hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中山間地域における農村女性のライフコース選択－子世代の結婚難・後継者確保難の影響

1平均世帯人員数は5.35→4.83→4.34→3.69と減少し、最頻値は82年の6人世帯、93年の7人世帯から、2014年には2人世帯となり、世帯規模は著しく縮小している。23世代世帯と4世代世帯を合わせた直系家族は70.7%→61.4%→49.2%→39.3%と減少している。3「対象者世代+未婚子」の核家族世帯は32年間にわたって25%前後で安定推移しているが、2014年の同居未婚子最年長者の平均年齢は46.6歳まで上昇し、同居未婚子の約75%が40歳以上、37.0%が50歳以上の未婚者で占められている。この結果は、子世代の結婚難の深刻化を示している。4「夫婦のみ世帯」は82年の1.8%から05年の17.5%へと増加したが、05年以降は単独世帯が増加している。5世代交替に伴って直系家族の中心的世帯構成は「親世代+対象者世代+未婚子」から「対象者世代+子世代+孫」へと移行した。しかし、82年の直系家族のうち14年に次世代直系家族を再生産できた世帯は33.3%にとどまっている。第二次世界大戦後、日本の家族制度は法制度において、家制度(直系家族制度)から夫婦家族制度へと転換した。また、家族社会学の通説では、現実生活上でも日本の家族制度は1960年代以降、直系家族制度から夫婦家族制度へと転換し、世帯形態の核家族化と親族関係の双系化という大きな変化が生じたとされている。本研究はこの家族社会学の通説に対して、1982年2014年の長期反復調査の実証データから農村家族の世帯変動と世代交替の諸相を分析して、戦後70年が経った現代家族においても直系家族制度が維持・存続していると反論することを目指している。本年度行った世帯構成の変動経路と直系制家族の再生産を果たした世帯数などの分析によって、現代家族も現実生活上は直系家族制度が維持・存続している可能性が高いことを明らかにできた。日本三大玉露茶の生産地である静岡県藤枝市岡部町において、同一の対象者と世帯を1982年から2014年の32年間にわたって追跡し、茶生産の盛衰に揺れ続けた農村家族の世代更新の軌跡と農村女性のライフコースの変容を明らかにした。1982年、1993年、2005年、2014年の追跡調査から、239世帯の4時点パネルデータを一部の分析が可能なところまで完成させた。第1回調査を実施した1982年に3059歳だった対象者は、第4回調査の2014年には6390歳となった。本分析から次の点が明らかになった。(1)対象者世帯のうちで子や孫が結婚後に同居して対象者世代の次の世代または次の次の世代を更新した「子・孫世代更新世帯」が4割を超えた。ただし、世代更新は1993年までは活発であるが、2005年以降は停滞しており、結婚時期の遅い対象者ほど世代更新の実現は難しくなっている。(2)対象者が未婚子と同居している「更新未確定世帯」は、2005年以前は子世代の進学・就職・結婚による他出や子どもの結婚同居によって減少しているが、近年は子世代の結婚難により横ばいとなり、2014年の同居未婚子の平均年齢は46.6歳、未婚子の36.0%が50歳以上と極めて深刻な状況を呈している。(3)子世代が他出して「夫婦のみ」または「単身世帯」へと移行した「更新困難世帯」は、14年に27.6%と3割弱を占めている。これまで農村地域では、長男夫婦による結婚当初からの一貫同居と農業経営の継承によって直系家族制が維持されてきた。しかし、中山間地域の農村家族でも2000年以降は、子世代の大学進学・就職・結婚などによる「離家」が一般的になっており、子世代や孫世代の「帰家」(再同居)、
前胸腺刺激ホルモンを中心とした昆虫脳ペプチド類の構造、機能および動態

1.前胸腺刺激ホルモン(PTTH)のアミノ酸配列をペプチドおよび遺伝子の双方から解析し、109残基の全配列を明らかにするとともに、PTTHがジスルフィド結合で架橋した2量体構造を有することを明らかにした。また、抗体を用いた免疫組織化学によりPTTHが脳の側方部2対の神経分泌細胞で産生され、アラタ体から放出されていることを明らかにした。さらに、大腸菌による大量発現に成功し、この発現PTTHを用いてジスルフィド結合の架橋様式を決定した。2.インスリン族ペプチド、ボンビキシンの3対のジスルフィド結合を選択的に架橋させる合成法を開発し、大量合成および類縁体の合成に成功した。現在、NMRを用いて高次構造の解析を進めている。また、エリ蚕およびエビガラスズメガのボンビキシン様ペプチドの遺伝子のクローニングに成功した。3.羽化ホルモン(EH)および性フェロモン生合成活性化ペプチド(PBAN)の遺伝子のクローニングに成功した。PBANの遺伝子には休眠ホルモンを含むPBANとC末端部分が相同なペプチドが4個コードされていた。さらに、EHは脳の中央部2対の、PBANは食道下神経節の12個の神経分泌細胞で産生されていることを免疫組織化学的に明らかにした。4.カイコ脂質動員ホルモンの全構造を、また、休息ホルモンのN末端部分の配列を明らかにした。カイコの前胸腺刺激ホルモン(PTTH)を単離し、各種酵素で消化したペプチド断片の配列分析の結果から、41残基目を除くN末端から104残基目までのアミノ酸配列を明らかにした。電気泳動上の挙動からPTTHの分子量は約30000で二量体であることがわかった。N末端15残基のペプチドを化学合成し、これを抗原にしてモノクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてカイコ脳から作製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、PTTHのcDNAを単離した。塩基配列分析の結果、この遺伝子はシグナル配列のあと役割未知の分子量2K、6Kの2つのペプチドをコードする配列に続いて109残基のPTTH単量体をコードしていた。109残基のうちN末端から104残基はペプチド側から決定した配列と完全に一致し、41残基目はアスパラギン残基をコードしていたことから、この残基には糖鎖が結合していると考えられた。このcDNAをプローブとしてPTTHのゲノム遺伝子を単離し、これが約3kbpの長さをもち、その中に4個のイントロンが存在することを明らかにした。また、上記モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学およびin situハイブリダイゼイションにより、PTTHが脳の側方の2対の神経分泌細胞で生産され、軸索を通って反対側のアラタ体から分泌されることがわかった。カイコのインスリン様ペプチドであるボンビキシンの一分子種ボンビキシンーIVを化学合成した。ボンビキシンに対する数種の抗体を作製し、ラジオイムノアッセイ系を確立した。この系を用いて発生に伴う血中ボンビキシン量の変動を調べた結果、蛹期に特に雌に高濃度で存在することから卵巣発育との関係が示唆された。また、カイコから約30個の、エリカイコから6個の遺伝子をクローニングし、構造を明らかにした。その他の脳ペプチドとして、羽化ホルモンの全配列(61残基)、性フェロモン生合成活性化神経ペプチドの全配列(33残基)を決定した。本年度の成果は以下のとおりである。(1)カイコの前胸腺刺激ホルモン(PTTH)のcDNAを組み込んだ発現ベクタ-(pETPTTH)を作製し、これを大腸菌に導入してPTTHを大量発現させた。菌体から抽出、精製した結果、活性を有する二量体分子を約1mg/lの収量で得ることができた。これを用いてジスルフィド架橋様式を調べたところ、N末端から15残基目のCys同士の1対でのみ単量体間のジスルフィド架橋がかかっており、残りのCysは単量体内で3対のジスルフィド結合を形成していると推定された。

