST融合タンパク質として発現させ、超音波処理後、融合タンパク質を封入体として回収し、8M尿素液で可溶化した。次に6M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0Mの尿素液で透析し、徐々に尿素濃度を下げることにより水溶性のEHEPを得た。このEHEPは、野生型EHEPと同様にフロロタンニンによるBGLの阻害を抑制した。21Kセルラーゼはアメフラシ消化液中で最も濃度(0.1mg/ml)が高いが、カルボキシメチルセルロースに対する活性は他のセルラーゼに比べ非常に低く(約50分の1)、そのセルロース分解における役割は不明であった。今回、21Kセルラーゼは、セルロースに強固に安定的に結合し、エンドグリコシダーゼ活性に加えて、セロビオースやセロトリオースを遊離するエキソグリコシダーゼ活性を有することを明らかにした(第69回日本生物工学会大会発表2017年9月)。セルロース系バイオマスの利用における最も解決すべき問題は、セルラーゼコストが高すぎることにある。安価なアミエビの粗抽出液を市販セルラーゼ(トリコデルマ由来メイセラーゼ)と併用することにより、未利用の海藻資源であるワカメ茎やワカメめかぶの糖化反応を効率化し、セルラーゼコストを下げる方法を開発した。EHEPはフロロタンニンと特異的に結合し、不溶性の沈殿を形成する。この沈殿物からフロロタンニンを回収する方法について検討したところ、沈殿物をpH8.0以上の緩衝液で懸濁し反応すると、沈殿物は可溶化しEHEP/フロロタンニン複合体が解離することを見出した。

北海道大学との共同研究によって明らかにしたEHEPの立体構造から推定されるフロロタンニンとの結合に重要なアミノ酸残基の変異体を大腸菌で作成し、変異体の活性から、結合に重要なアミノ酸残基を明らかにした。褐藻類からエタノール生産とポリフェノールであるフロロタンニンの分離、応用を組み合わせた海藻利用技術を開発し、海藻を使った新産業の育成に貢献することを目的として、褐藻類の効率的な糖化条件、アメフラシ消化液に存在するフロロタンニン結合タンパク質、EHEPの性質、アメフラシセルラーゼの作用機構、フロロタンニンの生理作用について検討した。特に、GHF45に属する21kDaセルラーゼの作用機構について解析し、本酵素がセロビオハドロラーゼと同様にセルロース繊維に強固に結合し、セロビオースを遊離すること、他のbeta1,4-エンドグルカナーゼと強いシナジー効果を示し、アメフラシ消化液のセルロース分解システムにおいて非常に重要な酵素であることを証明した。さらに、廃棄物であるワカメ茎、メカブの有効利用を開発するため、海藻糖化のための前処理方法、アミエビ酵素の利用について検討し、アミエビ抽出液の併用によって、産業用セルラーゼの必要量を20分の1に減少させ、コストダウンできる方法を開発した。EHEPとフロロタンニンの作用機構は、EHEPの結晶構造解析とEHEP変異体の機能解析により分子レベルで明らかにした。EHEPの108番目のアスパラギン残基がフロロタンニンの結合に最も重要であることが判明した。また、フロロタンニンとEHEPの結合は弱酸性が至適pHであるが、pH7.5以上ではフロロタンニンが遊離し、EHEPとフロロタンニンの結合は可逆反応であることがわかった。フロロタンニンは培養小腸上皮細胞と反応させると、特にシグナル伝達を制御する遺伝子の発現が変動することが、マイクロアレイ法によって証明された。以上の結果より、アラメ等の褐藻類に含まれるフロロタンニンは、有用な食品機能成分として活用できる可能性が示された。未利用の褐藻類としてワカメメカブの糖化条件を検討し、メカブを水洗、酢酸処理と熱処理を行い、メイセラーゼ(トリコデルマ由来セルラーゼカクテル)とアミエビ抽出液を併用することで、メイセラーゼ単独で行った場合の必要量を10分の1以下に減らせることが判明したので、今後は長期保存可能で安価なアミエビセルラーゼ標品の調整法について検討を進め、さらに糖化液を発酵させ、エタノールや香気成分の分析を行う予定である。具体的には、アミエビ抽出液を熱処理、酸処理、バッチ法によるイオン交換ゲルによる精製を組み合わせ、セルラーゼ標品を作成する。