hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非言語性知能検査UNITを利用した多文化心理教育アセスメントモデルの開発

2015年3月末時点で、UNITに関しては、日本人81人、韓国人15人、中国人24人、フィリピン15人、ブラジル15人、のデータを収集した。加えて、2016年1月にUNITの改訂版が発売されたため、UNIT2を新たに購入し、検査内容についてレビューを行った。UNIT2の発売に伴い、開発者との協議の上、今後UNIT2に関しても同様の調査を進められるようにUNITの調査数を変更し、一部調査の実施をUNIT2の使用に切り替えた。UNIT2に関しては、日本人2人、韓国人4人、中国人2人、フィリピン11人、ブラジル10人分のデータを収集した。本研究は多文化背景児童生徒の心理教育的アセスメントモデルを開発することを目的とした。平成28年度は、近年の米国における多文化心理教育アセスメントついて論じた資料論文が採択された。8月には、米国コロラド州で開催されたAPA年次大会にて、情報収集を行うとともに、UNITの開発者であるDr. Bruce Brackenとの打ち合わせを行った。さらに、同州内のUniversity of Northern ColoradoにてDr. Robyn Hessと米国の多文化支援の現状について意見交換を行い、学内の心理クリニックや障害学生支援室にも訪問した。加えて、UNITの信頼性と妥当性を検討するため、昨年度までに収集した計150名分の検査データの統計分析を進めた。概ね、文化による有意な得点差は見られなかった。結果については、国際学校心理学会2016にてポスター発表、多文化間精神医学会(宇都宮)で口頭発表をそれぞれ行い、現在、国際学校心理学会の学術雑誌であるInternational Journal of School and Educational Psychologyへ投稿し、査読中である。当初、UNITを利用した事例研究行うことを検討していたが、事例研究に適切と判断される協力者を得るのが困難であったこと、検査の実用化を想定した場合、2016年に発売された改訂版を利用して事例研究を行うことがより妥当性が高いと判断したため、本研究では事例研究は行わなかった。ただし、手続きに関する研究倫理委員会の審査承認を得る、必要な検査や文献のレビュー行うなど事例研究に必要な事前準備は行った。今後は、新たに採択された基盤(C)研究:非言語性知能検査UNIT2とC-LIMを利用した多文化心理教育アセスメントモデルの開発にて、UNIT2のデータ収集を継続・完了し、UNIT2を利用した事例研究を行う。本研究では、日本における多文化心理教育アセスメントのモデルを開発することを目的とし、米国で文化マイノリティの子どもたちに広く利用されているUniversal Nonverbal Intelligence Tests(UNIT)を日本で使用した場合の検査得点の公平性を検証するため、日本に在住する、日本人、中国人、韓国人、フィリピン人、ブラジル人の検査得点を収集し、その得点比較を行った。
合成構造物のクリープ・乾燥収縮量に関する実測、データベースの構築と応用法の研究

平成6年度までには、5回の研究・連絡会を開催して、本研究を着実に遂行した。その概要を示すと、以下のとおりである。まず、コンクリートを充填した長方形断面の6体の合成柱に関するクリープ・乾燥収縮は、約1年にわたる実験をほぼ終了した。そして、それをレオロジーモデルを用いて数理処理する手法を開発し、同定も完了して実用に供し得るデータとしてまとめた。このほか、合成桁の床版(現場打ち・プレキャスト床版とも)の乾燥収縮に伴うクリープ係数に関する実験も行う機会があったので、この成果についても、本研究成果の中に付け加えることとした。つぎに、合成構造物のクリープ・乾燥収縮量に関するデータベースとしては、本研究のために購入したソフトParadox.4.0Jを活用して、以下に示す2つのデータベースを構築した。すなわち、その1つとしては、これまでの文献に登載されている実測データに着目し、論文名、著者名、研究機関はもちろん、その研究概要、成果、ならびにキーワードなどをパソコンによって手軽に検索できるものを構築した。もう1つのものとしては、本研究で行った実験成果はもとより、これまで実施された実験結果にもとづき、合成構造部材のクリープ係数、および乾燥収縮量をデータベース化し、同様にパソコン上で検索できるようにした。そして図表化されたデータは、実際の設計業務に役立つよう、各種の設計基準とも照合できるようにした。さらに、これらの応用例として、目下、注目を集めつつある外ケーブル使用の合成桁橋のクリープ使用の合成桁橋のクリープ・乾燥収縮による応力、および変位解析用の汎用プログラムを新しく展開した理論にもとづいて構築した。そして、多くの数値解析を行って、あらゆる面から、その妥当性を検討した。以上に示したように、これら一連の研究によって、当初、計画したすべての研究が順調に進み、ほぼ完成の域に達しめることができた。平成5年度には、3回の研究・連絡会を開催して、研究代表者、および研究分担者の役割分担どおりに、本研究を着実に進めている。それらの概要を示すと、以下のとおりである。まず、コンクリートを充填した長方形断面の合成柱に関するクリープ・乾燥収縮のデータが国内外でほとんど見当たらなかったので、これらについてのデータを得るために、平成6年1月に実験を開始し、信頼度の高いデータを得つつある。そして、平成6年度中には、実験データの整理を完了し、実用に供し得るようまとめる予定である。つぎに、合成構造物のクリープ・乾燥収縮に関するデータベースについては、最も新しいソフトであるParadox 4.0Jを購入し、研究者はもちろん設計者が使いやすいように、新たなソフトを構築し、多数のデータを集積中である。そして、平成6年度中には、設計の専門家の知識も借りて、ソフトを完成させ、研究者・技術者の使用に供し得るようにしたい。さらに、合成構造物のクリープ・乾燥収縮応力の解析は、ほぼ完成の域にまで至っており、目下、これから採用される機会が多くなると考えられる外ケーブル使用の合成構造物にも適用可能なように、それらの剛性マトリックスを追加している最中である。これらのプログラムが出来上がれば、平成6年度中には、プログラムの専門家である研究分担者によって、一層汎用性のあるプログラムに改良するための準備を進めつつある。上で述べたように、本研究の目的とする項目、【.encircled1.】長方形断面のクリープ・乾燥収縮実験、【.encircled2.】クリープ・乾燥収縮のデータベースに構築、および【.encircled3.】合成構造物のクリープ・乾燥収縮解析用の汎用プログラムの開発については、現在、計画どおりいずれも順調に研究が進んでいる。今後、何か問題が起こってくれば、全員で協議し、より良き成果が得られるように努力したい。

