hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
まちづくりと連動する地域貢献学習システムの開発

米国等の海外で実施されている地域貢献学習(サービス・ラーニング)の先進的な事例の調査を行った。その結果、地域貢献学習を実施する上での大学の体制、教員や学生の活動の傾向等を明らかにした。一方で日本国内においても、先進的な事例について調査を行い、我が国における地域貢献学習の現状を把握した。これら二つの調査を統合し、我が国で地域貢献学習を普及するための方法について考察した。注釈)本研究は、3年度にわたる研究を予定していたが、研究代表者の海外留学のために2008年度の1年間で研究を終了した。ここに研究成果をまとめているが、2010年度から研究を再開したいと考えている。本研究は、我が国におけるまちづくりが着実に深化しつつあるという状況を基盤としながら、米国等で行われているサービス・ラーニングの仕組みを参考にして、我が国における学生教育・市民教育の方法を向上させる「地域貢献学習」システムを開発することを目的としている。研究の初年度は、(1)米国等の海外で行われているサービス・ラーニングの実態調査を行い、いくつかの先進的な事例を通じて得られる情報をもとに、その要点を明らかにする。(2)我が国で行われている大学のまちづくり支援から、それがもたらす地域貢献効果と教育効果について、いくつかの先進的な事例を通じて得られる情報から明らかにする、こととした。第1に、海外においては、米国のカリフォルニア州立大学バークレー校、ポートランド州立大学、及びワシントン州立大学といった西海岸の大学を調査した、また、カナダのブリティッシュ・コロンビア大学とオーストラリアの南オーストラリア大学とアデレード大学の取り組みを調査した。結果として、(1)キャンパス・コンパクトと大学教育協会が、米国全体の大学教育の社会貢献を促進していること、またコミュニティ・エンゲージメントと呼ばれるコミュニティ強化の取り組みが盛んであり、これらがサービス・ラーニングの基盤となっている。(2)大学にコミュニティと連携する窓口と実力をもった担当職員が配置されている。(3)学部一年生から参加できるコースが存在する。(4)協定よりも寄付によって大学と地域組織との連携が成立している。こと等を明らかにした。第2に、国内では、東京芸術大学と芝浦工業大学といった東京を中心として地域貢献活動を行っている大学を調査した。結果として、教育コースとしては確立されていないものの、幅広い学生が地域貢献に参加している現状と、市民教育として効果をあげている実態を明らかにした。工学
新生代後期奇蹄目(哺乳類)の研究-陸上古環境の進化データベース-

1.東アフリカ・エチオピア南部コンソ地域で国際学術研究(学術調査)によって採集された前期更新世哺乳類化石3100標本の標本情報を中心とする古環境データベースを完成した。このうち奇蹄目は3科7種に及んだ。これらの解析よりより森林的な環境からより草原的な環境へ変化する様子が復元できた。2.中国西南部雲南省元謀盆地の後期新生代哺乳類化石産出層準の堆積学的検討と花粉分析により当時の古環境変遷を初めて明らかにした。とくに鮮新世から前期更新世に温暖期と寒冷期の繰り返しによる5回の気候変動が認められた。3.北海道朝日町の初期中期中新世奇蹄目化石のクリーニングを行い北米産のバク科化石と比較した結果、新しい種類のバク科の化石であることを明らかにした。このような成果のもとに以下の研究を継続しつつある。1.中国西南部雲南省元謀盆地の後期新生代哺乳類化石産出層準の年代データ(古地磁気、放射年代、生層序など)を加えつつある。2.以上に関連した東南アジアの後期新生代古環境データ(古地磁気、放射年代、生層序、花粉などの微化石、堆積構造との関係、化石の産状など)を文献上で検索しデータベースに加えつつある。これらデータを総合することにより後期新生代のユーラシア東部や東アフリカの陸上古環境データベースを完成させ、他の地域のデータとリンクすることにより、哺乳類の適応放散、動物群の入れ替わりと地球温暖化や草原環境の成立などとの関連も解明したい。
スピン・マルチプレットの磁気光散乱を用いた磁性研究

スピン・ダイマー系と歪んだスピン四面体鎖の磁性を,スピン・マルチプレットの光散乱を用いて研究した。スピン・ダイマー系に関しては,磁場・圧力等の外場により誘起された反強磁性相で,二次のRaman processにより一次のAndersson-Higgs modeが観測される事を,実験・理論の両面で示すことができた。スピン四面体鎖を持つ物質の単結晶試料に関しては,磁気Raman散乱は観測されなかった。平成22年度は相互作用するスピン・ダイマー系KCuCl_3の低温高圧下での光散乱測定を中心として、スピン・マルチプレット系の研究を行いました。その結果、圧力誘起量子臨界点で起こる系の磁気的な状態の変化に対応する異常を観測する事ができました。臨界圧力以上での圧力誘起量子相では、低温で磁気励起に対応するエネルギーに、光散乱ピークが観測されます。そのエネルギー・シフトは他の磁気測定やボンド演算子理論の予言と矛盾の無い圧力依存性を持ちます。ピークの半値幅、すなわち磁気励起の寿命の逆数は、磁気励起のエネルギーに比例します。これは、磁気励起の三次の非線形性に由来するものと解析しました。圧力誘起量子相で光散乱で観測されるのは波数零の有限のエネルギーを持った磁気励起です。その外に零エネルギーから波数に比例したエネルギーを持つgaplessな励起(Golestoneモード)が存在します。光散乱で観測された磁気励起は、三次の非線形性によって二つのgaplessな励起に緩和するのです。この磁気励起の緩和を観測し、緩和機構に理論的な解釈を与えたのは、本研究が始めてです。国際会議で発表を行い、そのproceedingが出版準備中です。また、歪んだ四面体構造を持つ擬一次元量子スピン系Cu_3Mo_2O_9が、8K以下での反強磁性秩序の発現と共に、c軸方向の強誘電性とβ軸方向の反強誘電性を同時に兼ね備えた特異な誘電特性を発現する事を明らかにしました。これは、当該物質がフラストレート・モット絶縁体での電荷再配列効果に起因したマルチフェロイック物質としての性質を持つ事を意味する画期的な結果です。中でも特徴的なのは、この物質の低温相が磁気的な超周期構造を持たないのに強誘電性が実現している事です。この結果を論文にまとめ、平成23年度に投稿いたします。本年度は、歪んだ四面体構造を持つ擬一次元量子スピン系Cu_3Mo_2O_9が、8K以下での反強磁性秩序の発現と共に、c軸方向の強誘電性とa軸方向の反強誘電性を同時に兼ね備えた特異な誘電特性を発現する事を明らかにしました。中でも特徴的なのは、この物質のマルチフェロイック相が磁気的な超周期構造を持たずに実現する事です。この結果の一部は、Journal of the Physical Society of Japan (JPSJ)の原著論文として掲載され、Papers of Editors' Choice賞を受賞し、又JPSJの8、9月のTop 20 Most Downloaded Articlesになりました。この他にも「科学新聞(9/2号)」や「固体物理(2012年2月号)」といった、一般向けの新聞・雑誌等で紹介されました。又、私の実験的な研究を受けて、理論的な研究が連携研究者の松本正茂によってなされました。その結果、スピン・マルチプレットの考え方を、磁性鎖と相互作用するスピン・ダイマー系に拡張する事に成功しました。この結果はJPSJの原著論文として掲載されました。当初の研究目的では「スピン・マルチプレットの考え方の適用限界を知る」としていましたが、この手法は私の予想を超えた幅広く適用可能である事が明らかになりました。Cu_3Mo_2O_9の研究にリソースがある程度の集中したのですが、研究実施計画に記載したKCuCl3の光散乱を用いた測定に関しては、日本物理学会や国際会議(LT26)で発表を行ない、国の内外に研究成果を広めました。我々が光散乱測定で観測している磁気励起は,Anderson-Higgsモードと呼ばれ,種々の物理現象に共通してあらわれる普遍性を持った励起状態であることが明らかになった。TlCuCl3及びKCuCl3の光散乱測定では,この分野の中性子非弾性散乱測定の権威であるスイスPSI研究所のCh. Ruegg教授と議論し,中性子非弾性散乱測定の未公開な結果と比較した。この結果を反映させ,現在論文を作成中である。また,スピン・シングレットと擬一次元磁性鎖が相互作用した磁気構造が期待されるマルチフェロイック物質Cu3Mo2O9と,その磁性を担うS= 1/2のCu2+イオンを,ほぼ同じイオン半径を持つ非磁性不純物Zn2+イオンに置換した(Cu,Zn) 3Mo2O9や,非磁性のMo6+をイオン半径が大きく違く非

