hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質沈着による心肥大、心不全進展の病態の解明

遺伝子異常によって特異的な心肥大を呈するjuvenile visceral steatosis(JVS)マウスではカルニチン欠乏のための脂肪酸代謝の異常がイノシトール脂質や1,2-ジアシルグリセロールを始めとする脂質系細胞情報伝達物質を変化させシグナル伝達機構の障害をもたらしている可能性を示した。また、ヘテロ体ではほとんど機能障害がなく生命予後もWild-typeマウスと同じと考えられていたが、JVSマウスのヘテロ体に圧を負荷することにより心肥大を示し、心不全によって寿命が短くなった。このように、脂質代謝の異常が心不全に関与することが示された。高カロリー食と運動不足による肥満の結果、血中トリグリセリド血症と高インスリン血症・インスリン抵抗性をきたし、それが誘引になる心肥大・心不全の進展は最近注目されているが、その分子的解明は十分にされていなので、脂肪酸蓄積により脂質沈着が心肥大と心機能不全をjuvenile visceral steatosis(OCTN2(-/-)or jvs(-/-))マウスで観察した。また、ヒトのeNOSの代表的な遺伝子多型であるGlu298AspとT-786Cは、その分布はそれぞれk完全に独立している。また血管内皮機能への関与も独立してほぼ同程度の影響がみられ、298Aspと-786Cの遺伝子を持つと焼く30パーセントの血流依存性内皮拡張反応が減弱する。また、両方の遺伝子多型は相乗的に作用し、両遺伝子を持つと約50パーセントの血流依存性内皮拡張反応が減弱する。前者はLDL粒子の粒子サイズ、酸化LDL、インスリン値、HDLに関与しているが、後者は血圧とアディポネクチン濃度に関係するため、動脈硬化に寄与するPathwayは相違していることが示唆された。特に、後者はメタボリック症候群と深い関係を持つことが示唆された。その他にもトリグリセリド代謝に関与するMicrosomal triglyceridetransfer proteinの遺伝子多型は動脈硬化に関与するLDLの量的、質的影響があることがわかった。また、心肥大、心機能不全時の心筋リモデリングにおけるシステイン・プロテアーゼであるカテプシンの役割とアンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)の作用メカニズムをカテプシンの心筋リモデリングにおける役割を高血圧により心不全をきたすDahl食塩感受性ラットにて検討した。食塩を負荷したDahl食塩感受性ラットの左室心筋ではカテプシンなどのプロテアーゼの遺伝子発現と活性が亢進していて、カテプシン阻害薬E64dやARBの投与でエラスチンとコラーゲンのバランスを維持し弾性板の分解を抑制していた。ARBはNADPHoxidaseのsubunitsの増加と活性を減弱させ、活性酸素の生成を減少させてE64dと同様な効果があった。培養心筋細胞の検討でもARBはNADPHoxidase拮抗薬のapocyninと同様にアンジオテンシンIIが誘導するカテプシンの遺伝子発現や活性を抑制した。これらのことより、カテプシンの活性は心筋リモデリングを促進し、ARBはNADPHoxidaseによる活性酸素の生成を抑制することによって心筋肥大のリモデリングと機能異常を阻止することが示された。また、このモデルにカルシウム拮抗薬のNifedipineの長期投与は高圧とは独立した作用で心筋の線維化を抑制し、心拡張能を改善し田が、この薬剤の抗酸化作用がこれらの改善に関与していることが示された。(1)低比重リポタンパク(LDL)の生化学的、物理的相違と動脈硬化小粒子LDLが動脈硬化に寄与していることを治療している糖尿病の患者でも証明したが、今まではゲル電気泳動によるピークのサイズのみを検討していたので、リポ蛋白の分析をHPLCによって粒子のサイズに従い20分画に分析する方法を用いて検討した。動脈硬化促進的に働くといわれる血中の酸化LDL (MDA-LDL)と一番相関するのはsmall LDLよりもっと小型のvery small LDLであり、また、very small LDLは糖代謝異常の症例の動脈硬化を表す脈波速度の進展にも寄与していることが示された。(2)マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)が下肢虚血の血管新生に血管内皮細胞および内皮前駆細胞を介して重要な役割をしている。MMPが血管新生に関与していることを、マウスの下肢虚血モデルでMMP-2ノックアウトマウス(KO)を使って検討した。下肢虚血モデルの血行改善はMMP-2-KOマウスでは悪く、毛細血管や側副血行の発達が悪かった。大動脈リング培養によっても血管増殖が悪くMMP-2を添加することにより一部改善した。MMP-2-KOマウスの大動脈由来の内皮細胞や骨髄由来の血管内皮前駆細胞(c-kit+細胞)は細胞増殖能が低下していた。また、下肢虚血後に血中や組織の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は減少し、c-kit+細胞も少なかった。

このマウスに野生種の骨髄を移植すると虚血は改善した。これらの結果から、MMP-2は血管内皮増殖や血管内皮前駆細胞の活動を維持するに欠くことのできない因子であることが示された。
Gene Targeting法によるT細胞シグナル伝達機構の解析

本研究は,ホモロガスリコンビネ-ションに基づくgene targeting法in vitroでT細胞ハイブリド-マに応用し,抗原認識におけるT細胞シグナル伝達系に関与する抗原レセプタ-複合体や,それに解合するテロシンキナ-ゼなどの分子の機構を解明することを目標とした。標的としたのはCD3ζ.7鎖およびチロシンキナ-ゼfynである。CD37鎖はこれまでゲノム遺伝子構造が未知であったが,本研究でCD3ζ.7は最後のエキソンのみを異にするalternative splicingによって形成されることを発見した。そこで各々の特異的エキソンにneo^γ遺伝子を入れ,3端にTK遺伝子を入れたポジティブ・ネガティブ選択のできるベクタ-を作製した。これらをT細胞ハイブリド-マに導入して,片側アリルに変異を導入したクロ-ンを樹立した。ζ鎖targeting細胞は,通常のmRNA,ζ蛋白,細胞表面T細胞レセプタ-/CD3複合体がほとんどなくなり,抗原刺激にも反応しない機能的に不活性になった。この結果から,ζ鎖が抗原によるT細胞活性化に不可欠であることが,突然変異株でなく,特異的変異株を用いて証明できた。更に,片側アリルのみの不活性変異にもかかわらず,ζ蛋白がほとんど産生されないことから,片側が“Active allele"であると考えられた。両アリルへの変異導入のために,neo^γとhygro^γの両ベクタ-を準備したが,片側の変異で不活化が誘導できた事は,in vitro targetingの有用性を示している。TCR複合体に解合するfynについては,neo^γ/ジフテリア毒素遺伝子を用いる選択方法により試みたが成功に至っていない。更にin vitro targetingの成功を基礎に,CD3ζ,CD37ベクタ-を導入したES細胞の樹立,ES由来の形質を有するキメラマウスの作製に成功し,現在,これらの文配でgernilineに変異を持つマウスを作製している。(1)CD3ζ,ηゲノム遺伝子の単離とTargeting constructの作製:CD3η鎖遺伝子の解析に成功した。ζとηは最後のエキソンのみが異なり4kb下流にあり他は同一であり、異るスプライシングで産生される。この調節がT細胞機能に重要である。ζおよびη鎖特異的なエキソンを含むゲノム遺伝子を分離し、各エキソンにneo耐性遺伝子を、また遺伝子の端にHSVーtk遺伝子を接続させたポジティブ・ネガティブ選択のできるTargeting Constrcutを作製した。<in>___ー<vitro>___ーで両染色体に働かすためにneo^rと共にhygromycin^r遺伝子を押入したものも同時に作製した。(2)T細胞への<in>___ー<vntro>___ーTargetingの試み:fynのゲノム遺伝子のエキソンにneo^r遺伝子を導入し、ポジティブ選択用にジフテリア毒素を接続したベクダ-を用いてT細胞にエレクトロポレ-ション法により遺伝子導入した。ES細胞では、G418耐性細胞が10^-の頻度で出現したこの方法でも、T細胞では10^<-7>の頻度であり、約十のクロ-ンが得られたが、相同組換えを起こしているものはなかった。既ち、<in>___ー<vitro>___ーでT細胞では、ES細胞に比べて相同組換えが起り難い事が判明し、細胞や条件を変えて頻度を上げると共に、HSVーtkに戻ったベクタ-を用いてネガティブとポジティブ選択の程度を独立に調べる必要がある。

