hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1食の食事量を主体的に把握する食育の有効性：体組成の変化を指標として

本年度は、食育を実施しない場合(以下、非介入と示す)の調査を実施した。調査内容は、食事摂取状況は食物摂取頻度調査法、エクセル栄養君FFQg Ver.5(建帛社)を用いて調査した。身体活動量は、3次元加速度計Active style Pro HJA-750C(オムロン社製)を用いて7日間測定した。3次元加速度計は起床時から就寝時まで腰に装着し、水泳、入浴、部活動、睡眠時は外した。同時に30分ごとに行動内容を記録してもらった。身体組成は、3次元加速度計の測定期間の中で初日にInBody230(InBody Japan社製)を用いて早朝空腹時に測定した。対象者は新体操13名、なぎなた10名、陸上跳躍7名、チアリーディング12名であった。新体操は期分けにより有意な変化は認められなかった。陸上跳躍はシーズンとシーズン後を比較して、シーズン後は体重及び体脂肪量が有意に増加した。チアリーディングは体脂肪量が2回目は1回目及び3回目より有意に低値であった。身体組成と食事及び身体活動との関連を検討した結果、新体操では、試合期において体脂肪量と休日の歩数に正の相関関係が、炭水化物摂取量では負の相関関係が認められた。陸上跳躍はシーズン後からシーズンの差を変化率として、測定項目間の検討を行った結果、体脂肪量の変化率とエネルギー摂取量の変化率との間には関連は認められなかったが、芋類・豆類・砂糖類の変化率との間に有意な正の相関関係が認めれた。低強度活動時間の変化率とは有意な負の相関関係が認められた。食育資料の作成を実施した。料理の一般的な量を中サイズとし、小は0.5倍、大は1.5倍とした。20種類の献立を各3サイズ検討した。女子体育大学生(101名)では大サイズが量の判断が難しかった。お皿の大きさや料理の数をそろえる必要があるといった課題が残った。1年目に行う予定であった、非介入の測定を今年度行ったたため、介入を今年度実施することになった。それに伴い、本学の研究倫理委員会へ提出した研究計画書等が再提出となり、食育資料を用いた介入研究が開始できていないため。食育資料を作成する際に、お皿の大きさ及び、料理の数を統一させなかったため、料理サイズを把握する際に、お皿の大きさの影響を大きく受けてしまった。そのため、食育に使用する資料を作成しなおす必要ができたため。最終年度である今年度は、食育資料を用いた介入研究を実施する。そのためにまず、食育資料の再検討を実施する。その際、お皿の大きさ及び、料理の数を統一し、料理の種類の違いによる量の把握の難しさに関する検討を実施する。その後料理カードを作成し食育を実施できるように準備する。食育の対象者を身体組成の変化がみられ、身体組成と食事及び身体活動量で関連が認められたチアリーディングとなぎなたに絞って測定を実施することとする。当該年度は、大学生女子アスリートが適切な食事量を選択できない理由を検討するために、大学生女子アスリートの食事に対する認識の特徴及び生活習慣の特徴を質問紙を用いて検討した。対象者は東京都近郊の女子体育大学に通う70名(新体操部33名、陸上競技部37名)及び、女子大学に通う185名(健康スポーツ実習受講者)とした。質問項目は、運動習慣の有無、生活リズムの主観的評価、食習慣スコア、体型、食事量の比率とした。食事量の比率については、1日の食事(朝食・昼食・夕食・間食)を10とした場合に各食事量の割合を主観で回答してもらった(以下食事量比率と示す)。その結果、一般女子大学生では「家族と同居」、大学生女子アスリートでは「一人暮らし」が最も多く占めており、2群間において有意な違いが認められた。食事の摂取頻度や朝食の重要性に関する認識については、2群とも「毎日食べている」「とても重要だと思う」と回答した者が多く、有意な違いはみられなかった。しかし朝食の重要性に対する理由については、項目によって有意な違いがみられた。体型については、一般女子大学生は平均的な体型であるにも関わらず痩身願望が高く、大学生女子アスリートは「体型の自己認識の理由」と「食事が及ぼす影響」に関する質問に対して生活スタイルにあった回答をしていた。大学生女子アスリートは総じて生活時刻が規則正しく、早寝と適度な睡眠時間が確保されていた。朝食の内容に関しては重要であると認識しており、日々の身体調整も必要としているにも関わらず、摂取内容等が不十分であるのは居住形態の違いによるものと考えられた。今年度はまず、大学生女子アスリートの生活習慣の実態を明らかにするために、質問紙調査を用いて運動習慣のない女子大学生との比較を実施した。本調査に関しては分析を実施し、大学生女子アスリートの食習慣は居住形態及び生活リズムの主観的評価との関連が明らかになった。食事量に関する認識の特徴は現在分析中である。さらに今年度は、食事量を把握するための教材を作成した。当初、厚生労働省による「健康な食事」を基準に用いる予定であったが、対象者に身近である料理を一食の基準とするために、学生食堂の一食量を調査し基準を作成した。現在、教材の作製を進めている。同時に、食育の有効性を検討するための身体活動量、身体組成及び食事調査の1回目の調査を実施、解析している。

