hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
交易理論に基づく協調的問題解決力を育成する体験型教材の開発と評価

本研究は、比較優位にもとづく貿易利益の仕組みを体験的に学習できるゲーム用いた実験を行った。ゲームに情報の非対称性を取り入れ、協力行動による利益をフィードバックした結果、「利己主義的人間観」因子の平均値が、ゲーム前と比較して優位に低下した。内容理解は、グループ学習では十分なものの、個人では不十分なケースが見られた。中学生を対象とした体験ゲームの実験の中で、協調的問題解決と人的ネットワークの形成に関して新たな課題が見つかった。人的ネットワークの形成に関する計量分析を行う手法を開発し、大学生を対象として実験を行った。【本研究の目的】本研究は,経済学分野の重要テーマである交易理論を基盤とした実用性の高い学習ゲーム教材の開発とその教材を中等教育へ適用することを目指す.利益の追求と捉えられがちな交易の背景には,他人とのシンパシーが不可欠であることに着目し,交易量を増大させる方略を探究する過程を通じてより良い取引を行うには「信頼」が必要であることを体験する学習ゲーム教材を開発する.本研究では,交易に「信頼感」を付加したゲームを開発し,「最適な状態」と「プレーヤの現状」の差分を定量的にフィードバックできる機能を盛り込む.ゲーム内容・心理プロセス・学習効果の関連性を分析し,経済学リテラシーの獲得を促す指導方法とカリキュラム開発を行う.【研究実施計画】本研究では,国際経済学の重要な理論モデルである交易理論を題材にし,交易理論が想定する世界を教室で行うことのできるゲームに置き換え,生産と取引の過程に「信頼感」を制御するルールを新規に加える.他者との交換で成立する交易を円滑に行うには,同感と相互信頼が不可欠であることを取引量の変化から直感的に理解させ,社会を豊かにする経済学リテラシーを育成する学習ゲームを提案し,その実践のために不可欠となる指導方法と教材を開発する.(A)交易理論の要件の構造化と「信頼感」を加えた学習ゲームのフレーム作り,(B)学習ゲームを用いた指導方法とカリキュラムの開発,(C)中学校での実践と評価,教員研究会でのデモンストレーションと教材導入に向けた指針作りの3ステップで研究を進める。【研究実績】研究初年次は、(A)について「信頼感」を「自分が最適な行動をとる確率が1であることを相手に伝える」ことと「相手が最適な行動をとる確率が1で発生する」ことの2つに分割したゲームのフレームを作成し、公立中学校2校の1年生、2年生約340名を対象に道徳の授業として実施することができた。当初の研究計画では、1年次:ゲームのフレーム作り、2年次:学習ゲームの指導方法とカリキュラムの開発、3年次:中学校での実践と評価、であった。1年次に中学校での実践を行うことができ、開発のサイクルを一通り経ることができたので、おおむね順調に進展していると判断する。【研究の目的】本研究は、経済分野の重要なテーマである交易理論を基盤とした実用性の高い学習ゲーム教材の開発とその教材を中等教育へ適用することを目指す。利益の追求と捉えられがちな交易の背景には、他人とのシンパシーが不可欠であることに注目し、交易量を増大させる方略を探求する過程を通じてより良い取引を行うには「信頼」が必要であることを体験する学習ゲーム教材を開発する。本研究では、交易に「信頼感」を付加したゲームを開発し、「最適な状態」と「プレーヤの現状」の差分を定量的にフィードバックする機能を盛り込む。ゲーム内容・心理プロセス・学習効果の関連性を分析し、経済学リテラシーの獲得を目指す指導方法とカリキュラム開発を行う。【研究実施計画】本研究では、国際経済学の重要な理論モデルである交易理論を題材にし、交易理論が想定する世界を教室で行うことのできるゲームに置き換え、生産と取引の過程に「信頼感」を制御するルールを新規に加える。他者との交換で成立する交易を円滑に行うには、同感と相互信頼が不可欠であることを取引量の変化から直感的に理解させ、社会を豊かにする経済学リテラシーを育成する学習ゲームを提案し、その実践のために不可欠となる指導方法と教材を開発する。(A)交易理論の要件の構造化と「信頼感」を加えた学習ゲームのフレーム作り、(B)学習ゲームを用いた指導方法とカリキュラム開発、(C)中学校での実践と評価、教員研究会でのデモンストレーションと教材導入に向けた指針作りの3ステップで研究を進める。【研究実績】研究二年次は、(B)について大学生を対象にミクロ経済学講義(対象40名)、初年次導入ゼミ(対象25名)においてプレ実験を行い、中学校の授業時間に合わせた指導方法を開発し、中学校2校の2年生6クラスを対象に道徳の国際理解項目で実践を行うことができた。1年次にゲームのフレームとしてゲーム内の変数である信頼感を「自分が最適な行動をとる確率が1であることを相手に伝える」ことと「相手が最適な行動をとる確率が1で発生する」ことの2つに分割したゲームのフレームを作成した。2年次では、1年次に開発したゲーム教材について中学校のカリキュラム内での位置付けについて中学校教員の協力を得ながら分析を行い、道徳の国際理解項目において6時間の学習時間枠のうちの2時間を用いた指導方法を開発することができた。3年次も継続して同じ項目の指導時間において学習ゲームを用いた指導を行うことができる見込みであるので、おおむね順調に進展していると判断する。本年度は、比較優位にもとづく貿易利益の仕組みを体験的に学習できるゲーム用いた実験を行った。