フロロタンニンに関しては、不溶性のEHEP/フロロタンニン複合体がpH8.0以上で解離し、フロロタンニンを遊離することが判明したが、この結果は、EHEPで濃縮沈殿させたフロロタンニン複合体を摂取すると、十二指腸以降、消化液が弱塩性になるとフロロタンニンが遊離され、細胞から吸収され、機能を発現することを示唆し、EHEPは海藻中の有用なフロロタンニンのキャリアとして使える可能性が高い。植物ポリフェノールについては、各種培養細胞を用いた生理活性測定が行われているので、アラメ、カジメのフロロタンニンについても、抗肥満活性や抗炎症活性の測定や他の生理作用について検討する。新たな作用を発見するために、フロロタンニンで処理した培養細胞のトランスクリプトーム、プロテオーム解析も行い、細胞内情報伝達ネットワークに及ぼす影響についても解析する予定である。また、ワカメメカブに含まれるフロロタンニンを探索し、健康食品として有効利用するための手がかりとする。
配位性官能基導入による高機能性不斉有機分子触媒の創製研究

近年、環境にやさしい不斉合成触媒として有機分子触媒が注目を集めている。しかしながら、既存の不斉有機分子触媒では達成できない不斉合成反応も数多く存在し、新機能を付与した触媒分子の設計・開発が望まれている。今回、信頼性の高いいくつかの不斉触媒骨格に対し配位性置換基を導入した新規不斉有機分子触媒を開発し、これまでに達成困難であった不斉合成反応の克服を目指した。昨年度の研究において、キナ属の樹脂から単離でき、比較的安価かつ大量に入手可能なキナアルカロイド骨格にヘテロアレーンスルホニル基を導入した新規高機能不斉触媒を設計・合成した。本触媒の機能性を確認するために、ケチミンへのヒドロペルオキシドの不斉求核付加反応を検討した。このようなイミン類へのヒドロペルオキシド分子の付加反応は、生理活性物質として有用な光学活性なα-アミノペルオキシド類を与えるため、非常に重要な合成反応であるものの、ケチミン類に対する反応はこれまでに全く報告されていなかった。そこで、イサチンから誘導されるケチミンに対し、ヒドロペルオキシドの付加反応を検討したところ、高立体選択的に生成物が得られることが明らかとなった。また、これまでにほとんど検討例のないα,β-不飽和エステル類へのマロン酸ハーフチオエステル(MAHT)の脱炭酸型共役反応の検討を行った。クマリン-3-カルボン酸とMAHTの反応において、反応条件を種々検討したところ、キニンから誘導したシンコナアルカロイドアミンに8-キノリンスルホニル基を導入したアミド型触媒を用いることで、高立体選択的に脱炭酸型共役付加反応が進行することが明らかとなった。さらに、イミダゾリン部位をキラルリン酸部位を適切な位置に組み込んだ不斉触媒の設計・合成を行い、3H-インドール-3-オン類へのピロールの不斉Friedel-Crafts型反応を検討したところ、高い立体選択性で目的生成物を得ることに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。光学活性化合物の効率的合成手法の確立および環境にやさしい合成技術の開発は重要な研究であり、問題解決を目指した新規不斉触媒の創製が強く求められている。このような背景のもと、申請者は新規の立体制御型活性化基の開発、また、その立体制御型活性化基を触媒分子に組み込むことによる不斉有機分子触媒の高機能化を目指した。まず、我々の研究室で以前から開発を行っている配位性官能基を有するシンコナアルカロイド触媒を用い、これまでに成功例のないケトン由来のイミンへのイソシアニドの付加-環化反応によるイミダゾリン形成反応を検討した。触媒そのものの活性は低かったものの、ピリジンカルボニル基を有する触媒に金属塩を添加することで、高度の立体制御を可能にしつつ、高収率で生成物を得ることに成功した。また、本反応はイソシアニドに置換基を導入し、連続四置換不斉炭素を構築する手法へも展開可能であった。さらに、本触媒群を用い、これまで全く検討例のなかったケチミン類へのチオールの付加反応を検討したところ、この場合は、ヘテロアレーンスルホニル基を導入したシンコナアルカロイド触媒が効果的に機能し、高収率・高立体選択的に生成物を与えた。本手法をヒドロペルオキシドの付加反応に適用した所、高立体選択的に生成物を与えることも確認できている。さらに、ほとんど成功例のないサッカリン由来のケチミン類への脱炭酸型マンニッヒ反応の開発にも成功した。また、現在、いくつかの新規の配位性官能基を有する不斉触媒の合成にも成功しており、これまでに達成できなかった不斉合成反応に関して、検討を行っている。

