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社会的相互作用に基づく数学的意味の構成に関する認識論的・記号論的研究

社会的構成主義を基盤とするDorflerの一般化モデルを社会文化主義の視座から理論的に補完することによって,算数・数学の授業における社会的相互作用に関する理論的枠組みを構築した。また,その理論的枠組みに基づいて,小学校第4学年におけるわり算に関する教授・学習の課題を指摘し,授業の改善について検討した。今日、算数・数学の多くの授業では、主体的な学習の実現のために、子どもたちの多様な考え方に基づく「社会的相互作用(social interaction)」の過程が重視されている。本研究の第1の目的は、「社会的相互作用」と「数学的一般化」という2つのキーワードに注目しながら、算数・数学学習における「主観的認識から客観的認識への変容過程」を認識論的かつ記号論的に分析するための理論的枠組みを構築することにある。また、第2の目的は、その理論的枠組みに基づいて、社会的相互作用を主軸とした算数・数学の授業を設計、実施、評価しながら、理論的枠組みの規範性ならびに記述性を検証し、多様な考えに基づく算数・数学学習への実践的示唆を得ることにある。これら2つの研究目的にそって、初年度の平成19年度には、下記の3つの研究に取り組んだ。1.社会的相互作用に関する記号論的考察として、Steinbringの「認識論的三角形」をはじめ、CobbやPresmegらが提唱している「意味の連鎖(chaining of signification)」に関する研究、さらには、PeirceやHusserlの研究に基づきながら、数学学習に関する記号論的分析を進めているRadfordの研究などに注目した上で、社会的相互作用の過程に関する記号論的考察を行った。2.数学的意味の構成に関する認識論的考察として、構成主義、相互作用主義、社会文化主義の3つの認識論における知識観をはじめ、数学的意味の構成に果たす社会的相互作用の位置づけなどを比較検討した。3.我々の研究グループが既に提案している「一般化分岐モデル」について、社会的相互作用の視座からその理論的補完を行い、一般化分岐モデルの精緻化を図った。具体的には、「記号の対象化」の段階を社会文化主義の視座から理論的に補完することの必要性を指摘した。今日,算数・数学の多くの授業では,主体的な学習の実現のために,子どもたちの多様な考えに基づく「社会的相互作用(social interaction)」の過程が重視されている。本研究の第1の目的は,「社会的相互作用」と「数学的一般化」という2つのキーワードに注目しながら,算数・数学学習における「主観的認識から客観的認識への変容過程」を認識論的かつ記号論的に分析するための理論的枠組みを構築することにある。また,第2の目的は,その理論的枠組みに基づいて,社会的相互作用を主軸とした算数・数学の授業を設計,実施,評価しながら,理論的枠組みの規範性ならびに記述性を検証し,多様な考えに基づく算数・数学学習への実践的示唆を得ることにある。これら2つの研究目的にそって,2年目にあたる平成20年度には,下記の2つの研究に取り組んだ。1.社会的相互作用に関する理論的考察として,オランダのGravemeijerらが提唱している「実際的数学教育」(realistic mathematics education)の理論およびその実践に注目した。具体的には,「実際的数学教育」の理論的基盤となっている「数学化」や「数学的モデル化」,さらには,「model of」,「model for」の考え方を検討しながら,社会的相互作用に関する記号論的考察を行った。2.本研究グループが提唱している「一般化分岐モデル」について,社会的相互作用の視座からの理論的精緻化について検討した。具体的には,社会-文化主義理論で重視されている「文化的道具(cultural tool)」の視点から,「一般化分岐モデル」が依拠する認識論である「社会的構成主義」の限界を指摘した。また,その限界をふまえつつ,1.で検討した「実際的数学教育」における「自己発達モデル」という視座から,「一般化分岐モデル」の理論的補完の可能性について検討した。平成21年度の研究では,平成19年度ならびに平成20年度の研究に引き続いて,社会的相互作用に関する下記の2つの研究に取り組んだ。第1は,算数・数学の授業における社会的相互作用の役割や機能に関する研究である。具体的には,新しい算数・数学科学習指導要領において強調されている「算数・数学的活動」に注目しながら,「算数・数学的活動」と社会的相互作用の相互関係という視点から,社会的相互作用を活かした算数・数学の授業のあり方について,実践的な視座から考察を行った。考察の結果,算数・数学の授業づくりのポイントとして,次のような指摘を行った。つまり,活動主義や構成主義において主張されるように,数学は,本来,人間の活動性の所産といえる。しかし,個人的な活動を源とする数学的意味は主観的な性格を有する場合が多い。そのため,活動から導かれた主観的な意味を教室集団において社会的に再構成し,共有された意味に洗練していくことが,教授・学習の重要な目的であり要になる。その意味で,社会的相互作用は,「算数・数学的活動」に基づいて構成された主観的な数学的意味を,教室集団において協定され合意された客観的な数学的意味に転換するという重要な役割と意義を担っていることになる。

したがって,このような視座からの算数・数学の授業の充実を図っていくことが重要であることを指摘した。第2は,上記第1の内容をふまえながら,特定の教材に関する教授・学習モデルを検討する研究である。平成21年度の研究では,Gravemeijerらの先行研究をもとに,小学校の「わり算の筆算」の指導について検討した。検討の結果,社会的相互作用を活かしながら,わり算の意味の形成とわり算の筆算形式との接続に配慮することの重要性を指摘した。
歯質代替高分子材料の開発

