hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南部・ヤコビ構造のポアソン化の研究

これらの発表に対する質疑応答を通して,2次元分布であれば余階数が何であってもそのannihilatorsubbundleの開部分多様体Sは必ずsymplectic submanifoldになることがわかった。この成果は今論文にまとめる準備中である。昨年度は,多様体M上の一般の接分布Dについて研究したが,今年度は,2-ベクトル場から生成される接分布にも注目した。その動機は,2-ベクトル場がポアソンの場合,1-形式の空間に自然なリー環構造が入り,Lie algebroidになることが知られており,ポアソンという仮定を取り除いた場合どのような状況が生じるか興味がつのったからである。πを一般の2-ベクトル場とし,πのスカウテン括弧積[π,π]の階数は一定と仮定する。π^^をその束準同型とする。その時,我々の得た主な結果は系:[π,π]^0の像π^^([π,π]^0)は完全積分可能な接分布である。であり,Alan Weinstein (University of California, Berkeley)とIzu Vaisman (University of Haifa)に問い合わせたところ,オリジナルな興味深い結果とのコメントを得ている。口頭発表は,2002年11月の秋田での「シンプレクティック幾何とその周辺」研究集会で児玉裕介(三上の指導する修士課程1年生)が"手作り数式処理プログラムの応用例"なるタイトルでそれぞれ部分的な結果を発表した。これ等の研究でのπから決まる接分布は必ず偶数であるが,ヤコビ構造をポアソン化する際のアイデアを元に,水谷忠良先生(埼玉大学)の協力を得て,ジェットバンドルでの研究をモデルに,2次と1次ベクトル場の組に対し拡張を工夫しながら,"Integrability of Plane Fields defined by 2-vector Fields"なる仮タイトルで今論文を共同執筆中である。
太平洋地域における国際経済摩擦の研究

この研究は、昭和58年より3年間にわたって行われてきたものである。近年「太平洋の時代」の到来と言われている。確かに、この地域には先進国・発展途上国とも、ダイナミックな経済が多い。しかし反面それだけに、それらの相互依存・相互交流に際して、種々の摩擦・軋轢も生じやすい。日米貿易摩擦はその典型例であり、日本が途上国に対して行う技術移転にもスムーズには行かない側面が多てある。3年間にわたるこの共同研究は、こうした諸摩擦に焦点を絞り、経済学・経営学の両立場からできるかぎり多面的なアプローチを試みたものである。問題は大きいから、網羅的な分析を行ったとはいいがたいが、予想以上の成果を挙げ得たものと考えている。具体的には、この3年間原則として毎月1回の定期的な研究会を行ってきたのに加えて、国際経済摩擦をテーマとするシンポジウム及びセミナーを各々2回ずつ開催し、研究分担者の研究報告並びに外部の研究者も数多く招いて互いに活発な意見交換をした。この研究を進めるに当たり、我々が研究の本拠を名古屋大学経済学部附属経済構造分析資料センターに置いたことは、大きなプラスであった。とりわけ、同センターが国内外から招致した客員研究員との共同研究・討論の成果は、報告書の各研究の随所に有効に生かされている。昭和61年4月より、同センターは拡充・改組され、経済構造研究センターとして再発足する。我々もこの研究成果を土台にして、想を新たに「太平洋の時代」の研究を21世紀に向けて進める所存である。
ホヤ血球による金属運搬と被嚢接着機構に関する形態学および機能解析

海産無脊椎動物ホヤ類は、海水中で基質に強固に接着するという性質と、血球中に高濃度の金属イオンを蓄積する性質をもつ。申請者らはホヤ血球が被嚢の接着面まで金属を運搬し、かつ、金属結合タンパク質が接着に寄与するのではないかとの学術的な問いを設定した。本研究は3年間の研究期間で、ホヤ被嚢の形成・接着過程における血球移動経路の解明とCaイメージング、刺激応答性Caチャネルおよび接着タンパク質のin vitro機能解析およびin vivo機能解析を実施する計画である。
欧州伝世の17世紀から18世紀の伊万里・染付磁器の体系的整理と様式展開の再検討

伊万里磁器は日本陶磁史上初めて欧州に輸出され、王侯貴族の間で爆発的な人気を博した貴重な文化遺産である。従来の伊万里陶磁研究では、色絵磁器が代表的な作品として取り上げられてきたため、その様式展開に関する研究も色絵を中心に行われてきた。一方、染付磁器については、色絵とは別に体系的な整理を行い、検討することが課題として残されていた。特に、輸出向けの製品については、国内における伝世例や里帰り品等身近な資料数が少ないため、今後の海外における調査の進展が期待されていた。そこで、本研究では、これまで申請者が携わった、欧州に伝世する17世紀から18世紀の伊万里磁器の調査成果を活かし、さらに染付磁器の追加調査を実施し、伊万里・染付磁器の編年を基軸とした体系的な整理を行うことを目的とした。また、当時の欧州市場における競合製品であった清朝の青花磁器についてもできる限り調査を実施し、伊万里・染付磁器と比較研究を行うことを目指した。研究は下記の方法で実施した。(1)申請者が参加した21世紀COE九州産業大学・柿右衛門様式陶芸研究センタープログラム(平成16年度採択、拠点番号28)と、平成22年度・23年度奨励研究(課題番号22901009・23901005)の調査成果から、伊万里・染付磁器を選出し、さらに染付磁器の追加調査を行い、文様、器形等詳細に分析し、特徴を明らかにした。(2)調査した作品群と有田地域の窯跡から出土した陶片との比較研究を行い、可能な限り生産地(内山・外山)別に分類した。上記の調査成果をまとめ、輸出向け伊万里・染付磁器の様式展開について再検討した。その結果、下記の研究成果が得られた。(1)欧州における伊万里・染付磁器の伝世例は稀少とされてきたが、新発見の作品群の存在を明らかにした。(2)南川原山製と推定される作品が数多く遺ることが分かった。また、そのなかには、色絵の柿右衛門様式と同様の意匠展開を見せる作品が存在することが分かった。(3)17世紀末から18世紀前半の染付磁器が遺っており、それらの生産地の中心は内山であったと考えられる。
将来の泌乳と繁殖に関わる子牛のＩＧＦ－１産生能の決定因子の解明と人為的制御の検証

