hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネのアミロベクチン変位体の遺伝-育種学的解析

しかし、60及び105kDタンパク質はSDSを加えた場合のみ抽出され、この両者は膜結合型であると考えられた。・ヨウ素定色法による変異体の探索:sug-1変異体では高B.V.480、ae変異体では正常λmax・高B.V.620など、各々の変異体間で吸光特性に特異性が認められた。加えて、既知の変異体と異なるヨウ素呈色パターンを示すものを得た。これらは新しい変異体の可能性があり、遺伝解析とデンプンの構造解析を進めている。・鎖長構造と糊化特性:ae変異体(EM10)は枝作り酵素BEIIaを欠き、短鎖/長鎖比が小さいアミロペクチン構造を有していた。「金南風」デンプンは4M尿素溶液で糊化するが、ae及びアミロースを欠くaewx両デンプン共に7.5Mで糊化が認められたことから、糊化の難易性はアミロペクチンの構造変化に起因すると考えられた。一方、同座の変異体EM72、129、189のデンプンは6.5Mで糊化した。全ae変異体でアミロペクチンのグルコース重合度(DP)17以下の短鎖(A鎖とB1鎖の一部)が著しく減少したが、難糊化系統ほど短鎖が少ない傾向を示した。また、供試したae全系統で著しいBEIIa活性の低下が認められ、ae変異体はBEIIa遺伝子の変異体であることが確認できた。しかし、6.5M糊化ae系統は、7.5M糊化ae系統よりBEIIa活性が高かった。これらのことから、アミロペクチン構造変化はデンプンの糊化特性に大きく影響し、短鎖の減少はデンプンの難溶性を生ずること、また、BEIIaは主にアミロペクチンのA鎖の合成に関与すると推察される。本年度は研究の結果、以下のことが明らかとなった。・HPAEC-PAD法を用いて鎖長分析を行ったところ、flo-3変異体の胚乳アミロペクチンは長鎖の顕著な減少が認められた。加えて、Northern及びWestern Blot分析の結果、flo-3変異体はRNA(転写)レベルでもタンパク質(翻訳)レベルでも3種の枝作り酵素のうち最も主要なBEIの発現が全く認められなかった。これらのことから、flo-3変異体はBEIの構造遺伝子もしくは発現制御に関する変異体であり、BEIはアミロペクチン長鎖の合成に関与するものと推察された。・120kDタンパク質を欠損する心白変異体EM719は、Nativc-PAGE分析で胚乳特異的ホスホリラーゼ活性が全く認められなかったことから、EM719は胚乳特異的ホスホリラーゼに関する変異体であり、かつ、120kDタンパク質がこの酵素に対応する可能性が示された。・イネ胚乳に期待される3種の枝作り酵素に関しては、BEI及びBEIIbについてはすでにflo-3及びac変異体を得ていたが、今年度新たに枝作り酵素BE-IIaに関する変異体を単離出来た。枝作り酵素の活性染色の結果、この変異体は、登熟種子胚乳で活性をほとんど欠くとともに、葉身でも活性を示さなかった。この変異体は単劣性遺伝子支配であること、粒の外観にはほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなった。・在来種に見出した難糊化変異は、BEIIb発現量が減少し、ac変異体同様アミロペクチン短鎖が減少していた。三染色体分析及びRPLP分析の結果、この変異は単一の共優性遺伝子に支配され、染色体6に座乗し、alk遺伝子と同一かもしくはその極近傍に位置することが明らかとなった。また、EST解析の結果、alk遺伝子は3種のアミロペクチン可溶性合成酵素、RSSI、RSSII及びRSSIIIのうち、RSSIIと対応することが明らかとなった。
マリアナ諸島アナタハン火山の噴火メカニズム・地下構造の研究

北マリアナ諸島にあるアナタハン島火山においてGPS測量・傾斜測定・人工衛星データを用いた干渉SAR解析等の測地学的手法からアナタハン火山のメカニズムや地下構造を推定した.アナタハン島の地下のマグマ溜まりは島の西方2km沖の地下5km付近に存在し,そこから東方に向かって斜めにマグマが上昇していくことがわかった.また干渉SAR解析では降下火山灰層の厚さを推定できることがわかった.北マリアナ諸島にあるアナタハン島火山においてGPS測量・傾斜測定・人工衛星データを用いた干渉SAR解析等の測地学的手法からアナタハン火山のメカニズムや地下構造を推定した.アナタハン島の地下のマグマ溜まりは島の西方2km沖の地下5km付近に存在し,そこから東方に向かって斜めにマグマが上昇していくことがわかった.また干渉SAR解析では降下火山灰層の厚さを推定できることがわかった.マリアナ諸島アナタハン火山は,日本から連なる伊豆・小笠原島弧の南方延長上にあるマリアナ弧に位置し,火山島としては同島弧の最南部に位置している活火山である.長期にわたりほぼ無人の島となっているため火山調査がほとんど行われてこなかったが,2003年5月に有史初の大噴火が発生した.これまでのGPSの調査からマグマ溜まりは島の西方に存在する可能性が高いが,現在の地震観測点が2ヶ所であるため,震源の位置を決めることができなかった.本研究では,アナタハン島にGPS観測点や傾斜計を設置して地殻変動からマグマ溜まりの位置を推定するとともに,地震計を増設して火山性地震や微動の発生源を調べる.またマリアナ諸島のそのほかの火山島のGPS基準点の再測定を実施し,マリアナ弧の運動や火山活動を調査する.平成19年度の現地調査は2008年12月に実施する予定であったが,2007年12月よりアナタハン火山の火山活動が活発となり,危険性の面から現地調査が不可能となった.活動は2008年3月にほぼ終息したため,同5月に北マリアナ政府危機管理局を訪問し,火山活動の情報収集を行った.その結果を踏まえて同67月に東京大学地震研究所・高知大学と共同でヘリコプタおよび小型船をチャーターして現地調査を行った.アナタハン島内にGPS基準点4ヵ所を設置して繰り返し測定を開始した.また1ヵ所に傾斜計,5ヵ所に地震計を設置して地殻変動および地震活動の連続観測を開始した.マリアナ諸島の6島の火山島のGPS再測定の結果,前回2003,04年の結果と比較することにより,1)火山活動による局地的な地殻変動はこの期間では見られない.2)マリアナ弧の西側にあるマリアナトラフは背弧拡大しており,その速度は北部のウラカスで10mm/年,南部のグアム付近で46mm/年におよぶ,3)拡大のオイラー極は北緯21度付近にあるが,マリアナ弧の北部と南部では微妙に拡大方向が異なる,ことが分かった.マリアナ諸島アナタハン火山は,日本から連なる伊豆・小笠原島弧の南方延長上にあるマリアナ弧に位置し,火山島としては同島弧の最南部に位置している活火山である.2003年5月に有史初の大噴火が東火口から発生した.これまでのGPSの調査からマグマ溜まりは島の西方に存在する可能性が高いが,詳しいことは分かっていない.本研究では,アナタハン島にGPS観測点や傾斜計を設置して地殻変動からマグマ溜まりの位置を推定するとともに,地震計を増設して火山性地震や微動の発生源を調べた.本研究で第2回目の現地調査を東京大学地震研究所と共同でチャーターヘリを用いて2009年1月下旬に実施した.5点のGPS基準点にGPS受信器を設置して再測定した結果,アナタハン島の東部が2008年6月の調査以降最大2cm隆起するとともに,南東に約2cm変位していることが分かった.これらは西火口原の下にあるマグマ溜まりの膨張が原因と考えられた.また傾斜の連続観測のデータから,2008年7月の小噴火の10日前から西火口原が隆起する変動観測され,最終的に700μradを超える傾斜となったことが分かった.この事実からも,西火口原の地下にはマグマ溜まりが存在し,噴火活動に呼応して変動していると推定された.また,測地衛星「だいち」のデータを使用して,アナタハン島の干渉SAR解析を行った.しかし,GPS測定期間(2008年6月2009年1月)中に衛星軌道が大きく変更になったため,干渉SAR解析からアナタハン島の地殻変動を把握することができなかった.しかし,2008年13月の火山活動時期を挟む時期の干渉SAR解析では火口の周辺に最大20cmの隆起を示す解析結果が得られた.現地調査の結果,この地域には解析された隆起量にほぼ相当する厚さの火山灰が地表を覆っていることが分かった.また層厚が20cm以上になると,データの干渉性が極端に悪くなりSAR解析ができない.このとから,20cm以下の厚さの火山灰であれば,火山灰層の厚さを干渉SAR解析で計測することが可能であることがわかった.マリアナ諸島アナタハン火山は,日本から連なる伊豆・小笠原島弧の南方延長上にあるマリアナ弧に位置し,火山島としては同島弧の最南部に位置している活火山である.長期にわたりほぼ無人の島となっているため火山調査がほとんど行われてこなかったが,2003年5月に有史初の大噴火が発生した.

