hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核酸四重鎖のトポロジーで支配される細胞内機能の解明と制御

本研究の目的は核酸四重鎖構造のトポロジーの細胞内での役割を物理化学的解析を通して理解することである。2018年度は四重鎖構造の複製反応に対する化学的要因について検討した。まず、グアニン四重鎖形成配列中のグアニン塩基が酸化された場合の影響を検討した。がん遺伝子と知られるVEGF遺伝子のプロモーター配列由来のグアニン四重鎖形成配列について、グアニン塩基の1つを8-oxoグアニンに置き換えたところ、四重鎖構造の不安定化と、トポロジーの変化が観察された。その結果、複製反応の阻害効果が大幅に低下した。さらに、リガンド分子による四重鎖の複製に対する化学的制御にも取り組んだ。前述の酸化したグアニン塩基を持つグアニン四重差に対し、グアニン四重鎖のリガンドであるピレンを5'末端に有する3塩基のグアニンが連続する人工核酸を添加したところ、酸化されたグアニン塩基と置き換わるように相互作用した。形成した四重鎖は、酸化されていない天然型と同等の安定性とトポロジーを示した。以上から、化学的要因によって四重鎖の安定性やトポロジーが変化する事で複製反応の制御機構が影響を受け、また人為的に化学制御できることを示すことに成功した。この成果は2018年度に論文発表し(Takahashi et al., JACS, 2018)、新聞記事として取りあげられた。さらに上記の人工核酸の効果をより詳細に検討することで、リガンドが相互作用する四重鎖の位置によっても四重鎖の複製阻害効果が異なることを見出した(Takahashi et al., Molecules, 2018)。これらの結果は、小分子化合物やタンパク質などが四重鎖のトポロジーに依存した相互作用を行うことで複製反応を制御していることを示唆しており、得られた知見は次年度以降行う小分子やタンパク質の影響に関する研究推進に役立てる。2018年度はリガンドを用いて四重鎖のトポロジーに依存する複製反応の化学的制御に関する研究を進め、論文発表することができた。小分子化合物やタンパク質による複製反応の影響の検討を始めており、研究が順調に進展している。2019年度は現在進めている特定の四重鎖構造を認識する低分子リガンドの探索と、その四重鎖トポロジーと複製反応に与える影響を引き続き解析する。四重鎖構造の安定性と複製効率の変化を指標に、特定の四重鎖トポロジーに結合するリガンドを探索する。低分子リガンドとしてナフタレンジイミド化合物をベースに検討する。様々な修飾を施したナフタレンジイミド化合物と四重鎖構造との相互作用を安定性、CDスペクトル解析、およびNMR解析によって評価する。これらの四重鎖構造に関するデータと複製反応の効率を定量的に比べることで、低分子リガンドによる四重鎖のトポロジー依存的な複製反応制御のメカニズムを解析する。H29年度は複製反応におけるDNA四重鎖構造の影響を定量的に調べる手法の開発と解析を行った。四重鎖構造の安定性はUVメルティング法で解析した。さらに複製反応については、鋳型核酸上に四重鎖を形成する配列を設計し、蛍光ラベルしたプライマーからの複製反応をKlenow Fragment DNA polymeraseを用いてその経時変化を電気泳動で解析した。その結果、四重鎖の熱安定性が高いほど複製反応を阻害する効果が強まった。その一方、四重鎖のトポロジーの違いによってその複製阻害効果は大きく異なった。特に、i-motif構造に対する複製反応への阻害効果が最も強いことが見出された。四重鎖構造の安定性と複製効率の定量的な解析の結果、各四重鎖構造に対する複製反応の活性化エネルギーが異なることが複製の四重鎖トポロジー依存性の原因であることが確認された。さらに同じDNA配列においても、分子クラウディング環境によってトポロジーが変化し、安定性と複製効率の相関性が変化することが明らかになった。これらの結果は、細胞内で様々に変化するクラウディング環境に応じて、遺伝子複製の異常や組換えが生じることを示唆する。したがって、四重鎖トポロジーの変化は複製異常を原因とするがん等の疾患の要因となる可能性がある。以上の成果をまとめ、論文発表することができた(S. Takahashi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 114, 9605-9610 (2018))。また、本アッセイ系の確立によって、四重鎖構造に相互作用する低分子化合物や核酸分子の影響を定量的に解析するプラットホームを構築することができた。H29年度は解析系の確立だけで無く、四重鎖構造のトポロジーが影響が複製反応を制御する要因であることを見出すことができた。また、研究内容を論文発表することもできた。現在、計画2年目に行う予定の四重鎖構造に相互作用する小分子化合物による複製反応の影響の検討を既に始めており、研究が順調に進展している。がん遺伝子と知られるVEGF遺伝子のプロモーター配列由来のグアニン

四重鎖形成配列について、グアニン塩基の1つを8-oxoグアニンに置き換えたところ、四重鎖構造の不安定化と、トポロジーの変化が観察された。その結果、複製反応の阻害効果が大幅に低下した。さらに、リガンド分子による四重鎖の複製に対する化学的制御にも取り組んだ。前述の酸化したグアニン塩基を持つグアニン四重差に対し、グアニン四重鎖のリガンドであるピレンを5'末端に有する3塩基のグアニンが連続する人工核酸を添加したところ、酸化されたグアニン塩基と置き換わるように相互作用した。形成した四重鎖は、酸化されていない天然型と同等の安定性とトポロジーを示した。以上から、化学的要因によって四重鎖の安定性やトポロジーが変化する事で複製反応の制御機構が影響を受け、また人為的に化学制御できることを示すことに成功した。この成果は2018年度に論文発表し(Takahashi et al., JACS, 2018)、新聞記事として取りあげられた。さらに上記の人工核酸の効果をより詳細に検討することで、リガンドが相互作用する四重鎖の位置によっても四重鎖の複製阻害効果が異なることを見出した(Takahashi et al., Molecules, 2018)。これらの結果は、小分子化合物やタンパク質などが四重鎖のトポロジーに依存した相互作用を行うことで複製反応を制御していることを示唆しており、得られた知見は次年度以降行う小分子やタンパク質の影響に関する研究推進に役立てる。2018年度はリガンドを用いて四重鎖のトポロジーに依存する複製反応の化学的制御に関する研究を進め、論文発表することができた。小分子化合物やタンパク質による複製反応の影響の検討を始めており、研究が順調に進展している。H30年度は特定の四重鎖構造を認識する低分子リガンドの探索と、その四重鎖トポロジーと複製反応に与える影響を解析する。四重鎖構造の安定性と複製効率の変化を指標に、特定の四重鎖トポロジーに結合するリガンドを探索する。例えばこれまでに報告されているリガンドの中で、テロメア配列のアンチパラレル型を誘起するThioflavin TやBMVC、パラレル型を誘起するN-Methyl mesoporphyrinなど様々な四重鎖結合リガンド存在下において安定性と複製効率を算出し、比較する。さらに、パラレル型のみを形成するVEGF遺伝子の四重鎖の複製効率と比較したり、種々の鋳型ライブラリーを用いた検討を行ったりすることで、各種リガンドが種々の四重鎖構造に対して安定性およびトポロジーにそれぞれどの程度影響を及ぼすか定量的に分類化する。四重鎖構造に関してはCD測定により随時確認する。2019年度は現在進めている特定の四重鎖構造を認識する低分子リガンドの探索と、その四重鎖トポロジーと複製反応に与える影響を引き続き解析する。低分子リガンドとしてナフタレンジイミド化合物をベースに検討する。様々な修飾を施したナフタレンジイミド化合物と四重鎖構造との相互作用を安定性、CDスペクトル解析、およびNMR解析によって評価する。これらの四重鎖構造に関するデータと複製反応の効率を定量的に比べることで、低分子リガンドによる四重鎖のトポロジー依存的な複製反応制御のメカニズムを解析する。
一般超幾何関数とモノドロミー保存変形による可積分系の大域的研究

