hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己肯定感に注目した子どもの「貧困に抗う力」育成のためのサポートシステムの構築

2.子どもの貧困は,福祉や教育の場面でどのように表れ(現象し),どのような問題や困難をもたらしているか.社会福祉(ソーシャルワーク),保育や学校教育,スクール・ソーシャルワーク,医療ソーシャルワーク,児童養護施設でのインケアなどは,子どもの貧困に対して,事実として,1)どのように対応しているか、2)どういうことが可能か.3)どのように対応すべきか、を明らかにしたこと.3.親子関係を良好なものとする支援とともに,親以外の大人との良好な関係を豊かに築く支援は,貧困により子どもが剥奪された機会や経験を提供することとセットになって,自己肯定感とポジティブで前向きな態度を育てるうえで効果的なものとなりうることを示したこと.4.レジリエンス概念の重要性が浮かび上がってきた.レジリエンスや自己肯定感を個人に内在的な特性や傾向ととらえるのではなく,経済状態や,家族,学校,地域,交友関係に及ぶさまざまな環境の変数として理解することが「サポートシステム」を構想する際にはより重要であることを明らかにした.5.親の貧困が子どもの貧困の直接的原因であることから、母子世帯を中心にして親の貧困の解消策を明らかにした。本研究の成果は次の4つからなる。1.「子どもの貧困への総合的アプローチ」を明らかにし、親の貧困から貧困が子どもに及ぼす悪影響までの経路とステージを明らかにした。2.子ども自身に対して福祉や教育がどのような対応が可能であるかを深く追求し、「自己肯定感」や「レジリエンス」を育むような働きかけが重要であることを明らかにした。3.アンケート調査「京都子ども調査」の分析を通して、子どもの自己肯定感には親や家族、学校の先生、友人などの、人との関係が大きな影響を及ぼすことを明らかにした。4.妊娠・出産期に始まり、保育、教育、児童養護の各場面での「子どもへの対応」の具体的方法を明らかにした。2016年度は、引き続き研究会を開催し、年度前半にはとりわけアンケート調査の実施依頼先を早急に開拓し、アンケート調査の詳細を決定していくこと、そして年度後半には小学生5年生や中学2年生を対象にした子どもの貧困に関するアンケート調査を実施することが重要課題である。また2016年度には、福祉や教育の現場・研究双方のゲストスピーカーを迎えての研究会を開催し、問題の正確な把握に努める。最後に2016年度には、最終的な研究成果のまとめに向けて研究参加者の「分担」などを取り決めていく予定である。今後の推進方策は次のとおりである。子どもの貧困は教育、福祉の各分野(保育、小学校教育ほか)でどのように表れ、どのように対応されてきたか(対応されてこなかったか)ほかのリサーチクェスチョンRQに沿って検討を続けてきた。これなどは触れるべき主要な項目を構成。今後は、どのように対応しているか(現在進行形)と、どのように対応すべきか(sollen)にシフトしてゆく。そのために必要な調査などを実施すること。経済的要素および「親の貧困」を直接扱う担当者及び章がない。そこで、急きょ、桜井啓太さん(名古屋市立大学)に加わっていただいた。要望としては、1子供の貧困率(相対的貧困率)と生活保護水準などとの関係、2効果的な親の貧困削減策(児童扶養手当、児童手当、生活保護手当などを視野に)が検討課題。それでもまだ手薄なので、メンバーを補足する必要があるかもしれない。大阪府の「子ども調査」が大きく取り上げられている。
骨代謝におけるマイクロＲＮＡ生理機能の解明

骨代謝は形成と吸収のバランスの厳密な制御によりその恒常性が維持されている。近年の高齢化社会の進展に伴い、骨関連疾患の克服が強く求められているが、医薬応用につながる骨代謝調節の分子機構は不明のままである。本申請者は世界で初めてRNAヘリカーゼp72の全身性KOマウスの作製に成功し、その解析からp72が特定のmiRNA群のプロセシングに重要な因子であることを証明した。我々の予備的検討により、p72にプロセシングを受けるmiRNA群が骨代謝調節機能を持つ可能性が強く示唆された。また、骨芽細胞分化を調節するmiRNAとして、miR-145を同定している。これらの知見を踏まえ、マウスを用いた個体レベルでmiRNAによる骨代謝調節機能の解明を行うことにした。p72の生体内での機能を解明するため、p72 floxマウスを作製することとした。floxマウス作製にあたり、まずin vitroにおいてp72が骨芽細胞分化に影響を与えるかについて解析を行った。マウス線維芽細胞由来MC3T3-E1細胞を用い、siRNAでp72をノックダウンすると骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの活性が低下した。floxマウスについては4ラインのキメラマウスを獲得し、F1マウスと各種骨細胞特異的Creマウスとの交配を行い、組織特異的KOマウスの作出に成功した。miR-145の骨芽細胞分化における機能解析を行ったところ、miR-145は骨芽細胞分化に必須の転写因子の機能発揮に必須の因子を標的とし、その発現を制御していることが判明した。また、骨再生時においてもmiR-145は機能することを確認した。このように、miRNAは骨代謝において重要な役割を果たしていることを証明した。25年度が最終年度であるため、記入しない。これらの知見を踏まえ、マウスを用いた個体レベルでのmiRNAによる骨代謝調節機能の解明を行うことにした。マウス線維芽細胞由来MC3T3 #8211;E1細胞を用い、siRNAでp72をノックダウンすると骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの活性が低下した。またp72と非常によく似た分子であり、RNAヘリケース活性を有するp68についても同様の解析を行ったところ、p68も骨芽細胞分化に影響を及ぼすことを明らかにした。floxマウスにはTT2 ES細胞を用い、4ラインの相同組み換えクローンを取得した。これらESクローンよりキメラマウスの作製を行ったところ、全てのラインでキメラマウスを取得し、その後の交配によりES細胞を由来とするF1マウスの作出に成功した。また、p72の組織特異的トランスジェニックマウスの作製を試み、数匹の組織特異的founderマウスの作出に成功した。本研究の大きな柱であるflox

マウスの作製に関し、キメラマウスからF1マウスの取得に時間を要してしまった。昨年度はキメラマウスからのF1マウスの取得に時間を要してしまった。原因としてはマウス飼育施設の設備的な問題が考えられる。このため、マウスの飼育管理を別の飼育施設に移動し、floxマウスと各Creマウスとの交配を急ぎ、骨組織の解析を進める。これらマウスの解析と同時進行でin vtro系での実験を詳細に詰める。また、miR145に関してはマウスを用いた骨髄除去法にmiR145の生理機能を生体レベルで検討する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
透明物体の光学的特性および照明効果を考慮したリアルタイムレンダリング手法の研究

