hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺高血圧症新規治療標的探索のためのPDGF経路新規下流エフェクター解析

肺高血圧症は難治性疾患である.PDGFシグナル経路はPHの病態である肺動脈平滑筋細胞(PASMC)の増殖に重要であるが,その経路の阻害薬は,臨床的に有効性を発揮する投与量では強い副作用が生じるとして臨床応用が断念された.効果的な増殖阻害を実現するためには,PDGF経路下流で,よりピンポイントの治療標的発見が必要である.本研究は,研究代表者らが最近肺高血圧症でのPDGF経路下流として見出した転写因子DLX1に着目して進めるものである.平成30年度には,肺高血圧症の一つである慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)症例の手術検体を病理組織学的に解析し,日本のCTEPH患者の血管病変において線維化が顕著であることを報告した(J Thorac Cardiovasc Surg 2019, in press).また,CTEPHを含む複数の肺高血圧症のサブタイプに対し,患者由来のPASMCにおいてDLX1が増殖に必須であることを確認することができた.このようなベースラインでの増殖におけるDLX1の重要性に加え,DLX1ノックダウンにより,PASMCのPDGF刺激によるCCND1遺伝子発現増加やBrdUの取り込みといった増殖応答が顕著に抑制されることが見出された.さらに,DLX1ノックダウンに伴い,PASMCの生理的機能に重要な分子,たとえば収縮に必須のタンパクの発現変化等が認められた(投稿準備中).すなわち,DLX1のPASMCにおける重要性は増殖に留まらず,収縮や遊走など,多くのPASMCの機能の制御に関与することが示唆された.また,平成30年度にはマイクロ流路デバイスを用いたin vitro肺血管リモデリングモデルにおけるDLX1ノックダウンならびに流れ負荷の条件を検討し,確立した.申請時の計画において,平成30年度は病理組織学的検討,マイクロ流路デバイス中におけるDLX1ノックダウンの実施,DLX1のベースラインあるいはPDGF刺激時の増殖応答への関与の解析等を実施することとしていたが,いずれの項目においても順調な進展が得られたため.実際,これまで既存知見の少なかったCTEPH患者の病変血管の特徴を各種臨床的パラメータと併せて検討し,その成果をJ Thorac Cardiovasc Surg誌に報告した.また,マイクロ流路デバイスを用いた検討については,申請時には平成31年度に予定していたmicroarray解析用のサンプルを既に調製済みである.さらに,DLX1の機能解析については,当初計画していた増殖以外の機能の評価も実施することができ,DLX1の機能が多岐にわたることを見出しつつある.平成30年度に実施した病理組織学的検討を,肺高血圧症患者由来PASMCの培養実験により得られた知見とあわせ,DLX1の肺高血圧症における重要性の検討をさらに進める.また,平成30年度中に確立したマイクロ流路デバイスを用いた解析を,静置培養において得られた知見を参考にしつつ推進する.とりわけ,マイクロ流路デバイスにおけるDLX1ノックダウンにより得られたサンプルをマイクロアレイ解析に供し,DLX1により制御され,肺高血圧症の病態進展に関与する候補因子の探索および解析を行う.こうした解析を通じ,DLX1ノックダウンがどのようにしてPDGFへの応答性を阻害するのかを検討する.また,DLX1の機能・下流因子の解析においては,当初計画していた増殖関連因子に留まらず,平成30年度に得られた初期検討結果に基づき,収縮や遊走などをも含めた,より多角的な解析を実施する.肺高血圧症は難治性疾患である.PDGFシグナル経路はPHの病態である肺動脈平滑筋細胞(PASMC)の増殖に重要であるが,その経路の阻害薬は,臨床的に有効性を発揮する投与量では強い副作用が生じるとして臨床応用が断念された.効果的な増殖阻害を実現するためには,PDGF経路下流で,よりピンポイントの治療標的発見が必要である.本研究は,研究代表者らが最近肺高血圧症でのPDGF経路下流として見出した転写因子DLX1に着目して進めるものである.平成30年度には,肺高血圧症の一つである慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)症例の手術検体を病理組織学的に解析し,日本のCTEPH患者の血管病変において線維化が顕著であることを報告した(J Thorac Cardiovasc Surg 2019, in press).また,CTEPHを含む複数の肺高血圧症のサブタイプに対し,患者由来のPASMCにおいてDLX1が増殖に必須であることを確認することができた.このようなベースラインでの増殖におけるDLX1の重要性に加え,DLX1ノックダウンにより,PASMCのPDGF刺激によるCCND1遺伝子発現増加やBrdUの取り込みといった増殖応答が顕著に抑制されることが見出された.さらに,DLX1ノックダウンに伴い,PASMCの生理的機能に重要な分子,たとえば収縮に必須のタンパクの発現変化等が認められた(投稿準備中).すなわち,DLX1のPASMCにおける重要性は増殖に留まらず,収縮や遊走など,多くのPASMCの機能の制御に関与することが示唆された.

また,平成30年度にはマイクロ流路デバイスを用いたin vitro肺血管リモデリングモデルにおけるDLX1ノックダウンならびに流れ負荷の条件を検討し,確立した.申請時の計画において,平成30年度は病理組織学的検討,マイクロ流路デバイス中におけるDLX1ノックダウンの実施,DLX1のベースラインあるいはPDGF刺激時の増殖応答への関与の解析等を実施することとしていたが,いずれの項目においても順調な進展が得られたため.実際,これまで既存知見の少なかったCTEPH患者の病変血管の特徴を各種臨床的パラメータと併せて検討し,その成果をJ Thorac Cardiovasc Surg誌に報告した.また,マイクロ流路デバイスを用いた検討については,申請時には平成31年度に予定していたmicroarray解析用のサンプルを既に調製済みである.さらに,DLX1の機能解析については,当初計画していた増殖以外の機能の評価も実施することができ,DLX1の機能が多岐にわたることを見出しつつある.平成30年度に実施した病理組織学的検討を,肺高血圧症患者由来PASMCの培養実験により得られた知見とあわせ,DLX1の肺高血圧症における重要性の検討をさらに進める.また,平成30年度中に確立したマイクロ流路デバイスを用いた解析を,静置培養において得られた知見を参考にしつつ推進する.とりわけ,マイクロ流路デバイスにおけるDLX1ノックダウンにより得られたサンプルをマイクロアレイ解析に供し,DLX1により制御され,肺高血圧症の病態進展に関与する候補因子の探索および解析を行う.こうした解析を通じ,DLX1ノックダウンがどのようにしてPDGFへの応答性を阻害するのかを検討する.また,DLX1の機能・下流因子の解析においては,当初計画していた増殖関連因子に留まらず,平成30年度に得られた初期検討結果に基づき,収縮や遊走などをも含めた,より多角的な解析を実施する.平成30年度に,比較的高価な培養基材を必要とするマイクロ流路デバイス中におけるノックダウン実験およびサンプル調製等のための条件検討を予定していたが,これらの検討が当初の計画よりも順調に進み,完了したため.次年度以降,平成30年度に確立した実験条件に基づき,マイクロ流路デバイスを利用した解析,ならびにDLX1の機能・下流因子の解析を申請時の計画に基づき進める予定である.
２色覚を基点としたカラーユニバーサルデザイン手法の開発と実用化