特殊関数というよい性質を持つ関数の中でガウスの超幾何関数やパンルべ関数は微分方程式の解となる,積分表示をもつ,差分関係式を持つなどで特徴づけられる.これらを一般化し統一的な方法で記述して,その本質を明確にする研究を行った.これらを一般化した一般超幾何方程式(GHGS)と一般Schlesinger系(GSS)はともにグラスマン多様体上で定義された線形,非線形微分方程式系である.GSSの解の中で,GHGSの解で表現される解があるか,どのような形で表示されるかを,Shah & Woodhouseの結果を深めることによって調べた.その副産物として準古典直交多項式との関連を見出した.(1)量子パンルベ系の特殊解に付随するコホモロジー群の決定は,進展がなかった.量子パンルベ系はパンルベ系のハミルトニアンを正準量子化して得られるシュレディンガー方程式であるが,その系の位置変数に関する多項式解が存在し,この多項式解が,具体的にガウスの超幾何積分やその合流型超幾何積分の被積分関数を種とする多重積分で表わされることが知られている.これらの積分表示から,量子パンルベ系を逆に再構成できるか?,上記の(2,4)-グラスマン多様体上の超幾何関数であるガウスの超幾何や合流型超幾何を(2,n)-グラスマン多様体上の超幾何で置き換えて,それを種とする多重積分から量子ガルニエ系を決定することができるか?という問題を考察する予定であったが,そのためのステップである多項式解の積分表示に付随したコホモロジーを決定するという問題についてはほとんど新しい結果は得られなかった.(2) q-超幾何関数の量子群からの研究.古典的なガウスの超幾何方程式のq-類似であるハイネのq-超幾何方程式やガウスの超幾何関数の合流型方程式のq-類似については,大山陽介氏の結果がありq-差分方程式の分類がある.その解についてジャクソン積分による積分表示を与えたが,これらを量子群の視点から理解するべく研究した.古典的な場合に(2,4)-グラスマン多様体上の超幾何方程式として理解され,積分表示はGL(4)の極大可換部分群の指標のラドン変換として与えられる.この描像をq-超幾何の場合にも適用するために,量子グラスマン多様体の点によって決まる非可換な積分変数の一次式のべき関数の積分を定義し,それが,これまで青本等が研究していたq-超幾何積分を本質的に与えることが分かった.これは(2,n)-グラスマン多様体上の超幾何関数のq-類似に当たる.しかし,まだ合流型超幾何関数の同様の理解は得られていない.当初の本年度の研究計画では,(a)量子Painleve系の特殊解の積分表示におけるhomology群の決定.(b)GSSのTwistor理論からみたHamilton構造の決定とtau関数との関係を明確にする,の2つであった.(1)量子パンルベ系の特殊解を与える積分のホモロジー群の特徴付けについては進展がなかった.(2) Twistor理論による一般Schlesinger系(GSS)の導入,その対称性の記述について論文を発表した.これは,(2,n)-グラスマン多様体上の超幾何関数がGL(n)の正則元の中心化群Hとして得られる極大可換部分群(nの分割で決まる)によって定義されるが,GSSは一般化反自己双対YangMills方程式の解に対応するTwistor空間上の同じ群Hの作用に関して同変なベクトル束が存在するための条件として具体的に記述された.またGSSの対称性はHに関するワイル群の類似物によって記述された.(3)古典的なガウスの超幾何方程式のq-類似であるハイネのq-超幾何方程式やガウスの超幾何関数の合流型方程式のq-類似については,大山陽介によるq-差分方程式の分類がある.その解についてジャクソン積分により積分表示を与えたが,これらを量子群の視点から理解する研究した.ガウスの超幾何は古典的な場合に(2,4)-グラスマン多様体上の超幾何方程式として理解され,積分表示はGL(4)の対角行列からなる極大可換部分群の指標のラドン変換として与えられる.この描像をq-超幾何の場合にも適用するために,(2,n)量子グラスマン多様体の点によって決まる非可換な積分変数の一次式のべき関数を定義し,これへの量子群の作用を調べた.非可換版のラドン変換を構成することまではできなかった.(2,n)グラスマン多様体上の合流型超幾何関数のq-類似については,nの分割が1および2からなる場合に同様のことを示した.(1)量子パンルベ系の特殊解の研究とその一般化.量子パンルベ系は,パンルベ系のハミルトニアンを用いて正準量子化して得られるシュレディンガー方程式であるが,名古屋創氏はその系が位置変数に関する多項式解が,ガウスの超幾何積分やその合流型超幾何積分の被積分関数を種とする多重積分で表わされることを示した.名古屋氏との議論で,次の問題が重要であることが明確になった.上記の(2,4)-グラスマン多様体上の超幾何関であるガウスの超幾何や合流型超幾何を(2,n)-グラスマン多様体上の超幾何で置き換えて,それを種とする多重積分から量子ガルニエ系を決定することができるかという問題である.この問題の重要なステップは,多項式解の積分表示に付随した代数的コホモロジーを決定することがであるが,量子パンルベ2型に対する簡単な場合にそれを決定した.