対象となる女子大学生アスリートのトレーニングの期分け及び、授業等のスケジュールを調整して調査時期を決定し、実施している。本年度は、食育を実施しない場合(以下、非介入と示す)の調査を実施した。調査内容は、食事摂取状況は食物摂取頻度調査法、エクセル栄養君FFQg Ver.5(建帛社)を用いて調査した。身体活動量は、3次元加速度計Active style Pro HJA-750C(オムロン社製)を用いて7日間測定した。3次元加速度計は起床時から就寝時まで腰に装着し、水泳、入浴、部活動、睡眠時は外した。同時に30分ごとに行動内容を記録してもらった。身体組成は、3次元加速度計の測定期間の中で初日にInBody230(InBody Japan社製)を用いて早朝空腹時に測定した。対象者は新体操13名、なぎなた10名、陸上跳躍7名、チアリーディング12名であった。新体操は期分けにより有意な変化は認められなかった。陸上跳躍はシーズンとシーズン後を比較して、シーズン後は体重及び体脂肪量が有意に増加した。チアリーディングは体脂肪量が2回目は1回目及び3回目より有意に低値であった。身体組成と食事及び身体活動との関連を検討した結果、新体操では、試合期において体脂肪量と休日の歩数に正の相関関係が、炭水化物摂取量では負の相関関係が認められた。陸上跳躍はシーズン後からシーズンの差を変化率として、測定項目間の検討を行った結果、体脂肪量の変化率とエネルギー摂取量の変化率との間には関連は認められなかったが、芋類・豆類・砂糖類の変化率との間に有意な正の相関関係が認めれた。低強度活動時間の変化率とは有意な負の相関関係が認められた。食育資料の作成を実施した。料理の一般的な量を中サイズとし、小は0.5倍、大は1.5倍とした。20種類の献立を各3サイズ検討した。女子体育大学生(101名)では大サイズが量の判断が難しかった。お皿の大きさや料理の数をそろえる必要があるといった課題が残った。1年目に行う予定であった、非介入の測定を今年度行ったたため、介入を今年度実施することになった。それに伴い、本学の研究倫理委員会へ提出した研究計画書等が再提出となり、食育資料を用いた介入研究が開始できていないため。食育資料を作成する際に、お皿の大きさ及び、料理の数を統一させなかったため、料理サイズを把握する際に、お皿の大きさの影響を大きく受けてしまった。そのため、食育に使用する資料を作成しなおす必要ができたため。教材開発に関しては、基準量を決定し、基準量の0.75倍を「小」、1.5倍を「大」とした食事を調理し撮影する。さらにそれらの難易度を把握するための調査を実施する。1回目の身体活動量、身体組成及び食事調査の分析をする。その後、教材を用いた食育を実施した場合の身体活動量、身体組成及び食事調査を実施する予定である。最終年度である今年度は、食育資料を用いた介入研究を実施する。そのためにまず、食育資料の再検討を実施する。その際、お皿の大きさ及び、料理の数を統一し、料理の種類の違いによる量の把握の難しさに関する検討を実施する。その後料理カードを作成し食育を実施できるように準備する。
Rj_2Rj_4遺伝子保有ダイズ品種の根粒菌株選択機構の解明と根粒菌接種技術への応用

ダイズ栽培における接種菌の根粒占有率向上のための根粒着生調節遺伝子(Rj)保有品種の根粒菌株選択能活用の可能性について検討した。ダイズIAC-2(Rj_2Rj_3)とHill(Rj_4)を交配し、その後代からRj_2Rj_4遺伝子型系統を選抜し、その系統のRj_3遺伝子保有の有無について調査し、いずれのRj_2Rj_4遺伝子型系統にもこの遺伝子の存在が確認し、Rj_2とRj_3遺伝子は同一染色体上に存在すると推定した。Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズを圃場栽培し、着生根粒から根粒菌を分離し、それらの分離菌がインドール酢酸産生能を有し、BTB培地をアルカリ化する菌とインドール酢酸産生能がなく、BTB培地をアルカリ化はするが、2週間以後逆に培地を酸性化する菌の2群に大別されることを示した。さらに、これらの分離根粒菌をそのコロニーの生理的形態的特徴によって9グループ分類したが、Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズによって特定のグループの根粒菌が選択されていることを立証することは出来なかった。一方、Uptake-hydogenaseを保有する菌株が高率に含まれるUSDA110血清型の根粒菌に対する各種Rj遺伝子型ダイズの選択性をポットおよび圃場試験で検討した結果、Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズのUSDA110血清型根粒菌に対する選択性が他のRj遺伝子型より大きいと判定した。分離根粒菌のゲノムDNAのRFLPには、分離源ダイズのRj遺伝子型による特異性は認めることが出来なかった。しかし、nodulation typeや生理的特性によって分離された各グループに属する根粒菌間に一定の傾向が読み取れたので、ダイズ根粒菌のゲノムDNAの構造にはRj遺伝子保有ダイズに対する親和性やその他の生理的特性に関連した特異性が存在する可能性がある。Rj遺伝子を保有するダイズ品種は特定の生理的特性を有するダイズ根粒菌による根粒形成を抑制するのみならず、根粒形成において特定根粒菌株に対する選択性を示す。すなわち、Rj_2品種はRj_4品種で根粒形成しない菌株(C型)を、Rj_4品種で根粒形成しない菌株(B型)に対して選択性を示す。そこで、この両Rj遺伝子を保有するダイズではどの様な選択性を示すかを検討した。Rj_2品種IAC-2とRj_4品種Hillを交配し、その後代から両遺伝子を保有する12系統を選抜した。これらの系統とIAC-2,Hillおよび非Rj品種を九州農試(筑後)転換畑土壌を充填したポットで栽培し、採取した根粒から根粒菌を分離、ダイズ根粒菌USDA110の抗血清による凝集反応、コロニーの形状、トリプトフアン添加培地におけるIAA生産能を調査した。その結果、Rj_2Rj_4系統からは、他の品種に比較して高率にセロタイプUSDA110の菌株が分離され、IAA生産能を示す菌は少なかった。つぎに、これらのダイズを九大農場に播種、ダイズ根粒菌USDA110を接種、開花期に抜取り、根粒着生状況、根粒活性、分離根粒菌の抗血清USDA110に対する反応を調査し、また、莢伸長期にも同様な調査を実施した。開花期調査では、USDA110接種により窒素固定の相対エネルギー効率はほぼ全品種で上昇が認められたが、宿主の遺伝子型による差には一定の傾向は認められなかった。

