hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の家族介護に影響する諸要因とサービスの最適提供に関する研究

(2)家族介護の質が不十分な項目は、(1)便所における配慮・改造、(2)浴室における配慮・改造、(3)家の中での移動のための配慮・改造、(4)自立促進をはかるための努力、(5)障害高齢者の社会的交流・活動のニーズ充足、(6)痴呆性高齢者の問題行動への適切な対処、であった。(3)家族介護の質の現況と有意な相関のある変数は、主介護者のバーンナウト、対処スタイル、介護をめぐる家族関係の強度、主介護者の介護知識であった。以上の結果を踏まえて、サービスの最適提供の在り方に関して今後検討する。1.研究目的平成7年度の課題は、家族介護の3要素(1.介護の源泉としての家族介護力、2.介護の主観的な結果としての介護者の負担感・不安感)、3.介護の客観的結果としての介護者の健康度、生活時間、所得・支出)およびサービス提供状況を考慮に入れた上で、家族介護と公的サービスの社会的に妥当ないくつかの組み合わせパターンを主として事例分析等を通して検討することである。2.研究方法このための事例調査を、東京都S区の24時間巡回型ホームヘルプサービス利用の20世帯を対象に行った。この事例調査を通してのより具体的な分析の課題は、全国的に新しく導入され始めている巡回型ホームヘルプサービスが、高齢者の家族介護にどのような影響を及ぼし、その結果他の在宅サービスも含めた公的サービスのパッケージと家族介護との組み合わせがどの程度社会的に妥当なパターンを形成しているかを検討することである。サービスの影響を把握するために、サービスの開始前の平成7年7月と約3ヶ月後の10月の2回にわたって訪問面接法による調査を行った。回答者は主介護者である。3.研究結果(1)巡回型ホームヘルプサービスに特定できる影響は、(1)介護時間の減少、(2)主介護者、高齢者双方の安心感の増大、(3)高齢者の情緒的安定といった側面に認められた。(2)他方で、(1)主介護者の身体的・精神的・社会的負担感の軽減、(2)主介護者の生活時間の活性化、(3)家族介護の質という面では、巡回型だけではむしろ適切な在宅サービス・パッケージ全体による影響が認められた。(3)最終的な研究目的としている、家族介護と公的サービスの社会的に妥当ないくつかの組み合わせパターンの析出に関しては、欧米に比べて子ども世代の家族による同居介護がまだ一般的な日本の現状でのサービスの介入の困難さが改めて浮き彫りになり、この報告の時点ではまだ結論的な結果を得ていない。今後、専門家会議での議論等と通して分析を進める予定である。
理科実験・観察における情報処理能力に関する研究

本研究は児童・生徒及び大学生のもつ過去の理科の実験・観察に対するエピソードなどを調査・分析することにより,実験・観察における子どもの情報処理能力の向上をはかるための研究を行った。大学生及び児童・生徒合計750名の過去の理科実験・観察に関するエピソード記憶を分析した結果,以下のような点が明らかになった。(1)小学校の理科実験の記憶は中・高・大学生ともに,数多く保持されていることが分かった。小学生がよく記憶して楽しいといった実験は大学生でも同様の傾向がみられた。(2)すべての校種において否定的エピソードよりも肯定的エピソードを持つものが多いことが分かった。(3)高校・大学生では,特に化学分野に関する実験などをよく記憶しており,また,否定的エピソードを持つ実験・観察に,薬品を用いたものや生物の解剖を挙げている。(4)中学校・高等学校では理科の成績と肯定的エピソードに弱い相関関係がみられた。また,小・中学校で理科嫌いと肯定的エピソードの間に負の相関がみられた。特に小学校段階の理科学習での理科の実験・観察に関するエピソードが後の理科学習への態度形成に大きな影響を及ぼしていると考えられる。否定的なエピソードの記憶は,肯定的なエピソードを持たせてくれる経験に対して,後込みさせてしまうことにもつながる。理科学習の実験・観察の指導にあたって,肯定的エピソードが得られるような工夫をする事が望ましいと考えられる。理科の目標である自然に対する知識・理解すなわち概念形成はもちろんであるが,感情に訴えるような指導法・良い記憶に残る実験・観察,楽しい雰囲気の理科授業というようなことも留意する必要がある。今後の課題としてさらに具体的・実践的な方法を探る必要がある。
公開鍵基盤(PKI)と話者照合技術の融合に関する研究

