hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自律型水中ロボットによる浅海用環境モニタリングシステムに関する基礎研究

本研究は、自律的水中ロボット(AUV)による浅海域(干潟、海岸、藻場など)における大域的環境モニタリングシステムを確立することを目指して、1)浅海域におけるAUVの水中航行制御技術の確立、2)浅海域におけるAUVの機体形状の設計手法の確立を目的とする。ここで、浅海域における外乱(波、潮流)に対して、姿勢制御能力が高いと思われる胸鰭運動装置を装着したAUVを考える。平成13年度は、浅海波に見られる上下方向よりも大きい前後方向の波粒子運動に対して、ホバリングするために、前後方向、左右方向、上下方向に最大の推力を出すための胸鰭運動装置の鰭運動の最適化を行った。魚の胸鰭の運動学的研究から、胸鰭の動きは、種類によって、また遊泳速度によって変わることが明らかになっている。おおまかには、胸鰭の動きは、高速域における上下運動を中心とした揚力型と、低速域における前後運動を中心とした抗力型に分かれる。これらの型について、非線形最適化手法を用いて、水流中と静水中における胸ひれ運動の最適化を行った。その結果、(1)については、水流中では、揚力型が抗力型より大きな推力を出し、また推進効率も大きいがわかり、一方、静止中では、抗力型が揚力型より少ない消費パワーで大きな推力を出すことがわかった。平成14年度は、胸ひれ運動の最適化に関する昨年度の研究結果をふまえ、前後に二対・計4個の3軸胸鰭運動装置を搭載した水中ロボットを用いて、遊泳性能及び運動制御性能試験を行い、外乱(波、潮流)中において、制御技術を開発した。遊泳性能試験の中で、直進(前進)については、鰭の周波数を変えることにより速度は可変で、揚力型の鰭周波数3Hz時に、最高速度が0.578m/sであった。最高速度では揚力型が勝るが、出足の速さは、抗力型の方が速い。このことは、抗力型の方が、応答性が良いことを意味している。その他、揚力型と抗力型を用いて、前進速度付潜航・浮上、その場旋回、横移動、円運動ができることを明らかにした。制御性能試験では、PTP制御(Point To Point)を行い、鉛直面内と水平面内において同時に制御が可能であることを明らかにした。波浪中において、水面付近に水中ロボットを配置して、ロール制御を行なった。波との同調周期において、ひれ運動周波数3Hzにおいて、約2/3のロール運動の減少が得られた。外乱中でも、素早い応答を示し、姿勢制御が十分に作動することを明らかにした。

ここで、浅海域における外乱(波、潮流)に対して、姿勢制御能力が高いと思われる胸鰭運動装置を装着したAUVを考える。本年度は、浅海波に見られる上下方向よりも大きい前後方向の波粒子運動に対して、ホバリングするために、前後方向、左右方向、上下方向に最大の推力を出すための胸鰭運動装置の鰭運動の最適化を行った。魚の胸鰭の運動学的研究から、胸鰭の動きは、種類によって、また遊泳速度によって変わることが明らかになっている。おおまかには、胸鰭の動きは、高速域における上下運動を中心とした揚力型と、低速域における前後運動を中心とした抗力型に分かれる。非線形最適化手法を用いて、水流中と静水中における胸ひれ運動の最適化を行った。流速は0.2m/sで運動周波数は1.25Hzとした。条件として次の3つを与えた。(1)前進方向に最大の推力を出し、上下方向には小さな推力とする。(2)上下方向に最大の推力を出し、前後方向には小さな推力とする。(3)横方向に最大の推力を出し、前後方向および上下方向には小さな推力とする。その結果、(1)については、水流中では、揚力型が抗力型より大きな推力を出し、また推進効率も大きいがわかり、一方、静止中では、抗力型が揚力型より少ない消費パワーで大きな推力を出すことがわかった。本研究は、自律的水中ロボット(AUV)による浅海域(干潟、海岸、藻場など)における大域的環境モニタリングシステムを確立することを目指して、1)浅海域におけるAUVの水中航行制御技術の確立、2)浅海域におけるAUVの機体形状の設計手法の確立を目的とする。今年度は、水流中と静水中における胸ひれ運動の最適化に関する昨年度の研究結果をふまえ、前後に二対・計4個の3軸胸鰭運動装置を搭載した水中ロボットを用いて遊泳性能及び運動制御性能試験を行い、外乱(波、潮流)中において、制御技術を開発した。遊泳性能試験の中で、直進(前進)については、鰭の周波数を変えることにより速度は可変で、揚力型の鰭周波数3Hz時に、最高速度が0.578m/sであった。最高速度では揚力型が勝るが、出足の速さは、抗力型の方が速い。このことは、抗力型の方が、応答性が良いことを意味している。これについては、後進、その場潜航、その場浮上についても同じ結果が得られた。その他、揚力型と抗力型を用いて、前速度付潜航・浮上、その場旋回、横移動、円運動ができることを明らかにした。制御性能試験では、PTP制御(Point To Point)を行い、鉛直面内と水平面内において同時に制御が可能であることを明らかにした。波浪中において、水面付近に水中ロボットを配置して、ロール制御を行なった。波との同調周期において、ひれ運動周波数3Hzにおいて、約2/3のロール運動の減少が得られた。外乱中でも、素早い応答を示し、姿勢制御が十分に作動することを明らかにした。
ＴＧＦ－β１溶出性グラフトによる先天性心疾患における肺循環