セロタイプUSDA110の菌の比率は主根根粒では90%前後、側根根粒での比率は6070%で、これも宿主遺伝子型による差異は明確でなかった。開花期の側根根粒の調査では、セロタイプUSDA110の菌の比率はいずれの遺伝子型でも低下したが、Rj_2Rj_4系統では低下が少ない傾向が認められ、USDA110接種効果のが他の遺伝子型品種より高くなる可能性が伺われた。Rj遺伝子を保有するダイズ品種は特定の生理的特性を有するダイズ根粒菌による根粒形成を抑制するのみならず、根粒形成において特定根粒菌株に対する選択性を示す。すなわち、Rj_2Rj_3品種はRj_4品種で根粒形成しない菌株(C型)を、Rj_4品種はRj_2Rj_3品種で根粒形成しない菌株(B型)に対して選択性を示す。そこで、この両Rj遺伝子を保有するダイズではどの様な選択性を示すかを検討するため、Rj_2Rj_3品種IAC-2とRj_4品種Hillを交配し、その後代からRj_2とRj_4の両遺伝子を保有するA,B,Cの3系統、12品種を選抜した。これらの品種についてRj_3の有無をUSDA33を接種して検定した結果、全ての品種で検出され、Rj_2とRj_3は同一の染色体上に存在すると推定された。接種試験用ダイズ栽培の培地の燐酸濃度と微量要素添加が根粒形成に及ぼす影響を検討し、燐酸濃度が上昇すると総根粒数は増大するが、50ppmを越えると主根の根粒数が減少し、微量要素の添加がその傾向を減少させることなどから、燐酸による一部の微量要素の不可給化が根粒形成を遅延させると推定した。Rj_2Rj_3Rj_4-遺伝子型およびnon-Rjダイズを九大農場で栽培し、200の分離菌を得、コロニーの形状とインドール酢酸産生能によって、9タイプに分類した。これらの分離菌株の中の30菌株をnon-Rj及びRj_2Rj_3Rj_4遺伝子型のA,C系統ダイズに接種し、根粒数と着生の早晩を比較した結果、A,C系統間に差が認められたことから、根粒菌株との間の親和性に系統間差がある判断した。Nodulation type Aの根粒菌は、Rj_2Rj_3およびRj_4両遺伝子型ダイズに有効根粒を形成する菌であるが、本研究で作出したRj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズに根粒形成する菌も当然Type Aである。これらのダイズはType Aに属する菌株のみによって有効根粒形成するが、おのおののRj遺伝子型によって遺伝的・生理的特性が異なる菌を選択されるとするならば、Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズからの分離菌はNon-Rj,Rj_2Rj_3あるいはRj_4遺伝子型ダイズからのType Aの分離菌とは特性に相違があってしかるべきである。そこで、各種Rj遺伝子型ダイズを圃場栽培し、その根粒からの分離菌の生理的特性、すなわち、コロニーの形状、色調、酸・アルカリ産生能、インドール酢酸産生能、Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズに対する親和性などについて調査した。しかし、Rj_2Rj_3Rj_4遺伝子型ダイズから分離した根粒菌には他のRj遺伝子型ダイズからの分離菌と区別される顕著な特異性は認めることは出来なかった。つぎに分離根粒菌の染色体DNAの構造に特異性が存在するか否かを検討するため、その制限断片長多型RFLPを調査比較した。その結果、予想されたような明確な差異は認めることは出来なかったが、nodulation typeや生理的特性によって分類された各グループに属する根粒菌の間には、以下の傾向が読み取れた。すなわち、Ndulation type AのIs-17,Is-55,Is-77,Is-80のRFLPには類似性が認められ、nodulation type BのIs-1とUSDA122は同一、USDA33とは異なっていた。
大気エアロゾル・海洋表面マイクロ層における光反応の実験的解明への挑戦

地球環境では,気相・液相・固相に加え,大気エアロゾルや海洋表面マイクロ層など界面(とくに気液界面)において複雑な化学反応がおきており,エアロゾルの物理化学的性質(放射強制力や毒性)や大気ー海洋間の物質循環に大きな影響を与えている.近年,気液界面における有機物の光反応が注目されているが,「気液界面の光反応」に関する実験は非常に少なく,初期過程である「有機物の光分解によるラジカル生成」すら定量的に分かっていないのが現状である.そこで本研究では,気液界面に存在する代表的な有機物であるノナン酸の液体試料に紫外光レーザーを照射し,生成したOHラジカルをレーザー誘起蛍光法で直接検出する実験をおこなう.地球環境では,気相・液相・固相に加え,大気エアロゾルや海洋表面マイクロ層など界面(とくに気液界面)において複雑な化学反応がおきており,エアロゾルの物理化学的性質(放射強制力や毒性)や大気ー海洋間の物質循環に大きな影響を与えている.近年,気液界面における有機物の光反応が注目されているが,「気液界面の光反応」に関する実験は非常に少なく,初期過程である「有機物の光分解によるラジカル生成」すら定量的に分かっていないのが現状である.そこで本研究では,気液界面に存在する代表的な有機物であるノナン酸の液体試料に紫外光レーザーを照射し,生成したOHラジカルをレーザー誘起蛍光法で直接検出する実験をおこなう.
外来がん患者の不眠に対する自律訓練法の効果

女性の乳がん患者と一般女性を対象に、不眠の有無とその影響要因を比較したところ、不眠について有意な差は認められなかった。そこで全研究対象者に、不眠の有無を従属変数とする多重ロジスティック回帰分析を行った結果、12歳以上の子供の同居、抑うつ、疲労感が影響要因として抽出された。不眠を軽減するには、がん疾患に関わらず一般女性を対象としたスクリーニングとこれら影響要因を軽減するような援助が必要である。国内外の文献で先行研究の検討を行い、外来通院中のがん患者が自宅で自律訓練法を用いた場合の睡眠への影響を評価する研究計画を立案し、研究施設にて医師や看護師、および採血を伴うため検査部と打ち合わせを重ね、研究における役割や活動の共通理解を深め、研究計画の最終確認を行った。また、携帯通信端末でのデータ収集に向け、業者との打ち合わせと調整、契約を行った。免疫機能の血液検査に向けて業者と打ち合わせを行い、実施可能な研究計画として、手順を確定していった。患者が必要ならばどこでも自律訓練法ができるように、自律訓練法の動画「自律訓練法リラクセーションガイド」「自律訓練法リラクセーションガイド短時間版」の2編作成し、Youtubeで公開した(http://youtu.be/KXkUVktqtIEおよびhttp://youtu.be/P8rtZQWPPzM)9月には研究者所属の大学の研究倫理委員会で承認された。しかし、2か所の研究施設より拒否されたため、研究施設を変え新たに研究者所属大学の研究倫理委員会で審査を受けている。国内外の文献で先行研究の検討を行い、外来通院中のがん患者が自宅で自律訓練法を用いた場合の睡眠への影響を評価する研究計画を立案し、研究施設にて医師や看護師、および採血を伴うため検査部と打ち合わせを重ね、研究における役割や活動の共通理解を深め、倫理的配慮について検討を重ね、研究計画の最終確認を行った。また、携帯通信端末でのデータ収集に向け、システムを提供する業者との打ち合わせと調整、契約を行った。免疫機能の血液検査に向けて業者との打ち合わせを行い実施可能な研究計画として手順を確定していった。必要な時患者がどこでも自律訓練法ができるように、自律訓練法の動画「自律訓練法リラクセーションガイド」「自律訓練法リラクセーションガイド短縮版」の2編を作成し、Youtubeで公開した( http://youtu.be/KXkUVktqtIE、http://youtu.be/P8rtZQWPPzM )。研究者所属大学の研究倫理委員会で承認されたが、予定していた2か所の研究施設より受け入れられなかったため、研究施設を変え、新たに研究者所属大学の研究倫理委員会で審査を受けている。また、外来通院中のがん患者の心理的ストレスと睡眠状態について横断的実態調査をする目的で、研究倫理委員会の承認を経て調査を開始し順調にデータを収集している。質問紙は、HADS, EORTCQLQ-C30(使用承認済),睡眠状態等に関する自作の調査票である。調査研究については、倫理審査を経て研究を開始し、順調にデータを収集している。介入研究については、研究者所属大学の研究倫理委員会の承認を経たが、予定していた2か所の研究施設の理解が得られず、新たに別の研究施設と調整を行い、倫理審査が継続中である。外来通院中の乳がん患者と一般女性の不眠の有無と不眠に影響する要因を調査比較し、乳がん患者の不眠に自律訓練法による介入試験を実施する際の資料とすることとした。乳腺外科の外来を受診する乳がん患者と、検診などで訪れた女性を一般女性として研究対象とし、基本属性、EORTC QLQ C-30、HADSを用いて調査した。528の調査票の入った封筒が持ち帰られ、研究者に返送されたのは292 (回収率55.3%)、そのうち記入漏れのない287を有効回答とした(有効回答率98.3%)。287名の対象者の平均年齢は51.7 (SD 11.7)歳、一般女性者の57.9%、乳がん患者の57.6%が不眠ありと答え、有意差は無かった。そこで、全対象者を不眠の有無で2群に分け比較すると、12歳以上の子供の同居、HADS-不安、HADS-抑うつ、役割機能、息切れ、食欲不振、疲労感、疼痛、情緒機能、認識機能、社会生活、経済的困難、全般的健康状態の13項目で有意な差が認められた。不眠の有無を従属変数とし、有意差がみられた13項目を一括投入し多変量ロジスティック解析を行ったところ、12歳以上の子供との同居でオッズ比(OR)0.404、HADS-抑うつOR 1.137、疲労感でOR 1.026と有意な影響が認められた。研究者らの予測に反して、乳がん患者と一般女性で不眠だと自覚している人数の割合に差はなかった。そして、疲労感と抑うつが不眠を増加させる方向に影響し、12歳以上の子供との同居は不眠を減少させる方向に影響していた。乳がんの女性ばかりでなく女性一般の多くが不眠・疲労感・抑うつを抱えている可能性があることから、それらをスクリーニングし支援していくことが必要と考える。支援の方法の一つとして、自律訓練法をはじめとするセルフリラクセーションが考えられ、今後その有用性や効果的な支援方法の検討が必要である。