遺伝子解析の結果、PTTH遺伝子はゲノムあたり1コピ-であることがわかった。また、抗PTTH抗体を用いた脳とアラタ体の免疫組織化学を経時的に追跡したが、顕著な変化は認められなかった。(2)分子内に存在する3対のジスルフィド結合を位置選択的に架橋する方法を開発し、この方法を利用してボンビキシンーIIとーIVの全合成に成功した。また、この方法を用いてエリカイコから遺伝子が単離されているボンビキシン様ペプチドを合成したが、そのペプチドの活性はボンビキシンーIIの1/1001/1000と弱かった。ボンビキシンmRNAのin situハイブリダイゼイションをジゴキシゲニン標識法により全脳で行う方法を開発した。この方法で、エリカイコ脳中央部9対の細胞で発現していることを確認した。PCR法を用いてこれまでに見つかっていなかったボンビキシンーIVの遺伝子を明らかにすることができた。(3)カイコ羽化ホルモンの分子多様性をアミノ酸配列のレベルで明らかにし、この分子を大腸菌を用いて発現させた。カイコ性フェロモン生合成性化神経ペプチドのC末端部の類縁体を多数合成し、C末端5残基が活性を示す最小のペプチドであることを明らかにした。カイコの脂質動員ホルモンを単離、構造決定したところ、これまでに鱗翅目昆虫から単離されている脂質動員ホルモンと同一のアミノ酸配列をもつことがわかった。本年度の成果は以下のとうりである。(1)カイコ前胸腺刺激ホルモン(PTTH)と相同性のある分子をPCR法を駆使することにより、エリ蚕からクロ-ニングした。カイコPTTHと同様、ペプチド内に7個のシステインが存在し、アミノ酸配列のホモロジ-は約50%であった。また、カイコPTTHでは糖鎖が付加しているアスパラギンはセリンに置換されていること、前駆体に含まれる2つのペプチドの配列はカイコPTTHとはかなり異なっていることが明らかとなった。また、エビガラスズメ脳中にもカイコPTTH抗体と反応するペプチドが存在することを免疫組織化学的手法を用いて明らかにした。(2)カイコ羽化ホルモン(EH)の遺伝子構造を明らかにした。解析の結果、EHは、26残基のシグナルペプチドを含む88残基のペプチドとして翻訳されること、また、ゲノム上では3つのエクソンからなることが明らかとなった。さらに、in situハイブリダイゼ-ションおよび免疫組織化学により、EHは脳間部4個の神経分泌細胞で合成されていること、幼虫期には、軸索を経由して腹部にいたる中央神経系へ輸送され、蛹期には、主に側心体に貯蔵され、放出されていることが明らかとなった。(3)カイコ性フェロモン生合成活性化ペプチドに対する抗体を作製し、免疫組織化学的手法により、食道下神経節中の12個の細胞で合成されていることを明らかにした。(4)カイコPTTHを大腸菌により、ボンビキシンを化学合成により大量合成し、高次構造解析のためのNMRの測定を行った。その結果、PTTHについては詳細な解析を行うためには安定同位体で標識することが必要であること、ボンビキシンについては測定中に不溶化したため、測定溶媒の検討が必要であることがわかった。1.PTTHの二量体構造を形成している15残基目のシステインをアラニンに置換した変異体を大腸菌により合成した。
地球本位型技術・社会システムの日本とオランダの比較研究

日本とオランダの環境計画を中心にして国レベルの温暖化防止計画、水のマスタープラン、都市エネルギー計画、廃棄物処理・リサイクル計画をもとにシステムの枠組み、指標を活用して、循環効果の評価を試みるとともに地球本位型社会への転換をはかるのに重要な要因を抽出する手法の開発とフレームワーク・評価技法の開発をした。その上で、地球本位型社会への転換をはかるための環境原則としてPrecautionary Principle、Polluter Pays Principle、および、Cooperation Principleの果たす役割の検討。さらに、転換をはかるために重要な役割をはたす要因としてSocialization、Actorization、Dialogueization、および、Internationalizationといった要因を抽出できた。これらは、いずれも社会的手法に属するものである。社会化とは環境手法が社会によって指示されなければならないことを意味し、とりわけ、環境政策目的の社会化のプロセス設計が国民の指示をえるのに必要なこと、合意形成型コミュニティの形成が環境政策をより効果あるものとして成果をあげるために必要なことを示すことができた。主体化とは、単にそれぞれの政策主体と政策被主体との関係を築くのではなく、ボランタリーアプローチとともに政策の社会的マトリックスやネットワークを形成することが必要なことを示すことができた。対話化とは、ひとつにはPrecautionary Principleに関連して科学的知見が不確実な状況でも予見的政策をすすめるために科学者と政策形成者との対話をすすめると同時に社会的対話をすすめるPersuasive communication手法の開発の必要性を指摘できた。国際化とは、国内的合意をとるために積極的に政策提案を国際的に定期することにより国際的にファーストムーバーとして主導権をとりながら予防志向的に国内的合意をとりつけるものである。このように、環境計画およびその目的ないし目標を実現させるためのそれぞれの科学的手法はそれ自体合意を形成するための基礎的知見を共有化させるものであり、合意の形成の基礎史料である。これを実効ある行動へと結びつけるには、規制手法や経済手法による「むちとにんじん」による誘導だけではなく、Socialization、Actorization、Dialogueization、および、Internationalizationといった社会的手法の開発とその社会的マトリックス化が必要となる。このような社会的手法の開発をすすめることによって、規制的手法、経済手法、および、社会的手法のベストミックスが可能となる。
ヒト肺癌におけるマトリックスメタロプロテアーゼによる肺血管と胸膜の弾性板の破壊

