hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞移植を用いた胎児性アルコール症候群の治療~脳神経回路網の再生の試み

胎児性アルコール症候群のモデルラットに対して,ラット胎仔由来の神経幹細胞の経静脈的移植療法を施行した。その結果,胎児性アルコール症候群の主要症状である多動性と衝動性の行動異常が正常ラットと同等の程度まで改善することを明らかにした。妊娠期の母親の摂取によって,胎児がアルコールに曝露されたときに発症する胎県性アルコール症候群(FAS)に対して,侵襲の少ない経静脈的神経幹細胞移植による治療の可能性についてラットを用いて検討した。妊娠1013日の母親ラットにエタノールを投与し,出生した仔をFASモデルとした。FASモデルラットでは多動性と衝動性が高く,FASの臨床症状と同様の症状を認めたが,生後1ヶ月にラット胎仔の脳より採取した神経幹細胞を経静脈的に移植すると,移植1ヶ月後には,これらの行動異常は正常ラットと同等の程度まで改善した。移植したNSCは,放射性同位元素と蛍光色素で標識しており,経静脈的移植後の脳内への移植細胞の移行性と脳内分布についても検討した。移植1ヶ月後の脳組織を液体シンチレーションカウンターで測定した結果,対照移植群に比べ,FAS移植群で放射活性がより高い傾向を認め,FAEモデルラットにおいては,脳の神経回路に異常が生じているために,移植した神経幹細胞が障害を受けた脳内により積極的.に移行している可能性が推察された。FAS移植群の脳スライス切片を用いた解析では,蛍光色素標識した細胞が脳内の広い範囲に分布していることを観察した。また,脳の特に帯状回,海馬,および側脳室下帯については,標識細胞が高密度に存在していた。脳内で検出された標識細胞の一部は軸索形成と考えられる形態変化を示していた。経静脈的移植は侵襲が少な,いことが利点であるが,移植した細胞のうち脳内に移行するのは数%であると言われている。移植細胞の脳内移行の効率化を図る目的で,生体親和性が高く抗原性が極めて低いアテロコラーゲンをNSC浮遊液に混和しで,アルコール依存症モデルラットに移植すると,脳内への移植細胞の移行量が増大した。このことからアテロコラーゲンは経静脈的神経幹細胞移植の治療効率を向上させる可能性があると期待している。胎児性アルコール症候群(FAS)に対して,経静脈的神経幹細胞移植を行い,多動性と衝動性といったFASの行動異常が正常ラットと同等の程度まで改善することを報告した。また胎児期のアルコール暴露が脳に及ぼす影響は,出生してアルコール暴露が断たれても基本的に非可逆的であり,また様々な精神疾患への罹患が高いことも知られており,我々は既に,胎生期にアルコール暴露を受けたFASモデルラットから得た神経幹細胞は,通常の神経幹細胞よりもアルコールによる障害を受けやすいことを見出し報告している。さらに,精神疾患における脳ダメージからの回復とその予防・治療法の開発検討を進める目的で, FASのモデル動物に標識した神経幹細胞を移植し,神経幹細胞の脳内動態の可視化を図るとともに,移植した細胞が,脳のどこでどんな細胞に分化・発達しているのかについて解析を進めた。FASのモデルラットの生後1ヵ月目に蛍光色素(CFDA-SE)で標識した神経幹細胞を経静脈的に移植し,移植2ヶ月後に脳組織標本を作製した。移植した細胞は脳内に広範に分布しており,免疫染色にてMAP2やdreblin A, GFAP陽性であり,樹状突起を形成したニューロンやアストロ細胞に分化し生存していることを観察した。また5-HTやGAD, ChAT陽性の細胞も認め,ニューロンに分化した移植細胞がさまざまなフェノタイプの神経細胞に分化,発達していることが分かった。今後,移植細胞の機能発現を電気生理学的に解析するなどして,その脳神経回路への組み込みについて詳細な解析を進めていきたいと考えている。
生徒の飛び出し事故を減らすセンサを利用した警告灯の制御

研究の目的登下校において、生徒が通学に使用する自転車と車、歩行者と自転車や車との事故など、児童・生徒の飛び出しによる事故が特に多い。狭い路地とつながっている道路においては、カーブミラーも無く危険な部分である。夜無灯で自転車を乗る人も多く、あわててブレーキを踏むこともあり、カーブミラーだけで判断するのは無理があり危険である。そこで今回センサを使用し、警告灯で注意を促すことで少しでも生徒の事故を減らすシステムを作成し、制御を行う。研究方法1詳細なデータを採る。(a)道路の幅、自転車の速度の違いによる停止距離を調査。(b)カーブミラーのある場所では見える距離のデータを採り、平均を求める。また夜間の見え方や昼間との見え方の違いを調べる。路地から出てくる自転車と自動車の速度を調べる。2センサー回路の制御と実験(a)センサー範囲の調整をし、PICの製作と制御プログラムの書き込み、ソーラパネルと小型バッテリー、過充電防止回路で警告灯を製作。(b)実際の距離、速度等から点灯タイミングを調整し実際に使用できるように製作する。研究結果今回簡単なセンサーだけで制御を行ったが、赤外線センサーが最低2個あれば感知する順番で路地から出るのか、入るのかがわかり、警告点灯をONにするのか否かを判断でき、また多数感知する場合は、方向を考慮せず点灯させるのがよいこともわかった。生徒は飛び出しの危険が実際によくわかり、簡単なセンサーで事故を防ぐことができる事を実感した。ただし、塀や生け垣から道路に向かって点灯させるため、責任が発生する「停止」等の命令的な言葉は使えず、「注意」と言う点灯に変更した。さらにプログラムや他のセンサを追加し、もっと多くの場所で実験ができればと考える。
新規磁性抗癌剤を用いた口腔癌治療法の開発

我々は医工連携研究で、有機化合物でありながら磁性をもち、さらに強い抗腫瘍効果をもつ「Fe(Salen)」を同定した。さらにこの研究をすすめ、磁性がより強く、あらゆる化合物に容易に結合する新しい化合物(以下、「鉄アセン」)を合成した。この鉄アセンと市販医薬品を化学結合させることで、抗癌剤のみならず、抗生剤や鎮痛剤などの薬剤の磁性化を行うことができると期待できる。本申請では、鉄アセンの磁性強度や細胞毒性の有無について評価を行い、鉄アセンを用いた新しいドラッグデリバリーの手法を検討する。
Wnt/PCP経路による微小管の平面内極性化機構の解析