そこで全研究対象者に、不眠の有無を従属変数とする多重ロジスティック回帰分析を行った結果、12歳以上の子供の同居、抑うつ、疲労感が影響要因として抽出された。不眠を軽減するには、がん疾患に関わらず一般女性を対象としたスクリーニングとこれら影響要因を軽減するような援助が必要である。研究者所属大学の研究倫理委員会の審査で承認されたが、2か所の研究施設で拒否され、研究場所を変えて倫理審査を受ける必要が出たため。調査研究については、順調にデータが収集できているため、今後は購入した統計ソフトで計画通りに解析し公表する予定である。介入研究については、倫理性・研究の意義・実施可能性・研究の厳密性について、研究施設職員及び研究グループで充分検討しながら倫理審査で承認を得ていく。リラクセーション看護倫理審査承認後は、介入研究の公開データベースに登録を行い、直ちに研究を開始する。調査研究については順調にデータを収集しているが、介入研究について、研究者所属大学の倫理審査を経た後2か所の研究施設から受け入れられなかった。研究場所を新たに調整し倫理審査を受けているため、介入研究実施にかかる分の助成金の使用を見合わせている。研究の進捗が遅れ、予定していた物品の購入を見合わせまた、外部委託の検査料が発生していないため。介入研究実施のため、携帯通信端末によるシステム使用料、外注で免疫機能を測定するための血液検査料、研究参加謝礼、介入研究及び調査研究での調査票の回収のための郵送料、データ解析のための統計ソフトの購入、the 19th International Conference on Cancer Nursingへの参加費等に使用する計画である。今後倫理審査承認後はすみやかに研究開始し、必要物品を購入する予定である。また、研究開始に伴い、外部委託の検査料が発生する予定である。
QCDに基づく高密度状態方程式の構築

当研究課題の格子QCD計算において中心的な手法となるHAL QCD法に関して、そこで得られる非局所バリオン間ポテンシャルの微分展開の収束性を確かめるため、NNチャンネルと同じ構造が期待されかつ理論解析が相対的に容易なΞΞの1S0相互作用に着目し、微分展開のNNLO次数のあらわな評価を行った。その結果、ウォールソースと呼ばれる演算子を用いた場合のLO次数の低エネルギーでの結果はNNLO次数の結果と良く一致することがわかった。これは、ウォールソースを用いることで効率的に高次微分項が抑制されていることの証拠と成る。さらに、非弾性散乱の効果や有限体積効果についても詳細な考察を展開した。一方、与えられたバリオン間ポテンシャルのもとでの、高密度物質の状態方程式の導出については、核物質および中性子物質について、クラスター変分法による結果と従来のAPR状態方程式の比較を、2体力だけの場合、3体力を含めた場合で比較し、多体問題手法の違いによる状態方程式の不定性に関する評価を行った。さらに、中性子星のクラスト領域での状態方程式について、クラスター変分法による状態方程式、APR状態方程式、SLy4状態方程式の3者の定量的比較を行った。30年度が最終年度であるため、記入しない。
胃の腺腫および腺癌の正確な診断と適切な治療の選択を目的とした分子臨床病理学的解析

胃の粘膜内腺管形成病変について、MUC gene由来タンパクと細胞増殖、β-cateninの発現の観点からその特性をすでに私は報告し(Int J Cancer 94: 166-70. 2001., Oncology64: 251-28.2003)、低異型度腺腫と腺癌の間にはadenoma-adenocarcinoma sequenceはほとんどみられないと仮説した。粘膜内腺癌では完全腸型形質を発現する病変においてのみ5番染色体長腕APC遺伝子近傍マイクロサテライトのloss of heterozygosity (5q-LOH)があることをすでに我が施設から報告している(Pathol. Res. Prac. 194: 405-12, 1998)。低異型度腺腫についての免疫組織化学的分類と5q-LOH解析については、低異型度腺腫の多くを占める完全腸型形質を発現する病変の約半数で5q-LOHがみられることがわかった。またDNA ploidy解析については全例がdiploid modeを呈していることがわかった。これらの結果からも胃の低異型度腺腫は通常の胃の腺癌と関連の高くない病変であることが示唆された。これらの研究を雑誌論文として発表し(Pathol. Res, Prac. 204. 2008. 1-9)し、第80回日本胃癌学会の日韓合同セッションにおいて口演発表を行った。韓国の消化管病理は米国からの影響を大きく受けており、胃の粘膜内腺管形成病変の病理学的取り扱いについても日本と異なる点がある。この発表において、胃粘膜内腺管形成病変の診断および内視鏡的治療が進んでいる日本での、これらの病変についての考え方を発表できたと考えている。胃の粘膜内腺管形成病変について、MUC gene由来タンパクと細胞増殖、β-cateninの発現の観点からその特性をすでに私は報告し(Int J Cancer94;166-70,2001., Oncology64:251-28,2003.)、良性腺腫と腺癌の間にはadenoma-adenocarcinoma sequenceはほとんどみられないと仮説した。粘膜内腺癌では完全腸型形質を発現する病変においてのみ5番染色体長腕APC遺伝子近傍マイクロサテライトのloss of heterozygosity(5q-LOH)があることをすでに我が施設から報告している(Pathol.Res.Prac.194;405-12,1998)。良性腺腫について免疫組織化学的分類と5q-LOHの解析を行い、良性腺腫の多くを占める完全型腸型形質を発現する病変の約半数で5q-LOHがみられることを私はすでに学会報告した。さらにploidy解析では良性腺腫の全例がdiploid modeを呈し、良性腺腫でもanueploid modeやpolyploid modeがみられると報告のある大腸とは特徴が異なることがわかった。また腸型形質として新たに注目されているCdx2についての免疫組織化学的検討を加えた結果、良性腺腫がすべて核に陽性所見を呈することがわかった。少数ではあるが胃型形質を発現する良性腺腫もみられ、これらでは5q-LOHはほとんどみられず、完全腸型腺腫とは特徴を異にする病変であることが示唆された。これらの研究を雑誌論文として発表する準備を進めている。また、胃粘膜では再生修復過程や萎縮の質的変化として化生がみられ、萎縮性胃炎や腸上皮化生は胃の前癌病態とも解釈されている。萎縮や腸上皮化生と同様に日常的に観察されているものの、詳細な検討が為されていない粘液腺化生について形態学的、免疫組織化学的検討を行い、学会にて研究発表を行った。前癌病態とも解釈されているこれらの変化の観察を進めながら、CGH法などのさらに詳細な方法を用いて平成19年度も胃腺腫や腺癌の発生および進展の研究を進めていく計画にある。