ある程度抽象的な思考が可能でかつ経済取引の経験があまりない年齢層として、中学校1年生を対象に2時間の授業を行い、ゲームの効果を検証した。ゲームに情報の非対称性を取り入れ、協力行動による利益をフィードバックした結果、「利己主義的人間観」因子の平均値が、ゲーム前と比較して優位に低下した。内容理解は、グループ学習では十分なものの、個人では不十分なケースが見られた。不正解者の分析より、1グループあたりの人数を5人以下にする方が良いこと、得意を持たないチームに所属した生徒は取引利益の理解が困難であることが示唆された。中学1年生の実験において、グループの理解は、第1ステップの説明後に実施した第2ステップにおいて、12班が全て特化の状態に到達した。個人の理解は、事前テストと事後テストにおいて、「ばあた」の数値関係を把握する計算問題は、すべての生徒が正解した。グループ学習であれば、中学1年生でも比較優位の構造を理解できることが示唆された。中学生を対象とした体験ゲームの実験の中で、協調的問題解決と人的ネットワークの形成に関して新たな課題が見つかった。そこで、研究3としてスラックラインを用いた協調的問題解決課題を初年次教育に応用する研究を行い、次に研究3として人的ネットワークの形成に関する計量分析を行う手法を開発し、大学生を対象として実験を行った。ネットワークの中心性に着目し、中心性の強い学生がその後も中心性を増していくとする「マタイの法則」について検証したところ、半期の授業内では中心性の高い学生がその後の中心性の指標が高くなることが分かった。本研究は、比較優位にもとづく貿易利益の仕組みを体験的に学習できるゲーム用いた実験を行った。人的ネットワークの形成に関する計量分析を行う手法を開発し、大学生を対象として実験を行った。今後の研究の推進方策は、中学校の道徳・総合的な学習における本研究開発ゲームの指導方法を開発することである。中学校での実践を行う中で,生徒の言動に「うまくできないのは,その子の努力が足りないからだ」,「下手な人とペアになると自分が損をする」といった発言が見られた.複数の中学校教員とのミーティング時に「自分の成果を他の生徒に見せたがらない傾向が増えてきた.協力することの大切さは教えられるが,協力することの価値やメリットを納得させることが難しい.」という意見を聴く機会も増えた.自分の意見を伝えることに対する心理的なハードルを下げつつ、多面的思考力を育成するために他者の意見を提示できるようなシステムを開発して、ゲーム内の議論の多様性を確保することを目指す。また、ゲームの推移を教員が把握しやすいような「教員モード」のシステムを開発することによって、ゲームに教員が適切に介入するための方略を研究する。今後の研究の推進方策は、中学校での実践と評価を行うことである。
生体インピーダンス法による薬物投与計画

本研究では、当初、全身麻酔に用いられる薬物について、その静脈内ボーラス投与後の連続的な血中濃度測定に基づく分布容積と生体インピーダンス法(bioimpedance analysis,BIA)に基づく推定体液区分量(主として細胞外液量)の関連性を検討することが目的であった。しかし、従来のBIAによる測定法(whole body BIA)では、体液量分布が各身体部分において均一でないため、全身で測定したインピーダンスに基づく体液組成の推定には、著しい誤差を含む可能性が高いと考えられる。従って、まず、その精度を向上させる目的で、身体各部分より求められたsegmental BIAとwhole body BIAの比較検討を行った。その結果、後者では細胞外液量を過少推定する傾向が認められ、この点で、前者の優位性が実証された。一方、周術期の組織損傷は、炎症や浮腫による体液量とその分布に劇的な変動を生じ、結果として、薬物動態にも多大な影響を与えることが予想される。そこで、BIAに対する組織構造変化の影響を評価する目的で、周術期患者における生体インピーダンスの経時的変化から、損傷組織構築と体液動態変化の関連性に検討を加えた。組織構築の評価には、colloid suspension modelを発展させた理論モデルを独自に提唱し、生体インピーダンス変化との良好な相関関係を得ることが可能であった。しかし、BIAに基づく推定細胞外液量を薬物の至適役与計画に役立てるには、その絶対値としての信頼性を確立することが欠かせず、特に周術期においては、未だ誤差を生じる可能性が高い。従って、BIAによる体液推定の理論的根拠を確立し、より精度の高いパラメータを抽出することが今後の課題である。本研究では、非脱分極性筋弛緩薬であるベクロニウムと新しい静脈麻酔薬であるプロポフォールを対象に、それぞれのボーラス投与後の連続的な血中濃度測定から求める薬物動態パラメータと、生体インピーダンス法(bioimpedance analysis,BIA)に基づく推定体液区分量との関連性を検討し、薬物の至適投与計画の推定にBIAを応用することを目的とする。従来のBIAによる体液量推定では、印加電流の周波数を変化させることにより、低および高周波数領域での全身抵抗測定から体液量を細胞外液量および細胞内液量に分けて求めている。しかし、体液量分布は各身体部分において均一でなく、全身で測定した抵抗が必ずしも体液区分を正確には検出できない可能性が考えられる。従って、初年度における計画では、BIAにおける体液区分推定の精度を向上させる目的で、身体各部分より求められたsegmental BIAと従来のBIA(whole body BIA)の比較検討を行った。ASA12の予定手術患者30例において手術前後の両BIAを測定し、実測による術中の水分バランスとの相関を検討した結果、細胞外液量の変化は体幹抵抗の変化と良好な相関(r=0.82)が認められる一方、全身抵抗との相関は良好ではなかった(r=0.50)。従って、全身抵抗を利用したwhole body BIAでは、細胞外液量を過少に推定する可能性が高く、segmental BIAがこの点で優れていることが示唆された。以上、初年度における結果として、BIAの一応用としての薬物至適投与計画の推定には、十分な精度の体液量推定が必要と考えられ、従来のwhole body BIAによる方法の修正が必要なことが示された。本研究では、非脱分極性筋弛緩薬であるベクロニウムと新しい静脈麻酔薬であるプロポフォールを対象に、それぞれの静脈内ボーラス投与後の連続的な血中濃度測定から求められる薬物動態パラメータ、および生体インピーダンス法(bioimpedance analysis,BIA)に基づく推定体液区分量(主として細胞外液量)の関連性を検討することが目的である。

しかしながら、従来のBIAによる体液量推定では、体液量分布が各身体部分において必ずしも均一でなく、従って、全身で測定したインピーダンスは体液区分を正確に反映しない可能性が考えられる。そこで、BIAにおける体液区分推定の精度を向上させる目的で、身体各部分より求められたsegmental BIAと従来のBIA (whole body BIA)の比較検討を行い、後者では細胞外液量を過少に推定する可能性が高く、前者がこの点で優れていることを報告した(Crit Care Med投稿中)。一方、周術期における組織損傷は、炎症や浮腫による体液の量および分布の劇的な変動を生じうる。このような体液の非機能化は、薬物分布にも大きな影響を与えることが予想され、今年度は、多周波数による生体インピーダンス法が組織構造変化をどの程度忠実に反映するかを実証する目的で、周術期手術患者における生体インピーダンスの経時的変化から、損傷組織高分子構造および体液動態の周術期における変化を検討した。その結果、生体インピーダンス変化は、組織のcolloid suspension modelから導出された理論式によく適合することが示された。本研究では、非脱分極性筋弛緩薬であるベクロニウムと静脈麻酔薬であるプロポフォールを対象に、それぞれの静脈内ボーラス投与後の連続的な血中濃度測定から求められる薬物動態パラメータ、および生体インピーダンス法(bioimpedance analysis,BIA)に基づく推定体液区分量(主として細胞外液量)の関連性を検討することが目的である。しかし、従来のBIAによる体液量推定では、体液量分布が各身体部分において必ずしも均一でなく、従って、全身で測定したインピーダンスは体液区分を正確に反映しない可能性が存在する。そこで、体液区分推定の精度を向上させる目的で、身体各部分より求められたsegmental BIAと従来のBIA(whole body BIA)の比較検討を行い、後者では細胞外液量を過少に推定する可能性が高く、前者がこの点で優れていることを実証した。このような体液の非機能化は、薬物分布にも大きな影響を与えることが予想され、BIAが組織構造変化を忠実に反映することを実証する目的で、周術期手術患者における生体インピーダンスの経時的変化から、損傷組織高分子構造および体液動態の周術期における変化を検討した。結果として、組織のcolloid suspension modelから導出された理論式に生体インピーダンス変化がよく適合することが示された。以上の研究成果から、BIAによる細胞外液推定を薬物の至適役与計画に役立てるには、絶対値としての信頼性を確立することが欠かせず、現状では、未だ誤差を生じる可能性が高いと考えられる。BIAによる体液推定の理論的根拠を確立することが今後の課題である。
骨造成促進のための新規治療法開発に向けた基礎的研究