本研究課題の目標は,従来の3色覚配色を先に行うのではなく,2色覚の色知覚平面にて,2色覚向け配色を行った後に,2色覚に対する色の見えを保持しつつ,3色覚向け配色へと展開する2色覚の色知覚を基点とした新しいカラーユニバーサルデザイン手法を開発し,実用化することである.この方法を開発するにあたり,2色覚向け配色から3色覚向け配色へと転換する際に,1型色覚と2型色覚の混同色の違いをどう扱うかということが問題になる.そこで,この転換にて,ある程度の色変化の許容範囲を設けることによって,この問題の解決を試みた.許容範囲を決める基準として,JIS Z 8102の「物体色の色名」にて定義されている系統色名の範囲(以下,系統色名カテゴリとする)内を色変化の許容範囲とした.これにより,実際に,配色カードを用い,2色覚を基点としたカラーユニバールデザイン手法の色見本の試作を行った.その結果,カラーユニバーサルデザイン手法として有効である結果が得られた.さらに,色彩デザインにおける配色の際に2色覚の考慮すべき特性についての研究も並行して行った.2色覚の特性を容易に検査できる赤緑混色比調整のアノマロスコープの開発,2色覚および異常3色覚の色名応答の呈示時間依存性,広色域ディスプレイにおける色覚異常を持つ人のオブザーバーメタメリズムの測定などを行い,これらの研究にて得られた知見をカラーユニバーサルデザインへと活用していくことも検討していく.2色覚向け配色から3色覚向け配色へと転換する際に,1型色覚と2型色覚の混同色の違いによって生じる問題を,ある程度の色変化の許容範囲を設けることによって解決を試みた.JIS Z 8102の「物体色の色名」にて定義されている系統色名の範囲(以下,系統色名カテゴリとする)内を色変化の許容範囲することで,解決できることがわかった.さらに,実際に,配色カードを用い,2色覚を基点としたカラーユニバールデザイン手法の色見本の試作を行い,カラーユニバーサルデザイン手法として有効である結果が得られた.この研究を日本色彩学会誌へ論文投稿し,受理され,掲載に至った.平成30年度に試作した2色覚を起点としてカラーユニバーサルデザインのための色見本の色数を199色から1948色へと拡張したものの作成を行う.さらに,この色見本を活用し,実際に色彩デザインの現場にて使用できるのかどうかについて,デザイナーに対するアンケートなどによって,検討を行う予定である.また,2色覚の特性の把握に関する研究を平成30年度に引き続き行い,カラーユニバーサルデザインへの有用な知見を得ていく計画である.本研究課題の目標は,従来の3色覚配色を先に行うのではなく,2色覚の色知覚平面にて,2色覚向け配色を行った後に,2色覚に対する色の見えを保持しつつ,3色覚向け配色へと展開する2色覚の色知覚を基点とした新しいカラーユニバーサルデザイン手法を開発し,実用化することである.しかし,2色覚向け配色をする際に2色覚が知覚している色彩をどのように活用したらよいのか,そして,色彩に対してどのような印象を持つのはわかっていない.そこで,研究初年度となる平成29年度は,最初の2色覚向け配色を考案する際に必要となる2色覚の色覚特性の測定に重点をおき,研究を行った.具体的には,2色覚が知覚している青黄ー明度平面の色カテゴリ,および2色覚に対する色の目立ちを調査した.配色を想定した場合,最低でも7つのカテゴリが存在することが明らかになった.すなわち,カラーユニバーサルデザインとして,同時に7色まで使えることを示唆する.さらに,2色覚に対する色の目立ちの測定結果は,3色覚とは異なり,色情報の寄与がほとんどなく,明度コントラストによって決まることを示した.これらのことは2色覚の色カテゴリのような色知覚や色の目立ちのような機能的役割は3色覚と大きく異なることを示唆し,2色覚特有の特性であると言える.これらの知見は,カラーユニバーサルデザインの実践に無視することができない有益である.以上の研究から,2色覚基点のカラーユニバーサルデザインの開発にて,2色覚の色覚に関する基礎的な特性を得ることができた.2色覚が知覚している青黄ー明度平面の色カテゴリ,および2色覚に対する色の目立ちを調査した.そして,その成果の学会発表を行った.また,一部の成果については,論文の投稿を行い,現在,審査中である.本研究課題の目標は,従来の3色覚配色を先に行うのではなく,2色覚の色知覚平面にて,2色覚向け配色を行った後に,2色覚に対する色の見えを保持しつつ,3色覚向け配色へと展開する2色覚の色知覚を基点とした新しいカラーユニバーサルデザイン手法を開発し,実用化することである.この方法を開発するにあたり,2色覚向け配色から3色覚向け配色へと転換する際に,1型色覚と2型色覚の混同色の違いをどう扱うかということが問題になる.そこで,この転換にて,ある程度の色変化の許容範囲を設けることによって,この問題の解決を試みた.許容範囲を決める基準として,JIS Z 8102の「物体色の色名」にて定義されている系統色名の範囲(以下,系統色名カテゴリとする)内を色変化の許容範囲とした.これにより,実際に,配色カードを用い,2色覚を基点としたカラーユニバールデザイン手法の色見本の試作を行った.その結果,カラーユニバーサルデザイン手法として有効である結果が得られた.さらに,色彩デザインにおける配色の際に2色覚の考慮すべき特性についての研究も並行して行った.