小児先天性心疾患例では肺動脈の低形成や出生後の肺循環障害の進行が、予後に大きく影響している。肺高血圧に伴う内中膜肥厚などの病理変化を来たし加療に難渋することが少なくない。本研究では先天性心疾患症例において従来から頻繁に人工血管などに使用されるexpanded polytetrafluoroethyleneを利用したTransforming Growth Factor-β1 (TGF-β1)溶出性グラフトを考案し、その臨床的有用性の検討を目的とした。単離肺動脈平滑筋細胞はTGF-β1前処置によって有意に増殖と遊走を抑制した。肺高血圧ラットの肺動脈圧はTGF-β1投与によって改善は示さなかった。乳幼児において肺循環に異常を来たした病態、とくに先天性心疾患症例の肺動脈の低形成や出生後の循環動態に伴う肺循環障害の進行は予後に大きく影響していることが多い。開心手術前後および将来にわたって肺血管抵抗上昇や肺高血圧が心不全の原因として進行する場合もある。このような症例においては、肺血管組織は、血管内皮の肥厚、平滑筋細胞の増殖と遊走、叢状変化など肺高血圧に伴う病理学的変化、血管リモデリングが進行している。肺動脈性肺高血圧は近年では一酸化窒素吸入、Phosphodiesterase-5阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤などの薬剤が開発され治療に一定の効果がえられているものの未だに根治的な加療の方法は見つかっていない。本研究では、先天性心疾患小児において、従来より最も頻繁に人工血管や補填物として使用されるexpanded polytetrafluoroethylene (ePTFE)を利用して、Transforming Growth Factor-β1(TGF-β1)溶出性グラフトを考案し、肺高血圧に対する臨床的、病理学的な有用性を検討することである。肺動脈平滑筋細胞の培養およびTGF-β刺激による血管平滑筋細胞の遊走、増殖などを観察し、TGF-β刺激による肺高血圧への進展抑制と改善に関しては合致するような経過と結果が得られた。肺高血圧ラットを用いて、肺血管病変の変化をTGF-β1添加ePTFEグラフト群と非添加グラフト群の2群間で比較を行っている。通常(TGF-β1非含有)のePTFEを肺動脈に移植したラットにモノクロタリンを投与することによって肺高血圧症を惹き起こし、肺動脈圧および右室心筋重量を測定した。次に、TGF-β1添加ePTFEグラフトを移植したラットについて、同様にモノクロタリン負荷を施行し、肺高血圧の重症度・右室心筋重量・肺血管病変への影響を検討している。乳幼児の肺循環機能不全病態、とくに先天性心疾患症例においては肺動脈の低形成や出生後の循環動態に伴う肺循環障害の進行が、その予後に大きく影響していることが多い。術前術後および将来にわたって肺血管抵抗上昇や肺高血圧が心不全の原因として進行する場合もある。肺動脈性肺高血圧は難病指定されており、予後が不良で臨床経過のなかでも、その加療に難渋することが非常に多い。近年では一酸化窒素吸入、Phosphodiesterase-5阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤などの薬剤が開発され治療に一定の効果がえられているものの未だに根治的な加療の方法は見つかっていない。現在は、肺高血圧ラットとそれから摘出した肺動脈平滑筋細胞の培養およびTGF-β刺激による血管平滑筋細胞の遊走、増殖などを観察している。実験開始当初に予想していたこととして、TGF-β刺激による肺高血圧への進展抑制と改善に関しては合致するような経過と結果が得られつつある。先天性心疾患症例においては、肺動脈の低形成や出生後の循環動態変化に伴う肺循環障害の進行が、その予後に大きく影響していることが多い。このような症例においては肺高血圧に伴う病理学的変化を来たし、臨床経過のなかでも、その加療に難渋することが少なくない。本研究では、先天性心疾患小児において従来より最も頻繁に人工血管などに使用されるexpanded polytetrafluoroethylene (ePTFE)を利用したTransforming Growth Factor-β1(TGF-β1)溶出性グラフトを考案し、その臨床的有用性を検討することを目的とした。まず、TGF-β1による培養肺動脈平滑筋細胞の遊走・増殖の抑制効果を確認した。

ラット肺動脈内皮細胞・平滑筋細胞を各々培養し、胎児牛血清やTGF-β1・PDGF・VEGFなどの増殖因子の添加の下で、細胞の遊走能・増殖能を検討した。サイトカインが血管内皮細胞、平滑筋細胞の増殖に関与することは既に多くの報告がなされているが、肺動脈に関してはその効果の報告は少なく、本研究で初めて確認した。TGF-β1溶出性ePTFEグラフトの病理学的変化、およびにシロリムスを添加したePTFEグラフトと非添加のePTFEグラフトの補填後の組織学的相違について検討した。ePTFEは多孔質構造を呈しているため、グラフト壁内に線維芽細胞や平滑筋細胞が浸潤し、グラフトに新生内膜が形成されることが認められた。植え込みから日数が経つに従って、ePTFEグラフトに内膜異常増殖や線維化、石灰化が認められる症例が増加した。乳幼児において肺循環に異常を来した病態、特に先天性心疾患症例の肺動脈低形成や出生後の肺循環動態に伴う肺循環障害の進行は予後に大きく影響していることが多い。開心手術前後および将来にわたって肺血管抵抗上昇や肺高血圧が心不全の原因として進行する場合もある。TGF-β1溶出グラフトは肺血管抵抗、肺血管病変の変化抑制に有用であると考えられた。小児循環器先天性心疾患症例においては肺血管組織の異常、肺動脈の低形成や出生後の循環動態に伴う肺循環障害の進行が、その予後に大きく影響していることが多い。このような症例においては肺高血圧に伴う病理学的変化を来たし、臨床経過のなかでも、その加療に難渋することが少なくない。本研究では、先天性心疾患小児において従来より最も頻繁に人工血管などに使用されるexpanded polytetrafluo- roethylene (ePTFE)を利用したTransforming Growth Factor-β1(TGF-β1)溶出性グラフトを考案し、その臨床的有用性を検討することを目的とした。モノクロタリンを投与した肺高血圧ラットから採取した血管平滑筋細胞の培養において、TGF-βの投与が遊走、増殖の抑制に有用であるか否かを検討した。コントロールに比較して、TGF-βで前処置したものは肺動脈平滑筋細胞の増殖と遊走を抑制した。胎児牛血清やTGF-β1・PDGF・VEGFなどの増殖因子の添加の下で、細胞の遊走能・増殖能を検討する。サイトカインが血管内皮細胞、平滑筋細胞の増殖に関与することは既に多くの報告がなされているが、肺動脈に関してはその効果の報告は少ないため、本研究で確認することとする。ePTFEにTGF-β1を吸収させ、徐放させるコーティングについて研究を検討している。ePTFEは連続性小孔を有するポリマーであるため、容易に薬剤を吸収することが予想されるが、徐放するようにするには工夫が必要である。現在、ラット肺動脈にePTFEの補填を行い、コントロール群および肺高血圧群での違いについて検討する予定としている。
大腸癌におけるMSI腫瘍の簡易判別法の開発と診断への応用