透明な物体で生じる光学的効果(反射・屈折・コースティクス)を考慮した透明物体の高速レンダリング法の研究を行った。透明な物体として、水のような流体を対象とした研究を行った。また、大理石のような半透明物体をリアルタイムにレンダリングする研究を行った。本研究では、流体シミュレーションの結果からリアルタイムに水面を構築し、レンダリングする方法を提案した。対象とする流体シミュレーションとしては、近年注目を集めている粒子法を扱った。粒子法では流体を離散的な粒子でシミュレーションしており、粒子から水面を構成する必要がある。そこで、シミュレーションに用いられる各粒子に濃度分布を与え、濃度分布から等値面を抽出し、等値面を水面として生成する。各粒子の濃度分布の計算をGPU(Graphics Processing Unit)で高速に計算する手法を提案した。流体シミュレーションの結果には、水表面が大変形するものも存在するため、位相が複雑な水面を表現するのに適しているポイントベースレンダリングをもちいて水面をレンダリングする方法を提案した。これらの結果をまとめ、国際会議Computer Graphics International 2006に投稿し採択された。さらに、半透明な物体のリアルタイムレンダリング法を提案した。半透明物体をレンダリングするためには、半透明物体で散乱し視点に到達する光である表面下散乱光を考慮する必要がある。従来表面下散乱の計算には時間を要していたが、GPUを利用したアルゴリズムを開発することにより、リアルタイムに半透明物体をレンダリングする手法を提案した。この結果をまとめ、Visual Computing/グラフィクスとCAD合同シンポジウム2006に投稿し採択された。さらにこの成果をまとめ、画像電子学会論文誌に投稿し採択された。透明な物体として、ガラスやプラスティックを対象とした物体自身が変形しない剛体、および水のような流体の両方についてそれぞれ研究を行った。1.ガラスのような剛体を対象としたレンダリングに関する研究透明物体をレンダリングするためには、透明物体へ入射する光源あるいは視点から物体へ入射する光線が、物体内部で反射屈折して物体外部へ放出したレイを計算する必要がある。剛体の場合、物体が変形しないためこの放出したレイを、離散化した入社方向において前計算しておくことが可能となる。これによって高速に透明物体をレンダリングする方法を提案し、結果をまとめて国際会議Computer Animation and Social Agents2005および電子情報学会論文誌(英文誌)に投稿し採択された。2.水のような流体を対象としたレンダリングに関する研究水のような流体においてはレイの屈折・反射方向を逐次計算する。流体シミュレーションの結果には、水表面が大変形するものも存在するため、位相が複雑な水面を表現するのに適しているポイントベースレンダリングをもちいて水面をレンダリングする方法の研究を行った。この結果をまとめ、学会Visual Computing/グラフィクスとCAD合同シンポジウム2005に投稿し採択された。
有機酸触媒による多置換環状物質の実践的合成

トリフリックイミド触媒による多成分連続反応の開発昨年度までにトリフリックイミドはシリルエノールエーテルの(2+2)-環化付加反応および(3+2)-環化付加反応や、シロキシジエンのDiels-Alder反応を効率よく触媒化することを見出していた。18年度は、これらを単位反応とする連続的多成分反応を企画し、単純な原料から一挙に複維な多置換環状物質を与える方法論を開発し、より選択的かつ高収率に反応が進行するよう条件の最適化を行った。また、反応途中にトリフリックイミドがシリルエノールエーテルの異性化を促進することを見出したので、この異性化反応の詳細なメカニズムおよび条件の探索を行った。それにより、より複雑な構造をもつ環状化合物の合成に展開することができた。トリフリックイミド触媒による複素環合成法の開発これまで見出した反応では、トリフリックイミドは反応系中でシリルエノールエーテルと反応し高活性ルイス酸であるシリルトリフリックイミドが生じることにより促進することが明らかとなっていた。一方、含窒素複素環の合成にトリフリックイミドを触媒として利用したところ、これまでと異なり単なるプレンステッド酸として反応促進に寄与していることが明らかとなった。合成面では、アルデヒド、アミン、シロキシジエンの3成分から一挙に多置換ピペリドンを収率よく合成する方法を見出すとともに、トリフリックイミドは水素移動型の酸化還元反応を触媒することも明らかとし、アリールアルジミンとアリルシランを原料に、逆電子要請型hetero-Diels-Alder反応と酸化反応が連続的に進行する新規触媒反応を見出し、迅速なキノリン合成に展開することができた。本研究では複雑な分子構造を効率的かつ環境に配慮した条件で大量に供給しうる合成法の開発を目的に、有機酸触媒による連続反応および環化付加反応を基盤として以下の研究を行った。触媒反応の開拓と確立電子過剰および電子不足なC2C4単位の電子2成分の組合せで分子間環化付加反応を検討し、有機酸触媒による46員環の環状化合物の簡便構築法の開発を行った。例えば、シリルエノールエーテルとシクロプロパンを基質として用いた反応では、触媒としてトリフリックイミドを用いることで多置換シクロペンタン化合物の簡便構築に成功した。また、アリルシランと不飽和エステルを基質と用い、世界ではじめて触媒的にシクロブタンを形成することに成功した。これにより、酸素官能基が置換していないシクロブタンを簡便に得ることができるようになった。また、ヘテロ原子を含む基質を積極的に利用し、従来のルイス酸触媒を用いる反応では不得手としていた多置換複素環を触媒的に合成できるようになった。現在は、その有用性を確かめるとともに、さらに実用的な合成法への昇華を検討中である。生理活性分子のプロセス合成薬理学的および農薬化学的に非常に興味深い活性を示す天然物の合成を検討した。抗腫瘍活性を示す天然物パエスレリンAを標的に、有機酸触媒反応を効果的に2回使うことで超短行程合成を検討した。現在、骨格構築に成功しており、さらなる分子変換を現在も検討中である。
キノコ菌糸の光応答遺伝子の全解析と一次代謝産物との相関性の評価

