hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいGaNAsSe半導体混晶による波長1.5μm帯広帯域光通信用光源の開発

GaAs超格子を発光層とするp-n型ダイオードを作製し、中心波長1.35μmで250meVと広い半値幅を持つエレクトロルミネッセンスが確認されたが、1μm付近にもより大きな発光ピークが観測される。これは発光層のGaNAsSeが高い電子濃度を持つn型伝導を示すため、n型のGaNAsSe/GaAs超格子とp-GaAsとの間にダイオードのp-n接合が位置し、この領域で主に発光再結合するためである。これを解決するためにドーピングによるp-n接合位置の制御をさらに進め、GaNAsSe/GaAs超格子からの発光がドミナントなダイオードが作製できた。また、より低次元構造の量子ドットの検討を進めた。InAs/GaAs量子ドットでは、下層のGaAs表面再配列構造の制御により量子ドットへのGa拡散が低減でき、オープンドット構造で1.51.6μm帯で強く発光することを確認した。しかし埋め込み構造にすると量子ドットに加わる歪みにより短波長発光化する。これを解決するためにGaNAs/InGaAs短周期超格子による量子ドットの埋め込み構造を提案し、長波長発光化と発光量子効率の改善を確認した。さらにGaSb/GaAs量子ドットの検討も進め、窒素を添加してGaSb量子ドットを作製するとウェッティング層からの強い発光が低減でき、量子ドットからの発光がドミナントとなることを見いだした。量子ドットのサイズ揺らぎによる広い発光スペクトルが実現可能であり、光通信帯広帯域光源の実現が期待される。
アトピー性皮膚炎の慢性掻痒メカニズムの解明を目指した新しい研究アプローチ

アトピー性皮膚炎などに伴う慢性的な痒みにおける神経系メカニズムは依然不明である。本研究では、アトピー性皮膚炎モデルマウス等を用いて,脊髄後角において転写因子STAT3依存的に長期活性化するアストロサイトと,同細胞から産生放出されるLCN2が痒みの慢性化に重要な役割を担っていることを世界で初めて明らかにした。この成果は,痒みの慢性化メカニズムの理解,そして将来的に神経系をターゲットとした慢性掻痒治療薬の開発へと繋がる可能性がある。アトピー性皮膚炎等による慢性的な痒みは,過度の肉体疲労や精神的ストレスなどを起こし,多くの患者のQOLを低下させている。しかし,痒みの慢性化機序は依然不明である。本研究では,アトピー性皮膚炎モデルの脊髄後角でアストロサイトが活性化するという事前研究をもとに,その因果性を解明することを目的とした。項目1)脊髄後角アストロサイトの活性化メカニズム:アストロサイトの活性化と皮膚炎との関連性を検討した。モデルマウスの爪を切り揃え,引掻き行動による皮膚への物理的な刺激を回避した結果,脊髄後角アストロサイトの活性化と皮膚炎が緩解した。さらに,TRPV1陽性C線維を破壊したモデルマウスではアストロサイトの活性化が抑制されたことから,炎症皮膚から同線維を介して脊髄後角のアストロサイトへ情報が送られている可能性が示唆された。項目2)活性化アストロサイトの慢性掻痒への因果性:転写因子STAT3に注目した。STAT3はモデルマウスの脊髄アストロサイトで活性化し,さらにJAK阻害剤による薬理学的阻害やアストロサイト選択的なSTAT3不活性化により,アストロサイトの活性化および痒み行動が共に抑制された。項目3)脊髄後角アストロサイトによる痒み神経伝達の変調メカニズム:アトピー性皮膚炎モデルマウスで変動するアストロサイト由来因子としてリポカリン2(LCN2)を特定した。モデルマウスの脊髄後角においてLCN2はアストロサイトに発現していた。さらに,アストロサイト培養細胞でも発現が確認され,その発現はSTAT3依存的であった。モデルマウスの脊髄後角アストロサイトのLCN2をノックダウンすることで痒み行動が抑制された。以上より,アトピー性皮膚炎に伴って脊髄後角でSTAT3依存的に活性化するアストロサイトと,同細胞から産生されるLCN2が痒みの慢性化に重要であることを世界で初めて明らかにした。今年度の実施項目として計画した内容をほぼすべて遂行することができ,さらに脊髄後角アストロサイトのLCN2を選択的にノックダウンすることにも成功し,その痒み行動における重要な役割を明らかにすることができた。さらに研究成果をNature Medicine誌に報告した。前年度までに,慢性掻痒モデルマウスの脊髄後角において長期的に活性化するアストロサイトのSTAT3とそれに続くLCN2(lipocalin 2)の産生放出が慢性掻痒に重要であることを明らかにした。そこで本年度は,アストロサイトでのSTAT3活性化とLCN2産生放出における細胞内カルシウム制御分子(IP3受容体とtransient receptor potential channel(TRP)チャネル)の関与を検討した。マウス初代培養アストロサイトを調製し,IL-6刺激後のSTAT3のリン酸化をウエスタンブロッティング法,LCN2の産生放出をELISA法により解析した。IL-6刺激によって即時的で一過性のSTAT3のリン酸化と遅発性で持続的なリン酸化が認められ,LCN2の産生放出は後者と時間的に相関した。遅発性のSTAT3リン酸化とLCN2産生放出は,IP3R阻害薬により抑制された。培養アストロサイトに発現しているIP3Rサブタイプ(IP3R1とIP3R2)のうち,IP3R1 siRNAによるノックダウンによってSTAT3のリン酸化が抑制され,LCN2産生放出も抑制された。また,TRPチャネルについても同様に検討し,TRPチャネルサブタイプ(詳細は非公表)がアストロサイトに発現し,その阻害薬およびsiRNAでIL-6誘発のSTAT3リン酸化とLCN2産生放出が抑制された。以上より,アストロサイトのSTAT3の活性とLCN2の産生放出に同細胞に発現するIP3R1とTRPチャネルが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。平成28年度に計画している各項目に従って順次予定通り進めていく。神経薬理学マウス凍結精子購入代金が当初予定よりも安価であったため。次年度の実験動物購入に使用予定。
リボゾーム機能とユウキ触媒活性の融合による有用蛋白質の生産

