hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストン脱メチル化酵素Jmjd1aによる糖脂質代謝調節

Jmjd1aは、転写の発現抑制に関与するエピジェネティックな標識であるヒストンH3の9番目のリジンのメチル化修飾を外す酵素である。我々は、Jmjd1aのノックアウト(KO)マウスが肥満や糖脂質代謝異常をきたすことを発見して報告した。さらに、遺伝子発現解析を行うとともに、独自に作製したクローン化Jmjd1a抗体を用いてクロマチン免疫沈降とショットガンプロテオミクスを行った。その結果、KOマウスや新規に樹立した褐色脂肪細胞におけるJmjd1aの代謝関連標的遺伝子を明らかにし、さらにレトロトランスポゾンをコードする領域がJmjd1aによって制御されていることを明らかにした。プロテオミクス解析では、RNAプロセシングに関わるタンパク群やヒストン脱アセチル化に関与するSin3aとの複合体形成を認めたほか、Jmjd1aの翻訳後修飾を明らかにした。本研究結果は、ヒストンのメチル化変化が代謝制御に関わるという世界で最初期の報告に結実しており、さらに詳細な分子機構の解明に結びつくことが期待される。我々はHistone H3の9番目のLysine (H3K9)の脱メチル化酵素であるJmjdlaのKnockout (KO)マウスが肥満をきたすことを発見した。そこで、このマウスにおける血漿プロファイリングを行った。その結果、Jmjdla KOマウスは野生型マウスに比較して、血中の中性脂肪値、コレステロール値、グルコース値、インスリン値が有意に高値であった。さらに、グルコース負荷試験、インスリン負荷試験の結果、Jmjdla KOマウスではインスリン感受性が低下していた。これらの結果から、Jmjdla KOマウスがメタボリックシンドロームの状態にあり、初期糖尿病マウスモデルであることを見出した。実際、このマウスの白色脂肪量は野生型より多く、さらに16週齢までの若年マウスを用いて病理学的解析を行った結果、脂肪細胞のサイズが大型化していることが明らかになった。一方、肝臓、骨格筋、褐色脂肪においては、特別な病理学的変化を認めなかった。次に、肥満のメカニズムを解明するため、生理学的検索を行ったところ、摂食量や酸素消費量においては野生型とJmjdla KOマウスの違いを認めなかったが、Jmjdla KOマウスは野生型に比べて呼吸商が高値であった。このことは、Jmjdla KOマウスのエネルギー源が脂肪から糖にシフトしていることを示しており、脂肪が特異的に蓄積している表現形を鑑みて、合理的であった。さらに、Jmjdlaの標的遺伝子を検索するために、肝臓、骨格筋、白色脂肪、褐色脂肪においてマイクロアレイを行った。マイクロアレイの結果をもとに、Adamts9、ApoC1、Glut4の発現が、Jmjdla KOマウスの白色脂肪とsiRNAを用いてJmjdlaをKnock downした3T3L1脂肪細胞の両方で、低下していることを見出した。さらに、ChIP PCR法でJmjdlaとH3K9デメチル化が、これらの遺伝子のプロモーター部位に多く結合していることを確認した。これらの遺伝子は、糖尿病や脂肪蓄積を関連する遺伝子であり、JmjdlaKOマウスが肥満を示す原因となっていると考えられる。以上の結果は、ヒストンのメチル化変化と代謝の関係を示す最初期の発見のひとつであり、その成果はGene to Cells誌に掲載された。本年は、ヒストン脱メチル化酵素Jmjd1aの標的遺伝子解析を行うために、Mouse Embryonic Fibloblast(MEF)の作製系を樹立し、それを用いてChIPシークエンス行った。ChIPシークエンスの条件検討には非常に多くの時間を費やしたものの、結果的にピストンH3K9me2,H3K9me3抗体を用いて再現性のあるChIP-PCR、ChIPシークエンスを行うことができるようになった。その結果、代謝関連遺伝子や細胞周期関連遺伝子群のプロモーター領域にJmjd1aノックアウトマウス由来のMEF細胞特異的にH3K9me2,H3K9me3レベルが増大している結果が得られた。この結果が転写調節に反映することを確認するために引き続きマイクロアレイを用いた発現解析を行う予定である。実際には、ヒストン修飾変化による発現変化は定常状態では少ない印象が得られたため、今後の検討においては何らかの追加的な刺激が必要と考えられる。そのため、低グルコース、高グルコースで刺激したMEFを用いて研究を行うことを予定している。

本年度のChIPシークエンスの検討はヒストンH3K9me2,H3K9me3抗体を用いて行ったが、今後はH3K9me1などの抗体のほか、Jmjd1a抗体を使用する予定である。そのため、Jmjd1a抗体作成を行った。当初、Jmjd1aのN末端、C末端の50アミノ酸の抗原を設計してバキュロウィルスの系をもちいて、マウス抗体を作成したが、Jmjd1aを認識する抗体を得ることができなかった。そのため、mid-portionに抗原を設計しなおすこととし、再度抗体作製を行ったところ、ウェスタンブロッティング・免疫沈降の両方でJmjd1aを認識することができる細胞上清を得ることができた。現在、抗体をクローン化してモノクローナル抗体を作成しており、次年度には、ChIPやプロテオミクスの条件等が行うことが期待される。そのことにより、Jmjd1aの直接的な標的遺伝子が明らかになり、その作用機序を解明していけるものと考えている。ヒストン脱メチル化酵素Jmjdlaの標的遺伝子解析を行ったほか、Jmjdlaと時計遺伝子の関与について検討した。さらに、Jmjdlaの作用複合体解析を開始した。肥満のJmjdlaKOマウスと野生型マウスから得られたMEF細胞についてChIPシークエンス(seq)行い、標的遺伝子を解析した。昨年度の結果に加え、ヒストンH3K9mel抗体を用いたChIP seqの結果を得ることで、H3K9のメチル化レベルがJmjdlaの発現によって変化する遺伝子領域を検討した。さらに、H3K4me3抗体を用いてChIP seqを行って、活性化された遺伝子の転写開始点を網羅的に解析するとともに、RNA seqの手法を用いて遺伝子発現自体を検討した。その結果、4.5sRNAのコード領域の近傍にJmjdlaKO MEF特異的に発現している未知の転写産物が確認された。JmjdlaKOマウスの表現形を考慮すると、この転写産物は代謝制御に関与している可能性が考えられることから、より詳細な検討を行うこととし、全長のクローニングを開始した。JmjdlaKOマウスから得られる臓器を用いた発現マイクロアレイの結果に基づいた基礎データにおいて、サーカディアンリズム関連遺伝子の発現変化を認めたことから、Jmjdlaとリズム調節の関連についての検討を行った。中枢時計への影響を検討するため、マウスの行動解析をおこなった。12時間の明暗条件に順応させた後に恒暗条件にして、活動時間のシフト変化を検討したが、JmjdlaKOマウスにおける有意な変化を認めなかった。この結果、Jmjdlaが末梢時計に関与している可能性を考えて検討を行った。JmjdlaKOと野生型のMEFを100nMデキサメサゾンで15分間処理して慨日リズムの時間振幅を誘導した後、時間経過後の時計遺伝子発現を検討した。Hlf遺伝子の発現が、検討したどの時間においてもJmldlaKO MEFで低下していたものの、コアクロック遺伝子の発現リズムの差は認められず、Jmjdlaとコアクロック遺伝子との関連に関する証左は得られなかった。Jmjdlaの作用複合体を解析するため、作製したJmjdlaモノクローナル抗体を用いてプロテオミクス解析を開始し、現在詳細に条件検討を行っている。
麻酔薬の作用機序におけるGABA受容体とERK経路の役割に関する研究