本研究では、Wnt/PCP経路が平面内極性化をもたらす分子機構を解明することを目的としている。平面内細胞極性を解析するための組織として、極性を持った多繊毛細胞がシート状に並ぶ脳室表面の組織を用いている。脳室表面は多繊毛細胞である上衣細胞に覆われており、脳脊髄液の流れがShare Stress(せん断応力)となって上衣細胞に水平軸での極性(平面内細胞極性)を与えている。本年度は、脳室壁組織を用いてWnt/PCP分子群の免疫染色を行い、上衣細胞表層部において、脳脊髄液の流れに沿った、平面内で非対称に局在化するWnt/PCP分子を検出することができた。また、前年度から続けている微小管の電子顕微鏡画像の解析も進み、上衣細胞の繊毛基底小体に接続する微小管を捉えることができた。一方で、脳室壁上衣細胞の微小管の極性化に関与する分子として、Wnt/PCP経路制御分子Dapleを解析している。Daple遺伝子欠損マウスの脳室壁上衣細胞では、微小管の平面内極性化がなくなり、基底小体の向きも乱れて繊毛の方向異常となり、水頭症を生じることを前年度に報告した。本年度は、Dapleが微小管を制御する分子機構を解析するため、脳室壁組織でDapleと結合する分子をスクリーニングし、その結果Dapleと結合する微小管制御分子を同定した。脳室壁組織の免疫染色や、組織溶解液を用いた生化学実験によってこれらの微小管制御分子の局在や活性状態を解析し、Dapleノックアウトマウスと野生型で比較検証している。概ね研究計画に沿って進んでおり、前年度までに取得したデータの解析を進めて、標的分子を検索することができた。Dapleと結合する微小管関連分子の中でも、繊毛細胞で平面内細胞極性に影響を与える分子を発見した。Dapleと結合する微小管制御分子の、脳室壁組織での機能を証明する。脳室壁組織で候補分子を発現または活性制御した際の、上衣細胞内の微小管ダイナミクスやWnt/PCP分子郡への影響を評価する。そのため本年度では、PCP分子の一つDapleノックアウトマウスの組織において、平面内細胞極性の異常を検証した。マウス組織における平面内細胞極性を見るために、脳室壁表面にシート状に並ぶ上衣細胞を組織ごと免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡で細胞表層部の微小管の配向を撮影した。野生型では微小管が細胞内で非対称的に配向していたが、Dapleノックアウトマウスでは微小管の平面内極性が見られなかった。さらに野生型マウスの脳室にDaple shRNAを導入したところ、周囲の野生型細胞が正常な平面内極性を示しているにもかかわらず、Dapleノックダウン細胞だけが微小管の平面内極性を失っていた。このことから、脳室内の脳脊髄液の流れる向きや他のPCP分子とは独立して、Dapleが微小管の平面内l極性化を制御することがわかった。これらの結果をまとめ、国際科学誌Cell Reportsに論文を発表した。また、Dapleノックアウトマウスの脳室壁組織から電子顕微鏡試料を作成し、微小管の平面内での配向と細胞膜や基底小体との接続を観察試みたが、透過型電験用の超薄切片では微小管の全長を捉えることができなかった。さらに収束イオンビームFIB-SEMにて基底小体周辺部分を連続で切って撮影したが、微小管は不明瞭で3D画像化までできなかった。しかし、共同研究によって超高圧電子顕微鏡による微小管の解析を進めることができた。当年度はDapleノックアウトマウスの表現型を論文にし、DapleをPCP分子だとして、先立って報告することができた。後発の当該分野の論文にすでに引用されている。

脳室壁組織の免疫染色や、組織溶解液を用いた生化学実験によってこれらの微小管制御分子の局在や活性状態を解析し、Dapleノックアウトマウスと野生型で比較検証している。概ね研究計画に沿って進んでおり、前年度までに取得したデータの解析を進めて、標的分子を検索することができた。Dapleと結合する微小管関連分子の中でも、繊毛細胞で平面内細胞極性に影響を与える分子を発見した。Dapleが微小管の平面内細胞極性を制御する分子機構を解析するため、脳室壁組織をDaple抗体で免疫沈降したサンプルをMS解析行う。平面内極性化した組織にてDaple結合タンパク質をスクリーニングし、微小管関連タンパク質を検索する。Dapleと結合する微小管制御分子の、脳室壁組織での機能を証明する。脳室壁組織で候補分子を発現または活性制御した際の、上衣細胞内の微小管ダイナミクスやWnt/PCP分子郡への影響を評価する。
高血圧性脳内動脈硬化病変のリモデリングと三次元立体的モリフォメトリー解析

高血圧性脳出血や脳深部の多発小梗塞および脳血管性痴呆等の共通の原因病変である脳内細小動脈硬化ことに中膜壊死に着目し、病変の進行する過程において、動脈壁自体が、どのようなリモデリング反応を示すか、また脳動脈中膜壊死は脳内の立体分布で、どのような部位に多いかを日本人の剖検脳を用いて検討した。「方法」:正常圧で灌流固定された剖検脳標本を用い、高血圧群17例と、非高血圧群21例とに分け、それぞれ脳底部の内頚動脈末梢部(C1)、中大脳動脈M2部、脳内動脈の穿通枝(PA、脳底部より1-1.5cmの外側線条体動脈および皮質より入る髄質動脈(long medullary artery,直径約200-300μm)につき、中・内膜、内腔の各面積および壁圧、半径、狭窄度(内膜/内弾性板領域)等を画像解析・自動計測装置にて測定し、相互の相関性を検討、さらに動脈壁にかかる壁張力を算出し、壁張力とリモデリングとの相関をも検討した。また、内腔、内膜、中膜、外膜をトレースして、三次元立体化ソフト(OZ95)にインプットし、3D再構築化し、壁構築と壁病変を立体的に再構築し、部位的なリモデリングの相違の検討やマッピングを試みた。「結果・考察」:その結果、脳底部動脈および脳内動脈では、内膜肥圧の程度に応じて内腔を保持する血管径の代償性拡大によるリモデリングが行われ、両者に有意な相関をみた(C1,M2:p<0.05,PA:p<0.001)。また加齢や高血圧で脳動脈中膜が菲薄・拡張した壁には、中膜のみで構成される壁への張力Tは極めて高値になるが、この壁は肥厚した内膜が加わり壁圧が増すことで、その張力はいずれもほぼ均等な低値となり、内膜肥厚は拡張壁にかかる張力増大の安定化の役割を担った。これに対して、300μm以下の脳内動脈硬化の特徴像は、中膜壊死、線維化や硝子化など退行性病変が主体で管腔の拡大を伴うことが多いが、内膜肥厚による増殖性病変は少ない。このため、壁張力増大を低下させるための安定化要因が乏しく、壁破綻による脳内出血をもたらす要因となっていると考えられた。三次元立体的な病変の相互関係をみると、高度な中膜壊死をきたす部位は、外側線条体動脈(穿通枝)では分岐部または分岐部直後、髄質動脈では、屈曲部直前の部に高率に見られた。このことから、動脈の中脈病変の成り立ちには、血行力学的因子が大きく関与しているものと考えられた。