2色覚の特性を容易に検査できる赤緑混色比調整のアノマロスコープの開発,2色覚および異常3色覚の色名応答の呈示時間依存性,広色域ディスプレイにおける色覚異常を持つ人のオブザーバーメタメリズムの測定などを行い,これらの研究にて得られた知見をカラーユニバーサルデザインへと活用していくことも検討していく.2色覚向け配色から3色覚向け配色へと転換する際に,1型色覚と2型色覚の混同色の違いによって生じる問題を,ある程度の色変化の許容範囲を設けることによって解決を試みた.JIS Z 8102の「物体色の色名」にて定義されている系統色名の範囲(以下,系統色名カテゴリとする)内を色変化の許容範囲することで,解決できることがわかった.さらに,実際に,配色カードを用い,2色覚を基点としたカラーユニバールデザイン手法の色見本の試作を行い,カラーユニバーサルデザイン手法として有効である結果が得られた.この研究を日本色彩学会誌へ論文投稿し,受理され,掲載に至った.カラーユニバーサルデザインの実践に有益な知見を得るために,平成29年度に引き続き,2色覚の色覚メカニズムや色彩心理に関する研究を行っていく.さらに,2色覚のサブタイプである1型2色覚と2型2色覚の類似性や相違性についても研究を行い,1型2色覚,2型2色覚の共通した特性を活用することで,汎用性のあるカラーユニバーサルデザイン手法への展開を試みる.平成30年度に試作した2色覚を起点としてカラーユニバーサルデザインのための色見本の色数を199色から1948色へと拡張したものの作成を行う.さらに,この色見本を活用し,実際に色彩デザインの現場にて使用できるのかどうかについて,デザイナーに対するアンケートなどによって,検討を行う予定である.また,2色覚の特性の把握に関する研究を平成30年度に引き続き行い,カラーユニバーサルデザインへの有用な知見を得ていく計画である.
糖尿病の診断と食事療法がもたらす夫婦システムの変遷過程の解明と支援ツールの開発

文献レビュー,インターネット調査,および面接調査により,糖尿病を抱えた夫婦が,診断後に食事習慣の変化にどのように適応していくかについて理論モデルを構築し,支援ツールを開発した。糖尿病を有する夫婦は「食の好み」,「健康志向」,「食事づくりの手間」の3要素のバランスをとりながら食事療法に適応していくとする「3要素バランスモデル」に基づく適応プロセスを提示した。そして,適応/不適応パターンをアセスメントするための補助ツールを新たに開発した。本研究の目的は,家族心理学の立場から,糖尿病の診断により食生活の改善を求められた夫婦に生じるシステムの動きについて検討することであった。初年度の今年は,食生活の改善を求められた2型糖尿病をもつ夫婦が新しい食生活に適応していく変化の過程を解明することを目的とした研究の準備として予備的調査を行った。まず,理論的知見の整理のために家族心理学・家族看護学的視点から行われた近年の糖尿病研究をレビューした。これまで家族システム論で得られた知見の多くは糖尿病者とその配偶者の支援に援用可能であったが,実際の支援においては,食事作りなどの家庭内における性別役割分業が夫婦システムに与える影響を考慮する必要があると考えられた。続いて,新しい食生活への適応過程に関する研究の予備調査として,糖尿病者が診断前後に経験する情動体験や直面化体験(糖尿病のことや将来の健康について思いめぐらす体験)と行動変容の有無との関連についてインターネットを利用して調査を行った。その結果,直面化を引き起こす出来事の種類に個人差はあるが,総じて約89割の糖尿病者がその出来事を通して直面化を体験していることがわかった。しかし,直面化体験のみで行動変容の有無は決定されておらず,家族の行動変容があるかどうかといった要因が関連していることも示された。本研究は,当事者の行動変容が個人要因だけでなく,家族の要因によっても影響を受けていることを示している点で,学術的にも臨床的にも意義深い知見である。糖尿病と向き合う直面化体験は医療従事者が夫婦システムに介入するタイミングになりうるが,そこで望ましい行動変容が生じるかどうかを見極めるには,家族システムの動きを把握する必要がある。今年度の成果は,今後の研究において,そうした個人を超えた家族システム全体をとらえる視点の研究を進める必要があることを示す重要な知見といえる。本研究の目的は,食習慣の改善を求められた夫婦に生じるシステムの動きを解明し,2型糖尿病の病状悪化を予防するための心理的支援方法を提案することであった。今年度は当該目的の達成のために以下の成果を得た。《成果1》夫婦が糖尿病の食事療法において陥りやすい問題点を整理するため,健康カウンセリングおよびカップル・セラピーに関する文献の整理・検討を行った。また,筆者が過去に実施したインターネット調査のデータを再分析し,食事療法に関する夫婦の問題を性別役割の観点から検討した。その結果,夫婦が陥りやすい問題として,1変化を引き受けることに関する態度の乖離,2食事療法の責任の所在をめぐる問題,3食事ルールの不明瞭さ,4閉じられたコミュニケーションなどがあった。加えて,家事をめぐる性別役割の影響から,女性患者でパートナーからの支援不足が問題になりがちであることが示された。《成果2》成果1で示された問題を解決するための方法論的工夫を考察するため,国際会議への参加や海外の糖尿病療養指導士(CDE)との情報交換を行った。その結果,方法論的な工夫として,1患者教育において患者のエンパワーメントに加えて夫婦や家族のエンパワーメントの視点を取り入れること,2患者を取り囲むチーム医療から,patient-centeredなチーム医療へ,さらにはpatient- and family-centeredなチーム医療へ移行し,多様な職種が総合的に連携していくこと,3糖尿病の問題に対処する(coping)アプローチを超えて,糖尿病の価値を創造していく(flourishing)アプローチを目指すことなどが考えられた。《成果3》成果1および成果2の知見の社会的発信として,国内学会での発表や糖尿病専門誌への投稿を行った。本研究は,1食習慣の改善を求められた夫婦に生じるシステムの動きの解明と,22型糖尿病の病状悪化を予防するための心理的支援方法の提案の2つで構成されている。1について,当初計画していた継時的面接調査については,対象者のリクルートが困難と判断し研究計画を変更した。変更後は,回顧的面接調査および複線経路・等至性モデルによる分析によって代替することとした。現在,調査研究を進めている段階である。2については,文献レビューや学会での専門家間の情報収集により,支援ツールの作成に向けた方向性が定まってきた。1システム変化過程の解明については研究計画の変更によりやや遅れているが,2の心理的支援方法の提案については順調に進んでいる。区分としては,調査研究での遅れを鑑みて,「やや遅れている」と評価した。本研究では,以下の成果を得た。《成果1》文献および調査データをもとに,「夫婦の食事療法において陥りやすい問題点の整理」と「性別を踏まえた食事療法における夫婦の問題」の検証を行った。その結果,夫婦の取り組みには性別による違いがみられ,男性糖尿病者ー女性配偶者において過干渉の問題が,女性糖尿病者ー男性配偶者において関心の低さの問題が生じやすいことが示された。