この発表において、胃粘膜内腺管形成病変の診断および内視鏡的治療が進んでいる日本での、これらの病変についての考え方を発表できたと考えている。
シロアリが白色腐朽材を好まない理由の解明とその現象の利用の可能性

ヤマトシロアリの採取をするためにアカマツあるいはクロマツ林内で枯れ枝や切り株中を探索した時、褐色腐朽材や健全材ではシロアリが営巣・摂食して居ることには頻繁に遭遇するが、白色腐朽材にはほとんどシロアリが営巣・摂食していない,褐色腐朽材ではセルロースやヘミセルロースなどが優先的に分解されリグニンが残されているのでシロアリの餌としてはむしろ不都合であるが、初期腐朽では適度に柔らかくなって養分もほとんど残されており、また腐朽菌種によっては道しるべフェロモンとして働く代謝産物を作ることもあるため営巣・摂食しやすいと考えられる.他方、白色腐朽材にはリグニンが少なくセルロース、ヘミセルロースが残されており、しかも適度に柔らかくなって営巣・摂食しやすく褐色腐朽材より優れた餌になりうるはずであり、上記の事象の合理的な説明がつかない。本研究の目的はこの理由を萌らかにすることである。昨年度は、京大生存研のシロアリ試験地でトランセクト法による調査を実施し、白色腐朽材がイエシロアリおよびヤマトシロア夢に忌避される傾向があることが確認された。また、2年前に埋設しておいたアカマツステークにおいても同様の現象が確認された。しかしながら分離菌で腐朽した木材を加熱すると忌避効果は示されないことがわかった。そこで、今年度は野外杭試験で暴露された腐朽材を試料として加熱、風乾およびそのままの状態で摂食試験を行ない、そのままの状態では、忌避効果が示されることが明らかになった。この試料につき、凍結乾燥後ヘキサン抽出を行い抽出画分をペーパーディスク法で検定したところ、この画分に忌避活性があることが明らかになった。今後、この画分の活性物質の化学構造を特定するとともに、活性を持つ腐朽菌の探索を行う予定である。ヤマトシロアリの採取をするためにアカマツあるいはクロマツ林内で枯れ枝や切り株中を探索した時、褐色腐朽材や健全材ではシロアリが営巣・摂食して居ることには頻繁に遭遇するが、白色腐朽材にはほとんどシロアリが営巣・摂食していない。褐色腐朽材ではセルロースやヘミセルロースなどが優先的に分解されリグニンが残されているのでシロアリの餌としてはむしろ不都合であるが、初期腐朽では適度に柔らかくなって養分もほとんど残されており、また腐朽菌種によっては道しるベフェロモンとして働く代謝産物を作ることもあるため営巣・摂食しやすいと考えられる。他方、白色腐朽材にはリグニンが少なくセルロース、ヘミセルロースが残されており、しかも適度に柔らかくなって営巣・摂食しやすく褐色腐朽材より優れた餌になりうるはずであり、上記の事象の合理的な説明がつかない。本研究の目的はこの理由を明らかにすることである。今年度は、この現象がイエシロアリとヤマトシロアリが混在した地域でも見られる現象か確認することおよび実験的にこの現象の原因を追究するための腐朽材試料を収集することを目的として、京大生存研のシロアリ試験地でトランセクト法による調査を実施した。また、収集した資料から腐朽薗を分離し、木材腐朽試験を実施した。トランセクト法による調査では、試験地の任意の3区画での調査によって、白色腐朽材がイエシロアリおよびヤマトシロアリに忌避される傾向があることが確認された。収集した白色腐朽材から分離培地によって菌を純粋分離し、木材腐朽試験を実施している。
走行サービスレベルの国際比較にもとづく新しい自転車利用空間システムの提案