生細胞中でのタンパク質合成反応はリポソームと呼ばれる細胞内小顆粒上で進行する。そして、リポゾーム上で合成されるポリアミノ酸すなわちタンパク質は、メッセンジャーRNA(mRNA)にコードされた遺伝情報に従って、分子量やモノマー配列といった一次構造が厳密に制御されており、その一次配列の均一性によって高機能性を発揮する。本研究では、生物由来のタンパク質合成システムを基盤として、天然に存在する20種類のアミノ酸しか使用できないという生物独自の制約に縛られない、新たなバイオシステムの創製を行う。さらに、このシステムを利用して材料工学的に興味深いにもかかわらず従来技術では生産不可能であった機能性タンパク質の合成を試みる。具体的には、リポゾームを中心としたタンパク質合成系を、有機溶媒の一つであるピリジンと水との混合系中で再構築する。従来利用されてきた水溶液中での生体外タンパク質合成系は、リポゾームやmRNA以外に多数の可溶性タンパク質因子や化学エネルギー源であるアデノシン三リン酸(ATP)およびグアノシン三リン酸(GTP)を必要とし、モノマーであるアミノ酸をアミノアシル-tRNAの形で活性化してこの系に加えることにより、アミノ酸をmRNA特異的に重合している。これらの各成分を調製・最適化して安定な「タンパク質の生産システム」を構築することは極めて困難であり、実用化にはほど遠いのが現状である。この問題を解決する有望な手段として、我々は50-60%のピリジンを添加することにより、可溶性タンパク質因子やエネルギー源を一切必要とすることなく、アミノアシル結合のエネルギーのみで駆動する、新規な生体外タンパク質合成系の開発に成功した。最近、我々はピリジン/水=40/60-60/40の範囲からなる有機溶媒と水との混合系において、可溶性蛋白因子画分やATP、GTPを必要とすることなく、リボソーム上でmRNAを鋳型とする蛋白質合成が進行することを発見した。有機溶媒中でプロテアーゼやヒドロキシターゼなどの加水分解型酵素はその逆反応、すなわちアミド化やエステル化を触媒することが知られているが、蛋白質合成のような動的な反応が有機溶媒中で進行すると言ったことは、これまで全く報告がない。本研究では、この有機溶媒/水混合系を利用して、高効率で普遍性のある生体外蛋白質合成系を開発し、これまで量産が不可能であった有用蛋白質を生産することを目的とした。本年度はシステムの基本的特性の把握を行い、以下の知見を得た。(1)各種有機触媒の評価、絞り込み:本システムにおいてはピリジンに限らず、広く三級アミンの使用が可能と考えられた。そこで、ピリジン以外にアミノピリジン類や核酸塩基関連化合物などの触媒活性を評価し、アデニン骨格を有する三級アミン類に同様の活性が認められた。しかし、システムの安定性などを考慮し、ピリジンが最も有用な三級アミンであるとの結論に達した。(2)最適なシステムの確立:現状では、リボソーム全体を用いてシステムの構築を行っているが、効率低下を招かない範囲でシステムは単純な方が望ましく、この意味からも、リボソーム全体を用いるのではなく、例えばrRNAのみでシステムの構築を試みた。その結果、rRNAのみのシステム構築も可能であることが判明したが、著しく低効率であり、実用化は現在のところ不可能と判断した。(3)高度好熱菌、酵母そして牛ミトコンドリアなど多種類の生物由来の系リボソームを利用したシステムの構築に成功した。来年度は実際に有用蛋白質の生産を試みる。生細胞中でのタンパク質合成反応はリボソームと呼ばれる細胞内小顆粒上で進行する。本研究では、リボソームを中心としたタンパク質合成系を、有機溶媒の一つであるピリジンと水との混合系中で再構築し、可溶性タンパク質因子やエネルギー源を一切必要とすることなく、アミノアシル結合のエネルギーのみで駆動する、新規な生体外タンパク質合成系の開発に成功した。

(1)反応効率はピリジン濃度が50%の時最大となるが、鋳型分子(mRNA)依存性は確認されなかった。ピリジン濃度を60%まで上昇させることにより、反応効率は低下するものの、鋳型分子(mRNA)依存性が確認された。特に、鋳型分子としてウリジル酸とシチジル酸の交互共重合体(poly UC)を用いることにより、モデル蛋白質としてセリンとロイシンの交互共重合体の合成を60%ピリジン中で試みたところ、目的となる交互共重合体が主な産物であることを確認した。(2)大腸菌、酵母そしてミトコンドリア由来の全てのリボソームを用いることにより、ピリジン系の構築が可能であることが判明した。さらに、ピリジン系の抗菌スペクトルを抗生物質により検討したところ、水溶液系の場合と同様の結果が得られた。このことは、ピリジン系の基本的な作動原理が水溶液系と同様であることを示唆する。(3)ピリジン系は可溶性タンパク質因子やGTPを一切必要としないため、いかにしてトランスロケーションが進行しているのかを解析した。その結果、ピリジンの作用によりリボソームの構造が変化し、自発的なトランスロケーションが進行していることが示唆された。現在、本格的な機能性タンパク質を合成するためのモデル化合物として、poly UUUCを鋳型分子として用い、セリン-フェニルアラニン-フェニルアラニン-ロイシンを繰り返し構造にもつブロックポリペプチドの合成を試みている。
分析哲学の研究手法を用いた精神医学の理論的基礎の確立

本研究では、1.精神医学全般の理論的基礎に関する問題(精神疾患の定義、正常と異常の線引き、精神疾患の分類法など)、2.精神医学の代表的な理論や手法(精神療法、認知療法、ナラディヴ・アプローチなど)の理論的基礎の批判的検討、3.個々の精神疾患に特有の理論的問題(パーソナリティ障害における社会的問題と医学的問題の線引き問題など)の検討、という3つの問題領域を考察する。研究の最終的な成果としては、精神医学の理論的基礎をめぐる哲学的な問題について、哲学および精神医学のどちらを専門とする読者にも理解可能な、精神医学の哲学に関する教科書または概説書を執筆することを目指す。
運動性の異なる複数種の鞭毛ダイニンによる協調的力発生の研究