さらに、イミダゾリン部位をキラルリン酸部位を適切な位置に組み込んだ不斉触媒の設計・合成を行い、3H-インドール-3-オン類へのピロールの不斉Friedel-Crafts型反応を検討したところ、高い立体選択性で目的生成物を得ることに成功した。当初の実験計画では、新規不斉触媒の設計と合成、および1,2の困難な不斉合成手法を可能にすることを目指していたが、研究実績に示したようにこれまでに成功例のない合成手法3つを達成した。このように、研究実施計画にあった不斉触媒・合成手法の開発において、一定以上のレベルの成果が上げられたといえる27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,高機能性を有する新規不斉触媒を用い、未だ効率的合成法の確立が為されていない不斉合成反応を中心に検討し、三成分連結型反応、四置換不斉炭素を有する化合物の合成を試みる。高効率な合成手法の開発することで、簡便な生理活性物質合成が達成可能であると期待できる。また、分子軌道計算を用いる不斉触媒設計も平行して検討する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ミスマッチ修復がクロマチン複製と協調して機能する機構の解析

ミスマッチ修復はDNA合成エラーを複製後修復する機構であり、遺伝情報維持・突然変異抑制・発がん抑制に必須の機能を持つ。ミスマッチの修復には、誤った情報を含む新生鎖の識別が必須であり、この過程にはDNA複製との密接な協調が必要であると予想される。加えて真核生物のミスマッチ修復はクロマチン上で機能するはずである。ところが、ミスマッチ修復がどのような機構でDNA複製と協調し、どのような機構を介してクロマチン上で機能するかは、いまだよく理解されていない。そこで本研究では、ミスマッチ修復がクロマチン複製とどのように協調して機能するかを解析した。我々はこれまで、DNA合成因子であるPCNAが新生DNA鎖のシグナルとして機能することを、試験管内再構成系を用いて証明してきた。本年度はミスマッチ修復因子とPCNAの相互作用を解析し、ミスマッチ塩基周辺において、ミスマッチ修復因子がPCNAのDNAからの解離ステップを制御することを予想外に発見した。さらに、先年度までに同定したクロマチンリモデリング因子、ヒストンシャペロン因子の機能解析を進め、ミスマッチ修復への寄与と、ミスマッチ塩基存在下でのクロマチン動態制御への寄与を明らかにした。加えて出芽酵母を用いた実験系を立ち上げ、クロマチンリモデリング因子が突然変異抑制に機能することを示唆する結果を得た。これらの結果は、DNA複製とミスマッチ修復がPCNAを介して協調していること、および複製フォーク直後のクロマチン動態制御がミスマッチ修復に重要であることを示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。ミスマッチの修復には、誤った情報を含む新生鎖の識別が必須であり、この過程はDNA複製との密接な協調が必要であると予想される。これまでの研究から、ミスマッチ塩基はMutS複合体により認識され、MutL複合体が新生DNA鎖を切断すると考えられている。本研究者は、DNA合成因子であるPCNAが新生DNA鎖のシグナルとして機能しうることを試験管内再構成系を用いて示してきた。本年度はこれを発展させ、ミスマッチ修復因子がPCNAを介して新生DNA鎖の識別を行うメカニズムの解析を行った。ツメガエル卵抽出液において、MutSαのPCNA結合モチーフはミスマッチ修復に部分的に必要であり、一方でMutLαエンドヌクレアーゼのPCNA結合モチーフはミスマッチ修復に必須であった。興味深いことにMutSαの存在下では、MutSが存在しない場合と比較し、新生DNA鎖の識別活性が長時間残存することを見出した。この識別活性の残存は、MutSαとPCNAとの相互作用によるものと推定される。本年度はこれに加え、MutSαに依存してミスマッチ塩基周辺に呼び込まれる因子を探索し、いくつかのクロマチンリモデリング因子、ヒストンシャペロン因子を同定した。これらの機能解析を進め、一部のものについてはミスマッチ修復に関与することを示す結果を得た。次年度には解析をさらに進め、クロマチン上でミスマッチ修復が機能するのに必要な反応と因子を解析する予定である。新生鎖の探索・識別機構、およびクロマチン上でのミスマッチ修復反応の解析共に新しい知見が得られ、順調に理解が進んでいる。おおむね計画通りの進展と考える。次年度は本年度の結果をもとに、より詳細な分子機構の解明に向けた解析を行う。また次年度は計画最終年度であるので、論文投稿に向け結果の取りまとめを進める。