本研究の目的は、乳牛における乳生産や卵巣機能に重要な肝臓でのインスリン様成長因子-I(IGF-1)産生能の決定要因を遺伝形質と飼養管理の観点から検討することである。遺伝形質は成長ホルモン受容体の一塩基多型、飼養管理は哺乳期管理の変更により検討した。その結果、今回ターゲットとした遺伝形質の違いにより、IGF-1産生能が異なり、初回分娩後の乳量やエネルギー状態に違いをもたらすことが示された。一方、哺乳期管理の変更により血中IGF-1濃度は高められるが、IGF-1産生能には影響しないことが示された。以上より、乳牛の生産性に関与するIGF-1産生能は、遺伝的要因に影響を受けることが示唆された。H24年度は、昨年度から継続していた4ヶ月齢の乳用雌子牛への安息香酸エストラジオール製剤(EB)投与による血中IGF-1濃度の変動についての試験が終了し、血中IGF-1濃度や各個体の成長ホルモン受容体(GHR)の一塩基多型(SNP)等の解析を全て終えた(n=71)。その結果、既知のGHR-SNPのうちの1つにおいて、EB投与により野生型では血中IGF-1濃度が増加することに対し、変異型では血中濃度は増加せずにIGF-1産生を促すGHの血中濃度上昇のみが確認された。このSNP部位はプロモーター領域であることから、変異型を持つ牛はIGF-1産生効率が悪い可能性が考えられた。また、哺乳子牛に代用乳の給与量を増やす強化哺育も行った(強化哺育牛10頭、対照牛13頭)。その結果、哺乳日数は変わらないが、強化哺育により離乳時体重は有意に重くなった。加えて哺乳期間の血中IGF-1濃度は両群間に差はなかったが、4ヶ月齢時に上記と同様のEB投与試験を行った結果、強化哺育牛の方がEB投与前の血中IGF-1濃度が高く、さらにEB投与によって著しい血中IGF-1濃度の増加が確認された。以上よりH24年度の実験結果から、乳牛においてIGF-1産生に関わるGHRの機能の違いをもたらすGHR-SNPが特定されたこと、しかし哺乳期の管理によってはGHR-SNPに関係なくIGF-1産生能を高められる可能性があることが示された。また、今年度計画に入っていた「乳腺および卵巣の局所IGF-1システムと乳腺発育との関連性」を検証するため、2頭の育成牛から乳腺組織のサンプリングを行い、GHR-SNPを解析したが、採取部位によって抽出できるRNA量の差が大きく、データが安定しなかった。そのため、局所のIGF-1システムについては、H24年度の研究成果も踏まえ、実験内容を少し修正し、H25年度に明らかにしていく予定である。本研究の目的は、乳牛における乳生産や卵巣機能に重要な肝臓でのインスリン様成長因子-I(IGF-1)産生能の決定要因を遺伝形質および飼養管理の観点から検討することである。最終年度であるH25年度の研究計画は、1これまで生体レベルで確認されたIGF-1産生能の違いを細胞レベルで確認すること、2GHR-SNPの違いが分娩前後の栄養代謝状態、乳量や繁殖成績に及ぼす影響の検討、3IGF-1産生能の人為的制御を確認するため、強化哺育した牛の初回分娩後の栄養代謝状態、繁殖機能回復や乳量の調査を行うことであった。その結果、1においてGHR-SNPタイプの違いによる細胞レベルでのIGF-1産生能の違いは明らかにはならず、今後、ターゲットとする細胞について再検討の必要があると考えられた。2の調査では、野生型は1頭しかおらず、半変異型と両変異型で比較を行った。その結果、両変異型の方が半変異型よりも分娩前後のBCSが高く、血中GH濃度が低いにも関わらず、血中IGF-1濃度に差はなかった。また、分娩後100日以内の乳量も多くなった。しかし、繁殖成績は両タイプで違いはなかった。3の調査の結果、哺育期に強化哺育した牛とそうでない牛との間に、初回分娩後の乳量や繁殖成績に差はなかった。また、これらの全ての牛のGHR-SNPは両変異型であったため、強化哺育にGHR-SNPタイプも含めた関連性の解析はできなかった。以上より、H23-25年度の研究結果をまとめると、今回ターゲットとしたGHR-SNPのタイプの違いにより、生体レベルではIGF-1産生能が異なること、強化哺育により子牛時の血中IGF-1濃度は高められるが、IGF-1産生能には影響しないこと、そして、GHR-SNPのタイプは、初回分娩後の乳量やエネルギー状態に違いをもたらすことが示唆された。

一方、哺乳期管理の変更により血中IGF-1濃度は高められるが、IGF-1産生能には影響しないことが示された。以上より、乳牛の生産性に関与するIGF-1産生能は、遺伝的要因に影響を受けることが示唆された。本研究の目的は、乳牛における乳生産や卵巣機能に重要な肝臓でのインスリン様成長因子-I(IGF-1)産生能の決定要因を遺伝形質および飼養管理の観点から検討することである。H23年度は、すでにIGF-1産生能が決定していると予測される春機発動前の4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与における血中IGF-1濃度増加率とIGF-1産生や卵巣機能および乳生産との関連性が明らかとなっているGH、GH受容体およびIGF-1の遺伝子多型との関連性を調査するために下記の2つの試験を中心に試験を実施した。また、「春機発動前の子牛へのEB投与におけるIGF-1産生能と乳腺および卵巣の局所IGF-1システムと乳腺発育との関連性」を検証するための乳腺および卵巣組織採取については、今年度に実験対象として適切な牛がいなかったため、H24-25年度に行う。1.4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与試験;4ヶ月齢雌子牛(体重約120kg)に対し、成牛の発情時のレベルに相当するエストラジオール400μgの安息香酸エストラジオール製剤を筋注し、投与前と投与24時間後の血液から、IGF-1およびエストラジオール濃度と健康状態把握のために代謝物濃度を測定する。現時点で60頭のサンプリングが終了し、現在血中IGF-1濃度を測定している。2.遺伝子多型解析;上記の実験時に採取した血液からDNAを抽出し、遺伝子多型解析を行う。現在、60頭の牛の血液を遺伝子解析用に処理した。そして、遺伝子解析のターゲットとする遺伝子多型を絞るため、過去の研究報告で血中IGF-1濃度または分娩後の卵巣機能回復に関与することが明らかとなっている4つのGH受容体の一塩基多型において、初産牛の繁殖成績および泌乳成績との関連性を解析し、その中の2つのGH受容体の一塩基多型と繁殖成績との関連性が明らかとなった。本研究において、H23-24年度に予定していた実験計画はおおむね順調に進んでいる。まず、H23年度から継続の春機発動前の4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与における血中IGF-1濃度増加率と遺伝子多型との関連性を解析するための「4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与試験」と「遺伝子多型解析」、H24年度に計画していた「強化哺育によるIGF-1産生能の人為的制御」の実験においては、全て予定通りに遂行し解析も終えた。H24年度に計画していた「新しい遺伝子変異部位の同定」に関しては、今回解析したGHR-SNPのうちの1つにおいて、IGF-1産生に関わるGHRの機能に違いをもたらす可能性が考えられ、乳牛において、このような研究成果は報告されていないことから、このSNPにターゲットを絞ることが優先であると判断し、その解明に重点を置く事で、研究目的に合った結果が得られると考えられる。次に「乳腺および卵巣の局所IGF-1システムと乳腺発育との関連性」の検証については、サンプリングの安定性やデータ精度から当初の計画では遂行が難しいと考えられたが、H24年度の研究結果も踏まえ、実験内容を少し修正することでGHR-SNPの違いによる局所のIGF-1システムへの作用も明らかに出来ると考えられる。本研究のH23年度に予定していた実験計画はおおむね順調に進んでいる。まず、春機発動前の4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与における血中IGF-1濃度増加率と遺伝子多型との関連性を解析するための「4ヶ月齢乳用雌子牛へのEB投与試験」と「遺伝子多型解析」の2つの実験においては、全て予定通りに遂行している。次に「春機発動前の子牛へのEB投与におけるIGF-
派遣型介護労働者の雇用をめぐる法律問題