磁性不純物W6+イオンに置換した系で光散乱測定を行い,次の知見を得た。・この系では,低温でのフォノン散乱強度の大きな増大が観測された。Zn3Mo2O9ではこの増大が観測されなかったため,この特異な温度依存性は系がS = 1/2のCu2+イオンを含む事に由来する事が分かった。・Zn置換系で,異なる質量のイオンを導入した事による不純物モードが観測された。・低周波数部(約30 cm-1付近)に,特異な振動モードを観測した。8 Kで生じる磁性鎖のスピンが秩序化した事により生じる結晶場により,スピン・ダイマー内の波動関数の混成が期待されたが,光散乱では低温で新しいピークが観測されなかった。この事から,低温での波動関数の混成の度合いが小さい事が分かった。この事は種々の追実験で確認した。これらの結果は国際会議発表で五件,日本物理学会で九件発表し,四件の論文が掲載されている(うち二件は印刷中)。当初の計画では、光散乱という限られた手法を用いてスピン・マルチプレットを研究する事を計画していたが、擬一次元量子スピン系と相互作用したスピン・ダイマー系にスピン・マルチプレットの考え方を適用できる事を明らかにしたことや、マルチフェロイック物質としての性質をスピン・マルチプレットの考え方で記述できるなどの当初計画の想定を超えた結果が得られました。そのため当初の計画以上に進展していると判断しました。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初は光散乱という限定的な手法を用いた研究を計画していました。しかしながら、磁気的な超周期構造を持たずにスピン系に由来した強誘電性が発現するCu_3Mo_2O_9という物質が発見され、この物質の磁気的、誘電的、熱力学的な研究が、本研究の最終目標であるスピン・マルチプレットの考え方を発展させることに直結することがわかったので、次年度はもう少しCu_3Mo_2O_9の研究に重点を置きたいと思います。幸いに実験結果と定量的な比較ができる理論が構築されているので、例えば、強磁場下での磁気測定、誘電測定、分極測定、焦電流測定を行うことで、スピン・マルチプレットの新しい性質を実験的にも理論的にも示せると考えています。
獣医臨床DNA診断の確立

最新の分子生物学的手法を用い、動物の各種疾患のDNA診断を行うことによって正確で効率的な診断法を確立することを目的として以下の項目について研究を行った。遺伝症:ホルスタイン牛の白血球粘着分子異常症(BLAD)においては、CD18遺伝子の128番目のAspがGlyに置換されていることが明らかとなった。黒毛和種牛の血液凝固第XIII因子異常症においてはFXIIIA遺伝子の82番目のPheがSerに置換していることが示された。感染症:オウム病については主要外膜蛋白質の塩基配列を用いたPCRの系を確立した。リケッチアについても同様のPCR診断系を確立した。ネコ免疫不全ウイルスについては,env遺伝子のPCR診断系を確立し、さらにサブタイプの判別が可能となり、病原性の違いによる遺伝子の変異についても検討を加えた。また、牛免疫不全ウイルスのpol領域遺伝子を用いた臨床DNA診断系を確立することができた。腫瘍:犬および猫のT細胞リセプター,免疫グロブリンの遺伝子プローブを用いたサザンブロット法により,リンパ系腫瘍の細胞系統およびクローナリティを判別するDNA診断系を確立することができた。犬の自然発生腫瘍におけるp53遺伝子の変異をPCR-SSCP法によって解析し,悪性リンパ腫,白血病,骨肉腫,大腸癌などの症例において,腫瘍化と密接に関連すると思われる変異を検出することができた。また,ネコ白血病ウイルスの共通組み込み領域および癌遺伝子の異常に関して検討を行い、自然発生リンパ腫症例の11例中5例に異常を見い出し,そのなかでc-mycの異常と他の癌遺伝子群の異常との間に関連性が認められた。個体識別:犬のB細胞株cDNAライブラリーから蛋白質翻訳領域の全長を含む2種のMHCclassIIDRBクローンを得ることができ,これら塩基配列を用いることにより,犬のMHCタイピングが可能となった。遺伝病、感染症、腫瘍、個体識別の4分野において獣医臨床DNA診断の確立をめざして研究を行った。遺伝病-白血球粘着異常症が疑われる牛のPBL・cDNAを用い、CD18遺伝子を増幅するPCRを行ったところ、スプライシング異常および塩基の脱落は確認されなかったが、制限酵素TaqIで処理したところ正常牛と病牛の間でその切断パターンに差異が認められ、本法が有用なDNA診断として利用できることが示された。感染症-オウム病の病原体Chlamydia psittaciの主要外膜蛋白質遺伝子の塩基配列を用い、ウシおよびヒツジからの検出系を確立することができた。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)のプロウイルスDNAを脳炎および骨髄抑制を発症した自然感染ネコの脳、骨髄、リンパ節から増幅し、その塩基配列を解析した結果、これらウイルスの系統樹上の位置を確定することができ、また病原性に関与すると思われる遺伝子の変異を見い出すことができた。腫瘍-イヌのT細胞レセプターβ鎖遺伝子をクローニングし、それをプローブに用いたサザン法によって、リンパ腫細胞の細胞系統およびクローナリティを明らかにし、リンパ腫のDNA診断を確立することができた。ネコ白血病ウイルス(FeLV)の共通組み込み領域、c-myc、bmi-1、pim-1、fit-1に関し、自然発生リンパ腫症例を検討したところ、11例中5例に組み込みが見出され、さらに、c-mycと他の領域との関連性が示された。個体識別-イヌのB細胞株cDNAライブラリーからタンパク質翻訳領域の全長を含む2種のMHCclass II DRBクローンを得ることができ、これら塩基配列を用いることにより、イヌのMHC(DLA)タイピングが可能となった。遺伝病:牛の白血球粘着

