hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炭素―炭素不飽和化合物のカルボアミノ化反応の開発

今度の研究を進める上で極めて重要な予備的知見を得ることに成功した。そこで引き続き選択的にエナミン型付加体を与えるカルボアミノ化反応の条件検討を行う。具体的には、スルホニル基を配向基として用いる事により、ニッケルへの酸化的付加の位置制御による選択的付加反応を達成できると考えている。ニッケル触媒を用いたフタルイミドとアルキンの脱カルボニルを伴ったビシナル型カルボアミノ化反応により、イソキノロンが得られることを既に報告しているが、この反応を嵩高いルイス酸であるMAD (Methy lalminium Bis (2,6-di-tert-buthyl-4-methylphenoxido)を添加して行う事により、ジェミナル型カルボアミノ化反応が立体選択的に進行するという事実を新たに見出した。この様なアルキンの同一炭素上にアミノ基と炭素置換基を同時に導入するジェミナル型カルボアミノ化反応は、これまでは実現が困難な課題であったため、他に例がない。本申請研究では、予備的知見に基づき、炭素ー炭素不飽和化合物のジェミナル型カルボアミノ化反応の開発を検討する。具体的には、ニッケル触媒として用いる配位子やルイス酸を検討して、様々な炭素ー炭素不飽和化合物を用いてもジェミナル型カルボアミノ化反応が進行することを明らかにする。また、この特異な分子変換法における反応機構を解明するために、反応中間体として考えられるニッケル錯体の合成単離およびX線単結晶構造解析を実施する。さらに、分子軌道計算による反応機構の考察を行う。
ラット膝関節拘縮モデルによる関節拘縮の病態解明と治療に関する研究

ラットを使用して関節拘縮モデルを作成し,その関節構成体を病理組織学的に観察する事を目的に実験を開始した。関節の固定期間は2週間,4週間とし,2週固定では期間終了後に同期間制約を加えず飼育(以下,再可動群)し,関節構成体の変化を観察した。関節の固定により対照群に対して約30度の伸展制限を生じたが,再可動群では対照群と同様まで回復していた。関節構成体の病理組織学的所見では,大腿骨・脛骨の軟骨表層に線維芽細胞からなる滑膜に類似した膜様の組織が増生している像が観察され,表面に増生した膜様組織が半月板周囲から増生した肉芽様組織と癒着している像が観察された。膜様組織が増生している部分の関節軟骨では,酸性ムコ多糖体染色の染色性低下が認められ,関節の不動化による関節軟骨の多糖類産生能力の低下が示唆された。この変化は,再可動群においても改善は見られなかった。また,関節構成体として膝蓋靱帯下部の脂肪細胞に着目し,細胞の面積を計測した。対照群,固定群,再可動群の順で脂肪細胞の面積には有意な減少を示した。脂肪組織を観察したところ,固定群,再可動群では脂肪細胞の萎縮と共に,周囲に線維性組織の増生が観察され,脂肪細胞の柔軟性の変化が示唆された。関節構成体に対する実験と平行して,不動化に伴う関節拘縮が神経・筋に及ぼす影響を検索する目的で,大腿後部を走行する坐骨神経を観察したところ,固定群では対照群と比較して神経周膜・神経外膜を構成する線維の狭小化及び密生化が観察され,神経外膜の脂肪細胞が萎縮し,線維芽細胞が増殖していることが観察された。これらの所見は,神経の滑走性の変化を示唆している。また,加齢ラットにて坐骨神経周囲の同様の部分を観察したところ,関節の固定を行っていないにも関わらず若年の固定群に近い変化が観察された。この事から,関節固定によって生じる変化と加齢によって生じる変化には,共通する機序がある可能性が示された。ラット後肢膝関節を独自の手法にて不動化し,関節拘縮モデルを作成してその関節構成体を病理組織学的に観察する事を目的に実験を開始した。ラットはそれぞれ2週間,4週間にわたって関節を不動化され,それぞれ関節不動化を行わなかった対照群に対して約30度の伸展制限を生じた。関節構成体め病理組織学的所見では,大腿骨・脛骨の軟骨表層に線維芽細胞からなる滑膜に類似した膜様の組織が増生している像が観察され,表面に増生した膜様組織が半月板周囲から増生した肉芽様組織と癒着している像が観察された。また,滑膜中の脂肪細胞に着目し,ランダムに選択した30個の細胞面積を計測した。実験群と対照群での個々の脂肪細胞の面積の分散は,実験群は対照群に比べて分散が大きく有意な差を認め,面積の広さでは固定群において有意に減少していた。脂肪組織を観察したところ,実験群において脂肪細胞の萎縮・面積の分散以外にも脂肪組織以外の線維性組織の増加傾向を認めた。脂肪細胞の形を正常群と比較すると対照群は脂肪細胞の形が比較的均整が取れているのに対し,実験群は個々の脂肪細胞の形が不均一である事が観察された。19年度に行う予定である,理学療法の治療手技・効果に関する実験の準備として,不動化に伴う関節拘縮が神経・筋に及ぼす影響を観察した。実験群では対照群と比較して神経周膜・神経外膜を構成する線維の狭小化及び密生化が観察され,神経外膜の脂肪細胞が減少し,線維芽細胞が増殖していることが観察された。

関節構成体に対する実験と平行して,不動化に伴う関節拘縮が神経・筋に及ぼす影響を検索する目的で,大腿後部を走行する坐骨神経を観察したところ,固定群では対照群と比較して神経周膜・神経外膜を構成する線維の狭小化及び密生化が観察され,神経外膜の脂肪細胞が萎縮し,線維芽細胞が増殖していることが観察された。これらの所見は,神経の滑走性の変化を示唆している。また,加齢ラットにて坐骨神経周囲の同様の部分を観察したところ,関節の固定を行っていないにも関わらず若年の固定群に近い変化が観察された。この事から,関節固定によって生じる変化と加齢によって生じる変化には,共通する機序がある可能性が示された。
古環境の復元技術を応用した絶滅危惧種カワシンジュガイの絶滅の負債の発生機構解明

