hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ネフロネクチンによる制御性B細胞分化抑制機序の解明と新規自己免疫疾患治療法の開発

当研究室では、細胞外基質ネフロネクチン(Npnt)が自己免疫疾患を増悪化させる機能を有することを見出している。その後の研究から、Npntによる自己免疫疾患増悪化機構はNpntのカルシウム結合能を介した制御性B細胞(Breg分化)抑制によると予想した。そこで、Npnt内のカルシウム結合領域をカルシウムオーバーレイアッセイを用いて同定し、その領域に対する抗体が自己免疫疾患抑制能を有することを明らかにすることを目的に実験を進めた。NpntはEGF様リピート、Link、MAMドメインの3つの領域から構成されることから、まず、それぞれのドメインのみからなる変異体を作製し、カルシウム結合能を検討した。その結果、細胞接着配列RGDモチーフを有するLink領域内にカルシウム結合領域が存在することが分かった。アミノ酸配列解析から、EGF領域にカルシウム結合領域があることが予想されていたが、本結果はその予想と異なる結果であった。Link領域をさらに細かくした変異体を作製し、カルシウム結合能を検討した結果、RGDモチーフのN末側にカルシウム結合領域が存在することを明らかにした。そこで、その領域のペプチドを合成し、キャリア導入した抗原をウサギに免疫することで、Npntのカルシウム結合領域に対する抗体を作製した。当該抗体の自己免疫疾患抑制効果を多発性硬化症マウスモデルEAEを用いて検討した結果、残念ならが弱い増悪化抑制効果しか示さず、Npntカルシウム結合能はEAEには大きく関与しないことが分かった。NpntのBreg抑制機構は、新たなメカニズムが関与すると考え、Npnt結合分子の同定を質量分析にて試み、自己免疫疾患増悪化の関与が示されている分子を見出すことができた。現在、その分子によるBreg抑制効果の検討を進めている。ネフロネクチン(Npnt)は、α8β1インテグリンを受容体として腎臓発生に関与する細胞外基質である。申請者は、自ら確立したNpntELISA定量系を用いることでNpntが種々の自己免疫疾患マウス血中で発現亢進すること、Npntに対するポリクローナル抗体は自己免疫疾患モデル増悪化を抑制することを見出した。Npnt受容体α8β1インテグリンに対する中和抗体を新たに作製して検討したが、予想外に抗α8β1インテグリン抗体は自己免疫疾患の増悪化に影響を与えないことから、Npntはα8β1インテグリンを介さない新たな機序により自己免疫疾患を増悪化させることが分かった。NpntはB細胞活性化に伴い発現し、アミノ酸配列解析からNpnt内にCa2+結合領域が推定されたことから、B細胞とCa2+に着目した機能を検討した結果、NpntはCa2+結合能を有しNpnt添加によりB細胞内へのCa2+流入を抑制できることが分かった。国内グループからのB細胞内へのCa2+流入増大がBreg分化を亢進させるという報告から、NpntとBregとの関係性を推察し、B細胞活性化の際にNpntを添加した結果、Bregの特徴であるIL-10産生B細胞の割合がNpnt濃度依存的に減少することを明らかにした。そこで、本研究では、Npnt上のCa2+結合領域に対する抗体がBreg分化抑制の阻害と自己免疫疾患増悪化への抑制効果を示すことを最終目的とし、本年度はその中でNpnt上のCa2+結合領域の同定を目的として研究を進めた。具体的には、NpntはEGFリピート、Link、MAM領域から構成されることから、それぞれの領域からなるタンパク質を精製し、放射性同位体45Caを用いてどの領域とカルシウムが結合するかの検討を進めている。2016年4月から福山大学薬学部に異動となり、研究室のセットアップから開始する必要があった。本研究に使用する試薬や機器の準備に時間を要したことから、進捗が遅れてしまった。現在は、セットアップが完了し、本研究を開始することができている。ネフロネクチン(Npnt)のカルシウム結合部位を明らかにするため、様々な遺伝子構築を作製し、293細胞に遺伝子導入することで上清から様々なNpnt変異体タンパク質を精製した。Npntのカルシウム結合部位の同定は、放射性同位体Ca45によるカルシウムオーバーレイアッセイにより進めた。NpntはEGFリピート、Link、MAM領域から構成されているが、モチーフ解析からCa2+結合部位はEGF内に存在することが推察された。しかしながら実際にはCa2+はEGFリピートとは結合せず、Linkと結合することが分かった。Link内をさらに細かくした変異体を作製することで解析を進めており、現在、合成できるペプチド長までCa2+結合部位を明らかにしつつある。近いうちに抗体作製に取りかかることができる。Npntのカルシウム結合部位をCa45にて同定したら、次に当該部位が実際に細胞内Ca流入を抑制できることをFluo-4を用いた細胞内カルシウム流入試験により検討する。また制御性B細胞への影響を検討するために、脾臓細胞からB細胞を分離してB細胞活性化によるIL-10産生への影響を検討する。現在、それらの手技の確立も同時に進めている。また当研究で作製したサンドイッチELISA系を用いることで、珪肺症患者と強皮症患者で血中Npnt発現が亢進していることが分かった。珪肺症患者や強皮症患者は、自己免疫が亢進している場合が多いことから、ヒトにおいてもNpntと免疫疾患との関与を示唆する結果を得ることができた。2016年度に福山大学に赴任して、研究室のセットアップから開始する必要があり、研究機材の確保や試薬調整に多くの時間を要した。その後、実験を開始することができたが、初期の遅れを取り戻すことができていない。しかしながら、現在の実験経過は順調である。