これまでのGPSの調査からマグマ溜まりは島の西方に存在する可能性が高いが,現在の地震観測点が2ヶ所であるため,震源の位置を決めることができなかった.本研究では,アナタハン島にGPS観測点や傾斜計を設置して地殻変動からマグマ溜まりの位置を推定するとともに,地震計を増設して火山性地震や微動の発生源を調べた.またマリアナ諸島のそのほかの火山島のGPS基準点の再測定を実施し,マリアナ弧の運動や火山活動を調査した.平成21年度の現地調査は2009年7月17日に実施された.東京大学地震研究所と共同でヘリコプタをチャーターして期間中に2往復した.アナタハン島内のGPS基準点5カ所に機器を設置して繰り返し測定を行った.5カ所に設置してあった地震計を撤収して,地震データを回収した.また火山砕屑物の調査も行った.アナタハン島のGPS再測定の結果,島の東部は変形が小さく,島の西側で西向きの変位と沈降が続いており,このことから島西方2km沖の地下5km付近にアナタハン火山のマグマ溜まりがあり,それが現在は火山活動の低下にともなって収縮していると推定された.また地震活動は期間中きわめて低調であったことからも火山活動が終息に向かっていると推定された.また人工衛星データを用いた干渉SAR解析の結果ではアナタハン島の地表の隆起や沈降現象が見られていたが,我々のGPS測定や現地の火山灰調査の結果から降下火山灰層の堆積及び浸食による見かけのものであることが判明した.火山観測には多角的な観測・調査が必要であることがさらに示唆された.
細胞内Ca^<2+>調節に関するATP感受性Kチャネルの役割

研究目的:心筋細胞内Ca^<2+>([Ca^<2+>]i)の調節における、ATP感受性Kチャネル(K_<ATP>チャネル)およびNa^+/Ca^<2+>交換系の役割、相互の関連性を検討した。方法:1.単離心筋細胞モデルモルモット摘出心より酵素法にて単離左室心筋細胞浮遊液を作成。[Ca^<2+>]iの測定は、指示薬として5μM fura-2を細胞に負荷、340nm/380nmのUV励起光による500nmの蛍光強度比を光電子増倍管によってモニターした。Tyrode溶液にて灌流し、収縮性をEdge detection systemを用いて評価。Switch clamp法により活動電位を測定した。グルコース無添加のTyrode液に1mM Na_2S_2O_4を加えて化学的低酸素を誘発した。2.摘出心灌流モデルラット摘出心をLangendorff法にて灌流し、蛍光指示薬fura-2を経冠動脈的に心筋に負荷し、Ca^<2+>analyzerを用いて[Ca^<2+>]iを測定した。ペーシングとともに灌流量を10%に減少させるlow-flow ischemiaを誘発し、再灌流とともにペーシングを解除した。結果:1.単離心筋細胞モデル(1)低酸素により、収縮振幅の減少に伴いCa^<2+> transientの振幅減少とresting[Ca^<2+>iの上昇がみられ、活動電位の短縮を認めた。K_<ATP>チャネル開口薬lemakalimは好気的条件下にて活動電位を短縮させ、低酸素では短縮を増強しresting[Ca^<2+>]iの上昇を抑制した。(2)Na^+/Ca^<2+>交換系の活性を、灌流液をNa^+-free溶液に変換し、Ca^<2+>の細胞内流入によるfura-2シグナルの上昇によって評価したが、低酸素により交換系活性は抑制された。(3)非特異的Na^+/Ca^<2+>交換系阻害薬であるNi^<2+>の投与によりresting[Ca^<2+>]iは上昇したが、forward mode Na^+/Ca^<2+>交換系の抑制によると考えられた。K_<ATP>チャネル開口薬は、この[Ca^<2+>]i上昇に対して抑制効果を示した。2.摘出心灌流モデル(4)虚血によりCa^<2+>transientの振幅の低下と、拡張期[Ca^<2+>]iの上昇がみられ、単離心筋細胞を用いた低酸素・再酸素化モデルの結果と一致した。(5)Reverse mode Na^+/Ca^<2+>交換系阻害薬は虚血早期(1分後)の拡張期[Ca^<2+>]iの上昇については効果を示さず、虚血10分後にはその上昇を有意に抑制した。また再灌流時[Ca^<2+>]iの下降を促進した。結論:虚血後期・再灌流における細胞内Ca^<2+>過負荷には、reverse mode Na^+/Ca^<2+>交換系の役割が重要である。K_<ATP>チャネル開口薬には虚血早期のCa^<2+>過負荷抑制効果を有する可能性が示唆された。(3)非特異的Na^+/Ca^<2+>交換系阻害薬であるNi^<2+>の