分子異常症(BLAD)におけるCD18遺伝子の異常に関与する塩基配列の変異を解析した結果、点突然変異により128番目のAspがGlyに置換されていることが明らかとなった。黒毛和種牛における血液凝固第XIII因子(FXIII)異常症の遺伝子解析を行った結果、FXIII遺伝子の82番目のPheをSerに置換する点突然変異が、本疾患の発症に関与することが明らかとなった。これら両疾患のためのDNA診断系を確立することができた。感染症:牛免疫不全ウイルス(BIV)感染症のDNA診断を行うため、pol領域をnested PCRによって増幅した。その結果、感染牛の末梢血白血球からBIVのプロウイルスDNAおよびウイルスRNAを検出するDNA診断系を確立することができた。リケッチア(Coxiella burnetii)のDNA診断系においては、nested PCR法によるC. burnetiiの検出は、他の検査結果と良く一致し、リケッチアのDNA診断に応用できることが明らかとなった。腫瘍:犬の自然発生腫瘍におけるp53遺伝子の変異をPCR-SSCP法によって解析した。その結果、悪性リンパ腫の1例、単球性白血病の1例、骨肉腫の1例においては2本の異常バンドが、大腸癌の1例において4本の異常なバンドが検出された。塩基配列を決定したところ、悪性リンパ腫の症例ではコドン237、単球性白血病の症例ではコドン191および238、骨肉腫の症例ではコドン182のアミノ酸の変異が確認された。また大腸癌の症例においては、両方のアレル複雑な変異が検出された。これらの変異はいずれもp53の中心的な機能であるDNAの結合に関与する領域に存在し、p53の機能の不活化が予想された。
英語主語位置の通時的推移に関する情報構造論的研究：談話階層言語から命題階層言語へ

本研究では,生成統語論の枠組みで提案された「素性継承パラメタ」仮説に基づいて英語の主語位置の史的推移について実証的に調査するとともに,その変化を駆動するメカニズムを説明することを目指した。その結果,以下の点が明らかとなった。(i)古英語から初期中英語では主語の情報ステイタスに基づいて2つの統語位置が主語に対して利用可能であった。(ii)上位位置と下方主語位置がともに下方に推移した結果,後期中英語から初期近代英語にかけては,2つの主語位置が自由変異となった。(iii)後期近代英語以降は,主語の統語位置が1つに統合された。またこの分析の妥当性を他の通時的変化や共通時的変異によっても検証した。本研究の目的は,後期中英語から初期近代英語における主語位置の通時的・共時的変異に対して情報構造がどのように関与したかを明らかにすることである。この目的の達成のため,26年度は中英語において2つの主語位置が情報構造上どのように使い分けられていたかを明らかにすることを計画した。それに対する成果の概要は以下の通りである。まず,中英語から近代英語にかけて主語位置がどのように推移したかを通時的コーパスの調査により明らかにするとともに,近年の極小主義の理論的枠組みに基づいて分析を行うことができた。具体的には,初期中英語において2つの統語的位置が主語の情報ステイタスによって使い分けられていたのに対して後期中英語でそのような機能的役割分担が消失し,さらに近代英語期には主語を認可する統語的位置が1つに収束したことを明らかにした。この一連の変化は,異なる機能範疇主要部を占めていた数と人称の一致素性が下方推移しながら統合されていったというNawata (2009)の提案から予測されるものであり,主語は一致素性とともに文構造を通時的に下降していったことになる。またこの分析の帰結として以下の経験的・理論的帰結を得ることができた。第一に,他のゲルマン系言語でしばしば観察される他動詞虚辞構文が後期中英語に出現して近代英語期中に消失した理由についても自然に説明できることを示した。第二に,豊かな一致形態素の存在が顕在的動詞移動を一方向的に含意するというBobaljik (2002)の一般化に対してより妥当な説明を与えることができることを示した。この目的の達成のため,27年度は主語位置が後期中英語(LME)から初期近代英語(EModE)にかけてどのように変遷したかを明らかにすることを計画した。すでに26年度において他動詞虚辞構文がLMEからEModEの限られた期間にのみ認可されたという事実から後期近代英語(LModE)までどのようにして主語位置が統一されたことを説明したが,その具体的な位置まで特定するには至っていなかった。そこで本年度は他動詞虚辞構文と同じくLMEからEModEにかけて散発的に観察されたS-not-V型否定文がどのように認可されたか,そしてそれがLModEまでになぜ消失したかを考察し,結果として主語位置がFinP指定部ではなくTP指定部に推移したことを実証的・理論的に明らかにした。また,本研究を通して理論的な仮説として採用している仮説と手法を近接領域へと応用することで,本年は以下の2点の成果を得ることができた。第一にLModEまでに多くの定形動詞がV-to-T移動しなくなり否定文でdo支持を受けるようになる中,knowやbelieveなどの一部の動詞がdo支持に抵抗を続けたことが知られている(残留動詞移動)。この現象は現行の極小主義理論のもとでは説明の難しい問題であったが,主要部移動を動詞の豊かな一致形態素によって駆動されるものと(空の)否定接辞形態素に駆動されるものに二分し,後者が統語部門ばかりでなく音韻部門でも適用されうると仮定することで残留動詞移動現象の説明を試みた。第二に本研究で採用した英語の左方周縁部の構造を日本語の右方周縁部にも適用することにより,日本語の類似した4種類の補文標識「て」「って」「と」「っと」の構造および機能の違いを記述・分析した。当初の研究計画では,27年度は「後期中英語から初期近代英語にかけての主語位置の変遷を記述・説明する時期」として位置づけられていた。研究実績の概要に記したとおりこの計画の目標はほぼ達成され,さらにその成果を近接領域にまで応用することができたことから,本研究の仮説の妥当性が大筋において妥当であることが示された。したがって本研究は全体として「おおむね順調に進展している」と判断される。本研究の目的は,英語史における主語位置の通時的・共時的変異に対して情報構造がどのように関与したかを明らかにすることである。当初の計画で最終年度にあたる28年度は,本研究の主題とそれに関連する現象について,以下の成果を報告した。「英語主語位置の通時的下方推移分析」(『コーパスから分かる言語変化・変異と言語理論』所収)では,英語主語位置の通時的変遷を3つの時期に分けて分析した。提案した分析によれば第I期は古英語から初期中英語であり,この時期には主語はTopP指定部またはFinP指定部を占めていた。