新規ナノキャリアを用いた次世代インフルエンザユニバーサルワクチンの開発

次世代インフルエンザユニバーサルワクチンの新規ナノキャリアを開発するために、すべての亜型インフルエンザウイルスに共通するCTLエピトープを導入した組換えSV40ウイルス様粒子(SV40-VLP)を作製した。これは、アジュバントを加えなくても、マウスに効率よくインフルエンザウイルス特異的CTLを誘導した。また、それで免疫後、亜型の異なる2種類のインフルエンザウイルスを感染させても、ウイルスの増殖を有意に抑制することが明らかになった。これらの結果は、SV40-VLPが、副作用を伴うアジュバントを加えなくても有効であることを示したものであり、たいへん意義があると考えられる。昨年度(平成23年度)は、まず、ワクチンのナノキャリアとして実験に使用する組換えSV40ウイルス様粒子(SV40-VLP)を作製した。具体的には、すべてのインフルエンザウイルスの亜型や株に、共通に存在するウイルス内部抗原M1タンパク質由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープであるM1 58-66を、SV40-VLPの表面上のHIループまたは、DEループに導入した(SV40-VLP-M1-58-66)。それを、HLA-A2トランスジェニックマウスに投与し、アジュバントを加えなくてもSV40-VLP-M1-58-66単独で、効率よくマウスにインフルエンザウイルス特異的CTLを誘導できることを、さまざまな検出系で証明した。当該年度(平成24年度)では、昨年度の研究結果を基にして、SV40-VLP-M1-58-66で、HLA-A2トランスジェニックマウスを免疫し、インフルエンザウイルス特異的CTLを誘導させた後、インフルエンザウイルスを感染させて、肺におけるウイルス量を測定し、ウイルスに対する防御効果を検討した。その結果、インフルエンザウイルスの増殖を有意に抑制する事が明らかになった。この結果は、SV40-VLPがインフルエンザワクチンの新規キャリアになりうること、また、副作用を伴う人工アジュバントを加えなくても有効であることを示した重要な結果である。従って、新規インフルエンザワクチンの開発という本研究の主目的の達成に近づく大きな進歩であり、たいへん意義があると思われる。平成23年度は、組換えSV40ウイルス様粒子(SV40-VLP)を作製した。具体的には、すべてのインフルエンザウイルスの亜型や株に共通に存在するウイルス内部抗原M1タンパク質由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープであるM1 58-66を、SV40-VLP表面上のHIループまたはDEループに導入した(SV40-VLP-M1-58-66)。それを、HLA-A2トランスジェニックマウスに投与し、アジュバントを加えなくてもSV40-VLP-M1-58-66単独で、効率よくマウスにインフルエンザウイルス特異的CTLが誘導できることを、さまざまな検出系で証明した。平成24年度は、SV40-VLP-M1-58-66でマウスを免疫し、インフルエンザウイルス特異的CTLを誘導させた後、インフルエンザウイルスを感染させて肺におけるウイルス量を測定し、ウイルスに対する防御効果を検討した。最終年度では、インフルエンザウイルスによるウイルスチャレンジ実験を広範に行った。具体的には、SV40-VLP-M1-58-66で免疫したマウスに、インフルエンザウイルスを感染させ、ウイルスの増殖が抑えられて病状が改善されることを明らかにした。さらに、今まで1種類の亜型ウイルスしか実験に使用していなかったが、他の亜型ウイルスでもウイルス増殖抑制効果があることを示し、SV40-VLPワクチンが複数の亜型にユニバーサルな防御効果があることを示した。これらの結果は、SV40-VLPがワクチンの新規キャリアになりうること、また、副作用を伴うアジュバントを加えなくても有効であることを示した重要な結果である。