hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子異常からみた表面型大腸がんの発育進展

ヒト表面型大腸がんの形態学的特徴として,実体顕微鏡観察によって蜂巣様の表面構造がみられ,組織学的には正常線管と類似した単一管状線管の密な増生を認めることを示した.技術的には,形態と遺伝子の対比を重視する立場からmaicro-dissection法にてDNAを抽出し, PCR-RFLP法,PCR-SSCP法,DNAシーケンス等を行っていた.隆起型がんと表面型がんの遺伝子学的な比較において,p53遺伝子産物の異常頻度に有意差を認めなかったが,表面におけるK-ras変異が明らかな低率を示した.DCCコドン201多型性の解析では,表面型がんで201Gly型の頻度が高い傾向にあった.また,RT-PCR法による孤発進行大腸がんのNF1(K-rasの活性化を負に制御するがん抑制遺伝子)mRNAの発現は隆起型がんにおいてGAP Related Domein I/II比の変化がみられた.カテプシンD蛋白の免疫組織学的検討では,がん組織で細胞質内局在が変化(基底膜上,びまん性,あるいは焼失するパターン)し,表面型大腸がんでは,特にびまん性ないし消失するパターンが多いことが明らかになった.K-ras codon 12, 13, 61, H-ras, N-rasについて点突然変異の有無を検討し,その結果からK-ras codon 12の点突然変異とcox-2の上皮内過剰発現が相関し,そのことがポリープは発育に連鎖する機序を明らかにした.炎症性発がんモデルでは,F344ラットにTNB(150mg/kg),DMH(20mg/kg)を用いることにより表面型大腸がんを作成し,さらにNSAIDs(fenbufen, 40mg/kg)を投与してその腫瘍抑制効果を示した.ヒト表面型大腸がんの形態学的特徴として,実体顕微鏡観察によって蜂巣様の表面構造がみられ,組織学的には正常線管と類似した単一管状線管の密な増生を認めることを示した.技術的には,形態と遺伝子の対比を重視する立場からmaicro-dissection法にてDNAを抽出し, PCR-RFLP法,PCR-SSCP法,DNAシーケンス等を行っていた.隆起型がんと表面型がんの遺伝子学的な比較において,p53遺伝子産物の異常頻度に有意差を認めなかったが,表面におけるK-ras変異が明らかな低率を示した.DCCコドン201多型性の解析では,表面型がんで201Gly型の頻度が高い傾向にあった.また,RT-PCR法による孤発進行大腸がんのNF1(K-rasの活性化を負に制御するがん抑制遺伝子)mRNAの発現は隆起型がんにおいてGAP Related Domein I/II比の変化がみられた.カテプシンD蛋白の免疫組織学的検討では,がん組織で細胞質内局在が変化(基底膜上,びまん性,あるいは焼失するパターン)し,表面型大腸がんでは,特にびまん性ないし消失するパターンが多いことが明らかになった.K-ras codon 12, 13, 61, H-ras, N-rasについて点突然変異の有無を検討し,その結果からK-ras codon 12の点突然変異とcox-2の上皮内過剰発現が相関し,そのことがポリープは発育に連鎖する機序を明らかにした.炎症性発がんモデルでは,F344ラットにTNB(150mg/kg),DMH(20mg/kg)を用いることにより表面型大腸がんを作成し,さらにNSAIDs(fenbufen, 40mg/kg)を投与してその腫瘍抑制効果を示した.これまでの表面型大腸がんに関する検討で,実体顕微鏡観察によりH型(蜂の巣様)構造が認められ,病理組織学的には正常腺管と類似した単一管状腺管の密な増生をみることを発表してきた.遺伝子工学的には,micro-dissectionを用いたPCR-RFLP法,ドットハイブリダイゼーション法にて,表面型大腸腫瘍ではK-rasの変異が極端に低率であることを見出した.免疫組織学的には,浸潤癌における変異型P53は表面型・隆起型ともに陽性頻度が同程度であった.転移関連因子と考えられているDCCのコドン201多型性の検討では,進行癌と表面型癌で20^<Gly>型の頻度が高いことを示した.なお,ホルマリン固定材料からのDNA抽出など形態保存に配慮した研究方法には以前より取り組み,形態学的な見地から遺伝子検索を行っているが,本年度においては,全ゲノムを均一に増幅するDOP-PCR法を用いたDNA解析を開始し,剖検材料である胎児腎におけるangiotensin converting enzyme多型性の検出を可能にしており,今後は染色体解析への応用を試みたい.また,K-rasの活性化を負の方向に制御するがん抑制遺伝子NF1についてもRT-PCRを行い,進行大腸がんにおけるmRNAの発現量を検討中である.ヒト表面型大腸がんの形態学的特徴として,実体顕微鏡観察によって蜂巣様の表面構造がみられ,組織学的には正常腺管と類似した単一管状腺管の密な増生を認めることを示した.技術的には,形態と遺伝子の対比を重視する立場からmicro-dissection法にてDNAを抽出し,PCR-RFLP法,PCR-SSCP法,DNAシーケンス等を行ってきた.隆起型がんと表面型がんの遺伝子学的な比較において,p53遺伝子産物の異常頻度に有意差を認めなかったが,表面型におけるK-ras変異が明らかな低率を示した.DCCコドン201多型性の解析では,表面型がんで201 Gly型の頻度が高い傾向にあった.

また,RT-PCR法による孤発進行大腸がんのNF1(K-rasの活性化を負に制御するがん抑制遺伝子)mRNAの発現は,隆起型がんにおいてGAP Related Domein I/II比の変化がみられ,遺伝子変異の有無についても解析する予定である.カテプシンD蛋白の免疫組織学的検討では,がん組織で細胞質内局在が変化(基底膜上,びまん性,あるいは消失するパターン)し,表面型大腸がんでは,特にびまん性ないし消失するパターンが多いことが明らかになった.炎症性発がんモデルでは,F344ラットにTNB(150mg/kg),DMH(20mg/kg)を用いることにより表面型大腸がんを作成し,さらにNSAIDs(fenbufen,40mg/kg)を投与してその腫瘍抑制効果を示した。
細胞内レドックス状態のリアルタイムイメージングを達成する蛍光試薬の創製