真核生物鞭毛では、活性の異なる複数種のダイニンが配列しています。本研究の目的は、活性の異なるダイニンを配列した時にどのように協調して機能するのかを解明することです。最初の試みとして内腕ダイニンのサブユニット、アクチンへタグを付与し、配列を試みました。その結果、タグを付与したダイニンをクラミドモナスより精製できましたが、必要な量を得られませんでした。そこで、我々は、配列する標的を3種の頭部が異なる活性を持つヘテロトリマーダイニン、外腕ダイニンに変えました。外腕ダイニンをドッキングコンプレックスを介して微小管上に配列し、外腕ダイニンが協同的に働く様子を観察する実験系の構築に成功しました。真核生物の鞭毛内では、モータ活性の異なる複数種のダイニンが配列しています。本研究の目的は、活性の高い鞭毛ダイニンと低いダイニンを配列した時にどのように協調して微小管と相互作用するのかを解明し、活性の異なるダイニンの配列が鞭毛運動にいかに有利に働くのかをつきとめることです。本年度は、各種鞭毛ダイニン尾部へのタグ導入、導入位置及びタグの検討2)アンチタグ導入DNAを足場にダイニンを配列することを目標に研究課題に取り組みました。多くの内腕ダイニンが持つ軽鎖サブユニット"アクチン"のC末付近のループにHAタグを付加したクラミドモナス株を使用しダイニンの精製を行いました。しかしながら、鞭毛内のダイニン量が減少していたため、十分な量を得ることが出来ませんでした。そこで、タグを付加する位置を最も影響が少ないと思われる、アクチンのC末端にタグを付加したアクチン遺伝子を作成しました。また、タグ付加アクチン遺伝子を導入するクラミドモナス株について、アクチン欠失変異株と内腕ダイニン精製を難しくする外腕ダイニンを除いた二重変異株を作成しました。また、ダイニンcのN末ドメインの抗体、ダイニンfの140K中間鎖に対する抗体が、微小管滑り運動の発生および運動性の観察を行うインヴィトロ運動アッセイを行う際にダイニンc、fそれぞれの基盤への固定に有用であることを確かめました。当初、有用性が高いと期待していたクラミドモナス株からダイニンの精製が困難であったこと、精製法に不備がないことを確認したこと、代替のタグ付加アクチン遺伝子を作成した為、目標のダイニンの人工配列にまで、達成できませんでした。最初に、鞭毛内腕ダイニンa,b,c,d,e,gの基部に共通して存在する軽鎖サブユニットで、タグを導入してインヴィトロ運動アッセイに使用できれば非常に有用性が高いと思われる"アクチン"のC末付近のループにHAタグを付加したクラミドモナス株を使用し、ダイニンの精製を行いました。しかしながら、鞭毛内のタグが付加されたダイニンの存在量が少なく、実験に十分な量のダイニンの精製ができませんでした。実験に使用できる状態でアクチンにタグを導入することが困難である場合に対処する為、ダイニンcのN末ドメインの抗体、ダイニンfの140K中間鎖に対する抗体が、微小管滑り運動の発生および運動性の観察を行うインヴィトロ運動アッセイを行う際にダイニンc、fそれぞれの基盤への固定に有用であることを確かめました。本年度は、各種鞭毛ダイニン尾部へのタグ導入し、アンチタグ導入DNAを足場にダイニンを配列し、配列することによる運動性の変化を観察することを目標に研究課題に取り組みました。多くの内腕ダイニンが持つ軽鎖サブユニット"アクチン"のC末付近のループにHAタグを付加したクラミドモナス株を使用し、ダイニンの精製を行いました。HAタグ抗体をガラス基板上に付着ダイニンを固定、その上を微小管が運動する様子を観察することに成功、アクチンにタグを結合することの有効性を確認しました。しかしながら、十分な量のダイニンを得ることが出来なかった為、ダイニンを配列する実験は実施できませんでした。アクチンをサブユニットに持たないダイニンfは140K中間鎖を捕捉すると運動アッセイに有効であることが、予備実験で分かっている。そこで、140K中間鎖にタグを結合したコンストラクトを作成した。このことにより、主要な内腕ダイニン亜種すべてにタグを導入する材料が揃った。本年度は、内腕ダイニンaおよびcと根元で結合し、ダイニンbおよびeと近接、それらのダイニンの生体内の配列と鞭毛運動中の運動性の調節を担う可能性が高い、ラジアルスポークの分子形態観察を行い、鞭毛運動中にラジアルスポークが受ける力の大きさを推定し、学会発表しました。タグを導入したサブユニットの発現量が予想より多くなく、十分な量のダイニンの精製ができなかったことが、当初の予定より遅れた最大の要因です。鞭毛内腕

ダイニンa,b,c,d,e,gの基部に共通して存在する軽鎖サブユニットで、タグを導入してインヴィトロ運動アッセイに使用できれば非常に有用性が高いと思われる"アクチン"のC末にHAタグを付加したクラミドモナス株を使用し、ダイニンの精製を行いました。しかしながら、鞭毛内のタグが付加されたダイニンの存在量が少なく、実験に十分な量のダイニンの精製ができませんでした。しかしながら、内腕ダイニンは少数分子でも微小管運動の発生が可能であるため、精製したダイニンを使用し、タグに対する抗体でガラス基板上に固定し、運動性を確かめたところ、微小管運動を確認、アクチンにタグを結合することの有効性が確認できました。真核生物の鞭毛内では、モータ活性の異なる複数種のダイニンが配列しています。本研究の目的は、活性の高いダイニンと低いダイニンを配列した時にどのように協調して微小管と相互作用するのかを解明し、活性の異なるダイニンの配列が鞭毛運動にいかに有利に働くのかをつきとめることです。本年度は、各種鞭毛ダイニンを配列し、配列することによる運動性の変化を観察することを目標に課題に取り組みました。まず、多くの内腕ダイニンが持つ軽鎖サブユニット"アクチン"にHAタグを付加したクラミドモナス株からダイニンの精製を行い、運動性の観察を行いました。HA抗体上に固定したダイニン上を微小管が運動する様子の観察に成功しました。しかし、十分な量のダイニンを得ることが出来なかった為、ダイニンを配列する実験は実施できませんでした。そこで、本年度はへテロトリマーの外腕ダイニンを配列し、外腕ダイニンが協同的に働く様子を観察する実験系の構築を行いました。足場には、鞭毛軸糸断片を核として重合した微小管を使用しました。これにより2-9本の方向性の揃った微小管の束を作成することに成功しました。粗精製外腕ダイニンの添加により、微小管束は硬くなりました。負染色電子顕微鏡法で観察したところ、微小管上に24nm周期でダイニン外腕とサイズ、形状が一致する構造が、配列していました。遠心分離で微小管に結合する成分を共沈させ、電気泳動で確認すると、ATP非存在下では外腕ダイニンと内腕ダイニンfが微小管と共沈しましたが、ATP存在下では外腕ダイニンだけが共沈しました。束化した微小管にATPを加えると、微小管束に屈曲が発生する様子を観察できました。まれに、周期的に屈曲ー微小管束の乖離ー再結合する運動も観察できました。方向性を揃えた微小管束間に外腕ダイニンを橋渡しするように配列、微小管との相互作用を観察する実験系が構築できたと考えています。真核生物鞭毛では、活性の異なる複数種のダイニンが配列しています。本研究の目的は、活性の異なるダイニンを配列した時にどのように協調して機能するのかを解明することです。最初の試みとして内腕ダイニンのサブユニット、アクチンへタグを付与し、配列を試みました。その結果、タグを付与したダイニンをクラミドモナスより精製できましたが、必要な量を得られませんでした。そこで、我々は、配列する標的を3種の頭部が異なる活性を持つヘテロトリマーダイニン、外腕ダイニンに変えました。外腕ダイニンをドッキングコンプレックスを介して微小管上に配列し、外腕ダイニンが協同的に働く様子を観察する実験系の構築に成功しました。
人工視覚への応用を目指した光による双方向情報伝達技術の創成