当研究室では、細胞外基質ネフロネクチン(Npnt)が自己免疫疾患を増悪化させる機能を有することを見出している。その後の研究から、Npntによる自己免疫疾患増悪化機構はNpntのカルシウム結合能を介した制御性B細胞(Breg分化)抑制によると予想した。そこで、Npnt内のカルシウム結合領域をカルシウムオーバーレイアッセイを用いて同定し、その領域に対する抗体が自己免疫疾患抑制能を有することを明らかにすることを目的に実験を進めた。NpntはEGF様リピート、Link、MAMドメインの3つの領域から構成されることから、まず、それぞれのドメインのみからなる変異体を作製し、カルシウム結合能を検討した。その結果、細胞接着配列RGDモチーフを有するLink領域内にカルシウム結合領域が存在することが分かった。アミノ酸配列解析から、EGF領域にカルシウム結合領域があることが予想されていたが、本結果はその予想と異なる結果であった。Link領域をさらに細かくした変異体を作製し、カルシウム結合能を検討した結果、RGDモチーフのN末側にカルシウム結合領域が存在することを明らかにした。そこで、その領域のペプチドを合成し、キャリア導入した抗原をウサギに免疫することで、Npntのカルシウム結合領域に対する抗体を作製した。当該抗体の自己免疫疾患抑制効果を多発性硬化症マウスモデルEAEを用いて検討した結果、残念ならが弱い増悪化抑制効果しか示さず、Npntカルシウム結合能はEAEには大きく関与しないことが分かった。NpntのBreg抑制機構は、新たなメカニズムが関与すると考え、Npnt結合分子の同定を質量分析にて試み、自己免疫疾患増悪化の関与が示されている分子を見出すことができた。現在、その分子によるBreg抑制効果の検討を進めている。NpntはEGFリピート、Link、MAM領域から構成されている。Npntのアミノ酸解析からEGFリピート内に3カ所のカルシウム結合推察領域があることが分かった。そこでNpntのカルシウム領域がどの領域内に存在するかを放射性同位体45Caを用いたカルシウム結合アッセイにて解析した結果、EGFリピート領域とは45Caは結合せず、Link内に結合領域が存在する可能性を得ることができた。現在、本結果の再現性の確認実験を行っており、今後、さらに領域を絞ったNpnt変異体を作製し45Caとの結合領域を同定することを目指す。また、Npntはカルシウム結合ではなく異なる経路で自己免疫疾患に関与する可能性もある。そのため、Npntの新たな受容体を発現クローニングで試みる予定である。Npntのカルシウム結合部位をペプチド合成可能レベルまで同定し、そのペプチドに対する抗体を作製する。抗体は、まずはウサギポリクローナル抗体を作製するが、モノクローナル抗体の作製も検討する。得られた抗体を用いることで、制御性B細胞の関与が示唆されている実験的自己免疫性脳脊髄炎EAEモデルにおけるNpntのカルシウム結合部位の役割を明らかにする。
全身性エリテマトーデスにおける病原性T細胞の同定とその分子生物学的性状解析

研究代表者らは,3例のSLE患者より自己リンパ球混合培養反応を基本として,4株の自己反応性T細胞クローン(YK6,SN6,KI50,KI52)を樹立した.これらの自己反応性T細胞クローンは自己B細胞に特異的に増殖反応を示し,その反応性はHLAクラスII分子(SN6はDQ,KI50はDR14)に拘束されていた.これらのクローンのサイトカイン産生性をRT-PCR法により解析したところ,YK6,SN6はTh2型であり,KI50はTh0型,KI52はTh1型を示した.このうちTh2型およびTh1型の3クローンは自己B細胞の抗体産生をポリクローナルに補助し,抗DMA抗体,抗SS-A抗体などの自己抗体のみならず,外来抗原であるテタヌス毒素に対する抗体産生も強く補助した.一方,Th1のサイトカイン産生性クローンは積極的な抗体産生誘導能を示さなかった.以上の成績は,Th2型あるいはTh0型の自己反応性T細胞がSLEの病態形成に重要であることを示すともに,このサイトカイン産生性をTh1型に制御することが治療手段として有用であることを示唆している.これらのT細胞クローンがどのような自己抗原を認識しているかは,明らかにしていない.また,T細胞レセプターのVβ鎖のDNA配列をそのPCR産物よりdirect sequencingを行い解析した結果ではCDR3領域に共通性を認められなかった.研究代表者らは,3例のSLE患者より自己リンパ球混合培養反応を基本として,4株の自己反応性T細胞クローン(YK6,SN6,KI50,KI52)を樹立した.これらの自己反応性T細胞クローンは自己B細胞に特異的に増殖反応を示し,その反応性はHLAクラスII分子(SN6はDQ,KI50はDR14)に拘束されていた.これらのクローンのサイトカイン産生性をRT-PCR法により解析したところ,YK6,SN6はTh2型であり,KI50はTh0型,KI52はTh1型を示した.このうちTh2型およびTh1型の3クローンは自己B細胞の抗体産生をポリクローナルに補助し,抗DMA抗体,抗SS-A抗体などの自己抗体のみならず,外来抗原であるテタヌス毒素に対する抗体産生も強く補助した.一方,Th1のサイトカイン産生性クローンは積極的な抗体産生誘導能を示さなかった.以上の成績は,Th2型あるいはTh0型の自己反応性T細胞がSLEの病態形成に重要であることを示すともに,このサイトカイン産生性をTh1型に制御することが治療手段として有用であることを示唆している.これらのT細胞クローンがどのような自己抗原を認識しているかは,明らかにしていない.また,T細胞レセプターのVβ鎖のDNA配列をそのPCR産物よりdirect sequencingを行い解析した結果ではCDR3領域に共通性を認められなかった.
ROPマウス網膜のプロテオミクストラジェクトリの構築と毛細血管再形成機序の解明

未熟児網膜症(ROP)モデルマウスにおける血管新生とその後の退縮・毛細血管再形成までのメカニズムの解明するために、我々はまず、出生後(P)712日目に高酸素暴露を行ってROPモデルマウスを作製した。血管新生とその後の退縮・毛細血管再形成をフルオロセイン潅流後に、蛍光顕微鏡下で確認し、P14(相対的低酸素時)、P17(血管新生最大時)、P21(新生血管退縮時)、P28(毛細血管形成時)の4時系列とさらにP35の1時系列を加えてマウス網膜サンプルの採取と同時系列のコントロール網膜の採取も行った。時系列毎に4個の網膜を1回の2次元電気泳動のサンプルとして網膜を採取、さらに1群につき6回の2次元電気泳動を行う分として合計で240網膜を採取して、2次元電気泳動を行った。泳動ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色し、各群6枚の電気泳動ゲル、合計60枚のゲルの画像解析を行い、各ゲルで600個以上のタンパク質スポットを検出した。その後、各時系列のコントロールと比較し、ROP群で2倍以上、かつ有意差のあるゲル上のスポットを抽出したところ、それぞれの時系列で複数のスポットが見つかり、現在、質量分析計でそのタンパク質の同定を行っている。これとは別に、発達途中で一時的に発現上昇するNDRG1のROPモデルマウスでの発現変化も調べたところ、発現上昇がみられ、血管新生への関与が示唆された。一方で、血管新生機序の別の観点から、糖尿病網膜症モデルラットを作製し、こちらも2,12週での比較を行い、タンパク質の同定を完了した。これらのタンパク質の中には、直接血管新生に関わるという報告のあるタンパク質は見つからなかったが、いくつかのストレス反応性タンパク質の発現変化があり、血管新生前にストレス反応性タンパク質の関与が示唆された。未熟児網膜症(ROP)モデルマウスにおける血管新生とその後の退縮・毛細血管再形成までのメカニズムの解明するために、我々はまず、出生後(P)712日目に高酸素暴露を行ってROPモデルマウスの作製を試みた。既報の方法に従い作製を試みたが、高酸素曝露から2,3日で母マウスが死ぬため、チャンバー内の酸素流量と濃度、そしてチャンバーの密封性の検討が必要となった。結果として流量1L/minで適度に酸素が漏れる状況にすることによって、ROPモデルマウスの作製が可能となった。P14(相対的低酸素時)、P17(血管新生最大時)、P21(新生血管退縮時)、P28(毛細血管形成時)の4時系列とさらにP35の1時系列を加えてマウス網膜サンプルの採取と同時系列のコントロール網膜の採取も行った。時系列毎に4個の網膜を1回の2次元電気泳動のサンプルとして網膜を採取、さらに1群につき6回の2次元電気泳動を行う分として合計で240網膜を採取した。この時、一部のマウスはフルオロセインの潅流を行い、各時系列での網膜の無血管野形成や新生血管形成、さらに毛細血管再形成などの確認を行い、ROPモデルとしての妥当性の確認を行った。現在、採取した網膜を細胞溶解液でホモジネートと超音波処理をして泳動サンプルとして2次元電気泳動を行い、クーマシーブリリアントブルー染色した各群6枚の電気泳動ゲル、合計60枚のゲルの画像解析を行っており、自動解析では各ゲルで600個以上のタンパク質スポットが検出され、現在、マニュアルによるスポットマッチングの修正を行っている。
乳酸桿菌による自然免疫賦活化作用に関与する菌体因子の解明

