hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スルフォラファンのオートファジーを介する乳癌細胞死滅機構の同定と癌治療への応用

細胞死はCaspase-3の上昇とBc1-2値の減少によるアポトーシスであったが、オートファゴソームの形成、acidic vesicular organellesの出現やLC3の発現増強で特徴づけられるオートファジーがみられた。そこで、オートファジー阻害剤であるBafilomycin A1をSFNとともに作用させたところ、Baxの発現増強、Caspase-3やPARP-1の開裂、ミトコンドリア膜電位の低下によるアポトーシスの有意の増強による生細胞の減少をみたが、3-methyladenineでは有意な変化はみなかった。よって、SFNにオートファジー阻害剤(Bafilomycin A1)を併用すれば新たな乳癌治療として有望と考える。加うるに、KPL-1ヒト乳癌細胞株を雌BALB/cヌードマウスの乳腺脂肪織内に正所性に移植して、25あるいは50mg/kg・SFNを腫瘍細胞移植翌日より週5回腹腔内投与して26日目における原発腫瘍増大ならびに転移形成につき比較したところ、目立った毒性はなく、50mg/kg・SFNは有意な原発巣の増大抑制をみるとともに転移に対しても抑制傾向を示した。
先天性代謝異常症の国際的化学診断システムの確立

先天性代謝異常症は尿などの有機酸、アミノ酸を分析することで化学診断が可能である。著者らは国内の依頼には凍結試料を用いてきたが、海外から凍結試料を送付することは手間および費用の面で、非常に困難である。化学診断システムの国際化には試料の輸送法が最大の検討事項である。この点を検討するため、異常成分を混合した合成尿を浸みこませた乾燥ロ紙を作成し、中国、ブラジル、チリ、米国の協力機関に年4回送付した。これらの協力機関から検体の入った封筒をそのまま直ちに返送してもらい、その検体を分析に供した。これらの結果を、冷凍保存しておいた検体を対照に、輸送上の問題として季節(気温、湿団など)、輸送に要する時間、地域の特殊性などによる影響ついて検討を行なった。協力機関は北半球と南半球の国々であり、夏期と冬期を同一時期に検討することになった。その結果、輸送に要する日数や、種々の条件による影響は無視できるほど小さく、乾燥ロ紙による輸送法を本システムに採用し得ることを明らかにした。しかし、実際の化学診断は迅速性が要求されるため、さらに時間短縮について、通常の航空便と郵送料は高額ながらほぼ2倍の速度のEMS(国際ビジネス郵便)で比較検討した。その結果、上述の通り分析結果には影響はなかったが、時間の短縮が可能であり、急を要する化学診断のためEMSによる輸送は有用であることから明らかになった。しかし、中国のようにEMSを利用しても効果がほとんど上がらないところがあり、今後の課題として残された。結果の報告には時差に関係なく送信できるファクシミリ通信が有用であることを確認した。協力機関のみならず、その他の機関から実際の試料の分析依頼は予想以上に多く、早急に国際的システムとして確立する必要があり、本システムの運営方法(特に経費の問題)を含めて検討する必要が生じてきた。
企業の組織再編（Ｍ＆Ａ）が研究開発効率に及ぼす影響に関する研究

本研究では、M&Aの実施がその後の企業の研究開発効率にどのような影響を及ぼすかについて実証的に分析を行った。そのために、企業の生産性指標と整合性を持つようなもっとも正確な研究開発成果指標を、量と質の両面から算出する方法を確立した。算出した研究開発成果指標を用いて、それがM&A実施後に研究開発投資額に対して相対的に増加したか減少したかを、回帰分析により検証した。結論として研究開発効率がM&A実施後に低下していることを確認した。同時に、その要因として研究開発成果の量的減少が質的向上を上回っていることを確認した。また、M&A実施に関わる環境要因が、研究開発効率にさまざまに影響することも確認した。平成23年度に得られた特許データを用いて算出した特許出願価値を用いて、その指標データが研究開発成果の代理変数としての妥当性を有するかどうかについて検証を行った。具体的には、まずM&Aデータに基づいて抽出したM&A実施企業の財務データを入手し、各企業の各年について次のデータを算出した。各年の資本投資額を各年の資産額の増加額と減価償却費を用いて算出し、それをデフレータにより基準化した上で、減衰率を推定した上で資本ストックを求めた。さらに、各企業の人件費関連支出を合計し、それを賃金指数によってデフレートし、労働投入量を求めた。被説明変数とすべき付加価値を日銀方式により算出し、GDPデフレータによって基準化した。さらに、特許出願価値と特許出願件数について、減衰率を計算した上で、それらのストックを算出した。これらデータをコブダグラス型生産関数(被説明変数は付加価値)に適用し、説明変数としての特許出願価値ストックと出願件数ストックが、有意にプラスの効果を発揮するかどうかを確認した。分析の結果、特許出願価値ストックは有意にプラスの効果を発揮することが確認されたが、特許出願件数ストックでは有意な結果が得られなかった。そのことから、今回求めた特許出願価値は、企業の生産性にプラスの効果をもたらす指標であることが確認でき、その意味で研究開発成果指標として用いることの妥当性を立証することができた。M&Aの研究開発効率に及ぼす影響の検証を行うため、特許情報データ、M&A事例データ、企業財務データを使用して基本OLS回帰式により分析を実施した。昨年度、特許出願価値と企業の生産性の間の親和性の検証を得たことに基づいて、特許出願価値を被説明変数に用いて、M&A前後における研究開発効率の変化を回帰分析によって明らかにする。M&A前後における研究開発効率の変化については、平成24年度に親和性の検証が得られた特許出願価値を被説明変数として、ラグ期間を考慮した研究開発費でコントロールし、M&Aダミー(M&A前=0、M&A後=1とする)、M&A環境要因とM&Aダミーとの交差項を交えて知識生産関数を用いて回帰し、これら説明変数の符号条件と絶対値に着目し、M&A前後における研究開発効率の変化について、OLS回帰により明らかにした。その結果、ダミー変数のパラメーターは明らかにマイナスの値を示し、M&A実施に伴って、研究開発効率が全体として低下していることが、統計的な分析の結果として確認された。また、M&A実施企業のM&A前後でのこうした研究開発効率の変化をもたらすことになったと考えられる技術的背景についての実態をインタビューした。さまざまな解答が見られたものの、全体として、研究開発成果(特許出願件数)を量的に削減したためとする解答が多く認められた。こうした結果から、M&A実施後の研究開発効率の低下傾向は、研究開発成果の質的側面からもたらされた者ではなく、量的側面からもたらされたものであることが確認された。研究開発成果の定量的測定手法について先行研究を検討し測定に必要なデータの整理を行った。併せて、M&Aが研究開発効率に及ぼす影響に関して先行研究で採られてきた分析手法を精査し、そのうち活用できる点と改善すべき点を明確にした。さらに、必要なデータの収集を実施し、データベースの構築を行った。本研究では、特許情報の中から、特許出願に対して第三者が行った無効審判・異議申立、情報提供、特許包袋の閲覧、被引用回数、クレーム数、IPC分類数、発明者数、外国特許出願の有無などの特許属性データが持つ意味合いを吟味したうえで、特許出願価値に帰結させた。さらに、特許出願価値を算出する企業を特定するために、M&A事例を選定した。選定基準は、(1)国内上場企業同士のM&A、かつ、(2)M&A前後での各企業財務データが時系列で取得可能なものとした。そして、選定されたM&A事例の各企業が出願した特許出願属性データ、企業財務データを取得した。