mismatch repair(MMR)欠損により腫瘍細胞はマクロサテライト領域に不安定性(microsatellite instability : MSI)を示すとともに大腸癌の化学療法に最もよく用いられる5-FUやその誘導体を含む様々な抗腫瘍薬に対して高レベルから低レベルの抵抗性を示すことが知られている。更に最近の知見から、MMR欠損腫瘍に特化した化学療法の確立は可能であり、そのためには大腸癌全体の約20%前後と云われるMSI腫瘍の簡便検索法の確立やMSI腫瘍に卓効を示す薬剤の探索などが急務であると考えられた。本研究では(1)MSI症例を中心とした大腸癌を分類するための簡便法確立のための基礎研究(2)細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明の2点を中心に研究を行った。1.分子遺伝学的マーカーによる検討家族性大腸癌(FAP及びHNPCC)を除く散発性大腸癌70例を対象にMSI、LOH、EMAST検出用のlocus markerをそれぞれ7種、14種、6種を用いて検討した結果、MSI腫瘍11例(MSI-H 4例;MSI-L 7例)、EMAST陽性39例が見い出された。EMAST不安定性はMSI腫瘍全例で認められたが、MSI-H症例での泳動パッターンは典型的なEMAST陽性例とは異なっているため、両者の発生機序は異なっていると考えられた。更に、EMAST陽性例では陰性例と比較し、LOHの頻度が高く、chromosomal instability(CIN)腫瘍に包含されると考えられた。2.細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明MMR欠損大腸癌細胞株HCT116とその亜株HCT116+ch3を用いた研究から、MMR欠損細胞はDNA polymerase阻害薬に高感受性を示すことが分かった。この高感受性機構について検討した結果、現在のところ、MMRタンパクがDNA二重鎖切断(DSB)を防ぎ、DSB修復に関わっていることを示唆する結果を得ているが、更に、詳細に検討する必要がある。mismatch repair(MMR)欠損により腫瘍細胞はマクロサテライト領域に不安定性(microsatellite instability : MSI)を示し、また、MMR欠損細胞株と対応染色体導入細胞株に対する抗腫瘍薬の細胞毒性を比較した研究から、MMR欠損細胞は大腸癌の化学療法に最もよく用いられる5-FUやその誘導体を含む様々な抗腫瘍薬に対して高レベルから低レベルの抵抗性を示すことが知られている。本年度は、(1)MSI症例を中心とした大腸癌を分類するための簡便法の確立(2)細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明の2点を中心に研究を行った。(1)大腸癌を分類するための簡便法の確立これまで大腸癌の発癌過程はMSI経路とLOH経路とに分類され、それぞれ検出のためのlucus markerはある程度定まっている。一部の肺がんなどで報告されているEMASTのlocus markerを用いて検討した結果、MSI腫瘍とLOH腫瘍では泳動パターンが異なるlocus markerを見出したが、臨床病理学的特徴との関連は症例数を増やして検討すべき継続課題となった。(2)細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明

MMR欠損大腸癌細胞株HCT116とその亜株HCT116+ch3を用いた研究から、MMR欠損細胞はDNA polymerase阻害薬に高感受性を示すことが分かった。この高感受性機構についての詳細は不明であるが、caspase-cascadeに非依存的な経路を取ることが示唆される結果を得た。mismatch repair(MMR)欠損により腫瘍細胞はマクロサテライト領域に不安定性(microsatellite instability : MSI)を示すとともに大腸癌の化学療法に最もよく用いられる5-FUやその誘導体を含む様々な抗腫瘍薬に対して高レベルから低レベルの抵抗性を示すことが知られている。更に最近の知見から、MMR欠損腫瘍に特化した化学療法の確立は可能であり、そのためには大腸癌全体の約20%前後と云われるMSI腫瘍の簡便検索法の確立やMSI腫瘍に卓効を示す薬剤の探索などが急務であると考えられた。本年度は昨年度に引き続き(1)MSI症例を中心とした大腸癌を分類するための簡便法確立のための基礎研究(2)細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明の2点を中心に研究を行った。(1)分子遺伝学的マーカーによる検討家族性大腸癌(FAP及びHNPCC)を除く散発性大腸癌70例を対象にMSI、LOH、EMAST検出用のlocus markerをそれぞれ7種、14種、6種を用いて検討した結果、MSI腫瘍11例(MSI-H 4例;MSI-L 7例)、EMAST陽性39例が見い出された。EMAST不安定性はMSI腫瘍全例で認められたが、MSI-H症例での泳動パッターンは典型的なEMAST陽性例とは異なっているため、両者の発生機序は異なっていると考えられた。更に、EMAST陽性例では陰性例と比較し、LOHの頻度が高く、chromosomal instability(CIN)腫瘍に包含されると考えられた。臨床病理学的特徴との関連は現在データを取りまとめ中である。(2)細胞株を用いたMMR欠損細胞の高感受性薬の作用機作の解明MMR欠損大腸癌細胞株HCT116とその亜株HCT116+ch3を用いた研究から、MMR欠損細胞はDNA polymerase阻害薬に高感受性を示すことが分かった。この高感受性機構について検討した結果、現在のところ、MMRタンパクがDNA二重鎖切断(DSB)を防ぎ、DSB修復に関わっていることを示唆する結果を得ているが、更に、詳細に検討する必要がある。
自閉症スペクトラム障害児の胎児期から乳幼児期の行動特徴－早期発見と育児支援－

研究目的は、自閉症スペクトラム(以降ASD)児の胎児期から乳幼児期の行動特徴をとらえ、ASDの早期発見と育児支援の一助とすることである。研究1(母親)では、胎児期の胎動、母乳吸てつ行動、離乳食摂取、これらの時のアイコンタクトなどに対する母親の認識を明らかにする。研究2(開業助産師)では、地域に密着して妊娠時から乳幼児まで継続的に関わっている開業助産師が、ASD児を客観的に把握している様相を明らかにする。研究3(保健師では、保健師が健診場面で問題を認識する子どもの行動を明らかにすることである。母親に関しては、インタビュー形式をとり、質的分析を行った。その結果、子育てが大変であった。地域での理解が最近やっと得られるようになったとの回答が得られた。その結果、偏見を持って見られることが少なくなったとの回答も得られ、チェックリストの作成を行った。開業助産師においては、6名が研究に参加をしてくださったが、妊娠・分娩は扱っているが、子育てまで経過を観察している施設が少なく分析が難しい状態である。幸いにして、次年度は、参加予定の開業助産師は、8名いるため、半構造化面接の結果からASDの特徴的行動のチェックリストおよび母親の行動に関するチェックリストを作成し、母親の有効な育児方法を明確にする。保健師に関しては、3名ほどインタビューに応をじてくれたので、分析中であるが、できれば、さらに増やして分析を行う予定にしている以上のことを反映したチェックリストを作成し、ASDをもつ母親に「ASDの持つ親の会など」を通して量的な調査・分析を行い、ASDの子どもをより早期に発見し、早期に育児支援につなげていくことである。8月中には、郵送調査を行い、量的な分析を行い学会発表と論文投稿を行う予定としている。難航していたASDを持つ母親のインタビューが終わり、ほぼ分析が終わりチェックリスを作成した。開業助産師さんにも内諾を得て、半構造化面接を実施している。保健師のインタビューも実施している途中である。ASDの特徴行動のチェックリストおよび母親のチェックリストと開業助産師、保健師から聴取したデータから回答し易い質問紙を作成し、全国のASDを持つ母親の大規模調査を行う。8月中には、郵送調査を実施し、10月には分析・解析を行う。ASDを持つ母親の思いについては、分析が終わりチェックリストの作成も終了した。併せて保健師の認識、開業助産師の認識を半構造化面接を行い質的分析を行う。それをもとに質問紙を作成し、「全国のASDを持つ親の会など」を通して質問紙調査を行う予定としている。大体、500名位を予定していますので、回答が返って来ないことを考えると1000名位を抽出して調査を行い、量的分析を行う予定としている。この研究が終了したら、「母性衛生学会誌」「行動療法学会誌」「特殊教育学会誌」に投稿予定としている。[目的]発達障害を持つ母親に対して、関東地区、中部地区、関西地区において、座談会形式で妊娠中の出来事、子育てについての思いを知る。さらに、その母親に関わる開業助産師、保健師の認識について調査することが目的である。[方法]今年度は、面接のインタビューガイドを作成するために、神奈川県の小学校に通う発達障害をもつ母親5名に対して、同意を得たのち1対1での面接を行ない質的分析を行った。面接内容は、半構造化面接にもとづき母親の育児を行う上での困難感とサポートニーズについてである。[倫理的配慮]研究分担者の所属する早稲田大学倫理委員会で承認を得た。面接の内容は対象者の許可を得てICレコーダーで録音した。[分析]ICレコーダーより発話を書き起こし、それを基に逐語録を作成した。オープン・コーディングより文字テキストデータ1行ごとにコードをつけ,データの圧縮を行なった。[結果]対象者は、了解を得た5名のうち広汎性発達障害1名、ADHD1名,アスペルガー症候群1名、診断名はついていないが特別支援学級に通っている児童の母親2名である。子どもと母親の障害への認識、子どもへの告知、母親と子どもの思いに分類された。抽出された項目は、「子どもに対する障害の認識」「母親の心情」「子育て方法の悩み」「母親のリフレッシュ方法」「子どもに対して障害の告知」「子どもに対しての思い」「家族他のサポートニーズ」などがあげられた。[考察]この結果から、発達障害を持つ母親の思いが分かった。その中でも告知の問題が大きいことがわかった。この調査結果も加味しながら次年度行うインタビューガイドの作成に生かしていく必要も示唆された。研究代表者は、所属期間の移動により研究が大きく遅延した。実際に行った調査は、共同研究者の所属大学での研究倫理審査を行って、面接調査をおこなったものである。1年次に行う予定の研究を行うことが難しい状況にあった。【目的】神経発達障害である自閉スペクトラムが増加し、早期発見と早期療養の重要性が指摘されている。本研究は、乳幼児期のASD児の感覚障害や対人関係などの行動特徴を把握し、大規模調査の項目を得ることである。【方法】対象者は、中京地区の幼児期のASD児を持つ母親8名と幼児期の健常児をもつ母親13名。各郡を2群に分けて座談会形式で想起法による半構造化面接を行い、質的分析を行った。

