hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗血小板薬トラピジルの血管平滑筋細胞におけるPDGF増殖抑制機構の解明

我々はすでに,in vitroでトラピジルがPDGFによるラット血管平滑筋細胞増殖を抑制すること,及びその機序がmitogen-activatedkinase(MAPK)抑制を介すことを明らかにしている.さらに,トラピジルが細胞内cAMPを増加させることも示し,MAPK抑制がおそらくcAMP増加を介していることを提唱した(Hypertension.1998;31;665-671.).さらに我々は,トラピジルの作用機序の詳細を明らかにするため,トラピジルとcAMP増加物質であるフォールスコリンの血管平滑筋細胞に対する影響を比較検討した.まず,フローサイトメトリーを用いてラット平滑筋細胞細胞周期に対する影響を検討した.その結果PDGFが細胞周期を促進し,トラピジル,フォールスコリンとともにその促進を完全に抑制することを明らかにした.次に,細胞周期関連蛋白であるサイクリン,サイクリン依存性キナーゼ(CDK),CDKインヒビターに対する影響を検討した.そこでは,両試薬ともにPDGFによるサイクリンD1,サイクリンA蛋白量増加を抑制すること,及びCDK4,CDK2の活性を抑制することを明らかにした.しかし,CDKインヒビターに対する影響は両試薬で完全に異なっていた.すなわち,p27はPDGFで減少し,トラピジルはその減少に影響を与えなかったが,フォールスコリンはPDGFによる減少を完全に回復させた.p21はPDGFにより増加し,フォールスコリンはその増加に影響を与えなかったが,トラピジルはその増加を完全に抑制した.両試薬のCDKインヒビターに対する影響が異なったことから,トラピジルにはcAMP増加を介さない細胞周期抑制機序の存在が予想される.その候補の一つがsmall G protein familyであるRhoAである.現在,細胞溶解物を超遠心法により,solubleおよびparticulate分画に分離し,それぞれの分画におけるRhoAの発現量を比較検討することにより,両試薬の影響の評価を行っている.我々はすでに,in vitroでトラピジルがPDGFによるラット血管平滑筋細胞増殖を抑制すること,及びその機序がmitogen-activatedkinase(MAPK)抑制を介すことを明らかにしている.さらに,トラピジルが細胞内cAMPを増加させることも示し,MAPK抑制がおそらくcAMP増加を介していることを提唱した(Hypertension.1998; 31; 665-671.).今回我々は,トラピジルの作用機序をさらに明らかにするため,トラピジルとcAMP増加物質であるフォールスコリンの血管平滑筋細胞に対する影響を比較検討した.まず,フローサイトメトリーを用いてラット平滑筋細胞細胞周期に対する影響を検討した.その結果PDGFが細胞周期を促進し,トラピジル,フォールスコリンともにその促進を完全に抑制することを明らかにした.次に,細胞周期関連蛋白であるサイクリン,サイクリン依存性キナーゼ(CDK),CDKインヒビターに対する影響を検討した.そこでは,両試薬ともにPDGFによるサイクリンDl,サイクリンA蛋白量増加を抑制すること,及びCDK4,CDK2の活性を抑制することを明らかにした.しかし,CDKインヒビターに対する影響は両試薬で完全に異なっていた.すなわち,p27はPDGFで減少し,トラピジルはその減少に影響を与えなかったが,フォールスコリンはPDGFによる減少を完全に回復させた.p21はPDGFにより増加し,フォールスコリンはその増加に影響を与えなかったが,トラピジルはその増加を完全に抑制した.CDKインヒビターに対する影響が異なったことから,トラピジルにはcAN4P増加を介さない細胞周期抑制機序の存在が予想される.その候補一つがsmall G protein familyであるRhoAであり,現在RhoAに対する両試薬の影響を検討中である.我々はすでに,in vitroでトラピジルがPDGFによるラット血管平滑筋細胞増殖を抑制すること,及びその機序がmitogen-activatedkinase(MAPK)抑制を介すことを明らかにしている.さらに,トラピジルが細胞内cAMPを増加させることも示し,MAPK抑制がおそらくcAMP増加を介していることを提唱した(Hypertension.1998;31;665-671.).さらに我々は,トラピジルの作用機序の詳細を明らかにするため,トラピジルとcAMP増加物質であるフォールスコリンの血管平滑筋細胞に対する影響を比較検討した.まず,フローサイトメトリーを用いてラット平滑筋細胞細胞周期に対する影響を検討した.その結果PDGFが細胞周期を促進し,トラピジル,フォールスコリンとともにその促進を完全に抑制することを明らかにした.次に,細胞周期関連蛋白であるサイクリン,サイクリン依存性キナーゼ(CDK),CDKインヒビターに対する影響を検討した.そこでは,両試薬ともにPDGFによるサイクリンD1,サイクリンA蛋白量増加を抑制すること,及びCDK4,CDK2の活性を抑制することを明らかにした.しかし,CDKインヒビターに対する影響は両試薬で完全に異なっていた.すなわち,p27はPDGFで減少し,トラピジルはその減少に影響を与えなかったが,フォールスコリンはPDGFによる減少を完全に回復させた.p21はPDGFにより増加し,フォールスコリンはその増加に影響を与えなかったが,トラピジルはその増加を完全に抑制した.両試薬のCDKインヒビターに対する影響が異なったことから,トラピジルにはcAMP増加を介さない細胞周期抑制機序の存在が予想される.その候補の一つがsmall G protein familyであるRhoAである.

現在,細胞溶解物を超遠心法により,solubleおよびparticulate分画に分離し,それぞれの分画におけるRhoAの発現量を比較検討することにより,両試薬の影響の評価を行っている.
臨床看護師による術後せん妄のラベリングプロセスに関する研究