本研究は、介護労働者の雇用をめぐる現状を把握し、それを歴史的な発展のなかで位置づけるとともに、ヨーロッパを中心とする先進諸国での立法政策との比較を通じて、日本における問題の解決に向けて、法理論的な課題を明らかにしようとするものである。この目的のもと、平成7年度から平成8年度にかけて2年間にわたって在宅福祉を支えるホームヘルパーを中心に、(1)在宅福祉サービスをめぐる動向、(2)派遣型介護労働者の雇用をめぐる労働条件の実情把握、(3)比較法の視点から派遣型介護労働者をめぐる立法政策の課題を中心に研究を進めた。実態調査としては、京阪神地区以外に、金沢、岡山、福岡、横浜、東京都等の地域福祉における介護従事者についての実態調査に重点をおき、家政婦紹介所関係者、職業安定業務従事者、ホームヘルプ労働者などから「聞き取り調査」を行った。その結果、ホームヘルパーの地位は、(a)常勤の公務員、(b)非常勤の公務員、(c)社会福祉協議会等民間団体による常勤職員、(d)同登録・非常勤職員、(e)有料職業紹介による家政婦に、複雑に分化していることが確認できた。全体として「ホームヘルパは在宅介護のかなめ」と指摘されてきているが、実態は必ずしもそうした指摘にふさわしいものとなっていない。在宅福祉の要であるホームヘルパーの雇用条件を抜本的に改善するためには、日本に特有な非正規雇用による現状を改める必要がある。とくに、雇用管理をめぐる責任とサービス提供の責任との交錯をめぐる検討は皆無に近いので、この点についての本格的な比較研究は今後の大きな課題として位置づけられる。平成7年度は、つぎの3点を中心に研究計画を進めた。(1)まず、「介護型派遣労働者」の概念について、老人福祉法、老人保健法、職業安定法などの緒法に分立した関連する法制度を整理し、労働法と社会保障の両方の面から分析を行ってきた。とくに、病院の付添婦の廃止が進められ、その反面、新たな立法の動向として、介護労働を労働者派遣法の対象業務に追加する立法提言が、主として労働政策の観点から提出され、また、ゴールドプランの実施のなかで拡大しているホームヘルパーの雇用のあり方について、法案の動き、各自治体の条例、要綱を分析してきた。とくに、家事労働、派遣労働者、家政婦との異同の整理、労働者派遣法や介護保険をめぐる法改正との係わりでの問題意識が必要となっている。(2)実態調査としては、本格的大量調査を8年度の課題としているので、本年度は、その準備のために、金沢の地域福祉における介護従事者についての集中的な実態調査など、家政婦紹介所関係者、職業安定業務従事者、ホームヘルプ労働者などから「聞き取り調査」を行った。以上の結果、(1)ホームヘルパーの地位は、(a)常勤の公務員、(b)非常勤の公務員、(c)社会福祉協議会等民間団体による常勤職員、(d)同登録・非常勤職員、(e)有料職業紹介による家政婦に、複雑に分化していることが明らかになった。(3)歴史研究・比較研究として、ドイツ、北欧、イタリアの介護労働をめぐる法制度や実情について研究を行い、また、職業安定法の家政婦の有料職業紹介をめぐる制度の展開を分析した。比較研究では、日本では介護労働そのものが、家事労働を担当する点で低い評価を受けているのに対して、北欧やドイツでは、一定の専門的労働として高い評価や待遇を受けていることが明らかになってきた。2年間にわたって在宅福祉を支えるホームヘルパーを中心に、(1)在宅福祉サービスをめぐる動向、(2)派遣型介護労働者の雇用をめぐる労働条件の実情把握、(3)比較法の視点から派遣型介護労働者をめぐる立法政策の課題を中心に研究を進めた。(1)まず、ゴールドプランの実施のなかで各自治体ではホームヘルパーの数を増やしている。しかし、現実のホームヘルプサービスのレベルは必要(ニーズ)に比較して決定的に不足しており、財政的な考慮からサービスの量と質が規定されている。

他方、介護保険法の提案など在宅福祉をめぐる動向との関係で今後のホームヘルプサービス供給の在り方は、国・自治体ともに明確な方向として定まっていない。むしろ、医療から介護への施策に重点が移されているなかで、医療サービスが現実に削減される面が強く現実のニーズとサービス供給の矛盾が大きくなっている。(2)各自治体では直用公務員、社会福祉協議会・福祉公社職員だけでなく、登録型ホームヘルパーが中心となっている。その背景には、行政改革や国の財政難の状況からの福祉予算削減が決定的な意味を有している。しかし、登録型ホームヘルパーは法的な位置づけとしては労働者の扱いをされていない。労働省も指揮命令関係や労働時間管理を指標としているが、労働者扱いされている例は少ない。しかし逆に、就業規則の不整備などは登録ホームヘルパーの身分的不安定を意味している。今後の課題として労働法・社会保障法の適用と立法の整備が必要である(例えば、労災保険や雇用保険等の適用)。(3)各国の状況は多様であるが、労働者の地位については同一労働同一待遇の原則が確立しており、ホームヘルパーも公務員、直用労働者、パートタイマー等での身分的な格差はなく、この点で日本との間に決定的な格差がある。
中心市街地の活性化支援のための歩行者指向型Agent-basedモデリング手法