投与によりresting[Ca^<2+>]iは上昇したが、forward mode Na^+/Ca^<2+>交換系の抑制によると考えられた。K_<ATP>チャネル開口薬は、この[Ca^<2+>]i上昇に対して抑制効果を示した。2.摘出心灌流モデル(4)虚血によりCa^<2+>transientの振幅の低下と、拡張期[Ca^<2+>]iの上昇がみられ、単離心筋細胞を用いた低酸素・再酸素化モデルの結果と一致した。(5)Reverse mode Na^+/Ca^<2+>交換系阻害薬は虚血早期(1分後)の拡張期[Ca^<2+>]iの上昇については効果を示さず、虚血10分後にはその上昇を有意に抑制した。また再灌流時[Ca^<2+>]iの下降を促進した。結論:虚血後期・再灌流における細胞内Ca^<2+>過負荷には、reverse mode Na^+/Ca^<2+>交換系の役割が重要である。K_<ATP>チャネル開口薬には虚血早期のCa^<2+>過負荷抑制効果を有する可能性が示唆された。研究目的:モルモット単離心室筋細胞を用いて、ATP感受性Kチャネル(K_<ATP>チャネル)の開口あるいは閉鎖の細胞内Ca^<2+>([Ca^<2+>]i)動態に及ぼす影響の機序を明かにすることを目的とする。方法:1.単離心筋細胞の作成。雄性モルモットの摘出心をLangendorff法、Krebs Henseleit bicarbonate bufferにて灌流し、低Ca^<2+>溶液、プロテアーゼ、コラゲナーゼ等を用いて順次灌流後、左心室筋を細切、酵素溶液にてincubate、濾過法にて心筋細胞浮遊液を作成する。2.細胞内イオンの測定。単離されたモルモット心室筋細胞の[Ca^<2+>]i,[pH]iの測定には蛍光指示薬Fura-2,BCECFを細胞に負荷後、2波長UV励起光(Ca^<2+>:340nm/380nm,pH:450nm/500nm)による蛍光強度比(Ca^<2+>:500nm,pH:540nm)を光電子増倍管にて測定した。3.心筋細胞の灌流にはHEPES-buffered Tyrode溶液を用いた。心筋に微小ガラス電極を刺入しSwitch clmap法により、活動電位、Ca^<2+>電流を測定した。微小電極を介したCurrent clampにて細胞を刺激、収縮性はedge detectionsystemを用いて測定した。4.グルコース無添加のTyrode液に1mM Na_2S_2O_4を加えて化学的無酸素を3分間誘発し、再酸素化を行った。結果・結論:1.無酸素により、収縮振幅の減少に伴いCa^<2+> transientの振幅減少と、拡張期[Ca^<2+>]i上昇、細胞内pHの低下を観察した。さらに無酸素では活動電位の短縮を認めた。再酸素化によりいずれも無酸素前の好気的条件下の値に復した。2.好気的条件下にてK_<ATP>チャネル開口薬lemakalimは濃度依存性に活動電位を短縮させたが、無酸素条件下では活動電位をさらに著明に短縮した。しかしlemakalimは無酸素における拡張期[Ca^<2+>]
現実環境を融合するユビキタスネットワーク技術に関する研究

本研究課題では,目の前の人との通信,拡張現実技術を通して誘発される通信,すれ違い通信など,現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し,これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術を実現した.具体的には,本研究課題では,(1)無線ネットワークの構築技術,(2)通信対象の特定技術,(3)周辺情報の分散検索技術,を研究の柱として掲げ,各技術に関する課題とその解決策を示した.特に,現実環境上での直感性を活かしながら,利便性,安全性,操作性に優れたネットワーク基盤を確立した.また,提案技術をシミュレーションまたは実機上に実装し,評価を通して提案技術の有効性を明らかにした.本研究課題では,目の前の人との通信,拡張現実技術を通して誘発される通信,すれ違い通信など,現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し,これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術を実現した.具体的には,本研究課題では,(1)無線ネットワークの構築技術,(2)通信対象の特定技術,(3)周辺情報の分散検索技術,を研究の柱として掲げ,各技術に関する課題とその解決策を示した.特に,現実環境上での直感性を活かしながら,利便性,安全性,操作性に優れたネットワーク基盤を確立した.また,提案技術をシミュレーションまたは実機上に実装し,評価を通して提案技術の有効性を明らかにした.本研究課題では,目の前の人との通信,拡張現実(AR:Augmented Reality)技術を通して誘発される通信,すれ違い通信など,現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し,これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術の実現を目指す.具体的には,本研究課題では,(1)無線ネットワークの構築技術,(2)通信対象の特定技術,(3)周辺情報の分散検索技術,を研究の柱として掲げ,各技術に関する課題とその解決策を探求する.本年度は,直感性に関連する情報を現実環境から獲得する技術,および獲得した情報を通信対象の特定技術や暗号通信に応用する以下の技術を開発した.直感性に関連する情報を獲得する技術として,ユーザの位置情報を高精度に推定する技術を研究開発した.具体的には,ユーザ端末の測位機能を移動通信インフラに統合し,高速無線通信機能と高精度測位機能とを同時に実現する次世代のネットワークインフラ技術を確立した。提案技術は,移動通信インフラとして,基地局を無線で中継接続する無線メッシュネットワークを採用しており,高速無線アクセスと高精度測位とを同時に実現するユビキタス空間を,屋内外間わず低コストで構築することを可能にする.また,現実環境の情報から端末間で同一の情報を生成する技術を開発した.具体的には,近距離に存在する端末間でしか共有できない現実環境の情報を用いて,同一の情報を各端末で個別に生成する.生成した情報を暗号鍵として利用することや,通信対象の特定に応用することを検討した.これらの技術のプロトタイプシステムを構築し,提案手法の有効性を確認した.本研究課題の目的は、目の前の人との通信、拡張現実技術を通して誘発される通信、すれ違い通信など、現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し、これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術を確立することである。平成23年度は、昨年度からの継続課題であったシステムの基本設計および要素技術の設計を実施したことに加えて、開発した要素技術の統合およびテストベッド環境の構築を行った。具体的な成果は次の通りである。(1)現実環境の状況(コンテキスト)を取得するために、センサを用いた対象物体の測位技術を応用し、対象物体の動線を正確に抽出する技術を確立した。また、センサの幾何学的配置が測位精度に与える影響を調査し、センサを効率的に配置する手法を提案した。さらに、センサ間はメッシュネットワークで接続されるため、各センサのチャネル設定を、通信と測位の観点から考察し、通信と測位の両方の性能を同時に改善する手法を確立した。これらの技術の有効性を示すために、九州大学伊都キャンパスにおいて、普段の生活を営む学生の動線を解析する実証実験を行った。(2)現実環境で起こる様々な事象を地理的および時間的に解析する手法を確立した。現実環境の情報から特に重要な情報を抽出するため、事象の局所性および周期性を、得られたセンサデータから解析する技術を提案した。この技術の有効性を評価するために、Twitterの位置情報付きtweetを解析し、現実環境のトピックを抽出する実験を行った。(3)九州大学伊都キャンパスに無線センサを配置し、テストベッド環境を構築した。配置したセンサは(1)で述べた動線解析技術の評価で利用するとともに、次年度以降、開発した要素技術の有効性を評価するために用いる。本研究課題の目的は,目の前の人との通信,拡張現実技術を通して誘発される通信,すれ違い通信など,現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し,これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術を確立することである.最終年度である平成25年度は,昨年度構築したテストベッドの改善及び評価を行った.具体的には,下記のとおりである.(1)無線LANを用いた屋内位置推定技術の確立:位置推定技術においては,従来は,位置推定用のサーバを新たに設置する必要があり,そのインフラコストが問題となっていた.そこで,新たなサーバを設置せず,移動端末自身で,位置推定する計算コストが低い新たな手法を提案し,本提案手法を実装して評価することにより,本手法の有効性を実証した.(2)ヒトに優しいマルチメディア配信技術の確立:無線通信端末をタグとして用いて,当該タグをマルチメディアコンテンツと紐づけした,新しいコンテンツ配信技術を提案した.

