hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SLEモデルマウスにおけるYaa遺伝子変異によるマージナルゾーンB細胞の分化異常

全身性エリテマトーデス(SLE)モデルマウスの一つである、BXSBマウスは、755(Y-linked autoimmune acceleration)遺伝子がその発症機序に重要であることが知られている。Yaa遺伝子を導入したC57BL/6マウスにおいて認める、脾臓のマージナルゾーン(MZ)B細胞の減少に補体(C3)がどの様に関与しているかを調べる目的でC3ノックアウトマウスに指∂遺伝子を導入したマウスを作製し、Yaaマウス、C57BL/6マウスと比較した。MZB細胞の解析の結果、C3-/-YaaマウスはややMZ B細胞の比率を上げる作用を及ぼしたものの、C57BL/6 YaaマウスのMZB細胞の比率と有意な差は認めなかった。このことはYaaマウスにおける抗原抗体反応に伴うMZ B細胞の形成には、補体の役割はわずかであり補体以外の役割が大きいと考えられた。LPSやCpGをC57BL/6マウスとC57BL/6fa5マウスに投与した際の肺臓の濾胞(FO)B細胞及び、MZ B細胞の反応を調べることで様々な刺激による反応性の違いをYaaマウスとC57BL/6マウスで比較した。1回のCpGの投与によりC57BL/6YaaマウスにおいてMZ B細胞は減少する傾向がみられたが、1回のLPS投与ではC57BL/6マウス、C57BL/6Yaaマウス共にMZB細胞に特に影響を与えなかった。繰り返し投与することでそれぞれの反応性の違いがみられることが考えられ、研究を継続している。今回、LPS刺激に関わるRP105欠損マウス、ハプテンであるNPに反応性を有するQMマウスにYaaを導入することで、より詳細に特定の抗原に対するMZ B細胞の役割とYaa遺伝子との関係を調べることが可能となるため実験を継続中である。全身性エリテマトーデス(SLE)モデルマウスの一つである、BXSBマウスは、Yaa(Y-linked autoimmune acceleration)遺伝子がその発症機序に重要であることが知られている。Yaa遺伝子を導入したC57BL/6マウスにおいて認める、脾臓のマージナルゾーンB細胞の減少に補体(C3)がどの様に関与しているかを調べる目的でC3ノックアウトマウスにYaa遺伝子を導入したマウスを作成し、C57BL/6 Yaaマウス、C57BL/6マウスと比較した。更にリンパ節の胚中心の形成に重要であるCD40をノックアウトしたマウスにYaaを導入した際のマージナルゾーンB細胞の形成について解析した。また脾臓においてマージナルゾーンB細胞が、形質細胞に分化するかを調べるために、免疫病理学的手法を用いて解析した。近年特に生体内での免疫応答に重要なレセプターとして注目されているToll様受容体(TLR)のリガンドである、LPSやCpGをYaaマウスに投与した際の脾臓のマージナルゾーンB細胞について解析した。これらの内容は、軽井沢のリウマチフォーラムにおいて、「SLEモデルマウスにおけるYaa遺伝子変異によるマージナルゾーンB細胞の分化異常」というタイトルで、発表した。また、脾臓のマージナルゾーンB細胞と同じく、生体内での単球・マクロファージは、脾臓のマージナル洞において免疫応答の第一線を担う重要な鍵となる。単球/マクロファージとYaa遺伝子の関係について臨床免疫学会、アメリカリウマチ学会で発表した。
研究者間の創造的連携を支援する視覚的対話プログラムの開発

本研究は、高度な専門性を持ち、専門領域を超えたコミュニケーションが難しい理系研究者を対象として、領域横断的な研究を進めるための視覚的対話のワークショップのプログラムを開発することを目的とする。このプログラムは、研究者自らが複雑な研究を図解し、図解されたものを用いて対話し、動かし合いを通して、創造的に連携点を見つけ出すことを特徴とする。研究の実施にあたっては、1.視覚的対話の手法の研究者に対する調査、2.WSの実施と分析による創造的連携の理論モデルの構築とツールの開発。3.プログラムの改善とツールと手法の公開の3つを中心に進める。
ホタテ貝炭酸カルシウム・ゼラチン複合体骨補填材の開発

0.03mol、0.05mol、0.1molホタテ貝炭酸カルシウム(CCSS)含有のゼラチン複合体を作製し、各々の複合体を検討した。1%グルタールアルデヒド添加0.1molCCSS含有複合体が生体材料として有効であった。骨形成能確認のため動物実験を行なった。PDGF-BB(成長因子)を複合体に滴下し、背部皮下に移植した。骨の形成は観察されなかったが、組織侵入が旺盛であった。この結果から、PDGF-BBは組織の早期修復に有効であった。細胞を導入した複合体移植実験では、新生骨の形成が観察された。ホタテ貝炭酸カルシウム・ゼラチン複合体(以下、複合体)を作製し、ラット(ウィスター系)頭頂部に埋入し2, 4週後に観察をなった。コントロールとして、骨膜を剥いで戻したをも観察した。はじめに、PDGF無添加において、行なった。その結果、PDGF無添加にて骨の形成が起こっていた。このことは、成長因子を添加しない複合体でも骨を誘導できることを証明した。また、コントロール群では、骨の形成は見られなかった。これは、骨膜を剥いで戻しただけのものでは、骨の形成が起こらなく、骨を新たに形成させるには、骨と膜とのにスペースが必要であることを示している。PDGF添加においても、良好な骨形成が観察された。頭頂骨埋入では、骨膜反応性の骨形成がほとんどであると考えられる。骨芽細胞が並んでいるのが観察されたことから、新生骨でると判断される。ラット頭頂骨におけるオンレイグラフトモデルでは、複合体の有用性が期待された。しかしながら、ウサギ大腿骨骨端で埋入では、PDGF無添加群では、骨形成が観察されず、PDGF添加群では、期待したほどの骨の形成が観察されなかった。このことから、以下のことが推察される。・骨膜が細胞および血液の供給源であるため、新生骨形成には必須である。・骨端軟骨部では、血液供給および細胞供給が少ないため骨の形成が期待できない。・ドリルホール上のような一部の骨膜のみからでは、骨形成が期待できない。・ドリルホール周囲の軟骨では、骨形成を起こす細胞数が少ない。・複合に細胞を導入することで、より早く骨形成が行なえ、軟骨部における骨形成にも応用し、骨形成に不利とされている部での応用が期待できる。以上のことが結論付けられた。このため、来年度は、もう一度本年の追試を行なうとともに、細胞を導入し検証する。本年度における研究実施では、ゼラチン以外にサケコラーゲンとホタテ貝炭酸カルシウムを用い、ウィスター系ラット頭頂骨移植にて骨形成を検証した。その結果、良好な骨形成を確認した。また、PDGF-BBを用いたゼラチンスポンジをテフロンチューブに入れて背部皮下移植実験では、組織修復において良好な組織侵入をチューブの断端より確認したことにより、PDGF-BBは、早期組織治癒および組織修復に有効に利用できるものであることが判明した。また、ゼラチン・ホタテ貝炭酸カルシウム複合体を用いての同様の実験では、組織修復のみであり、骨の形成は確認されなかった。これは、PDGF-BBが皮下におけるレセプターの関係であると推察される。つまり、皮下における移植では、線維芽細胞に働き、骨を誘導する因子ではないことが考えられる。しかしながら、頭頂骨移植にては、骨形成を観察されたことを考えると、移植部つまり、場の問題であることが再度確認できた。ヌードマウスにおける、細胞導入した複合体移植実験では、骨の形成が確認された。導入された細胞は、すでに骨系に分化させた細胞であるため、骨の形成を確認できたと考える。これらの結果から考えると、細胞は細胞のいる場により、分化誘導がなされ、骨などへ誘導させたい細胞への分化は、骨誘導性タンパク(BMP)-2により背部皮下にて骨形成を確認した田崎ら(日本口腔インプラント学会誌、20-3、423-432、2007)の報告とを考え合わせると、成長因子とその濃度を局所的に上昇させることと、分化誘導の場を設けることにあると考える。本研究における骨補填材の有効性は、異所性に骨を形成する能力はないものの、骨存在下において骨の形成を確認できたことにより、有効性を実証した。
マルチスケール電磁アプローチによるニッケル基合金の材料劣化の評価