静脈麻酔薬プロポフォールの作用機序について、γアミノ酪酸(γaminobutyric acid:GABA)A受容体サブユニットとの関係を示す報告は多く存在する。しかしながら、GABAA受容体の発現はどのような分子メカニズムで調節され、それがプロポフォールによる麻酔作用とどのように関わっているかについては未だに不明な点が多い。本研究は細胞外シグナル調節キナーゼ(extracellular signal regulated kinase: ERK)とGABAA受容体発現の関係に注目し、ERKがGABAA受容体の発現、もしくは活性の制御に関連しているのではないかという仮説のもと研究を行っている。以前に防衛医科大学校生化学講座の佐藤泰司らは東京都健康長寿医療センターの遠藤昌吾と共同でERK2標的遺伝子改変マウスを作出した(Satoh et al., 2011, J. Neurosci)。本研究ではこれらのマウスを用いて、ERKとGABAA受容体の関係について解析を行ってきた。これらのマウスの海馬由来神経細胞初代培養細胞を採取し、初代培養神経細胞を得た後、培養15日目に細胞を回収した。これらのサンプルに対し、様々なGABAA受容体サブユニットに対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、GABAA受容体サブユニットの発現を解析してきたた。その結果、ERK2遺伝子の欠損により、いくつかのGABAA受容体サブユニットの発現が野生型マウスと比較して変化していることを発見した。さらに、これらの初代培養神経細胞において、各種GABAA受容体サブユニットの発現を共焦点レーザー顕微鏡で可視化する試みを行っており、ERKによるGABAA受容体サブユニットの発現の制御メカニズムを詳細に観察する予定である。現在まで海馬初代培養細胞におけるERKとGABA受容体の動態を共焦点顕微鏡を用いて可視化しようと試みている。この点に手間取っており、研究がやや遅れている。しかしながら解決の見込みが立ちそうなので、今後は研究を加速していきたい。なるべく早く、共焦点顕微鏡を用いてGABA受容体の動態を可視化する技術を確立したい。さらに電気生理学的手法も取り入れ、さまざまな手法を取り入れて包括的に仮説の検証を行っていく。初年度はノックアウトマウスの準備などで実験補助員の人件費が多くなった。一方、実験器具や試薬はできるだけ既存のものを使った。次年度以降もマウス管理用の実験補助員の人件費が見込まれるため、次年度使用額を使っていきたい。
海洋生物資源保全における予防原則の規範的意義の研究

本年度の研究実績は、主に以下の2点に整理することができる。まず第1に、予防原則の法規範性の特性について、国連海洋法裁判所のみなみまぐろ事件暫定措置命令の分析を出発点に、従来の学説の批判的検討を行った。その結果、「準則」ではなく「原則」としての予防概念の1つの特性が、国家の行動を直接規律する「行為規範」としての性質ではなく、そうした行為規範の発展や調整の局面において作用する「決定規範」としての性質に見出すことができることを明らかにした。第2に、以上の理解を前提として、漁業分野における予防概念の展開の特質を、持続的利用といった他の「原則」との相互作用の観点から把握し、漁業条約体制の実証的検討を通じて「原則」間の調整規則の発展を明らかにした。そしてこれらの調整規則の発展は、条約体制で発展する規則の正当性を維持し、その実効性を高めるという意義をもつと同時に、「決定規範」としての予防概念の適用に関する予見可能性を向上させるという意味で、法的確実性の維持という観点からも車要な意義を有することを明らかにした。以上の研究成果は、「条約解釈における予防概念の規範的意義」並びに「海洋生物資源における予防概念の展開」として平成19年度に公表する予定である。特に前者については、英文での公表も予定している他、環境法政策学会での報告が既に決定している。本研究の基本的な問題関心は、従来の自由主義的な秩序原理(経済功利主義)と予防原則の関係にあり、この点を問題視してきた予防原則の法規範性に対する否定的見解(以下「否定論」)の理論的克服を目的とする。17年度の前半においては、漁業分野における予防原則をめぐる従来の学説の検討と、漁業関連条約の秩序原理の検討を中心に研究をすすめ、関連する文献・資料の調査を遂行した。漁業分野に関する学説においては、汚染分野との異質性が総じて自覚されており、汚染における「予防原則」と漁業における「予防アプローチ」との区別が強調されることが多い。しかし、他の環境分野においてしばしば主張されるように、そこでいう「アプローチ」概念はその法規範性を否定する意味までも含むのかという点や、そうした「予防アプローチ」に基づく予防的制度の形成が、従来の秩序原理にいかなるインパクトを与えるものであるのかという点については、十分に明らかにされていない。このように漁業分野に関する従来の学説においても、否定論の根本的な問題提起に応じていないという理論上の問題があることが明らかにされた。以上のような先行研究の整理・評価をふまえたうえで、17年度後半においては、20世紀前期・中期の漁業協定や1958年「公海資源保全条約」等の実証的検討を主に遂行した。その結果、これらの条約体制の基本目的が最大限の食糧供給の確保にあり、各国の漁獲の権利に基づく経済功利主義の原理に基礎を置くものであることが明らかとなった。そして、その後予防アプローチを採用した1995年「国連公海漁業実施協定」等の検討にも着手し、経済功利主義からの「脱却」を志向する汚染分野とは対照的に、漁業分野においてはセーフティーマージンの設定による経済功利主義の「修正」に特徴があることが判明したが、この点についてはさらに検討を継続中であり、18年度に研究成果として公表していく予定である。
富士山をフィールドとした多面的実践学習プログラムの開発とそれによる教科間相互作用

