hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中学・高校用「生きた英語」音声教材のユーザ参加型共有システムの構築

中学や高校の普通教室でおこなわれる英語授業で利用可能なオーセンティックインプット教材を収集し,英語教員間で共有可能なシステムを構築した。主に即興のスピーチを含んだビデオクリップを授業で使用し,教師や学習者の意識を調査したところ,本研究で開発されたシステムが「生きた英語」を学習者に聴かせる頻度を増やし,学習者の英語学習に対する動機づけの維持に効果があるという可能性が明らかになった。本研究の目的は,中学・高校の(将来的には小学校の)英語教員に有益な「生きた英語」音声教材を共有する場を提供することである。3年計画の初年度として主に次の2点を行った。1.研究の前提として,「生きた英語(authentic English)」に関する先行文献を概観し,再定義し,あらためて英語教育における生きた英語の重要性について論じた。また,その一方で,生きた英語を中学・高校の英語授業で活用する際の問題点を整理し,一例として,(1)英語初級レベルの学習者への対応,(2)視聴覚機器の不備,といった点が明らかになった。これらのギャップを解消するための手法として,(1)音声教材共有システムを構築し,(2)近年,休息に普及しつつあるデジタルプレーヤーを媒介とした提示方法を提案した。2.日本人英語学習者向けの「生きた英語」の音声ファイルを収集するため,英語母語話者の英語教員,外国語指導助手を中心に,即興的(impromptu)なスピーチや会話のデータを音声・動画ともに広く集めた。また,教材としての利用を促進させるために音声データをもとにトランスクリプションを作成した。3.収集したデータを公開するために必要とされるシステムの機能を研究し,音声・動画ファイルや授業資料ファイルのアップロード及びダウンロード,ユーザのカテゴリーによるアクセスコントロール,ユーザによるコメント追加といった機能を持つコンテンツマネージメントシステムについて研究した。これらの研究の結果をふまえ,2年次では,実際に共有システムの運用を開始する予定である。本研究の目的は,中学・高校の英語教員に有益な「生きた英語」音声教材を,普通教室においても簡便に利用できる共有システムを構築することである。初年度の研究を受け,2年次には次の2点をおこなった。1.初年度でおこなった「生きた(authentic)英語」の再定義をもとに,引き続き,日本人英語学習者向けの「生きた英語」の音声ファイルを音声・動画ともに広く収集した。昨年度同様,外国語指導助手(ALT)や日本在住の英語母語話者が,原稿を用意せずに話す即興的(impromptu)なスピーチや会話を多く収録することを目指すとともに,アメリカ英語やイギリス英語だけでなく,他の多くの種(variety)の英語母語話者の音声収録もおこない,シンガポール英語や,米国留学経験のある日本語母語話者の英語を収録し,World Englishesの題材に利用可能な音声ファイルを作成した。また,英語が話されている場面(situation)の多様化を目指し,飲食店での注文の場面や機内放送といった,例えば高等学校オーラルコミュニケーションで多く取り扱われている場面の収録をおこなった。2.収録された音声ファイルを教材共有システムを構築した。世界的に普及が進む汎用CMS, Joomlaを採択し,運用を開始した。また,高等学校において本研究で公開した音声教材を用いた実践を試行し,次年度にさらに複数の授業で実践する予定である。スクリプトの公開方法,音声ファイルに関連する教材(プリント等)の配布方法については解決すべき問題が残されており,これらの点を含め,最終年度に引き続きシステム構築をおこなう予定である。3年次には計画の最終年度として,以下の2点について研究を進めた。1.初年度でおこなった「生きた英語」の定義をもとに,これまで2年間の研究に引き続き,日本人英語学習者向けの「生きた英語音声(authentic audio input, AAI)」を収集した。また,より運営しやすい汎用コンテンツ・マネージメント・システムとしてNetCommonsを採択し,これまで試用してきた音声ファイル共有システムを再構築した。2.本研究で収集した音声ファイルや共有システムの有効性を検証するため,実際の英語授業でAAIを教材として活用した実践研究をおこなった。AAIを使った活動例を考案し,高等学校,高等専門学校,大学にて計3種類の活動をおこなった。授業開始時のウォームアップでの利用,スピーチモデルとしての利用,既習の言語項目の発展学習としての利用といった活用法が実践された。学習者に対して質問紙調査をおこない,学習者の動機づけや学習志向と,AAI教材との関連を調査した。因子分析およびクラスター分析により学習者層を複数に分け,群間の比較を行った結果,本研究の対象となった学習者層では,特に英語学習に対する動機づけの低い生徒に対してAAIの利用が有効であり,英語学習者用に工夫された原稿を読み上げたものを聴くだけではなく,時には即興のスピーチや会話を聴かせることが動機づけの持続させる可能性があることが明らかになった。
近代日本における「無学歴学校」の歴史的研究--鉄道教習所を中心に--

1.資料調査の進捗状況北海道・宮城県・埼玉県・東京都・京都府・大阪府・島根県・広島県・山口県・福岡県の図書館・文書館で実施し、当該地まで出向かなければ閲覧できない資料を中心に大きな収穫を得た。昨年度実施を予定しておりながら、都合で実施できなかった訪問先を相当網羅できた。本研究の対象は正規の(したがって文部省所管の)教育制度ではなく、また現存する教育機関でもない。それゆえ調査の対象は各都道府県の教育史に関する資料のほか、「鉄道公報」をはじめとする鉄道省の発行物、一般の新聞・雑誌、受験生を対象とする受験案内書といった全国各地に散逸している。それらの一端を収集できたのは特筆に値する成果といえる。また、鉄道省と同様に、中等・高等教育へと列なる学校体系を有していた逓信省の所管学校(逓信官吏練習所・逓信講習所)に関する資料を相当数入手できたのは予想外の成果であった。これを基盤にして次年度以降、「無学歴学校」の研究を更に深化させたい。2.資料分析の進捗状況前年度に実施した日本教育学会第63回大会(於北海学園大学)における学会発表をもとに、受験雑誌『鉄道青年』の書誌的分析を進め、本年度の学内紀要に論文を投稿した。また、並行して収集を行った逓信省の所管学校に関する資料については、今なお整理の段階にあり、今後も分析を継続したい。3.学会発表の状況本年度は行っていない。4.その他特記事項なし。1.資料調査の進捗状況北海道・宮城県・山形県・東京都・神奈川県の図書館・文書館で実施し、当該地まで出向かなければ閲覧できない資料を中心に大きな収穫を得た。それでも「鉄道公報」および受験雑誌『鉄道青年』をほぼ全巻閲覧することができたのは特筆に値する成果といえる。2.資料分析の進捗状況受験雑誌『鉄道青年』の資料整理を終え、書誌的分析を行った。また、同誌のほか、収集したさまざまな資料をもとにして、全国5ヶ所(のち7ヶ所)に設置されていた鉄道教習所の沿革史を整備した。現在は日本国有鉄道の正史『日本国有鉄道百年史』(全19巻)の精読を行い、沿革史とつき合わせることにより、その時期ごとの鉄道教習所における教育制度がどのような意味を持ったのか明らかにする作業を実施中である。3.学会発表の状況日本教育学会第63回大会(於北海学園大学)において、受験雑誌『鉄道青年』の書誌的分析に関する発表を行った。4.その他本事業に着手する以前に、その予備的考察として行った鉄道教育制度に関する論文が、吉田文・広田照幸編『職業と選抜の歴史社会学-国鉄と社会諸階層-』(世織書房、2004年)に2本掲載された。
両側頸部郭清手術時の脳静脈還流障害による脳浮腫発現に関する実験的研究