近年,都市の活性化や再生が重要な政策課題になっている.特に地方都市では中心市街地の活性化や再生に向けて様々な政策を実施しているが,期待した効果があまり現れていない。より有効な政策立案のためには,中心市街地の施設環境と歩行者活動分布との因果関係を解明し,政府・市民・企業・専門家の知識や合意形成に基づいた意思決定を支援するツールの提供が重要であると考えられる.そこで本研究では中心市街地の活性化支援のための「歩行者指向型マルチ・エージェント意思決定支援システム」の開発と実証分析を行った.具体的には,マルチ・エージェントの概念を導入し,まず,歩行者の都心での回遊行動(都心へのアクセス交通手段,訪問施設やルート,活動の遂行・滞在時間・消費金額など)のモデルを開発し,施設立地・機能の分布が歩行者の回遊行動に与える影響を評価した.次に,利害関係者の意見や要望などを反映し,相互の協力・交渉プロセスを考慮した政策シナリオの設定とその総合評価を容易に行うことができ,効果的な施設立地・機能分担の意思決定を支援するツールの開発を行った.さらに,広島都心部を対象に実施したアンケート調査データを用いて,従来の研究のように歩行者の活動の一部のみを扱うのではなく,都心内における歩行者の様々な活動(歩行・立寄り・買物など)を全て取り扱い,歩行者指向型マルチ・エージェント意思決定支援システムを試験的に開発し,その適用可能性を明らかにした.このシステムを用いて,都心活性化に向けたシミュレーション分析から歩行者の回遊活動を活発化するための政策についての検討を行った.この研究は、中心市街地における歩行者と歩行環境との相互作用を表現するモデルの開発を行う。このモデルは、中心市街地の再開発が歩行者フローと施設のパフォーマンスに与える影響を予測するために使われる。このため、代替案の設計と評価に関わる基本的な計画タスクを記述するツールの中核をなすものの開発を目指す。そして、計画者の意思決定を支援するだけではなく、中心市街地の再開発に関わる各利害関係者の参加と合意形成に必要なコミュニケーションを円滑化できるようなAgent-based支援ツールを開発する。初年度の研究は研究全体のフレームワークを構築するために時間を費やした。そして、歩行者は各種活動を時空間において遂行するために都心を歩き回ると考えられるため、Activity-basedアプローチの考え方を援用し、各エージェントは特定の個人属性を有しており、ある目的をもって、そして、個人の活動スケジュールと時間制約のもとで都心を訪問するというメカニズムを特定化する作業は一段落した。構築したフレームワークでは、歩行者エージェント、施設エージェントと計画者エージェントを導入している。そして、広島都心部ですでに実施された歩行者アンケート調査データを用いて、歩行者の活動パターンについて分析し、多くの衝動的な立ち寄り行動が存在することを明らかにすると同時に、フレームワークの適用可能性を試験的に分析した。より有効な政策立案のためには,中心市街地の施設環境と歩行者活動分布との因果関係を解明し,政府・市民・企業・専門家の知識や合意形成に基づいた意思決定を支援するツールの提供が重要であると考えられる.そこで本研究では中心市街地の活性化支援のための「歩行者指向型マルチ・エージェント意思決定支援システム」の開発と実証分析を行った.具体的には,マルチ・エージェントの概念を導入し,まず,歩行者の都心での回遊行動(都心へのアクセス交通手段,訪問施設やルート,活動の遂行・滞在時間・消費金額など)のモデルを開発し,施設立地・機能の分布が歩行者の回遊行動に与える影響を評価した.次に,利害関係者の意見や要望などを反映し,相互の協力・交渉プロセスを考慮した政策シナリオの設定とその総合評価を容易に行うことができ,効果的な施設立地・機能分担の意思決定を支援するツールの開発を行った.さらに,広島都心部を対象に実施したアンケート調査データを用いて,従来の研究のように歩行者の活動の一部のみを扱うのではなく,都心内における歩行者の様々な活動(歩行・立寄り・買物など)を全て取り扱い,歩行者指向型マルチ・エージェント意思決定支援システムを試験的に開発し,その適用可能性を明らかにした.このシステムを用いて,都心活性化に向けたシミュレーション分析から歩行者の回遊活動を活発化するための政策についての検討を行った.
Z帯異常に着目した心不全病態形成機構の解明とその是正法の開発

心不全は要求する血液量を十分に拍出出来なくなる病態であるが、重症かつ難治性のものとして肥大型心筋症(HCM)や拡張型心筋症(DCM)がある。これまでのHCMやDCMの原因遺伝子の同定とその機能解析はZ帯機能異常と心不全との関連を強く示唆する。本研究ではZ帯構成要素変異による機能異常の解明とその是正戦略を得ることを目的とし、以下の研究成果を得た。(1)肥大型心筋症(HCM)の新規原因としてTcap遺伝子(TCAP)変異、拡張型心筋症(DCM)の新規原因として、Tcap遺伝子(TCAP)、αBクリスタリン遺伝子(CRYAB)、FHL2遺伝子(FHL2)それぞれの変異を特定した。また、拘束型心筋症にミオパラジン遺伝子(MYPN)変異を見出した。(2)TTNのHCM変異でFHL2結合性が亢進、DCM変異では低下した。一方、αBクリスタリンへの結合性はHCM変異、DCM変異とも低下した。CRYABにおけるDCM変異、FHL2におけるDCM変異はTTNへの結合性を減弱した。(3)MYPN変異を導入した心筋細胞ではサルコメア形成異常を認めた。(4)Cypher/ZASPと結合するタンパクを同定したところ、エネルギー代謝に関わるものであった。このタンパクは通常細胞質に存在するが、ストレス(低血清、低グルコース)時にZ帯に分布した。(5)筋収縮のCa感受性を亢進させるM21を強制発現させたトランスジェニックマウスを作製した。M21を高発現するマウスでは、心臓肥大、心筋細胞の錯走配列、核の大小不動、心筋線維化などヒトHCMと類似の病態を呈した。このことは、筋収縮のCa感受性亢進が心肥大や錯綜配列などのHCM病態を呈する直接の病因となること、M21高発現マウスはHCMの動物モデルとなることを示し、Ca感受性の制御が心筋症の病態形成制御戦略となることを強く示唆する。特発性心筋症患者を対象としてZ帯構成要素遺伝子群の変異を検索し、見出された変異について機能変化を検討した。その結果、Cypher/ZASP変異が拡張型心筋症の原因となること、この変異によってPKC結合性が増強することが判明した。一方、TCAP変異は拡張型心筋症、肥大型心筋症のいずれにも各2種見出されたが、拡張型心筋症における変異はMLPおよびカルサルチン1への結合性が減弱するのに対し、肥大型心筋症における変異はMLP,タイチン、カルサルチン1への結合性が増強した。このことから、同一遺伝子の変異であっても、その機能変化が異なることで、まったく異なる病態を規定することが明らかとなった。また、カルサルチン1はカルシニューリン結合タンパクであることから、これらの結果は、心筋症の発症機構にZ帯タンパクのリン酸化制御が関わることを強く示唆する。これとは別に、高血圧性心筋症の動物モデルであるダール食塩感受性ラットの心筋において心肥大期に発現が亢進する増殖因子様遺伝子DSS10(仮称)のヒトオルソローグについて検討したところ、高血圧性拡張型心筋症患者の2/9(22.2%)に変異が観察された。この変異は一般非心筋症者集団には1/1668(0.2)、特発性拡張型心筋症患者には0/134(0%)しか存在しないため、高血圧性拡張型心筋症と特異的に関連するものと考えられた。

