hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マルチメディア用カード型画像入力デバイスの研究

昆虫の複眼による画像処理システムにヒントを得て、新しい光学処理システムを考案した。1枚の光学レンズによって、ひとつの画像を形成するという古典的な画像形成システムではなく、2次元配列された数10ミクロン直径の微小マイクロレンズを多数組み合わせることによって、一つの画像を形成するという新規なアプローチに挑戦した。まず、石英基板への特殊な反応性イオンエッチングによって、同一サイズ・同一特性の微小な凸レンズが2次元に配列したアレイを製作した。製作技術を確立するとともに、各微小レンズの評価を行い、基板内で特性が一様であることを確認した。つぎに各種パラメータをもつ微小レンズアレイを使用し、2枚の基板を所定の間隔にセットし、かつ微小角度の回転ずれを与えることによって、所望の像形成システムを構築できることを確認した。また「像が90度回転」という固有の特徴を確認した。レンズ設計評価シミュレーションソフトを用い、微小レンズアレイによる結像システムを解析した。また幾何光学近似による光線追跡による結像システムの解析を行った。これらの結果、この結像システム固有の「像が90度回転する」現象をおおまかに説明することができた。今後、このレンズ設計シミュレーターを使用して行い、結像性能の限界を明らかにする。つぎにこのシステムに半導体の光-電気変換デバイス(たとえばCCD)を複合化することによって、総厚さ1mm以下のビデオ入力デバイスの実現をはかる。マルチ・メディア用カード型画像入力デバイスの研究第1段階(a)複眼を有する昆虫の光学処理システムについて検討した。(b)これを基に新規に考案した結像システムについて、理論的・実験的検討を進めた。(c)結像シミュレーシュンプログラムを作成し、解像後、明るさなどを検討した。第2段階(a)各種パラメータを持った微小レンズアレイを、石英基板をスパッタリングにより製作した。(b)この微小レンズアレイを使用した新結像システムを組み、像の形成を試みた。(c)結像シミュレーションと実験結果との対比を行った。以上の結果、(1)「昆虫などが有する複眼による像形成は、1個1個の微小レンズがそれぞれ完全像を形成するのではなく、多数の微小レンズ全体として1個の像形成に寄与する」という説がある。今回提案された新規な像形成システムによる実験結果および結像シミュレーション結果は、この説をサポートする。(2)微小レンズのサイズが小さくなるほぼ、像形成に寄与する微小レンズの個数が増加することから、像の品質すなわち解像度は上がると予測したが、さほど像質は向上しなかった。これは微小レンズのサイズがちいさくなるほど、アレイのなかでの焦点距離なのばらつきが顕著になったことが原因と推測される。(3)微小レンズが形成されていない領域からの漏れ光線が、像質(コントラスト)に影響することが明らかになった。マルチメディア用カード型画像入力デバイスの研究昆虫の複眼による画像処理システムにヒントを得て、新しい光学処理システムを考案した。一枚の光学レンズによって、ひとつの画像を形成するという古典的な画像形成システムではなく、2次元配列された数10ミクロン直径の微小マイクロレンズを多数組み合わせることによって、一つの画像を形成するという新規なアプローチに挑戦した。また幾何光学近似による光線追跡による結像システムの解析も行った。今後、このレンズ設計シミュレーターを使用し、本システムの結像性能の限界を明らかにする。
食餌同期性概日リズムを刻む視床下部背内側核ニューロンの機能解析

毎日固定した一定時間帯でのみ餌が得られる環境下では、動物は給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日行動リズムは、哺乳類の概日リズム制御中枢・視交叉上核(SCN)とは別の生物時計(食餌同期性クロック)によって制御されるが、その詳しいメカニズムは分かっていなかった。本研究で、食餌同期性クロックが機能するためには、脳内の視交叉上核以外の場所における時計遺伝子Bmal1の働きが必要であることが明らかになった。毎日固定した一定時間帯でのみ餌が得られる環境下(時間的食餌制限)では、動物は給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日行動リズムは、哺乳類の概日リズム制御中枢・視交叉上核(SCN)とは別の生物時計(食餌同期性クロック)によって制御される。我々は以前、視床下部背内側核(DMH)が食餌同期性クロックの有力な候補部位であることを見いだした。食餌同期性クロックは環境、生活習慣への適応、不適応のメカニズムを理解する上で重要であると考え、本研究ではDMH食餌同期性クロック(DOMFEC)ニューロンを突破口とし、食餌同期性概日リズム制御の神経メカニズムを明らかにすることを目的とする。全ての哺乳動物は、様々な行動パターンを約24時間周期で制御する生物時計を持っている。マウスなど夜行性の動物では、常に餌がある状態では視床下部視交叉上核(SCN)の生物時計によって、主に夜に活動・摂食するように支配される。しかし、餌が昼間の一定時間でのみ得られる環境下では、給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日行動リズムはSCNとは別の生物時計(食餌同期性クロック)によって制御される。食餌同期性クロックがどこにあるのか長い間明らかでなかったが、我々は視床下部背内側核(DMH)がその有力な候補であることを見いだした。食餌同期性クロックは環境、生活習慣への適応、不適応のメカニズムを理解する上で重要であると考え、本研究では我々が見いだしたDMH食餌同期性クロック(DOMFEC)ニューロンを突破口とし、食餌同期性概日リズム制御の神経メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行っている。時計遺伝子BMAL1をDOMFECニューロンで特異的に欠損したマウスをこれまでに作成した。DOMFECニューロンにおける分子時計機構が機能しないと考えられるので、今後これらのマウスにおける食餌同期性概日リズムを調べ、DMHが食餌同期性クロックとして機能することを検証する。また、Creリコンビナーゼ依存的に神経軸索トレーサーを発現する組換えアデノ随伴ウィルスを作成し、DOMFECニューロンを特異的にラベルする方法を確立した。予備的な実験によるとDOMFECニューロンの投射はDMH内に留まっており、局所的な神経回路を形成していることが示唆された。今後同様の方法を用いて、DOMFECニューロンの上流・下流ニューロンを同定していく。DOMFECニューロンを含む前脳腹側部(SCNは含まない)で特異的に時計遺伝子BMAL1を欠損したマウスでは、食餌同期性概日リズムが減弱していた。またこのマウスでは自由摂食下においても、活動期(夜間)の自発活動パターンが野生型マウスに比べ変化していることが明らかになった。従って、SCN以外の前脳腹側部に存在する概日分子時計が食餌同期性リズムや自由摂食下での自発活動リズムの形成に関わっていることが示唆された。現在さらに、DOMFECニューロンを含み上記のマウスと異なる空間パターンでBMAL1を欠損したマウスの解析を行っている。さらに、組換えアデノ随伴ウィルスベクターとFLEXシステム、DREADD (designer receptors exclusively activated bya designer drug)を組み合わせ、腹腔に薬剤を投与することでDOMFEC