看護師が、術後せん妄発症の徴候を知覚・認識し、その可能性を疑い、査定し、確信する過程と実際の対応に至るまでの過程(ラベリングプロセス)を明らかにするために調査した。結果、看護師は、査定を繰り返しながら最終的にせん妄であると判断に至っていた。せん妄の判断の根拠は、患者の「疎通や表情、行動の変化」であった。看護師は、自分ひとりでせん妄を判断・確信できる者が少なく、他の看護師や医師の判断がラベリングプロセスに織り込まれていた。平成19年度は、臨床看護師における術後せん妄のラベリングプロセスについての課題を明らかにするために、文献検討と臨床看護師への基礎的調査行った。1)文献検討これまでの国内外の看護研究により、術後せん妄のラベリングプロセス、とくに周手術期看護における術後せん妄の判断・診断、看護師の判断にかかわる場面について記載されているものを調査した。術後せん妄および看護判断について単独での研究は多くみられたが、両者の関連を追究した研究はみあたらなかった。研究の多くは、術後せん妄の要因に関する研究、日常生活援助に関する看護判断によるもので、結果の提示やその根拠を示すものにとどまり、判断過程に焦点をあてた研究については、今のところ見いだせていない。今後も検討を継続する予定である。2)基礎的調査外科系臨床看護師への本調査に向けて、具体的な調査内容を決定するための基礎的調査を行った。対象は、外科系病棟(消化器外科、呼吸器外科、心臓血管外科)に勤務する看護師7名であり、平均年齢30.1才、外科系での臨床看護師経験年数7.6年であった。これらによりいづれの病棟においても術後せん妄が頻繁に発症しており、対象者全員が術後せん妄患者の看護を複数回経験していた。術後せん妄は患者や家族はもちろん、看護師および看護チームにとって大きな問題となっていること、術後せん妄と判断する過程には複雑な要因が存在し、非常に困難を要していることが明らかになった。平成20年度は、臨床看護師における術後せん妄のラベリングプロセスについての課題を明らかにするための文献検討および臨床看護師への調査を実施した。1)文献検討:昨年度に引き続き、国内外の看護研究により、術後せん妄のラベリングプロセス、とくに周手術期看護における術後せん妄の判断・診断、看護師の判断に関わる場面について記載されているものを調査した。術後せん妄や看護判断の個々をテーマとした研究は若干みられたが、両者を取り扱った研究はなかった。今回の主テーマとなる看護判断についてのその過程に関するものも見当たらなかった。本年度も引き続き検討していく予定である。2)調査:外科系病棟看護師への質問紙調査および面接調査を実施した。質問紙調査の内容は、昨年度の基礎的調査結果および文献を参考とした。大学と病院の倫理委員会で承認を得、A大学病院において手術患者が入院する病棟の看護師を対象に質問紙を配布し、190名の回答があった。今後統計学的解析を行っていく予定である。面接調査は、5名行ったがデータが十分でないため、本年度も継続して調査を行う。平成21年度は、臨床看護師における術後せん妄のラベリングプロセスについての課題を明らかにするために実施した調査結果を分析し、まとめた。対象)外科病棟に勤務する対象候補看護師190名のうち、せん妄患者の看護経験を有する155名を対象とした。方法は、自記式の質問紙調査であり、実施前に倫理委員会の承諾を得た。結果)術後せん妄看護の経験件数は、11例以上の者が51.3%を占めていた。せん妄を予測する術前因子として重視されていたのは、「高齢であること」(66.9%)が最も多く、次が「落ち着きが無い」(41.8%)、「不安が強い」(39.2%)であったが、せん妄を予知する際の根拠として重視されていたのは、「チューブ類を自己抜去する」(70.1%)、「術前と表情が異なる」(61.4%)が多かった。また、せん妄をアセスメントする際に重視している事項は、「異常な行動」(74.7%)が最も多く、次が「表情」(64.7%)であった。なお、アセスメントする際にアセスメントツールを用いている者は11.8%であり、そのうちの42.9%がツールの使用が「容易である」、直観力がなくとも術後せん妄の判断は可能であるとしていた。自分にせん妄を判断・確信する直感があると認識している者は85.2%であり、その直感で、せん妄を判断できるという者は62.6%、確信できるという者は29.0%であった。アセスメントを繰り返して最終的にせん妄であると判断するのに、アセスメントツールを使用せずに判断する際の根拠は、「疎通や表情、行動の(術前からの)変化」が最も多く、次に、「他の看護師や医師の判断」を拠り所としていた。
ヒト臍帯血造血幹細胞の真に安全な新規増幅法開発

【背景・目的】これまでマウス移植系でHoxB4遺伝子導入による造血幹細胞(HSC)の増幅効果が報告されてきた。一方、HoxB4発現レトロウイルスベクターを用いたサル・イヌの大型動物移植系では、マウスでは観察されなかった白血病の高率な発症が示され、安全性が危惧されている。HoxB4は短期間発現で増幅効果を呈するのに対し、長期間発現で白血病を惹起するとされ、そこで我々はセンダイウイルス(SeV)ベクターのうち特にポリメラーゼ遺伝子欠損型SeV(SeV/ΔP)ベクターに注目した。これはウイルスの自己複製能が欠損しておりex vivoでの一過性発現を可能にする。今回このSev/ΔPベクターを用いたHoxB4一過性発現によるヒトHSC増幅に関する有効性と安全性をヒツジ移植系で検証した。【方法】ヒト臍帯血よりCD34^+分画を分離後、HoxB4遺伝子発現SeVベクターを96時間で計4回感染させた。Sev/ΔP/HoxB4感染細胞は、免疫系が未成熟な45-50日齢(満期147日)のヒツジ胎仔腹腔内へ移植した(HoxB4群;n=4,対照群;n=4)。生後の仔ヒツジ骨髄サンプルを用いたコロニーPCRによりヒト由来造血細胞の割合(ヒトキメラ率)を定量評価した。また定期的な末梢血・骨髄評価により白血病発症の有無をモニターした。【結果】SeVベクターによるヒトCD34^+細胞への遺伝子導入効率は約70%(MOI=100)で効率良く導入可能であった。10^5個のCD34^+細胞を移植した場合、生後の仔ヒツジ骨髄中のヒトキメラ率は、HoxB4群では対照群の4.8倍と計算された。なお移植後40ヶ月時点で白血病発症は皆無であり、仔ヒツジ骨髄・末梢血中に残存SeVベクターゲノムはPCRレベルで検出されなかった。【結語】SeV/ΔPベクターにより、ヒトCD34^+細胞への高い遺伝子導入効率を保ちつつ一時的遺伝子発現が可能となった。SeV/ΔPベクターによるHoxB4の一過性発現の結果、ヒツジ胎仔移植の評価系ではヒトHSCが有効に増幅されると同時に安全性も担保されていると考えられた。
憲法上の信頼保護原則の内容・機能・限界に関する研究

本研究は、法制度の変更がなされる場合、従前の法制度への信頼はいかなる場合にどの程度保護されるのかという問いに憲法の観点から取り組み、信頼保護原則に関する本格的な検討を行うものである。ドイツにおいて議論が盛んに行われている憲法上の信頼保護原則の保障内容と機能、限界を検討し、ドイツ連邦憲法裁の判例を素材に、違憲審査の際、比例原則と共に用いられる同原則の位置付けや具体的な衡量審査の在り様を分析する。これは、民主的正統性を有する立法者による「法制度の柔軟な変更の必要性」と「それによって生ずる個人や事業者の不利益」との衝突が生じる場面において、憲法はどのような要請をするのかを明らかにすることでもある。
アクチビン-ホリスタチン系による中胚葉誘導制御の分子機構