本研究においては、細胞内レドックス状態を計測することを目的とした新しい蛍光試薬の開発を試みた。新規蛍光試薬の構造として、蛍光基部位としてはシアニン化合物(Cy)、ペリレンビスイミド化合物(PBI)、酸化還元応答性部位としてはナフトキノン(NQ)、アントラキノン(AQ)を選択し、これらを連結することにより、目的とした新規蛍光試薬Cy-NQ、及びPBI-AQを得た。得られた新規蛍光試薬の蛍光測定を行った結果、両蛍光試薬のレドックス反応に対する応答性が観測された。レドックス反応(酸化還元反応)は、生物が生命活動を営む上で極めて重要である。生体内で生じるレドックス反応が、細胞の増殖、分化、細胞周期制御をはじめとする様々な生命現象に密接に関与することが明らかとされてきており、その詳細に関する関心は、益々高まりを見せている。生体内レドックス反応の本質には、種々の活性酸素種(Reactive Oxygen Species : ROS)が深く関与しており、その産生異常は生体内レドックス反応の均衡を破綻させることから、生物個体における多様な疾病や癌化に繋がると考えられている。従って、生体内レドックス状態の解析、更にはその疾病・癌化との関連性解明のため、現在、生体内ROSの産生をモニタリングする手法の開発が非常に重要な課題となっている。そこで本研究では、生体内ROSの産生を計測可能な新たな蛍光試薬の開発を試みた。今年度は、蛍光基ユニットであるシアニン化合物に対し、酸化還元ユニットであるキノン化合物を結合した新規蛍光試薬の合成を行った。まず、1,1,3,3-テトラメトキシプロパン及び2,3,3-トリメチルインドレニンを出発原料とし、カルボキシル基を導入したシアニン化合物を合成した。次に、1,4-ナフトキノンを出発原料として、アミノ基を導入したキノン化合物を合成した。両者をアミドカップリングにより結合し、目的とした蛍光試薬を得た。化合物の同定は、核磁気共鳴スペクトル測定及び質量分析測定により行った。本研究では、細胞内における活性酸素種(ROS)を検出可能な新しい蛍光試薬の開発を目的としている。前年度までに、蛍光基ユニットであるシアニン化合物(Cy5)に対し、酸化還元ユニットであるキノン化合物(ナフトキノン:NQ)を結合した新規ROS計測用蛍光試薬(Cy-NQ)の合成、並びに同定を行った。そこで本年度は、まず得られた蛍光試薬Cy-NQの基礎特性について検討を行った。最初に吸収スペクトル測定を行ったところ、470nm付近にキノン化合物に由来すると推察される吸収帯を確認することができた。次に、絶対PL量子収率測定装置を用いて、クロロホルム、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドの各溶媒中において、Cy-NQとメチル化Cyの蛍光量子収率の測定を行った。その結果、Cy-NQの蛍光量子収率がメチル化Cyの蛍光量子収率と比較して十分に減少しており、シアニンユニットとキノンユニットの間で期待した電子的な相互作用が生じていることが示唆された。そこで次に、Cy-NQに対して、生体中にも存在する還元剤であるアスコルビン酸を添加した。その結果、添加したアスコルビン酸の濃度に対応して、蛍光強度の増大が生じることが明らかとなり、Cy-NQが生体内酸化還元反応を検出する上で有用であることが期待できることが示唆された。次に、Cy-NQの細胞導入についても検討した。その結果、Cy-NQを生細胞に導入した場合には、死細胞に導入した場合と比較して細胞質から強い蛍光が観測され、細胞内物質によるCy-NQの還元が生じたことが示唆された。本研究では、細胞内に存在する活性酸素種(ROS)の総体を検出するための新しい蛍光試薬の開発を目的としている。前年度までに、蛍光基ユニットであるシアニン化合物(Cy5)に対し、酸化還元ユニットであるキノン化合物(NQ)を結合した新しい総体的ROS計測用蛍光試薬(Cy-NQ)を合成し、その性能検討を行った。そこで本年度は、目的とした蛍光試薬をより系統的に開発するための方法論として、ペプチド型総体的ROS蛍光プローブの開発について検討を行った。まず、ペリレンビスイミド化合物をブロモ化し、これにBoc基とOBzl基で保護されたチロシン(Boc-Tyr-OBzl)を反応させ、両者を結合した。次に、OBzl基を脱保護し、スクシンイミド化Fmoc(Fmoc-OSu)を反応させることにより、Fmoc保護されたペリレンビスイミド修飾チロシン(Fmoc-Tyr(PBI)-OH)を得た。一方、1-クロロアントラキノンに対し、Boc-Tyr-OBzlを反応させることで両者を結合した後、Fmoc-Osuを反応させることにより、Fmoc保護されたアントラキノン修飾チロシン(Fmoc-Tyr(AQ)-OH)を得た。

上記のようにして得られた蛍光基ユニットFmoc-Tyr(PBI)-OHと酸化還元ユニットFmoc-Tyr(AQ)-OHをペプチド固相合成法により結合し、目的とした蛍光プローブ、PBI-AQを得た。PBI-AQに還元剤であるNaBH_4を添加したところ、62%の蛍光強度の減少が確認され、PBI-AQのROS計測用蛍光試薬としての有用性が確認できた。また、Fmoc-Tyr(PBI)-OHに親水性アミノ酸、あるいは親水性高分子であるポリエチレングリコールを結合したところ、当該蛍光基ユニットにおける水溶性の大きな向上が観測され、ROS計測用蛍光試薬の水溶化の戦略として有効であることが示された。
20世紀前半のアメリカ文学における経済・ジェンダー・身体

資本主義の発展と変容は、人間存在と文学形式にどのような影響を与えるのか。この問いを根本的な前提としながら、本研究は、リアリズム、自然主義小説から、モダニズムまで、20世紀前半の主要なアメリカ文学作品を幅広く検証し、そこでどのように、資本主義経済と、ジェンダーやセクシュアリティをめぐる問題が相互に関係し、その複雑な交差が、身体という「場」において展開するのかを解明する。
中性単一成分分子性金属の創成と展開