生物の絶滅の負債(i.e.絶滅までの時間的な遅れ)の発生は保全すべき生物が現状では生息するものの、近い将来に絶滅する可能性が極めて高いことから、発生の仕組みを詳しく解明する必要がある。絶滅の負債に関する既存研究では、負債の発生原因として、主に分断化が着目されてきた。本研究では、河川に棲む絶滅危惧二枚貝カワシンジュガイ属を対象に、本属の稚貝の欠落を絶滅の負債の指標とすることで、これまで見過ごされてきた“生息環境の劣化による絶滅の負債の発生"を実証する。本年度は、稚貝の入手に成功したコガタカワシンジュガイを対象に、本年度生まれの稚貝を河川に暴露させる野外実験を行った。北海道東部地域において、これまでの調査から1)親貝が生息し、2)稚貝の多少が異なるという2つの条件を満たす11河川を選択し実験を行った。実験は810月の3カ月間行い、各月で稚貝の生残率を計測した。また、同時に環境要因(水質や細粒土砂、物理環境など)を計測した。結果、コガタカワシンジュガイ稚貝は個体群の稚貝割合の高い河川でより高い生残率を示し、稚貝の欠落した個体群では生残率がゼロあるいは極めて低い値となった。稚貝の生残率は、河川の富栄養化指標(全窒素や全リン)および流水中の細粒土砂量と負の相関を示した。以上より、河川の富栄養化や細粒土砂流入といった生息環境の劣化が稚貝の生残率を低下させることで、稚貝の欠落が起きることが分かった。これはつまり、生息環境の劣化による生活史ステージ間の生残率の違いが生物の絶滅の負債を発生させることを実証した。今後、これまでに収集した基礎データ(個体群の現況など)を整理し、本実験のデータと合わせて論文の執筆および投稿を行う予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
「見るもの」としてのファッション─表象装置としてのミュージアムとの関係から

最終年度にあたる平成30年度は、前年度までの二年間においてアメリカで実施した二つの研究調査を総括する作業を主として行なった。これらの歴史文献調査とは、一つは商業空間におけるファッションの登場の歴史であり、もう一つは教育研究機関におけるファッションの視覚化の歴史である。前者については、ニューヨークを中心とする商店や百貨店において「ファッション」がいかにして飾られるものとなったのかを、ショーウィンドウとマネキンの発展から明らかにした。後者については、博物館や美術館などのミュージアム、特にニューヨークのアメリカ自然史博物館・ブルックリン美術館・メトロポリタン美術館の三つのミュージアムにおいて「ファッション」がいかに展示され「作品」としての価値を獲得したのかを明らかにした。これらの調査結果を踏まえ、19世紀においては女性誌やファッション誌のなかで描かれていた理想的女性像が、20世紀前半においては百貨店やミュージアムなどの公共施設において再現されていく歴史的様相を明らかにした。そして、雑誌紙面から展示空間への二次元から三次元へのメディアの移行にもかかわらず、ファッションとともに理想的女性像が再生産される歴史を明らかにし、近代アメリカにおける「ファッションと女性」の分かち難い連関について考察した。以上の研究成果を書き下ろしの二本の研究論文としてまとめ、さらにこれまでの科研の研究課題の成果とともに、『まなざしの装置ーファッションと近代アメリカ』と題した学術書として青土社より出版し、研究成果を広く世間に公開した。本研究は、20世紀におけるファッションとミュージアムの関係の接近において、ファッションがいかに「見るもの」として構築され、表象装置としてのミュージアムのもとに制度化されたのか、その歴史的プロセスを明らかにするものである。とりわけニューヨークのミュージアム、アメリカ自然史博物館、ブルックリン美術館、メトロポリタン美術館を対象として、衣装収集、デザイナー支援、ファッション展立案の歴史的経緯を辿ることによって、アメリカン・ファッションの確立にミュージアムが果たした役割を明らかにするとともに、文化的な枠組みとしてのファッションの「着るもの」から「見るもの」への質的変容について考察するものことを目的とする。当初の研究計画では、研究期間3年間のうち単年度ごとに各美術館を調査する計画であったが、研究初年度にあたるH28年度において、ニューヨーク州立ファッション工科大学客員研究員としてのまとまった期間の海外調査が可能となった。そのため当初計画を見直し、H28年度には三つの美術館全てを対象とする基本調査を行うこととし、特にアーカイヴに所蔵される関連資料の全体的なボリュームの把握を行ったうえで、ファッション展確立の歴史に関する基本的な資料の実見調査と収集を行った。また関連資料を所蔵する研究機関、たとえばニューヨーク州立ファッション工科大学付属美術館および貴重資料室、ニューヨーク市立博物館、ハーバード大学付属図書館、コロンビア大学付属図書館、ニューヨーク歴史協会、ブルックリン歴史協会などにおいても同様の調査を行った。研究全体の骨組みとなる基礎的資料の収集をふまえ、資料の読解と考察を行い、調査報告を作成した。H28年度半期サバティカルの取得によってまとまった期間の海外調査が可能となったため、複数の研究期間の調査を同時に行うことによって、研究全体の推進に注力することができた。とりわけ、ニューヨークの三つのミュージアム、アメリカ自然史博物館、ブルックリン美術館、メトロポリタン美術館(衣装部門の前身である衣装美術館)を対象とし、各館における衣装コレクション、デザイナー支援活動、ファッション展企画の成立と発展を辿ることによって、文化的枠組みとしてのファッションがいかに「着るもの」から「見るもの」へと質的変容を遂げたのか、その歴史的プロセスを考察する。平成28年度の後半から引き続き、平成29年度5月までニューヨーク州立ファッション工科大学客員研究員として、同大学付属図書館・美術館での文献資料・服飾資料の実見調査と収集を行うとともに、上記の博物館・美術館のアーカイヴにおいて関連資料(文書記録・手紙・写真・カタログ・リーフレット等)の実見調査と収集を行った。そして収集した資料の整理・読解・考察を通じて、デパートの設立によるショーウィンドウの発展、ならびにミュージアムにおけるファッション展の成立の経緯を明らかにし、都市空間と文化施設において、見るものとしてのファッションが制度化される歴史的プロセスを論考にまとめた。さらにこれらの論考を、これまで取得してきた科研研究課題の既発表論文と整理統合することによって博士論文としてもまとめた。平成28年度から平成29年度5月にかけてニューヨーク州立ファッション工科大学の客員研究員として長期海外調査が可能となったため、資料の実見調査と収集作業を早めに遂行することができた。

以上の研究成果を書き下ろしの二本の研究論文としてまとめ、さらにこれまでの科研の研究課題の成果とともに、『まなざしの装置ーファッションと近代アメリカ』と題した学術書として青土社より出版し、研究成果を広く世間に公開した。H28年度に研究全体の基本的資料を把握・収集することができたため、今後は不足部分の補完調査を集中的に実施することによって、研究成果のアウトプットに努めたい。研究成果の発表については博士論文の提出のため、同論文の一部としての公表の形をとることになった。資料取集と読解考察の作業が早めに終了したため、今後は別の形での論考の執筆と公開に努めたい。平成29年度前半に海外長期調査のために平成30年度研究費を前倒しし、研究の早期推進に努めた。不使用分については、平成30年度の論文執筆など、主として研究成果のまとめと公開の作業に使用する予定である。
核分裂とマイクロクラスター分裂の比較研究-量子崩壊と熱崩壊の機構-