ニューロンを直接且つ特異的に活性化あるいは抑制できる系を構築したので、DOMFECニューロンの活性化・抑制が食餌同期性概日リズムや摂食、自発活動量にどのような効果を及ぼすか、明らかにする。毎日固定した一定時間帯でのみ餌が得られる環境下(時間的食餌制限)では、動物は給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日行動リズムは、哺乳類の概日リズム制御中枢・視交叉上核(SCN)とは別の生物時計(食餌同期性クロック)によって制御される。申請者は、食餌同期性概日リズムにおいて、DMHにおける時計遺伝子の機能が重要との仮説の基、本研究計画を提案し、遂行してきた。しかしこの2-3年に、DMHのみならず時計遺伝子の関与にさえ否定的な報告がされた。今年度申請者らは、神経系特異的に時計遺伝子Bma11を欠損したマウスを解析し、神経系における時計遺伝子・概日時計が食餌同期性活動リズムに必須で、この時計を欠損すると自発活動リズムだけでなく摂食調節機構も時間的食餌制限に適応できず、体重を維持できないことを示した。時計遺伝子が関与しないとの先行報告には問題点があり、それを踏まえた統合的な説明を提示した。またDMHの関与に関してもごく最近、先行論文との違いを踏まえた上で「やはりDMHが重要である」との報告がされた。従って、本研究課題の妥当性・重要性が確認された。さらに、DMHを含む前脳腹側部(SCNは除く)特異的なBma11欠損マウスにおいて、食餌同期性活動リズムの減弱を確認した。またこのマウスは自由摂食下でも活動期の自発活動パターンに異常が生じることから、SCNは大まかな夜行性の活動パターンを決定し、詳細な活動リズムの表出にはSCN外の前脳腹側部に存在する概日時計が必要であることを示した。以上から、脳領域・細胞特異的Bma11欠損マウスが食餌同期性クロックの解析に有効なことが分かったので、来年度は前述の欠損マウスの解析をさらに進め、また現在作成中の他の脳領域・細胞特異的Bma11欠損マウスの解析を行う。毎日固定した一定時間帯でのみ餌が得られる環境下(制限給餌)では、動物は給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日活動リズムは、概日リズム制御中枢・視交叉上核(SCN)とは別の生物時計(食餌同期性クロック)により制御される。申請者は食餌同期性概日リズムにおいて、視床下部背内側核(DMH)における時計遺伝子の機能が重要との仮説の基、本研究計画を提案し、遂行してきた。今年度申請者らは、神経系特異的に時計遺伝子Bma11を欠損したマウスを解析し、神経系における時計遺伝子・概日時計が食餌同期性活動リズムに必須で、この時計を欠損すると自発活動リズムだけでなく摂食調節機構も制限給餌に適応できず、体重を維持できないことを示した。即ち、脳内の食餌同期性クロックが食物探索行動と摂食を適切なタイミングで行うように制御していると考えられる。
マンガン酸化物の電荷/軌道秩序状態と相分離に関するナノ構造

強相関電子系物質である遷移金属酸化物は、固体内の電子が持つ内部自由度である電荷、軌道、スピンに加えて、格子系との強い相互作用により、超伝導特性や金属-絶縁体転移、巨大磁気抵抗効果、電荷・軌道秩序構造などの種々の特異な物理的特性を示す。最近、マンガン酸化物で見出された電子の局在性に起因した電荷秩序構造と電子の遍歴性に起因した強磁性金属状態の共存状態(相分離状態)が見出され、巨大磁気抵抗効果や金属-絶縁体転移と強く相関していることが明らかになってきている。本研究では、マンガン酸化物での相分離状態及び電荷・軌道秩序構造に関するナノ構造について主に透過型電子顕微鏡を用いて研究を行った。以下今回行った研究で得られた主な成果成果について示す。(1)マンガン酸化物のMnサイトの一部をCrイオンで置換することによって得られるNd_<0.5>Ca_<0.5>Mn_<1-y>Cr_yO_3において、Crで2%置換することにより絶縁体-金属転移が誘発されることを見出すとともに、ローレンツ電子顕微鏡観察を行うことにより数十nmサイズの強磁性領域と電荷・秩序構造が共存する電子相分離状態の直接観察に成功し、電子相分離の実態をはじめて実空間像として示した。(2)(La_<5/8-x>Pr_x)Ca_<3/8>MnO_3での相分離状態における強磁性磁区構造観察を行い、ミクロンサイズで強磁性金属状態と電荷秩序構造が共存していることを明らかにした。強相関電子系物質として特徴づけられる遷移金属酸化物は、固体内の電子が持つ内部自由度である電荷、スピン及び軌道間の強い相互作用に起因した超伝導特性や金属-絶縁体転移、巨大磁気抵抗効果、電荷秩序構造など種々の特異な物理的特性を示す。最近、我々はこのような多種多様な物理的特性を示す強相関電子系物質の一つであるマンガン酸化物において、電子の局在性に起因する電荷秩序状態と電子の遍歴性に起因する強磁性金属状態の共存状態(相分離状態)の存在を明らかにし、相分離状態と物理的特性との相関について研究を進めている。今年度は、Nd_<0.5>Ca_<0.5>MnO_3等において見いだされている電荷/軌道秩序状態に着目し、Mnサイトの一部を他の遷移金属(CrイオンやScイオン)で置換することによる電荷/軌道秩序構造の構造変化を調べるとともに、新しく誘起される強磁性金属相と電荷/軌道秩序状態との相分離状態についてローレンツ電子顕微鏡法及び高分解能電子顕微鏡を用いて研究を行った。以下、今年度得られた主な研究成果を示す。(1)Mnイオンの一部をCrイオンで置換すると、新たな強磁性金属状態が出現することを見出した。さらに、そのナノ構造を透過型電子顕微鏡を用いて調べた結果、強磁性金属相への転移温度である120K以下では、電荷/軌道秩序状態は数十ナノメートルのサイズで存在しており、強磁性金属相と相共存していることが明らかとなった。さらに、ローレンツ電子顕微鏡法を用いて強磁性分域の観察を行った結果、強磁性金属状態は10-20nmサイズのマイクロ分域として存在していることの直接観察に初めて成功した。(2)一方、Mnサイトの一部をScイオンで置換した場合、Crの場合とは異なり、新たな強磁性金属相は出現せず、60K以下の低温領域では、長距離秩序を持った電荷/軌道秩序状態が形成されていることが見出された。
近世たたら製鉄の展開と森林資源