平成6年度までには、5回の研究・連絡会を開催して、本研究を着実に遂行した。その概要を示すと、以下のとおりである。まず、コンクリートを充填した長方形断面の6体の合成柱に関するクリープ・乾燥収縮は、約1年にわたる実験をほぼ終了した。そして、それをレオロジーモデルを用いて数理処理する手法を開発し、同定も完了して実用に供し得るデータとしてまとめた。このほか、合成桁の床版(現場打ち・プレキャスト床版とも)の乾燥収縮に伴うクリープ係数に関する実験も行う機会があったので、この成果についても、本研究成果の中に付け加えることとした。つぎに、合成構造物のクリープ・乾燥収縮量に関するデータベースとしては、本研究のために購入したソフトParadox4.0Jを活用して、以下に示す2つのデータベースを構築した。すなわち、その1つとしては、これまでの文献に登載されている実測データに着目し、論文名、著者名、研究機関はもちろん、その研究概要、成果、ならびにキーワードなどをパソコンによって手軽に検索できるものを構築した。もう1つのものとしては、本研究で行った実験成果はもとより、これまで実施された実験結果にもとづき、合成構造部材のクリープ係数、および乾燥収縮量をデータベース化し、同様にパソコン上で検索できるようにした。そこで、図表化されたデータは、実際の設計業務に役立つよう、各種の設計基準とも照合できるようにした。さらに、これらの応用例として、目下、注目を集めつつある外ケーブル使用の合成桁橋のクリープ使用の合成桁橋のクリープ・乾燥収縮による応力、および変位解析用の汎用プログラムを新しく展開した理論にもとづいて構築した。そして、多くの数値解析を行って、あらゆる面から、その妥当性を検討した。以上に示したように、これら一連の研究によって、当初、計画したすべての研究が順調に進み、ほぼ完成の域に達しめることができた。
現代ヨ-ロッパの安全保障に関する総合的研究

1989年度から始まった本研究プロジェクトは、この間に期せずして起こった同年後半からのソ連・東欧諸国の変動によってヨ-ロッパで安全保障の新たな体制が模索されるに従って、新たな研究面での取り組みを要求されることになった。第一に、当初前提とした“INF"後という発想は既に“過去"の事柄となった。そのため、欧州の安全保障問題はCSCE(全欧安保協力会議)、NATO、EC、といった諸国のフォ-ラムや国際組織に即してまた検討する必要があることが判明した。第二に、これも研究計画発足後、東西ドイツ統一問題が急浮上し、当初から予定していた各国の安全保障問題を検討する上でも、ドイツをめぐる安全保障問題の研究は不可欠なことが判明し、ドイツ問題に関する研究体制を強化した。第三に、東側諸国における旧来の体制の崩壊は、東側諸国の急速な西側への接近をもたらし、他方西側諸国自体もまたその影響を受ける、と言うように欧州諸国の相互影響がしきりとなり、当初から全般的な性格の分担テ-マはもとより、国別の分担テ-マと言えども、他諸国の動向を見極めることなしには扱いきれないことが判明した。しかも第四に、こうした“東西"関係の密接化は、従来のイデオロギ-を中心とした関係からの転換と、経済問題を重要課題としたある意味での“南北"問題的様相の発生を意味していた。初年度は、こうした知見をもとに欧州安全保障の基礎概念の再検討を招聘者ヴァイリネンと共に行うと同時に、ドイツ問題の分析をドリフテと、また特にECやCSCEの中心国として欧州の重要な鍵を握るイギリスの安全保障についての検討をメンドルとの研究会の中で行った。こうして、全般的に言えば、ヨ-ロッパの安全保障問題はソ連・東欧諸国の急激な政治変動、及び1990年度に同意を見たCFE(欧州通常戦力)とCSBM(信頼・醸成措置)に関する会議の進展が示すように、軍備管理・軍縮交渉の急速な進展によって大きな転換に直面した。そうした欧州の緊張緩和の中で、第五に、新たな欧州秩序の枠組みとしてCSCEが欧州国際政治の中央に躍りでることになった。これについては、新たに招聘者に加えたゲバリとCSCEのこれまでの経緯並びにパリ会議最終文書の検討や、CSCEの機能的、実態的分析を行った。とはいえ第六に、欧州の安全保障が旧ソ連に東中欧の地域粉争や核管理の未解決問題を抱え、未だ不透明な部分を孕んでいることは否定できない。こうした点で、欧州全般の安全保障の専門家であるガスタイガ-を招聘し、CSE交渉の成果と問題点を議論し、今後の欧州の安全保障の動向について検討を加えた。さらに第七に、欧州の安全保障新秩序の構築の中で、特にNATOとECの役割変化が今後の動向を把握する上で重要になって来たため、分担者の植田と小久保を中心にこの二つの国際機構の変化を重点的に分析した。他方、各国ないし地域別の問題は、フィンランド(百瀬)、ノルウェ-(大島)、フランス(服部)、バルカン(柴)、ドイツ(伊東)、ソ連(小泉)、アメリカ(関場)が前述の全体状況の変化が地域の安全保障に与える影響、逆に地域の変化が全体に与える意味を研究した。その結果第八に、近年の欧州の安全保障の変化は、歴史的タイムスパンの中に置いて考察することによって、その意味がより深く捉えられること、さらに近年の変化に特徴的なことにしては、欧州の中心諸国が自己を統合に向けて再編成しているだけではなく、周辺地域も各々そうした中心部の統合に対し相互補完的な形で地域協力の再編成または創製を行ないつつある点が明らかになった。以上の研究成果は、研究代表者百瀬編集の以下の3冊の研究書の発刊を通じて世に問われることになった。1)『ヨ-ロッパ小国の国際政治』(東京大学出版会)2)『欧州安全保障協力会議、CSCE1975ー1990』(日本国際問題研究所ー近刊)3)『欧州の安全保障ー過去と現在』(東京大学出版会ー近刊)。