さらに,実装した.また,本サービスを,九州大学の学園祭で配信した実証実験を行った.アクセス数が約5千件になり,非常に有意義な実証実験となった.この実証実験を通じて,本提案手法の有効性を確認した.(3)発展途上国向けの新しいユビキタス環境技術の確立:発展途上国では,先進国がこれまで発展してきたユビキタス環境の変遷をたどることなく,一気に先進環境の一部を構築する状況にある.従って,これまでの先進国の構築してきたユビキタス環境が,適用できない状況である.本研究では,従来のユビキタスインフラを前提としない新たな環境を構築するための技術を提案した.本研究課題の目的は,目の前の人との通信,拡張現実技術を通して誘発される通信,すれ違い通信など,現実環境を拠り所にした通信にいち早く着目し,これらの通信を効果的に支援する新たなネットワーク基盤技術を確立することである.平成24年度は,昨年度構築したテストベッドの改善及び若干の評価を行った.具体的には,下記のとおりである.(1)無線LANを用いた屋内位置推定手法の1つであるシーン解析法において,事前の学習データ取得のコストを削減手法がいくつか知られているが,既存手法の多くは理想的な空間を扱ったものであり,現実空間への適用には問題があった.そこで,本研究では,壁などを考慮したリアルな環境に適用できる学習データ取得コストの削減手法を提案し,実環境で評価し,有効であることを示した.また,他の位置測位推定手法として,従来人手で行っていたキャリブレーションを,複数の基地局(アクセスポイント:AP)が協調することにより,自動的に行う手法を提案し,実環境で評価し,提案手法の有効性を示した.(2)無線ネットワークにおいては,モバイル端末の位置測位にかかるコストとスループットはトレードオフの関係にある.そこで,位置測位コストの削減とスループットの向上の2つの問題を取り扱ったAPのチャネル割り当て手法を提案し,提案手法をシミュレーションにより評価し,本手法の有効性を示した.(3)適応的な無線ネットワーク切り替え方式を提案,実装した.実現場で評価することにより,提案手法の有効性を示した.(4)さらに,昨年度九州大学伊都キャンパス内に構築したテストベッドに改善を加えた.現在,日常の研究活動を対象として,動線解析などいくつかの実験を行い,若干の評価を行った.現実環境を融合するユビキタスネットワーク技術に必要なシステムの全体設計および要素技術の開発を実施しており、研究成果を着実にあげている。さらに、予定していたテストベッド環境の構築が完了しており、おおむね順調に進展しているといえる。25年度が最終年度であるため、記入しない。現実環境を融合するユビキタスネットワーク技術に必要なシステムの全体設計,および要素技術を研究開発し,それらの要素技術を統合させたテストベッド環境も構築し,いくつかの評価も行っており,おおむね順調に進展しているといえる.今後は、平成23年度までに開発した各要素技術を統合し、さらに、平成23年度に構築したテストベッド環境および評価を踏まえ、改善していく。また、提案技術の必要性が広く理解されうるアプリケーションを構築し、提案ソフトウェアの総合評価を行う。
表面修飾による酸化鉄表面のスピン偏極度向上機構の解明と有用性の検証

本研究では、水素吸着によるFe3O4表面のスピン偏極度向上機構を明らかにし、界面修飾により高スピン偏極界面を実現することを目的としている。本年度では、水素吸着により生じる最表面および表面第二層の鉄原子のフェルミ準位近傍での電子状態変化を走査型トンネル顕微/分光法(STM/STS)により調べた。また、表面スピン状態測定のための装置改造の検討を行うとともに、炭素原子蒸着機構を測定チャンバに新たに設置し、炭素原子を蒸着しながらのSTM測定を可能にした。以下に具体的な研究実施状況を示す。1.通常のSTM測定で使用する一定電流モードではなく、マルチパススキャン法を活用することによりフェルミ準位直下の電子状態密度の実空間マッピングをおこなった。水素吸着により表面鉄原子のフェルミ準位直下の状態密度が大きく増加するというSTSスペクトルを再現する結果を得ることに初めて成功した。2. STM/STS及びマルチパススキャン法を用いた状態密度の実空間マッピングにより表面第二層の局所電子状態を取得することで、最表面の原子構造と電子状態の起源となる表面第二層の原子構造の決定に取り組んだ。表面第二層の鉄原子が位置する原子サイト間でフェルミ準位直下の状態密度の周期的な空間変調を観測した。この結果は表面第二層の鉄原子が電荷整列することを示しており、この電荷整列が最表面の再構成構造と半導体特性の起源であることを示唆している。3.水素吸着による表面第二層の鉄原子の電子状態変化をSTM/STS及びマルチパススキャン法を用いた状態密度の実空間マッピングにより調べた。表面OH基の直下に位置する表面第二層の鉄原子の電子状態が金属特性を示すことがわかった。これらの結果から、水素吸着により生じる水素原子からの電子移動現象が最表面の鉄原子だけでなく表面第二層の鉄原子の電子状態にも大きな変調を与えることが明らかになった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
群れの行動生物学的および理論生命科学的理解に基づいた群知能の構成とその具現化