我々はツメガエル未受精卵と胞胚にすでに中胚葉誘導を引き起こすのに充分量のアクチビン様活性が存在することを見いだして,母性由来アクチビンが正常胚において中胚葉誘導反応の引き金を引いている可能性を提示した。本年度はアフリカツメガエル卵に母性由来アクチビン及びホリスタチンが存在することを明かにすることに焦点を当てて研究を実施して次のような成果を得た。(1)ツメガエル由来細胞XTCの培養液をアフィニティークロマトグラフィー,FPLCゲルろ過ついで逆相HPLCにより分画した。その結果,ホリスタチンと三種類のアクチビンA,AB,Bをそれぞれ単離することに成功し,ツメガエルにも三種類のアクチビンアイソフォームが存在することを確認することができた。(2)ツメガエル初期胚の中胚葉誘導の場において,アクチビン-ホリスタチン系がどのように機能しているのかを知るために,これらのタンパク質因子をツメガエル胚に同定することを試みた。約10,000個の初期胚(ステージ1-5)から,(1)と同じ方法により精製した。逆相HPLCカラムからの溶出位置及び各画分の活性測定の結果から,ホリスタチン及び三種類のアクチビンをそれぞれ同定することができた。回収された活性から概算すると収量は10,000個の卵からホリスタチンが402ng,アクチビンA,AB及びBがそれぞれ1.4ng,1.3ng,6.4ngと算出された。これらの結果から,カエル初期胚には,アクチビンBがアクチビンAやABに比べ数倍多く含まれていること,そしてホリスタチンが大過剰存在していることが示唆された。
網膜中心窩移動術の定量化および合併症の検討

加齢性黄斑変性および近視性血管新生黄斑症などの難治性黄斑疾患に対する外科的治療として、我々は中心窩移動術の開発を行ってきた。本研究では、イヌ眼およびサル眼を用いて強膜短縮あるいは網膜全周切開による中心窩移動術を施行し、術式および組織学的、電気生理学的検討を行った。また、文書で患者の同意を得た上で、臨床例における中心窩移動術の検討を行った。強膜短縮による網膜移動術をイヌ眼を用いて行ったところ、後極部網膜に網膜襞形成が必発であること、網膜移動距離が1乳頭径前後であることを、組織学的には、網膜襞内の網膜ではアポトーシスを生じていることを明らかにした。臨床例では、脈絡膜新生血管板の小さな症例(特に近視性新生血管黄斑症など)に適応となり、手術浸襲が少なく、術後視力の良好な症例があった。網膜全周切開による中心窩移動術については、サル眼を用いて手術を施行し、手術手技の改良を行った。特に意図的網膜剥離作製時に生理的網膜接着を弱めるため、カルシウムを含まない灌流液を用いて灌流を行うことで、後の手術操作を容易にし、手術時間を短縮することができた。組織学的には、サル網膜の中心窩の電子顕微鏡観察を行い、中心窩視細胞の部分的消失が生じていた。しかし、術後網膜には、アポトーシスは検出されなかった。網膜電図による径時的検討では、術後1ヶ月では、フラッシュ、桿体、錐体、フリッカーの各網膜電図のいずれも低下していたが、術後2ヶ月では、それぞれ術前の測定値の54%,49%,34%,43%まで回復した。サル眼においては網膜接着が強く、意図的網膜剥離作製時に網膜色素上皮障害を生じる場合が多かった。臨床例では、網膜全周切開による中心窩移動術により視力回復あるいは維持の得られた症例が70%あり、今後さらなる検討を行っていくことにより、中心窩移動術が難治性黄斑疾患に対して有効な治療法となっていくと考えられる。全身麻酔下にて10頭のビーグル犬の片眼に対して、強膜短縮を用いた網膜移動術を施行し、網膜移動距離および網膜組織像について検討した。イヌはヒトと眼球構造が異なり、渦静脈が周辺部強膜内を走っているため手術操作がヒトよりも煩雑になった。強膜短縮は、耳側赤道部強膜において約180度にわたり輪部より7mmと11mmに5糸のマットレス縫合を置いた。硝子体手術の方法を用いて30ゲージ鈍針により意図的網膜剥離をほぼ全範囲に作成した後、マットレス縫合を締め強膜短縮を行った。その後、網膜をほぼ完全に復位させ、手術を終了した。網膜移動距離は、術前眼底写真と術終了時のビデオ画像より算出し、鼻内側に平均0.53±0.30乳頭径移動していた。また、術後早期の組織学的変化を調べるため、術後1週、2週、4週で眼球摘出を行い、網膜組織を光学顕微鏡的に観察した。まず、強膜短縮に必ず伴う網膜襞における網膜の変化をみるため、視細胞の錐体細胞のmatrixをピーナツレクチン(PNA)を用いて染色したところ、網膜襞内の錐体細胞のmatrixが著明に減少していた。また、網膜襞内の外顆粒層が減少し、視細胞の配列が乱れていた。

次に、術後網膜におけるアポトーシスを検討するため、ApopTag(Oncor社)を用いて組織化学染色を行ったところ、網膜襞内の視細胞に強い陽性反応が認められた。しかし、意図的網膜剥離を作成したが網膜襞を形成することなく復位した網膜においては、PNA染色も正常網膜と同様な染色を示し、アポトーシスの陽性反応も認められなかった。強膜短縮を用いた網膜移動術においては、網膜襞の形成部位をコントロールしていく必要があることが明らかになった。今後、もう一つの術式である周辺部網膜全周切開を用いた網膜移動術についてさらに検討を行い、これらの手術適応、手術侵襲を評価していく予定である。カニクイサル5頭を用いて、周辺部網膜全周切開による中心窩移動術を施行し、術後経時的に眼底写真、蛍光造影検査、各種網膜電図を施行し、術後の網膜機能の回復過程を検討した。また、手術手技についても検討を加えた。サル眼は、ヒト網膜と同じ特徴を有しており、実際のヒト眼における手術と同様に行うことができた。中心窩移動術においては、意図的網膜剥離を全範囲にわたり作製する必要があるが、サル眼においては網膜接着が強く、網膜剥離作製時に網膜色素上皮を障害し、術後に網膜色素上皮の過形成、網膜視細胞の障害を2次的に生じやすかった。カルシウムを含まない潅流液を使用することにより生理的な網膜接着力を弱め、手術操作を比較的容易にすることができた。術後経過における網膜機能の回復をフラッシュ、桿体、錐体、フリッカーの各網膜電図を用いて検討した所、術後1ヶ月では、フラッシュ、桿体、錐体、フリッカーの各網膜電図の回復は、それぞれ術前の測定値の41%,15%,22%,31%と低下していたが、術後2ヶ月になると、それぞれ術前の測定値の54%,49%,34%,43%まで回復した、術後3ヶ月においては、2ヶ月後とほぼ同様の値を示し、網膜電図上は、少なくとも術後2ヶ月間は網膜機能の回復を待たねばならないことを明らかになった。さらに、術3ヶ月後に眼球を摘出し、電子顕微鏡にて網膜を観察したところ、中心窩陥凹を認めるものの、中心窩視細胞の部分的な消失と黄斑上膜の存在が明らかになった。以上の結果より、中心窩移動術は、網膜に与える侵襲は比較的強いと考えられるが、今後、生理的網膜接着力を弱めるなどの手術手技の改良により、手術侵襲を軽減し、黄斑疾患の治療に役立てたい。
動体追跡照射法