本研究では,公開鍵基盤(PKI)を利用した認証の利便性・信頼性を高める方法として,音声による個人認証(話者照合)をPKIと融合する技術についての検討を行う.この技術を確立するためには,特に,話者照合の耐雑音性を向上させることが重要である.昨年度,特徴量ベクトルの各次元を独立のストリームとみなし,雑音によって信頼度の低下した次元の重みを小さくすることで耐雑音性の向上をはかる,マルチストリーム型の話者照合について,各次元の信頼度重みを線形判別分析(LDA)で推定する認証手法の提案を行った.本年度は,この手法の実用性に関する種々の検討を行い,重みの教師なし推定と,雑音種を未知とした場合のマルチコンディション推定について,手法の提案と性能評価を行った.その結果,双方の手法とも耐雑音性の向上が確認され,特に後者の性能が実用上の観点から優れていることが分かった.また,昨年度実験室環境で収集した男性話者20名による,2ケ月に渡る連続数字発声データを利用し,話者照合とPKI認証を融合したリモートマシンへのセキュアログインシステムのプロトタイプを構築した.構築システムでは,ユーザがパスフレーズを入力する代わりに,音声による認証を行うことでリモートシステムにアクセスすることができる.収録データを用いて,1発声に対するベースラインの照合性能の評価を行った結果,本人棄却誤り率1. 5%のときに詐称者受理誤り率は約0. 3%となった.したがって,1回のログインに対して3回のキーワード発声を検証するシステムとすることで,本人棄却誤りを約4%,詐称者受理誤りを約1億分の3とすることが可能であり,実用的なシステムの構築が可能であることが示された.本研究では,携帯電話のような小型機器を入力デバイスとして想定した場合の,公開鍵基盤(PKI)を利用した認証の信頼性を高める方法として,音声による個人認証(話者照合)をPKIと融合する技術についての検討を行う.この技術を確立するためには,話者照合の実用性を高める必要があり,特に,話者照合の耐雑音性を向上させることが重要である.そこで本年度は,単一の音響特徴量のみでなく,他の複数の特徴量を組み合わせることで耐雑音性の向上をはかるマルチストリーム型の話者照合方式についての検討を行った.これまでに,音声に含まれるケプストラム特徴量と基本周波数特徴量を2つのストリームとみなし,マルチストリームHMMを利用して融合した,雑音に頑健な話者照合手法を提案している.そこで,この手法において,想定される種々の雑音環境に対し,最適なストリーム重みと照合閾値を,線形判別分析とAdaboostを利用して自動的に推定する手法の提案を行った.評価実験は,男性話者36名が一ヶ月ごと5時期に渡って発声した4桁連続数字を用いて行った.白色雑音が様々なSN比で音声に重畳した場合を想定して,ストリーム重みと,閾値の自動推定を行ったところ,提案手法によって人手によって定めた最適値に近い数値が得られることが確認された.具体例な結果としては,「本人棄却率=詐称者受理率」という等誤り率を目標として自動最適化を行った場合に,SN比20dBにおいて本人棄却率3.4%,詐称者受理率3.7%を得た.ケプストラム特徴量のみを用いた場合の等誤り率が4.9%であり,人手によって最適化した場合の等誤り率が3.4%であることから,提案手法によってストリーム重みと閾値の最適化が行われたことがわかった.本研究では,公開鍵基盤(PKI)を利用した認証の信頼性を高める方法として,音声による個人認証(話者照合)をPKIと融合する技術についての検討を行う.この技術を確立するためには,特に,話者照合の耐雑音性を向上させることが重要である.その手法として,複数の特徴量を適当な重みで組み合わせることで耐雑音性の向上を図るマルチストリーム型の話者照合方式について研究を行っている.昨年度は,音声に含まれるケプストラム特徴量と基本周波数特徴量との組み合わせについて検討を行った.本年度は,さらなる発展として,特徴量ベクトルの各次元を独立のストリームとみなし,雑音によって信頼度の低下した次元の重みを小さくすることで耐雑音性の向上をはかる,マルチストリーム型の話者照合について検討を行った.次元ごとの信頼度重みの推定には,音声認識の耐雑音性の向上のために提案を行った,線形判別分析(LDA)に基づく重み推定手法を利用した.評価実験には,男性話者36名が一ヶ月ごと5時期に渡って発声した4桁連続数字を用いた.評価用データにエレベータホール・走行車内・列車内雑音などを,様々なSN比で重畳し,手法を評価したところ,全ての雑音種の15,20dBにおいて誤り率の低減が観測され,手法の有効性が示された.また,PKI基盤などの実用に耐える高精度な話者認識技術を確立するためには,できるだけ多人数の,また,多時期で収録した音声データが必要であると考えるが,現状では十分なデータがなく,研究の進展が困難である.そこで本年度は,実システムの利用を想定し,音声データの追加収録を行った.具体的には,使用者が二ヶ月間,毎日,計算機システムにログインするために話者照合を利用することを想定し,数字発声の収録を行った.その結果,男性話者20名による,総発声数約7000,約400MBのデータが構築された.本研究では,公開鍵基盤(PKI)を利用した認証の利便性・信頼性を高める方法として,音声による個人認証(話者照合)をPKIと融合する技術についての検討を行う.

この技術を確立するためには,特に,話者照合の耐雑音性を向上させることが重要である.昨年度,特徴量ベクトルの各次元を独立のストリームとみなし,雑音によって信頼度の低下した次元の重みを小さくすることで耐雑音性の向上をはかる,マルチストリーム型の話者照合について,各次元の信頼度重みを線形判別分析(LDA)で推定する認証手法の提案を行った.本年度は,この手法の実用性に関する種々の検討を行い,重みの教師なし推定と,雑音種を未知とした場合のマルチコンディション推定について,手法の提案と性能評価を行った.その結果,双方の手法とも耐雑音性の向上が確認され,特に後者の性能が実用上の観点から優れていることが分かった.また,昨年度実験室環境で収集した男性話者20名による,2ケ月に渡る連続数字発声データを利用し,話者照合とPKI認証を融合したリモートマシンへのセキュアログインシステムのプロトタイプを構築した.構築システムでは,ユーザがパスフレーズを入力する代わりに,音声による認証を行うことでリモートシステムにアクセスすることができる.収録データを用いて,1発声に対するベースラインの照合性能の評価を行った結果,本人棄却誤り率1. 5%のときに詐称者受理誤り率は約0. 3%となった.したがって,1回のログインに対して3回のキーワード発声を検証するシステムとすることで,本人棄却誤りを約4%,詐称者受理誤りを約1億分の3とすることが可能であり,実用的なシステムの構築が可能であることが示された.
高精度洪水流量観測法と観測から得られる河道貯留量を考慮した高水計画の研究

洪水流量ハイドログラフ(時間-流量曲線)は、河川計画の基本となる量である。分流点や、合流点を含む河道の洪水流量のハイドログラフを高精度で求める方法は、今のところ存在しない。このため、河道の分流計画や、合流計画を、洪水流の水理現象を考慮に入れて合理的に立てることは、いまのところ困難な状況にあり、このため、分・合流点が、河道のネック部となっている河川は多い。著者らは、平成16年度までに、観測された洪水流の水面形の時間変化を解として、非定常二次元浅水流解析によって、江戸川の流量ハイドログラフを任意地点で、かつ高精度で求めることを可能にした。本年度は、この方法を改良、一般化し、以下の二つの課題を解明した。第一は、利根川とその支川渡良瀬川の合流点(132km)を含む本川、支川区間の流量ハイドログラフ、及び利根川とその派川江戸川の分流点(121km)を含む本川、派川区間の流量ハイドログラフを高精度で求める方法を確立し、現地観測データでその有効性を確認した。第二は、この方法を堤防が決壊し、破堤氾濫が起こっている時の氾濫流量ハイドログラフを算定できるように拡張した。この算定法を、常願寺川の河川敷に作った大型実験水路において発生させた破堤氾濫時の実測流量ハイドログラフと、水路内の水面形の時間変化を用いて非定常二次元解析から求めた氾濫流量ハイドログラフの計算値とほぼ一致することを示し、氾濫流量の時間分布と氾濫量が高い精度で求めることを可能にした。これらの成果は、河川管理上、学術上、技術上、非常に重要な貢献を与えるものである。(1)綿密な水面形観測に非定常二次元流解析を併用することで、洪水流量ハイドログラフを高精度に推算することが可能である。このためには、水位観測を時空間的に密に行うことが重要である.観測流量も必要であるが、洪水ピーク付近を含んだ12時間毎の観測流量と洪水初期下降期の上下流端における水位ハイドログラフが得られていれば、観測水面形の連続条件を満たすように非定常二次元流解析を行うことで、時間的に連続的な流量ハイドログラフを高精度に推定し、河道内における貯留量の変化や、ピーク流量の変化量を見積もることができる。(2)流量ハイドログラフの非定常性が強い円山川では、流量ハイドログラフの大きな変形と3%のピーク流量逓減が確認された。数kmという短い区間に対する流量の逓減量はピーク流量に対して数%のオーダーであるため、流量が1%以下のオーダーの精度で正しく観測されていなければ観測流量の差から貯留量を見積もることは困難である。しかし、本研究で示した様に水面形の時間変化を追跡することで貯留量を高精度に見積もることが可能である。(3)高精度洪水流量ハイドログラフと貯留量を得るのに必要な水位測定の縦断間隔は,通常の緩流河川では(23)kmであることを示した.(4)洪水流の河道内における貯留量、ピーク流量逓減は観測区間に流入してくる洪水ハイドログラフの特性(非定常性、ピーク流量)と河道特性(平面形、横断形、高水敷の粗度等)によって異なる。治水計画において、どのような洪水ハイドログラフを計画洪水に選定するかによって、河道内貯留量の持つ重要性が異なる。そのために、江戸川や円山川の出現洪水について、流域における雨の時空間分布と洪水ハイドログラフの関係をよく調べ、これによって、計画に用いるハイドログラフはどのようなものであるべきかを検討することができる。
ヤマトシジミへの木粉給餌と軟体部の増加