松江藩領ではたたら製鉄が発展し、江戸時代製鉄業の中心地となった。たたら製鉄では鉄生産に大量の木炭を必要とした。その木炭は鉄山と呼ばれる天然林から供給された。たたら製鉄の経営者たちは、鉄山を多く買い集めてその経営を確立した。これに対して、1726年、松江藩は鉄方法式によって経営者たちがその後も生産を持続できるようにたたらの数を限定し森林資源の配分を行った。その経営者の具体例として、奥出雲の卜藏家の鉄山購入の歴史的経緯について検討し、他の経営者とその性格を比較した。交付申請書に記した、(1)松江藩領鉄師文書のうち鉄山証文など森林資源の分配・利用に関する史料の調査・収集を行うことについて、24年度には、奥出雲町所蔵の卜藏家文書を中心に実施し同家の鉄山証文の調査を行ったが、25年度は、さらに絲原家・櫻井家・田部家などに伝えられている鉄山証文と対比し、その形式・内容の検討を行うことを予定しており、それを実施した。その際、卜藏家について現地調査による鉄山の位置の確認や卜藏家が鉄山を買得するまでの経緯の解明を試みたところ、新たな研究成果が得られる見通しを得たので、本年度はその作業を中心に研究を実施した。すなわち、鉄師卜藏家の性格について、同じく松江藩の鉄方法式で鑪株を認められた鉄師である絲原家・櫻井家・田部家などと対比してみると、その鉄山集積過程において買得を中心とするという意味でほぼ同様の推移を示すものの、村の鉄山師からの成長というやや性格を異にする側面がうかがえ、それらの点を中心に研究成果を論文としてまとめ、現在投稿中である(受理ずみ)。同じく、(2)松江藩領の鉄師文書によって製鉄に必要な木炭量と所持鉄山面積との対応関係を検討することについて、24年度にはすでに研究の一部を発表するなど一応の成果をあげた。25年度は、田部家の鉄山を中心にその位置や範囲について現地調査する予定であったが、上記(1)の卜藏家鉄山の現地調査と同家古文書調査にもとづく論文作成を先行させることにしたので本年度は1度の調査にとどまった。ただし、卜藏家文書のなかに見いだした享保11年松江藩鉄方法式の卜藏家写本が善本であることについて、再調査を行って確認したうえ、昨年作成していた仁多郡鉄師別鉄山・腰林配置の略図を新たに公表する機会を得たので関連作業は進展している(『奥出雲町文化的景観調査報告書』)。平成24年度研究実施計画に記した、(1)松江藩領鉄師文書のうち鉄山証文など森林資源の分配・利用に関する史料の調査・収集を行うことについて、計画通り奥出雲町所蔵の卜藏家文書を中心に実施し、慶安2年(写しでは寛永16年)以降の約100通におよぶ鉄山(製鉄用の木炭供給林)・腰林の売買を示す証文類を抽出撮影し、同家が所持した鉄山の18世紀半ばまでの推移を整理した。その結果、芦谷・大畑・赤川・亀石・万歳などの同家主力鉄山は17世紀のうちに買得されており、他の有力鉄師と同じく享保の鉄方法式以前に経営基礎を確立したことが推定されたが、家督分けを繰り返す中で経営の不安定化も想定された。また同家史料のなかに、森林資源の配分を定めた享保11年松江藩鉄方法式の善本を新たに得て、当該段階における鉄師別鉄山・腰林配置の略図も作成した。同じく、(2)松江藩領の鉄師文書(絲原家文書)によって製鉄に必要な木炭量と所持鉄山面積との対応関係を検討することについて、島根県立図書館所蔵の旧島根県史編纂資料や田部家文書からの情報も新たに加え、まずは明治期にそれぞれの鉄師が稼働させていた鑪・鍛冶屋数と、地租改正によって把握されたそれぞれの鉄山面積とを対比させる作業を行った。その結果、確かに一定の対応関係が認められるが、絲原家の史料による従来の見積もりには再検討が必要なようである。これらの成果の一部はすでに研究発表も行った。交付申請書に記した,(1)松江藩領の鉄師田部家ほかに伝えられた近世前期の鉄山証文について総合的考察を行い成果を取りまとめることについて,昨年度まずは卜藏家を中心に論文としてまとめる作業を行い,本年度はその発表(昨年度研究発表欄に印刷中として掲載ずみ)に加えて,根拠となった文書群を新たに「研究成果報告書」に翻刻して紹介する作業を行った。そこでは,卜藏家の史的性格を同じく松江藩の鉄方法式で鑪株を認められた鉄師である絲原家・櫻井家・田部家などと対比するかたちで論じている。

すなわち上記3家が中世以来の古い由緒とは別に鉄山のほとんどを買得により,その性格が近世的・専業的鉄師とみられるのに対し,卜藏家は鉄山所持の由来が一部異なることから,村の有力者から鉄師への成長という側面を指摘している。本年度は,その論文の発表に加え,それを支える史料としての卜藏家文書を「研究成果報告書」に翻刻・印刷し紹介することができた。なお,製鉄に必要な木炭量と所持鉄山面積との対応関係や鉄山の配置図作成については,すでに昨年度において仁多郡鉄師別鉄山・腰林配置の略図を公表するなど関連作業は進展している(『奥出雲町文化的景観調査報告書』2013年)。同じく,(2)隣接する幕領石見銀山領との対比のため,幕領飛騨の資料調査を行うとした計画については,24年度および25年度の実施状況報告書に記したように,東北の鉄生産地域との対比に変更している。本年度も岩手県庁所蔵の旧藩時代の山帳(藩有林)の調査と釜石地域の現地調査を行った。その結果,大橋高炉や橋野高炉など幕末の木炭高炉の立地について,周辺村々の御山の林相(山帳の分析から)との関係で再検討する余地があること,甲子村御山大松倉山に従来全く知られていない高炉計画の存在などが明らかになった。これについては,短報ながら先の「研究成果報告書」に解説と資料を紹介した。日本史交付申請書に記した(1)について、上述のように予定していた卜藏家鉄山証文について調査と収集・整理を行い、成果をまとめて研究誌に投稿(受理)するに至った。同じく(2)についても、24年度に引き続き本年度も絲原家所持鉄山に加えて仁多郡の他の4鉄師も含めて享保11年段階の鑪・鍛冶屋の操業に対応する鉄山配置等の検討を進めた。先に整理した明治期の鑪・鍛冶屋操業と鉄山面積についての資料を踏まえて、次の段階に進む準備となっている。(3)島根県立図書館での調査については、24年度に先行して実施したので本年度は行わなかった。24年度実施状況報告書の「今後の研究の推進方策等」に、25年度には東北地方における製鉄と林野利用について比較の観点で調査したい旨、新たに加えたが、これについて本年度に岩手県庁保存文書や宮城県公文書館で関係資料の調査を行うことができ、鉄山の所持利用の形態の出雲との相違について理解を深めることができた。平成24年度研究実施計画に記した(1)について、上述のように予定していた卜藏家鉄山証文について調査と収集・整理を行うことができた。またそこに記されている同家所持鉄山の位置や範囲についても、仁多郡の他の4鉄師も含めて享保11年段階の鉄山・腰林配置略図を作成した。同じく(2)についても、鑪・鍛冶屋の稼働と燃料を供給する鉄山との持続可能な対応関係を、まずは明治期の鑪・鍛冶屋の稼働と対応する鉄山面積を把握することで、面積等不明の江戸期へも遡及させる前提を整えることができた。ただ9月後半に研究代表者が約2週間病気で入院したため、鉄山の現地調査にもとづく情報収集はやや不足気味である。当初計画通り、これまで収集してきた絲原家・櫻井家・田部家の鉄山証文に卜藏家のそれを加え、近世前期の鉄山証文の形式・内容、周辺村民との関係、鉄山集積の推移などの検討を文書中心に行い、かつ現地調査にもとづく情報も取り入れてその総合的考察をめざしたい。なお、25年度から付加した比較対照の観点を引き継ぎ、東北地域における製鉄と林野利用についての予備的調査を引き続き実施したい。次年度は3年計画の最終年度に当たる。本研究では、鉄山証文の紹介が大きな意味をもつので、この間調査収集したそれら史料の翻刻を中心に研究成果報告書を印刷しその紹介の責務も果たしたい。
アラビドプシス花序で発現するcDNAの系統的解析

