hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報化時代における佚文収集の手法についての研究：大蔵経からの抽出を事例として

2018年度は、史料の収集を中心に研究を進めた。国際仏教学大学院大学に赴いて、日本の古写経の複写を行い、次年度以降の比較検討材料を収集した。また、研究計画に挙げた法琳の著作についてデジタルテキストを作成し、引用書の部分が判明しやすくなるような加工を行っている(継続中)。一方、これまでの研究成果を用いて、パターン抽出によるキーワードを利用したオンラインデータベースを利用した佚文収集と分析についてのテストケースとして、『世本』作篇の佚文収集と分析に関する研究を行い、論文として公刊した。また、悉皆調査との比較のために、『國語』韋昭注に引かれる『世本』佚文を、過去の研究で見つけ出したパターンを利用して集解的に抽出し、その整理を行った。これについての研究は、現在論文として投稿中である。また別に、文献の成書時期やキーワードのパターン認識の上で重要な情報として、君主や皇帝一族の名前を挙げることができる。その名前を調査する上で、現在一般に知られている名前が実は、何らかの理由により後世誤認されたものがある事を、過去前漢前少帝の名前について研究を行った。本年、その関連研究として、我が国の聖武天皇第一皇子の名前について、従来言われている「基」というそれが、「某」からの誤記で誤って定着したものであり、本来の名前は不明であるという内容の学会報告を行った。上記2018年度の研究を行う上で、国際仏教学大学院大学・台湾国家図書館・宮内庁書陵部・国立公文書館・東京大学史料編纂所を訪問して、史料の閲覧・複写を行った。資料の収集については、現在まで順調に進んでいる。法琳の著作のデジタル化については、既に終わっているが、引用書のマークアップに当初の想定より時間を要しているため、次年度はこの作業を重点的に行いたい。また、パターン認識で抽出したキーワードによる佚文収集については、『國語』韋昭注を利用したテストケースでは、ほぼ悉皆調査と遜色の無いデータが得られている。2019年度は、上述のように法琳の著作のデジタルデータ作成の作業を重点的に行いたい。また、佚文収集についても、前年度のテストケース的なものを作成しつつ、より広範囲なものを行いたいと考えている。また、日本古写経を利用したキーワード抽出の精度向上について、本年度はいくつかの人名や固有名詞などをターゲットに調査を行う予定にしている。
歯髄幹細胞を用いた新しい末梢神経損傷治療法の開発

細胞移植群において、後肢の経時的変化で肢の開きが非細胞移植群よりも著名に認められ、坐骨神経の中枢側1/2の範囲における炎症性細胞数は、対照群と比較して少ない傾向が観察された。次に、抗Myelin basic protein抗体による解析において、細胞移植群では中枢側1/2の範囲で抗体陽性を示す領域が対照群と比較して広かった。前脛骨筋の湿重量(患側の前脛骨筋湿重量/健側の前脛骨筋湿重量×100)において、細胞移植群は対照群と比較して有意に高値を示した。本実験から歯髄細胞移植の効果が示唆される結果が得られたと考えているが、今後さらなる解析が必要であると考えている。ヒト歯髄幹細胞移植による末梢神経麻痺の新しい治療法開発を目的として研究を進めている。平成26年度は、まずその坐骨神経挫滅モデル作成法を検討しており、挫滅方法として血管クリップを用いた挫滅を採用した。血管クリップを用いることにより、挫滅強度を一定にすることができ、細胞移植後の評価をより正確に行うことができると考えている。移植細胞については、愛知学院大学歯学部附属病院にて抜去した歯牙を国立長寿医療研究センター再生歯科医療研究部に輸送し、歯髄幹細胞を分取、培養を行っている。さらに、フローサイトメトリー、Real-Time RT-PCR、TAXIScanによりその形質評価を行い移植に適した形質を保持していることを確認した。細胞移植方法については、細胞をコラーゲンにサスペンドし、ラット坐骨神経挫滅部周囲に酸化セルロースとともに留置する方法を採用するべく検討中である。末梢神経障害はしばしば、外傷や手術合併症によって引き起こされ、かなりの障害となる。自家神経移植autograftは神経の修復/再生においてはゴールドスタンダードである。しかしながら、正常神経の侵襲を伴い、感覚の喪失、神経腫の形成、神経障害性疼痛などを引き起こす可能性がある。そこでわれわれは、ヒト歯髄幹細胞を用い末梢神経麻痺の新しい治療開発を目的として研究を進めている。平成26年度には挫滅モデルの検討を行い、挫滅方法として血管クリップを用いた挫滅方法を採用した。また移植細胞については、愛知学院大学附属病院にて抜去した歯牙を国立長寿医療センター幹細胞再生医療研究部に輸送し、歯髄幹細胞を分取、培養を行っている。その細胞はフローサイトメトリー、Real-Time RT-PCR、TAXIScanにより形態評価を行い移植に適した形質を保持していることを確認した。平成27年度には以前から検討を行っていた歯髄幹細胞を酸化セルロースをスキャホールドとしてコラーゲンと共に移植する方法を確立した。酸化セルロースは口腔外科領域で臨床の現場でも止血剤として用いられており、将来的にすぐ臨床の場で応用できることを見据えている。また細胞移植予備実験を行い、神経組織を採取しHE染色による炎症の程度評価、NF、MBPを用い免疫染色にて髄鞘の再生評価をし、前脛骨筋の湿重量を測定することにより麻痺の回復の程度を機能評価できないかと検討を行っている。しかし再生を評価するには評価項目が乏しく現在さらなる評価項目についての検討を進めている。細胞移植を行った群と細胞移植を行った群を比較する際の形態学的評価についてはある程度決定しているが、機能学的評価についての方法を現在検討中である。現在の末梢神経麻痺の根治的治療として,自家神経移植が行われているが,神経採取に伴った神経障害を引き起こすことから新規治療法の開発が必須と考えている.近年,間葉系幹細胞に類似する特徴を示す歯髄幹細胞には,神経・血管誘導能を備えることが分かってきた.そこで,我々は坐骨神経挫滅モデルを用いて末梢神経挫滅部への局所に直接歯髄細胞を投与したときの有用性を検討してきた。平成26年度には挫滅モデルの検討を行い、挫滅には血管クリップを用いる方法を採用。移植する歯髄幹細胞は形質評価を行い、移植に適した形態を保持していることを確認した。平成27年度は細胞を移植する際のスキャホールドについて検討を行い、細胞と共に酸化セルロース、コラーゲンを混ぜて移植する方法を確立した。酸化セルロースは口腔外科領域で臨床の場でも止血剤として用いられており、将来的にすぐ臨床の現場でも応用できることを見据えている。さらに細胞移植予備実験を行い、麻痺の回復を検討する評価項目について模索した。平成28年度には細胞移植実験を行い神経組織を採取し、HE染色による炎症の程度評価、NF、MBP抗体を用いて免疫染色し、髄鞘の再生を評価した。機能評価として前脛骨筋湿重量の測定を行い運動機能の回復をみて、Cat Walk(ノルダス社)にて歩行観察をおこない肢の運動機能回復についての評価も行った。ラット坐骨神経挫滅部への細胞移植方法がまだ確立されておらず、そのために最も適切な移植細胞数についても未だ検討されていない。