量子ガルニエ系を合流型の場合まで決定することはできていない.(2)グラスマン多様体上の(合流型)超幾何方程式のrigidityの判定.解析的な常微分方程式において,その局所的なデータである特異点における特性指数たちから,大域的なデータである微分方程式そのものが決まるかという問題がrigidityの問題である.それを測る尺度がrigidity指数であるが,(3,6)-グラスマン多様体上の超幾何方程式系の場合に,合流しない場合と合流型のもっとも簡単な場合に対応するガウスマニン系を決定し,さらにその系を1次元直線に制限して得られる常微分方程式のrigidity指数を決定した.その結果,(3,6)-グラスマン多様体上の超幾何方程式系の直線への制限はrigidではないことが分かった.これは(2,n)-グラスマンの場合がrigidであることと状況が違うことを示している.平成26年度の研究課題は以下の2つであった.1.Riemann-Hilbert分解の手法を用いた一般Schlesinger系(GSS)の特殊解の構成の完成.Painleve方程式P_6についてはShahとWoodhouseの仕事がある.2.GSSに対するSchlesinger変換の構成およびHGFの隣接関係との関連を明確にする.gl(N)のHのLie環hによるroot空間分解との関連を明確にする.第1の課題については,GSSの解に対応するTwistor空間上のSL(2)-ベクトル束が直線束のextensionになっている場合に,その貼り合わせ関数をグラスマン多様体Gr(2,N)上の一般超幾何関数を用いて与え,Atiyah-Ward構成によりGSSの特殊解を構成したが,まだ一般超幾何関数におけるパラメータとGSSにおけるパラメータの具体的な対応は記述できていない.この特殊解の構成によって,古典的な直交多項式の重み関数をグラスマン多様体Gr(2,N)上の一般超幾何積分の被積分関数で置き換えて得られる準直交多項式とGSSの上記の特殊解が関係していることが分かった.より具体的には,重み関数のモーメントを成分とするHankel行列式がGSSの特殊解のtau関数になっているということである.このことは,研究集会「微分方程式の展望」において発表した.課題としては,上に述べたように,一般超幾何関数におけるパラメータとGSSにおけるパラメータの具体的な対応は記述できていないことである.第2の課題については,まだ具体的な結果が得られていない.特殊関数というよい性質を持つ関数の中でガウスの超幾何関数やパンルべ関数は微分方程式の解となる,積分表示をもつ,差分関係式を持つなどで特徴づけられる.これらを一般化し統一的な方法で記述して,その本質を明確にする研究を行った.これらを一般化した一般超幾何方程式(GHGS)と一般Schlesinger系(GSS)はともにグラスマン多様体上で定義された線形,非線形微分方程式系である.GSSの解の中で,GHGSの解で表現される解があるか,どのような形で表示されるかを,Shah & Woodhouseの結果を深めることによって調べた.その副産物として準古典直交多項式との関連を見出した.大学に関連する他の業務が多忙で年間15回ほどの出張を行ったため,本年度に取り組む予定であった研究課題を推進する十分な時間が確保できなかったのが主な理由である.また,得られた結果をスペインで開催された研究集会において発表するつもりであったが,同様の理由で参加できなかった.
運動ニュ-ロンに対するシナプス入力の可塑性に関する研究

平成元年度平成3年度の研究計画である運動ニュ-ロンに対するシナプス入力の可塑性に関する研究に関し、インサイチュ・ハイブリダイゼイション法によるギャップ結合のチャネル蛋白の遺伝子発現機構の解析を中心に次の結果が得られた。1.ハ-バ-ド大学のGoodenough教授より提供されたラットの肝細胞のギャップ結合蛋白(コネクシン32)のmRNAに特異的に相補するDNA(cDNA)からマルチプライム法で放射性プロ-ブ( ^<35>SーATPと^<35>SーCTPでラベルする)を作成し、これをプロ-ブとしたインサイチュ・ハイブリダイゼイション法を確立した。2.新生雄ラットの大脳皮質、海馬、視床、視床下部などのニュ-ロンでギャップ結合蛋白のmRNAの発現が認められた。3.成体雄ラットの腰髄の3箇所の運動ニュ-ロン群、即ち球海綿体脊髄核(SNB),背外側核(DLN)及び後背外側核(RDLN)の運動ニュ-ロンの細胞体や近立樹状突起にギャップ結合蛋白のmRNAの発現が認められた。4.成体雄ラットを去勢すると、アンドロゲン感受性SNB運動ニュ-ロンのギャップ結合蛋白のmRNA発現量は対照群の約3/5に減少したが、テストステロン処理によりそれは対照群のレベルまで回復した。一方、アンドロゲン非感受性のRDLN運動ニュ-ロンのそれは性ホルモン環境の変化による影響を受けなかった。平成元年度の研究計画であるインサイチュ・ハイブリダイゼイション法によるギャップ結合のチャネル蛋白の遺伝子発現機構に関し、当初の計画ではギャップ結合のチャネル蛋白のDNAの一部を合成し、それをハイブリダイゼイションのプロ-ブとして用いる予定であったが、ハ-バ-ド大学のGoodenough教授よりラットの肝細胞(コネクシン32)と心筋細胞のギャップ結合蛋白(コネクシン43)に対する相補性DNA(cDNA)を供与されたので、これらを用いてインサイチュ・ハイブリダイゼイションを行った。インサイチュ・ハイブリダイゼイション法には、DNA-DNA、DNA-RNA及びRNA-RNAハイブリッド形成の3法があるが、まずRNA-RNAハイブリッド形成を試みた。コネクシン32(肝細胞のギャップ結合蛋白)に対するcDNAからRNA転写産物を作製するとき、^<35>S-UTPを加えてラベルし、放射性RNAプロ-ブを得た。これが目的のmRNAの相補性RNA(cRNA)であり、これを用いて、肝臓、脳の組織切片上でギャップ結合蛋白のmRNAが発現しているかどうか試みてみたが、それぞれの組織で特異的なハイブリドの形成は認められなかった。この理由は不明である。そこで、DNA-RNAハイブリダイゼイションを試みてみた。コネクソン32に対するcDNAからマルチプライム法で放射性DNAプロ-ブ(^<35>S-CTPでラベルした)を得た。これを用いてハイブリダイズさせると、新生ラットの肝臓組織及び脳組織に特異的なシグナルが発現した。脳組織では、大脳皮質、海馬領域、上衣細胞層などに特異的なシグナルが認められた。これらの結果は、新生ラットの肝臓及び脳組織にはギャップ結合蛋白のmRNAが発現していることを示している。平成2年度の研究計画であるインサイチュ・ハイブリダイゼイション法によるギャップ結合のチャネル蛋白の遣伝子発現機構に関し、次の結果が得られた。(1)ラットの肝細胞のギャップ結合蛋白であるコネクソン32のmRNAに対する相補性DNA(cDNA、ハ-バド大学Goodenough教授提供)からマルチプライム法で放射性DNAプロ-ブ( ^<35>SーCTPと^<35>SーATPでラベルした)を得た。これを新生ラットの脳組織のクリオスタット切片とハイブリダイズさせると、特異的なオ-トラヂオグラフィ-のシグナルが脳組織に発現した。即ち、シグナルは大脳皮質、海馬、線条体、視床下部や上衣細胞層などのニュ-ロン、グリア及び上衣細胞に特異的に認められ、神経綱にはシグナルが殆ど認められなかった。