本研究は電子線の照射量(吸収線量、線エネルギー付与率)をコントロールすることにより高分子材料を改質し、歯質の代替可能な傾斜高分子材料の研究開発を行ったものである。高分子材料の粘弾性を保持したまま、外表面近傍に硬度を付与した傾向性を持つ高分子材料を電子線の照射により開発した。本研究を行う上で障害となる放射線劣化について文献調査を行った。これに基づいて高分子材料の酸素共存下放射線照射による劣化に関する基礎実験を行い、許容値を残留酸素濃度2730ppm以下とした。本研究の電子線加熱照射試験で使用する放射線照射治具の考案、設計、製作を行った。放射線照射治具は放射線照射時の酸素障害を防止するため、ガス置換がスムーズに行えるよう留意した。本研究で使用する試料を、医療分野で実績があり、放射線により架橋型の反応を示すポリカーボネート樹脂とアミド樹脂を選定した。改質効果の尺度として硬度を測定することとした。試料を作成し放射線照射治具内にセット、ガラス転移温度に加熱後電子線を真空中あるいは不活性ガス雰囲気中で照射を行い、改質効果の測定を行った。傾斜性が付与された試料の表面性状の観察、接触角の測定、吸水率、グルコース付着量の測定を行った。さらに物理化学的試験および生物学的安全性試験のうち細胞毒性試験の一貫としてピスフェノールA分析を実施した。この成果を第24回日本バイオマテリアル学会で発表を行い、レビューを受けた。実用化への可能性を見るため、市販されているポリカーボネート人工歯に、電子線を窒素ガス雰囲気下加熱照射試験を実施し、傾斜性が付与されることを確認した。実用化実験の結果およびこれまでに得られている物理化学的試験、生物学的安全性試験について総括的に評価し、本研究の成果の有用性について考案、研究報告を纏めた。本研究は、歯質の力学的特性データをもとに研究開発目標値を設定し、選定した高分子材料が、長所である粘弾性の特徴を失うことなく、物性を開発設定値に近似するよう、高分子材料に加熱電子線照射試験を実施し、歯質代替傾斜高分子材料の開発を行った。1.研究実績歯質代替傾斜材料の開発の経緯を報告する。1-1これまでの臨床データを基に、歯科用傾斜高分子材料の開発目標として口腔機能学的見地から力学的試験項目のうち硬度を選択し、目標値を設定した。1-2-1試験に供する高分子材料を購入し、射出成形機を用いて力学的試験試料を作成した。1-2-2放射線照射治具の考案、設計、製作を電気興業(株)応用特機担当、特殊照射担当と計3回の出張(2月25日,3月8日,3月22日)で詳細に検討を重ね、照射容器を完成させた。1-2-3高分子に目標である傾斜性を付与するため1-2-2で製作した容器内に試料をセットし、窒素雰囲気下(酸素濃度2730ppm以下)で加熱電子線照射を各条件で実施した。1-3各条件下の試料の硬度試験を行い、電子線の吸収線量-試料加熱温度-試料の硬度の相関データを整理、統計処理を行い、最適照射条件を特定した。1-4最適照射条件で高分子材料の試料の硬度が26%向上したが、開発目標値には達していない。次年度電子線照射を継続して行い、研究を続行する。本年度は、口腔機能学的見地から、昨年度設定した開発目標値へ近付けるため、設定した2種類の高分子材料ポリカーボネート樹脂、アミド樹脂(以下、PC、PAとする)の物性が向上し傾斜特性が付与されるよう加熱放射線照射を継続して行い、その結果を日本バイオマテリアル学会で発表し、レビューを受けた。また、得られた傾斜高分子材料の実用化への有用性を考察した。1.研究実績歯質代替傾斜

高分子材料の開発の経緯を報告する。1-1 PC, PAの物性試験用試料を酸素濃度、温度モニター等で環境を一定条件下にした状態で、PCは150°C加熱、窒素中、吸収線量1.757.00kGyの電子線照射を行い、PAは140°C加熱、真空中、2.5100kGyのγ線照射を行った。1-2放射線照射によって得られた新材料の物性試験を行い、向上率を算出、統計処理後、メディカルディバイスに対する材料として有用な知見を第24回日本バイオマテリアル学会で発表した。・実施した物性試験は硬度、原子間力顕微鏡による表面性状観察、接触角、吸水率、口腔内環境の汚れ付着を想定したグルコース付着量である。1-3新材料(PC、PA)の細胞毒性試験、及びPCについては放射線照射前後ビスフェノールA(BPA)の測定を行い、安全性を確認した。・細胞毒性試験はV79細胞を用いたコロニー形成阻害法によった。・PCのBPAはGC-MS法より行った。1-4歯質代替高分子材料の実用化のため人工歯の照射実験を実施した。1-5研究代表者と研究分担者全員で検討会を開催し、物理化学的試験、生物学的安全性試験並びに実用化実験について総括的に評価し、本法の有用性を考察し研究報告を作成した。
乱れた固溶体系における秩序化過程の研究

チオフェン・ベンゼン二成分系については測定を全濃度域に拡大し,また298Kにおける蒸気圧と混合熱測定より,混合過剰熱力学関数を決定した。これを熱容量デ-タと組合せることにより,固溶体に対する混合過剰熱力学関数を決定することに成功し,研究を一段落させた。同称にKCN・RbCN二成分固溶体の熱容量を測定して相図を決定すると共に,CN^-イオンの緩和挙動を明らかにしたので,速報誌に発表した。次いで包接水和物の研究に入り,既に発見していたテトラヒドロフラン(THF)水和物の純粋,及びKOHド-プの両試料について誘電率測定を行った。ド-プ試料に現われた62Kの一次相転移に伴なって、ホスト格子の水分子が配向秩序化すると共に,ゲスト分子の配向も同時に秩序化することが明らかとなった。水分子の双極子モ-メントの秩序化によって強い静電場が発生し,これが双極性ゲスト分子に有利な配向を与えるものと考えられる。なお,中性子実験によって低高温両相の回折デ-タを得たので,高温相中でのゲストの配向の乱れの性格を決定することができた。低温相の回折線は異常な拡がりを示し,現段階では秩序構造を決定するに至っていない。THFより更に大きい双極子モ-メントをもつアセトン包接水和物に対して,純粋及びド-プ両試料につき熱容量測定を行った。前者に対しては86K付近にガラス転移点,後者に対しては47Kに一次相転移を発見したので,速報誌に発表した。同時に誘電率測定も行い,THFと類似した結果を得た。トリメチレンオキシド(TMO)はアセトンとTHFの中間の双極子モ-メントをもつので,これについてもKOHド-プ試料の熱容量を測定し,35Kに一次相転移を発見した。この場合のみ,誘電率測定から,ゲスト分子は低温相でも再配向運動を行なっている。これら三種の包接水和物の動的及び静的性質の相関を検討中である。最初に予定した樟脳のd体、及び光学活性体二成分系としてのラセミ体結晶については熱容量測定が終り、両者のエントロピ-の解析によってラセミ体の相転移がdー及びlー体両分子の重心並びに配向の秩序化の2つの過程から成立っていることが確認されたので、これを国際誌に発表した。文献で報告されていた100K付近でのラセミ体の誘電分散が、試料の十分なアニ-ルによってどう変化するかは大変興味深い問題で、近い将来に追求したい。これに必要な単結晶切断装置は充分に整備された。チオフェン・ベンゼン二成分系については、x=0.003より1.0まで12種類の固溶体の熱容量測定を終了し、予期通り準安定相系列のII_2ーII_1相転移温度がベンゼン濃度と共に急激に低下する特異な不純物効果を発見した。これはII_1相が不整合相であるとするX線の結果を裏付けるもので、不整合相は不純物によるピン止め効果の為、微量のベンゼン固溶によって不整合相のまゝ凍結し、残余エントロピ-を生じるものと考えられる。特異な不純物効果のみを速報誌に発表し、全体の相図並びに分子運動に及ぼすベンゼン効果を別の国際誌に詳細に発表した。次いで本年度購入の誘電率クライオスタットを使用し、チオフェンの安定及び準安定相両系列の誘電率を測定した。期待した通りに、従来の文献値はすべて準安定相に対するものであることを確認し、安定相について始めてその誘電率を測定した。その結果、VーIV相転移は整合・不整合相転移特有の振舞いを示すことを発見したので、そのベンゼン濃度依存性についても詳細に研究を進めた。それにより不純物添加試料に2種類の分子運動の存在を確認したので、これらの結果を速報誌に発表した。本年度購入のデ-タ収録装置、及び温度自動制御用部品の設置により測定は極めて安定、且つ迅速に行われるようになり、多くの固溶体試料についての研究を能率よく行いうることが可能となった。