シロイヌナズナ花序茎頂由来の均一化cDNAライブラリーのスクリーニングにより得られた低い発現レベルでかつ茎頂特異的に発現すると期待されている遺伝子についてデータベースでの相同遺伝子の再検索を行った。その結果、ゲノム解読の進行に伴い、シロイヌナズナゲノム由来の配列にヒットすることが極めて多くなった。ゲノム上の遺伝子の全体像が第2、第4染色体の全構造から見えてきているが、ゲノム上には代謝やエネルギー獲得に関わる遺伝子が多数コードされているのに対して、我々のスクリーニングした花序特異的低発現性の遺伝子群にはこれらの割合が相対的に少なく、シグナリングあるいは機能予測不可能なものの割合が高かった。遺伝子発現の空間あるいは時間的な制御をRT-PCRにより調べ、その発現のパターンから機能予測や制御システムの考察をした。対象とした組織のmRNA分布については結果が得られたが、すべての組織や細胞を初めから調製することは不可能で、RT-PCRでは今後データ更新することが困難である。cDNAマイクロアレイを導入を進めるため、cDNAについて塩基配列の決定と増幅DNAのスライドグラスに固定を進めているところである。発現の特異性に基づいて単離された新規な遺伝子の機能解析を行うため、約100のcDNAに対するアンチセンスRNAを発現する植物を1500系ほど作成し、T2およびT3世代を用いて表現型の観察した。これまでに、異常な分岐パターンを示すもの、矮性になるもの、花成が早まるものや遅れるものが見いだされた。これらは今後、網羅的なアプローチに加え、個別研究のレベルでの詳細な解析が必要である。
枯渇効果による蛋白質の結晶化

本研究では大小の粒子から成る2成分剛体球系における、枯渇効果による結晶化を扱ってきた。系の大粒子間には、小粒子によって引き起こされる枯渇効果により、引力を含む相互作用がはたらく。この相互作用を有効ポテンシャルとして計算し、有効ポテンシャルのはたらく一成分系としてモデル化を行う。2014年度はこのモデル化された有効一成分系における結晶化密度を計算した。この時の計算は定性的にシミュレーションと一致したが、定量的には違っている部分もあった。2015年度はこの定量的な違いについて検討をした。2014年度の研究において、この有効ポテンシャルの計算の際、多数の小粒子溶媒のなかに、大粒子を二つだけ沈めた時の大粒子間の有効ポテンシャルを計算した。そして、その有効ポテンシャルを大粒子が多数含まれる系に適用していた。しかし実際は大粒子が多数含まれる系において、3つめ以上の大粒子による相互座用への影響があることが考えられる。そのため、大粒子の密度が比較的高い結晶状態では、枯渇効果による有効ポテンシャルが変化していると考えられる。2014年度の研究において、有効ポテンシャルの違いによって結晶化の挙動が変化する場合があることを示している。今年度検討した大粒子の多体の効果は、有効ポテンシャルに違いを与える可能性が高い。したがって、結晶化密度にも違いを与えることが考えられる。2015年度の後半では、この多体の効果を取り入れ、より定量的な計算ができる理論の構築を行った。その概要は、小粒子溶媒中に2つの大粒子を入れた系に大粒子を追加した時の小粒子の密度変化を考えることである。特に、第三の大粒子の枯渇効果への影響を確率的に取り込むことにより、小粒子の密度変化を考える。新たに得られた小粒子密度における有効ポテンシャルを計算し、それを結晶化密度の計算に取り込むことで、より定量的な議論が可能になると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度、私は枯渇効果が結晶化に及ぼす影響を、有効ポテンシャルを用いて調べた。(枯渇効果:大きさの違う要素から構成される系で、より大きい要素の間には小さい要素のエントロピー効果によって実効的な相互作用がはたらく効果。)有効ポテンシャルは、小さい粒子からなる溶媒に沈めた、より大きい粒子間にはたらくエントロピー駆動による相互作用である。特に、大きさの異なる二成分系の大粒子間にはたらく有効ポテンシャルの極小が結晶化に及ぼす影響を調べた。ここで、結晶化する密度の計算には熱力学的摂動論および密度汎関数法と呼ばれる手法を用いた。その結果、粒子の中心部分からの距離rが1<r<1.07d(dは大粒子の直径)の部分の有効ポテンシャルによって、結晶化の挙動が決まることが分かった。この領域の引力が強いと、より低い大粒子密度の液相から高密度の結晶へ転移する。この結果は、このような有効ポテンシャルを実現する小粒子の密度や直径を実験的に調整できれば、低い密度から高い密度の結晶を実験的に得られる可能性を示唆している。枯渇効果は、多成分系において互いに引力を持たない粒子同士でも、その大きさの違いによって引力が実効的にはたらく効果である。この効果はたんぱく質溶液に高分子を添加することで結晶化させる、といった実用的な応用の可能性を持っている。また、化学反応や生化学の分野ではこの効果が考慮されていない研究もまだ多い。本研究による理論的裏づけは、より多くの分野の人にも知ってもらうことで様々な研究の発展へ寄与する可能性を持っている。当初の計画通りに枯渇効果による有効ポテンシャルが結晶化に及ぼす影響を明らかにした。