【倫理的配慮】研究分担者の所属する早稲田大学倫理委員会で承認を得(2016-194)、対象者には文書を示して口頭にて説明し、参加の同意を得た。【結果】健児では、1名の離乳食の好き嫌い以外には、乳児期の発達特徴に外れる行動はみられなかった。ASD乳児の行動特徴は、「聴覚」「表在感覚」「視覚」「味覚」「胎動」「玩具」「対人行動」の7カテゴリに分類された。どのASD児も複数のカテゴリにに渡る行動特徴を示したが、全員に共通する行動特徴は得られなかった。【考察および今後の方向性】乳幼児期のASD児は、感覚障害に由来する行動、同一性に関する遊び行動、対人行動と多岐に渡る行動特徴を示し個人差も大きいことが考えられた。育児環境による刺激の差も影響する可能性が示唆された。今後の研究については、昨年度のカテゴリを併せて、「子どもに対する障害の認識」「母親の心情」「子育て方法の悩み」「母親のリフレッシュ方法」「子どもに対して障害の子告知」などを生かして、開業助産師、保健師の面接インタビューガイドを作成する予定である。研究代表者の所属機関の変更、共同研究者の所属機関の学部改組のため、昨年同様研究が大きく遅延した。研究目的は、自閉症スペクトラム(以降ASD)児の胎児期から乳幼児期の行動特徴をとらえ、ASDの早期発見と育児支援の一助とすることである。研究1(母親)では、胎児期の胎動、母乳吸てつ行動、離乳食摂取、これらの時のアイコンタクトなどに対する母親の認識を明らかにする。研究2(開業助産師)では、地域に密着して妊娠時から乳幼児まで継続的に関わっている開業助産師が、ASD児を客観的に把握している様相を明らかにする。研究3(保健師では、保健師が健診場面で問題を認識する子どもの行動を明らかにすることである。母親に関しては、インタビュー形式をとり、質的分析を行った。その結果、子育てが大変であった。地域での理解が最近やっと得られるようになったとの回答が得られた。その結果、偏見を持って見られることが少なくなったとの回答も得られ、チェックリストの作成を行った。開業助産師においては、6名が研究に参加をしてくださったが、妊娠・分娩は扱っているが、子育てまで経過を観察している施設が少なく分析が難しい状態である。幸いにして、次年度は、参加予定の開業助産師は、8名いるため、半構造化面接の結果からASDの特徴的行動のチェックリストおよび母親の行動に関するチェックリストを作成し、母親の有効な育児方法を明確にする。保健師に関しては、3名ほどインタビューに応をじてくれたので、分析中であるが、できれば、さらに増やして分析を行う予定にしている以上のことを反映したチェックリストを作成し、ASDをもつ母親に「ASDの持つ親の会など」を通して量的な調査・分析を行い、ASDの子どもをより早期に発見し、早期に育児支援につなげていくことである。8月中には、郵送調査を行い、量的な分析を行い学会発表と論文投稿を行う予定としている。難航していたASDを持つ母親のインタビューが終わり、ほぼ分析が終わりチェックリスを作成した。開業助産師さんにも内諾を得て、半構造化面接を実施している。保健師のインタビューも実施している途中である。ASDの特徴行動のチェックリストおよび母親のチェックリストと開業助産師、保健師から聴取したデータから回答し易い質問紙を作成し、全国のASDを持つ母親の大規模調査を行う。
ヒラマキガイを用いた冠輪動物における順遺伝学モデルシステムの構築の試み