ヤマトシジミは、セルロースの摂餌・分解・同化という森林におけるシロアリに相当するような「分解者」の役割を有していることが明らかにされている。また、ミミズもセルラーゼを持っていることが知られている。そこで、木材を粉体にし、ヤマトシジミおよびミミズが餌として利用できないかを目的とした。ヤマトシジミの糞を観察したところ、消化管を通って肛門よりでてきたと判断することができた。一方、シマミミズの糞の化学分析結果を行なったところ、与えた餌の木粉よりも、糞の方がホロセルロース量が少なく、リグニン量が多いことがわかった。つまり、シマミミズも木粉のセルロースを食していると考えられる。ヤマトシジミを青森県十三湖の漁協から購入した。春先は産卵のため体力が低下しているとのことで、秋季に、成長を見るために、小さめのものを購入した。数は数えていないが、200匹ほどと思われる。スギ材を水とともにボールミルにより数十μmに粉砕し、ヤマトシジミに給餌した。また、木材には窒素がほとんどないため、稲藁を木材と同様にボールミルで粉砕したものを木粉に混ぜたものも使用した。さらに、二枚貝用の飼料として市販されているM-1も使用した。入水管から入れ、出水管から出しているかどうかを観察するために、ガラスの水槽で各10匹ほど飼育した。水槽以外で飼育するヤマトシジミは、出来るだけ独立性を高めるため、浄化装置処理水を直接小分水槽に給水しするフローとし、小分水槽を入れた200L水槽の飼育水を給水し、排水も同じ200L水槽にし、200L水槽の飼育水を浄化装置で常時浄化するシステムとした。飼育水は、市販の人工海水塩およびイオン交換水を用いて約5psu(1psu=0.1%)に調整したものを用いた。1週間に一度、飼育水を交換し、浄化に勤めた。木粉を給餌後、ヤマトシジミを観察し、出水管より木粉を出しているところを観察することができた。また、出水管より出したものを顕微鏡で観察し、糞であることを確認した。これより、ヤマトシジミは木粉を身体の中に入れ、糞として出していることが確実であることが分った。しかし、木粉が栄養になっているかどうかは分らない。まずは、ヤマトシジミを水槽に慣らすことが必要であり、これは達成できたと考えられる。栄養としているかどうかは、次年度に明らかにする予定である。閉鎖型の循環浄化システムを用いて、シジミを飼育した。資料より、秋期にヤマトシジミの軟体部が大きく増加した10ー11月の水温が20°Cであったことから、実験水温を20°Cとし、20°Cに設定した部屋に水槽を設置した。約1ヵ月慣れさせた後、飼育実験に用いた。その後、木粉、稲ワラ+木粉、二枚貝用飼料を与えた。セルロースが分解されるのにどれほどの時間を有するか分からないので、15ヵ月間与えた。シジミが木粉を食したかどうかの判別は、次のようにして行なった。糞(真糞)と擬糞の判断は比較的容易で、細かい粒子が棒状に集まって、ある程度の密度をほぼ均等に保っているもの、これらは消化管を通って肛門よりでてきた「糞(真糞)」である。一方、不定形で密度ムラが著しいものは擬糞である。その他の細かい粒は、糞なのかどうか?よく分からない。ばらばらで固められていないのであれば擬糞とした方が良いと考えられる。ただし、真糞も時間をおくとばらばらになるので、排出直後の観察が必要である。糞と思われるものを随時写真に撮り、以上の判断を行なうことにより、木粉を食していると判断できる。しかし、徐々に死んでいくことも分かった。この理由として、木材には窒素がほとんどないことがあげられる。生物が生きていくためには、糖質だけでなく、タンパク質が必要である。タンパク質のもとになるアミノ酸を合成するためには、窒素がなければならない。この意味で、窒素のない木材は、食料として考えた場合、最大の欠点と考えられる。林産学まず、ヤマトシジミが木粉を身体の中に入れるかどうかを、観察により明らかにすることが第一番目の目標であり、このことは実際に観察できたこと、また、出水管より出しているのが糞であることを確かめているので、当初の目標は達成できたと考える。

また、実際に木粉を栄養としているかどうかを、ヤマトシジミの殻表面に番号を記すことにより個体識別をし、実験開始前に個体湿重量(g)を電子天秤で0.01gの精度で測定し、殻長、殻高、殻幅をノギスで0.01mmの精度で測定することによって、確かめる予定であったが、研究実績の概要で書いたが、春先にはヤマトシジミが弱ってしまうことから、秋季に購入したため、飼育水槽に慣らすのが精一杯で、個体重量や大きさを測定することができなかった。飼育手法は確立できたと考えられるので、ヤマトシジミの殻表面に番号を記すことにより個体識別をし、実験開始前に個体湿重量(g)を電子天秤で0.01gの精度で測定し、殻長、殻高、殻幅をノギスで0.01mmの精度で測定することによって、栄養としているかどうかを確かめる。また、実験終了時に、50°Cで2日以上乾燥させることにより、軟体部乾燥重量を求め、最終的には、ヤマトシジミの安定同位体比質量分析を行なうことにより、その値が、陸起源有機物に近ければ、餌として分解していることを確かめる。当初、春先にヤマトシジミを購入する予定であったが、シジミの専門家より、春先は産卵のため体力が低下しており、秋季の方がいいというアドバイスをいただいたため、ヤマトシジミの購入が秋季となってしまった。そのため、飼育の補助をしてもらうアルバイトを雇う機関が短くなってしまい、使用額が異なってしまった。生き物は、専門に観察する人が必要であり、2014年4月から2015年2月まで、フルに嘱託で人を雇い、ヤマトシジミの観察を行なってもらう予定である。
新規顎関節OAモデルと滑膜由来未分化間葉系幹細胞を用いた軟骨再生治療法の確立

本研究では、外科処置を必要としない新規の顎関節OAモデルである、ヨード酢酸(Iodoacetic Acid Mono: IAM)誘発ラット顎関節OAモデルを作製し、これと滑膜由来間葉系幹細胞(滑膜由来MSC)を用いた下顎頭軟骨の再生法について検討することを目的とした。平成25年度では滑膜由来MSCの軟骨分化におけるSZP(Superficial zone protein)発現の解析、および、コラーゲン-ヒアルロン酸混合ゲルを用いた滑膜由来MSCの軟骨分化誘導についての検討、さらに、ラットIAM顎関節OAモデルの作製を行う計画であった。上記の計画に沿って、まず滑膜由来MSCの軟骨分化におけるSZP発現について検討を行った。滑膜由来MSCの軟骨分化を行うには、ペレット培養(三次元培養)が必要であり、その手技は困難を極めた。培養途中で壊死するものも多く、培養に用いる試薬に関して再検討を行う必要があった。改善を加えて検討を行い、比較的安定した分化誘導が認められるようになったところである。
細胞外ATPによる内耳前庭神経節細胞の細胞内カルシウムイオン動態に関する研究