ポリADP-リボシル化反応は、ポリADP-リボース合成酵素(PARP)によって行われ、細胞内の様々な作用に関与している。PARPの間葉系幹細胞(MSC)の分化への関与も報告があるが、即ちPARP阻害剤のMSCへの副作用の可能性を意味する。本研究ではPARP阻害剤のMSCへの影響を調べた。1 μM PJ34の添加で骨芽細胞への分化が抑制されたが、軟骨や脂肪への分化には影響がなかった。mRNAレベルの骨分化マーカーや転写因子の発現は、PJ34の投与で低下した。よって、PARP阻害剤は骨芽細胞分化を抑制し、ポリADP-リボシル化反応がBMP-2経路を調整することによって関与することが示唆された。口腔外科の臨床において、外傷や腫瘍切除後によって生じた組織の欠損に対して骨を造成したり、デンタルインプラントを埋入する際に、歯槽骨(歯茎の骨)が足りない場合に、従来から自家組織移植や人工材料を用いた骨造成が行われてきた。これらの手術方法は比較的安定した治療実績を持つ優れた方法ではあるが、欠損部が大きい場合には充分な骨造成を得られず、骨の質や量が必要なレベルまで得られないことが往々にしてある。更に、自家組織移植では組織採取部位に新たな組織欠損や瘢痕を生じる事が課題であり、人工材料の移植では、感染や異物反応による人工物の吸収・露出など、長期予後については不明な点が多い。再生医療による骨造成についても、未だに手技が確立されていないことから、より安定した骨造成のためには、現行の自家骨移植における骨造成率を限りなく促進させることと、骨吸収率を最小化させることが現実的である。アポトーシスの指標の1つであるPARP (poly ADP-ribose polymerase)は、遺伝子安定性や細胞死誘導、細胞間シグナル、細胞の分化など、多種多様な生命現象に関与していることが分かっており、現在その研究をすすめている。その中で、PARPの間葉系幹細胞から骨芽細胞分化への関与を示唆する実験結果が得られた。この結果から着想を得て本研究では、骨芽細胞への分化にPARPが関与していると仮説し、PARP活性の阻害や強制発現による骨芽細胞への分化や骨造成の変化を検証する。同時に遺伝子発現の変化について網羅的検索を行い、骨芽細胞の分化や骨造成のメカニズムを解明することによって、得られた結果を手術の際に必要な骨造成に応用したり、骨の代謝異常が原因となっている疾患の治療法の新規開発の一助となることを目指している。本研究においては、従来アポトーシスのマーカーとして考えられているポリADP-リボースに着目し、その活性低下による細胞分化への影響を調べている。間葉系幹細胞(MSC)はosteoblastの他に、chondrocyteやadypocyteに分化でき、その分化マーカーについても確立されているが、詳細なメカニズムについては不明な点が多い。本研究は、PARP-1欠損マウス由来のES細胞が分化異常を起こすことに着目し、Parp-1遺伝子が幹細胞レベルでの分化に関与しているという仮説を立て、現在解析を行っている。本研究では、マウス大腿骨骨髄由来の間葉系幹細胞とポリADP-リボシル化反応の阻害剤を用いて、ポリADP-リボシル化反応という観点からの間葉系幹細胞からの分化のメカニズムの解明を目的としている。マウス間葉系幹細胞から、osteoblast、adipocyte、chondrocyteへそれぞれ分化させ、その際に阻害剤を併用した群とコントロール群を比較した結果、adipocyteとchondrocyteへの分化には有意差は認めらなかったが、osteoblastへの分化経路においては、阻害剤の添加によって有意に骨芽細胞への分化が遅延が認められた。本年度は、この骨芽細胞への分化の阻害のメカニズムについて、骨分化マーカーのmRNAレベルでの発現レベルの変化をみることによって調べた。本研究では、細胞内で様々な生体反応に関与していると考えられているポリADPリボシル化反応に着目し、特に細胞分化への関与について、反応活性を低下させることによって生じる変化をコントロール群と比較し検証を行っている。まず、骨髄中に存在する間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞(osteoblast)の他、軟骨芽細胞(chondrocyte)や脂肪細胞(adypocyte)に分化でき、そのプロトコールおよび分化マーカーはすでに確立されている。しかし、未分化な間葉系幹細胞からそれぞれの細胞に分化する詳細なメカニズムについては不明な点が多い。本研究は、ポリADP-リボース(PARP)遺伝子欠損マウス由来のES細胞が分化異常を起こすことに着目し、PARP-1遺伝子が幹細胞レベルでの分化に関与しているという仮説を立て、PARP阻害剤を用いてその検証を行った。まず、マウス大腿骨より調整した間葉系幹細胞(MSC)に対するPARP阻害剤の細胞毒性について、MTTアッセイと細胞毒性試験を行い、単回投与で細胞毒性を起こさない濃度を決定した。次に、MSCを1骨芽細胞、2軟骨芽細胞、3脂肪細胞へ分化させる際に、前述した濃度のPARP阻害剤を添加し、その影響を調べた。その結果、軟骨芽細胞と脂肪細胞への分化にはPARP阻害剤の有意な影響は認められなかったが、骨芽細胞への分化は阻害され、分化時期の遅延と分化レベルの低下が認められた。次に骨芽細胞への分化におけるの関連因子の発現について、mRNAレベル・タンパクレベルでの変化を調べた。その結果、PARP阻害剤の投与によって、これらの関連因子の有意な発現レベルの変化が認められた。