富士山をフィールドとして,地学・芸術・文学から構成される多面的実践学習プログラムを作成した。平成26年・28年度には,学部生向け専門科目「地学野外実習」の場を活用し,同プログラムの現地での実践を試みた。そこでは,特に風景をスケッチする経験が,現地でのフィールド観察の視野の広さ・観察の視点の深さ等に,どのように影響するかに注目した。課題レポートにおけるスケッチ関連の記述から判断すると,絵を描くことに費やす時間とエネルギーに見合う,多数の正の側面が得られたように思われる。また,各過程で描かれたスケッチや絵画を比較することで,逆に現場での観察の経験が芸術的な表現にも正の影響を与えることが確認された。平成26年度は,当初の予定通り,富士山をフィールドとして,それぞれの専門分野からの視点から,1)野外の観察地点の下見・調査,2)浮世絵,和歌等の選別・収集,を行うとともに,3)多面的実践学習プログラムの作成および一部実践,を実施することができた。より具体的に述べると以下の通りである。富士山および関東各地の富士見の名所をフィールドとして,富士山の地形的特徴の明瞭性を重視しつつ,和歌・俳句の解釈および写生の実施に適しているか否か,という観点で下見を行った結果,十数箇所を抽出することができた。また,膨大な数の富士山を対象とした浮世絵,和歌等のなかから,その地形的特徴,地質学的な成り立ちの理解に繋がるものを取捨選択し,あとに述べる野外観察実習の事前・事後指導において,提示することができた。さらに,これら調査結果を集約した野外観察プログラムに基づき,茨城大学教育学部授業「地学野外実習」として,富士山をフィールドとした野外実習を実施することができた。引率教員の構成は,地質・地形・美術,理科教育と多様な専門分野からなり,本研究の根幹となる全く異なる分野どうしの相互影響度をはかる絶好の機会となった。また,野外実習後も定期的(月に一度の頻度)に研究組織内で打合せをもち,野外実習の成果,今後の課題,平成27年度の研究計画等,議論し,詰めることができた。平成26年度は特に,美術的な事前観察がその後の地質的・地形的な観察にどのような影響を及ぼすか,また地質・地形的な観察が,美術的な表現にどのように影響を及ぼすか,という点を中心にデータを取ることができ,現在,解析中である。本研究の目的は,自然科学・美術・文学的な観察・鑑賞の対象であり続け,また日本のシンボルとも言える富士山を対象として,浮世絵や和歌・俳句の鑑賞,写生の実施・俳句作り,立体地形モデルの作成と観察,巨大床地図の観察,地形実験,現地観察を有機的に配置した多面的実践学習プログラムを構築し,その実践を行うこと,それによる教科間相互作用を測ることにある。これを踏まえ,2年目にあたる平成27年度には以下の点を主に実施した。1)平成26年度に実施した富士山における地学野外実習に関する総括・まとめ・公表2)平成28年度に予定されている地学野外実習に向け,各種教材および教育プログラムの策定まず,1)に関しては,特に平成26年度地学野外実習の引率を担当した地学,理科教育,美術の各分野の教員が中心となり,それぞれの分野からの反省を行うとともに,教科間の関連付けについても議論を重ねた。また,平成28年度に予定されている第二回目の富士山での野外実習に向け,課題を抽出し,改善点の概要をまとめた。以上の成果は,以下で示すように,学会で発表するとともに,論文としてまとめ公表済みである(伊藤ほか,2015)。2)に関しては,研究分担者それぞれが,各分野の教材開発を行うとともに,それの関連づけに関し議論を重ね,全体のおおまかな枠組みを決定することができた。とくに,平成26年度に実施できなかった富士山を素材とした浮世絵・絵画等の鑑賞を,現地調査のモチベーションにつなげるべく,富士山の地形的な特徴等が明確なものの抽出作業も徹底して行った。平成26年度に富士山をフィールドに実施した地学野外実習については,特に,地学・理科教育・美術の観点から,その成果を総括することができた。またそれについては,学会で発表するとともに,論文として公表することができた。ただ,各種都合により,富士山に関連した文学を野外実習の充分に生かすことができなかった,教育心理の面から教育効果を測ることができなかった等,課題も残った。しかし,平成28年度に実施予定の研究計画全体を盛り込んだ地学野外実習については,概要も明確になり,その効果が期待できる。これを踏まえ,3年目にあたる平成28年度には以下の点を主に実施した。1)富士山をフィールドとした地学野外実習の実施2)多面的学習プログラムのノウハウの他フィールドでの応用まず,1)に関しては,平成26年度の地学野外実習に引き続き,本科研費期間,二回目の実施となった。

前回と比較し,a)引率者として新たに教育心理の専門家を加え,教育的効果の測定を行った点,b)事前事後指導において,富士山をモチーフとした絵画の鑑賞を取り入れた点,c)下見の成果を取り入れ,富士山南西部も観察地点に加え,結果,富士山をぐるりと一周,様々な角度から見ることができた点,で大きく異なる。これら新しい試みの成果は,テキストマイニングの手法を用いて現在解析中である。2)については,富士山で実施した内容の簡易版を筑波山をフィールドとして実施した。参加した学生は美術を専門とする学生であり,自然科学的な学びが芸術的な表現にどのように反映されるか,現在検討中である。またフィールドの違いを越えた実践手法の一般化が可能であるか,今後の検討課題である。これら研究成果は,平成29年度中の論文化を目指している。これまで,この科研費研究期間前である平成23年度に加え,平成26年度,平成28年度の計三回分,富士山をフィールドとした地学野外実習を実施することができた。初回の平成23年度は純粋に「地学」の野外実習であるが,その後,平成26年度・平成28年度については,地学が主体ではあるが,美術・文学・日本史等に関する要素も取り入れた分野横断的かつ多面的な内容となっている。平成23年度分,平成26年度分,それぞれ単独の試みは,伊藤ほか(2012),伊藤ほか(2015)として公表済みであるが,現在,三回の試みを総括した論文を執筆中である。その論文では,三回分の学生レポートを素材として,学びの質をテキストマイニングの手法を用い定量的に議論する予定である。また,文学の観点から実施した事後指導の内容は,橋浦(2017)として公表済みである。最終年度は,これまでの研究の総決算として,特に富士山をフィールドとして実施した野外観察実習のまとめを行った。具体的には,参加学生によるレポート・感想,事前指導時,野外実習時,事後指導時に描かれたスケッチなどを材料に,本研究で作成した多面的実践学習プログラムの教育的な効果について考察した。その結果,受講学生は自然をじかに見つめて,諸感覚を働かせ,様々な視点から対象をとらえて描くことができていたこと,自然や対象の美しさや面白さ,情緒,生命感やものの存在感,美の感動や不思議などを感じ取ることができていたこと,などが明らかとなった。また,少なくとも大学生のレベルでは,スケッチに費やす多くの時間とエネルギーに見合う,観察課題の抽出,観察対象に対する新たな気づき等,多数の正の側面が得られたように思われる。以上の結果は,Ito et al. (2017)としてAGU 2017ニューオーリンズにおいて公表した。また,上記,プログラムの汎用性を確認するため,筑波山においても同様の試みを実施した。その結果,美術におけるスケッチ学習に理科的内容の指導を加えることで,学習者に,科学的な理解,気付きによる視点の変化,興味・関心の醸成をもたらし,加えて,個々の観察における視点の明確化,独自性のあるスケッチ作品の創出に寄与することが明らかとなった。本研究の成果は,片口ほか(2018)として,茨城大学教育学部紀要にて公表した。富士山をフィールドとして,地学・芸術・文学から構成される多面的実践学習プログラムを作成した。平成26年・28年度には,学部生向け専門科目「地学野外実習」の場を活用し,同プログラムの現地での実践を試みた。そこでは,特に風景をスケッチする経験が,現地でのフィールド観察の視野の広さ・観察の視点の深さ等に,どのように影響するかに注目した。
気道防御反射を修飾する種々の要因に関する研究

