hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハイドレートケージにおけるゲスト物質の滞留と拡散に関する研究

ガスハイドレート内における水素を研究ターゲットの1つとし、水素混合ハイドレートの相平衡関係や、ゲスト分子の籠占有性、水素包接・放出挙動を研究した。ハイドレート籠を形作る水素結合のエネルギー的な「ゆらぎ」や機能がゲスト分子の滞留や拡散に影響を与えること、隣り合うハイドレート籠に包接されているゲスト分子が、周囲を取り囲む水分子の水素結合を越えて密接に相互作用していることを明らかにした。交付申請書に記載した最終目的を達成するために、2つの課題「ハイドレートへの水素分子の吸収・放出に適した補助剤の探索(課題1)」と「ESR測定によるハイドレート籠内における水素原子移動の解析(課題2)」について研究を遂行した。平成21年度の成果は以下の通りである。課題1では、新たな補助剤として、アミン類、アンモニウム塩、ボスホニウム塩を用い、水素を含有した広い意味でのクラスレートハイドレートの安定性を測定するとともに、ハイドレート(フレッシュもしくは再利用骨格)への水素吸収量・吸収速度を測定した。得られた成果のうち、ハイドレート骨格の再利用に関する研究では、再利用ハイドレート骨格内での水素分子の拡散がフレッシュ骨格と大きく異なり、拡散速度が極めて大きくなることを見いだした。これはハイドレート骨格内でのゲスト分子の滞留と拡散現象を解明する上での重要な発見であり、平成22年度以降、重点的に研究していく予定である。課題2では、大気圧下におけるハイドレート内での水素原子移動に関する研究を遂行しつつ、高圧力下でin situ測定可能なESR測定装置の開発を目指して専用高圧力チャンバーの開発を行った。前者では、ハイドレート骨格内における水素原子の移動現象に対して、骨格自体の安定性が及ぼす影響と大小籠間の関係について研究するため、プロパン分子に他のガス種(炭化水素または非炭化水素)を混合して研究を行った。その結果、非炭化水素分子の存在は、水素原子移動に大きな影響を与えることを発見した。ハイドレート籠内でのゲスト分子の滞留と拡散現象を解明する上で、隣り合う籠内のゲスト分子間の相互作用や、ゲスト分子一水分子間の相互作用は重要であり、さらに研究を進める予定である。後者については、解決すべき問題が残っているが、開発は順調に進行していると考えている。平成22年度の成果は以下の通りである。課題1では、昨年度発見した「再利用ハイドレート骨格における水素分子の拡散速度はフレッシュ骨格における拡散速度より大きくなる(プリトリートメント効果)」について継続して研究を行った。その結果、水素結合ネットワークが比較的柔軟であると思われるセミクラスレートハイドレート系にて、プリトリートメント効果が顕著に発現することなどを明らかにし、ハイドレート骨格内でのゲスト分子の拡散速度を向上させうるガスハイドレートを探索するための一つの指針を得た。課題2では、大気圧下におけるハイドレート内での水素原子移動に関する研究を遂行しつつ、エキシマ光照射下かつ高圧力下でin situ測定可能なESR測定装置の開発を目指して専用高圧力チャンバーの開発を行った。前者では、昨年度部分的に明らかにした「隣り合う籠内のゲスト分子間の相互作用や、ゲスト分子-水分子間の相互作用が与える影響」について研究を進めるために、非炭化水素ガスやアミンをゲスト分子としたハイドレート内におけるラジカル種の熱安定性ならびに水素原子の移動について研究した。炭化水素系のハイドレート内では検出されなかったホスト分子由来のラジカル種が水素結合ネットワーク上を見かけ上移動することを示唆する結果を得た。ハイドレート籠内でのゲスト分子の滞留と拡散現象を解明する上で、水素結合の「ゆらぎ」などハイドレート籠の性質を解明することは重要であり、さらに研究を進める予定である。後者「専用高圧力チャンバーの開発」については、解決すべき問題を残しているが、当該研究期間内の完成に向けて開発を進めている。平成23年度の成果は以下の通りである。課題1では、ハイドレートに特定の前処理を施すことによる水素吸収速度の促進効果が、セミクラスレートハイドレート粒子表面の性質に大きく影響されることを明らかにした。特に、水素結合性ゲスト分子を用いた混合ガスハイドレートにおいて、この現象が顕著に発現することなど補助剤探索に向けた重要な指針を得た。課題2では、エキシマ光照射による水分子の選択的な解離からもたらされるガスハイドレート内のラジカル反応を電子スピン共鳴法ならびに質量分析により明らかにした。ハイドレート結晶内部における異種ゲスト分子間ならびにゲスト分子と水素結合ネットワーク間の反応性を明らかにした。また、クラスレートではない一般的な水和物構造との直接比較から、ハイドレート結晶に特有の水素結合の性質の一端を明らかにした。

交付申請書に記載した「ESR用高圧チャンバーの開発・最適化」については当初想定したチャンバーを完成することができなかったが、当該課題で得られた実績を基に、さらに電子スピン共鳴装置の専門家を交え、開発を継続する。両課題から、ガスハイドレート結晶内における水分子が、氷や一般的な水和物と大きく異なる性質を持つことなど重要な知見を得ることができた。
ウイルスを利用した腫瘍検出センサーの開発