日本人に多い脳血管性痴呆の原因の一つである脳深部多発小梗塞や高血圧性脳内出血などの共通の原因動脈病変である脳内細小動脈硬化ことに中膜壊死に着目し,初期病変から進行病変へと変化する過程において,動脈壁自体が,どのようなリモデリング反応を示すかを検討した.複数施設で剖検され,かつ正常圧で灌流固定された脳標本を用い,生前に高血圧(HT)を示した群17例と,明らかな高血圧を示さずかつ剖検にても高血圧性臓器病変の見られない非高血圧(non-HT)群21例とに分け,それぞれ脳底部の内頚動脈末梢部(Ci),中大脳動脈M2部,脳内動脈の穿通枝(PA,脳底部より1-1.5cmの中線条体動脈外側枝,直径約300-400μ)につき,中・内膜,内腔の各面積および壁厚,半径,狭窄度(内膜/内弾性板領域)等を画像解析装置にて測定し,相互の相関性を検討,さらに動脈壁にかかる壁張力を算出し,壁張力とリモデリングとの相関をも検討した.その結果,脳底部動脈および脳内動脈では,内膜肥厚の程度に応じて内腔を保持する血管径の代償性拡大によるリモデリングが行われ,両者に有意な相関をみた(C1,M2:p<0.05,PA:p<0.001).また加齢や高血圧で脳動脈中膜が菲薄・拡張した壁には,中膜のみで構成される壁への張力Tは極めて高値になる(C1:15.8,M2:10.9,HT-PA:12.1,non-HT-PA:10.9x10^5 dyne/cm^2)が,この壁に肥厚した内膜が加わり壁厚が増すことで,その張力はいずれもほぼ均等な低値となり(C1:7.5,M2:6.5,HT-PA:7.0,non-HT-PA:6.5),内膜肥厚は拡張壁にかかる張力増大のスタビライザーの役割を担った.これに対して,300μm以下の脳内動脈硬化の特徴像は,中膜壊死,線維化や硝子化など退行性病変が主体で,管腔の拡大を伴うことが多いが,内膜肥厚による増殖性病変は少ない.このため,壁張力増大を低下させるための安定化要因が乏しく,壁破綻による脳内出血をもたらす要因となっていると考えられた.平成11年度には,さらにこれらを解明することと,三次元的リモデリング解析をも行う.脳深部多発小梗塞や高血圧性脳出血等の共通の原因病変である脳内細小動脈硬化ことに中膜壊死に着目し,病変の進行する過程において,動脈壁自体が,どのようなリモデリング反応を示すか,また脳動脈中膜壊死は立体分布で,どのような部位に多いかを日本人の剖検脳を用いて検討した.方法:正常圧で灌流固定された剖検脳標本を用い,高血圧群17例と,非高血圧群21例とに分け,それぞれ脳底部の内頚動脈末梢部(C1),中大脳動脈M2部,脳内動脈の穿通技(PA,脳底部より1-1.5cmの外側線条体動脈および皮質より入る髄質動脈(long medullary artery,直径約200-300μm)につき,中・内膜,内腔の各面積および壁厚,半径,狭窄度(内膜/内弾性板領域)等を画像解析・自動計測装置にて測定し,相互の相関性を検討,さらに動脈壁にかかる壁張力を算出し,壁張力とリモデリングとの相関をも検討した.また,内腔,内膜,中膜,外膜をトレースして,三次元立体化ソフト(OZ95)にインプットし,3D再構築化し,壁構築と壁病変を立体的に再構築し,部位的なリモデリングの相違の検討やマッピングを試みた.結果・考察:その結果,脳底部動脈および脳内動脈では,内膜肥厚の程度に応じて内腔を保持する血管径の代償性拡大によるリモデリングが行われ,両者に有意な相関をみた(C1,M2:p<0.05,PA:p<0.001).また加齢や高血圧で脳動脈中膜が菲薄・拡張すた壁には,中膜のみで構成される壁への張力Tは極めて高値になるが,この壁に肥厚した内膜が加わり壁厚が増すことで,その張力はいずれもほぼ均等な低値となり,内膜肥厚は拡張壁にかかる張力増大の安定化の役割を担った.これに対して,300μm以下の脳内動脈硬化の特徴像は,中膜壊死,線維化や硝子化など退行性病変が主体で,管腔の拡大を伴うことが多いが,内膜肥厚による増殖性病変は少ない.このため,壁張力増大を低下させるための安定化要因が乏しく,壁破綻による脳内出血をもたらす要因となっていると考えられた.三次元立体的な病変の相互関係をみると,高度な中膜壊死をきたす部位は,外側線条体動脈(穿通技)では分岐部または分岐部直後,髄質動脈では,屈曲部直前の部に高率に見られた.
シリコンの結晶異方性エッチングモデルと溶液組成イオン効果の研究