この場合において、各特許属性データが相互にプラスの相関を有していることを確認した上で、因子分析により因子負荷量を算出し、その値から各属性が有するノイズを除去した値を求めた。得られたノイズ除去後の因子負荷量を、各属性のウエイト値として、各属性の件数、回数等に乗じたうえで、ウエイト付けされた全属性値の合計を個々の特許出願の価値として算出した。昨年度実施した企業ヒアリングによる情報などに基づいて、M&A実施が研究開発効率にどのような形(効率の質的側面と量的側面のいずれか)で影響を及ぼしているかについて、まとめを行った。企業によって量的増減の散らばりが見えたものの、結論的には、トータルとしてみた時に研究開発成果の質的水準は上昇していたものの、それを上回るような量的減少が生じ、結果的に質量を合わせた効率が低下していたことが判明した。特に、量的減少の理由については各企業からはさまざまな理由が挙げられたが、主に研究開発成果の量から質への転換、費用削減による効率の追求といったことがその背景にあったことが確認された。さらに、M&A実施当事者企業の業種の異同、M&A実施形態(合併か買収か)、当事者企業が有する技術の類似度、当事者企業どうしの相対規模、市場集中度など、M&Aに関わる各種諸事情を説明変数として、特許出願の価値の集計値を被説明変数とし、研究開発費などでコントロールしたOLS回帰式を使用して回帰を行った。それによって、M&Aを取り巻く諸事情が統合後の研究開発効率にどのような影響をもたらすかについてのインプリケーションを得た。結論として、当事者企業の相対規模はその格差が大きいほど、また相互の技術分野は異なるほど、M&A実施後の研究開発効率は高まることが確認された。その他の諸事情については、M&A実施後の研究開発効率の変化に特段の影響を及ぼすという事情は認められなかった。これらの結果をベースとして、今後の研究の方向性について整理を行った。つまり、研究開発効率の質的変化と量的変化のそれぞれに影響を及ぼす要因について分析し、それらがM&A実施前後でどのように変化したかを確認することが課題となると整理づけた。知的財産経済論平成24年度までに、M&A実施企業の特定、特許データの入手、財務関連データの取得を行い、それによってM&A実施企業の研究開発成果指標を策定し、それが統計的にも、実態的にも妥当性を有するかどうかを確認することとしていた。平成24年度までに得られたデータを基にして、因子分析手法を発展させた単一潜在変数モデルを適用して、特許出願価値を算出した。そして、それが企業の生産性を示す付加価値と有意にプラスの関係を有することが確認でき、特許出願価値が研究開発成果指標として有効であることが統計的に確認できた。また、企業インタビューを通して、特許出願価値指標が企業の抱く研究開発成果と齟齬がないことも確認でき、実態的な裏付けも得ることができた。その意味で、当初の研究計画通りに研究を進展させることができ、無事に妥当な結果を得ることができた。当初の計画に示した平成25年度の内容が、ほぼすべて実現できており、これまでの研究実績は、計画通り進んでいると見てよいと考える。
延髄腹外側部の神経作動物質の動態に対するアンジオテンシンIIの影響

アンジオテンシンIIによる圧受容体反射に対する修飾のおこる機構を解明する目的で、この現象における延髄腹外側部のアミノ酸性神経伝達物質の関与を脳微小透析法を用いて評価した。まず、非昇圧量のアンジオテンシンIIの存在下で圧受容体反射の感受性は明らかに低下し、この際延髄腹外側部からのグルタミン酸とグルシンの放出が増加した。さらに、グリシンの同部への注入によりアンジオテンシンIIの注入時と同様の圧受容体反射の減弱が観察された。アンジオテンシンIIの中枢性作用にアミノ酸性の神経伝達物質が関与していることが示唆された。一方、微量の変換酵素阻害薬投与時には、延髄腹外側部のグルタミン酸放出量の減少が認められる。変換酵素阻害薬による血圧下降が消失する程度の非昇圧量のアンジオテンシンIIの持続的補充下では、グルタミン酸放出の変化が対照に近づく事から、このグルタミン酸の減少は変換酵素阻害薬によるアンジオテンシンIIの減少に依存したものである。次に、この減少したグルタミン酸を延髄腹外側部で生理的量で補充すると、血圧下降の最下点は変わらないが、血圧の原値への復帰が促進される。このように、変換酵素阻害薬は血中のアンジオテンシンII濃度の低下を介して、延髄腹外側部のアミノ酸性神経伝達物質の放出量の変化を来し、反射性頻脈の出現を抑制させる事が示唆された。スウェ-デンのUngerstedtらのグル-プによって開発された脳マイクロダイアリシス法は、in vivoの状態で脳内神経伝達物質の動態を定量的に測定したり、逆に脳内への特定の物質を選択的に注入し得る方法である。本研究では、この方法を用いて微量の変換酵素阻害薬投与による血圧・心拍数・延髄腹外側部の神経伝達物質の放出の時間的変化を、ほぼ同等の降圧を来すニトログリセリンと比較し、変換酵素阻害薬による降圧時の特徴を検討した。変換酵素阻害薬による降圧による反射性の頻脈はニトログリセリンによるものより幅は小さく、延髄腹外側部のグルタミン酸放出量の減少が認められが、ニトログリセリンの投与ではこのような減少は認められない。変換酵素阻害薬による血圧下降が消失する程度の非昇圧量のアンジオテンシンIIの持続的補充下では、グルタミン酸放出が対照に近づく事から、グルタミン酸の減少は変換酵素阻害薬によるアンジオテンシンIIの減少に依存すると考えられる。グリシン放出は変換酵素阻害薬単独投与時には不変であり、ニトログリセリン投与時にのみ見られることから、グリシンの変化はアンジオテンシンII以外の未知の機構により引き起こされているものと考えられた。次に、グルタミン酸を延髄腹外側部でダイアリシス法により生理的な量で補充すると、血圧の原値への復帰が促進され、しかも、この際脈拍数が増加して高値に固定した。このようにグルタミン酸の補充は血圧よりも脈拍数の増加が著しい。一方グリシンの補充により、変換酵素阻害薬の降圧効果が減弱された。心拍数に関してはグリシン併用では変換酵素阻害薬単独とほとんど差が無く、グリシンは血圧に大きく影響を与えることが判明した。本年度は、変換酵素阻害薬による延髄外側部のアミノ酸性の神経伝達物質の動態にこの様な差の見られることを示した。スウェーデンのUngerstedtらのグループによって開発された脳マイクロダイアリシス法は、in vivoの状態で脳内神経伝達物質の動態を定量的に測定し、逆に脳内へ特定の物質を選択的に注入し得る方法である。本研究では、この方法を用いて昇圧閾値以下のアンジオテンシンII持続静注によって惹起される圧受容体反射感受性変化と吻側延髄腹外側部の神経伝達物質の放出の時間的変化との関連について検討した。昇圧閾値以下のアンジオテンシンII(5.4pmoI/kg/min)の120分にわたる持続静注の前後で、2-40μg/kgのフェニレフリンの静注による昇圧を観察し、昇圧と心拍数の変化との間の回帰直線の傾きを圧受容体反射の指標とした。