モルモットの前庭神経節細胞を生きたまま単離し、ATP刺激時の細胞内Ca^<2+>動態を検討した。抗ニューロフィラメント抗体(NF200)を用いて単離した前庭神経節細胞を同定した。単離した前庭神経節細胞をATP刺激したところ、濃度依存的に細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が観察された。細胞外Ca^<2+>-freeの状態においてもATP刺激にて細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を認めた。これらのことから、ATP刺激による細胞内Ca^<2+>濃度上昇は外部動員および内部動員の両者に依存するものと考えられた。次にATPの受容体であるP_2-purinergic receptorの拮抗剤であるReactive blue2、Suraminそれぞれの存在下では、ATPによる細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は両者共に濃度依存的に抑制された。P_1-purinergic receptorに親和性を有するAdenosine刺激では、細胞内Ca^<2+>濃度の変化は認められなかった。これらのことから、モルモット前庭神経節細胞にP_1ではなくP_2-purinergic receptorが存在し、ATP刺激による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇機構はP_2-purinerric receptorを介したものであることが示唆された。また陽イオン透過性カルシウムチャネルのblockerであるLaCl_3の存在下では、ATP刺激時の細胞内Ca_2濃度の上昇は抑制され、電位依存性L型カルシウムチャネルのblockerであるNiffedipineの存在下では抑制されなかった。これらのことから、外部動員による細胞内Ca_2濃度の上昇機構はLaCl_3-sensitiveなカルシウムチャネルからの流入によることが示唆された。以上のことから内耳前庭において細胞外ATPが求心性の神経伝達物質または神経修飾物質としての働きがある可能性が示唆された。正常モルモットの前庭神経節細胞を単離した。単離した前庭神経節細胞をATP(100μM)にて刺激したところ、一過性の細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が観察された。そしてこの反応は再現性を示した。細胞外Ca^<2+>の非存在下すなわちCa^<2+>-freeの状態においてもATP(100μM)刺激にて一過性の細胞内Ca^<2+>濃度上昇を認めたが、その上昇度は細胞外Ca^<2+>の存在下に比し低値であった。またカルシウムチャネルのblockerであるLaCl_3の存在下では、その細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は抑制された。これらのことから、ATP(100μM)刺激による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は外部動員および内部動員の両者に依存するものと考えられた。次にATPの受容体であるP_2-purinergic receptorの拮抗剤であるReactive blue2(100μM)、Suramin(100μM)それぞれの存在下では、ATP(100μM)による細胞内Ca^+濃度の上昇は抑制された。これらのことから、モルモット前庭神経節細胞にP_1ではなくP_2-purinergic receptorが存在し、ATP刺激による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇機構はP_2-purinergic receptorを介したものであることが示唆された。以上のことから内耳前庭において細胞外ATPが求心性の神経伝達物質または神経修飾物質としての働きがある可能性が考えられた。今後ATP、Reactive blue2、Suraminそれぞれの濃度依存についての検討を予定している。
象牙質和覚過敏症モデルによる知覚過敏抑制効果の評価

象牙質知覚は動水力学説に基づいた象牙細管内液の移動により惹起されると言われている。従って象牙質知覚過敏症抑制材を客観的に評価するには、象牙細管内液の移動の抑止力を計測する手法が有効であると思われる。抜去されたヒト第3大臼歯10歯を用いた。歯軸垂直面において厚さ1および1.5mmの歯冠部象牙質スライスを作製したのち10%中性ホルマリン溶液にて浸漬し、実験時に30%H_2O_2にて象牙細管を開通した。歯冠側と歯髄側の象牙細管が開口するスライス両面から、Oリングを介し透明アクリルチューブによりこれらを把持した。歯髄側のアクリルチューブ内に0.02%ルミノールを含む1%NaOH溶液、歯冠側アクリルチューブ内に小孔サイズ0.2μmのフィルタ(Whatman)によって微粒子を除去した0.3%H_2O_2を含むフェリシアン化カリウム溶液を満たした。試料近傍(距離約30mm)にプリアンプおよび電子冷却素子を内蔵するフォトダイオード(S6204:浜松ホトニクス)を設置した。以上の装置は外光をほぼ完全に遮断する暗箱内に封止した。0.3%H_2O_2はルミノール化学発光のトリガーであり、両側のアクリルチューブ内試薬が象牙細管を通じて混合することにより生ずる発光はオシロスコープにより観察したのち、ADコンバータを通じてパーソナルコンピュータに記録された。試薬が象牙質スライス両面に接した状態では一過性の僅かな発光が見られた。次にフェリシアン化カリウム溶液が充填されたアクリルチューブに対して10500mmHGの空気圧を加えたところ発光が経時的に観測された。これらの発行量は個々の試料に応じて変動があるものの、同じ試料では圧力と正の相関をもって発光量が変化した。また1.0mm厚スライス試料の発光量が1.5mmのものと比較して全般的に発光量が大きくなる傾向であった。象牙質試料は30%H_2O_2による象牙細管の開通が施されない状態ではいかなる条件でも発光は見られなかった。化学発光を利用した象牙質知覚過敏シミュレータは象牙細管内液の移動を視覚的にしかも高感度に観察できるシステムである。象牙細管の開口の度合を発光量の変動で捉えることができるから、象牙質知覚過敏抑制材の効果を端的に評価できるツールとして極めて有効と思われる。本研究では、象牙質知覚過敏抑制剤における象牙細管内液の移動抑止効果を客観的に評価するため、細管内液の移動を再現するシミュレーターを構築し、高感度光検知器等を用いて液の移動の様子をリアルタイムに検知して、象牙質知覚過敏抑制剤の効果を判定するものである。ヒトおよび牛抜去歯の象牙質切片を生成した後、交通する双方の象牙細管開孔面それぞれにOリングを介した金属チューブを設置した。片方に水、もう一方に3 mol/l食塩水を満たすことで、浸透圧による象牙細管内に液の移動を惹起した。