放射線治療において、体内で呼吸性移動などで動く腫瘍を高精度で治療することは、いままで極めて困難であった。今回我々は体内深部の動く腫瘍の位置をリアルタイムに把握しながら、放射線照射を行う装置を開発した。リニアックX線装置室に特別に設置した2台のX線透視装置にて腫瘍内に刺入した2mmの金マーカーの位置を、パターン認識技術を用いて、一秒間に30回の速度で認識させる。金マーカーの形状はあらかじめコンピューターに覚えさせておき、X線画像中のこのマーカーの位置を自動認識させる。治療計画時にあらかじめ金マーカーと腫瘍の位置関係を求めておき、計画された部位に金マーカーが来た瞬間、0.03秒後に治療用X線を発射する。金マーカーの速度は秒速40mmまで、位置の把握が(1mmでマーカー位置の把握が可能であった。被曝量の増加は治療線量の1%程度であり、この照射技術の利用で、不必要に照射されていた体積を従来の1/3程度に減少できることが判明した。実際の肝腫瘍2例に対して、金マーカーの刺入と動体追跡照射法を行い、照射精度の向上を確認できた。前立腺癌5例、脊髄近傍の腫瘍2例に用い、照射位置の確認に、同法が有用であることを確認した。実際には、4セットのX線透視装置を用い、放射線治療ビームが360度どの方向から照射される場合にも、透視の死角ができないように工夫した。パターン認識技術とリアルタイムの位置同定を可能とした同法は、新しい位置決め法として放射線治療以外にも応用可能と考えられ、平成10年12月に特許申請を行った。放射線治療の精度を根本的に高めるためには、腫瘍の位置をリアルタイムで把握し、それに同期させた照射を行う必要がある。この研究は、X線透過技術と動物体認識装置を組み合わせて、これを実現するためのものである。今年の主な研究は、3次元的な腫瘍位置の把握をリアルタイムに行うためのソフト開発であった。治療直前にX線撮影を2方向から行い、その画像処理により、病変の3次元的位置を把握するアイデアは、従来の放射線治療の精度保持技術を根本的に変える可能性を含んでいる。X線撮影2方向からの撮影での3次元位置確認法は、定位手術的照射において血管造影の際に用いる座標計算方法であり、従来は患者側に固定された座標軸を持たせて、その精度を保持した。しかし、発想を転換し摩擦計算用マーカーを、患者側ではなく、空間側に持たせている。今年は、X線装置の導入の前に、可視光線を用いて、上記の動体認識をリアルタイムに行うソフトを開発し、その基礎実験を行った。また、この治療を実現するために必要な、時間軸を入れた放射線治療計画、いわば4次元治療計画装置の設計、開発をおこなった。すなわち、同一患者の肺腫瘍の治療計画用CT検査を呼気位、吸気位、中間位で行い、それぞれでの線量分布を計算し、どの部位での線量分布が最も優れているかを計画するシステムである。このシステムの導入により、次年度は患者治療と同じ条件で治療プランニングを行、動体追跡装置の導入を行う。

被曝量の増加は治療線量の1%程度であり、この照射技術の利用で、不必要に照射されていた体積を従来の1/3程度に減少できることが判明した。実際の肝腫瘍2例に対して、金マーカーの刺入と動体追跡照射法を行い、照射精度の向上を確認できた。前立腺癌5例、脊髄近傍の腫瘍2例に用い、照射位置の確認に、同法が有用であることを確認した。実際には、4セットのX線透視装置を用い、放射線治療ビームが360度どの方向から照射される場合にも、透視の死角ができないように工夫した。パターン認識技術とリアルタイムの位置同定を可能とした同法は、新しい位置決め法として放射線治療以外にも応用可能と考えられ、平成10年12月に特許申請を行った。
光ニューロ並列識別眼を備えたレーザマニピュレート法による形状ごとの微小物体分別法

本研究の成果は大別して以下の3部分からなっている。1)粒子の形状・寸法の並列瞬時識別法、2)粒子のレーザマニピュレート法、3)形状識別眼を備えた光マニピュレート法。1)粒子の形状・寸法の並列瞬時識別法の新技術が開発された。(1)形状の異なる寸法が数ミクロンから数十ミクロンまでの粒子群を形状または寸法ごとにその空間分布を同時に実時間で分離並列表示可能な多重マッチトフィルタ法を確立した。(2)数ミクロンの微粒子の光回析パターンからその形状・寸法を識別するため、顕微鏡光学系にリレーレンズ系と暗視野光学系を組み込んで1個ずつの粒子の微弱な光回析パターンが同時に得られる特殊な顕微光学系を開発した。(3)上記(1)で多重マッチトフィルタを迅速簡便に作成するために光導電プラスチック材料の開発およびその現像装置が開発され、旧来のマッチトフィルタ法の利便性を高め、一般人のこの技術領域への進出を容易にした。(4)ビデオカメラで撮り込んだ粒子画像も容易に瞬時に形状・寸法識別ができるような実時間並列識別光学システムの開発研究がなされ、その可能性が明らかになった。2)粒子のレーザ光による捕捉に関する理論的実験的な研究成果を得た。(1)ミクロンサイズ粒子をコンマ数ミクロンずつ異なる寸法群に分別するための粒子の光ふるい分け法が開発され、新技術分野が開発された。(2)数ミクロンの粒子はレーザー光照射方向に動くものが多く、サブミクロン粒子は光照射方向と逆進する粒子がほとんどであることが実験的に認められた。3)形状識別眼を備えた粒子の光マニピュレート法が開発された。(1)粒子の形状識別眼と光遠隔操作用光学系を併合した粒子の形状・寸法ごとの自動分別光学系が開発研究された。(2)粒子の形状・寸法ごとの自動分別光学系が開発研究された。(2)粒子の形状・寸法ごとに1個ずつその挙動が測定できる手法が開発された。1)20mWHe-Neレーザの拡大平行光束中のレンズの前焦点面に入った単純な球,三角,四角,楕円等の形状で寸法が数ミクロンから数十ミクロンまでの粒子群を形状または寸法ごとにその空間分布を同時に実時間で分離並列表示可能な多重マッチトフィルタ法を確立した。この光学識別システムをつくり、カメラで撮り込んだ粒子映像を直接、形状・寸法別に識別する光ニューロ識別眼を備えた実験装置を試作した結果、この光ニューロ識別眼システムの有効性と可能性が明らかになった。2)上記のシステムで重要な役割を果す多重マッチトフィルタを迅速簡便に形成する光導電プラスチックスの開発で、現像蒸気として無害なシクトヘキサンを用いて光回拆効率が25%以上の高性能のものが開発された.3)数ミクロンの微小な粒子の形状・寸法を光回拆パターンから識別するために、上記のシステムを光学顕微鏡に組込んだとき、微小な粒子からの回拆パターンが明確に捉え得るか否かの検討がなされた。その結果、明視野では数個の同一形状・寸法粒子からの回拆パターンは見えるが、1個ずつの粒子からの回拆パターンは回拆光が微弱なたためとらえられない。これに対しては暗視野顕微鏡法を用いることが必要であることが明らかになった。4)数ミクロン以上のポリスチレン粒子はレーザ光照射方向に光圧力により動くものが多い。