頸部郭清術は、脳静脈血の主還流路である内頸静脈やリンパ節を切除するため、脳静脈還流障害に起因する頭蓋内環境の変化を来す可能性がある。本研究では、両側頸部郭清をラットに施行し、術後の脳浮腫および脳組織障害の発生について検討を加えた。【実験1】雄のWistar系ラットを用い、ペントバルビタール30mg/kgの腹腔内麻酔下に、ラットにおける主な脳静脈還流路である両側外頸静脈、ならびに頸部リンパ節の結紮を含む頸部郭清術を施行した。24時間および48時間後に断頭し、乾湿重量法にて大脳半球水分含量を測定し、脳浮腫発生の有無を検討した。これを頸部切開を行っただけのシャム操作群の値と比較した。【実験2】実験1と同様の両側頸部郭清ラットで、48時間後にエバンスブルー(EB)2%溶液を静注し、30分間に断頭後、脳冠状断面におけるEBの漏出を観察してblood-brain barrier(BBB)の障害を検討した。また、病理組織学的変化についても検討を加えた。【結果】実験1で、24時間ならびに48時間後の実験群の脳水分含量は、シャム操作群の値と比較して有意に増加し、脳浮腫の発現を示唆する所見を得た。また、実験2では、一部のラットに部分的なEBの漏出が認められ、BBBの障害を惹起する脳血管透過性の亢進が推察された。また、病理組織学的にも、核濃縮等の神経細胞の損傷所見が得られた。従来より、ラットにおける両側頸静脈結紮による脳浮腫の発生は否定されてきたが、リンパ経路を同時に遮断することで、早期より脳浮腫が引き起こされる可能性が明らかとなり、本手術後の頭蓋内病態を研究する上で、このモデルが有用であることが明らかとなった。
がんゲノム啓発を目的としたまんが教材を用いた教育効果の検証

本研究では、がんゲノムに対する一般市民の知識や意識変化を評価し、地域の特性を生かした市民啓発の方法を検討することを目的とする。近年、がんゲノム医療が加速しているにも関わらず、現在のがん教育及び学校教育におけるヒト遺伝学やゲノム医学に関する記載が少なく、リテラシー向上は急務である。遺伝医療・がんの専門家、および患者・市民参画(PPI)の取り組みとして当事者会とも連携を取りながら一般市民を対象とした継続的な質問紙調査を実施する。得られた知見をもとにフィードバックを行い、健康管理やがん予防に繋がる適切な行動変容を目指す。
光分子スイッチによる人工細胞ソーティング

本研究では、光に応答するジェミニ脂質を各種合成し、これらを光分子スイッチとして用い、光により、リポソームを自在に集積・組織化することを目的とした。さらに、この系を展開し様々な分子スイッチを組み込んだ人工細胞の混合溶液から、必要なもののみを光によって選別しこれらを基板上に並べる「人工細胞ソーティング」の実現を目指した。これらの目的のもと研究を推進し、今年度は以下の研究成果を得た。(1)光分子スイッチによる人工多細胞システムの制御:合成した光分子スイッチをリポソームに組み込み、その光応答に基づくリポソーム間会合挙動について、動的光散乱測定、示差走査熱量測定、ゼータ電位測定、蛍光異方性測定などの手法を駆使し、網羅的な知見を得た。(2)光分子スイッチによる「人工細胞ソーティング」:光分子スイッチによるリポソームの会合の原理を展開し、さまざまな光に応答する別種の分子スイッチを組み込んだリポソームの混合溶液から、目的とするリポソームを光によって選び出し、基板上にソーティングできることを明らかにした。基板は、従来から用いられている脂質平面二分子膜を固体基板上に作製し、これに分子スイッチを組み込んで用いた。さらに、固体基板のみならず、ジャイアントリポソームに分子スイッチを組み込むことで、ジャイアントリポソームを用いたリポソームソーティングが実現できることも明らかにした。(1)光応答性分子スイッチの合成:ペプチド残基としてイオン認識が可能なアミノ酸を導入し、さらに、この脂質のスペーサー部位に、光応答部位のアゾベンゼン基を導入した分子スイッチを合成した。(2)光分子スイッチによる人工多細胞システムの制御:光分子スイッチをリン脂質からなるリポソームに組み込み、その光応答に基づくリポソーム間会合挙動について、動的光散乱測定、示差走査熱量測定、ゼータ電位測定、蛍光異方性測定などの手法を駆使し、網羅的な知見を得た。具体的には、紫外光、可視光照射に応答して、水溶液中におけるリポソーム間の会合を可逆的に制御できることを明らかにした。また、基板として用いるリン脂質の種類を変化させることで、これらリン脂質からなるリポソームの相転移挙動を利用して、リポソーム間の会合を制御できることも見出した。さらに、この原理を展開し、光応答性分子スイッチを組み込んだリポソームの混合液体から、目的とするリポソームを光によって選び出し、基板上にソーティングできることを示した。
周術期薬物が内臓諸臓器抵抗血管に及ぼす直接作用とその機序に関する研究