初年度は、こうした知見をもとに欧州安全保障の基礎概念の再検討を招聘者ヴァイリネンと共に行うと同時に、ドイツ問題の分析をドリフテと、また特にECやCSCEの中心国として欧州の重要な鍵を握るイギリスの安全保障についての検討をメンドルとの研究会の中で行った。こうして、全般的に言えば、ヨ-ロッパの安全保障問題はソ連・東欧諸国の急激な政治変動、及び1990年度に同意を見たCFE(欧州通常戦力)とCSBM(信頼・醸成措置)に関する会議の進展が示すように、軍備管理・軍縮交渉の急速な進展によって大きな転換に直面した。そうした欧州の緊張緩和の中で、第五に、新たな欧州秩序の枠組みとしてCSCEが欧州国際政治の中央に躍りでることになった。これについては、新たに招聘者に加えたゲバリとCSCEのこれまでの経緯並びにパリ会議最終文書の検討や、CSCEの機能的、実態的分析を行った。とはいえ第六に、欧州の安全保障が旧ソ連に東中欧の地域粉争や核管理の未解決問題を抱え、未だ不透明な部分を孕んでいることは否定できない。こうした点で、欧州全般の安全保障の専門家であるガスタイガ-を招聘し、CSE交渉の成果と問題点を議論し、今後の欧州の安全保障の動向について検討を加えた。さらに第七に、欧州の安全保障新秩序の構築の中で、特にNATOとECの役割変化が今後の動向を把握する上で重要になって来たため、分担者の植田と小久保を中心にこの二つの国際機構の変化を重点的に分析した。他方、各国ないし地域別の問題は、フィンランド(百瀬)、ノルウェ-(大島)、フランス(服部)、バルカン(柴)、ドイツ(伊東)、ソ連(小泉)、アメリカ(関場)が前述の全体状況の変化が地域の安全保障に与える影響、逆に地域の変化が全体に与える意味を研究した。その結果第八に、近年の欧州の安全保障の変化は、歴史的タイムスパンの中に置いて考察することによって、その意味がより深く捉えられること、さらに近年の変化に特徴的なことにしては、欧州の中心諸国が自己を統合に向けて再編成しているだけではなく、周辺地域も各々そうした中心部の統合に対し相互補完的な形で地域協力の再編成または創製を行ないつつある点が明らかになった。以上の研究成果は、研究代表者百瀬編集の以下の3冊の研究書の発刊を通じて世に問われることになった。1)『ヨ-ロッパ小国の国際政治』(東京大学出版会)2)『欧州安全保障協力会議、CSCE1975ー1990』(日本国際問題研究所ー近刊)3)『欧州の安全保障ー過去と現在』(東京大学出版会ー近刊)。本年度は計画の第二年次にあたるため、欧州の安全保障問題について地域別に理解を深めると共に、全体像の把握に努め、情報・資料の収集に力を注いだ。そのために、欧州から専門研究者を招き、また、日本側の研究者は欧州に出張して意見を交換し、以下のような成果を得た。全般的に言えば、ヨ-ロッパの安全保障問題は、ソ連・東欧諸国の急激な政治変動、及び今年度に同意を見たCFE(欧州通常戦力とCSBM(信頼・醸成措置)に関する会議の進度が示すように、軍備管理・軍縮交渉の昨年以来の成果によって大きな転換に直面している。この点で、欧州全般の安全保障の専門家であるC・ガスタイガ-を招聘しCFE交渉の成果と問題点を議論し、今後の欧州の安全保障の動向について検討した。
都市ごみ溶融飛灰中重金属の簡易抽出/高率濃縮を実現する溶融処理条件の確立

過去2年間で,実際の施設から採取した溶融飛灰中の金属濃縮法,飛灰中のPb,Znの形態分析法,溶融飛灰の金属含有量を向上させるための溶融条件の最適化に関して検討を行ってきた.本年度は,飛灰が捕集される部分に関して,高温集塵を採用して2段捕集とすることで,重金属が濃縮した飛灰と塩類を主体とした不溶化前処理不要な飛灰とに分離することを検討した.実験は,電気管状炉を用いて,飛灰を模擬した純物質からなる試料を揮発させ,その後段の500800°Cに高温捕集部を,100°Cの地点に低温捕集部を設けて飛灰の捕集を行った.まず1段捕集と2段捕集とでの捕集飛灰の品位を比較した結果,2段捕集とすることで,高温側に塩類が,低温側に重金属類が分配されることを確認した.次に高温捕集部の温度を変化させ,最も分離効率の高い設定温度域を検討した結果,高温捕集部を700°C800°Cとすることで,Pbは90%以上が低温部で捕集され,高温部で僅かに捕集されたPbは,難水溶性であることを確認した.この結果は,低温部捕集灰は山本還元に,高温捕集灰は不溶化前処理を必要とせずに,埋立処分が可能であることを暗示するものである.次に,より多様な金属元素に対しても分離捕集の効果を検証するために,元素の揮発挙動に影響を与えるガス雰囲気,投入試料の元素組成(C,S,C1含有量)を変化させた実験を実施した.還元雰囲気とすることで,亜鉛,カドミウム等の揮発は促進された.カドミウムの高温部への分配率は小さく,Pbと同様の効果が認められたが,亜鉛に関しては良好な分配は実現できなかった.銅はS含有量を変化させた際に揮発が促進されたが,大半が高温部にて捕集された.銅が高温部で捕集されたことは,DXN生成温度域を通過する前に触媒物質である銅を低減できることから,DXN生成抑制にも2段捕集が有効である可能性を示した.本研究では,飛灰への金属移行率を最大化する溶融プロセスを探求し,さらに生成された飛灰からの効率的に金属を回収する方法を確立することを目的としている.本年度は,(1)溶融飛灰中の亜鉛,鉛の湿式抽出法の検討,(2)飛灰中の鉛の形態分析,そして,(3)金属抽出に適した溶融条件を検討するための実験溶融炉の試作を行った.以下に得られた主要な結果を示す.23の実プラントから溶融飛灰を採取し,それぞれに対して,酸抽出・アルカリ抽出,アンモニア抽出を用いた抽出法について検討した.始めに金属含有量の分析結果から,各飛灰を5つのグループに分類した.分類はPb,Zn含有量,Ca含有量,Sn等によって分類した.各グループ毎に,湿式抽出の特徴に差異が認められ,Pb,Znを多く含む飛灰では,85%以上抽出するために多量の溶媒(酸,アルカリ,アンモニア)を要すること,ガス化溶融飛灰ではSiのキャリーオーバーによりZn,Pb品位が低く,回収も困難なこと,酸抽出は,回収対象金属以外に微量有害金属も同時に抽出するため,残渣処理に問題が起こることなどが明らかとなった.(2)Pbの形態分析:9種類のPb化合物を対象に,蒸留水,Na_2S_2O_3,CH_3COONH_4,AgNO_3,NaOH,NaOH(加熱処理後),CH_3COONH_4(酸化処理後),microwaweを用いた逐次抽出を試み,各Pb化合物が選択的に抽出できることを確認した.その後,実飛灰に関して,逐次抽出を実施し,Pb化合形態別の存在割合を把握した.前述の抽出法の検討において抽出率の高かった飛灰は,形態上,易溶解性の化合形態の占める割合が高い傾向にあった.(3)溶融炉の試作:電気環状炉を用いて飛灰の溶融条件を模擬できるシステムを作成した.本研究では、重金属(本実験ではPb,Zn)が高濃度で濃縮し,それらの形態がコスト的に有利な金属回収方法((1)水洗濃縮法、(2)水抽出法)で回収可能な形態となる最適な溶融条件を求めることを目的に,溶融温度,炉内雰囲気,飛灰性状を変化させ,それらが重金属の飛灰への移行と形態に与える影響について検討を実施した.溶融炉を電気管状炉により模擬し、そこで試料を溶融して飛灰を発生させ,フィルタや燃焼管出口付近で採取された溶融飛灰を分析し,溶融条件の変化に対してどのように溶融飛灰の性状が変化するかを調べた。飛灰の性状については,(1)各金属がどれだけ試料から溶融飛灰へ移行したか(移行率),(2)化合物形態が水溶性か難水溶性か(化合物形態)という観点から分析した.分析結果から,a)溶融飛灰へのPb,Znの高い移行、不純物の少い移行を評価するとともに、b)化合物形態から、(1)水洗濃縮法、(2)水抽出法のそれぞれに適した溶融炉運転条件を整理した.