光検出半導体素子アレイと発光素子を備え、神経活動を可視化、誘発・抑制するための極小の脳内埋植型CMOSデバイスを設計・試作した。培養神経細胞、及び、自由行動下動物の大脳皮質視覚野においてデバイスを運用するためのシステムを構築し、実際に神経細胞の機能解析を行うことを可能とした。本年度は試作したデバイスによる神経細胞の電位蛍光イメージング技術の確立を目指した。まずHEK293、PC12細胞を用いてon-chip細胞培養を行い、電位感受性蛍光指示薬のRH795による染色条件、high-K^+による細胞刺激手順、蛍光測定条件などを検討した。また光検出半導体素子アレイ上で長期細胞培養するための防水加工、細胞接着コート材の検討を行った。これらの検討をもとに測定用フィルタ透過特性の最適化、蛍光励起用LEDの波長変更を行うなど試作デバイスを改良した。改良した試作デバイス上で新生仔マウス大脳皮質より摘出した神経幹細胞の初代培養を行った。1ヶ月間培養して成熟、分化させた神経細胞で電位蛍光イメージ解析を行った。この結果、high-K^+刺激に応答した神経細胞の脱分極反応をリアルタイムでタイムラプスイメージングすることに成功した。次に試作したデバイスを用いて、マウス大脳皮質急性スライス組織で同様に電位蛍光イメージ解析を行い、刺激強度依存的な応答変化を検出した。またマウス生体脳視覚野領域にデバイスを埋植し、high-K+刺激、刺入電極からの電気刺激、またアトロピンで十分に散瞳させた眼から光刺激を与えて電位蛍光イメージ解析を行った。この際脳組織の染色条件、均一励起光照射のためのLED実装条件などの検討を行い、デバイスを改良して試作した。さらに頭骨と干渉しないようデバイス基板の外形加工、生体脳内へのデバイス埋植方法、長期留置のための術式などを改良することで適用した。また制御ボードの雑音低減と測定ソフトを改変して検出信号の最適化を行い一連のイメージングシステムを改良して再構築した。この結果、生体脳視覚野に埋植したデバイスによる神経細胞の電位蛍光イメージングが可能となった。また、既存技術では不可能な自由行動下マウスの左右視覚野を同時に測定するデュアルイメージングシステムを構築した。脳内埋植型CMOSセンサを用いて視覚野の神経活動を可視化するため、昨年度に電位蛍光イメージセンサを試作した。また、自由行動下マウスの左右視覚野を同時に測定するデュアルイメージングシステムを構築した。(1)本年度は視覚野でより微量の蛍光変化を検出するため、電位感受性蛍光色素(VSD)の種類に応じたセンサ至適実装条件を検討した。まず励起光源とVSDのマッチングを行うため、複数種のVSDで各々染色したHEK293細胞の薬剤投与刺激時における蛍光スペクトル変化を測定した。測定にはマルチ蛍光分光光度計を使用し、励起光源には固体レーザとデバイス基板に実装するLEDベアチップを使用した。LEDチップを複数種使用し、様々な波長・光強度下で染色細胞を測定して至適励起光条件を検討した。また脳ファントムを作製してデバイスを埋植し、励起光散乱パターンを解析した。パターンが均質になるようLEDチップ配向の最適位置を計算して基板に実装した。以上のようにして改良したデバイスとイメージングシステムで視覚野神経細胞の生理活動を計測した結果、新たに低侵襲な硬膜上計測に成功した。(2)光感受性チャネルタンパク遺伝子を導入した神経細胞に対し、時空間的に随意な光刺激を与えて活化・不活化するデバイスを試作した。動物脳表に適用する必要性からデバイス接触面は平坦実装が好ましく、かつ、光刺激と同時に上記(1)の光計測を行うには、光検出素子アレイ上に不透過構造物は実装できない。そこで透明なサファイア基板にindiumgallium nitrideを結晶化させたウエハを用いることで、これまで実現してきた脳神経イメージチップ上にマイクロLEDアレイを構築した。センサのアドレス機能を利用して個別点灯させることが可能である。これにより、顕微鏡や外部光学系を必要としない新しい神経インターフェースデバイスが実現された。
活性酸素シグナル生成系の制御機構の解明

細胞が生きていくためにはATPが必要であるが、効率よいATP合成を行うとその副産物として活性酸素ができる。活性酸素は反応性が高く、細胞及び組織の傷害を引き起こすが、一方で生体は、活性酸素を逆に有効利用していることが分ってきた。有効利用のためには、活性酸素の生成自体を目的とした酵素が必要となるが、NADPHオキシダーゼ(Nox)ファミリーはまさにそのような酵素群である。本研究では、種々のNoxによる活性酸素生成を詳細に検討し、その制御機構を分子レベルで明らかにした。活性酸素生成酵素NADPHオキシダーゼ(Nox)は、活性酸素シグナルの形成において重要な役割を果たすと考えられている。本研究は、Noxファミリー(Nox1Nox5)の活性化制御機構の時間的空間的な全体像を解明するものである。特に、「Nox活性化タンパク質の作用機構」に関する研究をさらに押し進めるとともに、「Nox活性化タンパク質の結合によりNoxに何が起こり、電子伝達がどのようになされ、活性酸素生成に至るのか」また「Noxが細胞内のどこに局在するのか、その局在はどのように変化するのか」という問題に焦点をあてる。本研究は、活性酸素を生成する酵素であるNADPHオキシダーゼ(Nox)ファミリーの活性化制御機構の時間的空間的な全体像を明らかするものである。平成20年度に私達は以下のような成果を得た。(1) Nox2活性化に必要なタンパク質p47^<phox>分子内の新規なNox活性化領域を同定し、この領域はp47^<phox>が膜に移行した後の過程に重要な役割を果たすことを示した。(2) Nox2活性化に必須のタンパク質p67^<phox>のN末側、SH3ドメインが、Nox2特異的に作用して活性酸素生成を増強する役割をもつことを明らかにした。また、p67^<phox>分子内に新規な活性化領域を同定し、この領域がNox2に直接結合して働くことを示した。(3) Nox2は、やはり膜蛋白質であるp22^<phox>とヘテロダイマーを形成しているが、このヘテロダイマー形成に必要な領域を見出し、慢性肉芽腫症(Nox2システムの異常のため活性酸素が生成できず重篤な感染症を繰り返す遺伝的疾患)のうちのいくつかの症例は、Nox2のアミノ酸置換によってp22^<phox>との結合が失われた結果であることを示した。(4) Nox2のC末細胞質領域にNADPH結合部位があることを実験的に示し、NADPHとの特異的な結合に必要なアミノ酸残基を同定した。その解析結果をもとに、Noxが新規な機構によりNADPHを認識していることを明らかにした。(5) Nox1Nox3の活性化に、Rac1、Rac2、Rac3の3種のRacが働きうることを明らかにした。またいずれの場合においても、Racのinsertregionは活性化に関与しないことを示した。平成21年度に私達は以下のような成果を得た。(1) Nox2活性化に必要なタンパク質p67^<phox>(TPRドメイン、N末側SH3ドメイン、PB1ドメイン、C末側SH3ドメインから成る)の全長型の低分解能の溶液構造をX線小角散乱法により決定し、p67^<phox>分子内ではドメイン間相互作用がなく「伸びた構造」をしていることを明らかにした。(2) p67^<phox>が十分なNox2活性化能をもつためには、N末側SH3ドメインがTPRドメインのすぐC末端側にくることが必要なこと、PB1ドメインがTPRドメイン近くてはいけないこと等を示した。(3)ヒト好中球の食作用時において、Nox2活性化に重要な膜リン脂質の動態を測定する方法を確立し、(i)ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸は、ファゴゾーム膜形成時に減少を始め閉じたファゴゾーム膜には存在しないこと、(ii)ホスファチジルイノシトール-3,4,5-トリスリン酸は、閉じたファゴゾーム膜にのみ集積すること、(iii)ジアシルグリセロールは、ファゴゾーム膜形成時に出現しファゴゾーム膜が閉じて暫くして消失すること、(iv)ホスファチジルセリンは、ファゴゾーム膜に常に存在すること等を明らかにした。(4)ヒト好中球の食作用時において、低分子量G蛋白質であるRab7は活性化型で閉じたファゴゾーム膜に集積するが、Rab5の集積は起らないことを示した。(5)哺乳類培養細胞を用いて、種々のNox(特にNox2)を比較的大量に発現させる系を確立した。