L. caseiのAsnHは細胞壁抽出物存在下においてのみ酵素活性を示した。また、asnH変異株では特徴的な厚く、緻密な細胞壁構造は損なわれることが明らかになり、asnHは細胞壁構造形成に関与することが示唆された。すなわち、L. caseiの有するasnHは細胞壁合成に関与し、自然免疫賦活化を示すことが示唆された。1AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連の解明大腸菌にて大量発現したAsnHタンパク質について、Amplex Red glutamic Acid/Glutamate Oxidaseassaykitを用いてAsnH酵素活性を算出した。乳酸桿菌細胞壁抽出物を基質として用いた際、asnH遺伝子を有し自然免疫賦活化作用を示す菌株のみ活性は認められた。一方、アスパラギン酸を基質として用いた際にはすべてにおいて活性は認められなかった。すなわち、AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連が示唆され、かつAsnHは細胞壁構造形成に関与することが推察された。2乳酸桿菌の菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との関連の解明定常期の菌体を走査型(SEM)および透過型(TEM)電子顕微鏡により観察、比較したところ、SEM撮影像ではasnH遺伝子を有する菌株において表層構造は多数の突起のようなものに覆われているのに対し、変異株ではこれらの突起は認められなかった。TEM撮影像ではasnH遺伝子を有する菌株においてペプチドグリカン層および表層多糖層が明瞭に認められたが、変異株ではペプチドグリカン層、表層多糖層ともに明瞭には認められず、ペプチドグリカン層においては有意に薄いことが明らかになった。また、asnH変異株ではJ1ファージであるレセプターである菌体表層多糖D-ガラクトサミンが欠失している。そこで、野生株およびasnH変異株の菌体表層成分をゲル濾過クロマトグラフィにより比較したところ、asnH変異株では多糖-ペプチドグリカン複合体(PS-PG)の一部に欠失が認められた。以上のことから、asnH変異株ではペプチドグリカンだけでなく表層多糖構造も欠失していることが示唆され、欠失が認められたPS-PGがL. casei ATCC 27139の自然免疫賦活化に関与する構造であると考えられた。(1) AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連の解明(研究計画1)AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連を明らかにするため、野生株およびasnH変異株のasnH遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製し、大腸菌にて大量発現および精製したAsnHタンパク質について、乳酸桿菌細胞壁抽出物を基質に、Amplex Red glutamic Acid/ Glutamate Oxidaseassaykitを用いてAsnH酵素活性を算出した。その結果、asnH遺伝子を有し自然免疫賦活化作用を示す菌株のみAsnH酵素活性を示すことが示唆された。一方、乳酸桿菌細胞壁抽出物の代わりにアスパラギン酸を基質として用いたところAsnH酵素活性は認められなかった。すなわち、AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連が示唆され、AsnHは細胞壁構造形成に関与することが推察された。(2)乳酸桿菌の菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との関連の解明(研究計画2)菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との関連を明らかにするため定常期の野生株、asnH変異株およびasnH相補株の菌体を走査型および透過型電子顕微鏡により観察、比較した。走査型電子顕微鏡像ではasnH遺伝子を有する菌株では菌体表層構造は多数の突起のようなものに覆われているのに対し、asnH変異株ではこれらの突起は認められなかった。一方、透過型電子顕微鏡像を用いて上記菌株の細胞壁の厚さを比較したが、これらの菌株間で細胞壁の厚さに違いは認められなかった。すなわち、AsnHは細胞壁ペプチドグリカン層形成には大きく関与しないが、菌体表層構造形成に関与し自然免疫賦活化作用を示すことが推察された。AsnH酵素活性と自然免疫賦活化作用との関連を明らかにし、研究計画1を達成した。研究計画2である菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との解明については、走査型および透過型電子顕微鏡により観察、比較し、AsnHが菌体表層構造形成に関与することを視覚的に明らかにした。現在は各菌株のペプチドグリカン断片についてLC-MS/MS解析を行いその構造の決定を試みており、研究はおおむね順調に進展している。研究計画2である菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との解明については、現在ペプチドグリカン断片についてLC-MS/MS解析を行い、その構造の決定を試みており、研究はおおむね順調に進展している。引き続き実験を行うとともに、予定通り菌体表層多糖についても構造の決定を試み、菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との関連を明らかにする。

次年度の消耗品費(1,500千円)はガスクロマトグラフィーおよび核磁気共鳴分光解析用器具・試薬購入費を計上したためである。その他の消耗品費は平成23年度とほぼ同額を想定しており、本研究で実施する細菌学的実験および分子遺伝学的実験に必要な一般的試薬等の消耗品費は、これまでに申請者が1年間で使用した量をもとに積算した。さらに今年度は学会発表用旅費(50千円)、英文論文校閲費(50千円)および論文投稿費(100千円)を計上した。
認知言語学的アプローチによる日本語学習者（中国語母語話者）の語彙知識に関する研究