本研究では、拡張型テトラチアフルバレン骨格を持つジチオレン金属錯体による中性単一成分分子性超伝導体、高い転移温度をもつ(強)磁性金属および溶解性分子性金属等の実現を目標とし、配位子の修飾や中心金属の選択により一連の新物質を創成し、この分子性結晶と金属結晶の性質をあわせ持つ新しい物質群の構造、物性および機能性を明らかにした。1)新しい単一分子だけで出来た分子性金属[Ni(tmdt)_2](tmdt=trimethylenetetrathiafulvalenedi thiolate)が金属の厳密な証明であるフェルミ面を持っていることを証明するために、33テスラ強磁場を使用し、マイクロカンチレバーを用いた微小結晶の磁化測定を行った。その結果[Ni(tmdt)_2]の磁気量子振動の観測に成功し、[Ni(tmdt)_2]が電子とホールからなる三次元的なフェルミ面を持つ金属であることを確認した。この研究により新たに設計・合成された中性単一分子の結晶、[Ni(tmdt)_2]が3次元金属であることを実験的に完全に証明することができた。2)転移温度の高い単一分子磁性金属に関しては、初めての単一分子性金属[Ni(tmdt)_2](tmdt=trimethylenetetrathiafulvalenedithiolate)と同型構造を持ち、奇数個の1電子をもつ金錯体分子[Au(tmdt)_2]を合成し、この錯体分子の結晶が、従来の分子性伝導体では考えられない、代表的な反強磁性無機金属であるマンガンの転移温度(約100K)より高温の110Kにおいて反強磁性秩序を持つ事を見出した。また未発表であるが、ごく最近ミクロ単結晶の伝導度の実験により転移温度以下においても金属的な電気抵抗の温度依存性を確認した。このように高い磁気転移を持つ分子性金属は勿論初めてであり、この研究により当初の目標を達成できた。3)また超伝導体については、最近合成に成功した分子性合金[Ni_<1-x>Au_x(tmdt)_2](0<x<1)の結晶は[Ni(tmdt)_2]よりも大きなファルミ面を持つと考えられ、従って超伝導の実現に有利であると予想される。微小結晶の単結晶の電気抵抗の測定を行った処、通常では残留抵抗が観測されるはずの2K以下の低温で僅かではあるが抵抗が減少を初め、また、反磁性の増大が観測された。この結果は,結晶中に微量な超伝導部分を含む事を強く示唆するものである。本結果は単一分子性超伝導体の存在を明確に示すものであり、今後、本合金系に限らず大きな超伝導部分を持つ結晶を見い出すことが重要な課題である。本年度は1)この[Ni(tmdt)_2]

錯体のde Haas van Alphen効果を田中・徳本(産総研)とBrooks(FSU)、安塚・宇治(金材研)等と共同で米国フロリダ州立大学NHMFL DC施設の33テスラの強磁場とAFMチツプカンチカレバーを使って観測することができた。この実験により、この中性単一成分分子が実際Fermi面をもつ金属であることが証明できた。[Au(dmdt)_2]は粉末ペレットでの伝導度・磁化率の測定から300K-50Kまでは少なくとも金属であると考えられる。[Au(tmdt)_2は高い伝導性(室温伝導度は12Scm^<-1>)を保持しながら100K付近という高い温度に磁気相転移が観測された。磁化率i測定から反強磁性相転移であろうと考えている。SPring-8の放射光施設BL0200において粉末データ測定を行いMEM/Rietveld法により構造解析を行った。水素を含め全原子がもとまり三次元電子密度図をだすことができた。またXPSの測定により[Au(tmdt)_2]の金は三価であることが解ったが、このことは金錯体では主に配位子が酸化され金属性を示すと説明される。初めての単一成分分子金属ジチオレンニッケル錯体[Ni(dmdt)_2](dmdt=dimethyltetrathiafulvalenedithiolate)と同形構造を持つ拡張型TTF骨格を持つジチオレン金錯体[Au(tmdt)_2]を合成しその伝導度測定を行ったところ、室温で15Scm^<-1>という高い伝導性を示した。磁化率測定、ESR測定を行ったところ、100K付近に反強磁性的な磁気相転移が観測された。本年^1HNMRの測定の結果、反強磁性相転移を示す緩和率の発散と,二次モーメントの急激な立ち上がりが85Kに観測された。電気伝導度測定および第一原理バンド計算からこの単一成分分子は三次元金属で、相転移の下の温度でもFermi面が消えずに残っており、金属的伝導性を示すこと、また三次元Fermi面はa*/2をnesting vectorとする擬一次元的なFermi面を擁していることがわかった。20Kにおける粉末構造解析から、低温においても室温構造と比較し、大きな構造変化がないことからこの磁気転移はこれまでの有機物で観測されたことのない高い転移温度を持つSDW反強磁性相転移であることがわかった。このように金属的な伝導性を示し高い磁気転移温度を持つ分子性金属はこれまでに存在しない。1)拡張型TTF骨格の配位子部のSを部分的にSeに置換した単一分子性伝導体2)拡張型TTF骨格の配位子を有するジチオラト亜塩錯体中心金属原子を磁性原子に置き換えた中性単一成分分子を集積し、金属結晶を構築できれば、転移温度が高い磁性金属となる可能性が期待できる。このような考えの基に[Cu(dmdt)_2]を合成したところ、常磁性金属が得られた。逆にZn^<2+>の電子構造は3d^<10>で閉殻構造を持つため亜塩の錯体は磁性のないひずみの少ない構造が期待される。そこで本年は[Zn(tmdt)_2]を合成し、SPring-8の放射光を用いたX線粉末回折によりその構造を調べたところ、[Cu(dmdt)_2](dmdt=dimethyltetrathiafulvalenedithiolate)と同様な構造をとることが分かった。Znの回りの配位状況は四面体的で、二つの配位子のなす角度は理想的な正四面体角に近く89.6度であった。伝導度は粉末ペレットで測定し室温で10^<-2>Scm^<-1>、活性化エネルギーは146meVで、半導体的であった。また磁化率測定から、非磁性であることがわかった。
言語文化的に多様な子どもたちの言語発達と学びへ向かう力を支える保育と地域支援

保育所、幼稚園、公私別、地域別に行われている就学前後の外国籍児童の状況調査と実践事例のメタ分析を進めている。多元的制度によって就学前教育が運営されている我が国の現状から、就学前の年齢の外国籍児童の実態を包括的に調査したデータが少ない。しかし、この数年様々な研究調査が行われるようになってきた。その知見を整理し、分析を進めている。現在のところ以下のような点が確認されている。1保育者の困り感の調査では、保護者に関する報告が多い:保護者とのコミュニケーションがうまくいかない、保育の方針がうまくつたわらない、保護者の園への協力が得られない、子どもの持ち物に不備が多い等である。次に多いのは、文化差による食習慣や時間の感覚の違いに関するものが多い。2子どもへの心配については、意識が強い場合とあまり問題視していない場合とがある:複言語環境で発達する子どもの支援は第二言語として日本語を学ぶ場合と異なる支援が必要だということが、あまり理解されていない。3発達障害等の医療につなぐべき特別な支援ニーズがある子どもなのか、文化差・言語の違いからの課題なのかの判断に苦慮されている。4外国につながる就学前の子どもの実態は、自治体の意識が高くないとつかめない:小学校就学の案内も、義務教育の対象ではないという理由で届かない、あるいは届いても日本語の手紙のみという場合が多い。中小の自治体では、転出入や自治会に依頼して不就学児童が出ないような取り組みをするところもあるが、大都市圏では生活圏の中で実態を把握するのが難しい。また就学前から学齢期の接続期の子どもについては、責任をもつのが誰なのか、自治体によって対応が分かれている。以上の点を踏まえて、2019年度は、1)子どもへの支援を検討するための保育現場の調査と、2)他領域の研究分野の知見を含めた家庭への支援に関する調査、をさらに進めていく予定である。外国につながる子どもの人数が変化した協力園があり、研究計画の変更が必要だった。従って、該当年度予算のうち、交通費等が少なく、また同時に使用する機材の数が少なくて済んだため、予算を少し残した。また、当初雇用予定だった大学院生の事情が変わり、研究助手の確保が難しかったこともあげられる。一方で、外国籍の子どもの支援を行う団体や当事者の保護者支援を行う団体との研究上の関係をつくることができ、予定上の協力者を得て聞き取り調査を行うことができた。2019年度は、保育現場でのデータ収集の対象を、戦略的に選択して研究補助者が少ない時期でも進められるように計画を工夫する。現在研究データの分析や成果の公表が遅れていることから、学会発表や論文等の執筆にも比重を置いていく。また、小学校以上で外国籍児童の指導を担当する教員への研修項目に関する研究結果が出てきていることから、その専門家である共同研究者とともに、就学前に必要な技術・知識の整理を進めて学会や支援団体の研究会等で共有し、専門家と実践家の双方からのインプットを得ていきたい。