ついでDSS10の機能解析を行ったところ、DSS10はZ帯に分布すること、TCAPと結合すること、変異によってTCAP結合性が減弱すること、変異があると細胞外への分泌が亢進すること、ラット心筋細胞に肥大とサルコメア整合性の促進をもたらすことが判明した。このことから、DSS10は高血圧存在下に心肥大と心筋リモデリングをもたらす因子であると考えられた。一方、酵母2ハイブリッド法を用いてCypher/ZASP遺伝子の心筋特異的発現ドメインに結合するタンパクをスクリーニングしたところ、2種類のタンパクが結合することが判明した。既知の原因遺伝子との機能連関を指標に候補遺伝子を選択し、心筋疾患者集団における変異検索を行う手法で、CRYABおよびFHL2に拡張型心筋症関連変異を見出した。ミオパチー関連CRYAB変異はクリスタリン凝集をもたらすが、心筋症関連変異で凝集を認めなかった。また、CRYABはタイチンN2B領域およびI26/I27ドメインに結合するが、心筋症関連変異はN2B結合性の低下をもたらした。した。一方、タイチンN2B領域には肥大型心筋症、拡張型心筋症それぞれに関連する変異を見出しているが、これらはいずれもCRYAB結合性を低下した。CRYABは虚血からの心筋保護を担うが、その機能の一端はタイチン結合を介すると考えられており、その異常は心筋症病態をもたらすと考えられた。また、拡張型心筋症関連FHL2変異もタイチンN2B結合性を低下した。酵母2ハイブリット法を用いてCypherの心筋特異的ドメインに結合するタンパクを同定した。Cypher心筋特異的ドメインには2種類の拡張型心筋症関連変異が報告されているが、そのいずれもがこのタンパクとの結合性を低下した。さらに、この結合タンパク遺伝子に心筋症関連変異を見出した。横紋筋特異的に発現する新規遺伝子(H452)の構造解析を行い、スプライシングパターンが異なる少なくとも3種のアイソフォームが存在することが判明した。これらのアイソフォームcDNAにそれぞれGFPを融合しラット心筋初代培養細胞にトランスフェクトした結果、いずれのアイソフォームともZ帯に分布するが、一番短いアイソフォームは核にも分布した。また、H452のアイソフォーム特異的な領域に対応するペプチドに対する抗体を作製し、組織標本を染色したところ、心筋、骨格筋のいずれにおいてもH452はZ帯と介在板に発現していた。また、肢体型筋ジストロフィー患者にH452変異を見出したが、心筋症患者では変異が検出されなかった。これらとは別に、HCV感染後拡張型心筋症の発症にHLAに連鎖したTNF-BAT1領域内遺伝子が関わることを示した。心不全は要求する血液量を十分に拍出出来なくなる病態であるが、重症かつ難治性のものとして肥大型心筋症(HCM)や拡張型心筋症(DCM)がある。我々はこれまでにHCMやDCMの原因遺伝子の同定とその機能解析を遂行して来たが、それらの研究成果はZ帯機能異常と心不全との関連を強く示唆する。本研究ではZ帯構成要素の変異とその機能異常の解明とその是正方策の開発を目的とした。本年度の主な成果は以下の通りである。既知の原因遺伝子のいずれにも変異が検出されないHCM多発家系を対象とした連鎖解析を実施し、その原因遺伝子座を9.8Mbの範囲にマップした。この領域には約200の遺伝子が存在するが、それらの変異検索により全く新しい原因遺伝子が発見できると考えられる。
インピーダンス計測法によるアルフベン固有モードの解明とアルファ粒子損失機構の解明

トーラスにおける減衰の少ないアルフベン固有モード(AEs)はITERなどでの核反応で生じるα粒子の閉じ込めに非常に大きな影響を及ぼすことが知られており、核融合研究の重要な課題とされている。本研究ではユーリッヒ研究機構プラズマ物理研究所のトカマク装置TEXTORの動的エルゴディックダイバーター(DED)のコイルを利用して、これに数十kHz-1MHzの高周波電流を主DCまたはACのDED電流(DC-1kHz,10kA)に重畳することによってトロイダル、ポロイダルモードの制御されたTAEの励起を行った。DEDコイルのインピーダンスの外部計測及び、トロイダル方向のミルノフコイルによる波動磁場計測によってTAEの特性を詳しく調べると共に、DEDコイルのDC電流による周辺プラズマの変化や周辺磁場構造の変化に伴うTAEの安定化の試みに関する研究を行った。DEDコイルを利用した高周波の重畳、電流.電圧計測回路の設計と組み立て、真空及びプラズマによる予備試験を行い、またDEDのプラズマ実験の時にこれらを用いてインピーダンス計測の予備実験の後、プラズマ密度、トロイダル磁場、DC DED電流等を変化させTAEの励起実験を行った。最大電圧150V,最大電流5A,周波数DC-1MHzのRF電源を用い、RFをDEDコイルのペアに印加した。プラズマ密度、トロイダル磁場、DED DC重畳電流、NBIなどのパラメータを変え、TAEの励起実験を行い、アンテナインピーダンス、MIrnovコイルによるRF磁場の計測を行った。RF磁場とインピーダンスのスペルトルが磁場、密度で変化する様子をTAEの計算と比べる解析を行いDED電流の小さなときにはプラズマの大きな変化は見られないがRF磁場が広い周波数領域で減少し、電流を増すと逆にRF磁場が増して行く領域があることを観測した。
植物バイオマス資源からの均一ナノファイバー製造に関する基盤技術の構築