本研究の第一の目的はヒトの気道粘膜に一定の刺激を与えることによって生じる気道防御反射の反射様式を明らかにすることであり、第二の目的は臨床上重要な様々な要因が如何に気道反射を修飾するかについて検討することである。本研究期間の平成7年度にはヒトにおける気道部位別刺激法ならびにその評価法を確立し、平成8年度の研究では静脈麻酔薬(プロポフォール)および麻薬(フェンタニール)の気道防御反射に対する影響についての研究を重点的に行った。また、喫煙の気道防御反射に対する影響、さらに吸入麻酔薬による麻酔導入時における気道防御反射の影響についても検討した。研究結果を以下に要約する。1.ヒトの後頭部および気管支分岐部の刺激に対する感受性は高く、吸入麻酔薬(セボフルレン)による麻酔下では咳嗽(咳)反射、呼気反射、痙攣様呼吸促迫反応、無呼吸反射を容易に誘発できる。一方、末梢の気管支部位は刺激に対する感受性が低く、気道防御反射は容易に生じない。2.セボフルレン麻酔による麻酔深度の増強は反射の反応時間を短縮するが、反射の質には影響しない。3.プロポフォール単独では気道防御反射を抑制することは不可能であり、小量のフェンタニール追加がより効果的に気道防御反射を抑制した。フェンタニールによる気道防御反射の抑制様式は咳反射や呼気反射を用量依存的に抑制するものであり、無呼吸反射や喉頭痙攣反応は比較的保存された。4.喫煙の影響に関しては、気道の刺激法の違いにより結果が異なり、機械的刺激によってのみ気道防御反射亢進の影響が認められた。5.気道刺激性が比較的少ないセボフルレンでも鼻気道を介する気道防御反射を誘発する可能性が示唆された。本年度はラリンゲルマスクおよび内視鏡を使用して、ヒトにおいて気道の部位別刺激を行う方法を確立した。具体的には、術前検査で心肺機能や神経筋機能に異常のない手術予定患者を対象として吸入麻酔による麻酔導入後にラリンゲルマスクを挿入し、さらにラリンゲルマスク内より内視鏡を気道内に挿入し直視下に気道各部位(喉頭、気管、気管支)粘膜の刺激する方法を確立した。気道粘膜は内視鏡を気道粘膜に接触させる機械的刺激および内視鏡吸引用側孔より目標とする部位に小量の蒸留水を注入することにより気道粘膜を刺激する蒸留水刺激法の二つの方法を行った。これらの刺激によって生じる気道反射は気道内圧や気流の変化を記録し、これらを分析することにより定性的および定量的に評価することが可能であった。二つの方法による再現性を繰り返し刺激によって検討したところ、蒸留水刺激法は再現性の点で機械的刺激法より明らかに優れており、標準的な刺激法になりうる可能性が示唆された。蒸留水刺激法を用いた研究の結果、喉頭部、気管分岐部、気管支部の刺激によって部位別の気道反射の違いが明かになった。すなわち喉頭部および気管支部は刺激に対する感受性が特に高く、咳反射、呼気反射、痙攣様呼吸促伯反応、無呼吸反射などを誘発するが、気管支部は刺激に対する感受性が低く、気道反射は容易に生じない。また、吸入麻酔薬(セボフルレン)による麻酔深度の増強は反射の反応時間を短縮するが、反射の質や気道部位別の違いには大きな影響は与えない。これらの結果は動物実験で報告されている結果と多少異なり、動物実験の結果をそのままヒトに当てはめることには問題があることを示唆している。本年度は我々がすでに確立した気道刺激法およびその評価法に加えて、内視鏡ビデオ撮影記録を用いた詳細な喉頭反応の観察を行った。本年度は静脈麻酔薬の気道防御反射に対する影響についての研究を重点的に行ったが、それに加えて喫煙の気道防御反射に対する影響、さらに吸入麻酔薬による麻酔導入時における気道防御反射の影響についても検討した。

1.静脈麻酔薬プロポフォールは単独投与の場合、喉頭粘膜への蒸留水刺激によって呼気反射、咳反射、痙攣様呼吸促迫反応を主とした反射を誘発した。しかし、プロポフォールに小量のフェンタニールが追加された場合は前述の反射硬化の発生頻度は減少し、無呼吸反射や喉頭痙攣反応が出現するようになった。さらに、フェンタニールの投与量が増加すると、呼気反射、咳反射、痙攣様呼吸促迫反応は用量依存的に抑制され無呼吸反射および喉頭痙攣反応だけが残るようになった。これらの結果はプロポフォール単独では気道防御反射を抑制することは不可能であり、小量のフェンタニール追加がより効果的に気道防御反射を抑制することを示唆している。2.喫煙の影響については喫煙者と非喫煙者を対照としてセボフルレン麻酔下での喉頭粘膜蒸留水刺激および機械的刺激に対する反応を検討した。その結果、蒸留水刺激では両群に差は認められなかったが、機械的刺激に対しては喫煙者でより強い反応が生じた。この結果は刺激の種類によっては喫煙が気道防御反射を亢進することを示唆するものである。3.吸入麻酔薬による導入時における気道反射の研究ではセボフルレンを用いて行ったが、気道刺激作用が比較的少ないセボフルレンでも鼻気道を介する気道防御反射が誘発されることを示唆された。
アーキア膜脂質の生産によるバクテリア細胞膜強化の試み