少しでも早く機能学的評価の追加項目について検討、予備実験をおよび本実験を進めて行く予定である。医歯薬学他の研究論文を参照し、できるだけ早く細胞移植法を確立し、27年度は予定通り機能評価や形態学的評価を進めていく予定である。免疫染色を行う際に抗体を多数使用する、移植する細胞を培養する際、試薬培地、機材が必要となる。また機能学的評価項目を検討する際、高額な機材を使用する理由が挙げられる。ラット末梢神経挫滅モデルの確立が遅れ、細胞移植を行う条件検討もまだ進行途中であることなど、研究の進行が全体的に遅延していることが理由として挙げられる。機能学的機能評価項目の一つとしてキャットウォークを用いた歩行観察、さらに筋電図をもちいた電気生理学的評価も加えたいと考えている。細胞移植に用いる器具・試薬のほか、データ解析用の機器購入を予定している。その他、今後実験動物の購入や、形態学的評価に用いる試薬やガラス器具等の購入、学会参加等に充当する予定である。
サーモサイフォンにおける自然対流の分岐現象に関する研究

矩形密閉容器内にスペーサを挿入した場合の矩形サーモサイフォンにおける自然対流について,シリコンオイルに感温液晶パウダーを用いて可視化を行って実験的に把握した.また,同じ幾何学的形状のものを対象として数値シミュレーションを行い,自然対流の不安定現象が生じるかどうかを検証した.可視化実験結果より,スペーサのない場合とスペーサが1本ある場合を比較すると,同じレイリー数であっても,スペーサがない場合には2次的な渦が成長して4つの渦のパターンになっているのに対して,スペーサの存在のために,渦の分割が妨げられ,依然として1つの大きな循環する渦が維持されていた.熱輸送の観点から考えると,渦が4つの場合には,上下方向の熱輸送は渦と渦の干渉によって行われるのに対して,スペーサを配置した場合には,1つの大きな流れで直接輸送されることになり,それだけ熱輸送特性が良くなるものと考えられる.また,スペーサを2本配置した場合については,低いレイリー数では,スペーサの間を上昇し,スペーサを取り囲むようにほぼ対称の渦が形成された.さらにレイリー数が大きくなるとスペーサの間を下降する流れから,2本のスペーサを囲むようにして1つの大きな渦が形成される流れに遷移する対流パターンが見られた.また,数値シミュレーションによって,内部にスペーサを挿入することによって対流の分岐開始条件をある程度制御することが可能であり,またスペーサの存在する場合の方がかなりよい熱伝達特性を示すことがわかった.今後,スペーサの特性を断熱,伝導と変化させ,そのときの対流の変化を調べる.さらに,加熱区間や冷却区間を変化させ,自然対流の特性を把握する予定である.矩形密閉容器内にスペーサを挿入した場合の矩形サーモサイフォンにおける自然対流について,シリコンオイルに感温液晶パウダーを用いて可視化を行って実験的に把握した.また,同じ幾何学的形状のものを対象として数値シミュレーションを行い,自然対流の不安定現象が生じるかどうかを検証した.可視化実験結果より,スペーサのない場合とスペーサが1本ある場合を比較すると,同じレイリー数であっても,スペーサがない場合には2次的な渦が成長して4つの渦のパターンになっているのに対して,スペーサの存在のために,渦の分割が妨げられ,依然として1つの大きな循環する渦が維持されていた.熱輸送の観点から考えると,渦が4つの場合には,上下方向の熱輸送は渦と渦の干渉によって行われるのに対して,スペーサを配置した場合には,1つの大きな流れで直接輸送されることになり,それだけ熱輸送特性が良くなるものと考えられる.また,スペーサを2本配置した場合については,低いレイリー数では,スペーサの間を上昇し,スペーサを取り囲むようにほぼ対称の渦が形成された.さらにレイリー数が大きくなるとスペーサの間を下降する流れから,2本のスペーサを囲むようにして1つの大きな渦が形成される流れに遷移する対流パターンが見られた.また,数値シミュレーションによって,内部にスペーサを挿入することによって対流の分岐開始条件をある程度制御することが可能であり,またスペーサの存在する場合の方がかなりよい熱伝達特性を示すことがわかった.今後,スペーサの特性を断熱,伝導と変化させ,そのときの対流の変化を調べる.さらに,加熱区間や冷却区間を変化させ,自然対流の特性を把握する予定である.
スピン波を用いた新規スピン流-電流変換機構の開拓

強磁性金属中のスピンの集団運動であるスピン波は伝導電子と強く結合している。本結合を利用できる新たなスピン-電流変換原理の研究を行った。強磁性金属へのスピン注入とそれに伴う起電力を測定し、注入するスピン、磁化および電圧測定方向の三方向の関係より調べ、スピン由来の新たな起電力を観測した。起源の特定のための精度向上に向けてマイクロ波の導入を検討し、この際に必要となるマイクロ波に起因する起電力の分離法を確立した。強磁性体中のスピンの集団運動であるスピン波を用いて、従来とは異なるスピン流の検出手法を創出することを目的とし、研究を進めた。平成25年度は、スピン蓄積を用いたスピン波変調を通した伝導電子スピン流の制御に向けて、円偏光による強磁性体/半導体構造でのスピン蓄積生成のための実験系の構築と試料作製条件の最適化を行った。強磁性体としてFeを、半導体としてSiドープn型GaAsを用いたFe/n-GaAs構造を作製し、電気抵抗測定および強磁性共鳴測定から試料の評価を行った。本研究に際しては、強磁性層の特性と強磁性体の半導体との界面特性が重要である。そのため、半導体基板上への強磁性層の形成に関して、様々な半導体界面の処理を試み、良質な強磁性共鳴特性が得られる試料作成条件を決定した。実験系としては、赤色レーザーを用いた円偏光が導入可能な光学系を構築を完了し、強磁性共鳴によるスピン波励起のためのマイクロ波導波路の導入中である。光学系として、入射光の角度依存性や、PEMを用いたロックイン法による高精度測定技術を導入した。Fe/GaAsにおけるカー効果による強磁性層の評価を行い、試料の特性および測定系の信頼性を確認した。また、熱励起されたスピン波のスピン蓄積の変調による電圧生成を測定するため、試料端に生成される電圧の円偏光の偏光依存性の測定を行った。今後、電圧測定手法の信頼性の向上を行い、マイクロ波の導入と合わせて、本研究原理の実証を目指す。強磁性体中のスピンの集団運動であるスピン波を用いた従来とは異なるスピンの検出手法の創出を目標とし、研究を進めた。近年、電子のスピンの流れを利用した情報処理および情報通信デバイスに注目が集まっており、電子デバイスとの統合の観点から必要となるスピンの電気的検出手法の多様化が求められている。本研究では、強磁性体中のスピンの集団運動であるスピン波が伝導電子とスピンを通じて強く結合していることに着目し、外部より注入するスピンによってスピン波を変調することで電流が生成されると予想し、実験を行った。スピン注入には円偏光照射による半導体Si-dope n型GaAsにおけるスピン蓄積生成を利用することとし、強磁性体としてFeを用いたFe/n-GaAs構造を作製した。電流特性の評価により、Fe層へのスピン蓄積効果の測定に欠かせないショットキー構造が形成されていることを確認した。光学系として赤色レーザーと偏光板および光弾性変調器を用い、起電力測定にはロックインアンプを用いて、Fe層で生じる起電力の円偏光依存性を測定した。このとき、磁場印加方向および起電力測定方向は、それぞれ光入射面に対して垂直および平行の二方向とした。測定の結果、電圧測定方向と入射面が平行のときFe層に起電力が現れることを確認した。平行方向での起電力の磁場印加方向依存性はスピン波変調による起電力を示唆するが、測定信号はナノボルトオーダーと微小であり、測定精度の向上が求められる。測定精度の向上手法としてマイクロ波による磁化ダイナミクスの増幅について検討し、この際に必要となるマイクロ波とスピン波に起因する起電力の分離法を確立した。26年度が最終年度であるため、記入しない。スピントロニクス26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は強磁性金属/半導体接合におけるスピン蓄積の及ぼす効果の検証を終了し、強磁性金属において熱およびマイクロ波によって励起された表面スピン波による伝導電子スピン流の検出に着手する予定であった。しかしながら、前者の強磁性金属/半導体構造におけるスピン蓄積の確認に時間を要した。また、マイクロ波によってスピン波を励起した際に付随した電圧について整理する必要があり、これの計算に時間を要した。研究を加速するべく、外部協力者と連携し、常磁性金属Pt/半導体界面におけるスピン流の定量評価技術を用いた評価を並行して行い、強磁性金属/半導体構造における起電力のより詳細な評価手法を確立させる。また、平成25年度に設計を終えたマイクロ波回路の導入を完了させ、室温で熱励起されたスピン波のみならず、マイクロ波により励起されたスピン波の変調によるスピン起電力の実験を遂行する。
細菌細胞表層の動的構造-体腔形成と分子・情報輸送-