アンジオテンシンIIは圧受容体反射の感受性を有意に抑制した。この抑制に伴って、吻側延髄腹外側部からのアミノ酸性神経伝達物質であるグルタミン酸(+60%)とグリシン(+40%)の有意な放出増加が認められた。しかし、グルタミン、タウリン、γ-アミノ酪酸などの放出には変化は認められなかった。同部へグリシンを外因性に補充することにより、アンジオテンシンIIを持続静注下に見られたと同程度の圧受容体反射の減弱が認められた。これらの事は、グリシンやグルタミン酸が吻側延髄腹外側部を中心とする心脈管系の制御機構において重要な役割を果していることを示唆している。特に、アンジオテンシンII静注によるグリシンの延髄腹外側部からの放出抑制は、アンジオテンシンIIの圧受容体反射の抑制作用の根底をなしていることをも示唆している。さらに、アンジオテンシンIIの圧受容体反射への影響は、我々の昨年の報告で、経静脈投与された変換酵素阻害薬により、延髄腹外側部のグリシン、グルタミン酸などのアミノ酸性神経伝達物質の放出の変化がみられたことと総合して考察すると、アンジオテンシンIIの作用が中枢性の機序を介していることをさらに支持する結果である。本年は主として高血圧自然発症ラットを対象に延髄腹外側部におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬の中枢作用機序検討をおこなった。ウレタン麻酔下に下記の4群の12週齢オス高血圧自然発症ラットの延髄腹外側部に脳微小透析法のプローブを挿入し、薬剤投与10分前投与後40分までの透析液中のアミノ酸を10分間隔で測定した。(1)変換酵素阻害薬デラプリル静注群、(2)同脳室内投与群、(3)ニトログリセリン静注投与群、(4)対象群の4群に分けた。血圧は(1)(3)群で30mmHg32mmHgと有意に低下したが、脈拍には変化はなかった。アミノ酸性神経伝達物質の遊出は、デラプリルを静注した(1)群のグリシンとGABAのみが著明に上昇した。他のアミノ酸は有意の変動を示さなかった。グリシンとGABAは、ともに投与後10分まで上昇し20分までに最高値を示し、以後急速に減少した。脳室内投与群ではこのようなアミノ酸放出の有意な変化が認められなかったことから、変換酵素阻害薬が循環血中のアンジオテンシンIIの減少を通じてグリシン、GABAといった抑制性アミノ酸の遊出を延髄腹外側部で増加させるような経路の存在が示唆された。このように従来研究を進めてきた正常血圧ラットのみでなく高血圧モデル動物においても、変換酵素阻害薬による降圧に延髄腹外側部のアミノ酸性神経伝達物質の変動が認められることが示された。
天然林施業を組み入れた地域の森林管理オプションの提示

木材の利用と生態系の保全とのバランスを考慮した天然林の管理について、北海道北部をモデル地域として考察した。択伐施業試験地における長期データから得られた主要樹種の個体群動態パラメータ、および樹種による伐採に対する反応の違い、天然更新補助作業等の効果を反映させた森林動態シミュレーションを実施した。森林の蓄積や、生物多様性の維持に寄与する構造を長期にわたって維持する森林施業の要件を、経済的な持続可能性も考慮して提示した。天然林施業を組み入れた地域の森林管理オプションを提示する、という大きな目的にむけて、平成26年度は、天然生林が優占する北海道北部のモデル地域(北海道大学研究林を中心)を対象に、次のような成果を得た。まず、過去に実施された択伐施業地における長期データを分析し、主要な育成対象樹種および他の優占樹種の個体群動態パラメータを算出した(第9回国際森林研究機関連合「異齢林施業に関する国際会議」および日本森林学会大会で口頭発表するとともに、国際誌への投稿を準備中)。この研究で明らかとなった、樹種による伐採に対する反応の違いを、今後、シミュレーションモデルの構築に活用していく。また、択伐施業地において、森林の構造、とりわけ森林内の生物多様性の保全に重要と考えられる構造要素の量を調査した。その結果、施業は林分構造をある程度維持していた一方で、枯死木などいくつかの構造要素の変化を招いたことが示された(日本生態学会大会で口頭発表し、国際誌への投稿を準備中)。さらに、更新施業地の現況把握から、施業の成否を分ける要因の分析を開始した。ササ地の掻き起こし作業で成立したカンバ林においては、施工後初期の土壌条件が重要な因子となっている可能性が示唆された(上に挙げた3つの学会で口頭・ポスター発表し、国際誌への投稿を準備中)。広葉樹造林地や造林した針葉樹と天然更新した広葉樹の混交林などで得られたデータを組み合わせて、シミュレーションのサブモデルを構築し、立地による施業の適否について考察した。天然林施業を組み入れた地域の森林管理オプションを提示する目的にむけて、天然生林が優占する北海道北部のモデル地域(北海道大学研究林を中心)を対象に野外調査を進め、次のような成果を得た。まず、既存の報告事例が少ない、広葉樹(ヤチダモ)人工林における長期データをもとに、間伐など保育作業の効果を分析した(第127回日本森林学会大会で発表)。間伐が、期待した効果を得られない場合があったことから、次年度にそのメカニズムを明らかにするための追加調査を予定している(その後、国際誌への投稿を予定)。昨年度の主要な取り組みであった、天然更新施工の成否分析においては、重要な因子と見積もられた土壌条件および周囲の植生条件について、とくに発芽に及ぼす物理環境、散布および埋土種子の維持に注目して野外調査・解析を継続し、立地条件に応じた施業の適否判断を進めた(第63回日本生態学会大会および第127回日本森林学会大会で発表し、国際誌への投稿を準備中)。また、択伐施業地において、森林内の生物多様性の保全に重要と考えられる構造要素(樹洞およびその形成因子である心材腐朽)の量・空間分布を明らかにし、利用と保全を両立するための施業シナリオを検討した。以上の調査結果から、森林の長期動態予測に必要なパラメータを取得し、森林動態の長期予測のためのサブモデルの構築を進めた。今後、これらを組み合わせ、複数の施業オプションを考慮したシミュレーションを行なう。地域の森林管理オプションを提示するうえで重要な役割を果たす森林動態シミュレーションについて、必要となる動態パラメータの算出を進めることができた。とくに、過去施工地の現況把握および長期データの分析について進捗があった。天然林施業を組み入れた地域の森林管理オプションを提示する目的にむけて、平成27年度においても、天然生林が優占する北海道北部のモデル地域(北海道大学研究林を中心)を対象に引き続き野外調査・データ解析を進めた。各種の天然更新補助作業を対象とした研究では、複数の対象樹種それぞれの定着に及ぼす作業の成否の条件を、とくに土壌および周囲の植生に注目してまとめた。ミズナラに関してはAsadaら(2017)として公表し、カンバ類に関する成果は国際誌へ投稿中である。一方、天然生林の択伐施業において、持続的な生産の大きな課題のひとつである残存木の枯死率の増加について、トドマツを対象とした研究成果を国際学会で発表し、投稿中である。これらを受けた補助期間全体の成果として、北海道の天然生林を対象に、複数の施業オプションを考慮した森林動態シミュレーションを実施した。択伐施業下で、森林の蓄積・構造を長期にわたって維持する要件として、伐採率10%、回帰年20年、小径木を伐採しないこと、残存木の枯死率増加を抑えることが挙げられたが、そこに、更新個体の成長を促す方策(表土を戻す地拵え、早期の除伐)を考慮した天然更新補助作業を組み込むことによって、経済的な持続可能性も達成しうる可能性が示唆された。この内容について第128回日本森林学会大会で発表するとともに、国際誌への投稿を準備中である(その後、普及誌において地域の森林管理オプションを提示する紹介記事を執筆する)。また、天然生林択伐施業地における、木材利用と他の生態系機能に関する論考について、同様に国際誌への投稿を準備中である。