(3)遺伝学的手法による変異株の作製:EMSで突然変異を誘導した後に変異株を取る方法により、CD37鎖を発現しない変異株、および抗原刺激に伴う細胞内Ca^<2+>上昇のない変異株の樹立に成功した。従来の方法でこれらの変異株は得られたが、fyn発現のない変異株は数多くスクリ-ニングしても得られず、細胞表面発現のない分子の変異株の単離には、Targetingのアプロ-チしかないことを示した。平成2年度にゲノム遺伝子の単離に成功したCD3ζ鎖およびCD37鎖遺伝子の特異的エキソンにneo^rまたはhygromycine^r遺伝子を導入し、3'末端にはHSVーtk遺伝子を付加したtargetingベクタ-を作製した。両ベクタ-をT細胞ハイブリド-マに遺伝子導入し,G418^rクロ-ンをPCRでスクリ-ニングし,更にサザンブロットにより,ζまたはη鎖に不活性化変異の導入された細胞株を各々樹立した。CD3ζ鎖targetedクロ-ンは,通常のmRNAもζ蛋白もほとんど産生しない。これに伴って細胞表面のT細胞レセプタ-発現は正常の1/10以下であり、抗原刺激に対して何の反応も示さなくなった。これらから,CD3ζ鎖はTCR複合体のassemblyおよび細胞膜への移送に重要であると共に抗原認識に不可欠であることが,今までの突然変異株でない,遺伝子特異的変異クロ-ンによって明らかになった。ζ鎖targeted株は染色体分析よりζ鎖のある第一染色体は2本のみであり,しかも片側アリルのみに不活性変異が導入されているにもかかわらず、ζ鎖蛋白ができない事から両染色体が等価ではなくactive alleleが存在し,ホモロガスリコンビネ-ションはこのalleleに起り易いと思われた。この事実は,培養細胞株を用いたシグナル伝達に関与する細胞内分子の機能解析に,in vitro targeting法が非常に有効であることを示した。in vitroの結果に基づき,CD3ζη欠損マウスを作製するため同じベクタ-をES細胞に導入することにより,CD3ζ,η共に,片側のアリルに変異を有するESクロ-ンの樹立に成功した。このESクロ-ンをブラストシストに導入しマウスに戻して,ES由来の形須を有するキメラマウスをCD3ζ,η両者について得た。現在,これらのキメラマウスをかけ合わせgermlinetransmissionを調べている過程である。これらの欠損マウスにより,T細胞機能;分化におけるCD3ζ,ηの役割を明らかにできると期待される。
CANDLES実験における中性子線源を用いた検出器較正およびバックグラウンド調査

本研究の目的は二重ベータ崩壊探索実験であるCANDLES実験において、中性子線源を用いてバックグラウンドの調査を行うことである。実際に線源用いてCANDLES実験で長い間不明であったQ値領域の主要BGを明らかにし、その結果をもとに遮蔽体のデザインと構築を行った。検出器に対して中性子線源を照射することにより、中性子がSUSや岩盤内のFe, Ni等に吸われて発生する高エネルギーガンマ線が主なBGであることを突き止め、そのエネルギースペクトルを得ることに成功した。シミュレーションと比較することにより、SUSと岩盤のBG比を3:7と見積もり、CANDLES実験用シールドのデザインに貢献した。研究代表者を中心に鉛によるガンマ線遮蔽体、ホウ素入りゴムシートによる中性子遮蔽体の構築が行われ、年度内に完成した。それによりBGレベルは2桁低減が見込まれ、大型実験ではかつてない超低BG環境が実現する。また中性子捕獲ガンマ線を人工的に作り出すために、Siを含んだポリエチレンブロックを制作し、その中心に中性子線源を配置する較正装置を開発した。これにより、これまで1.8MeVの一点のみで較正していたエネルギースケールを、Q値(4.27MeV)に近い3.5/5.0MeVの2点で較正できるようになり、Q値でのエネルギー不定性を半分以下に抑えることに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、カルシウム48同位体を用いた2重ベータ崩壊探索を目的としたCANDLES実験において、現在問題となっている高エネルギー領域のバックグラウンドの正体を明らかにする。カルシウム48はQ値が4.3MeVと全2重ベータ崩壊核の中で最も高く、バックグラウンドに強い核種であると言える。CANDLESでは300kgのCaF2シンチレータを用いて低バックグラウンド環境下での2重ベータ崩壊探索を目指している。これまでのデータ解析から5MeV以上の領域までバックグラウンドが存在していることがわかっており、これはウランやトリウム系列の自然放射性不純物では説明がつかず、長い間謎となっていた。一つの候補として実験装置の周囲にある岩盤やステンレスが中性子を捕獲した際にでるガンマ線が、このバックグラウンドを作っている可能性が考えられ、本研究においては実際に検出器に中性子線源を照射してその詳細を調べることが一つ目の目的である。またSi-28の原子核は中性子を吸って3.5MeVと5.0MeVのガンマ線を出すが、これはカルシウム48の2重ベータ崩壊のQ値(4.3MeV)に近い。Siを含んだポリエチレンブロックに中性子線源を設置することで、このガンマ線を作り出し、CANDLESにおけるエネルギー較正の不定性を減らすことが本研究の2つ目の目的となる。1年目の今年は、まずCANDLES実験において実際に中性子線源としてCf-252を用いたデータ取得を行った。中性子線源データのスペクトルは、これまでに得られていたバックグラウンドスペクトルを完全に再現し、5MeV以上の領域のバックグラウンドが初めて明らかになった。またそのスペクトルはシミュレーションでも良く再現され、詳細な解析の結果、実験室岩盤からのγ線と、ステンレスタンクからのγ線の比が、7:3で岩盤が支配的であることを明らかにした。これにより外部からのγ線シールドが必要であることを示し、実験グループは来年の鉛シールド導入に向けて動き始めている。導入されればBGが一桁以上削減できる。またSi-28の原子核を含むポリエチレンブロックを約30kg作成し、中心に中性子線源を配置しデータ取得を行った。それにより、Si-28が中性子を吸い込んだ際に出す3.5 / 5.0 MeVのγ線をCANDLES検出器で検出することに成功した。詳細な解析は現在遂行中であるが、これまで1.84MeVのγ線のみでエネルギー較正していた較正点を3つに増やすことによってエネルギースケールの不定性を抑えることが可能となった。バックグラウンドに関しては、その起源が完全に明らかとなったため、今年度はバックグラウンドをどう防ぐかに焦点を当てる。メインのバックグラウンドが周囲の岩盤からのガンマ線であるため、タンク周囲に鉛シールドを配置することでこれを防ぐ。