象牙質厚さは1mm以上とした。象牙細管内における食塩水の移動を確認するために、水側の管内にPt-Ir電極を設置し、50Hz,0.92Vを通電したところ、対側面が水の際、電流値は約140μAであったが、対側面を食塩水とした時点より電流値は漸次上昇し、30分後には約150μA、60分後には約170μAとなり、象牙細管内の移動を人為的に惹起できることが認められた。次に高輝度LED(530nm緑色、660nm赤色)を象牙質切片に照射し、光量バランス検知法によるフォトダイオードにより透過光を検知し、象牙細管内液移動による透過光のゆらぎの計測を試みたけれども、背景光ノイズならびに象牙質外ストリームのアーディファクトが大きく、ゆらぎ信号を検知することは出来なかった。現状の検知技術では、透過光成文中に含まれる極めて微弱なゆらぎ信号を背景光の影響を排除して検知することは困難と思われる。現在、透過光成分の検知に替わる微弱発光検知技術を用いた新たな象牙細管内液移動のリアルタイム検知を試みている。象牙質知覚は動水力学説に基づいた象牙細管内液の移動により惹起されると言われている。従って象牙質知覚過敏症抑制材を客観的に評価するには、象牙細管内液の移動の抑止力を計測する手法が有効であると思われる。抜去されたヒト第3大臼歯10歯を用いた。歯軸垂直面において厚さ1および1.5mmの歯冠部象牙質スライスを作成したのち10%中性ホルマリン溶液にて浸漬し、実験時に30%H_2O_2にて象牙細管を開通した。歯冠側と歯髄側の象牙細管が開口するスライス両面から、0リングを介し透明アクリルチューブによりこれらを把持した。歯髄側のアクリルチューブ内に0.2%ルミノールを含む1%NaOH溶液、歯冠側アクリルチューブ内に小孔サイズ0.2μmのフィルタ(Whatman)によって微粒子を除去した0.3%H_2O_2を含むフェリシアン化カリウム溶液を満たした。試料近傍(距離約30mm)にプリアンプおよび電子冷却素子を内臓するフォトダイオード(S6204:浜松ホトニクス)を設置した。以上の装置は外光をほぼ完全に遮断する暗箱内に封止した。0.3%H_2O_2はルミノール化学発光のトリガーであり、両側のアクリルチューブ内試薬が象牙細管を通じて混合することにより生ずる発光はオシロスコープにより観察したのち、ADコンバータを通じてパーソナルコンピュータに記録された。試薬が象牙質スライス両面に接した状態では一過性の僅かな発光が見られた。次にフェリシアン化カリウム溶液が充填されたアクリルチューブに対して10500mmHGの空気圧を加えたところ発光が経時的に観測された。これらの発光量は個々の試料に応じて度合があるものの、同じ試料では圧力と正の相関をもって発光量が変化した。また1.0mm厚スライス試料の発光量が1.5mmのものと比較して全般的に発光量が大きくなる傾向であった。象牙質試料は30%H_2O_2による象牙細管の開通が施されていない状態ではいかなる条件でも発光は見られなかった。化学発光を利用した象牙質知覚過敏シミュレーションは象牙細管内液の移動を視覚的にしかも高感度に観察できるシステムである。象牙細管の開口の度合を発光量の変動で捉えることができるから、象牙質知覚過敏抑制材の効果を端的に評価できるツールとして極めて有効だと思われる。
エラスチンの分子集合特性を利用した薬物放出制御担体の設計

化学合成作製した種々のランダムコポリマーを用いて、各々をγ線架橋反応処理を行った後に薬物徐放試験を行った。用いたポリマーはpoly(VPGVG)(以下Vppと略)、poly[8(VPGVG)、2(VPGK(Z)G)](以下VK(Z)ppと略)、poly[8(VPGVG)、2(VPGFG)](以下VFppと略)、poly[10(VPGVG)、1(VAPGVG)](以下VHppと略)、poly[8(VPGVG)、2(VPGFG)、1(VAPGVG)](以下VFHppと略)である。各ペプチドユニットの活性エステルをトリフルオロ酢酸によりBoc基を除去した後、ジメチルスルホキシドに溶解しトリエチルアミンを加えて2週間撹拌した。蒸留水で透析後、凍結乾燥してポリマーを得た。VK(Z)ppについてはZ基を除去(以下VKppと略)し、NMR測定による反応の確認を行った。その後、Boc化(以下VK(Boc)ppと略)した。まず、自己集合能の検討を実施した。ポリマー溶液を0.5°C/minの割合で5°C60°Cの範囲で昇温、降温させて濁度測定を行い、全てのランダムコポリマーについて、自己集合能を有することを確認することができた。次にγ線照射による架橋反応を行った。全てのサンプルにおいてγ線照射後は温度変化により粒径が変化することが示された。また、合成したランダムコポリマーの酵素に対する安定性を調べるため、エラスターゼを用いた安定性試験を行ったところ、γ線照射後のポリマーは分解を受けにくいことが確認された。γ線照射後の、凍結乾燥したナノ粒子にBiebrich Scarle tred(BS)を加え、色素を粒子内に取り込ませた後、37°Cで24h放置して色素を包含した担体を作製した。遠心分離して上清を吸光度(490nm)で測定した。さらに上清を取り除いた後に、新たに同量のPBSを加えて同様の操作を繰り返した。この操作を毎日繰り返し、ナノ粒子からの色素徐放を検討した。γ線照射したVppは、VFHppよりも徐放量が多いことが示され、このことは粒子の大きさが関連していると考えられた。分子集合機能を有するペンタペプチド(GVGVP)繰り返し構造を基本にして、GVGVPと同様にエラスチンの高ホモロジー領域に共通して存在し、抗血栓性を有するヘキサペプチドVal-Gly-Val-Ala-Pro-Gly(以下VGVAPGと略す)繰り返し構造の適当量をブレンドしたポリペプチドのデザイン・合成を行った。上記2種の配列に加え、GVGVPの2残基目をValからPheへ変換したGFGVPの配列を組み込んだ4種のポリペプチドを化学合成した。合成はBoc法を用いた液層合成法で行い、各々の保護ペプチドBoc-GVGVP-OH、Boc-GFGVP-OH、Boc-VGVAPG-OHを合成し、種々のモル比で混合したランダムコポリマーを合成した。各ペプチド配列の混合比はGVGVP:GFGVG:VGVAPG=10:0:0、8:2:0、10:0:1及び8:2:1である。合成したランダムコポリマーの水溶液を調製し、濁度測定を行って分子集合特性を調べた。溶液濃度は0.4mg/mlで0.5°Cの割合で5°Cから55°Cまで昇温した後、同じく55°Cから5°Cまで降温させて400nmでの吸光度を測定した。濁度測定の結果、合成した全てのポリペプチドは分子集合特性を示し、特にヘキサペプチドVGVAPGを組み込んだコポリマーは40°C付近から分子集合を開始したが、GFGVPを組み込んだコポリマーは25°Cと低い温度から白濁を開始し、高い分子集合特性を有することが示された。また合成した各ポリペプチドのCD測定を、行ったところ、合成した全てについてII型βターンを含むβ構造を持つことが示唆されたので、分子集合特性の発現にはβ構造を持つことが必要であることも示唆された。さらに、リン酸化酵素によってリン酸化反応を受けるペプチド配列Arg-Gly-Tyr-Ser-Leu-Glyの合成を固相法を用いて完了した。