ヒト肺腺癌の腫瘍浸潤部局所における活性型MMPsの証明、産生細胞の特定とその活性化機構の解析を行った.(1)Stage III浸潤腺癌では腫瘍浸潤部の腫瘍包巣周囲に、腫瘍中心部に比して明らかに強いgelatin分解活性を認めた.Stage I肺胞上皮癌では肥厚した肺胞中隔内にgelatin分解活性を認めたが、腫瘍細胞周囲の活性はほとんど観察されなかった.(2)これらの活性は、EDTAおよびphenanthrolinで抑制され、PMSFやNEMでは抑制を受けず、MMPに由来するものと考えられた.(3)胸膜浸潤部にgelatin分解活性が観察された.(4)血管浸潤部におけるgelatin分解活性は今回の検討では明らかにできなかった.2.Microdissectionにより取り出した浸潤部局所におけるgelatin分解活性のgel gelatin zymographyによる解析(1)浸潤部組織には、潜在型MMP-2、-9に加え、活性型MMP-2が検出された.3.Insitu hybridization法によるMMP-2ならびにMT1-MMPのmRNAの局在(1)MMP-2のメッセージは、腫瘍組織内外の間質細胞のほか腫瘍細胞にも検出された.(2)MT1-MMPのメッセージは、浸潤部の腫瘍細胞に発現が強い傾向が見られた.以上の結果から、ヒト肺腺癌の浸潤部-(膜部浸潤部を含め)においては活性型gelatinaseが重要な役割を演じており、主体は間質細胞と腫瘍細胞から分泌されたるMMP-2であり、その活性化には腫瘍細胞の産生するMT1-MMPが関わっていることが明かとなった.ヒト肺腺癌の腫瘍浸潤部局所における活性型MMPsの証明、産生細胞の特定とその活性化機構の解析を行った.(1)Stage III浸潤腺癌では腫瘍浸潤部の腫瘍包巣周囲に、腫瘍中心部に比して明らかに強いgelatin分解活性を認めた.Stage I肺胞上皮癌では肥厚した肺胞中隔内にgelatin分解活性を認めたが、腫瘍細胞周囲の活性はほとんど観察されなかった.(2)これらの活性は、EDTAおよびphenanthrolinで抑制され、PMSFやNEMでは抑制を受けず、MMPに由来するものと考えられた.(3)胸膜浸潤部にgelatin分解活性が観察された.(4)血管浸潤部におけるgelatin分解活性は今回の検討では明らかにできなかった.2.Microdissectionにより取り出した浸潤部局所におけるgelatin分解活性のgel gelatin zymographyによる解析(1)浸潤部組織には、潜在型MMP-2、-9に加え、活性型MMP-2が検出された.3.Insitu hybridization法によるMMP-2ならびにMT1-MMPのmRNAの局在(1)MMP-2のメッセージは、腫瘍組織内外の間質細胞のほか腫瘍細胞にも検出された.(2)MT1-MMPのメッセージは、浸潤部の腫瘍細胞に発現が強い傾向が見られた.以上の結果から、ヒト肺腺癌の浸潤部-(膜部浸潤部を含め)においては活性型gelatinaseが重要な役割を演じており、主体は間質細胞と腫瘍細胞から分泌されたるMMP-2であり、その活性化には腫瘍細胞の産生するMT1-MMPが関わっていることが明かとなった.
格子数値計算による超対称性の自発的破れの解明

超対称性は、素粒子標準模型の未解決問題である階層性問題や世代構造の起源、更に暗黒物質の正体等を解決するアイデアとして理論と実験の両面から、これまで精力的に調査研究されてきた。所で、それら理論が現実世界を記述するためには、低エネルギー領域で超対称性が自発的に破れていなければならない。実際、いくつかの超対称模型で、非摂動効果による超対称性の自発的破れの有無が調べられている。ただし、その解析手法は、それら模型特有の性質を多用しているために、すべての超対称模型に適用できるわけではない。そのために、超対称性の自発的破れの有無を判定できる体系的、かつ非摂動的解析手法が求められている。研究目的は、その体系的、かつ非摂動的解析手法の構築である。解析手法には、場の理論の非摂動的定式化である格子場の理論を用いる。超対称理論のグラディエント・フロー方程式から正則化に依らない格子上のエネルギー・運動量テンソルを構成して、真空エネルギーを数値計算で決定することで、超対称性の自発的破れの有無を判定する。この格子理論による手法は、一旦、格子上のエネルギー・運動量テンソルを構成できれば、原理的に数値計算可能なので、模型固有の性質によらず極めて汎用性が高い。研究成果は、(1)超対称Yang-Mills理論のグラディエント・フロー方程式の構成、(2)その方程式が超対称変換と無矛盾であることの証明、(3)相関関数の紫外有限性について、1次の摂動計算で確認し、摂動の全次数で紫外有限性を有することを証明、(4)その方程式が持つ超対称性と物理量の紫外有限性を利用して、エネルギー・運動量テンソルを含む超対称カレント多重項の正則化に依らない定式化である。本年度の成果は(3)と(4)で、日本物理学会にて講演を行った。また全体の成果を論文にまとめて雑誌に投稿中である。研究協力者は加堂大輔氏(Cula大)である。本研究の目的は、量子効果による超対称性の自発的破れの機構を格子場の理論を使った数値計算により明らかにすることである。超対称性の破れの有無は、真空エネルギーから決まる。破れの現象は非摂動的に現れ、その解析には従来の手計算を超えた手法が必要になる。本研究では、場の理論の非摂動的定式化である格子場の理論を用いる。特に、最近進展してきたグラディエント・フロー方程式によるエネルギー・運動量テンソルの格子上での定式化を拡張して、その構成法を超対称模型の場合に確立し、その数値計算から真空エネルギーを決定する。これにより、超対称性の自発的破れの機構を体系的に調査解明し、大統一理論や暗黒物質の起源等の超対称性の諸問題に新しい観点から攻め入る。本研究の基礎方程式となる4次元超対称ヤン・ミルズ理論のグラディエント・フロー方程式は、菊地-大野木(平成25年)によりヴェス・ズミノゲージ固定した超場の方程式として導出された。この方程式はゲージ対称性を持つが、超対称変換(ドウィット・フリードマン流の超対称変換)で閉じず、超対称性がどのように実現できるかは未解決であった。平成28年度の研究成果は、超対称変換のもとで、その方程式がゲージ変換のズレを除いて不変であることを示した。更に任意のゲージ固定項を付け加えてもその性質を保つこと導き、上記未解決問題に一つの答えを与えた。よって、ゲージ不変量(エネルギー・運動量テンソルなどの物理量)の超対称変換性は、その方程式に付随する任意のフロー時刻で普遍であることが分かった。この性質は、量子効果を考慮したグラディエント・フロー方程式にも期待できるので、超対称模型のエネルギー・運動量テンソルの格子上での定式化への大きな障壁を乗り越えたのである。研究体制は、研究代表者:浮田尚哉(筑波大学)と連携研究者:加堂大輔(慶應義塾大学)で実施した。平成28年度の研究計画では、本研究課題の基礎方程式となる4次元超対称ヤン・ミルズ理論のグラディエント・フロー方程式がドウィット・フリードマン流の超対称変換で不変となるような補正項を探し出し、その補正項を加えた方程式を使い超対称模型のエネルギー・運動量テンソルの格子上での定式化を完了する、としていた。研究開始時に、この方程式を超対称不変にする補正項の候補をいくつか見出していたが、どれも超対称不変にすることができなかった。原因を探るために、方程式が線形方程式となる可換ゲージ群模型で調べて見ると、超対称変換で閉じない項がゲージ変換にまとまることを見つけた。これをヒントにして、超対称ヤン・ミルズ理論の場合でも、同様に超対称変換で閉じない項がゲージへ変換にまとまることが分かった。この性質を発見するのに幾分時間を要したために、エネルギー・運動量テンソルの格子上での定式化の完成には至らなかった。よって、進捗状況をやや遅れているとした。ただし、エネルギー・運動量テンソルの構成には、補正項なしの方程式が使用できるので、今後の計算の簡単化が見込めることを注記しておく。超対称理論が現実世界を記述するためには、超対称性は破れていなければならない。そのために、超対称性の自発的破れの有無を判定できる体系的、かつ非摂動的解析手法が求めらている。