本研究では、我々が開発した腫瘍溶解アデノウイルス(AdΔE4)を応用して、がん細胞のみが発行し、蛍光を照射するとがんを可視化できるシステムを構築することを目的とした。当初、ウイルスのゲノム中に緑色蛍光タンパク(GFP)遺伝子を組み込んだウイルスを作成することを目的としたが、GFPの発現アデノウイルスとAdΔE4を同時に感染させる手法も効率的であることを見出し検討した。その結果、両ウイルスを感染させたがん細胞は特異的に発光し、正常細胞では発光が弱かった。これらの結果より、AdΔE4とGFP発現アデノウイルスを共感染することにより腫瘍センサーとして機能することが明らかになった。本研究の目的は、現在開発している腫瘍溶解アデノウイルスを応用して、腫瘍を検出するためのセンサーを開発することである。アデノウイルスを感染させるとARE-mRNAが核外輸送・安定化され、この現象はウイルスの複製に重要であることが明らかになっている。我々は、一部の初期遺伝子を欠損したアデノウイルス(AdΔE)は、あらかじめARE-mRNAが核外輸送・安定化しているがん細胞では増殖でき、ARE-mRNAが核内にとどまっている正常細胞では増殖できない可能性がある。本研究ではAdΔEのゲノム中に緑色蛍光タンパク(GFP)を組み込んだアデノウイルスを作成し、がん細胞のみが発行し、蛍光を照射するとがんを可視化できるシステムを構築する。1センサーの開発:当初の研究計画により、アデノウイルスの後期遺伝子の一部にGFP遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスの作成に取り組んだ。しかしながら、ウイルスプラスミドが非常に大きく(約40kb)、GFP遺伝子を挿入することが非常に難しく、これまでのところ成功していない。2AdΔEの腫瘍溶解効果: GFPを挿入する前のAdΔEの持つ腫脹溶解効果を検討した。HeLa(子宮頸がん)、MCF7(乳がん)、PC3(前立腺がん)、A549(肺がん)、HSC3(舌がん)、Ca9.22(歯肉がん)などのがん細胞、もしくは、BJ(陰茎上皮細胞)、HGF(歯肉線維芽細胞)、HAEC(上気道上皮)などの正常細胞などを用いてウイルス生産効率を検討したところ、がん細胞での生産効率の方が正常細胞のそれより高く、AdΔEが腫瘍溶解効果を持つことがわかった。現在、他のウイルス作成法を採用するか、もしくはGFPを新たに挿入しないでも使えるアデノウイルスの使用を計画している。本年度は、GFPを組み込んだ腫瘍溶解アデノウイルスを作成したが、成功しなかった。我々はアデノウイルスのプラスミドを所有しており、このプラスミドの適当な制限酵素siteにPCR法で増幅させたGFP遺伝子の挿入を試みたが成功しなかった。これはプラスミドが約40kbと非常に大きく、取り扱いが困難なことが大きな理由であると考える。従って、当初の研究計画より遅れていると言わざるをえない。それに対して、センサーの大元になる腫瘍溶解アデノウイルスAdΔEは、正常細胞と比べてがん細胞でより生産効率が高かったので、このウイルスは腫脹溶解効果を持つことが確認できた。今後、複数の計画を立てセンサーの開発に取り組む予定である。アデノウイルス感染によりARE-mRNAが核外輸送・安定化され、この現象はウイルスの複製に重要である。一部の初期遺伝子を欠損したアデノウイルス(AdΔE)は、あらかじめARE-mRNAが核外輸送・安定化しているがん細胞では増殖でき、ARE-mRNAが核内にとどまっている正常細胞では増殖できない可能性がある。本研究の目的は、AdΔEのゲノム中に緑色蛍光タンパク(GFP)を組み込んだアデノウイルスを作成し、がん細胞のみが発行し、蛍光を照射するとがんを可視化できるシステムを構築することである。まず、AdΔEの腫瘍細胞溶解効果を検討するため、その生産効率および細胞死に及ぼす影響をがん細胞と正常細胞を用いて確認した。その結果、AdΔEはがん細胞の方が正常細胞より両活性が高いことが明らかになった。また、アデノウイルスの後期遺伝子の一部にGFP遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスの作成に取り組んだが、ウイルスプラスミドが非常に大きく、GFP遺伝子を挿入することが非常に難しく成功しなかった。そこで、市販されているGFP発現用のアデノウイルスを購入し、開発した腫瘍溶解アデノウイルスAdΔEと一緒に投与した。このGFP発現ウイルスはE1Aが存在するとウイルスが増殖しGFPが強く発光するシステムで、一緒に存在するAdΔEが複製するとGFPが発現する。従って、腫瘍の部位でGFPが発現することになる。その結果、HeLa(子宮頸がん)細胞などのがん細胞ではGFPの活性が認められたが、BJ(陰茎上皮細胞)細胞などの正常細胞ではその活性は非常に弱かった。これらの結果より、AdΔEとGFP発現アデノウイルスを共投与することにより腫瘍センサーとして機能することが明らかになった。今後、腫瘍センサーになり得るアデノウイルスの作成に引き続き取り組む。

これまではアデノウイルスのプラスミドを用いて、GFP遺伝子を挿入する手法を用いた。しかしアデノウイルスの作成には組み換えを用いた手法が一般的である。この方法は、ウイルス遺伝子の相同部位が細胞内もしくは大腸菌内で組み換えを起こす性質を利用した方法である。挿入したいGFP遺伝子の両端に、ウイルスゲノムの挿入部位に存在する短いウイルス遺伝子を配置したプラスミドを作成する。次に、ウイルスゲノム遺伝子と作成したGFP+ウイルス遺伝子を持つプラスミド遺伝子を同時に細胞もしくは大腸菌に導入する。アデノウイルスの場合、およそ0.11%程度の確率で遺伝子組み換えが起こり、組み換えウイルスが作成される可能性がある。また、これらの手法が成功しない時は、市販されているGFP発現用のアデノウイルスを購入することもあり得る。このウイルスを使う時は、開発した腫瘍溶解アデノウイルスAdΔEと一緒に投与する。このGFP発現ウイルスはE1Aが存在するとGFPが発現するシステムで、一緒に存在するAdΔEが複製するとGFPが発現する。従って、腫瘍の部位でGFPが発現することになる。以上の様な複数の計画でセンサー開発に取り組む。分子生物学アデノウイルスプラスミドにGFPを挿入するのに手間取り、本来計画していたがん細胞でのセンサーの効果を検討できなかった。また我々の研究室の耐震工事等の理由で思い通りに研究が遂行できなかった。以上の様な理由で、計画していた使用額には達しなかった。今後の研究計画にも示した様に、次年度は腫瘍センサーの作成に取り組み、その効果を培養細胞を用いて確認する。さらに、当初の計画通りヌードマウス等を用いてin vivoでセンサーの効果を評価する予定である。従って次年度は培養細胞購入や動物実験に必要な、動物、器具などを主に購入し研究を推進する予定である。そして残りの科研費でさらに効率の高いウイルスセンサーを作成し、その効果を検討するためにアデノウイルス生産効率測定キットや、XTT assayキットを購入する予定である。
LD直接励起レーザーを用いた高強度高周波テラヘルツ波発生とその応用

本研究では、この高周波テラヘルツ帯に着目し、周期が数十fsの高強度光電場による物性制御を目指して、位相安定な高周波テラヘルツ光源の開発を行う。従来は広い帯域が利用可能なチタンサファイアレーザーをベースとしたものが主流であったが、近年レーザーダイオード直接励起の高安定なYbレーザーが利用できるようになってきた。この高い安定性と高繰返し性を活用しつつ、バンド幅の狭さを克服した、新たな高強度高周波テラヘルツ光源の実現を目指す。
iPS細胞3次元網膜組織培養を用いた老化によるミトコンドリア障害の解析

現代の高齢化社会において健康長寿は重要な社会問題であり、老化とともに進行する加齢黄斑変性等の失明疾患を含めた老化による視機能低下に対する新規介入法が切望される。一方、老化の一因にDNA損傷の蓄積(Sinclair et al., Cell 2008)やミトコンドリアの制御異常(Fang et al. Cell 2014)などがあるが、それらの関連には未知の部分が多い。DNAの修復にはエネルギーが必要であり、DNA損傷とエネルギーを産生するミトコンドリアの関連を解析することは重要である。本研究では、タモキシフェンでDNA損傷を誘発可能なマウスiPS細胞を、3次元組織培養により網膜組織に分化誘導し、DNA損傷を誘発した際の網膜の変化をミトコンドリアに着目して分子レベルで解析する研究である。そのために本研究では、共同研究者のSinclair教授が開発したタモキシフェン存在下でDNA二本鎖切断を引き起こすI-PpoI endonucleaseを発現するトランスジェニックマウス(Inducible Changes in the Epigenome mouse; ICEマウス)のiPS細胞を用いる。また、3次元網膜組織培養の方法には、神戸理化学研究所で開発された方法(Eiraku, Sasai et al., Nature 2011)がある。申請者らはこの手法を踏襲して、3次元組織培養を行っている。そして、将来の臓器・組織老化に対する新規治療介入法の開発につなげるための研究である。タモキシフェンを添加することでDNA二本鎖切断を誘導する条件を決定し、網膜組織培養における表現型の解析を行う方策である。そのために継続的に培養するとともに、動物の網膜を用いて染色等の解析系の立ち上げも行う方策である。3次元培養の立ち上げが効率的に行えたことにより、初期段階にかかる費用を抑えることが出来たため次年度使用額が生じた。この次年度使用額は、翌年度分と合わせて、組織染色に使用する抗体の購入や動物の購入や飼育に使用する。
口腔環境の変化が上気道常在菌に及ぼす影響-嫌気性菌を主として-