THFより更に大きい双極子モ-メントをもつアセトン包接水和物に対して,純粋及びド-プ両試料につき熱容量測定を行った。前者に対しては86K付近にガラス転移点,後者に対しては47Kに一次相転移を発見したので,速報誌に発表した。同時に誘電率測定も行い,THFと類似した結果を得た。トリメチレンオキシド(TMO)はアセトンとTHFの中間の双極子モ-メントをもつので,これについてもKOHド-プ試料の熱容量を測定し,35Kに一次相転移を発見した。この場合のみ,誘電率測定から,ゲスト分子は低温相でも再配向運動を行なっている。これら三種の包接水和物の動的及び静的性質の相関を検討中である。
がんの先端医療を受けている患者への支援システムの構築

先端医療を受ける患者は、高額な医療費や受療施設の限定など、身体・精神・社会的負担が大きい。先端医療であるがんワクチン療法を受けている患者の生活を支えQOL向上に寄与できる患者支援システムの構築を目的とした。がんワクチンを受ける患者を対象として、質的、量的研究を行った。患者は治療を受けている安堵を体験して今を生きており、患者の体験を援助者全員と共有することが支援上必要であるとわかった。またSOC(首尾一貫感覚)やQOLの観点から、患者の身体・心理的の変化を定期的に確認し、患者が望む治療を継続できる状況を整えることの重要性もわかり、先端医療を受ける患者への支援システム構築の基礎資料となった。本プロジェクトの目的は、先端医療であるがんペプチドワクチン(以下がんワクチン)療法を受けている患者の生活を支えQOL向上に寄与できる患者支援システムを構築することである。そのために、がんワクチン療法を受けている患者・家族の現状を調査し、問題点などを明らかにし、解決策、支援策を看護の視点に立って明らかにする必要がある。その第一段階として、「がんワクチンを受けている患者の体験」というテーマで研究し、2014年2月の第28回日本がん看護学会学術集会において発表した。この研究は、がんワクチン療法を受けている膵臓がん患者8名のインタビューから得られた結果を分析し、まとめたものである。自由診療でがんワクチンを受ける患者は、他に治療がないという状況を受けとめ、経済的・体力的問題を抱えながらも疾病や治療と向き合い、がんワクチンを受けられることになって「ホッとしている」状況ができるだけ延長されることを望んでいることが分かった。この研究は今後看護雑誌に投稿する予定で、現在論文としてまとめている所である。しかし、8名のがん患者へのインタビューはがんワクチン治療中の1回のみであったため、現実にがんワクチンを受けながら日々の生活を送っている患者の体験について十分に把握できたかどうか疑問が残った。そこで、更に患者の状況を詳細に把握し、患者・家族への援助について考察し、支援システムの構築の基礎資料とするために、「がんペプチドワクチンを受けている患者への援助の検討」というテーマで次の研究を計画しており、2014年3月時点で、倫理審査の申請中である。今後は患者・家族への具体的な援助の内容・方法を考え、実施し、評価する予定である。H26年2月に日本がん看護学会学術集会に発表したものをふまえて,「自由診療によりがんペプチドワクチンを受ける膵臓がん患者の体験」というタイトルで,日本がん看護学会誌への論文投稿の準備中である。H26年6月からH27年1月の間,がんペプチドワクチンを受ける患者に対して,治療の前後の2回,QOL(Quality of Life)とSOC(Sense of Coherence,首尾一貫感覚)について24名の患者への半構成面接と質問紙調査を実施した。治療が終了するまでの間に数回面談や電話をすることで生活状況や身体・精神状態を把握し,患者からの相談に答える等の援助を行った。治療前の状況について,H26年3月1日に日本がん看護学会学術集会において「がんペプチドワクチンを受けるがん患者のSOCとQOL」を発表した。H26年2月に日本がん看護学会学術集会に発表したものをふまえて,H27年10月に「自由診療によりがんペプチドワクチンを受ける膵臓がん患者の体験」というタイトルで,日本がん看護学会誌へ論文投稿した.査読を受け,H28年3月現在修正版を提出する準備中である.H26年6月からH27年1月の間,がんペプチドワクチンを受ける患者に対して,治療の前後の2回,QOL(Quality of Life)とSOC(Sense of Coherence,首尾一貫感覚)について24名の患者への半構成面接と質問紙調査を実施した.治療前の状況について,H26年3月1日に日本がん看護学会学術集会において「がんペプチドワクチンを受けるがん患者のSOCとQOL」を発表した.H27年度中に先進医療を受けている患者・家族への支援の構築を目指していたが,個々の患者背景や体験についての研究に時間を要しており,治療期間中の個々の患者への援助は実施することができたが,支援システムとしての構築は完成とはいえない.しかし,研究最終年として研究テーマである「先端治療を受けている患者への支援」については進捗があったと判断し,今後の課題について取り組んでいく基礎はできたと考える.先端医療を受ける患者は、高額な医療費や受療施設の限定など、身体・精神・社会的負担が大きい。H26年度中に先端医療を受けている患者の体験を明らかにしたうえで患者・家族への支援の構築を目指していたが,個々の患者背景や体験についての研究に時間を要しており,治療期間中の個々の患者への援助は実施することができたが,支援システムの構築に至っておらず,やや遅れている状況である。がん看護がんペプチドワクチンで治療を受けている個々の患者への援助は実施することができているが,システムとしての支援の構築に至っていない。