我が国の自転車交通は,歩行者との錯綜,迷惑駐輪,事故への対処が急務となっている。本研究では,自転車等の利用空間に関する走行ルール,道路構造設計の検討を含めた統合的な空間整備のありかたを分析することを目的として,以下の内容の検討を行った。1)プローブバイシクルによるサービスレベル評価法の開発2)フランス、中国、日本の多様な自転車利用空間の走行サービスレベルの計測・評価・比較3)多様な自転車利用空間の構成指針我が国の自転車交通は,歩行者との錯綜,迷惑駐輪,事故への対処が急務となっている。1)プローブバイシクルによるサービスレベル評価法の開発2)フランス、中国、日本の多様な自転車利用空間の走行サービスレベルの計測・評価・比較3)多様な自転車利用空間の構成指針プローブバイシクルによるサービスレベル評価法の開発について以下の研究を実施した。具体的には、走行中の自転車から走行状況指標を自動計測し、それによって自転車の安全性、利便性からみた走行サービスレベルを評価するシステムを開発した。(1)自動計測項目を増強したプローバイシクルの開発従来の研究で開発したプローブナイシクルにブレーキ操作量、ハンドル蛇角のセンサー、長時間録画が可能な小型ビデオレコーダーを追加するとともに、性能の安定化を図り、6台の機材を製作した。(2)指定経路走行実験徳島市、高松市、大阪市、岡山市で多様な道路区間を対象に、被験者に指定した経路を走行させ、上記のプローブバイシクルを用いて走行状態を計測し、同時に走行環境に対する体感評価を路線区間別に調査した。(3)中国におけるプローブバイシクル調査および自転車交通流の調査中国の上海・杭州市において、同済大学藩教授の協力のもと、自転車道路の流動状況を上方設置固定カメラから観測し、速度・密度・交通量の交通流特性を分析した。さらには、中国において普及している電動自転車および普通自転車のプローブバイシクルを製作して走行状態を計測、比較するとともに、固定カメラの交通流分析でも電動自転車・普通自転車の走行特性の違いを分析した。(3)サービスレベルモデルの作成体感評価を外的基準として走行障害イベントの頻度、強度を説明変数する関係モデルを構築し、サービスレベル評価関数を開発した。プローブバイシクルを用いて,昨年の中国に続いてフランスのツールーズ、東京、大阪において自転車空間の走行特性を調査した。1.フランス地方都市における走行実験フランス・ツールーズ市は自転車利用者が多く,また自転車レーン設置などを積極的に取り入れるなどの試みをしている。こうした新しい利用空間システムを含む路線を選定し,プローブシステムによる計測を行った。日本より持ち込んだプローブシステムおよび現地でレンタルした自転車に計測器を取り付けたプローブシステムをもちいて,多様な利用空間システムを含む指定経路を現地住民が複数回走行する実験を実施した。2.日本の自転車走行空間の走行実験上記と同様の調査を、自転車道、自転車レーンが整備されている東京、大阪において実施した。3.大学生の利用者意識の調査中国、フランス,韓国、徳島の大学生を対象に、自転車を乗り始めた時期からの自転車利用に関する経験と自転車空間に対する評価意識をアンケート調査による分析し、比較した。4.サービスレベル評価モデルの再構築以上のデータおよび昨年に実施した中国の上海、杭州での調査データ、岡山、高松の自転車走行空間での走行調査データを用いてサービスレベル評価モデルを再構築した。5.自転車走行空間の比較分析サービスレベル評価モデルおよびプローブシステムによる走行指標を用いて、自転車道、自転車レーン、自歩道の自転車利用空間システムを評価,比較して、得失を明らかにした。我が国の自転車交通については,歩行者との錯綜,迷惑駐輪,事故への対処が急務となっており,このため,本研究では,自転車等の利用空間に関する走行ルール,道路構造設計の検討を含めた統合的な空間整備のありかたを分析することを目的とした.具体的には,以下を検討して,利用空間システムの走行サービスレベルを評価,比較し,望ましい施策体系を整理した.1)プローブバイシクルによるサービスレベル評価法の開発2)多様な自転車利用空間システムの走行サービスレベルめ計測・評価・比較3)利用空間システム構成のありかた平成21年度は昨年度までに実施したプローブバイシクルによる日本,中国,フランスの自転車利用空間システムを評価,比較分析し,さらに日本で進められそいる自転車利用空間モデル事業での多様な取り組みや,米国での白転車空間整備に関わる制度・指針をヒアリシグ調査して,利用空間システムの構成についてありかたを整理した。(1)プローブバイシクル調査にもとづく走行空間評価自転車利用時の安全感・快適性とプローブパイシクルによる走行性能調査結果の関連性を分析した。特に,自転車専用空間と共有空間,一方通行と対面通行に着目して,空間システムを評価した。その結果,自転車の走行空間としては,自転車レーン(自転車専用通行帯)による一方通行の車道空間が最も優れていることがあきらかになった。また,米国等においでも対面型における事故多発の経験を踏まえて,自転車レーンを中心とした整備が進んでいることも明らかになった。(2)利用空間システム構成ああり方の整理上記の知見を踏まえて,自転車専用空間と共有空間,一方通行と対面通行,自転車速度の多様性,利用者の多様性に着目して,我が国における自転車道,自転車専用通行帯,自歩道の3区分の利用システム構成を評価し,住民の受容性を考慮して,自歩道と車道内の走行空間確保を併存させる方式を基本とした方針を整理した。
絶滅危惧Ⅱ類（VU)タンチョウの保全に資する有機汚染物質曝露調査

北海道東部の湿原に生息するタンチョウは、絶滅危惧種に選定されている。近年、その生息域は人間の生活圏に近づき,人為起源の化学物質への曝露量が増える可能性があることから,化学物質への曝露量の推定は保護活動を行う上で重要である。本研究では、タンチョウの筋肉組織中の残留性有機汚染物質(POPs)を初めて測定し、観察された濃度は他の鳥類より低く、毒性発現を考慮すべきレベルではないことが分かった。また、胆汁に排泄される多環芳香族炭化水素(PAH)の代謝物である水酸化PAHの分析法を開発し、タンチョウの胆汁中に排泄される代謝物を検出することに成功し、PAH曝露指標の候補になることを明らかにした。タンチョウの生息環境からの化学物質曝露は、卵殻薄化や孵化率の低下を引き起こす可能性があり、化学物質の曝露状況の把握は保護活動を行う上で重要である。本研究では、1989年より25年間にわたり釧路市動物園にて保存されているタンチョウのへい死個体の臓器・組織(胸筋、肺、肝臓等)に蓄積されている残留性有機汚染物質(Persistent Organic Pollutants; POPs)や多環芳香族炭化水素類(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)を定量し、曝露量や毒性発現の可能性を推定することを目的とする。また、曝露量の高い物質について生息環境から得た試料(大気、土壌、水、餌)を分析して生息地の汚染状況、寄与度の大きい曝露源(地元発生源または長距離輸送)を明らかにする。平成27年度は、列車衝突や車両衝突、電線衝突など突発的な原因によってへい死したタンチョウの成鳥野生個体の組織片を経年的に抽出し、POPsの組織中濃度を測定した。POPsが最も蓄積・濃縮しやすい脂肪組織(大腿筋から抽出して得られる脂肪試料)について試験的に定量し、すべての試料からヘキサクロロベンゼン(HCB)、ジクロロジフェニルトリクロロエタンとその代謝物(DDT類)、クロルデン類、ヘキサクロロシクロヘキサン類、PCB類、ポリブロモジフェニルエーテル(PBDE)類を同定・定量することに成功した。このことから、北海道東部に生息するタンチョウがPOPsに複合汚染されていることが明らかになった。また、胆汁に排泄されると予測さるPAH代謝物の分析を行うため、分析法の開発を実施し、高感度検出を可能にする誘導体化法を用いたLC-MS/MSによる分析法を開発した。タンチョウの大腿筋試料の脂肪に含まれるPOPsを定量することに成功し、すべての個体から多数のPOPsが検出された。タンチョウが複合的なPOPs汚染に曝されていることが明確になり、環境中の曝露源の解析へと研究をつなげることができる。組織試料からPOPsの定量を実施できたことは当初の計画どおりに順調に進展している。また、PAH代謝物の高感度LC-MS/MS分析を行えるようになり、胆汁試料の適切な前処理法が完成すれば、次年度以降に実試料についてのPAH代謝物の定量を着実に行うことができる。環境からのPAH類の曝露に関する調査について、その準備段階としてPAH類の1種であるPAHキノン類の環境試料の分析法の開発にも成功している。平成28年度は、列車衝突や車両衝突、電線衝突など突発的な原因によってへい死したタンチョウの成鳥野生個体のうち、測定可能であった47個体(20022016年に回収)について、筋肉組織中のPOPs濃度を測定した。すべての試料からヘキサクロロベンゼン(HCB)、ジクロロジフェニルトリクロロエタンとその代謝物(DDT類)、クロルデン類、ヘキサクロロシクロヘキサン類、PCB類、ポリブロモジフェニルエーテル(PBDE)類を同定・定量し結果の解析を行った。PCB類の濃度が最も高かったが、他の鳥類の濃度より低く、急性影響が現れるレベルではなかった。また測定物質濃度の関係からPBDE類は他のPOPsとは曝露経路が異なることが分かった。一方で、胆汁に排泄されると予測されるPAH代謝物として水酸化PAHの分析法を開発するため、胆汁試料の前処理法を確立した。精製したタンチョウの胆汁試料を液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)により分析し、9種のOHPAHを検出することに成功した。平成28年度も継続してタンチョウの筋肉組織中のPOPsを定量し、測定可能な試料のすべて測定を終了した。得られた定量値についてデータ解析を行い、POPsによって曝露経路が大きく異なることが明確になった。成果をまとめた論文はすでに投稿中であり、当初の計画以上に順調に進展している。また、PAH代謝物であるOHPAHのLC-MS/MSによる高感度検出に加え、固相抽出等を用いた胆汁試料の適切な前処理法が完成し、実際にタンチョウの胆汁試料からOHPAHを検出することに成功した。