口腔外科で治療対象となる舌、顎骨に発症する各種疾患の結果、嚥下機能障害や誤嚥が惹起されることも少なくないが、この様な口腔環境の変化ならびに口腔機能の低下により上気道、喉頭部の細菌叢に影響を及ぼしていると考えられるため、上気道の細菌叢について嫌気性菌を主として分離同定を行った。対象:下顎骨半側切除を行った2症例ならびに舌半側切除後再建を行った1症例の計3症例とした。方法:これら患者の上咽頭正中部より、表面麻酔施行後、1cm^2を目安にして滅菌綿棒にて擦過し、直ちに本学口腔細菌学講座に設置されている嫌気グローブボックス内で定量培養を行った。(コントロールとして頬粘膜より検体を採取した。)培養は検体をまず希釈液内でホモジュナイズし、10^<-1>から10^<-4>まで希釈し血液寒天培地下に37°C嫌気グローブボックス中で1週間培養し、数度培養を繰り返し純培養とした。同様にして好気培養も行った。純培養としたコロニーをPYG培地にて培養し、培養された細菌をグラム染色にて鏡検後、PYG液のガスクロマトグラフィーにより最終代謝産物の分析を行い、細菌をgenusレベルまで同定した。結果:抽出されたコロニー数は口腔粘膜と比し少く、ガスクロマトグラフィーによる最終代謝産物では50%以上で乳酸が検出された。鏡検結果も加え、Streptococcusを中心としたグラム陽性球菌が多く存在していることが確認された。また、Candidaなど真菌も多く確認された。
細菌線毛の尿路感染症における意義の解明と尿路感染症治療への抗線毛抗体の応用

1.細菌線毛の尿路分離株における分布:尿路分離菌の線毛保有率を赤血球凝集反応により検討した、大腸菌、セラチア等で線毛保有率が高く、緑膿菌、プロテウス等で低かった。大腸菌及びセラチアではマンノース低抗性(MR)およびマンノース感染性(MS)線毛があり、両線毛保有株も少なくなかった。2.線毛遺伝子のクローニングと線毛の種類による生体反応の相違:尿路感染由来Serratia marcescensよりMRおよびMS線毛遺伝子をクローニングした。このクローニングされたMRおよびMS線毛遺伝子操作により、MRおよびMS線毛のみの発現した細菌を作成した。この細菌を用いた腎感染モデル実験において、MR線毛より、むしろMS線毛が腎感染の慢性化および瘢痕形成に関与している事が明らかとなった。この瘢痕形成はスーパーオキサイド、デイスムターゼ(SOD)により予防できることより、MS線毛は生体のスーパーオキサイド(SO)産生を促進し、SOが腎組織を破壊すると考えられた。3.尿路感染に対する生体側感染防御因子の研究:尿路感染に対する生体側防御因子の中で、多核白血球は最も重要であり、尿中および腎実質内ではこの白血球機能が抑制されている可能性がある。そこで、尿および腎実質内で濃度の高いNaClおよび尿素の白血球機能に対する影響を検討した。その結果、NaClおよび尿素により白血球の食菌能、殺菌能、SO産生能が抑制される。この抑制のメカニズムはNaClと尿素により異なり、NaClはATP消費によるエネルギー涸渇であり、尿素はSO産生に関与する諸酸素に対する直接作用と考えられた。以上より、細菌線毛は尿路付着を介する感染発症とそれ以後の生体反応に関与している事が考えられた。細菌線毛は腸管感染症や尿路感染症において、菌の定着因子としての意義が明らかにされつつある。そこで、細菌線毛の尿路感染症における意義を調べる目的で、各種尿路感染症患者より得られた大腸菌,シトロバクター,クレブジエラ,セラチア,プロテウス,プロビデンシア等の菌種について、赤血球凝集反応により、線毛保有率と線毛の分類を行なった。1)大腸菌について:急性膀胱炎,複雑性腎盂腎炎,膀胱炎および腸管利用尿路変更術後患者尿より74株の大腸菌を分離した。ヒト・ウシ・ニワトリ・サル・モルモット赤血球に対する凝集性を検討し、いずれかの赤血球に対して凝集性を有するものは38株(51%)であり、マンノースに対する反応を加えて検討した結果、8種類の凝集パターンのある事が見出された。また、尿路変更術後患者尿より得られた菌で最も凝集反応腸性率が高く、急性膀胱炎,複雑性膀胱炎,慢性腎盂腎炎では同程度であった。マンノース耐性の凝集反応は急性膀胱炎が最も高頻度で、次いで複雑性腎盂腎炎,尿路変更術後,複雑性膀胱炎の順であった。2)その他の菌について:大腸菌以外の菌種ではセラチア、クレブジエラでは赤血球凝集陽性率が高かったが、シトロバクターでは低く、プロテウス、プロビデンシアでは極めて低かった。1.尿路感染起炎菌(グラム陰性桿菌)からの線毛成分の分離・精製:大腸菌を用いて線毛を分離・精製し電顕的に線毛成分であることを確認した。多くの菌株を用いて集める必要があり、現在進行中である。2.線毛成分の尿路感染症に及ぼす病原的意義の解明:臨床より分離した尿路感染起炎大腸菌74株を用いて各種動物赤血球の凝集パターンの解析を行なった。