本研究は、その体系的、かつ非摂動的解析手法を提案するものである。解析手法には、場の理論の非摂動的定式化である格子場の理論を用いる。超対称理論のグラディエント・フロー方程式から格子上のエネルギー・運動量テンソルを構成して、真空エネルギーを数値計算で決定することで、超対称性の自発的破れの有無を判定する。この格子理論による手法は、一旦、格子上のエネルギー・運動量テンソルを構成できれば、原理的に数値計算可能なので、模型固有の性質によらず極めて汎用性が高い。本年度の研究実績は、ます、出発点となる超対称理論のグラディエント・フロー方程式の持つ対称性(ゲージ対称性と超対称性)の代数的構造を明らかにし、その結果を日本物理学会2017年秋季大会で報告した。その後、フローした場の2点関数の1ループ計算を実行して、紫外有限性を有していることを発見し、更にフローしたゲージ場は、摂動の任意の次数で紫外有限であることを証明した。この紫外有限性は、数値計算と摂動計算を繋ぐ鍵となるので、日本物理学会年次大会(2018)で報告した。また、次年度開始の数値計算の整備を開始した。本研究課題の基礎となる超対称ヤンミルズ理論のグラディエント・フロー方程式の持つ対称性の代数的構造を明らかにし、かつ摂動計算で紫外有限性を確認できたことは、今後の数値計算と対応する摂動計算を問題なく融合できることを保証する。よって、数学的に強固な理論を構築できたことになる。また、次年度開始の数値計算の準備を開始しているので、本研究はおおむね順調に進展している。超対称性は、素粒子標準模型の未解決問題である階層性問題や世代構造の起源、更に暗黒物質の正体等を解決するアイデアとして理論と実験の両面から、これまで精力的に調査研究されてきた。所で、それら理論が現実世界を記述するためには、低エネルギー領域で超対称性が自発的に破れていなければならない。実際、いくつかの超対称模型で、非摂動効果による超対称性の自発的破れの有無が調べられている。ただし、その解析手法は、それら模型特有の性質を多用しているために、すべての超対称模型に適用できるわけではない。そのために、超対称性の自発的破れの有無を判定できる体系的、かつ非摂動的解析手法が求められている。研究目的は、その体系的、かつ非摂動的解析手法の構築である。超対称理論のグラディエント・フロー方程式から正則化に依らない格子上のエネルギー・運動量テンソルを構成して、真空エネルギーを数値計算で決定することで、超対称性の自発的破れの有無を判定する。研究成果は、(1)超対称Yang-Mills理論のグラディエント・フロー方程式の構成、(2)その方程式が超対称変換と無矛盾であることの証明、(3)相関関数の紫外有限性について、1次の摂動計算で確認し、摂動の全次数で紫外有限性を有することを証明、(4)その方程式が持つ超対称性と物理量の紫外有限性を利用して、エネルギー・運動量テンソルを含む超対称カレント多重項の正則化に依らない定式化である。本年度の成果は(3)と(4)で、日本物理学会にて講演を行った。また全体の成果を論文にまとめて雑誌に投稿中である。
抗原エピトープ高次構造に基づく新奇な抗歯周病合成ワクチンの開発

Porphyromonas gingivalis (Pg)は成人性歯周炎の原因菌として最重要視されており、本菌の線毛はその組織定着因子であることが示されている。本研究は、Pgの上皮細胞への付着を抑制できる抗体を誘導し得るような合成ワクチンの創製の可能性を探索することを目的とした。最初に、Pg線毛に対するマウスモノクローナル抗体(mAb)を作成し、菌の付着を抑制するmAbは線毛重合体の高次構造を特異的に認識することが示唆された。次いで、M13バクテリオファージのgp3遺伝子内に18merのランダムペプチドを組み込んだファージディスプレイペプチドライブラリーを構築した。前述のmAbとの反応性を指標にスクリーニングを行い、mAbに認識される線毛の立体構造を模倣すると考えられるペプチドのアミノ酸配列(エピトープ)を同定した。当該ファージクローンを大量調整し、ファージ粒子をマウスに投与したところ、挿入ペプチドTagおよび天然Pg線毛に対する抗体の誘導が可能であった。挿入ペプチドの立体構造の安定化による免疫原性の改善を期待して、当該配列を環状ペプチドとして表現するファージ構築に取り組んだ。当ペプチドをそのまま化学的に合成することは不可能であったので、エピトープに関係性の低い配列を削除し、可溶性の環状ペプチドとしての合成にも取り組んだ。しかしながら環状ペプチドとmAbとの結合は認められなかった。このような、ファージ表面に発現される機能性ペプチドとして選択されてきた配列でも、単独のペプチドとしては発現されなかったり、発現はしても機能を発揮できない例が報告されている。その一例に有効性が報告された、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)の融合体としての発現系を当ペプチドに適用すべくMBP遺伝子をクローニングし、新たなベクターを構築し、上記の18mer直鎖状ペプチドと11mer環状ペプチドのMBP融合体を作製したところ、直鎖状ペプチド-MBP融合体は可溶性タンパク質として発現することができ、mAbとも特異的な結合が確認された。Porphyromonas gingivalis(Pg)は成人性歯周炎の原因菌として最重要視されており、本菌の線毛はその組織定着因子であることが示されている。本研究の達成目標は、実験動物においてPgの上皮細胞への付着を抑制できる抗体を誘導し得るような合成ワクチンを創製することである。本年度の研究において、Pg線毛に対するマウスモノクローナル抗体(mAb)を作成した。樹立された種々のmAbの反応特異性と機能を解析したところ、Pgの付着を抑制するmAbは線毛重合体の高次構造を特異的に認識するものであることが示唆された。M13バクテリオファージのgp3遺伝子内に18merのランダムペプチドを組み込んだファージディスプレイペプチドライブラリーから、前述の特異性と機能を有するmAbであるPfyx 205(IgA,k)およびPfyx 206(IgG1,k)との間に反応性を示すファージクローンのスクリーニングを行った。1次スクリーニングで選択された種々のクローンのうち、最終的にPfyx 206に対する特異性が確認された1クローン選択し、挿入遺伝子のDNA配列を解析した。その結果、挿入ペプチドの推定アミノ酸配列はQAAAQDVWGVHTAGSAAGであり、線毛の259番目から272番目までのアミノ酸配列LAAAQAANWVDAEGと部分的な相同性が認められた。現在、さらにもう数クローンのPfyx 206