最終的に,簡易なシステムで飛灰中の金属濃縮が可能な溶融飛灰を精製させる条件は,(1)水洗濃縮法を意図した場合:溶融対象物を,中性飛灰と焼却飛灰の混合物とし,雰囲気をN2雰囲気(中性雰囲気),溶融温度を1400°C以下とする.(2)水抽出法による濃縮を意図した場合:溶融対象物を消石灰吹き込み飛灰と焼却灰の混合灰とし,雰囲気をN2雰囲気(中性雰囲気),溶融温度を1400°C以下とするということが明らかとなった.過去2年間で,実際の施設から採取した溶融飛灰中の金属濃縮法,飛灰中のPb,Znの形態分析法,溶融飛灰の金属含有量を向上させるための溶融条件の最適化に関して検討を行ってきた.本年度は,飛灰が捕集される部分に関して,高温集塵を採用して2段捕集とすることで,重金属が濃縮した飛灰と塩類を主体とした不溶化前処理不要な飛灰とに分離することを検討した.実験は,電気管状炉を用いて,飛灰を模擬した純物質からなる試料を揮発させ,その後段の500800°Cに高温捕集部を,100°Cの地点に低温捕集部を設けて飛灰の捕集を行った.まず1段捕集と2段捕集とでの捕集飛灰の品位を比較した結果,2段捕集とすることで,高温側に塩類が,低温側に重金属類が分配されることを確認した.次に高温捕集部の温度を変化させ,最も分離効率の高い設定温度域を検討した結果,高温捕集部を700°C800°Cとすることで,Pbは90%以上が低温部で捕集され,高温部で僅かに捕集されたPbは,難水溶性であることを確認した.この結果は,低温部捕集灰は山本還元に,高温捕集灰は不溶化前処理を必要とせずに,埋立処分が可能であることを暗示するものである.次に,より多様な金属元素に対しても分離捕集の効果を検証するために,元素の揮発挙動に影響を与えるガス雰囲気,投入試料の元素組成(C,S,C1含有量)を変化させた実験を実施した.還元雰囲気とすることで,亜鉛,カドミウム等の揮発は促進された.カドミウムの高温部への分配率は小さく,Pbと同様の効果が認められたが,亜鉛に関しては良好な分配は実現できなかった.銅はS含有量を変化させた際に揮発が促進されたが,大半が高温部にて捕集された.銅が高温部で捕集されたことは,DXN生成温度域を通過する前に触媒物質である銅を低減できることから,DXN生成抑制にも2段捕集が有効である可能性を示した.
脳磁図を用いたヒト高次脳機能の研究:特に「言語認知」と「顔認知」機構について

1.磁場(MEG)を指標にした語音学習の神経基盤の検討日本人では英語の/l/と/r/など日本語に含まれない音素の聞き分けが問題であるが、最近は学習によって聞き分けが改善することが報告されている。学習の前後に誘発脳磁場成分ミスマッチフィールド(MMF)を記録した。MMFは被験者の注意を必要とせず、/l/と/r/の聞き分け能力を修得したかどうかの客観的な指標となりうるものである。被験者は日本語を母語とする右手利きの健常者16名で、聞き分け率をトレーニングの前後に測定した。聞き分け率が15%以上向上した9名の被験者のうち8名では、左大脳半球から記録された脳磁場にトレーニング前には出現しなかったMMF成分が出現あるいは潜時の短縮がみられた。右半球ではこのような被験者間で一貫した変化は認められなかった。したがって、語音の聞き分けの獲得には左側の聴覚野が関与することが示唆された。2.「目の動き」認知に関するヒト脳部位局在脳磁図を用いて、健常者における顔認知の時間的空間的過程の検索を行った。先ず静止顔画像に対しては全ての被験者で1Mと2Mの二つの成分が認められた。1Mは両側半球の第一次視覚野、2Mは側頭葉後下部の紡錘状回が活動源であった。ヒトの顔認知には紡錘状回が重要な役割を果たしており、右半球が左半球より優位であることが示唆された。次に目の動きと一般的な動きに対する脳活動を解析した。ヒトのMT/V5野は目の動きにも背景の動きにも活動し、左半球よりも右半球が優位であった。目の動きに対して誘発された脳磁場活動の活動源は一般的動きに対するものより有意に後方、下方に位置推定された。MT/V5野は他者の目の動きを認知する上で重要な役割を果たし機能別の受容野を有していることが示唆された。脳磁図を用いたヒトにおける「言語認知機構」と「顔認知機構」の解明が本研究の主要目的である。本年度は、主として「顔認知機構」、特に「顔の各部分の動きに関与する脳内部位の同定」の研究を中心に行った。顔の部分の動き、特に目の動きの認知は日常生活において極めて重要と思われる。サルでは運動視の中枢は後頭葉と側頭葉の境界付近にあるV5/MT野と考えられているが、ヒトでは未だ十分には明らかにされていない。先行研究として、縦棒が水平移動する様に見える仮現運動(実際には2つの異なる位置に存在する縦棒の画像が短い時間間隔で示されるために動いているように見える)を用いてヒトの運動視中枢を検索したところ、その活動部位はサルと類似の位置に存在した(Human homologue of V5/MT)。この結果をふまえて、同じく仮現運動の原理を用いて目が水平運動をしているように見える視覚刺激を作成し、「目の動き」を見たときの脳内活動部位を脳磁図を用いて解析した。すると、潜時約190msec付近に明瞭な反応が見られ、その活動部位はやはり後頭葉と側頭葉の境界付近であった。また半球間差が見られ、右半球優位であった。同時に一般的な運動として円が中心に向かって動くように見えるradial運動と比較したところ、目の動きに対する活動部位は有意に後下方に存在しており、V5/MT野内においても運動の種類によって活動部位が異なることが示唆された。今後は、目の動きの方向の相違により脳反応に変化が見られるかどうか、また顔の他の部分、すなわち開口や閉口運動等を見たときに活動する部位が目の動きに対する反応部位と同様か否か、といった点を明らかにしていきたい。

目の動きに対して誘発された脳磁場活動の活動源は一般的動きに対するものより有意に後方、下方に位置推定された。MT/V5野は他者の目の動きを認知する上で重要な役割を果たし機能別の受容野を有していることが示唆された。
肢芽identityの選択機構・維持機構