この結果から、新生ラットの脳組織のニュ-ロン、グリア及び上衣細胞はギャップ結合蛋白のmRNAを発現していると考えられる。脳組織のパラフィン切片ではハイブリダイゼイションのシグナルがクリオスタット切片に比べて著しく減少することから、パラフィン包埋の過程でギャップ結合蛋白のmRNA活性が著しく低下することも判明した。(2)コネクシン32に対するポリクロ-ナル抗体を用いて新生ラット脳の海馬を免疫蛍光組織化学的に検索したところ、海馬の錐体細胞層のニュ-ロンの周りにコネクシン32免疫陽性反応物が認められた。また、この部位を電子顕微鏡で調べたところ、互いに隣接する2個のニュ-ロ間にギャップ結合の存在することが確認された。免疫組織化学的方法でギャップ結合蛋白の存在すること、電子顕微鏡観察でギャップ結合の存在することが示されたことは、インサイチュ・ハイブリダイゼイション法による海馬でのギャップ結合蛋白のmRNAの発現を強く支持していることが判った。平成3年度の研究計画であるインサイチュ・ハイブリダイゼイション法によるギャップ結合のチャネル蛋白の遺伝子発現機構の解析に関し、次の結果が得られた。1.ハ-バ-ド大学のGoodenough教授より提供されたラットの肝細胞のギャップ結合蛋白(コネクシン32)のmRNAに特異的に相補するDNA(cDNA)からマルチプライム法で放射性プロ-ブ( ^<35>SーATPと^<35>SーCTPでラベルする)を作成した。これを成体雄ラットの腰髄のクリオスタット切片とパラフィン切片とハイブリダイズさせると、双方の切片で腰髄の3箇所の運動ニュ-ロン群、即ち球海綿体脊髄核(SNB)、背外側核(DLN)及び後背外側核(RDLN)の運動ニュ-ロンの細胞体及び近位樹状突起に特異的なオ-トラジオグラフ-のシグナルが認められた。パラフィン切片のシグナルの発現量はクリオスタッフ切片のそれに比べると僅かに低かった。2.成体雄ラット(2カ月令、6匹)を去勢し、テストステロンを含むサイラスチックチュ-ブをその皮下に植えた。1カ月後動物を4%パラホルムアルデヒド溶液で潅流固定し、腰髄のパラフィン切片を作成した。対照群(6匹)及び去勢群(6匹)の腰髄切片も同様に作成した。ハイブリダイゼイション反応終了後、各実験群のSNBおよびRDLNで各動物当り30個のニュ-ロンを無作為に選び、それらのオ-トラジオグラフィ-のシグナル数を計測した。成体雄ラットを去勢すると、アンドロゲン感受性SNB運動ニュ-ロンのギャップ結合蛋白のmRNA発現量は対照群の約3/5に減少したが、テストステロン処理によりそれは対照群のレベルまで回複した。しかし、アンドロゲン非感受性のRDLN運動ニュ-ロンのそれは性ホルモン環境の変化による影響を受けなかった。
フレイル高齢者における尿失禁リスクの検討と多職種間連携による予防法の構築

日本老年医学会は高齢者が筋力や活動が低下している状態(虚弱)を「フレイル(Frailty)」と呼ぶことを2014年5月に提唱した。近年、「フレイル」と呼ばれる不健康を引き起こしやすい状態と生活習慣病との関連が注目されている。一方わが国では、超高齢社会を迎え、切迫性尿失禁や頻尿をきたす過活動膀胱患者は800万人を数えている。尿失禁を来す疾患には、過活動膀胱以外にも前立腺肥大症や腹圧性尿失禁などがあり、認知機能が低下してトイレが認識できないために起きる機能性尿失禁の場合もある。いずれの場合においても、尿失禁は患者自身のQOLを損なうだけでなく、介護負担も増すことから、その発症予防は、医学的のみならず社会的にも緊急課題になっている。尿失禁が改善することで外出への意欲が増すなど、尿失禁の治療とQOLは密接に関与している。フレイルに陥った高齢者を早期に発見し、尿失禁治療にも適切に介入することにより生活機能や膀胱機能の維持・向上を図ることができると考える。本研究は、社会の高齢化とともに頻度が増加している、フレイル(虚弱:Frailty)と高齢者における尿失禁のリスクを検討し、多職種間連携によりその予防法を構築することを目的としている。平成30年度はまず国内外のフレイル高齢者に関する研究データを収集し、尿失禁を有する患者と有しない高齢者におけるフレイル指標に関するデータを集めた。また名古屋市と連携し、過活動膀胱患者の実態調査を行うべく、準備を行っているところである。フレイルに関する文献検索や尿失禁や介護予防に関わる資料を分析することにより、今後どのような調査を継続して行うべきか、見通しが立ってきたため。近年欧米では、過活動膀胱患者が統計学的にフレイル高齢者になっている割合が高いことが報告されている。また、台湾においても、80歳以上の高齢男性において、尿失禁とフレイルとの関連が報告されている。しかしながら、我が国においてはまだこのような研究報告はなく、高齢者の健康増進を考える上で予防法も含めた検討が必要だと考えている。そこで、調査会社や行政と連絡しながらまずは過活動膀胱の有病率など、中高年以上の一般市民を対象にした実態調査をアンケートの郵送・回収という手法を用いて行う予定である。その上で、フレイル高齢者とコントロール群の高齢者における尿失禁の有病率をデイサービス利用者(要介護認定者)と支援を要しない高齢者などを対象にアンケート調査を行い、どのようなことが尿失禁の増悪因子になっているのかについてなど、比較検討するつもりである。本年度は、文献検索や資料作成などの仕事がメインであり、次年度のアンケート調査に向けて準備を行っていた。その中で物品費に残額が生じたため、翌年度に行う行政と連携したアンケート調査に必要な物品費、通信費、データ解析費用として残額を請求した助成金と合わせて使用予定である。
イモリプロラクチンとその受容体および分泌制御に関する研究