本研究計画は、原子核及びマイクロクラスターの量子的及び熱的崩壊の機構を比較解明する事によって、両者の類似性と異質性を明らかにする事を目的としている。マイクロクラスターの分裂に関する興味深い研究課題の一つは、多価に帯電したマイクロクラスターが核分裂によって崩壊するか、蒸発過程によって崩壊するかの境界を与える、いわゆる臨界クラスターサイズである。これまでは、バルクな系での表面張力を用いた臨界クラスターサイズの評価が行われ、臨界サイズが大きいときは、実験値を比較的よく再現することが出来た。臨界クラスターサイズが小さい場合の実験値と理論値の食い違いの原因を解明するために、我々は、表面張力のサイズ依存性を調べ、小さなマイクロクラスターでは、表面張力のクラスターサイズ依存性が無視できないことを明らかにした。この研究の中で、マイクロクラスターの物性を正しく記述するためには、相関エネルギーの正しい取扱いが必要であることに注目し、通常用いられる局所密度近似を改善して、Naクラスターに対しいわゆるGW近似による計算を行い、ホール状態のエネルギーはより深く、粒子状態のエネルギーはより高くなることを示した。現在は、これらの結果に基づくマイクロクラスターの分裂や光吸収などの研究を進めている。本研究のテーマは、マイクロクラスターの分裂と核分裂の類似性及び相違について研究することであるが、後者に関連して、その逆過程である重イオン核融合反応の研究が大いに進んだ。主な研究成果は以下のとおりである。(1)重イオン核融合反応に対する原子核の表面振動の影響においては、高次の結合効果が極めて重要である。(2)励起エネルギーが大きな入射核の表面振動は重イオン核融合反応に対する障壁分布の形には影響せず、位置をずらすたけである。(3)重イオン核融合反応に対する障壁分布は散乱核の表面振動における非調和性に極めて敏感である。
Notchシグナル抑制因子Numbによる神経系の多様性獲得機構の解明

神経系の運命決定に重要な役割を果たしているNotch及びその抑制因子であるNumbについて研究を行っている。Numbは細胞分裂時に非対称に分裂され一方の娘細胞でNotchシグナルを抑制することで神経細胞への分化を正に制御すると考えられているが、哺乳類においてその機構は依然、不明な点が多い。NumbとNotchによる神経分化の制御機構に関して分子レベル及び個体レベルでの解明を目指し研究を行っている。これまでNumbはNotchの細胞内領域と結合することで活性型Notchの核移行の抑制に働くと考えられていたが、それ以外にNumbは細胞内領域のみの活性型Notchよりも細胞外領域を含む全長Notchの活性を強く抑制するという興味深い結果を得た。この事より、リガンド依存的に刺激を受ける状態においてNumbがNotchシグナルをより強く抑制しうるという新しい制御機構の存在が示唆された。またNumbにはスプライシングにより生ずるisoformが存在しており、このisoformは機能的にも異なる効果を有していた。この結果からNumbは何らかの修飾を受けるか、或いは他の因子と協調的に働くことが示唆された。そこでNumbのisoform特異的な抗体を作製し、その発現部位の相違について検証した。その結果numb Short formは広く神経系に発現しているのに対しLong formは胎生期に一過性に限局して発現していることを見いだした(現在、論文投稿中)。現在その相違を生み出す要因に関して生化学的な解析を行っている。生体を用いた実験系としては、ウイルスを用いることなく簡便にマウス胎児脳に遺伝子を導入するIn Vivo Electroporation法を確立した。マウスにおいては現在作製に膨大な時間を必要とする生体での遺伝子の発現制御を簡便に行う事が出来るこの手法は、今後の神経分化機構の理解に大きく貢献するものと期待される。この系を用い神経系の細胞分化を制御するNotch1,Numb及びその変異体を導入し、その際のNotchシグナルの活性化を指標として解析することで、強制発現されたNumbが神経系の運命決定にどのような影響をもたらすかを生体レベルで解析している。
細胞外基質アリールスルファターゼの組織特異的な分子環境と形態形成 制御機構の解明

メダカアリールスルファターゼ(Ars)の分子環境と機能抑制の影響解析から、ArsAとArsBはユビキタスに合成されるが、細胞表層での局在や細胞外基質との共局在は血管内腔(ArsA)や脳室(ArsB)等の限られた領域であること、ArsBは形態形成に欠かせないことが示された。硫酸化基質の代謝酵素と考えられてきたArsは、発生過程で循環系を介して細胞外基質としての分子環境を築き、機能している可能性が示唆された。硫酸化基質の代謝酵素と従来考えられてきたアリールスルファターゼ(Ars)は、棘皮動物のウニでは形態形成運動に関与する細胞外基質であり、哺乳類でも細胞外基質の構成因子であることを既に明らかにした。本研究では、初期発生から器官形成に至る細胞の形態・構造、移動等の変化の解析に適しているメダカを用いて、Arsの細胞外基質としての分子環境とその発現異常による細胞外基質環境の破綻が形態形成に及ぼす影響を解析することにより、細胞外基質Arsがどのような分子機構で形態形成を制御しているのかを解明することを目的とする。本年度は、以下のとおり実施した。1)細胞外基質Arsの分子環境の解明......Arsが構築する細胞外基質環境を解析するために、ArsAとArsbのmRNAの発現を調べた。両者は共にマターナルに存在し、発生過程を通して発現が検出されたが、ArsBは体節期に特に高い発現を示した。in situハイブリダイゼーション法により、mRNAは局在せず、ユビキタスに発現することが示された。メダカゲノム情報をもとに、ArsAとArsBの特異的な領域を抗原として抗体を作成した。Arsと硫酸化基質や既知の細胞外基質との局在の比較解析を、蛍光抗体法と免疫電顕により進めている。2)Arsの形態形成における機能の解明......モルフォリノオリゴによる機能抑制実験を行った。ArsBの機能抑制は、エピボリーの抑制、前後軸の退縮、頭部形成不全、血管・骨格形成異常等を招き、ArsB遺伝子疾患であるムコ多糖症VI型と類似した特徴を示し、ArsBが形態形成において重要な役割を持つことが示された。ArsAの機能抑制は、ArsA遺伝子疾患MLDと同様、外見的には顕著な異常は検出されなかった。MLDで異常が報告されている神経系や免疫染色で発現が検出される組織への影響の解析を進めている。細胞外基質Ars(ArsA、ArsB)による形態形成制御機構を解明するために、初期発生から器官形成までの細胞の運動と形態変化の観察に適しているメダカを用いて、以下の研究を実施した。1.細胞外基質Arsの分子環境の解明Arsが構築する組織特異的な細胞外基質環境を解明するために、固定と免疫染色の過程で2価イオンを添加し、2段階に分けて組織を包埋、凍結切片を作製することにより、細胞外基質の遊離を防ぎ、細胞形態を維持した組織を用いることが可能になった。ArsAに関しては、新たに特異性の高い抗体を作り、血管や神経組織における発現を確認し、局在を精査している。ArsBに関しては、細胞外に分泌されたArsBとプロセッシングにより低分子化した細胞内ArsBを、特異抗体により区別して発現解析を行った。胚発生過程では主に細胞内ArsBが発現し、成体になると細胞外ArsBの発現が増え、組織ごとに両者の割合が異なることが示された。細胞外ArsBの割合が高い組織を用いて、細胞外基質ArsBの局在と分子環境を免疫電顕により解析している。2.Arsの形態形成における機能の解明Arsの発現異常が形態形成に及ぼす影響を調べ、機能を解析した。ArsBモルフォリノオリゴによる翻訳抑制胚では、エピボリーの阻害、前後軸の退縮、頭部形成不全等が観察されたが、コラーゲン等の細胞外基質の発現への影響は低かった。胚発生期には、細胞内ArsBが主に機能している可能性があり、ArsBが制御するシグナルカスケードを解析している。Arsの継続的な欠損が及ぼす影響を調べる目的で、TILLING法により、Ars変異体をスクリーニングし、ArsA、ArsB共にスルファターゼドメインとその近傍に変異を持つ候補を検出した。細胞外基質アリールスルファターゼ(Ars)による形態形成制御機構を解明するために、初期発生から器官形成に至る細胞の形態・構造、移動等の変化の解析に適したメダカを用いて以下の研究を実施した。(1)細胞外基質Arsの分子環境の解明......前年度に確立した細胞外基質を保持した蛍光抗体染色法と免疫電顕により、ArsAが血管内皮細胞の内腔に面した細胞表面に局在していることを確認した。