本研究では、T-box型転写因子Tbx5、Tbx4遺伝子の肢芽wing/leg identity決定における機能を詳細に検討することを目的とした。発生過程のニワトリ肢芽では、Tbx5がwing budに、Tbx4がleg budに特異的に発現する。この発現の意味を探るため、電気穿孔法を新たに改良し、Tbx5をlegに、Tbx4をwingに強制発現させた。この結果、wingの形態は大きく変化し、ツメ、4本の独立した指、羽毛の消失とウロコの形成等、leg様の形態が確認された。また、legの形態も著しい変化を見せ、全体が羽毛に覆われ、骨の形態にwing様の変化が認められた。このような変化は、Hox遺伝子の肢芽における発現変化を伴って起こっていることも確認された。このような事実は、両Tbx遺伝子が肢芽のwing/leg identityの決定に直接関与していることを意味している。また、Tbx5をlegに発現させたときには、内在性のTbx4遺伝子の発現は著名に抑制されていた。これに対し、Tbx4をwingに発現させた時には、内在性のTbx5の発現には全く変化がなかった。このことは、Tbx5遺伝子が遺伝的には優性であり、legの形態がdefault stateであることを意味しており、進化論上の四肢形態の機嫌を知る上で重要な知見である。本研究では、同時に、Tbx5遺伝子が発生過程の眼の背側に限局して発現していることが見出された。この意味を探るため、同様に電気穿孔法によって、Tbx5遺伝子を眼の腹側に強制的に発現させた。この結果、眼の形態が著しく変化し、double dorsal様になった。これは、種々の背側、腹側マーカーの発現の逆転によっても確認された。Tbx5遺伝子の発現は、眼の発生の後期にも維持されることから、網膜視蓋投射への関与が示唆された。これを確かめるため、レトロウイルス法によってTbx5遺伝子を網膜の腹側に発現させたところ、網膜視蓋投射の極性に著しい乱れが認められた。このことは、tbx5遺伝子が肢芽のみならず、眼の形態形成にも大きな役割を担っていることを示している。
ナノグラフェン材料を応用した高感度ひずみセンサの開発

本研究では,医療・介護ロボットの触覚や動き,脈拍や人体の動きなどをリアルモニタリングするために,グラフェンナノリボンを用いた大変形可能・超高感度ひずみセンサの開発を目標とし,CVD法を用いて高品質のグラフェン薄膜を成膜する技術を確立するとともに,成膜されたグラフェンを用いてグラフェンナノリボンを作製する技術を開発し,その電気特性の評価を行った.まず、熱CVD法を用いたアセチレンガスによる成膜において触媒であるCu薄膜の表面への酸化処理,アニール処理による表面の向配性の制御,またCu薄膜をポケット状へ加工することによるアセチレンの流量制御により,グラフェン核形成速度を制御することにより,高品質・単層グラフェン薄膜を成膜することに成功した.成膜されたグラフェン薄膜をCu薄膜上からグラフェンナノリボンへ加工するにはSiO2/Si基板上への転写が必須である.そのため、PMMAを用いたグラフェン薄膜転写プロセスの検討を行い,転写基板であるSiO2/Si基板表面への酸素プラズマ処理を施すことでグラフェン薄膜を全面転写することに成功した.また、グラフェンナノリボンの電気特性を計測するために金属電極をグラフェン薄膜上へ形成させる必要がある.そのためにSi基板を用いた遮断マスクを用いたグラフェン薄膜上金属電極の作製の検討を行い,グラフェン薄膜上へ金属電極を形成させることに成功した.さらに金属電極を形成した後,グラフェンナノリボン形成のためにHSQレジストを用いたEBリソグラフィ技術を用いて最小幅約40 nmのHSQ/GNR層の作製に成功した.作製されたグラフェンナノリボンのI-V特性は良好な値を示し,金属電極とグラフェンナノリボンのオーミックコンタクトが形成されていることを確認した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではひずみが負荷されるグラフェンナノリボン電子物性の支配因子を解析的に解明するとともに,大変形追従可能なフレキシブル基板上へのグラフェンナノリボン応用ひずみセンサの開発を行う.本年度は三次元大規模変形負荷環境におけるグラフェンナノリボン電子物性変動支配因子解明と,フレキシブル基板上に大量生産可能なグラフェンナノリボン応用ひずみセンサ製造プロセス開発を行った.まず,第一原理解析を応用し,グラフェンナノリボン電子物性の変動支配構造因子を解析した.隣接した炭素原子のπ軌道のなす角(二面角)を用いることで,三次元変形を呈するグラフェンナノリボンのバンドギャップ変化をその寸法に依存せず統一的に評価できることを明らかにした.化学気相蒸着(CVD)法に基き,従来品質制御が困難と考えられてきたアセチレンガスを応用し,気相熱分解で安定した高速供給可能なアセチレンガスの超低分圧制御手法と,グラフェンと格子整合性が高い超清浄(111)強配向Cu基板の製造方法などを確立することで,従来最高品質を実現できていると考えられてきたメタンガスを応用して製造したものと同等以上の品質の単層グラフェン膜を従来比10倍以上の速度で実現した.銅基板上に形成したグラフェン膜を既存薄膜プロセスに移行可能なSiO2/Si基板に転写する技術,低熱応力制御微細加工技術,などを確立し,グラフェン膜応用トランジスタ構造の試作と動作確認を通し,開発した統合プロセスの有効性を実証した.さらに,微細加工した単層グラフェンナノリボンを大規模変形対応可能なフレキシブル基板(polydimethylsiloxane)上に低損傷で転写するプロセスを確立し,ひずみゲージの試作に成功するとともに,試作ひずみゲージが一軸引張負荷,曲げ負荷に追従応答することも実証した.本年度は三次元大規模変形負荷環境におけるグラフェンナノリボン電子物性変動支配因子解明と,フレキシブル基板上に大量生産可能なグラフェンナノリボン応用ひずみセンサ製造プロセス開発を行った.第一原理計算により一次元引張ひずみと三次元曲げ変形が負荷されるグラフェンノリボンの電気特性への影響を解析的に検討し,一次元引張ひずみが支配的になることを明らかにした.化学気相蒸着(CVD)法に基き,従来品質制御が困難と考えられてきたアセチレンガスを応用し,気相熱分解で安定した高速供給可能なアセチレンガスの超低分圧制御手法などを用いて,高品質な単層グラフェンを高速かつ安定に成膜するプロセスを開発し,従来比10倍以上の製膜速度を実現した.また,低熱応力制御微細加工技術などを確立し,グラフェンナノリボン応用ひずみセンサ製造プロセスを開発した.本研究成果は4件の学術論文にまとめるとともに国際学会にて1件の賞を受賞しており順調に研究が進んでいるといえる.本研究では,医療・介護ロボットの触覚や動き,脈拍や人体の動きなどをリアルモニタリングするために,グラフェンナノリボンを用いた大変形可能・超高感度ひずみセンサの開発を目標とし,CVD法を用いて高品質のグラフェン薄膜を成膜する技術を確立するとともに,成膜されたグラフェンを用いてグラフェンナノリボンを作製する技術を開発し,その電気特性の評価を行った.まず、熱CVD法を用いたアセチレンガスによる成膜において触媒であるCu薄膜の表面への酸化処理,アニール処理による表面の向配性の制御,またCu薄膜をポケット状へ加工することによるアセチレンの流量制御により,グラフェン核形成速度を制御することにより,高品質・単層グラフェン薄膜を成膜することに成功した.成膜されたグラフェン薄膜をCu薄膜上からグラフェンナノリボンへ加工するにはSiO2/Si基板上への転写が必須である.