しかし0.1ミクロン程度以下の微粒子は光照射方向と逆進する粒子がほとんどであることが実験的に認められた。5)レーザ・マニピュレート法では照射レーザ光束の光強度分布はガウス分布をしていることが必要であり、重要であることが理論計算でも、実験的にも確認された。6)研究計画に従って、購入YAGレーザによる光走査トラップ光学系も顕微鏡に組込まれ、粒子捕捉が行われた。研究目的である直径数ミクロン程度までの粒子群を形状・寸法ごとに瞬時に識別するためには、1個ずつの粒子からの光回折パターンを鮮明に得る必要があるが、従来はこれが困難であった。本研究では顕微鏡の載物台の下からHe-Neレーザ平行光を照射し、載物台上の粒子1個ずつの光回折パターンを同時に得ることのできる特殊な顕微鏡光学系を新たに開発できた[未発表]。また、これらの光回折パターンを多重マッチトフィルタ法で瞬時識別するために写真乾板の代わりに光導電プラスチックスを用いたホログラム迅速作成装置を完成させ[成果(1)]、多重マッチトフィルタ法で光回折パターン群から1個ずつの粒子の形状・寸法を同時実時間測定する方法を確立した[成果(2)]。このとき、ビデオ撮影で液晶ディスプレイ上に写しだした被識別物体像を空間光変調素子でインコヒーレント・コヒーレント変換して画像識別する方法を開発し、実時間並列識別光学システムを構築した[成果(1)]。そして物体形状識別の確度を上げるためにニューロコンピューティングシステムを組み込んだ識別眼の開発が行われた[成果(1),(3)]。なおニューロコンピューティング回路は光アナログ系だけで構成するまでに至らずハイブリッドにとどまっている[成果(3)]。粒子を形状・寸法ごとにレーザー光圧力で光マニピュレートする方法をローレンツMie光散乱理論でシミュレートし、また、空気中及び水中での粒子捕捉実験を行ない検討した結果、その可能性が明らかになり、新技術分野が開拓できた[成果(4),(5)]。形状識別眼と遠隔操作用光学系を組み込んだ顕微鏡システムを改良し、形状識別しながら粒子の光マニピュレートが可能なシステムを構築して、疑似血球粒子や液晶スペ-サ粒子の分別実験を行った。球形スペ-サ粒子は容易に寸法ごとに自動的に光分別できる[成果(4),(5)]。不規則形状のミクロンサイズ粒子は現段階では形状ごとに自動的には光マニピュレートできない。なお、形状ごとに粒子をマニピュレートした場合の粒子挙動の明確な識別法が開発された[成果(6),(7)]。
ウェーブレットに基づいたウィグナー分布型信号検出器開発の基礎研究

不規則雑音に埋れた信号の検出問題は,従来の通信分野,計測・制御分野はもとより,生体信号や地殻の亀裂信号の検出など自然科学分野などにも応用される技術である.本研究では,不規則雑音をうけて計測されるセンサー信号の検出と受信されるべき信号のパラメータの推定問題として信号の形状は既知であり,その遅れ時間,伸縮パラメータは未知であるとして,近年信号処理分野で注目されている時間-周波数解析を前処理として用いた.時間-周波数解析では,ウイグナー分布をはじめ多種多様な手法が提案されており,いずれの手法でも本研究に用いることが可能である.ウィグナー分布は検出すべき信号の相関をフーリエ変換することによって得られるが,本研究ではフーリエ変換の代わりにウェーブレット変換を用いた信号検出器について開発を行い,この方法が有効であることを確認した.さらに擬似ウィグナー分布の使用の可能性をも視野において信号検出器の開発を進めた.本手法の有効性を確認するためにいくつかのシミュレーションを行なった.信号として1周期正弦波,ガウス包絡線を持つ正弦波,周波数変調信号(チャープ信号),矩形波を用いたが,いずれの信号に対しても本手法の有効性が示せた.さらにウィグナー分布による解析ではクロス干渉項が生じる2連信号についてもシミュレーションを行い,本手法にはそのクロス項の影響が無いことを示した.本手法は,前処理として観測データを時間-周波数分布関数に変換するため,従来の相関法よりも誤差が少なくSN比$一10$[dB]といった高い雑音レベルに対してもタフな推定手法であることが確認できた.さらに提案した手法を超音波センサーによる距離計測に応用し,検証実験を行った.実データにおいても本手法が有効であることを確認した.また開発した手法のさらなる応用として雑音に埋もれたFM信号の瞬時周波数の推定問題に用い高雑音における推定精度は世界的に見てもトップクラスであることが示せた.不規則雑音に埋れた信号の検出問題は,従来の通信分野,計測・制御分野はもとより,生体信号や地殻の亀裂信号の検出など自然科学分野などにも応用される技術である.本研究では,不規則雑音をうけて計測されるセンサー信号の検出と受信されるべき信号のパラメータの推定問題として信号の形状は既知であり,その遅れ時間,伸縮パラメータは未知であるとして,近年信号処理分野で注目されている時間-周波数解析を前処理として用いた.時間-周波数解析では,ウイグナー分布をはじめ多種多様な手法が提案されており,いずれの手法でも本研究に用いることが可能である.ウィグナー分布は検出すべき信号の相関をフーリエ変換することによって得られるが,本研究ではフーリエ変換の代わりにウェーブレット変換を用いた信号検出器について開発を行い,この方法が有効であることを確認した.さらに擬似ウィグナー分布の使用の可能性をも視野において信号検出器の開発を進めた.本手法の有効性を確認するためにいくつかのシミュレーションを行なった.信号として1周期正弦波,ガウス包絡線を持つ正弦波,周波数変調信号(チャープ信号),矩形波を用いたが,いずれの信号に対しても本手法の有効性が示せた.さらにウィグナー分布による解析ではクロス干渉項が生じる2連信号についてもシミュレーションを行い,本手法にはそのクロス項の影響が無いことを示した.本手法は,前処理として観測データを時間-周波数分布関数に変換するため,従来の相関法よりも誤差が少なくSN比$一10$[dB]といった高い雑音レベルに対してもタフな推定手法であることが確認できた.さらに提案した手法を超音波センサーによる距離計測に応用し,検証実験を行った.実データにおいても本手法が有効であることを確認した.また開発した手法のさらなる応用として雑音に埋もれたFM信号の瞬時周波数の推定問題に用い高雑音における推定精度は世界的に見てもトップクラスであることが示せた.本研究では,不規則雑音をうけて計測されるセンサー信号の検出と受信されるべき信号のパラメータの推定問題に関する研究をおこなった.本年は初年度にあたり,まず問題設定として信号の形状は既知であり,その遅れ時間,伸縮パラメータは未知であるとした.また,観測データには信号の伝送途中に何らかの不規則雑音が介在するとして,この雑音に埋もれた観測データより信号のパラメータの推定を行う新しい手法を開発した.本手法の概要は以下のとおりである.信号の伸縮パラメータが周波数によく反映されることから,近年信号処理分野で注目されている時間-周波数解析を前処理として用いた.時間-周波数解析では,ウイグナー分布をはじめ多種多様な手法が提案されており,いずれの手法でも本研究に用いることが可能であるが,本研究では比較的計算時間が短く,時間解像度の高い擬似ウィグナー分布を用いた.不規則雑音に埋もれた観測データの時間-周波数分布関数は時間と周波数の2軸に対して確率場を形成するため,その確率場に対する尤度関数を求め,それを最大にすることによって未知パラメータを同定する手法を開発した.尤度関数を構築するにあたっては,擬似ウィグナー分布関数の統計的性質が必要となる.雑音を正規性白色雑音としてこの統計的性質を理論的に導出し,それを本手法に用いた.本手法の有効性を確認するためにいくつかのシミュレーションを行なった.信号として1周期正弦波,ガウス包絡線を持つ正弦波,周波数変調信号(チャープ信号),矩形波を用いたが,いずれの信号に対しても本手法の有効性が示せた.