本研究では個体と個体が成す巨大な群れの関係性の理論構築を行い、生物の観察結果を基に個体と群れの行動原理の物理・数理的解析を基にこれらを操る統一的制御理論を構築し、実際のロボットとして具現化することにより、生物学及び工学の両面から個体の知能と群れの知能の本質に迫ることを目的としている。具体的な研究実績内容を以下に示す。(1)群れ形成機能:群れ形成機能::(A).測る、(B).理解:個体が運動するためのエネルギーを考慮した群れのシミュレータの構築、(C).操る、(D).創る:エネルギーを環境から取り込みながら動くロボットが自己の存続を考慮して実世界で移動するための分散制御則の構築、(2)環境適応機能と群れ社会の機能向上の理解と実現::群れ社会の機能向上::(A).測る、(B).理解:トゲオオハリアリを用いた実験結果とシミュレーション結果による仮説検証、(3)個体の局所情報による群れの大域的情報の推定機能::(B).理解、(C).操る:餌の不足情報あるいはコロニーサイズの情報に基づいて個体の行動の変化アルゴリズムの検討、(4)群の身体性と群れ可同定性::群の身体性:(B).理解:ベイズ推論と逆ベイズ推論を導入して、群れが分裂し再び一個の群れに回帰する運動を解析、群れ可同定性:(B).理解:マーキング個体を用いたネットワーク分析、(C).操る:実証データに基づいてシミュレータを用いて,個体の巣所属認識(個体の内部状態として実装)が個体間相互作用によって二極化する過程の再現の検討また、共同研究の成果を、システム制御情報学会研究発表講演会SCI'18(2018年5月16-18日、京都)においてオーガナイズドセッション「群れの行動生物学的および理論生命科学的理解に基づいた群知能の構成と具現化」を企画し、他の研究者も交えて議論を行った。これまでの研究成果をもとに、以下のように研究計画に沿って研究を推進していく予定である。(1)群れ形成機能; (A).測る、(B).理解:個体が運動するためのエネルギーを考慮した群れのシミュレータの改良; (C).操る、(D).創る:エネルギーを環境から取り込みながら動くロボットが自己の存続を考慮して実世界で移動するための分散制御則の改良とロボットの製作(2)環境適応機能と群れ社会の機能向上の理解と実現;環境適応機能:(C).操る、(D).創る:行動則の改良と実機実験;群れ社会の機能向上:(A).測る、(B).理解:トゲオオハリアリを用いた実験結果とシミュレーション結果による仮説の再検討(3)個体の局所情報による群れの大域的情報の推定機能; (B).理解、(C).操る:餌の不足情報あるいはコロニーサイズの情報に基づいた個体の行動アルゴリズムの改良、(C).操る:餌の不足情報あるいはコロニーサイズの情報に基づいて個体の行動を変化させる場合とさせない場合の群としてのパフォーマンスの差異を検討し、シミュレーションにより仮説の妥当性を証明(4)群の身体性と群れ可同定性;群の身体性: (B).理解:ベイズ推論と逆ベイズ推論を導入して、群れが分裂し再び一個の群れに回帰する運動を解析;群れ可同定性: (B).理解:マーキング個体を用いたネットワーク分析、(C).操る:実証データに基づいてシミュレータを用いて,個体の巣所属認識(個体の内部状態として実装)が個体間相互作用によって二極化する過程を再現本研究では個体と個体が成す巨大な群れの関係性の理論構築を行い、生物の観察結果を基に個体と群れの行動原理の物理・数理的解析を基にこれらを操る統一的制御理論を構築し、実際のロボットとして具現化することにより、生物学及び工学の両面から個体の知能と群れの知能の本質に迫ることを目的としている。

個体と群れの行動原理の物理・数理的解析を基にこれらを操る統一的制御理論を構築し、実際のロボットとして具現化することにより、生物学及び工学の両面から個体の知能と群れの知能の本質に迫ることを目的としている。具体的な研究実績内容を以下に示す。(1)群れ形成機能::A).測る:セルラオートマトンを使った10万個体以上からなる群れのシミュレータの構築、(2)環境適応機能と群れ社会の機能向上の理解と実現::環境適応機能:(B).理解:環境適応機能のアルゴリズム化およびモデル構築とシミュレーションによる有効性の検証、(C).操る:モジュラーロボットの環境適応行動アルゴリズムの構築、群れ社会の機能向上:(A).測る:トゲオオハリアリを用いた実験環境の整備と観察実験準備、(3)個体の局所情報による群れの大域的情報の推定機能::(A).測る、(B).理解:栄養交換をするアリの餌の不足度合と群れ全体の餌の不足度合およびアリの周りの他のアリのフェロモン濃度と群れ全体のコロニー数の関係をマルチエージェント・シミュレーションにより確認、(4)群の身体性と群れ可同定性::群の身体性:(A).測る、(B).理解:外部世界と内部世界を多対一の写像とし代表元を導入することにより内部と外部を同型写像と見なす数学的枠組みの構築、群れ可同定性:(A).測る:分巣を行うことが知られているアリ(アミメアリ等)の大規模コロニーを実験室内で観測し、分巣が誘導される条件を検討個々の共同研究の推進と全体会議を通した研究目的の共有化を実施し、その成果を取りまとめ論文投稿するための準備が進んでおり、シナジー効果が出てきている。また、2017年10月29日ー11月1日に国際会議International Symposium on Swarm Behavior and Bio-Inspired Robotics2017を京都大学で開催するなど、国内外の研究者との議論を通して研究推進を加速している。これまでの研究成果をもとに、以下のように研究計画に沿って研究を推進していく予定である。(1)群れ形成機能; (A).測る、(B).理解:個体が運動するためのエネルギーを考慮した群れのシミュレータの改良; (C).操る、(D).創る:エネルギーを環境から取り込みながら動くロボットが自己の存続を考慮して実世界で移動するための分散制御則の改良とロボットの製作(2)環境適応機能と群れ社会の機能向上の理解と実現;環境適応機能:(C).操る、(D).創る:行動則の改良と実機実験;群れ社会の機能向上:(A).測る、(B).理解:トゲオオハリアリを用いた実験結果とシミュレーション結果による仮説の再検討(3)個体の局所情報による群れの大域的情報の推定機能; (B).理解、(C).操る:餌の不足情報あるいはコロニーサイズの情報に基づいた個体の行動アルゴリズムの改良、(C).操る:餌の不足情報あるいはコロニーサイズの情報に基づいて個体の行動を変化させる場合とさせない場合の群としてのパフォーマンスの差異を検討し、シミュレーションにより仮説の妥当性を証明(4)群の身体性と群れ可同定性;群の身体性: (B).理解:ベイズ推論と逆ベイズ推論を導入して、群れが分裂し再び一個の群れに回帰する運動を解析;群れ可同定性: (B).理解:マーキング個体を用いたネットワーク分析、(C).操る:実証データに基づいてシミュレータを用いて,個体の巣所属認識(個体の内部状態として実装)が個体間相互作用によって二極化する過程を再現
実バイオマスから直接電気エネルギーを生み出す固定化生体触媒の開発