青色光刺激を与えたヒラタケ菌糸の一次代謝産物を網羅的に解析した結果、鳥インフルエンザ特効薬として知られるタミフルの製造原料となるシキミ酸が、暗所培養菌糸と比較して飛躍的に増加していることを見出した。ヒラタケ菌糸の一次代謝産物解析,遺伝子発現解析,並びにタンパク質発現解析結果に基づいて,このシキミ酸蓄積現象は、解糖系の律速反応酵素(6-ホスホフルクトキナーゼ),ペントースリン酸経路の律速反応酵素(グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)並びにシキミ酸経路の律速反応酵素(DAHP合成酵素)の各発現量が増加したことに起因することを明らかにした。(1)シキミ酸代謝経路に及ぼす光質効果と光強度効果の解析:1前年度に確立した実験方法により、光強度と照射時間、及び温度を一定にして、単色可視光LED(青色、緑色、赤色、赤色光)を照射したヒラタケ菌糸からシキミ酸を抽出し定量した。2青色光刺激を与えた場合のシキミ酸蓄積量と比較して,シキミ酸代謝経路に及ぼす単色可視光の光質(光波長)効果を解析した。3上記1と2の実験結果から、ヒラタケ菌糸体内にシキミ酸を蓄積させる効果を有する単色可視光は、青色光のみであることが判明した。4照射時間と温度を一定にして、ヒラタケ菌糸体内のシキミ酸蓄積量に及ぼす青色光強度の影響を解析したところ、シキミ酸蓄積には最適な光強度が存在することがわかった。(2)青色光刺激によるシキミ酸蓄積能を有する最適キノコ菌糸の探索ヒラタケは、ヒタタケ科ヒラタケ属の食用キノコである。同科同属のキノコ、及び他科他属の各キノコ菌糸を暗所培養した後、上記1と同条件下で青色光を照射した。各キノコ菌糸からシキミ酸を抽出して定量したところ、シキミ酸蓄積能はキノコ菌糸の科・属に依存することがわかった。(3)ヒラタケ菌糸の一次代謝産物に及ぼす光質効果の解析:青色光刺激によるヒラタケ菌糸の一次代謝産物変化と比較するため、緑色光刺激による一次代謝産物変化を網羅的に解析した。緑色光刺激を与えた場合の一次代謝産物変化は、青色光刺激による変化とは異なることがわかったが、シキミ酸のような顕著な有用代謝産物の増加は確認できなかった。しかし、青色光と緑色光では、明らかに代謝経路に及ぼす影響が異なるため、子実体原基形成段階・子実体生長並びに形態形成段階における影響を追跡する必要があると考えられる。(4)シキミ酸蓄積を制御する遺伝子の発現解析:シキミ酸生合成に関わる律速反応酵素をコードする遺伝子の発現量と青色光照射時間に良い相関性が確認された。1.青色光刺激による時系列遺伝子発現解析結果1植物育成装置内で暗所培養した菌糸体コロニーに,時系列で青色光照射した後,市販のRNA抽出キットを用いて,菌糸体から全RNAを抽出した。2委託解析により、カスタムマイクロアレイを作成した。上記1の実験により抽出した全RNAを用いて,時系列遺伝子発現解析実験を実施した。3この実験から、青色光刺激により発現量が誘起される遺伝子群と抑制される遺伝子群を約200種ずつ発見した。4発見した約400種の光応答遺伝子には、遺伝子がコードするタンパク質・酵素の機能が全く不明である遺伝子が数多く含まれることがわかった。2.シキミ酸の抽出方法と分析条件の構築1シキミ酸分析用のHPLC分析カラムとして、移動相として用いる溶媒の組成や分離能、また価格から、GLサイエンス製Intersil HILIC(5μm,4.6 x 250 mm)が最適であることがわかった。シキミ酸定量のための内部標準物質として、適切な化合物が見つからなかったため、絶対検量線を作成してシキミ酸を定量した。22011年4月に行ったメタボローム委託解析でのシキミ酸抽出条件を参考にして,実験室におけるヒラタケ菌糸からシキミ酸を簡便に抽出する最適条件を確立した。3上記1と2により構築された分析条件により、青色光刺激によるシキミ酸蓄積量の時系列変化を解析した結果、光照射6時間後から明瞭に蓄積量の増加が確認され、照射36時間後には、1kgの菌糸体あたり0.4g蓄積されることが確認された。4上記3の実験結果から推察すれば、菌糸への光刺激によるシキミ酸の製造方法は,周年での安定生産が可能であること、従って年間あたりの製造量は、トウシキミからの約3倍になると見積もられることから、トウシキミからの抽出法の代替法として優位性があると評価された。

発光ダイオードが持つ光源特性を利用して、ヒラタケ糸の生長に及ぼす単色可視光の光質と光強度の影響について研究したところ、菌糸に青色光刺激を与えると(中心発光波長:470nm,光量子束密度:105μmol/m2/s)、菌糸生長が完全に抑制される現象を見出した。青色光刺激によるヒラタケ菌糸の生長抑制現象を詳細に検討するため,青色光刺激を与えた菌糸の一次代謝産物を網羅的に解析した結果、鳥インフルエンザ特効薬として知られるタミフルの製造原料となるシキミ酸が、暗所培養菌糸と比較して飛躍的に増加していることを見出した。しかし緑色光、赤色光、遠赤色光を菌糸に照射してもシキミ酸は全く増加しなかった。シキミ酸は、解糖系で生合成されるホスホエノルールピルビン酸(PEP)と、ペントースリン酸経路で生合成されるエリトロース-4-リン酸(E4P)との縮合反応による7-ホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシアラビノヘプトン酸(DAHP)を経由して生合成されることから、ヒラタケ菌糸への青色光刺激によるシキミ酸の蓄積は、解糖系の律速反応酵素である6-ホスホフルクトキナーゼ(PFK)、ペントースリン酸経路の律速反応酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6DP)、及びシキミ酸経路の律速反応酵素であるDAHP合成酵素の各発現量が増加したことに起因するのではないかと推定した。そこでこれら3つの酵素をコードする遺伝子の発現量と、各遺伝子配列を基に作成した一次抗体を用いて酵素の発現量を解析したところ、青色光刺激による遺伝子発現量と酵素発現量は、いずれも時系列的に増加することを見出した。本成果は、青色光刺激により糸状菌から有用物質を生産する新規技術としても大変重要であることを示すものであり、今後の応用が期待される。光生物科学1.ヒラタケ菌糸体内に、シキミ酸を蓄積させる最適な光質と光強度に関する知見が得られた。2.青色光と緑色光がヒラタケ菌糸の一次代謝産物に及ぼす影響の違いが確認できた。3.青色光刺激によるシキミ酸蓄積量の増加は、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析実験から、シキミ酸生合成に関与する各代謝経路の律速反応酵素の発現量に依存する可能性が高いことを示す有力な結果が得られた。1.カスタムマイクロアレイを用いて網羅的に青色光応答遺伝子を解析することに成功したが、発見された約400種の遺伝子の機能については不明な遺伝子が多いため、ヒラタケ菌糸の青色光応答メカニズムを解明するには至っていない。2.ヒラタケ菌糸に青色光刺激を与えることにより蓄積されたシキミ酸量を、実験室において簡便に分析できる条件が確立されたため、光環境条件を変えてシキミ酸蓄積量変化を追跡できるようになった。また青色光照射36時間の結果から、タミフル製造原料となるシキミ酸の新規製造法として有望であることがわかった。1.シキミ酸生合成を制御する各代謝経路の律速反応酵素の発現解析平成25年度に実施した遺伝子発現解析結果と相関して、シキミ酸生合成を制御する各代謝経路の律速反応酵素の発現が実際に増加しているか確認する。2.研究を総括して成果報告書を作成するとともに、学会発表や学術論文として公表する。1.菌糸生長段階に及ぼす光波長効果と光強度効果の解析緑色光刺激により発現が誘起または抑制される特有な光応答遺伝子の有無については,いまだ解明されていない。そこでカスタムマイクロアレイを用いて,緑色光応答遺伝子を網羅的に解析する。2.シキミ酸代謝経路に及ぼす光質効果の解析1青色光,緑色光,赤色光および遠赤色光を照射しながら培養した菌糸体コロニーから,シキミ酸を抽出して定量し、光質効果を解析する。2青色光刺激を与えた場合のシキミ酸生合成量と比較して,シキミ酸代謝経路に及ぼす光質効果を解析する。3青色光強度を変えて、シキミ酸蓄積量変化との相関性を解析する。該当なし
月経期喘息(Menstrual asthma)の発症機序に関する研究