特に、二つの異なる有効ポテンシャルを用いた相図の比較から、有効ポテンシャルのどの部分が結晶化に大きな影響を与えるかを明らかにするという大きな目標を達成している。また、自由エネルギーの極小の出現によって転移密度の振る舞いが大きく変化するという発見も得た。この点から、当初の計画よりも詳細な研究ができたと言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の年次計画の通り、初年度に枯渇効果による実効ポテンシャルが結晶化に及ぼす影響を調べた。今後はこの結果を論文にまとめて雑誌へ投稿する。また、2年目には当初の計画の通り、これまでの研究に含まれていなかった条件を加えた研究を行う。初年度の研究では、2成分系の小粒子の密度が結晶化の前後で一定であるという仮定をして計算していた。しかし、実際は結晶化の際に大粒子の結晶から小粒子が追い出されて結晶化するために、小粒子の密度は一定でない。これに伴い、有効ポテンシャルも変化する。この効果は従来の研究でも無視されてきた効果だが、その影響は小さくないと考えられる。従って、この効果を含んだ計算を行い、初年度の計算と比較することで、より厳密な枯渇効果による結晶化への影響を明らかにする予定である。
寒冷地における湿性植物群落の水収支および水分生理特性に関する研究

わが国で最大の高層湿原が残されている北海道宗谷支長管内サロベツ原野において、湿性植物群落の群落組成と構造、水収支および植物の水分生理特性について土壌水分計や各種気象器機と本研究貴で購入したスーパーポロメータを用いて平成4年、5年の暖候期に現地研究を実施した。得られた結果は次のようにまとめられる。(1)研究地域の植物群落は乾燥化の程度(地下水位の深さとその変動特性)により、a・チマキザサ群落、b・ササ・高層湿原境界群落、c・ミズゴケ・ヤチヤナギ・イソツツジ高層湿原群落、d・ミズゴゲ・ホロムイスゲ高層湿原群落、e・ヌマガヤ・ヨシ・コバイケイソウ中間湿原群落、f・ヨシ優先低層湿原群落の6タイプに分類された。湿原の発達と還変の過程がこで明らかにできることが判明した。(2)ヤチヤナギの根系の形態は地下水位が低い地点から高い地点に向かうにつれて地下茎直径は減少し、地下茎長は長くなる傾向を示した。(3)1993年の夏、6月下旬から8月中旬にかけてサロベツ地域ではほとんど雨が降らず、地下水位は低下し最低時には地下40cmにまで達した。しかし、植物の根系が発達する地下10cmの水分ポテンシャルは-2.1kPaで、土層中には植物が利用可能な重力水が十分残されていた。(4)7月から10月にかけて10回にわたり測定した日最大気孔伝導度の平均はヤチヤナギが0.62cm/gで最大であり、イソツツジ、チ、キザサが続いた。ヌマガヤ、ホロムイツツジ、ハイイヌツゲは種間差はほとんどなく、0.4cm/s程度であった。木本植物の値が大きく湿原植物の特徴が見られたが、草本植物では一般の植物と同程度の値を示した。(5)気孔の開度が光飽和点を越えた日中の蒸散量は葉一大気湿度飽差の高い日には飽差の挙動に支配されていた。しかし、飽差が低い日は気孔伝達の影響が大きかった。我国で最大の高層湿原が残されている北海道宗谷支庁管内サロベツ原野において,湿性植物群落の水収支および水分生理特性について現地調査を実施した。調査は乾燥化の程度および植物群落構造がことなる4地点において水位,中央部1ヶ所で気温と日射の長期観測を行なうとともに,植物群落の構成種や植物種別の葉面積あるいは乾物重などを層別に詳しく実施した。また,湿原を代表する植物の一つであるヤチヤナギを対象として水分状態による植物根系構造の変化についても調査を行なった。地表の水収支を規定する最も重要な要因である気孔抵抗については購入したスーパーポロメータを用いて植物構成種・群落構造・乾燥化の程度ごとに詳細に観測した。得られた結果は以下にまとめられる。1)調査地域の植物群落は乾燥化の程度などにより,a.チマキザサが優先するササ群落,b.ササが高属湿原に入り込んでいる前線付近のササ・高層湿原境界群落,C.ミズゴケにヤチヤナギ・イソツツジなどが見られる高層湿原A,d.ミズゴケとホロムイスゲが優先した高層湿原B,e.ヌマガヤ・ヨシが優先しコバイケイソウなどが見られる中間湿原,f.ヨシが優先する低層湿原の6群落に分類された。

2)植物種別の気孔コンダリタンス(気孔抵抗の逆数)をほぼ同じ光条件下で比較するとヤチヤナギが最も大きくして1.2cm/S,ハイイヌツゲ・ササがその1/3の0.4cm/S,ヌマガヤ・イソツツジ・ホロムイツツジでは1/2の0.50.6cm/Sであった。3)ヤチヤナギの根系の形態は地下水位が低い地点から高い地点に向うにつれて地下茎直径は減少,地下基長は長くなる傾向を示した。4)ササの気孔コンダクタンスは光量400μmol/m^2・Sで飽和に達する傾向が見られたが,飽和のレベルには地点間の差、季節による差が見られた。わが国で最大の高層湿原が残されている北海道宗谷支庁管内サロベツ原野において、湿性植物群落の水収支・熱収支および水分生理特性について現地調査を実施した。今年度は高層湿原にチマキザサが侵入している最前線付近において、地下水位と泥炭土層中の水分ポテンシャルの関係について明かにするとともに、土壌水分優先する6種(チマキザサ・ヌマガヤ・ヤチヤナギ・イソツツジ・ホロムイツツジ・ハイイヌツゲ)の維管束植物を対象に蒸散特性の季節変化、日変化の特徴と微気象環境の関係を明らかにした。植物の蒸散特性の指標としては現地で実測した気孔伝導度(気孔抵抗の逆数)と葉の形状と風速の観測値から求められる葉面境界層伝導度を用いた。得られた結果は次のようにまとめられる。1)1994年の夏、6月下旬から8月中旬にかけてサロベツ地域ではほとんど雨が降らず、この間地下水位は低下を続け、最低時には地下40cmにまで達した。しかし、植物の根系が発達する地下10cmの水分ポテンシャルは-2.1kPaで、土層中には重力水が十分残されていた。2)7月から10月にかけて10回にわたり測定した日最大気孔伝導度の平均はヤチヤナギが0.62cm/sで最大であり、イソツツジ、チマキザサが続いた。ヌマガヤ、ホロムイツツジ、ハイイヌツゲは種間差はほとんどなく0.4cm/s程度であった。木本植物が高く湿原植物の特徴が見られたが、草本植物では一般の植物と同程度の値を示した。3)気孔の開度が光の影響を受けていない日中の蒸散量は葉一大気湿度飽差の高い日には飽差の挙動に支配されていた。しかし、飽差が低い日は気孔伝導度の影響が大きかった。
膜型プロテアーゼの基質分解産物に着目したがん特異的に発現するバイオマーカーの解析