様々なバイオマス資源から均質で機械的?化の少ない構造用ナノファイバーを効率的に製造するための基盤技術の構築を目指した。グラインダー処理により木材、稲ワラ、ジャガイモ柔細胞か12-55nm程度のナノファイバーが得られた。また、その弾性率や結晶性には大きな差異が無かった。さらに、高速ブレンダーおよびビーズミルによりグラインダー処理と同等のナノファイバーが得られた。本研究では、様々なバイオマス資源について、ナノファイバー化の難易、複合材料原料としての適性(ポリマー中での分散性、耐熱性、補強特性、等)を統一的に明らかにすることを目的とする。さらに、それらに基づき、様々なバイオマス資源について応用できる、均質で機械的劣化の少ない構造用ナノファイバーを効率的に製造するための基盤技術(汎用技術)を構築する。今年度は、木材(ベイマツ)、稲ワラ、ジャガイモ絞りかす(柔細胞)を原料とし、原料とセルロースナノファイバーの構造、機械特性の関係について検討した。これらの原料からリグニン、ヘミセルロース、デンプン等を除去後、同じ条件でグラインダーによる解繊処理を行った。木材からは12-20nm、稲ワラからは12-35nm、ジャガイモ柔細胞からは12-55nmの均一ナノファイバーがそれぞれ得られた。ナノファイバーシートに関するX線解析より、これらの原料間ではナノファイバーの結晶性には差がないことが明らかとなった。また、同様にシートの引張弾性率、引張強度においても有意な差は認められなかった。以上のことから、木材や稲ワラにおいて構造支持体としての役割を果たしている細胞組織とジャガイモにおいてデンプンの貯蔵の役割を果たしている細胞組織とでは細胞の機能は異なるが、その基本骨格であるセルロースナノファイバーの特性についてはほぼ同じであるといえる。このことは、どのような植物資源からも、高性能のセルロースナノファイバーが抽出出来ることを示唆するものである。さらに、竹の繊維および柔細胞からのセルロースナノファイバー抽出を試み、それらの形状、ナノファイバーシートの機械特性を評価した。両者においても明確な差は認められなかった。前年度までに、様々なバイオマス資源からグラインダー処理で製造したナノファイバーのモルフォロジーおよび力学特性について検討した結果、原料によらず20-50nm程度のナノファイバーが得られること、それらの弾性率や結晶性には大きな差異が無いことが明らかになった。この成果を踏まえ、本年度は、より簡便で、かつグラインダー処理と同等のナノファイバーを製造する技術について検討した。その結果、脱リグニン処理した木粉を、0.5-1%の水溶液濃度で高速ブレンダーにより約40000rpmで10-30分間撹拌することで、グラインダー処理と同等のナノファイバーが得られることが明らかになった。木粉パルプの高速ブレンダー撹拌によるナノ解繊過程について、SEMや光学顕微鏡を用いて観察したところ、パルプ表面のS1層が撹拌過程で剥がれ、続いてS2層が膨潤することで一気にナノ解繊が生じる解繊機構とパルプがちぎれて微少なフラグメントとなり、その後、ナノ繊維化する解繊機構の二種類があることが認められた。また、前者のナノ解繊機構では短時間の撹拌で均一ナノファイバー化しやすいことも認められた。さらに、水とDMSOの混合溶液を撹拌媒体として用いることで、木粉パルプの解繊性は変化した。このことより、セルロースとの親和性に優れた膨潤剤を水に添加することで、より高効率でナノ解繊できる可能性が示唆された。以上の結果から、従来のグラインダーや高圧ホモジナイザーを用いたセルロースナノファイバー製造技術とは異なるナノ解繊手法が開発されたといえる。様々なバイオマス資源からグラインダー処理で製造したセルロースナノファイバー(CNF)のモルフォロジーおよび力学特性について検討した結果、原料によらず20-50nm程度のナノファイバーが得られること、それらの弾性率や結晶性には大きな差異が無いことが明らかになった。さらに、脱リグニン処理した木粉を高速ブレンダーにより撹拌することで、グラインダー処理と同等のナノファイバーが得られることが明らかになった。これらの成果を踏まえ、本年度は、ビーズミルによる新規のナノ解繊技術について試みると共に、その効果を他の解繊技術と比較した。試料は60mesh以下のスギ木粉(Cryptomeria japonica)を用いた。この木粉に対し抽出成分の除去、脱リグニン処理および脱ヘミセルロース処理を行った。得られたパルプ状試料に蒸留水を加え適当な濃度に調製したスラリーをバッチ式ビーズミルによる解繊処理に供した。粉砕媒体であるビーズは、直径の異なる3種類(0.5mm、1mm、2mm)のジルコニアビーズを用いた。処理条件を変えて得られたそれぞれのCNFについて、FE-SEMによる形態観察と共に窒素ガス吸着による比表面積測定(解繊度の評価)、X線回折(結晶性の評価)等の分析を行った。同様の検討をグラインダー処理、高圧ホモジナイザー処理についても行った。いずれのビーズ径でも時間の経過とともに比表面積値が上昇し、木粉パルプのナノ解繊が進んでいることがわかった。また各処理時間において、1mmビーズを用いた場合が最も大きい比表面積値を示した。

X線回折のパターンから算出した結晶化度に関しては、ビーズ径の違いによる差は認められず、いずれのビーズ系でも同様の解繊に伴う結晶性低下がみられた。ビーズミルは、グラインダー法に比べ生産効率に優れており、また、高圧ホモジナイザーより均一なナノファイバーを得やすいことが示唆された。
運動ニューロン特異的遺伝子過剰発現マウスを用いたALSの実験的治療の研究

本年度は変異SOD1導入ALSマウスモデルの病勢進行におけるカスパーゼの役割について運動ニューロン特異的遺伝子過剰発現マウスを作製して下記のような実験を行った。変異SOD1トランスジェニックマウスは家族性ALSのよいモデルであり、ALSの治療法開発に格好の材料を提供する。これまでの研究から、カスパーゼ-9活性化をはじめとするミトコンドリア経由のアポトーシスシグナルが変異SOD1マウスにみられる神経変性に重要な役割を果たしていることが示唆されている。ALSにおけるカスパーゼ-9の役割を明らかにするため、我々はカスパーゼ-3、-7、-9を阻害するX染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)および広範囲のカスパーゼを阻害因子であるが、カスパーゼ-9だけは阻害しないバキュロウイルスのp35のALSへの影響を調べた。コリンアセチル転移酵素のプロモーターを使ってXIAPを脊髄運動ニューロンに比較的特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製し、変異SOD1マウスとかけ合わせたところ、発症時期には影響しなかったが、罹病期間を延長させる効果で、生存期間を延長させた。一方同様にp35の効果を検討したところ、p35は発症時期を遅らせることで生存期間を延長させたが、罹病期間には影響しなかった。さらにカスパーゼ-9はマウスALSの発症直前から活性化が観察されたばかりでなく、ヒトALS患者剖検脊髄運動ニューロンでも活性化されていた。以上より、カスパーゼ-9はALSの病勢進行に重要な役割を果たしており、よい治療のターゲットとなると考えられた。
子宮頚癌患者における抗ヒトパピローマウイルス(HPV)免疫回避機構