ArsBは、組織ごとにプロセッシングにより低分子化した細胞内型とプロセッシングを受けない細胞外分泌型の割合が異なり、細胞外分泌型は脳に多く、脳室に面した上衣細胞と考えられる細胞で主に合成され、脳室内に多く局在していることが示された。脳室内では、ArsBとコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、コラーゲンI抗体で認識される分子とが共局在していた。(2)Arsの形態形成における機能の解明......Arsの発現異常が形態形成に及ぼす影響を調べた。ArsBモルフォリノオリゴによる翻訳抑制胚では、胚全体でArsBの発現が低下し、頭部形成不全を含む発育遅延が認められた。しかし、胚発生期には主に細胞内型ArsBが検出され、ArsBのアミノ酸が変異したメダカでは胚発生期の形態形成には殆ど影響が確認されなかった。発生初期には細胞内Arsが主に機能している可能性がある。(3)細胞外基質Arsによる形態形成制御モデルの検討......ArsA、ArsB共に種々の組織で合成されていたが、細胞表層での局在、細胞外基質との共局在は、血管や脳室等の循環系に面した領域に限られていた。胚発生期には細胞内Arsの割合が多く、Arsモルフォリノオリゴ処理が他の細胞外基質の発現や局在に及ぼす影響は低かった。Arsは循環系を介して発生後期に細胞外基質としての分子環境を築き、機能している可能性が示唆される。本研究では、細胞外基質Arsの分子環境と形態形成における機能の解明が、2つの柱をなしている。前者に関しては特異的な抗体の作製、固定・免疫染色条件と注目すべき組織が決まり、免疫電顕による解析を行っている。後者に関しては、モルフォリノオリゴを用いた翻訳抑制によるArs欠損の短期的影響だけでなく、TILLING法によりArs欠損の長期的影響の解析が可能になった。今後両者の結果を統合して、検証することにより、研究目的をおおむね達成しうると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、これまでの解析で明らかになった細胞外Arsの発現が高い組織におけるArsを核とした分子環境を、免疫電顕等により解析するとともに、Arsと共局在する因子との相互作用を調べる。Arsの機能は、モルフォリノオリゴによる翻訳抑制胚だけでなく、TILLING法によるArs変異体を用いて解析する。Arsのアミノ酸変異の影響は、組換えタンパク質を用いた生化学的解析を行う予定であるが、タンパク質の合成が困難な場合は、変異Ars mRNAの過剰発現により調べる。Ars同士の機能重複に関しても検討する。これらの結果をもとに、細胞外基質Arsによる形態形成制御モデルの構築を行う。
免疫複合体型糸球体腎炎の成立機序に関する免疫病理学的研究

糸球体内皮細胞膜上にレクチンを結合させた後に抗レクチン抗体を作用させ経時的に免疫複合物の動態を観察し以下の結論を得た。HPAを抗原として用いた場合、内皮細胞膜上で抗体と反応し細胞骨格を介して局剤を変化させ顆粒状の免疫沈着物を形成する。更にそれは糸球体ろ過圧によって糸球体内皮下→上皮下へと移動し最終的にはヒト膜性腎症類似の病像を呈する。このように外来性の抗原が内皮細胞膜上で抗原抗体反応により最終的に上皮下沈着物となってゆく過程が免疫病理学的に明らかにされた。この事はヒト膜性腎症の成因の多様性を示唆しており重要な所見であると考えられた。又、培養ラット糸球体上皮細胞を用いた系では別のレクチン(LCH)を用いて細胞膜上で形成される免疫複合物の動態を観察し以下の結論を得た。即ち37°CでLCHを結合させると急速に細胞内へ取り込まれる。4°CでLCHを細胞表面に結合させた後37°Cで抗LCH抗体(2価)を作用させると細胞外へ放出される。これらの所見なら培養細胞系でも外来性抗原(LCH)と抗体の反応により免疫複合物が形成され近接の構造物中へ放出されることが明らかとなった。次にHPA結合性糖蛋白質をラット糸球体細胞膜から精製しこれに対するポリクロ-ナルおよびモノクロ-ナル抗体を作製した。当初の予想に反しこれらの抗体は糸球体上皮細胞を特異的に認識した。モノクロ-ナル抗体の認識する抗原はまだ十分に解析できていないが、ポリクロ-ナル抗体は160KDのポドカリキシンの糖鎖を含む抗原沢定基を認識することが明らかとなりこの抗原決定基が糸球体上皮細胞膜の自由面に特異的に存在することが示唆された。ヒト糸球体にも同様の抗原が存在することも判明し、ヒト急性糸球体腎炎の発症機序を考える上で重要な所見である。又、ラットにこれらの抗体を投与してみると軽度ではあるが、糸球体の変化を惹起し得ることが確認された。Gal NAcを認識するHPAレクチンを腎灌流によりラット腎糸球体に結合させておき、これに抗HPA抗体を作用させることにより糸球体局所(内皮細胞表面)で炎症が惹起される実験的糸球体腎炎のモデルを作成した。このモデルにおける免疫複合物(免疫沈着物)の生成機序及び沈着部位の検討を主として免疫病理学的手法により検討したところ次の二点が明らかにされた。1.抗体投与後短時間(5分以内)のうちに内皮細胞表面に顆粒状の免疫複合物の形成がみられる。2.この免疫複合物は灌流腎の血流を再開させて経時的に観察すると内皮細胞表面→内皮下→下皮下へと移動し最終的にヒト膜性腎症類似の病変を形成する。一方、Glu NAcを認識するLCHレクチンを用いて同様の実験を行うと免疫複合物は内皮下に多くみられる。但しLCHの場合も初期の病変は〓〓〓と類似し内皮細胞表面に免疫複合物で形成される。このように同じ外来性抗原でも用いるレクチンの種類により最終的な沈着部位が異なる点は興味ある知見であり、今後この差異の生ずる要因の検討(等零点、基底膜成分との結合性等)を試る予定である。