特異的なファージを得てペプチド配列を比較すべくファージのスクリーニングを継続するとともに、上述の1クローンの表現するペプチドの合成に取組んでいる。また、ヒトの歯周炎患者における線毛の強い免疫原性が、一般定期健康診査時に得られた血清中の抗体価測定により確認された。Porphyromonas gingivalis(Pg)は成人性歯周炎の原因菌として最重要視されており、本菌の線毛はその組織定着因子であることが示されている。綿毛重合体の高次構造を認識し、Pg菌体の上皮細胞への付着を抑制するモノクローナル抗体(mAb)Pfyx206を作製し、18merランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーから、特異的に反応性するファージクローンを同定した。この挿入されたペプチドの免疫学的機能を確認するための抗原を作製すべくペプチドの化学合成を行ったが、特異な配列のためか成功しなかった。そこでファージを生物学的に大量に調整し、ファージ粒子そのものをマウスに投与して誘導される抗体の特異性を検討した。ファージ粒子の投与により挿入ペプチドに対する抗体を誘導する方法論は未確立なため、対照として無関係のmAbに特異的なファージクローンを別マウスに投与した。試験・対照の両ファージに共通なE-tag配列のみを発現するscFv融合タンパクに対する抗体価は、各ファージの免疫で強く上昇し、対照ファージ免疫マウスではその挿入配列の合成ペプチドに対する抗体価の特異的な上昇が認められ、ファージ粒子の投与により挿入ペプチドに対する抗体の誘導が可能であることが明らかになった。試験ファージの挿入ペプチドの合成は不可能(既述)なため、天然Pg綿毛に対する抗体価を測定した。試験ファージ免疫マウスで抗体価の弱い上昇が認められた。挿入ペプチドの立体構造の安定化による免疫原性の改善の可能性が期待されたため、当該配列を環状ペプチドとして表現するファージの構築に取組んだが、ファージの発現量が少なく、免疫に必要な量を確保できなかった。可溶性かつ機能的に大量発現できる系としてのペプチドと他のタンパクとの融合発現系、当該配列の末端残基の短縮などの工夫による安定発現する環状ペプチド表現ファージや環状ペプチドの化学合成などを、Pfyx206との親和性の改善を指標として試ている。我々の作製したモノクローナル抗体(mAb)pfyx206は、成人性歯周炎の原因菌として重要視されるPorphyromonas gingivalisの線毛多量体の高次構造をエピトープとして認識し、本菌のヒト口腔上皮細胞への定着を抑制する。同様の機能を持つ抗体を宿主に誘導するための合成ワクチンの創製を最終的な目標として、ファージ・ディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーを用いた探索により、本mAbによって認識されるファージクローンが同定され、それに挿入された、線毛の1次構造と部分的に相同性を示す18merペプチド配列(QAAAQDVWGVHTAGSAAG)が、線毛の立体構造エピトープを模倣している可能性が示唆されている。
マウス前立腺癌モデルに対するalpha-GalCerを用いた免疫療法の試み

前立腺癌マウス担癌モデル作成の準備として、ホルモン非依存性前立腺癌細胞株としてPC-3細胞を培養し、ホルモン依存性前立腺癌細胞株としてLNCaP細胞を培養しこれらを使用して動物実験を行っている。コラーゲン・ジェルを1:1の割合にて氷冷下で混合し、Balb/cマウスまたはヌードマウスの皮下に注射することにより上記の前立腺癌細胞が生着し、腫瘍の増殖を認めることを確認した。これにより、ホルモン依存性、ホルモン抵抗性前立腺癌マウス担癌モデルを確立した。またalpha-GalCerをこれらマウスに静脈注射し有害事象が起こら無いことを確認している。現在マウスの個体数を増やしたコントロール実験を行い、ホルモン依存性、ホルモン抵抗性前立腺癌マウス担癌モデルにおける、alpha-GalCerの抗腫瘍効果について検討中である。またa-GalCerをこれらマウスに静脈注射し有害事象が起こら無いことを確認している。今後、マウスの個体数を増やしたコントロール実験を行い、前立腺癌マウス担癌モデルにおける、a-GalCerを用いた免疫療法の可能性について更に検討する予定である。
選択的スプライシングによるシェディング制御の分子機序と機能的意義

膜タンパク質を切断して細胞外領域を可溶化するシェディングは、細胞間のシグナル伝達を絶対的に制御する分子機構であるが、その制御機構には不明な点が多い。これまでの研究で我々は、2つの接着分子CADM1とALCAMのシェディング感受性が、全配列の3%にも満たない短い選択的エキソンの有無により180度転換するという意外な事実を明らかにしている。更にCADM1の選択的エキソンがコードするアミノ酸配列が、細胞外の糖鎖修飾部位と細胞表面との間の距離を伸ばすことでCADM1をシェディング感受性にしていることも明らかにして報告した。当該年度は接着分子ALCAMの選択的エキソンがシェディングを阻害する分子機構について解析した。まず、この選択的エキソンがコードするアミノ酸配列には糖鎖修飾を受けうるセリン残基が2つ存在したので、それらを糖鎖修飾を受けないアラニン残基に置換した所、シェディング耐性に変化はなく、CADM1と異なりALCAMのシェディング感受性は糖鎖修飾によって制御されるのではないことがわかった。次に選択的エキソンがコードするアミノ酸配列に酸性アミノ酸が多いことに注目し、これらの酸性アミノ酸を全て中性アミノ酸に置換した所、シェディング耐性から感受性へと変化することがわかった。塩基性アミノ酸への置換は更にシェディング感受性を亢進した。また塩基性アミノ酸に置換した変異体ALCAMの切断部位を特定した所、膜から15アミノ酸付近であることが明らかとなった。酸性アミノ酸が膜から15アミノ酸付近に集中していることと考え合わせると、ALCAMの選択的エキソンはシェディング切断部位近傍に酸性アミノ酸を挿入することでシェディング耐性を付与していることが示唆される。ALCAMの選択的エキソンがコードする酸性アミノ酸がシェディングを阻害することを明らかにすることができた。さらに、シェディング感受性のALCAMスプライシングバリアントと、シェディング耐性のALCAMスプライシングバリアントにアミノ酸置換を加えシェディング感受性にした変異体とで、シェディング切断部位と膜表面との距離がほとんど一致することも明らかにした。これらの結果から、シェディングを担うADAMファミリープロテアーゼが膜から一定の距離の範囲で切断するという性質があることと、切断部位近傍に酸性アミノ酸が多いと切断できなくなることを明らかにすることができたと考えている。以上の成果から、ALCAMの選択的スプライシングがシェディング感受性を制御する分子機構について明らかにすることができたので、予定通り研究が進展していると評価した。今後は選択的スプライシングによってCADM1やALCAMのシェディング感受性が制御される分子機構の機能的意義に迫っていきたい。具体的にはCRISPR/Cas9を用いて、選択的エキソン欠損細胞を構築し、細胞接着や運動に変化が見られるか検討する。また選択的エキソンを挟んだfloxマウスも存在するので、生体内での役割を明らかにしていきたいと考えている。一方で研究計画に記したように同様に選択的スプライシングでシェディング感受性が制御される他の膜タンパク質についての研究も進めていきたい。