アルカリ水溶液を用いたシリコンの結晶異方性エッチングにおいて,水溶液中の成分によってエッチレートの異方性が激変する現象を解明した.エッチング液中の不純物としてのCuイオンはエッチング速度を低下させ,エッチング面を荒らす効果があることを,理論的・実験的に明らかにした.一方,エッチング液中に微量の界面活性剤を加えると,これが特定の結晶方位に選択的に吸着し,エッチレートの異方性を激変させることを,エッチング液とシリコンの固液界面でのFTIRその場観察によってはじめて見出した.この現象を利用して異なる特性を持つエッチング液を使い分けることにより,MEMSデバイスに必要とされる複雑な形状の微細3次元構造を安価に実現するプロセスを発明し,特許出願した.アルカリ水溶液を用いたシリコンの結晶異方性エッチングにおいて,水溶液中の成分によってエッチレートの異方性が激変する現象を解明した.エッチング液中の不純物としてのCuイオンはエッチング速度を低下させ,エッチング面を荒らす効果があることを,理論的・実験的に明らかにした.一方,エッチング液中に微量の界面活性剤を加えると,これが特定の結晶方位に選択的に吸着し,エッチレートの異方性を激変させることを,エッチング液とシリコンの固液界面でのFTIRその場観察によってはじめて見出した.この現象を利用して異なる特性を持つエッチング液を使い分けることにより,MEMSデバイスに必要とされる複雑な形状の微細3次元構造を安価に実現するプロセスを発明し,特許出願した.シリコンの結晶異方性エッチングにおいて,これまでエッチングに寄与しないとされてきたアルカリ水溶液中のプラスイオンの効果を研究した.エッチング液中の銅イオンが,シリコンのエッチレートを低減し,同時に,面粗さを増大する現象をこれまでに当研究室が明らかにしたが,この1年間では,この現象が発生する物理化学的なメカニズムを研究した.日本・フィンランドの2国間共同研究の相手方であるヘルシンキ工科大グループによる第1原理計算の結果,シリコン結晶表面のステップ・テラス構造の特定位置で銅イオンが高い親和性をもつこと,また,これによってエッチングが進行しづらくなることが判った.さらに,銅イオンがシリコン表面にある凹凸の稜線と強い親和性があることから,ごく微量の銅イオンの存在がSi(110)の表面に発生するテーパ状のヒロックの発生の原因の一つになりうることを示した.ステップ・テラスモデルのもとづき,セルラ・オートマトンを利用したエッチング形状シミュレーションシステムを開発した.従来,結晶異方性エッチングでは,凸型マスク先端で激しいアンダカットが発生し,一方,凹型マスク形状では応力集中が生じるような鋭い稜線を持つ特殊な形しかできないといわれてきたが,ある種の界面活性剤をエッチング液に添加することで,曲線プロフィルをもつエッチングマスクでは.これを反映した連続的な曲線エッチプロフィルが得られることを示した.以上の内容を,学術誌論文8件,国際会議発表4件,著書1件で公表した.シリコンをTetra Methyl Ammonium Hydroxide(TMAH)水溶液でエッチングするさいに,微量の界面活性剤がエッチング特性,特に,エッチングの異方性を変えてしまう現象について研究した.昨年度までの研究で,エッチレートの結晶方位依存性の変化を把握してきたが,平成20年度は,界面活性剤(Triton X100)がどのようにしてエッチングの異方性を変化するかのメカニズムの一端を解明した.すなわち,この界面活性剤はエッチング中にシリコンの特定の結晶方位に選択的に吸着してエッチング速度を低下させることを,世界ではじめて観測した.吸着の観測には,in-situ FTIR(Fourier Transform Infra-Red)Spectroscopyを用いたが,これは今年度から新たに共同研究者として加わった,東北大の協力に依るところが大きい.一方,この現象のMEMS加工技術への応用として,任意の曲線パターンを有するシリコン単結晶梁構造を,TMAH水溶液によるウェットプロセスだけで製作できることを見出したので,その基本プロセスを特許出願した.以上の成果は,学術会議論文12件,学術雑誌論文7件,招待講演3件として公表済み,あるいは発表決定している.シリコンをTetra Methyl Ammonium Hydroxide(TMAH)水溶液でエッチングするさいに,微量の界面活性剤がエッチング特性,特に,エッチングの異方性を変えてしまう現象について研究した.昨年度は,界面活性剤(Triton X100)がエッチング中にシリコンの特定の結晶方位に吸着することを,in-situ FTIR計測ではじめて明らかにしたが,今年度はさらに,界面活性剤の吸着量をエリプソメトリ法で定量的に計測し,各方位での吸着量を比較して検証を進めた.さらに,吸着した分子がその後のエッチングを妨げるという事実を実験的に確認した.以上の結果を総合し,界面活性剤添加によりエッチング異方性が変化するメカニズムは,界面活性剤が特定の結晶方位に多く吸着する結果,エッチング速度を選択的に低下させるという結論を得た.ただし,界面活性剤が特定の結晶方位に選択的に吸着するメカニズムの解明は今後の課題である.一方,エッチング液中に含まれるK+,TMA+,Cu++などの陽イオンがエッチング特性に及ぼす効果は相互比較ができたものの,いまだに統一的解釈を確立するに至っていない.上記の界面活性剤添加による異方性変化がMEMSデバイスの3次元構造形成に応用できることを実験的に検証することができたので,MEMSデバイスの3次元構造製作プロセスを特許出願した.以上の研究成果は,国内外会議論文8件,学術雑誌論文11件,図書3件,として公表済み,あるいは発表決定している.
新海洋像：その持続的利用を図る国際レジーム

この計画研究班は、海の恵みを国際社会が最適利用するのに必要となる条件を明確化させることを目的とし、経済学や国際政治学など社会科学を軸足とした学際的な研究を行うものである。科学等に不確実性が存在する中での国際合意形成過程に関する研究については、国家管轄外区域における生物多様性(BBNJ)を巡る国連での議論を主な題材として合意形成過程を研究しOECD諸国(先進国)とG77諸国(途上国)では関心事項が異なっていることなどを明らかにた。また、国際社会で合意形成が進む条件については、関心国が少なすぎる場合は交渉が成り立たないことなども明らかにした。本課題は、海の恵みを国際社会が最適利用するのに必要となる条件を、国際法の実施側面と国際政治の観点から明確化させることを目的としている。平成24年度(繰り越し分を含む)においては、代表者である八木(東大)が、前FAO(国連食糧農業機関)関係者からヒアリングを行い、「FAO公海上の漁船による国際的な保存・管理措置の遵守を促進するための協定(フラッギング協定)」などの起草過程に関する調査を行った。また、「国連海洋法条約」において国家管轄圏外の生物多様性を保全するための新条約策定の是非について議論がなされている状況を調査した。これらの一部は、八木信行(2013).(分担執筆).エコロジーをデザインするーエコ・フィロソフィーの挑戦.春秋社.東京. pp114-133.として出版した。分担者である都留(中央大)は、「国連海洋法条約」にアメリカが批准をしていない歴史的経緯と問題点、現在の動向についての分析を行った。アジア海域で勢力を強化する中国に法的に歯止めをかける意味でもオバマ政権内では条約批准に前向きの姿勢が見られるが、上院議会内では、国際条約に制約を受けることを嫌う共和党の反対勢力の影響力が強く、いまだ批准の見込みがたっていないことを明らかにした。更に分担者である中田(東京海洋大)は、生態系サービスを管理する適当な国際機関が存在しない現在、これに間接的に関わる国際事象が生じている例として、メカジキ紛争を取り上げ、事象の分析を通じて、生態系サービスの管理を考えるにあたって資する論理を抽出しようとした。以上に基づき、領域の研究者一同を集めた会合において、海洋生態系サービスなどに関する国際的な現状と課題について報告を行った。これをもって、自然科学を扱う領域の他の研究チームに対して社会科学的な側面の情報をインプットする作業も行うことができたと考えている。本年は、代表者である八木(東大)が、国連が開催する国家管轄権外の海洋生物多様性保全作業部会とそのワークショップに参加し、合意形成の中で科学がどの程度取り入れたれているのかなどに関する分析作業を行った。この際は、国連会合の中で研究代表者がパネリストとして実際に海洋生態系の保全戦略に関する発表を行い、会場の出席者からフィードバックをもらうことで更に研究課題を洗い出す作業も実施した。分担者である都留(中央大)は、「国連海洋法条約」及び「生物多様性条約」に関する分析を行い、昨今、国家管轄権外の遺伝子資源の開発問題や保全が課題となっているものの、制度的(法的)には、国連海洋法条約や生物性多様性条約のいずれもが十分に扱えない欠缺状況にあることなどを明らかにした。研究成果としては、都留康子(2014).国家管轄権外の海洋生物多様性の保全をめぐる制度間の相互作用ーグローバル化時代の法と政治ー中央大学社会科学研究所『グローバル化と社会科学』、及び都留康子(2014)「海は資源の宝庫」『ビジネス法務』2014年3月号が存在。更に分担者である中田(東京海洋大)は、対馬において海洋保護区案件を分析し、以下の成果を上げた。青木望美(2014)「海洋保護区における予防原則の適用ー長崎県対馬市の試みを事例に」地域文化研究第15号。加えて、以上に基づき、自然科学を専門とする領域の研究者一同を集めた会合において、海洋生態系サービスなどに関する国際的な現状と課題について報告を行った。これをもって、自然科学を扱う領域の他の研究チームに対して社会科学的な側面の情報をインプットする作業を行った。八木(東大):2014年5月に国連本部で開催された第15回国連海洋法条約および海洋に関する非公式協議に出席(旅費は外務省が支給)、研究結果を発表するとともに、国連における国家管轄外の生物多様性保全問題における合意形成状況を調査した。また、7月および9月にはIPBES(生物多様性及び生態系サービスに関する政府間プラットフォーム)の専門家会合に出席し(旅費は当研究費を使用)、合意形成過程を調査した。更に本研究費で雇用した特任研究員(Robert Blasiak)とともに過去の漁業条約成立過程に関する研究を行い、ある資源の漁獲国数が増加するとその資源を管理するための国際約束が成立しやすくなること、逆に、公海にも分布している重要魚種(例えばタチウオ)あっても、漁業国が1カ国が主として漁獲している場合は国際約束は成立しないことを見出し、Marine Policy誌で出版した。堀(高知大):2014年4月に世界銀行とオランダ政府がハーグで開催した「Global Oceans Action Summit」において研究内容をポスター発表するとともに、各国の研究状況を調査した。また、IPBES(生物多様性及び生態系サービスに関する政府間プラットフォーム)の状況についても昨年に引き続き調査をした。この研究は、海の恵みを国際社会が最適利用するのに必要となる条件を国際法の実施側面と国際政治の観点から明確化させることを目的とし、社会科学の分野を軸足として学際的な研究を行う内容である。