ニッケル基合金は、火力・原子力発電所等における高温環境下にて多用される重要な材料であるため、その応力腐食割れ対策は非常に重要な課題であり、その一因である鋭敏化を定量的に非破壊で評価する手法の確立が求められている。本研究は、磁気特性は材料のマイクロストラクチャーに対して敏感であることに着目し、電磁気的な手法に基づくニッケル基合金の鋭敏化の定量的な評価手法を確立する。このために、以下のとおり、材料劣化の微視的な組織及び磁化の観察と巨視的な磁気測定を組み合わせ議論を行った。(1)鋭敏化度の異なるニッケル基合金(インコネル600)熱処理材を作製し、磁気力顕微鏡を用いた微視的な磁気特性評価を行った。その結果、結晶粒界における磁化と推定とクロム濃度欠乏層とが相関することを見出した。また、鋭敏化によりニッケル基合金の磁化曲線の形状が変化するが、この形状について微視的観察結果に基づいてモデル化を行った。(2)鋭敏化に伴う結晶粒界におけるミクロな磁気的変化と、交流磁化法、渦電流法における信号との間の関係を議論した。さらに、(1)で得られた磁気モデルに基づく電磁場有限要素解析と実験結果を比較することにより、渦電流法及び交流磁化法における信号と磁気特性との関係を定量的に議論し、鋭敏化度を信号値から推定する手法を提案した。本研究における上記の(1)と(2)の実績から、電磁非破壊評価手法によりニッケル基合金の鋭敏化度を評価する新しい手法が確立されたといえる。ニッケル基合金は、火力・原子力発電所等における高温環境下にて多用される重要な材料であるため、その応力腐食割れ対策は非常に重要な課題であり、その一因である鋭敏化を定量的に評価する手法の確立が求められている。本研究では、磁気特性は材料のマイクロストラクチャーに対して敏感であることに着目し、電磁気的な手法に基づくニッケル基合金の鋭敏化の定量的な評価手法を確立することを目標とする。最終的には、材料劣化の微視的な組織及び磁化の観察と巨視的な磁気測定を組合せた議論を行い、新しい方法論を確立する。平成16年度は、下記の2項目について研究を実施した。(1)鋭敏化処理条件を変えた複数のニッケル基合金試験片に対して、磁気力顕微鏡観察による磁化分布観察、SEM観察による結晶粒の観察、EDXによる結晶粒界近傍のクロム濃度分析を行い、結晶粒界、磁区の特性量を抽出した。次年度に、これらの結果に基づいて微視的な特性量を考慮した修正Jiles-Atherton(J-A)モデルに基づいて磁気ヒステリシス曲線について議論する予定である。(2)鋭敏化処理条件を変えた複数のニッケル基合金試験片に対して、インピーダンスアナライザを用いて渦電流法により評価を行い、渦電流信号と鋭敏化との相関があることを確認した。また、巨視的な磁気特性と導電率を測定し、渦電流信号との整合性を議論した。次年度に、この結果と本研究で構築する磁気モデルとの整合性を検討する。
憲法秩序の領域分化をめぐる法的論証作法の日独比較

本研究は、個別の憲法各論的分野にきめ細かく憲法上の原理原則を応用することが可能となっているドイツと、そうなっているとはいいがたい日本とを比較し、かつその差異の原因がドイツでの法教義学に由来する連邦憲法裁判所の「基準定立」にあり、その結果、ドイツでは各論に広く憲法原理が影響を及ぼし得ている、ということの解明を目指す。具体的には、(a)民法財産法、(b)環境法、(c)警察法(個人情報収集との関連)、(d)社会保障法、(e)統治機構を取り上げ、各領域のドイツ憲法判例の類型化とそこで確立されている「基準定立」につき、ドイツ憲法学のどのような伝統的解釈に由来する原理原則の具体化であるのかを考察する。
吸入性粒子状物質によるアレルギー性炎症の発症機序の解析