2019年度は、保育現場でのデータ収集の対象を、戦略的に選択して研究補助者が少ない時期でも進められるように計画を工夫する。現在研究データの分析や成果の公表が遅れていることから、学会発表や論文等の執筆にも比重を置いていく。また、小学校以上で外国籍児童の指導を担当する教員への研修項目に関する研究結果が出てきていることから、その専門家である共同研究者とともに、就学前に必要な技術・知識の整理を進めて学会や支援団体の研究会等で共有し、専門家と実践家の双方からのインプットを得ていきたい。協力園で急に外国につながる子どもの人数が変化した園があり、研究計画の変更が必要だった。従って、該当年度予算のうち、交通費等が少なく、また同時に使用する機材の数が少なかったためである。次年度は、安定したデータ収集のために、旅費と当該年度に購入予定だった調査用機材が必要となる。また、研究成果の国際学会での発表を予定しており、その旅費や発表準備費用が必要である。
味や香りが異なる食品の咀嚼によって生じる脳および全身の変化についての検討

本研究では,様々な味・香りのガム咀嚼中の脳血流変化および体循環,自律神経活動(心拍血圧ゆらぎ解析)を評価し,味・香りの変化にこれらが受ける影響について検討を行った.その結果,味・香りがあるガムを咀嚼した時が最も脳血流が上昇し,味のある食品を摂取することが脳循環をはじめとする循環系の賦活化に重要であることが示された.次に,ガム咀嚼時に分泌される唾液中のコルチゾールを計測し,味および香りが異なるガムを咀嚼した時のストレス反応を明らかにすることを目的に実験を行った.その結果,甘み/レモンの香りがある最もおいしく感じるガムの咀嚼によって,ストレス抑制効果のあるコルチゾールが多く分泌されることが分かった.本研究では,まず,様々な味・香りのガム咀嚼中の脳血流変化および体循環,自律神経活動(心拍血圧ゆらぎ解析)を評価し,味・香りの変化にこれらが受ける影響について検討を行った.その結果,味・香りがあるガムを咀嚼した時が最も脳血流が上昇し,味のある食品を摂取することが脳循環をはじめとする循環系の賦活化に重要であることが示された.また,無味のガム咀事では心臓迷走神経活動が変化しなかったため循環系の賦活が抑制されたと考えられ,自律神経活動が循環調節に深く関わっていることが示された.本結果については英文にまとめ,掲載決定済みである.次に,ガム咀嚼時に分泌される唾液中のコルチゾールを計測し,味および香りが異なるガムを咀嚼した時のストレス反応を明らかにすることを目的に実験を行った.健常成人96人の被験者に対し,味・香りの異なるガム咀嚼時に分泌される唾液中のコルチゾールを計測し,味・香りが異なるガム(無味,甘みのみ,レモンの香りのみ,甘み/酸味,甘み/レモンの香り)を咀嚼した時のコルチゾール計測と官能試験を行った.その結果,甘み/レモンの香りがあるガムが最もおいしいと被験者らは感じており,咀嚼による唾液分泌量とコルチゾール濃度は,甘み/レモンの香りのガムが他5種類の唾液より高い値を示したことから,おいしいと感じる味・香りのあるガム咀嚼によってストレス抑制効果のあるコルチゾールが多く分泌されることが分かった.また,f-MRIを用いて咀嚼時の脳血流計測を行うための予備実験として,顎口腔運動前後の頭位変化の影響をMRIを用いて評価した.その結果,運動前後の相関係数は0.97であり,頭位の変化は小さかった.さらに,顎口腔系の不随意運動時と咀嚼運動時のストレス反応を比較する為に,睡眠時ブラキシズム前後の心拍ゆらぎを記録し,解析をおこなった.その結果は現在総括中である.本研究では,様々な味・香りのガム咀嚼中の脳血流変化および体循環,自律神経活動(心拍血圧ゆらぎ解析)を評価し,味・香りの変化にこれらが受ける影響について検討を行った.その結果,味・香りがあるガムを咀嚼した時が最も脳血流が上昇し,味のある食品を摂取することが脳循環をはじめとする循環系の賦活化に重要であることが示された.次に,ガム咀嚼時に分泌される唾液中のコルチゾールを計測し,味および香りが異なるガムを咀嚼した時のストレス反応を明らかにすることを目的に実験を行った.その結果,甘み/レモンの香りがある最もおいしく感じるガムの咀嚼によって,ストレス抑制効果のあるコルチゾールが多く分泌されることが分かった.本申請課題は,味や香りが異なる食品の咀嚼によって生じる脳および全身の変化について明らかにすることが目的である.すなわち,味や香りの異なる食品の咀嚼によって脳に伝えられる情報が中枢でどのように処理されて全身に伝達されるのかを,脳血流・自律機能(神経性・体液性)・体循環(心拍・血圧),咀嚼時の情動という因子を複合的に分析し明らかにする試みである.研究は,1.食品の味・香りの違いが脳血流および体循環に与える影響について,2.食品の味・香りの違いが咀嚼中の嚥下に与える影響について,3.食品の味・香りの違いが咀嚼運動時の自律神経活動に与える影響について,の3項目に分けて行う.すでに申請者は味・香りが咀嚼時の脳血流に与える影響を検討するための実験を行っており,脳血流は味・香りの変化に影響されること,咀嚼時の脳血流と自律神経活動および情動の変化との間には何らかの関連性が認められることを明らかにし,論文投稿予定である.また本年度は,実験機器の動作確認や被験者の確保を行い,学内倫理委員会への申請,実験補助者への協力依頼や教育など,実験を遂行するための環境の整備を行った.その上で,味と香りが異なる食品を製作し,6種類のガム咀嚼時の唾液を採取し,唾液に含まれるストレスマーカーとなるホルモンの分析を終了させている.本申請課題の結果,味や香りが様々であり,多様な情動を生じさせる被験食品を咀嚼する時のストレスを明らかにすることができれば,食事をおいしく・