具体的にはCRISPR/Cas9を用いて、選択的エキソン欠損細胞を構築し、細胞接着や運動に変化が見られるか検討する。また選択的エキソンを挟んだfloxマウスも存在するので、生体内での役割を明らかにしていきたいと考えている。一方で研究計画に記したように同様に選択的スプライシングでシェディング感受性が制御される他の膜タンパク質についての研究も進めていきたい。年度終わりの消耗品の消費が予想と異なったため。
鎮静剤と鎮痛剤の高齢・脳疾患ラット自律神経機能および脳シナプス膜機能の抑制作用

今年度の本研究ではSHRSPラットおよびSDラットを用い,鎮静剤・鎮痛剤の併用による,自発運動量,心拍数,体温など生体への影響を観察した。そして,ラット脳シナプス膜画分への影響を検討した。1.高週齢ラットの飼育雄性,7-10週齢のWistar系SDおよびSHRSPラットを本学動物実験センターへ納入・飼育し,40週齢以上を高週齢ラットとした。なお,SHRSPラットの7割が飼育・前処置・実験中に死亡した。2.血圧非観血式自動血圧測定装置(ソフトロン社BP-98A)を用いtail-cuff法にてラットの尾で計測した。3.小動物用テレメターシステムを用いた自発運動量・心拍・体温小動物用テレメーターシステム(Vital View 4000)の受信装置とデータ発信器(PDT-400HR)2組を購入し,設備拡充した。4.高週齢ラットに対するミダゾラムとペンタゾシン同時投与鎮静効果を得るミダゾラム0.5mg/Kg(MID0.5)と鎮痛効果を認めるペンタゾシン6および12mg/Kg(PEN6,PEN12)の同時投与は,生理食塩水を注射(対照)に比較して鎮静効果と鎮痛効果を増強し,運動協調性機能低下を増長させた。5.高週齢SHRSPラットへのミダゾラムとペンタゾシン同時投与自発運動量:MID0.5+PEN6同時投与は,15,30分の時点で対照より低下した。MID0.5+PEN12.0同時投与は15,30,60分の時点で対照より低下した。なお,120分の時点で各群は対照と差を認めなかった。心拍と体温:全時点でCONと有意差なし。6.ラット脳シナプス膜画分におけるGABA_A癌受容体複合体への影響平成17年度末に動物実験センターラット飼育室でマイコプラズマが蔓延,施設長命令で高週齢ラット等70匹を薬殺した。今後,高週齢脳疾患ラットの脳シナプス膜画分を調整し本実験を継続したい。本研究では行動薬理学的研究の成績を中心に,高齢・脳疾患ラットの対する鎮静剤と鎮痛剤の併用による相互増強作用の程度および副作用の強さを実証した。今年度,本研究では高齢のラットを用い,鎮静剤・鎮痛剤の併用与薬による,自発運動量,心拍数,血圧,体温など生体への影響に関する行動観察を行った。20週令(♂)ラットに,若年ラットで呼吸抑制を認めずに鎮静効果が得られる鎮静剤(ベンゾジアゼピン:ミダゾラム;0.5,1.0mg皮下注射)および鎮痛剤(ペンタゾシン;6,12mg皮下注射)の単独および同時与薬した。この状況のバイタルサイン(血圧測定・心拍・体温計測)および鎮静(Irwnの多次元観察法のて判定),鎮痛(Randall-Selitto法;圧刺激装置にて下肢を刺激),そして運動機能(加速ローターロッドにて転落時間)を240分間にわたり行動観察を行った結果を下記に示す。

1)鎮静剤および鎮痛剤の単独投与(1)ミダゾラム0.5mg/Kg投与:鎮静効果;90分間,運動機能抑制;90分間,バイタルサイン;変動なし(2)ペンタゾシン6.0/Kg投与:鎮痛効果;90分間,運動機能抑制;90分間,バイタルサイン;変動なし(3)ペンタゾシン12.0/Kg投与:鎮痛効果;120分間,運動機能抑制;180分間,バイタルサイン;血圧上昇2)鎮静剤および鎮痛剤同時(併用)投与;(1)ミダゾラム0.5mg/Kgとペンタゾシン6.0/Kg鎮静効果;120分間,鎮痛効果;120分間,運動機能抑制;120分間,バイタルサイン変動;なし,運動機能回復;120分(2)ミダゾラム0.5mg/Kgとペンタゾシン12.0/Kg鎮静効果;180分問,鎮痛効果;180分間,運動機能抑制;240分間,バイタルサイン変動;血圧と体温上昇,運動機能回復;240分であった。鎮静有効最小量;ミダゾラム0.5mg/Kgと鎮痛有効中等量;ペンタゾシン12.0/Kgの同時与薬では,ミダゾラム0.5mg/Kgの単独投与に比較して,血圧・心拍・体温は上昇,運動機能回復に2倍の時間を要した。したがって鎮静剤と鎮痛剤の同時投与には十分な術後管理が必要である。本研究では高週齢(4550週令)の高血圧自然発症ラットSHRSP(脳梗塞簡易発症高血圧・脳梗塞)ラットを用い,鎮静剤と鎮痛剤の同時投与による,自発運動量,心拍数,血圧,体温など生体への影響を行動薬理学的に観察した。鎮静剤:ミダゾラム0.5mg/Kg(MID),鎮痛剤:ペンタゾシン6mg/Kg(PEN6)または12mg/Kg(PEN12)を単独または同時与薬(皮下注射)した。ラット脳シナプトニューロソームのGAB触受容体複合体C1^-取込み機能,培養海馬切片の神経細胞死における鎮静・鎮痛薬の影響を検討した。1)鎮静および鎮痛効果投与30・60分後,コントロール(生理食塩水を注射; CON)と比較してMID, PEN6とPEN12の単剤投与は鎮静効果を認めた。投与30分後の鎮痛効果はMID+PEN6同時投与,PEN12単独投与,そしてMID+PEN12同時投与の順に強く認めた。なおMID+PEN12同時投与では180分後まで鎮痛効果を認めた。2)運動協調性機能抑制作用;投与30分後においてMID・PEN6・PEN12の単剤投与,MID+PEN6同時投与で抑制作用を認めた。なお,30分後,MID・PEN12同時投与ではローターロッド上の歩行不可能な状態であった。PEN12単剤およびMID+PEN6同時投与は60分後まで,MID+PEN12同時投与では120分後まで抑制作用を認めた。180分以後で各群はコントロール(生理食塩水を注射; CON)と差を認めなかった。3)自発運動量,心拍,体温をテレメータシステムにて72時間観察投与後30分ではMID単独の他はCONより運動量が低下した。投与後120分時点の自発運動量はMID+PEN6とMID+PEN12の併用投与で自発運動量は低下した。72時間後の運動量は差を認めなかった。脈拍数は有意な差を認めなかった。体温は120分後,CONと比較してPEN6+PEN12で増加した。4)GABA_A受容体複合体C1^-取り込みへの影響,培養海馬切片の神経細胞死における鎮静・鎮痛薬の影響を見極めることができなかった。【総括】高週齢高血圧自然発症ラットの行動薬理学的観察では,鎮静・鎮痛剤の各有効量を同時投与した時には,運動協調性機能の抑制時間と自発発運動量の低下時間を相加的に延長させる新知見を得た。
ナノクリスタルドープ光導波路及び次世代フォトニックデバイスへの適用