アーキアの膜脂質の構造は、バクテリアや真核生物といった他生物の膜脂質とは大きく異なっている。その構造の違いにより、アーキア膜脂質で構成された膜はイオンなどの小分子の透過性が低く、その性質が極限環境におけるアーキアの生育を可能にしていると考えられている。そこで我々はアーキア膜脂質をバクテリアである大腸菌に生産させることで、その細胞膜の強化を図っている。本研究では、アーキア膜脂質の生産量を向上させるために、前駆体生合成経路の大腸菌への導入を実施した。また、膜の強化に対してより高い効果が期待される、超好熱性アーキア特異的な膜脂質の生合成経路を明らかにし、同脂質の大腸菌における生産系を構築した。アーキア膜脂質の存在が同脂質を生産する大腸菌の細胞膜に与える影響を調べることを目的とし、まずは生産量の向上を図った。酵母のメバロン酸経路の遺伝子をプラスミドによりアーキア膜脂質生産大腸菌に導入し、さらに同経路の中間体を与えるメバロノラクトンを培地に添加することでアーキア膜脂質の生産量を向上させることに成功した。しかし、達成された生産量は膜の性質を調べるにはまだ不十分なレベルであり、さらに高生産状態は不安定で維持することが難しかった。そこで、その改善を目的として複数種のアーキアおよびバクテリアからアーキア膜脂質などイソプレノイドの生合成前駆体供給経路であるメバロン酸経路関連酵素の遺伝子を単離した。それらの酵素の一部は、近年我々が見出した変形メバロン酸経路に関与するものであり、それ以外の酵素も、古典的な真核生物型のメバロン酸経路に関与するものの、既知酵素とは大きく配列が異なっている。それらの遺伝子の大腸菌への導入によって、アーキア膜脂質をはじめとするイソプレノイドの生産を大幅に向上させることができると期待している。特に、バクテリア由来の一部酵素については、生成物によるフィードバック制御を受けないという予備的な結果が得られており、導入の効果が高いと予想される。また、多様な構造のアーキア膜脂質の生産が大腸菌細胞膜に及ぼす影響の違いを調べるため、ヒドロキシアーキオールコアを持ったアーキア膜脂質の生産系を構築した。既知酵素のホモログ遺伝子を多様なアーキアから単離し、アーキア膜脂質生産大腸菌に導入することで、異なる種のアーキアから水和反応を触媒すると予想される酵素遺伝子を見出した。大腸菌におけるアーキア膜脂質の生産量が低いことが最大の課題であり、その改善のためにプラスミドによるメバロン酸経路の導入や培地成分の検討などの対処を行った。その結果、アーキア膜脂質の生産量を向上させることには成功したが、それでも大腸菌内在性の膜脂質と比べるとアーキア膜脂質の生産量は少なく、細胞膜の物性や大腸菌のフェノタイプへの影響を安定に観察できていない。特に、アーキア膜脂質の高生産状態が不安定であり、培養を繰り返すと生産量が低下することが大きな問題となっている。今後は導入するメバロン酸経路遺伝子をバクテリアやアーキア由来のものに変えたり、遺伝子導入の手法を再検討するといった対策が必要だと思われる。また、ヒドロキシアーキオールコアを持つアーキア膜脂質の生合成遺伝子については、いずれも既知の構造の膜脂質を生産するアーキアに由来するものであり、したがって当初期待していたような、構造の異なるヒドロキシアーキオール脂質の生合成遺伝子は単離できていない。超好熱性アーキアAeropyrum pernixが特異的に生産する、C25,C25アーキオールコアを持ったイソプレノイド膜脂質の生合成経路の解明に成功した。その過程において、新奇な2つのプレニル基転移酵素と1つのプレニル基還元酵素の同定を行なっている。それらの酵素はいずれもC25炭化水素鎖を有するアーキア膜脂質の前駆体に対し、一般的なC20炭化水素鎖を持つ前駆体に対するよりも高い特異性を示した。それらの酵素の遺伝子に加えて、必要なアーキア酵素の遺伝子をプラスミドを用いて大腸菌に導入し、バクテリア細胞内でのC25,C25アーキオール型アーキア膜脂質の生産に初めて成功した。同脂質は強靭な膜を形成することが知られており、大腸菌の細胞膜に対する影響に興味が持たれる。また、アーキア膜脂質の大腸菌細胞における生産量の向上とそれによる表現系の明確な変化の観察を目指し、同脂質の前駆体供給経路であるメバロン酸経路をCRISPR/Cas9システムを用いて大腸菌ゲノムに挿入した。しかし、一部酵素の活性が低いなどの問題が生じ、プラスミドを用いた導入方法に比べて低い生産量しか達成されなかった。ゲノムにおける挿入部位などの再検討が必要だと思われる。一方、プラスミドを用いた手法では、最近我々が見出した新奇な変形メバロン酸経路や、それを人工的に改変した経路の導入を試みることでイソプレノイド生産量を向上させることに成功している。今後アーキア膜脂質の生産向上への応用を図る予定である。

また、膜の強化に対してより高い効果が期待される、超好熱性アーキア特異的な膜脂質の生合成経路を明らかにし、同脂質の大腸菌における生産系を構築した。大腸菌へのメバロン酸経路遺伝子群の導入を、プラスミドではなくゲノムへの相同組換えによって行い、アーキア膜脂質の安定した高生産を実現しようと考えている。大きな遺伝子断片のゲノムへの挿入は一般に難しいが、近年バクテリアのゲノム操作にも用いられるようになったCRISPR/Cas9システムによる実施例が報告されており、我々もこの手法を用いる予定である。酵母由来の遺伝子群と、バクテリア由来の遺伝子群それぞれの大腸菌ゲノムへの導入を予定している。アーキア膜脂質の構造多様性の確保については、ヒドロキシアーキオールコアを持つ膜脂質以外にも、一般の膜脂質より炭化水素鎖が長いC25アーキオールコアを持つ膜脂質の生産を行おうと考えている。すでに一部生合成遺伝子の単離は行っており、今後既発表の方法と同様にして大腸菌における生産系を構築する。多様な構造のアーキア膜脂質を大腸菌において大量かつ安定に生産させることで、細胞膜の物性や大腸菌の表現系にどのような影響が出るかを多面的に観察していきたい。酵素化学当初平成28年度のスタートを予定していた研究内容である、細胞膜の物性評価や大腸菌の表現系の検討に至る前に問題が生じ、その解決に時間がかかっている。そのため予算の未消化分が生じ、平成29年度に繰り越されることとなった。繰り越した予算は当初平成28年度に予定していた膜の物性評価などの実験を平成29年度に開始するため、および新たに生じた課題である膜脂質の安定生産の実現を目的とした実験のために使用する。平成29年度分として請求した予算については、膜脂質の構造多様性の確保といった当初の予定通りの実験を実施するのに使用する。
クラウドコンピューティングミドルウェアのソフトウェアモデル検査手法