これら2つの主語位置は異なる情報構造上の役割を担っており,前者が旧情報を表す代名詞主語および定名詞句主語によって,後者が新情報を表す不定名詞句によって,それぞれ占められていた。また第II期は後期中英語から初期近代英語であり,この時期には主語はFinP指定部またはTP指定部を占めていた。第I期と異なり,これら2つの主語位置は機能的に等価であり,主語の情報構造上の役割とは無関係に任意に使い分けられていた。最後に第III期は後期近代英語以降であり,主語位置はTP指定部に統一された。英語主語位置の通時的推移は動詞移動の消失と期を一にして進行したが,後期近代ではknow, believe, care, doubtなど一部の動詞が動詞移動の消失に抵抗し,否定文においてnotの前に置かれることがしばしばあった。この問題について扱ったのが「I knownot whyー後期近代英語における残留動詞移動ー」(『文法変化と言語理論』所収)である。この論文では動詞移動の駆動因として動詞屈折接辞と否定接辞の2種類を仮定し,後期近代英語以降,否定接辞によって駆動される動詞移動が「二重詰めNegPフィルター」の違反を生じさせ,これを回避するために音韻部門でのNeg-to-T移動が適用された,と論じた。当初の研究計画において,28年度は主語位置の変遷が同時期に観察される他の統語変化にどのような影響を与えたかを理論的に解明するとともに,英語が談話階層型言語から主語卓立型言語へと変化した過程を明らかにする時期として位置づけられていた。これらに関係する統語変化のモデルを提示し,論文として発表できたことから,本研究は全体として「おおむね順調に進展している」と判断される。今年度は,英語の史的コーパスPenn Parsed Corpus of Modern British English第2版が2016年にリリースされたのを受けて,前年度までに取り組んできた後期近代英語の残留動詞移動に関する実証的・理論的研究の検証作業を,データ規模を拡大させて行った。初期近代英語において,多くの動詞は文中副詞や否定辞notに先行する語順からこれらの要素に後続する語順へと移行したが,know, believe, doubt, careなど一部の動詞はこの語順変化に抵抗し,否定文において引き続き古い語順を示し続けた。統語的パラメタ変異に基づく従来の分析では,これらの動詞の例外的振る舞いを説明することは難しかったが,本研究では文法化の観点からこの現象の原理的説明を試みた。具体的には,knowなどの動詞は初期近代英語で1人称主語における主観的用法が引き金となって軽動詞としての用法を発達させ,これらが主語の基底生成位置とともに否定を表すNegPよりも上位で基底生成された結果,見かけ上の残留動詞移動現象が生じたことを明らかにした。これは,「疑念」の強い主観的意味を表すdoubtが,know, believe, careに比べていっそう強い抵抗を示したことからも支持される。そうすると,いわゆる動詞移動は単一の統語操作ではなく,統語的・音韻的・語彙的要因が絡み合った複合的な現象として捉えられる。この分析の帰結として,統語的移動に関するかぎり動詞の一致形態素が動詞移動の必要十分条件であるとする「豊かな一致の強い仮説」が支持されることになる。本研究では,生成統語論の枠組みで提案された「素性継承パラメタ」仮説に基づいて英語の主語位置の史的推移について実証的に調査するとともに,その変化を駆動するメカニズムを説明することを目指した。
固形腫瘍に対する遺伝子改変T細胞と腫瘍溶解ウイルスによる複合免疫療法の開発

腫瘍溶解ウイルスの固形腫瘍に対する感染効率を評価するため、GFP強制発現腫瘍溶解ウイルスを作成した。In vitroにおいてこのウイルスが複数の神経芽種細胞株および肉腫細胞株に対し効率よく遺伝子導入されることを、腫瘍細胞表面上のGFP発現をフローサイトメトリー法で評価することにより確認した。このウイルスは、比較的低濃度から、腫瘍細胞にGFPを発現させることが明らかとなった。このため、現在X抗原発現腫瘍溶解ウイルスを作成中であり、ウイルスが完成次第、これらの腫瘍へのin vitroにおける遺伝子強制発現効率につき、フローサイトメトリー法を用いて評価する。また、in vitroにおいて高効率にX抗原を発現させることができれば、担癌マウスモデルを作成し、in vivoにおけるX抗原発現効率についても評価を行う。上記実験と並行して、X抗原特異的T細胞の樹立も進めている。X抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子については、既存のベクターを遺伝子組み換えにより改変することで、新規のキメラ抗原受容体ベクターを完成させた。しかし、新規ベクターの遺伝子導入効率および、T細胞培養後の標的キメラ抗原受容体の発現効率が劣るため、さらなる培養方法の改良が必要と考えられる。このため、現在効率の良い培養法の確立を目指して、理想的なフィーダー細胞の探索や、サイトカインの組み合わせなどを調整している。高効率のX抗原特異的T細胞が樹立され次第、X抗原陽性腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を評価する予定である。In vitroにおける腫瘍溶解ウイルスの遺伝子導入効率は良好であり、X抗原遺伝子導入ウイルスについても同様の効率が期待できる。一方、X抗原特異的CAR-T細胞の樹立には、T細胞培養の効率性を高めるための工夫が必要と思われ、当初の予定よりも時間を要する可能性がある。引き続きX抗原発現アデノウイルスベクターの作成を継続し、完成でき次第、in vitroおよびin vivoでの発現効率について評価を行う。また引き続き、X抗原特異的T細胞の効率の良い培養法の確立に向け、研究を進めていく。X抗原特異的T細胞が樹立され次第、in vitroおよびin vivoにおけるX抗原特異的T細胞の、X抗原陽性腫瘍に対する抗腫瘍効果を評価する。次年度使用額が生じた理由当初計画で見込んだよりも安価に研究が進んだため、次年度使用額が生じた。使用計画次年度使用額は平成31年度請求額と合わせて消耗品費として使用する予定である。
転写因子の核内分解による転写制御機構の研究