残りの1年間で実行可能な援助の方策を実施できるよう努め,システム構築に結びつけたいと考える。H25年度中には、がんワクチン療法を受ける患者の体験を明らかにして、支援の方向性を見いだすことまでを計画していたが、患者ががんワクチンを受けながら生活している状況の把握が十分でなく、具体的援助までを考えることができなかったため。本年度購入を予定していた物品(プロジェクタ等)の製品検討が遅れたため購入を見送ったため。また,計画が遅延し,患者支援のための物品購入等が発生しなかったため。H26年度中に患者への援助について、実行可能な方策を考え、一部は実施できるようにしたいと考えている。援助の例としては、がんワクチンセンター内での看護援助の向上のためのリサーチナースへの啓発、患者支援のための小冊子作りやインターネットによる情報の発信、がんワクチンセンターと市中病院との連携、自治体への協力依頼、などである。H27年度に援助の実施と評価を行うこととする。物品等の購入(プロジェクタ等)患者支援のための物品等の購入海外での学会発表のための旅費等本年度購入予定であった物品等(プロジェクター、統計ソフトなど)の実際的な製品の検討が遅れたため、購入を次年度に見送ったため。また、計画が遅延し、人件費などが発生しなかったため。物品等(プロジェクター、統計ソフトなど)の購入。人件費などを適切に使用する。
腸管病原性大腸菌のヒト特異的感染と宿主細胞との相互作用の研究

腸管病原性大腸菌EPECの腸管上皮細胞への付着はBFP(束状線毛)による初期付着段階の後、III型分泌装置による病原蛋白質の細胞への注入、さらに細胞表層への付着因子intiminを介した強固な接着へと順次作用を変化させ付着様式を変化させていくことが明らかになっている。前年度までの本研究で、細胞付着後のEPECにおける線毛や付着因子の発現およびIII型分泌による病原因子の分泌が、付着様式あるいは宿主細胞との相互作用の変化に伴い発現活性化あるいは抑制されることを明らかにしてきた。さらに付着に伴う病原因子の発現変化は転写段階において制御されていることを示した。そこで細胞付着後の病原因子の発現の切り替えにおける細菌-宿主細胞間の相互作用の役割について明らかにするため、BFP欠損株あるいはIII型分泌装置欠損株、intimin欠損株における細胞付着後の病原性遺伝子の発現を検討した。その結果、初期付着後のIII型分泌蛋白質の発現はBFPによる付着がなくても細胞との接触により上昇すること、細胞付着後期にみられた病原性遺伝子の発現低下はIII型分泌装置による細胞との相互作用の段階が必要であることが明らかとなった。また、フォルマリン処理した細胞への付着によってもIII型分泌蛋白質やintiminの発現上昇がみられたことから細胞表面との接触刺激が必要であるが、付着に伴う細胞の構造変化などの動的変化は必要でないことが明らかとなった。一方、EPECの病原性プラスミドにコードされる病原性制御因子はプラスミドおよび染色体上の病原性遺伝子の発現制御に関与しているが、病原性遺伝子以外にも多くの染色体遺伝子の発現に関与していることが明らかとなった。制御因子が発現調節する遺伝子は、菌の低酸素条件下の増殖に適した代謝経路の遺伝子群であることから、病原性調節因子は菌の腸管内への適応にも積極的に関わっている可能性が示唆された。腸管病原性大腸菌EPECのヒト上皮細胞に対する付着特異性を、培養細胞を用いたin vitro感染実験系で検討し、ヒト由来細胞とマウス由来細胞との間にEPECの感染率に顕著な差があることを見いだした。ヒト以外の動物由来の細胞の中には高率で感染するものが見いだされたが、細胞をフォルマリンで前処理することによりヒト由来以外の細胞に対する感染率のみ顕著に低下した。すなわちEPECのヒト特異的感染は細胞付着初期段階における宿主細胞表面のフォルマリンにより修飾されにくい因子との相互作用により決定されていることが示唆された。さらにEPEC感染初期段階に主要な役割を担う束状線毛(BFP)がこのヒト特異的付着に必須であることを明らかにした。一方、EPECの細胞付着様式は細胞に付着後段階的に変化することが知られているが、初期付着に必須のBFPの産生は付着後徐々に消失することを見いだした。さらに細胞に付着したEPECにおける遺伝子発現の変化を追跡するため、感染細胞よりRNAを抽出しEPECの病原性遺伝子群の転写量の変化をDNA microarrayを用いて測定した。その結果、BFP合成遺伝子群の転写は感染とともに一過的に上昇するがすぐに減少した。また、次の付着段階に必須のEsp蛋白質や付着因子intiminをコードする遺伝子群の転写はBFP遺伝子群と同様に付着後上昇したが、しばらく持続し感染後期に漸く減少した。他方、病原性プラスミドのEPEC細胞内コピー数が感染後期で増加していた。以上の結果より、EPECにおいては細胞に付着後も細胞との付着様式の変化に伴い病原因子の発現が転写段階において調節されていることを明らかにした。

腸管病原性大腸菌EPECの腸管上皮細胞への付着はBFP(束状線毛)による初期付着段階の後、III型分泌装置による病原蛋白質の細胞への注入、さらに細胞表層への付着因子intiminを介した強固な接着へと順次作用を変化させ付着様式を変化させていくことが明らかになっている。前年度までの本研究で、細胞付着後のEPECにおける線毛や付着因子の発現およびIII型分泌による病原因子の分泌が、付着様式あるいは宿主細胞との相互作用の変化に伴い発現活性化あるいは抑制されることを明らかにしてきた。さらに付着に伴う病原因子の発現変化は転写段階において制御されていることを示した。そこで細胞付着後の病原因子の発現の切り替えにおける細菌-宿主細胞間の相互作用の役割について明らかにするため、BFP欠損株あるいはIII型分泌装置欠損株、intimin欠損株における細胞付着後の病原性遺伝子の発現を検討した。その結果、初期付着後のIII型分泌蛋白質の発現はBFPによる付着がなくても細胞との接触により上昇すること、細胞付着後期にみられた病原性遺伝子の発現低下はIII型分泌装置による細胞との相互作用の段階が必要であることが明らかとなった。また、フォルマリン処理した細胞への付着によってもIII型分泌蛋白質やintiminの発現上昇がみられたことから細胞表面との接触刺激が必要であるが、付着に伴う細胞の構造変化などの動的変化は必要でないことが明らかとなった。一方、EPECの病原性プラスミドにコードされる病原性制御因子はプラスミドおよび染色体上の病原性遺伝子の発現制御に関与しているが、病原性遺伝子以外にも多くの染色体遺伝子の発現に関与していることが明らかとなった。制御因子が発現調節する遺伝子は、菌の低酸素条件下の増殖に適した代謝経路の遺伝子群であることから、病原性調節因子は菌の腸管内への適応にも積極的に関わっている可能性が示唆された。
亜鉛イオンによる骨芽細胞分化促進と骨再生療法の開発