また,夫婦の問題は「食の好み」「健康志向」「食事作りの手間」のバランス構造から生じることを考察し,新たに「家庭内の食事提供における三要素バランスモデル」を提唱した。以上の成果を,国内学会誌に掲載した。《成果2》新たな心理的支援方法の提案として,糖尿病夫婦の支援のための面接補助ツールを作成した。開発した補助ツールは3種類で,1「三要素バランスモデル」に基づいた援助ツール(「食の好み」「健康志向」「食事作りの手間」の3領域が記された台紙に,糖尿病者/配偶者で色分けされた各10枚のチップを食事療法で重要視している領域に置いていくもの),2食事療法の取り組みに関するアナログスケール(自身の取り組みを0から100までの尺度で主観的に評価してもらうもの),3ライフラインチャート(糖尿病発覚前糖尿病発覚時現在のあいだの主観的取り組み量の移り変わりをグラフ化して表現してもらうもの)であった。《成果3》本研究は夫婦が直面する課題を食習慣の改善に限定したが,糖尿病夫婦が直面する課題は多岐にわたる。そこで,成果2で作成したツールの有用性を検証し,さらに糖尿病夫婦の疾病受容プロセスを明らかにするための発展的な研究を計画し,実施のために東北大学大学院教育学研究科の研究倫理審査委員会の承認を得た。文献レビュー,インターネット調査,および面接調査により,糖尿病を抱えた夫婦が,診断後に食事習慣の変化にどのように適応していくかについて理論モデルを構築し,支援ツールを開発した。糖尿病を有する夫婦は「食の好み」,「健康志向」,「食事づくりの手間」の3要素のバランスをとりながら食事療法に適応していくとする「3要素バランスモデル」に基づく適応プロセスを提示した。そして,適応/不適応パターンをアセスメントするための補助ツールを新たに開発した。本研究全体の目的は,(1)食習慣の改善を求められた2型糖尿病をもつ夫婦が新しい食生活に適応していく変化の過程を解明すること,(2)2型糖尿病の病状悪化を予防するための新しい心理的支援方法の提案を試みることの2点であった。今年度は文献レビューとインターネットを利用した予備調査を行った。文献レビューを通して,これまでの研究を総合的に振り返り,研究目的の達成へ向けた情報収集と知見の整理をすることができた。またインターネットを用いた予備調査では,文献レビューの知見を補完する成果を得ることができた。これらは,今後予定している目的(1)の達成に向けた本調査の理論的基盤となるものであり,今後の研究を進めやすくすると思われる。一方で,当初の計画では初年度より本調査を行う予定であったが,諸事情により研究計画の変更をせざるをえなかった(詳細に関しては別欄「今後の研究の推進方策等」に記載)。ただし,目的達成に向けて遅れの生じない研究計画に変更できたことや,初年度で理論的知見の整理を行うことができたことなどを踏まえると,今後の研究の進度に大きな影響はないと考えられる。以上を総合的に評価して,今年度の達成度はおおむね順調であったと評価できる。本研究は,1食習慣の改善を求められた夫婦に生じるシステムの動きの解明と,22型糖尿病の病状悪化を予防するための心理的支援方法の提案の2つで構成されている。
皮膚悪性リンパ腫の病態形成の包括的解析

CTCLにおいて、IL-25の発現は上昇しており、腫瘍細胞からのIL-13産生増強を促進していた。また、CTCLの腫瘍細胞はcyclophilin Aを産生し、自己が発現するCD147と結合を介して、自己増殖を誘導していた。さらに、CTCLの腫瘍細胞はCD137に加えて、CD137Lを異所性に発現しており、自己増殖を誘導していた。進行期菌状息肉症では、末梢血中のIL-10産生制御性B細胞は減少し、病勢マーカーと逆相関を認めた。本研究では、1)皮膚悪性リンパ腫におけるTh2優位な腫瘍微小環境の形成に寄与する因子の解析、2)皮膚悪性リンパ腫におけるB細胞の役割の解析、3)皮膚悪性リンパ腫細胞の新たな自己分泌因子の同定とその役割の解析を通して、皮膚悪性リンパ腫の病態形成に関わる因子を包括的に解析し、皮膚悪性リンパ腫の新規治療法を提案することを目的としている。今回我々は、皮膚悪性リンパ腫の中で代表的な疾患である菌状息肉症、セザリー症候群を対象に、Th2反応を促進するサイトカインIL-25および新たな自己分泌分子であるcyclophilin Aの解析を行った。まず、菌状息肉症、セザリー症候群の患者の病変局所、血清中ではIL-25の発現が上昇しており、病勢と相関していることを見出した。また、IL-25はIL-25受容体を発現している菌状息肉症の細胞株からのTh2サイトカインであるIL-13産生を誘導していることを発見した。さらに、セザリー症候群の症例の中には、末梢血中腫瘍細胞がIL-25受容体を発現している症例があり、やはりIL-25はそれらの腫瘍細胞からIL-13産生を誘導していることも分かった。以上の結果から、IL-25が菌状息肉症、セザリー症候群のTh2優位な腫瘍微小環境の形成に寄与していると考えられた。続いて、我々は菌状息肉症、セザリー症候群の腫瘍細胞がcyclophilin Aとその受容体であるCD147を発現していることを見出した。さらに、菌状息肉症、セザリー症候群の腫瘍の細胞株の上清中にcyclophilin A阻害薬を加えたところ、腫瘍細胞の増殖が抑制されたことから、cyclophilin Aがオートクリンに腫瘍細胞の増殖を促していると考えられた。当初の目的のうち、Th2優位な微小環境の形成に寄与する因子の解析は、ほぼ完了し、自己分泌因子についても順調に解析は進行している。続いて、CTCL患者の末梢血中におけるIL-10産生制御性B細胞について、解析を行った。CTCL患者の末梢血中ではIL-10産生制御性B細胞の数、割合が減少しており、病勢マーカーと逆相関を認めた。IL-10はCTCLの腫瘍細胞の増殖を抑える可能性が報告されており、IL-10産生制御性B細胞の減少がCTCLの病態に関わっている可能性が示唆された。また、我々は免疫チェックポイント分子であるCD137、CD137Lに注目した。通常、CD137はT細胞やNK細胞に発現し、CD137Lは樹状細胞などの抗原提示細胞に発現している。CD137-CD137Lの相互関係はT細胞の活性化を誘導し、抗腫瘍免疫を増強することが知られている。今回、我々は、CTCLの腫瘍細胞がCD137に加えて、異所性にCD137Lを発現していることを見出した。さらに、中和抗体を用いて、その相互関係を阻害したところ、腫瘍細胞の増殖、生存、CXCR4を介した遊走能の低下がみられた。また、中和抗体はCTCLの細胞株をマウスに接種するtumor inoculation modelにおいて、in vivoにおける腫瘍の成育も阻害することができた。以上の結果から、CD137-CD137Lの相互関係を阻害することはCTCLの新たな治療につながると考えられた。IL-25の解析については、ほぼ完了しており、論文を作成中である。Cyclophilin Aの解析については、オートクリンによる自己増殖の際に、働いているシグナル系の同定、in vivoにおけるcyclophilin A阻害薬、抗CD147中和抗体などの治療効果を解析する予定としている。B細胞の役割の解析については、IL-10産生制御性B細胞の解析を行う予定としている。皮膚科
日本発の防災教育uitemateのASEAN地域を中心とした普及状況調査