実に培養糸球体細胞を用いたin vitroでのレクチンー抗レクチン系の動態に関する実験では顆粒状の免疫複合物の形成には細胞骨格を介した局在の変化(patching)が関与することが示唆された。また糸球体細胞膜抽出物からHPA結合性糖蛋白質を精製する実験を行ったところ、分子量約1415万の糖蛋白が部分精製でき家兎に免疫してポリクローナル抗体を得た。これらを用いて物理化学的・免疫組織化学的検討を行い以下の基礎データを得た。1.家兎抗体は糸球体細胞膜成分とはニューラミニダーゼ処理時に反応する。2.家兎の抗体は腎では糸球体とのみ反応して、これまで報告のある類似の蛋白(ポドカリキシン)とは明らかに局在が異なる。今後モノクローナル抗体を作成し、実に詳細に検討する必要がある。ラット左腎単離潅流システムにおいて温度、抗体の性状、薬剤の影響を見たところ以下の結果を得た。HPAレクテンを糸球体内皮に結合させた後4°Cで抗体(1gG-2価)を作用させても顆粒状免疫複合物の生成はおこらず37°Cでは明瞭に観察される。又クロ-ルプロマジン添加や1価抗体(Fab分画)を用いた場合も顆粒状免疫沈着物の形成が抑制される点で、本モデルにおける急速な顆粒状免疫複合物の生成には細胞骨格が関与している事が示唆された。又、HPAアフィニティ-カラムを用いて糸球体細胞膜から精製したHPA結合糖蛋白質に対するポリクロ-ナル抗体を家兎に免疫して作成した。これを用いてラット糸球体での局在を調べたところ糸球体上皮細胞のfreesurfaceに特異的に局在し、他の部分には存在しないことが明らかとなった。この抗体の認識する糖蛋白は分子量160KDのシアログリコプロティンでエンドグリコシダ-ゼFで消化すると抗体との反応がなくなることから、この抗体の認識する抗原決定基はケリアシュキ-らのポドカリキシンのN-グリカンを含む部分であることが明らかとなった。これらの点から糸球体上皮細胞の自由面は特異な抗原決定基をもつと推察され、更にこの抗体がヒト糸球体とも同様に反応することから、ヒト糸球体腎炎(特に急性腎炎)との関係が注目された。又、まだ十分検討はしていないが、同様の性質をもつと考えられるマウスモノクロ-ナル抗体(9C2と命名)を得た。更に糸球体内皮細胞と反応するモノクロ-ナル抗体(48F5・H5H3)を得、これらをラットに投与して起腎炎性を検討したところ、軽度ではあるが糸球体に形態学的変化を引き起こすことが確認さた。この結果は、今後エピト-プ特異的に抗体を投与した時に起こる糸球体の変化を解析することにより糸球体腎炎の発症・進展過程を研究する有力な方法となると考えられた。
時を刻む脳:意識と無意識の時間知覚メカニズムの解明

ヒトの知覚現象の中で、3つの連続する聴覚刺激あるいは視覚刺激を呈示した際にできる2つの短い時間間隔を等しく見積もる心理現象(「時間的同化」)が報告されている.研究では視覚刺激を用いた「時間的同化」に着目し、注意メカニズムの違いにおける時間知覚処理機構について、事象関連電位(ERP)を用いて検証した。注意メカニズムには、刺激系列に基づいた予期によって自ら注意を誘発する内因性注意、刺激の顕著さに注意が引きつけられる外因性注意の2種類がある。前者は前頭皮質、後者は頭頂皮質が担っていると考えられていろ、事象関連電位の測定にはEGI社製多チャンネル脳波計を使用した。実験協力者は正常視力あるいは矯正による正常視力てある成人男女を対象とし、データ計測は2012年5月から11月の期間に実施した。課題は時間間隔の異同判断をボタン押しで回答する二者強制選択課題、全ての刺激呈示後にボタン押しのみを行う単純反応課題を実施した、実験条件はT1≦T2(/240/400/,/320/400/,/400/400/,数字はミリ秒)とT1≧T2(/400/240,/400/320/,/400/400/,数字はミリ秒)の2条件を設定した.T1≦T2条件では、二者強制選択課題において、前頭中心部にCNV(随伴陰性電位)が惹起したが、時間的同化が起こらない/240/400/ではCNVは減衰した、また後頭部のVEP(視覚誘発電位)のN1成分も同様の変調をきたした。T1≧T2条件では、二者強制選択課題において、時間的同化が起こらない/400/240/でP3が明瞭に惹起した。また後頭部のVEPの変調は見られなかった。このERP反応と先行研究との内容を併せて考えると、T1≦T2条件は内囚性注意、T1≧T2条件は外因性注意の影響が見られる。よって仮説が支持するとおり、内因性注意に基づいた時間知覚処理機構は前頭中心部、外因性注意に基づいた時間知覚処理機構は頭頂部がそれぞれ担っている.これらの研究成果について、2012年7月にイギリスのブライトンで開催されたThe 16th annual meeting of the ASSCにてポスター発表を行った。【目的】近年、「時間的同化」という新しい時間の錯覚現象が注目されている。これは3つの連続する聴覚刺激を提示した際にできる2つの時間間隔を等しく見積もる心理現象である。この「時間的同化」が起こる際の神経活動を捉えて、時間知覚の認知処理と自動処理の2つの処理機構を明らかにする。【方法】本年度は視覚系で起こる「時間的同化」の神経処理機構を検証するために、事象関連電位(ERP)を用いて検証した。実験では空間周波数0.5cpd、コントラスト20%、呈示時間30ミリ秒の白黒正弦波格子を視覚刺激として用いた。視覚刺激を3回連続で呈示した際にできた1番目と2番目の時間間隔(それぞれT1、T2とする)は、T1≦T2とT1≧T2の2条件で設定した。T1≦T2条件ではT2を400ミリ秒で固定し、T1を240、320、400ミリ秒の3パターンとし、それぞれをランダムに呈示した。一方、T1≧T2条件ではT1を400ミリ秒で固定し、T2を240、320、400ミリ秒の3パターンとし、それぞれをランダムに呈示した。被験者はT1とT2の異同判断をボタン押しで回答し、その際のERPを測定した。【結果】異同判断の結果から、T1-T2=160ミリ秒のパターンではT1とT2を「違う」と判断するが、T1-T2=0ミリ秒、80ミリ秒のパターンでは「同じ」と判断することが判明した。ERPの結果から、T1≧T2条件におけるT1-T2=160ミリ秒のパターンでは第3刺激呈示後400から500ミリ秒にかけて顕著な陽性成分が惹起した。【考察】「時間的同化」が起こる場合と起こらない場合での神経活動が異なることが判明した。この神経機構を詳細に解明するために306チャンネル脳磁計を用いて、さらなる研究を進めていく。ヒトの知覚現象の中で、3つの連続する聴覚刺激あるいは視覚刺激を呈示した際にできる2つの短い時間間隔を等しく見積もる心理現象がある。この現象は「時間的同化」として報告されており、その根底には時間縮小錯覚という時間の錯覚現象が関与すると考えられている。本年度の研究では、視覚刺激を用いた「時間的同化」に着目し、意識的なメカニズムである時間知覚の注意処理について、事象関連電位(ERP)を用いて検証した。実験協力者は正常視力あるいは矯正による正常視力である成人男女を対象とし、データ計測は2011年6月から2012年2月の期間に実施した。事象関連電位の測定にはEGI社製多チャンネル脳波計を使用した。課題は時間間隔の異同判断をボタン押しで回答する2者強制選択課題、全ての刺激呈示後にボタン押しのみを行う単純反応課題を実施した。結果は、2課題間の差分波形から前頭中心部付近にNegative Slope(NS)が観察された。特に240/400ミリ秒では、3つ目の視覚刺激が出現する前からNSは減衰した。