アレルギー性疾患の増加は社会問題の一つとなっており、その原因の解明と効果的な治療法の開発が急務とされている。アレルギー性疾患の要因として、微小粒子状物質の関与が示唆されており、PM2.5などが健康被害を引き起こすとしてその影響が懸念されている。我々は粒子状物質としてアルミニウム塩やシリカを肺に注入することによって引き起こされるアレルギー性炎症モデルを作成した。このモデルでは抗原特異的なIgEが誘導されるが、その反応はMyD88依存性であり、さらにIL-1受容体やIL-1aの欠損マウスではIgEの誘導が低いことを認めた。IL-1aは主に肺胞マクロファージの細胞死によって誘導されていた。アレルギー性疾患の増加の要因として生活環境における化学物質の増加などが考えられており、特に産業の発達とともに産出されてきた様々な微小粒子状化学物質のアレルギー性疾患への関与が示唆されている。最近では微小粒子状物質の一つであるPM2.5が健康被害を引き起こすとしてその影響が懸念されている。粒子状物質はアレルゲンとは異なり、それ自身は抗原とはならない。しかしながら粒子状物質を抗原とともに感作することで、その抗原に対する免疫応答を増強させるアジュバント効果を有することが知られている。興味深いことに、粒子状物質の多くがアレルギー反応の原因となるTh2型免疫反応を誘導することが報告されており、粒子状物質によるTh2アジュバント効果と近年のアレルギー性疾患の増加との関連が示唆されている。しかしながら、粒子状物質がどのような機構で免疫反応を活性化し、Th2型免疫反応を誘導するかについては明らかにされていない。本年度では、粒子状物質であるアルミニウム塩やシリカ、酸化ニッケル粒子をマウスの肺に注入することで誘発されるアレルギー性炎症についてin viviを中心に解析を行った。粒子を気管内注入し、抗原を曝露することで多量の抗原特異的なIgEが誘導された。種々の遺伝子欠損マウスでの解析の結果、この現象にはpro-allergic cytokineであるIL-33やTSLPは関与しておらず、IgEの誘導はMyD88依存性であった。粒子の肺への注入により、ダメージ関連分子パターン(DAMPs)として宿主のDNAやIL-1αが誘導され、これらがそれぞれ肺の炎症やIgE産生誘導に関与していた。これらの結果から、粒子状物質によって肺において誘導されるDAMPsがTh2型免疫応答の活性化やIgEの誘導に関与していることが示唆された。本研究課題は自然免疫の活性化を基盤に粒子状物質によるTh2型免疫反応の誘導機構を解明することを目的としている。我々はこれまで、結晶質シリカやアルミニウム塩のような粒子状物質がマクロファージを刺激し、炎症性因子であるIL-1βおよびプロスタグランジンE2(PGE2)を誘導すること、さらにPGE2がIgEの誘導に関与することを報告してきた。そこで24年度は粒子状物質によるマクロファージの活性化とPGE2誘導に関与するシグナル伝達経路に焦点をおき、主にin vitroにて解析を行った。結晶質シリカやアルミニウム塩は細胞内炎症シグナル複合体であるインフラマソームを活性化し、IL-1βを誘導することが知られているが、インフラマソームを欠損したマウス由来のマクロファージにおいてもシリカやアルミニウム塩によるPGE2産生が認められた。種々のシグナル伝達阻害剤を用いてPGE2誘導に関するシグナル伝達経路を解析したところ、Sykの阻害剤によりPGE2産生が強く抑制された。同様の結果がsiRNAを用いたSykのノックダウンにおいても認められた。さらに他の脂質メディエーターであるPGD2やロイコトリエンの産生もシリカやアルミニウム塩の刺激によりマクロファージから誘導されたが、これらの産生もSykの阻害により抑制された。これらの結果から、粒子状物質による脂質メディエーターの産生誘導にはSykが重要な役割を演じていると考えられ、粒子状物質により引き起こされる炎症反応においてSyk阻害剤が有用であることが示唆された。アレルギー性疾患の要因として、微小粒子状物質の関与が示唆されており、最近ではPM2.5が健康被害を引き起こすとしてその影響が懸念されている。一般に粒子状物質は免疫反応を増強させるアジュバントとして働き、アレルゲンに対する感作性を増強させると考えられている。興味深いことに、粒子状物質はTh2型免疫反応を活性化しやすいことが知られており、粒子状物質によるTh2アジュバント効果と近年のアレルギー性疾患の増加との関連が示唆されている。しかしながらそのメカニズムは詳細には明らかにされていない。

昨年度まで、我々は粒子状物質としてアルミニウム塩やシリカを用い、これらを肺に注入することによって引き起こされるアレルギー性炎症モデルを作成した。このモデルでは抗原特異的なIgEが誘導されるが、その反応はpro-allergic cytokineであるTSLPやIL-33は関与しないことを認めた。興味深いことにこの反応はMyD88依存性であり、IgE誘導因子としてダメージ関連分子パターン(DAMPs)である宿主のDNAやIL-1aの関与の可能性を認めた。本年度はさらに詳細にメカニズムを解析し、IL-1受容体やIL-1aの欠損マウスではIgEの誘導が低いことを認めた。一方、宿主のDNAに関しては肺での炎症にはほとんど関与しなかった。IL-1aは粒子の肺への投与後により長期間(2週間)誘導された。その産生細胞は主に肺胞マクロファージであり、細胞死によって誘導されていることが明らかになった。免疫学本年度の課題であるin vivoの解析を立ち上げることができ、さらに遺伝子欠損マウスでの実験結果により、粒子によって誘導されるアレルギー性炎症の原因因子を特定することができた。このことは当初の計画以上に研究が進展していることを意味している。in vivoの解析は予定通り終了し、24年度後半には25年度の課題であるin vivoの解析へと進むことができた。25年度の計画にスムーズに移行することができたため、当初の予定以上に進行していると考えている。25年度はin vivoの実験系を立ち上げることに成功し、さらに粒子により誘導されるアレルギー性炎症を引き起こす原因因子を特定することができた。しかしながら、どのような機序でどのような機序でこれらの因子が産生されるのか、さらにこれらの因子がアレルギー性炎症の主要因子の一つであるIgEを誘導するメカニズムも明らかにされていない。26年度は、主にこれら原因因子の誘導機構やIgE産生に関与するメカニズムについて解析を行う予定である。実験手法としては、最近我々が確立した肺胞マクロファージや肺胞II型上皮細胞の培養系を用い、in vitroにて粒子に対する影響を解析する。その際に主にDNAの放出やIL-1αの産生に着目する。さらにそれらの誘導に関与するシグナル伝達経路についても検討する。25年度は当初の予定通りin vivoの解析を中心に行う。マウスの感作方法として、粒子状物質をOVA共に腹腔内投与(一般的な粒子状物質によるアジュバント活性の評価方法)、または粒子状物質を気管内注入にした後にOVAを曝露(吸入性粒子状物質とアレルゲンの吸入による感作モデル)の方法を用い、in vivoにおいてTh2型免疫反応(アレルギー性炎症)を誘導する。これらの方法において、アルミニウム塩またはシリカをアジュバントとすることでOVA特異的なIgEが増強され、肺の炎症が生じることを予備的実験において既に確認している。
がんの化学予防における安全性の検討 : 抗酸化物質によるヒト遺伝子損傷