その結果、腸管感染の大腸菌に高率にみられるウシ赤血球の凝集がゼロであった。又腸管利用の尿路変向術症例からの大腸菌の高率に凝集反応がみられた。このことは定着因子(線毛)の違いによるものであろう。3.線毛を中心とする菌側病原因子に対する生体側尿路感染防御因子の作用に関する研究:線毛のリセプターを有する尿中粘液物質、上皮細胞を除いた感染防御の細胞性因子の代表として好中球をとり上げた。塩化ナトリウム,尿素を用い各滲透圧条件を作り、好中球機能として活性酸素産生(スーパーオキサイド)の程度をみた。その結果、高滲透圧下では活性酸素産生が低値を示したが、同一滲透圧下においても用いた2種の物質で差がみとめられた。4.上記の2及び3は一部62年度の研究とも関係してくるが、今後の研究においても、尿路感染成立初期における線毛を中心とした各種菌側病原因子と生体側防御因子との相互作用を明らかにするため、動物実験モデルの作成と平行してin vitroの系での解析も進めていく予定である。1.細菌線毛の種類と尿路病原性に関する研究:尿路分離菌における細菌線毛の保有率と線毛の種類について検討した.尿路感染由来大腸菌では赤血球凝集性により8種類のパターンがあり,少なくとも8種類の線毛発現形態のあることが示唆された.その他の尿路感染由来の腸内細菌属について,赤血球凝集反応により,線毛保有率を検討した.その結果,セラチア,クレブジエラ,大腸菌等では線毛保有率が高く,シトロバクター,プロテウス,プロビデンシア,緑膿菌等では線毛保有率が低かった.2.ラテックス凝集反応によるP線毛保有状況:尿路由来大腸菌には, P線毛とタイプ1線毛の存在が知られており,その意義が論じられている.P特異的凝集反応にて,急性単純性膀胱炎患者より得られた大腸菌株についてP線毛の保有状況を検討した.その結果, P線毛保有率は20%,タイプ1線毛保有率は50%で,両者保有株が6%であった. P線毛保有株は全てマンノース抵抗性凝集反応を示したが,マンノース抵抗性凝集反応を示す株の52%はP線毛ではなく, nonーP, nonータイプ1線毛の存在が示唆された.3.線毛発現に及ぼす尿成分の影響:タイプ1,P線毛の発現に対する尿及びその構成々分の影響を調べた.その結果,タイプ1,P線毛ともに尿および尿素の影響を受けたが, NaClの影響は少なかった.4.線毛を中心とする菌側病原因子に対する生体側尿路感染防御因子の作用に関する研究:尿路感染症の主な防御因子として重要な白血球機能の腎盂および尿中での影響を調べる目的で, NaClや尿素のスーパーオキサイド産生能に対する影響を調べた.その結果,高浸透圧下ではスーパーオキサイド産生能の低下があり, NaClと尿素では2つの違ったメカニズムに依る事が明らかとなった.1.細菌線毛の種類と尿路病原性に関する研究・尿路分離細菌の線毛保有率と線毛の種類を検討した。尿路感染由来大腸菌は8種類の赤血球凝集パターンがあり、線毛発現形態に種類がある。そこで、ラテックス凝集反応による特異的P線毛保有株を検討した。その結果、急性単純性膀胱炎患者尿由来の大腸菌では、20%がP線毛保有株で、Type1線毛保有株が50%、両者同時保有株が6%であった。また、P線毛保有株の全株はマンノース低抗性(MR)凝集反応を示すが、MR凝集反応陽性株の52%は非P線毛であった。このことは非P、非Type1線毛が存在することを示している。2.線毛のクローニング.と線毛の種類による生体反応の相違に関する研究・Seratia marcescens
ヒトパピローマウイルス蛋白と樹状細胞を利用した子宮頚癌特異的免疫療法

子宮頚癌の99.7%にHuman papillomavirus(HPV)DNAが検出され、頚癌の発癌にHPVが密接に関連していることが明らかとなっている。HPV陽性子宮頚癌細胞ではHPVウイルス蛋白E6とE7が常に発現しているため、このE6/E7蛋白あるいはそのペプチドを癌抗原として特異的癌免疫療法に応用できる可能性がある。しかしこれまでのところヒトにおいてはE7ペプチドだけでは十分なCTLを誘導できず、有効なImmune Adjuvant(IA)が必要であると思われる。我々はヒト樹状細胞(DC)をIAとしてE7ペプチドあるいは蛋白による特異的CTLが誘導できるかどうかを検討した。インフォームドコンセントを得て採血を行ない、Sallustoの方法に従って末梢血液からGM-CSFとIL-4存在下で培養し樹状細胞を得た。Biomagnetic separation beadsを用いて選択的にCD8陽性細胞を採取した。DC(1x10^6/well)にHPV-16E7ペプチドあるいはE6/E7蛋白で刺激後CD8陽性T細胞(5x10^6/well)とともに培養した。CTLの特異性はT2細胞あるいはDCをTargetとしたCytokine Release Assayで判定した。CD8陽性細胞の選択性はあらかじめFACS検査によって95%の陽性率(5%はCD4+T cellの混入)を確認した。この方法により自己樹状細胞を使用してペプチドおよびE6/E7蛋白の両者において特異的CTLを誘導できることが判明した。免疫反応の開始にはCD4+Helper T cellが重要であることが明らかとなっているが、自己樹状細胞を利用することによりE7ペプチドのみならず、蛋白においても特異的CTLが誘導できることが判明した。HPV(Human papillomavirus)陽性子宮頚癌患者よりインフォームドコンセントをえて末梢血より単球を分離した。プラスチックフラスコに1x10^8個の単球を投与して5-7日間サイトカイン(2000IU/mlGM-CSFおよび2000IU/mlIL-4)と共に培養し十分な樹状細胞を得ることができた。また樹状細砲の特徴を形態的にも確認できた。一方同じ患者より採取した単球よりBiomagnetic separation beadsを用いて選択的にCD8陽性細胞を採取できた。CD8陽性細胞の選択性はFACS検査にて95%以上であることを確認した。この方法により自己樹状細胞を使用してHPV-16E7ペプチド(10-50microgram/ml)と共に培養したあとCD8陽性細胞を2回以上刺激したところ、特異的CTLを誘導することができた。特異的CTLはT2細胞をTargetとしたCytokine Release Assayで判定し300-800 picograms/ml/24hrs.INF-gammaの陽性所見であった。しかしその反応は必ずしもペプチド濃度依存性ではなく、またペプチドの種類によっても反応は異なり、今後さらなる研究が必要である。HPV(Human papillomavirus)陽性子宮頸癌患者よりインフォームドコンセントをえて末梢血より単球を分離した。また樹状細胞の特徴を形態的にも確認できた。この自己樹状細胞を使用してHPV-16E7ペプチド(10-50microgram/ml)と共に培養したあとCD8陽性細胞を2回以上刺激したところ、特異的CTLを誘導することができた。

特異的CTLはT2細胞をTargetとしたCytokine Release Assayで判定し300-800 picograms/ml/24hrs.INF-gammaの陽性所見であった。しかしその反応は必ずしもペプチド濃度依存性ではなく、またペプチドの種類によっても反応は異なった。また子宮頸癌細胞培養株にも反応した。ペプチドの種類によっても特異的CTLの反応は異なり、今後臨床応用するには複数のペプチドを使用するほうがより効果的と思われる。
小細胞肺癌におけるアムルビシン治療最適化のための効果予測因子の同定