さらに400/240ミリ秒では、3つ目の視覚刺激の呈示後400500ミリ秒で、頭頂部付近に陽性成分が惹起した。これら2つの反応が心理判断とも一致していたことから、時間知覚の注意処理には前頭-頭頂の神経活動が関連すると考えられる。これら研究成果の一部を、2011年6月に京都で開催されたThe 15th annual meeting of the ASSC、2011年11月に静岡で開催された第41回日本臨床神経生理学会学術大会にてそれぞれポスター発表を行った。今後は、視覚刺激に注意を向けない状態で記録されるミスマッチ陰性電位に着目し、無意識的なメカニズムである時間知覚の自動処理に着目して研究を進めていく。ヒトの知覚現象の中で、3つの連続する聴覚刺激あるいは視覚刺激を呈示した際にできる2つの短い時間間隔を等しく見積もる心理現象(「時間的同化」)が報告されている.研究では視覚刺激を用いた「時間的同化」に着目し、注意メカニズムの違いにおける時間知覚処理機構について、事象関連電位(ERP)を用いて検証した。注意メカニズムには、刺激系列に基づいた予期によって自ら注意を誘発する内因性注意、刺激の顕著さに注意が引きつけられる外因性注意の2種類がある。前者は前頭皮質、後者は頭頂皮質が担っていると考えられていろ、事象関連電位の測定にはEGI社製多チャンネル脳波計を使用した。実験協力者は正常視力あるいは矯正による正常視力てある成人男女を対象とし、データ計測は2012年5月から11月の期間に実施した。課題は時間間隔の異同判断をボタン押しで回答する二者強制選択課題、全ての刺激呈示後にボタン押しのみを行う単純反応課題を実施した、実験条件はT1≦T2(/240/400/,/320/400/,/400/400/,数字はミリ秒)とT1≧T2(/400/240,/400/320/,/400/400/,数字はミリ秒)の2条件を設定した.T1≦T2条件では、二者強制選択課題において、前頭中心部にCNV(随伴陰性電位)が惹起したが、時間的同化が起こらない/240/400/ではCNVは減衰した、また後頭部のVEP(視覚誘発電位)のN1成分も同様の変調をきたした。T1≧T2条件では、二者強制選択課題において、時間的同化が起こらない/400/240/でP3が明瞭に惹起した。また後頭部のVEPの変調は見られなかった。このERP反応と先行研究との内容を併せて考えると、T1≦T2条件は内囚性注意、T1≧T2条件は外因性注意の影響が見られる。よって仮説が支持するとおり、内因性注意に基づいた時間知覚処理機構は前頭中心部、外因性注意に基づいた時間知覚処理機構は頭頂部がそれぞれ担っている.これらの研究成果について、2012年7月にイギリスのブライトンで開催されたThe 16th annual meeting of the ASSCにてポスター発表を行った。当初の予定どおり、2011年度は意識的なメカニズムである時間知覚の注意処理の神経機構を解明し、それらの研究結果を2つの学会(内1つは国際学会)において発表を行っているため。今後は事象関連電位(ERP)を用いて、無意識的なメカニズムである時間知覚の自動処理の神経機構を明らかにする。また研究成果をまとめたものを国際学術誌へ投稿する。
グリオーマにおけるHRM法を用いた高感度TERT遺伝子変異検出法の確立

本年度は、まず下垂体腺腫に対してのTERTプロモーター領域の変異、メチル化を判定する方法の樹立から試みた。70例の下垂体腺腫(初発53例、再発17例)に対して後方視的に解析した。各腫瘍の年齢、腫瘍径、組織型、手術摘出率、再発までの期間などの臨床的パラメーターとTERT遺伝子プロモーターの変異、メチル化の程度(定量解析)、TERT mRNA発現量の遺伝子情報との関連を統計学的に解析した。手技としては、TERTプロモーターホットスポット変異に対しては、Sanger sequence法を用いた。TERTプロモーターメチル化の解析にはDNAをbisulfite処理し、methylation-sensitive high-resolution melting法を用いて定量的に測定した。TERT発現の評価は、real-time quantitative PCRを用いてmRNAレベルを測定し、相対定量法により正常脳に比べどのくらい発現が亢進しているか測定した。結果は、TERT遺伝子プロモーターの変異は全くみられなかった。一方で、TERT遺伝子プロモーターのメチル化は16%の下垂体腺腫に検出された。TERTメチル化を有する下垂体腺腫は有意に腫瘍再発までの期間が短かく、TERT mRNAの発現も著明に上昇していた。以上から、TERT遺伝子プロモーターメチル化を持つ下垂体腺腫が腫瘍再発を早期に来すことを示すことが証明された。本結果はTERT遺伝子メチル化が下垂体腺腫の再発予測因子のバイオマーカーになりうる可能性を示唆した。今回用いたmethylation-sensitive high-resolution melting法は、TERTプロモーターにおけるbisulfite処理後に生じる変異の程度を高感度に定量評価する方法である。脳腫瘍の1つの下垂体腺腫において、本法を用いた解析法にて論文化に至る結果が得られたため。引き続き、グリオーマにおけるTERT変異を高感度に検出できるhigh-resolution melting法の確立に向けて、条件設定などの工夫を行ってゆく。(理由)学会発表回数が当初の予測より少なかったから(使用計画)さらに研究成果を充実させて、学会発表や論文作成の準備に使用する。
RSウイルス感染症の地理情報システム(GIS)を用いた空間的分子疫学研究