またステンレスタンクが中性子を吸って出すガンマ線も防ぐために、ホウ素入りの中性子シールドをステンレスタンク内外に配置する。この二つの改造によって、中性子捕獲ガンマ線のバックグラウンド量はこれまでの80分の1になる試算である。すでに本研究の結果を基にしたシミュレーションスタディによって、シールドデザインは完成しており、今年度はシールドの構築を終わらせる予定である。またSi-28を含むポリエチレンブロックを用いてデータ取得を行ったが、統計数が少ないことによる不定性が大きいことが判明した。この対策として、ブロックの周囲をグラファイトの中性子反射材で囲うことで、中性子が外に逃げるのを防ぐ予定である。これによって数倍の統計数が期待され、目標としていた0.5%以内でのエネルギー較正を達成する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
gelatinase Aの遺伝子導入による糸球体硬化抑制

方法MMP-2発現および活性の検討。MMP-2発現を検討するため2472時間後に特異的抗体を用いた蛍光抗体法によりその発現をコントロールと比較した。またその活性を調べるためにゼラチンを含むポリアクリルアミドゲルを用いたザイモグラフィーを行った。MMP-2遺伝子導入の培養上清中IV型コラーゲン量に及ぼす影響の検討。遺伝子導入を行った細胞にTransforming Growth Factor-1(TGF-β1)を培養上清に加え72時間刺激培養を行った後の培養上清中のIV型コラーゲン量をコントロールと比較した。結果遺伝子導入操作後メサンギウム細胞はコントロールの細胞と比較してMMP-2発現の増加が蛍光抗体法により示された。2472時間後のザイモグラフィーによる検討では有意なゼラチン分解活性の増加は認めなかった。遺伝子導入操作後メサンギウム細胞をTGF-β1による刺激培養後に培養上清中のIV型コラーゲンの量をコントロール群と比較したが72時間後まで優位な変化は認めなかった。方法人腎臓由来の培養メサンギウム細胞を用いた。TGF-β1またはトロンビンを培養上清に加え3時間72時間刺激培養を行った。培養上清中から以下のものを特異的抗体を用いた酵素免疫法またはゼラチンを含むポリアクリルアミドゲルを用いたザイモグラフィーによって測定した。1-糸球体細胞外基質の重要な構成成分であるIV型コラーゲン。結果TGF-β1,トロンビンはIV型コラーゲンの産生を濃度及び時間依存性に増加させた。メサンギウム細胞培養上清がMMP-2活性を示すことはザイモグラフィーによって確認されたがトロンビンはこれに影響を及ぼさなかった。セリンプロテアーゼの阻害剤であるジイロプロピルフルオロフォスフェートで処理したトロンビンはこれらの作用を示さなかった。TCF-β1,トロンビンはIV型コラーゲンの遺伝子発現を増加させたが、MT1-MMPの発現は減少させることがRT-PCRにより示された。
VIP自己抗体のスクリーニングとその性質

ヒトVIP自己抗体が、VIPを配列特異的に分解することが知られている。ペプチド結合を配列特異的に切断する抗体が得られれば、医薬の開発や蛋白質化学の研究にも有用である。そこで、抗VIP抗体のスクリーニングをした。男女、年令を問わずに、再採血が可能なヒトの血漿を得た。血漿100μ1を[^<125>I]VIPと1夜、5°Cで保った後、ポリエチレングリコールを加えて沈殿を集め、放射活性を測定した。非放射性VIPの添加、無添加での放射活性の差の添加[^<125>I]VIPの放射活性に対する割合(SB値)が5%以上の場合、抗VIP抗体陽性であるとした。これまで、107名のヒトについて調べたところ、抗VIP抗体陽性なヒトは30人であった。この内、これまで23人の血漿からIgGを調製し、VIP分解活性を調べた。2人の血漿からのIgGは、37°C、19時間後、10-20%のVIPを分解した。このうち、1人の血漿のIgGについて、VIPの切断位置をシーケンサーを用いて調べた。その結果、Ala(18)-Val(19)の間のペプチド結合を切断していることが推定された。Paul等の報告によれば、抗VIP抗体陽性のヒト(SB値が5%以上)は調べたうちの16-18%であった。そのうちの25%のヒトのIgGがVIP分解能を持っていた。また、SB値は40%ものヒトを報告している。我々の場合、抗VIP陽性のヒトの割合はPaul等より大きかったが、SB値は低く、大きくても20%であった。さらに、VIP分解活性のあるIgGを持つヒトは少なく(6%)、その比活性も低かった。今後は抗VIP抗体陽性のヒト(残り7名)より、IgGを調製し、VIP分解の有無を検討したい。
知的障害のある人の犯罪被害認識と証言能力及びインタビュー技法の検討

知的障害のある人が虐待や放火事件などの事件・犯罪に巻き込まれ被害者および加害者として裁判に関わる事例が我が国においても多く報告されている。近年、知的障害者においても正当な裁判を受ける権利が議論され始めたが、一方実際の法廷では学術的検討や心理学的裏付けがないままに知的障害者の証言や自白・供述内容が放置あるいは不当に処されているのが現実である。本研究のテーマは知的障害のある人の目撃および証言能力および質問に対する回答特徴を明らかにすることであり3年間の研究期間を設定した。一年目の今年度は第一の課題として知的障害者の証言能力測定に関する妥当な研究方法について検討を行った。検討方法は事例分析および直接インタビューによる回答内容の分析とした。事例分析としてはK事件の被害者の支援や裁判過程を通して得られた、被害者本人の過去に対する記憶や質問に対する回答特徴、および支援過程の進行に伴う心理的変化と言及内容の相違についてエピソード記録の分析を中心に行った。結果、・知的障害のある人の知的能力あるいはコミュニケーション能力の測定については療育手帳判定および知能検査による評価に加えて長い実生活体験による言及能力を加味する方法が必要であった。・実際の被害経験者においては質問形式(オープンあるいはクローズドクエスチョン)による回答の相違に加えて被害者の被害経験および今後の裁判進行などの状況理解が回答内容に影響を持つことが示唆された。直接インタビューによる検討では知的障害のある人に対するビデオ視聴および過去体験の言及における質問方法と回答特徴を分析した。質問形式は説明要求型質問4つおよび誘導的質問によった。今後は回答傾向を分析しながら適切なインタビュー技法検討の視点を抽出することが課題である。
原子間力顕微鏡による二次う蝕発生機序の解析