がんの化学予防に用いられることの多い抗酸化物質についてヒト遺伝子損傷性により安全性を評価した。種々の抗酸化物質を用いて単離DNAあるいは細胞内DNAに対する損傷性を検討した。ヒト培養細胞に抗酸化物質を添加し、一定時間後に細胞からDNAを抽出し、パルスフィールドゲル電気泳動法により細胞のDNA損傷性を検討した。その結果、ビタミンA、レチナール、α-トコフェロールおよびケルセチンでは細胞内DNA損傷が検出された。また、酸化的DNA損傷の指標である8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)生成量を電気化学検出器付HPLCにて定量したところ、細胞内8-OH-dG生成量はビタミンA、レチナールおよびN-アセチルシステインの添加で有意な増加が認められた。単離DNAに対するDNA損傷性の検討では、抗酸化物質と^<32>Pでラベルしたヒトがん抑制遺伝子p53のDNA断片と金属イオン存在下で反応させ、電気泳動を行いオートラジオグラムを得た。その結果、ビタミンA、レチナール、α-トコフェロール、ケルセチンおよびN-アセチルシステインは銅(II)イオン存在下で塩基特異性を有するDNA損傷を来すことが明らかとなった。このDNA損傷は,カタラーゼあるいは銅(I)イオンの特異的キレート剤であるバソキュプロインにより抑制されたことから、過酸化水素および銅(I)イオンの関与が考えられた。また、同様の実験条件で8-OH-dGの増加を確かめた。以上の結果より、抗酸化物質は酸化抑制作用のみならず、ある条件下では酸化促進作用を示し、DNA損傷性を有することが明らかとなった。これらの酸化的DNA損傷が発がん過程のイニシエーションとプロモーションに関与する可能性があり、抗酸化剤の予防的投与の危険性が示された。第一次予防の重要性に鑑み、安全性を十分検討した上で、がんの化学予防に抗酸化物質を適用することが望まれる。本研究の目的は、がんの化学予防に用いられることの多い抗酸化物質についてヒ卜遺伝子損傷性を検討し安全性を評価することである。がんの化学予防に用いられる抗酸化物質として、β-カロチン、ビタミンA、α-トコフェロール、セレン化合物、尿酸、イソチオシアネート類、等についてそのDNA損傷性を検討した。これらの抗酸化物質と、^<32>Pでラベルしたヒトがん抑制遺伝子p53のDNA断片を金属イオンやNADHなど内因性物質の存在下で反応させ、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行いオートラジオグラムを得た。その結果、これらの抗酸化物質は銅イオン(II)存在下で塩基特異性を有するDNA損傷を来すことが明らかとなった。このDNA損傷は、カタラーゼあるいはバソキュプロインにより抑制されたことから、過酸化水素および銅イオン(I)の関与が考えられた。また、calf thymus DNAと抗酸化物質を上記と同様の条件で反応させ、酸化的DNA損傷の指標である8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)生成量を電気化学検出器付HPLCにて測定した結果、8-OH-dGの増加が確かめられた。さらに、ヒト培養細胞(HL60)に抗酸化物質を添加し、一定時間後に細胞からDNAを抽出し、8-OH-dG生成量を測定をしたところ、ビタミンA、α-トコフェロール等の添加で有意な増加が認められた。また、パルスフィールドゲル電気泳動法により、同様に培養した細胞の巨大DNA断片を検出した。以上の結果より、抗酸化物質が酸化抑制作用のみならず、酸化促進作用をも併せもち、過剰の抗酸化物質はDNA損傷性を有することが明らかとなった。今後、さらに抗酸化物質がどのような条件で酸化促進作用を示すのかを解明し、抗酸化物質のがんの化学予防への安全な利用方法について検討する。

がんの化学予防に用いられることの多い抗酸化物質についてヒト遺伝子損傷性を検討し安全性を評価した。抗酸化物質として、β-カロチン、ビタミンA類、α-トコフェロール、フラボノイド、尿酸、イソチオシアネート類およびN-アセチルシステインを用いて単離DNAあるいは細胞内DNAに対する損傷性を検討した。これらの抗酸化物質と、^<32>Pでラベルしたヒトがん抑制遺伝子p53のDNA断片と金属イオン存在下で反応させ、電気泳動を行いオートラジオグラムを得た。その結果、これらの抗酸化物質は銅(II)イオン存在下で塩基特異性を有するDNA損傷を来すことが明らかとなった。このDNA損傷は、カタラーゼあるいは銅(I)イオンの特異的キレート剤であるバソキュプロインにより抑制されたことから、過酸化水素および銅(I)イオンの関与が考えられた。また、酸化的DNA損傷の指標である8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)生成量を電気化学検出器付HPLCにて定量し、8-OH-dGの増加を確かめた。さらに、ヒト培養細胞にこれらを添加し、一定時間後に細胞からDNAを抽出し.、パルスフィールドゲル電気泳動法により細胞のDNA損傷性を検討した。その結果、ビタミンA、レチナール、α-トコフェロールおよびケルセチンでは細胞内DNA損傷が検出された。また、細胞内8-OH-dG生成量を測定をしたところ、ビタミンA、レチナールおよびN-アセチルシステインの添加ではコントロールに比べ、有意な増加が認められた。以上の結果より、抗酸化物質は酸化抑制作用のみならず、ある条件下では酸化促進作用を示し、DNA損傷性を有することが明らかとなった。これらの酸化的DNA損傷が発がん過程のイニシエーションとプロモーションに関与する可能性があり、抗酸化剤の予防的投与の危険性が示された。
フオトクロミック分子を抗原とする免疫応答の光制御技術の開発

抗体やT細胞レセプターの多様性の特徴を生かすと、光で形を変える分子(フォトクロミック分子)を抗原とする免疫応答システムが確立できると考えられる。また、それらの免疫応答システムは光制御が可能である。そこで、1)フォトクロミック分子(アゾベンゼン誘導体)に対するモノクローン抗体の調製を試み、アゾベンゼンを抗原(Glu-azoAla-Gly-Gly,azoAla=L-p-phenylazophenylalanine)とする数種類のモノクローン抗体の作製に成功した。次に、2)それらのモノクローン抗体を用いて、抗原抗体反応の追究とその光制御を行った。その結果、紫外光(360nm)と可視光(430nm)の照射により、抗体はアゾベンゼンペプチドのトランス型に結合し、シス型になると解離することが明らかになった。また、3)パルスレーザ光を用いて、抗原抗体反応の光制御のメカニズムを追究した。その結果、抗体の抗原結合部位の中で、抗原の光異性化反応が起こっていることが明らかになった。また、4)シス・トランスの異性化反応は数+ピコ秒以内に起こっていた。5)次に、アゾベンゼンを抗原とするヘルパーT細胞の調製に取り掛かり、アゾベンゼン誘導体を抗原とする、T細胞ハイブリドーマ株の樹立に成功した。6)それらのT細胞ハイブリドーマを用いて、T-B細胞間相互作用を画像処理法により追究した。その結果、T細胞ハイブリードマは抗原提示細胞とフォトクロミック抗原の存在下で活性化され、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇した。7)また、T細胞ハイブリドーマは抗原提示細胞との相互作用によりアポトーシスが誘導されることが明らかになった。そしてT細胞のアポトーシスを光制御できることを明らかにした。8)これらの成果を集約し、フォトクロミック分子による免疫応答の光制御技術を確立した。T細胞レセプターや抗体は自然がかつて生み出した如何なる蛋白質も及ばない構造の多様性をもっている。その特徴は、一言でいえば、未知の構造に対する無限の多様性である。この多様性の特徴を生かせば、光で形を変える分子(フォトクロミック分子)を抗原とする免疫応答システムを確立できる。また、それらの免疫応答システムは光制御がかのうであると考えられる。そこで、本研究では、【.encircled1.】フォトクロミック分子(アゾベンゼン)に対するモノクローン抗体の作製を試み、アゾベンゼンを抗原とする数種類のモノクローン抗体の作製に成功した。次に、【.encircled2.】そのモノクローン抗体を用いて抗原抗体反応の光制御を行った。その結果、照射する光の波長により(紫外光(360nm)と可視光(430nm))、抗原と抗体の解離会合反応が誘導され、抗原抗体反応が光制御されたことを示すことができた。さらに、【.encircled3.】フォトクロミック分子を抗原とする免疫リポソームの作製に着手し、アゾベンゼンに対する抗体のFab-フラグメントを結合させた免疫リポソームの作製に成功した。また、【.encircled4.】蛍光偏光解消の実験から、それらの免疫リポソーム膜上のFab-フラグメントは、freeなIgGや、Fabフラグメントと比べて、Fab-部分の回転運動が著しく抑制されていることを示した。一方、【.encircled5.】フォトクロミック分子を抗原とするT細胞クローンの作製にも着手し、アゾベンゼン-L-チロシンを抗原とするヘルパーT細胞クローンの作製に成功した。また、【.encircled6.】