モデル生物を用いた順遺伝学的な解析方法は、発生学、基礎医学などの研究に有効である。しかしながら、順遺伝学を用いた研究が実施できるのは、ごく限られた動物種においてのみである。特に問題なのは、冠輪動物には、順遺伝学的なアプローチを用いることができる種が存在しない点である。この問題を解決するために、冠輪動物の軟体動物門に属するヒラマキガイ(Biomphalaria glabrata)を順遺伝学のモデル生物の候補として選び、突然変異誘発、表現型のスクリーニング、突然変異の責任遺伝子同定を行う。これらのアプローチによって、ヒラマキガイを遺伝学のモデル動物とするための基盤を整備するのが本研究の目的である。平成21年度の研究において、Biomphalaria glabrataを用いた突然変異の誘発のプロトコールを確立した。平成22年度の研究では、この方法を用いて、大規模な突然変異誘発をスタートさせた。Biomphalaria glabrataを1mMのENU(N-ethy1-N-nitrosourea)(突然変異誘発物質)で処理し、約100のF1個体を得た。F1を自家受精させて得られたF2ファミリーの個体の1/4は、誘発された突然変異のホモ接合体であると予測できる。約半数のF2胚で発生異常が認められた。発生異常を示したF2ファミリーのうち、表現型を示さないヘテロ接合体を自家受精させ、F3を得た。得られた22のF3ファミリーのうち、8ファミリーでは、F2と同じ表現型が得られた。この結果は、これらの8ファミリーが、発生異常を示す突然変異系統であることを示している。本研究によって、Biomphalaria glabrataを用いた大規模な突然変異誘発が可能であることが示された。平成21年度の研究では、Biomphalaria glabrataを用いて、突然変異の誘発と、突然変異系統を樹立する方法を確立するためのパイロット実験を実施した。Biomphalaria glabrataを突然変異誘発物質で処理した個体(P)から、約50のF1個体を得た。F1を、一個体ずつ飼育して自家受精させ、それぞれからF2の個体(F2ファミリー)を得た。F2ファミリーの個体の1/4は、誘発された突然変異のホモ接合体であると予測できる。約10のF2ファミリーの胚を観察した結果、5つのF2ファミリーにおいて発生異常を示す致死個体を見出した。これらのファミリーは、発生異常を示す劣性致死突然変異の系統であると考えられた。また、現在、発生異常を示したF2ファミリーのうち、表現型を示さないヘテロ接合体を自家受精させ、得られたF3においてもF2と同じ表現型がみられることを確認している。
Sox9と膵癌の関連性ならびにmicroRNAを利用した分子標的薬の研究

膵癌は早期発見が困難な上に、極めて予後不良な悪性疾患である。そのため、その早期診断、治療が急務とされる疾患である。また、Sox9は膵の正常分化に関わる重要な遺伝子として、近年注目されている。正常分化に関わる遺伝子が突然変異し癌化する例としてWilms腫瘍(WT1遺伝子)、肺腺癌(LUN遺伝子)などが知られている。今回、膵の正常分化に関わるSox9と膵癌発生との関連性について検討し、今後の臨床に役立てることを目的とした。(結果)(1)当科において2003年4月から2010年12月までに手術を行った膵癌患者55例を対象とし、癌部膵管上皮におけるSOX9染色を行い、陽性率を算出した(200倍視野で無作為に4視野選択し、500個当たりの腫瘍に対しての陽性率を算出)。正常膵管:膵癌上皮=82.7%±5.0%:0.8%±1.6%(p=0.0002)という結果であり、膵癌症例では有意差を持ってSOX9陽性率が低いことが分かった。そこで、多段階発癌を示す膵管内乳頭状粘液腫瘍(IPMN)ではどのような結果となるか同様の方法を用いて検討してみた。(2)1995年4月から2010年12月までに当科で手術を行ったIPMN患者68例を対象とした。膵管内乳頭状粘液腺腫(IPMA):37例、非浸潤性膵管内乳頭状粘液性腺癌(NI-IPMC):15例、微小浸潤性膵管内乳頭状粘液性腺癌(MI-IPMC):7例、浸潤性膵管内乳頭状粘液性腺癌由来浸潤性膵癌(IC-IPMC):9例という内訳であった。(結論)SOX9は膵癌、IPMN評価に対する新規的markerとなる可能性があり、さらに膵発癌に寄与し、膵癌、IPMNの治療標的としての可能性を秘めていると考えられる。しかしながら、今後のさらなる検討が必要である。
テネイシンCを分子標的とした心筋梗塞後リモデリング治療法開発のための基礎的研究

梗塞後の心室リモデリング進展におけるテネイシンCの役割を解明するために、12週令オスBalb/cバックグラウンドテネイシンCノックアウトマウスおよび野生型マウスの冠動脈を結紮し心筋梗塞モデルを作成した。結紮後28日までの生存率には差がみられなかったが、28日後の心機能解析で左室拡張終期径、左室収縮終期径、左室拡張末期圧はノックアウトの方が有意に低く、左室駆出率、fractioning shortningはノックアウトのほうが有意に大きく、テネイシンCがない方が梗塞後の心機能の改善が良好であった。梗塞巣の大きさには差は見られなかったが、境界部付近の残存心筋細胞肥大の程度および残存心筋間質の線維化の程度はノックアウトのほうが有意に低かった。さらに、アンジオテンシンII投与モデルでノックアウトではマクロファージの集籏が有意に少なく、反応型線維化が有意に抑制されていた。これらの結果は、急性心筋梗塞、拡張型心筋症患者で血中テネイシンC濃度が高い症例は心室リモデリングをおこしやすく予後が悪いという我々の最近の結果を支持した。さらに、CAGプロモーターとマウステネイシンC遺伝子の間にloxではさんだstopを挿入したトランスジェニックマウスを作成し、α-myosin heavy chain(αMHC)プロモーターCrePRIマウスあるいα-smooth muscle actin Creと交配したF1lでテネイシンCの心臓での過剰発現を試み,ほぼ設計通りに心筋細胞特異的にテネイシンの過剰発現が誘導できること、さらにWestern Blotで全長の分子ができていることが確認できた。このマウスの心筋傷害後の修復過程では、筋線維芽細胞が野性型より多く動員され、凝固壊死域周囲の間質線維化の程度も野性型より強く、ノックアウトマウスにみられた心筋組織修復の変化を裏付ける結果が得られた。梗塞後の心室リモデリング進展におけるテネイシンCの役割を解明するために、ノックアウトマウスを用いて心筋梗塞モデルを作成し野性型と対比した。12週令オスBalb/cバックグラウンドテネイシンCノックアウトマウス(KO:n=30)および野生型マウス(Wt:n=37)の冠動脈結紮したところ、KO12匹、WT17匹が1日以内に急性心不全で死亡、その後28日までにKO1匹,WT4匹が心不全で死亡したが生存率には差は認められないと考えられた。ノックアウトの1匹は8日後心破裂で死亡した。28日後KO, WTそれぞれ16匹について心機能を解析すると拡張末期径、左室拡張末期圧はノックアウトの方が有意に低く、テネイシンCがない方が心機能の改善が良好であった。梗塞巣の大きさには差は見られなかった。これは、急性心筋梗塞後テネイシンCが高い患者では6ヶ月後に心室リモデリングをおこす頻度が高く、慢性期の心機能回復が不良で予後が悪いという我々の最近の結果と一致した。さらに、CAGプロモーターとマウステネイシンC遺伝子の間にloxではさんだstopを挿入したトランスジェニックマウスを作成し、α-myosin heavy chain(αMHC)プロモーターCrePRIマウスと交配してテネイシンCの心臓での過剰発現を試みた。理論的には、このマウスではタモキシフェン投与によりαMHCを発現させ、Cre recombinationを誘導できるが,実際にはleakがあり、誘発をかけなくても,生後6週ごろから、本来なら正常で発現しない心筋細胞がテネイシンCを産生、周囲間質に分泌することが確認された。Recombinationによる過剰発現は少なくとも31週令まで持続していることが確認できたが、現在のところ、過剰発現させただけでは心臓に明らかな変化を認めていない。