本研究では、バイオマスの糖化と単糖の酸化を同時に行う電極の開発を行った。グルコース酸化酵素を固定化した電極を調整し、グルコースから電流を取り出すことができた。続いてこの電極にバイオマス分解酵素であるアミラーゼを固定化し、デンプンを燃料として直接電気エネルギーを取り出すことができた。また、βグルコシダーゼを固定化した電極を調整し、セロオリゴ糖からも直接電気エネルギーを取り出すことに成功した。低炭素社会の構築に向けて、新しいエネルギー供給源としてバイオマスの有効利用法の開発が急務である。本研究では、初めにグルコース酸化酵素(グルコースオキシダーゼ)を固定化した電極を調製した。グルコースオキシダーゼは糸状菌Aspergillusoryzaeを用いて発現、精製した。このタンパク質をカーボンペースト電極に固定化し、グルコースを基質として電流を測定した。グルコースからの電流を確認し、続いでキシロースを糖源とした電流を測定した。これより、キシロースを糖源としても電流を取り出せることを確認した。更に、デンプンを炭素源とし、溶液中にアミラーゼ及びグルコアミラーゼを添加して電流値を測定した。アミラーゼを添加しない場合には電流値は観測されなかったが、アミラーゼの添加に応じて電流が増加した。更に、αアミラーゼを添加した場合に比べて、αアミラーゼとグルコアミラーゼの両方を添加した場合、電流値が増加した。続いて、これらの酵素を電極に固定化することを試みた。初めにグルコースオキシダーゼとαアミラーゼを固定化した電極を作製し、グルコースからの電流を測定した。グルコースオキシダーゼのみを固定化した時とほぼ同等の電流が観測された。続いて、デンプンを用いて電流値を観測したところ、この2つを固定化した電極を用いた場合にのみ電流値の増加が確認された。以上より、バイオマス分解酵素とグルコース酸化酵素を固定化した電極を用いてバイオマスから直接電流を取り出すことに成功した。しかし、その電流変換効率はいまだ改善の余地がある。今後、より効率を向上させるべく条件検討を行っていく。微生物を用いてバイオマスから燃料や化成品原料等の有用物質を生産する技術は実用化へ着々と進んでいる一方で、現在の社会の大半を担う電気エネルギーをバイオマスから作ろうという試みはほとんど行われていない。バイオマスから直接電流を取り出す事ができれば、環境に優しいクリーンなエネルギーとして社会に大きく貢献できると考えられる。本研究では、バイオマス資源から直接電気エネルギーを生産する技術の開発を目的とした。本年度は、固定化酵素電極の作成を目指し、酵素を用いて単糖類を電流に変換する技術の開発を濃なった。グルコース等の単糖類は、酸化酵素であるグルコースオキシダーゼ(GOD)によりグルコラクトンに酸化され、電子を放出する。よってグルコースオキシダーゼを固定化した電極を作製しグルコースから電気エネルギーを取り出す系について検討を行った。特に、酵素量、メディエーターの種類、そしてそれらを覆うポリマーが電極の性能に非常に重要であることを新たに見出した。これより、グルコース酸化型電極の調製方法を確立した。続いて、バイオマスから直接電気エネルギーを得る系について検討を行った。デンプン質系バイオマスをターゲットとし、その分解酵素であるアミラーゼを共に固定化した電極を作成し、評価を行った。これより、バイオマス分解酵素を固定化することでバイオマスから直接電気エネルギーを得ることに成功し、また溶液への添加よりも電極に固定化した方が効率がよいことを新たに見出した。また、実際のバイオマスとしてお米から直接電気エネルギーを取り出すことにも成功した。
高度情報化に対応する障害児教員養成カリキュラムとマルチメディアモジュールの開発

平成8年度には、特殊教育におけるコンピュータ等の情報機器の活用に関する教員研修をより充実させることを目的に教師教育用マルチメディア教材を開発した.教材はHTML(Hyper Text Markup Language)を使って記述され,学習者はコンピュータのマウスを操作することで各自の興味に従って教材に含まれる映像や資料を表示させることができる.作成されたマルチメディア教材の評価を27名の特殊教育教員を対象に行った.事前と事後においてコンピュータに対するイメージを評定させた。形容詞対には(1)「むつかしい-やさしい」,(2)「機械的-人間的」,(3)「かたい-やわらかい」,(4)「嫌い-好き」の4対を選定した.各評定について,事前-事後の対応が各被験者で成立するのでデータに対応のある場合のt検定を行った.その結果,「むつかしい」から「やさしい」(事前の評点は平均で2.4,標準偏差が1・4,事後が3・4,標準備差が1・8)へと有意(両側検定,p<.01)に,「機械的」から「人間的」(事前の評点は平均で2.5,標準偏差が1.5,事後が2.9,標準偏差が1.5)へと有意ではないがイメージの変容の傾向がみられ(両側検定,.05<p<.1)、開発したマルチメディア教材が有用であることが示された.平成9年度は、新しく制作された自作ソフトウェアの19本を追加して、マルチメディアモジュールの充実を計ったほか、作成したマルチメディアモジュールを有効に活用するための赤外線リモートコントロールセットを開発した。今後は、継続的な教材配布体制の確立と、急速に普及しつつあるインターネットの教育活用を考慮したカリキュラム、高度マルチメディアモジュールの開発が急務であると考えられた.平成8年度には、特殊教育におけるコンピュータ等の情報機器の活用に関する教員研修をより充実させることを目的に教師教育用マルチメディア教材を開発した.教材はHTML(Hyper Text Markup Language)を使って記述され,学習者はコンピュータのマウスを操作することで各自の興味に従って教材に含まれる映像や資料を表示させることができる.作成されたマルチメディア教材の評価を27名の特殊教育教員を対象に行った.事前と事後においてコンピュータに対するイメージを評定させた。今後は、継続的な教材配布体制の確立と、急速に普及しつつあるインターネットの教育活用を考慮したカリキュラム、高度マルチメディアモジュールの開発が急務であると考えられた.特殊教育におけるコンピュータ等の情報機器の活用に関する教員研修をより充実させることを目的に教師教育用マルチメディア教材を開発した.本教材はHTML(Hyper Text Markup Language)を使って記述され,学習者はコンピュータのマウスを操作することで各自の興味に従って教材に含まれる映像や資料を表示させることができる.作成されたマルチメディア教材の評価を27名の特殊教育教員を対象に行った.事前と事後においてコンピュータに対するイメージを評定させた。形容詞対には(1)「むつかしい-やさしい」,(2)「機械的-人間的」,(3)「かたい-やわらかい」,(4)「嫌い-好き」の4対を選定した.各評定について,事前-事後の対応が各被験者で成立するのでデータに対応のある場合のt検定を行った.その結果,「むつかしい」から「やさしい」(事前の評点は平均で2.4,標準偏差が1.4,事後が3.4,標準偏差が1.8)へと有意(両側検定,p<.01)に,「機械的」から「人間的」(事前の評点は平均で2.5,標準偏差が1.5,事後が2.9,標準偏差が1.5)へと有意ではないがイメージの変容の傾向がみられた(両側検定,.05<P<.1).このように,教材の使用後にコンピュータに対するイメージが「むつかしい」ものから「やさしい」ものへ,「機械的」なものから「人間的」なものへと変化する傾向がみられたことなどから、操作性の向上をはかるなど改善の余地はあるものの,開発したマルチメディア教材が有用であることが示された.今後さらに,新しく制作される自作ソフトウェアの追加など,継続的な教材配布体制の確立が急務であると考えられた.平成9年度は、前年度に開発された特殊教育におけるコンピュータ等の情報機器の活用に関する教員研修をより充実させることを目的とした教師教育用マルチメディアモジュールの充実を計ったほか、作成したマルチメディアモジュールを有効に活用するための赤外線リモートコントロールセットを開発した。