雄イモリが雌に対して示す求愛行動は、プロラクチン(PRL)と雄性ホルモンにより引き起こされる。PRLを脳室内に投与した場合、腹腔内投与の場合より微量で行動を引き起こすことがわかった。したがってPRLの作用部位は中枢にあると考えられる。そこでイモリPRL受容体の脳内の局在を免疫組織化学的手法で明らかにするために、イモリPRL受容体に対する特異抗体を作製した。この抗体用いた免疫組織化学的手法で、イモリ脳内の前方視索前野,内側扁桃核,大細胞性視索前核,視交叉上核,視床下部腹側核,室周核,脈絡叢でPRL受容体免疫陽性細胞が確認された。^<35>S標識したイモリPRL受容体アンチセンスRNAプローブを用いたin situ hybridizatlonでは前方視索前野、大細胞性視索前核、脈絡叢でシグナルが検出された。また、抗イモリPRL受容体抗体を脳室投与するとウサギIgG投与に比べ、有意に求愛行動を阻害した。さらに大細胞性視索前核ではPRL受容体樺免疫陽性とアルギニンバソトシン(AVT)、メソトシン様免疫陽性の共存がみられた。以上の結果から血中PRLは脈絡叢PRL受容体を介して脳脊髄液中に移送され、PRL受容体を発現している神経細胞群に直接作用し求愛行動の発現を引き起こしていることが示唆された。抗イモリPRL受容体抗体の脳室投与により求愛行動が阻害された現象は、PRLの血中から脳脊髄液中への移送や神経細胞でのPRLシグナルのブロックによるものと推測された。AVTは雄イモリ求愛行動を助長することが知られている。したがってAVTニューロンにPRL受容体が発現している可能性が出てきたことから、PRLによって誘起される求愛行動の少なくとも一部はAVTを介している可能性が示唆された。雄イモリが、雌に対して示す求愛行動はプロラクチン(PRL)と雄性ホルモンにより引き起こされる。また、PRLは脳室内投与の場合、腹腔内投与より微量で行動を引き起こす。そこで、^<35>S標識したイモリプロラクチン受容体(PRLR)アンチセンスRNAプローブを用いたin situ hybridizationを行い、イモリ脳内のPRLR mRNAの発現部位を調べた。その結果、脈絡叢にPRLR mRNAが強く発現していることがわかった。哺乳類や鳥類の研究でも、脈絡叢にはPRLRの強い発現が見られることがわかっており、現在のところ血中のPRLを脳脊髄液中に転送する役目があると考えられている。今回、イモリでも脈絡叢にPRLR発現が見られたことから、血中のPRLを脳脊髄液中に転送している可能性が示唆された。しかし、上記の手法では脈絡叢以外の部位で、明確な発現部位の特定はできなかった。そこで、PRLR cDNA配列から推定されるアミノ酸配列を解析し、細胞外領域内の9残基からなるペプチドを合成し、抗血清を作製した。この抗血清を用いた免疫組織化学的手法でイモリ脳内のPRLRタンパク質の発現部位の探索を行った。その結果、preoptic recess organとnucleusinfundibularis dorsalisに抗血清に反応する神経細胞が見られた。これらの部位は生殖行動やPRLの分泌制御に関わる部位と考えられており、そのPRLRを持つ細胞が雄イモリの求愛行動の発現や、PRLの分泌に関わっている可能性が示された。PRLは脳室内投与の場合、腹腔内投与より微量で行動を引き起こす。そこでイモリプロラクチン受容体(PRLR)の脳内の局在を免疫組織化学的手法で明らかにするために、まずイモリPRLRの細胞外領域の15残基からなるペプチド(SLLYKTEGKNTYSEC)を合成し、ウサギに免疫して抗血清を作製した。さらに抗原を認識するIgGを抗原ペプチドカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。この抗体がイモリPRLRを認識するかどうかを確認するためにイモリPRLRを発現させたCOS-7細胞のタンパク質を用いたウエスタンブロッティングを行なうと、約110kDaと80kDaの特異的なバンドを検出した。イモリPRLRの推定される分子量(67kDa)よりもサイズが大きいが、glycopeptidase Fで糖鎖を除去すると約67kDaのバンドが現れるため、糖鎖の付加により高分子側にバンドがシフトしていると考えられた。以上よりこの抗体はイモリPRLRを認識すると考えられた。さらにこの抗体用いた免疫組織化学的手法で、イモリ脳内のanterior preoptic area medial amygdala, magnocellular preoptic nucleus, suprachiasmatic nucleus, ventral hypothalamic nucleus, nucleus of perivehtricular organ, choroid plexusでPRLR様免疫陽性細胞が確認された。さらに^<35>S標識したイモリPRLRantisense RNAprobeを用いたin situ hybridizationではanterior preoptic area, magnocellular preoptic nucleus, and choroid plexusでシグナルを検出できた。以上の結果からchoroid plexusのPRLRが血中PRLを脳脊髄液中に転送し、PRLが直接上記の神経細胞群に作用し求愛行動の発現を引き起こしていることが示唆された。

PRLを脳室内に投与した場合、腹腔内投与の場合より微量で行動を引き起こすことがわかった。したがってPRLの作用部位は中枢にあると考えられる。そこでイモリPRL受容体の脳内の局在を免疫組織化学的手法で明らかにするために、イモリPRL受容体に対する特異抗体を作製した。この抗体用いた免疫組織化学的手法で、イモリ脳内の前方視索前野,内側扁桃核,大細胞性視索前核,視交叉上核,視床下部腹側核,室周核,脈絡叢でPRL受容体免疫陽性細胞が確認された。^<35>S標識したイモリPRL受容体アンチセンスRNAプローブを用いたin situ hybridizatlonでは前方視索前野、大細胞性視索前核、脈絡叢でシグナルが検出された。また、抗イモリPRL受容体抗体を脳室投与するとウサギIgG投与に比べ、有意に求愛行動を阻害した。さらに大細胞性視索前核ではPRL受容体樺免疫陽性とアルギニンバソトシン(AVT)、メソトシン様免疫陽性の共存がみられた。以上の結果から血中PRLは脈絡叢PRL受容体を介して脳脊髄液中に移送され、PRL受容体を発現している神経細胞群に直接作用し求愛行動の発現を引き起こしていることが示唆された。抗イモリPRL受容体抗体の脳室投与により求愛行動が阻害された現象は、PRLの血中から脳脊髄液中への移送や神経細胞でのPRLシグナルのブロックによるものと推測された。AVTは雄イモリ求愛行動を助長することが知られている。したがってAVTニューロンにPRL受容体が発現している可能性が出てきたことから、PRLによって誘起される求愛行動の少なくとも一部はAVTを介している可能性が示唆された。
臨界点近傍における高圧流体に関する研究

本研究はいくつかのサブプロジェクトからなり、得られた知見は次のようにまとめられる。臨界点近傍における流体の熱力学基礎物性:室温からわずかに高温側に臨界温度を持つ流体に対して、臨界点のごく近傍での圧力・密度・温度関係を実測し、同時に臨界物性を決定した。従来から用いられている均一分子場モデルにかわって、スケ-リング則にもとづく非古典的状態式の有効性とその問題点を明らかにした。臨界流体中への固体の溶解度と混合系の相挙動:四種類の臨界流体と十種類以上の有機固体とからなる二成分混合系の相挙動ならびに溶解度を広い温度・圧力範囲で実測した。固体の溶解度に及ぼす置換基の効果や臨界流体の溶媒能力を電子物性的な立場で解釈し、溶媒選択における経験的則を提出した。同時に、複雑な相挙動を三相共存点の軌跡に重点をおいて分類することを試み、固体・液体・気体を含む混合系の相挙動を6種類の骨格図で分類することができた。溶液の密度勾配と溶質クラスタ-サイズ:一般には均質と考えられている溶液を長時間放置すると溶液中に密度勾配が生じる。この現象を溶質クラスタ-の重力場でのブラウン運動で説明することを試み、そのクラスタ-サイズが10nmを越すほど大きく溶液を均質なものとして捉えることの問題点を明らかにし、新たに開発した瞬間凝固法と電子顕微鏡観察からこれとほぼ同サイズのクラスタ-を写真にとらえた。超臨界流体を利用した微粒子の生成機構:超臨界流体に溶解させた固体成分を急激に膨張させることにより得られる微粒子の生成機構を電子顕微鏡観察を基に行った。一次的な超微粒子は溶液中の溶質クラスタ-とほぼ同サイズであり、この一次粒子の置かれている環境温度を調整することにより様々な形の二次的微粒子を生成させることの可能性を示した。気液の臨界点近傍における高圧流体の挙動は臨界異常と呼ばれるほど特異な性質を呈することが知られている。この現象は分子集団の形成とその運動に基づく密度ゆらぎで定性的に説明される。このことは、従来から使われている分子場近似に基づく状態方程式にかわり,臨界流体の相挙動を表現するための新しい型の状態方程式の必要性を示している。臨界流体の特異性を明らかにし、その特徴を利用した技術開発の可能性を検討するのが本研究の目的である。本研究はCHF_3,N_2O,C_3H_6各臨界流体の熱力学的物性のうち特に臨界温度,圧力,密度を正確に求めた。またスケ-リングした状態方程式に最適化二変数を導入することにより,複雑な状態式の簡便な使用方法を提出した。同時にイジングクラスの普遍性についても本方法を用いて考察した。また純粋な臨界流体中に第2成分を微量添加した場合,新たに分子集団を形成し,臨界以上を示す領域が変化すると考えられるが,具体的にどのような相挙動を示すのかについて,ピラゾ-ルを添加剤としCO_2,C_2H_6の臨界挙動の推移を観察した。特にピラゾ-ルCO_2系の高圧側臨界終点付近での密度ゆらぎが非常に大きいことを確認した。個体成分を含む臨界流体を急激に爆発させると流体が分子集団から瞬間的にストリッピングされるため,折出した超微粒子の観察から分子集団のサイズの関する情報を得る目的の実験を試行した。その結果約10nm程度の微粒子が得られたが,本実験法は高分子などの微粒子生成技術と関連して興味深い結果を得ることができた。