梗塞後の心室リモデリング進展におけるテネイシンCの役割を解明するために、12週令オスBalb/cバックグラウンドテネイシンCノックアウトマウスおよび野生型マウスの冠動脈を結紮し心筋梗塞モデルを作成した。結紮後28日までの生存率には差がみられなかったが、28日後の心機能解析で左室拡張終期径、左室収縮終期径、左室拡張末期圧はノックアウトの方が有意に低く、左室駆出率、fractioning shortningはノックアウトのほうが有意に大きく、テネイシンCがない方が梗塞後の心機能の改善が良好であった。梗塞巣の大きさには差は見られなかったが、境界部付近の残存心筋細胞肥大の程度および残存心筋間質の線維化の程度はノックアウトのほうが有意に低かった。さらに、アンジオテンシンII投与モデルでノックアウトではマクロファージの集蔟が有意に少なく、反応型線維化が有意に抑制されていた。これらの結果は、急性心筋梗塞、拡張型心筋症患者で血中テネイシンC濃度が高い症例は心室リモデリングをおこしやすく予後が悪いという我々の最近の結果を支持した。さらに、CAGプロモーターとマウステネイシンC遺伝子の間にloxではさんだstopを挿入したトランスジェニックマウスを作成し、α-myosin heavy chain(αMHC)プロモーターCrePRIマウスあるいα-smooth muscle actin Creと交配したF1でテネイシンCの心臓での過剰発現を試み,ほぼ設計通りに心筋細胞特異的にテネイシンの過剰発現が誘導できること、さらにWestern Blotで全長の分子ができていることが確認できた。このマウスの心筋傷害後の修復過程では、筋線維芽細胞が野性型より多く動員され、凝固壊死域周囲の間質線維化の程度も野性型より強く、ノックアウトマウスにみられた心筋組織修復の変化を裏付ける結果が得られた。
大規模災害によるストレスと母児健康リスクに関する実証的研究

東日本大震災の被災地では、妊婦への長期にわたる栄養、運動、心因性ストレス等のマイナスの生活習慣と低出生体重児への関連について観察研究を行なう。本年度は、1)出生児の登録・調査。2)ヒト生体試料(尿、胎盤)の収集3)対象児の身体的発達及び神経行動的調査を開始した。これまでに、1)低出生体重児(2500g未満)131名登録した(達成率43.6%)。また対象者として妊娠初期女性1589名の登録(目標3000名)を終了した。該当する妊娠女性の80%以上に声かけ、88.1%の同意率であった。2)尿および胎盤組織の採取も順調に行われた。胎盤のインプリント遺伝子の発現解析ではIGF2が低出生体重児で有意に低い。またGRB10、GAB1、CDKN1Cも、低出生体重児で低い傾向を示した(n=20)。またDNAメチル化の解析ではH19、GRB10は低出生体重児で低値を示す傾向を示した。3)神経行動学的な発達検査:新生児行動評価を生後3日目に実施開始、新版K式発達検査2001を生後6および18ヶ月(修正月齢)に実施している。
情報伝達と遺伝子発現における生体金属の構造学的研究

A)真核細胞における細胞内情報伝達系での蛋白質間の分子認識機構を解明する目的で、低分子量G蛋白質RhoAの標的蛋白質であるRho-kinaseのRho結合ドメイン及びRhoAとGTPγSとの複合体の結晶を得た。実験室ではそれぞれ分解能3.0Å及び2.4Åの回折データを与えており、RhoAの構造決定を終了したその結果、MgイオンがGTPγSが三リン酸のβとγ位のリン酸基に配位して、加水分解の求核攻撃をする水分子に対して三リン酸基を固定していることを見出した。また、H-Rasに比べて4カ所の挿入あるいは欠損部位及びswitch I、II、switch I、II間のシートのコンホメーションが異なることを見出した。B)嫌気的条件センサー蛋白質ArcBにおける蛋白質リン酸化を中心としたリン酸転移反応におけるHis、Asp及び金属イオンの役割大腸菌由来の嫌気的条件センサー蛋白質ArcBのドメイン構成は複雑であり、N末端側から、アンカー部分、受容体ドメイン、HPK(ヒスチジン蛋白質キナーゼドメイン)ドメイン、分子内レシ-バ・ドメイン、そしてもう一つのヒスチジンを含むリン酸転移(HPt)ドメインをもつ。ここではATPからのHPKドメインへの自己リン酸化に続いて、分子内レシ-バ・ドメイン、HPtドメインそして標的レギュレータ蛋白質のレシ-バ・ドメインへの複雑なリン酸転移が起こる。本年度世界に先駆けて構造決定したArcBのHPtドメインの活性部位を詳述し、レシ-バ・ドメインとの関係を考察した。C)ヘムをもつ転写因子CooAの大量精製と結晶化の試み第4班班員である青野重利博士が単離し、精力的に分子生物学的、生化学的、および分光学的解析を推進されている光合成細菌由来のCooAは一酸化炭素センサーとしてのFeイオンを配位したヘムをもつ珍しい転写因子である。この三次元構造を明らかにする目的で大量精製系を確立した。現在、酸化型の活性変異型CooAの結晶化を試みている。
超高線量下における放射性物質の可視化実現

2011年東日本大震災により福島原発の炉心が融解し、原発の機能が失われると同時に多量の放射性物質が飛散した。この原発の廃炉作業は国家レベルの緊急課題でありながら、事故から8年近く経つ現在でもその見通しは立っていない。その主要因として、核燃料デブリがメルトダウンにより格納容器内部にとどまり続け、多量の超高線量放射性物質が位置同定すらままならない状況であることが挙げられる。本研究では500 Sv/h以上とも予想される超高線量環境下でありながら、放射性物質由来のガンマ線を捉えることで、その位置同定を実現する技術を新たに開拓する。
試験管内分子進化法を用いた外部刺激応答性リボスイッチの開発と細胞への応用