本研究は、活性酸素を生成する酵素であるNADPHオキシダーゼ(Nox)ファミリーの活性化制御機構の時間的空間的な全体像を明らかするものである。平成22年度に私達は以下のような成果を得た。(1)Nox2活性化に必須の細胞質タンパク質であるp67^<phox>(Rac結合TPRドメイン、N末側SH3ドメイン、p40^<phox>結合PB1ドメイン、C末側SH3ドメインというドメイン構造をもつ)が、TPRドメインよりC末側の領域(活性化ドメイン:extended activation domain)を用いて直接Nox2に相互作用することで、Nox2のスーパーオキシド生成を誘導することを明らかにした。(2)Nox1活性化に必須の細胞質タンパク質であるNoxa1(N末側Rac結合TPRドメインとC末側SH3ドメインからなる)においても同様に、TPRドメインよりC末側の領域に活性化ドメインが存在すること示し、これがNox1の活性化に重要な役割を担うことを明らかにした。(3)p67^<phox>のN末端Rac結合TPRドメインと活性化ドメインが協調して働くため重要な分子構造を示すとともに、Nox2、p67^<phox>、およびRacの3者複合体を比較的大量に発現させる系を確立した。(4)Nox2はp67^<phox>とp47^<phox>により活性化され、Nox1はNoxo1とNoxa1により活性化されるが、一方Nox4はこれら細胞質タンパク質による制御を受けず恒常的に活性酸素を生成する。このような特異的な制御機構が、それぞれのNoxのC末端細胞質領域に依存することを明らかにした。(5)Noxのパートナー分子である膜タンパク質p22^<phox>との結合には、NoxのC末端細胞質領域が必要であることを示した。平成23年度は、「Noxの活性発現に必要なタンパク質p22^<phox>とNoxとの結合様式」の解析を行い、Noxは膜貫通領域の2カ所を用いてp22^<phox>と結合することを明らかにし、この領域のアミノ酸置換を用いた実験により、今まで説明がつかなかった慢性肉芽腫症(食細胞Nox系が欠損する遺伝病)の症例の一部が説明可能になった。これは炎症などの病態解明に重要な知見を与えると考えられる結果である。更に、「Noxの各領域の役割」についてNoxのキメラタンパク質を用いて解析し、「NoxのN末膜貫通領域がNox2型であるかNox4型であるかによって、primary productとして生成される活性酸素の種類が決定されること」を明らかにするとともに、「Nox活性化タンパク質(p47^<phox>やp67^<phox>等)による調節を受けるかあるいは恒常的に活性酸素を生成するか否かを決めているのはC末細胞質領域であること」を示した。また、Nox2、p67^<phox>、Racの3者複合体の大量精製系を確立し結晶化を行った。Noxは膜上で均一に存在するのではなく、例えば遊走中の好中球ではNox2はその前方でのみ活性化されるし、Nox1は上皮細胞のapical側の細胞膜にのみ発現している。この様に、Noxの活性化は細胞の極性形成と強くcoupleしている。
ヒト胎児の心動作および末梢循環調節機序の発達過程に関する研究

本研究を通じて、正常ヒト胎児では妊娠の進行にともなって、房室弁通過血流速度、上行大動脈、肺動脈および腹部大動脈などの心内および大血管血流速度は増加することが明らかとなり、これら諸種の部位における血流速度のnomogramが作成できた。また、妊娠進行にともなう心内および体循環血流の増加は、心臓径の増大に基づいた一回駆出量の増加に起因していると考えられた。一方、末梢循環としては、臍帯動脈および中大脳動脈の血流波形の解析から、正常胎児においては、胎盤および脳血管抵抗は妊娠進行とともに低下することが明らかとなり、Resistance Index指標としたnomogramが作成できた。これら正常胎児における心および末梢循環動態の指標を用いて疾病胎児における循環動態を検討した、完全房室ブロックおよび上室性頻拍を有する胎児では、心収縮率は前者では増加、後者では減少し、心拍出量を保持する機構が存在することが明らかとなった。さらに、肝および胎盤血管腫を有する症例においても、心室拡張を介して循環血流量を保持する機構が機能していること、また、双胎妊娠例のなかで双胎間輸血症候群の症例では心収縮率が低下し、心機能不全の状態に陥っていることが明らかとなった。このことは、本症胎児血中のhANP値が上昇していた事実からも裏付けられる。このような疾病胎児における心動態の偏位に加え、子宮内発育遅延症、胎児仮死例あるいは胎児水腫例においては、脳血管抵抗の減少が出現し、末梢レベルにおける循環動態調節機序が存在する可能性が示唆された。以上の成績は、心拍数および心収縮動態という心パフォーマンスと、血管抵抗あるいは血流速度で表される末梢血行動態は、正常なヒト胎児において互いに連関を持ちながら機能していることを示している。そして、疾病胎児においては、両者が慢性あるいは急性の循環調節機序を営むことによって循環動態の維持に関与していることが考えられた。本年度は、胎児期の心動態と新生児期の転帰との双方の関連から、胎児心機能不全の病態生理を解明することを目的に検討を加えた。対象は1986年4月から1990年3月の期間に、心機能の評価を目的に心エコ-法を施行した105例である。このなかで13例は心不全のため、早期新生児期に死亡に至った。胎児の心動態の評価には、超音波Bモ-ド法およびMモ-ド法を用いて腔水症の有無、左右両心室の拡張終期径(EDD)およびFS(Fractional Shortening)値を測定した。EDDおよびFSについては、出産前1週間以内に得られた測定値を用い、両心室のいずれかが当該妊娠週数の(平均値+2SD以上)、(平均値ー2SD未満)を示した場合を各々、心拡張、および心収縮率の低下が存在すると判定した。新生児の転帰は出産後24時間以内の心不全の存否によって2群に分け、各々の群と子宮内における腔水症、心拡張および心収縮率低下の三つの指標との関連を検討した。その結果、対象とした全症例のなかで、腔水症、心拡張および心収縮率低下のいずれかの所見を示した例は60例(57.1%)であった。さらに、三つの指標ともに異常を示した症例は6例に認められ、そのなかの5例(83.3%)が心不全によって死亡した。また、腔水症に心拡張あるいは心収縮率の低下のいずれかを随伴した例は60例中4例であった。そのなかの3例(75.0%)は心不全で死亡した。心拡張と心収縮率低下を認めた症例は上室性頻拍の4例で、いずれも生存した。