本研究では、亜鉛放出型チタンより溶出した溶出亜鉛液を応用した骨再生療法の開発を試みた。溶出亜鉛添加による骨芽細胞分化促進へ対する効果に関しては、アルカリフォスファターゼ染色、リアルタイムPCR、アリザリンレッド染色による基質石灰化などの点を検討した。溶出亜鉛液添加により骨芽細胞分化が亢進することが確認された。また、培養7日目の細胞を実験動物皮下および頭蓋骨欠損モデルへ移植した。溶出亜鉛を添加した細胞で著明な骨形成を認めたサンプルもあったが、再生骨量の不安定性と手術部位感染の問題があり、十分な結果は得られなかった。頭頸部領域における腫瘍の術後や外傷による広範な骨欠損に対する治療法として骨再生療法への期待が高まっていることから、本研究では低侵襲かつ安全性を有した新規骨再生療法の構築を目的とした。組織再生においては細胞、細胞増殖の足場、増殖・成長因子の3要素が重要となる。申請者らは骨髄間葉系幹細胞を用いた実験系において亜鉛放出型チタンより溶出された溶出亜鉛液が従来用いられてきた亜鉛化合物と比較して有意に骨芽細胞分化を亢進することを明らかにしており、本年度はこの溶出亜鉛液の骨芽細胞におけるシグナル因子としての役割を歯髄幹細胞を用いた実験系において解析した。1)アルカリフォスファターゼ染色:歯髄幹細胞を標準培地で培養後、細胞がサブコンフルエントになった後、骨芽細胞誘導培地へ培地交換を行うとともに溶出亜鉛液を添加した。溶出亜鉛液添加群において明確な染色性の亢進がみられた。2)骨芽細胞分化マーカーのmRNA発現、タンパク発現:骨芽細胞分化マーカーとされる遺伝子群に関してリアルタイムPCRを用いてmRNA発現を測定した。溶出亜鉛添加群において有意なmRNA発現の上昇が認められた。また、BMP/TGF-βシグナル関連のmRNAに関しても網羅的に発現を測定した所、溶出亜鉛添加群においてBMPシグナルの増強が確認された一方、BMPのアンタゴニストであるNogginに関しては発現が減少している事が確認された。また、骨芽細胞分化に関連するタンパクおよびシグナルのリン酸化に関してウエスタンブロットを行った。3)基質石灰化に関して:アリザリンレッド染色、von Kossa染色により基質石灰化を確認した。アリザリンレッド染色を行ったサンプルに関しては溶解した後、吸光度測定を行った所、溶出亜鉛添加群において基質石灰化の亢進が確認された。頭頸部領域における様々な疾患は、治療後の骨の欠損を伴う事が多くあり、骨欠損へ対する治療法として骨再生療法への期待が高まっている。申請者らは、骨芽細胞分化における生体内微量元素の1つである亜鉛の効果に着目し、研究を行ってきた。本研究では従来より用いられてきた塩化亜鉛および硫酸亜鉛ではなく、亜鉛放出型チタンより溶出された溶出亜鉛液を用いた骨再生療法の開発を目的とした。本年度はコントロールとして塩化亜鉛を用い溶出亜鉛液との比較検討を行った。幹細胞は歯髄幹細胞を用いた。1)細胞増殖:細胞増殖に関しては亜鉛無添加、塩化亜鉛添加、溶出亜鉛添加において有意な差は認めなかった。2)アルカリフォスファターゼ染色:骨芽細胞誘導7日目のサンプルにおいて亜鉛無添加群および塩化亜鉛添加群では同程度の染色性であったが、溶出亜鉛液添加群では著明なアルカリフォスファターゼ染色を認めた。3)リアルタイムPCRによるmRNA発現:培養7日目に骨芽細胞分化における代表的な分化マーカー遺伝子であるtypeI collagen、ALP、osteocalcin、Runx2の発現に関して溶出亜鉛添加群で著明な発現上昇が確認された。また、血管内皮細胞増殖因子であるVEGFのmRNA発現においても増強を認めた。4)基質石灰化:培養14日目および28日目にアリザリンレッド染色、von Kossa染色により基質石灰化を確認し、溶出亜鉛添加群で基質石灰化の亢進が確認された。また、以上の結果を元に実験動物の皮下移植を試みた。外科系歯学歯髄幹細胞の溶出亜鉛液添加による分化促進作用に関しては、in vitroにおける検討によって明らかとなったため、予定通り次年度よりin vivoにおける異所性骨形成能および骨修復能に関して検討を行う。また、歯髄幹細胞を用いた実験系より最適な培養条件の設定が可能となった事から、次年度は脂肪幹細胞、iPS細胞を用いたin vitro、in vivoにおける骨芽細胞分化および骨形成に関する評価を併行して行っていく予定となっている。上記のごとく、本年度は細胞培養における最適な培養条件の設定が可能となった事から、次年度より培養細胞の移植実験および脂肪幹細胞、iPS細胞を含めた種々の幹細胞ソースの培養および移植実験を進め、新たな骨再生療法の確立を目指す。
走査型超音波探針顕微鏡/硬度顕微鏡の試作