平成30年度調査は、第1回目として、平成30年10月26日から10日間、イスラム教徒の多いインドネシアのバリ島、ジャワ島(ジャカルタ)、バタム島の3地域にて調査を行った。第2回目は、平成31年3月4日から7日間、仏教徒の多いタイの数地域にて調査を行った。インドネシア調査のカウンターパートは、インドネシア国家救難庁であり、国家救難庁が小学生や一般市民に行う水辺サバイバル普及教育活動の実態調査のヒヤリングを行った。また、ジャカルタのプールとバタム島の海岸において、背浮きによる水上でのサバイバル技能講習会を行い、同時に、受講者に対し、インドネシアの水辺安全教育実態や水辺安全に関する神等の民俗伝承についてのアンケート調査を行った。タイ調査では、まずバンコク郊外のNAKHON県では、Ratchasima Rajapat University近くのプールにおいて、タイライフセービング協会主催のサバイバルスイミング講習会を視察し、タイ国で普及されている水難サバイバル泳法を視察した。次に、Ratchasima Rajapat Universityカルチャーセンターにおいて、民俗学研究者とタイにおける水神伝承のヒアリングを行った。そして、タイ東部のNAKHONおよびSURIN両県において、複数の幼稚園、小学校、病院を訪問した。タイ国では水難事故防止のために保健省が行政力を発揮しており、幼児・初等教育の場に病院スタッフや仏教団体がボランティア指導員として出入りしている。彼らの行う水辺安全プログラム視察とヒアリング調査、およびアンケート調査を行った。東南アジアで年間30万人以上が、洪水・高潮・津波等の水災害で犠牲になる中で、水害から命を守るの「背浮き」技能の普及のために、「背浮き」泳法指導員の養成活動が、2012年から、スリランカ・タイ・マレーシア・インドネシア・フィリピンで始まった。その背浮き泳法による水辺安全文化と技能の普及実態の追跡調査と、仏教・イスラム教・キリスト教等の相違なる他宗教民族を有する東南アジアの国々で、水神に関わる民俗学的伝承の比較研究を行うことが平成29年度からの3年間の研究である。平成29年度は、キリスト教徒の多いフィリピンと仏教徒の多いスリランカ、平成30年度は、イスラム教徒の多いインドネシアと仏教徒の多いタイでの調査が、水辺安全指導プログラム授業視察と、指導実態や水辺安全に関わる民俗・宗教観についてのヒアリング調査とアンケート調査が、おおよそ予定通り行われた。なお、4か国での調査においては、タイとスリランカでは、現地の指導現場を視察できたが、インドネシアとフィリピンでは、指導現場の視察ができなかった。そして、過去2年間に実施したアンケート調査が分析途中のため、小学校での水泳教育が行われていない東南アジア各国の背浮き教育普及実態と各国の水辺安全と民俗・宗教観について、現段階ではまとめきれていない状況である。早急に2年間のアンケート調査を分析検討と各国のカウンターパートへの補足ヒアリングを通して、各国の水辺安全の普及状況、特に背浮き教育普及実態の概要を確認したいと考えている。3年間研究の最終年度にあたる令和元年は、11月にイスラム教徒の多いマレーシアを視察し、背浮きを含む水辺安全教育の普及実態と水辺安全に関する民俗宗教的文化について、マレー半島のクアラルンプールとボルネオ島北東部のサバ州コタキナバルにて、水辺安全教育授業視察とヒアリング調査とアンケート調査を行う予定である。そして、コタキナバルにて、溺水予防国際ワークショップを開催する。ワークショップでは、過去2年間に訪問したフィリピン・スリランカ・インドネシア・タイにおける背浮き普及状況やそのプログラム内容、水難予防に関する伝承を通した宗教観の比較検討の研究結果をはじめ、水防災の観点から溺水予防教育の現状と課題について、各国の水辺安全普及教育活動のリーダーに発表してもらい、東南アジアにおける水防災教育と溺水予防教育の在り方について総括的に議論する。最終的には、現段階での東南アジア各国における背浮きによる浮いて救助を待つ溺水予防泳法の普及教育状況を把握し、各国で水辺安全教育普及としての背浮きによる溺水予防泳法の普及プログラムを現地のリーダーと相談しながら構築したい。そして、現地の水域環境や教育事情に合わせた、背浮きを中心とした水辺安全教育普及社会教育システムモデルを各国の行政や消防や海難救助隊とも連携して、国家全体で検討できる具体的提言をしていきたいと考えている。平成29年度は、11月上旬にキリスト教徒の多いフィリピンと、3月上旬に仏教徒の多いスリランカにて、背浮きによる溺水予防教育活動(Uitemate)の実態調査を実施した。フィリピン調査は平成29年11月1日9日までフィリピン各地で実施した水難予防教育活動の中で、11月4日の研究発表会において、参加者の溺水予防教育実態と水にまつわる伝説や伝承に関しての質問紙調査を行った。また、11月7日と8日の両日、マニラ近郊の公立小学校3校と私立小学校1校を訪問した。今回の4小学校へのヒアリングの目的は、1各小学校の水泳教育および溺水予防教育現状と、2フィリピンにおける水辺安全のために地域に伝わる妖怪・妖精を含めた民話についてであり、各小学校の校長と教科教員からヒアリングを行った。スリランカ調査は、平成30年3月4日・5日・6日の3日間、コロンボ市内で実施したスリランカ国内における溺水予防教育活動の中で、3月4日(火)にスリランカ西部州にあるコロンボ・マウントラビニア海岸にて、スリランカ各地から集まった男女66人のスリランカライフセービング協会のインストラクターを対象に、溺水予防教育活動実態と水にまつわる伝説や伝承に関しての質問紙調査を行った。現在、フィリピンとスリランカ両国での国内の溺水予防教育実態と水辺安全のために地域に伝わる妖怪・妖精を含めた民話調査について、データを分析中である。