二重管式同軸線路型マイクロ波プラズマ化学気相堆積(MPCVD)装置を用いてシリコンナノクリスタル(Si-nc)を作製し、作成条件と作成されたSi-ncによる発光特性との関係について評価を行った。さらにSiナノクリスタルの生成にイオン衝撃が関係していると考えられるが、生成過程を解析することによりこれを明らかにした。さらに、Siナノクリスタルの数を計算することにより、解析の妥当性も明らかにした。他方、新たなシリコン系光機能材料を目指してa-Si : HとSi_3N_4からなる多層膜を作製し膜質を評価した。作製した多層膜の光学的エネルギーバンドギャップの理論曲線と実験値はよく一致しており、良質な多層膜が作製でき、これをスラブ導波路に加工した。その結果TMモードを透過し、TEモードをカットするという特性を、本スラブ導波路に光を照射し、a-si : H層を光ポンピングすることにより、導波路の伝搬特性が変化することを見い出している。基板上に高密度に精密配列制御された高品質化合物半導体ナノクリスタルの作成を目標とし基礎的な検討を行った。GaAs基板上に電子ビーム露光(EBX)法により直径約300nm、深さ約20nmナノオーダーのディップ形成条件を把握し、その上にInAsを分子線エピタキシャル(MBE)法により成長を行った。その結果ディップ沿ってリング状に位置制御された高さ約25nmのナノクリスタルを得ることができ、室温におけるPLを確認した。また積層化のための技術的知見が得られた。他方、上記半導体ナノクリスタルが適用される光機能デバイスとして、半導体光増幅器を利用した多モード干渉型波長変換デバイスの基本動作や光スイッチの高性能動作を達成し、光機能デバイス応用のための技術的な課題を解決した。これまで研究してきたArプラズマに加え、水素プラズマによる良質なa-Si:H膜の成膜を試みた。その結果、放電管軸方向に平行に1300Gauss以上の磁界をかけることで高密度で安定な水素プラズマが得られ、Arを用いた時に比べ堆積速度は遅いが、約6Å/sと十分実用的な堆積速度が得られることがわかった。これらの結果を元にSiナノクリスタルを含むa-Si:H膜を作製し、波長514.5nmのAr+レーザでフォトルミネッセンススペクトルを測定した。その結果、試料を酸化させることによって、800nm近辺を中心波長としたブロードな発光スペクトルが室温において観測できた。このときのSiナノクリスタルのサイズは4nm前後であることが分かった。さらに、アモルファスシリコン系多層薄膜や高品質Siナノクリスタルの生成が可能となるように、現有の二重管式同軸線路形MPCVD装置を、新たにコンピュータによりガス圧や、ガス流量、バルブ操作が精密に制御できるよう改造した。化合物半導体系ナノクリスタルの粒径制御や均一化、さらに導波路への均質ドープ化を同時に達成する方法として、独自のナノクリスタル堆積装置を考案した。分子線セルの開口近傍でV族及びIII族元素の蒸気圧を精密に制御することによりナノクリスタル化を図るもので、約10nmクラスのサイズまでナノクリスタルの形成が可能であるように構造設計されてある。これまで、本方法の可能性を確認する種々の調査・検討を踏まえて基礎的なレベルの装置設計を行い、そして12月に装置導入にこぎ着けた。現在、装置の立ち上げを鋭意行うと共に、ナノクリスタル形成メカニズムについて、理論的な検討を進めているところである。他方、化合物半導体ナノクリスタルの高い光非線形特性を活かした光機能素子として、非対称非線形特性構造を有する非相反半導体光増幅素子を考案し、基礎的な解析を行った。その結果、利得差30dB程度の一方向増幅特性が期待されることが分かった。

独自に開発した二重管式同軸線路型マイクロ波プラズマ化学気相堆積(MPCVD)装置を用いてシリコンナノクリスタル(Si-nc)を作成し、作成条件と作成されたSi-ncによるフォトルミネッセンスによる発光特性との関係について詳細な評価を行った。その結果、モノシランのアルゴンに対するガス流量比の増加と共にSi-ncの微細化が可能であること、また、Si-nc生成後の大気中での加熱酸化処理により発光効率が上昇することなどの知見を得た.他方、コンピューター制御によりガス流量やガス圧などの精密制御を可能とした上記MPCVD装置を用いて、新たなシリコン系光機能材料を目指して水素化アモルファスシリコン(a-Si:H)と窒化シリコン(Si_3N_4)からなる超薄膜多層構造の作成を試み、作成条件を把握した。そして、実際に導波路構造を形成し、低損失導波特性を確認した。今後、これらシリコン系材料の新たな機能について検討していく予定である。粒径および組成の均一性に優れた高品質化合物半導体ナノクリスタルを作成すべく、独自に考案した2重るつぼ型セルを装着したナノクリスタル堆積装置の立ち上げを進めた。装置に関して種々のトラブルが生じたが、それらを逐次解決した。基本的な装置のパフォーマンスの確認とナノクリスタル作成のための準備として、まず同時に装着した通常の分子線セルを用いて材料として最も基本的なGaAsを成長すべく、Ga並びにAsのビーム強度とセル温度などの条件を把握した。また成長のためのGaAs基板前処理条件などを把握し、実際に成長を試みた。照射するIII-V族比や基板温度等をパラメーターとして、良好な成長を得るための知見を得た。今後、これらの検討結果を踏まえ、2重るつぼを用いたナノクリスタル作成の実験へと進む予定である。他方、本装置を用いて作成可能な光機能材料であるフォトニック結晶を用いた新規デバイスの作成方法について一案を得た。独自に開発した二重管式同軸線路型マイクロ波プラズマ化学気相堆積(MPCVD)装置を用いてシリコンナノクリスタルを内部に含むa-Si:Hナノボール膜を作製し、イオン衝撃が膜質、発光特性に与える影響を検討した。その結果、基板電位を変化させることによりシース電圧が変化し、イオン衝撃エネルギーを制御できることが分かった。また、Siナノクリスタルの生成にイオン衝撃が関係していることをその生成過程を解析することにより明らかにした。他方、コンピュータ制御によりガス流量やガス圧などの精密制御を可能とした上記MPCVD装置の用いて、新たなシリコン系光機能材料を目指してa-Si:HとSi_3H_4からなる多層膜を作製し膜質の評価を行った。作製した多層膜の光学的エネルギーバンドギャップの理論曲線と実験値はよく一致しており、良質な多層膜が作製できた。高品質化合物半導体ナノクリスタルの、高密度でかつ基板上の所望位置への精密配列制御の基礎的な検討を行った。GaAs基板上に電子ビーム露光(EBX)法によりナノオーダーのディップを形成し、その上に分子線エピタキシャル(MBE)成長を行った。
光環境サイクルという視点からの、新たな心身症治療法の可能性