研究成果;月経に関連した気管支喘息の急性増悪、即ち月経期喘息の発症機序を明らかにすべく以下のような研究を行った。1.女性ホルモン調節可能ラットの作成;雌のBNラット(7週令)を全麻下に両側卵巣摘除術を施行し、内因性のエストローゲン、プロゲステロンを枯渇させ、その後エストローゲン単独補充群、プロゲステロン単独補充群、エストローゲン+プロゲステロン補充群、ホルモン非補充群の4群に分類した。2.女性ホルモンの喘息反応に対する効果および関与するケミカルメディエーターの分析;上記4群のラットにおいて、卵白アルブミンおよび水酸化アルミニウムの皮下注で感作し、感作成立後にウルトラネブライザーで経気道的に抗原(卵白アルブミン)を暴露し、経時的に気道内圧を測定し、即時型(IAR)および遅発型喘息反応(LAR)の発現を観察した結果、エストローゲン+プロゲステロン補充群でIARおよびLARの発現が抑制されることが明らかにされた。この時、気道の狭窄に関与するケミカルメディエーターを明らかにするために、各群の血中のケミカルメディエーターの分析を行った結果、エストローゲン+プロゲステロン補充群では血中のロイコトリエンC_4値が有意に減少していることが明らかにされた。(15±3.0pg/ml、n=4、p<0.05)その他のヒスタミン、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、GM-CSF、LT-B_4、PAF等は有為な変化を示さなかった。以上の結果より、女性ホルモンの周期的投与は経気道的抗原暴露後の喘息反応を有意に抑制し、その抑制のメカニズムの一つとして、ロイコトリエンC_4の抑制が重要であると考えられた。研究成果;月経に関連した気管支喘息の急性憎悪、即ち月経期喘息の発症機序を明らかにすべく以下のような研究を行った。1.女性ホルモン調節可能ラットの作成;雌のBNラット(7週令)を卵白アルブミンで感作後、全麻下に両側卵巣摘除術を施行し、内因性のエストローゲン、プロゲステロンを枯渇させ膣スメアによってその効果を確認した。その後、エストローゲン10μg補充群、エストローゲン+プロゲステロン500μg補充群、ホルモン非補充群の3群に分類した。2.女性ホルモンの喘息反対に対する効果;上記3群のラットにおいて、感作成立後にウルトラブライザーで経気道的に抗原(卵白アルブミン)を暴露し、経時的に気道内圧を測定し、即時型および遅発型喘息反応(LAR)の発現を観察した結果、エストローゲン+プロゲステロン補充群でLARの発現が抑制されることが明らかにされた。(抗原チャレンジ8時間後の気道内圧:エストローゲン群363±32%ベースライン、エストローゲン+プロゲステロン群163±25%ベースライン、p<0.05)。3.抗原暴露後の炎症性細胞浸潤に対する女性ホルモンの効果;エストローゲン+プロゲステロン群で抗原暴露8時間後の肺胞気管支洗浄夜中の好酸球数が有意に減少しており(0.8±0.1×10^4/ml、p<0.05)、プロゲステロンの効果ではないかと考えられた。以上の結果より、女性ホルモンのうちプロゲステロンが抗原暴露後の気道内への好酸球の浸潤を抑制し、遅発型喘息反応の発現を抑制しているのではないかと考えられた。通常の月経の発現が、プロゲステロンの急速な低下により引き起こされることより、月経期喘息に血中プロゲステロンの減少が関与しているのではないかと考えられた。各群のnが少ないため今後更なる検討を必要とする。

1.女性ホルモン調節可能ラットの作成;雌のBNラット(7週令)を全麻下に両側卵巣摘除術を施行し、内因性のエストローゲン、プロゲステロンを枯渇させ、その後エストローゲン単独補充群、プロゲステロン単独補充群、エストローゲン+プロゲステロン補充群、ホルモン非補充群の4群に分類した。2.女性ホルモンの喘息反応に対する効果および関与するケミカルメディエーターの分析;上記4群のラットにおいて、卵白アルブミンおよび水酸化アルミニウムの皮下注で感作し、感作成立後にウルトラネブライザーで経気道的に抗原(卵白アルブミン)を暴露し、経時的に気道内圧を測定し、即時型(IAR)および遅発型喘息反応(LAR)の発現を観察した結果、エストローゲン+プロゲステロン補充群でIARおよびLARの発現が抑制されることが明らかにされた。この時、気道の狭窄に関与するケニカルメディエーターを明らかにするために、各群の血中のケミカルメディエーターの分析を行った結果、エストローゲン+プロゲステロン補充群では血中のロイコトリエンC_4値が有意に減少していることが明らかにされた。(15±3.0pg/ml、n=4、p<0.05)。その他のヒスタミン、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、GM-CSF、LT-B_4、PAF等は有意に変化を示さなかった。以上の結果より、女性ホルモンの周期的投与は経気道抗原暴露後の喘息反応を有意に抑制し、その抑制のメカニズムの一つとして、ロイコトリエンC_4の抑制が重要であると考えられた。
非放射性誘電体線路を用いた94GHz帯ミリ波集積回路の研究

本研究は、これまで35GHzや60GHzで実績のあるNRDガイド回路技術を、次世代周波数として期待されている94GHzに拡張するための基礎データを得るものであり、その研究成果は以下のとおりである。1.94GHzNRDガイドガン発振器の研究94GHz帯で注目されているInPを用い、NRDガイドガン発振器の試作、実験を行った。発振出力は10mW程度得られ、ガンダイオードパッケージ等を工夫すれば更に出力が向上するものと考えられる。またこの発振器のジョセフソン電圧標準システム用ミリ波源への応用を念頭に、発振周波数安定化の実験も並行して行った。実験の都合上、高出力の得易い60GHz帯NRDガイドガン発振器を用いたが、PLLを適用するためのNRDガイド回路の構成法を確立することができた。2.NRDガイド電力合成器の基礎研究94GHz帯では大電力は得難くなるので、漏れ波NRDガイドによる空間電力合成法を検討し、10GHz及び35GHzにおけるモデル実験により、その可能性を確認した。この合成法は94GHzに適した構造であり、期待できる。3.準光学的手法によるNRDガイドHEMT増幅器の基礎研究NRDガイドHEMT増幅器を準光学的手法で実現するという、新しいアイデアのテストを10GHz帯で行い、予想どおりの増幅動作が確認できた。この結果は将来的には94GHz帯でモノリシック化できるものと思われる。
食肉製品のための高機能乳酸菌の分子生物学的育種と育種株の利用法の検討