PARPの間葉系幹細胞(MSC)の分化への関与も報告があるが、即ちPARP阻害剤のMSCへの副作用の可能性を意味する。本研究ではPARP阻害剤のMSCへの影響を調べた。1 μM PJ34の添加で骨芽細胞への分化が抑制されたが、軟骨や脂肪への分化には影響がなかった。mRNAレベルの骨分化マーカーや転写因子の発現は、PJ34の投与で低下した。よって、PARP阻害剤は骨芽細胞分化を抑制し、ポリADP-リボシル化反応がBMP-2経路を調整することによって関与することが示唆された。昨年度までに、阻害剤添加による間葉系幹細胞の分化に対する影響について、in vitroの解析を全て完了させる予定にしていた。タンパクの発現レベルでの解析が必要なマーカーについてはまだ調べられていないが、その他のin vitroにおける骨芽細胞への分化に必要な項目については調べることが出来た。具体的には、阻害剤の投与によって影響を受けると考えられる間葉系幹細胞への細胞毒性のレベル、増殖能への影響に加えて、細胞外基質の生成に対する影響、更にはmRNAレベルでの骨分化マーカーの発現レベルへの影響などである。この結果、阻害剤の投与によって、阻害剤そのものによる細胞毒性がなく、細胞増殖能への影響が有意に認められない濃度の薬剤投与における、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化に対する阻害剤の影響を調べることが出来た。従って、概ね順調に進展していると考えている。口腔外科タンパクレベルでの解析が必要なマーカーがあるものの、in vitroにおける解析は、細胞毒性、細胞増殖能、細胞外基質の生成、mRNAレベルの骨分化マーカーの発現レベルを調べることが出来、概ね予定通りに進捗している。今年度の今後の予定としては、まずタンパクレベルでの解析が必要なマーカーの発現レベルを調べることを最優先とする。想定している結果が得られたら、次にはin vivoにおける解析を行う予定である。ヌードマウスに間葉系幹細胞を移植し、骨の再生能力に対する阻害剤の影響を調べる予定にしている。具体的には、マウス頭蓋骨骨欠損モデルを使用して、細胞培養から阻害剤を併用した細胞と、コントロール群の細胞をそれぞれ頭蓋部の骨欠損部に移植し、更に阻害剤を持続投与させるマウスとコントロール群に分けて飼育し、in vivoにおける骨の再生能力に対する影響を調べる予定である。間葉系幹細胞は、ラット大腿骨の骨髄由来の幹細胞を用いている。間葉系幹細胞を骨芽細胞への分化メディウムを用いて分化させたところ、PARP阻害剤を添加することによって分化が遅延されることが分かった。そのため、骨芽細胞への分化のメカニズムにおいて、どの要素が関与しているのかを検証するためにRT-PCRを行い、骨分化マーカーの発現を調べた。その結果、それなりの結果が得られたため、PARP阻害剤の投与濃度と細胞の継代数を変えて,比較検証した。その結果、MSCの継代が上がるにつれて、すなわちMSCが老化するに従って、PARP阻害剤によってMSCの骨芽細胞への分化の遅延が増強することがわかり、老化との関連が示唆された。
老化動物における末梢神経再生遅延の細胞レベルでの解析とその対策

1.2か月齢と24か月齢の雌C57BLマウスの坐骨神経切断後のワーラー変性に伴うシュワン細胞増殖をin vitro autoradiographyを用いて検討した結果、若年成熟マウスでは切断後3日目にピークを有する増殖活性を示した。しかし、老化マウスではシュワン細胞の増殖がおよソ1/10と高度に低下し、かつそのピークも切断後5日目と遅れており、末梢神経損傷後の軸索再生遅延と関連を有するものと思われた。2.未処置の老若マウス坐骨神経からシュワン細胞を分離し15%FBS加DMEMを用いて8日間培養したところ、老化マウスでは若年成熟マウスの半分以上の増殖活性を示した。このことは、老化動物のワーラー変性に伴うシュワン細胞増殖の遅延が老化したシュワン細胞固有の増殖能の低下に由来するものだけではないことを示している。3.老若マウスから高純度のシュワン細胞を大量に得る目的で、後根神経節からChi et al(1993)の方法に基づき実験を行なった。これらのシュワン細胞の増殖能を種々濃度のFBS、bovine pituitary extract,fibroblast growthfactor,platelet-derived growthfactorを用いて調べた結果、老化動物では若年成熟動物よりも増殖活性が低値を示すことが判明した。4.障害神経へのマクロファージの侵入が老化動物で遅延していることが,Mac-1を用いた免疫細胞染色の結果明らかになった.5.Silicaを腹腔内投与した2カ月齢マウスでは,坐骨神経切断後のマクロファージの侵入が遅れ,シュワン細胞の分裂増殖も遅れる傾向がみられた.6.マウス・シュワン細胞のcyclic AMPに対する増殖・分化に対する影響をラットのそれと比較したところ、マウスではより低濃度が好条件となることが判明した。7.神経損傷時のシュワン細胞増殖に大きな影響を有するマクロファージの機能が年齢によってどう変化するかを調べる基礎実験として、胸腺筋様細胞から分泌される増殖・la発現因子を検討している。その結果分子量10万の均一な物質に抽出された。8.Krabbe病の実験モデルであるtwitcher mouseのシュワン細胞の機能障害病がin vivoよりもin vitroでよく評価されることを示した。老化動物の末梢神経損傷後の再生遅延を細胞レベルで解明するために以下の実験を行ない、一定の結果を得た。1.24か月齢と2か月齢の雌C57BL/6Jマウスの坐骨神経の切断前と切断後1-7日目にシュワン細胞のin vivoでの細胞増殖の相違をin vitro thymidine autoradiographyを用いて検討した。その結果2か月齢のマウスではシュワン細胞が切断後1日目で増殖を開始し、3日目にピークに達した。それに対して、24か月齢マウスではシュワン細胞の増殖は2か月齢の1/10程度の増殖性しか示さなかった。2.このワーラー変性時のシュワン細胞増殖性の違いが、老化動物のシュワン細胞の機能不全に基づくものか、他の要因とのinteractionに問題があるのかを確かめる実験を行なった。純粋培養した2か月齢と24か月齢マウスのシュワン細胞を15%FBSを添加した培養液で培養したところ、24か月齢マウスのシュワン細胞は2か月齢の1/2までthymidineを摂取した。このことからワーラー変性時の24か月齢

マウスのシヨワン細胞増殖能が低い原因が、シヨワン細胞機能低下のみならず他の原因の関与があることが示唆された。3.2をさらに推し進める目的で、現在1)24か月齢と2か月齢マウスシュワン細胞の種々増殖因子に対する反応をみている(マウスはよく用いられるラットと増殖態度が異なることが判明したので、まず、2か月齢マウスを用いてcyclic AMP,glialgrowthfactorに対する反応の違いを検定中である)。2)macrophageの反応が年齢により異なることをin vivoとin vitroで検討中である。
絶滅危惧種カワシンジュガイの長期的な個体群維持機構の解明