光環境サイクルは生体に大きな影響を与えるとされているが、病状にたいする治療的な影響についてはいまだ検討されていない。本年度は、生体機能異常を呈することが多い、心身症患者における光環境サイクルの影響を検討した。対象は心身症にて入院患者のうち研究に同意の得られた15人。携帯型の照度、運動量、心電図計測器を用いて24時間記録を行い、結果を、日中と夜間における光照射量と自律神経機能、心身症症状との関連を検討した。結果、積分照度が大きいいほど、心拍変動により得られる自律神経機能が良好であり、この両者には相関がみられた。一方運動量と自律神経機能の間には有意な相関はみられなかった。光照射、運動量のいずれもが、自律神経機能に影響すると考えていたが、光照度が活動量よりも患者の自律神経機能に大きな影響を与えていた。運動量の多寡によって自律神経機能に違いが認められなかったことは、入院という環境下では、患者間の運動量に大きな差が生じにくく、このため運動の影響が評価できなかったものと考えられる。一方、入院という均質な環境、病室という限られた空間においても、光照射量の違いが、自律神経機能の良否に影響したということは、入院環境における窓の存在や、窓からの日光の照射量、室内の光照明環境などが、患者の病状の回復に重大な影響を与える可能性を示唆しており、今後の病院、病室設計や入院生活プログラムの作成において光照射量を考慮する必要性考があるとえられた。現在進行中の研究では、24時間測定が必要だが、入院患者は心身ともに疲労感の強い状態での入院が多く、研究への同意が得られにくい。このため研究へのエントリー患者数が当初の予定より少なく、科学的に妥当な解析をするための症例数を集めることに若干の遅れを生じている。本年度中に、現在進行中の患者群での照度と心身症症状、自律神経機能との関係を解析し、結論を出す。結果を用いて、妥当な光照射療法の介入方法を作成し、介入研究の実施計画をたてる。次年度には、介入研究を開始する。研究へのエントリー患者数が予定を下回ったため、次年度繰越が生じた。次年、積極的に研究を依頼することで、遅れを解消し、研究を進捗させる。
ウイルスベクタ-を用いた膵標的化抗体の作製と膵癌治療法の開発

抗体と架橋することが出来るように遺伝子改変したアデノウイルスベクター(Adv-FZ33)を用いて、膵癌細胞上の表面抗原と強く結びつくモノクローナル抗体をスクリーニングしさらにその抗原を同定することにより、膵癌の標的化治療を試みた。スクリーニングで得られた抗体は20種類で、それら抗体中でF2-27は特に腫瘍選択性に優れており、TOF-MASSによる抗原解析から**であることが判明した。F2-27は膵癌細胞のみならず、胃癌、前立腺癌、肺癌細胞株にも反応した。Adv-FZ33に治療遺伝子であるHSV-tk遺伝子を組み込んだvoctorを作製し、GCV(ganciclovir)との併用療法を行ったところ、胃癌、前立腺癌細胞株においてF2-27選択的tk遺伝子導入出来、GCVの濃度依存的にkillingが認められた。膵癌細胞と抗体と架橋することが出来る遺伝子改変したアデノウイルスベクター:Adv-FZ33を用いて遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体を作製、スクリーニングを行い、癌細胞に対して標的化可能な表面抗原と抗体との組み合わせ探索を行っている。既に同方法で20クローンの抗体を樹立している。これらの抗体と一緒にAdv-FZ33を膵癌細胞株に感染させるとAdv-FZ33単独の感染に比べて、約100倍のレポーター遺伝子を導入できることを確認している。これら得られた20種類のうち7種類の抗体に対する抗原の同定に成功した。内訳はCD71に反応する抗体が6種類であり、残りの抗体クローン名F2-27は、膵癌細胞のみならず胃癌、前立腺癌、肺癌細胞株にも反応したが、正常コントロールとして用いた細胞線維芽細胞には反応を示さないものであった。CD71はII型膜糖タンパクで、鉄イオンの細胞内への取り込みや細胞の成長に関与し、増殖能が高い細胞ではCD71は発現が増加し、非分裂細胞では減少もしくは見られない。活性化された代謝や急速な成長に伴い、多くの鉄イオンを必要としているため、グリオーマ、膵臓癌、大腸癌などでCD71が過剰発現していることが報告されている。従って、癌標的化の対象にする予定である。F2-27に対する抗原はTOF-MASSによる解析から**であることが判明した。F2-27は腫瘍選択制に優れているため、さらにIn vitroでの抗原(抗体)特異的な治療実験を行う予定である。膵癌細胞と抗体と架橋することが出来る遺伝子改変したアデノウイルスベクター:Adv-FZ33を用いて遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体を作製、スクリーニングを行い、癌細胞に対して標的化可能な表面抗原と抗体との組み合わせ探索を行い、20クローンの抗体を樹立した。これらの抗体と一緒にAdv-FZ33を膵癌細胞株に感染させると、Adv-FZ33単独の感染に比べて、約100倍のレポーター遺伝子を導入できることを確認している。これら得られた20種類の抗体のうち、7種類の抗体に対する抗原の同定に成功した。この中の、抗体クローン名F2-27は、膵癌細胞のみならず胃癌、前立腺癌、肺癌細胞株にも反応したが、正常コントロールとして用いた細胞線維芽細胞には反応を示さないものであり、腫瘍選択制に優れていた。抗原はTOF-MASSによる解析から**であることが判明した。F2.27を用いて、さらにin vitroの系で抗原(抗体)特異的な治療実験を行った。Adv-FZ33に治療遺伝子であるHSV tk遺伝子を組み込んだvoctorを作製し、GCV(ganciclovir)との併用療法を行ったところ、PC-3、MKN-1細胞でF2-27選択的tk遺伝子導入出来、GCV依存的killingが認められた。現在抗癌剤での併用効果を検討している。さらに、F2-27に対する抗原を過剰発現する細胞において、F2-27がagonisticに働くか、antagonisticに働くか検討している。また、他のレセプターチロシンキナーゼとのクロストークを確認する実験も行っている。

この中の、抗体クローン名F2-27は、膵癌細胞のみならず胃癌、前立腺癌、肺癌細胞株にも反応したが、正常コントロールとして用いた細胞線維芽細胞には反応を示さないものであり、腫瘍選択制に優れていた。抗原はTOF-MASSによる解析から**であることが判明した。F2-27は新規抗原ではなかったため、相互作用しうるタンパク質の探索は行っていない。また、F2-27単独では、抗原を過剰発現する細胞株の形態変化や増殖活性に変化をおこさせなかった。現在はsiRNAの系を持ちいて、細胞接着や増殖活性、抗癌剤の感受性変化を調べている。抗原同定までの、免疫沈降条件設定が最も時間を必要とするが、自施設では経験が豊富であり、スムーズにクリアできた事が要因と思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。特に問題なく進んでいる。計画の変更はない。