本手法は,前処理として観測データを時間-周波数分布関数に変換するため,従来の相関法よりも誤差が少なく高い雑音レベルに対してもタフな推定手法であることが確認できた.次年度は,提案した手法に対する繰返し推定アルゴリズムの開発を行い,推定値の性質を解析する.また磁気センサーなどによる実験での検証を行う.本研究では,不規則雑音をうけて計測される信号の検出と受信されるべき信号のパラメータの推定問題に関する研究をおこなった.本年度の研究をまとめると以下の3点である.1.初年度に提案した信号の検出および信号パラメータの推定手法に対し,それぞれのパラメータの推定値を繰り返しアルゴリズムにより個々に同時推定する手法を提案し,その有効性をシミュレーション実験により確認した.2.推定値の評価として様々な信号に対するシミュレーションをそれぞれ50回おこない,雑音の分散に対する推定値の評価をクラメール・ラオの下界値と比較しておこなった.その結果S/N比が約-10dBといった雑音レベルが非常に高い場合にも有効であることを確認した.3.提案した手法を超音波センサーによる距離計測に応用し実データにおいても本手法が有効であることを確認した.これらの成果の一部は現在下記2件論文投稿中である.2)井嶋,大住,佐藤,I.Djurovic,大倉,"不規則雑音に埋もれた信号の未知パラメータ推定:擬似ウィグナー分布によるアプローチ,"電子情報通信学会論文誌(A).最終年度ではこれまでの研究成果に対する評価,および新しい工学的応用の可能性について検討を行い研究の総括をおこなった.本年度の研究をまとめると以下の3点である.1.これまでの検証実験(磁気センサーによる物体検出,超音波センサーによる位置・速度推定)に対する検出・推定能力の理論的評価および実験結果との比較.2.提案した手法の推定連続波レーダー信号およびFM信号への応用.3.研究のまとめ.前年度までは信号の遅延時間と伸縮パラメータを未知パラメータとしてそれを推定する手法を提案してきた.本年度はこの手法をFM-CW(周波数変調連続波)レーダー信号の遅延時間とドップラー周波数の推定として応用し,計算を高速化する手法を導入することでレーダーによる物体との相対距離および速度の推定に使用できることを示した.同様に雑音に埋もれたFM信号の瞬時周波数の推定問題に対しては高雑音における推定精度が世界的に見てもトップクラスであることが示せた.本研究で提案した推定手法は様々な信号の様々な未知パラメータの推定に用いることができ観測データが非常に高い雑音(SN比-12dB程度)に乱されている場合であっても有効であることを,それぞれシミュレーションおよび超音波,磁気センサーによる実験で確認した.
プレキャストコンクリート水路における石灰石粗骨材の溶脱に関する研究

石灰石骨材を用いた東北地方のプレキャストコンクリート製品水路において,モルタル部分の剥落よりも先に粗骨材が溶脱し,多数のクレーター状のくぼみができるという極めて特異で重度の劣化が起こっている。本研究の目的は,石灰石粗骨材の溶脱現象のメカニズムを明らかにし,その防止対策を確立することである。本研究が実施されれば,東北地方のみならずわが国全域の石灰石骨材コンクリート水路の長寿命化に貢献できると判断される。2018年度は、溶脱現象の究明のために,先ず1現地調査2石灰石骨材の構成成分の分析,3コンクリートテストピースによる溶脱試験等を実施した。その結果以下のことが明らかとなった。1青森、岩手および宮城県の用水路の調査を行った。いずれも施工後20年以上であったが、伊豆野堰用水路では最大で、24mmの窪みができており、粗骨材が完全に溶けだしていた。青森の早川用水路では、全長14kmあるが、ほぼ全てに石灰石の溶脱が認めらえた。水質も調べたが、硬度は軟水の領域であり、カルシウムの溶脱に特別寄与するようなイオンは認められなかった。22種類の石灰石および比較のための安山岩の組成成分を分析した結果、石灰石のCaO含有量はいずれも90%以上であった。2者の違いは、SiO2およびMgO含有量が数%ことなっていた。安山岩のCaOは30%と極めて少なかった。3水槽内の150&#8467;の水道水をポンプで連続的に循環させ、220×220×100mmのコンクリート平板テストピースの表面劣化状況の観察とCaイオンの溶脱量を調べた。その結果、約9か月で1.2mm程度の窪みが確認された。また、Caイオンの溶脱量は時間とともに比例的に増加していた。実験は、おおむね計画通りに行われた。とくに現地調査においても、実情が確認され、思った以上に広く分布していることが分かった。当初の計画では、石灰石骨材を10種類程度集める予定であったが、文献調査等により、東北地方の骨材の違いが少ないことが分かった。今後は、ドロマイトの含有量の高い石灰骨材を入手したい。溶脱試験では、水の流速による影響が大きいと考えられるため、流速を違えた実験を追加することとした。さらにカチイオン分析を行い溶脱への影響を確認することとした。また、補修技術について検討することとした。備品が当初の購入予定額より低く押さえられたことにより、次年度使用額が生じた。この金額は、次年度の計画を一部変更して、それに伴う物品費および学会旅費に充てたい。
「がまん」をコントロールする要因に関する生理心理学的研究