本研究の目的は各種修復物に隣接したエナメル質の二次う蝕発生機序過程を解明することである。修復物としてアマルガム(AM),コンポジットレジン(CR)およびグラスアイオノマーセメント(GI)に隣接するエナメル質(0.6mm×3.6mm)に0.2M酢酸緩衝液(pH4.0)で脱灰し経時的に表面微細構造を原子間力顕微鏡(AFM)で観察した。さらに,脱灰液中のエナメル質から溶出したカルシウム量を測定するとともに脱灰エナメル質の表面化学組成について定量分析した。次に,各種修復物に隣接した研磨エナメル質および5分脱灰後のエナメル質にう蝕原因菌の一つであるStreptococcus mutans MT 3940を付着させ,その分布と形状をAFMで観察し,以下の結果を得た。1) AFM観察で2分脱灰後のCRに隣接したエナメル質に陥凹を認めたが,AMに隣接したエナメル質に変化はなかった。脱灰5分後以降,AM,CRともに隣接するエナメル質の形態的な変化を認めた。しかしながら,GIに隣接したエナメル質表面は20分脱灰後も変化はなかった。2) AMやCRに隣接したエナメル質から溶解されたカルシウム量はGIより多かった。3) AMやCRに接した脱灰エナメル質のCaO量とP_2O_5量はエナメル質中央部に比べ減少し,特にP_2O_5量の減少が著明であった。AMやCRに接した脱灰エナメル質のCa/P原子比はエナメル質中央部より増加したが,GIではどの分析領域もほとんど変化はなかった。4) GIに隣接したエナメル質における細菌付着はAMやCRに比べ少なかった。また,研磨面と脱灰面での細菌付着量の違いはなかった。以上より,GIはAMやCRに比べその隣接するエナメル質表面の初期脱灰や細菌付着は少なく,二次う蝕の発生を抑制することが分かった。また,これらの観察にAFMが有用であった。平成9年度の研究は各種修復物-歯質境界部の初期脱灰現象を経時的に定量測定することである。まず,実験方法の確立を図るため,次のような術式で行った。ヒト抜去前歯唇面エナメル質を1mm×4mm×3mmのブロックとして切り出した。1mm×4mmのエナメル質面を露出させ,樹脂包埋した直径12mm,厚さ2mmの試料体を作製し,エナメル質に隣接した窩洞を形成し,アマルガム充填した。脱灰進行状態の観察には原子間力顕微鏡を用い,コンタクトモードで容器セル内に鏡面研磨した試料体を装着し水中で観察を行った。脱灰液は0.2M酢酸緩衝液(ph=4)を用いた。エナメル質表面に脱灰液0.5mlが触れるようにし,累積浸漬時間は10分,30分,60分,90分,120分,180分,240分及び360分とした。これら脱灰液中に含まれるカルシウム濃度を原子吸光光度計を用いて測定し,各ステージにおける単位面積当たりの溶解量を求めた。各ステージにおけるカルシウム溶解量は最終累計浸漬時間の360分後で653μg/mm^2であった。さらに原子間力顕微鏡を用いて,アマルガムと歯質境界部の立体画像と表層断面形状を読み取ることができた。脱灰進行状態の観察では,累積浸漬時間90分後よりエナメル質表層の脱灰による凹凸を検知することができた。

累積浸漬時間240分及び360分後ではアパタイト結晶の凹凸も明確となり,特に境界部エナメル質のアパタイト結晶は境界部より離れた部位のアパタイト結晶に比べ,やや崩壊した像を呈していた。さらに今後,例数を増やすと共に接着性修復材を用いた場合のカルシウム溶出量の違いや修復物境界部のアパタイト結晶の構造変化を観察する。また,平成10年度ではう蝕原因細菌の修復物-エナメル質境界部への付着や境界部エナメル質の形態的変化を観察する予定である。平成9年度の研究で原子間力顕微鏡(AFM)を用いてアマルガム(AM)-エナメル質境界部の初期脱灰現象を観察した。平成10年度ではコンポジットレジン(CR)とグラスアイオノマーセメント(GI)を加え,形態観察とともにカルシウムの溶解量と脱灰エナメル質のカルシウム(Ca)と燐(P)の定量分析を行った。まず,ヒト抜去前歯唇面エナメル質面0.6mm×3.7mm,高さ4mmのブロックとして切り出し,エナメル質面を露出させ樹脂包埋した直径12mm,厚さ3.5mmの試料体を作製し,エナメル質に隣接した窩洞にAM,CR及びGIを業者指示に従って充填した。その後,エナメル質を鏡面研磨し,0.2M酢酸緩衝液(pH=4)0.25mlを累積時間で0,2,5,10,15,20分間脱灰させた。それぞれの脱灰時間毎に修復物-エナメル質境界部の表面性状を原子間カ顕微鏡を用い水中,コンタクトモードで観察した。脱灰2分後にCR境界部のエナメル質は脱灰された像が観察されたが,AM境界部では認められなかった。GI境界部では20分脱灰させてもエナメル質の変化は認められなかった。20分脱灰後の累積カルシウム溶出量はAM試料体が113.3μg/cm^2,CR試料体が127.5μg/cm^2であったのに対し,GI試料体は69.9μg/cm^2と低い値であった。また20分脱灰後の試料体をX線マイクロアナライザーでエナメル質表層のCaとPの定量分析を行ったところ,AMやCRの境界部ではP成分値が著しく減少し,Ca/p原子比がGI境界部と比較して増加した。以上のことからGIはAMやCRと比べ,隣接したエナメル質の脱灰を抑制し,AFMを使用した表面性状を観察することが可能となったことが分かった。さらに上記試料体にStreptococcus mutansを60分付着させ,風乾のみでAFM観察を行った。修復物によるエナメル質への細菌付着に特に差はなかった。
マイクロ流体過程を用いた効果的なクルクミン送達のためのポリエステルナノ粒子の合成