ポリマー溶液を0.5°C/minの割合で5°C60°Cの範囲で昇温、降温させて濁度測定を行い、全てのランダムコポリマーについて、自己集合能を有することを確認することができた。次にγ線照射による架橋反応を行った。全てのサンプルにおいてγ線照射後は温度変化により粒径が変化することが示された。また、合成したランダムコポリマーの酵素に対する安定性を調べるため、エラスターゼを用いた安定性試験を行ったところ、γ線照射後のポリマーは分解を受けにくいことが確認された。γ線照射後の、凍結乾燥したナノ粒子にBiebrich Scarle tred(BS)を加え、色素を粒子内に取り込ませた後、37°Cで24h放置して色素を包含した担体を作製した。遠心分離して上清を吸光度(490nm)で測定した。さらに上清を取り除いた後に、新たに同量のPBSを加えて同様の操作を繰り返した。この操作を毎日繰り返し、ナノ粒子からの色素徐放を検討した。γ線照射したVppは、VFHppよりも徐放量が多いことが示され、このことは粒子の大きさが関連していると考えられた。
乳酸菌の皮膚角化細胞炎症応答抑制に基づくアトピー性皮膚炎改善効果の検証

本研究は乳酸菌の炎症シグナル調節作用に着目し、皮膚角化細胞を通じた炎症応答制御の可能性について検討を行ったものである。細胞培養系での検討により、一部のLactobacillus族乳酸菌株にヒト皮膚角化細胞からのTARC(胸腺および活性化制御ケモカイン)発現を抑制する働きがあることを明らかにした。TARC抑制作用の強い乳酸菌株の生体塗布による症状の発症に及ぼす効果についてアトピー性皮膚炎モデルマウスで確認を行ったところ、菌体破砕後抽出物の塗布により、皮膚炎の発症に有意な抑制効果が観察された。以上の結果から乳酸菌の皮膚炎予防剤としての利用の可能性につながる研究成果が得られた。さらにこの抑制作用におけるTLR2の関与について明らかにするため、TLR2を標的としたsiRNA導入によりmRNAおよび細胞表面におけるタンパク質レベルでTLR2の発現が抑制されたHaCaT細胞を調製し、先ほどと同様の加熱死菌体刺激条件下においてTARCの誘導を行ったところ、未導入条件下でみられていたTARCの発現抑制作用が消失することが明らかとなった。以上の結果から、本研究で使用したLactobacillus属乳酸菌株はTLR2を介して皮膚角化細胞に抑制状態を誘導し、TNF-α刺激によって誘導されるTARCの発現を抑制することが明らかとなった。ヒト角化細胞株HaCaTにおけるLactobacillus属乳酸菌によるTARC発現抑制作用に関して、その作用メカニズムの解析を行った。これまでの検討において最も強い抑制作用を示したLactobacillusreuteri JCM1112株の加熱死菌体によりHaCaT細胞を刺激し、TLR2を介したシグナル伝達において誘導が想定される分子について経時的に発現量の変化を観察したところ、脱ユビキチン化酵素であるTNF-α-induced protein 3(A20)、Cylindromatosis(CYLD)の発現に有意な上昇が確認された。そこでこれら2つの分子に対するsiRNA導入によるノックダウンを行い、乳酸菌死菌体刺激後のTARC発現抑制に関する影響をみたところ、A20分子のノックダウン条件下でTARCの発現抑制が弱まる傾向が観察された。またsiRNAによるノックダウン条件下でTNF-αによるTARC誘導を行ったところ、A20分子のノックダウン条件下ではTARCの誘導が有意に増加したため、A20分子の誘導が本乳酸菌株によるTARC発現抑制に働いている可能性が示唆された。また興味深いことに、TLR2シグナル伝達下にあるA20ならびにCYLDの代表的なターゲット分子であるtumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)をノックダウンすることで、TNF-αによるTARC誘導がほとんど消失することが明らかとなった。TRAF6のTNFRを介したTARC誘導への関与についても確認を行う必要があると考えられる。ヒト皮膚角化細胞株HaCaT細胞の培養系においてTNF-α誘導性のTARC(胸腺および活性化制御ケモカイン)発現を抑制する乳酸菌株として選抜したLactocbacillus reuteri JCM 1112株の、生体塗布による症状の発症に及ぼす効果について明らかにすることを目的に、アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いた検討を行った。検討に先立ち、JCM 1112株の加熱死菌体を破砕し、水-ブタノール分配抽出によって得られた抽出物がヒト皮膚角化細胞株HaCaT細胞のTARC発現に及ぼす影響ついて確認を行った。活性が確認された水抽出物(LW)を、0(コントロール群)、1 mg(1 mg LW塗布群)および10 mg(10 mg LW塗布群)ずつ週2回の頻度でNC/Nga系マウス皮膚に塗布し、コナヒョウヒダニ抽出物添加軟膏によって誘導される皮膚炎の発症に及ぼす効果について21日間(試験全体で28日間)観察を行った。検討の結果、10 mg LW塗布群において試験期間を通じた皮膚炎の抑制傾向が観察され、LW塗布開始後25日目にコントロール群と比較して皮膚炎の有意(P < 0.05)な抑制が観察された。なお、試験期間を通じて両濃度のLW塗布によって体重の変化や経皮感作によると思われる症状の悪化は観察されなかった。本研究は乳酸菌がTLR2を介してマスト細胞の脱顆粒反応を抑制することに着想を経て、TLR2を発現する皮膚角化細胞での新たな機能性を明らかにすることを目的に研究を行ってきた。本研究を通じて、TNF-αによる誘導されアトピー性皮膚炎に関係する角化細胞由来主要ケモカインの一つであるTARCの発現に対する乳酸菌の新たな生理作用が明らかになったほか、その作用が皮膚炎モデルマウスにおいても皮膚炎抑制効果として示され、乳酸菌の新たな利用法につながる可能性をもつ研究成果が得られた。昨年度の検討において乳酸菌の作用はTNF-αによって誘導されるTARC誘導に対して有効であり、共刺激として用いたIFN-γに対する誘導には大きく影響しなかった。