RSウイルス(以下RSVと略す)はA型とB型に分類され、主に冬期に流行し乳幼児の下気道感染起因ウイルスとして重要である。我々は表面抗原であるG蛋白第二可変領域の塩基解析からA又はB型と遺伝子型を決定し、RSウイルスの地域内流行状況について地理情報システム(Geographic Information System)を用いて地理的・空間的に解析してきた。前年度を通じて多数の検体が集まったため今年度は分子生物学的遺伝子型解析を主に行った。平成15年度より引き続き平成16年度も新潟市内の小児科医院を受診した下気道炎を疑わせる乳幼児から、同意の上、鼻腔吸引液を採取し、患者検体からRT-PCRでA・B型の分類を行い、さらにPCR産物をシークエンスしてRSVのG蛋白第二可変部位の塩基配列を決定し、Peretらの方法(J Gen Virol, 1998)を用い樹形図に展開し遺伝子型を決定した。前回報告した平成15年7月以降、平成17年2月まで354件検体採取され、うち123件がA型、27件がB型RSVであった。平成15年は9月から11月にかけてA型を中心とした流行で、平成16年1月以降春先まで散発的にB型がみられ、同年1112月に再びA型が主流の大きな流行がみられた。平成15年は遺伝子型GA5がA型の主流であったが、平成16年秋からは今までの分類型に属さない新しい遺伝子型のA型RSVの流行をみており、この変化は宿主免疫を逃れるための変異と思われRSVの進化を見る上で今後の流行動勢が興味深い。B型RSVに関しては平成14年秋に初めて検出された、G蛋白第二可変部位に60塩基の挿入がみられる特殊な型が平成15年も検出され続け、この年は全例同型であった。平成16年秋以降も検出されているものの挿入の無い通常型も混じっていた。この特殊なB型RSVは平成11年にブエノスアイレスで初めて検出され、平成14年秋冬には当教室以外にも札幌、横浜市でも確認され全国的に流行した可能性があり、RSVの世界的な伝播形式を考える上でも非常に興味深い所見と思われ、英文雑誌発表を行った(次ページ研究発表リスト)。RSウイルス(以下RSVと略す)はA型とB型に分類され、主に冬期に流行し乳幼児の重症下気道感染起因ウイルスとして重要である。我々は表面抗原であるG蛋白の遺伝子型からA型とB型に分類し、サブタイプ別の地域内流行状況について地理情報システム(Geographic Information System;以下GISと略す)を用いて地理的・空間的に解析した。2001年11月から2002年3月、2002年9月から2003年6月まで、新潟市内の1小児科を受診した下気道炎を疑わせる乳幼児から、同意の上、鼻腔吸引液を採取し、患者検体からRT-PCRでA・B型の分類を行った。さらに、患者の住所、年齢、地域の人口データなどの情報をGISソフトArc View^<【○!R】>でデジタル地図上に展開し、地域内流行状況を地理的・空間的に検討した。2001/2002年シーズンは鼻腔吸引液74件中PCR陽性32件中A型30件、B型2件でA型が多くみられた。2002/2003年は鼻腔吸引液176件PCR陽性53件中A型45件、B件8件で、2001/2002のA型の流行からB型への移行がみられた。GISを用いて患者の住所情報からRSV患者分布を点表示し、国勢調査データに基づいた500m四方メッシュ内の10歳未満人口との関連を解析した。2001/2002はA型について、2002/2003はB型について解析したところ、10歳未満人口密度の高い地域に患者が集中する傾向がみられたため、通院圏として医院を中心とした2.5km半径の円内に半径1kmの円を500m角毎に作成し、円内のRSV患者発生と人口密度との関連を調べた。2001/2002のA型では10歳未満人口密度が0-1000人/1km円で罹患率0.61±0.99(平均値±標準偏差、10才以下人口1000人あたり)、1000-2000で1.73±1.33、2000-3000で2.50±1.81と人口密度が高いほど罹患率が有意に上昇した。2002/2003のB型でも10歳未満人口密度0-1000で罹患率0.61±0.99、1000-2000で1.73±1.33、2000-3000で2.50±1.81とA型と同様に人口密度が高いほど罹患率が有意に高い特徴が示された。

平成15年度より引き続き平成16年度も新潟市内の小児科医院を受診した下気道炎を疑わせる乳幼児から、同意の上、鼻腔吸引液を採取し、患者検体からRT-PCRでA・B型の分類を行い、さらにPCR産物をシークエンスしてRSVのG蛋白第二可変部位の塩基配列を決定し、Peretらの方法(J Gen Virol, 1998)を用い樹形図に展開し遺伝子型を決定した。前回報告した平成15年7月以降、平成17年2月まで354件検体採取され、うち123件がA型、27件がB型RSVであった。平成15年は9月から11月にかけてA型を中心とした流行で、平成16年1月以降春先まで散発的にB型がみられ、同年1112月に再びA型が主流の大きな流行がみられた。平成15年は遺伝子型GA5がA型の主流であったが、平成16年秋からは今までの分類型に属さない新しい遺伝子型のA型RSVの流行をみており、この変化は宿主免疫を逃れるための変異と思われRSVの進化を見る上で今後の流行動勢が興味深い。B型RSVに関しては平成14年秋に初めて検出された、G蛋白第二可変部位に60塩基の挿入がみられる特殊な型が平成15年も検出され続け、この年は全例同型であった。平成16年秋以降も検出されているものの挿入の無い通常型も混じっていた。この特殊なB型RSVは平成11年にブエノスアイレスで初めて検出され、平成14年秋冬には当教室以外にも札幌、横浜市でも確認され全国的に流行した可能性があり、RSVの世界的な伝播形式を考える上でも非常に興味深い所見と思われ、英文雑誌発表を行った(次ページ研究発表リスト)。
ディスオーダー領域を有するリン酸化タンパク質を利用した新規抗癌剤の創出

申請者の所属する研究室でクローニングされた多機能タンパク質IRBITは、DNA合成に必要なデオキシリボヌクレオチドを合成する代謝酵素リボヌクレオチド還元酵素(RNR)の活性を制御する。RNRの阻害剤は抗癌剤として広く用いられており、IRBIT由来のペプチドをRNR阻害剤として利用できるか検討した。RNRとの結合には、IRBITのN末端約100アミノ酸の天然変性領域が重要な役割を果たしている。この配列には、多数のSer/Thr残基が存在し、うち少なくとも7カ所はリン酸化される。これらのSer/Thr残基のうち、S64, S66, S68, S70, S71, T72, S74, S76, S77, S80, T82, S84, S85, S90を、Ala(非リン酸化型)あるいはAsp(リン酸化ミミック型)に置換した部位特異的突然変異体を作成した。これらのIRBIT変異体とRNRをHeLa細胞に過剰発現し、免疫沈降法で結合を解析した。その結果、IRBITのS66, S68, S70, S71, S74, S77, S84をAlaに置換すると、RNRとの結合が顕著に阻害された。S68, S71, S74, S77, S84はリン酸化部位であり、これらのSerのリン酸化がRNRとの結合に重要である可能性が示唆された。リン酸化非依存的に結合するペプチドを見出す目的で、これらのSerをAspへの置換したIRBIT変異体とリボヌクレオチド還元酵素との結合を解析したところ、S68Dは全く結合せず、S74Dは結合が顕著に阻害された。以上の結果より、IRBITの天然変性領域のリン酸化がRNRとの結合を制御すること、RNRを抑制するIRBIT由来のペプチドの開発は困難であることが明らかになった。
種々の芳香族化合物によって化学修飾された新規酵素系の構築