楽しく食べる生理的意義の一端を明らかにすることができ,同時に口腔機能の維持および回復の意義について,新たな見地からエビデンスを付加することができると予想される.実験機器や場所の確保を行い,被験者の確保,学内倫理委員会への申請,実験補助者への協力依頼など,実験を遂行するための環境の整備を行った.また,唾液の生化学分析を行うために,兵庫医科大学の共同実験施設の分析調整分野の技官の協力を得て予備実験を行い,唾液に含まれるストレスマーカーとなるホルモン(コルチゾール)の定量を行い,実験協力者とともにタンパク定量ができるようになった.さらに,甘味成分とそれぞれにマッチした香りを含んだ被験食品(ガム)の作製を食品会社に依頼し,予備実験としてガム咀嚼時の咀嚼筋筋活動を計測し,同程度の硬さ,粘度になるよう調整したものを製作した.製作した被験食品5種類を用いて約100名の唾液を採取し,唾液分泌量の計測とタンパクの同定を行った.その結果は,9月に開催される学会での発表と,その後の英文執筆を予定している.現在,心拍血圧ゆらぎおよび脳波計測で世界的に有名な大学での研修を行っている.計測方法,分析方法,データ解釈に対するトレーニング終了後は,本申請課題のテーマである心拍血圧ゆらぎ解析によるストレス分析を行う予定である.また,すでに行った実験に用いた被験食品は,味成分とそれぞれにマッチした香り(例;酸味とレモン,甘味とイチゴ)を含んだガムを用いたが,味と香りがミスマッチな場合(例;酸味とチョコレート,苦味とイチゴ)は,未だ検討していない.すなわち,美味しくない食品を咀嚼した場合は,情動の変化やストレスをともない,ストレスホルモンや唾液分泌に影響を与えると予想される.そこで,"おいしくない"食品を咀嚼した場合のストレスホルモンと唾液分泌について今後検討を加える予定である.本年度は昨年度に引き続き,電極や電池などの消耗品,唾液の生化学分析を行うために必要な機材および消耗品を計上している.データ収集および分析には,実験協力者の参加が不可欠であり,謝金を計上してある.また,被験食品の準備と購入に費用がかかることが予想される.さらに,海外研修費用や学会発表や研究打ち合わせのための旅費および論文執筆後の校正,出版に費用がかかると予想される.
土壌の乾燥再湿潤による有機物分解メカニズムの解明と定量的解析

将来の気候変動によって、土壌が乾燥再湿潤される回数が増加すると予測されている。土壌が乾燥再湿潤されると、微生物基質炭素(C)の増加を引き金として、微生物活性の増加とそれによる土壌からのCO2や養分放出量の増加というカスケード反応が起こる。そこで本研究では、乾燥履歴や微生物群集組成が異なる土壌を用いて、乾燥再湿潤による有機物分解メカニズムの解明を行うことを目的とする。2018年度は、乾燥履歴の異なる日本、カザフスタン、タイの森林や農耕地土壌において、乾燥再湿潤処理の繰り返しが微生物バイオマスとCO2放出速度に与える影響を調べた。さらに、滅菌処理した土壌への乾燥再湿潤処理の繰り返しの影響を調べ、土壌微生物でなく土壌有機物の易分解化が進むかどうかを解明した。その結果、土壌の乾燥履歴が多いカザフスタン土壌や日本、タイ農耕地土壌では、乾燥再湿潤処理の繰り返しによっても微生物バイオマスCの増減はほとんどなかった。一方、土壌の乾燥履歴が少ない日本やタイの森林土壌や日本水田土壌では、一回の乾燥再湿潤処理によって微生物の死滅によるバイオマスC減少割合が高くなった。しかし、乾燥再湿潤処理を繰り返すと、粘土含量の高い土壌では最終的にバイオマスCが減少し、粘土含量の低い土壌ではバイオマスCが増加した。粘土含量の低い土壌を滅菌処理後、乾燥再湿潤処理を繰り返すと、土壌有機物由来バイオマスCが増加した。つまり、土壌有機物の易分解化が進行したことが解明された。この研究課題では、乾燥履歴や微生物群集組成が異なる土壌において、乾燥再湿潤による有機物分解メカニズムの解明を行うことを目的に研究を行っている。現在までに、乾燥履歴の異なる土壌において、乾燥再湿潤処理の繰り返しが微生物バイオマスとCO2放出速度に与える影響を解明した。その結果、特に粘土含量の低い土壌では、乾燥再湿潤によって土壌有機物の易分解化が促進される可能性を見出した。以上の成果は、土壌の乾燥再湿潤によって、土壌からの炭素放出量が多くなることを示唆しており、重要な成果である。2019年度は、粘土含量が異なる土壌における乾燥再湿潤の影響を評価することで、メカニズムの解明に迫る。特に、「粘土含量が低く有機物保持能が低い土壌では、乾燥再湿潤によって土壌有機物の易分解化が進む」という、これまでの結果から得られた仮説を証明する。具体的には、粘土含量が異なる日本水田土壌において、γ線照射により微生物を死滅させた土壌に同一の水田土壌微生物群集を添加し、微生物の影響を同一にした条件下で、乾燥再湿潤処理の影響を評価する。これにより、土壌有機物の易分解化が粘土含量によって異なるかを評価し仮説を検証する。以上は、今後の気候変動によって土壌の炭素循環がどのように影響されるかを解明する上で重要である.将来の気候変動によって、土壌が乾燥再湿潤される回数が増加すると予測されている。土壌が乾燥再湿潤されると、微生物基質炭素(C)の増加を引き金として、微生物活性の増加とそれによる土壌からのCO2放出量の増加というカスケード反応が起こる。そこで本研究では、乾燥履歴や微生物群集組成が異なる日本の森林と農耕地土壌を用いて、乾燥再湿潤による有機物分解メカニズムの解明を行うことを目的とする。今年度は、日本水田土壌において、異なる強度の乾燥再湿潤処理が微生物バイオマスCとCO2放出速度に与える影響を調べた。さらに、日本森林土壌の長期(2か月)風乾保存が微生物群集組成に与える影響を調べた。その結果、土壌の乾燥強度が強くなるにつれて、微生物の死滅によるバイオマスC減少割合が高くなった。また、死菌体が基質Cになるため、易分解性Cが微生物によるCO2放出の制限因子にならなくなる(基質C飽和になる)場合があった。これまでのデータも含めて整理したところ、このC飽和を惹起するバイオマスCの減少割合の閾値として20%を推定した。つまり、乾燥再湿潤などの攪乱によって土壌微生物の20%が死滅した場合には、既存の有機物分解モデルは適用できないことが分かった。また、アンプリコン解析による細菌群集構造は、8つの日本森林土壌を風乾保存しても湿潤の場合とほとんど同じであった。つまり、死菌体中のDNAの大部分は、風乾状態では分解されずに残ることが分かった。日本水田土壌への様々な乾燥再湿潤処理が微生物バイオマスCとCO2放出速度に与える影響を調べ、さらにこれまでのデータと合わせて解析したことにより、土壌への乾燥再湿潤処理がバイオマスとCO2放出に与える影響の全容が解明されつつある。また、成果の一部は、Applied Soil Ecology誌に発表するなど、着実に成果を得ている。