28年度が最終年度であるため、記入しない。
統語処理を支える脳内ネットワークの機能低下が言語機能に及ぼす影響

平成30年度は左下前頭回/三角部や左運動前野外側部の脳腫瘍患者の脳構造に関する検討を行った。我々はこれまで、左下前頭回/三角部や左運動前野外側部の脳腫瘍患者では統語処理を支える脳内ネットワークの機能低下が、局所的ではなく大域的に起こることを報告した。このような大域的な変化が構造面に及ぶ可能性について、前年度より取り組んでいる皮質構造解析(Surface based morphometry:SBM)法を用いて解析した。その結果、局所の神経膠腫により大脳皮質厚や皮質構造の複雑さ(皮質フラクタル次元)が脳全体において変化することが明らかとなった。この結果は、脳局所の障害により、脳内ネットワークの機能的結合性が大域的に変化するだけではなく、構造的変化も大域的に惹起されることを示した。また、昨年度に引き続き、昭和大学神経内科の物忘れ外来を受診した患者を対象に、認知機能と脳構造の関連性について調査した。本年度は、言語性記憶を含めた記憶能力と、脳構造の関係に加えて、認知機能との関連が推定されている脂質代謝の関係についても調べた。記憶機能はWMS-Rを用いて評価した。大脳皮質構造はSBM法を用いて皮質厚と脳回指数(Gyrification Index: GI)を計測した。脳回指数は局所の脳回の曲率を計測した。WMS-Rの下位項目と脂質代謝マーカーの相関解析の結果、HDLと論理的記憶I、視覚性対連合I/IIとの間に正相関を認めた。SBMの結果、血清HDLC値と両側の島皮質と下前頭回のGIとの間に正相関を認めた。最後に、左側の島皮質と右側の下前頭回のGIと論理的記憶Iの得点との間に正相関を確認した。以上の結果から論理的記憶には左右の両側の大脳半球の関与が重要であることが明らかになった。この結果は脳内ネットワーク全体において構造的変化が認知機能と関連することを示唆する。本研究では、これまで用いたfMRIやSPECTといった脳機能に対する解析に加えて、SBMという最新の解析手法を患者脳に対して用いる試みを行ってきたが、認知症などの神経変性疾患だけではなく、脳腫瘍のような占拠性病変を有する患者においても適応できることが分かった。SBMが精神疾患や変性疾患だけではなく、占拠性病変においても適応可能であることが分かった。また、使用上の注意点も確認できた。今後は、変性疾患だけではなく、脳腫瘍による大脳皮質構造の変化と脳内ネットワークの関係について解析する予定である。平成29年度はまず、左下前頭回の脳萎縮を特徴とする神経変性疾患である進行性非流暢性/失文法性失語の患者4名の脳血流低下部位を検討した。その結果、左下前頭回だけではなく、統語処理のネットワークに含まれる脳領域全般の脳血流低下が有意であることを報告した。この知見は、脳内ネットワーク単位での機能低下が統辞理解障害に関与することを示する知見である。次に、昭和大学神経内科の物忘れ外来を受診した患者を対象に、認知機能と脳構造の関連性について調査した。被験者にはアルツハイマー病・レビー小体型認知症・前頭側頭型認知症を中心とした変性疾患を対象とした。脳画像解析はSurface-based morphometryにより皮質厚を計測した。さらに、皮質構造の複雑さの指標として、近年開発された、皮質フラクタル次元の解析を行った。皮質フラクタル次元が高いほど、皮質構造が複雑であることを示唆する。その結果、言語性対連合記憶課題の正答率と左島皮質と左側頭葉内側面の皮質厚が正の相関を示すことが明らかとなった。さらに、言語性対連合記憶課題の正答率は両側側頭前頭皮質のフラクタル次元と正の相関を示すことが明らかとなった。以上の結果は、対連合記憶課題は宣言的記憶と関連が強いことを考慮すると、言語性宣言的記憶は局所の脳領域ではなく、脳内ネットワークの構造変化が関与する可能性を示唆するものである。さらに、脳梁病変を伴わない失書の左頭頂部の病変例について調べた。同部位は統語処理関連のネットワークに含まれる脳領域であった。しかしながら、この症例では明らかな統語理解障害はなかった。以上の結果は、脳局所の脳損傷が必ずしもネットワークの機能低下を惹起するわけではないことを示唆する。当初の予定通り、神経変性疾患を対象とした脳画像解析を行った。解析法としては、SPECTを用いた脳血流評価に加えて、Surface-based morphometry (SBM)を組み入れることに成功した。SBMはやや高度な知識を要する手法であるものの、皮質厚、皮質表面積、脳回皺裂についてより詳細な情報を検定することが可能である。本研究でも皮質厚だけではなく、皮質フラクタル次元という最新の解析技術を用い、論文発表につなげることができた。また、当初の予定どおり、急性脳損傷例に関しては、病変部位や疾患にとらわれず急性脳損傷例を対象に統語機能検査を含めた神経心理学的検査を行い、詳細な症例報告を行うことができた。

その結果、局所の神経膠腫により大脳皮質厚や皮質構造の複雑さ(皮質フラクタル次元)が脳全体において変化することが明らかとなった。この結果は、脳局所の障害により、脳内ネットワークの機能的結合性が大域的に変化するだけではなく、構造的変化も大域的に惹起されることを示した。また、昨年度に引き続き、昭和大学神経内科の物忘れ外来を受診した患者を対象に、認知機能と脳構造の関連性について調査した。本年度は、言語性記憶を含めた記憶能力と、脳構造の関係に加えて、認知機能との関連が推定されている脂質代謝の関係についても調べた。記憶機能はWMS-Rを用いて評価した。大脳皮質構造はSBM法を用いて皮質厚と脳回指数(Gyrification Index: GI)を計測した。脳回指数は局所の脳回の曲率を計測した。WMS-Rの下位項目と脂質代謝マーカーの相関解析の結果、HDLと論理的記憶I、視覚性対連合I/IIとの間に正相関を認めた。SBMの結果、血清HDLC値と両側の島皮質と下前頭回のGIとの間に正相関を認めた。最後に、左側の島皮質と右側の下前頭回のGIと論理的記憶Iの得点との間に正相関を確認した。以上の結果から論理的記憶には左右の両側の大脳半球の関与が重要であることが明らかになった。この結果は脳内ネットワーク全体において構造的変化が認知機能と関連することを示唆する。本研究では、これまで用いたfMRIやSPECTといった脳機能に対する解析に加えて、SBMという最新の解析手法を患者脳に対して用いる試みを行ってきたが、認知症などの神経変性疾患だけではなく、脳腫瘍のような占拠性病変を有する患者においても適応できることが分かった。今回、SBMを用いた研究成果を論文発表できたので、この手法を神経変性疾患と統語理解障害にさらに適応し、ネットワーク単位の機能低下の影響を解明する。さらに、神経膠腫などの占拠性病変に対しても多数例を集めるように努力し、占拠性病変が脳内ネットワークに及ぼす影響についても調べることとした。占拠性病変に対してSBMを行った研究報告は少なく、特に、皮質フラクタル次元解析を用いた解析例はない。神経膠腫により脳内ネットワーク全体の機能的結合性が変化したことを考慮すると、神経膠腫により皮質厚や皮質複雑性が変化する可能性が推定される。今後は占拠性病変が大脳全体の皮質構造に与える影響についても調べる方針である。SBMが精神疾患や変性疾患だけではなく、占拠性病変においても適応可能であることが分かった。また、使用上の注意点も確認できた。今後は、変性疾患だけではなく、脳腫瘍による大脳皮質構造の変化と脳内ネットワークの関係について解析する予定である。平成29年度は当初の計画より症例数が4例と少ないため、謝金にかかる費用が当初予定より少なかった。今後は被験者への謝金、論文出版費用(オープンアクセス化を含む)学会発表経費、ベッドサイドでの検査デバイス購入費などに充てる。論文のオープンアクセスにかかる費用(2019年3月出版)を翌年度分として請求する計画である。また、今後も国内・国際学会発表、論文発表、解析に用いる計算機購入などに充てる予定である。
東南アジア熱帯林での一斉結実に対する大型動物の反応