土壌分離細菌SPhingomonas sp.A1は、高分子多糖アルギン酸を炭素源として利用する。しかし、アルギン酸は菌体外に存在するが、本菌の低分子化酵素アルギン酸リアーゼは細胞質に局在している。アルギン酸リアーゼ以外に、アルギン酸低分子化酵素は存在しない。従って、この多糖は高分子のまま細胞内に取り込まれ、細胞内で低分子化されると考えられた。そこで、細胞表層とその超薄切片について「取り込みの分子装置」を検索した結果、細胞表層に巨大な体腔の形成を認め、超薄切片には細胞膜が細胞質に陥入した明瞭な部位の存在を確認した。さらに、体腔には多糖が濃縮されて存在し、体腔は細胞外の高分子物質の存否に依存して開閉することを明らかにした。具体的には、高分子多糖存在下で培養した細菌細胞の表層をムコ多糖染色すると、体腔に相当する部位が強く染色される。酵母エキス生育菌では染色されない。体腔のない酵母エキス生育菌をアルギン酸培地に移すと体腔が形成される。体腔形成細胞を、酵母エキス培地に戻すと体腔は消失する。これらの事実から、体腔が高分子物質(多糖)の輸送装置であることを確認した。低分子物質の細胞内取り込み機構は、単純拡散やエネルギー駆動(モーター)ポンプ、或いは、ボーリンゲートなどを対象に広く研究されている。細胞内で合成された高分子物質の分泌機構の研究も、世界中で行われている。しかし、高分子物質の取り込み機構に関する研究は類例がなく、本研究によって、微生物における高分子取り込み機構の存在を始めて証明した。また、高分子取り込み変異株を利用して取り込みに関わる遺伝子を分離し、体腔形成の機構とその発現制御機構、並びに体腔形成の情報伝達機構を検討する基礎を確立した。細胞内で合成された高分子物質が、細胞外に分泌される過程に関しては特殊な分子構造が提出されているが、細胞が高分子物質を取り込む機構は殆ど不明である。微生物細胞が高分子物質を資化する場合には、先ず、菌体外酵素によって高分子物質を低分子化し、生じた低分子化物を取り込むのが一般的である。しかし、本研究で扱うスフィンゴモナス属細菌(A1株)では、低分子化酵素は細胞質に存在し菌体外に分泌されない。また、A1株は、微生物学の歴史の中で初めて見い出した細胞表層に特殊な体腔(巨大な穴)を有する細菌であり、その体腔に高分子物質を濃縮する。従って、体腔を介した極めて斬新な高分子物質取り込み機構の存在が予想される。本研究では、微生物細胞が高分子物質(多糖アルギン酸)を細胞内に取り込む分子機構を明らかにすることを目的としている。A1株から変異誘導AL-L株は、高分子アルギン酸(26kDa)は資化できないが、低分子化したアルギン酸(1kDa未満)は資化可能であることから、AL-L株は細胞内への取り込みに変異を有していると考えられた。A1株の遺伝子ライブラリーを構築してAL-L株に導入し、高分子アルギン酸資化性回復株AL-LCを取得した。AL-LC株には9kbのDNA断片がクローニングされており、その全一次構造を決定した結果、取り込み遺伝子群が見い出された。本遺伝子群は、高分子物質取り込みの特異的膜トランスポーター[透過酵素領域(0.6kb)、ATPase領域(1.1kb)]をコードしており、微生物の高分子物質取り込み系の存在を初めて明らかにした。以上の結果より、高分子アルギン酸は、先ず、体腔に濃縮された後、トランスポーターによって細胞内に取り込まれ、細胞内で低分子化及び資化が行われることが判明した。これは、微生物細胞の高分子利用機構の新規発見である。現在、透過系タンパク質の活性・構造相関の解析及び体腔形成の情報伝達系を解析している。

また、高分子取り込み変異株を利用して取り込みに関わる遺伝子を分離し、体腔形成の機構とその発現制御機構、並びに体腔形成の情報伝達機構を検討する基礎を確立した。
骨格筋小胞体から横行小管カルシウムチャネルへのフィードバック性情報伝達