コレステロール代謝を制御する転写因子SREBPについて核内分解機構の解析を行った。SREBPは小胞体膜上に膜蛋白質として局在し、N末端側が切断され、この活性型が核へ移行し、核内で転写因子として機能する。この核内活性型は短寿命で、細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると寿命が延びた。興味深いことにプロテアソーム阻害剤による活性型SREBPの安定化は応答遺伝子であるHMGCoA合成酵素mRNA発現を上昇させた。プロテアソーム阻害剤による効果が、小胞体膜上の前駆体の安定化により活性型が恒常的に核内へ移行した結果か、核内の活性型が延命した結果かについて解析を行った。あらかじめ活性型SREBPを一過的に過剰発現するCHO細胞株を樹立し、一過的に過剰発現した活性型SREBPの核内での存在量を阻害剤存在下で追跡した。プロテアソーム阻害剤は核内活性型SREBP量を増大させ、プロテアソームによる活性型SREBP分解機構の存在が示唆された。さらにプロテアソームによる分解を証明する目的で、種々のプロテアソーム特異的阻害剤、同様の効果の見られるシステインプロテアーゼ阻害剤等について分解抑制効果を比較したところ、ALLN、Lactacystinにのみ分解阻害活性が認められた。さらにこの分解系にユビキチン化が関与するか、また分解は核内で生じるのか、もしくは細胞質へ移行した後に起こるかについて検討を行った結果、SREBPはポリユビキチン化修飾を受け、これがプロテアソームによる分解のシグナルとなり、また分解は核内で起こることが確認された。以上の知見は、コレステロール代謝、脂肪酸代謝を制御する転写因子の核内での活性調節にユビキチン-プロテアソーム系が関与することを明らかにした初めての証拠である。核内分解に先立ち、SREBPの小胞体から核への移行機構について解析を行った。リコンビナントSREBP-2(活性型)を調製し、ジギトニン処理をしたHeLa細胞を用いて核輸送実験を行った。SREBP-2は細胞質を加えた条件下で、温度依存的に核へ輸送され、またこの輸送はATPを必要とし、WGA(Wheat Germ Agglutinin)処理により核への輸送は阻害された。このSREBPの核輸送が、SV40T抗原の核移行シグナル(NLS:Nuclear Localization Signal)を介した輸送機構と同一か否かを明らかにする目的で核移行シグナルを付加したアルブミンを過剰に加え、阻害効果を観察した。核移行シグナルを付加したGFP(Green Fluorescent Protein)の核輸送は過剰量の核移行シグナル付加アルブミンにより阻害されたが、SREBP-2のそれは阻害を受けなかった。さらに、結合実験から、SREBP-2は核移行シグナルと結合するlmportin αとは結合しないことが明らかになり、lmportin α/βとの複合体を形成して核輸送される核移行シグナル含有蛋白質とは異なる機序で核輸送されることが推察された。

あらかじめ活性型SREBPを一過的に過剰発現するCHO細胞株を樹立し、一過的に過剰発現した活性型SREBPの核内での存在量を阻害剤存在下で追跡した。プロテアソーム阻害剤は核内活性型SREBP量を増大させ、プロテアソームによる活性型SREBP分解機構の存在が示唆された。さらにプロテアソームによる分解を証明する目的で、種々のプロテアソーム特異的阻害剤、同様の効果の見られるシステインプロテアーゼ阻害剤等について分解抑制効果を比較したところ、ALL N、Lactacystinにのみ分解阻害活性が認められた。現在は、この分解系にユビキチン化が関与するか、また分解は核内で生じるのか、もしくは細胞質へ移行した後に起こるかについて検討を行っている。コレステロール代謝を制御する転写因子SREBPについて核内分解機構の解析を行った。SREBPは小胞体膜上に膜蛋白質として局在し、N末端側が切断され、この活性型が核へ移行し、核内で転写因子として機能する。この核内活性型は短寿命で、細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると寿命が延びた。興味深いことにプロテアソーム阻害剤による活性型SREBPの安定化は応答遺伝子であるHMGCoA合成酵素mRNA発現を上昇させた。プロテアソーム阻害剤による効果が、小胞体膜上の前駆体の安定化により活性型が恒常的に核内へ移行した結果か、核内の活性型が延命した結果かについて解析を行った。さらにプロテアソームによる分解を証明する目的で、種々のプロテアソーム特異的阻害剤、同様の効果の見られるシステインプロテアーゼ阻害剤等について分解抑制効果を比較したところ、ALLN、Lactacystinにのみ分解阻害活性が認められた。さらにこの分解系にユビキチン化が関与するか、また分解は核内で生じるのか、もしくは細胞質へ移行した後に起こるかについて検討を行った結果、SREBPはポリユビキチン化修飾を受け、これがプロテアソームによる分解のシグナルとなり、また分解は核内で起こることが確認された。以上の知見は、コレステロール代謝、脂肪酸代謝を制御する転写因子の核内での活性調節にユビキチンープロテアソ-ム系が関与することを明らかにした初めての証拠である。
卵巣の生理と病理へのミュラー管抑制因子の関与

Primerはexon3,4,exon1,3,exon2,3に設定した3種類を作成しRT-PCRをおこなった.さまざまなに条件設定でRT-PCRを行った.結局exon3,4に設定したprimerが最も安定して目的とするバンドが得られることが判明したので,以下の実験を行った.Primerはexon3,4,exon1,3,exon2,3に設定した3種類を作成しRT-PCRをおこなった.さまざまなに条件設定でRT-PCRを行った.結局exon3,4に設定したprimerが最も安定して目的とするバンドが得られることが判明したので,以下の実験を行った.Primerはexon3,4 exon1,3に設定した2種類を作成しRT-PCRをおこなった.種々に条件を変えてRT-PCRを行なったが雑多なバンドが多く、目的とするバンドが得られていない.その原因としてはtotal RNAの劣化、PCRの各段階での条件設定がふさわしくないことが考えられるので、現在検討中である.対象は産婦人科領域で容易に採取可能で、MIを発現していると報告されている、Granulosa cellを用いた。開腹手術時に患者の同意を得て卵胞液を穿刺、吸引し卵胞液中に含まれるGranulosa cellを遠沈により得た。このGranulosa cellをそのまま、あるいはmonolayer cultureにより初代培養したGranulosa cellから、total RNAを抽出した.4種類の卵巣癌細胞株,4つの手術採取採取した卵巣癌組織で同様にtotal RNAを抽出した.Primerはexon3,4 exon1,3に設定した2種類を作成しRT-PCRをおこなった.種々に条件を変えてRT-PCRを行なったが雑多なバンドが多く、目的とするバンドが得られていない。今後はPrimerを新たに作成しMIを検出しやすいRT-PCRの実験系を作る必要がある.Primerはexon3,4,exon1,3,exon2,3に設定した3種類を作成しRT-PCRをおこなった.さまざまなに条件設定でRT-PCRを行なった.結局exon3,4に設定したPrimerが最も安定して目的とするバンドが得られることが判明したので゙、以下の実験を行った.
Runx2コンディショナル欠損マウスを使用した成体間葉系幹細胞の機能解析