ボルネオ島のダナムバレー森林保護区・キナバタンガン下流生物サンクチュアリ・タビン野生動物保護区の三つの調査地で、カメラトラップによる大型動物密度のモニタリングを行った。調査開始当初に一斉結実が見られた。いずれの調査地でも、一斉結実期にヒゲイノシシの新生児の撮影頻度、および複数個体が撮影される頻度が増加した。また、過去の申請者の調査で、霊長類の中で、オランウータンだけが、結実期に数を増やすことが分かっている。これらの結果から、一斉結実に対し、ヒゲイノシシのように、それに合わせて繁殖を行ったり、オランウータンのようにそれに合わせてよそから移住してくるといった、数の反応を示す種がいることが分かった。本研究では、他の大陸に見られない一斉結実が見られる東南アジア熱帯林で、オランウータンなどの大型動物が、果実生産の季節性に対して、どのように反応しているのかを明らかにし、結実の季節性に対する反応の違いが、異種の共存に貢献しているという仮説を検証することが目的である。本年度は、ダナムバレー森林保護区・キナバタンガン下流生物サンクチュアリ・タビン野生動物保護区の三つの調査地で、カメラトラップによる大型動物密度のモニタリングを5月から7月に開始した。それに加えて、気候と果実生産の季節変化についての定期的なモニタリング調査を並行して行った。調査開始当初に一斉結実が見られ、これは調査地であるサバ州東部では、過去10年間で最大のものであると考えられる。結果についてはまだ予備的な分析しか行っていないが、3箇所の調査地いずれでも一斉結実が起こり、ヒゲイノシシの総個体数が増加し、新生児が観察された。その他の種については、個体数や繁殖の増加は確認されなかった。このことから、一斉結実に対する数の反応を示すのは、ヒゲイノシシのような、ごく少数の種に限られることが示唆される。また、一斉結実が大型動物の栄養収支に与える影響を評価するため、果実試料を収集し、その栄養分析を行った。過去に調査を行った、レッドリーフモンキーについて、資料の分析を行い、一斉結実に対する機能の変化について研究を進めた。本年度は、ダナムバレー森林保護区・キナバタンガン下流生物サンクチュアリ・タビン野生動物保護区で昨年度開始した、カメラトラップによる大型動物密度の季節・空間変異と、気候と食物利用可能性の季節変化についての定期的なモニタリング調査を継続して行うとともに、キナバタンガン下流生物サンクチュアリでも、野外調査によって行動観察による調査を実施した。具体的な調査項目は以下のとおりである。1.密度センサス:調査路近傍に自動撮影カメラを設置し、カメラ撮影頻度を密度の代理指標とする。上記3つの調査地で行う。2.生物季節・気象の調査:調査路上の樹木の展葉・開花・結実フェノロジーと雨量、気温を記録する。3.行動観察:キナバタンガン下流生物サンクチュアリに生息する7種の昼行性の霊長類のうち、ブタオザルを主要な対象とする。ブタオザルは広大な遊動域を持っており、一斉開花結実に対し、ほかの種にはない反応をすることが予測される。ブタオザルの調査はまだ準備段階で、本格的な資料収集の開始には至っていないが、数回の予備調査の結果、調査地内での群れの分布がおおよそ明らかになり、行動観察による詳細な資料収集の体制が整いつつある。本年度は、キナバタンガン下流生物サンクチュアリで、一昨年度開始した、カメラトラップによる大型動物密度の季節・空間変異と、気候と食物利用可能性の季節変化についての定期的なモニタリング調査を継続して行うとともに、キナバタンガン下流生物サンクチュアリでも、野外調査によってブタオザルを主要な対象とする行動観察による調査を実施した。具体的な調査項目と現時点で明らかになった予備的な結果は以下のとおりである。1.密度センサス:調査路近傍に自動撮影カメラを設置し、カメラ撮影頻度を密度の代理指標とした。一斉結実時に、ヒゲイノシシで撮影枚数や複数個体が写っている写真の割合が増加し、幼若個体は一斉結実時にのみ撮影された。

2.生物季節・気象の調査:調査路上の樹木の展葉・開花・結実フェノロジーと雨量、気温を記録した。3.行動観察:キナバタンガン下流生物サンクチュアリに生息する7種の昼行性の霊長類のうち、ブタオザルを主要な対象とした。ブタオザルは広大な遊動域を持っており、一斉開花結実に対し、ほかの種にはない反応をすることが予測される。直接追跡、ボートからのセンサス、およびテレメトリシステムを利用した遊動の調査によって、ブタオザルが数平方キロメートルに及ぶ遊動域を持つこと、川辺を利用する頻度が、果実生産の季節性に影響を受けること、果実の多い場所に遊動する傾向があることが明らかになった。カメラトラップによる3箇所の大型動物の数の変動のモニタリングと果実生産の調査は、順調に行われている。すでに平成22年度の調査開始当初に非常に大きな一斉結実が見られたため、目的の達成はすでに確実で、現在は非結実期のデータを取り続けている状態である。新たな調査項目として取り組んだブタオザルの調査は、現在まだ準備段階だが、準備は順調に進んでおり、来年度に本格的な資料収集を開始できると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。カメラトラップによる調査は、すでに一斉結実時の調査を終えたことから、維持の困難な調査地から、順次撤退を開始する。その分の余力を、新たに開始したブタオザルの調査に振り向けることにする。
実験結果との対話的手法に基づくロバスト制御系の学習的設計法