本研究は、食肉製品に保健的機能性の優れた乳酸菌を利用することにより、新しい付加価値の高い食品が開発可能になるという考えに基づき実施された。まず、プロバイオティック乳酸菌として知られるヒト腸管由来Lactobacillus属を中心とする菌株の食肉製品への利用を検討した。その結果、有望な菌株の一つとして、Lactobacillus gasseri JCM1131株が選抜された。さらに、食肉製品に利用できるような十分な食塩耐性や亜硝酸耐性を備えた変異株の作出を試みた結果、優れた変異株を得ることに成功した。また、乳酸菌の作用により食肉タンパク質から生理活性成分を作らせるために、菌株の検索を試みた結果、Lactobacillus rhamnosus FERM P-15120が良好な菌株として残された。L. rhamnosus FERM P-15120を用いて調製した発酵豚肉ホモジネイトは、高いアンジオテンシンI変換酵紊(ACE)阻害活性と血圧降下作用を示した。この活性は、発酵中に生成するACE阻害ペプチドによることが判明した。このペプチドを精製し、構造を明らかにした結果、Val-Phe-Pro-Met-Asn-Pro-Pro-Lysの配列を有するオクタペプチドであった。この配列は、豚骨格筋ミオシン重鎖中に存在するものであり、プロテアーゼの作用によりミオシン重鎖が分解して生成するものと見られた。このオクタペプチドを化学合成し、ACE阻害活性を検討した結果比較的高い活性を示した。発酵条件や菌株の変異処理により、発酵ホモジネイトのACE阻害活性が変化することも明らかにされた。さらに、発酵豚肉ホモジネイトの機能性を検討したところ、ストレス性胃潰瘍の予防効果があることが、ラットの水浸拘束試験により明らかにされた。現在、活性成分の精製を進めている。本研究は発酵食肉製品に利用するスターター乳酸菌として望ましい性質をもつ菌株の育種を目的としたものである。まず、腸管由来のプロバイオティック乳酸菌として知られるLactobacillus gasseriの食肉製品への利用を目指し、十分な食塩耐性や亜硝酸耐性を備えた変異株の作出を試みた。また、乳酸菌の作用により食肉タンパク質から生理活性ペプチドを生成させるために、プロテアーゼ活性の高い菌株の検索と育種を実施した。Lactobacillus gasseri JCM1131は食肉中での良好な生育を示すプロバイオティック乳酸菌であるが、ほとんどの食肉製品に利用されている添加物である食塩や亜硝酸塩に対して十分な耐性を持っていなかった。そこで、紫外線照射による変異株の作出を試みた結果、4%食塩と200ppm亜硝酸ナトリウムに対して十分な耐性を示す変異株を得ることに成功した。この変異株は、親株と比べて食塩や亜硝酸塩耐性をもつ以外に表現型質上に大きな差が認められず、食肉製品に用いるプロバイオティック乳酸菌スターターとして有望な菌株と考えられる。Lactobacillus属を中心とする乳酸菌約200株を用いてプロテアーゼ活性が高く、かつペプチドの生成効率のよい菌株を検索したところ、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus NCFB2483などいくつかの有望菌株を見出すことができた。現在、これらの菌株およびプロテアーゼを用いて、食肉タンパク質からの生理活性ペプチド生成条件を検討している。さらに、高プロテアーゼ活性変異株の作出も試みている。本研究は付加価値の高い発酵食肉製品を開発するために必要なスターター乳酸菌を得て、その効果的な利用法の構築を目指したものである。まず、プロバイオティック乳酸菌として知られるヒト

腸管由来のLactobacillus gasseriの食肉製品への応用を考え、食肉製品に利用できるような十分な食塩耐性や亜硝酸耐性を備えた変異株の作出を試みた。また、乳酸菌の作用により食肉タンパク質から生理活性成分を作らせるために、プロテアーゼ活性の高い菌株の検索と育種を試み、生成されるペプチドを検討した。Lactobacillus gasseri JCM1131は、食肉中での良好な生育を示すプロバイオティック乳酸菌であるが、大部分の食肉製品に利用されている添加物である食塩や亜硝酸塩に対して十分な耐性を持っていない。そこで、紫外線照射による変異株の作出を試みた結果、これらの物質に対して十分な耐性を示す変異株を得ることができた。また、Lactobacillus属を中心とする乳酸菌約300株を用いてプロテアーゼ活性が高く、かつペプチドの生成効率のよい菌株を検索したところ、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCFB2483、Lactobacillus helveticus JCM1554、Lactobacillus acidophilus IAM12475、Lactobacillus rhamnosus FERM P-15120といった有望菌株を得ることができた。これらの菌株およびプロテアーゼを用いて、食肉タンパク質からの生理活性ペプチドの生成を検討した結果、ACE阻害ペプチド(血圧降下ペプチド)や抗酸化ペプチドの生成が認められた。さらに、現在、高プロテアーゼ活性変異株の作出により、効率のよいペプチド生成を目指している。本研究は、保健的機能性に優れた乳酸菌を利用することにより、付加価値の高い食肉製品を開発するための研究である。これまで、プロバイオティック乳酸菌として知られるヒト腸管由来のLactobacillus gasseriの食肉製品への応用を考え、食肉製品に利用できるような十分な食塩耐性や亜硝酸耐性を備えた変異株の作出を試みた。また、乳酸菌の作用により食肉タンパク質から生理活性成分を作らせるために、菌株の検索を試みた結果、Lactobacillus rhamnosus FERM P-15120が良好な菌株として残された。Lactobacillus rhamnosus FERMP-15120を用いて調製した発酵豚肉ホモジネイトは、高いアンジオテンシン1変換酵素,(ACE)阻害活性と血圧降下作用を示した。この活性は、発酵中に生成するACE阻害ペプチドによることが判明した。このペプチドを各種HPLCの組合せにより精製し、構造を明らかにした結果、Val-Phe-Pro-Met-Asn-Pro-Pro-Lysの配列を有するオクタペプチドであった。この配列は、豚骨格筋ミオシン重鎖中(76-83)に存在するものであり、プロテアーゼの作用によりミオシン重鎖が分解して生成するものと見られた。このオクタペプチドを化学合成し、ACE阻害活性を検討した結果、比較的高い活性(IC50=66.0uM)を示した。発酵条件や菌株の変異処理により、発酵ホモジネイトのACE阻害活性が変化することも明らかにされた。
HIV感染感受性に影響する宿主因子の解析