今回の調査結果をもとに、各国の溺水予防教育活動の現状を把握し、それぞれの国の溺水予防教育活動の課題を示し、溺水予防教育活動の更なる普及のための具体的プログラムや普及活動について提言していきたいと考える。また、両国の水辺安全のために地域に伝わる妖怪・妖精を含めた民話調査分析することにより、両国の共通点や相違点を明確にしながら、その民話発生の地域文化思想について検討を加えていこうと考えている。平成29年度の調査国は、当初の計画では仏教徒の多いスリランカとタイでの2カ国での調査を計画していたが、タイの代わりに平成31年度に実施する予定であったキリスト教徒の多いフィリピンと実施年度を変更した。訪問国は一部変更したが、予定通り2カ国で実施することができた。調査は、予定していたそれぞれの国の背浮きによる溺水予防教育(Uitemate)の普及実態を、1カリキュラム内容の見学、2指導員への普及実態質問紙調査、3指導員からの普及教育上の課題や水辺安全に関する民話・伝承についてのヒアリングにより実施することであるが、ほぼ上記3つの方法により調査することができた。平成30年度調査は、第1回目として、平成30年10月26日から10日間、イスラム教徒の多いインドネシアのバリ島、ジャワ島(ジャカルタ)、バタム島の3地域にて調査を行った。第2回目は、平成31年3月4日から7日間、仏教徒の多いタイの数地域にて調査を行った。インドネシア調査のカウンターパートは、インドネシア国家救難庁であり、国家救難庁が小学生や一般市民に行う水辺サバイバル普及教育活動の実態調査のヒヤリングを行った。また、ジャカルタのプールとバタム島の海岸において、背浮きによる水上でのサバイバル技能講習会を行い、同時に、受講者に対し、インドネシアの水辺安全教育実態や水辺安全に関する神等の民俗伝承についてのアンケート調査を行った。タイ調査では、まずバンコク郊外のNAKHON県では、Ratchasima Rajapat University近くのプールにおいて、タイライフセービング協会主催のサバイバルスイミング講習会を視察し、タイ国で普及されている水難サバイバル泳法を視察した。次に、Ratchasima Rajapat Universityカルチャーセンターにおいて、民俗学研究者とタイにおける水神伝承のヒアリングを行った。そして、タイ東部のNAKHONおよびSURIN両県において、複数の幼稚園、小学校、病院を訪問した。タイ国では水難事故防止のために保健省が行政力を発揮しており、幼児・初等教育の場に病院スタッフや仏教団体がボランティア指導員として出入りしている。彼らの行う水辺安全プログラム視察とヒアリング調査、およびアンケート調査を行った。東南アジアで年間30万人以上が、洪水・高潮・津波等の水災害で犠牲になる中で、水害から命を守るの「背浮き」技能の普及のために、「背浮き」泳法指導員の養成活動が、2012年から、スリランカ・タイ・マレーシア・インドネシア・フィリピンで始まった。
糖尿病性腎症の発症・進展におけるエンドセリンおよび一酸化窒素合成酵素の包括的解析

本研究は、糖尿病性腎症をモデルとし、病的状態におけるエンドセリン系と一酸化窒素系との生体内相互作用を遺伝子操作マウスを用いて解明することを目的とする。具体的には、糖尿病性腎症において、(1)腎糸球体内皮細胞由来の過剰なエンドセリンが腎糸球体上皮細胞の機能障害をきたすこと、(2)エンドセリンによる腎糸球体上皮細胞の障害を腎糸球体内皮細胞由来の一酸化窒素が抑制すること、(3)血管内皮細胞の一酸化窒素の発現はエンドセリンによって増強されること、の三点を生体内で証明することである。当該年度では、平成23年度に作製したエンドセリン過剰発現マウス/一酸化窒素合成酵素欠損マウスおよびエンドセリン欠損マウス/一酸化窒素合成酵素過剰発現マウスを用いて、その表現型を解析した。具体的には、糖尿病発症後8週目のマウスを初期糖尿病腎症、同21週目を後期糖尿病腎症として下記項目について解析した。(1)腎バリア機能に関与するポドサイトの形態学的変化について走査型電子顕微鏡を用いて評価すし、ポドサイトの形態維持にエンドセリンと一酸化窒素が相補的に作用していることを示した。(2)腎小体の局所におけるエンドセリン、エンドセリン受容体、一酸化窒素合成酵素などの発現をレーザーマイクロダイセクション法と定量的PCR法を用いて定量評価し、腎小体におけるエンドセリン系と一酸化窒素系の相互作用を示すことができた。現在、上記知見をまとめた論文を作成中であり、国際一流誌に投稿の予定である。当該年度は上記研究を実行するための予備的研究を遂行した。さらにこれらのマウスに対しストレプトゾトシンを用いて糖尿病を誘発するために、薬物用量設定および投与期間を最適化した。また、腎障害の指標を少量の尿および血液検体から同定するために質量分析を用いた測定系を確立した。最後に腎の形態学的検索を行うための検疫組織染色の条件を検討し、最適化した。これらの成果に伴い、次年度は上記で確立した遺伝子改変マウスの解析に着手する予定である。当該年度においては糖尿病発症後8週目のマウスを初期糖尿病腎症、同21週目を後期糖尿病腎症として、それぞれの時点で尿中のアルブミン、血中クレアチニンを測定し腎機能障害の指標とした。酸化ストレスの指標として、活性酸素種を測定した。病理組織学的手法を用いて線維化(Sirius Red染色)、糸球体硬化(PAS染色)をスコア化し形態学的障害の評価を行った。その結果、エンドセリン過剰発現(ET-1-Tg)マウスと一酸化窒素合成酵素欠損(eNOS KO)マウスを交配したマウスでは腎臓における機能的および形態的異常がエンドセリン欠損(veET-1 KO)マウスと一酸化窒素過剰発現(eNOS-Tg)マウスを交配したマウスに比べ著明であることが明らかとなった。今後は、エ:ンドセリン系と一酸化窒素系の相互作用を確認する目的で、腎臓におけるエンドセリン濃度をEIA法で、一酸化窒素代謝物の濃度をHPLCで測定する。またエンドセリン受容体、エンドセリン変換酵素、一酸化窒素合成酵素の蛋白量を免疫プロッティング法を用いて定量化する。以上の成果は、エンドセリンを介した慢性腎臓病に対する新たな治療戦略の確立に貢献することが期待される。

(1)腎バリア機能に関与するポドサイトの形態学的変化について走査型電子顕微鏡を用いて評価すし、ポドサイトの形態維持にエンドセリンと一酸化窒素が相補的に作用していることを示した。(2)腎小体の局所におけるエンドセリン、エンドセリン受容体、一酸化窒素合成酵素などの発現をレーザーマイクロダイセクション法と定量的PCR法を用いて定量評価し、腎小体におけるエンドセリン系と一酸化窒素系の相互作用を示すことができた。現在、上記知見をまとめた論文を作成中であり、国際一流誌に投稿の予定である。遺伝子改変マウスの系統樹立および時間を要する糖尿病モデル作成もほぼ終了し検体の採取は終了している。それらの検体の解析系は予備実験で確立しており、当初の予定通りで研究は進展している。研究計画に変更等はなく、採取した検体の解析結果からエンドセリン系と一酸化窒素合成系の相互作用を明らかにする予定である。
温熱療法時における腫瘍内微細温度分布の有限要素法を用いた推定