一つの指標のみが異常を呈した例は43例で、うち心不全死亡例は2例(4.7%)のみであった。三つの指標すべてが正常範囲を示した40例のなかで、心不全で死亡した症例は3例であった。以上のことから、子宮内において腔水症に心収縮率の低下あるいは心拡を伴う例は、すでに子宮内において心ポンプ機能の低下が存在していること、そしてそれらは新生児期に高率に心不全に陥ることが明らかとなった。双胎妊娠における胎児の心動態および血中のhANP値との関連から、Discordant twinの病態を検討した。対象は1988年4月ー1990年3月に妊娠24週以降に分娩に至った双胎妊娠12例である。これらを次の4群に分類した。I群(3例):両児(L児、S児)の出産体重差25%以上でL児に心拡大と心収縮率低下があり、臍帯血Hb差が5g/dl以上、II群(3例):出産体重差25%以上でL児に心拡大と心収縮率低下があり、臍帯血Hb差が5g/dl未満、III群(3例):出産体重差25%以上で心拡大、心収縮率低下はなく、Hb差が5g/dl未満、対照群(3例):出産体重差25%未満。ここに、胎児心の評価は、超音波Bモ-ド法ならびにMモ-ド法を用いて左右両心室の拡張終期径およびFS値を測定し、それぞれが当該妊娠週数の(平均値+2SD以上)、(平均値-2SD未満)の値を示した場合を各々、心拡張および心収縮率低下し判定した。分娩時に得られた両児の臍帯静脈血清中hANP濃度をRIA法を用いて測定し、統計学的解析にはStudent's tーtestを用いた。その結果、各々の群におけるhANP値は、I群:L児20.7±3.1pg/ml、S児19.3±6.0pg/ml、II群:L児296.7±64.3pg/ml(Mean±SD)、S児246.7±65.1pg/ml、III群:L児15.7±4.0pg/ml、S児15.6±4.1pg/ml、対照群L児12.7±3.8pg/ml、S児14.0±3.5pg/mlであり、各々の群内でL児とS児との間には有意差を認めなかった。一方、II群のL児、S児はいずれも対照群のL児、S児と比較して有意にhANP値は高値であり、I、III群は対照群と比較して有意差を認めなかった。以上の結果から、Discordant twinのなかで心拡大を呈する例は心への容量負荷が増大しており、さらに、両児にHb差を生じた双胎間輸血症候群では、心容量負荷が改善する病態が存在することが明らかとなった。本年度は、前年度までに正常ヒト胎児を対象として収集した房室弁通過血流速度、上行大動脈、肺動脈および腹部大動脈などの心内および大血管血流速度、および、臍帯動脈ならびに中大脳動脈といった末梢血管血流波形から末梢血管抵抗の指標として算出したResistance Indexを包括し、これらの指標の妊娠進行にともなうnomogramを作成した。つぎに、これら正常胎児における心および末梢循環動態の指標を用いて、疾病胎児における循環動態を検討した。その結果、まず完全房室ブロックおよび上室性頻拍を有する胎児では、心収縮率は前者では増加、後者では減少し、心拍出量を保持する機構が存在することが明らかとなった。この成績を基礎にして本年度は、腔水症の出現および心収縮率の低下が認められた胎児完全房室ブロック症例に対し、経胎盤的ジギタリス治療を試みた結果、治療後に心収縮率の上昇および腔水症の消失が認められ、本指標が子宮内治療効果の判定に有用であることが明らかとなった。
生活習慣病関連遺伝子、Elovl6が骨軟骨発達異常を来すメカニズムの解明

Elovl6は炭素数1216の飽和・一価不飽和脂肪酸の伸長を司る脂肪酸伸長酵素である。本研究では、Elovl6の骨の発達における役割とそのメカニズムについて検討した。Elovl6欠損新生児は、対照群と比較して小柄な骨格を示し、脛骨成長板は、Collagen10α1を発現する肥大層が厚かった。初代Elovl6欠損細胞ではCollage10α1とその関連遺伝子の発現増加を認め、それらを制御するタンパク質の細胞内分布も変化していた。すなわち、Elovl6欠損による脂肪酸組成の変化は、少なくとも生直後までの成長板の発達に関与することが示唆された。生活習慣病と、関節症や骨粗鬆症といった骨・軟骨組織の病気の相関が近年、臨床研究により明らかにされてきたが、その病態のメカニズムはまだ、十分に解明されていない。本研究は、生活習慣病と有意の相関がみられる遺伝子、脂肪酸伸長酵素“Elovl6"を欠損したマウスにおいて胎生期の成長板・骨の発達に異常がみられる、という我々の最近の知見に基づき、その詳細な表現型の検討とその背景となる作用メカニズムの解明を行うことを研究目的とした。平成26年度は、普通食下においてElovl6欠損マウスの胎生期の骨・成長板の各発達段階での表現型を主に検討した。1)E15.5からE18.5までの胎児と新生児の成長、patterningの異常を体重の変化、Alcian blueとAlizarin redによるwhole skeletal染色などにより検討した。2)軟骨細胞の増殖とアポトーシスの評価。軟骨細胞の増殖に関しては、BrdUを母体あるいは新生マウスに注射し、2時間後に殺戮。E15.5, E18.5,生直後の脛骨の連続パラフィン切片を作成し、BrdUのとりこみで細胞の増殖を評価した。TUNEL染色で成長板での軟骨細胞のアポトーシスを評価した。3)軟骨細胞の肥大の促進、遅延の評価。軟骨細胞の肥大の始まるE14.5および、軟骨から骨への置換がほぼ完了する生直後の脛骨の組織標本において、ISHの手法を用いて検討した。4)破骨細胞の数をTRAP遺伝子の発現と染色で解析した。5)新生マウスの肋軟骨から初代軟骨細胞を単離培養し、軟骨細胞からRNAを精製して、マイクロアレイ解析を行い、Elovl6の標的遺伝子を検討した。本研究は、生活習慣病と有意の相関がみられる遺伝子である脂肪酸伸長酵素“Elovl6"を欠損したマウスにおいて胎生期の成長板・骨の発達に異常がみられる、という我々の最近の知見に基づき、その詳細な表現型の検討と作用メカニズムの解明を行うことを研究目的とした。平成26年度は、普通食下においてElovl6欠損マウスの胎生期の骨・成長板の各発達段階での表現型を検討した。1)成長過程のモニター: E15.5からE18.5までの胎児と新生児の成長、patterningの異常を体重の変化、whole skeletal染色などにより解析した。2)軟骨細胞の増殖とアポトーシスの評価:骨、軟骨細胞の増殖に関しては、BrdUを母体あるいは新生マウスに注射し、2時間後に殺戮。3)軟骨細胞の分化の評価。5)新生マウスの肋軟骨から初代軟骨細胞を一晩培養し、翌日、軟骨細胞からRNAを精製して、マイクロアレイ解析を行い、Elovl6の標的遺伝子を検討した。平成27年度は、6)マイクロアレイの解析から選定した軟骨細胞関連標的遺伝子の成長板での遺伝子発現を初代軟骨細胞によりreal-time qPCRで確認した。Elovl6の欠損で最も上昇したのはCollagenXa1で、この発現上昇の原因として、Foxa2/3とMef2cの発現上昇を確認した。Elovl6欠損マウスは脛骨の成長板で増殖軟骨細胞層が軽度薄く、肥大軟骨細胞層が増大している表現型を呈した。そのメカニズムの解明にあたって初代軟骨細胞を用いてマイクロアレイ解析をおこなった。欠損マウスの表現型に合致してCollagenXa1遺伝子発現の顕著な増加を観察し、その背景となる機序を解明している。これまでに、脂肪代謝に重要な転写因子Foxa2/3, Mef2cの遺伝子発現のElovl6欠損、およびノックダウン細胞での増加と、Foxa2の軟骨細胞の核内局在が増加していることを見出した。生活習慣病と、骨・軟骨組織の病気の関連性が近年、臨床研究において指摘されるようになってきたが、その病態のメカニズムはまだ、十分に解明されていない。本研究課題は、生活習慣病と有意の相関がみられる"Elovl6"遺伝子を欠損したマウスにおいて胎生期の成長板・骨の発達に異常がある、という我々の最近の知見に基づき、その表現型の検討と作用メカニズムの解析を行うことを研究目的とした。平成26年度は、普通食下においてElovl6