臨界点近傍における流体の熱力学基礎物性:室温からわずかに高温側に臨界温度を持つ流体に対して、臨界点のごく近傍での圧力・密度・温度関係を実測し、同時に臨界物性を決定した。従来から用いられている均一分子場モデルにかわって、スケ-リング則にもとづく非古典的状態式の有効性とその問題点を明らかにした。臨界流体中への固体の溶解度と混合系の相挙動:四種類の臨界流体と十種類以上の有機固体とからなる二成分混合系の相挙動ならびに溶解度を広い温度・圧力範囲で実測した。固体の溶解度に及ぼす置換基の効果や臨界流体の溶媒能力を電子物性的な立場で解釈し、溶媒選択における経験的則を提出した。同時に、複雑な相挙動を三相共存点の軌跡に重点をおいて分類することを試み、固体・液体・気体を含む混合系の相挙動を6種類の骨格図で分類することができた。溶液の密度勾配と溶質クラスタ-サイズ:一般には均質と考えられている溶液を長時間放置すると溶液中に密度勾配が生じる。この現象を溶質クラスタ-の重力場でのブラウン運動で説明することを試み、そのクラスタ-サイズが10nmを越すほど大きく溶液を均質なものとして捉えることの問題点を明らかにし、新たに開発した瞬間凝固法と電子顕微鏡観察からこれとほぼ同サイズのクラスタ-を写真にとらえた。超臨界流体を利用した微粒子の生成機構:超臨界流体に溶解させた固体成分を急激に膨張させることにより得られる微粒子の生成機構を電子顕微鏡観察を基に行った。一次的な超微粒子は溶液中の溶質クラスタ-とほぼ同サイズであり、この一次粒子の置かれている環境温度を調整することにより様々な形の二次的微粒子を生成させることの可能性を示した。
miRNAを標的とした新しい再生治療法の開発

miRNAを標的とした新しい再生治療法開発のために、SOX2などの幹細胞特異的転写因子のプロモーター領域及びエンハンサー領域を用いてがん幹細胞分離システムを構築した。SOX2プロモーターの活性が高い細胞集団を乳がん細胞株MCF-7より分離したところ、コントロールと比較して高いsphere形成能を示した。この結果は、幹細胞特異的転写因子に着目することにより、がん幹細胞を分離できる可能性を示唆している。がん幹細胞の高純度精製システム樹立を目的として、ヒトSox2及びOct4遺伝子プロモーター領域において種間で保存された領域をクローニングし、その下流にルシフェラゼーゼ遺伝子を組み込んだベクターを作成した。これらのベクターをヒト乳がん細胞株MCF-7,T47D,MDA-MB-231細胞に遺伝子導入し、Sox2及びOct4の遺伝子発現量と比較を行った。幹細胞特異的転写因子のプロモーターの活性は、実際の遺伝子発現のレベルと相関性が認められた。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子を蛍光蛋白遺伝子GFPと置換した場合、遺伝子導入した細胞の一部に蛍光蛋白の発現が認められた。現在、蛍光蛋白陽性細胞を分離し、解析を行っている。更にプロモーターにエンハンサー領域を組み込みこんだベクターの解析をすすめている。更に、幹細胞特異的転写因子の1つであるKLF4を検出するシステムの構築をおこなった。KLF4結合領域を含むヒトlefty1プロモーターをクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込み、Cos7にヒトKLF4存在、非存在下で活性の解析を行った。また、KLF4を強く発現しているHela細胞に構築したベクターおよび、KLF4結合領域を欠落しているベクターを遺伝子導入した。その結果、KLF4依存的なプロモーター活性の増加が認められた。マウスlefty1にも同様な配列が存在することから、現在作成したベクターの詳細な解析を行っている。幹細胞を高純度に精製する新たなシステムの樹立を目的として、平成22年度に行ったSOX2,OCT4,KLF4に対するレポーターベクターの作製を、平成23年度も引き続き行った。上述の幹細胞特異的転写因子の遺伝子発現調節領域及び転写因子結合領域を用いてベクターの作成を行い、遺伝子の発現量と相関性のあるSOX2プロモーターの活性が高い細胞集団を乳がん細胞株MCF-7より分離したところ、幹細胞形成能を解析するアッセイの1つsphere formationでは、コントロールと比較して高いsphere形成能を示した。またこの細胞集団では、SOX2プロモーター領域に結合領域が存在するが、SOX2発現調節については未報告の転写因子の発現が上昇していた。現在、SOX2プロモーターに対する影響を解析中である。さらに、SOX2プロモーターに結合する因子の同定をTOFF-MASS解析により行っている。更にCMV miniプロモーターの上流に、ヒトLEFTY1遺伝子プロモーター領域に由来するKLF4結合領域を挿入し、KLF結合部位を複数回含むベクターを作成した。KLF4結合領域に変異を導入したコントロールではKLF4への応答性は認められず、一方、作成したベクターはKLF4依存的にルシフェラーゼ活性を誘導した。現在、ルシフェラーゼ遺伝子をptdTomatoなどの蛍光遺伝子と置換し、がん細胞株よりKLF4発現集団の分離を行っている。
GISTの発生、悪性化に関与する遺伝子異常