TRIM5αはHIV1型(HIV-1)増殖の初期過程をアカゲザル細胞中で阻害する因子として2004年に同定された。昨年度我々は、サルにおける増殖能が株により異なるHIV2型(HIV-2)とカニクイサルTRIM5αとの関係を調べ、HIV-2カプシドタンパク質(CA)の119番目のアミノ酸がプロリンの株はカニクイザルTRIM5αによる感染抑制を受けるが、アラニンまたはグルタミンの株はカニクイザルTRIM5αによる感染抑制を受けないことを明らかにした。この1アミノ酸のヒトTRIM5αによる感染阻害への影響を検討したところ、カニクイサルTRIM5αによる感染阻害を受けない株はヒトTRIM5αによる感染阻害も受けにくく、カニクイサルTRIM5αによる感染阻害を受ける株はヒトTRIM5αによっても感染が阻害されやすいことも示した。そこで本年度は、オックスフォード大学Rowland-Jones教授と共同で、西アフリカのHIV-2感染患者コホートの69名のCAのアミノ酸配列を調べた。その結果、血中ウイルス量の違いと有意な相関のあるアミノ酸変異が3カ所(119、159、178番目)見つかった。119番目のアミノ酸は、まさに我々がTRIM5αの感染阻害効果との関連を見いだした場所であり、ヒトTRIM5αによって感染が阻害されるプロリンを持つHIV-2に感染していると血中のウイルス量が低いことから、119番目のアミノ酸を含むカプシド領域がヒトTRIM5αの標的であること、及びヒトTRIM5αがHIV-2感染個体内のウイルス増殖の制御に寄与していることが強く示唆された。感染者個体内で上記のアミノ酸変化が起きたことを示す事例は見つからなかったため、感染しているHIV-2のアミノ酸配列を解析することにより、感染者の予後予測が可能になると考えられる。TRIM5αはアカゲザルにおけるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)感染抵抗性因子として2004年に同定された。レトロウイルスに対する自然免疫を担う重要な分子であるが、その感染阻害の分子機構は明らかにされていない。また、HIV-1以外のレンチウイルスに対する効果はその一部しか解明されていない。ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)は、株間でサル細胞への感染性が大きく異なることが知られているが、本研究は、HIV-2株間の感染性の違いがサルTRIM5αとの反応性の違いによるか否かを明らかにし、株間でサルTRIM5αとの反応性に違いが認められた場合にはその反応性の違いを決定しているHIV-2側の責任遺伝子領域を同定することを目的とする。ヒトCD4陽性T細胞株にカニクイザルのTRIM5αを発現させ、8株のHIV-2のTRIM5α感受性を検討した。その結果、2株が感受性、6株が耐性であった。各HIV-2株のTRIM5αの標的とされるカプシド蛋白質(CA)をコードするHIV-2ゲノムの塩基配列を決定したところ、感受性株は120番目のアミノ酸がプロリン(P)、耐性の株ではグルタミン(Q)あるいはアラニン(A)であった。そこでTRIM5αに感受性のGH123株の分子クローンのCAの120番目のPをQあるいはAに置換したところ、どちらの変異体もTRIM5α耐性に変化した。HIV-2のCAの120番目のアミノ酸の変異がCAの三次元構造に及ぼす影響を検討するため、X線結晶構造が明らかになっているHIV-1のCAの構造を基にして、HIV-2のCAの三次元構造をコンピュータで予測した。その結果、120番目のアミノ酸はCAの6番目と7番目のアルファヘリックスの間のループの中にあり、CAの外側に位置していた。また、120番目のアミノ酸がPからQやAに置換すると、120番目のアミノ酸を含むループの構造が大きく変化することが明らかになった。これらの結果から、HIV-2のCAの120番目のアミノ酸を含むループがTRIM5αと直接結合するものと思われる。
シロオビアゲハのベイツ型擬態に関わる紋様形成の分子機構

擬態の進化を明らかにするうえで、モデルとの紋様形成の対比は重要である。そこで紋様の色はどのような色素でできているか、紋様の位置決定はどのようになされているかに着目して研究を行った。まず擬態のモデルであるベニモンアゲハの赤色色素の同定を試みた。ベニモンアゲハの赤色領域を切り出し、70%メタノール溶液中で50、60、70、80度に加温し色素を抽出した。抽出した色素液の吸光度測定を行ったところ、503nm付近に最大吸収波長をもつことが分かった。次に逆相HPLCで分析を行った。溶出条件は0/0-10/0-80/70-95/70(min/%アセトニトリル)のように行った。粗抽出液の最大吸収波長である503nmのクロマトでのピークを検出すると、20から30分付近に多くのピークが観察された。この中にはメインのピークとして27.6分(ピーク1)と28.0分(ピーク2)の2つがあることが明らかとなった。この2つのピークをそれぞれ分取し、質量分析、および精密質量分析を行ったところ、ピーク1は質量数658.2、元素組成C30H34N4O11Sであり、ピーク2は質量数688.2、元素組成C31H36N4O12Sであることが明らかとなった。シロオビアゲハについてもベニモンアゲハ同様に抽出を行い、HPLC分析を行ったが目立ったピークは得られず、両種の赤色色素は異なっていることがわかった。このことからベイツ型擬態は収斂的に進化してきたことが示唆された。次に擬態紋様の位置決定にどのような遺伝子が関与しているかを網羅的に探索するためにRNA sequencingによる解析を行った。現在解析途中であるために明確な結論は述べられないが、多数の転写因子や酸化還元に関わる酵素などが強く発現していることがわかった。今後両種について比較解析を行い、その候補遺伝子についてin situ hybridizationなどの発現解析や機能解析を行えば、擬態の進化についてさらなる知見が得られると考えられる。シロオビアゲハはメスのみがベイツ型擬態をする種であり同種・同性にもかかわらず翅の紋様は大きく異なっている。擬態紋様を生み出すには紋様のプレパターンと色素合成が協調的に変化することにより作りだされると考えられるので、まず紋様のプレパターン形成に関わる遺伝子の探索を蛹期初期の翅を用いて行った。先の研究でwntシグナルが紋様と関わっていることが示唆されたので、wntシグナルに関わるwinglessのwhole mount in situ hybridization(WISH)を行ったところ、後翅の辺縁部で強く発現しており、winglessが紋様形成に関与していることが強く示唆された。さらに様々な遺伝子についてWISHを行ったところ、spaltとDistal-l essに関しても同様に紋様形成に関与していることが示唆された。次に擬態の進化について考察するために、擬態のモデルであるベニモンアゲハについてもマイクロアレイにより紋様のプレパターン形成に関わる遺伝子の探索を行った。すると後翅の白色紋様形成にシロオビアゲハと同様にNotchシグナルが関与していることが示唆された。続いて擬態紋様形成の最下流で働いている色素がどのような物質か、同定を行った。最初にシロオビアゲハの白色色素の同定を行った。白色色素は70%メタノール溶液で溶出され、383nmに最大吸収波長をもつことが分かった。この抽出物を水とアセトニトリル(AcN)のbinarysolvent systemで、溶出条件0%AcN:10分、50%AcN:20分、70%AcN:30分でHPLCにかけたところ、383nmに吸収をもつピークが5つあることが分かった。このことから白色色素は単一物質ではなく混合物であることが示唆された。今後プレパターン形成に関してさらに発現解析を行うとともに、シロオビアゲハとベニモンアゲハの白色および赤色色素を同定することにより擬態の進化について明らかにしていこうと考えている。