近年、人為的影響による河川生態系の不健全化は著しく、その対応策の立案は国際的な課題となっている。人為的影響に対して特に脆弱とされるのは、絶滅の連鎖の影響を受けやすい共生関係で結ばれた種群である。幼生期にヤマメに寄生するという興味深い生活史をもつカワシンジュガイは、日本の各地で個体群の急速な衰退が認められている。個体群維持のメカニズムを明らかにし、衰退に歯止めをかける必要がある。カワシンジュガイは、貝礁と呼ばれるパッチ状の局所個体群を形成する。カワシンジュガイの自発的な移動能力は限られるが、幼生期(グロキジウム幼生)にはヤマメに寄生して局所個体群間を移動する。一方、ヤマメから離脱した稚貝は(0.5mm程度)、数年にわたって出水のたびに流下する。カワシンジュガイの局所個体群は、「ヤマメによる幼生分散」および「稚貝の水流による流下分散」を通してつながっている。したがって、長期的な個体群の維持のためには、局所個体群の集まりである「メタ個体群」としての存続がカギとなる。2013年度は、カワシンジュガイのメタ個体群の構造(すなわち、局所個体群間のつながりのあり方)を明らかにするため、現在でも健全なカワシンジュガイ個体群を維持している北海道・朱太川水系において、(1)流域全体の局所個体群の分布把握および(2)局所個体群サイズに対するヤマメおよび水流を介した個体の移入の効果の検証を行った。(1)については、90kmにおよぶ徹底的な分布調査を行ったところ、本川とふたつの支川にのみ繁殖個体群(周囲のヤマメに対して高い寄生率を示す個体群)が分布していることを明らかになった。繁殖個体群の分布する範囲は広く、本川の河口から21-30.5kmの範囲に分布が認められた。(2)については、(1)から得られた結果をもとに、上下流双方の個体供給ポテンシャルが局所個体群サイズに及ぼす影響を分析した。その結果、上流側の個体供給ポテンシャルは個体群サイズに対して強い正の効果を示した。一方、下流側からの効果は認められなかった。ここで重要なのは、上流に向かうにつれ局所個体群サイズは小さくなるが、それらは個体の供給源として重要な役割を果たしている点である。この結果は、個体群の構造を考慮せず、大きな個体群から優先的に保全を行った場合、予期せぬ衰退を招くことを示唆している。上流域に存在する個体群は、その個体群サイズに関わらず、保全の際には注意を払うべきである。(抄録なし)(抄録なし)本研究では絶滅危惧種カワシンジュガイの長期的な個体群維持機構を明らかにすることを目的としている。その中核となる要素は、メタ個体群動態の解明である。局所個体群間の移動分散過程は、メタ個体群動態の理解に欠かせない。2012年度はこの点に焦点を当てた研究を行った。河川上流域に生息するカワシンジュガイは、その生活史初期において、グロキジウム幼生と呼ばれる幼生がヤマメの鰓に約一か月寄生することが知られている。カワシンジュガイの局所個体群間の分散は幼生期および宿主から脱落直後の稚貝の水流による分散に限られているため、その基礎的知見は本種のメタ個体群動態の理解のために必要不可欠である。2012年度の研究では、ヤマメによるグロキジウム幼生の分散パターンを把握するため、ヤマメの標識再捕獲調査(流呈方向の分散パターンの把握)および定置網調査(支流への分散パターンの把握)を行った。標識再捕獲調査はグロキジウム幼生の寄生期間である7月8月にかけて実施した。計345個体のヤマメに対して標識を行い、36個体が再捕獲された。その結果、グロキジウム幼生はヤマメに寄生している寄生期間中に上流方向へ偏った分散を行っていることが明らかとなった。カワシンジュガイは流れの速い上流域を主なハビタットとしており、特に増水時などには水流による下流方向への分散の影響を強く受けているものと考えられる。寄生期間中の上流方向への分散は、水流による下流方向の分散に対抗する手段のひとつとして機能していると考えられる。定置網調査では、標識再捕獲調査と同時期に、本流から支流へ移動してくるヤマメ個体数の定量化を行った。その結果、ヤマメはより水温の低い支流へ頻繁に分散していることが明らかとなった。カワシンジュガイの幼生および稚貝は夏季の高水温に対して極めて脆弱であることが知られており、水温の低いハビタットへ移動することでより高い生存率が期待される。

カワシンジュガイの局所個体群は、「ヤマメによる幼生分散」および「稚貝の水流による流下分散」を通してつながっている。したがって、長期的な個体群の維持のためには、局所個体群の集まりである「メタ個体群」としての存続がカギとなる。2013年度は、カワシンジュガイのメタ個体群の構造(すなわち、局所個体群間のつながりのあり方)を明らかにするため、現在でも健全なカワシンジュガイ個体群を維持している北海道・朱太川水系において、(1)流域全体の局所個体群の分布把握および(2)局所個体群サイズに対するヤマメおよび水流を介した個体の移入の効果の検証を行った。(1)については、90kmにおよぶ徹底的な分布調査を行ったところ、本川とふたつの支川にのみ繁殖個体群(周囲のヤマメに対して高い寄生率を示す個体群)が分布していることを明らかになった。繁殖個体群の分布する範囲は広く、本川の河口から21-30.5kmの範囲に分布が認められた。(2)については、(1)から得られた結果をもとに、上下流双方の個体供給ポテンシャルが局所個体群サイズに及ぼす影響を分析した。その結果、上流側の個体供給ポテンシャルは個体群サイズに対して強い正の効果を示した。一方、下流側からの効果は認められなかった。ここで重要なのは、上流に向かうにつれ局所個体群サイズは小さくなるが、それらは個体の供給源として重要な役割を果たしている点である。この結果は、個体群の構造を考慮せず、大きな個体群から優先的に保全を行った場合、予期せぬ衰退を招くことを示唆している。上流域に存在する個体群は、その個体群サイズに関わらず、保全の際には注意を払うべきである。当初の計画以上に順調に成果が得られ、2012年中に取得したデータの一部に関しては、すでに英語論文として国際誌に投稿中である。また、異なる視点から収集したデータセットについても、すでに英語論文としてまとめ終わっている段階にあり、次年度はじめには国際誌に投稿できる状態にある。(抄録なし)2012年度は当初の計画以上に順調に研究が進捗したため、今後は採用期間中にできる限りより多くのデータを英語論文としてまとめ上げることに集中する。また、昨年度取得しきれなかったデータに関しては補足的なサンプリング、実験などを行い、データの補完を行う。(抄録なし)
アジア・オセアニア地域における大型重力波観測施設の共同建設に関する研究