1.脱分極に応答したT管電位センサー(L型Caチャネル)が,センサーと対をなす筋小胞体(SR)のCa遊離チャネルからCaを放出し,そのCaがL型Caチャネルにフィードバックされることにより,センサーの構造がモジュレートされ,SRへの情報伝達効率が上がるどうか研究した。2.L型Caチャネル賦活剤(Bay K 8644とCLO_4^-)でカエル骨格筋単一筋線維を処置すると,低濃度のカフェインにより引き起こされるCICRが促進されること,および,電位センサーが静止状態またはK^+により不活性化されたとき,CICRは促進されないとの知見を得た.研究の途中,CLO_4^-がL型Caチャネルと同時に,ウサギSRのCa遊離チャネルにも作用するとの知見が発表された.そこで,CLO_4^-がカエルSRにも作用するか否かを検討した.3.カエル骨格筋よりCa遊離チャネルを含むSRを単離し,人工脂質膜に組み込み,細胞質側のCaにより開口したCaチャネルの単一電流に対するCLO_4^-の効果を研究した.CLO_4^-を与える前のCaチャネルコンダクタンスは平均723psであった.5-30μM CLO_4^-の投与により変化しなかった(733pS).一方,開口確率は20μM以上のCLO_4^-によりはじめて増加した.カエル骨格筋単一筋線維のCLO_4^-による単収縮の増強は1μMの濃度で観察された。また,カフェインは直接Caチャネルの開口確率を増加した.Bay K 8644は開口確率を変えなかった.4.以上の結果は比較的低濃度のCLO_4^-およびBay K 8644は電位センサーに,カフェインはSRCaチャネルに特異的に作用することを示唆した.これらの薬物を用い,本研究の目的を達成することが可能である.1.脱分極に応答したT管電位センサー(L型Caチャネル)が,センサーと対をなす筋小胞体(SR)のCa遊離チャネルからCaを放出し,そのCaがL型Caチャネルにフィードバックされることにより,センサーの構造がモジュレートされ,SRへの情報伝達効率が上がるどうか研究した。また,カフェインは直接Caチャネルの開口確率を増加した.Bay K 8644は開口確率を変えなかった.4.以上の結果は比較的低濃度のCLO_4^-およびBay K 8644は電位センサーに,カフェインはSRCaチャネルに特異的に作用することを示唆した.これらの薬物を用い,本研究の目的を達成することが可能である.
ラオスにおける前近代的鉄製錬技術の民族考古学的研究

本研究課題では、ラオス北部における前近代的鉄製錬技術で生産された鉄素材の金属学的性質を明らかにすることによって、.鋼製鉄器を用いる鉄器文化の構造解明を試みるものである。ラオス北部では1960年代に伝統的手法による鉄製錬が停止しており、現在は板バネ等の近代製鋼技術による市場流通の鉄製品を用いて鉄器が生産されている。そのため、当該地域の鉄器文化を規定したであろう本来の始発鉄素材の性格は、過去の不十分な民族誌の記述基づいて「生産性の低い塊錬鉄」という評価に止まってきた。そのため、本研究課題ではシェンクワーン県において1964年まで操業された鉄製錬跡で採取された製錬関連資料及び2010年に現地で再現された製錬炉の操業による資料を金属学的に分析することによって、これまで曖昧であった鉄器素材の金属学的性質を解明した。分析は、対象資料を考古学的手法による資料実測・写真撮影・観察表の作成の後、金属学研究者との検討を行った結果、原料鉱石及び製錬生成鉄塊・鉄器素材と推測される鉄塊の金属鉄を中心に化学分析を行うこととした。その分析成果では、不純物が極めて少ない良質な磁鉄鉱を短時間で還元することによって一旦低炭素鋼を生産し、その素材をさらに鍛冶炉で溶解・鍛錬することで、より緻密な金属組織の素材に仕上げていくという技術内容であることが明らかになった。これは、低炭素でありながら刃器に適した素材を効率的に生産する技術系として構成されていることを示している。そして、この性質の鉄素材が、修理・転用・再利用を繰り返しながら消耗していく、当該地域の鋼製鉄器の取り扱い方を規定しており、限られた資源・エネルギーを有効に駆使する鉄器文化を構成する基盤になっていることが確認できた。これはラオス北部に限らず、東南アジア地域全体の伝統的な鉄器文化のあり方を解明する上で重要な分析成果になると考えられる。
フェムト秒レーザーを利用した超微細光制御素子の開発

フェムト秒レーザーを透明材料内部に集光照射すると、その焦点近傍のみが構造変化するが、構造変化とレーザー光の相互作用を明らかにすることを目的に、パルスの繰返し周波数が異なるフェムト秒レーザーパルス光をアルミノシリケートガラス内部に集光照射し、ガラス構成元素の拡散等の挙動を評価した。繰返し周波数1kHz(パルス間隔:1ミリ秒)の場合には焦点近傍における元素の移動は観察されないが、繰返し周波数を200kHz(パルス間隔:5マイクロ秒)の場合には、元素移動が観察された。特にガラスの網目形成元素であるSi、Alは中心に、一方網目修飾元素であるCaは焦点の周囲に移動した。これは、レーザー光の焦点近傍が高温・高圧状態(理論計算から温度:3000K以上、圧力:0.3GPa)となるため、ガラス骨格を形成しているSiやAlは収縮して中央部に集まった結果、Caが外に押しやられたためと考えられた。このパルスの繰り返し周波数による相違は、熱拡散の影響によると考えられ、繰り返し周波数200kHzの場合、レーザーのエネルギーが焦点付近で吸収されて熱に変換し、その熱がパルス間隔(5マイクロ秒)の間にアルミノシリケートガラス内をわずか約150nmしか拡散できないが、一方繰り返し周波数1kHzの場合、パルス間隔(1ミリ秒)の間に熱は約30μmも拡散することを計算により求めた。照射するフェムト秒レーザーの繰り返し周波数が十分に高い場合、熱が蓄積される結果、焦点近傍の元素移動が誘起されたと考えられる。以上のことから、材料の熱拡散に適したレーザーパルスの繰り返し周波数を選択することによって、誘起される構造を制御できることをを明らかにした。透明材料内部に微細電気配線パターンを形成することを目的として、Ag^+ドープガラスの内部にフェムト秒レーザーを集光照射して誘起される構造について評価した。Ag^+ドープガラスに高繰り返し周期のフェムト秒レーザーを照射することにより、照射後に熱処理を行うことなく、焦点付近のみに空間選択的にAgナノ粒子が析出することを確認した。一方、繰返し周期が低い(1kHz)場合、レーザー照射後にはAgナノ粒子は析出しないが、その後の熱処理により、Agナノ粒子の析出が確認された。このパルスの繰り返し周波数による相違は、熱拡散の影響によると考えられ、繰り返し周波数200kHzの場合、レーザーのエネルギーが焦点付近で吸収され、熱に変換され、その熱がパルス間隔(5μs)の間に約1.9μm拡散する。一方、繰り返し周波数1kHz(パルス間隔:1ms)の場合、パルス間隔の間に熱は約27μm拡散するため、焦点(直径:約1μm)から遥か遠くに拡散することを計算により求めた。照射するフェムト秒レーザーの繰り返し周波数が十分に高い場合、熱の蓄積が大きくなり、Ag原子は熱処理を行うことなく、焦点付近に凝集し、ナノ粒子が形成されると考えられる。さらに焦点付近にAgナノ粒子が形成することにより、レーザービームが反射されて屈折率が変化する領域がレーザーの入射方向にのみ誘起され、最終的にラグビーボール状の非対称な誘起構造が形成されたと考えられる。高繰り返し周波数のフェムト秒レーザーを透明なバルク内で集光させると、その焦点は熱の点源として働き、誘起構造の形状はパルス間隔における熱の蓄積と放射により制御可能であることを明らかにした。
分泌神経支配除去による萎縮顎下腺の機能維持: 慢性的薬剤投与による抗萎縮作用