そのため、PMMAを用いたグラフェン薄膜転写プロセスの検討を行い,転写基板であるSiO2/Si基板表面への酸素プラズマ処理を施すことでグラフェン薄膜を全面転写することに成功した.また、グラフェンナノリボンの電気特性を計測するために金属電極をグラフェン薄膜上へ形成させる必要がある.そのためにSi基板を用いた遮断マスクを用いたグラフェン薄膜上金属電極の作製の検討を行い,グラフェン薄膜上へ金属電極を形成させることに成功した.さらに金属電極を形成した後,グラフェンナノリボン形成のためにHSQレジストを用いたEBリソグラフィ技術を用いて最小幅約40 nmのHSQ/GNR層の作製に成功した.作製されたグラフェンナノリボンのI-V特性は良好な値を示し,金属電極とグラフェンナノリボンのオーミックコンタクトが形成されていることを確認した.グラフェンナノメッシュ(GNM)電子バンド構造及びその電気伝導特性のひずみ依存性を理論と実験の両面から解明し,GNMひずみセンサを作製する.第一原理計算方法及び量子輸送シミュレーションを用いて,三次元ひずみ場負荷環境におけるGNMの電子バンド構造及び電気伝導性のひずみ依存性を予測し,そのひずみ応答特性の構造要素依存性を明らかにする.自己組織化ブロック共重合ポリマ(PS-b-PMMA)を用いて,ナノスケールの高密度アレイの孔(ナノホール)をグラフェンシートに形成し, GNM構造を作製する.電子線描画技術によりSi(100)基板上にステップとリップルなどの三次元ナノ構造を形成する.微小曲げ・折り試験によりGNM電子構造・電気伝導性の折り・曲げ変形感受性及びその構造要素の影響を実験的に検証する.大面積熱CVDグラフェンシートを用いて,透明でフレキシブルなGNMひずみセンサの試作と性能の評価を行う.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。三浦・鈴木研究室
肺癌センチネルリンパ節内微小転移検出法の開発-フローサイトメーターによる迅速診断-

癌のリンパ節微少転移をフローサイトメーター(FCM)で検出する方法(FDL法)の開発に関して、以下のような研究を行い、成果を得た。1.基礎的・技術的検討1)細胞分散法:メディマシーン法によりリンパ節からの十分な細胞分散が可能であった。2)細胞膜透過性亢進法と非洗浄染色法:エタノール固定法と、界面活性剤Triton X-100(TX)用いたTX法とを比較し、遠心洗浄を一切行わない方法(非洗浄法)の可能性を検討した。エタノール固定とTX法において非洗浄染色で良好な染色結果と細胞回収率が得られたが、洗浄法では細胞の喪失が著しかった。3)検出感度:正常リンパ節細胞にヒト肺腺癌細胞を混入(0.1-0.001%)し、FCMで癌細胞を検出したが、0.001%の癌細胞を検出できた。4)CK/CEA/DNA三重染色の至適方法:肺腺癌細胞で、CK/CEA/DNA三重染色における至適な染色法は以下の方法であった。分散細胞を70%エタノールで20分固定し、抗体希釈液で1回遠沈洗浄する。沈渣に抗体希釈液を800μl添加し、このうち400μlを陰性コントロールとする。遮光状態で400μl細胞液にFITC標識抗CK抗体を50μl、及びPE標識抗CEA抗体を50μl添加し、室温で20分間反応させた後、7-AADを50μl添加し、室温で10分間反応させる。2.臨床的有用性に関する検討:肺癌患者のリンパ節を用いて、病理診断とFDL法を比較した。病理診断で転移のみられたリンパ節はFDL法でも陽性と判定され、病理診断で転移がなかったがFDL法で陽性と判定されたリンパ節があった。3.術中迅速診断のための技術的検討:細胞をより迅速に分散できるようにメディマシーンを改良することや、より高速に測定できるFCMの開発が望まれる。微少リンパ節転移をフローサイトメーター(FCM)で検出するために次のような基礎的・技術的検討をおこなった。検討項目1)細胞分散法の検討2)細胞膜透過性亢進法、及び非洗浄染色法の検討3)検出感度の検討実験方法1)肺癌患者の新鮮未固定リンパ節をハサミ法とメディマシーン法の(Dako cytomation)で分散し細胞分散能を比較検討した。2)肺癌患者のリンパ節細胞とヒト肺腺癌培養細胞を用い、エタノール固定法と、界面活性剤Triton X-100 (TX)で細胞膜を破壊するTX法とを比較検討した。また、遠心洗浄を一切行わない方法(非洗浄法)の可能性を検討した。3)多量の正常リンパ節細胞の中にヒト肺癌培養癌細胞を僅かに混入(0.1-0.001%)させ、その検体から、FCMで癌細胞を検出できるか否かを検討した。現在までの結果1)メディマシーンの利用により、リンパ節からの十分な細胞分散が可能であった。2)エタノール固定、或いはTX法のいずれにおいても非洗浄染色で良好な染色結果と細胞回収率が得られた。洗浄法では細胞の喪失が著しく、不適当であった。3)FCMは少なくとも0.001%の癌細胞を検出できた。今後の展開1)病理検査結果や再発・転移情報との比較検討