従って、新規インフルエンザワクチンの開発という主目的の達成に近づく大きな進歩であり、たいへん意義があると思われる。当該(平成23)年度では、まず、ワクチンのナノキャリアとして実験に使用する組換えSV40ウイルス様粒子(SV40-VLP)を作製した。すなわち、ウイルス内部抗原M1タンパク質由来で、すべてのインフルエンザウイルスの亜型、株において共通に存在するHLA-A2拘束性CTLエピトープであるM1 58-66を、SV40ウイルス様粒子(SV40-VLP)の表面に導入した(SV40-VLP-M1-58-66)。そして、SV40-VLP-M1-58-66によってM1 58-66エピトープが細胞内に導入され、その細胞がCTLによって認識されることを、in vitroの実験系で明らかにした。

さらに、作製したSV40-VLP-M1-58-66を、腹腔投与、静脈投与、経鼻投与、筋肉投与、皮下投与など、さまざまな投与ルートでHLA-A2トランスジェニックマウスに投与して免疫した。それらのマウスから脾臓リンパ球を調整し、抗原特異的に誘導されるIFN-gamma陽性及びCD8陽性CTL数をフローサイトメトリーで測定した。さらに、マウスに誘導されたCTLのkilling活性を、in vivo CTL assayと51Cr release assayで測定した。その結果、すべて強い陽性を示し、アジュバントを加えなくてもSV40-VLP-M1-58-66単独で、効率よくマウスにインフルエンザウイルス特異的CTLを誘導できることが証明された。この結果は、本研究遂行の骨格となる重要な結果である。また、SV40-VLPが、有効なインフルエンザワクチンの新規ナノキャリアとなりうる可能性を示唆したのでたいへん意義があると思われる。当初の計画では、平成24年度までに、実験に使用するCTLエピトープを導入したSV40-VLPを作製し、それを使ってHLA-A2トランスジェニックマウスに免疫して、インフルエンザウイルス特異的CTLを誘導させる計画であった。インフルエンザウイルスの亜型、株に共通に存在するウイルス内部抗原M1タンパク質由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープは、問題無くSV40-VLPの表面に導入できた。その際、表面のHIループに導入したものとDEループに導入したもの2種類を作製したが、両方とも効率よくインフルエンザウイルス特異的CTLを誘導することができた。これらの実験が予想以上にスムーズに進んだため、平成25年度に行う予定であったインフルエンザウイルスによるチャレンジ実験を行った。その結果、免疫時にアジュバントを加えなくても、SV40-VLPキャリアだけで効率よくマウスにインフルエンザ特異的CTLを誘導することができ、さらに免疫誘導後、チャレンジしたインフルエンザウイルスの増殖を有意に抑制するという好結果を得た。また、昨年度に本研究に関する国内特許出願を行ったが、本年度では、国際特許出願も行った。さらに、SV40-VLPのワクチンへの応用に関して英文総説(Expert Review of Vaccines、査読有り)を執筆した。以上のように、今のところ、当初の計画以上に進展しており、現在までの達成度は高い自己評価となった。当初の計画では、平成23年度において、実験に使用するCTLエピトープを導入したSV40-VLPを作製し、それを使ってin vitroの実験を行う事であった。インフルエンザウイルスの亜型、株に共通に存在するウイルス内部抗原M1タンパク質由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープは、特に問題なくSV40-VLPの表面に導入できた。その際、表面のHIループに導入したものとDEループに導入したもの2種類を作製したが、CTL誘導効率に大差はなかった。
アズレンの特性を有する芳香族多環式構造の構築とその物性研究