膵癌に特異的な血液腫瘍マーカーはなく、既存の腫瘍マーカーと画像診断に頼らざるを得ない。多くの患者は何らかの症状が出てから受診のため、診断確定時の約4割の患者が遠隔転移をもつ末期癌である。そのため、難治癌の治療成績の向上は、検診、人間ドックで早期に発見することが必須となる。そのため、難治癌をいち早く診断できるバイオマーカーがゲノム、蛋白質、糖鎖、代謝産物を標的とした大規模オミックス研究が探索されているが、これまでに十分な成果が得られていない。これらオミックス解析は癌患者と健常人でのバイオマーカーの候補分子の発現量に対するS/N比を元に選抜するため、健常人でも若干の発現が見られる。この特異性の甘さが診断精度の検証において感度や特異度を低下させている原因となっている。そのため、癌でのみ発現するバイオマーカーを見出すことは喫緊の課題である。研究代表者は、悪性化形質の動力源となる膜型マトリックスメタロプロテアーゼ1(MT1-MMP)の研究分野を先導している。先行研究において、細胞膜上で特異的に発現しているMT1-MMPがその基質となる膜蛋白質を限定分解することで、膜蛋白質の機能制御に寄与していることを見出している。これまでにMT1-MMP基質のプロセシング断片に着目した系統的な研究はないことから、本研究で計画している膵癌細胞が産生するMT1-MMPプロセシングが産生する基質断片のdegradome解析は、膵癌への高い特異性をもつバイオマーカー候補を見出す可能性が高い。また、先行研究で見出した2種のシグナル分子断片は複数のがん種で発現特異性を確認済であり、アドバンテージを持って研究を進めることが出来る。以上より、本研究は、癌に特異性の高いバイオマーカーを同定し、膵癌等の難治がんの早期診断を可能とする血液診断法の確立を目指す。1.MT1-MMPによるプロテオリシスを受け遊離する膜蛋白質を同定するため、ヒト・膵がんPanc-1細胞に発現するMT1-MMPをノックダウンした細胞を作製した。ノックダウン細胞のMT1-MMP発現はライゼートによるウエスタンブロットでは検出できない程度であった。次に、ビオチン標識した野生型とノックダウン細胞の50倍に濃縮した培養液(CM)に含まれる蛋白質をウエスタンブロット後、アビジンにて遊離した膜蛋白質断片を検出したが、CMの遊離断片の蛋白質バンドの明確な異同が見られていない。今後、培養液の採取する条件、濃縮法等の検討を行う予定である。2.MT1-MMPによる膜上でのプロセシングで遊離するEphA2断片に対する特異抗体を作製するため、断片をスリースタイル293細胞のシステムを用いて天然型のEphA2遊離断片を作製した。3種類のモノクローナル抗体を樹立することに成功し、それらを抗体の性状を検討したところ、76A1抗体はMT1-MMP依存的に産生されるEphA2遊離断片のみに反応した。そこで、76A1を捕捉抗体として、非切断型(野生型)と遊離断片に反応する46A1を検出抗体としたELISAを構築し、10250 pg/mLのEphA2断片を定量する測定系を確立することに成功した。予備的に、種々のがん患者血清を購入し、それらに含まれるEphA2断片を測定した結果、本解析に用いた膵がん血清の約90%でEphA2遊離断片が健常人のそれよりも高値を示した。以上から、EphA2断片は新たな膵がんのバイオマーカーとなる可能性をもつことが示唆された。1.MT1-MMPプロセシングで遊離する新たな膜蛋白質遊離断片の解析は材料となる細胞、MT1-MMP発現量、遊離断片の採取法と解析法などの基礎的な検討を行う必要がある。MT1-MMPのプロセシングで遊離する新たな膜蛋白質断片の解析は以下の内容を考慮して進める。まず、遊離断片を効率的に同定するためには、その産生量の多い細胞を用いることが必要となる。そのため、膵がん細胞にこだわらず、MT1-MMPによる膜蛋白質のプロセシング断片の産生を比較し、適した細胞を用いることを検討する。また、現在、MT1-MMPをその高発現細胞からノックダウン法を用いているが、MT1-MMP非発現細胞にMT1-MMP発現ベクターを導入したMT1-MMP安定発現細胞を用いることも視野に入れる。2.EphA2遊離断片が新たな難治性がんのバイオマーカーとなる可能性をさらに検証するため、病院等で得られる信頼性の高い血清検体を用いた解析が必須となる。そのため、研究申請を本機関の倫理委員会等へ行い、研究体制を整えた後に進める予定である。

この特異性の甘さが診断精度の検証において感度や特異度を低下させている原因となっている。そのため、癌でのみ発現するバイオマーカーを見出すことは喫緊の課題である。研究代表者は、悪性化形質の動力源となる膜型マトリックスメタロプロテアーゼ1(MT1-MMP)の研究分野を先導している。先行研究において、細胞膜上で特異的に発現しているMT1-MMPがその基質となる膜蛋白質を限定分解することで、膜蛋白質の機能制御に寄与していることを見出している。これまでにMT1-MMP基質のプロセシング断片に着目した系統的な研究はないことから、本研究で計画している膵癌細胞が産生するMT1-MMPプロセシングが産生する基質断片のdegradome解析は、膵癌への高い特異性をもつバイオマーカー候補を見出す可能性が高い。また、先行研究で見出した2種のシグナル分子断片は複数のがん種で発現特異性を確認済であり、アドバンテージを持って研究を進めることが出来る。以上より、本研究は、癌に特異性の高いバイオマーカーを同定し、膵癌等の難治がんの早期診断を可能とする血液診断法の確立を目指す。1.MT1-MMPによるプロテオリシスを受け遊離する膜蛋白質を同定するため、ヒト・膵がんPanc-1細胞に発現するMT1-MMPをノックダウンした細胞を作製した。ノックダウン細胞のMT1-MMP発現はライゼートによるウエスタンブロットでは検出できない程度であった。次に、ビオチン標識した野生型とノックダウン細胞の50倍に濃縮した培養液(CM)に含まれる蛋白質をウエスタンブロット後、アビジンにて遊離した膜蛋白質断片を検出したが、CMの遊離断片の蛋白質バンドの明確な異同が見られていない。今後、培養液の採取する条件、濃縮法等の検討を行う予定である。2.MT1-MMPによる膜上でのプロセシングで遊離するEphA2断片に対する特異抗体を作製するため、断片をスリースタイル293細胞のシステムを用いて天然型のEphA2遊離断片を作製した。3種類のモノクローナル抗体を樹立することに成功し、それらを抗体の性状を検討したところ、76A1抗体はMT1-MMP依存的に産生されるEphA2遊離断片のみに反応した。そこで、76A1を捕捉抗体として、非切断型(野生型)と遊離断片に反応する46A1を検出抗体としたELISAを構築し、10250 pg/mLのEphA2断片を定量する測定系を確立することに成功した。予備的に、種々のがん患者血清を購入し、それらに含まれるEphA2断片を測定した結果、本解析に用いた膵がん血清の約90%でEphA2遊離断片が健常人のそれよりも高値を示した。以上から、EphA2断片は新たな膵がんのバイオマーカーとなる可能性をもつことが示唆された。1.MT1-MMPプロセシングで遊離する新たな膜蛋白質遊離断片の解析は材料となる細胞、MT1-MMP発現量、遊離断片の採取法と解析法などの基礎的な検討を行う必要がある。MT1-MMPのプロセシングで遊離する新たな膜蛋白質断片の解析は以下の内容を考慮して進める。まず、遊離断片を効率的に同定するためには、その産生量の多い細胞を用いることが必要となる。そのため、膵がん細胞にこだわらず、MT1-MMPによる膜蛋白質のプロセシング断片の産生を比較し、適した細胞を用いることを検討する。また、現在、MT1-MMPをその高発現細胞からノックダウン法を用いているが、MT1-MMP非発現細胞にMT1-MMP発現ベクターを導入したMT1-MMP安定発現細胞を用いることも視野に入れる。
本邦女性のヘルスケア利用におけるリアル・ワールド・エビデンスの構築