唾液腺の分泌神経切断による腺組織の萎縮は以前より報告されているが今回副交感神経系の鼓索神経を内在する舌神経の片側切断と反対側のSham Operationを同時に行いこれを対照側として比較した。実験側の顎舌下腺の重量は経時的に減少した(2週間群-14.8±3.4%,4週間群-17.3±9.1%)。これに比較して交感神経系の上頸神経節の切断では腺の有意の萎縮は認められなっかた(4週間群-6.39±11.0%)。さらに両神経の同時切断により腺組織は交感神経切断単独の効果より強い萎縮効果を示した(4週間群-27.3±10.4%)。また、唾液分泌機能の指標としてピロカルピン(1mg/kg)の腹腔内注射による分泌能は増加傾向を示し(15.9±25.2%)感受性が増強したことを示唆する。組織像からはこの萎縮が腺房細胞に主に起因していることが示唆された。一般的に副交感神経末端における神経伝達物質はアセチルコリンでムスカリン受容体を介すると考えられその特異的作働薬のベサネコール(3mg/kg)を舌神経の切断後4週間1日1回腹腔内に投与し抗萎縮効果を検討した。またβ-アドレナリン作働薬のイソプロテレノールを唾液腺の肥大を惹起しない微量(0.1mg/kg)を同様に投与した。ベサネコール単独投与群では腺組織重量の減少は変化しなかった。(-14.5±7.8%)。しかし唾液分泌量は実験側では非投与群に比較し増加傾向がみられた(302±72vs416±229ul/30min)一方対照側では逆に抑制傾向を示した。これは継続的ムスカリン様作働薬の投与による脱感作の影響が健側で現れたものと思われる。イソプロテノール単独投与群で実験側の増強傾向が最も顕著であった(547±138ul/30min)。以上のことから神経切断による腺組織の萎縮に対し分泌神経の刺激に代わり神経伝達物質の継続的投与を適切にコントロールすることにより唾液分泌能の維持は可能ではないかと思われる。
近赤外差動型レーザー誘起表面変位顕微鏡の開発と単一生細胞レオロジー計測への応用

生きた細胞1個のレオロジーを非破壊・非接触で計測するために、近赤外レーザー誘起表面変位(NIR-LISD)顕微鏡を開発した。LISD法によって、細胞の動的な緩和応答を観測可能な最大周波数が、従来法である原子間力顕微鏡やオプティカルストレッチャーでは1 kHz程度だったのに対し、300 kHzまで拡張することで、LISD法によって正常細胞とがん細胞の区別ができる可能性が示された。可視光を細胞に照射するときは、光による熱損傷を注意する必要があったが、近赤外光を用いることで熱損傷が軽減された。さらに、検出を反射型配置にすることによって、細胞1個からの動的粘弾性パワースペクトルの計測に成功した。開発初年度である本年度は、近赤外レーザー光源を用いて生きた細胞1個の表面変位を誘起・検出する顕微計測装置の設計・開発を行った。レーザー照射による細胞の熱損傷を軽減するため、初めに近赤外波長変換フェムト秒パルスレーザー(パルス幅:140fs、繰り返し周波数:80MHz、680nm1080nm)を励起光源として用い、テトラデカンでの表面変位信号の取得を試みた。繰り返し周波数が極めて高いメリットがあるが、一方でパルス幅が極めて短いことで界面が光圧で変形される前にパルス光が照射されない状態になり、有為な界面変形の観測が困難であった。観測できるレベルの界面変形にはある程度のレーザー照射時間が必要であることが分かったため、次に励起光源として近赤外波長変換CW(連続発振)レーザー光源(700nm1030nm)を用い、これをAOMで断続照射とする装置開発を行い基本的な光学設計・配備を完了した。上記と同時に、可視光によるレーザー誘起表面変位顕微計測も進め、粘弾性特性を計測可能な試料の大きさを検討するために、内径1μmの細胞内小器官である芽胞の計測を行った。その結果、芽胞の表面変位の変調周波数依存性(パワースペクトル)の取得に成功し、さらに芽胞を形成する枯草菌細胞との差異も検出した。そのことから従来の原子間力顕微鏡フォースカーブ計測のような接触法では原理的に不可能であった細胞内に埋もれた細胞内小器官の粘弾性計測への道を拓いた。さらに、典型的な細胞骨格を有する繊維芽細胞のパワースペクトルから、細胞骨格の一種である微小管が細胞膜の弾性に寄与していることも明らかにした。従来、微小管は細胞内での物質輸送のレールとしての役割が示されてきたが、初めて細胞膜の粘弾性特性への寄与を明らかにした。近赤外レーザー光源を用いて生きた細胞1個における細胞膜の粘弾性を非接触に計測するレーザー誘起表面変位顕微計測装置の設計・開発を行った。細胞膜に表面変位を誘起するためのポンプ光源として、近赤外波長変換CW(連続発振)レーザー光源を用いた。ポンプ光の波長は、水の吸収の最も少なく熱損損傷を最小限に抑えることができ、さらに生体透過性が高い800 nmを選んだ。音響光学素子を用いてポンプ光の強度を変調させ、プローブ光(633 nm)と同軸に試料に入射し、透過プローブ光の光子密度変化から表面変位を検出した。このときポンプ光を対物レンズ(開口数= 0.65)で絞り、試料に照射することで、水平方向に対して2-3マイクロメートルの空間分解能を達成した。試料として、テトラデカンを用いて信号の検出を試みた。計測原理から、試料界面でポンプ光とプローブ光の両方が合わさった時のみ、ポンプ光強度の変調周波数と同周波数成分をもつ信号が検出されると予想できる。ポンプ光強度の変調周波数を80 kHzまたは100 kHz, 120 kHzに設定し計測を行ったところ、それぞれのレーザー光のみの場合では信号は検出されず、両方の光を照射した時のみ同周波数成分をもつ信号が検出された。さらに、パワースペクトルを計測したところ、変調周波数が120 kHzまでのプラトー領域、120 kHzから500 kHzまでの遷移領域、500 kHz以上の信号が熱揺らぎに埋もれて傾きが-2となる領域という典型的なパワースペクトルが観測された。本スペクトル形状は、これまで開発してきた可視光をポンプ光源とする顕微計測装置の場合と同様であった事から、近赤外光を用いてもパワースペクトルの検出に成功したと言える。このように近赤外光源を用いたレーザー誘起表面変位顕微計測装置の開発に成功し、次年度における生きた細胞1個での計測に向けた基盤を築いた。当該年度は、近赤外レーザーを用いて生きた細胞1個における膜の粘弾性を計測可能な近赤外レーザー誘起表面変位(NIR-LISD)顕微鏡の開発、検出系配置の最適化、さらに細胞からのパワースペクトルの計測を行った。細胞膜に表面変形を誘起するためのポンプ光として、近赤外波長変換CWレーザー(700-1030 nm)を用いた。ポンプ光の波長は、水の吸収が少なく熱損損傷を最小限に抑えることができ、さらに生体透過性が高い800 nmを選んだ。ポンプ光を音響光学素子を用いて強度変調させ、プローブ光と同軸に試料に入射し、プローブ光の光子密度変化からパワースペクトルを検出した。このとき、ポンプ光を対物レンズで絞り、試料に照射することで、4-5 μmの空間分解能を達成した。テスト試料として表皮細胞を用いた。信号の検出方法として、透過プローブ光の広がりを検出する透過型配置と、反射プローブ光の広がりを検出する反射型配置の二通りを検討した。