本研究では、塩化白金触媒による芳香族環変換反応を基軸としたらせん形のアズレン縮環型ヘリセン類(AZH)を創製し、その物理化学的諸性質の解明と有機薄膜太陽電池としての応用研究を行った。具体的な研究項目としては、1)置換アズレン誘導体の効率的合成法の開発、2)AZH誘導体の合成とその物性評価、および3)アズレンの電子受容体材料としての応用研究の3つである。本研究では、塩化白金触媒による芳香族環変換反応を基軸としたアズレンノヘリセン類を創製し、その物理化学的諸性質の解明と新規材料としての応用研究を目指す。計画している研究項目は、1アズレン縮環系ヘリセン化合物の効率的合成法の開発、2アズレノヘリセン誘導体の合成とその物性評価、および3アズレンの電子受容体材料としての応用研究の3つである。本年度は研究項目1を中心に実施した。塩化(II)白金を触媒とするアズレノヘリセン形成反応に用いる基質は、合成に多段階を要するため、短工程で合成可能なモデル基質(ヘリセン用構造は与えない)を設計・合成し、触媒条件の最適化の検討を行った。その結果、白金触媒としてPtCl2またはツァイゼ塩[{(η2-C2H4)PtCl2}2]に対し電子欠損型配位子を組み合わせることで、環化異性化反応が円滑に進行する条件を見出した。特に、PtCl2と電子欠損型含フッ素配位子の組み合わせ条件下、1-(1-エン-3-イン)-2,6-ジアルキルベンゼン誘導体を、対応する置換アズレン体に高収率(85-99%)で変換させることに成功した。また、本反応機構を計算化学(DFT計算)を用いて詳細に解析した結果、電子欠損型含フッ素ホスフィン配位子が触媒サイクルの効率化に極めて重要であることも明らかにした。本研究では、塩化白金触媒による炭素骨格変換反応を基軸としたアズレン縮環系ヘリセン(AZH)類を創製し、その物理化学的諸性質の解明と新規材料としの応用研究を目指す。計画としている研究項目は、1アズレン縮環化合物の効率的合成法の開発、2AZH誘導体の合成とその物性評価、および3AZH誘導体の電子受容体材料としての応用研究の3つである。H25年度は項目1の研究として塩化白金触媒(PtCl2)に電子欠損型含フッ素配位子(P(C6F5))を組み合わせることで置換アズレン誘導体を高収率で合成する手法を開発することに成功した(合成法1)。この成果はH26年度にアメリカ化学会誌に報告した(Org. Lett. 2014, 16, 4662-4665.)。更に、その後の研究で配位子を共存させない場合でも、親電子剤共存下、ツァイゼ塩[{(η2-C2H4)PtCl2]を触媒として用いることで、置換アズレン誘導体を合成する手法の開発にも成功した(投稿準備中、合成法2)。続いて項目2の研究として、項目1の合成技術を活用してAZH誘導体の合成を検討した。その結果、合成法2を適用することで、内部置換型[5]ヘリセン(10%)よりも優先的にアズレノヘリセン(64%)を合成することに成功した。又、研究計画書に記載したAZH二量体であるAZH-5に関しては、二段階の一電子移動を示すユニークならせん状機能分子であることをサイクリックボルタンメトリー解析およびX線結晶構造解析により明らかにした(Molbank 2015, 2015(1), M843.)本研究では、塩化白金触媒による炭素骨格変換反応を基軸としたアズレン縮環系ヘリセン(AZH)類を創製し、その物理化学的諸性質の解明と新規材料としの応用研究を目指す。本年度は項目1の研究成果として、AZH-15に加え、新たに5員環部にホルミル基を有するAZH-6の合成にも成功した。各AZH類のX線結晶構造解析を行った結果、電子吸引基としてトリフルオロアセチル基を有するAZH-4と、ホルミル基を有するAZH-6はアズレン分子の大きな双極子モーメントを打ち消し合うようにhead-to-tail型のスタッキング構造を形成することが分かった。この際、AZH-4は右巻き(P体)と左巻き(M体)が交互に積層しているのに対し、AZH-6ではP体又はM体同士でhead-to-tail型二量体を形成し、これを基本単位とする積層カラム構造を形成していることを明らかとした。項目2の研究では、特徴的な集合体を形成するAZH-4とAZH-6と、ヘリングボーン層を形成するAZH-1の近接2分子間の正孔・電子移動度(電荷移動確立(W))の理論計算を行った。その結果AZH-4に関しては電子輸送能に優れ、AZH-6はバイポーラー性を有することが示唆された。項目3の研究として各AZH誘導体のn型材料としての機能評価を実施した。ドナー材料としてポリ-3-ヘキシルチオフェン(P3HT)を用いて、それとの混合薄膜かならなるバルクヘテロ構造を作成して評価した結果、AZH-1よりもAZH-4は短絡電流密度が優れていたが、変換効率が低い結果を与えた。