・胃癌にて切除された胃全摘出検体100例について5mm幅の全割標本を作製し、顕微鏡的GISTの真の発生頻度について検討を行ったところ、KITないしCD34陽性を示す顕微鏡的GISTを35症例50病変見出した。また、遺伝子増幅可能であった顕微鏡的GIST25例についてc-kit遺伝子exon11の変異解析を行ったところ、2例に臨床的GISTでしばしば報告されている領域の遺伝子変異(V559D, del557-561)を認めた。以上の結果から、我々が見出した顕微鏡的GISTは臨床的GISTの初期病変と考えられた。しかし、一般的に臨床的GISTの発生頻度は10万人に1-2人とされており、これと比較して本研究で見出した顕微鏡的GISTの発生頻度はきわめて高い。顕微鏡的GISTのごく一部のみが臨床的GISTに進展するものと考えられるが、それには、c-kit遺伝子変異に加えて、他の遺伝子変化が不可欠であると考えられた。・GIST35例について、9種類の癌関連CpG領域(p15, p16, p73, MGMT, E-cadherin, hMLH1, MINT(methylatedintumors)1, MINT2, MINT31)の異常メチル化の検討を、Methylation specific PCRで行った。c-kit遺伝子変異例25例では平均28.4%、PDGFRα遺伝子変異例7例では平均25.4%に異常メチル化が認められた。遺伝子変異のない症例3例では5領域に平均37.0%の異常メチル化を認め、変異有症例に比べて高率な傾向を認めた。また、遺伝子変異のない症例ではいずれも3領域異常に異常メチル化を認め、他の遺伝子変化の存在が考えられた。CpG領域別では、ミスマッチ修復遺伝子であるhMLH1で60%と最も高率に異常メチル化を認めた。これらの異常が遺伝子不安定性に関与し、GISTの発生、悪性化に関与しているものと考えられる。今後、異常メチル化をターゲットにした治療薬がGISTの治療にも有効である可能性が示唆された。胃癌にて切除された胃全摘出検体100例について5mm幅の全割標本を作製し、顕微鏡的GISTの真の発生頻度について検討を行ったところ、KITないしCD34陽性を示す顕微鏡的GISTを35症例50病変見出した。また、KIT, CD34陰性、desmin陽性を示す顕微鏡的平滑筋腫は28症例51病変認められ、12症例では顕微鏡的GISTと平滑筋腫が併存していた。遺伝子増幅可能であった顕微鏡的GIST25例にっいてc-kit遺伝子exon 11の変異解析を行ったところ、2例に臨床的GISTでしばしば報告されている領域の遺伝子変異(V559D, de1557-561)を認めた。顕微鏡的GISTの90%は胃上部の固有筋層に認められ、臨床的GISTの発生部位と一致した。顕微鏡的平滑筋腫も胃上部に発生が見られた。

顕微鏡的GISTのごく一部のみが臨床的GISTに進展するものと考えられるが、それには、c-kit遺伝子変異に加えて、他の遺伝子変化が不可欠であると考えられた。今後、このメカニズムを解明することがGIST治療におけるあらたな診断基準の確立、分子標的治療ターゲットの発見に繋がるものと考え、現在、解析を進めている。GISTの診断、治療、解析を行うにあたり、その前提となるKITの発現を正確に評価することは必須であるが、KIT免疫染色についてはその精度に疑問を呈する報告が複数されている。そこで複数の抗KIT抗体(ウサギポリクロナール抗体A458,ウサギモノクロナール抗体Y145、マウスモノクロナール抗体(T595,1DC3,K45)についえGISTを含むKIT発現腫瘍およびKIT陰性腫瘍について検討、問題点について考察を行った。A458,Y145についてはいずれの腫瘍においても高い感度と特異性が見られたが、A458ではKIT陰性腫瘍において、若干非特異的陽性像が観察された。1DC3,K45はいずれもホルマリン固定材料において感度が低く、通常の診断には不適当と考えられた。T595は一部のホルマリン固定材料において良好な陽性像が観察されたが、この抗体は肥満細胞におけるKIT発現を認識するものの、GIST前駆細胞と考えられるカハール細胞を認識することができない。GISTも陽性を示す症例と陰性を示す症例があり、免疫組織化学的なピットーフォールと考えられた。現段階では、GISTの診断、解析にはA458ないしYl45が適当であると考えられる。GIST35例について、9種類の癌関連CpG領域(p15,p16,p73,MGMT,E-cadherin,hMLH1,MINT(methylated in tumors)1,MINT2,MINT31)の異常メチル化の検討を、Methylation specific PCRで行った。c-kit遺伝子変異例25例では平均28.4%、PDGFRα遺伝子変異例7例では平均25.4%に異常メチル化が認められた。遺伝子変異のない症例3例では5領域に平均37.0%の異常メチル化を認め、変異有症例に比べて高率な傾向を認めた。また、遺伝子変異のない症例ではいずれも3領域異常に異常メチル化を認め、他の遺伝子変化の存在が考えられた。CpG領域別では、ミスマッチ修復遺伝子であるhMLH1で60%と最も高率に異常メチル化を認めた。これらの異常が遺伝子不安定性に関与し、GISTの発生、悪性化に関与している可能性が示唆される。
PTHrPトランスジェニック動物モデルを用いた肝再生分子機構の研究

遺伝子組換え技術を用い、発現ベクターであるpcDNA3に、アルブミンプロモーターと副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)cDNAを組み込み、BDF1マウス(♀)をホルモン(PMS、hCG)により排卵誘発し、C57BL6マウス(♂)と交配させ、受精卵を取り出し、マイクロマニュピレーターにより、上記の精製遺伝子を顕微注入じた。in vitro培養後、生存卵を偽妊娠させたICRマウス(♀)に移植し出産させた。遺伝子導入マウスの確認を行ない、F1,F2世代のマウスを作成し、それらの遺伝子導入も確認した。これらのマウス50匹あまりに対し、1年間表現型の形態的変化に関し調べたが、現在のところ大きな変化は認めない。その原因を解明するために、ヒトアルブミンプロモーターの活性を調べたところ、in vitroと異なりin vivoでは肝におけるプロモーター活性が低い可能性が考えられた。そこでAFPエンハンサーを繋いだPTHrP cDNAによるトランスジェニックマウスを現在作成中である。我々はまたPTHrP産生腫瘍を用いて、肝の形態形成や病態生理における作用を検討したところ、腫瘍移植4ヶ月目に軽度の肝の線維化と脂肪化を認めると共に、一部のラットに肝癌の発生を認めた。一方、前癌病変であるGST-P fociが腫瘍移植3ヶ月目より全ラットの肝において明らかに出現し始めた(未発表データ)。さらに我々はPTHrPが血管新生作用のあることを血管内皮細胞を用いた培養系にて証明した。よって血管新生という観点からも肝の再生、硬変化、癌化の解明を今後行って行きたい。遺伝子組換え技術を用い、発現ベクターであるpcDNA3に、アルブミンプロモーターとPTHrP cDNAを組み込み、BDF1マウス(♀)をホルモン(PMS、hCG)により排卵誘発し、BDF1マウス(♂)と交配させ、受精卵を取り出し、マイクロマニュピレーターにより、上記の精製遺伝子を顕微注入した。in vitro培養後、生存卵を偽妊娠させたBDF1マウス(♀)に移植し出産させた。現在遺伝子導入マウスの確認を行なっている。我々はまた副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)が、発生や再生時に、パラクライン・オートクライン的に作用し、その過剰発現は様々な組織において、癌化・線維化等とも相関を示すことを病理的に示してきたが(J Patol 182:174,J Gastroenterol 32:396)、慢性的なサイトカイン異常刺激によって肝硬変・肝癌の発生も誘導される可能性が、TGFαやHGFのトランスジェニックマウスの研究(これらはPTHrPの発現も増加させる)で、報告されている。そこでPTHrPトランスジェニックマウスが作成できる前に、PTHrP産生腫瘍を用いて、肝の形態形成や病態生理における作用を検討したところ、腫瘍移植4ヶ月目に軽度の肝の線維化と脂肪化を認めると共に、一部のラットに肝癌の発生を認めた。さらに我々はPTHrPが腫瘍血管新生作用のあることを血管内皮細胞を用いた培養系にて証明したので(第一回心血管内分泌代謝学会横浜1997)、血管新生という観点からも肝の再生、硬変化、癌化の解明を行って行きたい。遺伝子組換え技術を用い、発現ベクターであるpcDNA3に、アルブミンプロモーターと副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)cDNAを組み込み、BDF1マウス(♀)をホルモン(PMS、hCG)により排卵誘発し、C57BL6マウス(♂)と交配させ、受精卵を取り出し、マイクロマニュピレーターにより、上記の精製遺伝子を顕微注入した。