択伐施業試験地における長期データから得られた主要樹種の個体群動態パラメータ、および樹種による伐採に対する反応の違い、天然更新補助作業等の効果を反映させた森林動態シミュレーションを実施した。森林の蓄積や、生物多様性の維持に寄与する構造を長期にわたって維持する森林施業の要件を、経済的な持続可能性も考慮して提示した。地域の森林管理オプションを提示するうえで、最終的に重要な役割を果たす森林動態シミュレーションについて、必要となる動態パラメータの算出を進め、また、更新補助作業の影響を考慮したサブモデルを構築することができた。過去施工地の現況把握、および長期データの分析についても予定通り進捗している。また、施業が行なわれた森林における生態系の諸機能に関する分析も進めることができた。次年度も「研究実施計画」に基いて研究を推進する。これまでの成果について論文化を進めるとともに、それらを森林動態シミュレーションに組み込み、地域の森林管理オプションを提示する。造林学次年度以降も「研究実施計画」に基いて研究を推進する。昨年度の成果について、論文化を進める。野外調査地の事前設定がやや遅れたため、一部の観測機器(土壌環境計測用)の導入を見送った(ただし、平成28年度の実施において、生育期間を通した観測を行なうことでこのことは十分に挽回できる)。過去に森林施業が行われた箇所の現況を把握するために空中写真・衛星画像の購入を予定していたが、平成26年度に調査対象とした箇所については、既存のデータで箇所等を特定することができたため購入の必要が生じなかった。次年度使用額は上記の観測機器の購入に充てることを計画している。平成27年度はより広い地域を対象とするため、空中写真・衛星画像の購入に充てることを予定している。
ジーンターゲッティング法を用いた高等動物の神経機能の解析

本研究計画では、神経系に特徴的な機能分子の遺伝子をジーンターゲティング法によって改変・欠失させたミュータントマウスを用い、遺伝子変異の神経機能を及ぼす影響を解析することで、それらの分子の役割や機能のメカニズムを追求することを目的とする。特に、NMDA型グルタミン酸受容体に焦点を当てた(東大医学部三品教授らとの共同研究)。1.NMTA型グルタミン酸受容体ε1サブユニットを欠損させたミュータントマウスを用い、海馬CA1野シナプスの長期増強の解析を行った。成体ミュータントよりの海馬スライスにおいては、長期増強が顕著に抑制されていた。このマウスは空間学習能力も低下していた。この結果は海馬の長期増強が記憶の基礎過程であるとの考えを強く支持している。2.ε1遺伝子欠損の影響が生後発生の過程にどのように影響するかを検討した。CA1野シナプスにおけるNMDA受容体活性は、野性型もミュータントもともに週令が進むにつれて減少したが、ミュータント・マウスは週令に関わらず常に野性型のほぼ半分であった。これに対し長期増強に対する影響は、週令とともに重篤となり、成体では野性型マウスに比べて長期増強が半分以下に抑制された。3.NMDA型グルタミン酸受容体のもうひとつのサブユニットであるε2についても同様の検討を加えた。ε1とε2のそれぞれの遺伝子欠損の影響を比較した結果、海馬CA3野錐体細胞においては、NMDA受容体のサブユニット構成が同一細胞に形成されるシナプスの種類、またはその部位により異なっていると考えられることが分かった。この結果は、現在明らかでないNMDA受容体の実際の構造を示唆するのみならず、脳の高次機能と密接に関連した受容体のサブユニットが、入力特異的ないしは細胞の極性に基づいて、神経細胞内の特定の部位にソーティングされていることを示唆している。本研究計画では、イオンチャネルや受容体などの神経系に特徴的な機能分子の遺伝子を改変・欠失させたミュータントマウスを作成し、その神経機能に及ぼす影響を解析することでそれらの分子の役割や機能のメカニズムを追求することを目的とする。本年度は次の二つの点について検討した。1.NMDA型グルタミン酸受容体サブユニット欠損マウスの解析NMDA型グルタミン酸受容体にはいくつかのサブユニットがあるが、このうちの一つであるε1サブユニットを欠損させたミュータント・マウスで長期増強の解析を行った。9週令のε1の欠損マウスよりの海馬スライスにおいて、CA1野の長期増強が顕著に抑制され、またNMDA受容体によるシナプス電流も減少していることを観察した。(東大医学部三品教授らのグループとの共同研究)。このマウスはMorris型水迷路で検討したところ、学習能力も低下していたので、上記結果は海馬の長期増強が記憶の基礎過程であるとの考えを強く支持しているものと言える。2.シンタキシンの機能解析と欠損マウス作成の試みシナプス可塑性の発現には、伝達物質の放出の制御も関与していると考えられる。シナプス前終末の膜タンパク質であるシンタキシンがイオンチャネル型グルタミン酸受容体の性質を示し、かつ放出制御に関与しているのではないかとの推定がなされているが、我々がこの分子の機能を検討した結果では、イオンチャネルの性質を示すという点は確認できなかった。しかし、この分子が伝達物質放出の制御に重要な役割を果している可能性は十分に考えられる。シンタキシン遺伝子を修飾・抑制したマウスを作成するため、これまでにシンタキシン遺伝子クローンを単離し、そのエクソン・イントロン構造を解析し、制限酵素地図を作成した(杏林大学医学部