中国語を母語とし、外国語/第二言語として日本語を学習する日本語学習者の語彙習得を、質(深さ)の面で支援するための基礎的研究である。学習者コーパスを対象として基本的な多義動詞の使用を観察するとともに、学習者が多義動詞の意味をどのように理解しているかを測るテストやタスクを行った。その結果、日本語学習者は、日本語教育において初級で導入されるような基本的な動詞であっても、その多義性を十分に習得できておらず、構造的な知識を有するには至っていない(意味のネットワークを構築していない)ことが明らかになった。本研究は、外国語/第二言語として日本語を学習する日本語学習者、特に、中国語を母語とする学習者の多義語習得支援の基礎研究として行っているものである。習得支援の前提として、日本語学習者の多義語に関する語彙知識がいかなるものであるかを、認知言語学的アプローチにより明らかにすることを目的としている。初年度は、調査対象語の選定と対象語の意味ネットワークの記述を計画した。しかしながら、いずれも最終的な選定、記述の完成には至らず、対象語の候補の選定と、意味ネットワークの暫定的記述に留まった。まず、対象語の選定については、現代日本語の多義語を対象として意味分析をした先行研究、辞書や日本語教育における多義語の扱いについて調査した先行研究を踏まえ、和語動詞を調査対象とすることに決定した。「習得支援」という観点から、和語動詞の中でも、「4級の語彙」(日本語能力試験出題基準【改訂版】(2002))に限ることとした。さらに、その中から、学習者が最初に学習するのが主体の動きを表す意味・用法であり、その意味・用法が基本義だと考えられる2項動詞に限ることとした。その条件を満たす動詞について、先行研究や国語辞典の意味記述を検討し、「のむ、かう、かぶる、きる、つく、でる、とる、はいる、ひく、みる」の10語を調査対象語の候補として選定した。次に、対象語の意味ネットワークについては、新聞記事を中心に実例を収集し、「比喩による意味の拡張」という観点から、内省に基づき分析・記述した。第二年次は、公開されている既存の各種学習者コーパスを対象として、日本語学習者の和語多義動詞の使用実態を調査した。その目的の一つは第一年次に選定した調査対象語候補の見直しを行うこと、もう一つの目的は学習者の多義和語動詞の使用傾向を明らかにすることであった。第一の目的については、見直しの結果、調査対象を和語移動動詞に限定することとした。その理由は、移動動詞は日本語・中国語を含む言語一般において、最も基本的なものであり、より抽象的な事象を表現するための基盤となること、それゆえに非常に多義的であること、特に物理的な移動を表す場合と抽象的な事象を表す場合とを明確に区別することができ、意味の習得プロセスが把握しやすいこと、そして、各種学習者コーパスにおいて、その使用が観察できることである。第二の目的については、和語移動動詞を対象として、学習者コーパスを観察した。既存の各種学習者コーパスは、学習者の日本語レベルの判定をしているものもしていないものもあり、しているものについてもその判定基準は一様ではない。そのため、その使用実態を一様に解釈することはできず、コーパス毎に把握するにとどまった。日本語母語話者の使用実態と比較し、母語話者と日本語学習者の和語多義動詞の使用の共通点と相違点を明らかにすることを計画していたが達成できなかったため、第3年次にもコーパス調査を継続する。学習者の和語移動動詞の使用実態をコーパス調査により明らかにすることは、テスト(質問紙調査)の項目を限定する上で極めて重要である。第四年次は、第二・第三年次に行った、コーパス調査の結果の一部を、華南理工大学・名古屋大学中日言語文化合同研究会(中国)において発表した。また、台湾新竹市において、外国語として日本語を学習する中国語母語話者(大学24年生)を対象にした調査を行い、完了した。調査の一つは、質問紙調査で、一般的な語彙力を測る語彙テストと「入る」「出る」を調査項目とした多義語テストである。もう一つは、「入る」「出る」を調査項目としたカード分類タスクである。

さらに、日本国内において、第二言語として日本語を学習する中国語母語話者を対象にした調査、及び、日本語母語話者を対象にした調査を開始し、継続している。日本語母語話者に対しては、カード分類タスクのみ行っている。調査を継続するとともに、現在その結果を分析・考察中ではあるが、上級日本語学習者であっても、日本語学習の早い段階で導入され、使用頻度が高い動詞「入る」「出る」の多義性を十分に習得できておらず、多義語の意味の理解が限定されていて、日本語母語話者のように豊かではないこと、構造的ではないことが明らかとなった。中国語を母語とする日本語学習者は、一般的に、日本語学習、特に、語彙学習には有利だと認識されているが、多義語の意味の理解における日本語母語話者との隔たりが明らかになることにより、必要とされる語彙習得支援が明らかになり、日本語教育に貢献できると考えられる。本研究は、外国語/第二言語として日本語を学習する日本語学習者、特に、中国語を母語とする学習者の多義語習得支援の基礎研究として行っているものである。習得支援の前提として、日本語学習者の多義語に関する語彙知識がいかなるものであるかを、認知言語学的アプローチにより明らかにすることを目的としている。第三年次は、第二年次に行ったコーパス調査を継続した。公開されている既存の日本語コーパス、学習者コーパスを利用して、それぞれの多義和語動詞の使用実態を明らかにし、それがどのような要因により生じているのかを考察した。既存の各種コーパスは、発話・作文が一定条件の下で集められたものではなく、大きさも質も異なるため、一律に解釈し、その傾向を掴むことはできない。また、学習者の日本語習熟度による違い、学習環境による違い、日本語母語話者との違いを簡単に結論づけることはできない。そのため一つ一つのデータを丁寧に観察し、考察することが重要である。しかし、このような調査のみでは、学習者が多義動詞の複数の意味をいかに関連づけているのか、つまり、どのような多義動詞の意味のネットワークを有しているのかを明らかにすることができないため、あわせて質問紙調査を作成・実施することを予定していた。しかし、調査方法の見直しの必要が生じ、計画通りに研究を進めることができなかった。意味ネットワークを明らかにするための方法を早急に決定し、調査を実施する計画である。本研究は、外国語/第二言語として日本語を学習する日本語学習者の多義語習得支援の基礎研究として行っているものである。最終年度に行ったことは、第3年次までの研究成果の発表と第4年次の調査の補完である。第3年次までのコーパス調査の結果を、5件の口頭発表、2本の論文として公表した。また、第4年次の調査を補完するため、日本国内で名古屋大学在学中の中国語母語話者を対象にした調査を行った。調査の一つは、「入る」「出る」を調査項目とした多義語テストである。もう一つは、「入る」「出る」を調査項目としたカード分類タスクである。「入る」「出る」といった限られた動詞を対象にした調査ではあるが、この調査から一般的な語彙力の向上とともに多義語の知識も豊かにはなるが、意味の理解は非常に限定されていて、構造的ではないことが明らかになった。
電気化学的および熱化学的手法による有機アニオンの一電子移動反応の研究