上記ヘルパーT細胞が、抗原特異的、MHC拘束性のもとで、抗原提示細胞に応答し、細胞内カルシウムシグナルを伝達することを画像処理法により明らかにすることができた。これらの確立したシステムや研究成果は、フォトクロミック分子を抗原とする免疫応答の光制御技術の開発研究に今後重大な寄与をなすものと判断できた。抗体やT細胞レセプターの多様性の特徴を生かすと、光で形を変える分子(フォトクロミック分子)を抗原とする免疫応答がシステム確立できると考えられる。また、それらの免疫応答システムは光制御が可能である。そこで、1)フォトクロミック分子(アゾベンゼン誘導体)に対するモノクローン抗体の調製を試み、アゾベンゼンを抗原(Glu-azoAla-Gly-Gly,azoAla=L-p-phenylazophenylalanine)とする数種類のモノクローン抗体の作製に成功した。次に、2)それらのモノクローン抗体を用いて、抗原抗体反応の追求とその光制御を行った。その結果、紫外光(360nm)と可視光(430nm)の照射により、抗体はアゾベンゼンペプチドのトランス型に結合し、シス型になると解離することが明らかになった。また、3)パルスレーザ光を用いて、抗原抗体反応の光制御のメカニズムを追求した。その結果、抗体の抗原結合部位の中で、抗原の光異性化反応が起こっていることが明らかになった。また、4)シス・トランスの異性化反応は数十ピコ秒以内に起こっていた。5)次に、アゾベンゼンを抗原とするヘルパーT細胞の調製に取り掛かり、アゾベンゼン誘導体を抗原とする、T細胞ハイブリドーマ株の樹立に成功した。6)それらのT細胞ハイブリドーマを用いて、T-B細胞間相互作用を画像処理法により追求した。その結果、T細胞ハリブリド-マは抗原提示細胞とフォトクロミック抗原の存在下で活性化され、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇した。7)また、T細胞ハイブリドーマは抗原提示細胞との相互作用によりアポトーシスが誘導されることが明らかになった。そして、T細胞のアポトーシスを光制御できることを明らかにした。8)これらの成果を集約し、フォトクロミック分子による免疫応答の光制御技術を確立した。
In vitro-ABCトランスポーター輸送系を用いた薬物脳移行性予測法の構築

薬物の脳内濃度を決定する血液脳関門のトランスポーター活性の予測法の開発は、創薬・臨床研究における永年の課題である。昨年度までに、脳関門で薬物の脳移行を最も制御しているMDR1の輸送活性を、in vitroで計測したMDR1の単分子あたりの薬物輸送活性と脳関門における絶対発現量の統合によって、in vitroから予測できることをマウスをモデルとして実証した。そこで、本年度は、本課題の最終段階として、この予測されたMDR1の輸送活性と、脳関門における薬物の受動拡散速度を統合することによって、薬物の脳移行量(脳内濃度)を予測する基盤を構築することを目的とした。受動拡散速度は、血漿中と脳内の蛋白非結合型薬物の濃度比によって決定されると考え、12種のMDR1基質のマウス血漿中および脳内非結合型分率を計測し、その比率を取ることによって受動拡散速度を得た。この受動拡散速度とすでに得られているMDR1の輸送活性の予測値を統合することによって、薬物の脳移行量を表す脳内対血漿中薬物濃度比(K_<p brain>)を12基質について予測した。その結果、12基質中9基質において、K_<p brain>の予測値はマウスin vivo解析で測定された実測値と3倍以内の範囲で一致した。従って、MDR1基質薬物の脳移行量をin vitro実験系から良好に予測できることをマウスを用いて実証することに成功した。以上のことから、本課題の目的が達成された。他の3基質については、BCRPなどの他のトランスポーターによって輸送されるため、K_<p brain>の予測値が実測値と一致しなかったことが示唆された。我々は、ヒトの脳毛細血管において、MDR1と同程度にBCRPが高発現していることを明らかにした。従って、今後、全薬物の脳移行量を精度よく予測するために、BCRPについても、脳関門における輸送機能をin vitroから予測する基盤の構築に取り組む予定である。我々はトランスポーターのタンパク質絶対発現量を測定する技術を開発した。そこで、本年度は、薬物の脳移行を最も制御しているMDR1に焦点を絞り、発現量情報に基づいてin vitro系からin vivo脳関門のMDR1輸送機能を予測できるか否かを明らかにすることを目的とした。mouse MDR1(mdr1a)安定発現LLC-PK1(L-mdr1a)および親株LLC-PK1細胞を用いて12化合物のMDR1輸送基質の経細胞輸送速度を計測し、両細胞の経細胞輸送速度の比率を算出することによってmdr1a輸送活性を求めた。また、LC-MS/MSを用いてL-mdr1a細胞におけるmdr1aタンパク質絶対発現置は15fmol/μg proteinであることを明らかにした。各基質のmdr1a輸送活性値を15fmol/μg proteinで除することによってmdr1a単分子あたりの輸送活性を解明し、この単分子輸送活性値とマウス脳関門におけるmdr1a発現量(14fmol/μg protein)を統合することによって、in vivo脳関門のmdr1aの輸送活性を表すK_<p brain> ratio(定義;wild-type mouseとmdr1a knockout mouseの脳内対血漿中濃度比の比率)を予測した。その結果、すべての化合物においてK_<pbrain>ratioの予測値は、±2,7倍の範囲内で実測値と一致した。従って、発現量情報に基づいてin vitro系からin vivo脳関門のMDR1輸送機能を予測できることがマウスをモデルとして証明された。本法をヒトに適応することで初めてヒトにおいてMDR1基質薬物の脳内濃度の予測が可能となる。
嚢胞状卵胞の形成メカニズム:単一卵胞培養系を用いた解析