赤川教授らのグループとの共同研究)。本研究計画では、NMDA型グルタミン酸受容体ε1サブユニット遺伝子欠損マウス(ε1ターゲッティングマウス)を用い、遺伝子欠損の神経機能に及ぼす影響を解析することでその分子の役割や機能のメカニズムを追求することを目的とする。NMDA型グルタミン酸受容体にはいくつかのサブユニットがあるが、このうちの一つであるε1サブユニットを欠損させたε1ターゲッティングマウスについて、海馬CA1シナプスのNMDA受容体応答および長期増強について分析を行い次の様な結果を得た。1)成体(9週令)の段階では、ε1欠損によって、海馬CA1シナプスの基本的なシナプス伝達能、およびその伝達効率は変化しなかったが、NMDA受容体応答は、野性型マウスの約半分に減少していた。このとき、長期増強は顕著に抑制され、このマウスはMorris型水迷路で検討したところ、学習能力も低下していたので、上記結果は海馬の長期増強が記憶の基礎過程であるとの考えを強く支持しているものと言える。2)次に、ε1遺伝子欠損の影響が生後発生の過程にどのように影響するかを検討した。CA1シナプスのシナプス応答におけるNMDA受容体応答の相対的割合は、野性型もε1ターゲッティングマウスもともに週令が進むにつれて減少したが、ε1ターゲッティングマウスは週令に関わらず常に野性型のほぼ半分であった。これに対し長期増強に対する影響は、週令が進むとともに重篤となり、成体では野性型マウスに比べて長期増強が半分以下に抑制された。今後は、他のシナプスにおける遺伝子欠損の影響を検討して行く計画である。本研究計画では、NMDA型グルタミン酸受容体εサブユニット遺伝子欠損マウスを用い遺伝子欠損の神経機能に及ぼす影響を解析することで、その分子の役割や機能のメカニズムを追求するとともに、高等動物の神経機能、特にシナプス可塑性のメカニズムと生理的意義について検討することを目的とする。特に、NMDA型グルタミン酸受容体の海馬長期増強における役割について検討した。これまでに、NMDA型グルタミン酸受容体ε1サブユニット遺伝子をジーンターゲッテイング法によって欠損したマウスを用いて、その学習行動と長期増強の解析を行った。この遺伝子欠損マウスはほぼ正常に育つが、発生過程においては、週令とともに長期増強に対する影響は重篤となり、成体では野性型マウスに比べて長期増強が半分以下に抑制された。また、学習能力も同様に低下していた。この結果は、海馬の長期増強が記憶の基礎過程であるとの考えを強く支持しているものと言える。本年度はさらに、NMDA型グルタミン酸受容体のもうひとつのサブユニットであるε2についても検討を加え、ε1とε2のそれぞれの遺伝子ノックアウトの影響を比較検討し、各サブユニットの役割、意義を解析した。その結果、海馬CA3野錐体細胞においては、NMDA受容体の分子構築が同一細胞に形成されるシナプスの種類、ないしはその部位により異なっていると考えられることが分かった。
非営利組織における不正防止マネジメント

本研究は4ヵ年計画で実施される。第1年度に当たる平成30年度の研究概要は、以下の2点である。第1に、企業不祥事などの不正行為に関するこれまでの経営学研究の蓄積と、非営利組織の実態を踏まえながら、非営利組織における不正発生のメカニズムを明らかにしたことである。特に、実際の非営利組織の不正事例と照らし合わせながら、1不正行為を欲する事情(動機),2不正行為が可能な環境(機会),3不正行為をする言い訳(正当化)という3つの条件が揃うことで不正が発生するという「不正のトライアングル理論(Cressey 1953,Albrecht, 1991, 2014)」に基づいて、非営利組織における不正行為の発生メカニズムを提示することができた。非営利組織における不正発生のメカニズムに関する研究成果については、2つの学会報告において発表した。第2に、非営利組織の不正の実態を把握するためにのヒアリング調査を実施したことである。ヒアリング調査先は、東北地方のNPO法人であり、当該NPOで発生した不正の具体的内容、不正が発覚するまでの経緯と発覚してからの対応、不正防止に向けての課題などについて、ヒアリングを実施した。当該NPO法人では、当時の不正について詳細な記録が残っており、非営利組織における不正発生メカニズムの解明に大いに参考になった。特に、1財源不足解消のための工夫、2自発性・相互信頼に基づく組織運営、3社会的課題解決という組織ミッションという、これまで非営利組織の強みと考えらえてきた特性が、不正のトライアングルの3つの条件を誘発するという可能性を着想することとなった。また、NPO法人のガバナンスにも、不正行為を誘発する要因が存在し、不正防止策を考察することにおいて研究可能性が広がった。ヒアリング調査先から得られた知見は、今後の事例研究を推進するために有用であると考えられる。おおむね順調に進展していると評価する理由は,以下の2点である。第1に、非営利組織の不正発生メカニズムについて、非営利組織の特徴を踏まえながら既存研究を整理することで、不正のトライアングル理論をベースとした分析枠組みを提示することができ、研究成果として2つの学会報告で発表できたことである。第2に、非営利組織の不正について、実際に不正が行われたNPOからヒアリング調査を実施することができ、分析枠組みを精緻化するとともに、分析結果を導出する方向性が見えてきたことである。本研究課題の今後の推進の方策については、以下の3つである。第1に、非営利組織の不正発生メカニズムについて、学術論文として成果を発表することである。2つの学会報告で発表した研究成果を基に執筆する予定である。第2に、ヒアリング調査で得られた知見を整理し、事例分析を行うことである。具体的には、1財源不足解消のための工夫、2自発性・相互信頼に基づく組織運営、3社会的課題解決という組織ミッションという、これまで非営利組織の強みと考えらえてきた特性が、不正のトライアングルの3つの条件を誘発するという可能性について、より詳細に検討する予定である。これらの研究成果は、学会報告および学術論文として発表したい。第3に、今後もヒアリング調査に応じてくれる非営利組織を探索するとともに、不正発生のメカニズムの解明や不正の防止策に関する知見を獲得できる調査を実施する。第1年度は、1つのNPO法人に対してヒアリング調査を実施することができたが、今後は、複数の事例について分析を行いたい。