本研究では、塩化白金触媒による芳香族環変換反応を基軸としたらせん形のアズレン縮環型ヘリセン類(AZH)を創製し、その物理化学的諸性質の解明と有機薄膜太陽電池としての応用研究を行った。具体的な研究項目としては、1)置換アズレン誘導体の効率的合成法の開発、2)AZH誘導体の合成とその物性評価、および3)アズレンの電子受容体材料としての応用研究の3つである。モデル分子で見出した条件をAZH誘導体の合成に適用し、選択的にAZH分子を合成することに成功した。加えて、合成したアズレン分子において物性評価を行いAZH-5においてユニークな電子特性を見出した。有機合成化学次年度は、合成したAZH類のX線結晶構造解析および電子的特性(光電子収量分析装置によるイオオン化ポテンシャルの算出)の評価を行い、実際に有機薄膜太陽電池のn型半導体材料として発電効率を評価する。モデル反応ではあるが、塩化白金を触媒とする炭素骨格変換反応によりアズレン構造を効率的に与える条件を見出すことに成功した。次年度は触媒的環化異性化反応を基軸としたアズレン形成反応の基質適用範囲の探索を図り、それを足掛かりとしてヘリセン縮環型ヘリセンの効率的合成法の開発を目指す。H25年度に、合成化合物のスペクトル分析を行う予定であったが、対象化合物の合成が遅延したため、未使用額が生じた。合成化合物のスペクトル解析を次年度に行うこととし、未使用額(1,367円)はその経費に充てることとしたい。
転写因子ATF4を標的とした生活習慣病によるアルツハイマー病発症機構の解明

高齢化社会において急増するアルツハイマー病は、脳内におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の異常産生によって神経細胞死が引き起こされ、認知障害をもたらす。しかし、ほとんどのアルツハイマー病は未だ原因が不明であり、発症の分子機構も明確でない。本研究は、アルツハイマー病の危険因子である生活習慣に起因する肥満や糖尿病がもたらすストレスシグナル(小胞体ストレス)によるAβ産生増加機構の解明を目的とし、研究機関において以下の新規機構を明らかにした。1アルツハイマー病モデルマウス(APP23)及び老齢マウスの脳において、リン酸化eIF2αとATF4の発現レベルの上昇が認められた。さらに、APP23マウスの脳内Aβ凝集の周囲でも同じく発現上昇が認められた。2APP23マウスと肥満モデルマウス(db/db)の交配により作製した二重変異マウスは3ヶ月で死に至った。さらにATF4の発現も上昇した。3eIF2αの脱リン酸化に関与するGADD34を誘導するフラボノイドの一種ケルセチン(quercetin)を与えたAPP23マウス及び老齢マウスは聴覚恐怖刺激記憶評価試験において記憶が改善された。【目的】アルツハイマー病は、脳内におけるアミロイド-βタンパク質(Aβ)の異常産生が神経細胞死を引き起こし、認知障害をもたらす疾患である。アルツハイマー病の危険因子(肥満・糖尿病)の存在は知られているが、発症及び進行の要因であるAβ産生増加との関連は未だ不明のままである。本研究は、申請者らが培養細胞を用いて明らかにした「転写因子ATF4の発現上昇がもたらすAβ産生増加機構」を基盤に、危険因子によるAβ産生増加機構の解明と生体内での役割について明らかにすることを目的とする。【研究実績】フラボノイドの一種であるケルセチンは、eIF2α脱リン酸化関連因子GADD34のmRNA上昇をもたらす。【研究の意義と重要性】ATF4を標的とする創薬や脳内Aβ産生のマーカー開発に繋がる。さらに、肥満・糖尿病におけるアルツハイマー病発症の予防法開発に貢献できる。本研究の基盤となる「転写因子ATF4発現上昇がもたらすAβ産生増加機構」に伴う研究成果として、肥満・糖尿病の病態として注目されている小胞体ストレスが、転写因子ATF4を介したアミロイドβタンパク質産生を亢進することを明らかにしている(Ohta et al., BBRC 2011)。ここで得られたケルセチンによるeIF2α脱リン酸化関連因子GADD34のmRNAの上昇がAβ産生に関与しているか現在精査している。本研究遂行により明らかになったケルセチンによるGADD34mRNA上昇のAβ産生機構への関与、及び生体内における役割を検証する。