本邦で現在頻用されている揮発性吸入麻酔薬イソフルランやセボフルランは、臨床関連濃度で、摘出腸間膜抵抗血管において、交感神経伝達物質ノルエピネフリンに対する収縮反応に有意な影響を与える。これら麻酔薬のノルエピネフリン収縮反応に対する作用は、内皮依存性血管収縮成分と内皮非依存性血管拡張成分に分けられる。内皮存在下では、内皮依存性血管収縮作用は内皮非依存性血管拡張作用を凌駕するためノルエピネフリン収縮反応は増強するが、内皮非存在下においては、血管拡張作用のみが出現するため、ノルエピネフリン収縮反応は減弱する。これらの内皮依存性血管収縮作用に、一酸化窒素、内皮由来過分極因子、シクロオキシゲナーゼ系代謝産物、リポキシゲナーゼ系代謝産物、エンドセリン-1、アンギオテンシン-II、セロトニンの何れも関与しない。イソフルランは、血管内皮よりスーパーオキサイドを放出させ、血管収縮反応を増強する可能性が示唆された。セボフルランは、膜電位依存性Ca^<2+>流入を抑制し細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を抑制することで、また、収縮蛋白系Ca^<2+>感受性を抑制することで腸間膜抵抗血管平滑筋を弛緩させると考えられた。収縮蛋白系Ca^<2+>感受性の抑制は、正常膜機能に依存する可能性が示唆された。4つの代表的な揮発性吸入麻酔薬であるハロタン、エンフルラン、イソフルラン、セボフルランは、腸間膜抵抗血管平滑筋細胞内Ca^<2+>貯蔵部位の貯蔵Ca^<2+>量、Ca^<2+>取り込み機構、Ca^<2+>放出機構に対して異なる作用を有することが明らかになった。そのような多彩な作用を介して、吸入麻酔薬が、内臓抵抗血管のトーヌスやその反応性に有意な影響を及ぼす可能性が示された。静脈麻酔薬ケタミンが腸間膜抵抗血管に及ぼす作用とその機序に関して、内皮の役割も含めて、詳細に検討し、報告した。現在、肝動脈や腎動脈に対する揮発性吸入麻酔薬の作用について検討しているところである。本研究費申請時に提出した研究計画に従い、細胞内Ca^<2+>濃度測定装置が導入された昨年9月下旬までは、現有設備である等尺性張力測定装置を用いて、現在の全身麻酔薬の主流である揮発性吸入麻酔薬イソフルラン、セボフルラン、エンフルレン、ハロタンが摘出ラット腸間膜小動脈に及ぼす効果について血管内皮存在下、非存在下に検討を行った。結果、これら全ての麻酔薬は、臨床関連濃度で直接血管拡張作用を有することが示され、麻酔薬間で血管拡張作用の強さに差があることが明らかになった。さらに、膜透過標本実験からそのような血管平滑筋抑制作用の機序が麻酔薬間で異なることも明らかになった。また、血管平滑筋の収縮-弛緩機構に重要な役割を果たしている細胞内Ca^<2+>貯蔵部位に対する作用を検討すると麻酔薬間でやはり異なった作用が観察され、一部の麻酔薬が臨床関連濃度で細胞内Ca^<2+>貯蔵部位の統合性を脅かす可能性が明らかになった。最新の吸入麻酔薬であるセボフルランについて、内皮正常標本においてその作用を検討した結果、内皮依存性の収縮増強作用を有することが明らかになり、内皮由来弛緩因子の放出抑制がその原因の一つとして考えられた。

細胞内Ca^<2+>濃度測定装置導入後の張力-細胞内Ca^<2+>濃度同時測定実験により、セボフルランの直接血管平滑筋抑制作用メカニズムが次第に明らかになりつつある。セボフルランの収縮蛋白系のCa^<2+>感受性に及ぼす効果に関する細胞内Ca^<2+>濃度測定実験結果と膜透過標本実験結果の不一致は、膜透過標本では既に失われている何らかの内因性物質あるいは損傷を受けている細胞膜が、セボフルランの収縮蛋白系のCa^<2+>感受性に対する抑制作用に関与している可能性を強く示唆した。また、高濃度セボフルランの血管平滑筋抑制作用には、細胞内Ca^<2+>濃度の低下も大きく関与することが明らかになった。他の麻酔薬に関して同様の検討が必要と思われる。本研究費申請時に提出した研究計画に従い、平成10年度は細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)測定実験を本格化、吸入麻酔薬や周術期に使用される血管拡張薬が摘出ラット腸間膜動脈や肺動脈弁内皮細胞組織に及ぼす効果について検討を行った。セボフルランは、交感神経伝達物質であるノルエピネフリン(NE)やKClによって引き起こされた[Ca^<2+>]i上昇とそれに伴い発生した収縮の両者を抑制した。細胞内Ca^<2+>貯蔵部位を除去した条件下においても、セボフルランはNEによる[Ca^<2+>]i上昇とそれに伴う収縮を抑制したが、ベラパミルやジルチアゼム処理標本においては影響を及ぼさなかった。膜脱分極下あるいは非脱分極下に細胞外Ca^<2+>濃度を漸増して得られるCa^<2+>-張力関係に対するセボフルランの効果をNE存在下あるいは非存在下に検討すると、全ての条件下において、セボフルランはCa^<2+>-張力関係を右下方へと有意に移動したが、β-escin筋においては、Ca^<2+>-張力関係に有意な影響を及ぼさなかった。以上より、セボフルランは、細胞内Ca^<2+>動員機構のみならず収縮蛋白系のCa^<2+>感受性を抑制することで血管平滑筋を抑制することが明らかになった。Ca^<2+>感受性抑制作用は、細胞膜機能あるいは膜透過標本においては機能不全に陥っている収縮制御機構に依存する可能性が示唆された。セボフルランの[Ca^<2+>]i減少作用は、主として膜電位依存性Ca^<2+>流入の抑制によるものと考えられた。セボフルラン、イソフルラン、ハロタン、エンフルランはいずれも、それ自身で肺動脈弁内皮細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を引き起こした。セボフルランによる内皮細胞内Ca^<2+>濃度の上昇作用は細胞外Ca^<2+>除去やNiCl_2によって有意に抑制されたが、細胞内Ca^<2+>貯蔵部位のCa^<2+>の枯渇の影響は受けなかった。このことは、セボフルランが、細胞外よりCa^<2+>流入を刺激する可能性を示唆する。また、ブラジキニンによるCa^<2+>濃度の上昇を、セボフルランは高濃度で抑制した。以上のような作用により、麻酔薬が内皮細胞の機能的統合性を脅かす可能性が示唆された。平成11年度は、平成10年度よりスタートさせた細胞内Ca^<2+>濃度-収縮同時測定実験を中心に研究を行い、近年臨床導入されたハロゲン化炭化水素型揮発性吸入麻酔薬、セボフルランや種々の血管拡張薬が移植対象臓器の一つである小腸を栄養する腸間膜動脈に及ぼす直接作用とその機序に関する研究をほぼ終了させた。その結果をまとめた2編の論文は既に米国麻酔学会雑誌に受理され、近日中に掲載予定である。セボフルランとともに現在頻用されている
ハイブリッド型人工膵による異種移植研究