第2に、非営利組織の不正について、実際に不正が行われたNPOからヒアリング調査を実施することができ、分析枠組みを精緻化するとともに、分析結果を導出する方向性が見えてきたことである。本研究課題の今後の推進の方策については、以下の3つである。第1に、非営利組織の不正発生メカニズムについて、学術論文として成果を発表することである。2つの学会報告で発表した研究成果を基に執筆する予定である。第2に、ヒアリング調査で得られた知見を整理し、事例分析を行うことである。具体的には、1財源不足解消のための工夫、2自発性・相互信頼に基づく組織運営、3社会的課題解決という組織ミッションという、これまで非営利組織の強みと考えらえてきた特性が、不正のトライアングルの3つの条件を誘発するという可能性について、より詳細に検討する予定である。これらの研究成果は、学会報告および学術論文として発表したい。第3に、今後もヒアリング調査に応じてくれる非営利組織を探索するとともに、不正発生のメカニズムの解明や不正の防止策に関する知見を獲得できる調査を実施する。第1年度は、1つのNPO法人に対してヒアリング調査を実施することができたが、今後は、複数の事例について分析を行いたい。次年度使用額が生じた理由は、ヒアリング調査の実施場所が、研究分担者の近隣であったため、予定よりも、研究分担者の旅費を使用する必要がなかったためである。翌年度は、関連分野の資料の購入や、新たなヒアリング調査への旅費、学会報告における研究成果の発表のための旅費・参加費に当てる予定である。
TRPカチオンチャネルに注目した角結膜上皮性腫瘍の悪性度評価と新規治療戦略の確立

TRPチャネル群は感覚神経、非神経組織のカルシウムチャネルとして健常組織の機能維持に重要な役割を演じているだけでなく、悪性腫瘍の増殖、分化にも関与する。眼表面は上皮性腫瘍の発生母地となる。角膜輪部基底の幹細胞が腫瘍発生母地と考えられる上皮性腫瘍には、前癌病変と考えられる上皮異形成、上皮内癌、扁平上皮癌がある。現状では光学顕微鏡による組織病理所見で悪性度の確定診断が行われるに留まっている。眼表面(角結膜)腫瘍では、切除が困難な程度に眼表面に広く増殖している場合もあり、マイトマイシンCやインターフェロンの局所投与の併用などが治療戦略となっているが、これらが有効でない場合や、角膜上皮の遷延性の障害などの副作用も報告されてあり、新たな治療戦略の確立が望まれる。また、上記薬剤の局所投与の治療効果の判定としては、ヘマトキシリン・エオジン染色と細胞増殖指標の免疫組織化学が主な方法であるが、それをサポートする新たな免疫組織化学的手法も待たれるところである。和歌山県立医科大学で外科的に切除された角結膜上皮性腫瘍のパラフィン標本を用いて各種TRPチャネルの発現について免疫組織化学的検索をおこなう。発現において特徴的な一定の傾向が見られれば、あらたな悪性度判定や治療効果判定に使用できると考えている。検討する組織は、角結膜上皮内癌、異形成、翼状片、正常結膜である。上皮内癌、上皮異形成、正常結膜、翼状片についてTRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1の免疫組織化学的検討をおこなった。TRPV1とTRPA1の免疫組織学的局在は健常結膜、異形成上皮、上皮内癌で変化を見なかったが、TRPV2、TRPV3、TRPV4は上記の組織間で変化することが分かった。TRPチャネルの発現において、悪性組織と良性組織での発現の違いを裏付ける要素を見いだせていない。今後、上皮細胞の維持に関連する免疫組織化学的検討を進める予定である。和歌山県立医科大学眼科で外科的に切除した角結膜腫瘍、結膜弛緩症と斜視手術の余剰切除結膜のパラフィン標本で各種TRPチャネルファミリーの発現について免疫組織化学的検索をおこなった。上皮系腫瘍の悪性度とTRPチャネルファミリーの発現パターンとマイトマイシンC治療前後での発現パターンの変化を確認した。TRPV1発現は異形成と上皮内癌での発現で差異はなかったが、TRPV4発現は異形成では不変、上皮内癌では減弱したことから、TRPV4発現は、悪性度のマーカーになる可能性があると思われた。また、TRPV4発現は上皮内癌と異形成でマイトマイシンC治療後に発現が減弱することから、治療の効果判定の一助となる可能性があると思われた。免疫組織化学的検討は順調に進んでいるが、もう少し症例数が必要と思われる。上皮内癌、異形成、正常結膜などの組織を用いて、TRPチャネルの免疫組織化学的検討をおこなっている。発現において一定の傾向があれば、あらたな悪性度判定や治療判定に使用できるとかんがえているが、現在、TRPチャネルの発現は、一定の傾向を得られていない。TRPチャネルの発現において、角結膜腫瘍と正常結膜で、違いがあると予想していたが、個々の組織で一定の傾向が得られず、結果を出すことができていない。

上皮内癌、上皮異形成、正常結膜、翼状片についてTRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1の免疫組織化学的検討をおこなった。TRPV1とTRPA1の免疫組織学的局在は健常結膜、異形成上皮、上皮内癌で変化を見なかったが、TRPV2、TRPV3、TRPV4は上記の組織間で変化することが分かった。TRPチャネルの発現において、悪性組織と良性組織での発現の違いを裏付ける要素を見いだせていない。症例数を増やして検討を進める。また、培養実験も今後進める。新たに角結膜腫瘍や正常結膜の組織を得られれば、再度検討したいと考えている。今後、上皮細胞の維持に関連する免疫組織化学的検討を進める予定である。新しい結果がでておらず、学会発表していないため免疫染色など研究を進める上での必要な物品に使用する計画である。免疫染色など研究を進める上で必要な物品の購入に使用する計画である。症例があれば実験をすすめる予定です
思春期社会的ストレスが成熟後の社会行動に与える影響とその機序の解明