組織幹細胞である間葉系幹細胞(MSC)の個体レベルでの性質の多くは謎に包まれている。Runx2コンディショナル欠損マウスを独自に開発し、同マウスでの遺伝学的解析とフローサイトメトリー解析を組み合わせた解析結果から、Prx1とSca1が共陽性なMSCが最も幹細胞性の高いMSCであり、まずSca1陰性となり、次にPrx1陰性なOsterix陽性細胞となり、そして成熟した骨芽細胞となる、という骨形成への分化過程の詳細を明らかにした。つまり、「生体内」でのMSCの細胞生物学的な特徴(どのようなMSCが、どのような系列をたどり、どのような細胞となり、どのような機能を有するか)の一端が見えてきた。間葉系幹細胞は、骨芽細胞や脂肪細胞等への分化能をもつ幹細胞であるが、個体レベル、特に成体での機能の多くは謎に包まれている。この問題を解決するために、MSCが骨芽細胞に分化する過程に必須の転写制御因子Runx2に注目し、特定の時期・細胞にて遺伝子欠損させることのできる、Runx2コンディショナル欠損マウスを世界に先駆けて作製した。本研究では、Runx2コンディショナル欠損マウスを使用して、従来分かっていなかった「成体個体レベル」での、MSCに発現するRunx2の生理的役割・病態生理的役割と、Runx2によるMSCの動態制御機構(どんなときに増殖し、分化するのか?)を分子レベルで明らかとする事を目的としている。本年度においては、解析用のマウス(間葉系幹細胞特異的なRunx2欠損マウス)の作製を開始し、解析用に足りる充分のマウスを得ることに成功した。一部のマウスの解析結果からは、膜性骨化での骨芽細胞分化系譜において重要なMSCの特徴づけに成功した(投稿中)。骨粗鬆症とは、骨吸収が骨形成を上回る状態である。減少した骨量を回復させるには骨形成の活性化が必要であるが、骨形成促進剤の開発は充分に進んでいない。Runx2を全身的に欠損することで骨化が完全に障害されるため、開発したRunx2コンディショナル欠損マウスを使用することで、「どういったMSCでRunx2が骨を作るのに重要なのか?」といった問いに答えを出すことができる。また、「その重要な細胞は、どのような集団を形成しているのか?」といった問題に取り組むことで、骨を作りだすMSCの細胞生物学的な特徴づけができ、骨形成促進剤の開発に有用な情報が得られるのではないかと考えた。従来は、どういったMSCが、前骨芽細胞や骨芽細胞となり、骨形成に関与するのかが分かっておらず、そのため、Runx2が骨芽細胞分化系列のどういった段階で重要であるのかも長らく不明であった。既存の複数のMSCマーカーを用いたマウス遺伝学的解析とフローサイトメトリー解析を組み合わせた解析結果から、その内の2つ、Prx1とSca1が共陽性なMSCが最も幹細胞性の高いMSCであり、まずSca1陰性なり、次にPrx1陰性なOsterix陽性細胞となり、そして成熟した骨芽細胞となる、という骨形成への分化過程の詳細を明らかにした。また、Prx1+Sca1+細胞からPrx1-Sca1-Osx+細胞になる段階までの間に、Runx2が骨形成のうえで必須の働きを持つことが分かった(Takarada et al, Development, 2016)骨形成を担うMSCを個体レベルで特定することに成功した。今後はこの情報をもとに、分化系譜の詳細を分子レベルで明らかとすることが可能である。従来のMSC研究では、骨髄や脂肪組織等から回収した細胞を培養皿上にて増殖させ、その細胞をMSCとして研究に使用している。この実験系では、生体内のMSCの性質が再現しているとは言い難く、MSCの個体レベル(in vivo)での性質の多くは謎に包まれている。つまり、MSCからの各分化細胞への階層性/系譜の分子的理解は、造血幹細胞のそれとは異なり、ほとんど進んでいないと言える。前年度までの成果より、Prx1とSca1が共陽性なMSCが最も幹細胞性の高いMSCであり、まずSca1陰性となり、次にPrx1陰性なOsterix陽性細胞となり、そして成熟した骨芽細胞となる、という骨形成への分化過程の詳細を明らかにした。また、Prx1+Sca1+細胞からPrx1-Sca1-Osx+細胞になる段階までの間に、Runx2が骨形成のうえで必須の働きを持つことが分かった(Takarada et al, Development, 2016)。同定したPrx1+Sca1+MSCから一段階分化したPrx1+Sca1-細胞は、2種類のMSCマーカーにより細分類されることを本年度は突き止めた(未発表)。それぞれの分化段階の細胞をCell sortにより分離し、次世代シークエンサー(HiSeq)を利用したRNAseq解析を行い、各populationにて発現する遺伝子セット情報を得た。遺伝子発現を網羅的に解析することで、細胞系譜の変遷過程における遺伝子発現変化を捉え、各分化段階で選択的・特異的に働く遺伝子の同定や、pathway解析をすることで分化途中の各細胞での重要シグナル経路を理解することが可能である。Runx2コンディショナル欠損マウスを独自に開発し、同マウスでの遺伝学的解析とフローサイトメトリー解析を組み合わせた解析結果から、Prx1とSca1が共陽性なMSCが最も幹細胞性の高いMSCであり、まずSca1陰性となり、次にPrx

1陰性なOsterix陽性細胞となり、そして成熟した骨芽細胞となる、という骨形成への分化過程の詳細を明らかにした。つまり、「生体内」でのMSCの細胞生物学的な特徴(どのようなMSCが、どのような系列をたどり、どのような細胞となり、どのような機能を有するか)の一端が見えてきた。解析用のマウス(間葉系幹細胞特異的なRunx2欠損マウス)の作製を開始し、解析用に足りる充分のマウスを得ることに成功した。明らかとしたMSCの特徴づけの情報を利用し、それぞれの分化段階の細胞をCell sortにより分離することで、in vivoでの分化段階特異的な遺伝子/タンパク質発現、転写制御機構の網羅的解析(トランスクリプトーム、プロテオミクス解析)を実施する。幹細胞医学以下の解析により、従来分かっていなかった、成体個体での間葉系幹細胞が、どのような生理(病態)反応に重要であるのかを検討する。骨代謝表現型解析:脛骨・大腿骨・脊椎における骨密度をDEXA法により解析する。またマイクロCTにより骨構造解析を実施する。さらに、非脱灰薄切標本を用いて骨形態計測(骨構造、骨形成、骨吸収に関するパラメーター測定)を行う。糖・脂質代謝表現型解析:経時的に体重、体温、摂食量、飲水量、尿量、血糖値、ケトン体、中性脂肪、HbA1c、呼吸商(VCO2/VO2)および消費カロリーの測定を行う。また一定期間飼育後、グルコース耐性テスト(GTT)やインスリン感受性テスト(ITT)を行い、耐糖能およびインスリン抵抗性を野生型マウスと比較するとともに、レプチン、インスリン,アデイポネクチン等のホルモンの血中濃度を測定する。さらに、白色・褐色脂肪組織、肝臓、膵臓、筋肉を摘出し、それらの組織重量を測定するとともに、各種糖脂質代謝制御遺伝子の発現をReal-time RT-PCRや免疫染色により検討する。
遺伝子改変マウスを用いたスパインにおけるアクチン制御因子の生理機能解析