前者では、ポンプ光強度の変調周波数に対して、信号強度は傾き約-1.0を示し、熱レンズ信号が支配的だった。その原因は、ポンプ光の照射により細胞内に熱が発生したことに依るものと考えられた。そこで、細胞内の熱レンズの影響を受けない反射型配置で検出を試みた。その結果、表皮細胞1個からのパワースペクトルの検出に成功した。また、ポンプ光として可視光を用いたときは、光照射後に、細胞に穴が空いたり、膨らんだりしたが、800 nmの光を用いることで、そのような熱損傷は観察されなかった。このように、NIR-LISD顕微鏡を開発し、検出系を反射型配置にすることで、細胞1個からのパワースペクトルを取得できた。また、近赤外光を利用することで、細胞の熱損傷の軽減を確認した。近赤外を用いて、細胞分裂や細胞移動における膜の粘弾性の変動を、細胞が生きたまま長時間追跡可能な新たな計測装置の基盤を築いた。生きた細胞1個のレオロジーを非破壊・非接触で計測するために、近赤外レーザー誘起表面変位(NIR-LISD)顕微鏡を開発した。LISD法によって、細胞の動的な緩和応答を観測可能な最大周波数が、従来法である原子間力顕微鏡やオプティカルストレッチャーでは1 kHz程度だったのに対し、300 kHzまで拡張することで、LISD法によって正常細胞とがん細胞の区別ができる可能性が示された。可視光を細胞に照射するときは、光による熱損傷を注意する必要があったが、近赤外光を用いることで熱損傷が軽減された。さらに、検出を反射型配置にすることによって、細胞1個からの動的粘弾性パワースペクトルの計測に成功した。本年度は、水の吸収の少ない生体の窓である800 nmの近赤外光を用いてレーザー誘起表面変位顕微計測装置の光学系を構築し、液体表面からのMHz帯域までのパワースペクトルの検出に成功した。また、開口数0.65の対物レンズを用いてポンプ光を絞って試料に照射することで、焦点面水平方向で2-3 &#61549;mの空間分解能を達成した。このように近赤外レーザー誘起表面変位顕微計測装置の開発により、細胞膜の粘弾性を細胞が生きたまま長時間追跡する事や組織深部に埋もれた細胞の粘弾性特性の計測を可能にする新しいツールを提供することが期待できる。一方、近赤外レーザーによって誘起された表面変位のプローブの方法は、次年度の検討課題として残った。現行は、試料を透過したプローブ光の光子密度変化を計測しているが、細胞のような内部に小器官のような構造体を有している試料では、プローブ光が散乱され、細胞膜の変位に起因した信号が効率的に得られない可能性がある。そこで透過ではなく試料表面で反射したプローブ光の光子密度変化の検出が今後の目標となる。以上を統合すると、近赤外光を用いたレーザー誘起表面変位顕微計測装置を開発し、液体表面のパワースペクトルの検出に成功したものの、実際の細胞の計測に対しては光学系の改善必要箇所が明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。分析化学現行の透過型配置での計測、さらには反射型配置の設計および計測を、細胞1個に対して集中的に行う。とりわけ、反射型配置の構築では、ポンプ光として近赤外光を用いたことによるプローブ光との焦点位置の深さ方向のずれ(収差)の補正を行い、同じ焦点位置に集光させる必要がある。さらに、試料の表面変位の絶対値を定量評価するために、差動型光学配置を導入し干渉光強度の計測を行う。
塩挙動の解析に必要な土壌物理定数に関する研究

塩挙動を解析するには土壌水の挙動も同時に考えねばならない。したがって、本研究において取りあずかった土壌物理定数は主として塩挙動の解析に必要な分散係数であるが、その他にも不飽和透水係数,水分拡散係数,土壌水分特性曲線(pF水分関係)を取りあげた。これらの土壌物理定数の決定評価には多くの因子が影響し、たとえ同一土壌であっても一つの値で以てそれを決定評価することは出来ない。不飽和透水係数,土壌水分特性曲線については砂丘圃場を対象として現位置状態での土壌水分吸引圧測定とその値を利用しての算定を試み、砂丘畑での測定には気温,地温の温度が大きく影響することを明らかにし、これを考慮した補正式を提案して、これを基にした不飽和透水係数算出を試みた(研究発表の記載論文を参照)。また、これらの土壌物理定数の値と塩濃度(NaCl,Ca【Cl_2】を使用、SAR値0,10,∞)との関係について、砂丘土,マサ土を使用し、主として遠心法により塩の影響を実験検討したが、その影響による相異は見られなかった。塩挙動の解析には土壌の分散係数が必要となる。しかし、分散と拡散との用語の定義に混乱がみられ、これが塩挙動解析の基礎式に関係し、用語の定義の整理が必要である。この整理を試み、マサ土を使用して塩濃度(前述)による分散係数の測定を行った。定常法によるBreakthrough Curveの解析と非定常法のSmiles etal.法により行った。その結果は間隙水速度を変数とする指数曲線として整理,評価することが出来るが、結果には同一土壌であっても土壌中の水分状態,飽和,不飽和の状態が影響し、また測定上の問題として土壌柱の長さ、排水量測定時間の長短,カラム上の水深などがあり、これらの問題解決が必要である。今後、これらの点を実験検討する予定である。
炭素－水素結合活性化反応の機構研究に基づいた新触媒の開発とπ共役分子合成への展開