[1]SUTM像とSTM像との比較をするためには,試料のどの範囲を観察しているかを知る必要がある.市販のSEMに組み込め,2μm角を走査することが可能なSTMユニット(昨年度作製)により,STM像とSEM像との同時観察に成功した.試料には300°Cでマイカ上に蒸着した金膜をさらに高温で焼鈍し,大きな結晶粒としたものとシリコンウエ-ハ上の電極パタ-ンなどを観察した.本ユニットを用いることにより,現在分解能が10nm程度である超音波探針顕微鏡との対応像を取ることができる.[2]原子間力顕微鏡で使用しているカンチレバ-と同様の構造をSiの異方性エッチングを利用して作製し,その根元に圧電体薄膜であるZnOスパッタ膜を形成し,共振器として作動させ,試料表面との接触を検知する方法を考案した.その結果,約300MHzにおいて共振が確認されたが像を取ることには成功していない.[3]先端に導電性ダイヤモンド(極率半径約100nm)を取り付けた直径0.5mmφのPtの根元に共振周波数10MHzの圧電帯を貼付け従来の直径1mmφのW探針を用いた場合と比較した.ダイヤモンドはWの様には変形せず,STM像も取れることが確認できた.しかし,送り込んだ高周波パルスに対して,良好なパルスエコ-の検出ができていない.原因として考えられるのは,先端にダイヤモンドとPtという異種材料が接続されているために音響インピ-ダンスの相違が影響しているか,先端のホ-ン状の形状がエッチングによるW探針のように指数関数的に変化していないという2つの理由が考えられる.後者が大きいと考えている.[4]表面吸着の影響を調べるために,ロ-ドロックで試料及び探針交換可能な超高真空STMの作製し,完成させた.超高真空中での実験は現在計画中である.[1]SUTM像とSTM像との比較をするためには,試料のどの範囲を観察しているかを知る必要がある.市販のSEMに組み込め,2μm角を走査することが可能なSTMユニット(昨年度作製)により,STM像とSEM像との同時観察に成功した.試料には300°Cでマイカ上に蒸着した金膜をさらに高温で焼鈍し,大きな結晶粒としたものとシリコンウエ-ハ上の電極パタ-ンなどを観察した.本ユニットを用いることにより,現在分解能が10nm程度である超音波探針顕微鏡との対応像を取ることができる.[2]原子間力顕微鏡で使用しているカンチレバ-と同様の構造をSiの異方性エッチングを利用して作製し,その根元に圧電体薄膜であるZnOスパッタ膜を形成し,共振器として作動させ,試料表面との接触を検知する方法を考案した.その結果,約300MHzにおいて共振が確認されたが像を取ることには成功していない.[3]先端に導電性ダイヤモンド(極率半径約100nm)を取り付けた直径0.5mmφのPtの根元に共振周波数10MHzの圧電帯を貼付け従来の直径1mmφのW探針を用いた場合と比較した.ダイヤモンドはWの様には変形せず,STM像も取れることが確認できた.しかし,送り込んだ高周波パルスに対して,良好なパルスエコ-の検出ができていない.原因として考えられるのは,先端にダイヤモンドとPtという異種材料が接続されているために音響インピ-ダンスの相違が影響しているか,先端のホ-ン状の形状がエッチングによるW探針のように指数関数的に変化していないという2つの理由が考えられる.後者が大きいと考えている.[4]表面吸着の影響を調べるために,ロ-ドロックで試料及び探針交換可能な超高真空STMの作製し,完成させた.超高真空中での実験は現在計画中である.
阻害剤をプローブとするアロマターゼの解媒機能解析

本研究は、我々が開発した阻害剤である天然基質androstenedione(AD)の3-デオキシ体と6-アルキル体や5-en-7-oneステロイド等をプローブとして、アロマターゼ触媒機能の解析を目的とした。まず、3-デオキシADと5-en-7-one体の19-水酸化体と19-オキソ体を、dehydroepiandrosteroneを出発原料として合成に成功した。次いで、これらの19-水酸化体を常法に従い、対応する脱メチル化体(△^<10(1)>体)へ誘導した。また、6-アルキルADと6-オキソADの2,2-ジメチル体の19位酸素化体を合成するには至らなかった。これら合成された19-酸素化体と△^<10(1)>体のGC-MSを検討した結果、水酸基をTMS又はIPDMS等のシリルエーテルに、カルボニル基をメトキシムに誘導することにより、高感度に定量可能であった。次に、ヒト胎盤ミクロゾームを酵素源として、NADPH存在下阻害剤をそれぞれインキュベートした。6-アルキルADについては、6-アルキルエストラジオールをbis-TMS誘導体として、また、他の基質では19-酸素化体や△^<10(1)>体の生成をそれぞれGC-MSにて分析した。その結果、6-アルキルADの芳香核化のK_m値と拮抗阻害剤としてのK_i値との間には有意な相関がないことや、6α-アルキル体が6β-異性体に比較し、より効率的に芳香核化されることなどが明らかとなった。他方、3-デオキシADは、ADに比べれば効率は低いものの、19位酸素化反応を受けるが、脱メチル化体の△^<10(1)>体へには変換しないことも判明した。しかし、本研究では、5-en-7-one体の19位酸素化反応を検出することができなかった。以上、アロマターゼの触媒機能について新しい知見が得られるとともに、阻害剤としての特性と基質としての機能との関係を、本研究で初めて明らかにすることができた。
大動脈解離に対する統括的治療戦略の構築