ほとんどの粘膜型HPVを検出できるLCR-E7PCR法を開発した。この方法により日本におけるHPV感染の頻度、癌発生に関与するタイプのHPVの感染パターンを明らかにした。子宮頚部細胞に変化を認めないHPVの感染初期(細胞診正常、コンジローマ、LSIL(Low-grade squamous intraepithelial lesions))の女性では、17種類以上のHPVが単独または混合感染しており、特に混合感染が高頻度にみられたが、HSIL(Hitgh-grade squamous intraepithelial neoplasia)や子宮頚癌では混合感染の頻度は減少し、単独感染として検出されることが多かった。HPV16,18,31,33,51,52,56,58はこれらの悪性病変で検出されたためハイリスク型と考えられる。日本の子宮頚癌では、欧米に比べてHPV18,33,56型は少なく、HPV51,52,58型が多い傾向を示した。HLA classII抗原型との相関を調べたところ、HLA DR3,4の女性はHPV感染が成立し易く,HLA DR2,3,4,5またはDR2-DQw1,DR3-DQw2,DR5-DQw3 haplotypeは子宮頚癌の発症と相関していた。またHPV16DNA陽性でHLA DR2,3,4,5の女性は、それ以外のHLAタイプ群に比べてHPV16ウイルス抗体価が上昇していた。これらのHLA型の女性では、HPV感染後にTh2HelperT細胞の活性化が有意となりB細胞を刺激して抗体産生が誘導されるが、逆にTh1 Helperは抑制されている可能性が示唆された。そこで、このことを証明するために、頚癌組織中のTh1型サイトカイン(IL2,γ-INF)、Th2型サイトカイン(IL4,IL5)の発現を免疫染色により検査したが、特徴的な変化は今のところ見いだせていない。FHIT遺伝子は、多くの癌組織においてLOHや異常転写発現が頻発する癌抑制遺伝子であることが知られている。悪性型HPV感染とFHIT遺伝子の発現を検討したところ、ほとんどの子宮頚癌組織中にHPV-DNAは検出されたが、癌遺伝子であるE6-E7遺伝子の転写がみられない症例が存在した。E6-E7遺伝子の発現を認めない癌組織では高率にFHITの異常転写発現がみられた。一方、E6-E7遺伝子の発現が認められる症例ではFHITの異常transcriptionはほとんどみられなかった。これら異常転写発現を呈した症例では、fhit蛋白の発現がみられなかったことより、子宮頚部の癌化にはFHIT遺伝子の機能喪失が重要である可能性が示唆された。頚部の癌化の誘導には悪性型HPV感染とその遺伝子発現が重要であるが、癌化形質を獲得したのちにはFHIT遺伝子の機能喪失が二次的に誘導される可能性が示唆された。またその際には、免疫学的ターゲットとなりうるE6-E7遺伝子の発現が抑制された癌細胞のみが選択的に増殖した可能性も示唆される。(論文)。すべての粘膜型HPVタイプの感染と子宮頚癌発生との関連を明らかにするために我々独自のHPV-DNA診断法を開発した(LCR-E7 PCR法)。この方法を用いると30タイプ以上の粘膜型HPVを検出可能である。子宮頚癌ではHPV16,18,31,33,35,51,58型などが単独感染として検出されたが、低悪性度病変ではHPV30,42,53,56,66型など新たなタイプの単独感染や、異なるタイプの混合感染が多数みられた。

前者に代表される悪性型HPVタイプは選択的に持続感染し癌化を誘導するが、後者のHPVタイプは低悪性度病変を誘導する可能性はあるが癌化を誘導しないと考えられた。(国際ヒトパピローマウイルス学会、チャールストン、米国1月、1999にて発表、論文準備中)。今後はHPVタイプの違いによる免疫応答の違いや感染様式の違いについて検討する予定である。ほとんどの粘膜型HPVを検出できるLCR-E7 PCR法を開発した。この方法により日本におけるHPV感染の頻度、癌発生に関与するタイプのHPVの感染パターンを明らかにした。子宮頸部細胞に変化を認めないHPVの感染初期(細胞診正常、コンジローマ、LSIL(Low-grade squamous intraepithelial lesions)の女性では、17種類以上のHPVが単独または混合感染しており、特に混合感染が高頻度にみられたが、HSIL(High-grade squamous intraepithelial neoplasia)や子宮頚癌では混合感染の頻度は減少し、単独感染として検出されることが多かった。HPV16,18,31,33,51,52,56,58はこれらの悪性病変で検出されたためハイリスク型と考えられる。日本の子宮頚癌では、欧米に比べてHPV18,33,56型は少なく、HPV51,52,58型が多い傾向を示した。HLA class II抗原型との相関を調べたところ、HLA DR3,4の女性はHPV感染が成立し易く、HLA DR2,3,4,5またはDR2-DQw1,DR3-DQw2,DR5-DQw3,haplotypeは子宮頚癌の発症と相関していた。またHPV16DNA陽性でHLA DR2,3,4,5の女性は、それ以外のHLAタイプ群に比べてHPV16ウイルス抗体価が上昇していた。これらのHLA型の女性では、HPV感染後にTh2 Helper T細胞の活性化が有意となりB細胞を刺激して抗体産生が誘導されるが、逆にTh1 Helperは抑制されている可能性が示唆された。そこで、このことを証明するために、頚癌組織中のTh1型サイトカイン(IL2,γ-INF)、Th2型サイトカイン(IL4,IL5)の発現を免疫染色により検査したが、特徴的な変化は今のところ見いだせていない。
QRPAを用いたニュートリノレス二重ベータ崩壊の原子核行列要素計算

物理学にとって現在最も主要な課題であるニュートリノ有効質量の決定のため、原子核の二重ベータ崩壊を利用する方法がある。もしニュートリノがマヨラナ粒子であれば、この崩壊の確率を実験で測定し、原子核行列要素と位相空間因子を理論的に計算することによってニュートリノ有効質量が求まる。本課題実施者は、準粒子乱雑位相近似を用いて150Nd->150Smでの原子核行列要素を計算した。位相空間因子よりもこちらの方が近似方法によるばらつきが大きく改良が強く望まれているからである。完全性近似のもとで二核子移行による仮想経路を用いた計算が可能であるが、平成27年度の成果は、この方法と本来の二重ベータ経路による計算とが一致しなければならないという要請が、用いる有効相互作用に対する拘束条件になるということを見出したことである。これまでは崩壊を引き起こす演算子に含まれる有効軸性ベクトル流結合と陽子・中性子対相互作用という二つのパラメータの決定が分離できないという問題があったが、本年度の成果により、陽子・中性子対相互作用の強さを崩壊の演算子とは独立にかつ理論的に決められるようになった。上記の崩壊例においてこのように決めた陽子・中性子対相互作用の強さは陽子・陽子対相互作用と中性子・中性子対相互作用の強さのほぼ平均値であった。得られた原子核行列要素は、準粒子乱雑位相近似を用いている他のグループの値の上限値付近であった。計算過程の不確定性を理論的に除いたことによって計算結果の信頼性が向上したということが、成果の意義である。さらに48Ca->48Tiの計算も開始した。150Nd->150Smとはたいへん物理的性質の異なる核の崩壊で課題実施者の新しい方法が問題ないかどうか調べることが目的である。長年、標準理論で質量なしと仮定されてきたニュートリノに質量があるということがニュートリノ振動の実験によって確立し、現在その質量決定が物理学にとって重要な課題になっている。この決定のためのごく限られた方法のひとつであるニュートリノレス二重ベータ崩壊の原子核行列要素を計算することが本研究の目的である。原子核行列要素は我々の用いる準粒子乱雑位相近似(QRPA)、殻模型などで計算されたが、因子2から3というばらつきがあり、格段に精密な計算が求められている。我々は、QRPAの準ボソンに対する真空という基底状態の定義を用い、この状態をあらわに計算することによって始状態と終状態から求めたQRPA中間状態の重複を計算した。ここが我々の方法の新しい点である。平成26年度には、この方法によるニュートリノレス二重ベータ崩壊の原子核行列要素が初めて150Ndから150Smへの崩壊について計算された。この過程でQRPA基底状態の規格化因子が原子核行列要素を顕著に小さくすることが明らかにされた。これは、QRPAにおいて今まで気づかれていなかった多体相関の機構の発見を意味する。ここが平成26年度における本研究の最も中心的な実績である。我々はこの成果をフィジカルレビューCにて出版するとともに、精力的に国際ワークショップで口頭発表した。特に平成26年11月にドイツのダルムシュタットで開催されたワークショップでは特にこの課題の専門家たちが集まったが、その場で我々の新しい主張のほとんどの点に対し異議が出なかった。これは大きな成果である。研究実績の概要で述べたように、平成26年度には新しい計算による成果を上げ、論文および口頭の発表によって成果の広報を行った。よって本研究は、おおむね順調に進展している。引き続き他の崩壊例での原子核行列要素計算を行う。また本研究が明らかにした新しい多体相関の機構をさらに確固にするため、二つのニュートリノ放出を伴う二重ベータ崩壊の原子核行列要素計算、陽子・中性子対エネルギー密度汎関数の導入などを行う。