最近は若者も老人もがまんができない、と言われる。かまんには、長期的な利益のために短期的な利益を放棄するというものと、ルールに従ってしたい行動をしない、というものの2種類がある。がまんには大脳前頭連合野が重要な役割を果たし、この脳部位には、どちらのがまんについても関係した活動が見られる。がまんをコントロールすることが知られる薬物(リタリン)を投与したところ、サルでもがまんがより良くできるようになること、リタリン投与により、前頭連合野や線条体でドーパミンの放出が増すことも明らかになった。がまんの問題は「行動抑制」あるいは「セルフ・コントロール」の問題としてこれまで研究されてきている。ルールに従ったがまんをするのが「行動抑制」、長期的な利益のために短期的な利益をがまんするのが「セルフ・コントロール」である。サルに行動抑制に関係する「ゴー・ノーゴー課題」、「ストップ信号課題」と「多選択セルフ・コントロール課題」を訓練した。ゴー・ノーゴー課題では、ある刺激に対しては特定の運動反応を、別の刺激には運動反応の抑制をするように訓練した。ストップ信号課題では、運動反応の準備をしている間に、ときどき「ストップ信号」を出し、ストップ信号が出たときには運動反応を抑制するよう訓練した。セルフ・コントロール課題では、「ある刺激を選ぶと少しの報酬がすぐ出るが、別の刺激を選ぶと大きな報酬がかなりの時間を経て与えられる」、という事態で選択をするように訓練した。注意欠陥多動性障害(ADHD)は注意欠陥・多動・衝動性を特徴とした発達障害であり、前頭連合野との関連がいわれている。メチルフェニデート(リタリン)はドーパミンの作動薬的な働きをし、ADHDの治療薬として広く用いられているが、その作用メカニズムについては不明のところが多い。我々は認知課題遂行中のサルに対するメチルフェニデートの影響について行動レベルと神経伝達物質レベルで調べる試みを開始した。サルにメチルフェニデートを経口投与し、各課題を行なわせたところ、ゴーノーゴー課題ではノーゴー反応の促進が、セルフコントロール課題では、より多くの報酬のために長く待つことをがまんする反応の促進が見られた。こうしたサルにおいて、メチルフェニデートによる前頭連合野内の神経伝達物質の動態を調べるマイクロダイアリシス研究により、この薬物の認知課題に作用するメカニズムを解明する実験を開始した。サルに行動抑制に関係する「ゴー・ノーゴー課題」と「多選択セルフ・コントロール課題」を訓練した。20年度は行動抑制に関係した課題を遂行中のサルに対するメチルフェニデートの影響について行動レベルと神経伝達物質レベルで調べる研究を行った。メチルフェニデートを経口投与したところ、投与量により課題遂行の促進や障害が見られた。メチルフェニデートの投与量をいろいろ変えてサルに課題を行わせ、前頭連合野内と線条体における神経伝達物質の動態を調べるマイクロダイアリシス研究により、この薬物の認知課題に作用するメカニズムを解明する実験を開始した。実験では行動抑制に関係する「ゴー・ノーゴー課題」と「多選択セルフ・コントロール課題」を訓練したサルを用いた。ゴー・ノーゴー課題では、ある刺激に対しては特定の運動反応を、別の刺激には運動反応の抑制をするようサルは求められた。セルフ・コントロール課題では、「ある刺激を選ぶと少しの報酬」がすぐ出るが、別の刺激を選ぶと大きな報酬がかなりの時間を経て与えられる」、という事態でサルは選択を求められた。注意欠陥多動性障害(ADRD)は注意欠陥・多動・衝動性を特徴とした発達障害であり、前頭連合野との関連がいわれている。21年度はがまんに関係した課題を遂行中のサルに対するメチルフェニデートの影響について行動レベルと神経伝達物質レベルで調べる研究を行った。

メチルフェニデートを経口投与したところ、投与量により課題遂行の促進や障害が見られた。メチルフェニデートの投与量をいろいろ変えて、前頭連合野と線条体における神経伝達物質の動態を調べるマイクロダイアリシス実験を行った。前頭連合野では、臨床的適量をはるかに超えた量を投与しないとドーパミンの増加は見られなかったが、線条体では臨床的適量の投与で有意なドーパミンの増加がみられ、しかもその効果は臨床的効果の持続とほぼ平行していた。このことから、メチルフェニデートのADRD治療効果は、前頭連合野よりも線条体を介してなされていることが示唆された。
細菌べん毛ロッドの構造と分子機構の解明

細菌べん毛は高速回転(サルモネラなら300回転/秒)する生体ナノマシンである。この高速回転を支えるドライブシャフトとして機能する細菌べん毛ロッドの構造を明らかにし、生体シャフトの仕組みの解明を試みた。ロッドの主成分であるFlgGの結晶化に成功し、2オングストローム分解能での分子構造を明らかにした。得られた分子構造をポリロッドの低温電子顕微鏡像にあてはめ、FlgG同士が相互作用して作り上げるロッドの堅硬な構造の仕組みを解明した。本研究はべん毛の高性能潤滑回転機構の解明を目指して、ロッドの構造を結晶構造解析、低温電子顕微鏡法構造解析、生化学的解析から明らかにしようというものである。昨年度得られた回折データからSAD法により初期位相を決定し、分子モデルの構築を行ったところ、2.0A分解能でのFlgG(47-227)の構造を明らかにすることができた。この結晶構造をすでに低温電子顕微鏡法により明らかになっている7.0A分解能のポリロッド(FlgGの変異により野生株のものに比べて長く伸長したディタルロッド)モデルにあてはめ、生体中のディスタルロッドの分子構造を明らかにした。また、計画当初は来年度行う予定であったFlgB、FlgC、FlgFの局在位置を決定する実験も行った。ロッドタンパク質欠損株のべん毛基部体を電気泳動・質量分析・低温電子顕微鏡による構造解析からFlgB、FlgC、FlgFの局在位置を決定する実験も行った。その結果、ロッドタンパク質が一つでも欠けるとロッドは構築されないことがわかり、局在性を明らかにすることはできなかったが、ロッド構築に関わる新たな知見を得ることができた。細菌のべん毛は高速回転(サルモネラ菌なら1分間に約2万回転)する運動器官であり、約30種類ものタンパク質で構成された超分子ナノマシンである。べん毛のロッドはべん毛基部体の中心軸を成し、べん毛の高速回転を支えるドライブシャフトとして機能する。FliCのみで構成されるフィラメントやFlgEのみで構成されるフックと異なり、FlgB、FlgC、FlgF、FlgGと4種類のタンパク質で構成されているロッドは、フックやフィラメントと異なった複雑ならせん構造体であることが予測されているが、詳細は明らかになっていない。初年度はフックの根元に局在するFlgGの結晶化と構造解析を中心に行った。昨年度までに、FlgGのunfold領域を同定し、その部分を欠損させたFlgG(47-227)を発現、精製、結晶化スクリーニングし、結晶を得ていたが、回折データの質が悪く構造解析には至らなかった。今年度は良質な結晶を得るためにタンパク質精製法の改良と結晶化条件の最適化を最優先で行なった。その結果、精製法を見直してサンプルの純度を99.9%以上まで高め、その高純度のサンプルを使用して得られた単結晶からSPring-8 BL41での回折実験で2Å分解能の回折データを得ることに成功した。さらにセレノメチオニン置換体結晶の作製にも成功し、位相決定のための回折データを得ることもできた。得られた回折データからSAD法で初期位相を決定し分子モデルを構築することができた。現在、モデルの精密化を行っている。産前産後の休暇又は育児休業により研究を中断していたため、平成26年度の研究実績はありません。本研究は細菌べん毛の高性能潤滑回転機構の解明を目指して、べん毛のドライブシャフトにあたるロッドの構造を結晶構造解析、低温電子顕微鏡法構造解析、生化学的解析から明らかにしようというものである。本年度はプロキシマルロッド部分を構成するFlgFタンパク質の結晶化を重点的に行った。全長および重合化しやすい部分を取り除いたFlgF試料を作製し、結晶化スクリーニングを行ったところ、結晶を得ることはできなかったが、各試料の可溶化条件データを得ることはできた。また、前年度に解明したFlgG(47-227)の結晶構造を低温電子顕微鏡法により解析したポリロッド変異体の画像モデルにあてはめ生体中のディスタルロッド部分の分子構造を解析する作業をより丁寧に進め、FlgGのコア領域とC末端までの分子構造を明らかにした。さらに、FlgG(47-227)の結晶構造から、構造的相同性を利用して既知であったフックタンパク質の結晶構造の不明部分の一部を明らかにすることができ、フックタンパク質およびフックの分子構造の精度を向上させるることができた。本研究課題により細菌べん毛ロッドの大部分を占めるディスタルロッド部分の分子構造が明らかになり、潤滑回転機構解明に大きく貢献した。産前産後の休暇又は育児休業により研究を中断していたため生物物理FlgGの結晶構造を解明したので、その成果を論文にまとめて発表する。