具体的には、マルチメディアモジュールに加えた情報は、第7回心身障害児教育財団主催の特殊教育学習用ソフトウェアコンク-ルに入選した19作品である。入力された情報は、作品名、作品のねらい、教材としての工夫点、対象となる児童生徒、障害種別、児童生徒の操作の方法、使用効果などである。教材はHTML(Hyper Text Markup Language)を使って記述され,学習者はコンピュータのマウスを操作することで各自の興味に従って教材に含まれる映像や資料を表示させることができる。赤外線のリモートコントロールセットには、コンピュータの標準入力装置、すなわちキーボードとマウスの機能を代替する情報入力インターフェースの規格であるGIDEI:General Input Device Emulating Interfaceを採用した。制御用のコンピュータにはParallax社のBASIC Stamp IIを利用した。今後は、継続的な教材配布体制の確立と、急速に普及しつつあるインターネットの教育活用を考慮したカリキュラム、高度マルチメディアモジュールの開発が急務であると考えられた。研究成果について、平成8年度平成9年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2)研究成果報告書「高度情報化に対応する障害児教員養成カリキュラムとマルチメディアモジュールの開発」(平成10年3月)を作成した。
水質自動観測機の開発と面源負荷時系列の解析に関する研究

本研究で開発した現場据置型自動水質分析システムは以下の特徴を有するものである。1)フロースルー型ISE(イオン選択制電極)の利用による測定精度の向上と省試料化の実現。2)電位差計にDC駆動の生体電位計測電位差計を利用。3)DC(バッテリー)駆動による長期(24週間)運転の実現。4)逆洗機構の組込によるサンプル取水部フィルターの長寿命(23週間)化。5)自動2点校正回路の組込によるISE応答の変動への対応(定量精度の確保)、6)サンプル取水ループの直後にエアトラップ(空気抜き)を設置し、デッドボリュームを減少。7)流路・ISEに常時キャリアーを流すことによる分析回路の自動洗浄、8)耐菌性テフロンチューブによる流路の汚濁の防御。9)プランジャーポンプの採用による脈流の抑制と精度の向上。10)脱気装置の追加による送液の長期運転の向上。上記システムを奈良県南部の山林流域に2000年9月より現場設置し、装置の試運転と改善を行いながら、Na、K、Clの測定を行っている。最終的に上記構成に改めてからの測定は2000年2月よりであり、これ以降15分に1度の間隔で精度の良い計測が可能となった。通常試料採水が困難な冬季の降雨出水時でも連続的なデータ収集が実現できている。流量・降水量の水文資料と比較した結果、洪水時のヒステリシス等の検証も可能であった。電位応答波形から検量線の時間変動を考慮しつつ濃度を計算する変換プログラムも作成した。また、試料中に微量に含まれる気泡のため静電気が蓄積しノイズが増えるため、ISEと電位差計は作動接続が必須である。特に洪水時には気泡の混入量が増えるためISEの応答波形は乱れやすく、これには脱気装置の追加および堰に設置されたスクリーンの上流側移動により対処した。残された問題点として冬季の試料凍結があり、これにはチューブ周辺へのヒーターの追加を行う必要がある。本年度は自動観測装置の制作をほぼ完了しており、その成果を以下に列挙する。1.試料流量が0.21.0mlで済み、バッファと試料を交互にタイマ駆動により送液するDC電源のプランジャーポンプ送液装置を完成した。計画ではペリスタポンプとしていたが、装置の長期安定動作のため、プランジャーポンプに変更した。制御部もポンプ装置内に内蔵とした。2.イオン選択電極を、小型フラットタイプ電極からフロースルー型電極に変更した。試料の必要量には変更が無い。これは、設置を山林流域としたため、計画案ではセンサの定量下限と測定範囲が重なる項目があったためである。項目はナトリウム、カリウム、塩化物イオンに限定した。3.検出部に生体電位計をベースとしたDC電源の電位差計(10の910乗オーダーオームのインピーダンスを有する)を組み込み、出力信号の安定性を向上させた。現在は以上の構成でセンサの特性の検査を完了し、校正方法の確認と連続運転のテストを行っている。4月当初からの現場観測を予定している。
鱗翅目昆虫の性決定制御に関わるmiRNA-mRNAネットワークの包括的理解