クラウドコンピューティングに代表される,ネットワークアプリケーションを対象としたソフトウェア検証の手法を開発した.先行研究で開発したモデル検査手法に基づくツールを,さまざまなプロトコルや通信形態に対応できるように拡張するとともに,モデルベーステスト手法に基づくツールも新たに開発することで,検証可能なアプリケーションの範囲を広げた.クラウドコンピューティング環境におけるプロセス協調ソフトウェアであるZookeeperをはじめとするさまざまなネットワークソフトウェアへの適用を通して,ツールの有効性を確立した.研究実施計画に記載のテーマに関して進捗を述べる.(1)マスタースレーブモデル検査方式に関しては,その動作原理を定式化し,基本的な性質(健全性)の証明,および他方式に対する時間・空間性能の机上比較等の検討を行った.性能に関しては,最も一般の場合には状態数の増加が確認されたため,現実のアプリケーションが持つ特有の性質に着目した最適化方式を考案し,この方式が健全性を保つ条件を確定した.対象ミドルウェアの検証のためにはnative peer等の整備が必要であることから,プロトタイプの作成は優先度を下げることとし,今後は定式化のために置いた仮定(同期通信)の妥当性確認と仮定の除去の方向を目指す.(2) native peerクラスライブラリの構成に関しては,当初計画通り,java.nioパッケージに対応するように構築を行った.既存の部分的実装を検討した結果,クラスによってまちまちな方法がとられていることが判明したため,既存ブロック入出力をラップする層で,ペンディング入力の読込を整数型選択生成器で行う方式を一貫して用いるように方針のもとですすめ,次項目で必要な範囲のnative peerクラス群を実装できた.あわせて,本方式による実装で探索可能なパターンの定式化も行った.(3)既存ツールによるミドルウェアソフトの検証は,ZooKeeperコンポーネントを主対象とすることとした.クラウド基盤全般にわたってサーバ間の協調動作を制御する,並行動作による競合に関連の深いコンポーネントであるからである.既存テストセットによるテストで意味のない結果が大半を占めたことを受け,テストセットをモデル検査目的に合うように改変した.このテスト結果に基づき,今後,検証モデルの改造を行っていく.研究実施計画に記載の項目に従って進捗を述べる.(1)ノンブロッキングIOについては,実アプリケーションへの適用を行い,OSSのウェブサーバの不具合を検出して,有用性を示した.また,UDPプロトコルサポートを実現した.さらに,当初計画にない以下の2点を追加実施した.一つはnet-iocacheの設計見直しで,SUTとピアが整合していることに関する制約を緩和することを目指している.もう一つは,中心化方式からの技術の取り込みであり,具体的にはnative codeの自動処理を可能にする拡張を開始し,設計までを行った.(2)モデルベーステストツールModbatは,前年度のプロトタイプを発展させ,Scala上に実現したDSLを持つテストツールとして公開した.JPF用のjava.nioライブラリの他,SAT solverへの適用でも実際に不具合を検出し,有効性を示した.(3)マスター・スレーブモデル検査では,検証モデルを同期通信から非同期通信に変更した.アルゴリズムの再定義を完了し,その正当性も示した.プロトタイプ実装を行い評価した結果,性能を得るために設計変更が必要であることが判明したため,具体案の検討を行った.(4)ディプロイメントについては,引き続き運用時の環境構築に力点をおいている.この見地から,新しい仮想マシン間通信方法の考案,および,運用時の通信を監視するアーキテクチャの考案を行った.また,事例研究として,OpenFlow方式のSDNネットワークモデルを本課題のライブラリを用いて検証し,プロトコルサポート等に関するフィードバックを得た.研究実施計画に記載の項目に従って進捗を述べる.(1) Java通信ライブラリのJPF対応では,各APIの意味を確定し,特にblocking IOによる実装を用いてnon-blocking IOの検証を行うことが妥当であることを確認した.その上で,従来のアドホックな実装を整理し,再設計・実装を行った.この検討を通して,新しいモデルベースのAPIテスト方式を着想し,プロトタイプツールを実装した.ツールの適用により,意味論と実装との合致をテスト可能であることが確認できた.項目(2),(3)は,優先度を再検討した結果,ZooKeeper事例に基づいて探索空間の削減を行うこととした.これにより両項目を合わせての実施となった.(1)の結果を利用して,前年度のZooKeeper適用の際に適用不可能だったケースが適用可能となった.このうち状態空間の大きなものについて個別に探索空間削減を実現した.(4)マスタースレーブモデル検査は,予定通りプロトタイプ実装を行い,典型的なアプリケーションを用いて評価を行った.同期通信が理由となって,適用可能範囲が当初予想されたものよりも狭いことが認識されたため,非同期モデルへの拡張の検討を開始した.(5)ディプロイメントについては,クラウドコンピューティング環境において必要なソフトウェアを自動的に展開できるアーキテクチャDodaiを考案した.これを用いることで検証時の環境と整合性を持つ環境を運用時に使用することが保証できる.なお,項目(1)の実施中,複数接続方式設計に関して設計が不適切であったことが発見され,この修正に追加の4箇月を要した(繰越の要因)が,繰越期間の作業の結果,設計は適切に修正された.研究実施計画の項目に従って進捗を述べる.(1) net-iocachev2.TCP通信に関しては,クライアント側の基本的な機能を完成させた.チャネル間依存関係に関しては,すべてのチャネルに依存関係があり得るとの仮定を置き,キャッシュは線形のものに限定し,プリフェッチも使用しないという前提で,本機能の設計,実装を行った.この範囲で正しく機能することが確認できている.(2)モデルベーステストツールModbat.

入力されたモデルからより多くのテストパスを効率的に生成するための改良を検討し,設計・実装を行った.特に,従来の同期式コールバックに加えて,非同期式コールバックを追加したことで,適用可能なアプリケーションを増すことに成功した.(3) UDP検証.パケットの消失,重複,順序変更の3つの事象が非決定的に発生するプロトコルを解析するとの立場で研究を進めている.条件が無いと対象の遷移系の大きさが無限になってしまうので,遅延パケットの数と重複を発生させるパターンを限定(パラメタで与える)して,遷移系を有限としたモデルを扱うこととした.この前提の下で,状態数に関する理論的な解析を行い,各パラメタが遷移系の大きさに与える影響を明らかにした.さらに,net-iocache v2の上にUDP解析モジュールを実装し,主要なAPIに対応した.この実装を用いて,UDPによる通信を行うアプリケーションが持つ不具合を発見できることを実証した.(4) JPF探索アルゴリズム(マスター・スレーブモデル検査).JPFのメイン探索エンジン変更の準備として,LTLモデル検査アルゴリズムのうちのNDFSの実装と,DFSベースのヒューリスティック探索機能の実装を行った.(5) jpf-nas, nhandler連携.基本的な検討を行ったが,いずれについてもただちに実装可能な連携は難しいとの結論となった.しかし,検討の過程で明らかになった事項のいくつかは項目(1)の設計に反映させることができた.(1) net-iocache v2.(モデル検査器Java PathFinderでネットワークアプリケーションの検査を可能にする機構)平成26年度に行った再設計に基づき,既存の部分的な実装をベースに,全体の実装を行った.v1に比較して,SUT (検証対象プログラム)に対する暗黙の仮定を減らすことが実現でき,また,粒度の異なる状態探索の方法が選択可能となった.v1との性能比較を実施し,多くの探索方式において,v1を上回る速度で検証が可能となることを確認した.事例研究の一環として,IoTで用いられるプロトコルであるMQTTクライアントに対してv2を利用したモデル検査を実施することで障害を検出した.MQTTプロトコルによる通信に関しても本手法が有効であることが確認できた.また,早期にバグを発見する手法であるSAMCの考え方をnet-iocacheに導入する実験にも成功した.本ライブラリの公開に関しては,すでに研究者・開発者に利用可能としていたが,文書やサンプルプログラムなどを整備することで,いっそう利用しやすくした.
末梢血間葉系幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導