プロキシマルロッドの構造を明らかにするためにFlgFタンパク質の結晶構造解析に取り組む。FlgGのときと同様にunfold領域を欠損させたFlgFの大腸菌大量発現系をすでに構築しているので、精製法の改良と結晶化を重点的に行う。良質な結晶を得ることができれば、さらにセレノメチオニン結晶の作製、回折データ収集、位相決定、分子モデルの構築と研究を先に進める。初年度の最重点課題であったFlgGの結晶の改良と回折データ収集が想像以上に順調に進んだことで当初の計画よりも数ヶ月程早く研究が進み、今年度も順調に計画通り研究を進めることができたため。本年度はFlgG(47-227)結晶を改良し、結晶構造解析のできる良質なネイティブ結晶の回折データを得ることを最重要課題とした。精製法の見直しと結晶化条件の再探索を精力的に行ったことが幸いして、初年度の目標であった良質な回折データを得ることに成功した。その後、セレメチオニン結晶の作製と回折データの収集、位相決定、モデルの構築も順調に進み、現在、モデルの精密化を行っている(近日中に構造を決定する)。結晶化が順調に進んだことで、当初の予定よりも数ヶ月程早く研究が進んでいる。産前産後の休暇又は育児休業により研究を中断し、平成26年度の使用額が0だったため。生体中のディスタルロッドの分子構造が明らかになったので、この研究内容を論文にまとめ投稿する。ディスタルロッドの構造が明らかになったので、次はプロキシマルロッドの構造を明らかにするためにFlgFタンパク質の結晶構造解析に取り組む。ロッドの高性能潤滑機構の解明を目指して、結晶構造を決定し、結晶構造を低温電子顕微鏡によるロッドの解析像に当てはめ、生体中のFlgGロッドの構造の解明を目指す。研究内容を論文にまとめ投稿する。来年度に予定していた研究課題「FlgB、FlgC、FlgFの局在位置を決定する」のに適した各タンパク質の欠損株を海外の研究者から譲り受けることができたので、この研究課題を前倒しして本年度から行う。各欠損株から基部体を精製し、その基部体の構成タンパク質を二次元電気泳動と電子顕微鏡観察から解析して、その欠損タンパク質の局在位置を明らかにする。研究のために必要な大型実験装置はほぼ揃っているので、研究費はタンパク質精製と結晶化に必要な消耗品(ゲル濾過カラム、アフィニティーカラム、培地、試薬、界面活性剤、プラスチック器具、ガラス器具、結晶化プレート、結晶化用試薬、凍結用ループ、結晶保存容器など)を購入する。作業の効率化を図るために、電動ピペット、ホットスターラー、撹拌器等の少額備品も購入する。成果発表のための論文投稿料にもあてる。当研究のために必要な大型実験装置は揃っており、電動ピペット、ホットスターラー、撹拌器等の少額備品も購入する必要がなかったため。
鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのレセプターの分子基盤

鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のレセプター分子の決定を目的として、これまでに以下の解析を行った。1.フローサイトメトリーによるIBDVの吸着評価法を確立し、IBDVの吸着が標的細胞のプロテアーゼおよび糖鎖付加阻害薬処理により阻害されることを明らかにした。このことから、レセプター分子が糖蛋白質により構築されている可能性が示唆された。2. IBDVに高度に感受性のLSCC-BK3細胞をSDS-PAGEにより分画し、ビオチン標識したIBDVとの反応を解析した。分子量約110kDaの分子とビオチン化ウイルスとの反応を確認した。この反応はIBDV非感受性細胞にも検出された。3. IBDVに高感受性の鶏B細胞由来LSCC-BK3細胞からIBDVに抵抗性の細胞を確立した。感染実験では、BK3の70%以上にウイルス抗原が検出されたが、抵抗性細胞の抗原陽性率は1%から2%であった。また、BK3の約85%がμ鎖およびウイルス吸着陽性であったのに対し、抵抗性細胞は、大部分がウイルス吸着およびμ鎖陰性であった。4.野鳥血清を用い、IBDV血清型1および2に対する抗体調査を行った。血清型1および2に対する中和抗体が広い鳥種から検出され、IBDVが広い宿主域を持つことおよび多くの野鳥がIBDVに感受性であることが示唆された。5. IBDV弱毒生ワクチンの253番目のアミノ酸が鶏継代によってHis->Gln、鶏胚線維芽細胞継代でGln->Hisに置換することが明らかになり、このアミノ酸がウイルスの病原性、標的細胞との相互関係および増殖に重要な役割を担っている可能性が示唆された。また、ウイルスは主として細胞表面にIgM(SIgM)分子を持つ細胞に吸着するが、吸着は抗IgM抗体により阻止されず、ウイルスの吸着にSIgM分子が直接には関与していないことが示唆された。2.IBDVに高度に感受性のLSCC-BK3細胞をSDS-PAGEにより分画し、ビオチン標識したIBDVとの反応を解析した。分子量約110,76および50kDaの分子にビオチン化ウイルスとの反応が認められた。この反応は、抗IBDV中和抗体により阻止され、IBDVに特異的である可能性が推察された。現在、IBDVと親和性のあるこれらの分子について精製を行うと共に、抗体の作出を進めている。3.抗レセプターモノクローナル抗体の作出を目的としてLSCC-BK3細胞による免疫を行っている。これまでにLSCC-BK3細胞に反応するモノクローナル抗体9種を確立した。現在、これらモノクローナル抗体のウイルス感染阻止活性について詳細な検討を行っている。4.レセプター分子のクローニングを目的としてLSCC-BK3細胞のmRNAから発現ライブラリーを作出した。現在、レセプター分子発現クローンのスクリーニング作業を進めている。