思春期の社会的遊びは社会性の発達に重要であるが、この神経基盤は明らかではない。これまでに、ラットの遊び行動時にオキシトシン産生ニューロンが活性化されること、遊びを阻害すると成体で社会的相互作用が阻害されることを示してきた。本研究の目的は、「思春期に遊びが阻害されると、オキシトシン神経回路が可塑的に変化して、成体で社会行動の障害が起こる」という仮説を検証することである。オキシトシン産生ニューロンの投射先を探るために、オキシトシン遺伝子プロモーター制御下で蛍光タンパク質tdTomatoとDNA組換え酵素Flippaseを発現するトランスジェニックラットを作製し、ラインの選定を行った。オキシトシン産生ニューロンの存在する分界条床核、視床下部室傍核、視索上核の全てにおいて、オキシトシン産生ニューロンの90%程度でtdTomatoの発現が観察され、トランスジーンの特異的な発現が確認できた。現在、この動物に対して、Flippase依存的に膜移行性緑色蛍光タンパク質を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを投与し、検討を始めている。遊び行動におけるオキシトシンーオキシトシン受容体システムの機能を明らかにする目的で、CRISPR-Cas9系を用いてオキシトシン受容体遺伝子欠損ラットを作製し、ゲノム配列の確認を行ってラインの選定をした。また、この遺伝子欠損ラットにおけるオキシトシン受容体の発現を確認するため、ラット脳における受容体オートラジオグラフィマッピングの系を構築した。さらに、遊び行動時に活性化されるオキシトシン産生ニューロンの役割解析のために、オキシトシンプロモーター制御下でヒト改変ジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックラットを用いることを計画した。この動物に対して乳児期にジフテリア毒素を脳室内投与し、オキシトシン産生ニューロンが破壊される条件を検討した。今年度の主な計画は、オキシトシン産生ニューロンの投射先を同定するための遺伝子改変ラット作製とアデノ随伴ウイルスベクター投与の検討、オキシトシン-オキシトシン受容体系の機能を明らかにするための遺伝子改変ラットの作製とオキシトシン産生ニューロン破壊系の確立を行うことであった。これらは当初の計画通りおおむね順調に進展している。今年度作製した遺伝子改変ラットとアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、遊び行動時に活性化されるオキシトシン神経回路を同定する。さらに、人工受容体を用いて、同定したオキシトシン神経回路の活動を調節し、その効果を検証する。遺伝子改変ラットを用いて幼少期にオキシトシン産生ニューロンを破壊し、幼少期の遊び行動と成体における社会行動が障害されるかを検証する。また、オキシトシン受容体アンタゴニストを幼少期に投与し、同様の検証を行う。さらに、オキシトシン受容体遺伝子欠損ラットにおいて、幼少期の遊び行動と成体における社会行動が障害されるかを検証する。思春期に遊び行動を阻害されたラットにおいて、神経活動、ニューロン数、mRNA発現量を指標にして、成体でオキシトシン神経回路が抑制されるかを検証する。思春期の社会的遊びは社会性の発達に重要である。しかし、この神経基盤は明らかではない。これまでに我々は、ラットの遊び行動時にオキシトシン産生ニューロンが活性化されること、遊びを阻害すると成体で社会的相互作用が阻害されることを示している。神経活動マーカーであるc-Fosの発現を詳細に検討することで、遊び行動時のラットでは視床下部尾側部のオキシトシン産生ニューロンが特異的に活性化されることを見出した。さらに、オキシトシン産生ニューロンの投射先を探るために、オキシトシン遺伝子プロモーター制御下でDNA組換え酵素Flippaseを発現するトランスジェニックラットの作製を行った。この動物は所属研究室で作製し、現在ライン選定の段階にある。また、遊び行動時に活性化されるオキシトシン産生ニューロンの役割解析のために、オキシトシンプロモーター制御下でヒト改変ジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックラットを用いることを計画した。この動物に対して乳児期にジフテリア毒素を投与して、オキシトシン産生ニューロンを特異的に破壊する系の検討を行っている。さらに、遊び行動を阻害したラットの成体における社会行動について、社会的相互作用が阻害されるだけでなく、快情動に伴う50kHz帯域の発声に対する選好が障害されることを見出した。遊び行動時に活性化されるオキシトシン産生ニューロンを同定し、この投射先を同定するために遺伝子改変ラットの作製を行った。また、遊び行動時に活性化されるオキシトシン産生ニューロンの役割解析のため、遺伝子改変ラットを用いて幼少期にオキシトシン産生ニューロンを特異的に破壊する系の確立を進めている。さらに、遊び行動を阻害した時の成体における新たな社会行動障害を見出した。これらは当初の計画通り順調に進展している。

オキシトシン産生ニューロンの投射先を探るために、オキシトシン遺伝子プロモーター制御下で蛍光タンパク質tdTomatoとDNA組換え酵素Flippaseを発現するトランスジェニックラットを作製し、ラインの選定を行った。オキシトシン産生ニューロンの存在する分界条床核、視床下部室傍核、視索上核の全てにおいて、オキシトシン産生ニューロンの90%程度でtdTomatoの発現が観察され、トランスジーンの特異的な発現が確認できた。現在、この動物に対して、Flippase依存的に膜移行性緑色蛍光タンパク質を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを投与し、検討を始めている。遊び行動におけるオキシトシンーオキシトシン受容体システムの機能を明らかにする目的で、CRISPR-Cas9系を用いてオキシトシン受容体遺伝子欠損ラットを作製し、ゲノム配列の確認を行ってラインの選定をした。また、この遺伝子欠損ラットにおけるオキシトシン受容体の発現を確認するため、ラット脳における受容体オートラジオグラフィマッピングの系を構築した。さらに、遊び行動時に活性化されるオキシトシン産生ニューロンの役割解析のために、オキシトシンプロモーター制御下でヒト改変ジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックラットを用いることを計画した。この動物に対して乳児期にジフテリア毒素を脳室内投与し、オキシトシン産生ニューロンが破壊される条件を検討した。今年度の主な計画は、オキシトシン産生ニューロンの投射先を同定するための遺伝子改変ラット作製とアデノ随伴ウイルスベクター投与の検討、オキシトシン-オキシトシン受容体系の機能を明らかにするための遺伝子改変ラットの作製とオキシトシン産生ニューロン破壊系の確立を行うことであった。これらは当初の計画通りおおむね順調に進展している。現在作製中の遺伝子改変ラットとアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、遊び行動時に活性化されるオキシトシン神経回路を同定する。さらに、人工受容体を用いて、同定したオキシトシン神経回路の活動を調節し、その効果を検証する。遺伝子改変ラットを用いて幼少期にオキシトシン産生ニューロンを破壊し、幼少期の遊び行動と成体における社会行動が障害されるかを検証する。また、オキシトシン受容体アンタゴニストを用いて同様の検証を行う。思春期に遊び行動を阻害されたラットにおいて、c-Fosの発現、ニューロン数、mRNA発現量を指標にして、成体でオキシトシン神経回路が抑制されるかを検証する。今年度作製した遺伝子改変ラットとアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、遊び行動時に活性化されるオキシトシン神経回路を同定する。また、オキシトシン受容体アンタゴニストを幼少期に投与し、同様の検証を行う。さらに、オキシトシン受容体遺伝子欠損ラットにおいて、幼少期の遊び行動と成体における社会行動が障害されるかを検証する。
樹木のリグニン生合成とストレス応答におけるペルオキシダーゼ機能と発現の解析