ショウジョウバエではlet-7 miRNAが、精巣の適切な性分化や性成熟に必要であり、雌雄の性腺で最も発現量に差のあるmiRNAである。カイコでも、let-7の発現には雌雄差がある。興味深いことに、カイコの雄化遺伝子の1つであるImpは、ヒトやショウジョウバエにおいて、let-7による発現抑制を受ける。以上の事実から我々は、カイコのlet-7も性決定や性分化に関与しているのではないかと考えた。まず、カイコでもlet-7がImpの発現を抑制しているか否かを調べるため、卵巣由来のBmN細胞と雄の胚子由来のM1細胞を用いた解析を行った。これらの細胞におけるlet-7の発現を調べたところBmN細胞ではmatureなlet-7が、M1細胞ではpri-matureなlet-7が発現していた。このことより、BmN細胞ではlet-7がImpの発現を抑制している可能性が示唆された。そこで、let-7をノックダウンするため、anti-let-7 LNAをBmN細胞に処理したところ、matureなlet-7が減少し、pri-matureなlet-7が出現することわかった。このlet-7のノックダウンが実際に標的遺伝子の発現量に影響を及ぼし得るかを確認するため、let-7の標的として知られているBmFtzF1及びBmEF74のmRNA量を定量したが、有意な変化は認められなかった。IMPタンパク質の発現レベルをwestern blottingにより調べたが、let-7ノックダウンによる変化はみられなかった。カイコの性決定に関わる他の遺伝子(Fem、Masc、Bmdsx)の発現量についても調べたが、やはりlet-7ノックダウンによる影響はみられなかった。let-7をノックダウンしても、let-7の既知の標的遺伝子の発現量が変化しなかったことから、今後培養細胞を用いたlet-7ノックダウンアッセイ系には条件検討が必要であるといえる。一方、カイコの性決定時期にある胚子のmiRNA-seqを行ったところ、発現量に性差を示すmiRNAがみつかったため、現在これらのmiRNAについて解析を進行中である。miRNAがカイコの性決定遺伝子の発現パターンや発現量の制御に関与するかどうかを検証するため, miRNAによる翻訳抑制に必須の因子であるAgo1のノックダウンを行い, miRNA経路を遮断した場合に性決定遺伝子の発現量に変化がみられるか調査した.その結果, Bmdsxの発現量が雌雄どちらにおいても著しく減少することが判明したことから, miRNAがBmdsxの発現量の維持に関わることが強く示唆された.そこで, Bmdsxの発現量の制御に関わるmiRNAを同定するため,性決定時期に発現するmiRNAを網羅的に同定した後,発現量に性差のあるmiRNAを探索した.その結果,雌で高い発現を示すmiRNAを282個,雄で高い発現を示すmiRNAを330個同定することができた.それぞれ上位50個のmiRNAについてRT-PCR及びqRT-PCRを行い,胚発生時期における発現パターンと発現量の推移について詳細に調べた.その結果, miR-2733i-3pのみが性決定時期の雄において最も発現量が高いことが判明した(図3B).そこでmiR-2733i-3pをノックダウンした卵における性決定遺伝子の発現量を調べたところ、Bmdsxの発現量は雌雄どちらにおいても減少することが判明した. miR-2733i-3pの標的遺伝子を推定するため, in silico解析を行った結果, 1851遺伝子が標的として予測された.これらを予測信頼度の高い順に並べたところ,転写因子としてはBmdsxが最高位であることが判明した.レポーターアッセイによるmiR-2733i-3p標的部位のバリデーションを行った結果、miR-2733i-3pはBmdsx mRNAの3'UTRの509531ntに存在する標的配列を介して翻訳抑制を引き起こすことが判明した。本研究の目的は、カイコの性決定・性分化にmiRNAが関与するかどうかを明らかにすることを第1の目的として挙げ、さらにそのようなmiRNAが同定されたなら、その標的となる遺伝子を見つけ出すことをもう一つの目的としている。平成27年度までの研究成果により、我々は性分化のマスター遺伝子として知られるBmdsxの発現維持にmiRNA経路が必要であることを最初に証明し、実際にBmdsxの発現量の維持に関わるmiRNAを1種類同定することに成功した。しかも、このmiRNAのターゲットはBmdsxである可能性を強く支持する実験結果を得ることもできた。従って、既にこの時点で本研究の目的は概ね達成できたと判断できる。ここまでの研究成果により同定されたmiRNAが、実際に生体内でBmdsxの翻訳制御を行っていること、またカイコの性分化制御に欠かせない因子であるかどうか、という点について、残り1年間の研究期間内で明らかにすることができれば、本研究課題の目的は完全に達成されたと言うことができる。平成27度までの研究成果により、我々は鱗翅目昆虫特有のmicroRNAであるmiR2733ファミリーに属する3つのmiRNAが、カイコの性決定時期である産下後32時間の卵において最も高い発現を示すことを明らかにした。また、miR2733-i-3pは性分化のマスターレギュレーターであるBmdsxの3'UTRに存在する標的配列に結合し、その翻訳を阻害することがレポーターアッセイによるバリデーション実験によって支持された。

以上の点を踏まえ、平成28年度はmiR2733が実際に内在性のBmDSXのタンパク質翻訳量を下げるか否か、という点について確認することにした。このためにリコンビナントBmDSXタンパク質を精製し、これを抗原として用いた抗BmDSX抗体を作製した。この抗体を用いてWestern blottingの結果、胚子期におけるBmDSXタンパク質の発現量は極めて低いことがわかった。このため、胚子期におけるmiR2733の発現が内在性のBmDSXの発現量を下げるか否かという点について明らかにすることはできなかった。一方、平成27度までの研究成果により、胚子期におけるmiR2733の発現を抑制すると、BmdsxのmRNA量が減少することを我々は突き止めている。そこで平成28年度は、胚子期におけるmiR2733のノックダウンが性分化に及ぼす影響について調べることにした。カイコの受精卵にanti-miR2733 LNAを注射したところ、孵化個体が得られず胚致死することが判明した。そこで胚子期における性分化に及ぼす影響に焦点を絞った解析を行うことにした。胚子期における性的二型については知見がなかったため、胚子の切片標本をステージ毎に作製し、雌雄で比較した結果、催青II期(孵化1日前)のステージにおいて生殖巣の大きさや生殖細胞の数に有意な雌雄差を認めることができた。anti-miR2733 LNAを注射した胚子はこのステージまで発生する前に致死に至ったため、miR2733が性分化に及ぼす影響について明らかにすることはできなかった。Impは、ヒトやショウジョウバエにおいてlet-7による発現抑制を受ける。一方、我々はカイコのImpの3'UTRにlet-7のseed配列と相補鎖を成す配列を見出している。Impはカイコのdsx(Bmdsx)の性特異的スプライシングを雌型から雄型にシフトするために必要な因子であり、雄分化に関与するとされている。我々は、miRNAがカイコの性決定に関わる可能性を検証するため、カイコにおけるlet-7とImpとの関連性について調べることにした。当研究室において継代している雄胚子由来NIAS-Bm-M1と卵巣由来BmN細胞におけるlet-7の発現について調べたところ、注目すべきことにNIAS-Bm-M1細胞にはmature formが存在せず、BmN細胞にのみlet-7 mature miRNAが発現することが判明した。この発見により、これらの培養細胞はlet-7の機能を解析する上で優れたアッセイ系として利用できることがわかった。しかも、anti-let7 LNAをトランスフェクションするだけで簡便且つ完全にlet-7の発現を抑制できることも判明した。この培養細胞とLNAを用いたノックダウンを併用したlet-7アッセイ系を構築することにより、let-7とIMPタンパク質の発現量、及びそれ以外のカイコの性決定に関わる遺伝子(Fem、Masc、Bmdsx)の発現量についての関連性について次々に調べ上げることができた。しかし一方で、このアッセイ系を利用してもlet-7の既知の標的遺伝子の発現量を変化させることができていないことも明らかとなり、今後更なる条件検討が必要となる。