前年度までに開発したシクロメタル化錯体触媒による2ーフェニルピリジンとトリエチルシランとの触媒的脱水素シリル化反応に加えて、ベンジルアルコール誘導体の酸化ーシリル化反応による2-(トリメチルシリル)ベンズアルデヒドのワンポット合成に成功した。また、各種分光学的手法を用いて、ベンジルアルコール類の酸化とともに反応系中に添加するアミンとの反応によってイミンが形成した後にシクロメタル化錯体を与えることで、ベンジリデンイミン由来のシクロメタル化錯体が生成することを明らかにした。さらに、オルト位にケイ素置換基を導入したベンズアルデヒド誘導体を原料としてWittig反応を行うことで汎用高分子であるポリスチレンの合成原料であるスチレンモノマーの官能基化を短工程で達成した。このように、触媒的脱水素シリル化反応を用いることで従来は合成に多段階を要していたシリル化アルデヒドやシリル化スチレンを環境調和型手法により合成することに成功し、シクロメタル化錯体触媒の応用として顕著な研究成果が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。シクロメタル化錯体を触媒として2-フェニルピリジンとトリエチルシランを過剰量加えることで触媒的な脱水素シリル化反応が進行することを見出した。触媒反応に用いた基質と錯体との反応を段階的に行うことで、各反応において生成する反応中間体を分光学的手法を用いて明らかにするとともに、反応失活種については単離を行うことで、触媒反応メカニズムの全体像を解明した。また、反応メカニズムにおいて、ペリミジンカルベン配位子のフェニル部位がイリジウム金属中心と可逆的なシクロメタル化と脱離を繰り返す"Hemilabile"な配位子として作用することを初めて明らかにした。配位子がシクロメタル化したモノアニオン性配位子として配位している場合には、金属中心周りが非常に混みあって生成物の脱離を促進する一方、金属上のヒドリド配位子のアクセプターとして作用して中性配位子へと戻ることを重水素化したトリエチルシランを用いた実験により直接確認することにも成功した。Hemilabileなカルベン配位子を有するイリジウム錯体を触媒とする脱水素シリル化反応の開発に成功した。さらに、ベンジルアルコール誘導体のシリル化反応を検討したところ、ベンジルアルコールの酸化とオルト位の脱水素シリル化反応が連続的に進行し、2-(トリメチルシリル)ベンズアルデヒドがワンポットで得られることを見出している。更なるC-H結合活性化反応を開発するために、酸化還元特性を有する配位子を導入した種々の金属錯体の合成を行う予定である。ピンサー型配位子を有するMn, Fe, Ni, Cu等の第一周期遷移金属を新たな触媒候補に考えている。研究の第一段階として、これら錯体の合成と炭化水素に対する反応性の初期検討を行う。その後、C-H結合活性化反応の反応条件の最適化を行うとともに、シリル化を主眼に置いた炭化水素の官能基化反応を検討する。
血管新生における内腔圧の相反する機能とその制御メカニズムの解明

血管新生は、既存の血管から血管枝が出芽・伸長し新たな血管網を構築する現象であり、生体システムの形成・維持・破綻と密接に関連する。申請者らはこれまで、ゼブラフィッシュを用いた蛍光イメージングにより、「創傷治癒における血管新生では、内腔圧が血管伸長を負に制御していること」、一方、「腎臓の糸球体発生における血管新生では、内腔圧が血管伸長を正に制御していること」を発見した。これら発見は、“生体において内腔圧は状況によって血管新生を真逆に制御している"ことを示す重要な知見である。本研究では、内腔圧が血管新生を正・負に制御する機構とその生物学的意義を解明し、血管新生制御機構に関する新たな概念を提唱する。
足底装具（インソール）によるスポーツパフォーマンスへの効果の解明

インソールのスポーツ動作への効果に関する科学的エビデンスは極めて限られており、これまでにバランステスト等に対する効果を認める研究報告はあるものの、実際のスポーツの場面で求められる大きな筋力発揮やダイナミックな動作との間には大きな隔たりがあり、これを以てインソールのスポーツ動作への効果とするには大きな理論的飛躍がある。本研究は、最大発揮筋力及びダイナミックなスポーツ動作に対するインソールの直接的な効果を検証するものである。本研究は大きく3つの研究から成り、今年度(研究1)は、インソールの最大発揮筋力(背筋力)への効果を明らかにすることであった。健常な男子大学生30名を対象とし、足型3Dスキャン測定装置を用いて静止立位時の足部形状を測定した後に、そ足底圧測定装置と背筋力計を組み合わせた装置を用いて背筋力および背筋力発揮時・静止立位時の足底圧分布を計測した。なお、実験は裸足と2種類の形状の異なるインソールAUTOインソール・DELTAインソール)で行った。その結果、DELTA条件は他の2条件と比較して有意に高い最大背筋力値を示した(p<0.01)。さらに、このインソールに対する明確なレスポンダー群(R群)と非レスポンダー群(NR群)が存在することを確認した。群間で比較したところ静止立位時の裸足条件時踵骨角度に関してNR群はR群と比較して有意に(p<0.01)内反位にあった。この成果は、これまで不明だったインソールのスポーツ動作への効果に関する新しい科学的エビデンスであり、さらにその効果には足部のアライメントが関与していることを強く示唆するものである。当初の計画通り、今年度に計画していた研究を遂行し、新たなエビデンスを得ると共に研究を発展させうる重要な示唆を得ることができた。本成果の一部は、すでに国内学会および国際学会で公表済みであり、今後も国際学会における公表を予定している。次年度(研究2)は、前年度の結果を受けて、インソール装着が正の効果を生むレスポンダー群と効果がない非レスポンダー群に対してより詳細な足部の形状の3次元スキャンからインソールの効果と特有の足部形状との関係を明らかにし、どのような足部のマルアライメントがインソールの効果に影響を与えているかを明らかにするとともに、最大背筋力発揮中にインソールが足部のマルアライメントをどのように修正しているかについて研究を進める予定である。次年度使用額が生じた理由は、購入した物品:背筋力及び足底計測器同期計測システムにかかる費用を当初の予定より抑えることができたためであり、この費用を翌年度の物品購入費に充てる予定である。
NMDA受容体の構成的活性の検出と解析