(1)ハイブリッド型人工膵に改良;チューブタイプのMRPT型に加え、新たにバッグタイプのMRPB型の人工膵を作製したが、MRPB型に更に改良を行ない、透過性、機能性の高いものを作製した。このMRPBはin vitro及びin vivoにおいてその優秀な機能が実証された。また従来のマイクロビーズ型人工膵にも改良を加えて、新たに3層構造を有する人工膵を作製し、分離ラットラ島を封入して糖尿病マウスの腹腔内へ異種移植したところ、免疫抑制剤を用いることなく長期にわたり生着した。(2)人工膵へ封入するバイオリアクターとしてのB細胞株の利用;我々はマウスから正常B細胞と同じグルコーストランスポーターを有するB細胞株(MIN6)を樹立したが、MIN6細胞とMRPBに封入し、糖尿病ラットへ異種移植したところ、長期に及ぶ生着を得た。ヒト型インスリン分泌新B細胞株HINS51を用いて同様の検討を施行中で、興味ある成果を得つつある。(4)ハイブリッド型人工膵の皮下移植への可能性;MIN6細胞を封入した改良型マイクロビーズを糖尿病ラットの皮下へ異種移植したところ、1週間の生着を得た。将来的な臨床応用への今後の研究の継続を行なう予定である。(5)人工膵へ封入するバイオリアクターとしてのブタ膵の利用;成熟ブタ膵からの純化した大量ラ島分離法を確立し得た。ブタラ島をMRPBへ封入し、糖尿病ラットへ異種移植したところ、長期に及ぶ生着が得られた。(1)従来のマイクロビーズ型人工膵に改良を加え、新たに3層構造を有するマイクロビーズ型人工膵を開発したが、この人工膵は、抗IgG作用に秀れるのみならず、強力な補体抑制作用を有し、かつ素晴らしい生体適合性を保持することが明らかにされた。この改良型マイクロビーズに分離ラットラ氏島を封入して、約500個を糖尿病マウスの腹腔内へ異種移植したところ、免疫抑制剤を全く使用すること無く、3ヶ月以上に及ぶ血糖値の正常化が得られ、かつ、IVGTTによる耐糖能の著名な改善も得られた。(2)インスリンプロモーター・SV40T抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスから樹立されたB細胞株(MIN6)を、MRPB(Mesh-reinforced polyvinyl alcohol bag)型人工膵に封入して種子の検討を施行した。まず、MIN6を封入したMRPBは、in vitroにおいて、グルコース刺激に対する良好なインスリン分泌反応を示した。次いで、MRPBにMIN6(3×10^7)を封入し、STZにて作製した糖尿病ラットの腹腔内へ異種移植したところ、免疫抑制剤を全く使用しない状態で、24ヶ月にわたる血糖値の正常化が観察された。今度は、Pre-Cl,nical modelとして、イヌを用いて膵全摘犬を作製し、膵全摘後2週間後の全身状態の安定した時期に、MIN6(3×10^7)封入MRPB人工膵(16個)を膵全摘犬の腹腔内へ異種移植したところ、免疫抑制剤及びインスリン投与からの完全離脱の状態で、7ヶ月間にわたる生存が得られた。(1)ハイブリッド型人工膵の改良;チューブタイプのMRPT型に加え、新たにバッグタイプのMRPB型の人工膵を作製したが、MRPB型に更に改良を行ない、透過性、機能性の高いものを作製した。このMRPBはin vitro及びin vivoにおいて、その優秀な機能が実証された。また従来のマイクロビーズ型人工膵にも改良を加えて新たに3層構造を有する人工膵を作製し、分離ラットラ島を封入して糖尿病マウスの腹腔内へ異種移植したところ、免疫抑制剤を用いることなく長期にわたり生着した。(2)人工膵へ封入するバイオリアクターとしてのB細胞株の利用;我々はマウスから正常B細胞と同じグルコーストランスポーターを有するB細胞株(MIN6)を樹立したがMIN6細胞をMRPBに封入し、糖尿病ラットへ異種移植したところ、長期に及ぶ生着が得られた。

ヒト型インスリンを分泌する新しいB細胞株(HINS51)を用いて同様の検討を施行中であるが、興味ある結果を得つつある。(3)ハイブリッド型人工膵のDevice change;MIN6細胞を封入したMRPBを糖尿病ラットへ異種移植後に、機能廃絶したものを取り出して、新しい人工膵と交換して再移植したところ、再び長期に及ぶ生着を示した。MRPB型人工膵の臨床応用への有用性が示唆された。(4)ハイブリッド型人工膵の皮下移植への可能性;MIN6細胞を封入した改良型マイクロビーズを糖尿病ラットの皮下へ異種移植したところ、1週間の生着を得た。将来的な臨床応用への今後の研究の継続を行なう予定である。(5)人工膵へ封入するバイオリアクターとしてのブタ膵の利用;成熟ブタ膵からの純化した大量ラ島分離法を確立し得た。ブタラ島をMRPBへ封入し、糖尿病ラットへ異種移植したところ、長期に及ぶ生着が得られた。
概日時計リセット機構から探る緑藻の新奇光受容伝達経路

緑藻クラミドモナスは淡水域に棲息する単細胞生物です。単細胞生物であっても、我々と同じように体内時計(概日時計)を持っています。そして、その時計は赤色光でリセットされます。しかし、クラミドモナスでは赤色光を受容する光受容体が未だに知られていません。よって、クラミドモナスの体内時計のリセットには未知の光受容体が関わっていると思われます。本研究では、遺伝学的・生化学的手法を用いて、クラミドモナスが赤色光を感知する未知のメカニズムを明らかにします。
オートファジー現象における隔離膜形成・伸張機構の微細構造解析

マウス線維芽細胞におけるオートファジー隔離膜の形成過程について、電子顕微鏡用の新たな固定法を用いて詳細に解析した。アミノ酸飢餓によりオートファジーを誘導した結果、粗面小胞体膜と隔離膜の間に存在する、極細管からなるクラスター構造を見出し、それが光学顕微鏡レベルで同定されているオメガソームに相当することを明らかにした。この知見により、隔離膜形成に伴う新たな膜動態およびその基盤となる分子機構の研究を促進することができる。本研究では、各種Atgタンパク質欠損線維芽細胞において誘導されるオートファゴソームについて、特殊固定法を用いて詳細に形態学解析を行うことで、その生合成機序を明らかにする。本年度は特殊固定法の確立とAtg3欠損線維芽細胞を用いた解析を主に行った。1.オートファゴソーム隔離膜の観察を目的として様々な固定条件を試した。グルタールアルデヒド、パラホルムアルデヒド、オスミウム酸の至適濃度、バッファーの種類、固定温度、固定時間等の条件設定を行った。他のAtgタンパク質欠損細胞の解析に応用可能なレベルに達した。2. Atg3欠損線維芽細胞において蓄積される隔離膜を電子顕微鏡観察したところ、隔離膜近傍に多くの小管状構造が見られ、これらの一部は隔離膜および粗面小胞体と連続していた。このことは小管状構造が隔離膜の前駆体であることを示唆する。また、しばしば多重隔離膜構造が見られ、このことはAtg3欠損により隔離膜形成の初期段階の制御異常の存在を示唆する。3.オメガソームのマーカーであるGFP-DFCP1を安定に発現した細胞株を用いて、免疫蛍光法による解析を行ったところ、Atg3欠損によりDFCP1陽性顆粒が蓄積し、多くはAtg16L陽性顆粒と一致していた。高倍率で観察すると、お互いのシグナルは完全に一致しておらず、DFCP1が上記2で記載した小管状構造に相当するものと考えられた。以上の成果は学会に発表した。これらを踏まえ次年度は、形態計測およびAtg5,7,16L,FIP200欠損線維芽細胞について解析を展開し、論文作成を進める予定である。本研究では飢餓により誘導されるオートファゴソーム隔離膜の微細構造について、特殊固定法を用いて詳細に形態学解析を行い、その生合成機序を明らかにすることを目的とする。本年度は以下に列挙する成果を得た。1.光学顕微鏡レベルで隔離膜とオメガソームの位置関係を解析し、Atg3欠損線維芽細胞では、隔離膜/オメガソーム混成構造が蓄積されることを明らかにした。このことはAtg3欠損がオメガソームから隔離膜への移行過程を遅延させることを示唆すると共に、本培養細胞系が微細形態解析に有用であることを示す。2,Atg3欠損線維芽細胞においてオメガソームマーカーであるGFP-DFCP1の局在を免疫電顕法で解析したところ、隔離膜近傍の小管状構造に局在した。また、連続切片および電子線トモグラフィー法を用いてAtg3欠損線維芽細胞に見られる隔離膜を立体的に解析したところ、隔離膜近傍の小管状構造の一部が、隔離膜あるいは近傍の粗面小胞体に繋がっていた。したがって、この小管状構造がオメガソームの本態であることが示唆された。3.Atg5,7,16L,FIP200欠損線維芽細胞について、飢餓による隔離膜構造の誘導を解析したところ、Atg3欠損細胞のみならず、Atg5,7,16L欠損細胞でも隔離膜構造の誘導が見られた。このことは飢餓による隔離膜構造の誘導はAtg8/12結合反応に依存しないことを示唆する。1と2の成果は学会にて発表した。次年度は主に電子線トモグラフィー法等による隔離膜の微細形態解析の結果をまとめ、論文作成を進める予定である。本研究では飢餓により誘導されるオートファゴソーム隔離膜に付属する新規微細構造について、オスミウム酸を利用した特殊固定法を用いて詳細に形態学解析を行い、その生成機序を明らかにすることを目的とする。1.昨年度までに、オメガソームマーカーであるGFP-DFCP1の局在をAtg3欠損線維芽細胞において免疫電顕法で解析し、同分子がオートファジー隔離膜近傍の新規小管状構造に局在することを見出した。本年度はこれに加えて定量解析を行い、約2/3のシグナルが同小管状構造に局在した。このことは同小管状構造がオメガソームの本態であることを強く示唆する。2.また、野生型およびAtg3欠損線維芽細胞を用いて電子線トモグラフィー法による3次元立体構造解析を行い、同小管状構造が隔離膜のギャップ部位に位置すること、そしてその一部が近傍の粗面小胞体および隔離膜と連続していることを明らかにした。3.さらにAtg3欠損線維芽細胞においてGFP-DFCP1のライブセルイメージングを行い、GFP-DFCP1が極めて動的な動きをしつつ隔離膜形成に関与していることを見出した。