本研究では末梢血中に含まれる骨髄由来幹細胞から象牙芽細胞を誘導することを目的に、歯髄組織および骨髄組織からの細胞樹立、細胞の分化制御、細胞の生化学的、組織学的解析を行った。その結果、ラット歯髄組織から今後の歯牙再生研究に有用と考えられる細胞の樹立に成功した。また骨髄組織から得られた細胞の解析により、骨髄組織には複数の幹細胞が存在する可能性が示唆された。以上の成果は、今後の歯科再生医療における骨髄由来幹細胞の新たな可能性を示唆するものである。本研究は、歯の再生に用いる新規細胞供給源を開拓し、幹細胞を用いた歯科再生医療の実現に向けた基礎的研究データを得ることを目的としている。当該年度研究ではGFPトランスジェニックラット歯髄組織から樹立した象牙芽幹細胞株を用いて、硬組織形成細胞の分化誘導実験モデルの確立を中心に研究を行った。その結果、象牙芽幹細胞をBMP-2で誘導した場合に比べて、β-GP含有石灰化誘導培地で培養を行った細胞群がより高いALP活性を示した。石灰化誘導培地で象牙芽幹細胞を培養すると、培養2日の早期より細胞外に線維状の細胞外基質の産生が認められ、培養14日では細胞外基質により細胞の殆どが被われ観察できなくなった。また線維状細胞外基質は複雑に絡み合い、シャーレ底面から細胞と共に容易に剥離可能なシート状形態を呈していた。石灰化誘導培地で培養した細胞をアリザリンレッドで染色を行うと、線維状細胞外基質にアリザリンレッド陽性を示したことから、線維状細胞外基質に直接カルシウムの沈着が生じていると考えられた。カルシウム量の定量を行ったところ、線維性細胞外基質が出現する培養2日後から僅かにカルシウムの検出が認められ、培養日数の経過に伴ってカルシウム量の増加が確認された。樹立した象牙芽幹細胞株の経代を持続したところ、経代80代を超えても細胞の増殖能、細胞形態、GFP産生能を保持しており、また各分化誘導実験においても安定的な性格を示した。以上より、樹立した象牙芽幹細胞から硬組織形成細胞の分化誘導実験モデルの構築が確立できたと考えられ、今後の研究に応用可能であると判断した。当該年度研究ではGFPトランスジェニックラット歯髄組織から樹立した象牙芽幹細胞株を用いてマイクロアレイによる解析、および遺伝子発現様式の確認を行い、遺伝子発現プロファイルを作製した。GFPトランスジェニックラット歯髄から樹立した象牙芽幹細胞株をβ-GP含有石灰化誘導培地で誘導し、誘導5日目に細胞を回収、total RNAを抽出した。コントロールとして通常培地で5日間培養した同細胞を用いてマイクロアレイ法により遺伝子発現量変化の解析を行った。その結果、誘導前の細胞と比較して石灰化培地で培養した細胞ではDMP1が240倍、Osteocalcin、Bone sialoprotein2が約20倍、Ameloblastinが約10倍と歯および骨に関連する遺伝子発現量の著しい増加が認められた。マイクロアレイ法にて発現量の増減が著しかった遺伝子の中でも特に歯組織との関連が深いDMP1およびDSPPに関して、RT-PCR法によって発現の確認を行った。In vitro条件下においてDSPPは石灰化培地による誘導初期では殆ど発現が認められなかったが、細胞誘導2日目から弱いながらも遺伝子発現が確認され、誘導7目で遺伝子発現のピークが認められた。DMP1は石灰化誘導前から若干の発現を認めた。DMP1は石灰化培地による誘導で発現量は著しい増加を示し誘導7日目に最大発現量となり、その後も高い発現量を維持した。骨髄細胞の多分化能が明らかになり、再生医療への臨床応用研究が始まっている。本研究では歯の再生に骨髄由来間葉系幹細胞を用いるため、骨髄由来間葉系幹細胞と歯髄由来細胞の比較、解析を行い、歯科再生臨床応用に向けての基礎的研究データを蓄積することを目的としている。本年度研究においては、前年度研究において骨髄組織および粉砕骨から得られた細胞に差異が見られたことから、これらの細胞について詳細な解析を行った。また骨髄由来細胞および象牙芽細胞の実験動物生体内での解析を行い、形成する硬組織の相違について比較解析を行った。GFPマウス骨髄移植を行ったマウス骨髄組織からの細胞樹立および解析を試みたところ、培養初期ではシャーレ底面に付着する細胞の殆どはGFP陽性を示していたが、経代を重ねるごとに紡錘形のGFP陰性細胞の出現頻度が増加した。これらの細胞を石灰化誘導および脂肪誘導を行ったところ、骨芽細胞、脂肪細胞に分化した。現時点では分化した細胞の由来については断定できないが、粉砕骨から得られた高い増殖能を示す細胞はGFP陰性の間葉系幹細胞であると考えられ、従来報告されている細胞と性格が異なる可能性が示唆された。象牙芽細胞および骨髄由来細胞の実験

動物生体内条件下における細胞分化について検討した結果、双方ともSCIDマウス生体内で硬組織の形成が認められた。象牙芽細胞が形成する硬組織は細胞が基質に対して垂直に配列など象牙質に類似した構造が認められたが、免疫染色による検討では骨髄由来細胞が形成する硬組織と類似していた。当該年度研究では骨髄幹細胞を歯牙構成細胞へ分化誘導し歯科再生医療へ応用する為の基礎的研究データを得るため、象牙芽細胞遺伝子発現プロファイルからリプログラム因子絞り込みに必要な骨髄由来間葉系幹細胞の樹立と樹立細胞の性状解析を行った。また前年度研究に引き続き既に樹立した硬組織形成象牙芽細胞を用いて電子顕微鏡による観察を行った。骨髄組織からの間葉系幹細胞の樹立では、GFPトランスジェニックマウスの骨髄組織および粉砕骨組織からの細胞樹立を試みた。長期間の継代培養では骨髄由来の細胞は継代を経るごとに増殖活性を消失したが、粉砕骨から得られた細胞では高い増殖活性を長時間保っていた。骨髄から得られた細胞と粉砕骨から得られた細胞の形態には相違が見られ細胞の種類が異なると考えられた。また皮質骨から得られた細胞は、in vitro条件における石灰化培地によりアリザリンレッド染色陽性を示し、軟骨細胞および脂肪細胞への分化能も確認されたことから、骨髄由来間葉系幹細胞である可能性が示唆された。電子顕微鏡による観察では既に明らかになっていた象牙芽細胞が産生するコラーゲン基質の石灰化について焦点を絞り解析を行った。培養細胞は二重幕で被われた形態的に基質小胞と考えられる構造物を形成していた。また基質小胞を核としてコラーゲン基質上でカルシウム針状結晶が成長する様子が観察された。以上のことから本細胞は培養条件下においても、正常の象牙質が石灰化する過程と非常に類似した石灰化過程をとることが考えられた。前年度実施計画では樹立した象牙芽細胞を用いて分化誘導した硬組織形成象牙芽細胞の超微細構造の解析を行う予定であった。しかしながら電子顕微鏡で観察するためのサンプル調整過程で細胞の分化誘導が予定通りに進まず、解析に予想以上の時間を要した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度研究では象牙芽細胞遺伝子発現プロファイルからリプログラム因子絞り込みに必要な骨髄由来間葉系幹細胞の樹立と樹立細胞の性状解析を行った。また硬組織形成象牙芽細胞を用いて電子顕微鏡による観察を行った。本研究成果は前年度研究計画で予定していた計画とほぼ同様の進行状況であり、おおむね順調に進展していると判断した。細胞の調整は完了しているため、今後電子顕微鏡による超微細構造の解析を進める予定である。また骨髄由来間葉系幹細胞の樹立を行い、リプログラム因子の同定に向けて遺伝子プロファイルの作製を進める予定である。昨年度研究では骨髄幹細胞を歯牙構成細胞へ分化誘導し歯科再生医療へ応用する為の基礎的研究データを得るため、象牙芽細胞遺伝子発現プロファイルからリプログラム因子絞り込みに必要な骨髄由来間葉系幹細胞の樹立を行った。今年度実験計画は樹立した骨髄由来間葉系幹細胞の詳細な細胞生物学的解析、分子生物学的解析を行う。また骨髄由来間葉系幹細胞および硬組織形成象牙芽細胞のin vitro
遺伝子組換え法によるニワトリコクシジウム・コンポーネント・ワクチン作成