マイクロウェーブによる外部加温において、平衡状態が実現している腫瘍での腫瘍血管およびその周囲の温度分布を有限要素法を用いて検討した。(方法)腫瘍血管モデルとして、M.W.Dewhirstらの文献から、腫瘍血管の平均の直径を50μ、腫瘍血管の間の平均距離を300μとした。血管は同一方向に走行しているとし、血管を♯の交点に配列するモデルを考えた。腫瘍の熱的モデルとしては、各血管を結んだ直線の中点で最高温度となるものを考えた。今回、有限要素法は二次元で解析した。有限要素法による解析では、一つの腫瘍血管に注目し、その血管周囲の最高温度点を連ねた線で囲まれた領域での熱伝導問題として扱った。節点数452、要素数808、境界条件としては、腫瘍血管内壁を37°C、領域の辺縁を43°Cとした。(結果)腫瘍血管を中心とした、ほぼ同心円状の等温度曲線が得られた。温度勾配は腫瘍血管に近付くほど急峻となっており、領域辺縁部での温度勾配は0.03°C/μ、腫瘍血管では0.10°C/μであった。仮に腫瘍血管壁の厚さを10μとすると、この腫瘍血管モデルでは、腫瘍内の最高温度が43°Cのときに、腫瘍血管細胞の温度は3738°Cということになる。(考察)腫瘍血管の温度がセンサー表示温度よりも低いことが、腫瘍血管に対する温熱効果の減少となり、温熱療法が予期したほどの効果をあげていない原因である可能性が示唆された。1.有限要素法を用いて、腫瘍血管および血管周囲の微細な温度分布の推定を試みた。血管サイズ、血流量、電磁波で発生する熱量などの各種パラメータを変化させた時の、血管および血管周囲の温度分布を、有限要素法で解析した。本研究の中心テーマである腫瘍内微細温度分布の推定の中でも最も基本となる「血管壁およびその周囲組織」の温度分布は各種パラメータを設定することにより可能であった。2.温度分布を考察する領域を単一の血管から複数の血管を含む領域に拡大する場合、「血管構築」というパラメータを導入する必要があるが、「血管構築」に関しては自由度がありすぎ、実際の腫瘍血管の情報によりパラメータの設定範囲を限定しなければ意味のある温度分布の推定が困難と考えられた。腫瘍内血管モデルを検討するにあたって当初「病理学的知見」と「臨床で得られた腫瘍内温度分布」の利用を考えていたが、病理学的知見には腫瘍全体をカバーするような巨視的な知見が少なく、臨床で得られる腫瘍内温度分布もかなり大まかである。もっと別の情報も必要と考えられる。現在血管造影により得られる情報が利用できないか検討中である。3.平成7年度の研究計画であるが、前述の腫瘍内血管モデルを検討する他、腫瘍内全体の温度分布の推定を試みる予定である。特に従来考慮されていなかった「血流温の腫瘍内での変化」をパラメータとして入れることにより、さらに厳密な温度分布の推定を行う。さらに臨床上で問題となるパラメータ、たとえば「腫瘍に流入する動脈血温度」、「体表面からの冷却」、「近傍を通る大血管による冷却」、「necrosisの形成」などを考慮した場合の温度分布を検討する。その結果、マイクロウェーブによる温熱療法において定常状態に達した腫瘍内毛細血管壁の温度と、血管周囲組織の温度には、温熱療法上無視できない温度差の存在が確認された。2.当初、温度分布を考察する領域を単一の血管から複数の血管を含む領域に拡大する計画であった。

そのためには「血管構築」というパラメータを導入する必要があるが、「血管構築」に関しては自由度がありすぎ、実際の腫瘍血管の情報によりパラメータの設定範囲を限定しなければ意味のある温度分布の推定が困難と考えられた。腫瘍内血管モデルを検討するにあたって当初「病理学的知見」と「臨床で得られた腫瘍内温度分布」の利用を考えていたが、病理学的知見には腫瘍全体をカバーするような巨視的な知見が少なく、臨床で得られる腫瘍内温度分布もかなり大まかであった。そのため、拡大した領域での温度分布の解析に関しては十分な結果が得られることができなかった。
腸内で共生または排除が誘導される細菌による腸管免疫系応答と遺伝子発現の解析

腸管には膨大な数の腸内共生菌が生息する一方で、有害な病原微生物の排除を行う免疫グロブリンA(IgA)産生が調節されている。本研究は,マウスの腸内共生菌の優性菌であるBacteroidesとLactobacillusに注目し、IgA産生がどのように調節されているのかを細胞分子生物学的な手法によって解析した。その結果、BacteroidesがIgA産生細胞への分化を強く誘導する機構が明らかになった。腸内共生細菌の腸管免疫系応答に与える影響を解析する目的で,マウス腸内細菌の優勢菌であるBacteroidesまたはLactobacillus,さらに無菌(GF)および通常(CV)マウスを用いて腸内細菌を直接制御する系にて免疫反応に与える影響を比較した.GFおよび通常CVマウスの腸管粘膜組織中に分泌された総IgA量を測定したところ,CVマウスの方がGFマウスに比べてIgA産生が顕著に高かった.このとき,粘膜固有層(LP)におけるIgA産生細胞,IgA前駆細胞の割合を解析したところ,GFマウスの大腸では粘膜組織中のIgA産生量,IgA産生細胞,IgA前駆細胞がほとんど誘導されなかった.つまり,このことは腸内共生細菌が大腸部位のIgA産生応答に対して重要な役割を果たしていることを示している.そこで次に,GFマウス由来LPのIgM陽性細胞を精製し,BacteroidesまたはLactobacillusと共培養することによって,IgA産生の誘導を行う実験をしたところ,BacteroidesはLactobacillusに比べて有意に高いIgA産生がみられた.また,CVマウス由来小腸パイエル板細胞をBacteroidesまたはLactobacillusと共培養した際にも,IgA産生を強く誘導したのはBacteroidesであった.このとき,BacteroidesはIgAへのクラススイッチを誘導する作用がLactobacillusに比べて高い可能性が考えられ,腸内細菌によってIgA産生応答に対する影響が異なることが明らかになった.さらに,BacteroidesまたはLactobacillusを定着させたノトバイオートマウスを用いたin vivoでのIgA産生の誘導に関与する分子や遺伝子発現を解析中である.各種感染症に対する防御に重要な腸管粘膜免疫系の応答を腸内共生菌によって制御することをめざした.我々は,腸内細菌の存在しない無菌マウスと通常マウスとの比較研究から,腸内細菌の存在が感染防御に重要な免疫グロブリンA(IgA)産生応答を誘導し,特に腸内共生菌の中でもBacteroidesが, Lactobacillusに比べて顕著にIgA産生応答を惹起させていることを明らかにした.この反応は特にBacteroidesによる刺激が大腸部位の杯中心の形成を誘導し, IgA形質細胞の分化を誘導することをノトバイオートマウスの実験より明らかにした.さらに,小腸パイエル板細胞のin vitro培養系によって, IgMからIgAへのクラススイッチに重要なActivation-induced cytidine deaminase (AID)のmRNA発現を高める作用がBacteroidesが顕著に誘導したことから,腸内共生菌のBacteroidesがAIDを活性化させて腸管のIgA産生の誘導に強く関わっていることが示唆された.また,卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞受容体トランスジェニックマウスを無菌化し,この無菌マウス(GF)と通常マウス(CV)とでOVAを経口摂取したときのOVA特異的T細胞応答に与える影響を細胞分子レベルで解析した.CV, GFとも卵白摂取により腸間膜リンパ節CD4^+細胞によるIL-2産生量が低下したが, GFの方がCVより有意に高産生であった.さらにこのCTLA-4^+CD4^+細胞の割合はGFの方がCVに比べて低くかった.また,卵白摂取によってGFはCVに比べて血中OVA特異的抗体価(IgGl, IgG2a),総IgEの上昇する傾向がみられた。以上より,腸内共生菌が腸管免疫系T細胞の食品抗原に対する低応答化を促進し,全身性の抗原特異的抗体応答の抑制にも関与することが示唆された.
DISC1とNRG1/ErbBシグナル伝達