4.Atg5,7,16L,FIP200欠損細胞について同様の固定法を用いて形態解析したところ、Atg5,7欠損細胞でも新規小管状構造が観察できたが、FIP200欠損細胞では見つからなかった。このことは、同構造の形成がAtg結合反応には依存せず、より上流のシグナル因子群に依存することを示唆する。以上の成果は論文として作成し、次年度投稿予定である。また、専門分野の学術会議での発表を果たした(本報告書では未記載)。
新規ビフィズス菌特異的増殖因子の生産とそれを利用したプロバイオティクスの開発

本研究では、新規に発見したBGSの効率的生産およびその増殖因子を利用したビフィズス菌の実用的な大量生産技術を開発することについて検討し、研究期間において、以下の結果を得た。1.ビフィズス菌特異的増殖因子(BGS)の効率的生産(1)ラクトースを炭素源としたホモ乳酸菌とプロピオン酸菌の混合培養、精密濾過を用いる膜濾過型培養、オンライン炭素源濃度コントローラを用いたフィードバック制御のある流加培養、および膜濾過型培養にオンライン乳酸コントローラを装備したBGSの連続生産システムを用いることによって、通常の回分培養に比べて、BGS濃度およびその時間当たりの生産性を高めることができた。(2)特に、新しく開発した連続生産システムと炭素源として乳酸を用いた培養において、BGS濃度およびその時間当たりの生産性は最も高くなった。2.ビフィズス菌の効率的生産法の開発(1)2台のファーメンターと2本の精密濾過膜モジュールを組み合わせた膜型混合培養システムを新規に開発し、その液混合特性の解析、最適な操作方法とその条件の設定などを行った。(2)本システムを用いることによってPropionibacterium freudenrechiiとBifidobacterium longum、B. adolescentisまたはB. breveを組み合わせた培養を行った結果、合計の菌体生産量は回分培養の合計値に比べて、それぞれ1.2倍、1.6倍または1.6倍に達した。また、ビフィズス菌を培養する発酵槽とプロピオン酸菌を培養する発酵槽の実容積の比を変えることによって、ビフィズス菌をさらに多く生産できることがわかった。本研究では、新規に発見したBGSの効率的生産およびその増殖因子を利用したビフィズス薗の実用的な大量生産技術を開発することについて検討し,本年度は以下の結果を得た。1.ビフィズス菌特異的増殖因子(BGS)の効率的生産(1)ホモ乳酸菌とプロピオン酸菌の混合培養によって,ラクトースを炭素源としてBGSを生産する方法を開発した。(2)膜濾過型培養にオンライン乳酸コントローラを装備したBGSの連続生産システムを開発し,生菌数とBGSの生産性に対するa)乳酸濃度レベル,b)菌体濃度,c)供給乳酸濃度,d)培地の流入・流出速度,e)供給ポンプの制御方式などの影響について部分的に明らかにした。(3)プロピオン酸菌を各種担体に固定化し、BGSの生産について検討した結果,回分培養において遊離菌体を用いた場合とほぼ同じBGS生産性を得ることできた。2.ビフィズス菌の効率的生産法の開発(1) BGSを含むプロピオン酸菌培養上澄液添加培地を用いて,ビフィズス菌を培養し,その増殖促進効果を明らかにした。また,ビフィズス菌培地にプロピオン酸菌培養上澄液を流加しながら,ビフィズス菌を培養した結果,上澄液を添加しない場合に比べてビフィズス菌を多く生産できた。(2) 2台のファーメンターと2本の精密濾過膜モジュールを組み合わせた膜濾過型バイオリアクターを開発し,その液混合特性を解析した。本研究では、新規に発見したBGSの効率的生産およびその増殖因子を利用したビフィズス菌の実用的な大量生産技術を開発することについて検討し,本年度は以下の結果を得た。1.ビフィズス菌特異的増殖因子(BGS)の効率的生産(1)プロピオン酸菌の中からグリセロールを炭素源として、旺盛に増殖し、BGSも生産する菌株として、Propionibacterium acidipropioniciを選択した。(2)グリセロールを炭素源としたプロピオン酸菌の培養によるBGS生産について検討した結果,膜濾過培養およびオンライングリセロールコントローラを用いたフィードバック制御のある流加培養において、大幅にBGS生産性を高めることできた。(3)膜濾過型培養にオンライングリセロールコントローラを装備したBGSの連続生産システムを開発し,生菌数とBGSの生産性に対する