重力波検出が可能になれば、重力波そのものについて一般相対論から予測される位相速度や偏波成分について検証ができ、重力波源については、コンパクト星のダイナミクス、分布などの統計、絶対距離がわかる。また、重力理論そのものの検証も可能である。このように、物理的にも天文学的にも重力波の検出は画期的な知見をもたらす。このような重力波を直接検出するために、現在、米国、欧州などでkmスケールの高感度レーザー干渉計が建設されている。重力波の発生源の位置を特定するためには、最低3基の同程度の感度を有する独立な検出器が必要であるが、位置の決定精度向上のためには、アジア・オセアニア地域に1基あることが必要である。このため、日本、オーストラリアそれぞれが独自のkmスケール干渉計計画を有している。しかし、近年の国家財政の緊迫状況から、独自に建設を進めるより共同建設の方が実現性が高く、また、建設コストの廉価な国・地域を選択すればさらに実現性は高まるという判断のもとに、これらの地域での共同研究を進めることが本研究の目的であった。このための第一段階として、オーストラリアの研究グループを日本に招き、日本側の建設予定地視察を含め、日本に建設する場合の得失について検討を加えた。第二段階では、日本側がオーストラリア側の建設予定場所の視察・調査を含め、研究室の訪問を行い、技術協力に関する検討を行った。以上の結果、それぞれが重力波検出器建設のために協調することを確認し、互いの優位な技術を中心とする協力を進めるための覚書の締結に至った。ここで締結した覚書に基づく共同研究を進めていくことにより両者の研究のさらなる発展が期待される。この意味でこの調査研究の成果は意義のあるものである。
通時的変化を反映した共時的音韻現象に関する日露対照言語学的研究

研究課題である日本語と露語の音韻現象のうち、今年度は次の2点について研究を行った。一つ目に、一年目に行ったロシア語の名詞アクセントの研究のうち、単数主格語尾-aを取る女性名詞のアクセントが示す変化の方向性について更なる分析を行った。二つ目に、日本語の方言に見られるアクセント体系の変化の方向性に関する調査を行った。このうち、一つ目のロシア語女性名詞の問題では、ストレス位置の変遷やゆれが観察される語の多くが、数・格による語形変化のパラダイムにおいて次のような方向で変化してきていることが明らかになった。すなわち、1.同じ形態の屈折語尾を持つ単数生格と複数主格との弁別がストレス位置の相違によって可能になる、2.単数のパラダイムと複数のパラダイムで異なる位置にストレスを持つようになる、3.単数・複数それぞれのパラダイムの中でストレス位置が均一になる、という3つの方向性が見られた。そして、最適性理論の枠組みにおいて、各形態素のアクセントにかかわる素性と実際の語形との対応を評価する忠実性制約、異なる入力が同一の出力を生じることを禁止する制約、同一の入力から異なる出力が生じることを禁止する制約の3つを仮定すると、こうしたパラダイムの変化のほとんどは、この3つの制約の階層における忠実性制約の下降によって説明されることが明らかになった。また、それ以外の、特に初期段階に当る変化は、個別の語形から生じており、これは制約階層の変化という体系的な変化ではなく入力形の変化として捉えられるべきものであることもわかった。この分析は平成17年8月に開催された音韻論フォーラム2005において発表し、また『音韻研究』第9号にも掲載されることになった。二つ目の日本語の問題については、東濃方言の音声資料を採取し、活用形におけるアクセントの均一性と共通語化の関係を明らかにした。研究課題である日本語・ロシア語両言語の音韻現象のうち、今年度の当初の計画ではまず日本語に関する資料を収集・分析することであったが、研究協力者の都合等により、今年度の主な分析対象はロシア語とした。日本語に関する分析は来年度に行うこととし、ロシア語に関しても引き続き資料を収集するが、今年度中の研究の成果は次のとおりである。現代ロシア語の名詞における語強勢の位置が決定される仕組みに関して、さまざまな語構成を持つ名詞を対象に最適性理論の枠組みで分析を行った。名古屋大学などで語構成・語強勢位置と音韻の通時的変化に関する先行研究を収集し、比較分析したほか、ネイティヴスピーカーの語強勢位置に関する直感についても検討した。その結果、ロシア語に関して次のことが明らかになった。1単純語根を持つ名詞の多くが持つ強勢の位置はかつての声調に由来し、その位置の決定の仕組みは、日本語鹿児島方言などの声調言語の複合語に見られる仕組みと類似のものである。2上記1の原則を逸脱した語は、数のカテゴリーの内部での均質性・数のカテゴリー間の分極性・同じ音素列からなる語形の間での弁別性を持とうとする変化の指向が見られる。3複合語では形態素境界が声調特性よりも優先的に強勢位置の決定に関与する。4派生語尾では声調的な特性を持つものとアクセント的な特性を持つものとがある。5借用形態素が持つ韻律特性は、声調ではなく狭義のアクセントと考えられる。6各形態素に指定される特性が声調からアクセントへと変化するとともに、実際の語形の持つ韻律的特性を決定する文法が、アクセント言語のそれへと変化してきている。なお、今年度の研究の成果は、報告者の学位申請論文(課程博士(文学)、名古屋大学、平成16年3月提出済)「ロシア語の韻律的特性に関する研究」に反映された。研究課題である日本語・ロシア語両言語の音韻現象のうち、今年度の主な調査対象はロシア語とした。その中でも特に、新上昇調と呼ばれるかつての音調が関与したと考えられている、後舌中母音の二重母音的な音への通時的変化、およびそれが強勢音節に存在する場合の現代諸方言における強勢直前音節の母音の音価の類型について、調査を行った。その通時的変化の痕跡を残す方言の資料を収集するため、まず国内に存在する文献から調査可能な地域の方言について調査した。その結果として、調査対象を、いわゆる同化・異化型ヤ弁を持つヨーロッパ=ロシア東部(リャザン地域)方言に絞り、ネイティブスピーカーに対するアンケート調査・インタビュー(面接によるDAT等の機器を用いた音声の記録)・文献調査によって行う準備を進めた。その準備が整った平成17年2月、モスクワにおいて追加的文献調査を行い、続いてリャザン地方へ赴いたが、研究協力者の都合により面接による調査は断念せざるをえず、録音された方言の音声資料を入手したほか、この地域のみに保存されているという希少文献によりヨーロッパ=ロシア東部(リャザン地域)方言に関する調査を行った。帰国後、これらの資料を整理・分析しているところであるが、現在までに以下のことが分かっている。1)東部(リャザン地域)方言においては、強勢直前音節の頭子音が口蓋化子音である場合、その音節の母音は強勢音節の母音によって音価が決定される。すなわち、異化により、強勢音節の母音が狭母音である場合には広母音、強勢音節の母音が中母音である場合には狭母音となるが、強勢音節の母音が広母音である場合には同化により広母音となる。