本研究課題は,本邦唯一の長期観察大規模女性コホート研究である日本ナースヘルス研究(JNHS)の継続調査データから,女性ホルモン剤,ビタミン剤などサプリメント,婦人科検診の定期的受検,ロコモ予防の体操・運動,若年時からの体重管理といった保健習慣やヘルスケア法の有効性・安全性について包括的な評価を行うことを目的としている。本年度は,定期継続調査(対象者の登録時期に応じて,登録後12年後,14年後,16年後、18年後調査票の送付),転居による未回答者への継続調査票の再送付,同意に基づく住民票照会による死亡確認調査を行った。また,JNHS継続調査データにおけるヘルスケア法の確定作業(登録後10年間での女性ホルモン使用歴,登録後6年後における栄養素摂取状況とサプリメント使用状況,登録後10年間でのBMI推移分類)を行うとともに,主要評価項目の確定作業(登録後10年間における心血管系疾患,婦人科癌,骨粗鬆症の自己申告例における発症詳細調査[本人調査および医療機関調査]による発症例の確定,および死因別死亡の確定)を行った。定期的に実施している各種調査の継続,また,ヘルスケア法利用のデータ確定作業,疾病発症例や死亡例特定などの主要評価項目のデータ確定作業とも,予定通り順調に進んでいる。今後,毎年4回にわたって行う定期継続調査票の送付(新規定期継続調査票の送付および未回答者への再送付),転居などによる宛先不明例における住所照会,死亡確認調査を継続して行う。また,登録後10年間における使用歴について確定できた保健習慣・ヘルスケア歴について,主要評価項目である死亡,血管系疾患の発症,婦人科癌の発症,骨粗鬆症の発症の状況との関連を分析して,ヘルスケア法の有効性・安全性について包括的な評価を行う予定である。
心臓の組織再生に関わるIslet-1の転写制御機構の解析

3カ月令のカエルの心室先端部を切除して心筋再生を誘導し、術後1-7日後の心臓からRNAを抽出して遺伝子発現変化を解析した。その結果、islet-1遺伝子は心筋切除の翌日には有意な発現上昇を示した後、再生5日目までは高い発現量を維持することがわかった。心臓形成に関わる複数の遺伝子について心筋再生過程における遺伝子発現変化を調べた結果、nkx2.5など複数の転写因子が術後1日目に発現の有意な上昇を示すことがわかった。VISTAを用いて魚類から哺乳類の10種間で、islet-1遺伝子の5'上流600Kbにおける保存性の高い領域(MCR)の探索を行った。その結果、islet-1上流7箇所に、高い保存性をもつMCRが存在することがわかった。次にこの7箇所の保存領域について、JASPARとMetascapeを用いて転写調節因子が結合するモチーフ検索を行った。その結果、結合モチーフが繰り返し出現する転写調節候補遺伝子として、nkx2.5など10個の遺伝子を絞り込むことができた。マウスの8週令を用いた心筋再生実験では、心室壁面に凍傷を与えて心筋の創傷治癒を誘導する実験系を確立することができた。創傷誘導後5日までの遺伝子発現変化を解析した結果、マウスにおいても、凍傷を加えてから3日目までに、ツメガエルと共通する遺伝子の発現上昇が検出された。しかしマウスでは、islet-1の遺伝子発現変化は認められなかった。以上の結果から、心筋再生の初期過程では、両生類と哺乳類に共通の遺伝子発現変化が認められるが、islet-1の遺伝子発現には明確な差が見られることがわかった。これらの結果は、心筋再生能とislet-1発現の密接な関連を示唆している。カエルの心室切除後1日目にはislet-1の発現上昇が誘導されることがわかり、予想以上に早い反応であることがわかった。多くの遺伝子が心筋再生過程において転写の活性化を示すことがわかったが、islet-1遺伝子のプロモーター領域における保存性の解析と、その保存領域に検出される転写因子の結合モチーフ解析を行うことにより、islet-1遺伝子の転写誘導に密接に関わる遺伝子候補を絞り込むことができた。マウスの心筋再生実験では、心室からの出血を最小限に止める必要があり、両生類や魚類のような心室切除実験は難しい。そこで今回は凍傷により誘導された創傷の治癒過程を心筋再生のモデル実験とした。その結果、再生実験中での死亡を完全に回避することができ、両生類と極めて類似した遺伝子発現変化を検出することができたので、研究は順調に進んでいる。nkx2.5、mef2c、hif1aなどの転写因子はislet-1と同じく、カエルの心室切除後1日目に遺伝子発現の上昇を示した。そのため、これらの転写因子の発現上昇はislet-1発現の引き金になっているのか、islet-1発現上昇の結果なのかは不明である。しかしislet-1遺伝子のプロモーター領域の保存領域には、これらの転写因子の結合モチーフが複数検出されている。そこで、今後は当初の計画通り、islet-1の転写活性化を誘導する遺伝子候補の一つ一つについて、機能阻害実験、遺伝子破壊実験を行い、islet-1の活性化に及ぼす影響を解析する予定である。また、転写因子の結合モチーフを含むプロモーター領域を単離してレポーター解析を行い、転写活性化の候補遺伝子がislet-1遺伝子の転写誘導に直接作用するのか否かを調べる予定である。多くの遺伝子が心筋再生過程において転写の活性化を示すことがわかったが、islet-