H23年度の交付申請書に示した通り、前年度に引き続き、「改変型リボソームを用いたバイオテクノロジーの創成」というテーマで主に研究を行った。本提案研究である「人工リボスイッチの創成」プロジェクトは、H22年度の実績報告書にも示したように、人工リボスイッチ創成に関する論文が先にアメリカのグループによって発表された(ref.Nat.chem.biol.6,464-470(2010))ため、このプロジェクトを断念して、改変型リボソームのプロジェクトに力を注いだ。また、H22年度末から申請者は海外留学を行ったため、研究室の学生と共にこのプロジェクトを推進してきている。このプロジェクトでは、天然のリボソームから構成される翻訳系とお互いに影響し合わないオルソゴナルな翻訳系を改変型リボソームおよびトランスファーRNA(tRNA)を用いることで創成し、20種類の必須アミノ酸以外の特殊アミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質を合成する新たな系の確立を最終目的としている。前年度までの研究で、変異導入されたtRNAとそれに対応するribosomeのペアが翻訳反応を進行させる事を明らかにした。本年度は、これらの変異翻訳系がオルソゴナルに働くことを実際に示し、1チューブ内で、オルソゴナル翻訳系を走らせる事で、1本のmRNAから2本のペプチドを合成する事に成功した。これは、世界で初めて可能になったテクノロジーであり、将来的に細胞内でこのシステムを発現させる事で、生命機能の拡張というsynthetic biologyの分野に多大な貢献をする可能性があると考えている。当初予定していた通り、変異体のtRNAと変異体のリボソームを用いる事で、実際に1本のmRNAから2種類のペプチド配列を合成する事に成功したため。本研究内容を無細胞翻訳系から生きた細胞内で使えるような工夫を施す。そのためには、変異tRNAをアミノアシル化できるような新たな方法が必要である。その候補としては、天然のアミルアシルtRNA合成酵素をdirected evolutionによって進化させ、目的の非天然アミノ酸を細胞内で特異的に変異tRNAにチャージできるようにすることである。生体内に存在するtRNAは全て、共通の3'末端配列CCAを有している。この保存された配列は、リボソーム内でリボソームRNA(rRNA)やリボソームタンパク質と相互作用し、翻訳反応で重要な役割を担っていると考えられている。しかし、その機能は以前未解明な点が多い。これらを調べるのに有用な手法の一つとして、CCA末端の変異体tRNAを用いて研究を進めることが重要である。しかし、天然のARSによるアミノアシル化反応は、CCA末端配列に強く影響されるため、この方法でCCA末端変異体を調製することは難しい。一方、我々の研究室で開発されたアミノアシル化リボザイム、フレキシザイムは、活性カルボン酸を持つアミノ酸を基質として、あらゆるtRNAにアミノ酸を連結することができる。フレキシザイムとtRNAの相互作用は、フレキシザイムのGGU-3'末端とtRNAのCCA-3'末端の間の2つのGCワトソン・クリック塩基対からなっている。つまり、この2つの塩基対に相補的な変異を導入することで、CCA-3'末端変異体アミノアシルtRNAを調製できる可能性があるのである。まず、GGU-3'末端のGGをランダマイズした変異体フレキシザイム16種類と、CCA-3'末端のCCをランダマイズした変異体tRNA16種類を調製した。その後、調製したそれぞれのフレキシザイムとcomplementaryな3'末端配列を持つtRNAを混ぜ合わせて、アミノアシル化反応を行った。すると、ほぼ全ての変異体tRNAに対して高効率で、アミルアシル化されていることが確認された。つまり、フレキシザイムの変異体を用いることで、あらゆる3'末端配列を持つaminoacyl tRNAを調製することが可能になった。H22年度の交付申請書に示した通り、今年度は「人工リボスイッチの創成」と「改変型リボソームを用いたバイオテクノロジーの創成」という2つのテーマで研究を引き続き行った。しかし、我々の目指していた人工リボスイッチ創成に関する論文が先にアメリカのグループによって発表された(ref.Nat.chem.biol.6,464-470(2010))ため、このプロジェクトを断念して、改変型リボソームのプロジェクトに力を注いだ。このプロジェクトでは、天然のリボソームから構成される翻訳系とお互いに影響し合わない(つまり直交系)の翻訳系を改変型リボソームおよびトランスファーRNA(tRNA)を用いいることで創成し、20種類の必須アミノ酸以外の特殊アミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質を合成する新たな系の確立を最終目的とする。前年度までの研究で、アミノアシルリボザイムを用いることで、特殊アミノ酸を改変型リボソームに運ぶための改変型アミノアシル化tRNA(aa-tRNA)の作製に成功していた。そこで今年度は、1)この改変型aa-tRNAの天然型リボソームに対する挙動を調べ、2)これを受け入れるための改変型リボソームの創成に着手した。その結果、改変型aa-tRNAの3'末端配列、75Cの変異は極めてリボソームに対して不利になることが示された。また、C75の変異を補うような改変型リボソームを作製し、翻訳反応を行うと翻訳能が回復することが確認された。これは、リボソームとtRNAの分子間相互作用を翻訳反応レベルで解明した初めての結果であり、よりribosomeとtRNAから構成される翻訳という生命にとって普遍的な反応の理解を深めるのに貢献すると考えられる。

H23年度の交付申請書に示した通り、前年度に引き続き、「改変型リボソームを用いたバイオテクノロジーの創成」というテーマで主に研究を行った。本提案研究である「人工リボスイッチの創成」プロジェクトは、H22年度の実績報告書にも示したように、人工リボスイッチ創成に関する論文が先にアメリカのグループによって発表された(ref.Nat.chem.biol.6,464-470(2010))ため、このプロジェクトを断念して、改変型リボソームのプロジェクトに力を注いだ。また、H22年度末から申請者は海外留学を行ったため、研究室の学生と共にこのプロジェクトを推進してきている。このプロジェクトでは、天然のリボソームから構成される翻訳系とお互いに影響し合わないオルソゴナルな翻訳系を改変型リボソームおよびトランスファーRNA(tRNA)を用いることで創成し、20種類の必須アミノ酸以外の特殊アミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質を合成する新たな系の確立を最終目的としている。前年度までの研究で、変異導入されたtRNAとそれに対応するribosomeのペアが翻訳反応を進行させる事を明らかにした。本年度は、これらの変異翻訳系がオルソゴナルに働くことを実際に示し、1チューブ内で、オルソゴナル翻訳系を走らせる事で、1本のmRNAから2本のペプチドを合成する事に成功した。これは、世界で初めて可能になったテクノロジーであり、将来的に細胞内でこのシステムを発現させる事で、生命機能の拡張というsynthetic biologyの分野に多大な貢献をする可能性があると考えている。当初予定していた通り、変異体のtRNAと変異体のリボソームを用いる事で、実際に1本のmRNAから2種類のペプチド配列を合成する事に成功したため。本研究内容を無細胞翻訳系から生きた細胞内で使えるような工夫を施す。そのためには、変異tRNAをアミノアシル化できるような新たな方法が必要である。その候補としては、天然のアミルアシルtRNA合成酵素をdirected evolutionによって進化させ、目的の非天然アミノ酸を細胞内で特異的に変異tRNAにチャージできるようにすることである。
地球温暖化に対する北方森林生態系の反応:電熱線を使った野外操作実験による検証