2)ただし、同方言において、新上昇調に由来する後舌中母音および東スラヴ語において狭めの中母音であった前舌中母音は、それぞれ強勢音節において二重母音的に発音され、その直前の音節の母音は広母音となる。研究課題である日本語と露語の音韻現象のうち、今年度は次の2点について研究を行った。一つ目に、一年目に行ったロシア語の名詞アクセントの研究のうち、単数主格語尾-aを取る女性名詞のアクセントが示す変化の方向性について更なる分析を行った。二つ目に、日本語の方言に見られるアクセント体系の変化の方向性に関する調査を行った。このうち、一つ目のロシア語女性名詞の問題では、ストレス位置の変遷やゆれが観察される語の多くが、数・格による語形変化のパラダイムにおいて次のような方向で変化してきていることが明らかになった。すなわち、1.同じ形態の屈折語尾を持つ単数生格と複数主格との弁別がストレス位置の相違によって可能になる、2.単数のパラダイムと複数のパラダイムで異なる位置にストレスを持つようになる、3.単数・複数それぞれのパラダイムの中でストレス位置が均一になる、という3つの方向性が見られた。そして、最適性理論の枠組みにおいて、各形態素のアクセントにかかわる素性と実際の語形との対応を評価する忠実性制約、異なる入力が同一の出力を生じることを禁止する制約、同一の入力から異なる出力が生じることを禁止する制約の3つを仮定すると、こうしたパラダイムの変化のほとんどは、この3つの制約の階層における忠実性制約の下降によって説明されることが明らかになった。また、それ以外の、特に初期段階に当る変化は、個別の語形から生じており、これは制約階層の変化という体系的な変化ではなく入力形の変化として捉えられるべきものであることもわかった。この分析は平成17年8月に開催された音韻論フォーラム2005において発表し、また『音韻研究』第9号にも掲載されることになった。二つ目の日本語の問題については、東濃方言の音声資料を採取し、活用形におけるアクセントの均一性と共通語化の関係を明らかにした。
マウス受精卵培養時のメカニカルストレス応答解析

哺乳類受精卵の発育ステージとその内部の細胞を構成する分子・高分子の配置・発現によってメカニカルストレス(MS)に対する応答機構が異なると想定される。本研究では、その機構解明につながるような評価・解析系を構築する。マウス受精卵をマイクロ流路内に保持して、細胞内の変化観察と細胞内カルシウム濃度蛍光レシオイメージングが可能となった。倒立顕微鏡上で受精卵を観察できるためのマウス受精卵培養系の検討を行ったところ、受精卵は二細胞期から胚盤胞まで発育した。また、三次元培養系に適用できるようなマイクロ流体システム、およびハイドロゲルなどを用いた三次元培養系の検討を行った。初期胚に流体移動に伴うせん断応力(Fluid Shear Stress: FSS)を負荷した際に胚内で起こるイベントを調べることによって、アポトーシスに至る作用機序の解明につながる。そこで、顕微授精用保持ピペットを用いてマウス桑実胚および胚盤胞をマイクロ流路内に保持した実験系を構築した。独自に開発したマイクロ流路を共焦点蛍光顕微鏡のステージに設置し、シリンジポンプを用いて流路内の初期胚にFSSを数分間負荷した。15秒ごとにFSS負荷前後の共焦点像における蛍光を示す部分面積変化を計測した。桑実胚では透明体内部の空隙の面積が大きいために、胚盤胞と比較して細胞質面積増加率が大きくなった。この面積増加速度はFSS値が大きくなるにつれて上昇し、胚盤胞の方が桑実胚と比較して面積増加が早く終了した。この結果から、上記閾値近傍のFSSが負荷された際には細胞質体積の増加が起こり、この変化が胚発育に好ましくない影響を与える一因と考えられる。上記の実験のほかに、人工卵管および子宮とその中での受精卵培養とメカニカルストレス(MS)応答評価のために、新たな実験系構築1)および2)を進めた。1)MSを負荷させながら培養した際の核の増殖速度を生細胞核染色剤で染色した受精卵内の核数から評価する受精卵培養システムの構築を行った。倒立顕微鏡に顕微鏡用培養システムを組み込んだ培養系とした。2)三次元培養システムを構築のするためのマイクロ流路構造最適化およびMS負荷実験系の構築を行った。・マウス受精卵のメカニカルストレスに対する影響過去に得られたマウス受精卵に流体移動に伴うせん断応力(Fluid Shear Stress: FSS)を負荷した際の実験結果に関するデータを受精卵の粘弾性に基づいて解析した。蛍光を示すピクセル数を細胞断面積とした場合、FSS負荷後のそのピクセル数の増加は単一の指数関数で近似可能であった。定常流の際にはFSSが一定と仮定して、この時定数はフォークトモデルを適用した際には粘性/弾性の比となり、時定数が小さいほど弾性応答への収束に時間を要すると言える。また、この指数関数の収束値は受精卵内細胞の弾性を示す。FSS=13.3 dyne/cm2の場合、桑実胚内の細胞よりも胚盤胞内の細胞でこの時定数が0.45倍に、収束値は0.90倍に低下し、胚盤胞の細胞は桑実胚の細胞よりも弾性率が高く、粘性の寄与が小さいと言える。また、両方の受精卵における透明体内の細胞の変形は流れの方向に依らず等方的であったために、FSSに伴う外力だけでなく、流れが生じた際に電解質の濃度が変化することによる浸透圧もこの細胞体積上昇に関与している可能性がある。従って、受精卵のステージによるFSSに対する応答に違いは細胞の構造に基づき、透明体の膜特性評価および受精卵内細胞のチャネル活性評価が今後、重要と思われる。・培養システム開発に関する実績昨年と同様に流路内の細胞へFSS負荷な三次元培養システムの構築を目指したマイクロ流路を含むシステム全体の最適化を図った。特に、顕微鏡上で受精卵を含む細胞を観察および評価が容易なシステム開発として、顕微鏡観察用ステージヒーター内に設置された観察部位内のシリコーンエラストマー製マイクロ流路に外部から流体刺激を負荷できる流路系の取り回しとマイクロ流路との接合を工夫した。研究代表者の異動もあったことから、流路作製および培養システム構築に関する技術改善に注力し、実際の受精卵を用いた試験が想定以上に進まなかったため。受精卵に流れによるせん断応力(Shear Stress: SS)を負荷した際の各細胞応答を調べるために、共焦点蛍光顕微鏡とマイクロ流体システムを用いて、細胞内の挙動が観察できるように、流路内に保持したマウス受精卵変化の解析を行った。流れ刺激を桑実胚と胚盤胞に負荷し、細胞内カルシウム濃度の変化を計測した。これまでの実験結果から、SS負荷時には細胞内体積が増加する現象が観察され、細胞内カルシウム濃度変化を議論するにあたり、二波長励起・発光で評価するレシオイメージングが必要であった。今年度は、レシオイメージングが可能な蛍光色素の検討を始めに行った。共焦点蛍光顕微鏡のレーザー波長に適し、かつ受精卵の細胞内に留まる蛍光色素はFura-2, Fluo-4, Fluo-8, Rhod-4であった。励起・発光波長の組み合わせおよび感度から、Fluo-8(Fluo-4), Rhod-4の組み合わせが好適であることを見出した。その後、SS負荷実験を行った際に得られた画像の詳細を解析中であるが、受精卵内細胞が圧縮された際に細胞内カルシウム濃度の上昇が見られた。この傾向は過去の我々が得た研究結果と対応していた。