欠損マウスの胎生期の骨・成長板の各発達段階での表現系を検討した。1)成長過程のモニター:E15.5からE18.5までの胎児と新生児の成長、Patterningの異常を体重の変化、whole skeletal染色などにより解析した。2)軟骨細胞の増殖とアポトーシスの評価:骨、軟骨細胞の増殖に関しては、BrdU染色とTUNEL染色でそれぞれ評価した。3)軟骨細胞の分化の評価。軟骨細胞の肥大の始まるE14.5および、軟骨から骨への置換がほぼ完了する誠直ぼの脛骨の組織票本において、ISHの手法を用いて検討した。4)破骨細胞の数をTRAP遺伝子の発現と染色で解析した。5)新生マウスの初代軟骨細胞にてマイクロアレイ解析を行い、Elovl6の標的遺伝子を検討した。平成27年度は、6)マイクロアレイの解析からElovl6の欠損で最も上昇したのは、CollagenXa1で、この発現上昇の原因としてFoxa2/3とMef2cの発現上昇を確認し、タンパク質レベルでの解析を開始した。平成28年度は、CollagenXa1の遺伝子発現の上昇が、Foxa2のタンパク質の細胞内分布の変化に加え、Mef2c遺伝子の発現を制御する、HDAC4/5/7のタンパク質の細胞内分布が変化していることに基づくことを解明した。Elovl6は炭素数1216の飽和・一価不飽和脂肪酸の伸長を司る脂肪酸伸長酵素である。本研究では、Elovl6の骨の発達における役割とそのメカニズムについて検討した。Elovl6欠損新生児は、対照群と比較して小柄な骨格を示し、脛骨成長板は、Collagen10α1を発現する肥大層が厚かった。初代Elovl6欠損細胞ではCollage10α1とその関連遺伝子の発現増加を認め、それらを制御するタンパク質の細胞内分布も変化していた。すなわち、Elovl6欠損による脂肪酸組成の変化は、少なくとも生直後までの成長板の発達に関与することが示唆された。普通食下においてElovl6欠損マウスの胎生期の骨・成長板の各発達段階での表現型の解析を完了する予定であったが、E13.5、14.5の胎児の脛骨における表現型の解析がまだ不十分で引き続き検討を要する。また、破骨細胞の数をTRAP遺伝子の発現と染色で確認したが、機能の検査として、新生マウスの頭骸骨から分離する骨芽細胞と脾臓細胞を用いて、co-cultureを行い、osteoclastogenesisを観察したり、骨吸収pit assayにより、破骨細胞の骨吸収能を検討する部分は、まだ再検討の余地を要する。主な遅延の原因としては、遺伝子変異マウスの生存率が低く、また、胎児期は骨が小さく、組織断面の方向と深さが対照群と変異マウス群で比較に十分なほど合致した試料標本を同胞として得ることに予想していた以上の困難を経験したことによる。信頼性の高いデーターを得るために今後、期間を延長して引き続き検討が必要である。Elovl6欠損マウスは増殖軟骨細胞層が軽度薄く、肥大軟骨細胞層が増大していた。この表現型に合致してCollagenXa1遺伝子の顕著な増加を観察し、その背景となる機序を現在解明している。
網膜色素変性の臨床像におよぼす加齢黄斑変性関連遺伝子多型の影響

網膜色素変性の中心視野狭窄の進行度を修飾する因子として加齢黄斑変性の疾患感受性遺伝子であるARMS2遺伝子の遺伝子多型Ala69Serが機能しているかどうかを研究した。弘前大学医学部附属病院眼科外来にて管理している網膜色素変性患者を対象として弘前大学倫理委員会の承認の下、各患者のARMS2遺伝子多型を診断し、ハンフリー10-2プログラムにて計算される中心視野狭窄の進行度と遺伝子多型との関連性を統計学的に解析した。その結果、中心視野の進行度をMD slopeで比較すると各遺伝子多型間での進行度の統計学的差異は認められず、ARMS2遺伝子多型が網膜色素変性の進行度を修飾する可能性は否定された。遺伝性網膜変性疾患の代表疾患である網膜色素変性は進行性の視細胞変性を主体とする難病である。本疾患は原因遺伝子異常にともなう視細胞のアポトーシスないしネクローシスがその本体であると考えられている。その原因遺伝子はこれまでに少なくとも45種類同定されており、遺伝学的に異質性が高い疾患として知られる。また一方で、同一家系で恐らく同一の原因遺伝子によって発症していると考えられる症例でもその重症度や臨床像には差異が見られることがあり、臨床像の異質性も高いことが知られている。これは原因遺伝子以外に臨床像を修飾する何らかの因子の存在を示唆する事象である。加齢黄斑変性関連遺伝子の中でARMS1遺伝子として知られる遺伝子は視細胞ミトコンドリアにて発現するという研究報告がある。これが真実であれば、加齢黄斑変性の発症には視細胞の酸素代謝およびその脆弱性が関与しているという仮説が成り立つ。さらにそのことは網膜色素変性における視細胞の脆弱性に影響を与えるひとつの因子としてARMS1の関与をも示唆する。本研究において網膜色素変性の視野障害の進行速度とARMS1遺伝子多型との関連を調べるため、本研究の倫理審査を研究施設に申請し許可を得た。その結果を受けてノミネート候補患者の視野障害の程度を静的視野測定により定量化することを開始した。次年度にはARMS2遺伝子の多型解析をPCR法と塩基配列決定法により開始できる目途がたった。網膜色素変性は視細胞または網膜色素上皮細胞に特異的に発現する遺伝子の異常により発病することが近年明らかになってきた。現在までに約50種類の原因遺伝子が判明しているが、病気の本質である視細胞死がどのような分子機構で起こっているのかについては不明な点が多い。それは非常に他種類の原因遺伝子があり、かつ周じ遺伝子変異でも病態や病型が異なることが知られ、遺伝的異質性が高いことが理由となっている。本研究課題では網膜色素変性の病態を左右する疾患関連因子として加齢黄斑変性関連遺伝子であるARMS2遺伝子多型の関与を仮定して網膜色素変性の中心視野の進行度とARMS2遺伝子多型の相関を検討することにある。遺伝子診断と視野進行度との関係についての具体的検討は次年度の計画として、当該年度においては、当科で管理している網膜色素変性愚者の血液細胞を十分なインフォームドコンセントの下に採取した。年度末までに50名の血液を採取し、かつこれらの患者の中心視野障害の進行度をハンフリー自動視野計の10-2プログラムにて経時的に測定した。血液細胞はヘパリン採血の後、デキストランにて赤血球を沈殿させ、白血球濃厚液を調整後遠心分離にて白血球を集め、冷凍保管した。ゲノムDNAは白血球細胞からカラム操作により抽出した。次年度ではARMS2遺伝子の既知遺伝子多型を全例について塩基配列を決定することにより検索することとしている。多型毎に視野計で測定したMDスロープの値の平均値を計算し、統計学的農が見られるか否かを検討する予定である。それは非常に他種類の原因遺伝子があり、かつ同じ遺伝子変異でも病態や病型が異なることが知られ、遺伝的異質性が高いことが理由となっている。前年度までに採取した網膜色素変性患者80例の血液からゲノムDNAを精製し、ARMS2遺伝子多型を遺伝子診断にて決定した。遺伝子診断と視野進行度との関係を調べるため、患者の中心視野障害の進行度をハンフリー自動視野計の10-2プログラムにて経時的に測定した。