本研究では、ポプラペルオキシダーゼ遺伝子の網羅的取得と発現解析を行い、リグニン生合成およびストレス応答にかかわるペルオキシダーゼの機能を解明することを目的とした。まず、ポプラゲノムプロジェクトからペルオキシダーゼ遺伝子の解析を行い、現在までに83個の遺伝子を発見するとともに、独立した31個のペルオキシダーゼ遺伝子の単離とリアルタイムPCRによる定量的転写解析を行った。その結果、転写量が特に大きな8クローンおよび葉柄に高い部位特異性を示すクローンを同定した。また、7クローンは高いストレス誘導性が確認され、中でもPO55はストレス処理によりその転写量が10倍に増加した。次いで、定常状態のポプラ各組織に発現しているペルオキシダーゼのプロテオーム解析を行った。分化中木部のみで確認されたペルオキシダーゼアイソザイムは2つあり、そのうちの1つはPO35であり、リグニン生合成への関与が示唆された。タンパクレベルにおいて内皮や葉で高い発現が確認されたPO34やPO70は、転写解析においてストレス誘導性が確認されたことから、スベリン合成やまた傷害ストレスなどへの抵抗性反応に関与していると考えられた。高分子リグニンのin vitro重合を触媒しうる特異的ペルオキシダーゼアイソザイム(CWPO-C)を同定した。そのcDNAを単離するとともに発現解析を行った結果、本遺伝子はポプラ(Populus alba L.)組織内で恒常的に発現する一方で、各種ストレスによる発現の誘導は起こらなかった。また、精製酵素を用い抗体を作成したポリクローナル抗体を用いてポプラ二次木部における局在を免疫組織観察した結果、本酵素は細胞間層、セルコーナー、および二次壁に局在しており、その分布強度はリグニンの蓄積量と良く一致していた。以上の結果より、CWPO-Cはリグニン生合成に関与するペルオキシダーゼアイソザイムであることが強く示唆された。1.PO cDNAの取得と発現解析:ポプラ(poplus alba L.)の分化中木部、シュート、成葉よりmRNA調整後、逆転写反応によりcDNAを合成した。クラスIIIペルオキシダーゼに保存された数種の配列をもとにプライマーを作成した。これらプライマーの組み合わせと、先に合成したcDANを鋳型に用いてPCR反応行い、ペルオキシダーゼcDNAの部分配列を単離した。現在までに15種以上のクローンを単離した。これらの発現解析の結果、葉において発現されるペルオキシダーゼ遺伝子の数は分化中木部に比べて少なく、特定ペルオキシダーゼ遺伝子の発現頻度が高いことが明らかとなった。2.ポプラペルオキシダーゼ遺伝子の検索:ポプラゲノムプロジェクトのドラフトシークエンスデータからペルオキシダーゼと相同性の高い配列を抽出し、アッセンブリーを行った。現在の段階で50種をこえる暫定ペルオキシダーゼ遺伝子の存在が予想された。3.ペルオキシダーゼのストレス応答性:取得したペルオキシダーゼcDNA配列をもとに、傷害ストレス応答性を競合的PCRによって調査した。当年性ポプラの幹に傷害ストレスを与えた後、48時間以内の発現挙動を経時的に調査した。その結果、酸性ペルオキシダーゼに分類されるペルオキシダーゼは傷害ストレスによって24時間から48時間以内に発現誘導されるが、塩基性ペルオキシダーゼの誘導は起こらず、ストレスの有無にかかわらず恒常的に発現していた。また、後者は分化中木部、シュート、葉など大部分の組織に恒常的に発現していることが明らかとなった。Iリグニンの生合成に関与するペルオキシダーゼアイソザイム前年度の研究で、高分子リグニンのin vitro重合を触媒しうる特異的ペルオキシダーゼアイソザイム(CWPO-C)を同定した。

本年度はそのcDNAを単離するとともに発現解析を行った結果、本遺伝子はポプラ(Populus alba L.)組織内で恒常的に発現する一方で、各種ストレスによる発現の誘導は起こらなかった。また、精製酵素を用い抗体を作成した結果、非常に特異性の高いポリクローナル抗体が得られた。これを用いてポプラ二次木部における局在を免疫組織観察した結果、本酵素は細胞間層、セルコーナー、および二次壁に局在しており、その分布強度はリグニンの蓄積量と良く一致していた。以上の結果より、CWPO-Cはリグニン生合成に関与するペルオキシダーゼアイソザイムであることが強く示唆された。IIストレス応答性ペルオキシダーゼ前年度に引き続きポプラからのペルオキシダーゼcDNA単離を行った。今年度はP.nigra EST情報およびP.trichocarpaゲノム情報を活用した。前年度分と合わせて完全長cDNA12個含む合計26個のペルオキシダーゼcDNAを単離した。一方で、ポプラESTとゲノム情報の解析結果を用い、ゲノムを鋳型とするPCR反応によりペルオキシダーゼ遺伝子の網羅的取得を開始した。ノーザンハイブリダイゼーションにより、これまでに単離したペルオキシダーゼ遺伝子の発現解析を行った。ストレスとして障害・乾燥・高温・過酸化水素を導入した。また、若芽・本葉・分化中木部における部位特性の解析も行った。ストレス全般に高い感度で応答するもの、特定のストレスに応答するもの、全く応答しないあるいは発現抑制を受けるものもあり、個々のペルオキシダーゼ遺伝のストレス応答は多様でありよることが判明した。同様の多様性は各部位における発現でも確認された。植物ペルオキシダーゼは巨大な遺伝子ファミリーを形成しているが、各ペルオキシダーゼアイソザイムの生理的機能はほとんど明らかとなっていない。そこで本研究では、モデル樹木であるポプラを用いてペルオキシダーゼ遺伝子の網羅的取得と発現解析を行い、リグニン生合成およびストレス応答にかかわるペルオキシダーゼの機能を解明することを目的とした。まず、ポプラゲノムプロジェクトの全ゲノム塩基配列からペルオキシダーゼ遺伝子の解析を行い、現在までに83個の遺伝子を発見するとともに、独立した31個のペルオキシダーゼ遺伝子の単離とリアルタイムPCRによる定量的転写解析を行った。その結果、PO34、PO52、PO55、PO95、PO12、PO70、PO84、PO107の転写量は特に大きく、PO107は葉柄に高い部位特異性が確認された。また、PO34、PO44、PO55、PO59、PO70、PO86、PO95は高いストレス誘導性が確認され、中でもPO55はストレス処理によりその転写量が10倍に増加した。一方、ペルオキシダーゼのタンパク質レベルでの調節と生理機能に関する知見を得るため、定常状態のポプラ各組織に発現しているペルオキシダーゼの同定を2次元電気泳動とMALDI-TOF-MSで行った。分化中木部のみで確認されたペルオキシダーゼアイソザイムは2つあり、そのうちの1つはPO35であると同定した。