シロオビアゲハについてもベニモンアゲハ同様に抽出を行い、HPLC分析を行ったが目立ったピークは得られず、両種の赤色色素は異なっていることがわかった。このことからベイツ型擬態は収斂的に進化してきたことが示唆された。次に擬態紋様の位置決定にどのような遺伝子が関与しているかを網羅的に探索するためにRNA sequencingによる解析を行った。現在解析途中であるために明確な結論は述べられないが、多数の転写因子や酸化還元に関わる酵素などが強く発現していることがわかった。今後両種について比較解析を行い、その候補遺伝子についてin situ hybridizationなどの発現解析や機能解析を行えば、擬態の進化についてさらなる知見が得られると考えられる。翅の紋様形成に関わる遺伝子についてはジャノメチョウなどのeyespot形成について調べられているのみであるが、今回マイクロアレイによって紋様形成との関与が示唆される転写因子やシグナル伝達因子をコードする遺伝子が多数見つかったことは重要であると考えられる。さらに翅の色素に関しても同定には至っていないものの、物質をきちんと分離できる条件を見つけたので、今後質量分析やNMRにつなげることが容易になった点も評価できる。よって上記の評価とした。擬態紋様のプレパターン形成機構の解明に関しては、蛹期初期のマイクロアレイで紋様形成に関わる候補遺伝子について発現解析およびin vitro electropolation法による遺伝子の強制発現を行い、各遺伝子について紋様形成との関与を明らかにしようと考えている。シロオビアゲハとベニモンアゲハの翅の白色および赤色色素の同定に関しては白色に関しては分離条件を決定したので、質量分析およびNMRにより同定しよと考えている。一方でシロオビアゲハに関しては有機溶媒には溶解せず強酸による加水分解で溶出するしかないので、加水分解物から構造を推定しようと考えている。
1920～40年代における青年教育の成立・展開・転生に関する研究

本研究は、近代日本における勤労青少年の教育・訓練機関である、青年訓練所、実業補習学校、青年学校について、当該時期における社会変動との関連に留意しつつ、その成立と展開、さらにその戦後的形態を跡付けることを目的としている。平成22年度の成果としてまずは、各種資料収集・整理を挙げたい。収集された資料は、大きくは、青年教育関連の地方雑誌、女子青年教育関連の書籍、及び長野県飯田市の地域史資料にわけることができる。青年教育関連地方雑誌は、特に東京・本郷の連隊区司令部が発行した雑誌が研究史上でも触れられていないものとして非常に有益と考えられる。女子青年教育関連書籍については、図書館及び一般古書店に流通しているものを複写・収集した。長野県飯田市の地域史料は、1920年代の当該地域において青年会が青年訓練所反対運動を行ったという経緯があり、これも重要なものである。特に青年教育関連の雑誌は、国内外の資料館・図書館にも納められておらず、散逸が著しいため、今回の収集・整理は今後の研究への大きな貢献と考える。また並行して、本研究と接続可能な社会学理論の検討も大きく進んだ。検討したものとしては、フランスの社会学者P・ブルデュー、英国の教育社会学者B・バーンスティン、ドイツの社会学者N・ルーマンなどである。なかでも後二者は、本研究において青年教育全体を鳥瞰する上で重要な示唆を与えるものであった。これについては、今後も継続して検討していく予定である。具体的な成果としては、これまでの研究成果を集約して研究論文等にまとめたほか、研究会等での発表も行った。その他、学会誌への投稿論文も現在準備中である。1.男子の就学義務が定められた戦時期の青年教育の実態について、私立を中心に検討を行った。結果、(1)当該時期に都市部で中小事業者の共同による組合立青年学校が叢生した、(2)重化学工業分野を中心に企業内教育の青年学校化が進んだ、(3)したがって、男子義務制前後の青年学校の拡大は、量的な変化のみでなく、公立の青年学校とは質的に異なる私立青年学校の拡大に支えられており、結果として青年教育の質的な転換を含んでいたこと、を明らかにした。2.東京(日本橋)の青年学校において実施された教育調査を対象として、青年教育の存立の基礎となる認識論(まなざし)について検討した。また分析には二クラス・ルーマンのシステム理論を援用した。結果として、当該青年学校の教師たちの認識は、2つの段階性を持つことが明らかとなった。即ち(1)社会科学・心理学的認識、(2)哲学的・形而上学的認識である。とりわけ後者は、青年(イメージ)に対してアプリオリに問題性を読みこむ傾向があり、それによって青年学校の存在理由たる青年問題が本質主義的に構成されることとなった。3.1920後半40年代前半の20年弱にわたり、青年教育の教育・訓練の中核たる教練についての分析を行った。分析対象としては、当該時期に流通した教練の教授指導書を収集し、官製/民間の区別を用いて分類して分析した。結果、(1)教練は確かに軍隊教育とその内容を共有していること、(2)しかし、それらを組織し構成する意味の次元においては、軍隊に還元されない固有の人間形成技術であることが規範的に要請され、実際にそのように統制される傾向にあったこと、(3)しかし1941年以降は、積極的に軍隊教育と接続する方向へと転換していったこと、が明らかになった。
T細胞依存性、IgE非依存性の新規気管支閉塞機序の解明