一方、土壌の乾燥履歴が少ない日本やタイの森林土壌や日本水田土壌では、一回の乾燥再湿潤処理によって微生物の死滅によるバイオマスC減少割合が高くなった。しかし、乾燥再湿潤処理を繰り返すと、粘土含量の高い土壌では最終的にバイオマスCが減少し、粘土含量の低い土壌ではバイオマスCが増加した。粘土含量の低い土壌を滅菌処理後、乾燥再湿潤処理を繰り返すと、土壌有機物由来バイオマスCが増加した。つまり、土壌有機物の易分解化が進行したことが解明された。この研究課題では、乾燥履歴や微生物群集組成が異なる土壌において、乾燥再湿潤による有機物分解メカニズムの解明を行うことを目的に研究を行っている。現在までに、乾燥履歴の異なる土壌において、乾燥再湿潤処理の繰り返しが微生物バイオマスとCO2放出速度に与える影響を解明した。その結果、特に粘土含量の低い土壌では、乾燥再湿潤によって土壌有機物の易分解化が促進される可能性を見出した。以上の成果は、土壌の乾燥再湿潤によって、土壌からの炭素放出量が多くなることを示唆しており、重要な成果である。今後は、土壌の乾燥再湿潤が微生物群集組成に与える影響を解明し、有機物分解メカニズムを解明することを目指す。具体的には、乾燥再湿潤処理によって微生物の大部分が死滅することが分かっている日本森林土壌において、生き残った微生物の群集組成をDNAアンプリコンシークエンスにより解析する。2019年度は、粘土含量が異なる土壌における乾燥再湿潤の影響を評価することで、メカニズムの解明に迫る。特に、「粘土含量が低く有機物保持能が低い土壌では、乾燥再湿潤によって土壌有機物の易分解化が進む」という、これまでの結果から得られた仮説を証明する。具体的には、粘土含量が異なる日本水田土壌において、γ線照射により微生物を死滅させた土壌に同一の水田土壌微生物群集を添加し、微生物の影響を同一にした条件下で、乾燥再湿潤処理の影響を評価する。これにより、土壌有機物の易分解化が粘土含量によって異なるかを評価し仮説を検証する。以上は、今後の気候変動によって土壌の炭素循環がどのように影響されるかを解明する上で重要である.
他核種NMRによる溶液および液晶状態におけるいくつかのポリペプチドのコンホメ-ション解析の高度化

本研究は、溶液及び液晶状態におけるポリペプチド、ペプチド及び生体機能関連モデル化合物のコンホメ-ションの解析を高精度に行う方法の確立及びその応用を行うことを目的としている。固体高分解能^<13>C及び^<15>NNMRの測定により得られた固体^<13>C及び^<15>NNMR化学シフトがポリペプチド、ペプチド及び生体関連機能関連モデル化合物の溶液又は液晶状態におけるコンホメ-ション解析の基礎デ-タになることを明らかにした。固体化学シフトの基礎デ-タを集積することにより、種々ノポリペプチドなどの高精度のコンホメ-ション解析が行えると言う方法論が確立できた。応用として、ポリ(γ-n-オクタデシルL-グルタメ-ト)、ポリ(γ-オレイルL-グルタメ-ト)およびポリ(β-n-オクタデシルL-アスパルテ-ト)の主鎖及び側鎖のコンホメ-ションを温度可変した^<13>CNMR化学シフトデ-タより解析し、結晶状態、熔融状態におけるコンホメ-ションの安定性について議論した。また、サ-モトロピック液晶の発現機構を明らかにした。さらに、ポリ(L-フェニルアラニン)などのヘリックスセンスが正確にNMR化学シフトを通して解析した。蛋白質トロポミオシンの高次構造について、ポリペプチドの基礎デ-タを用いて溶液及び固体状態^<13>C化学シフトより高精度に解析を行った。生体中において金属イオンの輸送の機構と構造の関係を明らかにするために、モデル化合物イオノホアについて溶液構造と金属イオンの輸送の機構の関係をNμに解析より調べた。以上の結果をまとめると、溶液及び液晶状態におけるポリペプチド、ペプチド及び生体機能関連モデル化合物の高精度コンホメ-ション解析の方法論を確立したこととその応用性を明らかにしたことを結論とする。本研究は,溶液及び固体高分解能NMR法を用いて溶液,液晶及び固体状態におけるポリペプチド,ペプチド及び生体機能関連モデル化合物のコンホメーションの解析を高精度に行う方法の確立及びその応用を行うことを目的としたものである.従来は溶液の高分子のコンホメーション解析にスピン・スピン結合定数の測定を通して行われてきた.しかし,僅かな誤差がコンホメーション解析の精度を著るしく下げてきた.これを克服して高精度にコンホメーション解析を行うために固体高分解能NMRの測定によって得られた固体NMR化学シフトデータを基礎として,溶液,液晶及び固体状態におけるポリペプチド,ペプチド及び生体機能関連モデル化合物のコンホメーション解析を行った.研究対象としたポリ(γーnーオクタデシルLーグルタメート)の主鎖及び側鎖のコンホメーションを^<13>CNMR化学シフトデータについて解析し,サーモトロピック液晶の発現機構とコンホメーションの間に密接な関係があることを明らかにした.また,ポリペプチドが高次構造を形成する際の水素結合の構造と役割をモデルペプチドを合成して明らかにした.ポリ(Lーフェニルアラニン)のα及びωーヘリックスのセンスが右巻きであることを^<13>CNMR化学シフトデータを解析することにより明らかにした.また,絹フィブロインのコンホメーションについても議論した.さらに,生体中において金属イオンの輸送の機構と構造の関係を明らにするために,モデル化合物イオノホアについて溶液構造と金属イオンの輸送の機構の関係をNMR解析より調べた.次年度は前述の高精度コンホメーション解析の方法をより明確に確立することとその応用性の発展を検討する予定である.本研究は、溶液及び固体高分解能NMR法を用いて溶液、液晶及び固体状態におけるポリペプチド、ペプチド及び生体機能関連モデル化合物のコンホメーションの解析を高精度に行う方法の確立及びその応用を行うことを目的としたものである。