視野の進行度の計測は連続する2回以上の視野測定法にてMDslopeを測定し、各遺伝子多型との間に重症度の差異がみられるかいなかを検定した。その結果、現在の症例数の数がさほど多くなかったこととも関連すると考えられるが、各遺伝子多型と網膜色素変性の重症度との間には明確な関連性は見いだされなかった。しかし、今後、症例数を増やすことによってさらに新しい関係が見いだされる可能性があり、引き続き検討を続けることとした。
覚醒時非機能的咬合接触の是正は睡眠時咀嚼筋筋活動を制御する

昼間に観察される無意識な上下の歯を咬み合わせる癖(上下歯列接触癖)を是正する治療が睡眠時の頬にある咬むときに活動する筋肉の活動(歯ぎしり)を減らすかどうかについて検討した.上下歯列接触癖頻度は是正する治療前に比較し治療後に統計学的に有意に減少した.しかし,歯ぎしり数は治療前から治療後にわずかな減少を示したにすぎなかった.上下歯列接触癖と歯ぎしりとは関連性があるとは言えない可能性が示された.昼間、目が醒めているときに無意識に上下の歯を接触させてしまう癖(上下歯牙接触癖)および夜間、睡眠時に無意識に上下の歯を接触させてしまう癖(ブラキシズム)との関連性を明らかにするため、本年度は以下の実験を行った。有痛性顎関節症と診断され研究参加の同意が得られた患者30名(男性13名、女性17名、30.7±8.7歳)を対象とし、上下歯牙接触癖是正法の違いにより上下歯牙接触癖測定装置を是正法として使用する装置群(10名)、「歯を離しておく」と書いた貼り紙を部屋に10枚以上貼っておく貼り紙群(10名)および上下の歯を当てないように注意するだけのコントロール群(10名)の3群にランダムに割付けた。初診時には現在の病態説明ならびに患者教育のみを行った。評価項目は上下歯牙接触癖頻度、無痛最大開口量および運動時疼痛強度(VAS)の3項目とし、それぞれの項目について20日間の上下歯牙接触癖是正介入前後および3群間の比較を行った。3群とも各項目において、上下歯牙接触癖是正前と比較し上下歯牙接触癖是正後には有意に改善していた(Ttest, p<0.05)。上下歯牙接触癖是正介入後の群間比較では、装置群が上下歯牙接触癖頻度ならびに無痛最大開口量の項目において他の2群よりも有意に改善されていた(one-way ANOVA, p<0.05)。以上のことから、上下歯牙接触癖是正法としては上下歯牙接触癖測定装置を使用するのが最も好ましく、睡眠時のブラキシズムを軽減させる方法として適切であることが明らかとなった。顎関節症患者5名および健常者4名(平均年齢31.9±5.8歳)を被験者とし、覚醒時非機能的咬合接触(上下歯列接触癖)頻度と睡眠時咀嚼筋活動回数とを測定した。顎関節症患者の上下歯列接触癖の頻度は33.8%(中央値)であり,健常者の7.4%(中央値)より有意に高かった.顎関節症患者の睡眠時の咀嚼筋筋活動イベントは430.0±210.8(回)であり、健常者の350±205.5(回)と有意な差は認められなかった。以上のことから、サンプル数が少ないが、覚醒時非機能的咬合接触と睡眠時咀嚼筋筋活動との関連性は薄いことが示唆された。被験者の同意がなかなか得られなかったため。覚醒時に観察される非機能的な咬合接触(日中歯牙接触癖,Tooth Contacting Habit:TCH)は顎関節症患者の多くに認められ,この習癖を是正することにより顎関節症症状の改善がえられることから,顎関節症の原因因子として注目を集めている.しかしながら,顎関節症の原因因子として考えられている睡眠時ブラキシズムの是正方法が明らかになっていない.本年度は,覚醒時非機能的咬合接触(TCH)の是正治療が睡眠時咀嚼筋筋活動の軽減へ及ぼす影響について検討した.DC/TMDに基づき選択した顎関節症患者(男性3名,女性3名,平均年齢42.8±15.0歳)の覚醒時10時間(8:00ー18:00)のTCHイベント頻度(%)および睡眠時約6時間(24:00ー6:00)の咀嚼筋筋活動イベント数(個)を連続3日間測定し平均値をTCH是正介入前後の各イベントの変化として検討した.TCHイベント頻度は申請者らが開発した“TCH測定システム"を用いて測定した.咀嚼筋筋活動はウェアラブル超小型筋電計を主咀嚼側咬筋部皮膚に貼り測定した.TCHイベント頻度(%)はTCH是正介入前44.3±17.4に比較し介入後21.7±17.6に大幅に減少したが,咀嚼筋筋活動イベント数(個)は介入前48.4±10.4から介入後43.2±11.0にわずかな減少を示したにすぎなかった.覚醒時に無意識に発現するTCHと睡眠時に発現する咀嚼筋筋活動とは関連性があるとは言えない可能性が示唆された.しかし,被験者数が少ないため弱い主張しかできず,継続的に本研究を遂行し被験者数を増やした上で最終的な結論を出す所存である.昼間に観察される無意識な上下の歯を咬み合わせる癖(上下歯列接触癖)を是正する治療が睡眠時の頬にある咬むときに活動する筋肉の活動(歯ぎしり)を減らすかどうかについて検討した.上下歯列接触癖頻度は是正する治療前に比較し治療後に統計学的に有意に減少した.しかし,歯ぎしり数は治療前から治療後にわずかな減少を示したにすぎなかった.上下歯列接触癖と歯ぎしりとは関連性があるとは言えない可能性が示された.

睡眠時咀嚼筋活動を測定する超小型筋電計の入手時期が遅くなり、その後に同意を得られた患者が少なく分析可能なデータ収集が行えなかったため。顎関節症患者の覚醒時非機能的咬合接触を是正した時の睡眠時咀嚼筋筋活動の変化を検討する。医歯薬学本年度は、上下歯牙接触癖是正法としては上下歯牙接触癖測定装置を使用するのが最も好ましく、睡眠時のブラキシズムを軽減させる介入方法として適切であることが明らかとなった。来年度以降は超小型筋電計を使用して夜間睡眠時の咀嚼筋活動の測定を行い、上下歯牙接触癖是正介入が夜間睡眠時の咀嚼筋活動の軽減へどのような影響があるかを明らかにしていく。被験者からの謝金請求書類が未提出のため。次年度の謝金として使用する。