小細胞肺癌におけるアムルビシン単剤療法による長期奏功例因子の探索のため、入手した手術検体10例の内、6例(長期奏功例4例/無効例2例)のDNA、RNAを抽出DNAは、その品質が解析に不十分であり除外されたため、長期奏功例1例、無効症例2例の手術検体を追加し、遺伝子変異解析を実施した。結果、両群で明らかに差のある遺伝子変異は認めなかった。遺伝子発現解析は、nCounter Analysis System&reg; [Nanostring社]を用いて、小細胞肺癌の発がんやAMRの作用・代謝機構に関与すると考えられるmRNA 72種の候補遺伝子を選出し、実施した。解析結果からは長期奏功群では無効群と比較し遺伝子Aの発現レベルの低下を認めた。遺伝子Aは腫瘍の増殖やアポトーシスに関連する遺伝子であり、過去の報告より、発現レベルの低下している細胞ではアポトーシスがより起こりやすい可能性が考えられた。アポトーシスが起こりやすい状況下でDNA合成阻害剤であるアムルビシンが投与されることで、無効例と比較しより抗腫瘍効果が高い可能性が考えられた。最終年度は遺伝子Aの遺伝子経路を含むmRNA 220種の遺伝子発現解析を、同システムを用いて実施した。結果、遺伝子Aの発現レベルの差を確認し、さらに前回の72種の候補遺伝子には含まれなかった、別の遺伝子経路にある遺伝子Bに関しても発現レベルの差を認めた。遺伝子Bを含む遺伝子経路は、非小細胞肺癌において遺伝子Bのメチル化により、予後が大きく異なるこが報告されている。今後は遺伝子Bのメチル化の評価や、別検体を用いた遺伝子A,Bの遺伝子発現解析を検討している。小細胞肺癌におけるアムルビシン単剤療法による長期奏功例因子の探索のため、入手した手術検体10例の内、6例(長期奏功例4例/無効例2例)のDNA、RNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いた癌関連遺伝子127個のhot spot変異解析(NCC Oncopanel ver.4.0 [Agilent社])を行った。無効例の剖検検体1例から抽出したDNAは、その品質が解析に不十分であり除外されたため、長期奏功例1例、無効症例2例の手術検体を追加し、遺伝子変異解析を実施した。結果からは長期奏功群では、無効群と比較し、クロマチンリモデリングに関与する遺伝子変異を多く認めたが、無効群でも同様の遺伝子変異は認められたため、両群で明らかに差のある遺伝子変異は認めないとの結論に至った。遺伝子発現解析は、nCounter Analysis System&reg; [Nanostring社]を用いて、小細胞肺癌の発がんやAMRの作用機序・代謝機構に関与すると考えられるmRNA 72種の候補遺伝子を選出し、実施した。よりアポトーシスが起こりやすい状況下でDNA合成阻害剤であるアムルビシンが投与されることで、無効例と比較しより抗腫瘍効果が高い可能性が考えられた。提出した研究計画書に、概ね沿った経過で研究を進められているため。手術検体の遺伝子発現解析で得られた候補遺伝子である遺伝子Aに関して、関連する遺伝子経路の発現を確認するため、nCounter systemの遺伝子経路に特化した遺伝子パネルを用いて、その発現の程度を解析、確認する。免疫組織学的染色法で遺伝子Aや関連する遺伝子のタンパク発現が評価可能かを確認する。当該年度は、手術検体からnCounter systemの遺伝子経路に特化した遺伝子パネルを用いて、その発現の程度を解析していたが、次年度生検検体を含む腫瘍組織に研究の範囲を広げることになった。
寄生・宿主相互作用解明を指向した糖鎖の化学合成

近年、細胞表層に存在する糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖が細胞間の認識現象に深く関与する分子種であることが明らかとなり、特に高等動物より見出された糖鎖の化学的、生物学的研究が盛んに行われている。一方、無脊椎動物より見出された糖鎖構造はほ乳類の糖鎖構造とは大きく異なっているが、単離・構造決定にとどまり機能解明にまで至っていない。そこでこれら無脊椎動物由来の糖鎖構造と生物機能に興味を持ち、化学合成を行うことで機能解明を目指している。今回、寄生虫であるエキノコックス、マンソン住血吸虫、ブタ回虫、イヌ回虫及び接合菌より見出された糖鎖の化学合成を行い、20種類以上の目的化合物を得た。当研究室において細胞表層における複合糖質糖鎖の機能解明の一助として、下等動物より得られる糖脂質や糖タンパク質糖鎖の化学合成を目指してきた。合成化合物は均一構造を有しており、生命現象を分子レベルで解明する上で貢献でき、創薬への応用も期待できる。今年度は表題である『寄生・宿主相互作用解明を指向した糖鎖の化学合成』の一環として1.エキノコックス由来糖タンパク質糖鎖の合成2.糸状菌Mucor属由来糖脂質の合成を遂行した。1について我々はこれまでに同寄生虫より見出された新規糖脂質を化学合成し、これらはエキノコックス感染者の血清と相関があり、抗原性を見出してきた。一方で、同寄生虫の血清診断に利用される抗原にはEm18、EmA9、Em2などがあり、このうちEm2はGalβ(1-3)GalNAcを核として分岐したムチン型の糖鎖を持った糖タンパク質構造をとっていることが判明している。これまでに当研究室ではエキノコックスから見出された新規糖タンパク質を糖鎖の還元末端側にセリンが結合した形のモデル化合物の合成を試みたが、セリン誘導体は強塩基性条件下でセリンがβ脱離を起こし、効率よく合成することが困難であった。さらにEm2のペプチド部分には抗原性がないことも示唆されているため、今回は還元末端側にセリンではなく2-(trimethylsilyl)ethyl基を導入した6種類のモデル化合物の効率的な合成方法の構築を目指した。すなわち適切な保護基で保護した単糖誘導体を調製した後、立体選択的に順次縮合させ、三五糖誘導体を6種類合成した。現在までに3種類は脱保護が完了し目的化合物が得られており、残り3種類の脱保護を現在行っている。今後上記同様患者血清との相関を調べ、抗原性を明らかにできると特異的な診断薬への道が開けると考える。2についてはガラクトースのみから成る糖脂質が報告され、三、四、五糖の全合成を完了し、この結果は専門誌Carbohydrate Researchに受理された。今後、糸状菌における植物への細胞毒性並びにヒトヘの免疫応答に関する生物活性を期待する。今年度は表題である『寄生・宿主相互作用解明を指向した糖鎖の化学合成』の一環として1.エキノコックス由来糖タンパク質糖鎖の合成2.マンソン住血吸虫由来糖脂質の合成3.ブタ回虫由来糖脂質の合成を遂行した。1については、6種類の目的化合物のうち、Hl9年度においてすでに3種類は完了しており、また、残る3種類においても各オリゴ糖誘導体まで完成しており、20年度初旬に脱保護を検討し、6種類すべての合成を完了した。この内容は学術雑誌Carbohydrate Researchに投稿し、現在in pressの状態である。2についてはマンソン住血吸虫より見出されたGalNAcβ1-4Glcという新規な糖鎖をコアとした二八糖の糖脂質が報告され、本年度は二四糖の全合成を完了した。現在専門誌Carbohydrate Researchに投稿準備中である。本年度はさらに五六糖といった高次の糖鎖について合成を試みる。3についてはブタ回虫より見出されたGlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcをコア(arthro系列)とした糖脂質の非還元末端オリゴ糖に着目し、ブタ回虫感染患者と犬回虫(糖鎖の報告がなされていない)感染患者の判別を目的として5種のオリゴ糖鎖を合成した。いずれも位置選択及び立体選択を念頭に置き、効率合成を目指した。グリコシデーションによる糖伸長は、ほぼ満足な収率で導くことができたが、脱保護については低収率の箇所もいくつか見られ課題を残した。