アンドロゲン投与による単位卵胞あたりの変化を分子生物学的に解析するため、単一卵胞培養系を確立し、単一卵胞あたりのアンドロゲンの影響を解析した。その結果、アンドロゲン添加により卵胞生存率の低下、卵母細胞の形態異常と成熟率の減少が確認された。さらにアンドロゲン添加培養した卵母細胞では染色体が赤道上に集まらず紡錘糸が確認できなかったことにより、過剰なアンドロステンジオンが紡錘体形成に異常を起こすことが判明した。アンドロゲンとしてDHEA,、testosterone、androstenedioneの3種を7,10,15,20日間連日投与しモデルラットを作成した。アンドロゲン投与により性周期は停止し、卵巣組織は嚢胞状に変化することが判明した。アンドロゲン投与終了後は性周期および卵巣組織形態は自然に回復した。この結果と従来の報告から卵胞の嚢胞形成機構は「アンドロゲンの直接作用による卵子の変性→卵子からの黄体化抑制因子分泌の低下→顆粒膜細胞の早期黄体化→顆粒膜細胞のアポトーシス」からなるという仮説をたてた。この仮説の検証方法に一つとして、卵胞培養系を作成した。2週齢マウスの卵胞を用いて100150μmの二次卵胞をターゲットとし、oilfreeの96穴シャーレを用いた培養系を確立した。2日ごとに交換回収した培養液のestradiol値は培養期間と共に上昇したがprogesterone値は不変であった。胞状卵胞まで発育させた後、排卵刺激し成熟卵を得た。卵胞生存率は90%以上、卵子成熟率は80%以上であり、この卵胞培養系を用いてアンドロゲン添加実験を行なった。アンドロゲン添加により濃度依存的に生存率と成熟率が低下した。アンドロゲン添加により卵胞形態の様々な変化と卵細胞の変形が認められた。卵子由来のGDF-9発現量はアンドロゲン投与により卵胞初期で低下、胞状卵胞以降で急激に増加した。卵細胞のクロマチンの集合形態もアンドロゲンにより変化することが判明した。また電子顕微鏡により顆粒膜細胞の細胞内小器官の黄体化に似た変化をしていることが確認された。卵胞培養系において卵胞の嚢胞状変化は観察されなかったが、卵胞を構成している顆粒膜細胞は黄体化している可能性が示された。アンドロゲンとしてDHEA、testosterone、androstenedioneの3種を7,10,15,20日間連日投与しモデルラットを作成した。2週齢マウスの卵胞を用いて100150μmの二次卵胞をターゲットとし、oil freeの96穴シャーレを用いた培養系を確立した。
福山型先天性筋ジストロフィー原因遺伝子単離と遺伝子診断

福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD)は,先天性筋ジストロフィーに,脳奇形を伴う常染色体性劣性遺伝疾患であり、日本に多く、悲惨な病気である。本研究では、1.本症の病態解明へむけて、第9番染色体長腕31のごく狭い領域に絞りこまれたFCMD原因遺伝子を単離することと、2.この領域に存在するマーカーを使って、本症家系での出生前診断、発症前診断、保因者診断を行うことを目的として、以下のことを明らかにした。1.FCMD遺伝子領域内に存在する9q31のマーカー、mfd220との間に連鎖不平衡を見い出し、FCMD遺伝子をこのマーカーの近辺、約1Mb以内に追い込み、さらにmfd220を含むYACコンティグを作成。2.連鎖不平衡マッピングによりFCMD遺伝子はD9S2107を含んだ約100kb以下の領域に存在する可能性を報告し、この周辺のコスミドコンティグとEcoRI制限地図を作製。3.新たにE6、J7のマーカーを単離し、ハプロタイプを調べ、創始者ハプロタイプを示すFCMD染色体は80%、患者の95%がこのハプロタイプのホモまたはヘテロであった。以外にあと数本のFCMDハプロタイプが同定され、日本のFCMD変異は、数回起きた。創始者ハプロタイプを不完全に持つFCMD染色体の解析から、遺伝子はE6から動原体側のごく近い所に存在すると予想。4.さらにこの予想した所に、患者DNAのほとんどが約3kbの「挿入」を示すプローブを見い出した。一方、無関係な正常人では、この挿入は88人中1人にヘテロで認められたのみで、日本人のFCMD保因者頻度によく一致していた。この挿入はFCMDの原因自体に密接に関与している可能性があるとともに、診断にも使用できる。5.現在までに10数家系の出生前診断を行い、全例正診である。その他数十家系の遺伝子診断を行った。もちろん遺伝子診断のガイドラインを満たしている。また出生前診断における胎児剖検例の検討から、FCMDの脳奇形はglia limitans-基底膜複合体の亀裂が一因。福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD)は,先天性筋ジストロフィーに,脳奇形を伴う常染色体性劣性遺伝疾患であり,日本に多く,悲惨な病気であるが,本態はほとんどわかっていない。申請者らは本症の遺伝子が第9番染色体長腕31-33領域に存続することを報告してきた。本研究では、1.本症の疾病解明へ向けて、第9番染色体長腕31のごく狭い領域に絞りこまれたFCMD原因遺伝子を単離することと、2.この領域に存在するマーカーを使って、本症家系での出生前診断、発症前診断、保因者診断を行うことを目的としている。当該年度は1.FCMD遺伝子領域内に存在する9q31のマーカー、mfd220との間に創始者効果を表わす連鎖不平衡を見い出し、FCMD遺伝子をこのマーカーの近辺、約1Mb以内に追い込んでいたが、さらにこのマーカーmfd220を含むYACコンティグを作成した。2.またFCMDは遺伝的孤立集団である日本人に特異的に頻度が高いことから、病気の創始者は一人と考え、フィンランドでのような連鎖不平衡マッピングを行った。