2015年度に実施した研究の概要は以下の通りである。(1)漁業や生物資源利用に関する国際条約の起草過程および現在進行中の合意形成過程等に関する分析について,研究代表者である八木が、「生物多様性及び生態系サービスに関する政府間科学政策プラットフォーム(IPBES)」作業部会会合(2015年6月ハンガリーにて開催)に出席し、研究結果を発表するとともに、同組織における科学政策の国際合意形成過程を調査した。(2)海洋保全に関する国際的な見方に関する研究については,海洋管理の手段を政府による管理とすべきか,民間主導の経済的な管理とすべきかなどについて知見を得るために,2014年2月にアメリカ在住者を対象として海洋保全に関する見方の調査を行った。この結果,アメリカ人は,海洋生態系サービスの保全については,アメリカの管轄圏内の海域と管轄県外の国際海域をほとんど区別せずに見ていることなどが分かった。これを本年度査読論文にまとめて発表した。(3)また,規制が及ぼす波及効果について分析し,「風船効果」に焦点を当てて,1980年代に国連海洋法条約による国際レジームが成立して以降,縁辺海域で生じた事例などを分析した。特に1980年代の後半に各国が200カイリ規制を実施し,自国の200カイリ水域から外国漁船を閉め出したが,その結果,漁船は縁辺会の公海に向かい,例えばベーリング公海ではスケトウダラを対象とした漁業が漁獲量を急増させ,その後に資源量が悪化して漁獲が急減し,漁業がモラトリアムとされた事例が存在する健について事例分析を行った。これも査読論文としてまとめて発表した。研究は当初予定よりも進展しており,2015年度は、本研究の成果を査読付き原著論文を国際誌に3編(タイトルを以下に示す)、また総説・雑文を3編出版し、更には学会等における口頭発表・ポスター発表・招待講演は13件実施するなど,実績を残すことができたと考えている。この計画研究班は、海の恵みを国際社会が最適利用するのに必要となる条件を明確化させることを目的とし、経済学や国際政治学など社会科学を軸足とした学際的な研究を行うものである。漁業や海洋は、空間的には陸上から観察しにくい対象であり、また時間的にも環境変動などの不確実性が存在する。本研究班では、このような規制対象の特質が、国際的な合意形成をどのように阻害または促進するのかを解明することを目指している。更にはこれらの研究結果を自然科学の分野を研究対象とする他班にフィードバックさせ、領域全体の目的達成に資することを目指す。このうち、科学等に不確実性が存在する中での国際合意形成過程に関する研究については、国家管轄外区域における生物多様性(BBNJ)を巡る国連での議論を主な題材として合意形成過程を研究した。手法としては、当該会合に出席し代表団にインタビュー調査などを実施する、また得られた各国の発言内容をテキストマイニングするなどを用いた。この結果、BBNJに関しては、OECD諸国(先進国)とG77諸国(途上国)で関心事項が異なっていることが明らかになった。
小腸・肝臓における新たなpH依存性薬物輸送担体の同定

細胞に発現している輸送担体は、本来、イオンの恒常性の維持やアミノ酸等の栄養素の供給、生体にとって重要な生理活性物質の時間的・空間的維持のために機能している。近年、生体に存在している数多くの輸送担体が薬物を輸送することが明らかにされつつあり、中でも、様々な医薬品の吸収に関与するpH依存性輸送担体の存在が示唆されている。しかしながら、その輸送を担う分子実体の多くは未だ特定されていない。そこで本研究課題では、輸送実体が明らかになっていない医薬品を認識し、生体膜の透過を担う新規pH依存性輸送担体を機能レベルおよび分子レベルで同定することを目的としている。2018年度は、pH依存性輸送担体として、H+/オリゴペプチド共輸送担体およびpH依存性有機アニオン輸送担体に注目して検討を行い、以下の結果を得た。オリゴペプチド輸送担体は多彩な基質認識性を備えており、ペプチド構造を有する医薬品のみならず、ペプチド構造を有していないニコチン酸およびその誘導体を認識することが明らかとなった。pH依存性有機アニオン輸送担体は、肝臓のみならず、様々な組織で機能的に発現しており、その基質認識性から、既知の有機アニオン輸送担体(OAT, OATP)とは異なる、新たなpH依存性有機アニオン輸送担体であることが明らかになった。新規pH依存性有機アニオン輸送担体は、既知のpH依存性乳酸輸送担体(MCT)と比して、比較的嵩高いモノカルボン酸薬物(フェノキシ酢酸系除草剤、NSAIDs等)を輸送することが示された。2018年度は、オリゴペプチド輸送担体のアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて、二電極膜電位固定法により基質輸送に伴う誘起電流を測定した。その結果、典型的な基質であるジペプチド(Gly-Sar)と同様に、ニコチン酸およびその誘導体によっても内向きの誘起電流が生じることが明らかになった。一方、カルボン酸構造を有していないニコチンアミドやニコチン酸メチルでは誘起電流は認められなかった。これらより、基質のカルボン酸構造がオリゴペプチド輸送担体との相互作用において重要な役割を担っていることが示され、オリゴペプチド輸送担体がpH依存性有機アニオン輸送にも一部関与することが示唆された。pH依存性有機アニオン輸送担体に関しては、種々のモデル細胞や刷子縁膜小胞等を用いた解析を実施し、比較的嵩高いモノカルボン酸を基質とする新規pH依存性輸送担体が存在することが示唆された。上記進歩状況のように、ほぼ予定通りに成果は得られつつある。研究2年度目から3年度にかけては、新規pH依存性薬物輸送担体の同定を目指し、さらなる検討を進めていく。