これらの計算の遂行にとって最も重要なことは計算資源割り当ての確保であり、平成27年度も国内外の超並列計算機利用プログラムに応募する。国際ワークショップ参加の際、旅費の先方負担があった。次年度使用分は、研究会またはワークショップ参加のための旅費、または計算機使用料に充てられる予定である。
新規タンパク性複合脂質プローブの開発

96穴プレートにリン脂質を固相化した。固相化したリン脂質は、界面活性剤非存在化にホスホリパーゼDにより定量的に分解され、極性頭部が有効に水相に露出している事が確認された。このプレートにより、インドコブラサイトトキシン7(CTX7)は、ホスファチジルセリンのような酸性リン脂質に強く結合するが、ホスファチジルコリンには結合しないことが示された。CTX7の変異体の発現ベクターを作成し、リコンビナントタンパク質を封入体の形で得た。様々な条件下に再構成を試みたが、封入体は、溶血活性を示さなかった。リン脂質固相化プレートへの結合活性は遊離CTX定量法が確立できなかったため、確認できなかった。コブラサイトトキシン(CTX)はコブラ毒素タンパク質の50%以上をしめる主要成分であり、種々の細胞に対して毒性を示す。この細胞溶解並びに溶血活性の分子機構は明確には解明されていない。既に精製してある10種のコブラCTXのうち主要5種(CTX2, CTX710)について、全アミノ酸配列を決定し、細胞溶解並びに溶血活性の関係を調べた。溶血活性の強いP型に属するCTX9とCTX10は1アミノ酸置換の関係にあり、ほぼ同じ強い活性を示した。他方、溶血活性の弱いS型3種のCTXの中で、CTX2は弱い活性を示したが、お互いに1アミノ酸置換の関係にあるCTX7とCTX8は、ほぼ同程度の強い活性を示した。各種リン脂質を固相化した簡易リン脂質親和性測定法を開発し、CTX2,CTX7, CTX9のリン脂質に対する相対親和性を測定したところ、いずれもホスファチジルセリンに強い親和性を示した。一次構造とリン脂質親和性の関係から、S型では、ループIIに位置するLys30が、強い活性に重要である事が示唆された。また、クローニングした12種のCTX cDNAを含め51種のCTX cDNAの塩基配列アラインメントから、コドン毎の非相同置換/相同置換の比を調べたところ、CTXのループIIに対応するコドン領域が加速進化を受けている事が示された。同時に、リン脂質と相互作用するアミノ酸残基、CTXのコア構造を安定化させているアミノ酸残基に対応するコドンは保存的であった。これらの結果は、CBP Part C, 174, 158-164 (2016)に掲載された。新年度は、これらの結果を利用して、毒性を持たないリコンビナントCTX分子を作製する。また、CTX分子のリン脂質親和性を評価するために必要なリン脂質親和性測定法の改良を試みる。初年度の成果として、リン脂質結合に関与する領域と生体膜傷害活性を担う領域が、サイトトキシン(CTX)分子上の異なる領域に存在することを明らかにした。さらに、CTXの溶血活性の強弱は、リン脂質結合活性の強弱ではなく、生体膜傷害活性の強弱に依存していることを示した。この知見に基づいて、より確実性を持って細胞傷害活性を持たないリコンビナントCTXを設計することが可能となった。そこで、当初の計画では、最も毒性の強いCTX7を基本として、毒性を持たずリン脂質親和性を有する変異タンパク質を作製する予定であったが、最も毒性の弱いCTX2を基本として、リコンビナントタンパク質を設計することに変更した。本研究の第1目的は、ホスファチジルセリン(PS)に特異的に結合するタンパク分子の創出である。リン脂質の中でPSにして特異的であることを評価する測定系が必要である。初年度に作成した簡易リン脂質親和性測定法は、半定量的方法であり、解離定数(Kd)を推定することができない。そこで、この測定法を改良する必要である。問題点は、固相化されたリン脂質の有効量の推定と、そのリン脂質に吸着されたCTXの定量化であるので、プレート材質の検討、ホスホリパーゼとCTXの抗体の利用などの検討を現在行っている。昨年度の研究により、CTX分子でホスファチジルセリン結合に関与しているアミノ酸残基と毒性(膜障害活性)に関与しているアミノ酸残基がCTX分子上の別々の領域に推定された。この知見をもとに、毒性が弱まる(あるいはなくなる)と期待される変異を導入したCTXの発現ベクターを構築した。これらのベクターでトランスフォームした大腸菌は、生育しないか、発育が悪いかのいずれかであった。前者の場合は、リコンビナントCTXの大腸菌に対する毒性によるのものと推定され、リコンビナントCTXは得られなかった。後者の場合、リコンビナントCTXに毒性がない、または低いと推定されたが、CTXが封入体となっていたため、これを精製しリフォールディングを試みた。NaCl, KCl、ショ糖、ポリエチレングリコールを含むGSSG/GSH酸化還元緩衝液の条件でリフォールディングしたリコンビナントCTXは、一部で赤血球凝集反応を示す例が見られたが、溶血は引き起こさなかった。我々は、CTXの結合を、リン脂質を固相化した96穴プレートを用いて測定していた。しかし、固相化の条件でプレートが一部溶解するため再現性が低下する事、また遊離CTXの測定に溶血活性を指標としていたために、溶血活性をもたないリコンビナントCTXを定量することが困難であった。固相化については、プレートの材質と溶媒を変更することにより、再現性を向上させることが可能となった。次に、遊離のCTX量を直接感度良く定量できるよう酵素標識抗体法作成のためにCTX分子で保存性の高いカルボキシル末端側のペプチドを合成し、抗体を作成した。