YACコンティグより独自に単離したマーカーを用いて、アレルタイプするとともに、YAC上での位置を決定した。結果、FCMDはマーカーJ12を含んだ約100kb以下の領域に存在すると考えられ、FCMD遺伝子の単離に高度に焦点をしぼることが可能になっている。3.現在までに7家系の出生前診断を行い、全例正診である。その他10数例の遺伝子診断を行った。もちろん遺伝子診断のガイドラインを満たしている。また出生前診断における胎児剖検例の検討から、FCMDの脳奇形はglia limitans-基底膜複合体の亀裂が一因になっていることが明らかになった。福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD)は,先天性筋ジストロフィーに,脳奇形を伴う常染色体制劣性遺伝疾患であり、日本に多く、悲惨な病気であるが、本態はほとんどわかっていない。申請者らは本症の遺伝子が第9番染色体長腕31-33領域に存在することを報告してきた。本研究では、1.本症の病態解明へむけて、第9番染色体長腕31のごく狭い領域に絞りこまれたFCMD原因遺伝子を単離することと、2.この領域に存在するマーカーを使って、本症家系での出生前診断、発症前診断、保因者診断を行うことを目的としている。当該年度は、1.連鎖不平衡マッピングによりFCMD遺伝子はD9S2107を含んだ約100kb以下の領域に存在する可能性を報告したが、今回この周辺のコスミドコンティグとEcoRI制限地図を作製した。2.新たにE6、J7のマーカーを単離し、D9S2105、D9S2107と組み合わせてハプロタイプを調べたところ、創始者ハプロタイプを示すFCMD染色体は80%、患者の95%がこのハプロタイプのホモまたはヘテロであった。それ以外にあと数本のFCMDハプロタイプが同定され、日本のFCMD変異は、数回起きたものと考えた。このハプロタイプは正常染色体には見い出されていない。創始者ハプロタイプを不完全に持つFCMD染色体の解析から、遺伝子はE6から動原体側のごく近い所に存在すると予想した。3.さらにこの予想した所に、患者DNAのほとんどが約3kbの「挿入」を示すプローブを見い出した。この挿入はFCMD染色体138本中120本(86%)に認められ、ハプロタイプによる創始者染色体に一致した。一方、無関係な正常人では、この挿入は88人中1人にヘテロで認められたのmiで、日本人のFCMD保因者頻度によく一致していた。この挿入はFCMDの原因自体に密接に関与している可能性があるとともに、診断にも使用できる。
DNA複製およびその進行制御におけるDNAポリメラーゼεの役割

DNAポリメラーゼε(Polε)は真核細胞のDNA複製におけるDNA鎖伸長そのものに関与することに加えて、ポリメラーゼ活性とは別の細胞増殖に必須の未知の機能を持つことや、S期チェックポイント制御機構での複製フォーク進行阻害のセンサーとしての役割を担うこと、さらには複製開始にも関与することが報告されている。本研究では、これらの重要な生理学的役割をPolεがどのような分子機構により果たしているのかを解明することを目的として、出芽酵母Polεの構造と機能について生化学的解析を行い、以下の新たな知見を得た。1.Pol2C-末ドメインおよびアクセサリーサブユニットDpb2,Dpb3,Dpb4の生化学的機能(1)PCNAに依存したPolεのDNA合成反応:4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)から成るPolεは、高塩濃度下でPCNAに依存したDNA合成を行うことが知られているが、これに対してPol2のポリメラーゼドメイン(C-末領域を欠く)のみではDNA合成活性は保持されているものの、PCNA依存性が非常に低いことを明らかにした。さらにこのPCNA依存性にDpb2が関わることを示唆する結果を得た。(2)PolεのDNA結合能:Polε複合体およびPol2のポリメラーゼドメインのDNA結合能をゲルシフト法を用いて解析した。その結果、Pol2C-末領域および(あるいは)アクセサリーサブユニットに依存する二本鎖DNA結合能を見出した。このDNA結合はDNA合成反応とは競合しない。2.Polεの個々のサブユニットの発現と精製細胞増殖に必須であるアクセサリーサブユニット、Dpb2をカイコ体内で発現させ、この精製を完了した。Dpb3、Dpb4についてもこれらをカイコ体内で発現させることに成功したが、Pol2については成功するに至らなかった。出芽酵母DNAポリメラーゼε(Pol ε)は鋳型DNAに極めて安定に結合するが、この状態で別の単鎖DNA分子を認識して鋳型DNAから急速に解離する性質を持っている。本研究の目的は、このssDNAdependentPolεdisplacementの分子機構とその生物学的意義を明らかにすることである。特に、S期のチェックポイント制御でのPolεの複製異常のセンサーとしての働きや複製開始制御におけるPolεの役割との関連に注目して研究を進めている。平成11年度は以下の項目について研究を行った。Polε複合体を構成する4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)の遺伝子を個別にバキュロウイルス多量生産系で発現させ、DPB2,DPB3,DPB4の遺伝子産物は十分に発現することを確認した。現在はDpb2の精製に取り組んでいる。また、出芽酵母細胞を大量培養して得られた菌体からPolε複合体およびPol2のN末端部分からなるp145タンパク質を精製し、それぞれ高純度の標品を新たに取得した。さらに、今後の生化学的解析に必要なPCNA、RF-C、RPAタンパク質についても同時に精製を進め、それぞれ多量に高純度標品を取得した。Pol ε鋳型DNAからの解離は単鎖DNAによって特異的に引き起こされるが、中でもある種の高次構造を持つものがより強い効果を示すことを見出した。現在はBiacoreの実験系を用いてPolεの鋳型DNAからの解離を引き起こすDNAの構造特異性を調査している。さらに、ゲルシフト法を用いて、これらの高次構造を持つDNA分子に対するPolεの結合特異性や親和性の解析を行っている。Polεの細胞内での役割を知る目的で、細胞増殖に必須で、このポリメラーゼに特異的に存在するPol2のC-末ドメインおよびアクセサリーサブユニット(Dpb2,Dpb3,Dpb4)の生化学的機能の解析を行った。平成12年度の成果は以下とおりである。

1.Polεの個々のサブユニットの発現と精製細胞増殖に必須であるアクセサリーサブユニット、Dpb2をカイコ体内で発現させ、この精製を完了した。Dpb3、Dpb4についてもこれらをカイコ体内で共発現させ、Dpb3-Dpb4複合体の精製に着手したが(2-(2)参照)、カイコ由来の他の蛋白質と大きな複合体を形成していたため精製が困難であった。現在大腸菌を用いた蛋白質発現系でDpb3-Dpb4の発現を試みている。2.Pol2C-末ドメインおよびアクセサリーサブユニットの生化学的機能(1)PCNAに依存したPolεのDNA合成反応:4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)から成るPolεは、ある条件下でPCNAに依存したDNA合成を行うことが知られているが、これに対してPol2のポリメラーゼドメイン(C-末領域を欠く)のみではDNA合成活性は保持されているものの、PCNA依存性が非常に低いことを明らかにした。さらにこのPCNA依存性にDpb2が関わることを示唆する結果を得た。(2)PolεのDNA結合能:Polε複合体およびPol2のポリメラーゼドメインのDNA結合能をゲルシフト法を用いて解析した。その結果、Pol2C-末領域および(あるいは)アクセサリーサブユニットに依拠するDNA結合活性として二本鎖DNA結合能を見出した。このDNA結合はDNA合成反応とは競合しない。さらに最近、ヒトのクロマチンリモデリング複合体の中にPolεのDpb3とDpb4様の蛋白質が含まれていることが示され、この解析により、Dpb3-Dpb4がこの二本鎖DNA結合に関わる可能性が示唆された。精製したDPb3-Dpb4を用いてこの点を検討したい。
亜鉛の特性を利用したフォスフォプロテオーム解析技術の開発