当研究室において細胞表層における複合糖質糖鎖の機能解明の一助として、下等動物より得られる糖脂質や糖タンパク質糖鎖の化学合成を目指してきた。合成化合物は均一構造を有しており、生命現象を分子レベルで解明する上で貢献でき、創薬への応用も期待できる。今年度は表題である『寄生・宿主相互作用解明を指向した糖鎖の化学合成』の一環として1.イヌ回虫由来糖タンパク質糖鎖の合成2.マンソン住血吸虫由来糖脂質の合成3.ブタ回虫由来糖脂質の合成を遂行した。1については、2MeFucα(1→2)4MeGalβ(1→3)GalNAcα1→構造を有する天然型三糖と、これらの部分構造又はモノメチル体である非天然型4種の計5種類の合成を完了した。現在、患者血清との免疫反応を調べ、これらの合成糖鎖の抗原性について検討している。2についてはマンソン住血吸虫より見出されたGalNAcβ1-4Glcという新規な糖鎖をコアとした二八糖の糖脂質のうち、本年度は五六糖の全合成並びに長鎖糖脂質の非還元末端部について合成した。今後、イヌ回虫同様住血吸虫症患者血清との免疫反応を調べ、これらの合成糖鎖の抗原性を調査する。3についてはブタ回虫より見出されたGlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcをコア(arthro系列)とした糖脂質の非還元末端オリゴ糖に着目し、ブタ回虫感染患者とイヌ回虫(糖鎖の報告がなされていない)感染患者の判別を目的として五糖のオリゴ糖鎖を合成した。これは前年度、五糖誘導体の脱保護において効率よく目的糖鎖が得られなかったため、改良法を検討してきた。いずれも位置選択及び立体選択を念頭に置き、効率合成を目指した。なお、糖合成における鍵反応であるグリコシデーションによる糖伸長は、低収率の箇所もいくつか見られ改善が必要である。
細胞内寄生性病原体の侵入を防ぐ「バリア機構」を形成する胎盤の新規分子メカニズム

トキソプラズマ感染白血球の挙動を明らかにするため,赤色蛍光タンパクを発現する組換え原虫をGFPマウスの白血球に感染させたのち,野生型マウスの血流中に移入した。経時的に臓器を採材し,標的臓器に流入する白血球と虫体をそれぞれ緑色および赤色蛍光を指標に観察した。この実験により、感染白血球は非感白血球よりも血管内皮に接着しやすく効率よく肺等の臓器内に留まることが分かった。一方で、胎盤ではこのような現象はおこっていなかった。以上から胎盤では感染白血球の停滞が他臓器よりも起こりにくいことが分かった。一方、胎盤内の虫体数の多寡と胎児への垂直感染成立の間にはっきりした相関関係がないことが分かった。これら二つの事実を総合的に勘案すると、虫体は必ずしも胎盤組織で増殖してから胎児に侵入するのではなく、何らかのメカニズムで短期間に胎盤組織を通過していることが強く示唆された。現在のところ、感染白血球がそのまま通過しているのか、いったん白血球から脱出した虫体が通過しているのかははっきりしない。前者であった場合、胎児に到達した感染白血球から早期に中地が脱出してしまうと思われるため一時的に虫体の動きを止める必要があることが分かった。その手法についてはすでに決定し、予備実験は終了している。当初の予測とは異なった生命現象が見出されているため、完全に予定した通りの実験を遂行しているわけではないが、胎盤における感染現象の概要が把握できており大筋として当初の目的を達成している。これまでに、トキソプラズマ原虫の胎盤における挙動が明らかとなったが、垂直感染に至るまでの挙動に不明点が多い。この点に集中して今後の研究を展開する。本年の目的は母子境界領域である胎盤ラビリンス部の栄養膜巨細胞と母体血流中の感染白血球の接着に関与する接着分子群の発現パターンを明らかにすることである。これまで、マウスを用いた実験系で以下の結果を得ている。トキソプラズマに感染した白血球、特に単球から増殖前の虫体が脱出する現象を見出した。この様な現象は、生体内では肺や肝臓の毛細血管でよく見られた。培養系においては血管内皮細胞と感染白血球あるいは単球との接触が虫体脱出の引き金となっていた。また血管内皮細胞の種類によってこのような現象を起こすものと起こさないものがあることが分かった。両者の発現する接着分子のうち発現量が後者で有意に低いものを既に同定した。これらの分子との間に起こるシグナル伝達系が虫体の脱出に関与しているものと思われる。一方、胎盤ではこのような現象は見られず、また当該接着分子の発現も認められなかった。胎盤表層の母体血流と接触する細胞群では一部の接着分子の発現が抑制されていた。またこの制御にDNAメチル化が関与していることが明らかになった。中型動物においては、現時点で確定的なデータを得られていないが、予備的実験を複数回行い、マウスで行ったのと同様の実験が行える体制をほぼ整えることができた。計画段階で注目していなかった複数の分子について、本現象に関与している可能性が示唆されたため、これらの分子の発現動体についても検証した。ほぼ予定通り。いくつかの臓器において感染白血球は非感白血球よりも血管内皮に接着しやすく効率よく臓器内に留まっている傾向がみられ,肺では有意差が認められた。また肺に留まった感染白血球内の原虫の多くは4時間以内に白血球から脱出していた。肺において感染白血球の血管内皮細胞への接着と原虫の白血球からの脱出が同時に観察されたため,感染白血球の内皮細胞への接着が原虫の白血球脱出の引き金となっているのではないかと推測し,次の実験を行った。まず感染白血球を肺から取り出したばかりのマウス肺血管内皮細胞(MLEC)と共培養した群と間にメッシュを入れ白血球と内皮が直接接触しない群を作成した。これら2群について白血球から脱出する原虫数を測定して比較した。非継代MLECに接着した感染白血球からの脱出虫体数は接着を許さず培養した時の数十倍であった。以上から感染白血球の血管内皮接着がシグナルとなって原虫は白血球から脱出することが分かった。またこの脱出を補助する分子の一つを同定した。一方胎盤においてb対決流と触れる栄養幕細胞の表面ではこのような現象はおこらず、これが垂直感染防御の一翼を担っている可能性が示された。当初の予測とは異なった生命現象が見出されているため、完全に予定した通りの実験を遂行しているわけではないが、感染のおこりやすい臓器とそうでない臓器の違いがほぼ把握できており大筋として当初の目的を達成している。