上記進歩状況のように、ほぼ予定通りに成果は得られつつある。研究2年度目から3年度にかけては、新規pH依存性薬物輸送担体の同定を目指し、さらなる検討を進めていく。発注済みの試薬1点の国外からの納品が大幅に遅れたため。次年度は主に消耗品試薬購入費として使用する。
光遺伝学と磁気共鳴機能画像法の融合による大脳記憶機構の解明

認知記憶について、1)サル大脳の大域的情報処理機構を単一細胞活動レベルにまで遡って明らかにした。特に、領野間伝達により記憶信号を形成する過程が、従来の考えとは異なり、「前駆コード生成→増殖」により実現することを示し、新しい概念を創出した。2)こうして同定された神経回路の動作が行動に与えるインパクトを、当該領域の神経活動に対する侵襲的介入によって立証した。特に、メタ記憶に関してその大脳中枢が背外側前頭葉9野に存在することを示した。これらの成果により、メタ記憶のような意識の根幹に位置する事象の起源を、単一細胞レベルから行動レベルに至る首尾一貫した因果的なメカニズムとして理解することを可能にした。研究は順調に進捗している。本年度の研究実績に概要は以下の通りである。まず、記憶課題遂行中のサル大脳ネットワークの解析において、最初の大きな進捗が得られた(Miyamoto et al., Neuron 77, 787-799, 2013同誌SPOTLIGHTに掲載)。この研究では、マカクザルにヒトと同様の認知記憶課題を課し、磁気共鳴画像装置(MRI)内で課題遂行中の脳活動を記録してヒトと比較した。サルでもヒトでも、正しく記憶を想起した時に後部頭頂葉の活動が上昇することが明らかになった。さらに、サル後部頭頂葉に同定された2つの活動領域は、機能的にも解剖学的にも分化していて,それぞれヒトの頭頂葉の細胞構築学的には異なる領域に対応していることが示された。また、サル大脳への神経回路特異的な光遺伝学的刺激法/抑制法の確立に向けて、慢性サル行動課題実験用の新しいoptorodeの開発に成功した(Tamura et al., J. Neurosci. Methods 211, 49-57, 2012)。この新しいoptorodeの有用性は既に国際的に認められており、国際一流誌においての引用も増えつつある(Gerits et al., Trends Genetics 29, 403-411, 2013)。その他、サル大脳への神経回路解析においては、1つの図形を手がかりにして、事前に対として記憶している別の図形を連想する作業を遂行中のサルの側頭葉で、手がかり図形に応答しその情報を保持するニューロン(手がかり図形保持ニューロン)から、別の図形を思い出す時に活動するニューロン(対図形想起ニューロン)へと特異的に神経信号が伝達し、それがさらに他の対図形想起ニューロンへと伝播していくことによって、記憶想起信号が生成され、増幅されることを明らかにした(Hirabayashi et al. Neuron 77, 192-203, 2013同誌SPOTLIGHTに掲載)。本繰越によって、これまでの技術的課題であった組織障害性および発現特異性の問題がほば解決されたので、その証明として、ChR2を用いた光遺伝学の技術基盤開発に主眼をおいた実験の結果を論文として発表した。この実験では、カラム特異的遺伝子発現が可能であること、更にRNAiとの併用が可能であることを実証した(Tsubota et al., 2015)。神経可塑性において重要な役割を担うと提唱されているcofilin1分子をターゲットとして、その機能を単一の大脳体性感覚野カラムにおいて阻害し、その影響を電気生理学的に検証した。単一カラムにおけるcofilin1の機能阻害には、cofilin1に対するマイクロRNAを発現するレンチウイルスベクターを用いた。このレンチウイルスを、内因性光学信号計測法によりバレル中心を推定してバレルD2カラムに局所接種した。その結果、D2カラムに限局した遺伝子発現を実現できた。次に対側のD1ヒゲのみを残してその他の全てのヒゲからの入力を遮断することにより、経験依存的可塑性を誘導した。そして、cofilin1の機能を阻害した神経細胞のヒゲに対する反応を、細胞外電気生理記録法により記録した。その結果、D2カラム内のII/III層錐体細胞におけるcofilin1の機能は、D1カラムからの径カラム入力による経験依存的可塑性に必要であるが、D2カラムからのカラム内入力による経験依存的可塑性には必要でないことが示された。本年度は、まずChR2を用いた光遺伝学の技術基盤開発として、カラム特異的遺伝子発現が可能であること、更にRNAiとの併用が可能であることを実証した(Tsubota et al., 2015)。神経可塑性において重要なcofilin1分子をターゲットとして、その機能を単一の大脳体性感覚野カラムにおいて阻害し、II/III層錐体細胞におけるcofilin1の機能が径カラム入力による経験依存的可塑性に必要であることを証明した。サル大脳ネットワークダイナミクスのfMRI計測でも、多くの成果が得られた。サル大脳ネットワークおよび行動結果に対して、特定の大脳領域の機能障害がどのように影響を与えるかを解明した(Osada et al. , 2015)。新近性課題(Recency task)をサルに遂行させ、fMRIによって脳活動領域を同定し、特定の活動領域の機能障害をSVM法により解析した結果、大脳ネットワークにおける各領野のbetweenness centrality値(当該ネットワークにおいて、その領域がハブとしての性格をどの程度持っているかを定量的にあらわす値。ネットワーク理論での標準的指標)が、当該領域が傷害された場合に引き起こされる行動障害の程度と相関することを見出した。