タンチョウの生息環境からの化学物質曝露は、卵殻薄化や孵化率の低下を引き起こす可能性があり、化学物質の曝露状況の把握は保護活動を行う上で重要である。近年の湿原の減少や生息数の増加により、その生息域は人間の生活圏に近づいており、人為起源の化学物質への曝露量が増える等の生息環境の悪化が懸念される。本研究では、1989年より25年間にわたり釧路市動物園にて保存されているタンチョウのへい死個体の臓器・組織(胸筋、肺、肝臓等)に蓄積されている残留性有機汚染物質(Persistent Organic Pollutants; POPs)や多環芳香族炭化水素類(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)を定量し、曝露量や毒性発現の可能性を推定することを目的とする。平成29年度は、胆汁に排泄されるPAH代謝物である水酸化PAH(OHPAH)について、開発した液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)による分析法を用いて2環のナフタレンから4環のピレンまでの9種のOHPAHについて定量したところ、ピレンの代謝物が最も高濃度に検出された。食餌等から曝露したPAHの中でピレンの曝露量が相対的に高いと考えられた。また、肝臓や脂肪組織からのPAH類の分析に関する検討も実施した。さらに、筋肉組織中のPOPs濃度を測定した結果について解析し、POPs濃度が日本の他の鳥類で観察された濃度よりも低いことは、生息域の汚染が低いことに加えて、タンチョウは雑食性のため、肉食性の鳥類よりPOPsを蓄積しにくいと結論付けられた。北海道東部の湿原に生息するタンチョウは、絶滅危惧種に選定されている。近年、その生息域は人間の生活圏に近づき,人為起源の化学物質への曝露量が増える可能性があることから,化学物質への曝露量の推定は保護活動を行う上で重要である。本研究では、タンチョウの筋肉組織中の残留性有機汚染物質(POPs)を初めて測定し、観察された濃度は他の鳥類より低く、毒性発現を考慮すべきレベルではないことが分かった。また、胆汁に排泄される多環芳香族炭化水素(PAH)の代謝物である水酸化PAHの分析法を開発し、タンチョウの胆汁中に排泄される代謝物を検出することに成功し、PAH曝露指標の候補になることを明らかにした。平成27年度に大腿筋試料の脂肪からPOPsを定量することに成功したことから、28年度も継続してPOPsの分析を実施し、50羽程度のデータを得る。定量結果について、各個体の高濃度曝露の有無、化合物間の関連、体長等の個体情報や生息地の汚染状況との関係、餌のパターン、人間の生活圏との関わりによる曝露量の増大について考察する。また、胆汁中PAH代謝物の分析について、胆汁の前処理を完成させ、POPsを測定した個体の胆汁の定量を実施する。PAH曝露に関しても、POPsと同様に各個体情報をの関係性を考察する。生体試料の解析を終了した時点で、POPs及びPAHsの曝露源を推定し、次年度に調査すべき対象の生息環境(土壌や餌等)を決定する。平成28年度に測定可能な筋肉組織の全試料についてPOPsの定量を完了し、データ解析を行い論文として投稿中であるが、動物園に新たな収容個体がある場合には継続してPOPsの分析を行う。また、筋肉中濃度の違い等から曝露経路が異なると推定された化合物について、関連する環境因子について推定を行う。
ｉＰＳ細胞からの筋形成過程におけるジストロフィン機能：１分子イメジングによる解明