この実験により、感染白血球は非感白血球よりも血管内皮に接着しやすく効率よく肺等の臓器内に留まることが分かった。一方で、胎盤ではこのような現象はおこっていなかった。以上から胎盤では感染白血球の停滞が他臓器よりも起こりにくいことが分かった。一方、胎盤内の虫体数の多寡と胎児への垂直感染成立の間にはっきりした相関関係がないことが分かった。これら二つの事実を総合的に勘案すると、虫体は必ずしも胎盤組織で増殖してから胎児に侵入するのではなく、何らかのメカニズムで短期間に胎盤組織を通過していることが強く示唆された。現在のところ、感染白血球がそのまま通過しているのか、いったん白血球から脱出した虫体が通過しているのかははっきりしない。前者であった場合、胎児に到達した感染白血球から早期に中地が脱出してしまうと思われるため一時的に虫体の動きを止める必要があることが分かった。その手法についてはすでに決定し、予備実験は終了している。当初の予測とは異なった生命現象が見出されているため、完全に予定した通りの実験を遂行しているわけではないが、胎盤における感染現象の概要が把握できており大筋として当初の目的を達成している。計画は順調に進行している。当初想定していなかった分子も研究対象とする現象に関与している可能性が示唆されたため、今後はこれら分子も視野に入れて計画を微修正する。これまでに、トキソプラズマ原虫が感染白血球から標的臓器に乗り移るメカニズムが明らかとなったが、この現象が胎盤では非常におこりにくいことが示唆されている。そのため他臓器と胎盤の血液内皮細胞及び栄養幕細胞の表面分子の発現パターンを比較する予定である。また発現レベルが特徴的な分子についてはそのメカニズムを調べる。さらに垂直感染が成立する場合、虫体の侵入門戸がどこであるのかを解剖学的に調査する。感染動物の胎盤から連続切片を作成して河川箇所を探す従来の手法では効率が悪く、目的を達成できない可能性が高い。そこで臓器全体を透明化し、蛍光を発する組換え虫体を3Dイメージングで検索する手法を用いる予定である。すでに組換え虫体は作成済みであるが、必要であれば深部に感染する虫体からだの検出感度を上げるため、改良した組換え虫体を作成する。これまでに、トキソプラズマ原虫の胎盤における挙動が明らかとなったが、垂直感染に至るまでの挙動に不明点が多い。この点に集中して今後の研究を展開する。
膵癌治療で有用な治療耐性膵癌患者を同定するバイオマーカーの確立

膵癌治療効果改善のため,膵癌の治療耐性を獲得する症例を事前に同定できるバイオマーカーの検討を行うことを目的とし,3つのステップで実験を進めていく.まず,1膵癌術後再発に対して治療を行った症例を対象に,再発治療に対して有効性が低く,抵抗性を示した症例と,比較的有効であった症例を比較し,治療抵抗性に関わる臨床病理学的因子および遺伝子の同定を行う.次に,2治療抵抗性を示した症例郡に対して術前治療を行った際に,選定した遺伝子が誘導されていたのかについて検証を行う.以上の結果で,膵癌治療耐性を獲得する症例を遺伝子バイオマーカーで同定できる可能性が示されれば,3基礎実験(細胞実験および動物実験)によって,検証を行う.上記の計画のうち,平成30年度の予定では基礎実験の前提となる遺伝子の同定までを行う予定であった.まず,再発治療抵抗性に関して後方視的検討を行い,再発部位が肝転移であった症例は治療抵抗性を示し,一方で肺転移再発の症例は治療の反応性が比較的良いことを証明した.これを受けて,肝転移再発症例および肺転移再発症例の手術後血清サンプルからエクソソームを抽出し,microRNAの網羅的遺伝子発現検査を行った.これにより体内に潜伏している肝転移巣癌細胞の影響をうけたmicroRNAと肺転移巣癌細胞の影響をうけたmicroRNAの比較となり,治療抵抗性のちがう膵癌細胞の比較ができると考えた.この結果いくつかの候補遺伝子が同定され,この内過去文献から肝転移と関与しうる遺伝子を標的とするmicroRNAであるmiR26aを同定した.この遺伝子が,肝転移症例では術前治療によって低下することが示され,標的とするITGA5(インテグリンの1種,肝転移に関与)の癌での発現がmiR26aの発現と相関していることを証明した.今後基礎実験でこうした臨床知見と矛盾しないか検討を行う予定である.当初立てた計画進行と概ね乖離なく進行しているため.現在まで順調に候補遺伝子の同定まで進んでおり,今後は予定通り基礎実験として同定した候補遺伝子とその標的となる蛋白について,膵癌細胞株に遺伝子導入による強制発現およびノックダウンさせる実験系を行い,抗癌剤治療耐性となるのか検討を行う.また一方で抗癌剤暴露によって耐性が誘導されやすいかどうかについても検討する.またマウスを用いて,遺伝子導入による強制発現およびノックダウンさせた膵癌細胞株について,抗癌剤暴露の有無によって肝転移や肺転移しやすくなるのか検証し,バイオマーカーとしての確からしさについて検討する予定である.こうした基礎実験の一方で,肝転移巣などについて生検などで細胞が得られる機会があれば,得られた細胞についてmicroRNAや標的蛋白発現について検討を行い,矛盾がないか検証したり,今後の術後症例全例の血清から候補microRNAの発現を調べ,再発について検証するなど前向きな検討をしたいと考えている.膵癌治療効果改善のため,膵癌の治療耐性を獲得する症例を事前に同定できるバイオマーカーの検討を行うことを目的とし,3つのステップで実験を進めていく.まず,1膵癌術後再発に対して治療を行った症例を対象に,再発治療に対して有効性が低く,抵抗性を示した症例と,比較的有効であった症例を比較し,治療抵抗性に関わる臨床病理学的因子および遺伝子の同定を行う.次に,2治療抵抗性を示した症例郡に対して術前治療を行った際に,選定した遺伝子が誘導されていたのかについて検証を行う.以上の結果で,膵癌治療耐性を獲得する症例を遺伝子バイオマーカーで同定できる可能性が示されれば,3基礎実験(細胞実験および動物実験)によって,検証を行う.上記の計画のうち,平成30年度の予定では基礎実験の前提となる遺伝子の同定までを行う予定であった.まず,再発治療抵抗性に関して後方視的検討を行い,再発部位が肝転移であった症例は治療抵抗性を示し,一方で肺転移再発の症例は治療の反応性が比較的良いことを証明した.これを受けて,肝転移再発症例および肺転移再発症例の手術後血清サンプルからエクソソームを抽出し,microRNAの網羅的遺伝子発現検査を行った.これにより体内に潜伏している肝転移巣癌細胞の影響をうけたmicroRNAと肺転移巣癌細胞の影響をうけたmicroRNAの比較となり,治療抵抗性のちがう膵癌細胞の比較ができると考えた.この結果いくつかの候補遺伝子が同定され,この内過去文献から肝転移と関与しうる遺伝子を標的とするmicroRNAであるmiR26aを同定した.この遺伝子が,肝転移症例では術前治療によって低下することが示され,標的とするITGA5(インテグリンの1種,肝転移に関与)の癌での発現がmiR26aの発現と相関していることを証明した.今後基礎実験でこうした臨床知見と矛盾しないか検討を行う予定である.当初立てた計画進行と概ね乖離なく進行しているため.現在まで順調に候補遺伝子の同定まで進んでおり,今後は予定通り基礎実験として同定した候補遺伝子とその標的となる蛋白について,膵癌細胞株に遺伝子導入による強制発現およびノックダウンさせる実験系を行い,抗癌剤治療耐性となるのか検討を行う.また一方で抗癌剤暴露によって耐性が誘導されやすいかどうかについても検討する.またマウスを用いて,遺伝子導入による強制発現およびノックダウンさせた膵癌細胞株について,抗癌剤暴露の有無によって肝転移や肺転移しやすくなるのか検証し,バイオマーカーとしての確からしさについて検討する予定である.こうした基礎実験の一方で,肝転移巣などについて生検などで細胞が得られる機会があれば,得られた細胞についてmicroRNAや標的蛋白発現について検討を行い,矛盾がないか検証したり,今後の術後症例全例の血清から候補microRNAの発現を調べ,再発について検証するなど前向きな検討をしたいと考えている.