本課題の目的は、種々の型の有機マグネシウム試剤と芳香族カルボニルおよびニトロ化合物との反応における構造と反応性の相関について半定量的な基礎を得ることにある。これらの反応に一電子移動が関与することは典型的ラジカル生成物の副生により推定され、いくつかのマグネシウム試剤の電子供与能が(EDA)、酸化ピーク電位からすでに見種もられている。したがって本研究の第一の計画は、種々の基質の電子受容能(EAA)の指標として還元電位を測定することである。基質と試剤の電位の差(ΔE)値が個々の反応での一電子移動の効率の目安となる。ポーラログラフ装置を用いてカルボニルおよびニトロ化合物の還元電位をTHF-Bu_4NClO_4系で、リンツ大学のグリツナー教授の好意により提供されたビスビフェニルクロム(I)テトラフェニルボラートを内部標準として測定した。えられたΔE値はArMgBr、ArSMgBr、ArNHMgBr、ArN(MgBr)_2、ArOMgBrを含む諸試剤の15種の反応における正常および副生物の分布と相関することが判明した。第二の計画の熱化学的研究は、デンマーク工科大学のホルム教授が確立したグリニヤール反応における、電子移動の発熱的性格を、我々のMg-N-Mg結合をもつ試剤の反応に適用することである。フロー法を用いる彼の装置による反応熱測定の試みは、流速が不適当で成功しなかった。しかし、ベッマン温度計を用いるバッチ法によって観測された温度-時間曲線は、電気化学的測定値から提案した反応の分類とよく一致することが判明した。結果はまだ第一近似的な相関の域にあり、EDA-EAA原理の精密化を進めているところであるが、えられた相関々係は反応機構の研究に役立つと期待される。本原理を手引きとして、各種のマグネシウム試剤の合成化学的活用のための基礎的研究も併せて進行中である本課題の目的は、種々の型の有機マグネシウム試剤と芳香族カルボニルおよびニトロ化合物との反応における構造と反応性の相関について半定量的な基礎を得ることにある。本原理を手引きとして、各種のマグネシウム試剤の合成化学的活用のための基礎的研究も併せて進行中である昭和60年度3/4半期に購入したポーラログラフ装置は、本研究に極めて大きな効果をもたらした。その内容を以下の4項目に記す。1.有機マグネシウム試剤(ArMgBr,ArN【(MgBr)_2】,ArNHMgBr,ArSMgBr,ArOMgBr)の芳香族カルボニルおよびニトロ化合物との反応において、試剤の一電子酸化電位と基質の一電子還元電位との組合せによって、反応様式が付加・縮合・置換の何れかに拘わらず、正常生成物と異常生成物との收率分布がほゞ規定されることが明らかになった。さらに、2.みかけ上例外的な場合についても、反応初期の基質から試薬マグネシウム原子への配位による基質または試剤の電位の変化(実効電位)を考慮することにより、上記の相関々係が成立すること、3.この相関は、ベンゼン系カルボニルおよびニトロ化合物と上記5種のマグネシウム試剤の反応の機構論および分子軌道法的解釈に貢献し、さらにそれらの反応の応用における生成物の收率予測に役立つこと、4.基質がベンゼン系以外のシクロペンタジェニル基やC=C基をもつ場合には、他の要素ーたとえばArN【(MgBr)_2】試剤の反応では一電子移動につづく不均化によるニトレン様反応種の寄与ーが無視できなくなること。以上が、本研究課題のうち「電気化学的」手法による大きな成果の概要である。「熱化学的」手法についてはT.Holm教授(デンマーク工科大)を訪問し検討した結果、上記5種の試剤のうち電子供与能が最強のグリニャール試剤については有効であるが、本課題で中心的に研究されたArN【(MgBr)_2】

試剤は4番目の弱い電子供与体であるため、現在最も信頼性のある同教授の測定装置でも反応熱の検知ができず、残念ながら適用不可能であった。今後、電気化学的手法の活用により、検討する基質の範囲を拡げ、反応理論の確立につとめる計画である。
海産種子植物アマモの種子休眠と発芽に関する生理学的・分子生物学的研究

海産種子植物アマモの種子休眠と種子発芽の生理メカニズムを明らかにするため,生理学的・分子生物学的研究を行った。1.アマモ種子の生理学的解析2007年5月2日から7月6日に横須賀市走水の天然アマモ場において,正確な開花後日数の種子を採取した(開花後0-56日目)。これらの種子について形態観察と長軸長・生重量・含水率の測定を行い,形態的・生理的特徴から種子発達段階を(1)種子発達期(開花後0-21日目),(2)種子成熟期(開花後21-35日目),(3)種子休眠期(開花後35日目以降)と規定した。環境要因が成熟種子の発芽に与える影響を解析した。その結果,低海水温度(15°C)と低海水濃度,(22.5‰)が発芽に促進効果を示すこと,発芽促進効果の本質が低浸透圧であることが明らかになった。また,植物ホルモン(アブシシン酸)による発芽抑制効果も確認された。2.アマモ種子の分子生物学的解析モデル陸上植物の塩基配列を参考に,PCRによる休眠・発芽関連遺伝子の検出を試みた。合計65通りの条件でPCRを行ったが,休眠・発芽関連遺伝子(group 1 LEA,group 2 LEA,VP1/ABI3,AMY)は検出されなかった。この結果から,海産種子植物と陸上植物とでは休眠と発芽の生理メカニズムが大きく異なっている可能性が示唆された。一方,種子から単離されたZoHSP70遺伝子の発現様式から,ZoHSP70が種子成熟期の分子マーカーとして利用できることを示した。また,内部標準遺伝子としてZoEF1遺伝子とZoGP3DH遺伝子を単離し,これらがさまざまな組織で恒常的に発現していることを確認した。本研究で得られた成果は,アマモの植物生理学的研究や生物多様性研究において重要な基礎となる。また,アマモ場再生の現場においても,良質な種子の採集や発芽率の向上に応用が期待できる。海産種子植物アマモの種子休眠と種子発芽の生理メカニズムを明らかにするため、生理学的・分子生物学的研究を行った。1.アマモ種子の生理学的解析5月1日から7月12日にかけて、走水海岸(横須賀市)の天然アマモ場において、花穂のマーキング(計967本)と種子の採取(開花後0,3,7,11,14,18,21,28,32,35,42,49,56日目)を行った。種子の長軸長と短軸長は、開花後28-35日目頃まで増加した。種子総重量は開花後28日目頃まで増加し、その後減少した。種子含水率は、開花後21日目頃までは80%以上と高かったが、その後減少して開花後37日目以降では約40%で安定した。これらのことから、種子発達は開花後28日目頃まで進行し、その後水分の減少が起きることが明らかになった。成熟種子の発芽について解析した。水温18°Cでの発芽率は、通常の海水濃度では10%以下であるが、1/2海水濃度では約70%、1/4海水濃度では80%以上となった。また、1/2海水濃度での発芽率は、25°Cでは50%、18-20°Cでは70%以上となった。塩分の代わりにマニトールを用いて人工的に浸透圧を調節したところ、浸透圧が低いほど発芽率が高くなった。これらのことから、アマモ種子の発芽には低温と低浸透圧が促進的に作用することが明らかになった。2.アマモ種子の分子生物学的解析イネやトウモロコシの遺伝子配列を参考に、休眠関連遺伝子や発芽関連遺伝子の検出用PCRプライマーを作成した。アマモ種子から単離されたRNAやゲノムDNAを用いて、LEAとVP1/ABI3(休眠関連遺伝子)やAMY(発芽関連遺伝子)についてPCRクローニングを試みたが、現在まで有効なクローンは得られていない。一方、発現解析のコントロールとしてEF1遺伝子を単離し、各組織で恒常的に発現していることを確認した。