本研究では、RhoファミリーGTPaseのRac1およびCdc42の神経細胞における機能を明らかにすることを目的に研究を行った。大脳皮質・海馬特異的な遺伝子ノックアウトマウスをおよび、スライス培養系を用いて、Rac1が樹状突起スパインの制御に深くかかわっていることを明らかにすることができた。本研究成果により、精神遅滞といったヒト疾患の理解が深まることが期待できる。本年度は、昨年度の研究の推進方策に従って、大脳皮質の細胞構築およびスパイン形成におけるmTORシグナルの機能について明らかにすることを試みた。本研究では、細胞外の栄養状態やインスリン刺激に依存せずに高いキナーゼ活性を維持し続ける活性化型mTORを用いて下記の実験を行った。まず、子宮内エレクトロポレーション法によって胎生14日齢の大脳皮質神経細胞に活性型mTORを発現させることによって、大脳皮質の形成におけるmTORシグナルの役割を検証した。その結果、大脳皮質神経細胞におけるmTORシグナリングの活性化によって、神経細胞移動が障害され、細胞のサイズが顕著に増大することを見出した。これらの表現型は、Raptorのノックダウンあるいはラパマイシン投与によってレスキューされることから、mTORC1経路が大脳皮質形成を制御している可能性が示唆された。次に、個体レベルにおいてmTORの重要性を検証するために、Cre-loxP組換え依存的に活性型mTORを発現するトランスジェニックマウスの作製を試みた。Emx1-Creマウスを用いて、終脳特異的に活性型mTORを発現させたところ、成熟マウスにおいて大脳皮質の大きさが著しく縮小することを見出した。この委縮は胎生12日齢において既に認められ、cleaved caspase 3陽性の細胞が数多く観察された。このことから、胎生期におけるmTORシグナルの活性化は神経前駆細胞のアポトーシスを引き起こすことが示された。以上の結果より、大脳皮質形成期においてmTORシグナルは、神経細胞の移動・サイズ制御・生存に重要な役割を担っていることを明らかにすることができた。本年度は、遺伝子操作マウスの個体および脳スライスを用いて、脳および神経細胞の形態形成における低分子量Gタンパク質Rac1およびCdc42の役割について検討した。具体的にはまず、Rac1-floxマウスまたはCdc42-floxマウスをEmx1-Creマウスと交配することによって、大脳皮質や海馬においてRac1あるいはCdc42を欠損したマウスを作製した。これらのマウスの脳をゴルジ染色することによって、大脳皮質・海馬の神経細胞の形態を観察した。その結果、Rac1を欠損した神経細胞において、スパインの数の減少と形態の異常が観察された。一方、Cdc42欠損細胞においては、コントロールと比較して大きな違いは認められなかった。次に、Rac1-floxマウスまたはCdc42-floxマウスより海馬スライスを作製し、ジーンガンによってCre組換え酵素を遺伝子導入することによって、一部の神経細胞においてのみRac1あるいはCdc42をノックアウトした。この解析によって細胞自律的な各分子の機能を明らかにすることができる。海馬スライスを長期培養した結果、Rac1を欠損した神経細胞においてはスパインの形態が非常に細長く、未熟であった。一方、Cdc42を欠損した神経細胞は、コントロールと比較してスパインの数や形態に大きな違いは認められなかった。これらの結果より、Rac1はスパインの形成に重要な役割を担っていることが明らかになったと同時に、RhoファミリーGタンパク質間で神経細胞において機能的な相違があることが示唆された。Rac1の下流分子のPAKは精神遅滞の原因遺伝子であり、この疾患においてはスパインの減少や形態異常が引き起こされることがが知られている。このことから、本年度得られた成果は、疾患メカニズムを明らかにする上で科学的・社会的に重要であると考えられる。交付申請書に記載した研究計画は全て遂行することができたばかりでなく、期待以上の表現型を観察することができた。これらの結果は、ヒトの精神遅滞の症状と酷似しており、疾患メカニズムの解明に向けて、当初の計画以上に進展していると思われる。本年度はこれらの実験に加えて、さらに神経細胞の形態形成の分子メカニズムをつきつめてゆくために、Rac1を制御する因子についての研究にも着手することができた。具体的には、神経細胞におけるエネルギー代謝制御や細胞内小器官の局在制御などが、Rac1の制御に因果関係を持つのではないかと考えて研究を進めている。以上のことから、本年度は当初の計画以上に研究が進展し、実績を出すことができたと判断した。引き続きRac1のスパイン形成における役割の分子メカニズムについて研究を進める。これと同時に、本年度着手したRac1を制御する因子について下記の研究を行う。(1)大脳皮質におけるRac1変異マウスのプロテオーム解析大脳皮質においてRac1関連因子を網羅的に同定するために、終脳特異的Rac1欠損マウスとコントロールマウスとの間で、プロテオームおよびリン酸化プロテオームについて相対定量を行う。