統合失調症は多くの遺伝因子が報告されているが、DISC1とNeuregulin-1はそのリスク遺伝子として知られている。これらの分子は分子間相互作用し、脳内神経細胞において密接に重要な機能を有していると考えられる。本研究では、DISC1がNeuregulin-1分子のゴルジ体を起点とする細胞内輸送に関与し、適切なNeuregulin-1分泌過程の重要な調節の部分に寄与していることを、DISC1ノックアウトマウスの利用によって証明した。前駆体型Neuregulin-1の適切なプロセッシングの調節機構は、下流のシグナル伝達に強い影響を与えるために非常に厳密に制御されていると考えられているが、その前段階であるゴルジ体から細胞膜までの輸送制御についてはほとんど調べられていない。Neuregulin-1は発現量が非常に低く、さらに多種多様なアイソフォームが存在するために、その正確な分泌量を測定する系は存在していなかった。本研究では、細胞内局在と分泌量が同時に検出できるように、Neuregulin-1遺伝子の細胞外領域と細胞内領域の両方にV5タグ配列を挿入したプラスミドベクターを作製し、培養神経細胞に導入する。今年度はこのプラスミドベクターが完成し、その発現を確認した。しかし、野生型とDISC1変異型の神経細胞で、V5-Neuregulinの発現による分泌量を比較したが、有意な結果は得られなかった。そこで、Neureulin-1はゴルジ体を起点に細胞内輸送、分泌のプロセスを辿るため、遺伝子の上流にFM4ドメインを融合させたプラスミドベクターの改良版を作成した。この改良版によるV5-Neuregulin1の発現はShield-1化合物の添加により、FM4ドメインが小胞体およびゴルジ体膜より解離した。つまり、V5-Neruegulin-1の分泌制御をコントロールすることが出来た。この系を用いることにより、Neuregulin-1の分泌制御の定量的な測定が可能になり、DISC1ノックアウトマウス由来の神経細胞でその分泌量が減少していた。HA-Neuregulin-1トランスジェニックマウスを使用したDISC1のin vivo機能解析Neuregulin-1は神経系組織などで発現するEGF様成長因子であり、その分泌量の適切な制御は脳機能が正常に機能するためには必要不可欠なことである。Neuregulin-1は前駆体型で産生され、ゴルジ体から細胞膜までDISC1分子の制御下で輸送され、プロセシングを受け分子内切断されると、成熟型Neuregulin-1が細胞外へと分泌される。そのようにして放出された成熟型Neuregulin-1はリガンドとして、EGFR/ErbB受容体に結合し、下流のシグナルを活性化することが知られており、その一連の制御に乱れ、シグナル伝達型が生じることがシナプスの機能を低下させ、統合失調症などさまざまな精神神経疾患の遠因となっていると考えられている。このような仮説のもと、DISC1ノックアウトモデルマウスにおいて、内在性Neuregulin-1の分泌量の解析を試みた。しかし、Neuregulin-1は膜貫通型分泌性因子であり、発現量も非常に少ない。そのため、正確な細胞外への分泌量を定量することは、非常に困難であった。本研究では、DISC1がNeuregulin-1の分泌量を制御する分子メカニズムを明らかにし、その分泌量を正確に測定するため、性格の異なる二種類の変異マウスを準備した。共同研究者のLin Mei博士より、細胞外領域のEGFドメインの上流にHAタグ配列を挿入し、神経細胞特異的に発現するNeuregulin-1 TGマウスの供与を受け、交配を繰り返し、DISC1およびHA-NRG1マウスのダブルホモマウスを得ることに成功した。このマウス由来の大脳組織切片および培養海馬神経細胞よりNeuregulin-1の分泌を調べたところ、DISC1ノックアウトマウスにおいていずれもその分泌量が減少していることを明らかにした。H27年度はそのDISC1によるNeuregulin-1分泌の制御機構について、更なる分子細胞生物学的解析および組織学的解析を行う予定である。前駆体型ニューレグリン1(NRG1)の適切なプロセッシング調節機構は、ErbB受容体を介した下流のシグナル伝達に生理的な強い影響を与え、非常に厳密に制御されている。しかし、そのプロセッシングまでの過程について、つまり、ゴルジ体から細胞膜までのエキソサイトーシス制御についてはほとんど明らかになっていない。本研究では、ニューレグリン1のその正確な分泌量を測定する系を開発し、細胞内局在と分泌量を同時に検出することが可能となる、ニューレグリン1遺伝子の細胞外領域と細胞内領域の両方にV5エピトープタグ配列を挿入したプラスミドベクターを作製し、培養神経細胞に導入した。平成26年度までに、このプラスミドベクターが神経細胞において機能することを確認できた。しかし、野生型とDISC1変異型の神経細胞において、V5-ニューレグリン1の発現による分泌量を比較したが、有意な結果は得られなかった。最終年度となる平成27年度は、ニューレグリン1前駆体のエキソサイトーシス経路を可視化するために、ニューレグリン1遺伝子の上流にFM4ドメインを融合させたプラスミドベクターの改良版を作製した。この改良版によるV5-ニューレグリン1の発現はシールド1化合物の添加により、FM4ドメインが小胞体およびゴルジ体膜より解離した。つまり、V5-ニューレグリン1の分泌制御を人為的にコントロールすることが出来た。この系を用いることにより、ニューレグリン1の分泌制御の定量的な測定が可能になり、DISC1ノックアウトマウス由来の神経細胞でその分泌量が減少していたことを明らかにした。