この結果から,海産種子植物と陸上植物とでは休眠と発芽の生理メカニズムが大きく異なっている可能性が示唆された。一方,種子から単離されたZoHSP70遺伝子の発現様式から,ZoHSP70が種子成熟期の分子マーカーとして利用できることを示した。また,内部標準遺伝子としてZoEF1遺伝子とZoGP3DH遺伝子を単離し,これらがさまざまな組織で恒常的に発現していることを確認した。本研究で得られた成果は,アマモの植物生理学的研究や生物多様性研究において重要な基礎となる。また,アマモ場再生の現場においても,良質な種子の採集や発芽率の向上に応用が期待できる。
農業害虫の抗ウイルス反応を阻害するウイルス因子の同定と機能解析

昆虫媒介性の植物病原ウイルス病による作物被害を食い止める新規技術開発が求められている。一方、昆虫体内で感染・増殖しているウイルスは、宿主昆虫のRNA干渉反応を阻害する因子(VSR)を産生することで、昆虫体内での抗ウイルス作用を回避していることから、こうしたウイルス因子の機能を阻害する技術が開発できれば、ウイルス媒介昆虫を標的とした画期的なウイルス伝播阻止技術となりうる。本研究ではこうした技術開発に不可欠な基礎的知見を得るため、重要な昆虫媒介性植物ウイルスを対象とし、宿主昆虫体内で機能するウイルスVSRの同定および、分子機能解明を試みることを目的とする。今年度は、ショウジョウバエ由来のS2培養細胞を用いたVSRアッセイ系を用いて、トビイロウンカが媒介するイネラギットウイルス、イネグラッシーウイルス、ツマグロヨコバイが媒介するイネ萎縮病ウイルス由来の複数のセグメント、および、その他4種類のウイルス由来のセグメントに対し、VSRの機能を有するかを調査した。ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたレポータープラスミドを、ルシフェラーゼ遺伝子の配列を有する二本鎖RNAとともにS2細胞へ導入すると、ルシフェラーゼ遺伝子のノックダウンが観察されるが、さらにウイルス由来セグメントの発現プラスミドを同時に細胞に導入した場合、このノックダウンの抑制・阻害がみられるかどうかで、VSR活性の有無を判断した。その結果、複数のセグメントにおいては明らかなVSR活性は見出されなかったが、あるウイルス由来のセグメントにおいては強いVSR活性を示し、本因子が昆虫体内でVSRとしての機能を有することが示唆された。ほぼ計画通りに進捗している。VSR活性の見られたウイルス由来のセグメントを対象に、RNA干渉経路のどのステップを阻害するのか、どのような機能を有しているのかを明らかにする。昆虫媒介性の植物病原ウイルス病による作物被害を防除する技術開発が求められている。一方、昆虫媒介で感染・増殖しているウイルスは、宿主昆虫のRNA干渉反応を阻害する因子(VSR)を産生することで、昆虫の抗ウイルス作用を回避していることから、このウイルス因子の機能阻害技術が開発できれば、ウイルス媒介昆虫を標的としたウイルス伝播を阻止できる画期的な技術となりうる。本研究では、こうした技術開発に不可欠な基礎的知見を得るため、重要昆虫媒介性植物病原ウイルスを対象とし、宿主昆虫体内で機能するウイルスVSRの同定および分子機能解明を試みることを目的とする。今年度は、ショウジョウバエ由来のS2培養細胞を用いたVSRアッセイ系を用いて、トビイロウンカが媒介するイネラギットウイルス由来のS6na、イネグラッシーウイルス由来のp2NS、ツマグロヨコバイが媒介するイネ萎縮病ウイルス由来のsegment10、ヒメトビウンカが媒介するイネ縞葉枯病ウイルス由来のNS3に着目し、VSRの機能を有するかについて調査した。まず、S2細胞にルシフェラーゼのレポータープラスミドを、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする二本鎖RNA発現プラスミドとともに導入すると、ルシフェラーゼ遺伝子のノックダウンが観察された。これに各ウイルス由来産物の発現プラスミドをさらに導入し発現させたところ、p2NSおよび、segment10の発現プラスミドを導入させたときに、有意なノックダウンの阻害が観察された。p2NSおよび、segment10については、二本鎖RNA発現プラスミドの代わりに二本鎖RNAを導入した場合でもノックダウンを阻害する効果があることが分かり、これら因子はVSRとしての機能を有することが示唆された。さらに、segment10については、カイコ培養細胞を用いたアッセイ系でも同様にVSR活性を示すことが明らかとなった。計画通りに進捗している。今回着目したウイルス由来の他の因子及び、昆虫媒介性の他のウイルス由来の因子にも着目し、ショウジョウバエ培養細胞およびカイコ培養培養を用いてVSR活性の有無について解析を進める。また、VSR活性の見られたイネ萎縮病ウイルス由来のsegment10及びイネグラッシーウイルス由来のp2NSについてはRNA干渉経路のどのステップを阻害するかについて明らかにする。

VSR活性の見られたウイルス由来のセグメントを対象に、RNA干渉経路のどのステップを阻害するのか、どのような機能を有しているのかを明らかにする。計上していた旅費については、研究代表者が学会発表を行わなかったこと、また当初予定していた契約職員の雇用を行わなかったこと、さらに、一般試薬、酵素類、培地については当初の予定よりスケールダウンしての検定等が可能だったことなどから、次年度使用額が生じた。これらについては、研究をさらに進めるため、契約職員の雇用に当てるなどして、翌年度以降に使用する予定。計上していた旅費については、研究代表者が学会発表を行わなかったこと、また当初予定していた契約職員の雇用を行わなかったこと、さらに一般試薬、酵素類、培地等については当初予定をスケールダウンしての検定が可能だったことから、次年度使用額が生じた。翌年度は最終年度となるため、次年度使用額は契約職員の雇用費にあてるなどし、計画達成を向け研究を加速化させる予定である。
広帯域波長可変fsレーザーによる時間，空間，エネルギー分解光電子顕微鏡の開発