本年度は,前年度までに得た(i)ロバスト制御のための同定,および(ii)数値的最適化による制御系設計をさらに進展させ,以下の成果を得た.《1.ロバスト制御のための同定》前年に得た部分空間同定法の結果を基礎として,制御と同定の統合化を行う手法を得た.また,ロバスト制御ためにはモデル集合を同定することが必要となるが,これに関し,雑音の統計的性質を考慮にいれて保守性を減ずるひとつの方法を提案した.《2.数値的最適化による制御系設計》物理パラメータ変動に対処できるロバスト制御において重要な役割を演ずるμ解析・設計に関して,パラメータ依存LMI(線形行列不等式)を利用した新たな手法を開発した.これにより,従来より制御性能を改善できることが期待される.また,制御対象のモデルに依存せず入出力データから直接的に制御系に設計する手法についても検討し,凸最適化に基づいて制御系を学習的に設計する新たな手法を提案した.《3.浮上体を用いた制御実験》前年度に試作した4入力6出力のラジコン・ヘリコプタを用い,これを4つのサブシステムに分割してモデリングを行った.H_∞制御による基礎実験の後,サブシステム間の干渉を考慮した補償器を再設計し,ホバリング,および円軌道追従実験において一定の成果を得た.しかし,センサの精度の問題などから同定と制御の統合化にまでいたらなかった.本年度は,前年度までに得た(i)ロバスト制御のための同定,および(ii)数値的最適化による制御系設計をさらに進展させ,以下の成果を得た.《1.ロバスト制御のための同定》前年に得た部分空間同定法の結果を基礎として,制御と同定の統合化を行う手法を得た.また,ロバスト制御ためにはモデル集合を同定することが必要となるが,これに関し,雑音の統計的性質を考慮にいれて保守性を減ずるひとつの方法を提案した.《2.数値的最適化による制御系設計》物理パラメータ変動に対処できるロバスト制御において重要な役割を演ずるμ解析・設計に関して,パラメータ依存LMI(線形行列不等式)を利用した新たな手法を開発した.これにより,従来より制御性能を改善できることが期待される.また,制御対象のモデルに依存せず入出力データから直接的に制御系に設計する手法についても検討し,凸最適化に基づいて制御系を学習的に設計する新たな手法を提案した.《3.浮上体を用いた制御実験》前年度に試作した4入力6出力のラジコン・ヘリコプタを用い,これを4つのサブシステムに分割してモデリングを行った.H_∞制御による基礎実験の後,サブシステム間の干渉を考慮した補償器を再設計し,ホバリング,および円軌道追従実験において一定の成果を得た.しかし,センサの精度の問題などから同定と制御の統合化にまでいたらなかった.本年度は同定と制御の統合化設計の観点から,(a)閉ループ同定法とロバスト制御系設計法の理論的な確立と,(b)実験装置の試作を並行しながら研究を進め,以下の成果を得た.《1.ロバスト制御に適合した閉ループ同定手法の検討》システム同定の分野では,実験データから制御対象の状態空間表現の係数行列を直接求める「部分空間同定法」が多入出力系に適用できることなどから注目されている.本年度はこれに関して,雑音に対する非ロバスト性を克服する手法,および制御対象の極に関する部分的先見情報を活用する方法を提案した。《2.統合化設計に適したロバスト補償器の設計法の検討》近年,LMI(線形行列不等式)を基礎にし,数値的最適化手法を用いて制御系を設計する手法が,幅広い設計仕様に対応できるものとして注目を集めている.まず,LMIによる設計手法の有効性に関して基礎実験によりその有効性を確認した.その後,LMIを基礎として,非線形補償と線形ロバスト補償器を組み合わせた場合の全系のロバスト性解析手法を確立した.また,LMIによる低次元補償器の特徴付けを行った.《3.実験装置の試作》実験装置として,ラジコン・ヘリコプターをベースとして,浮上体を設計・試作した.本年度は浮上体位置検出や各種センサ信号の入出力装置部の試作を完了し,実験装置を上下および水平面内の回転の2自由度に運動を制限した上で,基礎実験をおこない,制御系として基本性能を満たすことを確認した.本年度は,前年度までに得た(i)ロバスト制御のための同定,および(ii)数値的最適化による制御系設計をさらに進展させ,以下の成果を得た.《1.ロバスト制御のための同定》前年度に得た部分空間同定法の結果を基礎として,制御と同定の統合化をおこなう手法を得た.また,ロバスト制御のためにはモデル集合を同定することが必要となるが,これに関し,雑音の統計的性質を考慮にいれて保守性を減ずる一つの方法を提案した.《2.数値的最適化による制御系設計》物理パラメータ変動に対処できるロバスト制御において重要な役割を演ずるμ解析・設計に関して,パラメータ依存LMI(線形行列不等式)を利用した新たな手法を開発した.これにより,従来より制御性能を改善できることが期待される.また,制御対象のモデルに依存せず入出力データから直接的に制御系を設計する手法についても検討し,凸最適化の基づいて制御系を学習的に設計する新たな手法を提案した.《3.浮上体を用いた制御実験》前年度に試作した4入力

6出力のラジコン・ヘリコプタを用い,これを4つのサブシステムに分割してモデリングをおこなった.H_∞制御による基礎実験の後,サブシステム間の干渉を考慮した補償器を再設計し,ホバリング,および円軌道追従実験において一定の成果を得た.しかし,センサの精度の問題などから同定と制御の統合化にまでは至らなかった.
イオン排泄・再吸収メカニズムの膜蛋白細胞内局在機構からの解明

本年度の研究では、腎臓イオン排泄・再吸収メカニズムの調節因子として、体液ホメオスターシスや血圧コントロールにおける重要な因子であり、前年度までの研究でその構成因子を解明していた遠位尿細管基底膜側カリウムチャネルの細胞内での機能局在機構の解明を更に進めた。チャネルの基底膜側への発現が構成因子であるKir4.1サブユニットのカルボキシル末端部の2つの特異的モチーフ配列(di-hydophobicmotifとPDZ-bindingmotif)により規定されることを解明した(J Am Soc Nephrol 16:2608-14,2005)。この結果、di-hydophobic motifが細胞表面への機能発現を制御し、PDZ-bindingmotifが基底膜側への局在を制御することを解明した。更にyeast two hybrid法を用い腎cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、Kir4.1のカルボキシル末端部と特異的に相互作用する蛋白断片の単離に成功している。断片の配列を用いることにより、機能局在を制御に関連するモチーフ配列を認識しカリウムチャネルの局在を制御する蛋白の同定を進めており、その解明により腎尿細管におけるイオン排泄・再吸収メカニズムに関与するプロテオミクスの解明を進行中である。プロテオミクスの解明に基づき体液ホメオスターシスや高血圧に関する新たな治療法の解明へ発展させる予定である。また、高血圧疾患に対する臨床治療の立場から、二次性高血圧の主因の一つである腎血管性高血圧の早期診断法の指標を明らかにし(Hypertens Res 28:237-242,2005)、その新たな治療法の提示を行った(J Vasc Surg 41:898-901,2005)。従来の研究結果から、イオン排泄・再吸収メカニズムにおいて腎遠位尿細管基底膜側カリウムチャネルが重要な役割を果たすことを明らかにしていた(J Physiol.2002:538:391-404)。更に、腎遠位尿細管基底膜側にはKir4.1が発現すること、Kir5.1/Kir4.1heteromerが腎臓において酸塩基調節に関与すること、も明らかにしていたが(J Physiol.2000:525:587-92)、Kir5.1の腎臓内局在は解明されておらず、腎臓においてKir5.1 homomerやKir4.1 homomerが独自の働きを示す可能性があった。本年度の研究では、Kir5.1特異的抗体を作製しKir5.1の腎臓内局在を明らかにした。Kir4.1との二重染色法を用いることにより、腎内においてKir5.1とKir4.1は共に遠位尿細管基底膜側に局在を示し、Kir5.1/Kir4.1 heteromerとして存在することを明らかにした。更に、このheteromer細胞内局在がKir4.1のカルボシキル末端の細胞質内105アミノ酸により規定されることを明らかにした(投稿中)。これらの研究によりイオン排泄・再吸収メカニズムに関与する因子を分子レベルで解明出来ることが期待できる。また、イオン排泄・再吸収メカニズムの破綻により生ずると考えられる高血圧の新たなる治療法に関して、臨床的見地からの解明の試みも行い、発表している(Hypertens Res.26:863-8,2003)。本年度の研究では、腎臓でのイオン排泄・再吸収メカニズムの調節因子として、体液ホメオスターシスや血圧コントロールにおいて重要な役割を果たすことを明らかにしていた遠位尿細管基底膜側カリウムチャネルに関して、その構成因子を明らかにすると共に、その機能発現を制御するシグナルを同定した。更に、Kir4.1サブユニットのカルボシキル末端に、このチャネルの機能発現を制御するシグナルが存在することを解明し、そのシグナルが2つの異なる特徴的なアミノ酸により構成されていることを解明した(投稿中)。酵母を利用した蛋白間結合の検出法により、このシグナルを認識する蛋白の候補の同定にも成功しており、その全配列の解明により、腎尿細管におけるイオン排泄・再吸収メカニズムに関与するプロテオミクスの理解に基づき、体液ホメオスターシスや血圧機構の破綻に対する新たな治療法の解明が期待できる。また、血圧調整機構の破綻により生ずると考えられる高血圧疾患に対する臨床治療の立場から、二次性高血圧の主因の一つである腎血管性高血圧の早期診断法の指標を明らかにすると共に(Hypertens Res印刷中、Urology印刷中)、その新たな治療法の提示を行った(J Vasc Surg印刷中)。