本研究の目的は、胸部大動脈ステントグラフト治療(TEVAR)によるエントリー閉鎖後の大動脈リモデリング(AoR)発生期間とその因子の解明である。我々はAoRが有効に発症する時期(ERD)を同定するため、これまでB型大動脈解離にTEVARを行った706症例の検討にて、大動脈解離発症から治療までの期間が1年以内であれば有意に発症する事を明らかにした。さらに多施設前向研究として厚労省先進医療B認可の元、17症例に治療を施行し6ヶ月以内では発症しやすいことが分かった。またバイオカーカーとしてのmicroRNA解析においては、特異なmicroRNAが大動脈解離において正常人に比し有意な相違を認めた。当研究は、スタンフォードB型解離性大動脈瘤に対するステントグラフト治療後の大動脈のremodelingの解析およびそれに関わるBiomarkerの同定を目的としている。remodelingの解析には安全かつ有効なステントグラフトによるエントリー閉鎖が必要となるが、現在本邦で使用可能なデバイスでは大動脈解離特有の急峻に屈曲し、かつ口径差の大きい大動脈に対し追従困難である。そこで、欧米で使用されている大動脈解離用デバイスであるconformable TAG (W.L.Gore & Associates, Flagstaff, AZ)を個人輸入にて購入し、平成23年度にスタンフォードB型大動脈解離患者6例の治療にあたった。30日死亡は認めず、良好な早期成績であった。術後6ヶ月後のCTでは、75%に真腔の拡大および偽腔の退縮が認められており、remodelingを達成できていた。この成績をもとに、cTAGを用いた前向き多施設共同研究によるremodeling解析トライアルに関する高度医療制度の認可も取得しており、今後、同トライアルによる解析を遂行していく計画である。また組織学的検討、およびバイオマーカーの検討に関しては、大動脈解離を発症し、人工血管置換に至った患者の組織および血液サンプルを、大阪心臓血管外科研究会(OSCAR)を利用し、各施設の協力を得て収集を開始した。現在、組織学的染色、microRNAの測定を施行中である。急性期と慢性期では組織の繊維化、発現micro RNAが異なっている可能性があり、さらなる解析を行っていく予定である。近年、本邦では有症状B型急性解離に対するステントグラフト治療(thoracic endovascular aortic repair: TEVAR)がClass Iの適応が認められ、アメリカでは昨年、急性および慢性大動脈解離に対してTEVARの適応が急激に拡大されてきた。しかしどのような時期、どのような形態に有効性があるのかは未だ明らかではない。本研究の目的は、TEVARによるエントリー閉鎖後の大動脈リモデリング(Aortic remodeling: AoR)発生期間とその因子の解明である。AoRはTEVAR後の良好な遠隔成績得るのに重要な因子であることは多く発表されており、解離早期の治療においては達成しやすいと言われている。我々はAoRが有効に発症する時期(Effective remodeling duration; ERD)を同定するため、これまでB型大動脈解離にTEVARを行った706症例について、AoR発症を術前及び術後CT画像にて計測を行い、大動脈解離発症から治療までの期間が1年以内であれば有意に発症しやすいことを明らかにし、多くの国際学会で発表する機会を得た。つまりB型解離において発症から1年以内という期間(ERD)では、TEVARが有効であることが推察された。さらに多施設による前向き研究として厚労省先進医療Bの認可のもと、これまで15症例に治療を施行しさらに早期である6ヶ月以内では発症しやすい傾向があり、さらなるデータの集積を行っている。またバイオカーカーとしてのmicro RNA解析においては、384のmicro RNAの解析を行い、大動脈解離において有意に上昇もしくは減少するmicroRNAの同定を臨床データより進めている。現在5例でその分析が終了し、ERDとバイオマーカーの関係という最終研究目標に解析を進めている。また動物実験においては、大動脈解離モデル作成に時間を要したが、安定した解離モデル作成に成功した。スタンフォードB型大動脈解離に対する低侵襲治療としてステントグラフトによるエントリー閉鎖が注目されており、その良好な初期成績のみならず遠隔期に大動脈リモデリングを達成した症例では遠隔期予後が良好である事を我々はこれまでの研究にて報告してきた。しかしながら、エントリー閉鎖後に有効に大動脈リモデリングを達成できる因子は不明であり、その解明が今後の治療体系構築に大きく寄与するものと考えられてる。本研究の目的は、エントリー閉鎖後の大動脈リモデリング達成に関わる因子として、解離発症から治療までの期間(Effective Remodeling Duration; ERD)を同定すること、およびリモデリング達成を予測するバイオマーカーを同定する事である。

まずERDの同定に関して、臨床的探求として解離対応型デバイスを用いた多施設共同前向き研究であるREMODEL trialを、平成24年度に厚生労働省先進医療Bとして認可頂いた。この結果、平成24年10月に第1例目のエントリーが大阪大学にて行われ、平成24年度中に6例のエントリーを行った。平成25年度には協力医療機関からのエントリーも予定されており、順次症例数を増加する予定である。バイオマーカーの同定においては、大動脈解離解析の前駆研究として腹部大動脈瘤におけるMicroRNA分布を解析し、大動脈瘤固有と考えられるMicroRNAの同定を達成した。更に、動物実験では大動脈解離モデルの作成を行った。全身麻酔下に左後側方切開にて下行大動脈に到達。大動脈遮断後に外膜のみを切開し、中膜を剥離することで解離腔を作成。Aortic puncherにてエントリー・リエントリーを作成し、外膜のみを縫合閉鎖し遮断解除する事で、真腔・偽腔に血流が流れるdouble barrel型大動脈解離を作成した。23年度の目標としていた大動脈解離用デバイスであるcomformable TAGによる治療を開始し、初期成績を得ることができた。また組織および血液の検体も目標数まで収集できているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。臨床的探索の基幹となる多施設共同前向き研究(REMODEL trial)が厚生労働省先進医療Bとして承認され、実際にエントリーを開始できたため、有効リモデリング期間(ERD)解析において大きな前進が得られた。また基礎的探索では動脈瘤固有のMicroRNAの同定、大動脈解離モデルの作成を行い、平成24年度計画に照らし概ね順調に伸展していると考えている。予定通り、スタンフォードB型大動脈解離のaortic remodelingに関しては症例数を増やし、データを蓄積していく方針としている。また、バイオマーカーに関しては、今後も検体を収集し解析していく方針としている。臨床的探索においては、協力医療機関からのエントリーを開始し予定症例数のエントリーを速やかに進める事で、ERDの解析に使用可能なデータ収集を進める予定である。また、大動脈解離モデルを複数作成し、バイオマーカー同定に必要な検体作成を進める予定である。
イオン選択性に優れた次世代チャネルロドプシンの創出とオプトジェネティクスへの応用