従来はコンホメーション解析にスピンカップリング定数を測定して行れてきた。しかし、僅かな誤差がコンホメーション解析の精度を著しく低下させる。これを克服して高精度にコンホメーション解析を行うために固体高分解能NMRスペクトルの測定によって得られる固体^1^3C及び^1^5N化学シフト値を基礎として、溶液、液晶及び固体状態におけるポリペプチド、オリゴペプチド及び生体関連モデル化合物のコンホメーション解析を行い、方法論の確立を試みた。研究対象としたポリ(γ-オレイルL-グルタメート)の主鎖及び側鎖のコンホメーションを^1^3C化学シフトデータについて解析し、サーモトロピック液晶の発現機構とコンホメーションの間に密接な関係があることを明らかにした。β-ターン構造をとっているオリゴペプチドが高次構造を形成する際の水素結合の構造と役割を^1^3C化学シフトデータを解析することにより明らかにした。さらに、生体中における金属イオンの輸送の機構と構造の関係を明らかにするために、モデル化合物イオノホアについて溶液構造と金属イオンの輸送の構構の関係をNMR解析により調べた。次年度は過去2年間に行った研究の補足実験を行い、本研究課題の総括を行いまとめる予定である。本研究は、溶液及び液晶状態におけるポリペプチド、ペプチド及び生体機能関連モデル化合物のコンホメ-ションの解析を高精度に行う方法の確立及びその応用を行うことを目的としている。固体高分解能^<13>C及び^<15>NNMRの測定により得られた固体^<13>C及び^<15>NNMR化学シフトがポリペプチド、ペプチド及び生体関連機能関連モデル化合物の溶液又は液晶状態におけるコンホメ-ション解析の基礎デ-タになることを明らかにした。固体化学シフトの基礎デ-タを集積することにより、種々のポリペプチドなどの高精度のコンホメ-ション解析が行えると云う方法論が確立できた。応用として、ポリ(γ-n-オクタデシルL-グルタメ-ト)、ポリ(γ-オレイルL-グルタメ-ト)及びポリ(β-n-オクタデシルL-アスパルテ-ト)の主鎖及び側鎖のコンホメ-ションを温度可変した^<13>CNMR化学シフトデ-タより解析し、結晶状態、液晶状態、溶融状態におけるコンホメ-ションの安定性について議論した。また、サ-モトロピック液晶の発現機構を明らかにした。さらに、ポリ(L-フェニルアラニン)などのヘリックスセンスが正確にNMR化学シフトを通して解析した。蛋白質トロポミオシンの高次構造について、ポリペプチドの基礎デ-タを用いて溶液及び固体状態^<13>C化学シフトより高精度に解析を行った。生体中において金属イオンの輸送の機構と構造の関係を明らかにするために、モデル化合物イオノホアについて溶液構造と金属イオンの輸送の機構の関係をNMR解析より調べた。以上の結果をまとめると、溶液及び液晶状態におけるポリペプチド、ペプチド及び生体機能関連モデル化合物の高精度コンホメ-ション解析の方法論を確立したこととその応用性を明らかにしたことを結論とする。
疾患iPS研究に基づく網膜色素変性症に対する新規神経保護治療薬の開発に向けた研究

研究代表者らはこれまでに、遺伝子変異により発症する網膜色素変性症の患者体細胞由来の人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて網膜細胞を誘導・培養し、神経保護治療法薬剤の開発に向けた病態メカニズムの解析(疾患iPS研究)を行い報告した。本研究では、疾患iPS研究の培養において有効性があった薬剤を、網膜色素変性症モデルマウス(ロドプシンP23Hノックインマウス)に投与して、生体内で網膜神経細胞の保護(細胞死抑制)効果を解析した。網膜色素変性症は、40008000人に1人で発症するとされ、遺伝子異常により生じる網膜視細胞もしくは網膜色素上皮細胞の変性であるが、そのメカニズムには不明の点が多い。現時点では、世界的にも承認された治療薬はなく、遺伝子異常がわかっていたとしても、対処法が無いという状況が続いている。徐々に進行し、国内失明原因の第3位を占める疾患である。早期に診断が付いても進行を抑制する安定した治療法はない。異常遺伝子が明らかになっても、細胞死のメカニズムが不明であるものが多いためである。そこで、申請者らはこれまでに、視物質であるロドプシン異常遺伝子を持つ網膜色素変性症患者の体細胞由来の人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて網膜細胞を誘導・培養し、神経保護治療法薬剤の開発に向けた病態メカニズムの解析(疾患iPS研究)を行い報告した(Yoshida, Ozawa, Okano et al. Mol. Brain 2014)。この中で本疾患におけるストレス応答反応の病態への関与を明らかにし、それを抑制する薬剤の候補を得た。そこで本研究では、疾患iPS研究の培養において有効性があった薬剤を、網膜色素変性症モデルマウスに投与して、生体内で網膜神経細胞の保護(細胞死抑制)効果が得られるかを解析することとした。これにより将来的には、網膜色素変性症のための新規進行抑制治療法の開発につなげることとした。予定通り網膜色素変性症モデルマウスは順調に飼育され、その表現型は組織学的、電気生理学的等の解析により、週齢を追って示されつつあり、予定通りの進捗である網膜色素変性症は、40008000人に1人で発症するとされ、遺伝子異常により生じる網膜視細胞もしくは網膜色素上皮細胞の変性であるが、そのメカニズムには不明の点が多い。そこで本研究では、疾患iPS研究の培養において有効性があった薬剤を、網膜色素変性症モデルマウスに投与して、生体内で網膜神経細胞の保護(細胞死抑制)効果が得られるかを解析する。モデルマウスの表現型の解析を進み治療開始のタイミング等の情報が得られたため、保護効果を得られる条件を解析している。本研究により将来的には、網膜色素変性症のための新規進行抑制治療法の開発につなげる。網膜色素変性症モデルマウスはほぼ順調に飼育され、その表現型は組織学的、電気生理学的等の解析により、週齢を追って示されている。モデルマウスの表現型はヘテロ遺伝子変異マウスで明らかであり、飼育が行いやすい。ただし、表現型や薬物介入の結果には性差のある可能性があり、雄のモデルマウスのみを用いることにしたため、そのためのモデルマウス入手の制限はやむを得ない。モデルマウスへの薬物投与はすでに開始済みである。網膜色素変性は、遺伝子異常を原因とし、徐々に進行する疾患で、失明原因の第3位を占める。日本人の4000-8000人に一人が発症するとされ、遺伝性疾患としては頻度が高いが、現時点では世界的に治療法がない。異常遺伝子が明らかになっても、ヒトの網膜細胞を採取しての研究は困難であり、細胞死のメカニズムが不明であるものが多いためである。これに対し、申請者らはこれまでに、異常遺伝子を持つ患者体細胞由来の人工多能性幹細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて網膜細胞を誘導・培養し、神経保護治療法薬剤の開発に向けた病態メカニズムの解析(疾患iPS研究)を行った。そして、患者遺伝子異常による網膜細胞死を抑制する薬剤スクリーニングを行った(Yoshida, Ozawa, Okano et al. Mol. Brain 2014)。そこで本研究では、疾患iPS研究の培養において有効性があった薬剤を、網膜色素変性モデルマウスに投与して、生体内で網膜神経細胞の保護(細胞死抑制)効果が得られるかを解析した。