断片の配列を用いることにより、機能局在を制御に関連するモチーフ配列を認識しカリウムチャネルの局在を制御する蛋白の同定を進めており、その解明により腎尿細管におけるイオン排泄・再吸収メカニズムに関与するプロテオミクスの解明を進行中である。プロテオミクスの解明に基づき体液ホメオスターシスや高血圧に関する新たな治療法の解明へ発展させる予定である。また、高血圧疾患に対する臨床治療の立場から、二次性高血圧の主因の一つである腎血管性高血圧の早期診断法の指標を明らかにし(Hypertens Res 28:237-242,2005)、その新たな治療法の提示を行った(J Vasc Surg 41:898-901,2005)。
ヒト下垂体腺腫におけるＥｒｂＢ受容体ファミリー機能の解明

下垂体腺腫に対する薬物治療は現時点ではドパミン受容体作動薬、ソマトスタチン受容体作動薬の2種類しかありません。また、プロラクチノーマを除く腫瘍は手術が第一選択です。我々はこれまで下垂体腺腫の薬物治療のターゲットとしてEGF受容体が関連している事を示してきましたが、今回EGF受容体のファミリーであるErbBについて詳しく調べました。下垂体腺腫の中でも特に治療が困難であるクッシング病について今回主に調べたところ、ErbB受容体のうちErbB4という受容体がホルモンを抑えるためにターゲットとなる可能性を示唆する結果を得る事が出来ました。我々はこれまで、クッシング病におけるACTH産生下垂体腫瘍に発現しているEGF受容体(EGFR)が治療薬としての分子標的となりうる事を示してきた。今回、本研究ではEGFRとネットワークを形成しているEGFRファミリーであるErbB1-4が分子標的になりうるかを検討している。現在クッシング病患者の術後組織として44検体を得る事が出来、ErbB1-4をターゲットとしたカネルチニブの効果を検討した。カネルチニブはEGFRのみを分子標的とするゲフィチニブに耐性を示す腫瘍に対してもACTH前駆体であるPOMCの発現抑制効果、ACTH分泌抑制効果を示した。その腫瘍中でのErbB受容体発現パターンによる解析では、ErbB4発現の多い腫瘍においてPOMC発現抑制、ACTH分泌抑制効果が強く、ErbB3発現の多い腫瘍では効果が弱い事が示された。次にErbB受容体の下流分子としてPOMC発現に重要な役割を担っている事が知られているcyclin Eに着目し、Cyclin E阻害薬であるロスコビチンを投与したところ、カネルチニブに対する反応性が高い腫瘍においてロスコビチンによるPOMC発現抑制効果が強い事が示された。これらの結果はErbB4キナーゼを阻害することにより腫瘍でのPOMC発現を抑制し、ACTH分泌を抑える事が出来る可能性がある。ACTH産生下垂体腺腫はミクロ腺腫が多くその局在診断、手術的根治が難しく、再発も多い事が知られている。コントロール不良の場合には5年生存率は50%と言われており、分子標的薬の新たな開発が急務である。本研究が将来的なACTH産生腺腫に対する分子標的薬の実現化に結びつく事を目指し現在研究を進行中である。本研究は機能性下垂体腺腫に対する新たな薬物療法の確立を目的としている。当該年度において、本研究の倫理委員会申請書が、神戸大学附属病院、虎の門病院において承認され、虎の門病院での下垂体手術症例は、手術時に得られた検体を培養液中に保存し、当研究室にすぐに配送頂いている。検体組織は当研究室ですぐに初代培養系として細胞培養プレートに同数となるよう播かれ、Pan-ErbB阻害薬であるCanertinib、ErbB1,ErbB2阻害薬であるLapatinibを投与し、24時間後の細胞からRNAを抽出しホルモン遺伝子の発現量の違いを検討した。特に現在まで、ACTH産生下垂体腺腫を34検体送っていただき、そのうち21検体のReal-time PCRによるPOMC遺伝子発現については解析が終了した。さらにPRL産生下垂体腺腫は6例、TSH産生下垂体腺腫1例も配送いただき、現在解析ができる状態となっている。下垂体腫瘍は頭蓋内腫瘍の約15%を占める比較的頻度の多い脳腫瘍である。そのほとんどが良性腫瘍であることから、予後良好である一方、腫瘍効果による神経症状、視野欠損、ホルモン産生低下症状が臨床上問題となる。また、ホルモン産生性下垂体腫瘍はそのホルモン過剰による症状が全身性に合併する。現在本疾患に対する治療は主に外科的切除が第一選択であり、薬物治療の発達が今後の課題である。現在臨床上使用されているソマトスタチンアナログ、ドパミンアゴニストが主な腫瘍を標的とした薬物療法であるが、これらに抵抗性を示す腫瘍に対しては対症療法、放射線療法が用いられている。我々はErbB受容体が下垂体腫瘍のホルモン産生、細胞増殖に関連していることを見出しており、本研究は今まで下垂体腺腫での機能が分かっていないErbB3, ErbB4についての初めての検討である。現在までに86名のクッシング病患者からの検体を用いた実験を行った。EGFRの発現を認める腫瘍ではEGFRのチロシンキナーゼ活性阻害薬(TKI)であるゲフィチニブによりACTHの前駆蛋白であるPOMC発現は抑制されたが、EGFR発現を認めない腫瘍において耐性を示した。一方ゲフィチニブ耐性腫瘍に対してErbB1-4すべてに対するTKIであるカネルチニブ処理をしたところPOMC抑制効果を認めた。この効果はErbB4発現の多い腫瘍に強い傾向がありErbB