この結果は、サル大脳ネットワークへの擾乱ダイナミクスをfMRI計測によって解明するとの本研究目的に、直接的回答を与える成果であると評価している。本年度は、まず神経回路特異的に遺伝子操作を行う技術基盤として、神経経路特異的に3種類以上の遺伝子導入を行う方法の開発に成功した(Matsuyama et al., 2015)。この研究では、鶏肉腫白血病ウイルスavian sarcoma leukosis virus (ASLV)の宿主特異性に基づいて、ASLVの複数のエンベロープと複数の受容体から、互いに特異性が直交する組み合わせを構成して、それが実際に視床ー皮質回路において発現特異性を示すことを証明した。即ち、ASLVエンベロープ(EnvA, EnvB, EnvC, EnvE)と受容体(TVA950, TVBS3, TVC, TVBT, DR-46TVB)の全ての組み合わせからin vitroスクリーニングによって候補を絞込み、in vivo発現テストによって最終的にTVA-EnvA, TVBS3-EnvB, DR-46TVB-EnvEの組み合わせが、2.5%以下のcross-reactivityで、哺乳類大脳でも発現特異性を示すことを証明した。また実際のサル大脳ネットワークおよび行動レベルで、特定の大脳領域の機能障害がこれらに与える影響を予測する技法を開発した(Osada et al., 2015)。更に、記憶の想起を支える大脳ネットワークの動作原理を、領域間信号と皮質層間信号を同時に記録・解析する手法により明らかにした(Takeda et al., 2015)。この研究では、複数の記録チャンネルを持つ電極を使用して側頭葉の皮質層間の信号を記録する新しい方法を導入して、皮質層間にまたがる神経回路がトップダウン信号によって活性化されることが重要であることを示した。これらの結果は、サル大脳ネットワークの大域構造を解明する本研究目的の推進に大きく貢献する成果であると評価している。ウィルス投与によるサル大脳皮質組織障害、ことにラットにおける結果からは予想できなかった霊長類に固有の組織脆弱性に由来する組織障害の問題によって、一部の実験は試行錯誤を余儀無くされたが、これらの組織障害の問題はすでに克服された。現在、当初計画どおり、サル大脳における光遺伝学的擾乱の行動レベルへのインパクトについて研究が進んでおり、今後も予定以上の成果が見込まれると考えている。本年度は、まずメタ記憶課題遂行中のサル大脳ネットワークの機能抑制擾乱時ダイナミクスの解析に大きな成果を挙げた(Miyamoto et al., Science 2017)。再認の成功・不成功に関する自己の確信度を判断する課題(メタ記憶課題)をサルに訓練した。ヒトと同じ精神物理学的指標であるmeta-d'やФを用いてサルの行動を評価し、サルが実際にメタ記憶課題を正しく遂行していることを示した。その上で、fMRI計測によって2つの「メタ記憶」関連領域(前頭葉9野,6野)を同定した。
戦略的人材開発の日欧比較研究:産学官連携によるグローバル人材開発

グローバル化が加速する21世紀の世界経済の中で、国際的に活躍できる「グローバル人材」の開発が要請されるなか、本研究は日本とヨーロッパで戦略的人材開発がどのように行われているかを比較・分析した。まず第1に、ヨーロッパのエラスムス・プラス(ERASMUS+)にみられる産学官連携によるグローバル人材開発の実態を調査する。フランス、ドイツ、スイス、日本の高等教育機関(大学、ビジネススクール等)の海外インターンシップや大学と企業の連携教育プログラム等グローバル人材開発の実態を比較・分析し、産学官連携によるグローバル人材開発の課題を検討した。研究成果は、二神枝保「産学官連携によるグローバル人材開発:日欧比較の視点からの分析」(産学官連携トランスナショナルHRM研究会早稲田大学2016年9月16日)、および二神枝保・村本由紀子「従業員のしごと能力開発とキャリア・プランに関する研究:日本企業とスイス企業の比較分析」(しごと能力研究学会第9回全国大会慶應義塾大学2016年10月29日)で報告した。以上のように、産学官連携によるグローバル人材開発の課題について検討し、戦略的人材開発の日欧比較を研究した。昨年度は、ヨーロッパと日本における多国籍企業のグローバル人材開発やキャリア・マネジメントについてのアンケート調査のデータを分析し、仮説を検証した。研究成果として、昨年度は、二神枝保「産学官連携によるグローバル人材開発:日欧比較の視点からの分析」(産学官連携トランスナショナルHRM研究会早稲田大学2016年9月16日)、および二神枝保・村本由紀子「従業員のしごと能力開発とキャリア・プランに関する研究:日本企業とスイス企業の比較分析」(しごと能力研究学会第9回全国大会慶應義塾大学2016年10月29日)について学会報告を行い、研究成果について専門家と貴重な意見交換も行った。グローバル化が進展する中、国際的に活躍できる「グローバル人材」の開発も要請されている。本研究は、日本とヨーロッパでグローバル人材の戦略的人材開発がどのように行われているかを比較・分析している。第1に、欧州のエラスムス・プラス(ERASMUS+)にみられる産学官連携によるグローバル人材開発の実態を調査した。研究成果として、二神枝保「産学官連携のキャリア・マネジメント:日欧比較の視点からの展望」(『横浜経営研究』第38巻第3・4号、pp.109-117、2018年)および二神枝保ほか編著『キャリア・マネジメントの未来図:ダイバーシティとインクルージョンの視点からの展望』(八千代出版、2017年)を執筆し、書籍として出版した。以上のように、産学官連携によるグローバル人材開発の現状と課題について検討し、戦略的人材開発の日欧比較を研究している。昨年度は、産学官連携によるグローバル人材開発の現状と課題について検討し、戦略的人材開発の日欧比較を研究した。第1に、フランス、ドイツ、スイス、日本の高等教育機関(大学、ビジネススクール等)の海外インターンシップや大学と企業の連携教育プログラム等産学官連携によるグローバル人材開発の実態を比較・分析した。日欧の産学官連携によるグローバル人材開発の現状と課題については、二神枝保「産学官連携のキャリア・マネジメント:日欧比較の視点からの展望」(『横浜経営研究』第38巻第3・4号、pp.109-117、2018年)および二神枝保ほか編著『キャリア・マネジメントの未来図:ダイバーシティとインクルージョンの視点からの展望』(八千代出版、2017年)で考察している。国際学会に出席し、研究報告を行い、国際的な研究ネットワークのなかで意見交換をする必要が生じたため。国際学会への参加費及び渡航費などに使用する。
植物の超塩基性土壌への適応進化：シュンジュギクの比較ゲノム解析