持続的長期増強成立時のPSD再構成に関わる新規合成蛋白質Homer1aの樹状突起からスパイン内への輸送を解析し輸送系を二つ見出した。活動依存性経路はNMDA受容体チャネル活性とPKG依存的にHomer1aを輸送したがEGFPの輸送には関与しなかった。一方、D-セリン経路は、活動依存的経路の阻害下でもD-セリンによりEGFPとHomer1aの輸送を起こした。Dーセリン拮抗薬やケタミンが阻害したがDーセリンがこれらによる阻害を解除した。NMDA受容体とスパイン内輸送系に関わるタンパク質がD-セリン依存的に結合することでスパイン内タンパク質輸送を可能にしていると考えられた。1. EGFP融合Homer1a(HE)を用いた光退色後蛍光回復(FRAP)法によりスパインへのタンパク質輸送を直接観察し予備実験の結果を確認した。FRAPにはシナプス活動に依存する成分と、常に作動しシナプス伝達に依存しない自発成分があり、自発成分はNMDA受容体D-セリンサイト拮抗阻害剤DCKAで阻害され、D-セリンで促進される。2. FRAPの両成分の関係を調べた結果、活動依存的に活性化されるプロテインキナーゼGが樹状突起輸送中のHEタンパク質をD-セリン依存性スパイン内輸送系に振り分けることが示唆された。HEタンパク質のスパイン内輸送系をD-セリンが調節するという申請時の仮説が支持された。3. D-セリンの作用標的分子を薬理学的に検討した。D-セリンは小脳ではデルタ2受容体に作用するが、海馬ではデルタ2受容体が発現しないのでNMDA受容体に絞って検討した。NMDA受容体にはサブユニット1-3があり、生理的アゴニストはグルタミン酸(サブユニット構成1/2)かグリシン(同1/3)である。D-セリンとグリシンはサブユニット1の同じ部位に結合する。サブユニット1阻害薬(DCKA、CGP78608、TPEN)は自発FRAPを阻害した。イフェンプロジル、AP5、Ro256981、MK801及びサブユニット3特異的阻害薬TK30は無効だった。グリシンは自発FRAPを部分的に阻害した。以上から、D-セリンはNMDA型グルタミン酸受容体(サブユニット1/2)に作用し、イオンチャンネル型受容体としての機能とは別の方法でFRAPにおけるスパイン内輸送を起こすことが示唆された。【目的】ラット海馬初代培養神経細胞単一スパインに光退色後蛍光回復(FRAP)法を適用して、樹状突起からスパインへのタンパク質輸送を直接観察し、EGFPとHomer-1a・EGFP融合タンパク質(H1aEGFP)での仕組みを比較した。昨年度までに、FRAPにはシナプス活動依存成分と、シナプス伝達に依存せずNMDA受容体D-セリンサイトを介して調節される成分の二つがあるという本課題の仮説を支持する結果を得たが、両成分のシナプス活動依存性の差をより明確にするために更に薬理学的検討を行った。【結果】H1aEGFPのスパイン移動のシナプス活動依存性成分はPKGの活性化が必要かつ十分であること、EGFPはこの成分の調節を受けないことが分かった。即ち、PKG阻害でH1aEGFPのFRAPは起きず、PKG活性化に必要なNMDA受容体、細胞外カルシウム、一酸化窒素合成酵素等の阻害下(FRAPは起きない)でPKGを直接活性化するとFRAPが起きた。一方で、NMDA受容体GluN1サブユニットD-セリンサイト拮抗薬DCKAはH1aEGFP及びEGFPのFRAPを両方とも阻害した。また、DCKAはPKG活性化剤を用いた直接活性化によるFRAPも阻害した。このDCKAの標的はNMDA受容体GluN1であると考えられる。ウエスタンブロッティングや免疫沈降による分子間相互作用解析の条件検討を開始した。【意義・重要性】これらの結果から、樹状突起からスパインへのHomer-1aタンパク質輸送機構には、シナプス活動依存性成分と非依存性成分があり、前者はNMDA受容体チャネル活性依存的なPKG活性化がH1aEGFP特異的に行い、後者はH1aEGFPとEGFPに共通で、シナプス活動に依存しないがDCKA感受性である。NMDA受容体構成的活性がD-セリン結合部位依存的スパイン内輸送として初めて実証された。ラット初代培養海馬神経細胞に発現させたHomer-1a・EGFP融合タンパク質(H1a-EGFP)を樹状突起からスパイン内に輸送する仕組みを調べるうちに、NMDA受容体チャネル活性に依存した輸送調節の他に、イオンチャネル活性を介さないNMDA受容体依存的な仕組みを示唆するデータを得た。このNMDA受容体の構成的活性の実在を検証し、分子的な仕組みの解明を通じて、種々の精神疾患で見られるシナプス後部分子構成の異常の原因の理解につなげることが本研究課題の目的である。FRAP法を用いてH1a-EGFPの樹状突起からスパイン内への輸送の仕組みを精査し、NMDA受容体構成的活性の薬理学的な検索とリガンド結合の有無で相互作用の変化するタンパク質の生化学的手法による同定を試みた。これまでに、H1a-EGFPの単一スパインでのFRAPにはNMDA受容体チャネルを介したカルシウム流入で始まりプロテインキナーゼG(PKG)の活性化が必要十分である活動依存的な仕組みと、カルシウム流入によらずにおきるがNMDA受容体のD-セリンサイト拮抗薬やポア部ブロッカーによって阻害される仕組みの二つがあることが分かった。

D-セリンサイト拮抗薬によるFRAPの阻害はD-セリンによって拮抗・解消されたが、PKGを直接活性化してもFRAPは再開しなかった。NMDA受容体のリガンドで調節されるがチャネル活性に依存しない輸送活性がNMDA受容体の構成的活性として実在すると結論した。生化学的手法によりGluN1サブユニットとスパイン内輸送系との間の相互作用を検出する試みを行い、リガンドによって相互作用が変化するタンパク質を検出したので更に検討を進めている。ラット海馬初代培養神経細胞に異所性発現させたH1a-EGFPの樹状突起からスパインへの輸送を直接観察するために、単一スパインにレーザーを照射して蛍光を退色させた後の輸送による蛍光回復を測定する方法(光退色後蛍光回復法=FRAP)を開発した。シナプス活動依存性のH1a-EGFPのFRAPは、自発発火等のシナプス活動によるNMDA受容体依存性カルシウム流入、一酸化窒素、サイクリックGMP、PKG活性化のカスケードにより起きた。カスケード各ステップの阻害剤を1-2時間投与するとH1a-EGFPのFRAPを阻害したが、EGFPのFRAPは阻害しなかった。長期投与の必要性からPKGの効果が持続性と思われる。阻害の後、直接PKGを活性化するとFRAPが回復するのでPKG活性化が必要十分である。一方、構成的輸送調節はこれと異なる特徴を持っていた。1)カルシウム流入を必要としない、2)EGFPのFRAPにも必要である、3)NMDA受容体GluN1サブユニットD-セリンサイト拮抗薬DCKAやCGP78608、及び同受容体ポア部近傍に作用するとされる解離性麻酔薬ケタミンは、20分程度の短期間の投与でH1aEGFP及びEGFPのスパイン移動を阻害し、これらの阻害剤の存在下ではPKGの直接活性化によってもFRAPは起きない。このように、シナプス活動依存性と非依存性の二つの輸送調節があることが明らかになった。NMDA受容体ポアブロッカーMK801は両経路に影響があると思われる。二つの仕組みの関係はまだ不明確である。NMDA受容体と輸送系の相互作用をウエスタンブロッティングや免疫沈降による分子間相互作用解析によって検討し、DCKAにより相互作用が変化するものを検出したが同定には至っていない。長期記憶形成時には、神経細胞体で新規合成されたシナプスタンパク質を、輸送中の樹状突起からシナプス後部スパインに移動させる仕組み(シナプスタグ)が働く(Okada et al., 2009)。初代培養ラット海馬神経細胞でのHomer1-aタンパク質の移動をFRAP法により直接観察した。シナプスタグを起こすにはNMDA受容体チャネル活動下流のcyclicGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)によるリン酸化が必要十分だったが、他にNMDA受容体チャネル活性が不要の移動成分も発見した。両移動成分の分離と構成的移動成分の仕組み解明が本年度の目的である。構成的移動は、TTX、AP5、PKG阻害剤等でシナプスタグ活性を消去後にも見られ、NMDA受容体NR1サブユニットのD-セリン拮抗薬のジクロロキヌレン酸とCGP78608、解離性麻酔薬ケタミンで阻害された。D-セリンはこれらの阻害剤存在下でも移動を起こしたがPKG活性化薬は無効だった。