ニワトリコクシジウム症は養鶏産業に多大な被害を与える疾病である。コクシジウム原虫の組織への感染は原虫が宿主細胞を認識することによって開始するが、この認識機構を阻害することによって、感染防除が可能と考えられる。本研究は、原虫の宿主認識機構を担うリガンド分子の性状を明らかにすることを目的として行った。実験は本研究で作製したモノクローナル抗体(KC-1)を用いて行った。この抗体はin vitroでEimeria tenellaスポロゾイトの宿主細胞浸入を阻害し、E.tenellaの生活環の初期ステージに特異的に反応する。KG-1の認識抗原の検索を行ったところ、スポロゾイト表面の分子量25kDaの抗原(KC-1抗原)と反応した。このKC-1の反応は宿主細胞抽出物の添加によって阻害され、このKC-1が認識する原虫表面のKC-1抗原は宿主細胞への付着能に関与するものと考えられた。KC-1抗原をウエスタンブロッティング法によって分離し、過ヨウ素酸処理するとKC-1抗体との反応が消え、KC-1抗原エピトープに糖が含まれることが示唆された。つぎに、KC-1抗体をプロテインA-アガロースに結合させて免疫アフィニティーカラムを作成してKC-1抗原を精製した。この精製抗原をC4逆相クロマトグラフィーで分析したところ、高い親水性を持つことが示され、糖の存在が強く示唆された。また呈色反応によって、KC-1抗原にはシアル酸型糖鎖は含まれないが、中性糖が含まれることが示された。精製抗原はゲル濾過法によって3つの画分に分画され、3画分中で最小の7kDaの画分が最も高い抗原性を持つことが明かとなった。^1H NMR分析では、この抗原画分は糖骨格に特徴的なスペクトルを示し、ペプチド骨格のメチル基由来と思われるシングレットピークを示した。以上の結果より、KC-1抗原は糖ペプチドであると結論された。本抗原は今後、コクシジウムワクチン抗原候補の1つとなるものと考えられる。
心臓発生過程でおこる心外膜前駆細胞分化でのレチノイン酸の役割

心外膜前駆細胞は、胚心臓の静脈洞に形成され、発生の進行にともない胚心臓をおおい、成人心臓の心外膜や冠状血管になる。本研究では、心外膜前駆細胞の分化過程でのレチノイン酸の作用について調べた。心外膜原基形成過程において、マーカー分子のWT1とTBX18タンパク質は心外膜原基の隆起が形成される以前に局在が観察された。培養系を用いて調べたところ、ニワトリ胚ステージ14、15の臓側中胚葉の外植体は心外膜前駆細胞に分化したが、ステージ11-13の臓側中胚葉を培養したときには分化の低下が見られた。この培養系にレチノイン酸を加えたところ外植体のWT1とTBX18の発現は増加した。心外膜前駆組織(proepicardium organ)は、胚心臓の静脈洞に形成され、発生の進行にともない胚心臓をおおい、成人心臓の心外膜や冠状血管になる。近年、心外膜前駆組織は冠状血管の平滑筋細胞・内皮細胞、心臓線維芽細胞、血球に分化するだけでなく、心筋細胞へ分化する可能性も示唆されている。しかしながら、「心外膜前駆組織の発生のしくみ」はほとんど分かっていない。心外膜前駆組織発生の仕組みを明らかにすることは「心臓の形づくり」の解明につながるばかりではなく、将来的な心外膜前駆組織を利用した疾病治療の開発に寄与すると考えている。研究代表者は、中胚葉から心外膜前駆組織への分化がこれまで報告されていたよりも早い発生段階で決定されること、そしてその分化にレチノイン酸が関係している可能性を見出した。本年度は予備実験から得られたデータに基づき予定心外膜形成領域の詳細な検討、またその領域の培養法の検討を行った。その結果、当初想定した時期よりもさらに早い段階で分化決定が行われている可能性を得た。そのため予定心外膜形成領域を調べる実験系、組織培養法についての再検討を行った。本年度に計画していた予定心外膜形成領域を調べる方法の検討に時間がかかったため当初予定していた計画よりやや遅れている。予定心外膜形成領域は臓側中胚葉から形成される。そのため、in ovoで細胞の蛍光染色をするときには卵殻に窓を開けた後、卵黄膜、外胚葉、壁側中胚葉のそれぞれをを微小外科手術により一部切断する必要がある。この実験系の検討と手技の習得により実験の進行が遅れた。本年度は培養系による生物検定を用いて心外膜前駆組織の分化時期の詳細な検討を試みた。ニワトリ胚の予定心外膜前駆組織領域を培養し、マーカー分子の発現を指標に分化の有無を判定した。その結果をもとに、より発生段階の早いステージの胚を用い心外膜前駆組織領域の分化決定時期を調べた。神経胚を用いたときに組織間の接着により予定心外膜前駆組織領域の切り出しが困難になったため、目的組織の分離法を検討した。分離法を確立した後、生物検定を行ったところ、コントロール群の結果の不安定性と胚から切り出した外植体の不接着が生じた。この結果は分化誘導能の判定に影響を与えたことから、早期の胚に適した微小外科手術法の検討、培養条件の検討をおこなった。生物検定により心外膜前駆組織領域の分化決定時期を調べた。神経胚期の生物検定では予定心外膜前駆組織領域の切り出しが困難になった。その理由として内胚葉、中胚葉、外胚葉の接着があること、また心外膜前駆組織ができる臓側中胚葉と壁側中胚葉の分離が不十分なことが考えられた。神経胚期の予定心外膜前駆組織領域の切り出し法を確立し、生物検定を行ったところコントロール群の外植体において、心外膜前駆組織のマーカーであるWT1、TBX18抗体の陽性の外植体と陰性の外植体の混在が見られた。コントロール群の不安定性の原因としては、1胚の発生段階のわずかな違い、2胚の個体差、3生物検定に用いる領域が一定しない、などが考えられた。そこで胚の発生段階をより厳密にするため、体節数を基準にして生物検定を行ったが結果は同じであった。また早期神経胚のコントロール群では培養ディッシュに接着しない外植体が生じ、心外膜前駆組織のマーカーの検出に問題を生じた。この原因は実験に用いる胚の細胞が未熟なことが考えられた。これらの原因を解消するため培養条件の検討をおこなった。