本研究では、蛇紋岩植物であるシュンジュギクについて、その進化の遺伝的背景および土壌適応の分子機構を明らかにするための解析を行った。ミヤマヨメナとシュンジュギクを含む38集団について、核SSRによる集団構造解析を行った。解析の結果、全体は地理的なまとまりを持つ3つのグループに分かれることが明らかになった。またシュンジュギクは、少なくとも愛知と三重・高知で2回独立に平行進化したことが示唆された。また、RNA-seqによるリファレンス作成と多型検出、遺伝子発現プロファイルの比較を行った結果、重金属耐性に関わると思われるGOを持つ遺伝子を探索した所FRD3が候補に上がった。25年度は、ミヤマヨメナについては近畿地方と中国地方で4カ所、シュンジュギクについては四国の高知県錦山にてサンプリングを行った。従来のサンプルと合計すると、シュンジュギクについては現在知られているすべての産地の3カ所(高知、伊勢、三河)、ミヤマヨメナは、8カ所となる。これらの集団サンプルについて以下のような調査・研究を行った。形態観察:各サンプルで葉や頭花のサイズ・形などの形態的特徴について計測を行い、種内の形態変異を調査した。その結果、蛇紋岩地域の植物では、葉のサイズ、頭花サイズ、小花数が有意に小さいという結果が得られた。遺伝的変異の解析: SSR(マイクロサテライト)を作成するため、ミヤマヨメナについてRNA-seq解析を行い、平均134bp長の約40万配列を得た。この配列をアセンブルした結果、約4万のconfigを得た。この配列に対し、SSR部位の検索を行って、100個のプライマーセットを作成した。ミヤマヨメナとその蛇紋岩地域の変種のシュンジュギクについて、このプライマーセットを試した結果、4遺伝子座について使用可能であった。この4遺伝子座について集団サンプリングした試料について解析を行った。その結果から遺伝的な類似から系統樹を作成したが、シュンジュギク3集団は、独立したクラスターを作らなかった。また、やストラクチャー解析によっても同一のクラスターにならなかった。この結果は、シュンジュギクが単系統ではなく、それぞれの地域で蛇紋岩土壌に独立の適応がおこったという仮説を支持するものである。遺伝子発現プロファイルの比較:ミヤマヨメナとシュンジュギクの各1個体の根からRNAを抽出した後、次世代シークエンサを用いてRNA-seq法により、根における遺伝子の発現遺伝子解析を行った。結果の解析は25年度中には終了しておらず、26年度に葉の発現プロファイルと同時に行う予定である。1.系統解析と遺伝構造昨年度作製したSSR用プライマー7セットを用い、本年度採集したサンプルの遺伝解析を行った。昨年度のデータを合わせた結果、A)ミヤマヨメナとシュンジュギクのNJ系統樹。全体は2系統からなり、シュンジュギクは全てその1系統に属し、さらに静岡-愛知および三重県・四国の2系統に分かれること、B)ストラクチャー解析の結果、ΔKの値よりK=2を最適値となり、日本海側と太平洋側の集団は異なるクラスターに由来する可能性が示唆され、シュンジュギクは太平洋側のクラスターに由来することが明らかになった。2.RNA-seqによるリファレンス作成と多型検出NGSによる発現定量解析・多型解析のため、ミヤマヨメナとシュンジュギクについて、RNA-seqリファレンス配列を作成した。また蛇紋岩適応に関わることが示唆されている遺伝子がシュンジュギクでの蛇紋岩適応に関わるかを検討するため、リファレンス配列からミヤマヨメナホモログを選び、そこにシュンジュギクのリードをマップすることで多型の検出を行なった。ミヤマヨメナMRS2-4とCAX1-3ではシュンジュギクとの間に非同義多型が検出された。3.栽培実験蛇紋岩土が生育に与える影響を知るため、培養土あるいは蛇紋岩土(三重・朝熊山)で、ミヤマヨメナを栽培した。その結果、A)蛇紋岩土で栽培した植物は、成熟葉が早く枯れる、B)蛇紋岩土でも、新たな葉形成は播種後4ヶ月以降も止まらず、全体が枯死することも少ない、C)播種後1ヶ月後の本葉第一葉の葉サイズおよび根の長さには差がなかった。蛇紋岩土が、根や葉の形態形成に直接与える影響は小さい可能性があることが明らかになった。そのため、蛇紋岩土自体が、ミヤマヨメナの生育を阻害する可能性が示唆された。1.系統解析と遺伝構造本年度は中国・四国地方を中心にサンプリングを行った。昨年度までの集団に加えて解析を行った結果、a)従来の結果と同様に、シュンジュギクの多起源仮説を支持した;b)日本海側の集団は太平洋側の集団と異なるクラスターを形成したことが明らかになった。2.RNA-seqによるトランスクリプトーム解析これまでの解析より、シュンジュギクはミヤマヨメナと比べてNiに耐性である可能性が示唆された。そこでシュンジュギクの蛇紋岩適応に関わる遺伝子候補を単離するために、Ni(NO3)2添加栄養液(0, 50 mM)で栽培したシュンジュギクとミヤマヨメナの根由来の転写産物について網羅的比較解析を行なった。

ミヤマヨメナとシュンジュギクにおいて、両条件で共通に発現変動する転写産物をスクリーニングした結果、Proton transport、Response to oxidative stress、H2O2 catabolic process、Nitrogen fixationなど、ストレス応答や重金属輸送に関わる可能性がある転写産物が含まれていた。3.栽培実験シュンジュギク自生地土壌にはニッケルが多いことから、過剰量のニッケルに耐性を持つ可能性があると考えられる。ここではミヤマヨメナにおけるニッケル障害の症状を確認すると共に、シュンジュギクのニッケル耐性の有無について検討した。ミヤマヨメナをニッケル入り栽培液で30日栽培し根と地上部の乾重、クロロフィル量を測定した。成長への影響は比較的少なく、クロロシスが顕著であった。また、ニッケル入り栽培液で18日間栽培し生育の違いを調べた結果、シュンジュギクはミヤマヨメナと比較してネクローシス・成長量低下の程度が軽くニッケル耐性であると考えられた。日本海側に倍数体集団を調査により発見した。シュンジュギクの起源を明らかにするためにはその集団を研究に加える必要があり、日本海側の集団サンプリングを追加で行ったため。その他の研究は順調に進行した。キク科ミヤマヨメナ(Aster savatieri, 2n=2x=18)は本州から九州までの湿潤な林床に生育する日本固有の多年草である。一方、その小型変種であるシュンジュギク(var. pygmaeus , 2n=2x=18)は愛知・三重・高知県の限られた蛇紋岩地に隔離分布し、非蛇紋岩型の祖先種が蛇紋岩地帯に侵入した後に分化したことが、これまで本研究で行った系統解析により示唆されている。28年度は、蛇紋岩植物シュンジュギクの土壌適応に重要な役割を果たしたと考えられる遺伝子候補を同定するため、遅れていたRNA-seq法を用いたミヤマヨメナとシュンジュギクの根由来の転写産物の網羅的比較解析を行った。ミヤマヨメナの根からmRNAを抽出してcDNAライブラリを作成後、Illumina社の次世代シークエンサーで100 bpペアエンドで配列を読んだ所37 Mのリードが得られた。これをアセンブルして74,818 contigsが得られ、ブラストサーチの結果42,022 contigsが、GO mappingでは36,142 contigsがアノーテーションされた。この結果に対し、ミヤマヨメナとシュンジュギクを、それぞれニッケルを含まない培養土と50μm含む培養土で育てた根からのmRNA配列をマッピングした。その上で、ミヤマヨメナとシュンジュギクで発現量が5倍以上異なる転写ユニット(遺伝子)を抽出した所、Ni: 0特有は169個、Ni:50特有が62個、両者で異なるものが23個となった。この中から重金属耐性に関わると思われるGOを持つ遺伝子を探索した所The MATEeffluxfamily protein (ferric reductase defective3: FRD3)が候補に上がった。この遺伝子は、重金属をキレートすることで、重金属耐性に関わる可能性がある。本研究では、蛇紋岩植物であるシュンジュギクについて、その進化の遺伝的背景および土壌適応の分子機構を明らかにするための解析を行った。ミヤマヨメナとシュンジュギクを含む38集団について、核SSRによる集団構造解析を行った。解析の結果、全体は地理的なまとまりを持つ3つのグループに分かれることが明らかになった。またシュンジュギクは、少なくとも愛知と三重・高知で2回独立に平行進化したことが示唆された。