a)グリセロール濃度レベル,b)菌体濃度,c)供給グリセロール濃度,d)培地の流入・流出速度,e)供給ポンプの制御方式などの影響について部分的に明らかにした。2.ビフイズス菌の効率的生産法の開発BGSを含むプロピオン酸菌培養上澄液添加培地を用いて,Bifidobacterium adolescentis,B.LongumおよびB.Breveをそれぞれ培養し,その増殖促進効果を明らかにした。また,ビフィズス菌培地にプロピオン酸菌培養上澄液を流加しながら,各ビフイズス菌を培養した結果,上澄液を添加しない場合に比べてビフィズス菌を多く生産できた。本研究では、新規に発見したBGSの効率的生産およびその増殖因子を利用したビフィズス菌の実用的な大量生産技術を開発することについて検討し,本年度は以下の結果を得た。1.ビフィズス菌特異的増殖因子(BGS)の効率的生産(1)グリセロールを炭素源として旺盛に増殖できるPropionibacterium acidipropioniciiを用いて、膜濾過培養およびオンライングリセロールコントローラを用いたフィードバック制御のある流加培養について検討した結果、通常の回分培養に比べて、BGS濃度およびその時間当たりの生産性を高めることができた。(2)膜濾過型培養にオンライングリセロールコントローラを装備したBGSの連続生産システムを用いて、培地中のグリセロール濃度を精度よく制御する方法について検討した結果、段階的にグリセロール濃度をあげることが有効であった。2.ビフィズス菌の効率的生産法の開発(1)開発した膜型混合培養装置システムを用いることによってP.freudenrechiiとBifidobacterium longum,B.adolescentisまたはB.breveを組み合わせた培養を行った結果,合計の菌体生産量は回分培養の合計値に比べて,それぞれ1.2倍,1.6倍または1.6倍に達した。(2)ビフィズス薗を培養する発酵槽とプロピオン酸菌を培養する発酵槽の実容積の比を変えることによって、ビフィズス菌をさらに多く生産できることがわかった。
P型ATPaseによる能動輸送機構の構造的解明

本研究は、近年、多数の関連した疾病が認識されるようになり広範な注目を集めているP型ATPase(ポンプ)による能動輸送機構を原子構造に基づいて解明し、究極的には「何故そういう構造が必要なのか」を理解することを目指している。最も研究が進んでいる筋小胞体Ca2+ポンプ(SERCA)に関しては反応サイクル全体をほぼカバーする10状態の結晶構造を決定できたが、「プロトンの対向輸送を伴うE2状態からE1状態への遷移は蛋白質全体にわたる非常に大きな構造変化を伴うがそれはどういう順に起こるか、またプロトン輸送の意味は何か」「2個のCa2+の結合がしないと燐酸化反応は起きないが、その活性化シグナルとは何か」という重要な問題は未解決のままであった。前者に関しては、昨年度に構造決定に成功した、細胞質側イオン通路のゲート残基の変異体のE2構造に量子化学計算を適用することによって明快な答えを得ることができ、論文を出版した。後者に関しては、Ca2+が1個だけ結合した状態(E1・1Ca2+)の結晶構造解析に成功し、Ca2+ポンプは2個のCa2+結合の前にMg2+やK+など、運搬はしないけれども、Ca2+よりもずっと大量に存在するイオンをCa2+の結合に向けた構造変化の加速のために利用していることを見出した。さらには、制御蛋白質であるphospholamban、sarcolipinとの複合体の結晶構造解析にも成功し、両者の作用の違いをも明らかにすることができた。ナトリウムポンプに関しては、昨年度に続き、E1・3Na+状態と予想される結晶の予備的構造決定に成功した。その結果、Mg2+が結合していることが判明した。これは古くから知られているMg2+によるNa+の結合阻害を説明するものである。現在、構造の精密化を行なっている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。a)イオンポンプ能動輸送機構の構造的解明を目指し、a1: “SERCAとNa+,K+-ATPaseの残された中間対の結晶化"とa2: “サイトI Ca2+による構造変化の解明"を提案した。a1では、細胞質側ゲート残基であるE309の変異体の結晶構造解析に注力した結果、Q変異体のみならずA変異体の結晶構造の決定にも成功した。E309Q変異体の構造は驚くべきものであり、細胞質側ドメインはE1様だが、膜内Ca2+結合部位の構造は明らかにE2であった。この構造変化がプロトン化グルタミン酸をグルタミンに置換したことによるものであることは明らかだが、その構造的基盤の解明には量子化学的計算を要すると考えられる。Na+,K+-ATPaseに関しては、E1・3Na+状態、E2・2K+状態に相当すると思われる予備的結晶を得ることに成功した。a2に関しては、Ca2+が1個だけ結合した状態の結晶構造が得られた。これは今後の大きな発展が見込める成果である。(b) Plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA)の構造決定に関しては、アデノウイルス・COS細胞系による大量生産を試み、予定よりも時間を要したが、一応の成功を得た。カルモジュリンによる制御の測定系も確立できた。(c) P4型ATPaseによる燐脂質フリップ機構の解明に関し、本年度は大量発現に取り組んだ。これまでに確立済みのアデノウイルス・COS細胞系とbicistronicなベクターを用いCDC50Aとの複合体の産生を試みたところ、ATP8A2に関しては、1 L培養あたり0.5 mg程度の精製蛋白質が得られるようになりATPase活性のリガンド依存性も確認できた。予定よりも大量発現に時間を要したものがあり、半年間の延長を申請したが、現時点ではほぼ予定通り進行している。特に、SERCAでCa2+が一個だけ結合したE1・1Ca2+状態の結晶化に成功したことは特筆すべき成果といえる。

ナトリウムポンプに関しては、昨年度に続き、E1・3Na+状態と予想される結晶の予備的構造決定に成功した。その結果、Mg2+が結合していることが判明した。これは古くから知られているMg2+によるNa+の結合阻害を説明するものである。現在、構造の精密化を行なっている。本研究は、近年、多数の関連した疾病が認識されるようになり広範な注目を集めているP型ATPase(ポンプ)による能動輸送機構を原子構造に基づいて解明し、究極的には「何故そういう構造が必要なのか」を理解することを目指している。最も研究が進んでいる筋小胞体Ca2+ポンプ(SERCA)に関しては反応サイクル全体をほぼカバーする10状態の結晶構造を決定できたが「2個のCa2+の結合による燐酸化反応の活性化シグナルとは何か」という重要な問題は未解決のままであった。本年度は、この問題に対し重要な手掛かりを与える、Ca2+が1個だけ結合した状態(E1・1Ca2+)の予備的結晶が得られたので、その構造決定と出発点となるE1・Mg2+状態の結晶の高分解能化を目指した。条件検討の結果、格段に精密化された原子モデルを得ることに成功した。さらに、Ca2+がポンプ蛋白質に結合する際のゲートとなるGlu残基のGln変異体の構造決定に成功した結果、予想外に大きな構造変化が認められ、研究期間を延長して構造の精密化とその詳細な解析を行った。ナトリウムポンプに関しては、昨年度に続き、ポンプをチャネルに変えてしまう毒物パリトキシンとの複合体の構造決定を目指した。まだ低分解能ではあるが、パリトキシン結合による大きな構造変化が認められ、パリトキシン由来の電子密度も観察された。また、E1・3Na+状態と予想される予備的結晶が得られたので、結晶化条件の改良を行った。P型ATPaseの一部は燐脂質を脂質二重膜の反対側へフリップする。ヒト由来の二つの複合体について、アデノウィルス-哺乳類培養細胞を用いた大量生産系の構築を行い、大量生産を開始した。本年度は大量生産条件の最適化を行い、特に、培養細胞の検討を行なった。得られた結晶構造中に見えない部分があり、結晶化条件の検討に時間を要した結果、半年の延長を申請したが、期待を上回る結果が得られた。E2からE1状態への遷移ではプロトンが放出されるが、その意義が理解できるようになったことは大きな進歩である。a)の“イオンポンプ能動輸送機構の構造的解明"に関しては、E309Q変異体の結晶構造に基づく量子化学的計算を完成させ、特に、E309からのプロトンの離脱が何を引き起こすかを調べる。それによって、E2⇒E1状態への変遷がどのようにして起こるか、そのシナリオを提案できる可能性がある。Na+,K+-ATPaseに関しては、特に、E1・3Na+状態の結晶の改良に注力する。脱水和方法の検討など、試みるべきことは多い。一方、「カルシウムポンプにおいて2個のCa2+の結合による燐酸化反応の活性化シグナルとは何か」という問題の解決に向けてE1・1Ca2+状態の結晶性の改良とそのもととなるE1・Mg2+構造の高分解能化、量子化学的計算を行なう。特に、K+などのCa2+以外のイオンがE1⇒E1・Mg2+⇒E1・1Ca2+⇒E1・2Ca2+のどの段階にどのように寄与するのかを当該イオンを含む緩衝液に浸漬した結晶から構造決定を行なうことで明らかにできよう。
シダ植物「配偶体フロラ」の解明