また、顕微観察が可能な状態での受精卵培養系を構築し、二細胞期から胚盤胞まで発育することを確認した。さらに、三次元ハイドロゲル培養について、受精卵培養に適用できるように検討している段階である。本研究は平成28年度で終了であるが、蛍光顕微観察による受精卵の物質代謝と発育との関係について今後研究を進める計画である。哺乳類受精卵の発育ステージとその内部の細胞を構成する分子・高分子の配置・発現によってメカニカルストレス(MS)に対する応答機構が異なると想定される。本研究では、その機構解明につながるような評価・解析系を構築する。マウス受精卵をマイクロ流路内に保持して、細胞内の変化観察と細胞内カルシウム濃度蛍光レシオイメージングが可能となった。倒立顕微鏡上で受精卵を観察できるためのマウス受精卵培養系の検討を行ったところ、受精卵は二細胞期から胚盤胞まで発育した。また、三次元培養系に適用できるようなマイクロ流体システム、およびハイドロゲルなどを用いた三次元培養系の検討を行った。マウス受精卵培養結果が芳しくなかったことと実験系の構築に時間を要したためである。研究実績欄に記載した上記の仮説を検証するために、FSS負荷時に透明体内を小分子が通過することの証明(透明体の膜特性)および受精卵各ステージにおける構造、チャネル活性、粘弾性相関に関する解明を行う。二波長励起法を用いた細胞内カルシウム濃度などのイメージング法を適用する。また、子宮モデルを作製するための安定的な細胞取得を目指す。生殖医工学新たな実験系構築を加速するとともに、マウス受精卵を用いる実験数を増やす計画である。最終年度(平成28年度)は研究経費が若干少ないために、前年度の使用額を減少した。平成28年度においては培養関連消耗品、実験補助者人件費、旅費を主に執行する計画である。
口蓋発生時の癒合部上皮消失過程における基底膜の動態

口蓋裂発症のメカニズムの一端を解明することを目的として、胎児マウスの口蓋形成について組織学的に解析を行った。口蓋は、左右の口蓋突起が正中部で接触することで形成されるが、この癒合上皮消失プロセスを硬口蓋と軟口蓋の前後で比較した。癒合上皮の消失にに必須である、TGF-betaシグナルは、口蓋前後で異なる細胞内シグナル経路を活性化していることがわかった。さらに癒合時の上皮消失(基底膜の変化)に伴って、口蓋間葉に発現してくるTenascin Cは、TGF-betaシグナルに制御されていること、また口蓋前後でその制御に違いがあることが示唆された。平成24年度に行った、マイクロアレイの結果から、口蓋間葉に発現するFibrillin-1遺伝子発現に焦点をしぼり解析を進めた。胎生13.5日齢から胎生14.5日齢のマウス頭蓋を採取し、無固定・非脱灰にて凍結切片を作成し、Anti-Fibrillin-1抗体を用いて免疫組織学的解析を行った。また、口蓋組織を前方の硬口蓋領域と後方の軟口蓋領域とに区別し、口蓋組織の前後によって、Fibrillin-1発現の比較検証を行った。Fibrillin1は、胎生13.5日齢、14.5日齢においても間葉の鼻腔側に発現し、基底膜にもその発現を認めた。また、口蓋後方部、軟口蓋領域のほうがその発現を広く認めた。Fibrillin-1遺伝子は、マルファン症候群の責任遺伝子であることは既に明らかとなっており、このマルファン症候群の口蓋症状として、高口蓋があげられることから、高口蓋発症機序を明らかにすることを目的とした。TGF-bシグナルは、口蓋間葉において細胞増殖を促進しており、また、マルファン症候群ではTGF-bシグナルの亢進が認められていることから、Fibrillin-1発現領域と、細胞増殖との関係を明らかにするため、Anti-Ki67抗体との2重染色、またBrdUを注入したマウスを用いAnti-BrdU抗体を用いて染色を行った。Fibrilli-1が発現している領域としていない領域での細胞増殖活性をカウントし比較したところ、Fibrillin-1発現領域では細胞増殖活性が低下していることが示唆された。現在、サンプル数を増やし、統計学的な手法で明らかにすることを試みている。口蓋発生時、左右口蓋棚の癒合過程で口蓋上皮の消失が起こる。この上皮消失過程における重要な働きを持つ遺伝子を網羅的に探索するため、マイクロアレイ解析を行い、その結果をもとにいくつか興味深い遺伝子をピックアップした。Fibrillinは、弾性系線維を構成する微細線維の主成分であり、Fibrillin 1の遺伝子変異は高口蓋を特徴とするマルファン症候群の責任遺伝子である。平成24年度は、このFibrillin 2蛋白の口蓋発生時における発現局在を免疫組織化学染色法を用いて調べた。Fibrillin1に加え、類似構造を持つ、先天性拘縮性くも指症の原因遺伝子であるFibrillin 2の発現についても合わせて検討した。Fibrillin 1は、胎生13.5日齢から胎生15.5日齢の口蓋間葉に発現し、基底膜にも存在していた。興味深いことに、Fibrillin 2は、口蓋上皮に発現し間葉組織には発現を認めなかった。また、細胞増殖のマーカーとなるKi67の発現との比較から、Fibrillin蛋白は、口蓋発生の初期においては、弾性線維形成ではなく細胞増殖を調節する働きが示唆された。口蓋発生に重要であるTGF-betaシグナルとの関与を明らかにするために、TGFb2、TGFb3の発現と比較したところ、Fibrillin 1は、TGFb2と、Fibrillin 2は、TGFb3と発現部位を同じくしていることが明らかとなった。口蓋発生時の口蓋突起癒合部上皮(MEE)消失に着目し口蓋の前後軸での解析を行った。MEE消失に必須因子であるTGFb3mRNAの発現量は口蓋後方部がやや低いものの、免疫染色組織学的にMEE部分の発現を比較すると、その前後軸での発現パターンに違いは認められなかった。そこでMEEにおけるTgfb3発現量ではなく、シグナル活性に着目し、Fibrillin-1発現とTGFb細胞内シグナル活性を組織学的に観察した。Fibrillin-1発現部位におけるTGFbシグナル活性は、抑制的に調節され、口蓋間葉での細胞増殖に関与していることが示唆された。口蓋上皮MEEにおいては、Smad2およびSmad3は、前方部、後方部より中央部に強い発現を示した。一方で、Phospho-p38は、口蓋後方部で高い発現を示していた。