当初網羅的遺伝子解析可能な対象症例を300症例と考え,可及的多くの症例を用いて網羅的遺伝子解析を行う予定であったが,治療抵抗性を示す症例の絞り込みの際に,対象症例が減少し,1年目に見込んでいた検査を最小限の費用で行うことが可能であった.もちろん症例が減ったため候補遺伝子の同定にパワー不足となることを危惧していたが,現在まで有望な遺伝子の同定に成功していると考えている.このため選定に用いなかった費用分は,検証に用いることが可能であり,より前向きに臨床応用可能な形での実験結果が得られる可能性が高まったと考えている.しかし残念ながら基礎実験で思わぬ結果となった際には,再度候補遺伝子の選定から行う必要があり,この際には対象症例を広げて検討を行う必要があり,今年度余剰となった費用はいずれにせよ必要となる見込みである.
日本手話の源流を探るための離島手話学術調査

聾者の言語である手話は学校教育が始まる以前から存在した。手話の歴史は聾者の歴史と同じ長さである。現在から手話の源流を探るには未就学聾者の手話を採集し研究するしかないが、離島や僻地などに人知れず居住し高齢化により絶滅に近い状態にある。未就学聾者の手話は数手話、色名手話、親族名称がないなどの特徴があり、指さしが多いのが特徴的である。一方、生活に密着した語彙は現代の手話よりも描写力があることがわかった。個人方言性が強いが共通性もみられる。I.佐渡調査と研究発表本年度は新潟県佐渡市の未就学聾者(A氏)の手話収録を2回実施し、その分析結果の中間報告を行った。準備調査として平成27年6月20日佐渡市を訪問、A氏のご家族の了承を得るべく調査目的を説明がてら撮影環境を確認すべくA氏宅を訪問した。ご家族からは快諾を得て第1回調査録画は平成27年7月19日A氏宅にカメラ4台を設置し、自由会話の形で、A氏(未就学聾者)、A氏夫人(就学聾者)、嫁(聴者、手話通訳者)の3人の対話を約1時間収録した。第2回調査録画は平成27年8月1日古い写真などをご用意いただき同じメンバーで思い出話をしていただいた。その結果、今は使用していない手話、独自の家庭手話など、貴重な資料が収録できた。中間発表1として平成27年10月16日佐渡市で開催した京都工芸繊維大学拡張コミュニティエイド研究センター秋季セミナー「高齢者社会と地域のかかわり」において、基調講演:神田和幸「手話の源流を探る」、研究発表1:木村勉「未就学聾者手話のデータ収集」として、分析結果の中間発表を行った。また中間発表2として平成28年3月28日第130回ヒューマンインタフェース学会研究会「高齢者、障がい者支援技術および一般」において、「手話の変遷モデルと源流調査」神田和幸・木村及び「離島における聾者ホームサインのデータ収集に関する調査報告」木村勉・神田和幸として発表した。II.他地域の未就学聾者調査上記A氏は我々の調査後すぐに逝去された。次の調査対象を探索すべく平成27年10月新潟市NPOにいまーるの協力を得て研修旅行に同行し新潟県内の聾者情報を聞き出した。妙高地区に未就学聾者が数名いるとの情報を得た。また新潟市西蒲区の情報があり、同年11月現地調査したが、確認には至らなかった。以上の結果を基に平成28年2月、3月、NPOにいまーると次年度調査について打ち合わせをした。当初の予定通り、佐渡の未就学聾者とは家庭との折衝にも成功し、2回の収録を実施できたが、被験者の死亡により今後の収録が不可能になったため、別の被験者について情報収集から始めなければならなくなった。しかし分析は順調であり、中間発表をすることができた。次年度は収集情報を元に、家族交渉から始めることになるが、概ねの予想はできている。最終年度は1.神田和幸,「地域社会における聴力しょうがい者に対する手話による就労・生活支援:新潟県の事例」,京都工芸繊維大学COIヘルスサイエンスシンポジウム,講演発表2016.8.222.神田和幸,手話の源流調査と手話歴史言語研究の方法の提案,日本歴史言語学会2016年大会,講演発表,2016.9.19の2件の講演発表により、成果を発表した。また3.神田和幸,日本手話の源流と変種の拡大,高見他編『〈不思議〉に満ちたことばの世界』上,開拓社,pp.113-117, 2017に寄稿し、同著は多くの言語学者の目に触れることが予想され、本研究の成果が広く知られる機会となろう。本研究はこれまで日本において研究されたことがない手話の歴史的研究であり、海外においてもあまり例がない。手話を歴史的に考察したモデルにより手話歴史言語学への道を拓いた。本研究の特徴は絶滅の危機に瀕している未就学聾者に焦点を当て、その言語的特徴を示した。これは学校において手話が習得されるという欧米の学説に対する反証として、将来必ず注目される。国内外において、学校内手話習得説が席巻しているのは、未就学聾者の手話は手話ではないという偏見が底流にあるからだが、それは手話が自然言語であるという主張と矛盾する。聾者は学校の存在以前から存在し、彼らも手話を使用していたはずだが、その手話が確認されなかったにすぎない。本研究では未就学聾者という学校以外で手話を獲得した人々の手話を収録し分析したが、日本では彼らは交通不便な地に住む後期高齢者であり、まもなく絶滅する。喫緊の研究課題であったが、一部の採録にどうにか間に合った。残念ながら継続的な研究資金が得られないため、mocapデータなどは採集できず、わずかな資料に留まったことが悔やまれる。

未就学聾者の手話は数手話、色名手話、親族名称がないなどの特徴があり、指さしが多いのが特徴的である。一方、生活に密着した語彙は現代の手話よりも描写力があることがわかった。個人方言性が強いが共通性もみられる。1.現在情報が確定している別の調査対象について、家族の了解を十分に得た上で、録画する予定である。2.すでに収集した資料の分析もまだ完了していないため、家族の協力や手話専門家の協力を得て、分析を進め、報告する計画である。3.調査地を新潟方面に限定する。当初の計画では全国的な調査を想定していたが、地域により個人情報秘匿が厳しい地域もあり、困難が予想されるため、研究期間が短いこともあって、本研究では地域を限定することにしたが、理論的な面での不都合はない。手話学分担者が旅費等の支出に他の資金を充当し研究をしたため、次年度への繰越の申請があり、統括者は事情を調査した上で承認した。繰越申請内容は、次年度は分担額が少なく、国内外の発表のための旅費が不足することが明白であり、今年度分旅費は別途資金を活用したとのことであった。次年度は分担者の分担額が少なく研究活動に支障を来すため、本年度からの繰越を充当し、国内外の研究結果発表の旅費に充当させる。