これらのマウス50匹あまりに対し、1年間表現型の形態的変化に関し調べたが、現在のところ大きな変化は認めない。その原因を解明するために、ヒトアルミンプロモーターの活性を調べたところ、in vitroと異なりin vivoでは肝におけるプロモーター活性が低い可能性が考えられた。そこでAFPエンハンサーを繋いだPTHrP cDNAによるトランスジェニックマウスを現在作成中である。我々はまたPTHrP産生腫瘍を用いて、肝の形態形成や病態生理における作用を検討したところ、腫瘍移植4ヶ月目に軽度の肝の線維化と脂肪化を認めると共に、一部のラットに肝癌の発生を認めた。一方、前癌病変であるGST-P fociが腫瘍移植3ヶ月目より全ラットの肝において明らかに出現し始めた(未発表データ)。さらに我々はPTHrpが血管新生作用のあることを血管内皮細胞を用いた培養系にて証明した。よって血管新生という観点からも肝の再生、硬変化、癌化の解明を今後行って行きたい。
新たに発見したデスアシルグレリンの体温低下作用による家畜の熱中症防止の検証

夏期の高温下での家畜の熱中症は多大な経済的損害を与える。我々はデスアシルグレリンが体温を低下させることをラットの投与実験で見いだした。そこで、夏期の高温時に肉牛と和牛においてデスアシルグレリンの臨床研究を行ったところ、熱中症防止の効果が認められた。またラットの実験から、デスアシルグレリン投与は高温下での血液性状の増加的変化(クレアチニン,尿素窒素,ヘマトクリットなど)を正常に維持する作用があることが判明した。以上の結果、デスアシルグレリンが熱中症予防に有効であると思われた。我国の夏期の全国的な高温化は深刻な状況にあり、夏期の家畜の損耗における経済的損失は約8百億円近くに及ぶと言われている。これには、牛や豚の繁殖率・受胎率の低下、乳牛での乳量および豚の増体率低下などが含まれている。一方で、現在でも人を含め熱中症の有効な治療薬は開発されていない。最近、胃で合成され、血中へ分泌されるデスアシルグレリンに極めて強い体温低下作用があることを発見し、ラットにおいてデスアシルグレリンの投与が高温下(33度以上)での致死率を著しく阻止することを発見した。そこで、このデスアシルグレリンの家畜の応用的研究を展開し、夏季の家畜の損耗による経済的損失への防止効果を検証した。これまでの予備実験では本学の附属牧場の乳牛2頭、和牛3頭を用いて、夏季(気温30度以上の日)に牛合成デスアシルグレリンを10 ul/kg単一末梢投与した。その結果すべての牛において、体表体温(サーモグラフィー)の低下と直腸温が有意に低下した。そこで、さらに本実験では、和牛6頭、乳牛6頭を用いて、デスアシルグレリンの投与量依存性の体温低下、および体温低下持続時間を詳細に検討した。しかし、グレリンおよびデスアシルグレリンを黒毛和牛(成牛)および乳牛に投与したが、今回は顕著な体表体温の低下は認められなかった。恐らく、外気温がそれほど高くなく、体温の上昇が顕著に表れなかったことが原因と推察された。平成27年度には外気温が30度以上を越える条件下で行うつもりである。以前に著者らはデスアシルグレリン(DAG)が体温調節中枢である視索前野の神経細胞を活性化し、副交感神経系を亢進することで体温低下作用を示すこと、また、DAG投与が高温暴露による体温上昇を抑制し生存率を向上させることを報告した。この体温低下作用はDAGの中枢と末梢のいずれの投与でも発現したことから、末梢投与したDAGが血液脳関門を通過して中枢に作用した可能性、あるいは末梢血管に直接作用した可能性が推測される。そこで、本研究ではDAGの血管に対する直接的作用について、および、そのメカニズムについて血液生化学的パラメータを指標として検討した。成熟ラットから大動脈及び尾動脈を採取し、リング標本を作製して、tyrode液で灌流したマグヌス管内で安定化させた。フェニレフリンで収縮させた後、DAG (2μM)を投与し、弛緩反応を測定した。また、NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)前投与下において同様の実験を行った。その結果、DAG投与によって、大動脈及び尾動脈は有意な弛緩反応を示した。また、この弛緩反応はL-NAME前投与により有意に抑制された。このことから、DAGが内皮依存性に一酸化窒素を介して、血管を弛緩させたことが示唆された。次に、ラットを通常飼育の23度から35度の高温室に移し、DAG(10nmol)を腹腔内に投与した後、腹大静脈から採血を行い、富士ドライケムを用いて血清AST、ALT、BUN、creatinin、Na+、K+、Cl&#8722;をそれぞれ測定した。その結果、高温暴露による血清AST、ALT、BUN、creatinin、K+の上昇がDAG投与によって有意に抑制された。このことからDAG投与が高温暴露による肝臓や腎臓をはじめとする組織の障害を抑制し、さらに高カリウム血症を阻止したことが示唆された。平成26年度は和牛および乳牛のデスアシルグレリンの体温低下作用や他の生理機能への影響について検討する計画であった。その結果すべての項目の実験が行われた。しかしながら夏の気温がやや全体を通して低かったことが原因でグレリンの効果の評価が難しかった。獣医生理学昨年の実験を再度行うと同時に以下の2点を実施する。まず、牛におけるデスアシルグレリンの高温下における受胎率向上への検証として、宮崎県内の農家、および附属牧場において、デスアシルグレリン投与による体温低下作用を利用し、夏季の受精卵移植もしくは人工受精時での受胎率向上実験を行う。また、ラットにおける高温下でのデスアシルグレリンの安全性評価、投与量評価、各種生理機能への評価(循環器系、呼吸系、運動系、代謝系、内分泌系)を行う。