具体的には、ロドプシン遺伝子異常を持つ網膜色素変性モデルマウスに対し、条件を振ってラパマイシンを継続的に投与して、網膜視細胞死を抑制することが可能かを組織学的に解析するとともに、網膜電図を測定して機能的にも解析した。また、その背景の分子メカニズムとして、疾患iPS研究で候補に挙がっていたメカニズムである小胞体ストレスの抑制について、in vivoで解析した。これにより、細胞培養による疾患iPS研究を、動物生体に応用する研究を行った。研究代表者らはこれまでに、遺伝子変異により発症する網膜色素変性症の患者体細胞由来の人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて網膜細胞を誘導・培養し、神経保護治療法薬剤の開発に向けた病態メカニズムの解析(疾患iPS研究)を行い報告した。本研究では、疾患iPS研究の培養において有効性があった薬剤を、網膜色素変性症モデルマウス(ロドプシンP23Hノックインマウス)に投与して、生体内で網膜神経細胞の保護(細胞死抑制)効果を解析した。今後は申請者らの先行研究である、疾患iPS研究により明らかにされた候補薬剤の一つであるラパマイシンの投与量や投与日程を振ることにより、コントロール群との効果の差を示す良い条件を探索する。効果の指標としては視機能を示す網膜電図を主に用い、必要に応じて組織学的解析も行う。また、副作用等についても配慮があり、体重等の情報も集めるようにする。万一、ラパマイシンによる介入で効果が不充分であると考えられる場合には、先行研究により示された他の候補薬剤の使用を検討する。そしてラパマイシンの投与量や投与経路等の条件について解析を進める。眼科学効率的な執行により残額が生じた。使用するマウスの週齢を合わせる必要があり、同時に多くの同週齢のマウスを飼育・準備するために時間調整が必要となったため、本年度使用するはずであった使用額の一部を次年度使用とすることとした。引き続き物品費や、旅費、解析費等に充てていく。解析に用いるモデルマウスの飼育および組織解析に用いる抗体等の購入のために用いる予定である。
プラスチックの出所情報に関する新分析法の開発

今日ほど真贋鑑定の必要に迫られている時代はないであろう。最近では,情報通信はもとより,貨幣,装飾品,食品に至るまで殆どすべての製品,産物に対して高度な偽物が出現し,大きな社会問題となっている。このような問題に対して製品樹脂に認証物質を混入させ,出所を明確にするシステム(プラゲノム)が提案されている。本研究ではこのような材料レベルでの出所認証を分子鋳型により行い,高度な生産管理分析法としての開発を行う。材料レベルにおいて出所情報を付加することの利点は,製品自体が破壊や粉砕されてもその情報が保持される高い信頼性にある。我々の研究グループは,プラスチック表面に分子の鋳型を高精度に作製する技術の開発を行ってきた。このとき,ポリマーには認証物質が含まれないので情報の暗号性が非常に高いと考えられる。本年度の検討では,アデノシン三リン酸(ATP)を認証物質と考え,その鋳型をポリピロール膜表面に過酸化により作製した。ATPを認証物質として選択した背景には酵素法により非常に高感度な定量が可能であること等による。鋳型膜をカーボン電極上に作製し,トリプルアンペロメトリにより検討を行った結果,ATPは鋳型に高い親和性を有し,認証物質として機能することが示された。さらにATP以外の物質は鋳型ポリマーには入りにくいことが実証されたので,この方法が認証手段として機能することが確認できた。今後さらに広範な検討を行い,本法実用化のための基礎的検討を進めたいと考えている。本年度の検討では,本手法がこの基本概念に従い機能するか確認する目的で,我々がこれまで鋳型ポリマーとして従来検討を行ってきたポリピロールを用い実験を行った。認証分子としては基本的な陰イオンであるリン酸イオンを用いて,カーボン電極上にポリピロール薄膜を作製した。このような薄膜のドーピング及び過酸化に対する応答を電気化学的に検討した。その結果,ポリマー表面にはドーパントイオンに対応する鋳型形成が示唆された。さらに,選択的な認証を目的としてDNAを用いた系についても検討を行ったが,24塩基長のオリゴヌクレオチドで十分な認証精度が確認された。
動脈硬化退縮を目指した新しい治療法<ナノテクノロジーを用いた病変指向性NO放出薬と遺伝子治療>の検討

今年度は、遺伝子として(1)テロメア短縮を抑制するTERT(2)エストロゲン受容体α,β等(3)各種NO合成酵素(4)SiRNAを用いたNADPHoxidase遺伝子除去したベクターを用意し,培養血管内皮細胞の検討により効率よく内皮機能を改善し,細胞老化を制御できる組み合わせを検討した。#1動脈硬化病変選択性遺伝子ウイルスベクター作成:精製済みのeNOS, iNOSのadeno-virus vectorに加え,補酵素BH_4を供給するGTPCHIのベクターを作成し,組み合わせた,NO放出能(酵素活性,NO代謝物,eNOS, iNOSmRNA,蛋白,活性酸素放出能(MLCA, FACScan)等を予定する。siRNAは細胞膜貫通領域での作用遮断を考えp47phoxを選択した。#3エストロゲン受容体(ER)α,βベクター作成:ERα,βのadnovirus vectorを用いて,eNOS, iNOS及びNADPH oxidase,以下で作るTERTとの相互作用を検討した。エストロゲンと同様ERα,βともeNOSを活性化した。#4テロメアを延長するTERT等の遺伝子ウイルスベクター:TERTをcloning,精製し,培養細胞(血管壁構成内皮,平滑筋,マクロファージ細胞)に導入し,各種老化指標(各PDLに対するテロメラーゼ活性,βガラクトシダーゼ染色性,P38MAPkinase活性等)及びアポトーシス指標(TUNNEL染色,DNA ladder,各caspase活性等)に対する影響を検討した。