本研究では、細胞外マトリックスと細胞骨格アクチン線維を結合させるジストロフィンージストログリカン(DP-DG)複合体について、動態と外力による変化を解明し、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD症)の発症機構を明らかにすることを目標としている。DMD症は筋萎縮症の中最も頻度が高く、およそ5歳から筋力低下が起こり、20歳代で心不全または呼吸不全により死に至る。原因はジストロフィン(DP)不全である。年齢が上昇するにつれて重篤化するのは、筋収縮時の力学的ストレスにDP不全筋細胞が耐えられないからだと考えているが、しかし、未だ解明には至っていない。私は、DGの細胞外ドメイン(αサブユニット)と細胞質ドメイン(βサブユニット)の両方を、二種類の蛍光物質で標記し、全反射顕微鏡で1分子観察を行い、これらのDGサブユニットの動きを追跡してきた。その結果、DGはプロテアーゼで切断されてαとβのサブユニットに分解されるが、αとβのサブユニットその後も相互作用する、相互作用時間は0.2秒程度であり、次々と結合相手を変えていく、αとβサブユニットは単純な拡散運動ではなく、細胞膜上で一時停留と拡散(時間比で6:4)を繰り返す、一時停留は特定の部位でおきやすい、などを発見した。さらに人工DP分子を用いて、DPとDGの2色同時1分子観察に成功し、1個のDP-DG複合体は寿命が1秒未満であり、細胞外マトリックスと細胞骨格アクチン線維とを動的に結合していること、DP-DG複合体は一個の細胞に多数あり、全体としては常に結合を保っていることが分かった。このことから、複合体は、全体としては常に結合を保ち、単体では結合が外れやすいことで、外力による細胞膜の破壊を避けていると想定できる。これらは細胞にとって、非常に重要な役割を担っており、DMD症発症機構の解明に貢献すると考えられる。まもなく論文投稿予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、2つの膜構造体、すなわち、ジストロフィン-ジストログリカン複合体(DP-DG複合体)と接着斑(focaladhesion=FA)、について以下の3点を明らかにすることを目標としている。(1)DP-DG複合体、FA、それらとアクチン膜骨格まで加えたシステムが、どのように形成されるか、(2)筋組織の分化過程や筋細胞に外力負荷が繰り返されたとき、そのシステムがどのように変化するか、(3)DPの欠損や変異が、分化過程や膜の力学的安定性にどのような影響を及ぼすか。昨年度は、DP-DG複合体とFAが筋組織の発生過程で形成される機構、さらに、筋細胞の細胞膜を安定化する機構を調べるため、まず、ES/iPS細胞を用いたDGの1分子観察系の確立を進めた。まず、Es細胞にDGの遺伝子をトランジェントトランスフェクションするのではなく(効率が悪い上に面倒なので)、DG-GFPを安定発現するES細胞株を樹立した。この細胞株では、DG-GFPが安定発現しているのみならず、その発現量をdoxycycline濃度依存的に替えることに成功した。すなわち、この細胞株を用いれば、分化の途上でdoxy(ycline濃度を変化させ、DG-GFPの発現量を調整することができる。またこれによって、DP-DG複合体が分化過程で形成される機構を調べることが可能となる。さらにFAの形成機構について、株化培養細胞を用いて調べた。Rac1(FAの組成分子)は、FAの中で自由拡散を行っており、拡散係数は、FA外の1/3であった。すなわち、FAは、多くのタンパク質からなる1個の巨大な凝集塊ではなく、タンパク質の小集合体からできた島が、群島のように集まって出来た構造体であることが分かってきた。本研究では、2つの膜構造体、すなわち、ジストロフィン-ジストログリカン複合体(DP-DG複合体)と接着斑(focal adhesion=FA)、について以下の3点を明らかにすることを目標としている。昨年度(平成25年度)は、DP-DG複合体の機能を調べるため、まずは株化培養細胞にDP-Haloタグタンパク質を発現させることにした。これにタグタンパク質の蛍光リガンドを加えて結合させ、蛍光標識できる。しかしDPの分子量が大きいため(426kDa)、発現に成功した報告はない。そこで、DP分子の既知の機能ドメインを寄せ集めて作られた分子量の小さい人工分子であるmicroDP (130kDa)を細胞に発現させることで、microDPの1分子観察に成功した。一方、既に出版された他の研究では、膜貫通型タンパク質のDGはERにおいて1本のポリペプチドとして合成されたあと、ゴルジ、または、細胞膜において、タンパク質切断酵素によってαとβの2つのサブユニットに分断される。しかしそれらのサブユニットが、非共有結合で結合したままでいると考えられてきたが、確証は得られていない。さらに最近、DGのαサブユニットはさらに、N末端側がいくつかの切断を受けて失われることが報告された。これらを確定することは、本研究を進めるのには重要であるので、以下の実験をおこなった。

すなわち、DGのαサブユニットの3つのポジション(29、170、500)に蛍光標識できるタグを挿入して、1分子観察した。その結果、DGのαサブユニットはポジション29と170の間で切断されることが確定できた。本研究では、細胞外マトリックスと細胞骨格アクチン線維を結合させるジストロフィンージストログリカン(DP-DG)複合体について、動態と外力による変化を解明し、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD症)の発症機構を明らかにすることを目標としている。DMD症は筋萎縮症の中最も頻度が高く、およそ5歳から筋力低下が起こり、20歳代で心不全または呼吸不全により死に至る。原因はジストロフィン(DP)不全である。年齢が上昇するにつれて重篤化するのは、筋収縮時の力学的ストレスにDP不全筋細胞が耐えられないからだと考えているが、しかし、未だ解明には至っていない。私は、DGの細胞外ドメイン(αサブユニット)と細胞質ドメイン(βサブユニット)の両方を、二種類の蛍光物質で標記し、全反射顕微鏡で1分子観察を行い、これらのDGサブユニットの動きを追跡してきた。その結果、DGはプロテアーゼで切断されてαとβのサブユニットに分解されるが、αとβのサブユニットその後も相互作用する、相互作用時間は0.2秒程度であり、次々と結合相手を変えていく、αとβサブユニットは単純な拡散運動ではなく、細胞膜上で一時停留と拡散(時間比で6:4)を繰り返す、一時停留は特定の部位でおきやすい、などを発見した。さらに人工DP分子を用いて、DPとDGの2色同時1分子観察に成功し、1個のDP-DG複合体は寿命が1秒未満であり、細胞外マトリックスと細胞骨格アクチン線維とを動的に結合していること、DP-DG複合体は一個の細胞に多数あり、全体としては常に結合を保っていることが分かった。このことから、複合体は、全体としては常に結合を保ち、単体では結合が外れやすいことで、外力による細胞膜の破壊を避けていると想定できる。これらは細胞にとって、非常に重要な役割を担っており、DMD症発症機構の解明に貢献すると考えられる。まもなく論文投稿予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、まず、接着斑は、タンパク質の小集合体からできた島が、群島のように集まって出来た構造体であることが分かってきた。これらは、2報の論文として出版された。ジストロフィンージストログリカン複合体(DP-DG複合体)については、ES/iPs細胞を用いたDGの1分子観察系の確立を進めた。DG-GFPを安定発現するES細胞株を樹立し、その発現量をdoxycycline濃度依存的に替えることに成功した。これによって、DP-DG複合体が分化過程で形成される機構を調べることが可能となった。昨年度は、ジストログリカン(DG)と人エジストロフィン分子(microDP)をそれぞれ株化培養細胞に発現させ、1分子観察をすることに成功した。さらに、DGのαサブユニットはアミノ酸配列の29番目、及び170番目のあとで切断されることを1分子観察で明らかにした。本年度は、これらに基づき、microDPとDGを2色同時1分子観察し、それらの相互作用を明らかにする。さらに、DP-DG複合体と会合する可能性が有る他の膜貫通型タンパク質との相互作用を餌明しようとしている。