2008年度は奥多摩・秩父で設定した配偶体調査メッシュ(1m×1mの中に、10cm×10cmのメッシュを100区画設定)での調査を重点的に行い、並行して国内各地から得られた配偶体サンプルの解析も行った。奥多摩・秩父での調査地では、各メッシュからサンプリングした配偶体を葉緑体rbcL遺伝子を用いた分子同定にかけ、対応する胞子体の種を推定した(野外から採集した配偶体は、左右対称軸で半分に切断し、半分をDNA抽出に、残り半分を証拠標本として保管した)。周辺に生育している胞子体の調査を行ってリストを作成し、胞子体の種組成との比較を行った。その結果、多くの配偶体は同所的、あるいは近辺に同種の胞子体が生育していることが示唆されたが、ハート型でない不定形・リボン形を持つ一部の種では、胞子体から遠くはなれた地点に配偶体が単独で生育していることが示唆された。一方、「配偶体フロラ」の季節変動を解明するため、奥多摩の同一地点において、季節を変えて(6月と11月)同一方法で配偶体をサンプリングし、分子同定によって種組成を比較した。その結果、調査メッシュ内では有意な種組成の変化は観察されなかった。本研究にあたっては、配偶体の分子同定精度を高めるため、日本産のシダ植物胞子体のrbcL遺伝子塩基配列情報を網羅することを目指しているが、2008年度内に日本産種の約7割の塩基配列が決定され、多くの群で種レベルまでの分子同定を行うことが可能になった。本研究によって、従来知る術が皆無であったシダ植物の「配偶体フロラ」について、技術的な問題は全て解決され、知らざれる種組成・分布傾向の一端を明らかにすることができた。平成18年度は「両親種の分布しない地点に生じる雑種胞子体」の例として伊豆半島のシンテンウラボシ(Colysis x shintenensis)に着目して、現地調査と予備的な遺伝子解析を行った。日本産の代表的なイワヒトデ属とその種間雑種について葉緑体rbcL遺伝子の解析を行ったところ、母性遺伝マーカーのみによってもある程度雑種性の検証が可能であることが判明した。そこで伊豆半島で野外調査を行い、両親種からはるかに離れて分布するとされたシンテンウラボシを採集してDNA解析を行った。その結果、シンテンウラボシと(オオイワヒトデ×ヤリノホクリハラン)されてきた植物が、実際にはヒトツバイワヒトデ(イワヒトデ×ヤリノホクリハラン)である可能性が強く示唆された。しかしながら、その場合も片親であるヤリノホクリハランは伊豆半島に産しないため、独立生活の配偶体の関わった雑種形成を示す実験系としてイワヒトデ属が有効であると考えられた。配偶体フロラの解析に欠かせない配偶体の分子同定技術については、PCR条件の改良などの結果、安定して結果が得られるようになった。伊豆半島で採集した配偶体サンプルの分子同定を予備的に進めたが、平成18年度中にはヤリノホクリハランの独立配偶体の可能性のある配偶体は検出されなかった。一方、予備的に行った国内各地産の配偶体の分子同定の結果、同じ県内には胞子体の分布の記録のない種の配偶体が発見される事例や、個体数が極めて少ない絶滅危惧種の配偶体が検出される例が見出されるという、極めて興味深い結果が得られた。
木質バイオマス処理技術の高度化に資するマルチスケール構造解析・評価技術の開発

産総研で実施してきた木質素材のマルチスケール構造解析技術とチューリッヒ工科大学(ETH)およびスイス連邦材料試験研究所(Empa)が保有するナノからマクロ領域での木質成分と化学物質の相互作用評価技術を摺り合せて、産総研シーズ「木質流動成形」など木質バイオマス処理技術を工業材料と呼べる技術へとレベルアップさせるための評価技術を開発する。内定年度:2018産総研で実施してきた木質素材のマルチスケール構造解析技術とチューリッヒ工科大学(ETH)およびスイス連邦材料試験研究所(Empa)が保有するナノからマクロ領域での木質成分と化学物質の相互作用評価技術を摺り合せて、産総研シーズ「木質流動成形」など木質バイオマス処理技術を工業材料と呼べる技術へとレベルアップさせるための評価技術を開発する。
冶金物質の放射率測定

高温における放射伝熱、あるいは測温に関連し、高温工学の基礎的数値の1つである放射率は、その重要さにもかかわらず、測定が少く、今後その蓄積が計られなければならない。放射率は測定物の表面の性質、状態が著しい影響を及ぼすので、光学物性値と実際上の値との間に大きな差を生じることがしばしばである。そこで本研究では、光学物性という立場と実際の熱伝達という面を考え合わせ、測定条件を正確に記述しうる範囲において、乾式製練の具体的状態に類似した条件下での測定を試み、放射率を分光的に、波長および温度の関数として測定した。本研究では、(1)まず測定装置の開発を行い、可視近赤外および赤外の分光放射率、ならびに全放射率の測定装置を完成させ、(2)溶融Al,Ag,Auおよび固体Ptについて分光放射率を、また、(3)Ptについて全放射率を測定して装置の適用性を吟味した。(4)現実の問題としてしばしば遭遇する半透明体との共存条件下での放射の問題を解析し、(5)半透明体の例として、【Na_2】【CO_3】融体と共存する黒鉛およびAgについて測定し、これらの結果により【Na_2】【CO_3】融体の透温スペクトルを得た。一方、(6)実用上重要な、粉体の有効分光放射率を測定するための装置を開発し、(7)アルミナ,黒鉛などについて測定し、(8)気孔の存在が、バルクにおいて放射率の小さい物質については大きな影響をおよぼすが、(9)黒鉛のようにバルクでも放射率の大きなものは粉体となったときの影響は少く、(10)粉体ではその有効射率は1に近づき、物質間の差は少くなる。今後、本装置を用い、実用上重要な系一鉄および鉄合金,酸化鉄含有スラグ,銅および銅合金,銅マットなど-の放射率を測定し、固/液相変化の影響,温度依存性,組成依存性などを調べる予定である。また、スラグ相などの透過率も測定してゆく予定である。
ギ酸脱水素酵素を用いたバイオ電解による二酸化炭素資源化の研究