本研究では,半導体表面の光キャリアダイナミクスを高時空間分解で観察できる時間分解光電子顕微鏡に,エネルギー分解能を付与する目的で光学系の改良を申請した.しかし,想定していなかった成果が得られた.この波長可変システムを利用することで,重大な問題である試料帯電を抑制することが可能であることが分かり,これにより,光電子検出では困難と考えられていたワイドギャップ半導体の光キャリア寿命計測に成功した.ワイドギャップ半導体は,ポストSiとして期待される材料であり,この申請研究で開発した装置が新規半導体評価装置になりうると期待され複数の半導体メーカと共同研究が始まった.太陽電池やトランジスタに代表される半導体デバイスの動作性能は,キャリアの動的特性が深く関係している.研究代表者は,フェムト秒レーザーを利用した時間分解光電子顕微鏡(TR-PEEM)を立ち上げ,高い時間・空間分解能(100 fsと50 nm)を両立して,半導体中の光キャリアの動的観測に初めて成功している.しかし,キャリア励起するためのレーザーパルス(ポンプ光)のエネルギーは,パルスレーザー源の基本波である1.2 eVとその第二次高調波である2.4 eVに制限されているため,測定や試料選定に制限があり,また,キャリアダイナミクスを詳細に説明することが困難であった.そこで,本申請研究では,ポンプ光の波長を幅広いエネルギー領域で可変にすることで,幅広い試料への適用,また,欠陥準位を介したダイナミクス観測を目的とした.本申請研究の基盤となる成果は, GaAs表面のナノスケール構造欠陥中の欠陥準位を介した超高速再結合過程の観測に成功したことである(Fukumoto et al., Review of Scientific Instruments 85, 083705 (2014)).さらに,データ解析を進めることで,欠陥ごとにキャリア寿命が異なることを見出し,その時定数からそれぞれの欠陥の欠陥準位密度の見積もりを行った.この成果は,Fukumoto et al., Applied Physics Express 8, 101201 (2015)に掲載されており2015年のSPOT LIGHT論文に選ばれた.申請研究開始と同時期に申請者が異動したため(東京工業大学から高エネルギー加速器研究機構へ),研究を迅速に遂行するためTR-PEEM装置の移設から開始した.このため,研究費の一部を移設費用に充てた.初年度(平成27年度)に計画していた,既存の波長変換器(OPA)を利用して広エネルギー領域を連続的に選択できる波長可変システム構築は順調に進み,PC制御による光電子顕微鏡の操作だけでなく,波長変換に必要な9つのモーター制御システムがほぼ完成した.研究代表者が,初年度4月に異動したこともあり,波長変換システムの構築に遅れが生じたが,初年度に予定していたOPAを利用した波長変換システムの構築は完了し,実際の測定が始まっている.初年度では,波長帯域を800 nmから2600 nmまで拡張する予定であったが,この波長域を選択した理由は,GaAsに存在する中間準位を介した再結合過程をTR-PEEMで解明することを目的のひとつとしていたためである.しかし,本申請研究で得られた成果を公表する過程で,複数の半導体メーカーからワイドギャップ半導体への応用を期待された.実際,共同研究を開始している.この経緯があり,波長域がバンドギャップを超える3.5 eVの高エネルギー側も発振できるように改良した.現状で,350 nmから2600 nmまで可変となっている.高空間分解能での測定には至っていないものの,SiCと並び開発が期待されているGaNのキャリアダイナミクスを観測できており,本申請研究はおおむね順調に進展しているといえる.申請者は,CRESTプロジェクト(代表:東京工業大学,腰原教授,20102015)に参加し,半導体表面に光励起した電子のダイナミクスが100 nmと100 fsの高い時間・空間分解能を両立して観察できる時間分解光電子顕微鏡(time-resolved photoemission electronmicroscopy: TR-PEEM)を開発している.本申請課題は,TR-PEEMの光源改良によりエネルギー分解能を追加し,励起電子の緩和過程を時間・空間・エネルギー分解計測することが目的であった.CRESTプロジェクトで装備したフェムト秒パルスレーザーのエネルギーは,0.5から2.4 eVの間で可変であったが,本研究課題により高エネルギー側を6 eVまで拡張することに成功した.得られたエネルギー分解能は40 meVであった.本研究の当初の目的は,半導体禁制帯中に存在する欠陥準位を介したキャリアダイナミクス観察であったが,装置改良・研究遂行していく過程で,思いがけなかった成果が得られた.第一に,材料のイオン化エネルギー・仕事関数が高い空間・エネルギー分解能(100 nmと40 meV)で容易にマッピングできたことである.第二に,UVレーザーパルスのエネルギーをイオン化エネルギー程度に調整できるようになったことで,重要な課題であった,光電子放出が引き起こす電子欠乏による試料帯電を大幅に抑制できたことである.これにより,測定時間の大幅な短縮,各種分解能の向上につながり,将来的に新規半導体評価装置となる可能性があるため,特許出願した.UV領域でエネルギー可変になったことで, SiやGaAsなどの典型的な半導体材料だけでなく,今後の発展が期待されるワイドギャップ半導体(SiCやGaN)のキャリアダイナミクス観察が可能となり,複数の半導体メーカと共同研究が始まり研究が大きく進展した.

本研究では,半導体表面の光キャリアダイナミクスを高時空間分解で観察できる時間分解光電子顕微鏡に,エネルギー分解能を付与する目的で光学系の改良を申請した.しかし,想定していなかった成果が得られた.この波長可変システムを利用することで,重大な問題である試料帯電を抑制することが可能であることが分かり,これにより,光電子検出では困難と考えられていたワイドギャップ半導体の光キャリア寿命計測に成功した.ワイドギャップ半導体は,ポストSiとして期待される材料であり,この申請研究で開発した装置が新規半導体評価装置になりうると期待され複数の半導体メーカと共同研究が始まった.次年度(平成28年度)は,完成した装置を利用して実際の測定を遂行する.測定対象としては,これまでに測定実績がある,グラフェンやとトポロジカル絶縁体などの2次元物質やワイドギャップ半導体を想定している.グラフェンにおいては,局所的に2原子層になっている領域は,1原子層領域と比較してキャリア寿命が長くなることを示唆する結果が得られており,高い時間空間分解能にエネルギー分解能を付与する.なお,2次元物質に関する研究は,フランスのマリー・キュリー大学のBoutchich准教授との共同研究である.GaNなどのワイドギャップ半導体デバイスは,スマートグリッドを利用した低炭素化社会の実現やIoT社会に貢献すると期待されている.そこで問題となるのが,デバイスの特性に大きく影響する欠陥特性を制御することであり,本申請研究の次年度は,ワイドギャップ半導体の欠陥特性解明にも注力する.これまでの予備的な測定から光キャリアの寿命測定に成功しており,これまで不可能と考えられていた局所的に存在するナノスケール構造欠陥のキャリアダイナミクスを選択的に観測する.半導体光物性本研究費交付開始時期に,研究代表者が東京工業大学から高エネルギー加速器研究機構に異動したことにより,装置の移設が必要となったため、前倒し申請をした。しかし、次年度の予算執行を考慮し、経費の節約したため、次年度に繰り越し額が発生した。本研究費で得られた成果を発表するための旅費に充てる。
早期消化管癌における低侵襲治療の安全性および確実性の向上を目指した注入術の開発