これらのことから、TNFRを介したTARC誘導機構に対して乳酸菌の刺激後に何らかの抑制作用がもたらされることが考えられた。今年度の目標は、乳酸菌の刺激後にTARC誘導応答の抑制が見られる作用機序に関して解析を進めることであった。検討を行うにあたりTLR2を介して誘導される何らかの抑制分子の誘導が起こり、その分子がTLFRシグナル伝達経路にも働きかけ、TARCの誘導を抑制している可能性を想定した検討を行った。その結果、K63ポリユビキチン化によるシグナル伝達過程を抑制するA20とCYLDという脱ユビキチン化酵素の関与をとらえることができた。siRNAによるノックダウンを行うことにより、Lactobacillus reuteri JCM1112株が皮膚角化細胞のTLR2を介してTNF-αによるTARC誘導を抑制する際に、A20分子の誘導が特に大きな要因になっている可能性が示された。またTNF-α受容体(TNFR)シグナル伝達下でA20やCYLDの制御を受ける分子としてはReceptor-interacting protein 1 (RIP1)が知られているが、上記の結果からはRIP1だけでなくTRAF6が皮膚角化細胞におけるTNF-αによるTARC誘導に重要な働きを持つ可能性が示唆され、A20分子の誘導からRIP1やTRAF6の脱ユビキチン化誘導によるTARC誘導抑制という抑制メカニズムに関する情報が得られた。また今年度の申請内容に掲げていた、来年度の動物試験の実施に向けた塗布試験の条件検討についても計画通り実施することができた。動物生命科学最終年度であるH27年度は細胞培養試験の結果に基づき、実際にマウス生体に対する対象成分の塗布試験を実施し、有効性を検証する。本研究は生体において皮膚のバリア機能が大きく低下した状態を想定した検討となるため、そのモデル動物として先天的にバリア機能の低下がみられるアトピー性皮膚炎を発症するNC/Nga系マウスを検討に用い、さらに界面活性剤であるSDSを併用して皮膚バリアを低下させた環境を形成させる。また同マウスを用いた予備検討により、対象成分をエタノールに溶解させることで特別な基材を用いることなく効率よく浸透させることができることがわかったため、菌体破砕処理後の抽出物を直接塗布した形で検討を行う。皮膚症状の発症は、代表的な皮膚炎原因物質の一つであるコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)の抽出物を含む軟膏剤を用いる。また当初の予定には入っていなかったが、昨年度の検討で脱ユビキチン化酵素A20の誘導を介した抑制機構の存在が示唆されたため、これに関連する補足データの所得も行い、学術誌での論文発表に向けた補足検討を実施する予定である。今年度の目標として、皮膚角化細胞にLactobacillus属乳酸菌を直接作用させ、I型アレルギーにおいて重要な働きを担うケモカインであるTARCの産生に対し抑制作用が見られるかを明らかにすることを掲げていた。
低消費電力・高精細大画面液晶テレビ用高性能ゲルマニウム薄膜トランジスタの開発

高性能液晶ディスプレイに用いるゲルマニウム系薄膜トランジスタの実現を目指し、シリコンゲルマニウム、ゲルマニウムの薄膜をマグネトロンスパッタにより成膜した。アルゴンプラズマの成膜では、基板温度250°C以上で結晶化し、アルゴン水素プラズマによる反応性スパッタでは結晶化が阻害されアモルファス膜が得られた。トランジスタを試作した結果、結晶化した薄膜はトランジスタ動作をせず、反応性スパッタによるゲルマニウム薄膜ではトランジスタ動作することを見出した。移動度の高いGeを用いた高性能Ge薄膜トランジスタを実現するには、狭バンドギャップに起因するリーク電流増大を徹底的に抑える必要がある。このためには、プラズマダメージを低減した成膜条件によるGe薄膜中の欠陥の徹底的低減、及びGeにSiを混ぜたSiGe薄膜による広バンドギャップ化の検討が重要である。本年度は、RF放電マグネトロンスパッタによるSiGe薄膜形成、及び回転マグネットスパッタによるGe薄膜形成を行い、その膜質を調査した。SiGeについては、Siを20%程度導入したSiGe薄膜のスパッタ成膜を行った結果、およそ融点の半分の温度である300°C程度以上で結晶化が起こり、350°C成膜においては結晶化率(Crystallinity)50%程度以上を実現した。また基板RFバイアスを導入して成膜時のイオン照射エネルギーを増加させることで、300°C成膜においても結晶化率35%が得られた。またGe薄膜についてはSiGeよりも低温の250°C程度から結晶化が起こることを見出し、結晶化率は280°C程度以上で50%程度であることが分かった。さらにSiO_2(100nm)/p^+-Si基板上へのGeアイランド形成及びアルミ配線形成を行い、ボトムゲート型の薄膜トランジスタの試作を行い、そのトランジスタ動作を確認した。ただし、On/Off比は結晶化したGe薄膜よりもむしろアモルファスGeにすることで向上することが見出された。21年度は高性能薄膜トランジスタを実現する薄膜形成条件を詳細に検討する予定である。高性能液晶ディスプレイに用いる高性能ゲルマニウム系薄膜トランジスタの実現を目指し、シリコンゲルマニウム、ゲルマニウムの薄膜をマグネトロンスパッタにより成膜した。ゲルマニウム薄膜については、超大型基板への均一成膜が容易に実現可能な回転マグネットスパッタ装置を用いて行った。アルゴンプラズマによるスパッタ成膜では、シリコンゲルマニウム、ゲルマニウムはそれぞれ300°C、250°C程度から結晶化が起こることが分かった。両者とも、結晶はほぼ(220)配向をしており、結晶化率は50%程度であった。移動度の高い薄膜トランジスタを実現するには、薄膜中のダングリングボンドを水素で終端することが重要である。そこで、通常のアルゴンガスによるスパッタだけでなく、アルゴンに水素ガスを20%添加して励起したプラズマにより反応性スパッタも行った。この反応性スパッタにより成膜したゲルマニウムは、250°Cの成膜においても結晶化がほとんど起こらず、アモルファスな膜となることが分かった。これら薄膜を半導体層として、ボトムゲート型の薄膜トランジスタを作成した。表面に熱酸化膜が100nm形成された低抵抗p+-Si基板を用い、この熱酸化膜をゲート絶縁膜とし、バルクの低抵抗Siをゲート電極とした。チャネル長、チャネル幅はそれぞれ4μm、20μmとした。トランジスタを試作した結果、結晶化した薄膜は整流特性が得られずトランジスタとならなかった。一方、反応性スパッタによるゲルマニウム薄膜では、移動度が0.03cm2/V-s程度、オンオフ比は100程度ではあるがトランジスタ動作することを確認し、水素ガスを用いた反応性スパッタの優位性を見出した。今後、Ar水素プラズマ条件の最適化や、ポスト水素ラジカル処理の導入等で更なる性能向上を目指していく予定である。
ゲノム構造変化による感音難聴の発症メカニズムの解明に関する研究

天性感音難聴においては、遺伝子上のひとつの塩基ないしは数塩基の、点変異、欠失や挿入による変異が原因となる。近年、これに加えて、コピー数変化(CNV: copy number variation)といわれる、より大きな規模での遺伝子の重複や欠失が、難聴の原因となることが明らかになりつつある。このCNVを網羅的に、複数の候補遺伝子から検出するために、次世代シークエンサーのリードデータから、簡便にCNVを検出する方法を確立した。これを一次スクリーニングとし、確認のため、aCGH(比較ゲノムハイブリダイゼーション法)を利用したマイクロアレイで検証を行った。次世代シークエンサーからCNV候補を見出し、複数の難聴遺伝子におけるCNVに対して、本CGHアレイを用いた検討を行った結果、複数の難聴遺伝子において、大きなゲノム領域の欠失などのCNVを確認することができた。多くの難聴患者の遺伝子サンプルから、複数の難聴関連遺伝子について、ゲノム構造変化やコピー数変化を認めており、aCGHでの検証を行っている。また、ロングリード型シークエンサーでの解析を企図している。ゲノム構造変化やコピー数変化を認めた症例の表現型として、難聴の状態などの臨床情報の収集を行い、比較検討する。また、ロングリード型シークエンサーでの解析を行う予定である。
感染宿主細胞の分化と連動するヒトパピローマウイルス複製機構の研究