この解析によって、Rac1の欠損によって変動したシグナル伝達経路を同定し、神経細胞における役割を大脳皮質あるいは海馬スライスを用いて明らかにしたい。(2)神経細胞におけるエネルギー代謝制御の解析細胞内のエネルギー制御のハブであるmTORキナーゼは栄養状態に応じてタンパク質合成やタンパク質分解を調節するばかりでなく、下流に細胞骨格を制御する機能を持つ。さらにmTORシグナル経路の破綻が自閉症などの精神疾患を引き起こすことが知られている。栄養やエネルギーが脳の形成やその機能に与える影響は、社会的に高い関心と重要な問題をはらんでいるにも拘らず、未だにほとんど手つかずの分野である。このことから、個体および脳スライスレベルでmTORの機能を明らかにしていきたい。具体的には、活性化型mTOR変異体やノックダウンベクターを、胎児大脳皮質への子宮内エレクトロポレーションまたは海馬スライスへのジーンガンによるトランスフェクションによって導入し、神経細胞や樹状突起スパインの形態に与える影響について明らかにする。この実験によって、神経細胞内のエネルギー代謝が脳や神経細胞間のネットワーク構築に対して、どのように作用しているかを明らかにすることができる。さらに、mTORとRac1シグナルの関連性を明らかにすることによって、精神疾患のメカニズムについてより深い知見が得られると期待できる。(1)次年度使用する研究費が生じた状況本年度は個体および脳スライスにおけるRac1・Cdc42の役割を検討したが、期待以上に早期に有意な表現型を観察できたため、これらの実験に使用する予定であった研究費の一部を次年度のRac1関連分子の同定やmTORキナーゼの解析に使用することとした。計画の一部変更によって次年度使用する研究費が生じたが、これによって神経細胞におけるRac1およびエネルギー代謝シグナルについてより多くの知見を得ることができると考えられる。(2)研究費の使用計画今後の研究の推進方策に掲げた実験を行うための研究費の使途は以下のとおりである。(1)遺伝子操作マウスおよび野生型マウスの飼育経費。(2)脳スライス培養に用いるプラスティック器具。(3)タンパク質発現ベクター・ノックダウンベクター作製のためのオリゴDNAおよび酵素・試薬類。(4)タンパク質発現・局在解析のための抗体。(5)研究成果発表のための国内および海外出張旅費。
ERストレスにおけるタンパク輸送抑制へのrER膜局在三量体Gタンパクの関与

ERストレス時に、ERからGolgi装置へのタンパク輸送が制御されることは予想されていたが、その調節機構は不明であった。本研究ではrER膜局在三量体Gi2タンパクが、ERからGolgi装置へのタンパク輸送は制御することから、ERストレス応答への関与を調べた。三量体Gi2タンパクのノックダウンにより、ERストレスは抑制された。PERKは活性化されていたが、下流のCHOPは活性化されていなかった。またATF6の活性化は抑制されていた。この結果はERストレス応答へのrER膜局在三量体Gタンパクの関与を示し、アポトーシスを調節する新たなターゲットの発見につながると考えられる。ERストレスが起こった細胞において、生成された異常タンパクのGolgi装置への輸送を避けるため、ERからGolgi装置までのタンパク輸送(COPII小胞輸送)は抑制されるが、ER膜上でのCOPII輸送小胞の形成がどのように抑制されるのか、その制御機構は不明であった。平成26年度本研究計画に基づき、ERストレスを惹起された細胞において、COPII小胞を構成するために必要なコートタンパク群のER膜上への集積がどのように抑制されているのかについて解析を行った。ER膜上でCOPII小胞を形成するためには、細胞質からER膜上へと(1)Sar1、(2)Sec23/24、(3)Sec13/31のCOPIIコート構成タンパクが順次移動する必要がある。そこでER膜と細胞質からなるcell free実験系(ミクロソーム結合実験)を用いて、細胞質からER膜へのCOPIIコート構成タンパクの移動を観察した。細胞質局在Sar1タンパクの正常細胞由来のER膜への移動を、tunicamycinおよびthapsigarginによりERストレスを誘導した細胞由来のER膜への移動と比較したところ、正常細胞とERストレス細胞のER膜へのSar1の親和性に違いは認められなかった。また、もう一方の研究計画の項目であるERストレスにおけるCOPII小胞形成へのER膜局在三量体Gi2タンパクの関与の証明については、百日咳毒素により三量体Gi2タンパクを不活化したER膜を用いて上述のミクロソーム結合実験を行ったが、百日咳毒素によるER膜への事前処置の間にER膜へダメージが起きたと考えられ、有効な結果が得られなかった。その為、研究計画を一部変更しsiRNA法による三量体Giα2タンパクノックダウン細胞の作出を試みた。siRNAによるGiα2タンパクの発現レベル抑制効果は60%程度の低下に過ぎず、ミクロソーム結合実験に用いたが、統計上有意な結果を得られていないため、更なる条件検討を行っている。ERストレスが生じた細胞において、ERからGolgi装置までのタンパク輸送(COPII小胞輸送)は抑制されるが、ER膜上でのCOPII輸送小胞の形成がどのように抑制されるのか、制御機構は不明であった。平成27年度本研究計画に基づき、ERストレスを惹起された細胞において、COPII小胞を構成するために必要なコートタンパク群のER膜上への集積がどのように抑制されているのかについて解析を行った。ER膜上でCOPII小胞を形成するためには、細胞質からER膜上へと(1)Sar1、(2)Sec23/24、(3)Sec13/31のCOPIIコート構成タンパクが順次移動する。そこでER膜と細胞質からなるcell free実験系(ミクロソーム結合実験)を用いて、細胞質からER膜へのCOPIIコート構成タンパクの移動を観察する必要がある。抗ラットSar1抗体は市販されているものに適切なものが存在せず、自作を行った。過去に作成し保有しているラットSar1b全長発現プラスミドより、抗原蛋白を得、抗ラットSar1ウサギポリクローナル抗体を作成した。また、もう一方の研究計画の項目であるERストレスにおけるCOPII小胞形成へのER膜局在三量体Gi2タンパクの関与の証明については、siRNA法による三量体Giα2タンパクノックダウン細胞の作出を試みた。ノックダウン条件検討を行い、siRNAによるGiα2タンパクの発現レベルを20%程度に抑制した細胞の作出に成功し、tunicamycin処置によるERストレス誘導を行った結果、ERストレスマーカーであるgrp78発現の有意な抑制が観察されている。また十分な例数を揃えられていないが、ERストレスセンサー経路の中のPERK-IRE1経路の活性化の抑制が起こっていることを示すデータが得られている。平成27年度研究計画の中で、ERストレスによるCOPII小胞形成過程への影響を調べる項目について、COPII小胞コート形成の3段階の過程において、ERストレスの影響を調べる計画であった。現在、3段階の過程の中で最初のステップであるSar1の移動について、今回作成し得られたSar1抗体を用いて十分な例数の実験を行った結果、Sar1の移動についてはERストレスの影響は無いという結果が得られているが。2段階目のSec23/24の移動および3段階目のSec13/31の移動についてはまだ実験が進んでおらず、結論を得ることが出来ない状態である。もう一方の研究計画の項目であるERストレスにおけるCOPII小胞形成へのrER膜局在三量体Gi2タンパクの関与の証明についてはtunicamycin処置ERストレス誘導時に、三量体Gi2タンパクノックダウン細胞においてERストレス応答が抑制されることを見出しており、研究の進捗は順調であると考えている。