酵素はタンパク質からなる生体触媒であり、温和な条件下で高い触媒活性を持つこと、また高い基質特異性を持つという特徴がある。酸化還元酵素反応と電極反応の共役系は酵素電極反応と呼ばれる。その中でも特に、酸化還元酵素と電極間で直接電子授受を行う様式の酵素電極反応を直接電子移動型の酵素電極反応と呼ぶ。本研究では二酸化炭素の関与した酸化還元反応を選択的に触媒する酵素電極反応を利用した二酸化炭素のギ酸への電気化学的な変換と、その逆反応を利用したバイオ燃料電池の実現を念頭に置き基礎的な検討を進めた。タングステン含有ギ酸脱水素酵素はギ酸二酸化炭素対とNAD+NADH対の相互変換を可逆に触媒することが知られている。本研究において、金ナノ粒子により表面を修飾した多孔質炭素材料を電極として利用することにより、ギ酸脱水素酵素の直接電子移動型の酵素電極反応により二酸化炭素とギ酸およびNAD+とNADHの可逆変換反応が実現可能であることを見出した。二酸化炭素とギ酸の可逆な変換が可能であることは、過電圧を限界まで小さくできることを意味する。すなわち、エネルギーロスを最小にした二酸化炭素固定系の実現が可能となった。また、バイオ燃料電池のアノードには上述のギ酸脱水素酵素固定電極が利用可能である。一方でカソードの改良を進めた。その中で、酸素の四電子還元を触媒するビリルビンオキシダーゼの直接電子移動型の酵素電極反応に注目した。ビリルビンオキシダーゼの直接電子移動型の酵素電極反応に対して、金を還元剤存在下で陽極酸化して形成した多孔質電極および金ナノ粒子により修飾した多孔質炭素材料が優れた特性を示すことを見出した。金を陽極酸化して作成した多孔質電極は、従来の多孔質炭素材料を塗布して作成した電極と比べて電極設計の自由度が高いことから、本法を利用することにより電極形状の微細化および構造制御が実現可能となった。酵素反応の持つ高い触媒活性と基質特異性を付与した電極反応はバイオエレクトロカタリシス反応と呼ばれる。本研究では、ギ酸と二酸化炭素の相互変換反応を触媒する酸化還元酵素である、タングステン含有ギ酸脱水素酵素(FoDH)の電気化学的応用を推進し、FoDHを利用した二酸化炭素還元電極およびギ酸酸化電極の作成及びその高効率化の追求を行った。電極作成に際して二つの方法論について検討を行った。一つは、FoDHと電極間で直接電子の授受が可能となる反応様式(直接電子移動)であり、もう一つをFoDHと電極の両者とも酸化還元反応が可能である電子移動の媒介物質(メディエータ)を利用した反応様式(メディエータ型電子移動)である。金ナノ粒子を多孔質炭素材料表面に分散させ、その表面に、4-メルカプトピリジンを吸着させた電極を作成したところ、FoDHと電極間での直接電子移動反応が観察された。この電極は二酸化炭素のギ酸への還元とギ酸の二酸化炭素への酸化を触媒するのみならず、FoDHの第2基質であるNAD+、NADHの相互変換反応を可逆に触媒することが見出された。しかしながら、現段階では十分な反応速度を達成できておらず(ギ酸酸化電流として2 mA cm-2)、メディエータ型電子移動反応についても検討を行った。電極から溶出せずFoDHを電極上に固定化するバインダーとしても作用する、ビオロゲン構造を側鎖に持つポリマーをメディエータとして使用したところ、より大きな反応速度(ギ酸酸化電流として30mA cm-2)を達成した。また、酸素還元反応を触媒する電極と組み合わせることで、開回路電圧1.2 V、最大出力12 mW cm-2のギ酸を燃料としたバイオ燃料電池を構築した。この出力は報告時点ではバイオ燃料電池の出力として世界最大である。・過電圧のない高電流密度での二酸化炭素バイオ電解法の創成FoDHの直接電子移動の実現により、当初予定していたメディーエータ型酵素電極反応に比べてより過電圧の小さい二酸化炭素バイオ電解が実現された。同時にギ酸と二酸化炭素の可逆変換が可能となった。しかしながら、電流密度を指標として考えると、高電流密度でのバイオ電解は、現状の直接電子移動型では困難である。電流密度の向上のためにはメディエータ型の酵素電極反応を追求する必要があると考えられる。・高効率で電極反応と気液反応を共役させる電極の設計直接電子移動型反応の実現により、メディエータと酵素が流通した条件と比べてより高効率なガス拡散型電極の構築が可能になった。直接電子移動型の電極反応を利用して高電流密度を実現するための課題として、電極の表面積の向上が挙げられる。これはメディエータ型酵素電極反応の最適化と異なる方法論の確立が必要である。

本研究において、金ナノ粒子により表面を修飾した多孔質炭素材料を電極として利用することにより、ギ酸脱水素酵素の直接電子移動型の酵素電極反応により二酸化炭素とギ酸およびNAD+とNADHの可逆変換反応が実現可能であることを見出した。二酸化炭素とギ酸の可逆な変換が可能であることは、過電圧を限界まで小さくできることを意味する。すなわち、エネルギーロスを最小にした二酸化炭素固定系の実現が可能となった。また、バイオ燃料電池のアノードには上述のギ酸脱水素酵素固定電極が利用可能である。一方でカソードの改良を進めた。その中で、酸素の四電子還元を触媒するビリルビンオキシダーゼの直接電子移動型の酵素電極反応に注目した。ビリルビンオキシダーゼの直接電子移動型の酵素電極反応に対して、金を還元剤存在下で陽極酸化して形成した多孔質電極および金ナノ粒子により修飾した多孔質炭素材料が優れた特性を示すことを見出した。金を陽極酸化して作成した多孔質電極は、従来の多孔質炭素材料を塗布して作成した電極と比べて電極設計の自由度が高いことから、本法を利用することにより電極形状の微細化および構造制御が実現可能となった。直接電子移動型酵素電極反応の実現により、極めて効率の良い系の構築が可能になった。しかしながら、電極の微細構造に基づいた電極設計を進めているが劇的な反応速度の増加は困難であると考えられる。そこで、より反応速度を向上させるために、メディエータの最適化を追求する。また、ガス状基質を用いた酵素電極反応における高効率化において直接電子移動型の酵素電極反応とメディエータ型酵素電極反応のいずれが適しているのか、一般的な解析法は確立していない。そこで、反応効率、電極設計、電極製造における全体的なバランス構築に関しての知見を深める。また、本研究は物質変換を意図しているため、より反応効率を向上させるためにガス拡散電極の流通系への適応を検討する。