IgE抗体の認められない非アトピー型喘息において、可逆性の気管支収縮が生じるメカニズムについて研究した。ヒト培養気管支平滑筋細胞封入ゲルを用いた平滑筋収縮アッセイ系を樹立し、患者由来の抗原特異的T細胞クローン培養上清に含まれる平滑筋収縮活性を測定した。免疫学的機序についてより詳細に解析する目的に、マウスT細胞クローン、T細胞移入気流閉塞モデルを樹立した(in vivo系)。幼若マウスの気管支平滑筋primary培養細胞を用いたゲル内収縮アッセイ系を確立した(in vitro系)。既知の気管支収縮物質に対するアンタゴニストにより、阻害されなかった。アトピー型、非アトピー型気管支喘息症例より、インフォームドコンセントを得た後、ヘパリン採血を実施、Ficoll-paque比重遠心法により末梢血単核球を分離し、無血清培地に懸濁した。抗原非特異的活性化刺激(固相化抗CD3抗体)や、抗原特異的刺激(ダニアレルゲン、カンジダ等の抗原)と培養し、上清を採取した。サイトカイン産生は特異的サンドイッチELISAで、細胞増殖応答を3H-thymidineパルスにより測定した。培養ヒト気管支平滑筋細胞を、24 well plate内でコラーゲンゲルに封入し、収縮活性のアッセイに用いた。培養上清はKrebs液に透析後、ゲルにアプライし、ゲル収縮を経時的に撮影し、収縮活性を測定した。遅発型喘息反応の惹起される症例の抗原刺激末梢血単核球培養上清中には、培養ヒト気管支平滑筋細胞ゲルの収縮活性が認められた。加えて、収縮活性の生化学的同定を目的として、IgE非依存的に遅発型喘息反応(LAR)の出現する症例の末梢血単核球を該当抗原で刺激し、限界希釈することで、アレルゲン特異的ヒトT細胞クローンの樹立を行った。得られたT細胞クローンを30 Gy照射された自己末梢血単核球を抗原提示細胞として、抗原刺激することでexpandし、resting後に、固相化抗CD3抗体で刺激、培養上清を採取した。細胞レベルの解析に留まらず、生体組織を用いたアッセイ系を立ち上げる目的に、Magnus管に牽引したモルモット気管リング収縮アッセイ系を立ち上げた。既知の収縮物質、上清をアプライし、収縮反応を経時的に記録した。in vivoでT細胞依存性の気流閉塞を解析するために、T細胞クローンを無処理マウスに移入、抗原チャレンジを行うことにより、気道過敏性、肺好酸球浸潤、気流閉塞を惹起するT細胞依存性喘息モデルを樹立した。今年度は、気管支喘息症例のT細胞由来気管支平滑筋収縮活性の研究に加えて、in vivo, in vitroでT細胞依存性の気流閉塞メカニズムをより詳細に解析する目的に、マウスでT細胞クローン移入による、抗原特異的遅発型喘息反応モデルを樹立し、発展させた。前年度までに樹立したOVA特異的T細胞クローンを無処置マウスに移入、抗原チャレンジを行うことにより、気道過敏性、肺好酸球浸潤、気流閉塞が惹起されるIgE非依存性、T細胞依存性喘息モデルであることを確認後、特に遅発型喘息反応がよく惹起されるクローンを選別した。このin vivoアッセイ系の知見を踏まえて、同クローンをin vitroで活性化し、培養上清を採取し、透析のうえ、培養ヒト気管支平滑筋細胞コラーゲンゲルのアッセイ系にアプライしたところ、T細胞クローンの活性化依存性に、ゲル収縮活性が検出出来ることを見出した。T細胞から、平滑筋収縮活性が産生されるとの知見は、きわめてユニークな発見で、意義が大きい。固相化抗CD3抗体による活性化刺激に加えて、抗原提示細胞+抗原刺激の系でも血清フリーの培養条件で、収縮活性の強い上清の採取ができないか検討を進めている。この収縮活性の同定に向けて、同じアッセイ系を用いて薬理学的なアプローチを開始した。ロイコトリエン阻害薬では、阻害されないことを確認した。もう一つのin vitroアッセイ系である、Magnus管に牽引したモルモット気管リング収縮反応系にもアプライし、収縮活性を検出出来るか解析中である。まず、気管支喘息症例を対象とした研究では、末梢血リンパ球からのIL-5産生を誘導する抗原に反応して、IgE非依存的に遅発型喘息反応が惹起される症例を見出し、末梢血T細胞から抗原特異的に、平滑筋収縮活性が産生されることを明らかにした。加えて、アレルゲン特異的T細胞クローンを多数樹立している。平滑筋収縮活性のアッセイ方法としては、培養ヒト気管支平滑筋細胞コラーゲンゲルのアッセイ系を樹立し、T細胞培養上清中の平滑筋収縮活性検出に成功した。さらに、Magnus管に牽引したモルモット気管リング収縮反応系も樹立し、現在ゲルアッセイ系で得られた結果との比較解析中である。免疫学的観点からは、種々のモノクローナル中和抗体、ノックアウトマウスが利用可能なマウスの系で、ヒトと共通のT細胞依存性気管支平滑筋収縮モデルが樹立できた意義は大きい。これらの成果を得て、最終年度の28年度には、より生化学的、薬理学的な解析を進め、分子レベルでの同定を行いたい。研究初年度に樹立したアレルゲン特異的ヒトT細胞クローンおよび培養ヒト気管支平滑筋細胞を封入したコラーゲンゲル収縮アッセイシステムを用いて、T細胞培養上清の平滑筋収縮活性の有無を検討した。固相化抗CD3抗体によるT細胞の活性化に依存して、収縮仮性が誘導されることを見出した。

抗ロイコトリエン薬、抗ヒスタミン薬、抗コリン薬によって収縮は抑制されなかった。今年度には加えて、幼若マウス気管支平滑筋初代培養細胞を封入したコラーゲンゲル収縮アッセイシステムを樹立した。メサコリン、ロイコトリエンによる用量依存的な収縮を確認した。この系により、27年度に樹立したマウスT細胞クローン移入による抗原特異的遅発型喘息反応モデルに用いたT細胞クローン培養上清の平滑筋収縮活性を評価した。ヒトT細胞クローンと同様に、固相化化抗CD3抗体による活性化依存性に平滑筋収縮活性が誘導されることを見出した。抗ヒスタミン薬、抗ロイコトリエン薬、抗コリン薬によって平滑筋封入ゲルの収縮は阻害されなかった。in vivoアッセイ系であるマウスT細胞クローン移入モデルにおいても、抗ロイコトリエン薬、抗コリン薬の前投与を評価した。約6時間後より、有意な気道抵抗の上昇を認めたが、抗ロイコトリエン薬、抗コリン薬のいずれによっても抑制されなかった。最後に、薬理学的な解析を進める目的に、Magnus管に牽引したモルモット気管リング収縮反応系の樹立を試みた。ロイコトリエン、メサコリン、ヒスタミンによる収縮は検出可能なレベルであったが、良好な感度、再現性が得られなかったため、培養上清の収縮活性検出には実験系のさらなる改良が必要と考えられた。IgE抗体の認められない非アトピー型喘息において、可逆性の気管支収縮が生じるメカニズムについて研究した。ヒト培養気管支平滑筋細胞封入ゲルを用いた平滑筋収縮アッセイ系を樹立し、患者由来の抗原特異的T細胞クローン培養上清に含まれる平滑筋収縮活性を測定した。免疫学的機序についてより詳細に解析する目的に、マウスT細胞クローン、T細胞移入気流閉塞モデルを樹立した(in vivo系)。幼若マウスの気管支平滑筋primary培養細胞を用いたゲル内収縮アッセイ系を確立した(in vitro系)。既知の気管支収縮物質に対するアンタゴニストにより、阻害されなかった。末梢血リンパ球からのIL-5産生を誘導する抗原に反応して、IgE非依存的に遅発型喘息反応が惹起される症例においては、抗原刺激末梢血リンパ球培養上清中に平滑筋収縮活性が検出できることを明らかにし、個体レベルでの喘息反応の有無とリンパ球からの平滑筋収縮活性の産生とが関連することを確立できた。IgE非依存的、T細胞依存的な遅発型喘息反応が惹起される症例から、アレルゲン特異的T細胞クローンを多数樹立できた。培養ヒト気管支平滑筋細胞コラーゲンゲルのアッセイ系において、T細胞培養上清によるゲル収縮活性を検出でき、T細胞由来の平滑筋収縮物質が存在することを証明できた。次年度に進めるより生化学的な解析に用いるための、貴重なマテリアルが得られたことも意味している。さらに、薬理学的な解析を進める目的にMagnus管に牽引したモルモット気管リング収縮反応系を確立した。この系での収縮活性について解析中である。26年度には、ヒトのアレルゲン特異的T細胞クローンを多数樹立し、新規にMagnus管に牽引したモルモット気管リング収縮反応系を立ち上げた。27年度には、収縮活性の高いマウス由来のクローンを樹立した。28年度には、これらの研究リソースをフルに活用し、大量培養、アッセイ、生化学的解析、精製へと研究を進めたい。