チャネルロドプシン-2(ChR2)の97番目のグルタミン酸残基は,種々のChRにおいて広く保存されており,静電的な相互作用により陽イオンの透過を促進していることが示唆されている。しかしMChR1では,その部分に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換している。この意義について,MChR1の構造-機能解析,Gd(3+)によるチャネルブロックなどの研究から,MChR1のチャネルポア構造はChR2のものとは異なっていることが示唆された。また,光駆動Na(+)ポンプの哺乳類細胞での発現最適化と光による培養ニューロン活動の抑制にも成功した。これらは次世代オプトジェネティクスツールとしての活用が期待される。チャネルロドプシン2 (ChR2)の第2膜貫通ヘリックス(TM2)に見られるE82, E83, E90, E97, E101の5つのグルタミン酸残基は,イオンチャネル機能に関わる重要なモチーフのひとつと考えられている。しかし,Mesostigma viride由来のチャネルロドプシン(MChR1)では,ChR2のE83に相当するアミノ酸がバリンに,E97に相当するアミノ酸がアラニンに置き換わっている。ChRのイオン透過・透過イオン選択メカニズムを明らかにし,透過イオン選択性に優れたチャネルロドプシン改変体を創出する上で,このモチーフの機能の差異を明らかにすることが重要と考え,この5つのグルタミン酸残基が透過イオンと相互作用することで,イオン透過や透過イオン選択性が規定されているとの仮説の検証を試みた。MChR1改変体の作製では,ホールセルパッチクランプ電流記録下において,野生型のMChR1と比較して,約10倍の大きさの光電流が得られる改変体の作製に成功し,これによりMChR1の光電流特性の詳細な解析が可能になった。この改変体を用いて,Gd3+による光電流抑制効果を調べたところ,ChR2のE97に相当するアラニンをグルタミン酸に置換した点変異体では,Gd3+の結合が高親和性にシフトすることがわかった。一方で,発生する光電流の大きさは,この置換によって約1/15倍に減少した。これらの結果は,TM2に保存されている5つのグルタミン酸残基は,透過イオンと相互作用することで,イオン透過や透過イオン選択性を規定しているとの仮説と矛盾しない。一方,ChR2の構造-機能解析では,透過イオン選択フィルターをして機能していると考えられる新たなアミノ酸残基を発見した。これらは,透過イオン選択性に優れたチャネルロドプシンの創出につながる可能性のある発見である。新規に発見された海洋細菌由来の光駆動ナトリウムポンプ・KR2について,ヒトコドンに最適化したKR2を作製し,これに細胞膜移行シグナル,黄色蛍光タンパク質(EYFP),小胞体輸出シグナルを付加したコンストラクトを培養ニューロンに発現させ,黄色光を照射したところ,光照射の期間ニューロンの発火を効果的に抑制した。これにより,KR2がオプトジェネティクスツールとして新たな選択肢のひとつになり得ることを明らかにした。クラミドモナス由来の光受容陽イオンチャネル・チャネルロドプシン2 (ChR2)がイオンチャネルとして機能する上で重要なはたらきをしていると考えられている第2膜貫通領域に保存されている5つのグルタミン酸残基について,メソスティグマ藻由来のチャネルロドプシン・MChR1ではChR2の97番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸がアラニンに置き換わっている。その意義について,種々の点変異体の作製とその光電流応答,Gd3+を用いたチャネルブロック効果の定量的解析により,MChR1のチャネルポアはChR2のものと比べて大きく,水和したままのイオンがバルクで透過していることが考えられた。この研究では,野生型MChR1と比べて約10倍も大きな光電流が生じる改変体の作製に成功し,新たなツールとしての可能性を示した。ChR2のあるアミノ酸残基1か所に変異を加えると,一過性の外向き電流が流れた後,内向きの定常電流が流れる特異な光電流キネティクスを示す変異体が得られていた。この外向きの光電流成分は,少なくとも塩化物イオンと炭酸水素イオンの陰イオンであることを電気生理学的解析により同定した。この変異体のイオン透過・透過イオン選択の分子構造基盤を明らかにすることで,チャネルロドプシンのイオン透過,透過イオン選択メカニズムの解明に大きく貢献することが期待される。2013年に海洋細菌Krokinobactereikastusから単離同定された新種の微生物型ロドプシン・KR2は,光エネルギーを利用して,細胞内のナトリウムイオンを細胞外へ濃度勾配に逆らって輸送する光駆動ナトリウムイオンポンプ(NaR)として機能する。ヒトコドンに最適化したKR2に,細胞膜移行シグナル,黄色蛍光タンパク質(EYFP),小胞体輸出シグナルを付加したコンストラクトをラット大脳皮質培養ニューロンに発現させ,緑色光を照射すると,その間ニューロンの発火を持続的かつ効果的に抑制した。この研究成果により,KR2が新たなオプトジェネティクスツールとして利用できることを明らかにした。今年度は,NaRの構造-機能解析とツールとしての更なる最適化を目指して,Indibacter alkaliphilus由来のNaR (IndiR2)とのキメラ分子を作製し,タンパク質の膜発現効率や光電流特性の詳細を解析した。

あるキメラ分子をマウス神経芽細胞腫×ラット脊髄後根神経節細胞ハイブリッド細胞株のND7/23細胞に発現させると,その膜発現はKR2やIndiR2よりも優れており,またKR2では見られなかった光電流の膜電位依存性が認められるなど,新たな特性をもつ分子が得られた。NaRはナトリウムイオンの細胞内流入と拮抗することで,膜電位が発火の閾値を超えることを抑制していると考えられる。光駆動プロトンポンプや光駆動塩化物イオンポンプが過分極型オプトジェネティクスツールとして主に利用されているが,細胞内pHの変化や過剰な過分極を引き起こすなどの問題点があった。NaRはこれらの欠点を解消したオプトジェネティクスツールとしての利用が期待される。チャネルロドプシン-2(ChR2)の97番目のグルタミン酸残基は,種々のChRにおいて広く保存されており,静電的な相互作用により陽イオンの透過を促進していることが示唆されている。しかしMChR1では,その部分に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換している。この意義について,MChR1の構造-機能解析,Gd(3+)によるチャネルブロックなどの研究から,MChR1のチャネルポア構造はChR2のものとは異なっていることが示唆された。また,光駆動Na(+)ポンプの哺乳類細胞での発現最適化と光による培養ニューロン活動の抑制にも成功した。これらは次世代オプトジェネティクスツールとしての活用が期待される。当初の研究計画の進捗はもとより,新規海洋細菌由来ロドプシンのオプトジェネティクスツールへの最適化およびその応用の成功や,特異な光電流応答を示すチャネルロドプシン点変異体の発見とその詳細な構造機能解析においても着実に成果を挙げている。これらの研究進捗状況を考慮すれば,本研究課題は「当初の計画以上に進展している」と評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子・細胞神経生物学チャネルロドプシンの一アミノ酸変異体のイオン透過・透過イオン選択性の構造的基盤解析においては,海外の研究機関との共同研究によって,強力に推し進めていくことを予定している。当初の研究計画通りに進行していることに加えて,ChRの構造ー機能解析において,本研究目標の達成に関わる新たな発見もあり,本研究課題は順調に進行していると判断できる。当初購入を予定していた機器を,当該年度に購入する必要がなくなったため。なお,機器を購入しなかったことによる研究計画の遅れはない。当初の研究計画はもとより,ChRにおいて,イオン選択フィルターとして機能していると考えられる新たなアミノ酸残基を発見できたことは,本研究計画を遂行する上で大きな進展となり得る。次年度では,当初の研究計画に加えて,新たに発見したChRのアミノ酸残基の機能についても鋭意検証していく。本年度に当該機器を購入し,研究の進展を図る。また,試薬や培養用プラスチック器具等の購入に充当する。研究計画当初購入を予定してた機器の購入見送りにより,次年度使用額が発生したが,これによって研究計画に遅れが生じるものではない。試薬や培養用プラスチック器具購入等の物品費に充当する。