1遺伝子のプロモーター領域における保存性の解析と、その保存領域に検出される転写因子の結合モチーフ解析を行うことにより、islet-1遺伝子の転写誘導に密接に関わる遺伝子候補を絞り込むことができた。マウスの心筋再生実験では、心室からの出血を最小限に止める必要があり、両生類や魚類のような心室切除実験は難しい。そこで今回は凍傷により誘導された創傷の治癒過程を心筋再生のモデル実験とした。その結果、再生実験中での死亡を完全に回避することができ、両生類と極めて類似した遺伝子発現変化を検出することができたので、研究は順調に進んでいる。nkx2.5、mef2c、hif1aなどの転写因子はislet-1と同じく、カエルの心室切除後1日目に遺伝子発現の上昇を示した。そのため、これらの転写因子の発現上昇はislet-1発現の引き金になっているのか、islet-1発現上昇の結果なのかは不明である。しかしislet-1遺伝子のプロモーター領域の保存領域には、これらの転写因子の結合モチーフが複数検出されている。そこで、今後は当初の計画通り、islet-1の転写活性化を誘導する遺伝子候補の一つ一つについて、機能阻害実験、遺伝子破壊実験を行い、islet-1の活性化に及ぼす影響を解析する予定である。また、転写因子の結合モチーフを含むプロモーター領域を単離してレポーター解析を行い、転写活性化の候補遺伝子がislet-1遺伝子の転写誘導に直接作用するのか否かを調べる予定である。心筋再生過程で発現上昇を示す遺伝子について、遺伝子発現部位を免疫組織化学的に解析するための試薬代を計上していたが、2018年度は候補遺伝子の絞り込みに時間がかかり、実施できなかった。そこで、2019年度は、絞り込んだ候補遺伝子の発現局在を調べるための試薬代として使用する予定である。
ビタミンD応答配列(VDRE)の解析 positive vs negative VDRE

ビタミンD応答配列(VDRE:vitaminn D response element)の機能を理解する上で、chick副甲状腺ホルモン遺伝子等でみられるDR3型のnVDRE(negative VDRE)が、正の応答性を示すVDREと構造が類似しているにもかかわらず応答が異なる機序を検討する必要がある。前年度は、DR3型nVDREのビタミンD応答性を検討したが、ビタミンD添加群は非添加群の85%程度の活性を示し、用いたnVDREの負の応答性が不十分であると判断されたので、今年度は、より負の応答性が明瞭な遺伝子プロモーターを得ることを目的として、ヒト1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのクローニングを行った。BAC(bacterial artificial chromosome)system "Down to the Well BAC Human DNA Pools"(Genome SYstems Ins,)を用いて、既報告の塩基配列を利用してprimerを合成し、PCR screeningを行い、1αOHaseの上流を含んでいると思われるBAc cloneを決定した。1αOHase遺伝子を含む上流約3Kbpを切り出し、pGEM3zfにsubcloningした。その後、luciferaseをリポーターとするベクターに組込み、subcloningした1αOHase遺伝子5'上流域がプロモーター活性を持つことを確認した。COS細胞にビタミンD受容体(VDR)発現ベクターともに導入したが、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのビタミンDの応答性は認められなかった。ビタミンD応答性が細胞特異的である可能性があるので尿細管細胞を用いる必要がある。また、VDRの導入のみでプロモーター活性の低下が認められたので、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーター活性の負の制御が、リガンド非存在下でみられる可能性が考えられた。A.nVDRE配列:1.GGGTCAggaGGGTGT(chick PTH遺伝子)、2.AGGCTAgccAGTTCA nx18GGTTCAgtgAGGTAC(rat PTH遺伝子)。これらのnVDREをそれぞれluciferase発現ベクターに挿入し、reporter plasmidを作製した。このreporterをSaos-2,COS7細胞に、後者ではビタミンD受容体発現ベクターと共に導入し、10^<-8>M1,25(OH)_2D_3を添加してその活性の変化を検討した。その結果、chickあるいはrat PTH遺伝子nVDREにおいて、添加群はcontrol群に比して、それぞれ86.7±6.3,86.4±10.3%の活性を示した。さらに、rat PTH遺伝子のnVDREを2つ含む場合でも1,25(OH)_2D_3添加群はcontrol群の85.9%の活性であった。B.chick PTH遺伝子nVDREは、pVDREの配列と、最後の2塩基において異なる。従って、本nVDREの塩基配列をGGGTCAggaGGGTGAあるいはGGGTCAggaGGGTCAに置換し、ホルモン応答性を検討したところ、それぞれcontrol群の53.5,178.1%であった。最後の2塩基置換を行うとビタミンD応答性が負から正に転換された。C.ビタミンDおよびレチノイドX受容体を用いて、in vitroにおけるnVDREとの結合性を検討したが、10^8M1,25(OH)_2D_3の添加によって、結合性の低下を認めなかった。
高圧力によるヒト脳神経細胞の細胞死の研究

ヒト由来の培養細胞を用いて、高圧力による細胞死について以下の結果が得られた。使用した細胞は正常リンパ芽球(EB3)、B cell lymphoma cell line(Ramos)、Neuroblastoma cell line(NB1)等である。高圧発生装置は共同研究者が独自に開発した結晶解析用装置で、細胞を培養液中に浮遊させたままで、高圧かつ一定の温度管理下におくことができる。圧力処理の条件は、一定の圧力で30分間、37°Cの加圧とした。1,EB3およびNB1の除圧直後の生細胞率は、85MPa以下の加圧では100%に保たれ、180-200MPaで0%になった。85MPaから200MPaの間では生細胞率は圧力増加に従ってSigmoidal curveを描いて減衰した。50%生細胞率は、約130-150MPaであった。2,除圧後CO_2インキュベータ-内で培養を継続し、継時変化を観察した。100MPa(EB3)と120MPa(NB1)の加圧後の場合はネクローシス細胞が漸増し、8時間後からアポトーシス細胞が出現し、以後16時間まで増加した。50MPa(EB3)の場合は除圧後アポトーシス細胞はみられず、細胞数の増加と細胞分裂が圧力処理後も起こっていた。圧力誘起アポトーシスは蛍光顕微鏡および電子顕微鏡による形態観察のほかTUNEL法により生化学的に検出した。3,高圧力処理によりDNA複製は顕著に障害され、細胞死を引き起こす圧力よりも低い圧力で障害された。4,Ramosの除圧直後の生細胞率は、25MPaまでは100%で、200MPaでは全部の細胞が死滅し、50%生存率は約100MPaであり、1より低かった。5,アポトーシスに関連する遺伝子産物の発現量を調べるために、p53,bcl-2,bcl-x_L,baxなどの抗体を用いてWesternblottingによる解析を行なっている。各細胞で発現量が異なり、現在加圧との関連を解析中である。