2)術中迅速診断のための技術的検討癌のリンパ節微少転移をフローサイトメーター(FCM)で検出する方法(FDL法)の開発に関して、平成16年度は以下のような研究を行い、成果を得た。1.FDL法の基礎的・技術的検討CK/DNA二重染色にてリンパ節細胞中の0.001%の癌細胞を検出することに成功したH15年度の成果を礎に、H16年度はさらに高い特異度を求めてCK/CEA/DNA三重染色を検討した。肺腺癌細胞株ABC-1を用いた。その結果、適切な染色条件は以下の通りであった。分散細胞を70%エタノールで20分固定し、エタノールの除去後、抗体希釈液で1回遠沈洗浄する。沈さに抗体希釈液を800μl添加し、撹拌する。このうち400μlを陰性コントロールとする。400μl細胞液にFITC標識抗cK抗体(DAKO,F0859)を50μl、及び、PE標識抗CEA抗体(BD,551478)を50μl添加し、撹拌する。陰性対照には蛍光標識抗Ig抗体を使用する。遮光状態で室温、20分間反応させる。7-AAD(BD,559925)を50μl添加・撹拌したのち、遮光状態で室温10分間反応させ、FCM測定する。なお、短時間に結果を出す術中迅速診断が目的でない場合は、より長い固定時間、免疫染色後の洗浄、より長い7AAD染色時間が望ましい。2.FDL法の臨床的有用性に関する検討1)患者リンパ節での比較検討術中迅速診断に提出された肺癌患者のリンパ節(#1,#3,#7,#9,#10)の残りを用いて、癌病理診断とFDL法とで比較した(CK/DNA二重染色法)。その結果、病理診断で転移のみられた2つのリンパ節はFMLでも陽性と判定された。一方、#10リンパ節は病理診断では転移なしであったが、FDL法では陽性となった。FDLの臨床的有用性が示唆された。2)術中迅速診断のための技術的検討FDL法の研究を進めるなかで明かとなった大きな課題はFCMの測定速度の問題であった。文献的検討、ならびにメーカー技術者との検討の結果、市販のFCMは秒速1万個が限度であり、1個のリンパ節細胞を1台のFCMで全て測定するのに1日かかることが判明した。より高速に測定できる機種の開発が望まれる。
新規ヒト・インプリンティング領域の探索と生殖補助医療への影響

ゲノムインプリンティングは、胎盤を保有する哺乳類に特異的な現象で、胎盤形成に存在の意義があると推察されている。本研究では、生殖細胞系列のエピゲノム基盤として、マウスインプリント領域(DMR)の系統的単離・同定と領域内分子機構の解明、ヒトへの保存性を基に、ヒト生殖補助医療(ART)がゲノムインプリンティング機構に与える影響と異常を起こす分子機構について明らかにすることを目的とする。さらに、胎盤特異的にインプリンティングを受ける遺伝子についても、研究を発展させる。本年度の成果は、(1)メチル化インプリント領域(DMR)における男性不妊症時患者精子のメチル化異常:ヒト男性精子のインプリント異常について、網羅的な解析を正確に行い、その異常の頻度、程度、影響を受けやすい領域を明らかにした。その結果、およそ25%にメチル化異常を認め、精子数の少ない乏精子症精子では、その頻度が高い事が判明した(80%)。同様に、程度も精子数と負の相関を示した。また、異常のパターン分類により、DNAメチル化異常は精子成熟過程の異常かあるいは初期化の異常であることが示唆された。(2)胎盤特異的インプリント遺伝子の単離:ART妊娠では、胎盤異常の頻度が高い。そのため、周産期合併症の頻度も高い。今回、マウスを用い、胎盤特異的インプリント遺伝子を複数同定した。また、ヒト胎盤へのインプリントの保存性も確認した。初期化異常を示すクローンマウスの胎盤は、肥大化する。我々が発見した胎盤特異的インプリント遺伝子は、このマウスの胎盤でインプリント異常を示した。2年の期間内に以下の3つのサブ研究テーマを遂行する。初年度は、以下のテーマについて検討した。(1)網羅的メチル化インプリント領域(DMR)の同定と様式の特徴の解析:マウスDMRの候補領域より、新規DMRを同定し、GI遺伝子とGI領域の分子機構について明らかにし、GI領域の境界や調節領域の分子機構について解析した。その結果、新規のDMRとしてマウス1番染色体上に、Zdbf2-Gpr1領域に3つ新たに発見し、精子形成過程で、メチル化酵素(Dnmt3a,3b)依存的にメチル化される事が判明した。また、Zdbf2、Gpr1遺伝子はいずれも父由来発現を示すインプリント遺伝子であることも判明した。(2)ヒト・マウス間のDMRの比較エピゲノム解析:(1)で明らかとなった新規DMR領域と22箇所の既知DMRの構造と機能の保存性について、ヒト、マウス間での共通性、多様性、相互性、連続性について比較ゲノム解析を行った。その結果、精子型インプリント3領域と卵子型インプリント19領域を、正常血液細胞、精子細胞を用いて明らかにした。また、この領域内に含まれるDNA多型も明らかにした。研究実績の概要で示した通り、目標どおりに達成できた。また同時に、ヒトインプリント領域の同定ではDNA多型を明らかにした。この結果を基に、正確なメチル化インプリントの解析が可能となり、今後の臨床検体を用いた解析では、より信頼のおける成果が得られると予想される。これまでに得られた成果を基に、ヒト男性精子のインプリント異常について、網羅的な解析を正確に行い、その異常の頻度、程度、影響を受けやすい領域を明らかにする。また、異常のパターン分類により、DNAメチル化異常の発症メカニズムについて、総合的に検討する。
マルチ銅オキシダーゼによる酸素還元機構の解明と機能改変体の電極触媒としての利用