苫小牧研究林のクレーンサイトにおいて地上15-20mにある枝(地上部)の温暖化処理を2008年5月から本格的に開始した。その結果、温暖化処理は、地区部処理区、地下部+地上部処理区、対象区の3つのタイプが揃った。それぞれの温暖化処理区において、このまま温暖化が続いた場合の100年後の気温を想定して5度の温度上昇を維持するための装置も設置してある。この電熱ケーブルを枝に張り巡らす地上部の温暖化処理は世界でも例を見ない手法である。以上の実験環境の整備により、北海道の代表的なミズナラ自然林を舞台に、人工的な温暖化現象を作り出し、樹木にどのような変化が現れるのかを長期的に調べることが可能な状態になった。本年度の温暖化処理区での調査は、昨年に引き続き林冠部の葉形質と食害度の調査を行った。さらに、葉の光合成と呼吸量の測定も行った。温暖化の処理効果を近接リモートセンシングで把握できるようにクレーンの上部に分光カメラと熱カメラを設置して林冠部の撮影によるモニタリングを開始した。一方、林床植物の群集構造そして繁殖戦略についての調査を開始した。土壌の温暖化を直接大きな影響を受けているのは林床植物群集であると考えている。今年度の主な結果は、ドングリ生産量が枝の地上部(枝)の温暖化処理によって2-5倍に増加したことである。また、秋の落葉も10日ほど遅くなり、地上部の温暖化は樹木の様々な生態的な特徴に影響を与えていることがわかってきた。また、樹木の生理機能に関しては、土壌の温暖化処理によって春先の葉の呼吸量が増加することがわかった。しかし、地上部の温暖化処理はこれら機能への影響は見られなかった。北海道大学苫小牧研究林の冷温帯の代表的な森林であるミズナラ自然林において、電熱ケーブルを用いて地下部を温暖化する操作実験を行った。この実験では15m以上の林冠構成樹木を扱っている。本研究の目的は「地下部温暖化が遠くは離れた林冠部での植物-昆虫の相互作用に与える影響を解明する」ことである。温暖化の操作実験は林冠部が観察できる林冠クレーン及びジャングルジムのあるサイトにおいて行った。前年度(2006年の7月)の調査で、処理する予定の5個体と対象とする予定の5個体の間で食害度に有意な違いは見られなかった(P=0.24)。そこで、2007年5月において5m x 5mの処理区をつくり、地下に電熱ケーブルを10cmの深さ、20cm間隔で埋めることでミズナラ樹木個体の地下部の温暖化処理を行った。温度調節機を使って100年後を想定して5°Cの温度差を維持した。調査は、2007年6月と8月に林冠部上部と下部の食害度を目視で測定した。さらに、葉を採集して植物形質(LMA,窒素,C/N比)の分析も行った。地下部の温暖化は葉の窒素とC/N比に影響を与えた。モデル選択から6月も8月も葉形質は同じ結果が得られた。LMAは位置が選択され、窒素は処理が選択され、C/N比は処理、位置と処理*位置が選択された。この結果は、LMAは林冠上部に行くにつれ増加するが処理の影響は受けないこと、窒素は処理により低下するがC/N比は増加することを示している。さらに、地下部の温暖化は林冠部の食害度にも影響を与えた。6月の食害度はモデル選択から処理と位置が選択され、8月の食害度は処理のみが選択された。この結果は、どちらの月も処理により食害度が低下することを示している。この食害度の低下は葉形質の窒素とC/N比から説明できた。

また、秋の落葉も10日ほど遅くなり、地上部の温暖化は樹木の様々な生態的な特徴に影響を与えていることがわかってきた。また、樹木の生理機能に関しては、土壌の温暖化処理によって春先の葉の呼吸量が増加することがわかった。しかし、地上部の温暖化処理はこれら機能への影響は見られなかった。
カイメンの光受容蛋白質の機能解析による動物の光受容蛋白質の起源の探求

これまで光受容タンパク質(オプシン)の研究は、脊椎動物、節足動物、軟体動物など三胚葉動物に限られており、原始的な動物の光受容系の分子基盤は全く不明であった。本研究では、動物の光受容タンパク質および光受容系の起源や多様性を理解する目的で、三胚葉動物出現以前の原始的動物(海綿動物、刺胞動物)の光受容タンパク質の同定、解析を行った。・クロイソカイメンの幼生を用いたwhole mountでのin situ hybridizationおよび免疫組織化学的実験系の構築に成功した。・二胚葉動物の中で最も発達した眼を持つアンドンクラゲ(刺胞動物/箱虫綱)から、オプシン遺伝子の完全長cDNAの単離に成功した。・アンドンクラゲオプシンに対する抗体を作製し、免疫組織化学的解析を行った結果、レンズ眼の網膜に局在することが明らかとなった。このことは、私たちが単離したオプシンが、視物質としてアンドンクラゲの視覚の中心的な役割を担っていることを示唆している(論文投稿中)。・アンドンクラゲオプシンの動物培養細胞での大量発現を試みた結果、光受容タンパク質として再構成させることに成功した(論文投稿中)。この結果は、アンドンクラゲオプシンが確かに光レセプターとして機能していることを示す初めての直接証拠である。また、無脊椎動物の視物質の培養細胞系での発現としては2例目であり、特に二胚葉動物の視物質としては初めての成果である。この系を用いた変異体解析を行うことによって、下等無脊椎動物の光受容タンパク質のアミノ酸残基レベルからの機能解析が可能となった。これまで光受容蛋白質(オプシン)の研究は、脊椎動物、節足動物、軟体動物など高度に発達した光受容器官(眼)を持つ三胚葉動物に限られており、原始的な動物光受容の分子基盤は全く不明であった。本研究では、動物の光受容蛋白質および光受容システムの起源を調べる目的で、三胚葉動物出現以前の原始的動物(海綿動物、腔腸動物)の光受容蛋白質の同定、解析を行った。1.最も原始的な動物である海綿動物は幼生期に走光性を持つことが知られている。本年度は、一昨年から行ってきた予備調査の成果として、これまで採取困難であった走光性を持つクロイソカイメンの幼生の大量調達に成功し、質・量とも分子生物学実験に堪えるRNAの調整に成功した。PCR法による遺伝子クローニングを試みた結果、動物の視物質として一般的なオプシンは得られなかったが、別の光受容蛋白質であるクリプトクローム遺伝子の単離に成功した。また、クリプトクロームの生体内局在を調べる目的で、カイメンクリプトクローム特異的抗体の作製を開始した。2.二胚葉動物の中で最も発達した眼を持つアンドンクラゲ(腔腸動物・箱虫綱)の感覚器複合器官からオプシン遺伝子のクローニングに成功した。分子系統解析の結果、アンドンクラゲのオプシンは既知のどのタイプのオプシンにも属さなかった。アンドンクラゲオプシンの機能解析を行う目的で、アンドンクラゲオプシンの培養細胞での発現ベクターの構築、免疫組織化学的解析のための抗体の作製を行った。また、二胚葉動物の光情報伝達系を明らかにするために、感覚器複合器官からオプシンのエフェクター分子であるG蛋白質αサブユニット(Gα)のクローニングを行い、現在までにG12/13、Gq、GiタイプのGαの単離に成功した。