高リスク群ヒトハピローマウイルス(human papillomavirus : HPV)は、子宮頸癌の原因ウイルスである。HPV生活環は、感染標的である表皮細胞の分化と密接に連動している。未分化な表皮細胞に侵入したHPVは、その環状2本鎖DNAゲノムを、感染細胞の核内で低コピー数のエピゾームとして維持する潜伏持続感染状態となる(潜伏期)。感染宿主細胞が分化すると、表皮形成の終盤でウイルスゲノムの大規模複製、次いでキャプシドタンパク質を発現し、子孫ウイルス粒子を産生する(増殖期)。本研究は、HPVゲノム複製の分子機構の解明を目的とし、DNA損傷修復系との相互作用に着目した。まずは、潜伏期のウイルスゲノム複製について調べた。結果、ウシパピローマウイルスを潜伏感染する細胞では、DNA損傷応答系因子のATMが活性化し、その活性化はウイルスゲノムの複製をある程度抑制していることが分かった。一方で、HPV16を潜伏感染している患者由来の細胞では、ATMは活性化しておらず、HPV16潜伏感染時におけるHPVゲノム複製には、宿主の染色体複製因子が関与する可能性が示唆された。以上をふまえ、3年目の本年度は、増殖期のHPVゲノム複製について検討した。HPV16潜伏感染細胞に、HPVゲノム複製因子であるE1およびE2を外来性プロモーターより発現誘導すると、ウイルスゲノムの大規模複製を誘導できた。同時にATMが活性化し、アポトーシスによる細胞死が誘導されることを見つけた。ATMは、E1を介したウイルスゲノムの複製を検知して活性化し、感染細胞の排除やウイルスゲノム複製を抑制することにより、宿主の感染防御において重要な役割を果たすことが示唆された。高リスク群ヒトパピローマウイルス(Human Papillomavirus;HPV)は、子宮頸癌の原因ウイルスである。HPV生活環は、感染標的細胞である表皮の形成と密接に連動しており、表皮細胞の分化に応じてウイルスゲノム複製を3段階に切り替える。ところが、このようなHPVの生活環を支える分子機構は不明な点が多い。ウイルス複製の全貌を明らかにすることにより、ウイルス複製を抑制し、癌の原因を取り除くことが期待される。本研究では、ウイルスゲノム複製と宿主のDNA損傷修復系との相互作用に注目した。まず、ヒトパピローマウイルス複製のモデルとして、ウシのパピローマウイルスを潜伏持続感染状態で維持する細胞株を解析した。結果、ウイルスゲノムを維持している細胞では、宿主細胞のDNA損傷応答系のひとつであるATM系が活性化していることを見つけた。ATM系の活性化がウイルスのゲノム複製に与える影響を検討するため、ウイルスゲノムを維持する細胞に、DNA損傷応答系の阻害薬を処理したところ、ウイルスゲノムの複製が充進るすという結果を得た。すなわち、ウイルスのゲノム複製は、細胞のDNA損傷修復系の活性化によって、抑制されることを明らかにした。さらに、RNA干渉法を用いたノックダウンにより、ウイルスゲノム複製の抑制にはATMが重要な役割を果たすことを明らかにした。感染性ウイルス粒子を用いた感染実験でも同様の結果をえた。このことから、宿主のDNA損傷修復系は、ウイルス感染直後から活性化し、ウイルスのゲノム複製を抑制することが分かった。パピローマウイルスのゲノム複製が、潜伏感染状態であっても、宿主のDNA損傷修復系に異常と認識されることは、新しい知見である。本研究では、このようなHPVの生活環を支える分子機構を明らかにすることを目的とし、HPVゲノムと宿主細胞のDNA損傷修復系やDNA複製機構との相互作用に焦点をおいて解析する。2年目の本年度は、潜伏持続感染状態におけるHPVゲノム複製と宿主細胞のゲノム複製がどのように連動しているかについて調べた。具体的には、HPV感染患者から樹立された細胞株でHPVゲノムをエピゾームとして維持する表皮細胞株に、染色体ゲノム複製を制御するタンパク質を導入して、それらのHPVゲノム複製におよぼす影響を調べた。Cdt1は、MCMヘリカーゼ複合体をゲノム複製起点に誘導するタンパク質であり、すなわち染色体DNA複製の開始を制御する。そのCdt1を過剰に発現させると、HPVゲノムのコピー数が増加することを見つけた。一方で、Cdt1と相互作用し、その働きを抑制するタンパク質であるGemininを過剰に発現させると、HPVゲノムコピー数が減少した。このことから、潜伏持続感染時におけるHPVゲノム複製は、宿主細胞のゲノム複製の制御因子によって同様に制御されている可能性が考えられた。さらに、クロマチン免疫沈降法を用いた解析から、宿主細胞のORC(origin recognition complex)がHPVゲノムの特定の領域に結合することが示唆された。HPVは、DNAヘリカーゼであるE1を独自にコードしており、HPVゲノム複は、宿主細胞の染色体DNA複製から独立した機構により複製すると考えられてきた。しかしながら、本年度の研究成果から、少なくとも潜伏持続感染時におけるHPVゲノム複製は、宿主のDNA合成機構におそらく完全に依存し、その制御をうける可能性が考えられた。

感染宿主細胞が分化すると、表皮形成の終盤でウイルスゲノムの大規模複製、次いでキャプシドタンパク質を発現し、子孫ウイルス粒子を産生する(増殖期)。本研究は、HPVゲノム複製の分子機構の解明を目的とし、DNA損傷修復系との相互作用に着目した。まずは、潜伏期のウイルスゲノム複製について調べた。結果、ウシパピローマウイルスを潜伏感染する細胞では、DNA損傷応答系因子のATMが活性化し、その活性化はウイルスゲノムの複製をある程度抑制していることが分かった。一方で、HPV16を潜伏感染している患者由来の細胞では、ATMは活性化しておらず、HPV16潜伏感染時におけるHPVゲノム複製には、宿主の染色体複製因子が関与する可能性が示唆された。以上をふまえ、3年目の本年度は、増殖期のHPVゲノム複製について検討した。HPV16潜伏感染細胞に、HPVゲノム複製因子であるE1およびE2を外来性プロモーターより発現誘導すると、ウイルスゲノムの大規模複製を誘導できた。同時にATMが活性化し、アポトーシスによる細胞死が誘導されることを見つけた。ATMは、E1を介したウイルスゲノムの複製を検知して活性化し、感染細胞の排除やウイルスゲノム複製を抑制することにより、宿主の感染防御において重要な役割を果たすことが示唆された。