Candida rugosa由来のリパーゼの表面のリジン残基及びメチオニン残基を、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル(Z基)、P-ニトロ-Z基、及びP-メトキシ-Z基などのII電子密度の異なる芳香環を有する化合物を用いて化学修飾を行った。これらの化学修飾リパーゼの構造評価をFTIR, CDスペクトル及びキャピラリーゾーン電気泳動から行い、エステル化反応及び加水分解反応におけるエナンチオ選択性に及ぼす化学修飾基の効果について調べた。その結果、以下の事項が明らかになった。(1)芳香環により化学修飾すると、FTIRスペクトル解析からリパーゼの2次構造のα-ヘリックス含有量が大きく減少し、高次構造の変化を伴っていた。さらに、キャピラリーゾーン電気泳動の解析から、酵素の表面電荷が負に偏っていることが明らかになった。(2)基質として、2-フェノキシプロピオン酸類及び対応するプチルエステルを用い、化学修飾リパーゼを触媒とするエステル化反応及び加水分解反応では、エナンチオ選択性(E値)は未修飾リパーゼに比べて約10倍向上した。(3)E値の向上効果は、初速度の測定から非優先基質であるS体の反応速度が著しく抑制されることが原因である。(4)E値は、加水分解反応においてZ化率(TNBS法により測定した化学修飾率)が増大するにつれて向上する傾向が見られた。他の修飾基では、E値を最大にする最適修飾率が存在した。(6)芳香環以外のアセチル基やBoc基などによって修飾したリパーゼとの比較を行ったところ、芳香環を有する化学修飾基がE値の向上効果も大きいという傾向が見られた。(7)Z基とは異なる性質を示すと考えられるヘキサフルオロベンゼンによって化学修飾されたリパーゼは、上記反応において高いE値を示すことが明らかになった。Candida rugosa由来のリパーゼの表面を、ベンジルオキシカルボニル(Z基)、P-ニトロ-Z基、及びP-メトキシ-Z基などのΠ電子密度の異なる芳香環を有する化合物を用いて化学修飾を行った。これらの化学修飾リパーゼの構造評価をCDスペクトルから行い、加水分解反応におけるエナンチオ選択性に及ぼす化学修飾基の効果について調べた。(1)芳香環により化学修飾すると、リパーゼの2次構造のα-ヘリックス含有量が大きく減少し、高次構造の変化を伴っていた。(2)基質として、2-フェノキシプロピオン酸類のブチルエステルを用い、化学修飾リパーゼを触媒とする加水分解反応では、エナンチオ選択性(E値)は未修飾リパーゼに比べて著しく向上した。(4)E値は、Z化率(TNBS法により測定した化学修飾率)が増大するにつれて向上する傾向が見られた。(7)Z基とは異なる性質を示すと考えられるヘキサフルオロベンゼンやナフタレンのΠ電子系によって化学修飾されたリパーゼを合成中であり、上記で得られた結果との比較検討を行い、E値に及ぼす化学修飾基の効果を明らかにする予定である。Candida rugosa

由来のリパーゼの表面のリジン残基及びメチオニン残基を、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル(Z基)、P-ニトロ-Z基、及びP-メトキシ-Z基などのΠ電子密度の異なる芳香環を有する化合物を用いて化学修飾を行った。これらの化学修飾リパーゼの構造評価をFTIR,CDスペクトル及びキャピラリーゾーン電気泳動から行い、エステル化反応及び加水分解反応におけるエナンチオ選択性に及ぼす化学修飾基の効果について調べた。その結果、以下の事項が明らかになった。(1)芳香環により化学修飾すると、FTIRスペクトル解析からリパーゼの2次構造のα-ヘリックス含有量が大きく減少し、高次構造の変化を伴っていた。さらに、キャピラリーゾーン電気泳動の解析から、酵素の表面電荷が負に偏っていることが明らかになった。(2)基質として、2-フェノキシプロピオン酸類及び対応するブチルエステルを用い、化学修飾リパーゼを触媒とするエステル化反応及び加水分解反応では、エナンチオ選択性(E値)は未修飾リパーゼに比べて約10倍向上した。(3)E値の向上効果は、初速度の測定から非優先基質であるS体の反応速度が著しく抑制されることが原因である。(4)E値は、加水分解反応においてZ化率(TNBS法により測定した化学修飾率)が増大するにつれて向上する傾向が見られた。他の修飾基では、E値を最大にする最適修飾率が存在した。(6)芳香環以外のアセチル基やBoc基などによって修飾したリパーゼとの比較を行ったところ、芳香環を有する化学修飾基がE値の向上効果も大きいという傾向が見られた。(7)Z基とは異なる性質を示すと考えられるヘキサフルオロベンゼンやナフタレンのΠ電子系によって化学修飾されたリパーゼの合成を行い、上記反応について検討中である。
消化管知覚過敏を軽減させるニューラルフィードバック練習装置の開発

本研究は,IBSの脳波活動パターンをもとに機械学習アルゴリズムによって被験者の脳から情報を読み出し,その情報を被験者にフィードバックする装置を開発する.この練習装置を用いて特定の脳領域活動を特定のパターン(ターゲットパターン)に誘導し,被験者の内臓知覚変化を誘導し,練習に用いた脳領域の活動を,対応する知覚や認知・行動の変化を引き起こすことを検証する.すなわち, IBSのDMNが腹痛のない人に近似してくると視覚や音声でフィードバックして, IBSの中心病態にある脳腸相関の病態DMNを補正させ,この練習がIBSの腹痛を減弱させるセルフマネジメントの有力な手段になると期待している.本研究は,IBSの脳波活動パターンをもとに機械学習アルゴリズムによって被験者の脳から情報を読み出し,その情報を被験者にフィードバックする装置を開発する.この練習装置を用いて特定の脳領域活動を特定のパターン(ターゲットパターン)に誘導し,被験者の内臓知覚変化を誘導し,練習に用いた脳領域の活動を,対応する知覚や認知・行動の変化を引き起こすことを検証する.すなわち, IBSのDMNが腹痛のない人に近似してくると視覚や音声でフィードバックして, IBSの中心病態にある脳腸相関の病態DMNを補正させ,この練習がIBSの腹痛を減弱させるセルフマネジメントの有力な手段になると期待している.