本研究の目的は、低侵襲治療である早期消化管癌の内視鏡的切除で生じる偶発症を抜本的に解決する策として、粘膜下層への新規加温硬化性コラーゲン・ゲル注入術の出血予防・潰瘍治癒効果を実証し、その作用機序を解明することである。また、本研究結果は、内視鏡治療の安全性を高めてその普及に貢献するのみならず、潰瘍治癒メカニズムの解明や新規治療法の創出にも貢献することが期待される。最終年度(平成30年度)は、前年の慢性実験を継続し、データ収集を続けた。本実験は、生体ブタの胃を用いた慢性実験である。仮想病変に対する胃ESDを行い、ブタを飼育、7日目, 14日後に経過を内視鏡的に観察し、画像データを取得した。さらに最終日に安楽死させて胃を摘出し、潰瘍部の状態を肉眼的・病理組織学的・免疫組織化学的検討した。慢性実験は、急性実験時と同様に順調に行うことできた。結果については、主要評価項目である内視鏡治療後の潰瘍のサイズは生理食塩水、新規加温硬化性コラーゲン・ゲルにおいて7日目、14日目で有意差を示さなかった。副次評価項目の潰瘍ステージについても明らかな差は認めなかった。また、組織病理学的評価では治療後7日目、14日目のいずれの検体でもゲルの残存は認めず、炎症所見の増加など特異的な所見も認められ図、安全性が示唆された。研究実施は、概ね計画通り進めることができたことは大変意義深かった。昨年度の実験結果、すなわち途中結果は、本年度に国内および国際学会で発表した。また、論文報告ができており、本年度の結果も同様に業績として残す予定である。本研究は、低侵襲治療である早期消化管癌の内視鏡的切除で生じる偶発症を抜本的に解決する策として、粘膜下層へのコラーゲンゲル注入術の出血予防・潰瘍治癒効果を実証し、その作用機序を解明することを目的として開始した。初年度(平成28年度)の研究計画は、1ex vivoによる注入用コラーゲンゲルの調整(条件決定)と2生体ブタを用いた非臨床試験(急性実験)にて粘膜下局注剤としての粘膜下膨隆維持性と出血抑制効果を段階的に実証することであった。1研究分担者である柚木、成田が担当した。これまでの確立したコラーゲンゲル注入術の物性制御法を用いて、生体注入用コラーゲンを12点調製した。ブタ切除胃を用いてこれらの粘膜下膨隆形成能及び病理組織学的な評価を行った。2研究代表者である浦岡が主に担当し、研究分担者である柚木、成田が材料提供した。生体ブタの胃を用いて、粘膜下膨隆形成および維持性を既存の局注剤(生理食塩水およびヒアルロン酸ナトリウム水溶液)と内視鏡的に比較した。ブタの安楽死後に胃を摘出し、肉眼的・病理組織学的な評価も行った。初年度のおける研究実施は、上記目的を達成するためのステップとして重要であり、概ね計画通り進めることができたことは意義深い。次年度には、生体ブタを用いた慢性実験を行う予定である。研究代表者と研究分担者が、実験を共同で行い、ミーティングやメール審議を重ねるなど十分な研究体制が確保されたことが、概ね順調に進展させて来られた大きな理由である。研究経費を十分に活用し、研究計画を進めることができた。1ex vivoによる注入用コラーゲンゲルの調整(条件決定)は順調であった。一方で、今後の進捗結果により微調整する可能性はある。2生体ブタを用いた非臨床試験(急性実験)にて粘膜下局注剤としての粘膜下膨隆維持性と出血抑制効果を段階的に実証するにおいても、予定数のブタを使用することができ、順調であった。病理組織学的評価が年度内に十分できておらず、次年度においても継続させる予定である。本研究の目的は、低侵襲治療である早期消化管癌の内視鏡的切除で生じる偶発症を抜本的に解決する策として、粘膜下層へのコラーゲンゲル注入術の出血予防・潰瘍治癒効果を実証し、その作用機序を解明することである。初年度には、1ex vivoによる注入用コラーゲンゲルの調整(条件決定)と2生体ブタの胃を用いた非臨床試験(急性実験)にて粘膜下局注剤としての粘膜下膨隆維持性と出血抑制効果を段階的に実証した。2年目である本年度は、生体ブタの胃を用いた慢性実験を行った。前年度に決定した1条件のコラーゲンゲルを用い、1年目と同様の仮想胃ESDを行いブタを飼育、翌日、7日、および21日後に経過を内視鏡的に観察・画像データを取得した。ESDは、急性実験時と同様に順調に行うことができた。内視鏡観察的に術後の人工潰瘍はコントロールと比べ、コラーゲンゲルを使用した群では治癒速度が速かった。術中及び術後経過中いずれの期間においても有害事象は認められなかった。

病理組織学的にも、速い治癒速度と安全性を示す所見が得られた。研究実施は、概ね計画通り進めることができたことは最終年度に向け大変意義深かった。研究代表者と研究分担者が、実験を共同で行い、ミーティングやメール審議を重ねるなど十分な研究体制が確保されたことが、概ね順調に進展させて来られた大きな理由である。研究経費を十分に活用し、研究計画を進めることができた。一方で、研究代表者の異動により、予定数のブタを使用したデータ集積が予定より遅れた。本研究の目的は、低侵襲治療である早期消化管癌の内視鏡的切除で生じる偶発症を抜本的に解決する策として、粘膜下層への新規加温硬化性コラーゲン・ゲル注入術の出血予防・潰瘍治癒効果を実証し、その作用機序を解明することである。また、本研究結果は、内視鏡治療の安全性を高めてその普及に貢献するのみならず、潰瘍治癒メカニズムの解明や新規治療法の創出にも貢献することが期待される。最終年度(平成30年度)は、前年の慢性実験を継続し、データ収集を続けた。本実験は、生体ブタの胃を用いた慢性実験である。仮想病変に対する胃ESDを行い、ブタを飼育、7日目, 14日後に経過を内視鏡的に観察し、画像データを取得した。さらに最終日に安楽死させて胃を摘出し、潰瘍部の状態を肉眼的・病理組織学的・免疫組織化学的検討した。慢性実験は、急性実験時と同様に順調に行うことできた。結果については、主要評価項目である内視鏡治療後の潰瘍のサイズは生理食塩水、新規加温硬化性コラーゲン・ゲルにおいて7日目、14日目で有意差を示さなかった。副次評価項目の潰瘍ステージについても明らかな差は認めなかった。また、組織病理学的評価では治療後7日目、14日目のいずれの検体でもゲルの残存は認めず、炎症所見の増加など特異的な所見も認められ図、安全性が示唆された。研究実施は、概ね計画通り進めることができたことは大変意義深かった。昨年度の実験結果、すなわち途中結果は、本年度に国内および国際学会で発表した。また、論文報告ができており、本年度の結果も同様に業績として残す予定である。初年度は、概ね順調に進展した。不足分は補足しながら、次年度も、研究助成交付申請書の通り、実験を進めていく。初年度、次年度と概ね順調に進展した。一方で、予定より不足した実験は、最終年度に行う。実験終了後は、実施した非臨床試験の比較および統計解析に用いる補足実験を必要に応じて追加する。また、将来の事業化を見据え、企業を含めたコンソーシアムを形成する。研究計画は概ね予定通り実施することができたが、実施が十分でなかった点があったことと、未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。研究代表者の異動により、予定数のブタを使用したデータ集積が予定より遅れた。翌年度の消耗品購入に充てる予定である。