ヒトゲノム解析がほぼ完了した現在,それらがコードする様々なタンパク質の機能解析が次の研究ターゲットとなっている。特にタンパク質のリン酸化は,細胞内の様々な制御機構に関わる共通のメカニズムであり,リン酸化されたアミノ酸残基を同定することは,代謝経路や細胞内機能におけるリン酸化蛋白質の役割を知る上で不可欠である。本研究では,独自に合成したリン酸アニオン認識分子「フォスタグ」を用いたリン酸化分子の新しい分離分析法を開発した。代表的な方法は,1)リン酸アフィニティクロマトグラフィー法,2)リン酸化分子の選択的質量分析,3)フォスタグを結合した電気泳動ゲルを利用したリン酸化タンパク質のプロファイリング法,4)SNPタイピングによる遺伝子検査法,5)リン酸化タンパク質の網羅的ウエスタン解析法である。中でもリン酸化タンパク質のプロファイリング法は,リン酸化数やリン酸化部位の違いによりほぼ同じ分子量のリン酸化タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分離する画期的な分離分析法である。この方法は,これまでのリン酸化プロテオミクス研究を劇的に進展させるものと確信している。フォスタグを用いた遺伝子検査法は,末端にリン酸基をもつPCRプライマー(SNPタイプ1)とリン酸基を持たないもの(SNPタイプ2)を用意し,リン酸基のついているPCR産物をついていないもの(いずれも同じ塩基対数)から分離して検出する方法である。この方法により,ミニゲルクラスの電気泳動装置があれば,ほほ100%の検出感度でSNPタイピングが通常の実験室で数十のサンプルを一度に検査できる。本課題研究により,新しいリン酸化プロテオミクス研究技術を数多く開発することができた。今後,それらの技術が世界標準のリン酸化プロテオミクス技術となるようさらに研究開発を進めていく予定である。ヒトゲノム解析がほぼ完了した現在,それらがコードする様々な生体分子の機能解析が次の研究ターゲットとなっている。特に蛋白質のリン酸化は,細胞内の様々な制御機構に関わる共通のメカニズムであり,リン酸化されたアミノ酸残基を同定することは,代謝経路や細胞内機能におけるリン酸化蛋白質の役割を知る上で不可欠である。個々のリン酸化生体分子を特異的に捕捉する抗体を用いる方法とは異なり,本研究ではリン酸アニオン部分を認識する機能性分子(フォスフォプロテオーム解析試薬:フォスタグ)を用いた新しいリン酸化分子の分離分析法を開発する。「フォスタグ」の「フォス」はリン酸アニオン(フォスフェート)の頭文字を,「タグ」は標識を表している。本研究は,21世紀の蛋白質機能解析(プロテオーム)や細胞機能解析(セローム)研究の発展に大きく貢献するものと確信している。15年度は,リン酸化生体分子の分離・検出に適した様々な機能を付加した新規のフォスタグ(蛍光発色団やビオチンなどを結合させたもの,アガロースビーズに結合させたポリマーなど)を合成した。合成した化合物の溶液内平衡反応や溶解性などついて,分光分析,pH滴定法,電気泳動法などにより検討した。リン酸化蛋白質の二次元電気泳動法でのフォスタグの有用性(選択的な蛍光染色能)について調べた。その結果,Native-PAGE法を用いた場合リン酸化タンパク質を選択的に染色できることが明らかとなった。また,アガロースに結合させたフォスタグは,リン酸化ペプチドやタンパク質のアフィニティークロマト用ゲルとして利用可能であることも分かった。特に蛋白質のリン酸化は,細胞内の様々な制御機構に関わる共通のメカニズムであり,リン酸花されたアミノ酸残基を同定することは,代謝経路や細胞内機能におけるリン酸化蛋白質の役割を知る上で不可欠である。

個々のリン酸化生体分子を特異的に捕捉する抗体を用いる方法とは異なり,本研究ではリン酸アニオン部分を認識する機能性分子(フォスフォプロテオーム解析試薬:フォスタグ)を用いた新しいリン酸化分子の分離分析法を開発する。「フォスタグ」の「フォス」はリン酸アニオン(フォスフェート)の頭文字を,「タグ」は標識を表している。本研究は,21世紀の蛋白質機能解析(プロテオーム)や細胞機能解析(セローム)研究の発展に大きく貢献するものと確信している。15年度は,リン酸化生体分子の分離・検出に適した様々な機能を付加した新規のフォスタグ(蛍光発色団を結台させたもの,アガロースビーズに結合させたポリマーなど)を合成した。合成した化合物の溶液内平衡反応や溶解性などついて,分光分析,pH滴定法,電気泳動法などにより検討した。リン酸化蛋白質の二次元電気泳動法でのフォスタグの有用性(選択的な蛍光染色能)について調べた。その結果,Native-PAGE法を用いた場合リン酸化タンパク質を選択的に染色できることが明らかとなった。また,アガロースに結合させたフォスタグは,リン酸化ペプチドやタンパク質のアフィニティークロマト用ゲルとして利用可能であることも分かった。16年度は,電気泳動ゲルに利用可能なアクリルアミド-フォスタグとビオチン化-フォスタグを合成し,それらの利用法について検討した。ビオチン化フォスタグはSPR分析にやカラムクロマトグラフイーで使用可能なことが明らかとなった。ヒトゲノム解析がほぼ完了した現在,それらがコードする様々な蛋白質の機能解析が次の研究ターゲットとなっている。特に蛋白質のリン酸化は,細胞内の様々な制御機構に関わる共通のメカニズムであり,リン酸化されたアミノ酸残基を同定することは,代謝経路や細胞内機能におけるリン酸化蛋白質の役割を知る上で不可欠である。本研究では,独自に合成したリン酸アニオン認識分子「フォスタグ」を用いたリン酸化分子の新しい分離分析法を開発している。17年度は,ビオチン基やアクリルアミド基を結合したフォスタグを利用した実用的な二っの研究技術の開発に成功した。(1)ビオチン化フォスタグと化学発光酵素系,HRP-ストレプトアビジンを組み合わせて,ウエスタン解析による高感度なリン酸化蛋白質の発光検出法を検討した。その結果,放射性同位体リンを使用しないで,ナノモルレベルのリン酸化蛋白質を選択的に検出することができた。この方法は,高価で不安定な抗リン酸化抗体を持たなくてもよく,通常の実験室で行うことがき,セリン/スレオニンやチロシンのリン酸基をすべて検出できる画期的な検出法である。(2)アクリルアミド化フォスタグと通常のアクリルアミドを共重合させた電気泳動ゲルを用いたリン酸アフィニティーSDS電気泳動法を検討した。その結果,ほぼ同じ分子量のリン酸化蛋白質と非リン酸化蛋白質を効率良く分離して同時に定量検出することができた。この方法は,キナーゼやフォスファターゼの特異性を簡単かつ効率よく調べることを可能にする技術である。ヒトゲノム解析がほぼ完了した現在,それらがコードする様々なタンパク質の機能解析が次の研究ターゲットとなっている。