マルチ銅オキシダーゼによる酸素の4電子還元が共通した反応機構で進行することをCueO及びビリルビンオキシダーゼのタイプI銅配位子並びにプロトン輸送に関与するアミノ酸への変異導入によって明らかにした。この時、三核銅部位の外圏に配置されたアミノ酸が電子供与体として機能しないことがわかった。酸素還元過程の詳細をさらに詳しく解明するため中性子回折を行うことを計画し、重水中でCeuOを結晶化した。また、緩衝液起源の酢酸イオンがタイプII銅に結合することを見出した。さらに、タイプI銅の外圏部の改変により酵素活性を高め、なおかつ、優れた電極応答を実現し、生物燃料電池の電極触媒としての利用の道を開いた。マルチ銅オキシダーゼによる酸素還元機構の解明(活性酸素種を生成しない酸素の水への変換の仕組み解明)マルチ銅オキシダーゼであるCueOおよびビリルビンオキシダーゼにおいて水素結合ネットワークに存在するグルタミン酸をグルタミンおよびアラニンに変異させ、グルタミン酸が酸素の還元過程においてプロトンの運搬に関与する重要なアミノ酸であることを明らかにした。また、アラニンに置換すると水分子のみで代替のプロトン輸送経路が形成されることを明らかにした。水素結合ネットワークの動的性質について予備的なMD計算を行ったところ、極めて短い時間時間で溶媒の水分子とネットワーク内の水分子が入れ替わっていることが示唆された。二重変異体を結晶化し、酸素還元中間体の結晶構造解析を試みたが、中間体成分の割合の変動と結晶作成中にある程度の速度で構造変化が進行することがネックとなっており、変異体作成および結晶化の条件検討を続けている。酸素還元での第4の電子ドナーとして三核銅部位近傍に存在する非配位性のアミノ酸に着目し、変異導入を行った。これらの詳細な検討は次年度に行う予定である。CueOの高分解能構造情報獲得を目指した中性子回折を行うための巨大結晶の作成を進めている。マルチ銅オキシダーゼの高機能化(金属酵素の酵素機能を上昇させる試み)マルチ銅オキシダーゼであるCueOにおいてタイプ1銅への配位子であるシステインを非配位性のアミノ酸に置換し、酵素活性の上昇を確認した。しかし、ビリルビンオキシダーゼにおいて同様の変異を行うと酵素活性が低下した。また、CueOのタイプ1銅に配位したヒスチジンの背後の水素結合を切断で、酵素活性の上昇に成功した。1.捕捉に成功しているマルチ銅オキシダーゼの2種の酸素還元中間体のうち2電子還元体(中間体1)の結晶構造解析を試みたが、結晶作成中に含量が低下していくことがわかり、X線回折データを得るまでの中間体作成や結晶作成の時間を可能な限り短縮する方法について検討した。2.マルチ銅オキシダーゼの中性子回折を実現するため重水を溶媒とし、巨大結晶作成を試みて来た。進歩はしているが、3辺とも1mm以上のクオリテーの高い結晶は未だ得られていない。一部、ペプチドを切断すればより大きな結晶が得られることがわかったことから、野生型と改変体の両方の結晶化を試みる。改変体の作成については、結果を投稿中である。3.酸素の4電子還元に際して、第4番目の電子が最終的に、酸素還元部位から遠くはなれた位置にある部位からもたらされることは間違いないが、酸素還元部位により近い場所に配置されたアミノ酸残基が一時的な電子ドナーとして働く可能性は否定できない。そこで、潜在的に電子ドナーとなりうる4つのアミノ酸残基に変異導入して、それらの反応への寄与の有無について検討した。銅への配位子やプロトン輸送に関わることが明らかとなったアミノ酸にも同時に変異導入し、酸素還元中間体を捕捉、キャラクタリゼーションし、酸素の4電子還元について詳細に検討した。これらの結果の一部について投稿準備中である。4.野生型および改変体の直接電気化学を行い、酸化還元電位と酵素活性の相関関係について検討した。作用電極として、種々のカーボン材料が使用可能であることを確認した。マルチ銅オキシダーゼによる酸素の4電子還元機構の解明について、大筋は描けており、部分的にはこれ以上検討する必要はない部分もあるが、全容解明までには至っていない。難しい部分が残っているので、研究の進捗速度は遅く、成果の発表が遅れがちになっている。研究をしていく中で、これまでは世界の誰も着手していない新規な課題も見いだせており、本研究の発展として、予備的実験を始めている。電気化学によるアプローチについては、新たに種々のカーボン材料を用い始めているが、現時点では再現性が高くないことから、成果を発表する段階に至っていない。マルチ銅オキシダーゼであるCueOの結晶構造解析データにマイナーな成分が存在することを見いだし、緩衝液由来の酢酸イオンがタイプII銅に結合していることを明らかにした。この結果は、ドメイン間に形成された狭いチャンルを通して外部アニオンが活性部位まで到達可能であることを示していた。また、酸素を水に変換する過程で必要なプロトンが水分子の排出経路からも供給されることがわかり、マルチ銅オキシダーゼが酢酸緩衝液中で高い活性を示す理由が明らかとなった。さらに、これまでマルチ銅オキシダーゼの結晶化は酢酸緩衝液でしか行うことができず、部分還元状態の構造が得られることが多かったが、初めて中性付近での結晶化に成功し、構造解析を行った。さらに、酵素反応に関するより詳細な情報を得るため、プロトンを可視化することを計画し、重水中でCueOの結晶化を行った。

最終的に中性子回折を行うことが可能な巨大結晶はまだ得られていないが、重水中で作成した結晶でも構造解析できることが明らかとなった。また、酸素の還元部位近傍に配置されたアミノ酸に変異導入し、これらが酸素の水への変換過程で、電子ドナーとして機能していないことを明らかにした。CueOと異なりビリルビンオキシダーゼでは基質からタイプI銅への電子の通り道としてトリプトファンとヒスチジンが翻訳後修飾によって共有結合していることを見い出した。そして、部位特異的変異導入や化学修飾によってこの経路に摂動を加え、新規の翻訳後修飾部位が電子伝達経路ばかりでなく酸化還元電位の調整部位としても機能していることを明らにした。酵素活性を高めたCueOとビリルビンオキシダーゼ変異体の電気化学測定を行い、メソポーラスカーボンなどによって高い電流値を実現し、電極触媒として利用出来ることを示した。マルチ銅オキシダーゼによる酸素の4電子還元が共通した反応機構で進行することをCueO及びビリルビンオキシダーゼのタイプI銅配位子並びにプロトン輸送に関与するアミノ酸への変異導入によって明らかにした。この時、三核銅部位の外圏に配置されたアミノ酸が電子供与体として機能しないことがわかった。酸素還元過程の詳細をさらに詳しく解明するため中性子回折を行うことを計画し、重水中でCeuOを結晶化した。また、緩衝液起源の酢酸イオンがタイプII銅に結合することを見出した。さらに、タイプI銅の外圏部の改変により酵素活性を高め、なおかつ、優れた電極応答を実現し、生物燃料電池の電極触媒としての利用の道を開いた。本研究は金属酵素による活性酸素種を生成しない酸素の水への変換機構の解明と変異導入により酵素機能を高めるという2つの側面があり、そのため、多様な改変と改変体のキャラクタリゼーションを目指しており、欧米の研究グループと競争状態にあるが、着眼点のユニークさと変異導入の多様さ、ならびに研究スピードにおいて、かなりの部分でリード出来ている。研究の達成度は概ね順調であるが、大きなブレークスルーを目指した中間体の構造解析はある程度進んでいるものの、ハードルが高いことは事実である。また、計算の困難な金属タンパク質のMD計算は予備的計算レベルであり、研究発表できる段階ではない。X線結晶構造解析と振動分光による反応中間体の構造解析を実現する。プロトン輸送機構に関しての計算科学による解析は研究体制の問題(研究の担い手の不足)から後回しになっており、再開を模索する。変異導入により酵素活性を高めたマルチ銅オキシダーゼを電極触媒として利用する系を確立する。ビリルビンオキシダーゼについては翻訳後修飾されたアミノ酸側鎖間の共有結合が電子伝達経路となっていることを新たに見いだしていることから、マルチ銅オキシダーゼの酵素活性との関連を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。生化学酸素の還元機能でこれまで明らかとなっていない第4の電子ドナーの関与の有無については、総ての可能性のあるアミノ酸残基への変異を完成させたとところであり、今後これらの変異体について、ひとつづつ調べて行く。酸素還元中間体の結晶構造解析については、結晶化の方法とそれを測定にまでこぎ着ける方策についてさらに検討を続ける。